(57)【要約】【課題】ＰＡＣＥ４遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡを提供する。【解決手段】ヒトおよび／またはラットＰＡＣＥ４遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列に相補的なセンス鎖ＲＮＡと、そのアンチセンス鎖ＲＮＡとを含む２本鎖ＲＮＡ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列からなるラットＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第766〜790位配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、該ＲＮＡの相補鎖を含むアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡ。
【請求項２】
配列番号１の塩基配列からなるラットＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第945〜969位配列、または配列番号２の塩基配列からなるヒトＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第1143〜1167位配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、該ＲＮＡの相補鎖を含むアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡ。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列からなるラットＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第1820〜1844位配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、該ＲＮＡの相補鎖を含むアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡ。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列からなるラットＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第2622〜2646位配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、該ＲＮＡの相補鎖を含むアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡ。
【請求項５】
配列番号１の塩基配列からなるラットＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第1655〜1689位配列、または配列番号２の塩基配列からなるヒトＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第1863〜1887位配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、該ＲＮＡの相補鎖を含むアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡ。
【請求項６】
配列番号２の塩基配列からなるヒトＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第964〜988位配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、該ＲＮＡの相補鎖を含むアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡ。
【請求項７】
配列番号２の塩基配列からなるヒトＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第2018〜2042位配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、該ＲＮＡの相補鎖を含むアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡ。
【請求項８】
配列番号２の塩基配列からなるヒトＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第2860〜2884位配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、該ＲＮＡの相補鎖を含むアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡ。
【請求項９】
センス鎖ＲＮＡが配列番号３のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号４のＲＮＡである請求項１に記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項１０】
センス鎖ＲＮＡが配列番号５のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号６のＲＮＡである請求項２に記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項１１】
センス鎖ＲＮＡが配列番号７のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号８のＲＮＡである請求項３に記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項１２】
センス鎖ＲＮＡが配列番号９のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号１０のＲＮＡである請求項４に記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項１３】
センス鎖ＲＮＡが配列番号１１のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号１２のＲＮＡである請求項５に記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項１４】
センス鎖ＲＮＡが配列番号１３のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号１４のＲＮＡである請求項６に記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項１５】
センス鎖ＲＮＡが配列番号１５のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号１６のＲＮＡである請求項７に記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項１６】
センス鎖ＲＮＡが配列番号１７のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号１８のＲＮＡである請求項８に記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項１７】
請求項１〜８に記載の２本鎖ＲＮＡから選択される１または２以上の２本鎖ＲＮＡを有効成分として含有する、ＰＡＣＥ４遺伝子の発現抑制剤。
【請求項１８】
請求項１〜８に記載の２本鎖ＲＮＡから選択される１または２以上の２本鎖ＲＮＡの発現ベクターを有効成分として含有する、ＰＡＣＥ４遺伝子の発現抑制剤。
【請求項１９】
２本鎖ＲＮＡが請求項９〜１６に記載の２本鎖ＲＮＡから選択される１または２以上の２本鎖ＲＮＡである、請求項１７または１８に記載のＰＡＣＥ４遺伝子の発現抑制剤。
【請求項２０】
請求項１７、１８または１９に記載の発現抑制剤を有効成分として含有する抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スブチリシン様プロプロテインコンベルターゼファミリーに属するＰＡＣＥ４遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡと、その用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
スブチリシン様プロプロテインコンベルターゼ（subtilisin-like
proprotein convertase）は、バクテリアのプロテアーゼであるスブチリシンと構造類似した触媒領域（スブチリシン様触媒領域）を有するＣａ依存性セリンプロテアーゼであり、現在、Ｆｕｒｉｎ（ＰＡＣＥ，ＳＰＣ１とも言われる）、ＰＣ２（ＳＰＣ２とも言われる）、ＰＣ３（ＰＣ１，ＳＰＣ３とも言われる）、ＰＡＣＥ４（ＳＰＣ４とも言われる）、ＰＣ４（ＳＰＣ５とも言われる）、ＰＣ６（ＰＣ５，ＳＰＣ６とも言われる）、ＰＣ８（ＰＣ７，ＬＰＣ，ＳＰＣ７とも言われる）の７種類が同定されている。
これら７種のスブチリシン様プロプロテインコンベルターゼ（以下、これらを総称して「ＳＰＣファミリー」という）は、細胞の分化・増殖を調節する分化因子などの不活性型前駆体蛋白質を活性化することが知られている。その中でも、ＰＡＣＥ４は特に、器官形成などの発生・分化過程で重要な役割を果たすと考えられている。更に、近年、ＰＡＣＥ４がマトリックスメタロプロテアーゼなどの活性化に関与することによる、癌の転移・浸潤との関連性も報告されている（例えば、非特許文献１および２参照)。
【０００３】
一方、ＲＮＡ干渉（RNA  interference：ＲＮＡｉ）は、ある遺伝子と相同な、センス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡとからなる２本鎖ＲＮＡ（double-strand  RNA）が、その遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の相同部分を破壊するという現象であり、１９９９年に線虫を用いた実験によりはじめて提唱された。その後、マウス初期胚や哺乳動物培養細胞でもＲＮＡｉが起こることが示され、ＲＮＡｉの誘導機構は哺乳動物にも存在することが明らかにされた。２００１年には、比較的短い２本鎖ＲＮＡ（small  interfering  RNA：ｓｉＲＮＡ）が、哺乳動物培養細胞系でも細胞毒性を示さずにＲＮＡｉを誘導できることが示されている。
このように、ｓｉＲＮＡは毒性を示すことなく特定の遺伝子発現を抑制することから、ヒト疾患の治療への有効性が期待されている。
【０００４】
ＰＡＣＥ４遺伝子のｓｉＲＮＡに関しては、関節炎の治療に使用することが公知である（例えば、特許文献１参照）。また、ＰＡＣＥ４遺伝子のｓｉＲＮＡを血管形成および／またはリンパ管形成の阻害に使用する方法が報告されている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】ＵＳ２００５／００９０４６６  Ａ１
【特許文献２】ＵＳ２００５／０２７２６６４  Ａ１
【非特許文献１】Molecular Carcinogenesis，28：63-69，2003
【非特許文献２】Cancer Research，65：7310-7319，2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＰＡＣＥ４遺伝子の発現を抑制することができる新規な２本鎖ＲＮＡを提供することを目的としている。このような２本鎖ＲＮＡは、癌などのＰＡＣＥ４が関与する疾患に対する、治療および／または予防に用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この発明によれば、前述の課題を解決するための手段として、次の（１）〜（２０）がそれぞれ提供される。
（１）配列番号１の塩基配列からなるラットＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第766〜790位配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、該ＲＮＡの相補鎖を含むアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡ。
尚、相補鎖とは、相補的塩基配列からなるＲＮＡ鎖を意味する。
（２）配列番号１の塩基配列からなるラットＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第945〜969位配列、または配列番号２の塩基配列からなるヒトＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第1143〜1167位配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、該ＲＮＡの相補鎖を含むアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡ。
（３）配列番号１の塩基配列からなるラットＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第1820〜1844位配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、該ＲＮＡの相補鎖を含むアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡ。
（４）配列番号１の塩基配列からなるラットＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第2622〜2646位配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、該ＲＮＡの相補鎖を含むアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡ。
（５）配列番号１の塩基配列からなるラットＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第1655〜1689位配列、または配列番号２の塩基配列からなるヒトＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第1863〜1887位配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、該ＲＮＡの相補鎖を含むアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡ。
（６）配列番号２の塩基配列からなるヒトＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第964〜988位配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、該ＲＮＡの相補鎖を含むアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡ。
（７）配列番号２の塩基配列からなるヒトＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第2018〜2042位配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、該ＲＮＡの相補鎖を含むアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡ。
（８）配列番号２の塩基配列からなるヒトＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡの第2860〜2884位配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、該ＲＮＡの相補鎖を含むアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡ。
（９）センス鎖ＲＮＡが配列番号３のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号４のＲＮＡである前記（１）に記載の２本鎖ＲＮＡ。
（１０）センス鎖ＲＮＡが配列番号５のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号６のＲＮＡである前記（２）に記載の２本鎖ＲＮＡ。
（１１）センス鎖ＲＮＡが配列番号７のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号８のＲＮＡである前記（３）に記載の２本鎖ＲＮＡ。
（１２）センス鎖ＲＮＡが配列番号９のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号１０のＲＮＡである前記（４）に記載の２本鎖ＲＮＡ。
（１３）センス鎖ＲＮＡが配列番号１１のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号１２のＲＮＡである前記（５）に記載の２本鎖ＲＮＡ。
（１４）センス鎖ＲＮＡが配列番号１３のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号１４のＲＮＡである前記（６）に記載の２本鎖ＲＮＡ。
（１５）センス鎖ＲＮＡが配列番号１５のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号１６のＲＮＡである前記（７）に記載の２本鎖ＲＮＡ。
（１６）センス鎖ＲＮＡが配列番号１７のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号１８のＲＮＡである前記（８）に記載の２本鎖ＲＮＡ。
（１７）前記（１）〜（８）に記載の２本鎖ＲＮＡから選択される１または２以上の２本鎖ＲＮＡを有効成分として含有する、ＰＡＣＥ４遺伝子の発現抑制剤。
（１８）前記（１）〜（８）に記載の２本鎖ＲＮＡから選択される１または２以上の２本鎖ＲＮＡの発現ベクターを有効成分として含有する、ＰＡＣＥ４遺伝子の発現抑制剤。
（１９）２本鎖ＲＮＡが前記（９）〜（１６）に記載の２本鎖ＲＮＡから選択される１または２以上の２本鎖ＲＮＡである、前記（１７）または（１８）に記載のＰＡＣＥ４遺伝子の発現抑制剤。
（２０）前記（１７）、（１８）または（１９）に記載の発現抑制剤を有効成分として含有する抗癌剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ＰＡＣＥ４遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡが提供される。この２本鎖ＲＮＡは、ＰＡＣＥ４が関与する疾患、特に癌の治療剤として使用できる可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の２本鎖ＲＮＡは、ＰＡＣＥ４遺伝子の発現を抑制するものである。ラットおよびヒトのＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡ配列は公知であり、この塩基配列に基づいて、２本鎖ＲＮＡを設計することができる。すなわち、ＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列から選択した任意領域について、それぞれｔをｕに変えたものをセンス鎖とし、その相補的な配列をアンチセンス鎖として設計されたＲＮＡのそれぞれの３’側に２〜４残基のオーバーハングを付加することで二本鎖ＲＮＡを作製することができる。このようにして作製された二本鎖ＲＮＡをラットＰＡＣＥ４遺伝子を発現している組織・細胞に導入して、ＰＡＣＥ４遺伝子の発現量を測定し、有効なＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡを選択する。
【０００９】
ラットＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１：GeneBank  ACCESSION  NO／L31894）から選択する任意領域としては、配列番号１の第769〜790位、第945〜969位、第1820〜1844位、第2622〜2646位、第1655〜1689位を選択できる。また、ヒトＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号２：GeneBank  ACCESSION  NO／M80482）から選択する任意領域としては、配列番号２の第964〜988位、第1143〜1167位、第2018〜2042位、第2860〜2884位、第1863〜18887位を選択できる。本発明のＰＡＣＥ４遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡは、これらの任意領域の配列に相当するＲＮＡを含むセンス鎖と、そのアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡである。具体的には、以下の８種類の２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を提供する。
【００１０】
[4-1]センス鎖      ：  5'  -gggcauagcauauaaugcaaagauaag-  3'（配列番号３）
アンチセンス鎖：3'  -uacccguaucguauauuacguuucuau-  5'  （配列番号４）
[4-2]センス鎖      ：  5'  -cuuucgaguauggcauuaaaaagggag-  3'（配列番号５）
アンチセンス鎖：3'  -uagaaagcucauaccguaauuuuuccc-  5'  （配列番号６）
[4-3]センス鎖      ：  5'  -gagaaacaaggaaaguugaaagaauag-  3'（配列番号７）
アンチセンス鎖：3'  -uacucuuuguuccuuucaacuuucuua-  5'  （配列番号８）
[4-4]センス鎖      ：  5'  -gugucgaagaugugaugaaaacugcag-  3'（配列番号９）
アンチセンス鎖：3'  -uacacagcuucuacacuacuuuugacg-  5'  （配列番号１０）
[4-5]センス鎖      ：  5'  -gaaggaagucucaacuuuuggcaaaag-  3'（配列番号１１）
アンチセンス鎖：3'  -uacuuccuucagaguugaaaaccguuu-  5'  （配列番号１２）
[4-6]センス鎖      ：  5'  -gggcauagcguacaaugccaaaauaag-  3'（配列番号１３）
アンチセンス鎖：3'  -uacccguaucgcauguuacgguuuuau-  5'  （配列番号１４）
[4-7]センス鎖      ：  5'  -gagaagcaagggaaguugaaagaauag-  3'（配列番号１５）
アンチセンス鎖：3'  -uacucuucguucccuucaacuuucuua-  5'  （配列番号１６）
[4-8]センス鎖      ：  5'  -gugucgaaggugugacgagaacugcag-  3'（配列番号１７）
アンチセンス鎖：3'  -uacacagcuuccacacugcucuugacg-  5'  （配列番号１８）
【００１１】
このような２本鎖ＲＮＡは、例えば、公知の方法（例えばCarruthers（1982）Cold
Spring Harbor Symp．Quant．Biol．47：411-418；Adams（1983）J．Am．Chem．Soc．105：661；Belousov（1997）Nucleic  Acid  Res．25：344-3444；Frenkel（1995）Free  Radic．Biol．Med．19：3783-380；Blommers（1994）Biochemistry33：7886-789；Narang（1979）Meth．Enzymol．68:90；Brown（1979）Meth．Enzymol．68：109；Beaucage（1981）Tetra．Lett．22：1589；米国特許第4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術によりＲＮＡを合成し、２本鎖にアニールさせることによって作製することができる。
【００１２】
上述したように、本発明の８種類のｓｉＲＮＡ[4-1］〜[4-8]は、ＰＡＣＥ４遺伝子の発現抑制剤として試薬あるいは医薬品に使用できる。このとき、ｓｉＲＮＡは単一種を単独で使用してもよいが、ＰＡＣＥ４遺伝子発現の抑制効果を向上させるため、２種類以上のｓｉＲＮＡを混合して使用することもできる。
【００１３】
上記ＰＡＣＥ４遺伝子の発現抑制剤の医薬品としての用途は、ＰＡＣＥ４が関与する疾患、特に癌への治療剤として使用できる可能性がある。すなわち、本発明の抗癌剤は、上述したＰＡＣＥ４遺伝子発現抑制剤を有効成分として含有する。
本発明のＰＡＣＥ４遺伝子発現抑制剤および抗癌剤は、２本鎖ＲＮＡを薬学的に許容できる担体と混合し、常法に従い製剤化される。担体としては、リポソーム、脂質小胞体、ミセルなど、希釈剤、結合材、増量剤、崩壊剤、分散剤、賦形剤、乳化剤、吸収剤、保存料、着色料などが挙げられる。
【００１４】
本発明のＰＡＣＥ４遺伝子発現抑制剤および抗癌剤は、注射剤、凍結乾燥品、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、シロップ剤、坐剤、軟膏剤、クリーム剤、点眼剤などの剤型をとることができる。また、このＰＡＣＥ４遺伝子発現抑制剤および抗癌剤は、当業者にとって既知である任意の手段により、局所的または全身に投与することができる。投与量は、被投与者の年齢、体重、健康状態、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型などによって適宜に変更することができ、具体的な投与手順は当業者により設定することができる。例えば、成人には、錠剤として投与する場合に０．１μｇ〜１０ｇ、好ましくは１μｇ〜１ｇ、さらに好ましくは１０μｇ〜１００ｍｇを１日に１〜５回投与することができる。
【００１５】
更に、本発明のＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ([4-1]〜[4-8]）を発現するベクターを、培養細胞または生体内の細胞に導入することにより、細胞内で本発明のＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡが産生され、導入した細胞でのＰＡＣＥ４遺伝子の発現を抑制することができる。このようなＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡの発現ベクターを、ＰＡＣＥ４遺伝子発現抑制剤および抗癌剤として投与することも可能である。ベクターとしては、上記のｓｉＲＮＡを、原核細胞ベクター、真核細胞ベクター、ウイルスベクターなどの公知のベクターに挿入・連携することにより構築できる。その具体的手順については、例えば、常用のテキストＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら著，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１年発行（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ｃｏｍ）に記載されている。
発現ベクターは、そのままの形態で、或いは常法に従い、公知の担体を用いて製剤化した後、皮下、皮内、筋肉内などに投与することができる。
【実施例１】
【００１６】
＜ｓｉＲＮＡによるＰＡＣＥ４遺伝子の発現抑制試験＞
ラット胎仔顎下腺原基の器官培養系を用い、唾液分泌に関わる水チャネルＡＱＰ５の発現と顎下腺の分枝形成を指標として、以下に示す本発明の５種類のｓｉＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ）についてＰＡＣＥ４遺伝子の発現抑制効果を確認した。
（ｓｉＲＮＡの配列）
[4-1]センス鎖      ：  5'  -gggcauagcauauaaugcaaagauaag-  3'（配列番号３）
アンチセンス鎖：3'  -uacccguaucguauauuacguuucuau-  5'  （配列番号４）
[4-2]センス鎖      ：  5'  -cuuucgaguauggcauuaaaaagggag-  3'（配列番号５）
アンチセンス鎖：3'  -uagaaagcucauaccguaauuuuuccc-  5'  （配列番号６）
[4-3]センス鎖      ：  5'  -gagaaacaaggaaaguugaaagaauag-  3'（配列番号７）
アンチセンス鎖：3'  -uacucuuuguuccuuucaacuuucuua-  5'  （配列番号８）
[4-4]センス鎖      ：  5'  -gugucgaagaugugaugaaaacugcag-  3'（配列番号９）
アンチセンス鎖：3'  -uacacagcuucuacacuacuuuugacg-  5'  （配列番号１０）
[4-5]センス鎖      ：  5'  -gaaggaagucucaacuuuuggcaaaag-  3'（配列番号１１）
アンチセンス鎖：3'  -uacuuccuucagaguugaaaaccguuu-  5'  （配列番号１２）
上記[4-1]〜[4-5]の５種類のｓｉＲＮＡは、ラットＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）に基づいて設計された。それぞれ選択した配列と、その位置を下記の表１に示す。
【００１７】
【表１】
2008167719.tif 000002
【００１８】
（方法）
胎生15日齢ＳＤラット胎仔より顎下腺原基を実体顕微鏡下摘出し、BGJb培地に浮遊したポリカーボネート性の膜上に並べて1時間前培養（37℃，5％CO2）した。ＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡｓ（4-1，4-2，4-3，4-4および4-5）の導入はoligofectamine（インビトロジェン社）を用いて行い。導入開始０時間後、24時間後および48時間後の形態変化を写真撮影した。コントロールは１０％ＦＣＳのみの存在下で培養し、同様に形態変化を記録した。48時間後に全ＲＮＡをＴＲＩ  ｒｅａｇｅｎｔ（シグマ社）を用いて単離し、ＡＱＰ５、ＰＡＣＥ４などの発現レベルをＲＴ−ＰＣＲにより解析した。ＲＴ−ＰＣＲは各々について単独で、one  step  RT-PCR  system（インビトロジェン社）を用いて行った。反応後、各１μｌを用い、ＰＡＣＥ４とｆｕｒｉｎ，ＡＱＰ５とβ−ａｃｔｉｎを同一レーンにして、１％アガロースゲル電気泳動にかけた。各遺伝子の発現レベルをＮＩＨ  Ｉｍａｇｅにより定量し、コントロールを100％として表した。
【００１９】
（結果）
(1)ＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-1]を導入した場合
ｓｉＲＮＡ濃度500ｎＭでＲＮＡｉ実験を行った場合、コントロールと比較して分枝形成などの形態変化に大きな差は認められなかったが、ＲＴ−ＰＣＲによる解析の結果（図１Ａ上）、ＰＡＣＥ４の発現レベルがコントロール（レーンＮｏ．Ｓ；以後同様）の約30％程度にまで抑制されていた。この時、分化の指標でもあるＡＱＰ５の発現レベルもコントロールの約40％程度にまで減少していた。そこで導入時のｓｉＲＮＡ濃度を１μＭに上げてＲＮＡｉ実験を行った結果、ＰＡＣＥ４の発現レベルはコントロールの約５％にまで抑制され、ＡＱＰ５の発現レベルもほぼ完全に抑制された（図１Ａ下）。この時の形態変化では、10％ＦＣＳのみ存在下で培養した場合（コントロール；図１Ｂ左）、培養時間の経過と共に分枝形成が進行するのに対して、ｓｉＲＮＡを導入した場合には分枝形成が抑制され、48時間後には唾液腺上皮の消失が認められた（図１Ｂ右）。
【００２０】
(2)ＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-2]を導入した場合
ｓｉＲＮＡ濃度500ｎＭでＲＮＡｉ実験を行った場合、コントロールと比較して分枝形成などの形態変化に大きな差は認められなかったが、ＲＴ−ＰＣＲによる解析の結果（図２Ａ上）、ＰＡＣＥ４の発現レベルがコントロールの約50％程度にまで抑制され、分化の指標であるＡＱＰ５の発現レベルはコントロールの約50％程度に減少していた。導入時のｓｉＲＮＡ濃度を１μＭに上げた場合、ＰＡＣＥ４の発現レベルはコントロールの約30％にまで、ＡＱＰ５の発現レベルは約10％にまで抑制された（図２Ａ下）。この時の形態変化では、コントロール（図２Ｂ左）と比較して、ｓｉＲＮＡを導入した場合には分枝形成が抑制され、腺房部の肥大化が認められた（図２Ｂ右）。
【００２１】
(3)ＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-3]を導入した場合
ｓｉＲＮＡ濃度500ｎＭでＲＮＡｉ実験を行った場合、前述のｓｉＲＮＡｓと同様に形態変化の大きな差は認められなかったが、ＲＴ−ＰＣＲの結果（図３Ａ上）ではＰＡＣＥ４の発現レベルはコントロールの約40％程度にまで抑制され、ＡＱＰ５の発現レベルはコントロールの約５０％程度に減少していた。ｓｉＲＮＡ濃度を１μＭに上げた場合、ＰＡＣＥ４の発現レベルはコントロールの約30％、ＡＱＰ５の発現レベルは約10％にまで抑制された（図３Ａ下）。この時の形態変化は、コントロール（図３Ｂ左）に対して、ｓｉＲＮＡを導入した場合、分枝形成が抑制され、腺房部の肥大化が認められた（図３Ｂ右）。
【００２２】
(4)ＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-4]を導入した場合
ｓｉＲＮＡ濃度500ｎＭでＲＮＡｉ実験を行った場合、やはり分枝形成などの形態変化への影響は認められなかったが、ＲＴ−ＰＣＲによる解析の結果（図４Ａ上）、ＰＡＣＥ４の発現レベルはコントロールの約40％程度にまで抑制され、ＡＱＰ５の発現レベルはコントロールの約30％程度に減少していた。ｓｉＲＮＡ濃度１μＭでは、ＰＡＣＥ４の発現レベルはコントロールの約10％にまで抑制され、ＡＱＰ５の発現レベルはｓｉＲＮＡ[4-1]（結果１）参照）に匹敵するレベルまで抑制された（図４Ａ下）。この時の形態変化は，コントロール（図４Ｂ左）に対して、分枝形成の抑制および腺房部の肥大化が認められ、唾液腺上皮のサイズが、ｓｉＲＮＡ[4-2]や[4-3]の場合（結果(2)および(3)参照）より小さくなる傾向が認められた（図４Ｂ右）。
【００２３】
(5)ＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-5]を導入した場合
ｓｉＲＮＡ濃度500ｎＭで、ＰＡＣＥ４（ｓｉＲＮＡ[4-5]）とＰＣ６（ｓｉＲＮＡ[6-1]）の共抑制実験を試みた（図５）。実験はＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-5]単独導入（図５，レーンＮｏ．１）、ＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-5]とＰＣ６  ｓｉＲＮＡ[6-1]の共導入（図５，レーンＮｏ．２）、およびＰＣ６  ｓｉＲＮＡ[6-1]単独導入（図５，レーンＮｏ．３）の３パターンで行った。いずれの場合も分枝形成などの形態変化への影響は顕著でなかったが、ＲＴ−ＰＣＲによる解析で（図５）、ＰＡＣＥ４の発現レベルはＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-5]の導入量に応じて抑制されることが示唆された。つまり、共導入実験（レーンＮｏ．２）の場合、ＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-5]の導入に対してＰＣ６  ｓｉＲＮＡ[6-1]がコンペティターとして作用した結果、ＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-5]単独導入時（レーンＮｏ．１）のＰＡＣＥ４発現レベルがＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-5]非導入時（レーンＮｏ．３）の26％に対して、45％となった。一方、ＡＱＰ５の発現レベルもＰＡＣＥ４発現の抑制レベルに比例して共導入実験（レーンＮｏ．５）では73％、ＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-5]単独導入時（レーンＮｏ．４）では32％まで抑制された。
【００２４】
（ヒトＰＡＣＥ４遺伝子の発現抑制について）
表２に、前記５種類のＰＡＣＥ４遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ[4-1]〜[4-5]において、設計の基にしたラットＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）上の２５塩基の配列とその位置、およびそれに対応するヒトＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号２）上の２５塩基の配列とその位置を示す。本発明の上記５種類のラットＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡのうち、ｓｉＲＮＡ[4-2]および[4-5]については、ラットとヒトのそれぞれのＰＡＣＥ４で共通する配列であるので、ｓｉＲＮＡ[4-2]および[4-5]は、ラットＰＡＣＥ４遺伝子だけでなくヒトＰＡＣＥ４遺伝子の発現も抑制すると考えられる。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
表３に、ラットＰＡＣＥ４遺伝子の発現を抑制した上記ｓｉＲＮＡ[4-1]、[4-3]および[4-4]において、対応するヒトＰＡＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号２）上の２５塩基の配列とその位置、さらにその配列を基に作製したＲＮＡの配列を示す。本発明の前記３種類のラットＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ（[4-1]、[4-3]および[4-4]）は、ラットＰＡＣＥ４遺伝子の発現を抑制するので、ヒトＰＡＣＥ４  ｃＤＮＡにおいて対応する配列を基に作製された下記３種類のｓｉＲＮＡ[4-6]〜[4-8]は、ヒトＰＡＣＥ４遺伝子の発現を抑制すると考えられる。
【００２７】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明の２本鎖ＲＮＡは、ＰＡＣＥ４機能の研究の為の試薬として、さらに、ＰＡＣＥ４が関与する疾患、特に癌の治療剤および／または予防剤として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ラット胎仔顎下腺原基の器官培養系における、本発明のＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-1]のＰＡＣＥ４遺伝子の発現抑制効果を示す図面である。図１Ｂが、ｓｉＲＮＡ導入開始後の形態変化を示す写真図であり、図１Ａが、導入48時間後における各遺伝子の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図である。
【図２】ラット胎仔顎下腺原基の器官培養系における、本発明のＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-2]のＰＡＣＥ４遺伝子の発現抑制効果を示す図面である。図２Ｂが、ｓｉＲＮＡ導入開始後の形態変化を示す写真図であり、図２Ａが、導入48時間後における各遺伝子の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図である。
【図３】ラット胎仔顎下腺原基の器官培養系における、本発明のＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-3]のＰＡＣＥ４遺伝子の発現抑制効果を示す図面である。図３Ｂが、ｓｉＲＮＡ導入開始後の形態変化を示す写真図であり、図３Ａが、導入48時間後における各遺伝子の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図である。
【図４】ラット胎仔顎下腺原基の器官培養系における、本発明のＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-4]のＰＡＣＥ４遺伝子の発現抑制効果を示す図面であり、図４Ｂが、ｓｉＲＮＡ導入開始後の形態変化を示す写真図であり、図４Ａが、導入48時間後における各遺伝子の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図である。
【図５】ラット胎仔顎下腺原基の器官培養系における、本発明のＰＡＣＥ４  ｓｉＲＮＡ[4-5]と、ＰＣ６遺伝子のｓｉＲＮＡ[6-1]の共抑制試験において、ｓｉＲＮＡ導入48時間後における各遺伝子の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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