(57)【要約】【課題】本発明の課題は刺激光の照射位置を前もって確認するためのガイド光システムを簡便な構成で提供することである。【解決手段】本発明の課題はレーザを試料に照射することによって試料に光刺激を与える機能と前記レーザの照射位置を刺激前に指し示すガイド光を射出するガイド光源を備える顕微鏡において、前記ガイド光源は可動式であり、前記レーザの光路上を妨げる状態と妨げない状態で配置されることを特徴とする顕微鏡によって解決される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺激光を試料に照射することによって試料に光刺激を与える機能と前記刺激光の照射位置を刺激前に指し示すガイド光を射出するガイド光源を備える顕微鏡において、
前記ガイド光源は可動式であり、前記刺激光の光路を妨げる状態と妨げない状態で配置されることを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】
前記刺激光は対物レンズの焦点面と共役な位置に配置された絞りによって照射領域を制限され、
前記ガイド光源は前記絞りと前記刺激光を放射する刺激光源の間に配置されることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記ガイド光源は平面光源であることを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記試料内の蛍光物質を励起させるための励起光を射出する励起光源と、
前記刺激光の光路と前記励起光の光路が結合する光線分離手段をさらに備え、
前記光線分離手段と前記刺激光源の間に前記絞りが配置されることを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記ガイド光源は赤色光源であることを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記励起光と前記試料からの蛍光を分光する分光手段を備え、
前記分光手段と長波長光を遮断する励起フィルタの間に前記光線分離手段は配置されることを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記絞りの開口領域は可変であることを特徴とする請求項１から請求項６の何れかに記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、刺激光照射位置確認の為のガイド光照射システムを備えた顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物細胞内の蛋白や小器官の動態及び機能を解析する研究において、生物細胞内の一部に刺激光を照射し、その反応を観察する研究方法が広く知られている。
この研究方法の典型的な形は蛍光試料を抗体染色や遺伝子導入によって細胞内の観察対象に標識し、刺激光照射反応による蛍光の強度や分布を観察することによって細胞内の生体反応を調べるものである。
【０００３】
例えば、ＦＲＡＰ(Fluorescence Recovery After Photobleaching)と呼ばれる観察手法では、蛍光試料で着色した細胞質の一部に強い刺激光を当てることによって蛍光試料を漂白し、漂白されていない部分から漂白された領域に蛍光試料が戻っていく様子を観察する。このことによって細胞内の物質の動きを捉えることが出来る。また、ＦＬＩＰ(Fluorescence Loss In Photobleaching)と呼ばれる観察手法ではＦＲＡＰと違い刺激光を継続的に照射する。この手法もやはり細胞内の物質の動きを捉えることが出来る。
【０００４】
通常は暗い蛍光特性しか持たない蛍光蛋白質であるが、刺激光を照射することによって大きく蛍光強度が上がるものがある。これをPhoto Activationと呼ぶ。これを使うと、多くの細胞の中から選択的にマーキングが出来る。つまり、特定の細胞に着目することや追跡しながら観察をすることができる。また、Photo Conversionと呼ばれる現象を起こす蛍光試料では、刺激光を当てることにより可逆的に蛍光の色を変化させることが出来る。
【０００５】
さらにCaged試薬と呼ばれる試薬では不活性化した状態で生細胞の中に導入することが出来て、刺激光を照射することによってその試料を活性化させることが出来る。このCaged試薬を使えば目的の生体反応を望みのタイミングで引き起こすことが出来る。
【０００６】
上記に挙げた研究方法において、所望の位置に刺激光を照射することは非常に重要なことである。そこで、刺激光を照射する位置を事前に確認しておきたいという要望がある。そのためには、反応が起きない波長域の可視光により刺激光と同じ位置を照明する必要がある。そのための機能がガイド光であり、その実装の仕方についてはいくつかの先行例がある。
【０００７】
例えば特許文献１においては、単一の光源からの光を三つに分割し、分割した各々の光の波長、又は、光の強度を調節することで、試料が反応し得る刺激光から、反応が起こらないガイド光源に変換させることが開示されている。
【特許文献１】特開２００６−１３９０２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、先行技術に見られるガイド光システム簡略化については改良の余地が見られる。そして、上述のような光刺激を使った観察方法はより一般的になっていくことが予想されているので、ガイド光システムの簡略化に対する要求もより強くなっていくことが予想される。
【０００９】
そこで、本発明の課題は、刺激光の照射位置を前もって確認するためのガイド光システムを簡便な構成で提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の上記課題は、刺激光を試料に照射することによって試料に光刺激を与える機能と前記刺激光の照射位置を刺激前に指し示すガイド光を射出するガイド光源を備える顕微鏡において、前記ガイド光源は可動式であり、前記刺激光の光路を妨げる状態と妨げない状態で配置されることを特徴とする顕微鏡によって解決される。
【００１１】
さらに上記構成は、前記刺激光は対物レンズの焦点面と共役な位置に配置された絞りによって照射領域を制限され、前記ガイド光源は前記絞りと前記刺激光を放射する刺激光源の間に配置されることが望ましい。
【００１２】
また、前記ガイド光源は平面光源であることが好ましい。
上記構成に加え、前記試料内の蛍光物質を励起させるための励起光を射出する励起光源と、前記刺激光の光路と前記励起光の光路が結合する光線分離手段をさらに備え、前記光線分離手段と前記刺激光源の間に前記絞りが配置される構成も考えられる。
【００１３】
このとき、前記ガイド光源は赤色光源であることが好ましい。
さらに、前記励起光と前記試料からの蛍光を分光する分光手段を備え、前記分光手段と長波長光を遮断する励起フィルタの間に前記光線分離手段は配置されることが好ましい。
【００１４】
本発明における前記絞りの開口領域は可変であることが望ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、刺激光の照射位置を前もって確認するためのガイド光システムを簡便な構成で提供される。また、本発明によるガイド光システムは簡便な構成であるために、利用者にとって扱いやすく、また確実に操作が行える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、図面を参照しながら本実施の形態の説明を行う。
図１は、本実施の形態の顕微鏡の構成を示した図である。図１において、図示しないレーザ光源からレーザ導入部１１を介して刺激光が顕微鏡システムに導入される。典型的なレーザ導入部１１は、顕微鏡の外部に設置されたレーザ光源から光ファイバによって導かれる。そして、レーザ導入部１１から導入された刺激光はコリメータレンズ１２によって平行光束に変換され、試料面と共役な位置に配置された視野絞り１４に照射される。つまり、本構成による刺激光は視野絞り１４によって適切な領域に制限され、かつ試料面に対して垂直にかつ平行光束として照射される。
【００１７】
ここで、刺激光を照射する領域を適宜調節するために、視野絞り１４は開口領域が可変であることが望ましい。あるいは視野絞り１４は選択的に挿脱可能に設置してもよい。例えば、視野絞り１４の開口領域を円形や矩形にすることによって刺激光の照射領域も円形や矩形に設定することが出来る。
【００１８】
なお、刺激光は観察する試料や実験内容によって適切に調節されるものであるので、図示されないＮＤフィルタなどの光学フィルタを選択可能に配置することが望ましい。
視野絞り１４を通過した刺激光はリレーレンズ１７経由して対物レンズ１９に入射される。そして、対物レンズ１９より射出された刺激光は、上述のように、ステージ１５上の試料１６に平行光束となって照射される。
【００１９】
本発明では、上記のように照射される刺激光を前もって照射位置を確定させる方法を提供する。そのために本発明で採用した方法は、視野絞り１４とコリメータレンズ１２の間にガイド光源１３を挿脱可能に配置することである。
【００２０】
この配置によれば、ガイド光源１３からのガイド光も視野絞り１４によって制限され、その結果として刺激光と同じ領域を照射することができる。また、ガイド光源１３を付け加えるだけの構成なので、非常に簡便である。
【００２１】
このとき、ガイド光源１３は平面光源であることが好ましい。そうすることによって、視野絞り１４とガイド光源１３の間の距離を調節（あるいは設計）する必要がなくなる。例えばLED光源を利用すれば消費電力も少なく、かつガイド光源１３が小型軽量化できる。本発明によるガイド光源１３は可動式に設置されているので、小型軽量化は望ましい。
【００２２】
また、ガイド光源１３は赤色光を発することが好ましい。赤色光は可視光の中でエネルギーが低く、試料に対するダメージが少ない。また、後述する蛍光観察時には蛍光物質の褪色も抑えることが出来る。
【００２３】
図１における構成例では、試料の刺激だけではなく観察のための装置も備えている。
ハーフミラー１８はリレーレンズ１７と対物レンズ１９の間の光路に配置され、試料からの観察光と刺激光を分離する。なお、観察対象や手段によってはハーフミラー１８の代わりにダイクロイックミラーを利用する構成も考えられる。
【００２４】
ハーフミラー１８によって分離された観察光は結像レンズ２０によって撮像素子２１の受光面に結像される。つまり、撮像素子２１は受光面に結像された観察光を撮像する。このとき、撮像素子２１は静止画像用の撮像素子でも動画撮像用の撮像素子でもかまわない。動画撮像用の撮像素子を利用すれば、刺激光を照射された試料の時間変化を観察する際に便利である。
【００２５】
また、図１における構成例では透過照明用の装置も備えている。透過照明用光源２２から射出される照明光はコレクタレンズ２３やコンデンサレンズ２４などの照明光学系を経由して、ステージ１５上の試料１６を照らす。
【００２６】
上記のように、本構成例によれば透過照明により試料の形状を確認しながらガイド光を使って刺激光照射位置を決めることが出来る。また、更には、ガイド光用の光路を必要としないので、簡便な構成となる。
【００２７】
さらに上記構成は、刺激光は対物レンズ１９の焦点面と共役な位置に配置された絞りによって照射領域を制限され、ガイド光源１３は絞りと刺激光を放射する刺激光源の間に配置されている。よって、刺激光とガイド光の両方を一つの絞りによって制限できるので、簡単かつ確実に同じ領域を照射する構成となる。
【００２８】
次に、図２を使って本発明の実施におけるもう一つの構成例を説明する。図２は図１の構成例に加えて落射照明装置を備えている。刺激光を使った顕微鏡観察では蛍光観察を行うこと多いので、落射照明に対する装置構成を考えることは重要である。例えば、背景技術で述べた例の中でもＦＲＡＰ，ＦＬＩＰ，Photo activation，Photo conversionは一般に蛍光観察で行われる。
【００２９】
図2における本発明の実施例においては、落射照明に係わる装置以外の構成は図1における構成とほぼ同様である。
図2における落射照明は高輝度光源２５、リレーレンズ２６、励起フィルタ２７で実現される。高輝度光源２５はリレーレンズ２６で平行光束化され、励起フィルタ２７に照射される。ここで、励起フィルタ２７は、蛍光物質の励起に必要な短波長の光のみを透過させる。
【００３０】
なお、典型的な落射照明において、励起フィルタ２７は後段のダイクロイックミラー２８の付近に設置されることに注意したい。より詳しくは、励起フィルタ２７とダイクロイックミラー２８と蛍光フィルタ２９は多くの場合一つのユニットとして提供される。それを本構成では刺激光とガイド光の光路との結合地点であるハーフミラー１８よりも前段に配置している。その理由は、ガイド光は赤色を利用することが想定してあり、この赤色光が励起フィルタ２７によって妨げられないようにするためである。
【００３１】
また、本構成例で利用されるダイクロイックミラー２８は少し特殊なものである。本構成例で利用されるダイクロイックミラー２８は、典型的には長波長を透過して短波長を反射するものである。このとき、この分光が理想的に行われたならば、赤色光のガイド光はダイクロイックミラー２８を１００％透過してしまい、試料面に達することはできない。つまり、本構成例で利用されるダイクロイックミラー２８は赤色光の領域で１００％の透過率を有しているものは適さない。しかし、一般的なダイクロイックミラーは分光の境界付近では理想的な分光を実現するように設計されているが、赤色光領域のように分光の境界から離れたところでは理想的な性能を持ってはいない。つまり、一般的なダイクロイックミラーであれば、本発明の実施に差し支えない。
【００３２】
図２における構成例では、図１と同様に観察のための装置なども備えている。しかしこれらの構成と機能の説明は図1での説明と重複するのでここでは省略する。
以上のように、第二の実施の形態の顕微鏡装置は励起光を試料に照射する機構と刺激光を照射する機構を同時に備えた構成となっている。この構成によれば、蛍光観察において刺激光をガイドするシステムが提供される。
【００３３】
最後に図３を使って、挿脱可能に設置されたガイド光源１３の機構の一例を説明する。図３において、刺激光であるレーザは図示されないレーザ光源からレーザ導入部１１に導入される。レーザ導入部１１にはコリメータレンズ１２が内蔵されていて、レーザは適切な光束径に変換される。
【００３４】
レーザ導入部１１から射出されたレーザはＮＤフィルタによって光量を調節される。本構成例では、スライダ３１に設置された複数のＮＤフィルタの中から一つを選択することによってレーザの光量を調節する。
【００３５】
その後、レーザはガイド光源挿脱部３０を通過し、視野絞り１４に照射される。このときガイド光源挿脱部３０内のガイド光源１３がレーザの光路を遮らない状態であるときには、レーザは視野絞り１４に照射される。また、光路を遮る状態（図の状態）であるときには、ガイド光からのガイド光が視野絞り１４を照射する。つまり、ガイド光源挿脱部３０はガイド光源１３の抜き差しによって光路切り替え機能に相当する機能を実現する。
【００３６】
また、刺激光であるレーザもガイド光源１３からのガイド光も、同じ視野絞り１４によって照射領域を制限される。よってこの視野絞り１４を可変とすることによってガイド光と刺激光を同期させながら照射領域を変更できる。図3における構成例では、視野絞り１４の開口矩形領域を調節可能とした。
【００３７】
以上のように本発明によれば、刺激光の照射位置を前もって確認するためのガイド光システムを簡便な構成で提供される。
なお、本発明は上述の実施形態としての例に限らず、その趣旨を逸脱しない範囲で様々な変更が可能である。例えば、刺激光源としてUVフラッシュランプ光源等を利用することもできる。より一般には、ガイド光の強度が刺激光の強度の１／３程度以下であれば本発明の趣旨を逸脱しない実施が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本実施の形態の顕微鏡装置の構成図である。
【図２】本実施の形態の蛍光顕微鏡装置の構成図である。
【図３】ガイド光源近傍の構成図である。
【符号の説明】
【００３９】
１１      レーザ導入部
１２      コリメータレンズ
１３      ガイド光源
１４      視野絞り
１５      ステージ
１６      試料
１７      リレーレンズ
１８      ハーフミラー
１９      対物レンズ
２０      結像レンズ
２１      撮像素子
２２      透過照明用光源
２３      コレクタレンズ
２４      コンデンサレンズ
２５      高輝度光源
２６      リレーレンズ
２７      励起フィルタ
２８      ダイクロイックミラー
２９      蛍光フィルタ
３０      ガイド光源挿脱部
３１      スライダ
【図１】
2008158166.tif 000003
【図２】
2008158166.tif 000004
【図３】
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