(57)【要約】【課題】  凍結乾燥時に有用物質を変性させることなく、かつ保存期間中に生理活性が低下しない凍結乾燥方法を提供する。【解決手段】  有用物質の水溶液を凍結乾燥して有用物質を精製する過程において、下記一般式（１）で表される化合物（Ａ）またはその塩（Ｂ）を存在させて、凍結乾燥させることを特徴とする凍結乾燥方法【化１】2008131934.tif 000006【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖、抗生物質およびビタミン類からなる群より選ばれる１種以上の有用物質の水溶液を凍結乾燥して該有用物質を精製する過程において、下記一般式（１）で表される化合物（Ａ）またはその塩（Ｂ）を存在させて凍結乾燥させることを特徴とする凍結乾燥方法。
【化１】
2008131934.tif 000005
（式中、Ｒ1はアミノ酸の残基を表す。Ｒ2〜Ｒ4はそれぞれ独立に、水素原子、または炭素数１〜３６の直鎖または分岐の炭化水素基で、その一部が他の官能基に置換されていてもよい。）
【請求項２】
該化合物（Ａ）が、アミノ酸のアミド（Ａ１）またはアミノ酸のイミン（Ａ２）である請求項１記載の凍結乾燥方法。
【請求項３】
該化合物（Ａ）がアルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギンおよびグルタミンからなるアミノ酸群から選ばれる１種以上のアミノ酸の誘導体である請求項２記載の凍結乾燥方法。
【請求項４】
該アミノ酸がアルギニンである請求項２または３記載の凍結乾燥方法。
【請求項５】
凍結乾燥後の活性が、凍結乾燥前に比べて４０％以上保持される請求項１〜４いずれか記載の凍結乾燥方法。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか記載の方法で精製されたことを特徴とする、酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖、抗生物質、またはビタミン類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品、医薬品および生化学の分野において用いられる凍結乾燥方法の改良、ならびに本発明の凍結乾燥方法を用いる凍結乾燥物の製造方法に関する。さらに詳しくは、凍結乾燥後に有用物質の力価が低下しにくい凍結乾燥方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素やペプチドなどのタンパク質は、診断・検査薬、医薬品として広く利用されており、これらの製品においては、製造工程および保存期間中に生理活性（力価）が損なわれないことが重要である。
安定してタンパク質を取り出し精製するための一つの方法として凍結乾燥が一般的に行われているが、何も添加せずに凍結乾燥すると、酵素が変性、失活し、例えば酵素の場合、力価が著しく低下し、場合によっては５〜１５％しか保持できないという問題点があった。
これに対し、糖類などを添加すると、力価の低下は少し抑制され、２０〜３５％まで向上するが、依然として保存期間中に生理活性が損なわれ、力価が  １０％程度しか保持されないという問題点がある（たとえば、特許文献１）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２７０００６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、凍結乾燥時に有用物質を変性することなく、かつ保存期間中に生理活性が低下しない凍結乾燥方法を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖、抗生物質およびビタミン類からなる群より選ばれる有用物質の水溶液を凍結乾燥して有用物質を精製する過程において、下記一般式（１）で表される化合物（Ａ）またはその塩（Ｂ）を存在させて、凍結乾燥させることを特徴とする凍結乾燥方法；その凍結乾燥方法によって精製されて得られた有用物質である。
【０００６】
【化１】
2008131934.tif 000002
【０００７】
（式中、Ｒ1はアミノ酸の残基を表す。Ｒ2〜Ｒ4はそれぞれ独立に、水素原子、または炭素数１〜３６の直鎖または分岐の炭化水素基で、その一部が他の官能基に置換されていてもよい。）
【発明の効果】
【０００８】
本発明の凍結乾燥方法は、凍結乾燥時に有用物質を変性することなく、かつ保存期間中に生理活性が低下しないので食品、医薬品、および生化学の分野において有効に使用することができる。また、各種有用物質の製造コストを大幅に改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明はタンパク質（酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチドなど）、アミノ酸、核酸、糖、抗生物質、ビタミン類などの有用物質の水溶液を凍結乾燥して有用物質を精製する過程において、下記一般式（１）で表される化合物（Ａ）、またはその塩（Ｂ）を存在させて、凍結乾燥させることを特徴とする凍結乾燥方法である。
【００１０】
【化２】
2008131934.tif 000003
【００１１】
（式中、Ｒ1はアミノ酸の残基を表す。Ｒ2〜Ｒ4はそれぞれ独立に、水素原子、または炭素数１〜３６の直鎖または分岐の炭化水素基で、その一部が他の官能基に置換されていてもよい。）
【００１２】
すなわち、酵素、ペプチドなどのタンパク質や抗生物質などを取り出し精製するための凍結乾燥において、そのまま凍結乾燥すると、これらがが変性、失活し易く、力価が著しく低下するという問題点があるが、本発明では、特定の化学構造を有する上記の化合物（Ａ）を凍結乾燥時の保護剤として添加することにより解決することを見出した。
【００１３】
本発明の凍結乾燥方法において、保護剤として作用させるために存在させる化合物（Ａ）は、実質的には、アミノ酸の誘導体である。
上記一般式（１）中のＲ1は、アミノ酸の残基を表す。このアミノ酸としては、特に限定されるものではなく、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸などが挙げれる。力価の保持率の観点から、好ましくはアルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギンおよびグルタミンであり、さらに好ましくはアルギニンである。
【００１４】
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立に、水素原子、または炭素数１〜３６の直鎖または分岐の炭化水素基で、その一部が他の官能基に置換されていてもよい。
具体的に上記一般式（１）中のＲ2はカルボン酸残基を表す。ここでカルボン酸残基とは、カルボン酸構造式からカルボキシル基を除いたものと定義する。したがって、カルボン酸が酢酸の場合は、Ｒ2はメチル基を表す。
Ｒ2のカルボン酸としては、蟻酸、酢酸、プロピオン酸などの脂肪族カルボン酸や、安息香酸、フタル酸などの芳香族カルボン酸などが挙げられる。
【００１５】
具体的に上記一般式（１）中のＲ3およびＲ4はケトンまたはアルデヒドのカルボニル化合物の残基を表す。ここで、カルボニル化合物の残基とは、カルボニル化合物の構造式からカルボニル基を除いた部分と定義する。例えば、アセトンの場合はＲ3およびＲ4はメチル基となり、アセトアルデヒドの場合はＲ3がメチル基、Ｒ4が水素原子を表す。
Ｒ3およびＲ4のケトンとしては、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトンなどが挙げられる。Ｒ3およびＲ4のアルデヒドとしては、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ベンジルアルデヒドなどが挙げられる。
また、その一部が水酸基で置換されていてもよい。
【００１６】
本発明における保護剤として作用する化合物（Ａ）は、アミノ酸のアミド（Ａ１）またはアミノ酸のイミン（Ａ２）である。アミノ酸の種類としては特に限定するものではないが、好ましくはアルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギンおよびグルタミンであり、さらに好ましくはアルギニン、ヒスチジンであり、最も好ましいものはアルギニンである。
【００１７】
本発明におけるアミノ酸のアミド（Ａ１）は、アミノ酸とカルボン酸との反応によって生成するアミド化合物であり、カルボン酸としては特に限定されるものでないが、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、ペンタン酸などが挙げられる。
【００１８】
本発明におけるアミノ酸のイミン（Ａ２）は、アミノ酸とアルデヒドまたはアミノ酸とケトンとの反応によって生成するイミンであり、アルデヒドとしては特に限定するものでなないが、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ベンズアルデヒドなどが挙げられる。ケトンとしては、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトンなどが挙げられる。
【００１９】
本発明における保護剤としては、前述の化合物（Ａ）以外に、前述の化合物（Ａ）の塩である化合物（Ｂ）も使用できる。このような化合物（Ｂ）としては、前記アミノ酸アミドの塩またはアミノ酸イミンの塩などが挙げられ、具体的にはナトリウム塩、カリウム塩、有機アミン塩などが挙げられる。
【００２０】
本発明における化合物（Ａ）の添加量は、目的とする酵素等の有用物質１００部に対して１部〜１，０００部が好ましく、活性の保持の観点から１０部〜５００部がさらに好ましい。  添加量が１部未満の場合、十分に活性を保持することができなくなり、１，０００部より多い場合、実使用上効率的でないので適さない。
【００２１】
本発明の凍結乾燥方法によれば、有用物質の凍結乾燥後の活性が、凍結乾燥前に比べて、通常４０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上保持できる。
ここでいう活性とは、酵素および抗体の場合は力価を表し、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖、抗生物質およびビタミン類の場合は純度を表す。
従来の方法では、特に酵素の場合、一般に１０％前後しか力価が保持できなかったのに対して、本発明の方法によれば、力価を高い保持率で製造できるので、製造コストを大幅に改善することができる。
【００２２】
本発明の凍結乾燥方法で得られた有用物質は、さらに凍結乾燥後２５℃、６ヶ月間密閉した状態で保存した後においても、凍結乾燥前に比べて活性を３０％以上保持される。
従来の方法で得られた有用物質として、特に酵素の場合に、保存期間中にさらに活性が低下してしまうのに対して、本方法は、活性を長期間高い保持率で保持することができるので、食品、医薬品および生化学の分野において有効に使用することができる。
【００２３】
本発明の凍結乾燥方法の一例を以下に説明するが、化合物（Ａ）またはその塩（Ｂ）を凍結乾燥する直前に加えてもよいし、それより前の工程で加えていてもよい。
＜酵素の凍結乾燥による精製の場合＞
１．酵素水溶液に化合物（Ａ）またはその塩（Ｂ）を加え、かきまぜる。
２．これを液体窒素に浸漬し凍結する。
３．凍結乾燥機で減圧条件下、−４０℃で２晩乾燥させる。
【００２４】
本発明の凍結乾燥方法が適用できる有用物質としては特に限定されないが、酵素（Ｐ１）、組み換えタンパク質（Ｐ２）および抗体（Ｐ３）、ペプチド（Ｐ４）、アミノ酸（Ｐ５）、核酸（Ｐ６）、糖（Ｐ７）、抗生物質（Ｐ８）およびビタミン類（Ｐ９）などが挙げられる。
【００２５】
本発明が適用できる酵素（Ｐ１）としては、加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、転移酵素、合成酵素および脱離酵素などが挙げられる。
加水分解酵素としては、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、グルコアミラーゼなどが挙げられる。
異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼが挙げられる。
酸化還元酵素としては、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
転移酵素としては、アシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼなどが挙げられる。
合成酵素としては、脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ、クエン酸シンターゼなどが挙げられる。
脱離酵素としては、ペクチンリアーゼなどが挙げられる。
【００２６】
本発明が適用できる組み換えタンパク質（Ｐ２）としては、タンパク製剤、ワクチン等が挙げられる。
タンパク製剤としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン、カルシトニン等が挙げられる。
ワクチンとしては、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン等が挙げられる。
【００２７】
本発明が適用できる抗体（Ｐ３）としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が挙げられる。
【００２８】
本発明が適用できるペプチド（Ｐ４）としては、特にアミノ酸組成を限定するものではなく、ジペプチド、トリペプチドなどが挙げられる。
【００２９】
本発明が適用できるアミノ酸（Ｐ５）としては、例えばグルタミン酸、トリプトファン、アラニンなどが挙げられる。
【００３０】
本発明が適用できる核酸（Ｐ６）としてはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。
【００３１】
本発明が適用できる抗生物質（Ｐ７）としてはストレプトマイシンおよびバンコマイシンなどが挙げられる。
【００３２】
本発明が適用できる糖類（Ｐ８）としては、ヒアルロン酸、アルブミン、セラミド、エリスリトール、トレハロース、リポ多糖およびシクロデキストリンなどが挙げられる。
【００３３】
本発明が適用できるビタミン類（Ｐ９）としては、ビタミンＡ類およびそれらの誘導体並びにその塩、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２等のビタミンＢ類およびそれらの誘導体並びにその塩、ビタミンＣ類およびそれらの誘導体並びにその塩が挙げられる。
これらのうち、本発明の方法は、（Ｐ１）および（Ｐ２）に好適に適用され、特に（Ｐ１）の生産に適している。
【００３４】
本発明のもう１つの実施態様は、上記の凍結乾燥方法で得られた有用物質であり、具体的には、酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド、アミノ酸、核酸、抗生物質、糖類またはビタミン類で、かつ高い力価などのの保持率を有するこれらの有用物質である。
これらのうち好ましいのは（Ｐ１）および（Ｐ２）、特に（Ｐ１）である。
【実施例】
【００３５】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
製造例１  （アルギニンアセトアミドの合成）
２００ｍＬコルベンにアルギニン（和光純薬製）５２．２ｇ（０．３モル）に酢酸（和光純薬製）を６０ｇ（１．０モル）加え、３０℃で３時間窒素雰囲気下で攪拌した。エバポレーターで濃縮後、水から再結晶してアルギニンアセトアミドを得た。乾燥精製した後、用いた。
【００３６】
製造例２  （アルギニンイソプロピルイミンの合成）
２００ｍＬコルベンにアルギニン（和光純薬製）５２．２ｇ（０．３モル）にアセトン（和光純薬製）を５８ｇ（１．０モル）加え、３０℃で３時間窒素雰囲気下で加熱攪拌した。エバポレーターで濃縮後、水から再結晶し乾燥精製してアルギニンイソプロピルイミンを得た。
【００３７】
製造例３  （リシンアセトアミドの合成）
アルギニン５２．２ｇ（０．３モル）をリシン４３．８ｇ（０．３モル）に変更する以外は製造例１と同様にリシンアセトアミドを得た。
【００３８】
実施例１
リゾチーム（市販品「リゾチーム」和光純薬製、力価２００００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）５０ｍｇをイオン水１０ｇに溶解させ、アルギニンアセトアミド２８．５ｍｇ（０．１３ミリモル）を加え、１分間軽くかき混ぜた。この溶液が入った容積２０ｍＬの密栓付きガラス瓶を液体窒素中に１分浸漬し凍結した。その後、凍結乾燥機（アルバック社製ＤＦ−０１Ｈ）で減圧下（０．１ｔｏｒｒ）、−４０℃で４０時間かけて凍結乾燥した。乾燥後、五酸化リンが入ったデシケーターで３日間保存し、水分の調整をおこない、本発明の凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１）を得た。
この（Ｒ−１）を後述の方法で酵素活性（力価）を測定した。
【００３９】
実施例２
アルギニンアセトアミドの代わりに、アルギニンイソプロピルイミン２８．５ｍｇ（０．１３ミリモル）を使用する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−２）を得た。
【００４０】
実施例３
アルギニンアセトアミドの代わりにリシンアセトアミド２４．８ｍｇ（０．１３ミリモル）を使用する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−３）を得た。
【００４１】
比較例１
アルギニンアセトアミドの代わりに、トレハロース（和光純薬製）５０．０ｍｇ（０．１３ミリモル）を使用する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ’−１）を得た。
【００４２】
比較例２
アルギニンアセトアミドの代わりに、グルコース（和光純薬製）２３．８ｍｇ（０．１３ミリモル）を使用する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ’−２）を得た。
【００４３】
＜酵素活性（力価）の測定＞
実施例１〜３および比較例１、２で得られた凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１）〜（Ｒ−３）と（Ｒ’−１）〜（Ｒ’−２）１６ｍｇを、それぞれ５ｇのイオン交換水に溶解させ、この水溶液１０μＬを０．４％枯草菌懸濁液（２０％枯草菌懸濁液１ｍｌにイオン交換水４６．５ｍＬおよび１モル／Ｌリン酸カリウム水溶液２．５ｍＬを加えて前もって調製したもの）３ｍＬに加えた。
加えた直後の４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ0）を分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定し、さらに５分後にもう一度吸光度（Ａ5）を測定し、これらの４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化ΔＡ＝Ａ0−Ａ5を読み取った。
また、実施例１〜３および比較例１、２のリゾチーム濃度と同濃度の市販品「リゾチーム」で他に添加剤を加えないブランクの水溶液を調製し、これを用いて上記と同様に、４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ΔＡb）を読み取った。
【００４４】
各凍結乾燥後のリゾチームの「力価の保持率」は以下の式を用いて算出した。
【００４５】
力価の保持率（％）＝（ΔＡ／ΔＡb） ×１００
【００４６】
また、実施例１〜３および比較例１〜２で得られた凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１）〜（Ｒ−３）と（Ｒ’−１）、（Ｒ’−２）を２５℃、密封状態で６ヶ月保存した後、再び上記測定を行い、４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ΔＡ’）を測定した。
【００４７】
各凍結乾燥リゾチームの６ヶ月保存後の力価の保持率は以下の式を用いて算出した。
【００４８】
６ヶ月保存後の力価の保持率（％）＝（ΔＡ’／ΔＡb） ×１００
【００４９】
上記実施例および比較例の力価の保持率と６ヶ月保存後の力価の保持率を表１に示す。
【００５０】
【表１】
2008131934.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の凍結乾燥方法は、タンパク質などの有用物質を凍結乾燥して精製する過程において使用できる。有用物質としては、タンパク質、アミノ酸、核酸、糖、抗生物質およびビタミン類が挙げられる。また、本発明の凍結乾燥方法は、凍結乾燥時に有用物質を変性することなく、かつ保存期間中に生理活性が低下しないので食品、医薬品、および生化学の分野において有効に使用することができる。