(57)【要約】【課題】高い信頼性でがんのリンパ節転移を判定できる方法を提供すること。【解決手段】生体から採取されたリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチンに関連するポリペプチドを定量する工程、及び前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記リンパ節へのがん細胞の転移を判定する工程、を含むがんのリンパ節転移判定方法を提供する。この方法によると、より高い信頼性でがんのリンパ節転移を判定することができる。【選択図】図１
2008020438.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から採取されたリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチンに関連するポリペプチドを定量する工程、及び
前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記リンパ節へのがん細胞の転移を判定する工程、
を含むがんのリンパ節転移判定方法。
【請求項２】
前記検出用試料が、前記リンパ節組織と緩衝液とを混合し、前記リンパ節組織を前記緩衝液中で破砕し、前記リンパ節組織中のポリペプチドを液中に移行させることによって得られる溶液である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記緩衝液が、ｐＨ２．５〜５．０である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記緩衝液が、ジメチルスルホキシドをさらに含む、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
前記緩衝液が、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
前記定量工程において、前記ポリペプチドがイムノアッセイによって定量される、請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
前記判定工程において、前記定量結果と所定の閾値とを比較することによりがん細胞の転移が判定される請求項１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記判定工程において、前記定量結果が前記閾値以上である場合に、前記リンパ節組織にがん細胞が転移していると判定される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記サイトケラチンがサイトケラチン１９である、請求項１〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
前記がん細胞が、乳がん、胃がん又は大腸がんの細胞である、請求項１〜９の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ節へのがん細胞の転移を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、リンパ節へのがん細胞の転移を判定するため、生体からリンパ節組織を採取し、このリンパ節組織中の腫瘍マーカー遺伝子の発現量（タンパク質又はｍＲＮＡ）を測定することが行われている。腫瘍マーカー遺伝子の発現量が正常細胞の発現量よりも大きい（又は小さい）場合は、前記リンパ節組織にがん細胞が転移していると疑われる。
【０００３】
がんのリンパ節転移を判定する方法として、例えば特許文献１記載の方法が知られている。特許文献１には、肺腺癌のリンパ節転移を診断する方法について記載されており、具体的には、リンパ節転移のある患者の肺の組織片と、リンパ節転移のない患者の肺の組織片を試料とし、様々なタンパク質の発現量を測定することによって転移診断マーカーとして有用なタンパク質を同定している。また、このタンパク質を用いることにより、肺腺癌患者における肺がんのリンパ節転移を診断することが可能であるとの開示がある。
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−５３１１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、本発明者らは、リンパ節転移の判定を行う際は、原発巣ではなくリンパ節組織に含まれる腫瘍マーカーのタンパク質を測定する方がより高い信頼性でリンパ節転移判定を行うことができると考え、本発明を完成した。
【０００６】
本発明の目的は、従来の方法よりも高い信頼性でがんのリンパ節転移を判定できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、生体から採取されたリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチンに関連するポリペプチドを定量する工程、及び前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記リンパ節へのがん細胞の転移を判定する工程、を含むがんのリンパ節転移判定方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、がんのリンパ節転移を判定する方法が提供される。この方法によると、より高い信頼性でがんのリンパ節転移を判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の一実施形態であるがんのリンパ節転移判定方法は、生体から採取されたリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチンに関連するポリペプチドを定量する定量工程、及び前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記リンパ節へのがん細胞の転移を判定する判定工程、を含む。
【００１０】
本明細書におけるがんとは、悪性化した腫瘍のことであり、悪性腫瘍と同義である。がんには、癌腫、肉腫、造血器由来のがんなどが含まれる。癌腫としては、乳がん、胃がん、大腸がん、前立腺がん、子宮頸部がん、子宮体部がんなどの上皮細胞由来のがんが例示される。肉腫としては、骨肉腫、軟部肉腫などが例示される。造血器由来のがんとしては、白血病や悪性リンパ腫などが例示される。また、本明細書において、「がんの転移」とは、原発巣に存在していたがん細胞が、原発巣とはことなる組織に転移することであり、「がん細胞の転移」と同義で用いられる。
【００１１】
試料としては、リンパ節組織が用いられる。ここでいうリンパ節組織とは、手術等により切除したリンパ節組織全体又はその一部、及び生検などによりリンパ節から採取された複数のリンパ節細胞を含有する試料を含む。本実施形態の方法によると、このリンパ節組織にがん細胞が含まれているか否か、即ち、原発巣からこのリンパ節組織にがん細胞が転移しているか否かを判定することができる。この判定結果は、治療方針や組織郭清領域を決定する際の指標の１つとして用いることができる。例えば、乳がん、胃がん又は大腸がんの患者から腫瘍の近傍のリンパ節組織を生検により採取し、上記方法によってがんのリンパ節転移の有無を判定することは、リンパ節を摘出すべきか、或いはどの程度郭清すべきか等を決定する一助となる。
【００１２】
ポリペプチドの定量に際しては、リンパ節組織から検出用試料が調製され、この検出用試料に含まれるポリペプチドが定量される。このポリペプチドは、サイトケラチンに関連するものであり、サイトケラチン（以下、ＣＫともいう）のタンパク質であってもよいし、その断片であってもよい。ＣＫはケラチンとも呼ばれ細胞骨格を構成するタンパク質の１つである。ＣＫには、ＣＫ１８、１９、２０などの種類があり、何れの種類のＣＫを定量してもよいが、ＣＫ１９が好ましい。
【００１３】
検出用試料の調製方法としては特に限定されず、市販のタンパク質抽出キットを用いることができる。調製は、緩衝液を用いて行うことが好ましい。具体的には、リンパ節組織に緩衝液を添加し、緩衝液中の細胞に対して化学的及び／又は物理的処理を行うことによって細胞中のポリペプチドを液中に移行させ、このポリペプチドを含む溶液を検出用試料とすることができる。
【００１４】
この緩衝液は強酸性であることが好ましい。ｐＨの好ましい範囲は２．５〜５．０であり、より好ましくは３．０〜４．０である。ｐＨをこの範囲に保つために、公知の緩衝液を用いることができる。
【００１５】
また、緩衝液には界面活性剤を含有させることが好ましい。界面活性剤によって細胞膜や核膜が損傷するため、この損傷を通して細胞中の分子が液中に移行しやすくなる。このような作用を有するものであれば界面活性剤の種類は特に限定されないが、非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤がよりこのましい。特に、次のような一般式：
Ｒ１−Ｒ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ
（ここで、Ｒ１は炭素数１０〜２２のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、イソオクチル基；Ｒ２は−Ｏ−又は−（Ｃ６Ｈ６）−Ｏ−；ｎは８〜１２０の整数）
で表されるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が好適であり、例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテルなどが挙げられる。具体的には、Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル)などが好適である。緩衝液中の界面活性剤の濃度は０．１〜６％（ｖ／ｖ）が好ましく、より好ましくは１〜５％（ｖ／ｖ）である。
【００１６】
緩衝液にさらにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有させてもよい。緩衝液中のＤＭＳＯの濃度としては、１〜５０％（ｖ／ｖ）が好ましく、５〜３０％（ｖ／ｖ）がより好ましく、１０〜２５％（ｖ／ｖ）が最も好ましい。
【００１７】
ジメチルスルホキシドや上述の界面活性剤を含み、上述のｐＨである緩衝液を検出用試料の調製に用いることによって、サイトケラチンのような細胞内に存在するタンパク質を効率的に溶液中に移行させることができる。この効果は、緩衝液の組成やｐＨなどの複合的な要因により生じるものと推測される。
【００１８】
検出用試料調製の際には、リンパ節組織に対してホモジナイズ等の物理的処理を施すことが好ましい。これにより、生体試料中の細胞の細胞膜や核膜が物理的に破砕され、細胞内の分子が液中に移行しやすくなる。ホモジナイズは、ペッスルなどによって手動で行ってもよいし、市販の電動ホモジナイザを用いて行ってもよい。得られたホモジネートを数秒〜数分間遠心分離することによってホモジネート中に浮遊していた細胞の破片等を沈殿させることができる。これにより、タンパク質等の細胞内に存在する分子を含む上清を検出用試料とすることができる。
【００１９】
上記のような緩衝液を用いると、簡単な遠心操作のみで調整を行うことができ、従来必要であったタンパク質の精製等の処理が不要であるため、検出用試料調製を簡便且つ短時間で行うことができる。さらに、検出用試料にはＤＮＡやＲＮＡも含まれている。従って、同一の検出用試料を用いて特定の核酸（例えば、腫瘍マーカーのｍＲＮＡ）の定量や特定の遺伝子の変異（例えば、一遺伝子多型など）検出等を行うことも可能である。
【００２０】
ポリペプチドの定量は、公知の方法により行うことができ、特に限定されないが抗原抗体反応を利用した定量法（イムノアッセイ法）を用いることが好ましい。例えば、プロテインチップ等を用いた解析法、ドットブロット法やウェスタンブロット法などのイムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、カウンティングイムノアッセイ法（ＣＩＡ: Sysmex Journal Vol.20 No.1, 77-86(1997)参照）などを用いることができる。これらのうち、ウェスタンブロット法を用いると、検出用試料に含まれるポリペプチドの種類を分子量に基づいて分離することができるため、より特異的に目的とするポリペプチドを定量することができる。
【００２１】
ポリペプチドの定量値は、予め作製された検量線に基づいて算出されることが好ましい。検量線は、既知量のタンパク質を含む試料を用いて検出用試料のポリペプチド測定と同様の条件で測定することにより作成することができる。
【００２２】
上記の様にして測定されたポリペプチドの定量結果に基づいてリンパ節組織へのがん転移の有無が判定される。この判定は、上述の方法により測定されたポリペプチドの定量値を所定の閾値と比較することにより行われることが好ましい。
【００２３】
閾値は、がんやサイトケラチンの種類に応じて適宜設定される値であり、がん細胞の転移が認められたリンパ節組織 (陽性検体)に含まれるポリペプチド量以下であって、がん細胞の転移が認められなかったリンパ節組織(陰性検体)に含まれるポリペプチド量よりも高い値に設定することができる。特に、複数の陽性検体のポリペプチド量と複数の陰性検体のポリペプチド量とを予め測定しておき、最も高確率にこれらの陽性検体と陰性検体とを区別できる値を閾値として設定することが好ましい。
【００２４】
本実施形態の方法は、従来行われている組織診や核酸検出による判定と同等の精度でがん転移を検出することができる。さらに、この方法は、組織の１つの断面で判定する組織診よりもがん転移の見落としの可能性が低く、より客観的な方法である。
【００２５】
＜実施例１＞
１．  測定用試料の調製
乳がん患者から切除したリンパ節１１３個を用いて測定用試料を調製した。
なお、これらのリンパ節のうち、ヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の検鏡（組織診）により、９１個はがん転移陰性のリンパ節（うち、３７個がｐＮ０、５４個がｐＮ１〜３）であり、２２個はがん転移陽性のリンパ節（ｐＮ＋）であった。
【００２６】
まず、各リンパ節(約５０〜６００ｍｇ／個)に、pH3.4の緩衝液(２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、５％  Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル、SIGMA社製)及び２０％  ＤＭＳＯ(和光純薬)を含む）２００μＬを添加し、ブレンダーでホモジナイズした。得られたホモジネートを10,000×ｇ、室温で１分間遠心分離し、上清を５０〜２００μＬ採取してこれを検出用試料とした。
【００２７】
２．ＣＫ１９タンパク質の定量
ＣＫ１９ｍＲＮＡの定量に用いた検出用試料２０μＬに３×ＳＤＳ処理バッファ（１５０ｍＭ  Tris HCl(pH6.8)、３００ｍＭ  ジチオスレイトール、６％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．３％  ブロモフェノールブルー、及び３０％  グリセロールを含む）１０μＬを添加して９５℃５分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料１５μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンにトランスファーし、これをブロッキングバッファ（２０ｍＭ  Tris(pH7.6)、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Tween20、及び５％  スキムミルクを含む）に浸漬して１時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ  Tris(pH7.6)、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．１％  Tween20を含む）で２分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液（一次抗体：Cytokeratin 19 (A53-B/A2)（サンタクルズ社製、Lot:#L2403：ＣＫ１９タンパク質アミノ酸配列の３１２位〜３３５位を認識）をＴＢＳ−Ｔで５００分の１に希釈した溶液）に浸漬し、４℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液（二次抗体：ECL anti-mouse IgG HRP linked F(ab')2 fragment（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をＴＢＳ−Ｔで２０００分の１に希釈した溶液）にメンブレンを浸漬し、３０分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、ECL-Advance Western Blotting Detection Kit（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により酵素反応を行った。LumiAnalyst（ロシュ社製）で酵素反応後のメンブレン画像を取り込み、QuantityOne（バイオラッド社製）によってメンブレン画像の蛍光強度を算出した。上述のようにして測定された蛍光強度を、検量線にあてはめ、ＣＫ１９タンパク質の量を算出した。検量線は、上記と同じゲルで測定用試料を収容したウェルとは別のウェルに濃度既知のＣＫ１９タンパク質を含む試料を収容し、上述の蛍光強度測定を行うことにより作成された。
【００２８】
３．結果
測定されたタンパク質定量値（濃度：ｎｇ／μＬ）を対数軸に展開し、グラフを作成した。このグラフを図１に示す。グラフ中、「ｐＮ０」には、ｐＮ０のリンパ節を用いて調製した検出用試料中のＣＫ１９タンパク質定量値、「ｐＮ１〜３」には、ｐＮ１〜３のリンパ節を用いて調製した検出用試料中のＣＫ１９タンパク質定量値、「ｐＮ＋」には、がん転移陽性のリンパ節を用いて調製した検出用試料中のＣＫ１９タンパク質定量値がそれぞれ示される。
【００２９】
図１からわかるように、本実施例で測定したＣＫ１９タンパク質定量値は組織学的検査による判定と合致していた。
【００３０】
また、がん転移陰性のリンパ節のうち、最もＣＫ１９タンパク質量が多かったリンパ節では、０．３ｎｇ／μＬのＣＫ１９タンパク質が検出され、がん転移陽性のリンパ節のうち、最もＣＫ１９タンパク質量が少なかったリンパ節では１ｎｇ／μＬのＣＫ１９タンパク質が検出された。即ち、がん転移の有無を判定するためには、０．３〜１の間で閾値を設定することができる。従って、ＣＫ１９タンパク質定量値がこの閾値以上であった場合は、がんのリンパ節転移は陽性であると判定することができ、閾値未満であった場合は、がんのリンパ節転移は陰性であると判定することができる。
【００３１】
以上より、本実施例の方法によると、従来広く行われている組織診と同等の精度でリンパ節へのがん転移を検出することが可能であることが示された。
【００３２】
＜実施例２＞
１．測定用試料の調製
乳がん患者から切除したリンパ節３１個を用い、実施例１と同様にして検出用試料を調製した。これらのうち、ヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の検鏡（組織診）によって、がん細胞の転移が認められたリンパ節（陽性検体）が２２個あり、がん細胞の転移が認められなかったリンパ節（陰性検体）は９個あった。
【００３３】
２．ＣＫ１９タンパク質の定量
上記検出用試料を用い、実施例１と同様にしてＣＫ１９タンパク質を定量した。
３．ＣＫ１９ｍＲＮＡの定量
上記検出用試料を用い、試料中のＣＫ１９のｍＲＮＡを定量した。先ず、検出用試料を核酸増幅装置（ＧＤ−１００、シスメックス製）にセットし、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応によってＣＫ１９ｃＤＮＡを増幅させた（測定用試薬として、ＧＤ−１００には核酸増幅用試薬としてサイトケラチン試薬（シスメックス製）がセットされた）。反応液の濁度をリアルタイムに測定することによりＣＫ１９のｍＲＮＡ（検出用試料１μＬ当たりのコピー数）を定量した。
【００３４】
４．結果
測定されたｍＲＮＡ定量値（濃度：コピー数／μＬ）及びタンパク質定量値（濃度：ｎｇ／μＬ）を対数軸に展開し、グラフを作成した。このグラフを図２に示す。グラフ中、▲は組織学的にがん転移陽性と判定された陽性検体であり、■は組織学的にがん転移陰性と判定された陰性検体である。
【００３５】
図２より、本実施例で測定されたＣＫ１９タンパク質定量結果は、ＣＫ１９ｍＲＮＡの定量結果とよく相関していた。また、ＣＫ１９タンパク質定量値の閾値を０．３〜１の間で設定することにより、全ての陽性検体をがん転移陽性と判定することができた。よって、本実施例の方法によると、高感度とされるｍＲＮＡの検出による判定と同等の精度でリンパ節へのがん転移を検出することが可能であることが示された。
【００３６】
以上より、本実施形態の方法によると、従来の方法と同等の精度でがんのリンパ節転移を検出することができ、組織診によるがん転移の判定結果や核酸検出によるがん転移の判定結果と整合した結果を得ることができる。
【００３７】
＜実施例３＞
１．測定用試料の調製
大腸がん患者から切除したリンパ節１２３個を用いて測定用試料を調製した。
なお、これらのリンパ節のうち、ヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の検鏡（組織診）により、９２個はがん転移陰性のリンパ節（うち、３１個がｐＮ０、６１個がｐＮ１〜３）であり、３１個はがん転移陽性のリンパ節（ｐＮ＋）であった。その他は、実施例１と同様にして測定用試料を調製した。
【００３８】
２．ＣＫ１９タンパク質の定量
上記検出用試料を用い、実施例１と同様にしてＣＫ１９タンパク質を定量した。
【００３９】
３．結果
【００４０】
図３からわかるように、大腸がんにおいても、本実施例で測定したＣＫ１９タンパク質定量値は組織学的検査による判定と合致していた。
【００４１】
＜実施例４＞
１．測定用試料の調製
胃がん患者から切除したリンパ節９８個を用いて測定用試料を調製した。
なお、これらのリンパ節のうち、ヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の検鏡（組織診）により、７２個はがん転移陰性のリンパ節（うち、３４個がｐＮ０、３８個がｐＮ１〜２）であり、２６個はがん転移陽性のリンパ節（ｐＮ＋）であった。その他は、実施例１と同様にして測定用試料を調製した。
【００４２】
２．ＣＫ１９タンパク質の定量
上記検出用試料を用い、実施例１と同様にしてＣＫ１９タンパク質を定量した。
【００４３】
３．結果
【００４４】
図４からわかるように、胃がんにおいても、本実施例で測定したＣＫ１９タンパク質定量値は組織学的検査による判定と合致していた。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】実施例１の結果を示すグラフである。
【図２】実施例２の結果を示すグラフである。
【図３】実施例３の結果を示すグラフである。
【図４】実施例４の結果を示すグラフである。
【図１】
2008020438.tif 000003
【図２】
2008020438.tif 000004
【図３】
2008020438.tif 000005
【図４】
2008020438.tif 000006