(57)【要約】【課題】長時間にわたる経時的な観察を行う場合においても、レーザ光の光軸の位置ズレを精度よく補正して、安定した観察を行う。【解決手段】光源７と、強度変調器８と、強度変調されたレーザ光Ｌを走査するスキャナ１４と、レーザ光Ｌを標本Ａに集光し、標本Ａにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ１５と、集光された蛍光を検出する光検出器１７と、強度変調器８と対物レンズ１５との間において、光源７からのレーザ光Ｌの位置ズレを検出するレーザ位置検出部１１およびその検出結果に基づいて位置ズレを補正するレーザ位置補正部１０と、これらを制御する制御部４とを備え、制御部４が、光検出器１７およびスキャナ１４を作動させる蛍光検出開始時刻から強度変調器８を安定させるのに要する時間と、レーザ光Ｌの位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前に強度変調器８を作動させるよう制御する顕微鏡装置１を提供する。【選択図】      図１
2008233227.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を射出する光源と、
該光源からのレーザ光の強度変調を行う強度変調器と、
該強度変調器により強度変調されたレーザ光を走査するスキャナと、
該スキャナにより走査されたレーザ光を標本に集光する一方、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器と、
前記強度変調器と前記対物レンズとの間に配置され、前記光源からのレーザ光の位置ズレを検出するレーザ位置検出部と、
該レーザ位置検出機構による検出結果に基づいてレーザ光の位置ズレを補正するレーザ位置補正部と、
これらを制御する制御部とを備え、
該制御部が、前記光検出器およびスキャナを作動させる蛍光検出開始時刻から前記強度変調器を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前に強度変調器を作動させるよう制御する顕微鏡装置。
【請求項２】
前記制御部は、複数設定された蛍光検出開始時刻が、前記強度変調器を安定させるのに要する時間とレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和より近接している場合に、これらの蛍光検出開始時刻間において強度変調器を作動停止しないよう制御する請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記光源が、複数波長のレーザ光を出射可能であり、
前記制御部は、レーザ光の波長が切り替えられる場合に、前記スキャナおよび光検出器を作動させる蛍光検出開始時刻から前記光源を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前にレーザ光の波長の切り替えを開始するよう制御する請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記光源が、複数波長のレーザ光を出射可能であり、
前記制御部は、波長を切り替えて同時期に行う一群の観察前に、先頭波長におけるレーザ光の光軸に対する位置ズレ量を他の波長について波長毎に記憶しておき、
先頭波長による観察時には、前記光検出器および前記スキャナを作動させる蛍光検出開始時刻から前記光源を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前にレーザ光の波長の切り替えを開始させ、
残りの波長による観察時には、前記光検出器および前記スキャナを作動させる蛍光検出開始時刻から前記強度変調器を安定させるのに要する時間より前に強度変調器を作動させ、前記光源を安定させるのに要する時間より前にレーザ光の波長の切り替えを開始させ、これらの時間の間に記憶されている位置ズレ量だけ位置ズレ補正を行うよう制御する請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記対物レンズの前段において光路を遮断し、前記光検出器による蛍光検出開始時刻から蛍光検出終了時刻までの間で光路を開放するシャッタを備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
光源から射出されるレーザ光の強度を強度変調器により変調し、レーザ光の光軸の位置ズレを検出して補正し、補正されたレーザ光を標本上において走査し、標本において発生した蛍光を検出する顕微鏡装置の制御方法であって、
予め設定された蛍光検出開始時刻から前記強度変調器を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前に強度変調器を作動させるよう制御する顕微鏡装置の制御方法。
【請求項７】
複数設定された蛍光検出開始時刻が、前記強度変調器を安定させるのに要する時間とレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和より近接している場合に、これらの蛍光検出開始時刻間において強度変調器を作動停止しないよう制御する請求項６に記載の顕微鏡装置の制御方法。
【請求項８】
前記光源が、複数波長のレーザ光を出射可能であり、
レーザ光の波長が切り替えられる場合に、前記スキャナおよび光検出器を作動させる蛍光検出開始時刻から前記光源を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前にレーザ光の波長の切り替えを開始するよう制御する請求項６に記載の顕微鏡装置の制御方法。
【請求項９】
前記光源が、複数波長のレーザ光を出射可能であり、
波長を切り替えて同時期に行う一群の観察前に、先頭波長におけるレーザ光の光軸に対する位置ズレ量を他の波長について波長毎に記憶しておき、
先頭波長による観察時には、前記光検出器および前記スキャナを作動させる蛍光検出開始時刻から前記光源を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前にレーザ光の波長の切り替えを開始させ、
残りの波長による観察時には、前記光検出器および前記スキャナを作動させる蛍光検出開始時刻から前記強度変調器を安定させるのに要する時間より前に強度変調器を作動させ、前記光源を安定させるのに要する時間より前にレーザ光の波長の切り替えを開始させ、これらの時間の間に記憶されている位置ズレ量だけ位置ズレ補正を行うよう制御する請求項６に記載の顕微鏡装置の制御方法。
【請求項１０】
蛍光検出開始時刻から蛍光検出終了時刻までの間で光路を開放し、それ以外において光路を遮断する請求項６から請求項９のいずれかに記載の顕微鏡装置の制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置とその制御方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、光源からのレーザ光を顕微鏡に導入する照明光学系内に音響光学素子または電気光学素子等からなる強度変調器を備えるとともに、光源と強度変調器との間に、レーザ光のビーム系を調節するビームエキスパンダや、レーザの光軸位置を補正するビームシフタが配置された顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
この特許文献１に開示されている顕微鏡装置は、強度変調器の狭い開口部に入射するレーザ光がけられてパワーロスを生じたり、レーザ光の波長切替時に、光軸の位置ズレや角度変化が生じたりしないように、ビームエキスパンダやビームシフタにより補正するようになっている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−３４５６１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記ビームエキスパンダやビームシフタによる光軸の位置ズレや角度変化の補正が一旦行われたとしても、長時間にわたる経時的な観察を行う場合に、時間経過に伴ってレーザ光源や強度変調器の温度上昇等が発生し、光学素子の光学特性が変化してレーザ光の光軸が変動する不都合がある。特に、前に行われた観察から長時間にわたる休止時間を経て観察を行う場合には、安定した観察を行うことができないという問題がある。
【０００６】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、長時間にわたる経時的な観察を行う場合においても、レーザ光の光軸の位置ズレを精度よく補正して、安定した観察を行うことができる顕微鏡装置とその制御方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、レーザ光を射出する光源と、該光源からのレーザ光の強度変調を行う強度変調器と、該強度変調器により強度変調されたレーザ光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査されたレーザ光を標本に集光する一方、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器と、前記強度変調器と前記対物レンズとの間に配置され、前記光源からのレーザ光の位置ズレを検出するレーザ位置検出部と、該レーザ位置検出機構による検出結果に基づいてレーザ光の位置ズレを補正するレーザ位置補正部と、これらを制御する制御部とを備え、該制御部が、前記光検出器およびスキャナを作動させた蛍光検出開始時刻から前記強度変調器を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前に強度変調器を作動させるよう制御する顕微鏡装置を提供する。
【０００８】
本発明によれば、蛍光検出が開始されると、光源から発せられたレーザ光が強度変調器により強度変調され、スキャナにより走査されて対物レンズにより標本に集光される。標本においてはレーザ光が照射された位置において蛍光物質が励起されて蛍光が発生し、発生した蛍光は対物レンズにより集光された後、光検出器により検出される。スキャナによる走査位置および光検出器により検出された蛍光強度に基づいて、蛍光画像を構築することができる。
【０００９】
強度変調器から出射されたレーザ光はレーザ位置検出部によりその光軸の位置ズレを検出され、その検出結果に基づいてレーザ位置補正部が光軸ズレを補正する。したがって、何らかの原因によってレーザ光の位置ズレが発生しても、これを補正して、精度よく標本に照射することができる。
【００１０】
この場合において、複数回にわたる顕微鏡観察が長時間をかけて行われる場合には、一旦補正されることにより位置ズレが解消していても、経時的な光学的特性の変動によって、さらに位置ズレが発生してしまうことが考えられる。本発明によれば、制御部が蛍光検出開始に先立って強度変調器を作動させ、該強度変調器が安定してからレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正を行うので、蛍光検出開始時にはレーザ光の位置ズレが解消している。この場合に、本発明によれば、レーザ光の位置ズレ検出を強度変調器が安定させたうえで行うことができレーザ光の位置ズレを精度よく補正することができる。
【００１１】
上記発明においては、前記制御部は、複数設定された蛍光検出開始時刻が、前記強度変調器を安定させるのに要する時間とレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和より近接している場合に、これらの蛍光検出開始時刻間において強度変調器を作動停止しないよう制御することとしてもよい。
このようにすることで、２回目以降の蛍光検出に先立って、強度変調器の安定を待つことなくレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正を行うことができ、長時間にわたって行われる顕微鏡観察においてもレーザ光の光軸ずれを精度よく補正して、標本に精度よく照射することができる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記光源が、複数波長のレーザ光を出射可能であり、前記制御部は、レーザ光の波長が切り替えられる場合に、前記スキャナおよび光検出器を作動させた蛍光検出開始時刻から前記光源を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前にレーザ光の波長の切り替えを開始するよう制御することとしてもよい。
【００１３】
このようにすることで、レーザ光の波長を切り替えて光源が安定し、かつ、強度変調器を作動させて強度変調器が安定してからレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正を精度よく行うことができ、予め定められた蛍光検出開始時刻からレーザ光を標本に精度よく照射して観察を開始することができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記光源が、複数波長のレーザ光を出射可能であり、前記制御部は、波長を切り替えて同時期に行う一群の観察前に、先頭波長におけるレーザ光の光軸に対する位置ズレ量を他の波長について波長毎に記憶しておき、先頭波長による観察時には、前記光検出器および前記スキャナを作動させる蛍光検出開始時刻から前記光源を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前にレーザ光の波長の切り替えを開始させ、残りの波長による観察時には、前記光検出器および前記スキャナを作動させる蛍光検出開始時刻から前記強度変調器を安定させるのに要する時間より前に強度変調器を作動させ、前記光源を安定させるのに要する時間より前にレーザ光の波長の切り替えを開始させ、これらの時間の間に記憶されている位置ズレ量だけ位置ズレ補正を行うよう制御することとしてもよい。
【００１５】
このようにすることで、先頭波長による観察時のみに、光源を安定させ、かつ、強度変調器を安定させてから、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正を行い、残りの波長による観察時には、レーザ光の位置ズレ検出を省略して、予め記憶されていた波長変化に基づく位置ズレ量だけ位置ズレ補正を行う。同時期に行う一群の観察において、先頭波長による観察時のみに位置ズレを検出して補正することで、経時的な光学的特性の変化による光軸ずれを検出して補正することができ、長時間にわたる観察においてもレーザ光を精度よく標本に照射することができる。また、先頭波長以外の波長による観察時には、位置ズレの検出を省略することで、異なる波長に対する観察を短時間の内に行うことができ、一群の観察に要する時間を短縮することが可能となる。
【００１６】
また、上記発明においては、前記対物レンズの前段において光路を遮断し、前記光検出器による蛍光検出開始時刻から蛍光検出終了時刻までの間で光路を開放するシャッタを備えることとしてもよい。
このようにすることで、蛍光検出開始時刻前のレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正時には、シャッタの作動により光路が遮断されることによって、レーザ光が標本に照射されることが防止される。これにより、レーザ光による標本の褪色等の発生を未然に防止し、標本の健全性を向上することができる。また、蛍光検出開始時刻から蛍光検出終了時刻までの間で光路を開放することにより、精度よく位置ズレが補正されたレーザ光を標本に照射することができる。
【００１７】
また、本発明は、光源から射出されるレーザ光の強度を強度変調器により変調し、レーザ光の光軸の位置ズレを検出して補正し、補正されたレーザ光を標本上において走査し、標本において発生した蛍光を検出する顕微鏡装置の制御方法であって、予め設定された蛍光検出開始時刻から前記強度変調器を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前に強度変調器を作動させるよう制御する顕微鏡装置の制御方法を提供する。
【００１８】
本発明によれば、蛍光検出開始に先立って強度変調器を作動させ、該強度変調器が安定してからレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正を行うので、蛍光検出開始時にはレーザ光の位置ズレが解消している。この場合に、本発明によれば、レーザ光の位置ズレ検出を強度変調器が安定させたうえで行うことができレーザ光の位置ズレを精度よく補正することができる。
【００１９】
上記発明においては、複数設定された蛍光検出開始時刻が、前記強度変調器を安定させるのに要する時間とレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和より近接している場合に、これらの蛍光検出開始時刻間において強度変調器を作動停止しないよう制御することとしてもよい。
【００２０】
このようにすることで、２回目以降の蛍光検出に先立って、強度変調器の安定を待つことなくレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正を行うことができ、長時間にわたって行われる顕微鏡観察においてもレーザ光の光軸ずれを精度よく補正して、標本に精度よく照射することができる。
【００２１】
また、上記発明においては、前記光源が、複数波長のレーザ光を出射可能であり、レーザ光の波長が切り替えられる場合に、前記スキャナおよび光検出器を作動させる蛍光検出開始時刻から前記光源を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前にレーザ光の波長の切り替えを開始するよう制御することとしてもよい。
【００２２】
このようにすることで、レーザ光の波長を切り替えて光源が安定し、かつ、強度変調器を作動させて強度変調器が安定してからレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正を精度よく行うことができ、予め定められた蛍光検出開始時刻からレーザ光を標本に精度よく照射して観察を開始することができる。
【００２３】
また、上記発明においては、前記光源が、複数波長のレーザ光を出射可能であり、波長を切り替えて同時期に行う一群の観察前に、先頭波長におけるレーザ光の光軸に対する位置ズレ量を他の波長について波長毎に記憶しておき、先頭波長による観察時には、前記光検出器および前記スキャナを作動させる蛍光検出開始時刻から前記光源を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前にレーザ光の波長の切り替えを開始させ、残りの波長による観察時には、前記光検出器および前記スキャナを作動させる蛍光検出開始時刻から前記強度変調器を安定させるのに要する時間より前に強度変調器を作動させ、前記光源を安定させるのに要する時間より前にレーザ光の波長の切り替えを開始させ、これらの時間の間に記憶されている位置ズレ量だけ位置ズレ補正を行うよう制御することとしてもよい。
【００２４】
このようにすることで、先頭波長による観察時のみに、光源を安定させ、かつ、強度変調器を安定させてから、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正を行い、残りの波長による観察時には、レーザ光の位置ズレ検出を省略して、予め記憶されていた波長変化に基づく位置ズレ量だけ位置ズレ補正を行う。同時期に行う一群の観察において、先頭波長による観察時のみに位置ズレを検出して補正することで、経時的な光学的特性の変化による光軸ずれを検出して補正することができ、長時間にわたる観察においてもレーザ光を精度よく標本に照射することができる。また、先頭波長以外の波長による観察時には、位置ズレの検出を省略することで、異なる波長に対する観察を短時間の内に行うことができ、一群の観察に要する時間を短縮することが可能となる。
【００２５】
また、上記発明においては、蛍光検出開始時刻から蛍光検出終了時刻までの間で光路を開放し、それ以外において光路を遮断することとしてもよい。
このようにすることで、蛍光検出開始時刻前のレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正時には、光路が遮断されることによって、レーザ光が標本に照射されることが防止される。これにより、レーザ光による標本の褪色等の発生を未然に防止し、標本の健全性を向上することができる。また、蛍光検出開始時刻から蛍光検出終了時刻までの間で光路を開放することにより、精度よく位置ズレが補正されたレーザ光を標本に照射することができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、長時間にわたる経時的な観察を行う場合においても、レーザ光の光軸の位置ズレを精度よく補正して、安定した観察を行うことができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡装置１について、図１〜図４を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１は、図１に示されるように、多光子励起用の短パルスレーザ光Ｌを出射する光源ユニット２と、該光源ユニット２から出射された短パルスレーザ光Ｌを標本Ａに照射して蛍光を検出する顕微鏡本体３と、これらを制御する制御部４と、顕微鏡本体３により取得された画像を表示する表示部５と、観察条件を入力する入力部６とを備えている。
【００２８】
前記光源ユニット２は、短パルスレーザ光Ｌを出射するレーザ光源７と、該光源から出射された短パルスレーザ光Ｌの強度変調を行うＡＯＴＦのような音響光学素子（強度変調器）８と、短波長光成分を優先的に透過するネガティブチャープを付与する分散補償器９と、短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置ズレおよび傾きを調節するビームシフタ１０と、短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置ズレおよび傾きを検出する位置ズレ検出器１１と、光源ユニット２からの短パルスレーザ光Ｌの出射をオンオフするシャッタ１２とを備えている。
【００２９】
ビームシフタ１０は、図２に示されるように、２枚の平面ミラー１０ａ，１０ｂとこれらを駆動するモータ（図示略）とを備え、ミラー１０ａ，１０ｂをＸ，Ｙ軸に沿って同時に駆動させることにより、短パルスレーザ光Ｌの光軸を平行移動させることができ、ミラー１０ａ，１０ｂを軸θｘ，θｙ回りに揺動させることにより、短パルスレーザ光Ｌの光軸の傾きを調節することができるようになっている。
【００３０】
位置ズレ検出器１１は、例えば、ビームシフタ１０の後段の光路から短パルスレーザ光Ｌの一部を分岐するビームスプリッタ１１ａと、該ビームスプリッタ１１ａにより光路から分岐された短パルスレーザ光Ｌを異なる光路長を介して検出する２つのセンサ１１ｂ，１１ｃとを備えている。符号１１ｄはビームスプリッタ、符号１１ｅはミラーである。
【００３１】
各センサ１１ｂ，１１ｃは、例えば、４分割フォトダイオードであり、受光する短パルスレーザ光Ｌのスポット位置に応じた４つのセンサ部分（図示略）の出力バランスにより、短パルスレーザ光Ｌの本来の光軸に対する該光軸に直交する方向に沿うオフセット量を検出することができるようになっている。また、異なる光路長を介した２つのセンサ１１ｂ，１１ｃにおけるオフセット量の差に応じて、短パルスレーザ光Ｌの本来の光軸に対する傾き量を検出することができるようになっている。
【００３２】
顕微鏡本体３は、標本Ａを搭載するステージ１３と、光源ユニット２から出力された短パルスレーザ光Ｌを２次元的に走査するスキャナ１４と、該スキャナ１４により走査された短パルスレーザ光Ｌを集光して標本Ａに照射する一方、標本Ａにおいて発生する蛍光を集光する対物レンズ１５と、該対物レンズ１５により集光された蛍光を短パルスレーザ光Ｌの光路から分岐するダイクロイックミラー１６と、該ダイクロイックミラー１６により分岐された蛍光を検出する光検出器１７とを備えている。符号１８は集光レンズである。
【００３３】
前記スキャナ１４は、例えば、相互に直交する軸線回りに揺動可能に支持された２枚のガルバノミラー１４ａ，１４ｂを対向配置させたものである。このスキャナ１４によれば、２つのガルバノミラー１４ａ，１４ｂを同期させて揺動させることにより、短パルスレーザ光Ｌを、例えば、ラスタスキャン方式に２次元的に走査させることができるようになっている。
前記光検出器１７は、例えば、光電子増倍管である。
【００３４】
前記制御部４は、短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置ズレの補正に必要な最大補正処理時間Ｔmaxを記憶する記憶部１９を備えている。また、記憶部１９には、他の一時的なデータ等を記憶するようになっている。
【００３５】
最大補正処理時間Ｔmaxは、位置ズレ検出に要する時間および位置ズレ補正に要する時間の合計時間Ｔaliと、音響光学素子８を安定させるために要する時間Ｔaoとの和で表される。
制御部４は、入力部６から入力される観察条件に従って、以下の処理を行うようになっている。
【００３６】
観察条件としては、例えば、画像取得回数、画像取得開始時間、フレーム間インターバル、スキャン速度、および画像サイズが入力される。制御部４は、入力された観察条件に基づいて、時間間隔をあけた複数の観察動作間における待機時間Ｔrestと、各観察動作においてスキャナ１４および光検出器１７を作動させるスキャン開始時刻Ｔnextとを算出し、各観察動作における補正処理開始時刻Ｔstartを以下の式により算出するようになっている。
Ｔstart＝Ｔnext−Ｔmax
【００３７】
次いで、制御部４は、補正処理開始時刻Ｔstartまで待機した後に、シャッタ１２により光路を遮断する一方、シャッタ１２により光路が遮断された状態で音響光学素子８を作動させてレーザ光源７からの短パルスレーザ光Ｌを射出するように内部のシャッタ（図示略）をあけるようになっている。この際における音響光学素子８の調光値は蛍光検出時と等しい値でよい。
【００３８】
また、この時点においては、音響光学素子８によるブランキング動作、すなわち、標本Ａに照射する短パルスレーザ光Ｌの照射範囲を制限するために短パルスレーザ光Ｌをオンオフする処理は停止しておくようになっている。
また、制御部４は、音響光学素子８の作動開始から音響光学素子８を安定させるために要する時間Ｔaoが経過した時点で、位置ズレ検出器１１を作動させて短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置ズレを検出し、ビームシフタ１０を作動させて光軸の位置ズレを補正するようになっている。
【００３９】
そして、制御部４は、ビームシフタ１０による光軸の位置ズレ補正が終了した段階で、シャッタ１２を開放させるようになっている。
その後、音響光学素子８によるブランキング動作を開始させ、スキャナ１４および光検出器１７を作動させて、標本Ａの所定範囲の２次元的な蛍光の輝度情報を取得するようになっている。これにより１回の観察動作が終了するので、観察条件において入力された画像取得回数だけ、上記ステップを繰り返すようになっている。
光検出器１７により検出された標本Ａの輝度情報は、スキャナ１４の走査位置情報に対応づけて記憶部１９に記憶され、制御部４により蛍光画像が作成されて表示部５により表示されるようになっている。
【００４０】
このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置１の制御方法について、図３および図４を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１を用いて、標本Ａの長時間観察（長時間タイムラプス観察）を行うには、まず、入力部６から撮像条件を入力する（ステップＳ１）。
【００４１】
制御部４は、入力された撮影条件に基づいて、待機時間Ｔrest、スキャン開始時刻Ｔnextおよび補正処理開始時刻Ｔstartを算出する（ステップＳ２）。
そして、時刻Ｔが補正処理開始時刻Ｔstartに達したか否かが判断され（ステップＳ３）、達した場合には、シャッタ１２が作動されて顕微鏡本体３への光路が遮断される（ステップＳ４）。
【００４２】
この状態で音響光学素子８が作動させられて（ステップＳ５）、短パルスレーザ光Ｌの分散補償器９への入射が開始される。この時点で、音響光学素子８が安定するのに要する時間Ｔaoが経過したか否かが判定され（ステップＳ６）、時間Ｔaoの経過を待って、位置ズレ検出器１１による光軸の位置ズレが検出され（ステップＳ７）、ビームシフタ１０による位置ズレの補正が行われる（ステップＳ８）。
【００４３】
これにより、短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置ズレが補正されるので、シャッタ１２を開くことにより短パルスレーザ光Ｌが顕微鏡本体３に精度よく入射される（ステップＳ９）。
顕微鏡本体３に入射された短パルスレーザ光Ｌはスキャナ１４によって２次元的に走査され、対物レンズ１５によって標本Ａに集光され、集光位置において多光子励起効果により蛍光を発生させる。発生した蛍光は、対物レンズ１５により集光された後、ダイクロイックミラー１６によって短パルスレーザ光Ｌの光路から分岐されて光検出器１７により検出される（ステップＳ１１）。
【００４４】
このとき、音響光学素子８の作動によりブランキング動作が行われ、標本Ａへの短パルスレーザ光Ｌの照射範囲が制限される（ステップＳ１０）。したがって、帰線期間における標本Ａへの短パルスレーザ光Ｌの照射が停止され、所定範囲内に均一な光子密度の短パルスレーザ光Ｌが照射される。これにより、１枚分の蛍光画像情報が取得され、１回の観察動作が終了する。この時点で観察条件として設定された画像取得回数に達したか否かが判断され、達していない場合には、ステップＳ２からのステップが繰り返される（ステップＳ１２）。
【００４５】
そして、設定された枚数の蛍光画像情報が取得された後には、光検出器からの蛍光画像情報とスキャナ１４の走査位置情報とに基づいて、蛍光画像が生成され（ステップＳ１３）、表示部に表示される（ステップＳ１４）。
【００４６】
このように、本実施形態に係る顕微鏡装置１とその制御方法によれば、音響光学素子８の安定を待って、短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置ズレ検出および位置ズレ補正を行うので、短パルスレーザ光Ｌの光軸を精度よく補正することができる。そして、このように精度よく光軸を補正された短パルスレーザ光Ｌを標本Ａに照射するので、光学部品によるけられやパワーロスを抑制し、安定した均一な短パルスレーザ光Ｌを標本Ａに照射して、標本Ａの観察を精度よく行うことができる。
【００４７】
また、蛍光画像の取得が行われる都度に光軸の補正が行われるので、長時間にわたるタイムラプス観察においてレーザ光源７や他の光学部品の温度上昇による経時的な光軸の位置ズレが発生しても、これを精度よく補正して、安定した観察を行うことができるという利点がある。
【００４８】
なお、本実施形態においては、間隔をあけて行われる複数回の観察動作毎に、補正処理開始時刻Ｔstartを算出して、音響光学素子８の作動を開始することとしたが、観察動作毎の間隔が短く、補正処理開始時刻Ｔstartが算出できない場合には、図５に示されるように、観察動作どうしの間における音響光学素子８のオンオフをなくし、音響光学素子８を常に作動状態として、位置ズレ検出および位置ズレ補正を行うこととしてもよい。この場合、スキャナ１４および光検出器１７を作動させて蛍光画像を取得する時間のみにおいて、音響光学素子８にブランキング動作を行わせるとともに、シャッタ１２を開放することとすればよい。
【００４９】
次に、本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡装置１とその制御方法について、図６〜図１０を参照して説明する。
本実施形態の説明において上述した第１の実施形態に係る顕微鏡装置１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００５０】
本実施形態に係る顕微鏡装置１は、レーザ光源７として、複数波長、例えば、７００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長範囲において任意の波長を選択的に出射可能な可変レーザ光源を備えている。
また、記憶部１９には、位置ズレ補正に要する時間Ｔali、位置ズレ検出に要する時間Ｔexm、音響光学素子８が安定するのに要する時間Ｔao、レーザ光源７が波長切り替え後に安定するまでに要する時間Ｔlaserが記憶されている。ここで、波長変化の幅Δλが増大すると、波長切り替え時の待機時間Ｔlaserが増大することが知られている。例えば、ΔλとＴlaserとの関係は、例えば、図８のような分布を示す。したがってシステム固有の分布を予め記憶部１９に記憶しておくことが好ましい。
【００５１】
制御部４は、まず、標本Ａに対して短パルスレーザ光Ｌを照射しないプレスキャンを行うことにより、波長毎の位置ズレ補正値を求め記憶部１９に記憶しておく。具体的には、図６に示されるように、レーザ光源７の射出波長を第１の波長λＡに合わせ、同時に音響光学素子８を作動させ、シャッタ１２を閉鎖する。
【００５２】
図６の場合には、レーザ光源７が安定するまでに要する時間Ｔlaserの方が音響光学素子８が安定するまでに要する時間Ｔaoより長いので、レーザ光源７が安定するのに要する時間Ｔlaserを待って、位置ズレ検出および位置ズレ補正を行い、位置ズレ補正値を記憶部１９に記憶する。その後、第２の波長λＢについても同様にして位置ズレ補正値を求め記憶部１９に記憶する。それ以外の波長についても観察を行う場合には同様にして位置ズレ補正値を求め記憶部１９に記憶する。
【００５３】
次いで、長時間タイムラプス観察を行う。
この実施形態において、長時間タイムラプス観察は、ほぼ同時期に、短パルスレーザ光Ｌの波長を切り替えながら、標本Ａからの蛍光を検出する一群の観察動作（図７では、第１の波長λＡによる観察動作と、第２の波長λＢによる観察動作）を、時間間隔をあけて長時間にわたって複数回行い、標本Ａの経時的な変化を観察する観察方法である。
【００５４】
具体的には、図９に示されるように、まず、入力部６から観察条件が入力される（ステップＳ２１）。そして、レーザ光源７から出射される短パルスレーザ光Ｌの波長λＡが選択され（ステップＳ２２）、これに基づく観察動作が行われる（ステップＳ２３）。次いで、波長λＢが選択され（ステップＳ２４）、これに基づく観察動作が行われる（ステップＳ２５）。
【００５５】
そして、これら一群の観察動作が、入力された観察条件に従って、時間間隔をあけて、所定の観察回数だけ行われたか否かが判断され（ステップＳ２６）、設定された観察回数だけ行われた後に、光検出器からの蛍光画像情報とスキャナ１４の走査位置情報とに基づいて、蛍光画像が生成され（ステップＳ２７）、表示部に表示される（ステップＳ２８）。
【００５６】
ここで、各観察動作（ステップＳ２３，Ｓ２５）について、図１０および図１１を参照して説明する。
まず、選択された短パルスレーザ光Ｌの波長λに基づいて、記憶部１９から位置ズレ補正値が読み出される（ステップＳ３１）。その後、ビームシフタ１０の作動により、プレスキャンにおいて求められた位置ズレ補正値に基づいて短パルスレーザ光Ｌの波長に依存する位置ズレ補正が行われる（ステップＳ３２）。
【００５７】
また、制御部４は入力された観察条件に基づいて、時間間隔をあけた複数の観察動作間における待機時間Ｔrestと、各観察動作においてスキャナ１４および光検出器１７を作動させるスキャン開始時刻Ｔnextとを算出し、補正処理に必要な時間Ｔali＋Ｔexm＋Ｔlaserが読み出され、補正処理開始時刻Ｔstartが次式により算出される（ステップＳ３３）。
Ｔstart＝Ｔnext−（Ｔali＋Ｔexm＋Ｔlaser）
【００５８】
補正処理開始時刻Ｔstartに達すると（ステップＳ３４）、シャッタ１２が閉鎖され（ステップＳ３５）、レーザ光源７の波長が第１の波長λＡに切り替えられ（ステップＳ３６）、音響光学素子８が作動させられる（ステップＳ３７）。時間Ｔlaserの経過を待つことにより（ステップＳ３８）、レーザ光源７が安定し、音響光学素子８も安定するので、位置ズレ検出が行われ（ステップＳ３９）、プレスキャンにおいて求められた位置ズレ補正値に対してさらなる位置ズレが生じているか否かが判定される（ステップＳ４０）。
【００５９】
そして、位置ズレが発生している場合には、ビームシフタ１０による位置ズレ補正が行われ（ステップＳ４１）、新たな位置ズレ補正値が短パルスレーザ光の波長と対応づけて記憶部に記憶される（ステップＳ４２）。一方、位置ズレが発生していない場合には、位置ズレ補正は行わない。
【００６０】
その後、スキャン開始時刻Ｔnextを待って（ステップＳ４３）、シャッタ１２が開かれ（ステップＳ４４）、音響光学素子８がブランキング動作させられ（ステップＳ４５）、スキャナ１４および光検出器１７が作動させられる（ステップＳ４６）。
これにより、観察動作が終了する。
【００６１】
本実施形態に係る顕微鏡装置１とその制御方法によれば、レーザ光源７から出射される短パルスレーザ光Ｌの波長が切り替えられることにより、音響光学素子８の設定、分散補償器９の設定等が切り替えられて光軸が変動するが、レーザ光源７が安定するまでに要する時間を待って位置ズレ検出および位置ズレ補正が行われるので、常に光軸の位置ズレを精度よく補正して顕微鏡本体３に入射させることができる。
【００６２】
また、予めプレスキャンを行って波長毎の位置ズレ補正値を記憶しておき、波長が切り替えられる都度に、記憶されていた位置ズレ補正値を読み出して位置ズレ補正を行うので、光軸の位置ズレを迅速に補正することができる。また、スキャナ１４および光検出器１７を作動させた蛍光検出動作毎に、位置ズレの検出を行うので、長時間タイムラプス観察のように、経時的に光軸の位置ズレが発生しやすい観察形態においても、光軸ズレを精度よく補正することができる。
【００６３】
なお、本実施形態においては、レーザ光源７から出射される短パルスレーザ光Ｌの波長切り替え開始と同時に音響光学素子８を作動させることとしたが、これに代えて、図１１に示されるように、音響光学素子８は、スキャン開始時刻Ｔnextから位置ズレ検出および位置ズレ補正に必要な時間Ｔexm＋Ｔaliおよび該音響光学素子８が安定するのに必要な時間Ｔaoだけ遡った時刻において作動開始させることにしてもよい。
【００６４】
また、観察条件によっては、１群の観察動作にかけることができる時間を十分に確保できる場合には、図１２に示されるように、短パルスレーザ光ｌの波長切り替えに伴いレーザ光源７が安定するのに要する時間の経過後、すなわち、レーザ光源７が安定してから音響光学素子８を作動させることにしてもよい。
【００６５】
また、本実施形態においては、短パルスレーザ光Ｌの波長を７００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲で任意に変更可能な可変レーザ光源７を採用したが、これに代えて、単一波長レーザ光を出射可能な複数のレーザ光源を組み合わせたレーザ光源ユニットを採用してもよい。この場合には、可変レーザ光源と比較して、レーザ光源が安定するまでに要する時間をほとんど無視し得る程低減することができる。したがって、短パルスレーザ光Ｌの波長切り替え時の待機時間が大幅に短縮され、音響光学素子８が安定するまでに要する時間に応じて、補正処理開始時刻Ｔstartを設定することにすればよい。
【００６６】
また、本実施形態においては、ほぼ同時期に行われる各一群の観察動作において、短パルスレーザ光Ｌの波長が切り替えられる毎に光軸の位置ズレ検出を行うこととした。これに代えて、プレスキャンにおいて、各一群の観察動作における最初の波長（先頭波長）と他の波長との間での光軸の位置ズレの差分値を検出して記憶しておき、図１３に示されるように、各一群の観察動作における先頭波長に設定されたときにのみ位置ズレ検出を行い、他の波長においては記憶しておいた位置ズレの差分値に基づく位置ズレ補正のみを行うことにしてもよい。
【００６７】
波長を切り替えることにより発生する光軸の位置ズレの差分値は、光学部品の温度が上昇しても変化しないので、これを記憶しておき、光学部品の温度上昇による光軸の位置ズレについては、一群の観察動作の先頭波長において検出し補正することで、他の波長については差分値に基づく位置ズレ補正のみで、各波長毎に温度上昇に伴う位置ズレ補正も行うことができる。
このようにすることで、波長を切り替えることに光軸の位置ズレ検出を行う必要がないので、波長切り替えに伴う待機時間を短縮することができる。
【００６８】
すなわち、記憶されている差分値に基づく光軸の位置ズレ補正のみであれば、オープンループで行うことができ、レーザ光源７および音響光学素子８の安定を待つ必要がない。したがって、シャッタ１２を閉じて開始される補正処理開始と同時に、位置ズレ補正を行うことができ、スキャナ１４および光検出器１７を作動させて行う蛍光検出動作の間隔を、レーザ光源７の安定に要する時間または音響光学素子８の安定に要する時間のいずれか長い方のみに短縮することができる。
これにより、複数の波長を切り替えて行う複数回の観察動作を互いに極力近接させて行うことができ、一群の観察動作における同時性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡装置を模式的に示す全体構成図である。
【図２】図１の顕微鏡装置に備えられる位置ズレ補正機構の一例を示す図である。
【図３】図１の顕微鏡装置の制御方法を示すフローチャートである。
【図４】図１の制御方法を説明するタイムチャートである。
【図５】図４の制御方法の変形例を示すタイムチャートである。
【図６】本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡装置の制御方法を示すフローチャートである。
【図７】図６の制御方法を説明するタイムチャートである。
【図８】図６の顕微鏡装置におけるレーザ光源の波長間隔と待機時間との関係を示すグラフである。
【図９】図６の顕微鏡の制御方法を主な流れを示すフローチャートである。
【図１０】図９のフローチャートにおける観察動作ルーチンを説明するフローチャートである。
【図１１】図６の制御方法の第１の変形例を示すタイムチャートである。
【図１２】図６の制御方法の第２の変形例を示すタイムチャートである。
【図１３】図６の制御方法の第３の変形例を示すタイムチャートである。
【図１４】図６の制御方法の第４の変形例を示すタイムチャートである。
【符号の説明】
【００７０】
Ａ  標本
Ｌ  短パルスレーザ光（レーザ光）
Ｔao  強度変調器を安定させるのに要する時間
Ｔali、Ｔali＋Ｔexm  レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間
Ｔnext  蛍光検出開始時刻
１  顕微鏡装置
４  制御部
７  レーザ光源（光源）
８  音響光学素子（強度変調器）
１０  ビームシフタ（レーザ位置補正部）
１１  レーザ位置検出部
１２  シャッタ
１４  スキャナ
１５  対物レンズ
１７  光検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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