(57)【要約】【課題】光源の位相制御効果を含めて多光子励起スペクトルあるいは多光子吸収スペクトルを計測する。【解決手段】広帯域レーザー光源１１から発生された個々の波長成分に位相変調器１２によって位相シフトを与え、マイケルソン干渉計１４とピエゾステージ１５を組み合わせた干渉自己相関計１３を通した光を試料１８に照射する。光検出器２０からの計測信号と光検出器２２からの参照信号のそれぞれをフーリエ変換した後、両者の比をとることにより、試料１８の二光子励起スペクトルあるいは二光子吸収スペクトルが求められる。【選択図】図１
2008020247.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
広帯域レーザー光源と、
前記広帯域レーザー光源から発生された光線の個々の波長成分に位相シフトを与える位相変調器と、
前記位相変調器を通った光線を第１の光路と第２の光路に分割し、前記第１の光路の光線と第２の光路の光線を干渉させる干渉計と
前記干渉計の一方の光路の光路長を掃引する手段と、
前記干渉計からの出射光を２分割する手段と、
前記２分割された一方の出射光を受光する第１の光検出器と、
前記２分割された他方の出射光の光路中に配置される試料を保持する試料保持部と、
前記試料保持部に保持された試料から発生される蛍光を透過するフィルターと、
前記フィルターを透過した蛍光を受光する第２の光検出器と、
前記第１の光検出器の出力及び第２の光検出器の出力をそれぞれフーリエ変換し、波長毎に両者の比をとることにより試料の励起スペクトルを求める演算部と
を有することを特徴とする多光子励起スペクトル計測装置。
【請求項２】
請求項１記載の多光子励起スペクトル計測装置において、前記位相変調器は、前記広帯域レーザー光源から発生された光線を分散してその波長成分を空間一次元的に配列させる光学系と、前記波長成分が空間一次元的に配列した位置に配置されて各波長成分に位相シフトを与える空間光変調器と、前記空間光変調器によって位相シフトが付与された各波長成分を結合して１本の光線にする光学系とを有することを特徴とする多光子励起スペクトル計測装置。
【請求項３】
請求項１記載の多光子励起スペクトル計測装置において、前記位相変調器は音響光学位相制御フィルターであることを特徴とする多光子励起スペクトル計測装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の多光子励起スペクトル計測装置において、干渉計の片方の光路を遮断する手段、及び前記第２の光検出器の出力が最大あるいは最小となるように前記位相変調器により前記個々の波長成分に与える位相シフト量を最適化する手段を有することを特徴とする多光子励起スペクトル計測装置。
【請求項５】
広帯域レーザー光源と、
前記広帯域レーザー光源から発生された光線の個々の波長成分に位相シフトを与える位相変調器と、
前記位相変調器を通った光線を第１の光路と第２の光路に分割し、前記第１の光路の光線と第２の光路の光線を干渉させる干渉計と
前記干渉計の一方の光路の光路長を掃引する手段と、
前記干渉計からの出射光を２分割する手段と、
前記２分割された一方の出射光を受光する第１の光検出器と、
前記２分割された他方の出射光の光路中に配置される試料を保持する試料保持部と、
前記試料保持部に保持された試料を透過した光線を受光する第２の光検出器と、
前記第１の光検出器の出力及び第２の光検出器の出力をそれぞれフーリエ変換し、波長毎に両者の比をとることにより試料の吸収スペクトルを求める演算部と
を有することを特徴とする多光子吸収スペクトル計測装置。
【請求項６】
請求項５記載の多光子吸収スペクトル計測装置において、前記位相変調器は、前記広帯域レーザー光源から発生された光線を分散してその波長成分を空間一次元的に配列させる光学系と、前記波長成分が空間一次元的に配列した位置に配置されて各波長成分に位相シフトを与える空間光変調器と、前記空間光変調器によって位相シフトが付与された各波長成分を結合して１本の光線にする光学系とを有することを特徴とする多光子吸収スペクトル計測装置。
【請求項７】
請求項５記載の多光子吸収スペクトル計測装置において、前記位相変調器は音響光学位相制御フィルターであることを特徴とする多光子吸収スペクトル計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多光子励起スペクトル及び多光子吸収スペクトルを計測する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、蛍光色素を用いたイメージング技術が飛躍的に進展し、フェムト秒レーザーを励起光源とした二光子蛍光イメージングが実用化されている。Nature Biotechnology, vol.21, pp.1369-1377, 2003 には、波長掃引法による二光子励起スペクトル計測について記載されている。Opt. Lett., vol.30, pp.911-913, 2005 には、フーリエ変換型二光子励起スペクトル計測法が記載されている。
【０００３】
二光子蛍光イメージングの特徴は、背景光が少なく、生体組織の深部のイメージングが可能であることであるが、さらに、励起光の位相を制御することにより蛍光収量を変えることができることがあげられる。すわなち、励起光の波長や強度以外に位相を制御パラメーターとすることができる。既に、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）をはじめとする蛍光タンパク質の二光子励起において位相制御を施し、蛍光収量を変えることと同時に実効的に蛍光タンパク質の褪色を抑制することが可能であることが報告されている（Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.311, pp.592-596, 2003）。
【０００４】
【非特許文献１】Nature Biotechnology, vol.21, pp.1369-1377, 2003.
【非特許文献２】Opt. Lett., vol.30, pp.911-913, 2005.
【非特許文献３】Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.311, pp.592-596, 2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
位相制御を二光子蛍光イメージングに活用すると、複数の異なる蛍光色素の中で所要の蛍光色素のみを選択的に励起・発光させることが可能となる。しかしながら、個々の発光色素の多光子励起スペクトル等の基礎となるデータベースが十分でないため、多光子励起技術が生かしきれていない。このような技術を効果的に適用するためには、蛍光色素の分光学的特性と位相制御効果などの知見を明らかにする必要がある。具体的には、励起光に位相変調を与えながら蛍光色素の二光子励起スペクトルを計測する。しかし、一般的な二光子励起スペクトルの計測では、フェムト秒レーザーの中心波長を掃引して測定するという手法であるため、このような励起光の位相の影響を調べることはできない。
【０００６】
また、蛍光を発しない分子では、多光子励起スペクトルに代わって、多光子吸収スペクトルがその性質を表す重要な情報となる。蛍光色素における褪色に相当する分子の解離や破壊が生じても、蛍光を発しない分子では客観的に判断することは困難である。したがって、多光子吸収スペクトルを計測するとともに、その位相制御効果を把握することは意義が大きい。
【０００７】
本発明は、従来技術では得られなかった光源の位相制御効果を含めて多光子励起スペクトルあるいは多光子吸収スペクトルを計測できる装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
広帯域フェムト秒レーザー（波長帯域：６５０−１１００ｎｍ）を光源として、蛍光色素などの計測対象とする試料を非線形媒質とした干渉自己相関信号のフーリエ解析から二次の応答関数を算出することにより、試料の二光子励起スペクトルを求める。その際、光源と干渉自己相関計の間に位相変調器を配置すると、励起光の個々の波長成分に任意の位相シフトを与えること、すなわち、励起光のスペクトル位相に変調を施すことが可能となる。これにより、位相変調を付加したパルスを用いて、二光子励起スペクトルの変化の様子を観測することができる。また、同じ光学系を用いて、試料から発生される蛍光の代わりに試料の透過光を検出するようにすると、位相変調を付加したパルスを用いて、試料の二光子吸収スペクトルの変化の様子を観測することができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、光源の位相制御効果によって変化する多光子励起スペクトルあるいは多光子吸収スペクトルを計測することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
図１は、本発明による多光子励起スペクトル計測装置の一例を示す概略図である。この装置は、広帯域レーザー光源１１、広帯域レーザー光源１１から発生された光線の個々の波長成分に所望の位相シフトを与える位相変調器１２、干渉自己相関計１３を備える。広帯域レーザー光源１１としては、スペクトル帯域６５０ｎｍ−１１００ｎｍのパルス光を発生する広帯域フェムト秒レーザー光源を用いた。位相変調器１２は波長帯域６５０−１１００ｎｍで十分に校正されており、フーリエ変換限界パルスのみならず、任意の位相構造を持つパルスを発生させることができる。
【００１１】
図２は、位相変調器１２の例を示す模式図である。図２（ａ）に示す位相変調器は、二組の回折格子３１，３３と凹面鏡３２，３４から成る４−ｆ光学系のフーリエ面（中央）に透過型の空間光変調器３５を配置した構成を有する。２つの回折格子３１，３３は同じ特性のものである。また、回折格子３１は凹面鏡３２の焦点に配置され、回折格子３３は凹面鏡３４の焦点に配置されている。広帯域レーザー光源１１から位相変調器に入射した光線は、回折格子３１で分散され、凹面鏡３２でフーリエ面に集光される。フーリエ面では光の波長成分が空間一次元的に配列している。そのフーリエ面に配置された液晶空間光変調器などのピクセル化された空間光変調器（例えば１２８ピクセル）３５にパソコン等の制御部３６から信号を与えて、個々の波長成分に対して所望の位相シフトを与える。個々の波長成分に対して所望の位相シフトを与えられた光線は、凹面鏡３４によって平行光束となり、回折格子３３により１本の光線に戻されて位相変調器から出射する。
【００１２】
図２（ｂ）に示す位相変調器は、回折格子３７と凹面鏡３８からなる光学系のフーリエ面にデフォーマブルミラーやＭＥＭＳ（micro electro mechanical systems）などの反射型の空間光変調器３９を配置した構成を有する。回折格子３７は凹面鏡３８の焦点に配置されている。広帯域レーザー光源１１から位相変調器に入射した光線は、回折格子３７で分散され、凹面鏡３８でフーリエ面に集光される。フーリエ面では光の波長成分が空間一次元的に配列している。そのフーリエ面に配置された反射型の空間光変調器３９の各ピクセルに制御部４０から信号を与えて、個々の波長成分に対して所望の位相シフトを与える。個々の波長成分に対して所望の位相シフトを付与された光線は、凹面鏡３８によって平行光束となり、回折格子３７により１本の光線に戻されて位相変調器から出射する。
【００１３】
図２（ｃ）は、４−ｆ光学系を必要としないインライン型変調器として、ＡＯＰＤＦ（音響光学位相制御フィルター）４１を用いた位相変調器の例である。ＡＯＰＤＦ４１は制御部４２により制御される。ＡＯＰＤＦでは、ＲＦ信号によって励振された音響波と光パルスを音響光学結晶中で相互作用させることにより個々の波長成分に対して所望の位相シフトを与える。
【００１４】
本実施例の干渉自己相関計１３は、マイケルソン干渉計１４と、その片方の光路に設置されたピエゾステージ１５を有する。ピエゾステージ１５にはコントローラーから時間とともに線形に増加あるいは減少する信号が印加され、光路長を掃引することができる。これにより、両方の経路を通る光の間の遅延時間（τ）を精密に掃引することができる。ビームスプリッタ１６によって２分割されたマイケルソン干渉計１４からの出力光の片方を励起光として、計測対象である試料１８にレンズ１７を用いて集光する。試料１８は試料保持部２６に保持されている。そして、試料が発する蛍光を光検出器２０によって電気信号に変えることにより干渉自己相関信号を得る。この時、励起光が直接、光検出器２０に入ることを防ぐために光検出器２０の前にフィルター１９を置く。フィルター１９は励起光の波長帯域（６５０−１１００ｎｍ）を遮断し、蛍光の波長帯域（３２０−６２０ｎｍ）を透過する特性を有する。もう片方の出力光は、参照用の干渉自己相関信号を得るため二光子吸収光検出器（ＧａＡｓＰ光検出器など）２２にレンズ２１によって集光・照射する。二光子吸収光検出器の代わりに第２高調波発生用非線形光学結晶（ＢＢＯなど）を置き、発生する第２高調波をフィルター（１９と同様のもので可）で分離した後、光検出器（２０と同様のもので可）で検出することもできる。
【００１５】
マイケルソン干渉計１４の片方のアームをピエゾステージ１５により掃引して遅延時間を与えることにより、光検出器２０，２２で受光される光信号は干渉相関信号となる。その際、二光子励起による試料の発光のみをフィルター１９で分離して検出すると二次干渉相関信号が得られる。この二次干渉相関信号をフーリエ変換すると、励起光の二光子スペクトル（励起光スペクトルの自己畳み込み積分）と測定系の応答関数の積が得られる。ここで、応答関数は装置関数と試料の応答関数、すなわち二光子励起スペクトルの積である。参照光側も同様であるが、ここでは試料の二光子励起スペクトルに代わって、二光子吸収光検出器の応答関数が信号に含まれる。従って、両者の比を取ることにより、励起光の二光子スペクトル並びに装置関数は相殺されて、二光子励起スペクトルの相対値（二光子吸収検出器の応答関数に対する）が求められる。二光子吸収光検出器の応答関数が既知であれば、最終的に試料の二光子励起スペクトルが得られる。演算部２３において、光検出器２０からの計測信号と光検出器２２からの参照信号を取得し、それぞれをフーリエ変換した後、両者の比をとることにより、試料１８の二光子励起スペクトルが求められる。求まった二光子励起スペクトルは表示部２４に表示される。
【００１６】
広帯域レーザー光源１１、位相変調器１２、干渉自己相関計１３のピエゾステージ１５、及び演算器２３は統括制御部２７によって統括制御される。統括制御部２７は、ピエゾステージ１５の移動と、演算部２３における光検出器２０からの計測信号の取得ならびに光検出器２２からの参照信号の取得の同期を取る。これにより、演算部２３において、計測信号と参照信号を任意の回数繰り返して取得した後、それぞれ積算し、信号雑音比を高くする。また、試行錯誤的最適化アルゴリズムにより、位相変調器１２により個々の波長成分に付与する位相変調量を統括的に制御する。
【００１７】
多光子励起スペクトルに影響を及ぼす位相変調器１２による位相変調量の求め方の一例として、次のような方法がある。まず、干渉計１４の片方の光路をシャッター２８により遮断することにより、常時、一定の強度の出射光を試料に照射する。その間、位相変調器１２により個々の波長成分に付与する位相変調量のパターンを試行錯誤的に変化させながら光検出器２０によって試料から発生される蛍光の強度をモニターし、光検出器２０の出力が最大あるいは最小となるような位相変調量のパターンを求める。その後、位相変調器１２による個々の波長成分に付与する位相変調量のパターンを光検出器２０の出力が最大あるいは最小になったときのパターンに固定し、干渉計１４を正常動作に戻し、ピエゾステージ１５を作動させて試料の多光子励起スペクトルを計測する。
【００１８】
図３は、ＥＣＦＰ（シアン色蛍光タンパク質変異体）を試料とし、その二光子励起スペクトルについて本発明の多光子励起スペクトル計測装置を用いて位相制御の効果を調べた例を示す図である。簡単のために、フーリエ変換限界（ＦＴＬ）パルスに±２５ｆｓ2の群速度遅延（線形チャープ）を与えて比較を行った。むろん、位相変調器はより複雑な位相変調・制御を行うことが可能であり、また、試行錯誤的に位相変調を与えながら、二光子励起スペクトルを観測することもできる。励起光のチャープ（群速度遅延）によって二光子励起スペクトルの変化が認められた。このような計測は、二光子励起過程に限らず、原理的には全ての多光子過程に適用可能である。
【００１９】
以上、本発明を蛍光色素の多光子励起スペクトルの測定に適用する例について説明したが、本発明は吸収スペクトルの計測にも応用可能である。吸収スペクトルの計測にあたっては、図１に示した装置おいて、フィルター１９を除去し、試料を透過した光を光検出器で検出するようにすればよい。位相変調器１２により試料に照射される広帯域の照射光の個々の波長成分に任意の位相シフトを与えることにより、多光子吸収スペクトルの変化の様子を観測することができる。蛍光を発しない分子では、多光子励起スペクトルに代わって、多光子吸収スペクトルがその性質を表す重要な情報となる。例えば、ＤＮＡは波長２７０ｎｍ付近に吸収帯を持つことが知られており、これより５４０ｎｍの二光子吸収、および８１０ｎｍの三光子吸収の可能性が示唆される。しかしながら、蛍光を発しないため実際に二光子吸収や三光子吸収が生じているか判断することは困難である。一方、蛍光色素を生細胞の所望の器官に導入し、二光子励起による蛍光イメージングを行うと、同時に細胞内のＤＮＡも強度の高い励起光に曝されるため、二光子吸収や三光子吸収の結果として損傷に至る可能性があり、これは生細胞の継続的な観察を阻害する。したがって、多光子吸収スペクトルを計測するとともに、その位相制御効果を把握することは、生細胞の多光子蛍光イメージングを行うにあたり有益な情報を提供することになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明による多光子励起スペクトル計測装置の一例を示す概略図
【図２】位相変調器の例を示す模式図。
【図３】本発明の装置による測定例を示す図。
【符号の説明】
【００２１】
１１：広帯域レーザー光源
１２：位相変調器
１３：干渉自己相関計
１４：マイケルソン干渉計
１５：ピエゾステージ
１６：ビームスプリッタ
１７：レンズ
１８：試料
１９：フィルター
２０：光検出器
２１：レンズ
２２：光検出器
２３：演算器
２４：表示部
２６：試料保持部
２７：統括制御部
２８：シャッター
３１：回折格子
３２：凹面鏡
３３：回折格子
３４：凹面鏡
３５：空間光変調器
３６：制御部
３７：回折格子
３８：凹面鏡
３９：空間光変調器
４０：制御部
４１：ＡＯＰＤＦ
４２：制御部
【図１】
2008020247.tif 000003
【図２】
2008020247.tif 000004
【図３】
2008020247.tif 000005