(57)【要約】      （修正有）【課題】原核生物細胞中でのヒトアルファ−フェトプロティンの発現および精製方法を提供する。【解決手段】Ｅ．ｃｏｌｉを用いた、ヒトアルファ−フェトプロティン遺伝子によりコードされた蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列相同性を有し、グリコシル化されておらず、且つ天然型のヒトアルファ−フェトプロティンと実質的に同一の生物活性を有する、実質的に純粋な生物活性を有する非グリコシル化ヒトアルファ−フェトプロティン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアルファ−フェトプロティンの発現を指令することのできる発現制御因子に作動的に結合している前記ヒトアルファ−フェトプロティンをコードする組み換えＤＮＡ分子を含有する形質転換された原核生物細胞の提供と、前記形質転換細胞による前記ヒトアルファ−フェトプロティンの発現可能化を含む、原核生物細胞中におけるヒトアルファ−フェトプロティンを生産する方法。
【請求項２】
前記原核生物細胞がE.coli であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現制御因子がE.coli Ｔｒｐプロモータであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記発現制御因子がE.coli Ｔａｃプロモータであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法により生産された事実上純化されたヒトアルファ−フェトプロティン。
【請求項６】
請求項５に記載の事実上純化されたヒトアルファ−フェトプロティンを含有する治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
本発明はクローン化ヒトアルファ−フェトプロティンの発現及び精製に関する。
アルファ−フェトプロティン（ＡＦＰ）は、通常、胎児血液中にのみ大量に認められる血清蛋白質である。成人血液中では、アルファ−フェトプロティンの増加は肝臓の再生及びある種のガン腫に関連している。
アルファ−フェトプロティンの特定の機能は知られていない。その機能として、胎児アルブミン、母体の免疫攻撃からの防御、母体のエストロゲンからの防御などが考えられている。
【０００２】
Morinaga et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4604, 1983）（非特許文献１）はヒトＡＦＰのクローニングを報告した。
Innis et al.（Arch. Biochem. Biophys. 195:128, 1979）（非特許文献２）は、ヒトＡＦＰの約９５０塩基対断片のE.coliプラスミドｐＢＲ３２２へのクローニングを報告した。
【０００３】
Nishi et al.（J. Biochem. 104:968, 1988）（非特許文献３）は、E.coli及びSaccharomyces cerevisiae中でのラットＡＦＰの発現を報告した。Nishi et al.は、エストラジオール結合アッセイにおいて、細菌により生産されたラットｒＡＦＰは事実上活性を有しないが、酵母により生産されたラットｒＡＦＰは元のＡＦＰと同様の活性を有することも報告した。さらに、ラジオイムノアッセイまたはオークターロニー二重免疫拡散アッセイにおいて、酵母により生産されたラットｒＡＦＰは細菌により生産されたラットｒＡＦＰよりも、元のラットＡＦＰと類似した性質を有していた。Nishi et al.は、“オークターロニー二重免疫拡散アッセイにおいて、元のｒＡＦＰ及び酵母ｒＡＦＰはラットＡＦＰに対する抗体と完全に融合した沈降線を形成するが、E.coli ｒＡＦＰは類似の試験において部分的一致反応を示した…この研究において機能的に活性のある酵母ｒＡＦＰは正しいジスルフィド結合対を有するものと思われる。これに対して、E.coli ｒＡＦＰは恐らくこれらの正しいジスルフィド結合対を形成できないのであろう。”と述べている。
【０００４】
Yamamoto et al.（Life Science 46:1679, 1990）（非特許文献４）は、酵母中でのヒトＡＦＰの発現を報告し、このようにして生産されたｒＡＦＰは“免疫学的に元のＡＦＰと区別できない”と報告した。
Giuliani et al.（Protein Engineering 2:605, 1989）（非特許文献５）は、ヒトＡＦＰの一部（アミノ酸３８〜１１９）のE.coli中での発現を報告した。
日本特許出願第８８１５８５９６（特許文献１）において、E.coli中での組み換えヒトドメインＩ ＡＦＰの調製方法が報告されている。
【特許文献１】日本特許出願第８８１５８５９６
【非特許文献１】Morinaga et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4604, 1983）
【非特許文献２】Innis et al.（Arch. Biochem. Biophys. 195:128, 1979）
【非特許文献３】Nishi et al.（J. Biochem. 104:968, 1988）
【非特許文献４】Yamamoto et al.（Life Science 46:1679, 1990）
【非特許文献５】Giuliani et al.（Protein Engineering 2:605, 1989）
【発明の開示】
【０００５】
発明の要旨
一般的に本発明は、原核生物細胞中でヒトアルファ−フェトプロティンを生産する方法に関する。本方法には、ヒトアルファ−フェトプロティンの発現を指令することのできる発現制御因子に作動的に結合しているヒトアルファ−フェトプロティンをコードする組み換えＤＮＡ分子を含有する形質転換された原核生物細胞の提供と、形質転換細胞によるヒトアルファ−フェトプロティンの発現可能化が含まれる。好適な実施例において、原核生物細胞はE.coliである。さらに好適な実施例において、発現制御因子はE.coli Ｔｒｐプロモータ及びE.coli Ｔａｃプロモータである。
【０００６】
関連する態様において本発明は、ヒトアルファ−フェトプロティンの発現を指令することのできる発現制御因子に作動的に結合しているヒトアルファ−フェトプロティンをコードする組み換えＤＮＡ分子を含有する形質転換された原核生物細胞の提供と、形質転換細胞によるヒトアルファ−フェトプロティンの発現を可能にすることにより生産された、事実上純化されたヒトアルファ−フェトプロティンに関する。
関連する態様において本発明は、上記に記載した通りに生産され事実上純化されたアルファ−フェトプロティンを含有する治療用組成物に関する。
【０００７】
“ヒトアルファ−フェトプロティン”とは、ヒトアルファ−フェトプロティン遺伝子によりコードされた蛋白質と事実上同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。Moringa et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4604, 1983）は、ヒトアルファ−フェトプロティンに相同的なｃＤＮＡの配列を報告している。
【０００８】
“発現制御因子”とは、蛋白質をコードする配列に作動的に結合し、その配列の発現を制御する因子となる認識配列を含む塩基配列を意味する。従って、発現制御因子は一般的に、例えば、プロモータ、リボゾーム結合部位、リプレッサ結合部位及びアクチベータ結合部位など転写と翻訳の両方を制御する配列を含む。
【０００９】
“事実上同じアミノ酸配列”とは、天然型ヒトアルファ−フェトプロティンのアミノ酸配列と最低８０％の相同性を示し、典型的には天然型ヒトアルファ−フェトプロティンのアミノ酸配列と最低約８５％の相同性を示し、さらに典型的には天然型ヒトアルファ−フェトプロティンのアミノ酸配列と最低約９０％の相同性を示し、通常的には天然型ヒトアルファ−フェトプロティンのアミノ酸配列と最低約９５％の相同性を示し、さらに通常的には天然型ヒトアルファ−フェトプロティンのアミノ酸配列と最低約９７％の相同性を示すポリペプチドを意味する。比較する配列の長さは一般的には最低１６アミノ酸、通常的には最低２０アミノ酸、さらに通常的には最低２５アミノ酸、典型的には最低３０アミノ酸、好ましくは３５アミノ酸以上である。
【００１０】
ポリペプチドの相同性は、典型的には配列解析ソフト（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705）を用いて測定する。蛋白質解析ソフトは、種々の置換、欠失、置換及び他の変更に対して相同性の度合いを判定することにより類似の配列を捜し出す。保存的置換は典型的には以下のグループ内での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。
【００１１】
ここに使用されている通り、“事実上純化された”という用語は、天然では混在している物質から分離された蛋白質またはポリペプチドを指す。典型的には、目的とする蛋白質が試料中の全蛋白質の最低６０〜７５％である時、この目的蛋白質は事実上純化されている。小さな変異のある派生物または化学修飾物は典型的には同じポリペプチド配列を有する。事実上純化された蛋白質は典型的には、試料中にその蛋白質を約８５〜９０％以上含み、さらに通常的には、最低約９５％、さらに好ましくは約９９％以上を含んでいる。通常、精製度はクロマトグラフィカラム、ポリアクリルアミドゲルまたはＨＰＬＣ分析により測定する。
【００１２】
蛋白質は、天然状態では混在している天然の混在物から分離された時、天然では混在している成分を事実上含有しない。このため、化学合成された蛋白質、または天然で生産される場合と異なる細胞系において生産される蛋白質は、事実上天然には混在している成分を事実上含有しない。このためこの用語は、E.coli及び他の原核生物中で合成された、真核生物由来のポリペプチド及び核酸に対して使用することができる。
【００１３】
本発明は、事実上純化されたヒトアルファ−フェトプロティンを提供する。部分的にはヒトアルファ−フェトプロティンの構造的及び機能的性質に基づいて、生体物質からヒトＡＦＰを単離する種々の方法が考案されている。その他の方法として、ヒトＡＦＰの純化に使用する非常に特異的なアフィニティカラムを作製するため、抗ＡＦＰ抗体を固体基質に固定化する。
【００１４】
事実上全長を有するポリペプチドに加えて本発明は、ヒトアルファ−フェトプロティンの、生物活性を有する組み換え断片も提供する。例えば、リガンド結合活性を有する断片または免疫抑制活性を有する断片などである。
【００１５】
ヒトアルファ−フェトプロティンをコードする天然または合成ＤＮＡ断片またはその望ましい断片は、細胞培養物中に導入することができ、かつその細胞中で発現することのできるＤＮＡ構築物中に含有されている。このような宿主細胞中に導入されるよう調製されたＤＮＡ構築物は典型的には、宿主細胞が利用することのできる複製起点、ヒトアルファ−フェトプロティンの望ましい部分をコードするＤＮＡ断片、アルファ−フェトプロティンをコードする断片に作動的に結合した転写及び翻訳開始制御配列、及びアルファ−フェトプロティンをコードする断片に作動的に結合した転写及び翻訳終止制御配列を含む。転写制御配列は典型的には、宿主により認識される異種プロモータを含む。適切なプロモータの選択は宿主に依存するが、ｔｒｐ、ｔａｃ及びファージプロモータ、ｔＲＮＡプロモータ及び解糖系酵素プロモータなどのプロモータを適切な環境下で使用することができる（Sambrook et al. eds., Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY 1989）。ある種の例においては、宿主中での転写を制御することのできる認識配列（例えば、E.coliのｌａｃリプレッサ）を適切な部位に含むことが望ましい。複製機構と転写翻訳制御配列及び発現させるＤＮＡ断片をコードする遺伝子の挿入に便利な部位を有する、購入可能な発現ベクターを使用することができる。
上述の種々のプロモータ、転写及び翻訳因子は一般的に“発現制御因子”と呼ばれる。
【００１６】
ヒトＡＦＰの全長または一部をコードするＤＮＡ断片を、宿主の染色体に挿入することもできる。
【００１７】
目的のＤＮＡ断片を含有するベクターは細胞宿主の型に依存して、良く知られた方法で宿主細胞中に導入することができる（Sambrook et al. supra）。“形質転換された細胞”という用語は、形質転換された細胞のprogeny （子孫）も含むことを意味する。
【００１８】
組み換え蛋白質を高発現するのに有用な原核生物宿主には、E.coli、Bacillus subtilis 、及びPseudomonas の種々の株が含まれる。
【００１９】
本発明の方法は、生物活性を有するヒトアルファ−フェトプロティンを高生産する手段を提供する。本発明の方法に従って生産されたＡＦＰは、天然のヒトＡＦＰと同一の方法で修飾されないにもかかわらず生物活性を有する。
本発明の他の特徴及び利点は以下に記載する好適な実施例及び請求の範囲から明白である。
【実施例】
【００２０】
ｃＤＮＡライブラリーの構築
４．５月齢のヒト流産児の肝臓細胞（湿潤重量〜３グラム）から単離したポリ（Ａ）＋ＲＮＡから調製したｃＤＮＡ（０．５〜３ｋｂ）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した（その他の方法として、胎児ｃＤＮＡライブラリーはClontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CAから入手することもできる）。全ＲＮＡはグアニジンチオシアネート法（Chirgwin et al., Biochemistry 18:5294, 1979 ）により調製し、ｍＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィ（Collaborative Research, Bedford, MA ）により選択した（Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., Wiley Interscience, New York, 1989）。ｃＤＮＡはLibrarian II ｃＤＮＡ合成キット（Invitrogen, San Diego, CA ）を用いて合成し、１％アガロースゲルにより分画した。０．５〜３ｋｂの断片を抽出後ベクターｐＴＺ１８−ＲＢ（Invitrogen）に連結し、このプラスミドを用いてE.coli ＤＨ１αＦ´（Invitrogen）を形質転換した。コロニーをColony/Plaque Screenフィルター（Du Pont, Wilmington, DE ）に吸着させ、０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌからなる溶液中で１０分間インキュベートしてコロニーを溶菌、変性した。１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５０Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中で５分間フィルターを洗浄し、風乾した。次いでフィルターをクロロホルムを用いて５回洗浄し、０．３Ｍ ＮａＣｌに浸して細胞残渣を除去した後風乾した。真空状態で８０℃、２時間焼結することによりＤＮＡをニトロセルロースに固定した。焼結したフィルターは、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム［ｐＨ７．０］）、１×デンハルト溶液（０．２ｇ／ｌポリビニルピロリドン、０．２ｇ／ｌ ＢＳＡ、０．２ｇ／ｌフィコール４００）、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、０．５％ ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ E.coli ＤＮＡ中で３７℃、３時間プレハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションは、ＳＤＳを含まず１〜２×１０６ｃｐｍ／ｍｌの５´末端リン酸化により３２Ｐ標識した２種のオリゴヌクレオチドを含む以外はプレハイブリダイゼーション溶液と同一の溶液中で、３７℃、１８〜２４時間行なった（Current Protocols in Molecular Biology, supra）。ライブラリーのスクリーニングに使用したオリゴヌクレオチドの配列は、５´−ＴＧＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＧＧＡＡＡＡＡ−３´（配列番号：１）、及び５´−ＣＡＴＧＡＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＧＴＡ−３´（配列番号：２）である。これらの配列はそれぞれ、ヒトＡＦＰをコードする配列の塩基７７２〜７９２、及び１４０５〜１４２２に対応している。フィルターは、６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム中で３７℃、３０分間２回洗浄し、次いで、同一の溶液中で４８℃、３０分間１回洗浄した。乾燥させたフィルターを、Du Pont Cronex Lightning Plus intensifier screen存在下でKodak ＸＡＲフィルムに２４〜４８時間感光し、陽性クローンを同定した。陽性クローンを単離、増幅後、これらについてサザンブロット解析を行なった（Current Protocols in Molecular Biology, supra）。簡単に記載すると、適切な制限酵素を用いて精製ＤＮＡを加水分解し、その結果得られた断片を１％アガロースゲルを用いて分離した。次いでＤＮＡをニトロセルロース膜に転写した。ハイブリダイゼーション条件は、前述の２種のプローブに加えて第���の３２Ｐ標識したオリゴヌクレオチド（５´−ＣＡＴＡＧＡＡＡＴＧＡＡＴＡＴＧＧＡ−３´（配列番号：３）、ヒトＡＦＰをコードする領域の塩基７〜２４に対応している）を使用する以外は上記に記載したのと同一のものとした。スクリ−ニングした３，０００コロニーの中から５個の陽性クローンを同定した。そのうちの１クローン、ｐＬＨｕＡＦＰを以下に記載する構築に使用した。
【００２１】
全長ヒトＡＦＰｃＤＮＡの構築
以下に記載する５種のＤＮＡ断片を用いて、翻訳開始コドン、それに続くヒトＡＦＰをコードする配列及び翻訳終止コドンを含む構築物を作製した。
【００２２】
断片１：リン酸化されていない２種のオリゴヌクレオチドをアニールして、５´付着末端ＥｃｏＲＩ認識部位、それに続くＡＴＧ開始コドン及びコーディング配列中６０番目の塩基に位置するＰｓｔＩ制限酵素部位を含むヒトＡＦＰｃＤＮＡの最初の６０ｂｐ分からなる２本鎖ＤＮＡ分子を作製した（ここでは、塩基１は成熟蛋白質の第一コドン（Ｔｈｒ）の一番目の塩基を指し、これはMorinaga et al., supraの塩基１０２に対応している）。この断片を、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩにより直鎖状にしたｐＵＣ１１９（ｐＵＣ１９のＮｄｅＩ部位に、Ｍ１３の塩基５４６５のＨｇｉＡＩから塩基５９４１のＡｈａＩＩまでの遺伝子間領域が挿入されている）に連結した。その結果得られたＤＮＡをE.coli ＮＭ５２２（Pharmacia, Piscataway, NJ ）中で増幅した。組み換えプラスミドを制限酵素消化してＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ挿入断片を切り出し、次いで５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ゲルから回収した。
【００２３】
断片２：ｐＬＨｕＡＦＰをＰｓｔＩ及びＮｓｉＩ消化し、上述の通りゲルによる精製を行なって、９７ｂｐのヒトＡＦＰｃＤＮＡ断片（塩基５７〜１５３）を得た。このクローンはヒトＡＦＰのコーディング領域全体と同時に５´及び３´非翻訳配列も有する。
【００２４】
断片３：ｐＬＨｕＡＦＰをＮｓｉＩ及びＡｌｗＮＩ消化し、上述の通り精製を行なって、２２４ｂｐのヒトＡＦＰｃＤＮＡ断片（塩基１５０〜３７３）を得た。
【００２５】
断片４：ｐＬＨｕＡＦＰをＡｌｗＮＩ及びＳｔｙＩ消化し、上述の通り精製を行なって、１３２２ｂｐのヒトＡＦＰｃＤＮＡ断片（塩基３７１〜１６９２）を得た。
【００２６】
断片５：リン酸化されていない２種のオリゴヌクレオチドをアニールして、塩基１６９３に位置するＳｔｙＩ部位から、塩基１７７３に位置するＡＦＰコーディング領域を終結させるＴＡＡ終止コドンまでのヒトＡＦＰ配列、及びそれに続くＢａｍＨＩ付着部位からなる２本鎖ＤＮＡ分子を作製した。この合成ＤＮＡは、これ以上の操作を行なうことなく使用した。
【００２７】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（StrataGene, La Jolla, CA）をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いて完全に加水分解して、上述の５種の精製断片を含有するライゲーション溶液に添加した。対照となるライゲーション溶液には、直鎖状ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのみを含むようにした。これら２種のライゲーション溶液の一部を用いて、E.coli ＤＨ５α（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Grand Island, NY）コンピテント細胞を形質転換した。幾つかの形質転換株から組み換えプラスミドを単離し、広範囲にわたる制限酵素解析及び塩基配列決定によりスクリーニングを行なった。１個の組み換えプラスミドを選択し、ｐＨｕＡＦＰと命名した。このプラスミドを使用して、数種の発現ベクターにヒトＡＦＰ遺伝子を挿入した。ｐＨｕＡＦＰは、ヒトＡＦＰのコーディング配列全体及び５´末端にＡＴＧ開始コドン、３´末端にＴＡＡ終止コドンを含有する固有のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を有する。
【００２８】
ＡＦＰ発現ベクター
E.coli中でのヒトＡＦＰの効率的な大量生産は、３種の異なる発現系により行なった。ＴＲＰシステムでは直接発現を行なった。ＲＸ１システムでは、ｔｒｐＥ及びベクター配列にコードされている２０アミノ酸を含む融合蛋白質が生産された。ＭＡＬシステムでは、ｍａｌＥ遺伝子産物（４２ｋｄのマルトース結合蛋白質）に融合したＡＦＰが発現された。
【００２９】
ＴＲＰシステム：ＡＦＰをコードする、ｐＨｕＡＦＰの１１８６ｂｐＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を発現ベクターｐＴｒｐ４（Olsen et al., J. Biotechnol. 9:179, 1989）のｔｒｐプロモータ及び改変したリボゾーム結合部位の下流にクローニングした。
簡単に記載すると、ｐＨｕＡＦＰをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、末端をKlenowポリメラーゼで埋めた。次いで、１１８６ｂｐのＡＦＰ断片をゲルにより精製した。ｐＴｒｐ４をＣｌａＩ消化し、末端をKlenowポリメラーゼで埋め、この直鎖状ベクターをゲルにより精製した。１１８６ｂｐのＡＦＰ断片とｐＴｒｐ４を連結し、このプラスミドを用いて以下のE.coli株を形質転換した：ＤＨ５α、ＢＬ２１（F.W.Studier, Brookhaven National Laboratory, Upton, NY）、ＳＧ９２７（American Type Culture Collection, Rockville, MD:Ａｃｃ Ｎｏ．３９６２７）、ＳＧ９２８（ＡＴＣＣ Ａｃｃ Ｎｏ．３９６２８）、及びＳＧ３９５（ＡＴＣＣ Ａｃｃ Ｎｏ．３９６２３）。
【００３０】
ＲＸ１発現システム：ヒトＡＦＰｃＤＮＡを、ｔｒｐプロモータに隣接してかつＴｒｐＥの翻訳フレーム中に発現ベクターｐＲＸ１（Rimm et al., Gene 75:323, 1989）にクローニングした。ヒトＡＦＰｃＤＮＡはＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ消化することによりｐＨｕＡＦＰから切り出し、適切に処理したｐＲＸ１（BioRad Laboratories, Hercules, CA ）中にクローニングした。次いで、ｐＲＸ１／ＨｕＡＦＰとして同定される最終的なプラスミド構築物を用いて、上述のE.coli株及びＣＡＧ４５６（D.W.Cleveland, John Hopkins University, Baltimore, MD ）を形質転換した。
【００３１】
ＭＡＬ発現システム：ＡＦＰｃＤＮＡは、ｔａｃプロモータの制御下でＭａｌＥの翻訳フレームの中に、発現ベクターｐＭＡＬ（New England Biolabs, Inc., Beverly, MA）中に挿入した。簡単に記載すると、ｐＨｕＡＦＰをＢａｍＨＩで消化し、末端をKlenowポリメラーゼで平滑化した。ＥｃｏＲＩ消化によりヒトＡＦＰｃＤＮＡを残りのプラスミドＤＮＡ部分から単離した後ゲルにより精製した。精製した断片を、適切に処理したｐＭＡＬ−Ｃに連結した。正しい方向で断片が挿入されたプラスミドをｐＭＡＬ／ＨｕＡＦＰと命名し、これを用いてE.coli ＤＨ５α、ＴＢＩ（New England Biolabs ）及びＳＧ９３５を形質転換した。
３種の発現ベクターの構築に使用されたＡＦＰコーディング領域の塩基配列を決定し、全長ＡＦＰをコードしていることを確認した。
【００３２】
E.coli中でのＡＦＰの発現
細菌培養物は通気条件下で３０℃または３７℃でインキュベートした。E.coliは、必要に応じて適切な抗生物質を含有する（５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン−ＨＣｌ、及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリン−Ｎａ）ＬＢ培地で一晩培養した。
【００３３】
ＴＲＰ及びＲＸ１発現システム：ｔｒｐプロモータは、トリプトファン欠損条件下で誘導した。誘導は、以下の通りに調製したＭ９ＣＡ培地中で行なった：１ｇ カザミノ酸（Difco Laboratories, Detroit, MI ）、６ｇ Ｎａ２ ＨＰＯ４ 、３ｇ ＫＨ２ ＰＯ４ 、０．５ｇ ＮａＣｌ、１ｇ ＮＨ４ Ｃｌを１リットルのミリ−Ｑ水（Millipore Corp., Bedford, MA）に添加し、ｐＨを７．４に調整した後オートクレーブした。冷却した培地に、２ｍＭ ＭｇＳＯ４ 、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２ 、及び０．２％ グルコースとなるよう各試薬を添加した。一晩培養した培養物を、抗生物質を添加したＭ９ＣＡ中で１００倍に希釈した後、Ａ５５０が０．４になるまで３０℃で細胞を増殖させ、遠心分離により集菌し、沈殿物を−２０℃で保存した。
【００３４】
ＭＡＬ発現システム：ｔａｃプロモータは非代謝性誘導物質ＩＰＴＧにより誘導した。一晩培養した培養物を、抗生物質を添加したＬＢ培地中で１００倍に希釈した後、Ａ５５０ が０．４になるまで３７℃で細胞を増殖させた。次いで、ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭになるよう添加し、さらに２時間培養した。遠心分離により集菌し、沈殿物を−２０℃で保存した。
【００３５】
E.coli中で発現されたＡＦＰの検出
組み換えＡＦＰの発現及び挙動を決定するために解析研究を行なった。細胞沈殿物は、ＳＤＳ−溶菌溶液（０．１６Ｍ トリス−ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、４％ ｗ／ｖ ＳＤＳ、０．２Ｍ ＤＴＴ、２０％ グリセロール、０．０２％ ブロモフェノールブルー）中に懸濁して５分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用するか、または１０ｍＭ Ｎａ２ ＨＰＯ４ 、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡからなる溶菌緩衝液に懸濁して１ｍｇ／ｍｌ リゾチームと共に４℃で３０分間インキュベートした後、５０％出力、パルスモード３×１分で超音波破砕した（Sonics and Materials, Danbury, CT: model VC300 sonifier ）。溶菌物を１０，０００ｇで２０分間遠心分離し、可溶性蛋白質を含む上清を別の試験管にデカントし、使用するまで−２０℃で保存した。不溶性蛋白質を含む沈殿物はＳＤＳ−溶菌緩衝液に再度懸濁し、５分間煮沸した後、使用するまで−２０℃で保存した。ＳＤＳ−溶菌緩衝液中に放出された全蛋白質と、可溶性画分及び沈殿画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット後の免疫学的検出により解析した。これらの研究中、クーマシーブルーにより染色したゲルは、日常的にビデオデンシトメータ（ＢｉｏＲａｄ、ｍｏｄｅｌ ６２０）を用いてスキャンした。これにより、生産されたＡＦＰの量を、全細胞蛋白質に対するパーセンテージで評価することができた。
【００３６】
ＴＲＰシステムにおいて発現されたＡＦＰの精製
特記しない限り、すべての操作は４℃で行なった。１リットルの培養物から回収した各凍結細胞沈殿物を、２５ｍｌの溶菌緩衝液Ａ（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、２０％ ショ糖、１００μｇ／ｍｌ リゾチーム、１０μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ）に再度懸濁し、１０分間インキュベートした。ＥＤＴＡを最終濃度３５ｍＭになるよう添加し、抽出液をさらに１０分間静置した。２５ｍｌの溶菌緩衝液Ｂ（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を添加した後、溶菌物をさらに３０分間インキュベートした。細胞溶菌物を１２，０００ｇで２０分間遠心分離し、組み換えＡＦＰを含む沈殿物を５０ｍｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で２回洗浄し、各洗浄後は上述の通りに遠心分離した。沈殿物を５０ｍｌの変性緩衝液（０．１Ｍ Ｋ２ ＨＰＯ４ ［ｐＨ８．５］、６Ｍ 塩酸グアニジン、０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール）に溶解し、超音波破砕し、次いで、Nutator （Clay Adams）上で４時間攪拌した。可溶化された抽出物を、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で５０倍に希釈し、組み換えＡＦＰ蛋白質を２４時間復元させた。希釈する前のＡＦＰは微細凝集していると思われるため、この５０倍希釈工程は重要である。希釈及び再濃縮の後はＡＦＰは凝集しない。Amicon filtration unitを用いてＹＭ１０膜上で溶液を１００倍に濃縮し、Millex ０．２２μｍ膜フィルター（Millipore ）に通して清澄化した。組み換えＡＦＰは、室温で、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で平衡化したＭｏｍｏＱカラム（Pharmacia ）に通し、結合蛋白質を、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中、１Ｍ ＮａＣｌの０〜１００％の直線密度勾配を用いて溶出して、さらに精製した。分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＡＰＡＧＥ、及びウエスタンブロッティングにより解析した。
【００３７】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンイムノディテクション法
不連続な緩衝液系中のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びアルカリ−ＰＡＧＥは、mini-Protean電気泳動装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、Hames et al.（Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach, IRL Press, London, 1981）の方法に従って行なった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥあるいはＡＰＡＧＥ後の組み換えヒトＡＦＰの免疫学的検出は、ゲルを転写緩衝液（１２．５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、９６ｍＭ グリシン、２０％ メタノール［ｐＨ８．２］）中に１５分間浸して行なった。次いで、各ゲルの上にイモビロンＰＶＤＦ膜（Millipore ）を乗せ、ゲルが陰極に接するよう、mini-Protean電気泳動装置（ＢｉｏＲａｄ）の２枚の電極格子の間にはさんだ。システムを転写緩衝液中に浸し、１５０ｍＡの電流を２時間流した。２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３％ ゼラチンにより、イモビロンＰＶＤＦ膜上の反応していない部位を１時間ブロックした。一次抗体及び二次抗体にはそれぞれ、ウサギ抗−ヒトＡＦＰ抗血清及びアルカリホスファターゼに共役させたヤギ抗−ウサギＩｇＧ抗体（ＢｉｏＲａｄ）を使用した。アルカリホスファターゼ活性は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸及びｐ−ニトロブルーテトラゾリウム（ＢｉｏＲａｄ）を用いて検出した。
【００３８】
ＡＦＰ発現の定量
組み換えヒトＡＦＰは、ヒトＡＦＰ ＥＬＩＳＡキット（Abbott Laboratories, Chicago, IL）を用いて定量した。
ＡＦＰの収率は、銀染色ゲルのスキャンすることにより計算した。Ｔｒｐ発現システムを用いた、ＡＦＰをコードするプラスミドによりＳＧ９３５細胞を形質転換した場合、ＡＦＰはE.coli菌体全蛋白質の２〜５％を占める（培養液１リットル当たり約３〜７ｍｇのＡＦＰ）。上述の通り、初期抽出物中のＡＦＰは不溶性である。上述の再可溶化法により、安定で部分精製された単量体ＡＦＰの形で５０〜６０％のＡＦＰを回収することができる（E.coli ２０リットル当たり約５０ｍｇの収率）。この部分精製されたＡＦＰをさらに精製して、２５ｍｇの純化された単量体ＡＦＰを得ることができる。
【００３９】
Ｎ−末端解析
Porton 蛋白質／ペプチド気相マイクロシークエンサと配列を最適化するためのintegrated customized microbore HPLCを用いて自動化エドマン分解を行なった。蛋白質配列解析は、PC/Gene software package（Intelligenetics ）中の選択されたプログラムを使用することにより行なった。
【００４０】
使用法
原核生物細胞中で生産された組み換えヒトＡＦＰ及びその断片は、診断用の標準物質及び治療目的に使用することができる。
組み換えＡＦＰ及びその断片は単独で、または、薬理学上許容できる担体または希釈液と組み合わせて効果的な量を投与することができる。ポリペプチド及び組成物は単独で、または、他の治療用薬剤と組み合わせて例えば静脈注射、経口、筋肉注射または鼻腔内注入などの便利な方法により投与することができる。
【配列表】
2008120804000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月6日(2007.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアルファ−フェトプロティン遺伝子によりコードされた蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも97％の配列相同性を有し、グリコシル化されておらず、且つ天然型のヒトアルファ−フェトプロティンと実質的に同一の生物活性を有する、実質的に純粋な生物活性を有する非グリコシル化ヒトアルファ−フェトプロティン。