(57)【要約】【課題】優れた抗菌活性を有する醗酵生産物の提供、殊に、尋常性ざ瘡治療剤並びに歯周病治療剤として有用な化合物の提供。【解決手段】本発明者らは、様々な微生物から得られる生理活性物質について鋭意探索した結果、ストレプトミセス属に属する放線菌より、プロピオニバクテリウム属菌種や歯周病起炎菌種に優れた抗菌活性を有する新規な環状化合物を単離することに成功し、更にこれらの化合物は抗炎症作用をも有することを見出した。本発明化合物を有効成分として含有する医薬組成物は、抗菌剤並びに抗炎症剤、殊に、尋常性ざ瘡の予防若しくは治療剤、並びに歯周病予防若しくは治療剤として有用である。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で示される環状化合物又はその塩。
【化１】
2008007455.tif 000010
（式中、X、Y、及びR1乃至R4は下表の組合せを有する。）
【表１】
2008007455.tif 000011
【請求項２】
請求項１記載の環状化合物又はその塩を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項３】
抗菌剤である請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
抗炎症剤である請求項２記載の医薬組成物。
【請求項５】
尋常性ざ瘡の予防若しくは治療剤である請求項３記載の医薬組成物。
【請求項６】
歯周病予防若しくは治療剤である請求項３記載の医薬組成物。
【請求項７】
ストレプトミセス(Streptomyces)属に属し、請求項１記載の化合物を生産する能力を有する微生物を培養し、その培養物から請求項１記載の化合物を単離することを特徴とする、請求項１記載の化合物の製造法。
【請求項８】
ストレプトミセス属に属する微生物がストレプトミセス  エスピー  (Streptomyces sp.) Q47152株である請求項７記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬、特に抗菌剤として有用な新規発酵生産物に関する。
【背景技術】
【０００２】
尋常性ざ瘡（にきび）は、主に思春期前後から発症する脂腺性毛包の慢性炎症性疾患である。尋常性ざ瘡は、アンドロゲンの分泌増加、皮脂分泌の亢進、毛包漏斗部の角化異常に起因する毛孔の狭窄による面皰形成、さらにはプロピオニバクテリウム属の菌種、特にプロピオニバクテリウム  アクネス(Propionibacterium acnes)などの毛包内細菌により産生されるリパーゼ等の菌体外酵素や好中球遊走因子などの炎症性物質が関与して発症する。発症後は、面皰、膿皰を形成、色素沈着や小瘢痕を残し消退する。この治療には、毛孔を塞いでいる角質の除去とともに、ピー・アクネス(P. acnes)の増殖を抑制するためにイオウ、サリチル酸、レゾルシンやマクロライド系抗生物質などの各種抗菌剤が使用されている。しかしながら、汎用されるマクロライド系抗生物質等に対する耐性菌の出現もあり、今なお、有効な治療薬の開発が切望されている。
また、歯周病は、歯周ポケット内の歯周病原菌が引き起こす慢性炎症（歯肉炎・歯周炎）とそれによってもたらされる歯槽骨吸収を主たる病態とする疾患である。この病因となる歯周病原菌は一般的にグラム陰性嫌気性菌群であり、代表的なものとして成人性歯周病の起炎菌であるポルフィロモナス ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)やプリボレラ  インターメディア(Prevotella intermedia)がある。これらの菌は歯周ポケット内でバイオフィルムを形成しながら増殖し、その外膜上のリポポリサッカライドや分泌するタンパク質分解酵素などの起炎性物質が関与して歯肉炎・歯周炎を発症させる。この治療は現行では歯石除去やスケーリング・ルートプレーニングと呼ばれる器具での歯周ポケットの清掃が中心であり、それでも改善が見られない患者に対してミノサイクリン製剤を歯周ポケット内に注入する治療がなされている（日歯周誌  第30巻1号 p206-222）。しかしながらミノサイクリン製剤は抗菌スペクトラムの広い抗生物質であり口腔内常在菌に対する影響や耐性・菌交代が懸念されることから、更に有効な治療薬の開発が現在でも切望されている。
現在まで、抗炎症作用を有する環状の発酵生産物の報告がある（例えば、特許文献１並びに２、及び非特許文献１）。しかしながら、プロピオニバクテリウム属、或いは歯周病起因菌に対して優れた活性を有する化合物の報告はない。
【特許文献１】特開2005-200324
【特許文献２】WO95/22339
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, p11273-11276
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
優れた抗菌活性を有する醗酵生産物の提供、殊に、尋常性ざ瘡治療剤並びに歯周病治療剤として有用な化合物の提供が切望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、様々な微生物から得られる生理活性物質について鋭意探索した結果、ストレプトミセス属に属する放線菌より、プロピオニバクテリウム属菌種や歯周病起炎菌種に優れた抗菌活性を有する新規な環状化合物を単離することに成功し、更にこれらの化合物は抗炎症作用をも有することを見出し本発明を完成した。
即ち、本発明は下記式(I)で示される環状化合物又はその塩に関する。また、該化合物を有効成分として含有する医薬組成物、殊に抗菌剤、抗炎症剤、尋常性ざ瘡の予防若しくは治療剤、並びに歯周病予防若しくは治療剤に関する。更に、本発明は、ストレプトミセス  エスピー  (Streptomyces sp.) Q47152株等のストレプトミセス(Streptomyces)属に属し、式(I)で示される本発明化合物を生産する能力を有する微生物を培養し、その培養物から本発明化合物を単離することを特徴とする、本発明化合物の製造法にも関する。
【化２】
2008007455.tif 000002
（式中、X、Y、及びR1乃至R4は下表の組合せを有する。）
【表２】
2008007455.tif 000003
【発明の効果】
【０００５】
本発明化合物はプロピオニバクテリウム属の菌種、特にプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)等に対して優れた抗菌活性を有し、抗菌剤として尋常性ざ瘡の予防若しくは治療に有用である。更に、本発明化合物は成人性歯周病の起炎菌として知られるポルフィロモナス ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)や、プリボレラ  インターメディア(Prevotella intermedia)に良好な抗菌作用を有し、抗菌剤として歯周病の予防若しくは治療に有用である。
また、本発明化合物は良好な抗炎症活性を有しており、各種炎症性疾患の予防若しくは治療に有用である。炎症性疾患としては、例えば、敗血症およびそれに起因する疾患、炎症性自己免疫疾患、炎症性血管疾患、炎症性心血管疾患、アレルギー性疾患、炎症性肝臓疾患、炎症性腎臓疾患、炎症性消化器疾患、炎症性心疾患、炎症性循環器疾患、感染症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性呼吸疾患症候群（ＡＲＤＳ）、発熱、移植片対宿主病、重症筋無力症、変形性関節症、痛風および火傷等が挙げられる。
優れた抗菌活性と抗炎症作用を併せ持つ本発明医薬組成物は、尋常性ざ瘡や歯周病の治療に特に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の環状化合物は、ストレプトミセス属に属する当該物質生産菌を栄養培地にて培養し、当該物質を蓄積させた培養物から常法によって得られる。当該物質の製造方法において使用する微生物は、ストレプトミセス属に属し当該物質の生産能を有する微生物であればいずれも用いることができる。このような微生物としては、例えば沖縄県八重山郡竹富町波照間（波照間島）の土壌より分離されたストレプトミセス属に属する放線菌ストレプトミセス  エスピー  (Streptomyces sp.) Q47152株を挙げることができる。
【０００７】
ストレプトミセス  エスピー(Streptomyces sp.) Q47152株の菌学的性質
１．形態
本菌株は各種有機及び無機培地において生育がやや不良で、基生菌糸の色調は灰味茶〜暗い黄茶色である。気菌糸はスターチ・無機塩寒天培地上にもっとも良く形成され、白〜青味灰色を呈する。胞子鎖はコイル状で、50個以上の胞子が連鎖する。電子顕微鏡による観察では、胞子の形状は円筒形、大きさは1.0〜1.5×0.4〜0.8μｍで、その表面はとげ状である。液体培養で基生菌糸の断片化は見られない。胞子のう、運動性胞子等の特殊な器官は観察されない。
【０００８】
２．各種寒天培地上の性状
各種寒天培地上の性状は以下に示すとおりである。特に記載しない限り、２８℃で２１日間培養し、常法に従って観察したものである。色調の記載については色の標準（日本色彩研究所）によった。
【表３】
2008007455.tif 000004
【０００９】
３．生理的性質
【表４】
2008007455.tif 000005
（注）生育温度範囲及び至適生育温度は各温度（5,10,15,20,24,28,32,37,40,45,50℃）で、7〜21日までの観察結果（脱脂牛乳に対する作用は37℃で3〜21日までの観察結果）である。それ以外は、特に指摘のない限り、28℃で2週間後の観察結果を示す。
【００１０】
４．炭素源の資化性（プリドハム・ゴドリーブ寒天培地、28℃培養）
【表５】
2008007455.tif 000006
【００１１】
５．菌体成分の化学分析
LECHVALIERらの方法（LECHVALIER, MP. et al; PP277-238 in DIETZ, A et al ed., Actinomycete Taxonomy, SIM Special Publication No.6, 1980）に従い本菌株の酸加水分解物の分析を行った結果、LL-ジアミノピメリン酸が検出された。主要な菌体メナキノンはMK-9(H8)であった。
上記諸性状を有する菌種を各種文献（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology vol.4, 1989等）により検索すると、本菌株はストレプトミセス (Streptomyces) 属に属す菌株と判断される。そこで、本菌株をストレプトミセス  エスピー (Streptomyces sp.) Q47152と命名した。なお、本菌株は、〒305-8566日本国茨城県つくば市東1丁目1番地１中央第6  独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(IPOD)に受領番号FERM BP-10436号として寄託されている（寄託日2004年12月1日）。また、微生物は人工的に又は自然に変異を起こしやすいので、本発明において用いられるストレプトミセス エスピー Q47152株は、天然から分離された微生物の他に、これに紫外線、Ｘ線、化学薬剤などで人工的に変異させたもの及びそれらの天然変異株についても包含する。
【００１２】
（製造方法）
本発明化合物はストレプトミセス属に属し、本発明化合物生産能を有する微生物を培養することによって得られる。培養は一般微生物の培養方法に準じて行われる。
培養に用いられる培地としては、ストレプトミセス  エスピー (Streptomyces sp.) Q47152等の、本発明化合物生産能を有するストレプトミセス属の微生物が利用する栄養源を含有する培地であればよく、合成培地、半合成培地または天然培地が用いられる。培地に添加する栄養物として公知のものを使用できる。培地の組成は、例えば炭素源としては、Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース、シュークロース、ラムノース、ラフィノース、イノシトール、マンニトール、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、マルトース、トレハロース、デンプン、ブドウ糖、デキストリン、グリセリン、植物油、ポテトスターチ等が挙げられる。窒素源としては肉エキス、ペプトン、グルテンミール、綿実粕、大豆粉、落花生粉、魚粉、コーンスチーブリカー、乾燥酵母、酵母エキス、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿酸その他の有機、無機の窒素源が用いられる。また、金属塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄、コバルトなどの硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、リン酸塩などが必要に応じて添加される。さらに、必要に応じてメチオニン、システイン、シスチン、チオ硫酸塩、オレイン酸メチル、ラード油、シリコン油、界面活性剤などの生成促進物質または消泡剤を添加することもできる。
培養条件としては好気的条件下で培養するのが一般的に有利で、培養温度は１５〜４５℃の範囲、好ましくは２０〜４０℃付近で行われる。培地のｐＨは約５〜９、好ましくは約６〜８の範囲に調整すると好結果が得られる。培養期間は培地の組成、温度条件に応じて適宜設定されるが、通常１〜１４日程度、好ましくは３〜８日程度である。
【００１３】
（単離法）
本発明化合物の単離は、天然物から生理活性物質を単離する際の通常の抽出、精製の手段を適宜利用して行うことができる。本発明化合物は、メタノールやエタノール、ブタノール等のアルコール類やアセトンに溶け易いことから、これらの溶媒で抽出するのが好ましい。また、本発明化合物は酢酸エチルやクロロホルム等の有機溶剤には溶解するが、水には溶解しにくいことから、水と、酢酸エチルやクロロホルム等による分液操作により、抽出精製することができる。
また、活性成分を含む画分を適当な担体に接触させることにより活性成分を吸着させ、次いで適当な溶媒で溶出することにより活性を有する本発明化合物を精製することができる。好ましくは、セファデックス（登録商標）ＬＨ−２０、アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ−２、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０、ダイヤイオン（登録商標）ＣＨＰ−２０、又はダイヤイオン（登録商標）ＳＰ−９００のような多孔性吸着樹脂に接触・吸着させ、次いでメタノール、エタノール、アセトン、ブタノール、アセトニトリル、クロロホルム等の有機溶媒又は水、或いはそれらの混合液を用いて、本発明化合物を溶出させることができる。このとき有機溶媒と水の混合比率を段階的に又は連続的に変化させることが有利な場合がある。また、本発明化合物含有画分は、シリカゲル、ＯＤＳ等を用いたカラムクロマトグラフィー、遠心液々分配クロマトグラフィー、ＯＤＳを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の当業者に自明の各種精製法によっても精製することができる。これらの各種操作法を適宜組み合わせて行うことが、純粋な化合物を分離精製するうえで有利な場合がある。
【００１４】
本発明化合物は、酸付加塩を形成することができる。かかる塩としては、製薬学的に許容される塩であり、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、或いは、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マイレン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸等が挙げられる。
また、本発明化合物は不斉炭素原子を有するので、これに基づく立体異性体（ラセミ体、光学異性体、ジアステレオマー等）が存在する。本発明は、これらの立体異性体の混合物もしくは単離されたものを包含する。また、本発明は、本発明化合物の水和物、各種溶媒和物等も含まれる。更に、本発明には結晶多形などの本発明化合物の結晶をも包含する。
【００１５】
本発明化合物を有効成分として含有する医薬組成物は、通常製剤化に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて調製される。
投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、あるいは静注、筋注等の注射剤、坐剤、経皮剤、経鼻剤あるいは吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
本発明による経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、本発明化合物又はその塩が、少なくとも一つの不活性な賦形剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な添加剤、例えばステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤やカルボキシメチルスターチナトリウム等の崩壊剤、溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性コーティング剤で被膜してもよい。
【００１６】
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な溶剤、例えば精製水、エタノールを含む。この組成物は不活性な溶剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁化剤のような補助剤、甘味剤、矯味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の液剤、懸濁剤、乳剤を含む。水性の溶剤としては、例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水性の溶剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（商品名）等がある。このような組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解、懸濁して使用することもできる。
外用剤としては、軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤、ゼリー剤、パップ剤、噴霧剤、ローション剤、点眼剤、眼軟膏等を包含する。一般に用いられる軟膏基剤、ローション基剤、水性又は非水性の液剤、懸濁剤、乳剤等を含有する。例えば、軟膏又はローション基剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、白色ワセリン、サラシミツロウ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、モノステアリン酸グリセリン、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ラウロマクロゴール、セスキオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。ここに、口腔用外用剤としては、練歯磨、液状歯磨、泡状歯磨等の歯磨剤、歯肉マッサージクリーム、局所添付剤、洗口剤、マウスウォッシュ、トローチ剤、チューンガム等の様々な剤型が挙げられる。有効成分以外の成分として、口腔用として当業者に常用されている成分を配合することができ、例えば、公知の界面活性剤、研磨剤、香料、増粘剤、保湿剤等を適宜用いることができる。
【００１７】
投与量は症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常、成人１日当たり経口投与の場合、0.1〜1500 mg、非経口投与の場合、0.01〜500 mg程度が適当であり、これを１日に１回乃至複数回投与する。投与量は種々の条件で変動するので、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。また、外用剤として用いる場合は、化合物（I）を0.001〜20％、好ましくは0.01〜10％を含む外用剤が好ましい。これを１日１〜数回、症状に応じて局所に投与する。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明する。本発明化合物は下記実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
（培養方法）  グルコース 1%、ポテトスターチ 2%、ポリペプトン 0.5%、酵母エキス 0.5%、炭酸カルシウム 0.4%よりなる培地（滅菌前pH7.0）を30mlずつ100ml容の三角フラスコに分注し、121℃で20分間滅菌した。この培地にSY寒天培地（可溶性デンプン2%、酵母エキス0.2%、寒天2%、pH7.3）に良く生育させたストレプトミセス  エスピー Q47152株をかき取って接種し、30℃、250回転／分の条件で3日間振とう培養し、種培養液とした。次に同じ組成の培地を92本の500ml容の三角フラスコに100mlずつ分注し、121℃で20分間滅菌した。この培地に前記種培養液を2mlずつ接種し、30℃、250回転／分の条件で3日間、振盪培養した。MS#3600  7%, Dried yeast  1.0%,  Wheat germ  2%, CoSO4  10ppm, よりなる培地（滅菌前pH6.5）を30Lジャー（20L仕込み）５基、200Lタンク（160L仕込み）、及び300Lタンク（200L仕込み）に作製し、121℃20分滅菌を行った。この培地に前記の培養液9.2Lを接種し、30℃、150回転／分、1VVMの条件で2日間、通気攪拌培養した。
（精製工程１Ａ）培養液360Lを等量のアセトンで抽出し、濾過後イオン交換水で1.5倍希釈し、吸着樹脂セパビーズSP850（三菱化学（株）、以下SP850と記載する）（30L）に供し、80%(v/v)アセトン水溶液で溶出した。このフラクションをODSカラムクロマトグラフィー(ダイソーゲルSP-120-15/30-ODS-B：ダイソー（株）、以下ODSカラムと記載する）（18L）に供し、0.1%(w/v)酢酸アンモニウムを含む70%(v/v)メタノール水溶液で洗浄後、メタノールで溶出した。
（精製工程１Ｂ）メタノール溶出液(31L)を水で2倍希釈しSP850(2L)に供し、90%(v/v)アセトン水溶液4Lで溶出した。この溶出液を減圧濃縮し、溶媒を除去した粗抽出液をヘキサン洗浄後、酢酸エチル抽出した。有機溶媒層を減圧乾固させ、メタノール溶解成分の半量をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（200ml）に供した。ヘキサン、ヘキサン：酢酸エチル（１：１）で洗浄した後、酢酸エチル1000mlで溶出した。
（精製工程１Ｃ）この溶出液1-500ml部分のうち5/18量をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(50ml)に供し、CHCl3:MeOH:NH4OH(10:1:0.1)60-90mlで溶出した。この溶出液を減圧乾固後、DMSO 1mlに溶解し、ODS HPLC(Mightysil RP-18 GP 250x20mm, 関東化学、以下ODS HPLCと記載する）に供し、0.4%(w/v)酢酸アンモニウムを含む50%(v/v)アセトニトリル水溶液で溶出し、UV220nmで検出して目的のピークを分取した。分取した溶液をODS HPLCに供し、0.05%(v/v)トリフルオロ酢酸を含む60%(v/v)アセトニトリル水溶液で溶出し、UV220nmで検出して目的のピークを分取した。溶出液を減圧濃縮した後に酢酸エチル抽出した。有機溶媒層を水洗浄した後に、硫酸ナトリウムで脱水処理し、減圧乾固させることにより化合物Q4-E(20mg)を取得した。
【００２０】
物理化学的性状
（化合物Q4-E）
色および形状：白色粉末
分子式：C53H68ClN9O15
高分解能ESI-MS: m/z 1106.4601 ([M+H]+, Δ 40 mmu)
UV吸収(MeOH)：λmax（ε）  266nm (37,400)
旋光度  [α]D22.2  =  -17.4° (c 0.02, MeOH)
NMRデータ：CDCl3中で測定した1H NMR、及び13C NMRの一次元のチャートを図１及び２に示す。
【００２１】
実施例２
（精製工程２Ｃ）実施例１の（精製工程１Ｂ）で得た500ml-1000ml部分の溶出液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(100ml)に供し、CHCl3:MeOH:NH4OH(10:1:0.2)350mlで溶出した。この溶出液を減圧乾固後、DMSO 3mlに溶解し、うち1mlをODS HPLCに供し、0.05%(v/v)トリフルオロ酢酸を含む60%(v/v)アセトニトリル水溶液で溶出し、UV220nmで検出して目的のピークを分取した。溶出液を減圧濃縮した後に酢酸エチル抽出した。有機溶媒層を水洗浄した後に、硫酸ナトリウムで脱水処理し、減圧乾固させることにより、化合物Q4-F(5mg)を取得した。
【００２２】
物理化学的性状
（化合物Q4-F）
色および形状：白色粉末
分子式：C104H128Cl2N18O32
高分解能ESI-MS: m/z 1106.4238 ([M+2H]2+, calc. 1106.42376, Δ 40 mmu)
UV吸収(MeOH)：λmax（ε）  261nm (3,400)
旋光度  [α]D22.2  =  -59.2° (c 0.02, MeOH)
NMRデータ：CDCl3中で測定した1H NMR、及び13C NMRの一次元のチャートを図１５及び１６に示す。
【００２３】
実施例３
（精製工程３Ａ）  実施例１と同様に培養したQ47152株の培養液360Lを等量のアセトンで抽出し、濾過後イオン交換水で1.5倍希釈し、SP850(30L)に供し、80%(v/v)アセトン水溶液で溶出した。溶出液をODSカラム(18L)に供し、0.1%(w/v)酢酸アンモニウムを含む60%(v/v)メタノール水溶液で溶出した。
（精製工程３Ｂ）  溶出液をDaiso ODS-Bカラム(ダイソー（株）)（18L）に供し、0.05%(v/v)トリフルオロ酢酸を含む52%(v/v)アセトニトリル水溶液で溶出した。この溶出液(10L)のうち1Lを減圧濃縮し、脱溶媒後、酢酸エチル800mlで溶媒抽出した。有機溶媒層を水洗浄した後に、硫酸ナトリウムで脱水処理し、減圧乾固させることにより化合物Q4-G(52mg)を取得した。
【００２４】
物理化学的性状
（化合物Q4-G）
色および形状：白色粉末
分子式：C52H63Cl2N9O16
高分解能ESI-MS: m/z 1140.3857 ([M+H]+, Δ 920 mmu)
UV吸収(MeOH)：λmax（ε）  264.5nm (13,100)
旋光度  [α]D22.2  =  -25.0° (c 0.02, MeOH)
NMRデータ：CDCl3中で測定した1H NMR、及び13C NMRの一次元のチャートを図３及び４に示す。
【００２５】
実施例４
（精製工程４Ｂ）  実施例３の（精製工程３Ａ）と同様にして得た溶出液(15 L)のうち60mlを減圧乾固後メタノール(1ml)に溶解した。この溶液をODS HPLCに供し、0.05%(v/v)トリフルオロ酢酸を含む50%(v/v)アセトニトリル水溶液で溶出し、UV220nmで検出して目的のピークを分取した。溶出液は減圧濃縮した後に酢酸エチル抽出した。有機溶媒層を水洗浄したあと、硫酸ナトリウムで脱水処理し、減圧乾固させることにより化合物Q4-H(5.5mg)を取得した。
【００２６】
物理化学的性状
（化合物Q4-H）
色および形状：白色粉末
分子式：C51H62ClN9O16
高分解能ESI-MS: m/z 1092.4081 ([M+H]+, Δ 10 mmu)
UV吸収(MeOH)：λmax（ε）  267.5nm (13,700)
旋光度  [α]D22.2  =  -26.6° (c 0.02, MeOH)
NMRデータ：CDCl3中で測定した1H NMR、及び13C NMRの一次元のチャートを図５及び６に示す。
【００２７】
実施例５
（精製工程５Ｂ）  実施例３の（精製工程３Ａ）と同様にして得た溶出液(20L)をイオン交換水で2倍希釈し硫酸水溶液でpHを3付近に調整後、SP850(2L)に供し、メタノール6Lで溶出した。溶出液を減圧濃縮し、Daiso ODS-Bカラム（340ml）に供し、0.05%(v/v)トリフルオロ酢酸を含む40%(v/v)アセトニトリル水溶液で溶出した。
（精製工程５Ｃ）この溶出液(250ml)のうち50mlをイオン交換水で2倍に希釈し、ODS HPLCに供し、50mMリン酸2水素カリウムを含む40%(v/v)アセトニトリル水溶液で溶出し、UV220nmで検出して目的のピークを分取した。溶出液をイオン交換水で2倍に希釈し、ODS HPLCに供し、50mMリン酸2水素カリウムを含む35%(v/v)アセトニトリル水溶液で溶出し、UV220nmで検出して目的のピークを分取した。溶出液を減圧濃縮した後に酢酸エチル抽出した。有機溶媒層を水洗浄したあと、硫酸ナトリウムで脱水処理し、減圧乾固させることにより化合物Q4-I(13mg)を取得した。
【００２８】
物理化学的性状
（化合物Q4-I）
色および形状：白色粉末
分子式：C44H58N8O13
高分解能ESI-MS: m/z 907.4201 ([M+H]+, Δ 40 mmu)
UV吸収(MeOH)：λmax（ε）  233nm (12,900)
旋光度  [α]D22.2  =  -67.9° (c 0.02, MeOH)
NMRデータ：CDCl3中で測定した1H NMR、及び13C NMRの一次元のチャートを図７及び８に示す。
【００２９】
実施例６
（精製工程６Ｃ）  実施例５の（精製工程５Ｂ）で得た溶出液(250ml)のうち50mlをイオン交換水で2倍に希釈し、ODS HPLCに供し、50mM酢酸アンモニウムを含む35%(v/v)アセトニトリル水溶液で溶出し、UV220nmで検出して目的のピークを分取した。溶出液をイオン交換水で2倍に希釈し、ODS HPLCに供し、50mM酢酸アンモニウムを含む35%(v/v)アセトニトリル水溶液で溶出し、UV220nmで検出して目的のピークを分取した。溶出液をイオン交換水で2倍に希釈し、Daiso ODS-Bカラム（10ml）に供し、15%(v/v)アセトニトリル水で洗浄した後にアセトニトリルで溶出した。溶出液を減圧乾固させることにより化合物Q4-J(8.7mg)を取得した。
【００３０】
物理化学的性状
（化合物Q4-J）
色および形状：白色粉末
分子式：C52H66ClN9O17
高分解能ESI-MS: m/z 1124.4349 ([M+H]+, Δ 580 mmu)
UV吸収(MeOH)：λmax（ε）  265.5nm (16,100)
旋光度  [α]D22.2  =  -158.7° (c 0.02, MeOH)
NMRデータ：CDCl3中で測定した1H NMR、及び13C NMRの一次元のチャートを図９及び１０に示す。
【００３１】
実施例７
（培養方法）  グルコース 1%、ポテトスターチ 2%、ポリペプトン 0.5%、酵母エキス 0.5%、炭酸カルシウム 0.4%よりなる培地（滅菌前pH7.0）を30mlずつ100ml容の三角フラスコに分注し、121℃で20分間滅菌した。この培地にSY寒天培地（可溶性デンプン2%、酵母エキス0.2%、寒天2%、pH7.3）に良く生育させたストレプトミセス  エスピー Q47152株をかき取って接種し、30℃、250回転／分の条件で3日間振とう培養し、種培養液とした。次に同じ組成の培地を40本の500ml容の三角フラスコに100mlずつ分注し、121℃で20分間滅菌した。この培地に前記種培養液を2mlずつ接種し、30℃、250回転／分の条件で3日間、振盪培養した。MS#3600  7%, Dried yeast  1.0%,  Wheat germ  2%, CoSO4  10ppm, よりなる培地（滅菌前pH6.5）を300Lタンクに作製（200L仕込み）し、121℃20分滅菌を行った。この培地に前記の培養液4Lを接種し、30℃、150回転／分、1VVMの条件で2日間、通気攪拌培養した。
（精製工程７Ａ）  このようにして培養したQ47152株の培養液180Lにアセトン180Lを添加し、充分に攪拌した後、濾過した。濾液に水180Lを添加し、SP850（10L）に供した。50%(v/v)アセトン水溶液32Lで洗浄した後、80%(v/v)アセトン水溶液で溶出した。溶出液40Lに水40Lとトリフルオロ酢酸40mlを添加し、ODSカラム（18L）に供した。50%および60%(v/v)メタノール水溶液  0.05%酢酸アンモニウム各66L、97Lで洗浄した後、80%(v/v)メタノール水溶液0.05%酢酸アンモニウムで溶出した。溶出液20Lに水20Lを添加し、ODSカラム（2L）に供した。35%(v/v)メタノール、0.05%トリフルオロ酢酸5Lで洗浄した後、53%(v/v)アセトニトリル、0.05%(v/v)トリフルオロ酢酸で溶出した。
（精製工程７Ｂ）  サンプルを800mlずつ分画して、目的のピークを含む画分を、減圧濃縮、酢酸エチル400mlで抽出、400mlの水で洗浄した後、脱水・減圧濃縮、乾固し、約1.6gの粗抽出物を得た。この抽出物をクロロホルム10mlに溶かし、シリカゲルクロマトグラフィ（100ml）に供した。クロロホルム300mlで洗浄した後、クロロホルム-メタノール（30:1）溶液で50mlずつ6フラクション、クロロホルム-メタノール（20:1）溶液で50mlずつ6フラクション、クロロホルム-メタノール（10:1）溶液で50mlずつ6フラクション、100%メタノールで50mlずつ6フラクション、溶出を行った。クロロホルム-メタノール（30:1）溶出画分のフラクション6と、クロロホルム-メタノール（20:1）溶出画分のフラクション1、計100mlを減圧濃縮・乾固し、1.2gの化合物Q4-Kを得た。
【００３２】
物理化学的性状
（化合物Q4-K）
色および形状：白色粉末
分子式：C52H66ClN9O15
高分解能ESI-MS: m/z 1092.4440 ([M+H]+, Δ -0.5 mmu)
UV吸収(MeOH)：λmax（ε）  269.0nm (29827.5634)、
旋光度  [α]D24.4  =-30.02°(c 0.1, MeOH)
NMRデータ：CDCl3中で測定した1H NMR、及び13C NMRの一次元のチャートを図１１及び１２に示す。
【００３３】
実施例８
（精製工程８Ｂ）  実施例７の（精製工程７Ａ）と同様にして得た溶出液について、溶出開始から250ml〜1050ml部分の溶出液を分取し、減圧濃縮、酢酸エチル400mlで抽出、400mlの水で洗浄した後、脱水・減圧濃縮・乾固し、約175mgの粗抽出物を得た。この抽出物を1mlのメタノールに溶かし、シリカゲルクロマトグラフィ（20ml）に供した。クロロホルム-メタノール（30:1）の溶液60mlで洗浄後、クロロホルム-メタノール（20:1）の溶液20mlで溶出し、減圧濃縮した後、酢酸エチル20mlで抽出し、濃縮乾固して化合物Q4-Lを約44.3mg得た。
【００３４】
物理化学的性状
（化合物Q4-L）
色および形状：白色粉末
分子式：C43H55ClN8O13
高分解能ESI-MS: m/z 927.3650 ([M+H]+, Δ-0.5mmu)
UV吸収(MeOH)：λmax（ε）  268.40nm (15302.0274)
旋光度  [α]D24.4  =-87.28°(c 0.1, MeOH)
NMRデータ：CDCl3中で測定した1H NMR、及び13C NMRの一次元のチャートを図１３及び１４に示す。
【００３５】
上記実施例１〜１０で得られた化合物は、その物理化学的性状より、以下の式で示される構造を有する化合物であると同定された。
【化３】
2008007455.tif 000007
【表６】
2008007455.tif 000008
【００３６】
実施例１１
プロピオニバクテリウム属菌種ならびに歯周病起因菌種に対する本発明化合物の最小発育阻止濃度(MIC)は、GAM寒天培地を用いて嫌気性条件にて37℃, 24h培養後、生育の有無を測定し、判定した。本発明化合物の、プロピオニバクテリウム アクネス(Propionibacterium acnes) JCM6425、プロピオニバクテリウム グラヌロサム(Propionibacterium granulosum) GAI7414、ポフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis) ATCC33277、及びプレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)BI-5500に対するMIC（μｇ/ｍｌ）は、下表の通りである。
【００３７】
【表７】
2008007455.tif 000009
実施例１２  TPA誘発マウス耳浮腫抑制活性
BDF1系雌性マウスの右耳介部の両面にTPA 2μg/ear塗布して皮膚炎を誘発した。薬剤は、TPA誘発の24時間と1時間前に右耳介部の両面に10μLずつ塗布した。TPA誘発の6並びに20時間後に右耳介部の厚さを測定し浮腫の指標とした。
本発明の化合物Q4-Jは、1％及び3％溶液をそれぞれ塗布したとき、コントロールに比べて6時間後で48%及び78%、20時間後で6%および54%の抑制活性を示した。よって、本発明の有効成分である化合物は良好な抗炎症作用を有することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】化合物Q4-Eの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図２】化合物Q4-Eの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図３】化合物Q4-Gの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図４】化合物Q4-Gの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図５】化合物Q4-Hの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図６】化合物Q4-Hの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図７】化合物Q4-Iの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図８】化合物Q4-Iの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図９】化合物Q4-Jの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図１０】化合物Q4-Jの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図１１】化合物Q4-Kの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図１２】化合物Q4-Kの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図１３】化合物Q4-Lの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図１４】化合物Q4-Lの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図１５】化合物Q4-Fの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図１６】化合物Q4-Fの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図１】
2008007455.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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