(57)【要約】【課題】所望の品質を有する皮膚外用剤を安定に提供する。【解決手段】本発明に係る皮膚外用剤は、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸及びポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体のうち少なくとも一方を含む。ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸はＬ−グルタミン酸のみからなるため、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸、及び、これにより得られるポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体の品質は、製造するごとに性質が不均一とならず、安定する。さらに、本発明に係る皮膚外用剤は保湿性に優れているため、保湿剤、化粧料として好適に使用可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸及びポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体のうち少なくとも一方を含むことを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項２】
上記皮膚外用剤が、化粧料であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤。
【請求項３】
上記皮膚外用剤が、保湿剤であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚外用剤に関する。さらに詳しくは、高い保湿効果を有するポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸及びポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体のうち少なくとも一方を含み、保湿剤、化粧料として好適な皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
荒れ肌には、角質細胞の剥離によるものと、乾燥により皮膚の健康状態が悪化して、表皮の硬化や損傷に至るものとがある。中でも角質細胞の剥離による荒れ肌は、コレステロール、セラミド、脂肪酸等の角質細胞間脂質の溶出、紫外線、洗剤等による角質細胞の変性、表皮細胞の増殖バランス及び／又は角化バランスの崩壊による角層透過バリアの形成不全等によって発生する。
【０００３】
従来、荒れ肌を予防、又は治癒する目的で、角質細胞間脂質成分、又はそれに類似する角質細胞間脂質を合成して、肌に供給する等の検討が行われている。角層細胞間脂質とは、有棘層及び顆粒層の細胞で生合成された層板顆粒が、角層直下で細胞間に放出され、伸展し、層板（ラメラ）構造を形成することにより、細胞間に広がった物質をいう。
【０００４】
層板顆粒は、グルコシルセラミド、コレステロール、セラミド、リン脂質等から構成されるが、角層細胞間脂質にはグルコシルセラミドは殆ど含まれていない。すなわち、層板顆粒中のグルコシルセラミドは、β−グルコセレブロシダーゼによって加水分解を受け、セラミドに変換されると考えられている。そして、セラミドがラメラ構造を形成することで、角層細胞間脂質として角層透過バリアの形成を改善し、荒れ肌を防ぐバリアとして機能すると考えられている。特に、洗剤等による肌荒れには、セラミドの補充が有効であり、肌荒れの改善に高い効果を示すことが報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
一方、表皮が硬化や損傷することによる荒れ肌を防ぐため、従来、保湿効果を有する、化粧料等の皮膚外用剤が用いられている。保湿効果を有する皮膚外用剤を用いることで、皮膚からの水分揮散が防止され、表皮及び角質層に水分を保持させる。これにより、皮膚の恒常性が維持され、保湿性、柔軟性を保つことができ、みずみずしい肌を保つことができる。
【０００６】
従来報告されている、皮膚に対して保湿効果を有する親油性の物質として、オリーブ油等の植物油、ラノリン等の動物由来の脂質等が挙げられる。また、皮膚に対して保湿効果を有する親水性の物質として、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール等の水溶性多価アルコール、ヒアルロン酸及びキサンタンガム等の多糖類、ポリエチレングリコール等の水溶性高分子、ピロリドンカルボン酸塩、アミノ酸に代表される低分子量の天然保湿因子、植物抽出エキス等が挙げられる。
【０００７】
このように皮膚に対する保湿効果を有する物質として、様々な物質が存在するが、近年、安全性を重要視する風潮等から、動物由来の物質や、化学合成品は避けられる傾向にある。そして、天然物由来の物質や、微生物による発酵生産物が好ましいとされている。さらには、生体のみならず環境にも負荷の少ない生分解性素材が、期待され注目を浴びている。
【０００８】
生分解性素材の中でも、微生物が生産するバイオポリマーが有望視されている。バイオポリマーの中でも、アミノ酸が縮重合して構成されるポリアミノ酸と呼ばれる一群のバイオポリマーには、様々な機能が見出されており、その潜在能力に注目が集まっている。従来、ポリアミノ酸として、ポリ−γ−グルタミン酸（以下、「ＰＧＡ」と表記する）、ポリ−ε−リジンおよびシアノファイシンの３種類が同定されている。
【０００９】
ＰＧＡは、グルタミン酸のα−アミノ基とγ−カルボキシル基とがアミド結合したポリアミノ酸である。ＰＧＡは、古くから日本人に親しまれている納豆の糸引きの主体物質として知られる、吸水性のポリアミノ酸であるが、このように親しまれてきた背景として、その魅力的な機能性によるところが大きい。ＰＧＡの魅力的な機能としては、生分解性及び高吸水性を兼ね備えている点が知られている。これらの機能を利用して、上述した化粧料をはじめ、医療品、食品等、種々の分野、用途で用いられることが期待されている。
【００１０】
ＰＧＡとしては、Ｌ−グルタミン酸及びＤ−グルタミン酸の両光学異性体が不規則に結合してなるＰＧＡが一般的であるが、Ｌ−グルタミン酸のみが結合してなるＰＧＡ（特許文献１、非特許文献１〜３）や、Ｄ−グルタミン酸のみが結合してなるＰＧＡ（非特許文献４）も報告されている。また、特許文献２では、ＰＧＡの架橋体を吸水性樹脂として用いている。
【００１１】
なお、本明細書では、説明の便宜のため、Ｄ−グルタミン酸及びＬ−グルタミン酸が結合してなるＰＧＡを「ＤＬ−ＰＧＡ」と表記する。また、Ｄ−グルタミン酸のみからなるＰＧＡを「Ｄ−ＰＧＡ」と表記し、Ｌ−グルタミン酸のみからなるＰＧＡを「ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸」又は「Ｌ−ＰＧＡ」と表記する。
【特許文献１】特表２００２−５１７２０４号公報（２００２年６月１８日公表）
【特許文献２】特開平１０−２５１４０２号公報（１９９８年９月２２日公開）
【非特許文献１】Aono, R., M. Ito, and T. Machida, Contribution of the Cell Wall Component Teichuronopeptide to pH Homeostasis and Alkaliphily in the Alkaliphile Bacillus lentus C-125, Journal of Bacteriology, 1999, Vol. 181, 6600-6606.
【非特許文献２】Weber, J., Poly(gamma-glutamic acid)s are the major constituents of nematocysts in Hydra (Hydrozoa, Cnidaria), Journal of Biological Chemistry, 1990, Vol. 265, 9664-9669.
【非特許文献３】Hezayen, F. F., B. H. A. Rehm, B. J. Tindall and A. Steinbuchel, Transfer of Natrialba asiatica B1T to Natrialba taiwanensis sp. nov. and description of Natrialba aegyptiaca sp. nov., a novel extremely halophilic, aerobic, non-pigmented member of the Archaea from Egypt that produces extracellular poly(glutamic acid), International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2001, 51, 1133-1142.
【非特許文献４】Makino, S., I. Uchida, N. Terakado, C. Sasakawa, and M. Yoshikawa, Molecular characterization and protein analysis of the cap region, which is essential for encapsulation in Bacillus anthracis, Journal of Bacteriology, 1989, 171, 722-730.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、上記従来のＰＧＡを含有する皮膚外用剤では、所望の品質を有する皮膚外用剤を安定して製造することが困難であるという問題や、保湿性が不十分であるという問題点を有する。
【００１３】
上述のように、現在、製品化されているＤＬ−ＰＧＡは、化学的にヘテロなポリマーである。具体的には、ＰＧＡは、納豆菌やその類縁菌から生産されているが、Ｄ−グルタミン酸及びＬ−グルタミン酸が不規則に結合しており、その含有比率や、配列は生産菌の培養毎に変動する。一般に、ポリアミノ酸の構造的特徴（構成するアミノ酸の光学活性や種類、分子サイズ、結合様式など）は、その機能に強く影響を与える。上記ＤＬ−ＰＧＡは、分子毎に構造が異なるため、その性質も分子毎に異なる。これでは、所望の品質を有するＤＬ−ＰＧＡを安定して製造することが困難である。
【００１４】
また、ＤＬ−ＰＧＡの保湿性は不十分であるため、化粧品等の皮膚外用剤としての実用化には大きな課題が残る。
【００１５】
ところで、従来、Ｌ−ＰＧＡを含む皮膚外用剤を製造したという報告はない。これには次の理由が考えられる。
【００１６】
一般に、ＰＧＡを用いて皮膚外用剤を製造する場合、保湿性が要求されるため、高分子量のＰＧＡが不可欠である。一方で、従来、液体培養では、平均分子量が大きいＬ−ＰＧＡは得られていない。これでは、Ｌ−ＰＧＡを含有する保湿剤を製造することを着想することすら困難である。
【００１７】
また、工業的な用途のＰＧＡは、液体培養によって製造可能であることが要求される。平板培養では一度に大量の微生物を培養することが難しく、平板培地上からＬ−ＰＧＡを回収すると効率が悪いからである。
【００１８】
具体的には、Ｌ−ＰＧＡを合成する生物として、非特許文献１では好アルカリ性細菌Bacillus haloduransが開示され、非特許文献２ではヒドラが開示されている。しかし、これらの生物により合成されるＬ−ＰＧＡの分子量は１０万程度であり、極めて小さい。
【００１９】
また、特許文献１及び非特許文献３では、好塩性古細菌であるNatrialba aegyptiacaは、平板培地で培養すれば、分子量１０万〜１００万程度のＬ−ＰＧＡを生産することが報告されている。しかし、当該Natrialba aegyptiacaが液体培養条件下で合成するＬ−ＰＧＡは、分子量１０万程度であり、かつ、その合成効率は極めて低い。
【００２０】
一方、これまで得られているＤ−ＰＧＡは、産業上の利用に適していない。
【００２１】
何故なら、非特許文献４で開示されているＤ−ＰＧＡを合成する菌は、強い病原性を有する炭疸菌Bacillus anthracisだからである。産業上利用するＰＧＡの製造に、炭疸菌を使用することは極めて不適切である。
【００２２】
ところで、特許文献２にはＤＬ−ＰＧＡの架橋体が吸水性樹脂として用いられているが、ＤＬ−ＰＧＡの架橋体を皮膚外用剤として用いることは困難である。
【００２３】
特許文献２に開示されているＤＬ−ＰＧＡ架橋体の原料であるＤＬ−ＰＧＡは、バチルス・ズブチルス等の納豆菌やその類縁菌によって合成されている。これでは原料となるＤＬ−ＰＧＡの品質が一定しないため、安定して架橋体を得ることが困難である。本発明者らの検討においてもＤＬ−ＰＧＡの架橋体は得られなかった。これは、上述のようにＤＬ−ＰＧＡは、分子毎にその構造が異なるためであると考えられる。つまり、ＰＧＡの架橋体を作製する際の架橋効率は分子の構造に依存しており、分子毎の構造が不規則に異なる場合は、架橋効率が著しく低下する。よって、分子毎に構造が異なるＤＬ−ＰＧＡを架橋させることは困難であり、架橋体の収率も極めて低いものとなる。
【００２４】
従って、ＤＬ−ＰＧＡの架橋体を用いても、所望の品質の皮膚外用剤を安定して製造することは困難である。
【００２５】
一方で、従来、Ｌ−ＰＧＡの架橋体を得たという報告はない。
【００２６】
これは、上述のように、液体培養では、平均分子量が大きいＬ−ＰＧＡは得られていないためである。低分子量の有機化合物の架橋体を得ることが極めて困難であることは技術常識であるため、当業者は、低分子量のＬ−ＰＧＡの架橋体を得ることを着想することすら困難である。そのため、Ｌ−ＰＧＡの架橋体を得ることを試みたという報告すら無い
また、Ｄ−ＰＧＡの架橋体は、仮に得ることができたとしても、上述のようにＤ−ＰＧＡの生産菌は、現在炭疸菌のみであるため、産業上の利用に適していない。
【００２７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、所望の品質を有する皮膚外用剤を、安定に提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明者らは上記課題の解決のため、高い保湿性を有し、所望の品質を安定して製造することができる、天然物由来の生分解性素材を得るべく鋭意検討を行なった。その結果、高い分子量を有するＬ−ＰＧＡを独自に開発した。そして、当該Ｌ−ＰＧＡは、Ｌ−グルタミン酸のみが結合してなるため、光学活性が均一であり、かつ、分子量が高いことから優れた保湿性を有することから、皮膚外用剤に、Ｌ−ＰＧＡ及び／又はＬ−ＰＧＡの架橋体を含有させることで、上記課題を解決することができることを見出した。
【００２９】
すなわち、本発明に係る皮膚外用剤は、上記課題を解決するために、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸及びポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体のうち少なくとも一方を含むことを特徴としている。
【００３０】
本発明に係る皮膚外用剤では、上記皮膚外用剤が、化粧料であることがより好ましい。
【００３１】
本発明に係る皮膚外用剤では、上記皮膚外用剤が、保湿剤であることがより好ましい。
【発明の効果】
【００３２】
本発明に係る皮膚外用剤は、以上のように、Ｌ−ＰＧＡ及びＬ−ＰＧＡ架橋体のうち少なくとも一方を含む。そのため、所望の品質を有する皮膚外用剤を、安定に提供することができるという効果を奏する。
【００３３】
また、Ｌ−ＰＧＡ及びＬ−ＰＧＡ架橋体は、優れた保湿性を有するため、特に、化粧料、保湿剤として有用な、皮膚外用剤を提供することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更して実施することができる。
【００３５】
〔本発明に係る皮膚外用剤〕
本発明に係る皮膚外用剤はＬ−ＰＧＡ及びＬ−ＰＧＡ架橋体のうち少なくとも一方を含めばよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。
【００３６】
Ｌ−ＰＧＡは、Ｌ−グルタミン酸が結合してなるため、光学活性が均一であり、分子毎の性質も均一である。よって、Ｌ−ＰＧＡから得られるＬ−ＰＧＡ架橋体も、所望の品質で安定に製造することができる。そのため、Ｌ−ＰＧＡ及びＬ−ＰＧＡ架橋体のうち、少なくとも一方を用いることで、所望の品質を有する皮膚外用剤を安定して提供することができる。
【００３７】
さらに、Ｌ−ＰＧＡ及びＬ−ＰＧＡ架橋体は、保湿性に優れているため、本発明に係る皮膚外用剤は、保湿剤及び／又は化粧料として好適に用いることができる。
【００３８】
本発明に係る皮膚外用剤を保湿剤として用いる場合、具体的には、フェイスケア製品、ハンドケア製品、ボディケア製品、フットケア製品、ヘッドケア製品、及びヘアケア製品、ネイルケア製品、又はマウスケア製品等として、好適に用いることができる。
【００３９】
また、本発明に係る皮膚外用剤を化粧料として用いる場合、具体的には、乳液、美容液、クリーム、ローション、洗顔料、メイク落とし等のフェイスケア製品、ハンドケア製品の他、ボディケア製品、フットケア製品、ヘッドケア製品、及びヘアケア製品、ネイルケア製品、又はマウスケア製品等として、好適に用いることができる。
【００４０】
なお、本明細書において、「皮膚」とは、顔、首、胸、背中、腕、脚、手および頭皮の皮膚が意図される。また、本明細書において「皮膚外用剤」とは、乾燥、荒れ肌等、皮膚状態を改善しあるいは皮膚状態の悪化を抑制するために使用されるものを意図する。
【００４１】
（Ｌ−ＰＧＡ）
本発明に係る皮膚外用剤に含まれるＬ−ＰＧＡは、Ｌ−グルタミン酸が結合してなるホモポリマーであり、その構造は下記式（１）にて示される構造を有する。
【００４２】
【化１】
2008120725.tif 000002
【００４３】
（式（１）においてｎは重合数を示す）
本発明に係る皮膚外用剤に含まれるＬ−ＰＧＡの平均分子量としては、皮膚外用剤の用途等に応じて、適宜選択すればよいが、好ましくは１３０万以上、より好ましくは２００万以上、さらに好ましくは３５０万以上である。
【００４４】
Ｌ−ＰＧＡの平均分子量が高ければ高いほど、当該Ｌ−ＰＧＡを含む皮膚外用剤の保湿性が向上する。そのため、Ｌ−ＰＧＡの平均分子量の上限値は特に限定されるものではない。なお、後述するＬ−ＰＧＡの製造方法によれば、例えば、平均分子量６００万、最大で１５００万のＬ−ＰＧＡを得ることができる。
【００４５】
なお、本明細書において「平均分子量」とは、プルラン標準物質の分子量換算にて算出した数平均分子量（Mn）を意図する。
【００４６】
本発明に係る皮膚外用剤に含まれるＬ−ＰＧＡとしては、従来公知の種々の方法で得たＬ−ＰＧＡを用いればよく、例えば、Ｌ−ＰＧＡを生産する微生物（以下、単に「Ｌ−ＰＧＡ生産微生物」と表記する）を用いて得たＬ−ＰＧＡを用いればよい。
【００４７】
（Ｌ−ＰＧＡ生産微生物）
Ｌ−ＰＧＡ生産微生物としては、Ｌ−ＰＧＡを合成する微生物である限り限定されるものではなく、Ｌ−ＰＧＡ生産微生物の野生型、その変異株、又は、遺伝子組換え技術により、Ｌ−ＰＧＡの生産能力を付与、又は強化された微生物を用いればよい。中でも、好塩菌又はその変異処理株が好ましい。好塩菌としての性質を有していれば、好熱菌、高度好熱菌、好冷菌、好酸菌、好圧菌および低温生育菌等を用いてもよい。好塩菌は、低度好塩菌（０．２〜０．５ＭのNaCl濃度で生育）、中度好塩菌（０．５〜２．５ＭのNaCl濃度で生育）、高度好塩菌（２．５〜５．２ＭのNaCl濃度で生育）の３種類に分類され、いずれを用いてもよいが、高度好塩菌が好ましい。なお、好塩菌は、他の微生物が生育不可能な高塩条件下においても生育可能であることから、無菌操作無しで培養することができる。
【００４８】
また、Ｌ−ＰＧＡ生産微生物としては、古細菌であってもよい。古細菌としては、上述の高度好塩菌に分類される高度好塩古細菌の他、好熱古細菌、メタン菌（メタン生成古細菌）等が挙げられるが、Ｌ−ＰＧＡを生産可能である限り、いずれの古細菌を用いてもよい。古細菌の中でも高度好塩古細菌が好ましい。
【００４９】
高度好塩古細菌としては、例えば、Halobacterium（ハロバクテリウム）属、Haloarcula（ハロアルクラ）属、Haloferax（ハロフェラックス）属、Halococcus（ハロコッカス）属、Halorubrum（ハロルブルム）属、Halobaculum（ハロバキュラム）属、Natrialba（ナトリアルバ）属、Natronomonas（ナトロノモナス）属、Natronobacterium（ナトロノバクテリウム）属、Natronococcus（ナトロノコッカス）属等が挙げられるが、Natrialba属が好ましく、Natrialba aegyptiaca（ナトリアルバ  エジプチアキア）がさらに好ましい。N. aegyptiacaは、高塩環境下で発生する脱水現象から、巧みに身を守るためにＬ−ＰＧＡを生産すると考えられている（例えばF. F. Hezayen, B. H. A. Rehm, R. Eberhardt, A. Steinbuchel, Polymer production by two newly isolated extremely halophilic archaea: application of a novel corrosion-resistant bioreactor, Applied Microbiology and Biotechnology, 2000, 54,319参照）。また、N. aegyptiaca の中でも、Natrialba aegyptiaca（ナトリアルバ  エジプチアキア）０８３０−８２株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８７２）、Natrialba aegyptiaca（ナトリアルバ  エジプチアキア）０８３０−２４３株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８７３）、及び、Natrialba aegyptiaca（ナトリアルバ  エジプチアキア）０８３１−２６４株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８７４）からなる群から選択される少なくとも一つの菌株を用いることがさらに好ましい。N. aegyptiacaを用いれば、より分子量の大きいＬ−ＰＧＡを得ることができる。特に、N. aegyptiaca ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８７２、N. aegyptiaca ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８７３、N. aegyptiaca ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８７４は、いずれもの菌株も平均分子量１３０万以上のＬ−ＰＧＡを、液体培養条件下で合成することができる。よって、Ｌ−ＰＧＡの架橋体の収率がよく、また、Ｌ−ＰＧＡの製造効率もよい。
【００５０】
N. aegyptiaca ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８７２、N. aegyptiaca ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８７３、及び、N. aegyptiaca ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８７４は、特願２００６−１４２６８５に記載の変異処理方法及びスクリーニング方法に基づいて、本発明者らが独自に見出したN. aegyptiacaの変異株である。なお、本明細書において、単に「N. aegyptiaca」と表記したときは、N. aegyptiacaの変異株をもその意味に含む。
【００５１】
このように、本発明に係る皮膚外用剤に含ませるＬ−ＰＧＡとしては、平均分子量の大きいＬ−ＰＧＡを生産する微生物を、上記スクリーニング方法により選抜して用いてもよく、さらに、上記変異処理方法で微生物に変異処理を施した上で、上記スクリーニング方法により選抜した微生物を用いてもよい。
【００５２】
（変異処理方法）
ここで、上述の特願２００６−１４２６８５記載の変異処理方法により、Ｌ−ＰＧＡ生産性が向上した微生物の変異株を作製する一実施形態について説明する。
【００５３】
上記変異処理方法としては、例えば、遺伝子組換えによる方法、細胞又は胞子に対して、変異原性のある薬剤を接触させる方法、Ｘ線又はγ線等の放射線、紫外線等を照射する方法等、従来公知の方法を用いればよい。上記変異原性のある薬剤としては、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）等のアルキル化剤を挙げることができる。本発明者らは、ＮＴＧを用いて、Ｌ−ＰＧＡ生産微生物に変異処理を施した。なお、Ｌ−ＰＧＡ生産微生物に対して、上述の変異処理を施す場合には、変異処理後の菌株の生存率が１％以下となる程度の強度で行なうことが好ましいが、特に限定はされるものではない。
【００５４】
例えば、本発明者らは、N.aegyptiaca（ＪＣＭ１１１９４）を親株として、まずＰＧＡ生産用の培地で培養した後、ＮＴＧ溶液で培養し、さらにＰＧＡ生産用の培地で培養した。このとき、生存率が１％以下となるＮＴＧ溶液の濃度等の条件を見出し、生存した菌体を変異株として得た。
【００５５】
ここで、ＰＧＡ生産用の培地としては、当該変異処理方法に供する菌株がＰＧＡを生産可能な培地である限り限定されるものではないが、本発明者らは、２２.５重量％ NaCl、２重量％ MgSO４・７H２O、０.２重量％ KCl、３重量％ Trisodium Citrate、１重量％ Yeast Extract、０.７５重量％ Casamino acidの組成のＰＧＡ生産用液体培地を用いた。培養条件は、特に限定されるものではないが、例えば本発明者らは、３mlの上記ＰＧＡ生産用液体培地を含む１８ml試験管で、３７℃  ３００rpmで３日間培養した後、得られた培養液０．５mlを、５０mlの上記ＰＧＡ生産用液体培地を含む５００ml容坂口フラスコに植菌し、３７℃  １８０rpmで５日間培養した。
【００５６】
また、上記ＮＴＧ溶液の組成としては、当該変異処理方法に供する菌株の生存率が１％になるように、適宜設定すればよく、特に限定されるものではない。例えば本発明者らは、ＮＴＧ（東京化成株式会社）の飽和溶液、７０重量％、５０重量％、２０重量％、１０重量％の水溶液を、上記ＰＧＡ生産用液体培地で培養した菌株を懸濁液に、当該懸濁液の１／１０量添加して当該懸濁液を培養した。当該懸濁液を作製する際に、菌株を懸濁させる液体は、特に限定されるものではないが、本発明者らは、１００mM クエン酸緩衝液（pH６.０）を用いた。具体的には、上記ＰＧＡ生産用液体培地による培養で得られた培養液から、３０００rpmで５分間遠心分離して、菌体を回収した後、１００mM クエン酸緩衝液（pH６.０）を加え懸濁した。この遠心分離から懸濁までの操作を３度繰り返して懸濁液を得た。ＮＴＧ溶液による培養条件は、特に限定されるものではない。例えば、本発明者らは、４２℃  １５０rpmで１時間培養した。
【００５７】
ＮＴＧ溶液による培養後の菌株を培養するＰＧＡ生産用の培地としては、特に限定されるものではなく、上記ＰＧＡ生産用液体培地を用いてもよいが、本発明者らは、ＰＧＡ生産用寒天培地（１０％ NaCl、２％ MgSO４・７H２O、０.２％ KCl、３％ Trisodium Citrate、１％ Yeast Extract、０.７５％ Casamino acid、２％ Agar）に播種して３７℃で５日間培養した。これにより、N.aegyptiaca（ＪＣＭ１１１９４）を親株として、当該変異処理方法に供した場合、７０重量％のＮＴＧ溶液を用いたとき、生存率が１％以下となった。
【００５８】
（スクリーニング方法）
次に、上記スクリーニング方法について説明する。なお、上記スクリーニング方法に供する菌株は、上記変異処理方法により変異処理を施した菌株を供してもよく、当該変異処理方法を施していない野生株を供してもよい。
【００５９】
上記スクリーニング方法は、塩感受性の高いＬ−ＰＧＡ生産微生物を選抜することで行なう。具体的には、Ｌ−ＰＧＡ生産微生物が、通常、Ｌ−ＰＧＡを生産することが困難な塩濃度下で、Ｌ−ＰＧＡ生産微生物を培養し、ムコイド状を示すコロニーを目安に選抜すればよい。塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、カルシウム、亜鉛及び鉄等の、従来公知のものを用いればよいが、好ましくはナトリウムである。
【００６０】
なお、本明細書において「ムコイド状」とは、コロニーが粘性を示す状態を意図し、具体的には、微生物が、ポリペプチド鎖の主柱に共有結合した単糖や多糖鎖側鎖を有する高分子を生産して、当該微生物のコロニーが粘性を示す状態を意図する。つまり、上記スクリーニング方法では、Ｌ−ＰＧＡと多糖とが結合することで粘性状態、即ちムコイド状を示すコロニーを目安に選抜すればよい。
【００６１】
また、本明細書において「塩感受性」とは、微生物が、Ｌ−ＰＧＡの生産を開始する塩濃度を意図する。そして、「塩感受性が高い」とは、微生物が、Ｌ−ＰＧＡの生産を開始する塩濃度が低いことを意図する。つまり、上記スクリーニング方法では、より少ない塩濃度でＬ−ＰＧＡを生産する菌株を選抜する。具体的には、NaClが５重量％以上２０重量％以下、好ましくは７重量％以上１５重量％以下で、Ｌ−ＰＧＡを生産する菌株を選抜することが好ましい。
【００６２】
従来、液体培養条件下で、ＰＧＡ生産微生物をスクリーニングすることは困難であった。何故なら、例えばN. aegyptiacaは、固体培地表面でムコイド状のコロニーを形成すると、コロニー同士が融合するため、シングルコロニーの分離が困難だったからである。さらに、シングルコロニーの分離可能であったとしても、一株ずつ液体培養し、Ｌ−ＰＧＡの生産の有無を確認するために、膨大な時間と労力が必要であった。つまり、本発明に係る皮膚外用剤は、本発明者らが独自に見出したスクリーニング方法により得た、高分子量のＬ−ＰＧＡ生産菌を用いることで、初めて可能となった全く新たな皮膚外用剤である。
【００６３】
ここで、上記変異処理方法により得たN. aegyptiacaの変異株から、Ｌ−ＰＧＡの生産能に優れた菌株をスクリーニングする方法の一例を説明するが、これに限定されるものではない。
【００６４】
まず、上記スクリーニング方法に供する変異株を、従来公知の栄養培地で培養するとよい。栄養培地としては、特に限定されるものではないが、例えば肉汁、ペプトン、大豆粉、Yeast Extract、Casamino acid、アミノ酸類またはそれらの混合物などを含有する培地、または必要な栄養素類を含有する無機合成培地などの寒天平板培地を用いればよい。また、ＰＧＡ生産微生物がＰＧＡを生産しやすい培地を用いてもよい。当該ＰＧＡを生産しやすい培地としては、特に限定されるものではないが、例えば２２.５重量％ NaCl、２重量％ MgSO４・７H２O、０.２重量％ KCl、３重量％ Trisodium Citrate、１重量％ Yeast Extract、０.７５重量％ Casamino acid、２重量％ Agarからなる寒天培地（以下、「ＰＧＡ生産用寒天培地Ａ」と表記する）を用いればよい。培養期間は特に限定されるものではないが、２〜４日間が好ましい。
【００６５】
次に、Ｌ−ＰＧＡ生産微生物がＬ−ＰＧＡを生産しにくい培地を用いて、当該変異株を培養して、当該培地においてもＬ−ＰＧＡを生産する菌株を選抜すればよい。上記Ｌ−ＰＧＡを生産しにくい培地としては、Ｌ−ＰＧＡ生産微生物がＬ−ＰＧＡを生産しにくい組成である限り限定されるものではない。具体的には、当該培地中の塩濃度を低くするとよい。例えば、本発明者らは、１０重量％のNaClを含む固体培地を用いた。これは、N. aegyptiacaは、１０重量％以上の塩を含む培地で生育すること自体は可能であるが、２０重量％以上の塩を含む培地で培養しない限り、Ｌ−ＰＧＡを生産しない株が多いからである。また、N. aegyptiacaは、NaClの濃度が１０重量％の固体培養条件下では、ムコイド状を示さない。さらに、液体培養よりも固体培養の方が、一菌体当たりのＬ−ＰＧＡ生産量が１０倍以上高い。
【００６６】
より具体的には、本発明者らは、１０重量％ NaCl、２重量％ MgSO４・７H２O、０．２重量％ KCl、３重量％ Trisodium Citrate、１重量％ Yeast Extract、０.７５重量％ Casamino acid、２重量％ Agarからなる寒天培地（以下、「ＰＧＡ生産用寒天培地Ｂ」と表記する）を用いた。このときの培養条件は、特に限定されるものではないが、例えば、温度は３７℃とすればよく、培養期間は４〜６日とすればよい。
【００６７】
なお、ＰＧＡ生産用寒天培地Ｂ等のＬ−ＰＧＡを生産しにくい培地を用いて、菌株を培養する間は、併せてＰＧＡ生産用寒天培地Ａ等のＬ−ＰＧＡを生産しやすい培地を用いて、スクリーニングに供する菌株のＬ−ＰＧＡ生産能を、並行して確認することが好ましい。
【００６８】
選抜した菌株は、さらにＬ−ＰＧＡを生産しやすい培地で培養して、Ｌ−ＰＧＡ生産能の再現性を確認することが好ましい。当該確認には、例えば上記ＰＧＡ生産用寒天培地Ａを用いて培養すればよい。
【００６９】
このようにして塩感受性の高い菌株を選抜することができる。
【００７０】
次に、選抜した塩感受性の高い菌株を、ＰＧＡ生産用の液体培地で培養して、Ｌ−ＰＧＡの生産量を測定し、さらにＬ−ＰＧＡ生産量の高い菌株を再選抜するとよい。
【００７１】
このとき、既に、Ｌ−ＰＧＡを良好に生産するＬ−ＰＧＡ生産微生物が選抜されているため、液体培養による選抜を容易に行なうことができる。これは上述の塩感受性の高い菌株を選抜する方法が、他のＰＧＡ生産微生物を選抜する方法に比べて優れている点の一つである。つまり、当該選抜方法を行なわずに、液体培養による選抜のみで、Ｌ−ＰＧＡを生産可能な微生物又はその変異株を入手することは、当業者にとって容易でない。何故なら、固体培養で得られるコロニーを、それぞれ液体培養して、Ｌ−ＰＧＡの生産量を確認する必要があるからである。この作業は天文学的数字になるため、事実上不可能であることは当業者であれば容易に理解できる。本発明者らは鋭意努力し、Ｌ−ＰＧＡを液体培養で生産できる微生物又はその変異株を容易に入手する方法を見出した。
【００７２】
Ｌ−ＰＧＡ生産量の高い菌株を再選抜するときに用いる、ＰＧＡ生産用の液体培地としては、特に限定されるものではないが、上述の変異処理方法で用いたＰＧＡ生産用液体培地を用いればよい。培養条件は、特に限定されるものではなく、例えば、本発明者らは上記ＰＧＡ生産用液体培地を用いて、３７℃、１１８０ｒｐｍで４日間培養することにより、Ｌ−ＰＧＡの生産能に優れた菌株を選抜した。また、一度小さい系で培養した後に、系を大きくして培養してもよい。例えば、本発明者らは、菌株のシングルコロニーを、１白金耳掻き取り、３mlの上記ＰＧＡ生産用液体培地を入れた１８ml容試験管に植菌して、３７℃、３００rpmで３日間培養した。そして、得られた培養液０．５mlを、５０mlの上記ＰＧＡ生産用液体培地を入れた５００ml容坂口フラスコに植菌して、３７℃、１８０rpmで３日間培養した。
【００７３】
次に、液体培地中のＬ−ＰＧＡを測定して、より多くのＬ−ＰＧＡを生産した菌株を選抜すればよい。
【００７４】
液体培地中のＬ−ＰＧＡの量を測定する方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、硫酸銅やエタノールを用いてＬ−ＰＧＡを沈澱させて、当該沈殿物の重量測定、又は、Ｋｉｊｅｒｄｅｒ法による総窒素の測定を行なう方法（M.Bovarnick,J.Biol.Chem.,145巻、415頁、1942年）、塩酸加水分解後のグルタミン酸量を測定する方法（R.D.Housewrigt,C.B.Thorne,J.Bacteriol.,60巻、89頁、1950年）、塩基性色素との定量的な結合を利用した比色法（M.Bovarnick et al., J.Biol.Chem.,207巻、593頁、1954年）が挙げられる。中でも、塩基性色素との定量的な結合を利用した比色法を用いることが好ましい。
【００７５】
上記比色法で用いる塩基性色素としては、例えばクリスタルバイオレット、アニリンブルー、サフラニンオー、メチレンブルー、メチルバイオレット、トルイジネブルー、コンゴレッド、アゾカルマイン、チオニン、ヘマトキシリンなどが挙げられるが、サフラニンオーが好ましい。本発明者らは、１/５倍希釈したサフラニンオーを用いて、液体培地中のＬ−ＰＧＡの量を測定して、親株と比較してＬ−ＰＧＡの生産能が高い菌株を選抜した。
【００７６】
これまで説明した変異処理方法及びスクリーニング方法により、本発明者らは、３０,０００株をスクリーニングして、その結果、３株のＬ−ＰＧＡ生産変異株を得た。
【００７７】
このようにして得られた菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ナトリアルバ  エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）０８３０−８２株（受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、受領日：平成１８年４月４日、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８７２）、ナトリアルバ  エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）０８３０−２４３株（受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、受領日：平成１８年４月４日、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８７３）、またはナトリアルバ  エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）０８３１−２６４株（受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、受領日：平成１８年４月４日、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８７４）として寄託されている。
【００７８】
当該３株はいずれも、親株であるＪＣＭ１１１９４株より優れたＬ−ＰＧＡ生産能を有し、高分子量のＬ−ＰＧＡを工業的なスケールで製造することができる。例えば、上述の二段階に分けた培養によれば、ＪＣＭ１１１９４株は、培養液１Ｌあたり０．６１ｇのＬ−ＰＧＡを生産したが、０８３１−２６４株は、４．９９ｇのＬ−ＰＧＡを生産した。
【００７９】
（Ｌ−ＰＧＡの製造方法）
次に、Ｌ−ＰＧＡの製造方法として、N. aegyptiacaを用いた場合について例示するが、本発明に係る皮膚外用剤に含まれるＬ−ＰＧＡを得る方法は、これに限定されるものではない。
【００８０】
N. aegyptiacaを培養する培地は、当該N. aegyptiacaが生育可能で、かつ、Ｌ−ＰＧＡを合成可能である培地である限り、特に限定されるものではないが、液体培地であることが好ましい。液体培地を用いれば、一度に大量にN. aegyptiacaを培養できるため、Ｌ−ＰＧＡの製造効率が極めて向上する。
【００８１】
N. aegyptiacaの培養に用いる培地の成分は、N. aegyptiacaが摂取可能な炭素源及び無機塩類を含めばよく、必要に応じてYeast Extract等、その他の栄養物を添加すればよい。例えば、本発明者らは、後述する実施例において、２２．５％ NaCl、２％ MgSO4・７H2O、０．２％ KCl、３％ Trisodium Citrate、１％ Yeast Extract、０．７５％ Casamino acidの培地を用いてN. aegyptica ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８７４を培養している。なお、Yeast Extractを培地に添加する場合、その濃度は０．１重量％以上１０重量％以下であることが好ましく、０．５重量％以上５．０重量％以下がさらに好ましい。
【００８２】
N. aegyptiacaは高度好塩菌であるので、Ｌ−ＰＧＡの製造に用いるN. aegyptiacaの生育特性に応じて、培地に塩を添加してもよい。培養時の塩濃度は１０重量％以上３０重量％以下、好ましくは１５重量％以上２５重量％以下で培養すればよい。
【００８３】
N. aegyptiacaの培養に用いる培地のpHは、特に限定されるものではないが、５．０以上１０以下が好ましく、さらに好ましくは６．０以上８．５以下である。なお、pHの調整には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、塩酸、硫酸、これらの水溶液等を用いればよいが、pHを調整可能な限り限定されるものではない。
【００８４】
培地を作製した後は、通常の方法で殺菌した後に、Ｌ−ＰＧＡの生産に用いるN. aegyptiacaを添加して培養すればよい。なお、培地の殺菌は、従来公知の方法で行なえばよく、例えば、１１０〜１４０℃で８〜２０分行なえばよい。なお、培地のNaClの濃度を飽和濃度にすることで、殺菌工程を省略することもできる。上述のように、N. aegyptiacaは高度好塩菌であるため、飽和濃度のNaCl存在下でも生育可能であるが、他の微生物は生育不可能であるからである。
【００８５】
N. aegyptiacaを液体培養する場合には、振とう培養、通気攪拌培養等を行なうことが好ましい。また、培養温度は、特に限定されるものではないが、２５℃以上５０℃以下が好ましく、３０℃以上４５℃以下がさらに好ましい。
【００８６】
N. aegyptiacaの培養期間は、他の培養条件、目的とするＬ−ＰＧＡの生産量に応じて適宜設定すればよく特に限定されるものではなく、例えば２〜４日間程度でよい。
【００８７】
上述の培養条件等に基づいてN. aegyptiacaの培養を行なうと、Ｌ−ＰＧＡは、主として菌体外に蓄積される。
【００８８】
N. aegyptiacaを培養した後の培地から、Ｌ−ＰＧＡを分離、回収する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いればよい。例えば、（１）固体培養物から２０％以下の食塩水により抽出分離する方法（例えば特開平３−３０６４８号公報を参照）、（２）硫酸銅による沈殿法（例えばThrone.B.C., C.C.Gomez,N.E.Noues and R.D.Housevright:J.Bacteriol.,68巻、307頁、1954年を参照）、（３）アルコール沈殿法（例えばR.M.Vard,R.F.Anderson and F.K.Dean:Biotechnology and Bioengineering,5巻、41頁、1963年を参照）、（４）架橋化キトサン成形物を吸着剤とするクロマトグラフィー法（例えば特開平３−２４４３９２号公報を参照）、（５）分子限外濾過膜を使用する分子限外濾過法、（６）上記（１）〜（５）を適宜組み合わせた方法などが挙げられる。また、これらの方法は、Ｌ−ＰＧＡの生産にN. aegyptiaca以外の微生物を用いた場合にも適用することができる。このようにして分離、回収したＬ−ＰＧＡは、Ｌ−ＰＧＡ含有液として後述のＬ−ＰＧＡ架橋体の製造に用いてもよく、必要に応じて、スプレードライ、凍結乾燥等、従来公知の方法で粉末にしてもよい。
【００８９】
以下に、N. aegyptiacaを培養した後の培地からＬ−ＰＧＡを分離、回収する方法の一例を説明するが、これに限定されるものではない。
【００９０】
まず、遠心分離等により、N. aegyptiacaを培養した後の培養液から菌体を取り除き、次に、得られた上清から、エタノール等の低級アルコールを加えることで、Ｌ−ＰＧＡを沈殿させるとよい。当該沈殿物は、適宜緩衝液に溶解させた上で、透析等により、不純物を除去することが好ましい。なお、本発明者らは、後述する実施例でも示すように、菌体を回収した後の上清に、３倍量の水を加えて希釈して、さらに、pHを３．０に調整した後、５時間、室温で攪拌した上で、３倍量のエタノールを加えることで沈殿物を回収した。また、当該沈殿物を０．１mM Tris-HCl緩衝液（pH８．０）に溶解させ、これを透析することにより、不純物を除去した。
【００９１】
透析を行なっても、核酸やタンパク質が混入していることが考えられるため、DNase処理、RNase処理、Proteinase処理等を行なうことが好ましい。また、これらの処理後、さらに透析等の精製処理をすることで、より高純度のＬ−ＰＧＡを得ることができる。
【００９２】
以上により、Ｌ−ＰＧＡを含有する溶液を得ることができる。さらに、得られた溶液に対して凍結乾燥等を行なえば、粉末状のＬ−ＰＧＡ架橋体を得ることができる。また、必要に応じて、さらに、当該溶液の精製を行なってもよい。精製は、従来公知の方法で行なえばよく、例えば上述の透析を行なってもよく、陰イオン交換樹脂を用いればよい。
【００９３】
（Ｌ−ＰＧＡ架橋体）
本発明に係る皮膚外用剤に含まれるＬ−ＰＧＡ架橋体は、Ｌ−ＰＧＡ分子同士の架橋構造を有するものであればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。
【００９４】
本明細書において「架橋構造」とは、直鎖状の高分子化合物の分子同士が、物理的あるいは化学的な方法で連結した構造を意図する。また、本明細書において「架橋体」とは、架橋構造を有することで、物理的、化学的性質が変化した高分子化合物のことを意図する。
【００９５】
つまり、Ｌ−ＰＧＡ架橋体は、Ｌ−ＰＧＡの分子同士が、共有結合によって、３次元状に連結している。具体的には、Ｌ−ＰＧＡの分子間で、上記式（１）におけるＨ以外のいずれかの元素同士が共有結合することにより、Ｌ−ＰＧＡ分子同士が３次元状に連結している。換言すれば、本発明に係るＬ−ＰＧＡ架橋体は、Ｌ−ＰＧＡ分子同士が３次元状に繋がったポリマー、即ち、Ｌ−ＰＧＡを構成分子とするネットワークポリマーである。なお、Ｌ−ＰＧＡの分子間で、一方のＬ−ＰＧＡ分子における、上記式（１）に示すＮと、他方のＬ−ＰＧＡ分子における、上記式（１）の最右端に示すＣとが結合したものは、Ｌ−ＰＧＡの分子同士の重合であって、「架橋構造」の意図するところではない。
【００９６】
本発明に係る皮膚外用剤に含まれるＬ−ＰＧＡ架橋体を構成する、Ｌ−ＰＧＡの平均分子量は、その分子同士が架橋している限り、限定されるものではないが、１００万以上が好ましく、さらに好ましくは２００万以上であり、さらに好ましくは３５０万以上である。分子量が１００万以上であれば、原料であるＬ−ＰＧＡからハイドロゲルを製造したときのゲル化率が向上するため、ハイドロゲルの収率を向上させることができる。
【００９７】
Ｌ−ＰＧＡの平均分子量が高ければ高いほど、得られるＬ−ＰＧＡ架橋体の吸水倍率が向上する。そのため、本発明に係るＬ−ＰＧＡ架橋体を構成するＬ−ＰＧＡの平均分子量の上限値は特に限定されるものではない。
【００９８】
本発明に係る皮膚外用剤に含まれるＬ−ＰＧＡ架橋体の吸水倍率は、特に限定されるものではないが、後述する本発明に係るＬ−ＰＧＡ架橋体の製造方法によれば、例えば１０倍以上５０００倍以下、特に１９００倍以上４４００倍以下のものを好適に得ることができる。特に、ＰＧＡを材料した吸水性樹脂として、吸水倍率が３３００倍より大きいものは、上記特許文献２においてＤＬ−ＰＧＡを用いても得ることができなかった、画期的なＰＧＡ性の生分解性吸水性樹脂である。
【００９９】
なお、本明細書において「吸水倍率」とは、物質が、水等の親水性液体を含んで膨潤することによる重量の増加率を意図する。Ｌ−ＰＧＡ架橋体の吸水倍率は、例えば次のように算出すればよい。即ち、Ｌ−ＰＧＡ架橋体の粉末を、当該Ｌ−ＰＧＡ架橋体が膨潤するために十分な量の水に入れ、４℃にて１週間静置させることで十分に膨潤させた後、８０メッシュの金網で水切りした後のＬ−ＰＧＡの湿重量から、当該Ｌ−ＰＧＡ架橋体の粉末の乾燥重量を引いた値を、当該Ｌ−ＰＧＡ架橋体の粉末の乾燥重量で割って算出することができる。
【０１００】
なお、本発明に係る皮膚外用剤に含まれるＬ−ＰＧＡ架橋体としては、Ｌ−ＰＧＡのみからなる架橋体であることが好ましいが、ＤＬ−ＰＧＡ分子やＤ−ＰＧＡ分子を含んでいてもよい。ただし、製造するＬ−ＰＧＡ架橋体毎の品質を安定にするため、その含有量は０重量％以上２０重量％以下であることが好ましい。
【０１０１】
（Ｌ−ＰＧＡ架橋体の製造方法）
本発明に係る皮膚外用剤に含まれるＬ−ＰＧＡ架橋体を製造する方法は、Ｌ−ＰＧＡの分子同士を架橋させる架橋工程を含んでいればよい。Ｌ−グルタミン酸のみからなる、光学活性が均一なＬ−ＰＧＡを原料として、これを架橋させることで、Ｌ−ＰＧＡ架橋体の分子毎の性質が均一となる。よって、所望の品質を有するＬ−ＰＧＡ架橋体を安定して製造することができる。
【０１０２】
Ｌ−ＰＧＡは、溶媒に溶解させてＬ−ＰＧＡの溶液を作製した上で、架橋反応に供すればよい。Ｌ−ＰＧＡを溶解させる溶媒としては、Ｌ−ＰＧＡを溶解させることができる限り限定されるものではないが、例えば、水、アルコール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル等が挙げられ、中でも、水、メチルアルコール、エチルアルコールが好ましく、水がさらに好ましい。これらの溶媒に溶解させるときのＬ−ＰＧＡの濃度は、特に限定されるものではないが、好ましくは１重量％以上１０重量％以下であり、さらに好ましくは２重量％以上８重量％以下であり、特に好ましくは２重量％以上７重量％以下である。また、Ｌ−ＰＧＡの溶液のpHは、特に限定されるものではないが、５．０以上９．０以下が好ましく、さらに好ましくはpH６．０以上８．０以下である。
【０１０３】
Ｌ−ＰＧＡの溶液に架橋反応を施すと、当該溶液中でＬ−ＰＧＡの架橋体が形成され、当該Ｌ−ＰＧＡ架橋体が当該溶媒を含んで膨潤することで、ハイドロゲルが得られる。これは後述するＬ−ＰＧＡ架橋体を含んでなるハイドロゲルの態様の一つである。さらに、当該ハイドロゲルを凍結乾燥等することによって、溶媒成分を除去することによって、当該溶媒成分を含まないＬ−ＰＧＡ架橋体を得ることができる。
【０１０４】
上述したＬ−ＰＧＡ架橋体を製造する方法によれば、架橋反応において、例えば、５０％以上１００％以下、特に７０％以上１００％以下のゲル化率でＬ−ＰＧＡを得ることができる。
【０１０５】
なお、本明細書において「ゲル化率」とは、原料として用いたＬ−ＰＧＡの重量に対する、架橋反応によって架橋体を形成したＬ−ＰＧＡの重量の百分率を意図する。換言すれば、「ゲル化率」とは、原料として用いたＬ−ＰＧＡに対して、得られるＬ−ＰＧＡ架橋体ひいてはハイドロゲルの収率を表す。具体的には、架橋反応によって得たハイドロゲルの乾燥重量を、当該架橋反応に供したＬ−ＰＧＡの乾燥重量で割って得た数値に、百を乗じて算出する。
【０１０６】
Ｌ−ＰＧＡの架橋反応の方法は、Ｌ−ＰＧＡの分子同士を架橋させることができる限り限定されるものではなく、従来公知の方法で行なえばよい。例えば、架橋剤を用いてもよく、放射線を用いてもよいが、中でも放射線を用いることが好ましい。放射線を用いれば、架橋反応後に、架橋剤を除去する操作を必要とせず、高純度のＬ−ＰＧＡ架橋体を製造することができる。
【０１０７】
Ｌ−ＰＧＡの架橋反応で、使用可能な放射線としては、特に限定されるものではなく、α線、β線、γ線、電子線、中性子線、Ｘ線等を用いればよい。中でも、γ線が好ましい。γ線は、例えばコバルト６０を線源とする照射装置等、従来公知の方法、機器を用いて発生させればよい。
【０１０８】
また、Ｌ−ＰＧＡに照射する放射線の照射線量は、０．５kGy以上２０kGy以下が好ましく、さらに好ましくは２kGy以上１０kGy以下であり、特に好ましくは３kGy以上７kGy以下であるが、製造するＬ−ＰＧＡ架橋体の用途等に応じて適宜設定すればよい。一般に照射線量が多ければ硬質のハイドロゲルを得ることができ、照射線量が少なければ軟質のハイドロゲルを得ることができる。
【０１０９】
また、Ｌ−ＰＧＡの架橋に放射線を用いる場合、Ｌ−ＰＧＡの溶液を放射線透過性容器に入れて用いればよい。放射線透過性容器としては、特に限定されるものではなく、例えばガラス製バイアル瓶等、ガラス製容器等を用いることができる。
【０１１０】
Ｌ−ＰＧＡの溶液を放射線透過性容器に入れた後は、そのまま放射線を照射してもよいが、予め、当該溶液に対して窒素を用いてバブリングしておくことが好ましい。当該溶液中に含有される酸素を除去することで、架橋反応の阻害を防ぐことができる。
【０１１１】
なお、Ｌ−ＰＧＡの架橋に架橋剤を用いる場合は、エポキシ化合物、カルボン酸基及び／又はカルボキシレート基を含有する多糖、アミノ酸等、従来公知の架橋剤を用いればよく、特に限定されるものではない。例えば、エポキシ化合物としては、グリセリントリグリシジルエーテル、ジ−グリセリンポリグリシジルエーテル、ポリ−グリセリンポリグリシジルエーテル、ポリオキシエチレンソルビトールポリグリシジルエーテル、多糖類としては、グルコースとフルクトースとガラクトースとグルクロン酸とからなる混合物、ラムノースとグルコースとガラクトースとグルクロン酸とからなる混合物、及びヒアルロン酸を主成分とするポリカルボン酸、アミノ酸としては、ポリアスパラギン酸、ポリリシン、アスパラギン酸、リシン、アルギニン、及びこれらの混合物が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、適宜２種類以上を混合して用いてもよい。
【０１１２】
また、本発明に係る皮膚外用剤に含まれるＬ−ＰＧＡ架橋体を製造するために用いるＬ−ＰＧＡは、塩の状態であってもよく、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等を用いることができる。中でも、ナトリウム塩が好ましい。
【０１１３】
本発明に係る皮膚外用剤に含まれるＬ−ＰＧＡ架橋体を製造するために用いるＬ−ＰＧＡとしては、従来公知の種々の方法で得たＬ−ＰＧＡを用いればよく、例えば、上述のＬ−ＰＧＡを用いればよい。
【０１１４】
なお、ＤＬ−ＰＧＡ分子やＤ−ＰＧＡ分子を含んだ、Ｌ−ＰＧＡ架橋体を製造する場合は、ＤＬ−ＰＧＡ分子及び／又はＤ−ＰＧＡ分子を、上述のＬ−ＰＧＡの溶液に混合した上で、上述の架橋反応に当該溶液を供すればよい。
【０１１５】
本発明に係る皮膚外用剤に含まれるＬ−ＰＧＡ架橋体として、Ｌ−ＰＧＡ架橋体を含んでなるハイドロゲルを用いてもよい。
【０１１６】
なお、本明細書において「ハイドロゲル」とは、ポリマーが水等の溶媒を含むことにより膨潤して形成したゲルを意図する。換言すれば、ポリマーと溶媒等の水分とを主成分とするポリマーの溶媒膨潤体である。ハイドロゲルは、多量の水を含んでおり、液体と固体との中間の状態にある物質であり、流動性がない点で液体と異なる。また、押す等して加圧しても、ハイドロゲル中の溶媒が滲み出ることはない。
【０１１７】
つまり、Ｌ−ＰＧＡ架橋体を含んでなるハイドロゲルとは、Ｌ−ＰＧＡ架橋体と溶媒とを主成分とする溶媒膨潤体と言える。
【０１１８】
Ｌ−ＰＧＡ架橋体を含んでなるハイドロゲルは、上述のＬ−ＰＧＡ架橋体の製造方法において説明した通り、水等の溶媒にＬ−ＰＧＡを溶解した溶液に、架橋反応を施すことで、得ることができる。
【０１１９】
また、上述の粉末状のＬ−ＰＧＡ架橋体に、水等の溶媒を加えることにより、Ｌ−ＰＧＡ架橋体を含んでなるハイドロゲルを得ることができる。このとき、当該溶媒の量を少量とした上でハイドロゲルを得ておけば、さらに水等の溶媒を吸収可能な、吸水性に優れたハイドロゲルを得ることができる。また、Ｌ−ＰＧＡ架橋体を含んでなるハイドロゲルに吸収された溶媒は、当該ハイドロゲルから滲み出ることがないため、保湿性に優れている。
【０１２０】
Ｌ−ＰＧＡを含んでなるハイドロゲルは、所定の形状に均一に造粒してもよく、また、不定形破砕状、球状等であってもよい。また、衛生分野のみならず、多種多様な分野においても利用可能である。例えば、皮膚外用剤のみならず、紙オムツ等のトイレタリー品、体液吸収体等の医療品等、土壌改良剤として好適に利用することもできる。
【０１２１】
（皮膚外用剤の組成）
本発明に係る皮膚外用剤に含まれるＬ−ＰＧＡ及びＬ−ＰＧＡ架橋体のうち少なくとも一方の濃度は、特に限定されるものではないが、Ｌ−ＰＧＡのみを含む場合は、０．００００１〜３０重量％であることが好ましく、さらに好ましくは、０．０００１〜２０重量％であり、Ｌ−ＰＧＡ架橋体のみを含む場合は、０．００００１〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜２０重量％であり、Ｌ−ＰＧＡ及びＬ−ＰＧＡ架橋体を含む場合は、その総量が０．００００１〜３０重量％であることが好ましく、さらに好ましくは、０．０００１〜２０重量％である。この範囲であれば、臭いが少なく、色調も好ましい。さらに、高い保湿性を発揮するため、保湿剤及び／又は化粧料として、さらに有用な皮膚外用剤を得ることができる。
【０１２２】
本発明に係る皮膚外用剤は、Ｌ−ＰＧＡ及びＬ−ＰＧＡ架橋体のうち少なくとも一方を、従来公知の溶媒に溶解して作製すればよい。本発明に係る皮膚外用剤の作製に用いる溶媒としては、特に限定されるものではないが、水等を使用すればよい。
【０１２３】
また、本発明に係る皮膚外用剤は、使用の目的等に応じて適宜、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常、化粧料、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤に一般的に用いられる添加剤、例えば、炭化水素類、油脂類等の油性成分、ロウ類、シリコーン類、アルコール類、脂肪酸、酸化防止剤、抗菌剤、紫外線吸収剤、薬剤、精製水等の水性成分、植物の抽出物、中和剤、Ｌ−ＰＧＡ及びＬ−ＰＧＡ架橋体以外の保湿剤、増粘剤、防腐剤、界面活性剤、香料、着色剤、各種皮膚栄養剤等の添加物を添加してもよい。
【０１２４】
以下に、これらの添加物の具体例を挙げるが、これに限定されるものではない。また、これらの添加物は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【０１２５】
上記炭化水素類としては、例えば、流動パラフィン、スクワラン、マイクロクリスタリンワックス、セレシンワックス、パラフィンワックス、ワセリン等が挙げられる。
【０１２６】
上記油脂類としては、例えば、アボガド油、ツバキ油、マカデミアナッツ油、オリーブ油、ラノリン、ヒマシ油、オリーブ油、グレープシード油、カカオ油、ヤシ油、木ロウ、ホホバ油等の植物油脂類等が挙げられる。
【０１２７】
上記ロウ類としては、例えば、ホホバ油、カルナバロウ、キャンデリラロウ、ミツロウ、鯨ロウ等が挙げられる。
【０１２８】
上記シリコーン類としては、例えば、ジメチルポリシロキサン、メチフェニルシロキサン等が挙げられる。
【０１２９】
上記アルコール類としては、例えば、カプリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、コレステロール、フィトステロール、セタノール、ステアリルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルドデカノール等の高級アルコール類、エタノール等の低級アルコール類が挙げられる。
【０１３０】
上記脂肪酸としては、例えば、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、ラノリン脂肪酸、リノール酸、リノレン酸、ラウリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸等の高級脂肪酸等が挙げられる。
【０１３１】
上記酸化防止剤としては、例えば、ブチルヒドロキシトルエン、トコフェロール、フィチン等が挙げられる。
【０１３２】
上記抗菌剤としては、例えば、上記安息香酸、サリチル酸、ソルビン酸、パラオキシ安息香酸アルキルエステル、ヘキサクロロフェン等が挙げられる。
【０１３３】
上記紫外線吸収剤としては、例えば、パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、ケイ皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、３−（４’−メチルベンジリデン）−ｄ−カンファー、３−ベンジリデン−ｄ、１−カンファー、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチルエステル、２−フェニル−５−メチルベンゾキサゾール、２、２’−ヒドロキシ−５−メチルフェニルベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｔ−オクチルフェニル）ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−５’−メチルフェニルベンゾトリアゾール、ジベンザラジン、ジアニソイルメタン、４−メトキシ−４’−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン、５−（３，３−ジメチル−２−ノルボルニリデン）−３−ペンタン−２−オン等が挙げられる。
【０１３４】
上記薬剤としては、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、タウリン、アルギニン、ヒスチジン等のアミノ酸、又は、これらのアルカリ金属塩と塩酸塩；アシルサルコシン酸（例えばラウロイルサルコシンナトリウム）、グルタチオン、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸等の有機酸；ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル、γ−オリザノール、アラントイン、グリチルリチン酸（塩）、グリチルレチン酸およびその誘導体、ヒノキチオール、ビサボロール、ユーカルプトーン、チモール、イノシトール、サイコサポニン、ニンジンサポニン、ヘチマサポニン、ムクロジサポニン等のサポニン類、パントテニルエチルエーテル、エチニルエストラジオール、トラネキサム酸、アルブチン、セファランチン、プラセンタエキス等が挙げられる。
【０１３５】
上記各種皮膚栄養剤としては、ビタミンＡおよびその誘導体、ビタミンＢ２、パントテン酸及びその誘導体、ナイアシン、ビオチン及びこれらの混合物が挙げられる。
【０１３６】
上記中和剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、酢酸ナトリウム、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、トリエタノールアミン等が挙げられる。
【０１３７】
上記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビンタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシアルキルアリルエーテル、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレート、ソルビンタンセスキオレエート、ソルビンタンモノライレート、ポリオキシエチレンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、１−ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリエチレングリコールモノラウレート、ポリエチレングリコールモノオレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシチエレンヒマシ油、ポリオキシエチレンラノリン等のノニオン界面活性剤や、グリシン型、アルキルアミノベタイン、イミダゾリン型、Ｌ−アルギニン型、Ｌ−リジン型等の両性界面活性剤が挙げられる。
【０１３８】
上記Ｌ−ＰＧＡ及びＬ−ＰＧＡ架橋体以外の保湿剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール等の多価アルコール、グルコース、ソルビトール、デキストリン、トレハロース、乳糖等の糖類及びその誘導体、グルタミン酸ナトリウム、ケラチン誘導体、コラーゲン誘導体、トリメチルグリシン等のアミノ酸類及びその誘導体、カルボキシビニルポリマー、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム等の水溶性高分子、海藻エキス、酵母エキス、保湿作用を有する各種植物エキス、及びこれらの混合物等、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、オレイン酸オクチルドデシル、オレイン酸コレステリル等のエステル類、ポリアクリル酸ナトリウム、結晶性セルロース、各種植物精油及びこれらの混合物が挙げられる。また、上述の植物油脂類、ロウ類、脂肪酸類、高級アルコール類も保湿剤として使用できる。
【０１３９】
上記増粘剤としては、例えば、キサンタンガム等の水溶性多糖類、ヒドロキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等の水溶性セルロース類、プルラン、ポリアクリル酸ナトリウム等の水溶性高分子等が挙げられる。
【０１４０】
上記防腐剤としては、パラベン、サリチル酸、安息香酸塩、フェノキシエタノール、グルコン酸クロルヘキシジン等が挙げられる。
【０１４１】
上記香料としては、バニリン、オレンジフレーバー、レモンフレーバー、ミルクフレーバーゲラニオール、リナロール等が挙げられる。
【０１４２】
上記着色料としては、水溶性のタール系色素、水不溶性のタール系色素、クチナシ系色素、ベニバナ系色素、ウコン系色素、パプリカ色素、アナトー色素、コチニール色素等の天然色素、酸性、塩基性色素が挙げられる。
【０１４３】
さらに、例えば、ギシギシ、クララ、コウホネ、オレンジ、セージ、ノコギリソウ、ゼニアオイ、センブリ、タイム、トウキ、トウヒ、バーチ、スギナ、ヘチマ、マロニエ、ユキノシタ、アルニカ、ユリ、ヨモギ、シャクヤク、アロエ、クチナシ、サワラ、ホワイトリリー等の植物の抽出物等を添加してもよい。
【０１４４】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１４５】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、以下の実施例に示す「％」は全て「重量％」である。
【実施例】
【０１４６】
〔実施例１；ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の製造〕
Natrialba aegyptica（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８７４）のＬ乾燥アンプルに、０．４mlのＰＧＡ生産用液体培地（２２．５％ NaCl、２％ MgSO4・７H2O、０．２％ KCl、３％ Trisodium Citrate、１％ Yeast Extract、０．７５％ Casamino acid）を加えて懸濁液を得た。０．２mlの当該懸濁液を、PGA寒天培地（１０％ NaCl、２％ MgSO4・７H2O、０．２％ KCl、３％ Trisodium Citrate、１％ Yeast Extract、０．７５％ Casamino acid、２％ Agar）に接種し、３７℃で３日間培養して、シングルコロニーを得た。
【０１４７】
次に、５本の１８ml容試験管に、それぞれ、３mlのPGA生産液体培地（２２．５％ NaCl、２％ MgSO4・７H2O、０．２％ KCl、３％ Trisodium Citrate、１％ Yeast Extract、０．７５％ Casamino acid、pH７．２）を入れ、さらに、上記シングルコロニーを白金耳で1白金耳掻き取り植菌した。植菌後の試験管を、３７℃、３００rpmで３日間培養して、さらに、得られた培養液０．５mlを、５０ml PGA生産液体培地を入れた５００ml容坂口フラスコ１０本にそれぞれ植菌し、３７℃で５日間培養した。培養後、得られた培養液を遠心し、菌体を取り除いて上清を回収した。
【０１４８】
次に、回収した上清に３倍量の水を加え希釈した後、１Ｎ硫酸でpHを３．０に調整した。pHを調整した後、室温で５時間攪拌した。その後、３倍量のエタノールを加えて遠心分離を行い、沈殿物を回収した。この沈殿物がＬ−ＰＧＡである。
【０１４９】
回収したＬ−ＰＧＡを０．１ｍM Tris−HCl緩衝液（pH８．０）に溶解して、これを、低分子物質等の不純物を除去するために透析した。次に、透析後の液体に含まれる核酸を除去するために、当該液体に、MgCl２が１mM、DNaseＩ（TAKARA社製）が１０U/ml、RNaseＩ(NIPPON GENE社製)が２０μg/mlとなるように加えて、３７℃で２時間インキュベートした。次いでタンパク質を除去するために、核酸を除去した後の液体にProteinase K（TAKARA社製）を３U/mlとなるように添加して、３７℃で５時間インキュベートしてProteinase K処理を行なった。
【０１５０】
Proteinase K処理の後、超純水で透析し、低分子物質を除去した。次に、Ｌ−ＰＧＡを陰イオン交換樹脂（Q sepharose Fast Flow、GE ヘルスケア バイオサイエンス社製）に吸着させ、０．５MのNaCl水溶液で洗浄した後、１MのNaCl水溶液で溶出した。得られた溶液を、さらに超純水で透析し、透析後の溶液を凍結乾燥することにより、Ｌ−ＰＧＡのナトリウム塩（以下、「Ｌ−ＰＧＡ・Ｎａ塩」と表記する）を得た。なお、超純水は、MilliQ（Millipore社製の純水製造装置）で作製した。
【０１５１】
〔実施例２；ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の分子量分析−１〕
実施例１で得たＬ−ＰＧＡ・Ｎａ塩の平均分子量を、ＧＰＣ分析にて測定した。その結果、Mw=７，５２２，０００、Mn=３,７０４，０００、Mw/Mn=２．０３１であることが確認された（プルラン換算）。
【０１５２】
なお、ＧＰＣ分析は、以下の条件で行なった。装置：HLC−8220GPC（東ソー社製）、カラム：TSKgel α−M（東ソー社製）、流速：０．６ml/min、溶出液：０．１５M NaCl水溶液、カラム温度：４０℃、注入量：１０μl、検出器：示差屈折計。
【０１５３】
〔実施例３；ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の分子量分析−２〕
実施例１において、１．０MのNaCl水溶液溶出した後、さらに、１Ｎ ＨＣｌにを用いて、ｐＨを２．０に調製した以外は、実施例１と同様の操作を行なって得たＬ−ＰＧＡ・Ｎａ塩の平均分子量をＧＰＣ分析により測定した。その結果、Mw=２,８８８,０００、Mn＝１,３２７,０００、Mw/Mn=２．１７６、であることが確認された（プルラン換算）。なお、本実施例におけるGPC分析は、実施例２と同様の操作で行なった。
【０１５４】
〔実施例４；ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の作製〕
実施例１で得たＬ−ＰＧＡ・Ｎａ塩の５％水溶液を作製した。
【０１５５】
次に、Ｌ−ＰＧＡ・Ｎａ塩水溶液を、窒素を用いて３分間バブリングした後、蓋付き１０mlサンプル瓶に、２ml分取して蓋を閉めた。
【０１５６】
次に、サンプル瓶に、線源をコバルト６０とするγ線照射装置を用いてγ線を照射した。照射線量は、５kGyとなるように照射した。γ線照射後に得られた生成物を、サンプル瓶から取り出し、余分な水分を８０メッシュの金網で水切りした後、凍結乾燥することで、Ｌ−ＰＧＡ架橋体粉末を得た。なお、上記余分な水分には、未架橋のＬ−ＰＧＡが含まれており、当該水切りは、未架橋のＬ−ＰＧＡを除去することが主たる目的である。
【０１５７】
〔実施例５；乾燥肌荒れモデルによるポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の保湿性評価〕
テストスキン（東洋紡績株式会社製：Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＬＳＥ−００２）キット付属の取り扱い説明に従い、ＬＳＥ（Living Skin Equivalent)組織を取り出した。次に、アッセイプレート（上記テストスキンキットに付属）内に、当該ＬＳＥ組織をセットして、乾燥状態（温度３７℃、相対湿度１５%RHに調整したＣＯ２インキュベーター内）で７時間静置した。これにより、角層の水分が蒸発した乾燥肌荒れモデル（以下、「乾燥ＬＳＥ組織」と表記する）を得た。
【０１５８】
次に、純水、０．５％ＤＬ−ＰＧＡ水溶液、２．５％ＤＬ−ＰＧＡ水溶液、０．５％Ｌ−ＰＧＡ水溶液、２．５％Ｌ−ＰＧＡ水溶液を、各７０μｌ、マイクロピペットにて、それぞれ乾燥ＬＳＥ組織の表面に滴下した。なお、Ｌ−ＰＧＡとして、実施例１で得たＬ−ＰＧＡ・Ｎａ塩を用いた。また、ＤＬ−ＰＧＡとして、和光純薬製のＤＬ−ＰＧＡ・Ｎａ塩を用いた。
【０１５９】
次に、乾燥ＬＳＥ組織をセットしたアッセイプレート下部にアッセイ培地（上記テストスキンキットに付属）６００μｌを添加した後、温度３７℃、相対湿度１５％ＲＨに調整したＣＯ２インキュベーター内に静置して、２４時間インキュベートした。その後、乾燥ＬＳＥ組織をＣＯ２インキュベーターより取り出し、上記テストスキンキットに付属の取り扱い説明に従って、テトラゾリウム塩（ＭＴＴ）試薬０．３３３ｇ／ｍｌが含まれるアッセイ培地（上記テストスキンキットに付属）の混合液６００μｌをアッセイトレイに入れて、温度３７℃、相対湿度１５%ＲＨに調整したＣＯ２インキュベーター内で３時間インキュベートすることで、当該乾燥ＬＳＥ組織にＭＴＴ処理を施した。
【０１６０】
ＭＴＴ処理後、バイオプシーパンチ（東洋紡社製；直径８ｍｍ）を用いて、乾燥ＬＳＥ組織の中央部を、当該乾燥ＬＳＥ組織の下部のポリカーボネート膜ごとくり抜いた。次に、くり抜いた切片を、試験管に移して、０．０４Ｎ塩酸−イソプロパノールを３００μｌ加えて、暗所にて２時間静置した。次に、当該試験管中の溶液を攪拌して、十分混和させた後、３，０００ｒｐｍ、５分間遠心して上清を得た。次に、当該上清２００μｌに含まれる青紫色のホルマザンの量を、５７２ｎｍの吸光度を測定することで算出した。
【０１６１】
結果を図１に示す。図１は、保湿性評価の結果を示す図であり、縦軸は、乾燥処理を施さなかったＬＳＥ組織から抽出されたホルマザンの量を１００％としたときの、ホルマザンの量（吸光度）を示しており、横軸は、各サンプルの種類を示している。なお、図１において、「乾燥未処理」とは、乾燥処理を施していないＬＳＥ組織を示し、「無試料」とは、乾燥処理を施したＬＳＥ組織に対して、純水、ＤＬ−ＰＧＡ水溶液及びＬ−ＰＧＡ水溶液のいずれも滴下しなかったものを示す。即ち、図１には、乾燥未処理のサンプルに対して、直接ＭＴＴ処理を施してホルマザンの量を測定した結果及び、上述の乾燥ＬＳＥ組織に対して、直接ＭＴＴ処理を施してホルマザンの量を測定した結果も示している。
【０１６２】
なお、本実施例に記載の方法により得られる吸光度（ホルマザンの量）と、肌荒れ改善効果とは密接な関係があり、ヒトの乾燥肌荒れの状態評価を定量的、簡易的、且つ経済的に実施できる有効な乾燥肌荒れ改善評価方法である。
【０１６３】
図１から明らかなように、従来から保湿剤として使用されている市販のＤＬ−ＰＧＡでは、２．５％水溶液を滴下した結果、ホルマザンの量、即ち、肌荒れの回復率が３０％、であったのに対し、Ｌ−ＰＧＡの２．５％水溶液を滴下した結果、６０％の肌荒れ回復率が示された。これにより、Ｌ−ＰＧＡが、従来の市販品にくらべ約２倍の肌荒れ回復率を示し、高い保湿性を有することが示された。
【０１６４】
〔実施例６；ヒト肌荒れ試験によるポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体ハイドロゲルの保湿効果〕
ヒト上腕内部に０．５％ＳＤＳ溶液を１０分間接触させてＳＤＳ処理をすることで、肌荒れの状態とした。一方、実施例４で得たＬ−ＰＧＡ架橋体粉末を、０．１５％となるように、水に混合してハイドロゲル得た。
【０１６５】
次に、当該ハイドロゲルを、上記肌荒れの状態のヒト上腕内部に塗布して、１時間、室温（２３℃）、湿度４５％の恒温恒湿部屋で静置した。次に、角質水分量測定器（アイ・ビイ・エス株式会社製、品名：スキコン）で、静置後のヒト上腕内部（サンプルＤ）の皮膚角質水分量を測定した。
【０１６６】
同様の皮膚角質水分量の測定を、ＳＤＳ処理前のヒト上腕内部（サンプルＡ）、ＳＤＳ処理を施した後、当該ハイドロゲル塗布前のヒト上腕内部（サンプルＢ）、ＳＤＳ処理を施した後、当該ハイドロゲルの代わりに水を塗布して、上記恒温恒湿部屋に上述の条件と同じ条件で静置した後のヒト上腕内部（サンプルＣ）に対しても行なった。
【０１６７】
結果を図２に示す。図２はヒト肌荒れ試験の結果を示す図であり、縦軸は皮膚角質水分量を示し、横軸はサンプルの種類を表す。図２において、Ａ〜Ｄはそれぞれ、上記サンプルＡ〜Ｄに対応している。
【０１６８】
図２に示したように、サンプルＤで、高い皮膚角質水分量が得られ、角質水分含量が回復したことが示された。
【０１６９】
以上、本発明を実施例に基づいて説明したが、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明により、均一な光学純度でかつ高分子量のポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の架橋体によって、従来品よりも高い保湿性を有する皮膚外用剤を提供することが可能となり、特に化粧品業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】本発明の実施例５において、保湿性評価の結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例６において、ヒト肌荒れ試験の結果を示す図である。
【図１】
2008120725.tif 000003
【図２】
2008120725.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月2日(2007.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
高度好塩古細菌としては、例えば、Halobacterium（ハロバクテリウム）属、Haloarcula（ハロアルクラ）属、Haloferax（ハロフェラックス）属、Halococcus（ハロコッカス）属、Halorubrum（ハロルブルム）属、Halobaculum（ハロバキュラム）属、Natrialba（ナトリアルバ）属、Natronomonas（ナトロノモナス）属、Natronobacterium（ナトロノバクテリウム）属、Natronococcus（ナトロノコッカス）属等が挙げられるが、Natrialba属が好ましく、Natrialba aegyptiaca（ナトリアルバ  エジプチアキア）がさらに好ましい。N. aegyptiacaは、高塩環境下で発生する脱水現象から、巧みに身を守るためにＬ−ＰＧＡを生産すると考えられている（例えばF. F. Hezayen, B. H. A. Rehm, R. Eberhardt, A. Steinbuchel, Polymer production by two newly isolated extremely halophilic archaea: application of a novel corrosion-resistant bioreactor, Applied Microbiology and Biotechnology, 2000, 54,319参照）。また、N. aegyptiaca の中でも、Natrialba aegyptiaca（ナトリアルバ  エジプチアキア）０８３０−８２株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４７）、Natrialba aegyptiaca（ナトリアルバ  エジプチアキア）０８３０−２４３株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４８）、及び、Natrialba aegyptiaca（ナトリアルバ  エジプチアキア）０８３１−２６４株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４９）からなる群から選択される少なくとも一つの菌株を用いることがさらに好ましい。N. aegyptiacaを用いれば、より分子量の大きいＬ−ＰＧＡを得ることができる。特に、N. aegyptiaca ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４７、N. aegyptiaca ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４８、N. aegyptiaca ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４９は、いずれもの菌株も平均分子量１３０万以上のＬ−ＰＧＡを、液体培養条件下で合成することができる。よって、Ｌ−ＰＧＡの架橋体の収率がよく、また、Ｌ−ＰＧＡの製造効率もよい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
N. aegyptiaca ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４７、N. aegyptiaca ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４８、及び、N. aegyptiaca ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４９は、特願２００６−１４２６８５に記載の変異処理方法及びスクリーニング方法に基づいて、本発明者らが独自に見出したN. aegyptiacaの変異株である。なお、本明細書において、単に「N. aegyptiaca」と表記したときは、N. aegyptiacaの変異株をもその意味に含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
このようにして得られた菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ナトリアルバ  エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）０８３０−８２株（受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、受領日：平成１８年４月４日、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４７）、ナトリアルバ  エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）０８３０−２４３株（受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、受領日：平成１８年４月４日、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４８）、またはナトリアルバ  エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）０８３１−２６４株（受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、受領日：平成１８年４月４日、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４９）として寄託されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
当該３株はいずれも、親株であるＪＣＭ１１１９４株より優れたＬ−ＰＧＡ生産能を有し、高分子量のＬ−ＰＧＡを工業的なスケールで製造することができる。例えば、上述の二段階に分けた培養によれば、ＪＣＭ１１１９４株は、培養液１Ｌあたり０．６１ｇのＬ−ＰＧＡを生産したが、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４９は、４．９９ｇのＬ−ＰＧＡを生産した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
N. aegyptiacaの培養に用いる培地の成分は、N. aegyptiacaが摂取可能な炭素源及び無機塩類を含めばよく、必要に応じてYeast Extract等、その他の栄養物を添加すればよい。例えば、本発明者らは、後述する実施例において、２２．５％ NaCl、２％ MgSO4・７H2O、０．２％ KCl、３％ Trisodium Citrate、１％ Yeast Extract、０．７５％ Casamino acidの培地を用いてN. aegyptiaca ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４９を培養している。なお、Yeast Extractを培地に添加する場合、その濃度は０．１重量％以上１０重量％以下であることが好ましく、０．５重量％以上５．０重量％以下がさらに好ましい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
〔実施例１；ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の製造〕
Natrialba aegyptiaca（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４９）のＬ乾燥アンプルに、０．４mlのＰＧＡ生産用液体培地（２２．５％ NaCl、２％ MgSO4・７H2O、０．２％ KCl、３％ Trisodium Citrate、１％ Yeast Extract、０．７５％ Casamino acid）を加えて懸濁液を得た。０．２mlの当該懸濁液を、PGA寒天培地（１０％ NaCl、２％ MgSO4・７H2O、０．２％ KCl、３％ Trisodium Citrate、１％ Yeast Extract、０．７５％ Casamino acid、２％ Agar）に接種し、３７℃で３日間培養して、シングルコロニーを得た。