(57)【要約】【課題】  ＩＬ−１介在性疾患もしくは障害の処置における使用のために、重鎖および軽鎖のＣＤＲが規定されるアミノ酸配列を有する、ＩＬ−１β結合分子を提供すること。【解決手段】  ＩＬ−１介在性疾患もしくは障害の処置における使用のために、重鎖および軽鎖のＣＤＲが規定されるアミノ酸配列を有する、ＩＬ−１β結合分子を見いだした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む少なくとも一つの免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む抗原結合部位を含むＩＬ−１β結合分子であって、該ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｓｎを有し、該ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙを有し、そして該ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを有する、結合分子；ならびにその直接的同等物。
【請求項２】
配列に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む少なくとも一つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含むＩＬ−１β結合分子であって、該ＣＤＲ１’はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓを有し、該ＣＤＲ２’はアミノ酸配列Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒを有し、そして該ＣＤＲ３’はアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを有する、結合分子；ならびにその直接的同等物。
【請求項３】
重鎖(ＶＨ)および軽鎖(ＶＬ)可変ドメインの両方を含むＩＬ−１β結合分子であって、そこでは該ＩＬ−１β結合分子は：
ａ)配列に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)であって、該ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｓｎを有し、該ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙを有し、そして該ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを有する、ドメイン(ＶＨ)、ならびに
ｂ）配列に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)であって、該ＣＤＲ１’はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓを有し、該ＣＤＲ２’はアミノ酸配列Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒを有し、そして該ＣＤＲ３’はアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを有する、ドメイン(ＶＬ)、を含む少なくとも一つの抗原結合部位を含む、結合分子；ならびにその直接的同等物。
【請求項４】
ヒト抗体である、請求項１、２もしくは３に記載のＩＬ−１β結合分子。
【請求項５】
１位のアミノ酸から始まりかつ１１８位のアミノ酸で終わる配列番号１に示されるものと実質的に同一のアミノ酸配列を有する第一のドメインもしくは上述の第一のドメインのどちらか、ならびに１位のアミノ酸から始まりかつ１０７位のアミノ酸で終わる配列番号２に示されるものと実質的に同一のアミノ酸配列を有する第二のドメインを含む、少なくとも一つの抗原結合部位を含む、ＩＬ−１β結合分子。
【請求項６】
重鎖もしくはそのフラグメントをコードする第一のＤＮＡ構築体であって、それは、
ａ)フレームワークおよび超可変領域を交互に含む可変ドメインをコードする第一の部分であって、該超可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号１に示されるところの配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３にあり；可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まりそして可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる、第一の部分、ならびに
ｂ)重鎖の定常部分の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まりそして定常部分もしくはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンに続く停止コドンで終わるところの重鎖の定常部分もしくはそのフラグメントをコードする第二の部分、を含む構築体。
【請求項７】
軽鎖もしくはそのフラグメントをコードする第二のＤＮＡ構築体であって、それは、
ａ)フレームワークおよび超可変領域を交互に含む可変ドメインをコードする第一の部分であって；該超可変領域はＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’であり、そのアミノ酸配列は配列番号２に示され；可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まりそして可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる第一の部分、ならびに
ｂ)軽鎖の定常部分の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まりそして定常部分もしくはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンに続く停止コドンで終わるところの軽鎖の定常部分もしくはそのフラグメントをコードする第二の部分、を含む構築体。
【請求項８】
請求項６もしくは請求項７に記載の少なくとも一つのＤＮＡ構築体を含む、原核生物もしくは真核生物の細胞株中で複製できる発現ベクター。
【請求項９】
(ｉ)請求項８に記載の発現ベクターで形質転換される生物を培養することおよび(ｉｉ)培養液からＩＬ−１β結合分子を回収することを含む、ＩＬ−１β結合分子の製造方法。
【請求項１０】
Ｇｌｕ  ６４残基を含むループを含む成熟ヒトＩＬ−１βの抗原エピトープに対して抗原結合特異性を有し、そしてＩＬ−１βのその受容体への結合を阻害する能力を有する、ＩＬ−１βに対する抗体。
【請求項１１】
ｉ)請求項１０に記載のＩＬ−１βに対する抗体のＩＬ−１介在性疾患もしくは障害の処置のための使用；
ｉｉ)請求項１０に記載の抗体の有効量を患者に投与することを含む、患者におけるＩＬ−１介在性疾患もしくは障害の処置をするための方法；
ｉｉｉ)薬学的に許容される賦形剤、希釈剤もしくは担体と組合せて、請求項１０に記載のＩＬ−１βに対する抗体を含む、医薬組成物；ならびに
ｉｖ)請求項１０に記載のＩＬ−１βに対する抗体を、ＩＬ−１介在性疾患もしくは障害の処置をする医薬品を調製するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト・インターロイキンＩベータ(ＩＬ−１β)に対する抗体およびＩＬ−１介在性疾患および障害の処置のためのそのような抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキンＩ(ＩＬ−１)は、急性期炎症反応のメディエイターとして作用する、免疫システムの細胞により生成される活性体(activity)である。不適切なもしくは過剰のＩＬ−１、特にＩＬ−１β、の生成は、敗血症、敗血症性もしくは内毒素性のショック、アレルギー、喘息、骨欠損、虚血、発作、リウマチ様関節炎および他の炎症障害のような、種々の疾患および障害の病理に関連している。ＩＬ−１βに対する抗体はＩＬ−１介在性疾患および障害の処置での使用に提案されている；例えばＷＯ  ９５／０１９９７およびその序言における議論を参照すること。
【発明の開示】
【０００３】
我々は、今回、ＩＬ−１介在性疾患および障害の処置に使用するための、ヒトＩＬ−１βに対する改善した抗体を調製した。
【０００４】
したがって、本発明は、配列に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む少なくとも一つの免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む抗原結合部位を含むＩＬ−１β結合分子であって、該ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｓｎを有し、該ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙを有し、そして該ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを有する、結合分子；ならびにその直接的同等物を提供する。
【０００５】
したがって、本発明は、配列に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む少なくとも一つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含むＩＬ−１β結合分子であって、該ＣＤＲ１’はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓを有し、該ＣＤＲ２’はアミノ酸配列Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒを有し、そして該ＣＤＲ３’はアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを有する、結合分子；ならびにその直接的同等物を提供する。
【０００６】
第一の態様において、本発明は、上で規定した重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む単離免疫グロブリン重鎖を含む単一ドメインＩＬ−１β結合分子を提供する。
【０００７】
第二の態様において、本発明はまた、重鎖(ＶＨ)および軽鎖(ＶＬ)の両方の可変ドメインを含むＩＬ−１β結合分子であって、そこでは該ＩＬ−１β結合分子は：
ａ)配列に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)であって、該ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｓｎを有し、該ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙを有し、そして該ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを有する、ドメイン(ＶＨ)、ならびに
ｂ）配列に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)であって、該ＣＤＲ１’はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓを有し、該ＣＤＲ２’はアミノ酸配列Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒを有し、そして該ＣＤＲ３’はアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを有する、ドメイン(ＶＬ)、を含む少なくとも一つの抗原結合部位を含む、結合分子；ならびにその直接的同等物を提供する。
【０００８】
特記しない限り、いかなるポリペプチド鎖も、本明細書において、Ｎ−末端に始まりかつＣ−末端に終わるアミノ酸配列を持つとして記述される。抗原結合部位がＶＨおよびＶＬドメインの両方を含むときには、これらは同じポリペプチド分子上に位置し得るかまたは、好ましくは、それぞれのドメインは異なる鎖上に在り得るが、ＶＨドメインは免疫グロブリン重鎖もしくはそのフラグメントの部分でありそしてＶＬドメインは免疫グロブリン軽鎖もしくはそのフラグメントの部分である。
【０００９】
“ＩＬ−１β結合分子”とは、単独かもしくは他の分子と関連するかのどちらかでＩＬ−１β抗原に結合する能力のある任意の分子を意味する。結合反応を示し得る標準的な方法(定性的アッセイ)として挙げられるものは、例えば、無関連の特異性を持つが同じイソタイプの抗体、例えば抗−ＣＤ２５抗体、を用いる陰性対照テストを規準とする、ＩＬ−１βのその受容体への結合の阻害を測定するバイオアッセイもしくは任意の種類の結合アッセイである。有利なことには、本発明のＩＬ−１β結合分子のＩＬ−１βへの結合は競合的結合アッセイで示され得る。
【００１０】
抗原結合分子の例としては、Ｂ細胞もしくはハイブリドーマにより生成される抗体およびキメラの、ＣＤＲ−移植のもしくはヒトの抗体またはそれらの任意のフラグメント、例えばＦ(ａｂ’)２およびＦａｂフラグメント、ならびに単一鎖もしくは単一ドメイン抗体が挙げられる。
【００１１】
単一鎖抗体は、通常は１０〜３０のアミノ酸、好ましくは１５〜２５のアミノ酸からなるペプチドリンカーにより共有結合した抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインからなる。それ故に、そのような構造には重鎖および軽鎖の定常部分が含まれておらず、そして、小さいペプチドスペーサーは全体の定常部分より抗原性が小さいと信じられている。
【００１２】
“キメラ抗体”とは、そこでは、重鎖もしくは軽鎖またはその両方の定常領域がヒト由来である一方で、重鎖および軽鎖両方の可変ドメインは非−ヒト(例えばマウス)由来であるかもしくはヒト由来であるが異なるヒト抗体から誘導化されるところの抗体を意味する。“ＣＤＲ−移植抗体”とは、超可変領域(ＣＤＲ)が非−ヒト(例えばマウス)抗体もしくは異なるヒト抗体のような、ドナー抗体から誘導化される一方で、免疫グロブリンの全てのもしくは実質的に全ての他の部分、例えば、定常領域および可変ドメインの高度保存部分、即ちフレームワーク領域が受容者の抗体、例えばヒト由来の抗体、から誘導化されるところの抗体を意味する。しかしながら、ＣＤＲ−移植抗体は、フレームワーク領域において、例えば超可変領域に隣接するフレームワーク領域の部分において、ドナー配列の少数のアミノ酸を含んでもよい。“ヒト抗体”とは、例えばＥＰ  ０５４６０７３  Ｂ１、ＵＳＰ  ５５４５８０６、ＵＳＰ  ５５６９８２５、ＵＳＰ  ５６２５１２６、ＵＳＰ  ５６３３４２５、ＵＳＰ  ５６６１０１６、ＵＳＰ  ５７７０４２９、ＥＰ  ０４３８４７４  Ｂ１およびＥＰ  ０４６３１５１  Ｂ１に一般用語で記載されているように、重鎖もしくは軽鎖両方の定常および可変領域が全てヒト由来であるか、もしくはヒト由来の配列に実質的に同一であるが、必ずしも同じ抗体からでない抗体を意味し、そして、マウス免疫グロブリンの可変および定常部遺伝子がそれらのヒト同等物により置換されたマウスにより生成された抗体を含む。
【００１３】
本発明の特に好ましいＩＬ−１β結合分子はヒト抗体、とりわけ実施例でこの後説明するようなＡＣＺ  ８８５抗体である。
【００１４】
したがって、好ましいキメラ抗体においては、重鎖および軽鎖両方の可変ドメインはヒト由来であり、例えば、配列番号１および配列番号２に示されるＡＣＺ  ８８５抗体のものである。定常領域ドメインは、好ましくはまた、例えば“Sequences of Proteins of Immunological Interest”、Kabat E. A. et al., US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health、に記載されているような適当なヒト定常領域ドメインを含む。
【００１５】
超可変領域はいかなる種類のフレームワーク領域と関連してもよいが、好ましくはヒト由来である。適当なフレームワーク領域は、Kabat E. A. et al.、同書中に記載されている。好ましい重鎖フレームワークはヒト重鎖フレームワーク、例えば、配列番号１に示されるＡＣＺ  ８８５抗体のものである。それは配列でＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の領域からなる。同様に、配列番号２は、配列でＦＲ１’、ＦＲ２’、ＦＲ３’およびＦＲ４’の領域からなるところの好ましいＡＣＺ  ８８５軽鎖フレームワークを示す。
【００１６】
したがって、本発明はまた、１位のアミノ酸から始まりかつ１１８位のアミノ酸で終わる配列番号１に示されるものと実質的に同一のアミノ酸配列を有する第一のドメインもしくは上述の第一のドメインのどちらか、ならびに１位のアミノ酸から始まりかつ１０７位のアミノ酸で終わる配列番号２に示されるものと実質的に同一のアミノ酸配列を有する第二のドメインを含む、少なくとも一つの抗原結合部位を含む、ＩＬ−１β結合分子を提供する。
【００１７】
全てのヒトに自然に見出されるタンパク質に対して育てられたモノクローナル抗体は、非−ヒトシステム中で、例えばマウス中で、典型的には発育し、そしてそれ自体では、典型的に非−ヒトタンパク質である。この直接的結果として、ハイブリドーマにより生成されるような異種間の抗体は、ヒトに投与されたとき、異種間の免疫グロブリンの定常部分により優先的に介在されるところの望ましくない免疫反応を誘発する。それらは長期間にわたって投与できないので、このことは明らかにそのような抗体の使用を制限する。それ故に、ヒトに投与されたとき、実質的な同種異系反応を誘発しない、単一鎖の、単一ドメインの、キメラの、ＣＤＲ−移植のもしくはヒトの抗体を使用することは特に好ましい。
【００１８】
上述の事項の観点において、本発明のさらに好ましいＩＬ−１β結合分子は、
ａ)(ｉ)配列に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む可変ドメインならびに(ｉｉ)ヒト重鎖の定常部分もしくはそのフラグメントであって、該ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｓｎを有し、該ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙを有し、そして該ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを有するところの、免疫グロブリン重鎖もしくはそのフラグメントならびに
ｂ）(ｉ)配列にこれらの超可変領域ならびに所望によりまたＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’の超可変領域を含む可変ドメインならびに(ｉｉ)ヒト軽鎖の定常部分もしくはそのフラグメントであって、該ＣＤＲ１’はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓを有し、該ＣＤＲ２’はアミノ酸配列Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒを有し、そして該ＣＤＲ３’はアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを有するところの、免疫グロブリン軽鎖もしくはそのフラグメント、を少なくとも含むところのヒト抗ＩＬ−１β抗体；ならびにその直接的同等物から選択される。
【００１９】
これに代えて、本発明のＩＬ−１β結合分子は、
ａ)配列に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む第一のドメインであって、該超可変領域は配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するドメイン、
ｂ)配列に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む第二のドメインであって、該超可変領域は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するドメイン、ならびに
ｃ)第一のドメインのＮ−末端にかつ第二のドメインのＣ−末端にもしくは第一のドメインのＣ−末端にかつ第二のドメインのＮ−末端に、のどちらかに結合するペプチド・リンカー、を含む抗原結合部位を含むところの単一鎖結合分子；ならびにその直接的同等物から選択される。
【００２０】
周知のように、一つの、少数のもしくは数個さえのアミノ酸の欠失、追加または置換のような、アミノ酸配列における軽微な変更は、実質的に同一の性質を有する元のタンパク質の対立遺伝子形に至るであろう。
【００２１】
したがって、“その直接的同等物”なる用語の意味するものは、
(ｉ)そこでは、全体として取った超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、配列番号１に示される超可変領域に少なくとも８０％相同的、好ましくは少なくとも９０％相同的、さらに好ましくは少なくとも９５％相同的であり、ならびに
(ｉｉ)それは、分子Ｘのものと同一のフレームワーク領域を有するが、配列番号１に示されるものと同一の超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有する、規準分子と実質的に同じ程度でＩＬ−１βのその受容体への結合を阻害する能力のあるところのいかなる単一ドメインＩＬ−１β結合分子(分子Ｘ)、
または
(ｉ)そこでは、全体として取った超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’は、配列番号１および２に示される超可変領域に少なくとも８０％相同的、好ましくは少なくとも９０％相同的、さらに好ましくは少なくとも９５％相同的であり、ならびに
(ｉｉ)それは、分子Ｘ’と同一のフレームワーク領域および定常部分を有するが、配列番号１および２に示されるものと同一の超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を有する、規準分子と実質的に同じ程度でＩＬ−１βのその受容体への結合を阻害する能力のあるところの、結合部位当り少なくとも二つのドメインを有するいかなるＩＬ−１β結合分子(分子Ｘ’)、のどちらかである。
【００２２】
本明細書において、アミノ酸配列は互いに少なくとも８０％相同的であるが、この場合には、これらは、配列が最適にアラインし、アミノ酸配列中のギャップもしくは挿入は非−同一の残基として計算されるときには、似た場所に少なくとも８０％の同一のアミノ酸残基を有する。
【００２３】
ＩＬ−１βのその受容体への結合の阻害は、本明細書に後記されるようなアッセイを含む種々のアッセイで簡便に試験され得る。“同じ程度で”なる用語とは、規準および同等の分子が、統計学的根拠で、上記のアッセイの一つにおいて本質的に同一なＩＬ−１β結合曲線を示すことを意味する。例えば、本発明のＩＬ−１β結合分子がＩＬ−１βのその受容体への結合の阻害について典型的に有するＩＣ５０値は、上述のようにアッセイするとき、対応する規準分子のＩＣ５０と好ましくは実質的に同じものの±×５以内である。
例えば、使用されるアッセイは、可溶性ＩＬ−１β受容体および本発明のＩＬ−１β結合分子によるＩＬ−１βの結合の競合的阻害のアッセイであってもよい。
【００２４】
最も好ましくは、ヒトＩＬ−１β抗体は、
ａ)１位のアミノ酸から始まりかつ１１８位のアミノ酸で終わる配列番号１に示されるものと実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインならびにヒト重鎖の定常部分を含むところの一つの重鎖；ならびに
ｂ)１位のアミノ酸から始まりかつ１０７位のアミノ酸で終わる配列番号２に示されるものと実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインならびにヒト軽鎖の定常部分を含むところの一つの軽鎖、を少なくとも含む。
【００２５】
ヒト重鎖の定常部分は、γ１、γ２、γ３、γ４、μ、α１、α２、δもしくはεタイプ、好ましくはγタイプ、さらに好ましくはγ１タイプであってもよいが一方では、ヒト軽鎖の定常部分は、κもしくはλタイプ(λ１、λ２およびλ３サブタイプを含む)であってもよいが、好ましくはκタイプである。これらの定常部分全てのアミノ酸配列はKabat et al.、同書中に与えられている。
【００２６】
本発明のＩＬ−１β結合分子は、組換えＤＮＡ技法により生成され得る。この観点において、結合分子をコードする一つもしくはそれ以上のＤＮＡ分子を構築し、適切な対照配列下に置きそして発現用の適当な宿主生物内に転移させなければならない。
【００２７】
非常に一般的な様式において、したがって
(ｉ)本発明の単一ドメインＩＬ−１β結合分子、本発明の単一鎖ＩＬ−１β結合分子および本発明のＩＬ−１β結合分子の重鎖もしくは軽鎖またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ分子、ならびに
(ｉｉ)組換え手段による本発明のＩＬ−１β結合分子の生成のために本発明のＤＮＡ分子の使用、が提供される。
【００２８】
この技術の現況は、ここで提供される情報、即ち、超可変領域のアミノ酸配列およびそれらをコードするＤＮＡ配列が与えられると、当業者は本発明のＤＮＡ分子を合成することができるというようなものである。可変ドメイン遺伝子を構築する方法は、例えばＥＰＡ  ２３９  ４００に記載されていてそして以下に簡潔にまとめられ得る：どんな特異性を持つＭＡｂの可変ドメインをコードする遺伝子をクローン化する。フレームワークおよび超可変領域をコードするＤＮＡセグメントを決定し、そして、フレームワーク領域をコードするＤＮＡセグメントが結合点で適当な制限部位と共に融合されるように、超可変領域をコードするＤＮＡセグメントを除去する。制限部位は、標準手順によるＤＮＡ分子の突然変異誘発により適切な位置に作成され得る。二本鎖の合成ＣＤＲカセットを配列番号１もしくは２に与えられた配列にしたがうＤＮＡ合成により調製する。これらのカセットは、それらがフレームワークの結合点で連結されることができるように、付着末端と共に提供される。
【００２９】
さらに、本発明のＩＬ−１β結合分子をコードするＤＮＡ構築体を得るために、生成するハイブリドーマ細胞株からｍＲＮＡへのアクセスを持つことは必要ではない。かくして、ＰＣＴ出願第ＷＯ  ９０／０７８６１号は、遺伝子のヌクレオチド配列について書いた情報のみをつけて、組換えＤＮＡ技法による抗体の生成についての完全な指示書を与えている。この方法は、数多くのオリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ法によるそれらの増幅および所望のＤＮＡ配列を得るためのそれらのスプライシングを含む。
【００３０】
重鎖および軽鎖の定常部分をコードする適当なプロモーターもしくは遺伝子を含む発現ベクターは公的に入手可能である。かくして、いったん本発明のＤＮＡ分子が調製されると、それは適切な発現ベクター中に簡便に転移され得る。単一鎖抗体をコードするＤＮＡ分子はまた、例えばＷＯ  ８８／１６４９に記載されているような標準方法により調製され得る。
前述の事項の観点において、ハイブリドーマもしくは細胞株の供託は、本明細書の十分性の判定基準を満たすために全く必要ではない。
【００３１】
特別な実施態様において、本発明は下記のＩＬ−１β結合分子を生成するための第一および第二のＤＮＡ構築体を含む：
第一のＤＮＡ構築体は重鎖もしくはそのフラグメントをコード化し、そして、
ａ)フレームワークおよび超可変領域を交互に含む可変ドメインをコードする第一の部分であって、該超可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号１に示されるところの配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３にあり；可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まりそして可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる、第一の部分、ならびに
ｂ)重鎖の定常部分の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まりそして定常部分もしくはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンに続く停止コドンで終わるところの重鎖の定常部分もしくはそのフラグメントをコードする第二の部分、を含む。
【００３２】
好ましくは、この第一の部分は、１位のアミノ酸から始まりかつ１１８位のアミノ酸で終わる配列番号１に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインをコードする。さらに好ましくは、この第一の部分は、１位のヌクレオチドから始まりかつ３５４位のヌクレオチドで終わる配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。また好ましくは、第二の部分はヒト重鎖の定常部分、さらに好ましくはヒトγ１鎖の定常部分、をコードする。この第二の部分はゲノム由来のＤＮＡフラグメント(イントロンを含む)もしくはｃＤＮＡフラグメント(イントロン無し)であってもよい。
【００３３】
第二のＤＮＡ構築体は、軽鎖もしくはそのフラグメントをコード化し、そして、
ａ)フレームワークおよび超可変領域を交互に含む可変ドメインをコードする第一の部分であって；該超可変領域はＣＤＲ３’、所望によりＣＤＲ１’およびＣＤＲ２’、であり、そのアミノ酸配列は配列番号２に示され；可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まりそして可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる第一の部分、ならびに
ｂ)軽鎖の定常部分の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まりそして定常部分もしくはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンに続く停止コドンで終わるところの軽鎖の定常部分もしくはそのフラグメントをコードする第二の部分、を含む。
【００３４】
好ましくは、この第一の部分は、１位のアミノ酸から始まりかつ１０７位のアミノ酸で終わる配列番号２に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインをコードする。さらに好ましくは、この第一の部分は、１位のヌクレオチドから始まりかつ３２１位のヌクレオチドで終わる配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有する。また好ましくは、第二の部分はヒト軽鎖の定常部分、さらに好ましくはヒトκ鎖の定常部分、をコードする。
【００３５】
本発明はまた、そこでＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’もしくはＣＤＲ３’またはフレームワークの残基の一つもしくはそれ以上、典型的には少数(例えば１〜４)が、配列番号１および配列番号２に示される残基から、例えば突然変異、例えば対応するＤＮＡ配列の部位指向突然変異誘発、により変化されるところのＩＬ−１β結合分子を含む。本発明は、そのような変化したＩＬ−１β結合分子をコードするＤＮＡ配列を含む。特に本発明は、一つもしくはそれ以上のＣＤＲ１’もしくはＣＤＲ２’の残基が配列番号２に示される残基から変化されているところのＩＬ−１β結合分子を含む。
【００３６】
第一および第二の構築体において、第一および第二の部分はイントロンにより離されていてもよく、そして、エンハンサーが第一および第二の部分の間のイントロン中に簡便に位置してもよい。転写されるが翻訳されない、そのようなエンハンサーの存在は効率的な転写を手助けするであろう。特別な実施態様において、第一および第二の構築体は、有利にはヒト由来の重鎖遺伝子のエンハンサーを含む。
【００３７】
ＤＮＡ構築体のいずれも、適当な対照配列の制御下に、特に適当なプロモーターの制御下に、配置される。いかなる種類のプロモーターも、それが、そこでＤＮＡ構築体が発現のために転移されるであろうところの宿主生物に適応するならば、使用され得る。しかしながら、もし発現が哺乳類の細胞中で起こるとすると、免疫グロブリン遺伝子のプロモーターを使用することが特に好ましい。
【００３８】
望ましい抗体は、細胞培養液もしくはトランスジェニック動物中で生成され得る。適当なトランスジェニック動物は標準的な方法により得られ得るが、これらは、適当な対照配列下に配置された第一および第二の構築体を卵中にマイクロインジェクションし、そのように調製した卵を適切な擬−妊娠雌内に転移させ、そして望ましい抗体を発現する子孫を選択することを含む。
【００３９】
抗体鎖を細胞培養液中で生成するときには、ＤＮＡ構築体を、単一の発現ベクター内にもしくは二つの別であるが適合性の発現ベクター内に先ず挿入しなければならないが、後者の可能性が好ましい。
【００４０】
したがって、本発明はまた、上述のＤＮＡ構築体を少なくとも一つ含むところの原核生物もしくは真核生物の細胞株中に複製できる発現ベクターを提供する。
【００４１】
ＤＮＡ構築体を含むそれぞれの発現ベクターは、それから、適当な宿主生物内に転移される。ＤＮＡ構築体を二つの発現ベクター上に別々に挿入するときには、それらは別々に、即ち、細胞当り一つのタイプのベクターで転移するか、もしくは共−転移するかでよいが、後者の可能性が好ましい。適当な宿主生物は細菌の、酵母のもしくは哺乳類の細胞株であってもよいが、後者が望ましい。さらに好ましくは、哺乳類の細胞株は、リンパ球由来、例えば骨髄腫、ハイブリドーマもしくは正常な不死化Ｂ細胞、であるが、それは簡便には、いかなる内因性抗体の重鎖もしくは軽鎖を発現しない。
【００４２】
哺乳類の細胞における発現については、ＩＬ−１β結合分子をコードする配列が、ＩＬ−１β結合分子の高レベル発現を許容するか好むところの遺伝子座内部で宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれることが好ましい。そこでＩＬ−１β結合分子をコードする配列がそのように好まれる遺伝子座内に組み込まれている細胞は、それらを発現するＩＬ−１β結合分子のレベルに基づいて確認されかつ選択され得る。ＩＬ−１β結合分子をコードする配列を含む宿主細胞の調製のためには、いかなる適当な選択性マーカーも用い得る；例えば、ｄｈｆｒ遺伝子／メトトレキセートもしくは同等の選択システムを用い得る。本発明のＩＬ−１β結合分子の発現のための代わりのシステムとしては、ＥＰ  ０２５６０５５  Ｂ、ＥＰ  ０３２３９９７  Ｂおよび欧州特許出願第８９３０３９６４.４号に記載されているもののような、ＧＳベースの増幅／選択システムが挙げられる。
【００４３】
本発明のさらなる態様において、(ｉ)上で規定するような発現ベクターで形質転換される生物を培養すること、および(ｉｉ)培養液からＩＬ−１β結合分子を回収することを含む、ＩＬ−１β結合分子の製造方法が提供される。
【００４４】
本発明にしたがって、ＡＣＺ  ８８５抗体は、成熟ヒトＩＬ−１βのＧｌｕ  ６４残基を含むループを含むヒトＩＬ−１βの抗原エピトープに対して結合特異性を有するように思える。(成熟ヒトＩＬ−１βのＧｌｕ  ６４残基はヒトＩＬ−１β前駆体の残基１８０に相当する。)  このエピトープはＩＬ−１受容体の認識部位の外にあるように思われ、そしてそれ故に、このエピトープの抗体、例えばＡＣＺ  ８８５抗体、がＩＬ−１βのその受容体への結合を阻害する能力を有することは最も驚くべきである。Ｇｌｕ  ６４残基を含むループを含む成熟ヒトＩＬ−１βの抗原エピトープに対して結合特異性を有しそしてＩＬ−１βのその受容体への結合を阻害する能力を有するところの抗体、特にキメラのおよびＣＤＲ−移植の抗体そして特別にヒト抗体；ならびにそのような抗体のＩＬ−１介在性疾患および障害の処置のための使用は、新規でありそして本発明の範囲内に含まれる。
【００４５】
かくしてさらなる態様において、本発明は、成熟ヒトＩＬ−１βのＧｌｕ  ６４残基を含むループを含むヒトＩＬ−１βの抗原エピトープに対して抗原結合特異性を有しそしてＩＬ−１βのその受容体への結合を阻害する能力を有するところのＩＬ−１βに対する抗体を含む。
【００４６】
なおさらなる態様において、本発明が含むものは：
ｉ)Ｇｌｕ  ６４を含むループを含む成熟ヒトＩＬ−１βの抗原エピトープに対して抗原結合特異性を有しそしてＩＬ−１βのその受容体への結合を阻害する能力を有するところのＩＬ−１βに対する抗体、のＩＬ−１介在性疾患もしくは障害の処置のための使用；
ｉｉ)Ｇｌｕ  ６４を含むループを含む成熟ヒトＩＬ−１βの抗原エピトープに対して抗原結合特異性を有しそしてＩＬ−１βのその受容体への結合を阻害する能力を有するところのＩＬ−１βに対する抗体の有効量を患者に投与することを含む、患者にＩＬ−１介在性疾患もしくは障害の処置をするための方法；
ｉｉｉ)薬学的に許容される賦形剤、希釈剤もしくは担体と組合せて、Ｇｌｕ  ６４を含むループを含む成熟ヒトＩＬ−１βの抗原エピトープに対して抗原結合特異性を有しそしてＩＬ−１βのその受容体への結合を阻害する能力を有するところのＩＬ−１βに対する抗体を含む、医薬組成物；ならびに
ｉｖ)Ｇｌｕ  ６４を含むループを含む成熟ヒトＩＬ−１βの抗原エピトープに対して抗原結合特異性を有しそしてＩＬ−１βのその受容体への結合を阻害する能力を有するところのＩＬ−１βに対する抗体を、ＩＬ−１介在性疾患もしくは障害の処置をする医薬品を調製するために使用すること、である。
【００４７】
本説明の目的のために、もし抗体が実質的にＡＣＺ  ８８５抗体と同じ程度でＩＬ−１βのその受容体への結合を阻害する能力を有するならば、抗体は“ＩＬ−１βの結合を阻害する能力を有する”が、ここで“同じ程度で”とは上で規定した意味を有する。
【００４８】
ＡＣＺ  ８８５抗体は、抗−ＩＬ−１β抗体、例えば抗ヒトＩＬ−１β抗体、について以前報告された親和性より高いところのＩＬ−１βに対する結合親和性を有する。かくして、ＡＣＺ  ８８５は、約５０ｐＭ以下、例えば約３５ｐＭ、のＩＬ−１βへの結合に対する解離平衡定数ＫＤを有する。この高い結合親和性は、ＡＣＺ  ８８５抗体を治療的応用に特に適したものにする。
【００４９】
かくしてなおさらなる態様において、本発明は、約５０ｐＭもしくはそれ以下のＩＬ−１βへの結合に対するＫＤを有する、ＩＬ−１βに対する抗体を提供する。本発明のこの態様はまた、Ｇｌｕ  ６４を含むループを含む成熟ヒトＩＬ−１βの抗原決定因子に対して結合特異性を有するＩＬ−１βに対する抗体について上で説明したように、そのように高い親和性抗体についての使用、方法および組成物を含む。
【００５０】
本説明において、“ＩＬ−１介在性疾患”なる用語は、そこで、疾患または状態の因果関係、発展、進歩、存続もしくは病理学を含む疾患または医療状態において、直接的もしくは間接的であれ、ＩＬ−１が役割を果たすところの、全ての疾患および医療状態を包含する。
【００５１】
本説明において、“処置”もしくは“処置する”なる用語は、予防的もしくは予防の処置ならびに治癒的もしくは疾患を緩和する処置の両方を指すが、これは疾患に罹る危険にあるかもしくは疾患に罹っている疑いのある患者ならびに病気であるかまたは疾患もしくは医療状態に罹っていると診断されている患者の処置を含み、そして臨床的再発の抑制を含む。
【００５２】
上で規定したＩＬ−１β結合分子、特に本発明の第一および第二の態様にしたがうＩＬ−１β結合分子、Ｇｌｕ  ６４を含むループを含む成熟ヒトＩＬ−１βの抗原エピトープに対して抗原結合特異性を有する抗体、特にＩＬ−１βのその受容体への結合を阻害する能力を有する抗体、ならびに約５０ｐＭもしくはそれ以下のＩＬ−１βへの結合に対するＫＤを有する、ＩＬ−１βに対する抗体、はここでは“本発明の抗体”という。
【００５３】
好ましくは、本発明の抗体は本発明の第一および第二の態様にしたがうＩＬ−１β結合分子である。有利なことには、本発明の抗体はヒト抗体、最も好ましくはＡＣＺ  ８８５抗体もしくはその直接的同等物である。
【００５４】
本発明の抗体はＩＬ−１βの標的細胞への影響を遮断し、したがってＩＬ−１介在性疾患および障害の処置における使用に適用される。本発明の抗体のこれらおよび他の薬理学的活性は、例えば下記に記載するような標準試験方法で実証されるであろう：
【００５５】
一次ヒト繊維芽細胞によるＰＧＥ２およびインターロイキン−６のＩＬ−１β依存性生成の中和。
【００５６】
一次ヒト皮膚繊維芽細胞におけるＰＧＥ２およびＩＬ−６の生成はＩＬ−１βに依存する。ＴＮＦ−α単独ではこれらの炎症メディエーターを効率的に誘導できないが、ＩＬ−１と相乗作用を示す。一次ヒト皮膚繊維芽細胞はＩＬ−１−誘導細胞の活性化についての代用モデルとして使用される。
一次ヒト皮膚繊維芽細胞は、組換えＩＬ−１βまたは本発明の抗体もしくは６〜１８,０００ｐＭの範囲にあるＩＬ−１ＲＡの種々の濃度の存在下でＬＰＳ−刺激ヒトＰＢＭＣから得られる順化培地で刺激される。キメラ抗ＣＤ２５抗体Simulect[登録商標](バシリキシマブ)を、マッチド・イソタイプ対照として用いる。１６時間刺激後、上澄み液を取り、ＥＬＩＳＡにてＩＬ−６に対するアッセイを行う。本発明の抗体は、上の通り試験するとき、典型的にＩＬ−６生成阻害に対して約１ｎＭもしくはそれ以下（例えば、約０.１〜約１ｎＭ）のＩＣ５０を有する。
【００５７】
上のアッセイで示されるように、本発明の抗体は、ＩＬ−１βの効果を強力に遮断する。したがって、本発明の抗体は以下のような医薬的有用性を有する：
本発明の抗体は、ＩＬ−１介在性疾患もしくは医療状態、例えば、炎症状態、アレルギーおよびアレルギー状態、過敏反応、自己免疫疾患、重症感染、ならびに臓器もしくは組織移植拒絶反応、の予防および処置に有用である。
【００５８】
例えば、本発明の抗体は、同種移植片拒絶反応もしくは異種移植片拒絶反応を含む、心臓、肺臓、心肺同時、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚もしくは角膜の移植のレシピエントの処置のために、ならびに以下の骨髄移植および臓器移植に関連する動脈硬化のような移植片対宿主疾患の予防のために使用され得る。
【００５９】
本発明の抗体は、自己免疫疾患について、ならびに、骨欠損、炎症性疼痛、過敏反応(気道過敏反応および皮膚超過敏反応の両者を含む)およびアレルギーを伴う、炎症状態ならびにリウマチ性疾患を含む、炎症状態、特に関節炎(例えば、リウマチ様関節炎、慢性順行性関節炎および変形性関節炎)のような自己免疫成分を含む病因を有する炎症状態、ならびにリウマチ性疾患の、処置、予防、もしくは改善に特に有用である。本発明の抗体が使用され得る特異的自己免疫疾患としては、自己免疫性血液障害(例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、赤芽球ろう、および特発性血小板減少症を含む)、全身性エリテマトーデス、多発性軟骨炎、強皮症、Wegener肉芽腫、皮膚筋炎、活動性慢性肝炎、重症筋無力症、乾癬、Stevens−Johnson症候群、特発性鵞口瘡、自己免疫性炎症性腸疾患(例えば、潰瘍性大腸炎、Crohn病、および過敏性腸症候群を含む)、内分泌性眼障害、Graves病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病(Ｉ型糖尿病)、ブドウ膜炎(前部および後部)、乾性角結膜炎および春季カタル、間質性肺繊維症、乾癬性関節炎、ならびに糸球体腎炎(有および無−ネフローゼ症候群、例えば、特発性ネフローゼ症候群もしくは微小変化型腎症を含む)が挙げられる。
【００６０】
本発明の抗体はまた、喘息、気管支炎、塵肺、肺気腫および気道の他の閉塞性もしくは炎症性疾患の処置、予防もしくは改善に対しても有用である。
【００６１】
本発明の抗体は、ＩＬ−１によって介在されるかまたはＩＬ−１、特にＩＬ−１β、の生成もしくはＩＬ−１によるＴＮＦ放出の促進を伴うところの、望ましくない急性および超急性炎症反応、例えば、急性感染症、例えば敗血症性ショック(例えば、エンドトキシンショックおよび成人呼吸窮迫症候群)、髄膜炎、肺炎；ならびに重症やけどの処置に対して：ならびに感染、がん、もしくは臓器不全に必然的な病的ＴＮＦ放出に付随する、カヘキシーもしくは消耗症候群、特にＡＩＤＳ関連カヘキシー、例えば、ＨＩＶ感染に随伴するもしくは必然なもの、の処置に対して有用である。
【００６２】
本発明の抗体は、骨関節症、骨粗しょう症、および他の炎症性関節炎を含む骨代謝の疾患、ならびに加齢に関連する骨欠損および特に歯周疾患を含む骨欠損一般の処置に対して特に有用である。
【００６３】
これらの適用については、適切な服用量は、勿論、例えば使用する本発明の特定の抗体、宿主、投与形態、および処置する状態の性質および重症度に依存して変化する。しかしながら、予防的用途においては、満足な結果は、体重キログラム当たり約０.０５ｍｇ〜約１０ｍｇ、さらに普通には体重キログラム当たり約０.１ｍｇ〜約５ｍｇの投与量で得られると、一般的に示されている。予防的使用のための服用頻度は、普通には毎週約一回から３箇月毎に約一回まで、さらに普通には２週間毎に約一回から１０週間毎に約一回まで、例えば４〜８週間毎に一回までの範囲にあるであろう。簡便には、本発明の抗体は、非経腸的、静脈内例えば前肘もしくは他の末梢性静脈内へ、筋肉内、または皮下的に投与される。予防的な処置は、典型的には、本発明の抗体を毎月一回から２〜３箇月毎に一回までもしくはそれ以下の頻度で投与することを含む。
【００６４】
本発明の医薬組成物は、従来の様式で製造され得る。本発明にしたがう組成物は、好ましくは凍結乾燥した剤形で提供される。直接投与の場合には、適当な水性担体、例えば、注射用の無菌水もしくは無菌の緩衝生理食塩水にそれを溶かす。もしボラス注射としてよりむしろ点滴による投与のためにより大容量の溶液を作成することが望まれるならば、ヒト血清アルブミンもしくは患者自身のヘパリン添加血を生理食塩水中に処方時に組み入れることが有利である。そのような生理的に不活性なタンパク質の過剰な存在は、輸液で使用される容器および管の壁上への吸着による抗体の損失を防止する。もしアルブミンを用いるならば、適当な濃度は、生理食塩水の０.５〜４.５重量％である。
【００６５】
可溶性ＩＬ−１受容体ＩおよびＩＩによるＩＬ−１β結合の阻害の用量−作用曲線を示す添付図を参照するところの以下の実施例において、例示の意図でさらに本発明を説明する。
【実施例】
【００６６】
実施例
マウス免疫グロブリン・レパートリー(Fishwild et al., 1996, Nat Biotechnol., 14, 845-851)の代わりに、ヒトＩｇＧ／κレパートリーを発現すべく操作されたトランスジェニック・マウスを用い、ヒトＩＬ−１βに対する抗体を作成する。これらのマウスからのＢ細胞を標準的なハイブリドーマ技法によって不死化し、そしてヒトＩｇＧ１／κ抗体ＡＣＺ  ８８５を分泌するマウス・ハイブリドーマ細胞を得る。
【００６７】
実施例１：ハイブリドーマの作成と抗体の精製
遺伝子操作されたマウス１８０７７(Medarex Inc. Annadale, NJ)を、アジュバント中で幾つかの部位でＫＬＨ(５０μg)皮下注射にカップリングさせた組換えヒトＩＬ−１βで免疫する。融合３日前に、最終注射でさらに５回マウスを追加免疫する。融合の日に、マウス１８０７７をＣＯ２吸入により屠殺し、そしてＰＥＧ４０００を用いる通常方法により、脾細胞(４.１×１０７)を同数のＰＡＩ−Ｏ細胞、マウス骨髄腫細胞株、と融合する。融合細胞を、マウス腹膜細胞(Ｂａｌｂ  Ｃマウス)の支持細胞層を含む６２４ウェル(１ｍｌ／ウェル)中において、ＨＡＴを補充したＲＰＭＩ１６４０、１０％熱不活化ウシ胎仔血清５×１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール中で、平板培養する。上澄み液を収集し、ＥＬＩＳＡで試験しそしてＩＬ−１βに反応性のモノクローナル抗体のためのスクリーニングを行う。ＩｇＧ／κサブクラスの五個のモノクローナル抗体が同定される。４×９６ウェル・マイクロタイタープレートを用い、ウェル当たり０.５個の細胞を平板培養してクローニングを行う。二週間後ウェルを倒立顕微鏡で検査する。成長がポジティブなウェルから上澄み液を収集し、抗−ＩＬ−１βモノクローナル抗体の生成をＥＬＩＳＡで評価する。最初に同定されたハイブリドーマ＃６５７の四個のサブクローンからの順化上澄み液１〜２Ｌを調製し、そして、タンパク質Ａカラム上のアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製する。
【００６８】
重鎖および軽鎖の純度ならびに部分的アミノ酸配列
アミノ酸シーケンシング
精製した抗体ＡＣＺ  ８８５の軽および重鎖をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてアミノ末端アミノ酸をEdman分解により測定する。これらの研究で用いる抗体の純度は、シークエンシングによると、≧９０％である。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を、クローン化したハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により得て、そして十分にシークエンシングする。重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ末端配列ならびに対応するＤＮＡ配列を、以下の配列番号１および配列番号２に示すが、そこではＣＤＲを太字タイプで示す。
【００６９】
【表１】
2008295456.tif 000002
【００７０】
重鎖および軽鎖のための発現ベクターの構築
ＥＰ  ０２５６０５５  Ｂ、ＥＰ  ０３２３９９７  Ｂもしくは欧州特許出願第８９３０３９６４.４号に記載されたもののようなＧＳベースの増幅／選択システムを用いるが、ここで、使用する選択可能マーカーはＧＳコーディング配列である。
【００７１】
実施例２：生化学的および生物学的データ
モノクローナル抗体ＡＣＺ  ８８５は、インビトロでインターロイキン−１βの活性を中和すると見出されている。さらに、モノクローナル抗体をBiacore分析により、組換えヒトＩＬ−１βとの結合について特色づける。可溶性ＩＬ−１受容体との競合的結合試験により中和の様式を査定する。組換えおよび天然産出のＩＬ−１βに対する抗体ＡＣＺ  ８８５の生物活性を、ＩＬ−１βによる刺激に応答する一次ヒト細胞(実施例３)で測定する。
【００７２】
解離平衡定数の測定
組換えヒトＩＬ−１ベータのＡＣＺ  ８８５との結合に対する会合および解離速度定数を、BIAcore分析によって測定する。ＡＣＺ  ８８５を固定化し、そして１〜４ｎＭの濃度範囲における組換えＩＬ−１ベータの結合を、表面プラズモン共鳴により測定する。選択したフォーマットは一価性相互作用を表し、かくしてＩＬ−１βのＡＣＺ  ８８５に対する結合イベントを１：１の化学量論に従って取り扱うことを可能にする。BIAevaluationソフトウェアを用いてデータ解析を行う。
【表２】
2008295456.tif 000003
結論：ＡＣＺ  ８８５は、極めて高い親和性で組換えヒトＩＬ−１ベータに結合する。
【００７３】
可溶性ＩＬ−１のＩおよびＩＩ型受容体との結合競合試験
ＡＣＺ  ８８５と可溶性ヒトＩＬ−１のＩ型およびＩＩ型受容体との間の競合を、Biacoreによって測定する。ＡＣＺ  ８８５をチップ表面に固定化し、増加する濃度の組換えヒト可溶性受容体Ｉ型もしくは受容体ＩＩ型(０〜１２ｎＭ；おのおの４回の独立実験)の非存在下もしくは存在下で、ＡＣＺ  ８８５と結合させるために組換えヒトＩＬ−ベータ(１ｎＭ)を注入する。得られた結果を添付図に示す。
【００７４】
組換えヒト可溶性ＩＬ−１のＩ型もしくはＩＩ型受容体の存在下で、ＮＶＰ−ＡＣＺ  ８８５のヒトＩＬ−１βへの結合を測定した。Origin ６.０ソフトウェアを用いて、半極大値(ＩＣ５０)を図表的に測定した。平均値±ＳＥＭを得る(ｎ＝４)。
結論：ＡＣＺ  ８８５のＩＬ−１ベータへの結合は、ＩＬ−１受容体のＩ型もしくはＩＩ型の両方と競合的である。
【００７５】
ヒトＩＬ−１アルファ、ヒトＩＬ−１ＲＡ、および他の種からのＩＬ−１ベータに対する反応性プロフィール
ヒトＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ＲＡ、ならびにカニクイザル、ウサギ、マウスおよびラットのＩＬ−１ベータに対するＡＣＺ  ８８５の反応性プロフィールをBiacore分析によって測定する。ＡＣＺ  ８８５を固定化し、そして試験するサイトカインを８ｎＭの濃度(６回の独立した実験)で加える。
【表３】
2008295456.tif 000004
注入開始後１０００秒で共鳴ユニットを読み取った；すべてのセンサーグラムから走査緩衝液の注入を差し引き、そして抗−Ｆｃγの固定化後のベースラインをゼロに設定した。ヒトＩＬ−１βに対する積算共鳴ユニットの百分率として結合を表示する。
結論：ＡＣＺ  ８８５は、ヒトＩＬ−１アルファ、ヒトＩＬ−１ＲＡ、またはカニクイザル、ウサギ、マウスもしくはラットのＩＬ−１ベータと有意に交差反応しない。
【００７６】
実施例３：ＡＣＺ  ８８５によるヒト皮膚繊維芽細胞からのＩＬ−６放出の中和
次の方法論を用いて、ＡＣＺ  ８８５のヒトＩＬ−１βの作用を中和する生物活性を査定した。
【００７７】
１．ＩＬ−１βを含む順化培地の調製
ヒト末梢血単核細胞からの順化培地の調製を次のように行った：サルの末梢血からHanselの方法[Hansel, T. T. et. al. (1991)。高度精製ヒト血液好酸球の単離のための改良された免疫磁気手順。J. Imm. Methods 145: 105-110]にしたがって、ficoll-hypaque密度分離を用いて単核細胞を調製した; それらをＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で１０５個の細胞／ウェルの濃度で用いた。ＩＦＮβ(１００Ｕ／ｍｌ)およびＬＰＳ(５μｇ／ｍｌ)を加え、そして続けて細胞を６時間インキュベートした。１０分間１２００ＲＰＭでの遠心分離によりインキュベーションを停止した。上澄み液中のＩＬ−１βを、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。
【００７８】
２．中和アッセイ
ヒト皮膚包皮繊維芽細胞をClonetics(ＣＣ−２５０９)から得てそしてｂＦＧＦ(１ｎｇ／ｍｌ，ＣＣ−４０６５)、インスリン(５μｇ／ｍｌ，ＣＣ−４０２１)、および２％ＦＣＳ(ＣＣ−４１０１)を含むＦＢＭ(Clonetics，ＣＣ−３１３１)中で成長させた。
ＩＬ−６を誘導するために、４８ウェル組織クラスター中にウェル当たり１０４個の細胞の密度で細胞を播種した。翌日、サイトカイン添加前に２％ＦＣＳを含むＦＢＭ中で６〜７時間、細胞を絶食させた。刺激のために、ＦＢＭ＋約５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１βについて適当量の順化培地を含む２％ＦＣＳ、により培養培地を置き換えた。これに代えて、５０ｐｇ／ｍｌの最終濃度の組換えヒトＩＬ−１βを用いた。
【００７９】
細胞への添加に先立って、中和抗−ＩＬ−１β抗体を希釈した順化培地内で滴定した。ポジティブコントロールとして、組換えＩＬ−１Ｒａ(R&D Systems #280-RA-010)を用いた。
刺激後１６〜１７時間で細胞上澄み液を取り、そして放出されたＩＬ−６の量をサンドウィッチＥＬＩＳＡで測定した。
【００８０】
３．ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ
ＰＢＳ０.０２％ＮａＮ３中のマウス抗−ヒトＩＬ−６  ＭＡｂ(３１４−１４(Novartis Pharma; バッチＥＮ２３,９６１、５.５ｍｇ／ｍｌ)；３μｇ／ｍｌで１００μｌ)でＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを被覆し、＋４℃で終夜インキュベートした。翌日、マイクロタイタープレートをＰＢＳ／０.０５％Tween／０.０２％ＮａＮ３で４回洗浄し、そして３００μｌのＰＢＳ／３％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)／０.０２％ＮａＮ３で３時間遮断した。プレートを再び洗浄し(４回)、そして上澄み液(１：２０の最終希釈)もしくは組換えヒトＩＬ−６標準((Novartis Pharma #91902)，２倍希釈ステップで１〜０.０１５６ｎｇ／ｍｌの範囲にわたる滴定曲線)の１００μｌを２回加えた。終夜、室温でインキュベートした後、プレートを洗浄し(４回)、そして異なるマウス抗−ヒトＩＬ−６  ＭＡｂ(１１０−１４, Novartis Pharma;６.３ｍｇ／ｍｌ)；１μｇ／ｍｌで１００μｌ；室温で３時間)を加えた。さらに別に４回洗浄後、１／１００００(１００μｌ／ウェル；室温にて３時間)の最終希釈でビオチン標識ヤギ抗−マウスＩｇＧ２ｂ(Southern Biotechnology; #1090-08)を加えた。インキュベーション後、プレートを４回洗浄し、そして１／３０００(１００μｌ／ウェル；室温にて３０分)の最終希釈でアルカリホスファターゼ(Jackson Immunoresearch, #016-050-084)にカップリングさせたストレプトアビジンを加えた。洗浄(４回)後、基質(ジエタノールアミン緩衝液中のｐ−ニトロフェニルホスフェート；１００μｌ)を３０分で加えた。１.５Ｍ  ＮａＯＨの５０μｌ／ウェルを加えて反応を遮断した。４０５および４９０ｎｍのフィルターを用いて、マイクロタイターリーダー(Bio-Rad)中でプレートを読み取った。
【００８１】
３次曲線の当てはめを用い標準曲線を照合して、培養上澄み液中のＩＬ−６レベルを計算した。Ｓ字状曲線の当てはめに基づいて、ＩＣ５０の統計的評価および測定を実施した。
【００８２】
結果
【表４】
2008295456.tif 000005
ヒト皮膚繊維芽細胞からのＩＬ−６のＩＬ−１β−誘導分泌の阻害に対するＩＣ５０値。
組換えヒトＩＬ−１βもしくは５０〜１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１βを含有する順化培地で、線維芽細胞を刺激した。
【００８３】
実施例４：ＡＣＺ  ８８５に対するエピトープの定義
ＡＣＺ  ８８５は、高親和性でヒトＩＬ−１βに結合するが、アカゲザルから誘導化された高度に相同的なＩＬ−１βを認識できない。アカゲザルとヒトＩＬ−１βとの間のアミノ酸配列における最も顕著な差異の一つは、成熟ＩＬ−１βの６４位にある。この位置に、ヒトＩＬ−１βはグルタミン酸を有し、アカゲザルはアラニンを有する。それぞれの置き換えＧｌｕ６４Ａｌａを有する突然変異ヒトＩＬ−１βは、測定し得る親和性でＡＣＺ  ８８５に結合する能力を消失している。我々は、ヒトＩＬ−１βにおけるＧｌｕ６４が抗体ＡＣＺ  ８８５による認識に対しては必須であると結論する。Ｇｌｕ６４は、ＩＬ−１βのＩ型受容体に対する結合表面の部分ではないところのＩＬ−１βのループ上に、もしくはそれに近接して位置する。したがって、Ｇｌｕ６４を組み入れた結合性エピトープに対して目標を向けた抗体は、ヒトＩＬ−１βの生物活性を中和する潜在能力を有する。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】可溶性ＩＬ−１受容体ＩおよびＩＩによるＩＬ−１β結合の阻害の用量−作用曲線を示す。
【図１】
2008295456.tif 000006
【配列表】
2008295456000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月10日(2008.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む少なくとも一つの免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む抗原結合部位を含むＩＬ−１β結合分子であって、該ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｓｎを有し、該ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙを有し、そして該ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを有する、結合分子；ならびにその直接的同等物。
【請求項２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む単離ＩＬ−１β結合分子。
【請求項３】
配列に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む少なくとも一つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含むＩＬ−１β結合分子であって、該ＣＤＲ１’はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓを有し、該ＣＤＲ２’はアミノ酸配列Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒを有し、そして該ＣＤＲ３’はアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを有する、結合分子；ならびにその直接的同等物。
【請求項４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含む単離ＩＬ−１β結合分子。
【請求項５】
重鎖(ＶＨ)および軽鎖(ＶＬ)可変ドメインの両方を含むＩＬ−１β結合分子であって、そこでは該ＩＬ−１β結合分子は：
ａ)配列に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)であって、該ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｓｎを有し、該ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙを有し、そして該ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを有する、ドメイン(ＶＨ)、ならびに
ｂ）配列に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)であって、該ＣＤＲ１’はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓを有し、該ＣＤＲ２’はアミノ酸配列Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒを有し、そして該ＣＤＲ３’はアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを有する、ドメイン(ＶＬ)、を含む少なくとも一つの抗原結合部位を含む、結合分子；ならびにその直接的同等物。
【請求項６】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(ＶＨ)および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含む単離ＩＬ−１β結合分子。
【請求項７】
ヒト抗体である、請求項１から６のいずれかに記載のＩＬ−１β結合分子。
【請求項８】
１位のアミノ酸から始まりかつ１１８位のアミノ酸で終わる配列番号１に示されるものと実質的に同一のアミノ酸配列を有する第一のドメインもしくは上述の第一のドメインのどちらか、ならびに１位のアミノ酸から始まりかつ１０７位のアミノ酸で終わる配列番号２に示されるものと実質的に同一のアミノ酸配列を有する第二のドメインを含む、少なくとも一つの抗原結合部位を含む、ＩＬ−１β結合分子。
【請求項９】
重鎖もしくはそのフラグメントをコードする第一のＤＮＡ構築体であって、それは、
ａ)フレームワークおよび超可変領域を交互に含む可変ドメインをコードする第一の部分であって、該超可変領域は、そのアミノ酸配列が配列番号１に示されるところの配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３にあり；可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まりそして可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる、第一の部分、ならびに
ｂ)重鎖の定常部分の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まりそして定常部分もしくはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンに続く停止コドンで終わるところの重鎖の定常部分もしくはそのフラグメントをコードする第二の部分、を含む構築体。
【請求項１０】
軽鎖もしくはそのフラグメントをコードする第二のＤＮＡ構築体であって、それは、
ａ)フレームワークおよび超可変領域を交互に含む可変ドメインをコードする第一の部分であって；該超可変領域はＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’であり、そのアミノ酸配列は配列番号２に示され；可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まりそして可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる第一の部分、ならびに
ｂ)軽鎖の定常部分の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まりそして定常部分もしくはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンに続く停止コドンで終わるところの軽鎖の定常部分もしくはそのフラグメントをコードする第二の部分、を含む構築体。
【請求項１１】
請求項９もしくは請求項１０に記載の少なくとも一つのＤＮＡ構築体を含む、原核生物もしくは真核生物の細胞株中で複製できる発現ベクター。
【請求項１２】
(ｉ)請求項１１に記載の発現ベクターで形質転換される生物を培養することおよび(ｉｉ)培養液からＩＬ−１β結合分子を回収することを含む、ＩＬ−１β結合分子の製造方法。
【請求項１３】
Ｇｌｕ  ６４残基を含むループを含む成熟ヒトＩＬ−１βの抗原エピトープに対して抗原結合特異性を有し、そしてＩＬ−１βのその受容体への結合を阻害する能力を有する、ＩＬ−１βに対する抗体。
【請求項１４】
ｉ)請求項１３に記載のＩＬ−１βに対する抗体のＩＬ−１介在性疾患もしくは障害の処置のための使用；
ｉｉ)請求項１３に記載の抗体の有効量を患者に投与することを含む、患者におけるＩＬ−１介在性疾患もしくは障害の処置をするための方法；
ｉｉｉ)薬学的に許容される賦形剤、希釈剤もしくは担体と組合せて、請求項１３に記載のＩＬ−１βに対する抗体を含む、医薬組成物；ならびに
ｉｖ)請求項１３に記載のＩＬ−１βに対する抗体を、ＩＬ−１介在性疾患もしくは障害の処置をする医薬品を調製するための使用。