(57)【要約】【課題】患者サンプル中にＨＭＬ−２内因性レトロウイルスの発現産物の有無を検出する工程を含む、前立腺癌を診断する方法。【解決手段】ＨＭＬ−２ファミリーのヒト内因性レトロウイルスは、前立腺腫瘍中でアップレギュレートされた発現を示す。この発見を、前立腺癌のスクリーニング、前立腺癌の診断および前立腺癌の治療に使用し得る。本発明は、癌、特に前立腺癌を診断するための方法を提供する。この方法は患者のサンプル中のＨＭＬ−２内因性レトロウイルスの発現産物の存在または非存在を検出する工程を包含する。正常な組織に関する高レベルの発現産物は、サンプルを採取された患者が癌を有することを示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、癌、特に前立腺癌の診断に関する。詳細には、腫瘍、特に前立腺腫瘍において上方制御された発現を示すヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）の亜群に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景分野）
前立腺癌は、アメリカ合衆国内の男性における癌の最も共通の型である。良性前立腺肥大（ＢＰＨ）は、良性前立腺細胞の異常増殖であり、それによって前立腺が成長し、そして尿道および膀胱を圧迫し、尿の正常な流れを妨げる。アメリカ合衆国内の年齢６０才と７０才との間の男性の半分より多く、そして年齢７０才と９０才との間の９０パーセントもの男性がＢＰＨの症状を有する。この状態が人生の驚異となることはほとんどないが、症状を軽減する処置を必要とし得る。
【０００４】
前立腺内に始まる癌は、原発性前立腺癌（または前立腺癌）と呼ばれる。前立腺癌は、前立腺（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｇｌａｎｄ）内にとどまり得るか、または隣接するリンパ節に広がり得、そしてまた骨、膀胱、直腸、および他の臓器に広がり得る。前立腺癌は、血中の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）および前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）のレベルを測定することにより診断される。血中のＰＳＡのレベルは、前立腺癌、ＢＰＨ、または前立腺での感染症を有する男性において上昇し得る。このＰＡＰレベルは、特に、癌が前立腺を超えて広がる場合、多くの前立腺癌患者において標準を超えて上昇する。しかし、これらの検査だけでは前立腺癌と診断され得ない。なぜなら、上昇したＰＳＡレベルまたはＰＡＰレベルはまた、他の、非癌性の問題も示し得るからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前立腺の状態が良性かまたは悪性かの決定を助けるために、さらなる検査（例えば、経直腸的超音波断層法、静脈内腎盂像、および膀胱鏡検査）が通常実施される。癌が存在し得ることをこれらの検査結果が示唆する場合、患者は、前立腺癌を診断する唯一の確かな方法として生検を受けねばならない。従って、複数回の厄介な検査手順を実施する必要なく前立腺癌の早期発見および診断のための簡単且つ直接的な検査を提供することが望ましい。前立腺癌の予防および／または処置のための組成物および方法を提供することもまた望ましく、そして必要である。
【０００６】
本発明の目的は、前立腺癌の予防、処置、および診断に使用され得る物質を提供することである。さらなる目的は、前立腺癌の予防、処置、および診断における改良点を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
従って、本発明は、以下を提供する：
（項目１）  前立腺癌を診断する方法であって、患者サンプル中にＨＭＬ−２内因性レトロウイルスの発現産物の有無を検出する工程を含む、方法。
（項目２）  前記発現産物がＲＮＡまたはポリペプチドである、項目１に記載の方法。
（項目３）  前記患者サンプルが前立腺サンプルまたは血液サンプルである、項目１または２に記載の方法。
（項目４）  前記発現産物が以下の式：
Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５−ポリＡを有するＲＮＡである、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法：
ここでＮ１は、配列番号１５５と、少なくともｘ％の配列同一性を有し；Ｎ２は、配列番号１５６と、少なくともｘ％の配列同一性を有し；Ｎ３は、配列番号６と、少なくともｘ％の配列同一性を有し；Ｎ４は、任意のＲＮＡ配列を含み；Ｎ５は、配列番号５と、少なくともｘ％の配列同一性を有し；そして、Ｎ１またはＮ５の少なくとも一つが存在するが、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４およびポリＡは、任意である。
（項目５）  前記ＲＮＡがＮ１を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）  Ｎ１が前記ＲＮＡの５’末端である、項目５に記載の方法。
（項目７）  Ｎ４がポリペプチドコード配列を含む、項目４に記載の方法。
（項目８）  前記ポリペプチドが、項目４で規定される以下の式：Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５−ポリＡを有するｍＲＮＡによってコードされる、項目２に記載の方法。
（項目９）  前記ｍＲＮＡが以下のＨＭＬ−２ポリペプチド：ｇａｇ，ｐｒｔ，ｐｏｌ，ｅｎｖ，ｃＯＲＦ，ｔａｔの一つ以上をコードする、項目８に記載の方法。
（項目１０）  前記ポリペプチドを抗体を使用して検出する、項目８または項目９に記載の方法。
（項目１１）  前立腺癌を診断する方法であって、（ａ）前立腺細胞を含む患者サンプルを得る工程；および（ｂ）該患者サンプル中に、ＨＭＬ−２内因性レトロウイルスの発現産物の有無を検出する工程を含む、方法。
（項目１２）  工程（ｂ）が項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法を使用する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）  前記患者サンプル中のＲＮＡの濃縮工程を、工程（ｂ）より先に行う、項目１１または項目１２に記載の方法。
（項目１４）  ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ，ＬＣＲ、ＴＭＡまたはＮＡＳＢＡを使用して前記発現産物を検出する、項目１〜６または項目１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）  前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）  前立腺癌の診断に使用するための単離されたポリヌクレオチドであって：（ａ）項目４に記載のヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５−ポリＡ；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５の少なくとも７ヌクレオチドのフラグメント；（ｃ）（ａ）のヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５と少なくとも５０％の同一性を有するヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の相補体を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目１７）  フラグメント（ｂ）がＮ１由来である、項目１６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目１８）  項目１６に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号７〜３９、配列番号４４〜４５、配列番号５９〜９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９〜１０５、配列番号１０７、配列番号１１０〜１４５、配列番号１５０〜１５７、または配列番号１６１〜２２５の１つを含む、ポリヌクレオチド。
（項目１９）  配列番号５９〜８２の１つを含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目２０）  精巣癌、多発性硬化症またはインシュリン依存性真性糖尿病の診断または処置に使用するための、項目１９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目２１）  ５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−３’の式を有する単離されたポリヌクレオチドであって：
−Ａ−は、ａヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；−Ｃ−は、ｃヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；−Ｂ−は、（ａ）項目４に記載のヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５の７以上のヌクレオチドのフラグメントまたは（ｂ）項目４に記載のヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５の７以上のヌクレオチドのフラグメントの相補体、いずれかからなるヌクレオチド配列であり；そして該ポリヌクレオチドが、（ａ）核酸配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５のフラグメントでも（ｂ）核酸配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５のフラグメントの相補体どちらでもなく；そしてａ＋ｃ≧１、
である、ポリヌクレオチド。
（項目２２）  項目２１に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、Ｂが配列番号７〜３９、配列番号４４〜４５、配列番号５９〜９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９〜１０５、配列番号１０７、配列番号１１０〜１４５、配列番号１５０〜１５７、または配列番号１６１〜２２５の１つ以上由来の７以上のヌクレオチドのフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
（項目２３）  検出可能なラベルを含む、項目１５〜２２のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目２４）  項目１６に従うＲＮＡ内に含まれ得るテンプレート配列を増幅するためのプライマーを含むキットであって、該キットは第一のプライマーおよび第二のプライマーを備え、第一のプライマーは、実質的に該テンプレート配列に相補的であり、第二のプライマーは、該テンプレート配列の相補体と実質的に相補的であり、実質的な相補性を有する該プライマーの部分が増幅されるテンプレートＲＮＡ配列の末端を規定する、キット。
（項目２５）  前立腺癌の診断に使用するための単離されたポリペプチドであって：（ａ）配列番号１０９、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８および配列番号１４９からなる群から選択されるアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）の少なくとも７アミノ酸のフラグメント；または（ｃ）（ａ）と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、ポリペプチド。
（項目２６）  式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨを有する単離されたポリペプチドであって、Ａは、ａアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｃは、ｃアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｂは、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１１５、配列番号１０９、配列番号１１０、および配列番号１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも５アミノ酸のフラグメントからなるポリペプチド配列であり；そして該ポリペプチドは、ポリペプチド配列、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１１５、配列番号１０９、配列番号１１０、または配列番号１１１のフラグメントではなく；そしてａ＋ｃ≧１である、ポリペプチド。
（項目２７）  固相支持体に取り付けられた、項目２５または項目２６に記載のポリペプチド。
（項目２８）  検出可能な標識を含む、項目２５または項目２６に記載のポリペプチド。
（項目２９）  前立腺癌の診断に使用するための抗体であって、項目２５または項目２６に記載のポリペプチドに特異的に結合し得る、抗体。
（項目３０）  モノクローナル抗体である、項目２９に記載の抗体。
（項目３１）  固相支持体に取り付けられた、項目２９または項目３０に記載の抗体。
（項目３２）  項目１５〜２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目２５〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、または項目２９〜３０のいずれか１項に記載の抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目３３）  薬物として使用するための、項目３２に記載の組成物。
（項目３４）  前立腺癌の処置のための薬物製品における、項目１５〜２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目２５〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、または項目２９〜３０のいずれか１項に記載の抗体の使用。
（項目３５）  前立腺癌に対する活性を有する化合物に対するスクリーニングの方法であって、試験化合物を、ＨＭＬ−２発現をアップレギュレートされた細胞に由来する組織サンプルと接触する工程；該サンプル中のＨＭＬ−２の発現をモニタリングする工程；および該試験化合物の抗癌効果を決定する工程：を含む、方法。
（項目３６）  前立腺癌を処置する薬物製品における、ＨＭＬ−２プロテアーゼのインヒビターの使用。
（項目３７）  前立腺癌を処置する薬物製品における、ＨＭＬ−２  ｃＯＲＦのトランスドミナントネガティブ変異体の、使用。
（項目３８）  （ａ）前立腺細胞および（ｂ）項目１５〜２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目２４に記載のキット、項目２５〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、または項目２９〜３０のいずれか１項に記載の抗体を含む、組成物。
ＨＥＲＶ−ＫファミリーのＨＭＬ−２亜群のヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）が、前立腺腫瘍において上方制御された発現を示すことが見出されている。この発見は、前立腺癌のスクリーニング、診断、および治療に使用され得る。
【０００８】
本発明は、癌、特に前立腺癌を診断するための方法を提供する。この方法は患者のサンプル中のＨＭＬ−２内因性レトロウイルスの発現産物の存在または非存在を検出する工程を包含する。正常な組織に関する高レベルの発現産物は、サンプルを採取された患者が癌を有することを示す。
【０００９】
検出されるＨＭＬ−２発現産物は、ｍＲＮＡ転写産物、またはこのような転写産物から翻訳されたポリペプチドのいずれかである。これらの発現産物は、直接的または間接的に検出され得る。直接的検査は、患者のサンプル中のＨＭＬ−２
ＲＮＡ、またはＨＭＬ−２ポリペプチドを検出するアッセイを使用する。間接的検査は、インビボでＨＭＬ−２から直接的に発現されない生体分子を検出するアッセイ（例えば、ＨＭＬ−２  ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを検出するアッセイ、またはＨＭＬ−２ポリペプチドに応答して上昇してきた抗体を検出するアッセイ）を使用する。
【００１０】
（Ａ−患者のサンプル）
本発明の診断方法がＨＭＬ−２  ｍＲＮＡに基づく場合、その患者のサンプルは、細胞、好ましくは前立腺細胞を一般に含む。これらは、組織、好ましくは前立腺組織のサンプル中に存在し得るか、または細胞、好ましくは、循環中（例えば、転移中に）に逃れてきた前立腺細胞であり得る。前立腺細胞のかわり、または前立腺細胞を含むと同時に、そのサンプルは、ＨＭＬ−２由来のｍＲＮＡを含むビリオンを含み得る。
【００１１】
本発明の診断方法がＨＭＬ−２ポリペプチドに基づく場合、その患者のサンプルは、細胞、好ましくは、前立腺細胞および／またはビリオン（ｍＲＮＡについて上記のように）を含み得るか、あるいはＨＭＬ−２ポリペプチドを認識する抗体を含み得る。このような抗体は、代表的に循環中に存在する。
【００１２】
従って、一般的に、患者のサンプルは組織サンプル（例えば、生検）であり、好ましくは、前立腺サンプル（例えば、生検）または血液サンプルである。
【００１３】
患者は一般的にヒトであり、好ましくはヒト男性であり、そしてより好ましくは成人のヒト男性である。
【００１４】
発現産物が患者のサンプルそのものの中で検出され得るか、あるいはサンプル由来の物質（例えば、細胞溶解物の上清、あるいは、ＲＮＡ抽出物またはＲＮＡ抽出物から生成されたｃＤＮＡ、またはＲＮＡ抽出物から翻訳されたポリペプチド、あるいは患者から取り出された細胞の培養物由来の細胞など）において検出され得る。これらは、本発明の目的において、なおも「患者のサンプル」であるとみなされる。
【００１５】
本発明の方法は、インビトロおよびインビボで実施され得る。
【００１６】
患者のサンプルの他の可能な供給源としては、単離された細胞、組織全体、または体液（例えば、血液、血漿、血清、尿、胸水、脳脊髄液など）が挙げられる。
【００１７】
（Ｂ−ｍＲＮＡ発現産物）
本発明の診断方法がｍＲＮＡ検出に基づく場合、６個の基本領域を含むＲＮＡを検出する工程を代表的に包含する。５’から３’に向かって、これらは：
１．配列番号１５５に対し、少なくとも７５％の同一性（例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有する配列；または、配列番号１５５に対し、少なくとも５０％の同一性（例えば、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、そして、少なくとも９５％の信頼水準で、正常な（すなわち、癌ではない）細胞での発現と比べて、少なくとも１．５倍（例えば、２、２．５、５、１０、２０、５０倍など）高いレベルを発現される配列；または、配列番号１５５の少なくとも２０個連続するヌクレオチドのフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５個など連続するヌクレオチド）に対し、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有する配列；または、配列番号１５５の少なくとも２０個連続するヌクレオチドのフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５個など連続するヌクレオチド）に対し、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、そして、少なくとも９５％の信頼水準で、正常な（すなわち、癌ではない）細胞での発現と比べて、少なくとも１．５倍（例えば、２、２．５、５、１０、２０、５０倍など）高いレベルで発現される配列である。この配列は、代表的にＲＮＡの５’末端に存在する。配列番号１５５は、「ＥＲＶＫ６」ＨＭＬ−２ウイルスのＬＴＲにおけるＲ領域の開始のヌクレオチド配列である［ｒｅｆ．１］。Ｒ領域のこの部分は、全長のＨＭＬ−２転写物全てにおいて見出される。
【００１８】
２．以下の配列を含む下流領域：配列番号１５６に対し、少なくとも７５％の配列同一性（例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有する配列；または配列番号１５６に対し、少なくとも５０％の同一性（例えば、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、そして、少なくとも９５％の信頼水準で、正常な（すなわち、癌ではない）細胞での発現と比べて、少なくとも１．５倍（例えば、２、２．５、５、１０、２０、５０倍など）高いレベルで発現される配列；または、配列番号１５６の少なくとも２０個連続するヌクレオチドのフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５個など連続するヌクレオチド）に対し、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有する配列；または、配列番号１５６の少なくとも２０個連続するヌクレオチドのフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５個など連続するヌクレオチド）に対し、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、そして、少なくとも９５％の信頼水準で、正常な（すなわち、癌ではない）細胞での発現と比べて、少なくとも１．５倍（例えば、２、２．５、５、１０、２０、５０倍など）高いレベルで発現される配列。配列番号１５６は、ＥＲＶＫ６  ＬＴＲにおける配列番号１５５の下流のＲＵ５領域のヌクレオチド配列である。この領域は、全長のＨＭＬ���２転写物中に見出されるが、ＨＭＬ−２  ＬＴＲプロモーターから転写されたｍＲＮＡ全てには存在し得ない。
【００１９】
３．以下の配列を含む下流領域：配列番号６に対し、少なくとも７５％の配列同一性（例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有する配列；または、配列番号６に対し、少なくとも５０％の同一性（例えば、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、そして、少なくとも９５％の信頼水準で、正常な（すなわち、癌ではない）細胞での発現と比べて、少なくとも１．５倍（例えば、２、２．５、５、１０、２０、５０倍など）高いレベルで発現される配列；または、配列番号６の少なくとも２０個連続するヌクレオチドのフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個など連続するヌクレオチド）に対し、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有する配列；または、配列番号６の少なくとも２０個連続するヌクレオチドのフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個など連続するヌクレオチド）に対し、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、そして、少なくとも９５％の信頼水準で、正常な（すなわち、癌ではない）細胞での発現と比べて、少なくとも１．５倍（例えば、２、２．５、５、１０、２０、５０倍など）高いレベルで発現される配列。配列番号６は、Ｕ５領域と最初の５’スプライシング部位との間のＥＲＶＫ６ウイルス領域のヌクレオチド配列である。この領域は、全長のＨＭＬ−２転写物において見出されるが、いくつかの改変体により失われ、そして、上記の領域２と同様に、ＨＭＬ−２  ＬＴＲプロモーターから転写される全てのｍＲＮＡ中には存在し得ない。
【００２０】
４．任意のＲＮＡ配列を含む下流領域。この領域は、代表的に、１つ以上のＨＭＬ−２ポリペプチドのコード配列を含むが、代わりに以下を含み得る：変異体ウイルスコード配列；ウイルス性または非ウイルス性の非コード配列；または非ウイルス性のコード配列。これらの配列のいずれかの転写物は、ＨＭＬ−２  ＬＴＲの制御下で生じ得る。
【００２１】
５．以下の配列を含む下流領域：配列番号５に対し、少なくとも７５％の配列同一性（例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有する配列；または、配列番号５に対し、少なくとも５０％の同一性（例えば、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、そして、少なくとも９５％の信頼水準で、正常な（すなわち、癌ではない）細胞での発現と比べて、少なくとも１．５倍（例えば、２、２．５、５、１０、２０、５０倍など）高いレベルを発現される配列；または、配列番号５の少なくとも２０個連続するヌクレオチドのフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００個など連続するヌクレオチド）に対し、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有する配列；または、配列番号５の少なくとも２０個連続するヌクレオチドのフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００個など連続するヌクレオチド）に対し、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、そして、少なくとも９５％の信頼水準で、正常な（すなわち、癌ではない）細胞での発現と比べて、少なくとも１．５倍（例えば、２、２．５、５、１０、２０、５０倍など）高いレベルを発現される配列。配列番号５は、ＥＲＶＫ６の３’末端中のＵ３Ｒ領域のヌクレオチド配列である。この配列は、代表的に、ＲＮＡの３’末端近くに存在し、即座に任意のポリＡ尾部に先行する。
【００２２】
６．３’ポリＡテール
上記の配列の同一性パーセントは、初期設定パラメータ：オープンギャップペナルティー＝−２０、および伸長ペナルティー＝−５を用いて、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムにより決定される。
【００２３】
これらのｍＲＮＡ分子を、以下で「ＰＣＡ−ｍＲＮＡ」分子（「前立腺癌関連ｍＲＮＡ」）といい、そしてこれらのＰＣＡ−ｍＲＮＡを発現する内因性のウイルスは、ＰＣＡＶ（「前立腺癌関連ウイルス」）という。にもかかわらず、このＰＣＡＶはまた、他型の癌にも関連し得る。
【００２４】
いくつかのＰＣＡ−ｍＲＮＡは、これらの領域６つ全てを含むが、ほとんどのＨＥＲＶは、複数の終止コドン、フレームシフト、またはより大きな欠失などを集積しており、不完全である。これは、多くのＰＣＡ−ｍＲＮＡが、６つの領域全てを含んでいないことを意味する。しかし、全てのＰＣＡ−ｍＲＮＡが同じ群のＬＴＲの制御下で転写される場合、ｍＲＮＡが機能的ポリペプチドをコードし得ないにもかかわらず、全てのＰＣＡ−ｍＲＮＡの転写は、前立腺腫瘍において上方制御される。
【００２５】
検出されるべきｍＲＮＡが、ゲノムＤＮＡにおいてＨＭＬ−２の５’ＬＴＲにより駆動される場合、これらの領域の第１の領域が常に存在するが、残りの５つは、任意である。逆に、検出されるべきｍＲＮＡがＨＭＬ−２の３’ＬＴＲにより制御される場合、これらの領域の第５の領域は常に存在し得るが、残りの５つは、任意である。
【００２６】
従って、一般に、検出されるべきｍＲＮＡは、式Ｎｌ−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５−ポリＡを有し、ここで、：
−Ｎｌは、配列番号１５５に対し少なくとも７５％の配列同一性を有するか；または、配列番号１５５に対し少なくとも５０％の同一性を有し、そして、少なくとも９５％の信頼水準で、正常な（すなわち、癌ではない）細胞での発現と比べて、少なくとも１．５倍高く発現されるか；あるいは、配列番号１５５の少なくとも２０個連続するヌクレオチドのフラグメントに対し少なくとも８０％の同一性を有するか；または、配列番号１５５の少なくとも２０個連続するヌクレオチドのフラグメントに対し少なくとも８０％の同一性を有し、そして、少なくとも９５％の信頼水準で、正常な（すなわち、癌ではない）細胞での発現と比べて、少なくとも１．５倍高く発現される；
−Ｎ２は、配列番号１５６に対し少なくとも７５％の配列同一性を有するか；または、配列番号１５６に対し少なくとも５０％の同一性を有し、そして、少なくとも９５％の信頼水準で、正常な（すなわち、癌ではない）細胞での発現と比べて、少なくとも１．５倍高く発現されるか；あるいは、配列番号１５６の少なくとも２０個連続するヌクレオチドのフラグメントに対し少なくとも８０％の同一性を有するか；または、配列番号１５６の少なくとも２０個連続するヌクレオチドのフラグメントに対し少なくとも８０％の同一性を有し、そして、少なくとも９５％の信頼水準で、正常な（すなわち、癌ではない）細胞での発現と比べて、少なくとも１．５倍高く発現される；
−Ｎ３は、配列番号６に対し少なくとも７５％の配列同一性を有するか；または、配列番号６に対し少なくとも５０％の同一性を有し、そして、少なくとも９５％の信頼水準で、正常な（すなわち、癌ではない）細胞での発現と比べて、少なくとも１．５倍高く発現されるか；あるいは、配列番号６の少なくとも２０個連続するヌクレオチドのフラグメントに対し少なくとも８０％の同一性を有するか；または、配列番号６の少なくとも２０個連続するヌクレオチドのフラグメントに対し少なくとも８０％の同一性を有し、そして、少なくとも９５％の信頼水準で、正常な（すなわち、癌ではない）細胞での発現と比べて、少なくとも１．５倍高く発現される；
−Ｎ４は、任意のＲＮＡ配列を含む；
−Ｎ５は、配列番号５に対し少なくとも７５％の配列同一性を有するか；または、配列番号５に対し少なくとも５０％の同一性を有し、そして、少なくとも９５％の信頼水準で、正常な（すなわち、癌ではない）細胞での発現と比べて、少なくとも１．５倍高く発現されるか；あるいは、配列番号５の少なくとも２０個連続するヌクレオチドのフラグメントに対し少なくとも８０％の同一性を有するか；または、配列番号５の少なくとも２０個連続するヌクレオチドのフラグメントに対し少なくとも８０％の同一性を有し、そして少なくとも９５％の信頼水準で、正常な（すなわち、癌ではない）細胞での発現と比べて、少なくとも１．５倍高く発現され；そして、
−Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４またはＮ５の少なくとも１つが存在するが、ポリＡは任意である。
【００２７】
Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４またはＮ５のうち少なくとも１つのみは存在する必要があるが、これらの領域のうち２つ、３つ、４つまたは５つが存在することが望ましい。Ｎ１および／またはＮ５のうちの少なくとも１つが存在することが望ましい。
【００２８】
Ｎ１は、好ましくは、検出されるｍＲＮＡで存在する（すなわち、本発明は好ましくは、５’ＬＴＲによって駆動されるｍＲＮＡの検出に基づく）。より好ましくは、少なくともＮ１−Ｎ２が存在する。
【００２９】
Ｎ１が存在する場合、好ましくは、Ｎ１は、ｍＲＮＡの５’末端（すなわち、５’−Ｎ１−．．．）にある。
【００３０】
Ｎ５が存在する場合、好ましくは、Ｎ５は、３’のポリＡテールの直前（すなわち、．．．−Ｎ５−ポリＡ−３’）にある。
【００３１】
Ｎ４が存在する場合、好ましくは、Ｎ４は、ポリペプチドコード配列（例えば、ＨＭＬ−２ポリペプチドをコードする）を含む。ＨＭＬ−２ポリペプチドコード配列の例は、以下に記載される。
【００３２】
ＲＮＡは、一般的に、５’キャップを有する。
【００３３】
（Ｂ．１−サンプル中のＲＮＡの濃縮）
診断がｍＲＮＡ検出に基づく場合、好ましくは、本発明の方法は、以下の初期工程を包含する：（ａ）患者のサンプルからＲＮＡ（たとえば、ｍＲＮＡ）を抽出する工程；（ｂ）ｍＲＮＡを除去することなく、患者のサンプルからＤＮＡを除去する工程；および／または（ｃ）患者のサンプルから、配列番号４を含むＤＮＡを除去または破壊するが、配列番号４を含むＲＮＡは除去も、破壊もしない工程。正常な前立腺細胞および前立腺の癌細胞の両方のゲノムは複数のＰＣＡＶ
ＤＮＡテンプレートを含むが、ＰＣＡ−ｍＲＮＡレベルの増加は、癌細胞においてのみ見出されるので、このことが必要である。代替物として、相同ＤＮＡの存在によって影響されないＲＮＡ特異的アッセイが、用いられ得る。
【００３４】
生物学的サンプルからＲＮＡを抽出するための方法は、周知であり［例えば、参考文献２および８］、そしてグアニジウム緩衝液、塩化リチウム、ＳＤＳ／酢酸カリウムなどに基づく方法を含む。全ての細胞ＲＮＡが抽出された後、ｍＲＮＡは、例えば、オリゴ−ｄＴ技術を用いて濃縮され得る。
【００３５】
生物学的サンプルから、ｍＲＮＡを除去することなくＤＮＡを除去するための方法は、周知であり［参考文献２の付表Ｃ］、そしてＤＮａｓｅ消化を含む。
【００３６】
ＲＮＡ（ＰＣＡ−ｍＲＮＡ配列を含む）を除去せずにＤＮＡを除去するための方法は、ＰＣＡ−ｍＲＮＡ内の配列に特異的であるが（例えば、配列番号４内のＤＮＡ配列を認識する制限酵素）、対応するＲＮＡ配列を切断しない、試薬を使用する。
【００３７】
サンプルからＰＣＡ−ｍＲＮＡを特異的に精製するための方法もまた、用いられ得る。１つのそのような方法は、ＰＣＡ−ｍＲＮＡに結合する親和性支持体（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｕｐｐｏｒｔ）を使用する。この親和性支持体は、ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡに結合するポリペプチド配列（例えば、ｃＯＲＦポリペプチド（このペプチドは配列特異的な様式でＨＥＲＶ−Ｋ  ｍＲＮＡのＬＴＲに結合する）またはＨＩＶ  Ｒｅｖタンパク質（このタンパク質は、ＨＥＲＶ−Ｋ  ＬＴＲを認識することが示されている［３］））を含み得る。
【００３８】
（Ｂ．２−ＲＮＡの直接的検出）
サンプル中の、特定のＲＮＡ配列の存在または非存在を検出するための種々の技術が、利用可能である［例えば、参考文献２および８］。サンプルがゲノムＰＣＡＶ  ＤＮＡを含む場合、その検出技術は、一般的に、ＲＮＡ特異的であり；サンプルがＰＣＡＶ  ＤＮＡを含まない場合、その検出技術は、ＲＮＡ特異的でも、ＲＮＡ特異的でなくてもよい。
【００３９】
ＰＣＡ−ｍＲＮＡの領域に相補的なポリヌクレオチドプローブが、ハイブリダイゼーション条件化でＲＮＡ含有サンプルに接触される、ハイブリダイゼーションに基づく検出技術が、用いられ得る。ハイブリダイゼーションの検出は、そのプローブに相補的な核酸が存在することを示す。ＲＮＡを伴う使用のためのハイブリダイゼーション技術としては、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーションおよびアレイが挙げられる。
【００４０】
サンプル中のＲＮＡ分子の配列が得られる、配列決定もまた用いられ得る。これらの技術は、サンプル中に目的の配列が存在するか否かを、直接的に明らかにする。Ｎ１に対応するＲＮＡの５’末端の配列決定は、一般的に適切である。
【００４１】
増幅に基づく技術もまた、用いられ得る。それらの技術としては、ＰＣＲ増幅、ＳＤＡ増幅、ＳＳＳＲ増幅、ＬＣＲ増幅、ＴＭＡ増幅、ＮＡＳＢＡ増幅、Ｔ７増幅などが挙げられる。好ましくは、その技術は、指数関数的増幅を生じる。ＲＮＡを伴う使用に関する好ましい技術は、ＲＴ−ＰＣＲである［例えば、参考文献２の第１５章を参照のこと］。前立腺細胞由来のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲは、参考文献４、５、６および７に報告される。
【００４２】
（Ｂ．３−ＲＮＡの間接的検出）
ＲＮＡを直接的に検出するのではなく、ＲＮＡから誘導された分子を検出すること（すなわち、ＲＮＡの間接的検出）が好適であり得る。ｍＲＮＡを検出する代表的な間接的方法とは、逆転写によってｃＤＮＡを調製し、次いで直接的にそのｃＤＮＡを検出することである。ｃＤＮＡの直接的検出は、一般的に、ＲＮＡの直接的検出に関する上記の場合と同じ技術を用いる（しかしＲＴ−ＰＣＲのような方法がＤＮＡ検出に適さずかつｃＤＮＡが二本鎖であると考えられ、そのため検出技術は、配列、その相補体、または二本鎖分子に基づき得る）。
【００４３】
（Ｂ．４−ポリヌクレオチド物質）
本発明は、ＰＣＡＶ核酸の検出における使用のためのポリヌクレオチド物質を、提供する。
【００４４】
本発明は、以下を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：（ａ）上で規定されたヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５−ポリＡ；（ｂ）上で規定されたヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５の少なくともｘヌクレオチドのフラグメント；（ｃ）上で規定されたヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５と少なくともｓ％の同一性を有するヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）の相補体。これらのポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５−ポリＡの改変体（例えば、分解改変体、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルソログ、変異体など）を含む。
【００４５】
フラグメント（ｂ）は、好ましくは、Ｎ１のフラグメントである。
【００４６】
ｘの値は、少なくとも７（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００など）である。ｘの値は、２０００未満（例えば１０００未満、５００未満、１００未満、または５０未満）でもよい。
【００４７】
好ましくは、ｓの値は、少なくとも５０（例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９など）である。
【００４８】
本発明はまた、式５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−３’を有する単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで：−Ａ−は、ａヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；−Ｃ−は、ｃヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；−Ｂ−は、（ａ）上で規定されたヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５のｂヌクレオチドのフラグメントまたは（ｂ）上で規定されたヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５のｂヌクレオチドのフラグメントの相補体のいずれかからなるヌクレオチド配列であり；そしてこのポリヌクレオチドは、（ａ）ヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５のフラグメントでも、（ｂ）ヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５のフラグメントの相補体でもない。
【００４９】
好ましくは、−Ｂ−部分は、Ｎ１−Ｎ２のフラグメントであり、そしてより好ましくは、Ｎ１のフラグメントである。−Ａ−部分および／または−Ｃ−部分は、例えばＴＭＡにおける使用のために、プロモーター配列（またはその相補体）を含み得る。
【００５０】
ａ＋ｃの値は、少なくとも１（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）である。ｂの値は、少なくとも７（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）である。ａ＋ｂ＋ｃの値が、少なくとも９（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）であることが好ましい。ａ＋ｂ＋ｃの値は、多くて５００（例えば、多くて４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９）であることが好ましい。
【００５１】
−Ｂ−が、Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５のフラグメントである場合、−Ａ−のヌクレオチド配列は、代表的に、Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５中の配列−Ｂ−の５’にあるａヌクレオチドに対してｎ％未満の配列同一性を共有し、かつ／または−Ｃ−のヌクレオチド配列は、代表的に、Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５中の配列−Ｃ−の３’にあるｃヌクレオチドに対してｎ％未満の配列同一性を共有する。同様に、−Ｂ−が、Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５のフラグメントの相補体である場合、−Ａ−のヌクレオチド配列は、代表的に、Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５中の配列−Ｂ−の相補体の５’にあるａヌクレオチドの相補体に対してｎ％未満の配列同一性を共有し、かつ／または−Ｃ−のヌクレオチド配列は、代表的に、Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５中の配列−Ｃ−の相補体の３’にあるｃヌクレオチドの相補体に対してｎ％未満の配列同一性を共有する。ｎの値は、一般的には、６０以下（例えば、５０、４０、３０、２０、１０以下）である。
【００５２】
本発明はまた、上に規定されたヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５を有する核酸または上に規定されたヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５の相補体を有する核酸に選択的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドも提供する。好ましくは、そのポリヌクレオチドは、少なくともＮ１にハイブリダイズする。
【００５３】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で、実施され得る。条件は、当該分野において周知でありかつ公開されたハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加させる［例えば、参考文献８の７．５２頁］。（ストリンジェンシーを増加させるための）適切な条件の例としては、以下が挙げられる：２５℃、３７℃、５０℃、５５℃、および６８℃のインキュベーション温度；１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度（ＳＳＣが０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液の場合）および他の緩衝液系を用いたそれらの等価物；０％、２５％、５０％、および７５％のホルムアミド濃度；５分〜２４時間のインキューベーション時間；１回、２回、またはそれより多い洗浄工程；１分、２分、または１５分の洗浄インキュベーション時間；および６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの洗浄溶液、あるいは脱イオン化水。ハイブリダイゼーション技術は、当該分野において周知である［例えば、参考文献２、８、９、１０、１１などを参照のこと］。特定のポリヌクレオチド配列およびそのポリヌクレオチド配列によってコードされた特定のドメインに依存して、既知のポリヌクレオチドと本発明のポリヌクレオチドとを比較するためのハイブリダイゼーション条件は、当業者によって理解されるように、異なり得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、低ストリンジェンシー条件下で選択的にハイブリダイズし；他の実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、中程度のストリンジェンシー条件下で選択的にハイブリダイズし；他の実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下で選択的にハイブリダイズする。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、５０℃および１０×ＳＳＣである。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、５５℃および１×ＳＳＣである。高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６８℃および０．１×ＳＳＣである。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチドは、特に、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅反応における使用のためのプローブおよび／またはプライマーとして有用である。
【００５６】
本発明の１より多いポリヌクレオチドは、同じ核酸標的にハイブリダイズし得る（例えば、１以上が単一のＲＮＡにハイズリダイズし得る）。
【００５７】
２つの核酸配列の間の配列同一性％に対する参照は、それが整列された場合、２つの配列の比較において同じである塩基のパーセンテージを意味する。この整列および相同性％または配列同一性％は、当該分野において公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献１１のセクション７．７．１８に記載されるソフトウェアプログラム）を用いて決定され得る。好ましい整列プログラムは、ＧＣＧ  Ｇａｐ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１）であり、その配列プログラムは、好ましくは、以下のようなデフォルトパラメーターを用いる：オープンギャップ＝３；拡張ギャップ＝１。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドは、種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、直鎖状、環状、ベクター、プライマー、プローブなど）をとり得る。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドは、多くの方法（例えば、化学合成によって（少なくとも一部分において）、制限酵素を用いた長鎖ポリヌクレオチドの消化によって、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物自体からなど）で調製され得る。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドは、固体支持体（例えば、ビーズ、プレート、フィルター、フィルム、スライド、樹脂、など）に付着されてもよい。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドは、検出可能な標識（例えば、放射性標識もしくは蛍光標識、またはビオチン標識）を含み得る。これは、ポリヌクレオチドが核酸検出技術に用いられる場合（例えば、その核酸が、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ、ｂＤＮＡなどのような技術における使用のためのプライマーであるかまたはプローブとしてある場合）に特に有用である。
【００６２】
用語「ポリヌクレオチド」とは、一般的に、任意の長さのヌクレオチドの重合体形態を意味し、その重合体はデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらのアナログを含む。そのポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、およびＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログ（例えば、改変された骨格または塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）など）が挙げられる。用語「ポリヌクレオチド」とは、他に特に示されない限り、核酸の長さまたは構造について制限することを企図せず、そして以下は、ポリヌクレチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ，組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の供給源由来の任意の単離されたＤＮＡ、任意の配列由来の任意の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、そして公知であるかまたは公知でない、任意の機能を示し得る。他に特定または要求されない限り、ポリヌクレオチドを含む本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態および二本鎖形態を形成することが知られているかまたはそのことが予想される二本の相補的一本鎖形態各々の両方を含む。
【００６３】
本発明のポリヌクレオチドは、実質的な純度において、一般的にはインタクトな染色体以外として単離され得、そして得られ得る。通常、ポリヌクレオチドは、天然に存在する他の核酸配列を実質的に含まずに得られ、そのポリヌクレオチドは、一般的に、少なくとも約５０％（重量）の純度であり、通常は少なくとも約９０％の純度である。
【００６４】
本発明のポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）は、代表的に、「組換え体」である（例えば、天然に存在する染色体上では通常結合されない１つ以上のヌクレオチドに隣接する）。
【００６５】
ポリヌクレオチドは、例えば、以下：ポリペプチドを産生するため；生物学的サンプル中の核酸を検出するためのプローブとして；ポリヌクレオチドのさらなるコピーを産生するため；リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを産生するため；そして一本鎖ＤＮＡプローブまたは三本鎖形成オリゴヌクレオチドとして用いられ得る。好ましくは、このポリヌクレオチドは、ＰＣＡ−ｍＲＮＡを検出するために用いられる。
【００６６】
「ベクター」とは、１つ以上の細胞型の形質導入／トランスフェクションのために設計されたポリヌクレオチド構築物である。ベクターとは、例えば、挿入されるヌクレオチドの単離、増殖、および複製のために設計された「クローニングベクター」、宿主細胞中のヌクレオチド配列の発現のために設計された「発現ベクター」、組換えウイルスもしくはウイルス様粒子の産生を生じるように設計された「ウイルスベクター」、または１種類より多い型のベクターの属性を含む「シャトルベクター」であり得る。
【００６７】
「宿主細胞」は、外因性ポリヌクレオチドのレシピエントであり得るかまたは外因性ポリヌクレオチドのレシピエントであった、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、その子孫は、天然、偶発性、または意図的な変異および／または変化に起因して、元の親細胞に必ずしも完全に同一（形態学的にか、または総ＤＮＡ相補体において）であり得ない。宿主細胞は、本発明のポリヌクレトチドを用いて、インビボまたはインビトロでトランスフェクトまたは感染された細胞を含む。
【００６８】
（Ｂ．５−核酸検出キット）
本発明は、ＰＣＡＶ核酸中に含まれるテンプレート配列を増幅するためのプライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）を備えるキット、第１のプライマーおよび第２のプライマーを備えるキットを提供し、ここで第１のプライマーは、このテンプレート配列に対して実質的に相補的であり、かつ第２のプライマーは、実質的にそのテンプレート配列の相補体に相補的であり、ここで実質的相補性を有するこのプライマーの部分は、増幅されるテンプレート配列の末端を規定する。第１のプライマーおよび／または第２のプライマーは、検出可能な標識を含み得る。
【００６９】
本発明はまた、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを備えるキットを提供し、それらの一本鎖オリゴヌクレオチドは、一本鎖核酸または二本鎖核酸（あるいはそれらの混合物）中に含まれるＰＣＡＶテンプレート核酸配列の増幅を可能とし、ここで：（ａ）第１のオリゴヌクレオチドは、このテンプレート核酸配列に実質的に相補的なプライマー配列を含み；（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドは、このテンプレート核酸配列の相補体に実質的に相補的であるプライマー配列を含み；（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドは、このテンプレート核酸に相補的でない配列を含み；そして（ｄ）このプライマー配列は、増幅されるテンプレート配列の末端を規定する。特徴（ｃ）の非相補的配列は、好ましくは、プライマー配列の上流（すなわち、５’側）である。（ｃ）配列の１つまたは両方は、制限部位［１２］またはプロモーター配列［１３］を含み得る。第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識を含み得る。
【００７０】
本発明のキットはまた、標識化されたポリヌクレオチドを含み得、その標識化されたポリヌクレオチドは、テンプレート配列（またはその相補体）のフラグメントを含む。これは、増幅されたテンプレートを検出するためのハイブリダイゼーション技術において用いられ得る。
【００７１】
好ましくは、これらのキットに用いられるプライマーおよびプローブは、セクションＢ．４に記載されるポリヌクレオチドである。
【００７２】
好ましくは、そのテンプレートは、上のセクションＢ．１に規定される配列である。
【００７３】
（Ｃ−ポリペプチド発現産物）
本方法がポリペプチドの検出に基づく場合、ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現を検出することに関連する。このことは、代表的に１つ以上のＨＭＬ−２ポリペプチド（ｇａｇ、ｐｒｔ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｃＯＲＦ）を検出することに関連する。いくつかのＰＣＡ−ｍＲＮＡはこれらのポリペプチドの全てをコードするが（例えば、ＥＲＶＫ６（１））、大部分のＨＥＲＶ（ＰＣＡＶを含む）のポリペプチドコード領域は、ｍＲＮＡ転写物中に１つ以上のコード領域が、変異されているか、または存在しないかのいずれかであることを意味する変異を含む。従って、全てのＰＣＡＶが全てのＨＭＬ−２ポリペプチドをコードする能力を有するとは限らない。
【００７４】
ＨＭＬ−２ポリペプチドをコードする転写物を、内在性ゲノムの全長ｍＲＮＡのコピーの選択的プライシングにより作製した（例えば、参考文献１４３の図４）。
【００７５】
ＨＭＬ−２  ｇａｇポリペプチドは、完全なＨＭＬ−２ゲノム中の一番目に長いＯＲＦによりコードされる（１４０）。全長ｇａｇポリペプチドは、タンパク質分解性に切断される。
【００７６】
ｇａｇヌクレオチド配列の例としては、以下が挙げられる：配列番号７、８、９、および１１（ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ））；配列番号８５（ＨＥＲＶ−Ｋ１０８）；配列番号９１（ＨＥＲＶ−Ｋ（Ｃ７））；配列番号９７（ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ））；配列番号１０２（ＨＥＲＶ−Ｋ１０）。
【００７７】
ｇａｇポリペプチド配列の例としては、以下が挙げられる：配列番号４６、４７、４８、４９、５６、および５７（ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ））；配列番号９２（ＨＥＲＶ−Ｋ（Ｃ７））；配列番号９８（ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ））；配列番号１０３および１０４（ＨＥＲＶ−Ｋ１０）；配列番号１４６（「ＥＲＶＫ６」）。
【００７８】
ｇａｇポリペプチド配列のアライメントを図７に示す。
【００７９】
ＨＭＬ−２  ｐｒｔポリペプチドは、完全なＨＭＬ−２ゲノム中の二番目に長いＯＲＦによりコードされる。それはｇａｇ−ｐｒｔ融合ポリペプチドとして翻訳される。その融合ポリペプチドが、プロテアーゼを与えるために、タンパク質分解性に切断される。
【００８０】
ｐｒｔヌクレオチド配列の例としては、以下が挙げられる：配列番号８６（ＨＥＲＶ−Ｋ（１０８））；配列番号９９（ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ））；配列番号１０５（ＨＥＲＶ−Ｋ１０）。
【００８１】
ｐｒｔポリペプチド配列の例としては、以下が挙げられる：配列番号１０６（ＨＥＲＶ−Ｋ１０）；配列番号１４７（「ＥＲＶＫ６」）。
【００８２】
ＨＭＬ−２  ｐｏｌポリペプチドは、完全なＨＭＬ−２ゲノム中の三番目に長いＯＲＦによりコードされる。これはｇａｇ−ｐｒｔ−ｐｏｌ融合ポリペプチドとして翻訳される。この融合ポリペプチドは、３つのｐｏｌ生成物（逆転写酵素、エンドヌクレアーゼおよびインテグラーゼ）を与えるために、タンパク質分解性に切断される（１４）。
【００８３】
ｐｏｌヌクレオチド配列の例としては、以下が挙げられる：配列番号８７（ＨＥＲＶ−Ｋ１０８）；配列番号９３（ＨＥＲＶ−Ｋ（Ｃ７））；配列番号１００（ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ））；配列番号１０７（ＨＥＲＶ−Ｋ１０）。
【００８４】
ｐｏｌポリペプチド配列の例としては、以下が挙げられる：配列番号９４（ＨＥＲＶ−Ｋ（Ｃ７））；配列番号１０８（ＨＥＲＶ−Ｋ１０）；配列番号１４８（「ＥＲＶＫ６」）。
【００８５】
ｐｏｌポリペプチド配列のアライメントを図８に示す。
【００８６】
ＨＭＬ−２  ｅｎｖポリペプチドは、完全なＨＭＬ−２ゲノム中の四番目に長いＯＲＦによりコードされる。翻訳されたポリペプチドは、タンパク質分解性に切断される。
【００８７】
ｅｎｖヌクレオチド配列の例としては、以下が挙げられる：配列番号８８（ＨＥＲＶ−Ｋ（１０８））；配列番号９５（ＨＥＲＶ−Ｋ（Ｃ７））；配列番号１０１（ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ））；配列番号１０７（ＨＥＲＶ−Ｋ１０）。
【００８８】
ｅｎｖポリペプチド配列の例としては、以下が挙げられる：配列番号９６（ＨＥＲＶ−Ｋ（Ｃ７））；配列番号１０８（ＨＥＲＶ−Ｋ１０）；配列番号１４９（「ＥＲＶＫ６」）。
【００８９】
ｅｎｖポリヌクレオチド配列およびｅｎｖポリペプチド配列のアライメントを図６および図９に示す。
【００９０】
ＨＭＬ−２  ｃＯＲＦポリペプチドは、ｅｎｖと同一の５’領域および開始コドンを共有するＯＲＦによりコードされる。アミノ酸８７の後で、スプライシング事象は、ｅｎｖコード配列を除去し、そしてｃＯＲＦコード配列は、ｅｎｖのリーディングフレームに関係するリーディングフレーム＋１に続く（１５，１６；以下参照のこと）。ｃＯＲＦはまた、Ｒｅｃとも呼ばれている（１７）。
【００９１】
ｃＯＲＦヌクレオチド配列の例としては、以下が挙げられる：配列番号８９、および配列番号９０（ＨＥＲＶ−Ｋ（１０８））。
【００９２】
ｃＯＲＦポリペプチド配列の例は、配列番号１０９である。
【００９３】
（Ｃ．１−ＨＭＬ−２ポリペプチドの直接的な検出）
様々な技術が、サンプル中の特定のポリペプチドの存在または非存在を検出するために利用可能である。これらは一般的に、抗体とポリペプチド中の抗原性アミノ酸配列との間の特異的相互作用に基づく免疫アッセイ技術である。適切な技術としては、標準的な免疫組織化学的方法、免疫沈降、免疫発光、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡなどが挙げられる。
【００９４】
従って、一般的に本発明は、生物学的サンプル中に本発明のポリペプチドの存在を検出する方法、および／または、そのレベルを測定する方法を提供し、ここで、その方法はそのポリペプチドに特異的な抗体を使用する。一般的に、その方法は、以下の工程を包含する：ａ）サンプルをそのポリペプチドに特異的な抗体と接触させる工程；およびｂ）サンプル中の抗体とポリペプチドとの間の結合を検出する工程。
【００９５】
本発明のポリペプチドをまた、機能性アッセイ（例えば、結合活性または酵素活性を検出するアッセイ）により検出し得る。例えば、ｃＯＲＦの機能性アッセイが参考文献１６、１２９および１３０に開示される。プロテアーゼについての機能的アッセイは、参考文献１４０に開示される。
【００９６】
本発明のポリペプチドを検出する別の方法は、標準的なプロテオミクスの技術を使用すること（例えば、ポリペプチドを精製または分離し、次いでペプチド配列決定を使用すること）である。例えば、ある配列が標的ポリペプチド中に存在するかどうかを判定するために、ポリペプチドを２Ｄ−ＰＡＧＥを使用して分離し得、そしてポリペプチドのスポットを（例えば、質量分析計により）配列決定し得る。
【００９７】
インビボにおける使用のために（例えば、癌細胞が存在する部位を位置付けるか、または同定するため）、検出方法を適応し得る。これらの実施形態において、標的ポリペプチドに特異的な抗体を、個体に（例えば、注射により）投与し、そして標準的な画像化技術（例えば、磁気共鳴画像、コンピューター断層撮影走査など）を使用して、その抗体を位置付ける。適切な標識（例えば、スピン標識など）を使用する。これらの技術を使用して、癌細胞を別々に標識する。
【００９８】
標的ペプチドを精製する必要無しに、細胞上で免疫発光アッセイを容易に実施し得る。その細胞を、最初に固体支持体（例えば、顕微鏡スライド、またはマイクロタイターウェル）上に固定する。次いで、ポリペプチド特異的な抗体の導入を可能とするために、細胞膜を透過性にする（注意：固定化と透過性化は同時に達成され得る）。次に、コードされるポリペプチドに特異的な、蛍光標識された抗体に、その固定化細胞を曝露する。この標識（例えば顕微鏡下で可視化される）の存在は、標的のＰＣＡＶポリペプチドを発現する細胞を同定する。そのアッセイの感度を増加させるために、二次抗体により送達される標識を有した、抗ＰＣＡＶ抗体に結合する二次抗体を使用することが可能である（１８）。
【００９９】
（Ｃ．２−ＨＭＬ−２ポリペプチドの間接的な検出）
ポリペプチドを直接的に検出するよりもむしろ、ポリペプチドに応答して生体により生産される分子を検出すること（すなわち、ポリペプチドの間接的な検出）が好まれ得る。これは、代表的に抗体の検出に関係し、そこでは、患者サンプルは一般的に血液サンプルである。従来の免疫アッセイ技術、例えば、本発明のＰＣＡＶポリペプチドを使用して、これを典型的に固定化することにより、抗体を検出し得る。
【０１００】
ＨＥＲＶ−Ｋポリペプチドに対する抗体が、ヒトにおいて検出されている（１４３）。
【０１０１】
（Ｃ．３−ポリペプチド材料）
本発明は、本発明の検出方法における使用のためのポリペプチドを提供する。一般的には、これらのポリペプチドは、ＰＣＡ−ｍＲＮＡにより（例えば、−Ｎ４−領域中の配列により）コードされる。
【０１０２】
本発明は、以下を含む単離されたポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号１０９（ｃＯＲＦ）、配列番号１４６（ｇａｇ）、配列番号１４７（ｐｒｔ）、配列番号１４８（ｐｏｌ）、配列番号１４９（ｅｎｖ）からなる群より選択されるアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）のうちの少なくともｘアミノ酸のフラグメント；または（ｃ）（ａ）に対して少なくともｓ％の同一性を有するポリペプチド配列。これらのポリペプチドとしては、改変体（例えば、アリル改変体、相同体、オルトログ、変異体など）が挙げられる。
【０１０３】
値ｘは、少なくとも５（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００など）である。値ｘは、２０００未満で有り得る（例えば、１０００未満、５００未満、１００未満、または５０未満）。
【０１０４】
値ｓは、好ましくは少なくとも５０である（例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９など）。
【０１０５】
本発明はまた、式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨを有する単離されたポリペプチドを提供し、ここで：Ａはａアミノ酸からなるポリペプチド配列である；Ｃはｃアミノ酸配列からなるポリペプチド配列である；Ｂは、配列番号１０９、１４６、１４７、１４８、１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列のｂアミノ酸のフラグメントからなるポリペプチド配列である；そして、前記ポリペプチドは、配列番号１０９、１４６、１４７、１４８または１４９のポリペプチド配列のフラグメントではない。
【０１０６】
値ａ＋ｃは、少なくとも１（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）である。値ｂは、少なくとも５（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）である。値ａ＋ｂ＋ｃは、少なくとも９（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）であることが好ましい。値ａ＋ｂ＋ｃは最大で５００（例えば、最大で、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９）であることが好ましい。
【０１０７】
−Ａ−のアミノ酸配列は、配列番号１０９、１４６、１４７、１４８または１４９における配列−Ｂ−のＮ末端であるａアミノ酸配列に対して、ｎ％未満の配列同一性を代表的に共有し、そして、−Ｃ−のアミノ酸配列は、配列番号１０９、１４６、１４７、１４８または１４９における配列−Ｂ−のＣ末端であるｃアミノ酸配列に対して、ｎ％未満の配列同一性を代表的に共有する。値ｎは一般的に６０またはそれ未満（例えば、５０、４０、３０、２０、１０またはそれ未満）である。
【０１０８】
（ｂ）のフラグメントは、配列番号１０９、１４６、１４７、１４８、または１４９の、Ｔ細胞もしくは好ましくはＢ細胞のエピトープを含み得る。Ｔ細胞およびＢ細胞のエピトープは、実験的に（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ方法（１９、２０）または同様の方法を使用して）同定され得るか、またはそれらは（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性インデックス（２１）、マトリックスベースのアプローチ（２２）、ＴＥＰＩＴＯＰＥ（２３）、神経網（２４）、ＯｐｔｉＭｅｒ  ＆  ＥｐｉＭｅｒ（２５、２６）、ＡＤＥＰＴ（２７）、Ｔｓｉｔｅｓ（２８）、親水性（２９）、抗原インデックス（３０）、または参考文献３１に開示される方法、などを用いて）予想され得る。
【０１０９】
二つのアミノ酸配列間のパーセント配列同一性に対する参照とは、整列した場合、アミノ酸のパーセントが二つの配列の比較において同一であることを意味する。このアライメントおよびそのパーセント相同性または配列同一性を、当該分野に公知のソフトウェアプログラム（例えば参考文献１１の７．７．１８章に記載されるもの）を使用して決定し得る。好ましいアライメントを、ギャップオープンペナルティ１２およびギャップ延長ペナルティ２、ＢＬＯＳＵＭマトリックス６２を用いるアフィン（ａｆｆｉｎｅ）ギャップ検索を使用する、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定する。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献３２に教示される。
【０１１０】
本発明のポリペプチドを、多くの方法（例えば、（少なくとも一部の）化学合成によりプロテアーゼを使用する、より長いポリペプチドを消化することにより、ＲＮＡからの翻訳により、細胞培養物からの（例えば、組換え体の発現からの）精製により）において、生物自身から（例えば、精巣組織からの単離）、細胞株供給源などから調製し得る。
【０１１１】
本発明のポリペプチドを、様々な形態（例えば、ネイティブ、融合、グリコシル化された、非グリコシル化された、など）で調製し得る。
【０１１２】
本発明のポリペプチドを、固体支持体に結合し得る。
【０１１３】
本発明のポリペプチドは、検出可能な標識（例えば、放射標識、または発光標識、もしくはビオチン標識）を含み得る。
【０１１４】
一般的に、本発明のポリペプチドは、天然に存在しない環境において提供され、例えばそのポリペプチドは、天然に存在する環境より分離される。ある実施形態において、本ポリペプチドは、コントロールと比較した場合、そのポリペプチドに富んだ組成物中に存在する。そのような場合、精製されたポリペプチドが提供され、この精製により、そのポリペプチドが、実質的に他に発現されたポリペプチドを含まない組成物中に存在することを意味し、実質的に含まないことにより、９０％未満、普通は６０％未満、そしてより普通には５０％未満の組成物が、他に発現されたポリペプチドから成ることを意味する。
【０１１５】
用語「ポリペプチド」とは、任意の長さのアミノ酸ポリマーを称する。そのポリマーは線状で有り得るか、または分枝状であり得、改変されたアミノ酸を含み得、そして非アミノ酸により阻害され得る。この用語はまた、天然に改変されているアミノ酸ポリマーまたは介入（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂肪付加、アセチル化、リン酸化、もしくは他の全ての操作または改変（例えば、標識成分との結合））されているアミノ酸ポリマーに拡張し得る。また、この定義の中には、例えば、１つ以上のアミノ酸アナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含むポリペプチド、ならびに当該分野に公知の他の改変を含むポリペプチドが含まれる。ポリペプチドは、単一鎖として、または同伴する鎖として存在し得る。本発明のポリペプチドは、天然または非天然にグリコシル化され得る（すなわち、そのポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドに対応して見出されるグリコシル化パターンとは、異なるグリコシル化パターンを有する）。
【０１１６】
変異体は、アミノ酸の置換、付加、欠失を含み得る。アミノ酸置換は、保存的なアミノ酸置換あるいは非必須アミノ酸を除外する置換（例えば、グリコシル化部位、リン酸化部位、またはアセチル化部位を変更するような）、または機能に必要とされない１つ以上のシステイン残基の置換または欠失による誤った折りたたみを最小にする置換で有り得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸の一般的な電荷、疎水性／親水性、および／または立体容量を保存する置換である。改変体は、そのポリペプチドの特定の領域（例えば、機能性ドメイン、そして／または、そのポリペプチドがポリペプチドファミリーのメンバーである場合、コンセンサス配列に結合する領域）の生物学的活性を保持するか、または増強するように設計され得る。改変体を生成するためのアミノ酸の変更の選択は、アミノ酸のアクセス度（内部対外部）（例えば、参考文献３３）、多様なポリペプチドの耐熱性（例えば、参考文献３４）、所望されるグリコシル化部位（例えば、参考文献３５）、所望されるジスルフィド架橋（例えば、参考文献３６および３７）、所望される金属結合部位（例えば、参考文献３８および３９）、ならびにプロリンループを有する所望される置換（例えば、参考文献４０）に基づき得る。システイン欠損ムテインは、参考文献４１において開示されるように生成され得る。
【０１１７】
（Ｃ．４−抗体材料）
本発明はまた、本発明のポリペプチドに結合する、単離された抗体、またはその抗原結合性フラグメントを提供する。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに結合する、単離された抗体、またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１１８】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体で有り得、そして任意の適切な手段により（例えば、組換え体の発現により）生成され得る。
【０１１９】
本発明の抗体は標識を含み得る。その標識は、放射標識または蛍光標識のように、間接的に検出可能で有り得る。あるいは、その標識は、生成物が検出可能である酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼなど）のように、間接的に検出可能で有り得る。
【０１２０】
本発明の抗体は、固体支持体に付着され得る。
【０１２１】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを適切な動物（例えば、ウサギ、ハムスター、マウスまたは他のげっ歯類）に投与（例えば注入）によって調製され得る。
【０１２２】
抗体の抗原結合性フラグメントとしては、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２などが挙げられる。
【０１２３】
ヒト免疫系に関する適合性を増加させるために、その抗体はキメラであり得、またはヒト化され得る（例えば、参考文献４２および４３）か、または完全なヒト抗体が使用され得る。ヒト化された抗体は、ヒトにおいて元の非ヒトモノクローナル抗体よりもずっと免疫原性が低いので、それらはアナフィラキシーの危険をずっと低下させて、ヒトの処置に使用され得る。従って、これらの抗体は、新生物疾患の処置のための放射線増感剤としての使用、または癌治療の副作用を軽減させるための方法における使用のような、ヒトに対するインビボ投与に関係する治療的な用途に好まれ得る。
【０１２４】
ヒト化抗体は、例えば、以下の工程を含む種々の方法により達成され得る：（１）ヒトのフレームワークおよび定常領域に、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植する（「ヒト化する」）工程、必要に応じて１つ以上のフレームワークの残基を非ヒト抗体から移すことを伴う；（２）完全な非ヒトの多様性ドメインを移植する工程であるが、表面残基の置換によりヒト様表面を用いてそれらを「覆う」（「ベニヤ張り」）工程。本発明において、ヒト化抗体とは、「ヒト化（された）」抗体および「ベニヤ張りの」抗体の両者を含む（４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０）。
【０１２５】
ＣＤＲは、ネイティブの免疫グロブリン結合部位のＦｖ領域の結合親和性および特異性を合わせて定義するアミノ酸配列である（例えば、参考文献５１および５２）。
【０１２６】
句「定常領域」とは、エフェクター機能を授ける抗体分子の部分を称する。キメラ抗体において、マウス定常領域はヒト定常領域で置換される。ヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。これらの重鎖定常領域は、任意の５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γまたはμから選択され得る。
【０１２７】
抗体をヒト化する１つの方法は、ヒト重鎖配列およびヒト軽鎖配列に対する非ヒト抗体の重鎖配列および軽鎖配列を整列する工程、このような整列に基づいて非ヒト骨格残基をヒト骨格残基で置換する工程、非ヒト親抗体のコンホメーションと比較してヒト化配列のコンホメーションを分子モデリングする工程、およびヒト化配列モデルにおけるＣＤＲの推定コンホメーションが、親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲのコンホメーションに極めて近似するまで、非ヒトＣＤＲの構造を乱す骨格領域の残基を繰返し戻し変異する工程を含む。このようなヒト化抗体は、さらに誘導体化されて、例えば、Ａｓｈｗｅｌｌレセプター［参考文献５３および５４］を介する取込みおよびクリアランスを容易にし得る。
【０１２８】
ヒト化抗体または完全ヒト抗体はまた、ヒトの免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニック動物を用いて産生され得る。例えば、参考文献５５は、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示し、ここで、この動物は、内因性の重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の不活化に起因して、機能的な内因性免疫グロブリンを産生しない。参考文献５６はまた、免疫原に対する免疫応答を開始し得るトランスジェニックの非霊長類哺乳動物宿主を開示し、ここで、この抗体は、霊長類の定常領域および／または可変領域を有し、そしてここで、この内因性免疫グロブリンコード遺伝子座は、置換されているかまたは不活化されている。参考文献５７は、哺乳動物における免疫グロブリン遺伝子座を改変するため（例えば、定常領域もしくは可変領域の全てもしくは一部を置換して、改変抗体分子を形成するため）のＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用を開示する。参考文献５８は、不活化された内因性Ｉｇ遺伝子座および機能的ヒトＩｇ遺伝子座を有する、非ヒト哺乳動物宿主を開示する。参考文献５９は、内因性重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｌａｉｍ）を欠き、そして１以上の異種定常領域を含む外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現する、トランスジェニックマウスの作製方法を開示する。
【０１２９】
上記のトランスジェニック動物を使用して、ＰＣＡＶポリペプチドに対する免疫応答が生成され得、そしてこの動物から抗体産生細胞が取り出され得、そしてこの細胞を用いて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマが生成され得る。免疫プロトコル、アジュバントなどは当該分野で公知であり、そして例えば、参考文献６０において記載されるとおりのトランスジェニックマウスの免疫において用いられている。このモノクローナル抗体は、対応するポリペプチドの生物学的活性または生理学的影響を阻害または中和する能力について試験され得る。
【０１３０】
（Ｄ−コントロールサンプルとの比較）
（Ｄ．１−コントロール）
ＨＭＬ−２転写産物は、腫瘍（前立腺腫瘍を含む）においてアップレギュレートされる。このようなアップレギュレーションを検出するために、基準点、すなわち、コントロールが必要とされる。コントロールサンプルの分析によって、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現の標準レベルが得られ、この標準レベルに対して、患者のサンプルが比較され得る。
【０１３１】
ネガティブコントロールによって、発現のバックグラウンドまたは基底レベルが得られ、このレベルに対して、患者のサンプルが比較され得る。ネガティブコントロールと比較してより高いレベルの発現産物は、このサンプルを採取した患者が、例えば、前立腺癌を有することを示す。代表的には、前立腺癌に関しては、例えば、ネガティブコントロールは、生涯のベースラインレベルの発現またはプールされた健常者において観察された発現レベルを含む。逆に、等価なレベルの発現産物は、この患者がＨＭＬ−２関連癌（例えば、前立腺癌）を有さないことをを示す。
【０１３２】
ポジティブコントロールによって、患者のサンプルが比較され得る発現レベルが得られる。ポジティブコントロールと比較して等価またはより高いレベルの発現産物は、サンプルを採取した患者が癌（例えば、前立腺癌）を有することを示す。逆に、より低いレベルの発現産物は、この患者がＨＭＬ−２関連癌（例えば、前立腺癌）を有さないことを示す。
【０１３３】
直接的もしくは間接的なＲＮＡ測定に関して、または直接的なポリペプチド測定に関して、ネガティブコントロールは一般に、腫瘍細胞（例えば、前立腺腫瘍細胞）由来ではない細胞を含む。間接的ポリペプチド測定に関して、ネガティブコントロールは一般に、前立腺腫瘍を有さない患者由来の血液サンプルである。ネガティブコントロールは、患者サンプルと同じ患者由来の、しかし、ＨＭＬ−２発現がアップレギュレートされていない組織（例えば、非腫瘍性非前立腺細胞）由来のサンプルであり得る。ネガティブコントロールは、患者のサンプルと同じ患者由来の、しかし、患者の人生の、より早い時期に採取された、前立腺細胞であり得る。ネガティブコントロールは、前立腺腫瘍を有さない患者由来の細胞であり得る。この細胞は、前立腺細胞由来であってもそうでなくてもよい。ネガティブコントロール細胞は、ＢＰＨを有する患者由来の前立腺細胞であり得る。
【０１３４】
直接的もしくは間接的なＲＮＡ測定に関して、または直接的ポリペプチド測定に関して、ポジティブコントロールは一般に、腫瘍細胞（例えば、前立腺腫瘍）由来の細胞を含む。間接的ポリペプチド測定に関して、ネガティブコントロールは一般に、前立腺腫瘍を有する患者由来の血液サンプルである。ポジティブコントロールは、患者サンプルと同じ患者由来の、しかし、患者の人生において（例えば、寛解をモニタリングするために）より早い時期に採取された、前立腺腫瘍細胞であり得る。ポジティブコントロールは、前立腺腫瘍を有する別の患者由来の細胞であり得る。ポジティブコントロールは、前立腺細胞株であり得る。
【０１３５】
他の適切なポジティブコントロールおよびネガティブコントロールは、当業者に明らかである。
【０１３６】
コントロールにおけるＨＭＬ−２発現は、患者のサンプルにおける発現と同時に評価され得る。あるいは、コントロールにおけるＨＭＬ−２発現は、別々に（先または後に）評価され得る。
【０１３７】
しかし、２つのサンプルを実際に比較するよりは、コントロールは、絶対値、すなわち、（例えば、標準条件下の）前立腺腫瘍患者から採取されたサンプルから経験的に決定された発現レベルであり得る。
【０１３８】
（Ｄ．２−アップレギュレーションの程度）
コントロール（１００％）に比較したアップレギュレーションは通常、少なくとも１５０％（例えば、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％以上）である。
【０１３９】
（Ｄ．３−診断）
本発明は、前立腺癌を診断するための方法を提供する。本発明による「診断」が、疾患の確定的臨床診断から、患者が確定的診断をもたらし得るさらなる試験を受けるべきであるという指標までの範囲にわたり得ることが明らかである。例えば、本発明の方法は、スクリーニングプロセスの一部として用いられ得、ポジティブサンプルがさらなる分析に供される。
【０１４０】
さらに、診断は、癌を有することが既に既知の患者における癌の進行をモニタリングすることを包含する。癌はまた、本発明の方法によって病期分類され得る。好ましくは、癌は前立腺癌である。
【０１４１】
関連した癌の処置レジメン（治療測定法（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃ））の効力はまた、本発明の方法によってモニタリングされて、例えば、その効力が決定され得る。
【０１４２】
癌に対する感受性もまた、例えば、発現のアップレギュレーションが生じているが癌を発症する前の場合、検出され得る。予後方法もまた包含される。
【０１４３】
これらの技術の全ては、本発明における「診断」の一般的意味に含まれる。
【０１４４】
（Ｅ−薬学的組成物）
本発明は、上記で定義されたとおりのポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体を含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、薬としてのそれらの使用、および前立腺癌を処置するための薬の製造におけるそれらの使用を提供する。本発明はまた、免疫原性用量の本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを動物に投与する工程を包含する、免疫応答を惹起するための方法を提供する。
【０１４５】
本発明によって包含される薬学的組成物は、活性薬剤として、本明細書中に開示される本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体を治療有効量で含む。「有効量」は、有益な結果または所望の結果（臨床結果を含む）をもたらすに充分な量である。有効量は、１以上の投与において投与され得る。本発明の目的のためには、有効量は、前立腺癌の症状および／または進行を緩和、改善、安定化、逆転、緩慢化または遅延させるに充分な量である。
【０１４６】
組成物を用いて、癌ならびに原発性癌の転移物を処置し得る。さらに、薬学的組成物を従来の癌処置方法と共に用いて、例えば、腫瘍を放射線または従来の化学療法に感作し得る。用語「処置」、「処置している」、「処置する」などは、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを一般的にいうために本明細書において用いられる。この効果は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に予防することに関して予防的であり得るか、ならびに／または疾患および／もしくはその疾患に起因し得る有害な影響についての部分的もしくは完全な安定化もしくは治癒に関して治療的であり得る。本明細書中で使用される場合、「処置」は、哺乳動物（特にヒト）における疾患の任意の処置を包含し、そして以下を包含する：（ａ）疾患もしくは症状が、その疾患もしくは症状の素因を有し得るがその疾患もしくは症状を有しているとは未だ診断されていない被験体において生じるのを予防すること；（ｂ）疾患の症状を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること；または（ｃ）疾患の症状を軽減すること、すなわち、疾患もしくは症状の後退を引き起こすこと。
【０１４７】
薬学的組成物が、示差的に発現されるポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物に特異的に結合する抗体を含む場合、この抗体は、処置部位への送達のために薬物に結合され得るか、または検出可能な標識に結合されて、癌細胞（例えば、前立腺癌細胞）を含む部位の画像化を容易にし得る。抗体を薬物または検出可能な標識に結合するための方法は当該分野で周知であり、検出可能な標識を用いる画像化のための方法も同様である。
【０１４８】
本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」は、所望の疾患もしくは状態を処置、改善もしくは予防するため、または検出可能な治療効果もしくは予防効果を示すための治療薬剤の量をいう。この効果は、例えば、化学的マーカーまたは抗原レベルによって検出され得る。治療効果はまた、身体症状における減少を包含する。被験体に関する正確な有効量は、被験体の大きさおよび健康、状態の性質および程度、ならびに投与のために選択された治療剤または治療剤の組み合わせに依存する。所定の状態に関する有効量は、慣用実験によって決定され、そして臨床医の判断の範囲内である。本発明の目的に関して、有効用量は一般に、投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの本発明の組成物である。
【０１４９】
薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、治療薬剤（例えば、抗体またはポリペプチド、遺伝子および他の治療薬剤）の投与のためのキャリアをいう。この用語は、その組成物を受ける個体に対して有害な抗体の産生をそれ自体は誘導せず、かつ過度の毒性を伴わずに投与され得る、任意の薬学的キャリアをいう。適切なキャリアは、大きな、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子）であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。治療組成物中の薬学的に受容可能なキャリアとしては、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体が挙げられ得る。補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）もまた、このようなビヒクル中に存在し得る。代表的に、治療組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかの注射可能物として調製される；注射の前に液体ビヒクルへの溶解または懸濁に適切な固体形態もまた調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの定義の中に含まれる。薬学的に受容可能な塩（例えば、鉱酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）；および有機酸塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸、マロン酸、安息香酸など））もまた、薬学的組成物中に存在し得る。薬学的に受容可能賦形剤の徹底的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９９５）Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆  Ｗｉｌｋｉｎｓにおいて入手可能である。
【０１５０】
組成物は好ましくは、無菌であり、そして／または発熱物質を含まない。組成物は代表的には、ｐＨ７付近で緩衝化される。
【０１５１】
一旦処方されると、本発明によって意図される組成物は、以下であり得る：（１）（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、低分子アゴニストもしくはアンタゴニストなどとして）被験体に直接投与され得る；または（２）（例えば、エキソビボ遺伝子治療においてのように）被験体から誘導した細胞にエキソビボで送達され得る。組成物の直接送達は一般に、例えば、皮下、腹腔内、静脈内もしくは筋肉内、腫瘍内または組織間隙空間への非経口注射によって達成される。他の投与形態としては、経口投与および肺投与、坐剤および経皮適用、針および遺伝子銃またはハイポスプレーが挙げられる。投薬処置は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。
【０１５２】
形質転換された細胞の、被験体へのエキソビボ送達および再移植のための方法は、当該分野で公知である［例えば、参考文献６１］。エキソビボ適用において有用な細胞の例としては、例えば、幹細胞（特に、造血性）、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞または腫瘍細胞が挙げられる。一般に、エキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は、例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中のポリヌクレオチドのカプセル化および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション（全て当該分野で周知）によって達成され得る。
【０１５３】
示差的発現ＰＣＡＶ  ポリヌクレオチドは、前立腺腫瘍と相関することが見出されている。腫瘍は、提供されたポリヌクレオチド、対応するポリペプチドまたは他の対応する分子（例えば、アンチセンス、リボザイムなど）に基づく治療薬剤の投与による処置に敏感に反応し得る。他の実施形態では、この障害は、例えば、正常細胞と比較して癌性細胞において発現が増大している遺伝子のコード遺伝子産物の機能のインヒビター（アンタゴニスト）として、または癌性細胞において発現が減少している遺伝子産物についてのアゴニストとして（例えば、腫瘍サプレッサーとして作用する遺伝子産物の活性を促進するように）、作用する低分子薬物の投与による処置に敏感に反応し得る。
【０１５４】
本発明の薬学的組成物の用量および投与手段は、治療組成物の特定の品質、患者の状態、年齢および体重、疾患の進行、ならびに他の適切な要因に基づいて決定される。例えば、ポリヌクレオチド治療組成物薬剤の投与は、局所投与および全身投与（注射、経口投与、パーティクルガンまたはカテーテルによる投与および局所投与を含む）を含む。好ましくは、治療ポリヌクレオチド組成物は、本発明のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む。種々の方法を用いて、治療組成物を身体内の特定の部位に直接投与し得る。例えば、小さな転移病巣が位置決定され、そして治療組成物が、腫瘍本体内のいくつかの異なる位置に数回注射される。あるいは、腫瘍に供給する動脈が同定され、そして組成物を腫瘍内に直接送達するために、治療組成物がこのような動脈に注射される。壊死中心を有する腫瘍が吸引され、そして組成物が、今や空の腫瘍中心内に直接注射される。アンチセンス組成物は、例えば、組成物の局所適用によって、腫瘍の表面に直接投与される。Ｘ線画像化を用いて、上記の特定の送達方法が補助される。
【０１５５】
アンチセンスポリヌクレオチド、サブゲノムポリヌクレオチド、または抗体を含む治療組成物の、特定の組織への標的化送達もまた用いられ得る。レセプター媒介ＤＮＡ送達技術は、例えば、参考文献６２〜６７に記載される。ポリヌクレオチドを含む治療組成物は、遺伝子治療プロトコルにおける局所投与に関して約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇおよび約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲もまた、遺伝子治療プロトコルの間に用いられ得る。（例えば、コードされる遺伝子産物のレベルを増強または阻害するための）作用方法および形質転換効力および発現のような要因は、アンチセンスのサブゲノムポリヌクレオチドの最終的な効力に必要とされる投薬量をもたらす考慮要因である。より大きな発現が、より大きな面積の組織に関して所望される場合、より多くの量のアンチセンスサブゲノムポリヌクレオチドもしくは逐次の投与プロトコルにおいて再投与される同じ量、または例えば、腫瘍部位の異なる隣接組織部分もしくは近い組織部分への数回の投与が、ポジティブな治療結果をもたらすために必要とされ得る。全ての場合、臨床試験における慣用実験は、最適な治療効果に関する特定の範囲を決定する。
【０１５６】
本発明の治療ポリヌクレオチドおよび治療ポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを用いて送達され得る。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源または非ウイルス起源の遺伝子送達ビヒクルであり得る（一般的に、参考文献６８、６９、７０および７１を参考のこと）。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物または異種プロモーターを用いて誘導され得る。コード配列の発現は、構成的または調節されるかのいずれかであり得る。
【０１５７】
所望の細胞における所望のポリヌクレオチドの送達および発現のためのウイルスベースのベクターは、当該分野で周知である。例示的なウイルスベースのビヒクルとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：組換えレトロウイルス（例えば、参考文献７２〜８２）、アルファウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、アデノウイルスベクター、ならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、参考文献８３〜８８を参照のこと）。殺傷アデノウイルスに連結したＤＮＡ［８９］の投与もまた用いられ得る。
【０１５８】
非ウイルス性の送達手段および送達方法もまた、用いられ得、例として、死滅（ｋｉｌｌｅｄ）アデノウイルスに単独で連結されたまたは連結されていないポリカチオン結合型ＤＮＡ［例えば８９］、リガンド連結型ＤＮＡ［９０］、真核細胞送達媒体細胞（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｅｌｌ）［例えば、参考文献９１〜９５］および細胞膜を用いる核電荷中和または融合が挙げられるが、これらに限定されない。裸のＤＮＡがまた、使用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、参考文献９６および９７に記載される。遺伝子送達手段として作用し得るリポソームは、参考文献９８〜１０２に記載される。さらなるアプローチが、参考文献１０３および１０４に記載される。
【０１５９】
使用に適するさらなる非ウイルス性送達として、参考文献１０４に記載されるアプローチのような機械的な送達システムが挙げられる。さらに、コード配列およびこの発現産物は、光重合されたヒドロゲル材料の沈殿または電離放射線の使用を通して送達され得る［例えば、参考文献１０５および１０６］。コード配列の送達のために使用され得る、遺伝子送達のための他の従来の方法として、例えば、携帯型遺伝子導入粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｇｕｎ）の使用［１０７］または導入された遺伝子の活性化のための電離放射線の使用が挙げられる［１０８および１０９］。
【０１６０】
（ワクチン組成物）
本発明は、本発明のポリペプリドまたはポリヌクレオチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する組成物を提供する。
【０１６１】
さらにこの組成物は、アジュバントを含有し得る。例えば、組成物は、一つ以上の以下のアジュバントを含み得る：（１）水中油型乳濁液処方物（ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁構成成分のような他の特定の免疫刺激因子を含むかもしくは含まない）（例えば（ａ）マイクロフリューダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を使用してサブミクロン粒子の中に処方される、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５（必要に応じてＭＴＰ−ＰＥを含有する）を含む、ＭＦ５９ＴＭ［１１０；参考文献１１１の１０章］、（ｂ）サブミクロン乳濁液の中に微小流動化されたか、または大きな粒径の乳濁液を生成するためにボルテックされた、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）遮断された５％ポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含む、ＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリル脂質（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）である細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の一つ以上の細菌細胞壁構成成分を含む、ＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ））；（２）使用され得るＱＳ２１またはＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）のようなサポニンアジュバント、またはそれから作成された粒子（ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体））（ここでＩＳＣＯＭＳは、さらなる洗浄剤を欠き得る）［１１２］；（３）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えばγインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのようなサイトカイン；（５）モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−デアシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）［例えば、１１３、１１４］；（６）３ｄＭＰＬと例えば、ＱＳ２１および／または水中油型乳濁液とを含む組み合わせ［例えば、１１５、１１６、１１７］；（７）必要に応じてシトシンの代わりに５−メチルシトシンが使用される、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（すなわち、１つ以上のＣＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド）；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル［１１８］；（９）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［１１９］または少なくとも一つのさらなる非イオン性の界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤［１２０］；（１０）免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサポニン［１２１］；（１１）免疫刺激剤および金属塩の粒子［１２２］；（１２）サポニンおよび水中油型乳濁液［１２３］；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じてステロールを含む）［１２４］；（１４）アルミニウム塩、好ましくは水酸化物またはリン酸塩であるが、任意の他の適切な塩もまた、使用され得る（例えば、ヒドロキシリン酸塩、酸水酸化物（ｏｘｙｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、オルトリン酸塩、硫酸塩など［参考文献１１１の８章および９章］）。異なるアルミニウム塩の混合物もまた、使用され得る。この塩は、任意の適切な形態であり得る（例えば、ゲル、結晶質、アモルファスなど）；（１５）キトサン；（１６）コレラ毒素もしくはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定毒素（ｈｅａｔ  ｌａｂｉｌｅ  ｔｏｘｉｎ）、またはそれらの無毒化された変異体［１２５］；（１７）ＰＬＧのようなポリ（α−ヒドロキシ）酸の微粒子；（１８）組成物の効力を増強するための免疫刺激因子として作用する他の物質。アルミニウム塩および／またはＭＦ５９ＴＭが好ましい。
【０１６２】
組成物は、好ましくは無菌であり、そして／または発熱物質を含まない。代表的にはおよそｐＨ７で緩衝化される。
【０１６３】
組成物は、好ましくは免疫原性の組成物であり、そしてより好ましくはワクチン組成物である。この組成物は、哺乳動物（例えばヒト）において抗体を生じさせるために使用され得る。
【０１６４】
本発明のワクチンは、予防薬（すなわち、疾患を予防するため）または治療薬（すなわち、疾患の症状を弱めるまたは取り除くため）であり得る。
【０１６５】
効力は、本発明の組成物の投与後、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現をモニターすることにより試験され得る。
【０１６６】
（Ｆ−スクリーニング法およびドラッグデザイン）
本発明は癌に対する活性を有する化合物についてのスクリーニングの方法を提供し、この方法は：試験化合物と、ＨＭＬ−２発現がアップレギュレートされている細胞に由来する組織サンプルもしくは細胞株とを接触させる工程；およびサンプルにおけるＨＭＬ−２発現をモニタリングする工程を包含する。発現の減少は、試験化合物の潜在的な抗癌効力を示す。
【０１６７】
本発明はまた、前立腺癌に対して活性を有する化合物についてスクリーニングのための方法を提供し、この方法は：試験化合物と本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとを接触させる工程；および試験化合物とこのポリヌクレオチド／ポリペプチドとの結合相互作用を検出する工程を包含する。結合相互作用は、試験化合物の潜在的な抗癌効力を示す。
【０１６８】
本発明はまた、前立腺癌に対して活性を有する化合物についてのスクリーニングの方法を提供し、この方法は：試験化合物と本発明のポリペプチドとを接触させる工程；およびポリペプチドの機能をアッセイする工程を包含する。ポリペプチドの機能の阻害（例えば、プロテアーゼ活性の失活、ＲＮＡ輸送の減少；転写酵素活性の失活、エンドヌクレアーゼ活性の失活、インテグラ−ゼ活性の失活など）は、試験化合物の潜在的な抗癌効力を示す。
【０１６９】
代表的な試験化合物として、ペプチド、ペプトイド、タンパク質、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオシド、小有機分子、抗生物質、ポリアミン、ならびこれらの組み合わせおよび誘導体が挙げられるが、これらに制限されない。小有機分子は、５０ダルトンより大きく、約２，５００ダルトンより小さい分子量を持ち、そして最も好ましくは約３００ダルトンと約８００ダルトンとの間である。天然物を含有する抽出物または混合したコンビナトリアル合成の生成物のような、物質の複雑な化合物はまた、試験され得、そして、標的ＲＮＡに対して結合する構成要素は、続く工程において混合物から精製され得る。
【０１７０】
試験化合物は、合成化合物または天然化合物の巨大なライブラリーから誘導され得る。例えば、合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ、Ｃｏｒｎｗａｌｌ、ＵＫ）またはＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から市販されている。あるいは、細菌、真菌類、植物または動物から抽出された形態としての天然化合物のライブラリーが、使用され得る。さらに、試験化合物は、個々の化合物または混合物のいずれかとしてコンビナトリアルケミストリーを使用して合成的に生成され得る。
【０１７１】
本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、当該分野で周知の任意の利用可能な方法（例えば、シグナル伝達、抗体の結合、レセプターの結合、マイトジェンのアッセイ、走化性のアッセイなど）を使用してスクリーニングされ得る。アッセイ条件は、理想的には、インビボにおいて、天然活性が示される条件、すなわち、生理的なｐＨ、温度、およびイオン強度に似せるべきである。適切なアゴニストまたはアンタゴニストは、被験体において有害な副作用を起こさない濃度で、天然活性の強い阻害または強い増強を示す。天然のポリペプチドへの結合と競合するアゴニストおよびアンタゴニストは、天然の濃度と等しいかまたはそれより大きい濃度を要求し得るが、ポリペプチドに対し不可逆的に結合可能なインヒビターは、天然の濃度と同じ程度の濃度で加えられ得る。
【０１７２】
このようなスクリーニングおよび実験は、ＨＭＬ−２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの同定につながり得る。このようなアゴニストおよびアンタゴニストは、ＨＭＬ−２の発現および／または機能を変調、増強または阻害するために使用され得る［１２６］。
【０１７３】
本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、組換えによって産生されたＨＭＬ−２ポリペプチド）を使用する方法に関し、この方法は、結合する能力またはその他のＨＭＬ−２ポリペプチドの活性を変調（例えば、阻害）する能力について化合物をスクリーニングし、従って、例えばＨＭＬ−２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして働き得る化合物を同定する。１つのスクリーニングアッセイにおいて、ＨＭＬ−２ポリペプチドは、試験化合物の存在下または非存在下においてＨＭＬ−２の成長刺激活性に感受性の細胞と共にインキュベートされる。試験化合物がＨＭＬ−２活性を変えるかまたはこのＨＭＬ−２に結合する潜在性を、測定した。次いで、細胞の増殖を、決定した。試験サンプルにおける細胞増殖の減少は、試験化合物がＨＭＬ−２ポリペプチドに結合し、その結果ＨＭＬ−２ポリペプチドを不活性化すること、またはさもなければＨＭＬ−２ポリペプチド活性を阻害することを示す。
【０１７４】
ＨＭＬ−２遺伝子を過剰発現するように形質転換されたトランスジェニック動物（例えば、げっ歯類）を使用して、インビボにおいてＨＭＬ−２過剰発現から生じる腫瘍の展開を阻害する能力またはこのような一度展開された腫瘍を処置する能力について、化合物をスクリーニングした。侵襲性または悪性の潜在性が増加した前立腺腫瘍を有するトランスジェニック動物を使用して、ＨＭＬ−２ポリペプチドの効果を阻害する能力について、化合物（抗体またはペプチドを含む）をスクリーニングした。このような動物は、例えば、本明細書中の実施例に記載されるように産生される。
【０１７５】
上記のようなスクリーニング手順は、前立腺癌の処置における薬理学的な介入戦略において、潜在的な使用のための因子を同定するために有用である。さらに、ＬＴＲを含む、ＨＭＬ−２に対応するポリヌクレオチド配列を使用して、増大された遺伝子発現のインヒビターについてアッセイした。
【０１７６】
ＨＥＲＶ−Ｋプロテアーゼの強力なインヒビターは、既に公知である［１２７］。ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターによるＨＥＲＶ−Ｋプロテアーゼの阻害もまた、報告されている［１２８］。これらの化合物は、前立腺癌治療における使用のために研究され得、そしてまた、ドラッグデザインのための有用なリード化合物として有用である。
【０１７７】
ｃＯＲＦのトランスドミナント（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）ネガティブ変異体もまた、報告されている［１２９、１３０］。トランスドミナントｃＯＲＦ変異体は、前立腺癌治療における使用のために研究され得る。
【０１７８】
ＨＭＬ−２  ｍＲＮＡに対し相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を選択的に減少するまたは除去する（ｏｂｌａｔｅ）するために使用され得る。より具体的には、アンチセンス構築物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前立腺腫瘍細胞においてＨＭＬ−２ポリペプチドの産生を阻害するために使用され得る。アンチセンスｍＲＮＡは、ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡ転写の方向と比較してアンチセンス方向に配置された本発明のＨＭＬ−２ポリヌクレオチドを有する発現ベクターを、標的癌細胞にトランスフェクトすることにより産生され得る。適切なベクターとして、レトロウイルスベクターを含むウイルスベクターならびに非ウイルスベクターが挙げられる。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、同じ目標を達成するために標的細胞に直接導入され得る。オリゴヌクレオチドは、最も高いレベルの特異性を達成するために、そして例えば、イニシエーターＡＴＧでＰＣＡＶ−ｍＲＮＡに結合するために選択／設計され得る。
【０１７９】
ＨＭＬ−２ポリペプチドのモノクローナル抗体は、ポリペプチドの作用を遮断するために使用され得、その結果癌細胞の増殖を制御する。このことは、ＨＭＬ−２ポリペプチドに結合し、その作用を遮断する抗体の注入によって達成され得る。
【０１８０】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合する化合物を同定するためのハイスループットスクリーニング方法を提供する。好ましくは、このアッセイのための全ての生化学的な工程は、例えば、試験管またはマイクロタイタ−プレートにおいて単一の溶液中で行われ、そして試験化合物は、はじめ、単一化合物の濃度で分析される。ハイスループットスクリーニングの目的のために、スクリーニングされた全ての化合物の中から「ポジティブ」化合物と同定された試験化合物の比率を達成するように、実験条件を、調整する。例えば、巨大な化合物ライブラリーに由来する０．１％〜１％の総試験化合物は、１０μＭまたはより少ない（例えば、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、またはそれ未満）Ｋｉで所定の標的に結合することが示される場合、好ましくは。このアッセイは、標的に対してかなりの親和力を有する化合物の同定のために設定される。
【０１８１】
（Ｇ−ヒト内因性レトロウイルスのＨＭＬ−２ファミリー）
全ての真核生物のゲノムは、感染性レトロウイルスに関連する配列の複数のコピーを有する。これらの内因性レトロウイルスは、マウスにおいてよく研究されており、ここで本当の感染性の形態および数千の不完全なレトロウイルス様エレメント（例えば、ＩＡＰおよびＥｔｎ配列ファミリー）の両方が、存在する。生殖細胞系の変異または発癌性のトランスフォーメーションを起こすこれらのエレメントの挿入が、実証されてきたので、このＩＡＰおよびＥｔｎファミリーのいくつかのメンバーは、「活性」レトロトランスポゾンである。
【０１８２】
他の脊椎動物のレトロウイルスに対する相同性によって、内因性レトロウイルスは、ヒトゲノムＤＮＡの中で同定された［１３１、１３２］。ヒトゲノムは、おそらく内因性プロウイルスＤＮＡの無数のコピーを有しているが、その機能については少ししか知られていないと考えられている。大部分のＨＥＲＶファミリーは、比較的少ないメンバー（１〜５０）を有するが、１つのファミリー（ＨＥＲＶ−Ｈ）は、全ての染色体上に分配された１ハプロイドゲノム当たり約１０００コピーからなる。胚性細胞株および腫瘍細胞株におけるＨＥＲＶの大部分かつ一般的な転写活性は、これらが、疾患を引き起こす挿入突然変異原として作用し得るか、または天然もしくは有益な方法で隣接遺伝子の発現に影響し得ることを示唆する。
【０１８３】
ヒト内因性レトロウイルスＫファミリー（ＨＥＲＶ−Ｋ）は、周知である［１３３］。このファミリーはマウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）に関係し、そしてヒト、類人猿および旧世界ザル（ｏｌｄ  ｗｏｒｌｄ  ｍｏｎｋｅｙ）のゲノムにおいて存在するが、いくつかのヒトＨＥＲＶ−Ｋプロウイルスは、ヒトに特有である［１３４］。ＨＥＲＶ−Ｋファミリーは、ヒトゲノムの１ハプロイド当たり３０〜５０の全長コピーを有し、強力にウイルスタンパク質に翻訳される長いオープンリーディングフレームを有する［１３５、１３６］。２つの型のプロウイルスゲノムが公知であり、これらは、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の重複する境界における２９２ヌクレオチド長が存在する（２型）か、または存在しない（１型）かで異なる［１３７］。ＨＥＲＶ−Ｋファミリーのいくつかのメンバーは、ｇａｇタンパク質およびレトロウイルス微粒子をコードすることが知られており、これら両方が、生殖細胞腫瘍およびそれに由来する細胞株において検出可能である［１３８］。全長ＨＥＲＶ−ＫのＲＮＡ発現様式の分析はまた、中央ＯＲＦ（ｃＯＲＦ）と名付けられた１０５アミノ酸のタンパク質をコードする、二重にスプライシングされたＲＮＡであることが同定され、このｃＯＲＦは、ＨＩＶのＲｅｖタンパク質と機能的に等価である配列特異的核ＲＮＡ輸送因子である［１３９］。ＨＥＲＶ−Ｋ１０は、全長ｇａｇ相同的７３ｋＤａタンパク質および機能的プロテアーゼをコードすることが示されてきた［１４０］。
【０１８４】
生殖細胞腫瘍に患っている患者は、腫瘍検出の際に、ＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質に対して高抗体力価を示す［１４１］。正常な精巣および精巣腫瘍において、ＨＥＲＶ−Ｋ膜貫通型外膜タンパク質は、生殖細胞および腫瘍細胞の両方で検出されるが、その周りの組織では検出されない。精巣腫瘍の場合は、ｅｎｖ特異的ｍＲＮＡの発現と、膜貫通型ｅｎｖ、ｃＯＲＦおよびｇａｇタンパク質の存在と、患者の血清におけるＨＥＲＶ−Ｋ特異的ペプチドに対する抗体との相関が、報告されてきた。参考文献１４２は、ＨＥＲＶ−Ｋ１０  ｇａｇおよび／またはｅｎｖタンパク質が、セミノーマ細胞において合成され、そしてこれらの腫瘍を有する患者が、ｇａｇおよび／またはｅｎｖに対して相対的に高い抗体力価を示すことを報告する。
【０１８５】
ＨＥＲＶ−Ｋから粒子の形態で放出されるｇａｇタンパク質は、奇形癌由来の細胞株Ｔｅｒａ１の細胞培養上清において同定された。これらのレトロウイルス粒子（「ヒト奇形癌由来ウイルス」またはＨＴＤＶと呼ばれる）はＨＥＲＶ−Ｋ１０ゲノムに対して９０％の配列相同性を有することが示された［１３８、１４３］。
【０１８６】
ＨＥＲＶ−Ｋファミリーが全てのヒト細胞のゲノムに存在するが、ｍＲＮＡ、タンパク質および粒子の高レベルの発現は、ヒト奇形癌細胞株でのみ観察される［１４４］。他の組織または他の細胞株においては、非常に感度の高い方法を用いてでさえも、ｍＲＮＡの基本レベルの発現のみが、実証された。レトロウイルスプロウイルスの発現は、通常５’の長い末端反復配列（ＬＴＲ）のエレメントによって調節される。さらに、内因性レトロウイルスの発現の活性化は、新生物形成効果を誘発する下流遺伝子の発現を誘発し得る。
【０１８７】
第３染色体に位置するＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）配列が、開示されている［１４５］。
【０１８８】
ＨＭＬ−２はＨＥＲＶ−Ｋファミリーのサブグループである［１４６］。ＨＭＬ−２サブグループのメンバーであるＨＥＲＶ単離体として、ＨＥＲＶ−Ｋ１０［１３７、１４２］、参考文献１４７の図４に示される２７のＨＭＬ−２ウイルス、ＨＥＲＶ−Ｋ（Ｃ７）［１４８］、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）［１４５］、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）が挙げられる。表１１は、Ｄｏｕｂｌｅ  Ｔｗｉｓｔデータベース調査により決定されたＨＥＲＶ−ＫファミリーのＨＭＬ−２サブグループの既知の全てのメンバーの一覧表を提供し、ここでＤｏｕｂｌｅ  Ｔｗｉｓｔデータベースは、デフォルトパラメータ：オープンギャップペネルティー＝−２０および伸長ペナルティ＝−５を用いてＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用し、配列ＡＦ０７４０８６の全てのゲノムのコンティグを含む。
【０１８９】
本発明は、前立腺腫瘍においてＨＭＬ−２  ｍＲＮＡの発現が、アップレギュレートされる知見に基づく。ＨＭＬ−２は、よく認識されたファミリーであるので、当業者は、特定の内因性レトロウイルスが、ＨＭＬ−２であるか否かを困難なく決定し得る。本発明に従って使用するためのＨＭＬ−２のメンバーは、好ましくは、プロウイルスゲノムが、ＬＴＲを有するメンバーであり、このＬＴＲは、配列番号１５０（ＨＭＬ−２．ＨＯＭ由来のＬＴＲ配列［１］）と少なくとも７５％の配列一致性を有する。ＬＴＲの例は、配列番号１５１−１５４を含む。
【０１９０】
（Ｈ−ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ））
本発明は、正常な前立腺組織と比較して、前立腺癌のサンプル中の複数のＨＭＬ−２ポリヌクレオチドの上昇したレベルの発見に基づく。１つの特定のＨＭＬ−２（このｍＲＮＡが上方制御されることが見出された）は、「ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）」と本明細書中で命名される。
【０１９１】
ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）由来の配列は、配列番号１４〜３９で示され、そしてＡＴＣＣに寄託されている（表７を参照のこと）。当業者は、任意のさらなるＨＥＲＶをＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）として分類し得るか、またはそれらのＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチドに対する配列同一性に基づかない。好ましくは、このような比較は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列またはＡＴＣＣ寄託単離体におけるポリヌクレオチド挿入物の１以上または全てに対してである。あるいは、当業者は、レトロウイルス複製に関連する自然突然変異の割合を考慮に入れて、配列番号７〜１０および配列番号１４〜３９中の配列のいずれか１つ以上または全てとの比較に基づいて、配列同一性を決定し得る。従って、それは、配列における差異が、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）単離体と対応するか、または別のＨＥＲＶと対応した場合、明らかとなる。
【０１９２】
従って、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）は、上記に記載されるように本発明において使用され得るＨＭＬ−２亜群の特定のメンバーである。ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）はまた、ＨＥＲＶ−Ｋに関して先に記載された方法（例えば、精巣癌［１４２］、自己免疫疾患、多発性硬化症［１４９］、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）［１５０］などの診断）において使用され得る。
【０１９３】
（Ｈ．１−ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）核酸）
（Ｈ．１．１−ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ゲノム配列）
本発明は、以下を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：（ａ）配列番号７〜１０のいずれかのヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２７〜３９のいずれかのヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号７〜１０のいずれかのヌクレオチド配列の相補体；または（ｄ）配列番号２７〜３９のいずれかのヌクレオチド配列の相補体。
【０１９４】
（Ｈ．１．２−ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）フラグメント）
本発明はまた、以下に挙げるフラグメントを含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：（ａ）配列番号７〜１０に示されるヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２７〜３９のいずれかに示されるヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号７〜１０に示されるヌクレオチド配列の相補体；または（ｄ）配列番号２７〜３９のいずれかに示されるヌクレオチド配列の相補体。
【０１９５】
フラグメントは、好ましくは、少なくともｘヌクレオチド長であり、ここでｘは、少なくとも７である（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００など）。ｘの値は、約１５０と約２００との間、または約２５０と約３００との間であり得る。ｘの値は、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、または約７５０であり得る。ｘの値は、２０００未満であり得る（例えば、１０００未満、５００未満、１００未満または５０未満）。
【０１９６】
フラグメントは、好ましくは、以下配列の１つでも以下配列の１つのフラグメントでもない：（ｉ）配列番号４２に示されるヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号４３に示されるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号４４に示されるヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号４５に示されるヌクレオチド配列；（ｖ）公知のポリヌクレオチド；または（ｖｉ）２０００年１２月７日の時点で公知のポリヌクレオチド（例えば、２０００年１２月７日以前に、ＧｅｎＢａｎｋのＧｅｎｅＳｅｑのような開示データベースにおいて入手可能なポリヌクレオチド）。
【０１９７】
フラグメントは、好ましくは、配列への低い複雑性をマスクするためのマスクキングプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ）の配列への適用後にマスクされないままである、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチド１つの連続した配列である（すなわち、マスキングプログラムによって生成されるマスクされた配列のポリ−ｎストレッチの外側のポリヌクレオチドによって示されるように、当業者は、マスクされていない領域を選択する）。
【０１９８】
それらのポリヌクレオチドは、プローブとして特に有用である。一般に、ｘ＝１５であるプローブは、特有の同定のために十分な配列を示す。例えば、サンプル中の本発明のポリヌクレオチド（またはその改変体）の存在または非存在を測定するために、プローブを使用し得る。プローブ（特に、ＤＮＡ配列の標識されたプローブ）の使用によって、当業者は、相同的なまたは関連の遺伝子を単離し得る。相同遺伝子の供給源は、任意の種（例えば、霊長類（特にヒト）；ラットおよびマウスのようなげっ歯類；イヌ；ネコ；ウシ；ヒツジ；ウマ；酵母；線形動物など）であり得る。
【０１９９】
本発明の１つより多いポリヌクレオチド配列由来のプローブは、それらが由来する核酸が、単一配列と対応する場合、同一核酸にハイブリダイズし得る（例えば、１つ以上が、同一ｍＲＮＡ由来の単一ｃＤＮＡへハイブリダイズし得る）。
【０２００】
配列番号４２〜４５に示される配列の任意の部分と、それらの全体において同様には対応する、好ましいフラグメント（例えば、癌に関連するＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチドの同定のための）は、配列番号５９（ｇａｇ領域由来）、配列番号６０〜７０（ｐｏｌ領域由来）、配列番号７１〜８２（３’ｐｏｌ領域由来）である。
【０２０１】
配列番号４４および４５に示される配列の任意の部分と、それらの全体において同様に対応する、好ましいフラグメント（例えば、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチド、ＨＥＲＶ−ＫＩＩポリヌクレオチドおよび／またはＨＥＲＶ−Ｋ１０ポリヌクレオチドの同時の同定のための）は、配列番号８３および８４（ｇａｇ領域由来）である。
【０２０２】
ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）のｇａｇ領域、ＨＥＲＶ−ＫＩＩのｇａｇ領域およびＨＥＲＶ−Ｋ１０のｇａｇ領域に特有のポリヌクレオチドのプローブは、表１において提供される；ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）のプロテアーゼ３’領域およびポリメラーゼ５’領域、ＨＥＲＶ−ＫＩＩのプロテアーゼ３’領域およびポリメラーゼ５’領域およびＨＥＲＶ−Ｋ１０のプロテアーゼ３’領域およびポリメラーゼ５’領域は、表２において提供される；ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）の３’ｐｏｌ領域、ＨＥＲＶ−ＫＩＩの３’ｐｏｌ領域およびＨＥＲＶ−Ｋ１０の３’ｐｏｌ領域にのみ特有のポリヌクレオチドのプローブは、表３において提供される。
【０２０３】
（Ｈ．１．３−ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）フラグメントおよび非相同的配列）
本発明はまた、以下を含む単離されるポリヌクレオチドを提供する：（ａ）配列番号７〜１０または配列番号２７〜３９において示される配列のフラグメントであるセグメント、ここで（ｉ）前記フラグメントは、少なくとも１０ヌクレオチド長であり、そして（ｉｉ）配列番号４４および／または４５の部分とそれらの全体において同様に対応し；および、必要に応じて、（ｂ）（ａ）において定義されるセグメントに隣接１つ以上のセグメント、ここで前記任意のセグメンドの存在により、前記ポリヌクレオチドは配列番号７〜１０または配列番号２７〜３９に示される配列の任意の部分と同様に対応し得ない。ある実施形態において、任意の隣接セグメントは、配列番号７〜１０、配列番号４４および／または配列番号４５に示される核酸配列と４０％未満の配列同一性を共有する。他の実施形態において、任意の隣接セグメントは、配列番号７〜１０または配列番号４４および／または配列番号４５に共通の１０ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１５ヌクレオチドまたは２０ヌクレオチドの連続する配列を有さない。さらに他の実施形態において、任意の隣接セグメントは、存在しない。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００または１５００ヌクレオチド長までである。
【０２０４】
本発明はまた、式５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−３’を有する単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで：Ａは、ａヌクレオチドから成るヌクレオチド配列であり；Ｂは、（ｉ）配列番号７〜１０に示されるヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号２７〜３９のいずれかに示されるヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）配列番号７〜１０に示されるヌクレオチド配列の相補体、または（ｉｖ）配列番号２７〜３９のいずれかに示されるヌクレオチド配列の相補体であり；Ｃは、ｃヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；そしてここで、前記ポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号７〜１０に示されるヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号２７〜３９のいずれかに示されるヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）配列番号７〜１０に示されるヌクレオチド配列の相補体、または（ｉｖ）配列番号２７〜３９のいずれかに示されるヌクレオチド配列の相補体、のフラグメントではない。
【０２０５】
このポリヌクレオチドにおいて、ａ＋ｃは、少なくとも１であり（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）、そしてｂは、少なくとも７である（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）。ａ＋ｂ＋ｃの値は、少なくとも９であることが好ましい（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）。ａ＋ｂ＋ｃの値は、多くとも２００であることが好ましい（例えば、多くとも１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９）。
【０２０６】
Ａおよび／またはＣは、プロモーター配列（またはその相補体）を構成し得る。
【０２０７】
（Ｈ．１．４−同一性配列）
本発明は、以下に対して、少なくともｓ％の同一性を有するポリヌクレオチドを提供する：（ａ）配列番号７〜１０；（ｂ）配列番号７〜１０のｘヌクレオチドのフラグメント；（ｃ）配列番号１１〜１３；（ｂ）配列番号１１〜１３のｘヌクレオチドのフラグメント。ｓの値は少なくとも５０である（例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９など）。ｘの値は、少なくとも７である（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）。
【０２０８】
それらのポリヌクレオチドは、天然に存在する改変体（例えば、変性改変体、対立遺伝子改変体など）、同一性変位体、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）および機能的変異体を含む。
【０２０９】
改変体は、本明細書中の配列番号１４〜３９に開示されるポリヌクレオチド配列との推定改変体のハイブリダイゼーション（好ましくは、ストリンジェントな条件下でのハイブリザイゼーションによって）によって同定され得る。例えば、適切な洗浄条件を用いることによって、選択したポリヌクレオチドプローブと比べて、対立遺伝子改変体が多くとも約２５〜３０％塩基対（ｂｐ）のミスマッチを示す改変体を、同定し得る。一般的に、対立遺伝子改変体は、１５〜２５％ｂｐのミスマッチを含み、そしてさらに５〜１５％ｂｐ、または２〜５％ｂｐ、または１〜２％ｂｐほど小さいミスマッチ、および１ｂｐのミスマッチを含む。
【０２１０】
本発明はまた、本明細書中で提供される任意の１つのポリヌクレオチド配列に対応するホモログを含み、ここで、相同遺伝子の供給源は、任意の哺乳動物種（例えば、霊長類（特にヒト）；ラットのようなげっ歯類など）であり得る。哺乳動物種（例えば、ヒトおよび霊長類）の間で、ホモログは、一般的にヌクレオチド配列の間の実質的な配列類似性（例えば、少なくとも７５％の配列同一性、通常は少なくとも９０％の配列同一性、より通常には少なくとも９５％配列同一性）を有する。配列類似性は、大きい配列のサブセット（例えば、保存モチーフ、コード領域、隣接領域、ドメインなど）であり得る参照配列に基づいて計算される。参照配列は、通常、少なくとも約１８連続したｎｔ長、より通常には少なくとも３０ｎｔ長であり、そして比較される完全な配列に伸長し得る。配列分析のアルゴリズムは、当該分野において公知である。
【０２１１】
好ましいＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）単離体は、配列番号７〜１０に示される単離配列である。別の好ましいクラスのＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）単離体は、デフォルトパラメーター：オープンギャップ（ｏｐｅｎ  ｇａｐ）＝３および拡大ギャップ（ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ）＝１を用いて、アライメントプログラムＧＣＧ  Ｇａｐ（Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１）によって測定される場合、インテグラーゼに関する配列番号１３において示される３’ポリメラーゼ領域に対して少なくとも９０％、好ましくは９５％のヌクレオチド配列の同一性を有する単離体である。別の好ましいクラスのＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）単離体は、デフォルトパラメーター：オープンギャップ＝３および拡大ギャップ＝１を用いて、アライメントプログラムＧＣＧ  Ｇａｐ（Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１）によって測定される場合、逆転写酵素に関する配列番号１２において示される５’ポリメラーゼ領域に対して少なくとも９８％、より好ましくは９９％のヌクレオチド配列同一性を有する単離体である。レトロウイルス関係の別の典型的な分類は、逆転写酵素タンパク質における、アミノ酸配列類似性に基づく。従って、なおより好ましいクラスのＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）単離体は、１２のギャップオープンペナルティーおよび２のギャップ拡大ペナルティー、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスを有するアフィンギャップサーチを用いて、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ同一性サーチアルゴリズムによって決定される場合、配列番号１２において示されるヌクレオチド配列によってコードされる５’ポリメラーゼ領域に対して、少なくとも９０％、より好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性を有する単離体である。従って、これらの前立腺癌関連ポリヌクレオチド配列は、ヒト内在性レトロウイルスのクラス（ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）として本明細書中で命名された）を定義し、このメンバーは、変異を含み、これは理論に縛られることを望まないが多型または対立遺伝子改変体に起因し得る。
【０２１２】
（Ｈ．１．５−ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）のハイブリダイズ可能な配列）
本発明は、公知のポリヌクレオチドに関して以下に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：（ａ）配列番号７〜１０に示されるヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２７〜３９のいずれかに示されるヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号７〜１０に示されるヌクレオチド配列の相補体；（ｄ）配列番号２７〜３９のいずれかに示されるヌクレオチド配列の相補体；（ｅ）配列番号７〜１０に示されるヌクレオチド配列のフラグメント；（ｆ）配列番号２７〜３９のいずれかに示されるヌクレオチド配列のフラグメント；（ｇ）配列番号７〜１０に示されるヌクレオチド配列のフラグメントの相補体；（ｈ）配列番号２７〜３９のいずれかに示されるヌクレオチド配列のフラグメントの相補体；（ｊ）配列番号１４〜３９に示されるヌクレオチド配列；または（ｋ）表７で示されるＡＴＣＣ受入番号を有するＡＴＴＣ寄託物中に見出されるポリヌクレオチド。（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のフラグメントは、好ましくは、少なくともｘヌクレオチド長であり、ここでｘは、上記Ｈ．１．２で定義された通りであり、そして好ましくは、上記Ｈ．１．２で定義されるような配列（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）または（ｖｉ）のうちの１つではない。
【０２１３】
ハイブリダイゼーション反応は、上記Ｂ．４で定義されるような、異なった「ストリンジェンシー」条件下で行なわれ得る。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし；他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし；他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。
【０２１４】
（Ｈ．１．６−寄託されたＨＥＲＶ−Ｋ配列）
本発明はまた、以下を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：（ａ）ＡＴＣＣにて寄託された、そして表７に示されるＡＴＣＣ受入番号を有するようなＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ｃＤＮＡ挿入物；（ｂ）配列番号１４〜２６のいずれか１つで示されるＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）配列；（ｃ）配列番号２７〜３９のいずれか１つで示されるＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のフラグメント。（ｄ）のフラグメントは、好ましくは、少なくともｘヌクレオチド長であり、ここでｘは、少なくとも７である（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）。
【０２１５】
（Ｈ．１．７−好ましいＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）配列）
本発明の好ましいポリヌクレオチドは、本明細書中で提供される配列番号７〜１０および配列番号１４〜３９のポリヌクレオチド配列のいずれかで示される配列を有するポリヌクレオチドであり；本明細書に記載される生物学的材料から得られるポリヌクレオチド、特に、ＡＴＣＣに寄託されたそして表７で示されるＡＴＣＣ受入番号を有する単離体、または他の生物学的供給源（特にヒト供給源）に存在するか、あるいはストリンジェントな条件下（特に、高ストリンジェンシー条件下）での上記の配列へのハイブリダイゼーションにより得られる、ポリヌクレオチド配列；提供されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子；提供されるポリヌクレオチドの改変体およびそれらの対応する改変体（特に、コードされた遺伝子産物の生物学的活性（例えば、タンパク質ファミリーに対する遺伝子産物の割当ておよび／または遺伝子産物中に存在する機能的ドメインの同定の結果として提供されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子産物に起因する生物学的活性）を維持する改変体）である。本発明のより意図されるかまたは本発明の範囲に含まれる他のポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド組成物は、本明細書中の開示を提供された場合、当業者に容易に明らかである。
【０２１６】
（Ｈ．１．８−本発明のポリヌクレオチドの一般的な特徴）
この章Ｈ．１に記載されるポリヌクレオチドの一般的な特徴は、上記の章Ｂ．４に記載される一般的な特徴と同様である。
【０２１７】
単離されたポリヌクレオチドは、好ましくは、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【０２１８】
本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの全てまたは一部（例えば、内在性ヒトレトロウイルスのｇａｇ領域、５’ｐｏｌ領域または３’ｐｏｌ領域）をコードし得る。２本鎖または１本鎖のフラグメントを、従来の方法に従ってオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによって、制限酵素消化によって、ＰＣＲ増幅などによって、ＤＮＡ配列から取得し得る。
【０２１９】
本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ、およびそれらのフラグメント、特に、生物学的に活性な遺伝子産物をコードし、そして／または本明細書に開示される方法において有用である（例えば、診断において、目的のある差示的に発現された遺伝子の固有の識別子として、など）フラグメントである。用語「ｃＤＮＡ」は、本明細書中で使用される場合、、ネイティブな成熟ｍＲＮＡ種中に見出される配列エレメントの配列を共有する、全ての核酸を含むことを意図し、ここで、配列エレメントは、エクソンならびに３’および５’の非コード領域である。通常ｍＲＮＡ種は、連続したエクソンを有し、介在性のイントロンは、存在する場合、ポリペプチドをコードする連続的なオープンリーディングフレームを作製するために、核のＲＮＡスプライシングによって切り離されている。ｍＲＮＡ種はまた、エクソンおよびイントロンの両方と共に存在し得、ここで、このイントロンは、選択的スプライシングによって切り離される。その上、同一の遺伝子配列によってコードされるｍＲＮＡの異なった種は、細胞中で種々のレベルで存在し得、そしてそれらの種々のレベルのｍＲＮＡ種の検出は、細胞におけるコードされた遺伝子産物の差示的発現を示し得ることに注意するべきである。
【０２２０】
目的のゲノム配列は、記載される配列（ネイティブな染色体中に通常存在する全てのイントロンを含む）において定義されるような、開始コドンと終止コドンとの間に存在する核酸を含む。目的のゲノム配列は、成熟ｍＲＮＡ中に見出される３’および５’の非翻訳領域をさらに含み得る。このゲノム配列は、転写領域の５’末端および３’末端のいずれかに約１ｋｂ、しかしおそらくそれ以上の隣接ゲノムＤＮＡを含む特異的な転写配列および翻訳制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）をさらに含み得る。ゲノムＤＮＡは、１００ｋｂｐ以下のフラグメントとして単離され得；そして隣接染色体配列を実質的に含まない。コード領域３’および５’またはイントロン中に時々見出される内部調節配列のいずれかに隣接するゲノムＤＮＡは、適切な組織、段階特異的発現、または疾患段階特異的発現のために必要な配列を含む。
【０２２１】
本発明のポリヌクレオチドは、線形分子としてまたは環状分子内に提供され得、そして自律複製分子（ベクター）内または複製配列を持たない分子内に提供され得る。このポリヌクレオチドの発現は、それら自身または当該分野において公知である他の調節配列によって調節され得る。このポリヌクレオチドは、当該分野で利用可能な様々な技術を使用して適切な宿主細胞に導入され得る。その技術としては、トランスフェリンポリカチオン媒介ＤＮＡ移入、裸の核酸もしくはカプセル化された核酸を用いるトランスフェクション、リポソーム媒介ＤＮＡ移入、ＤＮＡコーティングされたラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションなどが挙げられる。
【０２２２】
配列番号または図に「示される（ｓｈｏｗｎ  ｉｎ）」または「図示される（ｄｅｐｉｃｔｅｄ  ｉｎ）」ポリヌクレオチド配列は、その配列が、配列番号または図の中で同一の隣接配列として存在することを意味する。その用語は、配列番号または図の部分または領域ならびに配列番号または図に含まれる配列全体を包含する。
【０２２３】
（Ｈ．２−ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチド）
（Ｈ．２．１−ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）オープンリーディングフレーム）
本発明は、単離されたポリペプチド（（ａ）ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）オープンリーディングフレーム内でコードされるポリペプチド；（ｂ）配列番号１１、１２または１３に示されるポリヌクレオチドでコードされるポリペプチド；または（ｃ）配列番号４６〜４９、５０〜５５、５６〜５７または５８のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチド）を提供する。
【０２２４】
本発明のＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチドによってコードされる推定ポリペプチドは、配列番号４６〜４９に示されるｇａｇ翻訳物および配列番号５０〜５５に示される３’ｐｏｌ翻訳物を含む。配列番号１５に示される配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列は、配列番号５６に提供され；配列番号１４に示される配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列は、配列番号５７に示される。配列番号２１〜２７（包括的）に示される配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるコンセンサス３’ｐｏｌポリペプチド配列は、配列番号５８に提供される。
【０２２５】
本発明によって包含されるポリペプチドとしては、例えば、以下の本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが挙げられる：配列番号７〜１０および配列番号１４〜３９、ならびに本明細書中で開示されるようなＡＴＣＣに寄託されたポリヌクレオチド、ならびに遺伝子コードの縮重に起因して開示されるポリヌクレオチドに対する配列と同一ではなく、そしてこれらのポリペプチドをコードする核酸。従って、本発明は、その範囲内に、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つの配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、またはその改変体を含む。
【０２２６】
前立腺腫瘍に関連するポリヌクレオチドの過剰発現が観察されるが、これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの発現レベルの増大は、前立腺腫瘍において役割をおそらく果たし得る。
【０２２７】
典型的に、レトロウイルス中で、単一の大きいｇａｇポリペプチドが合成され（例えば、ＨＥＲＶ−Ｋ１０における７３ｋＤａ  ｇａｇタンパク質）、続いて、ゲノムのｐｏｌ領域またはプロテアーゼ領域によってコードされる機能性プロテアーゼによって、多重機能性ペプチド内に切断される。ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）のｇａｇドメインおよびｐｏｌドメインの両方に対応する配列の過剰発現は、そのようなメカニズムを示唆する。ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ゲノムのｅｎｖおよび核ＲＮＡ輸送タンパク質ｃＯＲＦ領域に対応する配列もまた、過剰発現され得る。過剰発現するポリヌクレオチド配列内のオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチドは、前立腺腫瘍の進行において、有意な役割を果たし得る。
【０２２８】
これらのポリペプチドを特異的に認識する抗体または他の試薬によるこれらのポリペプチドの検出は、前立腺腫瘍またはこれらのＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）配列の過剰発現に関連する任意の他の癌の早期の診断を助け得る。
【０２２９】
さらに、これらのポリペプチドの機能の阻害は、前立腺癌または他のＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）配列関連癌の治療および処置のための手段を示唆し得る。そのような阻害を達成する１つの方法は、予防治療としてのワクチンの投与またはそのような癌を処置するための腫瘍形成後療法としての抗体媒介薬剤治療である。
【０２３０】
（Ｈ．２．２−ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）フラグメント）
本発明は、以下：（ａ）ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）オープンリーディングフレーム内でコードされるポリペプチド配列；（ｂ）配列番号１１、１２または１３に示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列；または（ｃ）配列番号４６〜４９、５０〜５５、５６〜５７または５８のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列、のフラグメントを含む単離されたポリペプチドを提供する。
【０２３１】
そのフラグメントは、好ましくは少なくともｘアミノ酸長であり、ここでｘは、少なくとも５（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、３００、４００、５００以上など）である。ｘの値は、典型的には、１０００を超える。
【０２３２】
そのフラグメントは、エピトープ（例えば、配列番号５６、５７または５８に示されるアミノ酸配列のエピトープ）を含み得る。
【０２３３】
配列番号４６〜４９は、ｇａｇ領域をコードするポリヌクレオチドに対応する配列番号１４、１５、１６および４０に示される配列（配列番号４０の配列は、正常な前立腺ライブラリーに見出されるポリヌクレオチドに由来する）を有するＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチドの翻訳物を提供する。配列番号５０〜５５は、ｐｏｌの３’領域に対応する配列番号２１〜２６（包括的）に示される配列を有するＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチドの翻訳物を提供する。配列番号５６および５７は、配列番号１５および配列番号１４のＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチドの翻訳物をそれぞれ提供する。配列番号５８は、３’ｐｏｌ領域（包括的に配列番号２１〜２６）由来のポリヌクレオチドのコンセンサス翻訳物を提供する。配列番号４６〜４９および５０〜５５に示される翻訳物のうち少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１１アミノ酸、少なくとも１２アミノ酸、少なくとも１３アミノ酸、少なくとも１４アミノ酸および少なくとも１５アミノ酸のポリペプチドフラグメント（例えば、エピトープ）が本発明に包含される。好ましい実施形態において、配列番号５６〜５８に示されるようなアミノ酸配列のＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）エピトープは、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数［２１］によって決定された。
【０２３４】
３’ｐｏｌ（配列番号５８）中の以下の領域は、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆアルゴリズムによって抗原であると決定された：アミノ酸：１−１０；１５−３５；４５−５５；６０−８５；１００−１１５；１２５−１４０；１７０−１９０；１９５−２１５；２３０−２６８。さらなるエピトープ含有フラグメントとしては、アミノ酸
【０２３５】
【数１】
2008212152.tif 000002
が挙げられる。
【０２３６】
ｇａｇ（配列番号５６）中の以下の領域は、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆアルゴリズムによって抗原であると決定された：アミノ酸：１−４０；４５−６０；８０−１０５；１３０−１４５；１４７−１８３；１８６−２２０；２４５−２５３；２５５−２８８。さらなるエピトープ含有フラグメントとしては、アミノ酸
【０２３７】
【数２】
2008212152.tif 000003
が挙げられる。
【０２３８】
ｇａｇ（配列番号５７）中の以下の領域は、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆアルゴリズムによって抗原であると決定された：アミノ酸：１−４０；８０−１０５；１４５−１８０；１８５−２２５；２４０−３３５。さらなるエピトープ含有フラグメントとしては、アミノ酸
【０２３９】
【数３】
2008212152.tif 000004
が挙げられる。
【０２４０】
（Ｈ．２．３−ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）フラグメント＋異種配列）
本発明はまた、式５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−３’を有する単離されたポリペプチドを提供し、ここで：Ａは、ａアミノ酸からなるアミノ酸配列であり；Ｂは、（ｉ）配列番号１１、１２または１３に示されるポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号４６〜４９、５０〜５５、５６〜５７または５８のいずれか１つ由来のｂアミノ酸フラグメントからなるアミノ酸配列であり；Ｃは、ｃアミノ酸からなるアミノ酸配列であり；そしてここで前記ポリペプチドは、（ｉ）または（ｉｉ）で定義されるアミノ酸配列のフラグメントではない。
【０２４１】
このポリペプチドにおいて、ａ＋ｃは少なくとも１（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）であり、ｂは少なくとも７（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）である。ａ＋ｂ＋ｃの値は、少なくとも９（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）であることが好ましい。ａ＋ｂ＋ｃの値は、多くとも２００（例えば、多くとも１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９）であることが好ましい。
【０２４２】
（Ｈ．２．４−相同配列）
本発明は、以下：（ａ）配列番号７〜４５によってコードされるポリペプチド配列；（ｂ）配列番号７〜４５によってコードされるポリペプチド配列のｘアミノ酸フラグメント；（ｃ）ポリペプチド配列（配列番号４６〜５８）；（ｄ）ポリペプチド配列（配列番号４６〜５８）のｘアミノ酸フラグメントと、少なくともｓ％の同一性を有するポリペプチドを提供する。ｓの値は、少なくとも３５（例えば、少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９など）である。ｘの値は、少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００）である。
【０２４３】
これらのポリペプチドとしては、天然に存在する改変体（例えば、対立遺伝子改変体など）、ホモログ、オルソログ、および機能的変異体が挙げられる。
【０２４４】
従って、本発明は、天然に存在するポリペプチドの改変体を包含し、ここでそのような改変体は、天然に存在するポリペプチドと相同であるかまたは実質的に類似であり、その天然に存在するポリペプチドと同じ種の起源または異なる種の起源であり得る（例えば、ヒト、マウス、または記載されるポリペプチドを天然で発現する他のいくつかの種、通常は哺乳動物種）。これらのポリペプチド改変体は、本発明の範囲内のポリヌクレオチドによってコードされ、そして遺伝子コードは、対応する改変体を構築するために、適切なコドンを選択するために使用され得る。
【０２４５】
（Ｈ．２．５−好ましいＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）配列）
本発明は、前立腺癌細胞において差次的に発現されるＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（例えば、配列番号４６〜５８に示されるポリペプチド）を提供する。このようなポリペプチドは、本明細書中で「前立腺癌関連ポリペプチド」または「ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチド」で呼ばれる。このポリペプチドは、前立腺癌関連ポリペプチドに特異的な抗体を作製するために使用され得、この抗体は、次に本明細書中でさらに詳細に議論されるように、診断方法、予後方法、治療方法などにおいて有用である。ポリペプチドはまた、本明細書中でさらに詳細に議論されるように、治療的な処置の標的として有用である。
【０２４６】
好ましいポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０２４７】
（Ｈ．２．６−本発明のポリペプチドの一般的な特徴）
このＨ．２章に記載されるポリペプチドの一般的な特徴は、上記のＣ．３章に記載されたものと同じである。
【０２４８】
本発明の単離されたポリペプチドは、好ましくはＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）配列を有するポリペプチドを含む。
【０２４９】
本明細書中に開示されるポリヌクレオチド（例えば、配列番号７〜１０および配列番号１４〜３９、およびＡＴＣＣに寄託され、そして表７に与えられるＡＴＣＣ登録番号を有する単離物中および／またはそれらの対応する全長遺伝子に示されるような配列を有するポリヌクレオチド）によってコードされる、ｇａｇ領域のポリペプチドまたはｐｏｌ領域のポリペプチドのようなポリペプチドは、これらのコードされるポリペプチドの間から、レセプターのような結合パートナーを同定するためのペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。ペプチドライブラリーは、当該分野で公知の方法に従って合成され得る（例えば、参考文献１５１および１５２を参照）。
【０２５０】
一般的に、本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、記載されるポリヌクレオチドによってコードされる全長ポリペプチドと記載されるポリヌクレオチドによって示される遺伝子によってコードされるポリペプチドの両方、ならびにそれらの部分またはフラグメントを指す。
【０２５１】
配列番号または図に「示される」または「図示される」ポリペプチド配列は、その配列が、配列番号または図において同一の連続配列として存在することを意味する。この用語は、配列番号または図の部分または領域ならびに配列番号または図中に含まれる配列全体を包含する。
【０２５２】
（Ｈ．３−抗ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）抗体）
本発明はまた、本発明のポリペプチドと結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる本発明のポリペプチドに結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、これらは、以下の工程：ｉ）本発明のポリペプチドまたはその抗原結合フラグメントを含有する組成物にって宿主動物を免疫する工程、およびｉｉ）抗原に対する抗体またはその抗原結合フラグメントを発現する前記宿主から細胞を回収する工程、を包含する方法によって作製される。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、これらは、以下の工程：抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する細胞株を提供する工程であって、ここで、この抗体は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる本発明のポリペプチドに結合する、工程、および前記抗体が産生される条件下において前記細胞株を培養する工程を包含する方法によって作製される。さらなる実施形態において、この抗体が回収され、モノクローナル抗体が、回収された宿主細胞または回収された宿主細胞から誘導される遺伝物質を使用して産生される。さらなる実施形態において、この抗体は、ポリクローナル抗体である。さらなる実施形態において、この抗体は、固体表面に付着されるかまたは検出可能なラベルをさらに含有する。
【０２５３】
本発明はさらに、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを結合する、抗体（単離された抗体であり得る）を提供する。抗体は、抗体および緩衝液および／または薬学的に受容可能な賦形剤を含有する組成物中に提供され得る。癌に関連するポリペプチドの抗体特異性は、本明細書中で詳細に議論されるように、種々の診断方法および治療方法において有用である。
【０２５４】
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドの発現産物、ならびに対応するｍＲＮＡ（特に異なる２次構造および／または３次構造を有するｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、または完全遺伝子、または前記発現産物のフラグメントが、研究目的、診断目的、および治療目的の抗体を産生するために調製され、使用され得る。対応遺伝子が割り当てられていないポリヌクレオチドに対して、本発明は、その対応遺伝子を同定するさらなる方法を提供する。このポリヌクレオチドまたは関連ｃＤＮＡは、上記に記載されたように発現され、そして抗体が調製される。これらの抗体は、このポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド上のエピトープに対して特異的であり、細胞または組織調製物またはインビトロの発現系の無細胞抽出物中において、対応するネイティブのポリペプチドを沈殿させるかまたはそのポリペプチドに結合し得る。
【０２５５】
ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドまたはそのエピトープに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、当該分野において公知である多数の方法のいずれかによるイムノアッセイに使用するために作製され得る。エピトープによって、ポリペプチドの抗原決定を言及する。エピトープの存在は、特異性によってポリペプチドに結合する抗体の能力によって証明される。２つの抗体は、それらが同じポリペプチドへの結合を互いに交差ブロックする場合、同じエピトープに対するものとみなされる。
【０２５６】
ポリペプチドに対する抗体を調製する１つのアプローチは、ポリペプチドの全てまたは一部のアミノ酸配列を選択および調製し、それを化学的に合成して、そして適切な動物（典型的にはウサギ、ハムスターまたはマウス）にその配列を注射することである。
【０２５７】
親水性領域にあるオリゴペプチド（従ってそれらは成熟ポリペプチドにおいて露出される可能性がある）に基づいて、オリゴペプチドが、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドに対する抗体の産生のための候補として選択され得る。さらなるオリゴペプチドが、例えば、抗原性指数（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ）［３０］を使用して決定され得る。
【０２５８】
本発明の他の実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体が提供され、ここで、この抗体は、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドに特異的であり、そして他のＨＥＲＶポリペプチドに感知できるほどに結合しない。句「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体、代表的にはマウスモノクローナル抗体に由来する抗体をいう。あるいは、ヒト化抗体は、親の、非ヒト抗体の抗原結合特性を保持するか、または実質的に保持するが、親の抗体と比較した場合に、ヒトにおいて減少した免疫原生を示す、キメラ抗体に由来し得る。本明細書中で使用される場合、句「キメラ抗体」は、代表的に異なる種が起源である２つの異なる抗体（例えば、参考文献１５３を参照のこと）に由来する配列を含む抗体をいう。最も代表的には、キメラ抗体は、ヒトおよびマウスの抗体フラグメント、一般的にヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。
【０２５９】
本発明において、本発明のＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドおよびこれらの改変体は、上記のようなトランスジェニック動物を免疫化するために用いられる。モノクローナル抗体は、当該分野で公知の方法を用いて作成され、そして抗体の特異性が、単離されたＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドを用いて試験される。
【０２６０】
ヒトもしくは霊長類のＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）またはこれらのエピトープの調製のための方法は、化学合成、組換えＤＮＡ技術または生物学的サンプルからの単離を含むが、これらに限られない。ペプチドの化学合成は、例えば、固体相ペプチド合成の古典的なＭｅｒｒｉｆｅｌｄ法［１５４］または迅速自動化多ペプチド合成システム（Ｒａｐｉｄ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）［１５５］におけるＦＭＯＣストラテジーによって実行され得る。
【０２６１】
ポリクローナル抗体は、抗原を注射した後に、引き続いて適切な間隔で追加免疫をすることにより、ウサギまたは他の動物を免疫することによって調製され得る。動物を採血し、そして通常、ＥＬＩＳＡまたはＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）の作用をブロックする能力に基づくバイオアッセイによリ精製されたＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）に対して血清がアッセイされる。鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウなど）を用いる場合、抗体は、卵の卵黄から単離され得る。モノクローナル抗体は、ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈｌｅｒの方法の後、免疫化マウス由来の脾細胞を継続的に複製する腫瘍細胞（例えば、骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞）と融合させることによって調製され得る［１５６、１５７、１５８］。このように形成されたハイブリドーマ細胞は、次いで限界希釈法によってクローン化され、そして上清は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたはバイオアッセイによって抗体産物についてアッセイされる。
【０２６２】
標的のポリペプチドを認識する抗体およびこれらに特異的に結合する抗体の特有の能力は、ポリペプチドの過剰発現を処置するためのアプローチを提供する。従って、本発明の別の局面は、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドに対して特異的な抗体を用いる患者の処置によって、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドの過剰発現を伴う疾患を予防または処置するための方法を提供する。
【０２６３】
ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドに対する、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかの特異的抗体は、上記のような当該分野において公知の任意の適切な方法によって生成され得る。例えば、マウスまたはヒトのモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術によって生成され得るか、または、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチド、またはこれらの免疫学的に活性なフラグメント、または抗イディオタイプ抗体、またはこれらのフラグメントが、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドを認識し得る抗体およびこれらに結合し得る抗体の生成を誘発するために動物に投与され得る。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、または鳥類の場合、ＩｇＹを含むがこれらに限られない任意のクラスの抗体、および任意のサブクラスの抗体に由来し得る。
【０２６４】
（Ｈ．４−ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ベクターおよび宿主細胞）
本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞を包含する。
【０２６５】
（Ｈ．５−ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）キット、ライブラリーおよびアレイ）
本発明は、試験サンプルにおける癌の存在を診断する際に使用するためのキット、本発明のポリヌクレオチドを含む電子ライブラリーおよびアレイを提供する。
【０２６６】
一般に、ポリヌクレオチドのライブラリーは、配列情報の収集物であり、この情報は、生化学的形態（例えば、ポリヌクレオチド分子の収集物として）、または電子形態（例えば、コンピューターシステム中および／またはコンピュータープログラムの一部として、コンピューターで読み出し可能な形態で記憶されたポリヌクレオチド配列の収集物として）のいずれかで提供される。このポリヌクレオチドの配列情報は、種々の方法（例えば、遺伝子発見のリソースとして、選択された細胞型において発現される配列の表示として（例えば、細胞型マーカー）、および／または所定の疾患または疾患状態のマーカーとして）で用いられ得る。一般に、疾患マーカーは、正常細胞（例えば、疾患によって実質的に影響されていない同じかまたは類似の型の細胞）に対して増加したレベルかまたは減少したレベルのいずれかでの、疾患によって影響されるすべての細胞に存在する遺伝子産物の表示である。例えば、ライブラリー中のポリヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドによりコードされるその他の遺伝子産物を表すポリヌクレオチドであり得、これは、正常な前立腺組織のような正常（すなわち、実質的に疾患がない）組織に対して、前立腺癌のような、癌によって影響される組織において過剰発現されるか、または過少発現されるかのいずれかである。
【０２６７】
ライブラリーのヌクレオチド配列情報は、任意の適切な形態、例えば、電子形態または生化学的形態において具現化され得る。例えば、電子形態で具現化された配列情報のライブラリーは、例えば、ｉ）癌細胞と正常細胞との間；ｉｉ）癌細胞と形成異常細胞との間；ｉｉｉ）癌細胞と癌以外の疾患または状態によって影響される細胞との間；ｉｖ）転移癌細胞と正常細胞および／または非転移癌細胞との間；ｖ）悪性癌細胞と非悪性癌細胞（または正常細胞）との間、ならびに／あるいは、ｖｉ）正常細胞と形成異常細胞との間のように、差示的に発現される（例えば、過剰発現または過少発現される）遺伝子の代表的なヌクレオチド配列を含むアクセス可能なコンピューターデータファイル（または、核酸分子の収集物である、生化学的形態で）を含む。他の組み合わせ、および種々の疾患または疾患の段階によって影響される細胞の比較は、当業者に容易に明らかとなる。ライブラリーの生化学的実施形態は、ライブラリー中の遺伝子の配列を有する核酸の収集物を含み、ここで、これらの核酸は、以下でより詳細に記載されるように、ライブラリー中の全遺伝子またはそれらのフラグメントに対応し得る。
【０２６８】
本発明のポリヌクレオチドライブラリーは、一般に、複数のポリヌクレオチド配列の配列情報を含み、ここで、少なくとも１つのポリヌクレオチドが、本明細書中で記載された配列の任意の配列を有する。複数は、少なくとも２、通常少なくとも３を意味し、そして本明細書中に記載された全ての配列までを含み得る。ライブラリー中のポリヌクレオチドの長さおよび数は、ライブラリーの性質（例えば、ライブラリーがオリゴヌクレオチドアレイ、ｃＤＮＡアレイ、配列情報のコンピューターデータベースなどである場合）とともに変化する。
【０２６９】
ライブラリーが電子ライブラリーである場合、核酸配列情報は、種々の媒体中に存在し得る。「媒体」は、本発明の配列情報を含む、単離された核酸分子以外の製造物をいう。このような製造物は、配列が核酸に存在する場合、配列に直接適用可能ではない手段によって試験され得る、形態におけるゲノム配列またはそれらのサブセットを提供する。例えば、本発明のヌクレオチド配列（例えば、本明細書中に記載された配列の任意のポリヌクレオチドの核酸配列）は、コンピュータ読み出し可能媒体、例えば、コンピューターによって直接読みかつアクセスされ得る任意の媒体に記録され得る。このような媒体は：磁気記憶媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ）；ＣＤ−ＲＯＭのような光学的記憶媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭのような電子的記憶媒体；および磁気／光学的記憶媒体のようなこれらのカテゴリーのハイブリッドを含むがこれらに限定されない。当業者は、任意の現在公知のコンピューター読み出し可能な媒体が、本配列情報の記録を含む製造物を作製するためにどのように用いられ得るかを容易に認識し得る。「記録された」は、当該分野で公知の任意のこのような方法を用いて、コンピューター読み出し可能な媒体に情報を記憶するためのプロセスをいう。任意の便利なデータ記憶構造が、記憶された情報にアクセスするために用いられる手段に基づいて選択され得る。種々のデータプロセッサプログラムおよびフォーマットが、記憶のために用いられ得る（例えばワードプロセッシングテキストファイル、データベースフォーマットなど）。配列情報に加えて、本明細書中に記載される１つ以上の配列を含むライブラリーの電子バージョンが、その他のコンピューター読み出し可能な情報および／または他の型のコンピューター読み出し可能なファイル（例えば、サーチプログラムソフトウェアなどを含むがこれに限定されない、例えば、サーチ可能なファイル、実行可能なファイルなど）と併せて、またはともに提供され得る。
【０２７０】
コンピューター読み出し可能な形態でヌクレオチド配列を提供することにより、この情報は、種々の目的のためにアクセスされ得る。配列情報にアクセスするコンピューターソフトウェアは、公に利用可能である。例えば、Ｓｙｂａｓｅシステム上のギャップＢＬＡＳＴ［１５９］サーチアルゴリズムおよびＢＬＡＺＥ［１６０］サーチアルゴリズムが、他の生物由来のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対する相同性を含むゲノム内のＯＲＦを同定するために用いられ得る。
【０２７１】
本明細書中で用いられる場合、「コンピューターベースのシステム」は、本発明のヌクレオチド配列情報を分析するために用いられる、ハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ記憶手段をいう。本発明のコンピューターベースのシステムの最小のハードウェアは、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、およびデータ記憶手段を含む。当業者は、現在利用可能なコンピューターベースのシステムの任意の１つが、本発明における使用に適切であることを容易に理解し得る。データ記憶手段は、上記のような本配列情報の記録を含む任意の製造物、またはこのような製造物にアクセスし得るメモリーアクセス手段を含み得る。
【０２７２】
「サーチ手段」は、標的配列もしくは標的構造モチーフまたはサンプルにおけるポリヌクレオチドの発現レベルを、記憶された配列情報と比較する、コンピューターベースのシステム上で実行される１つ以上のプログラムをいう。サーチ手段は、特定の標的配列または標的モチーフに一致するゲノムのフラグメントまたは領域を同定するために用いられ得る。種々の公知のアルゴリズムが公に知られ、そして市販されている（例えば、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ（ＮＣＢＩ））。「標的配列」は、６以上の連続したヌクレオチド、または２以上のアミノ酸、好ましくは約１０〜１００のアミノ酸、または約３０〜３００ヌクレオチド残基の任意のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列であり得る。種々の比較手段は、サンプル（例えば、標的配列、標的モチーフ、または相対的な発現レベルを分析する）からの配列情報とデータ記憶手段との比較を成し遂げるために用いられ得る。当業者は、公に利用可能なホモロジー検索プログラムの任意の１つが、標的配列とモチーフとの比較を成し遂げるために、本発明のコンピューターベースのシステムのための検索手段として用いられ得ることを、容易に認識し得る。サンプルおよびコントロール中の発現レベルを分析するコンピュータープログラムもまた、当該分野において公知である。
【０２７３】
「標的構造モチーフ」または「標的モチーフ」は、任意の合理的に選択された配列または配列の組み合わせをいい、ここで配列は、標的モチーフの折り畳みにおいて形成される三次元配置か、または調節部位または活性部位のコンセンサス配列に基づいて選択される。当該分野で公知の種々の標的モチーフがある。タンパク質標的モチーフは、酵素活性部位およびシグナル配列を含むがこれらに限定されない。核酸標的モチーフは、ヘアピン構造、プロモーター配列および転写因子の結合部位のような他の発現要素を含むが、これらに限定されない。
【０２７４】
入力手段および出力手段のための種々の構造的フォーマットが、本発明のコンピューターベースのシステムにおいて情報を入力および出力するために用いられ得る。出力手段についての１つのフォーマットは、異なるポリペプチドの相対的な発現レベルを順位決めする。このような表示は、当業者に、遺伝子発現のプロフィールを決定する相対的な発現レベルの順位を提供する。
【０２７５】
上記で考察したように、本明細書中で用いられる場合、「ライブラリー」はまた、本明細書中に記載される配列のポリヌクレオチドの生化学的ライブラリー（例えば、提供されたポリヌクレオチドを表す核酸の収集物）を包含する。この生化学的ライブラリーは、種々の形態（例えば、ｃＤＮＡの溶液、固体支持体の表面と安定に結合したプローブ核酸のパターン（すなわちアレイ）など）を取り込み得る。特に目的とするのは、本明細書中に記載される１つ以上の遺伝子が、アレイ上の配列によって表される核酸アレイである。アレイは、その表面の１つの上に少なくとも２つの異なる核酸標的を有する少なくとも１つの基材を有する製造物の物品を意味し、ここで異なる核酸の数が、著しく高く，代表的には、少なくとも１０ｎｔ、通常少なくとも２０ｎｔおよびしばしば少なくとも２５ｎｔであり得る。種々の異なるアレイファーマットが開発され、そして当業者に公知である。本発明のアレイは、種々の適用における使用を見出し、上記に列挙された例示の特許書類に開示されるような、遺伝子発現分析、薬剤スクリーニング、変異分析などを含む。
【０２７６】
上記の核酸ライブラリーに加えて、ポリペプチドの類似のライブラリーもまた提供され、ここでライブラリーのポリペプチドは、本明細書中に記載される配列に対応する遺伝子によってコードされるポリペプチドの少なくとも一部を表す。
【０２７７】
ポリヌクレオチドアレイは、サンプル中の多数のポリヌクレオチドまたはポリペプチドをアッセイし得る高い処理能力技術を提供する。この技術は、異なる発現について試験するための道具として用いられ得る。アレイを作製する種々の方法、およびこれらの方法のバリエーションは、当該分野において公知であり、そして本発明における使用について企図される。例えば、アレイは、２次元のマトリクスまたは結合プローブを有するアレイにおける基材（例えば、ガラス、ニトロセルロースなど）上に、ポリヌクレオチドプローブをスポットすることによって作製され得る。プローブは、共有結合または疎水的相互作用のような非特異的相互作用のいずれかによって、基材に結合され得る。ポリヌクレオチドのサンプルは、検出可能に標識され得（例えば、放射活性標識または蛍光標識を用いて）次いで、プローブにハイブリダイズされ得る。プローブのポリヌクレオチドに結合する標識されたサンプルポリヌクレオチドを含む、二重鎖ポリヌクレオチドは一旦検出され得るとすぐに、サンプルの非結合部分が、洗い流される。あるいは、試験サンプルのポリヌクレオチドは、このアレイにおいて固定化され得、そしてプローブが検出可能に標識される。アレイを構築するための技術およびこれらのアレイを用いる方法は、例えば、参考文献１６１〜１７７に記載される。
【０２７８】
例えば、アレイは、遺伝子の差示的発現を試験するために用いられ得、そして遺伝子機能を測定するために用いられ得る。例えば、アレイは、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子の差示的発現を検出するために用いられ得、ここで発現は、試験細胞とコントロール細胞（例えば、癌細胞と正常細胞）との間で比較される。例えば、対応する正常細胞において観察されない、癌細胞における高発現の特定のメッセージは、癌特異的遺伝子産物を示し得る。アレイの例示的な使用は、例えば、参考文献１７８および１７９にさらに記載される。さらに、アレイを用いる検出の方法における多くのバリエーションは、当業者内および本発明の範囲内に十分にある。例えば、プローブを固体支持体に固定化するよりもむしろ、試験サンプルは、次いでプローブと接触させられる固体支持体において固定化され得る。
【０２７９】
遺伝子またはポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが、癌でない同じ細胞型の細胞と比較して癌において高レベルまたは低レベルで検出される場合、癌細胞において差示的に発現される。代表的に、差示的に発現されるポリヌクレオチドについてのスクリーニングは、発現されるポリヌクレオチドにおいて差示的に発現され、その結果、例えば、癌でない同じ細胞型の細胞と比較される場合、癌細胞において、ｍＲＮＡは、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％〜約７５％、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または少なくとも約５０倍以上高い（例えば、過剰発現された）もしくは低い（例えば、過少発現された）レベルで見出される。例えば、インサイチュハイブリダイザーションまたは組織中の細胞型の間のある程度の識別を可能にする別のアッセイのいずれかを用いる場合、比較は、２つの組織の間でなされ得る。比較はまた、これらの組織供給源から取り出された細胞の間でなされ得る。従って、癌細胞において差示的に発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、癌について臨床的有意性がある。
【０２８０】
本発明の１つの好ましい実施形態において、アレイは、少なくとも２つのポリヌクレオチドを含み、これらはそれぞれ、配列番号１４〜３９およびＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２５６１、ＰＴＡ−２５７２、ＰＴＡ−２５６６、ＰＴＡ−２５７１、ＰＴＡ−２５６２、ＰＴＡ−２５７３、ＰＴＡ−２５６０、ＰＴＡ−２５６５、ＰＴＡ−２５６８、ＰＴＡ−２５６４、ＰＴＡ−２５６９、ＰＴＡ−２５６７、ＰＴＡ−２５５９、ＰＴＡ−２５６３、ＰＴＡ−２５７０を有する、単離体で存在するポリヌクレオチドからなる群から選択される配列を有する。別の好ましい実施形態において、アレイは、配列番号１４〜３９およびＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２５６１、ＰＴＡ−２５７２、ＰＴＡ−２５６６、ＰＴＡ−２５７１、ＰＴＡ−２５６２、ＰＴＡ−２５７３、ＰＴＡ−２５６０、ＰＴＡ−２５６５、ＰＴＡ−２５６８、ＰＴＡ−２５６４、ＰＴＡ−２５６９、ＰＴＡ−２５６７、ＰＴＡ−２５５９、ＰＴＡ−２５６３、ＰＴＡ−２５７０を有する、単離体で存在するポリヌクレオチドからなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチド、ならびに配列番号４２または４３に示される配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
【０２８１】
本明細書中に記載されるポリヌクレオチド、およびこれらの遺伝子産物は、発癌経路に従う初期の変化を検出し、そして／または種々の治療および予防的処置の効力をモニターする、（例えば、血液もしくは組織における）遺伝子マーカーまたは生化学的マーカーとして特定に興味深い。例えば、特定のポリヌクレオチドの発現のレベルは、予後不良を暗示し得、それ故、患者のためのより積極的な化学療法または放射線療法を保証する。その逆の場合も同じである。患者における処置および結果に対する応答と新規な代理の腫瘍特異的特徴との関係は、腫瘍の分子プロフィールに基づく、テーラーメード治療の設計を可能にする予後指標を定義し得る。これらの療法は、抗体標的化、アンタゴニスト（例えば、低分子）、および遺伝子治療を含む。特定のポリヌクレオチドの発現を測定すること、および正常な組織および疾患の改変体における公知の発現と、患者のプロフィールとの比較は、処置の特異性および患者の快適度の両方の点において、患者のための最も可能な処置の決定を可能にする。ポリヌクレオチド発現はまた、より良好な分類のために用いられ得、従って、癌の異なる形態および疾患状態を診断および処置する。本明細書中に記載されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現レベルの同定から恩恵を受け得る、腫瘍学において広く用いられる２つの分類は、癌障害の段階決定、および癌組織の性質の類別である。
【０２８２】
差示的に発現される遺伝子に対応するポリヌクレオチド（ならびにこれらのコードされた遺伝子産物）は、癌を有する患者または癌になりやすい患者をモニターして、潜在的な悪性現象が明白な形態レベルで検出可能となる前にこれらを分子レベルで検出するために有用であり得る。さらに、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド（ならびにポリヌクレオチドに対応する遺伝子）は、例えば、このポリヌクレオチドまたはこれらのコードされた遺伝子産物を使用することによる治療の有効性を評価するため（例えば、治療前、治療中、および治療後における患者の全身腫瘍組織量を評価するため）に、セラメトリクス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）として、有用であり得る。
【０２８３】
さらに、１つの型の癌において差示的に発現され、従って、この型の癌にとって重要である遺伝子と一致するものとして同定されたポリヌクレオチドもまた、他の型の癌（例えば、ポリヌクレオチドが、種々の型の癌の間で差示的に発現される遺伝子を表す）の発症、またはその発症の危険性に対して、密接な関係を有し得る。
【０２８４】
別の実施態様において、本発明の診断方法および／または予後判断の方法は、試験発現パターン（ＴＥＰ）を生成するための試験サンプル中の遺伝子の選択されたセットの発現の検出を含む。このＴＥＰは、参照サンプル（例えば、ポジティブコントロールサンプルまたはネガティブコントロールサンプル）中のその遺伝子の選択されたセットの発現の検出によって生成される、参照発現パターン（ＲＥＰ）に対して比較される。この遺伝子の選択されたセットは、本発明の遺伝子（それらの遺伝子は、本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列に対応する）のうちの少なくとも１つを含む。その試験サンプルがスクリーニングされるべき疾患において差示的に発現される遺伝子を含む選択された遺伝子セットが、特に対象である。
【０２８５】
差示的遺伝子発現の分析および診断／予後の文脈において本明細書で使用される場合、「参照配列」または「参照ポリヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドの選択されたセットをいい、その選択されたセットは、本明細書に記載の差示的に発現されるポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つ以上を含む。多数の参照配列（好ましくはポジティブコントロール配列およびネガティブコントロール配列を含む）が、参照配列として含まれ得る。さらなる適切な参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、および他のヌクレオチド配列データベース（例えば、発現配列タグ（ＥＳＴ）、部分配列および全長配列を含む）に見出される。
【０２８６】
「参照アレイ」とは、サンプルを用いたハイブリダイゼーションでの使用のための参照配列を有するアレイを意味し、ここで、この参照配列は、本明細書に記載される差示的に発現されるポリヌクレオチドの全ての、少なくとも１つの、または任意のサブセットを含む。通常、そのようなアレイは、少なくとも２つの異なる参照配列を含み、そして提供される差示的に発現される配列のうちいずれか１つまたは全てを含み得る。目的のアレイはさらに、他の遺伝子配列（特に疾患または障害（例えば、癌、形成異常、あるいは他の関係するかまたは無関係の疾患、障害、もしくは状態）についてのスクリーニングのために興味深い配列）の配列（多型を含む）を含み得る。このアレイ上のオリゴヌクレオチド配列は、通常少なくとも長さ約１２ｎｔであり、そしておおよそ提供される配列の長さであり得るか、または長さ１００ｎｔ〜２００ｎｔ以上のフラグメントを生成するように、隣接領域にまで延び得る。参照アレイは、当該分野で公知の任意の適切な方法に従って作製され得る。例えば、オリゴヌクレオチドの大きいアレイを作製する方法は、光指向型合成技術を用いる、参考文献１８０および１８１に記載される。コンピューター制御された系を使用して、モノマーの不均一なアレイが、多くの反応部位での同時結合を介して、ポリマーの不均一なアレイへと変換される。あるいは、マイクロアレイが、予め合成されたオリゴヌクレオチドの固体基材上への配置により作製される（例えば、参考文献１８２に記載のように）。
【０２８７】
本明細書で使用される場合、「参照発現パターン」または「ＲＥＰ」とは、選択された細胞型（例えば、正常細胞、癌細胞、環境刺激に曝露された細胞など）に関連する遺伝子（特に差示的に発現される遺伝子）の選択されたセットの発現の相対レベルをいう。「試験発現パターン」または「ＴＥＰ」とは、試験サンプル（例えば、ｍＲＮＡが単離された、未知または疑わしい疾患状態の細胞）中の選択された遺伝子（特に差示的に発現される遺伝子）のセットの発現の相対レベルをいう。
【０２８８】
ＲＥＰは、当該分野で周知の方法に従って、種々の方法で生成され得る。例えば、ＲＥＰはコントロールサンプルを、ポリヌクレオチドの選択されたセット（特に、差示的に発現されるポリヌクレオチドの選択されたセット）を有するアレイにハイブリダイズさせる工程、そのアレイからハイブリダイゼーションのデータを獲得する工程、およびそのＲＥＰとＴＥＰとの容易な比較を可能にするフォーマットでそのデータを保存する工程によって、生成され得る。あるいは、コントロールサンプル中の発現される配列全てが、例えば、コントロールサンプルからｍＲＮＡを単離すること、そのｍＲＮＡをｃＤＮＡへと変換すること、およびそのｃＤＮＡを配列決定することによって）単離され得、そして配列決定され得る。生じた配列情報は、そのサンプル中の発現される配列の正体および相対数を、大まかにかまたは正確に反映する。次いで、その配列情報は、そのＲＥＰとＴＥＰとの容易な比較を可能にするフォーマット（例えば、コンピューターに読み出し可能なフォーマット）に保存され得る。このＲＥＰは、データ保存前または保存後に正規化され得るか、および／あるいはより関心の低いものであるかまたは分析を複雑にし得る、発現される遺伝子の配列を選択的に除去するように処理され得る（例えば、ハウスキーピング遺伝子に関連するいくつかのまたは全ての配列は、ＲＥＰデータから除外され得る）。
【０２８９】
ＴＥＰは、例えば、試験サンプルをポリヌクレオチドの選択されたセット（特に差示的に発現されるポリヌクレオチドの選択されたセット）を有するアレイにハイブリダイズさせる工程、そのアレイからハイブリダイゼーションのデータを獲得する工程、およびそのＴＥＰとＲＥＰとの容易な比較を可能にするフォーマットにてそのデータを保存する工程によって、ＲＥＰと類似する様式で生成され得る。比較に使用されるＲＥＰとＴＥＰとは、同時に生成され得るか、またはこのＴＥＰは、以前に生成されそして保存されたＲＥＰに対して、比較され得る。
【０２９０】
本発明の１つの実施態様において、ＴＥＰとＲＥＰとの比較は、アレイを用いて試験サンプルをハイブリダイズする工程を含み、ここで、その参照アレイは、サンプルとのハイブリダイゼーションにおける使用のために、１以上の参照配列を有する。この参照配列は、本明細書に記載される差示的に発現されるポリヌクレオチドのうちの全て、少なくとも１つ、または任意のサブセットを含む。この試験サンプルに関するハイブリダイゼーションデータを獲得し、そのデータを正規化し、そして生成されたＴＥＰを、差示的に発現されるポリヌクレオチドの同一または類似の選択されたセットを有するアレイを使用して生成されたＲＥＰと、比較する。その２つのサンプル間で差示的に発現される配列に対応するプローブは、そのサンプルのうちの一方に関して、もう一方に対して減少したハイブリダイゼーション効率または増加したハイブリダイゼーション効率を示す。
【０２９１】
参照アレイとサンプルとのハイブリダイゼーションからのデータの収集方法は、当該分野で周知である。例えば、参照サンプルおよび試験サンプルのポリヌクレオチドが、検出可能な蛍光標識を使用して生成され得、そしてそのサンプル中のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、その検出可能な標識の存在について、例えば、顕微鏡および光を基材に指向するための光源を使用して、マイクロアレイを走査することによって検出され得る。光子計測器は、その基材から蛍光を検出し、その間に、ｘ−ｙ並進ステージが、基材の位置を変化する。本方法において使用され得る共焦点検出デバイスは、参考文献１８３において記載される。走査レーザー顕微鏡は、参考文献１６３において記載される。走査は、適切な励起線を使用して、使用される各々の蛍光団に対して実施される。次いで、その走査より生成されたデジタル画像は、続く分析のために組み合わされる。任意の特定のアレイエレメントについて、あるサンプル（例えば、試験サンプル）からの蛍光シグナルの比率が、別のサンプル（例えば、参照サンプル）からの蛍光シグナルと比較され、そして相対的なシグナル強度が決定される。
【０２９２】
アレイに対するハイブリダイゼーションから収集されたデータを分析するための方法は、当該分野で周知である。例えば、ハイブリダイゼーションの検出が蛍光標識に関する場合、データ分析は、収集されたデータから、基材の位置の関数として蛍光強度を決定する工程、アウトライアー（すなわち、所定の統計分布から逸脱するデータ）を除去する工程、および残存するデータから標的の相対的な結合アフィニティーを計算する工程を、包含し得る。その結果生じたデータは、標的とプローブとの間の結合アフィニティーに従って変化する各々の領域における強度を画像として、表示され得る。
【０２９３】
一般に、その試験サンプルは、その試験サンプルから生成されるＴＥＰと、参照サンプル（例えば、癌、または特定の病期の癌、形成異常に関連するサンプル、癌以外の疾患に罹患したサンプル、正常サンプルなど）から生成される１つ以上のＲＥＰを比較することによって、疾患または非疾患状態に関連する遺伝子発現プロフィールに対応する遺伝子発現プロフィールを有するものとして、分類される。ＴＥＰとＲＥＰとの間の整合または実質的な整合についての判断基準としては、同じセットまたは実質的に同じセットの参照遺伝子の発現、ならびに、実質的に同じレベルでのこれらの参照遺伝子の発現（例えば、サンプルの正規化後の、選択された参照配列に関連するシグナルについて、サンプル間に有意な差異はないか、または、所定の参照配列に対するシグナル強度において、少なくとも約２５％〜約４０％以下の差異）が挙げられる。一般に、ＴＥＰとＲＥＰとの間のパターン整合は、本発明の差示的に発現される遺伝子のうちの少なくとも１つ、全部、または任意のサブセットの発現における整合（好ましくは定性的または定量的な発現レベルにおける整合を）含む。
【０２９４】
パターン整合は、手動で実施され得るか、またはコンピュータープログラムを使用して行われ得る。基材マトリックス（例えば、アレイ）の調製方法、そのようなマトリックスを用いる使用のためのオリゴヌクレオチドの設計方法、プローブの標識方法、ハイブリダイゼーションの条件、ハイブリダイズされたマトリックスの走査方法、および生成されたパターンの分析（比較分析を含む）のための方法は、例えば、参考文献１８４中に記載される。
【０２９５】
（Ｈ．６−ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）に基づく診断法）
本発明は、試験細胞サンプル中のポリヌクレオチドの発現に関連した試験サンプルにおける、癌の存在を診断するための方法を提供し、この方法は、ｉ）本発明中の少なくとも１つのポリヌクレオチドもしくはそのフラグメント、または表７中に与えられたＡＴＣＣ受諾番号からなる群から選択される単離物において見出される、少なくとも１つのポリヌクレオチドもしくはそのフラグメントの発現レベルを検出する、工程；およびｉｉ）上記試験サンプル中のポリヌクレオチドの発現レベルと、コントロール細胞サンプル中のポリヌクレオチドの発現レベルを比較する工程を包含し、ここで、上記コントロール細胞サンプル中のポリヌクレオチドの発現レベルに対する上記試験細胞サンプル中のポリヌクレオチドの異なる発現が、上記試験細胞サンプルにおける癌の存在を示す。
【０２９６】
本発明のいくつかの実施形態において、上記癌は、前立腺癌である。本発明の他の実施形態において、上記癌は、精巣癌である。
【０２９７】
本発明のさらに他の実施形態において、上記検出する工程は、ＲＮＡの転写産物のレベルを測定すること；ポリヌクレオチドのレベルを測定すること；またはＰＣＲ、ＴＭＡ、ｂＤＮＡ、ＮＡＴまたはＮａｓｂａを包含する方法によって測定することである。さらなる実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、固体支持体に付着される。
【０２９８】
本発明はまた、試験細胞サンプルおよび本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む組成物を、提供する。本発明はさらに、試験細胞サンプル中のポリペプチドの発現に関連する、癌の検出のための方法を提供し、この方法は、ｉ）本発明の少なくとも１つのポリペプチドまたはそのフラグメントの発現レベルを検出する工程、およびｉｉ）上記試験サンプル中のポリペプチドの発現レベルとコントロール細胞サンプル中のポリペプチドの発現レベルを比較する工程を包含し、ここで、上記コントロール細胞サンプル中のポリペプチドの発現レベルに対する上記試験細胞サンプル中のポリペプチドの発現レベルの変化が、上記試験細胞サンプルにおける癌の存在を示す。本発明はまた、試験細胞サンプルにおける抗体の存在に関連する癌を検出するための方法も提供し、この方法は、ｉ）本発明の抗体のレベルを検出する工程、およびｉｉ）上記試験サンプル中の抗体のレベルとコントロール細胞サンプル中の抗体のレベルを比較する工程を包含し、ここで、上記コントロール細胞サンプル中の抗体のレベルに対する上記試験細胞サンプル中の抗体のレベルの変化が、上記試験細胞サンプルにおける癌の存在を示す。いくつかの実施形態において、上記癌は前立腺癌であり、そして、他の実施形態において、上記癌は精巣癌である。
【０２９９】
本発明はまた、以下を用いて、特に前立腺癌におけるＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチドの上昇したレベルに関連する癌を検出するための方法も、提供する：（ｉ）デフォルトパラメータ（オープンギャップ＝３およびエクステンドギャップ＝１）を使用して、アライメントプログラムＧＣＧ  Ｇａｐ（Ｓｕｉｔｅ
Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１）によって測定した場合、配列番号７〜配列番号１０に示されるポリヌクレオチド、またはＡＴＣＣに寄託されＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ-２５６１、ＰＴＡ-２５７２、ＰＴＡ-２５６６、ＰＴＡ-２５７１、ＰＴＡ-２５６２、ＰＴＡ-２５７３、ＰＴＡ-２５６０、ＰＴＡ-２５６５、ＰＴＡ-２５６８、ＰＴＡ-２５６４、ＰＴＡ-２５６９、ＰＴＡ-２５６７、ＰＴＡ-２５５９、ＰＴＡ-２５６３、ＰＴＡ-２５７０を有する単離物中のポリヌクレオチドと、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を有するポリヌクレオチド、あるいは配列番号７〜配列番号１０に示されるポリヌクレオチドに高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出する、工程；（ｉｉ）（ｉ）の配列によってコードされるポリペプチドまたはそのフラグメントを検出する、工程；および（ｉｉｉ）そのポリペプチドのうちの１つ以上に対して特異的である抗体を検出する工程。さらに、（ｉｖ）ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチドの過剰発現に関連する粒子を検出する工程もまた、癌（特に、前立腺癌）の診断およびその進行のモニターにおいて使用され得る
前立腺癌またはＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチドの上昇したレベルに関連する他の癌の治療レジメンもまた、癌の病期および／または特定の癌治療の効力を評価するために、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのレベルを検出することによって、モニターされ得る。
【０３００】
本発明は、癌細胞（特に前立腺癌細胞）を検出すること、被験体中の癌および癌の重篤度（例えば、腫瘍の悪性度、全身腫瘍組織量など）の診断を容易にすること、被験体の予後の決定を容易にすること、および治療に対する被験体の応答性を評価すること（例えば、（例えば化学治療法の間またはその後の、全身腫瘍組織量を評価することを介して）治療の効果の尺度を提供することによって）のために、本明細書中に記載されたポリヌクレオチドを使用する方法を、提供する。検出は、癌細胞中に差示的に発現されるポリヌクレオチドの検出、および／または癌細胞において差示的に発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの検出に、基づき得る。本発明の検出方法は、単離された細胞、または全組織もしくは体液（例えば、血液、血漿、血清、尿など）に対して、インビトロまたはインビボで実施され得る。
【０３０１】
この検出方法は、キットの一部として提供され得る。従って、本発明はさらに、生体サンプルにおける、癌細胞において差示的に発現されるポリヌクレオチドの、存在および／またはレベルの検出（例えば、差示的に発現される目的の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの検出による）、ならびに／またはこのポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドの存在および／またはレベルの検出のための、キットを提供する。これらのキットを使用する手順は、臨床検査室、実験室、医師、または個人によって、実施され得る。癌細胞中で差示的に発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを検出するための本発明のキットは、そのポリペプチドに特異的に結合する部分を含み得、この部分は、このポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する抗体であり得る。前立腺癌細胞中で差示的に発現されるポリヌクレオチドを検出するために使用される本発明のキットは、このようなポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする部分を、含み得る。このキットは、必要に応じて、その手順において有用であるさらなる構成成分を提供し得、この構成成分そしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：緩衝液、現像液、標識、反応表面、検出のための手段、コントロールサンプル、標準物、使用説明書、および解釈情報。
【０３０２】
従って、本発明は、前立腺癌を検出するためのキットを提供し、このキットは以下を含む：配列番号７〜配列番号１０および配列番号１４〜配列番号３９中に示されるような配列を有するか、または、ＡＴＣＣに寄託されＡＴＣＣ受諾番号ＰＴＡ−２５６１、ＰＴＡ−２５７２、ＰＴＡ−２５６６、ＰＴＡ−２５７１、ＰＴＡ−２５６２、ＰＴＡ−２５７３、ＰＴＡ−２５６０、ＰＴＡ−２５６５、ＰＴＡ−２５６８、ＰＴＡ−２５６４、ＰＴＡ−２５６９、ＰＴＡ−２５６７、ＰＴＡ−２５５９、ＰＴＡ−２５６３、ＰＴＡ−２５７０を有する単離物中に見出される配列を有する、少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
【０３０３】
いくつかの実施形態において、前立腺癌細胞において差示的に発現される遺伝子によってコードされるポリペプチドを検出するための方法が、提供される。種々の既知の方法のいずれかが、ポリペプチドに結合する抗体を使用するイムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）など）；およびコードされたポリペプチドに関する機能アッセイ（例えば、結合活性または酵素活性）を含むが、これらに限定されない検出のために、使用され得る。
【０３０４】
本明細書を読解することで当業者によって容易に理解されるように、本明細書中に記載される検出方法および他の方法は、容易に改変され得る。このような改変は、本発明の意図された範囲内である。例えば、上記の検出スキームにおいて、検出で使用するプローブは、固体支持体上に固定化され得、そして、試験サンプルは、固定化プローブと接触され得る。次いで、プローブへの試験サンプルの結合は、種々の方法において（例えば、試験サンプル−固定化プローブ複合体の検出を容易にするために、試験サンプルに結合した検出可能な標識を検出することによって）、検出され得る。
【０３０５】
本発明はさらに、コードされたポリペプチドに特異的な抗体を使用して、生物学的サンプル中のポリペプチドの存在を検出するため、および／または、生物学的サンプル中のポリペプチドのレベルを測定するための方法を提供し、このポリペプチドは、前立腺癌細胞において差示的に発現されるポリヌクレオチドによって、コードされる。この方法は、一般的に以下を包含する：ａ）前立腺癌細胞において差示的に発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに特異的な抗体と、サンプルを接触させる、工程；ｂ）この抗体とそのサンプルの分子との間の結合を検出する、工程。
【０３０６】
コードされた前立腺癌関連ポリペプチドに対して特異的な抗体の、特異的結合の検出は、適切なコントロールと比較した場合、コードされたポリペプチドがこのサンプル中に存在するという指標である。適切なコントロールとしては、コードされたポリペプチドを含有しないことが既知であるサンプル、または、レベルの増大したポリペプチドを含有しないことが既知であるサンプル；例えば、正常な前立腺組織、および、コードされたポリペプチドに対して特異的でない抗体と接触するサンプル（例えば、抗イディオタイプ抗体）が挙げられる。特異的な抗体−抗原相互作用を検出する種々の方法は、当該分野において公知であり、そして、標準的な免疫組織学的方法、免疫沈降、酵素イムノアッセイ、および放射イムノアッセイが挙げられるがこれらに限定されない方法において、用いられ得る。一般に、この特異的抗体は、直接的にかまたは間接的にかのいずれかに、検出可能に標識される。直接的標識としては、放射性同位体；その産物が検出可能である酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなど）；蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンなど）；ＥＤＴＡのような金属キレート基を介して抗体に付着する、蛍光放出金属（例えば、１５２Ｅｕ、またはランタニド系列の他のもの）；化学発光性化合物（例えば、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩など）；生体発光性化合物（例えば、ルシフェリン、エクオリン（緑色蛍光タンパク質））などが挙げられる。この抗体は、ポリスチレンのプレートまたはビーズのような、不溶性支持体に付着（結合）され得る。間接的標識としては、コードされるポリペプチドに特異的な抗体（「第１特異的抗体」）に対して特異的な第２の抗体（ここで、この第２の抗体は上記のように標識されている）；および特異的な結合対のメンバー（例えば、ビオチン−アビジンなど）が挙げられる。生物学的サンプルは、ニトロセルロース（これは、細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定し得る）のような固体支持体または固体キャリアに接触させられ得、そして固定され得る。次いで、この支持体は、適する緩衝液で洗浄され得、次いで、検出可能に標識された第１特異的抗体と接触する。検出方法は、当該分野において公知であり、そして、検出可能な標識によって放出されるシグナルに対して適切であるように選択される。一般に、検出は、適するコントロールおよび適切な基準と比較して達成される。
【０３０７】
いくつかの実施形態において、この方法は、インビボでの使用（例えば、前立腺癌細胞のような癌細胞が存在する部位を位置付けるかまたは同定すること）に適合する。
【０３０８】
いくつかの実施形態において、癌細胞において区別して発現される転写物の細胞における発現を検出することによって、癌細胞を検出する方法が提供される。種々の公知の方法のうちのいずれかが検出に用いられ得、それらとしては、前立腺癌細胞において区別して発現されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする、ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによる、転写物の検出；特定のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応による、転写物の検出；前立腺癌細胞において区別して発現される遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドを、プローブとして用いる、細胞のインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法は、前立腺癌細胞において区別して発現される遺伝子のｍＲＮＡレベルを検出および／または測定するために用いられ得る。いくつかの実施形態において、この方法は：ａ）ハイブリダイゼーション可能な条件下で、本明細書に記載の区別して発現される遺伝子に対応するポリヌクレオチドに、サンプルを接触させる工程；および、ｂ）ハイブリダイゼーション（あるならば）を検出する工程を包含する。
【０３０９】
適するコントロールと比較した場合の、区別的なハイブリダイゼーションの検出は、癌細胞において区別して発現されるポリヌクレオチドのサンプルにおける、存在の指標である。適切なコントロールとしては、例えば、癌細胞において区別して発現されるポリヌクレオチドを含有しないことがわかっているサンプル、および、その癌細胞において区別して発現されるポリヌクレオチドと同一の「センス」の、標識ポリヌクレオチドの使用が挙げられる。好ましい実施形態において、この癌細胞は、前立腺癌細胞である。ハイブリダイゼーション可能な条件は、当該分野において公知であり、そして上により詳細に記載されている。検出はまた、任意の公知の方法によって達成され得、これらの方法としては、適切に標識されたポリヌクレオチドを用いる、インサイチュハイブリダイゼーション、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）、ＴＭＡ、ｂＤＮＡ、ならびにＮａｓｂａおよび「ノーザン」またはＲＮＡブロッティング、あるいはこのような技術の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドに対する種々の標識および標識方法は、当該分野において公知であり、そして本発明のアッセイ方法において用いられ得る。特異的なハイブリダイゼーションは、適切なコントロールとの比較によって決定され得る。
【０３１０】
本明細書中に提供されるポリヌクレオチド（例えば、配列番号７〜１０および配列番号３〜２８で描写されるような配列を有するポリヌクレオチド）の、少なくとも１０ｎｔ、少なくとも１２ｎｔ、または少なくとも１５ｎｔの、連続するヌクレオチドを一般に含むポリヌクレオチドは、種々の目的（例えば、前立腺癌細胞において区別して発現されるポリヌクレオチドの転写レベルの検出および／または測定のためのプローブ）のために用いられる。本明細書中に開示されるポリヌクレオチドに対して特異的にハイブリダイズするプローブは、他の無関係の配列を用いて提供されるバックグラウンドハイブリダイゼーションよりも、少なくとも５倍、１０倍、または２０倍高度な検出シグナルを提供するはずである。本明細書中で用いられる場合、「プローブ」とは、試験サンプル中において区別して発現される遺伝子産物を検出するために用いられる、ポリヌクレオチド配列という意味であることは、注意されるべきである。当業者によって容易に理解されるように、このプローブは、直接的に標識され得、そして、例えば試験サンプル（例えば、ｍＲＮＡ）から得られた固定ポリヌクレオチドを含有するアレイと接触させられ得る。あるいは、このプローブがアレイに固定され得、そして試験サンプルが検出可能に標識され得る。本発明の方法のこれらの改変および他の改変は、十分に本発明の技術の範囲内であり、そして本発明の範囲内である。
【０３１１】
ヌクレオチドプローブは、提供されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を検出するために用いられる。ノーザンブロットにおいて、ｍＲＮＡは、電気泳動的に分離され、そしてプローブに接触される。特定のサイズのｍＲＮＡ種にハイブリダイズするプローブが、検出される。ハイブリダイゼーションの量は、例えば特定の条件下での、発現の相対的な量を決定するために定量され得る。プローブは、発現を検出するための細胞へのインサイチュハイブリダイゼーションのために用いられる。プローブはまた、ハイブリダイズする配列の診断的検出のために、インビボで用いられ得る。プローブは、代表的には、放射活性同位体で標識される。他の型の検出可能な標識（例えば、発色団、発蛍光団、および酵素）が用いられ得る。他のヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイの例は、参考文献１８５および１８６に記載される。
【０３１２】
ＰＣＲは、少量の標的核酸を検出するための別の方法である（例えば、参考文献１８７、１８８および１８９を参照のこと）。標的核酸とハイブリダイズする、２つのプライマーポリヌクレオチドヌクレオチドは、反応をプライミングするために用いられる。このプライマーは、本明細書中で開示されるＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチド内の配列か、または、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチドへの３’および５’から構成され得る。あるいは、このプライマーが、これらのポリヌクレオチドへの３’および５’である場合、プライマーは、それらまたはその相補体にハイブリダイズする必要はない。熱安定性ポリメラーゼでの標的の増幅の後、この増幅された標的核酸は、当該分野において公知の方法（例えば、サザンブロット）によって検出され得る。ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、参考文献８に記載の、従来のブロット技術（例えば、サザンブロット、ノーザンブロットなど）によって（例えば、ＰＣＲ増幅を用いずに）検出され得る。一般に、ｍＲＮＡ、または、ポリメラーゼ酵素を用いてｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡは、ゲル電気泳動を用いて精製および分離され得、そして、ニトロセルロースのような固体支持体に移され得る。この固体支持体は、標識プローブに曝され、ハイブリダイズされていない全てのプローブを洗浄によって除去され、そして、この標識プローブを含有する二重鎖が検出される。
【０３１３】
ＰＣＲ増幅を用いる方法は、少なくとも約１０５個の細胞を用いることが便利だが、単一の細胞由来のＤＮＡにおいて行われ得る。このポリメラーゼ連鎖反応の使用は、参考文献１９０に記載され、そして技術の総説は、参考文献８の１４．２〜１４．３３頁に見出され得る。検出可能標識は、この増幅反応に関与し得る。適する検出可能標識としては、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、または６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ））、放射活性標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈなど）などが挙げられる。この標識は、２段階システムであり得、ここでポリヌクレオチドは、高親和性結合パートナー（例えば、アビジン、特異的抗体など）を有するビオチン、ハプテンなどと結合され、ここでこの結合パートナーは、検出可能標識と結合される。この標識は、プライマーの一方または両方と結合され得る。あるいは、増幅に用いられるヌクレオチドのプールは、増幅生成物に標識を組み込むように、標識される。
【０３１４】
本発明はさらに、哺乳動物（例えば、ヒト）における新生物状態または新生物発生前状態を検出／診断する方法に関する。
【０３１５】
これらの方法に従って検出／診断され得る状態の例としては、前立腺癌が挙げられるが、これに限定されない。適切な発現パターンを示す遺伝子に対応するポリヌクレオチドは、被験体における前立腺癌を検出するために用いられ得る。参考文献１９１は、癌のマーカーを吟味する。
【０３１６】
１つの検出／診断方法は、以下を包含する：（ａ）哺乳動物（例えば、ヒト）から、生物学的サンプルを得る工程、（ｂ）そのサンプル中のＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドの存在を検出する工程、および（ｃ）存在する生成物の量を、コントロールサンプルにおけるそれと比較する工程。この方法に従うと、このサンプル中のＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）遺伝子産物の増大したレベルの存在は、その被験体が新生物状態または新生物発生前状態を有することを示す。
【０３１７】
好ましくは、この化合物は、結合タンパク質（例えば、抗体、ポリクローナルまたはモノクローナル、あるいはそれらの抗原結合フラグメント）であり、これは、検出可能マーカー（例えば、発蛍光団、発色団または同位体など）で標識され得る。適切な場合、この化合物は、固体支持体に付着され得る。複合体の形成の決定は、この複合体を、第１の化合物（または複合体）に特異的に結合する、さらなる化合物（例えば、抗体）と接触させることによってもたらされ得る。第１の化合物と同様に、さらなる化合物は、固体支持体に付着され得、そして／または検出可能マーカーで標識され得る。
【０３１８】
本発明に従う、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドの増大したレベルの同定は、アジュバント治療から恩恵を受けそそうな被験体（患者）の同定を可能にする。例えば、初期治療後被験体（例えば、手術を受けた被験体）に由来する生物学的サンプルは、循環ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドの存在、そのポリペプチドの増大したレベルの存在についてスクリーニングされ得、このレベルは、正常な集団の研究から決定され、残りの腫瘍組織の指標である。同様に、外科的に除去された腫瘍の切除部位に由来する組織は、（例えば、免疫蛍光によって）試験され得、生成物の（周囲の組織と比較して）増大したレベルの存在は、この腫瘍の不完全な除去の指標である。このような被験体を同定する能力は、特定の被験体の要求に治療を合わせることを可能にする。非外科的な治療（例えば、化学療法または放射線療法）を受けている非験体もまた、モニターされ得、このような被験体に由来するサンプルにおける、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドの増大したレベルの存在は、継続的な処置に対する必要性の指標である。（例えば、処置レジメンを最適化する目的のための）疾患の病期分類もまた、例えば、例えばＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドに対して特異的な抗体を用いる、前立腺生検によって達成され得る。
【０３１９】
本発明はまた、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドの検出において用いられ得るキットに関する。このキットは、容器手段内に配置される、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドに特異的に結合する化合物（例えば、抗体を含む結合タンパク質またはそれらの結合フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント））を含み得る。このキットは、結合アッセイを処理するための、補助的な試薬をさらに含み得る。
【０３２０】
（定義）
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を意味し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、排他的にＸからなってもよいし、または、追加の何かを含んでもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０３２１】
数値ｘに関する用語「約」とは、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０３２２】
用語「新生物細胞」、「新生物形成」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」および「癌細胞」（相互交換可能に用いられる）とは、細胞増殖の制御の有意な損失（すなわち、変調された細胞分裂）によって特徴付けられる、異常な増殖表現型を示すように、比較的自律的な増殖を示す細胞をいう。新生物細胞は、悪性または良性であり得、そして前立腺癌由来組織を含み得る。
【０３２３】
（本発明を実施する様態）
本発明の特定の局面は、以下の非限定的な例において、より詳細に記載される。この例は、当業者に本発明をどのように作製および使用するかという完全な開示および説明を提供するために提案され、そして、本発明者らが本発明としてみなすものの範囲を制限することも、以下の実験が行われた全てかつ唯一の実験を表すことも意図しない。用いた数字（例えば、量、温度など）に関する精度を保証する努力はなされているが、いくらかの実験誤差および偏差は考慮されるべきである。他で示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、そして圧力は、大気圧であるかまたはそれに近い。
【０３２４】
（ヒト前立腺細胞サンプルの供給源およびそれらによって発現されるポリヌクレオチドの単離）
癌において区別して発現される遺伝子を代表し得る、候補ポリヌクレオチドを、公共利用可能な供給源、ならびに、選択された細胞株および患者組織から作製されたｃＤＮＡライブラリーの両方から得た。規格化されたｃＤＮＡライブラリーを、１つの患者腫瘍組織から調製し、そして、マイクロアレイ上へのスポッティングのためのクローン化されたポリヌクレオチドを、このライブラリーから単離した。１３人の患者に由来する正常な組織および腫瘍組織を処理して、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ転写ポリヌクレオチドを作製し、次いでこれを、マイクロアレイにおける発現について評価した。これらのライブラリーの供給源として役立つ組織およびポリヌクレオチドを、表４に要約する。
【０３２５】
（規格化：）  規格化の目的は、特定の細胞型または組織において発現される全ての転写物が等しく表され［参考文献１９２および１９３］、そしてそれゆえに、最適に規格化されたライブラリーにおけるわずか３０，０００個の組換えクローンの単離が、細胞の全体的な遺伝子発現レパートリー（１細胞あたり１０，０００の数と見積もられる）を代表し得る、ｃＤＮＡライブラリーを作製することである。規格化された前立腺ライブラリーを作製するための原料物質は、凍結保存した、グリーソン分類３＋３腺癌の患者に由来する前立腺腫瘍組織、および、医学的監視下の危険な被験体のプールに由来する正常な前立腺生検であった。当該分野において周知（例えば、参考文献１９４）の方法に従って行われた、レーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ、Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって、組織の凍結切片から直接的に、前立腺上皮を回収し、実質的に相同な細胞サンプルを得た。
【０３２６】
総ＲＮＡを、製造業者の推奨手順に従って、ＲＮｅａｓｙＴＭ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、ＬＣＭ回収細胞から抽出した。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ  ＲＮＡ定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を用いて、ＲＮＡを定量した。１μｇの総ＲＮＡを逆転写して、そしてＳＭＡＲＴＴＭ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いてＰＣＲ増幅した。このｃＤＮＡ産物を、標準的な手順（参考文献８）を用いるアガロースゲル電気泳動によって、サイズ選択した。このｃＤＮＡを、Ｂｉｏ  １０１Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（登録商標）ＩＩキット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて抽出した。ｃＤＮＡの規格化を、ハイブリダイゼーションの原理の動力学を用いて行った：１．０μｇのｃＤＮＡを、１００℃での１０分間の加熱によって変性させ、次いで、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、５ｍＭのＥＤＴＡ．Ｎａ＋および５０％のホルムアミドの存在下で、４２℃で４２時間インキュベートした。一本鎖ｃＤＮＡ（「規格化された」ｃＤＮＡ）を、製造業者の推奨手順に従って、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（＃１３０−０５２０、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって精製し、３サイクルのＰＣＲ増幅によって、増幅および二本鎖ｃＤＮＡに変換し、そして、標準的な手順（参考文献８）を用いて、プラスミドベクターにクローン化した。この規格化プロセスおよびクローン化プロセスで用いる全てのプライマー／アダプターは、製造業者によって、ＳＭＡＲＴＴＭ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）中に提供される。スーパーコンピテント（ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞（ＸＬ−２  Ｂｌｕｅ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を、規格化されたｃＤＮＡライブラリーでトランスフェクトし、固体培地上にプレートし、そして３６℃で一晩増殖させた。
【０３２７】
（規格化されたライブラリーの特徴付け：）  １ライブラリー当たり１０，０００の組換え体の配列を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いる毛細管配列決定によって分析した。ライブラリーにおける転写の表現を決定するために、クローン配列に対してＢＬＡＳＴ分析を行い、単離されたクローンの各々に転写主体性を割り当てた（すなわち、ＸＢＬＡＳＴマスキングプログラムを用いて、単離されたポリヌクレオチドの配列を最初にマスクして、複雑性の低い配列を排除した（参考文献１９５、１９６および１９７））。一般に、マスキングは、配列の低い複雑性に起因して比較的関心が低い配列を排除すること、および、複数配列に共通の、反復領域（例えば、Ａｌｕ反復）との類似性に基づく複数の「ヒット」を排除することを除いて、最終的な検索結果に影響しない。次いで、残りの配列を、ＢＬＡＳＴＮ対ＧｅｎＢａｎｋ検索において用いた。ＢＬＡＳＴＸ対ＮＲＰ（非重複性タンパク質）データベース検索においても、問い合わせ配列としてこの配列を用いた。
【０３２８】
自動化配列決定反応を、製造業者の使用説明書に従って、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳを備えるＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して実施した。この反応を１分間、２０℃または３０℃でアニールしたこと以外は、この反応を、製造業者の使用説明書により、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００でサイクルさせた。配列決定反応をエタノール沈殿し、ペレットを８μｌのローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）緩衝液中に再懸濁し、１．５μｌを配列決定ゲル上に負荷し、そしてデータを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって収集した。
【０３２９】
配列がライブラリ中に示される回数を、クローン化したｃＤＮＡ配列に関する配列同一性分析の実施および各単離されたクローンに対する転写産物の同一性の割り当てによって決定した。第１に、各配列を点検して、それがミトコンドリア、細菌またはリボソームの不純物であるか否かを調べた。そのような配列を、引き続く分析から除外した。第２に、配列の人工産物（例えば、ベクターエレメントおよび反復エレメント）を、各配列からマスクおよび／または除去した。
【０３３０】
残存する配列を、遺伝子同定のために、ＢＬＡＳＴ［１９８］によってＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＥＳＴデータベースと比較し、そして残存する配列を、ＦａｓｔＡ［１９９］によって、規格化したｃＤＮＡライブラリにおけるｃＤＮＡの出現の頻度を計算するために相互に比較した。この配列をまた、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ＢＬＡＳＴＮ  １．３ＭＰ［１９８］）を使用して、ＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑヌクレオチドデータベースに対して検索した。第４に、配列を、ＢＬＡＳＴＸプログラム（ＢＬＡＳＴＸ  １．３ＭＰ［１９８］）で、非重複性タンパク質（ＮＲＰ）データベースに対して分析した。このタンパク質データベースは、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＰＩＲ、およびＮＣＢＩ  ＧｅｎＰｅｐｔプロテインデータベースの組み合わせである。ＢＬＡＳＴＸプログラムを、フィルターパラメータ：「ｘｎｕ＋ｓｅｇ」とともにデフォルトのＢＬＯＳＵＭ−６２置換マトリクスを使用して実行した。使用したスコアのカットオフは、７５であった。
【０３３１】
コンティグ中への重複するクローンのアセンブリを、プログラムＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．；Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．）を使用して実行した。構築したコンティグを、ＧＣＧパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１中のプログラムを使用して分析した。
【０３３２】
（本明細書中に記載されたポリヌクレオチドの概要：）  表６は、上述のように単離され、かつ差示的に発現した遺伝子（以下を参照のこと）に一致するとして同定されたポリヌクレオチドの概要を提供する。詳細には、表６は、以下：１）各クローンＩＤに対するＨＥＲＶＫ  ＯＲＦ；２）各配列に割り当てられたクローンＩＤ；３）＞／＝２×；＞／＝２−５×；＞／＝５×；および１／２×未満の発現比率を有する患者の割合（％）；ならびに患者「Ｐａｔ」（例えば、患者９３、患者９５、患者９６、など）あたりの腫瘍ｍＲＮＡ／正常ｍＲＮＡの発現比率を提供する。
【０３３３】
（アレイを使用する前立腺癌に関連するｃＤＮＡの増大したレベルの検出）
前立腺癌における差示的な発現に対してスクリーニングされる種々の候補遺伝子に相当する、ｃＤＮＡ配列を、ポリヌクレオチドアレイに関するハイブリダイゼーションによってアッセイした。このｃＤＮＡ配列は、上述のように細胞株または組織から単離されたｃＤＮＡクローンを包含した。分析されたｃＤＮＡ配列はまた、Ｕｎｉｇｅｎｅデータベース中の配列と重複する配列を包含するポリヌクレオチドを含み、そして分析されたｃＤＮＡ配列は、種々の起源、機能性、および特徴付けのレベルの種々の遺伝子産物をコードする。ｃＤＮＡを、約０．８μｌの約２００ｎｇ／μｌ溶液のｃＤＮＡを用いて、２連でスポットされた４６０８配列（コントロールを含む）に相当する、１スライドあたり９，２１６スポットの密度で、当該分野において周知の方法に従って、反射スライド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にスポットした。
【０３３４】
目的の遺伝子産物に対応する、選択されたｃＤＮＡクローンのＰＣＲ産物を、５０％  ＤＭＳＯ溶液中で調製した。これらのＰＣＲ産物を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＩＩ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｒｏｂｏｔを使用して、１アレイあたり９２１６個のクローンの密度で、Ａｍｅｒｓｈａｍアルミニウムマイクロアレイスライド上にスポットした。クローンを、合計で１チップあたり４６０８個の異なる配列について、２連でスポットした。
【０３３５】
ｃＤＮＡプローブを、上述の患者から単離された腫瘍組織サンプルおよび正常組織サンプルのレーザー捕獲顕微解剖（ＬＣＭ，Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｅｎｇｉｎｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって入手した全ＲＮＡから調製した。
【０３３６】
最初に、全ＲＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを使用して、ｃＤＮＡ中に逆転写し、続いて、第２鎖ＤＮＡの合成をした。次いで、ｃＤＮＡをインビトロで転写して、Ｔ７プロモーター媒介発現（例えば、参考文献２００）を使用して、アンチセンスＲＮＡを産生し、次いで、アンチセンスＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換した。さらに、第２のセットのｃＤＮＡを、Ｔ７プロモーターを用いてインビトロで転写して、アンチセンスＲＮＡを得た。次いで、このアンチセンスＲＮＡを、蛍光で標識化するかまたは、ＲＮＡを再びｃＤＮＡに変換して、第３回目のＴ７媒介の増幅を可能にし、さらなるアンチセンスＲＮＡを産生した。従って、この手順を、２回目または３回目のインビトロで転写について提供して、蛍光標識のために使用される最終的なＲＮＡを産生した。プローブを、ＲＮＡ出発物質由来の蛍光で標識化したｃＤＮＡを作製することによって標識化した。腫瘍ＲＮＡサンプルから調製した蛍光で標識化したｃＤＮＡを、正常細胞ＲＮＡサンプルから調製した蛍光で標識化したｃＤＮＡと比較した。例えば、正常細胞由来のｃＤＮＡプローブを、Ｃｙ３蛍光色素（緑色）で標識化し、そして腫瘍細胞から調製したｃＤＮＡプローブを、Ｃｙ５蛍光色素（赤色）で標識化した。
【０３３７】
差示発現アッセイを、等量の同一患者の腫瘍細胞由来のプローブおよび正常細胞由来のプローブを混合することによって実施した。アレイを、５×ＳＳＣ／０．２％  ＳＤＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６０℃で約２時間のインキュベーションによってプレハイブリダイズし、次いで、水中で３回およびイソプロパノール中で２回洗浄した。アレイのプレハイブリダイゼーションに続いて、次いで、このプローブ混合物を、高ストリンジェンシー（５０％  ホルムアミド、５×  ＳＳＣ、および０．２％  ＳＤＳ中、４２℃で一晩）の条件下で、アレイにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、このアレイを、５５℃で、以下のように３回洗浄した：１）１×  ＳＳＣ／０．２％  ＳＤＳ中での第１の洗浄；２）０．１×  ＳＳＣ／０．２％  ＳＤＳ中での第２の洗浄；および３）０．１×  ＳＳＣ中での第３の洗浄。
【０３３８】
次いで、アレイを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＩＩ  ｄｕａｌ  ｃｏｌｏｒ  ｌａｓｅｒ−ｓｃａｎｎｅｒ／ｄｅｔｅｃｔｏｒを使用して緑色蛍光および赤色蛍光について走査した。画像を、ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｕｔｏｇｅｎｅソフトウェアを使用して処理し、各走査のセットからのデータを規格化した。この実験を、今度は反対の色で２つのプローブを標識化し、両方の「色の指示（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）」においてアッセイを実施するために繰り返した。それぞれ実験を、ときどき、２つ以上のスライド（それぞれの色の指示において１つ）で繰り返した。各走査からのデータを規格化し、そしてアレイ上の各配列に対する蛍光のレベルを、４つのアレイからの８つの複製スポット／遺伝子、もしくは２つのアレイからの４つの複製スポット／遺伝子、またはいくつかの他の置換の相乗平均の比率として表現した。
【０３３９】
表６は、正常細胞に関連して、前立腺腫瘍サンプルにおいて差示的に発現した遺伝子産物に対する結果を要約する。差示的な発現の比率を、正常なプローブを用いる規格化されたハイブリダイゼーションシグナルによって割られた腫瘍プローブに関連した規格化されたハイブリダイゼーションシグナルとして表現し；従って、１より大きい比率は、遺伝子産物が、正常細胞に比較して癌性細胞において発現が増大することを示し、一方、１より小さい比率は、その逆を示す。各患者からの結果を、患者識別番号に対応する「Ｐａｔ」によって同定した。「一致」は、腫瘍細胞において選択された遺伝子産物の差示的な発現が、正常細胞と少なくとも２倍異なった患者の％を示す。
【０３４０】
アッセイした前立腺患者の少なくとも７９％において、その発現が少なくとも５００％増大した１０遺伝子の中から８遺伝子を、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）配列中に示した。
【０３４１】
表６は、差示的に発現され、かつｇａｇ、５’−ｐｏｌ（逆転写酵素）関連配列および３’−ｐｏｌ（インテグラーゼ）関連配列として分類された、それらの遺伝子産物を提示する。このような酵素の活性に影響することが知られる小分子インヒビターの使用を通じて、癌および転移の進行におけるこれらの遺伝子産物の機能を試験することを可能にし得る。
【０３４２】
（前立腺癌関連配列の分析）
任意の公知の配列に相同性が存在するか否かを決定するために、１人の前立腺腫瘍患者由来の１６個の異なるクローンのＰＣＲ産物を、配列決定した。これらのクローンおよび同一のライブラリ由来の他のクローンからのＰＣＲ産物を、ＤＮＡマイクロアレイ上にスポットした。１３人の前立腺腫瘍患者からのＲＮＡを、マイクロアレイ上でアッセイし、次いで、１６個のクローンのいくつかの全挿入物を、配列決定した（表６）。
【０３４３】
最初に、１６個の単離物を、配列番号２７〜３９を含めて示されるような配列を有することを、初回通過（ｆｉｒｓｔ  ｐａｓｓ）配列決定反応において決定した。最初に、正常な前立腺組織からの単離物を、配列番号４１において示されるような配列を有することを、初回通過配列決定反応において決定した。初回通過配列決定反応は、高スループットな工程をいい、ここで、ＰＣＲ反応は、反応決定テンプレートを産生し、次いで、配列決定を、単一の方向においてＰＣＲプライマーの１つで実施する。公共のデータベースの検索は、これらの１６個の単離物が、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＢ０４７２４０に開示され、かつ配列番号４４において示されるヒト内因性レトロウイルスＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）配列の領域、そしてまたＨＥＲＶ−Ｋ（１０）にある程度の同一性を有するが、それでもなお独特であることを示した。
【０３４４】
単離物を、２回目の核酸配列決定にかけ、そして単離物を、配列番号１４〜２６を含めて示されるような配列を有することを見出した。正常な前立腺組織からの単離物を、２回目の核酸配列決定にかけ、そして単離物を、配列番号４０において示されるような配列を有することを見出した。この第２回目の配列決定は、特別注文の工程であり、ここで、配列決定を、ＤＮＡベクター中の精製したｄｓＤＮＡテンプレートについて実施する。配列決定を、ベクターの隣接する領域から設計されたプライマーで、テンプレートの両末端（順方向および逆方向）から実行し、そして新しいプライマーを、挿入物全体にわたって必要とされる全ての付加的な反応について合成する。
【０３４５】
ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）のＧｅｎｂａｎｋの開示は、その遺伝的特徴の不完全な特徴付けのみ提供し、そしていずれの疾患とも関連がない。Ｇｅｎｂａｎｋの開示は、ヌクレオチド２１１３〜４１１６に位置するｇａｇ遺伝子およびヌクレオチド７４３７〜８１７４に位置するｅｎｖ遺伝子を有するとしてＨＥＲＶ−ＫＩＩを特徴付ける。報告されたＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）配列の詳細な分析は、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）ゲノムが、レトロウイルスのｇａｇドメイン、プロテアーゼドメイン、ｐｏｌ（逆転写酵素）の５’−末端ドメインおよびｐｏｌ（インテグラーゼ）の３’−末端ドメインに関連する領域を含むことを示す。詳細には、プロテアーゼ遺伝子の位置は、ヌクレオチド約３９１７〜約４９２０までであり、そしてポリメラーゼドメインの位置は、ヌクレオチド約４７９７〜約７４６８である。
【０３４６】
コンポジットＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチド配列を、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０に示し、そして図１は、略図中に、ヒト内因性レトロウイルスおよびＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）種の略図を提示する。配列番号７は、ポリヌクレオチドの配列番号１４〜１６を含めてのコンポジット配列であり、そして配列番号７は、配列番号１１に示されるようにコンセンサス配列を有する。この領域は、ヒト内因性レトロウイルスのｇａｇ領域に一致する。配列番号８および配列番号９は、配列番号１７〜２０を含めて示されるような配列を有するポリヌクレオチドのコンポジット配列であり、そして配列番号８および配列番号９は、配列番号１２に示されるようなコンセンサス配列を有する。この領域は、ヒト内因性レトロウイルスの５’ｐｏｌ領域に一致する。配列番号１０は、配列番号２１〜２６を含めて示されるような配列を有するポリヌクレオチドのコンポジット配列であり、そして配列番号１０は、配列番号１３に示されるようなコンセンサス配列を有する。この領域は、ヒト内因性レトロウイルスの３’ｐｏｌ領域に一致する。
【０３４７】
ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）  ｇａｇ領域に対する相同性は、８７％から９９％まで変動した。ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）５’−ｐｏｌ（逆転写酵素）領域に対する相同性は、８７％から９７％まで変動した。ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）３’−ｐｏｌ（インテグラーゼ）領域に対する相同性は、約８９％であった。ヒト内因性プロウイルスＨＥＲＶ−Ｋ１０と比較した場合、ｇａｇ領域のクローンの相同性は、約７９％であり、５’−ｐｏｌ領域では、８１％と８９％との間であり、そして３’−ｐｏｌ領域は、約８９％であった。表５は、対応するＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）領域およびＨＥＲＶ−Ｋ（１０）領域と、個々のクローンの配列の相同性を図示する。ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）配列（および沈着（ｄｅｐｏｓｉｔｅ）した単離物）におけるｐｏｌｙＡストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）の存在がクローニングの人工産物であり得るので、表５に示される％同一性を、末端ｐｏｌｙＡストレッチを除外するポリヌクレオチドで実施したアライメントで決定した。
【０３４８】
コンセンサスポリヌクレオチド配列の配列番号１１〜１３を、ＧＣＧ  ＰｉｌｅｕｐプログラムおよびＰｒｅｔｔｙプログラムのウェブインプリメンテーション、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（ＭＳＡ）で生成した。このプログラムは、参考文献２０１に記載されるＣｌｕｓｔａｌプログラムと類似したクラスター化アルゴリズムを使用する。アライメントおよびコンセンサス抽出についてのデフォルト値は、ギャップオープンに対して８、およびギャップエクステンション（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）に対して２であった。コンセンサス配列に残基を割り当てるために特定の類似の配列のポーリングプルラリティー（ｐｏｌｉｎｇ  ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）または最小数は、２であった。
【０３４９】
配列番号１４〜１６を含めて示されるポリヌクレオチド配列を、配列番号１１に示されるコンセンサスポリヌクレオチド配列に対して使用した。配列番号１７〜２０を含めて示されるポリヌクレオチド配列を、配列番号１２に示されるコンセンサスポリヌクレオチド配列に対して使用した。配列番号２１〜２６を含めて示されるポリヌクレオチド配列を、配列番号１３に示されるコンセンサスポリヌクレオチド配列に対して使用した。「Ｎ」は、ここで、適切である最小の代表的な塩基が存在しない、すなわち、その位置で同一の塩基を有する少なくとも２つの配列であることを示す。
【０３５０】
プローブとして標識化した配列番号１５０のヌクレオチド２４３−末端を使用する前立腺癌細胞株のノザンブロッティングは、それらが、全長のウイルスのゲノムの配列の両方およびサブゲノムのスプライスされた転写産物に対応する、いくつかのサイズのＰＣＡＶ転写産物を発現することを示す（図５）。このような転写産物の発現はまた、図１４のレーン１に示されるように、奇形癌細胞株［１５］において観察されている。
【０３５１】
（他のヒト内因性レトロウイルスの調査）
ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）は、ＨＥＲＶ−ＫファミリーのＨＭＬ−２サブグループのメンバーである。ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）およびＨＥＲＶ−Ｋ（１０）はまた、このサブグループのメンバーである。
【０３５２】
上述のような同一のマイクロアレイ技術を、前立腺腫瘍組織におけるＨＭＬ−２サブグループおよびＨＭＬ−６サブグループ中のＨＥＲＶ−Ｋファミリーのメンバーの発現を調べるために使用した。ＨＥＲＶ−Ｈウイルスの発現もまた調べた。
【０３５３】
表９における結果は、ＨＥＲＶ−Ｈが前立腺腫瘍中で上方制御されないことを示す。ＨＥＲＶ−ＫのＨＭＬ−６サブグループもまた、上方制御されない。前立腺腫瘍中で上方制御される唯一の内因性レトロウイルスは、ＨＭＬ−２サブグループ中にある。
【０３５４】
（前立腺腫瘍以外の腫瘍の調査）
ＨＭＬ−２内因性レトロウイルスは、前立腺腫瘍中で上方制御される。胸部癌および結腸癌を保有する患者から採取した腫瘍サンプルを、上記に記載されるマイクロアレイ技術を使用して、ＨＭＬ−２  ＨＥＲＶ−ＫウイルスおよびＨＭＬ−６  ＨＥＲＶ−Ｋウイルスの上方制御について調査した。
【０３５５】
表１０における結果は、ＨＭＬ−２ウイルスが、前立腺腫瘍由来の組織中で上方制御されるが、結腸腫瘍または胸部腫瘍に由来の組織中では上方制御されないことを示す。ＨＭＬ−６の発現は、いずれの腫瘍中においても上方制御されない。
【０３５６】
（ヒト前立腺癌の細胞および組織におけるＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）の検出）
前立腺癌組織および他のヒトの癌組織、ヒト結腸、非癌性の前立腺を含む正常なヒト組織に由来するＤＮＡ、ならびに他のヒト細胞株由来のＤＮＡを、参考文献２０２の手順に従って抽出する。ＤＮＡを、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．８、および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する溶液中に再懸濁し、そして回収されたＤＮＡの量を、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８色素［参考文献２０３］を使用する微量蛍光光度法によって決定する。
【０３５７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、緩衝液、Ｍｇ２＋、およびヌクレオチド濃度に関して、製造業者（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）によって推奨される条件に従って、Ｔａｑポリメラーゼを使用して実施する。熱サイクル（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）を、ＤＮＡサイクラー内で、９４℃で３分間の変性、引き続く、９４℃で１．５分間、５０℃で２分間、および７２℃で３分間の３５サイクルまたは５０サイクルのいずれかによって実施する。ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）遺伝子の選択された領域を増幅するためのＰＣＲの能力は、ポジティブなテンプレートとしてクローン化したＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチドを使用することによって試験する。最適なＭｇ２＋濃度、プライマー濃度および異なるサイクリング温度に対する必要条件を、これらのテンプレートで決定する。製造業者によって推奨される基本（ｍａｓｔｅｒ）混合物を使用する。基本混合物の構成成分の起こり得る汚染を検出するため、テンプレートなしでの反応を、慣用的に試験する。
【０３５８】
サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションを、ランダムプライマー手順［２０５］によって標識したクローン化した配列を使用して、参考文献２０４中に記載されるように実施する。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、６×  ＳＳＰＥ、５％  デンハルト液、０．５％  ＳＤＳ、５０％  ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌ  変性サケ精巣ＤＮＡを含有する溶液中で実施し、４２℃で１８時間インキュベートし、続いて２×  ＳＳＣおよび０．５％  ＳＤＳを用いて室温および３７℃で、そして最終的に０．５％  ＳＤＳを有する０．１×  ＳＳＣ中、６８℃で３０分間洗浄する（参考文献８）。パラフィン包埋組織切片について、参考文献２０６に記載される条件が、２５０ｂｐ配列を検出するために設計されたプライマーを使用して引き続く。
【０３５９】
（宿主細胞中でのクローン化したポリヌクレオチドの発現）
ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）  ｃＤＮＡのポリペプチド産物を調べるために、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）  ｃＤＮＡ由来の制限断片を、発現ベクターｐＭＴ２中にクローン化し（参考文献８の１６．１７〜１６．２２頁）、そして１０％  ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で増殖させたＣＯＳ細胞中にトランスフェクトする。トランスフェクションは、リン酸カルシウム技術（参考文献８の１６．３２〜１６．４０頁）を利用して実施し、そして細胞溶解物を、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞とトランスフェクトされていないＣＯＳ細胞の両方から、トランスフェクションの４８時間後に調製する。溶解物を、抗ペプチド抗体を用いる免疫ブロット法により分析にかける。
【０３６０】
免疫ブロット法実験において、細胞溶解物の調製および電気泳動を、標準的な手順に従って実施する。タンパク質の濃度を、ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ溶液を使用して決定する。ニトロセルロースへの半乾燥電気泳動の移行の後、この膜を、５％粉乳含有の５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＴＢＳ）中でブロックする。ＴＴＢＳ中での洗浄および二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でのインキュベーションの後、増強した化学発光（ＥＣＬ）プロトコル（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、製造業者によって記載されるように実施して検出を容易にする。
【０３６１】
（ポリペプチドに対する抗体の産生）
ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）に対して独特なポリペプチドを、細菌の発現系または他の発現系（例えば、酵母、バキュロウイルス）から合成または単離し、そしてｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ.）でウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）に結合体化する。これらのペプチドでの免疫化プロトコルを、標準的な方法に従って実施する。最初に、ウサギの事前の採血を、免疫化に先立って実施する。第１の免疫化は、フロイントの完全アジュバントおよび５００μｇの結合体化したペプチドまたは１００μｇの精製したペプチドを含有する。前回の注射の４週間後に実施される、引き続く免疫化の全ては、同量のタンパク質とともにフロイントの不完全アジュバントを含有する。採血を、免疫化の７〜１０日後に実施する。
【０３６２】
抗体のアフィニティ精製のために、対応するＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドを、ＭＢＳを用いてＲＳＡに結合体化させ、そしてＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に結合させる。抗血清を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１０倍に希釈し、そしてアフィニティマトリックスと共に一晩インキュベートした。洗浄後、結合した抗体を、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）を用いて樹脂から抽出する。
【０３６３】
（ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）Ｇａｇおよび／またはＰｏｌ関連配列を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ）
組換え的に産生されたＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）抗原に特異的に結合する抗体について血液サンプルを試験するために、以下の手順を使用する。組換えＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ｐｏｌまたは組換えＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ｇａｇまたは組換えＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ｅｎｖに関連したポリペプチドを精製した後、これらの組換えポリペプチドをＰＢＳで希釈し、５μｇ／ｍｌ（５００ｎｇ／１００μｌ）の濃度にする。この希釈された抗原溶液１００μｌを９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ  １プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，Ｖａ．）の各ウェルに添加し、次いでこのプレートを、室温で１時間または４℃で一晩インキュベートし、そしてＰＢＳ中０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄する。抗体の非特定的結合を減少させるためのブロッキングを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０中、１％ウシ血清アルブミン溶液の２００μｌを各ウェルに添加し、そして１時間インキュベートすることにより達成する。ブロッキング溶液の吸引後、１次抗体溶液（抗凝固処理された全血、血漿、または血清）の１００μｌを、ブロッキング溶液中に１／１６〜１／２０４８の範囲で希釈し、これをプレートに添加し、室温で１時間または４℃で一晩インキュベートする。次いで、このウェルを３回洗浄し、そしてヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体１００μｌを西洋ワサビぺルオキシダーゼ（ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｎ．Ｃ．）に結合体化させ、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で１／５００または１／１０００に希釈し、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド（ＯＰＤ、Ｓｉｇｍａ）溶液１００μｌを各ウェルに添加し、そして５〜１５分インキュベートする。このＯＰＤ溶液は、水中１％メタノール５０ｍｌに５ｍｇのＯＰＤの錠剤を溶解させ、そして使用する直前に３０％Ｈ２Ｏ２５０μｌを添加して調製する。この反応を、４Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を２５ｌ添加することにより停止させる。吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で４９０ｎｍにおいて読み取る。
【０３６４】
（ワクチンの調製）
本発明はまた、本発明のＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ｇａｇおよび／またはｐｏｌポリペプチドを用いて、患者においてＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドを発現する細胞に対する免疫応答を刺激する方法に関し、このポリペプチドは、悪性細胞により産生された抗原としてか、または悪性細胞に関連する抗原として作用する。本発明のこの局面は、ヒトにおいて、前立腺細胞あるいはＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ｐｏｌまたはｇａｇのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを発現する細胞に対して免疫応答を刺激する方法を提供する。この方法は、ヒトに対して免疫原性の量のポリペプチドを投与する工程を包含し、このポリペプチドは以下を含む：（ａ）ヒト内因性レトロウイルスＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドのアミノ酸配列、または
（ｂ）ヒト内因性レトロウイルスＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドのムテインまたはポリペプチドの改変体。
【０３６５】
（治療剤を試験するための手段としてのポリペプチドを発現するトランスジェニック動物の産生）
ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）核酸は、前立腺癌関連遺伝子の機能または調節の研究のために、遺伝的改変された非ヒト動物または細胞株におけるその部位特異的な遺伝子改変を生成するため、あるいは疾患（前立腺癌を含む）の動物モデルを作製するために使用される。用語「トランスジェニック」は、宿主細胞内で安定して伝達される外因性のＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）遺伝子を有する遺伝子的に改変された動物（ここで、この遺伝子は、改変ポリペプチドを産生させるために配列内で変更され得る）またはレポーター遺伝子に作動可能に連結された外因性のＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ＬＴＲプロモーターを有する遺伝子的に改変された動物を含むことを意図する。トランスジェニック動物は、核酸構築物をゲノムの中にランダムに一体化させることによって作製され得る。安定した組み込みのためのベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、および他の動物ウイルス、ＹＡＣなどが挙げられる。目的のトランスジェニックの哺乳動物は、例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマなどであり、そして特に齧歯類（例えばラット、マウスなど）である。
【０３６６】
これらの改変された細胞または動物は、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）遺伝子の機能および調節の研究に有用である。例えば、一連の小欠失および／または置換が、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）において作製され、前立腺腫瘍形成における異なるドメインの役割を決定し得る。目的の特定の構築物としては、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）遺伝子発現をブロックするためのアンチセンス構築物、ドミナントネガティブなＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）遺伝子突然変異の発現、およびＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）遺伝子の過剰発現が挙げられるが、これらに限定されない。正常にはそれが発現されないか、または発生の異常な時点における細胞または組織内のＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）遺伝子またはその改変体の発現が提供される。さらに、そうでなければ細胞内で正常に産生されてない、細胞内のＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）由来のポリペプチドの発現を提供することにより、細胞挙動における変化が誘導され得る。
【０３６７】
ランダムな組み込みについてのＤＮＡ構築物は、組み換えを媒介するための相同性の領域を含む必要がない。好都合なことに、ポジティブおよびネガティブ選択のためのマーカーが含まれる。哺乳動物細胞をトランスフェクトするための種々の技術については参考文献２０７を参照のこと。
【０３６８】
胚性幹（ＥＳ）細胞について、ＥＳ細胞株が使用されるか、または胚性肝細胞は、宿主（例えばマウス、ラット、モルモットなど）から新たに採取される。このような細胞は、適切な繊維芽細胞フィーダー層上で、または適切な増殖因子（例えば、白血病阻害因子（ＬＩＦ））の存在下で増殖される。ＥＳ細胞を形質転換する場合、これらはトランスジェニック動物を産生するのに用いられ得る。形質転換後、適切な培地中でフィーダー層上に、細胞をプレーティングする。この構築物を含む細胞は、選択培地を使用することにより検出され得る。コロニーが増殖するために十分な時間の後、これらを取り出し、そしてこの構築物の組み込みの発生について分析した。次いで、ポジティブなこれらのコロニーを胚操作および胚盤胞注入のために用いた。胚盤胞を、４〜６週齢の過剰排卵メスから採取した。このＥＳ細胞をトリプシン処理し、そしてこの改変された細胞を胚盤胞の胚腔に注入した。注入後、この胚盤胞を、各々偽妊娠のメスの子宮角に戻す。次いで、メスを出産間近にし、そして得られたキメラ動物を、その構築物を有する細胞についてスクリーニングした。胚盤胞およびＥＳ細胞の異なる表現型を提供することにより、キメラ子孫を容易に検出し得る。
【０３６９】
これらのキメラ動物を、改変された遺伝子の存在についてスクリーニングし、そして改変を有するオスとメスとを交尾させ、ホモ接合性の子孫を産生させる。遺伝子変更が発生中のいくつかの時点で致死性を引き起こす場合、組織または器官を、異質遺伝子型または類遺伝子型の移植片または移植物として、あるいはインビトロの培養物中で維持する。このトランスジェニックの動物は、任意の非ヒト哺乳動物であり得る（例えば、実験動物、家畜など）。このトランスジェニック動物を、機能的研究、薬物スクリーニング（例えば、前立腺癌に対する候補薬物の効果を決定するため、潜在的な治療レジメンまたは処置レジメンなどを試験するため）などに用いる。
【０３７０】
（ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）特異抗体を用いた診断的画像化）
本発明は、前立腺癌患者を初期提示で正確に示すため、および前立腺癌の転移性の広がりの早期検出のための、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドに対する抗体の使用を含む。ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ｇａｇもしくはＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ｐｏｌあるいはそれらの一部、あるいは他のＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を用いた放射免疫シンチグラフィーは、さらなる腫瘍特異的診断試験を提供し得る。本発明のモノクローナル抗体は、前立腺癌腫の組織病理学診断に用いられる。
【０３７１】
ヌードマウスにおける、前立腺癌細胞の皮下のヒト異種移植片を用いて、テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）標識された本発明のモノクローナル抗体が、セミノーマ細胞に関する記載（参考文献２０８）のように、外部ガンマシンチグラフィーにより、異種移植された前立腺癌を首尾よく画像化し得るかどうか試験した。ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリペプチドに特異的な各々のモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの腹水液から、ポリペプチドＡ−セファロース上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。精製された抗体（アビジン特異的モノクローナル抗体［２０９］のようなコントロールモノクローナル抗体を含む）を、９９ｍＴｃで標識し、続いて参考文献２１０および２１１の方法を用いて還元する。ヒト前立腺癌細胞を有するヌードマウスに、腹腔内で２００〜５００μＣｉの９９ｍＴｃ標識抗体を注射する。注射２４時間後、動物から約８ｃｍにセットされた６ｍｍピンホールコリメーターを備える、Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＺＬＣ３７００ガンマカメラを用いてマウスの画像を入手する。画像解析後、モノクローナル抗体の体内分布を決定するために、正常な組織および腫瘍を取り出し、計量し、そして注射した組織およびサンプルの放射活性を測定する。さらに、抗癌化合物と結合体化したＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）特異的抗体を、前立腺癌特異的化学療法剤として用いる。
【０３７２】
（寄託）
表７に例挙した材料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより寄託された。
【０３７３】
示される各々の刊行物および特許出願が詳細かつ個々に参考として援用されるのと同程度まで、本明細書中に記載されたすべての刊行物および特許出願は、本明細書中で参考として援用する。
【０３７４】
本発明の好ましい実施形態の先の記載は、明瞭さおよび理解の目的のために例示および実施例によって示される。これは、網羅的であるとも、開示された正確な形式に本発明を限定するとも意図されない。本発明の教示の観点から、多くの変化および改変が、本発明の趣旨から逸脱することなくなされ得ることは当業者に容易に明白である。添付された特許請求の範囲およびそれらの等価物によって、本発明の範囲が規定されることが意図される。
【０３７５】
【表１】
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【０３７６】
【表２】
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【０３７７】
【表３】
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【０３７８】
【表４】
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【０３７９】
【表５】
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【０３８０】
【表６】
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【０３８１】
【表７】
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【０３８２】
【表８】
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【０３８３】
【表９】
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【０３８４】
【表１０】
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【０３８５】
【表１１】
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参考文献（参考として全体を本明細書によって援用される目録）
（参考文献）
【０３８６】
【表１２】
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【図面の簡単な説明】
【０３８７】
【図１】図１は、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチドおよびレトロウイルスに関するそれらの位置の描写を含む、ヒト内因性レトロウイルスの概略図である。
【図２】図２は、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＨＭＬ−２．ＨＯＭ）（「ＥＲＶＫ６」としても公知である）ゲノム［１］内のオープンリーディングフレームの概略図である。
【図３】図３は、ＨＥＲＶ−Ｋ  ｍＲＮＡについて、先行技術［１６］に記載される、スプライシング事象を示す。
【図４】図４は、ｅｎｖ  ＯＲＦの５’末端および３’末端の近くで同定されたスプライシング部位を示す。３つのリーディングフレームは、異なる影付きである。
【図５】図５は、癌細胞株におけるＰＣＡＶ転写のノーザンブロット分析を示す。左側の一番上の矢印は、ゲノムｍＲＮＡ転写の位置を示す。その次の矢印は、ｅｎｖ転写の位置を示す。下の２つの矢印は、他のＯＲＦの位置を示す。このレーンは、以下の細胞株由来のＲＮＡを含む：（１）Ｔｅｒａ  １；（２）ＤＵ１４５；（３）ＰＣ３；（４）ＭＤＡ  Ｐｃａ−２ｂ；（５）ＬＮＣａＰ。Ｔｅｒａ  １は、奇形癌細胞株である；その他は、前立腺癌細胞株である。
【図６−１】図６は、２７  ＨＥＲＶ−Ｋウイルス由来の、ｅｎｖゲノムＤＮＡ配列の整列を示す。コンセンサス配列（配列番号１５７）は、最下行に示される。
【図６−２】図６は、２７  ＨＥＲＶ−Ｋウイルス由来の、ｅｎｖゲノムＤＮＡ配列の整列を示す。コンセンサス配列（配列番号１５７）は、最下行に示される。
【図６−３】図６は、２７  ＨＥＲＶ−Ｋウイルス由来の、ｅｎｖゲノムＤＮＡ配列の整列を示す。コンセンサス配列（配列番号１５７）は、最下行に示される。
【図６−４】図６は、２７  ＨＥＲＶ−Ｋウイルス由来の、ｅｎｖゲノムＤＮＡ配列の整列を示す。コンセンサス配列（配列番号１５７）は、最下行に示される。
【図６−５】図６は、２７  ＨＥＲＶ−Ｋウイルス由来の、ｅｎｖゲノムＤＮＡ配列の整列を示す。コンセンサス配列（配列番号１５７）は、最下行に示される。
【図６−６】図６は、２７  ＨＥＲＶ−Ｋウイルス由来の、ｅｎｖゲノムＤＮＡ配列の整列を示す。コンセンサス配列（配列番号１５７）は、最下行に示される。
【図６−７】図６は、２７  ＨＥＲＶ−Ｋウイルス由来の、ｅｎｖゲノムＤＮＡ配列の整列を示す。コンセンサス配列（配列番号１５７）は、最下行に示される。
【図６−８】図６は、２７  ＨＥＲＶ−Ｋウイルス由来の、ｅｎｖゲノムＤＮＡ配列の整列を示す。コンセンサス配列（配列番号１５７）は、最下行に示される。
【図６−９】図６は、２７  ＨＥＲＶ−Ｋウイルス由来の、ｅｎｖゲノムＤＮＡ配列の整列を示す。コンセンサス配列（配列番号１５７）は、最下行に示される。
【図６−１０】図６は、２７  ＨＥＲＶ−Ｋウイルス由来の、ｅｎｖゲノムＤＮＡ配列の整列を示す。コンセンサス配列（配列番号１５７）は、最下行に示される。
【図６−１１】図６は、２７  ＨＥＲＶ−Ｋウイルス由来の、ｅｎｖゲノムＤＮＡ配列の整列を示す。コンセンサス配列（配列番号１５７）は、最下行に示される。
【図６−１２】図６は、２７  ＨＥＲＶ−Ｋウイルス由来の、ｅｎｖゲノムＤＮＡ配列の整列を示す。コンセンサス配列（配列番号１５７）は、最下行に示される。
【図７−１】図７〜図９は、種々のＨＥＲＶ−Ｋウイルスに由来するｇａｇ（７）、ｐｏｌ（８）およびｅｎｖ（９）に対して推測されるポリペプチド配列の整列を、コンセンサス配列（配列番号１５８〜１６０）と一緒に示す。
【図７−２】図７〜図９は、種々のＨＥＲＶ−Ｋウイルスに由来するｇａｇ（７）、ｐｏｌ（８）およびｅｎｖ（９）に対して推測されるポリペプチド配列の整列を、コンセンサス配列（配列番号１５８〜１６０）と一緒に示す。
【図７−３】図７〜図９は、種々のＨＥＲＶ−Ｋウイルスに由来するｇａｇ（７）、ｐｏｌ（８）およびｅｎｖ（９）に対して推測されるポリペプチド配列の整列を、コンセンサス配列（配列番号１５８〜１６０）と一緒に示す。
【図７−４】図７〜図９は、種々のＨＥＲＶ−Ｋウイルスに由来するｇａｇ（７）、ｐｏｌ（８）およびｅｎｖ（９）に対して推測されるポリペプチド配列の整列を、コンセンサス配列（配列番号１５８〜１６０）と一緒に示す。
【図８−１】図７〜図９は、種々のＨＥＲＶ−Ｋウイルスに由来するｇａｇ（７）、ｐｏｌ（８）およびｅｎｖ（９）に対して推測されるポリペプチド配列の整列を、コンセンサス配列（配列番号１５８〜１６０）と一緒に示す。
【図８−２】図７〜図９は、種々のＨＥＲＶ−Ｋウイルスに由来するｇａｇ（７）、ｐｏｌ（８）およびｅｎｖ（９）に対して推測されるポリペプチド配列の整列を、コンセンサス配列（配列番号１５８〜１６０）と一緒に示す。
【図８−３】図７〜図９は、種々のＨＥＲＶ−Ｋウイルスに由来するｇａｇ（７）、ｐｏｌ（８）およびｅｎｖ（９）に対して推測されるポリペプチド配列の整列を、コンセンサス配列（配列番号１５８〜１６０）と一緒に示す。
【図８−４】図７〜図９は、種々のＨＥＲＶ−Ｋウイルスに由来するｇａｇ（７）、ｐｏｌ（８）およびｅｎｖ（９）に対して推測されるポリペプチド配列の整列を、コンセンサス配列（配列番号１５８〜１６０）と一緒に示す。
【図８−５】図７〜図９は、種々のＨＥＲＶ−Ｋウイルスに由来するｇａｇ（７）、ｐｏｌ（８）およびｅｎｖ（９）に対して推測されるポリペプチド配列の整列を、コンセンサス配列（配列番号１５８〜１６０）と一緒に示す。
【図９−１】図７〜図９は、種々のＨＥＲＶ−Ｋウイルスに由来するｇａｇ（７）、ｐｏｌ（８）およびｅｎｖ（９）に対して推測されるポリペプチド配列の整列を、コンセンサス配列（配列番号１５８〜１６０）と一緒に示す。
【図９−２】図７〜図９は、種々のＨＥＲＶ−Ｋウイルスに由来するｇａｇ（７）、ｐｏｌ（８）およびｅｎｖ（９）に対して推測されるポリペプチド配列の整列を、コンセンサス配列（配列番号１５８〜１６０）と一緒に示す。
【図９−３】図７〜図９は、種々のＨＥＲＶ−Ｋウイルスに由来するｇａｇ（７）、ｐｏｌ（８）およびｅｎｖ（９）に対して推測されるポリペプチド配列の整列を、コンセンサス配列（配列番号１５８〜１６０）と一緒に示す。
【図９−４】図７〜図９は、種々のＨＥＲＶ−Ｋウイルスに由来するｇａｇ（７）、ｐｏｌ（８）およびｅｎｖ（９）に対して推測されるポリペプチド配列の整列を、コンセンサス配列（配列番号１５８〜１６０）と一緒に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
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【図６−１１】
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【図６−１２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【配列表】
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