(57)【要約】【課題】  本発明はタンパク質のアセチル化状態をリアルタイムで測定可能な蛍光プローブの提供を目的とする。また、本発明は該蛍光プローブを用いて生細胞内のタンパク質のアセチル化状態をリアルタイムで測定する方法の提供を目的とする。【解決手段】  本発明は、アセチル化基質ドメインと、アセチル化基質結合ドメインを、リンカーペプチドで連結し、該アセチル化基質ドメインと該アセチル化基質結合ドメインに、異なる蛍光特性を持つ蛍光タンパク質を、各々、連結した蛍光プローブを提供する。また、本発明は、該蛍光プローブを生細胞内に導入して、蛍光プローブからのＦＲＥＴ変化を検出することで、生細胞内のタンパク質のアセチル化状態を測定する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチル化基質ドメインと、アセチル化基質結合ドメインを、リンカーペプチドで連結し、該アセチル化基質ドメインと該アセチル化基質結合ドメインに、各々、異なる２つの蛍光特性を持つ蛍光タンパク質を連結し、前記異なる２つの蛍光特性を持つ蛍光タンパク質がＦＲＥＴのドナーとアクセプターの関係にある蛍光プローブ。
【請求項２】
前記リンカーペプチドが、グリシン及び／又はセリンからなることを特徴とする請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
前記リンカーペプチドの配列が、配列番号１で表される配列が１〜９回繰り返された配列であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
前記蛍光タンパク質が、ＧＦＰ又はＧＦＰの色変異体であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項５】
前記ＧＦＰの色変異体が、Ｖｅｎｕｓ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰからなるグループから選択されることを特徴とする請求項４に記載の蛍光プローブ。
【請求項６】
前記アセチル化基質ドメインがヒストンＨ４であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項７】
前記アセチル化基質結合ドメインがブロモドメインを有するタンパク質であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項８】
前記ブロモドメインを有するタンパク質が以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるポリペプチドであることを特徴とする請求項７に記載の蛍光プローブ。
（ａ）配列番号２で表される配列の１〜４４３番目のアミノ酸からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表される配列の１〜４４３番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、アセチル化されたタンパク質と結合するポリペプチド
【請求項９】
前記ブロモドメインを有するタンパク質が以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるポリペプチドであることを特徴とする請求項７に記載の蛍光プローブ。
（ａ）配列番号４で表される配列の５７〜４６８番目のアミノ酸からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号４で表される配列の５７〜４６８番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、アセチル化されたタンパク質と結合するポリペプチド
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれかに記載の蛍光プローブをコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１乃至９のいずれかに記載の蛍光プローブを生細胞内に導入し、該蛍光プローブから得られるＦＲＥＴ変化を検出し、生細胞内における前記アセチル化基質ドメインのアセチル化−脱アセチル化の変動を測定する方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載のベクターを生細胞内に形質導入し、該ベクターから蛍光プローブが発現する条件下で細胞を培養し、細胞内で発現した蛍光プローブから得られるＦＲＥＴ変化を検出し、生細胞内における前記アセチル化基質ドメインのアセチル化−脱アセチル化の変動を測定する方法。
【請求項１４】
請求項７乃至９のいずれかに記載の蛍光プローブを生細胞内に導入し、該生細胞と候補化合物とを反応させ、蛍光プローブから得られるＦＲＥＴを検出し、生細胞と候補化合物を反応させた結果ＦＲＥＴが変化した場合、該候補化合物をブロモドメイン結合因子であると判定する、ブロモドメイン結合因子のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項７乃至９のいずれかに記載の蛍光プローブを生細胞内に導入し、該生細胞と候補化合物とを反応させ、蛍光プローブから得られるＦＲＥＴを検出し、該生細胞と候補化合物を反応させた結果ＦＲＥＴが変化した場合、該候補化合物をヒストンアセチル化酵素活性の制御因子であると判定する、ヒストンアセチル化酵素活性制御因子のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項７乃至９のいずれかに記載の蛍光プローブを生細胞内に導入し、該生細胞と候補化合物とを反応させ、蛍光プローブから得られるＦＲＥＴを検出し、該生細胞と候補化合物を反応させた結果ＦＲＥＴが変化した場合、該候補化合物をヒストン脱アセチル化酵素活性の制御因子であると判定する、ヒストン脱アセチル化酵素活性制御因子のスクリーニング方法。
【請求項１７】
ブロモドメイン結合因子のスクリーニングシステムであって、以下の手段：
（ａ）請求項７乃至９のいずれかに記載の蛍光プローブを生細胞に導入する手段、
（ｂ）前記生細胞と候補化合物とを反応させる手段、
（ｃ）蛍光プローブから得られるＦＲＥＴの変化を検出する手段、及び
（ｄ）前記ＦＲＥＴの変化の検出結果を指標にして、候補化合物の中からブロモドメイン結合候補化合物を選別する手段、
を含む前記システム。
【請求項１８】
ヒストンアセチル化酵素活性又はヒストン脱アセチル化酵素活性の制御因子のスクリーニングシステムであって、以下の手段：
（ａ）請求項７乃至９のいずれかに記載の蛍光プローブを生細胞に導入する手段、
（ｂ）前記生細胞と候補化合物とを反応させる手段、
（ｃ）蛍光プローブから得られるＦＲＥＴの変化を検出する手段、及び
（ｄ）前記ＦＲＥＴの変化の検出結果を指標にして、候補化合物の中からヒストンアセチル化酵素活性又はヒストン脱アセチル化酵素活性の制御因子候補化合物を選別する手段、
を含む前記システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生細胞内におけるタンパク質のアセチル化及び脱アセチル化を検出する方法に関する。より詳細には、生細胞内におけるタンパク質のアセチル化及び脱アセチル化状態を検出するための蛍光プローブ及び、該蛍光プローブを用いたアセチル化及び脱アセチル化状態の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の機能を制御する現象として、リン酸化と並びアセチル化が有名である。これまでに、ヒストンやｐ５３タンパク質など、多くのタンパク質がアセチル化によって活性制御を受けていることが報告されている。なかでも、ヒストンのアセチル化に関する知見はこれまでに多数報告されている。
【０００３】
コアヒストンのアセチル化はクロマチンの構造と機能を制御する重要な翻訳後修飾であるが、ヒストンのアセチル化はヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）とヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）によってダイナミックに制御されている。アセチル化されたヒストンはブロモドメインと呼ばれるアセチル化リジンと特異的に結合する部位をもつタンパク質と結合する。
従来、細胞内のタンパク質のアセチル化量を調べる方法として、細胞を、トリチウム標識された酢酸で処理することにより細胞内のアセチル化タンパク質をアセチル化ラベルした後、目的のタンパク質を精製し、アセチル化タンパク質の放射能をオートラジオグラフィーで検出する方法と、アセチル化タンパク質を特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロッティング法が用いられてきた。また、アセチル化タンパク質の局在を調べる方法として、固定化した細胞に膜透過処理を行い、アセチル化タンパク質を特異的に認識する抗体を用いてその局在を検出する免疫染色法が知られている。これらの従来法は、いずれも細胞を破砕することが必要であり、生きた細胞におけるタンパク質のアセチル化・脱アセチル化の空間分解能及び時間分解能を持った解析をすることは不可能であった。
一方、タンパク質アセチル化と同様に重要な翻訳後修飾であるタンパク質リン酸化は、蛍光プローブを用いた生細胞内での空間及び時間分解能を持った解析が報告されている（非特許文献１、非特許文献２、特許文献１及び特許文献２）。
【０００４】
また、ヒストンのアセチル化を制御するヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）とヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の活性の異常は、癌の発症と密接に関わっていることが報告されている（非特許文献３）。ＨＤＡＣ阻害剤であるｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ＳＡＨＡ）を、前立腺癌細胞を移植したマウスに投与すると、ＳＡＨＡを投与していないマウスと比較して２０日間で癌細胞が９７％減少していることが観察された（非特許文献４）。ＳＡＨＡは臨床第一相試験が報告されている（非特許文献５）。また、抗癌活性を持つ微生物由来のＦＫ２２８は、ＨＤＡＣの活性を阻害しており、慢性リンパ球性白血病と急性骨髄性白血病患者に対する臨床第一相試験も行われている（非特許文献６）。このようＨＤＡＣを阻害する化合物は有効な抗癌剤の候補になり得る。
【０００５】
【非特許文献１】Ｓａｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：２８７−２９４，２００２
【非特許文献２】Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１４９９７−１５００２，２００１
【非特許文献３】Ｆｕｒｕｍａｉら、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２４：１２４０−１２４５、２００６
【非特許文献４】Ｂｕｔｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：５１６５−５１７０、２０００
【非特許文献５】Ｋｅｌｌｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：３５７８−３５８８、２００３
【非特許文献６】Ｂｙｒｄら、Ｂｌｏｏｄ  １０５：９５９−９６７、２００５
【特許文献１】国際公開第２００２／０７７６２３号パンフレット
【特許文献２】特表２００５−５０１５２５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、上記事情に鑑み、生細胞内におけるタンパク質のアセチル化及び脱アセチル化を検出する方法について鋭意研究を行った結果、細胞を破砕することなく、タンパク質のアセチル化及び脱アセチル化を検出することが可能な蛍光プローブを開発し、本発明を完成させるに至った。
よって、本発明は、生細胞におけるタンパク質のアセチル化及び脱アセチル化を検出するための蛍光プローブの提供を目的とする。
また、本発明は、生細胞におけるタンパク質のアセチル化及び脱アセチル化を検出するための蛍光プローブを用いた、細胞内タンパク質のアセチル化及び脱アセチル化状態を検出する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１８）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「アセチル化基質ドメインと、アセチル化基質結合ドメインを、リンカーペプチドで連結し、該アセチル化基質ドメインと該アセチル化基質結合ドメインに、各々、異なる２つの蛍光特性を持つ蛍光タンパク質を連結し、前記異なる２つの蛍光特性を持つ蛍光タンパク質がＦＲＥＴのドナーとアクセプターの関係にある蛍光プローブ」である。
（２）本発明の第２の態様は、「前記リンカーペプチドが、グリシン及び／又はセリンからなることを特徴とする上記（１）に記載の蛍光プローブ」である。
（３）本発明の第３の態様は、「前記リンカーペプチドの配列が、配列番号１で表される配列が１〜９回繰り返された配列であることを特徴とする上記（１）に記載の蛍光プローブ」である。
（４）本発明の第４の態様は、「前記蛍光タンパク質が、ＧＦＰ又はＧＦＰの色変異体であることを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の蛍光プローブ」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記ＧＦＰの色変異体が、Ｖｅｎｕｓ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰからなるグループから選択されることを特徴とする上記（４）に記載の蛍光プローブ」である。
（６）本発明の第６の態様は、「前記アセチル化基質ドメインがヒストンＨ４であることを特徴とする上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の蛍光プローブ」である。
（７）本発明の第７の態様は、「前記アセチル化基質結合ドメインがブロモドメインを有するタンパク質であることを特徴とする上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の蛍光プローブ」である。
（８）本発明の第８の態様は、「前記ブロモドメインを有するタンパク質が以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるポリペプチドであることを特徴とする上記（７）に記載の蛍光プローブである。
（ａ）配列番号２で表される配列の１〜４４３番目のアミノ酸からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表される配列の１〜４４３番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、アセチル化されたタンパク質と結合するポリペプチド」
（９）本発明の第９の態様は、「前記ブロモドメインを有するタンパク質が以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるポリペプチドであることを特徴とする請求項７に記載の蛍光プローブ。
（ａ）配列番号４で表される配列の５７〜４６８番目のアミノ酸からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号４で表される配列の５７〜４６８番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、アセチル化されたタンパク質と結合するポリペプチド」である。
（１０）本発明の第１０の態様は、上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の蛍光プローブをコードする核酸」である。
（１１）本発明の第１１の態様は、「上記（１０）に記載の核酸を含むベクター」である。
（１２）本発明の第１２の態様は、「上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の蛍光プローブを生細胞内に導入し、該蛍光プローブから得られるＦＲＥＴ変化を検出し、生細胞内における前記アセチル化基質ドメインのアセチル化−脱アセチル化の変動を測定する方法」である。
（１３）本発明の第１３の態様は、「上記（１１）に記載のベクターを生細胞内に形質導入し、該ベクターから蛍光プローブが発現する条件下で細胞を培養し、細胞内で発現した蛍光プローブから得られるＦＲＥＴ変化を検出し、生細胞内における前記アセチル化基質ドメインのアセチル化−脱アセチル化の変動を測定する方法」である。
（１４）本発明の第１４の態様は、「上記（７）乃至（９）のいずれかに記載の蛍光プローブを生細胞内に導入し、該生細胞と候補化合物とを反応させ、蛍光プローブから得られるＦＲＥＴを検出し、生細胞と候補化合物を反応させた結果ＦＲＥＴが変化した場合、該候補化合物をブロモドメイン結合因子であると判定する、ブロモドメイン結合因子のスクリーニング方法」である。
（１５）本発明の第１５の態様は、「上記（７）乃至（９）のいずれかに記載の蛍光プローブを生細胞内に導入し、該生細胞と候補化合物とを反応させ、蛍光プローブから得られるＦＲＥＴを検出し、該生細胞と候補化合物を反応させた結果ＦＲＥＴが変化した場合、該候補化合物をヒストンアセチル化酵素活性の制御因子であると判定する、ヒストンアセチル化酵素活性の制御因子のスクリーニング方法」である。
（１６）本発明の第１６の態様は、「上記（７）乃至（９）のいずれかに記載の蛍光プローブを生細胞内に導入し、該生細胞と候補化合物とを反応させ、蛍光プローブから得られるＦＲＥＴを検出し、該生細胞と候補化合物を反応させた結果ＦＲＥＴが変化した場合、該候補化合物をヒストン脱アセチル化酵素活性の制御因子であると判定する、ヒストン脱アセチル化酵素活性の制御因子のスクリーニング方法」である。
（１７）本発明の第１７の態様は、「ブロモドメイン結合因子のスクリーニングシステムであって、以下の手段：
（ａ）上記（７）乃至（９）のいずれかに記載の蛍光プローブを生細胞に導入する手段、
（ｂ）前記生細胞と候補化合物とを反応させる手段、
（ｃ）蛍光プローブから得られるＦＲＥＴの変化を検出する手段、及び
（ｄ）前記ＦＲＥＴの変化の検出結果を指標にして、候補化合物の中からブロモドメイン結合候補化合物を選別する手段、
を含む前記システム」である。
（１８）本発明の第１８の態様は、「ヒストンアセチル化酵素活性又はヒストン脱アセチル化酵素活性の制御因子のスクリーニングシステムであって、以下の手段：
（ａ）上記（７）乃至（９）のいずれかに記載の蛍光プローブを生細胞に導入する手段、
（ｂ）前記生細胞と候補化合物とを反応させる手段、
（ｃ）蛍光プローブから得られるＦＲＥＴの変化を検出する手段、及び
（ｄ）前記ＦＲＥＴの変化の検出結果を指標にして、候補化合物の中からヒストンアセチル化酵素活性又はヒストン脱アセチル化酵素活性の制御因子候補化合物を選別する手段、
を含む前記システム」である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の蛍光プローブを用いると、生きた細胞内におけるタンパク質のアセチル化・脱アセチル化の時間的空間的動態を観察することができる。
【０００９】
特に、本発明の蛍光プローブを用いると、ヒストンのアセチル化・脱アセチル化の時間的空間的動態を観察することができる。
【００１０】
さらに、本発明の蛍光プローブを用いると、アセチル化を受けるタンパク質（以下、「アセチル化基質ドメイン」と称する）と、アセチル化を受けたタンパク質と結合するタンパク質（以下、「アセチル化基質結合ドメイン」と称する）との結合に対し、影響を与える因子のスクリーニングを行うことができる。
【００１１】
本発明の蛍光プローブは、生細胞内におけるタンパク質アセチル化状態を簡便かつ迅速かつ高感度で検出できる。従って、本発明の蛍光プローブは、ＨＡＴ及びＨＤＡＣを活性化又は阻害する化合物の生細胞を用いたスクリーニングに利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の実施形態の一つは、アセチル化基質ドメインと、アセチル化基質結合ドメインを、リンカーペプチドで連結し、該アセチル化基質ドメインと該アセチル化基質結合ドメインに、各々、異なる蛍光特性を持つ蛍光タンパク質を連結した蛍光プローブである（図１参照）。
「アセチル化基質ドメイン」には、アセチル化されるアミノ酸を含むタンパク質又はポリペプチド断片であって、必ずしも、機能的領域として作用しないものも含まれる。アセチル化基質ドメインとしては、例えば、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、ｐ５３タンパク質、α−チューブリン、ＨＳＰ９０、ＨＩＦ１α、ＮＦ−ｋａｐｐａＢ、Ｉｍｐｏｒｔｉｎ α、Ｋｕ７０、アンドロゲンレセプター  及びこれらの断片などを挙げることができる。また、「アセチル化基質結合ドメイン」とは、アセチル化基質ドメインと結合するタンパク質又はポリペプチド断片であって、必ずしも、機能的領域として作用しないものも含まれる。アセチル化基質結合ドメインとしては、例えば、ＢＲＤＴ（ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｅｓｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）、Ｂｒｄ２（ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）、Ｂｒｄ４、ＴＡＦＩＩ２５０、ＰＣＡＦ、ＧＣＮ５、ＣＢＰのブロモドメインなどを挙げることができる。
【００１３】
また、「リンカーペプチド」とは、アセチル化基質ドメインとアセチル化基質結合ドメインとを連結して一体化するためのペプチドのことである。リンカーペプチドを用いて連結して一本化することによって、同一分子内のアセチル化基質ドメインとアセチル化基質結合ドメインを優先的に結合させる。リンカーペプチドは、生細胞内において、アセチル化基質ドメインとアセチル化基質結合ドメインとの結合を阻害せず、また、アセチル化基質ドメインに連結される蛍光タンパク質と、アセチル化基質結合ドメインに連結される蛍光タンパク質との間で生じるＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を阻害しないものであれば、いかなるものでも使用可能であるが、かさ高くないアミノ酸から構成され、親水性（極性）のアミノ酸を含む１５〜５０アミノ酸長程度のペプチドが好ましい。このようなリンカーペプチドとしては、例えば、配列番号１で表される配列が１〜９回繰り返す配列からなるものが、より好ましくは、３〜５回繰り返す配列からなるものが好適に使用可能である。
【００１４】
本発明の蛍光プローブにおいて（図１参照）、２つの蛍光タンパク質、アセチル化基質結合ドメイン、リンカーペプチド、及びアセチル化基質ドメイン同士は、アセチル化基質結合ドメインとアセチル化基質ドメインが結合することができれば、直接結合しても、あるいは、数個〜数十個のアミノ酸がスペース（特に機能を有さない配列）として介在していても良い。本発明の蛍光プローブに使用される２つの「蛍光タンパク質」は、蛍光特性の異なるものであって、相互にＦＲＥＴのドナーとアクセプターの関係にあるものであれば、如何なるものであってもよく、限定はしないが、例えば、Ｖｅｎｕｓ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＧＦＰ、ＢＦＰなどから、ＦＲＥＴが生じる組合せを適宜選択して使用することができる。
【００１５】
本発明の他の実施形態は、本発明の蛍光プローブをコードする核酸及び該核酸を有するベクターである。本発明の蛍光プローブをコードする核酸は、当業者において周知の技術により調製することができ、例えば、蛍光プローブを構成する各ポリペプチド（蛍光タンパク質、アセチル化基質結合ドメイン、リンカーペプチド、及びアセチル化基質ドメイン）をコードする遺伝子の必要領域を連結することにより、調製することができる。各遺伝子は、該遺伝子を発現している細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製し、定法のスクリーニング方法により取得してもよく、又は、利用可能は市販のｃＤＮＡライブラリーなどを用いて取得してもよい。あるいは、各遺伝子が発現している細胞よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、該遺伝子配列に基づいて設計したＰＣＲプライマーで増幅して取得してもよい。この場合、ＰＣＲプライマーの５’末端側に適当な制限酵素サイトをデザインすることで、各遺伝子を容易に連結することができる。
【００１６】
蛍光プローブを細胞内で発現するためのベクターとしては、目的の細胞内で複製可能なものであって、蛍光プローブを発現させることができるプロモーターなどを有するものが使用可能である。例えば、動物細胞を用いる場合には、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＬＴＲプロモーター又はＳＶ４０プロモーターなどが利用可能である。蛍光プローブをコードするＤＮＡは、当業者において周知の技術を用いて、ベクター中に挿入することができる。得られた発現ベクターは、定法に従い、目的の細胞に導入することができる。
【００１７】
本発明の更なる実施形態は、本発明の蛍光プローブを生細胞内に導入し、該蛍光プローブから検出されるＦＲＥＴ変化を測定し、生細胞内における前記アセチル化基質ドメインのアセチル化−脱アセチル化の変動を検出する方法である。
本発明の蛍光プローブ（図１参照）は、アセチル化基質ドメイン（図１、ヒストンＨ４）とアセチル化基質結合ドメイン（図１、ブロモドメイン）との結合解離に伴うＦＲＥＴの変化をモニターすることで、アセチル化基質ドメインのアセチル化及び脱アセチル化状態の変動を、生細胞内でリアルタイムに検出することを可能にするものである。つまり、アセチル化基質ドメインがアセチル化されていない状態では、アセチル化基質結合ドメインと結合せず、両ドメインに連結している蛍光タンパク質間にＦＲＥＴが生じるが、アセチル化基質ドメインがアセチル化されると、アセチル化基質結合ドメインと結合するため、蛍光タンパク質間におけるＦＲＥＴが解消する。このようなＦＲＥＴの変化を検出することで、アセチル化基質ドメインのアセチル化状態をモニターすることができる。
さらに、本発明の蛍光プローブを用いると、アセチル化基質ドメインとして完全長のタンパク質、あるいは、該タンパク質の細胞内局在に影響を与えない程度の長さのタンパク質の一部を用いると、細胞内において適切な局在を示すことにより、アセチル化状態の変化をその局在位置においてモニターすることが可能となる。この場合、ＦＲＥＴの変化は特定の細胞について、蛍光顕微鏡などにより観察することができるため、目的のタンパク質（アセチル化基質ドメイン）のアセチル化状態の変化をリアルタイムで可視化することができる。
【００１８】
本発明の蛍光プローブの細胞内への導入は、発現させた蛍光プローブを細胞内導入試薬、あるいは、膜貫通ペプチドなどを連結させて導入することもできるが、上述した蛍光プローブの発現ベクターを目的の細胞に形質導入して、該細胞内で発現させる手法を用いてもよい。
【００１９】
本発明の他の実施形態は、本発明の蛍光プローブを生細胞内に導入し、ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）又はヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の活性を制御する因子をスクリーニングする方法である。本発明の蛍光プローブは、細胞内において、アセチル化されたアセチル化基質ドメインと結合するとＦＲＥＴが解消するという特徴をもつ。この特徴を利用すれば、細胞内における該蛍光プローブのアセチル化状態の変化をモニターすることで、ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）又はヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の活性に影響を与える物質を検出することができる。ここで「制御する因子」には、酵素活性を促進する因子及び阻害する因子の両方が含まれる。本実施態様により得られた候補化合物は、対象とするヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）又はヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）に対する影響を更に調べることで、各酵素活性の促進因子であるか阻害因子であるかを容易に判定することができる。また、本実施態様において、あらかじめ既知の各酵素（ＨＡＴ又はＨＤＡＣ）活性の阻害因子又は促進因子を細胞に対して添加してもよく、あるいは、あらかじめ各酵素（ＨＡＴ又はＨＤＡＣ）を細胞内で発現させておいてもよい。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、本発明の蛍光プローブを生細胞内に導入し、アセチル化基質ドメインとアセチル化基質結ドメインとの結合を競合的に阻害する因子をスクリーニングする方法である。上述のように本発明の蛍光プローブは、細胞内において、アセチル化されたアセチル化基質ドメインと結合するとＦＲＥＴが解消するという特徴をもつ。この特徴を利用して、アセチル化基質ドメインとアセチル化基質結合ドメインとの結合を、いずれかのドメインに競合的に結合して、両ドメイン同士の結合を阻害する物質の検出を行うことができる。つまり、細胞内に本発明の蛍光プローブを導入した状態で、アセチル化基質ドメインのアセチル化状態を一定の状態に保っておけば、アセチル化基質ドメインとアセチル化基質結合ドメインとの結合も一定の状態に保たれることになる。ここに、アセチル化基質ドメイン−アセチル化基質結合ドメインの相互作用と競合する物質が作用すると、蛍光プローブに存在する蛍光タンパク質間のＦＲＥＴに変動が生じるため、競合物質の存否を蛍光強度比の変化として捉えることが可能となる。例えば、アセチル化基質ドメインをヒストンＨ４又はＨ３とし、アセチル化基質結合ドメインをブロモドメインタンパク質又はそのブロモドメインとして蛍光プローブを調製すれば、ブロモドメインとヒストンとの結合を競合的に阻害する物質のスクリーニングが可能となる。ここでブロモドメインとしては、限定はしないが、例えば、配列番号２で表される配列の１〜４４３番目のアミノ酸からなるポリペプチド、又は、配列番号２で表される配列の１〜４４３番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、アセチル化されたタンパク質と結合するポリペプチド、あるいは、配列番号４で表される配列の５７〜４６８番目のアミノ酸からなるポリペプチド、又は、配列番号４で表される配列の５７〜４６８番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、アセチル化されたタンパク質と結合するポリペプチド、などを挙げることができる。
【００２１】
ブロモドメインは、転写のメディエーター／コアクチベーター等に見られるドメインのことで、アセチル化ヒストンと結合することが報告されている。ブロモドメインを有するタンパク質は、クロマチンの構造変化を通じて転写の制御に関与していると考えられているが、最近、ブロモドメインタンパク質がヒトの疾患の発症と関連している可能性も示唆されている。例えば、ＢＲＤ４−ＮＵＴ癌遺伝子発現を誘導するｔ（１５：１９）染色体転座が、複数の腫瘍患者において確認されている（Ｆｒｅｎｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３：３０４−３０７、２００３）。また、Ｂｒｄ２及びＢｒｄ４は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）タンパク質（ＬＡＮＡ−１）と結合することが知られており（Ｙｏｕら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８０：８９０９−８９１９、２００６；Ｖｉｅｊｏ−Ｂｏｒｂｏｌｌａら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７９：１３６１８−１３６２９、２００５；Ｐｌａｔｔら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７３：９７８９−９７９５、１９９９）、さらに、Ｂｒｄ４はヒトパピローマウイルスＥ２と結合し（Ｙｏｕら、Ｃｅｌｌ  １１７：３４９−３６０、２００４）、宿主染色体上の足場となり、ウイルスの宿主細胞内での伝播に利用されていることなどから、ウイルス感染に重要な役割を果たしていると考えられる。これらの機能には、アセチル化ヒストンを介して染色体に結合するブロモドメインの機能が重要と考えられるので、ブロモドメインと結合してアセチルヒストンＨ４との相互作用を阻害する物質は、抗癌剤、抗ウイルス剤として期待できる。
【００２２】
本発明の実施形態には、アセチル化基質ドメインと競合してアセチル化基質結合ドメインに結合する因子をスクリーニングするためのシステムも含まれる。
本発明のシステムには、
（ａ）本発明の蛍光プローブを生細胞に導入する手段、
（ｂ）前記生細胞とブロモドメイン結合候補化合物とを反応させる手段、
（ｃ）蛍光プローブから得られるＦＲＥＴの変化を検出する手段、及び
（ｄ）前記ＦＲＥＴの変化の検出結果を指標にしてブロモドメイン結合候補化合物を選別する手段、
及び、
（ａ）本発明の蛍光プローブを生細胞に導入する手段、
（ｂ）前記生細胞と候補化合物とを反応させる手段、
（ｃ）蛍光プローブから得られるＦＲＥＴの変化を検出する手段、及び
（ｄ）前記ＦＲＥＴの変化の検出結果を指標にして、候補化合物の中からヒストンアセチル化酵素活性又はヒストン脱アセチル化酵素活性の制御因子候補化合物を選別する手段、
を含む前記システム
【００２３】
本発明の蛍光プローブを細胞内へ導入する手段としては、発現ベクターを介して形質導入する方法によるのが一般的であるが、場合によっては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法により蛍光プローブを直接導入する方法であってもよく、これらの方法を採用する場合には、各々、倒立顕微鏡、マイクロマニュピレーター及びインジェクターなどの細胞導入装置、エレクトロポレーション装置などを使用してもよい。候補化合物と細胞を反応させる手段としては、適当な量の候補化合物を適当な担体と共に細胞と混合する方法が利用可能である。蛍光イメージは、例えば、４４０ＡＦ２１励起フィルター４５５ＤＲＬＰ２色性ミラーと、２つの放射フィルター（ＣＦＰ用；４８０ＡＦ３０、Ｖｅｎｕｓ用；５３５ＡＦ２６）を備えたＭｅｔａＦｌｕｏｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ社）を用いて取り込み、４８０ｎｍ／５３５ｎｍの蛍光強度比を経時的に観察することができる。また、候補化合物を選別する手段は、蛍光プローブからのＦＲＥＴが生じた結果、蛍光強度が変化したと判断できる場合に、該候補化合物がアセチル化基質結合ドメインと結合する化合物の候補、又はヒストンアセチル化酵素又はヒストン脱アセチル化酵素の活性を制御する化合物の候補であると判断する手段である。
【００２４】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
１．蛍光プローブの調製
本実施例では、アセチル化基質ドメインとしてヒストンＨ４の全長、アセチル化基質結合ドメインとしてＢＲＤＴのブロモドメイン又はＢｒｄ２のブロモドメイン、蛍光タンパク質としてＣＦＰとＶｅｎｕｓを用いて蛍光プローブを調製した（図１）。Ｖｅｎｕｓ、ＢＲＤＴのブロモドメイン、Ｂｒｄ２のブロモドメイン、ヒストンＨ４、ＣＦＰをコードするＤＮＡは、各々、配列番号９、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１１からなる鋳型ＤＮＡに対し、下記のプライマーセットを用いて、ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）を用い、添付の説明書に従ってＰＣＲを行うことにより取得した。なお、鋳型となるＤＮＡに関して、マウスヒストンＨ４については、プロクエストツーハイブリッドｃＤＮＡライブラリー（マウス脳；ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から、
Ｈ４−Ｆｏｒ：５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＴＣＡＧＧＡＣＧＡＧＧＡ−３’（配列番号１２）
Ｈ４−Ｒｅｖ  ｎｏ  Ｓｔｏｐ：５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＡＧＣＣＧＴＡ−３’（配列番号１３）、
のプライマーペアーを用いて、ｐｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）を使用し、ＰＣＲを行い、ＧＡＴＥＷＡＹ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりクローニングを行った。また、マウスＢＲＤＴについては、Ｐｉｖｏｔ−Ｐａｊｏｔら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２３：５３５４−５３６５，２００３に記載のクローニング方法により、ヒトＢｒｄ２については、スーパースクリプトプリメイドｃＤＮＡライブラリー（ヒト脳；ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から、
ｈＢｒｄ２＿ＥｃｏＲＩ＿ｆｏｒ：５’−ＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＡＡＣＣＣＡ−３’（配列番号１４）
ｈＢｒｄ２＿ＸｈｏＩｓｔｏｐＳａｌＩ＿ｒｅｖ：５’−ＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＴＣＧＡＣＧＧＣＡＧＴＡＧＡＧＡＣＴＧＧ−３’（配列番号１５）
プライマーペアーを用いて、ｐｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）を使用し、ＰＣＲを行い、クローニングを行った。Ｖｅｎｕｓについては、Ｎａｇａｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：８７−９０，２０００に記載のクローニング方法により入手し、ＣＦＰについては、クロンテック社から購入した。
Ｖｅｎｕｓ
ＧＦＰｆｏｒＥｃｏＲＩ：５’−ＣＣＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１６）
ＧＦＰｒｅｖＥｃｏＲＩ：５’−ＣＣＧＴＧＡＡＴＴＣＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣ−３’（配列番号１７）
ＢＲＤＴのブロモドメイン
ＢＲＤＴｆｏｒＥｃｏＲＩ：５’−ＡＧＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＡＣＣＣＧＡＧＧＡＧＣＴＡ−３’（配列番号１８）
ＢＲＤＴｒｅｖＳａｌＩ：５’−ＡＧＴＴＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＴＧＣＡＴＧＡＣＡＧＧ−３’（配列番号１９）
Ｂｒｄ２のブロモドメイン
ｈＢｒｄ２＿ＥｃｏＲＩ＿ｆｏｒ：５’−ＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＡＡＣＣＣＡ−３’（配列番号１４）
ｈＢｒｄ２＿ＸｈｏＩｓｔｏｐＳａｌＩ＿ｒｅｖ：５’−ＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＴＣＧＡＣＧＧＣＡＧＴＡＧＡＧＡＣＴＧＧ−３’（配列番号１５）
ヒストンＨ４
Ｈ４ｆｏｒＢａｍＨＩ：５’−ＡＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧＧＡＣＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’（配列番号２２）
Ｈ４ｒｅｖＳａｌＩ：５’−ＡＧＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＡＧＣＣＧＴＡ−３’（配列番号２３）
ＣＦＰ
ＧＦＰｆｏｒＳａｌＩ＿ＥｃｏＲＶ：５’−ＡＧＴＴＧＴＣＧＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＴＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣ−３’（配列番号２４）
ＧＦＰｒｅｖＸｈｏＩ：５’−ＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣ−３’（配列番号２５）
また、リンカーペプチドをコードするＤＮＡについては、下記のポリヌクレオチドを、定法によりアニールさせて調製した。
リンカーペプチド
Ｌｉｎｋｅｒ（ＧＧＧＧＳ）４ｆｏｒ：５’−ＴＣＧＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＡ  ＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧ−３’（配列番号２０）
Ｌｉｎｋｅｒ（ＧＧＧＧＳ）４ｒｅｖ：５’−ＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＧ−３’（配列番号２１）
【００２６】
調製した各ＤＮＡは、まず、下記の制限酵素セットで切断した後、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングをおこなった、
Ｖｅｎｕｓ：ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ
ＢＲＤＴ及びＢｒｄ２のブロモドメイン：ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ
リンカーペプチド：ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ
ヒストンＨ４：ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ
ＣＦＰ：ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ
次に、ヒストンＨ４とＣＦＰをｐｃＤＮＡ３．１のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニングし、その後、Ｖｅｎｕｓ、ＢＲＤＴのブロモドメイン及びリンカーペプチドを順次クローニングし、５’側から、Ｖｅｎｕｓ、ＢＲＤＴのブロモドメイン又はＢｒｄ２のブロモドメイン、リンカーペプチド、ヒストンＨ４、ＣＦＰをコードする各ＤＮＡの順に配置された発現ベクターを調製した。
蛍光プローブを発現させるＣｏｓ７細胞は、１０％ＦＣＳ，１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社)、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを添加したＤＭＤＭ中で培養した。
調製した発現ベクターは、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ社）を用いてＣｏｓ７細胞に形質導入し、その後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で静置した。
【００２７】
２．蛍光プローブを用いたアセチル化及び脱アセチル化状態の検出
以下、調製した蛍光プローブ（図１、以下ＶＢ４ＨＣ（ＢＲＤＴのブロモドメインを使用）又はＢｒｄ２−ＶＢ４ＨＣ（Ｂｒｄ２のブロモドメインを使用）とする。）を細胞内に導入し、ヒストンＨ４のアセチル化状態を検出した結果を示す。実験のコントロールとして、ＢＲＤＴのブロモドメインに存在する２つのチロシンをアラニンに置換し、アセチル化ヒストンとの結合能を消失させたもの（図１、ＶＢ４ＨＣ−Ｙ２Ａ）、ヒストンＨ４の４つのリジン（５番目、８番目、１２番目及び１６番目）をアルギニンに置換し、アセチル化を受けない変異体としたもの（図１、ＶＢ４ＨＣ−Ｋ４Ｒ）を作製して、適宜使用した。
２−１．ＶＢ４ＨＣの機能について
ＢＲＤＴのブロモドメインはヒストンＨ４の５番目のリジンと８番目のリジンがアセチル化された時に結合するが、５番目と８番目のリジンのアセチル化はヒストンＨ４が高度にアセチル化された状態で生じる。従って、本実施例で使用した蛍光プローブはヒストンＨ４の過剰アセチル化状態をモニターすることができる。図２は、Ｖｅｎｕｓ−ＢＲＤＴのコンストラクトを細胞内に形質導入し、Ｐｉｖｏｔ−Ｐａｊｏｔらの方法（Ｐｉｖｏｔ−Ｐａｊｏｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２３：５３５４−５３６４、２００３）により行ったペプチドプルダウンアッセイの結果を示すものである。この結果から、ＢＲＤＴのブロモドメインはアセチル化したヒストンＨ４と特異的に結合し、ヒストンＨ４の５番目と８番目の両方のリジンがアセチル化されたときのみＢＲＤＴのブロモドメインと結合することが明らかとなった（図２下段）。
【００２８】
２−２．ＶＢ４ＨＣの細胞内局在
ＶＢ４ＨＣの細胞内局在について検討を行った（図３）。ＶＢ４ＨＣをＣｏｓ７細胞に形質導入した後、蛍光イメージの観察のためにフェノールレッドを含まない培養液に置換した。細胞は、ＣＣＤカメラ（ＵＩＣ−ＱＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｅｓ社）を備えた顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１；オリンパス社）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で観察を行った。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２とＶｅｎｕｓのイメージは、Ｄｅｌｔａ  Ｖｉｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ社）を用いて、ＣＣＤカメラ（ＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓＣＨ３５０Ｌ；Ｒｏｐｅｒ社）を備えた顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０；オリンパス社）を用いて取り込んだ。その結果、作製したＶＢ４ＨＣは、ＤＮＡと同じ局在を示すことが分かった（図３Ｄ）。
また、細胞成分を分画してＶＢ４ＨＣの存在を確認したところ、内在性のヒストンと同様にクロマチン内に取り込まれていることも分かった（図４）。
【００２９】
２−３．ＶＢ４ＨＣの細胞内におけるアセチル化状態の経時変化
ヒストン脱アセチル化阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）処理によるＶＢ４ＨＣのアセチル化の蓄積をイムノブロッティング（ウエスタンブロティング法）により検出した結果である（図５）。ＶＢ４ＨＣを発現するＣｏｓ７細胞と発現していないＣｏｓ７細胞を、１μＭのＴＳＡで３７℃にて、０、１、２、３、４、８時間処理し、各時点で、複数箇所（Ｌｙｓ５、８、１２及び１６）でアセチル化されたヒストンＨ４に対する抗体で細胞全体についてイムノブロッティングを行った（図５）。その結果、蛍光プローブのアセチル化の蓄積する時間経過は、内在性のヒストンＨ４のアセチル化の蓄積の時間経過と一致することが確認された（図５、ＡとＢとの比較）。
次に、ＴＳＡの存在下でＶＢ４ＨＣから得られるＦＲＥＴを検出した。蛍光イメージは、４４０ＡＦ２１励起フィルター４５５ＤＲＬＰ２色性ミラーと、２つの放射フィルター（ＣＦＰ用；４８０ＡＦ３０、Ｖｅｎｕｓ用；５３５ＡＦ２６）を備えたＭｅｔａＦｌｕｏｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ社）を用いて取り込み、４８０ｎｍ／５３５ｎｍの蛍光強度比を経時的に観察した（図６及び図７）。その結果、蛍光プローブ、ＶＢ４ＨＣを発現させたＣｏｓ７細胞にＴＳＡを添加すると、核全体においてＦＲＥＴが解消するように蛍光強度比変化が生じ（図６）、この応答はＴＳＡ添加後、３時間以内に平衡に達することが分かった（図７）。この平衡に達するまでにかかる時間は、ウェスタンブロッティング法によってアセチル化のバンドが検出されるまでにかかる時間と等しい（図５参照）。ＶＢ４ＨＣのアセチル化サイトである４つのリジンをアルギニンにかえた変異体（ＶＢ４ＨＣ−Ｋ４Ｒ）（図１、Ｂ４ＨＣ−Ｋ４Ｒ）を発現しているＣｏｓ７細胞にＴＳＡを添加しても、蛍光強度比変化は起きなかった（図８、Ｋ４Ｒ）。これは蛍光プローブの応答が蛍光プローブのアセチル化に依存していることを示している。また、アセチル化基質結合ドメインに、アセチル化ヒストンＨ４と結合しないようなＢＲＤＴのブロモドメインを用いた蛍光プローブ（ＶＢ４ＨＣ−Ｙ２Ａ）を発現しているＣｏｓ７細胞にＴＳＡ添加しても、蛍光強度比変化は起きなかった（図８、Ｙ２Ａ）。ＦＲＥＴアクセプターであるＶｅｎｕｓに直接強い励起光を当て、Ｖｅｎｕｓの蛍光団を壊すと、Ｖｅｎｕｓの蛍光団からの蛍光（５３５ｎｍ）が減少、ＦＲＥＴドナーであるＣＦＰの蛍光（４８０ｎｍ）が回復する（図９）。この結果から、この蛍光プローブ（ＶＢ４ＨＣ）はアセチル化が誘導される前にＦＲＥＴを起こしていることを示している。また、Ｖｅｎｕｓの蛍光団を壊した後に、ＴＳＡを添加しても、蛍光強度比変化は起きなかった（図８、光退色）。この結果は、蛍光プローブの蛍光強度比変化が蛍光プローブのアセチル化によるＦＲＥＴ変化に依存していることを示している。
また、Ｂｒｄ２−ＶＢ４ＨＣについても、ＶＢ４ＨＣと同様にＴＳＡによりＦＲＥＴが解消するように蛍光強度比変化が生じた（図１０及び図１１）。従って、本発明の蛍光ブローブは、ＢＲＤＴのみならず、他のブロモドメインを使用した場合においても、効果的に機能することが明らかとなった。
【００３０】
以上のことから、作製した蛍光プローブは生細胞内で内在性のヒストンＨ４と同様の挙動を示し、蛍光プローブのアセチル化はＦＲＥＴ変化に伴う蛍光強度比変化として検出可能であることがわかった。また、ＴＳＡによってアセチル化を誘導した後、培地を交換することでＴＳＡを取り除くと、蛍光強度比は基底レベルまで減少した（図１２）。この結果は、この蛍光プローブはアセチル化と脱アセチル化を可逆的に検出することが可能であることを示している。なお、この蛍光プローブを発現させたＨｅＬａ細胞を１μＭＴＳＡ処理した場合も、Ｃｏｓ７細胞に発現させたときと同様の蛍光強度比変化が生じた（図１３）。
【００３１】
３．各種ＨＤＡＣ阻害剤によるヒストンＨ４のアセチル化状態のモニターへの適用
本実施例で報告した蛍光プローブ（ＶＢ４ＨＣ）を用いて、各種ＨＤＡＣ（ヒストン脱アセチル化酵素）阻害剤によるヒストンＨ４アセチル化誘導を調べた。ＴＳＡの例を図１４に、ＣＨＡＰ３１、ＳＣＯＰ３０４、ＳＣＯＰ４０２（Ｎｉｓｈｉｎｏら，Ｏｒｇ  Ｌｅｔｔ  ５：５０７９−５０８２，２００３）の例を、各々、図１５、１６、１７に示した。ＴＳＡは添加後、直ちにアセチル化の蓄積がはじまるのに対し（図１４）、ＳＣＯＰ３０４は添加後、９０分後からアセチル化の蓄積がはじまることがわかった（図１６）。これはこの蛍光プローブがヒストンＨ４のアセチル化の蓄積の時間変化を高分解能で追うことが可能であることを示している。また、ＴＳＡ添加によるアセチル化の蓄積をウェスタンブロッティングと比較したところ、ウェスタンブロッティングでアセチル化が検出できるＴＳＡの濃度の１０分の１の濃度である１ｎＭからアセチル化が検出できた（図１４）。この結果は、この蛍光プローブがヒストンＨ４のアセチル化を従来のウェスタンブロッティング法より高感度で検出可能であることを示している。さらに、市販のＨＤＡＣ阻害剤であるスクリプタイド（Ｓｉｇｍｅ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）とブチル酸ナトリウム（和光純薬）添加による蛍光プローブの応答を図１８、図１９に示した。
以上の結果から、本発明の蛍光プローブはヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の阻害剤の影響を検出することが可能であるため、ＨＤＡＣ阻害因子のスクリーニング等に有効であることが明らかとなった。
【００３２】
４．有糸分裂期におけるヒストンＨ４のアセチル化状態の観察
また、本発明の蛍光プローブ（ＶＢ４ＨＣ）を用いて、有糸分裂過程におけるヒストンＨ４のアセチル化状態を観察した。図２０に有糸分裂中のヒストンＨ４のアセチル化状態を擬似カラー表示で示した。染色体が凝集するとともにヒストンＨ４の脱アセチル化が起こり、分裂後期の初めにヒストンＨ４のアセチル化量は最も低くなり、分裂後期の後半からヒストンＨ４の再びアセチル化が起こり、分裂終期の後半には分裂前のアセチル化状態まで回復した（図２０及び図２１）。微小管重合阻害剤であるノコダゾール処理によって分裂期に停止させたＣｏｓ７細胞は、ノコダゾール未処理のＣｏｓ７細胞と比較して、分裂期のマーカーであるヒストンＨ３のＳ１０のリン酸化の増加が確認され、ヒストンＨ４のアセチル化は減少していることをウェスタンブロッティングによって確認した（図２２）。
【００３３】
５．ブロモドメイン結合因子のスクリーニング
以上の結果は、本発明の蛍光プローブを用いることで生体内のヒストンＨ４アセチル化の変動をリアルタイムで検出することを示したものであるが、原理的には、アセチル化ヒストンとブロモドメインの結合を競合阻害する物質が存在すれば、そのような阻害物質を簡便に検出できるはずである。すなわち、通常の細胞状態では一定レベルのアセチル化が存在するため、部分的なアセチル化ヒストン−ブロモドメインの相互作用があり、そのため４８０ｎｍ／５３５ｎｍの比は一定の値を示す。アセチル化ヒストン−ブロモドメインの相互作用と競合し、阻害するものがあれば、この値は低下するはずである。実際、ブロモドメインのアセチル化リジン結合ドメインと結合する化合物Ａ（ＳＰＥＣＳ社、ＩＤ番号；ＡＧ−６７０／４０９０９９５６）を添加すると蛍光強度比の減少が観察された（図２３）。この蛍光プローブの蛍光強度比の減少は似た構造を持つがブロモドメインと結合しない化合物Ｂ（ＳＰＥＣＳ社、ＩＤ番号；ＡＦ−３９９／１５１２８２７８）を添加しても観察されなかった。この結果は、生細胞内でこの化合物Ａが、蛍光プローブ内のＢＲＤＴのブロモドメインに競合的に結合することで、ブロモドメインとアセチル化リジンの結合を阻害していることを示している。
【００３４】
化合物Ａ
【化１】
2008167678.tif 000003
化合物Ｂ
【化２】
2008167678.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明の蛍光プローブにより細胞内におけるタンパク質のアセチル化状態の変動を簡便迅速にかつ高感度で検出することができる。従って、本発明の蛍光プローブは、特定のタンパク質のアセチル化状態の変動と密接に関連する疾患等の診断、あるいは、病態変動の検出などに多大なる効果をもたらすことが期待できる。特に、アセチル化ヒストンＨ４とブロモドメインタンパク質との結合が癌化や感染症などに関与しているとの報告もあることから、アセチル化ヒストンＨ４とブロモドメインタンパク質との結合を阻害する物質は、抗ガン剤や抗ウイルス剤としての効果が期待できる。従って、本発明の蛍光プローブは、癌や感染症など、各種疾患の治療剤のスクリーニングなどに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】蛍光プローブの模式図を示す（ＶＢ４ＨＣ、Ｂｒｄ２−ＶＢ４ＨＣ）。ブロモドメインは、ＢＲＤＴの１番目〜４４３番目のアミノ酸配列部分又はＢｒｄ２の５７番目〜４６８番目のアミノ酸部分を用いた。また、実験のコントロールとして、ＢＲＤＴのブロモドメインチロシンをアラニン置換したもの（ＶＢ４ＨＣ−Ｙ２Ａ）、ヒストンＨ４の全てのリジンをアルギニン置換したもの（ＶＢ４ＨＣ−Ｋ４Ｒ）を調製した。
【図２】無処理又は過剰にアセチル化（Ａｃ）したヒストンＮ末端テイルペプチドを用いたペプチドプルダウンアッセイの結果を示す（上段）。また、ヒストンＨ４の部分的にアセチル化したＮ末端テイルペプチドを用いたペプチドプルダウンアッセイの結果を示す（中段及び下段）。
【図３】蛍光プローブ（ＶＢ４ＨＣ）の細胞内局在の蛍光イメージを示す。Ａは、微分干渉による観察像を示し、Ｂ及びＣは、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２及びＶｅｎｕｓによる蛍光観察像を、また、Ｄは、ＢとＣを重ね合わせた観察像を示す。
【図４】蛍光プローブ（ＶＢ４ＨＣ）がヌクレオソームに取り込まれていることを確認した結果を示す。上段は、細胞質画分（１）、クロマチンを除いた核画分（２）、クロマチン画分に対し、抗ヒストンＨ４抗体を用いてイムノブロッティングを行った結果を示す。中段は、各画分に対して、抗ＧＦＰ抗体により免疫沈降を行い、沈降物に対し、抗ＧＰ抗体でイムノブロッティングを行った結果を示す。下段は、各画分を１．５％アガロースゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し解析した結果を示す。なお、ＩＰ及びＩＢは、各々、免疫沈降及びイムノブロッティングを行ったことを表す。
【図５】蛍光プローブ（ＶＢ４ＨＣ）のアセチル化状態の経時変化を調べた結果を示す。ＶＢ４ＨＣを発現しているＣｏｓ７細胞（Ａ）及び発現していないＣｏｓ７細胞（Ｂ）を、１μＭのＴＳＡで処理し、各時点でアセチル化ヒストンに対する抗体（Ａ及びＢの上段）、ＧＦＰに対する抗体（Ａの下段）、ヒストンに対する抗体（Ｂの下段）で細胞全体に対し、イムノブロッティングを行った結果である。コントロールとは、ＴＳＡを含まない同量のエタノールで同様の処理を８時間行ったサンプルに対する実験結果である。
【図６】蛍光プローブ（ＶＢ４ＨＣ）を発現させたＣｏｓ７細胞に、ＴＳＡ（１μＭ）を３０分の時点で添加し、３０分、９０分、１５０分、２１０分後に、プローブから得られる４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光強度比を擬似カラーのイメージで示した図である。
【図７】蛍光プローブ（ＶＢ４ＨＣ）を発現するＣｏｓ７細胞核からの蛍光強度比の経時変化を測定した結果である。細胞を１μＭのＴＳＡ又は同量のエタノール（コントロール）で、３０分の時点で処理し、測定を行った。
【図８】蛍光プローブ（ＶＢ４ＨＣ、ＶＢ４ＨＣ−Ｋ４Ｒ及びＶＢ４ＨＣ−Ｙ２Ａ）の１μＭのＴＳＡ又はＴＳＡを含まない同量のエタノールを添加後３時間での蛍光強度比の変化（平均値±標準偏差）を示すグラフである。コントロールは、ＴＳＡ（１μＭ）を含まない場合のＶＢ４ＨＣの測定結果である。また、光退色は、ＶＢ４ＨＣのＶｅｎｕｓを光退色させた後、ＴＳＡ処理した場合の蛍光強度比変化を示す。
【図９】蛍光プローブ（ＶＢ４ＨＣ）を発現させたＣｏｓ７細胞に、ＦＲＥＴアクセプターであるＶｅｎｕｓを光退色させるために４９５±５ｎｍの強い励起光を５分間当てた後、ＣＦＰ（４８０ｎｍ）及びＶｅｎｕｓ（５３５ｎｍ）の蛍光強度の変化を測定した結果を示す。
【図１０】蛍光プローブ（Ｂｒｄ２−ＶＢ４ＨＣ）を発現するＣｏｓ７細胞核からの蛍光強度比の経時変化を測定した結果である。細胞を１μＭのＴＳＡ又は同量のエタノール（コントロール）で、３０分の時点で処理し、測定を行った。
【図１１】蛍光プローブ（Ｂｒｄ２−ＶＢ４ＨＣ）の１μＭのＴＳＡ又はＴＳＡを含まない同量のエタノールを添加後３時間での蛍光強度比の変化（平均値±標準偏差）を示すグラフである。コントロールは、ＴＳＡ（１μＭ）を含まない場合のＢｒｄ２−ＶＢ４ＨＣの測定結果である。
【図１２】蛍光プローブ（ＶＢ４ＨＣ）を発現させたＣｏｓ７細胞からの４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光強度比の経時変化を示す。細胞は、３０分の時点で１００ｎＭＴＳＡで処理し、２１０分の時点でフェノールレッドを含まない成長培地で洗浄した。
【図１３】蛍光プローブ（ＶＢ４ＨＣ）を発現するＨｅＬａ細胞核からの蛍光強度比の経時変化を測定した結果である。細胞を１μＭのＴＳＡで、３０分の時点で処理し、測定を行った。
【図１４】ＴＳＡで処理したＶＢ４ＨＣ発現細胞からの蛍光強度比の経時変化（上段）と、処理濃度毎の蛍光強度比（平均値±標準偏差）（下段）を示す。経時変化の測定の場合、細胞は３０分の時点でＴＳＡ処理した（上段）。また、ＴＳＡの処理濃度毎の蛍光強度比は、ＴＳＡ処理後３時間で測定を行った（下段）。−はＴＳＡを添加しないコントロールである。
【図１５】ＣＨＡＰ３１で処理したＶＢ４ＨＣ発現細胞からの蛍光強度比の経時変化（上段）と、処理濃度毎の蛍光強度比（平均値±標準偏差）（下段）を示す。経時変化の測定の場合、細胞は３０分の時点でＣＨＡＰ３１処理した（上段）。また、ＣＨＡＰ３１の処理濃度毎の蛍光強度比は、ＣＨＡＰ３１処理後３時間で測定を行った（下段）。−はＣＨＡＰ３１を添加しないコントロールである。
【図１６】ＳＣＯＰ３０４で処理したＶＢ４ＨＣ発現細胞からの蛍光強度比の経時変化（上段）と、処理濃度毎の蛍光強度比（平均値±標準偏差）（下段）を示す。経時変化の測定の場合、細胞は３０分の時点でＳＣＯＰ３０４処理した（上段）。また、ＳＣＯＰ３０４の処理濃度毎の蛍光強度比は、ＳＣＯＰ３０４処理後５時間で測定を行った（下段）。−はＳＣＯＰ３０４を添加しないコントロールである。
【図１７】ＳＣＯＰ４０２で処理したＶＢ４ＨＣ発現細胞からの蛍光強度比の経時変化（上段）と、処理濃度毎の蛍光強度比（平均値±標準偏差）（下段）を示す。経時変化の測定の場合、細胞は３０分の時点でＳＣＯＰ４０２処理した（上段）。また、ＳＣＯＰ４０２の処理濃度毎の蛍光強度比は、ＳＣＯＰ４０２処理後３時間で測定を行った（下段）。−はＳＣＯＰ４０２を添加しないコントロールである。
【図１８】スクリプタイドで処理したＶＢ４ＨＣ発現細胞からの蛍光強度比の経時変化を示す。細胞は３０分の時点でスクリプタイド処理した。
【図１９】ブチル酸ナトリウムで処理したＶＢ４ＨＣ発現細胞からの蛍光強度比の経時変化を示す。細胞は３０分の時点でブチル酸ナトリウム処理した。
【図２０】分裂期における、ＶＢ４ＨＣを発現するＣｏｓ７細胞からの４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光強度比の経時変化を擬似カラーにより示した図である。
【図２１】分裂期におけるＶＢ４ＨＣを発現するＣｏｓ７細胞からの４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光強度比の経時変化を示す。
【図２２】分裂期に同調したＣｏｓ７細胞（Ｍ）と非同調のＣｏｓ７細胞におけるヒストンＨ４のアセチル化について、５番目又は８番目のリジンがアセチル化されたヒストンＨ４に対する抗体、及び１０番目のセリンがリン酸化されたヒストンＨ３に対するこ歌いを用いて解析した結果を示す。ＡｃＫ５、ＡｃＫ８はそれぞれ５番目、８番目のリジンがアセチル化されていることを表す。また、ｐＳ１０は１０番目のセリンがリン酸化されていることを表す。ＣＢＢ：クマジーブリリアントブルーによる染色。
【図２３】１０μＭの化合物Ａ又はＢで処理したＶＢ４ＨＣ発現細胞からの蛍光強度比の経時変化を示す。細胞は３０分の時点で化合物Ａ又はＢで処理した。−は化合物を添加しないコントロールである。
【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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