(57)【要約】      （修正有）【課題】直径が異なる細胞を捕捉するとともに、捕捉した細胞に対する薬液の注入が確実に実行されるようにすること。【解決手段】捕捉孔内には、最大細胞を捕捉する上段円筒状凹部２０１ａと最大細胞より小さい細胞を捕捉する下段円筒状凹部２０１ｂとが形成されている。捕捉孔内に多段の円筒状凹部を形成するため、それぞれの円筒状凹部によって対応する大きさの細胞を確実に捕捉することができる。また、上段円筒状凹部２０１ａの開口部における中心と下段円筒状凹部２０１ｂの開口部における中心とを結ぶ直線は、キャピラリ針の長手方向の軸と略平行になっている。このため、キャピラリ針が突き出される際に、キャピラリ針の先端がそれぞれの円筒状凹部によって捕捉された細胞の中心付近に到達する。【選択図】図５
2008295376.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長手方向の軸に沿って突き出されるキャピラリ針によって物質が注入されるインジェクション対象の細胞を捕捉する平面を備えた細胞捕捉プレートであって、
前記平面の一方の面に形成され前記平面に対して垂直方向に開口して細胞を支持する開口部と、前記開口部から前記平面の他方の面へ貫通し負圧により前記開口部に細胞を吸引する貫通孔とを含む捕捉孔を有し、
前記捕捉孔は、
前記開口部近傍における前記平面に平行な断面の面積が前記貫通孔近傍における前記平面に平行な断面の面積より大きいとともに、これらの２つの断面の中心を結ぶ直線が前記キャピラリ針の長手方向の軸に略平行に形成されることを特徴とする細胞捕捉プレート。
【請求項２】
前記捕捉孔は、
前記開口部から前記貫通孔へ向かうほど底面積が小さくなる複数の円筒部を連結した形状を有し、
前記貫通孔は、
底面積が最小の円筒部の底面から前記平面の他方の面へ貫通することを特徴とする請求項１記載の細胞捕捉プレート。
【請求項３】
前記捕捉孔は、
前記開口部から前記平面が円筒状に陥没して形成されインジェクション対象の細胞を支持する上段円筒状凹部と、
前記上段円筒状凹部の底面の一部に開口し円筒状に陥没して形成される下段円筒状凹部とを有し、
前記貫通孔は、
前記下段円筒状凹部の底面から前記平面の他方の面へ貫通することを特徴とする請求項１記載の細胞捕捉プレート。
【請求項４】
前記捕捉孔は、
前記上段円筒状凹部の開口部の中心と前記下段円筒状凹部の開口部の中心とを結ぶ直線が前記キャピラリ針の長手方向の軸に略平行に形成されることを特徴とする請求項３記載の細胞捕捉プレート。
【請求項５】
前記捕捉孔は、
前記開口部から前記貫通孔へ向かって前記平面に平行な断面の面積が漸次縮小する漏斗状部を有し、
前記貫通孔は、
前記漏斗状部の前記平面に平行な所定の位置に形成される底面から前記平面の他方の面へ貫通することを特徴とする請求項１記載の細胞捕捉プレート。
【請求項６】
前記捕捉孔は、
前記開口部の中心と前記漏斗状部の底面の中心とを結ぶ直線が前記キャピラリ針の長手方向の軸に略平行に形成されることを特徴とする請求項５記載の細胞捕捉プレート。
【請求項７】
前記開口部は、
直径がインジェクション対象の細胞の最大直径の７０〜８０％に相当する円形に形成されることを特徴とする請求項１記載の細胞捕捉プレート。
【請求項８】
前記貫通孔は、
底面の直径が１〜２μｍまたはインジェクション対象の細胞の最小直径の１０〜２０％に相当する円筒状に形成されることを特徴とする請求項１記載の細胞捕捉プレート。
【請求項９】
長手方向の軸に沿って突き出され所定のタイミングで物質を吐出して細胞に注入するキャピラリ針と、インジェクション対象の細胞を捕捉する平面を備えた細胞捕捉プレートとを有するマイクロインジェクション装置であって、
前記細胞捕捉プレートは、
前記平面の一方の面に形成され前記平面に対して垂直方向に開口して細胞を支持する開口部と、前記開口部から前記平面の他方の面へ貫通し負圧により前記開口部に細胞を吸引する貫通孔とを含む捕捉孔を有し、
前記捕捉孔は、
前記開口部近傍における前記平面に平行な断面の面積が前記貫通孔近傍における前記平面に平行な断面の面積より大きいとともに、これらの２つの断面の中心を結ぶ直線が前記キャピラリ針の長手方向の軸に略平行に形成されることを特徴とするマイクロインジェクション装置。
【請求項１０】
長手方向の軸に沿って突き出されるキャピラリ針によって物質が注入されるインジェクション対象の細胞を捕捉する平面を備えた細胞捕捉プレートの製造方法であって、
前記平面の一方の面から前記平面の他方の面へ貫通する貫通孔をエッチングによって形成する貫通孔形成ステップと、
前記貫通孔形成ステップにて形成された貫通孔を囲む円筒状の第１の円筒部を前記平面の一方の面側にエッチングによって形成する第１円筒部形成ステップと、
前記第１円筒部形成ステップによって形成された第１の円筒部を囲む円筒状の第２の円筒部であって、前記平面の一方の面に開口する開口部の中心と底面に形成される第１の円筒部の開口部の中心とを結ぶ直線が前記キャピラリ針の長手方向の軸に略平行になる第２の円筒部をエッチングによって形成する第２円筒部形成ステップと
を有することを特徴とする製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長手方向の軸に沿って突き出されるキャピラリ針によって物質が注入されるインジェクション対象の細胞を捕捉する平面を備えた細胞捕捉プレート、マイクロインジェクション装置、および細胞捕捉プレートの製造方法に関し、特に、直径が異なる細胞を捕捉するとともに、捕捉した細胞に対する薬液の注入が確実に実行されるようにすることができる細胞捕捉プレート、マイクロインジェクション装置、および細胞捕捉プレートの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞内に遺伝子、抗体、またはたんぱく質などを直接注入することにより、細胞の遺伝情報を改変したり、細胞に現れる変化を解析したりする研究が盛んに行われている。この研究が進めば、遺伝子の役割や抗体およびたんぱく質などの生体分子の機能が解明されるとともに、例えば個人の遺伝的特性に適合した遺伝子治療を行うテーラメード医療が可能となる。細胞内に遺伝子を注入する方式としては、電気的な方法（エレクトロポレーション）、化学的な方法（リポフェクション）、生物学的な方法（ベクター法）、機械的な方法（マイクロインジェクション）、および光学的な方法（レーザインジェクション）などが提案されている。しかし、電気的な方法は、大電流を流して細胞膜を破るため細胞へのダメージが大きく、化学的・生物学的な方法は、導入可能な物質に制限があるため効率が悪く、生物学的な方法は、感染などに対する安全性に懸念があるなどの欠点がある。
【０００３】
一方で、機械的な方法であるマイクロインジェクションは、最も安全で効率が高い方法として注目されている。マイクロインジェクションは、遺伝子以外にも抗体およびたんぱく質などの生体分子、ならびに化合物など（以下これらを総称して「薬液」という）を細胞に注入する際にも有用な技術である。
【０００４】
このようなマイクロインジェクションにおいては、図１２に示すように、キャピラリ針１０が細胞Ｃの位置へ自動的に移動し、細胞Ｃに薬液を直接注入する。このとき、キャピラリ針１０が正確に細胞Ｃの位置へ移動するためには、シャーレ２０内での細胞Ｃの位置を固定する必要がある。そこで、図１２においては、複数の貫通孔が設けられた細胞捕捉プレート３０がシャーレ２０内に設置され、細胞捕捉プレート３０のシャーレ２０底面側を負圧にすることにより、細胞Ｃが細胞捕捉プレート３０の貫通孔に吸い寄せられている。
【０００５】
具体的には、図１２において、シャーレ２０内は緩衝液で満たされており、細胞捕捉プレート３０および細胞Ｃは、緩衝液に浸っている。そして、シャーレ２０の底面から緩衝液が吸引されることにより、細胞捕捉プレート３０のシャーレ２０底面側が負圧となり、細胞Ｃは細胞捕捉プレート３０に穿設された貫通孔に吸い寄せられる。これにより、細胞Ｃの位置は細胞捕捉プレート３０の貫通孔の位置に固定され、貫通孔の座標があらかじめ記憶されていれば、キャピラリ針１０を細胞Ｃの位置へ正確に移動させることが可能となる。
【０００６】
ところで、吸引によって細胞Ｃの位置を固定する場合には、細胞の大きさと貫通孔の大きさとの関係を適切に調整することが必要である。すなわち、例えば図１３に示すように、細胞Ｃの大きさに対して細胞捕捉プレート３０の貫通孔が大きすぎる場合には、吸引により細胞Ｃそのものが貫通孔を通過してしまう虞がある。また、例えば図１４に示すように、細胞Ｃの大きさに対して細胞捕捉プレート３０の貫通孔が小さすぎる場合には、確実に細胞Ｃの位置を固定することができず、キャピラリ針１０の接触に伴って細胞Ｃが動いてしまうことがある。
【０００７】
そこで、例えば特許文献１においては、細胞捕捉プレートに直径が小さい貫通孔を穿設するとともに、貫通孔の周囲に直径が大きい凹み部を設けることが記載されている。すなわち、特許文献１に記載の細胞捕捉プレートにおいては、周囲より高さが低くなった円形平面の凹み部の中心に貫通孔が設けられている。このような細胞捕捉プレートによれば、貫通孔からの吸引により細胞が細胞捕捉プレートに吸着されると同時に、凹み部によって細胞の位置が確実に固定される。
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−３１８８５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、マイクロインジェクション対象の細胞の大きさは多様であり、細胞の直径によっては貫通孔が穿設された凹み部でも細胞を捕捉できるとは限らないという問題がある。すなわち、上述した特許文献１の凹み部の直径は、細胞の直径の８０％程度であるため、凹み部によって捕捉可能な細胞の直径は凹み部の直径によって自ずと限定される。したがって、マイクロインジェクション対象の細胞の直径によって細胞捕捉プレートを使い分けるなどの処置が必要となり、マイクロインジェクションの効率が低下してしまう。
【００１０】
また、同一種類の細胞でも直径の個体差が大きい場合があり、この場合にも、捕捉される細胞のうち凹み部の直径に適合しない細胞には十分な捕捉力が働かないため、インジェクションが失敗しやすくなり、インジェクションの効率が低下してしまう。
【００１１】
これらの問題の具体例を説明するために、２種類の細胞の直径のヒストグラムを図１５に示す。図１５においては、第１の細胞種のヒストグラムが白抜きで示されており、第２の細胞種のヒストグラムが斜線で示されている。同図に示すように、第１の細胞種の直径は主に７〜１０μｍに分布しており、第２の細胞種の直径は主に１３〜２３μｍに分布している。これらの２種類の細胞の直径の平均値には、およそ１１μｍの差があり、同一の細胞捕捉プレートを利用して捕捉するのは困難であると考えられる。
【００１２】
すなわち、例えば直径が大きい第２の細胞種に適した細胞捕捉プレートを用いると、図１６に示すように、第２の細胞種の細胞Ｃ２は、細胞捕捉プレート３０の貫通孔が設けられた凹み部３０ａによって捕捉される。一方、第１の細胞種の細胞Ｃ１は、細胞捕捉プレート３０の凹み部３０ａ内に完全に納まってしまい、凹み部３０ａが細胞Ｃ１を捕捉する機能を果たさず、貫通孔の断面積に対応する小さな捕捉力しか働かないことになる。また、図１５に示したヒストグラムにおいて、第２の細胞種の直径は、同一種類の細胞であるにも拘らずレンジが広く、第２の細胞種の細胞のみに対してマイクロインジェクションを行う場合にも、細胞捕捉プレートによって捕捉される細胞のうち多数の細胞に十分な捕捉力が働かないことになる。
【００１３】
さらに、図１６に示したように、通常、キャピラリ針１０の長手方向は、鉛直方向に対して一定の角度で傾斜している。これは、マイクロインジェクション対象の細胞の鉛直上方向には、細胞を照らす照明などが設けられるため、キャピラリ針１０およびキャピラリ針１０を移動させるための機構を細胞の鉛直上方向に設けることができないためである。このとき、キャピラリ針１０が突出した際に直径が小さい細胞Ｃ１の中心をキャピラリ針１０の先端が通過するようにキャピラリ針１０の移動が制御されていると、図１６から明らかなように、キャピラリ針１０の先端の移動軌跡は、直径が大きい細胞Ｃ２の中心から大きくずれることになる。
【００１４】
したがって、直径が大きい細胞Ｃ２に対して薬液を注入する場合には、キャピラリ針１０の先端が細胞Ｃ２の中心からはずれた位置に到達することになり、確実なマイクロインジェクションの実行が保証されない。すなわち、薬液が注入される位置が細胞の外縁部分となってしまい、薬液の効果が見られないことがある。また、キャピラリ針１０が突出する際に、キャピラリ針１０の先端が細胞Ｃ２の端部に接触して、細胞Ｃ２自体を凹み部３０ａから押し退けてしまう虞がある。
【００１５】
本発明はかかる点に鑑みてなされたものであり、直径が異なる細胞を捕捉するとともに、捕捉した細胞に対する薬液の注入が確実に実行されるようにすることができる細胞捕捉プレート、マイクロインジェクション装置、および細胞捕捉プレートの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決するために、本発明は、長手方向の軸に沿って突き出されるキャピラリ針によって物質が注入されるインジェクション対象の細胞を捕捉する平面を備えた細胞捕捉プレートであって、前記平面の一方の面に形成され前記平面に対して垂直方向に開口して細胞を支持する開口部と、前記開口部から前記平面の他方の面へ貫通し負圧により前記開口部に細胞を吸引する貫通孔とを含む捕捉孔を有し、前記捕捉孔は、前記開口部近傍における前記平面に平行な断面の面積が前記貫通孔近傍における前記平面に平行な断面の面積より大きいとともに、これらの２つの断面の中心を結ぶ直線が前記キャピラリ針の長手方向の軸に略平行に形成される構成を採る。
【００１７】
この構成によれば、捕捉孔が細胞の直径に応じた断面積を有する位置で細胞を支持し、キャピラリ針が突き出される際に、キャピラリ針の先端が捕捉孔に捕捉された細胞の中心付近を通過するため、直径が異なる細胞を捕捉するとともに、捕捉した細胞に対する薬液の注入が確実に実行されるようにすることができる。
【００１８】
また、本発明は、上記構成において、前記捕捉孔は、前記開口部から前記貫通孔へ向かうほど底面積が小さくなる複数の円筒部を連結した形状を有し、前記貫通孔は、底面積が最小の円筒部の底面から前記平面の他方の面へ貫通する構成を採る。
【００１９】
この構成によれば、捕捉孔内で連結される複数の円筒部の底面積が異なるため、それぞれの円筒部が底面積に応じた大きさの細胞を捕捉することができ、直径が異なる細胞を捕捉することができる。
【００２０】
また、本発明は、上記構成において、前記捕捉孔は、前記開口部から前記平面が円筒状に陥没して形成されインジェクション対象の細胞を支持する上段円筒状凹部と、前記上段円筒状凹部の底面の一部に開口し円筒状に陥没して形成される下段円筒状凹部とを有し、前記貫通孔は、前記下段円筒状凹部の底面から前記平面の他方の面へ貫通する構成を採る。
【００２１】
この構成によれば、捕捉孔内に底面積が大きい上段円筒状凹部と底面積が小さい下段円筒状凹部とが形成されるため、それぞれの円筒状凹部が底面積に応じた大きさの範囲の細胞を捕捉することができるとともに、捕捉孔内が二段に分かれているのみであるため、細胞捕捉プレートの製造が比較的容易である。
【００２２】
また、本発明は、上記構成において、前記捕捉孔は、前記上段円筒状凹部の開口部の中心と前記下段円筒状凹部の開口部の中心とを結ぶ直線が前記キャピラリ針の長手方向の軸に略平行に形成される構成を採る。
【００２３】
この構成によれば、二段の円筒状凹部における開口部の中心を結ぶ直線がキャピラリ針の長手方向の軸に略平行であるため、いずれの円筒状凹部に細胞が捕捉された場合でも、キャピラリ針の突き出し時にキャピラリ針の先端を細胞の中心付近に到達させることができ、細胞内への物質の注入を確実に行うことができる。
【００２４】
また、本発明は、上記構成において、前記捕捉孔は、前記開口部から前記貫通孔へ向かって前記平面に平行な断面の面積が漸次縮小する漏斗状部を有し、前記貫通孔は、前記漏斗状部の前記平面に平行な所定の位置に形成される底面から前記平面の他方の面へ貫通する構成を採る。
【００２５】
この構成によれば、捕捉孔内に断面積が漸次縮小する漏斗状部が形成されるため、漏斗状部内のそれぞれの位置の断面積に応じた大きさの細胞を捕捉することができる。また、捕捉孔の断面積の変化が連続的であるため、捕捉する細胞の直径が離散的な範囲に限定されることがない。
【００２６】
また、本発明は、上記構成において、前記捕捉孔は、前記開口部の中心と前記漏斗状部の底面の中心とを結ぶ直線が前記キャピラリ針の長手方向の軸に略平行に形成される構成を採る。
【００２７】
この構成によれば、漏斗状部の開口部と底面それぞれにおける中心を結ぶ直線がキャピラリ針の長手方向の軸に略平行であるため、捕捉孔内のどの位置に細胞が捕捉された場合でも、キャピラリ針の突き出し時にキャピラリ針の先端を細胞の中心付近に到達させることができ、細胞内への物質の注入を確実に行うことができる。
【００２８】
また、本発明は、上記構成において、前記開口部は、直径がインジェクション対象の細胞の最大直径の７０〜８０％に相当する円形に形成される構成を採る。
【００２９】
この構成によれば、開口部付近の捕捉孔の直径が細胞の最大直径の７０〜８０％であるため、インジェクション対象の最大細胞に対する捕捉孔の直径が小さすぎもせず大きすぎもせず、捕捉孔によって最大細胞を確実に固定することができる。
【００３０】
また、本発明は、上記構成において、前記貫通孔は、底面の直径が１〜２μｍまたはインジェクション対象の細胞の最小直径の１０〜２０％に相当する円筒状に形成される構成を採る。
【００３１】
この構成によれば、貫通孔の直径が１〜２μｍまたは細胞の最小直径の１０〜２０％であるため、最小細胞に対する貫通孔の直径が大きすぎることがなく、最小細胞が貫通孔内へ吸引されてしまうことを防止することができる。
【００３２】
また、本発明は、長手方向の軸に沿って突き出され所定のタイミングで物質を吐出して細胞に注入するキャピラリ針と、インジェクション対象の細胞を捕捉する平面を備えた細胞捕捉プレートとを有するマイクロインジェクション装置であって、前記細胞捕捉プレートは、前記平面の一方の面に形成され前記平面に対して垂直方向に開口して細胞を支持する開口部と、前記開口部から前記平面の他方の面へ貫通し負圧により前記開口部に細胞を吸引する貫通孔とを含む捕捉孔を有し、前記捕捉孔は、前記開口部近傍における前記平面に平行な断面の面積が前記貫通孔近傍における前記平面に平行な断面の面積より大きいとともに、これらの２つの断面の中心を結ぶ直線が前記キャピラリ針の長手方向の軸に略平行に形成される構成を採る。
【００３３】
この構成によれば、細胞捕捉プレートに形成された捕捉孔が細胞の直径に応じた断面積を有する位置で細胞を支持し、キャピラリ針が突き出される際に、キャピラリ針の先端が捕捉孔に捕捉された細胞の中心付近を通過するため、直径が異なる細胞を捕捉するとともに、捕捉した細胞に対する薬液の注入が確実に実行されるようにすることができる。
【００３４】
また、本発明は、長手方向の軸に沿って突き出されるキャピラリ針によって物質が注入されるインジェクション対象の細胞を捕捉する平面を備えた細胞捕捉プレートの製造方法であって、前記平面の一方の面から前記平面の他方の面へ貫通する貫通孔をエッチングによって形成する貫通孔形成ステップと、前記貫通孔形成ステップにて形成された貫通孔を囲む円筒状の第１の円筒部を前記平面の一方の面側にエッチングによって形成する第１円筒部形成ステップと、前記第１円筒部形成ステップによって形成された第１の円筒部を囲む円筒状の第２の円筒部であって、前記平面の一方の面に開口する開口部の中心と底面に形成される第１の円筒部の開口部の中心とを結ぶ直線が前記キャピラリ針の長手方向の軸に略平行になる第２の円筒部をエッチングによって形成する第２円筒部形成ステップとを有するようにした。
【００３５】
この方法によれば、細胞捕捉プレートに形成された捕捉孔が細胞の直径に応じた断面積を有する円筒部で細胞を支持し、キャピラリ針が突き出される際に、キャピラリ針の先端が捕捉孔に捕捉された細胞の中心付近を通過する細胞捕捉プレートが製造されるため、直径が異なる細胞を捕捉するとともに、捕捉した細胞に対する薬液の注入が確実に実行されるようにすることができる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、直径が異なる細胞を捕捉するとともに、捕捉した細胞に対する薬液の注入が確実に実行されるようにすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明の骨子は、捕捉プレートに形成される捕捉孔の開口方向に垂直な断面を貫通孔へ接近するにつれて縮小するとともに偏心させ、細胞を捕捉する捕捉孔の開口部の断面の中心と貫通孔近傍の断面の中心とを結ぶ直線がキャピラリ針の長手方向の軸と略平行になるように構成することである。以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００３８】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１に係る自動マイクロインジェクション装置１００の構成を模式的に示す図である。同図に示す自動マイクロインジェクション装置１００は、キャピラリ針１０１、シャーレ１０２、細胞捕捉プレート１０３、ステージ１０４、照明１０５、吸引部１０６、ステージ調整機構部１０７、キャピラリ針移動機構部１０８、捕捉座標記憶部１０９、制御部１１０、吐出機構部１１１、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラ１１２、および倒立顕微鏡１１３を有している。
【００３９】
キャピラリ針１０１は、キャピラリ針移動機構部１０８に取り付けられ、水平面上を移動するとともに、長手方向に突き出されたり引き上げられたりする。そして、キャピラリ針１０１は、内部に保持している薬液を吐出機構部１１１から吐出圧が加えられるタイミングで吐出する。
【００４０】
シャーレ１０２は、高さに対して底面の直径が大きい略円筒状の容器であり、細胞が生存可能な緩衝液で満たされている。シャーレ１０２は、ステージ１０４上に載置されており、ステージ１０４とともに水平面上を移動する。
【００４１】
細胞捕捉プレート１０３は、シャーレ１０２の中央に収容され、シャーレ１０２の底面と平行な平面部に設けられた捕捉孔の位置で緩衝液中の細胞を捕捉する。細胞捕捉プレート１０３の脚部とシャーレ１０２の底面との間は密閉されており、シャーレ１０２内の細胞捕捉プレート１０３によって隔てられる２つの空間は、細胞捕捉プレート１０３に形成された捕捉孔のみを介して連続している。換言すれば、細胞捕捉プレート１０３の捕捉孔に設けられる貫通孔のみが吸引される緩衝液の通路となる。細胞捕捉プレート１０３の具体的な形状および機能については、後に詳述する。
【００４２】
ステージ１０４は、ステージ調整機構部１０７に固定され、上面にシャーレ１０２を載置可能となっている。そして、ステージ１０４は、ステージ調整機構部１０７の制御によって、細胞捕捉プレート１０３によって捕捉されたマイクロインジェクション対象の細胞が照明１０５の鉛直下方かつ倒立顕微鏡１１３のレンズの鉛直上方に位置するように水平面上を移動する。なお、ステージ１０４は、ＣＣＤカメラ１１２が細胞捕捉プレート１０３上の細胞を撮影可能なように、透明な材料で製造されているか、または、細胞捕捉プレート１０３が位置する中央部分に撮影用の穴が設けられている。
【００４３】
照明１０５は、細胞捕捉プレート１０３に捕捉された細胞を照らす光源であり、倒立顕微鏡１１３のレンズの鉛直上方に設けられている。照明１０５の位置は、常に固定されている。
【００４４】
吸引部１０６は、細胞捕捉プレート１０３のシャーレ１０２底面側から緩衝液を吸引し、細胞捕捉プレート１０３のシャーレ１０２底面側を細胞が存在する側に対して負圧状態にする。
【００４５】
ステージ調整機構部１０７は、制御部１１０からの指示に従ってステージ１０４を水平面上に移動させる。具体的には、ステージ調整機構部１０７は、細胞が捕捉される細胞捕捉プレート１０３の捕捉孔の座標が照明１０５の鉛直下方かつ倒立顕微鏡１１３のレンズの鉛直上方に位置するようにステージ１０４を移動させる。
【００４６】
キャピラリ針移動機構部１０８は、インジェクション時のキャピラリ針１０１の先端が照明１０５の鉛直下方かつ倒立顕微鏡１１３のレンズの鉛直上方に位置するようにキャピラリ針１０１を水明面上に移動させる。また、キャピラリ針移動機構部１０８は、キャピラリ針１０１の水平面上の移動が完了した後、キャピラリ針１０１を長手方向の先端側へ突き出し、その後、キャピラリ針１０１を長手方向の根元側へ引き上げる。このとき、キャピラリ針移動機構部１０８は、キャピラリ針１０１の長手方向の変位を制御部１１０へ通知する。
【００４７】
捕捉座標記憶部１０９は、シャーレ１０２内の細胞捕捉プレート１０３に設けられた捕捉孔の座標を記憶する。換言すれば、捕捉座標記憶部１０９は、細胞が捕捉される捕捉座標をあらかじめ記憶する。
【００４８】
制御部１１０は、捕捉座標記憶部１０９から捕捉孔の座標を読み出し、読み出した座標を照明１０５の鉛直下方かつ倒立顕微鏡１１３のレンズの鉛直上方に位置させるようにステージ調整機構部１０７へ指示する。また、制御部１１０は、ステージ１０４の位置が調整されると、キャピラリ針移動機構部１０８へキャピラリ針１０１の位置の微調整を指示する。
【００４９】
さらに、制御部１１０は、キャピラリ針移動機構部１０８からキャピラリ針１０１の長手方向の変位の通知を受け、キャピラリ針１０１が最大限に突き出されたタイミング以降に吐出機構部１１１へ薬液の吐出を指示する。具体的には、制御部１１０は、例えばキャピラリ針１０１が最大限に突き出されて先端が細胞捕捉プレート１０３に最も接近した後、キャピラリ針１０１の先端が所定の高さにまで引き上げられたタイミングで薬液の吐出を吐出機構部１１１へ指示する。
【００５０】
吐出機構部１１１は、制御部１１０から薬液の吐出が指示されると、キャピラリ針１０１の内部に吐出圧を加え、キャピラリ針１０１の先端から薬液を吐出させる。
【００５１】
ＣＣＤカメラ１１２は、倒立顕微鏡１１３によって拡大された細胞であって細胞捕捉プレート１０３に捕捉された細胞に薬液が注入される様子を撮影する。また、ＣＣＤカメラ１１２は、薬液の注入後、細胞に生じた変化などを撮影する。
【００５２】
倒立顕微鏡１１３は、照明１０５の鉛直下方を拡大可能な位置に設置され、キャピラリ針１０１の先端付近および細胞捕捉プレート１０３に捕捉された細胞を拡大する。
【００５３】
図２は、本実施の形態に係る細胞捕捉プレート１０３の構成を示す平面図である。同図に示すように、細胞捕捉プレート１０３の中央の平面部２０２には複数の捕捉孔２０１が形成されている。これらの捕捉孔２０１は、平面部２０２に規則的に配列されていても良いが、図２に示すようにランダムに配置されることにより、平面部２０２に亀裂を生じにくくさせ強度を確保することができる。特に、本実施の形態においては、平面部２０２を挟んで一方の側（すなわちシャーレ１０２底面側）が負圧状態となって、平面部２０２に圧力がかかるため、ある程度は平面部２０２の強度を確保しておく必要がある。
【００５４】
また、平面部２０２における捕捉孔２０１の座標は、捕捉座標記憶部１０９によってあらかじめ記憶されている。したがって、捕捉孔２０１の座標が照明１０５の鉛直下方かつ倒立顕微鏡１１３のレンズの鉛直上方に位置するようにステージ１０４を水平面上で移動させることにより、捕捉孔２０１に捕捉された細胞をマイクロインジェクション対象の細胞とすることができる。この捕捉孔２０１の開口部における直径は、マイクロインジェクション対象の最大細胞の直径のおよそ７０〜８０％が望ましい。具体的には、例えば最大の細胞の直径が１６μｍ程度であれば、捕捉孔２０１の開口部の直径は１２μｍ程度が望ましい。
【００５５】
図３は、図２のＡＡ線断面を示す断面図である。同図に示すように、細胞捕捉プレート１０３の平面部２０２の周囲には、平面部２０２を支持する脚部２０３が形成されており、脚部２０３がシャーレ１０２の底面に密着し、捕捉孔２０１内に設けられた貫通孔のみが周囲の緩衝液の通路となる。すなわち、図３においては図示を省略したが、捕捉孔２０１の底面には貫通孔が設けられており、平面部２０２の脚部２０３側が負圧になることにより、平面部２０２の脚部２０３の反対側の緩衝液は、捕捉孔２０１の底面に設けられた貫通孔を通路として平面部２０２の脚部２０３側へ吸引される。このとき、緩衝液とともに緩衝液中の細胞が捕捉孔２０１に吸着され、捕捉孔２０１によって細胞が捕捉される。
【００５６】
平面部２０２の表面から捕捉孔２０１の底面までの深さは、細胞を確実に固定可能な深さであり、例えば７〜８μｍ程度である。そして、捕捉孔２０１の底面には、平面部２０２を貫通する貫通孔が形成されている。したがって、平面部２０２の厚さは、捕捉孔２０１の深さより大きいことが要求され、例えば１０μｍ程度とされる。
【００５７】
なお、図３においては図示を簡略化したが、捕捉孔２０１は、開口部から底面近傍へ向かうにつれて開口方向に垂直な断面積が縮小しており、開口部における断面の中心と底面近傍における断面の中心とを結ぶ直線がキャピラリ針１０１の長手方向の軸に略平行になっている。この捕捉孔２０１の形状については、以下に詳述する。
【００５８】
図４は、本実施の形態に係る捕捉孔２０１の構成を示す平面図である。同図に示すように、捕捉孔２０１内には、最大細胞を捕捉する上段円筒状凹部２０１ａと最大細胞より小さい細胞を捕捉する下段円筒状凹部２０１ｂとが形成されている。具体的には、上段円筒状凹部２０１ａの底面にこの底面よりも小さい底面積を有する下段円筒状凹部２０１ｂが形成されており、上段円筒状凹部２０１ａの底面の中心と下段円筒状凹部２０１ｂの底面の中心とは一致していない。すなわち、図４に示すように、平面視では、上段円筒状凹部２０１ａの底面と下段円筒状凹部２０１ｂの底面とに対応する２つの円が偏心している。
【００５９】
なお、ここでは上段円筒状凹部２０１ａおよび下段円筒状凹部２０１ｂの２段が捕捉孔２０１内に形成されるものとしたが、３段以上の円筒状凹部が捕捉孔２０１内に形成されても良い。３段以上の円筒状凹部が形成される場合にも、下段の円筒状凹部ほど底面積が小さく、底面は偏心している。具体的には、下段の円筒状凹部の底面の中心ほどキャピラリ針１０１から遠ざかる方向に位置している。
【００６０】
上段円筒状凹部２０１ａの底面の直径は、上述したようにマイクロインジェクション対象の最大細胞の直径の７０〜８０％程度が望ましい。同様に、下段円筒状凹部２０１ｂの底面の直径は、マイクロインジェクション対象の最小細胞の直径の７０〜８０％程度が望ましい。すなわち、捕捉孔２０１内に多段の円筒状凹部が形成される場合、それぞれの円筒状凹部の底面の直径は、捕捉対象となる細胞の直径の７０〜８０％とすることが望ましい。換言すれば、円筒状凹部との大きさの関係が上記の関係に該当する細胞がそれぞれの円筒状凹部によって捕捉される。
【００６１】
また、下段円筒状凹部２０１ｂの底面には、複数の貫通孔２０１ｃが形成される。これらの貫通孔２０１ｃは、平面部２０２を貫通しており、平面部２０２のシャーレ１０２の底面側が負圧となった際に、緩衝液の通路となる。なお、貫通孔２０１ｃは、捕捉孔２０１内に１つだけ形成されても良く、捕捉孔２０１内に複数の貫通孔２０１ｃが形成される場合にも、その配置は、図４に示すものに限定されない。本実施の形態においては、１つの捕捉孔２０１内に複数の貫通孔２０１ｃを形成することにより、細胞に対する吸着力を大きくしている。貫通孔２０１ｃの直径は、捕捉対象の細胞の直径と比較して十分に小さく、例えば１〜２μｍ程度である。または、細胞の最小直径に対して貫通孔２０１ｃの直径を１０〜２０％程度としても良い。
【００６２】
図５は、図４のＢＢ線断面を示す断面図である。同図に示すように、上段円筒状凹部２０１ａの開口部における中心と下段円筒状凹部２０１ｂの開口部における中心とを結ぶ直線（図中一点鎖線で示す）は、鉛直方向に対して傾斜している。そして、この直線は、キャピラリ針１０１の長手方向の軸と略平行になっている。また、上段円筒状凹部２０１ａの底面積より下段円筒状凹部２０１ｂの底面積が小さくなっており、捕捉孔２０１全体として、貫通孔２０１ｃへ向かう偏心した漏斗の内壁に段が形成された形状となっている。すなわち、下段円筒状凹部２０１ｂの開口部は、上段円筒状凹部２０１ａの底面に完全に含まれており、図４に示したように開口方向から捕捉孔２０１を見た場合に、下段円筒状凹部２０１ｂの底面全体が見えるようになっている。
【００６３】
このように、本実施の形態においては、捕捉孔２０１内に多段の円筒状凹部を形成するため、それぞれの円筒状凹部によって対応する大きさの細胞を確実に捕捉することができ、１つの細胞捕捉プレート１０３によって、直径が異なる細胞を捕捉することができる。また、多段の円筒状凹部の開口部の中心を結ぶ直線がキャピラリ針１０１の長手方向の軸に略平行であるため、キャピラリ針１０１が突き出される際に、キャピラリ針１０１の先端がそれぞれの円筒状凹部によって捕捉された細胞の中心付近に到達することになり、捕捉した細胞に対する薬液の注入が確実に実行されるようにすることができる。
【００６４】
以下、本実施の形態に係る捕捉孔２０１によって捕捉された細胞に対して薬液が注入される様子の具体例について図６を参照しながら説明する。図６は、本実施の形態に係る捕捉孔２０１の構成例を示す断面図である。同図に示す捕捉孔２０１は、３段の円筒状凹部を備えて形成されている。すなわち、捕捉孔２０１は、上段円筒状凹部２０１ａおよび下段円筒状凹部２０１ｂに加えて、中段円筒状凹部２０１ｄを備えている。
【００６５】
上段円筒状凹部２０１ａは、大型細胞３０１を捕捉するために形成されており、同様に、中段円筒状凹部２０１ｄおよび下段円筒状凹部２０１ｂは、それぞれ中型細胞３０２および小型細胞３０３を捕捉するために形成されている。これらの円筒状凹部の底面積は、下段へ向かうほど小さくなっており、それぞれの円筒状凹部の開口部の中心を結ぶ直線（図中一点鎖線で示す）は、キャピラリ針１０１の長手方向の軸と略平行になっている。
【００６６】
それぞれの円筒状凹部に対応する大型細胞３０１、中型細胞３０２、および小型細胞３０３は、貫通孔２０１ｃの下方が負圧になることによる吸引力によって、いずれも対応する円筒状凹部の開口部周縁に形成される段差によって支持され、捕捉孔２０１に確実に固定される。
【００６７】
さらに、円筒状凹部の開口部の中心を結ぶ直線がキャピラリ針１０１の長手方向の軸に略平行であり、各円筒状凹部の底面が偏心した多段状になっているため、キャピラリ針１０１が突き出される際に、キャピラリ針１０１の先端は、各円筒状凹部に捕捉され得るすべての細胞の中心付近に到達することになる。つまり、下段円筒状凹部２０１ｂによって捕捉される小型細胞３０３の中心付近にキャピラリ針１０１の先端が到達するようにステージ調整機構部１０７およびキャピラリ針移動機構部１０８が調整されれば、この先端は、上段円筒状凹部２０１ａによって捕捉される大型細胞３０１の中心３０１ａ付近を通過することになる。
【００６８】
このため、キャピラリ針１０１の先端から吐出される薬液は、確実に細胞内に注入される。また、キャピラリ針１０１が突き出される際に、キャピラリ針１０１の先端が細胞の端部に接触することがなく、捕捉された細胞を押し退けてしまうことがない。したがって、キャピラリ針１０１の先端が捕捉された細胞の細胞膜を貫通し、細胞内への薬液の注入が行われる。
【００６９】
一方、例えば図７に示すように、各円筒状凹部を底面が同心円となるように形成する場合、それぞれの円筒状凹部によって大型細胞３０１、中型細胞３０２、および小型細胞３０３を捕捉することは可能である。しかし、この場合は、キャピラリ針１０１が突き出される際に、キャピラリ針１０１の先端は、各円筒状凹部に捕捉され得るすべての細胞の中心付近に到達することはない。つまり、下段円筒状凹部２０１ｂに捕捉される小型細胞３０３の中心付近にキャピラリ針１０１の先端が到達するようにステージ調整機構部１０７およびキャピラリ針移動機構部１０８が調整されれば、この先端は、上段円筒状凹部２０１ａによって捕捉される大型細胞３０１の中心３０１ａから大きく離れた位置を通過することになる。
【００７０】
このため、各円筒状凹部の底面を偏心させた場合と比べて、細胞内に薬液が注入される確実性が低下し、キャピラリ針１０１の先端の移動に伴って、捕捉された細胞が押し退けられてしまう可能性がある。
【００７１】
次いで、上記のように構成された細胞捕捉プレート１０３を利用したインジェクション動作について、図８に示すフロー図を参照しながら説明する。
【００７２】
インジェクション開始時には、シャーレ１０２内に細胞捕捉プレート１０３が設置され、複数の細胞が生存する緩衝液が満たされている。この状態で、吸引部１０６によって細胞捕捉プレート１０３のシャーレ１０２底面側の吸引が開始される（ステップＳ１０１）。吸引が開始されることにより、細胞捕捉プレート１０３のシャーレ１０２底面側が負圧となり、シャーレ１０２内の緩衝液が細胞捕捉プレート１０３の貫通孔２０１ｃを通過して細胞捕捉プレート１０３のシャーレ１０２底面側へ流入する。これに伴って、緩衝液中の細胞が貫通孔２０１ｃに吸引され、捕捉孔２０１によって捕捉される。これにより、細胞は、細胞捕捉プレート１０３の捕捉孔２０１の座標に固定されたことになる。
【００７３】
このとき、捕捉孔２０１には、多段の円筒状凹部が形成されているため、それぞれの捕捉孔２０１において、細胞の大きさに応じた円筒状凹部が細胞を固定することになる。したがって、細胞の大きさのばらつきが大きい種類の細胞に対してマイクロインジェクションを行う場合でも、捕捉される細胞の大きさに偏りがなくなる。また、異なる種類の細胞に対してマイクロインジェクションを行う場合に、その都度細胞捕捉プレート１０３を交換する必要がない。
【００７４】
一方、制御部１１０によって、すべての捕捉孔２０１の座標が捕捉座標記憶部１０９から読み込まれる（ステップＳ１０２）。上述したように、捕捉孔２０１には細胞が捕捉されているため、捕捉孔２０１の座標は細胞が捕捉された捕捉座標に他ならない。制御部１１０によって捕捉座標が読み込まれると、いずれか１つの捕捉座標が制御部１１０からステージ調整機構部１０７へ通知され、この捕捉座標をマイクロインジェクション対象の位置へ移動させるように指示される。すなわち、細胞が捕捉された捕捉座標が照明１０５の鉛直下方かつ倒立顕微鏡１１３のレンズの鉛直上方に位置するようにステージ１０４の位置を調整することがステージ調整機構部１０７に要求される。
【００７５】
そして、ステージ調整機構部１０７によって、ステージ１０４の位置が調整される（ステップＳ１０３）。具体的には、ステージ調整機構部１０７によって、ステージ１０４が水平面上を移動し、ステージ１０４上のシャーレ１０２および細胞捕捉プレート１０３が制御部１１０からの指示通りの位置に固定される。また、キャピラリ針移動機構部１０８によって、キャピラリ針１０１の先端が薬液吐出時に照明１０５の鉛直下方に位置するように、キャピラリ針１０１の水平方向の位置が微調整される（ステップＳ１０４）。
【００７６】
ステージ１０４およびキャピラリ針１０１の水平方向の位置が調整されると、キャピラリ針移動機構部１０８によって、キャピラリ針１０１が長手方向の先端側へ突き出される（ステップＳ１０５）。キャピラリ針１０１長手方向の延長線上には、細胞捕捉プレート１０３の捕捉孔２０１によって細胞が捕捉されている。したがって、キャピラリ針１０１が突き出されると、やがてキャピラリ針１０１の先端が細胞に接触する。このとき、細胞捕捉プレート１０３に形成された捕捉孔２０１内に底面が偏心する多段の円筒状凹部が形成されているため、キャピラリ針１０１の先端は細胞膜の中央付近に接触し、細胞を押し退けることなく細胞膜を貫通する。
【００７７】
そして、キャピラリ針１０１の先端が細胞の細胞膜を貫通し、所定位置に到達すると、制御部１１０から吐出機構部１１１へ薬液の吐出が指示される。この指示を受け、吐出機構部１１１によって、キャピラリ針１０１の内部に吐出圧が加えられ、キャピラリ針１０１の先端から薬液が吐出される（ステップＳ１０６）。なお、薬液が吐出されるタイミングとしては、キャピラリ針１０１の先端が所定の位置まで突き出されたタイミングでも良いが、キャピラリ針１０１の先端が一度最大限に突き出された後に所定の位置まで引き上げられたタイミングでも良い。この場合、キャピラリ針１０１の先端を一度最大限に突き出すことにより、柔軟性がある細胞膜を確実に貫通することができ、引き上げられるタイミングで薬液を吐出することにより、細胞内に吐出される薬液のための空間が形成されることになる。
【００７８】
キャピラリ針１０１の先端から薬液が吐出された後、キャピラリ針１０１が初期位置まで引き上げられると、制御部１１０によって、捕捉座標記憶部１０９から読み込まれたすべての捕捉座標についてインジェクションが完了したか否かが判断され（ステップＳ１０７）、まだ完了していない捕捉座標がある場合には（ステップＳ１０７Ｎｏ）、ステージ調整機構部１０７によるステージ１０４の移動から処理が繰り返される。こうして、すべての捕捉座標に捕捉された細胞のインジェクションが完了する。
【００７９】
次に、本実施の形態に係る細胞捕捉プレート１０３の製造方法について、図９を参照しながら説明する。図９は、細胞捕捉プレート１０３の製造過程１〜８を示す図である。
【００８０】
細胞捕捉プレート１０３は、２層の活性層シリコン層にシリコン酸化膜（図９中斜線のハッチングで示す）が挟まれたＳＯＩ（Silicon On Insulator）基板を用いて製造される。まず、レジストパターニングにより（図９中縦線のハッチングはレジストを示す）、捕捉孔２０１の形状がＳＯＩ基板に転写される（製造過程１）。そして、厚さ１０μｍ程度の活性層シリコン層にＲＩＥ（Reactive Ion Etching）によって貫通孔２０１ｃが形成される（製造過程２）。同様に、ＲＩＥによって下段円筒状凹部２０１ｂおよび上段円筒状凹部２０１ａが形成される（製造過程３、４）。こうして、細胞捕捉プレート１０３の捕捉孔２０１の形状が整えられる。
【００８１】
そして、捕捉孔２０１が形成されたＳＯＩ基板全体が熱酸化によりシリコン酸化膜で保護された後（製造過程５）、脚部２０３に相当する部分がレジストによってマスクされて平面部２０２の下側のシリコン酸化膜が緩衝フッ酸（ＢＨＦ）によってエッチングされる（製造過程６）。引き続き、平面部２０２の下側の活性層シリコン層が水酸化カリウム（ＫＯＨ）溶液によって異方性エッチングされ（製造過程７）、最後に全体のシリコン酸化膜が緩衝フッ酸（ＢＨＦ）によって除去されて細胞捕捉プレート１０３が完成する（製造過程８）。
【００８２】
このように、本実施の形態に係る細胞捕捉プレート１０３は、捕捉孔２０１がＲＩＥによってエッチングされるため、微小な貫通孔２０１ｃや各円筒状凹部なども精度良く形成される。結果として、キャピラリ針１０１の長手方向の軸と略平行に底面の中心が並ぶ多段の円筒状凹部が正確な位置に形成され、この細胞捕捉プレート１０３によって、直径が異なる細胞を捕捉するとともに、捕捉した細胞に対する薬液の注入が確実に実行されるようにすることができる。
【００８３】
以上のように、本実施の形態によれば、細胞捕捉プレートに穿設される貫通孔からの吸引によって細胞を捕捉する捕捉孔内に貫通孔へ向かうにつれて底面積が小さくなる多段の円筒状凹部を形成し、これらの円筒状凹部の開口方向に対して垂直な断面の中心を結ぶ直線がキャピラリ針の長手方向の軸と略平行になるようにする。このため、それぞれの円筒状凹部によって大きさが異なる細胞を捕捉することができ、キャピラリ針が突き出される際にキャピラリ針の先端を捕捉された細胞の中心付近へ到達させることができる。結果として、直径が異なる細胞を捕捉するとともに、捕捉した細胞に対する薬液の注入が確実に実行されるようにすることができる。
【００８４】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２の特徴は、捕捉孔内に段を形成せず、貫通孔へ向かう偏心した漏斗状に捕捉孔を形成する点である。
【００８５】
本実施の形態に係る自動マイクロインジェクション装置の構成や細胞捕捉プレート１０３の概要は実施の形態１と同様であるため、その説明を省略する。本実施の形態においては、細胞捕捉プレート１０３の捕捉孔２０１の形状のみが実施の形態１とは異なっている。
【００８６】
図１０は、本実施の形態に係る捕捉孔２０１の構成を示す平面図である。同図に示すように、捕捉孔２０１は、開口部２０１ｅから貫通孔２０１ｃへ向かう内面２０１ｆ、２０１ｇに段差がなく、捕捉孔２０１の開口部２０１ｅと貫通孔２０１ｃが形成される底面とに対応する２つの円が偏心して形成されている。すなわち、捕捉孔２０１のキャピラリ針１０１側の内面２０１ｆは、キャピラリ針１０１と反対側の内面２０１ｇよりも広くなっている。
【００８７】
捕捉孔２０１の開口部２０１ｅの直径は、マイクロインジェクション対象の最大細胞の直径の７０〜８０％程度が望ましい。また、捕捉孔２０１の底面の直径は、貫通孔２０１ｃの直径以上であり、例えば２〜３μｍ以上である。
【００８８】
図１１は、図１０のＣＣ線断面を示す断面図である。同図に示すように、捕捉孔２０１の開口部２０１ｅにおける中心と捕捉孔２０１の底面における中心とを結ぶ直線（図中一点鎖線で示す）は、キャピラリ針１０１の長手方向の軸と略平行になっている。また、開口部２０１ｅより底面が小さくなっており、捕捉孔２０１全体として、貫通孔２０１ｃへ向かう偏心した漏斗形状となっている。すなわち、捕捉孔２０１のキャピラリ針１０１側の内面２０１ｆの傾斜が水平方向に対して緩やかであるのに対し、キャピラリ針１０１と反対側の内面２０１ｇの傾斜が水平方向に対して急峻である。
【００８９】
このように、本実施の形態においては、捕捉孔２０１が偏心した漏斗状に形成されるため、細胞の大きさに応じた位置で細胞を捕捉することができ、１つの細胞捕捉プレート１０３によって、直径が異なる細胞を捕捉することができる。また、捕捉孔２０１の開口部２０１ｅの中心と底面の中心とを結ぶ直線がキャピラリ針１０１の長手方向の軸に略平行であるため、キャピラリ針１０１が突き出される際に、キャピラリ針１０１の先端が捕捉孔２０１内のすべての位置に捕捉された細胞の中心付近に到達することになり、捕捉した細胞に対する薬液の注入が確実に実行されるようにすることができる。
【００９０】
すなわち、図１１に示すように、捕捉孔２０１によって大型細胞３０１、中型細胞３０２、および小型細胞３０３がそれぞれの大きさに応じた位置に捕捉された場合に、キャピラリ針１０１が突き出されると、キャピラリ針１０１の先端は、それぞれの細胞の中心付近に到達する。換言すれば、捕捉孔２０１の貫通孔２０１ｃ近傍において捕捉される小型細胞３０３の中心付近にキャピラリ針１０１の先端が到達するようにステージ調整機構部１０７およびキャピラリ針移動機構部１０８が調整されれば、この先端は、捕捉孔２０１の開口部２０１ｅ近傍において捕捉される大型細胞３０１の中心３０１ａ付近を通過することになる。
【００９１】
このため、キャピラリ針１０１の先端から吐出される薬液は、確実に細胞内に注入される。また、キャピラリ針１０１が突き出される際に、キャピラリ針１０１の先端が細胞の端部に接触することがなく、捕捉された細胞を押し退けてしまうことがない。したがって、キャピラリ針１０１の先端が捕捉された細胞の細胞膜を貫通し、細胞内への薬液の注入が行われる。
【００９２】
本実施の形態においても、細胞捕捉プレート１０３の製造は、実施の形態１と同様にＲＩＥと呼ばれるエッチングによって行われる。ただし、本実施の形態においては、捕捉孔２０１の内面２０１ｆ、２０１ｇが連続的に変化するため、ＳＯＩ基板を傾斜させ、エッチング中のプロセス条件を連続的に変化させれば良い。
【００９３】
以上のように、本実施の形態によれば、細胞捕捉プレートに穿設される貫通孔からの吸引によって細胞を捕捉する捕捉孔を貫通孔へ向かうにつれて偏心する漏斗状に形成し、捕捉孔の開口方向に対して垂直な断面の中心を結ぶ直線がキャピラリ針の長手方向の軸と略平行になるようにする。このため、それぞれの細胞の直径に適した位置で細胞を捕捉することができ、キャピラリ針が突き出される際にキャピラリ針の先端を捕捉された細胞の中心付近へ到達させることができる。結果として、直径が異なる細胞を捕捉するとともに、捕捉した細胞に対する薬液の注入が確実に実行されるようにすることができる。また、捕捉孔の断面積の変化が連続的であるため、捕捉する細胞の直径が離散的な範囲に限定されることがない。
【００９４】
なお、上記各実施の形態においては、捕捉孔２０１の開口方向に対して垂直な断面が円形となるものとしたが、この断面形状は円形に限定されず、楕円形状や四角形状などでも良い。
【００９５】
また、細胞捕捉プレート１０３の材料としては、ＳＯＩ基板のほかにも例えば石英基板やガラス基板などを用いることが可能である。
【００９６】
（付記１）長手方向の軸に沿って突き出されるキャピラリ針によって物質が注入されるインジェクション対象の細胞を捕捉する平面を備えた細胞捕捉プレートであって、
前記平面の一方の面に形成され前記平面に対して垂直方向に開口して細胞を支持する開口部と、前記開口部から前記平面の他方の面へ貫通し負圧により前記開口部に細胞を吸引する貫通孔とを含む捕捉孔を有し、
前記捕捉孔は、
前記開口部近傍における前記平面に平行な断面の面積が前記貫通孔近傍における前記平面に平行な断面の面積より大きいとともに、これらの２つの断面の中心を結ぶ直線が前記キャピラリ針の長手方向の軸に略平行に形成されることを特徴とする細胞捕捉プレート。
【００９７】
（付記２）前記捕捉孔は、
前記開口部から前記貫通孔へ向かうほど底面積が小さくなる複数の円筒部を連結した形状を有し、
前記貫通孔は、
底面積が最小の円筒部の底面から前記平面の他方の面へ貫通することを特徴とする付記１記載の細胞捕捉プレート。
【００９８】
（付記３）前記捕捉孔は、
前記開口部から前記平面が円筒状に陥没して形成されインジェクション対象の細胞を支持する上段円筒状凹部と、
前記上段円筒状凹部の底面の一部に開口し円筒状に陥没して形成される下段円筒状凹部とを有し、
前記貫通孔は、
前記下段円筒状凹部の底面から前記平面の他方の面へ貫通することを特徴とする付記１記載の細胞捕捉プレート。
【００９９】
（付記４）前記捕捉孔は、
前記上段円筒状凹部の開口部の中心と前記下段円筒状凹部の開口部の中心とを結ぶ直線が前記キャピラリ針の長手方向の軸に略平行に形成されることを特徴とする付記３記載の細胞捕捉プレート。
【０１００】
（付記５）前記捕捉孔は、
前記開口部から前記貫通孔へ向かって前記平面に平行な断面の面積が漸次縮小する漏斗状部を有し、
前記貫通孔は、
前記漏斗状部の前記平面に平行な所定の位置に形成される底面から前記平面の他方の面へ貫通することを特徴とする付記１記載の細胞捕捉プレート。
【０１０１】
（付記６）前記捕捉孔は、
前記開口部の中心と前記漏斗状部の底面の中心とを結ぶ直線が前記キャピラリ針の長手方向の軸に略平行に形成されることを特徴とする付記５記載の細胞捕捉プレート。
【０１０２】
（付記７）前記開口部は、
直径がインジェクション対象の細胞の最大直径の７０〜８０％に相当する円形に形成されることを特徴とする付記１記載の細胞捕捉プレート。
【０１０３】
（付記８）前記貫通孔は、
底面の直径が１〜２μｍまたはインジェクション対象の細胞の最小直径の１０〜２０％に相当する円筒状に形成されることを特徴とする付記１記載の細胞捕捉プレート。
【０１０４】
（付記９）長手方向の軸に沿って突き出され所定のタイミングで物質を吐出して細胞に注入するキャピラリ針と、インジェクション対象の細胞を捕捉する平面を備えた細胞捕捉プレートとを有するマイクロインジェクション装置であって、
前記細胞捕捉プレートは、
前記平面の一方の面に形成され前記平面に対して垂直方向に開口して細胞を支持する開口部と、前記開口部から前記平面の他方の面へ貫通し負圧により前記開口部に細胞を吸引する貫通孔とを含む捕捉孔を有し、
前記捕捉孔は、
前記開口部近傍における前記平面に平行な断面の面積が前記貫通孔近傍における前記平面に平行な断面の面積より大きいとともに、これらの２つの断面の中心を結ぶ直線が前記キャピラリ針の長手方向の軸に略平行に形成されることを特徴とするマイクロインジェクション装置。
【０１０５】
（付記１０）長手方向の軸に沿って突き出されるキャピラリ針によって物質が注入されるインジェクション対象の細胞を捕捉する平面を備えた細胞捕捉プレートの製造方法であって、
前記平面の一方の面から前記平面の他方の面へ貫通する貫通孔をエッチングによって形成する貫通孔形成ステップと、
前記貫通孔形成ステップにて形成された貫通孔を囲む円筒状の第１の円筒部を前記平面の一方の面側にエッチングによって形成する第１円筒部形成ステップと、
前記第１円筒部形成ステップによって形成された第１の円筒部を囲む円筒状の第２の円筒部であって、前記平面の一方の面に開口する開口部の中心と底面に形成される第１の円筒部の開口部の中心とを結ぶ直線が前記キャピラリ針の長手方向の軸に略平行になる第２の円筒部をエッチングによって形成する第２円筒部形成ステップと
を有することを特徴とする製造方法。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明は、直径が異なる細胞を捕捉するとともに、捕捉した細胞に対する薬液の注入が確実に実行されるようにする場合に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】実施の形態１に係る自動マイクロインジェクション装置の構成を模式的に示す図である。
【図２】実施の形態１に係る細胞捕捉プレートの構成を示す平面図である。
【図３】実施の形態１に係る細胞捕捉プレートの構成を示す断面図である。
【図４】実施の形態１に係る捕捉孔の構成を示す平面図である。
【図５】実施の形態１に係る捕捉孔の構成を示す断面図である。
【図６】実施の形態１に係る捕捉孔の構成例を示す断面図である。
【図７】多段状捕捉孔の構成例を示す断面図である。
【図８】実施の形態１に係るインジェクション動作を示すフロー図である。
【図９】実施の形態１に係る細胞捕捉プレートの製造方法を示す図である。
【図１０】実施の形態２に係る捕捉孔の構成を示す平面図である。
【図１１】実施の形態２に係る捕捉孔の構成を示す断面図である。
【図１２】インジェクション時の細胞捕捉方法の一例を示す図である。
【図１３】捕捉された細胞の様子の一例を示す図である。
【図１４】捕捉された細胞の様子の他の一例を示す図である。
【図１５】細胞直径の分布の例を示す図である。
【図１６】直径が異なる細胞の捕捉状態を示す図である。
【符号の説明】
【０１０８】
１０１  キャピラリ針
１０２  シャーレ
１０３  細胞捕捉プレート
１０４  ステージ
１０５  照明
１０６  吸引部
１０７  ステージ調整機構部
１０８  キャピラリ針移動機構部
１０９  捕捉座標記憶部
１１０  制御部
１１１  吐出機構部
１１２  ＣＣＤカメラ
１１３  倒立顕微鏡
２０１  捕捉孔
２０１ａ  上段円筒状凹部
２０１ｂ  下段円筒状凹部
２０１ｃ  貫通孔
２０１ｄ  中段円筒状凹部
２０１ｅ  開口部
２０１ｆ、２０１ｇ  内面
２０２  平面部
２０３  脚部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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