(57)【要約】      （修正有）【課題】従来の生ゴミからの乳酸生産方法は、まずアミラーゼによりスターチなどの多糖を、単糖のグルコースに糖化処理しなければならず、コストがかかる。これを改善し、スターチなどの多糖を原料として、糖化処理工程を省き、直接乳酸発酵するＬ−乳酸の製造方法を提供する。【解決手段】新規に分離、同定され、スターチからの直接乳酸発酵能力を持つ耐熱性微生物、Bacillus coagulans  Ｍ２１を生産菌とし、これを用いて、セロビオース、スターチを含有する培地から、直接発酵するＬ−乳酸液の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Bacillus coagulans  Ｍ２１の16sリボゾーマルRNA遺伝子の部分配列は、
GGATAACGCCGGGAACCGGGGCTAATACCGGATAGTTTTTCCTCCGCAGGAGGAAAAGGAAAGGCGGCTTCGGCTGCCACTTACAGATGGCCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGCCGGGGAAGAACAAGTGCCGTTCGAACAGGGCGGCGCCTTGACGGTACCCGGCCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTTCTTAAGTCTGATGTGAAATCTTGCGGCTCAAACCGCAAGCGGTCATTGGAAACTGGGAGGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACCTCCCTGGAGACAGGGCCTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGACCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCGAGACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCAGAAAACCATTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACCCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTT
である耐熱性微生物Bacillus coagulans AB116143 (99.286% identity)からなることを特徴とするＬ−乳酸生産菌。
【請求項２】
グルコースとセロビオース、スターチを含有する糖濃度2.0〜10％の培地に、上記耐熱性微生物Bacillus coagulans  M21を植菌濃度1.0〜10％にして加え，30〜58℃，pH5〜８において殺菌することなく直接培養基として発酵することを特徴とするＬ−乳酸液製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規に分離され，高い生産性によって多糖であるセロビオース、スターチからのＬ−乳酸発酵生産に利用しうる耐熱性微生物Bacillus coagulansと同定された好熱性Ｌ−乳酸生産菌とこれを用いてＬ−乳酸液を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は種々の食品添加物や工業用原料として重要な物質である。特に乳酸を化学的に重合することで得られる高分子ポリ乳酸はバイオマス由来プラスチック素材として近年大きく注目されている。３炭素化合物である乳酸の２位の炭素はメチル基、水酸基、カルボキシル基と結合する不斉炭素であり、その立体配座からＤ−乳酸およびＬ−乳酸の２種類の光学異性体（鏡像異性体）が存在する。世界的には現在、全生産量の90％が発酵法により、残り10％が化学的合成法により生産されている。
【０００３】
発酵菌として使用される微生物には、Ｌ−乳酸を主に生成する多くのラクトバチルス属の常温細菌（Lactobacillus rhamnosus，Lactococcus lactisなど）や、カビの一種Rhizopus oryzaeなどが用いられる事が総説にまとめられている（非特許文献１、非特許文献２）。また、Bacillus属の細菌を用いることによるＬ−乳酸の生産方法に関してBacillus coagulansJCM2257,Bacillus cereusJCM2152,Bacillus subtilisJCM1465,及び昆虫毒素などを生産するBacillus thuringiensis,Bacillus larvae,Bacillus lentimorbus,Bacillus popilliae,Bacillus shphaericusなどの微生物に関して特許が取得されている（特許文献１）。これとは別に、Bacillus coagulansを用いて膜分離を行いながら50℃にて連続的に乳酸を生産する方法が特許化されている（特許文献２）。これらの方法により光学純度[（Ｌ−乳酸 - Ｄ−乳酸）/（Ｌ−乳酸 ＋ Ｄ−乳酸）×100(％)]が約90〜98％の乳酸が生産されていた。
【０００４】
１９９０年頃より再生可能なバイオマス原料から得られ、生分解性を有するプラスチックとしてポリ乳酸が注目され、その生産量は年々増加している。ポリ乳酸はＬ−またはＤ−乳酸あるいはそれらの混合物を脱水重合して得られるが、原料の光学活性が高い乳酸と光学活性が低い乳酸で、前者からは結晶性が高く堅いプラスチックが、後者からは結晶性が低く解けやすいポリ乳酸が得られる。例えば堅さが要求されるエンジニアリングプラスチックなどではポリＬ−乳酸が主に用いられている。即ち光学純度の異なる乳酸はポリ乳酸プラスチックに求められる物性に応じた原料として使い分けられる。
【０００５】
一方、アセトニトリルを出発原料とする化学合成法では光学純度０%のＬ乳酸とＤ乳酸の混合物即ちラセミ乳酸が得られている。また、前述の総説にはＤ−，Ｌ−乳酸を生成するLactobacillus helveticus,Lactobacillus aminovorusによるラセミ乳酸の発酵生産の例も報告されている。ラセミ乳酸やそのエステルなどは食品添加物として用いられるが、このような用途では光学純度の高低はその効能と無関係である。
【０００６】
これに関連して、糖質を高く含有すると共にその他の栄養成分を同時に含有する等、内容物が複雑で、雑菌、自然乳酸菌が多数生存している生ゴミや農産バイオマスを原料として、設備、エネルギーコストがかからず、かつ高圧蒸気滅菌などによる栄養成分の分解や発酵阻害物質の生成が回避できる非殺菌開放系で、Ｄ−，Ｌ−乳酸（Lactobacillus plantarum）生産菌あるいはＬ−乳酸（Bacillus coagulans）生産菌の選択的増殖を制御することで、廉価でかつ用途に応じた光学純度の乳酸を高収率で生産する方法が申請者らにより現在公開されている（特許文献３）。しかしながら，本法においてB.coagulansを用いた場合、生ゴミや農産バイオマスを酵素アミラーゼを用い、糖化処理を行わねばならず、時間とコストがかかってしまう。
【０００７】
【非特許文献１】J.H.Litchfield著「Microbiological production of lactic acid」Advances in Applied Microbiology 42巻45-95頁１９９６年
【非特許文献２】K.Hofvendahl,B.H-Hagerdal著「Factors affecting thefermentativelacticacidproductionfromrenewableresources」EnzymeandMicrobialTechnology２６巻８７−１０７頁２０００年26:87-107(2000).
【非特許文献３】K.Sakai,M.Yoshihiro,H.Yamazumi,Y.Tau,M.Mori,M.Moriguchi,Y.Shirai著「SelectiveProliferationofLacticAcidBacteriaAndAccumulationofLacticAcidduringOpenFermentationofKitchenRefusewithIntermittentpHAdjustment.」FoodScienceandTechnologyResearch６巻１４０−１４５頁２０００年
【特許文献１】H.Ohara,M.Yahata,USPatent5801025１９９６年MethodforproducingL-lacticacidwithhighopticalpurityusingbacillusstrains(JP7-280660,JP-280661)
【特許文献２】VanNispen,JoannesG.M.,Jonker,Ronald,USPatent5002881１９８９年Processforthefermentativepreparationoforganicacids.
【特許文献３】酒井謙二，江崎豊，白井義人，特願2003-306871（２００３年）乳酸液の製造方法
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
生ゴミからの乳酸生産は、酵素アミラーゼにより、多糖であるスターチなどの糖源を単糖のグルコースに糖化処理しなければならず、コストがかかってしまう。スターチなどの多糖からの直接乳酸発酵が可能であれば、糖化処理の工程を省くことができる。
現在、報告されているBacillus coagulansでは、スターチからの直接乳酸発酵できるという報告はない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
新規に分離，同定された耐熱性微生物Bacillus coagulans  Ｍ２１を好熱性Ｌ乳酸生産菌とし、これを用い，セロビオース、スターチを含有する培地から直接発酵するＬ−乳酸液製造方法である。
本発明は、前記課題を解決するためになされたものであり，それは次の(1)と(2)のとうりである。
(1). Bacillus coagulans  M21の16sリボゾーマルRNA遺伝子の部分配列は、
GGATAACGCCGGGAACCGGGGCTAATACCGGATAGTTTTTCCTCCGCAGGAGGAAAAGGAAAGGCGGCTTCGGCTGCCACTTACAGATGGCCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGCCGGGGAAGAACAAGTGCCGTTCGAACAGGGCGGCGCCTTGACGGTACCCGGCCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTTCTTAAGTCTGATGTGAAATCTTGCGGCTCAAACCGCAAGCGGTCATTGGAAACTGGGAGGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACCTCCCTGGAGACAGGGCCTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGACCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCGAGACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCAGAAAACCATTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACCCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTT
である耐熱性微生物Bacillus coagulans AB116143 (99.286% identity)からなることを特徴とするＬ−乳酸生産菌。
(2). グルコースとセロビオース、及びスターチを含有する糖濃度2.0〜10％の改変MRS培地に、上記耐熱性微生物Bacillus coagulans  M21  を植菌濃度2.4％にして加え，50℃，ｐH7において殺菌することなく直接培養基として発酵することを特徴とするＬ−乳酸液製造方法。
即ち、本発明は、従来方法のように細菌，糸状菌によりデンプン（やセロビオース）を直接発酵してＬ−乳酸を生成するもの、例えば精製デンプンや米などを加熱によりα化の構造変化を起こさせ分解する方法の持つ高粘性、高濃度化による操作性の問題を解決したもので、前記新規な好熱性（耐熱性）を示す微生物により、殺菌系や冷却を必要としない系でのデンプンからの直接発酵を操作性良く可能にした進歩性ある優れた発明である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の好熱性Ｌ−乳酸生産菌とＬ−乳酸液製造方法は、糖源にグルコースとセロビオース、及びスターチを含有する培地から，新規に分離された前記耐熱性微生物Bacillus coagulansＭ21を一定量植菌し、初期pHを7.0にし、50℃の温度で加温することで多糖からの直接乳酸発酵ができるものである。
これにより従来生ゴミや農産バイオマスを酵素アミラーゼで糖化処理していた工程を省くことができ、乳酸発酵における時間の短縮と低コスト化が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明を実施するための最良の形態は、培地の糖源に多糖であるセロビオース、スターチを用い、この原料を高圧蒸気滅菌し、植菌量を２．４％とし、50℃に保つことで光学純度の高いＬ−乳酸を生産する方法である。
即ち本発明は、上記の手段により多糖であるセロビオースやスターチから乳酸を直接的に発酵でき、かつ９９%以上の高い光学純度の乳酸液が効率よく生産できる効果を得る。
これらの手段と効果は、図１〜図９に示す新規な上記好熱性Ｌ乳酸生産菌の同定と培養実験により得た新知見によってもたらされたものである。
好熱性Ｌ乳酸生産菌即ち耐熱性微生物Bacillus coagulansＭ21はグラム陽性桿菌であり，内生胞子を形成した。また，カタラーゼ活性は陽性であった。以上はBacillus属に属する細菌の性質とよく一致した。
表１には本分離菌耐熱性微生物Bacillus coagulans  Ｍ２１の16SリボゾーマルRNA遺伝子の部分配列（○○○ｂｐ）の分析結果を示した。これにより本分離菌の16SリボゾーマルRNA遺伝子の部分配列はBacillus coagulans  AB116143 と99.286%%相同であることが分かったのである。
以上のことから本分離菌耐熱性微生物Bacillus coagulans  Ｍ２１はBacillus coagulans  AB116143と命名されるべきであることが示された。
【００１２】
【表１】
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図１のグラフには、各pHに調整したSYP培地（１L中にグルコース２０ｇ、ペプトン５ｇ、酵母エキス５ｇ、炭酸カルシウム１０gを含む）を用いて新規Ｌ乳酸生産菌（熱性微生物Bacillus coagulans  Ｍ２１）を静置培養した際の、培養時の初発ｐＨと生育度（６１０ｎｍにおける濁度）の関係を示す。
これにより、本菌の最適ｐＨが７．３であり、生育可能ｐＨ範囲が５〜８付近であることが判明したのである。
図２のグラフには、pH７．０に調整したMRS培地中で，温度勾配培養装置を用いて各種温度で新規好熱性Ｌ−乳酸生産菌（耐熱性微生物Bacillus coagulans  Ｍ２１）を静置培養した際の、その培養時の温度と生育度（６１０ｎｍにおける濁度）の関係を示す。
これにより、本菌の生育上限温度が、５０℃前後であることが判明したのである。
図３のグラフには、各pHに調整した改変MRS培地（１L中にセロビオース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、肉エキス８ｇ、酢酸ナトリウム５ｇ、酵母エキス４ｇ、リン酸２カリウム２ｇ、クエン酸三アンモニウム２ｇ、硫酸マグネシウム０.２ｇ、硫酸マンガン０.０５ｇ、ソルビタンモノオレエート１ｍｌを含む）を用いて新規Ｌ乳酸生産菌（熱性微生物Bacillus coagulans  Ｍ２１）と既存株であるBacillus coagulans  ＮＢＲＣ１２５８３を静置培養した際の、培養後の乳酸生産量の関係を示す。
図４のグラフは上述の改変ＭＲＳ培地に寒天を添加した場合の比較である。
図５のグラフは、上述の改変ＭＲＳ培地の糖源にスターチを用いた場合の比較である。
図６のグラフは、上述の改変ＭＲＳ培地の糖源にスターチを用いて、さらに寒天を添加した場合の比較である。
【実施例１】
【００１３】
図３〜６には従来用いられていたBacillus  coagulansと新規分離菌即ち耐熱性微生物Bacillus coagulansＭ２１の改変ＭＲＳ培地の発酵結果を比較した。その結果乳酸蓄積量は、Bacilluscoagulansよりも高く、特に培地に寒天を添加した軟寒天培地ではセロビオース、またはスターチを糖源とした場合においても４倍以上に達することがわかったのである。
【００１４】
図７〜図９のグラフは、上述の改変MRS培地の糖源にグルコース、セロビオース、スターチを糖濃度３．５．７．１０．１５％と含有し、４８時間培養した後の乳酸、Ｄ／Ｌ−乳酸、酢酸、蟻酸の蓄積量を示すグラフ。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
以上の説明で明らかなように、本発明は、従来のBacillus coagulansでの生ゴミからの乳酸生産において、酵素アミラーゼによる糖化処理を省くことが可能であり、コストを大幅に削減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明における耐熱性微生物Bacillus coagulans  Ｍ２１の、培養時の初発ｐＨと生育度（６１０ｎｍにおける濁度）の関係を示すグラフ。
【図２】本発明における耐熱性微生物Bacillus coagulans  Ｍ２１の、培養時の温度と生育度（６１０ｎｍにおける濁度）の関係を示すグラフ。
【図３】セロビオースを糖源とする液体培地におけるBacillus coagulans    NBRC１２５８３とBacillus coagulans  Ｍ２１との比較
【図４】セロビオースを糖源とする軟寒天培地におけるBacillus coagulans    NBRC１２５８３とBacillus coagulans  Ｍ２１との比較
【図５】スターチを糖源とする液体培地におけるBacillus coagulans    NBRC１２５８３とBacillus coagulans  Ｍ２１との比較
【図６】スターチを糖源とする軟寒天培地におけるBacillus coagulans    NBRC１２５８３とBacillus coagulans  Ｍ２１との比較
【図７】各糖濃度のグルコース軟寒天培地におけるBacillus coagulans  Ｍ２１の乳酸生産量
【図８】各糖濃度のセロビオース軟寒天培地におけるBacillus coagulans  Ｍ２１の乳酸生産量
【図９】各糖濃度のスターチ軟寒天培地におけるBacillus coagulans  Ｍ２１の乳酸生産量
【符号の説明】
【００１７】
△    図１におけるM21・生育度
○    図１におけるM21・乳酸生産量
△    図２におけるM21
□    図３〜図６におけるＬ−乳酸
■    図３〜図６におけるＤ−乳酸
◆    図７〜図９における乳酸
■    図７〜図９におけるＬ−乳酸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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