(57)【要約】      （修正有）【課題】ゼラチン残渣よりのヒドロキシプロリン回収方法を提供する。【解決手段】ゼラチン製造工程の残渣を加水分解して、ヒドロキシプロリンおよびヒドロキシプロリルプロリン以外の他のアミノ酸を代謝分解する能力を有する微生物を用いる、ゼラチン残渣からのヒドロキシプロリンおよびヒドロキシプロリルプロリンの回収方法。該微生物は、プロリダーゼとプロリナーゼ（プロリルペプチダーゼ）とを生産し、ヒドロキシプロリン以外のアミノ酸を代謝する能力を有するもの、特にプロテウス・ミラビリスである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼラチン製造工程の残渣を加水分解して、ヒドロキシプロリンおよびヒドロキシプロリルプロリン以外の他のアミノ酸を代謝分解する能力を有する微生物を用いるゼラチン残渣からのヒドロキシプロリンおよびヒドロキシプロリルプロリンの回収方法。
【請求項２】
該微生物がプロリダーゼとプロリナーゼ（プロリルペプチダーゼ）とを生産し、ヒドロキシプロリン以外のアミノ酸を代謝する能力を有するものである請求項１の回収方法。
【請求項３】
該微生物がプロテウス・ミラビリスＢＳＧ−１８１である請求項１の回収方法。
【請求項４】
他のアミノ酸が、アラニン、アスパラギン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン、ヒドロキシリジンまたはα―アミノ酪酸である請求項１の回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ゼラチン製造工程より排出されるゼラチン残渣から、医薬合成原料として有用なアミノ酸のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンおよびトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリンの回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  ヒドロキシプロリンの製造法としては、アリルブロマイドとジエチルアセトアミドマロン酸とから合成する方法（例えば、非特許文献１参照）、Ｄ−グルタミン酸から合成する方法（例えば、非特許文献２参照）、グリオキサールとオキサロ酢酸とから合成する方法（例えば、非特許文献３参照）などの化学合成法と、プロリンの水酸化によって合成する方法（例えば、非特許文献４参照）の酵素的合成法がある。しかしながら、いずれの合成法も光学異性体や構造異性体が生成し、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンのみを得るためには煩雑な分離工程が必要である。【０００３】  一方、ヒドロキシプロリンを含有するコラーゲン加水分解物から他のアミノ酸を分解して残りのトランス−Ｌ−ヒドロキシプロリンを得る方法（例えば、特許文献５参照）が知られている。この方法によれば光学異性体や構造異性体の混在が無く、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを得ることができる。しかしながら、この方法では原料となるコラーゲンを酸加水分解することが必要で、さらに中和などの工程を経ねばならない。【０００４】
【非特許文献１】ブリテン・オブ・ザ・ケミカルソサエティー・オブ・ジャパン（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ），４６巻，２９２４頁（１９７３年）
【非特許文献２】ブリテン・オブ・ザ・ケミカルソサエティー・オブ・ジャパン（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ），４７巻，１７０４頁（１９７４年）
【非特許文献３】ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），４２巻，３４４０頁（１９７７年）
【非特許文献４】バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），６４巻，７４６頁（２０００年）
【特許文献５】特開平０５−１３０８８３号  公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  不溶性のコラーゲンからゼラチンを製造する工程の廃棄物として排出されるゼラチン残渣は、そのまま廃棄物として処理するためには処理費用が掛り、また一方飼料として利用するためには乾燥することが必要である。そこで、水分含量の多く、固形物も多く含まれるゼラチン残渣から少ない工程によって有用なアミノ酸を回収して医薬品等の原料として用いることが望まれている。【０００６】  このようなコラーゲン分子のペプチド結合を切断し、ヒドロキシプロリンを遊離させるための酵素としては、少なくともプロリンのイミノ基側を加水分解するプロリダーゼとプロリンのカルボキシル基側を加水分解するプロリナーゼ（プロリルペプチダーゼ）の２つの酵素が必要である。【００７】  プロリダーぜを生産する微生物としては、大腸菌、ラクトコッカス・クレモリス、キサントモナス・マルトフィリアが知られ、一方、プロリナーぜを生産する微生物としては、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム、バチルス・コアグランス、スフィンゴモナス・カプスラタが知られている。そして、これら両者を生産する微生物としては、わずかにキサントモナス・マルトフィリアのみが報告されている（例えば非特許文献６参照）。しかしながら、ゼラチンを自身の酵素で分解して生じるヒドロキシプロリンを代謝する能力が無く、他のアミノ酸のみを代謝する能力を持つ微生物については報告されていない。【０００８】
【非特許文献６】タンパク質核酸酵素，４２巻，２１９８頁（１９９７年）
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明者らは、５０箇所以上の土壌中の微生物をゼラチン残渣を栄養源とする培地で馴養して、当該培地に生育可能でヒドロキシプロリンを残して他のアミノ酸を代謝分解する微生物を鋭意検索した結果、プロリダーゼとプロリナーゼの２つの酵素を合せ持ち、さらにプロリンを代謝する能力を持たないと考えられる細菌を土壌中より分離した。この分離した細菌菌株を、ゼラチン残渣を単一の栄養源とする培地に植えて培養し、コラーゲン等の固形状タンパク質を分解せしめ、さらに夾雑するアミノ酸を分解せしめて、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを容易に精製単離する方法を確立し、本発明を完成させた。【００１０】  本発明は、コラーゲンよりゼラチンを抽出した残渣を原料として、これに固形状タンパク質を加水分解し、他のアミノ酸を分解してトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンおよびトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリンの回収方法を提供する。本発明で用いる微生物は、土壌中より分離された細菌であり、固形状タンパク質を加水分解せしめ、生じたアミノ酸のうちのトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンおよびトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリンを菌体内で代謝、資化、他の化合物へ分解する能力を有する。【００１１】  ゼラチン残渣培地で分離細菌を培養した培養液を、遠心分離で沈殿物を除去後、培養上清液をシリカゲル６０（メルク社製）にスポットして、フェノール：水＝３：１（容積比）を展開溶媒として薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行い、ニンヒドリンのアセトン溶液をスプレーし、１００℃に５分間加熱して黄色に発色したスポットのＲｆ値からプロリン（Ｒｆ＝０．５）と、ヒドロキシプロリン（Ｒｆ＝０．３８）の区別を確認することができる。【００１２】  本発明に用いる分離細菌は、プロテウス・ミラビリスＢＳＧ−１８１と表示し、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターにＮＩＴＥ  Ｐ−２８５号として寄託したが、その菌の形態的性質は第１表の通りである。比較対照としてプロテウス・ミラビリスＮＢＲＣ３８４９を用いた。【００１３】  分離細菌プロテウス・ミラビリスＢＳＧ−１８１の細菌学的性質は、第２表および第３表に示す通りである。比較対照として用いたプロテウス・ミラビリスＮＢＲＣ３８４９の細菌学的性質と共にそれらの表に記載されている。【００１４】  本発明に用いる培地は、ゼラチン残渣を単一の栄養源として、固形分濃度が１０〜３００ｇ／Ｌ（トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンとして１〜３０ｇ／Ｌ）、好ましくは２０〜１００ｇ／Ｌ（トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンとして２〜２０ｇ／Ｌ）となるように加え、ｐＨを６．５〜７．５に調整して、１２１℃で１５分間滅菌したものを用いる。【００１５】
【表１】
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【００１６】
【表２】
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【００１７】  培養は、固形物１ｇに対して１００万個〜１０億個、好ましくは１億個の細胞を植えて、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３５℃で培養を行い、培養中のｐＨを７．０〜８．０となるように塩酸、硫酸あるいは酢酸を用いて調整する。【００１８】  培養時間は、通常３６〜９６時間であるが、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン以外の他のアミノ酸が分解されて認められなくなった時点で終了する。培養後、遠心分離によりに培養液中の菌体と不溶性の物質を除去し、上清液に等量のアセトンを加えて生じた沈殿を再び遠心分離によって除去し、減圧下にアセトンを蒸発させて残った水溶液から、イオン交換クロマトグラフィー、等電点沈殿、晶析などの精製法によってトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（ＴＬＣでＲｆ＝０．３８）およびトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリン（ＴＬＣでＲｆ＝０．２０）を分離、回収する。
【発明の効果】
【００１９】  本発明により、わずかな飼料としての利用以外に廃棄物とされていたゼラチン残渣より、医薬合成の貴重な原料となるトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンおよびトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリンを回収する有用な技術を産業界に提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】  ゼラチン抽出残渣を含むペースト状廃液のｐＨを調整し、プロテウス・ミラビリスＢＳＧ−１８１を植菌して培養したタンクに流下させて、ｐＨを７．５に調整しながら連続培養した流出液に、等量のアセトンを加えたのち遠心分離機にかけて沈殿物を除去し、上清液を濃縮してアセトンを除去後、アミノ酸をカチオン交換樹脂に吸着させ、０．２規定アンモニア水溶液で溶出後ｐＨを６．３として等電点沈殿させてトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを得る。【００２１】  以下、実施例により本発明を具体的に説明する。実施例において用いるゼラチン残渣は、豚皮より硫酸処理によってゼラチンを抽出した残渣で、水酸化カルシウムで中和後に乾燥した粉末である。蛋白質含量５８．１％、粗脂肪２．８％、水分７．５％、灰分３０．６％の飼料用に供試されているものを用いた。
【実施例】
【００２２】実施例１
ゼラチン残渣８０ｇを２Ｌの水に懸濁し、リン酸水素２カリ４ｇと硫酸マグネシウム７水和物０．４ｇを加えた後ｐＨを７．０に調整し、２Ｌ容三角フラスコ４本に５００ｍｌずつ分注して、１２１℃で１５分間蒸気滅菌して培地とした。滅菌後室温まで冷却した培地に、普通寒天培地上３４℃で２４時間培養したプロテウス・ミラビリスＢＳＧ−１８１菌の細胞を滅菌水に懸濁した１０億個／ｍｌの種菌液を、各フラスコ当たり１０ｍｌずつ植菌し、３４℃で７２時間培養した。この培養液から遠心分離（３，０００Ｇ、１０分間）によって菌体と不溶性の培地成分を除去し、得られた上清に等量のアセトンを加え、さらに同一条件で遠心分離を行って上清を集め、減圧濃縮してトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンとトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリン９．７ｇ（ヒドロキシプロリンとしての回収率９８％）を含む濃縮液を得た。【００２３】
【表３】
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【００２４】実施例２
対照として、実施例１と同じ培地に、普通寒天培地上３４℃で２４時間培養したプロテウス・ミラビリスＮＢＲＣ３８４９の細胞を滅菌水に懸濁した１０億個／ｍｌの種菌液を、各フラスコ当たりゼラチン残渣２０ｇを含む実施例１と同一組成の培地５００ｍｌに、各フラスコ当たり１０ｍｌずつ植菌し、実施例１と同様に３４℃で７２時間培養した後、遠心分離（３，０００Ｇ、１０分間）によって菌体と不溶性の培地成分を除去し、培養上清液を得た。【００２５】  表１に実施例１と２で得られた培養液の濁度（６６０ｎｍの吸光度）、ｐＨ、残存たんぱく繊維の有無を第４表にまとめた。【００２６】実施例３
実施例１で得られた濃縮液を精製水で１，０００ｍｌに希釈した後、カチオン交換樹脂（三菱化成（株）製ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ、Ｈ＋型）２００ｍｌのカラムに通した通過液を集めて減圧濃縮し、ｐＨを６．３としてトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを晶析させた。以上の精製操作により、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン４．３ｇ（ヒドロキシプロリンの回収率６０％）を得た。【００２７】
【表４】
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【００２８】  このときのカチオン交換樹脂に吸着したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリンを０．２規定アンモニア水溶液で溶出し、エタノールで晶析させて４．６ｇ（ヒドロキシプロリンの回収率３１％）を得た。【００２９】実施例４
実施例２で得た培養液からは、実施例３と同様の操作によりトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンもトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリンも得ることができなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３０】  ゼラチンや低分子化した水溶性コラーゲンの健康効果や美容効果が認識されて、動物の結合組織からこれらを抽出する需要が増してきており、それと共に抽出後の廃棄物が多くなってきている。これらを廃棄物として処理するには処理費用が必要であるが、本発明技術を適用することにより、医薬品の合成原料として有用なアミノ酸であるトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンをこれらの廃棄物から回収することができるので、ゼラチンや水溶性コラーゲン製造業にとって経済的な利点が生じることから、本発明技術が実用化される可能性が高い。