(57)【要約】【課題】免疫学的定量法を用い、簡便に、かつ最小限の誤差で、高感度に定量可能な金属の免疫学的定量方法及び免疫学的定量装置、並びに、それらに用いられる金属錯体固定化膜を提供する。【解決手段】  金属の存在の判別対象である試料中に、前記金属をキレートして金属錯体を形成するキレート剤と、前記金属錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体とを混合して混合試料を調製する混合試料調製工程と、  前記混合試料を、前記金属錯体を固定化した金属錯体固定化膜に通液する通液工程と、  前記通液工程において、前記金属錯体固定化膜に固定化された前記金属錯体に結合する前記モノクローナル抗体の量に基づき、前記試料中に含まれる金属を定量する定量工程とを含む金属の免疫学的定量方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属の存在の判別対象である試料中に、前記金属をキレートして金属錯体を形成するキレート剤と、前記金属錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体とを混合して混合試料を調製し、前記試料中に前記金属が含まれる場合に、前記キレート剤が前記金属をキレートして形成される前記金属錯体を、前記モノクローナル抗体で捕捉させる混合試料調製工程と、
前記混合試料を、前記金属錯体を固定化した金属錯体固定化膜に通液させ、前記混合試料中に含まれる前記金属錯体を捕捉していない前記モノクローナル抗体を、前記金属錯体固定化膜に固定化された前記金属錯体に結合させる通液工程と、
前記金属を含まない前記混合試料を前記金属錯体固定化膜に通液させた場合に、前記金属錯体固定化膜に固定化された金属錯体に結合する前記モノクローナル抗体の量と、前記通液工程において、前記金属錯体固定化膜に固定化された前記金属錯体に結合する前記モノクローナル抗体の量とに基づき、前記試料中に含まれる金属を定量する定量工程と
を含むことを特徴とする金属の免疫学的定量方法。
【請求項２】
モノクローナル抗体が標識物質により標識され、定量工程が、前記金属を含まない前記混合試料を前記金属錯体固定化膜に通液させた場合に、前記金属錯体固定化膜に固定化された金属錯体に結合する前記モノクローナル抗体の量に対応する前記標識物質による光の吸収量と、前記通液工程において、前記金属錯体固定化膜に固定化された前記金属錯体に結合した前記モノクローナル抗体の量に対応する前記標識物質による光の吸収量とに基づき、前記試料中に含まれる金属を定量する請求項１に記載の金属の免疫学的定量方法。
【請求項３】
通液工程における、金属錯体固定化膜に混合試料を通液させる際における、前記混合試料の、送液量が１ｍｌ〜１０ｍｌであり、かつ送液速度が５ｍｌ／ｍｉｎ〜０．５ｍｌ／ｍｉｎである請求項１から２のいずれかに記載の金属の免疫学的定量方法。
【請求項４】
金属がカドミウムである請求項１から３のいずれかに記載の金属の免疫学的定量方法。
【請求項５】
モノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７０３として寄託されているハイブリドーマから産生された請求項４に記載の金属の免疫学的定量方法。
【請求項６】
金属が鉛である請求項１から３のいずれかに記載の金属の免疫学的定量方法。
【請求項７】
モノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７４５として受領されているハイブリドーマ、及び受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７４６として受領されているハイブリドーマのいずれかから産生された請求項６に記載の金属の免疫学的定量方法。
【請求項８】
金属が３価クロムである請求項１から３のいずれかに記載の金属の免疫学的定量方法。
【請求項９】
モノクローナル抗体が、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３７９として受領されているハイブリドーマから産生された請求項８に記載の金属の免疫学的定量方法。
【請求項１０】
金属の存在の判別対象である試料中に、前記金属をキレートして金属錯体を形成するキレート剤と、前記金属錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体とを混合して混合試料を調製し、前記試料中に前記金属が含まれる場合に、前記キレート剤が前記金属をキレートして形成される前記金属錯体を、前記モノクローナル抗体で捕捉させた前記混合試料を、前記金属錯体を固定化した金属錯体固定化膜に通液させ、前記混合試料中に含まれる前記金属錯体を捕捉していない前記モノクローナル抗体を、前記膜状担体に固定化された前記金属錯体に結合させる通液手段と、
前記金属を含まない前記混合試料を前記金属錯体固定化膜に通液させた場合に、前記金属錯体固定化膜に固定化された金属錯体に結合する前記モノクローナル抗体の量と、前記通液工程において、前記金属錯体固定化膜に固定化された前記金属錯体に結合した前記モノクローナル抗体の量とに基づき、前記試料中に含まれる金属を定量する定量手段と
を有することを特徴とする金属の免疫学的定量装置。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれかに記載の金属の免疫学的定量方法に用いられる金属錯体固定化膜であって、通液可能な膜状担体に金属錯体が固定化されてなることを特徴とする金属錯体固定化膜。
【請求項１２】
金属が、カドミウム、３価クロム及び鉛のいずれかである請求項１１に記載の金属錯体固定化膜。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属の免疫学的定量方法に関し、特に、金属錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を用いた金属の免疫学的定量方法、及びこの定量法に用いられる免疫学的定量装置、並びに、それらに用いる金属錯体固定化膜に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境保全などの社会的な環境意識や健康に対する影響への関心の高まりから、産業や生活に伴う様々な場面における環境汚染物質の排出・蓄積の動向が注視されている。環境汚染物質の中でも環境汚染が問題となっているカドミウム、水銀、鉛、６価クロム、ヒ素などの金属については公的機関により飲料水や地下水における水質基準、土壌における環境基準、環境への排出基準が設けられている。さらに、平成１５年２月に土壌汚染対策法が施行され、水質汚濁防止法と併せて、土壌に含まれることに起因して人の健康に係る被害を生ずるおそれがある他の金属についても法的規準が設けられつつある。
【０００３】
これら土壌や水などに対する金属についての汚染調査の公定法分析には、従来、原子吸光度計や質量分析法などが用いられている。しかしながら、公定法分析には、多大な時間と費用を要する。一方で、汚染調査が必要とされる土壌などの大幅な増加が見込まれることから分析時間と費用の削減のためには、特定物質が環境基準値以上存在している高濃度エリアを絞り込んだ後に、該高濃度エリアのみを公定法分析することが望ましく、高濃度エリアを絞り込むための簡易分析法が望まれる。
【０００４】
これに対し、試料中の被検物質の存在を判別する簡便かつ迅速な分析方法として、抗原抗体反応を利用した免疫学的定量方法（イムノアッセイ）が提案されている（例えば、非特許文献１参照）。
しかし、前記カドミウム、水銀、鉛、６価クロム、ヒ素などの金属の場合、金属元素またはそのイオン単独では抗原性を持たない。そのため、前記金属の存在の判別対象である試料中に、前記金属をキレートして金属錯体を形成するキレート剤を混合し、前記試料中に前記金属が含まれる場合に、前記キレート剤が前記金属をキレートして形成される金属錯体を抗原とし、抗体に認識させる。このような、金属錯体に対して特異的に反応する抗体として、例えば、カドミウム錯体及び水銀錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体や（例えば、特許文献１参照）、鉛錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体や（例えば、非特許文献２参照）、亜鉛錯体及び銅錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体や（例えば、特許文献２参照）、３価クロム錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体（例えば、特許文献３参照）などが知られている。
【０００５】
イムノアッセイのうち、最も一般的な測定方法は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。前記ＥＬＩＳＡ法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）などが知られている。
しかしながら、前記ＥＬＩＳＡ法では、被検物質の検出に特殊な機器を必要としたり、試料の前処理や測定に長時間を要したりするなどの問題点がある。このため、操作が簡単なイムノクロマト法が提案されている。
【０００６】
しかし、前記ＥＬＩＳＡ法、及び前記イムノクロマト法においては、検出に根本的な問題がある。両法において、最も高感度な検出感度が得るには、被検物質を担体上で２分子の抗体で挟み込む、いわゆる一般に知られるサンドイッチ法を用いるが、被検物質が金属の場合は、サンドイッチ法が成立しない。これは、被検物質が金属である場合、キレート剤が前記金属をキレートして形成される金属錯体を抗原として抗体に反応させるが、前記金属錯体が低分子であるため、生体高分子である抗体が前記金属錯体に結合すると、抗体の結合部位に前記金属錯体が埋もれてしまい、他の抗体が結合することができなくなるためである。
このため、前記ＥＬＩＳＡ法、及び前記イムノクロマト法を代表とするイムノアッセイの殆どの場合が、サンドイッチ法ではなく、競合法を採用している。
【０００７】
前記競合法は、前記被検物質を検出する際に、被検物質である前記低分子化合物と、前記低分子化合物又は前記低分子化合物に対する類似化合物とを、抗体に対する結合において競合させる方法である。しかし、この競合法は、抗体に対して試料中の被検物質と被検物質の類似化合物が競合的に結合する結果、本来の抗体の有する結合能力までの検出感度が得られにくいという原理的な短所がある。
【０００８】
さらに、前記ＥＬＩＳＡ法、及び前記イムノクロマト法において、被検物質を含む試料中に前記被検物質に対する抗体を混合し、前記被検物質と前記抗体とを反応させた後、前記抗体の捕捉物質（前記被検物質又は前記被検物質に対する類似化合物）を固定化した担体上に前記混合試料を供給し、前記混合試料中において前記被検物質を結合していないフリーの前記抗体を前記担体に結合させ、前記担体に結合した前記抗体の量を検出することにより、前記試料中の前記被検物質の定量を行う方法が提案されている（例えば、非特許文献３参照）。しかし、前記ＥＬＩＳＡ法、及び前記イムノクロマト法では、前記混合試料中において前記被検物質を結合していないフリーの前記抗体を前記担体に結合させるために、前記混合試料と前記担体との接触時間が長く、そのため、混合試料中の被検物質に結合していた抗体が、前記担体に転移する確率が高くなり、試料中の被検物質の定量感度が低下するという短所がある。
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−１３８５５０号公報
【特許文献２】特開２００５−２１４６７０号公報
【特許文献３】特開２００６−２９０８１１号公報
【非特許文献１】イムノアッセイによる絶縁油中のポリ塩化ビフェニルのスクリーニング／大村直也；Ｔｈｏｍａｓ  Ｒ．Ｇｌａｓｓ；佐々木和裕  他
【非特許文献２】Ｋｈｏｓｒａｖｉａｎｉ，  Ｍ．，  Ｂｌａｋｅ，  Ｒ．Ｃ．，  ＩＩ，  Ｐａｖｌｏｖ，  Ａ．Ｒ．，  Ｌｏｒｂａｃｈ，Ｓ．Ｃ．，  Ｙｕ，  Ｈ．，  Ｄｅｌｅｈａｎｔｙ，  Ｊ．Ｂ．，Ｂｒｅｃｈｂｉｅｌ  Ｍ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｂｌａｋｅ，  Ｄ．Ａ．，（２０００）  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏｗａｒｄ  ｌｅａｄ−ｃｈｅｌａｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ，１１：２６７−２７７．
【非特許文献３】Ｎ．Ｏｈｍｕｒａ，  Ｙ．Ｔｓｕｋｉｄａｔｅ，  Ｈ．Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ，  Ｓ．Ｊ．Ｌａｃｋｉｅ，  Ｈ．Ｓａｉｋｉ，  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，７５，１０４，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来における前記問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫学的定量方法を用い、金属について、簡便に、かつ最小限の誤差で高感度に定量可能な方法、及び該定量方法に用いられる免疫学的定量装置、並びに、それらに用いる金属錯体固定化膜を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、本発明者による前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  金属の存在の判別対象である試料中に、前記金属をキレートして金属錯体を形成するキレート剤と、前記金属錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体とを混合して混合試料を調製し、前記試料中に前記金属が含まれる場合に、前記キレート剤が前記金属をキレートして形成される前記金属錯体を、前記モノクローナル抗体で捕捉させる混合試料調製工程と、
前記混合試料を、前記金属錯体を固定化した金属錯体固定化膜に通液させ、前記混合試料中に含まれる前記金属錯体を捕捉していない前記モノクローナル抗体を、前記金属錯体固定化膜に固定化された前記金属錯体に結合させる通液工程と、
前記金属を含まない前記混合試料を前記金属錯体固定化膜に通液させた場合に、前記金属錯体固定化膜に固定化された金属錯体に結合する前記モノクローナル抗体の量と、前記通液工程において、前記金属錯体固定化膜に固定化された前記金属錯体に結合した前記モノクローナル抗体の量とに基づき、前記試料中に含まれる金属を定量する定量工程と
を含むことを特徴とする金属の免疫学的定量方法である。
＜２＞  モノクローナル抗体が標識物質により標識され、定量工程が、前記金属を含まない前記混合試料を前記金属錯体固定化膜に通液させた場合に、前記金属錯体固定化膜に固定化された金属錯体に結合する前記モノクローナル抗体の量に対応する前記標識物質による光の吸収量と、前記通液工程において、前記金属錯体固定化膜に固定化された前記金属錯体に結合した前記モノクローナル抗体の量に対応する前期標識物質による光の吸収量とに基づき、前記試料中に含まれる金属を定量する前記＜１＞に記載の金属の免疫学的定量方法である。
＜３＞  通液工程における、金属錯体固定化膜に混合試料を通液させる際における、前記混合試料の、送液量が１ｍｌ〜１０ｍｌであり、かつ送液速度が５ｍｌ／ｍｉｎ〜０．５ｍｌ／ｍｉｎである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の金属の免疫学的定量方法である。
＜４＞  金属がカドミウムである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の金属の免疫学的定量方法である。
＜５＞  モノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７０３として寄託されているハイブリドーマから産生された前記＜４＞に記載の金属の免疫学的定量方法である。
＜６＞  金属が鉛である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の金属の免疫学的定量方法である。
＜７＞  モノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７４５として受領されているハイブリドーマ、及び受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７４６として受領されているハイブリドーマのいずれかから産生された前記＜６＞に記載の金属の免疫学的定量方法である。
＜８＞  金属が３価クロムである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の金属の免疫学的定量方法である。
＜９＞  モノクローナル抗体が、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３７９として受領されているハイブリドーマから産生された前記＜８＞に記載の金属の免疫学的定量方法である。
＜１０＞  金属の存在の判別対象である試料中に、前記金属をキレートして金属錯体を形成するキレート剤と、前記金属錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体とを混合して混合試料を調製し、前記試料中に前記金属が含まれる場合に、前記キレート剤が前記金属をキレートして形成される前記金属錯体を、前記モノクローナル抗体で捕捉させた前記混合試料を、前記金属錯体を固定化した金属錯体固定化膜に通液させ、前記混合試料中に含まれる前記金属錯体を捕捉していない前記モノクローナル抗体を、前記膜状担体に固定化された前記金属錯体に結合させる通液手段と、
前記金属を含まない前記混合試料を前記金属錯体固定化膜に通液させた場合に、前記金属錯体固定化膜に固定化された金属錯体に結合する前記モノクローナル抗体の量と、前記通液工程において、前記金属錯体固定化膜に固定化された前記金属錯体に結合した前記モノクローナル抗体の量とに基づき、前記試料中に含まれる金属を定量する定量手段と
を有することを特徴とする金属の免疫学的定量装置である。
＜１１＞  前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の金属の免疫学的定量方法に用いられる金属錯体固定化膜であって、通液可能な膜状担体に金属錯体が固定化されてなることを特徴とする金属錯体固定化膜である。
＜１２＞  金属が、カドミウム、３価クロム及び鉛のいずれかである前記＜１１＞に記載の金属錯体固定化膜である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、金属について、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法を用い、簡便に、かつ最小限の誤差で高感度に定量することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（金属の免疫学的定量方法）
本発明の金属の免疫学的定量方法は、抗原抗体反応を利用するものであり、混合試料調製工程と、通液工程と、定量工程とを含む金属の免疫学的定量方法である。
【００１４】
前記混合試料調製工程では、金属の存在の判別対象である試料中に、前記金属をキレートして金属錯体を形成するキレート剤と、前記金属錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体とを混合して混合試料を調製し、前記試料中に前記金属が含まれる場合に、前記キレート剤が前記金属をキレートして形成される前記金属錯体を、前記モノクローナル抗体で捕捉させる。
【００１５】
前記通液工程では、前記混合試料を、前記金属錯体を固定化した金属錯体固定化膜に通液させ、前記混合試料中に含まれる前記金属錯体を捕捉していない前記モノクローナル抗体を、前記金属錯体固定化膜に固定化された前記金属錯体に結合させる。
【００１６】
前記定量工程では、前記金属を含まない前記混合試料を前記金属錯体固定化膜に通液させた場合に、前記金属錯体固定化膜に固定された金属錯体に結合する前記モノクローナル抗体の量と、前記通液工程において、前記金属錯体固定化膜に固定化された前記金属錯体に結合した前記モノクローナル抗体の量とに基づき、前記試料中に含まれる金属を定量する。
【００１７】
＜被検物質＞
被検物質である金属としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カドミウム、水銀、鉛、３価クロム、水銀、亜鉛、銅、鉄、アルミ、ヒ素、マンガン、ウラン、プルトニウム、ポロニウム、セレン、オスミウム、スズ、コバルト、ニッケル、ガリウム、ゲルマニウム、インジウム及びモリブデンなどが挙げられる。
【００１８】
＜混合試料調製工程＞
前記混合試料調製工程では、前記金属の存在の判別対象である試料中に、前記金属をキレートして金属錯体を形成するキレート剤を混合し、前記試料中に前記金属が含まれる場合に、前記キレート剤が前記金属をキレートして形成される前記金属錯体を抗原とし、前記金属錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体に認識させる。
【００１９】
前記混合試料調製工程で用いられる前記キレート剤としては、金属をキレートしうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメル及びエデト酸トリエンチンを挙げることができる。
なお、カドミウム及び３価クロムに対しては前記ＥＤＴＡが好ましく、鉛に対しては前記ＤＴＰＡが好ましい。
【００２０】
前記金属錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体は、前記金属錯体に対して特異的に反応し、キレート剤に対しては反応しない。
前記モノクローナル抗体としては、金属錯体に対して特異的に反応するものであれば、特に制限はなく、適宜作製したものであってもよく、市販品であってもよい。また、樹立されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを培養し、前記金属錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を調製してもよい。また、前記金属錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体は、例えば、前記金属錯体を用いてマウスなどの動物を免疫し、免疫した前記動物の脾臓細胞を回収し、該脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合して得たハイブリドーマを培養して作製することができる。
【００２１】
また、前記金属錯体に特異的に反応するモノクローナル抗体を標識物質により標識することにより、後の定量工程において、前記モノクローナル抗体を標識する標識物質による光の吸収量、蛍光量、発光量などに基づき、前記金属錯体固定化膜に固定化された金属錯体に結合した前記モノクローナル抗体量を測定することができる。
【００２２】
なお、前記金属錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を無標識の一次抗体とし、前記一次抗体に特異的に結合する標識物質により標識された抗体を二次抗体として用い、前記二次抗体の標識物質による光の吸収量、蛍光量、発光量などに基づき、前記金属錯体固定化膜に固定化された金属錯体に結合した前記モノクローナル抗体量を測定してもよい。
【００２３】
前記抗体の標識物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペルオキシダーゼ、ビオチン、色素粒子（金コロイド、ラテックス）、蛍光物質（ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４７など）などが挙げられる。
前記標識物質で前記モノクローナル抗体を標識する方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができる。
【００２４】
＜通液工程＞
前記通液工程では、前記混合試料を前記金属錯体固定化膜に通液するにあたり、送液量を１ｍｌ〜１０ｍｌ、かつ、送液速度を５ｍｌ／ｍｉｎ〜０．５ｍｌ／ｍｉｎとする。
好ましくは、送液量３ｍｌ、かつ送液速度０．５ｍｌ／ｍｉｎである。
前記混合試料と前記金属錯体固定化膜との接触時間が長い場合、混合試料中の前記金属錯体に結合していたモノクローナル抗体が、前記金属錯体固定化膜に固定化された金属錯体に転移する確率が高くなり、試料中の前記重金属の定量感度が低下する。
【００２５】
なお、前記金属錯体固定化膜に混合試料を通液後、前記金属錯体固定化膜に結合した抗体量を測定する前に、前記金属錯体固定化膜を洗浄し、前記金属錯体固定化膜に結合していないモノクローナル抗体を洗い除くことが望ましい。洗浄は、前記金属錯体固定化膜に水、生理食塩水及びＰＢＳ緩衝液のいずれかを送液して行う、または、前記金属錯体固定化膜を前記水、生理的食塩水及びＰＢＳ緩衝液のいずれかの中で濯ぐなどして行う。
なお、続く定量工程において、前記金属錯体固定化膜に結合した抗体量の測定は、前記金属錯体固定化膜が濡れた状態で測定しても、前記金属錯体固定化膜を乾燥後に測定してもよい。
【００２６】
＜定量工程＞
前記混合試料調製工程において、重金属錯体に特異的に反応するモノクローナル抗体を金コロイドで標識した場合、前記金属錯体固定化膜に固定化された金属錯体に結合した前記モノクローナル抗体の量を、前記金コロイドによる光の吸収量に基づき定量することができる。例えば、前記金コロイドの吸収波長である５３０ｎｍのＬＥＤを用いて前記金属錯体固定化膜を照射すると、照射された光は前記金属錯体固定化膜に固定化されている金属錯体に結合した抗体を標識する金コロイドに吸収される。そして、この透過光を、検出セル背面に設置されたフォトダイオードによって光電変換して電気信号（電圧Ｖ）として測定し、その電気信号の強度（信号強度）に基づき、前記金属錯体固定化膜に結合した抗体量を測定する。
また、前記抗体を蛍光物質で標識した場合、蛍光光度計などにより測定した蛍光量に基づいて定量することができ、前記抗体を化学発光物質で標識した場合、化学発光測定器などにより測定した発光量に基づいて定量することができる。
【００２７】
このような測定方法では、まず実際の試料測定に先立ち、ある濃度の標識抗体溶液を前記金属錯体固定化膜に通液させた場合の信号強度（ブランク）を測定し、この値を例えば、検出値Ｆ０とする。次に、金属の存在の判別対象である試料中に、前記ブランク測定時と同濃度の標識抗体溶液とキレート剤とを混合した混合試料を調製し、その後、前記ブランク測定時と同一送液量及び同一送液速度によって、前記混合試料を金属錯体固定化膜に通液した場合の信号強度を測定し、この値を例えば、検出値Ｆ１とする。
【００２８】
ここで、試料中に金属が存在するならば、前記金属をキレートして金属錯体を形成するキレート剤と、前記金属錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体とを混合する混合試料調製工程において、前記キレート剤が前記金属をキレートして形成される前記金属錯体と、前記モノクローナル抗体とが結合する。この混合試料中の金属錯体と結合したモノクローナル抗体は、続く通液工程において、金属錯体固定化膜に固定化されている金属錯体と結合できず、前記混合試料中に遊離状態で残ることとなるため、その結果が前記検出値Ｆ１における信号強度の低下となって示される。従って、検出値Ｆ１が検出値Ｆ０に比べ小さい場合（Ｆ１＜Ｆ０）、前記試料中に金属が存在すると判断でき、さらに、Ｆ１のＦ０に比べた低下の割合が、試料中に含まれる金属の量と比例することから、既知の濃度の金属を用いて予め検量線などを作成することにより、Ｆ１の低下の割合に応じて前記試料中に含まれる金属の定量を行うこともできる。
【００２９】
（免疫学的定量装置）
本発明の金属の免疫学的定量装置は、金属の存在の判別対象である試料中に、前記金属をキレートして金属錯体を形成するキレート剤と、前記金属錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体とを混合して混合試料を調製し、前記試料中に前記金属が含まれる場合に、前記キレート剤が前記金属をキレートして形成される前記金属錯体を、前記モノクローナル抗体で捕捉させた前記混合試料を、前記金属錯体を固定化した金属錯体固定化膜に通液させ、前記混合試料中に含まれる前記金属錯体を捕捉していない前記モノクローナル抗体を、前記膜状担体に固定化された前記金属錯体に結合させる通液手段と、前記金属を含まない前記混合試料を前記金属錯体固定化膜に通液させた場合に、前記金属錯体固定化膜に固定化された金属錯体に結合する前記モノクローナル抗体の量と、前記通液工程において、前記金属錯体固定化膜に固定化された前記金属錯体に結合した前記モノクローナル抗体の量とに基づき、前記試料中に含まれる金属を定量する定量手段とを有する。
【００３０】
＜通液手段＞
前記通液手段は、前記金属錯体固定化膜に対する前記混合試料の送液量と送液速度とを制御する。前記送液速度を０．０１ｍｌ／ｍｉｎ〜５０ｍｌ／ｍｉｎ、前記送液量を０．０５ｍｌ〜５０ｍｌの範囲で制御できるように構成することが好ましい。
例えば、前記混合試料調製工程で調製した混合試料を、シリンジ内に吸い取ったのち、前記シリンジの先端に、金属錯体固定化膜を保持した検出セルを取り付け、マイクロフィーダー（ｋｄ  サイエンティフィック、  シリンジポンプ、  １０−３１５−００）を用いて、送液速度を制御しながら前記シリンジ内の混合試料を前記検出セル内の金属錯体固定化膜に通液することにより、送液量と送液速度とを制御する。
【００３１】
前記検出セルとしては、前記金属錯体固定化膜を内部に保持し、かつ前記金属錯体固定化膜に固定化されている前記金属錯体と結合したモノクローナル抗体の標識物質による光の吸収量などの測定を阻害しないために、透明な材質からなることが好ましく、例えば、ガラス製、プラスチック製であることが好ましい。
前記検出セルは、底部が解放され、導入される試料が通液可能（いわゆるフロー式の検出セル）であるため、金属錯体固定化膜に対して前記試料を連続的に導入することができ、検出容器中に検出対象の抗金属モノクローナル抗体が蓄積・濃縮され、感度を向上させることができる。
また液相と固相の接触時間が極端に短く、液中の数パーセントにあたる抗体をフローにより連続的に捕捉するため、液相中の結合平衡状態を乱すことなく解析が可能であると同時に、連続捕捉が可能なため、液相中の結合が抗体の親和性支配になるまで抗体の結合部位濃度を低下させることができる。
【００３２】
＜定量手段＞
前記定量手段は、前記金属錯体固定化膜を対象とし、抗体標識に用いた標識物質によって吸収される光の吸収量を透過光または反射光を用いて測定する。
例えば、非特許文献１に記載の携帯型の透過光量測定器（柴田科学社製、イムニー）を用いて、前記金属錯体固定化膜に結合した抗体量を測定できる。前記イムニーでは、抗体を標識する金コロイドの吸収波長である５３０ｎｍのＬＥＤを金属錯体固定化膜に照射する。前記金属錯体固定化膜に照射された光は、前記金属錯体固定化膜に結合した前記抗体を標識する金コロイドに吸収され、この透過光が、検出セル背面に設置されたフォトダイオードによって光電変換されて電気信号（電圧Ｖ）として測定される。その電気信号の強度（信号強度）に基づき、前記金属錯体固定化膜に結合した抗体量を測定する。
【００３３】
（金属錯体固定化膜）
本発明の金属の免疫学的定量方法及び装置に用いられる金属錯体固定化膜は、金属錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を捕捉するために用いられ、通液可能な膜状担体に、前記金属錯体が固定化されている。
なお、前記金属錯体は、前記膜状担体の膜表面だけでなく膜内部にも固定化され、前記金属錯体固定化膜には前記金属錯体が高密度に保持されている。
【００３４】
前記膜状担体としては、通液する混合試料との均一な接触が可能であれば、形状や材質に特に制限はなく、セルロース、綿、ポリオレフィン、ポリエステル、ナイロン、ポリプロピレンなど、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、繊維体からなるものが好ましく、多数の繊維を高密度に有するものがより好ましい。このような繊維体としては、例えば、ろ紙、吸湿紙、織物、編物、不織布などが挙げられる。具体的には、ＦＣ５０Ｎ、ＦＣ４００及びＨ８０１０（日本バイリーン製の不織布）、５１Ｂ（アドバンテック社製の濾紙）、並びに９０３（ＮＩＰＰＮのイムノクロマトグラフィー用吸収紙）を挙げることができるが、イムノクロマトグラフィー用吸収紙（ＮＩＰＰＮ  ９０３）である。前記イムノクロマトグラフィー用吸収紙は、金属錯体の吸着及び固定に優れる。
前記金属錯体固定化膜は、前記繊維を所望の形状に成形して調製してもよく、シート状の繊維体を所望のサイズ及び形状に公知の方法で裁断や打抜することにより調製してもよい。
【００３５】
前記膜状担体への金属錯体の固定化方法は、物理吸着でも化学的な結合でも良い。また、前記膜状担体に対して金属錯体を直接に固定化してもよいし、タンパク質などの高分子を介して固定化してもよい。また、膜状担体として、金属をキレートする性質の素材を用い、該膜状担体に金属をキレートさせることにより固定化してもよい。
【００３６】
なお、本発明による金属の免疫学的定量方法は、前記金属錯体固定化膜に固定化された金属錯体に結合した抗体の量を定量するため、膜状担体に対する金属錯体の固着強度が大きいことが好ましい。例えば、標識抗体溶液（金属を含まない試料）を通液させた場合の前記金属錯体固定化膜の信号強度（ブランク）が、通液前の前記金属錯体固定化膜の信号強度における誤差（標準偏差）の２０倍以上を維持できる程度に、前記金属錯体が膜状担体に固定化されていることが好ましい。
【００３７】
（カドミウムの免疫学的定量方法）
カドミウムの免疫学的定量方法は、カドミウムの存在の判別対象である試料中に、前記カドミウムをキレートしてカドミウム錯体を形成するキレート剤と、前記カドミウム錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体とを混合して混合試料を調製し、前記試料中に前記カドミウムが含まれる場合に、前記キレート剤が前記カドミウムをキレートして形成される前記カドミウム錯体を、前記モノクローナル抗体で捕捉させる混合試料調製工程と、前記混合試料を、前記カドミウム錯体を固定化したカドミウム錯体固定化膜に通液させ、前記混合試料中に含まれる前記カドミウム錯体を捕捉していない前記モノクローナル抗体を、前記カドミウム錯体固定化膜に固定化された前記カドミウム錯体に結合させる通液工程と、前記カドミウムを含まない前記混合試料を前記カドミウム錯体固定化膜に通液させた場合に、前記カドミウム錯体固定化膜に固定化されたカドミウム錯体に結合する前記モノクローナル抗体の量と、前記通液工程において、前記カドミウム錯体固定化膜に固定化された前記カドミウム錯体に結合した前記モノクローナル抗体の量とに基づき、前記試料中に含まれるカドミウムを定量する定量工程とを含む。
【００３８】
前記混合試料調製工程で用いられる前記キレート剤としては、前記カドミウムをキレートしてカドミウム錯体を形成しうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）が好ましい。
【００３９】
前記混合試料調製工程で用いられる前記モノクローナル抗体としては、前記カドミウム錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体であればいずれの抗体でもよいが、例えば、前記ＥＤＴＡがカドミウムをキレートして形成されるカドミウム−ＥＤＴＡ錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体として、ハイブリドーマＮｘ２Ｃ３株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１６年２月２６日付けで受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７０３として寄託されている）により産生されるモノクローナル抗体（以下、「Ｎｘ２Ｃ３抗体」という）が挙げられる。
【００４０】
前記通液工程で用いられるカドミウム錯体固定化膜としては、前記モノクローナル抗体を捕捉しうるものであれば任意のカドミウム錯体を固定化したカドミウム錯体固定化膜を用いることができるが、前記ＥＤＴＡと、前記カドミウム−ＥＤＴＡ錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体をと混合した混合試料を通液する場合、前記カドミウム−ＥＤＴＡ錯体を固定化したカドミウム錯体固定化膜を用いる。
【００４１】
（鉛の免疫学的定量方法）
鉛の免疫学的定量方法は、鉛の存在の判別対象である試料中に、前記鉛をキレートして鉛錯体を形成するキレート剤と、前記鉛錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体とを混合して混合試料を調製し、前記試料中に前記鉛が含まれる場合に、前記キレート剤が前記鉛をキレートして形成される前記鉛錯体を、前記モノクローナル抗体で捕捉させる混合試料調製工程と、前記混合試料を、前記鉛錯体を固定化した鉛錯体固定化膜に通液させ、前記混合試料中に含まれる前記鉛錯体を捕捉していない前記モノクローナル抗体を、前記鉛錯体固定化膜に固定化された前記鉛錯体に結合させる通液工程と、前記鉛を含まない前記混合試料を前記鉛錯体固定化膜に通液させた場合に、前記鉛錯体固定化膜に固定化された鉛錯体に結合する前記モノクローナル抗体の量と、前記通液工程において、前記鉛錯体固定化膜に固定化された前記鉛錯体に結合した前記モノクローナル抗体の量とに基づき、前記試料中に含まれる鉛を定量する定量工程とを含む。
【００４２】
前記混合試料調製工程で用いられる前記キレート剤としては、前記鉛をキレートして鉛錯体を形成しうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）が好ましい。
【００４３】
前記混合試料調製工程で用いられる前記モノクローナル抗体としては、前記鉛錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体であればいずれの抗体でもよいが、例えば、前記ＤＴＰＡが鉛をキレートして形成される鉛−ＤＴＰＡ錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体として、ハイブリドーマＹｊ１Ａ３株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１７年１２月２２日付けで受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７４５として寄託されている）により産生されるモノクローナル抗体（以下、「Ｙｊ１Ａ３抗体」という）や、ハイブリドーマＹｊ２Ｈ７株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１７年１２月２２日付けで受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７４６として寄託されている）により産生されるモノクローナル抗体（以下、「Ｙｊ２Ｈ７抗体」という）が挙げられる。
【００４４】
前記通液工程で用いられる鉛錯体固定化膜としては、前記モノクローナル抗体を捕捉しうるものであれば任意の鉛錯体を固定化した鉛錯体固定化膜を用いることができるが、前記ＤＴＰＡと、前記鉛−ＤＴＰＡ錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体とを混合した混合試料を通液する場合、前記鉛−ＤＴＰＡ錯体を固定化した鉛錯体固定化膜を用いる。
【００４５】
（３価クロムの免疫学的定量方法）
３価クロムの免疫学的定量方法は、３価クロムの存在の判別対象である試料中に、前記３価クロムをキレートして３価クロム錯体を形成するキレート剤と、前記３価クロム錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体とを混合して混合試料を調製し、前記試料中に前記３価クロムが含まれる場合に、前記キレート剤が前記３価クロムをキレートして形成される前記３価クロム錯体を、前記モノクローナル抗体で捕捉させる混合試料調製工程と、前記混合試料を、前記３価クロム錯体を固定化した３価クロム錯体固定化膜に通液させ、前記混合試料中に含まれる前記３価クロム錯体を捕捉していない前記モノクローナル抗体を、前記３価クロム錯体固定化膜に固定化された前記３価クロム錯体に結合させる通液工程と、前記３価クロムを含まない前記混合試料を前記３価クロム錯体固定化膜に通液させた場合に、前記３価クロム固定化膜に固定化された３価クロム錯体に結合する前記モノクローナル抗体の量と、前記通液工程において、前記３価クロム錯体固定化膜に固定化された前記３価クロム錯体に結合した前記モノクローナル抗体の量とに基づき、前記試料中に含まれる３価クロムを定量する定量工程とを含む。
【００４６】
前記混合試料調製工程で用いられる前記キレート剤としては、前記３価クロムをキレートして３価クロム錯体を形成しうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）が好ましい。
【００４７】
前記混合試料調製工程で用いられる前記モノクローナル抗体としては、前記３価クロム錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体であればいずれの抗体でもよいが、例えば、前記ＥＤＴＡが３価クロムをキレートして形成される３価クロム−ＥＤＴＡ錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体として、ハイブリドーマＧｂ３Ｇ１２株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１７年１月２７日付けで受託番号ＡＰ−２０３７９として寄託されている）により産生される、３価クロム−ＥＤＴＡ錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体（以下、「Ｇｂ３Ｇ１２抗体」という）が挙げられる。
【００４８】
前記通液工程で用いられる３価クロム錯体固定化膜としては、前記モノクローナル抗体を捕捉しうるものであれば任意の３価クロム錯体を固定化したカドミウム錯体固定化膜を用いることができるが、前記ＥＤＴＡと、前記３価クロム−ＥＤＴＡ錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体をと混合した混合試料を通液する場合、前記３価クロム−ＥＤＴＡ錯体を固定化した３価クロム錯体固定化膜を用いる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明の実施例及び実験例について説明するが、本願発明は、これらの実施例及び実験例に何ら限定されるものではない。
【００５０】
（カドミウム−ＥＤＴＡ錯体固定化膜の作製）
Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｏｂｅｎｚｙｌ−ＥＤＴＡとニワトリ卵白由来のアルブミンタンパク質（ＯＶＡ）を５０ｍＭホウ酸溶液（ｐＨ９．５）中で混合し、前記ＥＤＴＡと前記ＯＶＡの複合体（ＥＤＴＡ−ＯＶＡ複合体）を調製した。前記ＥＤＴＡ−ＯＶＡ複合体を含む溶液中にイムノクロマトグラフィー用吸収紙（ＮＩＰＰＮ、９０３）を一晩浸振し、前記イムノクロマトグラフィー用吸収紙に前記ＥＤＴＡ−ＯＶＡ複合体を吸着させた。ついで、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を前記ＢＳＡ濃度が最終的に０．１％になるように加え、膜のブロッキングを行った。その後、前記ＥＤＴＡ−ＯＶＡ複合体及び前記ＢＳＡを含む溶液を除去し、これをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）緩衝液で洗浄し、ＥＤＴＡ固定化膜型担体とした。なお、前記ＰＢＳ緩衝液による洗浄操作は前記ＰＢＳ緩衝液を加えては、除去する操作を５回繰り返すことで行った。
次に、前記ＥＤＴＡ固定化膜型担体を１μＭの塩化カドミウム溶液に浸し、カドミウム−ＥＤＴＡ錯体を形成させた。塩化カドミウム溶液を除去した後、これを水で洗浄し、カドミウム−ＥＤＴＡ錯体固定化膜とした。なお、前記水による洗浄は、水を加えては除去する作業を５回繰り返すことで行った。
【００５１】
（鉛−ＤＴＰＡ錯体固定化膜の作製）
Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｏｂｅｎｚｙｌ−ＤＴＰＡとニワトリ卵白由来のアルブミンタンパク質（ＯＶＡ）を５０ｍＭホウ酸溶液（ｐＨ９．５）中で混合し、前記ＤＴＰＡと前記ＯＶＡの複合体（ＤＴＰＡ−ＯＶＡ複合体）を調製した。前記ＤＴＰＡ−ＯＶＡ複合体を含む溶液中に、イムノクロマトグラフィー用吸収紙（ＮＩＰＰＮ、９０３）を一晩浸振し、前記イムノクロマトグラフィー用吸収紙に前記ＤＴＰＡ−ＯＶＡ複合体を吸着させた。ついで、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を前記ＢＳＡ濃度が最終的に０．１％になるように加え、膜のブロッキングを行った。その後、前記ＤＴＰＡ−ＯＶＡ複合体及び前記ＢＳＡを含む溶液を除去し、これを前記ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、ＤＴＰＡ固定化膜型担体とした。なお、前記ＰＢＳ緩衝液による洗浄操作は前記ＰＢＳ緩衝液を加えては、除去する操作を５回繰り返すことで行った。
次に、前記ＤＴＰＡ固定化膜型担体を１μＭの塩化鉛溶液に浸し、鉛−ＤＴＰＡ錯体を形成させた。前記塩化鉛溶液を除去した後、これを水で洗浄し、鉛−ＤＴＰＡ錯体固定化膜とした。なお、前記水による洗浄は、水を加えては除去する作業を５回繰り返すことで行った。
【００５２】
（３価クロム−ＥＤＴＡ錯体固定化膜の作製）
カドミウム−ＥＤＴＡ錯体固定化膜の作製時と同様にして、ＥＤＴＡ固定化膜を作製した後、前記ＥＤＴＡ固定化膜型担体を１μＭの塩化クロム溶液に浸し、３価クロム−ＥＤＴＡ錯体を形成させた。塩化クロム溶液を除去した後、これを水で洗浄し、３価クロム−ＥＤＴＡ錯体固定化膜とした。なお、水による洗浄操作は、水を加えては、除去する操作を５回繰り返すことで行った。
【００５３】
（免疫学的定量装置）
＜通液手段＞
金属錯体固定化膜を保持するための検出セルは非特許文献１に記載の検出セルを用いた。前記金コロイド標識抗体溶液を、シリンジ（テルモ製、容量１０ｍｌ）内に吸い取ったのち、シリンジの先端に、前記金属錯体固定化膜を保持した検出セルを取り付け、マイクロフィーダー（ｋｄ  サイエンティフィック、シリンジポンプ、  １０−３１５−００）を用いて、送液速度を制御しながら、混合試料を検出セル内の金属錯体固定化膜に送液した。
＜定量手段＞
前記金属錯体固定化膜に結合した抗体量の光学的な測定は、非特許文献１に記載の携帯型の透過光量測定器（柴田科学社製、Ｉｍｎｙ）を用いて行った。光源には、金コロイドの吸収波長である５３０ｎｍのＬＥＤを用いて前記金属錯体固定化膜を照射する。照射された光は前記金属錯体固定化膜に固定化されている金属錯体に結合した抗体を標識する金コロイドに吸収され、透過光は、検出セル背面に設置されたフォトダイオードによって光電変換されて電気信号（電圧Ｖ）として計測される。
【００５４】
（金コロイド標識抗体液の調製）
定法に従って直径１０ｎｍから２０ｎｍの金コロイド粒子を調製し、定法に従ってモノクローナル抗体を金コロイド標識し、金コロイド標識抗体液を調製した。
カドミウム−ＥＤＴＡ錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体として、Ｎｘ２Ｃ３抗体（生産株は、独立行政法人産業総合技術研究所特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７０３として寄託）を用いた。
鉛−ＤＴＰＡ錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体として、Ｙｊ１Ａ３抗体（生産株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７４５として寄託）、及びＹｊ２Ｈ７抗体（生産株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７４６として寄託）を用いた。
３価クロム−ＥＤＴＡ錯体に対して特異的に反応するモノクローナル抗体として、Ｇｂ３Ｇ１２抗体（生産株は、独立行政法人産業総合技術研究所特許生物寄託センター受託番号：ＡＰ−２０３７９として寄託）を用いた。
【００５５】
（金コロイド標識抗体液の抗体濃度）
前記金コロイド標識抗体液、前記金属錯体固定化膜、及び前記免疫学的定量装置を用い、抗体濃度の異なる前記金コロイド標識抗体溶液３ｍｌを、前記金属錯体固定化膜に通液し、金属錯体固定化膜への抗体の結合量を、前記標識物質による光の吸収量に基づき測定した。
前記金属錯体固定化膜への抗体の結合量は、ある抗体濃度までは、直線的に増加するが、やがて結合量は一定の値に達する。
免疫学的定量方法では、前記金属錯体固定化膜に結合する抗体量が直線的に増加する濃度区間の高濃度側の抗体濃度を用いることが好ましい。
【００５６】
（実験例１）
カドミウムを含まない試料中に、前記Ｎｘ２Ｃ３抗体を金コロイド標識した調製済み金コロイド標識抗体液と、前記ＥＤＴＡを混合し、混合試料を調製した。なお、前記混合試料１ｍｌに対し、前記調製済み金コロイド標識抗体液２μｌの割合で添加した。
前記免疫学的定量装置を用いて、前記混合試料を前記カドミウム−ＥＤＴＡ錯体固定化膜に通液した後、前記カドミウム−ＥＤＴＡ錯体固定化膜に結合した前記Ｎｘ２Ｃ３抗体の量を測定した。送液量または送液速度を変化させた以外は、同様にし、以下の各測定条件について２回ずつ測定した。結果を図１及び図２に示す。
〔測定条件〕
送液速度：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、１．０ｍｌ／ｍｉｎ、２．０ｍｌ／ｍｉｎ、５ｍｌ／ｍｉｎ
送液量  ：１ｍｌ、３ｍｌ、５ｍｌ、１０ｍｌ
【００５７】
図１において、横軸は送液量を、縦軸は透過光量測定器で測定した信号強度（電圧Ｖ）を示しており、図２において、横軸は送液速度を、縦軸は透過光量測定器で測定した信号強度（電圧Ｖ）を示している。
図１及び図２に示すように、送液速度０．５ｍｌ／ｍｉｎ、送液量３ｍｌの条件で測定することにより、前記金属錯体固定化膜に結合した抗体量を測定する際に、十分な信号強度が得られる。したがって、以下の実験例では、少ない抗体量で十分な信号が得られる条件として送液速度０．５ｍｌ／ｍｉｎ、送液量３ｍｌを採用することにした。
【００５８】
（実験例２）
＜Ｎｘ２Ｃ３抗体を用いたカドミウムの免疫学的定量＞
−  混合試料の調製  −
カドミウム濃度０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭの各塩化カドミウム溶液に対し、１００μＭのＥＤＴＡと、前記Ｎｘ２Ｃ３抗体を金コロイド標識した調製済み金コロイド標識抗体液とをそれぞれ混合し、既知カドミウム濃度の混合試料をそれぞれ調製した。なお、前記混合試料１ｍｌに対し、前記調製済み金コロイド標識抗体液２μｌの割合で添加した。
【００５９】
−  カドミウムの定量  −
前記免疫学的定量装置を用い、前記既知カドミウム濃度の各混合試料について、前記カドミウム−ＥＤＴＡ錯体固定化膜に通液した後、前記カドミウム−ＥＤＴＡ錯体固定化膜に結合した前記Ｎｘ２Ｃ３抗体の量を測定した。各カドミウム濃度の混合試料について、３回ずつ測定した。結果を図３に示す。
【００６０】
図３において、横軸は測定に用いたカドミウムの濃度を、縦軸は透過光量測定器で測定した信号強度（％）を示している。前記透過光量測定器で測定した信号強度（％）は、カドミウム濃度０ｎＭの混合試料を用いて測定した信号強度を１００％とし、相対的に換算した値である。
図３の結果に基づき、例えば、グラフ作成ソフトウェアＯｒｉｇｉｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．５（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いて検量線を作成することにより、未知濃度のカドミウムについての定量が可能となる。
【００６１】
なお、前記検量線を用いた金属の免疫学的定量方法では、前記検量線において、試料中に含まれる金属の量に比例して信号強度が低下する範囲の上限値が、前記試料中に含まれる金属を正確に定量できる下限値となる。
図３の結果に基づいて作成した検量線では、信号強度８５％（ｙ＝８５％）以下の範囲で、前記試料中に含まれるカドミウムの量に比例して信号強度が低下しており、信号強度８５％（ｙ＝８５％）のときの試料中のカドミウム量（ＩＣ８５値）は、７．９ｎＭ（＝０．８８ｐｐｂ）であった。つまり、この実験例による、試料中に存在するカドミウムの検出感度の下限値は、７．９ｎＭ（＝０．８８ｐｐｂ）である。
なお、前記信号強度５０％（ｙ＝５０％）のときの試料中のカドミウム量（ＩＣ５０値）は、４４ｎＭ（＝４．９ｐｐｂ）であった。
【００６２】
（実験例３）
＜Ｙｊ１Ａ３抗体を用いた鉛の免疫学的定量＞
−  混合試料の調製  −
鉛濃度０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭの各塩化鉛溶液に対し、１００μＭのＤＴＰＡと、前記Ｙｊ１Ａ３抗体を金コロイド標識した調製済み金コロイド標識抗体液とをそれぞれ混合し、既知鉛濃度の混合試料をそれぞれ調製した。なお、前記混合試料１ｍｌに対し、前記調製済み金コロイド標識抗体液３μｌの割合で添加した。
【００６３】
−  鉛の定量  −
前記免疫学的定量装置を用い、前記既知鉛濃度の各混合試料について、前記鉛−ＤＴＰＡ錯体固定化膜に通液した後、前記鉛−ＤＴＰＡ錯体固定化膜に結合した前記Ｙｊ１Ａ３抗体の量を測定した。鉛濃度が異なる混合試料を用いた以外は、同様にし、各条件について、３回ずつ測定した。結果を図４に示す。
【００６４】
図４において、横軸は測定に用いた鉛の濃度を、縦軸は前記透過光量測定器で測定した信号強度（％）を示している。前記透過光量測定器で測定した信号強度（％）は、鉛濃度０ｎＭの混合試料を用いて測定した信号強度を１００％とし、相対的に換算した値である。
図４の結果に基づき、例えば、グラフ作成ソフトウェアＯｒｉｇｉｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．５（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いて検量線を作成することにより、未知濃度の鉛についての定量が可能となる。
【００６５】
図４の結果に基づいて作成した検量線では、信号強度８５％（ｙ＝８５％）以下の範囲で、前記試料中に含まれる鉛の量に比例して信号強度が低下しており、信号強度８５％（ｙ＝８５％）のときの試料中の鉛量（ＩＣ８５値）は、１．４ｎＭ（＝０．３５ｐｐｂ）であった。つまり、この実験例による鉛の免疫学的定量方法では、試料中に存在する鉛の検出感度の下限値は、１．４ｎＭ（＝０．３５ｐｐｂ）である。
なお、前記信号強度５０％（ｙ＝５０％）のときの試料中の鉛量（ＩＣ５０値）は、３．７ｎＭ（＝０．７７ｐｐｂ）であった。
【００６６】
（実験例４）
＜Ｙｊ２Ｈ７抗体を用いた鉛の免疫学的定量＞
鉛濃度１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１０００ｎＭの各塩化鉛溶液に対し、１００μＭのＤＴＰＡと、前記Ｙｊ２Ｈ７抗体を金コロイド標識した調製済み金コロイド標識抗体液とをそれぞれ混合した、既知鉛濃度の混合試料をそれぞれ調製した後、前記実験例３と同様にして、鉛の定量を行った。結果を図５に示す。なお、前記混合試料１ｍｌに対し、前記調製済み金コロイド標識抗体液３μｌの割合で添加した。
図５の結果に基づいて作成した検量線では、信号強度８５％（ｙ＝８５％）以下の範囲で、前記試料中に含まれる鉛の量に比例して信号強度が低下しており、信号強度８５％（ｙ＝８５％）のときの試料中の鉛量（ＩＣ８５値）は、１．４ｎＭ（＝０．３５ｐｐｂ）であった。つまり、この実験例による鉛の免疫学的定量方法では、試料中に存在する鉛の検出感度の下限値は、１．４ｎＭ（＝０．３５ｐｐｂ）である。
なお、前記信号強度５０％（ｙ＝５０％）のときの試料中の鉛量（ＩＣ５０値）は、７．７ｎＭ（＝１．６ｐｐｂ）であった。
【００６７】
（実験例５）
＜Ｇｂ３Ｇ１２抗体を用いた３価クロムの免疫学的定量＞
−  混合試料の調製  −
３価クロム濃度０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭの各塩化クロム溶液に、１００μＭのＥＤＴＡと、前記Ｇｂ３Ｇ１２抗体を金コロイド標識した調製済み金コロイド標識抗体液とを混合し、既知３価クロム濃度の混合試料をそれぞれ調製した。なお、前記混合試料１ｍｌに対し、前記調製済み金コロイド標識抗体液３μｌの割合で添加した。
【００６８】
−  ３価クロムの定量  −
前記免疫学的定量装置を用い、前記既知３価クロム濃度の各混合試料について、前記３価クロム−ＥＤＴＡ錯体固定化膜に通液した後、前記３価クロム−ＥＤＴＡ錯体固定化膜に結合した前記Ｇｂ３Ｇ１２抗体の量を測定した。各３価クロム濃度の混合試料について、３回ずつ測定した。結果を図６に示す。
【００６９】
図６において、横軸は測定に用いた３価クロムの濃度を、縦軸は前記透過光測定器で測定した信号強度（％）を示している。前記透過光量測定器で測定した信号強度（％）は、３価クロム濃度０μＭの混合試料を用いて測定した透過光量を１００％とし、相対的に換算した値である。
例えば、図６の結果に基づき、グラフ作成ソフトウェアＯｒｉｇｉｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．５（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いて検量線を作成することにより、未知濃度の鉛についての定量が可能となる。
【００７０】
図６の結果に基づいて作成した検量線では、信号強度８５％（ｙ＝８５％）以下の範囲で、前記試料中に含まれる３価クロムの量に比例して信号強度が低下しており、信号強度８５％（ｙ＝８５％）のときの試料中の３価クロム量（ＩＣ８５値）は、０．４μＭ（＝８３ｐｐｂ）であった。つまり、この実験例による３価クロムの免疫学的定量方法では、試料中に存在する鉛の検出感度の下限値は、０．４μＭ（＝８３ｐｐｂ）である。
なお、前記信号強度５０％（ｙ＝５０％）のときの試料中の鉛量（ＩＣ５０値）は、２．３μＭ（＝４８０ｐｐｂ）であった。
【００７１】
（実験例６）
前記金コロイド標識したＮｘ２Ｃ３抗体、前記カドミウム−ＥＤＴＡ錯体固定化膜、及び前記免疫学的定量装置を用いてカドミウムの検量線を作成した後、５００ｎＭの塩化カドミウム溶液について、前記カドミウムの検量線を用いた本発明の免疫学的定量方法によりカドミウムの定量を行った。
【００７２】
−カドミウムの検量線の作成−
カドミウム濃度０ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１０００ｎＭ、３０００ｎＭの塩化カドミウム溶液に対し、１μＭのＥＤＴＡを含む調製済み金コロイド標識抗体液を１対９の割合で混合し、既知カドミウム濃度の混合試料をそれぞれ調製した。なお、前記混合試料１ｍｌに対し、前記調製済み金コロイド標識抗体液２μｌの割合で添加した。
前記既知カドミウム濃度の各混合試料３ｍｌについて、カドミウム−ＥＤＴＡ錯体固定化膜に対し、送液速度０．５ｍｌ／ｍｉｎの一定流速で通液させ、その後、前記透過光量測定器（柴田科学社製、Ｉｍｎｙ）を用いて、前記カドミウム−ＥＤＴＡ錯体固定化膜に結合したＮｘ２Ｃ３抗体の量を測定した。なお、各カドミウム濃度の混合試料について、３回ずつ測定した。
【００７３】
上記測定結果について、平均値と標準偏差を求めグラフを作成した後（図７）、該グラフのプロットに対して近似値を求め、検量線を作成した（図８）。
【００７４】
図７は、各塩化カドミウム溶液を測定した際に得られた信号強度の平均をプロットしたグラフであり、横軸は測定に用いた塩化カドミウム溶液のカドミウム濃度を、縦軸は前記透過光量測定器で測定した信号強度（電圧Ｖ）を示している。
図８は、グラフ作成ソフトウェアＯｒｉｇｉｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．５（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いて、図７のプロットに対応するフィッティング曲線を加え、検量線を作成したグラフであり、横軸は測定に用いた塩化カドミウム溶液のカドミウム濃度を、縦軸は前記透過光量測定器で測定した信号強度（電圧Ｖ）を示している。
なお、図８に示す検量線は下記の検量線式（１）にて表される。
【００７５】
【数１】
2008232766.tif 000002
前記式（１）中、ｙは、透過光量測定器で測定した信号強度（電圧Ｖ）を表し、ｘは、カドミウム濃度（ｎＭ）を表す。
【００７６】
―  検量線を用いたカドミウムの定量  ―
上記検量線の作成時と同様に、カドミウム濃度５００ｎＭの塩化カドミウム溶液を用いて調製した混合試料をカドミウム−ＥＤＴＡ錯体固定化膜に通液した後、前記透過光量測定器（柴田科学社製、Ｉｍｎｙ）を用いて、前記カドミウム−ＥＤＴＡ錯体固定化膜に結合したＮｘ２Ｃ３抗体の量を測定した。測定は３回行い、それぞれ信号強度（ｙ）を求めた。
この測定結果について、それぞれ上記の検量線式（１）に代入することにより、該試料のカドミウム濃度（ｘ）を求めた。この結果を表１に示す。
なお、図８に示す検量線上に、前記透過光量測定器による測定結果（信号強度（ｙ））をブロットすることにより、該試料のカドミウム濃度（ｘ）を求めてもよい。
【００７７】
【表１】
2008232766.tif 000003
【００７８】
検量線式（１）に基づき算出した値ｘ（３回）を平均すると、前記透過光量測定器で測定した信号強度（測定値ｙ）から、前記検量線式（１）に基づき算出される試料中のカドミウム濃度は５１１±１０４（ｎＭ）である。
つまり本発明の免疫学的定量方法では、カドミウム濃度５００ｎＭの塩化カドミウム溶液について、４０７〜６１５ｎＭの範囲で定量できた。この検量線式（１）に基づく定量結果の範囲は、真のカドミウム濃度を含み、かつ、変動係数（ＣＶ、標準偏差／平均値）が約２０％と実用的な測定法の目安とされる３０％を下回っていた。
【００７９】
（実験例７）
前記金コロイド標識したＹｊ２Ｈ３抗体、前記鉛−ＤＴＰＡ錯体固定化膜、及び前記免疫学的定量装置を用いて鉛の検量線を作成した後、５０ｎＭの塩化鉛溶液について、前記鉛の検量線を用いた本発明の免疫学的定量方法により、試料中に含まれる鉛の定量を行った。
【００８０】
−鉛の検量線の作成−
鉛濃度０ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭの各塩化鉛溶液に対し、１μＭのＤＴＰＡを含む調製済み金コロイド標識抗体液を１対９の割合で混合し、既知鉛濃度の混合試料をそれぞれ調製した。なお、前記混合試料１ｍｌに対し、前記調製済み金コロイド標識抗体液３μｌの割合で添加した。
前記既知鉛濃度の各混合試料３ｍｌについて、鉛−ＤＴＰＡ錯体固定化膜に対して、送液速度０．５ｍｌ／ｍｉｎの一定流速で通液させ、その後、前記透過光量測定器（柴田科学社製、Ｉｍｎｙ）を用いて、前記鉛−ＤＴＰＡ錯体固定化膜に結合したＹｊ２Ｈ７抗体の量を測定した。なお、各鉛濃度の混合試料について、３回ずつ測定した。
【００８１】
上記測定結果について、平均値と標準偏差を求めグラフを作成した後（図９）、該グラフのプロットに対して近似値を求め、検量線を作成した（図１０）。
【００８２】
図９は、各塩化鉛溶液を測定した際に得られた信号強度の平均をプロットしたグラフであり、横軸は測定に用いた塩化鉛溶液の鉛濃度を、縦軸は前記透過光量測定器で測定した＋信号強度（％）を示している。前記透過光量測定器で測定した信号強度（％）は、鉛濃度０ｎＭの混合試料を用いて測定した信号強度を１００％とし、相対的に換算した値である。
図１０は、グラフ作成ソフトウェアＯｒｉｇｉｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．５（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いて、図９のプロットに対応するフィッティング曲線を加え、検量線を作成したグラフであり、横軸は測定に用いた塩化鉛溶液の鉛濃度を、縦軸は前記透過光量測定器で測定した信号強度（％）を示している。
なお、図１０に示す検量線は下記の検量線式（２）にて表される。
【００８３】
【数２】
2008232766.tif 000004
前記式（２）中、ｙは、透過光量測定器で測定した信号強度（％）を表し、ｘは、鉛濃度（ｎＭ）を表す。
【００８４】
―  検量線を用いた鉛の定量  ―
上記検量線の作成時と同様に、鉛濃度５０ｎＭの塩化鉛溶液を用いて調製した混合試料を鉛−ＤＴＰＡ錯体固定化膜に通液した後、前記透過光量測定器（柴田科学社製、Ｉｍｎｙ）を用いて、前記鉛−ＤＴＰＡ錯体固定化膜に結合したＹｊ２Ｈ７抗体の量を測定した。測定は３回行い、それぞれ信号強度（測定値ｙ）を求めた。
この測定結果について、それぞれ上記の検量線式（２）に代入することにより、該試料の鉛濃度（ｘ）を求めた。この結果を表２に示す。
なお、図９に示す検量線上に、前記透過光量測定器で測定した信号強度（測定値ｙ）をブロットすることにより、該試料の鉛濃度（ｘ）を求めてもよい。
【００８５】
【表２】
2008232766.tif 000005
【００８６】
検量線式（２）に基づき算出した値ｘ（３回）を平均すると、前記透過光量測定器で測定した信号強度（測定値ｙ）から、前記検量線式（２）に基づき算出される試料中の鉛濃度は５３．８±１４．８である。
つまり本発明の免疫学的定量方法では、鉛濃度５０ｎＭの塩化鉛溶液について、３９．０〜６８．６ｎＭの範囲で定量できた。この検量線式（２）に基づく定量結果の範囲は、真の鉛濃度を含み、かつ、変動係数（ＣＶ、標準偏差／平均値）が約２０％と実用的な測定法の目安とされる３０％を下回っていた。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の金属の免疫学的定量方法は、試料中の金属の濃度を、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法を用い、簡便に、かつ最小限の誤差で高感度に定量することができるため、環境中の金属濃度などの検査に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】図１は、実験例１において、Ｎｘ２Ｃ３抗体を用いて測定した各送液速度毎の送液量に対する信号強度（Ｖ）のプロットであり、「■」は送液速度５ｍｌ／ｍｉｎ、「●」は送液速度２ｍｌ／ｍｉｎ、「▲」は送液速度１ｍｌ／ｍｉｎ、「▼」は送液速度０．５ｍｌ／ｍｉｎの各条件における送液量に対する信号強度（電圧Ｖ）の平均値を示す。
【図２】図２は、実験例１において、Ｎｘ２Ｃ３抗体を用いて測定した各送液速量毎の送液速度に対する信号強度（Ｖ）のプロットであり、「■」は送液量１ｍｌ、「●」は送液量３ｍｌ、「▲」は送液量５ｍｌ、「▼」は送液量１０ｍｌの各条件における送液速度に対する信号強度（電圧Ｖ）の平均値を示す。
【図３】図３は、実験例２において、Ｎｘ２Ｃ３抗体を用いて測定した各濃度のカドミウム溶液に対する信号強度（％）のプロットであり、「◆」は平均値を示す。
【図４】図４は、実験例３において、Ｙｊ１Ａ３抗体を用いて測定した各濃度の鉛溶液に対する信号強度（％）のプロットであり、「◆」は平均値を示す。
【図５】図５は、実験例４において、Ｙｊ２Ｈ７抗体を用いて測定した各濃度の鉛溶液に対する信号強度（％）のプロットであり、「◆」は平均値を示す。
【図６】図６は、実験例５において、Ｇｂ３Ｇ１２抗体を用いて測定した各濃度の鉛溶液に対する信号強度（％）のプロットであり、「◆」は平均値を示す。
【図７】図７は、実験例６において、Ｎｘ２Ｃ３抗体を用いて測定した各濃度のカドミウム溶液に対する信号強度（電圧Ｖ）のプロットであり、「●」は平均値を示す。
【図８】図８は、図７における検量線を示すグラフである。
【図９】図９は、実験例７において、Ｙｊ２Ｈ７抗体を用いて測定した各濃度の鉛溶液に対する信号強度（％）のプロットであり、「●」は平均値を示す。
【図１０】図１０は、図９における検量線を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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