(57)【要約】【課題】本発明は、ＲＮＡ複製に関わる宿主側の因子を用いて、植物の生育への影響を最小限としつつ、トバモウイルスに対する抵抗性を付与することが可能なトバモウイルス抵抗性植物を製造する方法、およびその利用を提供する。【解決手段】植物体内において、ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドによるトバモウイルス増殖亢進活性を低下させる。これにより、植物の生育への影響を最小限としつつ、トバモウイルスに対する抵抗性を付与することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体内において、ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドによるトバモウイルス増殖亢進活性を低下させることを特徴とするトバモウイルス抵抗性植物の製造方法。
【請求項２】
上記ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドは、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドと、以下の（ｆ）〜（ｊ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドと、以下の（ｋ）〜（ｏ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドと、以下の（ｐ）〜（ｔ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドと、からなる群より選択される少なくとも２つのポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のトバモウイルス抵抗性植物の製造方法。
（ａ）配列番号２もしくは１０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２もしくは１０に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１もしくは９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ｄ）配列番号１もしくは９に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｅ）配列番号１もしくは９に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｆ）配列番号４もしくは１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｇ）配列番号４もしくは１２に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｈ）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ｉ）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｊ）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｋ）配列番号６もしくは１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｌ）配列番号６もしくは１４に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｍ）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ｎ）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｏ）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｐ）配列番号８もしくは１６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｑ）配列番号８もしくは１６に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｒ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ｓ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｔ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
【請求項３】
植物体内において、上記ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量を低下させることを特徴とする請求項１に記載のトバモウイルス抵抗性植物の製造方法。
【請求項４】
上記ポリヌクレオチドは、以下の（あ）〜（う）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドと、以下の（え）〜（か）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドと、以下の（き）〜（け）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドと、以下の（こ）〜（し）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドと、からなる群より選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項３に記載のトバモウイルス抵抗性植物の製造方法。
（あ）配列番号１もしくは９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（い）配列番号１もしくは９に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（う）配列番号１もしくは９に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（え）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（お）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（か）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（き）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（く）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（け）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（こ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（さ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（し）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項５】
上記ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドに変異を導入することによって、ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドによるトバモウイルス増殖亢進活性を低下させることを特徴とする請求項１に記載のトバモウイルス抵抗性植物の製造方法。
【請求項６】
ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを備えていることを特徴とするトバモウイルス抵抗性植物の製造キット。
【請求項７】
植物体内におけるＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドの発現量、植物体内におけるＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドの活性量、および植物体内におけるＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量のうち、少なくともいずれか１つを測定することを特徴とするトバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法。
【請求項８】
上記ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドは、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドと、以下の（ｆ）〜（ｊ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドと、以下の（ｋ）〜（ｏ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドと、以下の（ｐ）〜（ｔ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドと、からなる群より選択される少なくとも２つのポリペプチドであり、
上記ポリヌクレオチドは、以下の（あ）〜（う）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドと、以下の（え）〜（か）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドと、以下の（き）〜（け）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドと、以下の（こ）〜（し）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドと、からなる群より選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項７に記載のトバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２もしくは１０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２もしくは１０に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１もしくは９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ｄ）配列番号１もしくは９に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｅ）配列番号１もしくは９に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｆ）配列番号４もしくは１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｇ）配列番号４もしくは１２に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｈ）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ｉ）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｊ）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｋ）配列番号６もしくは１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｌ）配列番号６もしくは１４に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｍ）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ｎ）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｏ）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｐ）配列番号８もしくは１６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｑ）配列番号８もしくは１６に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｒ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ｓ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｔ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（あ）配列番号１もしくは９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（い）配列番号１もしくは９に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（う）配列番号１もしくは９に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（え）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（お）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（か）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（き）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（く）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（け）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（こ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（さ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（し）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項９】
ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドと特異的に結合する抗体、およびＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブのうち、少なくとも一方を備えていることを特徴とするトバモウイルス抵抗性植物のスクリーニングキット。
【請求項１０】
以下の（イ）〜（ト）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（イ）配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ロ）配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ハ）配列番号９、１１、１３、および１５のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ニ）配列番号９、１１、１３、および１５のいずれか１つに示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ホ）配列番号９、１１、１３、および１５のいずれか１つに示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ヘ）配列番号９の第２７位〜第５８１位、配列番号１１の第１４位〜第５６８位、配列番号１３の第１６位〜第５７０位、および配列番号１５の第６５位〜第６１９位のいずれか１つに示される塩基配列をオープンリーリングフレームとして含むポリヌクレオチド
（ト）配列番号９の第２７位〜第５８１位、配列番号１１の第１４位〜第５６８位、配列番号１３の第１６位〜第５７０位、および配列番号１５の第６５位〜第６１９位のいずれか１つに示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列をオープンリーリングフレームとして含み、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項１１】
以下の（チ）〜（ヲ）のいずれかに記載のポリペプチド。
（チ）配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（リ）配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ヌ）配列番号９、１１、１３、および１５のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ル）配列番号９、１１、１３、および１５のいずれか１つに示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ヲ）配列番号９、１１、１３、および１５のいずれか１つに示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トバモウイルス抵抗性植物の製造方法およびその利用に関するものであり、より詳細には、トバモウイルスのＲＮＡ複製に関わる宿主側の因子を用いて、トバモウイルス抵抗性植物を製造する方法、およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
トバモウイルス（Tobamovirus）は、アルファウイルス・スーパーファミリーに属するプラス鎖ＲＮＡウイルスである。トバモウイルスのメンバーとしては、例えば、タバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic virus、以下「ＴＭＶ」ともいう）、およびトマトモザイクウイルス（Tomato mosaic virus、以下「ＴｏＭＶ」ともいう）を挙げることができる。
【０００３】
プラス鎖ＲＮＡウイルスは，ウイルス粒子内にｍＲＮＡとして機能する１本鎖ＲＮＡ（極性のＲＮＡ）をゲノムとしてもつ。トバモウイルスを含む植物ウイルスの大多数、およびＣ型肝炎ウイルスやポリオウイルス等の動物ウイルスの多くは、プラス鎖ＲＮＡウイルスである。プラス鎖ＲＮＡウイルスが宿主細胞内に侵入すると、ゲノムＲＮＡより複製に関与するタンパク質（複製タンパク質）が翻訳される。複製タンパク質は自身のゲノムＲＮＡを認識し、宿主細胞のオルガネラ膜の細胞質側表面にＲＮＡ複製複合体を形成する。ＲＮＡ複製複合体は、プラス鎖と相補的なマイナス鎖ＲＮＡを介して、ゲノムプラス鎖ＲＮＡ（子孫ゲノムＲＮＡ）を複製する（非特許文献１および２を参照）。
【０００４】
プラス鎖ＲＮＡウイルスの一種であるトバモウイルスの上記複製タンパク質は、約１３０ｋＤａのタンパク質（１３０Ｋタンパク質）、および該１３０Ｋタンパク質の終止コドンのリードスル−により合成される１８０ｋＤａのタンパク質（１８０Ｋタンパク質）であることが知られている（非特許文献３および４を参照）。
【０００５】
また、上記ＲＮＡ複製複合体の性状や、ＲＮＡ複製複合体の形成に関わる宿主側の因子を解明するための研究も行われてきた。一般に、プラス鎖ＲＮＡウイルスに感染した細胞より得た膜画分には、ウイルスＲｄＲｐ活性が検出されるため、このような研究では、感染葉から単離・精製したウイルスＲｄＲｐを用いて種々の解析が行われてきた（非特許文献５を参照）。例えば、ＲｄＲｐあるいは上記複製タンパク質と共精製される宿主タンパク質を同定し、該宿主タンパク質のＲＮＡ複製における役割を解析する研究が報告されている（非特許文献６を参照）。
【０００６】
また、ＲＮＡ複製複合体の形成に関わる宿主側の因子の研究について、本発明者らは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）変異株を用いた遺伝学的手法により、トバモウイルスの増殖に関与する宿主タンパク質として、すでに、ＴＯＭ１、ＴＯＭ２Ａ、ＴＯＭ２Ｂ、ＴＯＭ３を同定している（非特許文献７および８を参照）。
【非特許文献１】Buck, K. W. (1996). Comparison of the replication of positive-stranded RNA viruses of plants and animals. Adv. Vrius Res. 47, 159-251.
【非特許文献２】Schwartz, M., Chen, J., Janda, M., Sullivan, M., den Boon, J., and Ahlquist, P. (2002). A positive-strand RNA virus replication complex parallels form and function of retrovirus capsids. Mol. Cell 9, 505-514.
【非特許文献３】Ishikawa, M., and Okada, Y. (2004). Replication of tobamovirus RNA. Proc. Jpn. Acad., Ser. B 80, 215-224.
【非特許文献４】Buck, K. W. (1999). Replication of tobacco mosaic virus RNA. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 354, 613-627.
【非特許文献５】Sivakumaran, K., Bao, Y., Roossinck, M.J., and Kao, C.C. (2000).  Recognition of the core RNA promoter for minus-strand RNA synthesis by the replicases of brome mosaic virus and cucumber mosaic virus. J. Virol. 74, 10323-10331.
【非特許文献６】渡辺貴斗・日比忠明．(2000). 植物プラス鎖 RNA ウイルスの RNA 複製酵素．ウイルス 50, 103-108.
【非特許文献７】Yamanaka, T., Ohta, T., Takahashi, M., Meshi, T., Schmidt, R., Dean, C., Naito, S., and Ishikawa, M. (2000). TOM1, an Arabidopsis gene required for efficient multiplication of a tobamovirus, encodes a putative transmembrane protein. Proc. Nalt. Acad. Sci. USA 97, 10107-10112.
【非特許文献８】Tsujimoto, Y., Numaga, T., Ohshima,K., Yano, M., Ohsawa, R., Goto, D.B., Naito, S., and Ishikawa, M. (2003). Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22, 335-343.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１および２に開示されるように、プラス鎖ＲＮＡウイルスの複製メカニズムの概略については知られている。しかしながら、上記ＲＮＡ複製複合体の性状や、ＲＮＡ複製複合体の形成に関わる宿主側の因子については、未だ十分に解明されていない。例えば、ＲＮＡ複製複合体の形成に関わる宿主側の因子についていえば、上記非特許文献６に開示されるように、ＲｄＲｐあるいは上記複製タンパク質と共精製される宿主タンパク質から、ＲＮＡ複製に関与する宿主タンパク質を見つけ出そうする試みがなされている。しかしながら、プラス鎖ＲＮＡウイルスの複製タンパク質またはＲｄＲｐと共精製された宿主タンパク質が，生体内でのプラス鎖ＲＮＡウイルス増殖に関与することが確実に示された例は極めて少ない。ＲＮＡ複製複合体の形成に関わる宿主側の因子は、植物プラス鎖ＲＮＡウイルスに抵抗性を有する植物の作出への利用も期待されるため、そのような因子のさらなる解明が望まれている。
【０００８】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＲＮＡ複製に関わる宿主側の因子を用いて、植物の生育への影響を最小限としつつ、トバモウイルスに対する抵抗性を付与することが可能なトバモウイルス抵抗性植物を製造する方法、およびその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質である、ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチド（以下、「ＡＲＬポリペプチド」ともいう）の発現を低下させた植物では、植物の生育がほとんど影響されることなく、トバモウイルス対する抵抗性が向上すること、および、試験管内ＴｏＭＶ  ＲＮＡ翻訳・複製系にＡＲＬタンパク質を添加すると、ＴｏＭＶ  ＲＮＡの複製が亢進されることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の産業上有用な発明を包含する。
【００１０】
（１）植物体内において、ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドによるトバモウイルス増殖亢進活性を低下させることを特徴とするトバモウイルス抵抗性植物の製造方法。
【００１１】
（２）上記ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドは、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドと、以下の（ｆ）〜（ｊ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドと、以下の（ｋ）〜（ｏ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドと、以下の（ｐ）〜（ｔ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドと、からなる群より選択される少なくとも２つのポリペプチドであることを特徴とする（１）に記載のトバモウイルス抵抗性植物の製造方法。
（ａ）配列番号２もしくは１０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２もしくは１０に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１もしくは９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ｄ）配列番号１もしくは９に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｅ）配列番号１もしくは９に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｆ）配列番号４もしくは１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｇ）配列番号４もしくは１２に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｈ）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ｉ）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｊ）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｋ）配列番号６もしくは１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｌ）配列番号６もしくは１４に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｍ）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ｎ）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｏ）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｐ）配列番号８もしくは１６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｑ）配列番号８もしくは１６に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｒ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ｓ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｔ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド。
【００１２】
（３）植物体内において、上記ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量を低下させることを特徴とする（１）に記載のトバモウイルス抵抗性植物の製造方法。
【００１３】
（４）上記ポリヌクレオチドは、以下の（あ）〜（う）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドと、以下の（え）〜（か）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドと、以下の（き）〜（け）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドと、以下の（こ）〜（し）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドと、からなる群より選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドであることを特徴とする（３）に記載のトバモウイルス抵抗性植物の製造方法。
（あ）配列番号１もしくは９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（い）配列番号１もしくは９に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（う）配列番号１もしくは９に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（え）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（お）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（か）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（き）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（く）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（け）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（こ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（さ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（し）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１４】
（５）上記ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドに変異を導入することによって、ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドによるトバモウイルス増殖亢進活性を低下させることを特徴とする（１）に記載のトバモウイルス抵抗性植物の製造方法。
【００１５】
（６）ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを備えていることを特徴とするトバモウイルス抵抗性植物の製造キット。
【００１６】
（７）植物体内におけるＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドの発現量、植物体内におけるＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドの活性量、および植物体内におけるＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量のうち、少なくともいずれか１つを測定することを特徴とするトバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法。
【００１７】
（８）上記ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドは、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドと、以下の（ｆ）〜（ｊ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドと、以下の（ｋ）〜（ｏ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドと、以下の（ｐ）〜（ｔ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドと、からなる群より選択される少なくとも２つのポリペプチドであり、上記ポリヌクレオチドは、以下の（あ）〜（う）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドと、以下の（え）〜（か）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドと、以下の（き）〜（け）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドと、以下の（こ）〜（し）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドと、からなる群より選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドであることを特徴とする（７）に記載のトバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２もしくは１０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２もしくは１０に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１もしくは９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ｄ）配列番号１もしくは９に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｅ）配列番号１もしくは９に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｆ）配列番号４もしくは１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｇ）配列番号４もしくは１２に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｈ）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ｉ）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｊ）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｋ）配列番号６もしくは１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｌ）配列番号６もしくは１４に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｍ）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ｎ）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｏ）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｐ）配列番号８もしくは１６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｑ）配列番号８もしくは１６に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｒ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ｓ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ｔ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（あ）配列番号１もしくは９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（い）配列番号１もしくは９に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（う）配列番号１もしくは９に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（え）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（お）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（か）配列番号３もしくは１１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（き）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（く）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（け）配列番号５もしくは１３に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（こ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（さ）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（し）配列番号７もしくは１５に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１８】
（９）ＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドと特異的に結合する抗体、およびＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブのうち、少なくとも一方を備えていることを特徴とするトバモウイルス抵抗性植物のスクリーニングキット。
【００１９】
（１０）以下の（イ）〜（ト）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（イ）配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ロ）配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ハ）配列番号９、１１、１３、および１５のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ニ）配列番号９、１１、１３、および１５のいずれか１つに示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ホ）配列番号９、１１、１３、および１５のいずれか１つに示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ヘ）配列番号９の第２７位〜第５８１位、配列番号１１の第１４位〜第５６８位、配列番号１３の第１６位〜第５７０位、および配列番号１５の第６５位〜第６１９位のいずれか１つに示される塩基配列をオープンリーリングフレームとして含むポリヌクレオチド
（ト）配列番号９の第２７位〜第５８１位、配列番号１１の第１４位〜第５６８位、配列番号１３の第１６位〜第５７０位、および配列番号１５の第６５位〜第６１９位のいずれか１つに示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列をオープンリーリングフレームとして含み、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２０】
（１１）以下の（チ）〜（ヲ）のいずれかに記載のポリペプチド。
（チ）配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（リ）配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ヌ）配列番号９、１１、１３、および１５のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
（ル）配列番号９、１１、１３、および１５のいずれか１つに示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド
（ヲ）配列番号９、１１、１３、および１５のいずれか１つに示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチド。
【発明の効果】
【００２１】
本発明にかかるトバモウイルス抵抗性植物の製造方法は、以上のように、植物体内において、ＡＲＬポリペプチドによるトバモウイルス増殖亢進活性を低下させる。そのため、植物の生育に影響を与えることなく、植物体内でのトバモウイルスの増殖を抑制することができる。それゆえ、天然の植物と同等の生育能を有するとともに、トバモウイルスに対する抵抗性を有するトバモウイルス抵抗性植物を製造できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２３】
＜Ｉ．ＡＲＬポリペプチドおよびＡＲＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチド＞
ＡＲＬポリペプチドは、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の１つである。低分子ＧＴＰａｓｅは細胞中ではＧＤＰまたはＧＴＰに結合した状態で存在する。ＧＤＰ結合型とＧＴＰ結合型とでは立体構造や相互作用するタンパク質が異なる。ＡＲＬポリペプチドが属するＡＤＰリボシル化因子（以下、「ＡＲＦ」ともいう）ファミリーのメンバーの多くは、２番目のアミノ酸残基がグリシンである。これらメンバーでは、Ｎ末端のメチオニン残基が除去され、上記グリシンがミリスチル化を受ける。そして、該ＡＲＦはＧＴＰに結合した状態では、ミリスチル基とＮ末端付近の疎水性α−ヘリックスを介して膜に結合する。一方、ＧＤＰに結合した状態では、立体構造が変化し、Ｎ末端近傍のα−ヘリックスはタンパク質内部に折りたたまれ、膜と結合しにくい状態になると考えられている（Pasqualato, S., Renault, L., and Cherfils, J. （2002）. Arf, Arl, Arp and Sar proteins: a family of GTP-binding proteins with a structural device for ‘front-back’ communication. EMBO Rep. 3, 1035-1041.を参照）。ＡＲＦファミリーのメンバーの内、最も研究が進んでいるＡＲＦ１は、ゴルジと小胞体と間の小胞輸送（ＣＯＰＩ小胞輸送）に関与し、細胞質および膜に局在するタンパク質であることが知られている（Donaldoson, J.G., Honda, A., and Weigert, R. （2005）. Multiple activities for Arf1 at the Golgi complex. Biochim Biophys Acta. 1744, 364-373.を参照）。細胞質に存在するＧＤＰ結合型ＡＲＦ１はゴルジ膜に存在する膜貫通タンパク質ｐ２３／ｐ２４またはMembrinを介して膜に結合し（Gommel et al, 2001, Honda et al., 2004）、その後、ゴルジ膜表面に存在するGTP exchange factorの働きにより、ＡＲＦ１に結合したＧＤＰがＧＴＰに交換される。ＧＴＰ結合型ＡＲＦ１はゴルジ体膜上で、膜の湾曲を誘起するとともに、コートマーをリクルートして輸送小胞を出芽させる。働きを終えたＧＴＰ結合型ＡＲＦ１はＧＴＰａｓｅ活性化因子の働きにより、ＧＤＰ結合型に変換され、膜から解離する。低分子ＧＴＰａｓｅ自体のＧＴＰ加水分解能は低く、ＧＴＰａｓｅ間で保存されたアミノ酸残基の置換により、ＧＴＰ結合固定型（膜固定型）、及びＧＤＰ結合固定型（細胞質局在型）のアリルを作製することが可能である（Okai, T., Araki, M., Tade, M., Tateno, T., Kontani, K., and Katada, T. （2004）. Novel small GTPase subfamily capable of associating with tubulin is required for chromosome segregation. J. Cell Sci. 117, 4705-4715.を参照）。
【００２４】
本発明にかかるＡＲＬポリペプチドは、植物が有するＡＲＬタンパク質ファミリーに属するポリペプチドである。Arabidopsis thaliana（和名：シロイヌナズナ、以下「Ａｔ」ともいう）では、ＡＲＬタンパク質ファミリーに属するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが少なくとも４つあることが知られている。本明細書では、これら４つのポリヌクレオチドをそれぞれ、ａｒｌａ１ａ、ａｒｌａ１ｂ、ａｒｌａ１ｃ、およびａｒｌａ１ｄと称し、これらを総称してａｒｌポリヌクレオチドと称する。また、由来も含めて表現するときには、例えば、シロイヌナズナ由来のａｒｌａ１ａをＡｔａｒｌａ１ａと称する。さらに、本明細書では、ａｒｌａ１ａ、ａｒｌａ１ｂ、ａｒｌａ１ｃ、およびａｒｌａ１ｄによってコードされるポリペプチドを、それぞれ、ＡＲＬＡ１ａ、ＡＲＬＡ１ｂ、ＡＲＬＡ１ｃ、およびＡＲＬＡ１ｄと称し、それらを総称してＡＲＬポリヌクレオチドと称する。また、ポリヌクレオチドと同様に、由来も含めて表現するときには、例えば、シロイヌナズナ由来のＡＲＬＡ１ａをＡｔＡＲＬＡ１ａと称する。
【００２５】
本発明にかかるＡＲＬＡ１ａとしては、配列番号２もしくは１０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１もしくは９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、およびそれらの変異体を挙げることができる。
【００２６】
上記配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＡｔＡＲＬＡ１ａである。なお、ＡｔＡＲＬＡ１ａのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、アクセション番号ＮＰ＿５６８５５３として登録されている。また、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、Ａｔａｒｌａ１ａである。なお、Ａｔａｒｌａ１ａの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、アクセション番号ＮＭ＿１２３１２７として登録されている。また、上記配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Nicotiana tobacum（以下、「Ｎｔ」ともいう）由来のＡＲＬＡ１ａである。また、配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、Ｎｔａｒｌａ１ａである。
【００２７】
また、ＡＲＬＡ１ｂとしては、配列番号４もしくは１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号３もしくは１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、およびそれらの変異体を挙げることができる。
【００２８】
上記配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＡｔＡＲＬＡ１ｂである。なお、ＡｔＡＲＬＡ１ｂのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、アクセション番号ＮＰ＿１９０５５５として登録されている。また、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、Ａｔａｒｌａ１ｂである。なお、Ａｔａｒｌａ１ｂの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、アクセション番号ＮＭ＿１１４８４６として登録されている。また、上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＮｔＡＲＬＡ１ｂである。また、配列番号１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、Ｎｔａｒｌａ１ｂである。
【００２９】
ＡＲＬＡ１ｃとしては、配列番号６もしくは１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号５もしくは１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、およびそれらの変異体を挙げることができる。
【００３０】
上記配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＡｔＡＲＬＡ１ｃである。なお、ＡｔＡＲＬＡ１ｃのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、アクセション番号ＮＰ＿１９０５５６として登録されている。また、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、Ａｔａｒｌａ１ｃである。なお、Ａｔａｒｌａ１ｃの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、アクセション番号ＮＭ＿１１４８４７として登録されている。また、上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＮｔＡＲＬＡ１ｃである。また、配列番号１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、Ｎｔａｒｌａ１ｃである。
【００３１】
ＡＲＬＡ１ｄとしては、配列番号８もしくは１６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号７もしくは１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、およびそれらの変異体を挙げることができる。
【００３２】
上記配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＡｔＡＲＬＡ１ｄである。なお、ＡｔＡＲＬＡ１ｄのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、アクセション番号ＮＰ＿５６９０５１として登録されている。また、配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、Ａｔａｒｌａ１ｄである。なお、Ａｔａｒｌａ１ｄの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、アクセション番号ＮＭ＿１２６１５６として登録されている。また、上記配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＮｔＡＲＬＡ１ｄである。また、配列番号１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、Ｎｔａｒｌａ１ｄである。
【００３３】
本明細書中においてタンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドが意図される。なお、「トバモウイルス増殖亢進活性」とは、トバモウイルスを増殖させる活性、好ましくはＧＴＰに結合し、トバモウイルスを増殖させる活性、より好ましくは、ＧＴＰに結合し、トバモウイルスのゲノムＲＮＡの複製を亢進する活性が意図される。また、本明細書中で使用される場合、「ＡＲＬポリペプチド」は「ＡＲＬペプチド」または「ＡＲＬタンパク質」と交換可能に使用される。
【００３４】
本発明はまた、ａｒｌポリヌクレオチドを提供する。本発明にかかるａｒｌポリヌクレオチドには、ａｒｌａ１ａ〜ｄが含まれる。該ａｒｌａ１ａ〜ｄは、それぞれ、ＡＲＬＡ１ａ〜ｄをコードするポリヌクレオチドである。具体的には、上記ａｒｌａ１ａとしては、配列番号１もしくは９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドおよびその変異体を挙げることができる。上記ａｒｌａ１ｂとしては、配列番号３もしくは１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドおよびその変異体を挙げることができる。上記ａｒｌａ１ｃとしては、配列番号５もしくは１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドおよびその変異体を挙げることができる。上記ａｒｌａ１ｄとしては、配列番号７もしくは１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドおよびその変異体を挙げることができる。
【００３５】
上記例示したポリヌクレオチドのうち、配列番号９、１１、１３、および１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、Ｎｔａｒｌａ１ａ〜ｄである。また、Ｎｔａｒｌａ１ａ〜ｄのオープンリーディングフレーム（以下、「ＯＲＦ」ともいう）は、それぞれ、配列番号９の第２７位〜第５８１位、配列番号１１の第１４位〜第５６８位、配列番号１３の第１６位〜第５７０位、および配列番号１５の第６５位〜第６１９位に示される塩基配列で表される。したがって、本発明にかかるポリヌクレオチドには、配列番号９の第２７位〜第５８１位、配列番号１１の第１４位〜第５６８位、配列番号１３の第１６位〜第５７０位、または配列番号１５の第６５位〜第６１９位に示される塩基配列をＯＲＦとして含むポリヌクレオチド、および配列番号９の第２７位〜第５８１位、配列番号１１の第１４位〜第５６８位、配列番号１３の第１６位〜第５７０位、または配列番号１５の第６５位〜第６１９位に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列をＯＲＦとして含むポリヌクレオチドが含まれる。なお、本明細書において、オープンリーディングフレームとは、ポリヌクレオチドにおいて、実際にタンパク質に翻訳される領域、すなわち、タンパク質のコード領域を指す。
【００３６】
本明細書中においてＤＮＡまたはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。また、本明細書中で使用される場合、「ａｒｌポリヌクレオチド」は「ａｒｌ遺伝子」と交換可能に使用される。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明にかかるポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。
【００３８】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００３９】
本発明にかかるポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明にかかるポリペプチドは、ミリスチル化され得るか、または非ミリスチル化され得る。さらに、本発明にかかるポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００４０】
本発明にかかるポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００４１】
また、本発明にかかるポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００４２】
一実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、ＡＲＬポリペプチドの変異体である。ここで当該変異体は、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドである。上記ＡＲＬＡ１ａの変異体としては、具体的には、配列番号２もしくは１０に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。同様に、上記ＡＲＬＡ１ｂの変異体としては、配列番号４もしくは１２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。上記ＡＲＬＡ１ｃの変異体としては、配列番号６もしくは１４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。さらに、上記ＡＲＬＡ１ｄの変異体としては、配列番号８もしくは１６に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
【００４３】
このような変異体には、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が含まれる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【００４４】
ポリペプチドを構成するアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００４５】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望のトバモウイルス増殖亢進活性を有するか否かを容易に決定することができる。
【００４６】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。これらは、本発明にかかるポリペプチドのトバモウイルス増殖亢進活性を変化させない。
【００４７】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００４８】
他の実施形態において、上記ＡＲＬＡ１ａの変異体は、配列番号１もしくは９に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドであってもよい。同様に、上記ＡＲＬＡ１ｂの変異体は、配列番号３もしくは１１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドであってもよい。上記ＡＲＬＡ１ｃの変異体は、配列番号５もしくは１３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドであってもよい。さらに、上記ＡＲＬＡ１ｄの変異体は、配列番号７もしくは１５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００４９】
さらに他の実施形態において、上記ＡＲＬＡ１ａの変異体は、配列番号１もしくは９に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドであってもよい。同様に、上記ＡＲＬＡ１ｂの変異体は、配列番号３もしくは１１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドであってもよい。上記ＡＲＬＡ１ｃの変異体は、配列番号５もしくは１３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドであってもよい。さらに、上記ＡＲＬＡ１ｄの変異体は、配列番号７もしくは１５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、トバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００５０】
ハイブリダイゼーションは、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１もしくは９に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１もしくは９の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【００５３】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
【００５５】
本発明にかかるポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【００５６】
一実施形態において、本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記ＡＲＬポリヌクレオチドの変異体である。ここで当該変異体はトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。具体的には、上記ａｒｌａ１ａの変異体としては、配列番号１もしくは９に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号１もしくは９に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを挙げることができる。同様に、上記ａｒｌａ１ｂの変異体としては、配列番号３もしくは１１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号３もしくは１１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを挙げることができる。上記ａｒｌａ１ｃの変異体としては、配列番号５もしくは１３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号５もしくは１３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを挙げることができる。さらに、上記ａｒｌａ１ｄの変異体としては、配列番号７もしくは１５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号７もしくは１５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５７】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列またはベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００５８】
本発明にかかるポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、生物材料であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。下述する実施例においては、シロイヌナズナおよびタバコを用いているが、これに限定されない。
【００５９】
また、本発明にかかるＡＲＬポリヌクレオチドには、上述したＡＲＬポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドも含まれる。
【００６０】
本発明にかかるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、後述するように、トバモウイルス抵抗性が付与された植物体を製造するために使用され得る。また、本発明によれば、トバモウイルス抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために適用することができる。このようなトバモウイルス抵抗性植物の製造方法や、トバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法は、例えば、植物育種の分野などに用いることができる。
【００６１】
また、本発明にかかるＡＲＬポリペプチドおよびＡＲＬポリヌクレオチド、ならびにそれらの変異体の用途は、上記トバモウイルス抵抗性植物の製造方法や、トバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法に限定されるものではない。具体的には、ＡＲＬポリペプチドがトバモウイルスの増殖に関与することを利用したあらゆる用途が本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００６２】
さらに、本発明には、ＡＲＬポリペプチドの変異体であって、トバモウイルス増殖亢進活性を有しないポリペプチド、およびＡＲＬポリヌクレオチドの変異体であって、トバモウイルス増殖亢進活性を有しないポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含まれる。このようなＡＲＬポリペプチド変異体およびＡＲＬポリヌクレオチド変異体を、植物体内で発現させることにより、トバモウイルス抵抗性を有する植物を作製することができる。このような植物は、例えば、上記ＡＲＬポリヌクレオチド変異体を従来公知の形質転換技術を用いて、植物体内に導入することにより製造することができる。
【００６３】
＜ＩＩ．ＡＲＬポリペプチドの生産方法＞
本発明は、ＡＲＬポリペプチドを生産する方法を提供する。一実施形態において、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、ＡＲＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いる。
【００６４】
本実施形態の１つの局面において、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上記ベクターが無細胞タンパク質合成系において用いられる。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットが用いられ得る。好ましくは、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。
【００６５】
無細胞タンパク質合成系は細胞内ｍＲＮＡやクローニングされたｃＤＮＡにコードされている様々なタンパク質の同定等に広く用いられる手法であり、無細胞タンパク質合成系（無細胞タンパク質合成法、無細胞タンパク質翻訳系とも呼ぶ）に用いられるのが無細胞タンパク質合成液である。
【００６６】
無細胞タンパク質合成系としては、コムギ胚芽抽出液を用いる系、ウサギ網状赤血球抽出液を用いる系、大腸菌Ｓ３０抽出液を用いる系、および植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液が挙げられる。一般的には、真核生物由来遺伝子の翻訳には真核細胞の系、すなわち、コムギ胚芽抽出液を用いる系またはウサギ網状赤血球抽出液を用いる系のいずれかが選択されるが、翻訳される遺伝子の由来（原核生物／真核生物）や、合成後のタンパク質の使用目的を考慮して、上記合成系から選択されればよい。
【００６７】
なお、種々のウイルス由来遺伝子産物は、その翻訳後に、小胞体、ゴルジ体等の細胞内膜が関与する複雑な生化学反応を経て活性を発現するものが多いので、各種生化学反応を試験管内で再現するためには細胞内膜成分（例えば、ミクロソーム膜）が添加される必要がある。特開２００５−６５６５１号公報（平成１７年３月１７日公開）に記載されるような植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液は、細胞内膜成分を保持した無細胞タンパク質合成液として利用し得るのでミクロソーム膜の添加が必要とされないので、好ましい。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、「細胞内膜成分」は、細胞質内に存在する脂質膜よりなる細胞小器官（すなわち、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などの細胞内顆粒全般）が意図される。特に、小胞体およびゴルジ体はタンパク質の翻訳後修飾に重要な役割を果たしており、膜タンパク質および分泌タンパク質の成熟に必須な細胞成分である。
【００６９】
本実施形態の他の局面において、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上記ベクターが組換え発現系において用いられることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、ａｒｌポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られるＡＲＬポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
【００７０】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
【００７１】
本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、ＡＲＬポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【００７２】
別の実施形態において、ＡＲＬポリペプチドの生産方法は、ＡＲＬポリペプチドを天然に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することが好ましい。本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、後述する抗体またはオリゴヌクレオチドを用いてＡＲＬポリペプチドを天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、ＡＲＬポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。
【００７３】
さらに他の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、本発明にかかるポリペプチドを化学合成してもよい。当業者は、本明細書中に記載される本発明にかかるポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明にかかるポリペプチドを化学合成できることを、容易に理解する。
【００７４】
以上のように、本発明にかかるポリペプチドを生産する方法によって取得されるポリペプチドは、天然に存在する変異ポリペプチドであっても、人為的に作製された変異ポリペプチドであってもよい。
【００７５】
変異ポリペプチドを作製する方法についても、特に限定されない。例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271-275(1995)参照）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異ポリペプチドを作製する方法、またはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異ポリペプチド作製法を用いることによって、変異ポリペプチドを作製することができる。変異ポリペプチドの作製には市販のキットを利用してもよい。
【００７６】
このように、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、少なくとも、ＡＲＬポリペプチドのアミノ酸配列、またはＡＲＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。
【００７７】
つまり、本発明の目的は、ＡＲＬポリペプチドの生産方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００７８】
なお、ＡＲＬポリペプチドの変異体が所望のトバモウイルス増殖亢進活性を有するか否かを決定するための方法としては、無細胞タンパク質合成系が好ましい。下述する無細胞タンパク質合成系にウイルスＲＮＡを添加することにより、ウイルスＲＮＡを翻訳して複製に必須なウイルスタンパク質を合成させることができる。この系を、本明細書中「インビトロ複製系」とも称する。
【００７９】
該インビトロ複製系によれば、野生型ＴｏＭＶのインビトロ複製系に、作製したＡＲＬポリペプチドを添加し、反応させ、野生型ＴｏＭＶ  ＲＮＡの複製を検出すれば、ＡＲＬポリペプチドの変異体でありかつトバモウイルス増殖亢進活性を有するポリペプチドを容易に選択することができる。
【００８０】
＜ＩＩＩ．トバモウイルス抵抗性植物の製造方法および製造キット＞
本発明にかかるトバモウイルス抵抗性植物の製造方法（以下、単に「本発明にかかる植物の製造方法」とも称する）は、植物体内におけるＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチド（以下、「ＡＲＬポリペプチド」ともいう）のトバモウイルス増殖亢進活性を低下させる工程を含む。上記構成によれば、植物の生育に影響を与えることなく、植物体内でのトバモウイルスの増殖を抑制することができる。それゆえ、天然の植物と同等の生育能を有するとともに、トバモウイルスに対する抵抗性を有するトバモウイルス抵抗性植物を製造できる。本発明にかかる製造方法は、上記工程以外の具体的な構成、例えば、植物体内におけるＡＲＬポリペプチドの活性を低下させる方法、使用装置、および使用器具等は特に限定されるものではない。
【００８１】
以下、本発明にかかる植物の製造方法について説明する。上述したように、本発明にかかる植物の作製方法は、植物体内において、ＡＲＬポリペプチドによるトバモウイルス増殖亢進活性を低下させる工程を包含していればよい。具体的には、ＡＲＬポリペプチドの発現量（蓄積量）を低下させたり、ａｒｌポリヌクレオチドの発現量を低下させたり、ａｒｌポリヌクレオチドに変異を導入することによりトバモウイルス増殖亢進活性が低下した変異型ＡＲＬポリペプチドを発現させたり、ＡＲＬポリペプチドの阻害剤処理することにより植物体内でのＡＲＬポリペプチドのトバモウイルス増殖亢進活性を阻害したりすることによって、植物体内におけるＡＲＬポリペプチドのトバモウイルス増殖亢進活性を低下させることができる。本発明にかかる植物の製造方法では、上述したＡＲＬＡ１ａ〜ｄのうち、いずれかのトバモウイルス増殖亢進活性を低下させればよいが、少なくとも２つのポリペプチドについて、植物体内におけるトバモウイルス増殖亢進活性を低下させることが好ましく、ＡＲＬＡ１ａ、ｃ、ｄのうち、２つまたは３つのポリペプチドについて、植物体内におけるトバモウイルス増殖亢進活性を低下させることがさらに好ましい。より具体的には、ＡＲＬＡ１ａおよびＡＲＬＡ１ｃのトバモウイルス増殖亢進活性を低下させることが好ましく、ＡＲＬＡ１ｃおよびＡＲＬＡ１ｄのトバモウイルス増殖亢進活性を低下させることがより好ましく、ＡＲＬＡ１ａ、ＡＲＬＡ１ｃ、およびＡＲＬＡ１ｄのトバモウイルス増殖亢進活性を低下させることがさらに好ましい。ＡＲＬＡ１ａおよびＡＲＬＡ１ｃのトバモウイルス増殖亢進活性を低下させることにより、植物にＴｏＭＶに対する抵抗性を付与することができる。また、ＡＲＬＡ１ｃおよびＡＲＬＡ１ｄのトバモウイルス増殖亢進活性を低下させることにより、植物に、ＴｏＭＶおよびＴＭＶに対する抵抗性を付与することができる。さらに、ＡＲＬＡ１ａ、ＡＲＬＡ１ｃ、およびＡＲＬＡ１ｄのトバモウイルス増殖亢進活性を低下させることにより、植物に、ＴｏＭＶおよびＴＭＶに対する抵抗性を付与することができる。なお、本明細書において、「植物体内において、ＡＲＬポリペプチドによるトバモウイルス増殖亢進活性を低下させる」とは、植物体内において、ＡＲＬポリペプチドによるトバモウイルス増殖亢進活性を、野生株よりも低下させることを意図するものであり、その低下の程度を限定するものではない。つまり、植物体内において、ＡＲＬポリペプチドによるトバモウイルス増殖亢進活性を完全に喪失させることをも包含するものである。
【００８２】
一実施形態において、本発明にかかる植物の製造方法に従ってトバモウイルス抵抗性が付与された植物体は、植物形質転換体または植物変異体であり得る。
【００８３】
本実施形態にかかる植物変異体は、例えば、天然に存在する変異体から、ＡＲＬポリペプチドのトバモウイルス増殖亢進活性が低下した植物を選抜することによって得ることができる。また、上記植物変異体は、化学的突然変異原である公知な化合物で種子などを処理する方法（化学的突然変異誘発法）ことによっても取得することができる。上記化学的突然変異原としては、アジ化ナトリウム（ＮａＮ3）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、アジドグリセロール（ＡＧ、３−アジド−１，２−プロパンジオール）、メチルニトロソ尿素（ＭＮＵ）、及びマレイン酸ヒドラジド（ＭＨ）などが例示できる。また、ＵＶ照射を用いてもよい。上記方法によれば、本発明にかかるａｒｌポリヌクレオチドのプロモーター領域において、１ヌクレオチド以上の変異が導入され、該ａｒｌポリヌクレオチドの転写がダウンレギュレート又はノックアウトされうる。これにより、本発明にかかるＡＲＬポリペプチドの発現量が低下し、結果として、本発明にかかるＡＲＬポリペプチドの活性を低下させることができる。また別の様式として、上記方法によれば、本発明にかかるａｒｌポリヌクレオチドのコード領域において、１ヌクレオチド以上の変異が導入され、トバモウイルス増殖亢進活性が低下した変異型ＡＲＬポリペプチドが発現されうる。これにより、植物体内におけるＡＲＬポリペプチドの活性を低下させることができる。なお、本発明にかかる遺伝子のコード領域における変異は、特に限定されるものではなく、フレームシフトを生じさせたり、翻訳産物であるタンパク質の末端切断及び／又は基質特異性の低下を生じさせたりする挿入、欠失及び置換を含むものである。また、ＡＲＬポリペプチドは、上述したようにＧＴＰ結合活性を有するポリペプチドである。ＡＲＬポリペプチドのトバモウイルス増殖亢進活性には、後述の実施例に示すように、ＧＴＰ結合活性が関与している。より詳しく説明すると、ＡＲＬポリペプチドのような低分子ＧＴＰａｓｅは、細胞中でＧＤＰまたはＧＴＰに結合した状態で存在する。ＡＲＬポリペプチドは、ＧＴＰと結合した状態で、トバモウイルスの増殖に関与する。したがって、ＡＲＬポリペプチドがＧＴＰと結合できないように、換言すれば、恒常的にＧＤＰと結合するように、ＡＲＬポリペプチドに変異を導入することによっても、本発明にかかるトバモウイルス抵抗性植物を製造することができる。なお、ＧＴＰと結合した状態のＡＲＬポリペプチドは膜に結合しており、ＧＤＰと結合した状態のＡＲＬポリペプチドは細胞質に局在していると考えられる。したがって、ＡＲＬポリペプチドが膜に結合しないように、換言すれば、恒常的に細胞質に局在するように、ＡＲＬポリペプチドに変異を導入することによっても、本発明にかかるトバモウイルス抵抗性植物を製造することができる。このような変異としては、例えば、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮｔＡＲＬＡ１ｄ）における第３３位のスレオニンのアスパラギンへの置換を挙げることができる。
【００８４】
また、本実施形態にかかる植物形質転換体は、例えば、以下の（i）〜（vi）に説明する方法により製造することができる。
【００８５】
（i）突然変異誘発法
本発明にかかるポリヌクレオチドを、キメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発の標的とする。上記キメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、植物細胞において所望の位置に突然変異を導入できることが知られている（Zhuら、1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8768-8773; 及びBeethamら、1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8774-8778を参照）。なお、キメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いた形質転換の具体的な方法は後述する。
【００８６】
また、所望の位置に突然変異が導入されているか否かは、従来公知の方法、例えば、ＰＣＲに基づく方法などを用いることにより、確認及び追跡することができる。
【００８７】
したがって、本発明にかかるポリヌクレオチドを、キメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発の標的とすれば、本発明にかかるポリヌクレオチド中の特定の部位に変異を導入することができる。
【００８８】
上記方法によれば、本発明にかかるポリヌクレオチドのプロモーター領域において、１ヌクレオチド以上の変異が導入され、本発明にかかるポリヌクレオチドの転写がダウンレギュレート又はノックアウトされうる。これにより、本発明にかかるＡＲＬポリペプチドの発現量が低下し、結果として、本発明にかかるＡＲＬポリペプチドの活性を低下させることができる。また別の様式として、上記方法によれば、本発明にかかるａｒｌポリヌクレオチドのコード領域において、１ヌクレオチド以上の変異が導入され、トバモウイルス増殖亢進活性が低下した変異型ＡＲＬポリペプチドが発現されうる。これにより、植物体内におけるＡＲＬポリペプチドの活性を低下させることができる。
【００８９】
なお、本発明にかかるポリヌクレオチドのコード領域における変異は、特に限定されるものではなく、フレームシフトを生じさせたり、翻訳産物であるタンパク質の末端切断及び／又は基質特異性の低下を生じさせたりする挿入、欠失及び置換を含むものである。
【００９０】
（ii）アンチセンス法
植物体内において、本発明にかかるポリヌクレオチドのアンチセンス鎖を発現させる。アンチセンス核酸配列を含有する発現ベクターを用いた形質転換の具体的な方法は後述する。
【００９１】
（iii）標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子発現
本発明にかかるポリヌクレオチド（標的遺伝子）のドミナントネガティブの形質を有するポリヌクレオチドを植物へ形質転換することによって、植物に内在する本発明にかかるポリヌクレオチドの発現を抑制することができる。本発明において「ドミナントネガティブの形質を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」とは、該ポリヌクレオチドを発現させることによって、植物体が本来もつ内在性の本発明にかかるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの活性を消失もしくは低下させる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのことを指す。
【００９２】
なお、上記ポリヌクレオチドを用いた形質転換の具体的な方法については、後述する。
【００９３】
（iv）共抑制
本発明にかかるポリヌクレオチド（標的遺伝子）配列と同一もしくは類似した配列を有するポリヌクレオチドの形質転換によって、内在性の本発明にかかるポリヌクレオチドの発現を抑制することができる（共抑制）。「共抑制」とは、植物に標的内在性ポリヌクレオチドと同一若しくは類似した配列を有するポリヌクレオチドを形質転換により導入すると、導入する外来ポリヌクレオチドおよび標的内在性ポリヌクレオチドの両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される（Curr. Biol., 7:R793, 1997; Curr. Biol., 6:810, 1996を参照）。例えば、本発明にかかるポリヌクレオチドが共抑制された植物体を得るためには、本発明にかかるポリヌクレオチド若しくはこれと類似した配列を有するポリヌクレオチドを発現できるように作製したベクターＤＮＡを目的の植物へ形質転換し、得られた植物より生育が抑制された植物を選択すればよい。共抑制に用いるポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドと完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、従来公知の方法で決定することができる。
【００９４】
（v）ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法
標的ポリヌクレオチド配列と同一もしくは類似した配列を逆位反復に配置したＤＮＡの形質転換によってもたらされるＲＮＡ干渉によって、内在性ポリヌクレオチドの発現を抑制することができる（ＲＮＡ干渉）。「ＲＮＡ干渉」とは、植物に標的内在性ポリヌクレオチドと同一若しくは類似した配列を逆位反復に配置したＤＮＡを形質転換により導入すると、外来ＤＮＡに由来する２本鎖ＲＮＡが発現し、標的ポリヌクレオチドの発現が抑制される現象のことをいう。ＲＮＡ干渉の機構としては、第１段階として、標的ポリヌクレオチドのｍＲＮＡと導入配列由来の２本鎖ＲＮＡが複合体を形成し会合した配列をプライマーとして相補的なＲＮＡが合成される。第２段階として、内在性ＲＮａｓｅによってこの複合体が断片化される。第３段階として、２０〜３０塩基対に断片化した２本鎖ＲＮＡが二次的なＲＮＡ干渉のシグナルとして機能することによって再び、内在性の標的ポリヌクレオチドのｍＲＮＡを分解すると考えられている。なお、形質転換の具体的な方法は、後述する。
【００９５】
例えば、本発明にかかるポリヌクレオチドがＲＮＡ干渉によって抑制された植物体を得るためには、まず、本発明にかかるポリヌクレオチドしくはこれと類似した配列を有するＤＮＡを逆位反復に配置したＤＮＡを発現できるように作製したベクターＤＮＡを目的の植物へ形質転換する。次に、得られた植物体からトバモウイルス増殖亢進活性が低下した植物を選抜すればよい。
【００９６】
ＲＮＡ干渉に用いるポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドと完全に同一である必要はないが、少なくとも１０塩基以上が連続して同一であり、好ましくは２０塩基から１００塩基が連続して同一であり、さらに好ましくは５０塩基が連続して同一である。またＲＮＡ干渉に用いるポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドと少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を有するポリヌクレオチドであってもよい。さらにより好ましくは、標的ポリヌクレオチドと少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を有するポリヌクレオチドが逆位反復に配置したものが挙げられる。とりわけ、これらの標的ポリヌクレオチドと配列の同一性を有するポリヌクレオチドがスペーサー配列を挟んで逆位反復に配置されたものが好ましい。配列の同一性は、従来公知の方法を用いて決定することができる。
【００９７】
ＲＮＡ干渉に用いるポリヌクレオチドの長さとしては、標的ポリヌクレオチドの全長を使用してもよいが、少なくとも２５塩基あればよく、好ましくは５０塩基、より好ましくは１００塩基、さらに好ましくは５００塩基あればよい。
【００９８】
また、ＲＮＡ干渉は植物ウイルスの感染によっても実現可能である。ゲノムとして１本鎖ＲＮＡをもつ植物ウイルスは、その複製過程において２本鎖ＲＮＡ形態をとる。そこで、植物ウイルスゲノム中に目的ポリヌクレオチド配列を適当なプロモーターと共に挿入し、この組換えウイルスを植物に感染させた場合、該ウイルスの複製に伴い目的ポリヌクレオチド配列の２本鎖ＲＮＡが生成されることになる。その結果、ＲＮＡ干渉の効果を得ることができる（Angell et al., Plant J. 20, 357-362,(1999)を参照）。
【００９９】
（vi）トランスポゾン法
トランスポゾン遺伝子を変異原として利用し、所望の植物等において、トランスポゾンタグ系統を作出することができる。このようにして、作出したトランスポゾンタグ系統から、本発明にかかるポリペプチドの発現量が低下した植物や、活性が低下した植物を選抜することにより、トバモウイルス増殖亢進活性の低い植物を作出することができる。
【０１００】
トランスポゾン遺伝子の植物への導入方法は、上述した形質転換法により行うことができる。
【０１０１】
上記のような方法で製造した植物から、トバモウイルス増殖亢進活性が低下した植物を選抜する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、ポリヌクレオチドの発現量を評価する方法としては、ノーザンブロット法などが例示できる。また、ポリペプチドの発現量は、本発明にかかるポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などの免疫学的方法を用いることができる。
【０１０２】
ここで、上記（i）〜（vii）の方法において、利用可能な形質転換方法について説明する。組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明にかかるポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクター、または外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
【０１０３】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
【０１０４】
植物へのポリヌクレオチドの導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられ、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法とに大別される。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７〜３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌらの方法（Micribiol. Lett., 67, 325 (1990)）が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをPlant Molecular Biology Manual（S.B.Gelvinら、Academic Press Publishers）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクター（例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１、およびｐＰＺＰ２０２など）が使用され得る。
【０１０５】
また、ポリヌクレオチドを直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
【０１０６】
ポリヌクレオチドが導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。選択マーカーとしては、ハイグロマイシン耐性に限定されず、例えば、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコールなどに対する薬剤耐性が挙げられる。
【０１０７】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法などによって組換えベクターが培養細胞に導入されて形質転換される。形質転換の結果として得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
【０１０８】
ポリヌクレオチドが植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【０１０９】
本発明にかかるポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、本発明にかかるポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。
【０１１０】
一実施形態において、本発明にかかる植物の製造方法に従ってトバモウイルス抵抗性が付与された植物体は、ＡＲＬポリペプチドの活性を阻害する阻害剤で処理された植物であり得る。上記阻害剤は、ＡＲＬＡ１タンパク質の活性を阻害するものであることが好ましい。また、上記阻害剤は、化学合成した化学物質でもよいし、天然に存在する化学物質でもよいし、抗体または抗体断片のような生体分子であってもよい。また、一実施形態として、ＡＲＬポリペプチドに対する抗体、または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを植物体内に発現可能に導入した形質転換体であってもよい。上記抗体または抗体断片は、ポリクローナル抗体またはその抗体断片であってもよいし、モノクローナル抗体またはその抗体断片であってもよい。いずれであっても、上記抗体または抗体断片は、ＡＲＬＡ１に対して、高度に特異的に結合し、該ＡＲＬＡ１タンパク質の活性を阻害するものであることが好ましい。
【０１１１】
本発明にかかる植物の製造方法によって作製されたトバモウイルス抵抗性が付与された植物体は、特に限定されず、トバモウイルス抵抗性が付与されたことによりその有用性を有し得る植物が挙げられる。このような植物としては、被子植物でも裸子植物でもよい。また、被子植物としては、単子葉植物でも双子葉植物でもよいが、双子葉植物であることがより好ましい。
【０１１２】
本発明はまた、トバモウイルス抵抗性が付与された植物を製造するためのキット（以下、単に「植物の製造キット」ともいう）を提供する。本発明にかかる植物の製造キットは、植物体内におけるトバモウイルス増殖亢進活性を低下させることが可能なものを備えていればよい。例えば、植物体内におけるＡＲＬポリペプチドおよびａｒｌポリヌクレオチドの発現量を低下させる方法（例えば、上述の（i）〜（vii）の方法）で用いられるポリヌクレオチドを植物体内で発現可能な形態で備える構成、および植物体内におけるＡＲＬポリペプチドの活性を阻害する阻害剤を備える構成が挙げられる。
【０１１３】
なお、本発明にかかる植物の製造キットは、上記ポリヌクレオチドや阻害剤以外に、上述した植物の製造方法を実行するために必要とされる試薬などを備えていることが好ましい。すなわち、本明細書を読んだ当業者は、トバモウイルス抵抗性が付与された植物を製造するためのキットの構成品が、トバモウイルス抵抗性が付与された植物を製造する方法において用いられるものであることを容易に理解する。
【０１１４】
＜ＩＶ．トバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法およびスクリーニングキット＞
本発明は、トバモウイルス抵抗性植物をスクリーニングするための方法（以下、単に「植物のスクリーニング方法」ともいう）を提供する。本発明にかかる植物のスクリーニング方法は、植物体内におけるＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドの発現量、植物体内におけるＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドの活性量、および植物体内におけるＡＤＰリボシル化因子様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量のうち、少なくともいずれか１つを測定するする工程（以下、「測定工程」ともいう）を包含していればよい。一実施形態において、本発明にかかる植物のスクリーニング方法に従ってスクリーニングされた植物は、天然であっても、形質転換体であっても、変異体であってもよい。
【０１１５】
上記測定工程としては、具体的には、例えば、目的の植物から抽出したＡＲＬタンパク質（粗抽出物であってもよいし、部分精製物であってもよいし、精製物であってもよい）をＡＲＬタンパク質に対する抗体と反応させ、ＡＲＬタンパク質と結合した抗体を検出することによって、植物体内におけるＡＲＬポリペプチドの発現量（蓄積量）を測定する工程を挙げることができる。より具体的には、ウエスタンブロット法や、ＥＬＩＳＡ法を用いて、植物体内におけるＡＲＬポリペプチドの発現量を測定する工程を挙げることができる。上記工程によれば、野生株との比較により、植物体内におけるＡＲＬポリペプチドの発現量が低下した植物体を容易に検出（スクリーニング）することができる。このようなＡＲＬポリペプチドの発現量が低下した植物体は、多くの場合、植物におけるトバモウイルス増殖亢進活性が低下しているため、上記工程により、トバモウイルスに対する抵抗性が向上した植物を容易にスクリーニングできる。上記工程において用いる抗体としては、後述する抗体を用いることができる。
【０１１６】
また、上記測定工程としては、例えば、目的の植物から抽出したＡＲＬタンパク質（粗抽出物であってもよいし、部分精製物であってもよいし、精製物であってもよい）の活性量を測定する工程を挙げることができる。より具体的には、ＡＲＬタンパク質が有するＧＴＰ結合活性を測定する工程を挙げることができる。上記工程によれば、野生株との比較により、植物体内におけるＡＲＬポリペプチドの活性量が低下した植物体を容易に検出（スクリーニング）することができる。このようなＡＲＬポリペプチドの活性量が低下した植物体は、多くの場合、植物におけるトバモウイルス増殖亢進活性が低下しているため、上記工程により、トバモウイルスに対する抵抗性が向上した植物を容易にスクリーニングできる。上記工程において、ＧＴＰ結合活性を測定する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いればよい。
【０１１７】
さらに、上記測定工程としては、例えば、ａｒｌポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、該オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出することによって、ａｒｌポリヌクレオチドの発現量を測定する工程を挙げることができる。このような工程によれば、野生株との比較により、ａｒｌポリヌクレオチドの発現量が低下した植物体を容易に検出（スクリーニング）することができる。ａｒｌポリヌクレオチドの発現量が低下した植物体は、多くの場合、植物におけるトバモウイルス増殖亢進活性が低下しているため、上記工程により、植物におけるトバモウイルス増殖亢進活性が低下した植物を容易にスクリーニングできる。
【０１１８】
上記測定工程として、例示した工程は、単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。単独で用いることにより、迅速にトバモウイルス抵抗性植物をスクリーニングすることができる。一方、複数を組み合わせて用いることにより、スクリーニングの精度を高めることができる。
【０１１９】
本発明にかかる植物のスクリーニング方法において用いられる上記オリゴヌクレオチドは、ａｒｌポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを得るためのＰＣＲプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。上記オリゴヌクレオチドはまた、以下のような用途に用いることもできる。：（１）ｃＤＮＡライブラリー中のａｒｌポリヌクレオチドまたはその対立遺伝子もしくはスプライシング改変体の単離；（２）ａｒｌ遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Verma et al., Human Chromosomes:A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)に記載される）；および（３）特定の組織におけるａｒｌ  ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。
【０１２０】
なお、当業者は、上述した用途がいずれも、本発明にかかる植物のスクリーニング方法において用いられるオリゴヌクレオチドと目的の遺伝子（ポリヌクレオチド）との間で生じるハイブリダイゼーションに起因しており、当該オリゴヌクレオチドが、目的の遺伝子（ポリヌクレオチド）とハイブリダイズさせるために用いられることを容易に理解する。
【０１２１】
本発明にかかるポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも７ｎｔ（ヌクレオチド）、１０ｎｔ、１２ｎｔ、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図されるが、当業者は、上述した用途に応じて好ましい長さを適宜設定し得る。「少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメント」によって、例えば、配列番号１に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基配列またはその相補配列を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号１に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号１に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Applied Biosystems Incorporated (ABI, 850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA 94404）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
【０１２２】
本発明にかかる植物のスクリーニング方法において用いられるオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。上記オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術によって、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少が観察される。上記オリゴヌクレオチドを導入することによって、ＡＲＬポリペプチドの含量を低下させることができ、その結果、植物中のトバモウイルス増殖亢進活性を低下させることができる。
【０１２３】
このように、本発明にかかる植物のスクリーニング方法において用いられるオリゴヌクレオチドを、ＡＲＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブまたは当該ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することによって、ＡＲＬポリペプチドを発現量が低下した植物体または組織を容易に検出（スクリーニング）することができる。さらに、上記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用して、植物体またはその組織もしくは細胞におけるＡＲＬポリペプチドの発現量を低下させることができる。
【０１２４】
さらに、本発明にかかる植物のスクリーニング方法を用いれば、ＡＲＬポリペプチドやａｒｌポリヌクレオチドの変異の検出も容易に行うことができるため、様々な植物変異体の集合から、ＡＲＬポリペプチドやａｒｌポリヌクレオチドに変異を有する植物変異体をスクーリングすることもできる。本発明にかかる植物のスクリーニング方法において、スクリーニング可能な植物変異体としては、上記本発明にかかる植物の製造方法で説明した植物変異体を挙げることができる。
【０１２５】
本発明はまた、トバモウイルス抵抗性が付与された植物をスクリーニングするためのキット（以下、単に「植物のスクリーニングキット」ともいう）を提供する。本発明にかかる植物のスクリーニングキットは、植物体内におけるトバモウイルス増殖亢進活性を低下させることが可能なものを備えていればよい。例えば、植物体内におけるＡＲＬポリペプチドの発現量を測定するための抗体を含むキット、植物体内におけるａｒｌポリヌクレオチドの発現量を測定するためのプローブを含むキット、および植物体内におけるＡＲＬポリペプチドのＧＴＰ結合活性を測定するための試薬を含むキットなどを挙げることができる。
【０１２６】
なお、本発明にかかる植物のスクリーニングキットは、上記抗体や、プローブ、ＧＴＰ結合活性を測定するための試薬以外に、上述した植物のスクリーニング方法を実行するために必要とされる試薬などを備えていることが好ましい。すなわち、本明細書を読んだ当業者は、トバモウイルス抵抗性が付与された植物をスクリーニングするためのキットの構成品が、トバモウイルス抵抗性が付与された植物をスクリーニングする方法において用いられるものであることを容易に理解する。
【０１２７】
＜Ｖ．抗体＞
本発明は、ＡＲＬポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。本発明にかかる抗体は、ＡＲＬポリペプチドと特異的に結合し得るものであれば限定されず、ＡＲＬポリペプチドに対するポリクローナル抗体等でもよいが、ＡＲＬポリペプチドに対するモノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、性質が均一で供給しやすい、ハイブリドーマとして半永久的に保存ができるなどの利点を有する。
【０１２８】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体および抗イディオタイプ抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２９】
上述したように、ＡＲＬポリペプチドには、ＡＲＬＡ１ａ〜ｄが包含される。一実施形態において、本発明にかかる抗体は、ＡＲＬＡ１ａ〜ｄと特異的に結合する抗体であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「ＡＲＬＡ１ａ〜ｄと特異的に結合する」は、ＡＲＬＡ１ａ〜ｄと特異的に結合するが、ＡＲＬＡ１ａ〜ｄ以外のＡＲＬポリペプチドとは結合しないことが意図される。よって、本発明にかかる抗体によれば、ＡＲＬＡ１ａ〜ｄの活性が低下した植物体を容易にスクリーニングすることができる。また、本発明にかかる抗体は、ＡＲＬＡ１ａ〜ｄのうち、特定のＡＲＬポリペプチドのみに特異的に結合する抗体出あり得る。そのような抗体によれば、ＡＲＬＡ１ａ〜ｄのうち、特定のＡＲＬポリペプチドのみの活性が低下した植物体をスクリーニングすることができる。すなわち、本発明にかかる抗体を目的の植物体由来の組織抽出物とインキュベートする工程を包含する植物のスクリーニング方法、および、本発明にかかる抗体を備えている植物のスクリーニングキットもまた、トバモウイルス抵抗性植物をスクリーニングするための本発明の範囲に含まれることが容易に理解されるべきである。
【０１３０】
本明細書中で使用される場合、用語「ＡＲＬＡ１ａ〜ｄと特異的に結合する抗体」は、ＡＲＬＡ１ａ〜ｄと特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメント）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)を参照）。従って、これらのフラグメントが好ましい。
【０１３１】
「抗体」は、種々の公知の方法（例えば、HarLow et al., Antibodies:A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)；岩崎ら、「単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」を参照）に従って、製造することができる。
【０１３２】
モノクローナル抗体は、以下のような方法を用いて製造することができる。すなわち、ＡＲＬポリペプチドもしくはそのフラグメントまたはその他の誘導体あるいはこれらのアナログ、あるいはこれらを発現する細胞を免疫原として用いてマウス脾臓リンパ球を免疫し、免疫したマウス脾臓リンパ球とマウスのミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する。次いで、このハイブリドーマによりモノクローナル抗体を産生させる。モノクローナル抗体を取得するために必要な技術は当該分野において公知である。例えば、ハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497 (1975)を参照）、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, Immunology Today 4, 72 (1983)を参照）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., 77-96 (1985)を参照）などが挙げられる。
【０１３３】
ペプチド抗体は、当該分野に公知の方法によって製造することができる。例えば、Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914;及びBittle, F. J. et al., J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985)を参照されたい。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化することができる。しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫することができる。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングさせることができ、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングさせることができる。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリア−カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびＦｒｅｕｎｄのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出可能な有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。
【０１３４】
さらなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、ＡＲＬポリペプチドと特異的に結合する抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、ＡＲＬポリペプチドと特異的に結合する抗体に結合する能力がＡＲＬポリペプチドまたはそのフラグメントからなる抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、ＡＲＬポリペプチドと特異的に結合する抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなるＡＲＬポリペプチドと特異的に結合する抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。
【０１３５】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2ならびに本発明にかかる抗体の他のフラグメントが、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることは、当業者には明白である。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生され得る。あるいは、ＡＲＬポリペプチド結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または化学合成によって産生され得る。
【０１３６】
このように、本実施形態にかかる抗体は、ＡＲＬポリペプチドと特異的に結合するフラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）2フラグメント）を備えていればよく、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。
【０１３７】
つまり、本発明の目的は、ＡＲＬポリペプチドと特異的に結合する抗体およびその利用を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【０１３８】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１３９】
本発明について、実施例、および図１〜図４に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【０１４０】
〔実施例１：Ｎｔａｒｌポリヌクレオチドの単離〕
（１）使用したウイルスおよび植物
本実施例では、ウイルスとして、ＴＭＶ−Ｃｇ株（トバモウイルスアブラナ科系統の一種）（Li et al., 1983, Yamanaka et al., 1998）、およびＴｏＭＶ−Ｌ株（トバモウイルストマト系統の一種）（Ohno et al., 1984）を用いた。また、植物材料として、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）エコタイプ Col-0, No-0を用いた。また、１８０Ｋ−ＦＬＡＧタンパク質のアフィニティー精製には、ステロイドホルモン添加によりＴｏＭＶ  ＲＮＡの複製が誘起可能な形質転換タバコＢＹ−２培養細胞（以下、「ＴｏＭＶ誘導感染ＢＹ−２細胞」ともいう）を用いた。なお、該ＴｏＭＶ誘導感染ＢＹ−２細胞の詳細については、Dohi. K., Nishikiori. M., Tamai. A., Ishikawa. M., Meshi. T. and Mori. M. Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells. Arch. Virol. 151: 1075-1084 (2006)、特開２００５−２４５２２８号公報（平成１７（２００５）年９月１５日公開）、特開２００５−１１０５９４号公報（平成１７（２００５）年４月２８日公開）、特開２００５−１０２６５２号公報（平成１７（２００５）年４月２１日公開）、および国際公開公報ＷＯ  ２００５／０３３３０６  Ａ１を参照されたい。
【０１４１】
（２）ＴｏＭＶ複製タンパク質（１８０Ｋ−ＦＬＡＧタンパク質）のアフィニティー精製
まず、上記ＴｏＭＶ誘導感染ＢＹ−２細胞より、ＴｏＭＶ複製タンパク質とマイナス鎖ＲＮＡを含み、ＴｏＭＶプラス鎖ＲＮＡを生体内と同様のパターンで合成する活性をもつ細胞抽出液（以下、「ｉＢＹＬ」ともいう）を調製した（特開２００５−２３７３０１号公報（平成１７（２００５)年９月８日公開）を参照）。次に、１．４ｍｌのｉＢＹＬより、膜浮遊遠心法を用いて、ｉＢＹＬ膜を調製し、１．２ｍｌの可溶化バッファー（０．７％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＬＰＣ（Lysophosphatidylcholine）、３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２ｍＭ  ＧＴＰ、０．２ｍＭ  ＵＴＰ）に懸濁し、１５℃で２０分間保温して、可溶化した。次に、１５，０００×ｇ、４℃、１０分間の遠心により不溶性成分を除去した。６００μｌのｉＢＹＬＳ１５画分には、終濃度０．２％のＬＰＣを添加して同様の可溶化処理を行った。ＬＰＣ処理した膜画分および可溶性画分に、予め可溶化バッファーにより３回洗浄した５０μｌ（packedvolume）のanti-FLAGM2 affinity gel（Sigma）を混ぜ、４℃で１時間撹拌した。レジンは０．２％ＬＰＣを含む可溶化バッファーにより５回洗浄し、０．２％ＬＰＣと１００μｇ／ｍｌのＦＬＡＧペプチド（Sigma）とを含む可溶化バッファー２５０μｌを添加して、４℃で３０分間撹拌することによりＴｏＭＶ複製タンパク質（１８０Ｋ複製タンパク質）を溶出した。なお、１８０Ｋ複製タンパク質には、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付加しておいた。また、ＦＬＡＧの付加により複製能力が損なわれないことも確認しておいた。
【０１４２】
次に、溶出画分のＴｏＭＶ  ＲＮＡ合成活性を測定するために、溶出画分に、外来鋳型としてＴｏＭＶビリオンＲＮＡ（１μｇ／５０−μｌ反応液）を加えてＲｄＲｐ反応を行った。その結果、図１に示すように、上記溶出画分において、ＴｏＭＶ  ＲＮＡ合成活性が検出された。
【０１４３】
さらに、上記溶出画分に含まれるタンパク質はアセトン沈殿により濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画後、銀染色（Wako）およびウエスタン法により解析した。その結果、上記溶出画分には、翻訳伸長因子ｅＥＦ１Ａ、熱ショックタンパク質ＨＳＰ７０、ならびにＴｏＭＶ増殖に関与することが遺伝学的に示された宿主膜貫通タンパク質ＴＯＭ１、ＴＯＭ２Ａが共精製された（Nishikiori, M. Dohi, K., Mori, M., Meshi, T., Naito, S. and Ishikawa, M. Membrane-Bound Tomato Mosaic Virus Replication Proteins Participate in RNA Synthesis and Are Associated with Host Proteins in a Pattern Distinct from Those That Are Not Membrane Bound. J. Virol. 80: 8459-8468 (2006)を参照）。これにより、上記溶出画分には、ＴｏＭＶ増殖に関与するタンパク質が含まれることが確認できた。
【０１４４】
さらに、ＳｔｒｅｐＩＩタグを用いて１８０Ｋ複製タンパク質を精製した溶出画分においても、外来鋳型依存的なＴｏＭＶ  ＲｄＲｐ活性、ならびにＦＬＡＧタグを用いた精製と同様の宿主タンパク質が共精製されることを確認した。ＳｔｒｅｐＩＩ精製は、低分子量の夾雑タンパク質の混入が少ない利点を有するため、上記実験により、上記方法によって１８０Ｋ複製タンパク質を共精製されるタンパク質は、ＴｏＭＶ増殖に関与するタンパク質である可能性が極めて高いといえる。なお、ＳｔｒｅｐＩＩタグを用いた精製では、複製タンパク質やＲｄＲｐ活性の回収率が、ＦＬＡＧタグを用いた精製と比べ低いため、以下の実験では、ＦＬＡＧタグを用いた精製により得られた１８０Ｋ複製タンパク質の溶出画分を用いた。
【０１４５】
（３）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析によるタンパク質の同定
Invitrogen 社のNuPAGE 12% Gelを用いて、上記ＦＬＡＧタグを用いて１８０Ｋ複製タンパク質を精製した溶出画分に含まれるタンパク質を分離した。ＭＳ用銀染色キットＩＩ（Wako）によりゲル中のタンパク質を染色した。その結果、上記溶出画分には、膜結合ＴｏＭＶ  １８０Ｋ複製タンパク質に加えて、該タンパク質の分解産物が多く含まれていたが、それ以外の宿主タンパク質由来と考えられるタンパク質バンドも検出された。そこで、これらのバンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルより切り出し、トリプシン処理し、得られたペプチド混合物を質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）により解析した。なお、質量分析によるタンパク質同定には、Mascot programを用い、データベースには、既知のタンパク質配列データ,および当研究室にて同定したＮｔＴＯＭ１およびホモログ、ＮｔＴＯＭ２Ａのアミノ酸配列を含むデータベースを用いた。
【０１４６】
その結果、図１に示すように、膜結合の１８０Ｋ複製タンパク質の精製画分には、ＮｔＴＯＭ１およびＮｔＴＯＭ１ホモログ、並びにＮｔＴＯＭ２Ａに由来するペプチドに加えて、約２０ｋＤａの未同定の宿主由来のタンパク質に由来するペプチドが検出された。この未同定の宿主由来のタンパク質は、既知のSolanum tuberosum ESTより予測されたアミノ酸配列との相同性から、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質スーパーファミリーに属するＡＤＰリボシル化因子様タンパク質（ADP ribosylation factor-like protein、ＡＲＬポリペプチドともいう）の１種であることが分かった。また、該ＡＲＬポリペプチドに類似のポリペプチドをコードする遺伝子はシロイヌナズナ、イネ、ショウジョウバエ、ヒトを含む高等真核生物に幅広く見出された。また、これらの遺伝子は高度に保存されていた（図２を参照）。さらに、上記ＡＲＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと高い相同性を示す遺伝子は、シロイヌナズナでは４種類存在した。ここでは、これら４種類のホモログ遺伝子を、Ａｔａｒｌａ１ａ〜ｄと称する。
【０１４７】
また、上記ＡＲＬポリペプチドと高い相同性を有するＡＲＬポリペプチドのうち、ヒトＨｓＡＲＬ８およびショウジョウバエのＡＲＬポリペプチドはリソソームに局在することが示されている（Hoffmann, I and Munro, S. (2006) An N-terminally acetylated Arf-like GTPase is localized to lysosomes and affects their motilityを参照）。しかし、植物由来のＡＲＬポリペプチドの詳細な機能は不明である。
【０１４８】
（４）Ｎｔａｒｌポリヌクレオチドの単離及び塩基配列の決定
上記ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析により検出されたＡＲＬポリペプチドに由来するペプチドのアミノ酸配列を用いて、タバコN. tabacum（Nt）cDNA（SMART cDNA synthesis kit, clontech）より、ＮｔａｒｌのｃＤＮＡ断片をディジェネレートＰＣＲ法により増幅した。なお、使用したプライマーを表１に示す。
【０１４９】
【表１】
2008178343.tif 000002
【０１５０】
増幅したＤＮＡ断片はZeroBlunt TOPO PCR cloning kit（Invitrogen）を用いてクローニングした。ＮｔａｒｌのｃＤＮＡ部分配列を解読し、さらにプライマーを設計して、５’ＲＡＣＥ、３’ＲＡＣＥを行った。５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲのプライマーを作製し、N.tabacum cv.Samsun株より得た全ＲＮＡより、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＮｔａｒｌのｃＤＮＡを増幅した。なお、使用したプライマーを表２に示す。
【０１５１】
【表２】
2008178343.tif 000003
【０１５２】
これら配列情報とEST database（ESTobacco, Advanced Technologies Ltd（Cambridge））を総合し、タバコは少なくとも４種類のａｒｌホモログ遺伝子をもつと考えられた。そこで、ＮｔａｒｌのｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。なお、使用したプライマーを表３に示す。
【０１５３】
【表３】
2008178343.tif 000004
【０１５４】
こうして、Ｎｔａｒｌの４つホモログ遺伝子の塩基配列を決定した。ここでは、これら４つのホモログ遺伝子をＡｔａｒｌａ１ａ〜ｄに対応するように、Ｎｔａｒｌａ１ａ〜ｄと称する。決定したＮｔａｒｌａ１ａ〜ｄの塩基配列から推定されるＮｔＡＲＬＡ１ａ〜ｄの推定アミノ酸配列およびＡｔａｒｌａ１ａ〜ｄの塩基配列から推定されるＡｔＡＲＬＡ１ａ〜ｄの推定アミノ酸配列を図２に示す。当該ＮｔＡＲＬＡ１ａ〜ｄおよびＡｔＡＲＬＡ１ａ〜ｄのアミノ酸配列は、ヒト（Homo sapiens, Hs）ＡＲＬ８ａ，８ｂアミノ酸配列との相同性を有していた（図２を参照）。また、シロイヌナズナゲノムにはADP ribosylation factor（ＡＲＦ）およびＡＲＬファミリーに含まれる遺伝子が２１個コードされているが（Vernoud et al., 2003を参照）、他のＡＲＦおよびＡＲＬとの相同性は低かった（Identities 34%以下、TAIR BLASTP, Karlin and Altschul, 1990, 1993を参照）。
【０１５５】
〔実施例２：シロイヌナズナａｒｌａ１変異株におけるトバモウイルス増殖の検討〕
前述のように、シロイヌナズナゲノム配列よりシロイヌナズナは４つのａｒｌａ１遺伝子をコードすると考えられた。ＥＳＴ情報、及び予備的ながらＲＴ−ＰＣＲの結果から、Ａｔａｒｌａ１ａ〜ｄの転写発現量は、１ｄ≧１ｃ＞１ａ＞１ｂ順であることが分かった。次に、Ａｔａｒｌ１ａ、ｃ、ｄについてＴ−ＤＮＡあるいはトランスポゾン挿入変異株を入手し、トバモウイルス増殖への影響を調べたところ、ａｒｌａ１ａ、ａｒｌａ１ｃ、ａｒｌａ１ｄの各単独変異株における、トバモウイルスの増殖効率は野生型株と同程度であった。Ａｔａｒｌａ１ａ〜ｄ遺伝子間の相同性が高いため（Identities 70%以上,TAIR BLASTP, Karlin and Altschul, 1990, 1993）、機能が重複している可能性が考えられた。そこで、交配を経てａｒｌａ１二重変異株を作製した。
【０１５６】
（１）ａｒｌａ１二重変異株の作製
Ａｔａｒｌａ１ａおよびｃ（遺伝子座Ａｔ５ｇ３７６８０，Ａｔ３ｇ４９８７０）へのＴ−ＤＮＡ挿入変異株（エコタイプCol-0）はSalk Institute Genomic Analysis Laboratory website（http://signal.salk.edu）、およびGABI-kat website（Lietal.,inpress,http://www.gabi-kat.de）で検索しNottingham Arabidopsis Stock Centreより入手した。Ａｔａｒｌａ１ｄ（遺伝子座Ａｔ５ｇ６７５６０）へのトランスポゾン挿入変異株（エコタイプNo-0、Kuromori et al.,2004）は理化学研究所より入手した。Ｔ−ＤＮＡまたはトランスポゾン挿入部位を確認するため、ゲノム配列情報を元に挿入部位を中心として、前後約５００ｂｐ（計約１０００ｂｐ）離れた部位に相同なプライマーを作製した。これらのプライマーと、Ｔ−ＤＮＡまたはトランスポゾン領域内のプライマーの計３種類のプライマーを用い、シロイヌナズナゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。使用したプライマーを表４に記す。
【０１５７】
【表４】
2008178343.tif 000005
【０１５８】
なお、シロイヌナズナゲノムＤＮＡは、以下の方法に従い取得した。播種後約３週間のロゼット葉１〜２枚に、ＤＮＡ抽出バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳ）を加え、Tissue Lyser（Qiagen）を用いて葉を破砕した。１５，０００×ｇ、室温、５分間の遠心処理により得られた上清から、イソプロパノール沈殿により全ＤＮＡを回収した。
【０１５９】
（２）ａｒｌａ１二重変異株におけるトバモウイルスＣＰの検出
播種後約３週間のロゼット葉表面にカーボランダム（６００メッシュ,Nacalai）を蒔き、接種源を共に擦りあわせた（葉１枚につき１００ｎｇウイルスＲＮＡ）。接種源としては、ＴｏＭＶビリオンＲＮＡ、ＴＭＶ−ＣｇビリオンＲＮＡを用いた。接種法および接種葉の解析はFujisaki et al.（2006）の方法に従った。
【０１６０】
葉の湿重量の２倍量の抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）アスコルビン酸、complete protease inhibitor（１錠／１０ｍｌ））を加え、乳鉢を用いて感染葉をホモゲナイズした。さらに、葉の湿重量の８倍量のゲルサンプル緩衝液（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳ、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）β−メルカプトエタノール、１２．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール、０．０２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＰＢ）を加えて１００℃、３分間加熱処理することによりタンパク質を変性させた。１５，０００×ｇ、４℃、３分間の条件で遠心分離した上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルとした。ウイルスＣＰの蓄積はウエスタン法（ＢＣＩＰ−ＮＢＴによる発色法）により解析した。
【０１６１】
その結果、図３に示すように、ａｒｌａ１ｃとａｒｌａ１ｄとの二重変異株においては、ＴｏＭＶ及びＴＭＶ−Ｃｇの増殖が接種葉レベルで抑制された。また、ａｒｌａ１ａとａｒｌａ１ｃとの二重変異株においてはＴｏＭＶの増殖も接種葉レベルで抑制された。なお、ａｒｌａ１ｃとａｒｌａ１ｄとの二重変異株およびａｒｌａ１ａとａｒｌａ１ｃとの二重変異株は、野生型株と比較して生育に差はみられなかった。以上から、シロイヌナズナ野生型ａｒｌａ１遺伝子はトバモウイルスの増殖に必要な宿主遺伝子であると考えられた。
【０１６２】
〔実施例３：試験管内ＴｏＭＶ  ＲＮＡ翻訳・複製を用いた野生型または変異型ＮｔＡＲＬＡ１ｄの解析〕
ウイルス非感染タバコＢＹ−２細胞より、脱液胞化処理を経て調製した抽出液（ＢＹＬ）を用いて、ＴｏＭＶ  ＲＮＡの翻訳、ならびに複製を再現することが可能である（Komoda et al., 2004）。また、この系では、ＴｏＭＶ  ＲＮＡの翻訳過程と複製過程を個別に解析することが可能である。ＮｔＡＲＬＡ１がＴｏＭＶ  ＲＮＡの翻訳過程または複製過程のいずれかに機能するかを調べるため、野生型ならびに変異型ＮｔＡＲＬＡ１ｄタンパク質を試験管内翻訳にて合成し、反応系に添加することにより、ＴｏＭＶ  ＲＮＡの翻訳または複製に影響があるか調べた。
【０１６３】
（１）ＮｔＡＲＬＡ１ｄタンパク質の大腸菌における発現・精製ならびに抗体の作製
６×ＨｉｓタグおよびＴｈｒｏｍｂｉｎ認識配列（ＬＶＰＲＧＳ）をＮ末端にもつＮｔＡＲＬＡ１ｄ（１７−１８５ａａ）をｐＤＥＳＴ−Ｈｉｓベクター（Tsunoda et al.,2005）を用いて、大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）、Novagen）において発現させた。なお、発現ベクターの構築に用いたプライマーを表５に示す。
【０１６４】
【表５】
2008178343.tif 000006
【０１６５】
可溶性のＨｉｓ−ＮｔＡＲＬＡ１ａをＮｉ2+レジン（Sigma）を用いて精製した。精製画分には多くの夾雑タンパク質が含まれていたため、１１％（ｗｔ／ｖｏｌ）アクリルアミド、０．５５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ビスアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、Ｈｉｓ−ＮｔＡＲＬＡ１ｄと夾雑タンパク質とを分離した。ゲル断片より０．１％ＳＤＳを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０）を用いてＨｉｓ−ＮｔＡＲＬＡ１ｄを溶出し、約３ｍｇ回収した。これを抗原として抗ＮｔＡＲＬＡ１ｄウサギ抗体を作製した。
【０１６６】
（２）試験管内ＴｏＭＶ  ＲＮＡ翻訳・複製
ＴｏＭＶ非感染ＢＹ−２脱液胞化プロトプラスト抽出液（ＢＹＬ）はIshibashi, K., Komoda, K., and Ishikawa, M. (2006). In vitro translation and replication of tobamovirus RNA in a cell-free extract of evacuolated tobacco BY-2 protoplasts. In Nagata, T., Matsuoka, K., and Inze, D. (eds.), Tobacco BY-2 cells. Biotechnology and agriculture and forestry, Tobacco BY-2 cells. 53, 183-194.に従って調製した。野生型ならびに変異型ＮｔＡＲＬＡ１ｄ  ｍＲＮＡは以下のように調製した。試験管内転写反応の鋳型を作製するため、Ｔ７プロモーター配列を有する合成プライマーを用いて（表1）、ＮｔＡＲＬＡ１ｄ  ＯＲＦを含む領域をＰＣＲにより増幅した。ＧＤＰ結合固定型（Ｔ３３Ｎ）ならびにＧＴＰ結合固定型（Ｑ７４Ｌ）ＮｔＡＲＬＡ１ｄをコードするＤＮＡ断片は、塩基配列を部分的に改変した合成プライマー（表６を参照）を用いて、オーバーラップＰＣＲ法により増幅した。
【０１６７】
【表６】
2008178343.tif 000007
【０１６８】
このＤＮＡ断片の５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Takara）によりリン酸化し、pSP64polyA vector（Promega）のＳｍａＩ認識配列に挿入した。ＥｃｏＲＩ認識配列を用いて線状化したベクターＤＮＡを鋳型として、５’キャップ構造と３’ポリＡ(30)配列をもつＮｔＡＲＬＡ１ｄ  ｍＲＮＡをAmpliCap T7 High Yield kit（Epicentre）を用いて試験管内合成した。２５μｌのＢＹＬ翻訳反応液（０．７５ｍＭ  ＡＴＰ、０．１ｍＭ  ＧＴＰ、２５ｍＭクレアチンリン酸、２５μＭメチオニン、２５μＭロイシン、５０μＭの１８種類のアミノ酸、８０μＭスペルミン、５μｇクレアチンキナーゼ、40units RNasin）に野生型または変異型ＮｔＡＲＬＡ１ｄ  ｍＲＮＡ（５００ｆｍｏｌ）を添加し、試験管内翻訳反応を２５℃で３０分間行った。続いて、ＴｏＭＶ  ＲＮＡ（５０ｆｍｏｌ）を添加し、試験管内翻訳反応を２５℃で６０分間行った。翻訳後,タンパク質解析サンプルとして５μｌ反応液を回収し、残り２０μｌに５×ＲｄＲｐ反応液を５μｌ加え、２５℃で６０分間ＲＮＡ複製反応を行った。複製反応後のＲＮＡは上記方法に従って精製し、電気泳動し、オートラジオグラムで検出した。
【０１６９】
その結果、野生型ＮｔＡＲＬＡ１ｄを添加した場合には、ＴｏＭＶ複製タンパク質の蓄積量はＮｔＡＲＬＡ１ｄを添加しない場合と比較して変わらなかったが、複製の結果生じた32Ｐ−ＴｏＭＶ  ＲＮＡの量は２−３倍に高まった（図４を参照）。ＮｔＡＲＬＡ１ｄの７４番目のアミノ酸残基のグルタミンをロイシンに置換し、ＧＴＰ結合固定型（膜結合型）にしたＮｔＡＲＬＡ１ｄＱ７４Ｌを添加した場合にもＲＮＡ複製の亢進が観察された（図４のレーンＡＲＬＡ１ｄＱ７４Ｌ）。一方、３３番目のアミノ酸残基のスレオニンをアスパラギンに置換し、ＧＤＰ結合固定型（細胞質局在型）にしたＮｔＡＲＬＡ１ｄＴ３３Ｎを添加した場合にはＴｏＭＶ  ＲＮＡの翻訳および複製に影響はみられなかった（図４のレーンＡＲＬＡ１ｄＴ３３Ｎ）。従って、野生型ＮｔＡＲＬＡ１ｄタンパク質はＴｏＭＶ  ＲＮＡの複製をサポートする宿主タンパク質であること、膜に結合したＮｔＡＲＬＡ１ｄがトバモウイルスＲＮＡ複製をサポートすることが示唆された。
【０１７０】
以上の実施例の結果から、ＡＲＬポリペプチドは植物体内でのトバモウイルスＲＮＡ複製に必須であることが明らかになった。
【０１７１】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１７２】
以上のように、本発明は、トバモウイルス抵抗性が付与された植物体を作製することができるので、種々の作物においてトバモウイルスを防除し得る。したがって、本発明は、育種分野に用いることができるだけではなく、トバモウイルスが感染する植物を用いる農業や園芸等の産業分野に適用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】図１は、ＴｏＭＶ誘導感染ＢＹ−２細胞から、ＴｏＭＶ複製タンパク質と共精製された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）およびＴｏＭＶ  ＲＮＡ合成活性の結果を示す図である。
【図２】図２は、各生物由来のＡＲＬポリペプチドのアミノ酸は配列の比較を示す図である。
【図３】図３は、シロイヌナズナａｒｌａ１遺伝子の二重変異株におけるトバモウイルスの増殖抑制効果を調べた結果を示す図である。
【図４】図４は、試験管内ＴｏＭＶ  ＲＮＡ翻訳・複製系を用いて、野生型および変異型タバコＡＲＬＡ１ｄタンパク質によるＴｏＭＶの増殖抑制効果を調べた結果を示す図である。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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