(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）および空胞型遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）の原因である、変異型ＧＮＥ遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作出する。【解決手段】ＧＮＥ遺伝子の塩基配列の一部（遺伝子産物であるＧＮＥタンパク質の、キナーゼドメインをコードする部位）に、欠損、置換または付加を生じさせる変異を加えることで、ＧＮＥ遺伝子のゲノムＤＮＡに変異が導入されている、トランスジェニック非ヒト哺乳動物、およびそれを用いたＤＭＲＶ治療薬のスクリーニング方法。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
GNE遺伝子のゲノムＤＮＡに変異が導入されていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
前記変異がGNEタンパク質のキナーゼドメインに導入されている、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
前記変異がGNE遺伝子のエキソン１０に導入されている、請求項２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
前記変異が点変異である、請求項１から３の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
GNEタンパク質のＮ末端から５７２番目のアミノ酸残基であるバリン残基がロイシン残基に置換されている、請求項４に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
GNE活性が低下している、請求項１から５の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
シアル酸生合成能不全である、請求項１から５の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
DMRV表現型を発現している、請求項１から５の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
腎臓疾患モデル非ヒト哺乳動物である、請求項１から５の何れかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
前記腎臓疾患が、糸球体腎炎や間質性腎炎、ネフロンろう，ネフローゼ症候群である請求項９に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
２ヵ月以上生存することができる、請求項１から１０の何れかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】
前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１から１１の何れかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１３】
請求項１から１２の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部を用いる、GNE活性低下に因る疾病の治療剤、予防剤、治療方法及び／又は予防方法のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１から１２の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部を用いる、シアル酸生合成能不全に因る疾病の治療剤、予防剤、治療方法及び／又は予防方法のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１から１２の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部を用いる、DMRVの治療剤、予防剤、治療方法及び／又は予防方法のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項１から１２の何れか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部を用いる、腎臓疾患の治療剤、予防剤、治療方法及び／又は予防方法のスクリーニング方法。
【請求項１７】
GNE遺伝子の組換えＤＮＡであって、適当な宿主のＧＮＥ遺伝子と入れ替えたときに宿主のGNE活性を低下させる組換えＤＮＡ。
【請求項１８】
GNE遺伝子の組換えＤＮＡであって、適当な宿主のＧＮＥ遺伝子と入れ替えたときに宿主のシアル酸生合成能を低下させる組換えＤＮＡ。
【請求項１９】
GNE遺伝子の組換えＤＮＡであって、適当な宿主のＧＮＥ遺伝子と入れ替えたときに宿主がDMRV表現型を発現する組換えＤＮＡ。
【請求項２０】
前記変異がGNEタンパク質のキナーゼドメインに導入されている、請求項１７から１９の何れか１項に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項２１】
前記変異がGNE遺伝子のエキソン１０に導入されている、請求項２０に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項２２】
GNEタンパク質のＮ末端から５７２番目のアミノ酸残基であるバリン残基がロイシン残基に置換されている、請求項２１に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項２３】
請求項１７から２２の何れか１項に記載の組換えＤＮＡを含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物、その作出に関するＤＮＡ及びトランスジェニック非ヒト哺乳動物又はその一部を用いたスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９８１年、埜中らによって縁取り空胞型遠位型ミオパチー(Distal Myopathy with Rimmed Vacuoles, ＤＭＲＶ)が報告された(非特許文献１)。ＤＭＲＶは、１５から３０歳で発症することが多く、下腿伸筋群が初期より強く障害され（図１）、その後大腿屈筋群の筋力低下、筋萎縮も加わり、発症１０年以内に車椅子の生活を余儀なくされることが多い難治性疾患である。２００１年、Eisenbergらによって、遺伝性封入体ミオパチー（Hereditary Inclusion Body Myopathy, ＨＩＢＭ）の原因がＧＮＥ(UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase)遺伝子の変異であることが示唆された(非特許文献２)。２００２年、本発明者の浅賀らはＨＩＢＭとＤＭＲＶは同じ遺伝子の変異に起因する疾患であることを報告した(非特許文献４)。しかしながらＧＮＥ遺伝子の欠損は致死性であるため(非特許文献３)、ＧＮＥ遺伝子ノックアウト動物をＤＭＲＶの病態解明と治療方法の開発研究のためにモデル動物として用いることは不可能である。
本発明者の浅賀らは、ＤＭＲＶの日本人患者家系の解析から、ＧＮＥ遺伝子の１７１４番目の塩基がグアニン（Ｇ）からシトシン（Ｃ）に置換され、キナーゼ部位に含まれるＧＮＥタンパク質のＮ末端から５７２番目のアミノ酸残基であるバリン残基がロイシン残基に置換されているという点変異(V572L)を発見した(非特許文献４)（図２）。
ＧＮＥタンパク質は、シアル酸の生合成の鍵となる酵素であり、ウリジン２リン酸Ｎ-アセチルグルコサミン２エピメラーゼ(UDP-N-acetylglucosamine  2-epimerase)及びＮ-アセチルマンノサミンキナーゼ(N-acetylmannosamine kinase)の２つの活性を持っている。リコンビナントＧＮＥタンパク質の研究によりV572L変異ヒトＧＮＥはキナーゼ活性が低下し、その患者の骨格筋のＯ型糖鎖に影響があることが報告されている（Am J Pathol 166: 1211-1130, 2005）。さらに、ＧＮＥ代謝産物であるＮ-アセチルマンノサミンやＮ-アセチルノイラミン酸を加えることで、ＤＭＲＶ患者から採取した細胞のシアル酸化状態が回復したことが報告された(非特許文献５)。
しかしながら、現在においてもＤＭＲＶには有効な治療法は見つかっておらず、臨床現場では徐々に悪化していく状態を、手をこまねいて見ているしかないのが現状である。
【非特許文献１】J Neurol Sci 51: 141-153, 1981
【非特許文献２】Nat Genet 29: 83-87, 2001
【非特許文献３】PNAS 99: 5267-5270, 2002
【非特許文献４】Ann. Neurol. 52: 516-519, 2002
【非特許文献５】Rinsho Sinkeigaku. 2005 Nov; 45 (11): 943-945
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、ＤＭＲＶの病態解明と治療方法の開発研究のためにも、ＧＮＥ遺伝子に変異を導入したトランスジェニックの作出が切望されてきた。しかしながら、その作出は困難であり、ＧＮＥ欠損白血球や患者由来の繊維芽細胞レベルの開発研究にとどまっているのが現状である。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、変異型ＧＮＥ遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明によれば、ＧＮＥ遺伝子のゲノムＤＮＡに変異が導入されていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ＧＮＥ遺伝子のゲノムＤＮＡに変異が導入されているため、ＧＮＥ活性が低下しており、ＧＮＥ活性低下モデル動物となり得る。また、ＧＮＥタンパク質はシアル酸生合成経路に関与していることから、シアル酸生合成が不全となっており、シアル酸生合成能不全モデル動物となり得る。ＤＭＲＶモデル動物となり得ることは言うまでもない。さらに、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の腎臓では、アルブミン尿、尿細管拡張、出血、炎症性細胞浸潤、糸球体数の減少が観察されることから、腎臓機能が不全となっており、糸球体腎炎や間質性腎炎、ネフロンろう，ネフローゼ症候群などの腎臓疾患モデル動物にもなり得る。
【０００５】
さらに、本発明によれば、ＧＮＥ遺伝子のゲノムＤＮＡに変異が導入されていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部を用いた、疾病の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニング方法が提供される。本発明のスクリーニング方法は、ＤＭＲＶや腎臓疾患等のＧＮＥタンパク質、シアル酸生合成に関連した疾病の病態解明と治療方法の開発研究に用いることができるという効果を奏する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ＧＮＥ活性低下モデル動物、シアル酸生合成能不全モデル動物、ＤＭＲＶモデル動物又は腎臓疾患モデル動物として用いることができる。また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、モデル動物またはその一部を用いた、疾病の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニング方法に用いることができる。本発明のスクリーニング方法は、ＤＭＲＶや腎臓疾患等のＧＮＥタンパク質、シアル酸生合成に関連した疾病の病態解明と治療方法の開発研究に用いることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本願発明者は、ＧＮＥ遺伝子の点変異(V572L)がＤＭＲＶの原因であると考え、同じ点変異をＧＮＥ遺伝子に導入したマウスを作出し、この点変異がＤＭＲＶ様病態を発症することを証明すると共に、ＤＭＲＶ発症の分子機構の解明と治療法の開発を目指して研究を進めてきた。言うまでもないが、ＧＮＥタンパク質の活性に変化をもたらす部位は、ＧＮＥ活性が低下するという効果を有する限り、特に限定されるものではない。これは、表１表２及び図３からも容易に推察できる。表１表２及び図３に示すように、他の患者家系の解析から、V572L以外の変異を有するＤＭＲＶが存在することが明らかとなっている。特に、表１及び２には、国内外におけるＤＭＲＶ患者に見られる具体的な点変異が示されている。
しかしながら、本願においては下記の実施例に示す様に、ＧＮＥタンパク質の機能及び構造を考慮して、好ましくはＧＮＥタンパク質のキナーゼドメイン、さらに好ましくはＧＮＥ遺伝子のエクソン１０において変異を導入させた。
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【０００８】
ＤＭＲＶは、四肢の遠位が好んで侵される病型の骨格筋疾患であり、筋線維の中に細かい顆粒状の物質で縁取られた空胞が見られることが特徴であるが（図４Ａ）、細胞質内に好塩基性封入体が観察されることも特徴である（図４Ｂ）。また、ＤＭＲＶは、常染色体劣性の遺伝形式を示し、血清クレアチンキナーゼの軽度の上昇がみられることもある(J Neurol Sci 64: 33-43, 1984)。したがって、上記の病態は、本願のトランスジェニック非ヒト哺乳動物がＤＭＲＶモデル動物となり得るかの指標となる。
【０００９】
また、糸球体腎炎や間質性腎炎、ネフロンろう，ネフローゼ症候群などは、腎臓の疾患であり、タンパク尿、尿細管拡張、糸球体硬化、出血（血尿）、炎症性細胞浸潤等が見られることが特徴である。
【００１０】
ＧＮＥタンパク質は、シアル酸の生合成の鍵となる酵素であり、ウリジン２リン酸Ｎ-アセチルグルコサミン２エピメラーゼ及びＮ-アセチルマンノサミンキナーゼの２つの活性を持っており、ウリジン２リン酸Ｎ-アセチルグルコサミン(UDP-N-acetylglucosamine)からＮ-アセチルマンノサミン(N-acetylmannosamine)、Ｎ-アセチルマンノサミンからＮ-アセチルマンノサミン６リン酸(N-acetylmannosamine-6-P)の生合成に関わる酵素である。図５に示すように、哺乳動物細胞におけるシアル酸は、Ｎ-アセチルマンノサミン、もしくは、ウリジン２リン酸Ｎ-アセチルグルコサミンから、一連の酵素反応によって合成される。Ｎ-アセチルマンノサミンのリン酸化によって生合成が開始し、続くフォスフォエノールピルビン酸(PEP)との縮合によってシアル酸９リン酸ができる。特異的な脱リン酸化酵素によってリン酸モノエステルが加水分解されると、シアル酸は核内に輸送され、そこでCTPと縮合しCMP-シアル酸となり、活性化される。このように、ＧＮＥタンパク質はシアル酸の生合成に深く関与することが示されている。
【００１１】
本願のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ＧＮＥ遺伝子の変異により、ＧＮＥタンパク質の活性が低下しているので、ＧＮＥ活性が低下していることが原因の疾患のモデル動物になり得る。具体的には、ＤＭＲＶ，ＨＩＢＭ，Quadriceps sparing myopathyなどのモデル動物になり得ると考えられる。
また、ＧＮＥ活性の低下により、シアル酸の生合成能が不全となっていることが予測されるので、シアル酸生合成能不全が原因の疾患のモデル動物にもなり得る。具体的には、ＤＭＲＶ、ＨＩＢＭ、Quadriceps sparing myopathy、ダウン症候群（Gulesserian等、Amino Acids. 2006 May 26）、筋萎縮性側索硬化症（Niebroj-Dobosz等、Immunochemical quantification of glycoconjugates in serum and cerebrospinal fluid of amyotrophic lateral sclerosis patients. Eur J Neurol. 1999 May;6(3):335-40.）、アルツハイマー病（Functional & Molecular Glycobiology）などのモデル動物になり得ると考えられる。特に、筋萎縮性側索硬化症およびアルツハイマー病については、細胞内封入体が疾患の発症に関与していると考えられている。ダウン症については、ＧＮＥの下流にあるシアル酸合成酵素（Sialic Acid Synthase, SAS）（図５）の低下が関与していると考えられている。
【００１２】
さらに、本願のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ＧＮＥ遺伝子の変異により、腎臓機能が不全となっているので、腎臓疾患モデル動物になり得る。具体的には、糸球体腎炎や間質性腎炎、ネフロンろう，ネフローゼ症候群などのモデル動物になり得ると考えられる。
【００１３】
本願において、「ＧＮＥ遺伝子のゲノムＤＮＡに変異が導入されている」とは、ＧＮＥ遺伝子の塩基配列の一部に、欠損、置換または付加を生じさせる変異が加えられていることをいう。ＧＮＥ遺伝子のゲノムＤＮＡに変異を導入するためには、ＧＮＥ遺伝子に対して欠失、置換または付加のうち、１つまたは２つ以上の方法を併せて使用してもよい。
【００１４】
本願において、「ＧＮＥタンパク質のキナーゼドメイン」とは、ＧＮＥタンパク質が有するキナーゼ活性に関与する領域のことであり、Ｎ末端から約４０１番目から約６００番目のアミノ酸残基に相当する。
【００１５】
本願において、「ＧＮＥ遺伝子のエキソン１０」とは、ＧＮＥ遺伝子塩基配列の１６３４番目から１８１６番目の塩基のことをいう。
【００１６】
本願において、「ＧＮＥ活性」とは、ＧＮＥタンパク質のエピメラーゼ活性及び／又はキナーゼ活性のことをいうものとする。
【００１７】
本願において、「ＧＮＥ活性が低下している」とは、変異型ＧＮＥ遺伝子の発現産物のＧＮＥタンパク質としてのエピメラーゼ活性及び／又はキナーゼ活性が天然型のＧＮＥタンパク質よりも低下していることをいうものとする。
【００１８】
本願において、「シアル酸生合成能不全である」とは、シアル酸の生合成能が、野生型と比較して低下していることをいうものとする。
【００１９】
本願において、「縁取り空胞型遠位型ミオパチー表現型を発現している」とは、筋線維の中に細かい顆粒状の物質で縁取られた空胞が見られること、細胞質内に好塩基性封入体が見られること、及び／又は血漿クレアチンキナーゼ値が上昇している状態のことをいうものとする。
【００２０】
本願において、「腎臓機能不全」とは、腎臓の機能が低下又は障害を受けている状態のことをいうものとする。その指標として、尿細管拡張、糸球体硬化、出血（血尿）、炎症性細胞浸潤、尿中アルブミン濃度の上昇等が挙げられる。
【００２１】
本願において、「腎臓疾患」とは、腎臓機能が不全となった状態のことをいい、具体的な疾患としては糸球体腎炎や間質性腎炎、ネフロンろう，ネフローゼ症候群などが挙げられる。
【００２２】
本発明のＧＮＥ遺伝子に変異を持つトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、公知の遺伝子相同組み換え法（ジーンターゲッティング法）により作製することができる。ジーンターゲッティング法は、本分野においては良く知られた技術であり、本分野の種々の実験書の教示に従って行うことができる。先ず、マウスのゲノムデータベースからＧＮＥ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を入手する。その情報をもとにＧＮＥ遺伝子の必要な領域をＰＣＲで増幅するか、ゲノムライブラリーから単離する。そして、そのゲノムの情報から、ＧＮＥ遺伝子の機能を低下あるいは欠損させた配列を有するターゲティングベクターを、下記の方法により作製することができる。
【００２３】
ターゲティングベクターを設計するにあたり、ＧＮＥ遺伝子の構造に変化をもたらす部位は、ＧＮＥ遺伝子の発現産物がＧＮＥタンパク質としての活性を低下させるという効果を有する限り、特に限定されるものではない。
【００２４】
また、ベクターを導入した組み換え体につき、ターゲティングベクターにより導入した薬剤耐性遺伝子を用いたスクリーニングとサザンブロット法やＰＣＲ法を用いたスクリーニングを併用して、選抜することが好ましい。そのために、それらのスクリーニングを容易に行う事ができるように便宜を考えてターゲティングベクターを設計することが望ましい。薬剤選択のマーカー遺伝子として、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子等を使用することができる。また、ネガティブ選択用遺伝子には、ＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素Ａ遺伝子等を使用することができる。
【００２５】
そのＤＮＡ断片を試験管内において遺伝子操作し、ＧＮＥ遺伝子の発現産物がＧＮＥタンパク質としての活性が低下するような変異ＤＮＡを作製する。なお下記の実施例においては、下記に詳しく述べるＣｒｅ−ｌｏｘＰのシステム（Ｒ．Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，１４２７−１４２９，１９９５）を用いて、ＧＮＥ遺伝子を変異させることを可能とするベクターを構築し、ＧＮＥタンパク質の活性を低下させている。しかし、本発明はＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いた方法に限定されるものではなく、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いない最も一般的なトランスジェニックマウスの作製方法によっても、ＧＮＥタンパク質の活性を低下させるような種々の改変を行うことができる。
【００２６】
次いで上記の方法により作製したターゲッティングベクターを使用して、相同組み換えを行う。本願明細書において、「ＧＮＥ遺伝子の相同組み換え」とは、ＧＮＥ遺伝子と同一または類似の塩基配列を有する改変したＧＮＥ遺伝子を、ゲノム中のＧＮＥ遺伝子のＤＮＡ領域に、人工的に組み換えさせることをいう。
【００２７】
目的とする遺伝子の相同組み換えが起こる頻度は低いことが知られており、目的とする相同組み換え体を得るためには、多数の組み換え体をスクリーニングする必要がある。しかし、受精卵では多数のスクリーニングを行うことが技術的に困難である。よって、受精卵と同様に多分化能を有し、かつｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができる細胞を使用することが好ましい。そして、その目的を達成するためには胚性幹細胞（ＥＳ細胞）による方法を用いることができるが、それに限定されるものではない。
【００２８】
現在マウス由来のＥＳ細胞株がいくつか確立されており、その一つに下記の実施例で使用しているＥ１４ＴＧ２ａ細胞株がある。しかし、それに限定されるものではなく、他のマウス由来のＥＳ細胞株である、ＴＴ２細胞株、ＡＢ−１細胞株、Ｊ１細胞株、Ｒ１細胞株等を使用することもできる。これらのいずれのＥＳ細胞株を用いるかは、実験の目的や方法により適宜選択して決定することができる。
【００２９】
ＧＮＥ遺伝子を改変してその発現産物の活性を低下させたターゲティングベクターを公知の方法に準じてマウスＥＳ細胞に導入する。そして、ＥＳ細胞中の目的とするＧＮＥ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を、ターゲティングベクター中の活性が低下したＧＮＥ遺伝子による相同組み換えによって置換する。相同組み換えは、ＧＮＥ遺伝子ゲノムＤＮＡ配列と、ターゲティングベクター中の非改変部分との配列との相同性を利用して、ある確率をもって生じさせることができる。
【００３０】
ターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入する方法としては、公知の電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リポソーム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等も利用できるが、導入遺伝子の相同組み換え効率を考えると、電気穿孔法を用いることが好ましい。
【００３１】
得られた組み換えＥＳ細胞につき、相同組み換えが起こっているかどうかのスクリーニングを行う。即ち、まずネオマイシン等の導入した薬剤耐性因子によりスクリーニングを行う。更にスクリーニングを確実にする為に、サザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、スクリーニングを行う。これらのアッセイにより、染色体上に存在する野生型ＧＮＥ遺伝子と導入したＧＮＥ遺伝子の間で正しく相同遺伝子組み換えが起こり、染色体上のＧＮＥ遺伝子に変異が移った細胞を選択することができる。
【００３２】
こうして得た変異遺伝子を持つＥＳ細胞を、野生型マウスの胚盤胞または８細胞期の胚内に導入する。そして、このＥＳ細胞とのキメラ胚を偽妊娠状態の仮親マウスの子宮に移植し、出産させることによりキメラ動物を作製することができる。トランスジェニック動物は、現在はＥＳ細胞が確立しているマウスにおいて作製することができるが、将来の技術進歩により他の動物種においても作製が可能となるであろう。
【００３３】
ＥＳ細胞を胚盤胞等の胚に導入する方法としては、マイクロインジュクション法や凝集法が知られているが、いずれの方法を用いることも可能であり、当業者が適宜改変することができる。マウスの場合には、ホルモン剤（例えば、ＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧおよびＬＨ様作用を有するｈＣＧを使用）により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、胚盤胞を用いる場合には受精から３．５日目に、８細胞期胚を用いる場合には２．５日目に、それぞれ子宮や卵管から初期発生胚を回収する。このようにして回収した胚に対して、ターゲティングベクターを用いて相同組み換えを行ったＥＳ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて注入し、キメラ胚を作製する。
【００３４】
一方、仮親とするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などの処置をした雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上記の方法により作製したキメラ胚を子宮内移植し、妊娠・出産させることによりキメラマウスを作製することができる。キメラ胚の着床、妊娠がより確実に起こるようにするため、受精卵を採取する雌マウスと仮親となる偽妊娠マウスとを、同一の性周期にある雌マウス群から作出することが望ましい。
【００３５】
ＥＳ細胞に由来する生殖細胞を持つマウス個体が、このようなキメラマウスの中から得られた場合、このキメラマウスを純系のマウスと交配し、そして次世代個体にＥＳ細胞由来の被毛色が現れることにより、ＥＳ細胞がキメラマウス生殖系列へ導入されたことを確認することができる。ＥＳ細胞が生殖系列へ導入されたことを確認するには、様々な形質を指標として用いることができるが、確認の容易さを考慮して、被毛色によることが望ましい。マウスにおいては野ネズミ色（アグーチ色）、黒色、黄土色、チョコレート色および白色などの被毛色が知られているが、使用するＥＳ細胞の由来系統を考慮して、キメラマウスと交配させるマウス系統を適宜選択することができる。また、体の一部（例えば尾部先端）からＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析やＰＣＲアッセイを行うことにより、選抜を行うこともまた可能である。
【００３６】
この様に、胚内に移植された組み換えＥＳ細胞が生殖系列に導入された動物を選択し、そのキメラ動物を繁殖させることにより、目的とする遺伝子発現産物の活性が低下した個体を得ることができる。得られたＧＮＥ活性低下ヘテロ接合体マウス同士を交配させることにより、目的とする遺伝子欠損ホモ接合マウスを得ることができる。作出されたＧＮＥ変異遺伝子を保有するヘテロ接合体、あるいはホモ接合体は生殖細胞および体細胞のすべてに安定的にＧＮＥ遺伝子変異を有しており、交配等により効率よくその変異を子孫動物に伝達することができる。
【００３７】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示に過ぎない。例えば、上述したように、変異を導入し、ＧＮＥタンパク質の活性に変化をもたらす部位は、ＧＮＥ活性が低下するという効果を有する限り、特に限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３９】
実施例１  ＧＮＥ点変異（V572L）マウスの作出
【００４０】
（１）ターゲティングベクターの構築
マウスＧＮＥ遺伝子のエキソン10にV572L (GTG → CTG)となるように点突然変異を導入することを目的としてターゲティングベクターを構築した。図６に、エキソン１０に変異を導入するために本発明で使用したターゲティングベクターの構造、及び相同組み換えにより得られる遺伝子の構造を示す。図６において、□で囲まれた数字の５から１２はエキソン５からエキソン１２を、それぞれ示す。
【００４１】
１） カリフォルニア工科大学のマウス バクテリア人工染色体ライブラリー (BAC) (Male CJ7/129SV由来、Research Genetics, Huntsville, AL, USA)をスクリーニングし、マウスＧＮＥ遺伝子を含むBACを得た。
２）National center for biotechnology informationのデータベース (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 及びマウスBACの塩基配列を決定することにより得たデータから制限酵素地図を作製した。
３）ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 用のプライマーを設計
マウスBACを鋳型としてターゲティングベクターの長腕側 (9.0 kb)と短腕側 (1.0 kb)を別々にPCRで増幅し、pBluescript II SK(+)ベクター (Stratagene, La Jolla, CA, USA)にサブクローニングした。
PCRで増幅された全てのエキソン領域並びにエキソンーイントロン境界部分は直接塩基配列を決定しPCRエラーが無いことを確認した。
尚、マウスＧＮＥ遺伝子のエキソン10は長腕側に含まれるようにPCRプライマーを設計し、長腕側PCR産物の3’末端と短腕側PCR産物の5’末端は一部重なる配列を含んでいる。
４）ターゲティングベクターの長腕側をサブクローニングしたベクター（長腕ベクター）  上のＧＮＥ遺伝子エキソン10にsite-directed mutagenesis法を用いてV572Lとなるように点突然変異 (GTG → CTG) を導入した。
５）短腕ベクターにジフテリア毒素A遺伝子（大阪大学大学院生命機能研究科の八木健先生より分与）を導入した。
６）短腕ベクターのマウスＧＮＥ遺伝子のイントロン10にネオマイシン耐性遺伝子（loxP-Neo-loxPカセット）を導入した。
７）点突然変異 (V572L)、ネオマイシン耐性遺伝子およびジフテリア毒素A遺伝子を含む短腕ベクターの一部分を制限酵素で切り出し、長腕を含むベクターにサブクローニングすることで目的とするターゲティングベクターを得た。
【００４２】
（２）ＧＮＥ点変異マウスの作出
【００４３】
下記の実施例において示すように、本発明のトランスジェニックマウスを作製するにあたり、コンディショナルなトランスジェニックマウスの作製において汎用されている、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰのシステム（R.Kuhn et al.Science,269,1427-1429,1995）を用いることも可能である。実施例においては既に述べたように、ＧＮＥ遺伝子を変異させることを可能とする、ターゲティングベクターを用いている。
１）相同組換えＥＳ細胞クローンの単離
作成したターゲティングベクターを制限酵素（Kpn I）で切断して直鎖状にした後、エレクトロポレーション（250V, 500μF）によりマウスＥＳ細胞（E14-1）に導入した。ＥＳ細胞を250μg/ml G418を含むＥＳ細胞培地により７-10日間培養し、G418耐性のＥＳ細胞のコロニーを作らせ、順次約670個のコロニーを単離した。各ＥＳ細胞クローンより染色体DNAを調製し、PCRにより相同組換えクローンをスクリーニングした。たった一つであったがPCR陽性のクローンが同定できたので、そのクローンを凍結保存すると共に、PCR産物のDNA塩基配列を読むことにより、思いどおりの点変異がＥＳ細胞のＧＮＥ遺伝子に導入されたことを確認した。
【００４４】
２）相同組換えＥＳ細胞からのネオマイシン耐性遺伝子の除去
相同組換えＥＳ細胞を融解・培養し、Cre遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクター（Adex-CANCre、東京大学医科学研究所の斎藤泉先生より分与）を感染させた。感染させたＥＳ細胞からコロニーを作らせ、約30個のコロニーを単離し、Creが発現してloxP配列で挟まれたネオマイシン耐性遺伝子が除去されたＥＳ細胞クローンをPCRにより選別した。約80％のクローンで思いどおりの除去に成功しており、12個のクローンを凍結保存すると共に、各クローンの核型（染色体の数）をカウントした。
【００４５】
３）相同組換えＥＳ細胞からキメラマウスの作出
核型の正常なクローンを２つ選抜し、野生型マウスの８細胞期胚とＥＳ細胞塊を接着させる凝集法（集合キメラ法）によりキメラ胚を作成し、偽妊娠受容雌マウスの子宮に移植した（図７）。各々のＥＳ細胞クローンからキメラ率の高い（毛色判定で80％以上）キメラマウスを複数匹得ることができた（図８）。
【００４６】
４）キメラマウスからＧＮＥ点変異ホモマウスの作出
キメラ率の高い雄のキメラマウスと野生型のC57BL/6マウスとを交配し、ＥＳ細胞由来の精子が受精したF1マウスを得ることに成功した。尾部から調製した染色体DNAをPCRで解析することにより、ＧＮＥ点変異ヘテロマウスが得られていることを確認した。ついでＧＮＥ点変異ヘテロマウス同士を交配することにより、目的のＧＮＥ点変異ホモマウスの作出に成功した（図９）。ＧＮＥ完全破壊マウスは胎生致死であることが報告されているが、ＧＮＥ点変異ホモマウスは正常に出生し成長した。また、雌雄共に繁殖能力は正常であった。なお、先に選抜した２つのクローンの両方からＧＮＥ点変異ホモマウスを得ることができ、以下に述べるＧＮＥ点変異ホモマウスの病態は両方のマウスに共通に見られた。
【００４７】
実施例２  ＧＮＥ点変異（V572L）マウスの表現型
【００４８】
（１）筋肉の凍結切片の作製
マウスはエーテル麻酔下で頸椎脱臼により安楽死させた。
背筋、大腿四頭筋、前脛骨筋の３カ所の骨格筋を筋線維にそってなるべく長くなるように摘出した。
摘出された筋組織はクリオモルドに対して筋線維を垂直にたてるように配置し、筋組織のほとんどが露出するように少量の包埋剤を流し込んだ。
クリオモルドをピンセットではさみ、あらかじめ十分に冷却したイソペンタン中に沈め、細かく揺すりながら凍結させた。
イソペンタンは、100mlビーカーに70ml程を注ぎ入れ、液体窒素中にビーカーを浸けて冷却した。
クライオスタットを用いて10μmの厚さの切片を作製し、MASコートされたスライドグラスに貼付けた。
ティシュー・テック  クリオモルド2号（Tissue-Tek 4566） サクラファインテックジャパン株式会社
凍結組織切片作製用包埋剤（M.E CRYO COMPOUND）株式会社マイクロ・エッヂ・インスツルメント
クライオスタット  ライカ凍結ミクロトーム CMシリーズ（LEICA CM1900）ライカマイクロシステムズ株式会社
MATUNAMI MASコート付  MICRO SLIDE GLASS
イソペンタン（isopentane）和光純薬166-00615
【００４９】
（２）ヘマトキシリンエオジン染色法
ハリスヘマトキシリン液で5分間染色後、流水で10分間水洗。その後、0.5%エオジン液で1分間染色し、流水で1分水洗した。アルコールで脱水し、キシレンで透徹後、カナダバルサムで封入した。なお、この実施例においては、下記の試薬等を用いて下記の条件で処理を行った。
試薬
ヘマトキシリン
Harris hematoxylin solution (Merck, Darmstadt, Germany)
エオジン
Eosin Y-solution 0.5% (Merck, Darmstadt, Germany)
カナダバルサム
Nacalai tesque
1. Harris ヘマトキシリン液  ５min
2. 水洗  10 min
3. 0.5% エオジン液  1 min
4. 水洗  1min
5. アルコール脱水
70%  2分
80%  2分
95%  2分
99%  3分
99%  3分
6. キシレン  3分
7. キシレン  ３分
8. カナダバルサムで封入
【００５０】
（３）NADH-TR染色
凍結保存してあるNADH液を解凍しNBT液と1:1の割合で混ぜる。この混合液を凍結切片にまんべんなくかけ、乾燥しないように湿潤したチャンバー内に置き、37℃で30分間インキュベートした。次いでイオン交換水で軽く水洗し、アセトンで分別し、水洗後グリセリンゼリーで封入した。
試薬
Gelatin   (Difco)
Glycerol  (Nacalai tesque)
Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced (NADH) (関東化学)
Nitro blue tetrazolium (Merck, Darmstadt, Germany)
＜グリセリンゼリー＞
ゼラチンをイオン交換水で溶解しグリセリンとフェノールを加えて80℃で混和した。37℃に温めて使用した。
１． 凍結保存してあるNADH液を解凍後NBT液に加えた。
２． 上記混合液をスライドガラス上の凍結切片にかけ、チャンバー内で37℃、30分間インキュベートした。
３． イオン交換水で軽く洗浄した。
４． 30%アセトンに数秒間浸漬した。
５． 60%アセトンに数秒間浸漬した。
６． 90%アセトンに数秒間浸漬した。
７． イオン交換水で軽く洗浄した。
８． グリセリンゼリーで封入した。
【００５１】
（４）抗ユビキチン抗体を用いた免疫組織化学染色
作成した筋肉の凍結切片を、ペルオキシダーゼブロッキング溶液を用いて−２０℃で２０分間処理し，２％ヤギ血清を用いて常温で６０分間ブロッキングした。その後、一次抗体を適当に希釈し４℃で一晩反応させ、ＴＢＳＴで洗浄した後に二次抗体を反応させた。ABC Rabbit IgG Kit（Vector PK-6101）で処理した後，ＤＡＢ溶液（Vector SK-4100）で発色させた。
【００５２】
免疫染色に使用した一次抗体は、ウサギ抗ユビキチン抗体（DakoCytomation, Cat#Z-0458）である。二次抗体はヤギ抗ウサギIgGビオチン化抗体(Vector BA-1000)を用いた。
【００５３】
（５）透過電子顕微鏡による観察
マウスを２．５％グルタールアルデヒドを含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で心臓より灌流固定し、組織を取り出し同じ固定液でさらに１時間固定した。その後、１％四酸化オスミウムを含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１時間、後固定した。次に上昇エタノール系列とプロピレンオキシドで脱水後、エポン包埋した。超薄切片作製後、酢酸ウランとクエン酸鉛で二重染色し、透過電子顕微鏡（日立  Ｈ７６００）で観察・撮影した。
【００５４】
（６）血漿クレアチンキナーゼ値測定
測定には３ヶ月齢から２４ヶ月齢のマウスを、野生型個体１１匹、ヘテロ個体２７匹、ホモ個体２８匹用いた。
【００５５】
ヘパリンコート処理したヘマトクリット毛細管（ドラモンド社製）を用いて、マウス尾部より30-50μlの血液を採取した。遠心分離操作（6,600回転、5分間）後、血漿成分のみを分離して試料とした。測定は富士ドライケム3500（富士フイルムメディカル製）及び同社製のクレアチンキナーゼ測定用スライド（CPK-PIII）による比色法を用いて行った。
【００５６】
（７）尿中アルブミン濃度測定
測定には３ヶ月齢から２４ヶ月齢のマウスを、野生型個体１０匹、ヘテロ個体２１匹、ホモ個体１８匹用い、ＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００５７】
ＧＮＥ点変異（V572L）マウスの表現型
ＧＮＥ完全破壊マウスは胎生致死であったのに対し、ＧＮＥ点変異マウスは正常に生まれてきた。雌雄ともに妊よう性に異常はなく、外見上は特に異常は認められなかった。
ＤＭＲＶは、筋線維の中に縁取り空胞が認められることが特徴であるが、細胞質内に好塩基性封入体が観察されることも特徴であり、これらの病理的変化が診断の決め手となる。本願発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の骨格筋を、月齢を追って解析したところ、明らかな縁取り空胞の形成は認められないが、患者でも病変が出やすい大腿四頭筋において、１０ヵ月齢以降の個体において好塩基性封入体が観察された（図１０及び図１１）。１５ヵ月齢まで観察を続けたところ、多くの筋繊維で封入体が観察された。さらに、電子顕微鏡を用いて１５ヵ月齢のＧＮＥ点変異マウスの大腿四頭筋の封入体を観察したところ、オートファゴソーム、オートリソソーム、グリコゲノソーム様構造や管状構造が観察された（図１２）。これらは、縁取り空胞の出現の前兆であると考えられる。
また、再生筋線維と思われる像も観察されたことから、筋線維の破壊の指標となる血漿クレアチンキナーゼ値を測定したところ、野生型マウスに比べてＧＮＥ点変異ホモマウスとヘテロマウスで高い値を示す個体がいることがわかった（図１３）。さらに、糸球体障害の指標となり、慢性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、腎硬化症など糸球体に組織変化をきたす腎臓疾患患者の尿中に出現する尿中アルブミン濃度を測定したところ、野生型マウスとＧＮＥ点変異ヘテロマウスの間には大きな違いは見られなかったが、ＧＮＥ点変異ホモマウスでは、有意に高い値を示し、糸球体に障害を有することが推察された（図１４）。そこで、腎臓組織を採取し観察したところ、皮質においては尿細管拡張、出血及び炎症性細胞浸潤が見られ（図１５）、髄質においては出血が見られ（図１６）、腎臓機能が不全となっていることが明らかとなった。
さらに、本発明のＧＮＥ点変異ホモマウス、ＧＮＥ点変異ヘテロマウス及び野生型マウスの５００日齢までの生存率を確認したところ、離乳した全てのマウスにおいて１ヵ月や２ヵ月で死亡するマウスは確認されず、８０日齢までの生存率がほぼ１００％であった（図１７）。その後、ＧＮＥ点変異ホモマウスの生存率は、ＧＮＥ点変異ヘテロマウス及び野生型マウスと比較して低い傾向を示したが、約４０％が５００日齢まで生存し、モデル動物として有用であることが明らかとなった。
以上のことから、本発明のＧＮＥ点変異マウスは、ＤＭＲＶの特徴的な病態を発症しており、ＤＭＲＶモデルマウスであることが明らかとなっただけでなく、腎臓疾患モデルマウスであることも明らかとなった。
【００５８】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、ＤＭＲＶ患者において下腿伸筋群が強く障害されることを示す像である。特に、図１ＡはＤＭＲＶ患者の全体像を示す図であり、図１Ｂは下腿のＭＲＩ像を示す図である。
【図２】図２は、ＤＭＲＶ患者における遺伝子異常を示す図である。特に、図２Ａは正常対照者の塩基配列を示す図であり、図２ＢはＤＭＲＶ患者の塩基配列を示す図である。
【図３】図３は、ＤＭＲＶに認められたＧＮＥ遺伝子変異の分布図である。
【図４】図４は、ＤＭＲＶの病理を示す組織像である。
【図５】図５は、シアル酸の合成経路を示した図である。
【図６】図６は、本発明において行われた遺伝子相同組み換えの概要を示した模式図である。
【図７】図７は、本発明のキメラマウスを作製するための手順を示した模式図である。
【図８】図８は、集合キメラ法により作出されたキメラ胚及びキメラマウスである。
【図９】図９は、キメラマウスからトランスジェニックマウスの作製手順を示した模式図である。
【図１０】図１０は、月齢による大腿四頭筋の組織像を示す像である。特に、図１０Ａは３．５ヵ月齢、図１０Ｂは、１０ヵ月齢、図１０Ｃは１５ヵ月齢の本発明のマウス大腿四頭筋の組織像を示す図である。
【図１１】図１１は、１５ヵ月齢の本発明のマウス大腿四頭筋の抗ユビキチン抗体を用いた免疫化学染色組織像を示す図である。
【図１２】図１２は、１５ヵ月齢の本発明のマウス大腿四頭筋の電子顕微鏡像を示す図である。
【図１３】図１３は血漿中のクレアチンキナーゼ値を示す図である。横軸はマウス月齢を表し，各個体の値は凡例により図示している。
【図１４】図１４は、図尿中のアルブミン濃度を示す図である。図中の数値は各遺伝子型における平均値を示し、各個体の値は凡例により図示している。
【図１５】図１５は、１５ヵ月齢の本発明のマウスの腎臓皮質の組織像を示す像である。
【図１６】図１６は、１５ヵ月齢の本発明のマウスの腎臓髄質の組織像を示す像である。
【図１７】図１７は、本発明のマウスの５００日齢までの生存率を示す図である。
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１７】
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【図１】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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