(57)【要約】【課題】本発明は、フォトレジスト法を用いた、異種の機能を有する相を複数枚積層した機能性複合膜、それを製造する方法ならびに酵素やタンパク質等を用い、機能性複合膜を利用して有用物質を製造する方法に関する。【解決手段】グルタミン酸脱炭酸酵素を含む物質を光感光性ポリビニルアルコールに溶解し、陽イオン交換膜の片面に塗布・乾燥後、光感光性樹脂が硬化する波長を含む光源を照射することにより重合するフォトレジストの手法を利用して複合化した複合膜を作製し、作製した複合膜ＣＭをＦｅｅｄ側ＦとＳｔｒｉｐ側Ｓとの２室からなる拡散透析槽の中央に配置し、機能性物質を固定化した複合面に酵素反応を行う基質溶液を流し、もう一方の複合面に電解質溶液等を流して透析を行うと、固定化した複合面で目的物が生成するとともに、生成物の一部が複合膜を透過して反対の電解質溶液に回収され、反応と分離が同時に行うことができる。【選択図】図１
2008238011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性複合膜となるベース材として高分子性イオン交換膜を用い、光感光性素材としてＰＶＡに光感光物質であるアジド系感光基を有する物質を用い、光感光性物質の量は光を照射して固化する量であり、固定化する水溶性物質は、溶液として混合あるいは含有量を高めるために凍結乾燥した粉体として光感光性物質含有ＰＶＡに混合、溶解あるいは分散させ、光感光性物質に対する酵素等の固定化物質の量は０．１〜３０ｗｔ％とすることを特徴とする機能性複合膜。
【請求項２】
前記固定化物質として、生理活性を有する物質を生産するためのグルタミン酸脱炭酸酵素、アミラーゼ等をはじめとする単一のタンパク質あるいは複合タンパク質等を含有することを特徴とする請求項１記載の機能性複合膜。
【請求項３】
光感光性を有する素材ならびに高分子機能性膜を用い、光感光性素材中に酵素などのタンパク質、あるいはシクロデキストリンなど化学的、物理的な相互作用を及ぼす機能性物質を溶解、分散し、高分子機能性膜上に塗布、含浸、乾燥後、光感光性素材が化学変化をする領域の波長を含む光源を照射して現像さらには定着を行うフォトレジスト法を用い、異種材料間の機械的結合性を高め、１枚の膜中に複数の機能を有する高機能複合膜を製造することを特徴とするフォトレジスト法を用いた機能性複合膜の製造方法。
【請求項４】
機能性高分子機能性膜上に酵素等を含む異種の相を複合化した複合膜を用い、酵素等の機能を発現させて物質の生成と分離を同時に行うことを特徴とする機能性複合膜を利用して有用物質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フォトレジスト法を用いた、異種の機能を有する相を複数枚積層した機能性複合膜、それを製造する方法ならびに酵素、タンパク質、シクロデキストリン等を用い、機能性複合膜を利用して有用物質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素等を利用して有用物質を生産する場合、酵素反応のみならず、分離操作、濃縮操作、精製操作等多くのステップを介して行われており、コストダウンを含む効率の良い生産を計るには、複数のステップを１ユニットで実現できる高効率なプロセスを導入し、製品として得るまでの工程、ユニット数を減少することは重要である。
【０００３】
この様な技術の一つとして、反応と分離を同時に行う組み合わせ型の反応器による運転は有効な手段となりえる。
特に、固液分離操作においてエネルギー消費量の少ない膜分離法を採用した場合、複雑なオペレーションを行わずに安定な操作が行えることから、膜分離法は魅力的な分離操作の一つとなる。
しかし、液体中に固体、あるいはコロイド状物質等の分子量が大きな物質が含まれる場合、膜面上へのスケールの付着を生じ膜の性能低下をもたらす。そのため、化学反応と分離操作を同時に行う際には、膜面にスケールが直接生成しないように、有用物質をゲル状、あるいは付着性を有する担体へ固定化して操作を行うことが必要である。
【０００４】
一般に、この様なシステムにおいては、固定化担体と機能性分離膜は一つのシステムの中で別々のユニットとして存在する場合が多い。
そのため、反応タンクの大型化、あるいは担体同士の接触による摩耗他等の問題が生じる。
この問題を解決する方法の一つとして、機能性分離膜の表面に他の機能性物質を含む相を形成した複合膜を用いる方法があり、たとえば機能性分離膜の一種であるイオン交換膜を複合化する技術については種々の方法が考案されている（特許文献１〜４を参照）。
しかし、これらの手法では機能性物質を母材となる膜に複合化する際、機能性物質を含む相を化学的に合成、あるいは塗布して複合化する手法を用いるため、熱的に不安定なタンパク質、酵素等を含む複合膜を作製する場合には、複合化反応の過程で有用物質の活性が低下し、かならずしも十分な機能の発現が行われない場合が多いと考えられる。
【特許文献１】特開２００５−０６８３９６号公報
【特許文献２】特開２００４−１３９８３７号公報
【特許文献３】特開２００４−１３９８３６号公報
【特許文献４】特開平１０−３１２８１５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明では、熱的、化学的なストレスを有する機能性物質等を含む相を、その化学的、物理的な機能を低下させることなく他の機能性を有する膜に複合化する新しい創製方法を提供する事、ならびにその複合膜の機能を発現させ、有用物質を生産する方法を提供する事を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の機能性複合膜は、機能性複合膜となるベース材として高分子性イオン交換膜を用い、光感光性素材としてＰＶＡに光感光物質であるアジド系感光基を有する物質を用い、光感光性物質の量は光を照射して固化する量であり、固定化する水溶性物質は、溶液として混合あるいは含有量を高めるために凍結乾燥した粉体として光感光性物質含有ＰＶＡに混合、溶解あるいは分散させ、光感光性物質に対する酵素等の固定化物質の量は０．１〜３０ｗｔ％とするものである。
前記固定化物質として、生理活性を有する物質を生産するためのグルタミン酸脱炭酸酵素、アミラーゼ等をはじめとする単一のタンパク質あるいは複合タンパク質等を含有するものである。
【０００７】
本発明のフォトレジスト法を用いた機能性複合膜の製造方法は、光感光性を有する素材ならびに高分子機能性膜を用い、光感光性素材中に酵素などの化学的、物理的な相互作用を及ぼす機能性物質を溶解、分散し、高分子機能性膜上に塗布、含浸、乾燥後、光感光性素材が化学変化をする領域の波長を含む光源を照射して現像さらには定着を行うフォトレジスト法を用い、異種材料間の機械的結合性を高め、１枚の膜中に複数の機能を有する高機能複合膜を製造するものである。
本発明の機能性複合膜を利用して有用物質を製造する方法は、高分子機能性膜上に酵素等を含む異種の相を複合化した複合膜を用い、酵素等の機能を発現させて物質の生成と分離を同時に行うものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のフォトレジスト法を用いた機能性複合膜の製造方法においては、光感光性素材を用いて複合膜を調製することから、機能性物質の機能性低下は化学合成法等に比較して少なく、そのため、酵素、タンパク質、シクロデキストリン等を含む複合膜も容易に作製できる。また、フォトレジストの技術の一つであるリソグラフ法を用いることから、現像、定着操作により任意のパターンを有する複合膜を設計できる。
また、本発明の機能性複合膜を利用して有用物質を製造する方法においては、得られた複合膜の反応相に原料となる液を供給し、他方の相には回収用の液を流すのみで複合膜の機能を発現させ、反応相で生成した物質を回収側に分離できることから、工業的に優れた生産方法であると言える。
さらに、特定の細胞やタンパク質に対して特異的に作用する物質を含む相を複合化した場合、アレルギー物質、ウイルス等の分離を行うことも可能であると考えられ、医薬分野、医療分野への応用も期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明者等は、熱的、化学的なストレスを有する機能性物質等を含む相を、その化学的、物理的な機能を低下させることなく他の機能性を有する膜に複合化する新しい創製方法を提供するため鋭意検討を行った。
その結果、グルタミン酸脱炭酸酵素を含む物質を光感光性ポリビニルアルコール、例えばアジド系感光基を有する水溶性ポリビニルアルコールに溶解し、陽イオン交換膜の片面に塗布・乾燥後、光感光性樹脂が硬化する波長を含む光源を照射することにより重合するフォトレジストの手法を利用して複合化した複合膜を作製する技術に想到し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、機能性を有する物質を含む感光性素材を用いて、熱的な重合反応、合成反応の操作を経ることなく、感光性素材が化学変化を生じる波長領域を含む光源を照射するのみで既存の機能性膜に複合化する技術、ならびに、発明した技術により作製した複合膜の機能を発現させ、物質の生産・分離操作を同時に行う技術である。
なお、既存の機能性膜は、有機性のものに限らず無機膜、セルロース等でも可能である。
【００１０】
上記の本発明で得られた複合膜は、複合相の違いで機能性が異なるため、たとえば反応性を付与した相と分離特性を有する相を複合化した複合膜のそれぞれの面に、反応溶液、および反応物を回収する溶液を流すと、反応相において生成物が生成されるとともに反対側の面へ同時に生成物が分離されてくるシステムを構築することも可能である。
【００１１】
本発明による複合膜の製造方法では、光感光性素材溶液に機能性物質を溶解するか、あるいはコロイド状の状態でできるだけ均一に分散させることにより、光架橋化後に得られる複合膜においても機能性物質が均一に存在する。また、機能性物質の含有量は溶解させる目的物質の量を調整することで可能となる。
機能性物質を含む光感光性樹脂溶液は、複合化を行う他の膜面上に塗布、乾燥を行うが、塗布する回数、あるいはスピンコートにより塗布相厚みの制御が可能であることから、複合化膜の積層構造を比較的制御しやすい。
塗布、乾燥を行った面には、ネガ型の光感光性素材を用いた場合紫外線の領域を含む光源等、素材が化学変化を生じる領域の波長を含む光源を照射して光重合を行うが、ピーク波長が３５２nmの光源でも十分に重合が可能であることから、紫外線によるダメージを受けやすい物質でもその機能の低下を極力抑制しながら固定化する事が可能となる。
【００１２】
また、この際、ネガ型の光感光性素材を用いた場合には照射光源をリソグラフ技術により任意の形状で照射すると、その部分のみが重合が進み硬化する。
その後、水他の現像液で洗浄することにより現像操作を行うと感光しない部分のみが流出する事から、光源のパターンに応じた重合が可能となり、化学的な合成法では得ることが困難な構造が制御された機能性膜を得ることができる。なお、ポジ型の光感光性素材溶液を用いた場合、現像操作を行うと光照射を行った部分のみが溶解するため、ネガ型の光感光性素材を用いた場合のパターン制御法とは逆の製法となる。
光重合により複合化を行う機能性膜は、含水性を有する場合、光感光性素材モノマーの一部は機能性膜の一部にも含浸されることから、光重合を行うと表面の含水相の一部においても重合が進行するため、機能性膜を別々に作製し張り合わせた場合よりも密着性が向上する。
【００１３】
上記手法により複合化を行った複合膜を用いて、その機能を発現させて有用物質を生産する場合、図１に示すように、作製した複合膜ＣＭをＦｅｅｄ側ＦとＳｔｒｉｐ側Ｓとの２室からなる拡散透析槽の中央に配置し、機能性物質を固定化した複合面に酵素反応を行う基質溶液を流し、もう一方の複合面に電解質溶液等を流して透析を行うと、固定化した複合面で目的物が生成するとともに、生成物の一部が複合膜を透過して反対の電解質溶液に回収され、反応と分離が同時に行うことができる。なお、Ｂは恒温槽である。
この際、酵素反応を行う場合、酵素の種類に応じて最適なｐＨ、温度に溶液を調整するとよい。
【実施例１】
【００１４】
以下、本発明のフォトレジスト法を用いた機能性複合膜の製造方法を実施例により説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
（１）ベースとなる機能性高分子膜として、厚さが１００〜２００μｍ程度のイオン交換膜を用いる。
（２）固定化剤として、ネガ型の光感光性を有し、ゲル状の光感光性物質を含有しているＰＶＡ水溶液（例えばアジド系感光基を有する水溶性ポリビニルアルコール）を用いた。
（３）光感光性物質の重量割合は水溶液重量に対して２〜５ ｗｔ％で実施したが、この濃度に固定するものではない。
（４）固定化される物質は、凍結乾燥法により処理を行った後、光感光性の機能を有するＰＶＡ水溶液に混合、溶解し、均一に分散させた。実施例における具体的な操作は、米糠から浸出したグルタミン酸脱炭酸酵素を含む粗タンパク質水溶液を凍結乾燥処理した後、所定量を光感光性機能を有するＰＶＡに溶解させた。
（５）前記水溶液（光感光性機能を有するＰＶＡ水溶液）に対する酵素等を含有する粗タンパク質の含有割合は２８％程度で実施したが、均一に分散させるという観点から好ましくは０．１ ｗｔ％から前記水溶液（光感光性機能を有するＰＶＡ水溶液）に対する飽和溶解度の範囲である。
（６）粗タンパク質等を含有する前記水溶液（光感光性機能を有するＰＶＡ水溶液）をセルロース膜、あるいはイオン交換膜面上に塗布、含浸操作を行い、その後乾燥操作を行った。実施例ではセルロース膜および陽イオン交換膜を用いてその片面に塗布、含浸操作を行ったが、複合化する膜についてはこの２種類に特定されるものではない。
（７）乾燥後、化学反応を進行させるため、３５２ ｎｍのピーク波長を有する光源を３０分照射したが、光化学反応が生じる波長領域を含む光線であればこのピーク波長に固定するものではない。また、光源のエネルギー出力、光源と複合膜との距離、照射時間については、ゲルが十分に固化する値であれば特定の値に固定されるものではない。
（８）上記の手法で得られた複合膜上の固定化相の厚みは、約３００μｍ程度であったが、単位膜面積あたりの固定化量を増加させるため塗布、含浸の操作および光反応の操作を繰り返すと膜の厚みが変わるため、その厚みに固定されるものではない。
（９）図２に陽イオン交換膜上にグルタミン酸脱炭酸酵素を含むＰＶＡ相を複合化した膜のイメージを示す。１はイオン交換基、２は陽イオン交換膜相、３は固定化物質、４は複合化した膜の接合相、５は光感光性物質で固定化した粗タンパク質を含む相である。
【実施例２】
【００１５】
以下、本発明の機能性複合膜を用いた有用物質の製造方法を実施例により説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
（１）実施例１の手法で作製したグルタミン酸脱炭酸酵素を含む粗タンパク質をＰＶＡ相に固定化するとともにセルロース膜に複合化した複合膜を、グルタミン酸脱炭酸酵素の機能が発現する１ ｍｏｌ／ｍ３のグルタミン酸水溶液に浸漬し、温度４０度のもとで生成する物質の反応を追跡した。
（２）図３にグルタミン酸水溶液中のアミノ酸濃度の経時変化を示すグラフ図を示す。●はγ―アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、○はグルタミン酸、△はアスパラギン酸、□はアラニンである。
（３）図３より、浸漬液中のグルタミン酸の濃度は急激に減少するが、それに対応して酵素反応によって生成したγ−アミノ酪酸の濃度が増加した。この結果より、ＰＶＡを基本骨格とした水溶性感光性素材に固定化してセルロース膜に複合化した酵素を含む粗タンパク質は、複合化を行ってもその機能は発現できることがわかる。
（４）なお、本実施例で使用したグルタミン酸水溶液は、グルタミン酸脱炭酸酵素の基質として供給した物質であり、他の酵素等タンパク質の機能を発現させる場合には、その基質特異性に応じた物質を供給するのが望ましい。また、温度、ｐＨ等の条件についても反応を阻害しない範囲であれば特に固定されるものではない。
【００１６】
（１）実施例１の手法で作製したグルタミン酸脱炭酸酵素を含む粗タンパク質をＰＶＡ相に固定化するとともに陽イオン交換膜の片面に複合化した複合膜を、図１に示す２室からなる透析槽の中央に配置した。
（２）図１に示すＦｅｅｄ側Ｆにグルタミン酸脱炭酸酵素等を含む粗タンパク質含有相を、また反対側のＳｔｒｉｐ側Ｓにイオン交換膜相を向けて設置した。
（３）Ｆｅｅｄ側Ｆに基質となるグルタミン酸水溶液を、またＳｔｒｉｐ側Ｓに、塩酸水溶液を流して、酵素反応と分離操作を同時に行った。なお、Ｆｅｅｄ側に流す溶液は酵素等の機能が発現する基質溶液であれば特に固定されるものではない。またＳｔｒｉｐ側に流す溶液は、機能性膜の機能が発現できる溶液であれば塩酸に固定されるものではない。また、運転形式は本実施例では回分循環型の操作で行ったが、十分な膜面積および溶液量が確保される場合には連続操作による運転も可能である。
（４）その結果を図４のＳｔｒｉｐ室におけるアミノ酸濃度の経時変化を示すグラフ図に示す。●はγ―アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、○はグルタミン酸、△はアスパラギン酸、□はアラニンである。
（５）図４より、透析の初期には基質であるグルタミン酸の膜透過が観測されるものの、生成したγ−アミノ酪酸が複合膜を透過して塩酸側に分離・回収された。
よって、新規に作製した複合膜の機能が発現したこと、また、その複合膜を用いて基質を複合膜の片側に流すのみで反対側の面に生成物を分離・回収できることが実験的に実証された。
【産業上の利用可能性】
【００１７】
食品産業、医薬品製造、医療分野、分析化学、センサーをはじめとする電子産業、さらには排水処理等幅広い分野への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】複合膜の機能を発現させ、酵素反応と分離操作を同時に行うための装置の概略図である。
【図２】陽イオン交換膜面の片側に酵素を含むＰＶＡ相を複合化した膜のイメージ図である。
【図３】グルタミン酸脱炭酸酵素を含むＰＶＡ相をセルロースに複合化した膜をグルタミン酸水溶液に浸せきした場合の溶液中におけるアミノ酸濃度の経時変化を示すグラフ図である。
【図４】グルタミン酸脱炭酸酵素を含むＰＶＡ相を陽イオン交換膜の片面に複合化した膜を図１に示す装置に装着し、回分循環型操作を行った場合の、Ｓｔｒｉｐ室におけるアミノ酸濃度の経時変化を示すグラフ図である。
【符号の説明】
【００１９】
１  イオン交換基
２  陽イオン交換膜相
３  固定化物質
４  複合化した膜の接合相
５  光感光性物質で固定化した粗タンパク質を含む相
【図１】
2008238011.tif 000003
【図２】
2008238011.tif 000004
【図３】
2008238011.tif 000005
【図４】
2008238011.tif 000006