(57)【要約】      （修正有）【課題】発現させた蛋白質の細胞内品質管理が期待できるよう、バキュロウイルス発現系において、凝集の発生を抑制しつつ、適切な量で蛋白質を発現させる技術を提供する。【解決手段】左から右方向へ以下のｂ）およびｃ）の構成を含んでなることを特徴とするバキュロウイルス転移ベクター、これにより外来遺伝子が導入されてなる組換えバキュロウイルス、バキュロウイルス発現系およびこれらを利用する組換え蛋白質および／またはポリペプチドの生産方法からなる。ｂ）特定の配列からなるバキュロウイルスＨＲｓ保存パリンドローム配列を少なくとも１つ以上包含するエンハンサＤＮＡ領域。ｃ）バキュロウイルスｖｐ３９遺伝子由来のプロモータ領域を包含するＤＮＡ領域。【選択図】図３
2008295449.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
左から右方向へ以下のｂ）およびｃ）の構成を含んでなることを特徴とするバキュロウイルス転移ベクター。
ｂ）配列番号１に記載するバキュロウイルスＨＲｓ保存パリンドローム配列を少なくと
も１つ以上包含するエンハンサＤＮＡ領域
ｃ）バキュロウイルスｖｐ３９遺伝子由来のプロモータ領域を包含するＤＮＡ領域
【請求項２】
左から右方向へ以下のａ）ないしｅ）の構成を含んでなることを特徴とするバキュロウイルス転移ベクター。
ａ）バキュロウイルス非必須遺伝子部位の５’末端または３’末端フランキング配列を
コードするバキュロウイルスのウイルスＤＮＡ配列
ｂ）配列番号１に記載するバキュロウイルスＨＲｓ保存パリンドローム配列を少なくと
も１つ以上包含するエンハンサＤＮＡ領域
ｃ）バキュロウイルスｖｐ３９遺伝子由来のプロモータ領域を包含するＤＮＡ領域
ｄ）所望の蛋白質あるいはポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
ｅ）バキュロウイルス非必須遺伝子部位の３’末端または５’末端フランキング配列を
コードするバキュロウイルスのウイルスＤＮＡ配列
【請求項３】
左から右方向へ以下のａ’）ないしｅ’）の構成を含んでなることを特徴とするバキュロウイルス転移ベクター。
ａ’）Ｔｎ７ＬまたはＴｎ７Ｒを含むＤＮＡ配列
ｂ）配列番号１に記載するバキュロウイルスＨＲｓ保存パリンドローム配列を少なくと
も１つ以上包含するエンハンサＤＮＡ領域
ｃ）バキュロウイルスｖｐ３９遺伝子由来のプロモータ領域を包含するＤＮＡ領域
ｄ）所望の蛋白質あるいはポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
ｅ’）Ｔｎ７ＲまたはＴｎ７Ｌを含むＤＮＡ配列
【請求項４】
前記ｃ）のプロモータ領域の下流に、所望の蛋白質あるいはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿入し得るクローニング制限酵素切断部位を包含するＤＮＡ領域をさらに含んでなる請求項１ないし３のいずれかに記載のバキュロウイルス転移ベクター。
【請求項５】
前記ｂ）のエンハンサＤＮＡ領域が、配列番号２に記載するバキュロウイルスＨＲｓ共通配列と８０％以上の相同性を有するＤＮＡ配列を包含するＤＮＡ領域である請求項１ないし４のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス転移ベクター。
【請求項６】
前記ｂ）のエンハンサＤＮＡ領域が、バキュロウイルスＨＲｓを包含するＤＮＡ領域である請求項１ないし４のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス転移ベクター。
【請求項７】
前記ｂ）のエンハンサＤＮＡ領域が、バキュロウイルスＨＲ３を包含するＤＮＡ領域である請求項１ないし４のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス転移ベクター。
【請求項８】
請求項１ないし７にいずれかの項に記載のバキュロウイルス転移ベクターにより外来遺伝子が導入されてなる組換えバキュロウイルス。
【請求項９】
外来遺伝子が抗体遺伝子である請求項８記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の組換えバキュロウイルスを感染させた鱗翅目昆虫細胞を含んでなる組換えバキュロウイルス発現系。
【請求項１１】
前記鱗翅目昆虫細胞が、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、ボンビックス・モリ（Bombyx mori）、ボンビックス・マンダリナ（Bombyx mandarina）、ヘリオシス・ビレセンス（Heliothis virescens）、ヘリオシス・ゼア（Heliothis zea）、マメストラ・ブラッシカス（Mamestra brassicas）、エスチグマン・アクレア（Estigmene acrea）もしくはトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）からなる鱗翅目昆虫の群から選択された細胞である請求項１０に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項１２】
前記鱗翅目昆虫細胞が、ボンビックス・モリの培養細胞、幼虫または蛹のいずれかである請求項１０に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項１３】
請求項１０ないし１２のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス発現系を含んでなる組換え蛋白質および／またはポリペプチドの生産方法。
【請求項１４】
請求項１０ないし１２のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス発現系を含んでなる抗体の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バキュロウイルス転移ベクター、これを利用して得られる組換えバキュロウイルス並びにこれらを利用する組換えバキュロウイルス発現系および組換え蛋白質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術を用いた有用蛋白質の生産は、今日では広く用いられている技術であり、バキュロウイルス発現系は、その技術の１つである。
【０００３】
このバキュロウイルス発現系では、バキュロウイルス非必須遺伝子であるポリヘドリン（AcMNPV orf8；BmNPV orf1：以下、「ｐｏｌｈ」と略す）のプロモータの後に、ｐｏｌｈに代えて外来遺伝子を挿入したコード配列を有するバキュロウイルス組換えベクターをバキュロウイルスと相同組換えすることで外来遺伝子発現ウイルスを作製する（特許文献１）。このｐｏｌｈと同様に、ｐ１０（AcMNPV orf137；BmNPV orf114）遺伝子由来のプロモータも、よく用いられている。
【０００４】
バキュロウイルス遺伝子は、４期の異なるウイルス複製サイクルのうち１期以降のサイクル中に、経時的に調整されながら、次々に発現する（非特許文献１）。したがって、発現の過程で、異なるバキュロウイルス遺伝子は、ウイルス複製サイクルに応じて、前初期（immediate-early期）、後初期（delayed-early期）、後期（late期）、最後期（very late期）に分類し得る。
【０００５】
ｐｏｌｈ遺伝子およびｐ１０遺伝子は、最後期に分類される遺伝子である。したがって、ｐｏｌｈ、ｐ１０などの最後期プロモータからの転写には、それ以前に発現される未知なる多数のウイルス生産物ならびに細胞生産物が必要になると思われる。このため、従来技術である最後期プロモータを用いる外来遺伝子の発現は、ウイルス感染が十分に進んだ後に行われることになる。また、これらの最後期プロモータは、短期間に急激な蛋白質の発現が特徴として挙げられる。
【０００６】
しかしながら、蛋白質を、大量にかつ急激に発現することは、凝集体の形成を引き起こすことが知られている。このため、蛋白質の発現量は多くても、活性型の目的蛋白質量が非常に低くなることが多い。このような凝集体の形成は、翻訳されたポリペプチド鎖が正しい立体構造にフォールディングする前に、中間体の段階で分子間相互作用により他のポリペプチド鎖と絡み合うことが原因として考えられており、ついには巨大な不溶性の複合体が形成されると考えられている。つまり、短期間に急激な蛋白質を発現させることは、ポリペプチド同士の接触の機会を増加させ、絡み合いを助長し、凝集体の形成を引き起こしやすい状態をもたらすと推測される。
【０００７】
この問題を解決するために、他の発現系では様々な手法が開発されているが（タカラバイオ  コールドショックプロモータ；特許文献２など）、バキュロウイルス発現系では同様の工夫は成功していない。また、ｐｏｌｈプロモータのような最後期発現プロモータで外来遺伝子を発現させる場合は、ウイルス感染ならびに増殖が十分に進んだ後に発現することになり、細胞が本来持っている蛋白質品質管理機能や発現能力が十分に期待できないという問題もある（非特許文献２）。
【０００８】
本出願人らは、従来からバキュロウイルス発現系を用いた蛋白質受託生産サービスを行っているが、この事業において、発現させた外来蛋白質の凝集が顕著な試料からこれに含まれる可溶性外来蛋白質を精製した場合、安定性が悪く、凝集してしまう事例を数多く経験している。しかし一方、凝集の少ない試料から精製した場合は、精製物の安定性が比較的良いことも経験しており、凝集の多寡と細胞内で産生される蛋白質の品質の間には何らかの関係があることが分かった。
【０００９】
これらの問題を解決するために、バキュロウイルス前初期遺伝子ｉｅ−１（AcMNPV orf147；BmNPV orf123）のプロモータや、バキュロウイルス後初期遺伝子３９ｋ（AcMNPV orf36；BmNPV orf27）のプロモータを用いることも検討されてきたが、バキュロウイルス発現系に用いた場合、発現量は十分ではなかった。
【００１０】
また、３９ｋプロモータの上流に、前初期および後初期プロモータに対するエンハンサとして知られるバキュロウイルス・ホモロガス・ＤＮＡ・リージョン（Homologous DNA Region；以下、「ＨＲｓ」と略す）を配置することで発現量が増大することが知られているが（非特許文献３）、これは主として細胞での形質転換で用いられる。このＨＲｓはエンハンサ機能を持ち、ＥｃｏＲＩ認識配列を中心としたパリンドロームが保存されていて（非特許文献４）、この領域にｉｅ−１遺伝子産物が結合すると考えられている。また、保存パリンドロームだけでも発現量が増大し、ＨＲ５（６回反復）では更に顕著であることが知られている（非特許文献５）。
【００１１】
更に、バキュロウイルス後期遺伝子ｖｐ３９（AcMNPV orf89；BmNPV orf72）のプロモータを用いた例（ｐＡｃＪＰ１、現在は市販されていない）もあり、発現量は十分であるものの、ｐｏｌｈプロモータには劣るため、現在では使用されなくなった。
【００１２】
更にまた、これを改善するためｐｏｌｈプロモータとの雑種プロモータも開発されたが（非特許文献６）、依然として細胞内品質管理の問題は解決されていない。上記ｖｐ３９と同様に後期遺伝子でありながら初期にもわずかに発現するｇｐ６４（AcMNPV orf128；BmNPV orf105）も用いられることがあるが、発現量は少なく、ＨＲｓで発現量が増加することが知られているが（非特許文献７）、十分ではなかった。
【００１３】
以上のような技術的背景から、凝集を抑制しながらも十分な量の蛋白質を発現するバキュロウイルス発現ベクターが求められていた。
【００１４】
【特許文献１】米国特許第４,７４５,０５１号
【特許文献２】特開２００６−３４０７２９
【特許文献３】特開２００３−５２３７１
【非特許文献１】P.D.Friesen及びL.K.Miller著、Curr.Top.Microbiol.Immunol.,              131:31 49(1986)
【非特許文献２】X.Du, S.M.Thiem(1997) J.Virol.71:7866-7872
【非特許文献３】L.A.Guarino,  M.D.Summers,J.Virol.,60:215-223(1986b)
【非特許文献４】L.A.Guarino、M.A.Gonzalez, M.D.Summers,J.Virol.,60:224-                  229(1986)
【非特許文献５】V.Olson, J.Wetter, P.Friesen, J.Virol.,77:5668-5677(2003)
【非特許文献６】Thiem et al., Gene 91(1):p87(1990)
【非特許文献７】ZHOU et al., Acta Biochimica et biophysica sinica 2003,                  35(1):p18
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、本発明の課題は、目的蛋白質を活性型で得られるように、バキュロウイルス発現系において、凝集の発生を抑制しつつ、適切な量で蛋白質を発現させる技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、まず発現時期が前初期、後期および後初期と後期を併せ持つ遺伝子として代表的なｉｅ−１、ｖｐ３９およびｇｐ６４遺伝子のプロモータ領域を含む開始コドン上流３５０ｂｐを用いて、バキュロウイルス発現系におけるグリーン・フロロレッセント・プロテイン（以下、「ＧＦＰ」という）の発現を、ＢｍＮ細胞を用いて経時的に調査した。この結果、ｖｐ３９プロモータでは、ほぼｐｏｌｈプロモータと同等の蛍光が確認されたものの後期で急激に発現しており、ｉｅ−１やｇｐ６４ではこれまで知られていた通り、ｐｏｌｈプロモータと比べてわずかな蛍光しか確認できなかった。
【００１７】
そこで発現量を増加させる目的で、エンハンサとして知られるＨＲｓのうちＨＲ３と、各プロモータ領域、それらの距離、さらに翻訳促進配列として知られているｐｏｌｈ５’ＵＴＲの組合せを検討し、同様にＧＦＰの経時的発現を調査したところ、ｉｅ−１およびｇｐ６４では若干の増加が見られたにとどまった。これに対し、ＨＲｓ保存バリンドローム配列であるＨＲ３と、ｖｐ３９の組合せでは、発現量はそれほど変化しないものの、蛋白質の発現時期が早くなり、しかも凝集が抑制されることを見出し、本発明を完成した。
【００１８】
すなわち本発明は、左から右方向へ以下のｂ）およびｃ）の構成を含んでなることを特徴とするバキュロウイルス転移ベクターである。
ｂ）配列番号１に記載するバキュロウイルスＨＲｓ保存パリンドローム配列を少なくと
も１つ以上包含するエンハンサＤＮＡ領域
ｃ）バキュロウイルスｖｐ３９遺伝子由来のプロモータ領域を包含するＤＮＡ領域
【００１９】
また本発明は、上記バキュロウイルス転移ベクターにより外来遺伝子が導入されてなる組換えバキュロウイルスである。
【００２０】
更に本発明は、前記の組換えバキュロウイルスを感染させた鱗翅目昆虫細胞を含んでなる組換えバキュロウイルス発現系である。
【００２１】
また更に本発明は、上記の組換えバキュロウイルス発現系を含んでなる組換え蛋白質および／またはポリペプチドの生産方法である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、蛋白質あるいはペプチドの発現時期を早め、かつ適切な量での蛋白質発現を可能とすることができるため、比較的凝集が少ない状態で外来蛋白質あるいはポリペプチドの生産を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の組換えバキュロウイルスを構築するには、まず、バキュロウイルス移転ベクターを構築することが必要である。このバキュロウイルス転移ベクターは、左から右方向へ以下のｂ）およびｃ）、
ｂ）配列番号１に記載するバキュロウイルスＨＲｓ保存パリンドローム配列（TTTACNNGTAGAATTCTACNNGTAAA：ここでNはA、C、GまたはTを示す）を少なくとも１つ以上包含するエンハンサＤＮＡ領域
ｃ）バキュロウイルスｖｐ３９遺伝子由来のプロモータ領域を包含するＤＮＡ領域
の２つのＤＮＡ領域を含むものであり、次の方法によって得ることができる。なお、本願明細書において、左から右方向とは、バキュロウイルスｖｐ３９遺伝子由来のプロモータ領域から転写が進行する方向である。また、上記エンハンサＤＮＡ領域に包含されるバキュロウイルスＨＲｓ保存パリンドローム配列は逆向になっていてもよい。
【００２４】
上記バキュロウイルス移転ベクターは、常法に従い、バキュロウイルスゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等の手段により配列番号１に記載するＨＲｓ保存パリンドローム配列を少なくとも１つ以上包含するエンハンサＤＮＡ領域をクローニングし、次いで同様にｖｐ３９プロモータを含む領域をクローニングすることにより構築することができる。上記した保存パリンドローム配列を少なくとも１つ以上包含するエンハンサＤＮＡ領域としては、例えば、バキュロウイルスＨＲｓ共通配列（CTAAACTCGCTTTACGAGTAGAATTCTACTTGTAAAACACAATCAAG：配列番号２）と８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ配列を包含するＤＮＡ領域、バキュロウイルスＨＲｓ共通配列を包含するＤＮＡ領域、バキュロウイルスＨＲ３（配列番号２９）を包含するＤＮＡ領域等が挙げられる。具体的なバキュロウイルスＨＲｓ共通配列と上記相同性を有するＤＮＡ配列を包含するＤＮＡ領域およびバキュロウイルスＨＲｓ共通配列を包含するＤＮＡ領域としては、前記ＤＮＡ配列およびＨＲｓ共通配列そのものもしくはこれら配列とその両端１００ｂｐを含む配列またはこれらの配列を複数回繰り返した配列等が挙げられる。また、バキュロウイルスＨＲ３を包含するＤＮＡ領域としては、バキュロウイルスＨＲ３そのものまたはバキュロウイルスＨＲ３とその下流約７００ｂｐからなるＨＲ３Ｌｏｎｇ断片（配列番号３０）等が挙げられ、これらの中でも特にＨＲ３Ｌｏｎｇ断片が好ましい。
【００２５】
一方、バキュロウイルスｖｐ３９遺伝子由来のプロモータ領域を包含するＤＮＡ領域としては、バキュロウイルスｖｐ３９遺伝子開始コドン上流５６〜６０ｂｐ及び、１０４〜１０８ｂｐに存在するバキュロウイルス後期プロモータモチーフ（DTAAG：ここでDはA、TまたはGを示す）を包含するもの等が挙げられる。具体的なバキュロウイルスｖｐ３９遺伝子由来のプロモータ領域を包含するＤＮＡ領域としては、バキュロウイルスｖｐ３９遺伝子開始コドン上流−１〜−１１０ｂｐ、好ましくは−１〜−３５０ｂｐからなるｖｐ３９ｐｒｏ（配列番号３１）が好ましい。
【００２６】
本発明の組換えバキュロウイルスにおいては、上記配列ｃ）の下流側には、所望の蛋白質あるいはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿入し得るクローニング制限酵素切断部位を包含するＤＮＡ領域を挿入することが望ましい。
【００２７】
上記所望の蛋白質あるいはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿入し得るクローニング制限酵素切断部位を包含するＤＮＡ領域としては、所望の外来遺伝子の挿入を適切な方向で行いうるマルチクローニングカセットが挙げられる。このマルチクローニングカセットの配列は数種の企業から入手可能であり（タカラバイオ、東洋紡など）、またはＤＮＡ合成装置を用いて合成することも可能である。いずれの方法も日常的に用いられており、また、これらマルチクローニングカセット単位の使用についても、当該技術分野において既知のものである。
【００２８】
また、このマルチクローニングカセットの下流側には、ｐｏｌｙＡシグナル好ましくはｐｏｌｈ遺伝子由来のｐｏｌｙＡシグナルを含む３’末端領域が続くことが望ましい。このｐｏｌｙＡシグナルも、市販されているベクター中から入手することができ、また合成することも可能である。
【００２９】
上記バキュロウイルス移転ベクターの好ましい１態様としては、次のものを挙げることができる。すなわち、エンハンサ側の上流側に、次のＤＮＡ配列ａ）
ａ）バキュロウイルス非必須遺伝子部位の５’末端フランキング配列をコードするバキ
ュロウイルスのウイルスＤＮＡ配列
を結合し、プロモーター側の下流側には、更に次の配列ｅ）
ｅ）バキュロウイルス非必須遺伝子部位の３’末端フランキング配列をコードするバキ
ュロウイルスのウイルスＤＮＡ配列
を結合すればよい。
【００３０】
上記配列ａ）およびｅ）のバキュロウイルス非必須遺伝子部位の好適な例としては、ｐｏｌｈを挙げることができる。すなわち、ｐｏｌｈ遺伝子領域を相同組換えにより置き換えることができるようなバキュロウイルスＤＮＡが入手しやすいことによる。このようなバキュロウイルスＤＮＡとしては、例えば、カイコ生体や、カイコより樹立された培養細胞（ＢｍＮ、ＢｏＭｏなど）に感染するＢｍＮＰＶに由来するＢｍＮＰＶ  ＤＮＡ，１  Ｃｕｔ（日本農産工業）等、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）やトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）などの生体並びにそれらから樹立された昆虫培養細胞（Ｓｆ−９、Ｓｆ−２１、Ｔｎ−５、Ｔｎ−３６８など）に感染するＡｃＭＮＰＶに由来するＢａｃＶｅｃｔｏｒ−１０００  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｃｕｔ  ＤＮＡ（ノバジェン）、ＢａｃＶｅｃｔｏｒ−２０００  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｃｕｔ  ＤＮＡ（ノバジェン）等、ＢｍＮＰＶ及びＡｃＭＮＰＶの双方の宿主に感染するＡＢｖバキュロウイルス（片倉工業：特許文献３）があげられる。
【００３１】
なお、上記配列ａ）およびｅ）の５’末端フランキング配列と、３’末端フランキング配列は、これを入れ替えることができる。すなわち、転移ベクター中には、相同組換えが上手くいくように、５’末端フランキング配列と、３’末端フランキング配列が存在すればよく、その中間に挟み込まれる配列ｂ）、ｃ）等で構成される配列が逆向きになっていてもよい。具体的な、ａ）およびｅ）の５’末端フランキング配列と、３’末端フランキング配列としては、ｐｏｌｈ上流の必須遺伝子ｌｅｆ−２の終始コドンを含んでさらに上流５００ｂｐ〜５ｋｂｐ、好ましくは２〜３ｋｂｐを含む配列と、ｐｏｌｈ下流の必須遺伝子ｏｒｆ１６２９の終始コドンを含んでさらに下流（ｌｅｆ−２とは逆向きなので、ｏｒｆ１６２９のＣＤＳの方向）５００ｂｐ〜５ｋｂｐ、好ましくは２〜３ｋｂｐを含む配列の組み合わせ等が挙げられる。なお、前記配列には更に、それぞれの遺伝子のｐｏｌｙＡシグナルを含む領域（終始コドン以降３０〜７０ｂｐ）をも含んでいることが好ましい。
【００３２】
また、上記配列ａ）およびｅ）のバキュロウイルス非必須遺伝子部位の別の好適な例としては、上記フランキング領域に換えてＴｎ７ＲおよびＴｎ７Ｌを挿入したバキュロウイルス転移ベクターを挙げることができる。このようなベクターは、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン）に用いることにより組換えバキュロウイルスを得ることができる。このバキュロウイルス転移ベクターにおいてもＴｎ７ＲおよびＴｎ７Ｌは入れ替えても良い。
【００３３】
上記バキュロウイルス転移ベクターの、配列ｃ）の下流側に、配列ｄ）として所望の蛋白質あるいはポリペプチド（以下、合わせて「蛋白質」という）をコードする外来遺伝子・外来ＤＮＡのＤＮＡ領域を組み込むことができる。この蛋白質を発現させる外来遺伝子・外来ＤＮＡには、ウイルス由来の遺伝子・ＤＮＡを含む原核生物由来遺伝子・ＤＮＡおよび、真核生物由来遺伝子・ＤＮＡが含まれる。好ましい遺伝子・ＤＮＡとしては、例えば、抗体遺伝子等が挙げられる。なお、前記ベクター中にクローニング制限酵素切断部位が組み込まれている場合には、それを利用してコードする外来遺伝子・外来ＤＮＡのＤＮＡ領域を組み込むことができる。このようにしたウイルス転移ベクターをウイルスＤＮＡと相同組換えし、得られた組換えバキュロウイルスを宿主細胞に感染させることによって当該細胞内で所望の蛋白質を発現させることが可能となる。また、蛋白質として抗体を発現させる際には、抗体遺伝子全体を用いて、前記方法により宿主細胞に感染させ、当該細胞内で抗体を発現させるだけでなく、抗体の軽鎖遺伝子と重鎖遺伝子とを別々のバキュロウイルスに組み込み、それらを宿主細胞に混合感染させ、当該細胞内で抗体を発現させることも可能である。
【００３４】
上記バキュロウイルス転移ベクターの最適実施態様としてはｐＭＶＰＬＲ（配列番号３２）が挙げられ、このものは左から右方向へ以下の構成を有する。
１）バキュロウイルスＢｍＮＰＶ（Ｔ３株）由来のＤＮＡ配列で、ｂｒｏ−ｅ、ｏｒｆ
１３３、ｏｒｆ１３４、ｌｅｆ−２遺伝子を包含する領域（５５８２〜７６９２番
目）
２）バキュロウイルスＢｍＮＰＶ（Ｔ３株）由来のＤＮＡ配列で、タンパクをコード
していない、ポリヘドリン遺伝子上流のＤＮＡ配列（７６２５〜７６９２番目）
３）バキュロウイルスＢｍＮＰＶ（Ｔ３株）由来のＤＮＡ配列で、ＨＲ３（７６９８〜
８７３３番目）を包含するＤＮＡ領域（ＨＲ３Ｌｏｎｇ断片：７６９８〜９３９４
番目）
４）バキュロウイルスＢｍＮＰＶ（Ｔ３株）のｖｐ３９遺伝子のプロモータ領域を含む
ＤＮＡ領域（ｖｐ３９ｐｒｏ：９４４２〜９７９１番目）
５）バキュロウイルスＢｍＮＰＶ（Ｔ３株）由来のＤＮＡ配列で、ポリヘドリン遺伝
子停止コドン下流から、ｏｒｆ１６２９、ＰＫ１、ｏｒｆ４遺伝子を包含する領域
（９８〜２８８５番目）
【００３５】
ウイルス転移ベクターとウイルスＤＮＡとの相同組換えにおいては、組換え効率を高めるために上記バキュロウイルスＤＮＡは線状化されたものを用いることが望ましい。このために用いる、バキュロウイルスＤＮＡを消化ないし切断のための制限酵素としては、Ｅｃｏ８１Ｉを挙げることができ、一つのバキュロウイルスＤＮＡ中での消化、切断個所は１ないし３箇所とすることが望ましい。
【００３６】
更に、本発明の組換えバキュロウイルスにより、蛋白質を産生させるための宿主としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、ボンビックス・モリ（Bombyx mori）、ボンビックス・マンダリナ（Bombyx mandarina）、ヘリオシス・ビレセンス（Heliothis virescens）、ヘリオシス・ゼア（Heliothis zea）、マメストラ・ブラッシカス（Mamestra brassicas）、エスチグマン・アクレア（Estigmene acrea）もしくはトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）を含む鱗翅目昆虫細胞を挙げることができ、培養細胞であっても、幼虫、蛹等の生体であっても良い。
【００３７】
なお、組換えバキュロウイルスを感染させた宿主細胞の培養時間は産生させる蛋白質の種類等により相違するが、一般には、培養細胞の場合には２から５日程度、幼虫または蛹の場合には５から７日程度である。
【００３８】
本発明の最適実施態様としては、ＡＢｖバキュロウイルスを元に構築され、所望の外来遺伝子を組み込んだ組換えＡＢｖバキュロウイルスを用い、これを、カイコ培養細胞あるいは幼虫、蛹に感染させ、所望の外来遺伝子を発現させる方法を挙げることができる。
【００３９】
上記最適実施態様において、特に外来遺伝子として抗体遺伝子を発現させた場合には、従来のプロモーターを用いて発現させた場合よりも、発現量の増加、会合体の形性の抑制等の優れた効果が得られる。
【実施例】
【００４０】
以下に、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制約されるものではない。本明細書に記載の内容を元に、本発明の構成および実施に関する様々な修正および変更が可能であることは当業者らによって容易に理解でき、これらは本発明の趣旨およびその範囲内にある。なお、以下の実施例において用いた開始材料および方法は、次の通りである。
【００４１】
（プロモータの取得）
ＢｍＮＰＶ−Ｔ３株（Accession No. NC_001962）のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、ＨＲ３とｖｐ３９プロモータならびに比較検討に用いるｉｅ−１、ｇｐ６４プロモータをＰＣＲによって取得した。
【００４２】
（線状化バキュロウイルスＤＮＡの取得）
組換えウイルス製造のための線状化バキュロウイルスＤＮＡは、ＡＢｖバキュロウイルス（片倉工業；特開２００３−５２３７１）のものを用いた。より具体的には１０分程度氷水などで低温麻酔した５令１日目のカイコ幼虫を行い、１×１０６個／１００μｌの濃度のＡＢｖバキュロウイルス液をＧ−２６などの注射針の付いた注射器を用いて皮下注射する。その後、カイコ３令用人工飼料（モーラス：片倉工業）を用いて、２５℃、湿度４５％で７日間飼育を行うことにより、バキュロウイルス粒子を増殖させ、幼虫の体液あるいは虫体磨砕液よりバキュロウイルス粒子を得た。
【００４３】
得られたバキュロウイルス粒子を、プロテイナーゼＫ消化とフェノール抽出に付し、ゲノムＤＮＡを精製した。さらにこれに制限酵素を作用させて、消化、切断し、線状化バキュロウイルスＤＮＡを得た。例えば、ＡＢｖバキュロウイルスゲノムＤＮＡの消化、切断の場合、バキュロウイルス  ＤＮＡ２００μｇに対して、制限酵素Ｅｃｏ８１Ｉを３０ｕｎｉｔｓ用い、３７℃で２０時間の処理条件で反応させることにより行われる。
【００４４】
（一般的手法）
なお、本明細書に記載の操作のうち、プラスミド調製、制限酵素消化などの基本的な操作については、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．”（2001年、Cold Spring Harbor Laboratory発行）に記載の方法によった。プラスミドの構築に使用した制限酵素および他の酵素は、タカラバイオ、東洋紡のいずれかから入手した。
【００４５】
また、プラスミドの構築は、特に記載が無い限りライゲーションはベクターを５ｆｍｏｌ、インサートを１５ｆｍｏｌとし、同量（５〜１０μＬ）のライゲーションキット（タカラバイオ）のソリューションＩ液を加え、１６℃で、１時間反応した。反応液を全て使用し、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ培地上で選択した。クローンを選抜後、プラスミドを精製した。この精製物を  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用い、下記の条件でシークエンス反応を行い、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３１００−ａｖａｎｔ（アプライドバイオシステムズ）にて解析した。
【００４６】
＜シークエンス反応＞
１．９６.０℃  １分
２．９６.０℃  １０秒
３．５０.０℃  ５秒
４．６０.０℃  ４分
５．２〜４を２５回繰り返し
【００４７】
ＰＣＲは、特に記載がない限りＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡）を用い、下記の条件でＤＮＡ−Ｅｎｇｉｎｅ（バイオラッド）により反応を行った後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン）により精製した。
【００４８】
＜ＰＣＲ反応＞
１．９４.０℃  ２分
２．９４.０℃  １５秒
３．５０.０℃  ３０秒
４．６８.０℃  １ｋｂｐにつき１分
５．２〜４を３０回繰り返し
【００４９】
組換えバキュロウイルスの作製は、線状化ＡＢｖバキュロウイルスＤＮＡと外来遺伝子導入バキュロウイルス転移ベクターのコ・トランスフェクションにより行った。すなわち、まず、３５ｍｍ細胞培養用ディッシュを用いて、ＢｍＮ細胞を約１×１０６個の単層に、静置培養で準備した。線状化ＡＢｖバキュロウイルスＤＮＡ（片倉工業）０．２μｇと、外来遺伝子導入バキュロウイルス転移ベクター０．５μｇを１．５ｍｌチューブ中で１００μｌのＴＣ−１００（無血清）に混合し、室温で１５分間静置した。ＴＣ−１００（無血清）１００μｌにカチオン性脂質試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；  インビトロジェン）を４μｌ混合し、室温で１５分間静置した。次に２つの溶液を混合し、さらに室温で１５分間静置した後に８００μｌのＴＣ−１００（無血清）を加えた。この混合液を３５ｍｍの細胞培養用ディッシュで単層に準備したＢｍＮ細胞に加え、２５℃で１６時間培養後に混合液を除去し、新たなＴＣ−１００（１０％ＦＢＳを含む）を２ｍｌ添加して、２５℃で７日間静置培養した。その培養上清を組換えウイルス原液とした。
【００５０】
組換えウイルス原液からの外来遺伝子組換えＡＢｖバキュロウイルスの単離は、”Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｒｙ  Ｇｕｉｄｅ”（L.A. KING and R.D.POSSE (1992)）の方法で行った。すなわち、ＢｍＮ細胞を１穴当たり１.５×１０３個／５０μｌ  ＴＣ−１００（１０％ＦＢＳ）で培養した９６穴プレートを準備した。組換えウイルス原液をＴＣ−１００（１０％ＦＢＳ）を用いて１０−３、１０−４、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８と６段階に希釈したウイルス希釈液を、各プレートの１穴当たり５０μｌずつ混合し感染させた。これらのプレートは乾燥防止のためシールして２５℃で静置培養した。組換えウイルスの選抜は、感染７日目に、光学顕微鏡下で多角体の形成がないことを確認することによって行った。
【００５１】
実  施  例  １
ＧＦＰによる経時的発現量の調査
（１）比較用バキュロウイルス転移ベクター調製用プラスミド（ｐＭＰｒｏＸＸ）の
構築：
本発明のバキュロウイルス転移ベクターを構築する開始材料としてはｐＭ０００００１（片倉工業、図１参照、以下、「ｐＭ０１」と略す）を用いた。また、従来のバキュロウイルス発現系、すなわち陽性対照区としてもこのベクターを用いた。これはｐｏｌｈプロモータを含むため、次の方法によりこれを除き、さらに構築に有用な複数の制限酵素認識部位を導入した。
【００５２】
すなわち、ｐＭ０１を鋳型とし、プライマー１（5'-aacaatgtaccgcgcggcgg-3'）及びプライマー２（5'-agatcttaagctagcaagcatatggccatggtatttccatttgtatcgttaataaaaaac-3'）を用いて、ＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＸＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。一方、ｐＭ０１をＢｓｔＸＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、アルカリフォスファターゼにより切断面を脱リン酸化した。ＤＮＡ断片と線状化したｐＭ０１をライゲーションして、大腸菌を形質転換した。この形質転換体のクローンをプラスミド精製、そしてｐＭ．ｒｅｖ（5'-caacgcacagaatctaacgc-3’）のプライマーを用いて塩基配列確認を行ってｐＭＰｒｏＸＸを選抜した。以下につづく（２）から（５）までのプラスミド構築の概略を図２に示す。
【００５３】
（２）ＨＲ３の取得及びベクターへの組込み
ＢｍＮＰＶ−Ｔ３株（Accession No. NC_001962）のウイルスゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマー３（5'-ccatggaatattagacaacaaagatttattttattcatg-3'）及びプライマー４（5'-aatattacgtccctgccagaa-3'）を用いて、ＰＣＲ断片（以下、「ＨＲ３Ｌｏｎｇ断片」という）を取得した。このＨＲ３Ｌｏｎｇ断片を、Ｅｘ−ＴａｑとｄＡＴＰによって末端にアデニンを１つ突出させて、ｐＴ７−Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ）とライゲーションして、大腸菌を形質転換した。
【００５４】
この形質転換体のクローンをプラスミド精製、そしてＭ１３．ｒｅｖ（5'-tcacacaggaaacagctatg-3'）のプライマーを用いて塩基配列確認を行って選抜した。この時、ＨＲ３Ｌｏｎｇは５’→３’向き（ＨＲ３ＬＲ／ｐＴ７）と３’→５’向き（ＨＲ３ＬＬ／ｐＴ７）の２種類を取得した。
【００５５】
上記ＨＲ３ＬＲ／ｐＴ７を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｈｅＩを用いて消化し、ＨＲ３Ｌｏｎｇ断片を切り出した。一方、上記（１）で作製したｐＭＰｒｏＸＸを、制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｈｅＩを用いて消化し、アルカリフォスファターゼにより切断面を脱リン酸化した。ＨＲ３Ｌｏｎｇ断片と線状化したｐＭＰｒｏＸＸをライゲーションして、大腸菌を形質転換した。この形質転換体のクローン（ｐＭＰｒｏＬＲ）をプラスミド精製、そしてｐＭ．ｒｅｖ（5'-caacgcacagaatctaacgc-3'）のプライマーを用いて塩基配列確認を行って選抜した。
【００５６】
また同様に、上記ＨＲ３ＬＬ／ｐＴ７を制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。これをＤＮＡブランティングキット（タカラバイオ）により切断面を平滑末端化し、ＨＲ３Ｌｏｎｇ断片を切り出した。一方、（１）で作製したｐＭＰｒｏＸＸを、制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｄｅＩを用いて消化した。これを同様に平滑末端化し、切断面を脱リン酸化した。ＨＲ３Ｌｏｎｇ断片と線状化したｐＭＰｒｏＸＸをライゲーションして、大腸菌を形質転換した。この形質転換体のクローン（ｐＭＰｒｏＬＬ）をプラスミド精製、そしてｐＭ．ｒｅｖ（5'-caacgcacagaatctaacgc-3'）のプライマーを用いて塩基配列確認を行って選抜した。
【００５７】
上記ＨＲ３ＬＲ／ｐＴ７を制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｄｅＩを用いて消化し、ＤＮＡ断片を切り出し、バキュロウイルスＨＲ３（以下、「ＨＲ３Ｓｈｏｒｔ断片」という）を得た。一方、（１）で作製したｐＭＰｒｏＸＸを制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｄｅＩを用いて消化し、切断面を脱リン酸化した。ＨＲ３Ｓｈｏｒｔ断片と線状化したｐＭＰｒｏＸＸをライゲーションして、大腸菌を形質転換した。この形質転換体のクローン（ｐＭＰｒｏＳＲ）をプラスミド精製、そしてｐＭ．ｒｅｖ（5'-caacgcacagaatctaacgc-3'）のプライマーを用いて塩基配列確認を行って選抜した。
【００５８】
また同様に、ＨＲ３ＬＬ／ｐＴ７を、制限酵素ＮｃｏＩを用いて消化し、ＤＮＡブランティングキット（タカラバイオ）により切断面を平滑末端化し、更に制限酵素ＮｄｅＩを用いて消化した。一方、（１）で作製したｐＭＰｒｏＸＸを制限酵素ＮｈｅＩを用いて消化し、ＤＮＡブランティングキットにより切断面を平滑末端化し、更に制限酵素ＮｄｅＩを用いて消化し、アルカリフォスファターゼにより切断面を脱リン酸化した。ＨＲ３  Ｓｈｏｒｔ断片と線状化したｐＭＰｒｏＸＸをライゲーションして、大腸菌を形質転換した。この形質転換体のクローン（ｐＭＰｒｏＳＬ）をプラスミド精製、そしてｐＭ．ｒｅｖ（5'-caacgcacagaatctaacgc-3'）のプライマーを用いて塩基配列確認を行って選抜した。
【００５９】
（３）発現時期が異なるバキュロウイルス由来プロモータの取得及びベクターへ
の組込み
ＢｍＮＰＶ−Ｔ３株（Accession No. NC_001962）のウイルスゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー５（5'-gctagcatcccaacggcgcagtg-3'）及びプライマー６（5'-agatcttaagagtcgtttggttgttcacgat-3'）を用いて、ＰＣＲを行い、ｉｅ−１プロモータ断片（ｉｅ−１開始コドン上流３５０ｂｐ）を取得した。同様に、プライマー７（5'-gctagcttggtaaacgtacactttaattattttac-3'）及びプライマー８（5'-agatcttaagattgttgccgttataaatatggac-3'）を用いてＰＣＲを行い、ｖｐ３９プロモータ断片を取得した。また、プライマー９（5'-gctagctttaaataaaccaaacacatgaatataatttt-3'）及びプライマー１０（5'-agatcttaagtgaggcatcttatatacccg-3'）を用いてＰＣＲを行い、ｇｐ６４プロモータ断片を取得した。この３種類のプロモータ断片をＥｘ−ＴａｑとｄＡＴＰによって末端にアデニンを１つ突出させて、ｐＴ７−Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ）とそれぞれライゲーションして、大腸菌を形質転換した。
【００６０】
これら形質転換体のクローン（ＩＥ／ｐＴ７，ＶＰ／ｐＴ７，ＧＰ／ｐＴ７）をプラスミド精製、そしてＭ１３．ｒｅｖ（5'-tcacacaggaaacagctatg-3'）のプライマーを用いて塩基配列確認を行って選抜した。これらのプラスミドを制限酵素ＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、それぞれのプロモータ断片（ＩＥ，ＶＰ，ＧＰ）を切り出した。
【００６１】
ｐｏｌｈプロモータ断片（ＰＨ）は、コア配列のみを合成した。すなわち５０ｍＭ−ＮａＣｌ中に、１μＭ合成ＤＮＡ１（5'-CTAGCaaataataaccatctcgcaaataaataCTTAA-3'）及び１μＭ合成ＤＮＡ２（5'-GATCTTAAGtatttatttgcgagatggttattatttG-3'）を混合し、熱変性後、徐冷して２本鎖ＤＮＡを形成させた。さらに、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５’末端をリン酸化した。
【００６２】
一方、上記（１）で作製したｐＭＰｒｏＸＸおよび（２）で作製した４種類のプラスミド（ｐＭＰｒｏＬＲ，ｐＭＰｒｏＬＬ，ｐＭＰｒｏＳＲ，ｐＭＰｒｏＬＬ）を、制限酵素ＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩを用いて消化し、アルカリフォスファターゼにより切断面を脱リン酸化した。上記４種類のプロモータ断片（ＩＥ，ＶＰ，ＧＰ，ＰＨ）と計５種類の線状化したプラスミドを計２０種類の組合せでライゲーションして、大腸菌を形質転換した。
【００６３】
この形質転換体のクローンをプラスミド精製、そしてｐＭ．ｒｅｖ（5'-caacgcacagaatctaacgc-3'）のプライマーを用いて塩基配列確認を行って選抜した。
【００６４】
（４）Ｐｏｌｈ遺伝子５’ＵＴＲの取得及びベクターへの組込み
ｐＭ０１（片倉工業）を鋳型として、プライマー１１（5'-cttaagaagtattttactgttttcgtaacagtt-3'）及びプライマー１２（5'-atagtccagccatcggtttg-3'）を用いてＰＣＲを行い、ｐｏｌｈ遺伝子５’ＵＴＲ断片を取得した。この５’ＵＴＲ断片を、Ｅｘ−ＴａｑとｄＡＴＰによって末端にアデニンを１つ突出させ、ｐＴ７−Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒとライゲーションして、大腸菌を形質転換した。この形質転換体のクローン（５ＵＴＲ／ｐＴ７）をプラスミド精製、そしてＭ１３．ｒｅｖ（5'-tcacacaggaaacagctatg-3'）のプライマーを用いて塩基配列確認を行って選抜した。
【００６５】
上記５ＵＴＲ／ｐＴ７に制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＳｎａＢＩを用いて消化し、ｐｏｌｈ遺伝子５’ＵＴＲ断片を切り出した。一方、（３）で作製した２０種類のプラスミドに制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＳｎａＢＩを用いて消化し、アルカリフォスファターゼにより切断面を脱リン酸化した。５’ＵＴＲ断片と２０種類の線状化したプラスミドをライゲーションして、大腸菌を形質転換した。この形質転換体のクローンをプラスミド精製、そしてｐＭ．ｒｅｖ（5'-caacgcacagaatctaacgc-3'）のプライマーを用いて塩基配列確認を行って選抜した。これらのプラスミドの構築に用いたバキュロウイルス転移ベクター名、利用プロモータおよびエンハンサ、挿入方向等を表１に示す。
【００６６】
【表１】
2008295449.tif 000003
【００６７】
（５）オワンクラゲ緑色蛍光蛋白質遺伝子を挿入したバキュロウイルス転移ベクターの
構築
オワンクラゲ緑色蛍光蛋白質（野生型のもの、以下、「ＧＦＰ」と表記する）遺伝子（Accession   No. M62653）を、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、ＧＦＰ遺伝子断片を切り出した。一方、（３）および（４）で作製した４０種類のプラスミドならびに陽性対照区としてｐＭ０１（片倉工業）を、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、アルカリフォスファターゼにより切断面を脱リン酸化した。ＧＦＰ遺伝子断片と計４１種類の線状化したプラスミドをライゲーションして、大腸菌を形質転換した。この形質転換体のクローンをプラスミド精製し、ｐＭ．ｒｅｖ（5'-caacgcacagaatctaacgc-3'）のプライマーを用いて塩基配列確認を行って選抜した。
【００６８】
（６）プロモータおよびＨＲｓ組換えバキュロウイルスの作製
上記（５）で得られた４１種類のＧＦＰ導入バキュロウイルス転移ベクターおよび陰性対照区としてＧＦＰを導入していないｐＭ０１（片倉工業）をＡＢｖバキュロウイルスとのコ・トランスフェクションを行うことにより、組換えウイルス原液を得た。
【００６９】
上記で得た各ウイルス原液よりそれぞれＧＦＰ組換えＡＢｖバキュロウイルスの単離を”Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｒｙ  Ｇｕｉｄｅ”（L. A. KING and R. D. POSSE A Laboratry Guide (1992)）の方法で行った。すなわち、ＢｍＮ細胞を１穴当たり１．５×１０３個／５０μｌ  ＴＣ−１００（１０％ＦＢＳ）で培養した９６穴プレートを準備した。組換えウイルス原液を、ＴＣ−１００（１０％ＦＢＳ）を用いて１０−３、１０−４、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８と６段階に希釈して調製したウイルス希釈液を、各プレートの１穴当たり５０μｌずつ混合し感染させた。これらのプレートは乾燥防止のためシールして２５℃で静置培養した。組換えウイルスの選抜は、感染７日目に、光学顕微鏡下で多角体の形成がないことを確認することによって行った。陰性対照区以外はさらにＧＦＰ蛋白質による蛍光が見られる組換えウイルスを選抜し、クローン化した。このとき２種類（ｐＶＰＸＸ５，ｐＧＰＬＬ５）については組換えウイルスを得ることができなかった。
【００７０】
（７）ＧＦＰ蛍光測定による各プロモータおよびＨＲ３ならびにｐｏｌｈ５’ＵＴＲ
の影響の解析
ＢｍＮ細胞を１穴当たり１．５×１０３個／５０μｌ  ＴＣ−１００（１０％ＦＢＳ）で培養した９６穴プレートを準備した。上記（６）で得た４０種類のＧＦＰ遺伝子発現ウイルスをｍ．ｏ．ｉ．＝５で感染させた。感染後、２時間ごとにＧＦＰの蛍光を、励起波長３９８ｎｍ、カットオフ４５５ｎｍ、測定波長５０９ｎｍの条件で経時的に測定を行った。
【００７１】
得られた蛍光強度（ＲＦＵ）のデータから陰性対照区のＲＦＵを差し引き、それぞれの組換えウイルスのＧＦＰ発現カーブを、”Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．”，２３，１１２．（Rodbard, D. and McClean, S.W. (1977)）の方法に準じてロジット（logit）変換を用いて以下の４係数ロジスティック曲線に回帰した。
【００７２】
４係数ロジスティック曲線は、酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）の検量線や生物の成長曲線、蛋白質の経時的発現曲線などに現れるＳ字型カーブを表すのに用いられる。上記で得られたデータは次式のように回帰した。このとき、Ａ＝０とした場合、Ｄは最大発現量（ＲＦＵ）を表し、ＣはＳ字の変曲点に当たる時間（ｈ）を、ＢはＳ字の曲率を表す。
【００７３】
なお用いられた回帰式は、次のものである。
【数１】
2008295449.tif 000004
【００７４】
この結果、ｉｅ−１およびｇｐ６４両遺伝子のプロモータおよびｐｏｌｈコア配列のみでは、最大発現量すなわち係数Ｄが、ＨＲ３等の付加の有無に関わらず、従来の技術すなわちｐＭ０１の１０％にも満たないことが分かった。よって、これらのプロモータを単独またはＨＲ３等との組合せで用いた場合、蛋白質生産の手段としては非効率的であると判断した。一方、ｖｐ３９プロモータを用いた場合は比較的高い発現量が認められたので、更に詳細に調査した。
【００７５】
上記４係数ロジスティック回帰曲線の式を以下のように変形し、１０％および９０％発現時間を算出した。１０％発現時間の早い順に、ベクターの構成と併せて下記の表２に示す。
【数２】
2008295449.tif 000005
【００７６】
【表２】
2008295449.tif 000006
【００７７】
ＨＲ３エンハンサを挿入した場合、すべてのもので１０％発現時間がｖｐ３９プロモータ単独（上記ｐＭＶＰＸＸ）と比較して早くなっていた。また、ｐｏｌｈ  ５’ＵＴＲは発現時期には殆ど影響しないことがわかった。よって、ＨＲ３の効果は発現時期を早めるものであることが示唆された。特にｐＭＶＰＬＲで発現時期が早いことが示された。直感的に理解しやすいよう、ｖｐ３９プロモータ単独（上記ｐＭＶＰＸＸ）および従来のｐｏｌｈプロモータ（上記ｐＭ０１）と併せて測定データおよびそれらの回帰曲線を図３にグラフ化した。
【００７８】
以降の実施例では、これら３種類のバキュロウイルス転移ベクターをＧａｔｅｗａｙデスティネーションベクター化したものでの発現比較を行った。すなわち、従来技術（ｐｏｌｈプロモータ）としての対照区はｐＭ０１、バキュロウイルスＨＲ３の効果を検証するための対照区はｐＭＶＰＸＸ、本発明のベクターの例はｐＭＶＰＬＲをベースとしたものである。
【００７９】
実  施  例  ２
蚕及び蛹での経時的発現量の調査
（１）ｐＭ０１、ｐＭＶＰＸＸ、ｐＭＶＰＬＲのＣ末端６ｘＨｉｓタグ付加デスティ
ネーションベクター化
ｐＭ０ＣＨＴ１５（片倉工業：ｐＭ０１のＣ末端６ｘＨｉｓタグ融合蛋白質発現用ベクター）を、制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて消化し、ＤＮＡブランティングキット（タカラバイオ）により切断面を平滑末端化した。これを制限酵素ＥｃｏＲＶによって消化した後、アルカリフォスファターゼにより切断面を脱リン酸化した。
【００８０】
２５ｎｇの、ゲートウエイ・リーディング・フレーム・カセットＢ（Gateway reading frame cassette B；インビトロジェン、以下、「ＲｆＢ」と略す）と５０ｎｇの線状化したプラスミドをライゲーションし、反応液を５倍に希釈し、その１μＬを用いて大腸菌ＤＢ３．１（インビトロジェン）を形質転換した。このクロラムフェニコール耐性形質転換体のクローンをプラスミド精製、そしてｐＭ．ｒｅｖ（5'-caacgcacagaatctaacgc-3'）のプライマーを用いて塩基配列確認を行って選抜し、ｐＭ０１−ＤｅｓｔＣＨとした。
【００８１】
ｐＭ０１−ＤｅｓｔＣＨを、制限酵素ＫｐｎＩとＳｎａＢＩを用いて消化し、ＲｆＢ断片とそれに続く６ｘＨｉｓタグ付加配列を切り出した。一方、上記ｐＭＶＰＸＸおよびｐＭＶＰＬＲを、制限酵素ＫｐｎＩとＳｎａＢＩを用いて消化し、アルカリフォスファターゼにより切断面を脱リン酸化した。上記６ｘＨｉｓタグ付加ＲｆＢ断片と線状化したプラスミドをライゲーションして、大腸菌ＤＢ３．１（インビトロジェン）を形質転換した。このクロラムフェニコール耐性形質転換体のクローンをプラスミド精製、そしてｐＭ．ｒｅｖ（5'-caacgcacagaatctaacgc-3'）のプライマーを用いて塩基配列確認を行って選抜し、それぞれｐＭＶＰＸＸ−ＤｅｓｔＣＨ、ｐＭＶＰＬＲ−ＤｅｓｔＣＨとした。これらのプロモータ周辺の差異を図４に簡単に示す。
【００８２】
（２）ＰＤＥ４Ｃ（phosphodiesterase 4C）遺伝子を挿入した各バキュロウイルス転移
ベクターの構築
ＰＤＥ４Ｃ遺伝子を含むエントリークローンベクター（ＪＢＩＣ成果コンソＩからＧａｔｅｗａｙエントリークローンを入手：No.FLJ38065AAAF）を、ｐＭ０１−ＤｅｓｔＣＨ、ｐＭＶＰＸＸ−ＤｅｓｔＣＨ、ｐＭＶＰＬＲ−ＤｅｓｔＣＨの各デスティネーションベクターと、それぞれ製造業者のマニュアルに従いＧａｔｅｗａｙ  ＬＲクロネース（インビトロジェン）によってＬＲクロネース反応した。反応溶液すべてを用いて８０μＬの大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。この形質転換体のクローンをプラスミド精製、そしてｐＭ．ｒｅｖ（5’-caacgcacagaatctaacgc-3’）のプライマーを用いて塩基配列確認を行って選抜した。また、プラスミドの名前をこれまでと比較しやすいよう、下記の通りに読み替えた。この読み替えは、後に続く実施例でも同様とする。
【００８３】
【表３】
2008295449.tif 000007
【００８４】
（３）ＰＤＥ４Ｃ遺伝子組換えバキュロウイルスの作製
コ・トランスフェクションにより、上記３種類のベクターをＡＢｖバキュロウイルスと組み換えた。次に、ウイルス感染細胞を回収し、抗Ｈｉｓ抗体を用いて、ウエスタンブロッティング解析により、Ｈｉｓ融合蛋白質の発現が見られ、且つウイルスゲノム中にＰＤＥ４Ｃ遺伝子がそれぞれ導入されている組換えウイルスを選抜し、クローン化した。
【００８５】
（４）蚕及び蛹での経時的回収及び解析
上記で得たクローン化済みウイルス液を用いて、それぞれ９種類のウイルスを５令１日目のカイコ幼虫および蛹化１日後の蛹に接種し、ウイルス感染後６４、７２、８８、９６、１１２、１２０、１３６、１４４時間ごとに２頭ずつ経時的に回収し、−８０℃のフリーザーで凍結した。
【００８６】
回収したカイコおよび蛹に、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を総量３０ｍＬになるように加え、プロテアーゼインヒビターカクテルＣｏｍｐｌｅｔｅ（ロシュ）１錠と共に、ホモジナイザー（日立）および超音波破砕機（ビブラセル）をこの順に用い、磨砕した。この磨砕液を低速遠心機（日立）により３，０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間遠心し、この上清をガーゼで濾過した。この濾過液をＴＢＳで２倍希釈し、１ｍＬを超遠心機ｏｐｔｉｍａ  ＭＡＸ（ベックマン）、ローターＴＬＡ−１００．３により４５，０００ｒｐｍ、４℃の条件で１時間遠心し、上清と沈殿に分けた。この沈殿に１ｍＬのＴＢＳを加え、超音波破砕機（ＢＲＡＳＯＮ）で完全に再懸濁した。
【００８７】
上記によって得た磨砕サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（アトー）で分離後、ブロッティング装置（アトー）により蛋白質をゲルからＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ）に転写した。転写後、蛋白質の吸着したＰＶＤＦ膜を、１％スキムミルク（和光純薬工業）を含むＴ−ＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）によりブロックキング処理後、一次抗体として２，０００倍希釈した抗Ｈｉｓウサギ抗体Ｇ−１８（サンタクルズ）、二次抗体として２０，０００倍希釈した抗ウサギＩｇＧヤギ抗体ＡＬＰ標識（ナカライテスク）を用いたウェスタンブロット解析を行った。シグナルの検出は、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ試薬（ナカライテスク）による発色で行った。
【００８８】
各回収時間での超遠心上清および沈殿のバンドについてＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）によりデンシトメトリーを行って光学密度を求めた。蛹での発現については図５に、幼虫での発現については図６に、それぞれ発現時間とデンシトメトリー結果の関係で示した。
【００８９】
この結果、各バキュロウイルス転移ベクターでの最適な回収時期は感染後１３８〜１４４時間であることが示された。図５および６から、従来技術であるｐｏｌｈプロモータを用いた場合（ｐＭ０１）は、顕著に凝集物が多いことが示された。また、幼虫での発現の場合（図６）ｖｐ３９プロモータ単独で用いたとき（ｐＭＶＰＸＸ）発現がわずかであった。これは幼虫に特有の現象であるか、外来蛋白質によるものであるかを確認するため、別の外来遺伝子について同様の調査をおこなった。
【００９０】
実  施  例  ３
ＳＰＨＫ１（sphingosine kinase 1）およびＡＳＢ６（ankyrin repeat and SOCS 
box-containing 6）の幼虫での経時的発現結果の解析
ＳＰＨＫ１およびＡＳＢ６（ＪＢＩＣ  成果コンソＩ  クローン  No.FLJ12340AAAFおよびNo.FLJ12942AAAF）について、実施例２と同様に組換えウイルス作製、発現、サンプル回収、可溶性不溶性分離、解析を行った。
【００９１】
この結果、ＳＰＨＫ１を発現させた場合（図７）は、本発明のｐＭＶＰＬＲでは可溶性発現量が従来と比較して顕著に多く、実施例２より良い結果を得たが、ｐＭＶＰＸＸについては同様の結果となった。
【００９２】
一方、ＡＳＢ６を発現させた場合（図８）では、ウイルス感染後１３８時間でｐＭＶＰＸＸがもっとも良い結果を示した。よって、実施例２（図６）および図７での幼虫でのｐＭＶＰＸＸの発現低下は外来蛋白質の種類に依存するものであると考えられた。
【００９３】
実  施  例  ４
各バキュロウイルス転移ベクターの可溶性割合
（１）ＢｍＮ細胞での発現量の調査
ＵＧＤＨ（UDP-glucose dehydrogenase、ＪＢＩＣ  成果コンソＩ  クローン  No.FLJ40611AAAF）およびＢＣＫＤＨＡ（branched chain keto acid dehydrogenase E1， alpha polypeptide、ＪＢＩＣ  成果コンソＩ  クローン  No.FLJ45695AAAF）について実施例２と同様に組換えウイルス作製を行った。これまで作製した各組換えウイルス（ＳＰＨＫ１，ＡＳＢ６）と併せ、計１２種類の組換えウイルスを用いて、ＢｍＮ細胞での発現を行った。すなわち、ＢｍＮ細胞を１穴当たり１．０×１０６個／２ｍｌ  ＴＣ−１００（１０％ＦＢＳ）で培養した６穴プレートを準備した。次いで各組換えウイルス液をｍ．ｏ．ｉ．＝５で感染させた。
【００９４】
感染１２０時間後、ピペッティングにより細胞をはがして培養上清ごとそれぞれ０．２５％ＣＨＡＰＳとなるように加え、氷上で１０分間静置して、細胞膜を穿孔した。各１ｍＬから、実施例２と同様に超遠心によって可溶性不溶性分離を行い、ウェスタンブロッティングの結果からデンシトメトリーにより解析を行った。
【００９５】
（２）蛹、幼虫、ＢｍＮ細胞での発現における可溶性割合の解析
上記ＢｍＮでの解析結果と併せて、実施例２および実施例３の蛹および幼虫での経時的発現試験の結果のうち、各バキュロウイルス転移ベクターおよび遺伝子での最良の発現時期についても可溶性割合を算出した。結果を以下に示す。
【００９６】
【表４】
2008295449.tif 000008
表中、「−」は、発現量が低すぎ、デンシトメトリーによる解析が不能であった例を示す。
また、ゴシック体表記は本発明の例を示す。
【００９７】
この結果、従来技術であるｐｏｌｈプロモータを持つｐＭ０１で各遺伝子を発現させた場合と比べて、本発明の例であるｐＭＶＰＬＲでは、すべてについて可溶性の割合が向上し、凝集の割合が低減していることが示された。
【００９８】
一方、ｖｐ３９プロモータ単独であるｐＭＶＰＸＸを用いた場合でも凝集の割合がある程度低減されるが、比較検討に耐えうるだけの発現量が得られない例が散見され（図９Ｂ、図１０Ｂ、図１２Ｂ）、発現させる外来蛋白質や発現宿主の影響を受けやすいことが分かった。また、全体の傾向として、可溶性の割合はｐＭ０１＜ｐＭＶＰＸＸ＜ｐＭＶＰＬＲとなっており、これは、図３で示される発現開始時期と逆相関の関係、すなわち発現開始時期が早いほど凝集の割合が低減することが考えられた。
【００９９】
そこで、これらについてごく一般的な最小二乗法・線形モデルの重回帰分析を試みた。すなわち、ＰＤＥ４Ｃを蛹で発現させたものを基準に置いてその他遺伝子（４種）と発現宿主（２種）をダミー変数とし、これらと各バキュロウイルス転移ベクターの１０％発現時期を独立変数（計７変数）とし、可溶性割合を従属変数として、それらの相関係数行列を求めた。さらにそこから偏相関係数等を求めたものを以下の表にしめす。
【０１００】
【表５】
2008295449.tif 000009
【０１０１】
ダミー変数を用いているので、数値の比較は標準化偏回帰係数を用いて行った。この結果、ＡＳＢ６、ＵＧＤＨ、ＢＣＫＤＨＡではｐ値＜０．０５で負の値をとり、これらは凝集しやすい蛋白質であることが示された。また、１０％発現時期についてもｐ値＜０．０５で負の値をとり、１０％発現時期と凝集の間に逆相関があることが示された。すなわち、発現開始時期が早いほど凝集が少なくなると考えられる。
【０１０２】
一方、発現宿主については、蛹を基準に置いたとき、幼虫およびＢｍＮ細胞で負の値をとるものの、有意差は認められなかった（ｐ値＞０．０５）。
【０１０３】
以上の結果をまとめると、従来のｐｏｌｈプロモータでは発現させた外来蛋白質のうち不溶性になってしまうものの量が多く、ｖｐ３９プロモータ単独では発現が安定しないことが分かった。これらと比較して、本発明のプロモータを利用した場合（上記ｐＭＶＰＬＲ）、概ね発現は安定し、さらには可溶性で発現する割合が増し、または可溶性発現量が増加しており、ある程度の発現量を確保しつつ早期に発現することによって細胞内品質管理が期待できることが示された。
【０１０４】
実  施  例  ５
その他のＨＲｓを用いたバキュロウイルス転移ベクターの作製
ＢｍＮＰＶ−Ｔ３株（Accession No.NC_001962）のウイルスゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマー１３（5'-agccatgggacatcatcgtttgattgtgttttacac-3'）及びプライマー１４（5'-tgctagcaccgaactcgttttacgagtagaatt-3'）を用いて、ＰＣＲ断片（以下、「ＨＲ１」という）を取得した。また、同様にプライマー１５（5'-tgccatggaaattgaactggctttacgagtagaattc-3'）及びプライマー１６（5'-agctagcatgacatcatattttgattgtgttttacacg-3'）を用いて、ＰＣＲ断片（以下、「ＨＲ５」という）を取得した。
【０１０５】
このＨＲ１およびＨＲ５断片をそれぞれ制限酵素ＮｃｏＩ及びＮｈｅＩを用いて消化し、ＨＲ１およびＨＲ５断片を切り出した。一方、実施例１（３）で作製したｐＭＶＰＸＸを、制限酵素ＮｃｏＩ及びＮｈｅＩを用いて消化し、アルカリフォスファターゼにより切断面を脱リン酸化した。ＨＲ１及びＨＲ５断片それぞれと線状化したｐＭＶＰＸＸをライゲーションして、大腸菌を形質転換した。この形質転換体のクローン（ｐＭＶＰ１ＲおよびｐＭＶＰ５Ｒ）をプラスミド精製、そしてプライマー８（5'-agatcttaagattgttgccgttataaatatggac-3'）を用いて塩基配列確認を行って選抜した。
【０１０６】
また、ＨＲｓ保存パリンドローム配列は、合成した。すなわち５０ｍＭ−ＮａＣｌ中に、合成ＤＮＡ３（5'-catggtttacaagtagaattctactcgtaaag-3'）及び合成ＤＮＡ４（5'-caaatgttcatcttaagatgagcatttcgatc-3'）をそれぞれ１μＭ混合し、熱変性後、徐冷して２本鎖ＤＮＡを形成させた。さらに、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５’末端をリン酸化した。
【０１０７】
一方、実施例１（３）で作製したｐＭＶＰＸＸを、制限酵素ＮｃｏＩ及びＮｈｅＩを用いて消化し、アルカリフォスファターゼにより切断面を脱リン酸化した。ＨＲ１及びＨＲ５断片それぞれと線状化したｐＭＶＰＸＸをライゲーションして、大腸菌を形質転換した。この形質転換体のクローン（ｐＭＶＰ１−ｐａｌｉｎｄｒｏｍｅｓ）をプラスミド精製、そしてプライマー８（5'-agatcttaagattgttgccgttataaatatggac-3'）を用いて塩基配列確認を行って選抜した。
【０１０８】
こうして得られた３種類のバキュロウイルス転移ベクターについて外来蛋白質を導入しても、発現開始時期または凝集の割合が前記実施例と同様に変化することが分かる。
【０１０９】
実  施  例  ６
組換えバキュロウイルスによる抗キマーゼ抗体分子の作製
ヒトキマーゼ（片倉工業：特開２００２−３００８８６号公報）に対する抗体を産生するハイブリドーマ２Ｄ１１Ｇ１０Ｄ株（このものはＦＥＲＭ Ｐ−１８７００として、平成１４年２月８日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている：片倉工業：特開２００３−２３５５５６号公報）のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマー１７（5'- gaGCGGCCGCATGGCTTGGGTGTGGACCTTG -3'）及びプライマー１８（5'- gaGATATCTCATTTACCAGGAGAGCGGGAG -3'）を用い、ＰＣＲにより重鎖遺伝子を含むＰＣＲ断片を取得した。同様に、プライマー１９（5'- gaGCGGCCGCATGGACATGAGGACCCCTGC -3'）及びプライマー２０（5'- gaGATATCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTC -3'）を用い、ＰＣＲにより軽鎖遺伝子を含むＰＣＲ断片を取得した。
【０１１０】
上記で取得した重鎖及び軽鎖の遺伝子を含むＰＣＲ断片をそれぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＶを用いて消化し、重鎖及び軽鎖遺伝子断片を切り出した。一方、実施例１で作製したｐＭＶＰＬＲ及び従来のプラスミドであるｐＭ０１を、制限酵素ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＶを用いて消化し、アルカリフォスファターゼにより切断面を脱リン酸化した。重鎖及び軽鎖遺伝子断片それぞれと、線状化したｐＭＶＰＬＲおよびｐＭ０１をライゲーションして、大腸菌を形質転換した。この形質転換体のクローンをプラスミド精製、そしてプライマー８（5'-agatcttaagattgttgccgttataaatatggac-3'）を用いて塩基配列確認を行って選抜した。
【０１１１】
上記で得られたプラスミド４種について、それぞれ実施例２と同様に組換えウイルス作製を行った。次いで、重鎖と軽鎖の組換えウイルスを混合感染させる他は実施例４（１）と同様に感染実験を行い、ＢｍＮ細胞の培養上清及び幼虫体液を得た。これらのサンプルについて、キマーゼを固相化したＥＬＩＳＡを行い、正常にキマーゼと結合する抗体（以下、「抗キマーゼ抗体２Ｄ」という）を得た。この抗キマーゼ抗体２Ｄの生産量を、抗マウスＩｇＧウサギ抗体（ＡＬＰ標識：ナカライテスク）とＢｌｕｅ−Ｐｈｏｓ（ＫＰＬ）で測定した。なお、標準抗体には、２Ｄ１１Ｇ１０Ｄ株培養上清から精製して得られたモノクローナル抗体を用いた。
【０１１２】
抗キマーゼ抗体２Ｄの生産量は、ｐＭＶＰＬＲを重鎖・軽鎖の両方に使用したときに、もっとも高い発現量であることが分かった（図１３）。特に培養上清では従来技術であるｐＭ０１と比べて発現量の増加が顕著であった。
【０１１３】
実  施  例  ７
組換えバキュロウイルスで生産した抗キマーゼ抗体分子の性状
実施例６で得られた幼虫体液のうち、発現に用いたプラスミドが重鎖軽鎖ともｐＭ０１のもの、及びｐＭＶＰＬＲのものから、ＰｒｏｔｅｉｎＡ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥヘルスケア）を用いて抗体分子をメーカー推奨の方法で精製した後、沈降速度法による超遠心分析（片倉工業）を行った。超遠心分析には、分析用超遠心機ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＸＬ-Ａ（ベックマンコールター）を用い、ＳＥＤＦＩＴ（ＮＩＨ）による解析を行った。精製回収量と、実施例６でのＥＬＩＳＡを一頭あたりの量に換算し、超遠心分析の結果とともに表６に示した。また、各プラスミドを用いて発現、精製された抗キマーゼ抗体２Ｄについて電気泳動（還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。
【０１１４】
【表６】
2008295449.tif 000010
【０１１５】
電気泳動の結果（図１４）より、精製されたそれぞれの抗体分子の純度にはあまり差がないことが分かった。しかし、超遠心分析の結果、組換えウイルス作製に用いたプラスミドがｐＭ０１すなわち従来のポリヘドリンプロモータで抗体分子を生産した場合、会合体が多く形成されることがわかった。また、従来のポリヘドリンプロモータで抗体分子を生産した場合、ＥＬＩＳＡで確認された活性型の抗体分子の量よりも精製量が多く、ＰｒｏｔｅｉｎＡ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦで精製可能ではあるが活性を持たない抗体分子が、およそ５０％を占めることがわかった。一方、ｐＭＶＰＬＲすなわち本発明のプロモータを用いると、会合体の形成が抑制され、１頭あたりのＥＬＩＳＡ測定値と精製回収量が一致していた。さらに、１頭あたりの生産量も増大していた。このことから、本発明のプロモータを用いると抗体分子の分泌量が増加し、併せて細胞内品質管理を十分に受けていることが示された。
【０１１６】
以上、本発明による構成および方法を好ましい実施例について述べてきたが、本発明の概念、趣旨および範囲を逸脱することなく、上述した構成、方法、これらの方法のステップや時間的順序などについて様々な変更や修正が可能であることは当業者によって容易に理解できよう。たとえば、他のＨＲｓを用いても同様の結果を得ることができる。また、ＨＲｓ保存パリンドローム配列の数を変更し、またはその上流にｉｅ−１遺伝子産物などを発現させる領域を加えることによって発現量や発現時期を変更することができよう。さらには、一つのプラスミドに複数のプロモータを挿入することで複数の遺伝子を共発現させ、または個別の組換えウイルスを複数共感染により発現させて、複合体を形成させることができよう。また、従来の最後期プロモータと組み合わせて発現時期をずらして複合体を形成させることも有効といえよう。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明により、上述のバキュロウイルス転移ベクターを包含する、安定に形質転換された組換えバキュロウイルスを得ることができる。そして、この組換えバキュロウイルスは、蛋白質あるいはペプチドの発現時期を早め、かつ適切な量での蛋白質発現を可能とすることができるため、比較的凝集が少ない状態で外来蛋白質あるいはポリペプチドの生産を行うことができ、目的とする生理活性を有する外来蛋白質を容易に得ることができる。
【０１１８】
従って、本発明の組換えバキュロウイルスは、医薬や試薬として利用される蛋白質の生産に有利に利用することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】本発明で用いる、ｐＭ０００００１の構成を示す図面である。このものは、バキュロウイルスのｐｏｌｈ周辺の配列を持ち、相同組換えによりＭＣＳに挿入した外来遺伝子をウイルスゲノム中に導入することができる。
【図２】本発明組換えバキュロウイルスの構築の概要を示す図面である。
【図３】組換えバキュロウイルス感染後の時間と、ＧＦＰの生産量の関係を示す図面である。
【図４】ｐＭ０１−ＤｅｓｔＣＨ、ｐＭＶＰＸＸ−ＤｅｓｔＣＨおよびｐＭＶＰＬＲ−ＤｅｓｔＣＨのプロモータ周辺の構成を示す図面である。
【図５】ｐＭ０１、ｐＭＶＰＸＸおよびｐＭＶＰＬＲの各プロモータを用いたときの、蛹でのＰＤＥ４Ｃの経時的発現を示す図面である。図中Ａは可溶性画分についての結果を、Ｂは沈殿画分についての結果をそれぞれ示す。
【図６】ｐＭ０１、ｐＭＶＰＸＸおよびｐＭＶＰＬＲの各プロモータを用いたときの、幼虫でのＰＤＥ４Ｃの経時的発現を示す図面である。図中Ａは可溶性画分についての結果を、Ｂは沈殿画分についての結果をそれぞれ示す。
【図７】ｐＭ０１、ｐＭＶＰＸＸおよびｐＭＶＰＬＲの各プロモータを用いたときの、幼虫でのＳＰＨＫ１の経時的発現を示す図面である。図中Ａは可溶性画分についての結果を、Ｂは沈殿画分についての結果をそれぞれ示す。
【図８】ｐＭ０１、ｐＭＶＰＸＸおよびｐＭＶＰＬＲの各プロモータを用いたときの、幼虫でのＡＳＢ６の経時的発現を示す図面である。図中Ａは可溶性画分についての結果を、Ｂは沈殿画分についての結果をそれぞれ示す。
【図９】ＰＤＥ４Ｃの発現における各バキュロウイルス転移ベクターの影響を示す電気泳動写真（ＢＣＩＰ−ＮＢＴ染色像）である。図中Ａは、蛹で発現させた場合の結果を、Ｂは幼虫で発現させた場合の結果を示す。
【図１０】ＳＰＨＫ１の発現における各バキュロウイルス転移ベクターの影響を示す電気泳動写真（ＢＣＩＰ−ＮＢＴ染色像）である。図中Ａは、蛹で発現させた場合の結果を、Ｂは幼虫で発現させた場合の結果を示す。
【図１１】ＡＳＢ６の発現における各バキュロウイルス転移ベクターの影響を示す電気泳動写真（ＢＣＩＰ−ＮＢＴ染色像）である。図中Ａは、幼虫で発現させた場合の結果を、ＢはＢｍＮ細胞で発現させた場合の結果を示す。
【図１２】ＢｍＮ細胞を用いたときの各バキュロウイルス転移ベクターの影響を示す電気泳動写真（ＢＣＩＰ−ＮＢＴ染色像）である。図中Ａは、ＵＧＤＨで発現させた場合の結果を、ＢはＢＣＫＤＨＡを発現させた場合の結果を示す。
【図１３】ｐＭ０１およびｐＭＶＰＬＲのプロモータを用いて、抗キマーゼ抗体２Ｄの重鎖と軽鎖を発現させたときの、ＢｍＮ培養上清および蚕幼虫体液中の活性型抗体分子の発現量を示す図面である。
【図１４】ｐＭ０１またはｐＭＶＰＬＲのプロモータを用いて発現させた後、精製した抗キマーゼ抗体２Ｄの電気泳動結果を示す図面である。
【図１】
2008295449.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2008295449.tif 000023
【図１４】
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【配列表】
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