(57)【要約】      （修正有）【課題】重金属や塩に対する耐性及び蓄積性を変化させることができる遺伝子、または塩や乾燥抵抗性を変化させる遺伝子を含む再対合ベクター、及びこれから製造される形質転換体の提供。【解決手段】重金属耐性や蓄積性を変化させることができる遺伝子であって、類似の４個の生体膜通過ドメインが５回反復された生体膜蛋白質を暗号化する配列を有する遺伝子。該遺伝子は６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが２回繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質をコードする配列を有する。また、乾燥抵抗性を変化させる遺伝子は、ＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質をコードする配列からなる群より選択される。【選択図】図１１
2008131929.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
類似の４個の生体膜通過ドメインが５回反復された生体膜通過蛋白質を暗号化する配列を含む重金属耐性と蓄積性を変化させる遺伝子。
【請求項２】
前記重金属は砒素、アンチモン、鉛、水銀、カドミウム、クロム、錫、亜鉛、バリウム、ビスマス、ニッケル、コバルト、マンガン、鉄、銅、バナジウム及び、これらの組み合わせからなる群より選択されるものであることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子。
【請求項３】
前記類似の４個の生体膜通過ドメインが５回反復された生体膜通過蛋白質を暗号化する配列は配列番号：１を有することを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子。
【請求項４】
前記類似の４個の生体膜通過ドメインが５回反復された生体膜通過蛋白質を暗号化する配列は配列番号：１と７０％以上の相同性を有する配列であることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子。
【請求項５】
前記類似の４個の生体膜通過ドメインが５回反復された生体膜通過蛋白質を暗号化する配列は配列番号：１と８０％以上の相同性を有する配列であることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子。
【請求項６】
前記類似の４個の生体膜通過ドメインが５回反復された生体膜通過蛋白質を暗号化する配列は配列番号：１と９０％乃至９５％の相同性を有する配列であることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子。
【請求項７】
植物で発現可能な転写及び翻訳調節因子によって調節されるように連結される請求項１乃至６のうちのいずれか による遺伝子を含む再組合ベクター。
【請求項８】
前記再組合ベクターは６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが２回繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列を含む重金属、塩または乾燥抵抗性と蓄積性を変化させる遺伝子及びＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列からなる群より選択される塩または乾燥抵抗性を有する遺伝子を追加的に含むものであることを特徴とする、請求項７に記載の再組合ベクター。
【請求項９】
前記６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが２回繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列は配列番号：３を有する遺伝子であることを特徴とする、請求項８に記載の再組合ベクター。
【請求項１０】
前記６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列は配列番号：３と７０％以上の相同性を有する配列の遺伝子であることを特徴とする、請求項８に記載の再組合ベクター。
【請求項１１】
前記６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列は配列番号：３と８０％以上の相同性を有する配列の遺伝子であることを特徴とする、請求項８に記載の再組合ベクター。
【請求項１２】
前記６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列は配列番号：３と９０％乃至９５％の相同性を有する配列の遺伝子であることを特徴とする、請求項８に記載の再組合ベクター。
【請求項１３】
前記６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列は配列番号：３と９５％乃至９９％の相同性を有する配列の遺伝子であることを特徴とする、請求項８に記載の再組合ベクター。
【請求項１４】
前記ＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列は配列番号：５を有することを特徴とする、請求項８に記載の再組合ベクター。
【請求項１５】
前記ＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列は、配列番号：５と７０％以上の相同性を有する遺伝子を有することを特徴とする、請求項８に記載の再組合ベクター。
【請求項１６】
前記ＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列は、配列番号：５と８０％以上の相同性を有する遺伝子を有することを特徴とする、請求項８に記載の再組合ベクター。
【請求項１７】
前記ＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列は、配列番号：５と９０％乃至９９％の相同性を有する遺伝子を有することを特徴とする、請求項８に記載の再組合ベクター。
【請求項１８】
発現可能な転写及び翻訳調節因子によって調節されるように連結される請求項１乃至７のうちのいずれかに記載の遺伝子を含む再組合ベクターに形質転換されることを特徴とする形質転換体。
【請求項１９】
前記再組合ベクターは６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが２回繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列を含む重金属、塩または乾燥抵抗性と蓄積性を変化させる遺伝子及びＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列からなる群より選択される塩または乾燥抵抗性を有する遺伝子を追加的に含むことを特徴とする、請求項１８に記載の形質転換体。
【請求項２０】
前記６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが２回繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列は配列番号：３を有する遺伝子であることを特徴とする、請求項１８に記載の形質転換体。
【請求項２１】
前記６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列は配列番号：３と７０％以上の相同性を有する配列の遺伝子であることを特徴とする、請求項１８に記載の形質転換体。
【請求項２２】
前記６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列は配列番号：３と８０％以上の相同性を有する配列の遺伝子であることを特徴とする、請求項１８に記載の形質転換体。
【請求項２３】
前記６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列は配列番号３と９０％乃至９５％の相同性を有する配列の遺伝子であることを特徴とする、請求項１８に記載の形質転換体。
【請求項２４】
前記６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列は配列番号３と９５％乃至９９％の相同性を有する配列の遺伝子であることを特徴とする、請求項１８に記載の形質転換体。
【請求項２５】
前記類似の４個の生体膜通過ドメインが５回反復された生体膜通過蛋白質を暗号化する配列は配列番号：１と９５％乃至９９％の相同性を有する配列の遺伝子であることを特徴とする、請求項１８に記載の形質転換体。
【請求項２６】
前記ＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列は配列番号：５を有することを特徴とする、請求項１８に記載の形質転換体。
【請求項２７】
前記ＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列は配列番号：５と７０％以上の相同性を有する遺伝子を有することを特徴とする、請求項１８に記載の形質転換体。
【請求項２８】
前記ＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列は配列番号：５と８０％以上の相同性を有する遺伝子を有することを特徴とする、請求項１８に記載の形質転換体。
【請求項２９】
前記ＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列は配列番号：５と９０％乃至９９％の相同性を有する遺伝子を有することを特徴とする、請求項１８に記載の形質転換体。
【請求項３０】
前記形質転換体は植物であることを特徴とする、請求項１８に記載の形質転換体。
【請求項３１】
上記植物は玉ねぎ、ニンジン、キュウリ、オリーブ、さつまいも、ジャガイモ、ハクサイ、大根、野菜、ブロッコリー、タバコ、ペチュニア、ひまわり、笠、芝、シロイヌナズナ 、アブラナ、シラカバ、ポプラ、雑種ポプラ及びオノオレカンバからなる群より選択されるものであることを特徴とする、請求項３０に記載の形質転換体。
【請求項３２】
植物で発現可能な転写及び翻訳調節因子によって調節されるように連結される請求項１乃至７のいずれかに記載の遺伝子を含む再組合ベクターに形質転換された植物の一部。
【請求項３３】
前記再組合ベクターは６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが２回繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列を含む重金属、塩または乾燥抵抗性と蓄積性を変化させる遺伝子及びＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列からなる群より選択される塩または乾燥抵抗性を有する遺伝子を追加的に含むものであることを特徴とする、請求項３２に記載の植物の一部。
【請求項３４】
上記植物は玉ねぎ、ニンジン、キュウリ、オリーブ、さつまいも、ジャガイモ、ハクサイ、大根、野菜、ブロッコリー、タバコ、ペチュニア、ひまわり、笠、芝、シロイヌナズナ 、アブラナ、笠、シラカバ、ポプラ、雑種ポプラ及びオノオレカンバからなる群より選択されるものであることを特徴とする、請求項３２に記載の植物の一部。
【請求項３５】
植物で発現可能な転写及び翻訳調節因子によって調節されるように連結される請求項１乃至７のいずれかに記載の遺伝子を含む再組合ベクターに形質転換されることを特徴とする植物細胞。
【請求項３６】
前記再組合ベクターは６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが２回繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列を含む重金属、塩または乾燥抵抗性と蓄積性を変化させる遺伝子及びＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列からなる群より選択される塩または乾燥抵抗性を有する遺伝子を追加的に含むものであることを特徴とする、請求項３５に記載の植物細胞。
【請求項３７】
上記植物は玉ねぎ、ニンジン、キュウリ、オリーブ、さつまいも、ジャガイモ、ハクサイ、大根、野菜、ブロッコリー、タバコ、ペチュニア、ひまわり、笠、芝、シロイヌナズナ 、アブラナ、笠、タバコ、シラカバ、ポプラ、雑種ポプラ及びオノオレカンバからなる群より選択されるものであることを特徴とする、請求項３５に記載の植物細胞。
【請求項３８】
（ａ）植物で発現可能な転写及び翻訳調節因子によって調節されるように連結される請求項１乃至７のいずれかに記載の遺伝子を含む発現カセットを製造し、
（ｂ）前記発現カセットを含む再組合ベクターを製造し、
（ｃ）前記再組合ベクターを植物細胞または植物組織に導入することを含む重金属耐性または蓄積性が向上した環境浄化用植物、或いは重金属吸収が低下した安全な植物の製造方法。
【請求項３９】
前記発現カセットは６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが２回繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列を含む重金属、塩または乾燥抵抗性と蓄積性を変化させる遺伝子及びＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列からなる群より選択される塩または乾燥抵抗性を有する遺伝子を追加的に含むものであることを特徴とする、請求項３８に記載の植物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は重金属や塩耐性または蓄積性を変化させることができる遺伝子及び、これら遺伝子を利用して製造される形質転換網に関し、より詳しくは重金属や塩に対する耐性や蓄積性を変化させる遺伝子及び、これら遺伝子と塩や乾燥抵抗性を向上させる遺伝子を含む再組合ベクター及び、この再組合ベクターを利用して製造する形質転換体及び重金属、塩、乾燥に対する耐性が優れていたり重金属を効果的に除去または蓄積することができる形質転換植物と重金属吸収が減少した形質転換植物、前記植物を利用した環境浄化方法及び安全な作物開発に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
重金属は主な環境汚染因子で、反応性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ ＯｘｉｄａｔｉｏｎＳｐｅｃｉｅｓ）の生成、ＤＮＡ損傷及び細胞内の様々な蛋白質と酵素の非活性化を引き起こす。過去数十年間産業化が進められることに伴って重金属による環境汚染が急激に増加した。１９９０年初めには年平均放出量が、カドミウム２２，０００トン、銅９５４，０００トン、鉛７９６，０００トン、亜鉛１，３７２，０００トンに至った（Ａｌｌｏｗａｙ   ＢＪ&Ａｙｒｅｓ ＤＣ（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ． Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ， Ｌｏｎｄｏｎ）。また、重金属に汚染された土壌は植物の正常な成長を阻害し、穀物の汚染を引き起こして人間の健康を脅かしているのが実情である。
【０００３】
したがって、全世界的に重金属を土壌から除去するための研究が進められている。一般的な方法は物理的または化学的な方法で、汚染された部分を直接除去或いは埋めたり、アルカリ溶液を利用して固定したりろ過したりする方法がこれに属する（Ｓａｌｔ ＤＥ， Ｂｌａｙｌｏｃｋ Ｍ，Ｋｕｍａｒ ＮＰＢＡ， Ｖｉａｔｃｈｅｓｌａｖ Ｄ， Ｅｎｓｌｅｙ ＢＤ， ｅｔ ａｌ．（１９９５）。Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ：ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｔｏｘｉｃ ｍｅｔａｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｎｔｓ． Ｂｉｏ-Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３， ４６８-７４;Ｒａｓｋｉｎ Ｉ， Ｓｍｉｔｈ ＲＤ， Ｓａｌｔ ＤＥ．（１９９７）Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｌｓ：ｕｓｉｎｇ ｐｌａｎｔｓ ｔｏ ｒｅｍｏｖｅ ｐｏｌｌｕｔａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８，２２１-６）。しかし、このような方法は高費用で、莫大なエネルギーが所要されるという問題がある。
【０００４】
これに反し、植物環境浄化技術（Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）は植物を利用する環境浄化法で、重金属を除去するのに非常に効率的、経済的で環境親和的な方法であって、植物抽出（ｐｈｙｔｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）、根ろ過（ｒｈｉｚｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）及び植物安定化（ｐｈｙｔｏｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）の３種類の方法を含む。植物抽出は重金属が蓄積できる能力を持っている植物を利用して土壌から重金属を除去する方法であり、根ろ過は植物の根を利用して汚染された水質から汚染物質を除去する方法で、植物安定化は植物を利用して土壌にある毒性物質を非活性化する方法である（Ｓａｌｔ ＤＥ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３（５）：４６８-４７４、１９９５）。
【０００５】
植物環境浄化技術の一例として、ラレアトリデンタタ（Ｌａｒｒｅａ ｔｒｉｄｅｎｔａｔａ）植物を用いて銅、ニッケル及びカドミウムを浄化する方法（米国特許第５，９２７，００５号）、ハクサイ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ ｆａｍｉｌｙ）の植物を利用する方法（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌ．１２７：６１-６８、１９９４）等が報告された。他の方法として、重金属に対する抵抗性を持たせる遺伝子を植物体に導入して形質転換された植物を利用する植物環境浄化技術が可能であると予測されている。重金属に対する抵抗性を向上させる植物遺伝子としては、ＡｔＡＴＭ３（ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）、ＣＡＸ２（Ｃａｌｃｉｕｍ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ２）、サイトクロムＰ４５０２Ｅ１、ＮｔＣＢＰ４（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ-ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＳＨＩＩ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ＡｔＰｃｒ１（ｐｌａｎｔ ｃａｄｍｉｕｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、ＡｔＰＤＲ１２（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）またはＭＲＴポリペプチド（ｍｅｔａｌ-ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）が知られている。ＡｔＡＴＭ３はＡＢＣ-ｔｙｐｅ輸送体で過発現形質転換植物がカドミウムと鉛に対する抵抗性が向上し、植物体内カドミウム含量を増加させると報告され（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４０：９２２-９３２、２００６）、ＣＡＸ２はカドミウム、マンガンのような重金属を植物体内に蓄積し（Ｈｉｒｓｃｈｉ ＫＤ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２４：１２５-１３４， ２０００）、サイトクロムＰ４５０２Ｅ１はトリクロロエチレン（ＴＣＥ）などの有機物質を植物内に受け入れて分解すると報告されている（Ｄｏｔｙ ＳＬ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：６２８７-６２９１，２０００）。ＮｔＣＢＰ４は形質転換植物体でニッケルに対して抵抗性を示し（Ａｒａｚｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２０：１７１-１８２，１９９９）、ＧＳＨＩＩはカドミウムを植物体内に蓄積し（Ｌｉａｎｇ Zｈｕ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１９：７３-８０，１９９９）、ＡｔＰｃｒ１過発現植物は体内カドミウム含量を減少させる機作でカドミウムに対する抵抗性を示し（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３５：１０２７-１０３９，２００４、韓国特許出願第１０-２００３-００５８２９９号、米国特許出願１０/９０７、６９４）、ＡｔＰＤＲ１２形質転換植物は植物に入ってきた鉛の量を減少させることによって鉛抵抗性を向上させ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３８：８２７-８３６、２００５）、ＭＲＴポリペプチドは鉄、カドミウム、マンガン及び亜鉛のような重金属を土壌から除去するもの（米国特許第５，８４６，８２１号）として知られている。
【０００６】
最近は植物の重金属に対する耐性及び蓄積性を効果的に増加させるために、植物遺伝子だけでなく酵母及びバクテリアから重金属に対する耐性や蓄積性に寄与する遺伝子を植物体に導入して植物の重金属に対する耐性及び蓄積性を変化させる方法が報告された。その例として、ｍｅｒＢ（ｏｒｇａｎｏｍｅｒｃｕｒｉａｌ ｌｙａｓｅ）は有機水銀物質を分解し（Ｂｉｚｉｌｙ ＳＰ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：６８０８-６８１３，１９９９）、バクテリアのＰ-ｔｙｐｅポンプであるZｎｔＡ遺伝子を植物に過発現させてカドミウムと鉛に対する耐性が増加し、吸収量が減少した植物（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３３：５８９-５９６、２００３）を製造する方法（韓国特許第０５１５５２０号）と酵母のＡＢＣ-ｔｙｐｅ輸送体であるＹｃｆ１（ｙｅａｓｔ ｃａｄｍｉｕｍ ｆａｃｔｏｒ１）遺伝子を植物に発現させてカドミウムと鉛に対する耐性と蓄積性が増加した植物（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：９１４-９１９，２００３）を製造する方法（国際特許ＰＣＴ/ＫＲ０２/０１９３４）、そして酵母のＭＲＰ-ｔｙｐｅＡＢＣ輸送体を植物に発現させて形質転換植物を製造する方法が報告された（韓国特許第０４８０８４３号）。
【０００７】
しかし、前記で列挙した重金属抵抗性を示す遺伝子で形質転換させた植物体は、重金属で汚染された土壌での成長が野生種に比べて改善されてはいるが、重金属の地上部蓄積性は大きく改善できなかった。環境浄化用植物は汚染物質に対して耐性を有するだけでなく、この汚染物質を地上部に移動させて汚染物質が蓄積できる特性を有することがさらに理想的である。植物の地下部よりは地上部を収穫して処理することがさらに安全で経済的であるためである。今まで知られた重金属抵抗性を示す遺伝子で形質転換された植物体は、重金属で汚染された土壌での成長が野生種に比べて多少改善された場合があるが、効果的に重金属を地下部で地上部に移動させて蓄積する植物はまだ開発されていない。
【０００８】
植物は水を吸収する時に、環境に存在する多様な汚染物質を共に吸収する。したがって、植物が水をさらに多く吸収して蒸散できれば、汚染された土壌から汚染物質をさらに早くさらに多く植物体内に蓄積することができる。このような植物は野生種に比べてより速い時間内に環境の汚染度を低下させることができるので、環境浄化に所要される時間と経済的な費用が節減できる。
なお、全世界的に水不足が大きな問題となっているため、砂漠化が進められている地域も多い。これは農業と環境に大きな問題を招いている。したがって、水を少なく使用して乾燥した環境や塩濃度の高い環境でも耐えられる植物の開発が切実に必要であるのが実情である。特に、乾燥地域で経済的に環境浄化をしようとする場合には、汚染物質に対する耐性が向上しただけでなく、乾燥抵抗性も向上した植物が理想的である。反面、蒸散作用を下げることができる植物は乾燥した条件での生存に有利であるので、環境が非常に乾燥した地域での環境浄化や農業生産性に寄与することができる。
【０００９】
環境浄化用植物の場合とは反対に、作物の場合には汚染物質の吸収を最少化する技術の開発が必要である。作物が重金属や他の汚染物質を吸収すると、それを消費する人と家畜の健康に悪影響を与えるためである。細胞から重金属を除去する遺伝子を作物に発現させることによって、重金属汚染からより安全な作物を開発することができる。また、細胞に重金属を蓄積させる遺伝子の発現を人為的に減少させたり、この遺伝子を変形して反対作用を起こすように発現させたりすると、このような形質転換植物は野生種に比べて重金属蓄積が減少し、この技術を安全な作物の開発に利用することができる。
【００１０】
重金属抵抗性、塩抵抗性、乾燥抵抗性などを変化させる遺伝子はまた、環境復原（Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｏｎ）に用いることができる。環境復原は人為的且つ自然的に破壊された自然を再び回復させ、生態系を再び構築して本来の状態に戻すことである。したがって、これは環境を快適にするだけでなく、自然資源を保存し、人間が他の生物種と共に生きていける拠り所を備えることである。復原方法としては汚染物質除去、耐性植物の植栽、絶滅した動物の再導入がある。このような環境復原の実際事例としては、ゴミ埋立地として使用された地域に自生植物と薬用植物を植栽して生息植物の種数を増加させ、住民生態教育場と休息空間に変えた大邱樹木園がある。生活汚水流入で水質が汚染して生態系がき損された貯水池を復元して自然生態公園に変えた光州雲川貯水池の事例もここに属する。ゴミ埋立地ではカドミウムが浸出水に出る場合が多く、廃鉱山地域は乾燥した場合が多い。したがって、重金属と乾燥に対する耐性の高い遺伝子はゴミ埋立地や廃鉱山の環境復原に有用である。干拓地は塩分の濃度が高いので、塩抵抗性遺伝子は干拓地の環境復原に用いることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、重金属に対して耐性を有したり、重金属蓄積性を変化させる遺伝子及び、塩や乾燥抵抗性を有したり、塩蓄積性を変化させる遺伝子を提供することにある。
また、本発明の第２の課題は、重金属に対して耐性や蓄積性を変化させる遺伝子を含む再組合ベクターを提供することにある。
また、本発明の第３の課題は、重金属に対する耐性や蓄積性が変化した形質転換体を提供することにある。
また、本発明の第４の課題は、重金属に対する耐性や蓄積性が変化した形質転換体の製造方法を提供することにある。
また、本発明の第５の課題は、重金属汚染地を環境親和的な空間に造成することができる方法を提供することにある。
また、本発明の第６の課題は、重金属含量が減少した安全な作物を開発する方法を提供することにある。
また、本発明の第７の課題は、塩や乾燥に対する抵抗性を向上させる遺伝子を含む再組合ベクターを提供することにある。
また、本発明の第８の課題は、塩や乾燥に対する抵抗性が向上した形質転換体を提供することにある。
また、本発明の第９の課題は、塩や乾燥に対する抵抗性が向上した形質転換体の製造方法を提供することにある。
また、本発明の第１０の課題は、塩濃度の高い地域や乾燥した地域を環境親和的空間に造成することができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するために本発明は、類似の４個の生体膜通過ドメインが５回反復された生体膜通過蛋白質を暗号化する配列を含む重金属耐性と蓄積性を有する遺伝子を提供する。
【００１３】
本発明はまた、植物で発現可能な転写及び翻訳調節因子によって調節されるように連結され、類似の４個の生体膜通過ドメインが５回反復された生体膜通過蛋白質を暗号化する配列または、この配列と相同性を有する配列を含む再組合ベクターを提供する。
【００１４】
前記再組合ベクターは６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが２回繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列、ＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列及び、これら配列と相同性を有する配列からなる群より選択される塩または乾燥抵抗性を有する遺伝子を追加的に含むことができる。
【００１５】
本発明はまた、前記再組合ベクターに形質転換された形質転換体を提供する。
本発明はまた、前記再組合ベクターに形質転換された植物を提供する。
本発明はまた、前記再組合ベクターに各々形質転換された植物細胞を提供する。
【００１６】
本発明はまた、（ａ）植物で発現可能な転写及び翻訳調節因子によって調節されるように連結され、類似の４個の生体膜通過ドメインが５回反復された生体膜通過蛋白質を暗号化する配列または、この配列と相同性を有する配列を含む発現カセットを製造し、（ｂ）前記発現カセットを含む再組合ベクターを製造し、（ｃ）前記再組合ベクターを植物細胞または植物組織に導入することを含む重金属耐性植物の製造方法を提供する。
【００１７】
前記発現カセットは６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが２回繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列、ＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列及び、これら配列と相同性を有する配列からなる群より選択される遺伝子を追加的に含むことができる。
【発明の効果】
【００１８】
上述のように、本発明による重金属耐性を有する遺伝子で製造された形質転換体は、重金属で汚染された環境で成長することができるので、汚染地に環境親和的な公園を作ることで環境復原に利用でき、汚染地の土壌流失による２次汚染を防止することができ、野生種に比べて重金属を少量吸収する安全な作物を開発するのに用いることができる。また、前記重金属耐性遺伝子と塩または乾燥抵抗性を有する遺伝子が導入された形質転換植物は、重金属に対する耐性に優れているだけでなく、様々な汚染物質を地上部げ引き上げると予想され、環境浄化に寄与できる新品種の開発に用いることができる。本発明で提示したＡｔＰＤＲ８遺伝子は、重金属だけでなく塩と乾燥抵抗性も増加させるので、廃鉱山地域と他の重金属汚染地域の浄化と復原に利用できる。ＴａＴＭ２０とＡｔＰＤＲ８遺伝子は植物体内重金属含量を減少させるので、重金属吸収が減少した安全な作物の開発に利用することができる。ＡｔＰＤＲ８やこれと相同性の高い遺伝子を過発現させたり、Ｒｏｐ２を抑制したりすると、塩や乾燥抵抗性が向上すると予想され、干拓地または乾燥地域の農業と環境に寄与できる新品種開発に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明で言及する”生体膜通過蛋白質”は、脂質二重層で構成される生体膜を貫通して位置する蛋白質のことである。前記生体膜通過蛋白質は類似の生体膜通過ドメインが４個ずつ５回繰り返される構造を有する蛋白質で、特に、重金属と塩の吸収及び排出に関与する。前記重金属は砒素、アンチモン、鉛、水銀、カドミウム、クロム、錫、亜鉛、バリウム、ビスマス、ニッケル、コバルト、マンガン、鉄、銅、バナジウムなどを含む。
【００２０】
本発明で言及する”ＡＢＣ輸送体（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ）”は、ＡＴＰを分解して出たエネルギーを使用して物質を運ぶ輸送体で、細胞内に栄養分を吸収したり、毒性物質を細胞外に運んだりする役割を果たす蛋白質のことである。
本発明で言及する”相同性”は、核酸（ＤＮＡ）または蛋白質間の配列類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を意味する。
【００２１】
本発明で言及される”発現抑制方法（ＲＮＡｉ）”は、相同性を有する塩基配列をヘアピン構造に作り、過発現させて当該遺伝子の発現を抑制することを意味する。ＲＮＡｉは細胞内でウイルスの防御機作でウイルスのｄｓＲＮＡを分解するための機作が作動し、その過程は次の通りである。１）Ｄｉｃｅｒという酵素がｄｓＲＮＡを切り出して２１−２３塩基長さのｓｍａｌｌ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を生成する。２）Ｄｉｃｅｒは切られたｓｉＲＮＡがＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）と結合できるように補助する。３）ｓｉＲＮＡが結合されたＲＩＳＣはｓｉＲＮＡのアンチセンスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を認識して切り出す。したがって、ｓｉＲＮＡとアンチセンスであるｍＲＮＡが分解されるものである。このような原理を利用して、特定遺伝子、本発明の場合には特にＡｔＰＤＲ８の一部配列を利用してそれがｄｓＲＮＡを生成できるようにデザインしたｃｏｎｓｔｒｕｃｔを形質転換させ、ＡｔＰＤＲ８の発現のみ減少したＲＮＡｉ形質転換植物を作ることができる。つまり、ＲＮＡｉはｓｉＲＮＡがｍＲＮＡの特異な配列を認識し結合してｍＲＮＡを分解する機作を利用するｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ技術である。この時、ｓｉＲＮＡはそのｓｉＲＮＡと類似の配列を有する他の遺伝子のｍＲＮＡ（この場合には、ＡｔＰＤＲ８と相同性を有する他の遺伝子）にも結合して、分解させる。
【００２２】
本発明で言及する”重金属抵抗性蛋白質”は、重金属の存在下で生命体の成長が抑制されないように媒介する蛋白質を意味する。
本発明で言及する”塩、乾燥抵抗性蛋白質”は、高濃度の塩や乾燥した条件下で生命体の成長が抑制されないように媒介する蛋白質を意味する。
本発明で言及される”形質転換植物”は、遺伝工学的に操作されたもので、外来ＤＮＡ配列を含み、植物細胞、植物組織或いは植物体で発現可能に製作されて外来ＤＮＡ配列を発現する。
本発明による重金属耐性と蓄積性を有する遺伝子は、類似の４個の生体膜通過ドメインが５回反復された生体膜通過蛋白質を暗号化する配列を含む。
【００２３】
前記類似の４個の生体膜通過ドメインが５回反復された生体膜通過蛋白質を暗号化する配列は配列番号：１のＴａＴＭ２０蛋白質の暗号化配列であるのが好ましい。また、前記相同性を有する配列は配列番号：１の配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％乃至９５％或いは９０％乃至９９％の相同性を有する配列である。
【００２４】
本発明はまた、前記遺伝子またはこの遺伝子配列と相同性を有する配列が植物で発現可能な調節因子に連結された遺伝子に連結される発現カセットを提供する。
前記発現カセットは６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが２回繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列を含む遺伝子、ＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列及び、これら配列と相同性を有する配列からなる群より選択される重金属、塩及び乾燥抵抗性及び蓄積性を変化させる遺伝子、または塩抵抗性や乾燥抵抗性を有する遺伝子を追加的に含むことができる。
【００２５】
前記６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列は配列番号：３のＡｔＰＤＲ８蛋白質の暗号化配列であるのが好ましい。また、前記相同性を有する配列は配列番号：３の配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％乃至９５％または９５％乃至９９％の相同性を有する配列である。
なお、前記発現カセットは植物の気孔運動を調節するＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質（Ｒｏｐ２蛋白質）を暗号化する遺伝子をさらに含むことができる。前記Ｒｏｐ２蛋白質を暗号化する遺伝子は配列番号：５の配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％乃至９９％の相同性を有する配列である。
【００２６】
本発明の一実施例による発現カセットは、プロモーター;ＴａＴＭ２０蛋白質を暗号化する遺伝子、ＴａＴＭ２０とＡｔＰＤＲ８蛋白質を暗号化する遺伝子及びＴａＴＭ２０、ＡｔＰＤＲ８及びＲｏｐ２蛋白質を暗号化する遺伝子からなる群より選択される遺伝子及び、これと相同性を有する配列の遺伝子及び転写終結部位を含む。前記プロモーターとしては植物発現用プロモーターでＣＭＶ（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）３５Ｓプロモーター、ＣＭＶ１９Ｓプロモーター、アグロバクテリウムトゥメファシエンスＴｉプラスミド（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔｉ ｐｌａｓｍｉｄ）のｎｏｓ（ｎｏｐａｌｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）プロモーター、ｏｃｓ（ｏｃｔｏｐｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）プロモーター及びｍａｓ（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）プロモーター、公知されたプロモーターがある。
【００２７】
また、本発明の発現カセットはＴａＴＭ２０、ＡｔＰＤＲ８またはＲｏｐ２蛋白質を暗号化する遺伝子の発現を確認したり、形質転換体を選別できるマーカをさらに含むことができる。標識遺伝子としてはカナマイシン、ヒグロマイシン、ゼンタマイシン及びブレオマイシンなどの抗生剤に対して耐性を示す遺伝子やＧＵＳ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）またはＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）等を暗号化する遺伝子がある。前記マーカは発現カセットと共に植物に伝達され、特定の抗生剤を含む培地で培養することによって形質転換体の選別を可能にする。
【００２８】
また、本発明は前記発現カセットを含む再組合ベクターを提供する。再組合ベクターはｐＧＡ１５３５/ＴａＴＭ２０とｐＣＡＭＢＩＡ１３０２/ＡｔＰＤＲ８である。ｐＧＡ１５３５/ＴａＴＭ２０はｐＧＡ１５３５に３５Ｓプロモーター、ＴａＴＭ２０遺伝子及びノパリン合成酵素転写終結部位を含み、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２/ＡｔＰＤＲ８は３５Ｓプロモーター、ＡｔＰＤＲ８遺伝子及びノパリン合成酵素転写終結部位を含む。
【００２９】
また、本発明は前記再組合ベクターを利用して形質転換された形質転換体を提供する。前記形質転換体は重金属を伝達する生体膜通過蛋白質を暗号化する配列、前記生体膜通過蛋白質とＡＢＣ輸送体を暗号化する配列及び、前記生体膜通過蛋白質、ＡＢＣ輸送体及び植物の気孔運動を調節する蛋白質を暗号化する配列を含み、前記配列は転写及び翻訳調節因子に連結され、前記因子によって調節されるように考案される。
【００３０】
本発明の形質転換体は植物であり、好ましくは植物、植物細胞及び植物組織で、植物組織は植物種子を含む。前記植物としては草本及び木本植物で、顕花植物（ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｐｌａｎｔｓ）、庭園植物（ｇａｒｄｅｎｐ ｌａｎｔｓ）、玉ねぎ、ニンジン、キュウリ、オリーブ、さつまいも、ジャガイモ、ハクサイ、大根、野菜、ブロッコリー、タバコ、ペチュニア、ひまわり、笠、芝、シロイヌナズナ 、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉ ｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ，Ｂ．ｎａｐｕｓ）、笠（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）、シラカバ（Ｂｅｔｕｌａ ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａ）、ポプラ、雑種ポプラ及びオノオレカンバ（Ｂｅｔｕｌａ ｓｃｈｍｉｄｔｉｉ）が代表的である。前記植物は体細胞胚芽形成法（ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）、細胞組織培養法（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）及び細胞株培養法（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）からなる群より選択される方法によって無性繁殖される植物であり得る。
形質転換体は公知の技術で製造することができ、アグロバクテリウムテュメペクシンス−媒介ＤＮＡ遷移が代表的である。さらに好ましくは、電気衝撃、微細粒子注入方法または遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）からなる群より選択される方法で製造された再組合アグロバクテリウムを浸漬法で植物に導入することである。
【００３１】
本発明はまた、（ａ）植物で発現可能な転写及び翻訳調節因子によって調節されるように連結され、類似の４個の生体膜通過ドメインが５回反復された生体膜通過蛋白質を暗号化する配列または、この配列と相同性を有する配列を含む発現カセットを製造し、（ｂ）前記発現カセットを含む再組合ベクターを製造し、（ｃ）前記再組合ベクターを植物細胞または植物組織に導入することを含む重金属耐性植物の製造方法を提供する。
【００３２】
前記発現カセットは６個の生体膜通過ドメインとＡＴＰ結合ドメインが２回繰り返されるＡＢＣ輸送体蛋白質を暗号化する配列または、この配列と相同性を有する配列を含む遺伝子及びＧＴＰ結合ドメインと細胞質から細胞膜に位置を移ることができるＣａａＬドメイン（ゲラニルゲラニレーションモチーフ）を有する蛋白質を暗号化する配列と、これら配列と相同性を有する配列からなる群より選択される重金属、塩及び乾燥抵抗性及び蓄積性を変化させる遺伝子または塩や乾燥抵抗性を有する遺伝子を追加的に含むことができる。
前記形質転換植物でＴａＴＭ２０蛋白質（配列番号：２）またはこれら蛋白質と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％乃至９５％、最も好ましくは９５％乃至９９％の相同性を有する蛋白質を過発現させると、重金属に対する耐性が増加し、蓄積性が変化した形質転換体を得ることができ、ＡｔＰＤＲ８蛋白質（配列番号：４）またはこれら蛋白質と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％乃至９５％、最も好ましくは９５％乃至９９％の相同性を有する蛋白質を過発現させると、重金属及び塩、乾燥ストレスに対する耐性が増加し、蓄積性が変化した形質転換体を得ることができる。
【００３３】
また、前記形質転換植物でＲｏｐ２蛋白質（配列番号：６）またはこれら蛋白質と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％乃至９９％の相同性を有する配列をＲＮＡｉ方法で低発現したり不活性化して発現させると、正常条件では植物の気孔がよく開放されて蒸散作用が活発に進められ、この蒸散作用によって重金属を地上部へ移動させる形質転換体を得ることができ、乾燥条件では気孔を早く閉じることで乾燥抵抗性が向上した植物を得ることができる。
したがって、本発明による形質転換植物は、重金属を地下部から地上部へ効果的に移動させて蓄積することができる。本発明による形質転換植物は植物の気孔運動を調節する遺伝子を変形させて導入したり、発現水準を変化させることで水と共に重金属などの汚染物質を蒸散力によって地上部へ移動させることができ、乾燥抵抗性も向上させることができる。
【００３４】
前記ＴａＴＭ２０とＡｔＰＤＲ８蛋白質を暗号化する遺伝子を植物原形質体に導入すると、植物の細胞膜で発現する。図１は２０個の膜貫通ドメインを含むＴａＴＭ２０の構造を示す図面（Ａ）であり、３次元ドメインが互いに相互作用して集まっている形状を図示し（Ｂ）、ＴａＴＭ２０とプロテインキナーゼｃフォスフォリレーションモチーフとの相同性を示す図面（Ｃ）である。
【００３５】
したがって、ＡＢＣ輸送体と生体膜通過蛋白質遺伝子で形質転換された形質転換体は、重金属で汚染された環境でも円滑に成長できるので、重金属の吸収量が低く、人体に無害で安全な作物を製造することができる。反対に、ＲＮＡｉなどの低発現技術を利用する場合には、重金属の吸収を高めて土壌、大気、水質などから植物を利用した重金属抽出植物の製造が可能である。黄砂や自然災害などによって重金属が遠隔地から流入される場合もあるので、このような形質の作物が必要である。
【００３６】
以下では本発明の実施例を記載する。下記実施例は本発明の例示に過ぎず、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【００３７】
実施例１：植物栽培条件
【００３８】
野生種と形質転換されたシロイヌナズナ 及び小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．ｃｖ．Ａｔｌａｓ６６）種子をエタノールとラックスを利用して表面殺菌し、４℃暗状態で２日間保管した後、１/２ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，１９６２）に致床した。培地は水平或いは垂直で２−３週間培養した。
【００３９】
実施例２：小麦の根ｃＤＮＡライブラリーでカドミウム抵抗性遺伝子同定
【００４０】
カドミウム抵抗性遺伝子を小麦根ｃＤＮＡライブラリーで同情するために、ｙｃｆ１−ｎｕｌｌ酵母に酢酸リチウム法を利用して挿入した後、機能的相補性を観察した。６０μＭの塩化カドミウム（ＣｄＣｌ２）が含まれている培地で育った細胞群体を選抜してプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）を同情し、その塩基配列を読取った後（配列番号：１）、これを再びｙｃｆ１−ｎｕｌｌ酵母に挿入してカドミウム耐性を再確認した。野生種酵母（ｗｔ）及びｙｃｆ１−ｎｕｌｌ酵母に空のベクター（ＥＶ）を入れたものと、ｙｃｆ１−ｎｕｌｌ酵母にＴａＴＭ２０遺伝子を含むベクターを入れて培地に培養した時、空のベクターのみを入れた野生種及びｙｃｆ１−ｎｕｌｌ酵母よりＴＭ２０を入れた酵母がカドミウムを含有する培地で成長が優れていた（図５）。これはＴＭ２０が酵母でカドミウム耐性を向上させるということを示す。
【００４１】
実施例３：Ｎ−末端とＣ−末端が除去されたＴａＴＭ２０ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔの製作及び酵母におけるカドミウム耐性試験
【００４２】
全てのＮ−末端とＣ−末端が除去されたＴａＴＭ２０ｃＤＮＡはＰＣＲ生産物の制限酵素切断によって生成された。ｙｃｆ１−ｎｕｌｌ酵母に各々の遺伝子を酢酸アセテート法によって挿入し、ウラシル（ｕｒａｃｉｌ）が欠乏した最少培地で選抜した。カドミウム抵抗性相補実験のために、各々の遺伝子を有しる酵母を１/２ＳＧ培地に３０ｕＭの塩化カドミウムを添加して摂氏３０度で３日間培養して観察した。その結果、Ｎ−末端及びＣ−末端が少しずつ除去された遺伝子で形質転換された酵母のカドミウム耐性が、空のベクターのみを入れたものと類似するということが分かった（図６Ａ）。これはＴａＴＭ２０によって現れる酵母のカドミウム抵抗性はＴＭ２０の４個の生体膜通過ドメインが５回反復された膜貫通ドメインが存在しなければならないということを意味する。
【００４３】
実施例４：形質転換シロイヌナズナの製造
【００４４】
ＴａＴＭ２０遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を使用してｐＹＥＳ２：ＴａＴＭ２０遺伝子から植物発現ベクターに再組合した。遊離されたＨｉｎｄＩＩＩ片は４０塩基対の５'側の翻訳されていない部分と完全な２６７０塩基組のＴａＴＭ２０遺伝子、１０９塩基対の３'側の翻訳されていない部分、そして翻訳終了コドンを含む。
【００４５】
ｐＧＡ１５３５が形質転換シロイヌナズナ の製造のための植物発現ベクターとして使用され、これはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと複数のクローニング場所とノパリン合成終結部位（ｎｏｐａｌｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を有する。花芽浸漬法（Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐｐｉｎｇ，Ｃｌｏｕｇｈ ａｎｄ Ｂｅｎｔ，１９８８）を使用してｐＧＡ１５３５：ＴａＴＭ２０遺伝子を有するアグロバクテリウム（ＬＢＡ４４０４）を使用してシロイヌナズナ を形質転換した。形質転換された種子は３０ｕｇ/Ｌのカナマイシン抗生剤が含まれている１/２ＭＳ培地で選抜され、生存した植物から種子を採取した。３世代の同質接合種子が表現型分析のために使用された。
【００４６】
ＡｔＰＤＲ８遺伝子をシロイヌナズナ から作ったｃＤＮＡを鋳型.としてＡｔＰＤＲ８Ｆ−ＳＢ（５'−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣＣ−３'）プライマとＡｔＰＤＲ８Ｒ−ＰＸ（５'−ＧＡＣＡＣＧＴＧＣＴＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＴＡＴＣＴＧＧＴＣＴＧＧＡＡＧＴＴＧＡＧ−３'）プライマを使用してＰＣＲに増幅した後、Ｔ−ｖｅｃｔｏｒに入れ、制限酵素を使用してｐＣａｍｂｉａ１３０２バイナリベクターに再対合した。ｐＣａｍｂｉａ１３０２ベクターは形質転換シロイヌナズナ の製造のための植物発現ベクターとして使用され、これはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと複数のクローニング場所、ノパリン合成終結部位を有している。
【００４７】
ＴａＴＭ２０と同様な方法でｐＣａｍｂｉａ１３０２：ＡｔＰＤＲ８を有するアグロバクテリウム（ＧＶ３１０１）を使用してシロイヌナズナ に形質転換し、形質転換された種子は３０ｕｇ/Ｌのハイグロマイシンを含む１/２ＭＳ培地で選抜して生存した植物から種子を受けた。
【００４８】
実施例５：カドミウム耐性検定
【００４９】
野生種とＴａＴＭ２０過発現シロイヌナズナ （ＴＭ２０−１、ＴＭ２０−２）が４０または６０μＭの塩化カドミウムが含まれている１/２ＭＳ培地で３週間培養された後、収穫して重量と根長さを測定した。ＴａＴＭ２０を過発現する植物が４０または６０μＭの塩化カドミウムが含まれている１/２ＭＳ培地で野生種に比べて成長が優れており（図８Ａ、Ｂ）、低濃度の塩化カドミウム（１５、２５μＭ）が含まれている培地でもＴａＴＭ２０を過発現する植物の生体量と根長さが野生種より優れていることが分かった（図８Ｃ、Ｄ）。これはＴＭ２０が植物でカドミウム耐性を向上させるということを示す。
野生種とＡｔＰＤＲ８形質転換シロイヌナズナ （過発現及び発現抑制植物）を３０−５０μＭの塩化カドミウムが含まれている１/２ＭＳ培地に植え、２〜３週間立てて培養した後、収穫して植物の生体量と根長さを測定した。野生種とＡｔＰＤＲ８を過発現する植物（ＰＤＲ８−１、−２、−３）を４０μＭの塩化カドミウム及び０．４ｍＭの窒酸化鉛を含有する培地で共に培養した結果、ＡｔＰＤＲ８過発現植物の生体量と根長さが野生種に比べて優れていることが分かった（図１０）。また、ＡｔＰＤＲ８発現を抑制植物（ＲＮＡｉ;８ｉ−１、−２、−３）とＡｔＰＤＲ８欠乏突然変異個体（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ;ｋｏ−１ａｎｄｋｏ−２）を野生種と共に塩化カドミウム及び窒酸化鉛を含有する培地で培養した結果、ＡｔＰＤＲ８発現抑制植物とＡｔＰＤＲ８欠乏突然変異はカドミウムと鉛に対して敏感であり（図１１Ａ、Ｂ、Ｅ）、植物のクロロフィル含量と生体量が大きく減少することが分かった（図１１Ｃ、Ｄ）。これはＡｔＰＤＲ８が植物でカドミウムと鉛に対する耐性を向上させるということを示す。
【００５０】
実施例６：カドミウム耐性機作検定
【００５１】
ＴａＴＭ２０とＡｔＰＤＲ８のカドミウム耐性機作がグルタチオンと関連があるかどうかを調べるために、グルタチオン合成阻害剤であるＢＳＯ（ｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ）を使用してカドミウム耐性を調査した。ＴａＴＭ２０の場合、カドミウムやＢＳＯが入っていない培地とＢＳＯのみを有する培地では空のベクターのみ入れた酵母と成長が類似し、カドミウムを含有する培地でＴａＴＭ２０形質転換酵母のカドミウム抵抗性が大きく増加するということが分かった。そして、カドミウムとＢＳＯと共に含む培地に培養した時には、ＴａＴＭ２０によって現れるカドミウム抵抗性が全く無くならず、維持されるということが分かった（図１２）。これは従来多く知られたグルタチオンを媒介とするカドミウム抵抗性機作とは異なる機作でＴａＴＭ２０が酵母のカドミウム抵抗性に寄与するということを意味する。
ＡｔＰＤＲ８の場合には、形質転換植物が１/２ＭＳやＢＳＯのみを有する１/２ＭＳでは野生種と成長が類似するが（図１３Ａ）、カドミウムを含む培地では過発現植物の成長は優れていて、発現抑制植物は敏感な表現型を示す（図１３Ｂ）。ＢＳＯと共にカドミウムを処理した培地でＡｔＰＤＲ８形質転換植物と野生種間の成長差が無くならず、さらに大きくなるということが分かった（図１３Ｃ、Ｄ）。この結果はＡｔＰＤＲ８によって現れるカドミウム抵抗性がグルタチオンを媒介としない新たな機作を通じて現れる可能性があることを意味する。
【００５２】
実施例７：カドミウム含量測定
【００５３】
ＴａＴＭ２０形質転換酵母のカドミウム含量を測定するために、酵母をウラシルのない合成ガラクトース培地（ＳＧ−ｕｒａ;ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇａｌａｃｔｏｓｅ−ｕｒａｃｉｌ）で培養した後、１０μＭの塩化カドミウムと１μＭの放射性塩化カドミウムを処理し、各時間別に細胞を収穫してガンマ線測定器でカドミウム量を測定した。ｙｃｆ−ｎｕｌｌ酵母に空ベクターのみを入れたもの（１６７Ｖ）に比べてＴａＴＭ２０を入れた酵母（１６７ＴＭ）の細胞内カドミウム量が低く（図１４Ａ）、カドミウム排出程度を測定した結果、ＴａＴＭ２０を入れた酵母がより速くカドミウムを細胞外部に排出するということが分かった（図１４Ｂ）。また、形質転換酵母細胞内のカドミウム含量を原子吸光光度計（ＡＡＳ）を使用して分析するために、酵母を２０μＭの塩化カドミウムが添加されたＳＧ−Ｕｒａ培地で育てた後、氷水で洗い、１１Ｎの硝酸で細胞を溶かしてカドミウム含量を測定した。その結果、ＴａＴＭ２０で形質転換された酵母のカドミウム含量が空ベクターのみを入れたものに比べて低いことが分かった。これら結果はＴａＴＭ２０が細胞内に入ったカドミウムを細胞外に排出して酵母のカドミウム抵抗性を増加させるということを意味する。
【００５４】
ＡｔＰＤＲ８形質転換植物体内カドミウム含量を測定するために、１/２ＭＳで２週間立てて培養した後、１００μＭの塩化カドミウムを根に処理し、１０時間培養した。地上部と根を各々分離して収穫した後、冷水で洗浄して乾燥した。乾燥された植物体は前記と同様な方法でＡＡＳを利用してカドミウム含量を測定した。ＡｔＰＤＲ８を過発現する植物（ＰＤＲ８−１）の地上部と根は野生種より少量のカドミウムを含み、ＡｔＰＤＲ８発現を抑制する植物（８ｉ−２）の地上部と根は多量のカドミウムが蓄積されているということが分かった（図１５Ａ）。また、カドミウム同位元素を使用して植物体内カドミウム含量を分析するために、１/２ＭＳで１０日間立てて培養した植物の根を放射性塩化カドミウムが含まれている培地に１０時間培養して洗浄した後、地上部と根を分離してガンマ線測定器で体内カドミウム含量を分析した。この結果でも野生種に比べてＡｔＰＤＲ８過発現植物には地上部と根のカドミウム含量がさらに低くなり、ＡｔＰＤＲ８発現抑制植物の地上部と根にはカドミウムがさらに多く蓄積されることが分かった。
【００５５】
ＡｔＰＤＲ８のカドミウム輸送能力を測定するために、ＡｔＰＤＲ８形質転換植物の原形質体にカドミウム同位元素を吸収させ、細胞内カドミウム含量を測定した。原形質体と共にカドミウム同位元素を培養し、各時間帯別に原形質体を収穫して細胞内カドミウム含量を測定した結果、野生種植物（ｗｔ）から得られた原形質体に比べて過発現植物（ＰＤＲ８−１）から得られた原形質体には少量のカドミウムが、そして発現抑制植物（８ｉ−２）から得られた原形質体には多量のカドミウムが蓄積されることが分かった（図１６Ａ）。また、カドミウム排出能力を調べてみるために、原形質体とカドミウム同位元素を共に培養した後、細胞外のカドミウムを洗浄し、各時間帯別に細胞内に残っているカドミウムを測定した結果から、野生種に比べて過発現細胞はカドミウムをさらに速く、発現抑制細胞はさらに遅くカドミウムを排出するということが分かった（図１６Ｂ）。これら結果は、ＡｔＰＤＲ８が細胞内に入ってきたカドミウムを細胞外部に排出して植物のカドミウム抵抗性を増加させるということを意味する。
したがって、ＡｔＰＤＲ８を過発現させた形質転換植物はカドミウム及び鉛を植物体外部に排出する耐性機作を持っていて体内重金属含量を大きく減少させた安全な作物を作るのに利用することができる。反対に、ＡｔＰＤＲ８やそれと類似の遺伝子の発現を減少させた形質転換植物は、カドミウム及び鉛を植物体外部に排出する作用が減少して体内重金属含量を増加させた環境浄化用植物を作るのに利用することができる。
【００５６】
実施例８：葉緑素含量測定
【００５７】
カドミウム、鉛などの重金属による植物の毒性現象のうちの１つは葉の黄化現象である。したがって、このような重金属に対する植物の耐性程度は葉緑素含量分析から分かる。植物の葉緑素含量を測定するために、葉を収得して９５％のエタノールで２０分間８０℃で抽出した。抽出物は６６４ｎｍと６４８ｎｍで吸光度を測定して葉緑素Ａ及び葉緑素Ｂの含量を計算した（Ｏｈ ＳＡ，Ｐａｒｋ ＪＨ，Ｌｅｅ ＧＩ，Ｐａｅｋ ＫＨ，Ｐａｒｋ ＳＫ，Ｎａｍ ＨＧ（１９９７）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｏｃｉｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．１２，５２７−３５）。ＡｔＰＤＲ８発現抑制形質転換植物（８ｉ−１、８ｉ−２、８ｉ−３）と野生形植物を５０μＭの塩化カドミウムが添加された培地で３週間育てた後、葉緑素含量を測定した結果、ＡｔＰＤＲ８発現抑制形質転換植物の葉緑素含量が野生型より低いことが分かった（図１１Ｃ）。これはＡｔＰＤＲ８発現が植物のカドミウム抵抗性に寄与することを確認する結果である。
【００５８】
実施例９：塩及び乾燥耐性及び含量検定
【００５９】
ＡｔＰＤＲ８形質転換植物の塩及び乾燥ストレスに対する耐性を試験するために、過発現植物、野生種及び発現抑制植物を培養して、植物体内塩含量を測定した結果、野生種に比べて過発現植物は塩をさらに少量、そして発現抑制植物はさらに多量の塩を含有することが分かった（図１７Ａ）。また、野生種及び過発現植物を１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１/２ＭＳ培地で３週間培養した結果、根長さと葉の色から、過発現植物が野生種に比べて塩耐性が増加したことが分かった（図１７Ｂ、Ｃ）。そして、ＡｔＰＤＲ８形質転換植物の乾燥ストレスに対する耐性を試験するために、土で４週間培養した植物に継続して水を供給する（+）か供給いない（−）条件で２週間培養したり（図１７Ｄ）、土で３週間培養した植物に１０日間水を供給せず、再び水を供給して４日間培養した植物の成長を観察した結果（図１７Ｆ）、ＡｔＰＤＲ８過発現植物は生体量が野生種より高い反面、発現抑制及び突然変異植物の生体量は低かった（図１７Ｅ）。このような実験結果から、ＡｔＰＤＲ８遺伝子を高い水準で発現する植物は、そうでない植物に比べて塩を体内に少なく蓄積して塩抵抗性と乾燥抵抗性が高いということが分かった。
【００６０】
また、ＡｔＰＤＲ８と非常に類似する塩基配列を有するＡｔＰＤＲ７が塩ストレスに対する耐性に関与するかどうかを調べるために、ＡｔＰＤＲ７欠乏突然変異植物（ＰＤＲ７ｋ０−１、−２）の種子を１/２ＭＳ及び２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１/２ＭＳ培地に植えて３週間培養した結果、塩を処理していない条件（１/２ＭＳ）では野生種と成長に差がなかったが、過剰の塩を処理した条件ではＡｔＰＤＲ７遺伝子が欠乏した突然変異植物が野生種に比べて非常に敏感な表現型を示すことが分かった（図２１）。ＡｔＰＤＲ７は前記ＡｔＰＤＲ８と塩基配列が８０％程度の水準に同一な遺伝子で、これら遺伝子が各々欠乏した突然変異植物が塩に対して共通に敏感な表現型を示すので、万一このような程度の相同性を有する遺伝子を植物に高い水準で発現させると、野生種より塩に対する耐性が増加した植物を開発することができると予想される。
【００６１】
実施例１０：ＧＦＰ：：ＴａＴＭ２０及びＧＦＰ：：ＡｔＰＤＲ８のシロイヌナズナ 原形質体への導入
【００６２】
ＴＭ/ＧＦＰ−Ｆプライマ（５’−ＡＡＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＣ−ＧＴＣＴＣＣＧ−３'）とＴＭ/ＧＦＰ−Ｒプライマ（５’−ＴＡＧＡＡＧＣＴＴＡＧＡＡＣＴＡＣＡＣＴＡＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴ−３'）を使用してｐＹＥＳ２：ＴａＴＭ２０からＰＣＲ増幅させたｃＤＮＡを利用してＧＦＰ：ＴａＴＭ２０融合遺伝子を製造した。増幅された遺伝子が３２６−ＧＦＰベクターのＨｉｎｄＩＩＩ場所に挿入されたＧＦＰ：：ＴａＴＭ２０はＣａＭＶ３５Ｓプロモーター調節下で発現する。また、ＡｔＰＤＲ８の場合には、Ｔ−ｖｅｃｔｏｒに入っているＡｔＰＤＲ８遺伝子を制限酵素で切断して３２６ＧＦＰ−３Ｇベクターに移し、ＧＦＰ：：ＡｔＰＤＲ８を製造した。プラスミドはシロイヌナズナ 原形質体内にＰＥＧ媒介形質転換法によって導入された（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＧＦＰ融合蛋白質の発現は原形質体に形質転換後、１６−２４時間後に蛍光顕微鏡で観察した。また、発現した蛋白質の発現位置を確認するために、形質転換させたシロイヌナズナ 原形質体から細胞質、細胞膜蛋白質を各々分離してＧＦＰ抗体でウェスタンブロットを実施した。
前記の結果を図２と図３に示した。図２は植物原形質体で発現したＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）−ＴａＴＭ２０融合蛋白質の発現位置を示す写真で（Ａ）、ＧＦＰ−ＴａＴＭ２０蛋白質が原形質体の細胞膜に位置することを示し、発現位置をウェスタンブロットで確認した場合にも、ＧＦＰ−ＴａＴＭ２０蛋白質が細胞質でなく膜部分に存在するということを確認した（Ｂ）。図３は植物原形質体で発現したＧＦＰ−ＡｔＰＤＲ８融合蛋白質の発現位置を示す写真（Ａ）と、発現局地性をウェスタンブロットで確認（Ｂ）したものである。その結果、ＧＦＰ−ＡｔＰＤＲ８蛋白質は原形質体の細胞膜に位置するということが分かる。
【００６３】
実施例１１：ＲＮＡ同定
【００６４】
植物のｔｏｔａｌＲＮＡは２０日栽培した小麦或いは２〜３週間栽培したシロイヌナズナ からトリゾル（Ｔｒｉｚｏｌ）を使用して抽出した。植物を１/２ＭＳに２〜３週間培養した後、液体質素を使用して均等に粉砕し、トリゾルを利用してｔｏｔａｌＲＮＡを分離し、これをノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲなどに用いた。
【００６５】
実施例１２：ＲＴ−ＰＣＲ
【００６６】
５μｇのＲＮＡを使用してｃＤＮＡをパワースクリップトＲＴ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）−ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とオリゴｄＴプライマを使用して合成した。２μｌのｃＤＮＡからＰＣＲ反応を行い、各々ＴａＴＭ２０、ＡｔＰＤＲ８、ＡｔＲｏｐ２に特異なプライマを使用した。対照区として小麦ではＧ３ＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒｏｌａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子を、シロイヌナズナ ではペタチューブリンとアクチを用いた。
ＴａＴＭ２０遺伝子の重金属による発現変化を知るために、小麦の根にカドミウムを処理した後、ｃＤＮＡを合成し、これを鋳型.としてＴａＴＭ２０ＲＴＦプライマ（５’−ＡＡＧＧＧＴＴＧＣＴＣＣＴＣＴＴＣＧＣＧＡＴＣＴＴＧ−３'）とＴａＴＭ２０ＲＴＲプライマ（５’−ＧＴＡＣＡＴＧＣＣＡＧＣＡＣＣＧＴＡＴＧＧＡＴＴＧ−３'）を使用してＰＣＲを行った結果、カドミウムによって地上部（ＣｄＳ）と、根（ＣｄＲ）でＴａＴＭ２０遺伝子の発現が増加するということを示している（図７Ａ）。それだけでなく、リアルタイム−ＰＣＲを行ってカドミウムによってＴａＴＭ２０の発現が増加することを確認した（図７Ｂ）。対照区としてＴａＧ３ＰＤＨＦ（５’−ＣＡＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＣＡＣＣＡＣＴＡＡＣＴ−３'）プライマとＴａＧ３ＰＤＨＲプライマ（５’−ＡＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＡＴＡＧＣＡＧＣＣＴＴ−３'）を使用してＧ３ＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子の発現を確認した結果、この遺伝子はカドミウムによって変化がないということが分かった。
【００６７】
ＡｔＰＤＲ８遺伝子の発現変化を知るために、シロイヌナズナ の根にカドミウム、鉛及び銅を処理した後、ｃＤＮＡを合成し、これを鋳型.としてＡｔＰＤＲ８−ＲＴＦ（５’−ＣＴＣＴＴＧＡＴＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＴＣＴＧ−３'）プライマとＡｔＰＤＲ８ＲＴＲ（５’−ＣＣＡＴＡＡＴＧＧＴＣＣＴＣＡＡＴＧＴＡＴＴＧＣ−３'）プライマでＰＣＲを行った結果、根でカドミウムと鉛、そして銅によってＡｔＰＤＲ８遺伝子の発現が大きく増加するということが分かった（図９Ｂ）。対照区として使用したチューブリン遺伝子の発現（Ｔｕｂ−Ｆ（５’−ＧＣＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴＴＣＣ−３'）、Ｔｕｂ−Ｒ（５’−ＡＧＧＣＴＣＴＧＴＡＴＴＧＣＴＧＴＧＡＴ−３'）プライマでＰＣＲを行った結果、チューブリンの発現は重金属によって変わらないということが分かった。
【００６８】
孔辺細胞におけるＲｏｐ２遺伝子の発現を知るために、孔辺細胞と体細胞から各々ｃＤＮＡを得て、これを鋳型.としてＲｏｐ２−フォワーダープライマ（５’−ＣＣＧＡＴＣＴＴＧＣＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＡＡＧＧ−３'）とＲｏｐ２−リバースプライマ（５’−ＣＴＴＡＴＣＡＣＡＡＧＡＡＣＧＣＧＣＡＡＣＧＧＴＴＣＴＴＡＴＴＣ−３）を使用してＰＣＲを行い、孔辺細胞でＲｏｐ２遺伝子の発現が高いということを確認した（図１８）。対照区としてａｃｔｉｎ２遺伝子の発現は孔辺細胞と体細胞で大きな差がないということが分かった（Ａｃｔｉｎ２−ｆｏｒｗａｒｄ、５’−ＧＧＣＣＧＡＴＧＧＴＧＡＧＧＡＴＡＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＧ−３'、Ａｃｔｉｎ２−ｒｅｖｅｒｓｅ、５’−ＴＣＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣＡＣＴＣ−３'）。
【００６９】
実施例１３：ノーザンブロットティング
【００７０】
３０μｇのＲＮＡをフォルムアルデヒドゲルで電気泳動した後、ナイロンメンブレインに移し、３２Ｐ−ｄＣＴＰで示された暗号配列に特異なＰＣＲ産物を利用して結合した。メンブレインを洗浄した後、フィルムに露出して遺伝子の発現程度を観察した。ＡｔＰＤＲ８遺伝子に特異な塩基片を得るために、ＰＤＲ８ＮＦプライマ（５’−ＡＧＣＣＴＴＧＣＴＴＴＧＴＴＴＣＡＣＡＧ−３'）とＰＤＲ８ＮＲプライマ（５’−ＣＣＣＴＡＣＴＣＡＴＴＣＴＣＣＣＣＡＴＴＧ−３'）を使用してＰＣＲに増幅した後、３２Ｐに標識してＡｔＰＤＲ８遺伝子の発現をノーザンブロットで確認した結果、ＡｔＰＤＲ８の発現が地上部と根でカドミウムと鉛、銅によって増加するということが分かった（図９Ａ）。
【００７１】
実施例１４：ウェスタンブロットティング
【００７２】
形質転換酵母とシロイヌナズナ から蛋白質を分離するために、抽出バッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ ｐＨ７．４、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、０．７ｕｇ/ｍＬのｐｅｐｓｔａｉｎＡ、５ｕｇ/ｍＬのａｐｒｏｔｉｎｉｎ、２０ｕｇ/ｍＬのｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、０．５ｍＭのＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を入れてよく混合した後、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上層液を得た後、再び１００，０００ｇで１時間遠心分離して細胞の膜部分と液状部分を分離した。１０〜５０μｇ程度の蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ニトロセルロース膜に移転させ、膜を７．５％の無脂肪牛乳を含む１ｘＴＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０ ｉｎ １ｘＴＢＳ）溶液に１時間浸した。１ｘＴＢＳＴ溶液で５分間２回繰り返して洗浄した後、各々の蛋白質に特異な抗体と３時間常温で反応させた。その後、１ｘＴＢＳＴ溶液で１５分間３回繰り返して洗浄し、ｓｈｅｅｐ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｈｏｒｓｈｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅと１時間反応させ、１ｘＴＢＳＴ溶液で１０分ずつ３回洗浄した。ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）溶液を使用して蛋白質の発現信号をｘ−ｒａｙフイルムで感知した。
ＧＦＰ−ＴａＴＭ２０及びＧＦＰ−ＡｔＰＤＲ８蛋白質を原形質体に導入した後、蛋白質を分離し、ＧＦＰ抗体を使用してウェスタンブロットを行った結果、蛋白質が細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌ、ＳまたはＣ）に位置せず、膜部位（ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍ）に存在することが分かった（図２Ｂ、図３Ｂ）。
【００７３】
実施例１５：ＲＮＡｉ形質転換植物の製造
【００７４】
ＡｔＰＤＲ８の発現を抑制するＲＮＡｉ植物を作るために、Ｐ８ＲＩ−ＸＫプライマ（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＧＡＴＧＣＣＴＴＧＣＴＴＴＧＴＴＴＣＡＣＡＧ−３'）とＰ８ＲＩ−ＢＸａプライマ（５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＣＣＣＴＡＣＴＣＡＴＴＣＴＣＣＣＣＡＴＴＧ−３'）でＰＣＲした後、ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ制限酵素を使用してｐＨａｎｎｉｂａｌベクターに挿入し、ＮｏｔＩ制限酵素を使用してバイナリベクターであるｐＡＲＴ２７ベクターにクローニングして製造した。ｐＡＲＴ２７−ＰＤＲ８ｉベクターはアグロバクテリウムを利用してシロイヌナズナ に形質転換してＡｔＰＤＲ８ＲＮＡｉ形質転換植物を製造した。
【００７５】
実施例１６：プロモーター−ＧＵＳ融合蛋白質を利用する遺伝子の発現組織結晶
【００７６】
ＭＳ培地で２週間培養した植物を０．５ｍＭのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６、０．５ｍＭのＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５００ｍｇ/ｍｌのＸ−Ｇｌｕｃ．を含む１００ｍＭのフォスフェートバッファーで２４時間培養し、１００％のエタノールに入れてクロロフィルを除去した後、光学顕微鏡で観察した。その結果、ＡｔＰＤＲ８プロモーター−ＧＵＳは葉と根で全て発現し（図４Ａ−Ｄ）、Ｒｏｐ２プロモーター−ＧＵＳは植物の孔辺細胞に多く発現するということが分かった（図１８）。また、葉と根での発現をより詳しく観察するために染色した組織をマイクロトーム（Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）で切断して顕微鏡で観察した結果、ＡｔＰＤＲ８プロモーター−ＧＵＳ遺伝子の発現が特に外皮細胞（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌ）で強く発現するということが分かった（図４Ｅ−Ｇ）。
【００７７】
実施例１７：根から水と異なる物質を地上部へ移す蒸散作用のインディケーターである気孔運動の測定
【００７８】
植物の葉の表皮層を剥離してスライドグラス上に置き、顕微鏡で観察しながら気孔の開放程度を測定し、最大値の半分に至るまでかかる時間（ｔ１/２）を計算した。非活性化したＲｏｐ２遺伝子（ＤＮ−Ｒｏｐ２）を発現させた植物の場合、気孔が野生種に比べて多く開かれ、速く開いたこと（ｔ１/２値が小さい）が観察され、常に活性化した形態のＲｏｐ２遺伝子（ＣＡ−Ｒｏｐ２）を発現させた植物の場合、気孔が遅く開かれ（ｔ１/２値が大きい）、あまり開かれていないことが観察された（図１９Ａ）。また、この遺伝子の発現をなくした場合にも（Ｒｏｐ２−ＫＯ）、気孔を野生種よりさらに多く、さらに速く開くことを観察した（図１９Ｂ）。したがって、この遺伝子やそれと類似した遺伝子をコーディングする蛋白質の量や活性を低下させると、野生種より気孔をさらに速く且つ多く開いて蒸散作用が増加した植物を作ることができる。汚染物質は主に蒸散作用の時に植物の地上部へ上がるので、この方法を用いて重金属を地上部へ多く上げて蓄積する植物を開発することができる。つまり、気孔をより大きく開いて蒸散作用を活発にして製造された形質転換植物を汚染地に植え、根から地上部への多様な汚染物質の移動を促進することができ、これは植物を利用する環境浄化に役に立つ。
【００７９】
実施例１８：干ばつに対する耐性のインディケーターであるＡＢＡによる気孔閉鎖運動の測定
【００８０】
植物の葉にＡＢＡを処理した後、植物の葉の表皮層を剥離してスライドグラス上に置き、顕微鏡で観察しながら気孔の閉鎖程度を測定した。非活性化したＲｏｐ２遺伝子（ＤＮ−Ｒｏｐ２）を発現させた植物の場合、気孔が野生種に比べて多く且つ早く閉じられることが観察され、常に活性化した形態のＲｏｐ２遺伝子（ＣＡ−Ｒｏｐ２）を発現させた植物の場合、気孔が遅く閉じられ、閉じられる程度は低いことが観察された（図２０）。したがって、この遺伝子やそれと類似した遺伝子をコーディングする蛋白質の量や活性を低下させると、野生種より気孔がさらに速く且つ多く閉じられる、干ばつに対して耐性を有する植物を作ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】２０個の膜貫通ドメインの細胞膜における配置を示すＴａＴＭ２０の構造（Ａ）、複数の３次元ドメインが互いに相互作用して集まっている形状を示した図面（Ｂ）及び、前記ＴａＴＭ２０で繰り返される互いに類似の生体膜貫通ドメイン配列（黒い棒）とプロテインキナーゼｃフォスフォリレーション（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）モチーフとの相同性を示す図面（Ｃ）である。
【図２】ＴａＴＭ２０蛋白質が植物の細胞膜に存在するということを示す写真で、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）−ＴａＴＭ２０融合蛋白質が植物の細胞膜に発現することを緑色蛍光を通じて分かり（Ａ）、ＧＦＰ抗体を使用してウェスタンブロットでこのＧＦＰ−ＴａＴＭ２０融合蛋白質の位置が細胞膜であることを再確認（Ｂ）する。
【図３】植物原形質体で発現したＧＦＰ−ＡｔＰＤＲ８融合蛋白質が細胞膜に位置することを緑色蛍光を通じて示す写真（Ａ）と、この融合蛋白質の位置をＧＦＰ抗体を使用してウェスタンブロットで確認（Ｂ）したものである。
【図４】シロイヌナズナ 植物でＡｔＰＤＲ８遺伝子の発現位置をＧＵＳ標識遺伝子を通じて分析したもので、ＡｔＰＤＲ８遺伝子のプロモーターとＧＵＳを融合させた遺伝子は根と幹に全て発現し、特に、外皮細胞（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌ）で強く発現することを示すものである。
【図５】酵母にＴａＴＭ２０を過発現させると、カドミウム耐性が向上するということを示す写真である。
【図６】完全な大きさのＴａＴＭ２０のみがカドミウム抵抗性に関与するということを証明したもので、Ｎ−末端とＣ−末端を除去した蛋白質が発現した酵母はカドミウム耐性が野生種と差がないことを示し（Ａ）、（Ａ）で示した遺伝子片が酵母で実際に発現すること（Ｂ）を示す。
【図７】カドミウムを処理すると、小麦の葉と根でＴａＴＭ２０の発現が増加するということをＲＴ−ＰＣＲ（Ａ）とリアルタイム−ＰＣＲ（Ｂ）で分析した結果である。
【図８】ＴａＴＭ２０形質転換シロイヌナズナ がカドミウムに対する耐性が向上したことを示す図面で、形質転換体でＴａＴＭ２０遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲに確認し（Ａ）、ＴａＴＭ２０遺伝子を発現する形質転換体をカドミウムを含む培地で成長させた時、野生種に比べてカドミウム耐性が向上することを示す写真（Ｂ）と、生体重量と根の長さを測定した図表（Ｃ、Ｄ）である。
【図９】シロイヌナズナ にカドミウム、鉛または銅を処理した時、ＡｔＰＤＲ８遺伝子の発現が増加することをノーザンブロット（Ａ）とＲＴ−ＰＣＲ（Ｂ）で確認したものである。
【図１０】ＡｔＰＤＲ８過発現シロイヌナズナ 形質転換体がカドミウムと鉛に対する耐性が向上したことを示す図面で、ＡｔＰＤＲ８過発現形質転換シロイヌナズナ でＡｔＰＤＲ８遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲに確認し（Ａ）、これらをカドミウム及び鉛が含まれる培地で栽培した時の生長（Ｂ）、生体重量（Ｃ）、根の長さ（Ｄ）を示す。
【図１１】ＡｔＰＤＲ８発現が減少した形質転換シロイヌナズナ はカドミウムに非常に敏感であるということを示す図面で、ＡｔＰＤＲ８−ＲＮＡｉに形質転換された植物体のＡｔＰＤＲ８遺伝子発現程度をＲＴ−ＰＣＲに確認し（Ａ）、これら形質転換植物体をカドミウムが含まれている培地で培養した時の生長（Ｂ）、葉緑素含量（Ｃ）、生体重量（Ｄ）を示し、これらのカドミウムに対する敏感性を野生種とＡｔＰＤＲ８が完全に欠乏した植物体と比較した（Ｅ）。
【図１２】ＴａＴＭ２０が過発現した酵母でグルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）合成阻害剤であるＢＳＯを処理し、細胞耐グルタチオンが減少した条件でもＴａＴＭ２０によって増加したカドミウム耐性が維持されるということを示すものである。
【図１３】ＡｔＰＤＲ８の過発現植物（ＰＤＲ８−１）、野生種（ｗｔ）、低発現植物体（８ｉ−２）をグルタチオン合成阻害剤であるＢＳＯとカドミウムを処理した条件で培養した時、ＡｔＰＤＲ８によって変化したカドミウム耐性が維持されるということを生長（Ａ、Ｂ、Ｃ）と生体重量及び根の長さ（Ｄ）を測定して示す結果である。
【図１４】ＴａＴＭ２０形質転換酵母はカドミウムを少なく吸収し、排出は優れているということを示す図面で、酵母内カドミウム含量をカドミウム同位元素及び原子吸光光度計を使用して野生種とＴａＴＭ２０形質転換酵母のカドミウム吸収（Ａ、Ｃ）及び排出（Ｂ）程度を測定した結果（Ｃ）を示す。
【図１５】ＡｔＰＤＲ８は植物体内カドミウム含量を減少させるという図面で、過発現植物（ＰＤＲ８−１）、野生種（ｗｔ）、低発現植物体（８ｉ−２）内のカドミウム含量を原子吸光光度計（Ａ）及びカドミウム同位元素（Ｂ）を使用して測定した結果を示す図表である。
【図１６】ＡｔＰＤＲ８が植物細胞からカドミウムの排出を向上させるという図面で、過発現植物（ＰＤＲ８−１）、野生種（ｗｔ）、低発現植物体（８ｉ−２）から分離した原形質体をカドミウム同位元素を含む培地に置いた時、細胞内カドミウム含量の変化を測定した結果を示す（Ａ、Ｂ）。
【図１７】ＡｔＰＤＲ８が植物の塩抵抗性と乾燥抵抗性を向上させるということを示す図面で、過発現植物（ＰＤＲ８−１）、野生種（ｗｔ）、低発現（８ｉ−２）、欠乏突然変異（Ｐ８ｋｏ−１）植物を培養した時、植物体内の塩の含量を示す結果（Ａ）と、過剰の塩が含まれている培地における過発現植物の生長形態（Ｂ）及び根の長さ（Ｃ）、そして乾燥ストレス条件（Ｄ、Ｅ、Ｆ）で培養した時の植物の生長形態（Ｄ、Ｆ）及び生体重量（Ｅ）を示す結果である。
【図１８】シロイヌナズナ におけるＲｏｐ２遺伝子が葉の孔辺細胞で強く発現するということを示す写真で、ＲＴ−ＰＣＲとＲｏｐ２ｐｒｏｍｏｔｅｒ：：ＧＵＳを通じて分析した結果である。
【図１９】突然変異Ｒｏｐ２遺伝子で形質転換されたり、Ｒｏｐ２遺伝子が発現しないシロイヌナズナ 植物の光による気孔開放運動を比較した図面で、活性型Ｒｏｐ２（ＣＡ−Ｒｏｐ２）を発現する植物は野生種（ｗｔ）に比べて気孔開放が遅くて少し開かれ、不活性型Ｒｏｐ２（ＤＮ−Ｒｏｐ２）を発現する植物はさらに早くてさらに多く開かれ（Ａ）、Ｒｏｐ２を発現しない植物は気孔をさらに早くてさらに多く開くことを（Ｂ）示す結果である。
【図２０】突然変異Ｒｏｐ２遺伝子で形質転換されたシロイヌナズナ 植物のＡＢＡによる気孔閉鎖運動を比較した図面で、活性型Ｒｏｐ２（ＣＡ−Ｒｏｐ２）を発現する植物は野生種（ｗｔ）に比べて気孔閉鎖が遅くて少し閉じられ、不活性型Ｒｏｐ２（ＤＮ−Ｒｏｐ２）を発現する植物はさらに早くてさらに多く閉じられることを示す図面である。
【図２１】ＡｔＰＤＲ７が塩ストレス抵抗性に関与するということを示す図面で、ＡｔＰＤＲ７欠乏突然変異植物を過剰の塩が含まれている条件で培養した時、野生種に比べて生育が遅いということを示す結果である。
【図１４】
2008131929.tif 000003
【図１５】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２１】
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【配列表】
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