(57)【要約】      （修正有）【課題】安価に大量に供給できるムギネ酸類の製造方法の提供。【解決手段】下記工程式で表されるムギネ酸類の製造方法。2008120741.tif 000035（式中、Ｒ1、Ｒ2は水素原子また水酸基を表し、Ｒ3は水酸基またはアミノ基を表す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（２）：
【化１】
2008120741.tif 000027
（式中、Ｒ1は水素原子また水酸基を表し、Ｒ4は水素原子またはカルボキシル基の保護基を表し、Ｒ5はアミノ基の保護基を表す。）
で表される化合物のビニル基を酸化開裂させると同時にアゼチジン−２−カルボン酸で還元的アミノ化反応させ下記一般式（３）：
【化２】
2008120741.tif 000028
（式中、Ｒ1、Ｒ4およびＲ5は前記と同義を表す。）
で表される化合物を得た後、該化合物のカルボキシル基を保護基で保護すると共にアミノ基の保護基を除去し、下記一般式（４）：
【化３】
2008120741.tif 000029
（式中、Ｒ1およびＲ4前記と同義を表し、Ｒ6はカルボキシル基の保護基を表す。）
で表される化合物またはその塩とし、次いで該化合物で下記一般式（５）：
【化４】
2008120741.tif 000030
（式中、Ｒ2は水素原子また水酸基を表し、Ｒ７はカルボキシル基の保護基を表し、Ｒ8は−ＯＲ9（Ｒ9は水酸基の保護基を表す。）、または−ＮＨＲ10（Ｒ10はアミノ基の保護基を表す。））
で表されるアルデヒドを還元的アミノ化反応させて下記一般式（６）：
【化５】
2008120741.tif 000031
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は前記と同義を表す。）
で表される化合物とした後、カルボキシル基の保護基および水酸基またはアミノ基の保護基を除くことを特徴とする下記一般式（１）：
【化６】
2008120741.tif 000032
（式中、Ｒ1およびＲ2は前記と同義を表し、Ｒ3は水酸基またはアミノ基を表す。）
で表されるムギネ酸類の製造方法。
【請求項２】
下記一般式（３−１）：
【化７】
2008120741.tif 000033
（式中、Ｒ1は水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を表す。）
で表される化合物。
【請求項３】
下記一般式（４−１）：
【化８】
2008120741.tif 000034
（式中、Ｒ1は水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｅｔはエチル基を表す。）
で表される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムギネ酸類の効率的な短段階製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
鉄欠乏は、現在世界中で最も一般的なヒトの栄養問題であり、工業国と発展途上国の両方で、多くの人達がこの問題を抱えている。ヒトは、必要な鉄を作物からもとっている。しかし、往々にして、作物は十分な量の鉄を土壌から取り込まず、葉緑素の生成に触媒的に働く鉄が欠乏して退緑、低収量、および栄養の質の低下を引き起こす。残念なことにほとんどの作物は生物学的に利用可能な鉄を少量しか含んでいない。加えて、土壌中に利用可能な鉄が少ないことは、植物の生長を制限し、収穫量の低下を招く。世界中の土壌の約３分の１が潜在的な鉄欠乏地帯と言われている。植物による鉄の取り込みを低下させる要因は、鉄不足だけではない。例えば、土壌中の鉄の生物学的利用能は高いｐＨ（アルカリ性）による影響を特に受ける。すなわち、アルカリ性土壌では鉄イオンは水に不溶な水酸化第二鉄（Fe(OH)3）の形で存在するため、植物は根から鉄分を十分に吸収することが出来ない。この問題に対し、イネ科植物種はファイトシデロフォア（phytosiderophore）と呼ばれる金属キレート剤であるムギネ酸を分泌し、３価の不溶態鉄をムギネ酸・鉄錯体として可溶化することによって、この鉄錯体を根から吸収し鉄を獲得することができる（非特許文献１参照。）。ムギネ酸は１９７８年に鉄欠乏オオムギの根から最初に単離・構造決定された鉄をキレートする物質である（非特許文献２参照。）。ムギネ酸はアゼチジンカルボン酸ユニット、アスパラギン酸ユニット、リンゴ酸ユニットが還元的に結合した化合物であるが、近年までにコムギから単離された２’−デオキシムギネ酸（非特許文献３参照。）など種々のムギネ酸の類縁体が単離されており（非特許文献４参照。）、これらを総称してムギネ酸類と呼んでいる。
【０００３】
ムギネ酸類を用いた研究または利用は今後さらなる発展が期待されるが、これらムギネ酸類の大量入手は困難であった。ムギネ酸類の製造例は、Ohfuneらによって１９８１年に報告された２’−デオキシムギネ酸の製造が最初であり(非特許文献５参照。)、同時期にFushiyaらによっても２’−デオキシムギネ酸の他の製造方法が報告されている（非特許文献６参照。）。次いで、１９８６年にHamadaらによってムギネ酸の製造方法が報告された（非特許文献７参照。）。その後Matsuuraらはさらに簡便に改良したムギネ酸の製造方法を報告している（非特許文献８参照。）。また、２００１年にMiyakoshiらは効率的な２’−デオキシムギネ酸および、ムギネ酸類の前駆体であるニコチアナミン（３”位の水酸基がアミノ基に置換されたもの）の製造方法を報告した（非特許文献９参照。）。このMiyakoshiらの効率的な製造方法の確立によって、ニコチアナミンは長谷川香料株式会社より市販されるようになり、多くの研究者が容易に入手できるようになった。最近になって、Singhらによって効率的な２’−デオキシムギネ酸の製造方法が報告された（非特許文献１０参照。）。この方法は、ムギネ酸を構成するアゼチジンカルボン酸ユニット、アスパラギン酸ユニット及びリンゴ酸ユニットの３つのユニットのうち、アゼチジンカルボン酸ユニットを保護することなく、２’−デオキシムギネ酸を合成することができる。その後、２’−デオキシムギネ酸は２００５年末からカナダのTRC
Inc.から市販されるようになった。
【０００４】
【非特許文献１】マーシュナー・エイチ（Marschner, H）ら、ジャーナル・オブ・プラント・ニュートリション（J. Plant Nutr.）、1986年、第9巻、ｐ．695-713
【非特許文献２】タケモト・ティ（Takemoto，T）ら、プロシディングス・オブ・ザ・ジャパン・アカデミー（Proc．Japan Acad．）、1978年、第54-B巻、ｐ．469-473
【非特許文献３】ノモト・ケー（Nomoto，K）ら、チミア（Chimia）、1981年、第７巻、ｐ．249-250
【非特許文献４】マ・ジェイ・エフ（Ma, J. F.）、ノモト・ケー（Nomoto，K）、フイジオロジア・プランタラム（Physiol. Plant.）、1996年、第97巻、p. 609-617
【非特許文献５】オーフネ・ワイ（Ohfune，Y．）ら、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（J．Am．Chem．Soc．）、1981年、第103巻、ｐ．2409-2410.
【非特許文献６】フシヤ・エス（Fushiya, S.）ら、ケミストリー・レターズ（Chem．Lett．）、1981年、ｐ．909-912
【非特許文献７】ハマダ・ワイ（Hamada，Y．）、シオイリ・ティ（Shioiri，T．）ザ・ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J．Org．Chem．）、1986年、第51巻、ｐ．5489-5490
【非特許文献８】マツウラ・エフ（Matsuura，F．）ら、テトラヘドロン（Tetrahedron）、1993年、第49巻、ｐ．8211-8222.
【非特許文献９】ミヤコシ・ケー（Miyakoshi，K．）ら、テトラヘドロン（Tetrahedron）、2001年、第57巻、ｐ．3355-3360.
【非特許文献１０】シン・エス（Singh，S．）ら、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）、2005年、第46巻、ｐ．1419-1421
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ムギネ酸類は、植物の鉄吸収メカニズムの解明研究に非常に重要なツールとして用いられてきた。さらに、ムギネ酸類はその鉄キレート能力から、ＥＤＴＡに代わる安全な金属キレート剤として、動植物の鉄欠乏症に対する有効なアプローチとして健康食品、化粧品または肥料などの分野で用いられる可能性を秘めている。従って、ムギネ酸類の製造方法の改善は重要である。
これまでに報告されている製造方法では全て製造中間体を単離精製しており、これらの操作に非常に多くの労力と時間を要すると共に、収率を低下させていた。
例えば、上記非特許文献５〜８が教える製造方法は多くの工程数を要することや、中間体の分離精製に多くの労力を費やすことなどから、安定な大量供給にはさらなる改良が必要とされた。また、上記非特許文献９が教える製造方法では２’−デオキシムギネ酸の収率が低く、２９％にとどまっている。また、同文献が教える方法により、ムギネ酸類の前駆体であるニコチアナミンは市販により容易に入手できるようになったが、２’−デオキシムギネ酸は、未だ高価であり、未だ高い収率で得ることができず、大量に入手するには未だ困難である。
【０００６】
安価に大量のムギネ酸類を提供できるようになれば、それらの研究分野への貢献、健康食品、化粧品または肥料などの分野での利用の可能性は計り知れない。しかし、上記したようにこれまでに報告された製造方法では、工程数が多いこと、中間体の単離精製に多くの労力を要し、収率が低いことなどから、安価での大量供給には問題があった。
本発明は従来技術におけるこのような問題を解決するものであり、安価に大量に供給できるムギネ酸類の製造方法を提供することを課題とする。すなわち、ムギネ酸類を実用的に製造するには、１）工程数の短縮化、２）製造中間体の単離精製操作の省略化、３）製造操作の簡便化、４）安価な反応試薬などが必要不可欠な課題として挙げられる。本発明は、これら必要不可欠な課題を一度に解決できるムギネ酸類の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ムギネ酸は、アゼチジンカルボン酸ユニット、アスパラギン酸ユニットおよびリンゴ酸ユニットの３つのユニットからなる化合物であるが、それらユニットのカップリング反応の際には、それらユニットが有する多数のカルボキシル基、アミノ基または水酸基の保護基の脱着が必要であり、こういった操作が工程数の多段階化に拍車をかけていた。そこで、発明者らはカルボキシル基、アミノ基または水酸基の保護基の使用を最低限に抑えることによって工程数の短縮を行った。即ち、発明者らは、アゼチジンカルボン酸ユニット及びアスパラギン酸ユニットにカルボキシル基に保護基を導入しないか、保護基を導入しても単離精製せず次の工程にすすめることができる方法を構築することにより工程数の短縮化と操作の簡便化が行えることを知見した。本発明者らは、さらに研究を重ね、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］  下記一般式（２）：
【化１】
2008120741.tif 000002
（式中、Ｒ1は水素原子また水酸基を表し、Ｒ4は水素原子またはカルボキシル基の保護基を表し、Ｒ5はアミノ基の保護基を表す。）
で表される化合物のビニル基を酸化開裂させると同時にアゼチジン−２−カルボン酸で還元的アミノ化反応させ下記一般式（３）：
【化２】
2008120741.tif 000003
（式中、Ｒ1、Ｒ4およびＲ5は前記と同義を表す。）
で表される化合物を得た後、該化合物のカルボキシル基を保護基で保護すると共にアミノ基の保護基を除去し、下記一般式（４）：
【化３】
2008120741.tif 000004
（式中、Ｒ1およびＲ4前記と同義を表し、Ｒ6はカルボキシル基の保護基を表す。）
で表される化合物またはその塩とし、次いで該化合物で下記一般式（５）：
【化４】
2008120741.tif 000005
（式中、Ｒ2は水素原子また水酸基を表し、Ｒ７はカルボキシル基の保護基を表し、Ｒ8は−ＯＲ9（Ｒ9は水酸基の保護基を表す。）、または−ＮＨＲ10（Ｒ10はアミノ基の保護基を表す。））
で表されるアルデヒドを還元的アミノ化反応させて下記一般式（６）：
【化５】
2008120741.tif 000006
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は前記と同義を表す。）
で表される化合物とした後、カルボキシル基の保護基および水酸基またはアミノ基の保護基を除くことを特徴とする下記一般式（１）：
【化６】
2008120741.tif 000007
（式中、Ｒ1およびＲ2は前記と同義を表し、Ｒ3は水酸基またはアミノ基を表す。）
で表されるムギネ酸類の製造方法。
［２］  下記一般式（３−１）：
【化７】
2008120741.tif 000008
（式中、Ｒ1は水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を表す。）で表される化合物、および
［３］  下記一般式（４−１）：
【化８】
2008120741.tif 000009
（式中、Ｒ1は水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｅｔはエチル基を表す。）
で表される化合物、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のムギネ酸類の製造方法によれば、安価な反応試薬によりムギネ酸類を製造できる。また、本発明のムギネ酸類の製造方法によれば、出発物質から順次反応試薬を加えていくのみで最終目的物の官能基が保護基で保護された保護体を得ることができる。この結果、全工程の中で精製は簡単な一度の操作のみである。従って、本発明によれば、ムギネ酸類を短時間で容易に製造できる。さらに本工程の大きな特徴としては、全ての反応をほぼワンポット(one-pot)で行うにも関わらず、非常に高収率で目的とするムギネ酸類を得ることができる。本発明のムギネ酸類の製造方法による全工程のスピードアップ化、製造操作の簡便化は、ムギネ酸類を大量に安価に供給するための非常に大きなアドバンテージとなる。実際に本発明によるムギネ酸類の全製造工程での試算は、現在市販されているものと比べても非常に安価となり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ムギネ酸、２’−デオキシムギネ酸、３−ヒドロキシムギネ酸、３−エピヒドロキシムギネ酸などのムギネ酸類やその前駆体であるニコチアナミンまたは２”−ヒドロキシニコチアナミンなどの新規な製造方法に関するものである。
【００１１】
本発明において、Ｒ4、Ｒ6またはＲ7で表される「カルボキシル基の保護基」としては、例えば、エステル残基を例示することができ、かかるエステル残基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル、シクロヘキシルなどの炭素数１〜６の直鎖状、分岐状または環状の低級アルキル基；ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｍ−ニトロベンジル、２，４−ジニトロベンジル、ｐ−クロロベンジル、ｐ−ブロモベンジル、ｐ−メトキシベンジルなどのアラルキル基；アセトキシメチル、アセトキシエチル、プロピオニルオキシメチル、ｎ−ブチリルオキシメチル、ｉｓｏ−ブチリルオキシメチル、ピバロイルオキシメチルなどの低級脂肪族アシルオキシメチルなどが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、低級アルキル基が好ましく、エチルまたはｔｅｒｔ−ブチルがとりわけ好ましい。
【００１２】
本発明において、Ｒ5またはＲ10で表される「アミノ基の保護基」としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（以下、Ｂｏｃと略記する。）などのアルコキシカルボニル基；ビニルオキシカルボニルなどのアルケニルオキシカルボニル基；ベンジルオキシカルボニル（以下、Ｃｂｚと略記する。）、９−フルオレニルメトキシカルボニルなどのアラルキルオキシカルボニル基；ベンジル、４−メトキシベンジルなどの置換されていてもよいアラルキル基；ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンゾイルなどのアシル基；ｐ−トルエンスルホニル、ベンゼンスルホニルなどのアリールスルホニル基；メタンスルホニルなどのアルキルスルホニル基などが挙げられる。アミノ基の保護基としては、ＢｏｃまたはＣｂｚがとりわけ好ましい。
【００１３】
本発明において、Ｒ9で表される「水酸基の保護基」としては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシルなどの炭素数１〜６の直鎖状または分岐状の低級アルキル基；トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルなどのトリアルキルシリル基；テトラヒドロピラン−２−イル、メトキシメチル、メトキシエトキシメチルなどのアセタール型保護基；ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルなどのアルコキシカルボニル基；ベンジルなどのアラルキル基などが挙げられる。水酸基の保護基としては、低級アルキル基が好ましく、ｔｅｒｔ−ブチルがとりわけ好ましい。
【００１４】
本発明のムギネ酸類の製造方法は、以下の工程１乃至４を含む。
【化９】
2008120741.tif 000010
（式中、上記各記号は前記と同義を表す。）
以下各工程について説明する。
【００１５】
（１）工程１
工程１において、原料となる一般式（２）であらわされる化合物（以下、化合物（２）と略記する。）としては、例えばアミノ基が保護基で保護された、例えばＢｏｃ−Ｌ−アリルグリシンまたはＣｂｚ−Ｌ−アリルグリシンまたはそれらのカルボキシル基が保護基で保護された化合物などが好ましく挙げられる。前記Ｂｏｃ−Ｌ−アリルグリシンまたはＣｂｚ−Ｌ−アリルグリシンなどは、市販のＬ−アリルグリシンより、PROTECTIVE GROUPS in ORGANIC SYNTHESIS (T. W. Green; P. G. M. Wuts著)に記載の方法に準じて容易に製造できる。また、これらは試薬などとして市販されているものも好ましく使用できる。
【００１６】
工程１において、化合物（２）は、そのビニル基が酸化開裂され、それと同時にアゼチジン−２−カルボン酸で還元的アミノ化反応に付される。酸化開裂は、例えばオゾン、過マンガン酸塩、ＲｕＣｌ3またはＯｓＯ4−NaIO4などにより行うことが好ましく、オゾンによる酸化開裂がより好ましい。オゾンによる酸化開裂は、例えば化合物（２）を溶媒に溶解した溶液に、オゾンガスを吹き込むこと（バブリング）によって行うことが好ましい。溶媒としては、例えばメタノール、ジクロロメタン、酢酸エチルなどの有機溶媒が挙げられる。オゾンによる酸化開裂が終了してオゾンが溶液中で飽和されると溶液が青く着色するので、オゾンガスのバブリングは、溶液の色が青くなるまで行うことが好ましい。オゾンガスのバブリングは、約−１００〜−５０℃の低温化で行われることが好ましい。オゾンガスは、例えばオゾンガス発生機などによって発生させることができる。オゾンガスのバブリング後は、過剰のオゾンを除去するため溶液の青色が消えるまで、溶液に例えば酸素または、窒素、アルゴンガスなどをバブリングすることが好ましい。
【００１７】
酸化開裂と同時に行われるアゼチジン−２−カルボン酸での還元的アミノ化反応は、還元剤の存在下に行われることが好ましい。該還元剤としては、例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムなどが好ましく挙げられる。還元的アミノ化反応におけるｐＨは、通常約4〜７が好ましく、約６〜７がより好ましい。また、還元的アミノ化反応は、通常冷却下ないし加温程度、好ましくは室温下に行なわれ、約１〜２時間攪拌することが好ましい。化合物（２）１モルに対するアゼチジン−２−カルボン酸の割合は約１モル（１：１のモル比で高収率が得られるのが本合成の利点である）が好ましい。また、化合物（２）１モルに対する還元剤の割合は約１〜２モルが好ましい。
Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸は試薬などとして市販されているものを好ましく使用できる。
【００１８】
上記工程１により一般式（３）で表される化合物（以下、化合物（３）と略記する。）を得ることができる。
化合物（３）としては、例えば一般式（３−１）または（３−２）：
【化１０】
2008120741.tif 000011
（式中、Ｒ1は上記と同義である。）で表される化合物（以下、それぞれ化合物（３−１）、化合物（３−２）と略記する。）などが好ましく挙げられる。
【００１９】
（２）工程２
工程２において、化合物（３）のカルボキシル基を保護基で保護すると共にアミノ基の保護基を除去することにより、一般式（４）で表される化合物（以下、化合物（４）と略記する。）またはその塩とすることができる。カルボキシル基を保護基で保護する反応としては、例えばアルコールとの脱水縮合反応などが挙げられる。該反応に用いられるアルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールなどが挙げられる。工程２におけるアミノ基の保護基の除去反応（以下、脱保護と略記する。）としては、その保護基の種類に応じて酸あるいは塩基による方法、または接触還元による方法などを適宜選択して行うことができる。脱保護における反応温度は、通常冷却下ないし加温程度で行なわれ、反応時間は約３０分〜２４時間が好ましい。
【００２０】
例えば、アミノ基の保護基がＢｏｃの場合は、例えばトリフルオロ酢酸や塩酸−テトラヒドロフラン溶液などの強酸性条件下で脱保護を行うことが好ましい。より具体的には、化合物（３）に、例えば塩酸／エタノール溶液を反応させることが好ましい。前記反応は、例えば氷冷下で約３０分〜５時間、次いで室温で約１〜２４時間、撹拌することにより実施できる。塩酸／エタノール溶液（以下、エタノール塩酸と略記する。）は、例えば塩化アセチルを過剰量のエタノールに添加することにより調製できる。塩化アセチルとエタノールの割合は、例えば塩化アセチル１容量に対してエタノール約２０〜５０倍容量が好ましい。或は、エタノールに塩酸ガスをバブリングすることによっても調製できる。予め秤量したエタノールと、塩酸ガスバブリング後のエタノールの重さを比べることによって、塩酸の溶解量を決めることが出来る。前記反応後、反応混合物を例えば減圧濃縮した後、例えばトルエンなどを加えて共沸蒸留により溶媒を留去させることが好ましく、さらに、共沸蒸留後に例えば真空ポンプなどで吸引して乾燥させることが好ましい。これにより、化合物（３）のカルボキシル基が保護基で保護されると共にアミノ基の保護基が除去された例えば化合物（４）の塩酸塩（一般式（４−１））：
【化１１】
2008120741.tif 000012
（式中、Ｒ1は上記と同義である。）
が生成される。
【００２１】
また、例えば、アミノ基の保護基がベンジルオキシカルボニル基（以下、Ｃｂｚと略記する。）の場合は、例えばパラジウムを触媒とした水素添加反応やバーチ還元などで脱保護を行うことが好ましい。
【００２２】
（３）工程３
工程３において、工程２で得られた化合物（４）で、一般式（５）で表されるアルデヒド（以下、アルデヒド（５）と略記する。）の還元的アミノ化反応を行うことが好ましい。該還元的アミノ化反応は、有機溶媒中、上記化合物（２）の還元的アミノ化反応と同様に例えば還元剤の存在下に、行うことができる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。アルデヒド（５）は、例えば、Nishimaru, T et al. Peptide
Science 2006, 42, 263-266.に記載の方法または該記載の方法に準じて容易に製造できる。還元的アミノ化反応により得られる反応混合物には、一般式（６）で表される化合物（以下、化合物（６）と略記する。）が含まれる。該反応混合物から、化合物（６）を分離または精製することが好ましい。該分離または精製は、公知の方法を用いることができ、例えば酢酸エチルやクロロホルム、ジクロロメタンなどの有機溶媒による抽出や、例えばシリカゲルなどを担体とするクロマトグラフィーなどを単独でまたは組合せて行うことができる。
【００２３】
（４）工程４
工程４において、化合物（６）におけるカルボキシル基の保護基および水酸基またはアミノ基の保護基の除去（脱保護）反応は、その保護基の種類に応じて、酸あるいは塩基による方法、または接触還元による方法を適宜選択して行うことができる。酸による方法の場合には、保護基の種類その他の条件によって異なるが、酸としては、例えば塩酸、臭化水素、フッ化水素、沃化水素、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、硫酸、リン酸などの無機酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸などの有機酸の他、酸性イオン交換樹脂などが挙げられる。塩基による方法の場合には、保護基の種類その他の条件によって異なるが、塩基としては、例えばナトリウム，カリウムなどのアルカリ金属もしくはカルシウム，マグネシウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩などの無機塩基、金属アルコキサイド類、有機アミン類、第四アンモニウム塩などの有機塩基の他、塩基性イオン交換樹脂などが挙げられる。上記酸または塩基による方法の場合において溶媒を使用する場合には、たとえば、水、メタノール、エタノール、酢酸エチル、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ピリジン、酢酸、アセトンまたは塩化メチレンなどを単一、もしくは混合して用いることができる。また金属と酸による方法においては水，アセトンなどが繁用されるが酸が液体のときは酸自身を溶媒として使用することもできる。酸および塩基による方法において反応温度は、通常冷却下ないし加温程度で行なわれ、反応時間は約３０分〜２０時間である。化合物（６）における、カルボキシル基の保護基および水酸基またはアミノ基の保護基の脱保護は、酸、例えば塩酸、とりわけ約４〜６Ｎ塩酸と１N水酸化ナトリウムによる方法が好ましい。
【００２４】
脱保護反応後、反応混合物から、一般式（１）で表される化合物を分離または精製する。該分離または精製方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば液体クロマトグラフィーや再結晶などが挙げられる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィーなどが挙げられ、これらは単独でまたは組合せて行うことができる。
【００２５】
なお、工程１において、原料となる化合物（２）のＲ1が水酸基である化合物は、化合物（２）のＲ1が水素原子である化合物から、例えば以下により製造できる。
【化１２】
2008120741.tif 000013
（式中、ＲＸはハロゲン化アルキルを表し、Ｒ5は前記と同義を表す。）
【００２６】
まず、一般式（２−１）で表される化合物（例えば、Ｂｏｃ−Ｌ−アリルグリシンまたはＣｂｚ−Ｌ−アリルグリシンなど；以下、化合物（２−１）と略記する。）を溶媒に溶解し、塩基の存在下ハロゲン化アルキルを反応させて、カルボキシル基を保護基で保護する。上記溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサンなどが挙げられる。塩基としては、例えば炭酸カリウムなどが好ましく挙げられる。化合物（２−１）と炭酸カリウムなどの塩基との割合は化合物（２−１）１モルに対し塩基約２〜５モルが好ましい。ハロゲン化アルキルのアルキル基は、上記例示したカルボキシル基の保護基から選択して使用すれば、脱保護及び再保護を行う必要がない。このようなアルキル基を有するハロゲン化アルキルとしては、例えばヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化ｎ−プロピル、ヨウ化イソプロピル、ヨウ化ｎ−ブチル、ヨウ化イソブチル、ヨウ化シクロヘキシルなどが挙げられる。化合物（２−１）とハロゲン化アルキルとの割合は化合物（２−１）１モルに対しハロゲン化アルキル約１．１〜１．５モルが好ましい。反応温度は、冷却から加温下、好ましくは室温である。反応時間は、通常約３０分〜約８時間、好ましくは約１〜３時間である。反応終了後は、反応混合物に例えば水などを加え、非極性溶媒（例えばエーテル、ヘキサンなど）でカルボキシル基が保護基で保護された化合物を１〜数回抽出することが好ましい。抽出した非極性溶媒を集め、例えば硫酸マグネシウムなどの乾燥剤で乾燥後、ろ過などにより乾燥剤を除去し、ろ液を濃縮して抽出溶媒を留去し、化合物（２−１）のカルボキシル基が保護基で保護された化合物を得ることができる。抽出溶媒の留去は、公知の方法、例えば減圧蒸留などにより実施できる。
【００２７】
次いで、得られた化合物を溶媒に溶解し、酸化させることが好ましい。溶媒としては、例えば１，２−ジクロロエタン、（エーテル除去）、（テトラヒドロフラン除去）、塩化メチレン、ｔ−ブタノール、ジオキサン、トルエンまたはトリクロロエタンなどの有機溶媒が挙げられる。酸化は、例えば触媒量の二酸化セレンの存在下、酸化剤、例えばｔｅｒｔ−ブチルパーオキシドまたは過酸化水素水などで行うことができる。二酸化セレンの触媒量としては、例えば、化合物（２−１）１モルに対して二酸化セレン約０．５〜０．９５モルが挙げられる。酸化剤の量は、例えば、化合物（２−１）１モルに対して酸化剤約２〜５モルが好ましい。酸化は、加温下で行うことが好ましく、温度は、約５０〜９０℃が好ましい。酸化における反応時間は、約１〜２４時間、好ましくは、約５〜１０時間である。反応後は常法に従って後処理を行えばよい。即ち、反応液に炭酸水素ナトリウムや水酸化ナトリウム水溶液などを加えた後、酢酸エチル、エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、などの有機溶媒を加えて１〜数回抽出する。抽出液を集め、硫酸マグネシウムなどの乾燥剤で乾燥する。乾燥後、濾過して乾燥剤を除き、濾液を例えば減圧濃縮などにより濃縮して溶媒を溜去して生成物（７）を得ることができる。得られた生成物（７）はカラムクロマトグラフィーなどにより精製することが好ましい。
【００２８】
このようにして、ムギネ酸、２’−デオキシムギネ酸、３−ヒドロキシムギネ酸、３−エピヒドロキシムギネ酸などのムギネ酸類やその前駆体であるニコチアナミン、または２”−ヒドロキシニコチアナミンなどが高収率で製造され得る。
【００２９】
以下に本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
Ｂｏｃ−Ｌ−アリルグリシンから化合物（３−３）の製造
【化１３】
2008120741.tif 000014
Ｂｏｃ−Ｌ−アリルグリシン１ｇ（４．７ミリモル）をメタノール（１５ミリリットル）に溶かし、オゾンガスを−７８℃でバブリングする。溶液の色が青くなるまでバブリングした後、青い色が消えるまで酸素をバブリングした。室温に戻した後、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸４７５ミリグラム（４．７ミリモル）とシアノ水素化ホウ素ナトリウム２９６ミリグラム（４．７ミリモル）を加え、１時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、シリカゲルを用いたショートパスシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ）の混合溶液でシアノ水素化ホウ素ナトリウムの残骸および少量のＬ−アリルグリシン由来の副生成物を取り除いた後、メタノール溶液を流す）により化合物（３−３）を１．３ｇ得た。（収量９０％）
【実施例２】
【００３１】
化合物（３−３）から化合物（６−１）の製造
【化１４】
2008120741.tif 000015
【００３２】
化合物（３−３）３００ミリグラム（１ミリモル）を１０％（ｖ／ｖ）エタノール塩酸（塩化アセチルとエタノールより調製）１５ミリリットルに０℃で溶かし室温で一晩撹拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、トルエン共沸により乾燥させ、真空ポンプで乾固するまで吸引した。生じた塩酸塩をメタノール４ミリリットルに溶かし、式（５−１）で表されるアルデヒド（以下、アルデヒド（５−１）と略記する。）：
【化１５】
2008120741.tif 000016
を２５０ミリグラム（１．１ミリモル）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム７０ミリグラム（１．１ミリモル）を順次加え、約２時間撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで２回抽出した。抽出液を集め、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、減圧濃縮により油状物質を得た。これをショートパスシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１（ｖ／ｖ）から酢酸エチル）無色の油状物質として化合物（６−１）を３７２ミリグラム得た。（収量７９％）
【実施例３】
【００３３】
化合物（６−１）から２’−デオキシムギネ酸の製造
【化１６】
2008120741.tif 000017
【００３４】
化合物（６−１）３００ミリグラム（０．６ミリモル）に６Ｎ塩酸１０ミリリットルを加え、約１５時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮させた後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１０ミリリットルを加え１５時間撹拌した後、反応混合物を１Ｎ塩酸で中和した。反応混合物を減圧濃縮し、粗２’−デオキシムギネ酸の塩酸塩を得た。これを水約５ミリリットルに溶かし、ダウエックス５０Ｗ−５イオン交換樹脂で処理し、アンモニア水で溶出させ、２’−デオキシムギネ酸のアンモニア塩の溶液とした。この溶液を減圧乾燥させ、粗２’−デオキシムギネ酸１８０ミリグラムを得た。これを水−メタノール−エタノールにより結晶化させ２’−デオキシムギネ酸を得た。得られた２’−デオキシムギネ酸の比旋光度、1H NMR、13C NMR、及びMSの各種スペクトルは天然のものと一致した（Nomoto, K. Chemia, (1981), 7, p249）。
【実施例４】
【００３５】
Ｂｏｃ−Ｌ−アリルグリシンから化合物（３−３）の製造
【化１７】
2008120741.tif 000018
【００３６】
Ｂｏｃ−Ｌ−アリルグリシン１．６ｇ（７．４ミリモル）をメタノール（２５ミリリットル）に溶かし、オゾンガスを−７８℃でバブリングした。溶液の色が青くなるまでバブリングした後、青い色が消えるまで酸素をバブリングした。室温に戻した後、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸７５２ミリグラム（７．４ミリモル）とシアノ水素化ホウ素ナトリウム４７０ミリグラム（７．４ミリモル）を加え、１時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、シリカゲルを用いたショートパスシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝５：１（ｖ／ｖ））の混合溶液でシアノ水素化ホウ素ナトリウムの残骸および少量のＬ−アリルグリシン由来の副生成物を取り除いた後、メタノール溶液を流す）により化合物（３−３）を２．１ｇ得た。（収量９３％）
【実施例５】
【００３７】
Ｂｏｃ−Ｌ−アリルグリシンから化合物（３−４）の製造
【化１８】
2008120741.tif 000019
【００３８】
Ｂｏｃ−Ｌ−アリルグリシン６７０ミリグラム（３．１ミリモル）を１０ミリリットルのジメチルホルムアミドに溶かし、炭酸カリウム１．３グラム（９．１ミリモル）、ヨウ化エチル０．３２ミリリットル（４．１ミリモル）を順次加えた。反応混合物を２時間室温で撹拌した後、水を加え、エーテルで２回抽出した。抽出液を集めた後、硫酸マグネシウムで乾燥、濾過、減圧濃縮によりエチルエステル体の粗生成物を得た。この粗生成物を１、２−ジクロロエタン２０ミリリットルに溶かし、二酸化セレン３２０ミリグラム（２．９ミリモル）、５．５Ｍ  ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシドを２ミリリットル（１１．６ミリモル）加えて、７０℃で８時間撹拌した。反応混合物に炭酸水素ナトリウム溶液を加え、酢酸エチルで２回抽出した。抽出液を集め、硫酸マグネシウムで乾燥、濾過、減圧濃縮により生成物（７−１）を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、４００ミリグラムの生成物（７−１）を油状生成物として得た。（収率５５％）。得られた生成物（７−１）は実施例４と同様の操作により化合物（３−４）へと導いた。（収率８０％）
【実施例６】
【００３９】
化合物（３−３）から化合物（６−１）の製造
【化１９】
2008120741.tif 000020
【００４０】
化合物（３−３）１．７グラム（５．６ミリモル）に、０℃に冷やしたエタノール塩酸（塩化アセチル４ミリリットルとエタノール１６０ミリリットルより調製）１４０ミリリットルを加え、０℃で２時間、室温で一晩撹拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、トルエン共沸により乾燥させ、真空ポンプで乾固するまで吸引した。生じた塩酸塩をメタノール３０ミリリットルに溶かし、アルデヒド（５−１）を１．３グラム（５．６ミリモル）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム３５４ミリグラム（５．６ミリモル）を順次加え、約５時間撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで３回抽出した。抽出液を集め、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、減圧濃縮により油状物質を得た。これをショートパスシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１（ｖ／ｖ）から酢酸エチル）無色の油状物質として化合物（６−１）を１．８グラム得た。（収量６８％）
【実施例７】
【００４１】
化合物（３−４）から化合物（６−２）の製造
【化２０】
2008120741.tif 000021
【００４２】
化合物（３−４）１７０  ミリグラム（０．４９ミリモル）に、０℃に冷やしたエタノール塩酸（塩化アセチル０．２ミリリットルとエタノール１０ミリリットルより調製）１０．２ミリリットルを加え、０℃で２時間、室温で一晩撹拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、トルエン共沸により乾燥させ、真空ポンプで乾固するまで吸引した。生じた塩酸塩をメタノール３０ミリリットルに溶かし、アルデヒド（５−１）を１１３ミリグラム（０．４９ミリモル）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム３１ミリグラム（０．４９ミリモル）を順次加え、約５時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮の後にショートパスシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１（ｖ／ｖ）から酢酸エチル）無色の油状物質として化合物（６−２）を１９３ミリグラム得た。（収量８１％）
【実施例８】
【００４３】
Ｂｏｃ−Ｌ−アリルグリシンから化合物（６−１）へのワンポット製造
【化２１】
2008120741.tif 000022
【００４４】
Ｂｏｃ−Ｌ−アリルグリシン４００ミリグラム（１．９ミリモル）をメタノール１５ミリリットルに溶かし、−７８℃でオゾンをバブリングした。溶液の色が青くなるまでバブリングした後、青い色が消えるまで酸素をバブリングした。Ｌ−アゼチジンー２−カルボン酸１８８ミリグラム（１．９ミリモル）とシアノ水素化ホウ素ナトリウム１１７ミリグラム（１．９ミリモル）を加え、室温に戻し２時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、０℃に冷やしたエタノール塩酸４０ミリリットル（塩化アセチル１．６ミリリットルとエタノール４０ミリリットルから調製）を加え、０℃で２時間、室温で一晩撹拌した後、減圧濃縮、トルエン共沸、真空ポンプにより乾固させる。生じた塩酸塩をメタノール２０ミリリットルに溶かし、アルデヒド（５−１）を４２８ミリグラム（１．９ミリモル）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム１２０ミリグラム（１．９ミリモル）を順次加え、約５時間撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで３回抽出した。抽出液を集め、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、減圧濃縮により油状物質を得た。これをショートパスシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１（ｖ／ｖ）から酢酸エチル（０．１％トリエチルアミン添加））無色の油状物質として化合物（６−１）を４８０ミリグラム得た。（収量５５％）
【実施例９】
【００４５】
化合物（６−１）から２’−デオキシムギネ酸の製造
【化２２】
2008120741.tif 000023
【００４６】
化合物（６−１）３００ミリグラム（０．６ミリモル）に６Ｎ塩酸１０ミリリットルを０℃で加え、室温で約１０時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮させた後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１５ミリリットルを加え、１０時間撹拌させた。１Ｎ塩酸により中和した後、減圧濃縮により粗２’−デオキシムギネ酸の塩酸塩を得た。これを水約５ミリリットルに溶かし、ダウエックス５０Ｗ−５イオン交換樹脂で処理し、アンモニア水で溶出させ、２’−デオキシムギネ酸のアンモニア塩の溶液とした。この溶液を減圧乾燥させ、粗２’−デオキシムギネ酸１８０ミリグラム（収量１００％）を得た。これを水−メタノールーエタノールにより結晶化させ２’−デオキシムギネ酸１２０ミリグラム（収量  ６６％）を得た。得られた２’−デオキシムギネ酸の比旋光度、1H NMR、13C NMR、及びMSの各種スペクトルは天然のものと一致した（Nomoto, K. Chemia, (1981), 7, p249）。
【実施例１０】
【００４７】
化合物（６−２）からムギネ酸の製造
【化２３】
2008120741.tif 000024
【００４８】
化合物（６−２）１００ミリグラム（０．３１ミリモル）に６Ｎ塩酸１０ミリリットルを０℃で加え、室温で約２時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮させた後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１０ミリリットルを加え１０時間撹拌する。反応混合物を１Ｎ塩酸で中和した後、減圧濃縮により粗ムギネ酸の塩酸塩を得た。これを水約５ミリリットルに溶かし、ダウエックス５０Ｗ−５イオン交換樹脂で処理し、アンモニア水で溶出させ、ムギネ酸のアンモニア塩の溶液とした。この溶液を減圧乾燥させ、粗ムギネ酸９９ミリグラムを得た。得られた粉末を水３ミリリットルに溶かし、DIANION HP20(水で 溶出)で精製した後、もう一度凍結乾燥し、ムギネ酸９５ミリグラム（収量９６％）を得た。1H NMR、及びMSスペクトルから、得られたムギネ酸は、天然ムギネ酸とその２’水酸基立体異性体との混合物であることが分かった。
【実施例１１】
【００４９】
ムギネ酸製造の別法
【化２４】
2008120741.tif 000025
【００５０】
実施例５に従い、まずＣｂｚ−Ｌ−アリルグリシンｔ−ブチルエステル１．４グラム（４．６ミリモル）を化合物（８）へと導き（収率５５％）、次いで５５０ミリグラムの化合物（８）を５８０ミリグラムの化合物（９）へと導いた（収率８６％）。続いて化合物（９）４５０ミリグラム（１．１ミリモル）をメタノール１０ミリリットルに溶かし、１０％パラジウム炭素８０ミリグラムを加え、水素雰囲気下で１時間撹拌した。メタノールで希釈した後、セライト濾過、減圧濃縮によりアミン体とした。ついで減圧濃縮物をメタノール１５ミリリットルに溶かした後、酢酸６６マイクロリットルを加え、ｐＨを４〜６に調製した。次いで、アルデヒド（５−１）を２５４ミリグラム（１．１ミリモル）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム７０ミリグラム（１．１ミリモル）を順次加え、約５時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって酢酸エチル／メタノール（４：１（ｖ／ｖ））溶液でシアノ水素化ホウ素ナトリウムとアルデヒドの残骸を取り除いた後、クロロホルム／メタノール（４：１（ｖ／ｖ））溶液、次いでクロロホルム／メタノール（２：１（ｖ／ｖ））溶液で化合物１０を溶出し、溶出液を留去して化合物（１０）を４８０ミリグラム得た。（収率８９％）
得られた化合物（１０）２００ミリグラム（０．４１ミリモル）を０℃の６Ｎ塩酸に溶かし、約２時間撹拌した後減圧濃縮させて、粗ムギネ酸の塩酸塩を得た。これを水約５ミリリットルに溶かし、ダウエックス５０Ｗ−５イオン交換樹脂で処理し、アンモニア水で溶出させ、ムギネ酸のアンモニア塩の溶液とした。この溶液を減圧乾燥させ、粗ムギネ酸を得た。得られた粉末を水３ミリリットルに溶かし、DIANION HP20(水で 溶出)で精製した後、もう一度凍結乾燥し、ムギネ酸１２５ミリグラム（収量９５％）を得た。1H
NMR、及びMSスペクトルから、得られたムギネ酸は、天然ムギネ酸とその２’水酸基立体異性体との混合物であることが分かった。
【実施例１２】
【００５１】
ムギネ酸の光学分割
実施例１１で得た化合物（１０）２５０ミリグラム（０．５１ミリモル）を２０％アセトニトリル水溶液（０．１％酢酸を含む）１０mlに溶解し、液体クロマトグラフィーで分取した。液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。
カラム：CAPCELLPAK  C18-UG80 (5μm)(Shiseido)
溶離速度：9.999ml/分
溶離条件：35% CH3CN-H2O (1% 酢酸)
溶出時間：マイナー：14.0分；メジャー：16.3分
インジェクション容量：各200μl
各フラクションを集め、溶媒を減圧下留去した。マイナーピーク、及びメジャーピークの各乾固物を6N HCl (20ml)に溶解し、室温で5時間撹拌した。溶媒を減圧下留去し、得られた塩酸塩をイオン交換カラム（Dowex50W8, 100-200mesh, H+ form）に担持させ、5% NH4OH水溶液で溶出し、凍結乾燥した。得られた粉末を水に溶かし、DIANION HP20（水で溶出）で精製した後、もう一度凍結乾燥した。マイナーピークからの精製物の収量は２０ｍｇであり、メジャーピークからの精製物の収量は８１mgであった。マイナーピーク精製物及びメジャーピーク精製物の各種物性の測定値を以下に示す。
＜マイナーピーク＞
[a]24D−63.5°(c 0.31, H2O);1H NMR (400MHz, D2O, pH=4.53 adjusted by the addition of 1N DCl)d 2.03 (1H, m), 2.19 (1H, m), 2.57 (1H, m), 2.72 (1H, m), 3.21 (1H, m), 3.29 (1H, m), 3.43 (1H, dd, J=2.7, 13.7 Hz), 3.56 (1H, dd, J=9.5, 13.7 Hz), 3.85 (1H, d, J=2.9 Hz), 4.03 (1H, app.q, J=9.7 Hz), 4.10 (1H, dt, J=4.2, 10.1 Hz), 4.17 (1H, dd, J=4.6, 7.3 Hz), 4.44 (1H, dt, J=9.3, 2.9 Hz), 4.88 (1H, t, J=9.5 Hz) ppm; 13C NMR (100MHz, D2O, pH=4.53 adjusted by the addition of 1N DCl)d 24.6, 32.9, 47.9, 53.9, 59.0, 67.4 (2C), 70.6, 73.2, 171.8, 175.8, 182.3 ppm; IR (film, cm-1) 3215, 3061, 2855, 1618, 1412, 1319, 1236, 1115, 1092, 976, 773; HRMS m/z calcd for C12H21N2O8+ [M+H]+: 321.1298, found: 321.1292.
＜メジャーピーク＞
[a]24D−48.8°(c 0.57, H2O); 1H NMR (400MHz, D2O, pH=4.50 adjusted by the addition of 1N DCl)d 2.02 (1H, m), 2.16 (1H, m), 2.57 (1H, m), 2.70 (1H, m), 3.16 (1H, dt, J=12.7, 7.1 Hz), 3.30 (1H, dt, 12.7, 7.1 Hz), 3.41 (1H, dd, J=9.8, 13.2 Hz), 3.57 (1H, dd, J=2.7, 13.2 Hz), 3.63 (1H, d, J=8.3 Hz), 4.06 (1H, app.q, J=9.7 Hz), 4.09 (1H, m), 4.16 (1H, dd, J=4.4, 7.6 Hz), 4.22 (1H, ddd, J=2.7, 8.3, 9.8 Hz), 4.89 (1H, t, J=9.5 Hz); 13C NMR (100MHz, D2O, pH=4.50 adjusted by the addition of 1N DCl)d 24.5, 32.7, 48.1, 54.4, 60.0, 67.4, 67.5, 69.9, 73.2, 172.4, 175.7, 182.1 ppm; IR (film, cm-1) 3213, 3051, 2839, 1610, 1412, 1329, 1238, 1107, 934, 773; HRMS m/z calcd for C12H21N2O8+ [M+H]+: 321.1298, found: 321.1298.
マイナーピーク精製物とメジャーピーク精製物とは比旋光度を除き、ほぼ一致していた。マイナーピークには目的物の天然と同じ立体配置をもつムギネ酸（２’位水酸基のＳ体）が含まれ、メジャーピークには２’位水酸基のＲ体が含まれることが確認された。また、1H-NMRの解析により、Ｓ体とＲ体とのモル比は１：３であることが分かった。
【化２５】
2008120741.tif 000026
【実施例１３】
【００５２】
合成ムギネ酸の活性の確認
実施例１２で得た２’位水酸基のＳ体及びＲ体、実施例９で得た２’位デオキシ体、並びにオオムギから「タカギ・エス（Takagi, S）ら、ジャーナル・プラント  オブ  ニュートリション、１９８４年、第７巻、p４６９−４７７」に記載の方法で精製したムギネ酸について、それらの鉄錯体がムギネ酸鉄錯体トランスポーターにより実際に細胞内に取り込まれることを確認した。
＜ムギネ酸鉄錯体トランスポーターを発現するアフリカツメガエル卵母細胞の作製＞
「ムラタ・ワイ（Murata, Y.）ら、プラント・ジャーナル（Plant J.）,2006年、第４６巻、p.  563-572.」に記載の方法で、アフリカツメガエルの卵母細胞に、オオムギのムギネ酸鉄錯体トランスポーター（Plant J. 2006, vol46, 563-572）をコードする遺伝子ＨｖＹＳ１遺伝子を導入した。具体的には、ｐＳＰ６４Ｐｏｌｙ（Ａ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＸｂａＩとＢａｍＨＩのサイトに、ＨｖＹＳ１  ｃＤＮＡ(配列番号１のコード領域)を挿入し、これを用いてＡｍｂｉｏｎ社のｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  ＫｉｔでｃＲＮＡを作製した。
アフリカツメガエル（浜松生物教材から購入）の腹部を切開し、卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｏｏｃｙｔｅｓ）を摘出した。そして、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅＩＡ（Ｓｉｇｍａ）を２ｍｇ／ｍＬになるように加え、ＯＲ−２溶液（８２．５ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）が入った遠沈管に卵母細胞を移し、室温で約２時間撹拌した後、ＯＲ−２溶液で３回、さらにＮＤ−９６溶液（９６ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２，５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）で３回洗浄した。ｃＲＮＡ５０μｇ／ｍＬ，５０ｎＬをデジタル式マイクロディスペンサー（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入した。卵母細胞はＮＤ−９６溶液中、１７℃で４８〜７２時間培養した。
＜ムギネ酸類の鉄錯体の調製＞
２’位水酸基のＳ体及びＲ体、２’位デオキシ体、並びにオオムギから精製したムギネ酸のそれぞれ３０ｍＭと塩化第２鉄３０ｍＭとを混合して、室温で２時間静置し、鉄錯体濃度５ｍＭになるように希釈した。
＜鉄取り込み活性の比較＞
卵母細胞クランプＯＣ−７２５Ｃ（Warner Instrument）を用いて細胞内へのムギネ酸鉄錯体の取り込みを電気化学的信号の検出により定量した。具体的には、ムギネ酸鉄錯体トランスポーターＨｖＹＳ１を発現させた卵母細胞を、ＮＤ−９６溶液で充たしたチャンバーにセットし、５ｍＭの基質鉄錯体溶液を１０μＬかけて（最終濃度５０μＭ）電気生理活性を測定した。卵母細胞に２本の３Ｍ  ＫＣｌを充たした微小電極を差し込み、実験槽の電位を０Ｖに固定したモードで、固定電位−６０ｍＶで変化する電流値を測定した。データはPowerLabデータ収録装置（Chart 4 ソフトウエア）で記録した。
結果を図１に示す。２’水酸基Ｓ体、２’水酸基Ｒ体、及び２’デオキシ体について測定された電流値の大きさ（電気生理活性）を、天然ムギネ酸について測定された電気信号の大きさ（電気生理活性）を１００とした場合の相対値で示した。２’水酸基Ｓ体、２’水酸基Ｒ体、及び２’デオキシ体は、いずれも天然ムギネ酸と同様であった。ワンポット合成により得られるムギネ酸のように、合成したムギネ酸の２’位の水酸基の立体配置が混合していても、また２’位デオキシ体でも、鉄錯体の植物内への輸送に有用であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の製造方法は、ＥＤＴＡに変わるキレート剤として利用可能なムギネ酸類を安価に大量に製造できるので有用である。また、本発明の製造方法により製造されるムギネ酸は、植物における鉄輸送機構の研究や、健康食品、化粧品または肥料などの分野で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ムギネ酸２’水酸基Ｓ体、ムギネ酸２’水酸基Ｒ体、及びムギネ酸２’デオキシ体の鉄錯体トランスポーターの基質としての活性を、天然ムギネ酸の活性と比較した結果を示す図である。
【図１】
2008120741.tif 000036
【配列表】
2008120741000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月26日(2008.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（２）：
【化１】
2008120741.tif 000037
（式中、Ｒ1は水素原子また水酸基を表し、Ｒ4は水素原子またはカルボキシル基の保護基を表し、Ｒ5はアミノ基の保護基を表す。）
で表される化合物のビニル基を酸化開裂させると同時にアゼチジン?２?カルボン酸で還元的アミノ化反応させ下記一般式（３）：
【化２】
2008120741.tif 000038
（式中、Ｒ1、Ｒ4およびＲ5は前記と同義を表す。）
で表される化合物を得た後、該化合物のカルボキシル基を保護基で保護すると共にアミノ基の保護基を除去し、下記一般式（４）：
【化３】
2008120741.tif 000039
（式中、Ｒ1およびＲ4前記と同義を表し、Ｒ6はカルボキシル基の保護基を表す。）
で表される化合物またはその塩とし、次いで該化合物で下記一般式（５）：
【化４】
2008120741.tif 000040
（式中、Ｒ2は水素原子また水酸基を表し、Ｒ７はカルボキシル基の保護基を表し、Ｒ8は−ＯＲ9（Ｒ9は水酸基の保護基を表す。）、または−ＮＨＲ10（Ｒ10はアミノ基の保護基を表す。））
で表されるアルデヒドを還元的アミノ化反応させて下記一般式（６）：
【化５】
2008120741.tif 000041
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は前記と同義を表す。）
で表される化合物とした後、カルボキシル基の保護基および水酸基またはアミノ基の保護基を除くことを特徴とする下記一般式（１）：
【化６】
2008120741.tif 000042
（式中、Ｒ1およびＲ2は前記と同義を表し、Ｒ3は水酸基またはアミノ基を表す。）
で表されるムギネ酸類の製造方法。＿
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月14日(2008.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（２）：
【化１】
2008120741.tif 000043
（式中、Ｒ1は水素原子また水酸基を表し、Ｒ4は水素原子またはカルボキシル基の保護基を表し、Ｒ5はアミノ基の保護基を表す。）
で表される化合物のビニル基を酸化開裂させると同時にアゼチジン−２−カルボン酸で還元的アミノ化反応させ下記一般式（３）：
【化２】
2008120741.tif 000044
（式中、Ｒ1、Ｒ4およびＲ5は前記と同義を表す。）
で表される化合物を得た後、該化合物のカルボキシル基を保護基で保護すると共にアミノ基の保護基を除去し、下記一般式（４）：
【化３】
2008120741.tif 000045
（式中、Ｒ1およびＲ4前記と同義を表し、Ｒ6はカルボキシル基の保護基を表す。）
で表される化合物またはその塩とし、次いで該化合物で下記一般式（５）：
【化４】
2008120741.tif 000046
（式中、Ｒ2は水素原子また水酸基を表し、Ｒ７はカルボキシル基の保護基を表し、Ｒ8は−ＯＲ9（Ｒ9は水酸基の保護基を表す。）、または−ＮＨＲ10（Ｒ10はアミノ基の保護基を表す。））
で表されるアルデヒドを還元的アミノ化反応させて下記一般式（６）：
【化５】
2008120741.tif 000047
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は前記と同義を表す。）
で表される化合物とした後、カルボキシル基の保護基および水酸基またはアミノ基の保護基を除くことを特徴とする下記一般式（１）：
【化６】
2008120741.tif 000048
（式中、Ｒ1およびＲ2は前記と同義を表し、Ｒ3は水酸基またはアミノ基を表す。）
で表されるムギネ酸類の製造方法。＿