(57)【要約】【課題】優れたＦｃフラグメント結合活性を有するペプチド、及びそれを含有するＩｇＧ又はそのＦｃフラグメント結合剤を提供する。【解決手段】前記ペプチドは、配列：ＧＴＸＸＸ  ＸＸＸＸＸ  ＸＸ［３位のＸはＹ，Ｖ，Ｉ、４位のＸはＴ，Ｈ，Ｋ、５位のＸはＳ，Ｒ、６位のＸはＳ，Ｑ、７位のＸはＬ，Ｉ、８位のＸはＳ，Ｒ，Ｔ、９位のＸはＦ，Ｈ，Ｉ，Ｙ、１０位のＸはＨ，Ｅ，Ｎ，Ｍ、１１位のＸはＴ，Ｍ，Ｓ、１２位のＸはＡ，Ｐ，Ｌ，Ｄ］で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合活性を示すペプチドである。前記ＩｇＧ又はそのＦｃフラグメント結合剤は、有効成分として、前記ペプチド又はその誘導体を含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合活性を示すペプチド、あるいは、その誘導体を有効成分として含む、ＩｇＧ又はそのＦｃフラグメント結合剤。
【請求項２】
配列番号７で表されるアミノ酸配列が、配列番号１〜６のいずれか１つで表されるアミノ酸配列である、請求項１に記載の結合剤。
【請求項３】
ＩｇＧが哺乳動物由来のＩｇＧである、請求項１又は２に記載の結合剤。
【請求項４】
ＩｇＧがヒトＩｇＧである、請求項３に記載の結合剤。
【請求項５】
ＩｇＧがＩｇＧ１である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合剤。
【請求項６】
配列番号７で表されるアミノ酸配列、あるいは、そのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合活性を示すペプチド、又はその誘導体。
【請求項７】
請求項６に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＧ又はそのＦｃフラグメント結合剤、及び、その有効成分として用いることのできる新規ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫反応の中心的な役割を担うタンパク質である抗体は、従来から医療や臨床診断をはじめとする幅広い分野で利用されており、近年では、抗体を利用した医薬品（抗体医薬品）の開発も盛んに行なわれている。また、抗体は、微量物質を特異的に検出・測定する手段としても利用されており、酵素免疫測定法や蛍光免疫測定法等に用いられている。これらの測定方法は、検査薬に応用されているほか、医学・薬学・生化学分野等の研究に欠くことのできないものとなっている。
【０００３】
一般的な抗体の作製方法としては、マウス、ウサギ、ヒツジ等の動物に抗原を接種して免疫することによって抗血清を調製し、その抗血清からポリクローナル抗体を精製する方法、ハイブリドーマをマウス等の腹腔にて増殖させ、モノクローナル抗体を含む腹水を調製し、その腹水から抗体を精製する方法、ハイブリドーマを血清培地や無血清培地中で培養してモノクローナル抗体を含む培養液を調製し、その培養液から抗体を精製する方法等がある。
【０００４】
そして、上記のようにして得られた抗血清や腹水、培養液から抗体を精製する方法としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の精製方法が知られている。例えば、アフィニティクロマトグラフィーには、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対して結合性を有するプロテインＡやプロテインＧをリガンドとして固定化したゲルが広く用いられている。
【０００５】
これらのプロテインＡやプロテインＧと同じように、各種動物由来のＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有する多数のペプチドが、特許文献１に開示されている。特許文献１の実施例には、各種動物由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを固定化したＥＬＩＳＡ用プレートを用いたスクリーニングにより、ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を示すペプチド（特許文献１の配列表における配列番号１６５〜２０７）、ウマＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を示すペプチド（同配列番号２０８〜２１２）、ヒツジＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を示すペプチド（同配列番号２１３〜２１６）、ウサギＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を示すペプチド（同配列番号２１７〜２２０）、モルモットＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を示すペプチド（同配列番号２２１〜２２７）、ヤギＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を示すペプチド（同配列番号２２８〜２３２）、ネコＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を示すペプチド（同配列番号２３３〜２４８）、イヌＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を示すペプチド（同配列番号２４９〜２６１）、ウシＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を示すペプチド（同配列番号２６２〜２６７）、ブタＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を示すペプチド（同配列番号２６８〜２７７）、マウスＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を示すペプチド（同配列番号２７８〜２８０）を取得することができたこと、そして、その内の２種類のペプチド（同配列番号１６６及び１７３）について、それぞれ、ペプチド固定化カラムを作成し、ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントを精製できたことが開示されている。
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１８９６５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１で実際に作成したペプチド固定化カラムでは、１００μｇ／ｍＬのＦｃフラグメント溶液１００μＬをカラム（固定化ペプチド量＝１．５ｍｇ）に通したところ、約６０〜９５％のＦｃフラグメントが吸着されずに素通りしてしまい、結合活性の点で更なる改良が必要であった。
【０００８】
従って、本発明の課題は、従来公知の前記欠点を解消し、更に優れたＦｃフラグメント結合活性を有するペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題は、本発明による、配列番号７で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合活性を示すペプチド、あるいは、その誘導体を有効成分として含む、ＩｇＧ又はそのＦｃフラグメント結合剤により解決することができる。
本発明の結合剤の好ましい態様によれば、配列番号７で表されるアミノ酸配列が、配列番号１〜６のいずれか１つで表されるアミノ酸配列である。
また、本発明の結合剤の別の好ましい態様によれば、ＩｇＧが哺乳動物由来のＩｇＧであり、更に好ましくはヒトＩｇＧである。
本発明の結合剤の更に別の好ましい態様によれば、ＩｇＧがＩｇＧ１である。
【００１０】
また、本発明は、
配列番号７で表されるアミノ酸配列、あるいは、そのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合活性を示すペプチド、又はその誘導体；
前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド；
前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、新規のＩｇＧ又はそのＦｃフラグメント結合剤を提供することができる。本発明の結合剤において有効成分として用いることのできるペプチド又はその誘導体それ自体も新規化合物であり、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合活性を有する。本発明の結合剤は、例えば、抗体（例えば、抗体医薬）の精製、微量物質の分析（検出、測定）等に用いることができるだけでなく、更には、結合剤自体を医薬用途［例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の増強］に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の結合剤は、有効成分として、配列番号７で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合活性（Ｆｃフラグメント結合活性）を示すペプチド、あるいはその誘導体を含む。
【００１３】
以下、本発明において有効成分として用いることのできる前記ペプチド及びそれらの誘導体を総称して「Ｆｃフラグメント結合ペプチド」と称する。なお、本明細書における用語「ペプチド」には、オリゴペプチド及びポリペプチドの両方が含まれる。
【００１４】
本明細書において「Ｆｃフラグメント結合活性」とは、ＩｇＧのＦｃフラグメントに特異的に結合することのできる活性を意味する。前記ＩｇＧには、各種哺乳動物、例えば、ヒト、ウマ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、マウス等由来のＩｇＧが含まれ、特に好ましくはヒトＩｇＧである。また、前記ＩｇＧには、ＩｇＧの各種サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１〜ＩｇＧ４が含まれ、特に好ましくはＩｇＧ１である。
【００１５】
或るペプチドがＦｃフラグメント結合活性を有するか否かは、公知方法により容易に判定することができる。例えば、Ｆｃフラグメント（又はＩｇＧ）を適当な担体（例えば、ＥＬＩＳＡプレート又はビーズ担体）に固定化し、前記Ｆｃフラグメントへの結合の有無を分析する方法（例えば、後述の実施例１又は実施例３参照）、あるいは、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance；ＳＰＲ）に基づく方法［例えば、ビアコア（BIACORE）システム（例えば、BIACORE 2000; BIACORE社）を用いる方法；後述の実施例２参照］により、或るペプチドがＦｃフラグメント結合活性を有するか否かを容易に判定することができる。
【００１６】
本発明において、Ｆｃフラグメント結合ペプチドを構成するアミノ酸残基数は、Ｆｃフラグメント結合活性を示す限り、特に限定されるものではないが、例えば、５〜１００個、好ましくは５〜６１個、より好ましくは５〜３７個、より好ましくは５〜２５個、特に好ましくは５〜１３個である。前記アミノ酸配列は、それ単独でＦｃフラグメント結合活性を示すアミノ酸配列（基本配列）のみからなることもできるし、その繰り返し配列からなることもできる。繰り返し配列からなる場合には、１種類の基本配列のみの繰り返し配列であることもできるし、２種類以上の基本配列の組合せであることもできる。基本配列を繰り返すことにより、結合力を増大させることができる。また、結合力が弱い場合でも、ポリリジンのような反応性の高い側鎖を高密度且つ近接して持つ支持体を用いて本ペプチドを固定化し、マルチ化することで結合力を高める事ができると考えられる。このマルチ化についてはFassina, GらのＩｇＧ精製カラムを作成した方法［Fassina G et al, Protein A mimetic peptide ligand for affinity purification of antibodies. J. Mol. Recognit 1996, 9(5-6), 564-569］などを参考として挙げることができる。
【００１７】
「配列番号７で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、Ｆｃフラグメント結合活性を示すペプチド」には、例えば、
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号７で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つＦｃフラグメント結合活性を示すペプチド；又は
配列番号７で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、Ｆｃフラグメント結合活性を示すペプチド
が含まれる。
【００１８】
配列番号７で表されるアミノ酸配列は、
ＧＴＸＸＸ  ＸＸＸＸＸ  ＸＸ（配列番号７）
［配列中、３番目のアミノ酸ＸはＹ，Ｖ，Ｉであり、４番目のアミノ酸ＸはＴ，Ｈ，Ｋであり、５番目のアミノ酸ＸはＳ，Ｒであり、６番目のアミノ酸ＸはＳ，Ｑであり、７番目のアミノ酸ＸはＬ，Ｉであり、８番目のアミノ酸ＸはＳ，Ｒ，Ｔであり、９番目のアミノ酸ＸはＦ，Ｈ，Ｉ，Ｙであり、１０番目のアミノ酸ＸはＨ，Ｅ，Ｎ，Ｍであり、１１番目のアミノ酸ＸはＴ，Ｍ，Ｓであり、１２番目のアミノ酸ＸはＡ，Ｐ，Ｌ，Ｄである］
である。
【００１９】
配列番号７で表されるアミノ酸配列としては、例えば、
ＧＴＹＴＳ  ＳＬＳＦＨ  ＴＡ（配列番号１）
ＧＴＹＴＲ  ＳＬＳＨＨ  ＴＡ（配列番号２）
ＧＴＹＨＳ  ＳＩＲＩＥ  ＭＰ（配列番号３）
ＧＴＶＴＳ  ＳＩＴＹＮ  ＳＬ（配列番号４）
ＧＴＩＫＳ  ＳＬＳＦＨ  ＴＤ（配列番号５）
ＧＴＹＴＳ  ＱＩＳＦＭ  ＴＡ（配列番号６）
を挙げることができる。
【００２０】
「配列番号７で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端（好ましくはＣ末端）に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つＦｃフラグメント結合活性を示すペプチド」において、Ｎ末端及び／又はＣ末端に付加することができる前記アミノ酸配列としては、例えば、リンカー配列、マーカー配列、ポリペプチド配列、又は別のＦｃフラグメント結合ペプチド配列を挙げることができる。
【００２１】
前記リンカー配列としては、例えば、ペプチドを担体に担持させるための配列、例えば、チオール基を有するアミノ酸［例えば、システイン（Ｌ体システイン又はＤ体システイン）又はホモシステイン）又はアミノ基と反応しない官能基（例えば、マレイミド基）を側鎖に有するアミノ酸１個からなるリンカー配列、あるいは、少なくとも一方の末端が、チオール基を有するアミノ酸又はアミノ基と反応しない官能基を有するアミノ酸であるリンカー配列を挙げることができる。
【００２２】
前記マーカー配列としては、例えば、ペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
【００２３】
前記ポリペプチド配列としては、例えば、精製用ポリペプチド［例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の全部又は一部］、検出用ポリペプチド［例えば、ヘムアグルチニン又はβ−ガラクトシダーゼαペプチド（ＬａｃＺ  α）の全部又は一部］、又は発現用ポリペプチド（例えば、シグナル配列）などを挙げることができる。
【００２４】
「配列番号７で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、Ｆｃフラグメント結合活性を示すペプチド」において、欠失、置換、及び／又は付加することのできるアミノ酸の個数は、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜８個、更に好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜４個、更に好ましくは１〜３個、更に好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個である。
【００２５】
本明細書において、ペプチドの機能を維持するために置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、以下に示すような各グループに属するアミノ酸は、そのグループ内で互いに似た性質を有するアミノ酸である。これらのアミノ酸をグループ内の他のアミノ酸に置換しても、タンパク質の本質的な機能は損なわれないことが多い。このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれ、ポリペプチドの機能を保持しつつアミノ酸配列を変換するための手法として公知である。
非極性アミノ酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、及びTrp
中性アミノ酸：Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、及びGln
酸性アミノ酸：Asp及びGlu
塩基性アミノ酸：Lys、Arg、及びHis
【００２６】
本発明において有効成分として用いることのできる「配列番号７（好ましくは、配列番号１〜６）で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、Ｆｃフラグメント結合活性を示すペプチドの誘導体」は、前記ペプチドの誘導体であって、且つ、Ｆｃフラグメント結合活性を示す限り、特に限定されるものではない。このような誘導体としては、例えば、ペプチドの安定性を向上させる各種修飾を施したペプチド誘導体を挙げることができる。前記修飾としては、例えば、Ｌ体アミノ酸のＤ体化（例えば、Ｎ末端アミノ酸のＤ体化、Ｃ末端アミノ酸のＤ体化、Ｎ末端及びＣ末端以外のアミノ酸のＤ体化）、Ｎ末アミノ基のアセチル化、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化、天然型アミノ酸の（性質の類似した）非天然型アミノ酸への置換、又はこれらの組合せを挙げることができる。
【００２７】
本発明による結合剤の有効成分であるＦｃフラグメント結合ペプチドは、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合活性を有するため、本発明の結合剤は、例えば、ＩｇＧ（例えば、抗体医薬）の精製、分析対象物質に対するＩｇＧとの併用による微量物質の分析、医薬［例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の活性増強剤］の用途に使用することができる。
【００２８】
本発明の結合剤を用いてＩｇＧの精製を行う場合には、Ｆｃフラグメント結合ペプチドそれ自体を単独で、好ましくは、適当な担体に結合した状態で使用することができる。前記担体としては、例えば、シリカビーズ、アガロースビーズ、セルロースビーズ、磁気ビーズ、又はガラスファイバー等を用いることができる。Ｆｃフラグメント結合ペプチドと担体との結合は、例えば、ジスルフィド結合による結合、あるいは、担体のマレイミド基を利用したマレイミド法などにより実施することができる。
【００２９】
本発明の結合剤を用いて微量物質の分析を行う場合には、例えば、Ｆｃフラグメント結合ペプチドに適当な標識物質（例えば、色素、蛍光化合物、発光化合物、酵素）を付加しておき、分析対象物質を含む可能性のある被検試料と、前記分析対象物質に対する抗体と、標識化Ｆｃフラグメント結合ペプチドとを接触させ、分析対象物質／抗体／標識化Ｆｃフラグメント結合ペプチドの複合体を分析することにより、被検試料中の微量物質の分析を行うことができる。
【００３０】
本発明の結合剤を医薬として使用する場合には、例えば、ペプチドそれ自体を単独で、あるいは、所望により薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。また、この場合、ペプチドに代えて、ペプチドをコードするポリヌクレオチド（好ましくは、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター）を用いることもできる［例えば、Gene Ther., Development of safe and efficient novel nonviral gene transfer using ultrasound: enhancement of transfection efficiency of naked plasmid DNA in skeletal muscle., 2002 Mar;9(6):372-80］。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３２】
《実施例１：ファージディスプレイ法によるＩｇＧ及びＦｃフラグメント結合ペプチドのスクリーニング》
本実施例では、ファージディスプレイ法により、ヒトＩｇＧ及びヒトＦｃフラグメントの両方に結合性を有するペプチドのスクリーニングを行った。
ファージディスプレイ法で用いるライブラリーとして、Ｍ１３ファージの表面のマイナータンパク質ｐIIIのＮ末端にペプチドがランダムに呈示されるライブラリー（呈示されるランダムアミノ酸数が１２個のペプチドライブラリー）を、Smith, G. P., Science, 288, 1315-1317（1985）、J. K. Scott and G. P. Smith, Science, 249, 386-390(1990)、及び米国特許第5,223,409号明細書（Ladnerら）の記載に基づいて作製した。また、ファージライブラリーのターゲット（ＩｇＧ、ＩｇＧ１、Ｆｃフラグメント）に対する結合性は、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）により判定した。具体的な操作は、特開２００４−１８９６５７号公報の記載に準じて実施した。
【００３３】
各種スクリーニングの結果を表１〜表４に示す。表１〜表４に示す数値は、吸光度比（サンプル吸光度／ブランク吸光度）である。
表１は、ＩｇＧを含まないウシ血清アルブミン（IgG-free BSA）でブロッキングを行ったこと以外は、特開２００４−１８９６５７号公報に準じて実施したスクリーニングにおける結果である。
表２は、ＣＨＯ（Chinese hamster ovary）細胞用培地中で行ったこと以外は、特開２００４−１８９６５７号公報に準じて実施したスクリーニングにおける結果である。
表３は、特開２００４−１８９６５７号公報に準じたスクリーニングにおける結果である。
表４は、ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントとして、製造方法の異なる各社のＦｃフラグメント［ATHENS RESERCH & TECHNOLOGY (ART) 社製、CHEMICON International (CMN) 社製、PROTOS IMMUNORESERCH (PIR) 社製］を使用したこと以外は、特開２００４−１８９６５７号公報に準じて実施したスクリーニングにおける結果である。
これらのスクリーニングの結果、ヒトＩｇＧ及びヒトＦｃフラグメントの両方に結合性を有するペプチドとして、配列番号３〜６の４種類のアミノ酸配列が得られた。
【００３４】
《表１》
配列番号       ３          ４          ５    
ＩｇＧ      ３．６７    １．６６    ２．６３
ＩｇＧ１    ３．３３    １．３３    １．７２
Ｆｃ        ５．１４    ６．０２    ９．６８ 
【００３５】
《表２》
配列番号                     ５                          ６         
ロットNo.    １      ２      ３      ４      ５        １      ２      ３   
ＩｇＧ      1.29    1.12    1.26    1.30    1.33      1.45    1.36    1.71
Ｆｃ        9.78    8.84   12.23    5.46    9.67      5.53    6.03    4.81  
【００３６】
《表３》
配列番号             ４                  ５         
ロットNo.    １      ２      ３        １      ２      ３   
ＩｇＧ      1.49    7.62    7.32      9.70    7.04    1.57
Ｆｃ        5.02   11.04    7.91     49.00   46.27   17.41  
【００３７】
《表４》
配列番号                       ５          
ロットNo.               １            ２      
Ｆｃ（ＡＲＴ製）    １９．２２    １５．８４
Ｆｃ（ＣＭＮ製）    ３４．００    ２４．０５
Ｆｃ（ＰＩＲ製）    ２８．９４    ３０．６１  
【００３８】
《実施例２：ＩｇＧ及びＩｇＧ１に対する結合能の確認》
実施例１で得られた配列番号３〜６のアミノ酸配列に基づいて、配列番号１及び２の２種類のアミノ酸配列を設計した。
本実施例では、配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含むペプチドのヒトＩｇＧ又はヒトＩｇＧ１に対する結合能を、ビアコア（BIACORE）システム（BIACORE 2000; BIACORE社）を用いて確認した。なお、センサーチップへのペプチドの固定には、配列番号１〜３のアミノ酸配列のＣ末端にシステインを付加したペプチドを合成し、そのシステインのチオール基を介して固定した。
【００３９】
ヒトＩｇＧに対しては、配列番号１で表されるアミノ酸配列の解離定数（ＫＤ）値は１０−９であり、配列番号２又は３で表されるアミノ酸配列のＫＤ値は１０−８であった。ヒトＩｇＧ１に対しては、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のＫＤ値は１０−８であり、配列番号３で表されるアミノ酸配列のＫＤ値は１０−１０であった。いずれのペプチドも高いＫＤ値を示し、ヒトＩｇＧ及びヒトＩｇＧ１に強く結合することが確認された。
【００４０】
《実施例３：ペプチド固定化カラムによるＩｇＧ１の回収》
抗体医薬として使用されるＩｇＧサブタイプは、主にＩｇＧ１である。実施例２においてヒトＩｇＧ１に対して最も優れた結合活性を示した配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに関して、ペプチド固定化カラムを調製し、ＩｇＧ１の回収能を評価した。
【００４１】
（１）ペプチド固定化カラムの調製
セルロースビーズ（セルファイン；チッソ）１００μＬをカラムに量りとり、カップリングバッファー（50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA・2Na, pH 8.5）で平衡化した。配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端にシステインを付加したペプチド３．１ｍｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１００μＬに溶解し、カップリングバッファーで６ｍＬに調整した後、カラムに全量を移した。密閉した後、撹拌しながら室温で一晩反応させた。カップリングバッファー５ｍＬを通流した後、システイン３ｍｇをカップリングバッファー３ｍＬに溶解して、カラムに移した。密閉した後、撹拌しながら室温で３時間反応させた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍＬを通流した後、パスツールカラムに全量を移した。ベット高は１００ｍｍであった。
【００４２】
（２）ＩｇＧ１溶液の回収
得られたカラムをＰＢＳ２ｍＬで平衡化した後、ＰＢＳをビーズ上面まで排出し、ＩｇＧ１溶液１００μＬをビーズ上面に流し込んだ。前記ＩｇＧ１溶液としては、５００μｇ／ｍＬ濃度になるように、ＩｇＧ１（CALBIOCHEM社; 400120）をＰＢＳに溶解したものを使用した。自然流下（１ドロップ＝２０μＬ／９０秒＝１３ｍｍ／分）にて通流後の溶液を９６ウェルプレートに回収（１ドロップ／ウェル）した。ＩｇＧ１溶液がビーズ上面まで流れたら、ＰＢＳ５００μＬをビーズ上面に流し込み、同じく自然流下にて通流した溶液を回収した。ＰＢＳがビーズ上面まで流れたら、溶出液（0.2mol/L グリシン-HCl, pH 2.2）５００μＬをビーズ上面に流し込み、同じく自然流下にて通流した溶液を回収した。中性になるまでＰＢＳを通流させ、通流液を回収した９６ウェルプレートにブラッドフォード（Bradford）溶液１００μＬ／ウェルを添加し、吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。なお、ブラッドフォード溶液は、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）５ｍｇをエタノール２．５ｍＬに溶解させ、リン酸５ｍＬを加えて、ＣＢＢが完全に溶解したことを確認後、脱イオン水（Milli-Q）で５０ｍＬに調整することにより調製した。
【００４３】
結果を図１に示す。図１において、矢印Ａは、ＩｇＧ１溶液の添加を示し、矢印Ｂは、ＰＢＳの添加（洗浄）を示し、矢印Ｃは、溶出液の添加を示す。
図１に示すように、ペプチド３．１ｍｇを固定化したカラムにおいて、添加したＩｇＧ１  ５０μｇの全てがカラムに吸着された。特開２００４−１８９６５７号公報（特許文献１）に記載の実施例では、ペプチド１ｍｇを固定化したカラムにおいて、Ｆｃフラグメント１０μｇを添加したところ、約６０〜９５％のＦｃフラグメントが吸着されずに素通りしており、本発明のペプチドの結合活性が極めて優れていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の結合剤は、例えば、抗体（例えば、抗体医薬）の精製、微量物質の分析（検出、測定）、医薬用途（例えば、ＡＤＣＣ活性の増強）等の用途に適用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００４５】
配列表の配列番号１〜７の配列で表される各アミノ酸配列は、Ｆｃフラグメント結合ペプチドである。
配列表の配列番号７の配列で表されるアミノ酸配列において、３番目のアミノ酸「Xaa」はＹ，Ｖ，Ｉであり、４番目のアミノ酸「Xaa」はＴ，Ｈ，Ｋであり、５番目のアミノ酸「Xaa」はＳ，Ｒであり、６番目のアミノ酸「Xaa」はＳ，Ｑであり、７番目のアミノ酸「Xaa」はＬ，Ｉであり、８番目のアミノ酸「Xaa」はＳ，Ｒ，Ｔであり、９番目のアミノ酸「Xaa」はＦ，Ｈ，Ｉ，Ｙであり、１０番目のアミノ酸「Xaa」はＨ，Ｅ，Ｎ，Ｍであり、１１番目のアミノ酸「Xaa」はＴ，Ｍ，Ｓであり、１２番目のアミノ酸「Xaa」はＡ，Ｐ，Ｌ，Ｄである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ペプチド固定化カラムによるＩｇＧ１の吸着及び溶出パターンを示すクロマトグラムである。
【図１】
2008295425.tif 000002
【配列表】
2008295425000001.app