(57)【要約】  【課題】生物学的指標を利用して、腫瘍発生リスクを適切に解析し得る手段を得ること。  【解決手段】（ａ）検体の非腫瘍部から採取した被検組織における細胞増殖促進遺伝子群、細胞増殖抑制遺伝子群、アポトーシス促進遺伝子群、アポトーシス抑制遺伝子群、細胞分化促進遺伝子群、及び、細胞分化抑制遺伝子群から選ばれる２以上の指標遺伝子の発現量を測定する工程、（ｂ）同組織におけるハウスキーピング遺伝子の発現量を測定する工程、（ｃ）工程（ａ）で得られる各指標遺伝子の発現量の測定値を、工程（ｂ）で得られるハウスキーピング遺伝子の発現量の測定値で補正した値を、各指標遺伝子に関する腫瘍発生指標とする工程、（ｄ）工程（ｃ）で得られる各指標遺伝子の腫瘍発生指標を、予め設定される基準値と比較して評価する工程、及び、（ｅ）工程（ｄ）で得られる各指標遺伝子の評価を２以上組み合わせる工程を有する腫瘍発生リスクの解析方法。  【選択図】図８
2008295301.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）検体の非腫瘍部から採取した被検組織における細胞増殖促進遺伝子群、細胞増殖抑制遺伝子群、アポトーシス促進遺伝子群、アポトーシス抑制遺伝子群、細胞分化促進遺伝子群、及び、細胞分化抑制遺伝子群から選ばれる２以上の指標遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｂ）同組織におけるハウスキーピング遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｃ）工程（ａ）で得られる各指標遺伝子の発現量の測定値を、工程（ｂ）で得られるハウスキーピング遺伝子の発現量の測定値で補正した値を、各指標遺伝子に関する腫瘍発生指標とする工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られる各指標遺伝子の腫瘍発生指標を、予め設定される基準値と比較して評価する工程、及び、
（ｅ）工程（ｄ）で得られる各指標遺伝子の評価を２以上組み合わせる工程を有し、
前記細胞増殖促進遺伝子群が、PCNA遺伝子、CyclinD1遺伝子、cdk2遺伝子、ファルネシルトランスフェラーゼ（farnesyl transferase）遺伝子、Ki67遺伝子、及びEGFレセプター遺伝子を含む遺伝子群であり、
前記細胞増殖抑制遺伝子群が、TGFβ遺伝子、p21遺伝子、及びINK4遺伝子を含む遺伝子群であり、
前記アポトーシス促進遺伝子群が、Bax遺伝子、caspase遺伝子、及びFas遺伝子を含む群であり、
前記アポトーシス抑制遺伝子群が、Bcl-2遺伝子、IAP遺伝子、及びsurvivin遺伝子を含む群であり
前記細胞分化促進遺伝子群が、ムチン遺伝子、Cdx-1遺伝子、intestinal alkaline phosphatase遺伝子、及びCD10遺伝子を含む群であり、並びに
前記分化抑制遺伝子群が、Cdx-2遺伝子を含む群である
腫瘍発生リスクの解析方法。
【請求項２】
工程（ｄ）が、下記
（ｄ−１）指標遺伝子の発現量が多い場合を危険因子（＋）発現量が少ない場合を危険因子（−）とし、腫瘍発生有を結果（＋）発生無を結果（−）として、発現量の感度と特異度の和が最も大きくなる値を、該遺伝子に関する基準値とする工程、
（ｄ−２）各指標遺伝子に関して、工程（ｃ）における該遺伝子の腫瘍発生指標と工程（ｄ−１）における該遺伝子の基準値とを比較し、
（ｄ−３ａ）指標遺伝子が細胞増殖促進遺伝子、細胞分化抑制遺伝子、又はアポトーシス抑制遺伝子である場合、腫瘍発生指標が基準値以上の場合を発生リスク上昇因子、基準値未満の場合を発生リスク低下因子と評価し、
（ｄ−３ｂ）指標遺伝子が細胞増殖抑制遺伝子、細胞分化促進遺伝子、又はアポトーシス促進遺伝子の場合、腫瘍発生指標が基準値未満の場合を発生リスク上昇因子、基準値以上の場合を発生リスク低下因子と評価する工程である請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｄ）が、下記
（ｄ−１）指標遺伝子の発現量の多少により数段階に分けて複数の基準値を設定し、
（ｄ−２）各指標遺伝子に関し、工程（ｃ）における腫瘍発生指標を工程（ｄ−１）でにおける基準値と比較して発現量の多いものを高得点として点数を付し、
（ｄ−３ａ）指標遺伝子が細胞増殖促進遺伝子、細胞分化抑制遺伝子、又はアポトーシス抑制遺伝子である場合、（ｄ−２）の点数は加算因子と評価し、
（ｄ−３ｂ）指標遺伝子が細胞増殖抑制遺伝子、細胞分化促進遺伝子、又はアポトーシス促進遺伝子の場合、（ｄ−２）の点数は引算因子と評価する工程である請求項１に記載の評価方法。
【請求項４】
検体の非腫瘍部が正常大腸粘膜であり、大腸における腫瘍発生リスクの解析方法である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ハウスキーピング遺伝子が、GADPH（glyceralde-hydo-3-phosphate dehydrogenase）遺伝子である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
指標遺伝子が、細胞増殖促進遺伝子群及びアポトーシス促進遺伝子群から選ばれる２以上の指標遺伝子である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
細胞増殖促進遺伝子群がPCNA遺伝子及びCyclinD1遺伝子からなる群である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
アポトーシス促進遺伝子群が、Bax遺伝子からなる群である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非腫瘍部から採取された被検組織における遺伝子の発現量を測定し、腫瘍の発生リスクを解析する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌による死亡率は、近年、高い値で推移を続けており、特に、大腸癌の死亡率はその中でも高い。そのため、癌の早期発見、又は癌の予防のための研究が積極的に行われてきている。
【０００３】
多くの癌は前癌病変を経て早期癌から進行癌になると考えられており、癌の検診は、治療可能な早期癌を見つけることを目的としている。早期癌を見つけるためには、頻回な検査を行うことになるが、癌を早期に発見するための検査は苦痛や危険を伴うことも多く、また、多大なコストや時間も必要である。例えば、大腸癌は、早期発見、早期治療によりほぼ完治が期待できる癌であるが、その検査である大腸内視鏡検査はきわめて負担の大きな検査である。具体的には検査の前日より強烈な下剤を大量に服用し、大腸の内容物をすべて除去してから、肛門から屈曲の強い大腸を盲腸まで検査具を挿入する必要がある。検査の時間も３０分以上を要し、その後の安静なども含めると数日が拘束される。検査費用も数万円かかる。このように、検査は、対象者がかなりの負担を要し、むやみに行うことはできない。しかし、適切なリスク評価がほとんど見出されていないため、現状ではほとんどの人に年１回程度の検査が勧められている。また、検査は熟練した医師が行う必要があるが、熟練医はいまだとても不足している。
【０００４】
このように従来の方法では対象者の負担が大きく、検査に熟練を要していた。このため、検査間隔を適切に判断できる指標がきわめて待たれている。
【０００５】
また、特に日本における大腸癌の罹患率は急激に増加しているが、罹患率の増加は早期発見、早期治療では抑制できず、発癌を予防することが重要である。内視鏡検査にて異常を認めた場合、生検が行われ、癌や前癌病変の存在の確認は可能であるが、将来の発癌率を知ることはできない。また、発癌予防はリスクの高い人に行うことが、効率的にも、倫理的にも望ましいが、リスクの適切な指標はこれまでほとんど見つかっていない。
【０００６】
更に、発癌の予防や治療において、生活習慣変容や発癌予防物質の内服などにより発癌の発生リスクが下がったか否かを確認する指標があれば、効果的な発癌予防法の開発や、効率のよい発癌予防の実践が可能となる。しかし、いまだ、そのような指標はほとんど見つかっていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、生物学的指標を利用して、腫瘍発生リスクを高い精度で把握し、腫瘍の早期発見のための検査、或いは腫瘍の予防又は治療を、効率よく適切に実施可能とする解析手段を得ることを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を達成することを主な目的として鋭意検討を重ねた結果、特定の遺伝子の発現量を調べ、それらを指標として腫瘍の発生リスクの評価を組み合わせることにより、腫瘍の発生リスクを高い精度でかつ効率良く解析し得ることを見出し、更に鋭意検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は下記の事項に関する。
【００１０】
項１（ａ）検体の非腫瘍部から採取した被検組織における細胞増殖促進遺伝子群、細胞増殖抑制遺伝子群、アポトーシス促進遺伝子群、アポトーシス抑制遺伝子群、細胞分化促進遺伝子群、及び、細胞分化抑制遺伝子群から選ばれる２以上の指標遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｂ）同組織におけるハウスキーピング遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｃ）工程（ａ）で得られる各指標遺伝子の発現量の測定値を、工程（ｂ）で得られるハウスキーピング遺伝子の発現量の測定値で補正した値を、各指標遺伝子に関する腫瘍発生指標とする工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られる各指標遺伝子の腫瘍発生指標を、予め設定される基準値と比較して評価する工程、及び、
（ｅ）工程（ｄ）で得られる各指標遺伝子の評価を２以上組み合わせる工程を有し、
前記細胞増殖促進遺伝子群が、PCNA遺伝子、CyclinD1遺伝子、cdk2遺伝子、ファルネシルトランスフェラーゼ（farnesyl transferase）遺伝子、Ki67遺伝子、及び、EGFレセプター遺伝子を含む遺伝子群であり、
前記細胞増殖抑制遺伝子群が、TGFβ遺伝子、p21遺伝子、及びINK4遺伝子を含む遺伝子群であり、
前記アポトーシス促進遺伝子群が、Bax遺伝子、caspase遺伝子、及びFas遺伝子を含む群であり、
前記アポトーシス抑制遺伝子群が、Bcl-2遺伝子、IAP遺伝子、及びsurvivin遺伝子を含む群であり
前記細胞分化促進遺伝子群が、ムチン遺伝子、Cdx-1遺伝子、intestinal alkaline phosphatase遺伝子、及びCD10遺伝子を含む群であり、及び、
前記分化抑制遺伝子群が、Cdx-2遺伝子を含む群である腫瘍発生リスクの解析方法。
【００１１】
好ましい態様の一つは、
項２（ａ）検体の非腫瘍部から採取した被検組織における細胞増殖促進遺伝子群、細胞増殖抑制遺伝子群、アポトーシス促進遺伝子群、アポトーシス抑制遺伝子群、細胞分化促進遺伝子群、及び、細胞分化抑制遺伝子群から選ばれる２以上の指標遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｂ）同組織におけるハウスキーピング遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｃ）工程（ａ）で得られる各指標遺伝子の発現量の測定値を、工程（ｂ）で得られるハウスキーピング遺伝子の発現量の測定値で補正した値を、各指標遺伝子に関する腫瘍発生指標とする工程、
（ｄ−１）指標遺伝子の発現量が多い場合を危険因子（＋）発現量が少ない場合を危険因子（−）とし、腫瘍発生有を結果（＋）発生無を結果（−）として、発現量の感度と特異度の和が最も大きくなる値を、該指標遺伝子に関する基準値とする工程、
（ｄ−２）各指標遺伝子に関して、工程（ｃ）における該遺伝子の腫瘍発生指標と工程（ｄ−１）における該遺伝子の基準値とを比較し、
（ｄ−３ａ）指標遺伝子が細胞増殖促進遺伝子、細胞分化抑制遺伝子、アポトーシス抑制遺伝子である場合、腫瘍発生指標が基準値以上の場合を発生リスク上昇因子、基準値未満の場合を発生リスク低下因子と評価し、
（ｄ−３ｂ）指標遺伝子が細胞増殖抑制遺伝子、細胞分化促進遺伝子、アポトーシス促進遺伝子の場合、腫瘍発生指標が基準値未満の場合を発生リスク上昇因子、基準値以上の場合を発生リスク低下因子と評価し、
（ｅ）工程（ｄ−３ａ）及び（ｄ−３ｂ）で得られる各指標遺伝子の評価を２以上組み合わせる工程を有する、項１に記載の方法である。
【００１２】
また、他の好ましい態様の一つは、
項３（ａ）検体の非腫瘍部から採取した被検組織における細胞増殖促進遺伝子群、細胞増殖抑制遺伝子群、アポトーシス促進遺伝子群、アポトーシス抑制遺伝子群、細胞分化促進遺伝子群、及び、細胞分化抑制遺伝子群から選ばれる２以上の指標遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｂ）同組織におけるハウスキーピング遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｃ）工程（ａ）で得られる各指標遺伝子の発現量の測定値を、工程（ｂ）で得られるハウスキーピング遺伝子の発現量の測定値で補正した値を、各指標遺伝子に関する腫瘍発生指標とする工程、
（ｄ−１）指標遺伝子の発現量の多少により数段階に分けて複数の基準値を設定し、
（ｄ−２）各指標遺伝子に関し、工程（ｃ）における腫瘍発生指標を工程（ｄ−１）における基準値と比較して発現量の多いものを高得点として点数を付し、
（ｄ−３ａ）指標遺伝子が細胞増殖促進遺伝子、細胞分化抑制遺伝子、又はアポトーシス抑制遺伝子である場合、（ｄ−２）の点数は加算因子と評価し、
（ｄ−３ｂ）指標遺伝子が細胞増殖抑制遺伝子、細胞分化促進遺伝子、又はアポトーシス促進遺伝子の場合、（ｄ−２）の点数は引算因子と評価し、
（ｅ）工程（ｄ−３ａ）で得られる評価を加算及び（ｄ−３ｂ）で得られる評価を引算することにより、各指標遺伝子の評価を２以上組み合わせてスコア化する工程を有する項１に記載の方法である。
【００１３】
項４：検体の非腫瘍部が正常大腸粘膜であり、大腸における腫瘍発生リスクの解析方法である項１〜３のいずれかに記載の方法。
【００１４】
換言すると、工程（ａ）が、正常大腸粘膜から採取した被検組織における細胞増殖促進遺伝子群、細胞増殖抑制遺伝子群、アポトーシス促進遺伝子群、アポトーシス抑制遺伝子群、細胞分化促進遺伝子群、及び、細胞分化抑制遺伝子群から選ばれる２以上の指標遺伝子の発現量を測定する工程である、
項１〜３のいずれかに記載の大腸腫瘍発生リスクの解析方法。
【００１５】
項５：ハウスキーピング遺伝子が、GADPH（glyceralde-hydo-3-phosphate dehydrogenase）遺伝子である項１〜４のいずれかに記載の方法。
【００１６】
換言すると、工程（ｂ）が、同組織におけるGADPH遺伝子の発現量を測定する工程である項１〜４のいずれかに記載の方法。
【００１７】
項６：指標遺伝子が、細胞増殖促進遺伝子群及びアポトーシス促進遺伝子群から選ばれる２以上の指標遺伝子である項１〜５のいずれかに記載の方法。
【００１８】
換言すると、工程（ａ）が、検体の非腫瘍部から採取した被検組織における細胞増殖促進遺伝子群及びアポトーシス促進遺伝子群から選ばれる２以上の指標遺伝子の発現量を測定する工程である項１〜５のいずれかに記載の方法である。
【００１９】
好ましい態様の一つは、工程（ａ）が、検体の非腫瘍部から採取した被検組織における、細胞増殖促進遺伝子群から選ばれる２以上の遺伝子及びアポトーシス促進遺伝子群から選ばれる１以上の遺伝子からなる指標遺伝子の発現量を測定する工程である項１〜５のいずれかに記載の方法である。
【００２０】
項７：細胞増殖促進遺伝子群がPCNA遺伝子及びCyclinD1遺伝子からなる群である項１〜６のいずれかに記載の方法。
【００２１】
項８：アポトーシス促進遺伝子群が、Bax遺伝子からなる群である項１〜７のいずれかに記載の方法。
【００２２】
好ましい態様の例は、工程（ａ）が、検体の非腫瘍部から採取した被検組織における細胞増殖促進遺伝子群及びアポトーシス促進遺伝子群から選ばれる２以上の指標遺伝子の発現量を測定する工程であり、細胞増殖促進遺伝子群がPCNA遺伝子及びCyclinD1遺伝子からなる群であり、アポトーシス促進遺伝子群がBax遺伝子からなる群である項１〜７のいずれかに記載の方法である。換言すると、工程（ａ）が、検体の非腫瘍部から採取した被検組織におけるPCNA遺伝子、CyclinD1遺伝子及びBax遺伝子からなる群から選ばれる２以上の指標遺伝子の発現量を測定する工程である項１〜７のいずれかに記載の方法である。
【００２３】
以下、本発明について、更に詳細に説明する。
【００２４】
尚、本明細書において、腫瘍とは、癌及び前癌病変である腺腫等の新生物を指す。
【００２５】
１．対象
本発明の腫瘍発生リスクの解析方法は、検体の非腫瘍部から採取した被検組織を用いて行われる。
【００２６】
非腫瘍部とは、腫瘍でない部分、すなわち、癌又は腺腫でない部分をいう。
【００２７】
非腫瘍部は、好ましくは、肉眼的に正常に見える組織である。
【００２８】
被検組織は、遺伝子の発現量が測定し得るものであれば、その種類は特に限定されず、発癌母地となるすべての細胞や組織が含まれる。具体的には、粘膜細胞が挙げられる。
【００２９】
被検組織の種類は、解析対象となる腫瘍、癌や腺腫の種類に応じて適宜設定することができる。
【００３０】
例えば、大腸における腫瘍の発生リスクの解析方法とする場合には、被検組織は、正常大腸粘膜から採取した細胞とすることができる。
【００３１】
被検組織の採取は、生検として用いられている公知の方法に従って、適宜行うことができる。
【００３２】
２．指標遺伝子
本発明において、指標に用いる遺伝子は、細胞増殖、アポトーシス及び／又は細胞分化との関連が考えられる遺伝子である。
【００３３】
換言すると、本発明において、指標遺伝子とは、細胞増殖促進遺伝子群、細胞増殖抑制遺伝子群、アポトーシス促進遺伝子群、アポトーシス抑制遺伝子群、細胞分化促進遺伝子群、及び／又は細胞分化抑制遺伝子群に属する遺伝子である。
【００３４】
尚、本明細書において、群とは、１又は複数の遺伝子の集まりの単位を意味する。
【００３５】
２−１．細胞増殖促進／抑制遺伝子群
細胞増殖促進遺伝子群には、PCNA遺伝子、CyclinD1遺伝子、cdk2、ファルネシル. トランスフェラーゼ（farnesyl transferase）遺伝子、Ki67遺伝子、及びEGFレセプター遺伝子等が含まれる。
【００３６】
細胞増殖促進遺伝子群は、細胞増殖を促進させる機能を有する細胞増殖促進遺伝子から適宜選択して設定される群である。
【００３７】
例えば、CyclinD1遺伝子は、細胞周期の制御に関連し増殖シグナルにより発現が誘導される遺伝子である。また、PCNA遺伝子は、増殖細胞の核に見られる抗原をコードする遺伝子として発見され、DNAの複製や細胞周期の進行に関与する遺伝子である。
【００３８】
好ましい実施態様の一つにおいて、細胞増殖促進遺伝子群は、PCNA遺伝子及びCyclinD1遺伝子からなる群である。
【００３９】
また、細胞増殖抑制遺伝子群には、TGFβ遺伝子、p21遺伝子、及びINK４遺伝子等が含まれる。細胞増殖抑制遺伝子群は、細胞増殖を抑制させる機能を有する細胞増殖抑制遺伝子から適宜選択して設定される群である。
【００４０】
２−２．アポトーシス促進／抑制遺伝子群
アポトーシス促進遺伝子群には、Bax遺伝子、カスパーゼ遺伝子及びFas遺伝子等が含
まれる。
【００４１】
アポトーシス促進遺伝子群は、アポトーシスを促進させる機能を有するアポトーシス促進遺伝子から適宜選択して設定される群である。例えば、Bax遺伝子はアポトーシスを促進するとともに、Bcl-2のアポトーシス抑制活性を阻害する遺伝子である。
【００４２】
また、アポトーシス抑制遺伝子群には、Bcl-2遺伝子、IAP遺伝子、survivin遺伝子等が含まれる。
【００４３】
アポトーシス抑制遺伝子群は、アポトーシスを抑制させる機能を有するアポトーシス抑制遺伝子から適宜選択して設定される群である。例えば、Bcl-2遺伝子は、アポトーシス抑制活性を有する遺伝子である。
【００４４】
２−３．細胞分化促進／抑制遺伝子群
細胞分化促進遺伝子群には、ムチン遺伝子、Cdx-1遺伝子、intestinal alkaline phosphatase遺伝子、CD10遺伝子等が含まれる。
【００４５】
細胞分化促進遺伝子群は、細胞分化を促進させる機能を有する細胞分化促進遺伝子から適宜選択して設定される群である。
【００４６】
また、細胞分化抑制遺伝子群には、Cdx-2遺伝子等が含まれる。
【００４７】
細胞分化抑制遺伝子群は、細胞分化を抑制させる機能を有する細胞分化抑制遺伝子から適宜選択して設定される群である。
【００４８】
３．ハウスキーピング遺伝子
ハウスキーピング遺伝子とは、細胞の一般的な機能に必要なタンパク質をコードし、どの細胞でも一定量が常に構成的に発現される遺伝子を意味する。
【００４９】
ハウスキーピング遺伝子の種類は適宜設定し得るが、例えば、GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、β-アクチン、β２-マイクログロブリン、HPRT 1（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1）などが挙げられる。
【００５０】
４．遺伝子の発現量の測定方法
指標遺伝子及びハウスキーピング遺伝子 の発現量 の測定のための方法、手法等も何等限定なく、リアルタイムPCR法（RT−PCR）を初めとして、公知の各種方法をいずれも採用することができる。
【００５１】
より具体的には、遺伝子の発現量の測定は、被検組織における遺伝子の転写物を検出する方法、同翻訳物を検出する方法等により行うことができる。
【００５２】
転写物を検出する方法は、遺伝子の転写物であるmRNAを検出することにより同遺伝子 の発現量 を測定するものであり、例えば、RT−PCRやノーザンブロット解析、RT-LAMP法、in situハイブリダイゼーション法、その他の各種方法を用いることができる。
【００５３】
翻訳物を検出する方法は、遺伝子 の翻訳物であるタンパク質を検出することにより同遺伝子 の発現量 を測定するものであり、例えば、タンパク質に対する特異抗体を採用するウェスタンブロット解析、免疫組織化学染色等の免疫学的測定法等により行い得る。
【００５４】
５．腫瘍発生指標
腫瘍発生指標は、指標遺伝子の発現量の測定値を、ハウスキーピング遺伝子の発現量の測定値で補正することにより得られる。
【００５５】
例えば、遺伝子の発現量をPCRで測定する場合、各遺伝子の腫瘍発生指標は、PCRサイクル数threshold cycle (Ct)を用いて、ハウスキーピング遺伝子のCtから、指標遺伝子のCtを差し引き、△Ctとして、表すことができる。
【００５６】
換言すると、△Ctは、下記式により表すことができる：
△Ct＝ハウスキーピング遺伝子のCt−指標遺伝子のCt
各指標遺伝子に関して得られる腫瘍発生指標は、腫瘍発生の有無に関連して予め設定された基準値と比較することにより、腫瘍発生リスクを評価するための適切な因子として用い得る。
【００５７】
６．評価
６−１．基準値の算出方法
本発明で用いる基準値は、腫瘍発生の有無と、遺伝子の発現量を因子として、適宜設定し得る。
【００５８】
例えば、好ましい態様の一つにおいて、基準値は、指標遺伝子の発現量の高低を危険因子とし、また、腫瘍の発生の有無を結果（エンドポイント）として、それらの関係を調べることにより、算出することができる。
【００５９】
具体的に、好ましい態様の一つにおいては、指標遺伝子の発現量が多い場合を危険因子（＋）発現量が少ない場合を危険因子（−）とし、腫瘍発生有を結果（＋）腫瘍発生無を結果（−）として、発現量の感度と特異度の和が最も大きくなる値を、該指標遺伝子に関する基準値とすることが挙げられる。
【００６０】
ここで、感度とは、発現量により腫瘍発生高値を示す因子が、腫瘍発生ありを正しく判定する割合を意味する。
【００６１】
特異度とは、発現量により腫瘍発生低値を示す因子が、腫瘍発生なしを正しく判定する割合を意味する。
【００６２】
このようにして求められる場合の基準値は、ハウスキーピング遺伝子の種類によって適宜設定し得る。
【００６３】
また好ましい態様の一つにおいて、基準値は、腫瘍発生程度により数段階に分けて設定することができる。
【００６４】
６−２．腫瘍発生指標と基準値の比較、及び各指標遺伝子についての腫瘍発生に関する評価
上記で求めた腫瘍発生指標と、基準値とを比較することにより、各指標遺伝子に関する腫瘍発生との関係を評価することができる。
【００６５】
比較方法及び評価方法は、基準値の設定方法等に応じて適宜設定し得る。
【００６６】
具体的には、以下の態様が考えられる。
【００６７】
（態様１）
指標遺伝子の発現量が多い場合を危険因子（＋）少ない場合を危険因子（−）とし、腫瘍発生有を結果（＋）発生無を結果（−）として、発現量の感度と特異度の和が最も大きくなる値を各指標遺伝子に関する基準値として算出する。
【００６８】
次いで、得られる基準値と前述の方法で求められる腫瘍発生指標とを、指標遺伝子ごとに、比較する。
【００６９】
比較に際し、指標遺伝子が細胞増殖促進遺伝子、細胞分化抑制遺伝子、又はアポトーシス抑制遺伝子である場合には、腫瘍発生指標が基準値以上の場合を発生リスク上昇因子、基準値未満の場合を発生リスク低下因子と評価する。
【００７０】
また、指標遺伝子が細胞増殖抑制遺伝子、細胞分化促進遺伝子、又はアポトーシス促進遺伝子の場合、腫瘍発生指標が基準値未満の場合を発生リスク上昇因子、基準値以上の場合を発生リスク低下因子と評価する。
【００７１】
より具体的に、例えば、CyclinD1遺伝子については、基準値が−2.51となる場合、△Ctが−2.51未満であれば発生リスク低下因子、−2.51以上であれば発生リスク上昇因子と評価する。
【００７２】
また、例えば、PCNA遺伝子について、基準値が−1.27となる場合、△Ctが−1.27未満であれば発生リスク低下因子、−1.27以上であれば発生リスク上昇因子と評価する。
【００７３】
Bax遺伝子については、基準値が−2.30である場合、△Ctが−2.30未満であれば発生リスク上昇因子、−2.30以上であれば発生リスク低下因子と評価する。
【００７４】
各指標遺伝子について得られる発生リスクの上昇・低下に関する評価を２以上組み合わせて、癌の発生リスクを解析することができる。例えば、上昇因子が多く、低下因子が少ないほど腫瘍発生リスクが高い傾向にあると解析することができる。反対に低下因子が少なく、上昇因子が多いほど、腫瘍発生リスクが低い傾向にあると解析することができる。
【００７５】
（態様２）
指標遺伝子の発現量の程度と腫瘍発生程度の関係より複数の群に分け、最も低発現である場合を１とし、発現量が増加する群になるにつれ、２、３、４と順次番号を付ける。
【００７６】
比較に際し、指標遺伝子が細胞増殖促進遺伝子、細胞分化抑制遺伝子、又はアポトーシス抑制遺伝子である場合には、付した番号を加算、指標遺伝子が細胞増殖抑制遺伝子、細胞分化促進遺伝子、アポトーシス促進遺伝子の場合には、付した番号を引算してスコアとする。このスコアを用いて癌の発生リスクを解析することができる。例えば、スコアが高いほど、腫瘍発生リスクが高い傾向にあると解析することができる。反対にスコアが低いほど、腫瘍発生リスクが低い傾向にあると解析することができる。
【００７７】
７．２以上の評価の組み合わせ
本発明においては、上記の要領で得られる各指標遺伝子の評価を２以上組み合わせて、腫瘍の発生リスクを解析する。
【００７８】
例えば、指標遺伝子の評価を上昇因子と低下因子の２群に分けて、それらを組み合わせて解析を行う。また、例えば、指標遺伝子の評価を点数により評価した場合には、それらの点数を組み合わせてスコア化し、得られるスコアで、発生リスクの程度を解析する。
【００７９】
２以上の評価を組み合わせることにより、腫瘍の発生リスクに対する解析の精度が顕著に高くなる。
【００８０】
組み合わせは、同じ群から選ばれる２以上の指標遺伝子に関する評価の組み合わせであってもよく、一群から選ばれる１以上の指標遺伝子と他の一群から選ばれる１以上の指標遺伝子の評価の組み合わせであってもよい。
【００８１】
具体的に、細胞増殖促進遺伝子群から選ばれる２以上の指標遺伝子による評価の組み合わせであってもよく、細胞増殖促進遺伝子群から選ばれる１以上の指標遺伝子とアポトーシス促進遺伝子群から選ばれる１以上の指標遺伝子による評価の組み合わせであってもよい。
【００８２】
より具体的には、CyclinD1遺伝子による評価とPCNA遺伝子の評価の組み合わせであってもよく、PCNA遺伝子による評価とBax遺伝子による評価の組み合わせであってもよい。また、CyclinD1遺伝子、PCNA遺伝子、及びBax遺伝子による評価の組み合わせであってもよい。
【００８３】
特に、該組み合わせは、同じ群から選ばれる２以上の指標遺伝子による評価を含んでいることが好ましい。例えば、細胞増殖促進遺伝子群から選ばれる２以上の遺伝子の評価に、他の群、例えば、アポトーシス促進遺伝子群から選ばれる１以上の遺伝子の評価を組み合わせて、腫瘍の発生リスク評価を行うことが好ましい。
【００８４】
同じ群に属する遺伝子の評価を２以上含む組み合わせによる解析を行うことによって、腫瘍発生リスクの解析精度を顕著に高めることができる。
【００８５】
指標遺伝子の組み合わせによる、腫瘍の発生リスクの解析は、例えば、以下のように行うことができる。
【００８６】
（解析例１）
増殖↓・アポトーシス↑・・効果的な予防処置をした状態
増殖↓・アポトーシス↓・・粘膜が落ち着いている状態
増殖↑・アポトーシス↑・・粘膜増殖亢進状態（炎症など）
増殖↑・アポトーシス↓・・最も発癌の危険性が高い状態
【００８７】
また、同じ群から選ばれる２以上の指標遺伝子の評価の組み合わせを含む、腫瘍の発生リスクの解析は、例えば、以下のように行うことができる。
【００８８】
（解析例２）
増殖↓・増殖↓・アポトーシス↑・・効果的な予防処置をした状態
増殖↑・増殖↓・アポトーシス↑・・（中間的な状態）
増殖↓・増殖↑・アポトーシス↑・・（中間的な状態）
増殖↓・増殖↓・アポトーシス↓・・細胞動態が落ち着いている状態
増殖↑・増殖↓・アポトーシス↓・・（中間的な状態）
増殖↓・増殖↑・アポトーシス↓・・（中間的な状態）
増殖↑・増殖↑・アポトーシス↑・・粘膜細胞増殖亢進状態
増殖↑・増殖↑・アポトーシス↓・・最も発癌の危険が高い状態
【００８９】
尚、解析例１、２において、増殖↓は、細胞増殖促進遺伝子の腫瘍発生指標が基準値未満の場合（発生リスク低下因子）であることを示す。増殖↑は、細胞増殖促進遺伝子の腫瘍発生指標が基準値以上の場合（発生リスク上昇因子）であることを示す。
【００９０】
また、アポトーシス↑は、アポトーシス促進遺伝子の腫瘍発生指標が基準値以上の場合（発生リスク低下因子）であることを示す。アポトーシス↓は、アポトーシス促進遺伝子の腫瘍発生指標が基準値未満の場合（発生リスク上昇因子）であることを示す。
【００９１】
このように、遺伝子の発現量に基づく評価を組み合わせることにより、高い精度で腫瘍発生リスクの解析を行うことが可能となる。
【００９２】
本発明の解析方法においては、本発明の効果を奏する範囲内であれば、上記指標遺伝子以外の他の遺伝子に関する評価を適宜加えて、腫瘍発生リスクの解析を行うこともできる。更に、本発明の効果を奏する範囲内であれば、環境因子や、対象者の年齢、性別又は病歴等の他の要因を含めて、解析を行うこともできる。
【００９３】
８．腫瘍発生リスク解析並びにその利用
本発明の方法は、腫瘍又は癌の早期発見のための適切な検査間隔、検査方法の設定に利用することが可能である。また解析結果に基づき、癌予防のための指導を行ったり、早い段階で対策や治療方針を設定することができる。
【００９４】
例えば、本発明により得られる腫瘍の発生リスクの解析結果に応じて、発生リスクの高い人では検査間隔を短く、発生リスクの低い人では検査間隔を長くして、対象者に適した検査間隔を設定することができる。更に、発生リスクが高い場合には、検査間隔を短くするだけではなく、生活習慣変容や発癌予防剤の内服などにより積極的な発癌予防を行うことができる。
【００９５】
また、発生リスクが低い場合には、癌に対する不安を軽減させることができ、対象者への有用な情報の提供手段としても利用できる。
【００９６】
また、発癌予防は、発生リスクの高い人に行うことが、効率的にも、倫理的にも望ましいが、適切な対象者に効率的な予防を実践することが可能になるため、対象者の設定にも利用可能である。
【００９７】
更に、本発明の方法を、効率的な発癌予防法の開発や、発癌予防の実践に利用することも可能である。例えば、生活習慣変容や発癌予防物質の内服などにより発癌の発生リスクが下がったか否かの確認に、本発明の方法を利用することもできる。
【００９８】
本発明の腫瘍発生リスクの解析方法は、大腸癌だけでなく、食道癌、胃癌、肝癌、膵癌、前立腺癌、肺癌、喉頭咽頭癌、乳癌などの固形癌で応用可能である。また、白血病などの血液腫瘍にも適用し得る。
具体的には、大腸癌、胃癌、肝癌などの細胞採取が容易な臓器での発生リスクの解析方法として好適に利用し得る。
【００９９】
特に、本発明の解析方法は、大腸癌の発生リスクの解析方法として、好適に利用し得る。
【発明の効果】
【０１００】
本発明により、腫瘍の発生リスク、特に大腸腫瘍の発生リスクを、高い精度で適切に評価し得る方法が提供される。
【０１０１】
本発明は、２つ以上の指標を組み合わせることにより、腫瘍の発生リスクを高い精度で解析することを可能にしている。
【０１０２】
特に、本発明においては、同様の機能を示す指標、例えば同じ細胞増殖促進に関する指標であっても、それらを組み合わせることにより、腫瘍発生リスクの解析精度が、顕著に高められることが明らかとなった。
【０１０３】
更に、本発明においては、指標を評価付けして組み合わせることによって、より解析精度が高められることも明らかとなった。
【０１０４】
本発明により、腫瘍発生リスクの適切な把握が可能となることで、従来、頻繁に行うことを要していた早期癌発見のための検査を、適切な間隔で、適切な対象者に実施することが可能となる。具体的に、発生リスクの高い人では検査の間隔を短く、リスクの低い人では間隔を長くすることにより、効率のよい検査の実施が可能となる。
【０１０５】
これにより、検査対象者の苦痛や危険を軽減することができ、検査のための多大なコストや時間を低減することもできる。
【０１０６】
更に、リスクの程度が分かることにより、リスクが低い場合には、癌の心配を軽減させることができる。また、リスクが高い場合には、検査間隔を短くするだけではなく、生活習慣変容や発癌予防剤の内服などにより積極的な発癌予防を行うことも可能となる。
【０１０７】
また、発癌予防は、発生リスクの高い人に行うことが、効率的にも、倫理的にも望ましいが、発生リスクが把握されることで、適当な対象者に効率的な発癌予防を実践することが可能になる。
【０１０８】
更に、従来の方法では、検査に詳細な検討を要していたが、本発明によれば、精度の高い解析結果を、容易に得ることが可能となる。
【０１０９】
さらに、本発明を用いれば、生活習慣変容や発癌予防物質の内服などによって発癌の発生リスクが下がったか否かを確認することもでき、発癌予防方法の効率的な開発や、発癌予防や治療の効果的な実践に役立てることもできる。
【０１１０】
このように本発明は、腫瘍発生リスクを高い精度で適切に把握し得る手段を提供するものであり、癌の予防又は早期治療、並びに罹患率の低下等に大きく貢献し得るものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１１】
以下、本発明をより具体的に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されることはない。
【実施例１】
【０１１２】
１．対象
大阪府立成人病センターにて1993年から1997年までに、内視鏡的に大腸腫瘍の摘出を
受け、大腸癌予防臨床試験に参加した患者の一部を用いて行った。
【０１１３】
臨床試験参加者は、臨床試験参加時40歳から69歳、全大腸が観察されていること、組
織学的に診断された大腸腺腫（腺腫・早期がん）を2個以上持ち、それらをすべて切除されていること、腸管切除の既往歴がないこと（虫垂切除は除く）、現在がんを持っていないこと、これらすべての条件を満たす患者であった。
【０１１４】
更にこれらの臨床試験に参加した者の内、４年目の内視鏡検査の時に、S状結腸粘膜の
採取についての研究の説明を受けて同意を得た者を今回の検討の対象とした。
【０１１５】
対象者は、男性170名、女性42人、計212名（平均年齢55.0±0.4歳；40-66歳）であ
った。
【０１１６】
２．材料
（ａ）被検組織
試験終了時である4年目の大腸内視鏡術施行時に採取された正常大腸粘膜細胞を材料とした。生検部位はS状結腸（肛門縁より20cm口側）で、内視鏡的に病変を認めない部位より採取し、万一、腫瘍性病変があった場合は、腫瘍性病変より5cm以上離れた部位で生検を行った。大腸粘膜は採取されて、直ちに液体窒素にて凍結したのち−80℃で保存した。
【０１１７】
（ｂ）指標遺伝子
CyclinD1遺伝子、PCNA(proliferating cell nuclear antigen)遺伝子、及びBax遺伝子を測定対象とした。
【０１１８】
（ｃ）ハウスキーピング遺伝子
ハウスキーピング遺伝子はglyceralde-hydo-3-phosphate dehydregenase (GAPDH)遺伝子を用いた。
【０１１９】
３．方法
各遺伝子の発現量の測定は、mRNA発現のリアルタイムPCR法にて行った。上記方法にて
採取した結腸粘膜細胞からRNAを抽出し、逆転写反応によりcDNA (complementary deoxyribonucleic acid)を合成した後、リアルタイムPCR法によりmRNAの定量を行った。
【０１２０】
（ａ）RNA抽出とｃDNA合成
サンプルに350μlのTRIzol Reagent (GIBCO BRL,Rockville,U.S.A)を加え、組織をすりつぶし100μl のクロロホルムを加えた後、10000rpm 4℃で5分遠心することによりRNAを抽出した。全RNA量を1.5μgになるように調製した後80%エタノールでRNAを洗浄して乾燥させたものに、12.5μlのDEPC(diethylpyrocarbonate)処理水で溶解し、95℃で2分間加熱した後に氷冷してRNAの高次構造を壊した後、10.5μlの逆転写酵素入りの混合液を添加し、42℃で60分インキュベートした。この混合液は、4.5μlの5×buffer（0.1M DTTを含む）、１μlのoligo dT(Amarham,Hokkaidou,Japan)、３μlの2.5M dNTP 混合液(TAKARA,Shiga,Japan)、１μlのRnasin (Promega,WI,USA)、１μlのAMV Reverse Transcriptase (Promega,WI ,USA) を含む。
【０１２１】
cDNAを合成した後、65℃10分間インキュベーションして酵素を完全に失活させた。
【０１２２】
（ｂ）細胞培養
大腸がん細胞株であるHCT-116は、DMEM(Nihonseiyaku,Tokyo,Japan)＋10％FBS(fetal bovine serum,Hyclone,Logan,U.S.A)+ペニシリン-ストレプトマイシン（GIBCO BRL,Rockville,U.S.A)を、25cm２フラスコ(IWAKI,Funabasi,Japan)で10％CO２培養した。このHCT-116細胞より、上記と同様の方法でRNAを抽出しcDNAを合成した。このHCT-116より得られたcDNAを、リアルタイムPCRのスタンダードとした。
【０１２３】
（ｃ）リアルタイムPCR(定量PCR)法
PCR反応液は、2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen,Tokyo,Japan)を12.5μl、各種プライマー各0.25μlずつ、サンプルcDNAを1.5μl、Rnase除去水を10.5μl混和し、全量25μlとした。リアルタイムPCRは、ABI 5700 Sequence Detection System を用いて、以下のプロトコールでPCRを行った；
50℃2分、95℃15分、その後50サイクルを、95℃15秒、60℃45秒、72℃15秒。
【０１２４】
内部コントロールとしてglyceralde-hydo-3-phosphate dehydregenase (GAPDH)を用いた。尚、標準曲線は、GAPDHと測定したい遺伝子のプレートごとにHCT-116より抽出したcDNAを希釈したものを測定し、相関係数をみて確認した。希釈系列は、100ng、33ng、10ng、3.3ng、1ngとした。
【０１２５】
リアルタイムPCR法の評価方法は、PCR反応に伴い増幅産物が一定量に達すると、SYBR Greenの蛍光が検出される。この蛍光の立ちあがった時のPCRサイクル数をthreshold cycle (Ct)といい、この数値で評価を行った。
【０１２６】
以下の式で、各指標遺伝子について、△Cｔを計算した：
△Ct＝(GAPDHのCt値)−(指標遺伝子のCt値)
得られた△Ct値を、各指標遺伝子の腫瘍発生指標とした。
【０１２７】
（ｄ）測定系確立
指標遺伝子の測定系確立のため、NCBIから、各指標遺伝子のｍRNAの塩基配列を検索し、その塩基配列をもとにプライマーを設計した。このプライマーとHCT-116より得られたcDNAを用いてPCRを行い、特異バンドが検出されることを確認し、その後HCT-116 のcDNAを用いて希釈試験を行い、リアルタイムPCRで濃度依存的に蛍光を検出できるかを確認し、実際のサンプルの測定を行った。
【０１２８】
（ｅ）統計解析
データは、StatViewを用いて統計解析を行い、検定方法はMann-WhitneyのU検定を用いて有意差検定を行った。
【０１２９】
４．腫瘍発生指標と基準値の比較による各指標遺伝子に基づく腫瘍発生評価、並びに組み合わせの検討
（ａ）基準値の算出
Cyclin D1遺伝子、PCNA遺伝子、Bax遺伝子の各指標遺伝子について、指標遺伝子の発現量が多い場合を危険因子（＋）少ない場合を危険因子（−）とし、中等度異型以上の腺腫発生の有無をエンドポイントとして、感度、特異度を求め、ROC曲線を作図した。
【０１３０】
各ROC曲線を図１〜３に示す。図１はCyclin D1遺伝子のROC曲線、図２はPCNA遺伝子のROC曲線、図３はBax遺伝子のROC曲線である。
【０１３１】
また、各指標遺伝子について、感度と特異度の和が最も大きくなる値を、該指標遺伝子に関する基準値として求めた。
【０１３２】
基準値は、CyclinD1遺伝子について−2.51、PCNA遺伝子について−1.27、Bax遺伝子について−2.30となった。
【０１３３】
また、Cyclin D1遺伝子の発現量測定値にPCNA遺伝子の発現量測定値を加え、Baxの発現量測定値を引いた組み合わせ値についてもROC曲線を作図した。組み合わせ値によるROC曲線を図４に示す。
【０１３４】
また、組み合わせ値の場合についても、感度と特異度の和が最も大きくなる値を、基準値として求めた。基準値は、−0.26となった。
【０１３５】
図１〜４のROC曲線の比較により示されるように、組み合わせによる感度、特異度は、指標遺伝子を単独で検討した場合に比して、明らかに改善していた。
【０１３６】
（ｂ）指標遺伝子の相関
各指標遺伝子の△Ctの分布により、相関を調べた結果を図５〜図７に示す。図５は、
CyclinD1遺伝子とPCNA遺伝子の相関を調べた図面を示す。図６は、PCNA遺伝子とBax遺伝子との相関を調べた図面を示す。図７は、CyclinD1遺伝子とBax遺伝子との相関を調べた図面を示す。
【０１３７】
図５、図６及び図７の結果において、指標遺伝子の相関は認められなかった。
【０１３８】
特に図５に示されるように、同じ細胞増殖促進遺伝子であるCyclinD1遺伝子とPCNA遺伝子においても相関が認められないことが明らかとなった。
【０１３９】
（ｃ）腫瘍発生指標と基準値の比較による検討
各指標遺伝子について、上記３で得られる腫瘍発生指標と上記４（ａ）で得られる基準値を比較し、腫瘍発生との関連を調べた。また各指標遺伝子の△Ctを組み合わせた場合についても、上記４（ａ）で得られる基準値と比較し、同様の検討を行った。結果を表１に示す。
【０１４０】
尚、表１におけるRRは相対危険度（relative ratio）を示す。
【０１４１】
【表１】
2008295301.tif 000003
【０１４２】
表１に示されるように、指標を組み合わせて解析を行うことにより、RRが改善した。
（ｄ）２群の組み合わせによる検討
各指標遺伝子について、発生リスク上昇又は低下による評価を行い、それらを組み合わせて腫瘍発生との関連を調べた。結果を表２及び図８に示す。
【０１４３】
表２のCYDの欄において、低は、Cyclin D1遺伝子の腫瘍発生指標が基準値未満の場合の評価（発生リスク低下因子）を、高は、Cyclin D1遺伝子の腫瘍発生指標が基準値以上の場合の評価（発生リスク上昇因子）を示す。
【０１４４】
PCNAの欄において、低は、PCNA遺伝子の腫瘍発生指標が基準値未満の場合の評価（発生リスク低下因子）を、高は、PCNA遺伝子の腫瘍発生指標が基準値以上の場合の評価（発生リスク上昇因子）を示す。
【０１４５】
Baxの欄において、高は、Bax遺伝子の腫瘍発生指標が基準値以上の場合の評価（発生リスク低下因子）を、低は、Bax遺伝子の腫瘍発生指標が基準値未満の場合の評価（発生リスク上昇因子）を示す。
【０１４６】
また、RRは相対危険度（relative ratio）を示す。
【０１４７】
【表２】
2008295301.tif 000004
【０１４８】
表２及び図８に示されるように、細胞増殖促進遺伝子とアポトーシス促進遺伝子を指標遺伝子として全ての指標遺伝子の発現量が低く、粘膜の細胞動態が落ち着いている状況を1としたとき、アポトーシス促進遺伝子が亢進するとRRが0.47に減少し、細胞増殖促進遺伝子が亢進するとRRが3.21に増加していることがわかった。
【０１４９】
結果
１)上記の検討結果から、２つ以上の指標を組み合わせることで、解析精度が顕著に向上することがわかった。特に、同じ群に属する２つの指標を含む解析により、高い精度が得られることがわかった。細胞増殖を示す２つの指標にはほとんど相関はなく、それらに影響を与える因子も別であると考えられる。
【０１５０】
２)表２に示されるように、全ての指標遺伝子の発現量が低く、細胞動態が落ち着いている状況を１としたとき、アポトーシス促進遺伝子が亢進すると腫瘍発生リスクが0.47に減少し、細胞増殖促進遺伝子が亢進すると腫瘍発生リスクが3.21に増加することがわかった。これだけ大きな差を見出す検査法は、従来になく、本発明の解析方法の有用性が確認できた。
【０１５１】
３)表１のように、測定値を単純に加算、引算して組み合わせた値を用いた解析により、RRは確かに改善するが、表２のように、各指標を理論的に群分けして組み合わせた解析により、RRが更に改善することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】図１は、Cyclin D1遺伝子発現量の測定値に基づくROC曲線を示す図面である。
【図２】図２は、PCNA遺伝子発現量の測定値に基づくROC曲線を示す図面である。
【図３】図３は、Bax遺伝子発現量の測定値に基づくROC曲線である。
【図４】図４は、Cyclin D1遺伝子、PCNA遺伝子及びBax遺伝子の発現量の測定値を組み合わせた値に基づくROC曲線である。
【図５】図５は、CyclinD1遺伝子とPCNA遺伝子の相関を調べた図面である。
【図６】図６は、PCNA遺伝子とBax遺伝子との相関を調べた図面である。
【図７】図７は、CyclinD1遺伝子とBax遺伝子との相関を調べた図面である。
【図８】図８は、CyclinD1遺伝子、PCNA遺伝子及びBax遺伝子の評価を組み合わせ、腫瘍発生との関連を調べた結果を示す図面である。
【図１】
2008295301.tif 000005
【図２】
2008295301.tif 000006
【図３】
2008295301.tif 000007
【図４】
2008295301.tif 000008
【図５】
2008295301.tif 000009
【図６】
2008295301.tif 000010
【図７】
2008295301.tif 000011
【図８】
2008295301.tif 000012