(57)【要約】【課題】本発明は、癌の原発腫瘍に対し有効な治療剤、より詳細には癌の予防・治療に有効なＮＫ４遺伝子治療剤及び組換えＮＫ４蛋白製剤を提供する。また、本発明は、癌の転移に対しても有効な治療剤、より詳細には癌転移の予防・治療に有効なＮＫ４遺伝子治療剤及び組換えＮＫ４蛋白製剤を提供する。  さらに、本発明は、癌を含む血管新生により生じる疾患に対し有効な治療剤、より詳細には血管新生により生じる疾患に対し有効なＮＫ４遺伝子治療剤及び組換えＮＫ４蛋白製剤を提供する。【解決手段】配列番号：１または配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含有するＤＮＡ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１製剤中に下記ＤＮＡが０．０１〜２０００ｍｇ含まれるように、以下の(a)、又は(b)を含む抗癌剤。
(a)  配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦアンタゴニスト活性及び血管新生抑制作用を有するＤＮＡを含有する組換え発現ベクター
(b)  (a)のベクターを含有するリポソーム
【請求項２】
発現ベクターがアデノウィルスベクターである請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
胃癌の治療剤である請求項１又は２に記載の抗癌剤。
【請求項４】
さらに他の抗腫瘍剤を含む請求項１〜３のいずれかに記載の抗癌剤。
【請求項５】
１製剤中に下記ＤＮＡが０．０１〜２０００ｍｇ含まれるように、以下の(a)、又は(b)を含む血管新生抑制剤。
(a)  配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦアンタゴニスト活性及び血管新生抑制作用を有するＤＮＡを含有する組換え発現ベクター
(b)  (a)のベクターを含有するリポソーム
【請求項６】
発現ベクターがアデノウィルスベクターである請求項５に記載の血管新生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＫ４をコードするＤＮＡを利用して癌または／および血管新生による疾患を予防・治療するための遺伝子治療剤に関する。より詳細には、ＮＫ４をコードするＤＮＡを生体の細胞内または／および生体内に導入することにより腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生を抑制する遺伝子治療剤及び遺伝子治療方法に関する。
また、本発明は、遺伝子組換え技術を応用してＮＫ４をコードするＤＮＡを含有する組換え発現ベクター、該組換え発現ベクターで形質転換した形質転換体、抗癌剤または／および血管新生抑制剤として有用な遺伝子組換えＮＫ４を大量かつ経済的に供給する技術に関する。
さらに、本発明は、癌または／および血管新生による疾患を予防・治療するための組換えＮＫ４蛋白製剤に関する。より詳細には、腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生を抑制する組換えＮＫ４蛋白製剤及び治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療には、外科的療法、化学療法、放射線療法、あるいはこれらを組み合わせた集学的療法等が行われている。
一方、癌で亡くなる人の多くは、原発腫瘍ではなく、原発腫瘍から遊離した癌細胞が他の臓器に転移することにより命を落とす。
すなわち、原発腫瘍を早期に発見できれば外科的療法により癌を取り除くことは可能であるが、膵臓癌や肺癌のような転移しやすい癌では、原発腫瘍のサイズが小さくても、発見されたときにはすでに目に見えないほどの小さな転移癌を形成していることが多く、これらを外科的に取り除くことは困難である。また、抗癌剤を用いる化学療法や放射線療法は、本来癌細胞を直接殺すことが目的なので、このような治療で原発腫瘍が一時的に小さくなったとしても、耐性癌の再発や、生き残った癌の転移を防ぐことは困難である。さらに、抗癌剤や放射線治療は、癌細胞だけではなく正常細胞をも殺す結果、激しい副作用を伴い患者の生活の質や免疫力を低下させる。
このような致命的な癌転移について満足のいく治療法がないのが現状であり、癌転移の阻止に有効な薬剤の開発が切望されている。
【０００３】
癌転移の機構に関しては過去に多くの研究が行われている。癌の多くは上皮組織で発生し、癌細胞が原発腫瘍から離脱し、上皮組織を区切っている基底膜を破り、周囲の組織へ浸潤し、血管やリンパ管に侵入し血液やリンパ液の流れによって遠隔の組織に運ばれ、再び血管やリンパ管から血管新生を伴いながら組織に浸潤・成長し、転移が成立する。
【０００４】
癌転移抑制剤の開発にはこれらの各プロセスのいずれかを阻止すればよいと考えることができる。例えば、転移先の血管内皮細胞との接着を抑制する物質[Iwamoto. Y et al., Science, 1132-1134 (1987)]、血管新生阻害剤[Cao.Y et al., J. Clin. Invest., 101, 1055-1063(1988)]、癌細胞の浸潤を抑制する物質（特開平３―３１２１４）、基底膜分解酵素の阻害物質[Irimura. T ，Nakajima. M and Nicolson G.L., Biochemistry, 25, 5322-5328(1989)、特開平５−１９４４１４]等が挙げられる。
【０００５】
血管新生は既存血管の毛細血管増殖により生じる。血管新生は胚発生、創傷治癒、及び組織又は臓器再生等の多数の生理学的プロセスに不可欠である。一方、腫瘍成長等の病態や、遠位部位への腫瘍内転移では血管新生の異常増殖が生じる。腫瘍血管形成の開始は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ），塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）等によって誘発されることが知られている。
【０００６】
ＨＧＦ（Hepatocyte growth factor）は、マイトゲン活性、モートゲン活性、モルフォゲン活性及び血管新生作用を有し、癌細胞をとりまく間質細胞との総合作用（tumor-stroma relationship）により、腫瘍の浸潤、転移を誘発することが知られている[Nakamura. T et al., Cancer Res., 57, 3305-3313(1997)、Jiang. W.G et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol., 29, 209-248(1999)]。ＨＧＦは、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体に結合し、チロシンリン酸化により腫瘍の浸潤、転移を誘発する[Jiang. W.G et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol., 29, 209-248(1999)]。ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体は癌細胞において、しばしば過剰に発現していることが知られている[Di. Renzo et al., Oncogene, 6, 1997-2003(1991)、Di. Renzo et al., Cancer Res., 55, 1129-1138(1995)、Nakajima. M et al., Cancer, 85, 1894-1902(1999)]。
【０００７】
最近、癌治療に関し腫瘍休眠療法が注目を浴びている。腫瘍休眠療法とは、血管新生阻害剤を用いて、癌細胞を休眠状態にするものである。血管新生阻害剤は、癌細胞を直接殺傷するのではなく、血管新生を阻害することにより、癌細胞の成長に必要な栄養、酸素の供給経路を絶ち、アポトーシスを誘導し、癌細胞を休眠状態にするものであり、血管新生阻害剤としてアンジオスタチン[Cao.Y et al., J. Clin. Invest., 101, 1055-1063(1988)]、エンドスタチン[Blezinger. P et al., Nat. Biotechnol., 17, 343-348(1999)]等が知られている。
【０００８】
ＮＫ４は、ＨＧＦのα鎖のＮ末端ヘアピンドメインと４つのクリングルドメインを有し、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体に結合し、ＨＧＦのアンタゴニストとして作用する[Date.K et al., FEBS Lett, 420, 1-6(1997)、Date.K et al., Oncogene, 17, 3045-3054(1998)]。ＨＧＦアンタゴニスト活性により腫瘍浸潤、転移を抑制し、また、ＨＧＦアンタゴニスト活性とは別のメカニズムでＨＧＦだけではなく、ＶＥＧＦやｂＦＧＦによる血管新生をも抑制することが知られている[Kuba. K et al., Cancer. Res., 60, 6737-6743(2000)]。
【０００９】
一方遺伝子の生体内に対する導入技術の進歩と共に遺伝子治療という新しい治療分野が確立されようとしている。すでに、癌治療を目的とした遺伝子治療は、多数行われているが、その大半は自殺遺伝子を癌細胞に導入することにより癌細胞を殺傷させることを目的としたものである。しかし、すべての癌細胞で目的の遺伝子を発現させることは困難であり、また、化学療法や放射線療法と同様、一時的な癌の退縮が果たせたとしても、残された癌細胞の浸潤や転移を阻止することはできず、癌の浸潤、転移に対し有望な遺伝子治療法は未だ確立されていない。
【００１０】
また、遺伝子治療においては、ウイルスベクターが主に用いられているが、ウイルスベクターは腫瘍細胞特異性がない。従って、腫瘍標的能力のないウイルスベクターは転移性疾患に到達する能力がないので、使用上、直接又は局所投与に限定される。
【００１１】
ＮＫ４をコードするＤＮＡを用いた遺伝子治療については未だ知られておらず、又、薬理作用を有するか否か、遺伝子治療が可能であるかについても不明であった。
【００１２】
また、ＮＫ４を蛋白製剤として利用するには大量のＮＫ４が必要とされている。しかしながら、ＮＫ４をコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込んだ、組換え発現ベクターを形質転換した形質転換体が、生物学的活性を有する該ＮＫ４を発現するか否か、遺伝子組換え技術を用いて大量かつ経済的に取得することができるか否かについては知られていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、癌の原発腫瘍に対し有効な治療剤、より詳細には癌の予防・治療に有効なＮＫ４遺伝子治療剤及び組換えＮＫ４蛋白製剤を提供することを目的とする。また、本発明は、癌の転移に対しても有効な治療剤、より詳細には癌転移の予防・治療に有効なＮＫ４遺伝子治療剤及び組換えＮＫ４蛋白製剤を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、癌を含む血管新生により生じる疾患に対し有効な治療剤、より詳細には血管新生により生じる疾患に対し有効なＮＫ４遺伝子治療剤及び組換えＮＫ４蛋白製剤を提供することを目的とする。
本発明の他の目的はＮＫ４をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え発現ベクター、該組換え発現ベクターを保持する形質転換体、該ＤＮＡを用いる組換えＮＫ４の製造法、該製造法により製造された組換えＮＫ４、ＮＫ４とｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体との結合活性を促進する物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法により得られる物質、又は、スクリーニングにより得られる物質を含有してなる医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、ＮＫ４をコードする配列番号：１又は配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡを腫瘍組織または／および腫瘍細胞、正常組織または／および正常細胞、又は、生体内に導入することにより、ＨＧＦアンタゴニスト活性による腫瘍の浸潤抑制や転移の阻止及びＨＧＦアンタゴニスト活性とは別のメカニズムによる血管新生の抑制により、腫瘍の成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生が抑制されることを見出した。
また、本発明者らは、ＮＫ４をコードする配列番号：１又は配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡを発現ベクターに組み込み、宿主に形質転換させることにより遺伝子組換え技術を応用して大量にかつ経済的に組換えＮＫ４を取得することができ、得られた組換えＮＫ４を卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、乳癌、大腸癌等の予防・治療に用いることができることを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ね、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１）  配列番号：１または配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（２）  配列番号：１または配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡである前記（１）記載のＤＮＡ、
（３）  前記（１）または（２）記載のＤＮＡを含有する組換え発現ベクター、
（４）  発現ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０またはプラスミドである前記（３）記載の組換え発現ベクター、
（５）  前記（１）若しくは（２）記載のＤＮＡまたは前記（３）若しくは（４）記載の組換え発現ベクターを含有するリポソーム、
（６）  前記（３）または（４）記載の組換え発現ベクターで形質転換した形質転換体、
（７）  宿主が細菌、酵母、植物細胞または哺乳動物細胞である前記（６）記載の形質転換体、
（８）  前記（６）または（７）記載の形質転換体を培養し、前記（１）記載のＤＮＡにコードされる蛋白質を生成せしめることを特徴とする前記（１）記載のＤＮＡにコードされる蛋白質の製造法、
（９）  前記（８）記載の製造法により得られた組換え蛋白質、
（１０）  前記（１）若しくは（２）記載のＤＮＡ、前記（３）若しくは（４）記載の組換え発現ベクター、前記（５）記載のリポソーム、前記（６）若しくは（７）記載の形質転換体または前記（９）記載の組換え蛋白質を含有してなる医薬、
（１１）  抗癌剤である前記（１０）記載の医薬、
（１２）  卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、肉腫、グリオーマまたはメラノーマの予防・治療剤である前記（１０）記載の医薬、
（１３）  血管新生抑制剤である前記（１０）記載の医薬、
（１４）  前記（１）若しくは（２）記載のＤＮＡ、前記（３）若しくは（４）記載の組換え発現ベクター、前記（５）記載のリポソーム、前記（６）若しくは（７）記載の形質転換体または前記（９）記載の組換え蛋白質と、他の抗腫瘍剤とを組合わせてなる医薬、
（１５）  卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、肉腫、グリオーマまたはメラノーマの予防・治療剤である前記（１４）記載の医薬、
（１６）  哺乳動物に前記（１）若しくは（２）記載のＤＮＡ、前記（３）若しくは（４）記載の組換え発現ベクター、前記（５）記載のリポソーム、前記（６）若しくは（７）記載の形質転換体または前記（９）記載の組換え蛋白質の有効量を投与することを特徴とする癌疾患の予防・治療方法、
（１７）  さらに他の抗腫瘍剤の有効量を投与する前記（１６）記載の予防・治療方法、
（１８）  哺乳動物に前記（１）若しくは（２）記載のＤＮＡ、前記（３）若しくは（４）記載の組換え発現ベクター、前記（５）記載のリポソーム、前記（６）若しくは（７）記載の形質転換体または前記（９）記載の組換え蛋白質の有効量を投与することを特徴とする癌の転移防止方法、
（１９）  哺乳動物に前記（１）若しくは（２）記載のＤＮＡ、前記（３）若しくは（４）記載の組換え発現ベクター、前記（５）記載のリポソーム、前記（６）若しくは（７）記載の形質転換体または前記（９）記載の組換え蛋白質の有効量を投与することを特徴とする血管新生抑制方法、
（２０）  前記（１）記載のＤＮＡにコードされる蛋白質とｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体を用いることを特徴とする前記（１）記載のＤＮＡにコードされる蛋白質のｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体に対する結合活性を促進する物質のスクリーニング方法、
（２１）  前記（２０）記載のスクリーニング方法を用いて得られる、請求項１記載のＤＮＡにコードされる蛋白質のｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体に対する結合活性を促進する物質、
（２２）  前記（２１）記載の物質を含有してなる医薬、
に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のＮＫ４をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え発現ベクター、該ＤＮＡを含有する人工ベクター、該ＤＮＡを含有する組換え発現ベクターで形質転換した形質転換体を含有する医薬によれば、ヒト又はマウス、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ等の動物に対し、腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生抑制により、高い抗腫瘍性を発揮し得、癌疾患の予防・治療に有用である他、血管新生による疾患の予防・治療においても有用である。
また、本発明のＮＫ４をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え発現ベクター、該ＤＮＡを含有する人工ベクター、該ＤＮＡを含有する組換え発現ベクターで形質転換した形質転換体を含有する医薬を腫瘍組織又は腫瘍細胞内に投与すれば、高い濃度でＮＫ４を存在させることができ、治療の効果があがる。一方、ＮＫ４をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え発現ベクター、該ＤＮＡを含有する人工ベクター、該ＤＮＡを含有する組換え発現ベクターで形質転換した形質転換体を含有する医薬によれば、生体内の組織又は細胞内で産生されたＮＫ４が他の組織又は細胞に作用し、原発腫瘍だけではなく、転移癌に対しても浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生抑制効果を奏することができる。
さらに、ＮＫ４は生体中に存在するＨＧＦの断片であることから、導入するＤＮＡ及び産生される蛋白質の免疫拒絶反応を抑えることができ、安全性が高いといえる。
従って、本発明は、癌または／および血管新生による疾患の遺伝子治療に大いに貢献することができる。
【００１７】
また、ＮＫ４をコードするＤＮＡを含有する組換え発現ベクターを宿主に導入することにより、今まで困難であった生物学的活性を有する組換えＮＫ４を大量、安定かつ容易に生産することが可能となり、組換えＮＫ４による腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生抑制により、癌または／および血管新生による疾患の予防・治療剤、及び、癌の転移防止剤として大いに貢献することができる。
【００１８】
さらに、本発明のＮＫ４とｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体との結合活性を促進する物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法を用いて得られる物質、又は、スクリーニングにより得られる物質を含有してなる医薬は、本発明の組換えＮＫ４又はそれをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え発現ベクター、該ＤＮＡを含有する人工ベクター、該ＤＮＡを含有する組換え発現ベクターで形質転換した形質転換体、形質転換体により産生された組換えＮＫ４を含有する抗癌剤及び血管新生抑制剤の効果をさらに有用なものとすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
配列番号：１で表される塩基配列は、ＮＫ４をコードするＤＮＡの一例である。ＮＫ４は、ＨＧＦのα鎖のＮ末端ヘアピンドメインと４つのクリングルドメインからなる蛋白質をいう。ＮＫ４は、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体に結合し、ＨＧＦアンタゴニスト活性により腫瘍の浸潤、転移を抑制する。また、ＨＧＦアンタゴニスト活性とは別のメカニズムで、血管新生抑制作用を有する。
【００２０】
配列番号：２で表される塩基配列は、ＮＫ４をコードするＤＮＡの一例である。配列番号：２で表される塩基配列は配列番号：１で表される塩基配列の３９１番目から４０５番目までの塩基が欠失しているものである。配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡにより産生される蛋白質もＨＧＦアンタ
ゴニスト活性及び血管新生抑制作用を有する。
【００２１】
本発明においては、上記の配列番号：１又は配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡの他にも、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも本発明のＮＫ４をコードするＤＮＡの範囲内である。すなわち、種々の人為的処理、例えば、部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異、欠失、連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が配列番号：１又は配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＨＧＦアンタゴニスト活性及び血管新生抑制作用を有する蛋白質を産生できれば本発明のＮＫ４をコードするＤＮＡの範囲内ものである。
具体的には、一般に１つのアミノ酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するため、配列番号：１又は配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡとは異なる塩基配列を含有するＤＮＡであっても、ＨＧＦアンタゴニスト活性及び血管新生抑制作用を有する蛋白質を産生できれば本発明のＮＫ４をコードするＤＮＡの範囲内のものである。
【００２２】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、上記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍ程度の塩化ナトリウム存在下、約６５℃程度でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる）を用い、約６５℃程度の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University(1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。
上記の配列番号：１又は配列番号：２で表される塩基配列とハイブリダイズするＤＮＡとして具体的には、配列番号：１又は配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列と少なくとも約７０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは約９０％以上の相同性を有するＤＮＡ、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００２３】
また、前記した配列番号：１又は配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされる蛋白質であって、ＨＧＦアンタゴニスト活性及び血管新生抑制作用を有する蛋白質もまた本発明のＮＫ４の範囲内である。
すなわち、ＮＫ４のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または／および付加されたアミノ酸配列を有するものであっても、ＨＧＦアンタゴニスト活性及び血管新生抑制作用を有する蛋白質は本発明のＮＫ４の範囲内である。
かかる蛋白質は、Molecular Cloning、A laboratory Manual Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Products in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons (1987-1997)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315(1985)、Nucleic Acids Resarch, 13, 4431(1985)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 488(1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、上記ＨＧＦアンタゴニスト活性及び血管新生抑制活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより製造することができる。
欠失、置換または／および付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、１個から数十個、好ましくは１個から３０個、さらに好ましくは１個から１０個、特に1個から数個のアミノ酸であることが好ましい。また、欠失、置換または／および付加される塩基の数は特に限定されないが、１個から数十個、好ましくは１個から９０個、さらに好ましくは１個から３０個、特に１個から数個の塩基であることが好ましい。
また、Ｎ末端アミノ酸として修飾アミノ酸残基ピログルタメートを有するものも本発明のＮＫ４の範囲内である。
【００２４】
なお、以下の遺伝子工学又は生物工学の基本操作については、市販の実験書、例えば、遺伝子マニュアル  講談社、高木康敬編  遺伝子操作実験法  講談社、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring harbor Laboratory）(1982)、モレキュラー・クローニング第２版（Molecular Cloning, 2nd ed.）、コールドスプリング・ハーバーラボラトリー（Cold Spring harbor Laboratory）(1989)、メッソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymol.）,194 (1991)、実験医学別冊・酵母による遺伝子実験法  羊土社(1994)等に記載された方法に従って行うことができる。
【００２５】
まず第一に、前記したＮＫ４をコードするＤＮＡを得る必要がある。ＮＫ４をコードするＤＮＡは、例えば、以下のようにして得ることができる。
例えば、公知のＨＧＦの塩基配列に基づいたプライマーを調整し、ヒトの組織又は細胞に含まれるＨＧＦ ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーから選択したＨＧＦｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法［PCR Protocols, Academic Press (1990)］を用いてＤＮＡの増幅を行い、上記のＮＫ４をコードするＤＮＡを取得することができる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド等いずれであってもよい。また、ヒトの組織又は細胞に含まれるｍＲＮＡから直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することもできる。また、公知のＨＧＦの塩基配列情報から従来公知の方法を用いて化学合成により得ることもできる。化学合成法としては、例えば、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機 ｍｏｄｅｌ  ３９２（パーキン・エルマー株式会社製）等のＤＮＡ合成機で化学合成する方法が挙げられる。
【００２６】
また、公知のＨＧＦのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって、ｃＤＮＡライブラリーから目的とするＤＮＡを増幅する方法、又は、ＨＧＦのＤＮＡ断片若しくは合成ＤＮＡを標識したもの（プローブ）とのハイブリダイゼーションによって選別する方法等が挙げられる。
【００２７】
次に、上記のようにして得られたＮＫ４をコードするＤＮＡを含有する組換え発現ベクターを構築する。本発明の組換え発現ベクターは上記ＮＫ４をコードするＤＮＡと該ＤＮＡ発現のための発現ベクターから構成される。
【００２８】
ＮＫ４をコードするＤＮＡは、上記に記載した方法によって得ることができる。
ＮＫ４をコードするＤＮＡは、そのまま、あるいは、所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加して使用することができる。該ＤＮＡは５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終始コドンとしてのＴＡＡ，ＴＡＧまたはＴＧＡを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終始コドンは、適当なＤＮＡアダプターを用いて該ＤＮＡに付加することができる。さらに、５’末端側には、ポリアデニル化配列を有していることが好ましい。
【００２９】
発現ベクターは、ＮＫ４をコードするＤＮＡを発現させるため、または発現に有利になるように、通常は、発現ベクターに調節配列を付加したものである。各々の調節配列はベクターに対して内在性であっても外来性であってもよい。
このような調節配列としては、シグナル配列、プロモーター、プロペプチド配列、エンハンサー、選択マーカー、ターミネーター等を挙げることができるが、これらに限定されない。調節配列には、ＮＫ４をコードするＤＮＡとの連結、及び上記調節配列の間の連結が容易になるように、リンカーをもたせることもできる。
【００３０】
なお、シグナル配列を組み込むことにより、生体細胞内又は宿主細胞内に産生されたＮＫ４を生体細胞外又は宿主細胞外に分泌することができる。すなわち、シグナル配列によりＮＫ４がシグナルペプチドを付加した形で産生することとなり、その結果、ＮＫ４を生体細胞外又は宿主細胞外に分泌することができる。ＮＫ４は分泌蛋白質であり、生体外にＮＫ４を分泌させるためにはシグナル配列は必須である。このシグナル配列により、ＮＫ４は積極的に細胞外へ分泌されて、当該細胞以外の遠く離れた細胞に対しても、ＮＫ４により腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生を抑制することができる。
シグナル配列を付加する方法としては、自体公知の方法を用いて行うことができ、例えば、J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 (1990)、特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法が挙げられる。
シグナル配列は好ましくは宿主細胞により認識され、かつ、プロセシングされるものである。宿主がエッシェリシア属（Escherichia）である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列等が、宿主がバチラス属(Bacillus)である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列等が、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列等が、宿主が哺乳動物細胞である場合には、ＨＧＦ・シグナル配列、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列等がそれぞれ利用できる。本発明においては、特に、ヒト由来のＨＧＦシグナル配列を利用するのが好ましい。
【００３１】
プロモーターは、翻訳開始コドンの上流に位置する非翻訳配列であり、特定のＤＮＡの転写をコントロールする。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主がエッシェリシア属（Escherichia）である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター等が、宿主がバチラス属(Bacillus)である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。
また、哺乳動物細胞を宿主として用いる場合は、ラウス肉腫ウイルス（ウイルスＲＳＶ）、ＭＰＳＶ、ポリオマーウイルス、鶏頭ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＳＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス等のウイルスゲノムから得られるプロモーター、メロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。また、高等哺乳動物宿主を用いる際には、好ましくは、ベクターにエンハンサーを導入する。エンハンサーを導入することにより転写が増大する。エンハンサーとしては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーター／エンハンサー、ポリオマーエンハンサー、アデノウイルスのエンハンサー等が挙げられる。
【００３２】
選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ＤＨＦＲ−）細胞を用いてＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
【００３３】
組換え発現ベクターは、一般的には、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、哺乳動物細胞等で蛋白質を発現させることのできるＤＮＡあるいはＲＮＡウイルスベクターやプラスミドベクターを用いて、構築することができる。組換え発現ベクターは、例えば、目的とするＮＫ４をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに連結することにより構築することができる。組換え発現ベクターは、公知技術[Molecular Cloning、Cold Spring harbor Laboratory、A laboratory manual(1989)]に従って構築することができる。
【００３４】
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、例えば、ｐＣＲ４、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等が、枯草菌由来のプラスミド、例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等が、酵母由来プラスミド、例えば、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等が、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス等の他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が用いられる。
【００３５】
上記のＮＫ４をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え発現ベクター又は該ＤＮＡを含有する人工ベクター（例えば、リポソーム）は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。
遺伝子治療に用いる際には、ヒトを含む哺乳動物の細胞内で蛋白質を発現でき、かつ、安全性の高いＤＮＡ若しくはＲＮＡウイルスベクター又はプラスミドベクターを用いるのが好ましい。
【００３６】
遺伝子治療において好ましいウイルスベクターとしては，アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０等が挙げられる。
【００３７】
より好ましくは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）若しくはアデノウイルスが挙げられる。アデノウイルスには種々の血清型が存在するが、本発明では２型若しくは５型ヒトアデノウイルスを使用することが好ましい。アデノウイルスは、感染効率が他のウイルスベクターに比べて高いこと、分裂していない細胞に感染することができること及び細胞のゲノムに組み込まれないことが知られており、この観点からアデノウイルスベクターを用いることはさらに好ましい。
【００３８】
ウイルスベクターはウイルス遺伝子を完全又はほぼ完全に欠失する複製欠失ウイルスが好ましい。アデノウイルスベクターは少なくともＥ１領域が非機能的であることが好ましい。また、他の領域も改変してよく、特にＥ３領域（ＷＯ９５／０２６９７）、Ｅ２領域（ＷＯ９４／２８９３８）、Ｅ４領域（ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７）又は後期遺伝子Ｌ１からＬ５の任意のものを改変することができる。複製欠失ウイルスのような改変ウイルスベクターは、自体公知の方法により作成することができる。また、改変ウイルスベクターは、自体公知の方法により回収・精製することができる。なお、例えば、特表平１１−５１４８６６、特表平１１−５０６３１１、特表平９−５００５２４、特表平８−５０１７０３、特表平８−５０８６４８、特開平８−３０８５７５等の改変ウイルスベクターを用いることもできる。
【００３９】
これらの改変ウイルスベクターにＮＫ４をコードするＤＮＡを導入し、生体内又は細胞に感染させることによって、生体内又は細胞内に遺伝子を導入することが可能である。
ウイルスベクターの調整法、遺伝子の導入方法は、別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社（１９９６）、あるいは、別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社（１９９７）等に記載されている。
【００４０】
発現ベクターを裸のプラスミドとしてｉｎ  ｖｉｖｏ導入することもできる。遺伝子治療において好ましいプラスミドとしては、ｐＣＡＧＧＳ[Gene,108,193-200(1991)]、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラジーン社）、特表平１１−５１１００９等が挙げられる。遺伝子治療用の裸のプラスミドは、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃で担体（金属粒子）とともにＤＮＡを細胞内に導入する方法等、自体公知の方法により細胞に導入することができる［Wu et al.,J. Blol. Chem. 267, 963-967(1992)、Wu et al.,J. Blol. Chem. 263, 14621-14624, (1988)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 2726-2730 (1991)］。
【００４１】
また、人工的なベクターとしては、リポソーム、マイクロカプセル、サイトフェクチン、ＤＮＡ―蛋白質複合体、バイオポリマー等が挙げられる。
【００４２】
リポソームとは、内部に水層を有する脂質二重膜でできた閉鎖小胞体であり、その脂質二分子膜構造は生体膜に極めて近似していることが知られている。リポソームを製造するに際し使用されるリン脂質としては、例えば、レシチン、リゾレシチン等のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等の酸性リン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質等が挙げられる。また、コレステロール等を添加することもできる。リポソームは、自体公知の方法に従って製造することができる。リポソームには、膜融合リポソーム、ＨＶＪ―膜融合リポソーム［Kaneda. Y et al., Biol. Chem, 264, 12126-12129(1989)、Kato. K et al., Biol. Chem, 266, 3361-3364(1991)、Tomita. N et al., Biochem. Biophys. Res., 186, 129-134, (1992)、Tomota. N et al., Cric. Res., 73, 898-905(1993)］、陽イオン性リポソーム（特表平２０００−５１０１５１、特表平２０００−５１６６３０）等が知られている。センダウイルス（ＨＶＪ）と融合させたＨＶＪ―膜融合リポソームを用いることは、特に好ましい。リポソームの表面にＨＶＪの糖タンパクを組み込み又は共有結合させてポリエチレングリコール等を添加すると、細胞への遺伝子導入効率があがる。
ＮＫ４をコードするＤＮＡにシグナル配列、プロモーター及びポリアデニル化配列を付加したＤＮＡをリポソーム中に含有させることにより、本発明の遺伝子治療剤とすることができる。また、組換え発現ベクターをリポソーム中に含有させることにより、本発明の遺伝子治療剤とすることもできる。
リポソームを用いてＤＮＡを導入する方法には、リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、陽イオン性リポソーム法、リポフェクチン法、リポフェクトアミン法等が挙げられる。
【００４３】
マイクロカプセルはフィルムコートされた粒子であり、膜形成ポリマー誘導体、疎水性可塑剤、表面活性剤または／および潤滑剤窒素含有ポリマーの混合物からなるコーティング材料でコートされた粒子等で構成される。特表２０００−５００７４４等は、遺伝子治療に好適に使用される。
ＮＫ４をコードするＤＮＡにシグナル配列、プロモーター及びポリアデニル化配列を付加したＤＮＡをマイクロカプセル中に含有させることにより、本発明の遺伝子治療剤とすることができる。また、組換え発現ベクターをマイクロカプセル中に含有させることにより、本発明の遺伝子治療剤とすることもできる。
【００４４】
ＮＫ４コードするＤＮＡを含有する組換え発現ベクターを宿主細胞へ導入した形質転換体を本発明の遺伝子治療剤とすることもできる。宿主としては、ビフィズス菌、乳酸菌、酵母、糸状菌等を用いることができる。好ましくは、ビフィズス菌、乳酸菌を用いる。ビフィズス菌としてはBifidobacterium longum、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve等が挙げられる。乳酸菌としては、ラクトバチラス属（Lactobacillus）、ストレプトコッカス属（Streptoccoccus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）等が挙げられる。また、これらの形質転換体をカプセルに含有させて本発明の遺伝子治療剤とすることもできる。
カプセルの形状は、好ましくは３層構造を使用する。３層構造の場合、形質転換体が最内層であり、この形質転換体を被覆する中間層が親油性の膜であり、最外層が必要に応じて口中溶解性の外皮膜、胃溶解性の外皮膜、小腸溶解性の外皮膜、大腸溶解性の外皮膜等を選択できる。最内層は形質転換体と必要に応じ水、整理食塩水、緩衝液、培養液等である。中間層の親油性の膜としては動物性油脂、植物性油脂、それらの生物学的若しくは化学的に処理された油脂等が用いられる。外皮膜としては、天然高分子皮膜、例えば、ゼラチン、寒天、ペクチン、アルギン酸等、又は必要に応じ、これらに蛋白質、糖蛋白、ムコ多糖、糖、糖アルコール、多価アルコール等を添加した物質から得られる高分子皮膜が好ましい。これらのカプセルは公知方法に従って製造される。
【００４５】
本発明の遺伝子治療剤の患者への導入方法としては、遺伝子治療剤を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法及びヒトからある種の細胞を取り出して体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法がある［日経サイエンス、４月号、２０−４５（１９９４）、月間薬事、３６、２３−４８（１９９４）、実験医学増刊、１２、１５（１９９４）］。本発明では、ｉｎ  ｖｉｖｏ法が好ましい。
【００４６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ法により投与する場合は、治療目的の疾患、標的臓器などに応じた適当な投与経路により投与される。例えば、病変の認められる組織に直接腫瘍内投与若しくは局所投与するか又は静脈、動脈、皮下、筋肉内、腹腔内、内視鏡的、エアロゾル的等により投与することも可能である。投与方法としては静脈内又は腹腔内投与が好ましい。また、病変の見られる組織、特に腫瘍への直接注射も好ましい。核磁気共鳴撮像又はコンピューター断層撮影等の当該技術分野で利用できる任意のものを使用して腫瘍を撮影し、例えば、定位注射により本発明の遺伝子治療剤を投与することができる。
【００４７】
なお、ＮＫ４をコードするＤＮＡにシグナル配列を付加することにより、分泌蛋白質となり、腫瘍組織内若しくは腫瘍細胞内又は局所投与する必要は必ずしもなく、細胞内で産生、分泌された蛋白質が遠く離れた標的臓器に作用し、腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生抑制作用を生ずる。従って、腫瘍組織以外の正常組織内又は正常細胞内への投与も可能である。なお、ヒトに投与する場合は静脈内投与又は筋肉内投与が好ましい。
【００４８】
製剤形態としては、上記の各投与形態にあった種々の製剤形態をとることができる。例えば、有効成分である本発明のＤＮＡを含有する注射剤とした場合、当該注射剤は常法により調整することができる。遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であれば、特に制限されず、蒸留水、塩化ナトリウム、又は塩化ナトリウムと無機塩等との混合物の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等が挙げられ得る。また、常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチン若しくは非イオン性界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調整してもよい。これらの注射剤を粉末化、凍結乾燥等の操作により用事溶解用製剤とすることもできる。
【００４９】
また、ＨＶＪ−リポソーム等のリポソーム製剤においては、例えば、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
さらに、マイクロカプセル製剤においては、疾患部位の周囲に遺伝子を存在し易くするために、例えば徐放製の製剤を調整し、経口製剤としたり又は患部、皮下、筋肉内等に埋め込むこともできる。
【００５０】
製剤中のＤＮＡの含量は、治療目的の疾患、投与部位、投与回数、所望治療期間、患者の年齢、体重等により異なり、適宜調整することができるが、通常癌患者（体重６０ｋｇとして）においては一般にＮＫ４をコードするＤＮＡの重量にして約０．０１〜２０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇである。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
以上のような本発明のＮＫ４遺伝子治療剤は、癌または／および血管新生による疾患の予防・治療剤として、及び、癌の転移防止剤として使用することができる。従って、本発明のＮＫ４遺伝子治療剤は腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生抑制に使用することができる。また、本発明のＮＫ４遺伝子治療剤は腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生抑制方法を提供することができる。
【００５１】
対象疾患の癌としては、例えば、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、子宮癌、胆管癌、膵島細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、精巣癌、睾丸腫瘍、甲状腺癌、皮膚癌、悪性カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、メラノーマ、グリオーマ等が挙げられるが、なかでも卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、肉腫、メラノーマ又はグリオーマが好ましく、特に、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌が好ましい。
【００５２】
血管新生による疾患としては、例えば、リウマチ性関節炎、乾癬、オスラー−ウェバー（Osler-Webber）症候群、心筋の脈管形成、末梢血管拡張症、血友病性関節炎、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、老人黄班部変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後繊維増殖症、又はペルオーシス等）、血管繊維腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫等）、白血病を含む造血器腫瘍、固形腫瘍、腫瘍転移、創傷肉芽形成等が挙げられる。
【００５３】
また、本発明のＮＫ４遺伝子治療剤は、他の抗腫瘍剤等と組み合わせて用いることができる。一般的には作用機序の異なる数種類の抗腫瘍剤と組み合わせて用いることが好ましい。
他の抗腫瘍剤としては、例えば、アルキル化剤、各種代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、その他の抗腫瘍剤、抗腫瘍性植物成分、ＢＲＭ（生物学的応答性制御物質）、細胞接着阻害剤、マトリックス・メタロプロテアーゼ阻害剤、ホルモン、ビタミン、抗菌性抗生物質又は化学療法剤等が挙げられる。
【００５４】
より具体的には、アルキル化剤として、例えば、ナイトロジェンマスタード、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、クロラムブチル等のアルキル化剤、例えば、カルボコン、チオテパ等のアジリジン系アルキル化剤、例えば、ディブロモマンニトール、ディブロモダルシトール等のエポキシド系アルキル化剤、例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ニムスチンハイドロクロライド、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ラニムスチン等のニトロソウレア系アルキル化剤、ブスルファン、トシル酸インプロスルファン、ダカルバジン等が挙げられる。
各種代謝拮抗剤としては、例えば、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、チオイノシン等のプリン代謝拮抗剤、フルオロウラシル、テガフール、テガフール・ウラシル、カルモフール、ドキシフルリジン、ブロクスウリジン、シタラビン、エノシタビン等のピリミジン代謝拮抗剤、メトトレキサート、トリメトレキサート等の葉酸代謝拮抗剤等、及び、その塩若しくは複合体が挙げられる。
抗腫瘍性抗生物質としては、例えば、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ダウノルビシン、アクラルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ＴＨＰ−アドリアマイシン、４’−エピドキソルビシン、エピルビシン等のアントラサイクリン系抗生物質抗腫瘍剤、クロモマイシンＡ3 、アクチノマイシンＤ等、及び、その塩若しくは複合体が挙げられる。
その他抗腫瘍剤しては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、タモキシフェン、カンプトテシン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセクラトン、シゾフィラン、ピシバニール、ウベニメクス、クレスチン等、及び、その塩若しくは複合体が挙げられる。また、プロカルバジン、ピポブロマン、ネオカルチノスタチン、ヒドロキシウレア等も挙げることができる。
抗腫瘍性植物成分としては、例えば、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン等のビンカアルカロイド類、エトポシド、テニポシド等のエピポドフィロトキシン類、及び、その塩若しくは複合体が挙げられる。
ＢＲＭとしては、例えば、腫瘍壊死因子、インドメタシン等、及び、その塩若しくは複合体が挙げられる。
細胞接着阻害剤としては、例えば、ＲＧＤ配列を有する物質、及び、その塩若しくは複合体が挙げられる。
マトリックス・メタロプロテアーゼ阻害剤としては、例えば、マリマスタット、バチマスタット等、及び、その塩若しくは複合体が挙げられる。
ホルモンとしては、例えばヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プラステロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、オキシメトロン、ナンドロロン、メテノロン、ホスフェストロール、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、メドロキシプロゲステロン等、及び、その塩若しくは複合体が挙げられる。
ビタミンとしては、例えば、ビタミンＣ、ビタミンＡ等、及び、その塩若しくは複合体が挙げられる。
【００５５】
また、本発明のＮＫ４遺伝子治療剤は、外科的療法や放射線療法と組み合わせて用いることもできる。放射線療法には、ガンマ線照射、Ｘ線照射、ＵＶ照射、マイクロ波照射、電子線照射等が挙げられる。
【００５６】
従って、本発明のＮＫ４遺伝子治療剤は、他の抗腫瘍剤等または／および外科的療法や放射線療法と組み合わせた癌または／および血管新生による疾患の予防・治療剤として、及び、癌の転移防止剤として使用することができる。従って、本発明のＮＫ４遺伝子治療剤は、他の抗腫瘍剤等または／および外科的療法や放射線療法と組み合わせた腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生抑制に使用することができる。また、本発明のＮＫ４遺伝子治療剤は、他の抗腫瘍剤等または／および外科的療法や放射線療法と組み合わせた腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生抑制方法を提供することができる。
【００５７】
本発明はＮＫ４をコードするＤＮＡを含有する組換え発現ベクターを宿主に形質転換することにより、遺伝子組換え技術を応用して大量かつ経済的に組換えＮＫ４を取得することができる。
【００５８】
ＮＫ４をコードするＤＮＡを含有する組換え発現ベクターは、宿主細胞へ導入され、形質転換体が構築される。
組換え発現ベクターを宿主へ導入する方法としては、自体公知の方法であればいずれも用いることができる。例えば、コンピテント細胞法[J. Mol. Biol., 53, 154(1970)]、ＤＥＡＥデキストラン法[Science, 215, 166, (1982)]、インビトロパッケージング法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72, 581(1975)]、ウイルスベクター法[Cell, 37, 1053, (1984)]、マイクロインジェクション法[Exp. Cell. Res., 153, 347(1984)]、エレクトロポレーション法［Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、リン酸カルシウム法[Science, 221, 551(1983)]、リポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)］、プロトプラスト法[特開昭６３−２４８３９４２、Gene, 17, 107, (1982)、Molecular ＆ General Genetics, 168, 111 (1979)]に記載の方法等を挙げることができる。
【００５９】
宿主としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、哺乳動物細胞等が挙げられる。例えば、細菌としては、エッシェリシア属（Escherichia）、エンテロバクター属（Enterobacter）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、バチラス属 (Bacillus)、ラクトバチラス属（Lactobacillus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、ストレプトコッカス属（Streptoccoccus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）等が挙げられる。
酵母としては、サッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Pichia pastoris）、パン酵母等が挙げられる。
糸状菌としては、アスペルギルス属（Asperugillus）、ペニシリウム属(Penicillium)等が挙げられる。
植物細胞としては、ワタ、トウモロコシ、ポテト、ソラマメ、ペチュニア、トマト、タバコ等が挙げられる。
哺乳動物細胞としては、マウスＣ１２７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、サルＣＯＳ細胞、マウス細胞ＢＡＬＢ／３Ｔ３、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒト細胞ＨｅＬａ、ヒトＦＬ細胞、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞[実験医学、１２、３１６（１９９４）]等が挙げられる。
【００６０】
得られた形質転換体は、組換えＮＫ４を産生するためにその宿主に応じた適切な培地中で培養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、無機物、ビタミン、血清及び薬剤等が含有される。
形質転換体の宿主が大腸菌の場合、ＬＢ培地（日水製薬）、Ｍ９培地[J. Exp. Mol. Genet., Cold Spring Laboratory, New York,431(1972)]等が、宿主が酵母の場合ＹＥＰＤ培地[Genetic Engineering, vol. 1, Plenum Press, New York, 117(1979)] 等が、宿主が動物細胞の場合、２０％以下のウシ胎仔血清を含有するＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＰＲＭＩ１６４０培地（日水製薬）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。形質転換体の培養は、通常２０℃〜４５℃、ｐＨは５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気、攪拌が行われるがこれらに限定されるものではない。また、宿主が接着性の動物細胞等の場合は、所望によりガラスビーズ、コラーゲンビーズ、アセチルセルロースフォローファイバー等の担体が用いられる。
【００６１】
組換えＮＫ４を産生している形質転換体は、その培養液上清中に組換えＮＫ４を分泌することから、この形質転換体の培養上清を用いて組換えＮＫ４の抽出を行うことができる。また、形質転換体中に産生された組換えＮＫ４の抽出を行うこともできる。蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームまたは／および凍結融解等によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により組換えＮＫ４の粗抽出液を得る方法等が適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等の蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００TM等の界面活性剤が含まれていてもよい。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる組換えＮＫ４の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が用いられる。
かくして得られた組換えＮＫ４は、塩の形であっても本発明の範囲内である。
【００６２】
本発明により産生された組換えＮＫ４は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。
組換えＮＫ４を含有する抗癌剤又は血管新生抑制剤は、種々の製剤形態、例えば、液剤、固形剤、カプセル剤等をとり得るが、一般的には有効成分である組換えＮＫ４のみ又はそれと慣用の担体とともに注射剤とされるか、慣用の担体とともに経口剤とされるか、又は徐放剤とされる。当該注射剤は常法により調整することができ、例えば、組換えＮＫ４を適切な溶媒、例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水等に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調整することができる。注射剤中の組換えＮＫ４の含量としては、通常、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては約０．０１〜５．０（Ｗ／Ｖ％）に調整される。また、経口剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤等の剤形に製剤化される。徐放剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、マイクロカプセル等の剤形に製剤化される。これらの製剤は、製剤化の常法に準じて調整することができる。製剤中の組換えＮＫ４の含量は、剤形、適用疾患等に応じて適宜調整することができる。
製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール等が挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等と配合してもよい。液状製剤とした場合は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥剤は、用事に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。また、徐放剤とした場合は、徐放用担体として例えば、可溶性コラーゲン又は可溶性コラーゲン誘導体、ゼラチン等の蛋白質、セラミックス多孔体、ポリアミノ酸、ポリ乳酸、キチン又はキチン誘導体、水膨潤性高分子ゲル等を使用することができる。
本発明の製剤は、該製剤の形態に応じた適切な投与経路により投与され得る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与することができる。また、徐放剤の形態にして生体内、例えば患部、皮下、筋肉内等に埋め込むことにより投与することができる。投与量は、患者の症状、年齢、体重等により適宜調整されるが、通常癌患者（体重６０ｋｇとして）においては組換えＮＫ４として約１ｍｇ〜３００ｍｇ、好ましくは約１０ｍｇ〜１００ｍｇであり、これを１日１回ないし数回に分けて投与するのが適当である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６３】
本発明の組換えＮＫ４蛋白製剤は、癌または／および血管新生による疾患の予防・治療剤、及び、癌の転移防止剤として使用することができる。従って、本発明の組換えＮＫ４蛋白製剤は腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生抑制に使用することができる。また、本発明の組換えＮＫ４蛋白製剤は腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生抑制方法を提供することができる。癌及び血管新生による疾患には、上記した疾患が挙げられる。
また、本発明の組換えＮＫ４蛋白製剤は、他の抗腫瘍剤等と組み合わせて用いることができる。他の抗腫瘍剤には、上記した抗腫瘍剤等が挙げられる。
さらに、本発明の組換えＮＫ４蛋白製剤は、外科的療法や放射線療法と組み合わせて用いることもできる。
従って、本発明の組換えＮＫ４蛋白製剤は、他の抗腫瘍剤等または／および外科的療法や放射線療法と組み合わせた腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生抑制に使用することができる。また、本発明の組換えＮＫ４蛋白製剤は、他の抗腫瘍剤等または／および外科的療法や放射線療法と組み合わせた腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生抑制方法を提供することができる。
【００６４】
本発明のスクリーニング方法は、
（１）前記したＮＫ４をコードするＤＮＡ又はＮＫ４を用いることを特徴とするＮＫ４の活性を促進する物質のスクリーニング方法Ａ、より具体的には、
（２）ＮＫ４とｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体を用いることを特徴とするＮＫ４のｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体に対する結合活性を促進する物質のスクリーニング方法Ｂである。
【００６５】
より具体的には、本発明のスクリーニング方法Ｂは、ＮＫ４とｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体とを接触させた場合における、ＮＫ４のｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体に対する結合活性を測定し、比較することを特徴とするＮＫ４のｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体に対する結合活性を促進する物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法に用いるｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体（ＮＫ４と結合する限り、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体の部分ペプチドであってもよい）としては、公知のｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体[Rodrigues G.A et al., Mol. Cell Biol., 11, 2962-2970(1991)、Park. M et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 6379-6383 (1987)]を用いることができる。
【００６６】
本発明のスクリーニング方法Ｂを用いて得られる物質は、ＮＫ４のｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体に対する結合活性を促進する化合物であり、ペプチド、蛋白質、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、ＤＮＡ等である。
本発明のスクリーニング方法Ｂを用いて得られる物質は、ＮＫ４のｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体に対する結合活性を促進することによりＮＫ４の活性を促進することができるので、ＮＫ４の活性促進剤などの安全で低毒性な医薬として使用することができる。従って、上記したＮＫ４をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え発現ベクター、該ＤＮＡを含有する人工ベクター、該ＤＮＡを含有する組換え発現ベクターで形質転換した形質転換体又は形質転換体により産生された組換えＮＫ４を含有する医薬と組み合わせて、癌の予防・治療剤、血管新生抑制剤として使用することができる。
また、本発明のスクリーニング方法Ｂを用いて得られる物質は、抗癌作用、血管新生抑制作用等を有していてもよく、そのような場合には、例えば、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、子宮癌、胆管癌、膵島細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、精巣癌、睾丸腫瘍、甲状腺癌、皮膚癌、悪性カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、メラノーマ、グリオーマ等の予防・治療剤、血管新生抑制剤として使用することができる。なかでも卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、肉腫、メラノーマ又はグリオーマが好ましく、特に、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、乳癌、大腸癌の予防・治療剤、血管新生抑制剤として使用することができる。
【００６７】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質を上記の医薬として使用する場合、常法に従って製剤化し、使用することができる。例えば、該物質は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等として経口的に、あるいは水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に使用することができる。例えば、該物質を生理学的に認められる慣用の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等とともに経口剤とされるか又は慣用の担体とともに注射剤として常法に従い製造することができる。
また、上記医薬組成物は、例えば、緩衝剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、酸化防止剤等と配合してもよい。
さらに、上記医薬組成物は適当な薬剤と組み合わせて、例えばｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体が高発現している臓器や組織を特異的なターゲットとしたＤＤＳ製剤として使用することもできる。
このようにして得られる医薬組成物は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法等により差異はあるが、経口投与の場合、癌患者（体重６０ｋｇ）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法等によっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常癌患者（体重６０ｋｇ）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好ましい。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６８】
実施例
以下、本発明の実施例を説明するが、以下の開示は本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明の技術的範囲を何等限定するものではない。
実施例１  ＮＫ４ｃＤＮＡの作製
ヒトのＭＲＣ−５線維芽細胞からFast Track mRNA isolation kit (Invitrogen)を使用し、ｍＲＮＡを単離し、これを使用してＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription / polymerase chain reaction）を行い、ＮＫ４ｃＤＮＡを単離した。具体的には、ｍＲＮＡ溶液０．５μｌ（１５０ｎｇ）、１０×ＲＴ−ＰＣＲ溶液［５００ｍＭ ＫＣｌ、 １００ｍＭ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ９．０)、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ −１００、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］５μｌ、ｄＮＴＰ (２．５ｍＭ) ４μｌ、プライマー：１（１０ｍＭ）２μｌ、プライマー：２（１０ｍＭ）２μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ(Takara) ０．５μｌ、ＲＮａｓｉｎ (Promega) ０．５μｌ、逆転写酵素(Takara) ０．５μｌ及びＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ  ３５．２μｌを混合し、４２℃  ３０分、９５℃  ５分で逆転写反応を行い、９４℃  ３０秒、５５℃  １分、７２℃  １分のサイクルを４０回繰り返し、さらに７２℃  ７分間反応させＮＫ４ｃＤＮＡを得た。このようにして得られたＮＫ４ｃＤＮＡをTA Cloning Kit (Invitrogen)を使用してｐＣＲＩＩＴＭベクターにクローニングし、ｐＣＲＩＩ／ＮＫ４を得た。
なお、プライマー：１及びプライマー：２の配列は以下のとおりである。
プライマー：１(５’− CCCGTCCAGCGGTACCATGTGGGTGACC −３’：配列番号３)
プライマー：２(５’− TACGGGATGGACTAGTTAGACTATTGTAG −３’：配列番号４)
【００６９】
実施例２  ＮＫ４ｃＤＮＡの塩基配列決定
上記で得られたＮＫ４ｃＤＮＡはTaq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を使用し、Gene Amp PCR System 9600 (Perkin Elmer)で塩基配列決定のためのサンプルを作製した。塩基配列の決定に当たり、ＡＢＩ社製のDNA Sequencer Model：377 オートシークエンサーを用い、蛍光標識ターミネーターを用いたサンガー法で塩基配列解析を行った。シークエンスによって２種類の塩基配列、配列番号：１及び配列番号：２が決定された。
【００７０】
実施例３  組換えアデノウイルス発現ベクターの構築
サイトメガロウイルスの初期プロモーター／エンハンサー、実施例１で調整したＮＫ４ｃＤＮＡ及びＳＶ４０のポリ（Ａ）シグナル配列からなる発現カセットをシャトルプラスミドベクターｐＳＶ２＋［Korst RJ, Hum. Gene Ther., 6, 277-287(1995)］に挿入することによって発現用カセットを構築した。この発現用カセットとＥ１Ａ及びＥ１Ｂ、Ｅ３の一部を欠くアデノウイルスタイプ５のゲノムからなるｐＪＭ１７(Microbix Biosystems Inc.)をＨＥＫ２９３細胞（ヒトの胚腎細胞）にカルシウム共沈法によりコトランスフェクトした。発現カセットの入った組換えアデノウイルスは、ウイルスＤＮＡの制限酵素消化によって生じるＤＮＡ断片の長さの違いにより目的ウイルスを選別し、ＮＫ４ｃＤＮＡを発現する組換えアデノウイルス発現ベクターＡｄＣＭＶ．ＮＫ４を構築した。構築した組換えアデノウイルス発現ベクターを［図１］に示す。
【００７１】
実施例４  ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４のＨＧＦ誘導腫瘍細胞浸潤に対する作用
マトリゲル  インベイション  チャンバー（Matrigel invasion chamber、２４ウェル）を用いた基底膜浸潤モデルでＨＧＦの腫瘍細胞浸潤誘導作用に対するＡｄＣＭＶ．ＮＫ４の効果を調べた。対照群として、ＳＵＩＴ−２細胞（ヒトの膵臓癌細胞）、ＮＫ４ｃＤＮＡの代わりにEsherichia coliの ＬａｃＺ遺伝子を含有するＡｄＣＭＶ．ＬａｃＺを使用した。トランスフェクトされていないＳＵＩＴ−２細胞、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４又はＡｄＣＭＶ．ＬａｃＺでトランスフェクトされたＳＵＩＴ−２細胞（ヒトの膵臓癌細胞）は、２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含んだＲＰＭＩ培地に懸濁され、５×１０３ cells／wellに調整された後、マトリゲル  インベイション  チャンバーのトランスウェル（transwell）に播かれた。ロワーカップ（lower cup）の２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含んだＲＰＭＩ培地には、ＨＧＦ存在下、非存在下のものが用意された。２４時間の培養後、トランスウェル（transwell）内の細胞を取り除き、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。顕微鏡下、トランスウェル（transwell）外に浸潤してきた細胞数で浸潤能を評価した。その結果を［図２］に示す。その結果、ＨＧＦの非存在下では、トランスウェル（transwell）外に浸潤してきた細胞はなかった。一方、１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦの存在下では、トランスフェクトされていない無処理のＳＵＩＴ−２細胞及びＡｄＣＭＶ．ＬａｃＺでトランスフェクトされたＳＵＩＴ−２細胞は強く浸潤した。一方ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４でトランスフェクトされたＳＵＩＴ−２細胞の浸潤は感染多重度（ＭＯＩ）依存的に強く抑制された。
これは、ＨＧＦが腫瘍細胞の浸潤を促すのに対し、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４により産出されたＮＫ４がＨＧＦのアンタゴニストとして作用することにより、腫瘍細胞の浸潤を抑制した結果である。
【００７２】
実施例５  ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４による腫瘍の成長抑制及び血管新生抑制
ヌードマウスを用い、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４による腫瘍の成長抑制及び血管新生抑制効果を調べた。対照群として、ＳＵＩＴ−２細胞（ヒトの膵臓癌細胞）、ＮＫ４ｃＤＮＡの代わりにEsherichia coliの ＬａｃＺ遺伝子を含有するＡｄＣＭＶ．ＬａｃＺを使用した。６週齢のヌードマウス（BALB/c nu/nu）（Japan SLC Inc.）の皮下にＳＵＩＴ−２細胞（Ａｄ非投与群）、ＡｄＣＭＶ．ＬａｃＺでトランスフェクトされたＳＵＩＴ−２細胞（Ａｄ−ＬａｃＺ）、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４でトランスフェクトされたＳＵＩＴ−２細胞（Ａｄ−ＮＫ４）を移植した。ＡｄＣＭＶ．ＬａｃＺ及びＡｄＣＭＶ．ＮＫ４は５０ ＭＯＩ（感染多重度）で感染させた。腫瘍移植後経時的に腫瘍体積を追跡した。また、腫瘍移植後２８日経過後に血管数を調べた。腫瘍体積は〔短径(ｍｍ)〕２×〔長径（ｍｍ）〕×０．５２で算出した。なお、腫瘍の成長は腫瘍体積を測定することによって評価した。
腫瘍体積を経時的に追跡した結果を［図３］に示す。腫瘍体積は、移植後１８日目でＡｄ非投与群が５３９ｍｍ３、ＡｄＣＭＶ．ＬａｃＺトランスフェクト細胞が４３５ｍｍ３、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４トランスフェクト細胞が１８０ｍｍ３であり、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４は腫瘍の成長を強く抑制した。この結果から、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４により腫瘍細胞で産生したＮＫ４は腫瘍の成長を顕著に抑制できることが確認された。
腫瘍移植後２８日経過後の血管数を［図４］に示す。ＡｄＣＭＶ．ＬａｃＺが感染した腫瘍周辺の血管数は１２．８血管数／視野であるのに対し、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４が感染した腫瘍周辺の血管の数は、６．１血管数／視野（ｐ＜０．０５）であり、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４は血管新生を強く抑制した。この結果から、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４により腫瘍細胞で産生したＮＫ４は血管新生を顕著に抑制できることが確認された。
【００７３】
実施例６  ＮＫ４遺伝子発現による腫瘍の成長抑制及びＮＫ４産生
ヌードマウスを用い、ＮＫ４遺伝子発現による腫瘍の成長抑制及びＮＫ４の産生を調べた。哺乳細胞での発現ベクターｐｃＤＮＡ３にヒトＮＫ４ｃＤＮＡを組み込んだ発現用ベクターｐｃＤＮＡ３／ＮＫ４をＴＭＫ１細胞（ヒトの胃癌細胞）にＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬（Life Technologies Inc.）を使用して導入した。１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にて２４時間培養後、Ｇ４１８を３００μｇ／ｍｌ含むＤＭＥＭ／Ｆ１２からなる選択培地にて培養した。ＮＫ４を恒常的に産生するＴＭＫ１細胞をクローニングした。ＮＫ４遺伝子を導入していないＴＭＫ１細胞ならびにＮＫ４を恒常的に産生するＴＭＫ１細胞をそれぞれＰならびにＴ１１とした。Ｐ細胞とＴ１１細胞を１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）にそれぞれ１×１０６個懸濁し、５週齢ヌードマウス（BALB/c）（Charles River Japan）の脇腹に皮下移植した。腫瘍体積は〔短径（ｍｍ）〕２×〔長径（ｍｍ）〕×０．５２で計算した。腫瘍の成長は腫瘍体積を測定することによって評価した。
腫瘍体積を経時的に追跡した結果を［図５］に示す。Ｔ１１細胞を移植したマウスの腫瘍成長はＰ細胞を移植したマウスと比較して、移植３１日経過後において７８％抑制された（ｐ＜０．０１）。この結果から、腫瘍細胞にＮＫ４遺伝子を発現させることにより腫瘍の成長が顕著に抑制されることが確認された。
ＮＫ４の産生量を[図６]に示す。移植３１日経過後、ＮＫ４の産生量をヒトＨＧＦを使用してＥＬＩＳＡ法により測定した。皮下腫瘍から摘出したＮＫ４の産生量はＰ細胞では０．０６ｎｇ／ｍｇ（検出限界以下）であるのに対し、ｐｃＤＮＡ３／ＮＫ４をトランスフェクトしたＴ１１細胞では３１．４ｎｇ／ｍｇであった。この結果から、ｐｃＤＮＡ３／ＮＫ４をトランスフェクトしたＴ１１細胞ではＮＫ４を産生していることが確認された。
【００７４】
実施例７  ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４による腫瘍の成長抑制及びＮＫ４産生
ヌードマウスを用い、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４による腫瘍の成長抑制及びＮＫ４の産生を調べた。対照群として、ＰＢＳ、ＮＫ４ｃＤＮＡの代わりにEsherichia coliの ＬａｃＺ遺伝子を含有するＡｄＣＭＶ．ＬａｃＺを使用した。ＴＭＫ１細胞（ヒトの胃癌細胞）（１×１０６個）は１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、５週齢ヌードマウス（BALB/c）（Charles River Japan）の脇腹に皮下移植した。ＴＭＫ１細胞移植７日後、マウスは腫瘍を形成した。１００μｌのＰＢＳ、１００μｌのＰＢＳと混合したＡｄＣＭＶ．ＬａｃＺ及びＡｄＣＭＶ．ＮＫ４（それぞれ１×１０９プラーク形成単位、ｐｆｕ）をＴＭＫ１細胞移植７日後から５日間マウスの腫瘍に直接投与した。
腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は〔短径（ｍｍ）〕２×〔長径（ｍｍ）〕×０．５２で計算した。腫瘍の成長は腫瘍体積を測定することによって評価した。腫瘍体積を経時的に追跡した結果を［図７］に示す。ＴＭＫ１細胞の移植７日後、腫瘍は直径約３〜５ｍｍであった。ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４投与は腫瘍移植後２１日経過後まで腫瘍成長傾向を示さなかった。腫瘍体積は腫瘍移植後３１日経過時において、ＰＢＳと比較して７１％抑制した（ｐ＜０．０１）。この結果から、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４は生体内において腫瘍の成長を顕著に抑制できることが確認された。
ＮＫ４の産生量を[図８]に示す。ＴＭＫ１細胞移植一週間経過後のＮＫ４の産生量をヒトＨＧＦを使用してＥＬＩＳＡ法により測定した。皮下腫瘍から摘出したＮＫ４の産生量はＰＢＳでは０．０５ｎｇ／ｍｇ（検出限界以下）、ＡｄＣＭＶ．ＬａｃＺでは０．０１ｎｇ／ｍｇ（検出限界以下）であるのに対し、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４では７．３６ｎｇ／ｍｇであった。この結果から、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４は生体内でＮＫ４を産生していることが確認された。
【００７５】
実施例８  組換え発現ベクターの構築
実施例１で作製したｐＣＲＩＩベクターに組み込まれたＮＫ４ｃＤＮＡを制限酵素 Kpn I / Spe Iで切断し、 Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ(Takara)処理により切断末端を平滑化させた。得られたＮＫ４ｃＤＮＡ断片をあらかじめ制限酵素 Xho Iで処理した後、切断末端を平滑化しておいたＣＨＯ細胞用発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲと混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで結合してＮＫ４発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲ／ＮＫ４を得た。得られたプラスミドの図を[図９]に示す。得られたＮＫ４発現ベクターはニワトリβ−アクチンプロモーターとウサギβ−グロビンポリ（Ａ）シグナル配列の間にＮＫ４ｃＤＮＡを有する。また、形質転換された細胞の選択は、マウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子にサイトメガロウイルス初期プロモーターとポリ（Ａ）シグナル配列で連結したＤＨＦＲキメラ遺伝子により可能となる。
【００７６】
実施例９  チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞への形質転換とその発現
上記ＣＨＯ細胞発現用ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲ／ＮＫ４はＷｉｇｌｅｒらの方法［Cell, 11, 233(1977)］によりチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞のＤＨＦＲ欠損細胞に導入した。約３０μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲ／ＮＫ４プラスミドをそれぞれ２４０μｌの０．５Ｍ 塩化カルシウムに溶解し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ 塩化ナトリウム及び１．５ｍＭ リン酸ナトリウムからなる２×ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．１）２４０μｌを攪拌しながら加えた。室温で３０分攪拌を続けプラスミドとリン酸カルシウムの共沈殿物を形成させた。続いて、１０％ウシ胎仔血清（ギブコ社）と１％グルタミンとを含むα―ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）を用いて５×１０５個のＣＨＯ細胞を５％ＣＯ２存在下で３７℃、２４時間培養した。培地交換した後、プラスミドとリン酸カルシウム共沈殿物を加え室温で２０分間放置した。さらに、３７℃で４時間インキュベートした後、培地を除去し、１５％グリセリンを添加した１×ＨＥＰＥＳ緩衝液を加え室温で５分間放置した。培地で細胞を洗浄した後、培地交換しさらに３７℃で７日間培養して形質転換細胞を得た。得られた細胞株はリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含まず、透析した１０％ウシ胎仔血清（ギブコ社）、２％グルタミンを含むα―ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）を用いて安定なＮＫ４高生産株を得るために１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭとメソトレキセート濃度を順次追加させながら同培地で継代培養を繰り返した。得られたＮＫ４産生組換え細胞をクローン選別を行い、安定なＮＫ４生産株を得た。
【００７７】
実施例１０  形質転換ＣＨＯ細胞培養上清からの組換えＮＫ４の精製
上記実施例９で得られたＮＫ４産生チャイニーズハムスターＣＨＯ組換え細胞株をリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含まず、１０％ウシ胎仔血清（ギブコ社）と１％グルタミンと２μＭ メソトレキセートを含むα―ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）で培養し、その培養上清より、組換えＮＫ４を精製した。
１）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー
ＮＫ４産生チャイニーズハムスターＣＨＯ組換え細胞株の培養液１２Ｌに最終濃度０．０１％になるようにＴｗｅｅｎ  ８０を添加し、ステベックスＨＶフィルター（日本ミリポア）により濾過した。０．１５Ｍ 塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｃｉｔｒａｔｅ−ＮａＯＨ、 ０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０、 ｐＨ６．５）で平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア製、カラム体積 ５０ｍｌ）に添加した。０．５Ｍ 塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで洗浄後、０．５Ｍから２．５Ｍの塩化ナトリウムによる直線濃度勾配により溶出したピーク画分を集め、ヘパリン溶出液Ａとした。
２）陰イオン交換クロマトグラフィー
ヘパリン溶出液Ａを１００倍容の緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 ０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０、ｐＨ８．０）で３回透析を行った後、緩衝液Ｂで平衡化したＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア製、カラム体積 ４０ｍｌ）に添加した。緩衝液Ｂで洗浄後、１Ｍ 塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂで溶出したピーク画分を集め、ＤＥＡＥ溶出液とした。
３）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー（２回目）
ＤＥＡＥ溶出液を１００倍容の緩衝液Ａで３回透析を行った後、０．１５ Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア製、カラム体積 ５０ｍｌ）に添加した。０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで洗浄後、０．３Ｍから２．５Ｍの塩化ナトリウムによる直線濃度勾配により吸着物を溶出した。ＮＫ４のピーク画分を集め、ヘパリン溶出液Ｂとした。精製された組換えＮＫ４の収量は約１２ｍｇであり、培養上清液からの回収率は約５０％であった。
４）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
組換えＮＫ４を２−メルカプトエタノール還元下及び非還元下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。精製組換えＮＫ４は非還元条件下［２−ＭＥ（−）］では約５０ｋＤａを示し、還元条件下［２−ＭＥ（＋）］では約６７ｋＤａを示した。
【００７８】
実施例１１  組換えＮＫ４による腫瘍の成長抑制
組換えＮＫ４による腫瘍の成長抑制の効果を調べた。腫瘍体積は〔短径（ｍｍ）〕２×〔長径（ｍｍ）〕×０．５２で計算した。腫瘍の成長は腫瘍体積を測定することによって評価した。腫瘍体積を測定した結果を［図１０Ａ］に示す。ＳＵＩＴ−２細胞（ヒトの膵臓癌細胞）懸濁液５０μｌ（２×１０７cells／ml）を６週齢ヌードマウス（BALB/c nu/nu）（Japan SLC Inc.）の膵臓に注入した。上記マウスに生理食塩水と混合した実施例１０で精製した組換えＮＫ４（1.5mg/kg/day）を一日につき２度、２５日間腹空内投与した。コントロールとしてＢＳＡを同量（1.5mg/kg/day）一日につき２度、２５日間腹空内投与した。組換えＮＫ４投与はコントロールと比較して腫瘍の成長を６０．７％抑制した（ｐ＜０．０５）。コントロール群は脾周辺に浸潤し、さらに、膵臓皮膜にまで浸潤していたが、ＮＫ４投与群は脾周辺及び膵臓皮膜への浸潤は認めらなかった。この結果により、組換えＮＫ４がＨＧＦのアンタゴニストとして作用し、腫瘍細胞の浸潤を抑制し、又、腫瘍の成長を抑制したことが確認された。
【００７９】
実施例１２  組換えＮＫ４による転移結節の抑制
組換えＮＫ４による転移抑制効果を検討した。転移抑制効果は、腸間膜及び腹膜壁の転移結節数を数えることにより評価した。転移結節の数は、１ｍｍ以上の転移結節を肉眼観察することにより行った。転移結節数を測定した結果を［図１０Ｂ］に示す。ＳＵＩＴ−２細胞（ヒトの膵臓癌細胞）懸濁液５０μｌ（２×１０７cells／ml）を６週齢ヌードマウス（BALB/c nu/nu）（Japan SLC Inc.）の膵臓に注入した。上記マウスに生理食塩水と混合した上記組換えＮＫ４（1.5mg/kg/day）を一日につき２度、２５日間腹空内投与した。コントロールとしてＢＳＡを同量（1.5mg/kg/day）一日につき２度、２５日間腹空内投与した。組換えＮＫ４投与はコントロール（ＢＳＡ）と比較してヌードマウスの腸間膜、横隔膜及び腹膜における転移結節の数を、８４．１％抑制した（ｐ＜０．０５）。この結果により、組換えＮＫ４が腫瘍細胞の転移を抑制したことが確認された。
【００８０】
実施例１３  組換えＮＫ４投与による生存率の効果
癌末期における組換えＮＫ４の投与の効果を評価した。生存率を評価した結果を[図１１]に示す。ＮＫ４の投与はＳＵＩＴ−２細胞（ヒトの膵臓癌細胞）懸濁液５０μｌ（２×１０７cells／ml）を６週齢ヌードマウス（BALB/c nu/nu）（Japan SLC Inc.）の膵臓に投与した後２４日目から開始した。ＮＫ４非投与のコントロールマウス（ｎ＝１５匹）は、ＳＵＩＴ−２細胞移植後２６日目から死亡し、６９日目にはすべて死亡した。一方、ＮＫ４投与マウス（ｎ＝１０匹）は４匹がＳＵＩＴ−２細胞移植後６５日以内に死亡したが、７０日以上過ぎても６匹は生存していた。この結果により、組換えＮＫ４の投与は末期癌の状態においても延命効果を有することが確認された。
【００８１】
製剤例１
生理食塩水１００ｍｌ中に実施例１０で調整した組換えＮＫ４（１ｇ）、マンニトール（１ｇ）及びポリソルベート８０（１０ｍｇ）を含有する溶液を無菌的に調整し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封して、本発明の医薬を凍結乾燥剤として調整した。
【００８２】
製剤例２
０．０２Ｍ リン酸緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１％ポリソルベート８０含有、ｐＨ７．４）１００ｍｌ中に、実施例１０で調整した組換えＮＫ４（１ｇ）及びヒト血清アルブミン１００ｍｇを含む水溶液を無菌的に配合して、１ｍｌずつバイアルに分注した。次いで、各バイアル中の液剤を凍結乾燥して密封して、本発明の医薬を凍結乾燥剤として調整した。
【００８３】
製剤例３
注射用蒸留水１００ｍｌ中に、実施例１０で調整した組換えＮＫ４（１ｇ）、ソルビトール（２ｍｇ）、グリシン（２ｍｇ）及びポリソルベート８０（１０ｍｇ）を含む溶液を無菌的に調整し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封して、本発明の医薬を凍結乾燥剤として調整した。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】組換えアデノウイルスベクターＡｄＣＭＶ．ＮＫ４の構築図を示した図である。
【図２】ＨＧＦ存在下、非存在下におけるＳＵＩＴ−２細胞(無処理の細胞)、ＡｄＣＭＶ．ＬａｃＺをトランスフェクトしたＳＵＩＴ−２細胞（ＬａｃＺ １００ ＭＯＩ）、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４をトランスフェクトしたＳＵＩＴ−２細胞（ＮＫ４ ５０ ＭＯＩ、ＮＫ４ １００ ＭＯＩ）の腫瘍浸潤抑制効果の結果を示した図である。
【図３】ＳＵＩＴ−２細胞（Ａｄ非投与群）、ＡｄＣＭＶ．ＬａｃＺをトランスフェクトしたＳＵＩＴ−２細胞（Ａｄ−ｌａｃＺ）、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４をトランスフェクトしたＳＵＩＴ−２細胞（Ａｄ−ＮＫ４）をヌードマウスへ移植後経時的に腫瘍体積を測定し、腫瘍の成長抑制効果の結果を示した図である。
【図４】ＳＵＩＴ−２細胞（Ａｄ非投与群）、ＡｄＣＭＶ．ＬａｃＺをトランスフェクトしたＳＵＩＴ−２細胞（Ａｄ−ｌａｃＺ）、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４をトランスフェクトしたＳＵＩＴ−２細胞（Ａｄ−ＮＫ４）をヌードマウスへ移植後２８日経過後の血管数を計測し、血管新生抑制効果の結果を示した図である。
【図５】ＴＭＫＩ細胞（Ｐ）とｐｃＤＮＡ３／ＮＫ４をトランスフェクトしたＴＭＫＩ細胞（Ｔ１１）をヌードマウスへ移植後、経時的に腫瘍体積を測定し、腫瘍の成長抑制効果の結果を示した図である。
【図６】ＴＭＫＩ細胞（Ｐ）とｐｃＤＮＡ３／ＮＫ４をトランスフェクトしたＴＭＫＩ細胞（Ｔ１１）をヌードマウスへ移植し、移植後３１日経過後のＮＫ４の産生量の結果を示した図である。
【図７】ヌードマウスにＴＭＫＩ細胞を移植し、移植後７日経過後ＰＢＳ、ＡｄＣＭＶ．ＬａｃＺ（Ａｄ−ｌａｃＺ）、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４（Ａｄ−ＮＫ４）を投与し、腫瘍体積を経時的に測定し、腫瘍の成長抑制効果の結果を示した図である。
【図８】ＴＭＫＩ細胞を移植したヌードマウスにＰＢＳ、ＡｄＣＭＶ．ＬａｃＺ（ＬａｃＺ）、ＡｄＣＭＶ．ＮＫ４（ＮＫ４）を連続３日投与後のＮＫ４の産生量の結果を示した図である。
【図９】ｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲ／ＮＫ４の模式図を示した図である。
【図１０】Ａは腫瘍体積を測定することにより、組換えＮＫ４の腫瘍の成長抑制効果の結果を示した図である。Ｂは転移結節数を計測することにより、組換えＮＫ４の転移抑制効果を示した図である。
【図１１】癌末期のヌードマウスに組換えＮＫ４を投与して、マウスの生存数を計測し、組換えＮＫ４の延命効果を示した図である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【配列表】
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