(57)【要約】【課題】腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７産生ベロ毒素を高感度に且つ短時間で検出できる方法を提供すること。【解決手段】カリックスクラウン誘導体の層が表面に形成された支持体を用意し、抗原抗体法を用いたサンドイッチ型検出法によって検体中のベロ毒素を検出する。【選択図】図２
2008233011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学式（１）乃至（３）のいずれかで示されるカリックスクラウン誘導体の層が表面に形成された支持体を用いることを特徴とする、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７産生ベロ毒素の検出法：
【化１】
2008233011.tif 000013
上記式（１）中において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互いに独立的に−ＣＨ2ＳＨ基を示すか、又はＲ1乃至Ｒ4のうち二つが、互いに結合してそれぞれ−ＣＨ2−Ｓ−Ｓ−ＣＨ2−基を形成することができ；又はＲ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、独立的に−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨであり得る；
【化２】
2008233011.tif 000014
上記式（２）中において、ｎは１であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示すか；又はＲ1及びＲ3は、それぞれ−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示し、Ｒ2及びＲ4は、それぞれＨを示すことができ；Ｒ5及びＲ6は、互いに独立的に、−Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル又はイソブチルを示す；
【化３】
2008233011.tif 000015
上記式（３）中において、ｎは２であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互いに独立的に−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示すか；又はＲ1及びＲ3は、それぞれ−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示し、Ｒ2及びＲ4は、それぞれ−Ｈ基を示し；Ｒ5及びＲ6は、互いに独立的に、−Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル又はイソブチルを示す。
【請求項２】
前記カリックスクラウン誘導体が、以下の化学式：
【化４】
2008233011.tif 000016
で示される化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の検出法。
【請求項３】
前記カリックスクラウン誘導体が、以下の化学式：
【化５】
2008233011.tif 000017
で示される化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の検出法。
【請求項４】
前記層が、前記カリックスクラウン誘導体の単分子層であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の検出法。
【請求項５】
前記支持体がプレート状又はチップ状であり、一面側にスポット状の反応領域が複数形成され、各反応領域に前記層が形成されている、請求項１〜４のいずれかに記載の検出法。
【請求項６】
前記反応領域が二次元的なアレイ状に配列している、請求項５に記載の検出法。
【請求項７】
以下のステップを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の検出法：
前記支持体にベロ毒素捕捉抗体を反応させるステップ；
検体を反応させるステップ；
ベロ毒素検出抗体を反応させるステップ；及び
結合したベロ毒素検出抗体を検出するステップ。
【請求項８】
前記ベロ毒素検出抗体が、蛍光物質で標識化した抗体（蛍光標識化抗ベロ毒素抗体）であることを特徴とする、請求項７に記載の検出法。
【請求項９】
前記蛍光物質がCy5であることを特徴とする、請求項８に記載の検出法。
【請求項１０】
前記ベロ毒素検出抗体が、前記ベロ毒素捕捉抗体が認識するベロ毒素のサブユニットと異なるサブユニットを認識する抗ベロ毒素抗体である、請求項７〜９のいずれかに記載の検出法。
【請求項１１】
前記ベロ毒素捕捉抗体が、ベロ毒素のβサブユニットを認識する抗ベロ毒素抗体であり、
前記ベロ毒素検出抗体が、ベロ毒素のαサブユニットを認識する抗ベロ毒素抗体である、ことを特徴とする請求項１０に記載の検出法。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれかに記載のカリックスクラウン誘導体の層が表面に形成された支持体からなる、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７産生ベロ毒素検出用器具。
【請求項１３】
前記層が、前記カリックスクラウン誘導体の単分子層であることを特徴とする、請求項１２に記載の検出用器具。
【請求項１４】
前記支持体がプレート状又はチップ状であり、一面側にスポット状の反応領域が複数形成され、各反応領域に前記層が形成されている、請求項１２又は１３に記載の検出用器具。
【請求項１５】
前記反応領域が二次元的なアレイ状に配列している、請求項１４に記載の検出用器具。
【請求項１６】
前記層に抗ベロ毒素抗体が結合していることを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれかに記載の検出用器具。
【請求項１７】
請求項１２〜１５のいずれかに記載の検出用器具と、ベロ毒素捕捉抗体と、及びベロ毒素検出抗体とを含んでなる、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７産生ベロ毒素検出キット。
【請求項１８】
請求項１６に記載の検出用器具と、及びベロ毒素検出抗体とを含んでなる、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７産生ベロ毒素検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７産生ベロ毒素の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７（以下、「Ｏ−１５７」ともいう）は、１９８２年に米国でハンバーガーによる集団食中毒患者から単離された。感染経路は菌体に汚染された食品を介して生体内へ取り込まれる事が多く、生体内に陽性菌体５０〜１００個程度で潜伏期間約一週間を経て生体に影響を及ぼす。症状に個人差はあるが、下痢、腹痛、血便などが報告されている。発症者の数％は溶血性尿毒症症候群（HUS）を示し、最悪の場合には脳症などの重篤な症状に至る。Ｏ−１５７を中心とする腸管出血性大腸菌感染症は三類感染症に指定されており、感染力や羅患時の症状などから、高い危険性はないが食品を取り扱う職業の人の感染は集団食中毒発生の原因となることがある。有症患者の多くは５歳以下の幼児と免疫力の低下した高齢者である。Ｏ−１５７は牛や羊といった反芻動物が保有する菌で、毎年世界中で多くの感染者と犠牲者を出している（非特許文献１、非特許文献２を参照）。
Ｏ−１５７はベロ毒素（Verotoxin , Shiga like toxin : STX , SLT）産生菌である。ベロ毒素はαサブユニット（MW：32,000 Da）１個とβサブユニット（MW：8,000 Da）５個からなるヘキサマーで、１型と２型があり、両型のアミノ酸配列は約５５%以上が相同であるが、性質はまったく異なる。
尚、本願発明に使用する化合物の詳細が特許文献１、２及び非特許文献３に開示されている。
【特許文献１】特開２００１−１８１２７５号公報
【特許文献２】特開２００６−２１９４９９号公報
【非特許文献１】厚生労働省ホームページ  食中毒・食品監視関連情報  関連情報http://www.mhlw.go.jp/topics/syokuchu/
【非特許文献２】横浜市衛生研究所ホームページ  感染症情報  感染症発生動向調査  http://www.mhlw.go.jp/topics/syokuchu/
【非特許文献３】Yoonsuk Lee, Eun Kyoung Lee, Yong Wan Cho, Takuya Matsui, In-Cheol Kang, Tai-Sun Kim, Moon Hi Han「ProteoChip: A highly sensitive protein microarray prepared by a novel method of protein immobilization for application of protein-protein interaction studies.」Proteomics 2003, 3, 2289_2304
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
腸管出血性感染症の検査方法には糞便を培養し菌体のスクリーニングを行なう方法、PCRを用いて糞便中及び血清中から菌体DNAを増幅させて検出する方法、及びELISAやEIAなどの免疫学検定法を用いて菌体及び毒素を検出する方法がある。糞便を培養する方法は正確さの点では他のどの方法よりも信頼性が高いが、培養に時間がかかるため感染初期での診断に用いることは困難である。同様にPCRを用いた方法は遺伝子から毒素や菌体の有無を確認する方法であり信頼性は高いものの、毒素を直接検出しておらず遺伝子を増幅させる時間が必要となる。そして、抗体と抗原が特異的に結合（抗原抗体反応）する性質を利用した免疫学検定法は、種々な物質に対して最も広く用いられている方法で、短時間で毒素を検出する事が可能である。
【０００４】
抗原抗体法を用いたベロ毒素の一般的な定量法はELISA（Enzyme−linked immunosorbent assay）である。ELISAは汎用性は高いものの、必要な抗体量及び検体量が比較的多量である。また、ELISAの測定限界は数ng/ml〜数百pg/mlであり、それ以下の存在量では検出することが不可能である。微量なベロ毒素が検出不可能であると、少量のＯ−１５７の存在を明らかにしたり、過去に検体に存在していた事を確認する事ができない。加えてELISAでは一般的に96穴のマイクロプレートを用いて検出を行なうため、一度に測定を行なえる検体数が限られる。
【０００５】
そこで本発明は、Ｏ−１５７産生ベロ毒素を高感度に且つ短時間で検出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以上の課題に鑑み鋭意検討した結果、ベロ毒素１型及び２型が混在する微量検体より短時間でベロ毒素を検出することに本発明者らは成功した（後述の実施例）。即ち、本発明者らは、高感度に且つ短時間でベロ毒素を検出できる手法を完成するに至った。本発明は、当該成果に基づき、以下に列挙する検出法、検出用器具、及び検出キットを提供する。
（検出法）
［１］  以下の化学式（１）乃至（３）のいずれかで示されるカリックスクラウン誘導体の層が表面に形成された支持体を用いることを特徴とする、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７産生ベロ毒素の検出法：
【化１】
2008233011.tif 000003
上記式（１）中において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互いに独立的に−ＣＨ2ＳＨ基を示すか、又はＲ1乃至Ｒ4のうち二つが、互いに結合してそれぞれ−ＣＨ2−Ｓ−Ｓ−ＣＨ2−基を形成することができ；又はＲ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、独立的に−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨであり得る；
【化２】
2008233011.tif 000004
上記式（２）中において、ｎは１であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示すか；又はＲ1及びＲ3は、それぞれ−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示し、Ｒ2及びＲ4は、それぞれＨを示すことができ；Ｒ5及びＲ6は、互いに独立的に、−Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル又はイソブチルを示す；
【化３】
2008233011.tif 000005
上記式（３）中において、ｎは２であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互いに独立的に−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示すか；又はＲ1及びＲ3は、それぞれ−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示し、Ｒ2及びＲ4は、それぞれ−Ｈ基を示し；Ｒ5及びＲ6は、互いに独立的に、−Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル又はイソブチルを示す。
［２］  前記カリックスクラウン誘導体が、以下の化学式：
【化４】
2008233011.tif 000006
で示される化合物であることを特徴とする、［１］に記載の検出法。
［３］  前記カリックスクラウン誘導体が、以下の化学式：
【化５】
2008233011.tif 000007
で示される化合物であることを特徴とする、［１］に記載の検出法。
［４］  前記層が、前記カリックスクラウン誘導体の単分子層であることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれかに記載の検出法。
［５］  前記支持体がプレート状又はチップ状であり、一面側にスポット状の反応領域が複数形成され、各反応領域に前記層が形成されている、［１］〜［４］のいずれかに記載の検出法。
［６］  前記反応領域が二次元的なアレイ状に配列している、［５］に記載の検出法。
［７］  以下のステップを含むことを特徴とする、［１］〜［６］のいずれかに記載の検出法：
前記支持体にベロ毒素捕捉抗体を反応させるステップ；
検体を反応させるステップ；
ベロ毒素検出抗体を反応させるステップ；及び
結合したベロ毒素検出抗体を検出するステップ。
［８］  前記ベロ毒素検出抗体が、蛍光物質で標識化した抗体（蛍光標識化抗ベロ毒素抗体）であることを特徴とする、［７］に記載の検出法。
［９］  前記蛍光物質がCy5であることを特徴とする［８］に記載の検出法。
［１０］  前記ベロ毒素検出抗体が、前記ベロ毒素捕捉抗体が認識するベロ毒素のサブユニットと異なるサブユニットを認識する抗ベロ毒素抗体である、［７］〜［９］のいずれかに記載の検出法。
［１１］  前記ベロ毒素捕捉抗体が、ベロ毒素のβサブユニットを認識する抗ベロ毒素抗体であり、
前記ベロ毒素検出抗体が、ベロ毒素のαサブユニットを認識する抗ベロ毒素抗体である、ことを特徴とする［１０］に記載の検出法。
【０００７】
（検出用器具）
［１２］  ［１］〜［３］のいずれかに記載のカリックスクラウン誘導体の層が表面に形成された支持体からなる、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７産生ベロ毒素検出用器具。
［１３］  前記層が、前記カリックスクラウン誘導体の単分子層であることを特徴とする、［１２］に記載の検出用器具。
［１４］  前記支持体がプレート状又はチップ状であり、一面側にスポット状の反応領域が複数形成され、各反応領域に前記層が形成されている、［１２］又は［１３］に記載の検出用器具。
［１５］  前記反応領域が二次元的なアレイ状に配列している、［１４］に記載の検出用器具。
［１６］  前記層に抗ベロ毒素抗体が結合していることを特徴とする、［１２］〜［１５］のいずれかに記載の検出用器具。
【０００８】
（検出用キット）
［１７］  ［１２］〜［１５］のいずれかに記載の検出用器具と、ベロ毒素捕捉抗体と、及びベロ毒素検出抗体とを含んでなる、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７産生ベロ毒素検出キット。
［１８］  ［１６］に記載の検出用器具と、及びベロ毒素検出抗体とを含んでなる、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７産生ベロ毒素検出キット。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の第１の局面は腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７産生ベロ毒素の検出法に関する。本発明の検出法は、以下の化学式（１）乃至（３）のいずれかで示されるカリックスクラウン誘導体の層が表面に形成された支持体を用いることを特徴とする。尚、本明細書では、特に言及しない限り、「カリックスクラウン誘導体」とはこれらの化合物のことを指す。
【化６】
2008233011.tif 000008
上記式（１）中において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互いに独立的に−ＣＨ2ＳＨ基を示すか、又はＲ1乃至Ｒ4のうち二つが、互いに結合してそれぞれ−ＣＨ2−Ｓ−Ｓ−ＣＨ2−基を形成することができ；又はＲ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、独立的に−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨであり得る；
【化７】
2008233011.tif 000009
上記式（２）中において、ｎは１であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示すか；又はＲ1及びＲ3は、それぞれ−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示し、Ｒ2及びＲ4は、それぞれＨを示すことができ；Ｒ5及びＲ6は、互いに独立的に、−Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル又はイソブチルを示す；
【化８】
2008233011.tif 000010
上記式（３）中において、ｎは２であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互いに独立的に−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示すか；又はＲ1及びＲ3は、それぞれ−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示し、Ｒ2及びＲ4は、それぞれ−Ｈ基を示し；Ｒ5及びＲ6は、互いに独立的に、−Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル又はイソブチルを示す。
【００１０】
尚、式（１）の化合物はカリックス［４］アレン−ビスクラウン−４の誘導体であり、式（２）の化合物はカリックス［４］アレン−クラウン−５の誘導体であり、式（３）の化合物はカリックス［４］アレン−クラウン−６の誘導体である。これらの化合物の詳細及び製造法などは上記特許文献１、２及び非特許文献３に開示されている。これらの文献に開示されたたコーティング法を実施すれば、所望の支持体の表面にカリックスクラウン誘導体の単分子層を形成することができる。カリックスクラウン誘導体の単分子層は、抗体のFc部分に多く存在するとされるアンモニウムイオンを認識し、分子結合を行なう。これにより、抗体の配向性に配慮した高密度配列が可能となり、高感度検出が実現する。
カリックスクラウン誘導体からなる試薬がProLinkerTM A及びProLinkerTM B（商品名、Proteogen社、ソウル、韓国）として販売されており、当該試薬で支持体の表面をコーティング処理すれば、本発明に必要な支持体を得ることができる。また、同社が販売するProteoChip Basese Plate（ProteoChip A, ProteoChip B, Well-on-a chip：商品名、Proteogen社、韓国）は当該試薬で支持体（スライドガラスなど）を処理したものであり、これを本発明における「カリックスクラウン誘導体の層が表面に形成された支持体」として用いてもよい。尚、ProLinkerTM A及びProLinkerTM Bの化学式を以下に示す。また、ProLinkerTM Aの結合模式図を図１に示す。
【化９】
2008233011.tif 000011
ProLinkerTM A
【００１１】
【化１０】
2008233011.tif 000012
ProLinkerTM B
【００１２】
本発明では、これら二つのカリックスクラウン誘導体のいずれかを使用することが好ましい。
【００１３】
支持体としては金属、ガラス、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂等の無機又は有機材料が用いられる。支持体の形状も特に限定されない。例えばプレート状又はチップ状に成形された支持体を用いればよい。支持体には反応領域が形成される。ここでの「反応領域」とは、ベロ毒素捕捉抗体、検体、及びベロ毒素検出抗体の反応に供される領域のことをいう。支持体あたりの反応領域の数、反応領域の大きさなどは特に限定されない。例えば、支持体の一面側にスポット状の反応領域を複数形成することにする。このような支持体を用いれば複数の検体の同時処理が可能となる。従って、多数の検体を扱う際に迅速な結果が得られる。複数の反応領域を形成する場合の形成パターンは特に限定されず、例えば二次元的なアレイ状に反応領域を配列させればよい。尚、カリックスクラウン誘導体の層が表面に形成された支持体に対して、任意の数の穴を設けたフィルムやシート等を貼付することによって、上記の如き反応領域を備えた支持体を容易に調製することができる。また、このような手段によれば、必要に応じて反応領域の増減が可能となる。
【００１４】
以下、本発明の一実施態様として、サンドイッチ型免疫測定法について説明する。尚、サンドイッチ型免疫測定法によれば極めて高感度の検出が可能となる。
この態様は、以下のステップ、即ち、カリックスクラウン誘導体の層が表面に形成された支持体を用意し、これにベロ毒素捕捉抗体を反応させるステップ（捕捉抗体結合ステップ）；検体を反応させるステップ（検体反応ステップ）；ベロ毒素検出抗体を反応させるステップ（検出抗体結合ステップ）；及び結合したベロ毒素検出抗体を検出するステップ（検出ステップ）を含むことを特徴とする。尚、通常、各ステップの間に、非特異的吸着成分の除去などを目的として洗浄操作が実施される。また、洗浄操作後に乾燥処理を実施することにしてもよい。
【００１５】
捕捉抗体結合ステップでは、カリックスクラウン誘導体の層が表面に形成された支持体を用意し、これにベロ毒素捕捉抗体を反応させることによって、支持体にベロ毒素捕捉抗体を結合させる。ベロ毒素捕捉抗体の反応は、抗体の固相化に通常用いられる方法・条件で実施すればよい。例えば、ベロ毒素捕捉抗体を含有する溶液を支持体に滴下又は塗布し、或いはベロ毒素捕捉抗体を含有する溶液中に支持体を浸漬し、室温〜４０℃の温度条件下、３０分〜１０時間、放置する。
ベロ毒素捕捉抗体には、ベロ毒素を特異的に認識する抗体（抗ベロ毒素抗体）が用いられる。ポリクローナル抗体を用いることも可能であるが、モノクローナル抗体（抗ベロ毒素モノクローナル抗体）を用いることが好ましい。より高感度の検出を可能にするためである。ベロ毒素捕捉抗体は、ベロ毒素のαサブユニットを認識するものでもβサブユニットを認識するものでもよい。ベロ毒素のβサブユニットを認識するモノクローナル抗体はVirostat社（ポートランド、米国）より入手することが可能である。勿論、新たに調製した抗ベロ毒素抗体をベロ毒素捕捉抗体として使用することにしてもよい。
【００１６】
検体反応ステップでは、捕捉抗体を結合させた支持体に対して検体を反応させる。検体の反応は、捕捉抗体の反応と同様の条件下で実施することができる。検体としては、様々な食品（飲料を含む）又はその抽出物や溶解物など、調理台や調理器具等の拭き取り検体、吐瀉物等、ベロ毒素の存在が疑われる任意の検体が用いられる。
【００１７】
好ましくは、捕捉抗体結合ステップと検体反応ステップとの間に、非特異的な吸着による検出感度の低下等を防止するために、BSAやカゼインなどを用いたブロッキング操作を行う。ブロッキング操作では、BSAやカゼインなどを含有する溶液を所定時間（例えば３０分〜２時間）反応させる。ブロッキング操作後、余分な吸着成分を除去するために洗浄操作を行う。洗浄操作後、乾燥処理に供することにしてもよい。
【００１８】
検出抗体結合ステップでは、ベロ毒素を特異的に認識する抗体であるベロ毒素検出抗体を反応させる。検出感度や特異性の観点から、ベロ毒素捕捉抗体と同様、ベロ毒素検出抗体にもモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
好ましくは、ベロ毒素捕捉抗体が認識するベロ毒素のサブユニットと異なるサブユニットを認識する抗ベロ毒素抗体がベロ毒素検出抗体として用いられる。このようにすれば、捕捉抗体に捕捉されたベロ毒素をベロ毒素検出抗体が認識し易くなり、検出感度の向上をもたらす。例えば、ベロ毒素のβサブユニットを認識する抗体をベロ毒素捕捉抗体として用いた場合、ベロ毒素のαサブユニットを認識する抗体をベロ毒素検出抗体として用いる。これとは逆に、ベロ毒素のαサブユニットを認識する抗体をベロ毒素捕捉抗体として用い、ベロ毒素のβサブユニットを認識する抗体をベロ毒素検出抗体として用いることにしてもよい。尚、ベロ毒素のαサブユニットを認識するモノクローナル抗体はVirostat社（ポートランド、米国）より入手することが可能である。
好ましい一態様では、蛍光物質で標識化した抗体（蛍光標識化抗ベロ毒素抗体）をベロ毒素検出抗体として使用する。この態様では、蛍光の測定によりベロ毒素が検出される。従って、極めて高感度の検出が可能となる。蛍光物質の種類は特に限定されない。蛍光物質として、Cy3、Cy5、Cy5.5、Texas RedTM、FITC（Fluorescein isothiocyanate）、PE（phycoerythrin）、APC（Allophycocyanin）、PerCPTM（BDバイオサイエンス社）、APC-Cy7（BDバイオサイエンス社）、PreCP-Cy5.5（BDバイオサイエンス社）を例示することができる。
【００１９】
ベロ毒素検出抗体として２種類の抗体、即ち抗ベロ毒素抗体（一次抗体）と、当該抗ベロ毒素抗体を認識する抗体（二次抗体）とを用いることにしてもよい。この場合、後続の検出ステップにおいて、一次抗体を介してベロ毒素に結合した二次抗体が検出される。
【００２０】
検出ステップではベロ毒素捕捉抗体によって捕捉された抗原（ベロ毒素）に結合したベロ毒素検出抗体が検出される。上記のように蛍光標識化抗ベロ毒素抗体を検出抗体に用いた場合、このステップでは蛍光の検出・測定が行われ、蛍光量を基に検体中のベロ毒素の量が算出される。蛍光の検出・測定には市販の蛍光スキャナー（例えばGE healthcare社、パーキンエルマー社が提供する）を利用すればよい。
【００２１】
本発明の第２の局面は、本発明の検出法に利用される器具（検出用器具）に関する。本発明の検出用器具は、上記の式（１）乃至（３）のいずれかで示されるカリックスクラウン誘導体の層が表面に形成された支持体からなる。好ましくは、カリックスクラウン誘導体の単分子層が表面に形成されている。支持体は例えばプレート状又はチップ状である。本発明の一態様では、支持体の一面側にスポット状の反応領域が複数形成され、各反応領域に前記単分子層が形成されている。複数の反応領域は例えば二次元的なアレイ状に配列している。
本発明の一態様では、カリックスクラウン誘導体の単分子層に抗ベロ毒素抗体が結合している。このように、捕捉抗体としての抗ベロ毒素抗体を予め固相化しておいてもよい。
【００２２】
本発明の第３の局面は、本発明の検出法に利用されるキット（検出用キット）に関する。本発明の検出用キットは上記の検出用器具を主要素とする。本発明の検出用キットは、好ましくは、検出法の一連の操作に必要な抗体（ベロ毒素捕捉抗体、ベロ毒素検出抗体）を含む。例えば、ベロ毒素捕捉抗体が固相化されていない支持体を検出用器具として採用する場合、当該支持体に加えて、ベロ毒素捕捉抗体及びベロ毒素検出抗体を含むキットにすることができる。同様に、ベロ毒素捕捉抗体が固相化された支持体を検出用器具として採用する場合、当該支持体に加えて、ベロ毒素検出抗体を含むキットにすることができる。
本発明のキットに、抗原抗体反応やブロッキング操作又は洗浄操作などを実施する上で必要な一以上の試薬（例えば緩衝液、ブロッキング溶液など）や装置・器具などを更に含めてもよい。尚、本発明のキットには通常、使用説明書が添付される。
【実施例】
【００２３】
抗原抗体法を利用し、ProteoChip A（Proteogen社、ソウル、韓国）を用いて、捕捉抗体（Capture mAb）と検出抗体（Detector mAb）によるサンドイッチ法でのベロ毒素の検出を試みた。ProteoChip AにはProLinkerTM A（Proteogen社、ソウル、韓国）が表面にコーティングされている。このリンカーは抗体のFc部分に多く存在するとされるアンモニウムイオンを認識し、分子結合を行なう。これにより、抗体の配向性に配慮した高密度配列が可能となる。
【００２４】
１．実験方法
以下の手順に従い、微量試料中のベロ毒素の検出を試みた。尚、検出法の模式図を図２に、実験プロトコルを図３に、使用した溶液組成を図４にそれぞれ示した。
（１）ProteoChip Aはスライドガラスの表面にProLinkerTM Aをコーティングしたものである。ProteoChip Aには、マイクロプレートのように各溶液を入れるためのウェルが設けられていないことから、任意の数の穴（直径約１．５mm）を穿孔した厚さ約１mmのシール（材質：ビニル）を、間に空気が入らないようにProteoChip Aの表面へ貼付することにし、シールの各穴の部分をウェルとして利用した。このようにウェルを形成することにすれば、ウェルの数を適宜増減することが可能である。また、ウェルの大きさも任意に設定することができる。
1%のグリセロールを含む1×PBSで調製した捕捉抗体（抗ベロ毒素１型・２型βサブユニットモノクローナル抗体混合溶液（100μg/ml））を各ウェルに1μlずつ添加し、室温で１時間静置した。抗ベロ毒素１型・２型βサブユニットモノクローナル抗体はVirostat（クローン番号：7582, 7583）より入手した。洗浄操作（0.3%のTween 20を含む1×PBSで5分間の洗浄を2回。続いて1×PBSで1分間の洗浄を4回）の後、窒素ガスで乾燥させた。
（２）1%ウシ血清アルブミン溶液を各ウェルに室温で１時間静置した（ブロッキング）。洗浄操作（0.3%のTween 20を含む1×PBSで5分間の洗浄を2回。続いて1×PBSで1分間の洗浄を4回）の後、窒素ガスで乾燥させた。
（３）100fg/ml〜1ng/mlの濃度に希釈したベロ毒素１型・２型混合溶液を各ウェルに1μlずつ添加し、室温で１時間静置した。ベロ毒素は和光純薬工業より入手した。洗浄操作（0.3%のTween 20を含む1×PBSで5分間の洗浄を2回。続いて1×PBSで1分間の洗浄を4回）の後、窒素ガスで乾燥させた。
（４）捕捉抗体と抗原決定基の異なるCy5標識検出抗体（抗ベロ毒素１型・２型αサブユニットモノクローナル抗体混合溶液（10μg/ml））を各ウェルに1μlずつ添加し、室温で１時間静置した。抗ベロ毒素１型・２型αサブユニットモノクローナル抗体はVirostat（クローン番号：7581, 7584）より入手し、Cy5による標識化はCy5標識試薬NHSタイプ（PA25000, GE healthcare）によって行った。洗浄操作（0.3%のTween 20を含む1×PBSで5分間の洗浄を2回。続いて1×PBSで1分間の洗浄を4回）の後、窒素ガスで乾燥させた。
（５）Cy５の励起波長である633nmで読み込む事が可能な蛍光スキャナー（Typhoon 9200、GE healthcare社製）で各ウェルの蛍光強度を測定し、画像化した。また、チップリーダー（Scanarray Express Ver.3.0、パーキンエルマー社製）を用いて各ウェルの蛍光強度を測定し、数値化した。
【００２５】
２．実験結果
蛍光強度の測定結果を図５及び６に示す。図５は蛍光スキャナーによって得られた各ウェルの蛍光イメージであり、図６はチップリーダーによって測定された各ウェルの蛍光強度をプロットしたグラフである。図６のグラフに示した検量線から試料中のベロ毒素濃度に対応した測定値が得られていることがわかる。また、図５及び６の結果より、本法では100fg/mlのベロ毒素の検出（検出範囲は10ng/ml〜100fg/ml、検出限界は10fg/ml）が可能であることが示された。既存のELISA法と比較した場合、本法の検出感度は100倍以上（概算）高感度である。
一方、本法によれば、簡便な操作で且つ短時間（具体的には６〜７時間程度）で定量的な結果を得ることが可能であった。尚、本法で使用したProteoChip Aでは、抗体の配向性に配慮された高密度配列がチップ上で実現していることから、検体が溶液状であれば複雑な前処理を行わなくとも、高感度で安定した測定値を得る事が可能である。
また、本法によれば使用する抗体量の低減も図られる。具体的には、同原理を用いたELISA法の約半分の抗体量（90ポイントで検体数を測定すると仮定した場合の抗体使用量は9μg程度）で測定可能であると試算された。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明は検体中のベロ毒素の検出に利用される。本発明の検出法は、（１）微量の検体からベロ毒素を検出することができる（即ちベロ毒素の高感度検出が可能となる）、（２）短時間の測定が可能となる、（３）反応領域が複数形成された支持体（例えばアレイ状に配列した反応領域をもつ支持体）を用いることにすれば、多数の検体を同時に処理することができ、ハイスループットな検出が可能となる、（４）使用する抗体の選定によって、ベロ毒素１型のみの検出、ベロ毒素２型のみの検出、又はベロ毒素１型と２型の同時検出が可能となる、（５）検体が溶液状であれば複雑な前処理も必要がなく、簡便な測定が可能となる等、様々な利点を有する。
【００２７】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ProLinkerTM Aの結合模式図
【図２】実施例に示したベロ毒素検出法（抗原抗体法を利用したサンドイッチ型検出法）の模式図。
【図３】実施例に示したベロ毒素検出法のプロトコル。
【図４】実施例に示したベロ毒素検出法に使用した溶液の組成。
【図５】実施例に示したベロ毒素検出法による検出結果（各ウェルの蛍光イメージ）。上５段が検体の蛍光イメージ。下２段はコントロール。
【図６】実施例に示したベロ毒素検出法による検出結果（各ウェルの蛍光強度を数値化したグラフ）。横軸は検体中のベロ毒素濃度。縦軸は蛍光強度（633nm）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図５】
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