(57)【要約】【課題】狭帯域なスペクトルが得られることで標的物質の検出感度が高感度となる検出素子、検出素子装置及び検出方法を提供する。【解決手段】本発明の検出素子８は、捕捉体５が固定化された金属層２を有する構造体７が支持体４上に形成されており、捕捉体５により検体液中の標的物質を捕捉する検出素子である。本発明の検出素子８は、金属層２の、支持体４に面する側とは反対側の面に上面誘電体層１が形成されており、金属層２の側面２ａに捕捉体５が固定化されていることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
捕捉体が固定化された金属層を有する構造体が支持体上に形成されており、前記捕捉体により検体液中の標的物質を捕捉する検出素子において、
前記金属層の、前記支持体に面する側とは反対側の面に上面誘電体層が形成されており、前記金属層の側面に前記捕捉体が固定化されていることを特徴とする検出素子。
【請求項２】
前記金属層の、前記支持体に面する側に下面誘電体層が形成されている、請求項１に記載の検出素子。
【請求項３】
前記上面誘電体層と前記下面誘電体層との屈折率が、全波長域に渡って、
ｎ検体液：前記検体液の屈折率ｎ上面誘導体：前記上面誘導体層の屈折率ｎ下面誘導体：前記下面誘導体層の屈折率の関係を満たす、請求項２に記載の検出素子。
【請求項４】
前記上面誘電体層と前記下面誘電体層との誘電率の波長依存性が略同一である、請求項２または３に記載の検出素子。
【請求項５】
前記上部誘電体層と前記支持体の誘電率の波長依存性が略同一である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の検出素子。
【請求項６】
検体液中の標的物質を検出する検出素子装置であって、
光源と、
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の検出素子と、
前記検出素子を透過した前記光源からの光を受光する受光手段とを有する検出素子装置。
【請求項７】
検体液中の標的物質を検出する検出方法であって、
請求項６に記載の検出素子装置を用意する工程と、
前記検出素子に前記検体液中の前記標的物質を接触させる工程と、
前記検出素子に前記標的物質が接触した際に生じる光学的な変化を検出する工程と、を含む検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属のプラズモン共鳴を利用し、検体中の標的物質を高感度に検出する検出素子、検出素子装置及び検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
＜標的物質検出素子＞
血液中には、ガン・肝炎・糖尿病・骨粗しょう症など特定の疾患に対するマーカーが複数存在している。罹患した際には、平時より特定のタンパク質の濃度が変化（増加もしくは減少）する。これらを平時からモニタしておくことで、重大な病気を早期に発見することが出来るため、次世代の医療技術として期待されている。また、腫瘍除去後の予後をモニタすることで、転移や再発を早期に発見することができると考えられており、医療の質向上にも大きな貢献をすると期待されている。
【０００３】
また、近年、食品衛生法が改正され、卵・落花生・そば・小麦・乳を表示することが事業者に義務付けられた。しかし、自分がどの食物に対して、どの程度アレルギー体質であるかということを定量的に知っている人は少ない。これらのデータを科学的に数値として知っておくことは、各人の健康増進や予防医療の観点から重要であり、本発明で開示する技術領域に大きな期待が寄せられている。
【０００４】
未加工で未精製のタンパク質を分析するための方法の１つは、生物学的なリガンド−アナライト相互作用を利用して特定の化合物を識別する検出素子を基本としたものである。
【０００５】
代表的な検出素子の方式として、蛍光免疫法、プラズモン共鳴法、光干渉法などがあげられる。いずれも一方の分子であるリガンドもしくは他方の分子であるアナライトを検出素子表面に固定し、検体中のリガンドもしくはアナライトを選択性よく選別して結合させる。これにより、夾雑物を排除し、目的とする標的物質のみを高効率に捕らえることが共通のステップとなる。
＜局在表面プラズモン共鳴(LSPR:Localized Surface Plasmon Resonance Sensor)>
プラズモン共鳴法を利用した検出素子では、金属プラズモンが界面物質の屈折率変化に高感度に反応することを利用して、金属薄膜や金属の微粒子の上にリガンドを固定し、そのリガンドと特異的に結合するアナライトの濃度を測定している。リガンドは化学的または物理的な手段を用いて検出素子表面に固定化される。当該技術を用いることで、リガンドアナライト間の反応の時間変化（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）についての情報を得ることも可能であり、標識不要という特徴とあわせてＬＳＰＲの利点であると考えられている。
【０００６】
特許文献１には、アミノ基で表面修飾されたガラス基板に金属微粒子を自己組織的に単分散させ固定化することで、局在表面プラズモン検出素子を作製し、その基礎特性について開示されている。また、吸光スペクトルの強度変化を検出することで、標的物質の濃度やｋｉｎｅｔｉｃｓを測定する手法について記述されている。
【０００７】
特許文献２では、検出素子出力信号の変化が微弱であるという課題と、また、その変化が認められるまでに長時間を要するという課題を解決するための検出素子が開示されている。すわなち、特許文献２は、一表面に複数の微細孔が形成され、微細孔内に金属微粒子が充填された基体を有し、金属微粒子の少なくとも一部が、一表面よりも基体の外側に露出している検出素子を開示している。
【０００８】
非特許文献１は、特許文献１と同様に金属微粒子を化学的に修飾されたガラス基板に固定化させたＬＳＰＲ検出素子を開示している。ここでは、ストレプトアビジンとビオチン反応を、吸光スペクトルの強度変化から観測できることを開示している。また、周囲の媒体を変化させたときの屈折率応答性は、７６．４ｎｍ／ｉｎｄｅｘと報告している。
【０００９】
また、非特許文献２にはナノスフィアリソグラフィ（ポリスチレンのナノビーズを用いたリソグラフィ手法）を用い、Ａｇのドットを並べてＬＳＰＲ検出素子を作製する技術が開示されている。周囲の媒体を変化させたときの屈折率応答性は、２００ｎｍ／ｉｎｄｅｘと報告されている。
【特許文献１】特許第３４５２８３７号明細書
【特許文献２】特開２００４−２４５６３９号公報
【非特許文献１】Anal. Chem. 2002, 74, 504-509, A Colorimetric Gold Nanoparticle Sensor To Interrogate Biomolecular Interactions in Real Time on a Surface
【非特許文献２】J. Phys. Chem.B 1999, 103, 9846-9853, Nanosphere Lithography：Effect of External Dielectric Medium on the Surface Plasmon Resonance Spectrum of a Periodic Array of Silver Nanoparticle
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記に開示されている技術では、プラズモン共鳴スペクトルの線幅が非常にブロードであり、標的物質の検出感度が低いという課題がある。
【００１１】
そこで、本発明は、狭帯域なスペクトルが得られることで標的物質の検出感度が高感度となる検出素子、検出素子装置及び検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明の検出素子は、捕捉体が固定化された金属層を有する構造体が支持体上に形成されており、捕捉体により検体液中の標的物質を捕捉する検出素子において、金属層の、支持体に面する側とは反対側の面に上面誘電体層が形成されており、金属層の側面に捕捉体が固定化されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の検出素子は金属層に上面誘電体層が形成されていることで金属層の側面にのみ捕捉体が固定化されることとなる。これにより、構造体と誘電体界面は略同一の共鳴条件となっている。そのため、入射光が照射された場合、界面で誘起されるプラズモンのモードが少なくなり、スペクトルの線幅（Ｑ値）を従来よりも狭帯域化することができ、検出素子の感度をより高めることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、図を参照しながら本発明に関して説明する。
＜標的物質検出素子＞
図１は、本発明の検出素子の概略を説明するための図であり、図１（ａ）は側面図であり、図１（ｂ）は平面図である。
【００１５】
検出素子８は、支持体４と、支持体４上に配置された検出素子として機能する構造体７とを有する。なお、本明細書における説明において、検出素子は標的物質検出素子と称する場合もある。金属ナノ構造体である構造体７は、上部誘電体層１と、金属層２と、下部誘電体層３とを有し、金属層２の側面２ａにのみ捕捉体５が固定化されている。下部誘電体層３は支持体４上に形成され、金属層２は下部誘電体層３上に形成されている。すわなち、下部誘電体層３は、金属層２の、支持体４に面する側に形成されている。上部誘電体層１は金属層２上に形成されている。すわなち、上部誘電体層１は、金属層２の、支持体４に面する側とは反対側の面に形成されている。
【００１６】
このように金属層２は上部誘電体層１及び下部誘電体層３に挟み込まれているので、金属層２の上面及び下面は露出しておらず、側面２ａのみが露出している。つまり、金属層２は側面２ａのみが露出しているため、捕捉体５はこの露出した側面２ａのみに固定化され、露出していない金属層２の上面及び下面には捕捉体５は固定化されていない。
【００１７】
金属層２の材料は、プラズモン共鳴の生じる金属であれば特に制限はない。ここでは、Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｐｔなど貴金属の中から適宜選択して用いることが好ましい。金属層２の厚みは、検体液や誘電体層の界面でプラズモンが生じ、検出素子として動作するような膜厚であれば、特に制限はない。ここでは、１０〜５００ｎｍの範囲内の膜厚であることが好ましい。
【００１８】
また、上部誘電体層１及び下部誘電体層３は、有機高分子材料、あるいは無機材料からなる。
【００１９】
有機高分子材料は、フッ素樹脂が利用でき、それらは、透明性や屈折率などの光学特性上の観点から非晶質構造をとるものを用いる。例えば、サイトップ（旭硝子（株）製）、テフロンＡＦ（デュポン社製）などのいずれか、もしくはそれらの混合物から構成される。
【００２０】
無機材料は、ＳｉＯ2，ＳｉＯｘ、フッソ化合物（ＣａＦ2，ＭｇＦ2，ＬｉＦなど）が挙げられ、これら材料から適宜選択して用いられる。
【００２１】
また、上部誘電体層１及び下部誘電体層３の各厚みは、同じであっても異なる厚みであっても特に問題はない。
【００２２】
また、上部誘電体層１と下部誘電体層３の屈折率の波長依存性が全波長域に渡って、次の関係式を満たすものであってもよい。
ｎ検体液：検体液の屈折率ｎ上面誘導体：上面誘導体層の屈折率ｎ下面誘導体：下面誘導体層の屈折率
ｎは物質の物理量であり屈折率である。ｎは波長依存性があり、使用する光によって値が異なる。本発明では、可視光〜赤外域（３５０〜１５００ｎｍ程度）で上記関係が満たされる必要がある。
【００２３】
なお、屈折率は以下のように複素数で表される。誘電体などの透明な物質の場合κはほぼ０としてよいので、屈折率は実部のみの値で表される。
ｎ＝ｎ＋ｉκ
本発明の場合、誘電率は、ε＝ｎ2で表される。
【００２４】
上面ならびに下面誘電体層の屈折率が上記のような関係を満たすことで、検体溶液の屈折率の如何に関わらず、Ｑ値の高いスペクトルを得ることが可能となる。
【００２５】
また、上面誘電体層１と下面誘電体層３との誘電率の波長依存性が略同一であってもよい。さらには、上部誘電体層１と支持体４の誘電率の波長依存性が略同一であってもよい。
【００２６】
上面誘電体層１と下面誘電体層３の屈折率が略同一となることで、さらにＱ値の高いスペクトルを得ることが出来、標的物質の検出感度を向上させることが可能となる。また、上部誘電体層１と支持体４の誘電率の波長依存性が略同一とすることで、基板表面での反射を減少させるということも可能である。
【００２７】
また、本発明の検出素子の構造体は、図１（ａ）に示す３層構造の他、図２に示すような２層の構造体１７としてもよい。すわなち、金属層２の、支持体４に面する側とは反対側の面に上面誘電体層１が形成されている構成としてもよい。この場合、図１（ａ）に示す構造体７の下部誘電体層３の役割は支持体４が担う。金属層２の上面は上部誘電体層１で被覆し、下面は支持体４によって被覆することで、金属層２の側面２ａのみが露出するようにしている。
【００２８】
図１及び図２には、本発明の検出素子の構造体の平面形状が正方形のものを例示したが、これに限定されるものではない。図３（ａ）の検出素子２８は、平面形状が長方形の構造体２７を有する。図３（ｂ）の検出素子３８は、平面形状が三角形の構造体３７を有する。図３（ｃ）の検出素子４８は、平面形状が円形の構造体４７を有する。なお、図３（ａ）〜図３（ｃ）の各構造体はいずれも３層構造のものを例示しているが、図２に示したような２層構造としてもよい。
【００２９】
また、捕捉体５については、図１〜図３では、入射光６の偏向方向に関係なく側面２ａに一様に固定化されたものを例示したが、本発明はこれに限定されるものではない。すわなち、図４に示すように、偏向方向（電場ベクトル）に垂直な側面に選択的に固定化してもよい。好ましくは、エバネッセント場が強くなる領域（図４においては、電場ベクトルと直交する側面）に選択的に固定化させた構成である。なお、図４（ａ）は構造体の形状が図３（ａ）に示した長方形のものについて示しており、図４（ｂ）は構造体の形状が図１に示した正方形のものについて示している。
【００３０】
また、支持体上の構造体の配置については、正方格子配置、三角格子配置、六方格子配置、回転対象配置、準周期型の配置など、どのような配置にしても特に制限はない。なお、構造体間のピッチは、５０〜２０００ｎｍの範囲にあることが好ましい。
＜標的物質検出素子の作製プロセス＞
標的物質検出素子の作製方法は、所望のパターンが形成できる方法であれば、どのような方法であっても特に問題はない。電子線（ＥＢ）リソグラフィによる手法であっても、ナノインプリント技術を用いた手法であっても、フォトリソグラフィやＸ線リソグラフィを用いた手法であっても何ら問題はない。さらには、自己組織的に形成する方法であっても何の問題もない。また、パターンを転写して金属−誘電体ナノ構造を形成する方法は、エッチングを用いても構わないし、リフトオフにより形成しても何ら問題はない。
＜捕捉体および標的物質＞
捕捉体５では、標的物質と特異的な結合対を形成するものであれば、特に制約はない。ここでは抗体や核酸を用いることが好ましい。
【００３１】
標的物質は、捕捉体５と特異的な結合対を形成するものであれば、特に制約はない。具体的には、検体中に含まれる標的物質は、非生体物質と生体物質に大別される。非生体物質として産業上利用価値の大きいものは、環境汚染物質としての塩素置換数／位置の異なるＰＣＢ類、同じく塩素置換数／位置の異なるダイオキシン類、いわゆる環境ホルモンと呼ばれる内分泌撹乱物質等が挙げられる。
【００３２】
生体物質は、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体から選択される。生体物質が含まれ、更に詳しくは、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質から選択される生体分子を含んでなるものである。具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプター、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ脂質等である。また、これらの何れかから選択された物質を含むものであれば、如何なる物質にも本発明を適用することができる。更には、上述の「生体物質」を産生する細菌や細胞そのものも、本発明が対象とする「生体物質」として標的物質となり得る。
＜検出素子の動作原理＞
次に、本発明の化学検出素子の動作原理につき、図５を用いて説明する。
【００３３】
図中、上方向から下方向(＋z方向)に向かって入射光６を入射させる（図５（ａ））。入射光６は、構造体７中の自由電子とカップリングし、構造体７の周囲にエバネッセント場領域ＥFを生じさせる（図５（ｂ））。エバネッセント場領域ＥFは、周囲の媒質の屈折率変化に対して敏感に応答する。
【００３４】
構造体７の金属層２の側面２ａに固定化された捕捉体５に、検体液中の標的物質が結合した場合、構造体７の周囲の屈折率が水の屈折率も増加する。そしてプラズモン共鳴の共鳴周波数が変化し、吸光スペクトルのピークが長波長側にシフトする（図５（ｃ））。この原理を使って抗原抗体などの生化学反応を検出することが可能である。
【００３５】
本発明の検出素子は、エバネッセント場領域ＥFを生じている構造体７の側面２ａのみに捕捉体５が固定化されている。このため、構造体７と誘電体界面は略同一の共鳴条件となっている。そのため、入射光６が照射された場合、界面で誘起されるプラズモンのモードが少なくなり、スペクトルの線幅（Ｑ値）を従来よりも狭帯域化することができ、検出素子の感度をより高めることが可能となる。
【００３６】
従来、エバネッセント場領域ＥFが発生していない構造体の上面にも捕捉体５を固定化した従来の検出素子のスペクトルの線幅（Ｑ値）はブロードなものであった。これに対し、本発明の場合、従来の構成に比べ、狭帯域なスペクトルを得られるため、従来の検出素子より高感度なセンシングが可能となる。
＜標的物質測定装置＞
（反応ウェルを用いた測定装置）
標的物質を測定するための本発明の測定装置について図６を参照しながら説明する。図６（ａ）は本発明の測定装置の断面図であり、図６（ｂ）は斜視図である。
【００３７】
本発明の測定装置は、光源２０２と、対物レンズ２０３と、偏向素子２０６と、反応ウェル２０１が形成された基板２００と、反応ウェル２０１内に配置された本発明の検出素子と、受光手段２０４とを有する。
【００３８】
光源２０２は、安定した光源であれば特に制限はない。本発明では、ハロゲンランプを用いることが好ましい。対物レンズ２０３は、光源２０２からの入射光を略並行にすることができれば、何ら問題はない。ここでは、色収差などがないものを用いることがより好ましい。偏光手段２０６は、偏光光を作れるものであれば特に制限はない。ここでは、ｙ方向の偏光を作る偏光子を用いることが好ましい。受光手段２０４は、１ｎｍ程度の波長分解能をもった分光計測装置が望ましい。本発明では、マルチチャネル検出器や分光光度計を用いることが好ましい。
【００３９】
反応ウェル２０１は、標的物質の非特異吸着が少ない材料（もしくは非特異吸着防止層でウェルの部材をコーティングする）で構成されたものを用いることが好ましい。反応ウェル２０１内には本発明の検出素子８が配置されている。なお、反応ウェル２０１内の検出素子は、検出素子８に限定されるものではなく、検出素子１８，２８，３８，４８であってもよい。
（マイクロ流路を用いた測定装置）
標的物質を測定するための本発明のマイクロ流路を用いた測定装置について図７を参照しながら説明する。図７（ａ）は本発明の測定装置の一部断面図であり、図７（ｂ）は斜視図である。
【００４０】
本発明のマイクロ流路を用いた測定装置は、光学測定系と、液流路系とからなる。
【００４１】
光学測定系は、光源６０１と、対物レンズ６１５と、受光手段６０２とを有する。液流路系は、液供給系と、標的物質検出チップ６１４と、廃液回収系とを有する。
【００４２】
光源６０１は、安定した光源であれば特に制限はない。本発明では、ハロゲンランプを用いることが好ましい。受光手段６０２は、１ｎｍ程度の波長分解能をもった分光計測装置が望ましい。本発明では、マルチチャネル検出器や分光光度計を用いることが好ましい。
【００４３】
液供給系は、検体リザーバ６０３と、洗浄液リザーバ６０４とを有し、これらは流路切換バルブ６０５及び送液チューブ６０８を介して標的物質検出チップ６１４の流路６１１の一端側に接続されている。
【００４４】
標的物質検出チップ６１４は、基板６１３と、流路６１１及び反応ウェル６１０が形成されたカバー６１２とを有する。
【００４５】
反応ウェル６１０内には本発明の検出素子８が配置されている。なお、反応ウェル６１０内の検出素子は、検出素子８に限定されるものではなく、検出素子１８，２８，３８，４８であってもよい。
【００４６】
検体リザーバ６０３は、標的物質の非特異吸着が少ない材料で構成させたリザーバ、もしくは、チップ中にリザーバを作りこんでもかまわない。本発明では、非特異吸着防止コーティングしたエッペンドルフチューブを用いることが好ましい。
【００４７】
洗浄液リザーバ６０４は、特に制限はない。ここでは、生化学検査用グレードのガラスもしくはプラスチックチューブを用いることが好ましい。
【００４８】
流路切り替えバルブ６０５は、流体のチューブを切り替えられれば特に制限はない。本発明では、三方向バルブを用いることが好ましい。
【００４９】
廃液回収系は、送液手段６０６と、廃液タンク６０７とを有し、廃液チューブ６０９を介して標的物質検出チップ６１４の流路６１１の他端側に接続されている。
【００５０】
送液手段６０６は、シリンジポンプやチューブポンプ、ダイヤフラムポンプなどを適宜選択して用いることができる。
【００５１】
廃液タンク６０７は、ポンプにシリンジポンプを使用した場合、シリンジがそのまま廃液タンクになる。チューブポンプやダイヤフラムポンプを用いた場合は、ビーカーや瓶を廃液タンクとして用いることができる。また、検体が少量しかない場合は廃液にせず、循環用の流路やチューブを用い検体を循環させてやってもよい。
【００５２】
送液および廃液チューブ６０８，６０９は、標的物質の吸着ができる限り少ない材質のチューブが好ましい。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。なお、各実施例は、本発明を限定するわけでもなければ最適な値を示しているものではない。
（実施例１）
＜１．標的物質検出素子＞
図８は本実施例の検出素子の製造方法を説明する工程図である。
【００５４】
支持体４は、厚み５２５μｍの石英ウェハーを用いる。構造体７の上部誘電体層１及び下部誘電体層３の材料はＳｉＯ2を用い、金属層２の材料はＡｕを用いる。また、上部誘電体層１と金属層２との間、及び金属層２と下部誘電体層３との間には、密着層としてＴｉを下引きしてある（不図示）。ｘｙ平面から見た構造体７の形状は、一辺が１５０ｎｍの正方形状とする。上部誘電体層１及び下部誘電体層３の厚みはそれぞれ５０ｎｍとし、また金属層２の厚みも５０ｎｍとする。
【００５５】
以上の構成の検出素子７の製造方法について以下説明する。
【００５６】
まず、石英基板からなる支持体４上にポジ型レジスト（ＺＥＰ５２０Ａ）をスピンコートして、レジスト層３０６を設ける。次に、導電性ポリマー層３０７として、エスペイサー（昭和電工製）をスピンコートする（図８（ａ））。
【００５７】
これを、電子線描画装置のチャンバーに導入し、所望のパターンを描画する（図８（ｂ））。
【００５８】
描画終了後、純水洗浄し導電性ポリマー層３０７を除去する（図８（ｃ））。
【００５９】
その後、現像液で現像し、レジスト層３０６のパターニングを行う（図８（ｄ））。
【００６０】
パターニングされたレジスト層３０６をマスクとして、下部誘電体層３、Ｔｉ密着層、金属層２、Ｔｉ密着層、上部誘電体層１を成膜する（図８（ｅ））。
【００６１】
次に、リフトオフを行い、レジスト層３０６、構造体７以外の、下部誘電体層３、Ｔｉ密着層、金属層２、Ｔｉ密着層、上部誘電体層１を除去する（図８（ｆ））。
【００６２】
最後に金属層２の側面２ａに捕捉体５を物理的に固定化させることで検出素子８が完成する（図８（ｇ））。
＜２．標的物質検出素子の基礎光学特性＞
図９を参照しながら説明する。図９は、図１に示した構造体７を有する検出素子８と、誘電体層がない構造体を有する検出素子との、波長に対する透過率を電磁界シミュレーションソフトにより計算したグラフである。図中、太線が図１に示した検出素子８の透過率を示し、細線が誘電体層がない検出素子の透過率を示している。また、それぞれの構造体ともに、大気中および純水中での透過スペクトルを示してある。
なお、積層構造体ドットの大きさは、ｘ＝ｙ＝１５０ｎｍ、またＳｉＯ2層である上部誘電体層１及び下部誘電体層３、Ａｕ層である金属層２の厚みは全て２０ｎｍである。また、Ａｕドットの大きさは、ｘ＝ｙ＝１５０ｎｍ、Ａｕ層の厚みは２０ｎｍである。
【００６３】
グラフより、大気中、純水中ともに、本発明の構造体７を有する検出素子８のスペクトル線幅は、誘電体層がない構造体を有する検出素子のスペクトル線幅よりも狭くなり、Ｑ値が向上した。
＜３．標的物質検出キット・装置＞
本実施例では、図６に示す測定装置を用いた。
【００６４】
光源２０２は、ハロゲンランプを用いた。対物レンズ２０３は、平凸シリンダーレンズ（シグマ光機、２０ｍｍ×４０ｍｍ）を用いた。受光手段２０４は、マルチチャネル検出器を用いた。反応ウェル２０１は、ＰＤＭＳ基板を加工したものを用いた。その表面は、非特異吸着防止用の処理が施されている。また、標的物質検出素子として、プラズモン光学素子である本発明の検出素子８が用いられる。
＜４．標的物質の測定＞
捕捉体５として抗ＩｇＥ抗体を固定化させた検出素子８を反応ウェル２０１内にセットし、以下のプロトコールを行う。
（１）ｐＨを調整したバッファー溶液で反応ウェル２０１、ならびに検出素子をよく洗浄する。
（２）検体液をマイクロピペッタで１００μＬ注入し、検出素子に接触させて抗原抗体反応をおこす。
（３）２時間反応させた後、検体液をマイクロピペッタで抜き取り、バッファー溶液で非特異吸着しているＩｇＥ抗原を洗浄する。
（４）再びバッファー溶液を注入し、プラズモン光学素子である検出素子の光学的な変化の測定、すわなち、スペクトル測定を行う。
【００６５】
以上のプロトコールに従い測定を行うと、図５（ｃ）に示すようなプラズモン共鳴スペクトルが得られる。本発明で開示した構成の検出素子では、金コロイドを固定化している検出素子やＡｕドットによる検出素子と比較して、スペクトルの線幅が細くなる。さらに、本発明の検出素子によれば、捕捉体５が側面２ａのみに固定化されているので捕捉体５の量が少なく、より感度の高い検出素子となっている。このスペクトルを解析することで、図１０に示すような検量線が得られる。実践が本発明の検出素子の検量線であり、破線が捕捉体の固定化される領域が制限されていない従来の検出素子の検量線である。本発明の検出素子を用いることで、従来のものに比べて検出限界(LOD;Limit of detection)を小さくすることが可能となる。
（実施例２）
＜１．標的物質検出素子＞
本実施例では、図３（ａ）に示した検出素子２８と、図１１（ａ）に示す検出素子７８との感度について比較検討した。検出素子７８の上部誘電体層１のｘｙ平面の面積は、金属層２のｘｙ平面の面積よりも小さくしている。このため、検出素子７８は、金属層２の側面２ａのみならず上面部分にも捕捉体５が固定化されている。
（第一の素子）
本実施例では側面２ａにのみ捕捉体５が固定化された図３（ａ）に示す検出素子２８を第一の素子とする。
【００６６】
第一の素子の支持体４は、厚み５２５μｍの石英ウェハーを用いた。構造体７の上部誘電体層１及び下部誘電体層３の材料はＳｉＯ2を用い、金属層２の材料はＡｕを用いた。また、上部誘電体層１と金属層２との間、及び金属層２と下部誘電体層３との間には、密着層としてＴｉを下引きしてある（不図示）。
【００６７】
構造体７のｘｙ平面の形状は、長軸が１５０ｎｍ，短軸が５０ｎｍの長方形である。
（第二の素子）
本実施例では側面２ａにのみならず、上面部分にも捕捉体５が固定化されている図１１（ａ）に示す検出素子７８を第二の素子とする。
【００６８】
第二の素子の支持体４は、厚み５２５μｍの石英ウェハーを用いた。構造体７の上部誘電体層１及び下部誘電体層３の材料はＳｉＯ2を用い、金属層２の材料はＡｕを用いた。また、上部誘電体層１と金属層２との間、及び金属層２と下部誘電体層３との間には、密着層としてＴｉを下引きしてある（不図示）。
【００６９】
金属層２及び下部誘電体層３のｘｙ平面の形状は、長軸が１５０ｎｍ，短軸が５０ｎｍの長方形である。上部誘電体層１のｘｙ平面の形状は、長軸が１００ｎｍ、短軸が５０ｎｍの長方形である。
＜２．標的物質検出キット・装置＞
実施例１で用いたものと同じキット・装置を用いて測定を行う。
＜３．標的物質の測定＞
図４の装置において、抗ＩｇＥ抗体を固定化させた検出素子８を装置にセットし以下のプロトコールを行う。
（１）ｐＨを調整したバッファー溶液で反応ウェルならびに、標的物質検出素子をよく洗浄する。
（２）検体液をマイクロピペッタで１００μＬ注入し、検出素子に接触させて抗原抗体反応をおこす。
（３）２時間反応させた後、検体液をマイクロピペッタで抜き取り、バッファー溶液で非特異しているＣＲＰ抗原を洗浄する。
（４）再びバッファー溶液を注入し、プラズモン光学素子である検出素子の光学的な変化の測定、すわなち、スペクトル測定を行う。
【００７０】
以上のプロトコールに従いそれぞれの素子について測定を行うと、図１２に示すような検量線が得られる。図１２中、太実線が第１の素子を備えた検出素子８の検量線、細実線が第二の素子を備えた検出素子７８の検量線、破線が誘電体層を備えていないＡｕコロイドを用いた検出素子の検量線である。同図に示すように、両素子とも、従来開示されていたＡｕコロイドを用いた検出素子よりも検出限界(LOD;Limit of detection)を小さくすることが可能となる。また、図３（ａ）に示すプラズモン素子のほうが、図１１（ａ）に示すプラズモン素子よりも誘電体層の面積が大きくスペクトルの線幅が狭くなるため、ＬＯＤ値が小さくなる。
【００７１】
なお、図１１（ｂ）に示す下部誘電体層３のｘｙ平面が金属層２よりも小さい素子、及び図１１（ｃ）に示す上部誘電体層１及び下部誘電体層３のｘｙ平面のいずれもが金属層２よりも小さい素子についても同様の結果となった。すわなち、図３（ａ）に示すプラズモン素子のほうが、図１１（ｂ）、図１１（ｃ）に示すプラズモン素子よりも誘電体層の面積が大きくスペクトルの線幅が狭くなるため、ＬＯＤ値が小さくなった。
（実施例３）
＜１．標的物質検出素子＞
図８を参照しながら、本実施例にかかる標的物質検出用の素子構成ついて説明する。支持体３０４は、厚み５２５μｍの石英ウェハーを用いる。金属と誘電体からなるナノ構造体については、３０１，３０３の材料はＳｉＯ2を用い、３０２の材料は金を用いる。また、ＳｉＯ2とＡｕの間には、密着層としてＴｉを下引きしてある（不図示）。
【００７２】
プラズモン素子のｘｙ平面の形状は、一辺が１５０ｎｍの正方形状とする。上下層の誘電体の厚みは、それぞれ５０ｎｍ、また金の厚みも５０ｎｍとする。
＜２．標的物質検出キット・装置＞
測定装置は図７に示したものを用いた。
【００７３】
光源６０１はハロゲンランプを用い、受光手段６０２はマルチチャネル検出器（浜松フォトニクス）を用いた。検体リザーバ６０３はエッペンドルフチューブを用い、洗浄液リザーバ６０４は生化学用のガラスボトルを用いた。流路切り替えバルブ６０５は三方向バルブ（ＧＬサイエンス）を用い、送液手段６０６はシリンジポンプ(kd Scientific KDS200)を用い、廃液タンク６０７はシリンジを用いた。送液および廃液チューブ６０８，６０９はテフロンチューブを用いた。流路６１１はカバー（ＰＤＭＳ基板）６１２に、１ｍｍ幅、１００μｍ幅、４０ｍｍ長の寸法で形成されている。基板６１３は石英ガラスを用い、対物レンズ６１５は平凸シリンダーレンズ（シグマ光機、２０ｍｍ×４０ｍｍ）を用いた。
【００７４】
検出素子は図１に示す検出素子８を用いた。
＜３．標的物質の測定＞
図６の装置において、抗ＣＲＰ抗体を固定化させた標的物質検出素子６１０を装置にセットし以下のプロトコールを行う。
（１）三方バルブ６０５を洗浄液リザーバ６０４側に切り替え、ｐＨを７．４に調整したバッファー溶液を０．１（ｍｌ／ｍｉｎ．）の流速で１０分間流し、検出素子８をよく洗浄する。
（２）三方バルブ６０５を検体リザーバ６０３側に切り替え、検体を０．１（ｍｌ／ｍｉｎ．）の流速で１０分間流し抗原抗体反応をおこす。
（３）検体を送液しながら、一定時間ごとに反射スペクトルを測定する。
（４）再び、三方バルブ６０５を洗浄液リザーバ６０４側に切り替え、バッファー溶液を流速０．１（ｍｌ／ｍｉｎ．）で１０分間流し、非特異的に吸着した抗原を洗い流す。
【００７５】
上記プロトコールにより、図５（ｃ）に示したスペクトルが各反応時間において得られる。
【００７６】
このスペクトルをグラフソフトにより関数フィッティングしスペクトルのピーク値を求めることにより、図１３に示すように抗原抗体反応のタイムコースが得られる。
（実施例４）
＜１．標的物質検出素子＞
本実施例では、図８に示した製造工程によって製造された検出素子８による、抗ＣＲＰ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、及び抗ＩｇＡ抗体の各抗原抗体反応のタイムコースを求めた。
【００７７】
支持体４は、厚み５２５μｍの石英ウェハーを用いた。構造体７の上部誘電体層１及び下部誘電体層３の材料はＳｉＯ2を用い、金属層２の材料はＡｕを用いた。また、上部誘電体層１と金属層２との間、及び金属層２と下部誘電体層３との間には、密着層としてＴｉを下引きしてある（不図示）。
【００７８】
捕捉体５は、抗ＣＲＰ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、及び抗ＩｇＡ抗体を用いる。
【００７９】
構造体７は、図１に示す正方形のものであり、一辺が１５０ｎｍである。上部誘電体層１、金属層２、及び下部誘電体層３の厚みはいずれも５０ｎｍである。
＜２．標的物質測定装置＞
本実施例では図１４に示す測定装置を用いた。
【００８０】
本実施例で用いた測定装置は、光学測定系と、液流路系とからなる。
【００８１】
本実施例の測定装置の光学測定系は、４ｃｈ同時測定が可能なマルチチャネル検出器を用いている点で図７に示す測定装置と異なるが、それ以外の構成は基本的に同様である。
【００８２】
光学測定系は、光源６０１と、受光手段６０２と、光ファイバー７１６とを有し、光源６０１に接続された光ファイバー７１６と、分光器６０２に接続された光ファイバー７１６とはカプラー７１５で接続されている。光ファイバー７１６は、光源からの光量が各波長帯域で充分とれれば特に制限はない。ここでは、可視光波長帯域のファイバーを用いることが好ましい。
＜３．標的物質の測定＞
抗ＣＲＰ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体及び抗ＩｇＡ抗体を捕捉体５として固定化させた検出素子８をそれぞれ用意し、各検出素子８を図１４に示す測定装置にセットし以下のプロトコールを行う。
（１）三方バルブ６０５を洗浄液リザーバ６０４側に切り替え、ｐＨを７．４に調整したバッファー溶液を０．１（ｍｌ／ｍｉｎ．）の流速で１０分間流し、検出素子８をよく洗浄する。
（２）三方バルブ６０５を検体リザーバ６０３側に切り替え、検体を０．１（ｍｌ／ｍｉｎ．）の流速で１０分間流し抗原抗体反応をおこす。
（３）再び、三方バルブ６０５を洗浄液リザーバ６０４側に切り替え、バッファー溶液を流速０．１（ｍｌ／ｍｉｎ．）で１０分間流し、非特異的に吸着した抗原を洗い流す。
【００８３】
上記プロトコールにより、反応場ごとに図５（ｃ）に示すようなスペクトルが得られる。このスペクトルをグラフソフトにより関数フィッティングしスペクトルのピーク値を求めることにより、図１５に示すようにそれぞれのマーカータンパク質について、反応のkinetics測定が可能となる。以上のように、複数の疾病マーカータンパク質とその抗体の反応プロファイルを測定することにより、一つのタンパク質の測定より高精度に疾病の要因を調べることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明の検出素子の一例の概略を説明するための側面図及び平面図である。
【図２】本発明の検出素子の他の例の概略を説明するための側面図及び平面図である。
【図３】本発明の検出素子の他の例の概略を説明するための側面図及び平面図である。
【図４】本発明の検出素子の他の例の概略を説明するための側面図及び平面図である。
【図５】本発明の検出素子の動作原理を説明するための図及びグラフである。
【図６】本発明の検出素子を備えた測定装置の一例の概略図である。
【図７】本発明の検出素子を備えた、マイクロ流路を用いた測定装置の一例の概略図である。
【図８】本発明の検出素子の製造工程の一例を示す工程図である。
【図９】本発明の構造体を有する検出素子と、誘電体層がない構造体を有する検出素子との、波長に対する透過率を電磁界シミュレーションソフトにより計算したグラフである。
【図１０】本発明の構造体を有する検出素子と、誘電体層がない構造体を有する検出素子との検量線を示すグラフである。
【図１１】金属層の面積より小さい面積の誘電体層を備えた構造体を有する検出素子の例を示す側面図及び平面図である。
【図１２】本発明の構造体を有する検出素子と、誘電体層がない構造体を有する検出素子との検量線を示すグラフである。
【図１３】本発明の検出素子における抗原抗体反応のタイムコースである。
【図１４】本発明の検出素子を備えた、４ｃｈ同時測定が可能なマルチチャネル検出器を用いた測定装置の一例の概略図である。
【図１５】本発明の検出素子における抗原抗体反応のタイムコースである。
【符号の説明】
【００８５】
２    金属層
２ａ    側面
４    支持体
５    捕捉体
７    構造体
８    検出素子
【図１】
2008232720.tif 000003
【図２】
2008232720.tif 000004
【図３】
2008232720.tif 000005
【図４】
2008232720.tif 000006
【図５】
2008232720.tif 000007
【図６】
2008232720.tif 000008
【図７】
2008232720.tif 000009
【図８】
2008232720.tif 000010
【図９】
2008232720.tif 000011
【図１０】
2008232720.tif 000012
【図１１】
2008232720.tif 000013
【図１２】
2008232720.tif 000014
【図１３】
2008232720.tif 000015
【図１４】
2008232720.tif 000016
【図１５】
2008232720.tif 000017