(57)【要約】【課題】任意遺伝子の発現等をモニタリングすることが可能な培養装置を提供することにある。【解決手段】本発明の培養装置は、発光レポーター遺伝子を導入した生物試料の液体培養を行う培養部と、前記培養部からの前記生物試料の培養液のサンプリングを行うサンプリング部と、前記培養部からサンプリングされた培養液に前記発光レポーターの基質を供給するための手段を含み、前記発光レポーター及び前記基質によって前記培養液が発する発光を測定する発光測定部と、制御用コンピュータとを備えることを特徴とする。【選択図】図２
2008178420.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光レポーター遺伝子を導入した生物試料の液体培養を行う培養部と、前記培養部からの前記生物試料の培養液のサンプリングを行うサンプリング部と、前記培養部からサンプリングされた培養液に前記発光レポーターの基質を供給するための手段を含み、前記発光レポーター及び前記基質によって前記培養液が発する発光を測定する発光測定部と、制御用コンピュータとを備えることを特徴とする培養装置。
【請求項２】
前記基質が溶液の基質であり、前記基質を供給するための手段が、前記培養液と前記基質とを個別に送液するポンプと、前記ポンプによってそれぞれ送液された前記培養液及び前記基質を混合する手段とを含むことを特徴とする請求項１記載の培養装置。
【請求項３】
前記発光レポーターがホタルルシフェラーゼであることを特徴とする請求項１又は２記載の培養装置。
【請求項４】
前記基質が揮発性の基質であり、前記基質を供給するための手段が、前記揮発性の基質を充満させた容器と、前記容器内を通り、前記培養液を前記容器内に通過させる通気性チューブとを含むこと特徴とする請求項１記載の培養装置。
【請求項５】
前記発光レポーターがバクテリアルシフェラーゼであることを特徴とする請求項１又は４記載の培養装置。
【請求項６】
さらに、生物試料を保管する保管部を含む請求項１〜５項のいずれか１項に記載の培養装置。
【請求項７】
前記サンプリング部が、前記発光を測定するため又は保管部へ保管するために、生物試料のサンプリングを行う請求項１〜６項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
さらに洗浄システム部を含む請求項１〜７項のいずれか1項に記載の培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制御プログラム、及び培養装置に関し、特に、培養装置を制御するのに適当な制御プログラム、及び細胞の連続培養に適した培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の液体培養は基礎研究や医療、醸造など様々な分野で行われており、細胞を一定の成長相に保ちつつ連続的に培養を行う連続培養は様々な研究で行われており、そのための装置は以前から存在していた(エイブル株式会社の製品群など；http://www.able-biott.co.jp/index.html)。従来の装置では細胞濃度や酸素濃度といった指標で細胞の状態をモニタリングすることと、連続培養からサンプリングした細胞を低温状態（４〜１０℃）で保存することができた。
【０００３】
また、生物発光リアルタイム測定法は生物に発光遺伝子を組み込んで生きたままの細胞で任意遺伝子の発現量の変動を連続的に測定できる有効な実験法である。（Kondo et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 1993, vol90 pp5672-5676）
【非特許文献１】エイブル株式会社の製品群など；http://www.able-biott.co.jp/index.html
【非特許文献２】Kondo et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 1993, vol90 pp5672-5676
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来の装置では（１）細胞の分裂速度をモニタリングすることや（２）生物発光レポーター株の生物発光量をモニタリングすること、（３）連続培養からサンプリングした細胞を極低温状態（約−８０℃以下）で保存することができなかった。
【０００５】
また、従来の生物発光リアルタイム測定法は、細胞を一定の状態で保ちつつ、生物発光を測定することができなかった。
【０００６】
したがって、これらの機能を総合的に兼ねそろえている培養装置、及び当該培養装置を効率的に制御し得る制御プログラムが提供されれば、細胞分裂速度及び任意遺伝子の発現量をリアルタイムで解析し、各サンプルからのデータを比較検討することにより新たな知見を提供し得るが、このような培養装置及び制御プログラムはこれまで存在しない。
【０００７】
そこで、本発明は、培養装置を的確に制御し、連続培養を可能とする制御プログラムの提供、及び細胞分裂速度、任意遺伝子の発現等をモニタリングすることが可能な培養装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、発明者らは、連続培養を可能とする制御システムについて鋭意研究した結果、本発明の培養装置及び制御プログラムを見出すに至った。
【０００９】
本発明の制御プログラムは、コンピュータを、
細胞濃度センサーからの測定値を読み取り、記録する手段、
予め細胞濃度の設定値データを記録する手段、
前記設定値データと前記測定値とを比較して、前記設定値が高い場合に培地を培養液へ供給し、低い場合に前記培地の供給を停止するように培地供給装置へ制御信号を送る手段、
前記培地の供給量を記録する手段、
として機能させることを特徴とする。当該制御プログラムによれば、細胞濃度センサーからの測定値と予め記録された細胞濃度の設定値とを比較して、培地の培養液への供給を的確に制御することができ、ひいては、当該プログラムを組み込むことにより連続培養を実現し得る装置を提供することができる。
【００１０】
本発明の制御プログラムの好ましい実施態様において、さらに、コンピュータを、
予め入力した細胞濃度センサーからの測定値と細胞濃度との相関関係を利用して、培養液中の細胞濃度を算出する手段、
前記算出された細胞濃度データを記録する手段、
前記記録された測定値と、前記記録された細胞濃度と、測定期間中の前記記録された測定値の変化量とによって、細胞増殖率を算出する手段、
として機能させることを特徴とする。当該制御プログラムによれば、細胞濃度センサーからの記録された測定値、細胞濃度、測定中の測定値の変化量とによって細胞増殖率をリアルタイムに提供することが可能となる。
【００１１】
本発明の制御プログラムの好ましい実施態様において、コンピュータを、
前記記録された培地の供給量と培養液の体積によって、細胞増殖率を算出する手段、
として機能させることを特徴とする。当該プログラムによれば、培地の供給量と培養液の体積によって、細胞増殖率をリアルタイムに提供し得る。
【００１２】
本発明の制御プログラムの好ましい実施態様において、コンピュータを、
予め設定されたタイミングで細胞のサンプリングを行うようにサンプリング装置へ制御信号を出力する手段、
として機能させることを特徴とする。当該制御プログラムによれば、細胞のサンプリングを所望のタイミングで行うことができる。これは、前記細胞濃度データ、細胞増殖率データ、及び後述する任意の遺伝子発現量データなどの各データに基づいて、タイミングを制御することも可能である。例えば、測定値により、概日リズムなどのリズム解析をも行うことができるのでリズム解析して得た予測される分裂速度/生物発光量を基に実験者が任意に設定した分裂速度／生物発光量の値で自動的にサンプリングを行うように制御することが可能である。
【００１３】
本発明の制御プログラムの好ましい実施態様において、コンピュータを、
リアルタイムに送られてくる前記測定値に基づいて、前記細胞増殖率を表示する手段と、
所定時間後に新たにリアルタイムに送られてくる測定値に基づいて、前記細胞増殖率をリアルタイムで更新表示する手段、
として繰り返し実行させることを特徴とする。当該プログラムによれば、リアルタイムに送られてくる測定値を利用して、細胞増殖率をリアルタイムに表示することを可能とする。
【００１４】
本発明の制御プログラムの好ましい実施態様において、さらに、コンピュータを、
リアルタイムに送られてくる生物試料の発光測定結果信号に基づいてリアルタイムでの生物試料の発光測定結果の表示内容を記録する手段、
前記記録した表示内容を比較する手段、
として機能させることを特徴とする。当該制御プログラムによれば、リアルタイムに送られてくる発光測定結果信号(光電子増倍管から発せられるアナログの電気パルス信号をデジタル信号に変換した信号)を利用して、生物試料の発光測定結果をリアルタイムに表示することを可能とする。
【００１５】
本発明の制御プログラムの好ましい実施態様において、コンピュータを、
リアルタイムに送られてくる生物試料の発光測定結果及び細胞増殖速度結果に基づいて前記サンプリングのタイミングを制御し、前記サンプリング装置へ制御信号を出力する手段、
として機能させることを特徴とする。当該プログラムによれば、培養中にモニタリングした任意の値(細胞分裂速度、生物発光量など)が予め設定された設定値を超えた場合などに、サンプリングを実行させることが可能である。
【００１６】
また、本発明のコンピュータ読み取り可能な記録媒体は、請求項１〜６項のいずれか１項に記載のプログラムを記録したことを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の培養装置は、連続培養部と、前記連続培養部からサンプリングされた培養液中に存在する生物試料の生物発光を測定する発光測定部と、前記連続培養部からの培養液のサンプリングを行うサンプリング部と、制御用コンピュータとからなることを特徴とする。当該培養装置によれば、細胞の連続培養が可能となるとともに、培養中の細胞の挙動、例えば、細胞分裂速度、生物発光量などに基づき、サンプリングを行うことができ、生物試料の培養環境下における挙動を観察することが可能である。
【００１８】
また、本発明の培養装置は、発光レポーター遺伝子を導入した生物試料の液体培養を行う培養部と、前記培養部からの前記生物試料の培養液のサンプリングを行うサンプリング部と、前記培養部からサンプリングされた培養液に前記発光レポーターの基質を供給するための手段を含み、前記発光レポーター及び前記基質によって前記培養液が発する発光を測定する発光測定部と、制御用コンピュータとを備えることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の培養装置の好ましい態様において、前記基質が溶液の基質であり、前記基質を供給するための手段が、前記培養液と前記基質とを個別に送液するポンプと、前記ポンプによってそれぞれ送液された前記培養液及び前記基質を混合する手段とを含むことを特徴とする。なお、前記発光レポーターがホタルルシフェラーゼであることが好ましい。
【００２０】
また、本発明の培養装置の好ましい態様において、前記基質が揮発性の基質であり、前記基質を供給するための手段が、前記揮発性の基質を充満させた容器と、前記容器内を通り、前記培養液を前記容器内に通過させる通気性チューブとを含むこと特徴とする。なお、前記発光レポーターがバクテリアルシフェラーゼであることが好ましい。
【００２１】
また、本発明の培養装置の好ましい態様において、さらに、生物試料を保管する保管部を含むことを特徴とする。これによって、培養中の任意の時間において、サンプリングされた試料を適宜保管することができる。
【００２２】
また、本発明の培養装置の好ましい態様において、前記サンプリング部が、前記生物発光を測定するため又は保管部へ保管するために、生物試料のサンプリングを行うことを特徴とする。
【００２３】
また、本発明の培養装置の好ましい態様において、前記制御用コンピュータが、上記制御プログラムによって制御されることを特徴とする。本発明の培養装置は、本発明の制御プログラムを使用することによって、好適に機能する。
【００２４】
また、本発明の培養装置の好ましい態様において、さらに、洗浄システム部を有することを特徴とする。この洗浄システム部によって、送液ラインの自動洗浄システムを提供することができる。すなわち、この洗浄システム部によって、複数種類の洗浄液（例えば、水、エタノールなど）と空気を用いてサンプリング経路を自動的に洗浄する機構を提供することが可能となる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、細胞の分裂速度をモニタリングすることができるので、連続培養中の細胞の分裂速度をデータとして把握することができる。また、生物発光レポーター株の生物発光レポーター遺伝子のプロモーターとして任意の遺伝子のプロモーター領域を用いることで、連続培養中の細胞の任意遺伝子の発現を生物発光として連続的かつ自動的に測定・記録することができる。また、サンプリングした試料を極低温下で保管することによって、RNAや不安定なタンパクなどの成分が分解されずに保存できる。さらに、上記の機能、すなわち、細胞の分裂速度及び任意遺伝子の発現量のモニタリング機能、及びサンプリングした細胞の極定温状態での保存機能、を併せ持つことによって、細胞分裂速度や任意遺伝子の発現量を元にサンプリングのタイミングを計算して自動実行させることができる。細胞分裂速度や任意遺伝子の発現量とサンプリングした細胞から得たデータとを比較することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の実施の形態を、図面を参照して詳細に説明する。図１(a)は、本発明の制御プログラムの模式図の一例を示す。図１(ｂ)は、本発明の装置の各部の写真と接続の様子の一例を示す。
【００２７】
＜本発明の使用方法と動作の一例＞
本発明の装置は（A）制御用コンピュータ、（B）連続培養部分、（C）発光測定部分、（D）サンプリング部分で構成されている。装置の各部はコンピュータ内のプログラムで制御される。
【００２８】
（A）制御用コンピュータ：  制御用コンピュータは本発明の他の部分と電気的に接続されている(図1a,b)。コンピュータ上で働く制御プログラムによって他の部分から送られてくる測定信号を読みとって電子ファイルとして記録し、制御信号を送って各部の動作を制御する(図1a,b)。
【００２９】
当該制御プログラムとして、好適には、本発明の制御プログラムを適用することができる。
【００３０】
ここで、本発明の制御プログラムの一例について説明すると以下のようである。すなわち、まず、予め細胞濃度の設定値データをキーボードなどの入力装置から入力する。データファイルには、細胞濃度センサーからは測定値が記録される。
【００３１】
中央処理装置は、メインメモリ中の制御プログラムの指令を受け、データファイルから設定値データと測定値データを読み出し、両者を比較し、設定値データと測定値データとでいずれが高いかを比較して、培地供給装置へ培地を培養液へ供給するかどうかの制御信号を送る。
【００３２】
また、培養液中の細胞濃度の算出は、予め入力した細胞濃度センサーからの測定値と細胞濃度との相関関係を利用する。得られた細胞濃度データと、記録された測定値と、測定中の測定値の変化量とによって、細胞増殖率を算出することができる。
【００３３】
ここで、細胞増殖速度について、算出方法の一例を含めて説明すれば以下の通りである。
【００３４】
本発明にかかる装置は数秒おきに光電センサーをもちいて培養液の濁度（培養中の細胞濃度に比例）を光電センサー出力の電圧変化として測定することができる（標準で6秒ごとに5回測定して平均値を算出）。細胞濃度が高くなるほどに電圧値は低下し、電圧値が設定した下限値よりも低くなったなら培地を供給して細胞濃度を希釈することができる。逆に上限値よりも高くなったなら培地の供給を停止することができる。
【００３５】
本発明は、細胞状態を一定に保つことができる。この際に本発明では、培地を供給した時間の比率や培養中の光電センサー電圧値の変化を記録しており、設定した測定間隔(下記T、細胞の種類によるが5〜60 minに設定することが多い)毎にこれらの記録値を元に計算を行うことでリアルタイムに細胞増殖速度を算出・記録することができる。
【００３６】
＜細胞増殖率の計算方法１：供給培地量型の計算＞
以下の計算式は連続液体培養中の培養液量(V)と細胞濃度を均一に保つために
加えた追加培養液の流速(S)、追加培地の供給時間率などの入力値から細胞増殖
率（Gi）を計算する。
【００３７】
入力値：
S:追加培養液の流速(ml/min)。連続培養開始時に決定する。
T:測定間隔(min)。連続培養開始時に決定する。
V:培養液の体積(ml)。連続培養開始時に決定する。
i:測定番号(0 - n)。連続培養期間に測定間隔毎にカウントアップしていく。
Ri: 測定番号i-1からiの期間における追加培地の供給時間率。連続培養期間に
装置が自動的に記録する。
【００３８】
出力値：
Gi: 単位時間あたりの細胞増殖率(Cell Growing rate / h)。入力値を元に自動
的に算出する。
【００３９】
出力値の計算式：
Gi = ((V+ Ri x T x S) / V)(60 / T)
【００４０】
＜細胞増殖率の計算方法２：電圧変化量型の計算＞
以下の計算式は測定開始時に入力した電圧−細胞濃度の検定曲線と、連続液体
培養中の培地を追加していないときの電圧変化量の合計値(ΣΔEi)などの入力値
から細胞増殖率（Gi）を計算する。
【００４１】
入力値：
j:細胞濃度-電圧の検定曲線の組み番号(0 - n)。連続培養開始時に決定する。
Cj: 電圧-細胞濃度の検定曲線を調べた際の細胞濃度(Cells / ml)。連続培養開始
時に決定する。
Ej: 電圧-細胞濃度の検定曲線を調べた際の電圧(V)。連続培養開始時に決定する。
Cc:連続培養時の培養液の細胞濃度(Cells / ml)。連続培養開始時に決定する。
T:測定間隔(min)。連続培養開始時に決定する。
i:測定番号(0 - n)。連続培養期間に測定間隔毎にカウントアップしていく。
ΣΔEi:測定番号i-1からiまでの期間における培地を供給していないときの電圧
変化量合計。連続培養期間に装置が自動的に記録する。
【００４２】
出力値：
ΔC: 培養時における電圧変化量あたりの細胞濃度変化量(Cells / ml / V)。
測定開始時に入力値を元に計算する。
Gi:単位時間あたりの細胞増殖率(Cell Growing rate / h)。入力値を元に自動的
に算出する。
【００４３】
出力値の計算式：
ΔC = (Cj - Cj-1) / (Ej - Ej-1)
・ただし、細胞濃度CjとCj-1はそれぞれ電圧-細胞濃度の検量線を引いたときに「Cj-1 < Cc < Cj」を満たす細胞濃度Ccもっともに近い値。
Gi = ((Cc + ΔC x ΣΔEi) / Cc)(60 / T)
【００４４】
以上のような計算式の一例を用いて、記録された測定値と、記録された細胞濃度と、測定中の測定値の変化量によって、細胞増殖率を算出することができる。
【００４５】
また、制御プログラムは、予め設定されたタイミングで細胞のサンプリングを行うようにサンプリング装置へ制御信号を出力することができる。予め設定するタイミングは、任意に決定することができ、限定されないが、生物発光量のモニタリングによって得られた値や、細胞増殖速度などのデータに基づいて決定してもよい。例えば、細胞分裂速度や遺伝子の発現量がピークのときなどにサンプリングを実行したり、培養中にモニタリングした任意の値（細胞分裂速度、生物発光量）が設定値を越えた場合にサンプリングを実行するように設定することができる。また、それらの測定値をリズム解析して得た予測される分裂速度／生物発光量のピークに自動的にサンプリングを行うことができる。
【００４６】
（B）連続培養部分：
連続培養部分は液体培養用のフラスコとそれに取り付けた細胞濃度センサー、追加用の培地、培地の追加制御用の部品（送液ポンプや電磁弁など）から構成されている(図1a,b)。細胞濃度センサーは制御用コンピュータと接続され、コンピュータ上の制御プログラムが測定値を読みとる。培地の追加制御用の部品も制御コンピュータと接続されており、コンピュータ上の制御プログラムは制御信号を送って培地の追加制御用部品の動作を制御する(図1a,b)。
【００４７】
センサーによって細胞濃度を測定する手段について説明すれば、以下のようである。例えば、光電センサーを用いて濁度として測定する方法や培養液の電気容量を測定する方法、粒子計を用いて測定する方法などがあり、これらを適宜本発明において使用することができる。濁度や電気容量として測定した場合は測定値を電気信号として取り出し、電流−電圧変換回路やA/D変換回路を介してコンピュータ上のプログラムで読みとる（図1a）。その際に細胞濃度は予め入力しておいたそれぞれの測定値と細胞濃度の相関を示した検量線から算出することができる。粒子計を用いた場合は粒子濃度を細胞濃度と見なすことができる。
【００４８】
本発明においては培養液の細胞濃度を濃度センサーを用いて任意の時間間隔で測定を行い、細胞濃度が入力した値よりも濃くなったら、培地を供給して細胞濃度を希釈することができる（図1a,b）。逆に設定値よりも薄くなったら培地の供給を停止し、細胞の増殖によって細胞濃度は増加する（図1a,b）。本発明はこの一連の動作を継続的に繰り返すことで細胞濃度を一定に保つことができる。細胞濃度以外にも上記の各測定値を直接指標にして培地の供給・停止を制御することができる。
【００４９】
培地の追加手段については、培地の供給の調節はコンピュータ上の制御プログラムから送液ポンプや電磁弁に電気信号を送ることで、送液ポンプの送液速度を制御することや電磁弁を開閉することによって行うことができる（図1a,b）。
【００５０】
また、測定値や細胞濃度の値をデータとして記録する方法については、本発明は上記の方法によって細胞状態を一定に保つ際に、センサーの測定値や細胞濃度、追加用培地を供給した時間の比率や記録を電子ファイルとして制御用コンピュータに記録することができる（図1a,b）。更に、これらの記録値を元に設定した測定間隔毎に計算を行うことでリアルタイムに細胞増殖速度を算出し、制御用コンピュータに電子ファイルとして記録することができる。
【００５１】
(C)発光測定部分：
細胞に生物発光遺伝子を組み込んでいた場合には、制御プログラムは装置を制御して定期的に培養液をサンプリングして、生物発光を測定することができる(図1a, 図2)。
【００５２】
サンプリングされた培養液中の生物試料の生物発光の測定には、例えば、基質が溶液、揮発性などの違いにより以下のような例を挙げることができる。基質が溶液である場合の例として、図２（ａ）に示す。発光レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼなどを用いる場合は、ペリスタポンプを駆動することで個別に送液した培養液と基質溶液とをサンプリング経路上で混合し、細胞に発光基質を供給することができる。その後、混合液が発する生物発光を光電子増倍管で測定することができる(図２a)。
【００５３】
なお、図２（a）においては、培養液中にホタルルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ生物試料を用いて、当該生物試料とD-ルシフェリン溶液を混合させているが、生物発光を測定できれば、混合の手段は特に問わない。
【００５４】
また、基質が揮発性のものを用いる場合の例として、図２（ｂ）に示す。発光レポーター遺伝子としてバクテリアルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合は、送液した培養液を揮発性基質であるn-デカナールを充満させた容器に通気性チューブを用いて通すことで細胞に発光基質を供給し、培養液が発する生物発光を測定部で測定する(図２b)。測定したデータは測定信号としてコンピューターに転送され、制御プログラムによって記録・表示される(図1a, 図2)。
【００５５】
(D)サンプリング部
装置はプログラムの入力に基づいて送液ポンプを駆動して培養液をサンプリングし、保管することが可能である(図1a,b)。極低温の保冷剤を満たすことができる保温部をサンプリング部に付加することで、サンプリングした細胞を極低温状態で（−80℃以下）に保つことを可能になっている。極低温とは特に限定されないが、ほとんどのタンパク質の働きを止めることができ、分解しやすい生体高分子（ｍRNAなど）も安定して保存し得るという観点から、好ましい温度範囲としては、−７０℃以下である。
【００５６】
また、本発明の制御プログラムを利用すれば、予め設定されたタイミングで細胞のサンプリングを行うように、制御信号により制御されたサンプリング装置などの駆動装置によって、細胞を保管部又は測定装置へ移送することができる。
【００５７】
ここで、本発明の一実施例を説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されることを意図するものではない。以下の実施例は、本発明の一実施態様を説明するために用いたものであり、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨及び範囲を逸脱しない限り、いかなる変更等を排除するものではない。
【００５８】
実施例１
本実施例において用いた培養装置について説明すれば以下の通りである。
連続培養部分は液体培養用の角フラスコとそれに取り付けた光電センサー（細胞濃度測定用）、追加用の培地、培地制御の追加制御用の送液ポンプから構成される。連続培養の開始には、液体培養用の角フラスコ内に培養液を入れ、光電センサーを取り付ける。培養用のボトルには送液ポンプを介して新鮮な培地を追加できるように接続する。制御プログラムは光電センサーを用いて培養液の細胞濃度を測定し、培養液濃度が入力した値よりも上昇すると培地を追加することで細胞濃度を一定に保つ。また、制御プログラムは測定した細胞濃度や細胞濃度の変化、追加した培養液量をそれぞれ記録しており、これらの値から細胞濃度を表示することや、細胞増殖速度の変化を計算して表示することができる。
【００５９】
細胞に生物発光遺伝子を組み込んでいた場合には、制御プログラムは装置を制御して定期的に培養液をサンプリングして、生物発光を測定することができる。発光レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子などを用いる場合は、ペリスタポンプを駆動することで個別に送液した培養液と基質溶液とをサンプリング経路上で混合し、細胞に発光基質を供給する。その後、混合液が発する生物発光を光電子増倍管で測定する。発光レポーター遺伝子としてバクテリアルシフェラーゼを用いる場合は、送液した培養液を揮発性基質であるn-デカナールを充満させた容器に通気性チューブを用いて通すことで細胞に発光基質を供給し、培養液が発する生物発光を測定部で測定する。測定したデータをコンピューターに転送され、制御プログラムによって記録・表示される。
【００６０】
装置はプログラムの入力に基づいて送液ポンプを駆動して培養液をサンプリングし、極低温で保管する。
【００６１】
以上のような培養装置を用いて、実際に、細胞増殖速度のモニタリング、生物発光のモニタリング、細胞から抽出したRNAの解析を行った。
【００６２】
(1) Synechocystis sp. PCC6803の細胞増殖速度のモニタリング
藍色細菌Synechocystis sp. PCC6803を1LのBG-11液体培地に植え付け、本装置を用いて30 ℃、白色光照射下（45μmol/m2/sec）で通気培養を開始し、培養液濃度がOD730=0.25(2.5 ×109 cells/ml)になるまで細胞を増殖させた。培養液濃度の安定を確認した後、12時間の暗処理を行い、その後、白色光照射下（45 μmol/m2/sec）に置き、細胞の増殖速度を追加した新鮮な培地の量から計算した。
【００６３】
その結果、連続培養中のSynechocystisの細胞増殖速度の変動パターンを観測できていることが判明した(図３)。図３は、本発明の装置及び制御プログラムを用いて測定した細胞増殖速度のリズムを示す。図３は、本培養装置の細胞増殖速度モニタリング機能を用いて、藍色細菌Synechocystis sp. Strain PCC6803の細胞増殖速度を測定した一実施例を示す。横軸は、測定開始からの時間、縦軸は、1時間あたりの細胞数の増殖倍率である。連続培養期間中の細胞増殖速度の変動パターンが観察できている。
【００６４】
図3に示す値は連続培養期間中に表示されており、これの表示値を元に実験スケジュールを柔軟に変更することができる。
【００６５】
(2)次に、ホタルルシフェラーゼを発光遺伝子として用いた生物発光モニタリングを行った。
【００６６】
好熱性藍色細菌Thermosynechococcus elongatusに耐熱性ホタルルシフェラーゼを発光遺伝子として組み込んだ発光レポーター株を1LのBG-11液体培地に植え付け、本装置を用いて50 ℃、白色光照射下（20μmol/m2/sec）、5％CO2通気培養を開始し、培養液濃度がOD730=0.6(6 ×109 cells/ml)になるまで細胞を増殖させた。培養液濃度の安定を確認した後、12時間の暗処理を行い、その後、連続明下（12 μMol/m2/sec）で連続培養を行った。生物発光測定は培養液を２時間に１回サンプリングして、5mM D-ルシフェリン溶液と混合して暗室内に110分間静置し、光電子増倍管で生物発光を測定した。
【００６７】
その結果、本装置の生物発光測定機能を用いて、好熱性藍色細菌Thermosynechococcus elongatusに耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ発光レポーター株の生物発光を測定することができた（図４a）。図４は、本発明の装置とプログラムを用いて測定した生物発光リズムを示す。図４（ａ）は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を用いた生物発光レポーター株の生物発光を測定した例を示す。図４（ｂ）は、バクテリアルシフェラーゼ遺伝子を用いた生物発光レポーター株の生物発光を測定した例を示す。
【００６８】
これによって、連続培養期間中の細胞の任意遺伝子の発現量が生物発光として測定できることが分かる。そして、ルシフェラーゼの前に接続したプロモーターの活性に従った明確なリズムを観測することができることが判明した。
【００６９】
（３）次に、バクテリアルシフェラーゼを発光遺伝子として用いた生物発光モニタリングを行った。
【００７０】
藍色細菌Synechocystis sp. PCC6803にバクテリアルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ発光レポーター株を1LのBG-11液体培地に植え付け、本装置を用いて30℃、白色光照射下（12μmol/m2/sec）、通気培養を開始し、培養液濃度がOD730=0.25になるまで細胞を増殖させた。培養液濃度の安定を確認した後、12時間の暗処理を行い、その後、連続明下（12μmol/m2/sec）で連続培養を行った。生物発光測定は培養液を1時間に１回サンプリング、通気性のチューブを用いて3%n-デカナール溶液を入れた容器通してから、暗室内に50分間静置した後、光電子増倍管で生物発光を測定した。
【００７１】
その結果、本装置の生物発光測定機能を用いて、藍色細菌Synechocystis sp. PCC6803にバクテリアルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ発光レポーター株の生物発光を測定することができた（図4b）。Thermosynechococcusのときと同様、明確なリズムを観測することができる。
【００７２】
（４）次に、自動サンプリング装置を用いてサンプリングしたクラミドモナス細胞から抽出したRNAの解析を行った。
【００７３】
Chlamydomonas reinhardtiiを1LのTAP液体培地に植え付け、本装置を用いて23 ℃、白色光照射下（45 μmol/m2/sec）で通気培養を開始し、培養液濃度が(1.7 × 106 cells/ml)になるまで細胞を増殖させた。培養液濃度の安定を確認した後、12時間の暗処理を行い、その後、白色光照射下（45 μmol/m2/sec）に置いた。本発明の自動サンプリング機能を用いて、連続培養したクラミドモナス細胞を２時間毎に50mlずつサンプリングし、極低温下で保管した。２４時間のサンプリングの終了後、極低温下で保管していた試料からRNAを抽出し、cabII遺伝子のプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを行った。
【００７４】
その結果、本発明の培養装置を用いてサンプリングした試料から得たRNAの電気泳動図のパターン（図5a）においては、rRNAが分解していないことが判明した。図５は、本発明の装置とプログラムを用いて培養及びサンプリングを行ったクラミドモナスの細胞から抽出したトータルRNAとノーザンブロット解析を示す。図５（a）は、装置を用いてサンプリングした試料から得られたトータルRNAの電気泳動図を示す。図５（ｂ）は、Cabll遺伝子プローブを用いたノーザンブロット解析を示す。
【００７５】
また、CabII遺伝子のDNA断片をプローブに用いたノーザン・ハイブリダイゼーション（図5b）では、CabII mRNAのバンドは分解されておらず明確なバンドを示した。このことから、本発明を用いてサンプリングしたクラミドモナス細胞から高品質のRNAを調製することができることが判明した。以上の結果、本発明の培養装置を用いてサンプリングし保管したクラミドモナス細胞から高品質のRNAを調製できることが判明した。
【００７６】
要約すると、本発明の培養装置及び制御プログラムにより、連続培養している細胞の分裂速度の変動を計算・表示できること、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ発光レポーター株の生物発光を測定・表示できること、バクテリアルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ発光レポーター株の生物発光を測定・表示できること、自動サンプリングした試料から分解しやすい生体高分子（mRNAなど）を高品質で調製できることが証明された。
【００７７】
また、本発明の装置・プログラムはこれらの機能を兼ね備えることにより、リアルタイム表示した細胞分裂速度や生物発光量（遺伝子発現量）をもとに培養液の自動サンプリングを柔軟なスケジュールで行うことができる。また、サンプリングした試料から得たデータと細胞分裂速度や生物発光量（遺伝子発現量）を比較することができることも証明された。
【００７８】
実施例２
次に、本発明の装置の機能について、既存の装置と比較した。本発明の装置と既存の装置との比較を以下の表1にまとめた。
【００７９】
【表１】
2008178420.tif 000003
【００８０】
既存の連続培養装置は培地の自動追加によって細胞濃度を一定に保つ機能は持っている。本発明の培養装置は、既存の培養装置が有していない以下の機能、「細胞分裂速度のリアルタイム測定機能」、「ホタルルシフェラーゼやバクテリアルシフェラーゼなどの発光レポーターを用いた生物発光のリアルタイム測定機能」、「自動サンプリング機能」、「自動凍結保存機能」、を装置に搭載することで、培養中の細胞の状態を詳細かつ全自動でリアルタイム測定し、自動的にサンプリングして凍結保存することを可能とすることができることが判明した。
【００８１】
実施例３
次に、本発明の別の実施態様を試みた。本発明の別の実施態様における模式図の一例を図６に示す。
既に説明した本発明の図１に示す実施態様との違いは、以下のようである。
すなわち、図１と比較した場合の変更点は、「洗浄システム」を追加した点である。「洗浄システム」はエタノールを用いて送液チューブ内壁に付着した細胞を洗浄し、空気と水を用いてエタノールを除去することで、送液チューブ内を常にクリーンな状態に保つためのものである。「洗浄システム」を搭載したことによって、高濃度の細胞培養液の自動サンプリングや生物発光のリアルタイム測定を安定に行うことが可能となる。高濃度の培養液を用いた生物発光リアルタイム測定については、後述の実施例４で説明する。
【００８２】
この洗浄システムを追加した場合の本発明の装置の動作について説明すれば、以下の通りである。
【００８３】
培養装置の動作機構
細胞濃度を光電センサーで測定し、コンピューター上の制御プログラムによって培地の追加量を自動計算して培養液へ培地を自動追加することで、細胞濃度を一定に保つ。細胞濃度は実験者が任意に設定することができる。また、同プログラムによって、単位時間あたりの培地追加量（体積）、または単位時間あたりの光電センサーの電圧変化量から細胞分裂速度（細胞増殖速度）をリアルタイムに自動算出する。実験者が設定した任意の時間間隔で培養液を自動的にサンプリングし、発光検出部で生物発光量を自動測定して測定値を信号としてコンピュータへ送信する。発光検出部の測光デバイスは、光電子増倍管や高感度CCDカメラなどを使用する。コンピュータが受信した信号は、プログラムによって自動処理されて生物発光量がリアルタイム測定される。さらに、実験者が設定した任意のタイミングで培養液を自動的にサンプリングして、凍結保存容器中で保存する。生物発光測定のためのサンプリングや凍結保存のためのサンプリングを自動実行した直後は毎回、洗浄システムでサンプリング経路に付着した細胞を自動的に洗浄して取り除く。
【００８４】
このようにして洗浄システムを用いることによって、送液チューブ内を常にクリーンな状態にすることができることが分かる。
【００８５】
実施例４
次に、本発明の別の実施態様に係る装置について検討を加えた。この実施態様は、図２の装置に変更を加えたものであり、実施例３で述べた洗浄機構を利用している。
本装置における生物発光のリアルタイム測定の仕組みについて説明すれば、以下の通りである。
【００８６】
(a)はホタルルシフェラーゼなど水溶性の発光基質を要求する生物発光系をレポーターに持った細胞の生物発光リアルタイム測定法である。まず、連続培養している培養液を送液ポンプで三叉路へ送液する。同時に別の送液ポンプでD-ルシフェリンなどの水溶性の基質を三叉路へ送液して培養液と混合し、培養液とルシフェリンの混合液を光電子増倍管などの測光デバイスの直下へ送液する。次に、測光デバイスで生物発光を測定し、測定データをコンピュータへ送信して記録する。コンピュータ上のプログラムで発光測定データをリアルタイムに視覚化および解析する。測定後の培養液は、廃液入れへ送液されて廃棄される。一連の動作は、コンピュータ上の制御プログラムによって実験者の設定した任意のタイミング・繰り返し回数・その他の設定値に基づいて自動的に実行される。
【００８７】
(b)はバクテリアルシフェラーゼ遺伝子など揮発性物質を発光基質に要求する生物発光系をレポーターに持った細胞の生物発光リアルタイム測定法である。まず、連続培養している培養液を送液ポンプで送液する。送液チューブには通気性チューブを使用し、これをあらかじめn-デカナールなどの揮発性の基質を充満させておいた容器に通しておく。揮発性の基質は通気性チューブの中へ拡散することができるので、送液チューブの中を培養液がゆっくりと通過する過程で培養液中の細胞に発光基質が投与される。基質を投与された培養液を光電子増倍管などの測光デバイスの直下へ送液する。次に、測光デバイスで生物発光を測定し、測定データをコンピュータへ送信して記録する。コンピュータ上のプログラムで測定データをリアルタイムに視覚化および解析する。測定後の培養液は、廃液入れへ送液されて廃棄される。一連の動作は、コンピュータ上の制御プログラムによって実験者の設定した任意のタイミング・繰り返し回数・その他の設定値に基づいて自動的に実行される。
【００８８】
こうして送液チューブ内をクリーンに保ちつつ測定を行うことができる結果、より高精度の装置を実現できることが分かる。
【００８９】
実施例５
次に、実施例１の実験手順にならって、単細胞性緑藻Chlamydomonas reinhardtiiの細胞増殖リズムのリアルタイムモニタリングについて調査した。
【００９０】
単細胞性緑藻Chlamydomonas reinhardtiiを1LのTAP液体培地に植え付け、本装置を用いて23℃、白色光照射下（46μmol/m2/sec）で通気培養を行った。培養液の細胞濃度がOD730=0.3になるまで細胞を増殖させ、細胞濃度をこの値に保つように連続培養を行った。連続培養中に12時間の暗期を培養液に与えて細胞内の生物時計をリセットした後、連続白色光照射下（46μmol/m2/sec）へ移してこの時刻を０時間目とした。連続明開始からの細胞の増殖速度をリアルタイム測定した。図８aは、培養液に追加した培地の体積から本明細書段落番号［0036］に記載の計算式によって細胞増殖速度を算出した場合であり、図8bは、培養液の細胞濃度変化を光電センサーの電圧変化として捉えて本明細書段落番号［0040］に記載の計算式によって細胞増殖速度を算出した場合である。いずれの場合も、細胞増殖速度は1時間あたりの細胞数の増殖倍率として図中に表示した。その結果、いずれの計算方法を用いた場合も、細胞増殖速度の変動パターンを概日リズムとして測定することができた。したがって、本装置を用いて２つの計算方法のいずれを用いても、細胞増殖速度をリアルタイム測定できることが実証された。
【００９１】
実施例６
次に、種々の生物の発光レポータ株における生物発光リズムのリアルタイム測定を行った。
【００９２】
(a) 常温性藍色細菌Synechococcus sp. strain PCC 7942のPkaiBC::luxAB発光レポーター株の生物発光リズム(図９(a))
【００９３】
バクテリアルシフェラーゼ遺伝子luxABを発光レポーターに持つSynechococcusを1LのBG-11液体培地に植え付け、本装置を用いて30℃、白色光照射下（20μmol/m2/sec）で5% CO2ガスを通気して培養を行った。培養液の細胞濃度がOD730=0.3になるまで細胞を増殖させ、細胞濃度をこの値に保つように連続培養を行った。連続培養中に12時間の暗期を培養液に与えて細胞内の生物時計をリセットした後、連続白色光照射下（20μmol/m2/sec）へ移してこの時刻を０時間目とした。そして、連続明開始からの生物発光を本装置でリアルタイム測定した。その結果、PkaiBC::luxAB発光レポーター遺伝子の発現を明瞭な生物発光リズムとしてリアルタイム測定することができた。
【００９４】
(b) 好熱性藍色細菌Thermosynechococcus elongatusのPkaiA::lucTe発光レポーター株の生物発光リズム(図９(b))
【００９５】
Thermosynechococcusのゲノムに最適化した耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子lucTeを発光レポーターに持つThermosynechococcusを1LのBG-11液体培地に植え付け、本装置を用いて50℃、白色光照射下（45μmol/m2/sec）で5% CO2ガスを通気して培養を行った。培養液の細胞濃度がOD730=2.0という高濃度になるまで細胞を増殖させ、細胞濃度をこの値に保つように連続培養を行った。連続培養中に12時間の暗期を培養液に与えて細胞内の生物時計をリセットした後、連続白色光照射下（45μmol/m2/sec）へ移してこの時刻を０時間目とした。そして、連続明開始からの生物発光を本装置でリアルタイム測定した。その結果、PkaiA::lucTe発光レポーター遺伝子の発現を明瞭な生物発光リズムとしてリアルタイム測定することができた。したがって、本装置は高濃度の培養液においても生物発光レポーター株の生物発光リアルタイム測定が可能であることが実証された。
【００９６】
(c) 単細胞性緑藻Chlamydomonas reinhardtiiのPpsbD::lucCP発光レポーター株の生物発光リズム（図９(ｃ)）
【００９７】
Chlamydomonasの葉緑体ゲノムに最適化したホタルルシフェラーゼ遺伝子lucCPを発光レポーターに持つChlamydomonasを1LのTAP液体培地に植え付け、本装置を用いて23℃、白色光照射下（45μmol/m2/sec）で通気培養を行った。培養液の細胞濃度がOD730=0.35になるまで細胞を増殖させ、細胞濃度をこの値に保つように連続培養を行った。連続培養中に12時間の暗期を培養液に与えて細胞内の生物時計をリセットした後、連続白色光照射下（45μmol/m2/sec）へ移してこの時刻を０時間目とした。そして、連続明開始からの生物発光を本装置でリアルタイム測定した。その結果、PpsbD::lucCP発光レポーター遺伝子の発現を明瞭な生物発光リズムとしてリアルタイム測定することができた。Chlamydomonasは真核生物なので、本装置は真核生物の生物発光レポーター株の生物発光リアルタイム測定が可能であることが実証された。
【００９８】
実施例７
次に、Chlamydomonas reinhardtiiのpsbD遺伝子のノーザン解析について調べた。
【００９９】
単細胞性緑藻Chlamydomonas reinhardtiiを1LのTAP液体培地に植え付け、本装置を用いて23℃、白色光照射下（45μmol/m2/sec）で通気培養を行った。細胞濃度がOD730=0.35になるまで細胞を増殖させ、細胞濃度をこの濃度に保つように連続培養を行った。連続培養中に12時間の暗期を培養液に与えて生物時計をリセットした後、連続白色光照射下（45μmol/m2/sec）へ移してこの時刻を０時間目とした。本装置の自動サンプリング機能を用いて、Chlamydomonasの細胞を4時間間隔で50mlずつサンプリングし、極低温に凍結保存した。極低温で凍結保存した細胞から全RNAを抽出し、Chlamydomonasの葉緑体遺伝子であるpsbDの発現をノーザン解析した（図10）。rRNAを染色して対照とした。その結果、psbD mRNAレベルの変動を概日リズムとして捉えることができた。したがって、本装置で培養、サンプリング、凍結保存した細胞から抽出したRNAは質的に十分良質であり、ノーザン解析などの実験に用いることが可能であることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
基礎研究、医療、醸造などの種々の分野における細胞の液体培養に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１（ａ）は，本発明の模式図の一例を示す。図１（ｂ）は、本発明の培養装置の一例における各部の写真と接続の様子を示す。
【図２】図２は、本発明の培養装置における発光測定部の一例を示す。図２（ａ）は、液体基質を使用する場合、図２（ｂ）は、揮発性基質を使用する場合の発光測定部の一例を示す。
【図３】図３は、本発明の装置及び制御プログラムを用いて測定した細胞増殖速度のリズムを示す。
【図４】図４は、本発明の装置とプログラムを用いて測定した生物発光リズムを示す。図４（ａ）は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を用いた生物発光レポーター株の生物発光を測定した例を示す。図４（ｂ）は、バクテリアルシフェラーゼ遺伝子を用いた生物発光レポーター株の生物発光を測定した例を示す。
【図５】図５は、本発明の装置とプログラムを用いて培養及びサンプリングを行ったクラミドモナスの細胞から抽出した全RNAとノーザンブロット解析の結果を示す。図５（a）は、装置を用いてサンプリングした試料から得られたトータルRNAの電気泳動図を示す。図５（ｂ）は、Cabll DNA断片をプローブに用いたノーザンブロット解析の結果を示す。
【図６】図６は、本発明の模式図の一例を示す。
【図７】図７は、本発明の培養装置における発光測定部の一例を示す。図７（ａ）は、液体基質を使用する場合、図７（ｂ）は、揮発性基質を使用する場合の発光測定部の一例を示す。いずれも、洗浄機構を用いた場合の例である。
【図８】図８は、単細胞性緑藻Chlamydomonas reinhardtiiの細胞増殖リズムのリアルタイムモニタリングの測定結果を示す。
【図９】図９は、種々の生物の発光レポータ株における生物発光リズムのリアルタイム測定の結果を示す。
【図１０】図１０は、Chlamydomonas reinhardtiiのpsbD遺伝子のノーザン解析の結果を示す。
【図１】
2008178420.tif 000004
【図２】
2008178420.tif 000005
【図３】
2008178420.tif 000006
【図４】
2008178420.tif 000007
【図５】
2008178420.tif 000008
【図６】
2008178420.tif 000009
【図７】
2008178420.tif 000010
【図８】
2008178420.tif 000011
【図９】
2008178420.tif 000012
【図１０】
2008178420.tif 000013