(57)【要約】      （修正有）【課題】脂肪組織を消化して得られた細胞群から脂肪組織由来幹細胞を高純度に分離して培養する方法の提供。【解決手段】脂肪組織を分解して得られた細胞懸濁液から細胞を抽出する抽出ステップＳ１と、抽出された細胞を、接着性向上のための表面処理の施されていない培養容器に播種する播種ステップＳ２と、播種された細胞を、培地交換しながら培養する培養ステップＳ３とを備え、該培養ステップＳ３における最初の培地交換を細胞の播種後、１６〜２４時間後に行う脂肪組織由来幹細胞の培養方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織を分解して得られた細胞懸濁液から細胞を抽出する抽出ステップと、
抽出された細胞を、接着性向上のための表面処理の施されていない培養容器に播種する播種ステップと、
播種された細胞を、培地交換しながら培養する培養ステップとを備え、
該培養ステップにおける最初の培地交換を細胞の播種後、１６〜２４時間後に行う脂肪組織由来幹細胞の培養方法。
【請求項２】
前記培養ステップが、継代処理を行う継代ステップを備え、
該継代処理後の培養ステップにおいて、培地にビタミンＣとｂＦＧＦを添加する請求項１に記載の脂肪組織由来幹細胞の培養方法。
【請求項３】
前記播種ステップが、抽出ステップにより抽出された細胞を５×１０４個／ｃｍ２以上の細胞密度で播種する請求項１に記載の脂肪組織由来幹細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪組織由来幹細胞の培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、脂肪組織を酵素により分解し、脂肪組織由来細胞群を分離する方法は知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特表２００５−５３４３１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の分離方法では、脂肪組織内の種々雑多な細胞群が分離されるため、脂肪組織由来幹細胞のみを高純度に分離することができないという不都合がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、脂肪組織を消化して得られた細胞群から脂肪組織由来幹細胞を高純度に分離して培養することができる脂肪組織由来幹細胞の培養方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、脂肪組織を分解して得られた細胞懸濁液から細胞を抽出する抽出ステップと、抽出された細胞を、接着性向上のための表面処理の施されていない培養容器に播種する播種ステップと、播種された細胞を、培地交換しながら培養する培養ステップとを備え、該培養ステップにおける最初の培地交換を細胞の播種後、１６〜２４時間後に行う脂肪組織由来幹細胞の培養方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、脂肪組織を分解して得られた細胞懸濁液から抽出ステップにおいて細胞が抽出され、抽出された細胞が播種ステップにおいて培養容器に播種され、培養ステップにおいて培地交換されながら培養が行われる。抽出ステップにおいて抽出される細胞は、例えば、粒径が同等であったり、比重が同等であったりすることにより抽出されるため、脂肪組織由来幹細胞のみならず他の同様の雑多な細胞が含まれている。
【０００８】
播種ステップにおいては、抽出された細胞群が培養容器に播種されるが、培養容器には接着性を向上する表面処理がなされていないので、接着力の弱い細胞は培養容器に接着することができず、接着力の強い脂肪組織由来幹細胞が培養容器に接着するようになる。そこで、培養ステップにおいては、播種後１６〜２４時間後に最初の培地交換を行うことにより、脂肪組織由来幹細胞を安定して接着させ、接着できない他の細胞群を培地交換によって古い培地とともに除去することができる。これにより、脂肪組織由来幹細胞を選択的に高純度に分離しつつ培養することができる。
【０００９】
上記発明においては、前記培養ステップが、継代処理を行う継代ステップを備え、該継代処理後の培養ステップにおいて、培地にビタミンＣとｂＦＧＦを添加することとしてもよい。
このようにすることで、選択的に分離された脂肪組織由来幹細胞を効率的に増殖させることが可能となる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記播種ステップが、抽出ステップにより抽出された細胞を５×１０４個／ｃｍ２以上の細胞密度で播種することとしてもよい。
このようにすることで、脂肪組織由来幹細胞の生着率を高め、より高純度に脂肪組織由来幹細胞を分離して培養することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、脂肪組織を消化して得られた細胞群から脂肪組織由来幹細胞を高純度に分離して培養することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の一実施形態に係る脂肪組織由来幹細胞の培養方法について、図１〜図３を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る脂肪組織由来幹細胞の培養方法は、図１に示されるように、脂肪組織を分解して得られた細胞懸濁液から細胞を抽出する抽出ステップＳ１と、抽出された細胞を培養容器に播種する播種ステップＳ２と、播種された細胞を培地交換しながら培養する細胞培養ステップＳ３とを備えている。
【００１３】
抽出ステップＳ１は、例えば、細胞懸濁液を遠心分離機にかけることにより行われる。遠心分離機にかけられた細胞懸濁液は、所定の回転数で所定時間だけ遠心させられることにより、比重に応じて分離され、幹細胞を含む細胞群と、それよりも比重の軽い血漿成分とに分離される。分離された細胞群は、例えば、シリンジにより吸引され、回収される。
【００１４】
播種ステップＳ２は、前記抽出ステップＳ１において抽出された細胞群を培地に懸濁して得られた細胞懸濁液を、浮遊細胞用のノントリートの培養容器に播種することにより行われる。浮遊細胞用のノントリートの培養容器は、細胞を底面に接着させるための疎水性処理等の何らの接着性向上の表面処理が施されていない培養容器、あるいは、そのような接着性を向上した材質により構成されていない培養容器、例えば、表面処理の施されていないプラスチック製のシャーレ等の培養容器である。
【００１５】
細胞培養ステップＳ３は、図２に示されるように、前記播種ステップＳ２において培養容器に播種された細胞をほぼコンフルエントになるまで培養する初代培養ステップＳ３１と、該初代培養ステップＳ３１により培養された細胞をトリプシンのようなタンパク質分解酵素等を用いて培養容器底面から剥離して回収する回収ステップＳ３２と、回収された細胞を再度、培地に懸濁して培養容器に播種して行う継代培養ステップＳ３３とを備えている。継代培養ステップＳ３３は、細胞を剥離して回収する回収ステップを挟んで複数回行われてもよい。継代培養ステップＳ３３においては、ビタミンＣおよびｂＦＧＦ等を添加して培養が行われる。
【００１６】
初代培養ステップＳ３１は、図３に示されるように、培養容器内に貯留された細胞懸濁液を静置する静置ステップＳ３１１と、該静置ステップＳ３１１後に上清を除去する洗浄ステップＳ３１２と、該洗浄ステップＳ３１２により上清を除去された細胞に培地を付与してほぼコンフルエントになるまで培養する培養ステップＳ３１３とを備えている。
静置ステップＳ３１１は、例えば、１６〜２４時間行われる。
【００１７】
本実施形態に係る培養方法によれば、抽出ステップＳ１において抽出された細胞群が、播種ステップＳ２においてノントリートの培養容器に播種され、細胞培養ステップＳ３において培養される。細胞培養ステップＳ３においては、まず、初代培養ステップＳ３１において、１６〜２４時間静置された後に、洗浄ステップＳ３２により上清が除去される。
【００１８】
この場合において、静置ステップＳ３１１が、ノントリートの培養容器内で１６〜２４時間という比較的短い時間にわたって行われた後に、最初の培地交換が行われるので、静置ステップＳ３１１の間に、培養容器内に播種された細胞群に含まれている細胞のうち、接着性の高い脂肪組織由来幹細胞が培養容器の底面に接着し、それ以外のより接着性の低い細胞は培養容器の底面に接着できずに、洗浄ステップＳ３１２において上清とともに除去される。このようにして、純度よく分離された脂肪組織由来幹細胞が初代培養ステップＳ３１の培養ステップＳ３１３において、ほぼコンフルエントになるまで増殖させられる。
【００１９】
そして、継代培養ステップにおいては、ビタミンＣおよびｂＦＧＦ等を添加して培養が行われることにより、ビタミンＣおよびｂＦＧＦの作用によって、効率的に増殖させることができる。
【００２０】
次に、本実施形態に係る脂肪組織由来幹細胞の培養方法の一実施例について説明する。
ヒト脂肪組織を、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ活性を有する酵素で消化し、遠心操作により細胞群を分離した。分離された細胞群を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含む培地内に混合して細胞懸濁液を生成し、５×１０４個／ｃｍ２の密度で浮遊細胞用のノントリートの培養容器に播種した。
【００２１】
播種後２０時間程度に上清を除去し、洗浄した。これにより、培養容器に接着できずに浮遊していた細胞を完全に洗い流した。そして、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含む培地内を付与し、７０％コンフルエントになるまで初代培養した。
【００２２】
その後、トリプシンで細胞を剥離して回収し、５×１０３〜１×１０４個／ｃｍ２の密度で、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、１０％ＦＢＳ、抗生物質、アスコルビン酸およびｂＦＧＦを含む培地内に懸濁し、接着細胞用の培養容器に播種して培養した。
このようにして培養した結果、４つのケースについて得られた細胞群をフローサイトメトリ法で解析した結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
この表において、ＣＤは細胞の特性を示すマーカであり、符号Ａ，Ｂは特性の異なる細胞群を示している。
全てのケースにおいて、細胞群Ａは、マーカがＣＤ３４陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１０４ｂ陽性、ＣＤ５４陽性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ３１陰性、ＣＤ１０６陰性であり、この場合には細胞群が脂肪組織由来幹細胞であることが示されている。一方、異なるマーカを示す細胞群Ｂは脂肪組織由来幹細胞以外の細胞であることが示されている。そして、これらの細胞群Ａ，Ｂの構成比率を比較すると、表２に示す通りであった。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
表２においては、本実施例により培養された細胞群Ａ，Ｂの構成比率と、培養条件を異ならせた場合の細胞群Ａ，Ｂの構成比率とを比較して示している。
この表２によれば、初代培養ステップＳ３１において、浮遊細胞用の培養容器に代えて接着細胞用の培養容器を使用した場合、継代培養ステップＳ３３において、ビタミンＣおよびｂＦＧＦを添加しなかった場合、および、静置ステップＳ３１１において、播種後２０時間経過後に最初の洗浄ステップＳ３１２を行った場合のいずれにおいても、本実施例の培養方法による構成比率と比較して細胞群Ａの構成比率が小さくなっている。
このことから、本実施例に係る培養方法によれば、脂肪組織由来幹細胞を効率的に増殖させることができることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の一実施形態に係る脂肪組織由来幹細胞の培養方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の培養方法の細胞培養ステップを示すフローチャートである。
【図３】図２の細胞培養ステップの初代培養ステップを示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００２８】
Ｓ１  抽出ステップ
Ｓ２  播種ステップ
Ｓ３  培養ステップ
Ｓ３１２  洗浄ステップ（培地交換）
Ｓ３２  回収ステップ（継代ステップ）
Ｓ３３  継代培養ステップ（継代ステップ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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