(57)【要約】【課題】全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の検査方法に関し、従来の抗Ｓｍ抗体及び／又は抗ｄｓＤＮＡ抗体を測定する検査法に比べて、より感度及び特異性の高い検査方法を提供することを課題とする。【解決手段】ＳＬＥの疾患マーカーである抗アルドラーゼＡ抗体を検査することによる。ＳＬＥの疾患マーカーである抗アルドラーゼＡ抗体に対するエピトープ部分が、アルドラーゼＡを構成するアミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端から第９４位〜第１８３位の領域に存在する。したがって、これらの領域から選択され、抗アルドラーゼＡ抗体に対する抗原性を有するポリペプチド、あるいはこれらの領域を含むポリペプチドを抗原ポリペプチドとして検査することによる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から第９４位〜第１８３位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号２）、あるいは配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加又は挿入されてなるアミノ酸配列の領域から選択され、少なくとも４個のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなることを特徴とする、抗アルドラーゼＡ抗体に対する抗原性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１種用いることを特徴とする抗アルドラーゼＡ抗体の測定方法。
【請求項３】
前記測定方法が、請求項１に記載のポリペプチドの少なくとも１種を抗原ペプチドとして固相に固定し、該固定した抗原ペプチドと検体中に存在する抗アルドラーゼＡ抗体との反応産物を検出することにより抗アルドラーゼＡ抗体の測定を行う、請求項２に記載の抗アルドラーゼＡ抗体の測定方法。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の抗アルドラーゼＡ抗体の測定方法を用いた全身性エリテマドーテス（ＳＬＥ）の検査方法。
【請求項５】
請求項１に記載のいずれか１種又は複数種のポリペプチドに対する抗体をＳＬＥの疾患マーカーとして検出するＳＬＥの検査方法。
【請求項６】
配列表の配列番号２、あるいは配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加又は挿入されてなるアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原ペプチドとして固相に固定し、該固定した抗原ペプチドと検体中に存在する抗アルドラーゼＡ抗体との反応産物を検出することによるＳＬＥ検査方法。
【請求項７】
全長アルドラーゼＡを抗原ペプチドとして固相に固定し、該固定した抗原ペプチドと検体中に存在する抗アルドラーゼＡ抗体との反応産物を検出することによるＳＬＥ検査方法。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項に記載のＳＬＥの検査方法に加え、さらに抗Ｓｍ抗体及び／又は抗ｄｓＤＮＡ抗体の測定を行うＳＬＥの検査方法。
【請求項９】
配列表の配列番号２、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加又は挿入されてなるアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１種含むＳＬＥ検査用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の新規マーカーとして、初めて抗アルドラーゼＡ抗体及び該抗アルドラーゼＡ抗体に対するエピトープ部分を確認したことによる、抗アルドラーゼＡ抗体の測定方法及びＳＬＥの検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus;以下「ＳＬＥ」という。）は、膠原病の一種である。
膠原病は、結合組織と血管の炎症を主とし、自己抗体の出現を伴う原因不明の自己免疫性・難治性疾患である。膠原病には、慢性関節リウマチ（以下「ＲＡ」ともいう。）、ＳＬＥ、全身性硬化症(強皮症)(ＳＳｃ)、多発性筋炎（ＰＭ）／皮膚筋炎（ＤＭ）、リウマチ熱（ＲＦ）、結節性多発動脈炎（ＰＮ）に加え、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）やシェーグレン症候群（ＳｊＳ）、ベーチェット病などの多くの類縁疾患がある。膠原病が疑われる場合には、まず一般検査が行われ、確定診断のために抗核抗体などの血清学的検査が行われる。
【０００３】
ＳＬＥは、免疫調節における広範囲の異常によって出現すると考えられている全身性の自己免疫疾患である（Wakeland et al., Immunity 15, 97〜408(2001)；Marrack et al., Nat. Med. 7, 899〜905(2001)）。ＳＬＥ患者には、核内タンパク質、ＤＮＡ、リン脂質などに対する自己抗体が出現する。現在は、ＳＬＥの検査のために抗Ｓｍ抗体及び抗ｄｓＤＮＡ抗体を測定する方法が一般的に行われている。抗Ｓｍ抗体についての検査結果はＳＬＥに非常に特異性が高いものの、感度が５〜３０％であり、抗Ｓｍ抗体だけではＳＬＥの診断に有用とはいえない。また、抗ｄｓＤＮＡ抗体についての検査結果は疾患の活動性に相関するが、ＳＬＥに対する特異性が低い。
【０００４】
一方、膠原病の一種であるＲＡのマーカーとして抗アルドラーゼ抗体が使用可能なことが開示されている（特許文献１）。また、ヒトアルドラーゼＡのＮ末から３８番目までのアミノ酸からなるポリペプチドが、ＲＡにおける抗アルドラーゼ抗体に対する抗原ポリペプチドとして有用であることが開示されている（特許文献２）。しかしながら、ＲＡが膠原病の一種としてＳＬＥとは共通しているとしても、これらの疾病の臨床症状は異なり、各々の原因についても全く異なる疾患として捉えられている。
【０００５】
さらに、糖尿病性網膜症の診断マーカーとして抗アルドラーゼ自己抗体に着目した報告がある（非特許文献１）。また、アルツハイマーの患者からの抗アルドラーゼ抗体の標的抗原となるアルドラーゼの単離について報告がある（非特許文献２）。しかしながら、これらの疾患はＳＬＥとは全く相違する。
【０００６】
ＳＬＥについて、従来の疾患マーカーによる検査方法に比べ、より感度及び特異性の高い疾患マーカーの解明ならびに検査方法が、診断及び予後の推定のために望まれている。
【特許文献１】特開平１１−９４８３６号公報
【特許文献２】特開２０００−１７８２９９号公報
【非特許文献１】Bo-Young Ahn et al., Proteomics 2006, 6, 0000-0000(www.proteomics-journal.com)
【非特許文献２】Felix Mor et al., J. Immunology 2005, 3439-3445
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＳＬＥの検査方法に関し、従来の抗Ｓｍ抗体及び／又は抗ｄｓＤＮＡ抗体を測定する検査法に比べて、より感度及び特異性の高い検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、抗アルドラーゼＡ抗体がＳＬＥの疾患マーカーとなりうることを初めて確認した。更に検討を重ねた結果、ＳＬＥのマーカーである抗アルドラーゼＡ抗体に対するエピトープ部分が、アルドラーゼＡの特定の領域に存在することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から第９４位〜第１８３位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号２）、あるいは配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加又は挿入されてなるアミノ酸配列の領域から選択され、少なくとも４個のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなることを特徴とする、抗アルドラーゼＡ抗体に対する抗原性を有するポリペプチド。
２．前項１に記載のポリペプチドを少なくとも１種用いることを特徴とする抗アルドラーゼＡ抗体の測定方法。
３．前記測定方法が、前項１に記載のポリペプチドの少なくとも１種を抗原ペプチドとして固相に固定し、該固定した抗原ペプチドと検体中に存在する抗アルドラーゼＡ抗体との反応産物を検出することにより抗アルドラーゼＡ抗体の測定を行う、前項２に記載の抗アルドラーゼＡ抗体の測定方法。
４．前項２又は３に記載の抗アルドラーゼＡ抗体の測定方法を用いた全身性エリテマドーテス（ＳＬＥ）の検査方法。
５．前項１に記載のいずれか１種又は複数種のポリペプチドに対する抗体をＳＬＥの疾患マーカーとして検出するＳＬＥの検査方法。
６．配列表の配列番号２、あるいは配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加又は挿入されてなるアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原ペプチドとして固相に固定し、該固定した抗原ペプチドと検体中に存在する抗アルドラーゼＡ抗体との反応産物を検出することによるＳＬＥ検査方法。
７．全長アルドラーゼＡを抗原ペプチドとして固相に固定し、該固定した抗原ペプチドと検体中に存在する抗アルドラーゼＡ抗体との反応産物を検出することによるＳＬＥ検査方法。
８．前項４〜７のいずれか１項に記載のＳＬＥの検査方法に加え、さらに抗Ｓｍ抗体及び／又は抗ｄｓＤＮＡ抗体の測定を行うＳＬＥの検査方法。
９．配列表の配列番号２、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加又は挿入されてなるアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは前項１に記載のポリペプチドを少なくとも１種含むＳＬＥ検査用試薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の抗アルドラーゼＡ抗体の測定による検査を行うと、感度及び特異性の高いＳＬＥの検査を行うことができる。また、アルドラーゼＡポリペプチドはＥＬＩＳＡ法に適用することができるため、多くの検体を処理することができ、より早期にＳＬＥの検査を行うことができる。さらに、従来行われていた抗Ｓｍ抗体及び／又は抗ｄｓＤＮＡ抗体の検査も並行して組み合わせて行うことにより、より感度及び特異性の高いＳＬＥの検査方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列は、NCBI accession No. NP_000025により特定されるヒトアルドラーゼＡを構成するアミノ酸配列である。
【００１２】
本発明のポリペプチドは、本発明の抗アルドラーゼＡ抗体に対して抗原性を有するポリペプチドをいう。本発明の抗アルドラーゼＡ抗体は、ＳＬＥの疾患マーカーとなりうる抗体をいう。本発明のポリペプチドは、具体的には、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第９４位〜第１８３位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号２）から選択されるポリペプチドであり、抗アルドラーゼＡ抗体に対して抗原性を有するものをいう。抗体に対して抗原性を有するポリペプチドとしては、少なくとも４個のアミノ酸を含むことが必要とされる。したがって、本発明のポリペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸を含み、上記の領域から選択されるアミノ酸配列を有し、抗アルドラーゼＡ抗体に対して抗原性を示すポリペプチドであれば、ポリペプチドに含まれるアミノ酸の数は特に限定されない。
【００１３】
また、本発明のポリペプチドは、上記に限定されるものではなく、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加又は挿入されてなるアミノ酸配列の領域から選択され、抗アルドラーゼＡ抗体に対する抗原性を有するポリペプチドであってもよい。
【００１４】
さらに、本発明のポリペプチドは、本発明における抗アルドラーゼＡ抗体を検出しうるのであれば、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から第９４位〜第１８３位の領域に示されるアミノ酸配列（配列番号２）あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加又は挿入されてなるアミノ酸配列を含むアルドラーゼＡであってもよい。具体的には、全長アルドラーゼＡであってもよい。
【００１５】
本発明の抗アルドラーゼ抗体の測定方法において使用されるポリペプチドは、上記から選択される少なくとも１種のポリペプチドである。特異性及び測定感度を向上させるために、複数種のポリペプチドを組み合わせて使用してもよい。例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよいし、本発明のポリペプチドに適合する少なくとも４個のアミノ酸を含むポリペプチドであってもよい。また、これらから選択される複数種のポリペプチドが混在したものであってもよい。
【００１６】
ＳＬＥなどの自己免疫疾患の患者が産生しうる自己抗体は、ポリクローナル抗体であるため、上記本発明の抗アルドラーセ抗体の測定方法に用いられる抗原ペプチドは、それ自体が複数個所にエピトープを有するものであってもよいし、複数種の抗原ペプチドを含むものであってもよい。
【００１７】
本発明の抗アルドラーセ抗体の測定方法又はＳＬＥの検査方法において、検体として、血清、血漿などの体液を使用することができる。
【００１８】
本発明の抗アルドラーセ抗体の測定方法は、該アルドラーゼ抗体と本発明のポリペプチドの抗原抗体反応を検出しうる免疫学的手法による。そのような免疫学的手法としては、ラテックス凝集法、オクタロニー法、免疫クロマトグラフィー法やＥＬＩＳＡ法などの自体公知の手法を適用することができる。多くの検体を処理しうるＥＬＩＳＡ法が、特に好適である。具体的には、本発明のポリペプチドを抗原ペプチドとして固相に固定し、該固相に固定した抗原ペプチドに検体を接触させ、抗原ペプチドと検体中に含有可能性のある抗アルドラーゼ抗体との免疫複合体、又は反応産物を検出することで、抗アルドラーゼ抗体を測定することができる。ＥＬＩＳＡ法の実施に伴う非特異反応の抑制方法や、検出の際に使用しうる標識物質、測定機器などは、自体公知のもの、又は今後開発されるものを適用することができる。
【００１９】
本発明は、本発明のポリペプチドを少なくとも１種用いることによる抗アルドラーゼ抗体の測定方法及び該抗アルドラーゼ抗体の測定方法を用いたＳＬＥの検査方法にも及ぶ。さらには、本発明のポリペプチドを少なくとも１種含むＳＬＥ検査用試薬にも及ぶ。また、前記検査用試薬を含み、その他ＥＬＩＳＡ法などに使用するマイクロプレート、標識物質など適宜必要な器具及び／又は試薬を含むＳＬＥ検査用キットについても本発明に含まれる。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明の理解を深めるために、本発明のポリペプチドの発明に至る経緯を実施例により説明し、本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではないことはいうまでもない。
【００２１】
（実施例１）ＳＬＥの患者血清中の新規自己抗原の同定
ＳＬＥにおいては症状の一つとして血管に炎症が起きることから、血管内皮細胞由来であるＨＵＶＥＣ（正常ヒト臍帯静脈内皮細胞）からタンパク質を抽出し、ＳＬＥの患者血清中の自己抗体が反応する新規自己抗原の同定を試みた。
【００２２】
まず、ＨＵＶＥＣからタンパク質を抽出し、該抽出したタンパク質を２Ｄ−ＰＡＧＥでゲル上にスポットとして展開した（図１参照）。
展開したタンパク質を、ＰＶＤＦ膜に転写して、患者血清を抽出したタンパク質と反応させ、ウェスタンブロット法により患者血清中に存在する抗体と展開した各タンパク質との抗原抗体反応パターンを調べた（図２参照）。健常ヒト血清でのウェスタンブロットパターン（図３参照）と比較し、患者血清中で特異的に見られる陽性スポットを自己抗原とした。また、抗アルドラーゼＡ抗体を含む試料でのウェスタンブロットパターンも調べた（図４参照）。
【００２３】
１）ＨＵＶＥＣからのタンパク質の抽出方法
ＨＵＶＥＣはCHAMBREX社から購入し、添付の培地を用いて培養した。増殖したＨＵＶＥＣをＰＢＳ（−）で洗浄後、細胞剥離器(cell scraper)ではがし、遠心分離により細胞を回収した。タンパク質抽出用キット（complete mammalian proteome extraction kit(Calbiochem社)）を用いてＨＵＶＥＣから２Ｄ−ＰＡＧＥ用にタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質は、タンパク質定量キット（RC-DC Protein Assay kit (Bio-Rad Laboratories社)）を用いてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をスタンダードとして定量した。
【００２４】
２）２Ｄ−ＰＡＧＥの手技
抽出したタンパク質５０μｇを７Ｍ 尿素(urea)、２Ｍ チオ尿素(thiourea)、４％ＣＨＡＰＳ(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesul fonate)緩衝液、 ２ｍＭ ＴＢＰ(tributyl phosphine)、０．０００２％ ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、電解質（０．２％ biolyte 3-10(Bio-Rad)）を含む膨潤溶液で溶かし、等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行った。
【００２５】
ＩＥＦの条件は以下の通りである。ＩＥＦには１１ｃｍのストリップ(ReadyStripTM IPG strips pH3-10NL)を用いた。タンパク質を含む膨潤溶液で１２時間、５０Ｖの電圧をかけてストリップゲルを膨潤させ、タンパク質をゲルに取り込ませた。膨潤後、２時間で２５０Ｖ 、その後１時間で８，０００Ｖまで上昇させ、４５，０００Ｖｈ通電した。ＩＥＦ後のストリップゲルを以下の手順で還元アルキル化した。
【００２６】
最初に２０ｍｇ／ｍｌ ＤＴＴを含む平衡化緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６Ｍ 尿素、２０％ｖ／ｖグリセロール、 ２％ＳＤＳ、ｐＨ８．８）で２０分間振とうし、その後、２５ｍｇ／ｍｌヨードアセトアミドを含む平衡化緩衝液で１３分間遮光して振とうした。続いて、２次元目の電気泳動は１０％ Bis-Tris CriterionTM XT Precast gel (Bio-Rad Laboratories社)を用いて泳動した。展開したタンパク質の染色にはＭＳ（Mass Spectrometry）銀染キット(和光純薬社)により染色した。
【００２７】
３）ウェスタンブロッティング
上記の手法により２Ｄ−ＰＡＧＥによりゲル上に展開したＨＵＶＥＣタンパク質をＰＶＤＦ膜に電気転写し、ＳＬＥ患者血清を用いて自己抗体が反応する新規自己抗原の探索を行った。血清の非特異的な反応を防ぐために、タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜を５％ スキムミルク／ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）により室温で１時間振とうしブロッキングした。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで１５０倍希釈したＳＬＥ患者血清を用いてＰＶＤＦ膜を室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで１０分間、３回ずつ洗浄した後、ＰＢＳＴで5,000倍希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ (GE healthcare社)を用いてＰＶＤＦ膜を室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで１０分間、３回ずつ洗浄した後、蛍光反応システム（chemiluminescence reaction system (PerkinElmer社)）により、自己抗体が反応する自己抗原を検出した。タンパク質は２Ｄ−ＰＡＧＥで展開しているため、自己抗原はスポットとして検出される。
【００２８】
患者血清に特異的なスポットに相当するタンパク質を染色したゲルから切り出し、トリプシンを用いたゲル内消化によりペプチドとして回収し、質量分析にて解析した。質量分析のデータを解析ソフトによりデータベースサーチすることでタンパク質を同定した。解析ソフトの例として、ＭＡＳＣＯＴ（Matrix science社）が挙げられる。このような手法を免疫プロテオミクス法という。
【００２９】
４）トリプシンを用いたゲル内消化方法、
ゲル内消化は、以下の論文に従って行った(Shevchenko A et al., Anal Chem 1996, 68, 850-8.)。トリプシン消化ペプチドは、５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、４５％蒸留水（ＤＷ）、５０％ＣＨ３ＣＮにより抽出し、凍結乾燥した。その後、０．１％ＴＦＡ，２％ＣＨ３ＣＮ，９８％ＤＷで溶解し、質量分析のサンプルとした。
【００３０】
５）質量分析法
質量分析は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と質量分析計（ＭＳ）を組み合わせたＬＣ／ＭＳ解析システムにより行った。ＬＣは、逆相ＨＰＬＣシステムにより、Magic 2002 capillary HPCL (Michrom BioResources社)を用い、カラムはC-18 RP column (length 15 cm, i.d. 200 mm; GL Sciences Inc社)を用いた。
【００３１】
ペプチドは以下の溶媒Ａ、溶媒Ｂを３０分で５〜６５％にグラジェントをかけることでカラムから溶出した（溶媒Ａ：０．１％ギ酸を含む ２：９８のアセトニトリル／蒸留水；溶媒Ｂ：０．１％ギ酸を含む９５：５のアセトニトリル／蒸留水）。ナノスプレーイオン源を介してイオン化したペプチドはＬＣＱイオントラップ型質量分析機(ThermoElectron 社)で解析した。データは、全ＭＳスキャンとそれに続いて最も強いピークをＭＳ／ＭＳスキャンにより得た。ＭＳ／ＭＳスペクトルはＭＡＳＣＯＴ検索プログラム(Matrix Science社)を用い、ヒトタンパク質スイスプロットデータベース(human protein Swiss-Prot database)に対してデータベースサーチをした。
【００３２】
上述の免疫プロテオミクス法により、ＨＵＶＥＣのタンパク質抽出液からＳＬＥの新規自己抗原として、アルドラーゼＡ（Aldlase A）を同定した。また、同手法によりＳＬＥの既知の自己抗原であるＳＳ−Ｂ／Ｌａ、ＧＡＰＤＨ(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)、ｈｎＲＮＰ Ａ２／Ｂ１(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1)、アネキシンＡ２(annexin A2)、 等の自己抗原も検出できた（図２参照）。このことより、免疫プロテオミクス手法が、自己抗原のスクリーニングとして有用であることが示された。
【００３３】
（実施例２）抗アルドラーゼ抗体のＳＬＥ疾患マーカーとしての有用性
アルドラーゼＡに対する抗アルドラーゼＡ抗体が、ＳＬＥの疾患マーカーとして有用か否かを確認するため、抗アルドラーゼＡ抗体の検出方法の確立を試みた。アルドラーゼＡについて、遺伝子をクローニングし、遺伝子組み換えタンパク質を大腸菌発現系により大量発現、精製した。アルドラーゼＡの組換タンパク質と患者血清でウェスタンブロット法により血清の反応性を再度確認した。
【００３４】
アルドラーゼＡの遺伝子は、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）のｃＤＮＡライブラリーに対し、アルドラーゼＡに特異的なプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を大腸菌発現ベクターであるpET28のNde1サイトにクローニングした。ＤＮＡシーケンス解析により遺伝子配列が正しいことを確認した。組み換えタンパク質は、精製を容易にするため、Ｎ末端に６×Ｈｉｓを融合したタンパク質として発現させた。pET28 Ald-AをBL21(DE3)codon plus RIL (Stratagene社)に形質転換し、組み換えアルドラーゼＡの大量発現を行った。形質転換した大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、濁度６００ｎｍが０．６に達してから０．４ｍＭのＩＰＴＧ（β-ガラクトシターゼ活性の誘導物質）を加え、２５℃、２時間で発現を誘導した。発現を誘導した大腸菌を遠心分離により回収し、ＰＢＳ＋１％トリトンＸ１００＋１％プロテアーゼ阻害剤(Protease inhibitor cocktail (ナカライテスク社))で懸濁し、超音波破砕により大腸菌を破砕した。大腸菌破砕液は高速遠心機により上清と沈殿に分離した。組み換えアルドラーゼＡは上清から精製した。まず、ＰＢＳ＋１ｍＭイミダゾールで平衡化させたＮｉセファロース樹脂(GE healthcare社)と遠心上清を４℃で１時間インキュベートさせた後、カラムに移し、ＰＢＳ＋３０ｍＭイミダゾールで洗浄し、ＰＢＳ＋２５０ｍＭイミダゾールで溶出した。溶出したタンパク質はＰＢＳで透析し、遠心上清を−８５℃で保存した。精製したタンパク質は、タンパク質定量キット(Bio-Rad Laboratories社)を用いて、ＢＳＡをスタンダードとして定量した。
【００３５】
（実施例３）抗アルドラーゼＡ抗体エピトープの確認
背景技術の欄で説明したように、特許文献１及び特許文献２において、ＲＡでは抗アルドラーゼＡ抗体がマーカーとなりうること、また該抗アルドラーゼＡ抗体の認識部位はアルドラーゼＡのＮ末端アミノ酸側（第１位〜第３８位）に存在することが報告されている。そこで、本発明におけるＳＬＥのマーカーとなりうる抗アルドラーゼＡ抗体に対するエピトープとなりうる領域について確認した。
【００３６】
正常なアルドラーゼＡ（全長アルドラーゼＡ）は、配列表の配列番号１に示す３６３個のアミノ酸より構成される。そこで、アルドラーゼＡについて第２７４位〜第３６３位のアミノ酸領域、第１８４位〜第３６３位のアミノ酸領域、第９４位〜第３６３位のアミノ酸領域の各Ｃ末端側のアミノ酸領域を欠損させた３種類の欠損変異体(deletion mutant)、アルドラーゼＡ C-del 1〜3を人工的に作製した（図５参照）。ＳＬＥ患者血清中の抗アルドラーゼＡ抗体に対するエピトープ領域を、全長アルドラーゼＡ及び３種類の欠損変異体を抗原としてウェスタンブロッティングにより確認した。
【００３７】
１）アルドラーゼＡ C-del 1〜3の３種類の欠損変異体の作製
アルドラーゼＡ C-del 1〜3の３種類の欠損変異体を作製するために、それぞれの領域に対してプライマーを作製し、pET28 Ald-Aを鋳型としてＰＣＲを行い、それぞれの欠損変異体を増幅した。これらの産物をpET28のNde1サイトにクローニングした。ＤＮＡシーケンス解析により遺伝子配列が正しいことを確認した。組み換えタンパク質は、精製を容易にするため、Ｎ末端に６×Ｈｉｓ融合したタンパク質として発現させた。それぞれの発現ベクターをpET28Ald-A C-del 1, pET28Ald-A C-del 2, pET28Ald-A C-del 3と名付けた。３種類の発現ベクターをそれぞれBL21(DE3)codon plus RIL (Stratagene社)に形質転換し、組み換えアルドラーゼＡ C-del 1〜3の大量発現を行った。形質転換した大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、濁度６００ｎｍが０．６に達してから０．４ｍＭ ＩＰＴＧ、２５℃、２時間発現を誘導した。発現を誘導した大腸菌を遠心分離により回収し、ＰＢＳ＋１％トリトンＸ１００＋１％プロテアーゼ阻害剤(ナカライテスク社)で懸濁し、超音波破砕により大腸菌を破砕した。大腸菌破砕液は高速遠心機により上清と沈殿に分離した。組み換えアルドラーゼＡ C-del 1〜3は沈殿（封入体(Inclusion body)）から精製した。封入体をＰＢＳ＋４％トリトンＸ１００で洗浄後、遠心分離した。次に、封入体を蒸留水で洗浄し、遠心分離した。ＰＢＳ＋８Ｍ尿素＋１０ｍＭ ＤＴＴで封入体からタンパク質を抽出し、ＰＢＳで１０倍にＤＴＴを希釈後、ＰＢＳ＋１ｍＭイミダゾールで平衡化させたＮｉセファロース樹脂(GE healthcare社)と室温で１時間インキュベートし、樹脂に組み換えタンパク質を吸着させた。タンパク質を吸着させた樹脂をカラムに移し、ＰＢＳ＋８Ｍ尿素＋３０ｍＭイミダゾールで洗浄し、ＰＢＳ＋８Ｍ尿素＋２５０ｍＭイミダゾールで溶出し−８５℃で保存した。溶出したタンパク質はタンパク質定量キット(Bio-Rad Laboratories社)を用いて、ＢＳＡをスタンダードとして定量した。
【００３８】
２）ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングには、全長アルドラーゼＡとアルドラーゼＡ C-del 1〜3を２００ｎｇずつ混合し、ゲル（10% Bis-Tris CriterionTM XT Precast gel (Bio-Rad Laboratories社)）を用いて電気泳動を行った。続いてＰＶＤＦ膜に電気転写し、５％スキムミルクで１時間ブロッキングし、１レーンずつ短冊状に切断し、ＰＢＳＴで1,000倍希釈した市販アルドラーゼＡ抗体(Santa Cruz社)、又はＰＢＳＴで１５０倍希釈した血清を用いて、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで１０分間、３回ずつ洗浄した後、ＰＢＳＴで5,000倍希釈したＨＲＰ標識抗ヤギ抗体(Santa Cruz社)又は、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ(GE healthcare社)を用いてＰＶＤＦ膜を室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで１０分間、３回ずつ洗浄した後、蛍光反応システム(PerkinElmer社)により、反応したタンパク質を検出した。
【００３９】
３）ウェスタンブロッティング結果
ＳＬＥ患者では全長アルドラーゼＡ、アルドラーゼＡ C-del 1及び C-del 2でバンドが認められたのに対し、アルドラーゼＡ C-del 3ではバンド反応が認められなかった。すなわち、ＳＬＥ患者に認められる抗アルドラーゼ抗体のエピトープとなりうる領域は、アルドラーゼＡを示す配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第９４位〜第１８３位の領域（配列番号２）に含まれることが考えられた（図６参照）。
【００４０】
一方、疾患コントロールとしてＲＡ患者についても同様の検討を行った。その結果、全長アルドラーゼＡ及びアルドラーゼＡ C-del 1〜3のすべてにおいてバンドが認められた。すなわち、ＲＡ患者に認められる抗アルドラーゼ抗体のエピトープとなりうる領域は、アルドラーゼＡを示す配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第１位〜第９３位の領域に含まれることが考えられた（図６参照）。このことより、ＳＬＥ患者に認められる抗アルドラーゼ抗体に対するエピトープは、ＲＡ患者に認められる抗アルドラーゼ抗体に対するエピトープとは異なることが確認された。
【００４１】
（実施例４）ＥＬＩＳＡ法による確認
ＥＬＩＳＡ法により４０名の患者血清を用いてアルドラーゼＡについての自己抗原陽性率を解析し、疾患マーカーとしての有効性を検証した。その結果、約３０％の患者において抗アルドラーゼＡ抗体が検出された（図７参照）。またＳＬＥ患者のうちでもより重症である腎障害のあるＳＬＥ患者の６４．７％において、抗アルドラーゼ抗体陽性を示すことが判明した（図８参照）。一方、健常人１９名の血清を用いて同様の解析を行った結果、抗アルドラーゼ抗体陽性率は０％であった（図７、８参照）。
【００４２】
さらに、疾患コントロール群として自己免疫疾患であるＲＡ患者４９名及び多発性筋炎（ＰＭ）患者１１名について同様の解析を行った。その結果、抗アルドラーゼ抗体陽性率は、それぞれ８．２％、１８．２％であった（図７、８参照）。
【００４３】
大腸菌発現系で大量発現、精製した全長アルドラーゼＡをＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレート(MaxiSorp Nunc社)に１００μｌずつ加え、シールし、４℃で一晩インキュベートし抗原をプレートに固相化した。次に、ＰＢＳでウェルを洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを１００μｌずつ加え、シールし室温で２時間振とうし、ブロッキングを行った。検体はＳＬＥ患者４０名、ＲＡ患者４９名、ＰＭ患者１１名及び健常人１９名を用いた。血清を抗原と反応させる際に、大腸菌タンパク質に対する血清中の抗体を吸収させるため、血清を、BL21(DE3)codon plus RIL のタンパク質（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳＴで血清を５００倍希釈し、室温で１時間振とうした。ブロッキング後のプレートをＰＢＳで洗浄し、希釈した血清を１００μｌずつ加え、シールして室温で１時間振とうし、インキュベートした。
【００４４】
続いて、ウェルを２００μｌのＰＢＳＴで５回洗浄し、ＰＢＳＴで5,000倍希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ(GE healthcare社)を１００μｌずつ加え、シールして室温で１時間振とうし、インキュベートした。ウェルを２００μｌのＰＢＳＴで５回洗浄した。ＴＭＢ＋（Dako社）を１００μｌずつウェルに加え、シールして室温で、振とうして発色させ、１００μｌの停止液（ＫＰＬ社）を加え、４５０ｎｍの吸収をマイクロプレートリーダー(Immuno-mini NJ-2300 microplate reader (Nalge Nunc International, Tokyo, Japan))で測定した。検体の吸光度／（健常人の吸光度の平均値＋３×健常人の標準偏差）×１００で計算し、グラフ化した。この式から１００結合単位(100 binding unit)をカットオフ値とした。
【００４５】
上記により、アルドラーゼＡに関し、ＳＬＥ患者とＲＡ患者では、異なる自己抗原を有することが示唆された。したがって、ＳＬＥ患者の場合は、ＲＡ患者とは異なるエピトープを認識する抗アルドラーゼＡ抗体であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
以上説明したように、抗アルドラーゼＡ抗体を測定してＳＬＥについて検査を行うと、従来の検査方法に比べて、より感度及び特異性の高い検査方法を行うことができる。また、アルドラーゼＡは、ＥＬＩＳＡ法に適用することができる。さらに、従来行われていた抗Ｓｍ抗体及び／又は抗ｄｓＤＮＡ抗体の検査を行うことにより、より感度及び特異性の高いＳＬＥの検査方法を提供することができる。その結果、多種類の検体を処理することができ、ＳＬＥの早期診断が可能となる。さらに、ＳＬＥの早期診断を可能とすることにより、ＳＬＥに対する適切な治療方法を早期に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】培養細胞（ＨＵＶＥＣ）のタンパク質抽出物についての２Ｄ−ＰＡＧＥ法によるタンパク質展開パターンを示す図である。（実施例１）
【図２】図１で展開したタンパク質に対して、ＳＬＥ患者血清を反応させたときのウェスタンブロッティング結果を示す図である。（実施例１）
【図３】図１で展開したタンパク質に対して、健常人の血清を反応させたときのウェスタンブロッティング結果を示す図である。（実施例１）
【図４】図１で展開したタンパク質に対して、抗アルドラーゼ抗体を含む試料を反応させたときのウェスタンブロッティング結果を示す図である。（実施例１）
【図５】アルドラーゼＡの部分欠失変異体を示す図である。（実施例３）
【図６】抗アルドラーゼＡ抗体のエピトープを確認するためのウェスタンブロッティング結果を示す図である。（実施例３）
【図７】アルドラーゼＡを抗原ペプチドとしたときのＥＬＩＳＡ結果を示す図である。（実施例４）
【図８】アルドラーゼＡを抗原ペプチドとしたときのＥＬＩＳＡ結果を示す図である。図７のＳＬＥ患者を腎障害の有無でグループ分けした。（実施例４）
【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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