(57)【要約】      （修正有）【課題】診断的な利点または治療的な利点を有する、新規ポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子の提供。【解決手段】Ｂ７関連プロテイン−２（Ｂ７ＲＰ−２）ポリペプチドおよびＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードする核酸分子。さらに、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを産生するための選択的結合因子、該核酸分子を含むベクター、宿主細胞およびその製造方法。これらはＢ７ＲＬＰ−２ポリペプチドに関連する疾患、障害、および状態の診断、処置、緩和、および／または予防するための薬学的組成物およびその製造方法に利用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号１、配列番号３、または配列番号５のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体に、少なくとも中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列、
を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドに少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３もしくは配列番号５のいずれかに示されるヌクレオチド配列または（ａ）のヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号３もしくは配列番号５のいずれかのヌクレオチド配列の領域、または（ａ）もしくは（ｂ）のヌクレオチド配列の領域であって、ここで、該ポリペプチドフラグメントは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるコードされるポリペプチドの活性を有するかまたは抗原性である、ヌクレオチド配列の領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のいずれか、または（ａ）〜（ｃ）のヌクレオチド配列の領域；
（ｅ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列、
を含む、単離された核酸分子。
【請求項３】
単離された核酸分子であって、以下；
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、またはＮ末端短縮である少なくとも１つの改変を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｇ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含む、単離された核酸分子。
【請求項４】
請求項１、請求項２または請求項３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
真核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
原核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを生成するためのプロセスであって、該ポリペプチドを発現させるのに適切な条件下で請求項５に記載の宿主細胞を培養する工程、および必要に応じて、該培養物から該ポリペプチドを単離する工程、を包含する、プロセス。
【請求項９】
請求項８に記載のプロセスによって生成される、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のプロセスであって、ここで、前記核酸分子が、該ネイティブのＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを含む、プロセス。
【請求項１１】
請求項２に記載の単離された核酸分子であって、ここで、前記同一性パーセントが、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムであるコンピュータープログラムを用いて決定される、単離された核酸分子。
【請求項１２】
化合物がＢ７ＲＰ−２ポリペプチド活性またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド産生を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、請求項５、請求項６、または請求項７のいずれかに記載の細胞を該化合物に曝露する工程、および該細胞におけるＢ７ＲＰ−２ポリペプチド活性またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド産生を測定する工程、を包含する、プロセス。
【請求項１３】
配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかのオルソログについてのアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するかまたは抗原性である、フラグメント；あるいは
（ｄ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列、または（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体についてのアミノ酸配列、
を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；あるいは
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、またはＮ末端短縮である少なくとも１つの改変を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列、
を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１４に記載の単離されたポリペプチドであって、ここで、前記同一性パーセントが、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムであるコンピュータープログラムを用いて決定される、単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドに特異的に結合する、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項１９】
配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６またはそのフラグメントのいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、請求項１８に記載の選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項２０】
抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２１】
ヒト化抗体である、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２２】
ヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２３】
ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２４】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２５】
キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２６】
ＣＤＲ移植抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２７】
抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２８】
可変領域フラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２９】
ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’フラグメントである、請求項２８に記載の可変領域フラグメント。
【請求項３０】
配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項３１】
検出可能な標識に結合されている、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３２】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの生物学的活性に拮抗する、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３３】
医学的疾患、状態、または障害を、処置、予防、または改善するための方法であって、有効量の請求項１８に記載の選択的結合因子を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
前記医学的疾患、状態、または障害が、骨粗鬆症、パジェット病、骨髄炎、高カルシウム血症、骨減少症、または骨壊死である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記医学的疾患、状態、または障害が、自己免疫疾患である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、変形性関節症、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、または乾癬である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記医学的疾患、状態、または障害が、慢性炎症性疾患である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記慢性炎症性疾患が、炎症性腸疾患、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、または糖尿病である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記医学的疾患、状態、または障害が、癌である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記医学的疾患、状態、または障害が、感染症である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いて動物を免疫することによって産生される、選択的結合因子。
【請求項４２】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載のポリペプチドに結合し得る選択的結合因子を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項４３】
請求項１８の選択的結合因子またはそのフラグメントを用いてＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの量を検出または定量するための方法。
【請求項４４】
請求項１８に記載の選択的結合因子を備える、生物学的サンプル中のＧＰＣＲポリペプチドの量を検出または定量するためのキット。
【請求項４５】
請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項４６】
前記薬学的に受容可能な処方剤が、キャリア、アジュバント、可溶化剤、安定剤、または抗酸化剤である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドの誘導体を含む、ポリペプチド。
【請求項４８】
水溶性ポリマーを用いて共有結合的に改変された、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
請求項４８に記載のポリペプチドであって、ここで、前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、またはポリビニルアルコールである、ポリペプチド。
【請求項５０】
請求項１、請求項２または請求項３のいずれかに記載の核酸分子および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項５１】
前記核酸分子が、ウイルスベクター中に含まれる、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
請求項１、請求項２または請求項３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ウイルスベクター。
【請求項５３】
異種アミノ酸配列に融合された、請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
【請求項５４】
前記異種アミノ酸配列が、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメントである、請求項５３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５５】
医学的疾患、状態または障害を処置、予防、または改善するための方法であって、請求項１３、請求項１４、もしくは請求項１５のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項１、請求項２、もしくは請求項３のいずれかに記載の核酸によってコードされるポリペプチドの有効量を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５６】
前記医学的疾患、状態、または障害が、骨粗鬆症、パジェット病、骨髄炎、高カルシウム血症、骨減少症、または骨壊死である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記医学的疾患、状態、または障害が、自己免疫疾患である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、変形性関節症、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、または乾癬である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記医学的疾患、状態、または障害が、慢性炎症性疾患である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記慢性炎症性疾患が、炎症性腸疾患、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、または糖尿病である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記医学的疾患、状態、または障害が、癌である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
前記医学的疾患、状態、または障害が、感染症である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
被験体における病理的状態または病理的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下：
（ａ）サンプル中の、請求項１３、請求項１４、もしくは請求項１５のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項１、請求項２、もしくは請求項３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの、発現の存在または発現量を決定する工程；および
（ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または発現量に基づき、病理的状態または病理的状態に対する感受性を診断する工程、
を包含する、方法。
【請求項６４】
デバイスであって、以下：
（ａ）移植に適した膜；および
（ｂ）該膜内にカプセル化された細胞、
を備え、ここで、該細胞は、請求項１３、請求項１４、もしくは請求項１５のいずれかに記載のタンパク質を分泌し；
ここで、該膜は、該タンパク質に対して透過性であり、該細胞に有害な物質に対して不透過性である、デバイス。
【請求項６５】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法であって、以下：
（ａ）請求項１３、請求項１４、もしくは請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドを、化合物と接触させる工程；および
（ｂ）該化合物に対する該Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの結合の程度を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６６】
前記化合物に結合したときの前記ポリペプチドの活性を決定する工程をさらに包含する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
動物においてポリペプチドのレベルを調節するための方法であって、請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子を該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６８】
請求項１、請求項２、または請求項３に記載の核酸分子を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項６９】
化合物がＢ７ＲＰ−２ポリペプチド活性またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド産生を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、請求項６８に記載のトランスジェニック哺乳動物を該化合物に曝露する工程、および該トランスジェニック哺乳動物におけるＢ７ＲＰ−２ポリペプチド活性またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド産生を測定する工程、を包含する、プロセス。
【請求項７０】
固体支持体に付着された請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項７１】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の少なくとも１つの核酸分子を含む、核酸分子のアレイ。
【請求項７２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、２０位のバリン；２９位のバリン；１０１位のバリン；１２０位のチロシン；１８４位のロイシン；２６０位のバリン；２６１位のバリンもしくはイソロイシン；２９１位のアスパラギン酸；または３０６位のグルタミン酸である少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有し、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２に示されるポリペプチドの活性を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項７３】
配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その開示が本明細書中で参考として明示的に援用される、２００１年５月２５日出願の米国仮特許出願第６０／２９３，６２９号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｂ７関連タンパク質２（Ｂ７ＲＰ−２）ポリペプチドおよびこのポリペプチドをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを産生するための、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞、薬学的組成物、および方法に関する。本発明はさらに、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドと関連する疾患、障害および状態の診断、処置、改善、および／または予防のための、薬学的組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸分子の同定、クローニング、発現、および操作における技術進歩ならびにヒトゲノムの解読は、新規治療剤の発見を大きく加速した。現在、高速核酸配列決定技術は、前例のない速度で配列情報を作製し得、そしてコンピュータ分析と合わされて、ゲノムの一部および全体へと重複配列を集合させこと、ならびにポリペプチドコード領域の同定を可能にする。既知アミノ酸配列のデータベース編集物に対する推定アミノ酸配列の比較は、以前に同定された配列および／または構造の目印に対して相同性の程度を決定することを可能にする。核酸分子のポリペプチドコード領域のクローニングおよび発現は、構造分析および機能分析のためのポリペプチド産物を提供する。核酸分子およびコードされるポリペプチドの操作は、治療剤としての使用に関して生成物に対して有利な特性を与え得る。
【０００４】
過去１０年間にわたるゲノム研究における有意な技術進歩にも関わらず、ヒトゲノムに基づく新規治療剤の開発に関する可能性は、未だほとんど実現されていない。潜在的に有利なポリペプチド治療剤をコードする多くの遺伝子またはこれらがコードするポリペプチド（これらは、治療分子に対して「標的」として作用し得る）は、未だ同定されていない。従って、診断的な利点または治療的な利点を有する、新規ポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子を同定することが、本発明の目的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、新規のＢ７ＲＰ−２核酸分子およびコードされたポリペプチドに関する。
【０００６】
本発明は、以下を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号１、配列番号３、または配列番号５のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体に、少なくとも中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここで、コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【０００７】
本発明はまた、以下を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドに対して少なくとも７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、または配列番号５のいずれかに示されるヌクレオチド配列または（ａ）のヌクレオチド配列の、対立遺伝子改変体もしくはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のいずれかのヌクレオチド配列、または（ａ）もしくは（ｂ）のヌクレオチド配列の領域であって、ここで、このポリペプチドフラグメントは、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６に示されるコードされたポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、ヌクレオチド配列領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のいずれかのヌクレオチド配列または（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列領域；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体に対して少なくとも中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【０００８】
本発明は、以下を含む単離された核酸分子をさらに提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、またはＮ末端短縮である少なくとも１つの改変を含む、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体に対して、少なくとも中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【０００９】
本発明は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００１０】
本発明はまた、以下を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかのオルソログのアミノ酸；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、このフラグメントは、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、アミノ酸配列のフラグメント；あるいは
（ｄ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列、または（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列の、または（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列対立遺伝子改変体もしくはスプライス改変体の、アミノ酸配列。
【００１１】
本発明は、以下を含む単離されたポリペプチドをさらに提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存されたアミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このフラグメントは、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；あるいは
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、またはＮ末端短縮っである少なくとも１つの改変を含む、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列。
【００１２】
本発明は、２０位がバリンであるか；２９位がバリンであるか；１０１位がバリンであるか；１２０位がチロシンであるか；１８４位がロイシンであるか；２６０位がバリンであるか；２６１位がバリンまたはイソロイシンであるか；２９１位がアスパラギン酸であるか；または３０６位がグルタミン酸である、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドをなおさらに提供し、ここで、このポリペプチドは、配列番号２に示されるポリペプチドの活性を有する。
【００１３】
Ｂ７ＲＰ−２のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドもまた、提供される。
【００１４】
本発明はまた、本明細書中に示される単離された核酸分子を含む発現ベクター、本明細書中に示される組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、ならびにＢ７ＲＰ−２ポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、宿主細胞を培養する工程およびこのように産生されたポリペプチドを必要に応じて単離する工程を包含する。
【００１５】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む、トランスジェニック非ヒト動物はまた、本発明に含まれる。Ｂ７ＲＰ−２核酸分子は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現および増加したレベル（これは、増加した循環レベルを含み得る）を可能にする様式で、動物中に導入される。あるいは、このＢ７ＲＰ−２核酸分子は、内因性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現を防止する（すなわち、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド遺伝子ノックアウトを保有するトランスジェニック動物を作製する）様式で、動物中に導入される。このトランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは、哺乳動物であり、そしてより好ましくは、ラットまたはマウスのようなげっ歯類である。
【００１６】
本発明のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの誘導体もまた、提供される。
【００１７】
さらに、本発明のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドに特異的に結合し得る選択的結合因子（例えば、抗体およびペプチド）が、提供される。このような抗体およびペプチドは、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
【００１８】
本発明のヌクレオチド、ポリペプチド、または選択的結合因子と、１以上の薬学的に受容可能な処方剤とを含む、薬学的組成物もまた、本発明に含まれる。この薬学的組成物は、治療有効量の本発明のヌクレオチドまたはポリペプチドを提供するために使用される。本発明はまた、上記のポリペプチド、核酸分子、および選択的結合因子を使用する方法に関する。
【００１９】
本発明のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドおよびＢ７ＲＰ−２核酸分子は、疾患および障害（本明細書中で記載されるものを含む）を処置、予防、改善、および／または検出するために使用され得る。
【００２０】
本発明はまた、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドと結合する試験分子を同定するために、試験分子をアッセイする方法を提供する。この方法は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを試験分子と接触させて、試験分子がそのポリペプチドに結合する程度を決定する工程、およびこの試験分子のこのポリペプチドに結合する範囲を決定する工程を包含する。この方法は、さらに、このような試験分子が、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定する工程を包含する。本発明は、さらに、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの活性に対する分子の影響を試験する方法を提供する。
【００２１】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現を調節する方法およびレベルを調整（すなわち、増加または減少）する方法もまた、本発明に含まれる。１つの方法は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与する工程を包含する。別の方法において、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現を調節または調整するエレメントを含む核酸分子が、投与され得る。これらの方法の例としては、本明細書中でさらに記載されているような、遺伝子治療、細胞治療、およびアンチセンス治療が挙げられる。
【００２２】
本発明の別の局面において、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドは、それらのレセプター（「Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドレセプター」）を同定するために使用され得る。「発現クローニング」の種々の形態は、タンパク質リガンドに対するレセプターをクローニングするために広範に使用されている。例えば、ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｏｄｉｓｈ，Ｔｒｅｎｄｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５巻、４３７〜４４１、ならびにＴａｒｔａｇｌｉａら、１９９５、Ｃｅｌｌ、８３：１２６３〜１２７１を参照のこと。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドレセプターの単離は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドシグナル伝達経路の新規なアゴニストおよびアンタゴニストを同定または開発するために有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドレセプター、抗Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドレセプター選択的結合因子（例えば、抗体およびそれらの誘導体）、低分子、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（これらのいずれかは、１以上の疾患または障害（本明細書中で開示されるものを含む）を処置するために使用され得る）が挙げられる。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される節の表題は、組織的な目的のみのためであり、そして記載される内容を限定するようには解釈されるべきではない。本願において引用される全ての参考文献は、本明細書中に明示的に参考として援用される。
【００２４】
（定義）
用語「Ｂ７ＲＰ−２遺伝子」または「Ｂ７ＲＰ−２核酸分子」あるいは「Ｂ７ＲＰ−２ポリヌクレオチド」とは、配列番号１、配列番号３、または配列番号５に示されるヌクレオチド配列、配列番号２、配列番号４、または配列番号６に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたはこれらからなる核酸分子および本明細書中で定義される核酸分子をいう。
【００２５】
用語「Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド対立遺伝子改変体」とは、生物体または生物体の集団の染色体の所定の遺伝子座を占める遺伝子の、天然に存在する可能ないくつかの代替的形態のうちの１つをいう。
【００２６】
用語「Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドスプライス改変体」とは、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドアミノ酸配列のＲＮＡ転写物中のイントロン配列の選択的プロセシングによって生成される、核酸分子（通常はＲＮＡ）をいう。
【００２７】
用語「単離された核酸分子」とは、（１）総核酸が供給源細胞から単離される場合に、天然で一緒に見出されるタンパク質、脂質、糖質、または他の物質のうち少なくとも約５０パーセントから分離されている本発明の核酸分子、（２）「単離された核酸分子」が天然で連結しているポリヌクレオチドの全てまたは一部に連結していない本発明の核酸分子、（３）天然では連結しないポリヌクレオチドに作動可能に連結した本発明の核酸分子、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として、天然には存在しない本発明の核酸分子をいう。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、いかなる他の混入核酸分子、またはその天然の環境において見出される他の混入物（これらは、ポリペプチド産生における使用、または治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用を妨げる）も実質的に含まない。
【００２８】
用語「核酸配列」または「核酸分子」は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をいう。これらの用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかから形成される分子を含み、その塩基アナログは、例えば、以下であるがこれらに限定されない：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（β−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン（ｏｘｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
【００２９】
用語「ベクター」は、コード情報を宿主細胞へと移すために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を言及するために使用される。
【００３０】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に適切なベクターであって、そして挿入された異種核酸配列の発現を指示および／または制御する核酸配列を含む、ベクターをいう。発現としては、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）のようなプロセスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３１】
用語「作動可能に連結された」を用いて、本明細書中では、このように記載された隣接配列が、その通常の機能を発揮するように構成または構築されている隣接配列の配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結された隣接配列は、このコード配列の複製、転写および／または翻訳をもたらすことが可能であり得る。例えば、コード配列は、このプロモーターがこのコード配列の転写を指示し得る場合に、プロモーターに作動可能に連結されている。隣接配列は、これが正確に機能する限り、このコード配列と連続する必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列が、このプロモーター配列とこのコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、なおこのコード配列に「作動可能に連結」されているとみなされ得る。
【００３２】
用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換されたか、または核酸配列で形質転換されて、次いで目的の選択された遺伝子を発現し得る細胞を言及するために使用される。この用語は、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が形態または遺伝子構造において元々の親と同一であろうとなかろうと、親細胞の子孫を包含する。
【００３３】
用語「Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、および関連ポリペプチドをいう。関連ポリペプチドとしては、以下が挙げられる：Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドフラグメント、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドオルソログ、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド改変体、およびＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体であって、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するもの。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドは、本明細書中で定義されるような、成熟ポリペプチドであり得、そして調製される方法に依存して、アミノ末端メチオニン残基を有しても有さなくてもよい。
【００３４】
用語「Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドのアミノ酸末端での短縮（リーダー配列を含むかまたは含まない）および／またはカルボキシル末端での短縮を含むポリペプチドをいう。用語「Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドフラグメント」はまた、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドオルソログ、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体、もしくはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド改変体のアミノ末端短縮物および／もしくはカルボキシル末端短縮物、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド対立遺伝子改変体もしくはＢ７ＲＰ−２ポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端短縮物および／もしくはカルボキシル末端短縮物をいう。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドフラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシングまたはインビボでのプロテアーゼ活性からもたらされ得る。膜結合形態のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドもまた、本発明によって意図される。好ましい実施形態では、短縮および／または欠失は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１００より多くのアミノ酸を含む。このようにして生成されるポリペプチドフラグメントは、約２５個連続したアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約１５０より多くのアミノ酸を含む。このようなＢ７ＲＰ−２ポリペプチドフラグメントは、必要に応じて、アミノ末端メチオニン残基を含み得る。このようなフラグメントは、例えば、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドに対する抗体を生成するために使用され得ることが理解される。
【００３５】
用語「Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドオルソログ」とは、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかに示されるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドアミノ酸配列に対応する、別の種由来のポリペプチドをいう。例えば、マウスおよびヒトのＢ７ＲＰ−２ポリペプチドは、互いのオルソログであるとみなされる。
【００３６】
用語「Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド改変体」は、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号６（リーダー配列を有するかまたは有さない）のいずれかに示されるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失（例えば、内部欠失および／またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチドフラグメント）、および／または付加（例えば、内部付加および／またはＢ７ＲＰ−２融合ポリペプチド）を有するアミノ酸配列を含むＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをいう。改変体は、天然に存在する（例えば、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド対立遺伝子改変体、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドオルソログ、およびＢ７ＲＰ−２ポリペプチドスプライス改変体）か、または、人工的に構築され得る。このようなＢ７ＲＰ−２ポリペプチド改変体は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５のいずれかに示されるＤＮＡ配列から変化するＤＮＡ配列を有する、対応する核酸分子から調製され得る。好ましい実施形態において、これらの改変体は、１〜３、または１〜５、または１〜１０、または１〜１５、または１〜２０、または１〜２５、または１〜５０、または１〜７５、または１〜１００、または１００より多くのアミノ酸の置換、挿入、付加および／または欠失を有し、ここで、これらの置換は、保存的、または非保存的、あるいはその任意の組み合わせであり得る。
【００３７】
用語「Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体」は、化学的に改変された、本明細書中に定義されるような、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号６のいずれかに記載されるポリペプチド、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドフラグメント、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドオルソログ、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド改変体をいう。用語「Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体」はまた、化学的に改変された、本明細書中に定義されるような、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド対立遺伝子改変体またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドをいう。
【００３８】
用語「成熟Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド」は、リーダー配列を欠失したＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをいう。成熟Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドはまた、他の改変（例えば、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）および／またはカルボキシル末端のタンパク質分解性プロセシング、より大きな前駆体からのより小さなポリペプチドの切断、Ｎ結合型および／またはＯ結合型グリコシル化など）を含み得る。
【００３９】
用語「Ｂ７ＲＰ−２融合ポリペプチド」とは、本明細書中に定義されるような、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号６のいずれかに示されるポリペプチド、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドフラグメント、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドオルソログ、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド改変体、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体の、アミノ末端またはカルボキシル末端での１つ以上のアミノ酸（例えば、異種タンパク質または異種ペプチド）の融合体をいう。用語「Ｂ７ＲＰ−２融合ポリペプチド」とはまた、本明細書中に定義されるような、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド対立遺伝子改変体またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端での、１つ以上のアミノ酸の融合体をいう。
【００４０】
用語「生物学的に活性なＢ７ＲＰ−２ポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドに特徴的な少なくとも１つの活性を有するＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをいう。さらに、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドは、免疫原として活性であり得る；すなわち、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドは、抗体が惹起され得る少なくとも１つのエピトープを含む。
【００４１】
用語「単離されたポリペプチド」とは、（１）供給源細胞から単離される場合に、天然で一緒に見出されるポリヌクレオチド、脂質、糖質、または他の物質の少なくとも約５０％から分離された本発明のポリペプチド、（２）「単離されたポリペプチド」が天然で連結しているポリペプチドの全てまたは一部に（共有結合的相互作用によっても非共有結合的相互作用によっても）連結していない、本発明のポリペプチド、（３）天然では連結していないポリペプチドに（共有結合的相互作用または非共有結合的相互作用によって）作動可能に連結している、本発明のポリペプチド、または（４）天然には存在しない本発明のポリペプチドをいう。好ましくは、この単離されたポリペプチドは、あらゆる他の混入ポリペプチドも、その治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用を妨げるその天然の環境において見出される他の混入物も、実質的に含まない。
【００４２】
用語「同一性」とは、当該分野で公知のように、配列の比較によって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の、配列間の関係をいう。当該分野において、「同一性」はまた、場合に応じて、一列の２つ以上のヌクレオチド配列間または２つ以上のアミノ酸配列間の一致によって決定したときの、核酸分子間またはポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、２つ以上の配列のうち小さなものと、特定の数理的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によってアドレス指定されるギャップアラインメント（存在する場合）との間の同一一致のパーセントを評価する。
【００４３】
用語「類似性」は、関連した概念であるが、「同一性」とは対照的に、「類似性」は、同一一致および保存的置換の一致の両方を含む関連性尺度をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば１０／２０個同一のアミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換である場合、パーセント同一性および類似性は、どちらも５０％である。同じ例において、保存的置換であるさらに５つの位置が存在する場合、パーセント同一性は５０％のままであるが、パーセント類似性は７５％（１５／２０）である。したがって、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド間のパーセント類似性は、これら２つのポリペプチド間のパーセント同一性よりも高い。
【００４４】
用語「天然に存在する」または「ネイティブの」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的物質と関連して使用される場合、天然において見出され、そして人によって操作されていない物質をいう。同様に、「天然に存在しない」または「ネイティブではない」は、本明細書中で使用される場合、天然で見出されないか、またはヒトによって構造的に改変もしくは合成された物質をいう。
【００４５】
用語「有効量」および「治療有効量」は、各々、本明細書中に示されるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの１つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを支持するために使用されるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ−２核酸分子の量をいう。
【００４６】
用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「生理学的に受容可能なキャリア」は、本明細書中で使用される場合、薬学的組成物としてのＢ７ＲＰ−２ポリペプチド、Ｂ７ＲＰ−２核酸分子、またはＢ７ＲＰ−２選択的結合因子の送達の達成または増強に適切な１つ以上の処方材料をいう。
【００４７】
用語「抗原」とは、選択的結合因子（例えば、抗体）により結合され得、そしてさらに動物において使用されて、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生し得る、分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。
【００４８】
用語「選択的結合因子」とは、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドについての特異性を有する分子をいう。本明細書中で使用される場合、用語「特異的」および「特異性」とは、選択的結合因子が、ヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチドに結合し、かつヒト非Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドに結合しない能力をいう。しかし、選択的結合因子がまた、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかに記載されるようなポリペプチドのオルソログ（すなわち、その種間バージョン（例えば、マウスＢ７ＲＰ−２ポリペプチドおよびラットＢ７ＲＰ−２ポリペプチド））に結合し得ることが、理解される。
【００４９】
用語「形質導入」とは、通常はファージによる、１つの細菌から別の細菌への遺伝子の移入をいうために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物細胞配列の獲得および移入をいう。
【００５０】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外因性ＤＮＡまたは異種ＤＮＡの取り込みをいうために使用され、そして細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合に「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が、当該分野で周知であり、そして本明細書中に開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）；およびＣｈｕら、１９８１、Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。このような技術を使用して、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入し得る。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」とは、細胞の遺伝的特徴における変化をいい、そして細胞が新しいＤＮＡを含有するように改変された場合、その細胞は形質転換されている。例えば、細胞がそのネイティブな状態から遺伝子改変された場合、その細胞は形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入に続いて、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込まれることにより細胞のＤＮＡと組換わり得るか、複製されることなしにエピソームエレメントとして一過的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製し得る。ＤＮＡが細胞分裂と共に複製される場合に、細胞は、安定に形質転換されたとみなされる。
【００５２】
（核酸分子および／またはポリペプチドの関連性）
関連した核酸分子が、配列番号１、配列番号３、または配列番号５の核酸分子の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体を含むこと、および上記のヌクレオチド配列のいずれかに相補的である配列を含むことが理解される。関連した核酸分子はまた、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかにおけるポリペプチドと比較して１以上のアミノ酸残基の置換、改変、付加および／または欠失を含むかまたは本質的にこれからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。このような関連したＢ７ＲＰ−２ポリペプチドは、例えば、１以上のＮ結合型および／もしくはＯ結合型グリコシル化部位の付加および／もしくは欠失、または１以上のシステイン残基の付加および／もしくは欠失を含み得る。
【００５３】
関連した核酸分子はまた、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかのＢ７ＲＰ−２ポリペプチドのうちの少なくとも約２５個連続したアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約１５０よりも多くのアミノ酸残基のポリペプチドをコードする、Ｂ７ＲＰ−２核酸分子のフラグメントを包含する。
【００５４】
さらに、関連したＢ７ＲＰ−２核酸分子としてはまた、本明細書中で定義したような中程度または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のいずれかのＢ７ＲＰ−２核酸分子の十分に相補的な配列、またはポリペプチド（このポリペプチドは、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む）をコードする分子の十分に相補的な配列、または本明細書中に定義したような核酸フラグメントの十分に相補的な配列、または本明細書中に定義したようなポリペプチドをコードする核酸フラグメントの十分に相補的な配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子が挙げられる。ハイブリダイゼーションプローブは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリーまたは合成ＤＮＡライブラリーを、関連した配列についてスクリーニングするために、本明細書中に提供されるＢ７ＲＰ−２配列を用いて調製され得る。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列のうちの、既知配列に対して顕著な同一性を示す領域は、本明細書中に記載されるような配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定され、そしてこれらの領域を用いて、スクリーニングのためのプローブを設計し得る。
【００５５】
用語「高度にストリンジェントな条件」とは、配列が高度に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを許容し、かつ著しく不一致なＤＮＡのハイブリダイゼーションを排除するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度および変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度によって主に決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての「高度にストリンジェントな条件」の例は、６５〜６８℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは４２℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００５６】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミドまたは他の変性剤）もまた用いられ得るが、ハイブリダイゼーションの速度は影響を受ける。他の薬剤は、非特異的ハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少させる目的のために、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液中に含まれ得る。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた用いられ得る。これらの添加剤の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施される；しかし、代表的なイオン強度の条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨにほとんど依存しない。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００５７】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基組成、長さおよび塩基対の不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変動要因を適応させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするために当業者によって調整され得る。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の方程式によって推定され得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基の百分率である。不完全に一致したハイブリッドについては、融解温度は、不一致１％毎に約１℃下げられる。
【００５８】
用語「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で形成され得るよりも程度が高い塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が形成され得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、５０〜６５℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは３７〜５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび２０％ホルムアミドである。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中で５０℃の、「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を可能にする。
【００５９】
「高度にストリンジェントな条件」と「中程度にストリンジェントな条件」との間に絶対的な区別が存在しないことが当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）では、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃で（同じイオン強度で）の洗浄を用いると、このことは、約６％の不一致を可能にする。より遠く関連した配列を捕捉するために、当業者は、単純に、温度を低くし得るかまたはイオン強度を高くし得る。
【００６０】
約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについての１Ｍ ＮａＣｌ＊中での融解温度の良好な推定は、以下によって与えられる：
Ｔｍ＝Ａ−Ｔ塩基対あたり２℃ ＋ Ｇ−Ｃ塩基対あたり４℃
＊６×塩クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のナトリウムイオン濃度は、１Ｍである。Ｓｕｇｇｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ、６８３（ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ編、１９８１）を参照のこと。
【００６１】
オリゴヌクレオチドについての高いストリンジェンシーの洗浄条件は、通常、６×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で、そのオリゴヌクレオチドのＴｍよりも０℃〜５℃低い温度においてである。
【００６２】
別の実施形態において、関連した核酸分子は、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５に示されるようなヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０パーセント同一であるヌクレオチド配列を含むかもしくはこれからなるか、または配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のいずれかに示されるようなポリペプチドに対して少なくとも約７０パーセント同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかもしくは本質的にこれからなる。好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５のいずれかに示されるようなヌクレオチド配列に対して約７５パーセント、または約８０パーセント、または約８５パーセント、または約９０パーセント、または約９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセント同一であるか、あるいはヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるようなポリペプチド配列に対して約７５パーセント、または約８０パーセント、または約８５パーセント、または約９０パーセント、または約９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセント同一であるポリペプチドをコードする。関連した核酸分子は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を保有するポリペプチドをコードする。
【００６３】
核酸配列における差異は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列の保存的改変および／または非保存的改変を生じ得る。
【００６４】
配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかのアミノ酸配列に対する保存的改変（およびコードするヌクレオチドに対する対応する改変）は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの機能的特徴および化学的特徴と類似の機能的特徴および化学的特徴を有するポリペプチドを生成する。対照的に、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの機能的特徴および／または化学的特徴における実質的な改変は、以下を維持することに対するその影響が顕著に異なる、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかのアミノ酸配列における置換を選択することによって達成され得る：（ａ）例えば、シートもしくはヘリックスコンホメーションのような、置換領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ。
【００６５】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基の極性にも電荷にもほとんどまたは全く影響がないような、非ネイティブな残基によるネイティブなアミノ酸残基の置換を含み得る。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」について以前に記載されたように、アラニンによって置換され得る。
【００６６】
保存的アミノ酸置換はまた、生物学的系における合成によるよりむしろ、化学的なペプチド合成によって代表的に組み込まれる、天然には存在しないアミノ酸残基を含む。これらとしては、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆転形態または反転形態が挙げられる。
【００６７】
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、複数のクラスに分割され得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００６８】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のクラス由来のメンバーとの交換を含み得る。このような置換された残基は、非ヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチドと相同なヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの領域、またはこの分子の非相同領域に導入され得る。
【００６９】
このような変更を行う際に、アミノ酸のハイドロパシー指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づいて、ハイドロパシー指数が割り当てられている。ハイドロパシー指数は、以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００７０】
タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を付与する際の、ハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当該分野において理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５−１３１）。特定のアミノ酸が、類似のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸の代わりに使用され得、そして依然として類似の生物学的活性を維持し得ることが、公知である。ハイドロパシー指数に基づいて変更を行う際に、ハイドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そして±０．５以内であるアミノ酸の置換が、なおより特に好ましい。
【００７１】
類似のアミノ酸の置換が、親水性に基づいて効果的になされ得る（特に、これによって作製された生物学的に機能的に等価なタンパク質またはペプチドは、本発明の場合と同様に、免疫学的実施形態における使用が意図される）こともまた、当該分野において理解されている。その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるような、タンパク質の最大の局所平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性に相関する。
【００７２】
以下の親水性値が、以下のアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変更を行う際に、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±ｌ以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そして±０．５以内であるアミノ酸の置換が、なおより特に好ましい。エピトープをまた、一次アミノ酸配列から、親水性に基づいて同定し得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」と呼ばれる。
【００７３】
所望のアミノ酸置換（保存的であれ非保存的であれ）は、当業者によって、このような置換が所望される時点で決定され得る。例えば、アミノ酸置換を使用して、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの重要な残基を同定し得るか、または本明細書中に記載されるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの親和性を増大もしくは減少させ得る。例示的なアミノ酸置換を、表Ｉに示す。
【００７４】
【表１】
2008167750.tif 000002
【００７５】
【表２】
2008167750.tif 000003
当業者は、周知の技術を使用して、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかに示されるようなポリペプチドの適切な改変体を決定し得る。生物学的活性を破壊することなく変化され得る分子の適切な領域を同定するために、当業者は、活性について重要であると考えられてない領域を標的化し得る。例えば、同一の種または他の種由来の類似の活性を有する類似のポリペプチドが公知である場合、当業者は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列をこのような類似のポリペプチドと比較し得る。このような比較において、類似のポリペプチドの中で保存されている分子の残基および部分が、同定され得る。このような類似のポリペプチドと比較して保存されていないＢ７ＲＰ−２分子の領域での変化が、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの生物学的活性および／または構造を不利に影響しないようであることは、明らかである。当業者はまた、比較的保存されている領域でさえ、天然に存在する残基が、化学的に類似するアミノ酸に置換され得、その一方で活性が保持される（保存的アミノ酸残基置換）を認識する。よって、生物学的活性または構造に重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することがない、またはポリペプチド構造を不利に影響することがない、保存的アミノ酸置換の対象であり得る。
【００７６】
さらに、当業者は、活性または構造に重要である類似のポリペプチド中の残基を同定する構造−機能研究を、検討し得る。このような比較の点で、当業者は、類似のポリペプチド中の活性または構造に重要であるアミノ酸残基に対応する、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド中のアミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、このように予測されたＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの重要なアミノ酸残基に化学的に類似のアミノ酸の置換を選択し得る。
【００７７】
当業者はまた、類似のポリペプチドにおける３次元構造と比較して３次元構造およびアミノ酸配列を分析し得る。このような情報の点で、当業者は、その３次元構造に関してＢ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ酸残基の整列を予測し得る。当業者は、そのタンパク質の表面上にあることが予想されるアミノ酸残基に根本的な変化が起こらないように選択し得る。なぜなら、このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関連し得るからである。さらに、当業者は、各アミノ酸残基で単一のアミノ酸置換を含む試験改変体を生成し得る。改変体は、当業者に公知の活性アッセイを使用してスクリーニングされ得る。このような改変体は、適切な改変体についての情報を得るために使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基への変化が、破壊された活性、所望されない減少した活性、または不適切な活性を生じたことが見出された場合、このような変化を有する改変体は、避けられる。換言すれば、このような慣用的実験から得られた情報に基いて、当業者は、アミノ酸を容易に決定し得、ここで、さらなる置換が単独でかまたは他の変異と組合わせてのいずれかで避けられるべきである。
【００７８】
多くの科学的刊行物が、２次構造の予測を記している。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：４２２−２７；Ｃｈｏｕら、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２２２−４５；Ｃｈｏｕら、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１３：２１１−２２；Ｃｈｏｕら、１９７８．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−４８；Ｃｈｏｕら、１９７８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；およびＣｈｏｕら、１９７９、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−８４を参照のこと。さらに、コンピュータープログラムが、２次構造の予測を補助するために現在利用可能である。２次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基く。例えば、３０％より大きな配列同一性、または４０％より大きな配列類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造的トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の成長は、増強された２次構造の予測（ポリペプチドまたはタンパク質の構造内の可能性のある数のフォールディングを含む）を提供する。Ｈｏｌｍら、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２４４−４７を参照のこと。所定のポリペプチドまたはタンパク質内に制限された数のフォールディングが存在すること、および、一旦臨界的な数の構造が解かれると、構造的予測は劇的により正確になることが、示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−７６）。
【００７９】
二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：１５−１９）、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６−５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４３５５−５８）および「エボリューショナリー連鎖（ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍら、上述、およびＢｒｅｎｎｅｒら、上述を参照のこと）が挙げられる。
【００８０】
好ましいＢ７ＲＰ−２ポリペプチド改変体としては、グリコシル化改変体が挙げられ、ここで、グリコシル化部位の数および／または型は、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列と比較して変更されている。１つの実施形態において、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド改変体は、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列よりも多いかまたは少ないＮ−連結グリコシル化部位の数を有する。Ｎ−連結グリコシル化部位は、以下の配列によって特徴付けられる：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ここで、Ｘで示されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る）。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ−連結炭化水素鎖の付加のために潜在的な新たな部位を提供する。あるいは、この配列を除去する置換は、現存のＮ−連結炭化水素鎖を取り除く。また、Ｎ−連結炭化水素鎖の再構成が提供され、ここで、１つ以上のＮ−連結グリコシル化部位（典型的には天然に存在する部位）が除去され、そして１つ以上の新たなＮ−連結部位が作製される。さらなる好ましいＢ７ＲＰ−２改変体としては、システイン改変体が挙げられ、ここで、１つ以上のシステイン残基が、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列と比較して、欠失されるかまたは他のアミノ酸（例えば、セリン）で置換される。システイン改変体は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドが生物学的に活性なコンフォーメーションに再フォールディングされなければならない場合（例えば、不溶性封入体の単離後）に有用である。システイン改変体は、一般に天然のタンパク質より少ないシステイン残基を有し、典型的には、不対システインから生じる相互作用を最小化する偶数個有する。
【００８１】
他の実施形態において、関連の核酸分子は、少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチド（ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する）をコードするヌクレオチド配列、あるいは少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチド（ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する）をコードするヌクレオチド配列を含むかまたはこれらからなる。関連の核酸分子はまた、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチド（ここで、このポリペプチドは、カルボキシ末端短縮および／またはアミノ末端短縮を有し、さらにこのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する）をコードするヌクレオチド配列を含むかまたはこれらからなる。関連の核酸分子はまた、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチド（ここで、このポリペプチドは、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシ末端短縮およびアミノ末端短縮からなる群より選択される改変の少なくとも１つを有し、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する）をコードするヌクレオチド配列を含むかまたはこれらからなる。
【００８２】
さらに、配列番号２、配列番号４または配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドは、相同なポリペプチドに融合されてホモダイマーを形成され得るか、または異種のポリペプチドに融合されてヘテロダイマーを形成され得る。異種のペプチドおよびポリペプチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｂ７ＲＰ−２融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通レセプタータンパク質またはその一部（例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン）；膜貫通レセプタータンパク質に結合するリガンドまたはその一部；触媒的に活性な酵素またはその一部；オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）；安定性を増加させるポリペプチドまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）；ならびに配列番号２、配列番号４もしくは配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは他のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドとは異なる治療活性を有するポリペプチド。
【００８３】
融合は、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは他のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでなされ得る。融合は、リンカーもしくはアダプター分子を含まずに直接であっても、リンカーもしくはアダプター分子を介してであってもよい。リンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基（代表的には、約２０〜約５０個のアミノ酸残基）であり得る。リンカーまたはアダプター分子はまた、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼ、または融合部分の分離を可能にするプロテアーゼの切断部位を有して設計され得る。融合ポリヌクレオチドは、一旦構築されると、本明細書中に記載される方法に従って誘導体化され得る、ということが明らかである。
【００８４】
本発明のさらなる実施形態において、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは他のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合される。抗体は、２つの機能的に独立した部分（抗原を結合する「Ｆａｂ」として知られる可変ドメイン、ならびにエフェクター機能（例えば、補体活性化および食細胞による攻撃）に関与する「Ｆｃ」として知られる定常ドメイン）を含む。Ｆｃが長い血清半減期を有する一方、Ｆａｂは寿命が短い。Ｃａｐｏｎら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−３１。治療剤タンパク質と一緒に構築された場合、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供し得るか、またはＦｃレセプター結合、プロテインＡ結合、補体結合、およびおそらくまさに胎盤移入のような機能を組み込み得る（前述）。表ＩＩは、当該分野において公知の特定のＦｃ融合物の使用を要約する。
【００８５】
【表３】
2008167750.tif 000004
【００８６】
【表４】
2008167750.tif 000005
１例において、ヒトＩｇＧヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域は、当業者に公知の方法を使用して、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで融合され得る。別の例において、ヒトＩｇＧヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドフラグメント（例えば、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの推定の細胞外部分）のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで融合され得る。
【００８７】
生じたＢ７ＲＰ−２融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティカラムの使用によって精製され得る。Ｆｃ領域に融合されたペプチドおよびタンパク質は、融合されていない対象物よりも実質的に長いインビボでの半減期を示すことが見出された。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量体化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であり得るか、または、特定の品質（例えば、治療的な品質）、循環時間、または減少した凝縮を改善するために変更され得る。
【００８８】
関連の核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に算出される。このような方法としては、以下に記載される方法が挙げられるがこれらに限定されない：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ（Ｐａｒｔ １，Ａ．Ｍ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９４）；Ｇ． ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ．ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９１）；ならびにＣａｒｉｌｌｏら，１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３。
【００８９】
同一性および／または類似性を決定する好ましい方法は、試験された配列間で最大一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータープログラムに記載される。２つの配列間での同一性および類似性を決定する好ましいコンピュータープログラム法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ ＮＬＭ ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，上述）から公的に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【００９０】
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアラインメントスキームは、この２つの配列の短い領域のみの一致を生じ得、そしてこの整列した小さな領域は、たとえ２つの全長配列間で有意な関係が存在しなくても非常に高い配列同一性を有し得る。よって、好ましい実施形態において、選択された整列法（ＧＡＰプログラム）は、本発明のポリペプチドの少なくとも５０個連続するアミノ酸にわたる整列を生じる。
【００９１】
例えば、コンピュータープログラムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、配列同一性パーセントが決定されるべき２つのポリペプチドは、これらのそれぞれのアミノ酸の最適な一致（アルゴリズムによって決定されるような「一致したスパン」）のために整列される。ギャップ開放ペナルティー（３×平均対角線（ｄｉａｇｏｎａｌ）として算出される；「平均対角線」は、比較マトリクスが使用される対角線の平均である；「対角線」は、特定の比較マトリクスによる各完全アミノ酸一致に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティー（これは、通常、０．１×ギャップ開放ペナルティーである）、ならびに比較マトリクス（例えば、ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２）が、アルゴリズムと組合わせて使用される。標準的比較マトリクスがまた、アルゴリズムによって使用される（Ｄａｙｈｏｆｆら，５ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｓｕｐｐ．３ １９７８）（ＰＡＭ２５０比較マトリクス）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５−１９（ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリクス）を参照のこと）。
【００９２】
ポリペプチド配列比較についての好ましいパラメータとしては、以下が挙げられる：
アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３；
比較マトリクス：ＢＬＯＳＵＭ ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，上述）
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
類似性の閾値：０
ＧＡＰプログラムは、上記のパラメータで有用である。上述のパラメータは、（エンドギャップに対するペナルティーなしとともに）ＧＡＰアルゴリズムを使用するポリペプチド比較のためのデフォルトパラメータである。
【００９３】
核酸分子配列比較のために好ましいパラメータとしては、以下が挙げられる：
アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，上述
比較マトリクス：一致＝±１０、不一致＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３
ＧＡＰプログラムはまた、上記のパラメータで有用である。上述のパラメータは、核酸分子比較のためのデフォルトパラメータである。
【００９４】
他の例示的アルゴリズム（ギャップ開放ペナルティー、ギャップ伸長ペナルティー、比較マトリクス、および類似性の閾値）（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン９，１９９７年９月に示されるアルゴリズムを含む）が、使用され得る。なされるべき特定の選択は当業者に明らかであり、そしてなされるべき特定の比較（例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ、タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ）に依存し、さらに、この比較が、配列の所定の対の間（この場合、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般に好ましい）またはある配列と大きな配列データベースとの間（この場合、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）のいずれかに依存する。
【００９５】
（核酸分子）
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子は、化学合成、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングもしくはゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅が挙げられるがこれらに限定されない種々の様式で容易に取得され得る。
【００９６】
本明細書中で使用される組換えＤＮＡ法は、一般に以下に示される方法である：Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）および／またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９４）。本発明は、本明細書中に記載されるような核酸分子およびこのような分子を得るための方法を提供する。
【００９７】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子がある種から同定された場合、この遺伝子の全てまたは一部をプローブとして使用して、同一種由来のオルソログまたは関連遺伝子を同定し得る。このプローブまたはプライマーを使用して、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを発現すると考えられている種々の組織供給源からｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし得る。さらに、配列番号１、配列番号３または配列番号５のいずれかに示される配列を有する核酸分子の一部または全てを使用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングしてＢ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定および単離し得る。典型的には、中程度のストリンジェンシー条件または高ストリンジェンシー条件が、スクリーニングから得られる偽陽性の数を最小化するためのスクリーニングのために使用される。
【００９８】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子はまた、発現したタンパク質の特性に基づくポジティブクローンの検出を使用する発現クローニングによって同定され得る。典型的には、核酸ライブラリーは、抗体または他の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）を結合することによってスクリーニングされて、宿主細胞に発現されてその表面上に提示されるタンパク質をクローニングする。抗体および結合パートナーは、所望のクローンを発現する細胞を同定するために、検出可能な標識で改変される。
【００９９】
以下に示される記載に従って行われる組換え発現技術を、これらのポリヌクレオチドを産生するために、そしてコードされるポリペプチドを発現するために続け得る。例えば、、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することによって、当業者は、多量の所望のヌクレオチド配列を容易に産生し得る。次いで、この配列を使用して、検出プローブまたは増幅プライマーを作製し得る。あるいは、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターに挿入され得る。適切な宿主に発現ベクターを導入することによって、コードされたＢ７ＲＰ−２ポリペプチドは、多量に産生され得る。
【０１００】
適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法において、ｃＤＮＡは、酵素（逆転写酵素）を使用してポリ（Ａ）＋ＲＮＡまたは総ＲＮＡより調製され得る。次いで、２つのプライマー（典型的には、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの２つの別々の領域に相補的な）が、ＴａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼとともにｃＤＮＡに添加され、そしてこのポリメラーゼは、２つのプライマー間のｃＤＮＡ領域を増幅する。
【０１０１】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら，１９８９，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８：７１６−３４に記載される手段のような、当業者に周知の方法を使用する化学合成である。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のためのホスホトリエステル法、ホスホルアミダイド法およびＨ−ホスホネート法が挙げられる。このような化学合成に好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイド化学を使用するポリマー支持された合成である。典型的には、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチド長である。約１００ヌクレオチドより長い核酸は、これらの方法を使用していくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、このフラグメントを一緒に連結して、Ｂ７ＲＰ−２遺伝子の全長ヌクレオチド配列を形成し得る。通常、ポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントはＡＴＧを有し、これは、メチオニン残基をコードする。このメチオニンは、宿主細胞中で産生されたＢ７ＲＰ−２ポリペプチドがこの細胞から分泌されるように設計されているか否かに依存して、このポリペプチドの成熟形態上に存在してもしなくてもよい。当業者に既知の他の方法もまた使用され得る。
【０１０２】
特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞において最適なＢ７ＲＰ−２ポリペプチド発現のために改変されているコドンを含む。特定のコドン変更は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドおよび発現のために選択された宿主細胞に依存する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって（例えば、所定の宿主細胞中で高度に発現される遺伝子における使用のために好ましいコドンを選択することによって）行われ得る。高度に発現される細菌性遺伝子のコドン嗜好（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）のための「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」のようなコドン頻度表を組み込むコンピューターアルゴリズムが使用され得、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。他の有用なコドン頻度表としては、以下が挙げられる：「Ｃｅｌｅｇａｎｓ−ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ−ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ−ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ−ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ−ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」および「Ｙｅａｓｔ−ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」。
【０１０３】
いくつかの場合において、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド改変体をコードする核酸分子を調製することが好ましくあり得る。改変体をコードする核酸分子は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ増幅、または他の適切な方法を使用して産生され得、ここで、プライマーは、所望の点変異を有する（変異誘発技術の記載については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上述、およびＡｕｓｕｂｅｌら、上述、を参照のこと）。Ｅｎｇｅｌら（上述）によって記載される方法を使用する化学合成もまた、このような改変体を調製するために使用され得る。当業者に既知の他の方法もまた、使用され得る。
【０１０４】
（ベクターおよび宿主細胞）
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、標準的連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入される。ベクターは、典型的には、使用される特定の宿主細胞中で機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、宿主細胞機構に適合可能であり、その結果、遺伝子増幅および／または遺伝子発現が生じ得る）。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞（バキュロウイルス系）および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドが翻訳後修飾で改変されるべきか否かに一部依存する（例えば、グリコシル化および／またはリン酸化）。そうならば、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説については、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９０）を参照のこと。
【０１０５】
典型的には、宿主細胞のいずれかにおいて使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列、ならびに外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。特定の実施形態において、このような配列（「隣接配列」と総称される）は、典型的には１つ以上の以下のヌクレオチド配列を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終止配列、ドナースプライシング部位およびアクセプタースプライシング部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸の挿入のためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカーエレメント。これらの配列の各々は、以下に論じられる。
【０１０６】
必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列（すなわち、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子）を含み得；そのオリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）、または別の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）またはｍｙｃ（これらに対しては、市販の抗体が存在する））をコードする。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にそのポリペプチドに融合され、宿主細胞からの、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリクスとしてタグに対する抗体を使用する、カラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、そのタグは、続いて、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような種々の手段によって、精製されたＢ７ＲＰ−２ポリペプチドから除去される。
【０１０７】
隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種由来および／または同じ系統由来）であり得るか、異種（すなわち、宿主細胞種以外または宿主細胞系統以外の種由来）であり得るか、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）であり得るか、または合成であり得るか、あるいは隣接配列は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド発現を調節するために正常に機能するネイティブな配列であり得る。このように、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物または無脊椎生物、あるいは任意の植物であり得、但し、その隣接配列は、宿主細胞の機構において機能的であり、そして宿主細胞の機構によって活性化され得る。
【０１０８】
本発明のベクター中において有用な隣接配列は、当該分野において周知であるいくつかの方法のいずれかによって得られ得る。代表的には、Ｂ７ＲＰ−２遺伝子隣接配列以外の、本明細書中で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、隣接配列の全長ヌクレオチド配列は、公知であり得る。ここで、その隣接配列は、核酸合成またはクローニングのための本明細書中で記載される方法を使用して合成され得る。
【０１０９】
その隣接配列の全てもしくは一部のみが既知である場合、ＰＣＲを使用して、そして／または適切なオリゴヌクレオチドおよび／もしくは同じ種もしくは別の種由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、その隣接配列は得られ得る。その隣接配列が既知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡフラグメントが、例えば、コード配列または別の遺伝子を含み得る、より大きなＤＮＡ片から単離され得る。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、その後のアガロースゲル精製を使用する単離、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、または当業者に公知の他の方法によって、達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。
【０１１０】
複製起点は、代表的には、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、その起点は、宿主細胞においてそのベクターの増幅に役立つ。特定のコピー数へのベクターの増幅は、いくつかの場合において、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの最適な発現に重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含まない場合、既知の配列に基づいて複製起点が化学合成され得、そしてそのベクター中に連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）由来の複製起点は、大部分のグラム陰性細菌にとって適切であり、そして種々の起点（例えば、ＳＶ４０の起点、ポリオーマの起点、アデノウイルスの起点、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の起点、またはパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶもしくはＢＰＶ）の起点）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターのために有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクター中には必要とされない（例えば、ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含むという理由だけで、しばしば、使用される）。
【０１１１】
転写終結配列は、代表的には、ポリペプチドコード領域の末端の３’側に位置し、そしてその転写終結配列は、転写を終結させる働きをする。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメント、続いてポリＴ配列である。この配列は、ライブラリーから容易にクローン化されるか、またはベクターの一部として市販さえされているが、この配列はまた、本明細書中に記載される方法のような核酸合成方法を使用して、容易に合成され得る。
【０１１２】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に対して、抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるタンパク質をコードするか、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補うタンパク質をコードするか、あるいは（ｃ）複合培地から入手可能ではない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。
【０１１３】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生のために大きく要求される遺伝子が、組換え細胞の連続する世代の染色体においてタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞にとって適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、選択圧下に置かれ、その選択圧下で、その形質転換体のみが、そのベクター中に存在する選択遺伝子によって生存するように独自に適合される。選択圧は、培地中の選択因子の濃度が連続的に変化し、それによって選択遺伝子とＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養することによって課される。結果として、増加した量のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１１４】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核生物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、代表的には、発現されるべきＢ７ＲＰ−２ポリペプチドのプロモーターの３’側でありかつコード配列の５’側に位置する。そのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、可変であるが、代表的には、ポリプリン（すなわち、高いＡ−Ｇ含量）である。多くのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、同定されており、それぞれが、本明細書中に記載の方法を使用して容易に合成され得、そして原核生物ベクター中で使用され得る。
【０１１５】
リーダー配列またはシグナル配列は、宿主細胞から外へとＢ７ＲＰ−２ポリペプチドを指向させるために使用され得る。代表的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、Ｂ７ＲＰ−２核酸分子のコード領域に位置するか、または直接Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドコード領域の５’末端に位置する。多くのシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞において機能性であるシグナル配列のいずれもが、Ｂ７ＲＰ−２核酸分子と組み合わせて使用され得る。従って、シグナル配列は、Ｂ７ＲＰ−２核酸分子に対して同種であっても（天然に存在しても）または異種であってもよい。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記載される方法を使用して化学合成され得る。多くの場合、シグナルペプチドの存在を介する宿主細胞からのＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの分泌は、分泌されたＢ７ＲＰ−２ポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を生じる。そのシグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはそのシグナル配列は、ベクター中に挿入されたＢ７ＲＰ−２核酸分子の一部であり得る。
【０１１６】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドコード領域に結合されたネイティブＢ７ＲＰ−２ポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチドコード領域に結合された異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列のいずれかの使用が、本発明の範囲内に含まれる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。ネイティブなＢ７ＲＰ−２ポリペプチドシグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞のために、そのシグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌のために、そのネイティブなＢ７ＲＰ−２ポリペプチドシグナル配列は、酵母インベルターゼ、α因子、または酸ホスファターゼリーダーによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、このネイティブシグナル配列が十分であるが、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。
【０１１７】
グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において望ましいようないくつかの場合において、グリコシル化または収量を改善するために種々のプレ配列が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更し得るかまたはプロ配列を加え得、このことはまた、グリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は、（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）−１位に、発現に付随して１つ以上のさらなるアミノ酸を有し得、この１つ以上のさらなるアミノ酸は、完全に除去されていないかもしれない。例えば、その最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合された、ペプチダーゼ切断部位において見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、その酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域で切断する場合、所望のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの少し短縮した形態を生じ得る。
【０１１８】
多くの場合において、核酸分子の転写は、ベクター内の１つ以上のイントロンの存在によって増加する；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺乳動物宿主細胞）において産生される場合、特に当てはまる。使用されるイントロンは、特に、使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合に、Ｂ７ＲＰ−２遺伝子内に天然で存在し得る。そのイントロンが遺伝子内に天然で存在しない（大部分のｃＤＮＡについての）場合、そのイントロンは、別の供給源から得られ得る。隣接配列およびＢ７ＲＰ−２遺伝子に対するイントロンの位置は、そのイントロンが有効に転写されなければならないので、一般的に重要である。従って、Ｂ７ＲＰ−２ ｃＤＮＡ分子が転写される場合、そのイントロンの好ましい位置は、転写開始部位の３’側でありかつポリＡ転写終結配列の５’側である。好ましくは、そのイントロンは、コード配列を中断しないように、そのｃＤＮＡの一方の側または他方の側（すなわち、５’側または３’側）に位置する。任意の供給源（ウイルス生物、原核生物および真核生物（植物または動物）を含む）由来の任意のイントロンが本発明を実行するために使用され得るが、但し、このイントロンは、挿入される宿主細胞と適合性である。合成イントロンもまた、本明細書中に含まれる。必要に応じて、１つより多くのイントロンが、ベクター内で使用され得る。
【０１１９】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には、宿主生物によって認識され、そしてＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結された、プロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する、その構造遺伝子の開始コドンに対して上流（すなわち、５’側）に（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ内に）位置する非転写配列である。プロモーターは、従来、２つのクラス（誘導プロモーターおよび構成的プロモーター）のうちの１つにグループ分けされる。誘導プロモーターは、培養条件におけるいくらかの変化（例えば、栄養の存在または非存在、あるいは温度の変化）に応答して、その誘導プロモーターの制御下にあるＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始する。他方、構成的プロモーターは、継続的な遺伝子産物産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対する制御がほとんど存在しないかまたは全く存在しない。多数のプロモーター（種々の潜在的な宿主細胞によって認識される）が、周知である。適切なプロモーターは、供給源のＤＮＡからプロモーターを制限酵素消化によって取り出し、そして所望のプロモーター配列をベクター中に挿入することによって、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブなＢ７ＲＰ−２プロモーター配列は、Ｂ７ＲＰ−２核酸分子の増幅および／または発現に指向させるために使用され得る。しかし、ネイティブなプロモーターと比較して多量の発現タンパク質の転写および収量が可能である場合、および使用のために選択された宿主細胞系と適合性である場合、異種プロモーターが好ましい。
【０１２０】
原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ系およびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター）が挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた、適切である。このプロモーター配列は、公開されており、その結果、当業者は、任意の有用な制限部位を供給するのに必要とされるリンカーまたはアダプターを使用して、所望のＤＮＡ配列にそれらのプロモーター配列を連結し得る。
【０１２１】
酵母宿主との使用に適切なプロモーターもまた、当該分野において周知である。酵母エンハンサーが、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、限定しないが、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得られるプロモーターが挙げられる。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
【０１２２】
Ｂ７ＲＰ−２遺伝子発現を制御する際に興味深くあり得るさらなるプロモーターとしては、限定しないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８：１４４４−１４４５）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：３７２７−３７３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５）。組織特異性を示しかつトランスジェニック動物において利用されている、以下の動物転写制御領域もまた興味深い：膵臓腺房細胞において活性な、エラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性な、インシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−２２）；リンパ球において活性な、免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ球細胞、および肥満細胞において活性な、マウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５）；肝臓において活性な、アルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）；肝臓において活性な、α−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）；肝臓において活性な、α１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）；骨髄性細胞において活性な、β−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳の稀突起神経膠細胞において活性な、ミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２）；骨格筋において活性な、ミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６）；ならびに視床��部において活性な、性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８）。
【０１２３】
エンハンサー配列は、高等真核生物による本発明のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加するように、ベクター中に挿入され得る。エンハンサーは、転写を増加させるようにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐの長さのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、相対的な方向および位置に依存しない。これらは、転写単位に対して５’側および３’側に見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が、公知である（例えば、グロビンエンハンサー配列、エラスターゼエンハンサー配列、アルブミンエンハンサー配列、α−フェトプロテインエンハンサー配列およびインシュリンエンハンサー配列）。しかし、代表的には、ウイルス由来のエンハンサーが、使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、Ｂ７ＲＰ−２核酸分子に対して５’側または３’側の位置でベクター中にスプライシングされ得るが、代表的には、プロモーターから５’側の部位に位置する。
【０１２４】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような出発ベクターから構築され得る。そのようなベクターは、望ましい隣接配列すべてを含んでも良いし、含まなくても良い。本明細書中に記載される望ましい隣接配列のうちの１つ以上が未だベクター中に存在しない場合、それらの隣接配列は、個々に得られ得、そのベクター中に連結され得る。その隣接配列の各々を得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１２５】
本発明を実行するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞と適合性のベクター、昆虫宿主細胞と適合性のベクターおよび哺乳動物宿主細胞と適合性のベクターである。このようなベクターとしては、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９０／１４３６３）ならびにｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が挙げられる。
【０１２６】
さらなる適切なベクターとしては、限定しないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルスが挙げられるが、これらのベクター系は、選択された宿主細胞と適合性でなければならないことが理解される。このようなベクターとしては、限定しないが、プラスミド（例えば、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数ＣｏｌＥ１−ベースのファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯＴＭ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））、ならびに哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはウイルスベクター（例えば、バキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ））が挙げられる。
【０１２７】
ベクターが構築され、そしてＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードする核酸分子がそのベクターの適切な部位に挿入された後に、完全なベクターが、増幅および／またはポリペプチド発現に適切な宿主細胞中に挿入され得る。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドついての発現ベクターを、選択された宿主細胞へ形質転換することは、以下を含む周知の方法によって達成され得る：例えば、トランスフェクション法、感染法、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、またはＤＥＡＥ−デキストラン法あるいは他の公知の技術。選択された方法は、部分的に、使用される宿主細胞の型の相関的要素である。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、そしてこれらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に示されている。
【０１２８】
宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）であっても、真核生物宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であってもよい。その宿主細胞は、適切な条件下で培養された場合、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを合成し、このＢ７ＲＰ−２ポリペプチドは、その後、（その宿主細胞がこのＢ７ＲＰ−２ポリペプチドを培地に分泌する場合に）培養培地から収集され得るか、または（このＢ７ＲＰ−２ポリペプチドが分泌されない場合には）このＢ７ＲＰ−２ポリペプチドを産生する宿主細胞から直接収集され得る。適切な宿主細胞の選択は、種々の要因（例えば、所望の発現レベル、活性に望ましいかもしくは必要とされるポリペプチド修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）、および生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さ）に依存する。
【０１２９】
多くの適切な宿主細胞が、当該分野において公知であり、多くが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能である。例としては、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂら、１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ．Ａ．９７：４２１６−４２２０）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞または２９３Ｔ細胞、あるいは３Ｔ３細胞が挙げられるが、これらに限定されない。適切な哺乳動物宿主細胞の選択、ならびに形質転換のための方法、培養のための方法、増幅のための方法、スクリーニングのための方法、産物生成のための方法、および精製のための方法が、当該分野において公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１細胞株およびＣＯＳ−７細胞株、ならびにＣＶ−１細胞株である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、霊長動物細胞株および齧歯類動物細胞株（形質転換細胞株を含む）が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物由来の細胞株、ならびに初代外植片もまた、適切である。候補細胞は、選択遺伝子を遺伝子型的に欠き得るか、または優性作用性選択遺伝子を含み得る。他の適切な哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓマウス、Ｂａｌｂ−ｃマウスまたはＮＩＨマウスから誘導された３Ｔ３株、ＢＨＫハムスター細胞株またはＨａＫハムスター細胞株。これらの細胞株の各々は、タンパク質発現の分野の当業者によって知られており、そして入手可能である。
【０１３０】
同様に、細菌細胞が、本発明に適切な宿主細胞として有用である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の菌株（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）は、生物工学の分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの種々の菌株もまた、本方法において使用され得る。
【０１３１】
当業者に公知の酵母細胞の多くの菌株もまた、本発明のポリペプチドの発現のため宿主細胞として利用可能である。好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１３２】
さらに、所望される場合、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら、１９９３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−８１７；Ｌｕｃｋｌｏｗ、１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４−５７２；およびＬｕｃｋｌｏｗら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−４５７９に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１３３】
グリコシル化Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを発現するために、トランスジェニック動物もまた使用され得る。例えば、トランスジェニック乳汁産生動物（例えば、ウシまたはヤギ）が使用され得、本発明のグルコシル化ポリペプチドが動物の乳汁中にて得られ得る。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを産生するために、植物もまた使用され得る。しかし、一般的に、植物において生じるグリコシル化は、哺乳動物細胞において生じるグリコシル化とは異なり、ヒト治療用途に適切ではないグリコシル化産物を生じ得る。
【０１３４】
（ポリペプチド産生）
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に周知の標準的な培地を使用して培養され得る。その培地は、通常、その細胞の増殖および生存に必要な全ての栄養分を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するための適切な培地としては、例えば、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）が挙げられる。真核生物細胞を培養するための適切な培地としては、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ １６４０（ＲＰＭＩ １６４０）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）および／またはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）が挙げられ、これらの全ては、培養される特定の細胞株に必要な血清および／または増殖因子を補充され得る。昆虫細胞培養物についての適切な培地は、必要に応じて、イーストレート（ｙｅａｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解産物、および／またはウシ胎仔血清を補充した、グレース培地である。
【０１３５】
代表的に、トランスフェクトされた細胞または形質転換された細胞の選択的な増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、培地に補充物質として加えられる。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されるプラスミドに存在する選択マーカーエレメントによって、検出可能である。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養培地に添加される化合物は、カナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリン、およびネオマイシンが挙げられる。
【０１３６】
宿主細胞によって産生されるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの量は、当該分野において公知の標準的な方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限定しないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降、および／または活性アッセイ（例えば、ＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイ）が挙げられる。
【０１３７】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計される場合、ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地中で見出され得る。しかし、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、細胞質および／または核（真核宿主細胞について）に、あるいは、細胞質ゾル（グラム細菌宿主細胞について）に存在する。
【０１３８】
宿主細胞の細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）に位置するかあるいは細胞質ゾル（細菌宿主細胞について）に位置するＢ７ＲＰ−２ポリペプチドについて、細胞内物質（グラム陰性細菌について封入体を含む）が、当業者に公知の任意の標準的技術を使用して宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿主細胞は、フレンチプレス、ホモジナイゼーション、および／または超音波処理、ならびにそれらの後の遠心分離によって、ペリプラズム／細胞質の中身を放出するように溶解され得る。
【０１３９】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドが細胞質ゾル内に封入体を形成した場合、この封入体は、しばしば、内側および／または外側の細胞膜に結合され得、従って、主に、遠心分離後にペレット材料において見出される。次いで、ペレット材料は、ｐＨ極限値で処理され得るか、あるいはジチオスレイトールのような還元剤の存在下でアルカリ性のｐＨにて、またはトリスカルボキシエチルホスフィンの存在下で酸性のｐＨにて、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体のようなカオトロピック剤で処理されて、封入体が放出され得、封入体が分断され得、そして封入体が溶解され得る。次いで、可溶化Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドが、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを単離することが所望される場合、単離は、本明細書中およびＭａｒｓｔｏｎら、１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−２７５に記載される方法のような標準的な方法を使用して達成され得る。
【０１４０】
いくつかの場合、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドは、単離の際に生物学的に活性でなくても良い。ポリペプチドをその三次構造に「再折り畳み」または変換し、そしてジスルフィド結合を生成するための種々の方法を使用して、生物学的活性を回複し得る。このような方法は、溶解されたポリペプチドを、通常は、７より上のｐＨおよび特定の濃度のカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の存在に曝露する工程を包含する。カオトロープの選択は、封入体溶解に使用される選択肢に非常に類似するが、通常、カオトロープはより低い濃度で使用され、溶解に使用されるカオトロープと必ずしも同一ではない。多くの場合、再折り畳み／酸化溶液はまた、還元剤、または特定の比の還元剤およびその酸化形態を含んで、特定の酸化還元電位を生じ、タンパク質のシステイン架橋の形成を生じるジスルフィドシャフリングを可能にする。通常使用される酸化還元対のいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２−２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。多くの場合において、共溶媒が、再折り畳みの効率を増加するのに使用され得るかまたは必要とされ得、この目的のために使用されるより一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【０１４１】
封入体がＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現において有意な程度まで形成されない場合、ポリペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後の上清中に見出される。ポリペプチドは、さらに、本明細書中に記載されるような方法を使用して上清から単離され得る。
【０１４２】
溶液からのＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成され得る。ポリペプチドが、ヘキサヒスチジン（Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド／ヘキサＨｉｓ）のようなタグまたは他の小さなペプチド（例えば、ＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））をそのカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかにおいて含むように合成された場合、カラムマトリクスがタグに対して高い親和性を有するアフィニティーカラムに溶液を通すことによって一工程で精製され得る。
【０１４３】
例えば、ポリヒスチジンは、ニッケルに対して大きな親和性および特異性を有して結合する。従って、ニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド／ポリＨｉｓの精製のために使用され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ § １０．１１．８（Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９３））を参照のこと。
【０１４４】
さらに、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドは、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを特異的に認識し得、そして結合し得るモノクローナル抗体の使用によって精製され得る。
【０１４５】
精製のための他の適切な手段はとしては、限定しないが、アフィニティークロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｅｖｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ＨＰＬＣ、電気泳動（ネイティブゲル電気泳動を含む）、その後のゲル溶出、および分取用等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」ｍａｃｈｉｎｅ／ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）が挙げられる。いくつかの場合において、２つ以上の精製技術を、増加した純度を達成するために組み合わせ得る。
【０１４６】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドはまた、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３２；ならびに、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．１９８４）に記載されるような当該分野で公知の技術を使用する、化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）によって調製され得る。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを有するかまたは有さずに合成され得る。化学合成されたＢ７ＲＰ−２ポリペプチドは、これらの参考文献に記載される方法を使用して酸化されて、ジスルフィド結合を形成し得る。化学的に合成されたＢ７ＲＰ−２ポリペプチドは、組換え的に産生されるかまたは天然の供給源から精製された対応するＢ７ＲＰ−２ポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有することが期待され、従って、組換えまたは天然のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドと相互交換可能に使用され得る。
【０１４７】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを得る別の手段は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドが天然に見出される供給源の組織および／または流体のような生物学的サンプルからの精製による。このような精製は、本明細書中に記載されるようなタンパク質精製のための方法を使用して行われ得る。精製の間、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの存在が、例えば、組換え的に産生されたＢ７ＲＰ−２ポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対して調製された抗体を使用してモニターされ得る。
【０１４８】
核酸およびポリペプチドを産生するための多くのさらなる方法は、当該分野において公知であり、この方法は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドに対する特異性を有するポリペプチドを産生するために使用され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２２９７−３０３を参照のこと。これは、ｍＲＮＡとそのコードされるペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載する。Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：２６８−７３もまた参照のこと。さらに、米国特許第５，８２４，４６９号は、特定の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドを得るための方法を記載する。この手順は、オリゴヌクレオチドの異種性プールを生成する工程を包含し、各々、５’ランダム化配列、中央部の予備選択配列、および３’ランダム化配列を有する。得られる異種性プールは、所望の生物学的機能を示さない細胞の集団に導入される。次いで、細胞の亜集団を、予め決定された生物学的機能を示すものについてスクリーニングする。その亜集団から、所望の生物学的機能を発揮し得るオリゴヌクレオチドが単離される。
【０１４９】
米国特許第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２３，３２３号；および同第５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチドを産生するためのプロセスを記載する。これは、確率論的な遺伝子またはそのフラグメントを産生し、次いで、その確率論的な遺伝子によってコードされる１以上のタンパク質を産生する宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって達成される。次いで、この宿主は、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産生する、これらのクローンを同定するためにスクリーニングされる。
【０１５０】
ペプチドまたはポリペプチドの産生するための別の方法は、Ａｔｈｅｒｓｙｓ，Ｉｎｃ．によって出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／２００９４（ＷＯ９９／１５６５０に記載される。「Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）として知られるように、このプロセスは、インサイチュ組換え方法によって、内因性遺伝子の発現または遺伝子の過剰発現の活性化を含む。例えば、内因性遺伝子の発現は、非相同組換えまたは非正統的（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ）組換えによって、遺伝子の発現を活性化し得る標的細胞中に、調節配列を組み込むことによって、活性化または増加される。この標的ＤＮＡは、まず、照射に供せられ、そして遺伝子プロモーターが挿入される。このプロモーターは、遺伝子の前方に最終的に開始点（ｂｒｅａｋ）を配置し、遺伝子の転写を開始する。これは、所望のペプチドまたはポリペプチドの発現を引き起こす。
【０１５１】
これらの方法はまた、包括的なＢ７ＲＰ−２ポリペプチド発現ライブラリーを作製するために使用され得、これは、続いて、種々のアッセイ（例えば、生化学的アッセイ、細胞アッセイおよび生物全体のアッセイ（例えば、植物、マウスなど））において、ハイスループット表現型スクリーニングのために使用され得ることが理解される。
【０１５２】
（合成）
本明細書中に記載される核酸およびポリペプチド分子が、組換え手段および他の手段によって生成され得ることが、当業者により理解される。
【０１５３】
（選択的結合因子）
用語「選択的結合因子」とは、１つ以上のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドに対する特異性を有する分子をいう。適切な選択的結合因子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに低分子。適切な選択的結合因子は、当該分野で公知の方法を用いて調製され得る。本発明の例示的なＢ７ＲＰ−２ポリペプチド選択的結合因子は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの特定の部分に結合し得、これによってＢ７ＲＰ−２ポリペプチドレセプターへのこのポリペプチドの結合を阻害する。
【０１５４】
選択的結合因子（例えば、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドに結合する抗体および抗体フラグメント）は、本発明の範囲内にある。抗体は、一特異性ポリクローナル抗体を含むポリクローナル抗体、モノクローナル（ＭＡｂｓ）抗体；組換え抗体；キメラ抗体；ヒト化抗体（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植片化抗体）；ヒト抗体；単鎖抗体；および／または二重特異性抗体；ならびにそれらのフラグメント；改変体；または誘導体であり得る。抗体フラグメントとしては、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド上のエピトープに結合する抗体の一部分が挙げられる。このようなフラグメントの例としては、全長の抗体の酵素的切断によって生じるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組換えプラスミドの発現）によって生じるものが挙げられる。
【０１５５】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、一般的に、動物（例えば、ウサギまたはマウス）において、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドおよびアジュバントの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって産生される。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドが、免疫させるためにその種において免疫原性であるキャリアタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビター）と結合するのに有用であり得る。また、凝集剤（例えば、ミョウバン）は、免疫応答を増強するために用いられる。免疫後、これらの動物は、飼育され、そしてこの血清を抗Ｂ７ＲＰ−２抗体力価についてアッセイする。
【０１５６】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養中の継代細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の方法を用いて産生される。モノクローナル抗体を調製するための適切な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒら，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７）が挙げられる。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本発明によって提供される。
【０１５７】
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤としての使用のために改変され得る。１つの実施形態は、特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体において、重（Ｈ）鎖および／または軽（Ｌ）鎖の一部分が対応する配列と同一であるか、または相同であるが、その鎖の残部は、別の種由来の抗体または別の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体において、対応する配列と同一であるかまたは相同である、「キメラ」抗体である。このような抗体のフラグメントもまた、これらのフラグメントが所望の生物学的活性を示す限り、含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５を参照のこと。
【０１５８】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。米国特許第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６２号を参照のこと。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源由来の抗体に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、当該分野で記載された方法（Ｊｏｎｅｓら，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６）を用いて、ヒト抗体の対応する領域についてのげっ歯類相補性決定領域の少なくとも一部分を置換することによって実施され得る。
【０１５９】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドに結合するヒト抗体もまた、本発明に包含される。内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を用いて、このような抗体は、必要に応じてキャリアと結合体化される、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド抗原（すなわち、少なくとも６連続アミノ酸を有する）での免疫によって産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：２５５１−５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，１９９３，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３を参照のこと。１つの方法において、このようなトランスジェニック動物は、この動物における重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子座を無能力化し、そしてそのゲノム中に、ヒト重鎖および軽鎖のタンパク質をコードする遺伝子座を挿入することによって生成される。次いで、部分的に改変された動物（すなわち、改変の完全未満の補完を有する）を交雑育種して、所望の免疫系の改変の全て有する動物を得る。免疫原を投与された場合、これらのトランスジェニック動物は、これらの抗原に対して免疫特異性である可変領域を含む、ヒト（例えば、マウスではなく）アミノ酸配列を有する抗体を産生する。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、ならびに欧州特許５４６０７３Ｂ１および同５４６０７３Ａ１に記載される。ヒト抗体はまた、本明細書中に記載されるように、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によってか、またはハイブリドーマ細胞における発現によって産生され得る。
【０１６０】
代替の実施形態において、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーから産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１）。これらは、糸状バクテイオファージの表面上の抗体レパートリーの提示を介した模倣免疫選択、およびその後の目的の抗原に対するそれらの結合によってファージの選択をプロセスする。１つのこのような技術は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４に記載されており、これは、このようなアプローチを用いた、ＭＰＬ−レセプターおよびｍｓｋ−レセプターに対する高親和性かつ機能的アゴニスト抗体の単離を記載している。
【０１６１】
キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、およびヒト化抗体は、組換え方法によって代表的に産生される。抗体をコードする核酸は、宿主細胞中に導入され、そして本明細書に記載される材料および手順を用いて発現される。好ましい実施形態において、抗体は、哺乳動物の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において産生される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、本明細書において記載されるように、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によってかまたはハイブリドーマ細胞における発現によって産生され得る。
【０１６２】
本発明の抗Ｂ７ＲＰ−２抗体は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの検出および定量のための任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）））において用いられ得る。これらの抗体は、用いられるアッセイ方法に適切な親和性を有するＢ７ＲＰ−２ポリペプチドに結合する。
【０１６３】
診断適用について、特定の実施形態において、抗Ｂ７ＲＰ−２抗体は、検出可能な部分で標識され得る。検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを産生し得るもののいずれかであり得る。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、または６７Ｇａ）；蛍光化合物もしくは化学発光化合物（例えば、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン）；または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂａｙｅｒら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８４：１３８−６３））であり得る。
【０１６４】
競合的結合アッセイは、限られた量の抗Ｂ７ＲＰ−２抗体と結合するために、試験サンプルの分析物（Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド）と競合する標識された標準物（例えば、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、またはその免疫学的反応性部分）の能力に依存する。試験サンプル中のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの量は、抗体に結合する標準的な量に反比例する。結合する標準物の量を決定するのを容易にするため、これらの抗体は、代表的に、競合の前後に不溶化され、その結果、これらの抗体に結合された標準物および分析物は、未結合の標準物および分析物から、都合よく分離され得る。
【０１６５】
サンドイッチアッセイは、代表的に、検出および／または定量されるタンパク質の２つの抗体（各々、異なる免疫原性部分、またはエピトープに結合し得る）の使用を含む。サンドイッチアッセイにおいて、試験サンプルの分析物は、代表的に、固体支持体上に固定化された第１抗体に結合し、その後、第２の抗体がこの分析物に結合し、したがって、不溶性の三部複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。第２の抗体は、それ自体に検出可能な部分を標識してもよいし（直接的サンドイッチアッセイ）、検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの型は、固相酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合、検出可能な部分は、酵素である。
【０１６６】
選択的結合因子（抗Ｂ７ＲＰ−２抗体を含む）はまた、インビボでのイメージングに有用である。検出可能な部分で標識された抗体は、動物に、好ましくは、血流中に投与され得、そして宿主における標識抗体の存在および位置が、アッセイされる。抗体は、核磁気共鳴、放射線学、または当該分野で公知の他の検出手段のいずれかによって、動物において検出可能な任意の部分で標識され得る。
【０１６７】
本発明の選択的結合因子（抗体を含む）は、治療剤として用いられ得る。これらの治療剤は、一般に、これらのいずれかが、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を、それぞれ、増強するかまたは減少させるという点で、アゴニストまたはアンタゴニストである。１つの実施形態において、本発明のアンタゴニスト抗体は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドに特異的に結合し得、そして、インビボまたはインビトロにおいてＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの機能的活性を阻害または排除し得る、抗体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、選択的結合因子（例えば、アンタゴニスト抗体）は、少なくとも約５０％、そして好ましくは、少なくとも約８０％、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの機能的活性を阻害する。別の実施形態において、選択的結合因子は、Ｂ７ＲＰ−２結合パートナー（リガンドまたはレセプター）と相互作用し得、これによって、インビボまたはインビトロにおいてＢ７ＲＰ−２ポリペプチド活性を阻害または排除する抗Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド抗体であり得る。選択的結合因子（アゴニストおよびアンタゴニスト抗Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド抗体を含む）は、当該分野で周知のスクリーニングアッセイによって同定される。
【０１６８】
本発明はまた、Ｂ７ＲＰ−２選択的結合因子（例えば、抗体）および生物学的サンプルにおいてＢ７ＲＰ−２ポリペプチドのレベルを検出するのに有用な他の試薬を備えるキットに関する。このような試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、ポジティブおよびネガティブコントロールサンプル、ならびに検出試薬を含み得る。
【０１６９】
（マイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、本発明に従って利用され得ることが理解される。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（例えば、ガラス）上に配置される核酸の小型の高密度アレイである。アレイ内の各セルまたはエレメントは、相補的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）についてのハイブリダイゼーションのための標的として働く単一核酸種の多数のコピーを有する。ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いた発現プロファイリングにおいて、ｍＲＮＡはまず、細胞または組織サンプルから抽出され、次いで、蛍光標識されたｃＤＮＡに酵素的に変換される。この物質は、このマイクロアレイにハイブリダイズされ、そして未結合のｃＤＮＡが洗浄によって除去される。次いで、このアレイ上に示された個々の遺伝子の発現は、各標的核酸分子に特異的に結合する標識されたｃＤＮＡの量を定量化することによって可視化される。このように、幾千もの遺伝子の発現が、生物学的材料の単一サンプルから、ハイスループットかつ並列様式で定量化され得る。
【０１７０】
このハイスループット発現プロファイリングは、以下を含むが、これらに限定されない本発明のＢ７ＲＰ−２分子に関して、広い範囲の適用を有する；治療剤のための標的としてのＢ７ＲＰ−２疾患関連遺伝子の同定および確証；関連したＢ７ＲＰ−２分子およびそのインヒビターの分子毒物学；治験のための代理マーカーの集団および世代の階層化；ならびに、ハイスループットスクリーニングにおける選択的化合物の同定に役立つことによって向上する関連したＢ７ＲＰ−２ポリペプチド低分子薬物開発。
【０１７１】
（化学的誘導体）
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの化学的に改変された誘導体は、本明細書中に記載された開示を考慮して、当業者によって調製され得る。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体は、このポリペプチドに天然に結合した分子の型または位置のいずれかにおいて異なる様式で改変される。誘導体は、１以上の天然で結合した化学的な基の欠失によって形成される分子を含み得る。配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６または他のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、１以上のポリマーの共有結合によって改変され得る。例えば、選択されたポリマーは、代表的に水溶性であり、その結果、それが結合するタンパク質は、水性環境（例えば、生理学的な環境）下で沈殿しない。ポリマーの混合物が、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終産物の調製物の治療的用途のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。
【０１７２】
各々のポリマーは、任意の分子量であり、そして分枝または非分枝であり得る。各々のポリマーは、代表的に、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの間の平均分子量を有する（用語「約（およそ）」は、水溶性ポリマーの調製の際に、いくつかの分子が示された分子量より多く、いくぶんかは少ない分子量を有することを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａと約５０ｋＤａの間、より好ましくは、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａとの間、そして最も好ましくは、約２０ｋＤａと約３５ｋＤａとの間である。
【０１７３】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ−結合型またはＯ−結合型炭水化物、糖、ホスフェート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（これは、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）、アルコキシ−、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含むタンパク質を誘導体化するために使用されたＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、約６ｋＤの低分子量デキストラン）、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびポリビニルアルコール。共有結合したＢ７ＲＰ−２ポリペプチドマルチマーを調製するために使用され得る、二官能性架橋分子もまた、本発明に包括される。
【０１７４】
一般に、化学的誘導体化は、タンパク質と活性化ポリマー分子とを反応させるために用いられる任意の適切な条件下で実施され得る。ポリペプチドの化学的誘導体を調製するための方法は、一般に、（ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドが、１つ以上のポリマー分子との結合を生じる条件下で、ポリペプチドと活性化ポリマー分子（例えば、反応性エステルまたはポリマー分子のアルデヒド誘導体）とを反応させる工程、および（ｂ）反応産物を得る工程、を包含する。最適反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー分子：タンパク質の比がより大きくなればなるほど、ポリマー分子との結合の割合がより多くなる。１つの実施形態において、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体は、アミノ末端に単一のポリマー分子の部分を有し得る。例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと。
【０１７５】
ポリペプチドのペグ化は、特に、当該分野で公知のペグ化反応のいずれかを使用することによって、特に実施され得る。このような反応は、例えば、以下の参考文献に記載される：Ｆｒａｎｃｉｓら，１９９２，Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０；欧州特許第０１５４３１６号および欧州特許第０４０１３８４号；ならびに米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ペグ化は、本明細書において記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（または、アナログ反応水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。アシル化反応について、選択されたポリマーは、単一反応性エステル基を有するべきである。還元的アルキル化について、選択されたポリマーは、単一反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（これは、水溶性である）であるか、またはモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【０１７６】
別の実施形態において、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドは、ビオチンと化学的に結合され得る。次いで、ビオチン／Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド分子は、アビジンへの結合が可能となり、四価のアビジン／ビオチン／Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド分子を生じる。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合し得、そして得られた結合体は、抗ＤＮＰまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭとともに沈澱して１０の結合価の十量体の結合体を形成し得る。
【０１７７】
一般に、本発明のＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体の投与によって緩和され得るかまたは調節され得る状態は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドについて本明細書において記載される状態を含む。しかし、本明細書において開示されるＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体は、誘導体化されていない分子と比較した場合、さらなる活性、増強した生物学的活性もしくは減少した生物学的活性、または他の特性（例えば、増加した半減期もしくは減少した半減期）を有し得る。
【０１７８】
（遺伝的に操作された非ヒト動物）
非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、または他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜）は、本発明の範囲内にさらに含まれ、ここで、ネイティブＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードする遺伝子は、破壊されており（すなわち「ノックアウト」）、その結果、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現レベルは、有意に減少するかまたは完全に消失する。このような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されるような技術および方法を用いて調製され得る。
【０１７９】
本発明はさらに、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、または他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜）を含み、ここで、この動物についてのＢ７ＲＰ−２遺伝子のネイティブな形態または異種Ｂ７ＲＰ−２遺伝子のいずれかは、この動物によって過剰に発現され、これによって、「トランスジェニック」動物を作製する。このようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２８１２２に記載されるような、周知の方法を用いて調製され得る。
【０１８０】
本発明はさらに、非哺乳動物を含み、ここで、本発明の１つ以上のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドについてのプロモーターは、１つ以上のネイティブＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現のレベルを変更するために、（例えば、相同組換え方法を用いることによって）活性化させるかまたは不活性化させるかのいずれかである。
【０１８１】
これらの非ヒト動物は、薬物候補スクリーニングに使用され得る。このようなスクリーニングにおいて、動物に対する薬物候補の影響が、測定され得る。例えば、薬物候補は、Ｂ７ＲＰ−２遺伝子の発現を減少または増加し得る。特定の実施形態において、産生されるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの量は、動物をその薬物候補に暴露した後に測定され得る。さらに、特定の実施形態において、動物に対する薬物候補の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、疾患または病理学的状態を生じ得るか、あるいは疾患または病理学的状態に関連し得る。このような場合において、遺伝子の発現を減少させる薬物候補の能力、または病理学的状態を予防もしくは阻害する薬物候補の能力を試験し得る。他の例としては、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の産生が、疾患または病理学的状態を生じ得るか、あるいは疾患または病理学的状態と関連し得る。このような場合において、このような代謝産物の産生を減少する薬物候補の能力、または病理学的状態を予防もしくは阻害する薬物候補の能力を試験し得る。
【０１８２】
（Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド活性の他の調節因子についてのアッセイ）
いくつかの状況において、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの活性の調節因子（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）である分子を同定することが所望され得る。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを調節する天然分子または合成分子は、本明細書中に記載されるもののような１つ以上のスクリーニングアッセイを使用して同定され得る。このような分子は、注入によるエキソビボ様式またはインビボ様式でか、あるいは経口送達、移植デバイスなどのいずれかで投与され得る。
【０１８３】
「試験分子」は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの活性を調節（すなわち、増加または減少）する能力についての評価の下にある分子をいう。最も一般的には、試験分子は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドと直接相互作用する。しかし、試験分子はまたＢ７ＲＰ−２ポリペプチド活性を、例えば、Ｂ７ＲＰ−２遺伝子発現に影響を与えることによってか、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）に結合することによって、間接的に調節し得ることも意図される。１つの実施形態において、試験分子は、少なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは約１０−８Ｍ、より好ましくは約１０−９Ｍ、そしてさらにより好ましくは約１０−１０Ｍの親和性定数でＢ７ＲＰ−２ポリペプチドに結合する。
【０１８４】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本発明によって包含される。特定の実施形態において、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドは、試験分子とＢ７ＲＰ−２ポリペプチドとの相互作用が可能な条件下で、試験分子と共にインキュベートされ、そして相互作用の程度が測定される。試験分子は、実質的に精製された形態または粗製の混合物中でスクリーニングされ得る。
【０１８５】
特定の実施形態において、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量の分子であり得、これは、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドと相互作用して、その活性を調節する。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現を調節する分子は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードする核酸と相補的であるか、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現を指向もしくは制御する核酸配列に対して相補的である核酸分子、および発現のアンチセンス調節因子として作用する核酸分子を含む。
【０１８６】
一旦、１つの試験分子がＢ７ＲＰ−２ポリペプチドと相互作用するとして同定されると、この分子は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド活性を増加または減少させる能力についてさらに評価され得る。試験分子とＢ７ＲＰ−２ポリペプチドとの相互作用の測定は、いくつかの様式で実施され得、これには、細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、液相アッセイ、および免疫アッセイが挙げられる。一般に、試験分子は、特定の期間、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドと共にインキュベートされ、そしてＢ７ＲＰ−２ポリペプチド活性が、生物学的活性を測定するために１以上のアッセイによって決定される。
【０１８７】
試験分子とＢ７ＲＰ−２ポリペプチドとの相互作用はまた、免疫アッセイにおいて、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用して直接的にアッセイされ得る。あるいは、本明細書中に記載されるようなエピトープタグを含むＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの改変形態は、溶液および免疫アッセイ中で使用され得る。
【０１８８】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドが、結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）との相互作用を介して、生物学的活性を示す場合において、種々のインビトロアッセイが、対応する結合パートナー（例えば、選択的結合因子、レセプター、またはリガンド）へのＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの結合を測定するために使用され得る。これらのアッセイは、結合パートナーに対するＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの結合の速度および／または程度を増加または減少させるその能力について、試験分子をスクリーニングするために使用され得る。１つのアッセイにおいて、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェル中で固定される。次いで、放射標識したＢ７ＲＰ−２ポリペプチド結合パートナー（例えば、ヨウ素化したＢ７ＲＰ−２ポリペプチド結合パートナー）および試験分子は、このウェルに、１つずつ（いずれかの順序で）または同時にのいずれかで添加され得る。インキュベーション後に、このウェルを洗浄し、そしてシンチレーション計数器を使用して、放射活性を計数し、結合パートナーがＢ７ＲＰ−２ポリペプチドに結合する程度を決定する。代表的に、分子は、ある濃度範囲にわたって試験され、そして試験アッセイの１以上のエレメントを欠く一連のコントロールウェルは、結果の評価の正確性のために使用され得る。この方法の代わりは、タンパク質の「位置」を逆にする工程を逆にする工程（すなわち、マイクロタイタープレートウェルに対してＢ７ＲＰ−２ポリペプチド結合パートナーを固定し、試験分子および放射標識したＢ７ＲＰ−２ポリペプチドと共にインキュベートし、そしてＢ７ＲＰ−２ポリペプチド結合の程度を決定する工程）を包含する。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８章（Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９５）を参照のこと。
【０１８９】
放射性標識に対する代替として、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドまたはその結合パートナーは、ビオチンと結合体化され得、そしてビオチン化されたタンパク質の存在が、次いで、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ））（これらは、比色測定的に検出される）に結合したストレプトアビジンを使用して検出され得るか、またはストレプトアビジンの蛍光タグ化によって検出され得る。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド結合パートナーに対する抗体（これは、ビオチンに結合されている）もまた使用されそして、ＡＰまたはＨＲＰに連結した酵素連結ストレプトアビジンとのこの複合体のインキュベーションの後に検出され得る。
【０１９０】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド結合パートナーはまた、アガロースビーズ、アクリルビーズ、または他の型のこのような不活性な固相基材への付着によって固定され得る。基材−タンパク質複合体は、相補タンパク質および試験化合物を含む溶液内に配置され得る。インキュベーション後、これらのビーズは、遠心分離によって沈澱され得、そしてＢ７ＲＰ−２ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の量が、本明細書中に記載の方法を使用して評価され得る。あるいは、基材−タンパク質複合体は、カラム内に固定され得、試験分子および相補タンパク質はカラムを通される。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドとその結合パートナーとの間の複合体の形成が、次いで、本明細書中に記載の技術（例えば、放射性標識または抗体結合）のいずれかを使用して評価され得る。
【０１９１】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド結合タンパク質とＢ７ＲＰ−２ポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる試験分子を同定するために有用な別のインビトロアッセイは、表面プラズモン共鳴検出器システム（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））である。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、製造業者に指示されるように利用され得る。このアッセイは、本質的に、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド結合パートナーのいずれかの、デキストランコーティングセンサーチップ（これは、検出器中に配置される）への共有結合を含む。次いで、この試験化合物および他の相補タンパク質が、同時にかまたは連続的にかのいずれかで、センサーチップを備えるチャンバーに注入され得る。結合する相補タンパク質の量は、センサーチップのデキストランコート側に物理的に結合する分子の質量の変化に基づいて評価され得、この分子の質量の変化は、検出器システムによって測定され得る。
【０１９２】
いくつかの場合において、２つ以上の試験化合物を一緒に、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドとＢ７ＲＰ−２ポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させるそれらの能力について評価することが所望され得る。これらの場合において、本明細書中に記載のアッセイは、第一の試験化合物と同時にか、またはそれに続いてのいずれかで、このようなさらなる試験化合物を添加することによって容易に改変され得る。このアッセイにおける工程の残りは、本明細書中に記載されるとおりである。
【０１９３】
インビトロアッセイ（例えば、本明細書中に記載されるもの）は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドとＢ７ＲＰ−２ポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成に対する効果について、多数の化合物をスクリーニングするために、有利に使用され得る。これらのアッセイは、ファージディスプレイ、合成ペプチド、および化学合成ライブラリーにおいて生成された化合物をスクリーニングするために、自動化され得る。
【０１９４】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドとＢ７ＲＰ−２ポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる化合物はまた、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド結合パートナーのいずれかを発現する細胞および細胞株を使用して、細胞培養物においてスクリーニングされ得る。細胞および細胞株は、任意の哺乳動物から得られ得るが、好ましくは、ヒト、または他の霊長類、イヌまたはげっ歯類の供給源由来である。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド結合パートナーを発現する細胞への、その表面での結合は、試験分子の存在下または非存在下で評価され、そして結合の程度が、例えば、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド結合パートナーに対するビオチン化抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る。細胞培養アッセイは、本明細書中に記載されるタンパク質結合アッセイにおいて、陽性であるとスコア付けされる化合物をさらに評価するために有利に使用され得る。
【０１９５】
細胞培養物はまた、薬物候補の影響をスクリーニングするために使用され得る。例えば、薬物候補は、Ｂ７ＲＰ−２遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、生成されるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ−２ポリペプチドフラグメントの量は、細胞培養物の薬物候補への曝露の後に測定され得る。特定の実施形態において、細胞培養物に対する薬物候補の実際の影響が検出され得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物に対する特定の影響を有し得る。このような場合に、遺伝子の発現を増加または減少させる薬物候補の能力、または細胞培養物に対する特定の影響を予防または阻害するその能力が試験され得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の生成が、疾患または病理的状態を生じ得るか、またはそれらと関連し得る。このような場合、細胞培養物におけるこのような代謝産物の生成を減少する薬物候補の能力が試験され得る。
【０１９６】
（内部移行タンパク質）
ｔａｔタンパク質配列（ＨＩＶ由来）が、タンパク質を細胞内に内部移行させるために、使用され得る。例えば、Ｆａｌｗｅｌｌら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６６４−６８を参照のこと。例えば、ＨＩＶ ｔａｔタンパク質の１１アミノ酸の配列（Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１４）（「タンパク質形質導入ドメイン」、またはＴＡＴ ＰＤＴを称される）は、細胞の細胞質膜および核膜を横切る送達を媒介するとして記載されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら，１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−７２；およびＮａｇａｈａｒａら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１４４９−１４５２（１９９８）を参照のこと。これらの手順において、ＦＩＴＣ構築物（ＦＩＴＣ標識されたＧ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１５）（これは、腹腔内投与後に組織を透過する）が調製され、そしてこのような構築物の細胞への結合が、蛍光活性セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析によって検出される。ｔａｔ−β−ｇａｌ融合タンパク質で処置された細胞は、β−ｇａｌ活性を示す。注入に続いて、このような構築物の発現が、多くの組織（肝臓、腎臓、肺、心臓および脳組織を含む）において検出され得る。これらの構築物は、細胞に入るためにある程度の変性を受け、そしてそれ自体、細胞内への移入に続いて、再折り畳みを必要とし得ると考えられる。
【０１９７】
従って、ｔａｔタンパク質配列は、所望のポリペプチドを細胞に内部移入させるために使用され得ることが理解される。例えば、ｔａｔタンパク質配列を使用して、Ｂ７ＲＰ−２アンタゴニスト（例えば、抗Ｂ７ＲＰ−２選択的結合因子、低分子、可溶性レセプター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、Ｂ７ＲＰ−２分子の活性を阻害するために、細胞内投与され得る。本明細書中で使用される場合、用語「Ｂ７ＲＰ−２分子」は、本明細書中に規定されるような、Ｂ７ＲＰ−２核酸分子およびＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの両方をいう。所望ならば、Ｂ７ＲＰ−２タンパク質自体はまた、これらの手順を使用して、細胞に内部投与され得る。Ｓｔｒａｕｓ、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１４６６−１４６７をまた参照のこと。
【０１９８】
（Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを使用する細胞供給源同定）
本発明の特定の実施形態に従って、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドに結合する特定の細胞型の供給源を決定し得ることは有用であり得る。例えば、適切な治療を選択する目的として疾患または病理学的状態の期限を決定することは、有用であり得る。特定の実施形態において、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードする核酸は、プローブとして使用されて、このようなプローブを用いて細胞の核酸をスクリーニングすることによって、本明細書中に記載される細胞を同定し得る。他の実施形態において、細胞におけるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの存在について試験するために、抗Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド抗体を使用し得、従って、このような細胞が本明細書中に記載される型の細胞であるかどうかを決定し得る。
【０１９９】
（Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド組成物および投与）
治療組成物は、本発明の範囲内である。このようなＢ７ＲＰ−２ポリペプチド薬学的組成物は、治療有効量のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ−２核酸分子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物中に、含み得る。薬学的組成物は、治療有効量の１以上のＢ７ＲＰ−２ポリペプチド選択的結合因子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物中に、含み得る。
【０２００】
受容可能な処方物材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。
【０２０１】
薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄性、色、等張性、におい、無菌性、安定性、解離もしくは放出の速度、吸着、または透過を改変、維持または保存するための処方物材料を含み得る。適切な処方物材料としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｓｕｌｆｉｔｅ））、緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸）、バルク剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、複合体化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、充填剤、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、着色剤、芳香剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン（Ｂ７ＲＰ−２ｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、張度増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、またはマンニトール、ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的なアジュバント。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０を参照のこと。
【０２０２】
最適な薬学的組成物は、当業者によって、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に依存して決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出を参照のこと。このような組成物は、Ｂ７ＲＰ−２分子の、物理的な状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響し得る。
【０２０３】
薬学的組成物における主要なビヒクルまたはキャリアは、自然状態では、水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、注入のための適切なビヒクルまたはキャリアは、水、生理食塩水溶液、または人工脳脊髄液であり得、非経口投与のための組成物において一般的な他の材料で補充され得る。中性の緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含み、これはさらに、ソルビトールまたは適切な置換物を含み得る。本発明の１つの実施形態において、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、任意の処方薬剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出）と混合することによって、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。さらに、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド産物は、スクロースのような適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方され得る。
【０２０４】
このＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、これらの組成物は、吸入または消化管を介する送達（例えば、経口）のために、選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当該分野の技術の範囲内にある。
【０２０５】
処方成分が、投与の部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝液は、生理学的ｐＨまたはわずかにより低いｐＨ（典型的に、約５〜約８のｐＨ範囲内）にこの組成物を維持するために使用される。
【０２０６】
非経口投与が意図される場合、本発明における使用のための治療組成物は、薬学的に受容可能なビヒクルに所望のＢ７ＲＰ−２分子を含む、発熱物質を含まない非経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注入のために特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、ここで、Ｂ７ＲＰ−２分子は、滅菌の等張溶液として処方され、適切に保存される。なお別の調製物は、所望の分子と、薬剤（例えば、注入可能なミクロスフェア、生物腐食性（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソーム）との処方物を含み得、これは、次いで蓄積注射を介して送達され得る産物の制御放出または持続放出を提供する。ヒアルロン酸もまた使用され得、そしてこれは、循環における持続時間を増進する効果を有し得る。所望の分子の導入のための他の適切な手段は、移植可能な薬物送達デバイスを含む。
【０２０７】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例えば、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドは、吸入のための乾燥粉末として処方され得る。ＣＢ７ＲＰ−２ポリペプチドまたは核酸分子の吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧剤と共に処方され得る。なお別の実施形態において、溶液は、噴霧され得る。肺投与が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２００６９にさらに記載され、これは化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する。
【０２０８】
特定の処方物が、経口投与され得ることもまた意図される。本発明の１つの実施形態において、このよう様式で投与されるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドが、固体投薬形態（例えば、錠剤およびカプセル）の調合において慣用的に使用されるキャリアを伴うか、または伴わず処方され得る。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大化され、そして前全身的分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小化される場合に、胃腸管内の時点で処方物の活性部分を放出するように設計され得る。さらなる薬剤が、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの吸収を容易にするために含まれ得る。希釈剤、芳香剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた使用され得る。
【０２０９】
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤との混合物中に、有効量のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドを含み得る。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することによって、溶液が、単位用量形態で調製され得る。適切な賦形剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：不活性な希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、あるいはリン酸カルシウム）；または結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア）；あるいは滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）。
【０２１０】
さらなるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの薬学的組成物は、当業者に明らかであり、持続送達処方物または制御送達処方物中にＢ７ＲＰ−２ポリペプチドを含む処方物を含む。種々の他の持続送達手段または制御送達手段（例えば、リポソームキャリア、生物腐食性微粒子あるいは多孔性ビーズおよび蓄積注射）を処方するための技術はまた、当業者に公知である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９（これは、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー性微粒子の制御放出を記載する）を参照のこと。
【０２１１】
徐放性調製物のさらなる例としては、成形された物品の形態（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリクスを含む。徐放性マトリクスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号）が挙げられ得る。徐放性組成物はまた、リポソームを含み得、これは、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−９２；および欧州特許第０３６６７６号、同第０８８０４６号、および同第１４３９４９号を参照のこと。
【０２１２】
インビボ投与のために使用されるＢ７ＲＰ−２の薬学的組成物は、代表的に無菌でなければならない。このことは、滅菌濾過膜を介する濾過によって達成され得る。組成物が、凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構築の前または後のいずれかで実施され得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥された形態または溶液で保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアル）内に配置される。
【０２１３】
一旦、薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水粉末もしくは凍結乾燥粉末として保存され得る。このような処方物は、すぐに使用できる形態または投与の前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥された形態）のいずれかで保存され得る。
【０２１４】
特定の実施形態において、本発明は、単一用量投与単位を生成するためのキットに関する。このキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性処方物を有する第二の容器の両方を含み得る。また、本発明の範囲内には、単一および多チャンバーの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが含まれる。
【０２１５】
治療的に使用されるＢ７ＲＰ−２の薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存する。当業者は、処置のための適切な投薬レベルが、従って、送達される分子、Ｂ７ＲＰ−２分子が使用されている指標、投与の経路、および患者のサイズ（体重、体表面、または器官の大きさ）および状態（年齢および全身の健康状態）に、部分的に依存して変化することを理解する。従って、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投薬量を力価決定し（ｔｉｔｅｒ）、投与経路を改変し得る。代表的な投薬量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲であり得る。他の実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。
【０２１６】
投薬の頻度は、使用される処方物中でのＢ７ＲＰ−２分子の薬物動態学のパラメーターに依存する。典型的に、臨床家は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで組成物を投与する。組成物は、従って、組成物は、経時的な単一用量として、２以上の用量（これは、同量の所望の分子を含んでも、含まなくてもよい）として、あるいは移植デバイスまたはカテーテルを介する連続的な注入として、投与され得る。適切な投薬量のさらなる改良は、当業者によって慣用的になされ、そしてそれらによって慣用的に実施される課題の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量−応答データの使用を介して確認され得る。
【０２１７】
薬学的組成物の投与の経路は、以下のような公知の方法と一致する：経口的に；静脈内、腹腔内、脳内（実質内の）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内の経路による注入を介する方法；徐放性系による方法；または移植デバイスによる方法。所望される場合、これらの組成物は、ボーラス注射によって投与され得るか、または注入によって連続的に投与され得るか、または移植デバイスによって投与され得る。
【０２１８】
あるいは、またはさらに、組成物は、その上に所望の分子が吸収されるかまたはカプセル化された膜、スポンジ、または他の適切な材料の移植を介して局所的に投与され得る。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織または器官に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラスまたは連続的な投与を介し得る。
【０２１９】
いくつかの場合において、エキソビボ様式において、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの薬学的組成物を使用することが所望され得る。このような例において、患者から取り出された細胞、組織または器官は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの薬学的組成物に曝露され、その後これらの細胞、組織または器官は続いて患者に移植し戻される。
【０２２０】
他の場合において、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドは、本明細書中に記載されるような方法を使用して、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを発現および分泌するように遺伝子操作された特定の細胞を移植することによって送達され得る。このような細胞は、動物細胞またはヒト細胞であり得、そして自己、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）、または異種間（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であり得る。必要に応じて、細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少するために、細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するようにカプセル化され得る。カプセル化材料は、典型的に、生体適合性の半透性ポリマーの包囲物または膜であり、これらは、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系によるかまたは周囲の組織由来の他の有害な因子による細胞の破壊を防止する。
【０２２１】
本明細書中に開示されるように、１つ以上のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドで単離された細胞集団（例えば、幹細胞、リンパ球、赤血球、軟骨細胞、神経など）を処置することが所望され得る。これは、単離された細胞を、（細胞膜を透過し得る形態で存在する）ポリペプチドに直接曝露することによって達成され得る。
【０２２２】
本発明のさらなる実施形態は、治療ポリペプチドのインビトロ産生と、遺伝子治療または細胞治療による治療ポリペプチドの産生および送達との両方のための、細胞および方法（例えば、相同組換えおよび／または他の組換え産生方法）に関する。相同組換えおよび他の組換えの方法を使用して、通常は転写的にサイレントなＢ７ＲＰ−２遺伝子（すなわち、過少発現される遺伝子）を含む細胞を改変し得、これによって、治療有効量のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドを発現する細胞を産生し得る。
【０２２３】
相同組換えは、転写的に活性な遺伝子における変異を誘導または矯正するように遺伝子を標的化するために元々開発された技術である（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐｔｉ、１９８９，Ｐｒｏｇ．ｉｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．＆ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３６：３０１）。この基本的技術は、特定の変異を、哺乳動物ゲノムの特定の領域へ導入するための方法として（Ｔｈｏｍａｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ，４４：４１９−４２８；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、１９８７，Ｃｅｌｌ，５１：５０３−５１２；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８５８３−８５８７）、または欠損遺伝子内の特定の変異を矯正するための方法として（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８７，Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５７６−５７８）開発された。例示的な相同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１号、ＥＰ ９１３０５１、欧州公開番号第５０５５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、国際公開番号 ＷＯ ９１／０９９５５に記載される。
【０２２４】
相同組換えを介して、ゲノム中に挿入されるべきＤＮＡ配列は、標的化ＤＮＡにこのＤＮＡ配列を結合することによって、目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。この標的化ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ領域に相補的である（相同である）ヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に相補的である標的化ＤＮＡの小片は、ＤＮＡ複製プロセスの間に親鎖と接触下に置かれる。共有される相同領域を介して内因性ＤＮＡの他の小片とハイブリダイズし、そして従って、組み換わることは、細胞内に挿入されたＤＮＡの一般的な特性である。この相補鎖が、変異または異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに結合された場合、これもまた、新たに合成された鎖に組換えの結果として組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、この新たなＤＮＡ配列が、テンプレートとして作用することが可能である。このように、この移入されたＤＮＡは、ゲノム内に組み込まれる。
【０２２５】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドと相互作用し得るかまたはＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現を制御し得るＤＮＡ領域（例えば、隣接配列）が、標的化ＤＮＡのこれらの小片に結合される。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサーまたは外因性転写調節エレメントが、所望のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に影響を与えるに十分に近位でかつ十分な方向で、その意図される宿主細胞のゲノムに挿入される。制御エレメントは、宿主細胞ゲノム中に存在するＤＮＡの一部を制御する。従って、所望のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現は、Ｂ７ＲＰ−２遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、むしろＤＮＡ調節セグメントと結合された標的化ＤＮＡ（その目的の内因性遺伝子と相同な領域を含む）の使用によって達成され得、この調節セグメントは、Ｂ７ＲＰ−２遺伝子の転写について認識可能なシグナルを、その内因性遺伝子配列に提供する。
【０２２６】
例示的な方法において、細胞内の所望の標的化された遺伝子（すなわち、所望の内因性の細胞遺伝子）の発現は、少なくとも調節配列、エキソンおよびスプライスドナー部位を含むＤＮＡの導入による、予め選択された部位でのその細胞ゲノムへの相同組換えを介して変更される。これらの成分は、実際には、これらの成分が、新たな転写単位の産生を生じる（ここで、そのＤＮＡ構築物中に存在する調節配列、エキソンおよびスプライスドナー部位が、内因性遺伝子に作動的に連結される）このような様式で染色体（ゲノム）ＤＮＡ中に導入される。染色体ＤＮＡへのこれらの成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変更される。
【０２２７】
本明細書中に記載されるように、変更された遺伝子発現は、得られたときの細胞において通常サイレントな（発現されない）遺伝子を活性化すること（または発現されるのを引き起こすこと）、ならびに得られたときの細胞において生理学的に重要なレベルで発現されない遺伝子の発現を増大させることを包含する。この実施形態はさらに、得られたときの細胞において生じる調節または誘導のパターンとは異なるように調節または誘導のパターンを変更すること、ならびに得られたときの細胞において発現される遺伝子の発現を減少させること（除去することを含む）を包含する。
【０２２８】
相同組換えを用いて、細胞の内因性Ｂ７ＲＰ−２遺伝子からのＢ７ＲＰ−２ポリペプチド産生を増大させ得るかまたは生じさせ得る１つの方法は、第１に、相同組換えを用いて部位特異的組換え系（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ、１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：５２１−５２７；Ｓａｕｅｒ、１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）由来の組換え配列を、細胞の内因性ゲノムＢ７ＲＰ−２ポリペプチドコード領域の上流に（すなわち、５’側に）配置することを含む。ゲノムＢ７ＲＰ−２ポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された部位に相同な組換え部位を含むプラスミドは、この改変された細胞株に、適切なリコンビナーゼ酵素により導入される。このリコンビナーゼ酵素は、このプラスミドを、プラスミドの組換え部位を介して、その細胞株におけるゲノムＢ７ＲＰ−２ポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置する組換え部位に組み込ませる（ＢａｕｂｏｎｉｓおよびＳａｕｅｒ、１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１：２０２５−２０２９；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１，２５１：１３５１−１３５５）。転写を増大させることが公知の任意の隣接配列（例えば、エンハンサー／プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー）は、このプラスミド内に適切に配置された場合に、新たな転写単位または改変された転写単位を作製するような様式で組み込み、この細胞の内因性Ｂ７ＲＰ−２遺伝子からのデノボＢ７ＲＰ−２ポリペプチド産生または増大したＢ７ＲＰ−２ポリペプチド産生を生じる。
【０２２９】
部位特異的な組換え配列がその細胞の内因性ゲノムＢ７ＲＰ−２ポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された細胞株を使用するためのさらなる方法は、相同組換えを使用して、第２の組換え部位を、この細胞株のゲノムの他の箇所に導入することである。次いで、適切なリコンビナーゼ酵素が、この２つの組換え部位の細胞株に導入されて、これが、組換え事象（欠失、逆位および転座）を引き起こす（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）。この組換え事象は、新たな転写単位または改変された転写単位を作製し、この転写単位が、この細胞の内因性Ｂ７ＲＰ−２遺伝子からのデノボＢ７ＲＰ−２ポリペプチド産生または増加したＢ７ＲＰ−２ポリペプチド産生を生じる。
【０２３０】
細胞の内因性Ｂ７ＲＰ−２遺伝子からのＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現を増加させるかまたは引き起こすためのさらなるアプローチは、細胞の内因性Ｂ７ＲＰ−２遺伝子からのデノボＢ７ＲＰ−２ポリペプチド産生または増加したＢ７ＲＰ−２ポリペプチド産生を生じる様式で、ある遺伝子（例えば、転写因子）の発現を増加させるかもしくは引き起こすこと、および／またはある遺伝子（例えば、転写リプレッサー）の発現を減少させることを包含する。この方法は、細胞の内因性Ｂ７ＲＰ−２遺伝子からのデノボＢ７ＲＰ−２ポリペプチド産生または増加したＢ７ＲＰ−２ポリペプチド産生が生じるように、天然には存在しないポリペプチド（例えば、転写因子ドメインに融合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）をその細胞に導入することを包含する。
【０２３１】
本発明は、さらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なＤＮＡ構築物に関する。特定の実施形態において、例示的なＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的化配列；（ｂ）調節配列；（ｃ）エキソン；および（ｄ）不対（ｕｎｐａｉｒｅｄ）スプライスドナー部位。このＤＮＡ構築物における標的化配列は、細胞中の標的遺伝子へのエレメント（ａ）〜（ｄ）の取り込みを、エレメント（ｂ）〜（ｄ）がその内因性標的遺伝子の配列に作動可能に連結されるように、指向する。別の実施形態においては、ＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的化配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター部位；ここで、この標的化配列は、エレメント（ａ）〜（ｆ）の取り込みを、（ｂ）〜（ｆ）のエレメントが内因性遺伝子に作動可能に連結されるように、指向する。この標的化配列は、相同組換えが生じる細胞染色体ＤＮＡにおける所定の部位に相同である。この構築物において、エキソンは、一般に、調節配列の３’側であり、そしてスプライスドナー部位は、エキソンの３’側である。
【０２３２】
特定の遺伝子の配列（例えば、本明細書中に提示されるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの核酸配列）が既知である場合には、この遺伝子の選択された領域に相補的なＤＮＡ小片は、合成され得るか、またはさもなければ、例えば、その目的の領域に結合する特異的な認識部位でのネイティブＤＮＡの適切な制限処理によって得られ得る。この小片は、細胞への導入時に標的化配列として作用し、そしてゲノム内のその相同領域とハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションがＤＮＡ複製の間に起こる場合、このＤＮＡ小片およびこのＤＮＡ小片に結合した任意のさらなる配列は、岡崎フラグメントとして作用し、そして新たに合成されたＤＮＡの娘鎖に組み込まれる。従って、本発明は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチドを包含し、このヌクレオチドは、標的化配列として使用され得る。
【０２３３】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド細胞治療（例えば、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを産生する細胞の移植）もまた意図される。この実施形態は、生物学的に活性な形態のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドを合成および分泌し得る細胞を移植することを包含する。このようなＢ７ＲＰ−２ポリペプチド産生細胞は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの天然の産生体である細胞であり得るか、または所望のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードする遺伝子もしくはＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現を増強する遺伝子で形質転換することによってそのＢ７ＲＰ−２ポリペプチドを産生する能力が増強された、組換え細胞であり得る。このような改変は、その遺伝子を送達するため、ならびにその発現および分泌を促進するために適したベクターによって、達成され得る。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを投与される患者において、外来種のポリペプチドの投与によって生じ得るような潜在的な免疫学的反応を最小化するためには、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを産生する天然の細胞がヒト起源であり、かつヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチドを産生することが、好ましい。同様に、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを産生する組換え細胞が、ヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されることが好ましい。
【０２３４】
移植される細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために、カプセル化され得る。ヒトまたは非ヒト動物の細胞は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの放出を可能にするが患者の免疫系によるかまたは周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する、生体適合性の半透過性のポリマー包皮または膜内で、患者に移植され得る。あるいは、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを産生するようエキソビボで形質転換された患者自身の細胞が、このようなカプセル化なしに、患者に直接移植され得る。
【０２３５】
生存細胞をカプセル化するための技術は、当該分野において公知であり、そしてカプセル化された細胞の調製およびこれらの患者への移植は、慣例的に達成され得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０５４５２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の効果的な送達のための、遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。これらのカプセルは生体適合性であり、そして容易に回収可能である。これらのカプセルは、プロモーターに作動可能に連結された生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化し、これらの細胞は、哺乳動物宿主への移植の際に、インビボでのダウンレギュレーションに供されない。このデバイスは、生存細胞からレシピエント内の特異的な部位への分子の送達を提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号、同第５，０１１，４７２号、および同第５，１０６，６２７号を参照のこと。生存細胞をカプセル化するための系は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）に記載されている。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０４７０（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）；Ｗｉｎｎら、１９９１、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−３２９；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９１、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２６９−２７５；およびＴｒｅｓｃｏら、１９９２、ＡＳＡＩＯ ３８：１７−２３もまた参照のこと。
【０２３６】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのインビボおよびインビトロ遺伝子治療送達もまた想定される。遺伝子治療技術の１つの例は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結され得るＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードするＢ７ＲＰ−２遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または合成ＤＮＡのいずれか）を使用して、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成することである。このプロモーターは、内因性Ｂ７ＲＰ−２遺伝子に対して同種であっても異種であってもよいが、但し、この構築物が挿入される細胞または組織型において、このプロモーターは、活性である。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、必要に応じて、部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ分子（例えば、相同組換えのために有用な内因性配列）、組織特異的なプロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、親細胞より優れた選択的利点を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子（例えば、細胞標的化のため）、細胞特異的インターナリゼーション因子、ベクターによる発現を増強するための転写因子、およびベクターの産生を可能にする因子を含み得る。
【０２３７】
次いで、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して、細胞に（エキソビボまたはインビボでのいずれかで）導入され得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの手段は、本明細書中に記載されるようなウイルスベクターによる手段である。特定のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）は、ＤＮＡ構築物を細胞の染色体ＤＮＡに送達し、そしてこの遺伝子は、染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。他のベクターは、エピソームとして機能し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞質内に残る。
【０２３８】
なお別の実施形態において、調節エレメントが、標的細胞におけるＢ７ＲＰ−２遺伝子の制御された発現のために含まれ得る。このようなエレメントは、適切なエフェクターに対する応答の際に、オンにされる。この様式で、治療ポリペプチドは、所望のときに発現され得る。１つの従来の制御手段は、小分子結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始し得るドメインを含むキメラタンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性化タンパク質）を二量体化するために使用される、小分子二量体化剤またはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９６／４１８６５、ＷＯ９７／３１８９８およびＷＯ９７／３１８９９を参照のこと）の使用を包含する。このタンパク質の二量体化を使用して、導入遺伝子の転写を開始し得る。このタンパク質の二量化は、導入遺伝子の転写を開始するために使用され得る。
【０２３９】
代替の調節技術は、目的の遺伝子から発現されたタンパク質を、その細胞の内側で凝集体またはクラスターとして貯蔵する方法を使用する。目的の遺伝子は、融合タンパク質として発現され、この融合タンパク質は、条件的凝集ドメインを含み、このドメインは、小胞体内での凝集したタンパク質の保持を生じる。貯蔵されたタンパク質は、細胞内で安定でありそして不活性である。しかし、これらのタンパク質は、条件的凝集ドメインを除去し、これによってこの凝集体またはクラスターを特異的に破壊する薬物（例えば、低分子リガンド）を投与することによって、放出され得、その結果、これらのタンパク質は、その細胞から分泌され得る。Ａｒｉｄｏｒら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８１６−８１７およびＲｉｖｅｒａら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８２６−８３０を参照のこと。
【０２４０】
他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、本明細書中に記載される系が挙げられるが、これらに限定されない。ミフェプリストン（ＲＵ４８６）が、プロゲステロンアンタゴニストとして使用される。プロゲステロンアンタゴニストに対する、改変されたプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインの結合は、２つの転写因子の二量体の形成し、次いで、これらの転写因子が、核を通ってＤＮＡに結合することによって、転写を活性化する。このリガンド結合ドメインは、そのレセプターがその天然のリガンドに結合する能力を排除するよう改変される。改変されたステロイドホルモンレセプター系は、米国特許第５，３６４，７９１号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９１１およびＷＯ９７／１０３３７に、さらに記載されている。
【０２４１】
なお別の制御系は、エクジソン（ショウジョウバエのステロイドホルモン）を使用し、これは、エクジソンレセプター（細胞質レセプター）に結合し、そしてこのレセプターを活性化する。次いで、このレセプターは、核に転移して、特定のＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答性遺伝子由来のプロモーター）を結合する。エクジソンレセプターは、転写を開始するための、トランス活性化ドメイン／ＤＮＡ結合ドメイン／リガンド結合ドメインを含む。エクジソン系は、米国特許第５，５１４，５７８号、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３８１１７、ＷＯ９６／３７６０９、およびＷＯ９３／０３１６２にさらに記載されている。
【０２４２】
別の制御手段は、ポジティブなテトラサイクリン制御可能トランスアクチベーターを使用する。この系は、転写を活性化させるポリペプチドに連結された、変異ｔｅｔリプレッサータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節トランスアクチベータータンパク質（すなわち、これは、テトラサイクリンの存在下で、ｔｅｔオペレーターに結合する）を生じる変異ｔｅｔ Ｒ−４アミノ酸変化）を含む。このような系は、米国特許第５，４６４，７５８号、同第５，６５０，２９８号、および同第５，６５４，１６８号に記載されている。
【０２４３】
さらなる発現制御系および核酸構築物は、Ｉｎｎｏｖｉｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．に対する米国特許第５，７４１，６７９号および同第５，８３４，１８６号に記載されている。
【０２４４】
インビボ遺伝子治療は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードする遺伝子を、Ｂ７ＲＰ−２核酸分子の局所的注射を介してかまたは他の適切なウイルス送達ベクターもしくは非ウイルス送達ベクターによって、細胞に導入することにより達成され得る。Ｈｅｆｔｉ、１９９４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５：１４１８−１４３５。例えば、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードする核酸分子は、標的化された細胞への送達のために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，国際公開番号ＷＯ９５／３４６７０；および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８）。組換えＡＡＶゲノムは、代表的に、機能的プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されたＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接する、ＡＡＶ逆方向末端反復を含む。
【０２４５】
代替の適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、肝炎ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、コロナウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、およびパピローマウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含む、インビボウイルス媒介遺伝子移入系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するようインビトロで処理されたヒト細胞の送達による、患者に治療タンパク質を提供するためのプロセスの例を、提供する。遺伝子治療技術の実施のためのさらなる方法および材料は、米国特許第５，６３１，２３６号（アデノウイルスベクターを含む）；米国特許第５，６７２，５１０号（レトロウイルスベクターを含む）；および米国特許第５，６３５，３９９号（サイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む）に記載されている。
【０２４６】
非ウイルス送達方法としては、リポソーム媒介移入、裸のＤＮＡ送達（直接注入）、レセプター媒介移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、および微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子治療の材料および方法としてはまた、誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ配列、親細胞より優れた選択的利点を提供し得るＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブ選択系および発現制御系（安全性の尺度）、細胞特異的結合因子（細胞標的化のため）、細胞特異的インターナリゼーション因子、およびベクターによる発現を増強するための転写因子、ならびにベクター作製の方法が挙げられ得る。遺伝子治療技術の実施のための、このようなさらなる方法および材料は、米国特許第４，９７０，１５４号（エレクトロポレーション技術を含む）；米国特許第５，６７９，５５９号（遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を記載する）；米国特許第５，６７６，９５４号（リポソームキャリアを含む）；米国特許第５，５９３，８７５号（リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載する）；および米国特許第４，９４５，０５０号（生物学的に活性な粒子が、細胞において、この粒子がこの細胞の表面を貫通しそしてこの細胞の内側に取り込まれる速度で推進されるプロセス、を記載する）、ならびにＷＯ９６／４０９５８（核リガンドを含む）に記載されている。
【０２４７】
Ｂ７ＲＰ−２遺伝子治療または細胞治療が、同じまたは異なる細胞における１つ以上のさらなるポリペプチドの送達をさらに含み得ることがまた意図される。このような細胞は、患者に別々に導入され得るか、またはこれらの細胞は、単一の移植可能なデバイス（例えば、上記のカプセル化膜）内に含まれ得るか、または細胞は、ウイルスベクターによって別々に改変され得る。
【０２４８】
遺伝子治療を介して細胞における内因性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド発現を増加させるための手段は、１つ以上のエンハンサーエレメントをＢ７ＲＰ−２ポリペプチドプロモーターに挿入することであり、ここで、このエンハンサーエレメントは、Ｂ７ＲＰ−２遺伝子の転写活性を増加させるよう作用し得る。使用されるエンハンサーエレメントは、遺伝子を活性化することが所望される組織に基づいて選択される；この組織においてプロモーター活性化を与えることが公知であるエンハンサーエレメントが、選択される。例えば、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードする遺伝子がＴ細胞において「オンにされる」場合には、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用され得る。ここで、付加される転写エレメントの機能性部分は、標準的なクローニング技術を使用して、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡのフラグメントに挿入され得る（そして必要に応じて、ベクターおよび／または５’および／または３’隣接配列などに挿入され得る）。次いで、この構築物（「相同組換え構築物」として公知）が、エキソビボでかまたはインビボでのいずれかで、所望の細胞に導入され得る。
【０２４９】
遺伝子治療はまた、内因性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによって、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド発現を減少させるために、使用され得る。このような改変は、代表的に、相同組換え法を介して達成される。例えば、不活化について選択されたＢ７ＲＰ−２遺伝子のプロモーターの全てまたは一部を含むＤＮＡ分子は、転写を調節するプロモーター片を除去および／または置換するように、操作され得る。例えば、プロモーターの転写アクチベーターのＴＡＴＡボックスおよび／または結合部位が、標準的な分子生物学の技術を使用して、欠失され得る；このような欠失は、プロモーター活性を阻害し得、これによって、対応するＢ７ＲＰ−２遺伝子の転写を抑制する。プロモーターにおけるＴＡＴＡボックスまたは転写アクチベーター結合部位の欠失は、（調節されるＢ７ＲＰ−２遺伝子と同じ種かまたは関連する種由来の）Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドプロモーターの全てまたは関連する部分を含むＤＮＡ構築物を生成することによって達成され得、ここで、１つ以上のＴＡＴＡボックスおよび／または転写アクチベーター結合部位のヌクレオチドが、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を介して変異される。結果として、ＴＡＴＡボックスおよび／またはアクチベーター結合部位は、活性が減少されているか、または完全に不活性にされている。この構築物はまた、代表的に、その改変されたプロモーターセグメントに隣接するネイティブな（内因性の）５’および３’ＤＮＡ配列に対応する、少なくとも約５００塩基のＤＮＡを含む。この構築物は、直接的にかまたは本明細書中に記載されるようなウイルスベクターを介して、適切な細胞に（エキソビボでかまたはインビボでかのいずれかで）導入され得る。代表的に、細胞のゲノムＤＮＡへのこの構築物の組み込みは、相同組換えを介し、ここで、このプロモーター構築物における５’および３’ＤＮＡ配列は、ハイブリダイゼーションを介するその内因性染色体ＤＮＡへの改変されたプロモーター領域の組み込みを補助するよう作用し得る。
【０２５０】
（治療的使用）
本発明のＢ７ＲＰ−２核酸分子、ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストは、多くの疾患、障害または状態（本明細書中に列挙されるものを含む）を、処置、診断、寛解または予防するために使用され得る。
【０２５１】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとしては、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの活性を調節するか、または少なくとも１つのＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの成熟形態の生物学的活性を、増強または減少させるかのいずれかである、分子が挙げられる。アゴニストまたはアンタゴニストは、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドと相互作用してその活性を調節するタンパク質、ポリペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量分子のような補因子であり得る。潜在的タンパク質アンタゴニストまたはアンタゴニストは、このタンパク質の細胞外ドメインの一部または全てを含むＢ７ＲＰ−２の可溶化形態または膜に結合した形態のいずれかと反応する抗体を含む。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド発現を調節する分子は、代表的に、発現のアンチセンス調節因子として作用し得るＢ７ＲＰ−２ポリヌクレオチドをコードする核酸を含む。
【０２５２】
骨組織は、コラーゲンマトリクスおよび非コラーゲンタンパク質、鉱物（主にカルシウムおよびリン）、ならびに細胞からなる。骨に見出される３つの型の細胞（骨細胞、骨芽細胞、および破骨細胞）は、骨が断続的に形成されかつ吸収されることによる劇的なプロセスに関する。骨芽細胞は、骨組織の形成を誘導する一方、破骨細胞は、吸収に関する。骨マトリックスおよび鉱物の吸収、または分解は、骨形成に比べて速くかつ効率的なプロセスであり、そして多量の鉱物を骨から放出する。破骨細胞は、骨格組織の正常な再モデル化の調節、およびホルモンによって誘導される吸収に関する。例えば、吸収は、細胞外液におけるカルシウムイオンの濃度の減少に応じた副甲状腺ホルモンの分泌によって刺激される。対照的に、吸収の阻害は、カルシトニンの主要な機能である。さらに、ビタミンＤの代謝物は、副甲状腺ホルモンおよびカルシトニンに対する骨の応答性を変更する。
【０２５３】
骨格の成熟に伴って、骨格における骨量は、骨形成および骨吸収のバランス（またはアンバランス）を反映する。ピーク骨量は、４０歳になる前の骨格成熟後に生じる。４０歳と５０歳との間に、この均衡はシフトし、そして骨吸収は、優位になる。年齢とともに進行する骨量の誘因可能な減少は、男性よりも女性において早く開始し、そしていくつかの女性において（主に、ＣａｕｃａｓｉａｎおよびＡｓｉａｎの家系）、閉経後に顕著に加速される。
【０２５４】
骨減少症は、骨量の平均レベル以下への任意の減少に一般に関する状態である。このような状態は、骨合成の割合における減少、または骨崩壊の割合における増加、あるいはこれらの両方より生じ得る。最も一般的な形態の骨減少症は、主に骨粗しょう症である。これは、閉経後の骨粗しょう症および老衰性骨粗しょう症の場合にもいう。この形態の骨粗しょう症は、年齢に伴う一連の骨の一般的な消失であり、そして通常は骨形成の正常な割合を有する骨吸収における増加の結果である。米国における全ての白人女性の約２５〜３０％は、徴候的骨粗しょう症を発達する。直接の関係は、骨粗しょう症と、４５歳以上の女性における尻、大腿部、頸部、および転子間骨折（ｉｎｔｅｒ−ｔｒｏｃｈａｎｔｅｒｉｃ ｆｒａｃｔｕｒｅ）の発生率との間に存在する。老齢の男性は、５０歳と７０歳との間の年齢で徴候的骨粗しょう症を発達するが、この疾患は主に女性に影響する。
【０２５５】
閉経後および老年性の骨粗鬆症の原因は、未知である。この状態に寄与し得るいくつかの因子が同定されている。これらは、加齢に伴うホルモンレベルの変化、ならびにカルシウムおよび他のミネラルの腸管吸収低下に起因する不適切なカルシウム消耗が挙げられる。処置としては、普通、進行の遅滞を目的とする、ホルモン治療または食事補給が挙げられる。しかし、今日まで、骨損失に対する有効な処置は存在しない。
【０２５６】
本発明のＢ７ＲＰ−２核酸分子、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、ならびにＢ７ＲＰ−２アゴニストおよびＢ７ＲＰ−２アンタゴニストを使用して、骨疾患および骨障害（例えば、正味の骨量減少（例えば、骨減少または骨溶解）によって特徴付けられる疾患または障害）を処置、診断、緩和または予防し得る。例えば、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを使用して、骨の再吸収速度を抑制し得る。この様式では、個体をＢ７ＲＰ−２ポリペプチドを用いて処置して、再吸収速度が正常よりも高い場合の骨の再吸収速度を低下させ得、または正常レベル未満の骨形成を代償するために骨再吸収を正常レベル未満に低減させ得る。
【０２５７】
本発明のＢ７ＲＰ−２核酸分子、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、ならびにＢ７ＲＰ−２アゴニストおよびＢ７ＲＰ−２アンタゴニストを用いて処置可能である状態としては、以下が挙げられる：骨粗鬆症（例えば、原発性骨粗鬆症、内分泌性骨粗鬆症（甲状腺機能亢進、副甲状腺機能亢進（ｈｙｐｅｒｐａｒａｔｈｒｙｏｉｄｉｓｍ）、クッシング症候群および末端肥大症）、遺伝性形態および先天性形態の骨粗鬆症（骨形成不全、ホモシスチン尿症、メンケズ症候群およびライリー−デイ症候群）ならびに四肢の不動化に起因する骨粗鬆症）；成人および若年における骨のパジェット病（変形性骨炎）；骨の損失をもたらす、骨髄炎または骨の感染性損傷；固形腫瘍（胸部、肺および腎臓）および血液の悪性疾患（多発性骨髄腫、リンパ腫および白血病）から生じる高カルシウム血症、特発性高カルシウム血症ならびに甲状腺機能亢進および腎臓機能障害に関連した高カルシウム血症；ステロイド投与によって誘発され、そして小腸および大腸の障害ならびに慢性の肝臓疾患および腎臓疾患と関連する、手術後の骨減少症；ゴシェ病、鎌状赤血球貧血、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、歯周疾患、骨溶解性転移および他の状態に関連した外傷性損傷または非外傷性壊死に関連した、骨壊死（すなわち、骨細胞死）。他の骨疾患および骨障害が、本発明の範囲内に含まれる。
【０２５８】
本発明のＢ７ＲＰ−２核酸分子、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、ならびにＢ７ＲＰ−２アゴニストおよびＢ７ＲＰ−２アンタゴニストを使用して、Ｔ細胞機能（例えば、Ｔ細胞レセプターのおとり（デコイ）としての機能）と関連する疾患を、処置、診断、緩和または予防し得る。例えば、抗体、細胞外ドメインを含有する可溶性タンパク質、またはＴ細胞活性化の長期化または増強を生じるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの他の制御因子を使用して、腫瘍に対する免疫応答を増加し得る。
【０２５９】
本発明のＢ７ＲＰ−２核酸分子、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、ならびにＢ７ＲＰ−２アゴニストおよびＢ７ＲＰ−２アンタゴニストを、自己免疫疾患、移植片の生存、腫瘍細胞増殖を阻害するための免疫細胞活性化、Ｔ細胞依存的なＢ細胞媒介性疾患、および癌遺伝子免疫治療の処置において使用し得る。１つの実施形態において、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド機能のアゴニストもしくはアンタゴニスト、可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体は、慢性の免疫細胞機能不全を伴う疾患の症状を緩和するのに有益であり得る。自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、変形性関節症、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＰＴ）、および乾癬）を、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド機能のアゴニストもしくはアンタゴニスト、可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体を用いて処置し得る。さらに、慢性炎症疾患（例えば、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸）、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、および真性糖尿病）を、また、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド機能のアゴニストもしくはアンタゴニスト、可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体を用いて処置し得る。
【０２６０】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド機能のアゴニストもしくはアンタゴニスト、可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体を、骨髄移植および器官移植のための免疫抑制剤として使用し得、そして移植片の生存を長期化するために使用し得る。このような、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド機能のアゴニストもしくはアンタゴニスト、可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体は、既存の処置以上に重要な有意性を提供し得る。骨髄移植治療および器官移植治療は、宿主により、外来性の細胞および組織のＴ細胞媒介性拒絶に対処しなければならない。Ｔ細胞媒介性拒絶を阻害するための現在の治療レジメンは、薬物シクロスポリンまたはＦＫ５０６を用いる処置を包含する。薬物が有効であっても、患者は、肝毒性、腎毒性および神経毒性を含む、重篤な副作用に苦しむ。治療剤のシクロスポリン／ＦＫ５０６のクラスの標的は、遍在性発現を有するホスファターゼである、カルシニュリンである。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド機能のアゴニストもしくはアンタゴニスト、可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体は、現在の免疫治療剤の使用で観察される重篤な副作用を、欠き得る。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド機能のアゴニストもしくはアンタゴニスト、可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体を、自己免疫障害（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、糖尿病および全身性エリテマトーデス）に対する免疫抑制剤として使用し得る。また、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド機能のアゴニストもしくはアンタゴニスト、可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体を使用して、トキシックショック症候群、炎症性腸疾患、輸血に起因する同種感作、Ｔ細胞依存的なＢ細胞媒介性疾患、および宿主の疾患に対する移植片の処置を緩和し得る。
【０２６１】
本発明のＢ７ＲＰ−２遺伝子を使用する遺伝子治療を、癌免疫治療において使用し得る。癌細胞中に導入されたＢ７ＲＰ−２遺伝子は、これら癌細胞を抗原提示細胞へと形質転換し得、そしてこれら細胞は動物中に戻された場合に免疫系のＴ細胞によって認識され得る。トランスフェクトされた腫瘍細胞のＴ細胞による認識は、Ｂ７ＲＰ−２遺伝子を発現する腫瘍および発現しない腫瘍の根絶を生じる。この免疫治療アプローチは、種々の白血病、肉腫、黒色腫、腺癌、乳癌、前立腺腫瘍、肺癌、結腸癌、または他の腫瘍に対して使用される。本発明は、同様の様式でＢ７ＲＰ−２遺伝子を使用して種々の腫瘍に応答してＴ細胞活性化を増強させる工程を包含する。
【０２６２】
例えば、多くのワクチンは、有効かつ特異的な抗体応答を誘発することによって作用する。いくつかのワクチン、特に腸内微生物（例えば、Ａ型肝炎ウイルスおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ）に対するワクチンは、短期間の抗体応答を誘発する。この応答を増強しそして持続させて、ワクチンの有効性を増加させることが望ましい。従って、可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドは、ワクチンのアジュバントとして役立ち得る。
【０２６３】
対照的に、Ｂ７ＲＰ−２はネガティブな免疫制御機能を有し得るので、抗体、低分子、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）またはＢ７ＲＰ−２機能の他のアンタゴニストを用いたＢ７ＲＰ−２活性の阻害は、免疫増強および抗腫瘍活性を生じ得る。
【０２６４】
また、抗腫瘍応答を、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド経路のアクチベーターまたはアゴニストによって増強し得る。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドアンタゴニストによる細胞免疫機能の増強はまた、ウイルス感染細胞の除去において有益であり得る。補完的な様式で、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドアンタゴニストはまた、抗体媒介性応答を増強し得、そして生体から遊離ウイルスを取り除く（ｃｌｅａｒ）のを援助するように機能し得る、ホルモン性免疫機能に対する効果を有し得る。
【０２６５】
対照的に、抗体産生を阻害することによって緩和される、多くの臨床状態が存在する。過敏症は、過剰または不適切である通常は有益な免疫応答であり、そして炎症反応および組織損傷を導く。抗体媒介性である過敏症反応は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体による拮抗作用に特に敏感であり得る。アレルギー、枯草熱、喘息および急性浮腫は、Ｉ型過敏性反応を引き起こし、そしてこれらの反応は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体により抑制され得る。
【０２６６】
抗体媒介性の過敏症反応を引き起こす疾患としては以下が挙げられ、これらを、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体を用いて処置し得る：全身性エリテマトーデス、関節炎（慢性関節リウマチ、反応性関節炎（ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）および変形性関節症）、腎症（糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、巣状分節状糸球体硬化症、巣状壊死性（ｆｏｃａｌ ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ）腎炎、半月形腎炎および増殖性細管障害（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｔｕｂｕｌｏｐａｔｈｙ）腎炎）、皮膚障害（天疱瘡、天疱瘡様および結節性紅斑）、内分泌障害（甲状腺炎、グレーヴズ病、橋本病、インスリン依存性真性糖尿病）、種々の肺性障害（ｐｎｅｕｍｏｐａｔｈｙ）（特に外因性肺胞炎）、種々の血管症、セリアック病、ＩｇＡの異常産生、多くの貧血および血小板減少症、ギヤン−バレー症候群、および重症筋無力症。
【０２６７】
さらに、リンパ球増殖性障害（例えば、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症およびクリオグロブリン血症）を、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体により阻害し得る。最終的に、「人工の免疫障害」である宿主疾患に対する移植片は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチド誘導体による抗体産生阻害から利益を受け得る。
【０２６８】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド機能のアゴニストまたはアンタゴニストは、処置される状態に適切である場合、１つ以上のサイトカイン、増殖因子、抗生物質、抗炎症剤および／または化学療法剤と（同時にかまたは連続的に）併用して使用され得る。
【０２６９】
望まれないレベルのＢ７ＲＰ−２ポリペプチドによるか、またはこれに媒介される他の疾患は、本発明の範囲内に包含される。望まれないレベルは、過剰なレベルのＢ７ＲＰ−２ポリペプチド、および正常以下（ｓｕｂ−ｎｏｒｍａｌ）のレベルのＢ７ＲＰ−２ポリペプチドを含む。
【０２７０】
（Ｂ７ＲＰ−２核酸およびポリペプチドの使用）
本発明の核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）を使用して、染色体上のＢ７ＲＰ−２遺伝子および関連遺伝子の位置をマッピングし得る。マッピングは、当該分野で公知の技術（例えば、ＰＣＲ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーション）によってなされ得る。
【０２７１】
Ｂ７ＲＰ−２核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）は、哺乳動物組織サンプルまたは体液サンプル中のＢ７ＲＰ−２核酸分子の存在について、定性的または定量的のどちらかで試験するための診断アッセイにおける、ハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る。
【０２７２】
また、１つ以上のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの活性を阻害することが所望される場合に他の方法を使用し得る。このような阻害は、発現制御配列（３重鎖を形成する）かまたはＢ７ＲＰ−２ ｍＲＮＡに相補的でありそしてそれにハイブリダイズする核酸分子によって、もたらされ得る。例えば、Ｂ７ＲＰ−２遺伝子の少なくとも一部に相補的である配列を有する、アンチセンスＤＮＡ分子またはアンチセンスＲＮＡ分子は、細胞中に導入され得る。アンチセンスプローブは、本明細書中に開示されるＢ７ＲＰ−２遺伝子の配列を使用する利用可能な技術によって設計され得る。代表的に、このようなアンチセンス分子の各々は、選択されたＢ７ＲＰ−２遺伝子の各々の開始部位（５’末端）に相補的である。次いで、アンチセンス分子が対応するＢ７ＲＰ−２ ｍＲＮＡとハイブリダイズする場合、このｍＲＮＡの翻訳を防止するかまたは低下させる。アンチセンスインヒビターは、細胞内または生物内でのＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの減少か、またはＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの不在に関する情報を提供する。
【０２７３】
あるいは、遺伝子治療は、１つ以上のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドのドミナントネガティブインヒビターを生成するために使用され得る。この状況では、各々の選択されたＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの変異ポリペプチドをコードするＤＮＡを調製し、そして本明細書中に記載される、ウイルス方法または非ウイルス方法のどちらかを使用して、患者の細胞中に導入し得る。このような変異体の各々は、代表的に、内因性ポリペプチドの生物学的役割において、内因性ポリペプチドと競合するように設計される。
【０２７４】
さらに、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドは、生物学的に活性であっても活性ではなくても、免疫原として使用され得る。すなわち、このポリペプチドは、少なくとも１つのエピトープを含有し、このエピトープに対してす抗体が惹起され得る。（本明細書に記載のように）Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドに結合する、選択的な結合性因子は、インビボおよびインビトロの診断目的のために使用され得る。この使用としては、体液または細胞サンプル中のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの存在を検出するための、標識形態での使用が挙げられるが、これに限定されない。また、抗体を使用して、本明細書中に記載される疾患および障害を含む、多くの疾患および障害を、予防、処置または診断し得る。抗体は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドに結合して、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの少なくとも１つの活性特性を低下させ得るかもしくはブロックし得るか、またはポリペプチドに結合して、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの少なくとも１つの活性特性を増大させ得る（Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの薬物動態を増大させることによることを含む）。
【０２７５】
本発明のＢ７ＲＰ−２ポリペプチドを使用して、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドレセプターを、発現クローニングストラテジーを使用してクローニングし得る。放射性標識された（１２５ヨウ素）Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドまたは親和性／活性タグ化されたＢ７ＲＰ−２ポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合物またはアルカリホスファターゼ融合物）を結合アッセイにおいて使用して、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドレセプターを発現する細胞型または細胞株または組織を同定し得る。このような細胞または組織から単離されたＲＮＡをｃＤＮＡに転換し、哺乳動物の発現ベクターにクローニングし、そして哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞または２９３細胞）中にトランスフェクトして発現ライブラリーを作製する。次いで、放射性標識されたＢ７ＲＰ−２ポリペプチドまたはタグ化Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを親和性リガンドとして使用して、細胞表面上にＢ７ＲＰ−２ポリペプチドレセプターを発現する細胞サブセットを、このライブラリーから同定および単離し得る。次いで、ＤＮＡをこれら細胞から単離し、そして哺乳動物細胞にトランスフェクトして二次発現ライブラリーを作製する。このライブラリー中では、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドレセプターを発現する細胞の割合は、元のライブラリーにおける割合におけるより何倍も高い。この富化プロセスを、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドレセプターを含有する単一の組換えクローンを単離するまで反復し得る。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドレセプターの単離は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドシグナル伝達経路の新規のアゴニストおよびアンタゴニストを同定または開発するのに有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドレセプター、抗Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドレセプター抗体、低分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ、そしてこれらを、本明細書中に記載される１つ以上の疾患または障害を、処置、予防または診断するために使用し得る。
【０２７６】
本発明のマウスＢ７ＲＰ−２核酸およびヒトＢ７ＲＰ−２核酸はまた、対応する染色体Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド遺伝子を単離するのに有用なツールである。例えば、Ｂ７ＲＰ−２配列を含有するマウス染色体ＤＮＡを使用して、ノックアウトマウスを構築し得、これによってＢ７ＲＰ−２ポリペプチドのインビボの役割の試験が可能となる。ヒトＢ７ＲＰ−２ゲノムＤＮＡを使用して、遺伝性組織変性疾患を同定し得る。
【０２７７】
以下の実施例は、例示の目的のためのみに意図されるものであり、そしていかなる様式でも本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２７８】
（実施例１：ヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチド遺伝子のクローニング）
一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される材料および方法を使用して、ヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングおよび分析した。
【０２７９】
照会配列としてラットＢ７ＲＰ−２オルソログ（配列番号５）を使用して、独自のデータベースの検索を実施した。ヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの一部をコードする核酸配列を含むものとして、３４２ｂｐクローンを同定した。この配列を、関連コンティグの試験によって７９２ｂｐ（配列番号１６）に拡大した。
【０２８０】
インサイチュハイブリダイゼーションによって頭蓋冠において検出された高レベルのＢ７ＲＰ−２発現に起因して、ヒト頭蓋冠骨ｃＤＮＡライブラリーならびにアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）２２４５−７１（５’−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−３’；配列番号１７）および２２４５−７２（５’−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−３’；配列番号１８）を使用して実施した増幅反応において、ヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を単離した。予想されるサイズのＰＣＲ産物を単離し、そしてＴｏｐｏ ＩＩベクター中にサブクローニングした。得られたライゲーション反応物を使用してコンピテント細菌を形質転換し、次いでこの様式で得られたクローンを配列決定により分析した。
【０２８１】
５’ＲＡＣＥ反応および３’ＲＡＣＥ反応の両方を実施して、ヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの全長ｃＤＮＡ配列を生成した。ｃＤＮＡ配列の３’末端に対応するｃＤＮＡ配列を単離するために、ｐＳＰＯＲＴ１ベクター中のヒト胎児頭蓋冠ｃＤＮＡライブラリー、ならびにプライマー２２４５−７２およびプライマー１０７１−８０（５’−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−３’；配列番号１９）を使用して、３’ＲＡＣＥを実施した。３’ＲＡＣＥ増幅産物の一部ならびにプライマー２２７９−２４（５’−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−３’；配列番号２０）および１０７１−８０を使用して、ネステッドＰＣＲを実施した。８００ｂｐのＰＣＲ産物を単離し、そしてＴｏｐｏ ＩＩベクター中にサブクローニングした。得られたライゲーション反応物を使用して、コンピテント細菌を形質転換し、次いでこの様式で得られたクローンを配列決定によって分析した。
【０２８２】
ｃＤＮＡ配列の５’末端に対応するｃＤＮＡ配列を単離するために、上記のヒト胎児頭蓋冠ｃＤＮＡライブラリー、ならびにプライマー２２７９−２２（５’−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−３’；配列番号２１）および１０７１−８０を使用して、５’ＲＡＣＥを実施した。５’ＲＡＣＥ増幅産物の一部ならびにプライマー２２７９−２１（５’−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−３’；配列番号２２）および１０７１−８０を使用して、ネステッドＰＣＲを実施した。４００ｂｐのＰＣＲ産物を単離し、そしてＴｏｐｏ ＩＩベクター中にサブクローニングした。得られたライゲーション反応物を使用して、コンピテント細菌を形質転換し、次いでこの様式で得られたクローンを配列決定によって分析した。
【０２８３】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡ配列を単離するために、上記のヒト胎児頭蓋冠ｃＤＮＡライブラリー、ならびにプライマー２３１８−３４（５’−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−３’；配列番号２３）および２３１８−３５（５’−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−３’；配列番号２４）を使用して、増幅反応を実施した。約１．６ｋｂのＰＣＲ産物を単離し、そしてＴｏｐｏ ＩＩベクター中にサブクローニングした。得られたライゲーション反応物を使用して、コンピテント細菌を形質転換し、次いでこの様式で得られたクローンを配列決定によって分析した。配列分析は、ヒトＢ７ＲＰ−２遺伝子が、３１６アミノ酸のタンパク質をコードする９４８ｂｐのオープンリーディングフレームを含有することを示した（図１Ａ〜１Ｂ）。
【０２８４】
マウスＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列およびラットＢ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列の単離は、マウスＢ７ＲＰ−２遺伝子（図２Ａ〜２Ｂ）およびラットＢ７ＲＰ−２遺伝子（図３Ａ〜３Ｃ）の両方がまた、９４８ｂｐのオープンリーディングフレームを含み、各々３１６アミノ酸のタンパク質をコードすることを示す。ヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）、マウスＢ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）およびラットＢ７ＲＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号６）を、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用して整列させた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３−８０）。ヒトＢ７ＲＰ−２オルソログ、マウスＢ７ＲＰ−２オルソログおよびラットＢ７ＲＰ−２オルソログのＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント（図４Ａ〜４Ｂ）は、ヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチドが多くの位置で非保存的アミノ酸置換に寛容であること（配列番号３２を参照のこと）、そしてさらに保存的アミノ酸置換がヒトＢ７ＲＰ−２アミノ酸配列中のいくつかの他の位置（例えば、２０位、２９位、１０１位、１２０位、１８４位、２６０位、２６１位、２９１位、および３０６位）で、なされ得ることを示唆する。Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（主に、ＳｍａｒｔデータベースおよびＰｆａｍデータベースに由来する、機能ドメインおよび構造ドメインの集合）に対する、ヒトＢ７ＲＰ−２オルソログ、マウスＢ７ＲＰ−２オルソログおよびラットＢ７ＲＰ−２オルソログのＢＬＡＳＴ分析は、これら３つのタンパク質がまた、少なくとも２つの保存されたタンパク質ドメイン、すなわち免疫グロブリンＶ型ドメインおよび免疫グロブリンＣ型ドメインまたはＣ−２型ドメインを共有することを示した（図５）。
【０２８５】
配列分析はまた、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドがＢ７ファミリーのタンパク質と相同性を共有することを示した。図６Ａ〜６Ｂは、ヒトブチロフィリンサブファミリー１メンバーＡ１（ｈｕ＿ＢＴＮ１Ａ１；配列番号７）、ウシブチロフィリン前駆体（ｂｏ＿ＢＴＮ；配列番号８）、マウスブチロフィリン（ｍｕ＿ＢＴＮ；配列番号９）、ヒトブチロフィリンサブファミリー２メンバーＡ１（ｈｕ＿ＢＴＮ２Ａ１；配列番号１０）、ヒトブチロフィリン様タンパク質（ｈｕ＿ＢＴ３．２；配列番号１１）、ヒトブチロフィリンサブファミリー３メンバーＡ２（ｈｕ＿ＢＴＮ３Ａ２；配列番号１２）、Ｇｒｕｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｂ−Ｇ−様タンパク質（ｇｒ＿ＢＧ２；配列番号１３）、およびヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチド（ｈｕ＿Ｂ７ＲＰ−２；配列番号２）のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【０２８６】
Ｂ７ＲＰ−２遺伝子の推定タンパク質産物はＢ７ファミリータンパク質に関係する。これらのタンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、そしてＴ細胞媒介性免疫応答の制御因子として機能する。Ｂ７ファミリータンパク質のメンバーは、小さな細胞質ドメイン、ならびに免疫グロブリンＶ（可変）ドメインおよび免疫グロブリンＣ（定常）ドメインを含む、細胞外領域を有する１型膜タンパク質である。Ｂ７ファミリーの公知のメンバーとしては、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、Ｂ７ＲＰ−１、およびＢ７−Ｈ１が挙げられる。Ｂ７−１およびＢ７−２は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４と相互作用し、そして、Ｔ細胞同時刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）経路のメディエーターである。Ｂ７ＲＰ−１は、別のレセプター（ＩＣＯＳ；誘導可能な同時刺激因子）に結合し、そしてまた、Ｔ細胞増殖の刺激因子である。Ｂ７−Ｈ１もまたＴ細胞増殖を同時刺激するが、ＣＤ２８にもＣＴＬＡ−４にもＩＣＯＳにも結合しない。このファミリーのタンパク質配列は、ほとんど保存されておらず、そして結果的に、特に全長コード領域配列の一部を比較する場合、計算的な方法を使用して、他の関連分子と区別することが困難である。Ｂ７ファミリーと配列相同性を提示する他のタンパク質としては、ブチロフィリンおよびＰＲＯ３５２が挙げられる。ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）はさらに遠い関係にある。
【０２８７】
Ｂａｋｅｒら（ＰＣＴ公開第ＷＯ ９９／４６２８１号）は、ＰＲ０３５２と呼ばれる３１６アミノ酸のポリペプチド（配列番号２６）をコードする、１９９８ｂｐの核酸配列（配列番号２５）を開示する。Ｃｈａｐｏｖａｌら（２００１，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎ．２：２６９−２７４）は、Ｂ７−Ｈ３と称される、３１６アミノ酸のポリペプチド（配列番号２８）をコードする、９５１ｂｐの核酸配列（配列番号２７）を開示する。Ｃｈａｐｏｖａｌらにより開示される核酸配列は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードする核酸配列と同一である。
【０２８８】
（実施例２：Ｂ７ＲＰ−２ ｍＲＮＡの発現）
骨形成中のＢ７ＲＰ−２ ｍＲＮＡ発現の動態を、デキサメタゾン、ビタミンＣおよびβ−グリセロホスフェート処理後の骨芽細胞において試験した。骨芽細胞をラットの骨髄から単離し、そして１０％ ウシ胎仔血清、３ｎｇ／ｍｌ β−ＦＧＦ、５０□Ｍ β−メルカプトエタノールおよび抗生物質を含む、α−最小栄養培地（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）中で培養した。細胞がコンフルエントに達した場合にデキサメタゾン（１０ｎＭ）およびビタミンＣ（５０□ｇ／ｍｌ）を培地に添加し、次いで１４日まで１日おきに培地を更新した。８日目に、β−グリセロホスフェート（５０□ｇ／ｍｌ）もまた添加した。２日目、３日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、１２日目および１４日目に、全ＲＮＡを調製し、そしてプローブとして全長ラットＢ７ＲＰ−２ ｃＤＮＡ配列を使用するノーザンブロット分析により分析した。各々のレーンに、２８Ｓ ｒＲＮＡおよび１８Ｓ ｒＲＮＡにより評価した、等量のＲＮＡ（１レーン当たり２０□ｇ）を充填した。デキサメタゾン、ビタミンＣおよびβ−グリセロホスフェート添加後のＢ７ＲＰ−２ ｍＲＮＡの発現の増加（図７）は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドが骨芽細胞の増殖または分化に関与し得ることを示す。
【０２８９】
Ｂ７ＲＰ−２ ｍＲＮＡの発現を、インサイチュハイブリダイゼーションによって位置付けた。正常のマウス胚（Ｅ１８．５）を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋し、そして５μｍで切片作製した。ハイブリダイゼーションの前に、切片を０．２Ｍ ＨＣｌを用いて透過性にし、プロテイナーゼＫで消化し、そしてトリエタノールアミンおよび無水酢酸を用いてアセチル化した。切片を、マウスＢ７ＲＰ−２タンパク質コード配列の５’配列および３’配列に対応する３３Ｐ標識したリボプローブを用いて、５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、切片をＲＮａｓｅＡで処理してハイブリダイズしていないプローブを消化し、次いで、０．１×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで漸減する塩濃度を有する、一連の緩衝液で５５℃にて洗浄する。次いで、切片をＮＴＢ２エマルジョン中（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に浸漬して、４℃で２〜３週間曝露させて、発色させ、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色した。切片を組織形態およびハイブリダイゼーションシグナルの同時評価を可能とする、暗視野・透過型光照明で検査した。Ｅ１８．５マウス胚の発達中の骨において、Ｂ７ＲＰ−２ ｍＲＮＡ発現を検出した（図８）。
【０２９０】
（実施例３：Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの産生）
（Ａ．細菌におけるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現）
ＰＣＲを、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列の５’末端および３’末端に対応するプライマーを使用して、その配列を増幅する。この増幅したＤＮＡ産物を、発現べクター中への挿入を可能にするために制限酵素部位を含むように改変し得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的な組換えＤＮＡ方法論を使用して、発現ベクター中に挿入する。ｌｕｘプロモーターおよびカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含む、例示的なベクター（例えば、ｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３））を、挿入されるＤＮＡの指向性クローニングのためにＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩで消化する。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株にエレクトロポレーションによって、連結された混合物を形質転換し、そして形質転換体を、カナマイシン耐性について選択する。選択されたコロニーからのプラスミドＤＮＡを単離し、そして挿入物の存在を確認するためにＤＮＡ配列決定に供する。
【０２９１】
形質転換した宿主細胞を、誘導前に、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ培地中で３０℃でインキュベートする。遺伝子発現を、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ｄ１−ホモセリンラクトンを最終濃度３０ｎｇ／ｍＬで添加することによって誘導し、続いて３０℃または３７℃のいずれかで６時間インキュベートする。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現を、培養物の遠心分離、細菌性ペレットの再懸濁および溶解、ならびにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による宿主細胞タンパク質の分析によって評価する。
【０２９２】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを含む封入体を、以下のように精製する。細菌細胞を遠心分離によってペレット化し、そして水中に再懸濁する。この細胞懸濁物を超音波処理によって溶解し、そして１９５，０００×ｇでの５〜１０分間の遠心分離によってペレット化する。この上清を捨て、そしてこのペレットを洗浄し、そしてホモジナイザーに移す。このペレットを、５ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ溶液（７５％液体Ｐｅｒｃｏｌｌおよび０．１５Ｍ ＮａＣｌ）に，一様に懸濁されるまでホモジナイズし、次いで、希釈し、そして２１，６００×ｇで３０分間遠心分離する。封入体を含む勾配画分を回収し、そしてプールする。この単離された封入体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２９３】
Ｅ．ｃｏｌｉ産生Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドに対応するＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の単一バンドを、ゲルから切り出し、そしてＮ末端アミノ酸配列を、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａら、１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１０−３５によって本質的に記載されるように決定する。
【０２９４】
（Ｂ．哺乳動物細胞におけるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現）
ＰＣＲを、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列の５’末端および３’末端に対応するプライマーを使用して、その配列を増幅する。この増幅したＤＮＡ産物を、発現ベクターへの挿入を可能にするために制限酵素部位を含むように改変し得る。このＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的な組換えＤＮＡ方法論を使用して、発現ベクターに挿入する。エプスタイン・バーウイルス複製起点を含む例示的な発現ベクター（ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、２９３−ＥＢＮＡ−１細胞中でのＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現のために使用し得る。増幅およびゲル精製されたＰＣＲ産物を、ｐＣＥＰ４ベクターに連結し、そしてリポフェクションによって２９３−ＥＢＮＡ細胞に導入する。トランスフェクトした細胞を、１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン中で選択し、そして得られた薬物耐性培養物を、コンフルエントまで増殖させる。次いで、この細胞を無血清培地中で７２時間培養する。馴化培地を除去し、そしてＢ７ＲＰ−２ポリペプチド発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２９５】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド発現を、銀染色によって検出し得る。あるいは、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを、エピトープタグ（例えば、ＩｇＧ定常ドメインまたはＦＬＡＧエピトープ）との融合タンパク質として産生し、このエピトープタグを、このペプチドタグに対する抗体を使用するウェスタンブロット分析によって検出し得る。
【０２９６】
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出すか、またはＢ７ＲＰ−２融合タンパク質を、エピトープタグに対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製し得、そして本明細書中に記載されるようなＮ末端アミノ酸配列分析に供する。
【０２９７】
（Ｃ．哺乳動物細胞におけるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現および精製）
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド発現構築物を、リポフェクションまたはリン酸カルシウムプロトコルのいずれかを使用して、２９３ ＥＢＮＡ細胞またはＣＨＯ細胞に導入する。
【０２９８】
産生されるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドに対する機能的研究を実施するために、多量の馴化培地を、ハイグロマイシン選択２９３ ＥＢＮＡクローンのプールから生成する。この細胞を、５００ｃｍ Ｎｕｎｃ Ｔｒｉｐｌｅ Ｆｌａｓｋ中で８０％コンフルエントまで培養した後に、１週間無血清培地へと交換し、その後この培地を回収する。馴化培地を回収し、精製まで−２０℃で凍結する。
【０２９９】
馴化培地を、以下に記載されるように、アフィニティークロマトグラフィーによって精製する。この培地を解凍し、次いで、０．２μｍのフィルターを通す。プロテインＧカラムを、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で平衡化し、次いで、濾過した培地をロードする。このカラムを、Ａ２８０の吸光度がベースラインに達するまでＰＢＳで洗浄する。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）でカラムから溶出し、そして１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で直ちに中和する。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを含む画分をプールし、ＰＢＳ中で透析し、そして−７０℃で保存する。
【０３００】
ヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチド−Ｆｃ融合ポリペプチドの第Ｘａ因子切断のために、アフィニティークロマトグラフィー精製タンパク質を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ８．０）中で透析する。制限プロテアーゼ第Ｘａ因子を、この透析したタンパク質に１／１００（ｗ／ｗ）で添加し、このサンプルを、室温で一晩消化する。
【０３０１】
（実施例４：Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドのインビトロ特徴付け）
骨石灰化の間、Ｂ７ＲＰ−２ ｍＲＮＡ発現の阻害活性を、頭蓋冠細胞においてデキサメタゾン、ビタミンＣ、およびβ−グリセロホスフェートで処置した後、試験した。頭蓋冠細胞を、新生児マウス（ＣＤ１株）から単離し、そして１０％ウシ胎仔血清、５０□Ｍ β−メルカプトエタノール、および抗生物質を含むα−必須最小（ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）培地中で培養した。デキサメタゾン（１０ｎＭ）およびビタミンＣ（５０□ｇ／ｍｌ）を、細胞がコンフルエントに達したときに培地に添加し、次いでこの培地を、１４日目まで一日おきに入れ換えた。１２日目に、β−グリセロホスフェート（１０ｍＭ）もまた添加した。１４日目に、骨石灰化の程度を、ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色によって決定した。可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドが、用量依存性様式で、小結節形成および石灰化をインビトロで阻害することが見出され（図９）、このことは、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドが、骨形成の調節に関与し得ることを示す。
【０３０２】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分にインフレームで融合されたＢ７ＲＰ−２の２つの細胞外Ｉｇドメインを含む組換えタンパク質（Ｂ７ＲＰ−２−Ｆｃ）を合成した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のリンパ節細胞を、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を使用して、Ｂ２２０＋細胞を枯渇化させた。精製したリンパ節Ｔ細胞を、Ｕ底９６ウェルプレート中で、プレート結合抗ＣＤ３（０．１μｇ／ｍｌ）および１０μｇ／ｍｌのプレート結合ヒトＩｇＧ１（アイソタイプコントロール）、Ｂ７ＲＰ−２−Ｆｃ、またはＢ７−２−Ｆｃ（ポジティブコントロール）を使用して活性化した。Ｔ細胞増殖を、７２時間のインキュベーションの期間の最後の８時間、３Ｈ−チミジンで細胞をパルスすることによってアッセイした。Ｂ７ＲＰ−２−Ｆｃは、コントロールに比べて５倍までＴ細胞増殖を阻害した（図１０Ａ）。培養上清における、インターロイキン−２（ＩＬ−２）産生（図１０Ｂ）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生（図１０Ｃ）を、ＥＬＩＳＡを使用して測定した。ＩＬ−２産生およびＩＦＮ−γ産生を、おそらくＴ細胞増殖の減少に起因して、同様に減少した（図１０Ｂおよび図１０Ｃ）。これらの結果は、Ｂ７ＲＰ−２がインビトロでのＴＣＲ媒介性Ｔ細胞増殖を阻害することを示す。
【０３０３】
（実施例５：Ｂ７ＲＰ−２のインビボでの特徴付け）
（Ａ．Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスの産生）
Ｂ７ＲＰ−２のインビボでの役割を、Ｂ７ＲＰ−２欠損マウスを作製することによって試験した。マウスＢ７ＲＰ−２ゲノムクローンを、プローブとして全長ラットＢ７ＲＰ−２ ｃＤＮＡを使用して、１２９／Ｊファージライブラリーから単離した。ターゲティングベクターを、Ｂ７ＲＰ−２の第２のＩｇドメインをコードするエキソンをネオマイシン耐性カセットと置換するように設計した（図１１）。Ｂ７ＲＰ−２の第２のＩｇドメインをコードするエキソンを含む、約３．２ｋｂゲノム配列（図１１において黒長方形）を、ＰＧＫプロモーター駆動性ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）によって置換した。ジフテリアトキシンＡ（ＤＴ−Ａ）をネガティブ選択のために使用した。ターゲティングベクターを、直接的なマイクロインジェクションによって、Ｅ１４胚性幹細胞（ＥＳ細胞）（１２９／Ｏｌａ）に導入し、そしてＥＳ細胞クローンを、相同組換えを受けたクローンを同定するためにＰＣＲによってスクリーニングした。
【０３０４】
選択されたＥＳクローンを、サザンブロット分析によって検証した。サザンブロッティングについて、Ｂ７ＲＰ−２（＋／＋）マウス、Ｂ７ＲＰ−２（＋／−）マウスおよびＢ７ＲＰ−２（−／−）マウス由来のＢｇｌ ＩＩ消化ゲノムＤＮＡを、図１１に示される５’隣接プローブにハイブリダイズさせた。Ｃ５７ＢＬ／６未分化胚芽細胞を、Ｂ７ＲＰ−２（＋／−）ＥＳ細胞と共に注入し、そして偽妊娠雌性マウスに移植した。得られたキメラマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配し、異型接合Ｆ１子孫を得、このＦ１子孫を交配し、Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスを生成した。２つの独立したＥＳクローンに由来するＢ７ＲＰ−２（−／−）マウスは、同じ表現型を示した。
【０３０５】
Ｂ７ＲＰ−２遺伝子の破壊を、Ｆ２子孫からのゲノムＤＮＡのサザン分析によって確認した（図１２）。抗Ｂ７ＲＰ−２抗体を、このマウスがＢ７ＲＰ−２タンパク質を産生しなかったことを検証するために使用した。ウサギポリクローナル抗体を、ラットＢ７ＲＰ−２−Ｆｃタンパク質に対して惹起させた。抗血清を、プロテインＡカラムを通して精製し、そして抗Ｆｃ抗体を、Ｆｃアフィニティーカラムを使用して回収した。Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスからのマウス胎性線維芽細胞（ＭＥＦ）のフローサイトメトリー分析は、Ｂ７ＲＰ−２タンパク質の非存在を確認した（図１３）。ＭＥＦを、抗Ｂ７ＲＰ−２ウサギＩｇＧおよびＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧで染色した。
【０３０６】
Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスを、予想されるメンデル比で得、そして正常なサイズ、成熟、および受胎能であることが見出された。骨髄、胸腺、リンパ節、脾臓、および末梢血におけるＴ細胞集団、Ｂ細胞集団、およびＮＫ細胞集団は、Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスにおいて正常であった。Ｃ５７ＢＬ／６×１２９／ＯｌａのＦ２動物およびＦ３動物を、次の分析のために使用した。
【０３０７】
（Ｂ．Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスにおけるＴ細胞応答）
Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスを、Ｂ７ＲＰ−２タンパク質の非存在が高められたＴ細胞媒介性過敏症に寄与するかどうかを決定するために使用した。Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞のいずれかによって駆動される気道炎症モデル、およびリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）感染に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を反映するフットパッドスエリング（ｆｏｏｔｐａｄ−ｓｗｅｌｌｉｎｇ）モデルを、Ｔ細胞応答を試験するために使用した。サイトカイン（Ｔｈ１偏向性またはＴｈ２偏向性）微小環境を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１２（Ｔｈ１）、またはＧＭ−ＣＳＦ単独（Ｔｈ２）の一過性アデノウイルス媒介性鼻腔内発現によって、Ｂ７ＲＰ−２（＋／＋）マウスおよびＢ７ＲＰ−２（−／−）マウスの気道内で確立した。適切なサイトカインｃＤＮＡを保有する複製欠損アデノウイルスの鼻腔内発現を、１日目（−）に開始した。（＋／＋）マウスおよび（−／−）マウスを、連続した１０日間（０〜９日目）において、オボアルブミン（ＯＶＡ）エアロゾル（０．９％生理食塩水中の１％重量／体積）に、２０分間曝露し、気道炎症を引き起こさせた。１１日目に、このマウスを屠殺し、そして気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）流体中の免疫細胞集団を、差示的に染色し、そして計数した。残存肺組織を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって、組織学的試験のためにプロセスした。いくつかの場合において、肺細胞を、コラーゲナーゼ処理によって遊離し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。エキソビボ脾臓細胞を、４００μｇ／ｍｌのＯＶＡの非存在下または存在下で５日間培養し、その後、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム）によってサイトカインの産生を測定した。
【０３０８】
Ｔｈ１条件下でのＯＶＡ感作の後、Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスは、Ｂ７ＲＰ−２（＋／＋）に比べて２．５倍より浸潤された免疫細胞を気道内に有した（図１４；全体）。リンパ球（図１４；リンパ球）、マクロファージ、および好中球の部分集団を、同程度まで増加させた。肺切片の組織学的試験は、Ｂ７ＲＰ−２の非存在下で増加した重篤度の浸潤を確認した（図１５；Ｔｈ１）。Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスの肺浸潤物中の、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の両方における活性化細胞（ＣＤ６９＋細胞）の割合を、コントロールと比較した（ＣＤ４＋Ｔ細胞の間では、それぞれ５９．５％および４７．２％；ＣＤ８＋Ｔ細胞の間では、それぞれ７６．７％および６５．９％；図１６）。
【０３０９】
Ｔｈ１条件下で感作されたＢ７ＲＰ−２（−／−）マウスから回収された脾臓細胞は、インビトロでＯＶＡで再刺激される場合、Ｂ７ＲＰ−２（＋／＋）脾臓細胞と比較して、約６０％を超えるＩＦＮ−γを産生した。しかし、Ｔｈ２条件下で、類似した数の肺浸潤免疫細胞を、Ｂ７ＲＰ−２（＋／＋）マウスおよびＢ７ＲＰ−２（−／−）マウスからのＢＡＬ流体および肺切片において見出した（図１４および図１５；Ｔｈ２）。好酸球増加症（Ｔｈ２−駆動性気道炎症の特徴）はまた、類似しており（図１５；Ｔｈ２；下パネル）、そしてＯＶＡ−刺激Ｂ７ＲＰ−２（＋／＋）脾臓細胞およびＢ７ＲＰ−２（−／−）脾臓細胞は、類似するレベルのＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を一定して産生した。従って、Ｔｈ１駆動性気道炎症において、Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスは、コントロールマウスより重篤な疾患を発症し、そしてＴ細胞活性化の増加を示すが、Ｔｈ２駆動性気道炎症においてはそうではない。
【０３１０】
ＣＴＬ媒介性過敏症反応におけるＢ７ＲＰ−２の役割を、Ｂ７ＲＰ−２（＋／＋）マウスおよびＢ７ＲＰ−２（−／−）マウスのフットパッドにＬＣＭＶを注射することによって試験した。フットパッドスエリングの程度および動力学は、遺伝子型間で、区別し得る（図１７）。これらのデータは、Ｂ７ＲＰ−２がＴｈ１媒介性応答をダウンレギュレーションすることに関与するが、Ｔｈ２媒介性過敏症反応またはＣＴＬ媒介性過敏症には関与しないことを示す。
【０３１１】
（実施例６：実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）におけるＢ７ＲＰ−２の役割）
Ｂ７ＲＰ−２の役割はまた、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）（別のＴｈ１駆動性疾患モデル）において調査される。ＥＡＥの誘導およびＥＡＥの臨床的スコアリングを、以下のように実施した。ＥＡＥを、ミエリン稀突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）のペプチド抗原呈示アミノ酸３５〜５５（Ｍ−Ｅ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ｙ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｆ−Ｓ−Ｒ−Ｖ−Ｖ−Ｈ−Ｌ−Ｙ−Ｒ−Ｎ−Ｇ−Ｋ（配列番号２９））でマウスを免疫することによって誘導した。Ｂ７ＲＰ−２（＋／＋）同腹仔およびＢ７ＲＰ−２（−／−）同腹仔（８〜１２週間）に、ＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ）中で乳化した３００μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチドおよび５００μｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを、０日目および７日目に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。マウスに、５００ｎｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）を、０日目および２日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＥＡＥ臨床スコアを、（中間レベルについて０．５の段階で）以下のように毎日測定した：０（臨床的徴候なし）；１（尾の緊張の消失）；２（不安定な歩行）；３（後肢麻痺）；４（後肢および前肢の麻痺）；５（死亡）。
【０３１２】
疾患発症の平均日数（臨床的スコアが１より大きい場合、１日目）は、Ｂ７ＲＰ−２（＋／＋）マウス（１８．４日；ｎ＝１４）よりＢ７ＲＰ−２（−／−）マウス（１６．１日；ｎ＝１６）においてより速く（図１８Ａ）、傾向は、同腹仔を比較した場合に明らかであった（図１８Ｂ）。より速い発症に関わらず、Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスは、疾患の末期までに、Ｂ７ＲＰ−２（＋／＋）マウスと同じ臨床的スコアを有した（図１８Ａ）。疾患発生率（（＋／＋）において１４／１６および（−／−）において１６／１８）または死亡率（（＋／＋）において１／１４対（−／−）において３／１６）はまた、等価であった。Ｂ７ＲＰ−２の非存在下でのＥＡＥの初期の発症は、Ｂ７ＲＰ−２がＴｈ１駆動性免疫応答を負に調節するという仮定に対する支持を提供する。
【０３１３】
（実施例７：Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスにおける細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答）
（Ａ．リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）特異的ＣＴＬ応答）
リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）またはインフルエンザウイルスに対する、抗ウイルス細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答に対するＢ７ＲＰ−２の効果をまた、インビボで試験した。最初のＣＴＬ応答について、Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスおよびＢ７ＲＰ−２（＋／＋）マウスに、２０００ｐｆｕのＬＣＭＶ（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ株）を静脈（ｉ．ｖ．）注射した。感染後８日目に、脾臓細胞を回収し、そしてエキソビボＣＴＬ活性を、ＬＣＭＶ糖タンパク質ペプチドｐ３３（Ｋ−Ａ−Ｖ−Ｙ−Ｎ−Ｆ−Ａ−Ｔ−Ｍ；配列番号３０）でパルスした５１Ｃｒ標識ＥＬ４細胞を使用する標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって測定した。ＬＣＭＶでの感染８日後のＢ７ＲＰ−２（−／−）マウス由来の脾臓細胞は、Ｂ７ＲＰ−２（＋／＋）マウス由来の脾臓細胞と同じレベルのエキソビボＣＴＬ活性を示した（図１９；初期）。
【０３１４】
Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスおよびＢ７ＲＰ−２（＋／＋）マウスにおけるＣＴＬ記憶応答を、フットパッドスエリングアッセイを使用して試験した。フットパッドスエリングについて、３０００ｐｆｕ ＬＣＭＶ（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ株）を、Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスおよびＢ７ＲＰ−２（＋／＋）マウスの後フットパッドに注射し、このフットパッドの厚さを、カリパーで測定した。記憶ＣＴＬ活性を測定するために、フットパッドスエリング実験のために使用されたマウスを、３０日目に屠殺し、その脾臓細胞を回収した。この回収された脾臓細胞を、１μＭのｐ３３ペプチドおよびラット脾臓細胞ＣｏｎＡ培養上清の存在下で、細胞を５日間培養することによって、インビトロで再刺激した。細胞傷害性を、上記のように測定した。Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスから回収した脾臓細胞において検出されるＣＴＬ活性のレベルは、Ｂ７ＲＰ−２（＋／＋）マウスから回収された脾臓細胞と同程度であった（図１９；記憶）。これらの実験は、ＬＣＭＶに対する正常初期ＣＴＬ応答および記憶ＣＴＬ応答を、Ｂ７ＲＰ−２の非存在下で上昇させ得ることを示す。
【０３１５】
（Ｂ．インフルエンザウイルス核蛋白質（ＮＰ）特異的ＣＴＬ応答）
ＬＣＭＶ感染に関連する強い抗原刺激が共刺激シグナルに対する必要性をマスクするという可能性を排除するために、インフルエンザウイルスに対するＣＴＬ応答を試験した。Ｂ７ＲＰ−２（−／−）マウスおよびＢ７ＲＰ−２（＋／＋）マウスを、２００ヘマグルチニン単位（ＨＡＵ）のインフルエンザＡ ＨＬｘ３１（Ｈ３Ｎ１）で腹腔内（ｉ．ｐ．）感染させた。インフルエンザウイルス核蛋白質（ＮＰ）特異的ＣＴＬの拡大を、抗ＣＤ８ ｍＡｂ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および四量体Ｈ−２Ｄｂ／ＮＰ３６６−３７４（Ａ−Ｓ−Ｎ−Ｅ−Ｎ−Ｍ−Ｅ−Ｔ−Ｍ；配列番号３１）（ＮＩＡＩＤ ＭＨＣ Ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）の感染の７日後および２１日後に染色した脾臓細胞のフローサイトメトリー分析によって、モニタリングした。一次インフルエンザウイルス感染および二次インフルエンザウイルス感染の間、ＮＰ３６６−３７４／Ｈ−２Ｄｂ−特異的ＣＴＬの拡大は、Ｂ７ＲＰ−２（＋／＋）マウスおよびＢ７ＲＰ−２（−／−）マウスで区別可能であった（図２０）。記憶ＣＴＬ応答について、Ｂ７ＲＰ−２（＋／＋）マウスおよびＢ７ＲＰ−２（−／−）マウス（４匹マウス／群）を、ＨＫｘ３１で感染させ、そして４週間後に、血清学的に異なるインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（これは、ＨＫｘ３１と同じＮＰ遺伝子を共有する）で再感染させた。再感染の７日後に脾臓細胞を回収し、四量体染色によって分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞間で、ＩＦＮ−γ産生細胞の数およびインビトロで最刺激される脾臓細胞の細胞傷害性に差異はなかった。
【０３１６】
（実施例８：抗Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド抗体の産生）
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドに対する抗体を、生物学的合成によって産生されたタンパク質または化学合成によって生成されたＢ７ＲＰ−２ペプチドでの免疫によって得ることができる。抗体生成に対する適切な手順は、ＨｕｄｓｏｎおよびＢａｙ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第２版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）に記載される手順を含む。
【０３１７】
抗体の産生のための１つの手順において、動物（代表的には、マウスまたはウサギ）にＢ７ＲＰ−２抗原（例えば、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド）を注射し、そしてＥＬＩＳＡによって決定されるような十分な血清力価レベルを有する抗体をハイブリドーマ産生について選択する。免疫された動物の脾臓を回収し、そして単一細胞懸濁物として調製し、そこから脾臓細胞を回収した。この脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞）に融合し、そしてまず２００Ｕ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、および４ｍＭグルタミンを含有するＤＭＥＭ中でインキュベートし、次いで、ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）中でインキュベートする。選択後、組織培養上清を、各融合ウェルからとり、そしてＥＬＩＳＡによって抗Ｂ７ＲＰ−２抗体産生について試験する。
【０３１８】
抗Ｂ７ＲＰ−２抗体を得るための代替的な手順（例えば、ヒト抗体の産生のためのヒトＩｇ遺伝子座を保有するトランスジェニックマウスの免疫、および合成抗体ライブラリー（例えば、抗体可変ドメインの変異誘発によって産生される合成抗体ライブラリー）のスクリーニング）もまた使用し得る。
【０３１９】
（実施例９：トランスジェニックマウスにおけるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの発現）
Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの生物学的活性を評価するために、肝臓特異的ＡｐｏＥプロモーターの制御下で、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする構築物を調製する。この構築物の送達は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドの機能に関する情報を与える、病理学的変化を引き起こすことが予想される。同様に、βアクチンプロモーターの制御下で、全長Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドを含む構築物を調製する。この構築物の送達は、遍在的な発現を生じることが予想される。
【０３２０】
これらの構築物を生成するために、ＰＣＲを、所望の配列の５’末端および３’末端に対応し、増幅産物の発現ベクターへの挿入を可能にする制限酵素部位を組込むプライマーを使用して、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅するために使用する。増幅の後に、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、ＰＣＲ産物をゲル精製し、適切な制限酵素部位で消化し、そして発現ベクターに組込む。例えば、増幅したＢ７ＲＰ−２ポリペプチド配列を、Ｇｒａｈａｍら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７：２７２−７４、およびＲａｙら、１９９１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２２６５−７３によって記載されるように、ヒトβ−アクチンプロモーターの制御下で発現ベクター中にクローニングし得る。
【０３２１】
連結後、反応混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株をエレクトロポレーションによって形質転換するために使用し、形質転換体を、薬物耐性について選択する。選択されたコロニーからのプラスミドＤＮＡを単離し、そして適切な挿入物の存在および変異の非存在を確認するためにＤＮＡ配列決定に供する。Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド発現ベクターを、２回のＣｓＣｌ密度勾配遠心分離によって精製し、適切な制限酵素で切断し、そしてＢ７ＲＰ−２ポリペプチド導入遺伝子を含む線状化されたフラグメントを、ゲル電気泳動によって精製する。この精製したフラグメントを、５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、および０．２ｍＭ ＥＤＴＡ中に、２ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁する。
【０３２２】
ＢＤＦ１×ＢＤＦ１交配マウス由来の単細胞胚を、（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２３６１４号）に記載されるように注入する。胚をＣＯ２インキュベーター中で一晩培養し、そして１５〜２０の二細胞胚を、偽妊娠ＣＤ１雌性マウスの卵管に移す。微量注入された胚の移植から得られる子孫を、以下のようにゲノムＤＮＡサンプル中に組込まれた導入遺伝子のＰＣＲ増幅によってスクリーニングする。耳の断片を、２０ｍＬの耳緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、および５００ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ）中、５５℃で一晩消化する。次いで、このサンプルを２００ｍＬのＴＥで希釈し、そして２ｍＬの耳サンプルを、適切なプライマーを有するＰＣＲ反応物中で使用する。
【０３２３】
８週齢において、トランスジェニックファウンダー動物およびコントロール動物を、剖検および病理学的分析のために屠殺する。脾臓の一部を回収し、そして全細胞ＲＮＡを、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して脾臓から単離し、そして導入遺伝子発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって決定する。脾臓から回収したＲＮＡを、以下のようにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用してｃＤＮＡに変換する。適切なプライマー（発現ベクター配列内のＢ７ＲＰ−２ポリペプチド導入遺伝子の３’に位置する）を、導入遺伝子転写物からｃＤＮＡ合成を開始するために使用する。トランスジェニックファウンダーおよびコントロール由来の１０ｍｇの全脾臓ＲＮＡを、１ｍＭのプライマーと７０℃で１０分間インキュベートし、そして氷上に配置する。次いで、反応物を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．１ｍＭ ＤＴＴ、および２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素を補充する。４２℃で５０分のインキュベーションの後、反応を、７２℃で１５分間加熱することによって停止し、そして２ＵのＲＮａｓｅＨで３７℃にて２０分間消化する。次いで、サンプルを、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドに特異的なプライマーを使用するＰＣＲによって増幅する。
【０３２４】
（実施例１０：トランスジェニックマウスにおけるＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの生物学的活性）
安楽死の前に、トランスジェニック動物を秤量し、イソフルオランによって麻酔し、そして血液を心臓穿刺によって取り出す。このサンプルを、血液学分析および血清化学分析に供する。Ｘ線撮影法を、終末全採血の後、実施する。全切開の後、主要な内臓器官を、重量分析に供する。
【０３２５】
全切開の後、組織（すなわち、肝臓、脾臓、膵臓、胃、胃腸管全体、腎臓、生殖器官、皮膚および乳腺、骨、脳、心臓、肺、胸腺、気管、食道、甲状腺、副腎、膀胱、リンパ節ならびに骨格筋）を回収し、そして組織学的試験のために１０％緩衝化Ｚｎ−ホルマリン中で固定化する。固定後、組織を、パラフィンブロック中で処理し、そして３ｍｍの切片を得る。全ての切片をヘマトキシリンおよびエオシン（ｅｘｏｓｉｎ）で染色し、次いで、組織学的分析に供する。
【０３２６】
トランスジェニックマウスおよびコントロールマウスの両方の脾臓、リンパ節およびパイアー斑を、以下のように、Ｂ細胞特異的抗体およびＴ細胞特異的抗体を用いて組織学的分析に供する。ホルマリン固定パラフィン包埋切片を、脱パラフィン処理し、そして脱イオン水中で水和する。この切片を３％過酸化水素でクエンチし、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｐｓｈａｗ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）でブロックし、そしてラットモノクローナル抗マウスＢ２２０およびラットモノクローナル抗マウスＣＤ３（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）中でインキュベートする。抗体結合を、ビオチン化ウサギ抗ラット免疫グロブリンおよび色原体としてＤＡＢ（ＢｉｏＴｅｋ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を有するペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）によって検出する。切片をヘマトキシリンで対比染色する。
【０３２７】
剖検後、トランスジェニック動物およびコントロール同腹仔由来のＭＬＮならびに脾臓および胸腺の切片を除去する。単一細胞懸濁物を、シリンジの平らな末端を用いて１００ｍｍナイロン細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）の底に対して組織をおだやかにすりつぶすことによって調製する。細胞を２回洗浄し、計数し、次いで各組織からの約１×１０６細胞を、２０μＬ容量中で０．５μｇのＣＤ１６／３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ）Ｆｃブロックと共に１０分間インキュベートする。次いで、サンプルを、ＣＤ９０．２（Ｔｈｙ−１．２）、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）、Ｇｒ−１、ＣＤ４、またはＣＤ８に対するＦＩＴＣまたはＰＥを結合体化したモノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）０．５μｇを有するＰＢＳ（Ｃａ＋およびＭｇ＋を含まない）、０．１％のウシ血清アルブミン、および０．０１％アジ化ナトリウム（１００μＬ容積）中にて２〜８℃で３０分間染色する。抗体結合の後、この細胞を洗浄し、次いでＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でフローサイトメトリーによって分析する。
【０３２８】
本発明は、好ましい実施形態に関して記載されているものの、バリエーションおよび改変は当業者が想起することが理解される。従って、添付される特許請求の範囲は、主張されるように本発明の範囲内に入る全てのこのような等価なバリエーションを含むことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０３２９】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトＢ７ＲＰ−２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を図示する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトＢ７ＲＰ−２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を図示する。
【図２Ａ】図２Ａは、マウスＢ７ＲＰ−２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）およびマウスＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号４）を図示する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、マウスＢ７ＲＰ−２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）およびマウスＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号４）を図示する。
【図３Ａ】図３Ａは、ラットＢ７ＲＰ−２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）およびラットＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号６）を図示する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ラットＢ７ＲＰ−２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）およびラットＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号６）を図示する。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ラットＢ７ＲＰ−２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）およびラットＢ７ＲＰ−２ポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号６）を図示する。
【図４Ａ】図４Ａは、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用して調製された、ヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチド（ｈｕＢ７ＲＰ−２；配列番号２）、マウスＢ７ＲＰ−２ポリペプチド（ｍｕＢ７ＲＰ−２；配列番号４）、およびラットＢ７ＲＰ−２ポリペプチド（ｒａＢ７ＲＰ−２；配列番号６）のアミノ酸配列アラインメントを図示しする。この配列は、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ ７．１．１アプリケーション（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ）をデフォルト設定で使用して、整列された。保存された残基が、四角で囲まれている。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用して調製された、ヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチド（ｈｕＢ７ＲＰ−２；配列番号２）、マウスＢ７ＲＰ−２ポリペプチド（ｍｕＢ７ＲＰ−２；配列番号４）、およびラットＢ７ＲＰ−２ポリペプチド（ｒａＢ７ＲＰ−２；配列番号６）のアミノ酸配列アラインメントを図示しする。この配列は、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ ７．１．１アプリケーション（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ）をデフォルト設定で使用して、整列された。保存された残基が、四角で囲まれている。
【図５】図５は、Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅに対するアミノ酸のＢＬＡＳＴ分析後に示された、ヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチド（配列番号２）、マウスＢ７ＲＰ−２ポリペプチド（配列番号４）、およびラットＢ７ＲＰ−２ポリペプチド（配列番号６）によって保有されるいくつかの保存されたドメインの位置を図示する。
【図６Ａ】図６Ａは、 ヒトブチロフィリン、サブファミリー１、メンバーＡ１（ｈｕ＿ＢＴＮｌＡ１；配列番号７；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１７２３）、ウシブチロフィリン前駆体（ｂｏ＿ＢＴＮ；配列番号８；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ１８８９２）、マウスブチロフィリン（ｍｕ＿ＢＴＮ；配列番号９；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０３８５１１）、ヒトブチロフィリン、サブファミリー２、メンバーＡ１（ｈｕ＿ＢＴＮ２Ａ１；配列番号１０；登録番号ＮＰ＿００８９８０）、ヒトブチロフィリン様タンパク質（ｈｕ＿ＢＴ３．２；配列番号１１；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣＣ０２６５２）、ヒトブチロフィリン、サブファミリー３、メンバーＡ２（ｈｕ＿ＢＴＮ３Ａ２；配列番号１２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００８９７８）、Ｇｒｕｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｂ−Ｇ様タンパク質（ｇｒ＿ＢＧ２；配列番号１３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０３３１０７）、およびヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチド（ｈｕ＿Ｂ７ＲＰ−２；配列番号２）のアミノ酸配列アラインメントを図示する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、 ヒトブチロフィリン、サブファミリー１、メンバーＡ１（ｈｕ＿ＢＴＮｌＡ１；配列番号７；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１７２３）、ウシブチロフィリン前駆体（ｂｏ＿ＢＴＮ；配列番号８；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ１８８９２）、マウスブチロフィリン（ｍｕ＿ＢＴＮ；配列番号９；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０３８５１１）、ヒトブチロフィリン、サブファミリー２、メンバーＡ１（ｈｕ＿ＢＴＮ２Ａ１；配列番号１０；登録番号ＮＰ＿００８９８０）、ヒトブチロフィリン様タンパク質（ｈｕ＿ＢＴ３．２；配列番号１１；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣＣ０２６５２）、ヒトブチロフィリン、サブファミリー３、メンバーＡ２（ｈｕ＿ＢＴＮ３Ａ２；配列番号１２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００８９７８）、Ｇｒｕｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｂ−Ｇ様タンパク質（ｇｒ＿ＢＧ２；配列番号１３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０３３１０７）、およびヒトＢ７ＲＰ−２ポリペプチド（ｈｕ＿Ｂ７ＲＰ−２；配列番号２）のアミノ酸配列アラインメントを図示する。
【図７】図７は、デキサメタゾン、ビタミンＣ、およびβ−グリセロホスフェートでの処置後、骨芽細胞のノーザンブロット分析によって検出されるＢ７ＲＰ−２ ｍＲＮＡの発現を図示する。
【図８】図８は、インサイチュハイブリダイゼーションによって検出される、Ｅ１８．５マウス胚中のＢ７ＲＰ−２ ｍＲＮＡの発現を図示する。
【図９】図９は、Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチドによる骨鉱化作用の阻害を図示する。細胞を、ポリペプチドなし（プレートＡ）、１０μｇ／ｍｌのＩｇＧｌアイソタイプコントロール（プレートＢ）、１μｇ／ｍｌの可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド（プレートＣ）または１０μｇ／ｍｌの可溶性Ｂ７ＲＰ−２ポリペプチド（プレートＤ）のいずれかで処理した。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、Ｔ細胞増殖、インターロイキン−２産生、およびインターフェロン−γ産生に対するＢ７ＲＰ−２の影響を図示する。
【図１１】図１１は、Ｂ７ＲＰ−２−／−マウスを作製するための、についての野生型マウスＢ７ＲＰ−２座、標的化ベクター、および変異Ｂ７ＲＰ−２対立遺伝子を図示する（Ｂ，Ｂｇｌ ＩＩ；Ｈ，Ｈｉｎｄ ＩＩＩ；Ｘ，Ｘｂａ Ｉ）。
【図１２】図１２は、Ｂ７ＲＰ−２遺伝子の破壊を確認するＦ２子孫由来のゲノムＤＮＡのサザン分析を示す。
【図１３】図１３は、示された遺伝子型のＭＥＦ細胞中のＢ７ＲＰ−２タンパク質発現のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１４】図１４は、サイトカイン誘導性気道炎症を有する、Ｂ７ＲＰ−２−／−マウスおよびＢ７ＲＰ−２＋／＋マウス由来の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の総細胞数およびリンパ球数を示す。
【図１５】図１５は、サイトカイン誘導性気道炎症を有するＢ７ＲＰ−２−／−マウスおよびＢ７ＲＰ−２＋／＋マウス由来の肺切片のヘマトキシリンおよびエキソシン染色を示す。
【図１６】図１６は、サイトカイン誘導性気道炎症を有するＢ７ＲＰ−２−／−マウスおよびＢ７ＲＰ−２＋／＋マウス（各グループにつき４匹のマウス）からプールされた肺浸潤物に基づく肺浸潤Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１７】図１７は、Ｂ７ＲＰ−２−／−マウスおよびＢ７ＲＰ−２＋／＋マウスのＬＣＭＶ誘導性足蹠腫脹を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、あるグループ（図１６Ａ）中の全てのマウスの平均臨床スコア、および同腹仔（図１６Ｂ）間で比較したＥＡＥ発症の時間；同一の同腹仔由来の個々のマウスを示す同一の列におけるＣｉ Ｃｉｒｃｌｅによって決定されるＢ７ＲＰ−２−／−マウスおよびＢ７ＲＰ−２＋／＋マウス中の実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の疾患原因を示し、表された結果は、４つの独立した実験の要約である。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、あるグループ（図１６Ａ）中の全てのマウスの平均臨床スコア、および同腹仔（図１６Ｂ）間で比較したＥＡＥ発症の時間；同一の同腹仔由来の個々のマウスを示す同一の列におけるＣｉ Ｃｉｒｃｌｅによって決定されるＢ７ＲＰ−２−／−マウスおよびＢ７ＲＰ−２＋／＋マウス中の実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の疾患原因を示し、表された結果は、４つの独立した実験の要約である。
【図１９】図１９は、注射後８日で収集された、Ｂ７ＲＰ−２−／−マウスおよびＢ７ＲＰ−２＋／＋マウス由来の脾細胞における、ＬＣＭＶに対するＣＴＬ応答、および注射後３０日で収集されそしてインビトロで５日間再刺激された、Ｂ７ＲＰ−２−／−マウスおよびＢ７ＲＰ−２＋／＋マウス由来の脾細胞における、ＬＣＭＶに対するメモリーＣＴＬ応答を図示する。
【図２０】図２０は、Ｂ７ＲＰ−２−／−マウスおよび＋／＋マウスから収集された脾細胞におけるインフルエンザウイルスに対するＣＴＬ応答およびＣＴＬメモリー応答を図示する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年1月15日(2008.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成の異常な調節が媒介する医学的状態または障害の治療、予防または改善のための医薬の製造のための、可溶性ポリペプチドの使用であって、前記可溶性ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２に記載の配列
（ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドの細胞外Ｉｇドメインの少なくとも１つを含む、配列番号２に記載のアミノ酸配列のフラグメント；
（ｃ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む配列番号２に記載のアミノ酸配列であって、前記少なくとも１つの保存的アミノ酸置換が、配列番号２の２０位、２９位、１０１位、１２０位、１８４位、２６０位、２６１位、２９１位、または３０６位に位置する前記アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２に記載のアミノ酸配列であって、前記Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮が配列番号２の約１０または約２０アミノ酸の欠失からなるアミノ酸配列
からなる前記使用。
【請求項２】
前記医学的状態または障害が、骨減少症、骨溶解または骨粗鬆症からの正味の骨量減少に媒介される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
免疫応答のダウンレギュレーションのための、またはＴ細胞増殖が媒介する医学的状態または障害の治療、予防もしくは改善のための医薬の製造のための、可溶性ポリペプチドをコードする核酸配列の使用であって、前記可溶性ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２に記載の配列
（ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドの細胞外Ｉｇドメインの少なくとも１つを含む、配列番号２に記載のアミノ酸配列のフラグメント；
（ｃ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む配列番号２に記載のアミノ酸配列であって、前記少なくとも１つの保存的アミノ酸置換が、配列番号２の２０位、２９位、１０１位、１２０位、１８４位、２６０位、２６１位、２９１位、または３０６位に位置する前記アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２に記載のアミノ酸配列であって、前記Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮が配列番号２の約１０または約２０アミノ酸の欠失からなるアミノ酸配列
からなり、
前記Ｔ細胞増殖が媒介する医学的状態または障害が、自己免疫疾患、移植片の生存、慢性炎症疾患および癌からなる群より選択される
前記使用。
【請求項４】
正味の骨量減少を特徴とする骨疾患が媒介する医学的状態または障害の治療、予防または改善のための医薬の製造のための、可溶性ポリペプチドをコードする核酸配列の使用であって、前記可溶性ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２に記載の配列
（ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドの細胞外Ｉｇドメインの少なくとも１つを含む、配列番号２に記載のアミノ酸配列のフラグメント；
（ｃ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む配列番号２に記載のアミノ酸配列であって、前記少なくとも１つの保存的アミノ酸置換が、配列番号２の２０位、２９位、１０１位、１２０位、１８４位、２６０位、２６１位、２９１位、または３０６位に位置する前記アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２に記載のアミノ酸配列であって、前記Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮が配列番号２の約１０または約２０アミノ酸の欠失からなるアミノ酸配列
からなる前記使用。
【請求項５】
前記免疫応答のダウンレギュレーションが、Ｔｈ−１媒介性である、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記免疫応答のダウンレギュレーションが、Ｔｈ−２またはＣＴＬ媒介性過敏症反応をダウンレギュレーションしない、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記核酸配列が、少なくとも配列番号１に記載の配列の１３５〜１０８２位のヌクレオチドを含む、請求項３または４に記載の使用。
【請求項８】
正味の骨量減少が媒介する医学的状態または障害が、骨減少症、骨溶解または骨粗鬆症である、請求項４に記載の使用。