(57)【要約】【課題】患者の医療、および血液と血液製剤または対人的な接触によるＨＣＶの伝播の予防には、ＨＣＶに関連する核酸、抗原および抗体を検出するための、信頼できるスクリーニング、診断および予後の手段が必要であり、これらを課題とする。【解決手段】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中のヌクレオチド配列に対応する８個またはそれ以上のヌクレオチドの非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列を有する非天然型の核酸を含み得る組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、以前は血行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス（ＮＡＮＢＶ）感染症と呼ばれていた
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を検出し処置するのに用いる組成物および方法に関す
る。より具体的には、本発明の実施態様は、ＨＣＶの検出、ＨＣＶ感染症の予防処置用の
ワクチンの開発、およびＨＣＶに対する受動免疫を伝達する抗体産物の開発のための組成
物および方法を特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶの原型分離株は、米国特許願第１２２，７１４号（ヨーロッパ特許公開第３１８
，２１６号も参照のこと）において特性が記載されている。「ＨＣＶ」という用語には、
本願で用いる場合、同じウイルス種の新しい分離株も含まれる。「ＨＣＶ−１」という用
語は、米国特許願第１２２，７１４に引用されている。
【０００３】
ＨＣＶは、他の形態のウイルス関連肝臓疾患とは区別できる伝播性の疾患である。他の
形態としては、公知の肝炎ウイルス、すなわち、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎
ウイルス（ＨＢＶ）、およびデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）を原因とする肝臓疾患、なら
びにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）によ
って誘発される肝炎が含まれる。ＨＣＶは輸血を受けた個体内で最初に同定された。
【０００４】
ＨＣＶのキャリアー、およびＨＣＶで汚染された血液もしくは血液製剤をスクリーニン
グおよび同定するために用いられる、鋭敏で特異的な方法が強く要望されている。輸血後
肝炎（ＰＴＨ）は輸血を受けた患者の約１０％に起こり、これらの症例の９０％までがＨ
ＣＶが原因である。この疾患は慢性肝臓障害へ進行することが多い（２５〜５５％）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
患者の医療、および血液と血液製剤または対人的な接触によるＨＣＶの伝播の予防には
、ＨＣＶに関連する核酸、抗原および抗体を検出するための、信頼できるスクリーニング
、診断および予後の手段が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願の情報は、ＨＣＶが複数の遺伝子型を有することを示唆する。すなわち、ＨＣＶウ
イルスの遺伝情報は、すべてのＨＣＶについて必ずしも全く同一ではなく、異なる遺伝情
報を有する複数の群が含まれている。
【０００７】
遺伝情報はＤＮＡとＲＮＡの糸状分子中に記憶される。ＤＮＡはデオキシリボヌクレオ
チドの共有結合鎖で構成され、ＲＮＡはリボヌクレオチドの共有結合鎖で構成される。各
ヌクレオチドは、４種の塩基：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシ
トシン（Ｃ）のうちの１つによって特徴付けられる。これらの塩基は、官能基の配向のた
めに、特定の塩基対が水素結合とπ−スタッキング相互作用によって互いに引き合って結
合するという点で、相補的である。ＤＮＡの一方の鎖の中のアデニンは、対向する相補的
な鎖の中のチミンと対を作る。ＤＮＡの一方の鎖の中のグアニンは、対同する相補的な鎖
の中のシトシンと対を作る。ＲＮＡ中、チミン塩基はウラシル（Ｕ）で置換され、このウ
ラシルは対向する相補的な鎖の中のアデニンと対を作る。生物の遺伝暗号は塩基対の配列
中に保持される。生きている細胞は、核酸の情報を解釈し、転写し、そして翻訳してタン
パク質およびペプチドを作る。
【０００８】
ＨＣＶのゲノムはＲＮＡの一本の正鎖で構成される。そのＨＣＶゲノムは、約３０００
個のアミノ酸のポリタンパク質をコードする連続したオープンリーディングフレーム（Ｏ
ＲＦ）を有する。ＯＲＦ中において、構造タンパク質はＮ末端領域のほぼ最初の１／４部
分にコードされているようであり、ポリタンパク質の大部分は非構造タンパク質に関与し
ている。
【０００９】
ＨＣＶのポリタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端までの間に、ヌクレオキャ
プシドタンパク質（Ｃ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、ならびに非構造タンパク質（
ＮＳ）１、２（ｂ）、３、４（ｂ）、および５を含む。
【００１０】
異なる遺伝子型のＨＣＶには、宿主の免疫系に変化した応答を与えるタンパク質がコー
ドされ得る。異なる遺伝子型のＨＣＶを、このような遺伝子型に対して特異的でない免疫
診断法および核酸プローブ法によって検出することは困難であり得る。
【００１１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中のヌクレオチド配列に対応する８個またはそれ以
上のヌクレオチドの非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列を有する非天然型の核酸を含み得る組
成物を提供する。
【００１２】
１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１ヌ
クレオチド配列に対応するヌクレオチド配列が、ＮＳ５領域、エンベロープ１領域、５’
ＵＴ領域、およびコア領域からなる領域群から選択され得る組成物を提供する。
【００１３】
１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１ヌ
クレオチド配列に対応するヌクレオチド配列が、ＮＳ５領域の配列に対応し得る組成物を
提供する。
【００１４】
１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１配
列に対応するヌクレオチド配列が、配列番号２−２２の配列内の配列から選択され得る組
成物を提供する。
【００１５】
１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１ヌ
クレオチド配列に対応するヌクレオチド配列が、エンベロープ１領域の配列に対応し得る
組成物を提供する。
【００１６】
１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１配
列に対応するヌクレオチド配列が、配列番号２４−３２の配列内の配列に対応し得る組成
物を提供する。
【００１７】
１つの実施形態において、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１ヌクレ
オチド配列に対応する少なくとも１つのヌクレオチド配列が、５’ＵＴ領域の配列に対応
し得る組成物を提供する。
【００１８】
１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１配
列に対応するヌクレオチド配列が、配列番号３４−５１の配列内の配列に対応し得る組成
物を提供する。
【００１９】
１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１ヌ
クレオチド配列に対応するヌクレオチド配列が、コア領域の配列に対応し得る組成物を提
供する。
【００２０】
１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中の非ＨＣＶ−１配
列に対応するヌクレオチド配列が、配列番号５３−６６の配列内の配列に対応し得る組成
物を提供する。
【００２１】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、Ｃ型肝炎ウイルスの１つ
またはそれ以上の遺伝子型に対応するヌクレオチド配列を有し得る組成物を提供する。
【００２２】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第１の遺伝子型の配列に
対応する配列を有し、この第１の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１−６、エンベロ
ープ１領域中の２３−２５、５’ＵＴ領域中の３３−３８、およびコア領域中の５２−５
７の配列によって実質的に定義され得る組成物を提供する。
【００２３】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第２の遺伝子型の配列に
対応する配列を有し、この第２の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号７−１２、エンベ
ロープ１領域中の２６−２８、５’ＵＴ領域中の３９−４５、およびコア領域中の５８−
６４の配列によって実質的に定義され得る組成物を提供する。
【００２４】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第３の遺伝子型の配列に
対応する配列を有し、この第３の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１３−１７、エン
ベロープ１領域中の３２、５’ＵＴ領域中の４６−４７、およびコア領域中の６５−６６
の配列によって実質的に定義され得る組成物を提供する。
【００２５】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第４の遺伝子型の配列に
対応する配列を有し、この第４の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号２０−２２、エン
ベロープ１領域中の２９−３１、および５’ＵＴ領域中の４８−４９の配列によって実質
的に定義され得る組成物を提供する。
【００２６】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第５の遺伝子型の配列に
対応する配列を有し、この第５の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１８−１９、およ
び５’ＵＴ領域中の５０−５１の配列によって実質的に定義され得る組成物を提供する。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、Ｃ型肝炎ウイルスに対応
するヌクレオチド配列を有する核酸を形成するための核酸の合成反応を開始させ得る組成
物を提供する。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、ハイブリッド生産物を検
出するための標識手段を有し得る組成物を提供する。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、溶液からハイブリッド生
産物を分離するための支持手段を有し得る組成物を提供する。
【００３０】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、ウイルスの核酸の転写あ
るいは翻訳を阻害し得る組成物を提供する。
【００３１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの核酸と共にハイブリッド生産物を形成する方法を提供し
、以下の工程：
ａ、Ｃ型肝炎ウイルスのゲノム中の非ＨＣＶ−１配列に対応する８個またはそれ以上の
ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する非天然型の核酸を、ハイブリッド形成条件を確
立させ得る条件に置く工程であり得、非天然型の核酸が、ハイブリッド形成条件下でＣ型
肝炎ウイルスの核酸と共にハイブリッド生産物を形成し得る工程；および
ｂ．ハイブリッド形成条件を確立させて、Ｃ型肝炎ウイルスの核酸の存在下でハイブリ
ッド生産物を形成する工程、
を包含する方法を提供する。
【００３２】
１つの実施形態において、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルスのゲノム中の非ＨＣＶ−１
配列に対応するヌクレオチド配列が、ＮＳ５領域、エンベロープ１領域、５’ＵＴ領域、
およびコア領域から実質的になる領域群のうち少なくとも１つの領域内の配列に対応し得
る方法を提供する。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、ＮＳ５領域内の配列に
対応する非ＨＣＶ−１配列に対応し得る方法を提供する。
【００３４】
１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、配列番号２−２２の配
列内の配列に対応する非ＨＣＶ−１配列に対応し得る方法を提供する。
【００３５】
１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、エンベロープ１領域内
の配列に対応する非ＨＣＶ−１配列に対応し得る方法を提供する。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、配列番号２４−３２の
配列内の配列から選択される非ＨＣＶ−１配列に対応し得る方法を提供する。
【００３７】
１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、５’ＵＴ領域内の配列
に対応する非ＨＣＶ−１配列に対応し得る方法を提供する。
【００３８】
１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、配列番号３４−５１の
配列内の配列から選択される非ＨＣＶ−１配列に対応し得る方法を提供する。
【００３９】
１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、コア領域内の配列に対
応する非ＨＣＶ−１配列に対応し得る方法を提供する。
【００４０】
１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、配列番号５３−６６の
配列内の配列から選択される非ＨＣＶ−１配列に対応し得る方法を提供する。
【００４１】
１つの実施形態において、本発明は、上記ヌクレオチド配列が、Ｃ型肝炎ウイルスの１
つまたはそれ以上の遺伝子型に対応する非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列に対応し得る方法
を提供する。
【００４２】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第１の遺伝子型の配列に
対応する配列を有し、この第１の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１−６、エンベロ
ープ１領域中の２３−２５、５’ＵＴ領域中の３３−３８、およびコア領域中の５２−５
７の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。
【００４３】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第２の遺伝子型の配列に
対応する配列を有し、この第２の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号７−１２、エンベ
ロープ１領域中の２６−２８、５’ＵＴ領域中の３９−４５、およびコア領域中の５８−
６４の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第３の遺伝子型の配列に
対応する配列を有し、この第３の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１３−１７、エン
ベロープ１領域中の３２、５’ＵＴ領域中の４６−４７、およびコア領域中の６５−６６
の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。
【００４５】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第４の遺伝子型の配列に
対応する配列を有し、この第４の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号２０−２２、エン
ベロープ１領域中の２９−３１、および５’ＵＴ領域中の４８−４９の配列によって実質
的に定義され得る方法を提供する。
【００４６】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第５の遺伝子型の配列に
対応する配列を有し、この第５の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１８−１９、およ
び５’ＵＴ領域中の５０−５１の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。
【００４７】
１つの実施形態において、本発明は、上記ハイブリッド生産物が、核酸の合成反応を開
始させ得る方法を提供する。
【００４８】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、ハイブリッド生産物を検
出するための標識手段を有し得る方法を提供する。
【００４９】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、溶液からハイブリッド生
産物を分離するための支持手段を有し得る方法を提供する。
【００５０】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、ウイルスの核酸の転写あ
るいは翻訳を阻害し得る方法を提供する。
【００５１】
本発明は、９個またはそれ以上のヌクレオチドの非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列に対応
する非天然型のポリペプチドを含む組成物を提供し、この９個またはそれ以上のヌクレオ
チドの配列がＣ型肝炎ウイルスゲノムの配列の中の配列に対応し得る組成物を提供する。
【００５２】
１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１配列が、ＮＳ５領域、エンベロ
ープ１領域、およびコア領域からなる領域群の１つから選択され得る組成物を提供する。
【００５３】
１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、ＮＳ５領
域中の配列に対応し得る組成物を提供する。
【００５４】
１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１配列が、配列番号２−２２の配
列内の配列から選択され得る組成物を提供する。
【００５５】
１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１配列が、エンベロープ１領域中
の配列に対応し得る組成物を提供する。
【００５６】
１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１配列が、配列番号２４−３２の
配列内の配列から選択され得る組成物を提供する。
【００５７】
１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１配列が、コア領域中の配列に対
応し得る組成物を提供する。
【００５８】
１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１配列が、配列番号５２−６６の
配列内の配列から選択され得る組成物を提供する。
【００５９】
１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、Ｃ型肝炎
ウイルスの１つまたはそれ以上の遺伝子型に対応するヌクレオチド配列を有し得る組成物
を提供する。
【００６０】
１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、第１の遺
伝子型の配列に対応する配列を有し、この第１の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１
−６、エンベロープ１領域中の２３−２５、およびコア領域中の５２−５７の配列によっ
て実質的に定義され得る組成物を提供する。
【００６１】
１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、第２の遺
伝子型の配列に対応する配列を有し、この第２の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号７
−１２、エンベロープ１領域中の２６−２８、およびコア領域中の５８−６４の配列によ
って実質的に定義され得る組成物を提供する。
【００６２】
１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、第３の遺
伝子型の配列に対応する配列を有し、この第３の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１
３−１７、エンベロープ１領域中の３２、およびコア領域中の６５−６６の配列によって
実質的に定義され得る組成物を提供する。
【００６３】
１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、第４の遺
伝子型の配列に対応する配列を有し、この第４の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号２
０−２２、エンベロープ１領域中の２９−３１、および５’ＵＴ領域中の４８−４９の配
列によって実質的に定義され得る組成物を提供する。
【００６４】
１つの実施形態において、本発明は、上記非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列が、第５の遺
伝子型の配列に対応する配列を有し、この第５の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１
８−１９、および５’ＵＴ領域中の５０−５１の配列によって実質的に定義され得る組成
物を提供する。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドが、宿主の中で免疫反応を生じ
させ得る組成物を提供する。
【００６６】
本発明は、９個またはそれ以上のヌクレオチドの非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列に対応
する非天然型のポリペプチドを含む組成物を提供し、この９個またはそれ以上のヌクレオ
チドの配列がＣ型肝炎ウイルスゲノムの配列の中の配列に対応し得る組成物と選択的に結
合し得る抗体を提供する
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの１つまたはそれ以上の遺伝子型を検出する方法を提供し
、以下の工程：
ａ．Ｃ型肝炎ウイルスの１つまたはそれ以上の遺伝子型に対応する８個またはそれ以上
のヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する非天然型の核酸を、ハイブリッド形成条件を
確立させ得る条件下に置く工程、
ｂ．ハイブリッド形成条件を確立させて、Ｃ型肝炎ウイルスの核酸の存在下でハイブリ
ッド生産物を形成する工程、；および、
ｃ．ハイブリッド生産物の形成に関して、天然に存在しない核酸をモニターする工程で
あり得、このハイブリッド生産物がＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型の存在を示す工程、
を包含する方法を提供する。
【００６７】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第１の遺伝子型の配列に
対応する配列を有し、この第１の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１−６、エンベロ
ープ１領域中の２３−２５、５’ＵＴ領域中の３３−３８、およびコア領域中の５２−５
７の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。
【００６８】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第２の遺伝子型の配列に
対応する配列を有し、この第２の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号７−１２、エンベ
ロープ１領域中の２６−２８、５’ＵＴ領域中の３９−４５、およびコア領域中の５８−
６４の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。
【００６９】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第３の遺伝子型の配列に
対応する配列を有し、この第３の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１３−１７、エン
ベロープ１領域中の３２、５’ＵＴ領域中の４６−４７、およびコア領域中の６５−６６
の配列によって実質的に定義され得る方法を提供する。
【００７０】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第４の遺伝子型の配列に
対応する配列を有し、この第４の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号２０−２２、エン
ベロープ１領域中の２９−３１、および５’ＵＴ領域中の４８−４９の配列によって実質
的に定義され得る方法を提供する。
【００７１】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、第５の遺伝子型の配列に
対応する配列を有し、この第５の遺伝子型が、ＮＳ５領域中の配列番号１８−１９の配列
によって実質的に定義され得る方法を提供する。
【００７２】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、配列番号６７−１４５の
配列に対応する配列を有し得る方法を提供する。
【００７３】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、ＨＣＶゲノムのコアおよ
び領域においてグループＩ遺伝子型を同定するための、配列番号６９、７１、７３、およ
び８１−９９の配列に対応する配列を有し得る方法を提供する。
【００７４】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、ＨＣＶゲノムのコアおよ
びエンベロープ領域においてグループＩＩ遺伝子型を同定するための、配列番号７０、７
２、７０、および１００−１１８の配列に対応する配列を有し得る方法を提供する。
【００７５】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、ＨＣＶゲノムの５’ＵＴ
領域においてグループＩＩＩ遺伝子型を同定するための、配列番号７７の配列に対応する
配列を有し得る方法を提供する。
【００７６】
１つの実施形態において、本発明は、上記非天然型の核酸が、ＨＣＶゲノムの５’ＵＴ
領域においてグループＩＶ遺伝子型を同定するための、配列番号７９の配列を有し得る方
法を提供する。
【発明の効果】
【００７７】
本発明の核酸、すなわち異なる遺伝子型を規定するＨＣＶウイルスゲノムに対応する核
酸は、核酸ハイブリッド形成アッセイ法のプローブとして、核酸の合成に関する反応に用
いるプライマーとして、存在し得る他の成分からＨＣＶウイルス核酸を分離するための結
合パートナーとして、および、ウイルス核酸の転写もしくは翻訳を阻害するためのアンチ
センス核酸として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７８】
本願で用いる選択された用語の定義を、本発明の理解を容易にするために以下に説明す
る。「対応する」という用語は核酸の特定の配列に対して相同的もしくは相補的であるこ
とを意味する。核酸とペプチド間の場合、「対応する」という用語は、ペプチドのアミノ
酸が核酸の配列またはその相補体に由来する順序にあることを指す。
【００７９】
「非天然型の核酸」という用語は、ゲノムの核酸、ｃＤＮＡ、半合成核酸または合成起
源の核酸の一部であって、その起源もしくは処理によって、（１）それが天然において結
合しているすべての核酸とは結合していないか、（２）それが天然において連結している
のと異なる核酸もしくは他の化学試薬に連結しているか、または（３）天然には存在しな
いものを指す。
【００８０】
同様に「非天然型のペプチド」という用語は、天然型の大きなペプチドもしくはタンパ
ク質または半合成もしくは合成ペプチドの一部であって、その起源または処理によって、
（１）それが天然において結合しているすべてのペプチドとは結合していないか、（２）
それが天然において連結しているのと異なるペプチド、官能基もしくは化学試薬に連結し
ているか、または（３）天然には存在しないものを指す。
【００８１】
「プライマー」という用語は、適正な条件下に置かれた場合により大きな核酸の合成を
開始させ得る核酸を指す。プライマーは、コピーされるべき核酸の領域に完全にまたは実
質的に相補的である。したがって、ハイブリッド形成を誘導する条件下では、プライマー
はより大きな核酸の相補的領域に対してアニーリングする。適切な反応物を添加すると、
プライマーはその重合試薬によって伸長されてより大きな核酸のコピーを作る。
【００８２】
「結合対」という用語は、相互の親和性または結合能力を示す分子の対を指す。本願の
目的に関して、「リガンド」という用語は結合対の一方の分子を意味し、「抗リガンド」
または「受容体」または「標的」という用語は結合対の反対側の分子を指す。例えば核酸
については、結合対は２つの相補的な核酸を含む。それらの核酸の一方はリガンドと呼ば
れ、他方の鎖は抗リガンド受容体もしくは標的と呼ばれる。リガンドもしくは抗リガンド
の呼称は、任意の便宜上の問題である。他の結合対としては、少数の例を挙げるならば、
抗原と抗体、医薬と医薬受容体部位、および酵素と酵素基質がある。
【００８３】
「標識」という用語は検出可能な分子の部分を指し、例えば、放射性同位元素、酵素、
発光剤、沈澱剤および染料があるが、これらに限定はされない。
【００８４】
「支持体」という用語には、フィルターおよび膜などの慣用的な支持体、および、媒体
中に実質的に分散させ、次いで、固定化、濾過、分配などによってその媒体から取り出す
かまたは分離し得る回収可能な支持体が含まれる。「支持体手段」という用語は、結合パ
ートナー、または共有結合もしくは非共有結合によって核酸、ペプチドまたは抗体に結合
し得る支持体を指す。
【００８５】
多数のＨＣＶの株と分離株が同定されている。ＵＳＡから得た最初の分離株（「ＨＣＶ
−１」；Ｑ．−Ｌ．  Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４巻、３５９〜３６２頁、１９
８９年；Ｑ．−Ｌ．  Ｃｈｏｏら、Ｂｒｉｔ．  Ｍｅｄ．  Ｂｕｌｌ．，４６巻、４２３
−４４１頁、１９９０年；Ｑ．−Ｌ．  Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ
．  Ｓｃｉ．，８８巻、２４５１〜２４５５頁、１９９１年；および上述のヨーロッパ特
許公開第３１８，２１６号を参照）の配列と比べると、日本の分離株（「ＨＣＶ  Ｊ１」
）は、ＮＳ３およびＮＳ４の領域内においてヌクレオチドおよびポリペプチドの両方の配
列がかなり異なることが見出された。この結論はその後に、ＮＳ５およびエンベロープの
領域（Ｅ１／ＳおよびＥ２／ＮＳ１）まで拡大された（Ｋ．Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｊ．  
Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．，７１巻、３０２７〜３０３３頁、１９９０年；Ｙ．  Ｋｕｂｏ
、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，１７巻、１０３６７〜１０３７２頁、１９８９
年；およびＫ．  Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｇｅｎｅ，９１巻、２８７〜２９１頁、１９９０
年参照）。前者のグループの分離株は、最初に米国で同定されたものであり、本明細書で
は「遺伝子型Ｉ（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｉ）」と呼ぶ。後者のグループの分離株は、最初に
日本で同定されたものであり、本願では「遺伝子型ＩＩ」と呼ぶ。
【００８６】
発明の簡単な説明
本発明は、異なる遺伝子型を規定するＨＣＶウイルスゲノムに対応する核酸およびペプ
チドを含む組成物を特徴とする。また本発明は、本願に記載の異なる遺伝子型を規定する
ＨＣＶウイルスゲノムの配列に対応する組成物の使用方法を特徴とする。
【００８７】
Ａ．核酸組成物
本発明の核酸、すなわち異なる遺伝子型を規定するＨＣＶウイルスゲノムに対応する核
酸は、核酸ハイブリッド形成アッセイ法のプローブとして、核酸の合成に関する反応に用
いるプライマーとして、存在し得る他の成分からＨＣＶウイルス核酸を分離するための結
合パートナーとして、および、ウイルス核酸の転写もしくは翻訳を阻害するためのアンチ
センス核酸として有用である。
【００８８】
本発明の１つの実施態様は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの非ＨＣＶ−１ヌクレオチド配列
に対応する少なくとも８個のヌクレオチドからなる核酸配列を有する非天然型の核酸を含
む組成物を特徴とする。このヌクレオチド配列は、好ましくは、ＮＳ５領域、エンベロー
プ１領域、５’ＵＴ領域およびコア領域からなる少なくとも１つの領域中に存在する配列
から選択される。
【００８９】
ＮＳ５の領域に対応する配列については、その配列は配列番号２〜２２の配列内の配列
から選択されることが好ましい。配列番号１の配列はＨＣＶ−１に対応する。配列番号１
〜２２の配列は本願の配列表に規定されている。
【００９０】
エンベロープ１領域に対応する配列については、その配列は配列番号２４〜３２の配列
内の配列から選択されるのが好ましい。配列番号２３の配列はＨＣＶ−１に対応する。配
列番号２３〜３２の配列は本願の配列表に記載されている。
【００９１】
５’ＵＴ領域に対応する配列については、その配列は配列番号３４〜５１の配列内の配
列から選択されるのが好ましい。配列番号３３の配列はＨＣＶ−１に対応する。配列番号
３３〜５１の配列は本願の配列表に記載されている。
【００９２】
コア領域に対応する配列については、その配列は配列番号５３〜６６の配列内の配列か
ら選択されるのが好ましい。配列番号５２の配列ＨＣＶ−１に対応する。配列番号５２〜
６６の配列は本願の配列表に記載されている。
【００９３】
本発明の組成物は、ＨＣＶの異なる遺伝子型に対応する核酸とハイブリット生産物を形
成する。
【００９４】
ＨＣＶは少なくとも５種の遺伝子型を有する。これらの遺伝子型を、本願ではＧＩ−Ｇ
Ｖと呼ぶ。第１の遺伝子型であるＧＩは、配列番号１〜６、２３〜２５、３３〜３８およ
び５２〜５７の配列で例示される。第２の遺伝子型であるＧＩＩは、配列番号７〜１２、
２６〜２８、３９〜４５および５８から６４の配列で例示される。第３の遺伝子型である
ＧＩＩＩは、配列番号１３〜１７、３２、４６〜４７および６５〜６６の配列で例示され
る。第４の遺伝子型であるＧＩＶは、配列番号２０〜２２および２９〜３１および４８〜
４９の配列で例示される。第５の遺伝子型であるＧＶは、配列番号１８、１９、５０およ
び５１の配列で例示される。
【００９５】
本発明の１つの実施態様は、ＨＣＶの遺伝子型を例示する１つ以上の配列に対応する配
列を有する核酸を含む組成物を特徴とする。
【００９６】
Ｂ．ハイブリッド生産の製造方法
また本発明の実施態様は、ＨＣＶ核酸に対応する配列を有する核酸とのハイブリッド生
産物の製造方法も特徴とする。１つの方法は、ＨＣＶ核酸に対応する非ＨＣＶ−１配列を
有する非天然型の核酸を、ハイブリッド形成が起こり得る条件下に置く工程を含む。その
非天然型の核酸は、ハイブリッド形成条件下で、ＨＣＶ核酸とハイブリッド生産物を形成
し得る。この方法は、さらに、ＨＣＶゲノムの１つの領域に対応する核酸の存在下で、ハ
イブリッド形成条件を確立させてハイブリッド生産物を形成する工程を含む。
【００９７】
ハイブリッド生産物の形成は、ＨＣＶの１つ以上の遺伝子型の存在を検出するために有
用である。非天然型の核酸は、好ましくは、ＮＳ５領域、エンベロープ１領域、５’ＵＴ
領域およびコア領域を含む１つ以上の領域内のＨＣＶの核酸とハイブリッド生産物を形成
する。ハイブリッド生産物を検出するには、非天然型の核酸に標識を結合させることが有
用である。ハイブリッド生産物の形成は、ハイブリッド生産物を形成しなかった標識され
た非天然型の核酸から、ハイブリッド形成生産物を分離することによって検出される。
【００９８】
ハイブリッド生産物の形成は、存在する可能性がある他の成分から、ＨＣＶ核酸の１つ
以上の遺伝子型を分離する手段として有用である。このような用途の場合、形成したハイ
ブリッド生産物を他の成分から分離するために、非天然型の核酸を支持体と結合させるこ
とが有用である。
【００９９】
核酸の“サンドイッチアッセイ”では、標識を結合させた１つの核酸、および支持体と
結合させた第２の核酸を利用する。本発明の１つの実施態様は、２種の核酸からなるサン
ドイッチアッセイを特徴とする。この２種の核酸は両者ともＨＣＶ核酸に対応する配列を
有する。しかし、少なくとも一方の非天然型核酸は、非ＨＣＶ−１  ＨＣＶ核酸に対応す
る配列を有する。少なくとも一方の核酸は標識と結合し得る。他方の核酸は支持体と結合
し得る。支持体に結合された非天然型の核酸は、ＨＣＶ核酸と、非ＨＣＶ−１配列を有す
る非天然型の核酸とを含有するハイブリッド生産物を分離するのために使用される。
【０１００】
本発明の１つの実施態様は、ＨＣＶの１つ以上の遺伝子型の検出方法を特徴とする。こ
の方法は、ハイブリッド形成が起こり得る条件下に非天然型核酸を置く工程を含む。その
非天然型の核酸は、ＨＣＶの１つ以上の遺伝子型由来の核酸とハイブリッド生産物を形成
し得る。第１の遺伝子型であるＧＩは、配列番号１〜６、２３〜２５、３３〜３８および
５２〜５７の配列で例示される。第２の遺伝子型であるＧＩＩは、配列番号７〜１２、２
６〜２８、３９〜４５および５８〜６４の配列で例示される。第３の遺伝子型であるＧＩ
ＩＩは、配列番号１３〜１７、３２、４６〜４７および６５〜６６の配列にで例示される
。第４の遺伝子型であるＧＩＶは、配列番号２０〜２２および２９〜３１の配列で例示さ
れる。第５の遺伝子型であるＧＶは、配列番号１８、１９、５０および５１の配列で例示
される。
【０１０１】
ＨＣＶ核酸と、ＨＣＶゲノム内の配列に対応する非ＨＣＶ−１配列を有する非天然型の
核酸とのハイブリッド生産物は、核酸を合成する反応を開始するのに有用である。
【０１０２】
ＨＣＶ核酸と、ＨＣＶの特定の遺伝子型に対応する配列を有する非天然型の核酸とのハ
イブリッド生産物は、そのような遺伝子型の核酸を合成する反応を開始するのに有用であ
る。１つの実施態様において、合成された核酸は、ＨＣＶの１つ以上の遺伝子型の存在を
示す。
【０１０３】
また核酸の合成によって、ウイルスタンパク質を合成する発現ベクター中への、その核
酸のクローン化が容易になる。
【０１０４】
本発明の実施態様は、ウイルス核酸の転写もしくは翻訳を阻害するためのアンチセンス
剤として有用である。ＨＣＶゲノム配列の特定の遺伝子型に対応する配列を有する非天然
型の核酸と、ＨＣＶ核酸とがハイブリッド生産物を形成すると、そのような遺伝子型の翻
訳または転写を阻止する。５種の遺伝子型をすべて含有させて治療剤を作り得る。
【０１０５】
Ｃ．ペプチドおよび抗体の組成物
本発明の別の実施態様は、非ＨＣＶ−１配列を有する核酸に対応する、３個以上のアミ
ノ酸からなる非天然型のペプチドを含む組成物を特徴とする。その非ＨＣＶ−１配列は、
好ましくは、ＮＳ５領域、エンベロープ１領域、５’ＵＴ領域およびコア領域からなる１
つ以上の領域内の配列と対応する。
【０１０６】
ＮＳ５領域の非ＨＣＶ−１配列を有する核酸に対応するペプチドについては、その配列
は配列番号２〜２２の配列内にあることが好ましい。配列番号１の配列はＨＣＶ−１に対
応する。配列番号１〜２２の配列は配列表に記載されている。
【０１０７】
エンベロープ１領域の非ＨＣＶ−１配列を有する核酸に対応するペプチドについては、
その配列は配列番号２４〜３２の配列内にあることが好ましい。配列番号２３の配列はＨ
ＣＶ−１に対応する。配列番号２３〜３２の配列は配列表に記載されている。
【０１０８】
コア領域に関する非ＨＣＶ−１配列を有する核酸に対応するペプチドについては、その
配列は配列番号５３〜６６の配列内にあることが好ましい。配列番号５２の配列はＨＣＶ
−１に対応する。配列番号５２〜６６の配列は配列表に記載されている。
【０１０９】
本発明の別の実施態様は、ＨＣＶの１つの遺伝子型の核酸配列に対応するペプチド組成
物を特徴とする。第１の遺伝子型であるＧＩは、配列番号１〜６、２３〜２５、３３〜３
８および５２〜５７の配列で例示される。第２の遺伝子型であるＧＩＩは、配列番号７〜
１２、２６〜２８、３９〜４５および５８〜６４の配列で例示される。第３の遺伝子型で
あるＧＩＩＩは、配列番号１３〜１７、３２、４６〜４７および６５〜６６の配列で例示
される。第４の遺伝子型であるＧＩＶは、配列番号２０〜２２、２９〜３１、４８および
４９の配列で例示される。第５の遺伝子型であるＧＶは、配列番号１８、１９、５０およ
び５１の配列で例示される。
【０１１０】
本発明の非天然型のペプチドはワクチンの成分として有用である。本発明の配列の情報
によって、ＨＣＶの異なる遺伝子型のすべてまたはいくつかに対するワクチンを設計する
ことができる。ワクチンを特定の遺伝子型に指向させると、遭遇する可能性がある因子に
対して最大の防護を行うように、予防治療を適合させることができる。ワクチンを１種以
上の遺伝子型に指向させると、そのワクチンを一層包括的なものにすることができる。
【０１１１】
また本発明のペプチド組成物は、ＨＣＶタンパク質に対して特異的な抗体を開発するた
めにも有用である。本発明の１つの実施態様は、組成物として、ＨＣＶゲノムの非ＨＣＶ
−１配列に対応するペプチドに対する抗体を特徴とする。この非ＨＣＶ−１配列は、好ま
しくは、ＮＳ５領域、エンベロープ１領域およびコア領域からなる領域内の配列から選択
される。未翻訳５’ＵＴ領域に関連するペプチドはない。
【０１１２】
ＮＳ５領域のペプチドに対する抗体については、そのペプチドは配列番号２〜２２の配
列内の配列に対応することが好ましい。エンベロープ１領域に対応するペプチドに対する
抗体については、そのペプチドは配列番号２４〜３２の配列内の配列に対応することが好
ましい。コア領域に対応するペプチドに対する抗体については、そのペプチドは配列番号
５３〜６６の配列内の配列に対応することが好ましい。
【０１１３】
特定の遺伝子型を反映するペプチドに対する抗体は、ＨＣＶのそのような遺伝子型の検
出、および治療剤のために有用である。
【０１１４】
本発明の１つの実施態様は、特定の遺伝子型の配列を有する核酸に対応するペプチドに
対する抗体を特徴とする。第１の遺伝子型であるＧＩは、配列番号１〜６、２３〜２５、
３３〜３８および５２〜５７の配列で例示される。第２の遺伝子型であるＧＩＩは、配列
番号７〜１２、２６〜２８、３９〜４５および５８〜６４の配列で例示される。第３の遺
伝子型であるＧＩＩＩは、配列番号１３〜１７、３２、４６〜４７および６５〜６６の配
列で例示される。第４の遺伝子型であるＧＩＶは、配列番号２０〜２２、２９〜３１、４
８および４９の配列で例示される。第５め遺伝子型であるＧＶは、配列番号１８、１９、
５０および５１の配列で例示される。
【０１１５】
本発明の組成物が、核酸のハイブリッド形成または免疫化学的反応を行うためのキット
の形態で、使用説明書とともに包装され得ることを、当業者は容易に理解する。
【０１１６】
本発明を、ＨＣＶの遺伝子型を示す配列を図示した以下の図面を用いてさらに説明する
。これらの配列は１〜１４５の数字で呼ばれ、これらの数字および配列は配列表に記載の
数字および配列と一致する。配列１４６および１４７は、アッセイの考察を容易にする。
その数字および配列は、配列表に記載されている数字および配列と一致する。
【０１１７】
（発明の詳細な説明）
本発明を、診断と治療の用途に関する、ＨＣＶゲノムおよび関連ペプチドおよび結合パ
ートナーに対応する配列を有する核酸として詳細に説明する。
【０１１８】
本発明を実施するために、特にことわりがない限り、当該技術分野の技術の範囲内にあ
る、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用的な手法が用いられ
る。このような手法は文献に充分説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｆｉｔ
ｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａ１，  １９８２年；  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＩおよびＩ
Ｉ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）；  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１
９８４年）；  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）特に１５４巻および１５５巻（Ｗｕおよ
びＧｒｏｓｓｍａｎ編）を参照のこと。
【０１１９】
ｃＤＮＡライブラリーを、ＨＣＶに感染させたチンパンジーの血漿中に存在する核酸配
列から誘導する。これらのライブラリーの１つである「ｃ」ライブラリー（ＡＴＣＣ  Ｎ
ｏ．４０３９４）の構築は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４４３６に記載されている。本
発明に関連するライブラリーの配列は、配列番号１、２３、３３および５２の配列として
記載されている。
【０１２０】
本発明の特徴にしたがって単離もしくは合成される核酸は、本発明を限定しない例とし
て、プローブ、プライマーおよびアンチセンス遺伝子として、およびそのような配列に対
応するペプチドを合成する発現系を開発するために有用である。
【０１２１】
記載した核酸配列は、ウイルスゲノムの４つの領域についてＨＣＶの遺伝子型を規定す
る。図１はＨＣＶの構造を示す。特に重要な４つの領域はＮＳ５領域、エンベロープ１領
域、５’ＵＴ領域およびコア領域である。
【０１２２】
配列番号１〜２２の配列として本願に記載されている配列は、ＮＳ５領域において、少
なくとも５つの遺伝子型を示唆する。配列番号１〜２２の配列は、図２および配列表に示
される。配列番号１〜２２の各配列は、ＮＳ５領域由来の３４０個のヌクレオチドを有す
る核酸から誘導される。
【０１２３】
５つの遺伝子型は、配列番号１〜２２の配列によって規定される配列をグループ分けす
ることによって規定される。便宜上、本願では、異なる遺伝子型にローマ数字およびアル
ファベット文字「Ｇ」を与える。
【０１２４】
第１の遺伝子型（ＧＩ）は、配列番号１〜６の配列内の配列で例示される。第２の遺伝
子型（ＧＩＩ）は、配列番号７〜１２の配列内の配列で例示される。第３の遺伝子型（Ｇ
ＩＩＩ）は、配列番号１３〜１７の配列内の配列で例示される。第４の遺伝子型（ＧＩＶ
）は、配列番号２０〜２２の配列内の配列で例示される。第５の遺伝子型（ＧＶ）は配列
番号１８と１９の配列内の配列で例示される。
【０１２５】
配列番号２３〜３２の配列として本願に記載されている配列は、ＨＣＶのエンベロープ
１領域において、少なくとも４つの遺伝子型を示唆する。配列番号２３〜３２の配列は、
図３および配列表に示される。配列番号２３〜３２の各配列は、エンベロープ１領域由来
の１００個のヌクレオチドを有する核酸から誘導される。
【０１２６】
第１のエンベロープ１遺伝子型グループ（ＧＩ）は、配列番号２３〜２５の配列内の配
列で例示される。第２のエンベロープ１遺伝子型（ＧＩＩ）領域は、配列番号２６〜２８
の配列内の配列で例示される。第３のエンベロープ１遺伝子型（ＧＩＩＩ）は、配列番号
３２の配列内の配列で例示される。第４のエンベロープ１遺伝子型（ＧＩＶ）は配列番号
２９〜３１の配列内の配列で例示される。
【０１２７】
配列番号３３〜５１の配列として本願に記載されている配列は、ＨＣＶの５’ＵＴ領域
において、少なくとも３つの遺伝子型を示唆する。配列番号３３〜５１の配列は、図４お
よび配列表に示される。配列番号３３〜５１の各配列は、５’ＵＴ領域由来の２５２個の
ヌクレオチドを有する核酸から誘導されるが、配列５０と５１はそのヌクレオチドが約１
８０個でありいくぶん短い。
【０１２８】
第１の５’ＵＴ遺伝子型（ＧＩ）は、配列番号３３〜３８の配列内の配列で例示される
。第２の５’ＵＴ遺伝子型（ＧＩＩ）は配列番号３９〜４５の配列内の配列で例示される
。第３の５’ＵＴ遺伝子型（ＧＩＩＩ）は、配列番号４６〜４７の配列内の配列で例示さ
れる。第４の５’ＵＴ遺伝子型（ＧＩＶ）は、配列番号４８および４９の配列内の配列で
例示される。第５の５’ＵＴ遺伝子型（ＧＶ）は、配列番号５０および５１の配列内の配
列で例示される。
【０１２９】
配列番号４８〜６２の配列は、ＨＣＶのコア領域内において、少なくとも３つの遺伝子
型を示唆する。配列番号５２〜６６の配列は、図５および配列表に示される。
【０１３０】
第１のコア領域遺伝子型（ＧＩ）は、配列番号５２〜５７の配列内の配列で例示される
。第２のコア領域遺伝子型（ＧＩＩ）は、配列番号５８〜６４の配列内の配列で例示され
る。第３のコア領域遺伝子型（ＧＩＩＩ）は、配列番号６５および６６の配列内の配列で
例示される。配列番号５２〜６５の配列は５４９個のヌクレオチドで構成される。配列番
号６６の配列は５１０個のヌクレオチドで構成される。
【０１３１】
各領域について記載した種々の遺伝子型は一致する。すなわち、ＮＳ５領域について第
１の遺伝子型の特徴を有するＨＣＶは、エンベロープ１領域、５’ＵＴ領域およびコア領
域の第１の遺伝子型の特徴と実質的に一致する。
【０１３２】
配列番号１〜６６の配列中に記載された配列にしたがって単離もしくは合成される核酸
は、プローブ、プライマー、捕獲リガンドおよびアンチセンス剤として有用である。プロ
ーブ、プライマー、捕獲リガンドおよびアンチセンス剤としての核酸は、特異性および安
定なハイブリッド生産物を形成する能力のため、通常約８個以上のヌクレオチドを含有す
る。
【０１３３】
プローブ類
ＨＣＶゲノムの１つの領域の特定の遺伝子型を規定する配列にしたがって単離もしくは
合成される核酸は、プローブとして使用してそのような遺伝子型を検出し得るし、または
他の核酸のプローブと組合わせて用いて実質的にＨＣＶのすべての遺伝子型を検出し得る
。
【０１３４】
本願に記載される配列の情報によって、ＨＣＶ内の各種の遺伝子型およびハイブリッド
形成条件中に遭遇する可能性がある外来の核酸配列に対して所望の包含性と排他性を与え
る８個以上のヌクレオチドの配列が同定される。
【０１３５】
当業者は、プローブとして用いる核酸配列には、ハイブリッド生産物の検出を容易にす
るために標識を与え得ることを容易に理解する。
【０１３６】
捕獲リガンド
捕獲リガンドとして用いるため、プローブについて先に述べた方式で選択された核酸は
容易に支持体に結合させ得る。核酸を支持体に結合させる方法は公知である。配列番号１
〜６６の配列内の配列に対応する配列を有する核酸は、１つの遺伝子型のウイルス核酸を
異なる遺伝子型のＨＣＶの核酸から分離するのに有用である。配列番号１〜６６の配列内
の配列にしたがって単離もしくは合成される核酸は、組合わせて用いれば、ＨＣＶのすべ
ての遺伝子型の実質的にすべての核酸を捕獲するのに有用である。
【０１３７】
プライマー
本願に記載された配列にしたがって単離または合成される核酸は、ＨＣＶ配列の増幅の
ためのプライマーとして有用である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法に関して、配列
番号１〜６６の配列の１つ以上の配列に対応する８個以上のヌクレオチドの核酸配列は、
適切な酸素および試薬と組み合せて、ウイルス核酸のコピーを作るのに有用である。１つ
以上の遺伝子型に対応する異なる配列を有する複数のプライマーは、かような遺伝子型に
ついてウイルス核酸のコピーを作るのに使用し得る。
【０１３８】
そのコピーはＨＣＶウイルスを検出する診断検定法に使用し得る。またそのコピーは、
クローニングベクターおよび発現ベクターに組込んで、ＰＣＲで合成した核酸に対応する
ポリペプチドを製造することができる。以下にさらに詳細に述べる。
【０１３９】
アンチセンス
本願明細書に記載した配列に従って単離もしくは合成した核酸は、ＨＣＶの発現を阻害
するアンチセンス遺伝子として有用である。
【０１４０】
ＨＣＶの遺伝子型に対応する核酸は、ＨＣＶに感染している細胞内に導入するためリポ
ソームのような適切な担体に負荷され得る。８個又はそれ以上のヌクレオチドを有する核
酸はウイルス核酸またはウイルスメッセンジャーＲＮＡに結合することができる。好まし
くはアンチセンス核酸は、３０個又はそれ以上のヌクレオチドからなり、ウイルス核酸ま
たはウイルスメッセンジャーＲＮＡのハイブリッド生成物に必要な安定性を提供するもの
が好ましい。アンチセンス核酸を負荷する方法は当該技術分野で公知であるが、例えばＰ
ａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓらに１９８０年１２月２３日付で付与された米国特許第４
，２４１，０４６号がある。
【０１４１】
ペプチドの合成
本願に記載の配列に従って単離もしくは合成される核酸はペプチド製造に有用である。
配列番号１〜３２および５２〜６６の配列で例示される配列は、適切なベクター内にクロ
ーン化され得、または核酸の単離に使用し得る。単離された核酸は、適切なＤＮＡリンカ
ーに結合され、適切なベクター中にクローン化される。そのベクターは、イー・コリ（Ｅ
．ｃｏｌｉ）のような適切な宿主生物を形質転換するのに用いられ得、その配列によって
コードされるペプチドが単離され得る。
【０１４２】
分子クローニング法は、テキストＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ  
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２年に記載されている。
【０１４３】
その単離されたペプチドは、ＨＣＶの特定の遺伝子型に対するワクチン、および抗体を
製造するのに用いる抗原物質として有用である。
【０１４４】
ワクチンと抗体
本発明のペプチド物質は、抗体およびワクチンを製造するのに有用である。
【０１４５】
ｃＤＮＡ配列またはそれから誘導されるヌクレオチド配列（配列のセグメントもしくは
修飾物を含む）を入手できれば、いずれかのストランドにコードされているペプチドの抗
原として活性な領域をコードする発現ベクターを構築し得る。抗原として活性な領域は、
ＮＳ５領域、エンベロープ１領域およびコード領域から誘導され得る。
【０１４６】
所望のペプチドをコードするフラグメントは、通常の制限酵素による消化法を用いるか
または合成法によって、ｃＤＮＡクローンから誘導され得、次に、例えばβ−ガラクトシ
ダーゼもしくはスーバーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、のような融合配列の一部分を
含有しているベクターに連結され得る。好ましくはＳＯＤに連結され得る。ＳＯＤの融合
配列を含有しているポリペプチドを製造するのに有用な方法とベクターは、１９８６年１
０月１日付で公開されたヨーロッパ特許公開第０１９６０５６号に記載されている。
【０１４７】
いずれかのセンスストランドにある、オープン・リーディングフレームを含有するＨＣ
Ｖ  ｃＤＮＡの所望の部分は、成熟タンパク質もしくは融合タンパク質のような組換えペ
プチドとして得られ得る。あるいはｃＤＮＡにコードされているペプチドは化学合成して
得られ得る。
【０１４８】
所望のペプチドを含有するＤＮＡは、融合型もしくは成熟型であることを問わず、およ
び分泌を可能にするシグナル配列を含有もしくは含有していないことを問わず、あらゆる
好適な宿主に適した発現ベクターに連結し得る。現在、真核および原核の宿主系の両方が
、組換えペプチドを製造するのに用いられている。ペプチドは、細胞を溶解し、または培
地から単離され、次いでその意図する用途に必要な純度まで精製され得る。精製は当該技
術分野で公知の方法、例えば分別抽出法、塩分画法、イオン交換樹脂によるクロマトグラ
フィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、遠心分離法などによって行い得る。例え
ば、タンパク質の各種精製法ついては、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｓｙを
参照。このようなペプチドは診断剤として使用し得、あるいは中和抗体を生成するペプチ
ドはワクチンとして処方し得る。また、これらのペプチドに対して生成する抗体は、診断
剤として使用可能であり、または受動免疫治療法もしくはＨＣＶの単離と固定に用い得る
。
【０１４９】
ペプチドの抗原領域は一般に比較的小さく、長さは典型的には８〜１０個あるいはそれ
以下のアミノ酸である。５個の小数のアミノ酸からなるフラグメントが抗原領域の特徴で
ある。これらのセグメントはＨＣＶゲノムのＮＳ５領域、エンベロープ１領域およびコア
領域に対応する。５’ＵＴ領域は翻訳されないことが知られている。したがって、このよ
うな領域のｃＤＮＡを使用して、この領域に対応するＨＣＶペプチドの短いセグメントを
コードするＤＮＡは、融合タンパク質としてあるいは単離されたペプチドとして組換え法
によって発現され得る。さらに、短いアミノ酸配列は、化学合成法によって容易に得られ
得る。合成されたペプチドが、正しいエピトープを提供するように正しく形成されている
が、小さすぎて免疫原性がない場合、そのペプチドは適切なキャリアーに連結され得る。
【０１５０】
このような連結を行う多数の方法が当該技術分野では公知であり、Ｎ−スクシンイミジ
ル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル−４
−（Ｎ−マレイミドーメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（米
国，イリノイ州，ロックフォード，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手した）を用い
ジスルフィド結合を生成させる方法がある（ペプチドにスルフヒドリル基がない場合はジ
スルフィド結合はシステイン残基を付加することによって得られる）。これらの試薬は、
それ自体の間で、および一方のタンパク質のペプチドシステイン残基と、他方のタンパク
質のリシンのε―アミノを介するアミド結合もしくは他の遊離アミノ基との間でジスルフ
ィド結合を生成する。このようなジスルフィド／アミド形成試薬は種々のものが公知であ
る。（例えばＩｍｍｕｎ  Ｒｅｖ，６２巻１８５頁、１９８２年参照）。他の二官能カッ
プリング剤はジスルフィド結合ではなくてチオエーテル結合を形成する。このようなチオ
エーテル形成試薬の多くは、市販されており、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢
酸、２−ヨード酢酸、４−Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸な
どの反応性エステルがある。カルボキシル基は、それをスクシンイミドもしくは１−ヒド
ロキシル−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリウム塩と結合することによって活性化し得
る。抗原をカップリングする別の方法としては、ヨーロッパ特許出願公開２５９，１４９
号に記載されているロタウイルス／結合ペプチドシステムが利用され得る。この開示事項
は本願に文献として援用する。上記のリストは網羅的なものではなく、上記化合物の修飾
物も使用し得ることは明かである。
【０１５１】
それ自体が宿主に対して有害な抗体の産生を誘発しないキャリアーはいずれも使用し得
る。適切なキャリアーは、一般に大きく、ゆっくり代謝される巨大分子であり、例えばタ
ンパク質類；ラテックスで官能性を与えられたセファロース、アガロース、セルロース、
セルロースビーズなどのような多糖類；ポリグルタミン酸、ポリリシンなどのようなアミ
ノ酸ポリマー；アミノ酸コポリマー；および不活性ウイルス粒子がある。特に有用なタン
パク質の基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン
分子、チログロブリン、オバルブミン、破傷風菌毒素、および当業者によく知られている
タンパク質である。
【０１５２】
ＮＳ５、エンベロープ１およびコアの領域由来の少なくとも１つのウイルスエピトープ
をコードにするＨＣＶアミノ酸配列を含有するペプチドは有用な免疫試薬である。５’Ｕ
Ｔ領域は翻訳されないことが知られている。例えば、末端を切取られた配列を有するペプ
チドは免疫検定法の試薬として使用できる。またこれらのペプチドは、抗血清製造用組成
物あるいはワクチンの候補となり得るサブユニット抗原である。この末端を切取られた配
列は未変性のウイルスタンパク質を各種の公知の方法で処理することによって製造し得る
が、ＨＣＶ配列を有する合成もしくは組換えによるペプチドを作る方が一般に好ましい。
これらの末端を切取られたＨＣＶ配列を有するペプチドは、全体がＨＣＶ配列（連続もし
くは非連続である１つまたはそれ以上のエピトープ）、またはＨＣＶ配列と異種タンパク
質との融合タンパク質を含有し得る。有用な異種タンパク質は組換え宿主から分泌され、
ＨＣＶエピトープの免疫反応性を強化し、またはポリペプチドが、免疫検定法の支持体も
しくはワクチンの担体と容易にカップリングする配列である。（例えばヨーロッパ特許公
開第１１６、２０１号、米国特許第４、７２２、８４０号、ヨーロッパ特許公開第２５９
、１４９号、米国特許第４、６２９、７８３号）。
【０１５３】
末端を切取られたＨＣＶ配列を含有するペプチドの大きさは広範囲に変え得、その最小
の大きさは１つのＨＣＶエピトープを与えるのに充分な大きさの配列であるが、最大の大
きさは重要ではない。便宜上、最大の大きさは、たとえあるとしても、通常、所望のＨＣ
Ｖエピトープを提供し、異種配列の機能を与えるのに必要な大きさより実質的に大きいこ
とはない。典型的には、末端を切取られたＨＣＶのアミノ酸配列は長さが約５〜約１００
個のアミノ酸の範囲内にある。しかし、さらに典型的にはＨＣＶ配列長さが最大約５０個
のアミノ酸であり、好ましくは最大３０個のアミノ酸である。少なくとも約１０、１２ま
たは１５個のアミノ酸、最大約２０個もしくは２５個までのアミノ酸を有するＨＣＶ配列
を選択することが通常望ましい。
【０１５４】
エピトープを含有するＨＣＶアミノ酸配列は多数の方法で同定することができる。例え
ばＮＳ５、エンベロープおよびコアの各領域に対応する全タンパク質配列は、このような
領域の全タンパク質配列にわたる一連の短いペプチドを作ることによってスクリーニング
し得る。例えば、ほぼ１００個のアミノ酸のペプチドから出発することによって、所望の
反応性を示すエピトープの存在について各ペプチドを試験し、次に１００個のアミノ酸か
らなる同定されたペプチドを次第に小さくした、かつ重複しているフラグメントを試験し
、目的とするエピトープをマップすることは日常的に行われる。免疫検定法でこのような
ペプチドをスクリーニングすることは、当業者に容易である。タンパク質配列のコンピュ
ータ分析を実施して潜在的なエピトープを同定し、その同定された領域を含有するペプチ
ドを調製してスクリーニングに用いることも公知である。
【０１５５】
また、ＨＣＶのエピトープの免疫原性は、例えばＢ型肝炎表面抗原に関連する粒子形成
性タンパク質と融合もしくは会合した形で、哺乳類もしくは酵母の系で調製することによ
っても強化し得る。例えば米国特許第４、７２２、８４０号参照。ＨＣＶエピトープが粒
子形成性タンパク質をコードする配列に直接結合された構築物はＨＣＶエピトープに対し
て免疫原性な融合体を産生する。さらに、製造されたすべてのベクターは、ＨＢＶに特異
的なエピトープを含有し、例えばプレ−Ｓ−ペプチドのように種々の異なる免疫原性をも
っている。したがって、ＨＣＶ含有する粒子形成性タンパク質で構成された粒子はＨＣＶ
とＨＢＶとに対して免疫原性である。
【０１５６】
肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）は、エス・セレビシェ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中
で形成され、集合して粒子になること（Ｐ．  Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａらの１９８２年の報
告）、および、例えば哺乳類細胞中で形成され、集合して粒子になること（Ｐ．  Ｖａｌ
ｅｎｚｕｅｌａらの１９８４年の報告）が報告されている。このような粒子が生成すると
そのモノマーサブユニットの免疫原性が増大されることが報告されている。またその構造
体は、プレサーフェイス（プレ−Ｓ）領域の５５個のアミノ酸を含有する、ＨＢＳＡｇの
免疫優性エピトープを有している（Ｎａｕｒａｔｈらの１９８４年の報告）。酵母中で発
現可能なプリ−Ｓ−ＨＢＳＡｇ粒子の構築物は１９８６年３月１９日付で公開されたヨー
ロッパ特許公開第１７４、４４４号に開示され、また酵母で発現される異種ウイルス配列
を含有するハイブリッドが、１９６６年３月２６日付で公開されたヨーロッパ特許第１７
５、２６１号に開示されている。またこれらの構築物は、ＳＶ４０−ジヒドロ葉酸レダク
ターゼベクターを用いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞
内で発現させ得る。（Ｍｉｃｈｅｌｌｅらの１９８４年の文献）。
【０１５７】
その上、粒子形成性タンパク質をコードする配列の一部分は、ＨＣＶエピトープをコー
ドするコドンと置換し得る。この置換で、哺乳動物の酵母の中でユニットの集合を仲介し
て免疫原性粒子を形成するのに必要とされない領域を削除して、付加的なＨＢＶ抗原部位
がＨＣＶエピトープと競合しないようにし得る。
【０１５８】
ワクチン類
ワクチンは、ＨＣＶ由来の１つ又はそれ以上の免疫原性ペプチドから調製し得る。ＨＣ
Ｖとフラビウイルス間にみられる相同性から、ワクチンとして最も有効であると思われる
ペプチドと、これらのペプチドがコードされるゲノムの領域とに関する情報が得られる。
【０１５９】
ＨＣＶに対する多価ワクチンは、ＮＳ５、エンベロープ１、およびコアの領域から誘導
された１つ又はそれ以上のタンパク質由来の１つ又はそれ以上のエピトープで構成され得
る。特に、ＮＳ５、エンベロープ１およびコアの領域由来の１つ又はそれ以上のＨＣＶタ
ンパク質もしくはサブユニット抗原を有するワクチンが考えられる。５’ＵＴ領域は翻訳
されないことが知られている。
【０１６０】
免疫原性ペプチドを活性成分として含有するワクチンの製造法は当業者には公知である
。典型的には、このようなワクチンは注射用薬剤の液状の溶液もしくは懸濁液として製造
され得る。また注射する前に液体の溶液もしくは懸濁液にするのに適した固体の形態のも
のも製造し得る。またその製剤は乳化させ得、または、そのタンパク質はリポソーム内に
封入し得る。活性な免疫原性成分は、医薬として許容されかつ活性成分と相溶性のある賦
形剤と混合され得る。適切な賦形剤としては、例えば、水、食塩水、デキストロース、グ
リセリン、エタノールなどおよびそれらの組合せがある。さらに、所望により、本発明の
ワクチンは、少量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤および／また
はワクチンの有効性を増大するアジュバントを含有し得る。有効なアジュバントの例とし
ては、限定はないが以下のものがある。すなわち水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ム
ラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル
−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６７３）、ｎｏｒ−ＭＤＰ
という）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン
−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）
−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ，ＭＴＰ−ＰＥという）、およびＲＩＢＩである。
なおＲＩＢＩは、細菌から抽出された３成分、すなわちモノホスホリル脂質Ａ、トレハロ
ースジミコレート（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）、および細胞壁骨格（
ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中に含有して
いる。アジュバントの有効性は、抗体の量を測定することによって決定し得、該抗体は種
々のアジュバントを含有するワクチン中に存在するＨＣＶ抗原配列を有する免疫原性ペプ
チドを投与した結果、該ペプチドに対して生産され得る。
【０１６１】
本発明のワクチンは、通常非経口で、例えば、皮下もしくは筋肉内に注射することによ
って投与され得る。他の投与法に適した別の製剤としては坐剤、および、ある場合には経
口用製剤がある。坐剤の場合、伝統的な結合剤と担体、例えばポリアルキレングリコール
類もしくはトリグリセリドを含有し得る。このような坐剤は、活性成分を０．５％〜１０
％好ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物から製造され得る。経口製剤は、例えば
医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッ
カリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常用いられる賦形剤を含有し
得る。
【０１６２】
下記の実施例は例示を目的とし提供するものであり、本発明の範囲を限定するものでは
ない。
【実施例】
【０１６３】
（Ｉ．血清からのＨＣＶ  ＲＮＡの検出）
ＲＮＡの血清からの抽出は、キット（ＲＮＡｚｏｌ（登録商標）Ｂキット，Ｃｉｎｎａ
／Ｂｉｏｔｅｃｘ）の製造者の指示に従って、グアニジニウム塩、フェノールおよびクロ
ロホルムを使用して行った。抽出したＲＮＡをイソプロパノールで沈澱させ、次いでエタ
ノールで洗浄した。合計２５μｌの血清をＲＮＡ単離のために処理し、精製したＲＮＡを
、ピロ炭酸ジエチルで処理した水５μｌ中に再懸濁し、次のｃＤＮＡ合成を行った。
【０１６４】
（ＩＩ．  ｃＤＮＡの合成とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅）
表１に、この実施例に用いたすべてのＰＣＲプライマーとプローブの配列と位置（ＨＣ
Ｖ１について）を示す。ヌクレオチドに対するアルファベット文字による名称は米国特許
法施行規則§§１．８２１〜１．８２５と同じである。即ちアルファベット文字Ａ、Ｃ、
Ｇ、ＴおよびＵは、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルという通常の
意味で用いられる。文字ＭはＡまたはＣを意味し；ＲはＡまたはＧを意味し；ＷはＡまた
はＴ／Ｕを意味し；ＳはＣまたはＧを意味し；ＹはＣまたはＴ／Ｕを意味し；ＫはＧまた
はＴ／Ｕを意味し；ＶはＡまたはＣまたはＧを意味し、Ｔ／Ｕを意味しない；ＨはＡまた
はＣまたはＴ／Ｕを意味し、Ｇを意味しない；ＤはＡまたはＧまたはＴ／Ｕを意味し、Ｃ
を意味しない；ＢはＣまたはＧまたはＴ／Ｕを意味し、Ａを意味しない；Ｎは（Ａもしく
はＣもしくはＧもしくはＴ／Ｕ）または（未知のものなど）を意味する。表１は下記のと
おりである。
【０１６５】
【表１】
2008178416.tif 000002
ｃＤＮＡの合成およびＰＣＲによる増幅については、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅ
ｔｕｓ［ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ］によって開発されたプロ
トコルを用いた。ランダムヘキサマー（ｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒ）およびＨＣＶに
対して特異的な相補的配列を有するプライマーの両者を、逆転写（ＲＴ）反応を開始する
ために使用した。反応成分の添加と混合を除いて、すべての工程は熱サイクラー（ｔｈｅ
ｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）内で実施した。第１ス
トランドｃＤＮＡの合成反応は９９℃５分間処理して不活性化し、ついで５０℃で５分間
冷却してから次の増幅を行うための反応成分を添加した。９７℃で１分間、５０℃で２分
間および７２℃で３分間のサイクルを最初５回行い、つぎに、９４℃で１分間、５５℃で
２分間および７２℃で３分間のサイクルを３０回行い、次いで最後の７２℃で７分間の延
伸を行った。
【０１６６】
遺伝子型分析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を行うのに、配列６７と６
８とをＰＣＲ反応のプライマーとして用いた。これらのプライマーは、コアとエンベロー
プの領域に対応するセグメントを増幅する。増幅後、反応生成物をアガロースゲルで分離
し、ついでナイロン膜に転写した。その固定化された反応生成物を、遺伝子型Ｉ（コアも
しくはエンベロープ１）、または、遺伝子型ＩＩ（コアもしくはエンベロープ１）に対応
する３２Ｐ標識核酸とハイブリッドさせた。遺伝子型Ｉに対応する核酸は、６９番（コア
）、７１番（エンベロープ）および７３番（エンベロープ）の配列を含有していた。遺伝
子型ＩＩに対応する核酸は７０番（コア）、７２番（エンベロープ）および７４番（エン
ベロープ）の配列を含有していた。
【０１６７】
遺伝子型Ｉのプローブは、遺伝子型Ｉの配列を有する分離株由来の増幅した生成物とだ
けハイブリッドした。同様に、遺伝子型ＩＩのプローブは、遺伝子型ＩＩの配列を有する
分離株由来の増幅した生成物とだけハイブリッドを形成した。
【０１６８】
他の実験では、ＰＣＲ生成物は配列７９と８０を用いて製造した。配列７３番を遺伝子
型Ｉを検出するのに用い、配列７４番を遺伝子型ＩＩを検出するのに用い、配列７７番（
５’ＵＴ）を遺伝子型ＩＩＩを検出するのに用い、および配列７８番（５’ＵＴ）を遺伝
子型ＩＶを検出するのに用いたことを除いて、前述したのと同様にして生成物を分析した
。各配列は、遺伝子型に特異的な方法でハイブリッドを形成した。
【０１６９】
（ＩＩＩ．ＨＣＶ  ＲＮＡについてのサンドイッチハイブリッド形成検定法を用いるＨ
ＣＶ  ＧＩ−ＧＩＶの検出）
増幅された溶液相の核酸サンドイッチハイブリッド形成検定法の方式をこの実施例で説
明する。この検定法の方式では、捕獲と検出を達成するために数種の核酸プローブを使用
する。捕獲プローブ核酸は固体担体に結合した相補的プローブ及びＨＣＶ核酸と会合し得
、核酸は捕獲を行うことができる。検出プローブ核酸は、ＨＣＶ核酸に結合する第１セグ
メント（Ａ）と、第２の増幅核酸とハイブリッドする第２セグメント（Ｂ）とをもってい
る。
【０１７０】
増幅核酸は、第１セグメント（Ｂ＊）を有し、そのセグメントはプローブ核酸のセグメ
ント（Ｂ）とハイブリッドし、かつ１５のセグメント（Ｃ）の反復を有している。増幅核
酸のセグメントＣは、３種の標識核酸とハイブリッドし得る。
【０１７１】
グループＩのＨＣＶ単離株のエンベロープ１遺伝子のヌクレオチド配列に対応する核酸
配列は８１〜９９番の配列内に記載されている。表２には、その核酸配列が対応するＨＣ
Ｖゲノムの領域と、その配列の好ましい用途を記載している。
【０１７２】
【表２】
2008178416.tif 000003
【０１７３】
【表２−１】
2008178416.tif 000004
グループＩＩのＨＣＶ単離株のエンベロープ１遺伝子のヌクレオチド配列に対応する核
酸配列は１００〜１１８番の配列中に記載されている。表３には、核酸が対応するＨＣＶ
ゲノムの領域と、その配列の好ましい用途が記載されている。
【０１７４】
【表３】
2008178416.tif 000005
Ｃ遺伝子と５’ＵＴ領域中のヌクレオチド配列に対応する核酸配列は配列１１９〜１４
５に記載されている。表４に、その配列と好ましい用途を示す。
【０１７５】
【表４】
2008178416.tif 000006
【０１７６】
【表４−１】
2008178416.tif 000007
検出及び捕獲プローブのＨＣＶ特異的セグメントおよび、このアッセイで使用されるそ
れぞれの名称は次のとおりである。
【０１７７】
捕獲配列は１１９〜１２２番および１４１〜１４４番の配列である。
【０１７８】
検出配列は１１９〜１４０番の配列である。
【０１７９】
各検出配列は、ＨＣＶ配列に対して実質的に相補的な配列に加えて、５’伸長部（Ｂ）
を有し、その伸長部（Ｂ）は第２増幅核酸のセグメントに相補的である。その伸長部（Ｂ
）の配列は、配列番号１４６として配列表に記載されているが以下に再度示す。
【０１８０】
ＡＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣＣＣＧＴＧＴＣＴＴ
各捕獲配列は、ＨＣＶ配列に対して実質的に相補的な配列に加えて、固体相に結合され
たＤＮＡに相補的な配列を含有している。固定支持体に結合されたＤＮＡに相補的な配列
は、捕獲配列の下流に保持されている。支持体に結合されたＤＮＡに相補的な配列は１４
７番の配列として記載されているが、以下に再度示す。
【０１８１】
ＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧ
マイクロタイタープレートを以下のように調製した。Ｗｈｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ
１  Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ  ｓｔｒｉｐｓ（ポリスチレン製微量滴定プレート、９６ウ
ェル／プレート）はＤｙｎａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から購入した。
【０１８２】
各ウェルに１Ｎ  ＨＣｌ  ２００μｌを添加し、室温で１５〜２０分間インキュベート
した。次ぎにプレートを１ｘＰＢＳで４回洗浄し、つぎにウェルを吸引して液体を除いた
。ウェルに１Ｎ  ＮａＯＨ  ２００μｌを添加し、室温で１５〜２０分間インキュベート
した。プレートを再び１ｘＰＢＳで４回洗い、吸引して液体を除いた。
【０１８３】
ポリ（ｐｈｅ−ｌｙｓ）をＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社から購入した
。このポリペプチドは、ｐｈｅ：ｌｙｓのモル比が１：１であり、平均分子量が４７，９
００ｇｍ／モルである。またこのペプチドは平均長が３０９個のアミノ酸の長さであり、
１５５個のアミン／モルを含有している。このポリペプチドの１ｍｇ／ｍｌ溶液を２Ｍ  
ＮａＣｌ／１ｘＰＢＳと混合して最終濃度を０．１ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ６．０）にした。こ
の溶液２００μｌづつを各ウェルに添加した。このプレートをプラスチックで包んで乾燥
を防止し、３０℃で一夜インキュベートした。そのプレートを１ｘＰＢＳで４回洗浄し、
ウェルを吸引して液体を除いた。
【０１８４】
以下の方法を用いて、核酸１４７番の配列に相補的な配列をプレートに結合させた（以
後固定化核酸と呼称する）。１３３番の配列に相補的な配列を有する固定化核酸の合成は
、ヨーロッパ特許第８８３０９６９７６号に記載されている。ジスクシンイミジルスベレ
ート２０ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３００μｌに溶解した。固定化核酸の２
６  ＯＤ260単位を連結用緩衝液１００μｌ（５０ｍＭ  リン酸ナトリウムｐＨ７．８）
に添加した。つぎにその連結混合物をＤＳＳ−ＤＭＦ溶液に添加しマグネティックスタラ
ーで３０分間撹絆した。ＮＡＰ−２５のカラムを１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．５
で平衡化した。連結混合物のＤＳＳ−ＤＭＦ溶液を、４℃にて、１０ｍＭリン酸ナトリウ
ムｐＨ６．５    ２ｍｌに添加した。得られた混合物を撹絆して混合し、上記の平衡化し
たＮＡＰ−２５カラムにロードした。ＤＳＳで活性化された固定化核酸ＤＮＡを、３．５
ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５で上記カラムから溶離した。溶離された、Ｄ
ＳＳ活性化固定化核酸ＤＮＡの５．６  ＯＤ260単位の量を、５０ｍＭリン酸ナトリウム
ｐＨ７．８  １５００ｍｌに添加した。この溶液５０μｌずつを各ウェルに添加し、その
プレートを一夜インキュベートした。次にプレートを１ｘＰＢＳで４回洗浄し、ウェルを
吸引して液体を除いた。
【０１８５】
プレートの最終のストリッピングを次のようにして行った。０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ
を含有する０．２Ｎ  ＮａＯＨ２００μｌずつを各ウェルに添加した。そのプレートをプ
ラスチックで包み６５℃で６０分間インキュベートした。次いでプレートを１ｘＰＢＳで
４回洗浄し、ウェルを吸引し液体を除去した。ストリッピングしたプレートを乾燥剤のビ
ーズとともに２〜８℃で貯蔵した。
【０１８６】
検定すべき血清試料は、ＰＣＲとそれに続く配列分析法を用いて分析して遺伝子型を測
定した。
【０１８７】
試料は、血清試料５０μｌとＰ−Ｋ緩衝液１５０μｌを各ウェルに添加することによっ
て調製した。Ｐ−Ｋ緩衝液は、５３ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中２ｍｇ／ｍｌのプ
ロテイナーゼＫ；０．６Ｍ  ＮａＣｌ；０．０６Ｍ  クエン酸ナトリウム；８ｍＭ  ＥＤ
ＴＡ、ｐＨ８．０；１．３％  ＳＤＳ；１６μｇ／ｍｌの超音波処理サケ精子ＤＮＡ；７
％ホルムアミド；５０ｆｍｏｌｅ捕獲プローブ；１６０ｆｍｏｌｅ検出プローブで構成さ
れている。プレートを振とうし、ウェルの内容物を混合し、カバーして１６時間６２℃で
インキュベートした。
【０１８８】
さらに１０分間室温で保持した後、各ウェルの内容物を吸引してすべての流体を除き、
ウェルを、洗浄緩衝液（０．１％ＳＤＳ；０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ；  ０．００１５Ｍ  
クエン酸ナトリウム）で２回洗浄した。つぎに増幅核酸を各ウェル（０．０４８Ｍ  Ｎａ
Ｃｌ；  ０．０４８Ｍクエン酸ナトリウム；０．１％ＳＤＳ；０．５％「ブロッキング剤
」（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、カタログ番号１０９０  １７６）の０
．７ｆｍｏｌｅ／μｌ溶液５０μｌ）に添加したプレートにふたをし、ウェルの内容物を
撹拌混合して、プレートを３０分間５２℃でインキュベートした。
【０１８９】
さらに１０分間室温に保持した後、ウェルを上記と同様にして洗浄した。
【０１９０】
アルカリホスターゼ標識をした核酸（これはヨーロッパ特許８８３０９６９７６号に開
示されている）、を各ウェルに添加した（２．６６ｆｍｏｌｅ／μｌをウェル当り５０μ
ｌ）。５２℃で１５分間、つぎに室温で１０分間インキュベートした後、ウェルを前に述
べたと同様に２回洗浄し、次に、０．０１５ＭＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリ
ウムで３回洗浄した。
【０１９１】
酵素でトリガーされた（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）ジオキセタン（Ｓｃｈａａｐら、Ｔｅｔ
．Ｌｅｔｔ．２８巻、１１５９〜１１６２頁、１９８７年およびヨーロッパ特許公開第０
２５４０５１号）をＬｕｍｉｇｅｎ，Ｉｎｃから入手して利用した。Ｌｕｍｉｐｈｏｓ  
５３０（Ｌｕｍｉｇｅｎ）５０μｌずつを各ウェルに添加した。ウェルを軽くたたいて試
薬を底部に落下させ、かつゆるやかに旋回させて試薬を底部に均一に分布させた。ウェル
にふたをし、３７℃で２０〜４０分間インキュベートした。
【０１９２】
プレートを、次に、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＭＬ  １０００ルミノメー夕（ｌｕｍｉｎｏｍ
ｅｔｅｒ）で読み取った。出力は反応中に発生した光の全合計として示された。
【０１９３】
この検定法は、遺伝子型のいかんにかかわらず、各血清試料を確実に検出した。
【０１９４】
（ＩＶ．異なる遺伝子型で規定された配列にコードされたポリペプチドの発現）
１〜６６番の配列内の配列でコードされるＨＣＶポリペプチドは、スーパーオキシドジ
スムターゼ（ＳＯＤ）を用いて融合ポリペプチドとして発現される。これらの配列を保持
するｃＤＮＡを、発現ベクターｐＳＯＤｃｆ１（Ｓｔｅｉｍｅｒらの１９８６年の文献）
中にサブクローン化する。
【０１９５】
まずｐＳＯＤｃｆ１から単離されたＤＮＡをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで処理し、ついで
、これら制限酵素によって生成された線状ＤＮＡに下記：
【０１９６】
【化１】
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のリンカーを連結した。
【０１９７】
クローン化した後、挿入断片を含有するプラスミドを単離した。
【０１９８】
挿入断片を含有するプラスミドをＥｃｏＲＩで切断する。このＥｃｏＲＩで線状にした
プラスミドＤＮＡに、ＨＣＶｃＤＮＡを連結する。得られたＤＮＡ混合物を用いてイー・
コリ菌株Ｄ１２１０を形質転換する（Ｓａｄｌｅｒらの１９８０年の文献）。ポリペプチ
ド類はゲル状で単離する。
【０１９９】
（Ｖ．  ポリペプチド類の抗原性）
セクションＩＶで製造されたポリペプチドの抗原性を以下の方法で評価する。８  １２
アレー（オーストラリア、ビクトリア州、Ｃｏｓｅｌｃｏ  Ｍｉｍｅｔｏｐｅｓ）中のブ
ロック上に配列したポリエチレン製のピンはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の２０％Ｖ
／Ｖ％のピペリジン溶液に３０分間室温で置くことによって調製する。そのピンを取り出
しＤＭＦ中で５分間洗浄し、ついでメタノール中で４回洗浄する（２分間／洗浄）。その
ピンを少なくとも１０分間空気乾燥し、ＤＭＦ中で（５分間）最終回の洗浄を行う。１−
ヒロドキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、３６７ｍｇ）をＤＭＦ（８０μＬ）に溶解し
、セクションＩＶで製造したＦｍｏｃで保護したポリペプチドの結合に使用する。
【０２００】
保護されたアミノ酸を、ＨＯＢｔとともに、マイクロ夕イタープレートのウェル内に入
れ、前記ピンブロックをプレートの上においてピンをウェル内で浸漬させる。集合体をプ
ラスチック袋内に密封し、２５℃で１８時間反応させて第１アミノ酸をピンに結合させる
。次いでブロックを取り出し、ピンをＤＭＦ（２分間）、ＭｅＯＨ（４回、２分間ずつ）
および再びＤＭＦ（２分間）で洗って、結合したアミノ酸を洗浄して脱保護する。この手
順を、個々の付加するアミノ酸を結合させる際に繰り返し、８量体を製造した。
【０２０１】
大部分のエピトープはＮ末端には見られないため正の電荷をもっていないので、遊離の
Ｎ末端はアセチル化して遊離のアミドを保護する。アセチル化反応は、マイクロタイター
プレートのウェルをＤＭＦ／無水酢酸／トリエチルアミン（５：２：１  Ｖ／Ｖ／Ｖ）で
満たし、ピンをウェル中で９０分間２０℃にて反応させることによって達成される。次い
でピンをＤＭＦ（２分間）、ＭｅＯＨ（４回、２分間）で洗浄し、少なくとも１０分間空
気乾燥する。
【０２０２】
側鎖の保護基は、ポリプロピレンの袋内で４時間室温で、ピンをトリフルオロ酢酸／フ
ェノール／ジチオエタン（９５：２．５：１．５，  Ｖ／Ｖ／Ｖ）で処理して除かれる。
ついでピンは、ジクロロメタン（２回、２分間）、５％ジーイソプロピルエチルアミン／
ジクロロメタン（２回、５分間）およびジクロロメタン（５分間）中で洗い、次いで、少
なくとも１０分間空気乾燥を行う。その後、ピンを水（２分間）およびＭｅＯＨ（１８時
間）中で洗浄し、減圧乾燥し、シリカゲルの入ったプラスチック製袋内に密封して貯蔵す
る。
【０２０３】
（ＶＩ．  Ｂ．１５．６ペプチドの検定）
８量体を有するピンを、破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）緩衝液（１％ドデシル硫酸ナト
リウム、０．１％２−  メルカプトエタノール、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４）中、６０℃
で３０分間超音波で処理する。つぎにピンを数回、水（６０℃）中に浸漬し、続いて沸騰
ＭｅＯＨ（２分間）中に浸漬し、次いで空気乾燥させる。
【０２０４】
つぎにピンをプレコートするが、それはピンを、２００μＬのブロッキング緩衝液（１
％オバルブミン、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ、および０．０５％ＮａＮ３を含有す
るＰＢＳ）が入っているマイクロタイターウェル中で、撹拌しながら、２５℃にて１時間
行う。次ぎにピンを、ＨＣＶに感染していると診断されたヒトの患者から得た抗血清１７
５ｍｌが入って入る微量滴定用ウェルに中に浸漬し、一夜４℃でインキュベートする。血
清中のポリクローナル抗体とポリペプチド間の複合体が生成して、ペプチドがインビボで
免疫応答を起こしはじめる。このようなペプチドは、ワクチン開発の候補である。
【０２０５】
上記のように本発明を説明し例証してきた。本願明細書に添付した請求の範囲から逸脱
することなく、かつ本発明の教示事項と適用範囲から逸脱することなく多くの変更と改変
を行うことができることは当業者にとっては明かなことである。
【０２０６】
本願は、Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型に関連する核酸、ペプチドおよび抗体の組成物、
ならびに、そのような組成物を診断および治療のために使用する方法を特徴とする。
【０２０７】
（配列表）  配列表は配列番号１〜１４７の配列を示す。
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【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１】図１は、ＨＣＶの遺伝子の構造を示す。
【図２ａ】図２ａは、ＨＣＶウイルスゲノムのＮＳ５領域に由来する配列番号１〜２２の核酸配列を示す。
【図２ｂ】図２ｂは、ＨＣＶウイルスゲノムのＮＳ５領域に由来する配列番号１〜２２の核酸配列を示す。
【図２ｃ】図２ｃは、ＨＣＶウイルスゲノムのＮＳ５領域に由来する配列番号１〜２２の核酸配列を示す。
【図２ｄ】図２ｄは、ＨＣＶウイルスゲノムのＮＳ５領域に由来する配列番号１〜２２の核酸配列を示す。
【図２ｅ】図２ｅは、ＨＣＶウイルスゲノムのＮＳ５領域に由来する配列番号１〜２２の核酸配列を示す。
【図３】図３は、ＨＣＶウイルスゲノムのエンベロープ１領域に由来する配列番号２３〜３２の核酸配列を示す。
【図４ａ】図４ａは、ＨＣＶウイルスゲノムの５’ＵＴ領域に由来する配列番号３３〜５１の核酸配列を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、ＨＣＶウイルスゲノムの５’ＵＴ領域に由来する配列番号３３〜５１の核酸配列を示す。
【図４ｃ】図４ｃは、ＨＣＶウイルスゲノムの５’ＵＴ領域に由来する配列番号３３〜５１の核酸配列を示す。
【図４ｄ】図４ｄは、ＨＣＶウイルスゲノムの５’ＵＴ領域に由来する配列番号３３〜５１の核酸配列を示す。
【図４ｅ】図４ｅは、ＨＣＶウイルスゲノムの５’ＵＴ領域に由来する配列番号３３〜５１の核酸配列を示す。
【図５ａ】図５ａは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。
【図５ｃ】図５ｃは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。
【図５ｄ】図５ｄは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。
【図５ｅ】図５ｅは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。
【図５ｆ】図５ｆは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。
【図５ｇ】図５ｇは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。
【図５ｈ】図５ｈは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。
【図５ｉ】図５ｉは、ＨＣＶウイルスゲノムのコア領域に由来する配列番号５２〜６６の核酸配列を示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図５ｇ】
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【図５ｈ】
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【図５ｉ】
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