(57)【要約】  【課題】バイオアッセイ用基板を用いて検出用物質と標的物質との相互作用を検出する場合における相互作用検出量を増加させる手段を提供すること、並びにその検出精度及びＳ／Ｎ比を向上させること。  【解決手段】複数の検出用物質が固定されたスポットエリアへ試料溶液を滴下し、該検出用物質と前記試料溶液中に存在する標的物質との相互作用を蛍光強度によって検出する基板であって、基板表面に配置されたウエル内にスポットエリアが所定数配設されているとともに、該スポットエリアを形成する底面に微細な凹凸構造が連続的に形成された構成を備えるバイオアッセイ用基板を提供する。例えば、微細加工技術を用いて、ナノオーダーの微細な凹凸構造をスポットエリアに連続的に形成することにより、固定表面積を増大できるため、検出用物質の固定量を増加でき、その検出精度及びＳ／Ｎ比を向上させることができる。  【選択図】図６Ｃ
2008020412.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の検出用物質が固定されたスポットエリアへ試料溶液を滴下し、該検出用物質と前記試料溶液中に存在する標的物質との相互作用を蛍光強度によって検出する基板であって、
基板表面に配置されたウエル内に前記スポットエリアが所定数配設されているとともに、該スポットエリアを形成する底面に微細な凹凸構造が連続的に形成された構成を備えるバイオアッセイ用基板。
【請求項２】
前記凹凸構造のトラックピッチ長をＬ、前記スポットエリアの底面に向けて入射される蛍光励起光の波長λ(i)、前記凹凸構造の屈折率をｎ(i)とした時、「数１」に示す式を満たしていることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ用基板。
【数１】
2008020412.tif 000004
【請求項３】
請求項１記載の基板を用いるバイオアッセイ方法であって、
一つのウエル内に存在する各スポットエリアから得られる蛍光強度の平均値を該ウエルの蛍光強度とするバイオアッセイ方法。
【請求項４】
基板裏面側から前記スポットエリアへ向けて蛍光励起光を入射し、スポットエリアから基板裏面側へ出射されてくる蛍光を検出することを特徴とする請求項３記載のバイオアッセイ方法。
【請求項５】
前記凹凸構造に基づいて励起光の偏光を制御することにより、蛍光励起光の光強度を調整することを特徴とする請求項３記載のバイオアッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質間の相互作用を検出するためのバイオアッセイ用基板などに関する。より詳細には、複数の検出用物質が固定されたスポットエリアへ試料溶液を滴下し、該検出用物質と前記試料溶液中に存在する標的物質との相互作用を蛍光強度によって検出するバイオアッセイ用基板、及び、その基板を用いたバイオアッセイ方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析、物質間の相互作用解析などに、ＤＮＡチップ（又はＤＮＡマイクロアレイ）、プロテインチップなどのバイオアッセイ用基板が活用され始めている。
【０００３】
一般的に、バイオアッセイ用基板には、予め、相互作用（ハイブリダイゼーションなど）の場となるウエルを複数設け、そのウエルごとに目的の検出用物質（プローブ核酸など）をそれぞれ固定する。そして、各ウエルに試料溶液を滴下などし、検出用物質と試料中に含有する標的物質との間の相互作用を進行させた後、蛍光強度などによりその相互作用を検出することにより、網羅的な解析を行う。
【０００４】
なお、本発明と関連性を有する先行文献として、例えば、特許文献１が挙げられる。特許文献１には、核酸プローブを固相化する領域に略均一な微小部分からなるフロスト面を形成することにより、検出精度を高める技術が開示されている。
【特許文献１】特開２００３−１０７０８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
検出用物質を基板表面に固定する場合、一層に固定する必要があるため、ウエル内に固定可能な検出用物質の量は限定される。従って、検出用物質と標的物質との相互作用量も限定されるため、バイオアッセイ用基板を用いて検出用物質と標的物質との相互作用を検出する場合、充分な検出量（蛍光強度など）を得ることが難しいという問題がある。
【０００６】
また、従来のバイオアッセイ用基板を用いて検出用物質と標的物質との相互作用を検出する場合、その検出精度及びＳ／Ｎ比が必ずしも充分でないという問題がある。
【０００７】
そこで、本発明は、バイオアッセイ用基板を用いて検出用物質と標的物質との相互作用を検出する場合における相互作用検出量を増加させる手段を提供すること、並びにその検出精度及びＳ／Ｎ比を向上させることを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、複数の検出用物質が固定されたスポットエリアへ試料溶液を滴下し、該検出用物質と前記試料溶液中に存在する標的物質との相互作用を蛍光強度によって検出する基板であって、基板表面に配置されたウエル内に前記スポットエリアが所定数配設されているとともに、該スポットエリアを形成する底面に微細な凹凸構造が連続的に形成された構成を備えるバイオアッセイ用基板を提供する。
【０００９】
例えば、リソグラフィー、エッチング、ナノインプリント、インジェクションモールディングなどの微細加工技術を用いて、ナノオーダーの微細な凹凸構造をスポットエリアに連続的に形成する。これにより、固定表面積を増大できるため、スポットエリア内における検出用物質の固定量を増加できる。従って、バイオアッセイ用基板を用いて検出用物質と標的物質との相互作用を検出する場合における相互作用検出量（蛍光強度など）を増加させることができ、その検出精度及びＳ／Ｎ比も向上させることができる。
【００１０】
その際、凹凸構造のトラックピッチ長をＬ、スポットエリアの底面に向けて入射される蛍光励起光の波長λ(i)、凹凸構造の屈折率をｎ(i)とした時、「数１」に示す式を満たしている構成にしてもよい。
【数１】
2008020412.tif 000003
【００１１】
一般に、蛍光励起光は、光源から出射された後、基板に近接して配置された絞込みレンズによってフォーカシングされ、スポットエリアに円錐状に入射する。そのため、励起光の中には、スポットエリアに角度を持って入射するものも存在する。その際、スポットエリアに形成された微細な凹凸構造が回折格子として機能して回折光が発生したり、基板表面の直下層に形成される反射膜の影響により反射光が発生したりすることがある。発生した回折光や反射光は、隣接する他のスポットエリアに入り込む場合がある。
【００１２】
それに対し、上記構成にすることにより、他のスポットエリアからの回折光や反射光の入射を防止できる。従って、バイオアッセイ用基板を用いて検出用物質と標的物質との相互作用を検出する場合における検出精度及びＳ／Ｎ比を向上させることができる。
【００１３】
以下、本発明に係る技術用語について説明する。
【００１４】
「相互作用」は、２つの物質が相互に結合することである。例えば、核酸の場合は相補的な核酸同士のハイブリダイズすることを、タンパク質の場合は抗原抗体反応やタンパク質間相互作用などのように２つのタンパク質が相互に結合することをいう。
【００１５】
「検出用物質」は、標的物質を検出するための検出子として機能する物質であり、検出表面などに固定などされて存在する。例えば、ハイブリダイゼーション検出の場合におけるプローブ核酸、タンパク質間相互作用検出の場合における所定のタンパク質などが包含される。
【００１６】
「標的物質」は、検出の目的となる物質であり、検出用物質と相互作用する物質である。一般に、生体試料などから調製した試料溶液中に存在し、バイオアッセイの際に、反応系に滴下・供給などされる。
【００１７】
「スポットエリア」は、基板表面に配置されたウエル内に配設された部位である。一般に、この部位に検出用物質を固定などし、検出用物質と標的物質との相互作用を該部位で進行させる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、バイオアッセイ用基板を用いて検出用物質と標的物質との相互作用を検出する場合における相互作用検出量を増加させる手段を提供することができ、その検出精度及びＳ／Ｎ比を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
＜本発明に係るバイオアッセイ用基板について＞
はじめに、図１から図３を用いて、本発明に係るバイオアッセイ用基板の例について、以下説明する。なお、各図は例示であり、本発明に係るバイオアッセイ用基板は、それらの図に示したもののみに狭く限定されない。
【００２０】
図１は、バイオアッセイ用基板表面の模式図である。
【００２１】
図１では、円板上の基板１上に、複数のウエル２が形成されている。なお、本発明に係るバイオアッセイ用基板は、円板上のもののみに狭く限定されない。また、ウエル２の数、位置、深さ、形状などについても、任意に設定可能であり、狭く限定されない。
【００２２】
基板１の材質などは特に限定されないが、所定波長の励起光（例えば、蛍光励起光）を透過可能な材質の方が、相互作用検出時などに基板側（裏面側）から励起できるなどの観点から、好ましい。例えば、ＣＤ（ｃｏｍｐａｃｔ  ｄｉｓｃ）、ＤＶＤ（ｄｅｇｉｔａｌ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｄｉｓｃ）、ＭＤ（ｍｉｎｉ  ｄｉｓｃ）など、公知の光情報記録媒体と同様の基材を用いることができ、石英などのガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの材料が好適である。
【００２３】
図２は、バイオアッセイ用基板の表面に形成されたウエルの一つを示す模式図である。
【００２４】
ウエル２には、複数のスポットエリア３を形成する。そして、各スポットエリア３に同種・同量の検出用物質を固定する。
【００２５】
検出用物質は、ＤＮＡチップなどの場合にはプローブ核酸、プロテインチップなどの場合には抗体など所定のタンパク質である。
【００２６】
例えば、プローブ核酸を固定する場合、検出したい核酸の塩基配列の全部又は一部と相補的な塩基配列を有するものを用いる。プローブ核酸は、合成核酸であるかどうかにより、狭く限定されない。鎖長（ｍｅｒ数）は、目的などに応じ、適宜設定可能である。
【００２７】
例えば、タンパク質を固定する場合、検出したいタンパク質と相互作用するタンパク質（抗体、酵素、受容体などを含む）、又は、その相互作用部位を少なくとも含有するポリペプチドを用いることができる。
【００２８】
検出用物質の固定手段は公知の方法を用いることができ、特に限定されない。例えば、基板表面をアビジン処理し、検出用物質をビオチン化し、アビジン−ビオチン結合により、基板表面の各スポットエリアに固定してもよい。また、目的などに応じて、検出用物質を所定長のリンカーなどを介して各スポットエリアに固定してもよい。
【００２９】
図２では、ウエル２内に９つのスポットエリア（符号３１〜３９）が所定数単位で配設されている。例えば、この基板を用いたバイオアッセイの際において、スポットエリア単位で蛍光励起光を照射し、各スポットエリアにおける蛍光強度を取得する。そして、それらの蛍光強度の平均値をそのウエル全体の蛍光強度として取り扱う。これにより、検出ムラを抑制できるため、検出精度を向上させることができる。
【００３０】
図３は、ウエル内に形成されたスポットエリアの断面模式図である。
【００３１】
このバイオアッセイ用基板では、スポットエリア３を形成する底面３ａに微細な凹凸構造４を連続的に形成する。これにより、固定表面積を増大できるため、検出用物質の固定量を増加できる。従って、バイオアッセイ用基板を用いて検出用物質と標的物質との相互作用を検出する場合における相互作用検出量（蛍光強度など）を増加させることができ、その検出精度及びＳ／Ｎ比も向上させることができる。
【００３２】
凹凸構造の形態パターンは、例えば、格子状縞、碁盤の目状格子、ドット状などにすることができる。これらの構成は、例えば、リソグラフィー、エッチング、ナノインプリント、インジェクションモールディングなどの微細加工技術を用いることにより、ナノオーダーで形成することができる。
【００３３】
凹凸構造のトラックピッチ長をＬ、スポットエリアの底面に向けて入射される蛍光励起光の波長λ(i)、凹凸構造の屈折率をｎ(i)とした時、上述の「数１」に示す式を満たすように、凹凸構造を形成してもよい。これにより、他のスポットエリアからの回折光や反射光の入射を防止できるため、バイオアッセイ用基板を用いて検出用物質と標的物質との相互作用を検出する場合における検出精度及びＳ／Ｎ比を向上させることができる。
【００３４】
例えば、バイオアッセイなどにおいて、波長５３２ｎｍにおける屈折率が１．６のチップ基板などを用いて、ＤＮＡ（標的物質）に蛍光色素（Ｃｙ３など）を結合させ、５３２ｎｍの蛍光励起光を用いて５５０〜６５０ｎｍ程度の蛍光を検出し、ハイブリダイゼーションの定量などを行う場合がある。その場合、例えば、凹凸構造のトラックピッチ長Ｌを、λ／ｎ以下（５３２／１．６＝３３２ｎｍ以下）、λ／１０以上（５３２／１０＝５３以上）以上にすることにより、上記の作用効果が得られる。
【００３５】
＜本発明に係るバイオアッセイ用基板の製造方法について＞
続いて、本発明に係るバイオアッセイ用基板の製造方法の例について、以下説明する。
【００３６】
本発明に係るバイオアッセイ用基板は、例えば、上述の基板に公知技術によりウエルを形成し、そのウエル内に所定数単位で複数のスポットエリアを配設し、そのスポットエリアの底面に微細な凹凸構造を形成することにより、製造することができる。
【００３７】
凹凸構造は、上述の通り、例えば、リソグラフィー、エッチング、ナノインプリント、インジェクションモールディングなどの公知の微細加工技術などを用いることにより、形成させることができる。
【００３８】
図４は、バイオアッセイ用基板の作製工程の例を示す図である。
【００３９】
まず、Ｓｉウエハ（Ｓｉ  ｗａｆｅｒ）、石英ガラス原板などに、フォトレジスト及び電子線レジストを塗布する（ｒｅｓｉｓｔ  ｃｏａｔ）。
【００４０】
次に、レーザー光、電子線リソグラフィーなどを用いて、所望の超微細格子やドットを描画し、その現像を行う（ｅｘｐｏｓｕｒｅ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ））。
【００４１】
次に、ドライエッチング又はウエットエッチングにより、所定構造の形態パターンを基板表面に転写し（ｅｔｃｈｉｎｇ）、Ｏ２プラズマアッシングにて、余分な残渣レジストを除去する（Ｏ２  ａｓｈｉｎｇ）。
【００４２】
次に、再度、レジストを塗布し（ｒｅｓｉｓｔ  ｃｏａｔ  ２）、前記形態パターンと直行するような描画や半ピッチずらした形態パターンを描画し、露光現像し（ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ２  ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ｒａｄｉａｌ））、エッチングを施し、パターンを転写し、アッシングする（ｅｔｃｈｉｎｇ  ２  ＆  Ｏ２  ａｓｈｉｎｇ）。
【００４３】
次に、検出用物質を固定する領域を限定するために、数ミリ〜数ミクロンのスポットエリアを、ポリイミドレジストなどを用いて作製し（ｒｅｓｉｓｔ  ｃｏａｔ  ３、ｅｘｐｏｓｕｒｅ）、その基板から電鋳メッキなどでマスタースタンパー（ｓｔａｍｐｅｒ；型）を作製する。なお、スタンパーの材質には、ニッケルなど公知のものを用いることができる。
【００４４】
次に、そのマスタースタンパーを用いて、ガラスやレジストなどにナノインプリント転写したり、プラスチックなどに成形したり（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｍｏｌｄｉｎｇ）することにより、バイオアッセイ用基板を大量かつ安価に作製する。
【００４５】
そして、作製したバイオアッセイ用基板の各スポットエリアに、公知技術により、それぞれ同種・同数の検出用物質を固定し、バイオアッセイに用いる。
【００４６】
＜本発明に係るバイオアッセイ方法について＞
続いて、本発明に係る基板を用いたバイオアッセイ方法の例について、以下説明する。
【００４７】
まず、人体などから採取した生物試料などから目的の試料溶液を調製する。核酸の試料の場合、例えば、生物試料から公知の方法で核酸を抽出・調製・合成などしたものを用いることができる。その場合、例えば、目的の試料から核酸を抽出などして用いてもよいし、目的の試料から核酸を抽出後、公知の方法により、ｃＤＮＡなどを合成して用いてもよい。タンパク質などの試料の場合も、例えば、公知の方法で抽出・調製などし、緩衝液などに溶解したものを用いることができる。
【００４８】
次に、バイオアッセイ用基板の各ウエル又は各スポットエリアに、試料溶液を滴下・供給する。試料溶液の滴下・供給は、例えば、バイオアッセイ測定装置により、レーザー光を用いてレンズと基板との間でフォーカス、トラッキングをかけながら正確な場所を特定して行う。
【００４９】
次に、各ウエル又は各スポットエリアにおいて、検出用物質と試料中に含まれる標的核酸との相互作用を進行させた後、その相互作用を蛍光強度で検出する。
【００５０】
その際、例えば、予め、試料（標的物質）に蛍光標識を施しておくことにより相互作用を検出してもよい。また、ハイブリダイゼーション検出の場合、検出用核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーション（二本鎖形成）をインターカレーターにより検出してもよい。
【００５１】
蛍光検出は、各ウエル又は各スポットエリアに、所定波長の蛍光励起光を照射し、その際における蛍光強度を検出することにより行う。蛍光励起光の照射手段には、例えば、ＬＥＤなどの光源を用いる。
【００５２】
図５は、バイオアッセイ用基板に蛍光励起光を照射した場合を示す模式図である。なお、図５は、図２のＡ−Ａ断面を模式的に示したものである。
【００５３】
図５に示す通り、基板表面に形成されたウエル２には、複数のスポットエリア３が形成されている。スポットエリア３の底面３ａには、検出用物質（図示せず）が固定され、該部位に蛍光励起光を照射することにより、検出用物質と標的物質との相互作用を検出する。
【００５４】
蛍光励起光Ｘ１は、絞り込みレンズ５を介して、スポットエリア３に照射される。検出用物質と標的物質が相互作用している場合、照射された蛍光励起光Ｘ１により蛍光物質が蛍光を発する。発せられた蛍光は、再び、絞り込みレンズ５を介して出射する（符号Ｘ２）。その蛍光を蛍光検出手段などで検出することにより、蛍光強度を取得できる。
【００５５】
なお、図５では、基板裏面側からスポットエリアへ向けて蛍光励起光を入射し、スポットエリアから基板裏面側へ出射されてくる蛍光を捕捉して蛍光強度の検出している。この場合、バイオアッセイ測定装置の光源と蛍光強度測定手段の両方を基板の裏面側に設けることができるため、装置構成を簡略化できるという利点がある。
【００５６】
蛍光強度を検出する場合において、例えば、蛍光励起光の照射をスポットエリア単位で行い、スポットエリアごとに蛍光強度を検出し、各スポットエリアにおける蛍光強度の平均値を、そのウエルにおける蛍光強度とするようにしてもよい。これにより、検出ムラを抑制できるため、検出精度を向上させることができる。
【００５７】
蛍光強度を検出する場合において、蛍光励起光Ｘ１の入射角度を任意に設定できる。本発明に係るバイオアッセイ用基板の場合、スポットエリア３の底面３ａに微細な凹凸構造を有する。そこで、Ｓ偏光、Ｐ偏光に基づき、蛍光励起光Ｘ１の振動方向を選択して偏光を制御することにより、蛍光励起光の光強度を制御できる。
【実施例１】
【００５８】
実施例１では、本発明に係るバイオアッセイ用基板の例を示す。
【００５９】
上述したバイオアッセイ用基板の作製方法に従い、円板状のバイオアッセイ用基板を試作した。
【００６０】
図６Ａは、試作したバイオアッセイ用基板及びその一部を拡大した図面代用写真である。図６Ａでは、円板状のガラス基板に１８０の反応エリアが規則的に配列している。各反応エリアの直径は５００μｍ、高さは５μｍである。
【００６１】
図６Ｂは、図６Ａ中の反応エリアの一つをさらに拡大した図面代用写真である。図６Ｂの左側の写真では、反応エリアの底面に、微細な凹凸構造が形成されている。なお、右側の写真は、微細な凹凸構造が形成されていない、従来の平滑面を示す。
【００６２】
図６Ｃは、図６Ｂ中の凹凸構造をＡＦＭにより測定した三次元凹凸イメージ像及びその電子顕微鏡写真である。図６Ｃでは、半径方向にトラックピッチ１５０ｎｍの溝が、周方向にピッチ３００ｎｍの溝が形成されている。
【００６３】
図６Ｄは、図６ＣのＡＦＭ凹凸構造におけるイメージ像の各断面ＡＦＭ像である。
【００６４】
図６Ｄに基づき解析を行った結果、このように凹凸構造を形成することにより、反応エリアの表面積が従来の平滑面と比較して約２倍になることが分かった。この結果は、ナノオーダーの微細な凹凸構造を反応エリアに連続的に形成することにより固定表面積を増大できることを、即ち、スポットエリア内における検出用物質の固定量を増加できることを示す。。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明により、バイオアッセイ用基板を用いて検出用物質と標的物質との相互作用を検出する場合における相互作用検出量を増加させる手段を提供することができ、その検出精度及びＳ／Ｎ比を向上させることができる。従って、ＤＮＡチップ、プロテインチップなどのバイオアッセイ用基板を用いる技術に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】バイオアッセイ用基板表面の模式図。
【図２】バイオアッセイ用基板の表面に形成されたウエルの一つを示す模式図。
【図３】ウエル内に形成されたスポットエリアの断面模式図。
【図４】バイオアッセイ用基板の作製工程の例を示す図。
【図５】バイオアッセイ用基板に蛍光励起光を照射した場合を示す模式図。
【図６Ａ】試作したバイオアッセイ用基板及びその一部を拡大した図面代用写真。
【図６Ｂ】図６Ａ中の反応エリアの一つをさらに拡大した図面代用写真。
【図６Ｃ】図６Ｂ中の凹凸構造をＡＦＭにより測定した三次元凹凸イメージ像及びその電子顕微鏡写真。
【図６Ｄ】図６ＣのＡＦＭ凹凸構造におけるイメージ像の各断面ＡＦＭ像。
【符号の説明】
【００６７】
１  バイオアッセイ用基板
２  ウエル
３  スポットエリア
４  微細な凹凸構造
【図１】
2008020412.tif 000005
【図２】
2008020412.tif 000006
【図３】
2008020412.tif 000007
【図５】
2008020412.tif 000008
【図４】
2008020412.tif 000009
【図６Ａ】
2008020412.tif 000010
【図６Ｂ】
2008020412.tif 000011
【図６Ｃ】
2008020412.tif 000012
【図６Ｄ】
2008020412.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月27日(2007.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
図１では、円板上の基板１上に、複数のウエル２が形成されている。なお、本発明に係るバイオアッセイ用基板は、円板状のもののみに狭く限定されない。また、ウエル２の数、位置、深さ、形状などについても、任意に設定可能であり、狭く限定されない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
次に、再度、レジストを塗布し（resist coat 2）、前記形態パターンと直交するような描画や半ピッチずらした形態パターンを描画し、露光現象し（exposure 2 & development (radial)）、エッチングを施し、パターンを転写し、アッシングする（etching 2 & O2 ashing）。