(57)【要約】      （修正有）【課題】骨髄細胞から間葉系幹細胞を経て骨芽細胞へと分化させる工程中の各段階における細胞、特に間葉系幹細胞を検出及び／又は識別するのに有用な遺伝子マーカーの提供。【解決手段】特定の塩基配列を有する遺伝子のうちの少なくとも一以上の遺伝子の発現量または発現量差を検出することによって、骨髄細胞、骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞、間葉系幹細胞、骨芽前駆細胞、又は骨芽細胞を検出及び／又は分離する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）から（ｉｘ）の何れかに記載の細胞検出用の遺伝子マーカー。
（ｉ）配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨髄細胞を検出するための遺伝子マーカー；
（ｉｉ）配列表の配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞を検出するための遺伝子マーカー；
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２０、２１、２２、２３、２４又は２５に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、間葉系幹細胞を検出するための遺伝子マーカー；
（ｉｖ）配列表の配列番号２６、２７又は２８に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨芽前駆細胞を検出するための遺伝子マーカー；及び
（ｖ）配列表の配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨芽細胞を検出するための遺伝子マーカー；
（ｖｉ）配列表の配列番号３７又は７に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨髄細胞と骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞の間で発現量の差を示す遺伝子：
（ｖｉｉ）配列表の配列番号３８又は３９に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞と間葉系幹細胞の間で発現量の差を示す遺伝子：
（ｖｉｉｉ）配列表の配列番号４０又は２１に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる間葉系幹細胞と骨芽前駆細胞の間で発現量の差を示す遺伝子：
（ｉｘ）配列表の配列番号２８、４１又は４２に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる骨芽細胞と骨芽前駆細胞の間で発現量の差を示す遺伝子：
【請求項２】
請求項１に記載の細胞検出用の遺伝子マーカーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有する、請求項１に記載の細胞検出用の遺伝子マーカーを検出するためのプローブ。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞検出用の遺伝子マーカーの塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる、請求項２に記載のプローブ。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞検出用の遺伝子マーカーをＰＣＲ法により特異的に増幅することができるセンスプライマーとアンチセンスプライマーの組み合わせからなる、請求項１に記載の細胞検出用の遺伝子マーカーを検出するためのプライマー。
【請求項５】
請求項２又は３に記載のプローブの少なくとも１つ以上を支持体に固定化させることにより得られる、細胞検出用のマーカー遺伝子を検出するためのマイクロアレイ又はＤＮＡチップ。
【請求項６】
被検細胞中の配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３に記載の塩基配列を有する遺伝子マーカーのうちの少なくとも一以上の遺伝子マーカーの発現量を検出し、骨髄細胞中の同じ遺伝子マーカーの発現量と比較することを含む、骨髄細胞を検出及び／又は分離する方法。
【請求項７】
被検細胞中の配列表の配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９に記載の塩基配列を有する遺伝子マーカーのうちの少なくとも一以上の遺伝子マーカーの発現量を検出し、骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞中の同じ遺伝子マーカーの発現量と比較することを含む、骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞を検出及び／又は分離する方法。
【請求項８】
被検細胞中の配列表の配列番号２０、２１、２２、２３、２４又は２５に記載の塩基配列を有する遺伝子マーカーのうちの少なくとも一以上の遺伝子マーカーの発現量を検出し、間葉系幹細胞中の同じ遺伝子マーカーの発現量と比較することを含む、間葉系幹細胞を検出及び／又は分離する方法。
【請求項９】
被検細胞中の配列表の配列番号２６、２７又は２８に記載の塩基配列を有する遺伝子マーカーのうちの少なくとも一以上の遺伝子マーカーの発現量を検出し、骨芽前駆細胞中の同じ遺伝子マーカーの発現量と比較することを含む、骨芽前駆細胞を検出及び／又は分離する方法。
【請求項１０】
配列表の配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６に記載の塩基配列を有する遺伝子マーカーのうちの少なくとも一以上の遺伝子マーカーの発現量を検出し、骨芽細胞中の同じ遺伝子マーカーの発現量と比較することを含む、骨芽細胞を検出及び／又は分離する方法。
【請求項１１】
遺伝子マーカーの発現量の検出を、請求項２又は３に記載のプローブ、請求項４に記載のプライマー、あるいは請求項５に記載のマイクロアレイ又はＤＮＡチップを用いて行う、請求項６から１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
骨髄細胞を培養して目的細胞に分化させる工程において、下記の（ａ）から（ｉ）に記載の遺伝子から選択される何れか一以上の遺伝子マーカーの発現量を検出し、下記の（Ａ）から（Ｅ）の何れか一以上の細胞中の同じ遺伝子マーカーの発現量と比較することを含む、下記の（Ａ）から（Ｅ）の何れか一以上の細胞へ分化させる培養工程をモニタリングする方法。
（ａ）骨髄細胞を検出するための遺伝子マーカーである、配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３に記載の塩基配列を有する遺伝子；（ｂ）骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞を検出するための遺伝子マーカーである、配列表の配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９に記載の塩基配列を有する遺伝子；
（ｃ）間葉系幹細胞を検出するための遺伝子マーカーである、配列表の配列番号２０、２１、２２、２３、２４又は２５に記載の塩基配列を有する遺伝子；
（ｄ）骨芽前駆細胞を検出するための遺伝子マーカーである、配列表の配列番号２６、２７又は２８に記載の塩基配列を有する遺伝子；
（ｅ）骨芽細胞を検出するための遺伝子マーカーである、配列表の配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６に記載の塩基配列を有する遺伝子；
（ｆ）骨髄細胞の培養と、骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞の培養との間で発現量の差を示す遺伝子である、配列表の配列番号３７又は７に記載の塩基配列を有する遺伝子；
（ｇ）骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞の培養と、間葉系幹細胞の培養との間で発現量の差を示す遺伝子である、配列表の配列番号３８又は３９に記載の塩基配列を有する遺伝子；
（ｈ）間葉系幹細胞の培養と、骨芽前駆細胞の培養との間で発現量の差を示す遺伝子である、配列表の配列番号４０又は２１に記載の塩基配列を有する遺伝子；
（ｉ）骨芽前駆細胞の培養と、骨芽細胞の培養との間で発現量の差を示す遺伝子である、配列表の配列番号２８、４１又は４２に記載の塩基配列を有する遺伝子；
（Ａ）骨髄細胞
（Ｂ）骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞
（Ｃ）間葉系幹細胞
（Ｄ）骨芽前駆細胞
（Ｅ）骨芽細胞
【請求項１３】
遺伝子マーカーの発現量の検出を、請求項２又は３に記載のプローブ、請求項４に記載のプライマー、あるいは請求項５に記載のマイクロアレイ又はＤＮＡチップを用いて行う、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄細胞から間葉系幹細胞を経て骨芽細胞へと分化させる工程中の各段階における細胞を検出するための遺伝子マーカー、並びに該遺伝子マーカーを用いて上記各段階の細胞を検出・分離する方法に関する。本発明はさらに、骨髄細胞から間葉系幹細胞を経て骨芽細胞へと分化させる培養工程をモニタリングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は未分化な細胞で、筋肉、骨、脂肪等、種類の異なるさまざまな細胞に分化できる多分化能を持ち、かつ自己複製の能力を持つ細胞である。間葉系幹細胞の代表的なものとしては骨髄や臍帯血の中にわずかに存在する細胞であるが、近年では脂肪組織や口腔骨膜からも間葉系幹細胞を分離する方法が報告されている。間葉系幹細胞はいろいろなホルモンやサイトカイン（小さな分泌性タンパク質）の添加によって、様々な細胞に分化することから再生医療、細胞医療技術で用いる移植用細胞としては最も有望で、既に骨、軟骨、心筋の再生の他、免疫抑制治療の臨床応用が始められつつある。
【０００３】
例えば、Prochymalは、白血病治療時の造血幹細胞移植前に間葉系幹細胞を投与することにより副作用である移植片対宿主病（Graft vs Host Disease）を抑制する療法で、フェーズ１臨床試験を終了し、2005年にフェーズ２に入り、2007年後半の上市を予定している。また、Provacelは、心筋梗塞による心筋の損傷を間葉系幹細胞により修復する療法で、2005年第1四半期にフェーズ1に入り、2006年中期にフェーズ2/3に入り、2009年の上市を予定している。さらに、Chondrogenは、関節の半月板損傷を間葉系幹細胞により修復する療法で、臨床試験入りをFDAに申請中である。
【０００４】
間葉系幹細胞の臨床応用を再生医療として広く実用化させるには、十分な量の間葉系幹細胞を確保することが重要であり、そのためには材料となる骨髄や脂肪細胞などにわずかに含まれる間葉系幹細胞を効率よく分離・精製すること、またそれらを培養して多分化能を保有したままの間葉系幹細胞を増殖させる必要がある。
【０００５】
しかし、ヒト骨髄ストローマ細胞の中でも比較的小さい細胞が多分化能を示すことが知られているが実際には間葉系幹細胞の由来や性質が十分に分かっているわけではない。そこで間葉系幹細胞を効率よく分離、精製するために、間葉系幹細胞を特異的に識別するマーカーの探索が行なわれている。
【０００６】
これまでに間葉系幹細胞のマーカーとしては、特許文献１及び２、及び非特許文献１に報告がある。しかしこれらの報告は全て、間葉系幹細胞と線維芽細胞の分離のみを目的としたものである。線維芽細胞は、骨髄から間葉系幹細胞を分離、精製する時に混在し、培養中も間葉系幹細胞と同様に増殖する上、形態的にも間葉系幹細胞と区別が付かないことから、これらを分離するマーカーを選抜している。マーカーの抽出は間葉系幹細胞と線維芽細胞との発現プロファイルの違いから決定している。
【０００７】
その他、間葉系幹細胞へ分化能を有する前駆間葉系幹細胞を識別するマーカーについての報告もある（特許文献３）。すなわち、胚性幹細胞をレチノイン酸存在下で培養すると、前駆間葉系幹細胞が分化の早期段階で出現し、この細胞集団は、神経外胚葉マーカーであるＳｏｘ１を発現していたことから、インビトロにおいて胚性幹細胞から分化させた前駆間葉系幹細胞を選抜するのにＳｏｘ１をマーカーとして用いる方法である。
【０００８】
間葉系幹細胞の収量向上のために検討されているものとしては、分離精製のための装置・機材などの開発・利用、分離ソースの工夫、生体内での間葉系幹細胞の富化として合成化合物の生体への投与、蛋白性分子などの生体への投与などがある。また、培養による間葉系幹細胞の増殖については、培地成分・添加物の工夫により解決が試されている。
【０００９】
また、増殖した間葉系幹細胞を再生医療に実用化する場合、細胞の品質を保証することは安全性確保の面から重要である。培養工程では細胞の突然変異や癌化、目的としない細胞への分化、細菌、ウイルスによる汚染などが生じる可能性があり、細胞の状態を管理することは必須である。生物細胞を医薬品として申請する場合、厚生労働省による指針の中ではマイコプラズマやウイルスの無菌試験が項目の一つとして挙げられており、培養法や核酸配列を利用したPCR法による検出が既存法として知られている。また、癌化を予測する方法としてはhTERTやc-myc等の癌関連遺伝子の発現量を測定する方法がある。しかし、既存の方法でこれらの項目を全て満たす為には多種多様な検査を行う必要があり現実的には困難である。再生医療を商業的に実用化するには細胞やスキャフォールドの調製技術といった基本技術はもとより、細胞の品質管理に関する簡易で安価な検査システムの構築が必要である。
【００１０】
さらに、これまでに培養過程における発現プロファイルの変化を調べた報告としては、例えば、特許文献４（脂肪細胞への分化誘導する方法並びに脂肪細胞への分化を制御する化合物およびそのスクリーニング方法）、非特許文献２（マウスのMSCセルラインにBMP-2を発現するようrhBMP2遺伝子を導入したC9細胞を用いてBMP2の発現を誘導することで骨芽細胞に分化する過程における遺伝子発現プロファイルの変化を調べている）、非特許文献３（前筋芽細胞のC2C12はBMP-2に依存して骨芽細胞に分化するが、その過程においてBMP-2処理から24時間以内の７箇所でマイクロアレイデータを解析し、骨分化における遺伝子発現変化を調べている。機能別に分類した遺伝子を羅列した記載がある。）などがある。
【００１１】
【非特許文献１】Molecular marker distinguish bone marrow mesenchymal stem cells from fibroblasts, Biochem. Biophys. Res Commun. 332,297-303, 2005
【非特許文献２】DNA microarray analysis using statistical methods and clustering: three case studies Osnat Ravid-Amir M.Sc. thesis submitted to the Scientific Council of the weizmann Institute of Science Prof. Eytan Domany (Research conducted under the supervision February(2003)
【非特許文献３】J. Cellular Biochemistry 89: 401-426 2003
【特許文献１】特開2004-290189号公報
【特許文献２】特開2005-27579号公報
【特許文献３】特開2005-304443号公報
【特許文献４】特開2000-217576号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、骨髄細胞から間葉系幹細胞を経て骨芽細胞へと分化させる工程中の各段階における細胞、特に間葉系幹細胞を検出及び／又は識別するのに有用な遺伝子マーカー；該遺伝子マーカーを検出するためのプローブ又はプライマー；骨髄細胞から間葉系幹細胞を経て骨芽細胞へと分化させる工程中の各段階における細胞、特に間葉系幹細胞を検出及び／又は識別する方法、並びに骨髄細胞から間葉系幹細胞を経て骨芽細胞へと分化させる培養工程をモニタリングする方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を進めた結果、骨髄液から間葉系幹細胞、更には骨芽細胞に分化させる培養工程において、細胞の状態から培養工程を５つの群に分け、更にその中を細分して全工程8ポイントでの発現プロファイルを３万遺伝子について得た。それらを5検体に対して行い、全データを精緻に調べることにより、間葉系幹細胞で特徴的に発現する遺伝子群、骨芽細胞で特徴的に発現する遺伝子群などを選抜した。これらの遺伝子のうち、各群に特徴的に発現する遺伝子を用いることにより、各群に含まれる細胞すなわち間葉系幹細胞や骨芽細胞などを培養工程に含まれる他の群の細胞のみならず、これらの培養工程に含まれない線維芽細胞などから識別分離することが可能となった。更にはそれぞれの群で特徴的な発現をする遺伝子を組み合わせることにより、培養工程をモニタリングすることが可能になった。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１４】
すなわち本発明によれば、以下の（１）から（１３）に記載の発明が提供される。
（１）  以下の（ｉ）から（ｖ）の何れかに記載の細胞検出用の遺伝子マーカー。
（ｉ）配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨髄細胞を検出するための遺伝子マーカー；
（ｉｉ）配列表の配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞を検出するための遺伝子マーカー；
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２０、２１、２２、２３、２４又は２５に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、間葉系幹細胞を検出するための遺伝子マーカー；
（ｉｖ）配列表の配列番号２６、２７又は２８に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨芽前駆細胞を検出するための遺伝子マーカー；及び
（ｖ）配列表の配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨芽細胞を検出するための遺伝子マーカー；
（ｖｉ）配列表の配列番号３７又は７に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨髄細胞と骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞の間で発現量の差を示す遺伝子：
（ｖｉｉ）配列表の配列番号３８又は３９に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞と間葉系幹細胞の間で発現量の差を示す遺伝子：
（ｖｉｉｉ）配列表の配列番号４０又は２１に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる間葉系幹細胞と骨芽前駆細胞の間で発現量の差を示す遺伝子：
（ｉｘ）配列表の配列番号２８、４１又は４２に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる骨芽細胞と骨芽前駆細胞の間で発現量の差を示す遺伝子：
【００１５】
（２）  （１）に記載の細胞検出用の遺伝子マーカーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有する、（１）に記載の細胞検出用の遺伝子マーカーを検出するためのプローブ。
（３）  （１）に記載の細胞検出用の遺伝子マーカーの塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる、（２）に記載のプローブ。
【００１６】
（４）  （１）に記載の細胞検出用の遺伝子マーカーをＰＣＲ法により特異的に増幅することができるセンスプライマーとアンチセンスプライマーの組み合わせからなる、（１）に記載の細胞検出用の遺伝子マーカーを検出するためのプライマー。
【００１７】
（５）  （２）又は（３）に記載のプローブの少なくとも１つ以上を支持体に固定化させることにより得られる、細胞検出用のマーカー遺伝子を検出するためのマイクロアレイ又はＤＮＡチップ。
【００１８】
（６）  被検細胞中の配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３に記載の塩基配列を有する遺伝子マーカーのうちの少なくとも一以上の遺伝子マーカーの発現量を検出し、骨髄細胞中の同じ遺伝子マーカーの発現量と比較することを含む、骨髄細胞を検出及び／又は分離する方法。
（７）  被検細胞中の配列表の配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９に記載の塩基配列を有する遺伝子マーカーのうちの少なくとも一以上の遺伝子マーカーの発現量を検出し、骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞中の同じ遺伝子マーカーの発現量と比較することを含む、骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞を検出及び／又は分離する方法。
【００１９】
（８）  被検細胞中の配列表の配列番号２０、２１、２２、２３、２４又は２５に記載の塩基配列を有する遺伝子マーカーのうちの少なくとも一以上の遺伝子マーカーの発現量を検出し、間葉系幹細胞中の同じ遺伝子マーカーの発現量と比較することを含む、間葉系幹細胞を検出及び／又は分離する方法。
（９）  被検細胞中の配列表の配列番号２６、２７又は２８に記載の塩基配列を有する遺伝子マーカーのうちの少なくとも一以上の遺伝子マーカーの発現量を検出し、骨芽前駆細胞中の同じ遺伝子マーカーの発現量と比較することを含む、骨芽前駆細胞を検出及び／又は分離する方法。
【００２０】
（１０）  配列表の配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６に記載の塩基配列を有する遺伝子マーカーのうちの少なくとも一以上の遺伝子マーカーの発現量を検出し、骨芽細胞中の同じ遺伝子マーカーの発現量と比較することを含む、骨芽細胞を検出及び／又は分離する方法。
（１１）  遺伝子マーカーの発現量の検出を、（２）又は（３）に記載のプローブ、（４）に記載のプライマー、あるいは（５）に記載のマイクロアレイ又はＤＮＡチップを用いて行う、（６）から（１０）の何れかに記載の方法。
【００２１】
（１２）  骨髄細胞を培養して目的細胞に分化させる工程において、下記の（ａ）から（ｉ）に記載の遺伝子から選択される何れか一以上の遺伝子マーカーの発現量を検出し、下記の（Ａ）から（Ｅ）の何れか一以上の細胞中の同じ遺伝子マーカーの発現量と比較することを含む、下記の（Ａ）から（Ｅ）の何れか一以上の細胞へ分化させる培養工程をモニタリングする方法。
（ａ）骨髄細胞を検出するための遺伝子マーカーである、配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３に記載の塩基配列を有する遺伝子；（ｂ）骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞を検出するための遺伝子マーカーである、配列表の配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９に記載の塩基配列を有する遺伝子；
（ｃ）間葉系幹細胞を検出するための遺伝子マーカーである、配列表の配列番号２０、２１、２２、２３、２４又は２５に記載の塩基配列を有する遺伝子；
（ｄ）骨芽前駆細胞を検出するための遺伝子マーカーである、配列表の配列番号２６、２７又は２８に記載の塩基配列を有する遺伝子；
（ｅ）骨芽細胞を検出するための遺伝子マーカーである、配列表の配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６に記載の塩基配列を有する遺伝子；
（ｆ）骨髄細胞の培養と、骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞の培養との間で発現量の差を示す遺伝子である、配列表の配列番号３７又は７に記載の塩基配列を有する遺伝子；
（ｇ）骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞の培養と、間葉系幹細胞の培養との間で発現量の差を示す遺伝子である、配列表の配列番号３８又は３９に記載の塩基配列を有する遺伝子；
（ｈ）間葉系幹細胞の培養と、骨芽前駆細胞の培養との間で発現量の差を示す遺伝子である、配列表の配列番号４０又は２１に記載の塩基配列を有する遺伝子；
（ｉ）骨芽前駆細胞の培養と、骨芽細胞の培養との間で発現量の差を示す遺伝子である、配列表の配列番号２８、４１又は４２に記載の塩基配列を有する遺伝子；
（Ａ）骨髄細胞
（Ｂ）骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞
（Ｃ）間葉系幹細胞
（Ｄ）骨芽前駆細胞
（Ｅ）骨芽細胞
【００２２】
（１３）  遺伝子マーカーの発現量の検出を、（２）又は（３）に記載のプローブ、（４）に記載のプライマー、あるいは（５）に記載のマイクロアレイ又はＤＮＡチップを用いて行う、（１２）に記載の方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の遺伝子マーカーを用いることにより、骨髄細胞から間葉系幹細胞を経て骨芽細胞へと分化させる培養工程中の各段階における細胞を検出・分離することが可能になった。また、本発明の遺伝子マーカーを用いることにより、骨髄細胞から間葉系幹細胞を経て骨芽細胞へと分化させる培養工程中の各段階の細胞をモニタリングすることができる。すなわち、培養途中でウィルスなどに細胞が感染した場合なども通常の培養工程に含まれる細胞と識別することができる。また、仮に同培養工程において成長の遅滞があった場合なども本来あるべき工程の細胞と区別することができるため、培養工程における品質管理が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明は、以下の（ｉ）から（ｉｘ）の何れかに記載の細胞検出又は分離、あるいはモニタリング用の遺伝子マーカーに関するものである。
（ｉ）配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨髄細胞を検出するための遺伝子マーカー；
（ｉｉ）配列表の配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞を検出するための遺伝子マーカー；
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２０、２１、２２、２３、２４又は２５に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、間葉系幹細胞を検出するための遺伝子マーカー；
（ｉｖ）配列表の配列番号２６、２７又は２８に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨芽前駆細胞を検出するための遺伝子マーカー；及び
（ｖ）配列表の配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨芽細胞を検出するための遺伝子マーカー；
（ｖｉ）配列表の配列番号３７又は７に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨髄細胞と骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞の間で発現量の差を示す遺伝子：
（ｖｉｉ）配列表の配列番号３８又は３９に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞と間葉系幹細胞の間で発現量の差を示す遺伝子：
（ｖｉｉｉ）配列表の配列番号４０又は２１に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる間葉系幹細胞と骨芽前駆細胞の間で発現量の差を示す遺伝子：
（ｉｘ）配列表の配列番号２８、４１又は４２に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる骨芽細胞と骨芽前駆細胞の間で発現量の差を示す遺伝子：
【００２５】
骨髄とは、骨の内腔を満たしている柔らかい組織であり、造血器官である。骨髄液とは骨髄に存在するもので、骨髄から採取することができる。本明細書において、「骨髄細胞」とは、骨髄液中に存在する細胞のことを言う。骨髄細胞には、赤血球、顆粒球、巨核球、リンパ球、脂肪細胞等のほか、少量の間葉系幹細胞、造血幹細胞、血管内皮前駆細胞などが含まれている。骨髄細胞は、例えば、ヒト腸骨、長管骨、もしくはその他の骨髄細胞を採取できる骨から採取することができる。
【００２６】
「間葉系幹細胞」とは、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞等への多分化能を持つ骨髄由来幹細胞である。「骨芽前駆細胞」とは、間葉系幹細胞に骨分化を誘導した後の細胞であって、未だ成熟骨芽細胞のマーカーを発現していない細胞である。「骨芽細胞」とは、ＡＬＰ活性、オステオカルシンなどの骨芽細胞のマーカーを少なくとも一つ以上発現する細胞のことである。
【００２７】
本発明においては、骨髄から骨髄液を採取し、骨髄液中の骨髄細胞を用いる。上記の通り、骨髄液には、赤血球、顆粒球、巨核球、リンパ球、脂肪細胞等のほか、間葉系幹細胞、造血幹細胞、血管内皮前駆細胞などの各種の骨髄細胞が含まれている。すなわち、本願明細書において、「骨髄細胞」とは、骨髄から得られる各種の細胞からなる細胞群を意味する。この骨髄細胞を後述する培養方法に供することにより、細胞群に含まれている間葉系幹細胞のみを高度に選択的に培養し、ほぼ純粋に間葉系幹細胞のみを含む細胞群を取得することができる。さらに、この間葉系幹細胞を、分化誘導により骨芽細胞等に分化させ、取得することができる。本発明の方法では、これらの工程を確実に管理することができる。
【００２８】
上記の（ｉｉｉ）配列表の配列番号２０、２１、２２、２３、２４又は２５に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる、間葉系幹細胞を検出するための遺伝子マーカーにより、後述する方法で検出、分離される間葉系幹細胞においては、細胞集団の中に、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の間葉系幹細胞が含まれている。
【００２９】
配列表の配列番号１から３６に記載の塩基配列を有する遺伝子は、それぞれ下記の遺伝子である。
配列番号１：Homo sapiens CREBBP/EP300 inhibitor 1 (CRI1), mRNA
配列番号２：Homo sapiens peroxiredoxin 1 (PRDX1), transcript variant 1, mRNA
配列番号３：Homo sapiens diazepam binding inhibitor (GABA receptor modulator, acyl-Coenzyme A binding protein) (DBI), mRNA
配列番号４：Homo sapiens cyclin L1 (CCNL1), mRNA
配列番号５：Homo sapiens annexin A2 (ANXA2), transcript variant 3, mRNA
配列番号６：Homo sapiens arginase, liver (ARG1), mRNA
配列番号７：Homo sapiens matrix metallopeptidase 9 (gelatinase B, 92kDa gelatinase, 92kDa type IV collagenase) (MMP9), mRNA
配列番号８：Homo sapiens peroxiredoxin 4 (PRDX4), mRNA
配列番号９：Homo sapiens ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit d (ATP5H), nuclear gene encoding mitochondrial protein, transcript variant 1, mRNA
配列番号１０：Homo sapiens NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3,
12kDa (NDUFB3), mRNA
配列番号１１：Homo sapiens microsomal glutathione S-transferase 3 (MGST3), mRNA
配列番号１２：Homo sapiens pIFI27-like protein mRNA, partial cds
配列番号１３：Homo sapiens transgelin (TAGLN), transcript variant 2, mRNA
配列番号１４：Homo sapiens CD163 molecule (CD163), transcript variant 1, mRNA
配列番号１５：Homo sapiens allograft inflammatory factor 1 (AIF1), transcript variant 2, mRNA
配列番号１６：Homo sapiens legumain (LGMN), transcript variant 1, mRNA
配列番号１７：Homo sapiens cathepsin C (CTSC), transcript variant 1, mRNA
配列番号１８：Homo sapiens CD14 molecule (CD14), transcript variant 1, mRNA
配列番号１９：Homo sapiens interferon, gamma-inducible protein 30 (IFI30), mRNA
配列番号２０：Homo sapiens insulin receptor substrate 2 (IRS2), mRNA
配列番号２１：Homo sapiens latexin (LXN), mRNA
配列番号２２：Homo sapiens TSC22 domain family, member 1 (TSC22D1), transcript variant 2, mRNA
配列番号２３：Homo sapiens secreted protein, acidic, cysteine-rich (osteonectin)
(SPARC), mRNA
配列番号２４：Homo sapiens connective tissue growth factor (CTGF), mRNA
配列番号２５：Homo sapiens metallothionein 1H (MT1H), mRNA
配列番号２６：Homo sapiens solute carrier family 40 (iron-regulated transporter), member 1 (SLC40A1), mRNA配列番号２７：Homo sapiens similar to P311 protein (H. sapiens) (LOC157630), mRNA
配列番号２８：Homo sapiens collagen, type XI, alpha 1 (COL11A1), transcript variant A, mRNA
配列番号２９：Homo sapiens major histocompatibility complex, class II, DR alpha (HLA-DRA), mRNA
配列番号３０：Homo sapiens fibulin 5 (FBLN5), mRNA
配列番号３１：Homo sapiens frizzled-related protein (FRZB), mRNA
配列番号３２：HLA-DP (DPB1*02012)=major histocompatibility complex class II antigen beta chain [human, LCL 45.1, mutant 45.EM19, mRNA Partial Mutant, 171 nt]
配列番号３３：Homo sapiens nuclear protein 1 (NUPR1), transcript variant 2, mRNA
配列番号３４：Homo sapiens high-mobility group box 2, mRNA (cDNA clone MGC:2393 IMAGE:2963045), complete cds
配列番号３５：Homo sapiens heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (HNRPA1), transcript variant 1, mRNA
配列番号３６：Homo sapiens cDNA clone IMAGE:3680553
【００３０】
配列表の配列番号３７から４２に記載の塩基配列を有する遺伝子は、それぞれ下記の遺伝子である。
配列番号３７：Homo sapiens cathepsin B (CTSB), transcript variant 1, mRNA
配列番号３８：Homo sapiens collagen, type I, alpha 2 (COL1A2), mRNA
配列番号３９：Homo sapiens interleukin 8 (IL8), mRNA
配列番号４０：Homo sapiens pentraxin-related gene, rapidly induced by IL-1 beta (PTX3), mRNA
配列番号４１：Homo sapiens apolipoprotein D (APOD), mRNA
配列番号４２：Homo sapiens transforming growth factor, beta-induced, 68kDa (TGFBI), mRNA
【００３１】
本発明の遺伝子マーカーは、上記骨髄細胞から間葉系幹細胞を経て骨芽細胞へと分化の各段階における細胞中での発現量を公知の方法、例えばマイクロアレイ法等を用いて測定し、各段階における細胞発現量を比較して、特定の分化段階における細胞中の発現量が他の全ての分化段階における細胞中の発現量と区別ができるか、あるいは、それの前後の分化段階における細胞中の発現量と区別ができることを指標として選択される。  本発明の遺伝子マーカーは、骨髄細胞から間葉系細胞を経て骨芽細胞へと分化する各段階の細胞の培養工程をモニタリングすることにも用いられるため、正常に分化していない細胞中の発現量と比較した場合にも、区別がつけられるものが好ましい。
【００３２】
遺伝子マーカーの選択を行う際に用いる骨髄細胞から間葉系幹細胞を経て骨芽細胞へと分化の各段階における細胞は、オンスペック細胞として、公知の方法で骨髄細胞から培養、分化誘導しながら、顕微鏡による形態変化や増殖の観察や、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化過程における骨基質計測等で確認して調製することができる。
【００３３】
また、正常に分化していない細胞（以下、「オフスペック細胞」と称することがある）としては、各培養工程において培養条件を変更して培養したもの、具体的には継代数や培養液組成を変えて培養した細胞、または正常に培養されなかったもの、例えば、培養過程において、脂肪細胞・軟骨細胞といった、骨以外に分化した細胞、細菌・ウイルスなどが混入した細胞、がん化した細胞、異なる系統の細胞、例えば、線維芽細胞等を用いることができる。
【００３４】
本発明においては、被検細胞中の上記（ｉ）から（ｉｘ）に記載した遺伝子のうち、何れか一以上の遺伝子マーカーの発現量を検出することによって、骨髄細胞、骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞、間葉系幹細胞、骨芽前駆細胞、又は骨芽細胞を検出及び／又は分離することができる。さらには、被検細胞が、骨髄細胞から間葉系幹細胞を経て骨芽細胞へと分化させる培養工程をモニタリングすることができる。
【００３５】
本発明において、骨髄細胞、骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞、間葉系幹細胞、骨芽前駆細胞、又は骨芽細胞（以下、「骨髄細胞から骨芽細胞までの細胞」と略記する場合がある）を検出及び／又は分離するため、又は分化培養工程のモニタリングのために、被検細胞中の本発明のマーカー遺伝子の発現量を検出する方法としては、当業者に公知の方法を用いることができる。例えば、ｍＲＮＡレベルで遺伝子の発現量を検出するためにはノーザンブロッティング法を用いることができる。この際、本発明の遺伝子マーカーのＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有するプローブを用いることができる。該プローブを用いて、「骨髄細胞から骨芽細胞までの細胞」における遺伝子マーカーの発現量を検出するには、公知の方法を用いて適宜実施することができる。例えば、配列表に示した遺伝子マーカーのＤＮＡ配列から適当な長さのＤＮＡプローブを作製し、放射標識又は蛍光標識等で標識しておき、これを被検試料とハイブリダイズして、その標識量を測定する方法等が挙げられる。該ＤＮＡプローブとしては、配列表に示した本発明の遺伝子マーカーの塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなるプローブを用いることができる。また、該プローブは、少なくとも１つ以上のプローブを支持体上に固定化させることによって、マイクロアレイ又はＤＮＡチップとして用いることもできる。
【００３６】
上記したＤＮＡプローブの作製において、本発明の塩基配列において、遺伝子マーカーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）を含む緩衝液による４２℃での洗浄からなる条件を挙げることができ、さらに好ましくは６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄からなる条件を挙げることができる。
【００３７】
マーカー遺伝子は、定量的又は半定量的ＰＣＲを用いてその発現量を検出することもできる。該ＰＣＲとしてはＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）を用いることができる。該ＰＣＲを行うに際しては、本発明の遺伝子マーカーを増幅するためのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーからなるプライマーを用いることができる。また、該ＰＣＲを行う反応液に、一遺伝子マーカーに対するプライマーのみを入れ、遺伝子マーカー毎に該ＰＣＲを行っても良いし、該ＰＣＲを行う反応液に、複数の遺伝子マーカーに対するプライマーを同時に入れ、複数の遺伝子マーカーに対し一度に該ＰＣＲを行っても良い。
【００３８】
本発明の細胞検出用マーカー遺伝子を検出するためのプローブ及びプライマーの具体例としては、表４に記載のものを挙げることができるが、これらに限定されるわけではなく、当業者であれば、配列番号１から４２に記載したマーカー遺伝子の塩基配列に基づいて、目的とするマーカー遺伝子を検出できるプローブ及びプライマーの塩基配列を適宜設定することができる。
【００３９】
また、本発明においては、マーカー遺伝子の発現量の検出を、配列表の配列番号１から４２の何れかの塩基配列がコードするタンパク質に対する抗体を用いて、タンパク質レベルで検出することもできる。上記の抗体としては、モノクローナル抗体でもよいし、ポリクローナル抗体でもよい。上記した抗体は、配列表の配列番号１から４２の何れかの塩基配列がコードするタンパク質又はその部分ペプチドを抗原として用いて、常法により作製することができる。上記した抗体を用いて、被検細胞における遺伝子マーカーの発現を検出するためには、例えば、例えばＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法等などの公知の免疫学的測定法を用いることができる。
【００４０】
上記抗体を用いて、被検細胞における本発明の遺伝子マーカーの発現量を検出し、後述する方法により間葉系幹細胞などの「骨髄細胞から骨芽細胞までの細胞」分離する際には、公知の方法により間葉系幹細胞などの「骨髄細胞から骨芽細胞までの細胞」を標識化し、その標識の強さ等を指標として分離することができる。該標識化方法としては、例えば、蛍光抗体法を挙げることができる。蛍光抗体法により間葉系幹細胞などの「骨髄細胞から骨芽細胞までの細胞」中に発現する遺伝子マーカーがコードするタンパク質を標識化するには、本発明の遺伝子マーカーがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体を蛍光標識し、これを、遺伝子マーカーがコードするタンパク質を発現している間葉系幹細胞などの「骨髄細胞から骨芽細胞までの細胞」に結合させて、該細胞を標識化する（直接蛍光抗体法）か、或いは、遺伝子マーカーがコードするタンパク質を発現している間葉系幹細胞に、未標識の特異抗体を結合させた後に、標識化した二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）を結合させて間葉系幹細胞などの「骨髄細胞から骨芽細胞までの細胞」中の遺伝子マーカーがコードするタンパク質を標識化し（間接蛍光抗体法）、該標識化された細胞を、その標識量を指標として分離、採取すればよい。
【００４１】
本発明においては、上記したプローブや抗体を用いて、被検細胞における本発明の遺伝子マーカーの発現量を検出し、これにより細胞の状態を識別して、骨髄細胞、骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞、間葉系幹細胞、骨芽前駆細胞、又は骨芽細胞を分離し、取得することができる。
【００４２】
具体的な「骨髄細胞から骨芽細胞までの細胞」の検出のために、該細胞を識別する方法としては、上記のように被検細胞中の一以上の遺伝子マーカーの発現量を検出し、これが、「骨髄細胞から骨芽細胞までの細胞」中の同じ遺伝子マーカーの発現量と比較して、これと同程度であるかを指標として行う。遺伝子マーカーの発現量の比較は、１つの遺伝子マーカーの発現量の絶対値でもよいし、２つ以上の遺伝子マーカーの発現量の比でもよい。
【００４３】
「骨髄細胞から骨芽細胞までの細胞」中の同じ遺伝子マーカーの発現量は、後述する方法で、特定の細胞であることを確認した細胞（以下、「オンスペック細胞」と称することがある）中の同じ遺伝子マーカーの発現量（以下、「オンスペック細胞の基準値」と称することがある）として予め取得しておくことが好ましい。
【００４４】
基準値を取得する場合、オンスペック細胞は１つの培養系でもよいが、複数の培養系から取得して用いることが好ましく、それぞれの遺伝子マーカーの発現量を統計的に処理して被検細胞中のマーカー遺伝子の発現量と比較することが好ましい。これらの解析は、Ｒ言語を使用する統計解析ソフトＲやＳ言語を使用するＳ−ＰＬＵＳ、ＳＰＳＳ、ＳＡＳ、ＳｔａｔＶｉｅｗなど公知の方法を使用して簡便に行うことができる。
【００４５】
比較を行う遺伝子マーカーは、検出及び／又は分離しようとする骨髄細胞から骨芽細胞までの細胞のいずれかの分化段階において、他の分化段階とは異なる発現量を示すことがわかっているものを用いる。具体的には、上記（ｉ）〜(ｉｘ)に記載のものが挙げられ、これらのうち、１つ以上を用いるか、又は複数の遺伝子マーカーについて組み合わせて解析する多変量解析のいずれも用いることができる。また、ある分化段階を判定するために、該分化段階のみを測定対象とする場合は、上記（ｉ）〜（ｖ）に記載のものが好ましく、一方で、該分化段階及び該分化段階の前及び／又は後の分化段階を測定対象とする場合には、上記（ｉ）〜（ｖ）に記載のものに加えて、隣り合う２工程間で顕著な発現量差を示す上記（ｖｉ）〜（ｉｘ）に記載のものも好ましい。
【００４６】
１つの遺伝子マーカーを用いる場合、具体的には、例えば、特定のオンスペック細胞を複数系用いて、該細胞中のマーカー遺伝子の発現量の平均値±2ＸSDあるいは±3ＸSDをオンスペック細胞の基準値と定め、被験細胞中の該マーカー遺伝子の発現量がこの基準値に入ることを指標として判定する方法が用いられる。
【００４７】
また、特定のオンスペック細胞を複数系用いて、該細胞中のマーカー遺伝子の発現量についてROC曲線を引き、これをオンスペック細胞のカットオフ値を定め、これを基準値として被験細胞中の該マーカー遺伝子の発現量がこれに含まれるのかどうかを指標として判定することもできる。また、クラスター分析などを用いることもできる。
【００４８】
一方、２つ以上の遺伝子マーカーについて解析する場合では、例えば、特定のオンスペック細胞中の該マーカーの発現量について、上記と同様の方法で基準値、あるいはその範囲を定め、被験細胞中の該マーカーの発現量がこの基準となる範囲に含まれるかどうかを判断することができる。具体的な解析方法としては、予測（重回帰分析、数量化I類）、判別（判別分析、数量化II類）、機械学習（最近傍法、決定木、support vector machine、neural network）、相関係数や距離関数を用いた類似度解析などを用いる。
【００４９】
また、別の例としては、２つ以上の遺伝子マーカーの発現量に基づいて、オンスペック細胞の基準値群と、該集団に被検物質中の該マーカーの発現量値群を集団として比較して判定することができる。具体的な解析方法としては、クラスター分析、多次元尺度法、主成分分析、因子分析、数量化III類、数量化IV類、自己組織化マップ、ネットワークの推定（ブーリアンネットワーク、ベイジアンネットワーク）などを用いる。
【００５０】
さらに詳細に説明すると、例えば、スピアマン相関係数を使用した判定法では、オンスペック細胞の基準値に対して、相関係数値が、０．６以上、好ましくは０．８以上、さらに好ましくは０．９以上であった時に、被検細胞が該特定の分化段階の細胞であると判定される。
【００５１】
また、階層型クラスタ解析では、オンスペック細胞の基準値群（クラスター）に、被検細胞の発現量値が入れば、該特定の分化段階の細胞であると判定され、異なるクラスターを形成すれば、該分化段階の細胞ではないと判定できる。
【００５２】
また、ユークリッド距離に基づいた多次元尺度法では、オンスペック細胞の基準値をプロットした同じ領域に、披検細胞の発現量値がプロットされた場合には、該特定の分化段階の細胞であると判定され、離れた領域にプロットされた場合には、該分化段階の細胞ではないと判定できる。
【００５３】
かくして、骨髄細胞から骨芽細胞までのいずれかの細胞と判定された細胞は、これを公知の方法で分離することができる。
【００５４】
本発明では、上記遺伝子マーカーを用いて骨髄細胞から骨芽細胞までの細胞の培養工程をモニタリング（以下、「モニタリング」と称することがある）することもできる。モニタリングするとは、上記の方法で各分化段階の細胞を検出することを手段とし、各培養工程にある細胞が、オンスペック細胞であるかどうかを判定し、培養工程における品質管理を目的とするものである。
【００５５】
モニタリングする各培養工程とは、（Ａ）骨髄細胞の培養、（Ｂ）骨髄細胞を培養した後の細胞であって間葉系幹細胞のみが選択培養される前の細胞の培養、（Ｃ）間葉系幹細胞の培養、（Ｄ）骨芽前駆細胞の培養、及び（Ｅ）骨芽細胞の培養工程である。
【００５６】
モニタリングのための、遺伝子マーカーの発現量の検出は、各培養工程においてその都度行ってもよいし、複数の工程にまたがって行ってもよい。また、予定している培養工程が全て終了したあと、各培養工程の全て、あるいは一部に対して行ってもよい。
【００５７】
各培養工程における遺伝子マーカーの発現量の検出、オンスペック細胞の基準値との比較および判定は、測定したい培養工程の細胞を一部取得して被検細胞とし、上記の方法で行うことができる。
【００５８】
モニタリングを行う培養工程の組み合わせを適宜決定し、上記工程（Ａ）から（Ｅ）の何れか一以上の培養工程を目的に応じて非常に簡便にモニタリングすることができる。例えば、骨髄細胞から間葉系幹細胞を培養する場合（上記工程（Ａ）から（Ｃ）までに相当）には、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｆ）及び（ｇ）に記載の遺伝子から選択される一以上の遺伝子を用いてモニタリングを行えばよい。好ましくは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に記載の遺伝子マーカーから選択される何れか一以上の遺伝子マーカーを用い、更に好ましくは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に記載の遺伝子マーカーを、工程毎に何れか一つ以上を選択してモニタリングを行えば良い。
【００５９】
また、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化誘導培養を行う場合（上記工程（Ｃ）から（Ｅ）までに相当）には、上記（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｈ）及び（ｉ）に記載の遺伝子マーカーから選択される何れか一以上の遺伝子を用いてモニタリングを行えばよい。好ましくは、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）に記載の遺伝子マーカーから選択される何れか一以上の遺伝子マーカーを用い、更に好ましくは、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）に記載の遺伝子マーカーを、工程毎に何れか一つ以上を選択して用いればよい。
【００６０】
本発明の遺伝子マーカーを検出するためのプローブ、上記プローブを固定したマイクロアレイ又はＤＮＡチップ、本発明の遺伝子マーカーを増幅するためのプライマー、及び本発明の遺伝子マーカーがコードするタンパク質に対する抗体は、それらを装備した間葉系幹細胞などの「骨髄細胞から骨芽細胞までの細胞」の識別用キットとして製品化しておくことができる。
【００６１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００６２】
実施例１［材料調製］
（培養試薬の調製）
骨髄液から間葉系幹細胞の培養液（以下、「間葉系幹細胞培養液」）には、Dulbecco's Modified Eagle Medium（Invitrogen社製）に10%ウシ胎児血清と抗生物質を添加し、最終濃度50μg/mLのビタミンC及び最終濃度10ng/mLのbFGFを添加した培地を調製した。
【００６３】
骨芽細胞への分化誘導培地（以下、骨芽分化誘導培養液）には、Dulbecco's Modified Eagle Medium（Invitrogen社製）に10%ウシ胎児血清と抗生物質を添加し、最終濃度50μg/mLのビタミンC、最終濃度100nMのデキサメタゾン及び最終濃度10mMのβ-グリセロリン酸を添加した培地を調製した。
【００６４】
軟骨細胞への分化誘導培地（以下、「軟骨分化誘導培養液」）には、Dulbecco's Modified Eagle Medium（Invitrogen社製）に10%ウシ胎児血清と抗生物質を添加し、最終濃度50μg/mLのビタミンC、最終濃度100nMのデキサメタゾン、最終濃度10ng/mLのTGFβ3及びITSを添加した培地を調製した。
【００６５】
脂肪細胞への分化誘導培地（以下、「脂肪分化誘導培養液」）には、Dulbecco's Modified Eagle Medium（Invitrogen社製）に10%ウシ胎児血清と抗生物質を添加し、最終濃度1μMのデキサメタゾン、最終濃度10μg/mLのインシュリン、最終濃度0.2μMのインドメタシン及び最終濃度0.5mMのIBMX(3-isobuthyl-1-methyl xanthine:シグマ社製)を添加した培地を調製した。
【００６６】
培養液の条件検討のために用いた間葉系幹細胞の培養液（以下、「間葉系幹細胞培養液 (条件検討用)」）は、Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12（Invitrogen社製）に10%ウシ胎児血清と抗生物質を添加して調製した。
【００６７】
（細胞培養）
ヒト由来間葉系幹細胞（human mesenchymal stem cell）の増殖培養には、間葉系幹細胞培養液を使用した。ヒト由来間葉系幹細胞の骨分化培養には骨芽分化誘導培養液を、軟骨分化培養には軟骨分化誘導培養液を、脂肪分化培養には脂肪分化誘導培養液を使用した。ヒト線維芽細胞（human fibroblast）の増殖培養には、線維芽細胞培地キット-2 (2%FBS)(Cambrex社製)、もしくは間葉系幹細胞培養液を使用した。また、これらの細胞は37℃、5%炭酸ガス濃度下で培養した。
【００６８】
（培養工程）
骨髄液から間葉系幹細胞を分離した後、増殖培養を経て、骨芽細胞・軟骨細胞・脂肪細胞に分化させるまでの一連の培養操作手順について、基本的なプロトコールを以下に示した。
【００６９】
骨髄液からの間葉系幹細胞増殖培養：1日目に、骨髄液を間葉系幹細胞培養液に懸濁し、フラスコに播種した。4日目に培養液の70%を交換し、その後は3~4日毎に全量培地交換をした。コンフルエントになったら細胞を継代し、この細胞が再びコンフルエントになったら回収し、分化誘導に使用した。
骨芽細胞分化誘導：回収した細胞を、骨芽分化誘導培地に懸濁、播種した。3~4日毎に全量培地交換を行い、14日間分化培養を行った。
軟骨細胞分化誘導：回収した細胞を、間葉系幹細胞培養液に懸濁、播種した。播種翌日に、軟骨分化誘導培養液に交換し、3~4日毎に全量培地交換をし、21日間分化培養を行った。
脂肪細胞分化誘導：回収した細胞を、間葉系幹細胞培養液に懸濁、播種した。播種翌日に、脂肪分化誘導培養液に交換し、3~4日毎に全量培地交換をし、14日間分化培養を行った。
【００７０】
（細胞の回収）
細胞の回収は、以下の8つの培養工程（ステージ）で実施した(図1)。
ステージ1：購入した骨髄液
ステージ2：培養4日目の培養初期細胞
ステージ3：継代数1の培養中期細胞
ステージ4：継代数2の培養後期細胞
ステージ5：分化誘導後、1日間培養した細胞
ステージ6：分化誘導後、4日間培養した分化初期細胞
ステージ7：分化誘導後、7日間培養した分化中期細胞
ステージ8：分化誘導後、14日間培養した分化後期細胞
【００７１】
(オンスペックモデルとオフスペックモデルの定義)
骨髄液から骨分化までの間で、上記規定の培養条件で正常に培養された細胞を、オンスペックモデルと定義した。一方、本工程において培養条件を変更して培養したもの、具体的には継代数や培養液組成を変えて培養した細胞、または正常に培養されなかったもの、例えば、培養過程において、脂肪細胞・軟骨細胞といった、骨以外に分化した細胞、細菌・ウイルスなどが混入した細胞、がん化した細胞、異なる系統の細胞、例えば、線維芽細胞をオフスペックモデルとした。
【００７２】
実施例２[マイクロアレイ解析]
(マイクロアレイ実験方法)
図１に示す培養工程１〜８ステージの細胞からRNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて全ＲＮＡを抽出後、Amino Allyl MessageAmp aRNA Kit（Ambion社製）を用いて相補的ｍＲＮＡを増幅し、その5 μｇをDNA microarray（AceGene Human oligo chip 30K 1chip version）にてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの方法はAceGeneR-1 Chip Version-取り扱い説明書に従った。さらに、リファレンスとしては、ベクトン・ディッキンソン社より購入した骨髄RNAの混合液を使用した。骨髄RNAの混合液を、上記と同様の方法で相補的ｍＲＮＡを増幅し、このRNAをリファレンスとして、全てのDNAマイクロアレイ実験に使用した。DNAマイクロアレイのスキャニングにはScanArray Express (PerkinElmer社製)を使用した。取得したスキャニング画像の数値化にはImaGene（BioDiscovery社製）を使用し、正規化にはGeneSight（BioDiscovery社製）を使用した。マイクロアレイデータの統計学的処理は、表計算ソフトExcel（Microsoft社製）と統計解析ソフトR(フリーソフトウェア)を使用した。
【００７３】
(マイクロアレイ解析結果)
１．マーカー遺伝子候補の絞込み
骨髄液から骨分化まで、図1に示した8ステージの細胞として正常に培養できたオンスペックモデルを、各5検体（A、B、C、D、E）用いて、それぞれから発現プロファイルデータを取得した。
【００７４】
各遺伝子の発現量について、まず上記5検体の平均値を算出し、その最大と最小の間差が2倍以上を示す遺伝子を抽出した。抽出した遺伝子群から、さらに、5検体の中のA検体を基準とし、8ステージの変動パターンについて、A検体と他の4検体のPearson相関係数を、検体AとB、検体AとC、検体AとD、検体AとEの組み合わせでそれぞれ算出した。算出したPearson相関係数の平均値を算出し、0.4以上を示す2080遺伝子を抽出した。
【００７５】
２．各培養工程に特徴的な遺伝子群の抽出
次に、上記１．で抽出した2080遺伝子について、図1に示す8ステージの培養工程を図２に示す5つの群（群1=ステージ1（骨髄液）、群2=ステージ2、群3=ステージ3、4（間葉系幹細胞）、群4=ステージ5（骨芽前駆細胞）、群5=ステージ6、7、8（骨芽細胞））に分けて、図3に示した決定樹の流れに従い、多重比較検定を行った。
群総当りの多重比較検定を行った結果、上記1．で抽出した2080遺伝子から、（１）特異的な発現量により、各群を規定できる36遺伝子（P<0.01）(表１)と、（２）隣り合う2群間で顕著な発現差を示す9遺伝子（（１）との重複は3遺伝子）(表２)を絞り込んだ。この合計45遺伝子から重複を除いた42遺伝子を、以下「マーカー候補遺伝子」とした。
【００７６】
（１）の36遺伝子において、群1を規定する13遺伝子と群2を規定する15遺伝子では、9遺伝子が重複していた。しかし、遺伝子は同じであっても、群1の骨髄液から回収される細胞において検出される発現量と、群2の培養初期細胞において検出される発現量とが有意に異なるため、各群を明確に規定できることがわかった。他の群間で重複する遺伝子についても同様であった。
【００７７】
【表１】
2008178403.tif 000002
【００７８】
【表２】
2008178403.tif 000003
【００７９】
実施例３  [培養工程各群を規定できる遺伝子の検証]
（オフスペックモデルの調製）
オフスペックモデルとして、間葉系幹細胞１検体から骨以外に分化させた細胞を調製した。具体的には軟骨分化細胞(分化培養4日、14日)、脂肪分化細胞(分化培養4日、14日)を調製した。各細胞の培養は実施例１に記載の条件で行った。この他に、線維芽細胞（Cambrex社製、製品コードCC-2511）、及びHSV-I(単純ヘルペスI型)ウイルスを人為的に接種した間葉系幹細胞を調製した。線維芽細胞は、線維芽細胞培地キット-2 (2%FBS)(Cambrex社製)、もしくは間葉系幹細胞培養液を使用し、2種類の細胞を調製した。HSV-I(単純ヘルペスI型)ウイルスを人為的に接種した間葉系幹細胞は、図1に示したステージ4の間葉系幹細胞に対して、約107コピーのHSV-Iを接種し、72時間培養を継続して調製した。
【００８０】
（マイクロアレイ解析結果）
オフスペックモデルとして調製した全ての細胞に対し、実施例2に記載の方法に従って発現プロファイルデータを取得した。
実施例２の２．で抽出した培養工程の１〜５群を規定できると予測される遺伝子３６個（表１）について、オンスペック基準5検体のデータにオフスペックモデルのデータを加えて評価したところ、オンスペックの細胞では、各群で遺伝子の発現量に差が見られ、上記３６遺伝子（表１）が特に大きい発現量の差を示した。また、オフスペックの細胞でも、上記３６遺伝子の発現量には差が見られ、これら３６遺伝子は、各群のオンスペック細胞を他の細胞と区別することができることを確認した。この結果の代表例を図４〜８に示した。図４〜８で群１〜５は、各群のオンスペック細胞中の上記３６遺伝子の発現量を示し、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、HSV-I接種間葉系幹細胞はオフスペック細胞の代表で、該細胞中の上記の各群を規定できる遺伝子の発現量を示す。
【００８１】
このことから、これらの上記３６遺伝子（表１）は、その発現量により、各群を規定できる遺伝子マーカーとなり得ることがわかった。
【００８２】
実施例４ [培養工程の判別可否の検証−1]
（階層型クラスタリングによるオンスペック基準5検体のステージ判別確認）
オンスペック基準5検体（A,B,C,D,E）に対して、マーカー候補42遺伝子の発現量を、統計解析ソフトR（フリーソフトウェア）を使用して階層型クラスタリング解析を実施したところ、各群において、全てのオンスペック基準検体が同一クラスタに分類された。このことから、マーカー候補４２遺伝子の発現量による階層型クラスタリング解析により、培養工程5群の判別が可能であった(図９の群１：オンスペックA,B,C,D,E_ステージ１、群２：オンスペックA,B,C,D,E_ステージ２、群３：オンスペックA,B,C,D,E_ステージ３及びステージ４、群４：オンスペックA,B,C,D,E_ステージ５、群５：オンスペックA,B,C,D,E_ステージ６及びステージ７及びステージ８)。
【００８３】
実施例５ [培養工程の判別可否の検証−2]
（追加検体を加えたステージ判別確認）
培養工程を判別する目的で絞り込んだ42遺伝子の妥当性を検証するため、新たに、骨髄液から骨分化まで、正常に培養できたオンスペックモデル6検体（F,G,H,I,J,K）を用いて実施例4と同様の解析を行った。図１に示すステージ4とステージ6の発現プロファイルデータを、マイクロアレイを用いて取得し、基準検体5検体（A,B,C,D,E）から得たデータと合わせて、マーカー候補42遺伝子の発現量を用いて階層型クラスタリング解析を行った。階層型クラスタリング解析の結果の代表例として、オンスペックモデル6検体（F,G,H,I,J,K）の2つのステージ（ステージ４及び6）についての結果を図９に示した。図９に示すとおり、オンスペックモデル6検体は、基準検体5検体（A,B,C,D,E）の場合と同じクラスタに含まれることが確認された(図9の群３：オンスペックF,G,H,I,J,K _ステージ４、：オンスペックF,G,H,I,J,K _ステージ６)。この結果から42遺伝子の発現プロファイルデータを取得することにより、培養工程が正常な経過をとったことをモニタリングできることが示された。
【００８４】
実施例６ [培養工程の判別可否の検証−3]
（オフスペックを用いた検証）
１．脂肪分化細胞を用いた検証
実施例3で取得した脂肪に分化させた細胞(分化培養4日、14日)の遺伝子発現データを、オンスペックモデルのデータに追加して、前述した階層型クラスタリング解析を行った。その結果、脂肪に分化させた細胞は、どの培養ステージとも異なるクラスタを形成することが確認された(図9の脂肪分化４ｄａｙ及び脂肪分化１４ｄａｙ)。このことから、培養過程で、骨芽細胞以外への分化といった、正常な培養に変化を及ぼす異常をモニタリングできることがわかった。
【００８５】
２．線維芽細胞を用いた検証
実施例3で取得したオフスペック（線維芽細胞）2検体の遺伝子発現データを、オンスペックモデルのデータに追加して、前述した階層型クラスタリング解析を行った。その結果、繊維芽細胞２検体は間葉系幹細胞のどの培養ステージとも異なるクラスタを形成することが確認された(図9の線維芽細胞１及び線維芽細胞１．１)。このことから、細胞形態的に類似している間葉系幹細胞と繊維芽細胞を極めて明確に識別できることが示された。
【００８６】
３．ウイルスを接種した間葉系幹細胞を用いた検証
実施例3で取得したオフスペック（HSV-Iウイルスを人為的に接種した間葉系幹細胞）の遺伝子発現データを、オンスペックモデルのデータに追加して、前述した階層型クラスタリング解析を行った。その結果、人為的にウイルスを接種した細胞は、正常に培養された間葉系幹細胞の全ての培養ステージと異なるクラスタを形成することが確認された(図9のHSVI接種後72hr)。このことから、培養過程にウイルス汚染など正常な培養に変化を及ぼす異常をモニタリングできる可能性が示された。
【００８７】
実施例７［リアルタイムPCRによる検証］
(リアルタイムＰＣＲ方法)
供試細胞よりRNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて全ＲＮＡを抽出後、全ＲＮＡ１μｇを鋳型としてcDNAを合成した。合成手順については、Super Script II Reverse Transcriptase （Invitrogen社製）の添付資料に記載されているプロトコール（First-Strand cDNA Synthesis Using SuperScriptII RT）に従った。なお、プライマーについては、Random Primer(6mer)（TaKaRa社製）を使用した。ｃＤＮＡを合成した後、合成後のcDNA溶液を5倍に希釈した。この希釈液1μLを鋳型としてリアルタイムPCRを行った。使用したプライマー・プローブ試薬については、表３に示した。
【００８８】
測定については、ABI PRISM 7700 Sequence Detector（ABI社製）を使用し、プローブ法、もしくはSYBR GreenI法にて実施した。プローブ法の場合には、TaqManR Universal PCR Master Mix, No AmpEraseR UNG (ABI社製品)の反応液を、SYBR Green I法の場合にはSYBR R GREEN PCR Master Kit (ABI社製品）の反応液を用いた。なお、表３に記載した「Hs」で始まるプローブは、ABI社製で製品番号を示した。
【００８９】
【表３】
2008178403.tif 000004
【００９０】
（マイクロアレイデータとの比較）
DNAマイクロアレイの遺伝子発現データは相対値で数値化されるが、リアルタイムPCRによる発現量解析は絶対値で数値化される。培養工程を判別する目的で絞り込んだ42遺伝子について、リアルタイムPCRによる遺伝子発現データの評価を行った。実施例2で用いたオンスペックモデル基準5検体について、培養工程8ステージにおける細胞の遺伝子発現量を、リアルタイムPCRを用いて測定した。なお、基準5検体のうち、検体Bのステージ2、及び検体Dのステージ1及び2については、total RNA量が不足していたため、データを取得できなかった。42遺伝子のCt値を測定後、ΔCt値(40−Ct値)を算出した。算出したΔCt値から、培養工程8ステージにおける経時的な発現変動をグラフに示し（図10〜15の左側のグラフ）、実施例２で取得したマイクロアレイの経時的な発現変動（図10〜15の右側のグラフ）と比較した。
【００９１】
その結果、培養工程各群を規定できる32遺伝子(表４)、及び隣り合う2群間で顕著な発現差を示す9遺伝子 (表2)について、重複する3遺伝子を除く計38遺伝子の発現変動パターンは、相似型を示すことが確認された(図10から図15)。さらに、相似型を示した38遺伝子についてはマイクロアレイのデータと同様に、群1を規定できる遺伝子はその他の全ての群に対して有意差（P<0.01）があり、群2から5を規定できる遺伝子についても同様であった。
【００９２】
【表４】
2008178403.tif 000005
【００９３】
実施例８[培養工程各群を規定できる遺伝子の検証]
（リアルタイムPCRによるオフスペックモデルの遺伝子発現データの取得）
実施例３で調製した1検体の間葉系幹細胞から骨分化させた細胞(分化培養4日、14日)・軟骨分化させた細胞(分化培養4日、14日)・脂肪分化させた細胞(分化培養4日、14日)、2系統の培養液を用いて調製した線維芽細胞2種類、HSV-I(単純ヘルペスI型)ウイルスを人為的に接種した間葉系幹細胞について、それぞれの細胞中のマーカー候補遺伝子の発現プロファイルデータを、リアルタイムPCRを用いて、実施例7に記載の方法に従って取得した。
【００９４】
実施例7に示した培養工程の各群を規定できると予測される32遺伝子（表４）について、オンスペック基準5検体（A,B,C,D,E）のデータにオフスペックモデルのデータを加えて評価したところ、オンスペックの細胞では、各群で遺伝子の発現量に差が見られ、上記32遺伝子（表４）が特に大きい発現量の差を示した。また、オフスペックの細胞でも、上記32遺伝子の発現量には差が見られ、これら32遺伝子は、各群のオンスペック細胞を他の細胞と区別することができることを確認した。この結果の代表例を図１６〜２０に示した。図１６〜２０で群１〜５は、各群のオンスペック細胞中の上記32遺伝子の発現量を示し、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、HSV-I接種間葉系幹細胞はオフスペック細胞の代表で、該細胞中の遺伝子の発現量を示す。
【００９５】
このことから、これらの32遺伝子はその発現量により、各群を規定できる遺伝子マーカーとなり得ることがわかった。
【００９６】
オンスペック基準5検体（A,B,C,D,E）とオフスペックモデルのリアルタイムPCRによる遺伝子発現データから、実施例7で示した培養工程各群を規定できる32遺伝子の中から、群３を規定できる3遺伝子（IRS2、LXNおよびTSC22D1）および群５の隣り合う２群で顕著に発現が異なる３遺伝子（COL11A1、FBLN5及びFRZB）を選択し、ユークリッド距離に基づいた多次元尺度法による2次元プロット解析を行った。その結果を図２１および２２に示す。図２１および２２において、プロットに示したＡ〜Ｅは検体を示し、数字はステージ（図１、２）を示す。図２１では、群３の基準検体A,B,C,D,Eのステージ３及び４が、全て同領域に存在した。図２２では、群５の基準検体A,B,C,D,Eのステージ６、７及び８が、全て同領域に存在した。各マーカー遺伝子により規定される群の検体におけるプロットは、近い範囲に集中し、その他の群やオフスペックモデル検体のプロットとは異なる分布を示した。なお、多次元尺度法には総計解析ソフトR（フリーソフトウェア）を使用した。
【００９７】
実施例９ [培養工程の判別可否の検証−１]
（階層型クラスタリングによる基準5検体(A,B,C,D,E)のステージ判別確認）
培養工程各群を規定できる32遺伝子(表4)、及び隣り合う2群間で顕著な発現差を示す9遺伝子 (表2)のうち、それぞれの細胞中のマーカー候補遺伝子の発現プロファイルデータを、リアルタイムPCRを用いて、実施例7に記載の方法に従って取得した。
【００９８】
重複する3遺伝子を除く計38遺伝子のΔCt値(40-Ct値)について、統計解析ソフトR（フリーソフトウェア）を使用して階層型クラスタリング解析を実施したところ、各群において、全てのオンスペック基準検体が同一クラスタに分類された。このことから、培養工程5群の判別が可能であった(図23の群１：オンスペックA,B,C,E_ステージ１、群２：オンスペックA,C,E_ステージ２、群３：オンスペックA,B,C,D,E_ステージ３及びステージ４、群４：オンスペックA,B,C,D,E_ステージ５、群５：オンスペックA,B,C,D,E_ステージ６及びステージ７及びステージ８)。
【００９９】
実施例１０ [培養工程の判別可否の検証−2]
（追加検体を加えたステージ判別確認）
培養工程を判別する目的で絞り込んだ38遺伝子の妥当性を検証するため、新たに、骨髄液から骨分化まで、正常に培養できたオンスペックモデル6検体（F,G,H,I,J,K）の全培養ステージの遺伝子発現データを、リアルタイムPCRを用いて実施例７に記載の方法に従って取得した。
【０１００】
オンスペックモデル6検体（F,G,H,I,J,K）を追加して、階層型クラスタリング解析を行った結果、オンスペックモデル6検体の各培養ステージは、基準5検体(A,B,C,D,E)の場合と同じクラスタに含まれることが確認された(図23の群１：オンスペックG,H,J,K_ステージ１、群２：オンスペックH,J,K_ステージ２、群３：オンスペックF,G,H,I,J,K _ステージ３及びステージ４、群４：オンスペックF,G,H,I,J,K _ステージ５、群５：オンスペックF,G,H,I,J,K _ステージ６及びステージ７及びステージ８)。この結果から38遺伝子の遺伝子発現データを取得することにより、培養工程が正常に経過したことをモニタリングできることが示された。
【０１０１】
実施例１１  [培養工程の判別可否の検証−3]
（オフスペックを用いた検証）
１. 軟骨分化細胞、及び脂肪分化細胞を用いた検証
実施例8で取得した軟骨に分化させた細胞(分化培養4日、14日)）と脂肪に分化させた細胞(分化培養4日、14日)の遺伝子発現データと、オンスペックモデルの遺伝子発現データについて、実施例１０と同様に階層型クラスタリング解析を行った。その結果、軟骨分化細胞、及び脂肪分化細胞は、どの培養ステージとも異なるクラスタを形成することが確認された（図2３の軟骨分化４ｄａｙ及び軟骨分化１４ｄａｙ、脂肪分化４ｄａｙ及び脂肪分化１４ｄａｙ)。このことから、培養過程で骨芽細胞以外への分化といった、正常な培養に変化を及ぼす異常をモニタリングできることがわかった。
【０１０２】
２．線維芽細胞を用いた検証
実施例8で取得した線維芽細胞2検体の遺伝子発現データと、オンスペックモデルの遺伝子発現データについて、実施例１０と同様に階層型クラスタリング解析を行った。その結果、繊維芽細胞２検体は間葉系幹細胞のどの培養ステージとも異なるクラスタを形成することが確認された（図23の線維芽細胞１及び線維芽細胞２)。このことから、細胞形態的に類似している間葉系幹細胞と繊維芽細胞を極めて明確に識別できることが示された。
【０１０３】
３．ウイルスを接種した間葉系幹細胞を用いた検証
実施例8で取得したHSV-I(単純ヘルペスI型)ウイルスを人為的に接種した間葉系幹細胞の遺伝子発現データを、オンスペックモデルの遺伝子発現データについて、実施例１０と同様に階層型クラスタリング解析を行った。その結果、人為的にウイルスを接種した細胞は、正常に培養された間葉系幹細胞の全ての培養ステージと異なるクラスタを形成することが確認された（図23のHSVI接種後72hr）。このことから、培養過程にウイルス汚染など正常な培養に変化を及ぼす異常をモニタリングできることがわかった。
【０１０４】
４．遺伝子発現プロファイルに培養条件が及ぼす影響についての検証
図1に示したステージ4の間葉系幹細胞から、オフスペック細胞として、通常の培養液で4回の継代を追加した間葉系幹細胞Aと、4回目の継代以降に培養液を実施例１に記載した間葉系幹細胞培養液(条件検討用)に変更した間葉系幹細胞Bを調製し、リアルタイムPCRを用いて、遺伝子発現データを取得した。
【０１０５】
オンスペックモデル11検体(A〜K)の遺伝子発現データと、上記で取得した間葉系幹細胞A、及びBの遺伝子発現データについて、実施例１０と同様に階層型クラスタリング解析を行った。その結果、これらの間葉系幹細胞A,Bは、どのオンスペック細胞とも異なるクラスタを形成することが判明した（図24の間葉系幹細胞A,B、群１、群２、群３、群４、群５)。
【０１０６】
また、実施例１０で選択した３８遺伝子を使用し、オンスペックモデル11検体の間葉系幹細胞（群３）と骨芽細胞（群５）、及び、上記の様に変更して培養した間葉系幹細胞A、Bを、ユークリッド距離に基づいた多次元尺度法によって2次元図にプロットした。この結果を図２５に示す。図中プロットに示したＡ〜Ｋは検体を示し、数字はステージ（図１、２）を示す。オンスペックモデルの間葉系幹細胞集団（群３）から、間葉系幹細胞A、間葉系幹細胞Bの順で離れており、また、骨芽細胞（群５）とも離れており、その間隔はいずれも顕著に開いていた(図25の群３：基準検体A,B,C,D,Eのステージ3及び4、追加検体F,G,H,I,J,Kのステージ3及び4、群５：基準検体A,B,C,D,Eのステージ６及び７及び８、追加検体F,G,H,I,J,Kのステージ６及び７及び８、間葉系幹細胞Ａ、間葉系幹細胞Ｂ)。このことから、細胞の継代数や培養液の組成によって発現プロファイルが変化することが示され、その様な発現プロファイルの変化に基づいて、異なる培養条件下にさらされているかモニタリングできることが確認された。
【０１０７】
実施例１２［培養ステージや細胞の品質判定方法についての検討］
（例1：相関係数を用いた判定）
実施例７に示した培養工程各群を規定できる32遺伝子(表4)から、代表的な23遺伝子（表5）を選抜した。オンスペックモデル基準5検体（A,B,C,D,E）の群1に属する細胞について、遺伝子毎に発現量の平均値を算出し、その23遺伝子の発現パターンを、群1の基準値と規定した。このような計算を群2から群5についても、同様に行い、各群の基準となる23遺伝子の発現パターンを算出した（図２６．群１：オンスペックA,B,C,Ｅ_ステージ１対群１の基準値、群２：オンスペックA,C,Ｅ_ステージ２対群２の基準値、群３：オンスペックA,B,C,D,Ｅ_ステージ３及び４対群３の基準値、群４：オンスペックA,B,C,D,Ｅ_ステージ5対群4の基準値、群５：オンスペックA,B,C,D,Ｅ_ステージ６及び７及び８対群５の基準値）。
【０１０８】
【表５】
2008178403.tif 000006
【０１０９】
次に、検証用としたオンスペック追加2検体（G,K）とオフスペックモデルについて、各細胞の23遺伝子の発現パターンと、群1から群5までの5つ基準発現パターンとのスピアマン相関係数を算出した。その結果、オンスペック追加2検体の群1の細胞は、他の群に対する基準値と比較して、群1の基準値に対して最も相関係数が高く、その値は0.9以上であった（図２６のオンスペックG,K_ステージ１対群１の基準値）。群2〜5に関しても同様の結果であった（群２：図２６のオンスペックK_ステージ２対群２の基準値、群３：図２６のオンスペックG,K_ステージ３及び４対群３の基準値、群４：図２６のオンスペックG,K _ステージ5対群4の基準値、群５：図２６のオンスペックG,K_ステージ６及び７及び８対群５の基準値）。
【０１１０】
一方、オフスペックモデルの間葉系幹細胞Ｂ、脂肪分化細胞、2検体の線維芽細胞、HSV-I接種細胞については、いずれの群の基準値に対しても、相関係数が0.9未満であった（図２６）。但し、間葉系幹細胞Ａは間葉系幹細胞の基準値に対し、0.9以上であった。また、軟骨細胞については、骨芽細胞の基準値に対し、相関係数が0.9以上であった（図２６）。
【０１１１】
（例2：ユークリッド距離関数を用いた判定）
実施例７に示した培養工程各群を規定できる32遺伝子(表4)から、代表的な23遺伝子（表5）を選抜した。オンスペック基準5検体（A,B,C,D,E）の群1に属する細胞について、遺伝子毎に発現量の平均値を算出し、その23パラメータを群1の中心座標と規定した。このような計算を群2から群5についても同様に行い、各群の中心座標を算出した。
【０１１２】
次に、検証用としたオンスペック基準2検体（G,K）と上記のオフスペックモデルについて、各細胞の23遺伝子の発現量を、各細胞の座標とし、群1から群5までの各中心座標からのユークリッド距離を算出した。その結果、群1の細胞は、群1の中心座標から近い距離に集まる傾向を示した。群2〜5に関しても同様の傾向を示した。例として、群3(間葉系幹細胞)および群5（骨芽細胞）の中心座標から各細胞までの距離を図27、図28に示す。図２７に示すように、群３におけるオンスペック基準７検体（A,B,C,D,E,G,K,）のステージ３及び４の中心座標からのユークリッド距離は、3.4〜7.2の間で近くに集まり、他の群あるいはオフスペックモデルの中心座標からのユークリッド距離は、8.1〜31.6で遠くに離れていた。また、図２８に示すように、群５におけるオンスペック基準７検体（A,B,C,D,E,G,K,）のステージ６及び７及び８の群３の中心座標からのユークリッド距離は、2.9〜8.0の間で近くに集まり、他の群あるいはオフスペックモデルの中心座標からのユークリッド距離は、9.7〜39.3で遠くに離れていた。
例１および例2に示すように、統計解析手法を用いた培養工程ステージ判別、品質管理が可能であることが示された。
【０１１３】
実施例１３［multiplex PCR検出系による検証］
(multiplex PCR方法)
供試細胞よりRNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて全ＲＮＡを抽出後、全ＲＮＡ１μｇを鋳型としてcDNAを合成した。合成手順については、Super Script II Reverse Transcriptase （Invitrogen社製）の添付資料に記載されているプロトコール（First-Strand cDNA Synthesis Using SuperScript II RT）に従った。なお、プライマーについては、Random Primer(6mer)(TaKaRa社製)を使用した。ｃＤＮＡを合成した後、合成後のcDNA溶液を5倍に希釈した。この希釈液5μLを鋳型としてmultiplex PCRを行った。なお、培養工程各群を規定できる代表的な23遺伝子を、12遺伝子と11遺伝子の2組に分け(表6)、表に示すプライマー(表7)を用いてPCR反応を行った。2組のPCR反応液は、Distilled Water,Deionized,Sterile(和光純薬工業株式会社製)、dNTP Mixture (2.5mM each:TaKaRa社製)、10×PCR Buffer(Conteins 15mM MgCl2:Roche社製) 、MgCl2 Solution (25mM:Roche社製)、AmpliTaq GoldTM (Roche社製)、鋳型DNA、プライマーを表8に示すように混合し、調製した。PCR条件は表9に示した。2組の反応で得たPCR産物は、DNA 1000 Kit(Agilent社製)を用いて電気泳動し、2100 bioanalyzer(Agilent社製)を用いて検出した。泳動結果を、Agilent 2100 Bio Sizingソフトウェア(Agilent社製)で解析し、各遺伝子産物のモル濃度（nmol/L）を算出した。
【０１１４】
【表６】
2008178403.tif 000007
【０１１５】
【表７】
2008178403.tif 000008
【０１１６】
【表８】
2008178403.tif 000009
【０１１７】
【表９】
2008178403.tif 000010
【０１１８】
骨髄液から骨分化まで、正常に培養できたオンスペックモデル1検体（Ｊ）について、群1(骨髄液)、群3(間葉系幹細胞)、群5(骨芽細胞)の遺伝子発現データをmultiplex PCR検出系を用いて取得した。取得した23遺伝子のモル濃度の値を用い、各細胞を、ユークリッド距離に基づいた多次元尺度法によって2次元図にプロットした。この結果を図２９左に示す。図中、アルファベットは検体を、数字はステージを示す。また、同じ検体の、リアルタイムPCRのΔCt値(40-Ct)を用い、同様にユークリッド距離に基づいた多次元尺度法によって2次元にプロットした結果を、図２９右に示した。図中、アルファベットは検体を、数字はステージを示す。multiplex PCRのプロット図とリアルタイムPCRのプロット図を比較した結果、パターンが類似しており、群１と群３と群５の領域が明らかに離れていることを確認した。以上の結果から、multiplex PCR検出系を用いた培養ステージ判別、品質管理のが可能であることが示された。
【０１１９】
これらの検討により選抜したマーカー遺伝子について、遺伝子発現の特徴を表10および表11に示した。特異的な発現量により、骨髄液から骨分化までの培養工程における各群を規定できるような32遺伝子（表4）、隣り合う2群間で顕著な発現差を示す9遺伝子（表2）のうち、重複する3遺伝子を除く計38遺伝子は、各群における遺伝子マーカーとなり得る遺伝子であり、組み合わせて利用することもできるが、各群で固有の特徴を示す遺伝子は単独でもマーカー遺伝子として利用できることが示された。また、これらのマーカー遺伝子の発現量を定量、または半定量的な検出系で数値化したデータを統計解析的手法により評価することで、培養ステージや細胞の状態を判別できることを確認した。このことから、遺伝子発現量に基づいた細胞の規格化や品質管理検査が可能であると考えられる。
【０１２０】
【表１０】
2008178403.tif 000011
【０１２１】
【表１１】
2008178403.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１は、培養工程（ステージ）を示す。
【図２】図２は、培養工程（ステージ）の群分けを示す。
【図３】図３は、決定樹を示す。
【図４】図４は、群1とその他の細胞について、ヒトマトリックスメタロペプチダーゼ９の発現量（log2比）の比較を示す。
【図５】図５は、群2とその他の細胞について、ヒトインターフェロン−γ誘導タンパク30発現量（log2比）の比較を示す。
【図６】図６は、群3とその他の細胞について、ヒトラテキシンの発現量（log2比）の比較を示す。
【図７】図７は、群4とその他の細胞について、ヒトＰ３１１タンパク類似タンパクの発現量（log2比）の比較を示す。
【図８】図８は、群5とその他の細胞について、ヒトフリッツルド類似タンパクの発現量（log2比）の比較を示す。
【図９】図９は、オンスペック基準検体（A,B,C,D,E）、オンスペックモデル検体（F,G,H,I,J,K）、脂肪分化細胞、線維芽細胞、ウイルスを接種した間葉系幹細胞における（42遺伝子の発現量（log2比）による階層型クラスタリング解析結果を示す。
【図１０】図１０は、マーカー候補遺伝子（７遺伝子）のリアルタイムPCRデータとマイクロアレイデータの比較を示す。
【図１１】図１１は、マーカー候補遺伝子（7遺伝子）のリアルタイムPCRデータとマイクロアレイデータの比較を示す。
【図１２】図１２は、マーカー候補遺伝子（7遺伝子）のリアルタイムPCRデータとマイクロアレイデータの比較を示す。
【図１３】図１３は、マーカー候補遺伝子（7遺伝子）のリアルタイムPCRデータとマイクロアレイデータの比較を示す。
【図１４】図１４は、マーカー候補遺伝子（7遺伝子）のリアルタイムPCRデータとマイクロアレイデータの比較を示す。
【図１５】図１５は、マーカー候補遺伝子（3遺伝子）のリアルタイムPCRデータとマイクロアレイデータの比較を示す。
【図１６】図１６は、群1とその他の細胞について、発現量（40-Ct値）の比較を示す。
【図１７】図１７は、群2とその他の細胞について、発現量（40-Ct値）の比較を示す。
【図１８】図１８は、群3とその他の細胞について、発現量（40-Ct値）の比較を示す。
【図１９】図１９は、群4とその他の細胞について、発現量（40-Ct値）の比較を示す。
【図２０】図２０は、群5とその他の細胞について、発現量（40-Ct値）の比較を示す。
【図２１】図２１は、オンスペック基準検体（A,B,C,D,E）、脂肪分化細胞、線維芽細胞、ウイルスを接種した間葉系幹細胞における群3を規定できる3遺伝子の発現量（40-Ct値）を用いた場合の、多次元尺度法による2次元プロット解析結果を示す。
【図２２】図２２は、オンスペック基準検体（A,B,C,D,E）、脂肪分化細胞、線維芽細胞、ウイルスを接種した間葉系幹細胞における群5を規定できる3遺伝子の発現量（40-Ct値）を用いた場合の、多次元尺度法による2次元プロット解析結果を示す。
【図２３】図２３は、オンスペック基準検体（A,B,C,D,E）、オンスペック検証検体（F,G,H,I,J,K）、脂肪分化細胞、軟骨分化細胞、線維芽細胞、ウイルスを接種した間葉系幹細胞における38遺伝子の発現量（40-Ct値）による階層型クラスタリング解析結果を示す。
【図２４】図２４は、オンスペック検体（A,B,C,D,E,F,G,H,I,J,K）、間葉系幹細胞A,Bにおける38遺伝子の発現量（40-Ct値）による階層型クラスタリング解析結果を示す。
【図２５】図２５は、オンスペック検体（A,B,C,D,E,F,G,H,I,J,K）、間葉系幹細胞A,B における38遺伝子の発現量（40-Ct値）を用いた場合の、多次元尺度法による2次元プロット解析結果を示す。
【図２６】図２６は、オンスペック検体（A,B,C,D,E,F,G,K）、オフスペックモデル検体における、23遺伝子の発現量（40-Ct値）のパターンを用いて算出した相関係数を示す。
【図２７】図２７は、オンスペック検体（A,B,C,D,E,F,G,K）、オフスペックモデル検体における、23遺伝子の発現量（40-Ct値）を用いて算出した、群3(間葉系幹細胞)の中心座標から各細胞までのユークリッド距離を示す。
【図２８】図２８は、オンスペック検体（A,B,C,D,E,F,G,K）、オフスペックモデル検体における、23遺伝子の発現量（40-Ct値）を用いて算出した、群5(骨芽細胞)の中心座標から各細胞までのユークリッド距離を示す。
【図２９】図２９は、オンスペック検体Ｊにおける群１（骨髄細胞）及び群３（間葉系幹細胞）及び群５（骨芽細胞）の、23遺伝子の発現量（40-Ct値）を用いた多次元尺度法による2次元プロット解析結果について、multiplex PCRとリアルタイムPCRの比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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