(57)【要約】【課題】  薬理活性を示す物質であっても、難水性の材料は生体内への投与が実質的に困難であり、薬剤原料の選択の幅が狭くなっていた。これらの薬剤を運搬する運搬体として、ウィルス型運搬体は、細胞内への運搬能力はあっても、毒性の除去に不安が残る。また、人工的に合成された物は体内で、吸収されたり、逆に体外に排出されずに残留してしまうといった課題があった。【解決手段】  生体産生物であるリポカリンファミリーは、樽型構造の内側が疎水基になっており、疎水性物質を取り込んで運搬できる。そこで、このリポカリンファミリーに難水性薬物を結合させ、ＤＤＳシステムの薬物運搬体とする。また、物質の溶解度を向上させることができるため、溶解補助剤としても利用できる。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
８本のベータストランドからなるバレル構造と、
少なくとも１箇所のオメガループと、
少なくとも１本のαヘリックスと、
を有するタンパク質からなる薬剤運搬体。
【請求項２】
薬剤を前記薬剤運搬体と結合させた医薬品。
【請求項３】
前記薬剤運搬体は、リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素である請求項２記載の医薬品。
【請求項４】
分子量が１５０から７００である化合物の極性溶剤に対する溶解度を向上させる溶解補助剤。
【請求項５】
前記化合物は人工合成物である請求項４記載の溶解補助剤。
【請求項６】
前記溶解補助剤は、リポカリンファミリーから選ばれた少なくとも１つのタンパク質である請求項４乃至５のいずれかの請求項に記載された溶解補助剤。
【請求項７】
前記溶解補助剤は、リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素である請求項４乃至６のいずれかの請求項に記載された溶解補助剤。
【請求項８】
極性溶剤と、
分子量が１５０から７００である化合物と、
前記化合物に対する溶解補助剤とを含む組成物。
【請求項９】
前記極性物質は水である請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
前記化合物は人工合成物である請求項８乃至９のいずれかの請求項に記載された組成物。
【請求項１１】
前記溶解補助剤は、リポカリンファミリーから選ばれた少なくとも１つのタンパク質である請求項８乃至１０のいずれかの請求項に記載された組成物。
【請求項１２】
前記溶解補助剤は、リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素である請求項８乃至１１のいずれかの請求項に記載された組成物。
【請求項１３】
前記化合物は、ジアゼパムである請求項８乃至１２のいずれかの請求項に記載された組成物。
【請求項１４】
前記化合物は、ＮＢＱＸである請求項８乃至１２のいずれかの請求項に記載された組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は体内産生物を基本にした薬剤運搬体とそれを用いた医薬品に関する。
また、本発明は化合物を水に溶解させる際の溶解度を向上させる溶解補助剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＤＳ（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）において、薬物運搬体の開発はキーとなる技術である。これまで多くの薬物運搬体が研究されてきた。薬物運搬体に期待される性能の１つに、難水溶性薬物の運搬がある。薬物は、効能があっても難水溶性では、体内に注入するのが難しい。また改質によって水溶性にすると効能が落ちるものが多い。このような難水溶性の薬物を薬物運搬体によって体内を運搬することができれば、利用できる薬物は非常に多くなる。
【０００３】
このような薬物運搬体としては、親水性特性を有する外側層と疎水性特性を有する内側の被包によって中に難水溶性薬物を入れる構成を持つものが考えられている（特許文献１）。
【０００４】
これまで研究されてきた薬物運搬体としては、リポソーム、微粒子、ナノ関連物質および薬物・ポリマー結合体などがある。中でもポリマーミセルは、難水溶性薬物の伝達に有利な運搬体として注目されてきた。例えば、親水性シェルに囲まれた疎水性コアからなるミセル形成組成物であって、親水性シェルがＰＶＰ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）からなるもの（特許文献２）がある。
【０００５】
ところで、体内成分はすべて水溶性というわけではなく、例えばビタミンＡ、Ｄ、Ｋ、Ｅなどは難水溶性である。にもかかわらず、体内で循環できているのは、これらを運搬するリポカリンファミリーというタンパク質があるからである。
【０００６】
例えばリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）は、さまざまな組織で活発に産生され、多くの生理的現象に関与している。従って、その利用の提案も多く、Ｌ−ＰＧＤＳを測定することで痴呆性疾患を鑑別したり（特許文献３）、腎疾患の病態管理に利用したり（特許文献４）、破水の検出（特許文献５）に利用したりする発明がある。
【０００７】
しかし、これらはＬ−ＰＧＤＳの酵素としての特性を利用しているものである。なお、Ｌ−ＰＧＤＳの構造は最近になって公開された（特許文献６）。
【特許文献１】特表平１０−５０２３７６号公報
【特許文献２】特表２００４−５０１１８０号公報
【特許文献３】特開２０００−２２１２４８号公報
【特許文献４】特開２０００−２４６９８０号公報
【特許文献５】特開２０００−２２９８３号公報
【特許文献６】特開２００４−１９４５８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ウィルス型のような薬物運搬体は、細胞内への運搬能力はあっても、毒性の除去に不安が残る。従って、薬物運搬体は上記のように、人工的に合成されたものが多い。しかし、人工的に合成された物は体内で、吸収されたり、逆に体外に排出されずに残留してしまうといった課題があった。また、化合物、特に難水溶性と言われる薬剤は、水に溶けないために、利用を制限されるといった課題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明は上記のような課題に鑑みてなされたものであり、体内産生物質であるリポカリンファミリーを薬物運搬体として利用するものである。
また、本願発明は、リポカリンファミリーから選ばれたタンパク質を、化合物、特に難水溶性の薬剤を極性溶剤（特に水）に溶解できるようにする溶解補助剤として用いる用途も提供するものである。また、本願発明は、このような溶解補助剤と化合物と、極性溶媒を含む組成物も提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
リポカリンファミリーはそもそも体内産生物質であるので、安全性に心配はない。また、特にＬ−ＰＧＤＳは、薬物の構造に関わらず、一定長のポリペプチドを包み込んで、体内を運搬する。従って、安全で効果の高い薬物運搬体及びそれを付加した薬品を提供することができる。
【００１１】
また、リポカリンファミリーに属するタンパク質は、一定の分子量までの化合物をポケット状の部分に取り込み水に溶かすことができるので、水に溶けにくいために使用が制限されている薬剤を水に溶かすことができる。
【００１２】
また、従来疫病に対して開発される薬剤に関しては、体内に摂取させるために、水溶性を付与させなければならず、薬効を多少犠牲にする場合もあったが、本発明の溶解補助剤を用いることで、薬効と水溶性をトレードオフする必要がなくなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
リポカリンファミリー
脂溶性低分子輸送たんぱく質群として知られているリポカリンファミリーに属するリポカリン蛋白質は、アミノ酸残基が１６０〜２００個からなり、分子量が約２万程度の蛋白質である。また、アミノ酸配列の相同性が、２０％程度であるにもかかわらず、その構造上の類似性は非常に高いことが知られている。
【００１４】
図１には、リポカリンファミリーの一部を示す。（ａ）レチノール結合蛋白質、（ｂ）主要尿蛋白質、（ｃ）ビリン結合蛋白質、（ｄ）β−ラクトグロブリン、（ｅ）ロブスタークラストシアニン、（ｆ）臭物質結合蛋白質などがリポカリンファミリーのメンバーである。
【００１５】
これら、リポカリン蛋白質の折りたたみ構造は、連続的に水素結合した８本の逆平行のβストランドからなり、疎水性低分子（リガンド）結合部を囲むようなバレル（樽）型になっている。８本のβストランドをつなぐ７箇所のループは、６箇所が短いヘヤピンで、１箇所がオメガループであり、このオメガループがリガンド結合部の蓋の役割をすると考えられている。また、１つのαヘリックスを有する。すなわち、８本のβストランドと１本のオメガループと、１つのαヘリックスを有する点がこれらリポカリンファミリーの構造上の類似点である。本発明においては、リポカリンファミリーとは、８本のβストランドと１本のオメガループと、１つのαヘリックスを有し、アミノ酸残基が約１６０〜２００個のタンパク質を含む。図１ではそれぞれのメンバーのαヘリックスおよびオメガループを符号９と符号１０で示した。
【００１６】
この構造では、バレル構造の中は疎水性であり、バレル構造の外側は親水性となっている。従って、バレルの中に疎水性リガンドを取り込み、輸送することができる。なお、ここでリガンドとは、分子量が数百程度以下の低分子物質の意味である。
【００１７】
図２には、これらの蛋白質のアミノ酸配列を示す。それぞれの蛋白質のアミノ酸配列の相同性は低いが、８９番目と１８６番目にシステイン残基があり、この間でジスルフィド結合が形成される。これもリポカリンファミリーに共通する特徴の１つである。
【００１８】
本発明は、これらリポカリンファミリーに属する蛋白質を、ＤＤＳの薬物運搬体として利用するものである。また、物質に対する溶解補助剤として利用するものである。
【００１９】
図３には、最近公表されたリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）の結晶構造の模式図を示す。Ｌ−ＰＧＤＳは、シクロオキシゲナーゼの働きによりアラキドン酸から合成されたＰＧＨ２を基質として、ＰＧＤ２を合成する酵素である。ＰＧＤ２は、中枢神経系において、睡眠誘発、体温低下、黄体ホルモン分泌の抑制、痛みや匂いの応答調節などの作用を示し、末梢神経では、肥満細胞からアレルギーのメディエーターとして放出され、血管拡張、気管支収縮、血小板凝集阻害などの作用を示す物質である。
【００２０】
一方、Ｌ−ＰＧＤＳは、リポカリンファミリーにも属しており、図１で示したリポカリンファミリー同様、８本のβストランドと１つのαヘリックスと１本のオメガループを有する。図３には、バレル構造部分に１から８までの番号を付し、またαヘリックスとオメガループをそれぞれ符号９と１０で示した。また、図２にはＬ−ＰＧＤＳのアミノ酸配列も示したが他のリポカリンファミリー同様、８９番目と１８６番目にシステイン残基があり、この間でジスルフィド結合が形成される事を示す。以下では、このＬ−ＰＧＤＳをＤＤＳの薬物運搬体や、溶解補助剤として利用した例について説明する。
【実施例】
【００２１】
（実施例１）
＜組み替え体Ｌ−ＰＧＤＳの作製＞
Ｌ−ＰＧＤＳは生体内で産生される酵素であるので、薬物運搬体として利用する場合は、人工的に合成し、場合によっては人工的に作り変える必要もある。そこで、まず生体が産生するＬ−ＰＧＤＳを組み換え体で作製した。
【００２２】
１．Ｌ−ＰＧＤＳをコードするｃＤＮＡのクローニング
マウス全脳より標準的方法によりＲＮＡを抽出し、これを鋳型として逆転写によりｃＤＮＡを合成した。本ｃＤＮＡを、マウス由来のＬ−ＰＧＤＳの塩基配列（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪＴＭ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｄ８３３２９）に基いて設計したプライマーを用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。プライマーは表１に配列番号１および２として示す。
【００２３】
ＰＣＲは、９４℃にて９０秒熱変成させた後、９４℃にて３０秒、アリーニング５５℃にて３０秒、および７３℃にて１分の反応サイクルを計３０回サイクル行い、その後７２℃にて７分間の伸長反応を行った。
【００２４】
増幅ｃＤＮＡは、クローニングベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｐｉｔ（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ）中のＳｒｆ  Ｉサイトにライゲーションし、反応液の一部を大腸菌に形質転換し、クローンを得た。得られたクローンは、ジデオキシ法（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｙ５  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及びＬｏｎｇ−Ｒｅａｄ  Ｔｏｗｅｒ  ＤＮＡシーケンサー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をマニュアルに従って用いて決定した）での配列決定より、本ｃＤＮＡがＭｏｕｓｅ  Ｌ−ＰＧＤＳタンパク質をコードしていることが確認できた（配列番号３）。表１に配列番号３として示す。本ベクターを「Ｌ−ＰＧＤＳ／ｐＣＲ−ｓｃｒｉｐｔ」と命名した。
【表１】
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【００２５】
２．インサートの調製
Ｌ−ＰＧＤＳ発現用のインサートを調整するために、上記Ｌ−ＰＧＤＳ／ｐＣＲ−ｓｃｒｉｐｔを制限酵素処理しフラグメントを得た。簡潔には、Ｌ−ＰＧＤ／ｐＣＲ−ｓｃｒｉｐｔ  １０μgに１０ＵのＢａｍ  ＨＩ（Ｔａｋａｒａ）、１０ＵのＥｃｏ  ＲＩ（Ｔａｋａｒａ）、１０×Ｋ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ）を加えて２０μlの反応液を調製し、３７℃にて一時間反応させた。次いでこの反応液を２．０％核酸電気泳動用アガロースゲル（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）中で電気泳動し、付加した制限酵素部位も含めほぼ５００ｂｐであること確認し、ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてマニュアルに従い、ゲルより発現用のインサートを回収しこれをポリペプチド発現用のインサートとした。
【００２６】
３．ベクターの調製
発現ベクターとしてｐＧＥＸ−２Ｔを用いた。ｐＧＥＸ−２Ｔベクター中のＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｔａｓｅ（ＧＳＴ）遺伝子の下流に上記ｃＤＮＡを挿入するために、ベクターｐＧＥＸ−２Ｔを制限酵素処理した。簡潔には、ｐＧＥＸ−２Ｔベクター１０μｇに１０ＵのＢａｍ  ＨＩ（Ｔａｋａｒａ）、１０ＵのＥｃｏ  ＲＩ（Ｔａｋａｒａ）、１０×Ｋ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ）を加えて２０μｌの反応液を調製し、３７℃にて一時間反応させた。
【００２７】
次いでこの反応液を、１．０％核酸電気泳動用アガロースゲル（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）中で電気泳動し、５０００ｂｐであること確認し、ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてマニュアルに従い、ゲルより発現用のインサートを回収し、これをポリペプチド発現用のベクターとした。回収したベクターは、上記の各インサートとのライゲーションに使用した。
【００２８】
４．ライゲーション及び形質転換
ライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ−Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてマニュアルに従い、上記のインサート５００ｎｇとベクター５０ｎｇとのライゲーションを行った。
【００２９】
ライゲーション後、反応液の一部を大腸菌に形質転換しクローンを得た。得られたクローンは、制限酵素処理しポリペプチド発現用のインサートを持つ発現ベクターを得た。簡潔には、得られたクローン１μｇを１ＵのＢａｍ  ＨＩ（Ｔａｋａｒａ）、１ＵのＥｃｏ  ＲＩ（Ｔａｋａｒａ）、１０×Ｋ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ）を加えて２０μｌの反応液を調製し、３７℃にて一時間反応させた。次いでこの反応液を２．０％核酸電気泳動用アガロースゲル（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）中で電気泳動し、インサートが約５００ｂｐでベクターが約５０００ｂｐあること確認した。
【００３０】
次いで、インサートが挿入されたベクターで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。その後、ＬＢ寒天培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有）にて３７℃で一晩培養することにより、形質転換クローンを選択した。これらのクローン（以下、「Ｌ−ＰＧＤＳ／ｐＧＥＸ」をグリセロールストックとして−８０℃で保存した。
【００３１】
Ｌ−ＰＧＤＳ／ｐＧＥＸをＬＢ液体培地（アンピシリン含有）５ｍｌ中で３７℃にて一晩振盪培養した。Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を最終濃度が０．６ｍＭになるように加えてインサートＤＮＡ由来タンパク質の発現を誘導し、さらに６時間培養を続けた。ポリペプチドは、ＧＳＴタグとの融合タンパク質として発現される。
【００３２】
培養液を４℃にて８，０００×ｇで１０分間遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を０．５ｍＭのＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  Ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＷＡＫＯ）を添加した１０倍量のＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭリン酸水素ニナトリウム、１．８ｍＭリン酸水素ニカリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ７．５)中で超音波処理（ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ  ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＭＹ  ＳＥＩＫＯ）により破砕した。破砕物を４℃にて１０，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清をタンパク質抽出画分として回収した。
【００３３】
５．ポリペプチドの精製
ＧＳＴタグ融合ポリペプチドを、タンパク質抽出画分より、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて以下のように精製した。マニュアルに従ってＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅゲルにＧＳＴタグ融合ポリペプチドを吸着させた。続いてＬ−ＰＧＤＳを溶出させるために、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅゲル（１ｍｌ）に吸着させたＧＳＴ−Ｌ−ＰＧＤＳに対し、１００単位のＴｈｒｏｍｂｉｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＳＩＧＭＡ）を加え、室温にて１６時間反応させた。
【００３４】
翌日これに、ＰＢＳ（−）を加え、Ｌ−ＰＧＤＳとＴｈｒｏｍｂｉｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅを溶出させた。溶出したＬ−ＰＧＤＳは、濃縮フィルター（ａｐｏｌｌｏ）を用いて濃縮後、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｃｌ、ｐＨ８．０でゲルろ過（ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５，  ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）後、Ｌ−ＰＧＤＳ画分を回収し、１ｍｇ／ｍｌの濃度で−２０℃にて凍結保温した。回収したＬ−ＰＧＤＳをｒＬ−ＰＧＤＳと呼ぶ。なお、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）は、リン酸緩衝生理食塩水である。
【００３５】
＜ジアゼパムの実験＞
Ｌ−ＰＧＤＳが薬物を生体内で運搬し、運んだ薬物が効果を示すという点を確認するために、ジアゼパム複合体のペントバルビタール麻酔時間延長作用を調べた。抗不安薬ジアゼパムは疎水性化合物で、水系溶媒には極めて溶けにくく、動物へ適用する際にはセルロース溶媒などに懸濁させて使用されている。
【００３６】
ジアゼパムの薬理活性を検出できる指標として、ペントバルビタール麻酔時間延長作用がある。ジアゼパムが利いていると、麻酔時間が長くなるので、Ｌ−ＰＧＤＳを用いた場合と用いない場合で、麻酔時間の長短を調べることで、薬理活性の有無を判断するものである。
【００３７】
具体的には、水系溶媒中に可溶化したジアゼパムとＬ−ＰＧＤＳジアゼパム複合体溶液をマウスの脳室内に投与し、ペントバルビタール麻酔時間に及ぼす影響について調べた。
【００３８】
＜薬液の調製＞
水系溶媒（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ８．０）にジアゼパム（３ｍｇ／ｍＬ）を充分に懸濁し、０．２μｍフィルターに通して不溶性粒子を除去したものをジアゼパム溶液とした。また、ｒＬ−ＰＧＤＳ（０．５，２および５ｍｇ／ｍＬ）存在下で同様に調製したものをｒＬ−ＰＧＤＳ−ジアゼパム複合体溶液とした。また、ｒＬ−ＰＧＤＳを２ｍｇ／ｍＬ溶かした溶液をＬ−ＰＧＤＳ溶液とした。
【００３９】
＜薬液の脳室内投与とペントバルビタール麻酔作用の測定＞
実施例にはｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）を使用した。軽エーテル麻酔下に頭皮を切開し、頭蓋部ブレグマより右方１ｍｍの箇所からマイクロシリンジ付き二段針（３ｍｍ）を挿入することで脳室内投与(５μＬ/マウス）を行った。各投与群は以下の様に設定した。なお、ジアゼパムが実際に溶解した量を、ｒＬ-ＰＧＤＳの量とジアゼパムの量をこの順で併記する。
（１）溶媒投与群（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ８．０）
（２）ｒＬ−ＰＧＤＳ（２ｍｇ／ｍＬ）のみ
（３）ジアゼパム溶液投与群（２．６ｍｇ／ｍＬ）
（４）ｒＬ−ＰＧＤＳ−ジアゼパム複合体溶液投与群（０．５ｍｇ／ｍＬ：３．５ｍｇ／ｍＬ）
（５）ｒＬ−ＰＧＤＳ−ジアゼパム複合体溶液投与群（２ｍｇ／ｍＬ：８．０ｍｇ／ｍＬ）
（６）ｒＬ−ＰＧＤＳ−ジアゼパム複合体溶液投与群（５ｍｇ／ｍＬ：１３．６ｍｇ／ｍＬ）
【００４０】
脳室内投与１０分後にペントバルビタール（３５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、マウスを仰臥位に保定することでその正向反射を観察した。正向反射が消失した時間を麻酔導入開始時間として記録した。麻酔導入後も正向反射を随時観察し、反射が完全に回復した時点を覚醒時間として記録した。麻酔時間は覚醒時間から麻酔導入開始時間を除算して求め、溶媒投与群の平均値を１００％として平均値±標準誤差で表した。
【００４１】
＜結果＞
図４に結果を示す。縦軸は相対的な麻酔時間であり上記（１）の溶剤投与群を１００％として表示している。横軸には、上記の（１）から（６）の投与群を記載した。
【００４２】
（１）溶媒投与群（図では「対照」と記載した）と（３）ジアゼパム溶液投与群（図では「ＤＺＰ／ＰＢＳ」と記載した）とのペントバルビタール麻酔時間に差は認められなかったことから、本試験で調製したジアゼパム溶液は麻酔延長作用を示す有効濃度に到達していないと考えられた。
【００４３】
一方で、上記（４）から（６）のｒＬ−ＰＧＤＳ−ジアゼパム複合体溶液投与群（図ではカッコ付の番号と「Ｃｏｍｐｌｅｘ」およびジアゼパムとｒＬ−ＰＧＤＳの濃度を記載した）はｒＬ−ＰＧＤＳ−ジアゼパム複合体溶液の濃度依存的にペントバルビタール麻酔時間の延長作用が認められ、ｒＬ−ＰＧＤＳ−ジアゼパム複合体溶液濃度が４００μＭ以上では有意な作用を示した。図４では、「＊」印をつけて示した（５）および（６）は、有意水準０．０５での判断である。
【００４４】
また、（４）から（６）を見ると、ｒＬ−ＰＧＤＳの濃度が上昇するに従ってジアゼパムの濃度も上昇してゆくのがわかる。
【００４５】
この結果は、ｒＬ−ＰＧＤＳ−ジアゼパム複合体溶液ではジアゼパムの溶解性が高まり、有効濃度に到達したと考えられる。以上の結果から、Ｌ-ＰＧＤＳは難水溶性化合物の溶解性を改善すること、また、その複合体はｉｎ  ｖｉｖｏで薬剤の持つ作用を発揮しうることが示された。
【００４６】
（実施例２）
雌雄砂ネズミ（体重７０〜８０ｇ）を軽エーテル麻酔後、１−２％フローセンにて維持麻酔を行った。砂ネズミを背位に固定し、正中頚部を切開して、両側総頚動脈および右側総頚静脈を丁寧に剥離した。右側総頚静脈には、ヘパリン生食液を満たしたＰＥ１０カテーテルを留置した。
【００４７】
前脳虚血は、両側総頚動脈をクリッピングすることで行った。虚血開始５分後にクリップを外し、前脳への血流を再開させた。再還流直後に、カテーテルより溶媒および検体（ＮＢＱＸ（２，３−Ｄｉｏｘｏ−６−ｎｉｔｒｏ−１，２，３，４− ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｆ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ−７−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）／ｒＬ−ＰＧＤＳ複合体）を単回静脈内投与し、直ちにインフュージョンポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｍｏｄｅｌ  １１）と連結して持続的静脈内投与（流速０．２ｍＬ／ｈ）を開始した。持続的静脈内投与は２時間行った。
【００４８】
投与終了後、カテーテル先端を縛ることで血液と検体の逆流を防ぎ、カテーテルを皮下に埋没させ、縫合を行った。なお、麻酔や外科手術に起因する非特異的な体温低下を防ぐため、全ての過程を白熱灯下の元で実施し、直腸温を３６〜３８℃に維持した。
【００４９】
前脳虚血手術の１週間後に、ペントバルビタール深麻酔下で経心的にホルマリン還流固定を行い、全脳を摘出後、海馬を含む冠状脳切片（２ｍｍ）を作製した。海馬ＣＡ１錐体神経細胞数は、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色により評価した。
【００５０】
図５乃至図８に海馬の染色写真を示す。図５乃至図６で、矢印は海馬のＣＡ１錐体神経細胞の部分である。上記の実験のように砂ネズミは前脳虚血状態にされているので、ＣＡ１錐体神経細胞はダメージを受けている。ＮＢＱＸはこの前脳虚血を回復させる薬として知られている。しかし、溶解しにくく、薬効が現れるほどの量を付与することが難しい薬としても知られている。
【００５１】
図５（ａ）は前脳虚血にしていない通常のＣＡ１錐体神経細胞を示す。ＣＡ１錐体神経細胞は染色され、濃い曲線のように確認できた。図５（ｂ）は前脳虚血された状態にＰＢＳだけを投与した場合を示す。ＣＡ１錐体神経細胞はダメージを受けたままであり、図５（ａ）の場合と比較して薄い曲線のように観察された。図５（ｃ）はｒＬ−ＰＧＤＳだけを与えた場合の結果である。図５（ｂ）の場合とあまり変わらなかったのがわかる。なお、図５および図６を通じて写真右下の太黒線は２００μｍである。
【００５２】
図６では比較を容易にするために（ａ）に図５（ａ）と同じ写真を掲載する。図６（ｄ）は、ＮＢＱＸを与えた場合の結果である。ＮＢＱＸは溶媒（ＰＢＳ）に溶解できるだけ溶解させて投与した。ＮＢＱＸは前脳虚血を回復させる薬効があるが、図５（ｂ）や（ｃ）の場合とほとんど変わらず、ほとんどＣＡ１錐体神経細胞の回復は見られなかった。
【００５３】
図６（ｅ）はＮＢＱＸとｒＬ−ＰＧＤＳを合わせて溶解させたものを投与した結果である。ＣＡ１錐体神経細胞は、前脳虚血をしていない図６（ａ）の場合と同じ程度に回復していたのがわかった。
【００５４】
図７は、倍率を高め撮影した結果を表す。この倍率であると、ＰＢＳのみ、ｒＬ−ＰＧＤＳのみ、ＮＢＱＸのみを示す図７の（ｂ）、（ｃ）、および図８（ｄ）は、ＣＡ１錐体神経細胞がダメージを受けたままで、図８（ｅ）で示すＮＢＱＸとｒＬ−ＰＧＤＳの混合物の場合は、ＣＡ１錐体神経細胞がほぼすべて生存していたのがわかった。なお、図７及び８を通じて太黒線は５０μｍを表す。
【００５５】
図９は、図８で撮影された細胞数をカウントした結果を示す。縦軸は平方ｍｍあたりの細胞数を示し、横軸はサンプルを示す。棒グラフ中に示した（ａ）乃至（ｅ）は、図５乃至図８で示した（ａ）乃至（ｅ）に相当する。符合（ａ）で示した前脳虚血を起こさなかった場合は、約３３００個／ｍｍ２あった細胞は、前脳虚血を生じたために（ｂ）乃至（ｄ）で示すように５００個／ｍｍ２以下に消滅してしまっていた。これは、ＰＢＳやｒＬ−ＰＧＤＳ、ＮＢＱＸだけでは前脳虚血はほとんど回復しないことを示す。しかし、ＮＢＱＸをｒＬ−ＰＧＤＳにまぜた混合物（ｅ）（図９では「ｃｏｍｐｌｅｘ」と記した）では、約８０％以上回復していた。
【００５６】
この時の溶液中のＮＢＱＸの濃度を調べると、ＮＢＱＸだけの場合は０．９ｍＭであるのに対して、ｒＬ−ＰＧＤＳを混合すると４．６ｍＭと約５．１倍も溶解度が向上していた。
【００５７】
このことから、ｒＬ−ＰＧＤＳはＮＢＱＸの溶解度を向上させることができ、またｒＬ−ＰＧＤＳと混ぜられたＮＢＱＸは、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ−ｂａｒｒｉｅｒ）を乗り越えて脳内に入り、海馬のＣＡ１領域で薬効を発揮したと結論できた。
【００５８】
またＮＢＱＸの分子量は３３６であり、ｒＬ−ＰＧＤＳは数万であるので、およそ５００程度以上の分子量の物質をブロックするといわれる血液脳関門をｒＬ−ＰＧＤＳが通過したとは考えにくい。従って、ｒＬ−ＰＧＤＳと結合して多量に解けたＮＢＱＸは、血液脳関門でｒＬ−ＰＧＤＳから分離し、脳内に入ったと考えられる。
【００５９】
このようにｒＬ−ＰＧＤＳは、物質の溶解度を向上させるだけでなく、体内で分離し物質だけを放出することもできる。すなわち、ＤＤＳとしても利用することができる。
【００６０】
（実施例３）
ｒＬ−ＰＧＤＳが物質の溶解度を向上させることを確認するために、いくつかの物質で溶解度がどのように変化するかを確認した。
【００６１】
調べた物質は、ゲニステイン、ジアゼパム、レチノイン酸、ＮＢＱＸ、ビリルビンである。特にジアゼパムとＮＢＱＸは人工的に合成された物質である。それぞれの物質がＰＢＳに対して単独で溶解させた時の濃度と、ｒＬ−ＰＧＤＳと一緒に溶解させた時の濃度を調べた。ｒＬ−ＰＧＤＳの量を増やせば溶解する量は増えるので、ここでは、ｒＬ−ＰＧＤＳを４２５μＭ一定とした。検体の分子量と結果を表２に示す。
【００６２】
検体であるゲニステイン、ジアゼパム、レチノイン酸、ＮＢＱＸ、ビリルビンは、ＰＢＳに対しては、５８、１５０、２２、７４０、０．２８μＭしか溶解しない。しかし、ｒＬ−ＰＧＤＳと一緒にすると１．２、１．１、０．２４、１．７、０．０３ｍＭと非常に多量に溶解した。これをより分かりやすくするために、ＰＢＳだけのときの濃度とｒＬ−ＰＧＤＳ存在下での濃度の比を取った。結果はそれぞれの検体に対して、２１、７．３、１１、２．３、１１０倍となりそれぞれの検体の溶解度が向上したのが分かる。
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は、体内に薬物を供給するＤＤＳへ利用できる。また、薬物を含むリガンドと一緒に水などの極性溶媒中に混入させることで、リガンドの溶解度を向上させる溶解補助剤として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】リポカリンファミリーの構造を示す図である。
【図２】リポカリンファミリーのアミノ酸配列の特徴を示す図である。
【図３】リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の構造を示す図である。
【図４】ｒＬ−ＰＧＤＳジアゼパム複合体のペントバルビタール麻酔時間延長効果を確認する実験結果を示す図である。
【図５】海馬のＣＡ１領域を染色した写真を示す図である。
【図６】海馬のＣＡ１領域を染色した写真を示す図である。
【図７】海馬のＣＡ１領域を染色した写真を示す図である。
【図８】海馬のＣＡ１領域を染色した写真を示す図である。
【図９】サンプル毎の海馬のＣＡ１領域で染色された細胞数を示すグラフである。
【符号の説明】
【００６５】
１乃至８  βストランド
９  αヘリックス
１０  オメガループ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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