(57)【要約】【課題】光照射によって、照射部位特異的に、照射直後に速やかに細胞接着分子を介した特異的な細胞接着性を持つ基板を作成する。【解決手段】光解離性保護基を細胞接着ペプチド部分に導入したケージドペプチドを基板上に結合してなる、細胞培養基板。【選択図】図１
2008167695.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光解離性保護基を細胞接着ペプチド部分に導入したケージドペプチドを基板上に結合してなる、細胞培養基板。
【請求項２】
細胞接着ペプチドがＲＧＤである、請求項１に記載の細胞培養基板。
【請求項３】
光解離性保護基がＲＧＤのＧのアミノ基に導入されたＮ-2-ニトロベンジル基である、請
求項２に記載の細胞培養基板。
【請求項４】
請求項１，２または３の細胞培養基板に、特定のタイミングおよび／または特定のパターンで光照射して光解離性保護基を除去し、細胞接着ペプチド部分を基板上において、特定のタイミングおよび／または特定のパターンで形成し、該基板上で細胞を培養することを特徴とする、細胞培養基板上に特定のパターンでおよび／または特定のタイミングで細胞を接着させた状態で細胞を培養する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、任意のパターンないし特定の位置ないし特定のタイミングで細胞を接着させることが可能な細胞培養基板および細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
周囲の細胞との関係における細胞内・細胞外シグナル伝達についての基礎研究から、近年、急速に伸展する細胞治療などの再生医療分野・評価系として細胞アレイを用いる創薬や環境分析など応用研究までにおいて、個々の細胞をきめ細かく操作・分析する手法へのニーズが高まっており、細胞を任意の部位あるいは時間で培養する、いわゆるパターン培養技術が求められている。
【０００３】
パターン培養の方法としては、細胞の細胞接着因子が結合できるフィブロネクチンを基板上に任意の部位に固定化するマイクロプリントを始めとして（非特許文献１）、光、熱、電気をトリガーとしたパターン培養の技術が開発されている。マイクロプリント法は、細胞接着領域を決定してから基板上で細胞を培養する手順を踏むため、培養中の制御ができず、時間分解能を持たない。また、温度応答性高分子膜(特許文献１，２、非特許文献
２−４)を用いて細胞接着性を制御する方法では、部位特異的な制御が困難である。電気
化学活性のある単分子膜（非特許文献５−７）を利用する方法では、細胞接着因子のリガンドとの結合性を直接制御していないため、非特異的な接着を完全には除外できない。
【０００４】
一方、光などをトリガーとして、時空間分解能を持って調節が可能なパターン培養技術
(特許文献３−５、非特許文献８−14)についても開発が進んでいるが、個々の技術につ
いて、以下のような問題点が残っている。
1) 光照射による基板の親水性等の物理化学的性質の変化により、タンパク吸着やそれに
後続して起こる細胞接着性を制御する方法（特許文献3−５、非特許文献８−１０）では
、細胞接着因子のリガンドとの結合性を直接制御していないため、非特異的な接着を完全には除外できない。
2) 細胞接着因子のリガンドであるペプチドをアゾベンゼン色素を介して基板に固定化す
る方法（非特許文献13）では、アゾベンゼンの光異性化によるわずかな長さの差の違いで制御するため、完全に細胞接着性の制御ができない。
3）細胞接着因子のリガンドを結合したい部位に光照射し、光照射部位にリガンドのペプ
チドを反応させ固定化し、細胞接着を制御する方法（非特許文献１１−１２）では、前述のマイクロコンタクトプリントと同様に、細胞存在下の培養実験中に光制御することができない。
【特許文献１】W02002/010349
【特許文献２】特開平11-349643
【特許文献３】特開平3-7577
【特許文献４】特開2006-6214
【特許文献５】特開2005-210936
【非特許文献１】Chen et al. Science 276, 1425-8
【非特許文献２】Stile et al. Biomacromalecules2, 185-94 (2001)
【非特許文献３】Yamato et al. Tissue Engineering 7, 473-80 (2001)
【非特許文献４】Yamato et al. Biomaterials 23, 561-7 (2002)
【非特許文献５】Harimoto et al. Journal of Biomedical Materials Research 62, 464-70 (2002)
【非特許文献６】Yousaf et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA 98, 5992-6 (2001)
【非特許文献７】Yeo et al. J.Amer. Chem. Soc. 125, 14994-5 (2003)
【非特許文献８】Nakayama et al. Macromolecules 29, 8622-30 (1996)
【非特許文献９】Nakanishi et al. J.Am.Chem.Soc. 126, 16314-5 (2004)
【非特許文献１０】Edahiro et al. Biomolecules 6, 970-4 (2005)
【非特許文献１１】Luo et al. Nature Materials 3, 249-53 (2004)
【非特許文献１２】Luo et al. Biomalecules 5, 2315-23 (2004)
【非特許文献１３】Auernheimer et al. J.Am.Chem.Soc. 127, 163107-10 (200５)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、細胞培養前、または細胞培養下の両条件において、光照射によって、照射部位特異的に、照射直後に速やかに細胞接着分子を介した特異的な細胞接着性を持つ基板を作成することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の細胞培養基板および細胞培養方法を提供するものである。
１．  光解離性保護基を細胞接着ペプチド部分に導入したケージドペプチドを基板上に結合してなる、細胞培養基板。
２．  細胞接着ペプチドがＲＧＤである、項１に記載の細胞培養基板。
３．  光解離性保護基がＲＧＤのＧのアミノ基に導入されたＮ-2-ニトロベンジル基であ
る、項２に記載の細胞培養基板。
４．  項１，２または３の細胞培養基板に、特定のタイミングおよび／または特定のパターンで光照射して光解離性保護基を除去し、細胞接着ペプチド部分を基板上において、特定のタイミングおよび／または特定のパターンで形成し、該基板上で細胞を培養することを特徴とする、細胞培養基板上に特定のパターンでおよび／または特定のタイミングで細胞を接着させた状態で細胞を培養する方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の細胞接着基板は、細胞接着ペプチド部分に光解離性保護基を導入しているため、光照射前では、該基板上で細胞を培養しても細胞はほとんど基板に接着することができないが、基板上の特定の位置、特定のパターンないし特定のタイミングで光を照射することにより、照射した位置にのみ細胞接着ペプチドを露出させることができ、ここに細胞を接着させることができる。したがって、細胞の接着パターンないし接着のタイミングを非常に精密に制御することができる。また、光照射と各種の細胞の接着を繰り返すことで、細胞播種後に細胞を増殖させる領域を任意の２次元パターンで決めることができるため、細胞相互間の関係を調べることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の細胞培養基板へのケージドペプチドの導入は、例えばCys残基のチオール基を
介して行うことができる。チオール基を介してケージドペプチドを固定化するに際しては、予め基板表面にアミノ基を導入させて、N-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤を用いてマレイミド表面を形成させ、このＭＡＬ基とCys残基のチオール基を反応させることにより好ましく実施することが
できる。基板上にアミノ基を導入する手段は特に限定されず、基板表面に分子を整列させる自己組織化表面の手法、反応試薬を用いて導入する方法、官能基を有する物質(例えば
、ポリ-Ｌ-リジン)を基板上にコーティングする方法などが挙げられる。また、基板表面
上に導入された官能基に対し架橋剤を反応させてアミノ基を導入する方法を用いてもよい。
【０００９】
ヘテロ二官能型架橋剤としては、種々市販されているものもあり、特に限定されるものではないが、例えばＮ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）
、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、Ｎ−（８−マレイミドカプリルオキシ）スクシンイミド（ＨＭＣＳ）、Ｎ−（１１−マレイミドウンデカノイルオキシ）スクシンイミド（ＫＭＵＳ）、Ｎ−（（４−（２−マレイミドエトキシ）スクシニル）オキシ）スクシンイミド（ＭＥＳＳ）、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩（スルホ−ＧＭＢＳ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩（スルホ−ＥＭＣＳ）、Ｎ−（８−マレイミドカプリルオキシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩（スルホ−ＨＭＣＳ）などが挙げられる。また、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような高分子の末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するものもヘテロ二官能型架橋剤として用いることができる。
【００１０】
本発明のケージドペプチドは、細胞接着ペプチドを１または２以上(好ましくは１つ)含む。細胞接着ペプチドとしては、ＲＧＤ、ＲＥＤＶ、Ｐ１５（ＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶ；配列番号1）、Ｃ／Ｈ−Ｖ（ＷＱＰＰＲＡＲＩ；配列番号2），ＹＩＧＳＲ（配列番号3）、ＳＩＫＶＡＶ（配列番号4）、Ｆ−９（ＲＹＶＶＬＰＲＰＶＣＦＥＫＧＭＮＹＴＶＲ；配列番号5），ＨＥＰ−ＩＩＩ（ＧＥＦＹＦＤＬＲＬＫＧＤＫ；配列番号6などが挙げられ、好ましくはＲＧＤが挙げられる。
【００１１】
ケージドペプチドは、アミノ酸数が３〜３０個程度、好ましくは４〜２０個程度である。ケージドペプチド中に含まれる細胞接着ペプチドは、基板から遠い位置(少なくとも基
板から２アミノ酸以上、好ましくは３アミノ酸以上、より好ましくは５アミノ酸以上離れた位置)にあるのが細胞との接着性の点で好ましい。
【００１２】
光解離性保護基は、紫外線照射により切断されるものであれば特に限定されないが、例えば下記式（II）
【００１３】
【化１】
2008167695.tif 000003
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は、同一又は異なって水素原子、低級アルキル基、低級アルコキ
シ基、アミノ基、ハロゲン原子、水酸基またはシアノ基を示すか、あるいはＲ1、Ｒ2及びＲ3のいずれか２つが一緒になってメチレンジオキシ基を示す。Ｒは、水素原子又はメチ
ル基を示す。〕で表される
基が挙げられる。
【００１４】
式（Ｉ）において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3で表される低級アルキル基としては、メチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどの炭素数１〜４の直鎖又は分枝を有するアルキル基が挙げられる。
【００１５】
低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどの炭素数１〜４の直鎖又は分枝を有するアルコキシ基が挙げられる。
【００１６】
ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
【００１７】
好ましい式（II）の基は、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は、いずれか２つが水素原子で、残りの１つ
が水素原子、低級アルキル基または低級アルコキシ基で、Ｒが水素原子で表される基である。
【００１８】
光解離性保護基は、紫外線照射により除去される。照射される紫外線としては、光解離性保護基を除去できる限り特に限定されず、通常の紫外線ランプなどが用いられる。紫外線照射の条件は特に限定されないが、例えばＴＬＣ検出用の紫外線ハンドランプ（トプコン製、PU-2)で１時間程度処理すればよい。
【００１９】
光解離性保護基を主鎖に導入した本発明のケージドペプチドは、下記式(I)の光解離性
保護基を有するジペプチドを合成し、次いで式(I) で表されるＮ保護ジペプチド化合物を、固相合成においてＮ保護アミノ酸の代わりに使用することにより得ることができる。
式（Ｉ）
【００２０】
【化２】
2008167695.tif 000004
（式中、Ｒ１はアミノ基の保護基を示す。ＡはＰｒｏ以外のペプチドを構成するαアミノ酸の側鎖を示す。Ｂはαアミノ酸の側鎖を示す。Ｒａは光解離性保護基を示す。）。
光解離性保護基を側鎖に有するケージドペプチドは、Ｎ保護アミノ酸の代わりに光解離性保護基を側鎖に有するＮ保護アミノ酸を使用して、固相合成法により製造することができる。
【００２１】
式(I)のジペプチドの合成は、αアミノ基に光解離性保護基を有するアミノ酸（Ａａａ
）とＮ保護アミノ酸（Ｂａａ）の酸フッ化物を反応させて、目的とする一般式(Ｉ)のジペプチドを合成することができる。反応は、光解離性保護基が結合したＡａａ１モルに対し、Ｎ保護−Ｂａａ−Ｆを１モルから過剰量使用し、０℃〜１００℃程度の温度下に１分から２４時間程度反応させることにより、有利に進行する。
【００２２】
ケージドペプチドの光解離性保護基の数は、ケージドペプチドの細胞接着活性が実質的に消失する限り特に限定されないが、例えば、１〜３個、好ましくは１〜２個、特に１個である。
【００２３】
本発明のケージドペプチドは、細胞接着ペプチド部分に光解離性保護基が結合して、その細胞接着活性が実質的に消失し、かつ、光照射により光解離性保護基が脱離した場合に細胞接着ペプチドの活性が回復するものをいう。
【００２４】
一般式(Ｉ)において、「Ａ」で表される基としては、Gly、Ala、Ser、Thr、Tyr、Phe、Trp、Asp、Glu、Met、Cys、Leu、Ile、Val、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Orn（オルニチン）などのPro以外の天然アミノ酸の側鎖が挙げられ、「Ｂ」で表される基としては、Ala、Ser、Thr、Tyr、Phe、Trp、Asp、Glu、Met、Cys、Leu、Ile、Val、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Gly、Pro、Orn（オルニチン）の側鎖が挙げられる。なお、A, Bで表されるアミノ酸の側鎖がNH2、SH、イミダゾリル、グアニジノ、OH、COOH）などの官能基を有する場合に
は、必要に応じてペプチド合成(特に固相合成)で通常使用される保護基で必要に応じて保護される。
【００２５】
固相合成の樹脂としては、ポリスチレンージ ビニルベンゼン共重合体などの公知の樹
脂を広く使用することができる。
【００２６】
また、ペプチド鎖の伸長、保護基の除去、樹脂からのペプチドの切断などは、常法に従い実施することができる。
【００２７】
本発明の細胞培養基板の材質は、非特異的な細胞の接着が起こらない限り特に限定されず、例えばガラス、プラスチック、金属、セラミックなどが挙げられ、好ましくはガラス、プラスチックが挙げられる。
【００２８】
細胞培養基板上における光解離性保護基を除去したパターンの形成は、特に限定されず公知の方法が広く使用されるが、例えば特定のパターンを有するマスクを介して基板上の特定の位置/領域に特定のタイミングで光を照射するなどの光リソグラフィー技術を用い
て実施することができる。特定のタイミングとしては、ある生理活性物質の添加前ないし添加後、時計遺伝子の特定の周期、特定の細胞周期、細胞の分化、遊走などが挙げられる。
【００２９】
該基板上で培養される細胞の種類、培養条件は特に限定されず、従来公知の細胞および培養条件を広く用いることができる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例および参考例を用いてより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
（参考例１）固相化用ペプチドの製造
以下の３つのペプチドを、上記の方法に従い製造した。
intact peptide-Cys 
配列：Tyr-Ala-Val-Thr-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Cys-amide (配列番号7)
質量分析値、観測値：1369.11、計算値：1369.48
reverse peptide-Cys
配列：Cys-Ser-Ser-Ala-Pro-Ser-Asp-Gly-Arg-Gly-Thr-Val-Ala-Tyr-amide (配列番号8)
質量分析値、観測値：1369.67、計算値：1369.48
caged peptide-Cys
配列：Tyr-Ala-Val-Thr-Gly-Arg-cGly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Cys-amide (配列番号9)質量分析値、観測値：1503.58、計算値：1504.6
ただし、cGlyはN-2-nitrobenzylglycineを示す。
【００３１】
（参考例２）ペプチドの固相化
材料：メチル基とN-ヒドロキシスクシミジル活性化エステルが両端に結合したポリエチレングリコール（以下、m-PEG-NHSと略す：商品名SUNBRIGHT ME-050CS, 日本油脂株式会
社、渋谷、東京）、及び、マレイミドと N-ヒドロキシスクシミジル活性化エステルが両
端に結合したポリエチレングリコール（以下、MA-PEG-NHSと略す：商品名SUNBRIGHT MA-034HS, 日本油脂株式会社、渋谷、東京）を用いた。
【００３２】
方法：m-PEG-NHSを25 mg/ml、MA-PEG-NHS を0.25 mg/mlの濃度で溶解したリン酸緩衝生理食塩水（ｐH7.4、以下、PBSと略す.）を作成し、その１５０μｌを、ポリLレジンでコ
ートしてあるガラスボトムディッシュ(PLL-Coat, 35 mm dish, Hole: 10 mm No.0, Cat.No. D110110, MATSUNAMI, 岸和田、大阪)のガラス上に滴下して、約24時間、４℃で静置し
た後、２ｍｌのPBSで3回洗浄し、m-PEG-NHSとMA-PEG-NHSを１００：１の比で固定化した
基板を作成した。
この基板に、1 mg/mlにPBSで溶解したペプチド溶液１５０μｌを滴下して、約24時間、４度で静置した後、２ｍｌのPBSで3回洗浄し、ペプチドを固定化した基板を作成した。
【００３３】
（参考例３）対照実験
HeLa細胞の培養実験において、m-PEG-NHSとMA-PEG-NHSを固定化させた基板へのペプチド
固相化の有無による影響を調べた（図2）。参考実験２に述べた方法によってポリL-リジ
ン固定化基板（PLL 固定化基板）、ポリエチレングリコール誘導体をさらに固定化した基板（m-PEG-NHSとMA-PEG-NHSを固定化した基板）、細胞接着因子が結合しないペプチドを
さらに固定化した基板（reverse peptide-Cys）、及び、細胞接着因子が結合できるペプ
チドをさらに固定化した基板（intact peptide-Cys）、を調整した。この基板も用い、HeLa細胞の培養を行った。HeLa細胞を2 x 104細胞 / dishの細胞密度で、無血清培地（500 IU/ml ペニシリン、5mg/ml ストレプトマイシンを含んだDelbecco’s modified Eagles medium (Cat.No.12430-047, Invitrogen)）内で培養した。培養開始から30分後に基板をPBSで洗浄してから、PBSで希釈した4 % パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定して、微分干渉観察 (Olympus IX70)を行った。
ポリL-リジン固定化基板やポリエチレングリコール誘導体固定化基板、細胞接着因子の結合しないペプチド固定化基板では、ほとんど細胞接着は認められなかった。しかし、細胞接着因子が結合できるペプチド固定化基板では、接着細胞数の著しい増加が観察された（図２）。また、マレイミド基にペプチドを修飾する前の疎水性な部位が含まれる状態の基板（図３、２段目）では、非特異的な細胞接着が観察された。
【００３４】
また、これらの修飾基板の紫外線照射の影響を調べた。PBSを２ｍｌ入れた基板の下方
から、紫外線ランプ（UV-100A型、（株）浜松ホトニクス）を用いて、紫外線（波長365 nm、光強度16 mW/cm2）を４分間照射した。この紫外線照射基板を用いて、上述と同じ方法で培養実験を行ったところ細胞接着への紫外線照射の有意な影響は観察されなかった。
【００３５】
（実施例１）  ケージドペプチドを固定化した基板での細胞培養実験
HeLa細胞の培養実験において、caged peptide-Cysを固相化した基板への接着における紫
外線照射量の影響を調べた。参考実験２に述べた方法でcaged peptide-Cysを固相化した
基板を調整し、この基板にPBSを２ｍｌ入れ、基板の下方から、紫外線ランプ（UV-100A型、（株）浜松ホトニクス）を用いて、紫外線（波長365 nm、光強度16 mW/cm2）を0, 0.5,
1, 2, 4分間照射した。この紫外線照射基板も用い、HeLa細胞の培養を行った。HeLa細胞を2 x 104細胞 / dishの細胞密度で、無血清培地（500 IU/ml ペニシリン、5mg/ml スト
レプトマイシンを含んだDelbecco’s modified Eagles medium (Cat.No.12430-047, Invitrogen)）内で培養した。培養開始から30分後に基板をPBSで洗浄してから、PBSで希釈し
た4 % パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定して、微分干渉観察 (Olympus IX70)を
行った。
紫外線照射前は、細胞はほとんど接着しなかったが、照射を行った基板上では、照射量依存的に接着細胞数が増加した (図3)。
【００３６】
（実施例２）  部位特異的な細胞培養実験
HeLa細胞の培養実験において、caged peptide-Cysを固相化した基板を用い、部位特異的
な細胞接着制御を行った。参考実験２に述べた方法でcaged peptide-Cysを固相化した基
板を調整し、この基板にPBSを２ｍｌ入れ、基板の下に基板半分を遮光するマスクを置き
、基板の下方から、紫外線ランプ（UV-100A型、（株）浜松ホトニクス）を用いて、紫外
線（波長３６５ｎｍ、光強度30 mW/cm2）を２分間照射した。この紫外線照射後の基板を
用い、HeLa細胞を2 x 105細胞 / dishの細胞密度で、無血清培地（500 IU/ml ペニシリン、5mg/ml ストレプトマイシンを含んだDelbecco’s modified Eagles medium (Cat.No.12
430-047, Invitrogen)）で培養した。培養開始から30分後に基板をPBSで洗浄してから、PBSで希釈した4 % パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定して、微分干渉観察 (Olympus IX70)を行った。
遮光部位では接着細胞がほとんど観察されなかったが、照射部位では接着細胞が観察され、紫外線照射部位特異的に細胞を接着できることが示された(図４)。
【００３７】
（実施例３）  細胞培養中に光照射することによる部位特異的な細胞培養実験
HeLa細胞の培養実験において、caged peptide-Cysを固相化した基板を用い、部位特異的
な細胞接着制御を行った。参考実験２に述べた方法でcaged peptide-Cysを固相化した基
板を調整し、この基板を用い、HeLa細胞を2 x 105細胞 / dishの細胞密度で、無血清培地（500 IU/ml ペニシリン、5mg/ml ストレプトマイシンを含んだDelbecco’s modified Eagles medium (Cat.No.12430-047, Invitrogen)）で培養した。培養開始から２0分後に、
基板の下に基板半分を遮光するマスクを置き、基板の下方から、紫外線ランプ（UV-100A
型、（株）浜松ホトニクス）を用いて、紫外線（波長３６５ｎｍ、光強度38.5 mW/cm2）
を２分間照射した。その後、さらに20分間培養した後に、基板をPBSで洗浄してから、PBSで希釈した4 % パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定して、微分干渉観察 (Olympus IX70)を行った。
遮光部位では接着細胞がほとんど観察されなかったが、照射部位では接着細胞が観察された (図5)。
（実施例４）光照射によって細胞接着を誘導させる細胞培養実験
HeLa細胞の培養実験において、caged peptide-Cysを固相化した基板を用い、光照射時期
特異的な細胞接着制御を行った。参考実験２に述べた方法でcaged peptide-Cysを固相化
した基板を調整し、この基板を用い、HeLa細胞を4 x 105細胞 / dishの細胞密度で、無血清培地（500 IU/ml ペニシリン、5mg/ml ストレプトマイシン、25mM  HEPES (ｐH7.4)を
含んだDelbecco’s modified Eagles medium (Sigma-Aldrich D2902)で培養した。培養は、37度に保った顕微鏡ステージチャンバー内で行い、30秒ごとに微分干渉像を撮影した。培養開始から約１５分後に、基板の上方から、紫外線ランプ（UV-100A型、（株）浜松ホ
トニクス）を用いて、紫外線（波長３６５ｎｍ、光強度33 mW/cm2）を２分間照射した。
培養を開始して紫外光照射直前まで細胞は球状であったが、紫外光照射直後から、基盤のRGDフラグメント部位と細胞膜上のインテグリンとの結合開始に起因する急速な細胞の伸
展が観察された（図６左列）。しかし、光照射しない場合、約1時間経過しても細胞は球
状のままであった（（図６右列）。この実験から、caged peptide-Cysを固相化した基板
を用いれば、任意のタイミングで、細胞の基盤への接着を開始できることが示された。
【００３８】
結論
(i)参考実験３から、無血清培地において、細胞接着因子を介した特異的な接着には、細
胞接着因子のリガンドとなる物質が固定化してある基板が必要であることが示された。
(ii)実施例１，２，３から、ケージドペプチドを用いれば、細胞接着因子を介した特異的な細胞接着を紫外線照射によって制御し得る基板を調整できることが示された。
(iii)RGDを含むペプチドはインテグリンの結合配列であり、細胞間・細胞内シグナル伝達、細胞接着に関与することから、細胞生物学や生体適合材料においての研究が古くから行われている。このcaged peptideの固相化を可能にしたことによって、光照射によって部
位特異的および時間特異的、無侵襲に、光リソグラフィー等による細胞のパターン培養を行えることから、細胞や組織におけるインテグリンを介した作用機序を解明するための研究開発用試薬としての利用や、生体適合材料開発のために産業上有用であると考えられる。
(iv)このパターン培養法では、細胞接着に関与するリガンド自身を不活性化しており、RGD以外の細胞接着に関与するペプチド配列をケージド化によっても、同様な細胞接着制御
が可能である。
(v)ペプチドの固定化基板作成は、ポリＬリジン固定化基板やポリエチレングリコール誘
導体によらず、ケージドペプチドを固定化する他の方法により可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】参考実験３、実施例１,２における基板作成と細胞接着の光制御実験のスキーム。ポリLリジン（PLL）をコートしてある培養基板へ(i)、マレイミドとスクシミジルエステルを持つ二架橋性のポリエチレングリコールを反応させ(ii)、次にペプチドを反応させて、ペプチドをコートした(iii)。細胞を付着させたい部位に光照射すれば、細胞が接着する(iv)。
【図２】（参考実験３）各種基板へのHeLa細胞の接着Scale bar = 200 μm
【図３】（実施例１）紫外線照射時間依存的にcaged peptide-Cys固相化基板に接着するHeLa細胞数が増加した。Scale bar = 200 μm
【図４】（実施例２）Caged peptide-Cys固相化基板の右半面のみに紫外線照射後、HeLa細胞を基板上で培養した結果、紫外線照射を行った部位のみにHeLa細胞が接着した。Scale bar = 200 μm
【図５】（実施例３）HeLa細胞を20分間、Caged peptide-Cys固相化基板上で培養後、基板の左半面のみに紫外線照射を行った。さらに20分間HeLa細胞を基板上で培養した結果、紫外線照射を行った部位のみにHeLa細胞が接着した。Scale bar=200 μm
【図６】微分干渉顕微鏡下において、HeLa細胞をCaged peptide-Cys固相化基板上で培養を行った。光照射を行わなかった場合ほとんど細胞接着が起こらないが（右一連の写真）、光照射を行うことによって、速やかに細胞接着が誘導されることが観察された（左一連の写真）。Scale bar=50 μm
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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