(57)【要約】【課題】本発明は、造血幹細胞、ＣＦＵ−ＳまたはＣＦＵ−Ｃを増殖、分化および／または循環系内に動員させる医薬組成物を提供する。また、本発明は、インビトロで造血幹細胞を増殖、および／または分化させる方法を提供するさらに、本発明は、血球減少状態を治療および／または予防するための医薬組成物を提供する。【解決手段】本発明の医薬組成物は、プラスミノーゲン活性化因子および／またはそれをコードする核酸を含んでなる。また、本発明は、プラスミノーゲン活性化因子を含む培養培地中で培養する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞、ＣＦＵ−ＳまたはＣＦＵ−Ｃを増殖、分化および／または循環系内へ動員させるための医薬組成物であって、プラスミノーゲン活性化因子および／またはそれをコードする核酸を含んでなる医薬組成物。
【請求項２】
プラスミノーゲン活性化因子が、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）である、請求項１の医薬組成物。
【請求項３】
プラスミノーゲン活性化因子が以下のグループより選択される、請求項１の医薬組成物：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質；および、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に１つまたは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質。
【請求項４】
プラスミノーゲン活性化因子をコードする核酸が以下のグループより選択される、請求項１の医薬組成物：
（ａ）配列番号２の塩基配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号２の塩基配列と少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質をコードする核酸；
（ｃ）配列番号２の塩基配列から１つまたは数個の核酸の欠失、置換、および／または付加を有する塩基配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質をコードする核酸；および、
（ｄ）配列番号２の塩基配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質をコードする核酸。
【請求項５】
インビトロで造血幹細胞、ＣＦＵ−ＳまたはＣＦＵ−Ｃを増殖、および／または分化させる方法であって、上記細胞をプラスミノーゲン活性化因子を含む培養培地中で培養することを含む、前記方法。
【請求項６】
プラスミノーゲン活性化因子が、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）である、請求項５の方法。
【請求項７】
プラスミノーゲン活性化因子が、以下の配列からなるタンパク質より選択される、請求項５の方法：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質；および、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に１つまたは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質。
【請求項８】
血球減少状態を治療および／または予防するための医薬組成物であって、プラスミノーゲン活性化因子および／またはそれをコードする核酸を含んでなる、前記医薬組成物。
【請求項９】
プラスミノーゲン活性化因子が、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）である、請求項８の医薬組成物。
【請求項１０】
プラスミノーゲン活性化因子が、以下の配列からなるタンパク質より選択される、請求項８の医薬組成物：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質；および、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に１つまたは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質。
【請求項１１】
プラスミノーゲン活性化因子をコードする核酸が、以下の配列からなる核酸より選択される、請求項８の医薬組成物：
（ａ）配列番号２の塩基配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号２の塩基配列と少なくとも９５％の同一性有する塩基配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質をコードする核酸；
（ｃ）配列番号２の塩基配列から１つまたは数個の核酸の欠失、置換、および／または付加を有する塩基配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質をコードする核酸；および、
（ｄ）配列番号２の塩基配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質をコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞、ＣＦＵ−ＳまたはＣＦＵ−Ｃを増殖、分化および／または循環系内に動員させる医薬組成物に関する。また、本発明は、インビトロで造血幹細胞、ＣＦＵ−ＳまたはＣＦＵ−Ｃを増殖、および／または分化させる方法に関する。さらに、本発明は、血球減少状態を治療および／または予防するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、特殊化されたニッチ中に常在し、ここで自己再生を通じて維持され、そして循環内に動員され、そして子孫を産生することも可能であり、この子孫が最終分化を経る（非特許文献１−３）。したがって、造血幹細胞は、赤血球、白血球、および巨核球（血小板）等、全ての血液細胞に分化する能力を持った細胞である。血球系の細胞にはそれぞれ固有の寿命があるため、造血幹細胞はこれらの血球を供給し続けるために絶えず分裂・増殖を繰り返している。このように、造血幹細胞は、すべての血球系列の細胞に分化することが可能であるため、血球減少に対する予防および治療、あるいは再生医療に利用することが期待されている。
【０００３】
本発明者らは、以前、マトリックス・メタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）に仲介されるＫｉｔＬの放出が、骨髄（ＢＭ）ニッチからの幹細胞リクルート（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）を調節することを立証した（非特許文献１）。したがって、これまでにＭＭＰ−９からＫｉｔＬを通じて、造血幹細胞リクルートを起こすということが知られている。ここで、リクルートとは、造血幹細胞の再生増殖に関する意味で使用され、循環系内への動員とは異なる概念である。
【０００４】
これまでに幹細胞の動員等の幹細胞への有利な効果を示す物質としてはＧ−ＣＳＦ等が知られている。しかしながら、これらの長期的な安全性は不明である。したがって、他に安全性が高く、幹細胞動員を引き起こす因子が探し求められていた。
【０００５】
プラスミンは、エンドプロテアーゼの１つであり、生理的には血管内に形成されたフィブリン等に働いてこれを分解することが知られている。また、プラスミンは、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）および他のセリンプロテアーゼによって、不活性プロ酵素であるプラスミノーゲン（Ｐｌｇ）から生成される（非特許文献４）。
【０００６】
ｔＰＡは内皮細胞（非特許文献５）、単球（非特許文献６）、巨核球（非特許文献７）およびマスト細胞（非特許文献８）によって合成される。ｔＰＡは、Ｐｌｇを活性タンパク質分解型のプラスミンに変換する、古典的な線維素溶解因子であり、大きな副作用を示すことなく、心筋梗塞の治療に臨床的に使用されている（非特許文献９−１０）。
【非特許文献１】Ｂ．  Ｈｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １０９，  ６２５  （Ｍａｙ  ３１，  ２００２）
【非特許文献２】Ｆ．  Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １１８，  １４９  （Ｊｕｌ  ２３，  ２００４）
【非特許文献３】Ｌ．  Ｍ．  Ｃａｌｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２５，  ８４１  （Ｏｃｔ  ２３，  ２００３）
【非特許文献４】Ｋ．  Ｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４４，  １３９  （１９８５）
【非特許文献５】Ｅ．  Ｇ．  Ｌｅｖｉｎ，  Ｄ．  Ｊ．  Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９４，  ６３１  （Ｓｅｐ，  １９８２）
【非特許文献６】Ｐ．  Ｈ．  Ｈａｒｔ，  Ｇ．  Ｆ．  Ｖｉｔｔｉ，  Ｄ．  Ｒ．  Ｂｕｒｇｅｓｓ，  Ｄ．  Ｋ．  Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，  Ｊ．  Ａ．  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６９，  １５０９  （Ａｐｒ  １，  １９８９）
【非特許文献７】Ｃ．  Ｂｒｉｓｓｏｎ−Ｊｅａｎｎｅａｕ，  Ｌ．  Ｎｅｌｌｅｓ，  Ｅ．  Ｒｏｕｅｒ，  Ｙ．  Ｓｕｌｔａｎ，  Ｒ．  Ｂｅｎａｒｏｕｓ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９５，  ２３  （１９９０）
【非特許文献８】Ｃ．  Ｓｉｌｌａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２，  １０３２  （Ｊａｎ  １５，  １９９９）
【非特許文献９】Ｒ．  Ｇ．  Ｗｉｌｃｏｘ，  Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ７８，  ２０  （Ｄｅｃ  １９，  １９９６）
【非特許文献１０】Ｈ．  Ｒ．  Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４９，  ７３  ３  （Ａｕｇ  ２１，  ２００３）
【非特許文献１１】Ｔ．  Ｈ．  Ｂｕｇｇｅ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｆｌｉｃｋ，  Ｃ．  Ｃ．  Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，  Ｊ．  Ｌ．  Ｄｅｇｅｎ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ９，  ７９４  （Ａｐｒ  １，  １９９５）
【非特許文献１２】Ｋ．  Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９３，  １００５  （Ｍａｙ  ７，  ２００１）
【非特許文献１３】Ｋ．  Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８，  ８４１  （Ａｕｇ，  ２００２）
【非特許文献１４】Ｋ．  Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ９７，  ３３５４  （Ｊｕｎ  １，  ２００１）
【非特許文献１５】Ｔ．  Ｍ．  Ｄｅｘｔｅｒ，  Ｔ．  Ｄ．  Ａｌｌｅｎ，  Ｌ．  Ｇ．  Ｌａｊｔｈａ，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ９１，  ３３５  （Ｊｕｎ，  １９７７）
【非特許文献１６】Ｙｅｐｅｓ，  ｅｔ  ａｌ  （２００２）．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０９，  １５７１−１５７８
【非特許文献１７】Ｈｕ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ  （２００６）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１，  ２１２０−２１２７
【非特許文献１８】Ｓ．  Ｍ．  Ｃａｍｉｏｌｏ，  Ｓ．  Ｔｈｏｒｓｅｎ，  Ｔ．  Ａｓｔｒｕｐ，  Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．  １３８，  ２７７  （Ｏｃｔ，１９７１）
【非特許文献１９】Ｍ．  Ｈｏｙｌａｅｒｔｓ，  Ｄ．  Ｃ．  Ｒｉｊｋｅｎ，  Ｈ．  Ｒ．  Ｌｉｊｎｅｎ，  Ｄ．  Ｃｏｌｌｅｎ，  ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５７，２９１２（Ｍａｒ  ２５，  １９８２）
【非特許文献２０】Ｂ．  Ｈｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １０，  ２４７  （Ｊｕｎ，  ２００５）
【非特許文献２１】Ｊ．  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｔ  （２００３）．  Ｎａｔｕｒｅ  ４２５，  ８３６−８４１．
【非特許文献２２】Ｓ．  Ｔｈｏｒｓｅｎ，  Ｐ．  Ｇｌａｓ−Ｇｒｅｅｎｗａｌｔ，  Ｔ．  Ａｓｔｒｕｐ，  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｄｉａｔｈ  Ｈａｅｍｏｒｒｈ  ２８，  ６５（Ａｕｇ  ３１，  １９７２）
【非特許文献２３】Ａ．Ｌ．Ｃｏｐｌｅｙ，Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ  ２１，１３５（１９８４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、造血幹細胞、ＣＦＵ−ＳまたはＣＦＵ−Ｃを増殖、分化および／または循環系内に動員させる医薬組成物並びに方法を提供する。具体的には、該医薬組成物は、プラスミノーゲン活性化因子および／またはこれをコードする核酸を含んでなる。さらに、本発明は、プラスミノーゲン活性化因子および／またはこれをコードする核酸を含む、血球減少状態を治療および／または予防するための医薬組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意研究に努めた結果、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）が、造血幹細胞を増殖、分化および／または循環内に動員させることを発見し、本発明を想到した。
【０００９】
具体的には、本発明は、マウスにｔＰＡを投与することにより、プラスミン、ＭＭＰ−９、ＫｉｔＬを介して、造血幹細胞等が増殖、分化および循環系内へ動員されたという知見に基づく。
【００１０】
阻害要因が多い生体内で上記の発明に想到したことは、当業者をして予想外であった。
（１）造血幹細胞を増殖、分化および／または循環内に動員させるための医薬組成物
（ｉ）プラスミノーゲン活性化因子を用いる医薬組成物
本発明は、造血幹細胞を増殖、および／または分化および／または循環系内に動員させるためのプラスミノーゲン活性化因子を提供する。
【００１１】
本発明はまた、造血幹細胞を増殖、および／または分化および／または循環系内に動員させるためのプラスミノーゲン活性化因子の投与方法を提供する。
本発明は、造血幹細胞を増殖、および／または分化および／または循環系内に動員させるための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、プラスミノーゲン活性化因子を含んでなる。
【００１２】
本発明はまた、造血幹細胞を増殖、および／または分化および／または循環系内に動員させるための医薬組成物の投与方法を提供する。本発明の当該投与方法に用いる医薬組成物は、プラスミノーゲン活性化因子を含んでなる。
【００１３】
本発明はまた、プラスミノーゲン活性化因子の、血球の減少状態を治療および／または予防するための、あるいは造血幹細胞または造血前駆体を循環系内に動員させるための医薬組成物の製造のための使用を提供する。
【００１４】
本発明は、例えば後述する実施例５、１２および１５等によって裏付けられる。
「造血幹細胞」とは、自己複製能および全ての血液細胞に分化する多分化能を持ち、数ヶ月以上の長期間にわたり造血を再構築する能力をもった細胞をいう。これまでの研究により、造血幹細胞は、骨髄、末梢血、および臍帯血にごく微量含まれていることが明らかとなっており、これらから採取することが可能である。現在までに、造血幹細胞をソーティングする方法は公知である。例えば、造血幹細胞が発現する細胞表面の抗原に基づいて、Ｌｉｎ−、ｃ−ｋｉｔ＋、ｓｃａ−１＋の細胞を骨髄、末梢血、および臍帯血からソーティングすることができる。上記Ｌｉｎ−、ｃ−ｋｉｔ＋、ｓｃａ−１＋の分画に造血幹細胞が存在することは確実視されている。また、「造血前駆体」とは、造血幹細胞から分化した細胞であって、赤血球および白血球などに未だ最終分化していない細胞をいう。これには、ＣＦＵ−ＳおよびＣＦＵ−Ｃが含まれる。
【００１５】
「増殖する」とは、細胞が元の性質を失わずに細胞分裂により、細胞数を増加することをいう。細胞数の計数は、例えば細胞懸濁液に血球計数盤を用いることによって目視により計数することができる。また、種々の細胞計数装置および血球計算機が市販されており、これを使用することにより細胞を計数してもよい。
【００１６】
「分化する」とは、ある細胞種が他の細胞種に変化することをいう。したがって、赤血球、白血球およびリンパ球のような最終分化のみならず、完全には分化していない系統限定幹細胞（ＣＦＵ−ＳおよびＣＦＵ−Ｃのような）への変化も分化の範疇である。一般に、血球細胞の分化状態は、細胞の形態および細胞表面の発現抗原により同定可能である。
【００１７】
「動員する」とは、造血幹細胞や造血前駆細胞が循環系内に移動することをいう。現在行われている造血幹細胞移植や造血幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖のための造血幹細胞は、骨髄からの採取、臍帯血からの採取、および末梢血からの採取により入手されている。これらのうち、患者に与える負担が少なく且つ十分量の造血幹細胞が入手可能であるため、末梢血からの採取が注目されている。しかしながら、造血幹細胞は通常骨髄中の幹細胞ニッチに存在し、末梢血中には存在しないために、造血幹細胞を循環系内に動員することが必要となる。本発明の医薬組成物によれば、造血幹細胞を循環系内に動員させることが可能となる。
【００１８】
本明細書でいう、「プラスミノーゲン活性化因子」とは、プラスミノーゲンをプラスミンに変換する機能を有すれば、任意のタンパク質を含みうる。例えば、プラスミノーゲン活性化因子は、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）が知られている。また、他のセリンプロテアーゼ（例えば、ストレプトキナーゼ）によっても、プラスミノーゲンはプラスミンに変換されることが知られている。
【００１９】
ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）は、５６２アミノ酸からなる一本鎖糖タンパク質（シグナルペプチドを含む）であり、プラスミン等により限定的に分解されジスルフィド結合により結合した二本鎖型（活性化型）となることが知られている。一本鎖型および二本鎖型のいずれも、プラスミノーゲンをプラスミンに分解することが可能である。本発明では、ｔＰＡは、プラスミノーゲンをプラスミンに分解する機能を有することが重要である。したがって、本発明において、ｔＰＡという場合は、一本鎖型および二本鎖型のいずれも含まれる。また、ｔＰＡには、プラスミノーゲンをプラスミンに分解する機能を有するならば、容易に産生されるように改変された組換え体であってもよい。ｔＰＡの組換えタンパク質としては、モンテプラーゼ（製品名：クリアクター（エーザイ、日本東京））、アルテプラーゼ（製品名：アクチバシン（協和醗酵）、製品名：グルトパ（三菱ウェルファーマ））、パミテプラーゼ（製品名：ソリナーゼ（アステラス））、ナテプラーゼ（製品名：ミライザー（日本シェーリング）等が、また、ｔＰＡの細胞培養タンパク質としては、ナサルプラーゼ（製品名：トロンボリナーゼ（ベネシス、三菱ウェルファーマ））が、その他のｔＰＡとしては、チソキナーゼ（製品名：プラスベータ（旭化成）、製品名：ハパーゼコーワ（興和））、バトロキソビン（製品名：デフィブラーゼ（東菱薬品工業））等が知られている。
【００２０】
ヒトウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）は、４１１アミノ酸残基からなる前駆体として産生される。その後、前駆体はプラスミン等により１５６番目の部位で切断を受け、切断部位のＣ末端側の鎖が活性型のｕＰＡとなる。本発明では、ｕＰＡは、プラスミノーゲンをプラスミンに分解する機能を有することが重要である。したがって、本発明において、ｕＰＡという場合、前駆体型および切断後の活性型のいずれもが含まれる。また、ｕＰＡには、プラスミノーゲンをプラスミンに分解する機能を有するならば、容易に産生されるように改変された組換え体であってもよい。
【００２１】
本発明の好ましい態様において、プラスミノーゲン活性化因子はｔＰＡである。
本発明のさらに好ましい態様において、ｔＰＡは以下のタンパク質からなる群より選択される：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質；および、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に１つまたは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質。
【００２２】
ここで、プラスミノーゲン活性化作用とは、プラスミノーゲンをプラスミンに変換する作用のことをいう。また、配列番号１は、野生型ヒトｔＰＡのアミノ酸配列である。配列番号１のアミノ酸配列は全長配列を表わしており、ｔＰＡの生理活性に不必要なシグナルペプチド（１−２３のアミノ酸残基と考えられている）を含む。したがって、配列番号１の配列からシグナルペプチドを除いた配列も、ｔＰＡに含まれる。
【００２３】
また、本発明において、上述のようにｔＰＡとは、プラスミノーゲンをプラスミンに変換する機能を有するタンパク質をいう。したがって、配列番号１に対して、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列含み且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質、および１つまたは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含み且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質もまた、ｔＰＡの範疇である。
【００２４】
本発明においては、ｔＰＡのアミノ酸の１つまたは数個の置換は、好ましくは保存的置換により行われる。ここで保存的置換とは、あるアミノ酸残基が生物学的に類似した特性を持つアミノ酸残基に置換されることをいう。保存的置換の例は、１つの脂肪族残基（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａ）を別の脂肪族残基に置換すること、１つの極性残基を別の極性残基に置換すること（例えば、ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；またはＧｌｎとＡｓｎ間で置換すること）、または１つの芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒ）を別の芳香族残基に置換することを含む。さらに、保存的置換の例は、活性ドメインの外側のアミノ酸の置換、およびｔＰＡの二次および／または三次構造を変化させないアミノ酸の置換をも含む。当業者は、周知の遺伝子工学的手法により、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２００１）等に記載の、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して、所望の欠失、挿入または置換を施すことが可能である。
【００２５】
本発明において、「数個のアミノ酸残基の欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列」の「数個」とは、２ないし９個をいい、好ましくは２ないし７個、さらに好ましくは２ないし５個、特に好ましくは２または３個をいう。
【００２６】
本発明の好ましい態様において、ｔＰＡは、プラスミノーゲン活性化作用を有し、配列番号１に８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する。
【００２７】
アミノ酸の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ＳおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００２８】
当業者に用いられる配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
【００２９】
同一の機能を有するタンパク質であっても、由来する品種の相違によって、そのアミノ酸配列に相違が存在しうることは当業者にとって周知の事実である。プラスミノーゲン活性化作用を有する限り、ｔＰＡは、配列番号１のアミノ酸配列のこのような相同体、変異体も含みうる。配列番号１のヒトｔＰＡ以外にも、例えばマウス（Ｍ．  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）やニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ）等で同様の活性を示すタンパク質をコードする遺伝子の存在が知られている。
【００３０】
本発明の医薬組成物は、好ましくは１またはそれより多くの医薬的に許容できる担体と共に投与可能である。医薬的に許容できる担体は、投与の経路について医薬的に許容できる希釈剤、増量剤、アジュバント、賦形剤、およびビヒクル、ならびに適した分散剤、湿潤剤、および懸濁剤を使用して処方される、水性のまたは油性の懸濁液であってよい。
【００３１】
医薬的に許容できる担体は、一般的に無菌であり、そして発熱性剤がなく、そして水、油、溶媒、塩、糖、および他の炭水化物、乳化剤、緩衝剤、抗菌剤、およびキレート剤を含んでよい。特定の医薬的に許容できる担体および担体に対する活性化合物の比は、組成物の溶解度および化学特性、投与の方式、ならびに標準の医薬実務により決定される。
【００３２】
本明細書に記載される組成物は、バイアル、ビン、チューブ、シリンジ吸入器または単一のもしくは複数の投与のために他の容器の中に含まれることが可能である。そのような容器は、ガラス、または例えばポリプロピレン、ポリエチレン、若しくはポリビニルクロリドのようなポリマー材料から作られることが可能である。好ましい容器は、シール、または一回の用量を引き出すために針により貫通することができ、次いで針を引き抜くと再びシールされるゴムのストッパーのような封入システムを含んでよい。
【００３３】
プラスミノーゲン活性化因子またはそれをコードする核酸は、適切な方式で患者に投与される。例えば、プラスミノーゲン活性化因子またはそれをコードする核酸あるいはそれらを含む医薬組成物は、静脈内、経皮、皮内、腹腔内、筋内、鼻腔内、硬膜外、経口、局所、皮下、またはいずれかの他の適した技術により投与可能である。好ましくは、静脈内または腹腔内に投与される。最適な薬剤処方は、意図される投与経路、搬送形式および望ましい投薬量に応じて、当業者が容易に決定可能である。
【００３４】
本発明の医薬組成物中のｔＰＡの量は、年齢、治療しようとする状態、体重、治療の望ましい期間、投与の方法、ならびに他のパラメーターに依存する。有効な用量は、医師または他の有資格の医学専門家により日常的に決定される。限定される訳ではないが、典型的な有効な用量は、およそ１ｘ１０３ＩＵ／ｋｇからおよそ５ｘ１０６ＩＵ／ｋｇ体重である。好ましい態様において、腹腔内注射のための用量はおよそ１ｘ１０５−５ｘ１０６ＩＵ／ｋｇである。また、好ましい態様において、静脈内注射のための用量は５ｘ１０３−５ｘ１０５ＩＵ／ｋｇである。
【００３５】
なお、「ＩＵ」とは国際単位（インターナショナル・ユニット）を示す。
（ｉｉ）プラスミノーゲン活性化因子をコードする核酸を用いる医薬組成物
本発明は、造血幹細胞を増殖、分化および／または循環系内に動員させるためのプラスミノーゲン活性化因子をコードする核酸を提供する。
【００３６】
本発明はまた、造血幹細胞を増殖、分化および／または循環系内に動員させるためのプラスミノーゲン活性化因子をコードする核酸を投与する方法を提供する。
本発明は、造血幹細胞を増殖、分化および／または循環系内に動員させるための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、プラスミノーゲン活性化因子をコードする核酸を含んでなる。
【００３７】
本発明はまた、造血幹細胞を増殖、分化および／または循環系内に動員させるための医薬組成物を投与する方法を提供する。本発明の当該投与方法に用いる医薬組成物は、プラスミノーゲン活性化因子をコードする核酸を含んでなる。
【００３８】
本発明はまた、プラスミノーゲン活性化因子をコードする核酸の、血球の減少状態を治療および／または予防するための、あるいは造血幹細胞または造血前駆体を循環系内に動員させるための医薬組成物の製造のための使用を提供する。
【００３９】
本発明の好ましい態様において、プラスミノーゲン活性化因子をコードする核酸は、ｔＰＡをコードする核酸である。
本発明のさらに好ましい態様において、ｔＰＡをコードする核酸は、以下の核酸からなる群より選択される：
（ａ）配列番号２の塩基配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号２の塩基配列と少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質をコードする核酸；
（ｃ）配列番号２の塩基配列から１つまたは数個の核酸の欠失、置換、および／または付加を有する塩基配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質をコードする核酸；および、
（ｄ）配列番号２の塩基配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列を含み、且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質をコードする核酸。
【００４０】
ここで、配列番号２は、野生型ヒトｔＰＡをコードする核酸配列である。配列番号２は、野生型ヒトｔＰＡのｃＤＮＡの塩基配列を表わしており、ｔＰＡのプラスミノーゲンをプラスミンに変換する機能には無関係なシグナルペプチドをコードする配列（１−６９の塩基配列と考えられている）を含む。したがって、配列番号２の配列からシグナルペプチドをコードする配列を除いた配列も、ｔＰＡをコードする核酸に含まれる。
【００４１】
また、本発明において、上述のようにｔＰＡとは、プラスミノーゲンをプラスミンに変換する機能を有するタンパク質をいう。したがって、配列番号２に対して、９５％以上の同一性を有する塩基配列含み且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質をコードする核酸、１つまたは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、および／または付加を有するアミノ酸配列を含み且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質をコードする核酸、並びに配列番号２の塩基配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列を含み且つプラスミノーゲン活性化作用を有するタンパク質をコードする核酸もまた、ｔＰＡをコードする核酸の範疇である。
【００４２】
「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件を意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６−７章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および例えば、約４０℃−６０℃、０．５−６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。
【００４３】
一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６５℃−６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。
【００４４】
当業者に知られていて、以下にさらに記載したように、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整することが可能であると理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１を参照されたい）。核酸を未知配列の標的核酸へハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは核酸の配列を並列し、最適な配列相補性をもつ単数または複数の領域を同定することによって決定可能である。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−２５℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式により決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８塩基対を超える長さのハイブリッドに関しては、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋４１（モル分率［Ｇ＋Ｃ］）−０．６３（％ホルムアミド）−５００／ｎであり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸は各々、少なくとも８ヌクレオチド（または、より好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）、またはそれがハイブリダイズする核酸の長さの少なくとも１％（より好ましくは少なくとも２５％、または少なくとも５０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０）である長さを有し、それがハイブリダイズする核酸と少なくとも５０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。ここで配列同一性は、上記により詳しく記載されるように、重複部分と同一性を最大化する一方、配列ギャップを最小化するように並列された、ハイブリダイズする核酸の配列を比較することによって決定される。
【００４５】
核酸の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列のパーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マジソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定され；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５４４−７１も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００４６】
好ましい態様において、ｔＰＡをコードする核酸には、配列番号２の塩基配列から１つまたは数個の欠失、置換、および／または付加を有する核酸配列によりコードされるタンパク質を含む。「数個」とは、好ましくは、２ないし２０個、より好ましくは２ないし１０個、さらに好ましくは２ないし５個、最も好ましくは２または３個である。好ましい態様において、１つまたは数個の欠失および／または付加によって、コドンの読み枠がずれフレームシフトすることにより、タンパク質の二次構造以上の高次構造は変化しない。しかしながら、フレームシフトの起こる部位がｔＰＡコード配列の３’末端に近く、タンパク質全体の構造および／または機能に与える影響が小さければフレームシフトを起こす欠失および／または付加も許容されうる。当業者は、周知の遺伝子工学的手法により、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）（上述）等に記載の、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して、所望の欠失、挿入または置換を施すことが可能である。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、プラスミノーゲン活性化因子をコードする核酸をベクター中に挿入して投与することも可能である。本発明における「ベクター」とは、プラスミノーゲン活性化因子をコードする核酸を、造血幹細胞等に導入し、その細胞中に所望の遺伝子産物を発現させるものであればどのようなものであってもよい。
【００４８】
好ましい態様においては、ベクターは、プラスミド、ウイルスまたはファージ等であり、さらに好ましい態様においてはプラスミドまたはウイルスである。プラスミドは、核酸によりコードされているプラスミノーゲン活性化因子を発現できるものであればどのようなものでもよい。好ましい態様において、プラスミドは、構成的に発現するプロモーターまたは造血幹細胞等においてのみに発現するプロモーターを有する。このようなプラスミドを造血幹細胞等にインビトロで導入し、これを生体内に静脈注射等により配送することも可能である。プラスミドを造血幹細胞等にインビトロで導入する方法は広く知られており、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法などがある。リポフェクション法に使用される試薬は市販されており、例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等がある。
【００４９】
本発明の医薬組成物に適したプラスミドは、限定されるわけではないが、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＸｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、ｐＭＹｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ等があり、また適したプロモーターとしては、例えばＣＭＶおよびＬＴＲ等がある。また、使用されうるウイルスも特に限定されない。しかしながら、好ましい態様において、ウイルスはアデノウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルス等公知のウイルスが使用される。このようなウイルスの作成方法は公知である。ウイルスは生体内に直接配送しても、インビトロで造血幹細胞等に導入し、その造血幹細胞を生体内に配送してもよい。
【００５０】
（２）ＣＦＵ−Ｓ、ＣＦＵ−Ｃおよび／またはこれらの細胞から分化可能な血球細胞を増殖、分化および／または循環系内へ動員させるための医薬組成物
本発明は、造血幹細胞から分化したＣＦＵ−Ｓ、ＣＦＵ−Ｃ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ等の造血系細胞に分化し得る細胞、好ましくはＣＦＵ−Ｓ、ＣＦＵ−Ｃおよび／またはこれらの細胞から分化可能な血球細胞を増殖、分化および／または循環系内へ動員させるための医薬組成物を提供する。本医薬組成物は、プラスミノーゲン活性化因子および／またはそれをコードする核酸を含んでなる。これは、マウスにｔＰＡを投与することにより、末梢血中のＣＦＵ−ＳおよびＣＦＵ−Ｃの数が増加した、という本発明の知見に由来する。また、本発明は、実施例５、１２および１５等によっても裏付けられる。
【００５１】
本発明の医薬組成物において、「プラスミノーゲン活性化因子」および「プラスミノーゲン活性化因子をコードする核酸」は、「（１）造血幹細胞を増殖、分化および／または循環内に動員させるための医薬組成物」の定義と同じである。
【００５２】
「ＣＦＵ−Ｓ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｓｐｌｅｅｎ）」とは、造血幹細胞から分化した極初期の細胞であり、特定の血球細胞に分化する系統限定幹細胞である。また、ＣＦＵ−Ｓは自己複製により増殖することも可能である。ＣＦＵ−Ｓの子孫は多くの細胞種に分化可能であるために、ＣＦＵ−Ｓは多能性を有すると考えられている。ＣＦＵ−Ｓから分化可能な血球細胞は、具体的には、赤血球、血小板、顆粒球（好中球、好酸球および好塩基球）、マクロファージ並びにリンパ球などが含まれる。
【００５３】
「ＣＦＵ−Ｃ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｃｕｌｔｕｒｅ）」とは、ＣＦＵ−Ｓからさらに分化した細胞であり、複数の種類の血球細胞に分化可能な系統限定幹細胞である。ＣＦＵ−Ｓと同様に、ＣＦＵ−Ｃは自己複製により増殖することも可能である。ＣＦＵ−Ｃから分化可能な血球細胞は、具体的には、顆粒球（好中球、好酸球および好塩基球）並びにマクロファージが含まれる。
【００５４】
本発明の医薬組成物によれば、ＣＦＵ−ＳおよびＣＦＵ−Ｃの細胞数を増殖、分化および／または循環系内へ動員させることが可能であり、これらの細胞から分化可能な血球細胞を増加させることができることは、当業者が認めるであろう。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、ＣＦＵ−ＳをＣＦＵ−Ｃの細胞数を増加させる。
（３）インビトロで造血幹細胞、ＣＦＵ−ＳまたはＣＦＵ−Ｃを増殖、および／または分化させる方法
本発明は、インビトロで造血幹細胞、ＣＦＵ−ＳまたはＣＦＵ−Ｃを増殖、および／または分化させる方法を提供する。本方法は、細胞をプラスミノーゲン活性化因子を含む培養培地中で培養することを含む。本方法は、マウスからソーティングしたＬｉｎ−細胞にｔＰＡを添加することにより、ＣＦＵ−Ｃの細胞数が劇的に増加したという、本発明の知見に基づく。また、本方法は実施例９、１２および１４等によっても裏付けられる。
【００５６】
本発明の方法において、「プラスミノーゲン活性化因子」および「プラスミノーゲン活性化因子をコードする核酸」は、「（１）造血幹細胞を増殖、分化および／または循環内に動員させるための医薬組成物」の定義と同じである。
【００５７】
「培養培地」とは、細胞を培養するための培養液をいう。造血幹細胞に使用可能な培養培地は、造血幹細胞の未分化性を維持することが求められる。このような培養培地は、当該技術分野では公知である。例えば、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４  Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン）、Ｘ−ＶＩＶＯ−１５等、任意の公知の培地が使用可能である。
【００５８】
「培養する」とは、細胞を培養培地中において維持・増殖させることをいう。造血幹細胞および未分化造血前駆細胞等の細胞を培養する培地および添加物、並びに培養方法は当該技術分野で公知である。しかしながら、造血幹細胞および未分化造血前駆細胞を培養する場合、好ましくはこれらの細胞の未分化状態を維持したまま培養する。このような目的のために使用される添加物としては、ＳＣＦ（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）およびＴＰＯ（トロンボポエチン）等のサイトカインがある。また、所望によりＦｌｔ３リガンドおよび／またはＩＬ−６等のサイトカインを添加してもよい。また、これらのサイトカインは、それらの生理的機能を有するならば容易に産生されるように改変された組換え体であってもよい。培養は、５％ＣＯ２、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で行うことが望ましい。
【００５９】
本発明の一態様において、造血幹細胞、ＣＦＵ−ＳまたはＣＦＵ−Ｃを、フィーダー細胞と共に培養することも可能である。このようなフィーダー細胞としては、間質細胞、好ましくはＭＳ−５細胞が挙げられる。
【００６０】
本発明の方法によれば、図４Ｄが示すように、ＣＦＵ−Ｃの細胞数が増加した。よって、好ましい態様において、本発明の医薬組成物はＣＦＵ−Ｃの細胞数を１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、さらに好ましくは２倍以上、より好ましくは２．４以上増加させることが可能である。
【００６１】
（４）血球減少状態を治療および／または予防するための医薬組成物
本発明は、血球減少状態を治療および／または予防するための医薬組成物を提供する。本医薬組成物は、プラスミノーゲン活性化因子および／またはそれをコードする核酸を含んでなる。
【００６２】
本発明の方法において、「プラスミノーゲン活性化因子」および「プラスミノーゲン活性化因子をコードする核酸」は、「（１）造血幹細胞を増殖、分化および／または循環内に動員させるための医薬組成物」の定義と同じである。
【００６３】
プラスミノーゲン活性化因子またはそれをコードする核酸を含む医薬組成物は、適切な方式で患者に投与される。例えば、プラスミノーゲン活性化因子またはそれをコードする核酸あるいはそれらを含む医薬組成物は、静脈内、経皮、皮内、腹腔内、筋内、鼻腔内、硬膜外、経口、局所、皮下、またはいずれかの他の適した技術により投与可能である。好ましくは、静脈内または腹腔内に投与される。最適な薬剤処方は、意図される投与経路、搬送形式および望ましい投薬量に応じて、当業者が容易に決定可能である。
【００６４】
本発明の医薬組成物により血球の減少状態が治療および／または予防される。血球の減少状態とは、例えば以下の状態からなる群よりなる：造血器腫瘍などに対する化学療法・放射線治療後の血球（白血球、赤血球および血小板）減少状態、並びに再生不良性貧血および骨髄異形成症候群などの造血不全症等の疾患。しかしながら、これらに限られず、通常よりも血球数が少ない状態であれば、本発明の医薬組成物により治療または予防される対象となる。
【００６５】
ここで、「治療および／または予防」とは、哺乳動物、特にヒトの上記疾病（血球の減少状態）の治療および／または予防を含み、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病または症状が起こることを予防すること；
（ｂ）疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること；
（ｃ）疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転を引き起こすこと。
【００６６】
また、「（１）造血幹細胞を増殖、分化および／または循環内に動員させるための医薬組成物」において記載される態様および用量等は、本発明の治療および／または予防するための医薬組成物にも適用可能である。
【発明の効果】
【００６７】
本発明の医薬組成物により、血球が減少状態にある患者を治療することや、血球減少状態を予防することが可能になる。また、プラスミノーゲン活性化因子は、これまでに大きな副作用を示すことなく臨床的に使用されている古典的な線維素溶解因子である。そのため、副作用を引き起こすことなく上記効果を達成することが可能である。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例によって本発明を説明するが、実施例は例証のためのものであり、本発明を制限するものではない。本発明の範囲は、請求の範囲の記載に基づいて判断される。さらに、当業者は本明細書の記載に基づいて、容易に修正、変更を加えることが可能である。
【００６９】
実施例は、特に記載しない限り、以下の方法により行った。
統計分析
結果を平均±ＳＥＭ（標準誤差平均）として表す。対応のない２テール・スチューデントｔ検定を用いてデータを分析した。＜０．０５のＰ値を有意と見なした。
【００７０】
材料および方法
動物。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドに、２１世代、戻し交配したマウスを、ヘテロ接合体交配することによって、年齢（６〜８週齢）および性別をマッチさせたＰｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスを得た（非特許文献１１）。ＣＤ１マウスに＞１０回戻し交配した後のＭＭＰ−９＋／＋マウスおよびＭＭＰ−９−／−マウスを用いた（非特許文献１）。ろ過した無菌空気Ｔｈｏｒｅｎｓｔｅｎ装置中でマウスを維持した。動物処置は順天堂大学の施設内動物実験委員会に認可された。
【００７１】
骨髄抑制モデル。Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスまたはＭＭＰ−９＋／＋マウスおよびＭＭＰ−９−／−マウスに、骨髄抑制剤５−ＦＵ（２５０ｍｇ／ｋｇ体重、協和発酵工業、日本・東京）を注射した。毎日、１．２５ｘ１０６  ＩＵ／ｋｇ体重の濃度で、ヒト組換えｔＰＡ（エーザイ、日本・東京のご好意により提供）またはＰＢＳをマウスに腹腔内注射した。生存を毎日監視した。示した時点で血液を抜き取った。
【００７２】
ＢＭ移植研究。Ｐｌｇ＋／＋（Ｌｙ５．２）マウスまたはＣ５７ＢＬ／６（Ｌｙ５．１）マウスのいずれかから得たＢＭ細胞を、致死的に放射線照射した（９．５Ｇｙ）Ｃ５７ＢＬ／６（Ｌｙ５．１）マウスに静脈内注射した。異なる時点で末梢血を抜き取って、そして末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。Ｌｙ５．１−ＰＥおよびＬｙ５．２−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に関してＰＢＭＣを染色し、そして蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって分析した。
【００７３】
ｉｎ  ｖｉｖｏの増殖因子投与。１００μｌの０．５％ＢＳＡに再懸濁したＳＤＦ−１（４００ｎｇ／マウス、Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  ＮＪ、１日２回注射）またはＶＥＧＦ（３００ｎｇ／マウス、Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  ＮＪ、１日１回注射）を、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスに５日間腹腔内投与した。対照群には、１００μｌの０．５％ＢＳＡを同様に注射した。異なる時点で血液および血漿試料を収集した。
【００７４】
末梢血分析。示した時点で、ヘパリン処理毛細管を用いて、後眼窩出血によって、マウスから血液を収集した。白血球（ＷＢＣ）数を測定した。Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、カナダ・オンタリオ州）を用いて、不連続勾配上の遠心分離後、ヘパリン処理血液からＰＢＭＣを単離した。さらに分析するまで、血漿試料を−８０℃で保存した。
【００７５】
ＣＦＵ−Ｓアッセイ。組換えｔＰＡでの処置の開始後、第１日、第２日、第３日、第５日および第１０日に、動員されたＰＢＭＣを得た。各時点について、３匹のレシピエントの同系マウスに、１３７Ｃｓ  γ線供給源から、〜０．９０Ｇｙ／分の線量率で、９Ｇｙを放射線照射して、内因性脾臓コロニーの産生を妨げた。放射線照射完了後、数時間以内に、１０５  ＰＢＭＣを放射線照射マウスの尾静脈にｉ．ｖ．注射した。マウスを１２日後に屠殺し、そして脾臓を取り除き、そしてブアン固定液中で固定した。次いで、肉眼で見える脾臓コロニー数をスコアリングした（非特許文献１２）。
【００７６】
組織学的評価。ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）またはＭＳＢ三色染色（コラーゲンは青に染まり、一方、細胞質および赤血球は赤／オレンジに染まり、そして核は黒に染まる）で、脱パラフィン処理したＢＭ切片を染色した。さらに、記載されるように（非特許文献１）、ＭＭＰ−９に関してもＢＭ切片を染色した（７−１１Ｃ）。フィブリン（フィブリノーゲン）に関してもまた、脱パラフィン処理したＢＭ切片を染色し（非特許文献１１）、その後、Ａｌｅｘａ  ４８８標識二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ）でも染色した。
【００７７】
また、ＢＭ切片をヒアルロニダーゼで前処理し、スキムミルクでブロッキングし、そしてウサギ抗ヒトＰｌｇポリクローナル抗体（Ｈ−９０、サンタクルズ、１／１００希釈）で１時間インキュベートした。ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＩＩ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｄａｋｏ）の後に、スライドをＤＡＢで発現させ、Ｈ＆Ｅで対比染色した。
【００７８】
競合移植実験
Ｐｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−マウス由来の１ｘ１０７ＢＭＭＣを２ｘ１０７  ＣＤ４５．１細胞と混合し、そして造血に対する比較寄与を、ＣＤ４５．２、ＧＲ−１、Ｂ２２０またはＣＤ３に対する抗体を使用してＰＢＭＣ中のドナー由来の３系統の寄与の％を解析することにより評価した。
【００７９】
他の実験においては、致死量の放射線を照射されたＬｙ−５．１マウスに、Ｐｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−マウス由来の１０、５０または１００ＫＳＬ（ｃ−Ｋｉｔ＋／Ｓｃａ−１＋／ｌｉｎ−）細胞（細胞濃縮当たり１０レシピエントマウス）を、５ｘ１０４  ＣＤ４５．１正常ＢＭ競合細胞とともに投与した。そしてＰＢ中のＣＤ４５．２の比率を、移植後７ヶ月後にアッセイした。
【００８０】
長期間移植
Ｐｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−マウス（ＣＤ４５．２＋）由来の１ｘ１０５、４ｘ１０４または２．５ｘ１０４ＢＭ細胞を、致死量の放射線（９００ｃＧｙ）を照射された遺伝的背景が同一なＣＤ４５．１マウスに尾静脈投与により移植した。もう１つの一連の実験では、ＣＤ４５．１マウス由来の１ｘ１０５、４ｘ１０４または２．５ｘ１０４ＢＭ細胞を、致死量の放射線を照射された遺伝的背景が同一なＰｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−（ＣＤ４５．２＋）レシピエントマウスに移植した。ドナー寄与％を、移植後９０日のレシピエントマウス中の末梢血白血球上のＣＤ４５．１およびＣＤ４５．２を計測することによって計算した。各レシピエントグループから６匹のマウスを解析した。処理群間の比較を、両側（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて行い、そしてデータを平均（Ｍ）±標準誤差（ＳＥＭ）としてプロットした。
【００８１】
インビボｔＰＡ投与
マウスに、全３日間の間、毎日１．２５ｘ１０６ＩＵ＝１ｍｇ／ｋｇ（体重）の濃度でヒト組換えｔＰＡを、またはＰＢＳを腹腔内に投与した。（ヒトの臨床において組換えｔＰＡ用量は１０ｍｇ／ｋｇである）。血液および血漿試料を各時点で回収した。
【００８２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
Ｌｉｎ−細胞分離
大腿および脛骨をフラッシュ処理して、マウスからＢＭ細胞を得た。Ｌｉｎ−細胞分離のため、商業的に入手可能な抗体カクテル（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー）を用いて、細胞を染色した。２ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に通した後、ｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１に対する抗体を用いてＬｉｎ−細胞を染色した。ＦＡＣＳ分析によって、分離したＬｉｎ−細胞の９０％より多くが、ｃ−Ｋｉｔ／Ｓｃａ−１二重陽性細胞であることが明らかになった。
【００８３】
ネズミＢＭ培養
５−ＦＵを含み／含まず処置した後に単離した、Ｐｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−  ＢＭ細胞由来のネズミＢＭ細胞（１ｘ１０６）を、血清不含培地（Ｘ−ＶＩＶＯ−１５）中、一晩置いた。酵素電気泳動法によって培養上清を分析した。
【００８４】
懸濁培養（間質細胞補助なし）
血清不含培地中、組換えＫｉｔＬ（２μｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を加え／加えず、組換えｔＰＡ（５μｇ／ｍｌ、クリアクター（登録商標）、エーザイ社、日本）の存在下／非存在下で、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウス由来のＢＭ由来Ｌｉｎ−細胞（１．０ｘ１０５）を一晩培養した。次いで、細胞を採取し、ｃ−Ｋｉｔ−ＦＩＴＣ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で標識し、そしてＦＡＣＳによってｃ−Ｋｉｔ発現に関して分析した。
【００８５】
間質細胞株培養
Ｐｌｇ＋／＋マウスのＢＭ由来の１ｘ１０５  Ｌｉｎ−細胞を、間質細胞（ＭＳ−５）の集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）層と一緒に、培養下に置いた。組換えｔＰＡ（５μｇ／ｍｌ）を培養に毎日添加した。ＫｉｔＬ（２μｇ／ｍｌ）を培養に一日おきに添加した。７日後、トリプシン（Ｓｉｇｍａ）を用いて接着細胞を回収し、そして非接着細胞と一緒にプールした。造血細胞総数を計数した。次いで、細胞を造血前駆体アッセイに供した。
【００８６】
別のセットの実験では、Ｐｌｇ＋／＋マウスのＢＭから、１．２ｘ１０５  Ｌｉｎ−細胞を単離し、そして組換えｔＰＡ（５μｇ／ｍｌ、クリアクター（登録商標）、エーザイ社、日本）の存在下／非存在下で、ｃ−Ｋｉｔに対する遮断抗体（クローンＡＳＫ、最終濃度０．５μｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（ＫｉｔＬ）に対する遮断抗体（最終濃度０．５μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含み／含まず、ＰＡＩ−１（２μｇ／ｍｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または毎日、最終濃度１ｎＭのＭＭＰ阻害剤（ＣＧＳ２７０２３Ａ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、スイス・バーゼル）を含み／含まず、ＭＳ−５間質細胞と共培養した。５日後、培養を終わらせ、そして接着細胞および非接着細胞を収集した。造血細胞を計数した後、細胞を造血前駆体アッセイに供した。
【００８７】
別のセットの実験では、ＭＳ−５間質細胞を、血清不含培地中、ｔＰＡ（５μｇ／ｍｌ、クリアクター（登録商標）、エーザイ社、日本）の存在下／非存在下で培養した。細胞上清を−３０℃で保存し、そして次いでＥＬＩＳＡによってＫｉｔＬ放出に関して分析した。
【００８８】
長期培養始原細胞アッセイ
２０％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ）、およびヒドロコルチゾン（１０−６ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ）を含有する長期培養培地中の間質層（ＭＳ−５）培養に、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウス由来のＢＭ細胞を添加した。５日ごとに、培地の半分に新鮮な長期培養培地を補充した。培養３週間後、接着細胞および非接着細胞を収集し、造血細胞数を測定し、そして細胞を造血前駆細胞アッセイに供した。ＣＦＵ−Ｃ数を測定した後、ＣＦＵ−Ｃ総数を４で割ることによって、長期培養始原細胞の絶対数を計算した。
【００８９】
造血前駆体アッセイ
ｍＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ネズミＫｉｔＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）およびヒト・エリスロポエチン（３単位／ｍｌ）を含有する、商業的に入手可能なメチルセルロースに基づくアッセイ（Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー）１ｍｌ中、ＰＢＭＣ（１０５細胞／プレート）またはＬｉｎ−細胞（５ｘ１０３細胞／プレート）を３つ組で蒔いた。第７日、倒立顕微鏡（４０ｘ倍率）でスコアリングを行った。
【００９０】
サイド・ポピュレーション細胞分析
以下のフィルターセット：Ｈｏｅｃｈｓｔブルーを検出する４０５／３０バンドパス（ＢＰ）、Ｈｏｅｃｈｓｔレッドを検出する５８５／４２ＢＰ、およびＨｏｅｃｈｓｔブルーからＨｏｅｃｈｓｔレッドを分離する４４０−ロングパス二色フィルターを含むＭｏＦｌｏ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて、全ＢＭ細胞を蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供した。ベラパミルで処理した細胞サブセットが、ＳＰゲートの同一性を確認した。
【００９１】
基質酵素電気泳動法（基質ザイモグラフィー）
５−ＦＵを単回注射した後、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスからＢＭ細胞（１ｘ１０６）を収集し、そして血清不含培地中で一晩培養した。ゼラチン−アガロースビーズで上清を処理して、ゼラチナーゼを濃縮し、そして０．１％ゼラチンを含有するドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）を通じてプロセシングした。２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中、室温で１時間インキュベーションし、そして冷水中でリンスした後、低塩コラゲナーゼ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、０．２ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ｌ  ＣａＣｌ２、および０．２％体積／体積  Ｂｒｉｊ−３５）中に、３７℃で１４〜１８時間、ゲルを置いた。０．２％クーマシーブルー・ストック１０ｍｌおよび脱染剤（ＤＷ、メタノールおよび氷酢酸、６：３：１）１９０ｍｌを含有する溶液でゲルを３０分間染色し、そして室温で１時間放置した後、ゼラチン溶解活性のバンドが視覚化された。プロＭＭＰ−２標準（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ケンブリッジ）を陽性対照として、そしてゼラチン溶解バンドの分子量を決定するために、用いた。
【００９２】
ウェスタンブロット分析
プラスミノーゲン抗体（クローンＥ−１４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いてウェスタンブロットし、そしてＥＣＬ化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて視覚化することによって、５−ＦＵ処置前および処置後に採取した、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウス由来の血漿試料を分析した。
【００９３】
ＦＡＣＳ分析
５−ＦＵ処置後のＰｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスのＢＭ細胞をＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣ抗体およびＧＲ１−ＰＥ抗体とインキュベーションし、そしてＦＡＣＳによって分析した。細胞をエタノールで固定し、そしてヨウ化プロピジウムで標識した後、ＦＡＣＳを用いて、ＢＭ細胞倍数性を分析した。
【００９４】
細胞周期分析のため、全ＢＭ細胞をＳｃａ−１−ＦＩＴＣで標識した。標識したＢＭ細胞を、氷冷エタノール中、３０分間固定した。ＲＮアーゼ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州）処理後、ヨウ化プロピジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州）で細胞を染色した。フローサイトメトリーによって、ＳＣＡ−１＋細胞のＤＮＡ含量を決定した（非特許文献１）。
【００９５】
もう１つの一連の実験において、Ｌｉｎ−細胞をＢＭから単離し、Ｓｃａ−１−ＦＩＴＣ染色をし、そして細胞周期解析をする前にヨウ化プロピジウムを実行した。サイドポピュレーション細胞解析のために、以下のフィルターセットを有するＭｏＦｌｏを使用して、全ＢＭ細胞を細胞活性化細胞選別（ＦＡＣＳ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に供した：ヘキストブルーを検出するための４０５／３０バンドパス（ＢＰ）、ヘキストレッドを検出するための５８５／４２ＢＰ、およびヘキストレッドをヘキストブルーから分離するための４４０−ｌｏｎｇ  ｐａｓｓ  ｄｉｃｈｒｏｍｉｃフィルター。ベラパミルで処理された細胞のサブセットは、ＳＰゲートの同一性を確認した。
【００９６】
ＫｉｔＬ、並びにプロＭＭＰ−９および活性ＭＭＰ−９に関するイムノアッセイ
血漿または培養上清中、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＫｉｔＬ（ＳＣＦ）およびプロＭＭＰ−９を測定した。ＭＭＰ−９活性アッセイＢｉｏｔｒａｋＴＮ系ＥＬＩＳＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国）を用いて、活性ＭＭＰ−９を分析した。
【００９７】
培養上清
（ａ）５−ＦＵ処理したＰｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−マウス由来のＢＭ細胞（１ｘ１０６）を回収し、一晩無血清培地中で培養した。（ｂ）ＭＳ−５細胞を６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）中で集密になるまで増殖させ、そして次いで一晩無血清培地中ｔＰＡ（５μｇ／ｍｌ、クリアクター（登録商標））に暴露した。（ｃ）Ｐｌｇ＋／＋マウス由来のＢＭ由来ｌｉｎ＋細胞（１ｘ１０５）を、一晩無血清培地中で、組換えｔＰＡ（５μｇ／ｍｌ、クリアクター（登録商標））の存在下／非存在下で培養した。これら培養物の培養上清を回収した。上清（ａ）−（ｃ）を基質ザイモグラフィーまたはＥＬＩＳＡにより解析した。
【００９８】
あるいは、集密ＭＳ−５細胞または初代集密間質細胞を、ｔＰＡ（５μｇ／ｍｌ、クリアクター（登録商標））の存在下、ＰＡＩ−１（２μｇ／ｍｌ、ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または１ｎＭの終濃度でＭＭＰ阻害剤（ＣＧＳ２７０２３Ａ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、バーゼル、スイス）ありで／なしで毎日培養した。細胞上清を−３０℃で保存し、そしてついでＥＬＩＳＡによりＫｉｔＬの放出について解析した。
【００９９】
ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して、酸グアニジンチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出により、４週齢のＬＴＣ間質およびＭＳ−５細胞より抽出した。
【０１００】
ＲＴ−ＰＣＴ解析
ＲＴ−ＰＣＴを、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（ＡＭＣ）（タカラ酒造、日本）を製造業者の推奨する方法で使用して実行した。すべてのプローブを、全ＲＮＡ抽出物の完全性を試験するために、βアクチンプライマー  ５’−ＴＧＧＡＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＣ−３’（センス鎖）および５’−ＴＡＡＡＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＣＧ−３’（アンチセンス鎖）を使用して、事前に選別した。これらのプライマーは、３４９ｂｐの産物を生じた。ｔＰＡに対するプライマー配列は、５’−ＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＡＡＴＧＴ−３’（センスプライマー）、および５’−ＧＣＴＣＡＣＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＡＡＡＧＡ−３’（アンチセンスプライマー）であり、５６４ｂｐの産物を生じる。プラスミノーゲンに対するプライマー配列は、５’−ＴＧＴＧＧＧＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＣＴＣＣ−３’（センスプライマー）、および５’−ＧＡＣＡＡＧＧＧＧＡＣＴＣＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＡ−３’（アンチセンスプライマー）であり、２６８ｂｐの産物を生じる。
【０１０１】
統計解析
結果を、平均±ＳＥＭ（標準誤差）として表した。データを不対（ｕｎｐａｉｒｅｄ）両側Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを使用して解析した。＜０．０５のＰ値を有意とした。
【０１０２】
実施例１
本実施例では、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスを用い、Ｐｌｇが幹細胞ニッチの非常に重要な構成要素であること、およびＭＭＰ活性化の潜在的な上流ターゲットであることを確認した。
【０１０３】
本発明者らは、Ｐｌｇ遺伝子がホモ接合的に破壊されたマウス（非特許文献１１）およびストレス造血のモデルを利用した。細胞周期細胞毒性薬剤である５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）によって誘導された骨髄抑制は、活発に細胞周期が循環しているＨＳＣおよび前駆細胞のアポトーシスを生じたが、Ｇ０期のＨＳＣには影響を及ぼさなかった（非特許文献１３）。５−ＦＵを投与されたＰｌｇ−／−マウスはすべて、５−ＦＵ注射の１０日後までに死んだが、Ｐｌｇ＋／＋マウスは５−ＦＵ処置を受けても生き延びた（図１Ａ）。循環白血球（ＷＢＣ）および血小板は回復を示した（図１Ｂ、Ｃ）。総ＢＭ細胞ＣＤ１１ｂ＋／ＧＲ−１＋骨髄細胞、並びに２Ｎ期および４Ｎ期の未成熟巨核球前駆体の再生は、Ｐｌｇ＋／＋マウスでは起きたが、Ｐｌｇ−／−マウスでは起きなかった（図１Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）。しかし、Ｐｌｇ−／−マウスでは、高倍数（＞Ｎ１６）のより分化した巨核球細胞が集積した（図１Ｇ）。これらのデータは、ストレスが誘導する巨核球細胞および骨髄細胞再生／成熟が、Ｐｌｇの非存在下で遮断されたことを示す。
【０１０４】
造血再生中、静止幹細胞（Ｇ０／Ｇ１）は細胞周期に進入する。安定状態条件下で、Ｐｌｇ−／−マウスは、より多くのＢＭ由来Ｓｃａ−１＋細胞を有した。これは、野生型対応物に比較した際、細胞周期のＧ０／Ｇ１期にある幹細胞数の大まかな見積もりとなる（図１Ｈ）。骨髄抑制によって、野生型幹細胞分画は、細胞周期のＳ期にシフトし、それによって造血再生が促進された。しかしこの細胞周期遷移は、Ｐｌｇ欠損細胞では起きず（図１Ｈ）、Ｐｌｇ−／−マウスにおいて、ＢＭ再生が損なわれているのは、細胞周期進行が遮断されるためであることが暗示された。
【０１０５】
実施例２
本実施例では、Ｐｌｇ以外の種類の遺伝子欠損マウスを用いて、Ｐｌｇが幹細胞増殖等に重要であるか否かを検討した。
【０１０６】
ｕＰＡ、ｔＰＡ（ｎ＝５、データ未提示）またはウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）（ｎ＝６、データ未提示）単一欠損マウスを５−ＦＵで処置した場合、Ｐｌｇ−／−マウスとは対照的に、マウスは死亡しなかった。しかし、ｕ−ＰＡ／ｔＰＡ二重欠損マウスの３分の１は、５−ＦＵ注射後、数日以内に死亡した（データ未提示）。ＢＭ回復は、ｔＰＡおよび／またはｕ−ＰＡによる活性化を介して、静止幹細胞の細胞周期へのシフトを促進し、そして細胞特異的系譜への分化を補助するが、この間、Ｐｌｇが必要であることが、これらのデータから示唆される。
【０１０７】
実施例３
本実施例では、５−ＦＵ投与後のＢＭ再生期におけるＭＭＰ−９およびＫｉｔＬ等の発現量の変化を検討した。
【０１０８】
５−ＦＵ処置した野生型動物の血漿のウェスタンブロッティングによって、ＢＭ再生期中にＰｌｇがプラスミンに変換されることが示された（図２Ａ）。Ｐｌｇ活性化は、ＭＭＰの活性化を導くことも可能である。本発明者らは、５−ＦＵ処置の５日後および１０日後のＰｌｇ＋／＋動物から得た培養ＢＭ細胞の上清において、プロ−ＭＭＰ−２およびプロ−ＭＭＰ−９の増加を、特に活性ＭＭＰ−９の増加を見出した（図２Ｂ）。一方、これらはＰｌｇ−／−マウスでは同程度に高くはなかった。しかし、免疫反応性ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−９活性化は、５−ＦＵで処置したＰｌｇ−／−マウスのＢＭでは減弱していた（図２Ｂ、Ｃ）。同様に、５−ＦＵで処置したＰｌｇ＋／＋マウスの血漿において、Ｐｌｇ−／−マウスと比較して、高レベルの活性ＭＭＰ−９およびプロＭＭＰ−９が検出可能であった（図２Ｄ、図５Ａ）。これらのデータは、骨髄抑制後の再生期中のＢＭ細胞におけるＭＭＰの活性化と関連付けられる。
【０１０９】
プラスミンがＭＭＰ類を活性化するのであれば、ＭＭＰ−９に制御される幹細胞活性サイトカインであるＫｉｔＬ（非特許文献１）の血漿レベルは、５−ＦＵ処置後のＰｌｇ−／−マウスで低いはずである。これは実際そのとおりであった（図２Ｅ）。組換えＫｉｔＬを毎日注射すると、骨髄抑制後のＰｌｇ−／−マウスの生存が部分的に回復し（図２Ｆ）、そしてＢＭ細胞回復が促進された（図２Ｇ、Ｈ）。これにより、本発明者らは、Ｐｌｇ−／−マウスにおいて、造血回復が欠如していることを、ＫｉｔＬ放出が損なわれていることに関連付けることが可能となった。したがって、Ｐｌｇ−／−マウスにおける造血回復欠損は、部分的に、造血ニッチを補充するのに必要な十分量の可溶性ＫｉｔＬが産生不能であることによって、説明可能である。
【０１１０】
実施例４
本実施例では、活性ＭＭＰ−９を増加させる因子を用い、ＰｌｇがＭＭＰを介して幹細胞動員を引き起こしているかを検討した。
【０１１１】
プラスミンがＭＭＰ類を活性化するのならば、Ｐｌｇ−／−マウスでは、これらの因子による幹細胞動員が損なわれているはずである。実際、Ｐｌｇ−／−マウスでは、組換えＳＤＦ−１が誘導する（非特許文献１４）、活性ＭＭＰ−９（図３Ａ）、プロＭＭＰ−９（図５Ｂ）、ＷＢＣ（図３Ｂ）および造血前駆体（図３Ｃ）の増加が欠損していた。同様に、血管新生因子ＶＥＧＦを投与すると、先に報告されたように（非特許文献１２）、Ｐｌｇ＋／＋マウスにおいては、血漿中のプロＭＭＰ−９（図５Ｃ）および活性ＭＭＰ−９（図５Ｄ）が増加し、そしてＷＢＣ数（図３Ｄ）、造血前駆体（図３Ｅ）が増大したが、Ｐｌｇ−／−マウスではそれほどではなかった。ＭＳ−５間質細胞をＶＥＧＦと一晩インキュベーションすると、ＲＴ−ＰＣＲによれば、ｔＰＡ遺伝子発現が上方制御された（データ未提示）。これらのデータによって、ケモカインおよび血管新生因子が、Ｐｌｇ（おそらくｔＰＡを介して）およびＭＭＰ類の両方を活性化することによって、幹細胞動員を促進することが示唆される。
【０１１２】
実施例５
本実施例では、マウスにｔＰＡを投与することにより、造血幹細胞または前駆体を循環内に動員可能であるか、または造血幹細胞を増殖可能であるかを確認した。
【０１１３】
野生型マウスに組換えｔＰＡを毎日注射すると、造血前駆体（コロニー形成単位細胞、ＣＦＵ−Ｃ）（図３Ｆ）およびより未成熟な造血幹細胞（ＣＦＵ−脾臓、ＣＦＵ−Ｓ）が循環内に動員され（図３Ｇ）、そしてＢＭ細胞充実度（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）が増加した（図３Ｈ）。これらのデータは、ｔＰＡ処置がＢＭ細胞増殖を増加させることを示唆する。実際、キャリアで処置した動物に比較して、ｔＰＡで処置したマウスのＢＭでは、より多くのＢＭ  Ｓｃａ−１＋細胞が細胞周期のＳ期に進入した（図３Ｉ）。Ｐｌｇの非存在下では、ｉｎ  ｖｉｖｏで、Ｇ０／Ｇ１期からＳ期への細胞周期進行が妨げられた（図１Ｈ）。これらのデータは、ｔＰＡ−Ｐｌｇ軸が造血細胞周期進行を調節することを示唆する。
【０１１４】
実施例６
本実施例では、ｔＰＡが仲介する細胞動員がＭＭＰ−９活性化に依存していることを確認した。
【０１１５】
具体的には、組換えｔＰＡを投与すると、ＢＭ中のＭＭＰ−９が上方制御された（図３Ｊ）。しかし、ＭＭＰ−９欠損マウスに、組換えｔＰＡと同時に５−ＦＵを投与すると、ＢＭ再生低下が示された（図３Ｋ）。合成広範囲ＭＭＰ阻害剤（ＭＰＩ）もまた、ｔＰＡが仲介する前駆体および幹細胞動員を遮断した（データ未提示）。これによって、ｔＰＡの効果が、プラスミン仲介性ＭＭＰ−９活性化を介して仲介されることが示される。
【０１１６】
実施例７
本実施例では、ＰｌｇがＫｉｔＬの放出に重要であることを確認した。
ＰｌｇがＫｉｔＬ放出に重要であり、そしてｔＰＡがＰｌｇをプラスミンに変換するのならば、ｔＰＡで処置した動物では、ＫｉｔＬ血漿レベルの増加が見出されるはずである。これは実際、Ｐｌｇ＋／＋マウスにおいて、ｔＰＡ処置後に見られ（図３Ｌ）、一方、ｔＰＡで処置したＰｌｇ−／−マウスでは、ＫｉｔＬ血漿レベルはわずかに上昇したのみであった（図５Ｅ）（図４Ｎ）。これらのデータによって、ｔＰＡは、プラスミノーゲン依存方式で、ＫｉｔＬ放出を改善することが示唆される。Ｐｌｇ経路がＢＭ幹細胞増殖および分化に重要であるならば、Ｐｌｇ−／−マウスには、欠陥が見られる可能性もある。Ｐｌｇ−／−マウスは、ｃ−Ｋｉｔ高発現Ｌｉｎ−細胞数が減少しており、これは、野生型対照に比較して、未成熟細胞が多いことを反映する（図４Ａ）。Ｌｉｎ−（大部分ｃ−Ｋｉｔ高）発現細胞のｃ−Ｋｉｔ強度は、ＫｉｔＬ処置後に有意に減少し、ｃ−Ｋｉｔ低発現細胞の集積を生じた。ｔＰＡで処置すると、ｌｉｎ−Ｐｌｇ＋／＋細胞上のｃ−Ｋｉｔ発現はわずかに減少したが、ｌｉｎ−Ｐｌｇ−／−細胞には影響はなかった。一方、ｌｉｎ−（大部分ｃ−Ｋｉｔ高）発現細胞をｔＰＡおよびＫｉｔＬとインキュベーションすると、Ｐｌｇ＋／＋細胞ではｃ−Ｋｉｔ強度が劇的に減少し、ｃ−Ｋｉｔ低発現細胞の集積を生じたが、Ｐｌｇ−／−細胞ではこうした現象はなかった。これらのデータは、プラスミノーゲンの活性化が、ｃ−Ｋｉｔ／ＫｉｔＬ発現およびシグナル伝達を改変し、おそらくそれによって幹細胞の運命を変化させることを初めて示す。
【０１１７】
実施例８
本実施例では、Ｐｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−マウスのサイド・ポピュレーション細胞を検討することにより、Ｐｌｇの幹細胞数に与える影響を確認した。
【０１１８】
本発明者らは、ネズミＨＳＣ数の測定値として、ネズミ・サイド・ポピュレーション細胞（ＳＰ細胞）を評価した。実際、Ｐｌｇ−／−マウス中のＳＰ細胞数は、Ｐｌｇ＋／＋マウスにおけるよりも少なかった（図５Ｆ）。Ｐｌｇ−／−マウスにおける幹細胞欠損は、Ｐｌｇ−／−  ＢＭ細胞が、野生型対応物よりも少ない長期培養始原細胞（ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）（ＬＴＣ−ＩＣ）を生じることを示すことによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで確認された（図５Ｇ）。さらに、骨髄移植アッセイにおいて、白血球抗原Ｌｙ５．２を発現するまたはＰｌｇ−／−  ＢＭ細胞が、Ｌｙ５．１を発現するＢＭ細胞を含む移植と競合する、Ｌｙ５．１競合移植アッセイでは、移植の４週間後および１７週間後に分析したＬｙ５．１＋／Ｌｙ５．２＋細胞比は、野生型対照に比較して、Ｐｌｇ−／−マウスにおいて、より高かった（それぞれ、１．０、１．０対０．４および０．４）。これらのデータを総合すると、Ｐｌｇ−／−マウスにおけるＨＳＣ数は、Ｐｌｇ＋／＋対照におけるより少ないことが示される。
【０１１９】
実施例９
本実施例では、ｔＰＡが、幹細胞数に影響を及ぼすのに加えて、幹細胞微小環境／幹細胞ニッチを調節するかどうかをインビトロで検討した。
【０１２０】
ＤｅｘｔｅｒによってネズミＢＭ用に開発された長期培養系（非特許文献１５）は、微小環境の構成要素を決定する、古典的なアッセイである。長期培養において、原始的な造血細胞は、間質層と会合し、そして典型的には、適切な培養条件を用いると何週間も骨髄前駆体および成熟顆粒球を生成可能である。
【０１２１】
ｔＰＡは、ＭＳ−５間質細胞株の存在下で、培養中のＬｉｎ−細胞の生存および増殖を改善した（図４Ｂ）。ｔＰＡおよびＫｉｔＬは、これらの間質細胞に基づく培養において、相乗作用して、前駆体数（細胞増殖）を増大させた。これらのデータを総合すると、ｔＰＡが、Ｐｌｇ依存方式で、間質由来因子（単数または複数）の放出を促進することによって、前駆細胞増大を調節可能であることが暗示される。
【０１２２】
実施例１０
本実施例では、ＢＭ細胞がＰｌｇまたはＰｌｇ活性体を産生可能であるかを研究した。その結果、ｔＰＡの投与により、免疫反応性Ｐｌｇおよび免疫反応性ＭＭＰ−９が発現することを確認した。
【０１２３】
Ｐｌｇ  ｍＲＮＡは肝臓細胞にのみ検出可能であり、新鮮なままで単離されたＢＭ  Ｌｉｎ−細胞またはｌｉｎ＋細胞あるいは培養ＢＭ間質には検出できなかった（図４Ｈ）。一方、ｔＰＡは、Ｐｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−マウスの両方のＢＭ間質細胞および培養ＭＳ−５間質細胞において強く発現し、そして新鮮なままで単離されたＰｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−マウス両方のｌｉｎ＋細胞またはＬｉｎ−細胞では弱く発現していた。
【０１２４】
ｔＰＡがＰｌｇを活性化可能であるので、本発明者らは、ｔＰＡは同様にＢＭ間質細胞においてＭＭＰを活性化可能であると結論づけた。活性化ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２も、組換えｔＰＡとインキュベートされたＭＳ−５（図４Ｉ）およびＰｌｇ＋／＋の動物からの新鮮なままで単離されたｌｉｎ＋細胞（図４Ｊ）でのザイモグラフィーにより検出された。免疫反応性Ｐｌｇは、洞様ＢＭ血管の非常に近くに組換えｔＰＡを注射後１時間で検出可能であり（図４Ｋ）、一方、ｔＰＡで処理した動物のＢＭにおける造血細胞および間質細胞は、免疫反応性ＭＭＰ−９を発現した（図４Ｌ）。
【０１２５】
実施例１１
本実施例では、ｔＰＡ処理によりＫｉｔＬの放出が増大することを確認した。
潜在的な間質由来因子の１つがＫｉｔＬである。したがって、本発明者らは、ＫｉｔＬを発現する接着性間質細胞（ＭＳ−５）等（非特許文献１）を、血清不含培養中、ｔＰＡで処理した。ｔＰＡ処理は、ＭＳ−５間質細胞（図４Ｃ）および初代ＢＭ間質細胞（図４Ｍ）からのＫｉｔＬ放出を有意に増大させた。ｔＰＡの天然阻害剤であるＰＡＩ−１でＭＳ−５間質細胞を処理すると、ＫｉｔＬ放出は、対照上清におけるより低かった。これらのデータによって、ＭＳ−５細胞はまた、ｔＰＡも発現して、ＫｉｔＬの安定した状態の放出を維持していることが示唆された。実際、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＭＳ−５細胞中にｔＰＡ  ｍＲＮＡが見出された（データ未提示）。重要なことに、ｔＰＡが仲介する、間質細胞からのＫｉｔＬの放出は、ＭＭＰ活性化を介して起こった：ＭＭＰ阻害剤を添加すると、間質細胞からのＫｉｔＬ放出は完全に阻害された。これらのデータは、ｔＰＡで処置した動物の血漿をＫｉｔＬに関して分析することによって、ｔＰＡがＫｉｔＬの放出をｉｎ  ｖｉｖｏで促進することを示した、我々の初期のデータ（図５Ｅ）を裏付けた。
【０１２６】
実施例１２
本実施例では、ｔＰＡが造血増殖因子として作用可能であるかを評価するために、インビトロおよびインビボの両方でのＨＳＰＣ（造血幹細胞／前駆細胞）増大を評価し、ｔＰＡの投与によりＣＦＵ−Ｓ等の細胞が増殖することを確認した。
【０１２７】
インビボのｔＰＡ投与は、野生型コントロールにおけるＢＭ細胞数を有意に増大させたが、これはＰｌｇ欠損およびＭＭＰ−９欠損マウスの両方で弱められた（図６Ａ）。ｔＰＡは、処理動物の未熟な脾臓コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｓ）（図６Ｂ）、および長期培養開始細胞（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）（ＬＴＣ−ＩＣ、図６Ｃ）の数、およびＢＭ細胞のｃ−Ｋｉｔ＋／Ｓｃａ−１＋／ｌｉｎ−（ＫＳＬ）細胞比率（図６Ｄ）を増やした。長期間のｔＰＡの投与は、持続的に上記の定常値と同様のＢＭ細胞数を維持した（図６Ｅ）。これらのデータは、ｔＰＡは、前駆体増殖および細胞分化に影響する造血増殖因子として作用しうることを示す。
【０１２８】
ｔＰＡ仲介造血細胞増殖および分化がインビボでＫｉｔＬに依存するかを試験するために、本発明者らはＫｉｔ−Ｌ欠損Ｓ１／Ｓ１ｄマウスおよびＷＢＢ６Ｆ１＋／＋コントロールマウスをｔＰＡで処理した。ＢＭ細胞充実度（図６Ｆ）および未熟ＣＦＵ−Ｓ前駆細胞の数（図６Ｇ）は、ＷＢＢ６Ｆ１＋／＋動物ではｔＰＡ投与後２日までに増加したが、Ｓ１／Ｓ１ｄマウスでは増加しなかった。まとめると、これらの実験は、ｔＰＡが造血細胞分化および増殖をＢＭ間質細胞／ＢＭニッチ細胞により提供されるＫｉｔＬを放出することにより促進することが示された。
【０１２９】
実施例１３
本実施例では、ＰｌｇおよびＭＭＰ−９がｔＰＡ仲介ＢＭ再構成に必要であるがどうかを検討し、ｔＰＡの造血再構成の効果にはＰｌｇおよびＭＭＰ−９が必要であることを確認した。
【０１３０】
ｔＰＡ仲介性造血がＰｌｇおよび／またはＭＭＰ−９を必要とするかという疑問を解決するために、本発明者らは、５−ＦＵでＰｌｇおよびＭＭＰ欠損マウスを処理し、そして毎日組換えｔＰＡと共にまたはなしで処理した。しかしながら、ｔＰＡは、Ｐｌｇ欠損マウスにおける生存性（図７Ａ）、またはＷＢＣの回復（図７Ｂ）、そしてＢＭ細胞の数（図７Ｃ）を改善しなかった。興味深いことに、組換えｔＰＡをＰｌｇ野生型マウスの骨に近い領域、骨芽細胞ニッチに投与した後に、強いＰｌｇ／プラスミン染色が免疫組織化学により検出された（図７Ｄ）。
【０１３１】
同様に、５−ＦＵ処理ＭＭＰ−９欠損マウスにおいて、ＢＭ細胞（図７Ｅ）またはＷＢＣ（図３Ｋ）の回復は遅れ、そして組換えｔＰＡを毎日投与することでレスキューすることはできなかった。造血回復が遅れ、そしてＭＭＰ−９−／−マウスの約７０％の死をもたらしたが、これはｔＰＡの投与により妨げることはできなかった（図７Ｆ）。したがって、骨髄抑制後のｔＰＡの造血再構成に対する効果は、ＰｌｇおよびＭＭＰ−９の両方の存在を必要とする。
【０１３２】
実施例１４
本実施例では、造血細胞に対する観察されたｔＰＡの効果が、ｔＰＡにより直接的にまたは非直接的（例えば、ＢＭニッチ中の間質細胞を経由して）に仲介されるかどうかを解明するために、本発明者らはインビトロにおける造血細胞増大に対するｔＰＡの効果を調べた。その結果、ｔＰＡは、間質細胞をフィーダー細胞として使用することにより、インビトロにおける造血幹細胞の増殖を引き起こすことを確認した。
【０１３３】
ｔＰＡは、間質細胞に基づいた培養（ＭＳ−５フィーダー層）においてのみＬｉｎ−細胞の増殖を改善したが（図８Ａ）、フィーダー層なしでは改善しなかった（図８Ｂ）。相乗効果で、ｔＰＡとＫｉｔＬは、これらの間質細胞に基づいた培養における前駆体の数を増大する。比較可能な数の前駆体コロニーが、Ｐｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−ｌｉｎ細胞を用いた培養において現れた（図８Ａ、図３ＪおよびＫ）。これらのデータは、ｔＰＡはＫｉｔＬのような間質由来因子の放出を促進することにより、前駆体細胞の増大を調節しうることを示す。
【０１３４】
実施例１５
本実施例では、ｔＰＡ処置後のｃ−Ｋｉｔ／ＫｉｔＬシグナル伝達が細胞増殖を促進するか否かを確認した。
【０１３５】
ｔＰＡ処置後のｃ−Ｋｉｔ／ＫｉｔＬシグナル伝達が細胞増殖を促進するのであれば、シグナル伝達を遮断すると、ｔＰＡが誘導する前駆体増大／増殖が妨げられるはずである。ｃ−Ｋｉｔおよび／またはＫｉｔＬに対する中和抗体を添加すると、間質細胞に基づく培養において、ｔＰＡが仲介するＬｉｎ−細胞からのＣＦＵ−Ｃ生成が妨げられた（図４Ｄ）。同様に、これらの培養にＰＡＩ−１を添加すると、ｔＰＡが仲介するＣＦＵ−Ｃ生成が消滅した。ｔＰＡは、ＢＭ間質細胞において、プラスミン生成を介してＭＭＰ類も活性化するため、ｔＰＡが仲介する幹細胞増殖がＭＭＰ活性化に依存するのかどうかという疑問が生じる。本発明者らのｉｎ  ｖｉｖｏデータを裏付けることに、合成ＭＰＩを添加した場合、前駆体産生が完全に遮断され、そしてｔＰＡが仲介する前駆体増大が妨げられた。これらのデータによって、ｔＰＡが、プラスミンが仲介するＭＭＰ類の活性化、およびＫｉｔＬ放出を介して、幹細胞の運命を調節可能であることが示唆される。
【０１３６】
実施例１６
本実施例では、ｔＰＡは間質細胞存在下で効果を有したので、Ｐｌｇ欠損マウスにおいて観察された造血欠損が間質／ニッチ欠損のためであるかを調べた。その結果、Ｐｌｇ−／−マウスにおける造血細胞分化および増殖の減少に、ＢＭニッチにおけるＰｌｇの存在が重要であることが示された。
【０１３７】
ＣＤ４５．１ドナー細胞をＰｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−レシピエントに移植したとき、移植後８０日でのＰＢ白血球に対するドナー細胞の寄与は、Ｐｌｇ−／−マウスにおいてより低かった（図８Ｃ）。このことは、限定細胞希釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）で特に明らかであり、そしてＰｌｇ−／−レシピエントマウスにおけるドナー細胞の移植後８０日でのマウス生存の減少と関連した（図８Ｄおよび図８Ｅ）。これらのデータは、ＢＭニッチ欠損におけるＰｌｇの欠失が、Ｐｌｇ−／−マウスにおける造血細胞分化および増殖の減少に重要であることを示唆する。
【０１３８】
実施例１７
本実施例では、ＢＭ再構成のためには、ＢＭニッチ中のＰｌｇの存在が重要であることが示された。
【０１３９】
Ｐｌｇ欠損微小環境における幹細胞の細胞増殖の減少の問題を解消するために、本発明者らはＰｌｇ−／−またはＰｌｇ＋／＋マウス由来の非常に多くのＢＭ細胞（２ｘ１０７細胞／マウス）を、致死量の放射線を放射されたＰｌｇ−／−またはＰｌｇ＋／＋マウス中に移植した。このような条件下で、すべてのマウスは生存し、そして白血球数により決定されるように４週後には移植体を示した（ＷＴマウスに移植されたＷＴ細胞は７９３３±９４５／μｌ（血液）、ＷＴマウスに移植されたＫＯ細胞は７１３３±１８１５、ＫＯマウスに移植されたＷＴ細胞は６４００±１６９７、ＫＯマウスに移植されたＫＯ細胞は７７００±１５５６／μｌ（血液））。次いで、キメラマウスを骨髄抑制剤５−ＦＵで処理した。Ｐｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−ＢＭドナー細胞のいずれかを移植したＰｌｇ欠損マウスは、骨髄抑制の誘導後最初の２週間で死亡した（図８Ｆ；１グループにつきｎ＝９）。反対に、Ｐｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−ＢＭドナー細胞を移植したすべてのＰｌｇ野生型マウスは生存し（１グループにつきｎ＝９）、このことは非造血区画であるＢＭニッチにおけるＰｌｇの重要な役割を強調する。次いで、本発明者らは、減少した生存性およびＰｌｇ欠損ＢＭニッチ内の幹細胞の分化がＫｉｔＬの産生の減少のためであり、これが細胞増殖および分化の減少をもたらすかどうかを調べた。興味深いことに、Ｐｌｇ＋／＋レシピエントコントロールと比較して、より低いＫｉｔＬレベルがＰｌｇ−／−レシピエントキメラマウス中で検出された（図８Ｇ）。これらのデータは、５−ＦＵでの骨髄抑制後のＢＭ再構成のために、ＢＭニッチのＰｌｇ成分からのＫｉｔＬ放出の重要性を強調する。
【０１４０】
Ｐｌｇのフィブリンへの結合は、Ｐｌｇ活性を増進する（非特許文献１８および１９）。骨髄抑制後の野生型動物由来のＢＭ切片の免疫組織化学染色は、Ｐｌｇと同様にフィブリンが、最近骨芽細胞ニッチと言われる領域である骨の内側の骨芽細胞の非常に近くに検出されたことを明らかにした（非特許文献２０および２１）（図８Ｈ）。フィブリンの沈着は、骨髄抑制ストレス後のＰｌｇ−／−のＢＭ中で観察され、Ｐｌｇ＋／＋マウスでより少ない程度ではあるが観察された。これらのデータは、ｔＰＡ、Ｐｌｇおよびフィブリンが骨芽ニッチ内に共に会合し、例えば、骨髄抑制後に線溶複合体の規則正しい局所活性をもたらすことを示唆する（図８Ｉ）。この線溶複合体は、今度はＭＭＰのような他のプロテアーゼのカスケードをさらに活性化可能であり、そして増殖因子を生物学的に利用可能にし、細胞リクルートおよび細胞分化を促進することを助ける。
【０１４１】
実施例１８
本実施例では、ｉｎ  ｖｉｖｏの長期造血を維持するために、どの細胞構成要素がＰｌｇに依存しているのかを理解するため、本発明者らは、Ｐｌｇ−／−マウスまたはＰｌｇ＋／＋マウス由来のＢＭを、致死的に放射線照射したＰｌｇ−／−マウスまたはＰｌｇ＋／＋マウスに移植することによって、キメラを発展させた。
【０１４２】
血球数によって決定されるように、５週間後、すべてのマウスが移植を示した。Ｐｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−  ＢＭドナー細胞のいずれかを移植したＰｌｇ欠損マウス（群あたりｎ＝３）の３分の２は、２ヶ月以内に死んだ。対照的に、Ｐｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−  ＢＭドナー細胞のいずれかを移植したＰｌｇ野生型マウスはすべて生存し（群あたりｎ＝３）、間質区画内の宿主Ｐｌｇが非常に重要な役割を持つことが強調された。ＢＭ移植の５週間後、血漿ＫｉｔＬレベルは、移植細胞（Ｐｌｇ＋／＋ドナー細胞２２０ｎｇ／ｍｌ対Ｐｌｇ−／−ドナー細胞２３１ｎｇ／ｍｌ）とは独立に、Ｐｌｇ＋／＋レシピエント・マウスにおけるものと同様であった。一方、Ｐｌｇ−／−レシピエント・マウスにＰｌｇ＋／＋ドナー細胞（１３６ｎｇ／ｍｌ）またはＰｌｇ−／−ドナー細胞（１５６ｎｇ／ｍｌ）を移植した後、血漿ＫｉｔＬレベルはより低かった。これらのデータは、ＢＭ間質ニッチの調節を介した造血制御において、Ｐｌｇが非常に重要な役割を有することを強調し、そしてｔＰＡが、ＫｉｔＬのような増殖因子を放出させ、ｔＰＡとＫｉｔＬの両方が幹細胞プールを調節することによって、幹細胞ニッチ／微小環境を調節可能であるという我々の現在のモデルと一致する。
【０１４３】
実施例１９
本実施例では、フィブリノーゲン／フィブリンとＰｌｇ／プラスミンの２つの系が幹細胞ニッチに与える影響を検討した。
【０１４４】
ｔＰＡは、フィブリンの非存在下では、Ｐｌｇの非効率的な活性化因子であるが、フィブリンの存在下では、Ｐｌｇの活性化が非常に増強される（非特許文献１８、１９および２２）。フィブリンは、ＢＭ表面に沿って沈着する（非特許文献２２）。本発明者らは、骨髄抑制ストレス後、ＭＳＢ三色染色によって決定されるように、Ｐｌｇ−／−のＢＭ中に広範囲にフィブリンが沈着するが、Ｐｌｇ＋／＋マウスではより低い度合いであることを見出した（図４Ｅ）。骨髄抑制後、幹細胞が常在するＢＭ領域中に、免疫組織化学染色によって、フィブリンが検出可能であった（図４Ｆ）：初期回復期中（骨髄抑制の３日後）、幹細胞は骨芽細胞と近接して（骨芽細胞ニッチ）常在し、そして後の時点（骨髄抑制の＞６日後）では、血管ニッチと称される（非特許文献２０）、骨髄腔の中央領域により多く見られる。我々のデータは、ＢＭにおけるフィブリノーゲン／フィブリン対Ｐｌｇ／プラスミンという２つの対抗する系の間のバランスが幹細胞プールを制御可能であることを示唆する。
【０１４５】
造血微小環境内の細胞遊走は、血液形成および血液細胞機能に非常に重要である。本発明者らの結果によって、ｔＰＡによるプラスミノーゲン活性化が、造血細胞におけるこの機能の重要な制御因子であることが示される（図４Ｇ）。ＭＭＰ類の連続活性化を伴う、ｔＰＡによるプラスミノーゲン活性化は、特に幹細胞遊走、増殖および分化に関して、ユニークな生理学的役割を果たす。本発明者らは、２つの別個のプロテアーゼ系の活性化を伴うカスケードが、幹細胞プールおよび幹細胞ニッチからのその脱出の調節に非常に重要な役割を果たすと結論付ける。
【０１４６】
また、ｔＰＡはＢＭ細胞により発現され、そしてＰｌｇはフィブリンと類似のニッチに発見される（図８Ｉ）。フィブリンは、ＰｌｇおよびｔＰＡを含む線溶複合体を、ＨＳＰＣが存在すると考えられるＢＭニッチの領域に局在させる。Ｐｌｇ／プラスミン系の活性化は、もう１つの重要なプロテアーゼカスケード、即ちＭＭＰを活性化しうる。ＭＭＰ−９の活性化は、ＫｉｔＬのような増殖因子を放出し、今度はこれが幹細胞ニッチ内の細胞増殖および分化を促進する。この過程は、ＢＭ内の造血細胞および末梢血を補充するのに役立つ。成人の造血の制御における線溶系の関与は、病態生理学および癌治療および再生医療に対する重要な示唆を持つ新たなパラダイムを表す。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１Ａ】図１Ａは、プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）＋／＋マウス（ｎ＝９）およびＰｌｇ−／−マウス（ｎ＝９）に単回用量の骨髄抑制剤５−ＦＵをｉ．ｖ．投与した後の、マウスの生存の評価を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）＋／＋マウス（ｎ＝９）およびＰｌｇ−／−マウス（ｎ＝９）に単回用量の骨髄抑制剤５−ＦＵをｉ．ｖ．投与した後の、ＷＢＣ数を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）＋／＋マウス（ｎ＝９）およびＰｌｇ−／−マウス（ｎ＝９）に単回用量の骨髄抑制剤５−ＦＵをｉ．ｖ．投与した後の、血小板数を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）＋／＋マウス（ｎ＝９）およびＰｌｇ−／−マウス（ｎ＝９）に単回用量の骨髄抑制剤５−ＦＵをｉ．ｖ．投与した後の、大腿あたりのＢＭ単核細胞（ＢＭＭＣ）総数を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）＋／＋マウス（ｎ＝９）およびＰｌｇ−／−マウス（ｎ＝９）に単回用量の骨髄抑制剤５−ＦＵをｉ．ｖ．投与した後の、示した日でのＢＭ切片のＨ＆Ｅ染色を示す。倍率ｘ２００。
【図１Ｆ】図１Ｆは、プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）＋／＋マウス（ｎ＝９）およびＰｌｇ−／−マウス（ｎ＝９）に単回用量の骨髄抑制剤５−ＦＵをｉ．ｖ．投与した後に、骨髄マーカーＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣおよびＧｒ−１−ＰＥに関してＢＭ細胞を染色し、そしてＦＡＣＳによって分析した図を示す（上部パネル）。大腿あたりのＣＤ１１ｂ＋／ＧＲ−１＋  ＢＭ細胞の絶対数を示す（下部パネル；ｐ＜０．０５）。
【図１Ｇ】図１Ｇは、プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）＋／＋マウス（ｎ＝９）およびＰｌｇ−／−マウス（ｎ＝９）に単回用量の骨髄抑制剤５−ＦＵをｉ．ｖ．投与した後の、細胞倍数性をＦＡＣＳにより示す。
【図１Ｈ】図１Ｈは、５−ＦＵ処置後、示した時点で、ＢＭ細胞のＤＮＡ含量を示す。（ｎ＝３／群および時点）。＊ｐ＜０．０５。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスに単回用量の５−ＦＵをｉ．ｖ．注射した（各群、ｎ＝１２）後の、Ｐｌｇおよびプラスミンをウェスタンブロット分析によって検出した結果を示す（１時点あたり３匹の動物由来のプールした血漿）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、５−ＦＵ注射後、異なる時点でＢＭ細胞（１時点あたり３匹のマウス由来）を得て、そして血清不含培地中で一晩培養した後の、ゼラチン酵素電気泳動法による、プロＭＭＰ−９（１０３ｋＤａ）、活性ＭＭＰ−９（８６ｋＤａ）、並びにプロＭＭＰ−２（７２ｋＤａ）および活性ＭＭＰ−２（６２ｋＤａ）の発現量を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、５−ＦＵ注射９日後のプロＭＭＰ−９に関するＢＭ切片の免疫組織化学を示す。倍率ｘ２００。Ｐｌｇ＋／＋マウスのＢＭ区画には陽性染色があるが、Ｐｌｇ−／−マウスでは陽性染色がない。
【図２Ｄ】図２Ｄは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスに単回用量の５−ＦＵをｉ．ｖ．注射した後の、末梢血（ＰＢ）から得た血漿における、活性ＭＭＰ−９量を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスに単回用量の５−ＦＵをｉ．ｖ．注射した後の、末梢血（ＰＢ）から得た血漿における、ＫｉｔＬ量を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスを未処置で放置する（ｎ＝８）か、または組換えＫｉｔＬの毎日のｉ．ｖ．注射と組み合わせて、これらのマウスに５−ＦＵを単回ｉ．ｖ．注射した（ｎ＝６）。処置動物の生存を毎日決定した（ｎ＝６、ｐ＜０．０５）。
【図２Ｇ】図２Ｇは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスを未処置で放置する（ｎ＝８）か、または組換えＫｉｔＬの毎日のｉ．ｖ．注射と組み合わせて、これらのマウスに５−ＦＵを単回ｉ．ｖ．注射した（ｎ＝６）。大腿あたりのＢＭ細胞総数を示す。
【図２Ｈ】図２Ｈは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスを未処置で放置する（ｎ＝８）か、または組換えＫｉｔＬの毎日のｉ．ｖ．注射と組み合わせて、これらのマウスに５−ＦＵを単回ｉ．ｖ．注射した（ｎ＝６）。５−ＦＵ処置１０日後のＢＭ切片のＨ＆Ｅ染色を示す。倍率ｘ２００。＊ｐ＜０．０５。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスに、第０日〜第５日、組換えＳＤＦ−１をｉ．ｐ．注射した（各群、ｎ＝６匹のマウス）後の、血漿中の活性ＭＭＰ−９を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスに、第０日〜第５日、組換えＳＤＦ−１をｉ．ｐ．注射した（各群、ｎ＝６匹のマウス）後の、ＷＢＣ数を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスに、第０日〜第５日、組換えＳＤＦ−１をｉ．ｐ．注射した（各群、ｎ＝６匹のマウス）後の、動員されたＣＦＵ−Ｃ数を示す。（群あたりｎ＝３）。動員されたＰＢＭＣをコロニーアッセイで評価した。
【図３Ｄ】図３Ｄは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスに、第０日〜第５日、組換えＶＥＧＦを毎日ｉ．ｐ．注射した（群あたりｎ＝６匹のマウス）後の、ＷＢＣ数を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスに、第０日〜第５日、組換えＶＥＧＦを毎日ｉ．ｐ．注射した（群あたりｎ＝６匹のマウス）後の、ＰＢＭＣ中のＣＦＵ−Ｃ数を示す。
【図３Ｆ】図３Ｆは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、組換えｔＰＡまたはキャリア対照を毎日ｉ．ｐ．注射した（群あたりｎ＝９）後の、循環ＣＦＵ−Ｃ数を示す。
【図３Ｇ】図３Ｇは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、組換えｔＰＡまたはキャリア対照を毎日ｉ．ｐ．注射した（群あたりｎ＝９）後の、ＣＦＵ−Ｓによって、動員細胞の多分化能を評価した。
【図３Ｈ】図３Ｈは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、組換えｔＰＡまたはキャリア対照を毎日ｉ．ｐ．注射した（群あたりｎ＝９）後の、大腿あたりのＢＭＭＣ数を示す。
【図３Ｉ】図３Ｉは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、組換えｔＰＡまたはキャリア対照を毎日ｉ．ｐ．注射した（群あたりｎ＝９）後に、ＢＭ  Ｌｉｎ−細胞をヨウ化プロピジウムで標識し、そして細胞周期を分析した結果を示す（２回の独立実験、５匹のマウス／時点）。
【図３Ｊ】図３Ｊは、ｔＰＡ処置開始２日後のＢＭ切片中のＭＭＰ−９に関する免疫組織化学を示す（倍率ｘ２００）。
【図３Ｋ】図３Ｋは、ＭＭＰ−９＋／＋マウスおよびＭＭＰ−９−／−マウスに、５−ＦＵの単回用量を注射した後、組換えｔＰＡまたはキャリアを毎日注射した（群あたりｎ＝６）後の、ＷＢＣ数を示す。
【図３Ｌ】図３Ｌは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに組換えｔＰＡまたはキャリアを毎日ｉ．ｐ．注射した後の、血漿ＫｉｔＬレベルを示す（ｎ＝９）。＊ｐ＜０．０５。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウス由来のＬｉｎ−細胞を、ＫｉｔＬを含み／含まず、ｔＰＡの存在下／非存在下で一晩培養した（ｎ＝３）後に、ｃ−Ｋｉｔ抗体で細胞を染色し、そしてＦＡＣＳによって分析した結果を示す。
【図４Ｂ】図４ＢはＰｌｇ＋／＋マウス由来のＬｉｎ−細胞を、ＭＳ−５間質細胞上、ＫｉｔＬを含み／含まず、ｔＰＡの存在下／非存在下で７日間培養した後に、細胞を採取し、そして前駆体アッセイに供した結果を示す（ｎ＝６）。
【図４Ｃ】図４Ｃ：集密ＭＳ−５間質細胞を、血清不含培地中、組換えｔＰＡ、ＰＡＩ−１またはＣＧＳ２７０２３Ａで２４時間処理した。２４時間後、ＥＬＩＳＡによって、放出ＫｉｔＬに関して上清を分析した結果を示す（ｎ＝２）。
【図４Ｄ】図４Ｄ：Ｐｌｇ＋／＋マウス由来のＬｉｎ−細胞を、血清不含培地中、集密ＭＳ−５間質細胞上で培養した（ｎ＝３）。ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、ｃ−ＫｉｔまたはＫｉｔＬに対する抗体、あるいはＭＰＩ（ＣＧＳ２７０２３Ａ）を培養に５日間添加した。次いで、細胞を収集し、そして前駆体アッセイに供した結果を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスの５−ＦＵ処置１０日後のＢＭ切片のＭＳＢ三色染色（矢印：青色フィブリン沈着）を示す。倍率ｘ２００。
【図４Ｆ】図４Ｆは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスを第０日に５−ＦＵでｉ．ｖ．処置した後の、各マウス由来のＢＭ切片におけるフィブリン（緑色蛍光）に関する免疫組織化学染色を示す。
【図４Ｇ】図４Ｇ：図４Ｇは、本発明におけるシグナルカスケードの概要を示す。ｔＰＡはプラスミノーゲンをプラスミンに変換し、そしてＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の産生を促進し、それによってＫｉｔＬが放出される。ｔＰＡ／プラスミノーゲン経路の活性化は、ＫｉｔＬ産生を増加させた。
【図４Ｈ】図４Ｈは、肝臓（レーン１；ｔＰＡに対する正のコントロール）、４週齢のＰｌｇ＋／＋マウス（レーン２）およびＰｌｇ−／−マウス（レーン３）のＢＭ間質、ＭＳ−５細胞（レーン４）、Ｐｌｇ＋／＋マウス（レーン５）またはＰｌｇ−／−マウス（レーン６）由来の新鮮なままで単離されたＢＭ由来Ｌｉｎ−細胞、並びにＰｌｇ＋／＋マウス（レーン７）およびＰｌｇ−／−マウス（レーン８）由来の新鮮なままで単離されたＢＭ由来ｌｉｎ＋細胞におけるｔＰＡおよびＰｌｇに対するＲＴ−ＰＣＲを示す。
【図４Ｉ】ＭＳ−５細胞を無血清状態下ｔＰＡのあり／なしで一晩培養した。図４Ｉは、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９についてザイモグラフィーにより解析した図である。
【図４Ｊ】Ｐｌｇ＋／＋マウス由来のｌｉｎ＋ＢＭＭＣを無血清状態下ｔＰＡのあり／なしで一晩培養した。図４Ｊは、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９についてザイモグラフィーにより解析した図である。
【図４Ｋ】図４Ｋは、ｔＰＡ処理開始後３日後のＰｌｇ＋／＋マウスのＢＭ切片におけるＰｌｇに対する免疫組織化学を示す（倍率ｘ２００）
【図４Ｌ】図４Ｌは、ｔＰＡ処理開始後３日後のＰｌｇ＋／＋マウスのＢＭ切片におけるＭＭＰ−９に対する免疫組織化学を示す（倍率ｘ２００）
【図４Ｍ】Ｐｌｇ＋／＋初代ＢＭ間質細胞を、ｔＰＡありでまたはなしで、組換えｔＰＡ、組換えＰＡＩ−１またはＭＰＩ（ＣＧＳ２７０２３Ａ）の存在下で無血清培地中で培養した。図４Ｍは、この培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＫｉｔＬについて解析した図である。
【図４Ｎ】Ｐｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−マウスに、０−２日に単回のｔＰＡまたはＰＢＳを腹腔内に投与した。ｔＰＡの投与後、各時点で血液を回収した。血漿試料を、ＥＬＩＳＡによりＫｉｔＬについて解析した（ｎ＝６；ＥＬＩＳＡは２回行った）。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスを、第０日の単回注射によって５−ＦＵで処置した後の、プロＭＭＰ−９を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスを、５日間、１日２回の組換えＳＤＦ−１で処置した後の、プロＭＭＰ−９を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスを、５日間、毎日、組換えＶＥＧＦで処置した後の、プロＭＭＰ−９を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、示した時点でＶＥＧＦ注射した後、活性ＭＭＰ−９に関して、血漿試料を分析した結果を示す（群および時点あたり、ｎ＝３）。
【図５Ｅ】図５Ｅは、ｔＰＡまたはＰＢＳ対照のｉ．ｐ．注射で、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウスを処置し、３日後、血液を抜き取った。ＥＬＩＳＡによって、ＫｉｔＬに関して、血漿試料を分析した結果を示す（ｎ＝２）。
【図５Ｆ】図５Ｆは、ベラパミル処理後、ＭｏＦｌｏを用いて、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウス由来の全ＢＭ細胞を分析して、ＳＰ細胞を検出した結果を示す（ｎ＝３、典型的な実験の１つを示す）。
【図５Ｇ】図５Ｇは、Ｐｌｇ＋／＋マウスおよびＰｌｇ−／−マウス由来のＢＭ細胞を長期培養（ＬＴＣ）に供し、そして大腿あたりのＬＴＣ始原細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）数を測定した結果を示す。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｐｌｇ欠損マウス、ＭＭＰ−９欠損マウスおよび同腹のコントロールマウスに、０−２日に腹腔内に組換えｔＰＡを投与し（短期間効果）、ＢＭ細胞を数えた結果を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｐｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−細胞のＢＭ細胞をＣＦＵ−Ｓアッセイで解析した結果を示す（ｎ＝９）。
【図６Ｃ】図６Ｃは、Ｐｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−細胞のＢＭ細胞をＬＴＣ−ＩＣアッセイで解析した結果を示す（ｎ＝９）。
【図６Ｄ】図６Ｄは、Ｐｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−細胞のＢＭ細胞を、ＫＳＬ細胞の存在確認のためＦＡＣＳにより解析した結果を示す（ｎ＝９）。
【図６Ｅ】図６Ｅは、Ｐｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−マウスに、０−５日に組換えｔＰＡを投与し（長期間効果）、そしてＢＭ細胞数を数えた結果を示す（ｎ＝９）。
【図６Ｆ】図６Ｆは、Ｓ１／Ｓ１ｄマウスおよびＷＢＢ６Ｆ１マウスを、ｔＰＡありで／なしで処理したときの、大腿当たりのＢＭ細胞数を示す（ｎ＝５）。
【図６Ｇ】図６Ｇは、Ｓ１／Ｓ１ｄマウスおよびＷＢＢ６Ｆ１マウスを、ｔＰＡありで／なしで処理したときの、１０５細胞当たりのＣＦＵ−Ｓの数を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、Ｐｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−マウスを単回の５−ＦＵ投与に続き毎日組換えｔＰＡまたは担体を投与したときの、Ｐｌｇ＋／＋（１グループにつきｎ＝９）およびＰｌｇ−／−マウス（１グループにつきｎ＝９）の生存率を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、Ｐｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−マウスを単回の５−ＦＵ投与に続き毎日組換えｔＰＡまたは担体を投与したときの、ＷＢＣ数を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、Ｐｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−マウスを単回の５−ＦＵ投与に続き毎日組換えｔＰＡまたは担体を投与したときの、大腿当たりのＢＭ細胞数を示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ｔＰＡを共投与したまたはしないＰｌｇ＋／＋マウスのＢＭ切片を、５−ＦＵ処理の２日後にＰｌｇについて染色した染色図を示す（茶色の染色）。ＢＭ領域のＰｌｇ染色は、骨芽細胞ニッチとも言われる。
【図７Ｅ】図７Ｅは、ＭＭＰ−９＋／＋およびＭＭＰ−９−／−マウスを単回の５−ＦＵ投与に続き毎日組換えｔＰＡまたは担体を投与したときの、大腿当たりのＢＭ細胞数を示す。
【図７Ｆ】図７Ｆは、ＭＭＰ−９＋／＋およびＭＭＰ−９−／−マウスを単回の５−ＦＵ投与に続き毎日組換えｔＰＡまたは担体を投与したときの、生存率を示す。ｎ＝１２。＊ｐ＜０．０５。
【図８Ａ】Ｐｌｇ＋／＋マウス由来のＬｉｎ−細胞を、ＭＳ−５ストローマ細胞上でＫｉｔＬありで／なしで、ｔＰＡの存在下／非存在下で培養した。図８Ａは、その７日後における前駆体アッセイの結果を示す（ｎ＝６）。
【図８Ｂ】ｔＰＡ仲介細胞および前駆体増殖は間質フィーダー層の存在なしで起こらなかった。Ｐｌｇ＋／＋マウス由来のＬｉｎ−細胞を浮遊培養で、ＫｉｔＬありで／なしでｔＰＡの存在／非存在において培養した。図８Ｂは、４日後に回収したときの、細胞数（左）および前駆体アッセイの結果を示す（ｎ＝３）。
【図８Ｃ】ＣＤ４５．１で遺伝的背景が同一なドナーマウスからＢＭ細胞を、限定細胞希釈で致死量の放射線を照射されたＰｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−ＣＤ４５．２＋レシピエントマウスに移植した（ｎ＝６）。図８Ｃは、移植後８０日でのマウスＰＢ細胞ドナ−の寄与（ＣＤ４５．１＋細胞）を評価した図である。
【図８Ｄ】ＣＤ４５．１で遺伝的背景が同一なドナーマウスからＢＭ細胞を、限定細胞希釈で致死量の放射線を照射されたＰｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−ＣＤ４５．２＋レシピエントマウスに移植した（ｎ＝６）。図８Ｄは、Ｐｌｇ＋／＋ＢＭ細胞を受けたＣＤ４５．１レシピエントマウスの生存率を示す（ｎ＝９）。
【図８Ｅ】ＣＤ４５．１で遺伝的背景が同一なドナーマウスからＢＭ細胞を、限定細胞希釈で致死量の放射線を照射されたＰｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−ＣＤ４５．２＋レシピエントマウスに移植した（ｎ＝６）。図８Ｅは、Ｐｌｇ−／−ＢＭ細胞を受けたＣＤ４５．１レシピエントマウスの生存率を示す（ｎ＝８）。
【図８Ｆ】致死量の放射線を照射されたＰｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−マウスに、５−ＦＵ投与前１６日に、Ｐｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−ドナーマウス由来のＢＭ細胞を移植した（各グループで、ｎ＝９）。ＢＭ細胞移植後、０日目に単回の５−ＦＵを投与した。図８Ｆは、移植されたマウスの生存率を示す（Ｐｌｇ＋／＋レシピエントマウスの生存率をＰｌｇ−／−と比べて、＊ｐ＜０．０５）。
【図８Ｇ】致死量の放射線を照射されたＰｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−マウスに、５−ＦＵ投与前１６日に、Ｐｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−ドナーマウス由来のＢＭ細胞を移植した（各グループで、ｎ＝９）。ＢＭ細胞移植後、０日目に単回の５−ＦＵを投与した。そして、５−ＦＵ投与後各時点で血液を回収した。図８Ｇは、血漿試料のＥＬＩＳＡによりＫｉｔＬについて解析した結果である。
【図８Ｈ】致死量の放射線を照射されたＰｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−マウスに、５−ＦＵ投与前１６日に、Ｐｌｇ＋／＋またはＰｌｇ−／−ドナーマウス由来のＢＭ細胞を移植した（各グループで、ｎ＝９）。ＢＭ細胞移植後、０日目に単回の５−ＦＵを投与した。そして、Ｐｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−マウスを、０日に静脈内に５−ＦＵを投与した。図８Ｈは、５−ＦＵで処理したＰｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−マウス由来のＢＭ切片におけるフィブリン（緑色蛍光）およびＰｌｇ（茶色染色）の免疫組織化学の結果である。
【図８Ｉ】ＰｌｇのｔＰＡ仲介活性化が、ＢＭニッチ内での造血ストレスの誘導後にプラスミンの産生をもたらす。このことが、ＭＭＰ特にＭＭＰ−９の活性化をもたらし、それによりＫｉｔＬのようなケモカイン／サイトカインを放出（ｒｅｌｅａｓｅ）／放出（ｓｈｅｄ）する。これらの因子は、幹細胞リクルート、増殖を促進し、ＢＭ再構成を改善しうるだけでなく、細胞動員を制御しうる。＊ｐ＜０．０５。
【図１Ａ】
2008050355.tif 000002
【図１Ｂ】
2008050355.tif 000003
【図１Ｃ】
2008050355.tif 000004
【図１Ｄ】
2008050355.tif 000005
【図１Ｅ】
2008050355.tif 000006
【図１Ｆ】
2008050355.tif 000007
【図１Ｇ】
2008050355.tif 000008
【図１Ｈ】
2008050355.tif 000009
【図２Ａ】
2008050355.tif 000010
【図２Ｂ】
2008050355.tif 000011
【図２Ｃ】
2008050355.tif 000012
【図２Ｄ】
2008050355.tif 000013
【図２Ｅ】
2008050355.tif 000014
【図２Ｆ】
2008050355.tif 000015
【図２Ｇ】
2008050355.tif 000016
【図２Ｈ】
2008050355.tif 000017
【図３Ａ】
2008050355.tif 000018
【図３Ｂ】
2008050355.tif 000019
【図３Ｃ】
2008050355.tif 000020
【図３Ｄ】
2008050355.tif 000021
【図３Ｅ】
2008050355.tif 000022
【図３Ｆ】
2008050355.tif 000023
【図３Ｇ】
2008050355.tif 000024
【図３Ｈ】
2008050355.tif 000025
【図３Ｉ】
2008050355.tif 000026
【図３Ｊ】
2008050355.tif 000027
【図３Ｋ】
2008050355.tif 000028
【図３Ｌ】
2008050355.tif 000029
【図４Ａ】
2008050355.tif 000030
【図４Ｂ】
2008050355.tif 000031
【図４Ｃ】
2008050355.tif 000032
【図４Ｄ】
2008050355.tif 000033
【図４Ｅ】
2008050355.tif 000034
【図４Ｆ】
2008050355.tif 000035
【図４Ｇ】
2008050355.tif 000036
【図４Ｈ】
2008050355.tif 000037
【図４Ｉ】
2008050355.tif 000038
【図４Ｊ】
2008050355.tif 000039
【図４Ｋ】
2008050355.tif 000040
【図４Ｌ】
2008050355.tif 000041
【図４Ｍ】
2008050355.tif 000042
【図４Ｎ】
2008050355.tif 000043
【図５Ａ】
2008050355.tif 000044
【図５Ｂ】
2008050355.tif 000045
【図５Ｃ】
2008050355.tif 000046
【図５Ｄ】
2008050355.tif 000047
【図５Ｅ】
2008050355.tif 000048
【図５Ｆ】
2008050355.tif 000049
【図５Ｇ】
2008050355.tif 000050
【図６Ａ】
2008050355.tif 000051
【図６Ｂ】
2008050355.tif 000052
【図６Ｃ】
2008050355.tif 000053
【図６Ｄ】
2008050355.tif 000054
【図６Ｅ】
2008050355.tif 000055
【図６Ｆ】
2008050355.tif 000056
【図６Ｇ】
2008050355.tif 000057
【図７Ａ】
2008050355.tif 000058
【図７Ｂ】
2008050355.tif 000059
【図７Ｃ】
2008050355.tif 000060
【図７Ｄ】
2008050355.tif 000061
【図７Ｅ】
2008050355.tif 000062
【図７Ｆ】
2008050355.tif 000063
【図８Ａ】
2008050355.tif 000064
【図８Ｂ】
2008050355.tif 000065
【図８Ｃ】
2008050355.tif 000066
【図８Ｄ】
2008050355.tif 000067
【図８Ｅ】
2008050355.tif 000068
【図８Ｆ】
2008050355.tif 000069
【図８Ｇ】
2008050355.tif 000070
【図８Ｈ】
2008050355.tif 000071
【図８Ｉ】
2008050355.tif 000072
【配列表】
2008050355000001.app