(57)【要約】【課題】タンパク質溶液からアポリポタンパク質を除去する方法を提供すること。【解決手段】タンパク質溶液からアポリポタンパク質を除去する方法であって、（１）ベントナイトをタンパク質溶液に添加し、 （２）該ベントナイトを、ベントナイトがアポリポタンパク質を吸収するのに十分な時間、該溶液と接触させ、及び、 （３）該ベントナイトを該タンパク質溶液から除去する、事を特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤の精製方法であって、
（１）アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む不純タンパク質画分を用意し、
（２）アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む不純タンパク質画分を、水溶液に、ｐＨ６．０±０．２で、可溶性タンパク質が溶解するのに十分な時間懸濁させ、
（３）該懸濁液を、濾過し、不溶性タンパク質を回収し、
（４）該不溶性タンパク質を水溶液に再懸濁し、
（５）ポリエチレングリコールを、該再懸濁不溶性タンパク質に添加して、α−２−グロブリンを沈殿させ、
（６）ポリエチレングリコール沈殿から、アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む上澄み液を回収し、
（７）ＺｎＣｌ2を、該上澄み液に添加して、粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を沈殿させ、
（８）粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を回収し、
（９）回収した粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を溶解し、
（１０）溶解した粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を、アニオン交換媒体に適用し、及び、
（１１）精製アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む画分を、アニオン交換媒体から回収する、
事を特徴とする方法。
【請求項２】
アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む不純タンパク質画分が、アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む不純タンパク質画分の各部分に対して、３〜７容量の水溶液に懸濁される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
水溶液が、水及び、０．０５〜０．１５Ｍの濃度でＮａＣｌを含有する溶液から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
不溶性タンパク質を含む水溶液のｐＨが、８．５±０．５に調整される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ポリエチレングリコールが、１０％〜２０％ｗ／ｗの濃度まで添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ポリエチレングリコール沈殿からの上澄み液のｐＨが７．５±０．５に調整される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＺｎＣｌ2が、１〜１１ｍＭの濃度まで添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＺｎＣｌ2沈殿から回収された粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を、ウイルス汚染物を不活性化する為に処理する事を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤が、溶剤と界面活性剤とで処理される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤が、トリ−ｎ−ブチルホスフェート及びポリソルベート８０で処理される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤が、０．１５〜０．４５％ｗ／ｖのトリ−ｎ−ブチルホスフェートと、０．５〜１．５％ｗ／ｖのポリソルベート８０で処理される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ベントナイトを、アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む溶出液に添加することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
精製アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤が、１．０単位／ＯＤ280の比活性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
精製アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤が、画分ＩＶ1＋ＩＶ4ペーストの１ｇ当たり、少なくとも１単位の収量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤の精製方法であって、
（１）アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む不純タンパク質画分を用意し、
（２）アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む不純タンパク質画分を、水溶液に、ｐＨ６．０±０．２で、可溶性タンパク質が溶解するのに十分な時間懸濁させ、
（３）該懸濁液を、濾過し、アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む不溶性タンパク質を回収し、
（４）該不溶性タンパク質を水溶液に、ｐＨ８．５±０．５で再懸濁し、
（５）ポリエチレングリコールを、再懸濁した不溶性タンパク質を含む水溶液に、１０％〜２０％ｗｔ／ｗｔの濃度まで添加して、α−２−グロブリンを沈殿させ、
（６）アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含むポリエチレングリコール上澄み液を回収し、
（７）該上澄み液のｐＨを７．５±０．５に調整し、
（８）ＺｎＣｌ2を、該上澄み液に添加して、粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を沈殿させ、
（９）粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を、プロスタック濾過で回収し、粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を水溶液に再溶解し、
（１０）再溶解した粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を、溶剤と界面活性剤とで処理してウイルス汚染物を不活性化し、
（１１）溶剤−界面活性剤処理した粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を、アニオン交換媒体に適用し、
（１２）アニオン交換媒体から、アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む画分を回収し、
（１３）アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む画分を、ベントナイトで処理して、アポリポタンパク質を吸着させ、及び、
（１４）精製アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む溶液を回収する、
事を特徴とする方法。
【請求項１６】
精製アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む溶液を限外濾過することを含む、回収された画分の処理を更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
精製アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む限外濾過された溶液を凍結乾燥する事を更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
精製アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤が、１．０単位／ＯＤ280の比活性を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
精製アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤が、画分ＩＶ1＋ＩＶ4ペーストの１ｇ当たり、少なくとも１．０単位の収量を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤の精製方法であって、
（１）アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む不純タンパク質画分を用意し、
（２）不純タンパク質画分を、アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を溶解することなく、アルブミン、アルファ−２−タンパク質及びベータータンパク質を溶解する温度でｐＨ６．０±０．２の水溶液に懸濁させ、
（３）不溶性タンパク質を、アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含めて、溶解タンパク質から分離し、
（４）該不溶性タンパク質を水溶液に再懸濁し、この溶液にポリエチレングリコールを添加し、この際、該溶液の温度及びｐＨ及びポリエチレングリコールの濃度を選択して、アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を沈殿することなく、α−２−タンパク質を沈殿させ、
（５）ポリエチレングリコール沈殿から上澄み液を回収し、ＺｎＣｌ2を添加し、この際、該溶液の温度及びｐＨ及びＺｎＣｌ2の濃度を選択して、粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を沈殿させ、
（６）沈殿した粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を回収し、該粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を水溶液に溶解し、
（７）粗アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤の水溶液を、アニオン交換媒体に適用し、及び
（８）アニオン交換媒体から、精製アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む画分を回収する、事を特徴とする方法。
【請求項２１】
溶剤−界面活性剤処理によるウイルス不活性化に掛けられたタンパク質溶液におけるタンパク質単位の収量増加方法であって、該タンパク質溶液に、溶剤−界面活性剤処理によるウイルス不活性化に伴うタンパク質の収量を増加させるのに十分な量の糖を安定剤として添加する事を特徴とする方法。
【請求項２２】
タンパク質が、アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
糖が、１０％〜２０％ｗｔ／ｗｔの量でタンパク質溶液に添加される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
糖がスクロースである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
タンパク質溶液からアポリポタンパク質を除去する方法であって、
（１）ベントナイトをタンパク質溶液に添加し、 
（２）該ベントナイトを、ベントナイトがアポリポタンパク質を吸収するのに十分な時間、該溶液と接触させ、及び、
（３）該ベントナイトを該タンパク質溶液から除去する、
事を特徴とする方法。
【請求項２６】
ベントナイトを、少なくとも一時間、タンパク質溶液と接触させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
タンパク質溶液に添加されるベントナイトの量が、約０．１〜約１．０％ｗｔ／ｗｔである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ベントナイトの除去後にタンパク質溶液に残留するアポリポタンパク質Ａとアポリポタンパク質Ｂとのそれぞれの量が、約０．０１ｍｇ／ｍｌ未満である、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤（アルファ−１−アンチトリプシン）の精製の為の改良方法及びタンパク質溶液からアポリポタンパク質を除去する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤（α−１−ＰＩ又はアルファ−１−ＰＩ）は、α−アンチトリプシンとしても知られている、分子量５２，０００の血清グリコプロテインである。アルファ−１−ＰＩは、肝臓で合成され、プラズマ法で分析すると、１５０〜３５０ｍｇ／ｄｌ（３０〜８０μＭに相当する）の水準で血清中に存在する。
アルファ−１−ＰＩは肺において機能して、好中球エラスターゼ、大量の肺胞壁の破壊へ導くセリンプロテアーゼを抑制する。通常の肺では、アルファ−１−ＰＩは、低気道において、９０％より多い抗好中球エラスターゼ保護を与える。
【０００３】
アルファ−１−ＰＩ欠乏は、多数の対立遺伝子性変異体として示される、常染色性の、劣性の、遺伝性疾患であり、プロテアーゼ阻害剤（Ｐｉ）系と呼ばれる対立遺伝子配列としての特徴を有する。これらの対立遺伝子は、異なる個人の血清中に生起するアルファ−１−ＰＩ水準を基にして分類されている。正常な個人は、正常なアルファ−１−ＰＩの血清水準を有する（正常な個人は、ＰｉＭＭ表現形を有すると呼ばれている）。欠乏性個人は、平均的正常水準の３５％未満の血清アルファ−１−ＰＩ水準を有する（これらの個人は、ＰｉＺＺ表現形を有すると呼ばれている）。全く無い個人は、それらの血清中に検出出来ないアルファ−１−ＰＩタンパク質を有する（これらの個人は、Ｐｉ（ｎｕｌｌ）（ｎｕｌｌ）表現形を有すると呼ばれている）。
アルファ−１−ＰＩ欠乏は、アルファ−１−ＰＩの低血清水準（平均的正常水準の３５％未満）及び肺水準によって特徴付けられる。これらの欠乏性個人は、高い全葉性気腫の発生の危険性を有している。この気腫は、ＰｉＺＺ、ＰｉＺ（ｎｕｌｌ）、及びＰｉ（ｎｕｌｌ）（ｎｕｌｌ）表現形を示す個人において支配的である。この状態の症状は、３０〜４０代で冒されている個人において著しい。
【０００４】
アルファ−１−ＰＩ欠乏に関わる気腫は、好中球エラスターゼを抑制する為に低気道における不十分なアルファ−１−ＰＩ濃度の結果として発生し、肺の実質組織の結合組織のフレームワークの破壊へと導く。アルファ−１−ＰＩ欠乏の個人は、彼等の低気道における好中球によって放出された好中球エラスターゼに対してはほとんど防御を持たない。アルファ−１−ＰＩ欠乏の個人におけるプロテアーゼ：プロテアーゼ阻害剤の不釣り合いは、慢性障害をもたらし、そして、最終的には、肺の実質組織及び肺胞壁の破壊をもたらす。
【０００５】
重症のアルファ−１−ＰＩ欠乏の個人は、一般に、通常の方法での決定で、５０ｍｇ／ｄｌ未満の内因性の血清アルファ−１−ＰＩ水準を示す。これらの低血清アルファ−１−ＰＩ水準の個人は、生涯にわたって、８０％より多い肺気腫の発生の危険性を有する。米国においては、少なくとも４０，０００人の患者は、或いは、肺気腫の患者全体の２％は、アルファ−１−ＰＩをコードする為の遺伝子の欠如の結果としてこの病気を持っている。アルファ−１−ＰＩの欠乏は、米国及びヨーロッパの白人の最も一般的な致命的遺伝性疾患の一つである。
【０００６】
アルファ−１−ＰＩ欠乏患者の治療は、血清中のアルファ−１−ＰＩ水準の置換又は増強に向けられている。アルファ−１−ＰＩの血清水準が増加されれば、これは、肺における高濃度へと導くことが期待され、かくして、肺における好中球エラスターゼ：アルファ−１−ＰＩの不釣り合いを是正し、肺組織の防御又は遅い破壊が期待される。正常及びアルファ−１−ＰＩ欠乏人口の研究は、最少の防御血清アルファ−１−ＰＩ水準が、８０ｍｇ／ｄｌ又は１１μＭ（約５７ｍｇ／ｄｌ；純粋標準を使用して）であることを示唆している。従って、血清アルファ−１−ＰＩは、肺胞アルファ−１−ＰＩの源であるので、アルファ−１−ＰＩ欠乏患者の最大増強治療は、アルファ−１−ＰＩの最少防御血清水準を用意することに向けられている。
【０００７】
アルファ−１−ＰＩ製剤は、１９８０年中頃から治療用として利用されてきている。その最大の用途は、先天性アルファ−１−ＰＩ欠乏の増強（置換）治療であった。Ｉｎ ｖｉｖｏでの人間のアルファ−１−ＰＩの半減期は、１．２７日の標準偏差で、４．３８日である。現在、推奨されている投与量の週６０ｍｇアルファ−１−ＰＩ／ｋｇ体重は、アルファ−１−ＰＩの低血清水準を、１１μＭ又は８０ｍｇ／ｄｌの防御許容限界水準以上の水準にまで回復させようとするものである。
【０００８】
以前は、アルファ−１−ＰＩは、種々の方法で精製されていた。その方法の一つは、アニオン交換クロマトグラフィー媒体のクロマトグラフィーと、それに続くＰＥＧ沈殿の組合せである。その他の精製方法は、ＰＥＧ沈殿と、それに続くアニオン交換クロマトグラフィー、又は多段ＰＥＧ沈殿工程と、それに続くアニオン交換クロマトグラフィーを使用するものである。その他には、ＰＥＧ沈殿、一つ以上のアニオン交換クロマトグラフィー工程及び金属キレートクロマトグラフィー工程との組合せが使用されていた。尚その他の方法としては、アルファ−１−ＰＩを精製する為の相分離方法が使用されていた。１．２６単位／ｍｇの比活性（specific activity）が、精製されたアルファ−１−ＰＩに対して報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、アルファ−１−ＰＩの精製の為の改良方法に関する。
本発明の目的は、タンパク質溶液からアポリポタンパク質を除去する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明方法は、不純タンパク質画分、好ましくは、アルファ−１−ＰＩを含むコーン画分（Ｃｏｈｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ）ＩＶ1＋ＩＶ4ペーストを提供することを含む。不純タンパク質画分は、冷水に懸濁して、又は、約ｐＨ６の生理食塩水溶液に懸濁して、アルブミン、アルファ−２−グロブリン（アルファ−２−マクログロブリン及びハトグロブリン）及びベータ−グロブリン（トランスフェリン）を含む可溶性タンパク質を溶解する。この懸濁液を、次いで、濾過して、アルファ−１−ＰＩを含む不溶性タンパク質を回収して、水（又は生理食塩水溶液）で洗浄する。洗浄された不溶性タンパク質画分を、次いで、水（又は、生理食塩水溶液）に再懸濁して、ｐＨを約８．５に調整する。ＰＥＧが、アルファ−２−グロブリンを沈殿させる為に添加される。上澄み液を回収して、ＺｎＣｌ2が、粗アルファ−１−ＰＩを沈殿する為に添加される。次いで、粗アルファ−１−ＰＩを、ＮａＥＤＴＡ緩衝液に再溶解し、Ｔｗｅｅｎ８０及びトリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴＮＢＰ）で処理し、ウイルスを不活性化する。好ましくは、スクロース、マルトース、グルコース等の様な糖は、収量増加の為に、ウイルス不活性化中に、アルファ−１−ＰＥの安定化の為に添加される。
【００１１】
この処理された溶液を、次いで、アニオン交換媒体に適用して、その他の残留タンパク質からアルファ−１−ＰＩを分離する。アルファ−１−ＰＩから成る画分は、次いで、回収され、好ましくは、ベントナイトで処理されて、末だ存在するアポリポタンパク質を除去する。得られる精製されたアルファ−１−ＰＩ溶液は、次いで、回収されて濃縮される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明方法によって精製されたアルファ−１−ＰＩは、１．０単位／ＯＤ280より大きい比活性を有する。本発明方法は、約１．０単位／ｇペーストより多い、好ましくは、約１．３単位／ｇペーストより多い収量を用意する。
本発明の使用によって、アルファ−１−ＰＩの品質及び収量が改善される。更に、本発明の精製方法は、その他の方法に比較してその処理を短縮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、高収量、高比活性アルファ−１−ＰＩ製剤を製造する為の精製工程の新規な組合せを含む。
アルファ−１−ＰＩは、不純タンパク質画分から精製される。不純タンパク質画分は、血漿、組み替え方法により製造されたアルファ−１−ＰＩ又は、アルファ−１−ＰＩから成るその他の源であっても良い。好ましい実施態様においては、不純タンパク質画分は、コーン画分ＩＶ1＋ＩＶ4ペーストであり、その調製は当該技術分野において周知である。
【００１４】
画分ＩＶ1＋ＩＶ4ペーストの初期処理 
画分ＩＶ1＋ＩＶ4ペースト（又はその他の不純タンパク質画分）は、５±２部の水に又は生理食塩水溶液、即ち、画分ＩＶ1＋ＩＶ4ペースト１部当たり、約０．０５〜約０．１５ＭＮａＣｌに、約１５℃未満で、約６．０±０．２のｐＨで、少なくとも約１時間懸濁される。アルブミン、アルファ−２−グロブリン及びベータ−グロブリンを含む可溶性タンパク質は、次いで、アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含む不溶性タンパク質から、フィルタープレス、遠心分離等によって分離される。残さを、１５℃未満で、水又はｐＨ６±０．２の生理食塩水溶液の約５オリジナルペースト容量で水洗し、不溶性ペースト中に物理的に補足された更なる可溶性タンパク質を除去する。
画分ＩＶ1＋ＩＶ4ペーストの水又はｐＨ６±０．２の生理食塩水溶液での懸濁、それに続く水洗によって、画分ＩＶ1＋ＩＶ4沈殿物中の殆ど全てのアルブミンと、殆どのアルファ−２−及びベータタンパク質が除去されることが分かった。
【００１５】
ＰＥＧ沈殿 
不溶性タンパク質残さは、残さの１容量当たり約５±２容量の水に、ｐＨ８．５±０．５で、約１５℃±５℃の温度で、短い時間或いは長い時間を使用しても良いが、好ましくは、約６時間再懸濁される。短い時間は、収量が時間が増加するにつれて改善されるところからして、好ましくない。処理時間と収量との最適な組合せとして、６時間が必然的に好ましい。固体Ｔｒｉｓが、次いで、最終濃度１０±５ｍＭまで添加され、固体ＮａＣｌが最終濃度１５０±２０ｍＭまで添加され、ｐＨが８．０に調整される。ポリエチレングリコール３３５０（ＰＥＧ）が、次いで、最終濃度１５±５％ｗｔ／ｗｔまで添加され、約１５±５℃で、約１時間混合される。ＰＥＧは、アルファ−２−グロブリンを沈殿する為に添加される。
形成されるＰＥＧ沈殿物は、フィルタープレスによって除去される。フィルタープレスは、濾過の前後で、１５０±２５ｍＭＮａＣｌと１５±５％ｗｔ／ｗｔＰＥＧを含む溶液で、ｐＨ８．０±０．５で洗浄される。或いは、沈殿物を、遠心分離によって除去しても良い。
【００１６】
ＺｎＣｌ2沈殿 
ＺｎＣｌ2（１００±１０ｍＭ）を、ＰＥＧ上澄み液に、最終濃度６±５ｍＭまで添加し、溶液をｐＨ７．５±０．５に調整する。溶液を約５±５℃に冷却し、少なくとも約１時間混合する。ＺｎＣｌ2は、粗アルファ−１−ＰＩを沈殿させる。粗アルファ−１−ＰＩは、濾過によって、好ましくは、例えば、“Prostak Open-Channel Modules”by Millipore Corporationに開示されている（ここに参照として導入される）プロスタック（Ｐｒｏｓｔａｋ）濾過、或いは、遠心分離で濃縮され、ろ液が分離される。濃縮された懸濁液又は沈殿物は、更なる工程の為に冷凍されても良い。
【００１７】
溶剤−界面活性剤処理によるウイルス不活性化 
粗アルファ−１−ＰＩを、再循環によって、プロスタックを通して約５０ｍＭＮａＥＤＴＡに再溶解する。糖、好ましくは、スクロースを約１５±５％ｗｔ／ｗｔ（又は約０．２５±０．０５Ｍクエン酸三ナトリウム塩）の量で、ウイルス不活性化中に、安定剤として添加する。溶液を１５±５℃で、スクロースが溶解するまで混合する。
アルファ−１−ＰＩ含有溶液は、溶剤−界面活性剤処理で不活性化されたウイルスである。１０±１％ｗｔ／ｖのポリソルビタール８０及び３±０．３％ｗｔ／ｗｔのトリ−ｎ−ブチルホスフェートの溶液を、アルファ−１−ＰＩ溶液に、１．０±０．５％ｗｔ／ｖポリソルビタール８０と０．３±０．１５％ｗｔ／ｗｔトリ−ｎ−ブチルホスフェートの最終濃度まで添加する。次いで、溶液を、２７±３℃で、ｐＨ８±０．５で、６時間以上培養して、アルファ−１−ＰＩ中に存在するかも知れないウイルスを不活性化する。
【００１８】
溶剤−界面活性剤処理によるウイルス不活性化中の安定剤としての糖、例えば、スクロースの存在は、対照、即ち、安定剤としての糖無しで溶剤洗浄によりウイルス不活性化されたアルファ−１−ＰＩ溶液に比較して、アルファ−１−ＰＩ単位の収量を増加する。収量増加は、好ましくは少なくとも１０％であり、より好ましくは少なくとも２０％であり、更に好ましくは３０％である。
培養後、処理されたアルファ−１−ＰＩ溶液は、０〜１０℃に冷却され、ｐＨが８．０±０．１に調整される。
【００１９】
アニオン交換クロマトグラフィー 
次いで、ＳＤ処理溶液を、ＳＤ処理溶液の１容量当たり約１容量の水で希釈する。希釈された溶液を、次いで、子め平衡化されたＱＡＥクロマトグラフィー媒体、又は、アルファ−１−ＰＩを結合し、その他のタンパク質をアルファ−１−ＰＩから分離させることのできるその他のアニオン交換媒体に適用する。バッチ又はカラムクロマトグラフィーのいずれかを使用しても良い。アルファ−１−ＰＩを媒体上に吸収した後、２０±１０ｍＭＮａＣｌ及び２０±１０ｍＭナトリウムホスフェート（ＮａＨ2ＰＯ4）を含む、ｐＨ８±１の緩衝液で洗浄して、ベータタンパク質を含む末結合物質を除去する。アルファ−１−ＰＩは、次いで、アニオン交換クロマトグラフィー媒体から、１００±５０ｍＭＮａＣｌと２０±１０ｍＭナトリウムホスフェートを含む溶出洗浄と共に、ｐＨ８±１で溶出される。アルファ−１−ＰＩを含む溶出液は、更なる処理の為に集められる。
【００２０】
アルファ−１−ＰＩの除去後、アニオン交換媒体は、順次に、２±０．２ＭＮａＣｌ、２０±１０ｍＭナトリウムホスフェートを含む、ｐＨ８±１の水溶液で、次いで、射出用の水（ＷＦＩ）で、次いで、５００ｍＭＮａＯＨを含む水溶液で、最後に、ＷＦＩで洗浄することによって清浄にされる。クロマトグラフィー媒体は、次いで、２±０．２ＭＮａＣｌ、２０±１０ｍＭナトリウムホスフェートに、ｐＨ８±１で貯蔵される。
【００２１】
アルファ−１−ＰＩ含有溶出液の処理 
アルファ−１−ＰＩ含有溶出液を一緒にして、０．１〜１．０％（ｗｔ／ｗｔ）のベントナイトで、約一時間以上処理して、アポリポタンパク質の量を、好ましくは、アポリポタンパク質Ａを約０．０１ｍｇ／ｍｌ未満まで及びアポリポタンパク質Ｂを約０．０１ｍｇ／ｍｌ未満まで減少させる。ベントナイトは、濾過、好ましくは、例えば、“Zeta Plus C Series Filter Medium”by Cuno Inc．に開示の（ここに、参照として導入される）クーノ（Cuno）濾過によって除去される。得られる溶液は、アルファ−１−ＰＩ活性が、少なくとも１０単位／ｍｌになるまで、限外濾過膜で濃縮される。濃縮生成物は、次いで、０．４５ミクロンフィルターで濾過され、粒状物を除去する。次いで、アルファ−１−ＰＩは、プラノバ（Planova）濾過されてウイルスを除去し、０．２２ミクロンフィルターで滅菌濾過されて、バイアルに入れて、貯蔵の為に凍結乾燥される。アルファ−１−ＰＩは、２〜８℃で貯蔵される。
凍結乾燥されたアルファ−１−ＰＩは、患者に投与する為に滅菌水に再溶解しても良い。
【００２２】
アルファ−１−ＰＩ活性アッセイ 
再構成されたアルファ−１−ＰＩのアルファ−１−ＰＩ活性を検出する為に、色素生産性アッセイ（chromogenic assay）を使用しても良い。このアッセイは、トリプシン（Sigma Chemical Co．of St．Louis，Missouriにより供給されたもの）の存在において、ｐ−ニトロアニリンを放出する、トリプシン感応色素生産性物質を利用する。放出されたｐ−ニトロアニリンは、４０５ｎｍで検出され、アルファ−１−ＰＩは、この物質からのｐ−ニトロアニリンの放出を抑制する。生成物中のアルファ−１−ＰＩの活性は、標準アルファ−１−ＰＩ活性カーブを参照することによって決定される。上記の方法により調製された再構成凍結乾燥アルファ−１−ＰＩの色素生産性アッセイは、少なくと約１．０単位／ＯＤ280の比活性を示す。
【００２３】
投与 
アルファ−１−ＰＩは、最初の１０分間は、毎分約０．０８ｍｌ／ｋｇ体重の割合で患者に注入しても良い。患者が何ら不快感を経験しない場合は、この割合を、許容限度まで増加しても良い。若し許容されるならば、同じ患者へのその後の注入は、高い割合で行っても良い。若し有害な事態が発生した場合は、その割合を減らすべきであり、或いは、その注入を、症状が静まるまで中断すべきである。次いで、注入は、患者によって許容される割合で再開しても良い。
大量の投与量が投与される場合は、アルファ−１−ＰＩの幾つかの再構成バイアルを、無菌方法を使用して、空の滅菌I.V注入容器にプールしても良い。
【００２４】
実施例１ 
コーン画分化スキームからの画分ＩＶ1＋ＩＶ4ペーストを、５℃で、ｐＨ６．０で、滴定無しに一時間、１８００ｍｌの水に懸濁した。懸濁が完了したら、懸濁液を、フィルタープレスで、１０ＣＰフィルター（Ｃｕｎｏ）で濾過した。ろ液を集め、アッセイに掛けて、アルファ−１−ＰＩ（A1PI）比活性（Ｓ．Ａ）及び２８０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ280nm）を測定した。フィルタープレス中のペーストを、５℃の水６００ｍｌで洗浄し、ろ液を集めた。この方法を四回以上繰返し、全てのろ液を収集して、アッセイに掛けて、A1PI比活性（Ｓ．Ａ）及びＯＤ280nmを測定した。３５０ｇのペーストが得られた。全ての処理サンプルのA1PI活性及びＯＤ280nmは、次の表１に開示される。
【００２５】
表１：水洗浄画分のＡ１ＰＩ活性及びＯＤ２８０ｎｍ
サンプル 容量（ｍｌ） A1PI(ｕ/ml) 全A1PI(ｕ) OD280nm   S.A.（ｕ/OD）
洗浄０   1450         0.06         87         22.2         0.003
洗浄１   600          0.1          60         29.9         0.003
洗浄２   600          0.08         48         25.5         0.003
洗浄３   600          0.04         24         13.0         0.003
洗浄４   600          0             0         4.8          0
洗浄５   600          0             0         3.0          0
【００２６】
実施例２ 
実施例１から得られた３５０ｇのペーストを、ｐＨ８．５で、１８℃の温度で、６時間、１０５０ｍｌの水に再懸濁した。固体Ｔｒｉｓを、１０ｍＭの最終濃度まで添加し、固体ＮａＣｌを１５０ｍＭの最終濃度まで添加し、ｐＨを８．０に調整した。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ３３５０）を最終濃度１５％（ｗｔ／ｗｔ）まで添加し、１８℃で１時間混合した。得られた沈殿物を、１０ＣＰフィルターのフィルタープレスで除去し、上澄み液を回収した。フィルタープレス中のペーストを１５％ｗｔ／ｗｔＰＥＧ３３５０、１０ｍＭＴｒｉｓ及び１５０ｍＭＮａＣｌを含む溶液で後洗浄した。ろ液と後洗浄ろ液とを一緒にした。結果は次の表２に纏められる。
【００２７】
表２：ＰＥＧ３３５０沈殿
サンプル 容量（ｍｌ） A1PI(ｕ/ml) 全A1PI(ｕ) OD280nm S.A.(ｕ/OD)
再構成   1400         1.063         1488     13.32     0.0798
ＰＥＧ   2465         0.513         1265      2.16     0.2375
ろ液 
【００２８】
実施例３ 
実施例２から回収したＰＥＧ３３５０ろ液に、ＺｎＣｌ2を、最終濃度２ｍＭまで添加し、ｐＨを７．５に調整し、温度を５℃に冷却して、粗A1PIを沈殿させた。一時間の混合後、粗A1PIを、プロスタック濾過で濾過し、濃縮し、得られ懸濁液を、ＮａＥＤＴＡ溶液で再溶解した。結果は、次の表３に纏められる。
【００２９】
表３：ＺｎＣｌ2沈殿
サンプル   容量（ｍｌ） A1PI(ｕ/ml) 全A1PI(ｕ) OD280nm S.A.(ｕ/OD)
プロスタック
ろ液       2200         0.0159       35         0.15       0.106
NaEDTA
再構成      264         4.305        1065      13.72       0.3138 
【００３０】
実施例４ 
１６．７％（ｗｔ／ｗｔ）の量で、スクロースを、実施例３のＮａＥＤＴＡ再溶解溶液に添加し、１８℃で混合し、スクロースを完全に溶解した。この溶液に、ポリソルベート８０を最終濃度１．０％まで、及びトリ−ｎ−ブチルホスフェートを最終濃度０．３％まで添加した。この溶液を、２７．５℃で６時間以上培養し、存在し得る汚染性脂質包膜ウイルスを不活性化した。培養後、溶液を５℃に冷却し、ｐＨを８．０に調整した。対照として、上記方法を、スクロースの添加無しで繰返した。１６．７％のスクロースの存在と、スクロース無し（対照）での溶剤−界面活性剤（ＳＤ）処理中のA1PIの安定性は、次の表４に示される。
【００３１】
表４：スクロースの存在でのＳＤ処理中のA1PIの安定性
サンプル 容量（ｍｌ） A1PI(ｕ/ml) 全A1PI(ｕ) NaEDTAからのA1PI(%)
SD A1PI   311         3.35         1042           97.8
対照      293         2.13          624           58.6 
【００３２】
実施例５ 
実施例４で得られたＳＤ−AIPI溶液に、ＱＡＥカラムに掛ける前にイオン強度を下げる為に、３１１ｇの蒸留水を添加した。この溶液を、１２ｍｌ／分の流量で、３００ｍｌの、予め平衡化したＱＡＥイオン交換カラムに導入した。このカラムを、６リットルの生理食塩水ホスフェートバッファー（２０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ８．０）で洗浄した。A1PIは、１．８リットルの生理食塩水ホスフェートバッファー（１００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ８．０）と共に溶出した。
イオン交換媒体を、順次に、２ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ８．
０、５００ｍＭＮａＯＨ及び蒸留水で洗浄して清浄にした。A1PIを含有する貯蔵画分を、アッセイに掛けた。結果を、次の表５に示す。
【００３３】
表５：ＱＡＥイオンクロマトグラフィー
サンプル 容量（ｍｌ） A1PI(ｕ/ml) 全A1PI(ｕ) OD280nm S.A.(ｕ/OD)
溶出液   1500         0.62         930         0.58     1.058 
【００３４】
実施例６ 
実施例５から得られた貯蔵溶出液に、３．0gの末焼成ベントナイトを添加し、２０℃で、一時間混合した。ベントナイトをクーノ（Ｃｕｎｏ）濾過で除去し、そのろ液を限外濾過で濃縮した。濃縮物を、連続で、プラノバ濾過と滅菌濾過を行った。ろ液をバイアル中に入れ、貯蔵の為に凍結乾燥した。全ての処理サンプルをアッセイに掛けた。結果を、次の表６に示す。
【００３５】
表６
サンプル     容量(ml)   A1PI(ｕ/ml) 全A1PI(ｕ) OD280nm   S.A.(ｕ/OD)
クーノ濾過   1710         0.52         885       0.385       1.351
濃縮物       75           11.6         870       8.092       1.434
最終バルク   92           9.4          865       6.225       1.510 
【００３６】
本発明は、上記の特定の実施態様に限定されるものではない。ここに開示の好ましい実施態様において開示されたものの材料、工程、及び処理パラメーターの変更したものは、本発明の実施から逸脱すること無しに使用できることは、当業者にとって自明であろう。従って、本発明を、上記の実施例に限定しようとするものではない。本発明の範囲は、以下のクレームにおいて定義される。
【手続補正書】
【提出日】平成20年1月8日(2008.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質溶液からアポリポタンパク質を除去する方法であって、
（１）ベントナイトをタンパク質溶液に添加し、 
（２）該ベントナイトを、ベントナイトがアポリポタンパク質を吸収するのに十分な時間、該溶液と接触させ、及び、 
（３）該ベントナイトを該タンパク質溶液から除去する、
事を特徴とする方法。
【請求項２】
ベントナイトを、少なくとも一時間、タンパク質溶液と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質溶液に添加されるベントナイトの量が、０．１〜１．０％ｗｔ／ｗｔである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ベントナイトの除去後にタンパク質溶液に残留するアポリポタンパク質Ａとアポリポタンパク質Ｂとのそれぞれの量が、０．０１ｍｇ／ｍｌ未満である、請求項１に記載の方法。