(57)【要約】【課題】本発明は、従来のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）アッセイの欠点を解消して、病院等における日常的使用も可能な単純かつ迅速なアッセイを提供するＤＰＤ濃度測定のための材料及び方法を提供する。【解決手段】本発明は、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ、特にはヒトジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼを特異的に認識するモノクローナル抗体、該抗体の生成に有用なハイブリドーマ細胞系及び該抗体を用いるアッセイ系を提供する。【選択図】図３
2008120824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学的材料、及び生物学的試料中のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）の測定に有用な方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）は、ピリミジン類の５，６−ジヒドロピリミジン類への変換について触媒作用する酵素であり、得られる異化物であるジヒドロウラシル及びジヒドロチミンは、それぞれ更にβ−アラニンまたはβ−アミノイソ酪酸に異化される。
【０００３】
ＤＰＤは、２’−デオキシ−５−フルオロウリジン（２’−ｄＦＵｒｄ）、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン（５’−ｄＦＵｒｄ、ドキシフルリジン）等の抗腫瘍薬として広く使用されている５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）並びにピリミジン類似体及び誘導体に由来する種々の異化物の還元反応について触媒作用することも知られている。腫瘍を患っている個体の生物学的試料中のＤＰＤ濃度は、５−フルオロウラシル誘導体の系統の抗腫瘍薬の治療的効果の興味深いマーカーであることが報告されている（例えば、Iigo et al., 1969, Biochem. Pharmacol., 38, 1885-1889 参照）。
【０００４】
ＤＰＤの欠損は、ピリミジン抗腫瘍薬の代謝産物の毒性のためであることが知られており、これは化学療法において生命を脅かす症状をもたらす（Milano, G. and Etienne, 1988,M.C., Pharmacogenetics, 4, 301-306）。最近になって、ＤＰＤ欠損の障害は初期に考えられていたよりも頻繁に起こることが見出された（Diasio and Lu, 1994, J. Clin. Oncol.,12, 2239-2242 ）。したがって、ＤＰＤ欠損を伴う患者を同定することは重要である。
従って、生物学的試料中のＤＰＤ濃度検出のための高感度かつ信頼性あるアッセイが必要とされる。
【０００５】
（従来の技術）
このようなアッセイのためのいくつかの方法論が記述されている。フェルナンデス−サルグエロ等は、ヒト末梢血リンパ細胞におけるＤＰＤ活性測定のための薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）手法を報告している（Fernandez-Salguero et al., 1995, Biochem.Pharm. 50, 1015-1020）。該アッセイは、基質として放射標識ウラシルを使用する。しかしながら、放射標識を使用する方法は、明らかに病院における日常的診断には適用できない。更に、このようなＴＬＣ法は、時間を消費するものである。
【０００６】
ＨＰＬＣを使用する別の方法も、例えばvan Gennip et al., 1982, Adv. Exp. Med. Biol., 253A:111-118、及び Sommadossi et al., 1982, J. Biol. Chem.,257: 8171-8176によって記述されている。これらの方法は、逆相ＨＰＬＣを使用して５−ＦＵの種々の異化物の合計を測定することにより酵素活性を測定することに基礎を置くものである。このような方法は、煩雑であり、かつ時間を消費するものである。
【非特許文献１】Iigoet al., 1969,Biochem. Pharmacol., 38, 1885-1889
【非特許文献２】Milano, G. and Etienne,1988, M.C., Pharmacogenetics, 4, 301-306
【非特許文献３】Diasio and Lu, 1994,J. Clin. Oncol.,12, 2239-2242
【非特許文献４】Fernandez-Salguero et al., 1995,Biochem. Pharm. 50, 1015-1020
【非特許文献５】vanGennip et al., 1982, Adv. Exp. Med. Biol., 253A:111-118
【非特許文献６】Sommadossi et al., 1982,J. Biol. Chem.,257: 8171-8176
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明によって向けられる課題は、上述した既知の方法の欠点を有さず、かつ病院における日常的使用のための単純かつ迅速なアッセイを提供するＤＰＤ濃度測定のための材料及び方法を見出すことである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題は、添付される特許請求の範囲に定義される発明により解決される。
本発明は、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）、特にはヒトジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼを特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。
【０００９】
上記のモノクローナル抗体は、好適にはヒト腫瘍細胞系HT-3 (ATCCHTB-32)由来のホモジネートに対して強い反応性を示すが、ヒト腫瘍細胞系MCF-7 (ATCCHTB-22) 由来のホモジネートに対して低い反応性またはまったく反応性を示さないモノクローナル抗体である。
【００１０】
上記のモノクローナル抗体は、ＤＰＤに高い特異性を示すモノクローナル抗体である。
【００１１】
好ましくは、ヒト腫瘍細胞系HT-3 (ATCC HTB-32)からのホモジネートを用いて選られた免疫沈澱は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析される場合に単一バンドを示す。
【００１２】
該モノクローナル抗体は、好適にはハイブリドーマ細胞系2B6-11-1, 9C7-30-1, 5E6-19-1, 3A5-6-1 (FERMBP-6015), 6H5-42-1, 4B9-12-1(FERM BP-6016), 2E2-B3-1-3 (FERM BP-6014)及び 3B12-B1-56-1-2 からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞系により産生されうる。好ましくは、該モノクローナル抗体は、3A5-6-1 (FERM BP-6015), 4B9-12-1 (FERM BP-6016), 2E2-B3-1-3 (FERM BP-6014)から選択されるハイブリドーマ細胞系により産生され得る。
【００１３】
該モノクローナル抗体は、上記細胞系の一つにより産生されるモノクローナル抗体と同等な態様でＤＰＤに結合するモノクローナル抗体、即ち、上記細胞系の一つにより産生されるモノクローナル抗体と同じエピトープに結合するか、あるいは上記細胞系の一つにより産生されるモノクローナル抗体と強く交差反応するモノクローナル抗体でありうる。
【００１４】
本発明は、上記に定義されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系にも関するものである。
【００１５】
そのハイブリドーマ細胞系は、好適には上記第１の特定のハイブリドーマ細胞系群から選択され、また好ましくは上記第２の特定のハイブリドーマ細胞系群のうちから選択される。
【００１６】
本発明は、ＤＰＤの定量及び／または定性的検出に有用なモノクローナル抗体の対にも関連し、この対は、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼを特異的に認識する第１のモノクローナル抗体及びジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼを特異的に認識する第２のモノクローナル抗体を含み、該第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体は、互いに異なるエピトープを認識する。
【００１７】
このようなモノクローナル抗体の対は、第１のモノクローナル抗体としてMab-3A5-6-1, Mab-6H5-42-1 及び Mab-3B12-B1-56-1-2 からなる群から選択されるモノクローナル抗体を、また第２のモノクローナル抗体としてMab-4B9-12-1, Mab-2E2-B3-1-3, Mab-9C7,Mab-2B6 及び Mab-5E6-19-1 からなる群から選択されるモノクローナル抗体を含みうる。
【００１８】
好ましくは、第１のモノクローナル抗体はMab-3A5-6-1 であり、第２のモノクローナル抗体はMab-4B9-12-1または Mab-2E2-B3-1-3 である。
【００１９】
更に本発明は、生物学的試料中のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの検出または定量測定のためのキットに関し、
（ａ）上記に定義される少なくとも１種のモノクローナル抗体、及び
（ｂ）該モノクローナル抗体とジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼとの免疫接合体を定性的及び／または定量的に検出するための標識、
を有してなる。
【００２０】
好ましくは、このキットは上記に定義されるモノクローナル抗体の対及び標識を含む。
【００２１】
他の側面において、本発明は生物学的試料中のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの検出及び／または定量のための免疫アッセイ方法に関し、該方法は
（ａ）試料を上記に定義される少なくとも１種のモノクローナル抗体により処理して、抗体とジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼとの間の免疫接合体を産生させ、及び
（ｂ）前記免疫接合体を標識手段により定性的または定量的に検出することを含む。
【００２２】
免疫アッセイは、免疫アッセイ技術において既知の任意の免疫アッセイ様式であり得る（例えば、M. Ferencik, 1993, in "Handbook of Immunochemistry", Chapman& Hall, London,UK 発刊参照）。特には、それは例えば免疫沈降法等の１点結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ等の２点結合アッセイ（サンドイッチアッセイ）であり得る。２点結合アッセイは、好ましくは上記に定義されるモノクローナル抗体対が使用されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
モノクローナル抗体の調製
特定の抗原に対するモノクローナル抗体の産生の方法論は、この技術で周知であり、例えば、Harlow et al., 1988,Section 6  of "Antibodies: a Laboratory Manual", Cold Spring HarborPress, New York,USA により記述されている。
【００２４】
ＤＰＤを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系が最初に樹立される。この目的のために、実験動物がＤＰＤ蛋白質またはその断片を抗原として免疫される。該実験動物は、ハイブリドーマ細胞系の樹立に使用するために適合するリンパ細胞及び脾臓細胞等の免疫能をもった細胞を有する任意の種であり得る。適当な種は、例えば、マウス、ラット、ウサギ及びヤギである。マウスまたはラットが特に都合がよい。抗原は、ＤＰＤ蛋白質自体またはその断片の混合物を含む断片であり得る。抗原として使用されるＤＰＤ蛋白質またはその断片は、天然供給源から蛋白質を単離するか、または組換え技術により製造することにより得られうる。ＤＰＤ蛋白質は、好ましくはヒト由来の肝臓組織等から、例えば、Lu等のJ. Biol. Chem.267, 17102-17105, 1992 等に既に報告されている単離方法により得られうる。
【００２５】
遺伝子組換え技術は、組換え抗原の調製のための都合よい手段を提供する。ヒトＤＰＤのヌクレオチド配列は、GenBank TM/ EMBLから、アクセス番号Ｕ０９１７９によって入手可能である（Yokota, H. et al., 1994, J.Biol. Chem. 269, pp. 23192-23196 ）。ヒトＤＰＤのヌクレオチド配列及びそれから導かれるアミノ酸配列は、下記の配列表に配列番号：１及び配列番号２としてそれぞれ示される。配列情報に基づいて、組換えＤＰＤ蛋白質またはその断片が、合成ＤＮＡまたはクローン化ＤＰＤ遺伝子の何れかを使用して、組換え遺伝子のための慣用の発現系を使用して産生されうる。クローニングを要する場合には、クローニング方法は例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅または自己維持的配列複製等の任意の核酸増幅方法に基づきうる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は特に信頼性が高く都合がよい。ＰＣＲクローニング方法は、ＤＰＤ遺伝子の全ヌクレオチド配列またはその遺伝子の部分ヌクレオチド配列を与えうる。例においては、ＧＳＴ蛋白質との融合蛋白質の形態でのＤＰＤの断片が、動物の免疫について有効な抗原であることが示される。
【００２６】
配列番号：２に示されるように、アミノ酸配列はＤＰＤ断片の化学合成のための有用な情報を提供する。このような合成ペプチドも、本発明に対して抗原として有用である。上記の何れかの方法により調製された抗原は、ウエスタンブロッティングによりそれらの抗原性が評価されうる。
【００２７】
前記抗原のマウス、ラット、ヒツジ、ウサギ等への注射により、本発明のモノクローナル抗体が、このような免疫動物から抗体の産生細胞を回収し、前記細胞を不死化することによって調製されうる。上記抗原による動物の免疫は、例えばHarlow等の上記文献に記述される様にこの技術で既知の手法によって行われうる。不死化は、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を与え、また該抗体産生細胞のミエローマ細胞との融合のように慣用の様式で行われうる。
【００２８】
このようなハイブリドーマ培養物の上澄みが、ウエスタンブロッティング等のドット−免疫結合アッセイ、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ等の慣用の手法によりモノクローナル抗体についてスクリーニングされる。
【００２９】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ上澄みから例えば、イオン交換クロマトグラフィー、蛋白質Ｇまたは蛋白質Ａでの親和性クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の慣用のクロマトグラフィー手法により精製されうる。
【００３０】
この分野で既知の手法によるモノクローナル抗体の大量産生のためには、所望の抗体を分泌するハイブリドーマが、注射に先立ってプリスタンにて前処理されたマウスに、腹腔内的に注射される。１匹のマウスにおけるこのような腹水腫瘍によって、約１００ｍｇまでのモノクローナル抗体が産生されうる。モノクローナル抗体は、例えば例２に記述されるようにこのような腫瘍により産生される腹水から精製されうる。
【００３１】
モノクローナル抗体は、オクタロニー免疫拡散法等の既知の方法、またはマウス・モノ Ab-ID EIA  キット (Zymed, San Francisco, CA, USA)等の商業的に入手可能な試験キットを使用して、それらのサブクラスに従って、性質決定されうる。本発明においては、例２において調製されるハイブリドーマ細胞系からの特定のサブクラスは、それぞれMab-2B6-11-1 (IgG1, κ), Mab-9C7-30-1 (IgG1,κ), Mab-5E6-19-1 (IgG3,κ), Mab-3A5-6-1 (IgM,κ) 及びMab-6H5-42-1 (IgM,κ) として決定された。
【００３２】
4B9-12-1, 3A5-6-1 及び2E2-B3-1-3として命名される本発明によるハイブリドーマ細胞系は、特に複数部位結合アッセイのための本発明のモノクローナル抗体の産生に有用である。これらの細胞系は、下記の受託番号のもとに１９９７年７月８日にブダペスト条約に基づいて日本の生命工学研究所（ＮＩＢＨＴ）に寄託されている：2E2-B3-1-3についてFERM BP- 6014, 3A5-6-1についてFERM BP- 6015 及び4B9-12-1についてFERM BP- 6016 。
【００３３】
本発明のモノクローナル抗体は、ＤＰＤの免疫親和性精製法に使用され得る。このような抗体は、最終的にこの技術で周知の方法、例えばセファロース等のＣＮＢｒ活性化アガロースに共有結合により結合することにより、固体担体に連結される。
【００３４】
更に、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト患者の腫瘍組織であり得る生物学的試料中のＤＰＤ濃度を決定するための診断用の道具としても使用され得る。このような用途のために、モノクローナル抗体は、蛍光色素、酵素等の色生成物質（酵素結合免疫吸着アッセイ；ＥＬＩＳＡ）またはビオチン等のこの技術で慣用的に使用される標識に結合されてよい。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体の使用により構築されうるアッセイ様式の性能の評価のために、放射標識を使用する下記の慣用のアッセイ法が使用され得る。
【００３６】
ＤＰＤ酵素活性のアッセイ方法
ＤＰＤの酵素活性は、５−ＦＵ異化物の合計、即ち［６−14Ｃ］５−ＦＵから形成されるジヒドロフルオロウラシル、α−フルオロ−β−ウレイドプロピオネート、及びα−フルオロ−β−アラニンを測定することにより決定されうる。特に次の手法が上記アッセイに適用される。
【００３７】
標準反応混合物は、全体積５０μｌ中に、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ２−メルカプトエタノール、１ｍＭジチオスレイトール、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、２５０μＭ  ＮＡＤＰＨ、２５μＭ  ［６−14Ｃ］５−ＦＵ（５６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、及び２５μｌ粗製酵素（最終蛋白質濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を含む。全反応は３７℃にて３０分間で行われ、次いで反応チューブ（０．５ｍｌエッペンドルフチューブ）を沸騰水中に３０分間浸けることにより停止させた。該反応チューブを、更に操作を行う前に、少なくとも２０分間、−２０℃にて冷凍した。蛋白質を遠心分離により除去し、次いで１０μｌの上澄み液をシリカゲルＴＬＣシート（ＭＥＲＣＫ５７３５）にスポットし、これには１０ｍＭ  ５−ＦＵ、５０ｍＭ  ジヒドロウラシル、２０ｍＭβ−ウレイドプロピオネート、１０ｍＭα−フルオロ−β−アラニン及び５０ｍＭ尿素を含む５μｌの真正マーカー混合物を予めスポットしておいた。スポットを、酢酸エチル／イソプロパノール／Ｈ2 Ｏ（６５：２３：１２、ｖ／ｖ／ｖ）の混合物の溶媒系にて展開した。これらの展開されるマーカーは、Naguib等、1985, Cancer Res. 45, 5405の方法により同定した。５−ＦＵ異化物として同定されるスポットの放射能は、ＢＡＳ１０００システム（富士フィルム）により検出されうる。ＤＰＤ活性は５−ＦＵの変換されたｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分として表される。
【００３８】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
本発明のモノクローナル抗体の免疫学的定量アッセイにおける典型的な応用として、１点結合法及び２点結合法（いわゆるサンドイッチアッセイ）が考慮される。一般的には２点結合法が高精度及び高感度の達成において有利といえる。上記に定義したモノクローナル抗体対を使用するＥＬＩＳＡは、感度がよくかつ迅速なアッセイ様式であることが示された（例３参照）。
【００３９】
ＥＬＩＳＡは、抗体のうちの一方を固体担体に固定化し、斯くして固定化された抗体を、ＤＰＤを含むと考えられる試料と接触させてＤＰＤ−抗体接合体を形成させ、該接合体を他方のモノクローナル抗体と反応させてＤＰＤサンドイッチ接合体、即ち抗体−ＤＰＤ−抗体を形成し、後者の接合体を例えばＨＲＰ標識ラット抗−マウスイムノグロブリン抗体により標識して該接合体を検出することにより行われうる。ＨＲＰ標識が使用される場合には、検出は例えば、ＨＲＰにより触媒される酵素反応において発色する基質であるＴＭＢ及びＨ2 Ｏ2 を含むＴＭＢマイクロウエルペルオキシダーゼキット系（ＫＰＬ）を使用する着色反応により行われうる。検出のための標識として、ラット抗−マウスイムノグロブリン抗体は、ビオチン、酵素、放射性同位体等の任意の慣用の標識を有してもよい。別法として、可動相のモノクローナル抗体がＨＲＰ、ビオチン、放射性同位体、ラテックス粒子等により標識されてもよい。
【００４０】
例３に示されるように、ＥＬＩＳＡの高い感度は、上記に定義されるモノクローナル抗体の対を使用して達成されうる。この高い感度は、このアッセイ法を上記のＤＰＤ欠損症状のようにＤＰＤ濃度が低い場合においても、人体からの生物学的試料におけるＤＰＤ濃度の測定について有用なものとする。
【００４１】
免疫沈降
本発明によるモノクローナル抗体は、免疫沈降法によるＤＰＤ蛋白質の単離及び測定にも有用である。免疫沈降の方法論自体は、この技術で周知である。上記に定義されるモノクローナル抗体を使用して、そのモノクローナル抗体の高い結合特異性により複雑な試料からの標的抗原（ＤＰＤ）の特異的分離が提供される。
【００４２】
使用され得る典型的沈降試薬の一つは、マウスイムノグロブリンのＦｃ領域に結合可能な蛋白質Ｇが、セファロース４Ｂビーズの表面に固定化された蛋白質Ｇ−セファロース４Ｂである。この試薬は、ＤＰＤが存在すると、ＤＰＤ−抗体−蛋白質Ｇ−セファロース４Ｂの複合体を形成し、該複合体は遠心分離により分離されうる。集められた複合体の沈殿物から、抗原及び抗体は酸性条件下、例えばグリシン−ＨＣｌ−緩衝溶液、ｐＨ３．０等により解離されうる。而して分離されたＤＰＤは、ゲル濾過の方法により容易にイムノグロブリンから単離されうる。ＤＰＤが結合するこのような複合体は、酵素の単離のみならず、酵素の定量にも有用である。而して本発明のモノクローナル抗体は、下記例６に示されるように複雑な生物学的試料からのＤＰＤの単離及び測定のための有力な道具である。
【００４３】
抗体捕捉アッセイ
本発明のモノクローナル抗体は、抗体捕捉アッセイにおいても有用である。このアッセイ様式において、モノクローナル抗体はマイクロタイタープレートのウエル等適当な容器の表面に固定化される。固定化は、この技術で既知の慣用方法により行われる。ＤＰＤを含む試料がこのようなウエルに入れられると、ＤＰＤペプチドは固定化された本発明のモノクローナル抗体により捕捉される。ウエルの洗浄後に、ＤＰＤの基質を含む溶液が添加される。こうして酵素生成物の検出系は、ＤＰＤ活性の検出手段を与えるであろう。ＤＰＤ遺伝子に遺伝的損傷を有する患者の場合に酵素活性を失った変異ＤＰＤ蛋白質を有し得るために、このアッセイ様式は、捕捉されたＤＰＤが、本来の酵素的作用を有するか否かを決定する為に有用であろう。
【００４４】
別法として、ＤＰＤが固定化モノクローナル抗体に捕捉された後に、このような免疫複合体が洗浄され、次いでＤＰＤポリペプチドが、例えば酸性条件等の適当な緩衝溶液にて溶離される。この操作も、精製ＤＰＤ調製物を提供する。
【００４５】
本発明のモノクローナル抗体を使用する臨床的方法
更なる側面において、本発明は患者におけるＤＰＤ欠損状態の測定方法に関し、この方法は；(a) 患者由来の生物学的試料を上記に定義されるモノクローナル抗体により処理し、及び（ｂ）該モノクローナル抗体とジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼとの免疫接合体を定量的に測定することを含んでなる。
【００４６】
他の側面において、本発明は癌を患う患者の、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）誘導体系抗腫瘍薬による治療に対する感受性の評価方法に関し、
（ａ）患者由来の生物学的試料を上記に定義されるモノクローナル抗体により処理し、
（ｂ）該モノクローナル抗体及びヒトジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの免疫学的接合体を定量的に測定し、患者由来の生物学的試料中のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ濃度を決定して感受性の尺度を得ることを含んでなる。
【００４７】
上記の方法は、患者についての測定濃度を、患者の参考濃度と比較することにより上記医薬の有効性を臨床家が予想することを可能とする。
【００４８】
更なる側面において、本発明は癌を患う患者の、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）誘導体系抗腫瘍薬による治療に対する感受性の評価方法に関し、
（ａ）患者由来の生物学的試料を上記に定義されるモノクローナル抗体により処理し、
（ｂ）該モノクローナル抗体及びヒトジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの免疫学的接合体を定量的に測定し、患者由来の生物学的試料中のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ濃度を決定し
（ｃ）前記患者由来の前記生物学的試料のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ濃度を測定し、並びに
（ｄ）該ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ濃度とジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ濃度の比を計算して感受性の尺度を得ることを含んでなる。
【００４９】
上記方法は、患者についての計算された該ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ濃度とジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ濃度の比を測定濃度を、患者の参考濃度と比較することにより、上記医薬の有効性を臨床家が予想することを可能とする。
【００５０】
略号
以下において、次の略号がしばしば使用されるであろう。
ＤＰＤ                  ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ
ＰｙＮＰａｓｅ          ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ
ＧＳＴ                  グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ
ＩＰＴＧ                イソプロピル  β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
ＫＬＨ                  キーホールリンペットヘモシアニン
５−ＦＵ                ５−フルオロウラシル
ＣＦＡ                  完全フロイントアジュバント
ＩＦＡ                  不完全フロイントアジュバント
ＥＩＡ                  酵素免疫アッセイ
ＥＬＩＳＡ              酵素結合免疫吸着アッセイ
ＴＬＣ                  薄層クロマトグラフィー
ＰＢＳ                  リン酸緩衝食塩水
ＰＣＲ                  ポリメラーゼ連鎖反応
ＴＭＢ                  テトラメチルベンジジン
（ＴＭＢキットは3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン及びＨ2 Ｏ2 を含む）
ＴＢＳ    トリス緩衝食塩水（２０mM  トリス／５０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７. ４）
ＴＴＢＳ  ０．０５％ＴＷＥＥＮ（商標）−２０を含むＴＢＳ
【実施例】
【００５１】
本発明は、以下の実施例により更に例示されるであろう。以下の記述は、次の図１，２，３，４，５，６−１及び６−２を参照することにより、よりよく理解されるであろう。
【００５２】
図１は、例１により産生される組換えＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質の抗−ＤＰＤペプチド２抗体を使用するウエスタンブロッティングによる抗原性の確認を示す。図１において、レーン１は分子量マーカー、レーン２はＧＳＴ蛋白質自体、及びレーン３はＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質である。
【００５３】
図２は、ＤＰＤを含むヒト組織ホモジネートに対する本発明のモノクローナル抗体のウエスタンブロットパターンを示す。この図において、レーン１は、分子量マーカー。レーン２は組換えＤＰＤ（ｒＤＰＤ）、レーン３はヒト腫瘍細胞系ＨＴ−３の異種移植片ホモジネート、レーン４，５及び６は、それぞれ異なるヒト肺ガンホモジネートである。
【００５４】
図３は、例３に記述される本発明によるＥＬＩＳＡによって得られた標準曲線を例示する。この図において、横軸はＨＴ−３活性の対数であり、縦軸は波長４５０ｎｍにおいて測定される光学密度の対数である。図３は、本発明のＥＬＩＳＡが、約２．５〜約１７０ピコモル／分／ｍｌの範囲のＤＰＤ活性を測定し得ることを示している。
【００５５】
図４は、共に正常組織及び乳癌組織において、ＤＰＤ活性アッセイ及び本発明のＥＬＩＳＡにより測定されたＤＰＤ濃度の間の相関を例示する。ＤＰＤ活性アッセイは、14Ｃ-放射標識を使用して慣用のＴＬＣ法により行われた。ここに使用されるＥＬＩＳＡは例３に記述されるものである。
【００５６】
図５は、例５に記述されるようにPyNPase/DPD 比の測定によるフルツロン（FURTULON）等の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）誘導体系抗腫瘍薬に対する感受性試験の結果を示す。PyNPase 濃度は、Nishida M. et al., 1996,Biol. Pharm. Bull.19(11), 1407-1411 により記述される方法を使用してアッセイされた。またここに使用されるＥＬＩＳＡは、例３に記述されるものである。
【００５７】
図６および７は、実施例６に記述される本発明によるモノクローナル抗体を使用する免疫沈殿アッセイの結果を例示する。
図６（ａ）及び（ｂ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示すもので、（ａ）は上澄みについて、また（ｂ）は免疫沈殿のビーズ溶離物についてである。図７（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、ウエスタンブロットの結果を示すもので（ａ）は抗−ＤＰＤ−１ポリペプチド抗体を使用して検出した上澄みからの結果、（ｂ）は抗−ＤＰＤ−１ポリペプチド抗体を使用して検出した免疫沈降からの溶出の結果、及び（ｃ）は（ｂ）と同じ溶離液について本発明のモノクローナル抗体3A5-6-1が検出に使用された結果を示す。それぞれのレーンは、下記の試料を使用した免疫沈降アッセイの結果に対応する：レーン 1: マウス IgG 1; レーン 2: 2B6-11-1; レーン 3: 2E2-B3-1-3; レーン４：4B9-12-1; 及びレーン5: 9C7-30-1。図７（ｂ）のレーンＣは、陽性対照としてのHT-3のホモジネートの操作である。
【００５８】
例１
抗原の調製
先に記述したように、ヒトＤＰＤのヌクレオチド配列及びそれから導かれるアミノ酸配列は、Yokota, H. et al., 1994, J. Biol. Chem.,269, (37) 23192-23196により報告されている（配列番号：１及び配列番号：２参照）。抗原としての融合蛋白質は、配列番号：１の１１７０位から３１６４位までの遺伝情報に基づいて調製され、この融合蛋白質は、下記のように遺伝子情報を保有するベクターpGEX 4 T-3により形質転換された宿主生物E. coli JM 109を用いてＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質として発現された。
【００５９】
１）ＤＰＤ発現ベクターの構築
配列番号：１の１１７０−３１６４位の遺伝情報に基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＤＰＤ遺伝子分節をクローニングするために、３個のＤＮＡプライマーが調製された。プライマー１（ＥｃｏＲＩリンカー＋センス）は、ＥｃｏＲＩリンカー(CGCGAATTC) を５’末端部分に含み、及び配列番号：１の１７７０−１７８５位のヌクレオチドに対応する正の鎖を配列を有する２５量体として調製された。
プライマー１：5'-CGCGAATTCTTTTGAAGCTGGATGG-3'     ( 配列番号：３)
(1770 Eco RI  リンカー +  センス)
【００６０】
プライマー２(Eco RI リンカー +  アンチセンス) は、５’末端部分のEco RIリンカー及び配列番号：１の３１４８−３１６４位のヌクレオチドの相補的な負の鎖を含む配列を有する２６量体として調製された。
プライマー２： 5'-CGCGAATTCTCACCTTAACACACCGG-3'（配列番号４）
(3164 Eco RI  リンカー +  アンチセンス)
【００６１】
プライマー３（アンチセンス）は、配列番号：１の３４９５−３５１０位のヌクレオチドに対応する配列の相補的な配列を有する１６量体として調製された。
プライマー３： 5'-AATCAAATATGGAGCA-3'   （配列番号：５）
(3510 アンチセンス)
【００６２】
全ＲＮＡは、ヒト肺二倍体細胞系ＷＩ３８細胞（ＡＴＣＣ  ＣＬＬ−７５）から、ＲＮＡ単離キット(Stratagene, La Jolla, CA, USA) を使用して、酸グアニジニウム・チオシアネート・フェノール・クロロホルム抽出（ＡＧＰＣ）方法（例えば、 Chomczynski, P. and Sacci,N., 1987, Anal.Biochem. 162, 156-159参照）に基づき、慣用方法により調製され、プライマー３を使用して逆転写酵素ＲＡＶ−２による逆転写反応に付してｃＤＮＡ調製物を得た。反応において、１ｍｇの全ＲＮＡが、２０ｍｌの反応溶液中で、４２℃において６０分間、逆転写反応に付され、次いで逆転写酵素が９５℃にて５分間加熱することにより変性された。こうして得たｃＤＮＡ調製物を、ＰＣＲ増幅において使用するまで、４℃に維持した。ｃＤＮＡの第１鎖の合成に使用された緩衝溶液は、5 mMのMgCl2 、各１ mM のdGTP、dATP、dTTP及びdCTP、Rnase阻害剤、20単位の逆転写酵素RAV-2 並びに 0.75 μM のプライマーを含んでいた。
【００６３】
次いでこのｃＤＮＡ調製物は、プライマー１及び２、並びに商業的ＰＣＲキット、即ちＲＴ−ＰＣＲキット（タカラ酒造、滋賀、日本）を使用して、ＤＮＡポリメラーゼ（３．５単位のｐｆｕ）をＴａｑポリメラーゼに代えて使用したことを除いてキットの使用書に従って、サーマルサイクラー装置（ZYMOREACTOR II, ATTO、東京、日本）上でＰＣＲ増幅に付した。全体積１００μｌを有するＰＣＲ増幅緩衝溶液は、2 mMのMgCl２、各0.2 mMの dGTP 、dATP、dTTP及びdCTP並びに各0.4 μM のプライマーを含んでいた。ＰＣＲプログラムは、９４℃において３０秒間、５５℃において１分間、及び７５度において４分間を３２サイクルであった。こうして増幅されたＤＰＤ  ｃＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動により１．４ｋｂｐに対応するバンドとして単離され、ＱＩＡＥＸ１１ゲル抽出キット（QIAGEN, Hilden, Germany）を用いて精製された。精製されたｃＤＮＡ断片は、ＥｃｏＲＩにより消化され、該ＥｃｏＲＩ断片は、ＤＮＡリゲーションキット（宝酒造、滋賀、日本）を用いて１６℃にて一夜でベクターpGEX4T-3 (Pharmacia, Uppsala,Sweden) に、ＥｃｏＲＩ部位にて挿入された。こうして得られたベクター（以下、pGEX4T-3-DPDと称する）は、ＧＴＳ−ＤＰＤ融合蛋白質を発現できた。上記挿入断片の部分ヌクレオチド配列を決定し、期待されるＤＰＤ遺伝子の部分配列を有することが確認された。
【００６４】
２）ＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質の発現
E. coli JM109( 東洋紡、大阪、日本) を、pGEX4T-3-DPDにより形質転換し、形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＳＯＢ（20 g/lのバクト−トリプトン、5 g/l のバクト−イースト抽出物、0.5 g/l の塩化ナトリウム、0.186 g/l の塩化カリウム及び0.95 g/lの塩化マグネシウム； pH 7.0 ）培地中にて２２℃にて培養して融合蛋白質を発現させた。前記Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体の細胞を、0.5 mMのIPTG (イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド) の添加により処理し、２２℃にて１６時間インキュベートし、次いで１％のTRITON（登録商標）-X100 、１％のサルコシル、１０ｍＭのＤＴＴ及び２ｍＭのＥＤＴＡ／ＰＢＳを含む緩衝溶液中で超音波処理に付した。細胞溶解物を遠心分離し、可溶性分画をグルタチオン−セファロース４Ｂカラム(Pharmacia, Uppsala, Sweden)に負荷した。吸着したＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質を、１０ｍＭの還元グルタチオンにより溶出した。ＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて約７５ｋＤａ蛋白質として同定した。
【００６５】
この目的融合蛋白質は、抗−ＤＰＤペプチド抗体との反応により確認された。この目的で、ＤＰＤの２種類のペプチド、即ちペプチド１（配列番号：６）及びペプチド２（配列番号：７）を、配列番号：２として記述される配列に基づいて化学合成し、例えばHarlow et al., 1988, in "Antibodies: a Laboratory Manual", Cold Spring HarborPress, New York,USA, pp 78 - 79に記述される様にしてグルタールアルデヒド法によりＫＬＨと結合し、抗原を得た。２００μｇの各抗原を、ＣＦＡと共にウサギに皮下的に注射して該動物を免疫し、続いてＩＦＡを伴う同じ量の抗原による追加免疫を行った。こうして生成される抗血清をＫＨＬカラム（ＫＨＬが担体、即ちアフィゲル−１０に固定化されたカラムであり、BioRad, Hercules, CA, USA から入手可能である）に通して抗−ＫＨＬ抗体を除去し、次いで使用前に、蛋白質Ｇカラム(MAB Trap GII, Pharmacia, Uppsala,Sweden)またはペプチドカラムに負荷し、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０の緩衝溶液にて溶出し、引き続き１ＭトリスＨＣｌにて中和することにより精製した。ペプチドカラムは、上記ペプチド１またはペプチド２を、アフィゲル−１５(BioRad, Hercules, CA, USA) に結合することによって調製される。抗−ＤＰＤペプチド１及び抗−ＤＰＤペプチド２ポリクローナル抗体の両者は、ヒト及びマウス由来のＤＰＤと、ウエスタンブロッティングにおいて反応性であり、従って、ＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質の産生の確認に使用された。上述のように、該形質転換体は抗−ＤＰＤペプチド２を用いるウエスタンブロッティングによりＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質を産生することが確認された（図１参照）。図１において、レーン１は分子量マーカー、レーン２はＧＳＴ蛋白質自体、レーン３はＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質である。レーン３に見られるように、該融合蛋白質は約７５ｋＤａの蛋白質として確認された。
【００６６】
例２
抗−ＤＰＤモノクローナル抗体の調製
１）細胞融合
例１において調製されたＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質（動物当たりに５０μｇ）をＣＦＡと共にＢａｌｂ／ｃマウスに１００μｌ／マウスの体積で腹腔内的に注射し、引き続いて２週間の間隔で２回、ＩＦＡと共に動物当たりに１０μｇのＧＳＴ−ＤＰＤ蛋白質を用いて腹腔内的に追加免疫した。最後の免疫から３日後に、感作マウスを切開して脾臓を取り出し、脾臓細胞を調製した。こうして得られた脾臓細胞を、予め約３７℃に加温した血清非含有ＲＰＭＩ１６４０（ニッケン・セイブツ・イガク・ケンキュウショ、京都、日本）を用いて注意深く洗浄した。引き続く融合処理は、緩衝溶液を含み約３７℃に予め加温した試薬を使用して行った。
【００６７】
マウスミエローマ細胞系P3x63 Ag8-U1 (Flow Laboratories Ltd, Irvine, UKから購入) も、血清非含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて注意深く洗浄した。該脾臓細胞（約4 x 108 ）を、マウスミエローマ細胞系P3x63 Ag8-U1 (8 x 107 )と、５：１の比率にて混合し、細胞融合を下記のように行った。細胞の混合物を遠心によりペレット化し、培地を吸引し、次いで該細胞混合物のペレットに２５０μｌの５０％ポリエチレングリコール溶液（PEG1500, Boehringer Mannheim）を、マイクロピペットのチップにてペレットを攪拌しながら１分間でゆっくり加え、次いで更に２５０μｌの５０％ポリエチレングリコール溶液を、マイクロピペットのチップにてペレットを攪拌しながら１分間でゆっくり加え；次いで該チューブの穏やかな回転により攪拌を２分間続けた。該細胞融合混合物に、５０ｍｌの血清非含有ＲＰＭＩ１６４０培地（ニッケン・セイブツ・イガク・ケンキュウショ、京都、日本）をゆっくりと５分間で滴下添加し、細胞を遠心分離により洗浄してＰＥＧを除去した。
【００６８】
細胞融合後にペレット化された細胞混合物を、１０％の子牛血清（ＦＳＣ）、ペニシリン／ストレプトマイシン及び２ＭＥを含むＲＰＭＩ１６４０（ニッケン・セイブツ・イガク・ケンキュウショ、京都、日本）培地中に再懸濁し、９６ウエルプレートのウエルにピペットでとり、これを次いで５％ＣＯ2 下、３７℃にてインキュベートした。インキュベーションの間の２日、４日及び７日目に、各ウエルの培地の半量を、ＨＡＴ培地（１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地にＨＡＴ溶液(Flow Laboratories Ltd, Irvine, UK) を添加することにより調製）により置き換え、インキュベーションを続けた。インキュベーションの約１０日目から、いくつかのウェルではブドウ状コロニーが形成され、最終的に1056ウェルにおいてハイブリドーマの増殖が認められた。
【００６９】
２）モノクローナル抗体のスクリーニング
（２−１）1 次スクリーニング
ハイブリドーマの増殖が認められた全ウェルについてＥＬＩＳＡ（固相−抗体結合法）により、次の通り陽性ウェルを調べた。９６ウエル免疫プレート(Maxisorp, Nunc, Roskilde, Denmark) のウエルを、何れかの蛋白質１μg/mlを含む溶液の50μl/ウエルの量にてGST-DPD 融合蛋白質またはＧＳＴにて被覆した。ＴＴＢＳにて未吸着のタンパクを洗浄除去し、３％のスキムミルク含有ＴＢＳにてブロッキングを室温で１時間行った。ウエルを再びＴＴＢＳにて洗浄した後、ハイブリドーマ培養上清を５０μl/ウエルを以て添加し、３７℃で１時間静置した。各ウエルをＴＴＢＳにて３回洗浄した後、２次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ) 標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンIgG+A+M(KPL 社）を加え、該プレートを３７℃で約１時間静置した。各ウエルをＴＴＢＳにて４回洗浄し、次いで基質（ＴＭＢ、マイクロウェル  キットシステム, ＫＰＬ社）を加えた。１Ｍリン酸の添加にて反応を停止した後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０nmの吸光度を測定した。ＧＳＴを被覆したものより、ＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質を被覆したものに強く反応した陽性ウェルを１次貯留として集めた。
【００７０】
（２−２）二次スクリーニング
スクリーニングの効率を確認するために、二次スクリーニングをウエスタンブロッティングにおいて、ＤＰＤ全配列を有する組換え蛋白質を使用することにより行った。
【００７１】
（Ａ）ＤＰＤ全配列を有する組換え蛋白質の調製
全配列ＤＰＤの組換え蛋白質を、ＲＴ−ＰＣＲクローニングに基づいてＤＰＤの全長ｃＤＮＡをクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターpTrcHisA (Invitrogen, San Diego, USA) に挿入された遺伝子の発現により調製し、この方法は、ＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質のクローニング及び発現における場合と本質的に同じであった。
【００７２】
最初に、ｃＤＮＡの第１鎖を、合成プライマー２及びＲＡＶ−２逆転写酵素を使用して、ヒト胎盤及び肝臓ｍＲＮＡ調製物(Clontech, Palo Alto,CA, USA)の逆転写反応により調製した。次いで、標的ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、合成プライマー４（EcoRI リンカー +  センス、62位； 5'- CGCGAATTCTCGAGACTGTAGGCACT -3' 、配列番号：８) 及びプライマー２並びにｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene, Lajolla, CA, USA)を使用して行った。ＰＣＲは、タカラＲＴ−ＰＣＲキットを使用して、使用書に従ってサーマルサイクラーZYMOREACTOR 11 (ATTO,Tokyo, Japan) により、９４℃にて３０秒間、５５℃にて１分間及び７５℃にて８分間の３５サイクルを以て行った。
こうして増幅されたｃＤＮＡ断片を、１％アガロースゲルでの電気泳動にて分離し、所望のバンドのＤＮＡを、ＤＮＡ精製キットQIAEX11 (QIAGEN, Hilden,Germany) を用いて精製した。精製されたｃＤＮＡをＥｃｏＲＩにて消化し、次いで発現ベクター、即ちpTrcHisA (Invitrogen, San Diego, USA) のＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。こうしてクローン化されたＤＰＤ  ｃＤＮＡは、全ＤＰＤ及びヒスチジン標識蛋白質の融合蛋白質として約１２０ｋＤａの蛋白質を発現し、これを更にスクリーニングに使用した。
【００７３】
（Ｂ）スクリーニング
上記のように得た組換えＤＰＤを、ラエムリの方法論に従って、NPG-D520L ゲル(Pagel, ATTO,Tokyo, Japan) 上で電気泳動にかけ、該蛋白質を半乾燥ブロッター(ATTO, Tokyo, Japan)を使用してＰＶＤＦ膜(Immobilon, Millipore, Bedford, MA, USA)上にブロッティングした。該ＤＰＤ蛋白質がブロッティングされたＰＶＤＦ膜を、３％スキムミルクを含むＴＢＳを用いてブロックし、ＴＴＢＳにて洗浄し、次いでスクリーナー・ブロッター・ミニ２８(Sanplatec Corp., Japan)上で、室温にて１時間、例１に記述したハイブリドーマの培養上澄みとの反応に付した。次いで、ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳにて洗浄後、それらを室温にて１時間、ＨＲＰ−標識ヤギ抗−マウスIgG+A+M 抗体（ＫＬＰ）と反応させた。膜をＴＴＢＳにて再度洗浄し、コニカイムノステイニング（Konica Immunostaining ）HRP-1000 (Konica,Tokyo, Japan) を使用して着色反応に付した。約１２０ｋＤａの組換えＤＰＤと強く反応した、例えば2B6, 9C7, 5E6, 3A5及び6H5 と命名されたコロニーを、候補として集めた。ここにおいて使用されるように、特定のハイブリドーマ、例えばハイブリドーマ2B6 により産生されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマの名称の頭に"Mab-"を付すことにより、例えばMab-2B6 として命名される。
【００７４】
上記の候補は、制限希釈法を２回以上繰り返してクローニングし、ハイブリドーマ細胞系（例えば、2B6-11-1, 9C7-30-1, 5E6-19-1, 3A5-6-1 及び6H5-42-1を含む）を樹立した。最初の制限希釈法の後に、上記のモノクローナル抗体、即ちMab-2B6-11, Mab-9C7-30, Mab-5E6-19, Mab-3A5-6 及びMab-6H5-42の特異性を、ＤＰＤを含む試料を使用してウエスタンブロッティングにより評価した。
【００７５】
図２は、ハイブリドーマ細胞系2B6-11, 9C7-30, 3A5-6-1, 5E6-19及び6H5-42により産生されるモノクローナル抗体についてのウエスタンブロッティングの結果を示す。この図に示されるように、抗体及びＤＰＤにより生じた免疫接合体が、分子量約１１０−１２０ｋＤａの位置付近に観察された。
【００７６】
上記ハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体のサブクラスを、マウス・モノ（Mouse Mono）Ab-ID EIA Kit (Zymed,San Francisco, CA, USA) を使用して検査し、それぞれMab-2B6-11-1 (IgG1,κ), Mab-9C7-30-1 (IgG1,κ), Mab-5E6-19-1 (IgG3,κ), Mab-3A5-6-1 (IgM,κ), Mab-6H5-42-1 (IgM,κ) として決定された。上記のモノクローナル抗体は、ＤＰＤ検出のためのサンドイッチＥＬＩＳＡに適用可能であることが確認された。しかしながら、腫瘍組織中のＤＰＤ濃度は肝臓よりも低いものと予想され、ＤＰＤ−欠損水準と正常水準との間の区別を可能とするためには高感度が必要とされるであろうことから、より高感度のＥＬＩＳＡ系を構築するために、更なるスクリーニングが好ましいと考えた。
【００７７】
（２−３）三次スクリーニング
代表としてハイブリドーマ3A5-6-1 のモノクローナル抗体をとり、Mab-3A5-6-1 の抗体により認識されるものとは異なるエピトープを認識し、かつ上記抗体以上に組織中の天然ＤＰＤの検出においてより高感度を達成するであろう更なるモノクローナル抗体をスクリーニングした。
【００７８】
モノクローナル抗体Mab-3A5-6-1 を、１０μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌ／ウエルを用いて、プレートのウエルを被覆するために使用し、未結合抗体を除去後、各ウエルを室温にて１時間、３％のスキムミルクを含むＴＢＳにてブロックした。ＴＴＢＳにて洗浄後、ウエルを約２μｇ／ｍｌの濃度のマウス肝臓ホモジネートの５０μｌ／ウエルと、室温にて１時間反応させた。ＴＴＢＳにて洗浄後、ウエルをハイブリドーマ培養物上澄の一次貯留の５０μｌ／ウエルと、３７℃にて１時間反応させた。再度、ＴＴＢＳにより洗浄後、ウエルをＨＲＰ標識ラット抗−マウスＩｇＧ１特異的モノクローナル抗体(Zymed, San Francisco, CA, USA)と、３７℃にて１時間反応させた。ＴＴＢＳによる洗浄に続いて、ウエルをＴＭＢマイクロウエルペルオキシダーゼキットシステム（ＫＰＬ）を用いて発色に付し、次いで反応を１Ｍリン酸の添加により停止させ、マイクロタイタープレート読み取り装置により４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７９】
強い反応を伴う２２個のウエルが決定され、これらのウエルのハイブリドーマを、上述したと同様な様式で上記マウス肝臓ホモジネートをヒト腫瘍細胞系、ＨＴ−３及びＭＣＦ−７のホモジネートに置き換え、更にスクリーニングに付した。前記ＨＴ−３は、１６０ｐｍｏｌ／分／ｍｇ蛋白質のＤＰＤ活性を有し、ウサギ抗−ＤＰＤ−ペプチド１または抗−ペプチド２ポリクローナル抗体を使用するウエスタンブロッティングにより１１０ｋＤａ付近の単一バンドとして検出される。他方において、細胞系ＭＣＦ−７は１．６ｐｍｏｌ／分／ｍｇのＤＰＤ活性を有するが、同様なウエスタンブロッティングにおいては検出されなかった。従って、発明者等は、細胞系ＨＴ−３と強く反応するが、細胞系ＭＣＦ−７とは反応しないハイブリドーマ（４Ｂ９及び２Ｅ２と称する）を選択した。これらのハイブリドーマ４Ｂ９及び２Ｅ２を、更に２回以上の制限希釈法に付して、ハイブリドーマクローン4B9-12-1及び2E2-B3-1-3（これらの抗体はＩｇＧ１，κとして決定された）を樹立した。
【００８０】
モノクローナル抗体Mab-4B9-12-1及びMab-2E2-B3-1-3は、免疫沈降によって可溶化状態のＤＰＤに対する特異性が確認された。
【００８１】
（２−４）モノクローナル抗体の精製
一般的に、本発明のモノクローナル抗体を産生しうるハイブリドーマが一旦樹立されると、モノクローナル抗体の産生及び精製はこの技術で知られているモノクローナル抗体の産生及び精製のための任意の手段によっても行われうる。例えば、モノクローナル抗体の産生は、ハイブリドーマ細胞を適切な培養培地中で培養し、該培養物からの抗体の回収及び精製によって実施されうる。別法として、ハイブリドーマ細胞の増殖は、該細胞をマウスの腹腔内腹水に植えることによって行われうる。モノクローナル抗体の産生及び精製は、下記の特定のモノクローナル抗体について例示されるように慣用の方法により行われうる。
【００８２】
１）Ｍａｂ−４Ｂ９−１２−１
ハイブリドーマ細胞系4B9-12-1を、血清非含有培地(PM 1000 Kit, Eiken, Tokyo,Japan)中で、細胞濃度約５ｘ１０5 ／mlにおいて培養した。培養の上澄みを集め、該上澄みをHiTrap  蛋白質G カラム (Pharmacia,Uppsala, Sweden) を通すことにより、抗体（ＩｇＧ）を以下のように精製した。
【００８３】
HiTrap蛋白質Ｇカラムを２０ｍＭのリン酸緩衝溶液（ＰＨ７．０）により平衡化し、次いで上澄み調製物をカラムにかけた。カラムを２０ｍＭリン酸緩衝食塩水により洗浄後、ＩｇＧ分画を０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ３．０）により溶出した。こうして集めた分画を、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）により中和し、次いでＰＢＳに対して透析した。BIO-RAD Dc  蛋白質アッセイキット(Biorad, Hercules, CA, USA; 対照はBSA であった) を使用する精製抗体分画の蛋白質測定は、３００ｍｌの培養上澄みから４ｍｇの抗体を示した。このモノクローナル抗体のサブクラスはIgG1, κとして決定された。
【００８４】
２）Ｍａｂ−３Ａ５−６−１
マウスに対する０．５ｍｌのプリスタン(Sigma, St. Louis, MO, USA) の腹腔内的注射から１週間後、５ｘ１０5 細胞のハイブリドーマ3A5-6-1 細胞を、動物の腹腔部内に注射により接種した。２週間後、動物から腹水を採取し、遠心分離し、０．８μｍフィルターを通してろ過した。抗体（ＩｇＭ）の精製は、イムノピュア（ImmunoPure） IgM  精製キット(Pierce, Rockford, Illinois, USA) を使用することにより行った。０．５ｍｌの腹水に０．５ｍｌのイムノピュアＩｇＭ結合緩衝溶液を添加し、該混合物をイムノピュア固定化ＭＢＰカラムに付加した。該カラムをイムノピュアＩｇＭ結合緩衝溶液にて洗浄後、抗体をイムノピュアＩｇＭ溶出緩衝溶液にて溶出させ、抗体の分画をＰＢＳに対して透析した。ＢＳＡを対照とする蛋白質測定は、約０．５ｍｌの腹水から約２ｍｇの抗体（ＩｇＭ）が得られたことを示した。
【００８５】
例３
本発明のモノクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡ
免疫学的定量アッセイとして、１点結合法及び２点結合法（いわゆるサンドイッチアッセイ）が、この技術で周知である。一般的に、２点結合法は、より高い精度及び感度を達成するために有利であるといわれている。上記例２において得られたモノクローナル抗体を、下記のようにサンドイッチＥＬＩＳＡの構築に使用した。
【００８６】
（ａ）第１の抗体の被覆
Mab-4B9-12-1の溶液を、１０μｇ／ｍｌの濃度をもって、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて調製し、５０μｌのこの溶液を９６ウエルイムノプレート(Maxsorp, Nunc, Roskilde, Denmark)の各ウエルに加え、これらのウエルを膜状封止材で封止し、４℃にて一夜インキュベートして抗体を固定化した（この例において、プレートはインキュベートの間封止されていた）。
【００８７】
未結合抗体の回収後、ウエルをＴＴＢＳにて洗浄し、次いで３％のスキムミルクを含むＴＢＳを用い、室温にて３時間インキュベートすることによりブロックした。
【００８８】
（ｂ）試料の負荷
ＤＰＤを含有する標準試料として、ＨＴ−３異種移植片ホモジネートを、２ｍｇ／ｍｌの濃度にて調製した。該ホモジネートの連続希釈物を１％のスキムミルクを含むＴＢＳ中に調製し、５０μｌの試料をそれぞれのウエルに加え、次いで該イムノプレートを３７℃にて２時間インキュベートした。
【００８９】
（ｃ）第２の抗体との反応
ウエルをＴＴＢＳにて洗浄後、２μｇ／ｍｌのMab-3A5-6-1 を３％スキムミルクを含むＴＢＳ中に含む抗体溶液を、５０μｌの体積をもって各ウエルに加え、該イムノプレートを３７℃にて１時間インキュベートした。この処理によって、ＤＰＤが上記試料中に存在する場合に、ＤＰＤが２個のモノクローナル抗体の間にサンドイッチされた[Mab-4B9-12-1]-[DPD]-[Mab-3A5-6-1]の免疫接合体が生成される。
【００９０】
（ｄ）標識
該接合体を検出する目的で、ＨＲＰ標識ラット抗−マウスＩｇＭ抗体(Zymed, San Francisco, CA, USA) を接合体の標識に使用した。この商業的に入手可能なＨＲＰ標識抗体は、３％スキムミルクを含むＴＢＳにて１０００倍に希釈して使用した。
該イムノプレートのウエルを、ＴＴＢＳにより洗浄し、５０μｌの上記ＨＲＰ標識抗体を添加し、プレートを３７℃にて１時間インキュベートした。
【００９１】
（ｅ）検出
ウエルの洗浄後、着色反応を、基質としてＨＲＰにより触媒される酵素反応において発色するTMB 及び H2O2 を含むＴＭＢマイクロウエルペルオキシダーゼキットシステム（ＫＰＬ）を使用することにより行った。基質溶液をそれぞれのウエルに加え、１Ｍリン酸の添加により反応を停止した後に、ウエルの吸光度をマイクロプレート読み取り装置(BioRad, Hercules, CA, USA) により４５０ｎｍにて測定した。
【００９２】
代表的結果は、下記の表１に要約され、Mab-4B9-12-1及びMab-3A5-6-1 を含む上記ＥＬＩＳＡシステムにより得られた標準曲線は図３に例示されている。この図において、横軸はＨＴ−３活性の対数、及び縦軸は波長４５０ｎｍにて測定した光学密度（ＯＤ）の対数である。図３に示されるように、本発明のＥＬＩＳＡシステムは、約２．５〜１７０ｐｍｏｌ／分／ｍｌの範囲にわたりＤＰＤ活性の測定を可能とする。ＤＰＤ  ＥＬＩＳＡアッセイのこの高い感度は、人体由来の生物学的試料のＤＰＤ濃度の決定に有用であろう。更に上記のＤＰＤ  ＥＬＩＳＡは、かなり低いＤＰＤ濃度を示すことが知られている欠損症由来の試料のＤＰＤ濃度の決定を可能とするであろう。
【００９３】
【表１】
2008120824.tif 000003
*  活性、167.5pmol/mg/分を有する HT-3 標準を使用した
** ブランク水準から差し引いたＯＤ
【００９４】
例４
ＥＬＩＳＡ及びＤＰＤ活性の結果間の比較
例３に記述される本ＥＬＩＳＡにより測定された濃度と、ＤＰＤの酵素活性水準との間の相関を調べた。試料は、乳癌組織及び外科的摘出である隣接する正常組織であった。試料は、組織ホモジネートの形態で調製された。略述すれば、腫瘍及び正常組織は、最初に15 mM のNaCl 、 1.5 mM のMgCl2 及び 50 mMのリン酸カリウムを含む１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．４）にホモジネート化し、次いで105000 x gにて９０分間遠心分離した。上澄みを、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．４）及び１ｍＭの２−メルカプトエタノールに対して一夜透析した。
【００９５】
ＤＰＤ活性は、上述したように[6-14C]5-FU から形成される５−ＦＵ異化物、即ちジヒドロフルオロウラシル、α−フルオロ−β−ウレイドプロピオネート及びα−フルオロ−β−アラニンの合計が測定される、Fernandez-Salguero et al., 1995, Biochem.Pharm. 50, 1015-1020に記述される方法に近い、ＴＬＣ法によって測定された。ＥＬＩＳＡは、Ｓｃａｂｅｒ異種移植片ホモジネート（１０5 ｐｍｏｌ／分／ｍｇ）を標準として使用し、例３に記述されるのと同様な様式で行われた。
【００９６】
各試料は、上記ＴＬＣプレート法及びＥＬＩＳＡの両者によりアッセイされ、各試料のデータは、図４に示されるようにＥＬＩＳＡにより測定されたｐｍｏｌ／分／ｍｇにおけるＤＰＤ量をグラフの縦軸に、またＴＬＣ法により測定されたＤＰＤ活性を横軸にプロットした。活性アッセイと、本発明のＥＬＩＳＡの結果間の高い相関性が、腫瘍組織及び正常組織の両者について確認された。
【００９７】
例５
フルツロン等の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）誘導体系の抗腫瘍薬の有効性測定に対する本発明のＥＬＩＳＡの適用
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）誘導体系の抗腫瘍薬の一代表例、即ちフルツロン（５’−デオキシ−５−フルオロウリジン(5'-dFUrd)）は、ヒト細胞においてピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ(PyNPase) 、即ちチミジンホスホリラーゼの作用により５−ＦＵに変換されるプロドラッグである。
【００９８】
腫瘍細胞内のPyNPase/DPD 比を評価するための便利なアッセイシステムを考案した。該システムは、Nishida M. et al., 1996, Biol.Pharm. Bull. 19(11), 1407-1411 により記述されるPyNPase のアッセイのためのＥＬＩＳＡ、及び上記例３に記述される本発明のＥＬＩＳＡの組み合わせ含む。
【００９９】
PyNPase/DPD 比が、フルツロンの有効性の指標であることを調べるために、この比を、フルツロンに対して感受性であることが既に知られている多くの腫瘍組織、及びフルツロンに対して拒絶性であることが知られている多くの腫瘍組織について測定した。フルツロン−感受性組織の代表としての細胞系は、以下の９種のヒト腫瘍異種移植片細胞系である：Scaber (鱗状癌, ATCC HTB-3),ZR-75 (乳癌), MCF-7 (乳腺癌, ATCC HTB-22), LoVo (直腸癌, ATCC CCL-229), KN45 ( 胃癌), SIHA ( 鱗状癌), ME-180( 表皮癌), HCT116( 直腸癌) 及び COLO205 (直腸癌, ATCC CCL 222) 。フルツロン拒絶性組織の代表として使用した細胞系は以下の７種のヒト腫瘍異種移植片細胞系である：SK-OV-3 ( 卵巣腫瘍, ATCC HTB-77), MAD-MB-231 (乳癌),HT-29 (直腸癌, ATCC HTB-38),T-24 (膀胱癌, ATCC HTB-4),PC-3 ( 前立腺癌),WiDr-1 ( 直腸癌, ATCC CCL-218) 及び MKN28 (胃癌) 。
【０１００】
本発明のＥＬＩＳＡに基づいて測定された比を、図５のグラフにプロットした。図に示されるように、フルツロン−感受性細胞系は、拒絶性細胞系よりも実質的に高いPyNPase/DPD 比を示した。この結果は、腫瘍組織におけるPyNPase/DPD比が、腫瘍を患う患者の治療におけるフルツロンの有効性の尺度を与えるために有用であることを示す。
【０１０１】
例６
本発明によるモノクローナル抗体を使用する免疫沈降アッセイ
腫瘍細胞系ＨＴ−３の異種移植片ホモジネートを、ＤＰＤを含有する生物学的試料として使用した。該異種移植片ホモジネート(8.6 mg/ml) を、蛋白質Ｇセファロース４Ｂカラムに２回通して処理し、宿主に由来する抗体を吸着させ、下記の免疫沈降アッセイに付した。
【０１０２】
１５０μｌのＨＴ−３異種移植片ホモジネートを入れた試験管に、５μｌの試験されるべき本発明のモノクローナル抗体を加え、試験管を４℃にて２時間インキュベートした。次いで各２０μｌの５０％蛋白質Ｇ−セファロース４Ｂ(Sigma, ST. Louis,MO, USA) を試験管に加え、混合物を更に４℃にて２時間インキュベートした。反応後、混合物を遠心分離してビーズ分画と上澄みとに分離した。集めたビーズ分画を２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて７回洗浄し、６０μｌの０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ３．０）中に溶出し；溶出液を３μｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にて中和して免疫沈降調製物を得た。
【０１０３】
上澄み試料、及び以下ビーズ溶出物と称するビーズ分画からの溶出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより分析した。
図６は、本発明のモノクローナル抗体Mab-2B6-11-1、Mab-2E2-B3-1-3、Mab-4B9-12-1及びMab-9C7-30-1を使用した免疫沈降の結果を例示する。
【０１０４】
図６の（ａ）及び（ｂ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動パターンを示し、ここにおいて（ａ）は上澄みについて示し、（ｂ）は免疫沈降のビーズ溶出物を示し、またバンドは銀染色(2D-銀染色第一、第一化学、東京、日本) により可視化した。
【０１０５】
図７の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示し、ここにおいて（ａ）は抗ＤＰＤ−１ポリペプチド抗体を使用して検出される上澄みからの結果であり、（ｂ）は抗ＤＰＤ−１ポリペプチド抗体を使用することにより免疫沈降からのビーズ溶出物の結果であり、また（ｃ）は検出に本発明のモノクローナル抗体3A5-6-1 が使用される（ｂ）と同様のビーズ溶出物からの結果である。それぞれのレーンは、以下の試料を使用した免疫沈降アッセイの結果に対応する：レーン１：マウスIgG 1 ；レーン２： 2B6-11-1 ；レーン３： 2E2-B3-1-3 ；レーン４： 4B9-12-1 ；及びレーン５： 9C7-30-1 。図７の（ｂ）のレーンｃは、陽性対照としてのＨＴ−３ホモジネートの操作である。
【０１０６】
図６の（ｂ）に示されるように、免疫沈降は本発明のモノクローナル抗体、Mab-2E2-B3-1-3 (レーン3)及びMab-4B9-12-1 (レーン 4) の場合に約１２０ｋＤａに対応するバンドとして観察される。ＰＡＧＥゲル上で、50 kDa  及び 25 kDa辺りに見られるバンドは、使用された抗体の重鎖及び軽鎖に対応する。
【０１０７】
同時に、ウエスタンブロッティングを上澄み及びビーズ溶出物を使用して行った。ウサギ抗−ＤＰＤペプチド−１抗体またはMab-3A5-6-1 の何れかが、ＤＰＤ検出のために使用された。図６の（ａ）に示されるように、ＤＰＤに対応するバンドは上澄みの試料には観察されず（レーン３及び４参照）、一方で図７の（ｂ）及び（ｃ）に示されるように、１２０ｋＤａ辺りの単一バンドが、Mab-4B9-12-1  及び Mab-2E2-B3-1-3 を用いた免疫沈殿からの結果であるビーズから溶出される試料において、抗−ＤＰＤペプチド−１抗体またはMab-3A5-6-1 を使用して観察され、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥにて１２０ｋＤａ近傍に観察される単一バンドがＤＰＤに対応することを裏付けている。更に、Mab-4B9-12-1を用いた免疫沈降からのビーズ溶出物試料中、及び対応する上澄みのＤＰＤ活性をアッセイし、ＤＰＤ活性は下記表２に示されるようにビーズ溶出物中にのみＤＰＤ活性が観察された。
【０１０８】
【表２】
2008120824.tif 000004
【０１０９】
これらの結果は、本発明のモノクローナル抗体、即ちMab-4B9-12-1及び Mab-2E2-B3-1-3 が、天然の配位を持った活性なＤＰＤ分子を認識し、かつこれらの抗体のＤＰＤに対する特異性が、免疫沈降が単一バンドとして観察されるように極めて高いことを示している。
【０１１０】
更に、Mab-3A5-6-1が、Mab-4B9-12-1によっても特異的に認識されるＤＰＤ分子を特異的に認識することが確認され、このことは本発明のこれらの抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡシステムの信頼性を保証する。
【０１１１】
当業者が容易に理解するように、本発明のモノクローナル抗体は、ＤＰＤの精製のためのアフィニティカラムの調製にも有用である。
【０１１２】
配列表
一般情報
出願人：エフ．ホフマンーラ  ロッシュ  アーゲー
発明の名称：ジヒドロピリミジン  デヒドロゲナーゼを検出するための免疫学的材料および方法
配列の数  ７
配列番号：１
配列の長さ：３９５１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
起  源
生物名：ホモサピエンス（Homosapiens ）
特性キー：ＣＤＳ
位置：１．．３９５１
配列決定方法：Ｅ
配列
GCTGTCACTT GGCTCTCTGG CTGGAGCTTG AGGACGCAAG GAGGGTTTGT CACTGGCAGA  060
CTCGAGACTG TAGGCACTGC CATGGCCCCT GTGCTCAGTA AGGACTCGGC GGACATCGAG  120
AGTATCCTGG CTTTAAATCC TCGAACACAA ACTCATGCAA CTCTGTGTTC CACTTCGGCC  180
AAGAAATTAG ACAAGAAACA TTGGAAAAGA AATCCTGATA AGAACTGCTT TAATTGTGAG  240
AAGCTGGAGA ATAATTTTGA TGACATCAAG CACACGACTC TTGGTGAGCG AGGAGCTCTC  300
CGAGAAGCAA TGAGATGCCT GAAATGTGCA GATGCCCCGT GTCAGAAGAG CTGTCCAACT  360
AATCTTGATA TTAAATCATT CATCACAAGT ATTGCAAACA AGAACTATTA TGGAGCTGCT  420
AAGATGATAT TTTCTGACAA CCCACTTGGT CTGACTTGTG GAATGGTATG TCCAACCTCT  480
GATCTATGTG TAGGTGGATG CAATTTATAT GCCACTGAAG AGGGACCCAT TAATATTGGT  540
GGATTGCAGC AATTTGCTAC TGAGGTATTC AAAGCAATGA GTATCCCACA GATCAGAAAT  600
CCTTCGCTGC CTCCCCCAGA AAAAATGTCT GAAGCCTATT CTGCAAAGAT TGCTCTTTTT  660
GGTGCTGGGC CTGCAAGTAT AAGTTGTGCT TCCTTTTTGG CTCGATTGGG GTACTCTGAC  720
ATCACTATAT TTGAAAAACA AGAATATGTT GGTGGTTTAA GTACTTCTGA AATTCCTCAG  780
TTCCGGCTGC CGTATGATGT AGTGAATTTT GAGATTGAGC TAATGAAGGA CCTTGGTGTA  840
AAGATAATTT GCGGTAAAAG CCTTTCAGTG AATGAAATGA CTCTTAGCAC TTTGAAAGAA  900
AAAGGCTACA AAGCTGCTTT CATTGGAATA GGTTTGCCAG AACCCAATAA AGATGCCATC  960
TTCCAAGGCC TGACGCAGGA CCAGGGGTTT TATACATCCA AAGACTTTTT GCCACTTGTA  1020
GCCAAAGGCA GTAAAGCAGG AATGTGCGCC TGTCACTCTC CATTGCCATC GATACGGGGA  1080
GTCGTGATTG TACTTGGAGC TGGAGACACT GCCTTCGACT GTGCAACATC TGCTCTACGT  1140
TGTGGAGCTC GCCGAGTGTT CATCGTCTTC AGAAAAGGCT TTGTTAATAT AAGAGCTGTC  1200
CCTGAGGAGA TGGAGCTTGC TAAGGAAGAA AAGTGTGAAT TTCTGCCATT CCTGTCCCCA  1260
CGGAAGGTTA TAGTAAAAGG TGGGAGAATT GTTGCTATGC AGTTTGTTCG GACAGAGCAA  1320
GATGAAACTG GAAAATGGAA TGAAGATGAA GATCAGATGG TCCATCTGAA AGCCGATGTG  1380
GTCATCAGTG CCTTTGGTTC AGTTCTGAGT GATCCTAAAG TAAAAGAAGC CTTGAGCCCT  1440
ATAAAATTTA ACAGATGGGG TCTCCCAGAA GTAGATCCAG AAACTATGCA AACTAGTGAA  1500
GCATGGGTAT TTGCAGGTGG TGATGTCGTT GGTTTGGCTA ACACTACAGT GGAATCGGTG  1560
AATGATGGAA AGCAAGCTTC TTGGTACATT CACAAATACG TACAGTCACA ATATGGAGCT  1620
TCCGTTTCTG CCAAGCCTGA ACTACCCCTC TTTTACACTC CTATTGATCT GGTGGACATT  1680
AGTGTAGAAA TGGCCGGATT GAAGTTTATA AATCCTTTTG GTCTTGCTAG CGCAACTCCA  1740
GCCACCAGCA CATCAATGAT TCGAAGAGCT TTTGAAGCTG GATGGGGTTT TGCCCTCACC  1800
AAAACTTTCT CTCTTGATAA GGACATTGTG ACAAATGTTT CCCCCAGAAT CATCCGGGGA  1860
ACCACCTCTG GCCCCATGTA TGGCCCTGGA CAAAGCTCCT TTCTGAATAT TGAGCTCATC  1920
AGTGAGAAAA CGGCTGCATA TTGGTGTCAA AGTGTCACTG AACTAAAGGC TGACTTCCCA  1980
GACAACATTG TGATTGCTAG CATTATGTGC AGTTACAATA AAAATGACTG GACGGAACTT  2040
GCCAAGAAGT CTGAGGATTC TGGAGCAGAT GCCCTGGAGT TAAATTTATC ATGTCCACAT  2100
GGCATGGGAG AAAGAGGAAT GGGCCTGGCC TGTGGGCAGG ATCCAGAGCT GGTGCGGAAC  2160
ATCTGCCGCT GGGTTAGGCA AGCTGTTCAG ATTCCTTTTT TTGCCAAGCT GACCCCAAAT  2220
GTCACTGATA TTGTGAGCAT CGCAAGAGCT GCAAAGGAAG GTGGTGCCAA TGGCGTTACA  2280
GCCACCAACA CTGTCTCAGG TCTGATGGGA TTAAAATCTG ATGGCACACC TTGGCCAGCA  2340
GTGGGGATTG CAAAGCGAAC TACATATGGA GGAGTGTCTG GGACAGCAAT CAGACCTATT  2400
GCTTTGAGAG CTGTGACCTC CATTGCTCGT GCTCTGCCTG GATTTCCCAT TTTGGCTACT  2460
GGTGGAATTG ACTCTGCTGA AAGTGGTCTT CAGTTTCTCC ATAGTGGTGC TTCCGTCCTC  2520
CAGGTATGCA GTGCCATTCA GAATCAGGAT TTCACTGTGA TCGAAGACTA CTGCACTGGC  2580
CTCAAAGCCC TGCTTTATCT GAAAAGCATT GAAGAACTAC AAGACTGGGA TGGACAGAGT  2640
CCAGCTACTG TGAGTCACCA GAAAGGGAAA CCAGTTCCAC GTATAGCTGA ACTCATGGAC  2700
AAGAAACTGC CAAGTTTTGG ACCTTATCTG GAACAGCGCA AGAAAATCAT AGCAGAAAAC  2760
AAGATTAGAC TGAAAGAACA AAATGTAGCT TTTTCACCAC TTAAGAGAAG CTGTTTTATC  2820
CCCAAAAGGC CTATTCCTAC CATCAAGGAT GTAATAGGAA AAGCACTGCA GTACCTTGGA  2880
ACATTTGGTG AATTGAGCAA CGTAGAGCAA GTTGTGGCTA TGATTGATGA AGAAATGTGT  2940
ATCAACTGTG GTAAATGCTA CATGACCTGT AATGATTCTG GCTACCAGGC TATACAGTTT  3000
GATCCAGAAA CCCACCTGCC CACCATAACC GACACTTGTA CAGGCTGTAC TCTGTGTCTC  3060
AGTGTTTGCC CTATTGTCGA CTGCATCAAA ATGGTTTCCA GGACAACACC TTATGAACCA  3120
AAGAGAGGCG TACCCTTATC TGTGAATCCG GTGTGTTAAG GTGATTTGTG AAACAGTTGC  3180
TGTGAACTTT CATGTCACCT ACATATGCTG ATCTCTTAAA ATCATGATCC TTGTGTTCAG  3240
CTCTTTCCAA ATTAAAACAA ATATACATTT TCTAAATAAA AATATGTAAT TTCAAAATAC  3300
ATTTGTAAGT GTAAAAAATG TCTCATGTCA ATGACCATTC AATTAGTGGC ATAAAATAGA  3360
ATAATTCTTT TCTGAGGATA GTAGTTAAAT AACTGTGTGG CAGTTAATTG GATGTTCACT  3420
GCCAGTTGTC TTATGTGAAA AATTAACTTT TTGTGTGGCA ATTAGTGTGA CAGTTTCCAA  3480
ATTGCCCTAT GCTGTGCTCC ATATTTGATT TCTAATTGTA AGTGAAATTA AGCATTTTGA  3540
AACAAAGTAC TCTTTAACAT ACAAGAAAAT GTATCCAAGG AAACATTTTA TCAATAAAAA  3600
TTACCTTTAA TTTTAATGCT GTTTCTAAGA AAATGTAGTT AGCTCCATAA AGTACAAATG  3660
AAGAAAGTCA AAAATTATTT GCTATGGCAG GATAAGAAAG CCTAAAATTG AGTTTGTGGA  3720
CTTTATTAAG TAAAATCCCC TTCGCTGAAA TTGCTTATTT TTGGTGTTGG ATAGAGGATA  3780
GGGAGAATAT TTACTAACTA AATACCATTC ACTACTCATG CGTGAGATGG GTGTACAAAC  3840
TCATCCTCTT TTAATGGCAT TTCTCTTTAA ACTATGTTCC TAACCAAATG AGATGATAGG  3900
ATAGATCCTG GTTACCACTC TTTTACTGTG CACATATGGG CCCCGGAATT C           3951
配列番号：２
配列の長さ：１０２５残基
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
分子の型：蛋白質
起  源
生物名：ホモサピエンス（Homosapiens ）
位置：１．．１０２５
配列決定方法：Ｅ
配列
Met Ala Pro Val Leu Ser Lys Asp Ser Ala Asp Ile Glu Ser Ile Leu
1               5                  10                  15
Ala Leu Asn Pro Arg Thr Gln Thr His Ala Thr Leu Cys Ser Thr Ser
20                  25                  30
Ala Lys Lys Leu Asp Lys Lys His Trp Lys Arg Asn Pro Asp Lys Asn
35                  40                  45
Cys Phe Asn Cys Glu Lys Leu Glu Asn Asn Phe Asp Asp Ile Lys His
50                  55                  60
Thr Thr Leu Gly Glu Arg Gly Ala Leu Arg Glu Ala Met Arg Cys Leu
65                  70                  75                  80
Lys Cys Ala Asp Ala Pro Cys Gln Lys Ser Cys Pro Thr Asn Leu Asp
85                  90                  95
Ile Lys Ser Phe Ile Thr Ser Ile Ala Asn Lys Asn Tyr Tyr Gly Ala
100                 105                 110
Ala LysMet Ile Phe Ser Asp Asn Pro Leu Gly Leu Thr Cys Gly Met
115                 120                 125
Val Cys Pro Thr Ser Asp Leu Cys Val Gly Gly Cys Asn Leu Tyr Ala
130                 135                 140
Thr Glu Glu Gly Pro Ile Asn Ile Gly Gly Leu Gln Gln Phe Ala Thr
145                 150                 155                 160
Glu Val Phe Lys Ala Met Ser Ile Pro Gln Ile Arg Asn Pro Ser Leu
165                 170                 175
Pro Pro Pro Glu Lys Met Ser Glu Ala Tyr Ser Ala Lys Ile Ala Leu
180                 185                 190
Phe Gly Ala Gly Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ala Ser Phe Leu Ala Arg
195                 200                 205
Leu Gly Tyr Ser Asp Ile Thr Ile Phe Glu Lys Gln Glu Tyr Val Gly
210                 215                 220
Gly Leu Ser Thr Ser Glu Ile Pro Gln Phe Arg Leu Pro Tyr Asp Val
225                 230                 235                 240
Val Asn Phe Glu Ile Glu Leu Met Lys Asp Leu Gly Val Lys Ile Ile
245                 250                 255
Cys Gly Lys Ser Leu Ser Val Asn Glu Met Thr Leu Ser Thr Leu Lys
260                 265                 270
Glu Lys Gly Tyr Lys Ala Ala Phe Ile Gly Ile Gly Leu Pro Glu Pro
275                 280                 285
Asn Lys Asp Ala Ile Phe Gln Gly Leu Thr Gln Asp Gln Gly Phe Tyr
290                 295                 300
Thr Ser Lys Asp Phe Leu Pro Leu Val Ala Lys Gly Ser Lys Ala Gly
305                 310                 315                 320
Met Cys Ala Cys His Ser Pro Leu Pro Ser Ile Arg Gly Val Val Ile
325                 330                 335
Val Leu Gly Ala Gly Asp Thr Ala Phe Asp Cys Ala Thr Ser Ala Leu
340                 345                 350
Arg Cys Gly Ala Arg Arg Val Phe Ile Val Phe Arg Lys Gly Phe Val
355                 360                 365
Asn Ile Arg Ala Val Pro Glu Glu Met Glu Leu Ala Lys Glu Glu Lys
370                 375                 380
Cys Glu Phe Leu Pro Phe Leu Ser Pro Arg Lys Val Ile Val Lys Gly
385                 390                 395                 400
Gly Arg Ile Val Ala Met Gln Phe Val Arg Thr Glu Gln Asp Glu Thr
405                 410                 415
Gly Lys Trp Asn Glu Asp Glu Asp Gln Met Val His Leu Lys Ala Asp
420                 425                 430
Val Val Ile Ser Ala Phe Gly Ser Val Leu Ser Asp Pro Lys Val Lys
435                 440                 445
Glu Ala Leu Ser Pro Ile Lys Phe Asn Arg Trp Gly Leu Pro Glu Val
450                 455                 460
Asp Pro Glu Thr Met Gln Thr Ser Glu Ala Trp Val Phe Ala Gly Gly
465                 470                 475                 480
Asp Val Val Gly Leu Ala Asn Thr Thr Val Glu Ser Val Asn Asp Gly
485                 490                 495
Lys Gln Ala Ser Trp Tyr Ile His Lys Tyr Val Gln Ser Gln Tyr Gly
500                 505                 510
Ala Ser Val Ser Ala Lys Pro Glu Leu Pro Leu Phe Tyr Thr Pro Ile
515                 520                 525
Asp Leu Val Asp Ile Ser Val Glu Met Ala Gly Leu Lys Phe Ile Asn
530                 535                 540
Pro Phe Gly Leu Ala Ser Ala Thr Pro Ala Thr Ser Thr Ser Met Ile
545                 550                 555                 560
Arg Arg Ala Phe Glu Ala Gly Trp Gly Phe Ala Leu Thr Lys Thr Phe
565                 570                 575
Ser Leu Asp Lys Asp Ile Val Thr Asn Val Ser Pro Arg Ile Ile Arg
580                 585                 590
Gly Thr Thr Ser Gly Pro Met Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Ser Phe Leu
595                 600                 605
Asn Ile Glu Leu Ile Ser Glu Lys Thr Ala Ala Tyr Trp Cys Gln Ser
610                 615                 620
Val Thr Glu Leu Lys Ala Asp Phe Pro Asp Asn Ile Val Ile Ala Ser
625                 630                 635                 640
Ile Met Cys Ser Tyr Asn Lys Asn Asp Trp Thr Glu Leu Ala Lys Lys
645                 650                 655
Ser Glu Asp Ser Gly Ala Asp Ala Leu Glu Leu Asn Leu Ser Cys Pro
660                 665                 670
His Gly Met Gly Glu Arg Gly Met Gly Leu Ala Cys Gly Gln Asp Pro
675                 680                 685
Glu Leu Val Arg Asn Ile Cys Arg Trp Val Arg Gln Ala Val Gln Ile
690                 695                 700
Pro Phe Phe Ala Lys Leu Thr Pro Asn Val Thr Asp Ile Val Ser Ile
705                 710                 715                 720
Ala ArgAla AlaLys Glu Gly Gly Ala Asn Gly Val Thr Ala Thr Asn
725                 730                 735
Thr Val Ser Gly Leu Met Gly Leu Lys Ser Asp Gly Thr Pro Trp Pro
740                 745                 750
Ala Val Gly Ile Ala Lys Arg Thr Thr Tyr Gly Gly Val Ser Gly Thr
755                 760                 765
Ala Ile Arg Pro Ile Ala Leu Arg Ala Val Thr Ser Ile Ala Arg Ala
770                 775                 780
Leu Pro Gly Phe Pro Ile Leu Ala Thr Gly Gly Ile Asp Ser Ala Glu
785                 790                 795                 800
Ser Gly Leu Gln Phe Leu His Ser Gly Ala Ser Val Leu Gln Val Cys
805                 810                 815
Ser Ala Ile Gln Asn Gln Asp Phe Thr Val Ile Glu Asp Tyr Cys Thr
820                 825                 830
Gly Leu Lys Ala Leu Leu Tyr Leu Lys Ser Ile Glu Glu Leu Gln Asp
835                 840                 845
Trp Asp Gly Gln Ser Pro Ala Thr Val Ser His Gln Lys Gly Lys Pro
850                 855                 860
Val Pro Arg Ile Ala Glu Leu Met Asp Lys Lys Leu Pro Ser Phe Gly
865                 870                 875                 880
Pro Tyr Leu Glu Gln Arg Lys Lys Ile Ile Ala Glu Asn Lys Ile Arg
885                 890                 895
Leu Lys Glu Gln Asn Val Ala Phe Ser Pro Leu Lys Arg Ser Cys Phe
900                 905                 910
Ile Pro Lys Arg Pro Ile Pro Thr Ile Lys Asp Val Ile Gly Lys Ala
915                 920                 925
Leu Gln Tyr Leu Gly Thr Phe Gly Glu Leu Ser Asn Val Glu Gln Val
930                 935                 940
Val Ala Met Ile Asp Glu Glu Met Cys Ile Asn Cys Gly Lys Cys Tyr
945                 950                 955                 960
Met Thr Cys Asn Asp Ser Gly Tyr Gln Ala Ile Gln Phe Asp Pro Glu
965                 970                 975
Thr His Leu Pro Thr Ile Thr Asp Thr Cys Thr Gly Cys Thr Leu Cys
980                 985                 990
Leu Ser Val Cys Pro Ile Val Asp Cys Ile Lys Met Val Ser Arg Thr
995                1000                1005
Thr Pro Tyr Glu Pro Lys Arg Gly Val Pro Leu Ser Val Asn Pro Val
1010                1015                1020
Cys
配列番号：３
配列の長さ：２５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
分子の型：ＤＮＡ
特性キー：ＣＤＳ
配列
CGCGAATTCT TTTGAAGCTG GATGG   25
配列番号：４
配列の長さ：２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
分子の型：ＤＮＡ
特性キー：ＣＤＳ
配列
CGCGAATTCT CACCTTAACA CACCGG   26
配列番号：５
配列の長さ：２５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
分子の型：ＤＮＡ
特性キー：ＣＤＳ
配列
AATCAAATAT GGAGCA   16
配列番号：６
配列の長さ：１８残基
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
分子の型：ペプチド
位置：５２．．６９
配列決定方法：Ｅ
配列
Cys Glu Lys Leu Glu Asn Asn Phe Gly Asp Ile Lys His Thr Thr Leu
52           55                 60                  65
Gly Glu
69
配列番号：７
配列の長さ：２０残基
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
分子の型：ペプチド
位置：６６０．．６７９
配列決定方法：Ｅ
配列
Ser Gly Ala Asp Ala Leu Glu Leu Asn Leu Ser Cys Pro His Gly Met
660                 665                 670                 675
Gly Glu Arg Gly
679
配列番号：８
配列の長さ：２７塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
分子の型：ＤＮＡ
特性キー：ＣＤＳ
配列
CGCGAATTCT CGAGACTGTAGGCACT   27
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、例１により産生される組換えＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質の抗−ＤＰＤペプチド２抗体を使用するウエスタンブロッティングによる抗原性の確認を示すゲルの写真図であって、レーン１は分子量マーカー、レーン２はＧＳＴ蛋白質自体、及びレーン３はＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質である。
【図２】図２は、ＤＰＤを含むヒト組織ホモジネートに対する本発明のモノクローナル抗体のウエスタンブロットパターンを示すゲルの写真図であって、レーン１は、分子量マーカー。レーン２は組換えＤＰＤ（ｒＤＰＤ）、レーン３はヒト腫瘍細胞系ＨＴ−３の異種移植片ホモジネート、レーン４，５及び６は、それぞれ異なるヒト肺ガンホモジネートである。
【図３】図３は、例３に記述される本発明によるＥＬＩＳＡによって得られた標準曲線を例示するグラフである。この図において、横軸はＨＴ−３活性の対数であり、縦軸は波長４５０ｎｍにおいて測定される光学密度の対数である。
【図４】図４は、共に正常組織及び乳癌組織において、ＤＰＤ活性アッセイ及び本発明のＥＬＩＳＡにより測定されたＤＰＤ濃度の間の相関を例示するグラフである。ＤＰＤ活性アッセイは、14C-放射標識を使用して慣用のＴＬＣ法により行われ、ここに使用されるＥＬＩＳＡは例３に記述されるものである。
【図５】図５は、例５に記述されるようにPyNPase/DPD 比の測定によるフルツロン（FURTULON）等の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）誘導体系抗腫瘍薬に対する感受性試験の結果を示すグラフである。PyNPase 濃度は、Nishida M. et al., 1996,Biol. Pharm. Bull.19(11), 1407-1411 により記述される方法を使用してアッセイされ、また、ここに使用されるＥＬＩＳＡは、例３に記述されるものである。
【図６】図６は、実施例６に記述される本発明によるモノクローナル抗体を使用する免疫沈殿アッセイの結果を例示する写真図である。図６（ａ）及び（ｂ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示すもので、（ａ）は上澄みについて、また（ｂ）は免疫沈殿のビーズ溶離物についてである。
【図７】図７は、実施例６に記述される本発明によるモノクローナル抗体を使用する免疫沈殿アッセイの結果を例示する写真図である。図７（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、ウエスタンブロットの結果を示すもので（ａ）は抗−ＤＰＤ−１ポリペプチド抗体を使用して検出した上澄みからの結果、（ｂ）は抗−ＤＰＤ−１ポリペプチド抗体を使用して検出した免疫沈降からの溶出の結果、及び（ｃ）は（ｂ）と同じ溶離液について本発明のモノクローナル抗体3A5-6-1 が検出に使用された結果を示す。
【図１】
2008120824.tif 000005
【図２】
2008120824.tif 000006
【図３】
2008120824.tif 000007
【図４】
2008120824.tif 000008
【図５】
2008120824.tif 000009
【図６】
2008120824.tif 000010
【図７】
2008120824.tif 000011