(57)【要約】      （修正有）【課題】活性代謝物がグルタチオン抱合される薬物による毒性発現のメカニズムの解明およびヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできる遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物を提供する。【解決手段】γ―グルタミルシステイン合成酵素の発現がＲＮＡ干渉法によりノックダウンされている、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。このＲＮＡ干渉法では、第１の特定塩基配列と、第２の特定塩基配列と、第１の塩基配列および第２の塩基配列を連結するループ配列と、を含む塩基配列からなるｓｈＲＮＡをを発現可能なアデノウイルスベクターを非ヒト哺乳動物に感染させることにより、γ―グルタミルシステイン合成酵素の発現を抑制する。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタチオン合成能がノックダウンされている、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
グルタチオン合成酵素の発現がノックダウンされている、請求項１記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
前記グルタチオン合成酵素がγ―グルタミルシステイン合成酵素である、請求項２記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
前記グルタチオン合成酵素の発現がＲＮＡ干渉法によりノックダウンされている、請求項２または３記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
前記ＲＮＡ干渉法が、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現させる干渉法である、請求項４記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
前記ＲＮＡ干渉法が、前記ｓｈＲＮＡまたは前記ｓｉＲＮＡを発現可能なアデノウイルスベクターを前記非ヒト哺乳動物に感染させる干渉法である、請求項５記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
前記遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物がラットである、請求項１乃至６いずれかに記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、肝臓組織におけるグルタチオン含有量が有意に低い、請求項１乃至７いずれかに記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、グルタチオン抱合能が有意に低い、請求項１乃至７いずれかに記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、肝臓組織における活性代謝物の解毒能が有意に低い、請求項１乃至７いずれかに記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
活性代謝物がグルタチオン抱合により解毒される薬物のヒトにおける薬物動態を再現するモデル動物として使用可能である、請求項１乃至７いずれかに記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】
同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、肝臓組織におけるグルタチオン含有量が有意に低い、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項１３】
同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、グルタチオン抱合能が有意に低い、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項１４】
同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、肝臓組織における活性代謝物の解毒能が有意に低い、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物。
【請求項１５】
請求項１乃至１４いずれかに記載の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物またはその一部を用いる、活性代謝物がグルタチオン抱合により解毒される薬物についての薬物動態の試験方法。
【請求項１６】
配列番号：１に記載される第１の塩基配列と、
配列番号：２に記載される第２の塩基配列と、
前記第１の塩基配列および前記第２の塩基配列を連結するループ配列と、
を含む塩基配列からなるｓｈＲＮＡ。
【請求項１７】
配列番号：１に記載される塩基配列に対して１以上の塩基を欠失、置換、付加してなる第１の塩基配列と、
配列番号：２に記載される塩基配列に対して１以上の塩基を欠失、置換、付加してなる第２の塩基配列と、
前記第１の塩基配列および前記第２の塩基配列を連結するループ配列と、
を含む塩基配列からなるｓｈＲＮＡ。
【請求項１８】
前記ｓｈＲＮＡをラットの細胞内で発現させることにより、前記ラットの細胞内におけるγ―グルタミルシステイン合成酵素の発現をＲＮＡ干渉法によりノックダウンさせることができる、請求項１６または１７記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項１９】
配列番号：１に記載される第１の塩基配列と、
配列番号：２に記載される第２の塩基配列と、
を含む塩基配列からなるｓｉＲＮＡ。
【請求項２０】
配列番号：１に記載される塩基配列に対して１以上の塩基を欠失、置換、付加してなる第１の塩基配列と、
配列番号：２に記載される塩基配列に対して１以上の塩基を欠失、置換、付加してなる第２の塩基配列と、
を含む塩基配列からなるｓｉＲＮＡ。
【請求項２１】
前記ｓｉＲＮＡをラットの細胞内で発現させることにより、前記ラットの細胞内におけるγ―グルタミルシステイン合成酵素の発現をＲＮＡ干渉法によりノックダウンさせることができる、請求項１９または２０記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２２】
請求項１６乃至１８いずれかに記載のｓｈＲＮＡまたは請求項１９乃至２１いずれかに記載のｓｉＲＮＡを発現可能なアデノウイルスベクター。
【請求項２３】
前記アデノウイルスベクターをラットに感染させ、前記ｓｈＲＮＡまたは前記ｓｉＲＮＡを発現させることにより、γ―グルタミルシステイン合成酵素の発現をＲＮＡ干渉法によりノックダウンさせることができる、請求項２２記載のアデノウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床で問題となる薬物による副作用の３分の１以上は、代謝反応に起因するものであると言われている。そのうちの９０％以上がチトクロムＰ４５０による代謝反応が関与する。最近、代謝反応に起因する薬物相互作用に関心が高まり、医療用医薬品の添付文書も相互作用をチトクロムＰ４５０の分子種レベルで説明するように改訂されてきている。
【０００３】
さらに、１９９７年米国ＦＤＡの「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」でも示されたように、薬の開発から臨床での適切な使用に至るまで、代謝反応が関わる薬物相互作用に充分注意をする必要が言われるようになってきた。特に、すでに臨床で使用されている薬に見いだされている様々な薬物相互作用について代謝レベルで主にｉｎ  ｖｉｔｒｏで検討することにより、相互作用についてさらに理解を深めることが重要となってきた。
【０００４】
実験動物やｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験結果からヒトでの結果を予測することを「外挿」と言う。すなわち、実験動物で得られた代謝物が本当にヒトにも生成し得るものであるか等が問題となる。ラットやマウスの齧歯類よりも、ヒトに近いイヌやサルを用いた研究も盛んに行われているが、膨大な数の実験動物の使用を少しでも減らすためにも、適切にヒトへの外挿ができる実験手段の開発が望まれている。こうした観点から、ヒトの薬物代謝酵素の遺伝子を導入したあらたな試験系の開発が望まれている。
【０００５】
ヒトの薬物代謝酵素の遺伝子を導入した公知の薬理学的および毒性学的研究のための非ヒトトランスジェニック動物としては、例えば、ヒトＣＹＰ４５０イソ型を発現するトランスジェニックマウス（特許文献１の実施例６）などが挙げられる。
【０００６】
【特許文献１】特表２００４−５３３８２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ヒトＣＹＰ４５０イソ型を発現するトランスジェニックマウスは、ヒトにおける薬物誘導性肝障害を予測するモデル動物としてはさらなる改善の余地がある。なぜなら、ラットおよびマウスの肝臓組織におけるグルタチオン合成能は、ヒトの肝臓組織におけるグルタチオン合成能よりも著しく高いため、活性代謝物をグルタチオン抱合して解毒してしまう能力に優れるためである。
【０００８】
特に、グルタチオン抱合の速度はラットよりマウスが４倍速いことが知られている（Liu J et al., “Characterization of the acetaminophen-glutatione conjugation reaction by liver microsomes: species difference in the effects of acetone.”, Toxicol Lett., 1991, May;56(3):269-74）ことから、ヒトＣＹＰ４５０イソ型を発現するトランスジェニックマウスでは、薬物誘導性肝障害が起こりにくく、ヒトにおける薬物誘導性肝障害を予測するモデル動物としては使用困難である。そのため、現在のところ、未だ実用に耐えるヒトにおける薬物誘導性肝障害を予測するモデル動物は得られていない。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、活性代謝物がグルタチオン抱合される薬物による毒性発現のメカニズムの解明およびヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできる遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、グルタチオン合成能がノックダウンされている、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物が提供される。
【００１１】
この遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物によれば、グルタチオン合成能がノックダウンされているため、薬物の活性代謝物のグルタチオン抱合による解毒作用を抑制することができる。その結果、通常であれば活性代謝物がグルタチオン抱合により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となるので、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできる遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物が得られる。
【００１２】
上記の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物は、別の視点から見れば、同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、肝臓組織におけるグルタチオン含有量が有意に低い、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物である。
【００１３】
この遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物によれば、同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、肝臓組織におけるグルタチオン含有量が有意に低いため、薬物の活性代謝物のグルタチオン抱合による解毒作用を抑制することができる。その結果、通常であれば活性代謝物がグルタチオン抱合により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となるので、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできる遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物が得られる。
【００１４】
上記の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物は、別の視点から見れば、同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、グルタチオン抱合能が有意に低い、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物である。
【００１５】
この遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物によれば、同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、グルタチオン抱合能が有意に低いため、薬物の活性代謝物のグルタチオン抱合による解毒作用を抑制することができる。その結果、通常であれば活性代謝物がグルタチオン抱合により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となるので、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできる遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物が得られる。
【００１６】
上記の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物は、別の視点から見れば、同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、肝臓組織における活性代謝物の解毒能が有意に低い、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物である。
【００１７】
この遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物によれば、同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、肝臓組織における活性代謝物の解毒能が有意に低いため、通常であれば活性代謝物がグルタチオン抱合により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となる。そのため、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできる遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物が得られる。
【００１８】
また、本発明によれば、上記のいずれかの遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物またはその一部を用いる、活性代謝物がグルタチオン抱合により解毒される薬物についての薬物動態の試験方法が提供される。
【００１９】
この薬物動態の試験方法によれば、上記のいずれかの遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物またはその一部を用いるため、通常であれば活性代謝物がグルタチオン抱合により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となり、その薬物の活性代謝物によるヒトにおける毒性発現予測が可能となる。
【００２０】
また、本発明によれば、後述する特定の塩基配列からなるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡが提供される。
【００２１】
これらの特定の塩基配列からなるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをラットの細胞内で発現させることにより、ラットの細胞内におけるγ―グルタミルシステイン合成酵素の発現をＲＮＡ干渉法によりノックダウンさせることができる。
【００２２】
そして、このラットでは、グルタチオン合成能がノックダウンされているため、薬物の活性代謝物のグルタチオン抱合による解毒作用を抑制することができる。その結果、このラットでは、通常であれば活性代謝物がグルタチオン抱合により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となるので、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできるモデルラットが得られる。
【００２３】
また、本発明によれば、上記のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのいずれかを発現可能なアデノウイルスベクターが提供される。
【００２４】
このアデノウイルスベクターをラットに感染させ、上記のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのいずれかを発現させることにより、γ―グルタミルシステイン合成酵素の発現をＲＮＡ干渉法によりノックダウンさせることができる。
【００２５】
そして、このラットでは、グルタチオン合成能がノックダウンされているため、薬物の活性代謝物のグルタチオン抱合による解毒作用を抑制することができる。その結果、このラットでは、通常であれば活性代謝物がグルタチオン抱合により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となるので、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできるモデルラットが得られる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、薬物の活性代謝物のグルタチオン抱合による解毒作用が抑制されるため、通常であれば活性代謝物がグルタチオン抱合により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となるので、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできる遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物が得られる。
【００２７】
また、本発明によれば、上記の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物を用いることにより、通常であれば活性代謝物がグルタチオン抱合により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となるので、ヒトにおける毒性発現予測が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２９】
＜本研究の経緯＞
グルタチオン（５−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ，ＧＳＨ）は、グリシン、グルタミン酸およびシステインから構成されるトリペプチドであり、内因性物質や薬物より生じるフリーラジカルを捕獲することで、組織中の核酸やタンパク質を酸化ストレスから保護している。グルタチオン−Ｓ−転移酵素は薬物および活性代謝物を解毒することに深く関わっているが、ヒトよりも齧歯類において酵素活性が高いことが知られており、この代謝能の違いが前臨床毒性試験における毒性予測を困難にしている原因の一つと考えられている。そこで、本発明者は、当初よりヒトにおける薬物誘導性肝障害を予測するラットモデルの作出を意図して、研究を開始した。
【００３０】
一般的に、薬物肝障害には、代謝的に活性化された化合物（活性代謝物と言う）が、細胞毒性を発現することに基因すると言われてきている。そして、活性代謝物の解毒には、グルタチオン抱合が最も寄与が大きいことが言われてきている。また、グルタチオン抱合酵素には多くの分子種が報告されており、さらに特異性が比較的低いために、全ての分子種の活性を抑制する必要があると考えられる。そこで、本発明者は、グルタチオンを合成する酵素活性を抑制することが良いと考えた。
【００３１】
ここで、酵素活性を抑制する主な方法にノックアウトとノックダウンがあるが、ノックアウトでは、遺伝子を欠損させることにより、他の遺伝子の発現に及ぼす影響が無視できない報告があるため、本発明者は、ノックダウンの方法を採用した。なかでもスモールヘアピンＲＮＡの発現ベクターをアデノウイルスの系で用いることを考えた。
【００３２】
すなわち、本研究では、グルタチオン合成酵素であるγ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（γ−Ｇｃｓ）に注目し、この酵素の産生をアデノウイルスの系を用いてＲＮＡ干渉法によりノックダウンすることを検討した。これにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでグルタチオン合成を阻害し、グルタチオンおよびグルタチオン−Ｓ−転移酵素活性を減少させた細胞実験系またはモデル動物実験系を作成し、グルタチオン抱合される薬物による毒性発現のメカニズムの解明および、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることを目的として検討した。
【００３３】
その結果、本発明者は、γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（γ−Ｇｃｓ）酵素の産生をアデノウイルスの系を用いてＲＮＡ干渉法によりノックダウンすることにより、ラットの肝臓組織におけるグルタチオン（５−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ，ＧＳＨ）含有量を実際に低減できることを見出した。そして、本発明者は、その結果、ラットの肝臓組織において実際にｉｎ  ｖｉｖｏで肝障害が発症することを見出した。すなわち、本発明者は、この遺伝子ノックダウンラットが、ヒトにおける薬物の活性代謝物による毒性発現予測に役立てることのできる遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物であることを確認した。
【００３４】
＜グルタチオン抱合＞
本願において、グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ；  ＧＳＨ）とは、細菌からヒトに至るまで普遍的に存在するペプチド性のチオールのことをいう。グルタチオンは細胞内の主要な抗酸化成分であり、また、毒物などを細胞外に排出することで、細胞を内的および外的な環境の変化から守る役割を果たしている。
【００３５】
グルタチオンには、還元型（ＧＳＨ）と、酸化型（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ；  ＧＳＳＧ）が存在する。酸化型は、二分子の還元型グルタチオンがジスルフィド結合によってつながった分子である。細胞内のグルタチオンは、通常はほとんど（９８％以上）が還元型であり、この状態はグルタチオン還元酵素によって維持されている。本願では、特に注記しないかぎり「グルタチオン」は還元型を指すことにする。
【００３６】
グルタチオンは、グルタミン酸、システイン、グリシンが、この順番でペプチド結合したトリペプチドである（Ｌ−γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ）。ただし、グルタミン酸およびシステインの結合は通常のペプチド結合とは異なり、グルタミン酸側鎖のγ−カルボキシ基およびシステイン主鎖のα−アミノ基からなる（γ−グルタミル結合）。このためグルタチオンは、ペプチドでありながら、ほとんどのプロテアーゼに対して耐性であり、分解されにくい。グルタチオンを直接分解できる酵素はγ−グルタミルトランスペプチターゼや、その近縁のごく限られた酵素のみである。
【００３７】
グルタチオンの生理的機能は多々あるが、グルタチオンの主要なひとつの生理機能は、様々な毒物・薬物・伝達物質等を細胞外に排出することである。グルタチオンはこれらの物質を、システイン残基のチオール基に結合させ（グルタチオン抱合）、自ら細胞外に排出されることで、細胞を解毒する。
【００３８】
すなわち、グルタチオンは、システイン残基のチオール基に様々な物質を結合する。これらの物質には、毒物や、抗生物質などの薬物、ロイコトリエンやプロスタグランジン等といった各種伝達物質が含まれる。そして、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴｓ）によってこれらの結合反応が触媒される。また、ある種の金属イオンは非酵素的にグルタチオンと結合する。そして、グルタチオンとこれらの物質との結合物（抱合体）は細胞外に排出され、細胞から有害物質が取り除かれる。哺乳類の場合は抱合体は血中を移動し、腎臓まで運ばれる。腎臓でこの抱合体はメルカプツール酸に変換され、胆汁中や尿中に排出される。
【００３９】
グルタチオンは、γ-グルタミルシステイン合成酵素と、グルタチオン合成酵素の二つによって段階的に合成される。まず、γ-グルタミルシステイン合成酵素がシステインにグルタミン酸を結合し、γ-グルタミルシステインを合成する。γ-グルタミル結合はこの際に形成される。引き続いて、グルタチオン合成酵素がγ-グルタミルシステインにグリシンを結合し、グルタチオンが合成される。
【００４０】
γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＣＳ）は、グルタチオン生合成の律速段階の下記の反応式の反応を触媒する酵素であり、体内グルタチオンレベルを保つための中心的な役割を果たしている。
【００４１】
Ｌ−Ｇｌｕ＋Ｌ−Ｃｙｓ＋ＡＴＰ→γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ＋ＡＤＰ＋Ｈ３ＰＯ４
【００４２】
ここで、ラットおよびマウスの肝臓組織におけるグルタチオン合成能は、ヒトの肝臓組織におけるグルタチオン合成能よりも著しく高いことが知られている。そのため、ラットおよびマウスを含む齧歯類は、薬物の活性代謝物をグルタチオン抱合して解毒してしまう能力がヒトよりも優れており、そのままではヒトにおける薬物誘導性肝障害を予測するモデル動物としては使用困難である。
【００４３】
特に、グルタチオン抱合の速度はラットよりマウスが４倍速いことが知られている（Liu J et al., “Characterization of the acetaminophen-glutatione conjugation reaction by liver microsomes: species difference in the effects of acetone.”, Toxicol Lett., 1991, May;56(3):269-74）ことから、マウスではラットよりも薬物誘導性肝障害が起こりにくい。そのため、後述するヒトにおける薬物誘導性肝障害を予測するモデル動物としては、マウスよりもラットを用いることが好ましい。もっとも、このことは、特に本願発明の範囲からマウスを除去する趣旨ではなく、マウスよりも相対的にラットを用いることが好ましいことを述べるに過ぎないものである。
【００４４】
＜ＲＮＡ干渉＞
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、細胞に導入された２本鎖ＲＮＡが、それと同じ配列を持つ遺伝子の発現を抑制する現象のことである。この方法は、標的遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現を抑制（ノックダウン）するため、遺伝子の機能解析に有効な方法として近年急速に注目されている。哺乳動物細胞では、３０ｂｐ以上の長い２本鎖ＲＮＡが導入されると抗ウィルス応答により非特異的抑制を引き起こし、アポトーシスを誘発しやすいが、短いＲＮＡでは単一のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のみが特異的に抑制される。
【００４５】
特異的発現抑制を制御する最も有効なＲＮＡ長は２１ｍｅｒで、３’末端に２塩基がオーバーハングしたｄｓＲＮＡであるとされている。このような２０ｍｅｒ前後の短い２本鎖のＲＮＡはｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれている。また、ヘアピン構造に折り畳んだ小さなＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））もｓｉＲＮＡと同様に遺伝子の発現を抑制することが知られている。
【００４６】
ｓｉＲＮＡを発現ベクターで発現する場合は、例えば、ベクター内に、ｓｉＲＮＡ配列をｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ配列としてもつＤＮＡ断片を組み込む。ベクターから発現したｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔをもつ一本鎖ＲＮＡは、細胞内で相補配列が水素結合を行い、ヘアピン構造を作り、ｓｈＲＮＡと呼ばれる。ｓｈＲＮＡは、細胞内でループ構造部分が切断され、２本鎖のｓｉＲＮＡとなり、ＲＮＡｉ効果をもたらす。
【００４７】
なお、一般に、ｓｉＲＮＡと比較し、ｓｈＲＮＡは安定した発現が可能であり、アデノウイルスへの組み込みも容易である。また、ラット個体および肝臓細胞といった遺伝子導入効率の低い標的に対しても、アデノウイルスを使うことである程度の高効率での遺伝子発現が可能である。これらの特徴から、一過性のＲＮＡ干渉を行う際には、ｓｈＲＮＡ  アデノウイルスによる遺伝子のノックダウンを用いることが好ましい。もっとも、このことは、特に本願発明の範囲から他のＲＮＡ干渉法を除去する趣旨ではなく、ｓｈＲＮＡ  アデノウイルスを用いることが好ましいことを述べるに過ぎないものである。
【００４８】
ラットおよびマウスの肝臓組織におけるグルタチオン合成能をノックダウンするには、例えば、γ-グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素という二つの酵素のうちいずれをＲＮＡ干渉によりノックダウンしてもよいが、γ-グルタミルシステイン合成酵素が律速反応を触媒しているため、γ-グルタミルシステイン合成酵素をノックダウンすることが好ましい。
【００４９】
この場合、ラットのγ-グルタミルシステイン合成酵素をノックダウンするためのｓｈＲＮＡ配列としては、下記の配列番号１および配列番号２を含む配列を用いることが好ましい。下記の配列番号１および配列番号２を含む塩基配列からなるこれらの配列を含むｓｈＲＮＡを用いることにより、ラットのγ-グルタミルシステイン合成酵素の発現を好適に抑制することができ、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできるモデルラットが得られることが後述する実施例の実験データで確認されているからである。
【００５０】
配列番号１：ＧＵＧＵＧＡＡＵＧＵＣＣＡＧＡＧＵＵＡ
配列番号２：ＵＡＡＣＵＣＵＧＧＡＣＡＵＵＣＡＣＡＣ
なお、配列番号１および配列番号２は互いに相補的な配列である。また、配列の左側が５’末端であり、右側が３’末端である。
【００５１】
より具体的には、γ-グルタミルシステイン合成酵素をノックダウンするためのｓｈＲＮＡ配列としては、下記の配列番号３を含む配列を用いることが好ましい。この配列を含むｓｈＲＮＡを用いることにより、ラットのγ-グルタミルシステイン合成酵素の発現を好適に抑制することができ、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできるモデルラットが得られることが後述する実施例の実験データで確認されているからである。
【００５２】
配列番号３：ＧＡＵＣＣＧＵＧＵＧＡＡＵＧＵＣＣＡＧＡＧＵＵＡＧＡＡＧＣＵＵＧＵＡＡＣＵＣＵＧＧＡＣＡＵＵＣＡＣＡＣＵＵＵＵＵＵＧＧＡＡＧＣ
なお、配列番号３は、配列番号１および配列番号２がループ配列によって連結された配列である。また、配列の左側が５’末端であり、右側が３’末端である。
【００５３】
なお、この配列からなるｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ  アデノウイルスとして静脈内注射により投与することが好ましい。この場合、ｓｈＲＮＡ  アデノウイルスの投与ウイルス量は、後述の実験データに示すように、２．５×１０１０ＰＦＵ／ｋｇ以上であることが好ましく、より好ましくは５．０ｘ１０１０ＰＦＵ／ｋｇ以上であり、さらに好ましくは１０×１０１０ＰＦＵ／ｋｇ以上であり、最も好ましくは２０ｘ１０１０（２×１０１１）ＰＦＵ／ｋｇ以上である。これらの投与ウイルス量以上であれば、ラットの細胞内におけるγ―グルタミルシステイン合成酵素の発現をＲＮＡ干渉法により好適にノックダウンさせることができることが図６に示すように実験的に確認されているからである。
【００５４】
＜作用効果＞
以下、本実施形態の作用効果について説明する。
本実施形態のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、上記の特定の塩基配列からなるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであるため、これらのｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのいずれかをラットの細胞内で発現させることにより、後述する実施例の実験データで示すように、ラットの細胞内におけるγ―グルタミルシステイン合成酵素の発現をＲＮＡ干渉法によりノックダウンさせることができる。
【００５５】
そして、本実施形態の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物では、グルタチオン合成能がノックダウンされているため、同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、肝臓組織におけるグルタチオン含有量が有意に低くなる。したがって、同一種の野生型の非ヒト哺乳動物に対して、グルタチオン抱合能が有意に低くなり、薬物の活性代謝物のグルタチオン抱合による解毒作用を抑制することができる。
【００５６】
その結果、本実施形態の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物によれば、後述する実施例の実験データで示すように、通常であれば活性代謝物がグルタチオン抱合により解毒されてしまう薬物によるヒトにおける毒性発現のメカニズムの解明が可能となるので、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることができる。
【００５７】
そして、本実施形態の薬物動態の試験方法によれば、上記のいずれかの遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物またはその一部を用いるため、通常であれば活性代謝物がグルタチオン抱合により解毒されてしまう薬物による毒性発現のメカニズムの解明が可能となり、その薬物の活性代謝物によるヒトにおける毒性発現予測が可能となる。
【００５８】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００５９】
例えば、上記実施の形態では配列番号１および配列番号２を含む配列（すなわち配列番号３）からなるｓｈＲＮＡを用いたが、特に限定する趣旨ではなく、他の配列からなるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを用いてもよい。
【００６０】
例えば、配列番号：１に記載される塩基配列に対して１以上の塩基を欠失、置換、付加してなる第１の塩基配列と、配列番号：２に記載される塩基配列に対して１以上の塩基を欠失、置換、付加してなる第２の塩基配列と、を含む配列（すなわち、配列番号３に記載される塩基配列に対して１以上の塩基を欠失、置換、付加してなる第３の塩基配列）からなるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを用いてもよい。なぜなら、一般的には、ＲＮＡ干渉作用を示す塩基配列のうち１以上の塩基を欠失、置換、付加しても、同様のＲＮＡ干渉作用を示すためである。
【００６１】
また、哺乳動物の種類がマウスであれば、マウスのγ―グルタミルシステイン合成酵素の塩基配列に対応した配列からなるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを用いてもよい。このようにすれば、マウスのγ―グルタミルシステイン合成酵素の発現を好適に抑制でき、ヒトにおける毒性発現予測に役立てることのできるモデルマウスが得られるからである。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６３】
＜実験材料＞
Ｆ−３４４系ラット（雄性、７週齢）は日本ＳＬＣ（Ｓｈｉｚｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）より購入した。Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｄｕａｌ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）はタカラバイオ株式会社（Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）より購入した。ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｈＲＮＡ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＫｉｔｓはＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．）より購入した。ＣＣＫ−８は和光純薬工業（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）より購入した。トログリタゾンは第一三共株式会社（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より御供与頂いた。その他の試薬は和光純薬工業等の特級またはＨＰＬＣ用のものを用いた。
【００６４】
＜実施例１＞
＜実験方法１＞
γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスの作成
Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．）に依頼し、ラットγ−Ｇｃｓ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｍＲＮＡの配列からｓｉＲＮＡ配列（下記の配列番号：１および配列番号：２）を選択し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてノックダウン効果を確認した後、その配列を用いて二本鎖オリゴＤＮＡ（下記の配列番号：４および配列番号：５）を作成し、ｐＵ６プロモーターを持つｐＧＳＵ６−ＧＦＰベクターに組み込んだ。制限酵素Ｈｉｎｃ  ＩＩで目的配列およびｐＵ６プロモーターを切り出し、ｐＡｘｃｗｉｔコスミドベクターに組み込んだ。以後のアデノウイルス作成はＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｄｕａｌ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）を用い、マニュアルに従って行った。
【００６５】
配列番号１：ＧＵＧＵＧＡＡＵＧＵＣＣＡＧＡＧＵＵＡ
配列番号２：ＵＡＡＣＵＣＵＧＧＡＣＡＵＵＣＡＣＡＣ
配列番号４：ＧＴＧＴＧＡＡＴＧＴＣＣＡＧＡＧＴＴＡ
配列番号５：ＴＡＡＣＴＣＴＧＧＡＣＡＴＴＣＡＣＡＣ
なお、配列番号１および配列番号２は互いに相補的な配列である。配列番号４および配列番号５は互いに相補的な配列である。また、配列の左側が５’末端であり、右側が３’末端である。
【００６６】
＜実験方法２＞
γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスの細胞への感染
細胞はラット肝癌由来細胞のＨ４ＩＩＥ細胞およびＢＲＬ３Ａ細胞、マウス肝癌由来細胞のＨｅｐａ１−６細胞、ヒト肝癌由来細胞ＨＬＥ細胞を用いた。細胞を６ｗｅｌｌまたは１２ｗｅｌｌプレートにまき、７０〜１００％コンフルエントまで培養した。培地を除き、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ（下記の配列番号：３）発現アデノウイルス（下記の配列番号：３からなるｓｈＲＮＡを発現するための配列番号６からなるＤＮＡ配列を含む）をＭＯＩ  １０、ＭＯＩ  ２０で１時間感染させた。対照としてＬｕｃ（ルシフェラーゼ）ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを同様に感染させた。１時間感染操作を行った後に培地を添加し、その３日後におけるｍＲＮＡの発現をｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ  ＰＣＲにて、タンパク量をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにて測定した。また、総グルタチオン含量の測定も行った。
【００６７】
配列番号３：ＧＡＵＣＣＧＵＧＵＧＡＡＵＧＵＣＣＡＧＡＧＵＵＡＧＡＡＧＣＵＵＧＵＡＡＣＵＣＵＧＧＡＣＡＵＵＣＡＣＡＣＵＵＵＵＵＵＧＧＡＡＧＣ
配列番号６：ＧＡＴＣＣＧＴＧＴＧＡＡＴＧＴＣＣＡＧＡＧＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＧＴＡＡＣＴＣＴＧＧＡＣＡＴＴＣＡＣＡＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣ
なお、配列番号３は、配列番号１および配列番号２がループ配列によって連結された配列である。また、配列番号６は、配列番号４および配列番号５がループ配列によって連結された配列である。また、配列の左側が５’末端であり、右側が３’末端である。
【００６８】
＜実験方法３＞
総グルタチオン含量測定
総グルタチオン含量はＭａａｓらの方法（Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １４：  ５２３−５３０  ：２０００）に修正を加え、以下の方法により測定した。凍結融解を３回繰り返した細胞懸濁液５０μＬに５％メタリン酸液２５μＬを氷上で加え、１０分間放置した。０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．０）／５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を２２５μＬ添加して撹拌した。１５，０００ｇで５分間遠心分離後、上清１００μＬを分取し、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液／５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を加えて全量を１．９ｍＬとした。１ｍｇ／ｍＬ  ＯＰＴを１００μＬ添加することにより反応を開始した。遮光し、室温で１５分間放置した後、蛍光強度をＥｘ（励起波長）：３５０ｎｍ、Ｅｍ（蛍光波長）：４２０ｎｍで測定した。
【００６９】
＜実験方法４＞
γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルス感染細胞への薬物処置後ＣＣＫによる細胞生存率の検討
Ｈ４ＩＩＥ細胞を９６ｗｅｌｌプレートにまき、コンフルエントとした後、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを１時間感染させた。７２時間後に肝毒性化合物であるトログリタゾンおよびアセトアミノフェンを処置し、２４時間後に各ｗｅｌｌに試薬１０μＬを加え、１時間培養した。その後、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のプレートリーダーで吸光度を測定した。
【００７０】
＜実験結果１＞
γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスによるノックダウン効率の確認
ラット、マウスおよびヒト肝癌由来細胞を用い、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ  ＰＣＲで各々の動物種におけるγ−Ｇｃｓ  ｍＲＮＡを定量した。その結果、ラット肝癌由来細胞であるＢＲＬ３ＡおよびＨ４ＩＩＥ細胞においては対照群と比べて８０％以上の有意な減少を示した。なおヒト肝癌由来細胞ＨＬＥ細胞および、マウス肝癌由来細胞Ｈｅｐａ１−６細胞において、減少は認められたが、対照群と比べ有意な差ではなかった（図１）。
【００７１】
次に、ｍＲＮＡレベルで有意に減少が認められたラット肝癌由来細胞２種において総グルタチオン含量を測定したところ、Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルス処置の対象群と比較して、ＢＲＬ３Ａ細胞で約３０％、Ｈ４ＩＩＥ細胞で約５０％の細胞内総グルタチオン含量の減少が認められた（図２）。しかしながらＨＬＥ細胞およびＨｅｐａ１−６細胞においては殆どグルタチオン含量の減少は認められなかった（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。
【００７２】
細胞内総グルタチオン含量の減少が著しかったＨ４ＩＩＥ細胞において、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行い、γ−Ｇｃｓ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔタンパク質の発現を定量したところ、約８０％以上のタンパク発現レベルの減少が認められた（図３）。また、γ−Ｇｃｓ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｓｕｂｕｎｉｔタンパク発現量も同様にＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇで確認したところ、対照群と比べてγ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルス処置群とタンパク発現量に差は認められなかった（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。
【００７３】
＜実験結果２＞
γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスの細胞への薬物毒性の影響
γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスをＨ４ＩＩＥ細胞に感染させ、３日後に肝毒性化合物であるトログリタゾン２５、５０、１００  ｍＭおよびアセトアミノフェン０．１、０．５、１、５  ｍＭを２４時間処置したところ、対照群と比べて細胞毒性への影響に有意な差は認められなかった（図４）。
【００７４】
＜実施例２＞
＜実験方法＞
ラットへのγ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルス投与
図５は、実験の経日的なプロトコールをまとめた概念図である。Ｆ−３４４系統のラットに、塩化セシウム密度勾配を用いて精製したｇ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルス、および対照としてＬｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ＰＦＵ／ｋｇでｉ．ｖ．（静脈内注射）した。２週間後に、アセトアミノフェン３００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇをｐ．ｏ．投与（経口投与）し、２４時間後に尾静脈より採血してＡＬＴおよびＡＬＴを測定した（図５）。
【００７５】
なお、この実験を行うに際して行ったγ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスの投与ウイルス量の検討結果を図６に示す。このγ−ＧｃｓのｍＲＮＡ量で評価しており、ＧＡＰＤＨのｃｏｐｙ数で補正している。投与ウイルス量が２０ｘ１０１０（２×１０１１）ＰＦＵ／ｋｇでプラトーにさがっているので、２×１０１１ＰＦＵ／ｋｇを投与することにした。一方、対照のＬｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスのアデノ（右端の２本のカラム）では、全くγ−ＧｃｓのｍＲＮＡは低下していない。
【００７６】
＜実験結果＞
γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルス投与ラットにおけるアセトアミノフェンの毒性への影響
γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスおよびＬｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを投与したラットおよびウイルス投与を行っていないＦ−３４４系統のラットに対し、アセトアミノフェン３００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇをｐ．ｏ．投与してから２４時間後に、ＡＬＴおよびＡＳＴを測定した。
【００７７】
その結果、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスの投与により、肝臓にダメージが無いことを確認した（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。また、図７に示すように、高タイターγ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスの投与により、４０ｘ１０１０、８０ｘ１０１０ＰＦＵ／ｋｇの投与量で有意差がつくほどＡＬＴおよびＡＳＴが上昇している。一方、２０ｘ１０１０ＰＦＵ／ｋｇの投与量でも少しＡＬＴが上がっているが、有意差はついていない。
【００７８】
図８は、アセトアミノフェンを３００、１０００ｍｇ／ｋｇの投与量でＦ−３４４系統のラットに単回投与し、２４時間後にＡＬＴを測定した結果である。γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを投与したラットでは、劇症肝炎ほどの水準までＡＬＴが上昇した。このことは、このγ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを投与したラットでアセトアミノフェンによる肝障害が発生していることを示す決定的なデータであると考えられる。
【００７９】
一方、Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを投与したラットでも、アセトアミノフェンの投与量１０００ｍｇ／ｋｇで有意差がついてしまった。これは対照群のバラツキが極めて小さいために、２０程度のＡＬＴ値でも有意差がついてしまったものであると考えられる。よって、このことにより、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを投与したラットでアセトアミノフェンによる肝障害が発生していることが否定されるわけではない。
【００８０】
図９〜２２は、いずれも肝病理の観察結果を示す写真である。これらの図のなかでも、大きな１枚の写真からなる図は、門脈域と中心静脈両方がはいるような場所を１００倍で撮影したものである。一方、２枚の写真がならべてある図は、上が門脈域周囲、下が中心静脈周囲を撮影したものである。なお、記号の意味は、Ｐ：門脈域、ＣＶ：中心静脈である。
【００８１】
図９は、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域および中心静脈の両方が入る場所を１００倍で撮影した写真である。図９では、門脈域および中心静脈の両方ともにおいて、著変は認められなかった。
【００８２】
図１０は、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域周囲（上）および中心静脈周囲（下）をそれぞれ２００倍で撮影した写真である。図１０でも、門脈域および中心静脈の両方ともにおいて、著変は認められなかった。
【００８３】
図１１は、Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域および中心静脈の両方が入る場所を１００倍で撮影した写真である。図１１では、門脈域および中心静脈の両方ともにおいて、著変は認められなかったが、肝細胞の細胞質が少し淡明化していることが認められた。
【００８４】
図１２は、Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域周囲（上）および中心静脈周囲（下）をそれぞれ２００倍で撮影した写真である。図１２でも、門脈域および中心静脈の両方ともにおいて、著変は認められなかったが、肝細胞の細胞質が少し淡明化していることが認められた。
【００８５】
図１３は、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを８×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域および中心静脈の両方が入る場所を１００倍で撮影した写真である。図１３では、門脈域および中心静脈の両方ともにおいて、著変は認められなかった。
【００８６】
図１４は、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを８×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域周囲（上）および中心静脈周囲（下）をそれぞれ２００倍で撮影した写真である。図１４でも、門脈域および中心静脈の両方ともにおいて、著変は認められなかった。
【００８７】
図１５は、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後に、さらにＡＰＡＰを１０００ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域および中心静脈の両方が入る場所を１００倍で撮影した写真である。図１５では、ＡＰＡＰにより中心静脈周囲の肝細胞が変性（凝固壊死）しており、門脈域周辺はｉｎｔａｃｔである。
【００８８】
図１６は、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後に、さらにＡＰＡＰを１０００ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域周囲（上）および中心静脈周囲（下）をそれぞれ２００倍で撮影した写真である。図１６でも、ＡＰＡＰにより中心静脈周囲の肝細胞が変性（凝固壊死）しており、門脈域周辺はｉｎｔａｃｔである。
【００８９】
図１７は、Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後に、さらにＡＰＡＰを１０００ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域および中心静脈の両方が入る場所を１００倍で撮影した写真である。図１７では、門脈域および中心静脈の両方ともにおいて、著変は認められなかったが、肝細胞の細胞質が淡明化していることが認められた。
【００９０】
図１８は、Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後に、さらにＡＰＡＰを１０００ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域周囲（上）および中心静脈周囲（下）をそれぞれ２００倍で撮影した写真である。図１８でも、門脈域および中心静脈の両方ともにおいて、著変は認められなかったが、肝細胞の細胞質が淡明化していることが認められた。
【００９１】
図１９は、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後に、さらにＡＰＡＰを０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域および中心静脈の両方が入る場所を１００倍で撮影した写真である。図１９では、門脈域および中心静脈の両方ともにおいて、著変は認められなかった。
【００９２】
図２０は、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後に、さらにＡＰＡＰを０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域周囲（上）および中心静脈周囲（下）をそれぞれ２００倍で撮影した写真である。図２０でも、門脈域および中心静脈の両方ともにおいて、著変は認められなかった。
【００９３】
図２１は、Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後に、さらにＡＰＡＰを０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域および中心静脈の両方が入る場所を１００倍で撮影した写真である。図２１では、門脈域および中心静脈の両方ともにおいて、著変は認められなかったが、肝細胞の細胞質が淡明化していることが認められた。
【００９４】
図２２は、Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後に、さらにＡＰＡＰを０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域周囲（上）および中心静脈周囲（下）をそれぞれ２００倍で撮影した写真である。図２２でも、門脈域および中心静脈の両方ともにおいて、著変は認められなかったが、肝細胞の細胞質が淡明化していることが認められた。
【００９５】
上述の図９〜図２２で示したように、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを投与した後に、ＡＰＡＰを投与した群では、中心静脈周囲の肝細胞脱落が生じることが判明した。その他、ＡＰＡＰを投与した群では、肝細胞に見られる変化として、細胞質の空胞化が観察された。すなわち、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスおよびアセトアミノフェンを投与した群では、中心静脈周囲の肝細胞が変性（凝固壊死）することが明らかとなった。
【００９６】
一方で、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスのみを投与した群は、肝細胞になんの変化の所見もなかった。また、Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを投与した場合に、肝細胞に見られる変化として、淡明化が観察された。すなわち、対照のＬｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを投与した群でのみ、肝細胞に少しの淡明化がおきている。この淡明化の原因は不明であるが、障害とは認められない。
【００９７】
そして、Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを投与した後に、さらにアセトアミノフェンを投与した群でも、それ以上の所見はない。Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスのみで、肝細胞に少しの淡明化がおきていることは意外であるが、それ以外は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験結果から予想される結果であった。
【００９８】
＜考察＞
本実施例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスをラット細胞またはラット個体に処置することで、グルタチオン合成を抑制することにより、肝臓におけるグルタチオン抱合による解毒的な代謝能を低下させ、肝毒性化合物の毒性を増強される系の構築について検討した。
【００９９】
ここで、γ−Ｇｃｓは、ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔおよびｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｓｕｂｕｎｉｔによるヘテロダイマーで形成されている。今回選択したｓｈＲＮＡの配列は、ｇ−Ｇｃｓ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔに対応する配列であるため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｇ−Ｇｃｓ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔの発現をｍＲＮＡレベルおよびタンパクレベルで８０％以上の水準で有意に抑制できた。
【０１００】
しかし、γ−Ｇｃｓはグルタチオン合成における律速酵素でありながら、細胞内総グルタチオン含量を約５０％程度しか抑制できなかったことを考えると、グルタチオン合成能は、γ−Ｇｃｓタンパク質の発現がかなり抑制された状態でも、グルタチオン濃度を維持するように働く機構であると考えられる。また、トログリタゾンによる肝毒性はヒトでは認められるが、齧歯類においては認められない。齧歯類はヒトと比べて肝臓内グルタチオン含量およびグルタチオン抱合能が数倍高いことがその理由のひとつとして考えられている。
【０１０１】
今回、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの検討でラット肝癌由来細胞を用い、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを処置することで、細胞内グルタチオン含量を減少させ、トログリタゾン処置することで細胞毒性の増強が認められるか否か検討を行った。しかし、対照群と比べて細胞生存率に有意な差を認めることはできなかった。
【０１０２】
トログリタゾンの毒性は、トログリタゾン未変化体の毒性と、活性代謝物による毒性が考えられる。グルタチオンが関わる解毒機構はトログリタゾンの活性代謝物に対するものであると考えられる。Ｐ４５０を発現していない肝癌由来細胞では、活性代謝物が産生されず、グルタチオン減少による毒性への影響が確認できなかったと考えられる。
【０１０３】
これに対して、ｉｎ  ｖｉｖｏの試験でトログリタゾンに代えてアセトアミノフェンを用いた場合には、両者の肝障害を引き起こすメカニズムが異なるため、異なる結果が得られる可能性があると考えられる。
【０１０４】
すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏの検討としてＦ−３４４系ラットにアセトアミノフェンを投与する場合においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験結果からは、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを投与した群において、対照に対して有意にグルタチオン合成が減少し、その結果、対照と比べてＡＰＡＰ−ＧＳＨ産生量が有意に減少する可能性があると予測される。
【０１０５】
そして、Ｆ−３４４系ラットに対して、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスおよびアセトアミノフェンを投与することによるｉｎ  ｖｉｖｏの検討を行った結果、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを投与した群において、ＡＰＡＰ投与により実際に対照に対して有意にγ−Ｇｃｓ  ｍＲＮＡ発現量および肝臓組織におけるＧＳＨ含有量が減少することが明らかとなった。
【０１０６】
さらに、この場合に、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを投与した群において、ＡＰＡＰ投与により肝臓組織におけるＡＬＴおよびＡＳＴも有意かつ著しく上昇するため、実際に肝障害が発症していることが判明した。そして、この場合に、病理検査の結果でも、γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを投与した群において、ＡＰＡＰ投与により中心静脈周囲の肝細胞脱落が生じており、実際に肝障害が発症していることが確認された。
【０１０７】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【０１０８】
たとえば、上記実施例では、遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物としてＦ−３４４系ラットを用いたが、特に限定する趣旨ではなく、Ｗｉｓｔｅｒ系をはじめとする他の系統のラットを用いてもよい。さらに、薬物動態および毒性の前臨床試験において、ラットが第一選択肢として多用されるため、実施例はラットで示したが、上記の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物は、ラットに限られず、ラットと同様の齧歯類であるマウスであってもよい。そして、上記の遺伝子ノックダウン非ヒト哺乳動物は、齧歯類に限られず、例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヤギなどのヒト以外のほ乳類であればよい。もっとも、これらの場合には、適宜γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡの設計を変更することが好ましいことは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルス処理によるγ−Ｇｃｓ  ｍＲＮＡの発現変化を示すグラフである。
【図２】ＢＲＬ３ＡおよびＨ４ＩＩＥ細胞における総グルタチオン量に対するγ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルス処理の影響を示すグラフである。
【図３】γ−Ｇｃｓタンパク質発現に対するγ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルス処理の影響を示すグラフである。
【図４】トログリタゾンの細胞毒性に対するγ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルス処理の影響を示すグラフである。
【図５】ラットにおけるγ−Ｇｃｓノックダウンおよび薬物誘導肝障害の実験の方法を説明するための概念図である。
【図６】γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを感染させられたＦ３４４系統のラットにおけるγ−Ｇｃｓ  ｍＲＮＡおよびグルタチオンの量が投与量に依存して減少することを示すグラフである。
【図７】Ｆ３４４系統のラットにおけるアデノウイルス投与による肝障害を示すグラフおよび表である。
【図８】γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを感染させられたラットにおけるアセトアミノフェンによる肝障害効果を示すグラフである。
【図９】γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域および中心静脈の両方が入る場所を１００倍で撮影した写真である。
【図１０】γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域周囲（上）および中心静脈周囲（下）をそれぞれ２００倍で撮影した写真である。
【図１１】Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域および中心静脈の両方が入る場所を１００倍で撮影した写真である。
【図１２】Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域周囲（上）および中心静脈周囲（下）をそれぞれ２００倍で撮影した写真である。
【図１３】γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを８×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域および中心静脈の両方が入る場所を１００倍で撮影した写真である。
【図１４】γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを８×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域周囲（上）および中心静脈周囲（下）をそれぞれ２００倍で撮影した写真である。
【図１５】γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後に、さらにＡＰＡＰを１０００ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域および中心静脈の両方が入る場所を１００倍で撮影した写真である。
【図１６】γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後に、さらにＡＰＡＰを１０００ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域周囲（上）および中心静脈周囲（下）をそれぞれ２００倍で撮影した写真である。
【図１７】Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後に、さらにＡＰＡＰを１０００ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域および中心静脈の両方が入る場所を１００倍で撮影した写真である。
【図１８】Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後に、さらにＡＰＡＰを１０００ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域周囲（上）および中心静脈周囲（下）をそれぞれ２００倍で撮影した写真である。
【図１９】γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後に、さらにＡＰＡＰを０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域および中心静脈の両方が入る場所を１００倍で撮影した写真である。
【図２０】γ−Ｇｃｓ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後に、さらにＡＰＡＰを０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域周囲（上）および中心静脈周囲（下）をそれぞれ２００倍で撮影した写真である。
【図２１】Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後に、さらにＡＰＡＰを０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域および中心静脈の両方が入る場所を１００倍で撮影した写真である。
【図２２】Ｌｕｃ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２×１０１１ｐｆｕ／ｂｏｄｙの投与量で投与された後１４日後に、さらにＡＰＡＰを０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．で投与された後１４日後のＦ３４４系統のラットの肝臓組織における門脈域周囲（上）および中心静脈周囲（下）をそれぞれ２００倍で撮影した写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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