(57)【要約】  【課題】  多量あるいは複雑な投与の問題を解決した混合ワクチンの開発が望まれている。  【解決手段】  ｉ）結合体がリン酸アルミニウム上に吸着されている点で特徴付けられる担体蛋白質に結合したヘモフィルスインフルエンザＢ型の莢膜ポリサッカライド；およびｉｉ）ジフテリア、破傷風および百日咳に対する保護を付与する他の抗原を含む、混合ワクチンにより、上述した課題が解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）結合体がリン酸アルミニウム上に吸着されている点で特徴付けられる担体蛋白質に結合したヘモフィルスインフルエンザＢ型の莢膜ポリサッカライド；および
ｉｉ）ジフテリア、破傷風および百日咳に対する保護を付与する他の抗原
を含む、混合ワクチン。
【請求項２】
結合体が、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎およびポリオからなる群より選択される疾患に対する保護を付与する１種または複数の他の抗原と混合されるところの、請求項１記載の混合ワクチン。
【請求項３】
担体蛋白質がジフテリアトキソイド、ジフテリアＣＲＭ１９７蛋白質および髄膜炎菌外膜蛋白質からなる群より選択されるところの、請求項１または２記載の混合ワクチン。
【請求項４】
ヘモフィルスインフルエンザＢ型の莢膜ポリサッカライドに結合された担体蛋白質が破傷風トキソイドであるところの、請求項１または２記載の混合ワクチン。
【請求項５】
ヘモフィルスインフルエンザＢ型ポリサッカライドの担体蛋白質に対する比率が１：０．３〜１：２（重量：重量）であるところの、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の混合ワクチン。
【請求項６】
吸着されている結合体が他の抗原と組み合わせる前に凍結乾燥されているところの、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の混合ワクチン。
【請求項７】
担体蛋白質に結合させ、リン酸アルミニウム上に吸着させるヘモフィルスインフルエンザＢ型の莢膜ポリサッカライドを含む凍結乾燥させたワクチンのコンテナと、ジフテリア、破傷風および百日咳に対する保護を付与するワクチンを含む別のコンテナとからなる、混合ワクチンの製造用キット。
【請求項８】
ヘモフィルスインフルエンザＢ型莢膜ポリサッカライド抗原を担体蛋白質に結合させ、その結合体をリン酸アルミニウム上に吸着させ、該他の抗原と混合することを含む、請求項１ないし６に記載のワクチンの製法。
【請求項９】
吸着工程が５と６の間のｐＨでなされるところの、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該他の抗原が、Ａ型肝炎、ジフテリア、破傷風、百日咳、Ｂ型肝炎およびポリオからなる群より選択される疾患に対する保護を付与するところの、請求項８または９記載の方法
【請求項１１】
ｉ）結合体がリン酸アルミニウム上に吸着されている点で特徴付けられる担体蛋白質に結合したヘモフィルスインフルエンザＢ型の莢膜ポリサッカライド；および
ｉｉ）Ａ型肝炎、ジフテリア、破傷風、百日咳またはポリオの一つの疾患に対する保護を付与する一群の抗原より選択される、ヘモフィルスインフルエンザｂ型以外の病原体に対する保護を付与しうる他の成分
を含む、混合ワクチン。
【請求項１２】
担体蛋白質がジフテリアトキソイド、ジフテリアＣＲＭ１９７蛋白質および髄膜炎菌外膜蛋白質からなる群より選択されるところの、請求項１１記載の混合ワクチン。
【請求項１３】
ヘモフィルスインフルエンザＢ型の莢膜ポリサッカライドに結合された担体蛋白質が破傷風トキソイドであるところの、請求項１１記載の混合ワクチン。
【請求項１４】
ヘモフィルスインフルエンザＢ型ポリサッカライドの担体蛋白質に対する比率が１：０．３〜１：２（重量：重量）であるところの、請求項１１ないし１３のいずれか１つに記載の混合ワクチン。
【請求項１５】
吸着されている結合体が他の抗原と組み合わせる前に凍結乾燥されているところの、請求項１１ないし１４のいずれか１つに記載の混合ワクチン。
【請求項１６】
ヘモフィルスインフルエンザＢ型莢膜ポリサッカライド抗原を担体蛋白質に結合させ、その結合体をリン酸アルミニウム上に吸着させ、ヘモフィルスインフルエンザｂ型以外の病原体に対する保護を付与しうる他の成分と混合することを含む、請求項１１ないし１５に記載のワクチンの製法。
【請求項１７】
吸着工程が５と６の間のｐＨでなされるところの、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該他の成分が、Ａ型肝炎、ジフテリア、破傷風、百日咳またはポリオの一の疾患に対する保護を付与する一群の抗原より選択されるところの、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
医薬にて使用される、請求項１ないし６または請求項１１ないし１５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
ヘモフィルスインフルエンザＢ型感染を患っているか、あるいは感染しやすい患者を治療するための医薬の製造における請求項１ないし６または請求項１１ないし１５のいずれか一項に記載のワクチン組成物の安全かつ効果的な量の使用。
【請求項２１】
ヘモフィルスインフルエンザＢ型の莢膜ポリサッカライドが破傷風トキソイドに結合し、ワクチンが以下の成分：ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞性百日咳抗原、Ｂ型肝炎表面抗原および不活化ポリオワクチンを含むところの、請求項１または１１記載の混合ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担体蛋白質に結合したポリサッカライド結合抗原を含む新規なワクチン処方に関する。特に本発明は、ヘモフィルスインフルエンザ（Haemophilus Influenzae）Ｂ型（Ｈｉｂ）感染予防のための抗原がリン酸アルミニウム上へ吸着されているワクチン処方に関する。本発明はまた、多価ワクチン、すなわち１以上の病態の改善または治療のためのワクチンに関する。本発明はまた、医薬におけるかかるワクチンの製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリサッカライドを利用するワクチンは、当該分野において公知である。例えば、ヘモフィルスインフルエンザｂ型（Ｈｉｂ）感染予防のためのワクチンは、担体蛋白質と結合した莢膜ポリサッカライド（ＰＲＰ）を基礎とする。ポリサッカライドは、リボース、リビトールおよびリン酸塩のポリマーである。これらのワクチンは、典型的に単純な（すなわち、アジュバント処理しない）処方として提供される。しかしある場合において、水酸化アルミニウムを含む希釈剤（ＭｅｒｃｋによるＰｅｄｖａｘ  Ｈｉｂ製品）を用いて凍結乾燥した結合体を復元する。典型的には、担体蛋白質は、ジフテリアまたは破傷風トキソイドあるいはナイセリア・メニギチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜蛋白質である。かかる結合ワクチン抗原の例は、米国特許第４３６５１７０号、米国特許第４６７３５７４号、ヨーロッパ特許第２０８３７５号、ヨーロッパ特許第４７７５０８号およびヨーロッパ特許第１６１１８８号に開示されている。
かかる結合ワクチンを他の抗原またはワクチンと同時に投与することが望ましく、これは、複数回の注射を必要とし得る。複数回の注射に伴う問題として、より複雑な投与方法および多量の全注射容量が挙げられる。これは、ワクチンを幼児に適用する場合、特に深刻な問題である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
それゆえ、混合ワクチンの製造が提唱されてきた。一のよく知られた混合ワクチンは、ジフテリア、破傷風およびボルデテラ・パーツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、百日咳菌）感染に対する保護を供給する。該ワクチンは、ある状況では、他のボルデテラ・パーツシス抗原も存在し得るが、典型的に、２または３個の抗原−（無毒化したＰＴ、ＦＨＡおよびしばしば、限定はしないが６９ｋＤａであることが多い）からなる全細胞または非細胞百日咳成分、およびトキソイド化ジフテリアならびに破傷風毒を含む。かかるワクチンは、しばしば、ＤＴＰｗまたはＤＴＰａと称される。他の抗原をＢ型肝炎またはポリオなどの疾患予防用のかかる混合ワクチンに加えることが望ましいであろう。
【０００４】
ポリサッカライド結合ワクチンをかかる混合に加えることが望ましいであろう。しかしながら、本発明者らは、成分の単純な混合がポリサッカライド成分に対する抗体力価の減少をもたらすことを見出した。
本発明者は、結合抗原をリン酸アルミニウムに吸着させると、この減少を抑えることができることを見出した。対照的に、抗原を水酸化アルミニウムに吸着させると、ポリサッカライド成分に対する抗体力価は完全に減少する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、本発明は、リン酸アルミニウム上に吸着したポリサッカライド結合抗原を含むワクチン組成物を提供する。好ましくは、抗原は、担体蛋白質と結合したＨｉｂ由来の莢膜ポリサッカライド（ＰＲＰ）である。
好ましくは、担体蛋白質は、ジフテリアかまたは破傷風トキソイド、ジフテリアＣｒｍ１９７蛋白質、またはナイセリア・メニギチディスのような細菌由来の外膜蛋白質である。
ポリサッカライド結合体は、いずれかの既知のカップリング技法によって調製できる。例えば、ポリサッカライドをチオエーテル結合を経て結合できる。該結合方法は、ポリサッカライドを１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）で活性化し、シアン酸エステルを形成することに依存する。従って、活性化されたポリサッカライドは、直接またはスペーサー基を介して、担体蛋白質上のアミノ基に結合し得る。好ましくは、シアン酸エステルは、ヘキサンジアミンと結合し、アミノ誘導ポリサッカライドは、チオエーテル結合の形成に関するヘテロライゲーション化学操作を用いて、担体蛋白質に結合する。かかる結合体は、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ９３／１５７６０ユニホームド・サービス・ユニバーシティー（Uniformed  Services  University）に記載されている。
【０００６】
結合体は、また、米国特許第４３６５１７０号（Jennings）および米国特許第４６７３５７４号(Anderson)に記載の直接還元的アミノ化法によって調製することもできる。他の方法は、ヨーロッパ特許第０１６１１８８号、ヨーロッパ特許第２０８３７５号およびヨーロッパ特許第０４７７５０８号に記載されている。
さらなる方法は、カルボジイミド縮合による、アジピン酸ヒドラジド（ＡＤＨ）で誘導された臭化シアン活性化ポリサッカライドの蛋白質担体への結合に関する。かかる結合は、Chu C.ら、Infec Immunity, 1983 245 256 に記載されている。
本発明の好ましい具体例において、ＰＲＰポリサッカライド対担体蛋白質の比率は、典型的な１：３から１：０．３〜１：２へ減少する。そのような低比率の結合体は、アジュバント処理しない状態においてさえ、干渉問題を有さないので、有利である。
【０００７】
本発明の好ましい具体例において、処方は、好ましくは、１またはそれ以上の：Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ジフテリア、破傷風、百日咳、Ｂ型肝炎およびポリオに対する保護を提供する抗原から選択された少なくとも１つの他の成分を含有する。
本発明の範囲内の個々の混合ワクチンは、ＤＴＰａ（ジフテリア−破傷風−非細胞百日咳）−Ｈｉｂ混合ワクチン処方、Ｈｉｂ−Ｂ型肝炎ワクチン処方、ＤＴＰａ−Ｈｉｂ−Ｂ型肝炎ワクチン処方およびＩＰＶ（不活性化ポリオワクチン）−ＤＴＰａ−Ｈｉｂ−Ｂ型肝炎ワクチン処方を包含する。
前記の混合物は、Ａ型肝炎に対して保護的である成分を包含してもよい。
【０００８】
かかるワクチンにおける使用に適当な成分は、既に商業上入手可能であり、詳細は、世界保健機関から得ることができる。例えば、ＩＰＶ成分は、ソーク（Salk）不活性化ポリオワクチンであり得る。ジフテリア、破傷風および百日咳ワクチンは、Infanrix DTPa（SmithKline Beecham Biologicals）のような非細胞産物からなってもよい。Ａ型肝炎に対する保護を提供する成分は、好ましくは、ＨＡＶのＨＭ−１７５株由来の死菌弱毒化ワクチンである‘Havrix’(SmithKline Beecham Biologicals)として知られる製品である［F. E. Andre, A Hepburnおよび E. D’Hondtによる‘Inactivated Canadidate Vaccines for Hepatitis A’.Prog. Med. Virol. Vol37, pages 72-95(1990)およびSmithKline Beecham Biologicalsによって出版されたthe product monograph‘Havrix’（1991)を参照]。Ｂ型肝炎成分は、‘Engerix-B'におけるような‘Ｓ'抗原を含み得る。
有利には、本発明に係るヘモフィルスインフルエンザＢ型または混合ワクチンは、小児用ワクチンである。
【０００９】
ワクチン製剤は、一般に、Vaccine  Design−The  Subunit and sdjuvant approach、PowellおよびNewman編；Pellum  Pressに記載されている。リポソーム内でのカプセル化は、例えば、Fullertonによる米国特許第４２３５８７７号に記載されている。蛋白質の巨大分子への結合は、例えば、Likhiteによる米国特許第４３７２９４５号およびArmorらによる米国特許第４４７４７５７号に開示されている。
各々のワクチン投与量における結合抗原の量は、典型的なワクチンにおける有意な、不利な副作用がない免疫保護応答を誘導する量として選択される。かかる量は、どの特異的な免疫原を用いるかに依存して変化するであろう。一般に、各投与量は、１〜１０００μｇの全免疫原、好ましくは２〜１００μｇ、最も好ましくは４〜４０μｇからなるであろうことが予想される。個々のワクチンについての最適量は、対象における抗体力価および他の応答の観察を含め、標準的な研究によって確かめることができる。最初のワクチン接種後、対象は、約４週間ごとに１または２回の追加免疫注射を受ける。
【００１０】
本発明に係るさらなる態様において、結合抗原をリン酸アルミニウム上に吸着させることを特徴とするワクチンの製造方法を提供する。吸着は、好ましくはｐＨ５〜６、好ましくは約５．４にて行われる。一の具体例において、ワクチンを、２４時間以上静置後、凍結乾燥させる。別法として、本発明のワクチンを、液体型で他の抗原と組み合わせてもよい。
本発明はさらに、かかるワクチンの最初の医学的使用を提供する。
さらなる具体例において、本発明は、ヘモフィルスインフルエンザＢ型感染を予防または改善する方法であって、本発明のワクチンの無毒で、有効量を投与することを特徴とする方法を提供する。
【００１１】
次に実施例を用いて、本発明を説明する。
実施例１
リン酸アルミニウム上へ吸着した破傷風トキソイド結合ＨｉＢポリサッカライドを含むワクチン処方
【００１２】
ヘモフィルスインフルエンザＢ型莢膜ポリサッカライド（ＰＲＰ）破傷風トキソイド（ＴＴ）結合体の合成
１．ａ  臭化シアン結合
ＰＲＰおよびＴＴの共有結合は、ＮＩＨ（Chu  C.ら(1983)、ヘモフィルスインフルエンザＢ型および肺炎双球菌６Ａ型ポリサッカライド蛋白質結合体の免疫原性におけるさらなる研究、Infec.Immunity,245-256）で明らかにされた結合化学によって行われる。ＰＲＰを、制御条件下、臭化シアンで活性化し、アジピン酸ヒドラジドスペーサーで誘導化する。
誘導化後、活性化ポリサッカライド（ＰＲＰ−ＡＨ）を透析濾過によって精製する。２つの精製成分（ＰＲＰ−ＡＨおよびＴＴ）の結合は、カルボジイミド縮合によって行う。次いで、結合体を限外濾過およびゲル濾過によって精製して、試薬および結合していないＰＲＰならびにＴＴを除去する。
【００１３】
ＰＲＰ−ＴＴ結合体の合成
１．ｂ  ＣＤＡＰ結合
３０ｍｇの天然ＨｉｂＰＲＰを６ｍｌの２ＭＮａＣｌ中に溶解した。２２５ｍｃｌのＣＤＡＰ（１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウムテトラフルオロボレート）をポリサッカライド溶液（アセトニトリル中１００ｍｇ/ｍｌの保存溶液）へ加えた。９０秒後に、４５０ｍｃｌの０．２Ｍトリエチルアミンを加えた。活性化をｐＨ１０．０にて、氷上および室温で1分間行った。
９０ｍｇの破傷風トキソイド(１/３の初期ＰＳ/蛋白質比)を活性化ポリサッカライドに加え、結合反応を室温で１時間行った。次いで、反応物を３ｍｌの１Ｍグリシン溶液（ｐＨ５．０）を用いて、室温で３０分間および４℃で一晩クエンチした。
結合体を０．２ＭＮａＣｌで平衡化したsephacryl HR ５００カラム上のゲル濾過によって精製した。炭水化物および蛋白質含量を各フラクション中で測定した。結合体をプールし、フィルター滅菌（Minisart＋０．２２２γｍ膜）した。
【００１４】
リン酸アルミニウム上への吸着
１．ｃ  ０．１５ｍｇのリン酸アルミニウムに、１２．５ｍｃｇの実施例１（ａ）のポリサッカライド結合体を加えた。これを２時間攪拌して、ｐＨを５．１に調整した。混合物を室温で１日静置し、次いで、吸着した結合体を２〜８℃でさらに９日間静置した。凍結乾燥産物を調製する場合、吸着した産物をラクトース（１５．７５ｍｇ）中で希釈して、２５ｍｃｇポリサッカライド/ｍｌおよび０．４ｍｇのＡｌ/ｍｌの最終組成物を得、得られた組成物を０．５ｍｌバイアル中に満たし、凍結乾燥した。
液体産物を調製する場合、吸着した結合体を１５０ｍＭＮａＣｌおよび５ｍｇ/ｍｌのフェノキシエタノールを含む注射用水で希釈し、２０ｍｃｇポリサッカライド/ｍｌおよび０．３２ｍｇＡｌ/ｍｌの最終組成物を得る。
【００１５】
１．ｄ  Ｂ型肝炎を有するおよび有さないジフテリア破傷風および百日咳(非細胞)ワクチンの処方は、ＷＯ９３／２４１４８（SmithKline  Beecham  Biologicals）の方法に従って、行った。
【００１６】
１．ｅ  結合体を予め吸着させた「低比率」ＰＲＰ−ＴＴリン酸アルミニウムの調製
破傷風菌（３０ｍｃｇ、６０ｍｃｇ）使用量を減少させる以外は実施例１ａに類似した方法で結合体を調製して、ポリサッカライド：蛋白質比が１：１または１：２で産物を得た。次いで、結合体を実施例１ｃの方法に従って、リン酸アルミニウムへ吸着させる。最終凍結乾燥調製物は、１２．５μｇの結合体、０．１５ｍｇのＡｌＰＯ４、１５．７５ｍｇのラクトースを含有する。これを０．１＋/−０．１のｐＨにて、使用前に０．５ｍｌの注射用水中で復元する。
【００１７】
実施例２：リン酸アルミニウムに予め吸着し、ＤＴＰａまたはＤＴＰａ−ＨＢと混合したＰＲＰ−ＴＴ結合体の免疫原性
単純なまたはＡｌＰＯ４上に予め吸着した実施例１ａ)のＨｉｂ結合体を(どちらのワクチンも凍結乾燥した)、注射前１時間以内にＤＴＰａまたはＤＴＰａＨＢと混合し、該混合物をヒトへの投与量(０．５μｇのＰＲＰ)の１／２０に相当する投与量で、皮下経路によって新生児ラット(１週齢)に注射した。ラットは、２週および４週後に追加免疫し、各免疫処置後に血清を集めて、抗ＰＲＰ抗体を測定した。対照は、セーライン中で復元したＨｉｂワクチン（ＡｌＰＯ４に吸着したまたは吸着していない）を包含する。
【００１８】
一群１０匹の無作為な新生児ラット（１週齢−ＯＦＡ系統）の群を０、１４、２８日に、Ｈｉｂワクチンのヒト投与量の１/２０で、単独またはＤＴＰａもしくはＤＴＰａＨＢ（ヒト投与量の１/２０）と混合して、皮下注射で３回免疫した。凍結乾燥Ｈｉｂワクチンのセーラインでの復元または混合（ＤＴＰａまたはＤＴＰａＢＨ）は、免疫処置前１時間以内に行った。
ラットを１４、２８、４２および５６日目に麻酔下で採血した。抗ＰＲＰ抗体を個体血清においてＥＬＩＳＡによって測定し、力価を測定対照標準を用いて、γ/ｍｌで表わした。ＧＭＴを各グループについて、および各時点について計算した。９５％の信頼限界を３回目の免疫後に得られた力価について計算した。
表１に示すように、Ｈｉｂ結合体のＡｌＰＯ４への吸着は、その免疫原性を修飾しない：いくつかの抗ＰＳは、２回目の投与後に生じ、良い追加免疫効果は、ヒト新生児において見られるように、３回目の投与後に示される。ＨｉｂワクチンのＤＴＰａまたはＤＴＰａＨＢとの混合は、抗ＰＲＰ応答を３〜８倍減じ、ＤＴＰａ−ＨＢの場合、この減少は有意である。対照的に、ＡｌＰＯ４へ予め吸着したＨｉｂワクチンは、単純ワクチンで得られたレベルと少なくとも等価のレベルまで抗ＰＲＰ応答を回復させる。
【００１９】
結論：
Ｈｉｂ／リン酸アルミニウム処方は、従って、Ｈｉｂを他の小児科用混合物と混合するとき生じる適合性問題を解決する可能性を有する。
【表１】
2008120833.tif 000002