(57)【要約】【課題】摂食することによって腸内細菌（善玉菌）を増加させる効果を有する、果菜発酵物及び果菜発酵物含有飲食品を提供する。【解決手段】果菜処理物に、ペディオコッカス・ペントサセウスに属し、腸内ビフィドバクテリウム増殖能を有する微生物を接種し、発酵させて果菜発酵物及び果菜発酵物含有飲食品を得る。【効果】前記菌体を含む果菜発酵物を摂食することにより、腸内細菌が有意に増加し、また、生体内のインターロイキン１２産生能も賦活される。この果菜発酵物は風味良好で、常温流通可能である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
果菜処理物に、ペディオコッカス・ペントサセウスに属し、腸内ビフィドバクテリウム増加能を有する微生物を接種し、発酵させて得られる果菜発酵物。
【請求項２】
微生物がペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株である、請求項１記載の果菜発酵物。
【請求項３】
果菜処理物が、果菜の破砕物、磨砕物、搾汁液、酵素処理物、濃縮物及び希釈物並びにこれらの膜処理物である、請求項１〜２記載の果菜発酵物。
【請求項４】
果菜が、トマト、赤ピーマン、ほうれん草、ケール、人参、タマネギ、オレンジ、グレープフルーツ、パッションフルーツ、パイナップル及びバナナから選択される１以上である、請求項１〜３記載の果菜発酵物。
【請求項５】
請求項１〜４記載の果菜発酵物を含有する飲食品。
【請求項６】
ペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株菌体を１×１０６個／ｍｌ以上含有することを特徴とする請求項５記載の飲食品。
【請求項７】
飲食品が、飲料、調味料、デザート、サプリメントである請求項５〜６記載の飲食品。
【請求項８】
果菜処理物に、ペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株を接種し、発酵させることを特徴とする果菜発酵物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵食品を取得源とする乳酸菌を用いた果菜発酵物及び果菜発酵物含有飲食品に関する。より詳細には、摂食すると腸内の善玉菌であるビフィドバクテリウムが有意に増加し、また、生体内のインターロイキン１２産生が有意に増加する果菜発酵物及び果菜発酵物含有飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、野菜や果実の処理物を乳酸発酵することにより原料由来の不快臭味を抑制し、官能的に優れた果菜発酵物を得るための技術が知られている。例えば、トマト搾汁液を殺菌し冷却した後、ラクトバチルス・ブルガリカスを加えて発酵を行った後に菌体を分離して発酵液を得ることを特徴とする発酵飲料の製造方法がある（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
また、Ｂｒｉｘ２〜３０の濃度に調整した人参汁に、不快臭味の改善効果を有するラクトバチルス・プランタラムＬ−０５１株を加えて発酵させた発酵人参ジュースが開示されている（例えば、特許文献２参照）。さらに、果菜処理物を、糖類に対する固有の資化性を有するラクトバチルス・プランタラムにより発酵させる、乳酸菌飲料の製造方法が開示されている（例えば、特許文献３参照）。
【０００４】
発酵飲料用素材としては、カボチャ、トウモロコシ、サツマイモ、有色サツマイモ、ニンジン、ほうれん草、赤ピーマン、セロリー、ケール、ブロッコリー、レタス、トマト、赤ビート、キャベツ、赤キャベツ、カブ、ダイコン、明日葉及びモロヘイヤ等が挙げられ、これらの処理物をペディオコッカス属に属する微生物を用いて発酵させて得られる野菜発酵飲料が知られている（例えば、特許文献４参照）。また、果菜処理物に、ペディオコッカス属に属する低温感受性変異株を作用させて発酵させた後、低温で保存する果菜発酵飲料が開示されている（例えば、特許文献５参照）。
【０００５】
また、インターロイキン１２産生促進剤及びそれを含む飲食品として、果汁飲料、豆乳飲料、又は野菜飲料を含む培地でテトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株、ペディオコッカス・ペントサセウスＴＵＡ０１２２株、ペディオコッカス・アシデラクテシィＴＵＡ０１２４株、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＩＳＬ７２０１株若しくはロイコノストック・メセンテロイデスＮＩＳＬ７２１９株を培養して得られる培養物及びそれを有効成分とする飲食品が知られている（例えば、特許文献６参照）。
【０００６】
しかしながら、摂食することによって腸内細菌（いわゆる善玉菌）を有意に増加させる果菜発酵物及びその製造方法はこれまでに知られていない。
【特許文献１】特公平０７−４２０４号公報
【特許文献２】特公平０７−１０００２５号公報
【特許文献３】特開平０９−６３９７７号公報
【特許文献４】特開２００１−２９２７２０号公報
【特許文献５】特開２００１−３２１１６１号公報
【特許文献６】特開２００６−２８０４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、摂食することによって腸内細菌（いわゆる善玉菌）を有意に増加させる果菜発酵物及び果菜発酵物含有飲食品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、白菜を主原料とする漬物中より単離同定したペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株（以下ＯＳ株）を摂食することによって、腸内の善玉菌であるビフィドバクテリウムが有意に増加することを見出した。また、ＯＳ株の摂食が、生体内のインターロイキン１２産生能も賦活することを知った。そして、ＯＳ株を用いて果菜処理物を発酵させて腸内細菌を有意に増加させる果菜発酵物を製造するための好適な条件を見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）果菜処理物に、ペディオコッカス・ペントサセウスに属し、腸内ビフィドバクテリウム増加能を有する微生物を接種し、発酵させて得られる果菜発酵物。
（２）微生物がペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株である、上記（１）記載の果菜発酵物。
（３）果菜処理物が、果菜の破砕物、磨砕物、搾汁液、酵素処理物、濃縮物及び希釈物並びにこれらの膜処理物である、上記（１）〜（２）記載の果菜発酵物。
（４）果菜が、トマト、赤ピーマン、ほうれん草、ケール、人参、タマネギ、オレンジ、グレープフルーツ、パッションフルーツ、パイナップル及びバナナから選択される１以上である、上記（１）〜（３）記載の果菜発酵物。
（５）上記（１）〜（４）記載の果菜発酵物を含有する飲食品。
（６）ペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株菌体を１×１０６個／ｍｌ以上含有することを特徴とする上記（５）記載の飲食品。
（７）飲食品が、飲料、調味料、デザート、サプリメントである上記（５）〜（６）記載の飲食品。
（８）果菜処理物に、ペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株を接種し、発酵させることを特徴とする果菜発酵物の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＯＳ株を用いて得た果菜発酵物は、摂食することによって腸内細菌（いわゆる善玉菌）を有意に増加させる。さらに、本発明の果菜発酵物は良好な香味を有し、インターロイキン１２産生能を賦活する効果も有する。本発明のこれらの効果は加熱殺菌処理されたＯＳ株菌体においても有効であり、常温流通や常温保存時にもその効果を維持することができる。本発明の果菜発酵物を原料として、高い健康効果を有する飲食品を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明で用いる微生物としては、ペディオコッカス属に属し、腸内ビフィドバクテリウム増加能を有する微生物が挙げられ、特に、ペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株が好ましい。ペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株は、本発明者らが調製した白菜のキムチ漬けから分離同定したものである。この微生物は、野菜汁や果汁等の果菜処理物中で旺盛に繁殖し、その結果得られる果菜発酵物は、腸内の善玉菌であるビフィドバクテリウムを増殖させる効果を有し、並びに、生体内のインターロイキン１２産生能を賦活させる効果をも有する。
【００１２】
なお、このペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターにＮＩＴＥ  Ｐ−３５４として２００７年４月２４日付けで寄託されている。
【００１３】
以下、ＯＳ株の菌学的性質を示す。
（ａ）形態的性質
・細胞の形及び大きさ：球状、０．５〜１．０μｍ
・細胞の多形性：有り（単球、双球及び４連球）
・運動性の有無：無し
・胞子形成能：無し
（ｂ）培養的性質
生育状態：ＭＲＳ寒天培地（表２参照）で１〜２日後に、円形、平滑、白色のコロニーを形成する。
（ｃ）生理的性質
・グラム染色性：陽性
・好嫌気性：通性嫌気性
・ガス生産性：無し（ホモ発酵）
・リンゴ酸分解：有り（マロラクティック発酵）
・糖の資化性の有無：表１に示す通りである。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
果菜の破砕物、磨砕物、搾汁液、これらの酵素処理物、これらの濃縮物及び希釈物並びにこれらの膜処理物から選択される１以上である果菜処理物に、前記のＯＳ株を接種し、発酵させることにより、本発明の果菜発酵物を得ることができる。
【００１６】
本発明に使用する果菜としては、任意の野菜が使用可能であるが、例えば、ナス、トマト、ピーマン、黄ピーマン、赤ピーマン、唐辛子、キュウリ、カボチャ、シロウリ、インゲン豆、エンドウ豆、ソラ豆、枝豆及びトウモロコシ等の果菜類や、白菜、キャベツ、ほうれん草、レタス及び小松菜等の葉菜類、大根、カブ、ゴボウ、人参、サツマイモ、山芋、チョロギ、ジャガイモ、サトイモ、クワイ、レンコン及びワサビ等の根菜類や、ネギ、タマネギ、ニラ、ラッキョウ及びニンニク等の鱗茎菜類、カリフラワー、食用菊及びミョウガ等の花菜類、ウド、タケノコ及びアスパラガス等の茎菜類が挙げられる。特に、トマト、赤ピーマン、ほうれん草、ケール、人参及びタマネギが、風味も良く、ＯＳ株の増殖にとって好適であり、香味も良く、好ましい。
【００１７】
本発明で用いる果実としては、任意の果実が使用可能であるが、例えば、仁果類のリンゴ、梨、枇杷、マルメロ及びカリン等や、柑橘類の温州ミカン、早生温州、ポンカン、ネーブルオレンジ、バレンシアオレンジ、福原オレンジ、日向夏、三宝甘、ハッサク、夏ミカン、伊予甘、ブンタン、スダチ、柚子、グレープフルーツ及びレモン等や、核果類のモモ、アンズ、スモモ、ウメ及びサクランボ等や、漿果類のブドウ、イチジク及びイチゴ等や、堅果類のクリ、シイの実、トチの実、カヤの実、胡桃、銀杏、ハスの実及びアーモンド等や、パイナップル、バナナ、スイカ、メロン、パパイヤ、マンゴー、パッションフルーツ、ライチー、クランベリー、ブルーベリー、ブラックベリー、エルダーベリー、ラズベリー、柿、キウイフルーツ、ザクロ及びイチジク等が挙げられ、特に、オレンジ、グレープフルーツ、パッションフルーツ、パイナップル及びバナナが、風味も良く、ＯＳ株の増殖にとって好適であり、香味も良く、好ましい。
【００１８】
果菜処理物の調製には、各種の公知の方法を使用すればよい。破砕物、磨砕物及び搾汁液調製のためには、例えば、上記果菜を洗浄しブランチングした後、スライサー、ダイサー、クラッシャー、コミトロール、マスコロイダー、パルパーフィニッシャー、フィルタープレス等で処理して調製することができる。また、上記果菜の搾汁液を、精密濾過（Ｍｉｃｒｏ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）や限外濾過（Ｕｌｔｒａ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）することで膜処理物を調製することができる。酵素処理物は、上記破砕物、磨砕物、搾汁液に例えばセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ等で処理して調製することができる。濃縮物は、上記破砕物、磨砕物、搾汁液、これらの酵素処理物及びこれらの膜処理物を、減圧濃縮や凍結濃縮等によって濃縮することにより、希釈物は、上記処理物等を水で希釈することにより調製可能である。
【００１９】
前記ＯＳ株を用いた発酵は、果菜処理物に直接接種して行うことができるが、より安定した発酵を行うためには、予めスターターを用意し、このスターターを上記果菜処理物に接種することが好ましい。
【００２０】
スターターとしては、通常の殺菌処理（９０〜１２１℃、１０〜２０分間等）を行った果菜処理物等の、乳酸菌の増殖に適した培地に、ＯＳ株の凍結乾燥菌体又は凍結保存菌液等を接種する。果菜処理物中でＯＳ株をより好適に増殖させるためには、本培養液と同じ果菜を含む前培養液でスターターを調製することがより好ましい。スターターの濃度は果菜の種類や発酵条件等により適宜調整できるが、例えばＯＳ株を生菌数で１０６〜１０１０個／ｍｌ含有するように調整することが好ましい。スターターを本培養液に接種する量は、本発明の果菜発酵物を安定的かつ効率的に製造することができるように適宜調整できるが、例えばＯＳ株を生菌数で１×１０６個／ｍｌ程度となるように接種することができる。接種量が少なすぎる場合は、発酵時間が必要以上に長くなり、その間に雑菌汚染を生じる可能性も高まるため好ましくない。一方、接種量が多すぎる場合にも、良好な発酵状態が得られず、また、多量のスターターを必要とすることになり、操作上も経済上も好ましくない。
【００２１】
上記のように、ＯＳ株を直接接種、又は前培養したスターターとして接種した果菜処理物を、好適な条件下で発酵させる。発酵温度は、１５〜４０℃程度であり、好ましくは、２０〜３０℃である。この範囲の発酵温度で、ＯＳ株の菌濃度が著しく増大する。発酵時間は、果菜処理物の種類やその発酵条件、又は果菜発酵物に含有させるＯＳ株の菌数に応じて適宜決定すればよいが、例えば１０〜４８時間程度で行うことができる。当該果菜発酵物の微生物汚染を防止するためには、この発酵時間はより短い方が良い。
【００２２】
なお、果菜処理物のｐＨはその原料に依存するため、原料によってはＯＳ株が良好に増殖できない程度までｐＨが低下する場合があり得る。このような果菜処理物における発酵性を改善し、発酵物中でのＯＳ株菌体量を十分に増加させるためには、例えばＯＳ株接種前に、水酸化ナトリウム等のｐＨ調整剤を用いて、果菜処理物のｐＨを４．０以上、好ましくは５．０〜８．０に調整することができる。
【００２３】
本発明の果菜発酵物を製造するためには、ＯＳ株を果菜処理物に接種後、菌体数が１０８個〜５×１０９個／ｍｌとなるまで発酵させることが重要である。このように発酵を行う場合、得られる果菜発酵物は腸内の善玉菌であるビフィドバクテリウムを有意に増加させる効果を有すると同時に、良好な風味を有する。また、この果菜発酵物を飲食品の原料として使用する場合にも、腸内細菌増殖効果を有するＯＳ株菌体を十分に含有させることが可能である。発酵が不十分であり、十分な菌体増殖が見られない段階で発酵を停止した場合には、得られる果菜発酵物は十分な腸内細菌増殖効果を有さず、また発酵物としての香味も乏しいものとなる。一方、当該菌体数以上に発酵を行っても、ＯＳ株は死滅期に入ってしまい、菌体数の増殖は見込めず、発酵物の香味も悪くなってしまう。
【００２４】
上記のように得られた本発明の果菜発酵物は、各種飲食品の原料とすることができる。飲食品は特に限定されないが、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）、スープ類、ウスターソース、中濃ソース、濃厚ソースのウスターソース類やトマトケチャップ、トマトソース、チリソース等のトマト加工調味料、たれ類やマヨネーズ、ドレッシング等の各種調味料、ヨーグルトやゼリー、ババロア、アイスクリーム等のデザート類、蕎麦、うどん、中華麺、即席麺等の麺類、グミ等の半固形状食品、ペースト状食品、ガム、サプリメント等の固形状食品等が挙げられる。
【００２５】
原料として配合する本発明の果菜発酵物の割合は任意であるが、例えば飲食品中に、ＯＳ株菌体を１×１０６個／ｍｌ以上、好ましくは１×１０７個／ｍｌ以上含有するように配合することが好ましい。この場合、飲食品中に存在するＯＳ株は、生きた状態であってもよく、又は加熱殺菌等により死んでいる状態であってもよい。ＯＳ株は加熱殺菌された状態で配合された場合でも腸内細菌増殖能を失わないため、常温流通や常温保存時にもその効果を維持することができる。飲食品中に存在するＯＳ株菌体が１０６個／ｍｌ未満の場合には、摂食した場合の腸内細菌増殖効果を十分に得ることができない。
【００２６】
本発明の果菜発酵物をサプリメントとして利用する場合には、公知の各種賦形剤、糖類、香料、乳化剤及び保存料の一種又は二種以上を適宜含んで製造することができる。これらサプリメントの製品形態は特に制限されず、使用形態に合わせて適宜選択でき、例えば錠剤、粉末、顆粒、カプセル剤、ペースト、乳化液、溶液等が挙げられる。
以下、実施例を示して本発明を説明するが、本発明の技術的範囲はこれによって何ら限定されることはない。
【００２７】
（実験例１  ペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株の分離）
ペディオコッカス・ペントサセウスは漬物等の多くの発酵食品に存在する乳酸菌であり、その発酵に関与していることが知られている。そこで本発明者らは、白菜を使用したキムチ漬けを調整し、ペディオコッカス・ペントサセウス菌株の分離源とした。
【００２８】
＜キムチ漬けの作成方法＞
（１）白菜１ｋｇを半分に切り、約４時間天日に干した。
（２）切った白菜の葉と葉の間に食塩約６０ｇをすり込み、ポリ袋に入れて冷蔵庫で約１６時間寝かせた後、白菜を絞って水切りした。
（３）頭とハラワタを取った煮干１０ｇを６０ｍｌの水に約３０分間浸した後、乾燥昆布３ｇを加えて、加熱沸騰し、分別濾過してダシ汁を得た。
（４）剥皮したリンゴ１００ｇ、生姜２０ｇ及びニンニク１０ｇをフードカッターでピューレ状に破砕したものに、中荒唐辛子１０ｇ、糸唐辛子１０ｇ及び松の実７ｇを加え、さらに上記ダシ汁を混合して調味液とした。
（５）上記水切りした白菜の葉と葉の間に上記調味液を塗り付け、密閉容器に入れて１５℃の暗所内に保存し、白菜のキムチ漬けとした。
【００２９】
＜乳酸菌の分離方法＞
ペディオコッカス・ペントサセウス等の乳酸球菌はキムチ漬けや糠漬等の漬物において、漬け始めから１０日前後で優勢菌種となるが、上記作成したキムチ漬けから、保存開始後２４時間毎にサンプリングして、以下の方法によって、乳酸球菌を分離した。
（１）キムチ漬け白菜に付着しているキムチ漬け汁を１白金耳取って、酸性トマト液体培地（培地組成は表２参照）１０ｍｌに接種し、３５℃で２４時間静置培養した。
（２）上記酸性トマト培地培養液を１白金耳取って、酸性トマト寒天培地プレート（表２参照）２０ｍｌに画線接種し、３５℃で２４時間培養した。
（３）上記トマト酸性寒天培地プレート上のコロニーを４００倍で顕微鏡観察して、球形のコロニーをＢＣＰ加プレートカウントアガー培地（表２参照）２０ｍｌ（日水製薬社製）に画線接種した後、３５℃で２４時間培養して、該ＢＣＰ培地中のブロムクレゾールパープルの変色によって、酸の生成を確認した。
（４）上記酸生成したコロニーをダラーム管中のＭＲＳ液体培地（表２参照）に接種して、３５℃で２４時間培養した後、上記ＭＲＳ培地中のガス発生のない菌を１，０００倍で顕微鏡観察して、上記接種菌がペディオコッカス・ペントサセウスと同じ四連球菌であることを確認した。
（５）上記四連球菌をアピ  ５０ＣＨＬ（日本ビオメリュー社製）で同定を行ったところ、７〜１１日目に分離した菌の全てが同一の糖資化性を示して、ペディオコッカス・ペントサセウス９９．９％と判定され、さらに遺伝子解析により、ペディオコッカス・ペントサセウスと同定し、これをＯＳ株と命名した。得られたＯＳ株の菌学的性質は、前述した通りである。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
（実験例２  ＯＳ株による腸内善玉菌の増殖効果）
ＯＳ株の菌体凍結乾燥粉末が、ラット腸内の細菌に与える影響を調査した。
【００３２】
＜ＯＳ菌体凍結乾燥粉末の作成＞
（１）トマトエキスＳＴ−６０（トマト搾汁液をＭＦ濾過してリコピン色素を除去し、減圧濃縮したＢｒｉｘ６０の糖度を有するトマト処理物、日本デルモンテ株式会社製）を蒸留水でＢｒｉｘ４.７に希釈してｐＨ６.０に調整し、１２１℃で１５分間加熱殺菌したトマトエキス培養液に、−８５℃でグリセロール保存しておいたＯＳ株を１白金耳接種して、３０℃で２４時間培養した。培養終了時の生菌数は２×１０９個／ｍｌであった。なお、生菌数の算出にはｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）を使用し、１ｃｆｕ／ｍｌを１個／ｍｌとして記載した。
（２）上記培養液を１００℃で１０分間加熱処理し、遠心分離（３，０００Ｇ×２０分）して、上清を捨て、菌体ペレットを得た。そして、この菌体ペレットに生理食塩水を適量加えて懸濁し、遠心分離して集菌した。この生理食塩水による菌体の洗浄をさらに２回繰り返して合計３回洗浄し凍結乾燥して、ＯＳ菌体凍結乾燥粉末を得た。
【００３３】
＜ペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株による腸内善玉菌の増殖効果＞
ＳＤ系ラット（雄、６週齢）を使用し、試験期間中は通常の餌と水を与え、さらに一日２回、下記表３の調整品３ｍｌを経口投与しながら１ヶ月間飼育した。
【００３４】
【表３】
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【００３５】
飼育終了後、当該試験ラットを１２時間断食させて、二酸化炭素で窒息させた。死亡確認後開腹して、盲腸部分全体（前端の結腸部分を含む）を切り取り、無菌嫌気試験管に入れた。一般環境で盲腸を開いて、その内容物を５０ｍｌ無菌試験管に入れ、９倍体積の無菌嫌気性希釈液（表４参照）と２０粒の無菌ガラス球を加えた後、シェーカーで振動して、検体の１０倍希釈液を得た。
【００３６】
次いで、１０倍ずつの系列希釈を行って、それぞれをＴＳＣ平板培地、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地及びＲｏｇｏｓａ平板培地（表４参照）に塗布して、また、１ｍｌ検体の１０倍希釈液を取って、未凝固のＴＳＣ平板培地７ｍｌ（約５５℃）に加えて、検体希釈液と培地を均等混合し、これを第一層のＴＳＣ平板培地上に載せて凝固させた。なお、嫌気性菌である乳酸菌が酸素との接触で死滅するのを防ぐため、以上の操作は全て３０分以内に完成させた。
【００３７】
その後、上記ＴＳＣ平板培地を嫌気操作台内に置いて、３７℃で一日培養し、また、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地及びＲｏｇｏｓａ平板培地は嫌気ジャーに入れ、３７℃で３日間培養した。培養後に上記平板培地を観察して、各種選択培地の特性と、菌形の鏡検結果を合わせて、コロニー数を計数した。
【００３８】
【表４】
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【００３９】
乳酸菌の計数は、クロストリディウム・パーフリンゲンス、ラクトバチルス属及びビフィドバクテリウム属を計数対象とした。クロストリディウム・パーフリンゲンスは、ＴＳＣ平板培地上に黒いコロニーを形成し、コロニー周囲に透明の輪を形成したものを計数した。また、ラクトバチルス属は、鏡検によって数個のサンプルの菌株形態を確認後、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地及びＲｏｇｏｓａ平板培地において、直接培地上のコロニー数を計数した。ビフィドバクテリウム属は、平板培地上の全てのコロニーを選び出し、鏡検によってコロニー数を計数した。その結果を表５に示す。なお、クロストリディウム・パーフリンゲンスについては、サンプルからこの菌を培養することができなかったため、各組の差異を判断することはできなかった。この原因は、ＳＤ系ラットの腸管中にこの菌株の存在量が非常に少ないためと考えられる。
【００４０】
【表５】
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【００４１】
表５より、１日当たりＯＳ菌体１．４×１０９個／ｍｌの懸濁液６ｍｌ（ＯＳ菌体数８．４×１０９個）を摂食することによって、腸内善玉菌であるビフィドバクテリウムが、菌数にして１００倍近く有意に増加することが分かった。そして、ＯＳ株菌体を豊富に含む果菜発酵物を摂食することにより、腸内善玉菌を増加させるのに必要とされる量のＯＳ株菌体が容易に摂食できることがわかる。
【００４２】
（実験例３  ＯＳ株培養液のインターロイキン１２の産生誘導試験）
ＭＲＳ培地５ｍｌにペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株を接種し、３０℃で２４時間前培養を行った。そして、この前培養液をスターターとして、別のＭＲＳ培地５ｍｌに０．１重量％接種し、３０℃で２４時間及び３０℃で７２時間静置培養した。培養終了後、１００℃で１０分間殺菌し、５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を処理して集菌した。集めた菌体を生理食塩水で希釈し、６００ｎｍにおける吸光度を、０．５（菌数１０８個／ｍｌ程度）、０．２５（菌数５×１０７個／ｍｌ程度）、０．１２５（菌数３×１０７個／ｍｌ程度）、０．０６２（菌数１．５×１０７個／ｍｌ程度）、０．０３１（菌数１０７個／ｍｌ程度）及び０．０１６（菌数５×１０６個／ｍｌ程度）とし、インターロイキン１２の産生誘導試験のサンプルとした。
【００４３】
上記試験サンプルを用いて、マウス腹腔滲出マクロファージのインターロイキン１２産生反応に対するＯＳ株菌体の増強効果を試験した。チオグリコレート１ｍｌを腹腔内に投与し、刺激したマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雄、７週齢）から無菌的に腹腔滲出マクロファージを調製した。腹腔滲出マクロファージ細胞浮遊液の細胞数を測定した後、細胞数を２×１０６／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌを播種した。これにＲＰＭＩ１６４０培地（対照）と、ＯＳ株菌体を１×１０８個／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液を、それぞれ１穴当たり１００μｌ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で１日培養し、培養後の培養液上清のインターロイキン１２をエンザイムイムノアッセイで測定した。
【００４４】
エンザイムイムノアッセイは、ラット抗マウスインターロイキン１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を０．２Ｍ、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液で２μｇ／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え、室温で一晩放置し、ラット抗マウスインターロイキン１２抗体を各穴に付着させたプレートを用いて行った。培養上清を１穴当たり１００μｌ加え、室温で９０分間放置後、培養上清のマウスインターロイキン１２をプレートに付着したラット抗マウスインターロイキン１２抗体と結合させた。洗浄後ラットビオチン化抗マウスインターロイキン１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を加え、プレートに結合させたマウスインターロイキン１２に結合させた。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を加え、ビオチンと結合させた。ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させて、反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定して、リコンビナントマウスインターロイキン１２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で作成した標識曲線から、培養上清中のインターロイキン１２の濃度を求めた。その結果を図１に示す。
【００４５】
図１より、加熱殺菌済みのＯＳ株の菌体懸濁液は、各種濃度において、インターロイキン１２を大幅に産生させる効果を示した。すなわち、ＯＳ株菌体は、腸内細菌を増殖させるのみならず、インターロイキン１２産生についても効果を有することが確認された。
【実施例１】
【００４６】
（ＯＳ株による果汁の発酵）
（１）果汁原料
各種果汁をＯＳ株によって乳酸発酵し、発酵物を調製した。本実施例で用いた果汁とその調製法を表６に示す。
【００４７】
【表６】
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【００４８】
（２）スターターの作成
トマトエキスＳＴ−６０（前出）を蒸留水でＢｒｉｘ４．７に希釈してｐＨ６．０に調整し、１２１℃で１５分間加熱殺菌したトマトエキス培養液に、−８５℃でグリセロール保存しておいたＯＳ株を１白金耳接種して、３０℃で２４時間の培養条件で、２回の植え継ぎ培養した培養液をスターター（生菌数２×１０９個／ｍｌ含有）とした。
【００４９】
（３）果汁の発酵
表６の果汁各４００ｇをそれぞれ５００ｍｌ容デュランビンに入れて、上記スターターを１／１０００量となるよう接種（初発菌数：約１０６個／ｍｌ）し、３０℃で静置培養した。培養開始時、１８時間後、２４時間後及び４２時間後毎に、２０ｍｌずつ培養液をサンプリングして、これらサンプリング液をＭＲＳ寒天培地上３５℃で３日間培養し、出現するコロニーを計測することにより生菌数を測定した。結果を表７に示す。
【００５０】
【表７】
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【００５１】
表７より、オレンジ果汁、グレープフルーツ果汁、パッションフルーツ果汁、パイナップル果汁、バナナピューレ及びパイナップル果汁とバナナピューレの各種比率での混合物の発酵において、ＯＳ株の生菌数が１×１０８個／ｍｌ以上となった。これらの果汁及びピューレにおいてはＯＳ株の発酵が良好に進み、特にパイナップル果汁とバナナピューレの発酵においては、生菌数が、１×１０９個／ｍｌ以上となり、非常に高い発酵能を示した。得られた各種の果汁発酵物は、いずれも香味良好な果汁発酵物であった。
【実施例２】
【００５２】
（ＯＳ株による野菜汁の発酵）
（１）野菜汁原料
各種野菜汁をＯＳ株によって乳酸発酵し、発酵物を調製した。本実施例で用いた野菜汁とその調製法を表８に示す。
【００５３】
【表８】
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【００５４】
（２）スターターの作成
実施例１と同様の方法でスターターを作成した。
【００５５】
（３）野菜汁の発酵
表８の各種野菜汁４００ｇずつを５００ｍｌ容デュランビンに入れて、上記スターターを１／１０００量接種し、初発菌数を１０６個／ｍｌ程度にして、２５℃で静置培養した。そして培養開始時、１０時間後、２０時間後、２４時間後、３４時間後及び４４時間後に、２０ｍｌずつ培養液をサンプリングして、これらサンプリング液をＭＲＳ寒天培地上で３５℃３日間培養し、出現するコロニーを計測して、生菌数を測定した。その結果を表９に示す。
【００５６】
【表９】
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【００５７】
表９より、ＯＳ株は、トマトエキス、赤ピーマン汁、ほうれん草汁、ケール汁、人参汁及びタマネギ汁のすべての発酵において、その生菌数が１×１０８個／ｍｌ以上となり、上記野菜汁の発酵能が高いことが判明した。特にトマトエキス、赤ピーマン汁、ホウレン草汁、ケール汁の発酵においては、生菌数が１×１０９個／ｍｌ以上となり、非常に高い発酵能を示した。得られた各種の野菜汁発酵物は、いずれも香味良好な野菜汁発酵物であった。
【実施例３】
【００５８】
（ＯＳ株によるトマト処理物の発酵）
ＯＳ株とペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ０１２２株（以下ＮＲＩＣ０１２２株と記載、特許文献６記載のＴＵＡ０１２２株と同一菌株）を用いて、トマト処理物を以下の条件で発酵し、発酵能を比較した。
【００５９】
（１）スターターの作成
実施例１と同様の方法で作成したトマトエキス培養液に、ＯＳ株とＮＲＩＣ０１２２株をそれぞれ１白金耳接種し、２５℃で２４時間の培養条件で、２回植え継ぎ培養した培養液をスターター（それぞれ生菌数１×１０９個／ｍｌ含有）とした。
【００６０】
（２）トマトエキスの発酵
トマトエキスＳＴ−６０（日本デルモンテ社製）に、活性炭処理水を加えてＢｒｉｘ４．７に希釈し、ｐＨ６．０に調整したトマトエキス希釈液４００ｇを、５００ｍｌ容デュランビンに分注し、１０５℃で１分間加熱殺菌して本培養液とした。次いで、ＯＳ株とＮＲＩＣ０１２２株のスターター１ｍｌを、初発菌数が１×１０６個／ｍｌ程度となるように、当該本培養液にそれぞれ接種し、２５℃で５６時間静置培養した。
【００６１】
これらの培養期間中、経時的に該本培養液をサンプリングし、これらサンプリング液をＭＲＳ寒天培地上３５℃で３日間培養し、出現するコロニーを計測することにより、菌の生育状況を測定した。ＯＳ株とＮＲＩＣ０１２２株の定常期における菌数を１００％としたときの相対的な比率で示した各菌株の生育状況を図２に示す。
【００６２】
図２より、ＯＳ株とＮＲＩＣ０１２２株のトマトエキスＳＴ−６０希釈液の発酵における細胞倍加時間（世代時間）を算出したところ、ＯＳ株、ＮＲＩＣ０１２２株共に対数増殖期は、培養時間８時間から１６時間の間であり、ＯＳ株の倍加時間は６４．８分、ＮＲＩＣ０１２２株は８７．１分であった。また、当該トマトエキスの発酵が定常期に達する時間は、ＯＳ株では２４時間であったが、ＮＲＩＣ０１２２株では４８時間であった。すなわち、ＯＳ株は、より短時間で増殖し、定常期に到達することがわかる。従って、本発明における発酵停止の指標菌数である１×１０９個／ｍｌ以上に増加するまでの時間も短く、果菜発酵物の製造時間を大幅に短縮することができ、このことは、発酵過程での雑菌汚染防止等の観点からも非常に好ましい。
【実施例４】
【００６３】
（乳酸発酵トマト入り野菜・果実混合飲料の作成）
実施例３同様に、ＯＳ菌株を用いて３０℃、２４時間培養を行って得られたトマトエキス発酵液（生菌数１．７×１０９個／ｍｌ含有）を８５℃達温で加熱殺菌し、乳酸発酵トマトエキスを得た。この乳酸発酵トマトエキス３％に、りんごストレート果汁（日本デルモンテ社製）３７％と、人参濃縮汁（Ｂｒｉｘ４２、日本デルモンテ社製）を活性炭処理水で希釈してＢｒｉｘ６．０に調整した人参汁６０％を混合し、１２１℃で１秒間殺菌して冷却し、本発明の果菜発酵物を含有する飲料である、乳酸発酵トマト入り野菜・果実混合飲料を作成した。この野菜・果実混合飲料は風味良好であり、ＯＳ株菌体濃度は５．１×１０７個／ｍｌであった。従って、コップ１杯約２００ｍｌ中にＯＳ株菌体１×１０１０個（１００億個）を含有し、これを摂食することにより、実験例２に示すような腸内善玉菌を増加させるのに必要とされる量のＯＳ株菌体を容易に摂食できる。
する。
【実施例５】
【００６４】
（錠剤状サプリメントの作製）
実験例２と同様に作成したＯＳ菌体乾燥粉末（１ｇ当たり７．１×１０１２個のＯＳ菌体を含有）を用いて、表１０の配合量を混合撹拌後打錠して、１錠当たりＯＳ菌体を１×１０１２個含有する、１錠０．３５ｇのサプリメントを調整した。得られた錠剤状サプリメントを摂食することにより、実験例２に示すような腸内善玉菌を増加させるのに必要とされる量のＯＳ株菌体を容易に摂食できる。
【００６５】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】実験例３の結果であって、ＯＳ株菌体懸濁液の各種濃度におけるインターロイキン１２産生量を示すグラフである。
【図２】実施例３の結果であって、定常期の菌数を１００％としたときのＯＳ株とＮＲＩＣ０１２２株のトマトエキス中での生育状況を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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