(57)【要約】【目的】  簡単な操作で２段階の反応が必要な分析を行うことが可能なバイオセンサを提供する。【構成】毛細管現象によって試料を吸い上げる吸引空洞２３と、酵素反応層１４を有する分析空洞２４と、吸引空洞２３と分析空洞２４とを繋ぐ流路２５とを備えたバイオセンサ１において、試料を前処理するための前処理試薬を、吸引空洞２３に固定化して設けると共に、吸引空洞２３に吸い上げた試料を吸引空洞２３内に保持し、その試料に所定の遠心力を加えた場合にその試料を分析空洞２４に流出させるための隔壁２６を、流路２５に設けた。【選択図】        図１
2008020287.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛細管現象によって試料を吸い上げる吸引空洞と、酵素反応層を有する分析空洞と、前記吸引空洞と前記分析空洞とを繋ぐ流路とを備えたバイオセンサであって、
前記試料を前処理するための前処理試薬を、前記吸引空洞に固定化して備え、
前記吸引空洞に吸い上げた試料を前記吸引空洞内に保持し、該試料に所定の遠心力を加えた場合に該試料を前記分析空洞に流出させるための隔壁を、前記流路に設けたことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
前記前処理試薬を、前記吸引空洞内に設けたメンブレンに固定化して設けたことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記吸引空洞内に、前記試料中の、前記酵素反応層における反応を検出する際のノイズとなる物質に対する処理試薬をさらに配置したことを特徴とする請求項１又は２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記処理試薬は、アスコルビン酸酸化酵素又はビリルビン酸化酵素であることを特徴とする請求項３記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記前処理試薬は、プロテアーゼであることを特徴とする請求項１又は２に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記試料のｐＨを前記前処理試薬による処理に適したｐＨに調整するための第１のｐＨ緩衝剤及び／又は前記試料の塩濃度を前記前処理試薬による処理に適した塩濃度に調整するための第１の調整塩を前記吸引空洞に配置したことを特徴とする請求項１又は２に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記分析空洞における試料のｐＨを前記酵素反応層による処理に適したｐＨに調整するための第２のｐＨ緩衝剤及び／又は前記分析空洞における試料の塩濃度を前記酵素反応層による処理に適した塩濃度に調整するための第２の調整塩を前記流路又は前記分析空洞に配置したことを特徴とする請求項６に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記酵素反応層が、電気化学測定のための酵素電極を構成することを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
前記酵素反応層が、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含有することを特徴とする請求項８に記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、液体試料を分析するためのバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、０．３〜１０μＬ（マイクロリットル）程度の液体試料をセンサユニット内に吸い上げ、センサユニット内部で種々の試薬により試料を処理してその反応を計測することにより、試料の分析を行う手法が種々提案されている。また特に、試薬として酵素を用い、酵素の基質特異性を利用して試料中の特定の物質の濃度を測定可能なバイオセンサは、種々の物質を含む生体試料の分析に適するため、医療用の検査機器を始め、様々な分野で用いられるようになっている。
【０００３】
このようなバイオセンサとしては、例えば特許文献１に記載のものが知られている。
特許文献１には、ヒトの全血のサンプルからグルコース濃度を測定する電気化学のバイオセンサが簡易血糖値計として開示されている。バイオセンサには試料の吸引口があり、検査試料である全血をこの吸引口に加えると、全血は毛細管現象により毛細管状充填室に引き込まれる。そして、毛細管状充填室の奥に空気口が形成されているために、空気を逃がしながら毛細管状充填室を全血で満たすことができる。また、この毛細管状充填室には作用電極と対電極が配置されていて、血球成分を含んだ全血の状態でグルコース濃度に相関した電流測定値を得て、簡易的に血糖値を測定できる構造になっている。
【特許文献１】特開２００２−３１０９７３号公報（第６−８頁）
【０００４】
また、微量の血液試料を分析する装置としては、特許文献２に記載のものも知られている。
特許文献２には、遠心操作により血漿分離が可能な血液分析装置において、血液試料の流路に、遠心分離時の遠心方向に血球成分が溜まる部分を配置し、そこに遠心分離により血球成分を集積させ、血漿成分が上清みとなるように遠心分離することが開示されている。この血液分析装置では、試料となるヒト全血の導入のために、排出口に外部ポンプを取り付けて、血液吸引口から吸引負圧によって全血を引き込んでいる。また、遠心分離後の血漿成分の移動も同様に、外部ポンプによる吸引負圧によって分析位置に導かれる構造になっている。
【特許文献２】特開２００４−１０９０８２号公報（第６−９頁）
【０００５】
なお、特許文献１に記載のバイオセンサは、グルコースデヒドロゲナーゼを利用して試料中のグルコース濃度に相関した電流値測定値を得るものである。しかし、血糖値に関連するデータを測定する方法は、他にも例えば特許文献３に記載の方法が知られている。
特許文献３には、糖化タンパク質の血中濃度が過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その血中濃度の測定値が、糖尿病の症状の診断及び管理の重要な指標となり得ることが開示されている。そして、この糖化タンパク質の血中濃度を、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を利用して測定する方法が開示されている。また、その測定を行う際、ＦＡＯＤと試料とを反応させる前に、プロテアーゼにより試料を前処理して糖化タンパク質を糖化ペプチド及び糖化アミノ酸に分解しておくことにより、ＦＡＯＤの反応速度を高め、糖化タンパク質の検出感度を高めることができることも開示されている。
【特許文献３】国際公開第９８／４８０４３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献３にも記載されているが、試料をプロテアーゼにより前処理する場合、前処理後の試料をＦＡＯＤと反応させる前にプロテアーゼを不活性化させておかないと、ＦＡＯＤ自身がプロテアーゼにより分解されてしまい、結果として糖化タンパク質の検出感度が低下してしまう。
【０００７】
これに対し、特許文献１に記載のバイオセンサは、試料を毛細管状充填室に吸い上げて、その場で酵素による反応とその電気化学的測定を行う構成である。また、特許文献２に記載の血液分析装置には、分析手段を２つ備えたものもあるが、これらは異なる項目の検出を行うためのものであり、１項目の検出は、１つの分析手段により行う構成である。
従って、これらのような従来の分析装置では、試料をプロテアーゼ処理した後、プロテアーゼを不活性化させた上でＦＡＯＤと反応させるといった、２段階の反応が必要な分析を行うことは難しいという問題があった。
【０００８】
この発明は、このような問題を解決し、簡単な操作で２段階の反応が必要な分析を行うことが可能なバイオセンサを提供することを目的とする。さらに、血液中の糖タンパク質の濃度の検出に特に好適なバイオセンサを提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この発明によるバイオセンサは、毛細管現象によって試料を吸い上げる吸引空洞と、酵素反応層を有する分析空洞と、上記吸引空洞と上記分析空洞とを繋ぐ流路とを備えたバイオセンサにおいて、上記試料を前処理するための前処理試薬を、上記吸引空洞に固定化して備え、上記吸引空洞に吸い上げた試料を上記吸引空洞内に保持し、その試料に所定の遠心力を加えた場合にその試料を上記分析空洞に流出させるための隔壁を、上記流路に設けたものである。
【００１０】
このようなバイオセンサにおいて、上記前処理試薬を、上記吸引空洞内に設けたメンブレンに固定化して設けるとよい。
上記吸引空洞内に、上記試料中の、上記酵素反応層における反応を検出する際のノイズとなる物質に対する処理試薬をさらに配置するとよい。
さらに、上記処理試薬を、アスコルビン酸酸化酵素又はビリルビン酸化酵素とするとよい。
また、上記前処理試薬を、プロテアーゼとするとよい。
【００１１】
また、上記試料のｐＨを上記前処理試薬による処理に適したｐＨに調整するための第１のｐＨ緩衝剤及び／又は上記試料の塩濃度を上記前処理試薬による処理に適した塩濃度に調整するための第１の調整塩を上記吸引空洞に設けるとよい。
さらに、上記分析空洞における試料のｐＨを上記酵素反応層による処理に適したｐＨに調整するための第２のｐＨ緩衝剤及び／又は上記分析空洞における試料の塩濃度を上記酵素反応層による処理に適した塩濃度に調整するための第２の調整塩を上記流路又は上記分析空洞に設けるとよい。
また、上記酵素反応層が、電気化学測定のための酵素電極を構成しているとよい。
さらに、上記酵素反応層が、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含有するとよい。
【発明の効果】
【００１２】
以上のようなこの発明によるバイオセンサによれば、簡単な操作で２段階の反応が必要な分析を行うことが可能である。また、このようなバイオセンサは、血液中の糖タンパク質の濃度の検出に特に好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、この発明を実施するための最良の形態を図面に基づいて具体的に説明する。
まず、この発明のバイオセンサの一実施形態の機械的な構成について説明する。
図１は、そのバイオセンサの構成を示す分解斜視図である。図２及び図３は、そのバイオセンサをそれぞれ異なる方向から見た斜視図である。図４は、図２の４−４線（吸引空洞、流路及び分析空洞の中央を通る線）に沿う端面図である。
図１に示すように、このバイオセンサ１は、電極基板１０と下基板２０とを備える。なお、電極基板１０と下基板２０とは、共に内側の面に特徴的な構造を有するため、この面が図に表われるように図示している。
【００１４】
電極基板１０は、反応検出用の電極を備えた基板であり、例えばＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）のポリエステルフィルムによるＦＰＣ（フレキシブルプリント回路）として形成することができる。
そして、下基板２０と対向する側の面に、作用極１１，対極１２，参照極１３の３つの電極を設けている。これらの電極は、図４に示すように、後述する分析空洞２４に露出するように設け、この部分で分析空洞２４内の試料に対して電気化学測定を行うためのものである。また、電極基板１０には、分析空洞２４に露出しない部分に、それぞれ作用極１１，対極１２，参照極１３と接続するコネクタ端子１１ａ，１２ａ，１３ａを設け、この部分に計測機器の端子を接触させて、各電極間に電圧を印加したり、各電極間の電気信号を検出したりできるようにしている。
【００１５】
また、作用極１１の表面には、バイオセンサ１により検出しようとする成分と反応する酸化還元酵素を含む酵素反応層１４を設け、この酵素と基質との反応量に応じた電気信号を、各コネクタ端子１１ａ，１２ａ，１３ａから得られるようにしている。酵素の反応量の電気信号に変換する方法としては、例えば、特公平７−１１４７０５号公報に記載のような、水溶性ポリマー溶液を利用して電極上に酸化還元酵素と共にメディエータ（電子受容体）を含む酵素反応層を設ける方法や、Wakako Tsugawa, Fumimasa Ishimura,  Kinuko Ogawa, and Koji Sode,Electrochemistry.,68,869(2000)に記載のような、メディエータに代えて過酸化水素を利用する方法が利用できる。
【００１６】
一方、下基板２０は、プラスチック等の樹脂で形成し、吸引空洞２３，分析空洞２４，流路２５，隔壁２６及びコネクタ窓２７を備えている。
吸引空洞２３、分析空洞２４、およびこれらを繋ぐ流路２５は、下基板２０上では溝として形成する。そして、図２に示すように下基板２０と電極基板１０とを組み合わせた状態では、電極基板１０によって蓋をされた状態となり、吸引口２１と空気口２２のみで外部と接する閉じた空間を形成する。また、これらの各部を透明な部材で構成すると、外部から試料の状態（バイオセンサ１中のどの部分まで吸入されたか、等）が確認できるため、好ましい。
【００１７】
また、吸引空洞２３は、分析対象の液体試料を吸い上げて、分析空洞２４において行う分析のための前処理を行うための空間であり、吸引空洞２３には、この前処理を行うための前処理試薬を配置する。そして、この前処理試薬は、吸引空洞２３内に固定化して設ける。
固定化の方法としては、前処理試薬が酵素等のタンパク質であれば、固定化用の残基を有するメンブレンやビーズに、共有結合により固定化した状態で配置することが考えられる。また、基質との接触性や、単位面積当たりの固定化量を考慮すると、多孔質の基材に固定することが好ましい。電極基板１０又は下基板２０上の吸引空洞２３を構成する部分に固定化用残基層を設け、ここに前処理試薬を固定化してもよい。いずれにせよ、固定化は、前処理試薬が試料と共に分析空洞２４に流出しないような方法で行えばよい。
【００１８】
また、試料の吸い上げは、吸引口２１に液体試料を触れさせることにより、毛細管現象を利用して行うことができる。この際、吸引空洞２３内の空気は、反対側の空気口２２から外部に排出することができる。なお、吸引口２１と空気口２２は同じ形状であり、２つの口のどちらから試料を吸い上げても、同じように吸引空洞２３を満たすことができる。
【００１９】
また、隔壁２６は、吸引空洞２３から流路２５への入り口に設けられ、吸引空洞２３に吸い上げた試料を吸引空洞２３内に保持し、特に力を加えられない状態で流路２５へ流れ込むことを防止するためのものである。もともと、流路２５の先の分析空洞２４には、空気を抜く構造がないため試料が吸い込まれ難い状態であるが、隔壁２６により試料を確実に吸引空洞２３内に保持できるようにしたものである。
【００２０】
また、隔壁２６は、吸引空洞２３内に吸い上げた試料に、流路２５方向への遠心力を加えた場合には、試料を流路２５を介して分析空洞２４に流出させられるよう、電極基板１０との間に隙間ができるように設けている。この隙間や隔壁２６の幅は、試料の表面張力や、電極基板１０及び下基板２０の濡れ性、分析作業時に試料にかけることのできる遠心力の強さ等を考慮して、適切な値に定める。
【００２１】
好ましいサイズの例としては、試料が人間の血液である場合、分析に必要な試料が１０μＬとし、前処理試薬固定用のメンブレンとして厚さ０．２ｍｍ，空隙率８０％のものを用いるとすると、吸引空洞２３の断面を２．０ｍｍ（幅）×０．２９ｍｍ（深さ）程度であり、吸引空洞２３の長さを２０ｍｍ程度とすればよい。この場合、吸引空洞２３の断面積は０．５８ｍｍ２である。メンブレンの幅及び長さを吸引空洞２３と同じにすると、メンブレンの容量は８μＬ、そのうち空隙が６．４μＬであり、吸引空洞内２３内のメンブレン以外の部分の容積は、３．６μＬとなり、計１０μＬの試料を吸い上げることができる。
また、隔壁２６と電極基板１０との隙間は、断面が１ｍｍ（幅）×０．１ｍｍ（深さ）程度、断面積は０．１ｍｍ２とすればよい。遠心力をかけない状態で試料が分析空洞２４に流出することを防止するためには、隔壁２６の長さは３ｍｍと比較的長くするとよい。
【００２２】
一方、分析空洞２４は、試料に分析用の処理を行うための空間である。電極基板１０と下基板２０とが組み合わされた状態では、分析空洞２４内に作用極１１、対極１２、および参照極１３が設けられた状態になる。そして、上述のように、遠心力によって吸引空洞２３から流路２５を通って分析空洞２４に流出してきた試料に対し、酵素反応層１４中の酵素を作用させ、その反応量を電気信号として取り出すことにより、試料中の検出対象物質の濃度を測定することができる。
【００２３】
なお、適切に測定を行うためには、分析空洞２４に図で右側（遠心力を働かせる方向）から試料を満たしていった場合に、作用極１１、対極１２、参照極１３の全てを覆う位置まで液面が達する必要がある。従って、吸引空洞２３の容積、分析空洞２４の断面積、および各電極の配置位置は、この条件を満たすように決定する必要がある。また、試料が遠心により沈殿画分を生じるようなものである場合、各電極を、上清画分で覆われるような位置に配置する必要がある。
【００２４】
以上のような構成を有するバイオセンサ１によれば、吸引口２１から吸い込んだ試料を隔壁２６により一旦吸引空洞２３に保持して、ここに配置した前処理試薬による前処理を行うことができる。そしてその後、流路２５の方向に遠心力をかけることによって、前処理後の試料を容易に隔壁２６を越えて分析空洞２４に導き、酵素反応層１４中の酵素と反応させて、基質の濃度と相関する電気信号をコネクタ端子１１ａ〜１３ａから取り出すことができる。
【００２５】
そしてこのとき、前処理試薬は分析空洞２４には流入しないため、前処理試薬として、酵素反応層１４における反応に影響を及ぼす試薬を用いたとしても、検出結果に影響を与えないようにすることができる。
従って、前処理と酵素反応層による処理との２段階の反応が必要な分析を簡単な操作で行うことが可能なバイオセンサが実現できる。
また、遠心力をかけることにより試料を吸引空洞２３から分析空洞２４に移動させるため、このときの遠心力を利用して、試料を沈殿画分と上清画分に分離すること
ができる。従って、試料の上清を分析する必要がある場合でも、分離前の状態で分析を開始でき、分析作業全体の簡略化を図ることができる。
【００２６】
次に、以上説明してきたバイオセンサ１に配置する試薬について、血液試料中のフルクトサミン濃度を、ＦＡＯＤを利用して測定するためのバイオセンサの場合を例に挙げて説明する。なお、フルクトサミンは、血漿タンパク質と血中グルコースが反応して生成する糖化タンパク質であるので、フルクトサミン濃度を求めるには、血漿中の糖化タンパク質濃度を求めればよいことになる。
【００２７】
このバイオセンサ１の場合、作用極１１上に、ＦＡＯＤを含む酵素反応層１４を形成する。例えば、作用極１１としてカーボン電極を用いる場合、水溶性ポリマーである1%-CMC（カルボキシメチルセルロース）水溶液を使用して酵素反応層１４を形成することができる。そして、メトキシＰＭＳ（1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate: m-PMS）とＦＡＯＤとトレハロースとを含む1%-CMC溶液を調製し、電極基板１０上に形成した作用極１１に滴下後、真空乾燥すればよい。メトキシＰＭＳは、メディエータである。また、ＦＡＯＤとしては、例えば、特開２００４−２７５１６８号公報に記載の、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．Ｎ１−１株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター  寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２６）由来のフルクトシルアミン酸化酵素（フルクトシルアミノ酸酸化酵素としての活性を有する）を用いると好適であるが、キッコーマン（Kikkoman）社が販売しているＦＡＯＤ−Ｅを用いることも考えられる。
【００２８】
また、上記のように酵素反応層１４を形成する場合、対極１２及び参照極１３としては、それぞれAg/AgCl電極を用いればよい。
そして、分析空洞２４に血液試料を導き、酵素反応層１４のＦＡＯＤと、試料中の糖化タンパク質とを反応させれば、その反応量を示す電気信号を得ることができる。
【００２９】
しかし、国際公開第９８／４８０４３号パンフレットに記載されているように、糖化タンパク質そのものをＦＡＯＤと反応させるよりも、予め糖化タンパク質をプロテアーゼで処理して糖化タンパク質を糖化ペプチド及び糖化アミノ酸に分解しておけば、ＦＡＯＤとの反応性を高め、検出感度を向上させることができる。
【００３０】
そこで、バイオセンサ１においては、吸引空洞２３に、前処理試薬としてプロテアーゼを配置し、前処理として、糖化タンパク質のアミノ酸への分解反応を行わせるようにした。プロテアーゼは、ＦＡＯＤと共存すると、ＦＡＯＤを分解してしまい、糖化タンパク質濃度の測定結果に影響を与えるため、従来であれば、試料をプロテアーゼ処理した後、プロテアーゼを不活性化する必要があった。しかしここでは、プロテアーゼをメンブレンに固定して設けることにより、分析空洞２４には流出しないようにしている。従って、プロテアーゼの不活性化処理は不要である。
【００３１】
このため、不活性化処理を意識せずにプロテアーゼを選択することが可能であり、固定化が可能な量であれば、単価が安いプロテアーゼを大量に使用することも可能である。また、このことにより十分な量のプロテアーゼを使用することができるので、プロテアーゼの選択に当たって、蛋白質の糖化部位を効率的に切断するといった基質特異性を特段に意識する必要もない。
ただし、前処理後の試料をそのまま分析空洞２４に流出させてＦＡＯＤと反応させることや、後述するように吸引空洞２３においてプロテアーゼ処理以外の処理も同時に行うことを考慮すると、これらの反応環境と至適ｐＨがなるべく近いプロテアーゼを用いることが好ましい。
なお、発明者らの実験により、プロテアーゼを全血試料と反応させても血球のバーストが起こらないことが確認されている。従って、プロテアーゼを全血試料と反応させた場合でも、プロテアーゼは血漿中の蛋白質を選択的に分解すると考えられる。
【００３２】
プロテアーゼを固定化するメンブレンとしては、血球がメンブレンに入り込まないよう血球寸法より小さい孔径の、多孔質膜を用いるとよい。具体的には、例えば、ポール（ＰＡＬＬ）社の、Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ（登録商標）ＡＢＣ Ｍｅｍｂｒａｎｅや、ＵｌｔｒａＢｉｎｄ（登録商標）Ｍｅｍｂｒａｎｅを利用することが考えられる。
そして、使用するメンブレンを、吸引空洞２３への配置に適したサイズ及び形状に切断した上で、プロテアーゼを含むカップリングバッファを滴下し、所定時間放置して固定化反応を行わせた後、ブロッキングバッファで洗浄して、メンブレン上の固定化に用いられなかった固定化用残基をブロックし、その後、純水で洗浄して凍結乾燥すればよい。
プロテアーゼとしては、例えばシグマ（Sigma）社のサブチリシンＡ（Subtilisin A）を使用することができる。
【００３３】
また、一般に、血中に含まれるアスコルビン酸やビリルビンといった還元性物質が、酸化酵素と基質との反応を電気化学的に測定する際に、その測定値に影響を与え、ノイズを生じさせることが知られている。
例えば、軽部征夫監修、「ＣＭＣテクニカルライブライブラリー１１３  バイオセンサー」、シーエムシー出版、２００２年５月、ｐ．１５７−１６３に記載されているように、メディエータとして過酸化水素を用いて反応を検出する場合、アスコルビン酸やビリルビンの酸化電位が過酸化水素のそれに近いため、酵素電極での測定電流が、（反応で生成した過酸化水素量＋存在する還元性物質量）に応じた値となり、見かけの電流値が上昇してしまう。
【００３４】
また、このような電流値の上昇を抑制する目的で、過酸化水素より酸化電位の低いメディエータを用いたとしても、還元性物質によりメディエータが還元されてしまい、測定電流が、（反応で生成した還元型メディエータ量＋還元性物質により還元された還元型メディエータ量）に応じた値となり、やはり見かけの電流値が上昇してしまう。
そこで、バイオセンサ１においては、吸引空洞２３にアスコルビン酸酸化酵素及びビリルビン酸化酵素を配置し、予め血液試料中のアスコルビン酸及びビリルビンを酸化して、これらの物質が分析空洞２４における糖化タンパク質量の測定に影響を与えないようにすることが好ましい。
【００３５】
また、吸引空洞２３に吸い上げる試料のｐＨや塩濃度と、吸引空洞２３での反応に好適なｐＨや塩濃度とが、異なることも考えられる。例えば、測定の簡便さを考慮すると、バイオセンサ１は、被験者から採取した血液をそのままサンプルとして使用できるように構成することが好ましいが、血液そのものは、必ずしも上記のプロテアーゼ、アスコルビン酸酸化酵素及びビリルビン酸化酵素の反応に好適なｐＨではない。
そこで、バイオセンサ１においては、血液試料のｐＨをプロテアーゼ、アスコルビン酸酸化酵素及びビリルビン酸化酵素の反応に適したｐＨに調整するためのｐＨ緩衝剤（第１のｐＨ緩衝剤）を、吸引空洞２３に配置することが好ましい。
【００３６】
アスコルビン酸酸化酵素や、ビリルビン酸化酵素、及びｐＨ緩衝剤は、ＦＡＯＤと共存したとしても、ＦＡＯＤの反応性に特段の影響は与えないので、吸引空洞２３内に固定化することは必要ない。従って、バイオセンサ１の使用前に外部にこぼれ落ちない程度に、吸引空洞２３の壁面あるいはプロテアーゼを固定化したメンブレン等に吸着させて配置すればよい。
このようにした場合、試料が吸引空洞２３に吸い上げられると、メンブレンに吸着されていたアスコルビン酸酸化酵素、ビリルビン酸化酵素及びｐＨ緩衝剤が試料に溶解し、試料のｐＨを所望の値に調整すると共に、アスコルビン酸酸化酵素及びビリルビン酸化酵素により試料中のアスコルビン酸及びビリルビンを酸化することができる。
【００３７】
そして、例えば、アスコルビン酸酸化酵素及びビリルビン酸化酵素を含み、所望のｐＨに調整したｐＨ緩衝剤溶液を、プロテアーゼを固定化したメンブレンに滴下し、メンブレンに吸収させた上で凍結乾燥すれば、プロテアーゼを固定化したメンブレンに、アスコルビン酸酸化酵素、ビリルビン酸化酵素及びｐＨ緩衝剤を吸着させることができる。
このとき、アスコルビン酸酸化酵素としては、例えば東洋紡績（TOYOBO）社のASCORBATE OXIDASE from Cucurbita sp.を使用することができる。ビリルビン酸化酵素としては、例えばシグマ社のBilirubin Oxidase from Myrothecium verrucariaを使用することができる。ｐＨ緩衝剤溶液としては、例えばTris-HClバッファや、リン酸バッファ等を用いることができる。
【００３８】
吸着に使用すべきｐＨ緩衝剤のｐＨは、チューブ内の実験により見積もることができる。例えば、発明者らの実験によれば、プロテアーゼとアスコルビン酸オキシダーゼとｐＨ９．４のTris-HClバッファを凍結乾燥し、そこに、Tris-HClの終濃度が１００ｍＭ（「Ｍ」はｍｏｌ／Ｌ）となるようにヒト血清（ｐＨ７．４で、健常人の値と一致）を加えたところ、酵素及びバッファ塩は完全にサンプルに溶解し、血清のｐＨを８．０に上昇させることができた。
【００３９】
なお、ｐＨに加えて塩濃度も調整する必要があれば、塩濃度調整用の塩も、第１の調整塩として同様に吸引空洞２３に配置するとよい。ｐＨは調整せず、塩濃度のみ調整することも考えられる。また、吸引空洞２３の容積は既知であるので、それに合わせて吸収させるｐＨ緩衝剤の量や濃度を調整することにより、試料中の塩濃度を調整することもできる。
【００４０】
また、分析中に血液が凝固することを防止するために、ヘパリンやＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸：ethylenediamine-N,N,N'N'-tetraacetic acid）等の抗凝固剤を、ｐＨ緩衝剤等の場合と同様に吸引空洞２３に配置してもよい。
また、メンブレンについて、ここではプロテアーゼの固定化前に切断する例を示したが、ｐＨ緩衝剤等の吸着まで完了してから、打ち抜き等により適切なサイズに切断してもよい。
また、ｐＨ緩衝剤等は、メンブレンでなく、下基板２０のうち吸引空洞２３を形成する部分に滴下し、凍結乾燥することにより、吸引空洞２３に直接吸着させて配置することもできる。
【００４１】
また、吸引空洞２３と分析空洞２４とで、反応に好適なｐＨや塩濃度が異なることも考えられる。例えば、バイオセンサ１では、吸引空洞２３におけるプロテアーゼ等の反応に好適なｐＨは、分析空洞２４におけるＦＡＯＤの反応に好適なｐＨとは異なる。
そこで、バイオセンサ１においては、吸引空洞２３から流入してくる試料のｐＨをＦＡＯＤの反応に適したｐＨに調整するためのｐＨ緩衝剤（第２のｐＨ緩衝剤）を、分析空洞２４又は流路２５に配置することが好ましい。
【００４２】
そして、このｐＨ緩衝剤は、所望のｐＨに調整したｐＨ緩衝剤溶液を、下基板２０のうち分析空洞２４又は流路２５を形成する部分に滴下し、真空乾燥することにより、分析空洞２４又は流路２５に配置することができる。
このようにすることにより、吸引空洞２３の試料を流路２５を通して分析空洞２４に流入させる際に、試料のｐＨを所望の値に調整することができる。
【００４３】
第１のｐＨ緩衝剤の場合と同様、吸着に使用すべきｐＨ緩衝剤のｐＨは、チューブ内の実験により見積もることができる。例えば、発明者らの実験によれば、ｐＨ７．０のTris-HClバッファを真空乾燥し、この真空乾燥したバッファに、Tris-HClの終濃度が150mMとなるように、上述したｐＨを８．０に上昇させた血清を加えたところ、バッファ塩は完全にサンプルに溶解し、血清のｐＨを７．５に下げることができた。ｐＨ７．０のリン酸バッファを用いても、同様なｐＨ調整が可能であった。
なお、塩濃度の調整についても、吸引空洞２３の場合と同様に行うことができる。
【００４４】
そして、バイオセンサ１は、以上のような下基板２０の、吸引空洞２３を形成する部分にプロテアーゼを固定化したメンブレンを配置し、下基板２０を各電極１１〜１３及び酵素反応層１４を形成した電極基板１０と位置合わせして、これらを超音波溶着することにより、形成することができる。
【００４５】
次に、以上説明してきたバイオセンサ１の使用方法について説明する。
バイオセンサ１を使用する場合、まず、使用者は、被験者の採血部位である指先に穿刺針を刺して、分析に必要な血液量以上の血液を出す。被験者の感染を防ぐためには、採血器具と採血針とが一体化したディスポーザブル採血器具を使うことが好ましい。また、分析に必要な血液量は例えば約１０μＬであり、この必要量の血液を吸い上げるために、吸引空洞２３の容積は必要量と同量になっている。
そして、使用者は、出した血液（全血）をバイオセンサ１の吸引口２１に接触させる。すると、血液は毛細管現象によって吸引されて、吸引口２１から空気口２２までの吸引空洞２３を満たす。
【００４６】
図５及び図６はそれぞれ、この状態を示す、図１及び図４と対応する図である。
これらの図に示すように、吸引空洞２３に吸い上げられた血液３は、隔壁２６の途中まで入ることはあっても、決して隔壁２６を乗り越えることはない。流路２５および分析空洞２４によって形成される空間が、内部の空気が抜け出る場所がない閉じた空間になっており、流路２５および分析空洞２４の内部の空気が抜け出ない構造になっているので、血液３が流路２５の方向には流れ込むことはないためである。
【００４７】
下基板２０の、少なくとも吸引空洞２３の部分が透明であれば、吸引された血液３は、下基板２０の裏面から確認することができる。この場合、もしも血液を十分に吸引できず、血液３が吸引空洞２３を満たしていない場合には、再度、指先の穿刺部位から血液を出して、吸引口２１から追加して吸い上げることができる。従って、吸引空洞２３に一定量の血液を間違いなく吸い上げることができる。
そして、この時点で、吸引空洞２３内に配置したｐＨ調整塩により血液３のｐＨが調整されると共に、プロテアーゼによりタンパク質をアミノ酸に分解する前処理に加え、アスコルビン酸酸化酵素及びビリルビン酸化酵素を配置した場合にはこれらによるアスコルビン酸とビリルビンの酸化処理が行われる。
【００４８】
従って、使用者は、吸引空洞２３に血液３を吸い上げた後、これらの処理に必要な時間待機する。この時間は、吸引空洞２３内に配置した酵素の量によって異なるが、例えば数分程度とすることができる。
その後、使用者は、バイオセンサ１を遠心機能付きの分析装置にセットし、分析を行う。
【００４９】
図７は、その分析装置を示す図である。ただし、この図には、遠心機構と検出用電極の概略構造のみを示し、検出回路、演算回路、表示部及び操作スイッチ部などは省略している。
図７に示すように、分析装置２の遠心機構部は、回転台４０及びモータ４１を備えている。符号４２で示すのは、電極基板１０上の各コネクタ端子１１ａ〜１３ａに接続して電圧を印加すると共に電気信号を検出するための、検出用電極である。
【００５０】
回転台４０は、バイオセンサ１を取り付けて、高速回転させるための取り付け台である。そして、図示はしていないが、バイオセンサ１を取り付けた際にコネクタ窓２７と重なる位置に孔を設け、検出用電極４２が回転台４０の下側からその孔及びコネクタ窓２７を通して電極基板１０上の各コネクタ端子１１ａ〜１３ａに接続できるようにしている。モータ４１は、回転台４０及びバイオセンサ１を回転させるための駆動モータであり、例えば直流モータである。
【００５１】
そして、バイオセンサ１を分析するときには、バイオセンサ１を、分析装置２の回転台４０に、吸引空洞２３が回転中心側、分析空洞２４が回転外周側となるように取り付ける。そして、分析装置２の図示しない操作スイッチを押すと、モータ４１の回転により、回転台４０が回転を始める。回転速度は徐々に上がり、最高回転速度は、例えば３０００ｒｐｍで、３０秒間継続する。
【００５２】
このとき、吸引口２１の位置で回転半径３ｃｍとすると、この位置の試料には重力の約３００倍の遠心力が加えられる。そして、吸引空洞２３は、血液３の溜まる部分が遠心力が加わる方向に対して鈍角な向きに配置されているため、流路２５の向きに遠心力が加えられた場合、この遠心力により、吸引空洞２３内の血液３は、隔壁２６を乗り越え、流路２５を通って分析空洞２４に流出する。吸引口２１と空気口２２から漏れることない。
【００５３】
また、回転を継続すると、血液３は比重によって血球成分３１と血漿成分３２に分離する。血漿成分３２の比重は血球成分３１に比べて小さいために、分析空洞２４では回転半径の遠い方から、血球成分３１、血漿成分３２の順番に並ぶ。なお、分析空洞２４における血球成分３１と血漿成分３２の分離位置の回転半径を６ｃｍとすると、３０００ｒｐｍの回転で、重力の約６００倍の遠心力が加わることになり、３０秒間の回転で、ほぼ完全に分離を行うことが可能である。
【００５４】
図８及び図９はそれぞれ、この状態を示す、図１及び図４と対応する図である。
これらの図に示すように、作用極１１，対極１２，参照極１３は、血漿成分３２が位置する領域に配置する。そして、血液３が分析空洞２４に流入した時点で、第２のｐＨ緩衝剤によりｐＨが調製されると共に、作用極１１上の酵素反応層１４に含まれるＦＡＯＤによる、血液３中の糖化タンパク質（糖化アミノ酸）の酸化反応が開始される。
【００５５】
そして、所定時間の回転後、分析装置２は、モータ４１の回転を停止させると共に、回転台４０を検出用電極４２に位置合わせして停止させる。そして、図示しない駆動機構により検出用電極４２を移動させ、回転台４０の下側から回転台４０の孔及びコネクタ窓２７を通して電極基板１０上の各コネクタ端子１１ａ〜１３ａに接続させる。
その後、所定時間放置した後、作用極１１と参照極１３の間に所定の電圧を印加し、値が安定するまで所定時間待った後で電流値を測定することにより、ＦＡＯＤと糖化タンパク質の反応を電気化学的に測定する。
【００５６】
この時点では、電極の位置する血漿成分３２の糖化タンパク質の反応のみ測定結果に反映され、血球画分３１の糖化タンパク質については、存在したとしても測定結果には反映されないようにすることができる。
そして、測定で得られた電流値を、フルクトサミン濃度既知のサンプルを分析して得た検量線に当てはめることにより、血液試料のうち血漿中のフルクトサミン濃度を求めることができる。なお、電流値は温度に依存するため、測定時の温度を固定するか、分析装置２に、検量線を温度に応じて補正する手段を設けることが好ましい。
【実施例】
【００５７】
以下、この発明を利用した、血中のフルクトサミン濃度測定のためのバイオセンサの具体的な作成例及び使用例について説明する。
まず、電極基板１０及び下基板２０を、図１に示す形状に成型した。電極基板１０は、ＰＥＴのポリエステルフィルムによりＦＰＣとし、下基板２０は、透明プラスチックにより形成した。その後、電極基板１０上に、カーボンにより作用極１１を、Ａｇ／ＡｇＣｌにより対極１２及び参照極１３を形成した。
【００５８】
なお、吸引空洞２３の断面は１．５ｍｍ（幅）×０．３ｍｍ（深さ）とし、隔壁２６と電極基板１０との隙間は、断面が１ｍｍ（幅）×０．１ｍｍ（深さ）となるようにした。
また、プロテアーゼを固定化するメンブレンとして、ポール社の、Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ（登録商標）ＡＢＣ Ｍｅｍｂｒａｎｅの、孔径が０．４５μｍのものを用い、吸引空洞２３のサイズに合わせて切断した。バイオセンサ１つ当たりのメンブレンの面積は、４９ｍｍ２であった。
【００５９】
そして、プロテアーゼとしてシグマ社のサブチリシンＡを１００ｋＵ（キロユニット）／ｍＬの濃度で含む、200mM-NaHCO3／500mM-NaCl (pH 8.3)のカップリングバッファを、切断したメンブレン１つに対して２０μＬ滴下し、室温で３０分放置した。
その後、10mM Tris-HCl (pH 8.0)のブロッキングバッファでメンブレンを洗浄した後、そのバッファに５分浸漬し、純水にて洗浄した。その後、（１）−４５℃で６時間凍結、（２）真空にして５℃／分で２５℃まで昇温、（３）６時間保持、を行うことにより、メンブレン及びプロテアーゼを凍結乾燥した。
以上でメンブレンへのプロテアーゼの固定化処理は完了である。
【００６０】
そして、このプロテアーゼを固定化したメンブレンに、0.01mg/mLのヘパリンと、5U/mLのアスコルビン酸酸化酵素（東洋紡績社製）を含む100mM Tris-HCl (pH 9.4)を１０μＬ滴下し、完全に吸収させた後、プロテアーゼ固定化の場合と同じ条件で凍結乾燥した。
以上で、ヘパリン、アスコルビン酸酸化酵素及び第１のｐＨ緩衝剤をメンブレンへ吸着させる処理は完了である。
【００６１】
一方、下基板２０には、分析空洞２４を形成する位置に、50mM Tris-HCl (pH 7.0)を１０μＬ滴下し、室温で３時間真空乾燥して、第２のｐＨ緩衝剤を配置した。
また、作用極１１上に、２ｍＭのメトキシＰＭＳと１Ｕ／ｍＬのＦＡＯＤと５０ｍＭのトレハロースとを含む１％‐ＣＭＣ溶液を３μＬ滴下し、４℃で１２時間真空乾燥して、酵素反応層１４を形成した。ＦＡＯＤとしては、上述した特開２００４−２７５１６８号公報に記載の、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．Ｎ１−１株由来のフルクトシルアミン酸化酵素を用いた。
そして、下基板２０の吸引空洞２３を形成する部分にプロテアーゼを固定化したメンブレンを配置し、下基板２０を電極基板１０と位置合わせして超音波溶着することにより、バイオセンサ１を形成した。
【００６２】
以上のバイオセンサ１により、コントロール及びサンプルについて、実施形態で説明したような分析装置２を用いて、以下の手順により測定を行った。
（１）サンプル１０μＬを吸引口２１に接触させ、吸引空洞２３に吸い込ませる
（２）分析装置にセットして２５℃で５分放置
（３）３０００ｒｐｍで３０秒間遠心処理
（４）２５℃で１分放置
（５）作用極１１に参照極１３に対して＋２５ｍＶの電圧を印加
（６）１００秒後に、作用極１１と参照極１３との間の電流値を測定
【００６３】
また、コントロールとしては、フルクトサミン高値及びフルクトサミン低値のヒト血清を用いた。これらの血清中のフルクトサミン濃度は、和光純薬工業社（Wako Pure Chemical Industries, Ltd）の「オートワコー  フルクトサミン」を用いたＦＯＤ−ＴＯＯＳ法により測定したところ、それぞれ６５０μＭ及び２０８μＭであった。
ＦＯＤ−ＴＯＯＳ法の測定原理は、以下の通りである。まず、血漿、あるいは血清中のフルクトサミンをプロテアーゼにより糖化アミノ酸に分解し、糖化アミノ酸とＦＡＯＤを作用させ、グルコソン、アミノ酸、過酸化水素を生成させる。そして、その過酸化水素はＰＯＤ（Peroxidase）存在下、４−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ−（２’−ヒドロキシ，３’−スルファプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム（ＴＯＯＳ）とを酸化縮合させ、青紫色の色素を生成させる。この色素の吸光度を測定することにより試料中のフルクトサミン濃度を測定することができる。
【００６４】
その結果、コントロールについては、フルクトサミン高値のもので７５ｎＡ（ナノアンペア）、低値のもので１８ｎＡの電流値が得られた。これらの結果を基に、ＦＯＤ−ＴＯＯＳ法により測定したフルクトサミン濃度を横軸に、バイオセンサ１により検出した電流値を縦軸とした検量線を作成した。なお、フルクトサミン高値の血清とフルクトサミン低値の血清とを種々の割合で混合したサンプルを用いた発明者らの実験により、フルクトサミン濃度と測定電流値との関係は直線性を示す（線形である）ことがわかっている。
サンプルとしては、ＦＯＤ−ＴＯＯＳ法にてフルクトサミン濃度が２４０μＭであったヒトの全血、並びにその全血から得られる血漿画分について測定を行った。
【００６５】
その結果、全血で２１ｎＡ、血漿で２４ｎＡの測定値が得られた。
図１０に、コントロール血清を用いて作成した前記検量線とサンプルの測定結果を合わせて示す。
上記結果より、バイオセンサ１により検出したサンプルの全血、並びに血漿の測定値が共に、検量線と良い一致を示すことが判る。従って、試料に血球が含まれた状態でプロテアーゼ処理を行っても、血漿中の糖蛋白質であるフルクトサミンの濃度の測定結果に影響はないといえる。
【００６６】
以上で実施形態及び実施例の説明を終了するが、この発明は、これに限られることはない。具体的なバイオセンサの構成、使用する試薬、測定する試料、測定方法等が、これに限られないことはもちろんである。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
以上説明してきたように、この発明のバイオセンサによれば、簡単な操作で２段階の反応が必要な分析を行うことが可能である。また、このようなバイオセンサは、血液中の糖タンパク質の濃度の検出に特に好適である。
従って、この発明を適用することにより、例えば、臨床診断分野の血液検査で使用できる、簡便な分析器具を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】この発明の一実施形態であるバイオセンサの構成を示す分解斜視図である。
【図２】図１に示したバイオセンサの斜視図である。
【図３】同じく、別の方向から見た斜視図である。
【図４】図２の４−４線に沿う端面図である。
【図５】図１に示したバイオセンサにおいて、吸引空洞に血液試料を吸い上げた状態を示す、図１と対応する図である。
【００６９】
【図６】同じく、図４と対応する図である。
【図７】図１に示したバイオセンサを用いた分析に使用する分析装置の概略構造を示す図である。
【図８】図５に示した状態から遠心を行った後の状態を示す、図１と対応する図である。
【図９】同じく、図４と対応する図である。
【図１０】この発明の実施例で用いた各サンプルにつき、ＦＯＤ−ＴＯＯＳ法により測定したフルクトサミン濃度と、バイオセンサにより検出した電流値との関係を示す。
【符号の説明】
【００７０】
１：バイオセンサ、２：分析装置、３：血液、１０：電極基板、１１：作用極、
１２：対極、１３：参照極、１４：酵素反応層、１１ａ，１２ａ，１３ａ：コネクタ端子
２０：下基板、２１：吸引口、２２：空気口、２３：吸引空洞、２４：分析空洞、
２５：流路、２６：隔壁、２７：コネクタ窓、３１：血球成分、３２：血漿成分、
４０：回転台、４１：モータ、４２：検出用電極
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2008020287.tif 000008
【図７】
2008020287.tif 000009
【図８】
2008020287.tif 000010
【図９】
2008020287.tif 000011
【図１０】
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