(57)【要約】      （修正有）【課題】神経毒性を検出するための方法およびキットを提供する。【解決手段】(a)被験物質を神経由来細胞に曝露する工程と、(b)前記神経由来細胞における特定の配列であらわされる遺伝子の発現レベルを測定する工程と、(c)前記工程で測定された遺伝子の発現レベルと、前記被験物質に曝露していない前記神経由来細胞における同一タイプの遺伝子の発現レベルとを比較する工程とを含む、被験物質の毒性を検出するための方法。特定の塩基配列、並びにこれらの相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対して特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続したヌクレオチドからなるプローブを含む、神経毒性を検出するためのキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)被験物質を神経由来細胞に曝露する工程と、
(b)前記神経由来細胞における配列番号１であらわされる遺伝子および配列番号２であらわされる遺伝子の少なくとも一つの発現レベルを測定する工程と、
(c)前記工程で測定された遺伝子の発現レベルと、前記被験物質に曝露していない前記神経由来細胞における同一タイプの遺伝子の発現レベルとを比較する工程と
を含む、被験物質の毒性を検出するための方法。
【請求項２】
前記発現レベルが、mRNAの発現量である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号1であらわされる遺伝子のmRNAの発現量が、配列番号1に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対して特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続したヌクレオチドからなるプローブを使用して測定され、
配列番号2であらわされる遺伝子のmRNAの発現量が、配列番号2に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対して特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続したヌクレオチドからなるプローブを使用して測定される
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号1であらわされる遺伝子のmRNAの発現量が、配列番号1に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に相補的であり、かつ配列番号1であらわされるＤＮＡを特異的に増幅可能な10〜50の連続したヌクレオチドからなるプライマーを使用して測定され、
配列番号2であらわされる遺伝子のmRNAの発現量が、配列番号2に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に相補的であり、かつ配列番号2であらわされるＤＮＡを特異的に増幅可能な10〜50の連続したヌクレオチドからなるプライマーを使用して測定される
請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記神経由来細胞が神経芽細胞腫である、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記神経芽細胞腫がマウス由来のNeuro2a細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記神経芽細胞腫が、アリルハイドロカーボン受容体の遺伝子が発現可能な様式で導入されたマウス由来のNeuro2a細胞（受託番号 FERM BP-10341または受託番号 FERM BP-10342）である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
配列番号1に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対して特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続したヌクレオチドからなるプローブ、および
配列番号2に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対して特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続したヌクレオチドからなるプローブ
の少なくとも一つを含む、神経毒性を検出するためのキット。
【請求項９】
配列番号1に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に相補的であり、かつ配列番号1であらわされるＤＮＡを特異的に増幅可能な10〜50の連続したヌクレオチドからなるプライマー、および
配列番号2に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に相補的であり、かつ配列番号2であらわされるＤＮＡを特異的に増幅可能な10〜50の連続したヌクレオチドからなるプライマー
の少なくとも一つを含む、神経毒性を検出するためのキット。
【請求項１０】
神経毒性を検出するためのチップであって、
配列番号1に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対して特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続したヌクレオチドからなるプローブ、および
配列番号2に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対して特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続したヌクレオチドからなるプローブ、
の少なくとも1つが固定されたチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経毒性を検出するための方法、キットおよびチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、注意欠陥多動性疾患(ADHD)あるいは学習障害(LD)のような神経障害が大きな社会問題となっているがその原因のひとつとして、内分泌攪乱物質類の神経毒性が疑われる。内分泌攪乱物質類のその毒性の一部は、アリルハイドロカーボン受容体を介して発現することが知られている。アリルハイドロカーボン受容体は、多環芳香族炭化水素(PAH)が結合する受容体であり、bHLH-familyに属する転写因子である(非特許文献１)。これまでに、内分泌攪乱物質の免疫毒性や生殖毒性の一部がアリルハイドロカーボン受容体を介した経路で発現することが報告されている(非特許文献２)。脳組織においてアリルハイドロカーボン受容体の発現が検出されることから(非特許文献３)、アリルハイドロカーボン受容体が神経毒性に関与すると考えられている。また、神経機能発現、及び発達形成とアリルハイドロカーボン受容体による遺伝子発現との関連性も示唆されている。しかし、神経系におけるアリルハイドロカーボン受容体による転写活性化に基づく特徴的な遺伝子、すなわちマーカー遺伝子は、ほとんど同定されていない。
【非特許文献１】Mark E. Hahn, Comparative Biochemistry and Physiology Part C 121 (1998): 23-53
【非特許文献２】Frank JG et al., Drug Metabolism and Disposition (1998) 26: 1194-1198
【非特許文献３】Petersen SL. et al., J. Comp. Neurol. (2000) 427(3): 428-439
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、迅速かつ簡便に被験物質の神経毒性を検出するための方法、キットおよびチップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、被験物質の神経毒性の有無により発現量が変化する遺伝子を見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００５】
本発明の第1の側面によれば、
(a)被験物質を神経由来細胞に曝露する工程と、
(b)前記神経由来細胞における配列番号１であらわされる遺伝子および配列番号２であらわされる遺伝子の少なくとも一つの発現レベルを測定する工程と、
(c)前記工程で測定された遺伝子の発現レベルと、前記被験物質に曝露していない前記神経由来細胞における同一タイプの遺伝子の発現レベルとを比較する工程と
を含む、被験物質の毒性を検出するための方法が提供される。
【０００６】
本発明の第2の側面によれば、
配列番号1に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対して特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続したヌクレオチドからなるプローブ、および
配列番号2に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対して特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続したヌクレオチドからなるプローブ
の少なくとも一つを含む、神経毒性を検出するためのキットが提供される。
【０００７】
本発明の第3の側面によれば、
配列番号1に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に相補的であり、かつ配列番号1であらわされる遺伝子のmRNAを特異的に増幅可能な10〜50の連続したヌクレオチドからなるプライマー、および
配列番号2に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に相補的であり、かつ配列番号2であらわされる遺伝子のmRNAを特異的に増幅可能な10〜50の連続したヌクレオチドからなるプライマー
の少なくとも一つを含む、神経毒性を検出するためのキットが提供される。
【０００８】
本発明の第4の側面によれば、神経毒性を検出するためのチップであって、
配列番号1に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対して特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続したヌクレオチドからなるプローブ、および
配列番号2に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対して特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続したヌクレオチドからなるプローブ、
の少なくとも1つが固定されたチップが提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、迅速かつ簡便に被験物質の神経毒性を検出するための方法、キットおよびチップが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１．アリルハイドロカーボン受容体を遺伝子導入した細胞の構築
本発明者らは、本発明を完成させるにあたり、まず、未分化な神経芽細胞腫にアリルハイドロカーボン受容体を遺伝子導入した被験物質評価用細胞としての機能をもつN2a-R細胞を構築した（後述の実験例の記載参照）。同細胞は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託された (受託番号:FERM BP-10341、FERM BP-10342)。
【００１１】
同細胞は、ダイオキシンをはじめとする被験物質に曝露することで伸展する突起の頻度が増加し、ドーパミン生合成に関与するTyrosine hydroxylase (下記文献４)や、突起形成や伸展の際に細胞骨格分子の再構築に関わるCell division cycle42(下記文献５)、またシナプス形成に関わるTau(下記文献６)などの発現が増加する。したがって、同細胞を用いてこれらの分子の発現を検出する、または細胞形態を観察することにより、被験物質による未分化な神経細胞の神経機能の発現の有無を判定することが可能である。また、同細胞は、未分化な神経細胞が神経機能を発現する、すなわち分化する際には突起を伸展するという特徴的な形態変化を示す。つまり、突起伸展も神経機能発現の有無の判断において指標の一つである (下記文献７)。すなわち、同細胞を用いることにより、被験物質の神経毒性の有無を判定することが可能である。
【００１２】
［文献４］  Bartolini G et al.,Anticancer Res. (2003) 23(2B): 1495-1499
［文献５］  Alleaume C et al., Exp Cell Res. (2004) 299(2):511-24
［文献６］  Knops, J et al., J. Cell Biol. (1991) 114(24): 725-733
［文献７］  Spiegelman BM et al., Cell. (1979) 16(2):253-263。
【００１３】
２．被験物質によりその発現量が特異的に影響を受ける遺伝子
本発明者らは、マウス神経芽細胞Neuro2aにアリルハイドロカーボン受容体を遺伝子導入して得られたN2a-R細胞(FERM BP-10341, FERM BP-10342)に対して、2,3,7,8-テトラクロロ-ベンゾ-p-ジオキシン(2,3,7,8-tetrachloro-benzo-p-dioxin;以下、TCDDと称する)を作用させた場合と、前記細胞に対してTCDDを作用させなかった場合とについて、それぞれの細胞において発現したRNAをリアルタイム定量PCRにより比較した。その結果、TCDDにより特異的にその発現量が変化した遺伝子を明らかにした。
【００１４】
図１に示すとおり、TCDDなどのダイオキシン類は、細胞内のアリルハイドロカーボン受容体（AhR）に結合して複合体を形成し、遺伝子の特定の配列（すなわち、異物応答エレメントXRE）に結合することにより、下流遺伝子（たとえば、薬物代謝酵素CYP1A1）の発現を活性化することが知られている。図１において、HSPは熱ショックタンパク質（heat shock protein）を示し、Arntは、アリルハイドロカーボン受容体核内トランスロケーター（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator）を示す。
【００１５】
本発明で使用したN2a-R細胞(FERM BP-10341, FERM BP-10342)は、上述のとおり、神経毒性を有する被験物質に感受性のある細胞である。即ち、その細胞の培養系に神経毒性を有する被験物質が存在している条件下では、その被験物質の支配を受けて種々の細胞機能の発現等が制御されるが、該培養系に被験物質が存在していない条件下では該発現が制御されない細胞である。従って、N2a-R細胞に対して神経毒性をもつ被験物質を作用させれば、被験物質の神経毒性のみの作用を細胞に対して付加することが可能である。従って、このような条件による解析により、その発現が被験物質（TCDD）により特異的に影響を受ける遺伝子が明らかにできた。特定されたポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号2に記載の塩基配列、およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列で示されるポリヌクレオチドである。マウス遺伝子のデータベースを利用して、配列番号1は、マウスのEpha8（Eph receptor A8）をコードする遺伝子であり、配列番号2は、マウスのSlc40a1 (solute carrier family 40 (iron-regulated transporter),member 1)であると同定された。
【００１６】
本発明の一つの態様として提供することができる被験物質の神経毒性を検出するためのポリヌクレオチドは、被験物質の神経毒性を検出するためのポリヌクレオチドであって、配列番号1、配列番号2に記載の塩基配列およびその相補配列で示されるポリヌクレオチドである。また、被験物質の神経毒性を検出するためのポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号2に記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する配列からなる核酸を含む。さらにこれらの相同性を有する配列は、配列番号1、配列番号2に記載の塩基配列によってコードされるタンパク質と同様の活性を有することが好ましい。
【００１７】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」の語は、天然に存在する種々のDNAおよびRNA、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルホスフォネート核酸およびS-オリゴ核酸などの人工的に合成された核酸類似体などを指す。また、本明細書で使用される「85%〜100%の相同性を有する」の語は、2つの塩基配列が互いに85%〜100%に相同性であり、残りの0%〜15%の塩基配列は、1つまたは数個の塩基が欠失されるか、および/または1つまたは数個の塩基が置換されるか、および/または1つまたは数個の塩基が付加されるかによって、修飾されていることにより相同性を有していない部分であることを示す。また、各配列中の「N」または「n」はアデニン、チミン、グアニン、またはシトシンの何れかのヌクレオチドを示す。
【００１８】
３．被験物質の神経毒性の検出方法
一つの態様において、被験物質の神経毒性の検出方法は、
(a)被験物質を神経由来細胞に曝露する工程と、
(b)前記神経由来細胞における配列番号１であらわされる遺伝子および配列番号２であらわされる遺伝子の少なくとも一つの発現レベルを測定する工程と、
(c)前記工程で測定された遺伝子の発現レベルと、前記被験物質に曝露していない前記神経由来細胞における同一タイプの遺伝子の発現レベルとを比較する工程と
を含む。
【００１９】
工程(a)において、「被験物質」は、神経毒性を有することが疑われる任意の物質であり得る。「被験物質」の濃度は、たとえば0.01〜100 nMとすることができる。「神経由来細胞」は、図１に示されるように、神経毒性を有する物質（たとえばダイオキシン類）を添加した際に、転写因子として機能する基質依存性レセプター（たとえばAhR）を介して、配列番号１で示される遺伝子および配列番号２で示される遺伝子の発現が増強される任意の細胞であり得る。具体的には、「神経由来細胞」は、アリルハイドロカーボン受容体（AhR）を細胞内で発現している細胞を使用することができる。「神経由来細胞」は、好ましくは神経芽細胞腫であり、より好ましくはマウス由来のNeuro2a細胞であり、更に好ましくはアリルハイドロカーボン受容体の遺伝子が発現可能な様式で導入されたNeuro2a細胞（受託番号 FERM BP-10341または受託番号 FERM BP-10342）である。曝露する期間は、たとえば3〜7 日間とすることができる。
【００２０】
工程(b)において、配列番号１であらわされる遺伝子および配列番号２であらわされる遺伝子の発現レベルは、当該技術分野で公知の手法に従って測定することができる。ここで発現レベルの測定は、ｍＲＮＡ量を測定してもよいし、タンパク質量を測定してもよい。ｍＲＮＡ量は、対象のｍＲＮＡに特異的に結合するプローブを用いて、RNaseプロテクションアッセイまたはノーザンハイブリダイゼーションにより測定してもよいし、対象のｍＲＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いて、公知の核酸増幅方法（たとえばＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、またはＬＡＭＰ法）により測定してもよい。タンパク質量は、対象のタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて測定することができる。
【００２１】
工程(c)において、「被験物質に曝露していない神経由来細胞」は、一般的には、被験物質の有無を除いて、被験物質を曝露した条件と同じ条件下に神経由来細胞を置いたものである。工程(b)で測定された遺伝子の発現レベルと、被験物質に曝露していない神経由来細胞における同一タイプの遺伝子の発現レベルとを比較した結果、前者の発現レベルが後者の発現レベルより高い場合、被験物質が神経毒性を有していると判断することができる。
【００２２】
４．核酸検出用プローブ
上述の配列番号1、2に記載の配列を有するポリヌクレオチドおよびその相補配列、並びにこれらの一部は、被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プローブとして使用することが可能である。このような被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プローブも本発明の範囲内にある。
【００２３】
被験物質の神経毒性を検出するために好ましい核酸検出用プローブは、配列番号1、配列番号2に記載の塩基配列およびその相補配列からなる群より選択される塩基配列に含まれる少なくとも連続した10塩基〜500塩基、15塩基〜300塩基、20塩基〜100塩基よりなる核酸を含む核酸検出用プローブであってよい。さらに、配列番号1、2に記載の塩基配列、並びにこれらの相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対して特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続した配列からなる核酸も、本発明の核酸検出用プローブに含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」は、当業者であれば容易に認識することができると考えられ、たとえば20℃〜65℃の範囲の温度で2×SSC緩衝液、0.1%w/vSDSであり、特に好ましくは高いストリンジェンシーの条件であり、少なくとも65℃の温度で0.1×SSC緩衝液、0.1%w/vSDSである。このような、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるプローブには、たとえば、配列番号1に記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号2に記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列にハイブリダイズすることができるプローブが含まれてもよい。更に、本発明のプローブは、配列番号1、配列番号2に記載の塩基配列、並びにこれらの相補的配列のうちの少なくとも1つが、1つまたは数個の塩基が置換、欠失、および挿入された配列に対してハイブリダイズすることができる核酸であっても構わないが、これらの置換、欠失、挿入された配列は、該置換、欠失、もしくは挿入がなされていない配列の相補鎖に対しても上記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる配列であることを条件とする。
【００２４】
このような核酸検出用プローブは、当業者に既知の方法を使用して、たとえば合成によって、また天然に存在する核酸を利用して組み換えによって作製することができる。
【００２５】
さらに、上記被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プローブの標識は、特に限定されず、例えば、32P に代表される放射性物質のほか、フルオレセインに代表される蛍光物質を用いることができる。
【００２６】
配列番号１であらわされる遺伝子に対するプローブとしては、以下のプローブ１およびプローブ２を挙げることができる。
【００２７】
[プローブ1]
CCATCCTCTCACTCAGAATCTACTACAAGAAGTGTCCCGCCATGGTACGCAACCTGGCGGCCTTCTCGGAGGCGGTAA
CCGGGGCTGACTCGTCCTCGCTGGTAGAGGTTCGAGGCCAGTGTGTGCGACACTCAGAGGAGCGCGACACACCCAAGA
TGTACTGCAGTGCCGAGGGCGAATGGCTGGTGCCCATCGGCAAGTGCGTGTGCAGTGCCGGCTATGAGGAGCGGCGCG
ATGCCTGTATGGCCTGTGAGCTGGGCTTCTACAAGTCAGCCCCCGGGGACCAGCTGTGTGCCCGATGCCCACCCCACA
GCCATTCTGCCACCCCTGCGGCCCAGACCTGCCGTTGTGACCTCAGCTACTACCGTGCGGCCTTGGACCCACCATCGG
CAGCCTGCACCCGGCCACCCTCAGCACCGGTGAACCTGATCTCCAGCGTGAACGGAACTTCTGTGACCCTGGAGTGGG
CCCCTCCTCTGGACCCAGGCGGCCGCAGTGACATCACCTACAAC（配列番号７）
[プローブ2]
AACCAGGCACTCGCTACATGTTCCAGGTCCGGGCCCGCACCTCAGCAGGCTGTGGACGCTTCAGCCAGGCCATGGAGG
TGGAGACCGGGAAACCCAGGCCCCGCTATGACACTCGGACCATCGTCTGGATCTGCCTGACACTCATCACAGGCCTGG
TGGTACTCCTCCTGCTTCTCATCTGCAAGAAGAGGCACTGCGGCTATAGCAAGGCATTCCAGGACTCTGATGAAGAGA
AAATGCATTACCAGAATGGCCAAGCACCCCCGCCTGTCTTCTTGCCCTTGAACCACCCCCCGGGGAAGCTCCCAGAAA
CCCAGTTCTCGGCAGAGCCCCACAACTATGAGGAACCGGGCCGTGCAGGCCGAAGCTTTACCAGAGAGATCGAGGCCT
CCAGGATCCACATTGAGAAGATCATAGGCTCGGGGGAGTCAGGAGAAGTATGCTATGGGAGGCTGCA（配列番号８）。
【００２８】
５．核酸検出用プローブを用いた神経毒性の検出方法
このような核酸検出用プローブを利用した検出方法としては、例えば、RNase プロテクションアッセイあるいは、ノーザンハイブリダイゼーション法が挙げられる。
【００２９】
RNase プロテクションアッセイによる配列番号1、配列番号2に示されるポリヌクレオチド発現量の測定は、被検物質に曝露された細胞より抽出された一定量の粗RNA試料に、検出対象となる配列番号1、配列番号2に示される遺伝子のmRNA又はその一部と特異的にハイブリダイズする過剰量のRNAであるプローブを添加し、更にRNase消化した後の残存RNA量を測定することにより実施することができる。すなわち、該残存RNA量が多いほど、配列番号1、配列番号2に示される遺伝子の発現量が高いと判断できる。
【００３０】
なお、該方法で用いるプローブは、例えば、80%ホルムアミド、40mM Pipes（pH6.4）、400mM NaCl、1mM EDTAからなるハイブリダイゼーション緩衝溶液中45℃、20時間保温してハイブリダイズ可能であり、かつ検出対象となる配列番号1、配列番号2に示される遺伝子のmRNAに特異的な塩基配列に相補的な塩基配列を有しているRNAであれば特に限定されない。また、該プローブの標識も特に限定されず、例えば、32Pに代表される放射性物質のほか、フルオレセインに代表される蛍光物質を用いることができる。
【００３１】
ノーザンハイブリダイゼーション法による配列番号1、配列番号2に示される遺伝子発現量の測定は、被検物質に曝露した細胞より抽出された一定量の粗RNA試料を分子量等による分画後、ナイロンフィルター等に固定し、検出対象となる配列番号1、配列番号2に示される遺伝子のmRNAと過剰量の該遺伝子検出用プローブを接触させ、固定化されたRNAにハイブリダイズしたプローブより得られるシグナル強度を測定することにより実施することができる。すなわち、該シグナル強度が強いほど、配列番号1、配列番号2に示される遺伝子の発現量が高いと判断できる。なお、該方法においてハイブリダイズするとは、例えば、50%ホルムアミド、0.65M NaCl、0.1Mナトリウム−Pipes、5×デンハート液、0.1%SDS、5mM  EDTAからなるハイブリダイゼーション緩衝液中42℃、20時間保温してハイブリダイズ可能であることを指す。検出用プローブは、検出対象となる配列番号1、配列番号2に示される遺伝子のmRNAに特異的な塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸であることが好ましいが、シグナル位置により検出対象mRNAを特定することができれば、特に限定されない。該プローブの標識も特に限定されず、例えば、32Pに代表される放射性物質のほか、フルオレセインに代表される蛍光物質を用いるもとができる。
【００３２】
また、被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プローブは、上述の核酸に加えて更なる配列を含んでいてもよい。たとえば、プローブを基体に固定するために、基体とプローブの間にリンカー配列を有する核酸として提供されてもよい。
【００３３】
６．プローブ固定化チップ
また、核酸検出用プローブは、基板上に固定化されてプローブ固定化チップとして提供されてもよい。また、そのようなプローブ固定化チップも本発明の範囲内に含まれる。
【００３４】
本発明の更なる側面に従うと、プローブ固定化チップは、上述した核酸検出用プローブを、以下のような基板に固定化することにより製作することが可能である。本発明に従って使用される基板の例は、多孔質体、マイクロタイタープレート、ビーズ、球状物質、粒子状物質、磁性体および磁気ビーズ等の基体などである。また、核酸検出用プローブを固定化すべき基体の材質、大きさおよび形状などは特に限定されるものではない。
【００３５】
前記プローブ固定化チップを用いた試料物質中の核酸の配列の検出は、例えば、被験物質を曝露した細胞から核酸成分の抽出を行った後、前記試料核酸とプローブ固定化チップとを接触させ、プローブ固定化チップ上のプローブと試料核酸とのハイブリダイゼーション反応を検知すればよい。
【００３６】
前記プローブ固定化チップ上のプローブと試料中の核酸成分とのハイブリダイゼーション反応を検知するには、主に、（１）標識物質を用いる方法、（２）電気化学的方法の２種類が考えられる。
【００３７】
（１）の標識物質を用いる方法の場合には、試料核酸は、予めＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５若しくはローダミンなどの蛍光色素、またはビオチン、ハプテン、オキシダーゼ若しくはホスファターゼ等の酵素、またはフェロセン若しくはキノン類等の電気化学的に活性な物質で標識してもよい。或いは前述した物質で標識したセカンドプローブを用いることで検出を行ってもよい。複数の標識物質を同時に使用してもよい。
【００３８】
（２）の電気化学的方法の場合、プローブを固定化する基体として導電性物質を用い、プローブ固定化チップを電極として使用する。この電極を用いたハイブリダイゼーション反応の存在の検出は他の一般的な電気化学的検出法と同じように、この電極の他に、対極や参照極を使用してよい。参照極を配置する場合、例えば、銀／塩化銀電極や水銀／塩化水銀電極などの一般的な参照極を使用し得る。異なる塩基配列を有するプローブは、それぞれ別々の異なる導電性基体に固定化して同一の基板などに配設されたチップを構成してよい。これにより精度の高い測定を行うことが可能である。その場合、各電極から得られる電気化学的信号がどのプローブに対応したものであるのか検知する。
【００３９】
試料物質から抽出した核酸成分とプローブ固定化チップに固定化されたプローブとのハイブリダイゼーション反応は、例えば、以下のように行うことが望ましい。即ち、ハイブリダイゼーション反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤などを添加してもよい。ここに抽出した核酸成分を添加し、９０℃以上で熱変性させればよい。プローブ固定化チップの挿入は、変性直後、或いは０℃に急冷後に行ってよい。また、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。反応中は、撹拌、或いは振とうなどの操作で反応速度を高めてもよい。反応温度は、例えば、１０℃〜９０℃の範囲で、反応時間は１分以上１晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、電極を取り出し洗浄を行う。洗浄には、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。
【００４０】
（１）の標識物質を用いる方法の場合、ハイブリダイゼーション反応の検出は、標識の種類に応じた適宜の検出装置を用いて、試料中の標識された塩基配列又は２次プローブ中の標識を検出することによって行えばよい。標識が蛍光物質の場合には、例えば、蛍光検出器を用いて標識を検出すればよい。
【００４１】
（２）の電気化学的方法の場合、以下のような手順で検出を行えばよい。基体は洗浄後、電極表面に形成した二本鎖部分に選択的に結合する二本鎖認識体を作用させ、電気化学的な測定を行えばよい。ここで用いられる二本鎖認識体は特に限定されるものではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。ＤＮＡ結合物質の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲で使用する。この際には、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。電極を二本鎖認識体と反応させた後、洗浄し、電気化学的な測定を行えばよい。
【００４２】
電気化学的な測定では、二本鎖認識体が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、二本鎖認識体に由来する反応電流値を測定すればよい。この際、電位は定速で掃引するか、或いはパルスで印加するか、或いは定電位を印加することができる。測定には、例えば、ポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。得られた電流値を基に、検量線から標的核酸の濃度が算出され得る。
【００４３】
電極を用いた塩基配列検出装置は、例えば、核酸抽出部、核酸反応部、二本鎖認識体反応部、電気化学測定部および洗浄部等から構成される。
【００４４】
また、電気化学的な手法に基づくプローブ固定化チップの他の例は、例えば、以下の文献に開示されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４，  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）。この文献は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００４５】
（Ａ）  蛍光検出法により検出されるプローブ固定化チップの作製
上述した本発明に従う核酸検出用プローブを基板に固定化する。基板は、例えば、ガラス基板およびシリコン基板等、従来用いられる何れの基板も使用することが可能である。固定化手段は、スポッター等を使用する手段、一般的な半導体技術を使用した手段等、当業者にそれ自身公知の手段を用いて固定することが可能である。
【００４６】
（Ｂ）電気化学的方法により検出されるプローブ固定化チップの作製
上述した本発明に従う核酸検出用プローブを、基板、例えば、電極基板、に共有結合、イオン結合、物理吸着または化学吸着等によって固定化する。電気化学的方法により検出されるプローブ固定化チップの例は、平成８年１０月２４日に登録された特許番号第２５７３４４３号の自動遺伝子検出装置等であるが、これに限られるものではない。当該文献は引用することによりここに組み込まれる。
【００４７】
本発明の更なる１側面に従うと、基板と、前記基板に固定化された上述した本発明に従う核酸検出用プローブとを具備するプローブ固定化チップを提供するものであり、そのようなプローブ固定化チップも本発明の範囲内にある。
【００４８】
本発明の１側面に従うと、上述の被検物質の神経毒性を検出するための核酸またはその一部は、被検物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プローブとして使用することが可能である。そのような被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プローブも本発明の範囲内にある。
【００４９】
７．核酸検出用プライマー
配列番号1、配列番号2に示されるポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーは、配列番号1、配列番号2に示される遺伝子のGenBank Accession No.（それぞれNM_007939(Epha8), NM_016917(Slc40a1)）から得られた塩基配列をもとに市販のプライマー構築ソフト、（たとえばAmplify）を用いて選択したプライマーが好適に使用できる。例えば配列番号3〜6に記載の塩基配列を有するプライマーを用いることができる。
【００５０】
配列番号1に特異的な遺伝子増幅用プライマーは、たとえば、配列番号1に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に相補的であり、かつ配列番号1であらわされるＤＮＡを特異的に増幅可能な10〜50の連続したヌクレオチドからなるプライマーであり得る。配列番号2に特異的な遺伝子増幅用プライマーは、配列番号2に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に相補的であり、かつ配列番号2であらわされるＤＮＡを特異的に増幅可能な10〜50の連続したヌクレオチドからなるプライマーであり得る。
【００５１】
好ましくは、上記配列番号1、配列番号2に特異的な遺伝子増幅用プライマーとしては、たとえば配列番号1に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号2に記載の塩基配列およびその相補的配列より選択される塩基配列に含まれる連続した15塩基〜30塩基の核酸を含む核酸検出用プライマーであってよい。
【００５２】
また、配列番号1、配列番号2に特異的な遺伝子増幅用プライマーは、配列番号1に記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号2に記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列選択される塩基配列に含まれる連続した10、15，20、25、30、40、50、またはそれ以上の塩基よりなる核酸を含んでいてもよい。
【００５３】
また更に、被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プライマーの好ましい例は、配列番号1を検出するためには、配列番号3、配列番号4に記載の塩基配列により示される核酸が含まれる。またより好ましくは、配列番号3と配列番号4に記載の塩基配列により示される核酸を、それぞれフォワードプライマーとリバースプライマーとして使用する。
【００５４】
[配列番号3]  GGGAAACCCAGGCCCCGCTA
[配列番号4]  CTGTAGCCACAGTGCCTCTT。
【００５５】
配列番号2を検出するためには、好ましくは配列番号5、配列番号6に記載の塩基配列により示される核酸が含まれる。またより好ましくは配列番号5と配列番号6に記載の塩基配列により示される核酸を、それぞれフォワードプライマーとリバースプライマーとして使用する。
【００５６】
[配列番号5]  ACCATGGATGGGTCCTTACTG
[配列番号6]  AGCATTCATGTCTGCTAATCTG。
【００５７】
さらに、被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プライマーは、上述の核酸に加えて更なる配列を含んでいてもよい。また、上記配列を有するプライマーは、リアルタイム定量PCRに最適なように設計することができる。
【００５８】
核酸増幅方法には、特に限定はなく、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法等のいずれもが好適に使用できる。
【００５９】
８．核酸検出用プライマーを用いた神経毒性の検出方法
上記核酸検出用プライマーを用いることにより、次のような手順によって被験物質の神経毒性を検出することが可能である。
【００６０】
配列番号1、配列番号2に示された遺伝子のｍＲＮＡの競合ＲＴ−ＰＣＲあるいはリアルタイムＰＣＲにより被験物質の神経毒性を検出することができる。その場合、上記プライマーの組み合わせを用いることができ、その増幅結果から配列番号1、配列番号2に示される遺伝子の発現の度合いを定量的に測定することができる。
【００６１】
上記リアルタイム検出においては、インターカレーターによる検出、ＴａｑＭａｎプローブによる検出、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡキメラプローブの開裂反応による検出等の方法が使用できる。リアルタイムPCRを使用する場合、全RNAから(dT)プライマーを用いて逆転写反応を行った後で、各遺伝子断片を特異的に増幅できるPCRプライマーを用いてリアルタイム定量PCRを行う。たとえば、リアルタイム定量PCRは、Opticon Monitorリアルタイム定量PCR(MJリサーチ社製)で行うことができる。リアルタイムPCR試薬には、たとえばDyNAmo SYBR Green qPCR kit(フィンザイム社製)を使用することができる。
【００６２】
さらに、被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プライマーは、上述した核酸に加えて更なる配列を含んでいてもよい。また、上記配列を有するプライマーは、リアルタイム定量PCRに最適なように設計することができる。
【００６３】
反応は、たとえば鋳型のcDNA溶液2μlに、上記配列番号1、配列番号2に特異的な遺伝子増幅用プライマーを1μlと滅菌水7μlを加えて全量を10μlと、これに等量のリアルタイムPCR試薬を加えてよく混合することによって行うことができる。PCR反応は、たとえば変性:98℃,10秒、アニーリング:58℃,10秒、伸長:72℃,20秒を1サイクルとして計40サイクル行うことができる。また、遺伝子増幅量の測定は、たとえば各サイクルの伸長反応後にSYBR Green Iの蛍光強度によって測定することができる。このとき、同様な方法で測定したシクロフィリン遺伝子などの発現量を内部標準として相対発現量に換算することができる。
【００６４】
次に、上記測定したmRNAの発現量と、被験物質に曝露していない神経由来細胞における配列番号1、配列番号2の配列のmRNAの少なくとも一つの発現量とを比較する。被験物質に曝露していない神経由来細胞におけるmRNAの発現量は、上記方法を使用して行うことができる。また、上記被験物質に曝露していない神経由来細胞におけるmRNAの発現量の測定と同時に測定することが好ましいが、被験物質に曝露していない神経由来細胞におけるmRNAの発現量を予め測定しておくこともできる。
【００６５】
また、このような被験物質に曝露していない神経由来細胞における配列番号1、配列番号2の配列のmRNAの少なくとも一つの発現量との比較により、それぞれのmRNAについての閾値を予め設定しておき、その閾値を越えるか否かによって検査対象である被験物質の神経毒性の有無および程度の判定を行うことができる。
【００６６】
９．核酸検出用キット
（１）核酸検出用プローブを具備するキット
配列番号1、配列番号2に記載の塩基配列、並びにこれらの相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対して特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続したヌクレオチドからなるプローブを含むキットが提供できる。上記「核酸検出用プローブを用いた神経毒性の検出方法」で用いられる、神経毒性を検出するためのキットの場合、当該キットは、たとえば、配列番号1であらわされる遺伝子のmRNA（あるいは逆転写反応により調製されたcDNA）と特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続したヌクレオチドからなる核酸検出用プローブ、または配列番号２であらわされる遺伝子のmRNA（あるいは逆転写反応により調製されたcDNA）と特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続したヌクレオチドからなる核酸検出用プローブの少なくとも一つを含む。
【００６７】
例えば、RNase プロテクションアッセイキットの場合は、上記核酸検出用プローブに加え、80%ホルムアミド、40mM Pipes(pH6.4)、400mM、1mM EDTAからなるハイブリダイゼーション緩衝液を含んでも良い。また該プローブは32Pに代表される放射性物質のほか、フルオレセインに代表される蛍光物質で標識されていても良い。なお本キットにより検出される配列番号1、配列番号2に示される遺伝子は同時に含まれる必要はなく、その数は特に限定されない。従って本キットを構成するプローブも特に限定されなく、検出対象とする配列番号1、配列番号2に示される遺伝子の種類及びその数により適宜選択すればよい。
【００６８】
（２）核酸検出用プライマーを具備するキット
上記「核酸検出用プライマーを用いた神経毒性の検出方法」で用いられる、神経毒性を検出するためのキットの場合、当該キットは、たとえば、配列番号１であらわされる遺伝子のmRNAから逆転写反応により調製されたcDNAを特異的に増幅可能な10〜50の連続したヌクレオチドからなるプライマー、または配列番号２であらわされる遺伝子のmRNAから逆転写反応により調製されたcDNAを特異的に増幅可能な10〜50の連続したヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一つを含む。
【００６９】
具体的には、細胞内における、配列番号1、配列番号2に示される遺伝子の発現量の変化を検出する方法において、該遺伝子より発現されるmRNAの量を指標に検出するキットが例示される。
【００７０】
例えば、検出方法にRT-PCRを利用した本発明におけるキットは、上記プライマー対の他に、逆転写酵素、dNTP、耐熱性DNAポリメラーゼ、PCR反応用緩衝液が組み込まれていてもよい。なお本キットにより検出される配列番号1、配列番号2に示される遺伝子は同時に含まれる必要はなく、その数は特に限定されない。従って本キットを構成するプライマー対も特に限定されなく、検出対象とする配列番号1、配列番号2に示される遺伝子の種類及びその数により適宜選択すればよい。
【実施例】
【００７１】
実験例：アリルハイドロカーボンレセプター遺伝子過剰発現細胞（N2a-R細胞）の構築
（１）アリルハイドロカーボン受容体遺伝子の調製
ラット脳からRNeasyキット（キアゲン社製）を使用して全RNAを抽出した。抽出したRNAをオリゴ(dT)プライマーを使用して逆転写する。次いで、これを鋳型に、Pyrobest  DNAポリメラーゼを使用して、変性：94℃ 1分、アニーリング：55℃ 1分、伸長：72℃ 4分を1サイクルとする25サイクルのPCR反応をおこない、ラットアリルハイドロカーボン受容体遺伝子のコーディング領域を増幅した。プライマーには、フォワードプライマー：5’- CCCAAgCTTACCATGAgCAgCggCgCCAACATCA（配列番号９）、リバースプライマー:5’-CCgCTCgAgAggAATCCgCTgggTgTgATATCAg（配列番号１０）を使用した。フォワードプライマーの5’末端にHindIII認識配列を付加し、リバースプライマーの5’末端にXhoI認識配列を付加した。さらに、リバースプライマーは、アリルハイドロカーボン受容体蛋白質がV5エピトープとヒスチジンタグが付加された融合蛋白質として発現するように設計した。
【００７２】
（２）アリルハイドロカーボン受容体遺伝子を組み込んだ受容体発現用核酸の調製
発現用核酸には、pcDNA4/V5-His B（インビトロジェン社製）を使用した。このpcDNA4/V5-His Bは、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター配列とV5エピトープ配列との間にマルチクローニングサイト（MCS）が配置されている。MCS内の適当な制限酵素部に所望の遺伝子をコードする配列を組み込むことにより、CMVプロモーターの制御下で目的とする蛋白質を過剰発現させることができる。
【００７３】
また、組み込む遺伝子のコーディング配列の3’末端を適切に変更することにより、V5エピトープとヒスチジンタグを目的蛋白質のC末端に付加することが可能である。まず、（１）で増幅したラットアリルハイドロカーボン受容体遺伝子のコーディング領域を制限酵素HindIIIとXhoIで消化する。同様にHindIIIとXhoIでpcDNA4/V5-His Bを消化した。次いで、pcDNA4/V5-His Bとラットアリルハイドロカーボン受容体遺伝子のコーディング領域を連結することにより、発現用核酸pcDNA4-rAhRを作製した（図２）。pcDNA4-rAhRを大腸菌TOP10（インビトロジェン社製）に導入して増幅および維持した。
【００７４】
作製したpcDNA4-rAhRにおいて、ラットアリルハイドロカーボン受容体遺伝子のコーディング領域をシーケンシングして該領域に変異が導入されていないことを確認した。シーケンシングのためのプライマーには、T7プライマーおよびBGHリバースプライマーを使用した。
【００７５】
（３）アリルハイドロカーボン受容体発現用核酸pcDNA4-rAhRを導入した神経芽細胞腫由来Neuro2aの作製
アリルハイドロカーボン受容体発現用核酸pcDNA4-rAhRのNeuro2aへの導入には、リポフェクタミン2000（インビトロジェン社製）を使用した。Neuro2aを24ウェルプレートにおいて80%コンフルエント（2×105細胞）で継代し、DF培地で一晩培養した。2μlのリポフェクタミン2000を50μlのOpti-MEM培地（ギブコ社製）と混合し、室温で15分間静置した。その後、0.8μgの上記（２）で作製した受容体発現用核酸pcDNA4-rAhRを含むOpti-MEM培地50μlとよく混ぜ合わせた。pcDNA4-rAhRは、MunIで消化して直鎖状にした後に使用した。リポフェクタミン2000と受容体発現用核酸の混合液を室温で20分間静置して、24ウェルプレートにおいてあらかじめ培養しておいたNeuro2aに加えて穏やかに混合した。24時間培養した後、Neuro2aを新鮮なDF培地で1/50希釈して6ウェルプレートに植え継ぎ、さらに培養を続けた。24時間後、ゼオシン（インビトロジェン社製）を300μg/mlの濃度で培地に添加し、pcDNA4-rAhRが導入された細胞の選択を開始した。以降は、3〜4日ごとに300μg/mlでゼオシンを含む新鮮な培地に交換して培養を継続した。2週間後、クローニングリング（イワキ社製）を使用して、76種のゼオシン耐性細胞のコロニーを得た。これらの細胞を、受容体発現用核酸pcDNA4-rAhRを安定に保持する細胞株として選択した。
【００７６】
（４）2,3,7,8-TCDD曝露条件下で突起伸展が観察される細胞株の選択
上記（３）で得た76種の細胞株を、DF1:1培地で、3〜5日間培養をおこない、各細胞株において細胞の形状を観察した。観察は倒立顕微鏡下でおこない、突起伸長が見られない細胞株を選択した。このとき、親株である神経芽細胞腫由来Neuro2aを同じ条件下で培養し、同様の観察をおこなったが、突起を伸長する細胞はほとんど観察されなかった。
【００７７】
さらに、選択した細胞株を10nMの2,3,7,8-TCDDを添加したDF1:1培地で1〜3週間培養を行った。細胞の形状の観察により、特に突起を伸長する細胞の割合が高かった2つの細胞株を選択した。これら細胞株を、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託した（受託番号 FERM BP-10341、FERM BP-10342）。
【００７８】
実施例１:TCDD応答遺伝子の選択
(1)N2a-R細胞の培養
まず、アリルハイドロカーボンレセプター遺伝子過剰発現細胞N2a-R細胞の培養に使用したDF培地は、牛胎児血清を10%で含むダルベッコMEM培地とハム培地を1:1の割合で混合することにより調製した。
【００７９】
アリルハイドロカーボンレセプター遺伝子過剰発現細胞N2a-R細胞(受託番号 FERM BP-10341、FERM BP-10342)を、DF培地中で37℃、5%二酸化炭素存在下で1日間培養した。次に、この培養の後、得られた細胞を2つの培養容器に分注することにより2つの区に分けた。片方の区には、2,3,7,8-テトラクロロ-ベンゾ-p-ジオキシン(2,3,7,8-tetrachloro-benzo-p-dioxin;以下、TCDDと称する)を終濃度が10nMとなるように加えた(以下、これをTCDD添加区と称する)。これに対してもう一方の区にはDMSOを加えた(以下、これをTCDD未添加区と称する)。これら2つの区のアリルハイドロカーボンレセプター遺伝子過剰発現細胞N2a-R細胞を3日間及び7日間培養した。
【００８０】
(2)TCDD添加区およびTCDD未添加区において発現された遺伝子の比較  
上記(1)に記載の方法により培養した2つの条件の区(TCDD添加区およびTCDD未添加区)の細胞において発現された遺伝子をマウスオリゴマイクロアレイ (Agilent社製)を用いて比較した。
【００８１】
まず、上記(1)に記載の2つの区の細胞から、それぞれ全RNAを抽出した。この抽出は、RNA Extraction  Kit(ファルマシア社製)を用いて、付属のマニュアルに従って行った。この抽出により得られた全RNAから、DNAを除去するためにDNaseIを処理した。その後、得られた溶液中に含まれる全RNA量を分光光度計で測定し、1μL当たりのRNAが250pmolとなるように濃度を調節した。
【００８２】
上記(1)に記載の2つの区の細胞から得られた全RNAを精製後、全RNA20μgに対し、オリゴdTプライマーをアニールさせた後、aminoallyl-dUTP存在下で逆転写酵素反応を行いaminoallyl-dUTPが導入されたcDNAを作製した。逆転写酵素反応で得られたcDNAとCy-dyeとのカップリング反応を行ってcDNAを蛍光標識した。なお、上記(1)に記載の2つの区のうちTCDD添加区細胞に由来するcDNAをCy5に、TCDD未添加区細胞に由来するcDNAをCy3にそれぞれ蛍光標識した。得られた2つの区の細胞由来のCy5、Cy3で標識されたcDNA溶液を混合し、マイクロアレイ基盤上に添加後、60度で17時間のハイブリダイゼーションを行った。その後、マイクロアレイをSSCバッファーを用いて洗浄後、マイクロアレイ基盤の遠心乾燥を行った。マイクロアレイの蛍光スキャニングはAgilent scannrer(Agilent社製)を用いて行った。画像データから数値データへの変換は専用ソフトFeature Extraction(Agilent社製)を用いて行った。バックグラウンドにはnegative control の蛍光値を用い、各スポットの蛍光値から差し引いた。サンプル・コントロール間のノーマリゼーションは、lowessを用いたグローバルノーマリゼーション法で行った。スキャニング時のフォトマルのゲインについては、全てのマイクロアレイでhighとlowの2種類で取得した。high取得時に蛍光強度が飽和していた遺伝子については、low取得時のデータを採用した。上記の方法から得られた遺伝子は、配列番号1、及び配列番号2である。配列番号1は、Epha8（Eph receptor A8）であり、マウス由来である。配列番号2はSlc40a1 (solute carrier family 40 (iron-regulated transporter), member 1)であり、マウス由来である。
【００８３】
(3) (2)で得られた遺伝子のRT-PCRおよびリアルタイムPCRによる発現変動の確認
上記実施例１の(2)で決定した配列番号1、配列番号2に示したの塩基配列をそれぞれ特異的に増幅できるPCRプライマーの例として次のプライマーを設計した。
【００８４】
配列番号1を増幅するためのPCRプライマーは、上流プライマーが配列番号3に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、下流プライマーが配列番号4に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【００８５】
[配列番号3]  GGGAAACCCAGGCCCCGCTA
[配列番号4]  CTGTAGCCACAGTGCCTCTT。
【００８６】
配列番号2を増幅するためのPCRプライマーは、上流プライマーが配列番号5に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、下流プライマーが配列番号6に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【００８７】
[配列番号5]  ACCATGGATGGGTCCTTACTG
[配列番号6]  AGCATTCATGTCTGCTAATCTG。
【００８８】
新たに、上記実施例１の(1)に記載の方法と同じ条件で、但し、TCDD添加濃度は0、10nMでアリルハイドロカーボンレセプター遺伝子過剰発現細胞N2a-R細胞を培養した。それらの各区について全RNAを抽出した。抽出した全RNAから(dT)プライマーを用いて逆転写反応を行った後で、各遺伝子断片を特異的に増幅できる上記PCRプライマーを用いてRT-PCRおよびリアルタイム定量PCRによって、TCDDによる発現量を比較した。
【００８９】
RT-PCRは、変性:98℃,10秒、アニーリング:58℃,10秒、伸長:72℃,20秒を1サイクルとして計40サイクル行った。
【００９０】
リアルタイム定量PCRは、Opticon Monitorリアルタイム定量PCR(MJリサーチ社製)で行った。リアルタイムPCR試薬にはDyNAmo SYBR Green qPCR kit(フィンザイム社製)を使用した。鋳型のcDNA溶液2μlに、上記の配列番号1、及び配列番号2に特異的な遺伝子増幅用プライマーを1μlと滅菌水7μlを加えて全量を10μlと、これに等量のリアルタイムPCR試薬を加えてよく混合した。PCR反応は変性:98℃,10秒、アニーリング:58℃,10秒、伸長:72℃,20秒を1サイクルとして計40サイクル行った。遺伝子増幅量の測定は各サイクルの伸長反応後にSYBR Green Iの蛍光強度を測定することで行った。同様な方法で測定したシクロフィリン遺伝子の発現量を内部標準として、相対発現量に換算した。RT-PCRの結果およびリアルタイムPCRの結果をそれぞれ図３、図４に示す。なお、図４は、TCDD3日間曝露の結果のみを示すが、7日間曝露によっても同様の結果、すなわちTCDDの添加により各遺伝子のmRNA量が増大するという結果が得られた。
【００９１】
図３、図４において明らかであるように、配列番号1、及び配列番号2は、RT-PCRおよびリアルタイムPCRによって特異的に増幅され、3日間、及び7日間の10nM TCDDの添加によって発現量が増加した(図３、４)。従って、配列番号1、及び配列番号2は、3日間、及び7日間の10nM TCDDの曝露に対して応答性があることが確認できた。
【００９２】
上記のとおり、TCDD応答性の塩基配列（配列番号１および２）が提供される。また、これらは、被験物質の神経毒性の判定に使用可能なマーカーとして提供された。
【００９３】
実施例２：被験物質の神経毒性をノーザンハイブリダイゼーションにより検出した例
上記実施例１の(1)に記載の方法と同じ条件で、但し、TCDD添加濃度は0、10nMでアリルハイドロカーボンレセプター遺伝子過剰発現細胞N2a-R細胞を培養した。それらの各区について全RNAを抽出した。抽出された一定量の粗ＲＮＡ試料を分子量等による分画後ナイロンフィルター等に固定し、検出対象となる配列番号1に示されるポリヌクレオチドmRNAと過剰量の該遺伝子検出用プローブを接触させ、ハイブリダイズさせた。
【００９４】
配列番号１の遺伝子の検出用プローブとして、5’ Digxygenin (DIG)で標識された配列番号７のプローブ１、および同様にDIGで標識された配列番号８のプローブ２を使用した。
【００９５】
ハイブリダイゼーションは、50%ホルムアミド、0.65M  NaCl、0.1M ナトリウム-Pipes、5×デンハート液、0.1% SDS、5mM EDTAからなるハイブリダイゼーション緩衝液中42℃、20時間保温することにより行なった。固定化されたRNAにハイブリダイズしたプローブより得られるシグナル強度が強いほど、配列番号1に示されるポリヌクレオチドの発現量が高いと判断できる。その結果、配列番号1に示されるポリヌクレオチドのmRNAは3日間、及び7日間の10nM TCDDの添加によってハイブリダイゼーションで得られるシグナルは増大した。
【００９６】
本実施例により、ハイブリダイゼーションで得られるシグナルを検出することにより被験物質の神経毒性を特異的に検出することが可能な方法が提供された。
【００９７】
実施例３：ベンツピレンの神経毒性を検出した例
TCDDをベンツピレンに代えた以外は、上記実施例１と同様の手法に従って、N2a-R細胞をベンツピレンに3日間曝露し、ＲＴ−ＰＣＲにより、配列番号１の遺伝子（Epha8）および配列番号２の遺伝子（Slc40a1）のmRNA発現量を測定した。その結果を図５に示す。図５において、DMSOは、「ベンツピレン未添加区」を示し、Bapは、「ベンツピレン添加区」を示す。
【００９８】
図５から明らかなとおり、ベンツピレンの添加により、配列番号１の遺伝子（Epha8）および配列番号２（Slc40a1）の遺伝子のmRNA発現量は増大した。この結果より、細胞を被験物質に晒した際の、配列番号１の遺伝子または配列番号２の遺伝子のmRNA発現量の増大を検出することにより、被験物質の神経毒性を検出可能であることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】ダイオキシン類がアリルハイドロカーボン受容体（AhR）を介して遺伝子の転写を活性化するメカニズムを模式的に示す図。
【図２】アリルハイドロカーボン受容体遺伝子を組み込んだ発現ベクターの模式図。
【図３】実施例１-(3)において行ったRT-PCRの結果を示す電気泳動写真。
【図４】実施例１-(3)において行ったリアルタイムPCRの結果を示すグラフ。
【図５】実施例３において行なったRT−PCRの結果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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