(57)【要約】【課題】腐植土由来物質を利用して、フミン酸水溶液より優れた抗菌・殺菌作用などを有する抗菌剤・殺菌剤を提供する。【解決手段】フルボ酸を有効成分として含有する殺菌剤。好ましい形態はフルボ酸の水性液の形態である。フルボ酸の水性液が噴射剤とともにエアゾール容器に充填されたエアゾール製品も好ましい形態である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルボ酸を有効成分として含有する殺菌剤。
【請求項２】
フルボ酸の水性液の形態である請求項１記載の殺菌剤。
【請求項３】
フルボ酸の水性液が噴射剤とともにエアゾール容器に充填されたエアゾール製品の形態である請求項２記載の殺菌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフルボ酸を有効成分として含有する殺菌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
フルボ酸は、フミン酸と共に腐植土からの抽出物として得られるフミン物質の１種である。
【０００３】
腐植土は、通常、５００万年以上前に海草、藻類などの植物、魚介類、そのほか無機質類などが海底、湖や沼などの底に堆積した堆積物が嫌気性微生物などにより分解、合成、有機化を受けたものであり、たとえば地下約２０ｍに約１０ｍの厚さの層として存在している。
【０００４】
フミン酸は、腐植土からの抽出液に存在する物質のうち、アルカリに可溶な着色物質で腐植酸ともいわれている。フルボ酸は、腐植土からの抽出液からフミン酸を酸析除去したのちに溶液中に残る着色物質である。
【０００５】
フルボ酸は、フミン酸に比べて分子量が小さく、炭素含量が低く酸素含量が高い（カルボキシル基含量が高い）ことが特徴である。その結果、フルボ酸の全酸量は９００〜１４００ｍｅｑ／１００ｇ程度で、フミン酸の５００〜８７０ｍｅｑ／１００ｇ程度と比べてかなり高い値を示している。
【０００６】
腐植土からの抽出物を利用したものとして、特公昭６２−３８０６号公報に、腐植土中のフミン酸を水で抽出して得たフミン酸水溶液を加熱殺菌するとともに、０．６μｍのフィルターにより濾過し、濃度調整およびｐＨ２．０〜５．０に調整したフミン酸水溶液を食品保存用殺菌剤として用いることが記載されている。
【０００７】
しかしながら、このフミン酸を含有する食品保存用殺菌剤は抗菌・殺菌作用が必ずしも充分でなく、熱処理しているにもかかわらず、２〜３ヵ月間保存しただけで褐変するなど、保存安定性が優れていないという問題がある。このように従来技術では、腐植土由来物質の特徴を充分に生かしきれていない。
【０００８】
【特許文献１】特公昭６２−３８０６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記の点に鑑みて、腐植土由来物質を利用して、特許文献１に記載のフミン酸水溶液より優れた抗菌・殺菌作用などを有する抗菌剤・殺菌剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち本発明はつぎの殺菌剤を提供する。
（１）フルボ酸を有効成分として含有する殺菌剤。
（２）フルボ酸の水性液の形態である前記（１）項記載の殺菌剤。
（３）フルボ酸の水性液が噴射剤とともにエアゾール容器に充填されたエアゾール製品の形態である前記（２）項記載の殺菌剤。
【００１１】
ここで、本発明の殺菌剤は、殺菌作用の他に、抗菌作用、防腐作用などを有するものであり、抗菌剤、防腐剤などの概念を包含するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の殺菌剤は、特許文献１に記載されているフミン酸水溶液に比べて抗菌・殺菌作用が優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００１４】
本発明の殺菌剤における有効成分としてのフルボ酸は、通常腐植土を水で抽出して得られた水性液の形態のものを使用する。以下、腐植土を水で抽出してフルボ酸を含有する水性液を得る方法について説明する。
【００１５】
本発明に用いる腐植土は、何処から採取したものでも用いることができるが、とりわけ長崎県北高来郡森山町唐比西名で採取した腐植土が好ましい。
【００１６】
採取した腐植土は水分を含んでおり、水田からとった土のようにべとついたものであり、粗乾燥および精密乾燥の２段階の乾燥工程をへてから抽出工程に供される。乾燥工程は、腐植土を乾燥させて細分化するとともに、好気性微生物のはたらきを活性化させて嫌気性菌のはたらきを抑制し、太陽熱殺菌を行なうと同時に、紫外線等吸収（光合成）によってアミノ酸、ビタミン、酵素などを活性化（熟成）するなどすると考えられる。これにより抗酸化作用、防腐食作用などの有益な作用が奏されると考えられる。乾燥工程を２段階で行なうことにより構成成分の均一化と腐植土以外の泥土の除去、抽出時のｐＨのばらつきの少ない安定した腐食土抽出物質含有水性液の取得を行なうことができる。前記粗乾燥は、まず採取した径が５〜５０ｃｍ程度の塊状の腐植土をコンクリートなどの腐植土と混ざらないもののうえで雨ざらし、日ざらしの状態（天日）で半年〜１年間乾燥させることにより行なわれる。この間、適宜腐植土をひっくりかえして全体によく天日があたるようにするのが好ましい。この工程により腐植土は乾燥した塊状物になる。ついで、ビニールハウス内でさらに乾燥させる（精密乾燥）。この乾燥は最短では１ヵ月間、通常１．５〜２ヵ月間行なわれる。これにより塊状物の乾燥がさらにすすみ、塊状のものは耕運機などでさらに粉砕して、砂状のさらさらにしたものにする。本発明でいう「腐植土」とは、前述した工程を経て得られる、乾燥し粉砕された腐植土のことである。
【００１７】
得られた腐植土の性質の一例を表１に示す。
【００１８】
【表１】
2008007451.tif 000002
【００１９】
前記抽出に用いる水（さらには溶媒としての水を含む）としては、ｐＨが中性である７を下回る６〜６．５の微酸性のものが最適である。ｐＨが７を超えたアルカリ性の水や不純物を含む水は、同時にフミン酸を抽出するから、好ましくない。
【００２０】
抽出は、腐植土と水との混合物を撹拌することにより行なうことができる。抽出時の温度は通常常温である。撹拌時間は通常１〜３時間、好ましくは２〜３時間である。
【００２１】
腐植土と用いる水との好ましい割合は、１：１〜１：５、さらには１：３〜１：５、とくには１：５（重量／容量比）である。水の量が前記範囲より少ないと、使用した腐植土に対する抽出液の収量が少なくなり、また、少なくした場合でも得られるｐＨはある程度の値よりは低くならないので無意味である。一方、水の量が前記範囲より多いと、得られる抽出液のｐＨが２．９９より高くなり、菌やウイルスの種類によっては、殺菌、滅菌、抗ウイルス効果などが充分でなくなり、用途が制限される場合が生じる。ただし、得られた抽出液のｐＨが高い場合や、ｐＨの低い抽出液を希釈してｐＨの高い液にした場合でも、高いｐＨでもよい用途には使用することができる。この場合でも、特公昭６２−３８０６号公報に記載されているフミン酸水溶液で同じｐＨのものよりも広い用途に使用することができる。
【００２２】
撹拌終了後、２〜４週間、好ましくは約３週間静置して浮遊微粒子を沈降させたのち、上澄液をデカンテーション、吸引、５０〜１００μｍのバッグフィルターによる予備濾過などの濾過工程に通常用いられる分離方法により分離する。上澄液と腐植土層との界面から５〜１０ｃｍ上に吸引口がくるようにし、吸引する場合には、腐植土層を吸引することなく上澄液を高い収率で吸引することができる。
【００２３】
つぎに抽出液を０．３μｍ以下のフィルターを用いて濾過する。この濾過を行なうことにより、雑菌の除去、浮遊物、懸濁物または経時に沈殿を起こす不溶性物質の排除を行なうことができる。０．３μｍより大きい孔径のフィルターでは前記のごとき抽出液を得ることができない。
【００２４】
用いるフィルターの孔径は０．３μｍ以下、好ましくは０．２μｍ以下であり、下限は０．１μｍである。フィルターの濾材は、濾液に影響を与えないかぎり制限されないが、具体的には、ナイロン、ポリプロピレン、ポリビニリデンフルオライドなどがあげられる。これらのなかでもポリビニリデンフルオライドが好ましい。
【００２５】
濾過は、加圧下、減圧下のいずれで行なうこともできるが、一般的には加圧下で行なう。その方法は、たとえば、前記材質のメンブレンフィルターのカートリッジをハウジングにセットし、これを加圧タンクに接続して２ｋｇ／ｃｍ2以下の圧力で圧送して行なう。この濾過を行なう前に、予備濾過を行なうことは、濾過の効率向上、濾過装置の負担軽減などの観点から好ましい。実際には５０〜１００μｍのバッグフィルターで濾過すれば充分である。
【００２６】
得られた濾液は、好ましくはｐＨ２．５０〜２．９９、さらにはｐＨ２．８５〜２．９５、とくにはｐＨ２．９である。ｐＨが２．５０未満のものは通常は得られず、２．９９を超える場合には、菌やウイルスの種類によっては殺菌、滅菌抗ウイルス効果などが充分でなくなる場合が生じ、防腐食効果の低下、抗酸化力の低下などがおこる。前記範囲より低いｐＨの濾液を、酸（たとえば塩酸）を添加する、加熱するなど抽出液を変質させる以外の手段で得ることは困難である。たとえば高いｐＨのものを酸（たとえば塩酸）を添加するなどしてｐＨを下げても、何もせずに得られた同じｐＨのものと比較したとき、性能が劣る。
【００２７】
このようにして得られたフルボ酸含有水性液は、抗菌・殺菌作用の他に、ウイルス不活性化作用、抗酸化作用、防腐食作用、界面活性作用、重金属溶解作用、有害化学物質溶解・中和能などをも有する。
【００２８】
これらの作用は、微生物により合成されたアミノ酸、タンパク質、ビタミン、酵素と、火成岩の侵触などで堆積したマグネシウム、カルシウム、ナトリウム、カリウム、アルミニウムなどのミネラルとが相互に影響して得られるものである。とりわけ、ミネラルとしては特にアルミニウム、マグネシウム、ナトリウム、カルシウムなどのイオンが大量に含まれており、イオン交換を行なった後ではｐＨ値が上昇することから、本発明のフルボ酸含有水性液の殺菌機序はフルボ酸が示す低ｐＨとミネラルに影響するところが大きいと考える。
【００２９】
本発明のフルボ酸含有水性液は、原液のまま用いることもできるが、目的とする用途に応じて適宜希釈して用いることもできる。
【００３０】
本発明のフルボ酸含有水性液（原液）におけるフルボ酸の含有量は、腐植土の腐食の度合い、母生物の種類などにより異なるが、通常３ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ（吸光光度法）の範囲である。フルボ酸の含有率はｐＨに直接関係しており、低ｐＨのものほどフルボ酸の含有率が多くなり、腐食が進化していると考えられる。これらの点から、フルボ酸の含有量は５ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌであるのが好ましい。フルボ酸の定性分析、定量分析は、日本食品分析センター、千葉工業大学などの機関で可能である。
【００３１】
飲用する場合は、希釈せずにそのまま飲むこともできるが、２〜５００倍に希釈して飲むこともできる。本発明のフルボ酸含有水性液を飲用する場合には、さらに陽イオン交換樹脂に通して、アルミニウムイオンを除去するのが好ましい。このとき他の陽イオンも除去される。
【００３２】
本発明のフルボ酸含有水性液を原液のまま、あるいは希釈して、たとえば以下に示すような用法で用いることができる。
【００３３】
殺菌剤（抗菌剤）として用いる場合、たとえば、食堂などの入口の手洗場などに本発明のフルボ酸含有水性液を入れた手洗用石鹸タンクを設け、手洗を行なえば手指の殺菌を行なうことができる。また、エアゾール容器に本発明のフルボ酸含有水性液を噴射剤とともに充填してエアゾール製品の形態として、食器、調理器具、手指などに噴霧すれば殺菌を行なうことができる。生鮮食料品を調理前に洗浄殺菌することは食中毒の予防や衛生上有効であるし、食品の鮮度向上につながる。また適度に希釈した水溶液でうがいをすれば、口内炎、歯周病、インフルエンザ、風邪などに有効である。化粧品に用いれば、ニキビ、アトピー肌、肌荒れに効果がある。対象としうる菌としては、大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、レジオネラ菌、サルモネラ菌、腸炎ビブリオ、その他種々のグラム陽性菌およびグラム陰性菌、真菌などがあげられる。
【００３４】
ウイルス不活性化剤として用いる場合、たとえばヘルペスウイルス、インフルエンザウイルスに対する場合、原液〜２倍希釈のもので、うがいなどを行なえば感染防止につながるし、エイズウイルスなどは飲用や局所洗浄などを行なうことにより、感染防止や予防につながる。
【００３５】
本発明の殺菌剤、ウイルス不活性剤などの薬剤は、フルボ酸含有水性液をフルボ酸に換算して３ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ含有するのが好ましく、より好ましくは５ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌである。フルボ酸の含有量が前記範囲未満では、殺菌作用などが充分に奏されない傾向があり、一方前記範囲を超える含有量のものは得ることが困難である。
【００３６】
本発明の薬剤は、フルボ酸含有水性液に加えて、グリセリン、１，３−ブチレングリコールなどの保湿剤、香料、エタノールなどの清涼剤などの通常の配合剤を添加してもよい。前記エアゾール製品に使用する噴射剤としては、炭酸ガス、炭化水素類、エーテル類、窒素ガスなどの１種または２種以上が挙げられる。
【００３７】
抗酸化剤として用いる場合、たとえば食品類、飲料水、ドリンク剤へ酸化防止、腐敗防止などの目的で添加する場合、安全に商品寿命の延長を見込むことができる。また、化粧品分野で使用する場合には、配合基剤（とくに油性基剤）の酸化変敗防止が可能である。その他の工業用としては、錆の発生しやすい個所の洗浄および潤滑水として利用することができる。
【００３８】
防腐食剤として用いる場合、食料品、飲料水、ドリンク剤に添加すると、酸化防止効果とともに防腐食効果が得られる。バクテリア、カビ、細菌類は低ｐＨ領域では生存が不可能であるため、それらの発生をくい止めることができる。化粧品に使用すると、天然防腐食剤として作用し、パラベンその他のかわりに使用することができる。
【００３９】
さらに本発明のフルボ酸含有水性液は、そのほか以下にあげる種々の産業分野において用いることができる。
【００４０】
化粧品産業において用いた場合は、たとえば、保湿効果を有する化粧品、ニキビ、吹き出物および炎症の抑制作用を有する化粧品、新陳代謝の活性化を目的とした化粧品、抗酸化力に優れた化粧品、それ自体を天然界面活性剤および（または）天然防腐食剤として利用した化粧品、無添加・無香料かつ無着色の化粧品、化粧品原材料が無毒化もしくは緩和された化粧品、皮膚刺激性のない化粧品、分泌物を調節することを目的としたデオドラント効果を有する化粧品またはエチケット商品、頭皮の老化防止作用を有するシャンプー、リンス、トリートメント、増毛剤もしくは育毛剤、天然ミネラル配合化粧品、低ｐＨの弱酸性化粧品などを製造することができる。
【００４１】
また、食品産業において用いた場合は、生鮮食品の殺菌、滅菌および鮮度保持、食品機器の洗浄、殺菌および滅菌、一般食品の酸化防止、抗酸化食品の無添加化、食品添加物の無害化と緩和、食品保存期間の延長、食品の変敗および変質の防止、微生物利用商品の効果の安定化と増進、製造工場内の殺菌および滅菌、商品への添加による味覚の向上などの効果が奏される。
【００４２】
また医療分野において用いた場合は、院内感染の防止、器具の洗浄および消毒、口腔の洗浄、それに供う口臭の減少、入院患者の床ずれ予防および寝たきり患者の衛生管理、手指の消毒殺菌、膀胱洗浄、肛内洗浄、手術室や無菌室の洗浄、医療従事者の衣服、帽子および靴の殺菌などの効果が奏される。
【００４３】
また一般家庭用として、室内の抗菌、殺菌を目的として、カーペット、カーテン、装飾品に使用することができ、安全無害のものであるため、吸入、皮膚障害の心配もなく、塩素系殺菌剤に比較して全く安心して使用できる。さらに子供用品や室内ペットの抗菌、殺菌も可能である。
【００４４】
また水産業および養殖業において用いた場合は、水産物の鮮度保持および向上、肉質の向上、耐病性の向上、成長の促進、色艶の改良、微量栄養素の補給などの効果が奏される。畜産業では、肉質の向上、耐病性の向上、糞尿臭の低減などがみられる。
【００４５】
そのほか、学校、幼稚園および保育所などの人の出入りの多い場所での感染予防に手洗い水、うがい水として、調理場の殺菌・滅菌処理水として、あるいは室内の殺菌、滅菌および浄化の目的で、貯水槽の水質保持、防腐食および殺菌の目的で、産業廃棄物処理の目的で、ヘドロ、ダイオキシンおよびＰＣＢ分解の目的で、用いることができる。
【００４６】
前述したように、本発明のフルボ酸含有水性液は、希釈して食品産業、医療関連産業、化粧品産業、農業工業分野あるいは各家庭において用いることもできる。たとえば、１０倍に希釈した場合、ｐＨは３．６５となるが、ウイルス以外の一般雑菌や食中毒の原因となるような菌のほとんどに効果を示すため、ウイルス以外への使用では原液（たとえばｐＨ２．９）とほぼ同等の効果がある。また、１００倍に希釈した場合、ｐＨは４．３５となるが、その場合では、滅菌効果においてはバラつきが発生し、有効範囲が狭くなるが、それでも黄色ブドウ球菌などは１００％殺菌できることから使用目的に応じた希釈が望ましい。また、５００倍に希釈した場合、ｐＨは４．６８となるが、この場合は、滅菌効果というより殺菌、消毒の目的で使用する方が望ましい。各家庭での使用や化粧品産業ではこの希釈倍率でも応用は広い。そのほか、たとえば１０〜５０倍に希釈したものを赤ちゃんの尻の清拭に用いれば、かぶれ防止、尻の消毒などを行なうことができる。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例をあげて本発明のフルボ酸を有効成分として含有する殺菌剤をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４８】
製造例１
長崎県北高来郡森山町唐比西名の湿地帯から腐植土を採取した。採取した腐植土を約１年間コンクリート上で天日にあてて乾燥させた。ついで１．５ヵ月間ビニールハウス内でさらに乾燥させた。得られた腐植土を粉砕して、粒径約０．０１〜０．５ｍｍの粒子にした。
【００４９】
得られた腐植土約１４０ｋｇを１ｔ槽（ポリエチレン製）に入れ（１ｔ槽に入れたときの容量が約０．６ｍ3）、精製水（ｐＨ６．５）７００リットルを加えた。これを竹ベラを用いて約２時間常温で撹拌し、３週間静置して浮遊微粒子を沈降させたのち、ｐＨ２．７の上澄液をポンプで吸引して取り出した。取り出した上澄液の量は約６００ｋｇであった。
【００５０】
得られた抽出液をバッグフィルターで予備濾過したのち、フィルター（孔径：０．２μｍ、商品名：フィルターカートリッジ０．２μｍ  ＭＣＹ４４４０ＮＦＰＨ４、日本ポール（株）製）で濾過し、ｐＨ２．８５の抽出液を得た。得られた本発明のフルボ酸含有水性液は、固形分含量１重量％、フルボ酸含量７．４ｍｇ／Ｌであった。その性質を表２に示す。
【００５１】
【表２】
2008007451.tif 000003
【００５２】
得られたフルボ酸含有水性液は、常温で長期間（６〜１２ヵ月）保存してもほとんど変化はなかった。
【００５３】
比較例１
特公昭６２−３８０６号公報記載のフミン酸水溶液（原液）を常温で２〜３ヵ月間保存したところ、茶褐色に変色していた。このことから特公昭６２−３８０６号公報記載のフミン酸水溶液は長期保存に適しておらず、本発明のフルボ酸含有水性液の方が保存性にすぐれていることがわかる。
【００５４】
試験例１（抗菌・殺菌作用）
試験菌として大腸菌（Escherichia coli  ＩＦＯ ３９７２）および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus  ＩＦＯ １２７３２）を用いた。ＮＡ培地（標準寒天培地（栄研化学株式会社製））で３５℃、１６〜２４時間培養した試験菌をＮＡ培地に再度接種して３５℃、１６〜２０時間培養した。この菌体を精製水に均一に分散させ、１ｍｌあたりの菌数が約１０7となるようにした菌液を調製した。
【００５５】
試験液として、製造例１で得られたフルボ酸含有水性液（原液）、該原液を精製水で１００倍に希釈した溶液を用いた。
【００５６】
前記試験液１００ｍｌに、前記菌液１ｍｌを添加後、２５℃で保存し、２時間、２４時間および４８時間後の生菌数をＳＡ培地（標準寒天培地（栄研化学株式会社製））を用いた寒天平板培養法（３５℃、２日間培養）により測定した。また、対照として、リン酸緩衝液に菌液を接種したものについても同様に試験した。結果を表３に示す。
【００５７】
【表３】
2008007451.tif 000004
【００５８】
大腸菌、黄色ブドウ球菌のいずれにおいても、生菌数が２４時間後では殆ど０に近く、４８時間後では０であったことから、本フルボ酸含有水性液は、殺菌効果がすぐれることがわかる。
【００５９】
試験例２（抗菌・殺菌作用）
試験菌として緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa  ＩＦＯ １３２７５)を用いた。ＮＡ培地（標準寒天培地（栄研化学株式会社製））で３５℃、１６〜２４時間培養した試験菌をＮＡ培地に再度接種して３５℃、１６〜２０時間培養した。この菌体を精製水に均一に分散させ、１ｍｌあたりの菌数が約１０7となるようにした菌液を調製した。
【００６０】
試験液として、製造例１で得られたフルボ酸含有水性液（原液）、該原液を精製水で２０倍に希釈した溶液を用いた。
【００６１】
前記試験液１００ｍｌに、前記菌液１ｍｌを添加後、２５℃で保存し、２時間、６時間および２４時間後の生菌数をＳＡ培地（標準寒天培地（栄研化学株式会社製））を用いた寒天平板培養法（３５℃、２日間培養）により測定した。また、対照として、リン酸緩衝液に菌液を接種したものについても同様に試験した。結果を表４に示す。
【００６２】
【表４】
2008007451.tif 000005
【００６３】
フルボ酸含有水性液の原液を用いた場合は、生菌数が２時間後で殆ど０に近く、殺菌効果があることがわかる。また、２０倍希釈液の場合、２４時間後でもゆるやかな殺菌を行っており、殺菌効果があることがわかる。
【００６４】
試験例３（抗菌・殺菌作用）
試験菌としてサルモネラ菌（Salmonella enteritidis  ＩＦＯ ３３１３)を用いた。ＮＡ培地（標準寒天培地（栄研化学株式会社製））で３５℃、１６〜２４時間培養した試験菌をＮＡ培地に再度接種して３５℃、１６〜２０時間培養した。この菌体を精製水に均一に分散させ、１ｍｌあたりの菌数が約１０7となるようにした菌液を調製した。
【００６５】
試験水として、製造例１で得られたフルボ酸含有水性液（原液）、該原液を精製水で２０倍に希釈した溶液を用いた。
【００６６】
前記試験液１００ｍｌに、前記菌液１ｍｌを添加後、２５℃で保存し、２時間、６時間および２４時間後の生菌数をＳＡ培地（標準寒天培地（栄研化学株式会社製））を用いた寒天平板培養法（３５℃、２日間培養）により測定した。また、対照として、リン酸緩衝液に菌液を接種したものについても同様に試験した。結果を表５に示す。
【００６７】
【表５】
2008007451.tif 000006
【００６８】
フルボ酸含有水性液の原液を用いた場合は、生菌数が２４時間後で殆ど０に近く、殺菌効果があることがわかる。また、２０倍希釈液の場合、２４時間後でも生菌数は増えておらず、抗菌効果があることがわかる。
【００６９】
試験例４（抗菌・殺菌作用）
試験菌としてメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）（Staphylococcus aureus  ＩＩＤ １６７７)を用いた。ＮＡ培地（標準寒天培地（栄研化学株式会社製））で３５℃、１６〜２４時間培養した試験菌をＮＡ培地に再度接種して３５℃、１６〜２０時間培養した。この菌体を精製水に均一に分散させ、１ｍｌあたりの菌数が約１０7となるようにした菌液を調製した。
【００７０】
試験液として、製造例１で得られたフルボ酸含有水性液（原液）、該原液を精製水で５０倍、１００倍に希釈した溶液を用いた。
【００７１】
前記試験液１００ｍｌに、前記菌液１ｍｌを添加後、２５℃で保存し、２時間、２４時間および４８時間後の生菌数をＳＡ培地（標準寒天培地（栄研化学株式会社製））を用いた寒天平板培養法（３５℃、２日間培養）により測定した。また、対照として、リン酸緩衝液に菌液を接種したものについても同様に試験した。結果を表６に示す。
【００７２】
【表６】
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【００７３】
フルボ酸含有水性液の原液を用いた場合は、生菌数が２４時間後に０であり、ＭＲＳＡに対して殺菌効果があることがわかる。また、５０倍希釈液、１００倍希釈液の場合、４８時間後では生菌数が殆ど０に近く、殺菌効果があることがわかる。
【００７４】
試験例５（抗菌・殺菌作用）
試験菌としてバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）（Enterococcus faecium  ＮＣＴＣ １２２０４)を用いた。ＴＳＡ培地（トリプトソイ寒天培地（栄研化学株式会社製））で３５℃、１６〜２０時間培養した試験菌をＴＳＡ培地に再度接種して３５℃、１６〜２０時間培養した。この菌体を滅菌精製水に均一に分散させ、１ｍｌあたりの菌数が約１０7となるようにした菌液を調製した。
【００７５】
試験液として、製造例１で得られたフルボ酸含有水性液（原液）、該原液を滅菌精製水で１０倍、１００倍に希釈した溶液にそれぞれウサギ血清（SIGMA CHEMICAL CO.)を３ｖ／ｖ％加えたものを用いた。
【００７６】
前記試験液１００ｍｌに、前記菌液１ｍｌを添加後、２５℃で保存し、３時間、６時間、２４時間および４８時間後の生菌数をＴＳＡ培地を用いた寒天平板培養法（３５℃、２日間培養）により測定した。また、対照として、滅菌精製水にウサギ血清（SIGMA CHEMICAL CO.)を３ｖ／ｖ％加えた後、菌液を接種したものについても同様に試験した。結果を表７に示す。
【００７７】
【表７】
2008007451.tif 000008
【００７８】
フルボ酸含有水性液の原液を用いた場合は、生菌数が４８時間後にほぼ０となり、ＶＲＥに対して殺菌効果があることがわかる。また、５０倍希釈液、１００倍希釈液の場合、４８時間後でも生菌数が増えず、抗菌効果があることがわかる。
【００７９】
試験例６（マウスにおける急性毒性試験）
製造例１で得られたフルボ酸含有水性液について、ＯＥＣＤ化学物質毒性試験指針（１９８７）に準拠し、マウスにおける急性経口毒性を調べた。
【００８０】
４週齢のＩＣＲ系雌雄マウス（日本エスエルシー株式会社）を購入し、約１週間予備飼育を行って一般状態に異常のないことを確認した後、試験に使用した。試験動物はポリカーボネート製ケージに各５匹収容し、室温２３±２℃、照明時間１２時間／日に設定した飼育室において飼育した。飼料（マウス、ラット用固型飼料：ラボＭＲストック、日本農産工業株式会社）および飲料水（水道水）は自由に摂取させた。
【００８１】
試験群および対照群ともに雌雄それぞれ１０匹を用いた。投与前に約４時間試験動物を絶食させた。体重を測定した後、試験群には雌雄ともに検体投与量として５０ｍｌ／ｋｇの用量を胃ゾンデを用いて強制単回経口投与した。対照群には雄は１．７ｍｌ、雌では１．４ｍｌの精製水を同様に投与した。観察期間は１４日間とした。投与後７および１４日に体重を測定し、ｔ−検定により有意水準５％で群間の比較を行った。体重測定の結果を表８（雄）、表９（雌）に示す。観察期間終了時に動物すべてを剖検した。
【００８２】
【表８】
2008007451.tif 000009
【００８３】
【表９】
2008007451.tif 000010
【００８４】
試験の結果、死亡例に関しては、雌雄ともに観察期間中に死亡例は認められなかった。一般性状に関しては、雌雄ともに観察期間中に異常は認められなかった。投与後７および１４日の体重測定では、雌雄ともに各群間で体重増加に差は見られなかった。観察期間終了時の剖検では、雌雄ともにすべての試験動物の主要臓器に異常は見られなかった。これらの結果から、本発明のフルボ酸含有水性液のマウスにおける単回経口投与によるＬＤ５０値は、雌雄ともに５０ｍｌ／ｋｇ以上であるものと考えられる。
【００８５】
試験例７（ウサギにおける眼刺激性試験）
製造例１で得られたフルボ酸含有水性液（検体）について、ＯＥＣＤ化学物質毒性試験指針（１９８７）に準拠し、ウサギを用いた眼刺激性を調べた。
【００８６】
日本白色種雄ウサギ（北山ラベス株式会社）を購入し、１週間以上の予備飼育を行って一般状態に異常のないことを確認した後、３匹を試験に使用した。試験動物はＦＲＰ製ケージに個別に収容し、室温２２±２℃、照明時間１２時間／日に設定した飼育室において飼育した。飼料はウサギ用固型飼料（ＣＲ−３、日本クレア株式会社）を制限給与し（１２０ｇ／日）、飲料水は水道水を自由摂取させた。試験開始時の体重が３．２７ｋｇ、３．４９ｋｇ、３．５４ｋｇのウサギをそれぞれウサギＮｏ．１、ウサギＮｏ．２、ウサギＮｏ．３とした。
【００８７】
各試験動物の両眼の前眼部を試験開始当日に検査し、異常のないことを確かめた。体重測定後、各試験動物の片眼結膜嚢内に検体０．１ｍｌを点眼し、約１秒間上下眼瞼を穏やかに合わせ保持した。他眼は無処置の対照とした。点眼後１、２４、４８および７２時間に、スリットランプ（×１０）（興和株式会社）を用いて角膜、虹彩、結膜などの観察を行い、Draize 法の基準に従って眼刺激性の程度を採点した。結果を表１０（ウサギＮｏ．１）、表１１（ウサギＮｏ．２）、表１２（ウサギＮｏ．３）に示す。
【００８８】
【表１０】
2008007451.tif 000011
【００８９】
【表１１】
2008007451.tif 000012
【００９０】
【表１２】
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【００９１】
検体０．１ｍｌをウサギ３匹の片目に点眼した結果、試験眼では点眼後１時間に２例、２４時間および４８時間に１例、対照眼では２４時間に１例で結膜の発赤が見られたが、７２時間までに消失した。Draize 法に従って算出した観察期間中の平均合計評点の最高値は、試験眼では１．３（点眼後１時間）、対照眼では０．７（点眼後２４時間）であった。これらの結果から、ウサギを用いた眼刺激性試験において、本発明のフルボ酸含有水性液は「無刺激物」の範疇にあるものと評価される。
【００９２】
試験例８（ウサギにおける皮膚一次刺激性試験）
製造例１で得られたフルボ酸含有水性液（検体）について、ＯＥＣＤ化学物質毒性試験指針（１９８１）に準拠し、ウサギにおける皮膚一次刺激性を調べた。
【００９３】
日本白色種雄ウサギ（北山ラベス株式会社）を購入し、１週間以上の予備飼育を行って一般状態に異常のないことを確認した後、３匹を試験に使用した。試験動物はＦＲＰ製ケージに個別に収容し、室温２２±２℃、照明時間１２時間／日に設定した飼育室において飼育した。飼料はウサギ用固型飼料（ＣＲ−３、日本クレア株式会社）を制限給与し（１２０ｇ／日）、飲料水は水道水を自由摂取させた。試験開始時の体重が２．８７ｋｇ、３．１２ｋｇ、３．１５ｋｇのウサギをそれぞれウサギＮｏ．１、ウサギＮｏ．２、ウサギＮｏ．３とした。
【００９４】
各々の試験動物の体幹背部被毛を試験の約２４時間前に剪毛した。体重測定後、試験動物１匹につき、約６ｃｍ2の面積で４箇所を設定し、そのうち２箇所には真皮までは達しないように角化層にすり傷を付け（有傷皮膚）、他の２箇所を無処置（無傷皮膚）とした。約２ｃｍ×３ｃｍに裁断したガーゼパッチに検体０．５ｍｌを均一に塗布し、無傷および有傷皮膚の各１箇所ずつに貼付した後、絆創膏（日局）で固定した。また、パッチが皮膚と接触するように、さらにブレンダームサージカルテープ（スリーエムヘルスケア株式会社）で保持した。残りの無傷および有傷皮膚は対照とした。暴露時間は４時間とし、その後パッチを取り除き、暴露面を精製水で清拭した。除去後１時間、２４時間、４８時間および７２時間に観察を行い、下記基準に従って刺激反応の採点を実施した。
【００９５】
＜紅斑および痂皮の形成＞
紅斑なし                                                ０
非常に軽度な紅斑（かろうじて識別できる）                １
はっきりした紅斑                                        ２
中程度ないし高度紅斑                                    ３
高度紅斑からわずかな痂皮の形成（深部損傷まで）          ４*
（最高点４）
＊出血、潰瘍および壊死は深部損傷として点数４に分類した。
【００９６】
＜浮腫の形成＞
浮腫なし                                                ０
非常に軽度な浮腫（かろうじて識別できる）                １
軽度浮腫（はっきりした膨隆による明確な縁が識別できる）  ２
中程度浮腫（約１ｍｍの膨隆）                            ３
高度浮腫（１ｍｍ異常の膨隆と曝露範囲を超えた広がり）    ４*
（最高点４）
【００９７】
また、Federal Register（１９７２）に準拠して、パッチ除去後１時間、２４時間および４８時間の採点値を合計して６で除し、さらに各試験動物の平均を算出して一時刺激性インデックス（P．I．I．）とし、Draize法の基準に基づき、検体の刺激性の評価を行った。結果を表１３に示す。
【００９８】
【表１３】
2008007451.tif 000014
【００９９】
無傷皮膚では、各観察時間において刺激反応は見られなかった。一方、有傷皮膚ではパッチ除去後１時間に２例（ウサギＮｏ．２、ウサギＮｏ．３）で非常に軽度な紅斑（点数１）が見られたが（このうちウサギＮｏ．２ではすり傷に局限）、２４時間には消失した。残る１例では各観察時間において刺激反応は見られなかった。Federal Register（１９７２）に準拠して求めた一次刺激性インデックス（P．I．I．）は０．１となり、ウサギを用いた皮膚一次刺激性試験において、検体は「弱い刺激物」の範疇に入るものと評価される。
【０１００】
試験例９（ヒトにおける皮膚一次刺激性試験）
製造例１で得られたフルボ酸含有水性液（検体）について、ヒトにおける皮膚一次刺激性を調べた。
【０１０１】
下記の条件に適合した１８歳から７４歳の男女５４名（男１７名、女３７名）の被験者を選出した。５４名の被験者全員が本試験を終了した。
【０１０２】
＜被験者参入基準＞
ａ．１６歳以上の男女。
ｂ．検体による反応と紛らわしい明らかな皮膚病のない人。
ｃ．試験開始前の最低７日間、局所的または全身的ステロイド使用、抗ヒスタミン薬服用をしていない人。
ｄ．カルテに完全に記入し、インフォームドコンセントを読み、理解した上で署名した人。
ｅ．指示に従う能力があり、信頼できる人。
【０１０３】
＜被験者除外基準＞
ａ．健康上、問題のある人。
ｂ．医師の診断を受けている人、あるいは試験の結果に影響を及ぼす可能性のある投薬を受けている人。
ｃ．妊娠中または授乳中の女性。
ｄ．化粧品その他のパーソナルケア製品に対して副作用が生じたことのある人。
【０１０４】
肩胛骨の間の上背部を被験部位として使用した。接触面を充分に覆う量の検体を透明粘着性包帯の３／４インチ×３／４インチの吸収パッド部分に塗布した。このパッチを閉塞性パッチとして被験部位に貼付した。検体を４８時間皮膚に接触させた後、被験部位の変化を目視により下記基準に従って評点した。肉眼で観察可能な皮膚の変化が見られない場合は、０と評価した。７２時間後に被験部位を再度評点した。
【０１０５】
＜評点基準＞
０：  反応なし
＋：  ごく僅かに識別できる、あるいは点状の紅斑反応
１：  被験部位のほとんどをカバーしている弱度の紅斑反応
２：  中程度の紅斑反応、弱度の浮腫反応
３：  明らかな紅斑反応、浮腫反応
４：  強度の紅斑反応、硬結、浸潤、浮腫
【０１０６】
その結果、全ての被験者について、所見は陰性（０＝反応なし）であり、一次刺激性は認められなかった。
【０１０７】
実施例１（消毒液）
製造例１で得られたフルボ酸含有水性液をそのまま消毒用洗面器に入れ、食堂などの入り口におき、従業員が出入りするたびに手を消毒するようにした。
【０１０８】
実施例２（スプレー式消毒液）
エアゾール容器に製造例１で得られたフルボ酸含有水性液と窒素ガスを充填してエアゾール製品（スプレー式消毒液）を作製した。
【０１０９】
これを食堂などの入り口におき、従業員が出入りするたびにスプレーして手を消毒するようにした。
【０１１０】
実施例３（美容液の製造）
製造例１で得られたフルボ酸含有水性液を市販の美容液（商品名：レルマス、太陽製薬（株）製）に６重量％の割合で配合し、フルボ酸含有美容液を得た。この美容液を１８〜３０才の敏感肌、アトピー体質、アレルギー体質やニキビで化膿した肌に適用した場合、ニキビ肌、アレルギー肌、アトピー肌特有の顔の赤みが消え、かゆみがなくなった。