(57)【要約】【課題】  ヒトのMTG8、MTGR1、MTG16および白血病融合タンパク質AML1-MTG8に関係して引き起こされる疾患の発症機構の解明、診断および治療に利用可能な物質、または転写などの細胞内プロセスの研究に利用可能な物質を提供する。【解決手段】  SELEX法によって得られたMTG8 TAFドメインに対して結合活性を有するRNA。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列からなるRNA。
【請求項２】
下記の式（Ｉ）に示す二次構造を形成することができる塩基配列からなり、MTG8 TAFドメインに対して結合活性を有するRNA。
【化１】
2008167688.tif 000005
（式中、Xは任意の核酸塩基を表し、N1及びN2は互いに相補的な１以上の核酸塩基を表す。）
【請求項３】
請求項１又は２に記載のRNAの塩基配列に１若しくは数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列からなるRNAであって、MTG8 TAFドメインに対して結合活性を有するRNA。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載のRNAに別のRNAを付加したRNAであって、MTG8 TAFドメインに対して結合活性を有するRNA。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載のRNAの一部を切断して短くしたRNAであって、MTG8 TAFドメインに対して結合活性を有するRNA。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載のRNAにおいて少なくとも1個の修飾ヌクレオチドが導入されているRNAであって、MTG8 TAFドメインに対して結合活性を有するRNA。
【請求項７】
標識化されている請求項１乃至６のいずれか一項に記載のRNA。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載のRNAの塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNA。
【請求項９】
請求項８に記載のDNAが挿入されたベクター。
【請求項１０】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載のRNAを用いて、MTG8、MTGR1、MTG16、若しくはAML1-MTG8、又はこれらのタンパク質のフラグメントを検出する方法。
【請求項１１】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載のRNAを用いて、MTG8、MTGR1、MTG16、若しくはAML1-MTG8、又はこれらのタンパク質のフラグメントを定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はMTG8 TAFドメインに結合するリボ核酸に関するものである。このリボ核酸は、MTG8 TAFドメインだけでなく、MTG8、MTGR1、MTG16およびAML1-MTG8とも結合するので、これらのタンパク質の検出、定量に有用である。
【背景技術】
【０００２】
白血病では、病型に特徴的な染色体転座が多く見られ、転座による遺伝子融合で新たな癌遺伝子が生じる。急性骨髄性白血病の10〜15%は、t(8;21)染色体転座を伴う。この転座によって転写因子AML1(別名RUNX1)のRUNTドメインとMTG8(別名ETO)のほぼ全域が連結したAML1-MTG8(別名AML1-ETO)が新たに生産される。MTG8は転写抑制活性を持つタンパク質であるため、AML1-MTG8は、造血系細胞の発生や分化に必須な転写因子AML1をドミナントに抑制すると考えられる。実際に分化に関わる転写因子や分化形質タンパク質の発現が抑制されることがこれまでに明らかにされている。さらに、細胞分化に伴う細胞周期の停止やアポトーシスの誘導を担うp53の安定化タンパク質p14ARFの発現もAML1-MTG8によって抑えられる。従ってAML1-MTG8の発現は幹細胞の自己複製の増進、分化抑制をもたらす事で癌化の要因になると考えられる。
【０００３】
現在、染色体転座を持つ白血病では、融合遺伝子を標的とした治療薬が開発され、実際に白血病の治療が行われている。慢性骨髄性白血病の分子標的治療薬であるイマチニブ(グリベック ノバルティス社)は、BCR-ABLタンパク質を標的として、ABLのチロシンキナーゼ活性を阻害することでがん細胞で異常に活性化した細胞増殖シグナルを阻害し、白血病細胞の増殖を抑制することによって高い治療効果を上げている。また、PML-RARαを発現する急性骨髄性白血病では、大量のレチノイン酸の投与によってPML-RARαによる転写不活性化を解除し、ブロックされていた転写を再度活性化し、細胞の分化誘導を再開させる治療が行われている。白血病融合遺伝子に対する核酸医薬としては、リボザイム、アンチセンス、siRNA等によって融合遺伝子の発現の抑制が研究されているが、医薬品として応用可能なものは今のところ得られていない。白血病治療薬としてのアンチセンス製剤としては、Bcl-2を標的としたGenasense (Genta社 米国)が現在第3相臨床試験まで進行している。
【０００４】
AML1は、RUNTドメインおよびtrans activation (TA)ドメインを持つ約49kDaのタンパク質因子で、CBFβと複合体を形成してコア結合因子とよばれる転写因子を形成する。AML1のDNA結合ドメインであるRUNTドメインは、認識配列に結合し、転写のコアクチベーターであるヒストンアセチル化酵素p300/CBP等と複合体を形成することで様々な造血細胞特異的な遺伝子の転写の活性化を行う。MTG8は、TAFドメインやZn fingerドメインを持つ約68kDaのタンパク質因子でN-CoR、mSin3A、SMRT、HDACs等と複合体を形成し、転写因子HEBと協調して遺伝子の転写の不活性化を行う。t(8;21)染色体転座によって、AML1のRUNTドメインとMTG8のほぼ全長が融合したAML1-MTG8が形成される。AML1-MTG8融合タンパク質は、約84kDaのタンパク質でAML1に対してドミナントネガティブに働き、血球細胞の分化に必須な転写活性化が抑制されることが白血病の発症に関与すると考えられている。
【０００５】
MTG8のファミリー遺伝子としては、MTGR1(別名EHT、CBFA2T2)およびMTG16(別名MTGR2、CBFA2T3)がある。MTGR1は約67kDa、MTG16は約71kDaのタンパク質因子で、MTG8同様のTAFドメインやZn fingerドメインを保持し、MTG8とアミノ酸レベルでの相同性が非常に高い。これらタンパク質は、MTG8と同じようにN-CoR、mSin3A、SMRT、HDACs等と複合体を形成し遺伝子の転写の不活性化を行う。さらにMTGR1は、MTG8と複合体を形成し、転写抑制の働きを増強することがわかっている。
【０００６】
ところで、in vitroにおいてある標的物質と特異的に結合するRNAを選択・濃縮する手法として、SELEX法と呼ばれる新たな手法が開発されている(非特許文献１)。SELEX法は、PCRプライマー用の配列（一方にはT7ポリメラーゼの配列を含む）を両端に含む適当な長さのランダム配列を持つRNAを合成し、これを標的タンパク質と会合させ固相化する。結合しなかったRNAを洗浄後、結合したRNAを回収し、RT-PCRで増幅後、次のラウンドで用いるRNAのテンプレートとする。これを１０ラウンド前後繰り返すことにより、標的タンパク質と特異的に結合するRNAアプタマーを取得する。この方法では、標的タンパク質の機能を促進や阻害するような生理活性を持つRNAを取得することが可能である。このことは病原タンパク質をターゲットにしてSELEXを行うことにより、得られたアプタマーを医薬品として応用できることを示唆している。従来の創薬に比べこのSELEX法を用いた創薬の優れている点として（１）従来の化学物質のスクリーニングより大規模の母集団よりスクリーニングをシステマティックに行える。（２）試験管内で容易に大量合成することができる。（３）免疫排除がない。（４）容易に合目的に改良を行える。（５）保存性が高く抗体を作ることが困難なタンパク質を標的にできる。などがあげられる。
【０００７】
【非特許文献１】C. Tuerk & L. Gold, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science 249:505-510, 1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヒトのMTG8、MTGR1、MTG16および白血病融合タンパク質AML1-MTG8に関係して引き起こされる疾患の発症機構の解明、診断および治療に利用可能な物質、または転写などの細胞内プロセスの研究に利用可能な物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、このような物質の候補としてMTG8 TAFドメインに対するRNAアプタマーを作製した。すなわち、MTG8 TAFドメインを標的タンパク質としてSELEXを行ない、得られたアプタマーの標的タンパク質およびMTGR1、MTG16、AML1-MTG8との結合活性を調べ、その有用性を示した。本発明は、これらの知見に基づいて、完成されたものである。
【００１０】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列からなるRNA。
（２）下記の式（Ｉ）に示す二次構造を形成することができる塩基配列からなり、MTG8 TAFドメインに対して結合活性を有するRNA。
【化１】
2008167688.tif 000002
（式中、Xは任意の核酸塩基を表し、N1及びN2は互いに相補的な１以上の核酸塩基を表す。）
（３）（１）又は（２）に記載のRNAの塩基配列に１若しくは数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列からなるRNAであって、MTG8 TAFドメインに対して結合活性を有するRNA。
【００１１】
（４）（１）〜（３）に記載のRNAに別のRNAを付加したRNAであって、MTG8 TAFドメインに対して結合活性を有するRNA。
（５）（１）〜（４）のRNAの一部を切断して短くしたRNAであって、MTG8 TAFドメインに対して結合活性を有するRNA。
（６）（１）〜（５）のいずれか一項に記載のRNAにおいて少なくとも1個の修飾ヌクレオチドが導入されているRNAであって、MTG8 TAFドメインに対して結合活性を有するRNA。
（７）標識化されている（１）〜（６）のRNA。
【００１２】
（８）（１）〜（７）に記載のRNAの塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNA。
（９）（８）に記載のDNAが挿入されたベクター。
（１０）（１）〜（７）のいずれか一項に記載のRNAを用いて、MTG8、MTGR1、MTG16、若しくはAML1-MTG8、又はこれらのタンパク質のフラグメントを検出する方法。
（１１）（１）〜（７）のいずれか一項に記載のRNAを用いて、MTG8、MTGR1、MTG16、若しくはAML1-MTG8、又はこれらのタンパク質のフラグメントを定量する方法。
【００１３】
（１）のRNAはMTG8 TAFドメインに対して結合活性を有する。ここで「結合活性を有する」とは、ランダム配列のRNAプールより高い結合活性を有していることを意味する。（１）のRNAはMTG8 TAFドメインと結合するので、MTG8様TAFドメインを含むタンパク質とも結合する。MTG8様TAFドメインを含むタンパク質としては、MTG8、MTGR1、MTG16、AML1-MTG8などを例示できる。
【００１４】
（２）のRNAは結合活性を失わせない範囲で、配列番号１記載の塩基配列からなるRNAの一部のヌクレオチドを変更したRNAである。式（Ｉ）におけるXは任意の核酸塩基を表すが、好適には、A又はCを表す。式（Ｉ）におけるN1及びN2は互いに相補的な１以上の核酸塩基を表すが、好適には、互いに相補的な３〜５の核酸塩基を表す。
【００１５】
（３）のRNAは（１）及び（２）のRNAに変異を導入してSELEXを再度行なうことで得ることができる。ここで得られる進化したRNAは（１）や（２）のRNAよりも結合活性や生理活性が高い可能性がある。このようにRNAに変異を導入することにより、種々の目的に合ったRNAアプタマーを作製することができる。置換、欠失若しくは挿入される塩基の個数は、数個以内であればよいが、好ましくは5個以下であり、最も好ましくは１個である。
【００１６】
（４）のRNAにおいて、付加されるRNAの長さは特に限定されないが、100mer以下であることが好ましく、30mer以下であることが更に好ましい。このように別のRNAを付加することにより、種々の目的に合ったRNAアプタマーを作製することができる。
【００１７】
（５）のRNAは、（１）〜（４）のRNAを目的に応じて短くしたものである。短くするのは、5'末端又は3'末端のいずれか一方でもよく、また、両方の末端でもよい。また、二次構造上、塩基対合を取らないループ領域を欠失させたものでもよい。切断する長さは特に限定されないが、3〜20merであることが好ましく、3〜10merであることが更に好ましい。（５）のRNAの具体例としては、TAF1-S1（配列番号７）、TAF1-S2（配列番号８）などを挙げることができる。
【００１８】
（６）のRNAは（１）〜（５）のRNAのリボースの部分または核酸塩基の部分または5'末端または3'末端を修飾したもので、（１）〜（５）のRNAの安定性、結合活性、生理活性を高めることができる。例えば、ピリミジンヌクレオチドのリボースの2'-OHをフルオロ化またはメチル化するとリボヌクレアーゼ耐性になり、安定性が飛躍的に向上する。なお、修飾ヌクレオチドにはデオキシリボヌクレオチドも含まれる。
【００１９】
（７）の標識化されているRNAは、MTG8、MTGR1、MTG16、若しくはAML1-MTG8、又はこれらのタンパク質のフラグメントの検出と定量に用いることができる。例えば、蛍光物質で標識化したアプタマーを細胞内に導入することで、細胞内での上記のタンパク質の挙動が観察できる。また、5'末端をビオチン化し固相化することで、RNAアプタマーを用いたTAFドメインを持ったタンパク質の分離カラムを作製することができる。なお、「MTG8、MTGR1、MTG16、若しくはAML1-MTG8のフラグメント」とは、MTG8、MTGR1、MTG16、若しくはAML1-MTG8のタンパク質の一部で、そのアミノ酸配列からそれがMTG8、MTGR1、MTG16、若しくはAML1-MTG8の一部であると認識できるものをいう。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によりMTG8、MTGR1、MTG16およびその他のTAFドメインを持つタンパク質に対して結合能を有するRNAアプタマーが提供される。本発明のRNAアプタマーは、AML1-MTG8白血病融合タンパク質の機能解析やがんなどの疾患の診断および治療に利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明において用いたSELEX法の概略を図１に示す。
MTG8タンパク質に対するRNAアプタマーの選択は、N末端にGlutathione-S-transferase(GST)が融合したMTG8 TAFドメインを大腸菌内で高発現させ、それをGlutathione Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare社)で一次精製し、Resource Sカラム(GE Healthcare社)で二次精製したものを標的タンパク質に用いて行った。以下、実験で用いているMTG8 TAFドメインとはGSTを融合したタンパク質のことをいう。これをGlutathione Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare社)またはGlutathione Sepharose 4B(GE Healthcare社)に固相化し、30merあるいは40merのランダム配列をもつRNAプールに対してselectionを行った。6ラウンドまでselectionのサイクルを回した後、濃縮されてきたRNAに対応するcDNAをpGEM-T Vector (Promega社)にクローン化し、塩基配列を決定した。その結果、30merのランダム配列を持つRNAプールから4種類、40merのランダム配列を持つRNAプールから2種類の収束した配列が得られた（図２）。これらをそれぞれTAF1(配列番号1), TAF2(配列番号2), TAF3(配列番号3), TAF4(配列番号4), TAF5(配列番号5), TAF6(配列番号6)と名付けた。
【００２２】
収束した配列の結合活性を、BIACORE Xシステム(Biacore AB社)を使用した表面プラズモン共鳴解析によって測定した。あらかじめビオチン化したpoly-dTを固定化したsensor Chip SA(Biacore AB社)に、poly-Aを付加したRNAを固定化し、MTG8 TAFドメインをインジェクションすることによって、得られたRNAに結合活性があるか調べた（図３）(図はMTG8 TAFドメインをインジェクションした時のグラフを示す)。selectionによって得られたRNAは、すべてMTG8 TAFドメインに対して結合能を持っていた。selectionによって得られたRNAの解離定数KdをBIACORE Xシステムを使った実験によって算出した（表１）。
【表１】
2008167688.tif 000003
【００２３】
得られたRNAアプタマーのうちselectionの出現頻度が高かったTAF1の二次構造を、RNAstructure ver.4.3(http://rna.urmc.rochester.edu/index.html)で予測した。予測した二次構造から、MTG8 TAF ドメインとの結合活性を有したままTAF1を小型化することを試みた。２つのステム構造と２つのループ構造をそのまま残し、5'末端を13mer、3'末端を7mer短くし、T7 RNAポリメラーゼによって転写ができるように1番目の塩基をGに置換したTAF1-S1(配列番号７)と5'末端を15mer、3'末端を11mer短くし、T7 RNAポリメラーゼによって転写ができるように2、3番目の塩基をGに、35、36番目の塩基をCに置換したTAF1-S2(配列番号８)を作製した（図４）。小型化したRNAの結合活性をBIACORE Xシステム(Biacore AB社)を使用して調べた。小型化したRNAアプタマーはどちらも、MTG8 TAFドメインとの結合能を保持していた（図５）。算出した結合定数Kdの値も、TAF1と比べてほとんど変わらなかった（表１）。このことから、結合活性を全く低下させることなくTAF1を小型化することができた。
【００２４】
ピリミジンヌクレオチドの2'-OHをフルオロ化した場合、MTG8 TAFドメインとの結合活性に影響があるか調べた。これら修飾RNAアプタマーの結合活性をBIACORE Xシステム(Biacore AB社)を使用して調べた（図６、表１）。得られたRNAアプタマーは、ピリミジンヌクレオチドの2'-OHをフルオロ化にしてもMTG8 TAFドメインとの結合活性へは影響がほぼないことがわかった。したがって、得られたRNAアプタマーは、結合活性を保持したままヌクレアーゼ耐性を獲得できることが示された。
【００２５】
MTG8 TAFドメインと結合する際、RNAアプタマーの必要な要素を調べるために、TAF1-S1のloop領域の塩基を一つずつ他の塩基に置換した変異体を作製した(配列番号9〜14)。それら変異体RNAとMTG8 TAFドメインに対する結合活性をBIACORE Xシステムで調べた。22番目のAをCに置換した変異体は、結合活性を保持していたが、ほかの変異体の結合活性はほとんどなくなっていた（図７）。これにより、変異を導入した5塩基からなるloop部分は、MTG8 TAFドメインとの結合に重要な役割を果たしていることいえる。
【００２６】
得られたRNAアプタマーによって、ヒト培養細胞のライセートからタンパク質を特異的にpull-downすることが可能か調べた。AML1-MTG8、MTG8、MTGR1、MTG16をそれぞれ発現させたHeLa細胞のライセートとピリミジン2'-フルオロ化TAF1を固定化したStreptavidin Sepharose High Performance(GE Healthcare社)をよく混合し、4℃で30分間緩やかに撹拌した。樹脂をBuffer Aでよく洗浄した後、4M Ureaを加えて吸着したタンパク質を溶出した。回収した溶出画分を、NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (1×NuPAGE MES SDS Running Buffer使用, Invitrogen社)を使い電気泳動した。特異的ペプチド抗体を用いたウエスタンブロット法を使用し、RNAアプタマーによってAML1-MTG8、MTG8、MTGR1、MTG16がpull-downできていているのかを分析した。その結果、RNAアプタマーを固定化した樹脂を用いた場合にのみAML1-MTG8、MTG8、MTGR1、MTG16のそれぞれのバンドが特異的に検出できた（図８）。これにより、ヒト培養細胞のライセート中からRNAアプタマーを固定化した樹脂が分離カラムとして機能しうることが示唆された。さらに、この実験により、得られたRNAアプタマーが全長のAML1-MTG8およびMTG8、MTGR1、MTG16に対しても結合活性を有することが証明された。
【００２７】
ヒト急性骨髄性白血病では、血球細胞においてAML1によって転写が活性化されるべき遺伝子がAML1-MTG8によって抑制されている。得られたRNAアプタマーによってAML1-MTG8によるこのドミナントな転写の抑制を解除することができれば、血球細胞の正常な分化が促されるはずであり、RNAアプタマーの白血病の治療薬への応用が期待できる。RNAアプタマーによる転写抑制の解除のモデル実験をBIACORE Xシステム(Biacore AB社)を使用して行った。実験の結果、30N ランダムRNAをインジェクションしてもRUの変化が全くないのに対して、TAF1-S2をインジェクションした場合、RU値は大幅に低下した（図９）。このRU値の低下は、TAF1-S2によってAML1認識dsDNAからAML1-MTG8様融合タンパク質が解離したこと意味する。この結果により、得られたRNAアプタマーによって、AML1-MTG8の転写抑制を解除することが可能であり、白血病の治療薬への応用も可能であると考える。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明の実験の手法を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するものであって、本発明の範囲を指定するものではない。
【００２９】
［実施例1］タンパク質精製
本発明で用いたヒトMTG8 TAFドメインはN末端にGSTタグのついた融合タンパク質として大腸菌内で過剰発現させ、Glutathione Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare社)で粗精製し、陽イオン交換カラムResource S(カラム容量１ml、GE Healthcare社)により精製した。AML1-MTG8様融合タンパク質(AML1-MTG8の融合部位周辺のRUNTドメインとTAFドメインを含むタンパク質)は、N末端にヒスチジンタグのついた融合タンパク質として大腸菌内で過剰発現させ、Ni-NTAアガロース（Qiagen社）を用いて粗精製し、さらに陽イオン交換カラムResource S（GE Healthcare社）、ゲルろ過カラムHiLoadTM 16/60 SuperdexTM 200 prep grade（GE Healthcare社）により精製した。
【００３０】
［実施例2］RNAアプタマーの取得
SELEX法を用いたin vitro RNA selectionはEllingtonらの方法（Ellington A.D. and Szostak J.W., In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature, 346:818-822, 1990）およびTuerkらの方法（Tuerk C. and Gold L., Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science, 249:505-510, 1990）を改良して行った。SELEXに用いたRNAプールは化学合成した以下のプライマーおよびランダム配列テンプレート（SIGMA GENOSYS社に合成依頼）より作成した。Klenow Fragment（Large Fragment E. coli DNAポリメラーゼ I, TAKARA BIO INC.社）により二本鎖DNAとし、これを転写のテンプレートとして、プライマーP１に含まれるT7 RNAポリメラーゼのプロモーターにより、AmpliScribe T7-Flash Transcription Kit(EPICENTRE Biotechnologies社)を用いて転写し、フェノール抽出とゲルろ過により精製した。
【００３１】
P1:    5'-TAATACGACTCACTATAGGGACACAATGGACG-3'(配列番号15)
30N ランダム配列テンプレート：    5'- CTCTCATGTCGGCCGTTA(30N)CGTCCATT
GTGTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3' (配列番号16)
40Nランダム配列テンプレート:    5'-CTCTCATGTCGGCCGTTA(40N)CGTCCATTGT
GTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3' (配列番号17)
RNAとタンパク質の結合はBuffer A[20mMリン酸ナトリウム(pH6.5),2mM酢酸マグネシウム,50〜200mM酢酸カリウム(selectionサイクルが進むにつれて段階的に上昇させた（表２）,0.1%(v/v) TWEEN 20,1mM (±)-ジチオトレイトール]中で行った。RNAとの反応後、をGlutathione Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare社)またはGlutathione Sepharose 4B(GE Healthcare社)によりpull-down後、RNAを回収し、プライマーP2を用いて逆転写した後、PCRでcDNAを増幅した。このcDNAを用いAmpliScribe T7-Flash Transcription Kit (EPICENTRE Biotechnologies社)でin vitro転写を行い次のラウンドのRNAを得た。
【００３２】
P2:    5'-CTCTCATGTCGGCCGTTA-3' (配列番号18)
６ラウンドselectionを行った後、そのPCR産物をpGEM-T vector（Promega社）にサブクローニング後、大腸菌株XL1 Blue（STRATAGENE社）に形質転換導入し、単一クローンを得た。これらは、plasmidを抽出後DNA sequencer (model 3100, ABI社)で、以下のsequence primerを用いて塩基配列を決定した。
sequence primer:    5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'（配列番号19）
【表２】
2008167688.tif 000004
【００３３】
［実施例3］結合活性の評価
６ラウンド後に得られたRNAのMTG8 TAFドメインに対する結合活性を、BIACORE Xシステム(Biacore AB社)を使用した表面プラズモン共鳴解析によって調べた。測定には、sensor chip SA(Biacore AB社)のフローセル 1にビオチン化プライマーP3を付加させたものを使用した。
【００３４】
P3:    5'-ビオチン-TTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号20）
また、sensor chip SAにRNAを固定化するために、あらかじめ3'末端にAが16個付加したRNAを用意した。配列の決定の際得られたRNAアプタマーの配列が組み込まれたベクターをテンプレートとして、PCRでcDNAを増幅した。この時、5'側のprimerには、P1(配列番号15)を、3'側のprimerにP4を用いた。
【００３５】
P4:     5'-TTTTTTTTTTTTTTTTCTCTCATGTCGGCCGTTA（配列番号21）
このPCRで増幅させたcDNAを転写のテンプレートとして、[実施例２]と同様の方法で3'末端にAが16個付加したRNAを得た。
【００３６】
selectionによって得られたRNAに対する結合活性は、Buffer B(20 mMリン酸Na(pH 6.5), 2 mM 酢酸マグネシウム, 200 mM 酢酸カリウム, 0.1 %(v/v) TWEEN 20, 1 mM (±)-ジチオトレイトール)、流速20μl/minで測定した。はじめに3'末端にpoly-Aを付加したRNA(4ng/μl)をNormal Injectionモードで20μl インジェクションした。その4分後に、180秒間のDelayed Injectionモードで100nMのMTG8 TAFドメインを20μl インジェクションした。
【００３７】
解離定数Kdの算出には、sensor chip SA(Biacore AB社)のフローセル 1に約100 RUのビオチン化プライマーP3を付加させたものを使用した。Buffer B、流速20μl/minで実験した。3'末端にpoly-Aを付加したRNA(4ng/μl)をNormal Injectionモードで20μlインジェクションした。その4分後に、180秒間のDelayed Injectionモードで1〜100 nMのMTG8 TAFドメインを20μlインジェクションした。解離定数Kd は、データ解析ソフトウェアBIA evaluation version 4.1(Biacore AB社)を使って算出した。
【００３８】
［実施例4］RNAアプタマーの小型化
RNAアプタマーTAF1の二次構造は、RNA structure ver.4.3 (http://rna.urmc.
rochester.edu/index.html)で予測した。予測した二次構造から、5'末端を13mer、3'末端を7mer短くし、T7 RNAポリメラーゼによって転写ができるように1番目の塩基をGに置換したTAF1-S1(配列番号７)と5'末端を15mer、3'末端を11mer短くし、T7 RNAポリメラーゼによって転写ができるように2、3番目の塩基をGに、35、36番目の塩基をCに置換したTAF1-S2(配列番号８)を作製した。転写の鋳型となるDNAとして、5'側にT7プロモーターを配したTAF1-S1あるいはTAF1-S2の配列を持つDNAを合成した（SIGMA GENOSYS社に合成依頼）。TAF1-S1の配列をもつ合成DNAには、３'側のprimerとしてP6（配列番号23）を用い、TAF1-S2の配列をもつ合成DNAには、３'側のprimerとしてP7（配列番号24）をそれぞれ用い、５'側のprimerには、P５（配列番号22）を用いてPCRし、それを転写用の鋳型DNAとした。この鋳型DNAによって、転写した際に、3'側にpolyAが付加した形でRNAを調製した。これら小型化したRNAのMTG8 TAFドメインに対する結合活性は、前述したBIACORE Xシステム(Biacore AB社)を使用した方法で分析した
【００３９】
［実施例5］MTG8 TAFドメインと結合するための必要なRNAアプタマーの要素の決定
MTG8 TAFドメインと結合するために必要なRNAアプタマーの要素を調べるために、TAF1-S1の5塩基からなるloop領域の塩基を一つずつ他の塩基に置換した変異体を作製した(配列番号9〜1４)。配列中の塩基の番号付けは、5'末端の塩基を１とし、3'側に昇順にした。転写の鋳型となるDNAは、5'側にT7プロモーターを配した変異体の配列を持つDNAを合成した（SIGMA GENOSYS社に合成依頼）。合成DNAを、5'側にprimerにP5（配列番号22）を、３'側のprimerはP6（配列番号23）を用いてPCRし、転写用の鋳型DNAとした。この鋳型DNAによって、転写した際に、3'側にpolyAが付加した形でRNAを調製した。それら変異体RNAのMTG8 TAFドメインに対する結合活性は、BIACORE Xシステムを使用し、前述した条件で行った。
【００４０】
［実施例6］RNAアプタマーのピリミジンヌクレオチド2'-OHのフルオロ化による結合活性への影響の検討
RNAのピリミジンヌクレオチドのリボースの2-OHをフルオロ化するとリボヌクレアーゼ耐性になり、安定性が飛躍的に向上する。ピリミジンヌクレオチドを2'-フルオロ化したRNAは、[実施例２]と同様の方法で転写用のテンプレートを調製し、DuraScribe T7 Transcription Kit (EPICENTRE Biotechnologhies社)を使って調製した。
【００４１】
［実施例7］AML1-MTG8、MTG8、MTGR1、MTG16を一過性に発現するHeLa細胞を作製する実験
HeLa細胞はRPMI1640培地（日水製薬社）に10％牛胎児血清（HyClone社）およびペニシリン・ストレプトマイシン（GIBCO社）を加えた培地中で、37℃、5％炭酸ガス存在下で培養した。発現ベクターを導入する前日に10cmシャーレに  2 x 106個のHeLa細胞を播いた。発現ベクターとしてpDEST26-MTG8｛pDEST26(N末端にヒスチジンタグがついたタンパク質を発現するほ乳動物細胞用発現ベクター、Invitrogen社)にMTG8bの全コード領域の配列を挿入したもの｝およびpDEST26-AML1-MTG8(pDEST26にAML1-MTG8の全コード領域の配列を挿入したもの)およびpVP16-MTGR1｛pVP16タンパク質を発現するほ乳動物細胞用発現ベクター、Clontech社｝にMTGR1の全コード領域の配列を挿入したもの｝およびpLNCX-MTG16｛pLNCXタンパク質を発現するほ乳動物細胞用発現ベクター、Clontech社｝にMTG16の全コード領域の配列を挿入したもの｝を用いた。陰性対象としてpDEST26(何も挿入していない)を用いた。各発現ベクター20μgに対し陽イオン性リポフェクション試薬DMRIE-C(Invitrogen社)30μlをOPTI-MEM培地(Invitrogen社) 5ml中で混合し、室温で45分放置し、リポソームを形成させた。発現ベクター／DMRIE-Cを直前にOPTI-MEM培地で一回洗浄したHeLa細胞に加え、37℃、5％炭酸ガス存在下で4時間処理した。20％牛胎児血清を含むRPMI1640培地を5ml加え、さらに37℃、5％炭酸ガス存在下で培養した。24時間後に細胞をPBSで一回洗浄し、1mlのPBS(136.8mM NaCl、2.68mM KCl、20mMリン酸Na(pH 7.4))を加えラバーポリスマンで細胞をかきとり、1.5mlの遠心管に移した。細胞を遠心（800×g、1分）して集め、上清を除いた。
【００４２】
［実施例8］ヒトの培養細胞ライセートのpull-down実験
AML1-MTG8、MTG8、MTGR1、MTG16をそれぞれ発現したHela細胞(ヒト子宮がん由来のセルライン)をBuffer A(20 mMリン酸Na(pH 6.5), 2 mM 酢酸マグネシウム, 200 mM 酢酸カリウム, 0.1%(v/v) TWEEN 20, 1 mM (±)-ジチオトレイトール, Protease inhibitor (Protease Inhibitor Cocktails for General, SIGMA社))に懸濁し、超音波で破砕した。15,000 rpmで30分間遠心し、上清を回収してこれを培養細胞ライセートとした。100pmol P３、100pmol 3'末端polyA付加ピリミジンヌクレオチド2'-フルオロ化TAF1と20μl Streptavidin Sepharose High Performance(GE Healthcare社)をよく混合し、4 ℃に10分間放置した。Buffer Aでよく樹脂を洗浄した後、ヒト培養細胞ライセート30μgとYeast RNA (Ambion社) 20μgをBuffer Aでtotal 200μl にしたものを加えた。それを4 ℃ で30分間緩やかに撹拌した。樹脂をBuffer Aでよく洗浄した後、4M Ureaを加えて吸着したタンパク質を溶出した。溶出液は、限外濾過チューブ(Microcon-10, MILLIPORE社)で濃縮して、NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (1×NuPAGE MOPS SDS Running Buffer使用, Invitrogen社)によって電気泳動した。泳動後、Sequi-Blot PVDF Membrane(BIO-RAD社)にタンパク質を転写した。転写後、5 %(w/v)スキムミルクを含むTBS-T(20 mM Tris, 500 mM NaCl, 0.1 %(v/v) TWEEN 20, pH7.5)にメンブレンを入れ、1時間振とうした。メンブレンをTBS-Tで10分間振とうして洗浄する操作を3回行った。次に、0.5 %カゼイン入りTBS-Tで2.5μg/ml に調製したAnti-human MTG8 TAF Domainをメンブレンに入れて1時間浸透し、TBS-Tで10分間振とうして洗浄する操作を3回行った。さらに、TBS-Tで1000倍に希釈したAnti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (GE Healthcare社)をメンブレンに入れ1時間浸透し、TBS-Tで10分間振とうして洗浄する操作を3回行った。検出には、ECL plus Western Blotting Detection System (GE Healthcare社)を用い、ルミノイメージアナライザー(LAS-1000, Fujifilm社)で分析した。
【００４３】
［実施例9］TAFアプタマーのヒト急性骨髄性白血病の治療へ応用のモデル実験
TAFアプタマーによるAML1-MTG8とAML1結合dsDNAの結合の解離実験は、BIACORE Xシステム(Biacore AB社)を使用して行った。sensor chip SA(Biacore AB社)のフローセル 1にビオチン化プライマーP3を約200RU付加させたものを使用し、Buffer B、流速20μl/minで実験した。はじめにAML1 RUNTドメインが認識する配列を含んだ二本鎖DNA(AML1結合dsDNA、配列番号25,26)をNormal Injectionモードで20μl インジェクションした。その3分後に、100nMのAML1-MTG8様融合タンパク質を20μl をNormal Injectionモードでインジェクションした。120秒間のDelayed Injectionモードで1μMのTAF1-S2または30N ランダムRNAを20μl インジェクションした。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】SELEX法の概略を示す図。初回のサイクルでは、T7 RNAポリメーラーゼプロモーター配列とランダム領域を含むDNAを合成し、P1,P2をプライマーに用いてPCRを行い、テンプレートを得る。これから合成したRNAを標的物質と会合させ、結合したRNAを回収する。回収したRNAからRT-PCRにより次のラウンドへのテンプレートを得る。本発明ではこれを６ラウンド繰り返した。最終ラウンドでのRT-PCR産物をクローニング、塩基配列決定に回す。
【図２】SELEX法によって選択されたRNAの配列を示す図。選択されてきた６ラウンド目のRNAプールの塩基配列を決定したところ、30Nランダムプール由来のRNAは４タイプの配列に収束しており、40Nランダムプール由来のRNAは２タイプの配列に収束していた。selectionでの出現頻度を図中に示した。これらのRNAを図中の配列の上よりTAF1、TAF2、TAF3、TAF4、TAF5、TAF6とした。
【図３】BIACORE Xシステムを用いた結合実験の結果を示す図。RNAをsensor Chip上に固定化し、100nMのMTG8 TAFドメインをインジェクションした。RUの上昇は、sensor Chip上に30NランダムRNAまたは40NランダムRNAを固定化した場合より、明らかに、収束していた配列を持つすべてのRNAは大きかった。したがって、TAF1〜6はすべてMTG8 TAFドメインに対して結合活性があることが示された。図は、MTG8 TAFドメインをインジェクションした時のグラフを示す。
【図４】TAF1、TAF1-S1、TAF1-S2の二次構造を示す図。右はTAF1を、中はTAF1-S1を、左はTAF1-S2の二次構造を示す。
【図５Ａ】BIACORE Xシステムを用いたTAF1-S1の結合実験の結果を示す図。RNAをsensor Chip上に固定化し、100nMのMTG8 TAFドメインをインジェクションした。TAF1-S1を固定化してもTAF1を固定化した場合同様に、RUの上昇が確認できた。図はMTG8 TAFドメインをインジェクションした時のグラフを示す。
【図５Ｂ】BIACORE Xシステムを用いたTAF1-S2の結合実験の結果を示す図。RNAをsensor Chip上に固定化し、100nMのMTG8 TAFドメインをインジェクションした。TAF1-S2を固定化してもTAF1を固定化した場合同様に、RUの上昇が確認できた。図はMTG8 TAFドメインをインジェクションした時のグラフを示す。
【図６】BIACORE Xシステムを用いた結合実験の結果を示す図。RNAをsensor Chip上に固定化し、100nMのMTG8 TAFドメインをインジェクションした。ピリミジンヌクレオチド2'-フルオロ化TAF1〜6はすべてMTG8 TAFドメインをインジェクションしたときRU値の上昇がみられた。図は、MTG8 TAFドメインをインジェクションした時のグラフを示す。
【図７】BIACORE Xシステムを用いた、TAF1-S1変異体の結合実験の結果を示す図。RNAをsensor Chip上に固定化し、100nMのMTG8 TAFドメインをインジェクションした。図はMTG8 TAFドメインをインジェクションした時のグラフを示す。
【図８】ヒト培養細胞ライセートのRNAアプタマーによるpull-down実験のウエスタンブロットの結果を示す図。HeLa、AML1-MTG8発現細胞、MTG8発現細胞、MTGR1発現細胞、MTG16発現細胞は、それぞれのライセートをそのまま流したレーンを示す。「＋」は、TAF1をStreptavidin Sepharose High Performanceに固定化した樹脂を使用したサンプルを、「−」は、何も固定化していない樹脂を使用したサンプルを示す。Markerは、Invitrogen社のMagicMarkTM XPを流したレーンを示す。
【図９】BIACORE Xシステムを用いた、TAF1-S2によるDNAとAML1-MTG8の結合の解離実験の結果を示す図。sensor Chip上にAML1結合dsDNAでAML1-MTG8様融合タンパク質を固定化し、TAF1-S2または30NランダムRNAをインジェクションした。図は、TAF1-S2または30NランダムRNAをインジェクションした時のグラフを示す。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１】
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【図８】
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【配列表】
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