(57)【要約】【課題】レオウイルスを用いて化学療法薬剤に対する新生物細胞の感受性を増加させる方法、ならびにレオウイルスおよび化学療法薬剤を用いて増殖障害を処置する方法を提供すること。【解決手段】新生物細胞を感作する方法であって、この方法は、以下：  （ａ）有効量のレオウイルスを上記細胞に投与する工程；および  （ｂ）有効量の化学療法薬剤を上記細胞に投与する工程、を包含する、方法。増殖性障害を有する被験体を処置する方法であって、上記被験体が化学療法薬剤に対して不応性である新生物細胞を含み、上記方法が：（ａ）レオウイルスによる新生物細胞の感染が生じる条件下で、有効量の上記レオウイルスを上記被験体に投与する工程；および、（ｂ）有効量の化学療法薬剤を上記被験体に投与する工程、を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レオウイルスおよび化学療法薬剤を用いて増殖障害を処置するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レオウイルスを用いて化学療法薬剤に対する新生物細胞の感受性を増加させる方法、ならびにレオウイルスおよび化学療法薬剤を用いて増殖障害を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（参考文献）
米国特許第６，１３６，３０７号
ＷＯ  ９４／１８９９２（１９９４年９月１日発行）
ＷＯ  ９４／２５６２７（１９９４年１１月１０日発行）
ＷＯ  ９９／１８７９９（１９９４年４月２２日発行）
【０００３】
【表１】
2008120837.tif 000002
【０００４】
【表２】
2008120837.tif 000003
【０００５】
【表３】
2008120837.tif 000004
【０００６】
【表４】
2008120837.tif 000005
上記の刊行物、特許および特許出願の全ては、各個々の刊行物、特許出願または特許の開示が、詳細かつ個々に、その全体が参考として援用されていることを示しているのと同じ程度に、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０００７】
（発明の背景）
癌は、死亡の主要な原因のうちの１つである。長期間医学的な研究に焦点が当てられてきたが、現在までの主要な癌治療は、手術、放射線治療および化学療法のままである。これらの治療の各々は、容易に克服できない制限に直面しており、改善された治療に対する研究は続いている。
【０００８】
化学療法の１つの重大な問題は、腫瘍が薬物に対して耐性を発生し得るということである。例えば、薬物は、患者に最初に導入される場合、非常に有効であり得、腫瘍細胞を殺
傷し、そして腫瘍の大きさを減少させ、その結果、その患者は、寛解に向かう。しかし、ある期間の後、腫瘍は再増殖し得、そしてこのとき、同じ薬物はその再増殖した腫瘍細胞の殺傷に全く有効でない。この進行性薬物耐性の現象は、大多数の腫瘍は死滅する一方で最初の薬物処置を生き残った、腫瘍中の薬物耐性細胞の小さな集団に起因するものと考えられている。これらの耐性細胞は、最終的に増殖して、薬物耐性細胞のみを本質的に含む腫瘍を形成する。
【０００９】
薬物の組合わせを用いた発症時の処置が、２つ以上の異なる薬物耐性経路を導く変異を同じ細胞中で自発的に発生するというわずかな可能性を考えて、解決策として提案された（ＤｅＶｉｔａ，Ｊｒ．，１９８３）。しかし、１つの薬物に対して耐性である細胞が、しばしば複数の薬物（異なる経路によって腫瘍細胞を殺傷し得る構造的に無関係の薬物を含む）に対して耐性であることが発見された。従って、組合わせ薬物治療は、この問題を解決しない。
【００１０】
機構が完全に明らかとなっているわけではないが、腫瘍細胞における多剤耐性についての最良の文書化され臨床的に関連する機構は、Ｐ−糖タンパク質（ＭＤＲ１遺伝子の産物）の発現と関連する。Ｐ−糖タンパク質は、細胞膜に位置する広範囲の特異性流出ポンプであり、多くの脂肪親和性細胞傷害性薬剤（アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、アクチノマイシンＤおよびタキソール（ｔａｘｏｔｅｒｅ）のような、いくつかの広範に使用される抗癌剤を含む）の細胞内蓄積を低下させることによって機能し、これによって細胞をこれらの薬物に対して耐性にする（Ｐａｓｔａｎら、１９９１）。
【００１１】
ＭＤＲ１に加えて、別の多面発現性薬物トランスポーターが、発見されている（Ｇｒａｎｔら、１９９４）。このタンパク質（多剤耐性関連タンパク質（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＲＰ）と称される）は、ＭＤＲ１遺伝子によってコードされるＰ糖タンパク質トランスポーターに類似した、細胞傷害性薬物（特に、化学療法薬物）に対する耐性パターンを与えることが示されている。その後、漸増する数のＭＲＰ関連タンパク質が、発見された（Ｂｏｒｓｔら、２０００）。その各々が、異なる薬物特異性を有し得るが、それらの生理学的な機能は、完全に知られているわけではない。
【００１２】
従って、薬物耐性の原因は、完全に理解されたわけではなく、そして、より効果的に腫瘍を処置するために、薬物耐性を克服するための方法についての必要性がなおも存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、レオウイルスの使用によって、化学療法薬剤に対する薬物耐性細胞を感作する方法に関する。レオウイルスは、近年、活性化されたｒａｓ経路を用いる細胞中でのレオウイルスの選択的複製に起因してｒａｓ活性化新生物細胞を殺傷するが、正常細胞は殺傷しない、選択的抗癌剤として発見された（米国特許第６，１３６，３０７号；Ｃｏｆｆｅｙら、１９９８；Ｓｔｒｏｎｇら、１９９８）。予期せぬことに、本発明において、レオウイルスは、化学療法薬剤に対する細胞の感受性も同様に増加したことが、本発明においてさらに発見された。従って、シスプラチンに不応性である腫瘍は、シスプラチンとレオウイルスとの組合わせを用いて処置され、そしてその結果は、この組合わせがレオウイルス単独よりも効果的であったことを示した。シスプラチンは、レオウイルスの非存在下で投与された場合、腫瘍に対して何の効果も有さなかったので、この組合わせの効果は、単に個々の効果の相加効果でも相乗効果でもない。むしろ、レオウイルスは、腫瘍が通常不応性である化学療法薬剤に対して腫瘍を感作させた。
【００１４】
従って、本発明の１つの局面は、新生物細胞を感作する方法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）有効量のレオウイルスを上記細胞に投与する工程；および
（ｂ）有効量の化学療法薬剤を上記細胞に投与する工程、
を包含する。
【００１５】
細胞は、好ましくは、ｒａｓ活性化された新生物細胞である。最も好ましくは、レオウイルスは、そのレオウイルスによる新生物細胞の感染を引き起こす条件下で投与される。細胞は、レオウイルスの非存在下で化学療法薬剤の影響を受けやすいが、好ましくは、化学療法薬剤に対して不応性である。
【００１６】
細胞を感作させるために、レオウイルスは、好ましくは、化学療法薬剤の投与前に投与され得る。あるいは、別の好ましい実施形態において、レオウイルスおよび化学療法薬剤は、互いに同時に投与され得る。レオウイルスおよび化学療法薬剤の両方は、単一用量（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ）または複数用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅｓ）で個々に投与され得る。
【００１７】
新生物細胞は、好ましくは哺乳動物中、特に、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒトおよび非ヒト霊長類中に位置する。この細胞は、最も好ましくは、ヒト中に位置する。
【００１８】
本発明は、任意の化学療法薬剤に対して細胞を感作させるために使用され得る。好ましい化学療法薬剤としては、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、メトトレキセート、ヒドロキシウレア、シクロホスファミド、ダカルバジン、ミトザントロン、アントラサイクリン（例えば、エピルビシンおよびドキソルビシン）、カルボプラチン、シスプラチン、タキソール、タキソテール（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、タモキシフェン、抗エストロゲン、およびインターフェロンが挙げられる。より好ましくは、化学療法薬剤は、プラチネート（ｐｌａｔｉｎａｔｅ）またはタキソールである。最も好ましい化学療法薬剤は、シスプラチンである。
【００１９】
レオウイルスは、任意のレオウイルス（哺乳動物レオウイルスおよび鳥類レオウイルスを含む）であり得る。好ましくは、レオウイルスは、哺乳動物ウイルス、特に、ヒトレオウイルスである。ヒトレオウイルスは、好ましくは血清型３レオウイルスであり、そして最も好ましくは、Ｄｅａｒｉｎｇ株血清型３レオウイルスである。
【００２０】
増殖障害を有する被験体を処置する方法もまた、本発明によって提供され、この被験体は、化学療法薬剤に不応性である新生物細胞を含み、この方法は、以下：
（ａ）レオウイルスによって新生物細胞の感染が生じる条件下で、有効量のレオウイルスを被験体に投与する工程；および、
（ｂ）有効量の化学療法薬剤を上記被験体に投与する工程、
を包含する。
【００２１】
レオウイルスは、化学療法薬剤に関連した任意の時間に投与され得る。好ましくは、レオウイルスは、化学療法薬剤の投与の前または化学療法薬剤の投与と同時に投与される。好ましくは、レオウイルスは、複数用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅｓ）で投与される。化学療法薬剤もまた、複数用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅｓ）で投与され得る。レオウイルスが、化学療法薬剤の任意の投与前に、複数用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅｓ）で投与され得ることが、意図される。
【００２２】
被験体は、好ましくは哺乳動物であり、特に、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒトおよび非ヒト霊長類であり、最も好ましくは、ヒトである。
【００２３】
増殖障害は、固形腫瘍であり得、特に、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、腎臓癌、副腎癌、肝臓癌、膵臓癌、乳癌ならびに中枢神経系癌および末梢神経系癌であり得る。固形腫瘍を処置するために、レオウイルスは、例えば、その固形腫瘍への注射もしくはその固形腫瘍付近への注射によってか、または全身投与によって投与され得る。
【００２４】
あるいは、増殖障害は、造血腫瘍、特に、リンパ腫および白血病であり得る。
【００２５】
増殖障害は、もとの腫瘍または転移した腫瘍であり得る。
【００２６】
被験体内の新生物が、化学療法薬剤に対する薬物耐性を発生することを妨害するための方法もまた、提供され、この方法は、以下：
（ａ）レオウイルスによって新生物の感染が生じる条件下で、有効量のレオウイルスを被験体に投与する工程；および、
（ｂ）有効量の化学療法薬剤を上記被験体に投与する工程、
を包含する。
【００２７】
レオウイルスは、化学療法薬剤に関連した任意の時間に投与され得る。好ましくは、レオウイルスは、化学療法薬剤の投与の前または化学療法薬剤の投与と同時に投与される。好ましくは、レオウイルスは、複数用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅｓ）で投与される。化学療法薬剤もまた、複数用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅｓ）で投与され得る。レオウイルスが、化学療法薬剤の任意の投与前に、複数用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅｓ）で投与され得ることが、意図される。
【００２８】
被験体は、好ましくは哺乳動物であり、特に、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒトおよび非ヒト霊長類であり、最も好ましくは、ヒトである。
【００２９】
好ましくは、レオウイルスの投与は、新生物が複数の薬物（構造的に無関係の薬物を含む）に対する薬物耐性を発生するのを妨害する。従って、本発明の好ましい実施形態は、被験体内の新生物が、化学療法薬剤に対する薬物耐性を発生することを妨害するための方法を提供し、ここで、第２の化学療法薬剤に対する薬物耐性もまた妨害され、この方法は、
（ａ）レオウイルスによって新生物の感染が生じる条件下で、有効量のレオウイルスを上記被験体に投与する工程；および、
（ｂ）有効量の化学療法薬剤を上記被験体に投与する工程
を包含する。
【００３０】
本発明の１つの局面は、新生物細胞を感作させる方法、増殖障害を処置する方法、またはレオウイルスと同じ様式で他のウイルスを用いて薬物耐性の発生を妨害する方法を提供する。本発明において有用なウイルスは、好ましくは、選択的に新生物細胞を感染し得る。好ましくは、このウイルスは、改変アデノウイルス、改変ＨＳＶ、改変ワクシニアウイルス、改変パラポックスウイルスｏｒｆウイルス、ｄｅｌＮＳ１ウイルス、ｐ５３発現ウイルス、ＯＮＹＸ−０１５ウイルス、Ｄｅｌｔａ２４ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ｈｒＲ３が欠損した単純疱疹ウイルス１変異体、ニューカッスル病ウイルス、脳炎ウイルス、帯状疱疹ウイルス、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、および麻疹ウイルスからなる群より選択される。より好ましくは、ウイルスは、改変アデノウイルス、改変ＨＳＶ、改変ワクシニアウイルス、改変パラポックスウイルスｏｒｆウイルス、ｄｅｌＮＳ１ウイルス、ｐ５３発現ウイルス、ＯＮＹＸ−０１５ウイルス、Ｄｅｌｔａ２４ウイルス、および水疱性口内炎ウイルスからなる群から選択される。
・本発明はさらに、以下を提供する：
・（項目１）
新生物細胞を化学療法薬剤に対して感作する方法であって、上記方法が：
（ａ）有効量のレオウイルスを上記新生物細胞に投与する工程；および
（ｂ）有効量の化学療法薬剤を上記細胞に投与する工程、
を包含する、方法。
・（項目２）
上記レオウイルスが上記化学療法薬剤の投与の前に投与される、項目１に記載の方法。
・（項目３）
上記レオウイルスが上記化学療法薬剤と同時に投与される、項目１に記載の方法。
・（項目４）
上記新生物細胞が哺乳動物内に位置する、項目１に記載の方法。
・（項目５）
上記哺乳動物が、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒトおよび非ヒト霊長類からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
・（項目６）
上記化学療法薬剤が、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、メトトレキセート、ヒドロキシウレア、シクロホスファミド、ダカルバジン、ミトザントロン、アントラサイクリン、カルボプラチン、シスプラチン、タキソール、タキソテール（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、タモキシフェン、抗エストロゲン、およびインターフェロンからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
・（項目７）
上記化学療法薬剤がシスプラチンである、項目１に記載の方法。
・（項目８）
上記レオウイルスが哺乳動物のレオウイルスである、項目１に記載の方法。
・（項目９）
上記哺乳動物レオウイルスがヒトレオウイルスである、項目８に記載の方法。
・（項目１０）
上記ヒトレオウイルスが血清型３レオウイルスである、項目９に記載の方法。
・（項目１１）
上記血清型３レオウイルスがＤｅａｒｉｎｇ株レオウイルスである、項目１０に記載の方法。
・（項目１２）
増殖性障害を有する被験体を処置する方法であって、上記被験体が化学療法薬剤に対して不応性である新生物細胞を含み、上記方法が：
（ａ）レオウイルスによる新生物細胞の感染が生じる条件下で、有効量の上記レオウイルスを上記被験体に投与する工程；および、
（ｂ）有効量の化学療法薬剤を上記被験体に投与する工程、
を含む、方法。
・（項目１３）
上記レオウイルスが上記化学療法薬剤の投与の前に投与される、項目１２に記載の方法。
・（項目１４）
上記レオウイルスと上記化学療法薬剤とが同時に投与される、項目１２に記載の方法。
・（項目１５）
上記レオウイルスが複数用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅｓ）で投与される、項目１２に記載の方法。
・（項目１６）
上記レオウイルスが、上記化学療法薬剤の投与の前に複数用量で投与される、項目１２に記載の方法。
・（項目１７）
上記被験体が哺乳動物である、項目１２に記載の方法。
・（項目１８）
上記哺乳動物が、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒトおよび非ヒト霊長類からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
・（項目１９）
上記増殖性障害が固形腫瘍である、項目１２に記載の方法。
・（項目２０）
上記固形腫瘍が、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、腎臓癌、副腎癌、肝臓癌、膵臓癌、乳癌ならびに中枢神経系癌および末梢神経系癌からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
・（項目２１）
上記レオウイルスが上記固形腫瘍の中または近傍に投与される、項目１９に記載の方法。
・（項目２２）
上記レオウイルスが全身に投与される、項目１２に記載の方法。
・（項目２３）
上記増殖性障害が造血性腫瘍である、項目１２に記載の方法。
・（項目２４）
上記造血性腫瘍がリンパ腫および白血病からなる群から選択される、項目２３に記載の方法。
・（項目２５）
上記造血性腫瘍が転移性腫瘍である、項目１２に記載の方法。
・（項目２６）
被験体内の新生物が、化学療法薬剤に対する薬剤耐性を発生させることを予防する方法であって、上記方法は、以下：
（ａ）レオウイルスによる新生物の感染が生じる条件下で、有効量の上記レオウイルスを上記被験体に投与する工程；および、
（ｂ）有効量の化学療法薬剤を上記被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
・（項目２７）
上記レオウイルスが上記化学療法薬剤の投与の前に投与される、項目２６に記載の方法。
・（項目２８）
上記レオウイルスと上記化学療法薬剤とが同時に投与される、項目２６に記載の方法。
・（項目２９）
上記化学療法薬剤がシスプラチンである、項目２６に記載の方法。
・（項目３０）
上記レオウイルス投与によって、新生物が第２の化学療法薬剤に対する薬物耐性を発生することが予防される、項目２６に記載の方法。
・（項目３１）
新生物細胞を化学療法薬剤に対して感作する方法であって、上記方法が、
（ａ）有効量のウイルスを上記新生物細胞に投与する工程であって、上記ウイルスが新生物細胞を選択的に感染し得る、工程；および
（ｂ）有効量の上記化学療法薬剤を上記細胞に投与する工程、
を包含する、方法。
・（項目３２）
上記ウイルスが、改変アデノウイルス、改変ＨＳＶ、改変ワクシニアウイルス、改変パラポックスウイルスｏｒｆウイルス、ｄｅｌＮＳ１ウイルス、ｐ５３発現ウイルス、ＯＮＹＸ−０１５、Ｄｅｌｔａ２４、および水疱性口内炎ウイルスからなる群から選択される、項目３１に記載の方法。
・（項目３３）
化学療法薬剤で被験体を処置する方法であって、上記被験体は、増殖性障害および新生物細胞を保持し、上記方法は、以下：
（ａ）ウイルスによる新生物細胞の感染が生じる条件下で、有効量の上記ウイルスを上記被験体に投与する工程；および、
（ｂ）有効量の化学療法薬剤を上記被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
・（項目３４）
上記ウイルスが、改変アデノウイルス、改変ＨＳＶ、改変ワクシニアウイルス、改変パラポックスウイルスｏｒｆウイルス、ｄｅｌＮＳ１ウイルス、ｐ５３発現ウイルス、ＯＮＹＸ−０１５、Ｄｅｌｔａ２４、および水疱性口内炎ウイルスからなる群から選択される、項目３３に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、レオウイルスを使用することによって、薬物耐性細胞を化学療法剤に対して感作させる方法に関する。レオウイルスは、活性化されたｒａｓ経路を有する細胞におけるレオウイルスの選択的複製に起因して、ｒａｓ活性化腫瘍性（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）細胞を殺傷するが正常細胞は殺傷しない選択的抗癌剤として近年発見されている（米国特許第６，１３６，３０７号；Ｃｏｆｆｅｙら、１９９８；Ｓｔｒｏｎｇら、１９９８）。予期せぬことに、レオウイルスが化学療法剤に対する細胞の感受性をなお増加させることが、本発明においてさらに発見された。よって、本発明は、癌化学療法の効率および選択性の両方を増強する方法を提供する。本発明はまた、進行性薬物耐性の発達を妨げるために使用され得る。
【００３２】
さらに詳細に本発明を記載する前に、本出願において使用される用語は、他で示されない限り以下のように定義される。
【００３３】
（定義）
本明細書中で使用される場合、新生物細胞を化学療法剤に「感作する」は、化学療法剤に対する新生物細胞の感受性を増強させる作用をいう。
【００３４】
化学療法剤に対する新生物細胞の「感受性」は、化学療法剤の阻害効果に対する新生物細胞の感受性である。例えば、化学療法剤に対する新生物細胞の感受性は、化学療法剤に応答する細胞増殖速度の低減によって示される。感受性はまた、新生物細胞によって生じる症状の低減によって実証され得る。
【００３５】
化学療法剤に対して「抵抗性」である新生物細胞は、化学療法剤によって殺傷も増殖阻害もされない新生物細胞である。新生物細胞が増殖阻害されるか否かを決定するために、化学療法剤の存在下または非存在下での細胞の増殖速度は、当該分野において確立された方法によって決定され得る。化学療法剤を伴っても伴わなくても増殖速度が有意に異ならない場合、新生物細胞は、化学療法剤によって増殖阻害されない。
【００３６】
化学療法剤に対して「抵抗性」である腫瘍は、化学療法剤の存在下でサイズ増加速度または重量増加速度が変化しない腫瘍である。あるいは、腫瘍を保有する被験体が化学療法剤を受けたか否かに関わらず、その被験体がその腫瘍に類似の症状または腫瘍の指標を提示する場合、この腫瘍は、化学療法剤に抵抗性である。例えば、白血球数が白血病の指標として一般に使用される。白血病患者の白血球数が化学療法薬物を受けた後に有意に変化しない場合、この患者の白血病は、化学療法薬物に抵抗性である。
【００３７】
「新生物細胞」（「増殖性障害を有する細胞」としても知られる）は、異常な高速度で増殖する細胞をいう。新生物細胞を含む新たな増殖は、新生物であり、腫瘍としても知られている。新生物は、一般に異なる塊を形成する異常な組織増殖であり、これは、正常組織増殖より迅速な細胞増殖によって増殖する。新生物は、正常組織の有する構造的組織化および機能的協調の部分的または完全な欠如を示し得る。本明細書中で使用される場合、新生物は、造血性腫瘍および固体腫瘍を含むことが意図される。
【００３８】
新生物は、良性（良性腫瘍）または悪性（悪性腫瘍または癌）であり得る。悪性腫瘍は、主要な３つの型に広く分類され得る。上皮構造から生じる悪性新生物は、癌腫と呼ばれ、結合組織（例えば筋肉、関節、脂肪または骨）から生じる悪性新生物は、肉腫と呼ばれ、免疫系の成分を含む造血性構造（血球の形成に関する構造）に作用する悪性腫瘍は、白血病およびリンパ腫と呼ばれる。他の新生物としては、神経繊維腫症が挙げられるがこれに限定されない。
【００３９】
「増殖性障害」は、正常細胞より急速に増殖する細胞（すなわち、新生物細胞）によって生じる疾患または状態である。増殖性障害としては、良性腫瘍および悪性腫瘍が挙げられる。腫瘍の構造によって分類される場合、増殖性障害は、固体腫瘍および造血性腫瘍を含む。
【００４０】
「ｒａｓ活性化新生物細胞」または「ｒａｓ媒介性新生物細胞」は、ｒａｓ経路の活性化に少なくとも一部起因して、異常な高速度で増殖する細胞をいう。ｒａｓ経路は、ｒａｓ遺伝子構造変異、ｒａｓ遺伝子発現レベルの上昇、ｒａｓ遺伝子メッセージの安定性の上昇、あるいはｒａｓまたはｒａｓ経路におけるｒａｓの下流もしくは上流の因子の活性化を導く任意の変異または他の機構によって活性化され得、これによりｒａｓ経路活性は増加され得る。例えば、ＥＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプターまたはｓｏｓの活性化は、ｒａｓ経路の活性化を生じる。ｒａｓ媒介新生物細胞としては、ｒａｓ媒介癌細胞（これは、ｒａｓ経路の活性化に起因して悪性様式で増殖する細胞である）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４１】
「レオウイルスの感染」は、細胞へのレオウイルスの侵入および複製をいう。同様に、「レオウイルスによる新生物の感染」は、新生物の細胞へのレオウイルスの侵入および複製をいう。
【００４２】
「化学療法剤」または「化学療法薬物」は、増殖性障害の処置において使用される、任意の化合物である。化学療法剤の例としては、限定されることなく以下の薬剤の分類が挙げられる：
−ナイトロジェンマスタード（例えば、シクロホスファミド、トロフォスファミド、イホスファミドおよびクロラムブシル）；
−ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチルＣＣＮＵ）およびニムスチン（ＡＣＮＵ））；
−エチレンイミンおよびメチルメラミン（例えば、チオテーパ）；
−葉酸アナログ（例えば、メトトキサレート）；
−ピリミジンアナログ（例えば、５−フルオロウラシルおよびシタラビン）；
−プリンアナログ（例えば、メルカプトプリンおよびアザチオプリン）；
−ビンカアルカノイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビンデシン）；−エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）（例えば、エトポシドおよびテニポシド）；
−抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシンａ２、マイトマイシンｃおよびミトザントロン）；
−エストロゲン（例えば、エイエチルスチルベストロール（ｅｉｅｔｈｙｌ  ｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ））；
−ゴナドトロピン放出ホルモンアナログ（例えば、ロイプロリド、ブセレリンおよびゴセレリン）；
−抗エストロゲン（例えば、タモキシフェンおよびアミノグルテチミド）；
−アンドロゲン（例えば、テストラクトンおよびデロスタノロンプロピオネート）；
−プラチネート（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）および
−インターフェロン（インターフェロンα、βおよびγを含む）。
【００４３】
本発明の化学療法剤は、好ましくは、低分子化合物である。よって、化学療法剤は、好ましくは、約５，０００未満、より好ましくは、約３，０００未満、なおより好ましくは、約２，０００未満、最も好ましくは、約１，０００未満の分子量を有する。
【００４４】
「プラチネート」は、中心元素として白金を含む化学療法薬物である。プラチネートの例としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキザリプラチン、オルマプラチン、イプ
ロプラチン、エンロプラチン、ネダプラチン、ＺＤ０４７３（シス−アミン（ａｍｍｉｎｅ）ジクロロ（２−メチルピリミジン）−白金（ＩＩ））、ＢＢＲ３４６４などが挙げられる。
【００４５】
「レオウイルス」は、天然に存在するか、改変されたかまたは組換え体であるかに関わらず、レオウイルス属に分類される任意のウイルスをいう。レオウイルスは、二本鎖のセグメント化ＲＮＡゲノムを有するウイルスである。ビリオンは、６０〜８０ｎｍの直径があり、同心状の２つのカプシドシェルを有し、これらの各々は、二十面体である。このゲノムは、１６〜２７ｋｂｐの総ゲノムサイズを有する１０〜１２個の別々のセグメントの二本鎖ＲＮＡからなる。個々のＲＮＡセグメントは、サイズが変動する。異なる（しかし、関連する型の）３つのレオウイルスが、多くの種から取り出されている。３つの型全ては、共通の補体結合抗原を共有する。
【００４６】
ヒトレオウイルスは、３つの血清型からなる：１型（Ｌａｎｇ系統またはＴ１Ｌ）、２型（Ｊｏｎｅｓ系統、Ｔ２Ｊ）および３型（Ｄｅａｒｉｎｇ系統またはＡｂｎｅｙ系統、Ｔ３Ｄ）。これらの３つの血清型は、中和アッセイおよび赤血球凝集素阻害アッセイの原理に基づいて容易に同定可能である（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．ら１９９６を参照のこと）。
【００４７】
レオウイルスは、天然に存在するかまたは改変され得る。天然の供給源から単離され得、研究室でヒトによって作為的に改変されていない場合、レオウイルスは、「天然に存在する」。たとえば、レオウイルスは、「自然の（ｆｉｅｌｄ）供給源」由来であり得、すなわち、レオウイルスで感染されているヒト由来であり得る。
【００４８】
レオウイルスは、改変され得るが、なお活性なｒａｓ経路を有する哺乳動物細胞を溶解性に感染し得る。レオウイルスは、増殖する細胞への投与の前に、（例えば、プロテアーゼ（例えば、キモトリプシンまたはトリプシン）での処理によって）化学的にか生化学的に前処理され得る。プロテアーゼでの前処理は、ウイルスの外被膜またはカプシドを除去し、そしてウイルスの感染力を増加し得る。レオウイルスは、リポソームまたはミセル中でコートされ得る（ＣｈａｎｄｒｏｎおよびＮｉｂｅｒｔ、１９９８）。例えば、ビリオンを、ミセルの存在下でキモトリプシンで処理して、硫酸アルカリ界面活性剤の濃度を形成し、新たな感染性のサブビリオン粒子を生成し得る。
【００４９】
レオウイルスは、２つ以上の型のレオウイルス由来の組換え体（すなわち、再分類した（ｒｅａｓｓｏｒｔｅｄ））レオウイルスであり、これらの型のレオウイルスは、異なる病原性表現型を有し、その結果、異なる病原性決定基を含み、これにより以前にレオウイルスサブタイプに曝露された哺乳動物による免疫応答を減少または予防する。このような組換え体ビリオンは、異なるサブタイプのレオウイルスを有する哺乳動物細胞の同時感染によって生成され得、生じたビリオンカプシドへの異なるサブタイプのコートタンパク質の再ソーティングおよび組込みを伴う。
【００５０】
レオウイルスは、変異コートタンパク質（例えば、σ１）をビリオン外層カプシドへ組み込むことによって改変され得る。このタンパク質は、置換、挿入または欠失によって変異され得る。置換は、ネイティブなアミノ酸に代わる異なるアミノ酸の挿入を含む。挿入は、１つ以上の位置でのタンパク質へのさらなるアミノ酸残基の挿入を含む。欠失は、タンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。このような変異は、当該分野において公知の方法によって生成され得る。例えば、コートタンパク質の１つをコードする遺伝子のオリゴヌクレオチド部位指向性変異誘発は、所望の変異コートタンパク質の生成を生じ得る。インビトロでのレオウイルス感染哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ１細胞）における変異タンパク質の発現は、レオウイルスビリオン粒子への変異タンパク質の組込みを生
じる（ＴｕｒｎｅｒおよびＤｕｎｃａｎ、１９９２；Ｄｕｎｃａｎら、１９９１；Ｍａｈら、１９９０）。
【００５１】
レオウイルスは、好ましくは、レオウイルスに対する免疫反応を低減または除去するように改変されたレオウイルスである。このような改変レオウイルスは、「免疫防御レオウイルス」と称される。このような改変は、哺乳動物免疫系からレオウイルスをマスクするためのリポソーム、ミセルまたは他のビヒクルへのレオウイルスのパッケージングを含み得る。あるいは、レオウイルスビリオン粒子の外層カプシドが除去され得る。なぜなら、外層カプシドに存在するタンパク質は、宿主の体液性応答および細胞性応答の主要な決定基であるからである。
【００５２】
用語「弱毒化アデノウイルス」または「改変アデノウイルス」は、ＰＫＲの活性化を妨げる遺伝子産物を欠き、阻害または変異されており、その結果、ＰＫＲ活性化がブロックされないアデノウイルスを意味する。好ましくは、ＶＡＩ  ＲＮＡは、転写されない。このような弱毒化アデノウイルスまたは改変アデノウイルスは、活性化したｒａｓ経路を有さない正常細胞において複製し得ないが、活性化したｒａｓ経路を有する細胞において感染および複製し得る。
【００５３】
用語「弱毒化ＨＳＶ」または「改変ＨＳＶ」は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を意味し、ここで、ＰＫＲの活性化を妨げる遺伝子産物を欠き、阻害または変異されており、その結果ＰＫＲ活性化がブロックされない。好ましくは、ＨＳＶ遺伝子γ１３４．５は、転写されない。このような弱毒化ＨＳＶまたは改変ＨＳＶは、活性化したｒａｓ経路を有さない正常細胞において複製し得ないが、活性化したｒａｓ経路を有する細胞において感染および複製し得る。
【００５４】
「パラポックスウイルスｏｒｆウイルス」は、ポックスウイルスである。このウイルスは、ヒトを含む異なる哺乳動物種において、急性の皮膚病変を誘導する。パラポックスウイルスｏｒｆウイルスは、破壊された皮膚または損傷した皮膚を通して、ヒツジ、ヤギ、およびヒトに自然感染し、上皮細胞の再生の際に複製し、痂皮に変化する膿疱性病変を誘導する（Ｈａｉｇら，１９９８）。用語「弱毒化パラポックスウイルスｏｒｆウイルス」または「改変型パラポックスウイルスｏｒｆウイルス」とは、ＰＫＲの活性化を防止する、遺伝子産物が、ＰＫＲ活性化がブロックされないように、欠損、阻害、または変異しているパラポックスウイルスｏｒｆウイルスであることを意味する。好ましくは、ＯＶ２０．０Ｌ遺伝子は転写されない。このような弱毒化または改変型パラポックスウイルスｏｒｆウイルスは、活性化ｒａｓ経路を有さない正常細胞では複製し得ない。しかし、活性化ｒａｓ経路を有する細胞では感染し、そして複製し得る。
【００５５】
用語「弱毒化ワクシニアウイルス」または「改変型ワクシニアウイルス」とは、ＰＫＲの活性化を防止する遺伝子産物が、ＰＫＲ活性化がブロックされないように、欠損、阻害、または変異しているワクシニアウイルスであることを意味する。好ましくは、Ｅ３Ｌ遺伝子および／またはＫ３Ｌ遺伝子は転写されない。このような弱毒化または改変型ワクシニアウイルスは、活性化ｒａｓ経路を有さない正常細胞内で複製し得ない。しかし、活性化ｒａｓ経路を有する細胞では、感染し、そして複製し得る。
【００５６】
被験体への「レオウイルスの投与」とは、標的新生物細胞に接触するような様式で、被験体にレオウイルスを投与する行動をいう。ウイルスが投与される経路、および処方、キャリアまたはビヒクルは、標的細胞の位置および型に依存する。広範な種々の投与経路が用いられ得、そして以下にさらに詳細に議論される。
【００５７】
「増殖障害を処置する」とは、増殖障害の症状を軽減するかもしくは取り除くか、また
は増殖障害の進行を遅くすることを意味する。
【００５８】
「転移性腫瘍」とは、同じ動物の別の場所に位置する腫瘍から転移している腫瘍である。
【００５９】
「有効量」とは、意図される効果を生じるのに十分である化学治療剤またはレオウイルスの量である。疾患を処置するために用いられる化学治療剤について、有効量は、疾患の症状を軽減するかもしくは取り除くか、または疾患の進行を遅くするのに十分な量である。化学療法剤に対して腫瘍を感作するためのレオウイルスについて、有効量は、化学療法剤に対する腫瘍の感受性を増大させるのに十分な量である。
【００６０】
「進行性薬物耐性」とは、新生物が、最初に、化学療法剤に対して感受性のある現象をいうが、新生物増殖を阻害するまたは疾患の症状を弱める際の薬剤の効力は、経時的に低下する。
【００６１】
（方法）
レオウイルスは、ｒａｓ活性化新生物に対する、有効な治療剤である。なぜならば、このウイルスは、活性化ｒａｓ経路を用いて細胞内で選択的に複製するからである（米国特許第６，１３６，３０７号）。ｒａｓ経路は、正常な細胞において活性化されず、従って、レオウイルスは、高い選択性で新生物細胞を殺す。理論には束縛されないが、正常な細胞中でのウイルス遺伝子の転写は、約６５ｋＤａの細胞タンパク質（二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）であると決定された）のリン酸化と関係していると考えられる。ＰＫＲは、ｒａｓ−活性化細胞においては観察されなかった。このＰＫＲのリン酸化は、翻訳の阻害を導き、従って、ウイルス複製は完了され得ない。しかし、ｒａｓ−活性化細胞において、ｒａｓまたはその下流の因子は、ＰＫＲのリン酸化をブロックし、それにより、ウイルスの翻訳および複製を開始させる。
【００６２】
本発明において、本発明者らは、レオウイルスと化学治療剤との組み合わせで、腫瘍を処置した。予想外なことに、本発明者らは、レオウイルスが化学療法剤に対して新生物細胞を感作し得、一方、化学療法剤は、単独で投与される場合にその細胞に対して何ら影響も有さないことを見出した。図１に示されるように、腫瘍由来のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２は、シスプラチンに対して不応性であった。これらの腫瘍は、シスプラチンの存在下で、未処置の腫瘍と本質的に同じである増殖速度で積極的に増殖した。対照的に、レオウイルスおよびシスプラチンの両方で処理した腫瘍は、殆ど完全に増殖を止めた。この組合わせ（レオウイルスおよびシスプラチン）の阻害効果は、レオウイルス単独よりも非常に高く、このことは、シスプラチンが腫瘍細胞の殺傷に寄与することを示す。従って、細胞は、シスプラチンに対して不応性である一方、レオウイルス処置は、薬物に対する腫瘍細胞の感受性を増大した。
【００６３】
理論に制限されることなく、本発明者らは、レオウイルスが、腫瘍細胞中における薬剤の蓄積を増大させることによってか、またはアポトーシスを誘導することによって、化学療法剤に対して、腫瘍細胞を感作すると考える。レオウイルスは、レオウイルス自身のタンパク質の翻訳のために、宿主細胞のタンパク質合成を阻害することが公知である。従って、レオウイルス感染は、薬物輸送タンパク質（ＭＤＲ１またはＭＲＰ）の合成を阻害し得、そして薬物をその細胞内に蓄積することを可能にする。薬物輸送タンパク質は、細胞から種々の薬物（構造的に無関係な薬物を含む）を輸送する原因となるので、このような輸送タンパク質の合成を阻害することは、種々の薬物に対する細胞の感作を導く。あるいは、レオウイルスは、感染した細胞のアポトーシスを誘導する（これは、さらなるストレスに対して、細胞をより感受性にし得る）ことが知られている。
【００６４】
従って、本発明は、化学療法の効力および選択性の両方を増大させる、価値のある方法を提供する。選択性は、化学療法に伴う主要な問題であった。なぜならば、化学療法剤は、一般に、正常な細胞および新生物細胞の両方の増殖を阻害するからである。しかし、化学療法剤は、制限された選択性を示す。なぜならば、新生物細胞は、殆どの正常な細胞よりもより速く増殖し、それ故に、より広い範囲にまで増殖が阻害される。それにもかかわらず、増殖の速い正常な細胞（例えば、骨髄細胞）は、化学療法剤により激しく損傷を受け、これにより、著しい副作用が導かれる傾向がある。対照的に、レオウイルスは、新生物細胞に対して、非常に選択的であり、そして新生物細胞のみを感作する。従って、レオウイルスは、新生物細胞においてのみ化学療法剤の蓄積を増大し、それにより、化学療法剤の効力および選択性の両方を増大する。
【００６５】
本発明において、レオウイルスが、レオウイルスの非存在下での薬物の効力と比較して、少なくとも約２０％まで、細胞または動物の薬物に対する感受性を増加することが好ましい。この感受性の増加は、より好ましくは、少なくとも約４０％、さらにより好ましくは、少なくとも約７０％、そしてさらにより好ましくは、少なくとも約１００％である。最も好ましい実施形態では、実施例１に示されるように、レオウイルスは、レオウイルスの非存在下で薬物に対して不応性である細胞を感作するために有用であり、そして感作効果は、数値的に表現され得ない。
【００６６】
薬物に対する細胞の感受性は、当該分野で確立された方法に従って観察または測定され得、これは、疾患の性質によって変化し得る。例えば、薬物に対する新生物細胞の感受性は、腫瘍のサイズまたは新生物細胞の増殖速度によって決定され得る（例えば、実施例１を参照のこと）。感受性はまた、同種の症状または疾患指標（例えば、白血病患者における血球数または肝癌患者における肝機能）の低下として観察され得る。
【００６７】
本発明は、任意の化学療法剤に対する新生物細胞の感受性を増加させるために用いられ得る。好ましい化学療法剤としては、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、メトトレキサート、ヒドロキシウレア、シクロホスファミド、ダカルバジン、ミトキサントロン、アントラサイクリン（例えば、エピルビシンおよびドキソルビシン）、カルボプラチン、シスプラチン、タキソール、タキソテーレ（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、タモキシフェン、抗エストロゲン、およびインターフェロンが挙げられる。新規の化学療法剤が、開発され続けている一方で、新規の薬剤に対する薬物耐性もまた、既知の薬剤に対する耐性と同じ様式で生じることが予想される。従って、レオウイルスは、新規の化学療法剤に対して新生物細胞を感作するか、または新生物が新規の薬剤に対する薬物耐性を発生することを防ぐと予想される。当業者は、本発明の方法が、本明細書中に開示される方法に従って新規の薬剤を適用し得るか否かを決定し得る。
【００６８】
レオウイルスは、標的新生物細胞と接触するような様式で投与される。レオウイルスが投与される経路、および処方物、キャリア、またはビヒクルは、標的細胞の位置および型に依存する。広範な種々の投与経路が用いられ得る。例えば、接近可能な固形新生物については、レオウイルスは、新生物への直接注射により投与され得る。造血性新生物については、例えば、レオウイルスは、静脈内投与され得るか、または血管内投与され得る。身体内の容易に接近できない新生物（例えば、転移性物）については、レオウイルスは、哺乳動物の身体を介して全身輸送され得、それにより、新生物に到達するような様式（例えば、静脈内または筋肉内）で、投与される。あるいは、レオウイルスは、単一の固形新生物に直接投与され得、次いで、身体を介して転移物へと全身輸送される。レオウイルスはまた、皮下投与、腹腔内投与、鞘内投与（例えば、脳腫瘍について）、局所投与（例えば、黒色腫について）、経口投与（例えば、口腔の新生物または食道の新生物について）、直腸内投与（例えば、結腸直腸の新生物について）、膣内投与（例えば、子宮頸部の新生物または膣の新生物について）、鼻内投与、または吸入スプレーによって投与（例えば、
肺の新生物について）され得る。
【００６９】
レオウイルスまたは化学療法剤は、単回用量（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ）または複数回用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅｓ）（すなわち、１回より多い用量）で投与され得る。複数回用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅｓ）は、異なる部位もしくは異なる経路で同時投与され得るか、または（例えば、数日もしくは数週間にわたって）連続投与され得る。レオウイルスは、好ましくは、化学療法剤の投与の前または化学療法剤の投与と同時に投与される。
【００７０】
レオウイルスは、好ましくは、単位投薬量形態（各々の投薬量は、約１０２ｐｆｕ〜約１０１３ｐｆｕのレオウィルスを含有する）で処方される。用語「単位投薬形態」は、ヒト被験体および他の哺乳動物について、単一の投薬として適切な、物理的に別個の単位のことを言い、各々の単位は、適切な薬学的賦形剤と共に、所望される治療効果を生じると見積もられた規定のレオウィルス量を含有する。
【００７１】
本発明は、他の腫瘍療法（例えば、放射線療法または手術）と組み合わされ得ることが意図される。
【００７２】
さらに、本発明は、新生物が薬物耐性を生じることを防ぐ方法を提供する。進行性の薬物耐性は、新生物を、新生物内の薬物感受性細胞を殺傷する薬物で処置し、それにより、薬物耐性細胞を選択することにより発生される。薬物耐性細胞の増殖の際に、新生物は、薬物耐性の表現型を表す。従って、レオウイルスを用いて、全ての細胞（薬物耐性細胞を含む）が殺傷または阻害される化学療法の過程の開始時に新生物を感作し得る。従って、このように処置された新生物は、薬物耐性を発生する機会がない。
【００７３】
ある薬物に対して耐性である細胞は、頻繁に、多剤耐性の現象に起因して、別の薬物に対して耐性である。従って、レオウイルスは、好ましくは、薬物耐性の発生を防ぐために、任意の化学療法剤で処置されていない新生物に投与される。しかし、一旦、薬物耐性が発生すると、レオウイルスは、さらに、薬物耐性細胞を感作し、そして化学療法の効力および選択性、ならびに腫瘍崩壊による新生物細胞の直接殺傷を増大させるために用いられ得る。
【００７４】
上記のように、本発明者らは、レオウイルスは、宿主細胞のタンパク質合成を阻害するか、またはアポトーシスを誘導することによって、化学療法剤に対して新生物細胞を感作すると考える。従って、他のウイルスもまた、レオウイルスと同じ様式で用いられ得ることが意図される。具体的には、新生物細胞に選択的に感染するウイルスが好ましい。これらのウイルスとしては、改変型アデノウイルス、改変型ＨＳＶ、改変型ワクシニアウイルス、改変型パラポックスウイルスｏｒｆウイルス、ｄｅｌＮＳ１ウイルス、ｐ５３発現ウイルス、ＯＮＹＸ−０１５ウイルス、デルタ２４ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ｈｒＲ３が欠損した単純ヘルペスウイルス１型変異体、ニューカッスル病ウイルス、脳炎ウイルス、帯状ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、および麻疹ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。これらの「腫瘍崩壊性」ウイルスは以下で議論される。
【００７５】
アデノウイルス、ＨＳＶ、ワクシニアウイルス、およびパラポックスウイルスｏｒｆウイルスは、二本鎖ＲＮＡキナーゼ（ＰＫＲ）に打ち勝つ機構を発達させたウイルスである。通常、ウイルスが細胞に入る場合、ＰＫＲは活性化され、タンパク質合成をブロックし、そして、ウイルスはこの細胞において複製することが出来ない。しかし、アデノウイルスは、大量の小型ＲＮＡ、ＶＡ１  ＲＮＡを作製する。ＶＡ１  ＲＮＡは広範囲にわたる２次構造を有し、通常、ＰＫＲを活性化する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と競合してＰＫＲに結合する。ＰＫＲを活性化するためにｄｓＲＮＡの最低限の長さを必要とするため、
ＶＡ１  ＲＮＡはＰＫＲを活性化しない。その代わりに、ＶＡ１  ＲＮＡは、大量に存在することによりＰＫＲを隔離する。従って、タンパク質合成はブロックされず、アデノウイルスは細胞内で複製し得る。しかし、タンパク質合成の機構はブロックされないが、宿主細胞のタンパク質合成は、ウイルスにより阻害されて、ウイルスタンパク質合成を促進することに注目すべきである。
【００７６】
ワクシニアウイルスは、異なる機構でＰＫＲを下方制御する２つの遺伝子産物、Ｋ３ＬおよびＥ３Ｌをコードする。Ｋ３Ｌ遺伝子産物は、ＰＫＲの天然基質であるｅＩＦ−２αのＮ末端領域との限られた相同性を有し、そしてＰＫＲの偽基質として作用し得る。Ｅ３Ｌ遺伝子産物は、ｄｓＲＮＡ結合タンパク質であり、そして活性化因子であるｄｓＲＮＡを隔離することにより、明らかに機能する。
【００７７】
同様に、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）遺伝子γ１３４．５は、遺伝子産物である感染細胞タンパク質３４．５（ＩＣＰ３４．５）をコードする。このタンパク質は、ＰＫＲにより発揮される抗ウイルス効果を防止し得る。パラポックスウイルスｏｒｆウイルスは、ＰＫＲ活性をブロックすることに関与するＯＶ２０．０Ｌ遺伝子をコードする。従って、これらのウイルスはＰＫＲによって阻害されることなく、細胞に首尾良く感染し得る。
【００７８】
改変型アデノウイルス、改変型ＨＳＶ、改変型ワクシニアウイルス、または改変型パラポックスウイルスｏｒｆウイルスにおいて、ウイルスの抗ＰＫＲ機構は変異されているか、あるいはそうでなければ不活化されている。従って、これらの改変型ウイルスは、正常なＰＫＲ機能を有する正常な細胞では複製することが出来ない。しかし、ｒａｓがＰＫＲを不活化することに起因して、ｒａｓ活性化新生物細胞は、ＰＫＲによるタンパク質合成阻害を受けにくい。従って、これらの細胞は、改変型アデノウイルス、改変型ＨＳＶ、改変型ワクシニアウイルス、または改変型パラポックスウイルスｏｒｆウイルスによる感染に対して感受性である。
【００７９】
これらのウイルスは、ウイルスＰＫＲインヒビターの、既知の構造−機能関係に従って、改変あるいは変異され得る。例えば、ワクシニアウイルスのＥ３タンパク質のアミノ末端領域は、ＰＫＲのカルボキシル末端領域ドメインと相互作用するため、このドメインの欠失あるいは点変異は、抗ＰＫＲ機能を妨げる（Ｃｈａｎｇら，１９９２，１９９３，１９９５；Ｓｈａｒｐら，１９９８；Ｒｏｍａｎｏら，１９９８）。ワクシニアウイルスのＫ３Ｌ遺伝子は、ｐＫ３（ＰＫＲの偽基質）をコードする。Ｋ３Ｌ内には機能喪失変異が存在する。短縮化によるか、あるいはＫ３Ｌタンパク質のＣ末端部分（ｅＩＦ−２αにおける残基７９〜８３に相同）内に点変異を置くかのいずれかにより、ＰＫＲ阻害活性を消滅させる（Ｋａｗａｇｉｓｈｉ−Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，１９９７）。
【００８０】
改変型ＨＳＶとしては、Ｒ３６１６（γ１３４．５遺伝子の両方のコピーが欠失されている）、Ｒ４００９（２つの停止コドンが、γ１３４．５遺伝子中に挿入されている）、およびＧ２０７（リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子およびγ１３４．５遺伝子において変異している）（Ａｎｄｒｅａｎｓｋｙら、１９９６）が挙げられるがこれらに限定されない。これらの改変されたウイルスは、脳腫瘍治療において用いられており、そして、最近、Ｒ３６１６は、ｒａｓ−活性化細胞に優先的に感染することが示されてる（Ｆａｒａｓｓａｔｉら、２００１）。
【００８１】
同様に、ｄｅｌＮＳ１ウイルス（Ｂｅｒｇｍａｎｎら、２００１）は、遺伝子操作されたインフルエンザＡウイルスであり、このウイルスは、ｒａｓ−活性化新生物細胞において選択的に複製し得る。インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質は、宿主によるＰＫＲ媒介型抗ウイルス応答を克服するビルレンス因子である。ＮＳ１は、ｄｅｌＮＳ１ウイルスにおいてノックアウトされ、このウイルスは、恐らく、ＰＫＲ媒介型阻害に起因して
、正常な細胞に感染できないが、ｒａｓ−活性化新生物細胞において首尾良く複製する。従って、ＮＳ１が改変または変異される改変型インフルエンザウイルス（例えば、ｄｅｌＮＳ１ウイルス）はまた、本発明において有用である。
【００８２】
他の腫瘍崩壊性ウイルスとしては、腫瘍抑制遺伝子を保持することによって、新生物細胞を選択的に殺傷するウイルスが挙げられる。例えば、ｐ５３は、正常細胞の制御されない増殖を阻害する細胞性腫瘍サプレッサーである。しかし、全ての腫瘍の約半分は、機能的に障害のあるｐ５３を有し、制御されない様式で増殖する。従って、野生型ｐ５３遺伝子を発現するウイルスは、ｐ５３遺伝子産物の不活性化に起因して新生物になる新生物細胞を、選択的に殺傷し得る。そのようなウイルスは構築され、変異型ｐ５３を発現する癌細胞において、アポトーシスを誘導することが示されている（Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙら、１９９６）。
【００８３】
類似したアプローチは、腫瘍サプレッサーのウイルスインヒビターを含む。例えば、特定のアデノウイルス、ＳＶ４０およびヒトパピローマウイルスは、ｐ５３を不活性化するタンパク質を含み、それによって、ウイルス自体の複製を可能にする（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ  １９９９）。アデノウイルス血清型５について、このタンパク質は、Ｅ１Ｂ領域によってコードされる５５Ｋｄのタンパク質である。ＯＮＹＸ−０１５ウイルスでのように、この５５Ｋｄのタンパク質をコードするＥ１Ｂ領域が欠失された場合（Ｂｉｓｃｈｏｆｆら、１９９６；Ｈｅｉｓｅら、２０００；ＷＯ９４／１８９９２）、５５ｋｄのｐ５３インヒビターは、もはや存在しない。結果として、ＯＮＹＸ−０１５が正常細胞に侵入した場合、ｐ５３は、ウイルス複製と同様に、細胞増殖も抑制するように機能する。ここで、この抑制は、細胞性増殖機構に依存する。従って、ＯＮＹＸ−０１５は、正常細胞中で複製しない。他方、破壊されたｐ５３機能を有する新生物細胞において、ＯＮＹＸ−０１５は、複製し得、最終的に細胞を死へ導く。さらに、このウイルスは、ｐ５３欠損新生物細胞に選択的に感染し、それを殺傷するために使用され得る。当業者はまた、確立された技術に従って、アデノウイルス５または他のウイルスにおいて、ｐ５３インヒビター遺伝子を変異し、そして破壊し得る。
【００８４】
別の例は、Ｅ１Ａ領域に２４塩基対の欠失を保持する変異型アデノウイルスであるＤｅｌｔａ２４ウイルスである（Ｆｕｅｙｏら、２０００）。この領域は、細胞性腫瘍サプレッサーＲｂへの結合、およびＲｂ機能の阻害を担う領域であり、それによって、細胞増殖機構、従ってウイルス複製が、制御されない様式で進行することを可能にする。Ｄｅｌｔａ２４は、Ｒｂ結合領域における欠失を有し、Ｒｂに結合しない。従って、この変異型ウイルスの複製は、正常細胞においてＲｂによって阻害される。しかし、Ｒｂが不活性化され、細胞が新生物になる場合、Ｄｅｌｔａ２４はもはや阻害されない。その代わりに、この変異型ウイルスは、効率的に複製し、Ｒｂ欠損細胞を溶解する。
【００８５】
なお他の腫瘍崩壊性ウイルスとしては、インターフェロンの感受性ウイルスが挙げられる。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、インターフェロン存在下で、新生物細胞を選択的に殺傷する。インターフェロンは、標的細胞において、抗ウイルス応答ならびに増殖阻害および／またはアポトーシスシグナルの誘導の両方を最終的に導く細胞表面レセプターに結合する循環因子である。インターフェロンが、理論的に腫瘍細胞の増殖の阻害に使用されるにも関わらず、この試みは、インターフェロン経路のメンバーの腫瘍特異的変異に起因して、あまり成功していない。
【００８６】
しかし、インターフェロンによって発揮される増殖阻害を避けるためにインターフェロン経路を破壊することによって、腫瘍細胞は、これらの抗ウイルス応答を同時に傷つけ得る。実際に、エンベロープネガティブセンスＲＮＡウイルスであるＶＳＶは、インターフェロンの存在下で、種々のヒト腫瘍細胞株中で迅速に複製され、その細胞株を殺傷する一
方、正常ヒト初代細胞培養物が、明らかにインターフェロンによって保護されたことが示された。ＶＳＶの腫瘍内注入はまた、皮下にヒト黒色腫異種移植片を有するヌードマウスの腫瘍負荷を減少した（Ｓｔｏｊｄｌら、２０００）。
【００８７】
他のインターフェロン感受性ウイルス（ＷＯ９９／１８７９９）、すなわち、インターフェロンの存在下で、正常細胞中で複製しないウイルスは、正常細胞の培養物を増殖させ、種々の濃度のインターフェロンの存在下で、目的のウイルスと培養物を接触させ、次いで、インキュベーション期間後、細胞殺傷の割合を決定することによって、同定され得る。好ましくは、正常細胞の２０％未満が殺傷され、より好ましくは、１０％未満が殺傷される。
【００８８】
いくらかの新生物細胞が、高レベルの酵素を発現し、この酵素に依存するウイルスを構築する事実を利用することもまた可能である。例えば、リボヌクレオチドレダクターゼは、肝臓転移内に豊富であるが、正常な肝臓にはわずかである。従って、リボヌクレオチドレダクターゼ発現が欠損する単純疱疹ウイルス１（ＨＳＶ−１）変異型（ｈｒＲ３）は、結腸癌腫細胞において複製するが、正常肝臓細胞では複製しないことが示された（Ｙｏｏｎら、２０００）。
【００８９】
上に議論されたウイルスに加えて、種々の他のウイルスは、基礎をなす機構がいつも明確でないにも関わらず、腫瘍殺傷に関連する。ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、悪性細胞中で、優先的に複製され、最も一般的に使用される株は、７３−Ｔである（Ｒｅｉｃｈａｒｄら、１９９２；Ｚｏｒｎら、１９９４；Ｂａｒ−Ｅｌｉら、１９９６）。ＮＤＶが腫瘍内接種後に腫瘍負荷を減少する、臨床的抗腫瘍活性はまた、頸部癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、黒色腫および腎臓癌を含む、種々の癌においても観察された（ＷＯ９４／２５６２７；Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ、１９９９）。
【００９０】
さらに、脳炎ウイルスは、マウス肉腫において、腫瘍崩壊性効果を有することが示されるが、弱毒化が、正常細胞におけるその感染性を減少するために要求され得る。腫瘍退行は、帯状疱疹ウイルス、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、または麻疹ウイルスに感染した腫瘍患者において記載された（総説については、Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ、１９９９を参照のこと）。本明細書中で開示される方法に従って、当業者は、新生物細胞を化学療法剤に対して感作するため、または新生物の薬剤耐性の発生を予防するために、これらまたは他のウイルスの能力を試験し得る。
【００９１】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、本発明の範囲を限定するとは決して解釈されない。
【実施例】
【００９２】
以下の実施例において、以下の略語は、以下の意味を有する。定義されない略語は、一般的に受け入れられる意味を有する。
℃＝摂氏温度
ｈｒ＝時間
ｍｉｎ＝分
μＭ＝マイクロモル濃度
ｍＭ＝ミリモル濃度
Ｍ＝モル濃度
ｍｌ＝ミリリットル
μｌ＝マイクロリットル
ｍｇ＝ミリグラム
μｇ＝マイクログラム
ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ｒｐｍ＝１分あたりの回転
ＦＢＳ＝胎仔ウシ血清
ＤＴＴ＝ジチオトレイトール
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ＰＢＳ＝リン酸緩衝化生理食塩水
ＤＭＥＭ＝ダルベッコ改変イーグル培地
α−ＭＥＭ＝α−改変イーグル培地
β−ＭＥ＝β−メルカプトエタノール
ＭＯＩ＝感染多重度
ＰＦＵまたはｐｆｕ＝プラーク形成単位
ＰＫＲ＝二重鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ
ＥＧＦ＝上皮増殖因子
ＰＤＧＦ＝血小板誘来増殖因子
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＭＤＲ＝多剤耐性
ＭＲＰ＝多剤耐性関連タンパク質
ＨＳＶ＝単純疱疹ウイルス
（実施例１  レオウイルスによる、不応性腫瘍細胞のシスプラチンに対する感作）
Ｃ３Ｈマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に、１．０×１０６ＰＦＵのｒａｓ形質転換Ｃ３Ｈ細胞（Ｄ．Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｇａｒｙの贈与物）を皮下的に移植し、腫瘍を発生させた。これらの研究で使用されたレオウイルス血清型３のＤｅａｒｉｎｇ株を、Ｌ細胞の懸濁培養物中で増殖させ、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）を抽出緩衝液から省いたほかは、Ｓｍｉｔｈ（Ｓｍｉｔｈら、１９６９）に従って精製した。精製したレオウイルスについての粒子／ＰＦＵ比は、代表的には１００／１であった。
【００９３】
腫瘍保持マウスを、以下に示すような４つの異なるレジメンで処置した：
【００９４】
【表５】
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レオウイルスを受けた動物について（シリーズ３〜４）、（２０μｌの生理的食塩水中）５×１０８ＰＦＵのレオウイルスを、０日目、６日目、１２日目、および１８日目に、動物の尾静脈を介して、静脈内注射した。レオウイルスを受けなかった動物（シリーズ１〜２）に、同じ方法および時間経過で、２０μｌの生理食塩水を注射した。シスプラチンを、体重１ｋｇあたり２．５ｍｇの用量で、１０日目、１６日目および２２日目に尾静脈に注射した。腫瘍を、腫瘍の増殖速度を評価するために、０日目から毎日測定した。
【００９５】
これらの腫瘍は、シスプラチンに対して不応性であった。図１に示されるように、シスプラチン単独で処置された腫瘍（シリーズ２）は、コントロールの腫瘍（シリーズ１）からほとんど区別つかないように進行し、このことは、シスプラチンが腫瘍の増殖速度に対する阻害効果を実質的に有さないことを示す。対照的に、シスプラチンとレオウイルスと
の組合せ（シリーズ４）は、腫瘍増殖を有意に減少する。この組合せによる阻害のレベルは、レオウイルス単独（シリーズ３）よりもはるかに甚大である。従って、レオウイルスと共に使用される場合、シスプラチンは、腫瘍抑制に寄与した。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、腫瘍増殖に対するレオウイルスおよびシスプラチンの効果を示す。全身性腫瘍を保有する動物に、モック（ｍｏｃｋ）処置（シリーズ１）、シスプラチン単独（シリーズ２）、レオウイルス単独（シリーズ３）またはシスプラチンとレオウイルスとの組み合わせ（シリーズ４）を与えた。結果は、腫瘍がシスプラチンに対して抵抗性であったことを示す。しかし、レオウイルスの存在下では、腫瘍は、シスプラチン感受性になった。
【図１】
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