(57)【要約】【解決すべき課題】ODSシリカゲル充填剤の製造方法として、従来のものより不活性化がなされているものの製造方法を見出すこと。【解決手段】下記工程を含むODSシリカゲル充填剤の製造方法：  −アミン化合物を用いた一次エンドキャッピング、  −一次エンドキャッピングに用いられたアミン化合物と異なるアミン化合物を用いた二次エンドキャッピング、および  −二次エンドキャッピングを行ったODSシリカゲル充填剤に、第三級アミンを用いて追加のエンドキャッピングを行う工程。【選択図】図２
2008232802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含むODSシリカゲル充填剤の製造方法：
−アミン化合物を用いた一次エンドキャッピング、
−一次エンドキャッピングに用いられたアミン化合物と異なるアミン化合物を用いた二次エンドキャッピング、および
−二次エンドキャッピングを行ったODSシリカゲル充填剤に、第三級アミンを用いて追加のエンドキャッピングを行う工程。
【請求項２】
追加のエンドキャッピングが三次エンドキャッピングのみであり、前記三次エンドキャッピングに用いるアミン化合物が第三級アミンのみである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
三次エンドキャッピングが９０℃〜９８．３℃の温度で行われる、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
二次エンドキャッピングに用いられるアミン化合物が第二級アミンおよび第三級アミンのいずれか一方である、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
二次エンドキャッピングに用いられるアミン化合物が第二級アミンのみであり、二次エンドキャッピングが２００℃〜３００℃の温度において行われる、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
二次エンドキャッピングに用いられるアミン化合物が第二級アミンおよび第三級アミンである、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
一次エンドキャッピングに用いられるアミン化合物が第二級アミンのみまたは第三級アミンのみである、請求項６に記載の製造方法。  
【請求項８】
二次エンドキャッピングに用いられるシリル化剤の添加量とアミン化合物の添加量との比が、１：１〜１：１０である、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
追加のエンドキャッピングを行う前のODSシリカゲル充填剤と追加のエンドキャッピングを行った後のODSシリカゲル充填剤の塩基性および配位性を有する化合物に対するピークの高さの比が、１：２〜１：２０である、請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
二次エンドキャッピングを行う前のODSシリカゲル充填剤と二次エンドキャッピングを行った後のODSシリカゲル充填剤の塩基性を有する化合物に対するピークの高さの比が、１：２〜１：２０である、請求項６〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法によって製造されるODSシリカゲル充填剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ODSシリカゲル充填剤の新規な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シリカゲルを基材とした逆相クロマトグラフィー（RPLC）は、オクタデシルシリル（ODS）シリカゲル充填剤が最も多く使用されているが、溶離において同充填剤と塩基性化合物との間に不可逆的な二次相互作用が生じることが、その開発以来課題となっている。
【０００３】
現在、ODSシリカゲル充填剤と溶質の不可逆的な二次相互作用は、その原因として化学修飾後の残存シラノールが原因であることが良く知られているが、シリカゲル中の金属不純物と配位性化合物との不可逆的な二次相互作用の例も報告されている（非特許文献１〜３）。そのため、オキシン銅、ヒノキチオール等の、とくに配位性の強い化合物のHPLC分析には金属不純物含量の少ない高純度シリカゲルを原料に使用したODSシリカゲル充填剤を使用することが一般的となっている。その結果、ODSシリカゲル充填剤の性能は飛躍的に向上し、ほとんどの配位性化合物の溶出挙動には問題がなくなったように考えられている。
【０００４】
しかしながら、高感度分析（微量分析）を実施する際には、オキシン銅、ヒノキチオールのような配位性化合物には、依然として不可逆的な二次相互作用が生じる場合がある。このような二次相互作用を具体的に挙げると、酸性領域における配位性化合物、とくにオキシン銅、ヒノキチオールを代表とする化合物の不可逆的な二次相互作用、および中性付近における強塩基性化合物の不可逆的な二次相互作用である。
【０００５】
このような不可逆的な二次相互作用に対する対策として、ODSシリカゲル充填剤に対する二次シリル化、すなわち、エンドキャッピングがある。エンドキャッピングの方法としては、トルエン還流温度でピリジン等の有機塩基の存在下トリメチルクロロシラン（TMCS)でシリル化反応する方法が一般的な方法として実施されているが（非特許文献４〜６）、反応温度を高温にした反応（200℃以上）（非特許文献７）、シリル化反応を密閉された不活性ガス中で行う気相反応（特許文献１）、オートクレーブ中の反応（非特許文献８、特許文献２〜３）、超臨界流体中の反応（非特許文献９、特許文献４）等、種々の反応条件を必要とする方法も報告されている。
また、反応促進剤として２種以上の異なるアミン化合物を用いてエンドキャッピングを行うことを含む方法もある（特許文献５）。この方法においては、エンドキャッピングを２回以上に分けて行ってもよいとされている。
【０００６】
エンドキャッピングの反応温度、反応の雰囲気等についての検討は上記のとおり行われているところ、反応試薬、例えばシリル化剤の検討に関しては一部実施されてはいるが（非特許文献１０）、他の反応試薬についての検討はほとんど実施されていないのが現状である。これに加え、現在報告されているエンドキャッピングの方法で製造されたODSシリカゲル充填剤は、高純度シリカゲルを使用しているにもかかわらず、不活性化が充分に達成されているとはいい難いという状況もある。また、エンドキャッピング後の洗浄操作が必要である等、操作が煩雑であるという問題もある（特許文献５）。
【０００７】
【非特許文献１】M. Verzele and C. Dewaele, Chromatographia, 18(1984)314．
【非特許文献２】Y.Ohtsu, Y.Shiojima, J.Koyama, K.Nakamura, K.Kimata and N.Tanaka, J.Chromatogr.,481(1989)147
【非特許文献３】K. Kimata, N.Tanaka,and T.Araki, J. Chromatogr., 594 (1992) 87
【非特許文献４】C.H. Lochmueller, and D.B. Marshall,Analitica Chimica Acta, 142(1982)63
【非特許文献５】K.Jinno, S.Shimura,N.Tanaka,K.Kimata,J.C.Fetzer and W.R.Biggs, Chromatographia, 27(1989) 285
【非特許文献６】N.Nagae, Y.Hatano and D.Ishii, Chromatography, 14(1993)45R
【非特許文献７】酒井芳博、浜川大爾、太田鈴枝、第2回LCテクノプラザ講演要旨集、BP２（1997）51
【非特許文献８】Y.Sakai and M.Hosoda, Chromatography, 17(1996)39
【非特許文献９】鎗田孝、井原俊英、堀本能之、野村明、第4回LCテクノプラザ講演要旨集、BP２（1999）36
【非特許文献１０】榊啓二、Separation Sciences ’94講演要旨集、21Ｐ（1994）
【非特許文献１１】D.W.Sindorf and G.E. Maciel, J. Am. Chem. Soc., 103(1981) 4263
【非特許文献１２】K.L.Miller and R.W. Linton, J. Chromatogr., 319(1985) 9
【非特許文献１３】N.Nagae, Chromatograhy, 15(1994) 175
【非特許文献１４】中村洋監修、“液クロ龍の巻”  ｐ32、筑波出版会
【非特許文献１５】日本分析化学会関東支部編，“高速液体クロマトグラフィーハンドブック”改訂2版、98、丸善株式会社
【特許文献１】特許第2611545号公報
【特許文献２】特開平6−174708号公報
【特許文献３】特開平10−73579号公報
【特許文献４】特許第2818857号公報
【特許文献５】特開2003-172733号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明は、上記の問題を解決し、ODSシリカゲル充填剤の製造方法として、従来のものより不活性化がなされているODSシリカゲル充填剤の、より簡便な製造方法を見出すことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題に鑑み、本発明者らは、エンドキャッピングの回数や反応試薬を従来のものから変更することによって、驚くべきことに、ODSシリカゲル充填剤の不活性化がさらになされることを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の各発明に関する：
（１）下記を含むODSシリカゲル充填剤の製造方法：
−アミン化合物を用いた一次エンドキャッピング、
−一次エンドキャッピングに用いられたアミン化合物と異なるアミン化合物を用いた二次エンドキャッピング、
−二次エンドキャッピングを行ったODSシリカゲル充填剤に、第三級アミンを用いて追加のエンドキャッピング。
（２）追加のエンドキャッピングが三次エンドキャッピングのみであり、前記三次エンドキャッピングに用いるアミン化合物が第三級アミンのみである、前記製造方法。
（３）三次エンドキャッピングが９０℃〜９８．３℃の温度で行われる、前記製造方法。
（４）二次エンドキャッピングに用いられるアミン化合物が第二級アミンおよび第三級アミンのいずれか一方である、前記製造方法。
（５）二次エンドキャッピングに用いられるアミン化合物が第二級アミンのみであり、二次エンドキャッピングが２００℃〜３００℃の温度において行われる、前記製造方法。
（６）二次エンドキャッピングに用いられるアミン化合物が第二級アミンおよび第三級アミンである、前記製造方法。
（７）一次エンドキャッピングに用いられるアミン化合物が第二級アミンのみまたは第三級アミンのみである、前記製造方法。
（８）二次エンドキャッピングに用いられるシリル化剤の添加量とアミン化合物の添加量との比が、１：１〜１：１０である、前記製造方法。
（９）追加のエンドキャッピングを行う前のODSシリカゲル充填剤と追加のエンドキャッピングを行った後のODSシリカゲル充填剤の塩基性および配位性を有する化合物に対するピークの高さの比が、１：２〜１：２０である、前記製造方法。
（１０）二次エンドキャッピングを行う前のODSシリカゲル充填剤と二次エンドキャッピングを行った後のODSシリカゲル充填剤の塩基性を有する化合物に対するピークの高さの比が、１：２〜１：２０である、前記製造方法。
（１１）前記いずれかに記載の製造方法によって製造されるODSシリカゲル充填剤。
【００１０】
本発明は、ODSシリカゲル充填剤の完全不活性化が困難な理由を、シリカゲル表面のシラノールの性質および反応試薬であるシリル化剤の反応性の両面から検討した結果なされたものである。
現在シリカゲルの表面に存在するシラノールは29Si CP/MAS NMR、の測定結果から１）孤立シラノール（Isolated Silanol）、２）会合型シラノール（Vicinal Silanol）、３）ジオール型シラノール（Geminal Silanol）に分類されているが（非特許文献１１〜１３）、これらシラノールのうち、会合型シラノールが最も反応性が強いといわれている。（非特許文献１２）
【００１１】
また、シリル化剤の反応性は、「クロロシラン類の代表はトリメチルクロロシラン（TMCS）であるが、シリル化に際しては化学量論よりやや過剰の第三級アミン（トリエチルアミン、ピリジン、トリメチルアミン）を併用するとうまく反応が進む」かつ「第二級シリルアミンであるジエチルトリメチルシリルアミン（NEt2−TMS）は室温で定量的にエカトリアルOH基と反応するが、アキシャルOH基とは反応しない」という特徴も有している。
【００１２】
本発明者らは、これらシリカゲル表面のシラノールの性質および、反応試薬であるシリル化剤の反応性を考慮し、エンドキャッピングの条件を検討した。その結果、エンドキャッピングに用いられる反応促進剤の種類を改変すること、または特定の反応促進剤を用いてエンドキャッピングを加重して行うことによって、ODSシリカゲル充填剤の不活性化の程度を従来品より顕著に高めることができることを見出したのである。
例えば、後述するように、第二級シリルアミンで一次エンドキャッピングを行ったODSシリカゲル充填剤を二次エンドキャッピングで第二級シリルアミンとTMCS／第三級アミンの混合液で反応させることによって、プロカインアミドのような溶質の溶出挙動を改善することができる。また、三次エンドキャッピング（最終）にTMCS／第三級アミンをエンドキャッピング剤として使用する三段階反応を行うことで、従来困難であったトルエン還流温度下の反応温度でも短時間（各ステップの反応時間は3〜5時間）の反応で完全エンドキャッピングが可能になる。
さらに、TMCS／第三級アミンで一次エンドキャッピングを行ったODSシリカゲル充填剤については、この一次エンドキャッピング品を使用して製造しているMightysil RP-18GP（二次エンドキャッピングの段階で第二級シリルアミンを使用した高温エンドキャッピング法を採用）をTMCS／第三級アミンでエンドキャッピングを行うと、とくに良好な品質のODSシリカゲル充填剤が得られる。
【００１３】
すなわち、本発明によれば、特定の反応促進剤を用いた一次エンドキャッピングおよび二次エンドキャッピングを行ったODSシリカゲル充填剤に対して、追加のエンドキャッピングを行い、例えば、最終エンドキャッピングを、TMCS／第三級アミンで実施することによって、極限までシラノールをなくすことが可能なのである。言い換えると本発明を応用することによって、高品位 ODSシリカゲル充填剤の製造が可能になるのである。
【発明の効果】
【００１４】
（１）本発明のODSシリカゲル充填剤の製造方法によれば、シリカゲルの不活性化の程度が高いODSシリカゲル充填剤が簡便に得られる。
（２）追加のエンドキャッピングが三次エンドキャッピングのみであり、前記三次エンドキャッピングに用いるアミン化合物が第三級アミンのみであるものによれば、シリカゲルの不活性化の程度が高いODSシリカゲル充填剤が効率的に得られる。
（３）本発明のODSシリカゲル充填剤の製造方法のうち、三次エンドキャッピングが９０℃〜９８．３℃の温度で行われるものによれば、有害なトルエンを用いることなく、安全にODSシリカゲル充填剤が得られる。
（４）本発明のODSシリカゲル充填剤の製造方法のうち、二次エンドキャッピングに用いられるアミン化合物が第二級アミンおよび第三級アミンのいずれか一方である、シリカゲルの不活性化の程度がより高いODSシリカゲル充填剤がより簡便に得られる。
（５）本発明のODSシリカゲル充填剤の製造方法のうち、二次エンドキャッピングに用いられるアミン化合物が第二級アミンのみであり、二次エンドキャッピングが２００℃〜３００℃の温度において行われるものによれば、シリカゲルの不活性化の程度がより一層高いODSシリカゲル充填剤が得られる。
（６）本発明のODSシリカゲル充填剤の製造方法のうち、二次エンドキャッピングに用いられるアミン化合物が第二級アミンおよび第三級アミンであるものによれば、シリカゲルの不活性化の程度がより一層高いODSシリカゲル充填剤が得られる。
（７）本発明のODSシリカゲル充填剤の製造方法のうち、一次エンドキャッピングに用いられるアミン化合物が第二級アミンのみまたは第三級アミンのみであるものによれば、シリカゲルの不活性化の程度がより一層高いODSシリカゲル充填剤がより簡便に得られる。
（８）本発明のODSシリカゲル充填剤の製造方法のうち、二次エンドキャッピングに用いられるシリル化剤の添加量とアミン化合物の添加量との比が、１：１〜１：１０であるものによれば、シリカゲルの不活性化の程度がより一層高いODSシリカゲル充填剤がより一層簡便に得られる。
（９）追加のエンドキャッピングを行う前のODSシリカゲル充填剤と追加のエンドキャッピングを行った後のODSシリカゲル充填剤の塩基性および配位性を有する化合物に対するピークの高さの比が、１：２〜１：２０であるであるものによれば、シリカゲルの不活性化の程度がさらにより一層高いODSシリカゲル充填剤が得られる。
（１０）本発明のODSシリカゲル充填剤の製造方法のうち、二次エンドキャッピングを行う前のODSシリカゲル充填剤と二次エンドキャッピングを行った後のODSシリカゲル充填剤の塩基性を有する化合物に対するピークの高さの比が、１：２〜１：２０であるものによれば、とくに塩基性を有し配位性を有さない化合物の溶出に対して、シリカゲルの不活性化の程度がさらにより一層高いODSシリカゲル充填剤が得られる。
（１１）前記いずれかに記載の製造方法によって製造されるODSシリカゲル充填剤は、シリカゲルの不活性化の程度が従来品より高いODSシリカゲル充填剤である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のODSシリカゲル充填剤の製造方法は、
（Ａ）少なくとも二次エンドキャッピングまでを行ったODSシリカゲル充填剤に、第三級アミンを用いて追加のエンドキャッピングを行う工程および
（Ｂ）一次エンドキャッピングに用いられたアミン化合物と異なるアミン化合物を用いた二次エンドキャッピングを行う工程、
を含む。
【００１６】
本発明において「一次エンドキャッピング」、「二次エンドキャッピング」および「三次エンドキャッピング」とは、それぞれエンドキャッピングを行っていないODSシリカゲル充填剤、すなわちシラン化を行っていないシリカゲルに対する最初のシラン化の後最初に行われるエンドキャッピング、前記一次エンドキャッピングの後最初に行われるエンドキャッピングおよび前記二次エンドキャッピングの後最初に行われるエンドキャッピングに行われるエンドキャッピングを意味する。また、「追加のエンドキャッピング」とは、既にエンドキャッピングが行われたODSシリカゲル充填剤にさらに行われるあらゆるエンドキャッピングを意味する。
【００１７】
本発明に用いられるシリカゲルは限定されないが、化学修飾を高効率に行える５０〜８００ｍ2/ｇの比表面積のものが好適に用いられる。より好ましくは２００〜４００ｍ2/ｇである。さらに、粒子径２〜２００μｍ、より好ましくは２〜１５μｍ、細孔径４０〜１０００Å、より好ましくは４０〜２００Åのものが好適に用いられる。
シリカゲルに化学結合させるＯＤＳ基としては、ジメチルオクタデシル基、メチルオクタデシル基、オクタデシル基のようなオクタデシル基を有するものであればいずれも用いることができる。用いられるシリル化剤としては、トリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）、ジメチルクロロオクタデシルシシラン（DMCODS）およびトリメチルクロロシラン等が好ましい。
【００１８】
また、本発明において、ＯＤＳ化およびエンドキャッピングには、反応促進剤としてアミン化合物を用いることが好ましい。かかるアミン化合物は、第一級、第二級および第三級のアミンのいずれも用いることができる。第一級アミンとしては、エチルアミン、ブチルアミン、プロピルアミン等が例示され、第二級アミンとしては、ジエチルアミン（ＤＥＡ）、ジブチルアミン、ジイソプロピルアミン、モルホリン、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）等が例示され、第三級アミンとしては、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、トリブチルアミン、ピリジン等が例示される。常温で液体であり、使い易さの点から、第二級アミンのジエチルアミン、ヘキサメチルジシラザン、第三級アミンのトリエチルアミン、ピリジン等がとくに好適に用いられる。
【００１９】
アミン化合物は２種以上を組み合わせて用いることも可能であり、かかる組み合わせとしては、ヘキサメチルジシラザンとピリジンまたはトリエチルアミン、ジエチルアミンとトリエチルアミン等が好ましく、ヘキサメチルジシラザンとトリエチルアミンとの組み合わせがとくに好ましい。
【００２０】
エンドキャッピングにおいて反応促進剤としてアミン化合物を用いる場合、エンドキャッピングにはいずれの方法を用いて行ってもよい。例えば、ＯＤＳ化にＤＥＡ等の第二級アミンを反応促進剤として使用した場合、一次エンドキャッピングにおいて反応促進剤としてＤＥＡ、ヘキサメチルジシラザン等の第二級アミンの存在下トリメチルクロロシランを作用させた後、さらに級の異なるピリジンやＴＥＡ等の第三級アミンの存在下トリメチルクロロシランを二次エンドキャッピングにおいて作用させることが例示される。
また、例えば、ＯＤＳ化反応に第三級アミンであるＴＥＡを反応促進剤に使用した場合、一次エンドキャッピングとして反応促進剤としてピリジンやＴＥＡ等の第三級アミンの存在下トリメチルクロロシランを作用させた後、さらに級の異なるＤＥＡ、ヘキサメチルジシラザン等の第二級アミンの存在下トリメチルクロロシランを二次エンドキャッピングとして作用させることが例示される。
本発明によるＯＤＳ化反応には、特許文献５に記載の方法などの公知の方法を用いることができる。
【００２１】
シリカゲル充填剤のエンドキャッピング方法として、トルエンまたは流動パラフィンなどを溶媒とする公知の方法を用いることができる。ヘキサメチルジシラザンを反応促進剤に使用する場合は、より短時間にエンドキャッピングを行うために、流動パラフィンを溶媒に用いることは好ましい。
【００２２】
・工程（Ａ）について
工程（Ａ）は、少なくとも二次エンドキャッピングまでを行ったODSシリカゲル充填剤に第三級アミンを用いて追加のエンドキャッピングを行う工程である。
【００２３】
本発明のODSシリカゲル充填剤の製造方法のうち、工程（Ａ）における追加のエンドキャッピングの回数は限定されないが、製造効率を考慮すると、三次エンドキャッピングを最終のエンドキャッピングとするものが好ましい。
追加のエンドキャッピングに用いられるシリル化促進剤は第三級アミンであり、とくにＴＥＡが好ましい。したがって、三次エンドキャッピングを最終のエンドキャッピングとし、かつシリル化促進剤としてＴＥＡを用いることはとくに好ましい。
【００２４】
本発明の製造方法において、一次エンドキャッピングおよび二次エンドキャッピングの方法は、それぞれのエンドキャッピングに用いられるアミン化合物の種類が同一でなければ限定されず、上記のような単一のアミン化合物をそれぞれにおいて用いる公知の方法を用いることができるほか、アミン化合物を組み合わせて用いることもできる。
単一のアミン化合物を一次エンドキャッピングおよび二次エンドキャッピングのそれぞれにおいて用いる場合には、級が異なるアミン化合物を用いることが好ましく、一次エンドキャッピングを第二級アミンを用いて行い、二次エンドキャッピングを第三級アミンを用いて行うことはとくに好ましい。
【００２５】
また、一次エンドキャッピングを第三級アミンを用いて行い、二次エンドキャッピングを第二級アミンを用いて行う場合、二次エンドキャッピングを高温の温度において行うことは好ましい。かかる温度は、典型的には２００℃〜３００℃の温度であり、好ましくは２２０℃〜２８０℃の温度であり、より好ましくは２３０℃〜２５０℃の温度である。
【００２６】
アミン化合物を組み合わせて用いる場合、用いられるアミン化合物は、それぞれを順次添加して用いてもよいし、全てのアミン化合物を混合して用いてもよい。ヘキサメチルジシラザンとトリエチルアミンとを組み合わせて用いることは好ましく、これらのアミン化合物を順次添加して用いることはより好ましい。
【００２７】
各エンドキャッピングに用いられるシリル化剤の添加量とアミン化合物の添加量は、シリカゲルの不活性化が促進されるものであれば限定されない。シリル化剤の添加量とアミン化合物の添加量との比は、好ましくは１：１〜１：１０であり、より好ましくは１：２〜１：９であり、最も好ましくは１：２．３〜１：４．５である。
追加のエンドキャッピングの方法も限定されず、トルエン還流法、高温液相法、気相方法および超臨界法のような公知の方法を用いることができる。また、追加のエンドキャッピングは、ｎ−ヘプタンのような炭化水素を溶媒として用いて、かかる溶媒の沸点以下の温度である１００℃未満の温度で行うこともできる。したがって、工程（Ａ）を用いる製造方法においては、従来法、例えば、１１０℃前後の温度で行われるトルエン還流法に比して、はるかにより低温下において行うことができる。かかる温度は、好ましくは９０℃〜９８．３℃であり、より好ましくは９０℃〜９８℃であり、最も好ましくは９７℃〜９８℃である。
【００２８】
・工程（Ｂ）について
工程（Ｂ）は、一次エンドキャッピングに用いられたアミン化合物と異なるアミン化合物を用いた二次エンドキャッピングを行う工程である。「異なるアミン化合物」とは、同一でない１種または２種以上のアミン化合物を意味し、共通して用いられるアミン化合物が存在してもよい。例えば、第二級アミン単体と第二級アミンおよび第三級アミンの併用は、それぞれ異なるアミン化合物である。
本発明の方法において、一次エンドキャッピングの方法および反応試薬の種類は限定されず、上記のような単一のアミン化合物をそれぞれにおいて用いる公知の方法を用いることができるほか、アミン化合物を組み合わせて用いることもできる。一次エンドキャッピングにおいてアミン化合物を組み合わせて用いることは好ましく、とくに第二級アミンを組み合わせて用いることが好ましい。最も好ましい組み合わせは、ＨＭＤＳとＤＥＡとの組み合わせである。
【００２９】
また、一次エンドキャッピングを第三級アミンを用いて行い、二次エンドキャッピングを１種または２種以上の第二級アミンを用いて行う場合、二次エンドキャッピングを高温の温度において行うことは好ましい。かかる温度は、典型的には２００℃〜３００℃の温度であり、好ましくは２２０℃〜２８０℃の温度であり、より好ましくは２３０℃〜２５０℃の温度である。
【００３０】
工程（Ｂ）において用いられるアミン化合物を組み合わせは、相互に級が異なるものが好ましく、第二級アミンと第三級アミンとの組み合わせがより好ましく、ヘキサメチルジシラザンとトリエチルアミンとを組み合わせて用いることは最も好ましい。
工程（Ｂ）において用いられるアミン化合物を組み合わせは、それぞれを順次添加して用いてもよいし、全てを混合して用いてもよい。これらのアミン化合物を順次添加して用いることはより好ましい。
【００３１】
各エンドキャッピングに用いられるシリル化剤の添加量とアミン化合物の添加量は、シリカゲルの不活性化が促進されるものであれば限定されないことは上記のとおりであるところ、工程（Ｂ）においても、アミン化合物の合計添加量をシリル化剤の添加量より大きくすることは好ましい。したがって、シリル化剤の添加量とアミン化合物の合計添加量との比は、好ましくは１：１〜１：１０であり、より好ましくは１：２〜１：９であり、最も好ましくは１：２．３〜１：４．５である。
【００３２】
本発明のODSシリカゲル充填剤の製造方法における工程（Ａ）または（Ｂ）によって、同充填剤の溶質に対するピークの高さが増大するところ、
（１）工程（Ａ）における追加のエンドキャッピングを行う前のODSシリカゲル充填剤と追加のエンドキャッピングを行った後のODSシリカゲル充填剤の塩基性および配位性を有する化合物に対するピークの高さの比、および／または
（２）工程（Ｂ）における二次エンドキャッピングを行う前のODSシリカゲル充填剤と二次エンドキャッピングを行った後のODSシリカゲル充填剤の塩基性および配位性を有する化合物に対するピークの高さの比が、それぞれ１：２〜１：２０であるものは好ましい。
【００３３】
本発明はODSシリカゲル充填剤にも関するところ、かかるODSシリカゲル充填剤の製造方法は、上記工程（Ａ）および（Ｂ）を含む製造方法であれば限定されず、他の工程については公知の方法が用いられる。
また、本発明においては、従来技術においては必須であるエンドキャッピング後のＯＤＳシリカゲルの酸洗浄は不要であるという利点がある。
【００３４】
本発明の製造方法によって製造されたＯＤＳシリカゲル充填剤は、カラムに充填されＨＰＬＣ測定に用いられる。カラムの材質は、ステンレス性もしくはポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリスチレンなどの樹脂性であってもよい。
本発明によるＯＤＳシリカゲル充填剤で測定できる物質にとくに制限はない。例えば、オキシン銅、チウラム、アシュラム、メコプロップ、ベンスリドなどのゴルフ場農薬、アルジカルブ、メチオカルブなどのカーバメート系農薬、ベンジルアミン、プロカインアミドなどの塩基性物質、安息香酸、ソルビン酸、デヒドロ酢酸などの有機酸やそのエステル類、カフェインやフェノールなどの種々の物質が挙げられる。有利なことに、従来再現性よく分析することが困難であったオキシン銅に、とくに好ましく適用することができる。
【００３５】
次に本発明を例によってさらに詳細に説明するが、かかる例はあくまで本発明の例示にすぎないものであって、如何なる意味においても本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３６】
［実施例１］
１．実験
１−１  ODS充填剤の新規エンドキャッピング
エンドキャッピングの検討には、異なる一次エンドキャッピングを行った充填剤であるODS-DDとODS-DTｐを使用した。すなわち、ODS-DDは、第二級シリルアミンで一次エンドキャッピングした充填剤であり、ODS-DTpは、TMCS／第三級アミンで一次エンドキャッピングした充填剤であり、それらの反応性の違いを検討した。
また、反応性の違いを確認する実験としてMightysil RP-18GPをTMCS／第三級アミンでエンドキャッピングした結果も検討した。
【００３７】
１-１-１  一次エンドキャッピング充填剤ODS-DDの合成方法
120℃で3時間乾燥した高純度シリカゲル（粒子径 5μm、平均細孔径12nm、比表面積350m2/g）にジメチルクロロオクタデシルシシラン（DMCODS）を第二級アミンであるジエチルアミン（DEA）を反応促進剤として反応させ合成したODSシリカゲル（ODS‐D）を原料に、一次エンドキャッピングのエンドキャッピング剤としてHMDSを用い、DEA存在下、トルエン還流温度下（110℃）で反応させた。
【００３８】
１-１-２  一次エンドキャッピング充填剤 ODS-DTpの合成方法
120℃で3時間乾燥した高純度シリカゲル（粒子径 5μm、平均細孔径 12nm、比表面積350m2/ｇ）にDMCODSを第二級アミンであるDEAを反応促進剤に使用して反応させ合成したODSシリカゲル（ODS‐D）を原料に、一次エンドキャッピングのエンドキャッピング剤としてTMCSを用い、第三級アミンであるピリジンの存在下、トルエン還流温度下（110℃）で反応させた。
【００３９】
その後、二次エンドキャッピング、三次エンドキャッピングを実施するが、ODS-DDおよびODS-DTp共に同じエンドキャッピングの方法を使用し、その結果を比較した。
【００４０】
１-１-３  二次エンドキャッピング
一次エンドキャッピングの終了したODSシリカゲル充填剤ODS-DDおよびODS-DTpをそれぞれ25gを1リットル四ツ口フラスコに採り、脱水トルエン300mlを加え撹拌する。
これにHMDS 10ml、TMCS 10mlを順次加え、最後にトリエチルアミン（TEA）40mlを加えトルエン還流温度下(110℃）で３〜４時間加熱する。
反応物は冷却後、濾集し、テトラヒドロフラン（THF）200mlで洗浄する。その後メタノール水（50％）300ｍｌで2回洗浄した後、メタノールで洗浄する。
120℃で乾燥し反応物を得る。これらの充填剤を、それぞれODS−DDＴth、ODS-DTp-Tthという。
【００４１】
１-１-４  三次エンドキャッピング
１-１-３で二次エンドキャッピングが終了したODS-DDＴth、ODS-DTp-Tth 25gをそれぞれ1リットル四ツ口フラスコに取り、脱水トルエン300mlを加えて撹拌する。これにTMCS10mlとTEA 20mlを加え、トルエン還流温度下（110℃）で３〜４時間反応させる。
反応物は冷却後、濾集し、テトラヒドロフラン（THF）200mlで先ず洗浄する。
その後メタノール水（50％）300ｍｌで2回洗浄した後、メタノールで洗浄する。120℃で乾燥し反応物を得る。これの充填剤を、それぞれODS-DDTth-Tt、ODS-DTp-Tth-Ttという。
【００４２】
１-１-５  Mightysil RP-18GPのエンドキャッピング
ODS-DTpを原料として、第二級シリルアミン（HMDS/TMCS）をエンドキャッピング剤として用い、高温エンドキャッピングして製造したMightysil RP-18GP  25ｇを1リットル四ツ口フラスコに取り、脱水トルエン300mlを加えて撹拌する。これにTMCS  10mlとTEA 20mlを加え、トルエン還流温度下（110℃）で３〜４時間反応させる。
反応物は冷却後、濾集し、テトラヒドロフラン（THF）200mlで洗浄する。その後メタノール水（50％）300ｍｌで2回洗浄した後、メタノールで洗浄する。
120℃で乾燥し反応物を得る。この充填剤をMightysil  RP-18GP-Ttという。
【００４３】
１-２  カラム充填
合成した充填剤を、エンドキャッピングの評価を行うためカラムに充填する。
カラムの充填方法（非特許文献１４）を以下に示す。
充填剤 1.7g を秤量し、クロロホルム13mlとTHF13mlを加え超音波浴中で5分間超音波分散する（カラム4.6mmΦ×150mmの場合）。
液体クロマトグラフ(日立L-6100)のカラム充填モードを使用しメタノール水溶液（80％）を加圧溶媒に使用して充填する。
カラムは、理論段数の確認を実施し、理論段数85,000段/ｍ以上のカラムを使用した。
【００４４】
１-３  充填剤の評価
１-３-１  エンドキャッピングの評価
充填されたカラムは、Mightysil RP-18GPのバッチ試験のうち、テストＩＩ（プロカインアミド試験）、テストＩＶ（オキシン銅試験）、テストＶ（ピリジンを含む塩基性物質）、テストＶＩ（ヒノキチオール試験：注入量は１μl）を実施することによって、エンドキャッピングの良否を評価した。
【００４５】
１-３-２  微量配位性化合物試験
さらに厳しく残存シラノールを確認するために、pH4.5付近の溶離条件で微量（ngオーダー）のオキシン銅の溶出状況を測定し、エンドキャッピングの良否を検討した。
溶離条件
溶離液：アセトニトリル/20mM KH2PO4＝40/60、流速：0.5 ml/min.、
検出波長：UV240nm、注入量：オキシン銅（2ppm溶液）2.5μl
【００４６】
２．結果と考察
２-１  塩基性化合物であるプロカインアミドの溶出挙動
三次エンドキャッピング後の各充填剤のプロカインアミドの溶出挙動の結果を図１に示す。
【００４７】
プロカインアミド（二番目のピーク）の溶出に関しては、全ての二次エンドキャッピングの反応系でTMCSとHMDSの混合液をシリル化剤に使用しTEAの存在下で反応させるプロセス（第二級シリルアミンとTMCS／第三級アミンの混合液）となっているが、いずれにおいてもその溶出挙動は良好であった。
今回エンドキャッピング剤にTMCS／HMDS混合液にTEAを存在させ反応を行なったことは、TMCSと有機アミンの反応では、塩基性化合物の溶出に問題を有していることが明らかとなったことに起因している（特許文献５）。とくにプロカインアミドを試料に使用した場合、テーリングの大きなクロマトグラムが得られた。このクロマトグラムは、一次エンドキャッピングをTMCSとDEAのエンドキャッピング剤で実施し、二次エンドキャッピングをTMCSとTEAのエンドキャッピング剤で行なった充填剤（ODS-TDT）を使用した結果であるが、このエンドキャッピング剤（TMCS/TEA）にHMDSを追加し反応を行なうと、図2−ｂ）に示すようにプロカインアミドの溶出状況が改善されることが明らかとなった。
この結果から、塩基性化合物の溶出を改善するには、HMDSが重要な働きをすることも明らかとなった。
【００４８】
ウラシルとプロカインアミドのピーク高さの比（今回測定した条件での結果）については（表−１）、第二級シリルアミンで一次エンドキャッピングしたODS-DDの三次エンドキャッピング品であるODS-DDTth-Ttは2.0を示し、TMCS／ピリジン（第三級アミン）でエンドキャッピングしたODS-DTpの三次エンドキャッピング品であるODS-DTp-Tth-Ttは1.7となり、ODS-DDTth-Ttのほうが良好であった。なお、ウラシルは、シラノールと相互作用しない化合物である。
【００４９】
【表１】
2008232802.tif 000003
【００５０】
一方、第二級シリルアミンで高温エンドキャッピングしたODSシリカゲル充填剤であるMightysil  RP-18GP-Ttは、プロカインアミド/ウラシルのピーク高さ比は2.0となり、同じ原料を使用したODS-DTp-Tth-Ttと同等に良好なクロマトグラムを示した（表−１）。すなわち、TMCS／第三級アミン一次エンドキャッピングの後の二次エンドキャッピングとして、第二級シリルアミンの高温エンドキャッピングを行うと、ODS-DDTth-Tt と同等の結果を得ることが可能であった。Mightysil  RP-18GP-Ttのクロマトグラムを図３に示す。
【００５１】
また、表−1に示したプロカインアミドとウラシルのピーク高さの比の値から、プロカインアミドの溶出挙動はTMCS／第三級アミンで三次エンドキャッピングを行うと、二次エンドキャッピング時までの結果を僅かながら上回ったことが示される。
【００５２】
２−２  ピリジンの溶出状況に関して
もう一つの塩基性化合物であるピリジンの溶出改善の結果を図４に示す。
ピリジン（二番目に溶出するピーク）の溶出についても、ODS-DDTth-Tt（図４a））は、プロカインアミドの溶出挙動と同じように、図４ｂ）に示すODS-DTｐ-Tth-Ttに比べ良好な結果を示した。すなわち、プロカインアミドの溶出試験の結果と同様に、塩基性化合物の溶出については、一次エンドキャッピングでHMDSを用いることによって、より良好な溶出が達成される。
【００５３】
また、Mightysil  RP-18GP-Ttによって、ピリジンの溶出挙動についてもプロカインアミド類の場合と同様に、ODS-DDTth-Tt と同等のクロマトグラムを得ることができた（図５）。
【００５４】
２−３  オキシン銅の溶出に関して
２−３−１  微量オキシン銅の溶出挙動
オキシン銅の溶出挙動を確認するため絶対量5ngの場合の試験を実施した。その理由は、注入量が100ngの場合、一次エンドキャッピング品であるODS-DDを除き比較的良好なクロマトグラムが得られ、本発明にかかる充填剤の性能を明確にすることが困難であると考えられたからである。このため、試料の注入量を5ngに変更し、かつ配位性化合物の溶出が厳しい条件となるpH4.5における20mM KH2PO4/アセトニトリル＝60／40の溶離液を使用し試験を行った。
結果を図６に示す。
【００５５】
オキシン銅の溶出も、塩基性化合物の溶出と同様に、ODS-DDTth-Tt（図６ａ））が微量の試料量においても、よりシャープなピークを示すことが判明した（図６ｂ））。
また、オキシン銅の溶出挙動は、エンドキャッピングの状態により大きく変化した。すなわち、二次エンドキャッピングの段階ではODS-DDTth-TtおよびODS-DTｐ-Tth-Ttのいずれにおいてもオキシン銅はほとんど溶出していないにもかかわらず（図７）、三次エンドキャッピングした段階で図６に示すとおりの優れた溶出挙動が達成された。
一方、Mightysil  RP-18GPにおいても、オキシン銅の溶出挙動は顕著に改善された（図８）。
【００５６】
このように、いずれの充填カラムにおいても、三次エンドキャッピングにおいてTMCS／第三級アミンを反応させることによってオキシン銅の溶出挙動は大きく改善された。
【００５７】
これらの結果から、オキシン銅の溶出挙動には、塩基性化合物と二次相互作用するシラノールおよび配位性化合物と不可逆的な二次相互作用するシラノールの両方と不可逆的な二次相互作用が影響することが明らかとなった。これは、オキシン銅が、含窒素系配位性化合物であり、塩基性も示すためであるが、同時に、同化合物が残存シラノールの評価物質として、上記各不可逆的な二次相互作用のいずれをも確認するための指標となる、大変重要な化合物であることが明らかとなったともいえる。
また、今回開発された製造方法で合成されたODSシリカゲル充填剤においては、従来のODSシリカゲル充填剤では必要であったリン酸酸性の溶液で洗浄する必要もなく、なおかつ溶出条件の厳しい液性の条件でもオキシン銅の溶出が可能であることも判明した。
【００５８】
２−３−２  反応試剤の添加量がオキシン銅の溶出に与える影響
一方、オキシン銅の溶出挙動は、二次エンドキャッピングの段階で使用するエンドキャッピング剤の添加量により差が見られた。すなわち、とくに、二次エンドキャッピングに使用するTMCS、HMDSおよびTEAの混合液の添加量のうち、オキシン銅の溶出挙動に影響を与えた。
図９にその結果を示す。図9−ａ）は充填剤25gに対してTMCSを40mM、HMDSを25mMおよびTEAを70mM添加した反応の結果であり、図９−b）は充填剤25gに対してTMCSを80mM、HMDSを50mMおよびTEAを140mM添加した反応の結果である。また図９−ｃ）は、TMCSを80mM、HMDSを50mMおよびTEAを280mM添加した反応の結果である。
これらの結果は、シリル化剤の添加量のみならず、反応促進剤である有機アミンTEAの添加量が結果に大きな影響を与えることを示している。図９−b）とｃ）との比較によって、シリル化剤であるTMCSとHMDSの添加量は同じであるが有機アミンであるTEAの添加量が２倍になると、オキシン銅も比較的良好な溶出挙動を示すようになり、その結果が大きく異なっていることが示される。
したがって、今回の検討においては、有機アミンの添加量はシラン化剤に対して２倍量以上添加した反応試剤を使用した。
【００５９】
２−４  ヒノキチオールの溶出に関して
ヒノキチオールもオキシン銅と同様に、配位性化合物の溶出状況の確認に使用される評価物質であるが、オキシン銅と異なり、含窒素化合物ではなく、塩基性は示さない化合物であるため、純粋に配位性化合物としての溶出挙動を測定することを可能とする化合物である。
三次エンドキャッピング後のヒノキチオールのクロマトグラムを図１０に示す。
ヒノキチオールの溶出挙動に関しては、塩基性化合物およびオキシン銅の溶出状況とは逆にODS-DTp-Tth-Ttがより良好な結果を示した。
【００６０】
図１１に一次エンドキャッピングと二次エンドキャッピング後のヒノキチオールの溶出挙動を示す。一次エンドキャッピングの段階では、TMCS／第三級アミンでエンドキャッピングを行ったODS-DTp（図１１b-１））を出発原料にした反応の経路では完全ではないがヒノキチオールは溶出していた。一方、第二級シリルアミンで一次エンドキャッピングを行った充填剤ODS-DD(図１１ａ-１）)においては、ヒノキチオールは全く溶出しなかった。
また、二次エンドキャッピングを行った後は、ODS-DDTthもODS-DTp-Tthもほとんど同じクロマトグラムを示した（図１１ａ-２）、ｂ-２））。
これらの結果は、配位性であって塩基性でない化合物の溶出改善にはTMCS／第三級アミンを使用するエンドキャッピングが最も効果的であることを示している。
また、二次エンドキャッピングは、HMDSとTMCSの混合液を第三級アミンであるTEAの存在下反応していることから、TMCS／第三級アミンの反応も生じていることになる。
【００６１】
MightysilRP-18GP-Ttの結果を図１２に示す。TMCS／第三級アミンでエンドキャッピングすることにより、Mightysil RP-18GPに比べ、ヒノキチオールのより良好なクロマトグラムを示した。すなわち、Mightysil RP-18GPの品質は一次エンドキャッピングの状態により大きい影響を受けると考えられるところ、上記のような三次エンドキャピングを行うことによって、ヒノキチオールのような塩基性を有さない配位化合物の溶出についても、さらに良好な品質を得ることが可能になる。
【００６２】
２-５  他社品との比較
以上示してきたように、ODSシリカゲル充填剤のエンドキャッピングは、反応させるシリルアミンによりその性能も異なることが判明したが、その反応性を応用することで、より完全なエンドキャッピングが湿式反応でも可能となることが判明した。
現状、塩基性化合物の溶出については問題のないODSシリカゲル充填剤は多いといえるが、配位性化合物の溶出に関する対策は、ほとんどされておらず、実際にエンドキャッピングの不備な充填剤が多い。このことにつき、図１３（オキシン銅の溶出挙動）と図１４（ヒノキチオールの溶出挙動）に示す。
【００６３】
これらはGLサイエンス社のイナートシルODS−３ と資生堂のカプセルパックC18  MG-ＩＩ（粒子径５μm、150mm×4.6mmΦ）のカラムを使用して測定したクロマトグラムであるが、両カラムともに塩基性化合物の溶出挙動は全く問題ないにもかかわらず、配位性化合物の溶出には欠点を有している（図１３、１４）。
その理由の一つとして、配位性化合物の不可逆的な二次相互作用は充填剤に含まれる金属不純物により生じるという認識があり、配位性化合物と二次相互作用するシラノールの検討がほとんど行われていないことが背景にあるものと考えられる。
したがって、従来の高純度シリカゲルにおいては、最終的にエンドキャッピングが確実に行われていなければ、配位性化合物との不可逆的な二次相互作用を除くことは困難である。
【００６４】
２−６  不可逆的二次相互作用が発生する原因
これまで述べてきた結果を基に、ODSシリカゲル充填剤の残存シラノールと塩基性化合物および、配位性化合物の不可逆的な二次相互作用が生じる原因は、例えば以下のように考察される。
シリカゲル表面は、シラノール（−Si−OH）とシロキサン（−Si−O−Si−）で構成されていることは疑う余地もない事実であり、シラノールは、下図に示すようにジェミナール型シラノール（双子シラノール）、孤立シラノールそして会合型シラノール（シングルシラノール）に分類されている（非特許文献１１）。これを立体構造的に分類すると、ジェミナール型シラノールと会合型シラノールはエカトリアル型シラノールとなり、孤立シラノールはアキシャル型シラノールとなる。
【００６５】
【化１】
2008232802.tif 000004
シリカゲル表面に存在するシラノール（非特許文献１５）
【００６６】
また、シリカゲルのアルキルシリル化は、反応性の高い会合型シラノールから反応していくといわれているところ（非特許文献１２）、この反応機構を下図に示す。この反応機構はエカトリアル型の会合型シラノールが反応する一例を示しているが、その結果として会合型シラノールがエンドキャッピングされると、アキシャル型シラノール（孤立シラノール）が出現することも示している。
【００６７】
【化２】
2008232802.tif 000005
シラノールのアルキルシリレーションの反応機構（非特許文献１２）
【００６８】
すなわち、会合型のシラノールが多く残存しているODSシリカゲルを第二級シリルアミンでエンドキャッピングした場合、孤立シラノールが未反応のまま残存することになり、これが結果として配位性化合物と不可逆的な二次相互作用を引き起こすものと考えられる。しかしながら、塩基性化合物との不可逆的な二次相互作用は低減される現象から判断すると、塩基性化合物は会合型シラノールと不可逆的な二次相互作用をすることになる。
アルキルシリル化において汎用されるもう一つの方法である、TMCS／第三級アミンを使用するエンドキャッピングは、孤立シラノールを含め、シリル化反応は進行するが、塩基性化合物と不可逆的な二次相互作用するシラノールとの反応は、第二級シリルアミンでエンドキャッピングした場合より小さいと考えられる。
したがって、エンドキャッピング剤のこれらの特徴を生かし、塩基性化合物と不可逆的な二次相互作用するシラノールを少なくとも２種の異なるアミン化合物を用いて可能な限り除いた後に、TMCS／第三級アミンでエンドキャッピングを行うことで、トルエン還流温度下においても、極限までODSシリカゲル充填剤の不活性化が達成できるのである。
【００６９】
３．結論
本発明による新たなエンドキャッピングを用いた充填カラムの製造方法は、シラノールとシリルアミンの反応のメカニズムに基づいて、例えば三次エンドキャッピングを行いエンドキャッピングの回数を従来法と異ならしめ、さらに二次エンドキャッピングを一次エンドキャッピングに用いられたアミン化合物と異なるアミン化合物を用いるという、シリカゲルの粒子径の大小にかかわらず応用可能な合成による方法である。
本発明の製造方法を応用することによって、従来の製品の品質改善、すなわち従来充分な管理が困難であったオキシン銅の微量領域も充分な管理が可能となるほか、定量的な測定が困難といわれているオキソリン酸等、配位性抗菌剤の低濃度領域の定量も可能となり、新たな高品質エンドキャッピング製品として製品化することも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、充填カラムの製造にかかる産業および他の関連産業の発展に寄与するところ大である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】三次エンドキャッピング後プロカインアミド類の溶出挙動を示すクロマトグラムである。a) ODS-DD-Tth-Tt、b) ODS-DTp-Tth-Tt  溶離液：ｐH7.6、20mMリン酸緩衝液/メタノール＝60/40、流速：0.5ml/min.カラム温度：40℃、検出：UV254nm  0.16AUFS（ピークは順にウラシル、プロカインアミド、アセチルプロカインアミド）
【図２】エンドキャッピング剤の違いによるプロカインアミドの溶出挙動の違いを示すクロマトグラムである。ａ）ODS-TDT 、ｂ）ODS-DTp-Tth  溶離液：ｐH7.6、20mMリン酸緩衝液/メタノール＝60/40、流速：0.5ml/min.カラム温度：40℃、検出：UV254nm  0.16AUFS（ピークは順にウラシル、プロカインアミド、アセチルプロカインアミド）
【図３】Mightysil RP-18GP-Ttのプロカインアミド類に対する溶出挙動を示すクロマトグラムである。溶離液：ｐH7.6、20mMリン酸緩衝液/メタノール＝60/40、流速：0.5ml/min.カラム温度：40℃、検出：UV254nm  0.16AUFS （ピークは順にウラシル、プロカインアミド、アセチルプロカインアミド）
【図４】エンドキャッピング後のピリジン溶出挙動を示すクロマトグラムである。  ａ）ODS-DD-Tth-Tt、ｂ）ODS-DTp-Tth-Tt  溶離液：アセトニトリル/H2O=30/70、流速：1ml/min.、カラム温度：40℃、検出：UV254nm  0.16AUFS（ピークは最初からウラシル、ピリジン、アニリン、o-トルイジン、N-メチルアニリン、2-エチルアニリン、3-ニトロアニソール、N,N- ジメチルアニリン）
【図５】Mightysil RP-18GP-Ttのピリジンの溶出挙動を示すクロマトグラムである。  溶離液：アセトニトリル/H2O=30/70、流速：1ml/min.カラム温度：40℃、検出：UV254nm  0.16AUFS（ピークは最初からウラシル、ピリジン、アニリン、o-トルイジン、N-メチルアニリン、2-エチルアニリン、3-ニトロアニソール、N,N- ジメチルアニリン）
【００７２】
【図６】微量オキシン銅の溶出状況を示すクロマトグラムである。ａ）ODS-DDTth-Tt、ｂ）ODS-DTｐ-Tth-Tt  溶離液：20mM KH2PO4/アセトニトリル＝60/40、流速：0.5ml/min.カラム温度：40℃、検出：240nm、試料注入量：5ng
【図７】二次エンドキャッピング後のオキシン銅の溶出挙動を示すクロマトグラムである。ａ）ODS-DDTth、ｂ）ODS-DTp-Tt  溶離液：20mM KH2PO4/アセトニトリル＝60/40、流速：0.5ml/min.カラム温度：40℃、検出：240nm、試料注入量：5ng
【図８】微量オキシン銅の溶出状況を示すクロマトグラムである。a) Mightysil RP18GP-Tt、b) Mightysil RP-18GP  溶離液：20mM KH2PO4/アセトニトリル＝60/40、流速：0.5ml/min.カラム温度：40℃、検出：240nm 0.01AUFS  試料注入量：5ng
【図９】反応試薬の添加量の違いによるオキシン銅の溶出結果を示すクロマトグラムである。ａ）TMCS 40mM(5ml)、HMDS 25mM(5ml)、TEA 70mM(10ml)での反応ｂ）TMCS 80mM(10ml)、HMDS 50mM(10ml)、TEA 140mM(20ml)での反応ｃ）TMCS 80mM(10ml)、HMDS 50mM(10ml)、TEA 280mM(40ml)での反応  溶離液：20mM りん酸/アセトニトリル＝95/5、流速：1.0ml/min.カラム温度：40℃、検出：250nm、試料：ウラシル、オキシン銅、カフェイン（溶出順）（オキシン銅を20μg/ml含む試料溶液を５μl注入）
【図１０】三次エンドキャッピング後のヒノキチオールの溶出状況を示すクロマトグラムである。ａ）ODS-DDTth-Tth、ｂ）ODS-DTp-Tth-Tt  溶離液：20mM KH2PO4/アセトニトリル＝60/40、流速：0.5ml/min.カラム温度：40℃、検出：UV320nm 0.16AUFS、注入量：0.５μg
【００７３】
【図１１】一次エンドキャッピングと二次エンドキャッピング後のヒノキチオールの溶出挙動を示すクロマトグラムである。a)-1  ODS-DD、a)-2  ODS-DDTth、b)-1  ODS-DTp、b)-2  ODS-DTp-Tth  溶離液：20mM KH2PO4/アセトニトリル＝60/40、流速：0.5ml/min.カラム温度：40℃、検出：UV320nm 0.16AUFS、注入量：0.５μg
【図１２】Mightysil RP-18GP-TtとMightysil RP-18GPのヒノキチオールの溶出挙動の比較を示すクロマトグラムである。ａ）Mightysil RP-18GP-Tt、ｂ）Mightysil RP-18GP  溶離液：20mM KH2PO4/アセトニトリル＝60/40、流速：0.5ml/min.カラム温度：40℃、検出：UV320nm 0.16AUFS、注入量：0.５μg
【図１３】他社カラムのオキシン銅の溶出挙動を示すクロマトグラムクロマトグラムである。a) GLサイエンス  Inertsil ODS-３、ｂ）資生堂  Capcell Pak C18 MG-ＩＩ  溶離液：20mM KH2PO4/アセトニトリル＝60/40、流速：0.5ml/min.カラム温度：40℃、検出：240nm 0.01AUFS、試料注入量：5ng
【図１４】他社カラムのヒノキチオールの溶出挙動の比較を示すクロマトグラムである。a) GLサイエンス  Inertsil ODS-３、ｂ）資生堂  Capcell Pak C18 MG-ＩＩ  溶離液：20mM KH2PO4/アセトニトリル＝60/40、流速：0.5ml/min.カラム温度：40℃、検出：UV320nm 0.16AUFS、注入量：0.５μg
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2008232802.tif 000016
【図１２】
2008232802.tif 000017
【図１３】
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【図１４】
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