(57)【要約】【課題】  リウマチに対する新たな治療薬を提供する。【解決手段】  Ｊａｇｇｅｄ１遺伝子またはＪａｇｇｅｄ１タンパク質を含むＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤とする。このＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤によれば、ＣＤ８Ｔ細胞の活性化が抑制され、その結果、リウマチの予防または治療が可能となる。前記遺伝子としては、特に、Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質の細胞外領域の構造遺伝子であることが好ましい。また、この構造遺伝子を挿入した組換ベクターをＤＮＡワクチンとして使用することが好ましい。【選択図】  図１
2008120740.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子およびタンパク質のいずれか一方を含むＣＤ８Ｔ細胞の活性化抑制剤であって、
前記遺伝子が、Ｊａｇｇｅｄ１遺伝子であり、前記タンパク質が、Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質であることを特徴とするＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤。
【請求項２】
前記遺伝子が、Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質の構造遺伝子である、請求項１記載のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤。
【請求項３】
前記Ｊａｇｇｅｄ１構造遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）に示すいずれか一つのＤＮＡである、請求項２記載のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤。
（ａ）配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）前記（ａ）および（ｂ）において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質と同様の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
前記遺伝子が、Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質の細胞外領域の構造遺伝子である、請求項１記載のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤。
【請求項５】
前記細胞外領域の構造遺伝子が、以下の（ｄ）〜（ｆ）に示すいずれか一つのＤＮＡである、請求項４記載のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤。
（ｄ）配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）前記（ｄ）および（ｅ）において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質の細胞外領域と同様の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項６】
さらに、ベクターを含み、前記遺伝子が前記ベクターに挿入されている、請求項１から５のいずれか一項に記載のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤。
【請求項７】
前記ベクターが、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項６記載のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤。
【請求項８】
前記Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質が、以下の（Ａ）〜（Ｃ）に示すいずれか一つのタンパク質である、請求項１記載のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤。
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｃ）前記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質と同様の機能を有するタンパク質
【請求項９】
前記タンパク質が、Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質の細胞外領域である、請求項１記載のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤。
【請求項１０】
前記Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質の細胞外領域が、以下の（Ｄ）〜（Ｆ）に示すいずれか一つのタンパク質である、請求項１記載のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤。
（Ｄ）配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｆ）前記（Ｄ）または（Ｅ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質の細胞外領域と同様の機能を有するタンパク質
【請求項１１】
リウマチ治療薬であって、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤を含むことを特徴とするリウマチ治療薬。
【請求項１２】
リウマチ治療用のＤＮＡワクチンであって、Ｊａｇｇｅｄ１遺伝子を含むことを特徴とするリウマチ治療用ＤＮＡワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤、リウマチ治療薬およびリウマチ治療用ＤＮＡワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチは、慢性持続性の多発関節炎であり、身体の多くの関節において炎症が起こって腫れるために痛みを伴い、この状態が長期にわたって進行することによって、さらに、関節の変形や機能障害を併発する、難知性の疾患である。日本国内においては１００万人近くの羅患者が存在することが知られている。関節リウマチが発症するメカニズムは、以下のような免疫異常によるものと考えられている。すなわち、何らかの原因により、関節腔の内面を覆っている滑膜細胞の増殖ならびに関節の血管の増加が起こり、血管内から関節滑膜組織にリンパ球やマクロファージ等の白血球が遊走する。このため、関節局所で免疫応答が生じ、リンパ球やマクロファージが産生するサイトカインの作用によって炎症反応が引き起こり、リウマチ疾患になるというメカニズムである。しかしながら、このような免疫異常が起こる原因については未だ明らかとなっていない。
【０００３】
リウマチ疾患等の膠原病においては、一般的に、患者自身のタンパク質（自己抗原）を認識するＴ細胞の活性化が主要な病態を形成していると考えられている。そこで、関節リウマチの治療薬としては、現在、免疫抑制剤を含む様々な種類の薬剤が使用されており、具体的に、リウマチ疾患において過剰に存在するＴＮＦγをターゲットとする中和抗体を用いた治療薬や、ＴＦＮの受容体（細胞外ドメインのみの可溶性ＴＮＦ受容体）を補充する治療薬等が販売されている。しかしながら、未だ有効性の高い治療薬は見出されていない。
【非特許文献１】Rovensky  J,  Svik  K.  Stancikova  M,  Istok  R,  Effect  of  immunostimulatory  ribomunyl  on  preventive  treatment  of  rat  adjuvant  arthritis  with  cyclosporine  and  methotrexate.  J  Rheumatol.  2003  Sep;  30(9):2027-32.
【非特許文献２】Matsuura  M,  Imayoshi  T,  Chiba  K,  Okumoto  T.  Effect  of  FTY720,  a  novel  immunosuppressant,  on  adjuvant-induced  arthritis  in  rats.  Inflamm  Res.  2000  Aug;  49(8):404-10.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、リウマチに対する新たな治療薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤は、遺伝子およびタンパク質のいずれか一方を含むＣＤ８Ｔ細胞の活性化抑制剤であって、前記遺伝子が、Ｊａｇｇｅｄ１遺伝子であり、前記タンパク質が、Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質であることを特徴とする。以下、本発明において、Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質を「Ｊａｇ１タンパク質」、Ｊａｇｇｅｄ１遺伝子を「Ｊａｇ１遺伝子」という。
【発明の効果】
【０００６】
自己に対する免疫には、一般に、ＣＤ４Ｔ細胞（ＣＤ４陽性細胞）やＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ８陽性細胞）が重要な役割を有することが知られている。そして、リウマチと同様に自己免疫疾患である多発筋炎は、主に細胞障害性ＣＤ８Ｔ細胞と呼ばれるキラーＴ細胞が、炎症を起こした筋肉に湿潤しているため、自己の筋細胞がＣＤ８Ｔ細胞の標的となって、組織破壊が生じていると考えられる。一方、ＣＤ８Ｔ細胞は、ＣＤ４Ｔ細胞と異なり、標的組織ではなくリンパ節で抗原提示を受けて増殖し、抹消血を経由して標的組織に移ることが知られており、非特異的刺激でも増殖し易い。このため、健常人の抹消血においても、ウイルス等の外敵を攻撃するＣＤ８Ｔ細胞が多く存在する。このようなＣＤ８Ｔ細胞の特性を考慮すると、多発筋炎患者の抹消血には健常者よりも高頻度にＣＤ８Ｔ細胞のクローン性増多があると推定される。そこで、本発明者は、同じように自己免疫疾患の一つであるリウマチ患者について、ＣＤ８Ｔ細胞の活性化を抑制（不活性化）することによって、その細胞応答性を抑制すれば、ＣＤ８Ｔ細胞が自己細胞（自己組織）を標的とすることを抑制でき、結果的にリウマチを予防、治療できると推測した。そして、本発明者は、鋭意研究を行った結果、Ｔ細胞のレセプターであるＮｏｔｃｈタンパク質と、そのリガンドであるＪａｇ１タンパク質とが相互作用することによって、ＣＤ８Ｔ細胞の活性化が抑制される（不活性化する）との知見を得て、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤によれば、Ｊａｇ１タンパク質（Ｊａｇ１遺伝子から翻訳されたＪａｇ１タンパク質を含む）とＮｏｔｃｈタンパク質とが相互作用することによって、ＣＤ８Ｔ細胞の活性化が抑制される。そして、ＣＤ８Ｔ細胞の不活性化により、例えば、前記Ｔ細胞の細胞応答性や、Ｔ細胞からのサイトカインの産生、Ｔ細胞の増殖等が抑制され、結果として、リウマチの予防や治療が可能となる。また、リウマチに関与すると考えられるＣＤ８Ｔ細胞の活性化を抑制することから、従来のようなあらゆる免疫力を抑制する薬剤とは異なり、例えば、副作用を軽減し、主として治療目的であるリウマチに関与する自己免疫を抑制することが可能になると考えられる。このため、本発明のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤は、新たなリウマチ治療剤として極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤は、前述のように、遺伝子およびタンパク質のいずれか一方を含み、前記遺伝子が、Ｊａｇ１遺伝子であり、前記タンパク質が、Ｊａｇ１タンパク質であることを特徴とする。
【０００９】
本発明のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤によって、ＣＤ８Ｔ細胞の活性化が抑制される理由は、前述のように、Ｊａｇ１タンパク質とＴ細胞のレセプターであるＮｏｔｃｈタンパク質との相互作用によるものと考えられる。しかしながら、この推定メカニズムは、本発明を何ら制限するものではない。つまり、本発明のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤は、Ｊａｇ１タンパク質およびＪａｇ１遺伝子の少なくとも一方を含んでいればよく、メカニズムに関わらずＣＤ８Ｔ細胞の活性化を抑制することができる。なお、後述する実施例において、本発明のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤により、実際に、ＣＤ８Ｔ細胞が不活性化され、リウマチの症状が抑制されることは証明済みである。
【００１０】
本発明において、ＣＤ８Ｔ細胞の活性化を抑制するために含まれる成分は、前述のような遺伝子およびタンパク質のいずれであってもよい。以下に、第１の実施形態として、前記遺伝子を含むＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤、第２の実施形態として、前記タンパク質を含むＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤について説明する。
【００１１】
＜第１の実施形態＞
本実施形態は、遺伝子を含むＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤の例である。本実施形態において、ＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤は、Ｊａｇ１遺伝子を含んでいればよい。本発明におけるＪａｇ１遺伝子とは、例えば、非翻訳部分を含むＪａｇ１遺伝子（例えば、完全長配列）でもよいし、翻訳部分のみを含むＪａｇ１タンパク質の構造遺伝子（以下、「Ｊａｇ１構造遺伝子」という）であってもよい。さらに、これには限定されず、後述するように、Ｊａｇ１タンパク質における細胞内領域を部分的に、もしくは全部除去した領域（例えば、Ｊａｇ１タンパク質の細胞外領域）の構造遺伝子であってもよい。本発明において「構造遺伝子」とは、転写・翻訳を受けタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列を規定する遺伝子（翻訳領域）を意味する。
【００１２】
まず、Ｊａｇ１構造遺伝子としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）に示すいずれか一つのＤＮＡがあげられる。
（ａ）配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）前記（ａ）〜（ｂ）において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記Ｊａｇ１タンパク質と同様の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１３】
前記（ａ）のＤＮＡは、マウスＪａｇ１タンパク質の構造遺伝子（ＣＤＳ領域）であり、配列番号２に示すマウスＪａｇ１タンパク質のアミノ酸配列（１２１８アミノ酸残基）をコードする。また、前記（ｂ）のＤＮＡは、ヒトＪａｇ１タンパク質の構造遺伝子（ＣＤＳ領域）であり、配列番号７に示すヒトＪａｇ１タンパク質のアミノ酸配列（１２１８アミノ酸残基）をコードする。なお、Ｊａｇ１構造遺伝子は、ヒトやマウス由来の配列には制限されず、例えば、他の哺乳類動物等のＪａｇ１構造遺伝子でもよい。
【００１４】
なお、配列番号１に、マウスＪａｇ１遺伝子の全配列を示し、配列番号６には、ヒトＪａｇ１遺伝子の全配列を示す（非翻訳領域を含む完全長配列）。また、マウスＪａｇ１遺伝子、マウスＪａｇ１構造遺伝子（ＣＤＳ領域）およびマウスＪａｇ１タンパク質は、ＮＣＢＩアクセッション：ＮＭ＿０１３８２２に、ヒトＪａｇ１遺伝子、ヒトＪａｇ１構造遺伝子（ＣＤＳ領域）およびヒトＪａｇ１タンパク質は、ＮＣＢＩアクセッション：Ｎｏ．ＭＮ＿００２１４に、それぞれ登録されている。
【００１５】
前記Ｊａｇ１構造遺伝子は、前記（ａ）における配列番号３の塩基配列には限られず、例えば、配列番号２に示すマウスＪａｇ１タンパク質のアミノ酸配列をコードする他の塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。また、同様に、前記（ｂ）における配列番号８の塩基配列には限られず、例えば、配列番号７に示すヒトｓＪａｇ１タンパク質のアミノ酸配列をコードする他の塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。
【００１６】
さらに、本発明におけるＪａｇ１構造遺伝子は、前記（ｃ）に示すようなＤＮＡでもよい。前記（ｃ）において、欠失、置換または付加が可能な塩基数は、ＤＮＡがコードするタンパク質が、Ｊａｇ１タンパク質の機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。前記塩基数としては、特に制限されないが、例えば、５０塩基に対して、１〜６個が好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個である。なお、本発明において、「Ｊａｇ１タンパク質と同様の機能を有する」とは、Ｊａｇ１タンパク質と同様のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制の機能を有することを意味する（以下、同様）。したがって、本発明における遺伝子は、この機能を有する限りにおいて、（ａ）や（ｂ）のＤＮＡの部分配列であってもよい。
【００１７】
また、前記（ｃ）に示すＤＮＡは、Ｊａｇ１タンパク質の機能を喪失しない範囲であれば、例えば、前記（ａ）および（ｂ）のいずれかのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよいし、前記いずれかのＤＮＡとの相同性が９０％以上のＤＮＡでもよい。ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、各配列番号で示された塩基配列のＴｍ値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、１０分の洗浄（２回）があげられる。また、相同性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。
【００１８】
つぎに、本発明における遺伝子は、前述のように、Ｊａｇ１構造遺伝子の部分配列であってもよい。すなわち、Ｊａｇ１タンパク質は、膜貫通ドメインである細胞内領域と、細胞外領域とを有するが、本発明における遺伝子は、例えば、Ｊａｇ１タンパク質における細胞内領域を部分的にもしくは全部除去した領域の構造遺伝子であってもよい。具体例として、前記細胞内領域を全部除去した、Ｊａｇ１タンパク質の細胞外領域の構造遺伝子があげられる。このＪａｇ１タンパク質の細胞外領域は、疎水性に富む細胞内領域を除いた領域であり、可溶性を示すことから、可溶化Ｊａｇ１タンパク質（ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｊａｇ１タンパク質）と呼ぶことができる（以下、「ｓＪａｇ１タンパク質」という）。ｓＪａｇ１タンパク質の構造遺伝子は、以下、「ｓＪａｇ１構造遺伝子」という。このようなｓＪａｇ１タンパク質は、可溶性に優れるため、例えば、生体内を移動し易く、また、前述のようにＣＤ８Ｔ細胞が多く存在する血液等にも導入され易いことから、所望の部位におけるＣＤ８Ｔ細胞の活性化を効率良く抑制できる。したがって、前記遺伝子としては、特に、ｓＪａｇ１タンパク質を発現するｓＪａｇ１構造遺伝子が好ましい。
【００１９】
前記ｓＪａｇ１構造遺伝子としては、例えば、以下の（ｄ）〜（ｆ）に示すいずれか一つのＤＮＡがあげられる。
（ｄ）配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）前記（ｄ）〜（ｅ）において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記ｓＪａｇ１タンパク質と同様の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００２０】
前記（ｄ）のＤＮＡは、マウスｓＪａｇ１タンパク質の構造遺伝子であり、配列番号２に示すマウスＪａｇ１タンパク質のアミノ酸配列（１２１８アミノ酸残基）における１〜１０６７番目の領域（配列番号５）をコードする。また、前記（ｅ）のＤＮＡは、ヒトｓＪａｇ１タンパク質の構造遺伝子であり、配列番号７に示すヒトＪａｇ１タンパク質のアミノ酸配列（１２１８アミノ酸残基）における１〜９３０番目の領域（配列番号１０）をコードする。なお、ｓＪａｇ１構造遺伝子は、ヒトやマウス由来の配列には制限されず、例えば、他の哺乳類動物等のｓＪａｇ１構造遺伝子でもよい。
【００２１】
また、ｓＪａｇ１構造遺伝子は、前記（ｄ）における配列番号４の塩基配列には限られず、配列番号５に示すマウスｓＪａｇ１タンパク質のアミノ酸配列をコードする他の塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。また、同様に、前記（ｅ）における配列番号９の塩基配列には限られず、例えば、配列番号１０に示すヒトｓＪａｇ１タンパク質のアミノ酸配列をコードする他の塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。
【００２２】
さらに、本発明におけるｓＪａｇ１遺伝子は、前記（ｆ）に示すようなＤＮＡでもよい。前記（ｆ）において、欠失、置換または付加が可能な塩基数は、ＤＮＡがコードするタンパク質が、ｓＪａｇ１タンパク質の機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。例えば、５０塩基に対して、１〜６個が好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個である。なお、本発明において、「ｓＪａｇ１タンパク質と同様の機能を有する」とは、ｓＪａｇ１タンパク質と同様のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制の機能を有することを意味する（以下、同様）。したがって、本発明における遺伝子は、この機能を有する限りにおいて、（ｄ）や（ｅ）のＤＮＡの部分配列であってもよい。
【００２３】
前記（ｆ）に示すＤＮＡは、ｓＪａｇ１タンパク質の機能を喪失しない範囲であれば、例えば、前記（ｄ）〜（ｅ）のいずれかのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよいし、前記いずれかのＤＮＡとの相同性が９０％以上のＤＮＡでもよい。また、相同性は、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。
【００２４】
また、本発明における遺伝子は、例えば、ｓＪａｇ１タンパク質の二量体をコードする配列であってもよい。
【００２５】
これらの遺伝子は、天然物でも合成物でもよく、例えば、公知であるＪａｇ１タンパク質やｓＪａｇ１タンパク質のアミノ酸配列、それらの構造遺伝子の塩基配列等の情報に基づいて、ＰＣＲやＲＴ-ＰＣＲ等の従来公知の方法により、クローニングすることが可能である。また、前記（ｃ）や（ｆ）に示す塩基が欠失等したＤＮＡについては、例えば、部位特異的突然変異誘発法等の従来公知の方法を適用することによって、容易に得ることができる。
【００２６】
本実施形態におけるＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤の形態としては、特に制限されないが、ＤＮＡワクチンであることが好ましい。本発明のＤＮＡワクチンは、前述のＪａｇ１構造遺伝子やｓＪａｇ１構造遺伝子等の遺伝子を含んでいればよく、その調製方法や組成、使用方法等は何ら制限されない。
【００２７】
以下、ＤＮＡワクチンの一例として、組換えベクターを例にあげて説明する。すなわち、発現ベクター等のベクターに前述のＪａｇ１構造遺伝子やｓＪａｇ１構造遺伝子等の遺伝子が挿入された組換えベクターである。なお、これは一例であって、本発明を限定するものではない。
【００２８】
前記ベクターとしては、特に制限されず、例えば、ＤＮＡワクチンを投与する対象細胞や対象組織、投与方法等に応じて適宜決定できるが、例えば、非ウイルスベクターとウイルスベクターがあげられる。前記非ウイルスベクターとしては、例えば、治療や予防の対象となる細胞内や生体内で前記遺伝子を発現できるベクターがあげられ、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ１０８，１９３−２００（１９９１））等の発現ベクターが例示できる。通常、これらのベクターのプロモーターの下流に、発現可能なように前記遺伝子を挿入すればよい。また、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶベクター；ａｄｅｎｏ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルスがあげられる。以上のようなベクターに、従来公知の方法に基づいて前記遺伝子を挿入することによって、組換えベクターを製造できる。
【００２９】
前記組換えベクターは、さらに、前記遺伝子の発現を調節する調節配列を含んでもよい。前記調節配列としては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）、筋βアクチンプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等の構成プロモーター、チミヂンキナーゼプロモーター等の組織特異的プロモーター、成長ホルモン調節性プロモーター、ｌａｃオペロン配列の制御下にあるプロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等の誘導性プロモーターや調節性プロモーターがあげられる。このような調節配列は、従来公知の方法に基づいて、前記遺伝子の発現を機能的に調節できる部位に配置または結合させればよい。また、この他にも、例えば、エンハンサー配列、ポリアデニル化シグナル、複製起点配列（ｏｒｉ）等を含んでもよい。
【００３０】
また、前記組換えベクターは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等の選択マーカーをコードする配列を有してもよい。また、前記組換えベクターは、例えば、ＣｐＧモチーフ（非メチル化ＣｐＧモチーフ）を有することが、遺伝子発現を効果的にする観点から好ましい。
【００３１】
つぎに、前記組換えベクターをＤＮＡワクチンとして被検体に導入する方法について説明する。ＤＮＡワクチンの導入方法は、特に制限されず、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで直接体内に導入する方法や、被検体から取り出した目的の細胞や組織にｅｘ  ｖｉｖｏでＤＮＡワクチンを導入し、導入後の細胞等を被検体の体内に戻す方法等がある。
【００３２】
前者のｉｎ  ｖｉｖｏ法の場合、例えば、前記組換えベクターを適当な溶媒に懸濁し、適宜滅菌処理を施した後、被検体に導入すればよい。導入方法は、特に制限されず、例えば、目的の細胞や組織等の種類に応じて、従来公知の方法が適宜採用できる。具体的としては、例えば、筋肉内、腹腔内等への注射、経口投与、皮下組織投与、遺伝子銃による投与、液浸等があげられる。
【００３３】
後者のｅｘ  ｖｉｖｏ法の場合、例えば、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、遺伝子銃による導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、前述のようなウイルスベクターを用いた方法等があげられる。
【００３４】
ＤＮＡワクチンの組成は、特に制限されないが、前記組換ベクターの他に、例えば、補助剤等を含んでもよい。前記補助剤は、特に制限されず、例えば、公知のＤＮＡワクチン用補助剤等を適宜用いることができる。
【００３５】
ＤＮＡワクチンの投与部位は、特に制限されず、例えば、自己免疫によりＣＤ８Ｔ細胞の活性化が生じている、もしくは、生じるおそれがある部位に投与することができる。また、目的部位への投与は、直接的な投与でもよいし、間接的な投与でもよい。間接的に投与する場合、ＤＮＡワクチンは、遺伝子としてｓＪａｇ１構造遺伝子を含むことが好ましい。前述のように、ｓＪａｇ１構造遺伝子から発現されるｓＪａｇ１は可溶性であるため、例えば、間接的な投与であっても、発現したｓＪａｇ１を効率良く目的部位に流動させることが可能である。投与の対象としては、特に制限されないが、例えば、ヒト、マウス等の哺乳類動物等があげられ、また、これらの細胞や組織等を採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与することもできる。
【００３６】
前記ＤＮＡワクチンの投与量は、特に制限されず、例えば、投与する対象、投与方法、投与形態、症状等によって適宜決定できる。具体例としては、ヒト（成人）に対して前記組換えベクターを５０〜１００μｇ投与することが好ましい。
【００３７】
＜第２の実施形態＞
本実施形態は、タンパク質を含むＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤の例である。本実施形態において、ＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤は、Ｊａｇ１タンパク質を含んでいればよい。しかしながら、これには限定されず、後述するように、Ｊａｇ１タンパク質における細胞内領域を部分的もしくは全部除去した領域（例えば、Ｊａｇ１タンパク質の細胞外領域）であってもよい。
【００３８】
まず、Ｊａｇ１タンパク質としては、例えば、以下の（Ａ）〜（Ｃ）に示すいずれかタンパク質があげられる。
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｃ）前記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｊａｇ１タンパク質と同様の機能を有するタンパク質
【００３９】
前記（Ａ）のタンパク質は、マウスＪａｇ１タンパク質であり、前記（Ｂ）のタンパク質は、ヒトＪａｇ１タンパク質である。なお、これらには制限されず、他の哺乳類動物等のＪａｇ１タンパク質も使用できる。
【００４０】
前記（Ｃ）において、欠失、置換または付加が可能なアミノ酸残基数は、前記（Ａ）のマウスｓＪａｇ１タンパク質や、前記（Ｂ）のヒトＪａｇ１タンパク質の機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。前記欠失等が可能なアミノ酸残基数は、例えば、５０アミノ酸残基に対して、１〜４個が好ましく、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個である。また、配列番号２や配列番号７のアミノ酸配列に対する相同性は、例えば、７０％以上である。したがって、本発明におけるタンパク質は、Ｊａｇ１タンパク質と同様の機能を有する限りにおいて、前記（Ａ）や（Ｂ）の部分配列であってもよい。
【００４１】
つぎに、本発明におけるタンパク質は、前述のように、Ｊａｇ１タンパク質には制限されず、その部分配列であってもよい。すなわち、Ｊａｇ１タンパク質における細胞内領域を全部もしくは部分的に除去した領域であってもよく、具体例として、前記細胞内領域を全部除去した、Ｊａｇ１タンパク質の細胞外領域（ｓＪａｇ１タンパク質）があげられる。本発明においては、前述のような理由から、ｓＪａｇ１タンパク質が特に好ましい。
【００４２】
ｓＪａｇ１タンパク質としては、例えば、以下の（Ｄ）〜（Ｆ）に示すいずれかのタンパク質があげられる。
（Ｄ）配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｆ）前記（Ｄ）または（Ｆ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、前記ｓＪａｇ１タンパク質と同様の機能を有するタンパク質
【００４３】
前記（Ｄ）のタンパク質は、マウスｓＪａｇ１タンパク質であり、配列番号２に示すマウス由来Ｊａｇ１タンパク質のアミノ酸配列（１２１８アミノ酸残基）における１〜１０６７番目の領域に相当する。また、前記（Ｅ）のタンパク質は、ヒトｓＪａｇ１タンパク質であり、配列番号７に示すヒト由来Ｊａｇ１タンパク質のアミノ酸配列（１２１８アミノ酸残基）における１〜９３０番目の領域に相当する。なお、これらには制限されず、他の哺乳類動物等のｓＪａｇ１タンパク質も使用できる。
【００４４】
前記（Ｆ）において、欠失、置換または付加が可能なアミノ酸残基数は、前記（Ｄ）のヒトｓＪａｇ１タンパク質や、前記（Ｅ）のマウスｓＪａｇ１タンパク質の機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。例えば、５０アミノ酸残基に対して、１〜４個が好ましく、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個である。また、配列番号５や配列番号１０のアミノ酸配列に対する相同性は、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。したがって、本発明におけるタンパク質は、ｓＪａｇ１と同様の機能を有する限りにおいて、前記（Ｄ）や（Ｅ）の部分配列であってもよい。
【００４５】
また、本発明におけるタンパク質は、例えば、ｓＪａｇ１タンパク質の二量体であってもよい。
【００４６】
このようなタンパク質は、例えば、天然物でもよいし、化学合成による合成物でもよいが、容易に大量調製が可能であることから、組換えＤＮＡ技術を用いて発現させたタンパク質であることが好ましい。このような組換えＤＮＡ技術を用いる調製方法としては、特に制限されないが、例えば、前記第１の実施形態で述べた組換えベクターを使用することが好ましい。この組換えベクターを、例えば、宿主−ベクター系に基づいて、適当な宿主に導入することにより、前記タンパク質を発現させることができる。このような方法により得られたタンパク質は、例えば、塩沈、遠心分離、カラムクロマトグラフィー等の精製処理を必要に応じて施し、回収した精製タンパク質をワクチンとして使用することができる。
【００４７】
前記タンパク質をワクチンとして被検体に投与する方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。例えば、目的の細胞や組織等の種類に応じて適宜採用できるが、例えば、筋肉内、腹腔内等への注射、経口投与、皮下組織投与、遺伝子銃による投与、液浸等があげられる。
【００４８】
前記タンパク質は、例えば、水酸化アルミニウム等の補助剤と混合したワクチン組成物として使用することが好ましい。また、目的タンパク質を、例えば、リポソーム中に封入したり、ポリマーに接合させてもよい。
【００４９】
前記タンパク質の投与量は、特に制限されず、例えば、投与する対象、投与方法、投与形態等によって適宜決定できるが、例えば、ヒト（成人）に対して５００〜１０００μｇが好ましい。
【００５０】
つぎに、本発明のリウマチ治療薬は、本発明のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤を含むことを特徴とする。本発明のリウマチ治療薬によれば、例えば、ヒトやヒトを除く哺乳類動物への投与によって、ＣＤ８Ｔ細胞の活性化が抑制できるため、これによりリウマチの予防や治療を行うことができる。なお、本発明のリウマチ治療薬は、前述のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤と同様の使用方法が採用できる。
【００５１】
つぎに、本発明のリウマチ治療用ＤＮＡワクチンは、Ｊａｇ１遺伝子を含むことを特徴とする。なお、Ｊａｇ１遺伝子としては、前述のように、非翻訳領域を含むＪａｇ１遺伝子（例えば、完全長配列）でもよいし、Ｊａｇ１構造遺伝子、その部分配列（例えば、ｓＪａｇ１構造遺伝子）であってもよい。また、その形態や使用方法も前述と同様である。
【００５２】
[実施例］
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は下記の実施例および比較例により制限されない。なお、市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールにも基づいて使用した。
【実施例１】
【００５３】
＜ＤＮＡワクチンの作製＞
ＤＮＡワクチンとして、マウスＪａｇ１タンパク質をコードするＣＤＳ配列を挿入したベクター（Ｊａｇｇｅｄ１／ｐｃＤＮＡ３．１）と、マウスＪａｇｇｅｄ１タンパク質のうち細胞内領域を欠損したタンパク質部分（細胞外領域：ｓＪａｇ１タンパク質）をコードする配列を挿入したベクター（Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｊａｇｇｅｄ１／ｐｃＤＮＡ３．１）とを、以下の方法により作製した。なお、図１（Ａ）に、Ｊａｇｇｅｄ１／ｐｃＤＮＡ３．１、図１（Ｂ）にＳｏｌｕｂｌｅ  Ｊａｇｇｅｄ１／ｐｃＤＮＡ３．１の概略を示す。
【００５４】
Ｊａｇｇｅｄ１／ｐｃＤＮＡ３．１は、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏｃｉｎ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩサイトに、配列番号３に示す配列を挿入することによって作製した。配列番号３に示す配列は、マウスＪａｇ１タンパク質のアミノ酸１〜１２１８番をコードするｃＤＮＡ配列である。このＪａｇｇｅｄ１／ｐｃＤＮＡ３．１は、以下、「Ｊａｇ１／ｐｃＤＮＡ」ともいう。
【００５５】
また、Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｊａｇｇｅｄ１／ｐｃＤＮＡ３．１は、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏｃｉｎ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶサイトに、配列番号４に示す配列を挿入することによって作製した。なお、配列番号４に示す配列は、マウスＪａｇ１タンパク質の細胞外領域（配列番号２に示すマウスＪａｇ１タンパク質のアミノ酸１〜１０６７番）をコードする配列である。このＳｏｌｕｂｌｅ  Ｊａｇｇｅｄ１／ｐｃＤＮＡ３．１は、以下、「ｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡ」ともいう。
【実施例２】
【００５６】
前記実施例１で作製したｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡから発現したｓＪａｇ１タンパク質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞に接触させ、前記ｓＪａｇ１タンパク質と前記Ｔ細胞のレセプターであるＮｏｔｃｈタンパク質とが相互作用するか否かを確認した。
【００５７】
＜レポーターアッセイ＞
トランスフェクションの前日、ＲＰＭＩ  １６４０培地を添加した６ウェルプレートに、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにＰｌａｔ−Ｅ細胞（一過性発現パッケージング細胞）を撒いた。このＰｌａｔ−Ｅ細胞に、導入試薬（商品名Ｆｕｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてＤＮＡワクチンであるｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡ（１μｇ）を導入し、２４時間後、前記６ウェルプレートにおける培地を新たな培地に交換した。そして、さらに、所定時間（７２時間）培養を行った後、培養液から上清を回収した。なお、比較例１として、ｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡに代え、ｓＪａｇ１のコード配列が未挿入であるｐｃＤＮＡ３．１（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、以下同様）をＰｌａｔ-Ｅ細胞に導入し、前述と同様にして培養と上清の回収を行った。なお、培養温度は３７℃とした（以下同様）。なお、ｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡを導入した前記Ｐｌａｔ−Ｅ細胞を培養することにより、回収した上清には、パッケージングされた感染ウイルスが含まれている。
【００５８】
他方、ＲＰＭＩ  １６４０培地を添加した２４ウェルプレートにおいて、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒト急性Ｔリンパ球性白血病由来のＴリンパ球）を３．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように培養した。そして、この培養細胞に、導入試薬（商品名ＤＭＲＩＥ−Ｃ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、レポーター遺伝子（ＴＰ１）１μｇ、および、ルシフェラーゼレポーターベクターであるｐＧＬ４．７４ベクター（商品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．２μｇを導入して、４８時間培養を行った。
【００５９】
９６ウェルプレートに、フィーダー細胞（骨髄ストローマ細胞であるＯＰ９細胞）を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように撒き、この上で、前述のＪｕｒｋａｔ細胞を、前記上清（１００μｌ／ｗｅｌｌ）の存在下、ＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて２４時間培養した。培養後のＪｕｒｋａｔ細胞を、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）によって溶解し、ホタルルシフェラーゼならびにウミシイタケルシフェラーゼルシフェラーゼによる発光反応の強度をルミノメーターで測定した。そして、レポーターであるホタルルシフェラーゼの強度（Ｒ１）をコントロールのウミシイタケルシフェラーゼの強度（Ｒ２）で割った値（Ｒ１／Ｒ２）を求めた。この結果を図２に示す。図２における時間（７２ｈｒ）は、ベクター導入後のＰｌａｔ-Ｅ細胞の培養時間である。
【００６０】
同図に示すように、ｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡを導入したＰｌａｔ−Ｅ細胞の培養液上清を使用した結果、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＲ１／Ｒ２の値が著しく増加した。Ｒ１／Ｒ２の増加は、ｓＪａｇ１タンパク質がＪｕｒｋａｔ細胞のレセプターであるＮｏｔｃｈタンパク質に結合し、これによってＮｏｔｃｈタンパク質を介したシグナル伝達が生じたことを意味する（陽性Ｎｏｔｃｈシグナル）。したがって、細胞内領域が除去された細胞外領域（ｓＪａｇ１タンパク質）のみであっても、Ｎｏｔｃｈタンパク質との相互作用が生じることが確認できた。
【実施例３】
【００６１】
コラーゲン誘導性関節リウマチモデルにおけるＤＮＡワクチン（Ｊａｇ１／ｐｃＤＮＡおよびｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡ）の効果を確認した。
【００６２】
まず、コラーゲン誘導の試験４日前（ｄａｙ−４）、ＤＢＡ／１Ｊマウス（オス）の両足の腓腹筋に、０．２５％ブピバカイン（局所麻酔薬）を含むＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ社製）を筋肉注射した（５０μｌ／片足）。つぎに、試験２日前（ｄａｙ−２）、前記マウスの両足の腓腹筋に、ＤＮＡワクチンであるＪａｇ１／ｐｃＤＮＡまたはｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡを、筋肉注射した（５０μｇ／５０μｌ／片足）。なお、比較例として、ＤＮＡワクチンに代えて、Ｊａｇ１およびｓＪａｇ１のコード配列が未挿入であるｐｃＤＮＡ３．１（以下、「ｐｃＤＮＡ」という）を注射した。以下、Ｊａｇ１タンパク質のコード配列（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）を有するＪａｇ１／ｐｃＤＮＡベクターを注射したマウス群を「Ｊａｇ１群」、ｓＪａｇ１タンパク質のコード配列を有するｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡベクターを注射したマウス群を「ｓＪａｇ１群」といい、Ｊａｇ１等のコード配列が未挿入であるｐｃＤＮＡを注射したマウス群を「比較群」という。
【００６３】
そして、コラーゲン誘導の試験当日（ｄａｙ０）、リウマチの誘導物質であるコラーゲン含有液を、等量のフロインド完全アジュバント（商品名Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒａ：ＤＩＦＣＯ社製）で乳化し、この乳化物をマウスに接種した。具体的に、Ｊａｇ１群には、コラーゲン１００μｇ／５０μｌ／片足の条件で、両足のｆｏｏｔｐａｄに接種し、ｓＪａｇ１群には、コラーゲン２００μｇ／１００μｌ／匹の条件で、尾底部の皮下に接種した。また、比較群については、さらに２群に分けて、一方には、Ｊａｇ１群と同様の条件でｆｏｏｔｐａｄへの接種を行い、他方には、ｓＪａｇ１群と同様の条件で尾底部の皮下への接種を行った。前記コラーゲン含有液は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）に４ｍｇ／ｍｌとなるようにウシコラーゲンタイプII（コラーゲン技術研修会）を添加して調製した。また、各群に対するコントロール（コラーゲン非誘導）として、前記コラーゲン含有液に代えてＰＢＳを使用し、同様に乳化物の投与を行った。
【００６４】
前記乳化物の投与後、７日おきに合計３回、試験２日前（ｄａｙ２）と同じ条件でＤＮＡワクチンを筋肉注射した（追加免疫）。具体的に、Ｊａｇ１群にはＪａｇ１／ｐｃＤＮＡ、ｓＪａｇ１群にはｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡ、比較群にはｐｃＤＮＡを注射した。そして、試験開始から２１日目（ｄａｙ２１）、前記コラーゲン含有液を、等量のフロインド不完全アジュバント（商品名Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒａ：ＤＩＦＣＯ社製）で乳化し、この乳化物をマウスの尾底部の皮下に接種した（コラーゲン２００μｇ／１００μｌ／匹）。また、各群に対するコントロールとして、前記コラーゲン含有液に代えてＰＢＳを使用し、同様に乳化物の投与を行った。そして、これらのマウス群について、コラーゲン誘導性の関節炎（ＣＩＡ）の兆候を、最終免疫を０日として所定期間ごと（０、２、５、７、９、１１、１４、１６、１８、２１、２３日）に確認し、下記評価基準に基づいてｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃｏｒｅを評価した。
【００６５】
（評価基準）
０  ＝  変化なし
１  ＝  肢の局所的な赤味、または、１本の足指の肥大および赤味
２  ＝  肢の軽度な肥大および紅斑、または、２本以上の足指の肥大
３  ＝  肢の顕著な肥大および紅斑
４  ＝  肢の最大肥大および紅斑、および、その後の強直症
【００６６】
これらの結果を図３に示す。同図（Ａ）は、Ｊａｇ１／ｐｃＤＮＡをｆｏｏｔｐａｄに接種した結果であり、同図（Ｂ）は、ｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡを尾底部に接種した結果である。なお、同図（Ａ）に示すｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃｏｒｅは、３匹のマウスについてマウスごとに３本の足のクリニカルスコア（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃｏｒｅ）を取得し、それらを合計した後に９で割った値である。同図（Ｂ）に示すｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃｏｒｅは、３匹のマウスについてマウスごとに４本の足のクリニカルスコア（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃｏｒｅ）を取得し、それらを合計した後に３で割った値である。同図における日数（ｄａｙ）は、最終免疫後の日数である。また、同図にプロットしているマウス群の種類を下記表に示す。なお、後述する実施例においても、マウス群は下記の通りである。
【００６７】
【表１】
2008120740.tif 000003
【００６８】
同図（Ａ）に示すように、Ｊａｇ１／ｐｃＤＮＡを使用したＣII／Ｊａｇ１群（同図において●：実施例３−１）では、Ｊａｇ１のコード配列を有さないｐｃＤＮＡを使用したＣII／ｐｃＤＮＡ群（同図において□：比較例２‐１）よりも、クリニカルスコアが減少し、ＣＩＡの臨床症状が軽減された。また、同図（Ｂ）に示すように、ｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡを使用したＣII／ｓＪａｇ１群（同図において■：実施例３−２）においても、ｓＪａｇ１のコード配列を有さないｐｃＤＮＡを使用したＣII／ｐｃＤＮＡ群（同図において○：比較例２−２）よりも、クリニカルスコアが顕著に減少し、ＣＩＡの臨床症状が著しく軽減された。特に、ｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡによれば、Ｊａｇ１／ｐｃＤＮＡを使用した場合よりも、さらにクリニカルスコアの減少、すなわち、ＣＩＡの臨床症状が軽減することができた。
【実施例４】
【００６９】
コラーゲン誘導性関節リウマチモデルマウスにＤＮＡワクチン（ｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡ）を接種し、そのモデルマウスのＴ細胞についてサイトカイン産生能を確認した。
【００７０】
前記実施例３と同様にして、ｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡを使用してＤＢＡ／１Ｊマウス（オス）に免疫を行った。そして、追加免疫の後、ｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡを接種した群について、２５日後（最終免疫を０日として２５日後）に脾臓を回収し、トリプシン処理によって、ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎを調製した。
【００７１】
そして、調製したｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎを、所定量（０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ）のコラーゲン存在下で７２時間培養し、コラーゲン誘導を行った。そして、この培養細胞を、１ｕｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体（２Ｃ１１）と１ｕｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８抗体（３７．５１）とでそれぞれコーティングした９６ウェルプレートに、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／２００μｌとなるように撒き直し、さらに２４時間培養した後、培養液の上清を回収した。なお、比較例３として、ｐｃＤＮＡを使用したマウス群（ＣII／ｐｃＤＮＡ群）についても同様に培養液上清を回収し、実施例４および比較例に対するそれぞれのコントロールも、前記実施例３と同様とした。
【００７２】
他方、０．５μｇ／ｍｌ精製抗マウスＩＦＮγ抗体（ＸＭＧ１．２：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、および、０．５μｇ／ｍｌ精製抗マウスＩＬ−４抗体（１１Ｂ１１：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、それぞれ９６ウェルプレート（商品名Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）に添加し、４℃で一晩インキュベートした。この抗体を固定化したウェルプレートを０．０５％ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０含有ＰＢＳ)で５回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを添加して、室温で一時間インキュベートした。インキュベート後、０．０５％ＰＢＳＴで５回洗浄した。そして、このプレートに、前述の回収した培養液上清を添加し（１００μｌ／ｗｅｌｌ）、室温で一時間インキュベートした。前記上清は、精製抗マウスＩＦＮγ抗体を固定化したウェルに対しては、１０倍、２０倍、４０倍に希釈したものを添加し、精製抗マウスＩＬ−４抗体を固定化したウェルに対しては、２倍、４倍、８倍に希釈したものを添加した。なお、希釈には、リン酸緩衝液を使用した。そして、前記ウェルプレートを０．０５％ＰＢＳＴで５回洗浄した後、前記各抗体を固定化したウェルに、０．５μｇ／ｍｌビオチン−抗マウスＩＦＮγ抗体（Ｒ４−６Ａ２：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と、０．５μｇ／ｍｌビオチン−抗マウスＩＬ−４抗体（ＢＶＤ６−２４Ｇ２：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、それぞれ１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように添加し、室温で１時間インキュベートした。このウェルプレートを、０．０５％ＰＢＳＴで５回洗浄し、さらに、１／１０００（１０００倍希釈）アビジン−Ｈｏｒｓｅ  Ｒｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように添加し、室温で３０分インキュベートした。このウェルプレートを０．０５％ＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＴＭＢ基質（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように添加することによって、発色反応を行った。ＴＭＢの添加から所定の時間（５〜１５ｍｉｎ）後、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ／ｗｅｌｌとなるように添加して発色反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにより発色の程度を測定した。
【００７３】
これらの結果を、図４に示す。同図において、（Ａ）は、Ｔ細胞から産生されたＩＦＮγ量を示すグラフであり、（Ｂ）は、Ｔ細胞から産生されたＩＬ−４量を示すグラフである。同図（Ａ）および（Ｂ）にそれぞれ示すように、ｓＪａｇ１のコード配列を含まないｐｃＤＮＡを使用した比較例３（ＣII／ｐｃＤＮＡ）は、コントロール（ＰＢＳ／ｐｃＤＮＡ）と比較して、コラーゲン誘導によってＩＦＮγおよびＩＬ−４の産生量が著しく増加した。これに対して、ｓＪａｇ１のコード配列を含むｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡを使用した実施例４（ＣII／ｓＪａｇ１群）は、同図（Ａ）および（Ｂ）にそれぞれ示すように、前記比較例３（ＣII／ｐｃＤＮＡ）と比べて、ＩＦＮγおよびＩＬ−４の産生は、いずれも十分な低下が確認できた。このようにＩＦＮγならびにＩＬ−４の産生が、ｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡを接種することによって抑制されたことから、ｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡによれば自己免疫に関係するＴ細胞の活性化を抑制できることがわかる。
【実施例５】
【００７４】
コラーゲン誘導性関節リウマチモデルマウスにＤＮＡワクチン（ｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡ）を接種し、そのモデルマウスの四肢について組織学的検討を行った。
【００７５】
前記実施例４においてｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡを用いて免疫処理したＤＢＡ／１Ｊマウス（オス）について、２５日後（最終免疫を０日として２５日後）に四肢を回収した。そして、前記四肢の切片を常法に基づいて１０％ホルマリン液で固定し、脱解後、パラフィン包埋ブロックを作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。また、比較例３におけるＣII／ｐｃＤＮＡと、コントロールであるＰＢＳ／ｐｃＤＮＡについても、同様に染色を行った。この切片を光学顕微鏡（商品名ＣＸ３１、オリンパス社製）で観察した結果を、図５に示す。同図において、（Ａ）は、ｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡを用いたマウス（ＣII／ｓＪａｇ１）、（Ｂ）は、ｐｃＤＮＡ３．１を用いたマウス（ＣII／ｐｃＤＮＡ３．１）、（Ｃ）は、コラーゲン誘導しておらず且つｐｃＤＮＡ３．１を用いたマウス（コントロールＰＢＳ／ｐｃＤＮＡ３．１）の結果を示す写真である。また、下記表に病変部位ならびに湿潤の程度を示す。なお、下記表における湿潤の程度は、以下のように評価した。
【００７６】
（湿潤の評価基準）
２：強度の細胞浸潤
１：軽度の細胞浸潤
０：浸潤なし
【００７７】
【表２】
2008120740.tif 000004
【００７８】
ｓＪａｇ１を発現しないＣII／ｐｃＤＮＡ３．１群では、同図（Ｂ）に示すように、コラーゲン誘導による炎症性細胞湿潤が確認された。これに対して、同図（Ａ）に示すｓＪａｇ１を発現するＣII／ｓＪａｇ１群では、炎症性の細胞湿潤が著しく抑制され、同図（Ｃ）のコントロールと同様の結果となった。この結果は、臨床症状の軽減とも合致する。このことから、コラーゲン誘導性炎症に、ＤＮＡワクチンであるｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡが有用であることがわかる。
【実施例６】
【００７９】
コラーゲン以外の物質（卵白アルブミン：ＯＶＡ）に対するＣＤ８陽性Ｔ細胞応答におけＤＮＡワクチン（Ｊａｇ１／ｐｃＤＮＡ）の効果を確認した。
【００８０】
試験３日前（ｄａｙ−３）、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（メス）の両足の腓腹筋に、０．２５％５％ブピバカイン（局所麻酔薬）を含むＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ社製）を筋肉注射した（５０μｌ／片足）。つぎに、試験当日（ｄａｙ０）、ＤＮＡワクチン（Ｊａｇ１／ｐｃＤＮＡ）５０μｇ／２５μｌとＯＶＡの発現ベクター（ＯＶＡ／ｐＣＩ）５０μｇ／２５μｌとを混合し、この混合物を前記マウスの両足の腓腹筋に筋肉注射した（トータルボリューム５０μｌ／片足）。さらに、１４日おきに、同様の条件で、ＤＮＡワクチンとＯＶＡ発現ベクターとの混合物を用いて追加免疫を行った（ｄａｙ０の接種を含めて合計３回）。３回目のワクチン終了後、試験開始から３３日目（ｄａｙ３３）に、膝窩と鼠径リンパ節とを回収し、トリプシン処理によって、ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎを調製した。この他に、比較例として、ＯＶＡ／ｐＣＩとｐｃＤＮＡとの混合物、ＯＶＡ／ｐＣＩとＤｅｌｔａ１／ｐｃＤＮＡとの混合物を使用し、また、コントロールとして、ｐｃＤＮＡを使用し、同様にしてｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎを調製した。なお、ＯＶＡ／ｐＣＩは、ｐＣＩベクター（プロメガ社製）のＥｃｏＲＩ制限酵素部位に、ＯＶＡタンパク質のＣＤＳ配列を挿入したベクターであり、Ｄｅｌｔａ１／ｐｃＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶとＥｃｏＲＩ制限酵素部位に、Ｄｅｌｔａ１タンパク質のＣＤＳ配列を挿入したベクターである。
【００８１】
得られたｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎをＦｃＲブロッキング試薬（商品名２．４Ｇ２、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で処理し、マウス細胞のＦｃレセプター（ＦｃＲ）をブロッキングした。そして、ブロッキング処理済みの細胞を、ＦＩＴＣ−抗マウスＣＤ８抗体（５３−６．７：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と、ＯＶＡ  ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥ（ＭＢＬ社製）とで染色した。これらの細胞を緩衝液（商品名ＦＡＣＳ（登録商標）ｂｕｆｆｅｒ、Ｓｉｇｍａ社製）で洗浄した後、さらに前記緩衝液で細胞を懸濁し、フローサイトメーター(商品名ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて、ＯＶＡ抗原の検出を行った。
【００８２】
これらの結果を、図６に示す。同図は、ＯＶＡ抗原に反応するＴ細胞抗原受容体を持つＴ細胞数を表すフローサイトメトリーの図である。同図において、右下は、ＯＶＡ／ｐＣＩとＪａｇ１／ｐｃＤＮＡとを接種したマウスの結果であり、右上は、ＯＶＡ／ｐＣＩとｐｃＤＮＡとを接種したマウスの結果（ＯＶＡ／Ｊａｇ１）であり、左下は、ＯＶＡ／ｐＣＩとＤｅｌｔａ１／ｐｃＤＮＡとを接種したマウスの結果（ＯＶＡ／ＤＬ１）であり、左上は、ＯＶＡによる誘導を受けていないコントロールであって、ｐＣＩとＰＢＳをワクチンした結果（ｐＣＩ／ＰＢＳ）を示す。
【００８３】
同図に示すように、Ｊａｇ１／ｐｃＤＮＡを接種していないマウス、すなわち、右上のＯＶＡ／Ｊａｇ１と、左下のＯＶＡ／ＤＬ１においては、ＯＶＡ抗原に反応するＴ細胞抗原受容体を持つＴ細胞の割合が、１．０８％および０．９３％と非常に高かった。これに対して、Ｊａｇ１／ｐｃＤＮＡを接種したマウスについては、前記Ｔ細胞の割合が０．３１％と、極めて低い値に抑制することができた。この結果から、Ｊａｇ１のコード配列を有するＤＮＡワクチンによれば、コラーゲンに関わらず、どのような抗原に対してもＣＤ８陽性Ｔ細胞応答性を低下できることが証明された。
【実施例７】
【００８４】
ヒトＴ細胞に対するｓＪａｇ１タンパク質の効果を確認した。
【００８５】
ヒト末梢血から比重遠心法により単核球を分離し、２４ウェルプレートに１×１０６個（５００μｌ）となるように添加した。培地は、ＲＰＭＩ  １６４０／１０％  ＦＣＳを使用した。そして、この２４ウェルプレートに、１μｇ／ｍｌ濃度のＯＫＴ３抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を添加して細胞を刺激し、同時に、以下のように調製したヒト由来ｓＪａｇ１タンパク質を含む培養上清を添加した。この上清は、Ｆｕｇｅｎｅ  ６（ロシュ社製）を用いてｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡを導入した２９３Ｔ細胞を４８時間培養し、回収することによって調製した。なお、前記培養上清の添加量は、２４ウェルプレートに対し１００μｌ／ウェルとした。抗体による刺激後６０時間の時点で、［３Ｈ］−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを２４ウェルプレートに対し１μＣｉ（２０μｌ）／ウェルとなるように添加して、１２時間後に［３Ｈ］−ｔｈｙｍｉｄｉｎの取り込みを液体シンチレーションカウンターにより測定した。また、コントロールとしては、抗体による刺激を行わず、ヒトｓＪａｇ１コード配列を挿入していないｐｃＤＮＡ３．１を導入した２９３Ｔ細胞の培養上清を添加した以外は、前記実施例６と同様に取り込みを測定した。比較例としては、ヒトｓＪａｇ１のコード配列を導入していない２９３Ｔ細胞の培養上清を添加した以外は、前記実施例６と同様に取り込みを測定した。
【００８６】
これらの結果を図７に示す。同図に示すように、ヒト由来ｓＪａｇ１タンパク質を添加していない比較例の系（図においてＯＫＴ３）では、チミジンの取り込みが非常に高い値を示したが、これに対して、ヒトｓＪａｇ１タンパク質を添加した実施例の系（ＯＫＴ３＋ｓＪａｇ１）では、取り込み量を効果的に抑制することができた。このことから、ヒトｓＪａｇ１を添加した系では、著しくＴ細胞の増殖が抑制されたといえる。
【００８７】
以上のように、各実施例において、マウスＪａｇ１構造遺伝子、マウスｓＪａｇ１構造遺伝子およびヒトｓＪａｇ１構造遺伝子について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏならびにモデルマウスに対するｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ８リンパ球の活性化抑制ならびにリウマチ発症の抑制を確認した。なお、これらの結果は、例えば、ヒトをはじめとする他のＪａｇ１タンパク質、ｓＪａｇ１タンパク質、Ｊａｇ１構造遺伝子やｓＪａｇ１構造遺伝子等を使用した場合であっても、ヒトをはじめとする他の動物等に対して同様の効果が得られることは明らかである。特に、ヒトＪａｇ１遺伝子やヒトｓＪａｇ１遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏでヒトに投与した場合にも、同様の結果が得られることは、当業者であれば容易に理解できる。また、当業者であれば、過度の試行錯誤を伴うことなく、例えば、ヒトをはじめとする他のＪａｇ１タンパク質、ｓＪａｇ１タンパク質やＪａｇ１構造遺伝子、ｓＪａｇ１構造遺伝子等を使用して、本発明のＣＤ８Ｔ細胞活性化抑制剤ならびにリウマチ治療剤を作製し、これを使用することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
以上のように、本発明の自己免疫疾患治療薬によれば、Ｔ細胞の活性化を抑制することによって、リウマチをはじめとする自己免疫疾患を予防または治療することが可能である。特にリウマチ疾患については、慢性持続性の多発関節炎であり治療や予防が困難であることから、本発明の自己免疫疾患治療薬は、新たな治療薬として有用性に優れるものである。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、本発明の一実施例における組換えベクターの概略を示す模式図であり、同図（Ａ）は、Ｊａｇｇｅｄ１／ｐｃＤＮＡ３．１ベクター、同図（Ｂ）は、Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｊａｇｇｅｄ１／ｐｃＤＮＡ３．１ベクターである。
【図２】図２は、本発明の他の実施例において、ｓＪａｇ１タンパク質とレセプターであるＮｏｔｃｈタンパク質との相互作用の有無を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明のさらにその他の実施例において、ＤＮＡワクチンを添加したコラーゲン誘導性関節リウマチモデルにおけるＣＩＡの経時的な変化を示すグラフであり、同図（Ａ）は、ＤＮＡワクチンとしてＪａｇ１／ｐｃＤＮＡを使用した結果、同図（Ｂ）は、ＤＮＡワクチンとしてｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡを使用した結果である。
【図４】図４は、本発明のさらにその他の実施例において、ＤＮＡワクチンを添加したコラーゲン誘導性関節リウマチモデルにおけるＩＦＮγならびにＩＬ−４の経時的な効果を示すグラフであり、同図（Ａ）は、ＩＦＮγの結果、同図（Ｂ）は、ＩＬ-４の結果である。
【図５】図５は、本発明のさらにその他の実施例において、ＤＮＡワクチンを添加したコラーゲン誘導性関節リウマチモデルにおける組織の写真であり、同図（Ａ）は、ｓＪａｇ１／ｐｃＤＮＡを使用した結果、同図（Ｂ）は、ｐｃＤＮＡを使用した比較例の結果、同図（Ｃ）は、コラーゲン誘導を行っていないコントロールの結果である。
【図６】図６は、本発明のさらにその他の実施例において、ＯＶＡに対するＣＤ８陽性Ｔ細胞応答におけＤＮＡワクチンの効果を示すフローサイトメトリーの結果である。
【図７】図７は、本発明のさらにその他の実施例において、ヒト由来ｓＪａｇ１タンパク質によるＴ細胞増殖阻害を、チミジンの取り込み量で確認した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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