(57)【要約】      （修正有）【課題】ＣＤ２８＋T細胞における応答を刺激するin vitro法であって、Ｔ細胞活性化を相互促進する新規の分子の提供。【解決手段】Ｂリンパ球、抗原提示細胞、及び免疫細胞に抗原提示可能なその他の細胞において、その細胞膜上に提示されている物質であり、Ｔ細胞膜上のＣＴＬＡ４やＣＤ２８を含む、その他のまだ同定されていないリセプターを介して、Ｔ細胞の増殖及び／又はＴ細胞からのサイトカインの分泌など、Ｔ細胞を活性化することを可能とする新規の物質。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２８＋T細胞における応答を刺激するin vitro法であって、ＣＤ２８＋T細胞を、B細胞活性化抗原B7-2の可変領域を含む融合タンパク質に接触させるステップを含み、前記B細胞活性化抗原B7-2が、SEQ ID NO:2又はSEQ ID NO:23の可変領域に対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を、免疫グロブリン定常領域に作動可能に連結して含む、in vitro法。
【請求項２】
前記可変領域がSEQ ID NO:2の約アミノ酸残基２４−１３３を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫グロブリン定常領域が、ヒンジ、CH2、及びCH3領域を含むCγ1ドメインである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫グロブリン定常領域が、ヒンジ、CH2、及びCH3領域を含むCγ4ドメインである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫グロブリン定常領域が、定常領域媒介性の生物学的なエフェクタ機能を減少させるように修飾されている、請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
CH2ドメインの少なくとも一つのアミノ酸残基が置換、追加、又は欠失により修飾されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的なエフェクタ機能が補体活性化またはFc受容体相互作用である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記応答がＣＤ２８＋T細胞の増殖である、請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記応答がＣＤ２８＋T細胞によるサイトカイン産生であり、前記サイトカインがIL-2、IL-4、IFN-γ、及びGM-CSFから成る群より選択される、請求項１乃至８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記応答が持続的なT細胞成長である、請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＤ２８＋T細胞がCD4＋T細胞である、請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞活性化を相互促進する新規の分子を符号化する分離した核酸と、Ｂ７−２活性を有し、図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）又は図１４Ａ−Ｄに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２３番）と少なくとも５０％、更に好適には少なくとも６０％、最も好適には少なくとも７０％は相同のペプチドを符号化する核酸と、Ｂ７−２活性を有したペプチドを符号化し、少なくとも２０のアミノ酸残基を備えたヌクレオチド配列を含む分離した核酸と、及びＢ７−２活性を備えた第１ペプチドを符号化するヌクレオチド配列と、第１ペプチドの可溶性、結合親和性、安定性又は結合価を変える成分に対応した第２ペプチドを符号化するヌクレオチド配列とを含むＢ７−２融合タンパク質を符号化する分離した核酸との提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原特異Ｔ細胞の活性化及びクローン膨張を誘発するには、抗原提供細胞（ＡＰＣ）によって提供される２つの信号が休止Ｔリンパ球の表面に届けられなければならない(Jenkins, M.and Schwartz, R.(1987)J. Exp.Med.165,302-309;Mueller, D.L., et al. (1990)J. Immunol.144,3701-3709;Williams I.R.andUnanue,E.R. (1990)J.Immunol.145,85-93)。第１の信号は、この免疫反応に特異性を与えるもので、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に関連して提供された異種抗原性ペプチドの認知に引き続いてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を介して媒介される。
第２の信号は、相互促進(costimulation)と呼ばれ、Ｔ細胞の増殖及び機能化を誘発する(Schwartz, R.H. (1190)Science 248,1349-1356)。相互促進は抗原に特異でもなく、ＭＨＣに限られてもいないし、ＡＰＣに発現される１つ以上の別個の細胞表面分子によって提供されると考えられる(Jenkins, M.K.,et al. (1988)J.Immunol. 140,3324-3330;Linsley,P.S., et al.(1991)J.Exp.Med.1783,721-730; Gimmi,C.D.,et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88,6575-6579;Young,J.W.,et al.,(1992)J.Clin.Invest.90,229-237;Koulova,L.,et al.,(1991)J.Exp.Med.173,759-762;Reiser,H.,et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89,271-275;van-Sventer,G.A.,et al.,(1990)J.Immunol.144,4579-4586;LaSalle,J.M.,et al.,(1991)J.Immunol.147,774-80;Dustin,M.I.,et al.,(1989)J.Exp.Med.169,503;Armitage,R.J.,et al.,(1992)Nature 357,80-82;Liu,Y.,et al.,(1992)J.Exp.Med.175,437-445)。
Ｂ７タンパク質（ＡＰＣ上で発現される）が、そうした重要な相互促進性の分子であることを示すかなりの証拠が発見されている(Linsley,P.S.,et al.(1991)J.Exp.Med.1783,721-730;Gimmi,C.D.,et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88,6575-6579;Koulova,L.,et al.,(1991)J.Exp.Med.173,759-762;Reiser,H,et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89,271-275;Linsley,P.S.,et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87,5031-5035;Freeman,G.J.et al.(1991)J.Exp.Med.174,625-631)。Ｂ７はＴリンパ球上で発現される２つのリガンドの対のレセプターである。
第１のリガンドは、ＣＤ２８と呼ばれ、休止Ｔ細胞上に構造的に発現され、活性化後に増加する。Ｔ細胞レセプターを介して信号を送った後に、ＣＤ２８のリガンドは、Ｔ細胞の増殖及びＩＬ−２分泌を誘発する(Linsley,P.S.,et al.(1991)J.Exp.Med.1783,721-730;Gimmi,C.D.,et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88,6575-6579;Thompson,C.B.,et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86,1333-1337;June,C.H,et al.(1990)Immuno.Today.11,211-6;Harding,F.A.,et al.,(1992)Nature 356,607-609.)。
第２のリガンドは、ＣＴＬＡ４と呼ばれ、ＣＤ２８に相同するが、休止Ｔ細胞上に発現されず、Ｔ細胞の活性化後に出現する(Brunet,J.F.,et al.,(1987)Nature 328,267-270)。ヒト及びマウスのＣＴＬＡ４タンパク質を符号化するＤＮＡ塩基配列は、Driavich,et al.,(1988)EUR.J.Immonol.18(12),1901-1905;Brunet,J.F.,et al.,(1987)同上;Brunet,J.F.,et al.,(1988)Immunol.Rev.103:21-36;Feeman,G.J.,etal.(1992)J.Immunol.149,3795-3801などに記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、Ｂ７はＣＤ２８に対してよりもＣＴＬＡ４に対して親和性があるが(Linsley,P.S.,et al.(1991)J.Exp.Med.174,561-569)、ＣＴＬＡ４の機能はまだ知られていない。Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４の相互促進性経路の重要性は、試験管内でも、生体内のモデル系でも実証されている。この相互促進性経路を遮断すると、ヒト及びマウスの系内に抗原特異耐性が形成される(Harding,F.A.,et al.,(1992)Nature 356,607-609;Lenschow,D.J.,et al.(1992)Sc1ence,257,789-792;Turka.L.A.,et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89,11102-11105;Gimmi,C.D.,et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90,6586-6590;Boussiotis,V.,et al.(1993)J.Exp.Med.178,17533-1763)。逆に、Ｂ７ネガティブマウス腫瘍細胞によるＢ７の発現は、腫瘍拒絶反応及び腫瘍の攻撃に対する長期に亘る保護を伴うＴ細胞に媒介される特異免疫を形成させる(Chen.L.,et al.(1992)Cell 71,1093-1102;Townsend,S.E.and Allision,J.P.(1993)Science259,368-370;Baskar,S.,et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90,5687-5690)。よって、Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路を操作することには、ヒトの免疫反応を促進したり、抑制したりする大きな潜在的可能性が有る。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、Ｔ細胞活性化を相互促進する新規の分子を符号化する分離した核酸に関する。好適な相互促進性分子は、Ｂリンパ球の表面上の抗原、抗原を専門に提供細胞（例えば、単核細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞など）及び抗原を免疫細胞に提供し、ＣＴＬＡ４かＣＤ２８、ＣＴＬＡ４とＣＤ２８の両方、又はその他の既知又はまだ定義されていないレセプターを免疫細胞に結合するその他の細胞（例えばケラチン合成細胞、内被細胞、星状細胞、線維芽細胞、乏突起神経膠芽細胞など）を含む。こうした相互促進性分子は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４結合対レセプター又はＢリンパ球抗原と称し、活性化したＴ細胞がＴ細胞増殖及び／又は細胞質分裂分泌を誘発する相互促進を提供できる。好適なＢリンパ球抗原としては、Ｂ７−２及びＢ７−３と、ＣＤ２８及び／又はＣＴＬＡ４を結合し、免疫細胞の相互促進を抑制したり、誘発できるＢ７−２及びＢ７−３の可溶性の断片又は誘導体とがある。一実施例では、ヒトＢ７−２Ｂリンパ球抗原の活性を備えたペプチドを符号化する分離した核酸が、提供される。好ましくは、この核酸は図８Ａ−Ｃに示したように（配列同定番号第１番）、ヒトのＢ７−２を符号化するヌクレオチド配列を備えたｃＤＮＡ分子である。別の実施例では、この核酸は図１４Ａ−Ｄに示したように（配列同定番号第２２番）、マウスＢ７−２を符号化するヌクレオチド配列を備えたｃＤＮＡ分子である。
【０００５】
本発明は、Ｂ７−２活性を有し、図８Ａ−Ｃで示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）又は図１４Ａ−Ｄで示したアミノ酸配列（配列同定番号第２３番）と少なくとも５０％、更に好適には少なくとも６０％、最も好適には少なくとも７０％は相同のペプチドを符号化する核酸も提供する。Ｂ７−２活性を有し、図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）又は図１４Ａ−Ｄに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２３番）と少なくとも８０％、更に好適には少なくとも９０％、更に好適には少なくとも９５％、最も好適には少なくとも９９８％又は９９％は相同のペプチドを符号化する核酸も、本発明の範囲に入る。別の実施例では、Ｂ７−２活性を有するペプチドが、高度に或は程度に厳重な条件で図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）を備えたペプチド又は図１４Ａ−Ｄに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２３番）を備えたペプチドを符号化する核酸と交雑する核酸によって符号化される。
【０００６】
更に本発明は、Ｂ７−２活性を有したペプチドを符号化し、少なくとも２０のアミノ酸残基を備えたヌクレオチド配列を含む分離した核酸に関する。Ｂ７−２活性を有し、少なくとも４０の長さの、少なくとも６０の長さの、少なくとも８０の長さの、少なくとも１００長さの、少なくとも２００の長さの、又はそれ以上の長さのアミノ酸残基を備えたペプチドも本発明の範囲に入る。とりわけ好適な核酸は、Ｂ７−２活性を有し、少なくとも２０のアミノ酸残基を備え、図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）と少なくとも５０％（好適には少なくとも７０％）の相同性のあるペプチドを符号化する。
【０００７】
好適な一実施例では、本発明は、Ｂ７−２活性を有し、以下の公式で表されるアミノ酸配列を有したペプチドを符号化する分離した核酸に関する。
Ｘn−Ｙ−Ｚm 
この公式においては、Ｙは本質的に図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）のアミノ酸残基２４−２４５からなる。Ｘn及びＺmは、Ｙにアミド結合によって結合される付加的アミノ酸残基である。Ｘn及びＺmは、図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）中のＹに対して隣接するアミノ酸残基から選択されたアミノ酸残基である。Ｘnは、図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）の中のアミノＹの末端に隣接のアミノ酸から選択されたアミノ酸残基である。これは例えばアミノ酸残基２３から１迄の中から選択される。Ｚmは、図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）の中のＹのカルボキシ末端に隣接のアミノ酸から選択されたアミノ酸残基である。これは例えばアミノ酸残基２４６から３２９迄の中から選択される。この公式によれば、ｎは０から２３まで（ｎ＝０−２３）の数字で、ｍは０から８４まで（ｍ＝０−８４）の数字である。とりわけ好適なＤＮＡは、Ｙが図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）のアミノ酸残基２４−２４５で、ｎ＝０で、ｍ＝０である公式Ｘn−Ｙ−Ｚmで表されるアミノ酸配列を有したペプチドを符号化する。
【０００８】
更に本発明は、Ｂ７−２活性を備えた第１ペプチドを符号化するヌクレオチド配列と、第１ペプチドの可溶性、結合親和性、安定性又は結合価を変える成分に対応した第２ペプチドを符号化するヌクレオチド配列とを含むＢ７−２融合タンパク質を符号化する分離した核酸に関する。好ましくは、Ｂ７−２活性を備えた第１ペプチドは、Ｂ７−２タンパク質の細胞外ドメイン部分（例えば図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）のアミノ酸残基２４−２４５）を含み、第２ペプチドは、例えばヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３領域を含むヒトＣγ１又はＣγ４領域の様な免疫グロブリン不変部で、Ｂ７−２免疫グロブリン融合タンパク質（Ｂ７−２Ｉｇ）を生成する(Capon et al.(1989)Nature 337,525-531及びCaponの米国特許第５，１１６，９６４号を参照のこと）。
【０００９】
Ｂリンパ球抗原Ｂ７−２及びＢ７−３を発現するＢ細胞の存在に関して生物サンプルをアッセイする核酸プローブも、本発明の範囲に入る。
本発明は、Ｂ７−２及びＢ７−３タンパク質抗原のような新規のＢリンパ球抗原の活性を備えた分離ペプチドにも係わる。Ｂ７−２活性を備えた好適なペプチドは、組換型発現により生成され、図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）を備える。Ｂ７−２活性を備えた別の好適なペプチドは、図１４Ａ−Ｄに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２３番）を備える。Ｂ７−２活性を備えたとりわけ好適なペプチドは、例えば患者中でＴ細胞媒介された免疫学的反応を増強するのに使用できる細胞外ドメイン部分（例えば配列同定番号第２番のアミノ酸残基２４−２４５）などのこのタンパク質の成熟した形態の少なくとも一部を含む。
Ｂ７−２活性を備えたその他の好適なペプチドは、以下の公式で表されるアミノ酸配列を有したペプチドを含む。
Ｘn−Ｙ−Ｚm 
この公式においては、Ｙは、図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）のアミノ酸残基５５乃至６８と、図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）のアミノ酸残基８１乃至８９と、図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号
第２番）のアミノ酸残基１２８乃至１４２と、図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）のアミノ酸残基１６０乃至１６９と、図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）のアミノ酸残基１８８乃至２００と、図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）のアミノ酸残基２６９乃至２８２と、を含む群から選択されたアミノ酸残基からなる。この公式においては、Ｘn及びＺmは、Ｙにアミド結合によって連結され、図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）の中のＹに隣接のアミノ酸から選択された付加的アミノ酸残基である。Ｘnは、図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）の中のＹのアミノ末端に隣接のアミノ酸から選択されたアミノ酸残基である。Ｚmは、図８Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）の中のＹのカルボキシ末端に隣接のアミノ酸から選択されたアミノ酸残基である。この公式によれば、ｎは０から３０まで（ｎ＝０−３０）の数字で、ｍは０から３０まで（ｍ＝０−３０）の数字である。
【００１０】
本発明の更に別の側面は、哺乳類の細胞の免疫抗原性を増強するために本発明の核酸（とりわけｃＤＮＡ）を使用することに関する。好適な実施例では、哺乳類細胞は、肉腫、リンパ腫、黒色腫、神経芽細胞腫、白血病、癌腫のような腫瘍細胞か、大食細胞のような抗原提供細胞である。これらは、細胞の表面に本発明のＢリンパ球抗原の活性を備えたペプチドを発現させるようにトランスフェクションされる。Ｂ７−２抗原のようなＢリンパ球抗原の活性を備えたペプチドを発現する大食細胞は、抗原提供細胞として使用でき、これは、適切な病原体に関連した抗原又は腫瘍抗原を適用すると、Ｔ細胞活性及び免疫促進を増強する。
哺乳類細胞は、Ｂ７−２抗原のような新規のＢリンパ球抗原の活性を備えたぺプチドを符号化する核酸を含んだ適切な発現ベクターで生体外でトランスフェクションし、宿主哺乳類に導入するか、又は遺伝子治療技術を用いて生体内で遺伝子とトランスフェクションできる。例えば、Ｂ７−２活性を備えたペプチドを符号化する核酸は単独で、又は他の相互促進性の分子を符号化する核酸と共にトランスフェクションできる。ここに述べたように、クラスＩ又はクラスＩＩＭＨＣ分子を発現しない腫瘍の免疫抗原性を増強する際には、適切なクラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子を、Ｂリンパ球抗原の活性を備えたペプチドを符号化する核酸でトランスフェクションされる哺乳類細胞に付加的にトランスフェクションすると良いかもしれない。
【００１１】
請求項１に記載された発明は、ＣＤ２８＋T細胞における応答を刺激するin vitro法であって、ＣＤ２８＋T細胞を、B細胞活性化抗原B7-2の可変領域を含む融合タンパク質に接触させるステップを含み、前記B細胞活性化抗原B7-2が、SEQ ID NO:2又はSEQ ID NO:23の可変領域に対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を、免疫グロブリン定常領域に作動可能に連結して含む、in vitro法である。
【００１２】
請求項２に記載された発明は、前記可変領域がSEQ ID NO:2の約アミノ酸残基２４−１３３を含む、請求項１に記載の方法である。
【００１３】
請求項３に記載された発明は、前記免疫グロブリン定常領域が、ヒンジ、CH2、及びCH3領域を含むCγ1ドメインである、請求項１又は２に記載の方法である。
【００１４】
請求項４に記載された発明は、前記免疫グロブリン定常領域が、ヒンジ、CH2、及びCH3領域を含むCγ4ドメインである、請求項１又は２に記載の方法である。
【００１５】
請求項５に記載された発明は、前記免疫グロブリン定常領域が、定常領域媒介性の生物学的なエフェクタ機能を減少させるように修飾されている、請求項１乃至４のいずれかに記載の方法である。
【００１６】
請求項６に記載された発明は、CH2ドメインの少なくとも一つのアミノ酸残基が置換、追加、又は欠失により修飾されている、請求項５に記載の方法である。
【００１７】
請求項７に記載された発明は、前記生物学的なエフェクタ機能が補体活性化またはFc受容体相互作用である、請求項５又は６に記載の方法である。
【００１８】
請求項８に記載された発明は、前記応答がＣＤ２８＋T細胞の増殖である、請求項１乃至７のいずれかに記載の方法である。
【００１９】
請求項９に記載された発明は、前記応答がＣＤ２８＋T細胞によるサイトカイン産生であり、前記サイトカインがIL-2、IL-4、IFN-γ、及びGM-CSFから成る群より選択される、請求項１乃至８のいずれかに記載の方法である。
【００２０】
請求項１０に記載された発明は、前記応答が持続的なT細胞成長である、請求項１乃至９のいずれかに記載の方法である。
【００２１】
請求項１１に記載された発明は、前記ＣＤ２８＋T細胞がCD4＋T細胞である、請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によって得られる核酸は、様々な発現べクターに挿入可能で、これが今度は様々な宿主の中における対応するタンパク質やペプチドの合成を指示する。
これら宿主は、とりわけほ乳類及び昆虫の細胞培養と、大腸菌のような原核細胞などの真核細胞である。本発明の範囲の発現ベクターは、上述の新規のＢリンパ球抗原の活性を備えた少なくとも一つのペプチドを符号化する核酸及びこの核酸の配列に動作可能に連結されたプロモータを含む。一実施例では、発現ベクターは、Ｂ７−２抗原の活性を備えたペプチドを符号化するＤＮＡと、Ｂリンパ球抗原（Ｂ７−１活性化抗原とここで称する上述のような特徴の有るＢ７活性抗原）の活性を備えたペプチドを符号化するＤＮＡと、を含む。こうした発現ベクターを用いて、宿主細胞をトランスフェクションして、ここで述べるように核酸で符号化された融合タンパク質を含むタンパク質やペプチドを生成することができる。
【００２３】
新規のＢリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−２及びＢ７−３）の活性を備えたペプチドを含む融合タンパク質又はハイブリッド（雑種の）融合タンパク質も本発明の特徴である。例えば免疫グロブリン不変部の様な第１ペプチドの可溶性、結合親和性、安定性及び／又は結合価を変える、第２ペプチドに結合されたＢリンパ球抗原の細胞外ドメイン部分を含む第１ペプチドを含む融合タンパク質が提供される。一実施例では、Ｂ７−２Ｉｇ融合タンパク質を形成するＣγ１又はＣγ４のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３領域に対応した配列のアミノ酸残基を含む第２ペプチドに融合された新規のＢ７−２タンパク質の細胞外ドメイン部分のアミノ酸残基を含む第１ペプチドを含む融合タンパク質が生成される。別の実施例では、Ｂ７−１抗原の細胞外ドメイン部分と、Ｂ７−２抗原の細胞外ドメイン部分を含む第１ペプチドと、Ｃγ１のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３に対応したアミノ酸残基を含む第２ペプチドと、を含む第１ペプチドを含むハイブリッド融合タンパク質が生成される。((Linsley,P.S.,et al.(1991)J.Exp.Med.1783,721-730;Capon etal．(1989)Nature 337,525-531及びCaponの米国特許第５，１１６，９６４号を参照のこと）
更に別の実施例では、ハイブリッド融合タンパク質は、Ｂ７−２の免疫グロブリン様の可変ドメインを含み、免疫グロブリン分子の不変部に結合されたＢ７−２の免疫グロブリン様の不変ドメインは含まない。一つの好適な実施例では、Ｂ７−２Ｉｇ融合タンパク質は、好適にはヒトＢ７−２タンパク質のアミノ酸残基２４ぐらいからアミノ酸残基１３３ぐらいまで（配列同定番号第２番に示されている）のＩｇＧ分子の不変部に融合されたヒトＢ７−２の可変部を含む。
【００２４】
本発明の分離ペプチドと融合タンパク質は、患者に投与して、１つ以上のＢリンパ球抗原の発現を上方統制したり、抑制したり、１つ以上のＢリンパ球抗原が、Ｔ細胞のような免疫細胞その本来の（自然）リガンドに対して結紮するのを阻止して、生体内での細胞媒介性の免疫学的反応を高めたり抑制することができる。
本発明の別の実施例では、抗体をを提供する。そして好適には、ここに述べた新規のＢリンパ球抗原又は融合タンパク質のペプチドとりわけ反応する単クローン抗体を提供する。好適抗体は、ＨＦ２．３Ｄ１、ＨＡ５．２Ｂ７、及びＨＡ３．１Ｆ９ハイブリドーマ細胞によって生成される抗ヒトＢ７−２単クローン抗体である。これらのハイブリドーマ細胞は、ＡＴＣＣ受諾番号：ＨＢ１１６８６（ＨＦ２．３Ｄ１）、ＡＴＣＣ受諾番号：ＨＢ１１６８７８（ＨＡ５．２Ｂ７）、ＡＴＣＣ受諾番号：ＨＢ１１６８６（ＨＡ３．１Ｆ９）で、米国代表菌株培養収集（ＡＴＣＣ）に保管されている。
【００２５】
本発明は、例えばＴ細胞上の本来の（本来の）リガンド又はその他の免疫システム細胞に対する本発明の新規のＢリンパ球抗原（例えばＢ７−２及びＢ７−３）の機能的相互作用を阻止し、よってレセプター・リガンド対を介した相互促進を阻止することにより、患者中の一般手的な免疫抑制及び抗原特定耐性を誘発する方法も提供する。
一実施例では、本来のリガンド（ＣＴＬＡ４及びＤＣ２８）に対する本来のヒトＢ７−２抗原の機能的相互作用を阻止するのに用いられる抑制性分子には、Ｂ７−２結合活性を備えるが、免疫細胞を相互促進する能力はない可溶性ペプチドや、リガンドへのＢ７−２の結合を妨げ、相互促進信号の伝達を妨げる抗体（抗Ｂ７−２抗体などの所謂、「阻止抗体」）や、本発明に従って生成できるＢ７−２−Ｉｇ融合タンパク質や、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＤＣ２８Ｉｇなどの可溶性の形態のＢ７−２レセプターが含まれる。こうした阻止作用物質は、単独でも、または本来のリガンド（例えば、抗Ｂ７−２抗体など）に対する他の相互促進性分子の相互作用を阻止する作用物質と共に使用することができる。本発明の方法によるＴ細胞反応の抑制及びＴ細胞耐性の誘発は、移植拒否反応（一体器官、皮膚、及び骨髄）及び対宿主性移植片病を防止するのに、予防的効果があるかも知れない。本発明の方法は、自己免疫疾患、アレルギー、アレルギー反応、移植拒否、及び対宿主性移植片病（とりわけ同種異系の骨髄移植における）を治療するのに、治療的効果があるかも知れない。
【００２６】
更に、本発明で提供されるのは、Ｂ７−２抗体の促進形態を使用して相互促進信号をＴ細胞に伝達して免疫学的反応を上方調節する方法である。Ｂ７−２抗体の促進形態は、例えばＢ７−２活性を備えたペプチド及びＢ７−２融合タンパク質等の、Ｂ７−２タンパク質の可溶性で多値形態である。抗体と共にＢ７−２の促進形態を伝達するのは、様々な病原体にたいするワクチンの効力を高める予防的効果があるかも知れないし、感染時期の特定の病原体にたいする、又は腫瘍を持つ宿主内の腫瘍にたいする免疫学的反応を上方調節するのに治療的効果があるかも知れない。
【００２７】
更に本発明は、レセプターに対するＢリンパ球抗原（例えばＢ７−２及びＢ７−３）の相互作用を阻止するか、又はレセプターを介した細胞内の信号送信に干渉できる分子を特定する方法を提供する。更に、新規のＢリンパ球抗原によるＴ細胞の相互促進に反応して生成されたシトキンを特定する方法も、本発明の範囲に入る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
既に特性を記したＢリンパ球活性抗原Ｂ７（ここではＢ７−１と呼ぶ）に加え、ヒトのＢリンパ球もＴ細胞の活性化を相互促進する他の新しい分子を発現させる。これらの相互促進分子には以下が含まれる。
・Ｂリンパ球の表面に存在する抗原、
・抗原の提供を専門とする細胞（例えば単核白血球、樹枝状細胞、ランゲルハン細胞）、・他の細胞（例えばケラチン生成細胞、内皮細胞、星状細胞、繊維芽細胞、乏突起神経膠細胞）。
これらの細胞は免疫細胞に抗原を与える。またこれらの細胞は、免疫細胞上に存在する以下を結合する。すなわち、ＣＴＬＡ４かＣＤ２８、またはその両方、または他の既知のレセプター、あるいは未だ明らかにされていないレセプターである。相互促進分子は、本発明の範囲内では、ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンド（対レセプター）またはＢリンパ球抗原と呼ぶ。活性Ｔ細胞に相互促進を与え、それによりＴ細胞の増殖、及び／又はシトキン分泌を誘導する新規のＢリンパ球抗原には、ここで説明し特性について記したＢ７−２（ヒトとマウス）、及びＢ７−３抗原が含まれる。
【００２９】
Ｂリンパ球抗原Ｂ７−２は、抗免疫グロブリンまたは抗ＭＨＣクラスＩＩの単クローン抗体で促進を与えてから約２４時間後、ヒトのＢ細胞により発現される。Ｂ７−２抗原によりＩＬ−２の分泌とＴ細胞の増殖が誘導されるが、これは検出可能である。活性化されてから約４８乃至７２時間後、ヒトのＢ細胞はＢ７−Ｌ及び第３のＣＴＬＡ４対レセプターであるＢ７−３を発現させる。Ｂ７−３は単クローン抗体ＢＢ−１で同定されるが、Ｂ７−１を結合する(Yokochi.T.et al.(1982)J.Immunol.128,823-827)。Ｂ７−３抗原もまたＢ７−１陰性活性Ｂ細胞上で発現される。Ｂ７−３抗原はＴ細胞の増殖を相互促進することができるが、この時ＩＬ−２の産生は検出されない。この現象はＢ７−１とＢ７−３は別個の分子であることを示している。Ｂ７−３は様々な細胞上で発現される。これらの細胞には活性Ｂ細胞、活性単核白血球、樹枝状細胞、ランゲルハン細胞、ケラチン生成細胞が含まれる。Ｂ細胞が活性化されてから７２時間後、Ｂ７−１とＢ７−３の発現は衰え始める。活性Ｂリンパ球の表面にはこれらの相互促進分子が存在する。この現象はＴ細胞の相互促進は、部分的には、Ｂ細胞が活性化された後、これらの分子が一時的に発現されることで調節されることを示している。
【００３０】
従って、本発明の１つの側面は、新しい相互促進分子を符号化するヌクレオチド配列を含む分離核酸に関係する。この相互促進分子としては、例えばＢリンパ球抗原、Ｂ７−２、分離された核酸の断片、あるいはそれと同等のものがある。
ここで用いる「核酸」という用語は、そうした断片あるいは同等のものを含めることを意図している。「同等」という用語は、機能的に同等のＢリンパ球抗原を符号化するヌクレオチド配列、または新規のＢリンパ球抗原の活性を持った機能的に同等のペプチドを符号化するヌクレオチド配列を含めることを意図する。新規のＢリンパ球抗原の活性とは、すなわち、免疫細胞上のＢリンパ球抗原、例えばＴ細胞上のＣＴＬＡ４及び／又はＣＤ２８、の本来のリガンドに結合し、免疫細胞の相互促進を阻害（例えば遮断）、または促進（例えば増強）できる能力を指す。そのような核酸は、図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第１番）に示したヒトのＢ７−２のヌクレオチド配列や図１４Ａ−Ｄ（配列同定番号第２２番）に示したマウスのＢ７−２ヌクレオチド配列と同等であると見なされ、本発明の範囲内にある。
【００３１】
一つの実施例では、核酸は、Ｂ７−２Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドを符号化するｃＤＮＡである。好ましくは、核酸は図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第１番）に示したように、ヒトのＢ７−２を符号化するヌクレオチド配列の少なくとも一部で構成されているｃＤＮＡ分子、または図１４Ａ−Ｄ（配列同定番号第２２番）に示したように、マウスのＢ７−２を符号化するヌクレオチド配列の少なくとも一部で構成されているｃＤＮＡ分子である。図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第１番）、または図１４Ａ−Ｄ（配列同定番号第２２番）のｃＤＮＡ分子の好適な部分には、分子の遺伝符号を指定する領域が含まれている。
【００３２】
別の実施例では、本発明の核酸はＢ７−２の活性を持ち、図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）または図１４Ａ−Ｄ（配列同定番号第２３番）に示したアミノ酸配列を含むペプチドを符号化する。好ましい核酸はＢ７−２活性を持ち、図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示したアミノ酸配列と少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、最も好ましくは少なくとも約７０％の相同関係を持つペプチドを符号化する。Ｂ７−２活性を持ち、図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示した配列と少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８乃至９９％が相同関係にあるペプチドを符号化する核酸も本発明の範囲内にある。相同とは、新規のＢリンパ球抗原、例えばＢ７−２など、の活性を持った２つのペプチド間、あるいは２つの核酸分子間に見られる配列の類似性を指す。相同は、比較のために一直線に並べられることがある各配列において、１つの位置を比較することにより、決定することができる。比較した配列における１つの位置が、同じヌクレオチドの塩基またはアミノ酸で占められている場合、その分子はその位置で相同関係にある。配列間の相同の程度（または割合）は、その配列が共有し一致している位置の数、すなわち相同関係にある位置が幾つあるかの関数である。本発明の別の側面は、核酸に対する厳格さが高い、または低い条件下で雑種を形成する核酸を提供する。この核酸は図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示したアミノ酸配列のすべてまたは一部を有するペプチド、または図１４Ａ−Ｄ（配列同定番号第２３番）に示したアミノ酸配列のすべてまたは一部を有するペプチドを符号化する。ＤＮＡの雑種形成を促進する適切な厳格さの条件とは、例えば、以下の通りである。すなわち、約４５℃の６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で洗浄した後、５０℃の２．０×ＳＳＣで洗浄を行うことが当業者に知られている。あるいはこの適切な厳格さの条件は、CurrentProtocols in Molecular Bio1ogy,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6においても見出すことができる。例えば洗浄段階での塩の濃度は、低い厳格さである約２．０×ＳＳＣ、５０℃から高い厳格さである約０．２×ＳＳＣ、５０℃までの間で選ぶことができる。さらに洗浄段階の温度も低い厳格さの条件である室温、すなわち約２２℃から、高い厳格さの条件である約６５℃まで高めてよい。
【００３３】
ここに記した新規のＢリンパ球抗原の活性を持ち、図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第１番）または図１４Ａ−Ｄ（配列同定番号第２２番）に示したヌクレオチド配列とは遺伝符号の縮退のため異なった配列を持つペプチドを符号化する分離核酸も、本発明の範囲内にある。そのような核酸は機能的に同等のペプチド（例えばＢ７−２活性を持つペプチド）を符号化するが、その配列は遺伝符号の縮退のため図８Ａ−Ｃや図１４Ａ−Ｄの配列とは異なっている。例えば多くのアミノ酸は、１つ以上のトリプレットによってデザインされる。同じアミノ酸を指定するコドン、すなわちシノニム（例えばＣＡＵとＣＡＣはヒスチジンのシノニムである）は、遺伝符号の縮退のために存在するのかもしれない。一例を挙げれば、Ｂ７−２のヌクレオチド配列内で見られるＤＮＡ配列の多形（とりわけコドンの第３塩基内で見られる多形）の結果、ＤＮＡに「静かな」突然変異が生じるかもしれない。この突然変異は符号化されるアミノ酸には影響しない。しかしながらＤＮＡ配列の多形は、確かにＢ７−２抗原のアミノ酸配列の変化につながるものであり、個体群内に存在すると思われる。新規のＢリンパ球抗原の活性を持ったペプチドを符号化している核酸の１つ以上のヌクレオチドに見られるこれらの変異（ヌクレオチドの約３−４％まで）は、本来の対立遺伝子の変異のため、個体群内の個体間に存在するかもしれない。このことは熟練した技術者により、正しく認識されよう。そのようなヌクレオチドの変異のすべて、及びその結果生じるアミノ酸の多形は、本発明の範囲内にある。さらにここで記した新規のＢリンパ球抗原のイソフォルム、またはこの抗原と関係があり、交差反応を起こしている同族種も１つ以上存在するかもしれない。そのようなイソフォルム、あるいは同族種は、Ｂリンパ球抗原（例えばＢ７−２抗原）に対する機能とアミノ酸配列に関連しているタンパク質と定義されるが、異なる座にある遺伝子で符号化される。
【００３４】
新規のＢリンパ球抗原を符号化する核酸の「断片」とは、以下のヌクレオチド配列と定義される。すなわち、
・Ｂリンパ球抗原の全アミノ酸配列を符号化するヌクレオチド配列よりもヌクレオチド数が少ないヌクレオチド配列であり、さらに
・Ｂリンパ球抗原の活性（すなわち、免疫細胞上のＢリンパ球抗原、例えばＴ細胞上のＣＴＬＡ４及び／又はＣＤ２８、の本来のリガンドに結合し、免疫細胞の相互促進を促進または阻害することができる能力）を持つペプチドを符号化するヌクレオチド配列である。
【００３５】
従ってＢ７−２活性を持つペプチドは、ＣＴＬＡ４及び／又はＣＤ２８を結合させ、Ｔ細胞で媒介される免疫反応を促進または阻害する。この免疫反応は、例えばシトキン産生、及び／又は一次活性化信号を受け取ったＴ細胞によるＴ細胞の増殖で証明されるものである。一つの実施例では、核酸の断片は、ＣＴＬＡ４及び／又はＣＤ２８を結合させ、Ｔリンパ球に相互促進信号を伝える抗原としての能力を保持しているＢ７−２抗原のペプチドを符号化する。別の実施例では、核酸の断片は、ヒトのＢ７−２抗原の細胞外部分を含むペプチド(例えば図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示した配列の約２４番目から約２４５番目までのアミノ酸残基）を符号化する。このペプチドはＣＴＬＡ４及び／又はＣＤ２８を結合させ、一価の形では相互促進を阻害し、多価の形では相互促進を誘導または増強するのに利用することができる。
【００３６】
好適な核酸断片は、少なくとも長さがアミノ酸残基２０個分のペプチドを符号
化する。好ましくは少なくとも長さがアミノ酸残基４０個分、より好ましくは少なくとも長さがアミノ酸残基６０個分のペプチドを符号化する。少なくとも長さがアミノ酸残基８０個分のペプチド、少なくとも長さがアミノ酸残基１００個分のペプチド、及び少なくとも長さがアミノ酸２００個分以上のペプチドを符号化する核酸断片も本発明の範囲内にある。とりわけ好適な核酸断片は、ヒトのＢ７−２活性と以下の公式で表されるアミノ酸配列とを持つペプチドを符号化する。
Ｘn−Ｙ−Ｚm
上記公式において、Ｙは図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示した配列の２４番目から２４５番目までのアミノ酸残基より成る。ＸnとＺmはアミド結合によりＹに連結した付加的なアミノ酸残基である。ＸnとＺmは図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示したアミノ酸配列において、Ｙに隣接するアミノ酸残基から選ばれる。上記公式において、Ｘnは図８（配列同定番号第２番）に示した配列において、Ｙのアミノ末端に隣接するアミノ酸から選ばれたアミノ酸残基である。すなわち、２３番目から１番目までのアミノ酸残基である。Ｚmは図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示した配列において、Ｙのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸から選ばれたアミノ酸残基である。すなわち、２４６番目から３２９番目までのアミノ酸残基である。さらに上記公式において、ｎは０から２３（ｎ＝０−２３）、ｍは０から８４（ｍ＝０−８４）までの数字である。とりわけ好適なペプチドは、上記で示した公式Ｘn−Ｙ−Ｚm（ｎ＝０，ｍ＝０）で表されるアミノ酸配列を持つ。
【００３７】
本発明の範囲内にある核酸の断片には、他の動物種に由来する核酸と雑種を形成することが可能な断片が含まれる。その目的は、ここに記したＢリンパ球抗原と交差反応を起こしうる新しいタンパク質を検出するためのスクリーニング用プロトコルで利用するためである。これらの断片やその他の断片についてここで詳細に記す。一般的にはＢリンパ球抗原の断片を符号化する核酸は、成熟したタンパク質の遺伝符号を指定する塩基から選ばれるだろう。しかしながら場合によっては、ヌクレオチド配列のリーダー配列あるいは遺伝符号を指定しない部分から断片のすべて、または一部を選んだほうが良いかもしれない。本発明の範囲内にある核酸には、組換え型タンパク質またはそれに関する断片の分子クローニング、発現、または精製に役立つリンカ配列、修正制限エンドヌクレアーゼ部位、及びその他の配列も含まれるかもしれない。核酸配列のこうした修正やその他の修正について、ここでさらに詳細に記す。
【００３８】
新規のＢリンパ球抗原、例えばＢ７−２抗原、の活性を持つペプチドを符号化する核酸は、活性Ｂリンパ球に存在するｍＲＮＡから得られるかもしれない。Ｂ細胞のゲノムＤＮＡからＢリンパ球抗原を符号化する核酸配列を得ることも可能であろう。例えばＢ７−２抗原を符号化する遺伝子は、ここに記したプロトコルに従い、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからクローンが可能である。Ｂ７−２抗原を符号化するｃＤＮＡは、適切な細胞系からｍＲＮＡ全体を分離することによって得られる。その後ｍＲＮＡ全体から二重鎖のｃＤＮＡを作製することができる。その後、多数ある既知の技術の１つを利用し、ｃＤＮＡを適切なプラスミド、またはウィルス性（例えばバクテリオファージ）ベクター内へ挿入することができる。新規のＢリンパ球抗原を符号化する遺伝子も、本発明が提供するヌクレオチドの配列情報に従い、確立されたポリメラーゼ連鎖反応技術でクローンが可能である。本発明の核酸はＤＮＡまたはＲＮＡの可能性がある。好適な核酸は、図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第１番）に示した配列を持つヒトのＢ７−２抗原を符号化するｃＤＮＡである。別の好適な核酸は、図１４Ａ−Ｄ（配列同定番号第２２番）に示した配列を持つマウスのＢ７−２抗原を符号化するｃＤＮＡである。
【００３９】
さらに本発明は、ここに記した新規のＢリンパ球抗原の活性を持つペプチドを少なくとも１つは符号化する核酸を含んだ発現ベクターにも関係する。この新規のＢリンパ球抗原は、操作上、少なくとも１つの調節配列に連結される。「操作上、連結される」とは、ヌクレオチド酸配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で（例えばシス、あるいはトランスで）、調節配列に連結されることを意味する。調節配列は技術的に認識され、適切な宿主細胞で希望するタンパク質の発現を命じるために選ばれる。従って調節配列という用語には、プロモーター、エンハンサー、及びその他の発現制御要素が含まれる。そのような調節配列は熟練した技術者、あるいはGoeddel,Gene Expression Techno1ogy:Methods inEnzymelogy 185,Academic Press,California,San Diego,CA,(1990)に記された当業者に知られている。発現ベクターのデザインはトランスフェクションされる宿主細胞の選択、及び／又は発現させたいタンパク質の種類といった因子に左右される場合があることは、理解しなければならない。一つの実施例では、発現ベクターにはＢ７−２タンパク質の少なくとも一部分、例えば細胞外のドメイン部分、を符号化する核酸が含まれる。別の実施例では、発現ベクターにはＢ７−２抗原の活性を持つペプチドを符号化するＤＮＡ、及び別のＢリンパ球抗原、例えばＢ７−１、の活性を持つペプチドを符号化するＤＮＡが含まれる。ヒトのＢ７−１抗原とマウスのＢ７−１抗原を符号化するｃＤＮＡは、それぞれ配列同定番号第２８番と配列同定番号第３０番に示す。これらの抗原について論理的に推定したアミノ酸配列についても、それぞれ配列同定番号第２９番と配列同定番号第３１番に示す。そのような発現べクターを利用することで、細胞をトランスフェクションし、それによってタンパク質あるいはペプチドを製造することが可能である。その中にはここに記した核酸配列で符号化される融合タンパク質やペプチドも含まれる。これらの実施例やその他の実施例について、ここでさらに詳細に記す。
【００４０】
本発明はまた、新規のＢリンパ球抗原の活性を持ったペプチドを製造する方法についても詳しく記す。例えば、Ｂ７−２タンパク質の活性を持ったペプチドを符号化するヌクレオチド配列について、その発現を命ずる核酸ベクターを用いて宿主細胞をトランスフェクションする。するとこの宿主細胞は、そのペプチドを発現させうる適切な条件下で、培養液（媒体(media)）を用いて培養することができる。さらに以下に記したＤＮＡを含む１つ以上の発現ベクターを利用し、宿主細胞をトランスフェクションし、これらのペプチドを共同発現させたり、あるいは融合タンパク質またはペプチドを製造することは可能である。ここに記したＤＮＡとは、すなわち、
・Ｂ７−２の活性を持つペプチドを符号化するＤＮＡ、
・別のペプチド、例えば他のＢリンパ球抗原（例えばＢ７−１、Ｂ７−３）の活性を持つペプチド、を符号化するＤＮＡ、である。
一つの実施例では、Ｂ７−２融合タンパク質を符号化するＤＮＡを含んだ組換え型発現ベクターが製造される。Ｂ７−２融合タンパク質は、以下に示したヌクレオチド配列の組換え型発現により製造することができる。すなわち、
・Ｂ７−２活性を持つ第１ペプチドを符号化するヌクレオチド配列
・第１ペプチド、例えば免疫グロブリンの不変部、の可溶性、親和性、安定性、または結合価を変える部分に対応する第２ペプチドを符号化するヌクレオチド配列
好ましくは、第１ペプチドはヒトのＢ７−２抗原の細胞外ドメインの一部分（例えば図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示した配列の約２４番目から約２４５番目までのアミノ酸残基）で構成される。第２ペプチドは免疫グロブリンの不変部、例えばヒトのＣγ１ドメインあるいはＣγ４ドメイン（例えばヒトのＩｇＣγ１のヒンジ、ＣＨ２部及びＣＨ３部、あるいはヒトのＩｇＣγ４。ここに言及してに編入したCapon等のの米国特許第５，１１６，９６４号を参照のこと）を含むことがある。その結果としてＢ７−２ Ｉｇ融合タンパク質は、Ｂ７−２の可溶性、結合親和性、安定性、及び／又は結合価（すなわち分子１個当たりの利用可能な結合部位の数）を変えたかもしれない。またこの融合タンパク質は、タンパク質の精製効率を高めるかもしれない。組換え技術で製造した融合タンパク質とペプチドは、タンパク質またはペプチドを含む培養液と細胞との混合物から分泌、または分離されるかもしれない。代わりになるべきものとして、タンパク質またはペプチドが細胞質に保持されるかもしれない。従って細胞を採収した後に溶解させると、タンパク質が分離される。一般的に細胞培養物には宿主細胞、培養液、及びその他の副産物が含まれる。細胞培養のための適切な培養液は、技術的にはよく知られている。タンパク質とペプチドは、タンパク質とペプチドを精製するための既知の技術を利用することにより、細胞を培養した培養液、宿主細胞、あるいはこの両者から分離することができる。宿主細胞をトランスフェクションし、タンパク質とペプチドを精製する技術について、ここでさらに詳しく記す。
【００４１】
とりわけ好適なヒトのＢ７−２ Ｉｇ融合タンパク質には、免疫グロブリンの不変部に結合したヒトのＢ７−２の細胞外ドメインの一部、または可変部様のドメインが含まれる。免疫グロブリンの不変部には、免疫グロブリンの構造に固有のエフェクター活性を弱める、または排除する遺伝的な変異が含まれているかもしれない。例えば、ヒトのＢ７−２の可変部様のドメイン（ｈＢ７．２Ｖ）またはヒトのＢ７−２の不変部様のドメイン（ｈＢ７．２Ｃ）を符号化するＤＮＡだけでなく、ヒトのＢ７−２（ｈＢ７−２）の細胞外部分を符号化するＤＮＡも、以下の部分を符号化するＤＮＡに結合させることが可能である。すなわち、
・ヒトのＩｇＣγ１のヒンジ、ＣＨ２部及びＣＨ３部を符号化するＤＮＡ、及び／又は
・部位命令型突然変異生成により変更されたＩｇＣγ４を符号化するＤＮＡ
これらの融合タンパク質の作製と特性については、実施例７で詳述する。
【００４２】
一つの具体例では、本発明のタンパク質は、Ｂ細胞活性抗原Ｂ７−２の可変部型である。「Ｂ細胞活性抗原Ｂ７−２の可変部型」という用語は、Ｂ７−２の免疫グロブリン様可変ドメインは含むが、Ｂ７−２の免疫グロブリン様不変ドメインは含まない型のＢ７−２を含めることを意図したものである。好適な実施例ではＢ７−２の可変部型は、ヒトのＢ７−２タンパク質（配列同定番号第２番）において、約１８番目から約３０番目までの位置にあるアミノ酸で始まり、約１２８番目から約１４０番目までの位置にあるアミノ酸で終了するアミノ酸配列より成る。極めて好適な実施例では、Ｂ７−２の可変部型は、ヒトのＢ７−２タンパク質（配列同定番号第２番）の約２４番目から約１３３番目までのアミノ酸より成る。Ｂ７−２の可変部型は、細胞表面で発現可能なＢ７−２の可変部型を形成するため、さらに膜内外のドメイン、例えばＢ７−２の膜内外のドメイン、に機能的に直接連結させることが可能である。「機能的」とは、２つ以上のドメインまたはペプチドを機能的に連結させることで形成された分子が機能しうる、ということを意味するものである。ヒトのＢ７−２の膜内外のドメインは、ヒトのＢ７−２タンパク質の約２４６番目から約２６８番目までのアミノ酸残基より成る。従って一つの実施例では、Ｂ７−２の可変部型は、以下のペプチドに機能的に連結される。すなわち、
・配列同定番号第２番のヒトのＢ７−２タンパク質について、約２３８番目のアミノ酸残基と約２５２番目のアミノ酸残基との間に最初のアミノ酸が位置し、
・配列同定番号第２番のヒトのＢ７−２タンパク質について、約２６０番目のアミノ酸残基と約２７４番目のアミノ酸残基との間に最後のアミノ酸残基が位置するペプチドである。
本発明のタンパク質に膜内外のドメインを組み込むと、そのタンパク質を符号化している核酸が細胞で発現された時、そのタンパク質は細胞表面上で発現されるようになる。
【００４３】
別の実施例では、Ｂ７−２の可変部型は機能的に細胞質のドメイン、例えばＢ７−２の細胞質ドメイン、に連結される。ヒトのＢ７−２の細胞質ドメインは、配列同定番号第２番のヒトのＢ７−２タンパク質の約２６９番目から約３２９番目までのアミノ酸残基より成る。従って一つの実施例では、Ｂ７−２の可変部型は、別のＢ７−２のペプチドに機能的に連結され、最初のアミノ酸残基は、ヒトのＢ７−２の約２６０番目から約２７５番目までのアミノ酸の間に位置し、末端のアミノ酸残基は配列同定番号第２番のヒトのＢ７−２の約３２３番目から約３３５番目までのアミノ酸の間に位置する。別の実施例では、Ｂ７−２の可変部型は、別のＢ７−２ペプチド、すなわち、ヒトのＢ７−２の約２６９番目から約３２９番目までのアミノ酸残基に機能的に連結される。
【００４４】
さらに別の実施例では、Ｂ７−２の膜内外のドメイン付近に対応するペプチドに機能的に連結しているＢ７−２の可変部型は、Ｂ７−２の細胞質ドメインにかなりよく対応しているぺプチドにさらに機能的に連結される。従って本発明の範囲内にあるタンパク質は、配列同定番号第２番の約２４番目から約１３３番目までの位置にあるアミノ酸配列より成るタンパク質を含み、配列同定番号第２番の約２４６番目から約２６８番目までの位置にあるアミノ酸配列（Ｖ領域と膜内外のドメイン）に機能的に連結されている。本発明の範囲内にある他のタンパク質は、配列同定番号第２番の約２４番目から約１３３番目までの位置にあるアミノ酸配列より成るタンパク質を含み、配列同定番号第２番の約２４６番目から約３２９番目までの位置にあるアミノ酸配列（Ｖ領域、膜内外のドメイン、及び細胞質のドメイン）に機能的に連結されている。さらに本発明の範囲内にある他のタンパク質は、Ｎ末端でＢ７−２のリーダー配列（例えば１番目から２３番目までの位置）を含む。互いに機能的に連結したＢ７−２タンパク質の異なる部分は含むが、Ｂ７−２の免疫グロブリン様の不変ドメインは含まないタンパク質も本発明の範囲内にある。他の実施例では、可変部が存在しない状態でＢ７−２の免疫グロブリン様不変ドメインを含むＢ７−２タンパク質が企図されている。
【００４５】
Ｂ７−２の可変部型も、少なくとも１つの異種構造ポリペプチドに連結させることが可能である。「異種構造ポリペプチド」という用語は、いかなるポリペプチドをも含めることを意図する。例えば、本発明のタンパク質を特定の細胞コンパートメントに割り当てるポリペプチドも含まれる。一つの実施例では、異種構造ポリペプチドは、タンパク質が細胞から分離されることを可能にする信号ペプチドである。本発明の範囲内にある別の異種構造ポリペプチドは、タンパク質が細胞表面で発現されることを可能にする信号ペプチドである。さらに別の実施例では、異種構造ポリペプチドは免疫グロブリン分子の不変部である。より好適な実施例では、異種構造ポリペプチドはここに記したようにＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインより成る。
【００４６】
Ｂ７−２の可変部型は、さらにリンカポリペプチドに結合させることが可能である。本発明のタンパク質において、２つのペプチドをブリッジするポリペプチドはいかなるものでも、ここで定義を下したように「リンカポリペプチド」に含まれる。代わりになるべきものとして、リンカポリペプチドはタンパク質のどちらかの末端、または両端に結合される。従ってタンパク質の１つの末端、または両端に結合されたリンカペプチドにより、例えば、本発明のタンパク質を固体の支持体（保持体）に結合させることが容易になる。リンカペプチドも細菌性タンパク質またはウィルス性タンパク質の断片である場合がある。
上述の融合タンパク質は、例えば、ヒトに由来する場合もあれば、またマウスに由来する場合もある。融合タンパク質を発現させる発現べクターや宿主細胞だけでなく、上述の融合タンパク質を符号化する核酸分子もまた本発明の範囲内にある。
【００４７】
１つ以上のＢリンパ球抗原（例えばＢ７−２、Ｂ７−３）の活性を持ったペプチドを細胞表面上で発現させる、トランスフェクションされた細胞も本発明の範囲内にある。一つの実施例では、ＣＯＳ細胞などの宿主細胞は、Ｂ７−２活性を持つペプチドを細胞表面で発現するように命じる発現ベクターでトランスフェクションされる。トランスフェクションされたそのような宿主細胞は、Ｂ７−２がＴ細胞の対レセプターに結合することを妨げる分子が何であるのか、あるいはＢ７−２の相互作用に応じてＴ細胞に相互促進の細胞内信号を送ることを妨げる分子が何であるのか、を明らかにする方法で利用することができる。別の実施例では肉腫、黒色種、白血病、リンパ種、癌腫、あるいは神経芽細胞種といった腫瘍細胞は、新規のＢリンパ球抗原の活性を持つ少なくとも１つのペプチドが、腫瘍細胞の表面で発現されるように命じる発現ベクターでトランスフェクションされる。ある場合では、腫瘍細胞をトランスフェクションし、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質、例えばＭＨＣのクラスＩＩα鎖タンパク質やクラスＩＩβ鎖タンパク質、あるいはＭＨＣのクラスＩα鎖タンパク質、必要ならばβ２ミクログロブリンタンパク質、を共同発現させた方が有益であるかもしれない。トランスフェクションされたそのような腫瘍細胞を利用し、患者に腫瘍免疫を誘導することが可能である。これらの実施例やその他の実施例について、ここでさらに詳しく記す。
【００４８】
本発明の核酸配列は、標準的な技術を利用し、化学合成することも可能である。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する様々な方法が知られている。この中には、市販のＤＮＡシンセサイザーで見られる、例えばペプチド合成のような、完全にオートメーション化された固体相合成も含まれる（参照文献に編入した以下の例を参照のこと。Itakura等の米国特許第４，５９８，０４９号；Caruthers等の米国特許第４，４５８，０６６号；Itakuraの米国特許第４，４０１，７９６号及び第４，３７３，０７１号）。
【００４９】
本発明の別の側面は、新規のＢリンパ球抗原（例えばＢ７−２、Ｂ７−３）の活性を持つ分離ペプチドに関係する。Ｂリンパ球抗原の活性を持つペプチドは、アミノ酸配列、例えば図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示したヒトのＢ７−２配列、あるいは図１４Ａ−Ｄ（配列同定番号第２２番）に示したマウスのＢ７−２配列、においてＢリンパ球抗原とは異なるかもしれない。しながらそのような差異の結果、Ｂリンパ球抗原と同じまたは似かよった方法で機能するペプチド、あるいはＢリンパ球抗原と同じまたは似かよった特性を持つペプチドが生じる。例えばＢ７−２タンパク質の活性を持つペプチドは、ここでは以下の能力を持つペプチドであると定義される。すなわち、
・免疫細胞のＢ７−２タンパク質の本来のリガンド、例えばＴ細胞のＣＬＴＡ４及び／又はＣＤ２８、に結合する能力を持つペプチドであり、
さらに、
・免疫細胞の相互促進を刺激または阻害する能力を持つペプチドである。
従ってＢ７−２活性を持つペプチドは、ＣＴＬＡ４及び／又はＣＤ２８を結合させ、Ｔ細胞で媒介される免疫反応（例えば一次活性化信号を受け取ったＴ細胞によるシトキンの製造及び／又は増殖で証明される）を促進または阻害する。一つの実施例は、Ｂ７−２結合活性を持つが、Ｔ細胞に相互促進信号を伝える能力を欠くペプチドを提供する。そのようなペプチドを利用し、患者におけるＴ細胞の増殖及び／又はシトキンの分泌を阻害または遮断することが可能である。代わりになるべきものとしては、Ｂ７−２結合活性とＴ細胞に相互促進信号を伝える能力とを持つペプチドを利用し、患者におけるＴ細胞の増殖及び／又はシトキンの分泌を促進または増強する。機能的に同等の力を持つこれらのペプチドやその他のペプチドを製造するＢ７−２タンパク質の様々な変更型について、ここで詳述する。ここで用いたように「ペプチド」という用語は、ペプチド、タンパク質、及びポリペプチドを指す。
【００５０】
ペプチドは図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示したヒトのＢ７−２タンパク質のアミノ酸配列、または図１４Ａ−Ｄ（配列同定番号第２３番）に示したマウスのＢ７−２タンパク質のアミノ酸配列を変更することにより製造することができる。アミノ酸配列の変更とは、例えば、Ｂ７−２の機能（すなわち、ＣＴＬＡ４及び／又はＣＤ２８を結合させ、Ｔ細胞の相互促進を刺激または阻害するＢ７−２の能力）に直接関係しないアミノ酸残基の置換、付加、あるいは欠失である。一般的には本発明のペプチドは、少なくともアミノ酸残基２０個分の長さであり、好ましくは少なくともアミノ酸残基４０個分、最も好ましくはアミノ酸残基６０個分の長さである。Ｂ７−２活性を持ち、かつ少なくともアミノ酸残基８０個分の長さ、少なくともアミノ酸残基１００個分の長さ、または少なくともアミノ酸残基２００個分以上の長さを持つペプチドも本発明の範囲内にある。好適なペプチドは、ヒトのＢ７−２抗原の細胞外ドメイン部分（例えば図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示した配列の約２４番目から約２４５番目までのアミノ酸残基）を含む。他の好適なペプチドは、以下の公式で表されるアミノ酸配列を持つ。すなわち、 
Ｘn−Ｙ−Ｚm
上記公式においてＹは、以下からなる群から選ばれたアミノ酸残基である。すなわち、
・図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示した配列の５５番目から６８番目までのアミノ酸残基、
・図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示した配列の８１番目から８９番目までのアミノ酸残基、
・図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示した配列の１２８番目から１４２番目までのアミノ酸残基、
・図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示した配列の１６０番目から１６９番目までのアミノ酸残基、
・図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示した配列の１８８番目から２００番目までのアミノ酸残基、
・図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示した配列の２６９番目から２８２番目までのアミノ酸残基。
上記公式においてＸnとＺmはアミド結合によりＹに連結された付加的なアミノ酸残基である。ＸnとＺmは、図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示したアミノ酸配列のＹに隣接するアミノ酸から選んだアミノ酸残基である。Ｘnは図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示した配列のＹのアミノ末端に隣接するアミノ酸から選んだアミノ酸残基である。Ｚmは図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第２番）に示した配列のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸から選んだアミノ酸残基である。上記公式によれば、ｎは０から３０（ｎ＝０−３０）、ｍも０から３０（ｍ＝０−３０）までの数字である。とりわけ好適なペプチドは公式Ｘn−Ｙ−Ｚm（ｎ＝０，ｍ＝０）で表されるアミノ酸配列を持つ。
【００５１】
本発明の別の実施例は、新規のＢリンパ球抗原、例えばＢ７−２やＢ７−３、の活性を持つペプチドに関し、実質的に純粋な製品を提供する。そのような製品には、本来、細胞内でペプチドとともに出現するタンパク質や他のペプチド、あるいはペプチドが細胞によって分泌される時に、本来、ペプチドとともに出現するタンパク質や他のペプチドが実質的に存在しない。
【００５２】
本明細書全体を通じて用いた「分離された」という用語は、組換え型ＤＮＡ技術でこれらを製造する場合、細胞材料あるいは培養液が実質的に存在せず、更にこれらを化学合成する場合は、化学的前駆物質あるいはその他の化学製品が実質的に存在しない、新規のＢリンパ球抗原、例えばＢ７−２、の活性を持つ核酸、タンパク質、あるいはペプチドを指す。分離された核酸でも、その核酸が由来する生物体において、本来、その核酸の側面を守っている配列（すなわち核酸の５'末端と３'末端に位置する配列）が存在しない。
【００５３】
本発明の様々なペプチド、ポリペプチド、タンパク質、及び融合タンパク質は可溶型として作製可能である。代わりになるべきものとして、本発明のタンパク質は、技術的によく知られた方法に従い、細胞の表面、例えばＣＨ０細胞の表面で発現させ、作製することが可能である。本発明のタンパク質はまた固体相の支持体（保持体）、例えばビードや板に結合させることも可能である。一つの具体例では、Ｂ７−２Ｉｇ融合タンパク質はビードのような固体相の支持体、例えば生物分解性のビードに結合されている。好適な実施例では、Ｂ７−２の可変部型は固体の支持物に結合されている。極めて好適な実施例では、ＩｇＧ分子の不変ドメインに連結されたヒトのＢ７−２ Ｉｇ（配列同定番号第２番）の約２４番目から約１３３番目までのアミノ酸配列より成るＢ７−２ＶＩｇ融合タンパク質が、固体相の支持物に結合されている。
【００５４】
その後これらの分子は、幾つかの可能な方法で固体相の表面に結合させることが可能である。例えば、Ｂ７−２の可変部型など本発明のタンパク質は、トシル(tosyl)結合を利用し、電子対共有修正を介し、ビードと架橋結合を作らせることが可能である。この方法では、本発明のタンパク質は、一般的には０.０５Ｍのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９.５）中に存在しており、メーカーの指示に従いトシル活性磁気免疫ビード(Dynal Inc.,Great Neck,NY)に付加する。２２℃で２４時間インキュベーションした後、ビードを収集し、広範囲に亘り洗浄する。免疫磁気ビードを利用することは必須ではない。なぜなら他の方法でも満足のいく結果が得られるからである。例えば、本発明のタンパク質もポリスチレン製ビード、または培養容器の表面で固定されるかもしれない。
【００５５】
Ｂ７−２ＶＩｇなどのタンパク質は、アビジンまたはストレプトアビジン−ビオチン複合体を介し、固体相の表面に結合させることも可能である。この特殊な実施例では、まず最初に、可溶性タンパク質がビオチンと架橋結合を形成し、その後アビジンまたはストレプトアビジン分子が結合している固体相の表面と反応する。タンパク質とアビジンまたはタンパク質とストレプトアビジンとの間で架橋結合を作り、これらをビオチン分子で覆われた固体相の表面と反応させることも可能である。
【００５６】
本発明のこれらの側面やその他の側面については、以下の小区分で詳述する。
【００５７】
Ｉ． 細胞系からの核酸の分離 
新規のＢリンパ球抗原の活性を備えたぺプチドを符号化する核酸を分離するのに使用される適切な細胞には、Ｂリンパ球抗原（例えばＢ７−１、Ｂ７−２及びＢ７−３など）の符号を指定するｍＲＮＡを生成し、このｍＲＮＡを対応するタンパク質に適切に翻訳する能力の有る細胞が含まれる。ｍＲＮＡの取得源の一つは、通常のヒト脾Ｂ細胞で、これは抗免疫グロブリン抗体または抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体による処理によって活性化しているものでも、休止しているものでも良く、新生Ｂ細胞の部分集合からのものでも良い。ヒトＢ７−２抗原の発現は、促進後にｍＲＮＡレベルが休止時のレベルの４倍になるので、休止Ｂ細胞からも、活性化Ｂ細胞からも検出できる。全細胞ＲＮＡは、休止Ｂ細胞からも、活性化Ｂ細胞からも通常の技法を用いてこれらの間隔で得ることが出来、ｃＤＮＡライブラリの構築に使用できる。
【００５８】
更に、新生Ｂ細胞の様々な部分集合が、Ｂ７−２及びＢ７−３を発現するかもしれない。又は、ｃＤＮＡライブラリの構築に使用できるｍＲＮＡの取得源（ソース）として利用できる。例えば、非ホジキンリンパ腫患者から分離した腫瘍細胞は、Ｂ７−１ｍＲＮＡを発現する。結節型貧分化リンパ腫Ｂ細胞（ＮＰＤＬ）
は、大細胞リンパ腫（ＬＣＬ）を拡散させる。バーキットリンパ腫細胞系も、ヒトＢ７−１ｍＲＮＡの好適なソースであり、Ｂ７−２とＢ７−３ｍＲＮＡの好適なソースとなりえるかも知れない。骨髄腫は、一般的にＢ７−２を発現するが、Ｂ７−１ｍＲＮＡは発現しない。よってこれは、Ｂ７−２ｍＲＮＡのソースとなりえる。バーキットリンパ腫細胞系ラージは、Ｂリンパ球抗原ｍＲＮＡのソースである。Ｂ７−２ｍＲＮＡは、休止通常のヒトＢ細胞及び活性化した通常のヒトＢ細胞の両方の個体群から得るのが好ましい。活性化したＢ細胞は、例えば抗免疫グロブリン抗体又は抗ＭＣＨクラスＩＩ抗体を用いて、短時間又は長時間（例えば数分から数日）にわたる促進（刺激）作用によって得ることができる。
【００５９】
ＩＩ． ｍＲＮＡの分離及びｃＤＮＡライブラリの構築 
全細胞ｍＲＮＡは、例えばChirgwin等(Biochemistry 18,5294-5299(1979))のグアニジニウム・チオシアネート抽出手法を用いて、様々な方法で分離できる。
この技法によれば、ポリ（Ａ+）ｍＲＮＡが作成され、オリゴ（ｄＴ）セルロース選択を用いてｃＤＮＡライブラリの構築用に精製される。ｃＤＮＡは、その後、ポリ（Ａ+）ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）プライミング及びＡＭＶ逆転写酵素を用いて合成される。単一クローンＭＬＶ逆転写酵素(メリーランド州BethesdaのMDGibco/BRLから入手可能)または逆転写酵素(フロリダ州St．PetersburgのSikagaku America,Inc.から入手可能)が好適に使用できる。
【００６０】
逆転写に続いて、ｍＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子は、公知の技術を用いて二重線状ＤＮＡに変換され、適当なベクターに組み入れられる。本実施例の実験は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ及びリボヌクレアーゼＨを、二重線状ｃＤＮＡに変換するのに用いる。
【００６１】
ｃＤＮＡをクローニングするのは、二重線状ＤＮＡを適当なベクターに結合する数々の公知技法の何れかで可能である。合成アダプターの使用が、とりわけ好適である。その理由は、これがクローニングの前にｃＤＮＡの制限酵素からの分割を緩和するからである。この方法を用いて、非自己補完キナーゼアダプターが、べクターとの結紮前にＤＮＡに加えられる。ほとんど全てのアダプターが使用できる。以下の実例に更に詳しく述べるように、非自己補完ＢｓｔＸＩアダプターは、クローニング用に、ＢｓｔＸＩとの消化によるクローニング用に作成されたｐＤＣＭ８べクターへの結紮用にｃＤＮＡに加えれられる。
【００６２】
真核生物のｃＤＮＡは、適切な真核生物のプロモータ及び複製元や、エンハンサー、スプライス受容体、及び／又はドナー配列及びポリＡ信号を含むその他の要素を提供するベクター中のセンスオリエンテーション中に置くと発現される。
本発明のｃＤＮＡは、真核生物のプロモータ、大腸菌中で作用する複製元、ＣＯＳ細胞中での成長を可能にするＳＶ４０複製元およびｃＤＮＡ挿入部位を含む適切なベクター中に置かれる。適切なべクターは、πＨ３(Seed and Aruffo,Proc.Natl.Acad.Sci.,84:3365-3369(1987))πＨ３ｍ(Aruffo and Seed,Proc.Natl.Acad.Sci.,84:8573-8577(1987))及びｐＣＤＭ７とｐＣＤＭ８(Seed,Nature,329:840-841(1987))を含み、ｐＣＤＭ８ベクターがとりわけ好適である（カリフォルニア州サンディエゴ所在のInvitrogenから入手可能）。
【００６３】
ＩＩＩ． 宿主細胞のトランスフェクション及び新規のＢリンパ球活性抗原の選別 
こうして作成されたｃＤＮＡライブラリは、発現クローニング技法を使って対象となる遺伝子をクローンするために用いられる。基本的な発現クローニング技法は、SeedとAruffoによって発表されているが(Proc.Natl.Acad.Sci.,84:3365-3369(1987)及びProc.Natl.Acad.Sci.,84:8573-8577(1987))、この技法に改良を加えることが必要になるかもしれない。
【００６４】
一実施例によれば、プラスミドＤＮＡは、公知のトランスフェクション技法によってサルＣＯＳ細胞系に導入され(Gluzman,Cell 23:175(1981))、複製し、ｃＤＮＡ挿入を発現する。Ｂ７−１抗原を発現する移入物(transfectants)は、抗Ｂ７−１単一クローン系抗体（例えば１３３及びＢ１．１）及び抗マウスＩｇＧ及びＩｇＭ塗布免疫磁気ビードによって欠失される。ヒトＢ７−２抗原を発現する移入物は、その移入物を融合タンパク質ＣＴＬＡ４Ｉｇ及びＣＤ２８Ｉｇと反応させ、その後抗ヒトＩｇ抗体を塗布したプレートでパニングして、明確に選択できる。ここで説明する実例では、ヒトＣＴＬＡ４Ｉｇ及びＣＤ２８Ｉｇ融合タンパク質が用いられたが、Ｂ７−１と、例えばマウスＢ７−１との種間反応性を考慮すれば、他の種間反応性種と反応するその他の融合タンパク質も使用できる可能性が有る。パニング後に、エピソームＤＮＡがパニングされた細胞から回収され、反応能をもつバクテリア宿主（好適には大腸菌）に形質変換される。プラスミドＤＮＡは、最終的にはＣＯＳに再導入され、発現及びパニングのサイクルは、少なくとも２回繰り返される。最終サイクルの後で、プラスミドＤＮＡが、個別コロニーから作成され、ＣＯＳ細胞にトランスフェクションされ、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ及びＣＤ２８Ｉｇとの間接免疫螢光を用いて新規のＢリンパ球抗原の発現があるか分析される。
【００６５】
ＩＶ． 新規のＢリンパ球抗原の配列化 
プラスミドが、ＣＴＬＡ４Ｉｇ及び／又はＣＤ２８Ｉｇと強く反応するクローンから作成される。これらのプラスミドは、その後に配列化(sequencing)される。１．０ｋｂ以上のＤＮＡ路を配列するのに適した公知技法であれば、何でも使用できる。
【００６６】
実例４に説明したように、９８７のヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレーム及び３’非符号化配列と約２７のヌクレオチドとの１，１２０の塩基対の挿入を含んだヒトＢ７−２クローン（クローン２９）が、得られた（図８Ａ−Ｃ、配列同定番号第１番）。このタンパク質のオープンリーディングフレームによって符号化された予測アミノ酸配列は、図８Ａ−Ｃのヌクレオチド配列の下に示されている。符号化されたヒトＢ７−２タンパク質は、長さにして３２９のアミノ酸残基である（配列同定番号第２番）。このタンパク質配列は、その他のタイプＩＩｇ上科膜タンパク質に共通した多くの特徴を持っている。タンパク質翻訳は、この領域におけるコンセンサス真核生物の翻訳誘導部位とのＤＮＡ相同（同族）関係に基づいて、メチオニンコンドン（ＡＴＧ、ヌクレオチド１０７乃至１０９）から開始されることが予測される(Kozak,M.(1987)Nucl.Acids Res.15:8125-8148を参照のこと)。Ｂ７−２タンパク質のアミノ末端（アミノ酸１乃至２３）は、２３位置にあるアラニンと２４位置にあるアラニンとの間に予測分割の有る分泌信号ぺプチドの特性を備える(von Heijne(1987)Nucl.Acids Res.14:4683)。この部位における処理は、約３４ｋＤａの未改質分子量を持つ３０６のアミノ酸のＢ７−２膜結合タンパク質を生成するであろう。このタンパク質は、アミノ酸残基おおむね２４乃至２４５のほぼ細胞外Ｉｇ上科Ｖ及びＣ様のドメインと、アミノ酸残基おおむね２４６乃至２６８の疎水性の膜内外ドメインと、アミノ酸残基おおむね２６９乃至３２９の長細胞形質ドメインと、から成るはずである。このＩｇ上科にたいする相同（同族）関係は、４０乃至１１０位置及び１５７乃至２１８位置のシステインに結合された細胞外領域内の２つの隣接のＩｇ様のドメインによるものである。また、この細胞外ドメインは、８つの潜在的にＮ結合されたグリコシル部位を含み、Ｂ７−１のように恐らくグリコシル化されている。
ヒトＢ７−２タンパク質のグリコシル化は、分子量を約５０から７０ｋＤａまで増加させるかもしれない。ヒトＢ７−２の細胞形質のドメインは、Ｂ７−１よりやや長いが、多システインの共通領域と、それに続く抗原提供細胞内で信号送信又は調整ドメインとして作用すると想定される正電荷したアミノ酸を含む。ヒトＢ７−２のヌクレオチドとアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋ及びＥＭＢＬデータベースと比較してみると、ヒトＢ７−１とのかなりの相同関係があることが分かる（約２６％のアミノ酸配列同一性）。ヒトＢ７−１、ヒトＢ７−２、及びマウスＢ７−１は、全てヒトＣＴＬＡ４及びＣＤ２８に結合するので、この相同アミノ酸は恐らくはＣＴＬＡ４及びＣＤ２８結合配列を形成するのに必要となるものを表すのであろう。ヒトＢ７−２（クローン２９）を符号化するｃＤＮＡ挿入を含むベクターでトランスフェクションされたＥ．コリは、受諾番号６９３５７で、１９９３年８月１８日付けで米国代表菌株培養収集（ＡＴＣＣ）に保管された。
【００６７】
Ｖ． その他の哺乳類種からの新規のＢリンパ球抗原のクローン化 
本発明は、ヒトの核酸分子に限るものではなく、Ｂリンパ球抗原を発現するその他の哺乳類種に由来するＢリンパ球抗原同族体が、ここで述べる技術を用いてクローン化でき、配列できることも含む。種間反応性を備えた例えばヒトなどのＢリンパ球抗原を用いて、異なる種（例えばマウス）におけるＴ細胞媒介免疫反応を改良することができるかもしれない。ある種から別の種へのｃＤＮＡクローンの分離も、ヒトＢ７−２ｃＤＮＡのようなヒトｃＤＮＡ挿入を用いて実行できる。
【００６８】
実例６に記載されているように、９２７のヌクレオチドの単一の長オープンリーディングフレーム及び３’非符号化配列の約１２６のヌクレオチドとの１，１６３の塩基対の挿入を含んだマウスＢ７−２クローン（ｍＢ７−２、クローン４）
が、得られた（図１４Ａ−Ｄ、配列同定番号第２２番）。このタンパク質のオープンリーディングフレームによって符号化された予測アミノ酸配列は、図１４Ａ−Ｄのヌクレオチド配列の下に示されている。符号化されたマウスＢ７−２タンパク質は、長さにして３０９のアミノ酸残基である（配列同定番号第２３番）。このタンパク質配列は、その他のタイプＩＩｇ上科膜タンパク質に共通した多くの特徴を持っている。タンパク質翻訳は、この領域におけるコンセンサス真核生物の翻訳誘導部位とのＤＮＡ相同関係に基づいて、メチオニンコンドン（ＡＴＧ、ヌクレオチド１１１乃至１１３）から開始されることが予測される（Kozak,M.(1987)Nucl.Acids Res.15:8125-8148を参照のこと）。Ｂ７−２タンパク質のアミノ末端（アミノ酸１乃至２３）は、２３位置のアラニンと２４位置のバリンとの間に予測分割の有る分泌信号ペプチドの特性を備える(von Heijne(1987)Nucl.Acids Res.14:4683)。この部位における処理は、約３２ｋＤａの未改質分子量を持つ２８６のマウスＢ７−２膜結合タンパク質を生成するであろう。このタンパク質は、アミノ酸残基おおむね２４乃至２４６のほぼ細胞外Ｉｇ上科Ｖ及びＣ様のドメインと、アミノ酸残基おおむね２４７乃至２６５の疎水性の膜内外ドメインと、アミノ酸残基おおむね２６６乃至３０９の長細胞形質ドメインと、から成るはずである。このＩｇ上科にたいする相同関係は、４０乃至１１０位置及び１５７乃至２１６位置のシステインに結合された細胞外領域内の２つの隣接のＩｇ様のドメインによるものである。また、この細胞外ドメインは、９つの潜在的にＮ結合されたグリコシル部位を含み、マウスＢ７−１のように恐らくグリコシル化されている。マウスＢ７−２タンパク質のグリコシル化は、分子量を約５０から７０ｋＤａまで増加させるかもしれない。マウスＢ７−２の細胞形質のドメインは、システインと、抗原提供細胞信号送信又は調整ドメインとして作用すると想定される正電荷したアミノ酸を含む（システインに続く）共通領域と、を含む。マウスＢ７−２のヌクレオチドとアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋ及びＥＭＢＬデータベースと比較してみると、ヒト及びマウスＢ７−１とのかなりの相同関係があることが分かる（約２６％のアミノ酸配列同一性）。マウスＢ７−２には、ヒト同族体ｈＢ７−２に対して約５０％の同一性及び約６７％の類似性を持つ。マウスＢ７−２（クローン４）を符号化するｃＤＮＡ挿入を含むベクター（プラスミドｐｍＢｘ４）とトランスフェクションされたＥ．コリ（ＤＨ１０６／ｐ３）は、受諾番号６９３８８で、１９９３年８月１８日付けで米国代表菌株培養収集（ＡＴＣＣ）に保管された。
【００６９】
マウスＢ７−２の様な他の種に由来する新規のＢリンパ球抗原を符号化する核酸は、遺伝子導入動物を生成するか、治療に有用な試薬の開発と選別に役立つ動物を「打ち負かす」のに使用できる。遺伝子導入動物（例えばマウス）とは、導入遺伝子(transgene)を含む細胞を持つ動物で、この導入遺伝子はその動物か、出生前に（例えば胎段階で）その動物に導入されたものである。導入遺伝子とは、遺伝子導入動物が発達するもととなる細胞のゲノムに統合されたＤＮＡである。一実施例では、Ｂ７−２ｃＤＮＡまたはその適切な配列が、確立された技術及びＢ７−２タンパク質を発現する細胞を含む遺伝子導入動物を生成するのに使用されるゲノム配列を用いて、ゲノムのＢ７−２をクローン化するのに使用できる。とりわけマウスのような遺伝子導入動物を生成するのに使用される方法は、この分野においては公知となっており、例えば米国特許番号第４，７３６，８６６号及び４，８７０，００９号に開示されている。一般的には、ある細胞が組織特定エンハンサーとともにＢ７−２導入遺伝子を統合する対象となる。統合によって、Ｔ細胞の相互促進と、Ｔ細胞の増殖の増大及び自己免疫に至る。胎段階で胚系に導入されたＢ７−２導入遺伝子の複写を含む遺伝子導入動物は、増大したＢ７発現の効果を検査するのに使用できる。こうした動物は、例えば自己免疫疾患からの防御を提供すると考えられる新薬のテスト動物として使用できる。本発明のこの側面によれば、動物にこの新薬を投与し、その導入遺伝子を持つ未投与の動物と比較してその疾患の発生が減れば、この疾患にたいする治療的介入の可能性を表すことになろう。
【００７０】
別の方法としては、Ｂ７−２の非ヒト同族体を用いて、内因性のＢ７−２遺伝子とその動物の胚細胞に導入された変更ゲノムＢ７−２ＤＮＡとの相同組換によって欠陥又は変更されたＢ７−２遺伝子を備えたＢ７−２「打ち負かし」動物を構築することもできる。例えば、マウスＢ７−２ｃＤＮＡを使って、ゲノムＢ７−２ＤＮＡを確立された方法でクローンとして発生させる（クローン化する）こともできる。ゲノムＢ７−２ＤＮＡの一部（例えば、細胞外ドメインを符号化するエキソンのような）を欠失させたり、例えば統合を観察するのに使用できる選択可能な標識などを符号化する他の遺伝子と取り替えことができる。一般的には、数キロベースの変更されていない側面を守るＤＮＡ（５’及び３’端に位置するもの）がこのベクターに含まれる（相同組換えベクターに関してはThomas,K.R.及びCapcchi,M.R.の(1987)Cell 51:503を参照のこと）。このベクターは、胎幹細胞系に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入される。そして、導入されたＤＮＡが内因性のＤＮＡと相同組換えした細胞が、選択される（例えば、Li,E.et al.(1992)Cell 69:915を参照のこと）。選択された細胞は、ここで凝集キメラを形成するため例えばマウスのような動物の胚盤胞に注入される(Brad1y,A.in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practica1Approach,E.J.Robertson,ed.(IRL,Oxford,1987) pp.113-152を参照のこと)。キメラの胚はその後、適当な偽妊娠メス養育動物に移植され、その胚は「打ち負かし」動物を生成するために一定期間育成される。生殖細胞の中に相同に組換えられたＤＮＡを持つ子孫は、通常の技法で発見でき、全ての細胞がこの相同に組換えられたＤＮＡを持つ動物を繁殖するのに用いることができる。「打ち負かし」動物の特徴には、移植片を受け入れたり、腫瘍を拒絶したり、感染病に耐える能力があり、こうした動物は、基本的な免疫生物学の研究に用いることができる。
【００７１】
ＶＩ． Ｂリンパ球抗原の発現 
新規のＢリンパ球抗原の活性を備えたペプチドを発現するようにトランスフェクションされた宿主細胞も、本発明の範囲に入る。この宿主細胞は、真核生物細胞または原核細胞ならどんな細胞でもよい。例えば、Ｂリンパ球抗原の活性を備えたペプチドは、Ｅ．コリ等のバクテリア細胞、昆虫の細胞（バキュロウィルス）、イースト、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）やＮＳＯ細胞などの哺乳類細胞中に発現してもよい。その他の宿主細胞が、Geoddel(1990)、同上に記載されており、当業者には公知である。
【００７２】
例えば、哺乳類や、昆虫や、イーストなどの真核生物の細胞の中の発現は、完全な又は部分的なグリコシル化及び／又は組換えタンパク質の関連した鎖間ジスルフィド架橋又は鎖内ジスルフィド架橋の形成に至る可能性が有る。イースト(S.cerivisae)内の発現の例としては、ｐＹｅｐＳｅｃｌ(Baldari.et al.,(1987)Embo J.6:229-234)や、ｐＭＦａ(Kurjan and Hersokowitz,(1982)Cel130:933-943)や、ｐＪＲＹ８８(Shultz et al.,(1987)Gene 54:113-123)や、ｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation,San Diego,CA)などが有る。培養された昆虫の細胞（ＳＦ９細胞）内のタンパク質の発現で入手可能なバキュロウィルスのベクターは、ｐＡｃシリーズ(Smith et al.,(1983)Mol.Cell Biol.3:2156-2165)や、ｐＶＬシリーズ(Lucklow,V.A.,and Summers,M.D.,(1989) Virology170:21-39)などがある。一般的に、哺乳類細胞内での過渡的増幅／発現に関しては、ＣＯＳ細胞(Gluzman,Cell 23:175-182(1981)が、ｐＣＤＭ８(Seed,B.,(1987)Nature 329:840)の様なベクターと共に使用される。一方、哺乳類細胞内での安定した増幅／発現に関しては、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−チャイニーズハムスター卵巣）細胞がｐＭＴ２ＰＣ(kaufman et al.,(1987),EMBO J./6:187-195)の様なベクターと共に使用される。組換えタンパク質生成用の好適な細胞系は、ＥＣＡＣＣ(カタログ番号８５１１０５０３番)から入手可能で、Galfre,G.及びMilstein,C.((1981) Methods In Enzymology 73:(13):3-46;Preparation of MonoclonalAntibodies:Strategies and Procedures,Academic Press, N.Y., N.Y.)によって説明されているＮＳＯ骨髄腫細胞系である。ベクターＤＮＡは、第三燐酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションなどの公知技術で哺乳類細胞内に導入可能である。宿主細胞を形質変換するのに適した方法は、Sambrook等のMolecular Cloning:A Laboratory Manual,“nd Edition,Cold Spring HarborLaboratory press(1989)やその他の実験室文献に記載されている。哺乳類細胞内で使用する際は、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルス性物質によって提供される。例えば、通常使用されるプロモータは、ポリオーマ、アデノウィルス２、サイトメガロウイルスや、最も頻繁にはシミアンウイルス４０に由来する。
【００７３】
一般的には、細胞のほんの一部分（約１／１０5）がＤＮＡを、自身のゲノムに統合することが知られている。一般的には、これらの成分を特定するためには、一般的には、選択可能な標識（つまり、抗生物質に対する耐性）を持つ遺伝子が、対象となる遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好適な選択可能な標識には、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、メトトレキセートなどの薬剤に対する耐性を付与するものを含む。選択可能な標識は、対象となる遺伝子と同じプラスミド上に導入されてもよいし、異なったプラスミド上に導入されてもよい。対象となる遺伝子を備えた細胞は、薬剤選択によって特定できる。つまり、選択可能な標識を持つ遺伝子を組み込んだ細胞は生き残るが、残りの細胞は死んでしまう。生き残った細胞は、Ｂ細胞抗原（例えば、ＣＴＬＡ４ＩｇやＤＣ２８Ｉｇなど）に対するリガンドでの細胞表面着色によって、Ｂリンパ球抗原の生産用に分離することができる。その他の方法としては、このタンパク質は、標識を付けたアミノ酸で代謝的に放射性同位元素を使って識別することもできる。更に、このタンパク質は、抗Ｂリンパ球抗原単クローン抗体又はＣＴＬＡ４ＩｇやＤＣ２８Ｉｇなどの融合タンパク質を使って細胞上澄みから免疫沈下(immunopreipitate)させてもよい。
【００７４】
原核生物内の発現は、非融合又は融合タンパク質の発現を指示する構成性又は誘導プロモータを持つベクターを含むＥ．コリの中でしばしば行われる。融合ベクターは、発現された目標遺伝子のアミノ末端のアミノ酸の数を増加させる。こうした融合ベクターには、一般的に次の３つの機能が有る。１）組換えタンパク質の発現を増加する。２）目標となる組換えタンパク質の可溶性を増加する。３）親和性精製においてリガンドとして作用することによって目標となる組換えタンパク質の精製を助ける。しばしば融合発現ベクターにおいては、たんぱく分解性の分割部位が、融合部分と目標組換えタンパク質の接合部に導入される。これで融合タンパク質の精製に続いて、目標組換えタンパク質を融合部分から分離できる。こうした酵素、そして同源の認識配列(cognate recognition sequence)には、因子Ｘａ、トロンビン、エンテロキナーゼ、などが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、マルトースＥ結合タンパク質、又はタンパク質Ａを目標組換えタンパク質に融合するｐＧＥＸ(Amrad Corp.,Melborune,Australia)、ｐＭＡＬ(New England Biolabs,Beverly,MA)及びｐＲＩＴ５(Pharmacia,Piscataway,NJ)、などがある。
【００７５】
大腸菌発現系には、誘導発現ベクタ−ｐＴｒｃ(Amann et al.,(1988)Gene69:301-315)及びpＥＴ１１(Studier et al.,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press,San Diego,California(1990)60-89:Novagenから入手可能)が含まれる。ｐＴｒｃベクター系においては、挿入された遺伝子は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモータからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写によってｐｅｌＢ信号配列で発現される。誘導後、組換え遺伝子はぺリプラズミック留分から精製できる。ｐＥＴ１１ベクター系においては目標遺伝子は、共発現ウイルス性のＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）によって媒介されたＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ０融合プロモータからの転写によって非融合タンパク質として発現される。このウイルス性ポリメラーゼは宿主大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって、ｌａｃＵＶ５プロモータの転写制御下でレジデントλプロファージから供給される。この系においては、組換えタンパク質は、変性した形状の封入小体から精製できる。そして、所望なら、変性剤を取り除くために段階的勾配透析によって復元してもよい。
【００７６】
大腸菌中の組換えＢ７−２発現を最大化する一つの戦略は、組換えタンパク質をたんぱく分解的に分割する能力に欠陥の有る宿主バクテリア中のタンパク質を発現することである(Gottesman,S.,Gene Expression Technology:Methods inEnzymology 185,Academic Press,San Diego,California(1990)119-128)。別の戦略は、発現ベクターに挿入されるＢ７−２遺伝子又は他のＤＮＡの核酸配列を変更して、各アミノ酸の個別コンドンが高度に発現した大腸菌タンパク質内で優先的に利用されるものに成るようにすることである(Wada et al.,(1992)Nuvc.Acids Res.20:2111-2118)。本発明の核酸配列のこうした変更は、標準的なＤＮＡ分析技術で実行できる。
【００７７】
新規のＢリンパ球抗原及びその部分は、哺乳類細胞などで発現され、硫安沈殿、分別柱クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、ゲル濾過、電気泳動、親和性クロマトグラフィなど）、最終的には結晶化などの本技術分野の標準的手順に従って精製されうる（"Enzyme Purification and Related Techniques",Methods inEnzymology,22:233-577(1971)を参照のこと）。部分的であれ、均一になるまでであれ一旦精製されると、組換え生成されたＢリンパ球抗原及びその部分は、ここに詳しく記載したように薬学的投与に適した組成物として利用できる。
【００７８】
ＶＩＩ． 本発明の核酸及び核酸配列の改質及びＢ７リンパ球抗原活性のアッセイ 
当業者には、新規のＢ７リンパ球抗原の活性を備えたペプチドを符号化する他の核酸を上述の工程を用いて分離できることが理解できるはずである。異なった細胞系が、塩基の異なった配列を持つＤＮＡ分子を提供することが予期される。
更に、遺伝的多形または遺伝子物質の細胞媒介改質（Ｆ／Ｒ）によって幾つもの変形が存在することもある。更には、Ｂ７リンパ球抗原のＤＮＡ配列は、変形したアミノ酸配列を持つタンパク質やペプチドを精製するように遺伝子技術によって改質できる。こうした配列は、本発明の範囲に入るものである。本発明では、発現ペプチドは、活性化Ｔ細胞に媒介された免疫反応及び免疫反応を誘導したり、抑制できる。
【００７９】
多数の工程を用いて分離ＤＮＡ配列の同等物又は断片を生成できる。Ｂ７−２タンパク質を符号化する核酸の小さいサブ領域や断片（例えば１乃至３０塩基の長さ）は、標準的な合成有機化学手段を使って作成できる。この技術は、Ｂ７−２ＤＮＡのより大きな断片の生成に使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド及びプライマーを作成するのにも役に立つ。
【００８０】
Ｂリンパ球抗原を符号化する遺伝子のより大きなサブ領域や断片は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＲＣ)(Sambrook,Fritsch and Maniatis,2 Molecular Cloning;A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989))を用いてＤＮＡの関連した片を合成したり、こうして得られたＤＮＡを適切な表現ベクターに結紮することにより、ペプチドとして発現できる。ＰＲＣを用いて、クローンされた二重鎖状ＤＮＡの特定の配列を、生成し、発現ベクターにクローンし、ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８結合活性に関してアッセイできる。例えば、ＰＲＣを用いて、分泌された（可溶性の）形態のヒトＢ７−２タンパク質を発現するには、このタンパク質の膜内外及び細胞形質の領域を符号化しないＤＮＡが合成される。このＤＮＡ分子は、適切な発現ベクターに結紮でき、ＣＨＯ等のような宿主細胞の中に導入できる。この宿主細胞の中では、Ｂ７−２タンパク質断片が合成され、分泌される。
すると、Ｂ７−２タンパク質断片は培養媒体から直に得られる。
【００８１】
別の実施例では、簡単な欠失や挿入、系統的欠失、塩基クラスターの挿入、単−塩基の置換などＢ７リンパ球抗原のＤＮＡの変形や改修同等物を生成する多数の方法の何れかを用いて、ＤＮＡに突然変異が導入される。例えば、図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第１番）に示したヒトＢ７−２ｃＤＮＡの配列や、図１４Ａ−Ｄ（配列同定番号第２３番）に示したマウスＢ７−２ｃＤＮＡの配列におけるアミノ酸置換や欠失のような変更は、部位命令型の突然変異原によって引き起こされるのが好ましい。部位命令型の突然変異系は、当業者には良く知られたものである。AmerchamInternational PLC,Amersion,U.K.からプロトコルや試薬は入手できる。
【００８２】
例えば、シトキン生成、及び／又は第１活性信号を受けたＴ細胞によるＴ細胞増殖によって示されているような、Ｂリンパ球抗原の本来のリガンドをＴ細胞上で結合したり、Ｔ細胞媒介免疫反応を促進（増幅）するか、抑制（阻止）したりする能力などの新規のＢリンパ球抗原の活性を持つペプチドも本発明の範囲に入る。より詳しくは、Ｔリンパ球、例えばＣＤ２８＋細胞など、に結合するペプチドは、相互促進信号をＴリンパ球に伝達する能力が有るかもしれない。これは、抗原及びクラスＩＩＭＨＣ又は第１信号をＴ細胞に送信する能力の有るその他の物質の存在下に送信されると、Ｔ細胞内のシトキン遺伝子の活性化を引き起こす。又は、こうしたペプチドは、クラスＩＭＨＣと共に使用して、ＣＤ２８＋細胞溶解Ｔ細胞を活性化させることもできる。更には、Ｂ７−２タンパク質の可溶性の単一遺伝子性の形が、その本来のリガンドをＣＤ２８f細胞上で結合する能力を保持するかもしれないが、このリガンドとの架橋が不完全なため、シトキン生成及び細胞分裂増大に不可欠な第２信号を伝達できないでかもしれない。こうしたペプチドは、細胞中にアネルギーまたは許容状態を誘発する手段を提供するが、本発明の範囲に入るものである。
【００８３】
ここで説明した特徴的なＢリンパ球抗原活性を保持したペプチドを得るためペプチドを選別するには、幾つかのアッセイの内の１つ以上を用いる。例えば、このペプチドは、細胞表面Ｂ７−２または融合タンパク質（例えばＣＴＬＡ４ＩｇやＣＤ２８Ｉｇ）と反応する抗Ｂ７−２単クローン抗体を持つ特定の反応性に関して、選別できる。具体的には、ＣＯＳ細胞などの適切な細胞を、ペプチドを符号化するＢ７−２ＤＮＡでトランスインフェクションして、その後に間接免疫蛍光及び流動細胞光度測定法によって細胞表面表現型について分析して、このペプチドがＢ７−２活性を備えているか判定する。トランスインフェクションされた細胞の細胞表面発現は、細胞表面Ｂ７−２又はＣＴＬＡ４ＩｇやＣＤ２８Ｉｇ融合タンパク質と特に反応性の高い単クローン抗体を用いて測定できる。Ｂ７−２の分泌形態の生成は、抗Ｂ７−２単クローン抗体又はＣＴＬＡ４ＩｇやＣＤ２８Ｉｇ融合タンパク質を用いて測定できる。
【００８４】
他の、更に好適なアッセイでは、Ｂ７−２抗原の機能的性質を利用する。上述したように、シトキンを合成するＴ細胞の能力は、単に抗原Ｔ細胞レセプターの占有や架橋（例えば、「活性化Ｔ細胞」を生成する抗ＣＤ３やホルボールエステルによって提供される「第１活性化信号」）に左右されるのでなく、この場合はＢリンパ球抗原（例えばＢ７−２、Ｂ７−１、又はＢ７−３）との相互作用による相互促進信号の誘導にも左右される。Ｂ７−２の本来のリガンドの例えばＣＤ２８＋Ｔ細胞上での結合は、シトキン（とりわけインターロイキン２）の拡大生成を誘発し、その結果Ｔリンパ球の増殖を促進する信号をＴ細胞に伝達する効果がある。Ｂ７−２の機能の他のアッセイは、例えばインターロイキン２、インターロイキン４、又はそれ以外の未知及び公知の新規シトキン等のシトキンの合成のアッセイ、及び／又は第１活性化信号を受取ったＣＤ２８＋Ｔ細胞によるＴ細胞の増殖のアッセイが有る。
【００８５】
試験管内では、Ｔ細胞には、抗Ｔ３単クローン抗体（例えば、抗ＣＤ３）又はホルボールエステル、または更に好適にはクラスＩＩＭＨＣに関連した抗原によって、第１活性化信号を与えることができる。第１活性化信号を受取ったＴ細胞は、ここでは活性化Ｔ細胞と称する。Ｂ７−２の機能のアッセイを行なうには、Ｂ７−２のソース（例えば、Ｂ７−２の活性を持つペプチドを発現する細胞又はＢ７−２の分泌形態）及びクラスＩＩＭＨＣに関連した抗原のような第１活性化信号を、Ｔ細胞培養に加えて、さらにインターロイキン２、ガンマインターフェロン、又はその他の未知及び公知のシトキンに関して培養上澄みをアッセイする。例えばProc,Natl,Acad.Scim USA,86:1333(1989)に記載されているような、インターロイキン２に関する公知のアッセイの何れも採用できる。また、この文献の関連した部分は、言及してここに編入したものとする。インターフェロンの生成を確かめるアッセイキットは、マサチューセッツ州ケンブリッジのGenzymeCorporationから入手できる。Ｔ細胞増殖は、以下の実例に説明した方法で測定することも可能である。ここで説明したＢ７−２抗原の特性を維持するペプチドによって、Ｔ細胞によってＩＬ−２の様なシトキンの一細胞当たりの生成が増化するかもしれない。さらにこのペプチドによって、相互促進信号が欠けたネガティブ制御に比べて、Ｔ細胞の増殖増大がもたらされるかもしれない。
【００８６】
同じ基本的な機能アッセイを用いて、Ｂ７−２の活性を持つが、相互促進信号
を伝達する能力に欠けるペプチドの選別ができるかもしれない。しかし、こうしたペプチドの場合は、Ｂ７−２タンパク質を付与しても、Ｔ細胞による増殖又はシトキン分泌の目立った増加には至らない。こうしたタンパク質が通常のＢ７−２相互促進信号を抑制したり、完全に遮断したり、或はアネルギー状態を誘発する能力は、細胞表面Ｂ７−２を発現し、抗原を提供する抗原提供細胞を備えたＴ細胞に対する促進の次の試みによって判定できる。ＩＬ−２合成及びＴ細胞増殖で判別できるように、仮にＴ細胞が次の活性化の試みに反応しなければ、アネルギー状態が誘発されたことになる。本発明によるアッセイの基礎として使えるアッセイシステムに関しては、Gimmi,C.D.等の(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,6586-6590及びShwartzの(1990)Science,248,1349-1356を参照のこと。
【００８７】
可溶性を増したり、治療的または予防的効果、または安定性（例えば生体外の保存期間及び生体内でのたんぱく分解性の低下）などの目的で、新規のＢリンパ球抗原の活性を持つペプチドの構造を改質することは可能である。このように改質されたペプチドは、ここに定義されたＢリンパ球抗原と機能的に同等であると考えられる。例えば、Ｂ７−２の活性を持つペプチドは、Ｔ細胞増殖を相互促進及び／又はシトキンを生成する能力を維持するように改質できる。Ｔ細胞上でＣＴＬＡ４／ＣＤ２８レセプターと相互作用を行なうのに不可欠なこれら残基は、不可欠なアミノ酸を、その存在がレセプター相互作用を高めたり、完全に無くしたり影響を与えないが減少させる他の残基で、好適には類似の残基、（保守的置換）と置換することで改修（改質）できる。更に、レセプター相互作用に不可欠でないアミノ酸残基は、組み入れることによって反応性を高めたり、完全に無くしたり、影響を与えないが、減少させる他の残基と置換することで改質できる。
【００８８】
新規のＢリンパ球抗原の活性を持つペプチドを改質する他の例は、ジスルフィドの漏れによる二量化を最小限にするために、シトキン残基を好適にはアラニン、セリン、スレオニン、ロイシン、又はグルタミン酸残基と置換することである。又、Ｂリンパ球抗原の活性を持つペプチドのアミノ酸側鎖を、化学的に改質できる。更に、別の改質は、ペプチドの環化である。
安定性及び／又は反応性を高めるには、Ｂ７−２の活性を持つペプチドを改質して、自然対立遺伝子の変種に起因する抗原のアミノ酸配列中に１つ以上の多形を組み入れることができる。Ｄアミノ酸、本来のものでないアミノ酸、又は非アミノ酸類似体を置換したり、加えて、本発明の範囲に入る改質タンパク質を作成できる。更にこのペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて、A.Sehonと同僚(Wie et al.同上)による方法で改質して、ＰＥＧと共役したペプチドを生成できる。更にＰＥＧは、このペプチドの化学合成中に付加できる。このペプチドのその他の変更型には、還元／アルキル化(Tarr in:Methods of ProteinMicrocharacterization,J.E.Silver ed.,Humana Press,Clifton NJ 155-194(1986))、アシル化(Tarr、上述)、適切なキャリアへの化学結合(Mishell andShiigi,eds,Selected Methods in Cellular Immunology,WH Feeman,SanFrancisco,CA(1980)、米国特許番号第４，９３９，２３９、又は薄いフォルマリン処理(Marsh(1971),Intl.Arch.of Allergy and Appl.Immunol.41:199-215)などがある。
【００８９】
精製を容易にし、ペプチドの潜在的な可溶性を高めるために、アミノ酸融合部分をタンパク質幹に加えることができる。例えば、ヘキサヒスチジンをペプチドに加えて、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィによって精製できる(Hochuli.E.et al.,(1988)Bio/Technology 6:1321-1235)。更に、無関係な配列の無いＢリンパ球抗原の分離を促進するため、特定のエンドプロテーゼ分割部位を、融合部分及びこのペプチドの間に導入できる。官能基をペプチドに加えたり、またはペプチドの疎水性領域を取り除くことにより、ペプチドの可溶性を増加する必要が有るかもしれない。
【００９０】
ＶＩＩ． Ｂリンパ球抗原を符号化する核酸配列及びＢ７−２の活性を持つペプチド
Ａ． 分子探査 
本発明の核酸は、生物サンプル中のＢリンパ球の活性化状態を測定することにより、病気の進行を追跡したり、Ｂリンパ球抗原の発現にたいする分子の影響（例えば、細胞のｍＲＮＡレベルを検出する）をアッセイできるので診察にも有効である。これらの診察に関するアッセイによれば、核酸配列を検出可能な標識（例えば、放射性、蛍光、生チニレート化標識など）でラベリングし、通常のドットブロット又はノーザン雑種形成手法を用いて、生物サンプルから全てのまたはポリ（Ａ+）ＲＮＡのｍＲＮＡ分子を探査できる。
【００９１】
Ｂ． 抗体生成 
本発明の核酸分子から生成されたペプチド及び融合タンパク質は、Ｂリンパ球抗原と特に反応する抗体を生産するのにも使用できる。例えば、Ｂ７−２タンパク質の全長、又はＢ７−２タンパク質のペプチド断片を使うことにより、これらはＢ７−２の予測アミノ酸配列に基づいたアミノ酸配列を持っているので、抗タンパク質／抗ペプチド多クローン性抗血清または単クローン抗体を、標準的な方法を用いて作ることができる。哺乳類（例えば、マウス、ハムスター、又はラビット）は、この動物の中に抗体反応を導き出す免疫抗原性形のタンパク質またはペプチドで免疫化することができる。このイムノゲンは、例えば組換えＢ７−２タンパク質又はその断片、合成ペプチド断片、又はその表面にＢリンパ球抗原を発現する細胞で良い。この細胞は、その表面にＢリンパ球抗原が発現されるように、例えば、脾Ｂ細胞または本発明のＢリンパ球抗原を符号化する核酸でトランスフェクションされた細胞（例えば、Ｂ７−２ｃＤＮＡ）で良い。このイムノゲンは、その免疫抗原性を増強するために改質してもよい。例えば、免疫抗原性をペプチドに与える技術には、キャリアへの結合などのこの分野で公知のものが有る。例えば、このペプチドは、アジュバントの存在下で投与してもよい。免疫化の過程は、プラズマ又は血清中の抗体滴定量の検出で観察できる。標準的ＥＬＳＩＡ又は他の免疫アッセイを、抗体のレベルを推定するために、抗原としてのイムノゲンと共に使用できる。
【００９２】
免疫化に引き続いて、抗血清と、所望なら血清から分離した多クローン抗体を得ることができる。単クローン抗体を得るには、細胞（リンパ球）を生産する抗体を、免疫化された動物から取り出して、標準的体細胞融合技術を用いて骨髄腫細胞に融合させ、これらの細胞に永遠性を与え、ハイブリドーマ細胞をえる。こうした技術は、この分野で良く知られたものである。例えば、元々KohlerとMilstein(Nature(1975)256:495-497)によって開発されたハイブリドーマ技術や、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbar et al.,Immunol.Today(1983)4:72)等のその他の技術や、ヒト単クローン抗体を生成するＥＢＶハイブリドーマ技術(Cole et al.Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy(1985))(Allen R.Bliss,Inc.,pages 77-96)や、組合せ抗体ライブラリィの選別(Huse et al.,Science(1989)246:1275)等がある。ハイブリドーマ細胞は免疫化学的に選別して、分離されたペプチドと単クローン抗体に対してとりわけ反応性の高い抗体を得ることができる。
【００９３】
「抗体」という用語は、ここでは新規のＢリンパ球抗原の活性を持つペプチドととりわけ反応性が高いか、ここで述べた融合タンパク質ととりわけ反応性が高い抗体の断片も含むものとする。抗体は通常の方法で分裂させ、その断片は抗体全体に関して上述されたものと同じ用途で選別できる。例えば、Ｆ（ａｂ’）2断片は、抗体をペプシンで処理して生成できる。生成されたＦ（ａｂ’）2断片を処理して、ジスルフィドブリッジを減少させ、Ｆａｂ’断片を生成できる。本発明の抗体は、抗Ｂリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−２、Ｂ７−３）部分を持つ両固有(bispecific)かつキメラの分子を含むものとする。
【００９４】
特に好適な抗体は、ハイブリドーマＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７、及びＨＦ２．３Ｄ１によって生成されるヒト単クローン抗体である。これらの抗体の作成と特性決定は、実例８に細述されている。単クローン抗体ＨＡ３．１Ｆ９は、ＩｇＧ１アイソタイプであると判定された。単クローン抗体ＨＡ５．２Ｂ７は、ＩｇＧ２ｂアイソタイプであると判定された。単クローン抗体ＨＦ２．３Ｄ１は、ＩｇＧ２ａアイソタイプであると判定された。これらのハイブリドーマ細胞は、ＡＴＣＣ受諾番号：ＨＢ１１６８６（ＨＦ２．３Ｄ１）、ＡＴＣＣ受諾番号：ＨＢ１１６８７（ＨＡ５．２Ｂ７）、ＡＴＣＣ受諾番号:ＨＢ１１６８８（ＨＡ３．１Ｆ９）で、１９９４年７月１４日付けでブダペスト条約の要件を満たした米国代表菌株培養収集に保管されている。
【００９５】
ヒト以外の被験対象内で生成された抗体がヒトに治療目的で使用される際は、度合は異なるが異物として認識され、患者の中で免疫反応が引き起こされるかもしれない。一般的な免疫抑制よりも好ましいこの問題を解決するか軽減する一つの方法は、キメラ抗体誘導体（例えば、ヒト以外の動物の可変部とヒトの不変部を組み合わせた抗体分子）を生成することである。キメラ抗体分子には、例えばマウス、ラット等からの抗体とヒトの不変部を結合した抗原がある。キメラ抗体を作成する様々な方法がこれまでに開示され、本発明の新規のＢリンパ球抗原の遺伝子生産物を認識する免疫グロブリン可変部を含むキメラ抗体を作成するのに使われている。例えば、Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851(1985);Takeda et al.,Nature 314:452(1985),Cabi1ly et al.,米国特許第４，８１６，５６７号、Boss et al.,米国特許第４，８１６，３９７号;Tanaguchiet al.,欧州特許公報ＥＰ１７１４９６号、欧州特許公報ＥＰ０１７３４９４、英国特許ＧＢ２１７７０９６号などを参照のこと。こうしたキメラ抗体は、対応する非キメラ抗体よりも、人間の患者内部で免疫抗原性が低いことが予想される。
【００９６】
人間の治療目的では、ここで説明されているＢリンパ球抗原の活性を持つペプチドととくに反応性が高い単クローン性またはキメラ抗体は、ヒト可変部キメラを作成して更に人間化することができる。ヒト可変部キメラ内では、可変部（とりわけ抗原結合ドメインの保存された骨組み領域）はヒトから由来するもので、超可変部のみがヒトから由来するものでない。「人間化された」キメラ抗体に関する一般的な解説は、Morrison,S.L.(1985)Science 229:1202-1207および 0i etal.,(1986)BioTechniques 4:214に記載されている。このように変更された免疫グロブリン分子は、この分野の幾つかの公知技術(例えば、Teng et al.,Proc.Natl.Acad,Sci.U.S.A.80:7308-7312(1983);Kozbor et al.,Immunology Today,4:7279(1983);Olsseon et al.,Meth.Emzymol.,92:3-16(1982))のいずれかで作成でき、ＰＣＴ出願ＷＯ９２／０６１９３又はＥＰ０２３９４００の教示に従って作成するのが好ましい。人間化されたキメラ抗体は、例えばScotgenLimited,２ Holly Road,Twichenham,Middlesex,Great Britainによって商業生産されている。
好適な人間化された抗体は、ＥＤＲ又はＣＥＡ置換によっても作成できる(Winterの米国特許第５，２２５，５３９、Jones et al.,(1986)Nature321:552-525;Verhoeyan et al.(1988)Science 239:1534;Beidler et al.(1988)J.Immunol.141:4053-4060を参照のこと)。低い免疫抗原性を備えた人間化された抗体は、ヒト患者に免疫治療を行なうには好ましい。人間化された抗体を用いた免疫治療は、同時に免疫抑制を行なう必要性を低くするであろうし、慢性的疾患状態や繰返し抗体治療を必要とする状態での長期的効果を高めることもある。
【００９７】
マウスやその他の種から由来する単クローン抗体を人間化する代りに、ヒトタンパク質に向けられたヒト単クローン抗体を生成することもできる。ヒトＢリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−２）免疫化できる、ヒト抗体目録を持った遺伝子導入マウスが既に作られている。これらの免疫化された遺伝子導入マウスから由来する脾腎細胞(splenocytes)を使って、ヒトＢリンパ球抗原ととくに反応するヒト単クローン抗体を分泌するハイブリドーマを作成できる（Wood et al.,ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／００９０６号、Kucherlapat1 et al.ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０７４１号、Lonberg et al.ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０３９１８号、Kay et al.ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０３９１７号、Lonberg et al.(1994)Nature368:856-569:Green,L.L.(1994) Nature Genet. 7:13-21:Morrison et al.,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 81:6851-6855;Bruggeman et al.(1993)Year Immunol 7:33-40;Tuaillon et al.(1993)PNAS 90:3720-3724;Bruggeman et al.(1991)Eur J Immunol 21:1323-1326を参照のこと）。
【００９８】
本発明の単クローン抗体の組成物は、組換えＤＮＡ技術の当業者には公知の他の方法によっても作成できる。別の方法としては、「組合せ抗体表示」と称されるものがあり、特定の抗原特異性を備えた抗原断片を発見し、分離するものであり、本発明のＢリンパ球抗原を結合する単クローン抗体を生成するのに利用できる（「組合せ抗体表示」の説明に関しては、例えば、Sastry et al.(1989)PNSA86:5728;Huse et al.(1989)Science 246:1275; Orlandi et al.(1989)PNSA86:3833を参照のこと）。Ｂリンパ球抗原で動物を免疫化した後、得られたＢ細胞プールの抗体目録が、クローン化される。免疫グロブリン分子の多様な集団の可変部のＤＮＡ配列を、オリゴマープライマ及びＰＣＲの混合物を用いて直接得る方法が知られている。例えば、５’リーダー（信号ペプチド）配列及び／又は枠組み１（ＦＲ１）配列に対応する混合オリゴヌクレオチドプライマや、更に保存３’不変部プライマに対応するプライマも、幾つかのマウス抗体からのＨ鎖及びＬ鎖可変部のＰＣＲ増幅に使用できる(Larrick et al.(1991)Biotechniques11:152-156)。類似の戦略を使って、ヒト抗体から由来するヒトのＨ鎖及びＬ鎖可変部の増幅に使用できる(Larrick et al.(1991)Methods:Comparison toMethods in Enzymology 2:106-110)。
【００９９】
一実施例では、ＲＮＡが、通常のプロトコル（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、Sastry et al.(1989)PNSA 86:5728-5732:Huse et al.(1989)Science246:1275-1281;Or1andi et al.(1989)PNSA 86:3833-3837)にしたがって末梢性血液細胞、骨髄、脾臓組織標本などの活性化Ｔ細胞から分離される。第１鎖ｃＤＮＡは、Ｈ鎖とκ及びλＬ鎖の夫々の不変部に特定のプライマ及び信号配列のプライマを用いて合成される。可変部ＰＣＲプライマを用いて、Ｈ鎖とＬ鎖の可変部が、単一で又は組み合わせて増幅され、表示パッケージを生成する際に更に操作するため適切なベクターに結紮される。増幅記録で役立つオリゴヌクレオチドプライマは、独特か、変性か、変性位置のイノシンを組み入れることがある。抑制エンドヌクレアーゼ認識配列も、プライマに組み入れてもよい。これで、増幅した断片の発現ため所定のリーディングフレーム内のベクターにクローン化が可能になる。
【０１００】
免疫化から由来する抗体目録からクローン化されたＶ遺伝子ライブラリは、表示パッケージの集団によって発現し（好ましくは糸状ファージから得られたもの）、抗体表示ライブラリを形成できる。理想的には、表示パッケージは、非常に多様な抗体表示ライブラリのサンプリング、各親和性分離後の高速分類、そして生成された表示ライブラリからの抗体遺伝子の簡単な分離を可能にするシステムから成る。ファージ表示ライブラリを生成するための一般に入手可能なキット(例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System,カタログ番号２７−９４００−０１；Strategene SurfZAP（商標）ファージ表示キット、カタログ番号２４０６１２)以外に、多様な抗体表示ライブラリの生成にとりわけ適した様々な方法と試薬がある(例えば、Ladner et al.米国特許第５，２２３，４０９号、Kang et al.ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９号、Dower et al.ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７２７１号、Winter et al.ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２０７９１号、Markland et al.ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１５９７６号、Breitlinget al.ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０１２８８号、McCafferty et al.ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１０４７号、Garrard et al.ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０９６９０号、Lander et al.ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０２８０９号、Fuches et al.(1991)Bio/Technology 9:1370-1372;Hay et al.(1992)Hum AntibodHybridomas 3:81-85;Huse et al.(1989)Science 246:1275-1281;Griffths et al.(1993)EMBO J 12:725-734; Hawkins et al.(1992) J Mol Biol 226:889-896;C1ackson et al.(1991)Nature 352:624-628;Gram et al.(1992) PNAS89:3576-3580;Garrad et al.(1991)Bio/Technology 9:1373-1377;Hoogenboomet al.(1991)Nuc Acid Res 19:4133-4137;Barbas et al.(1991)PNAS88:7978-7982)。
【０１０１】
幾つかの実施例では、Ｈ鎖及びＬ鎖のＶ領域ドメインは、同じポリペプチド上で発現され、柔軟性リンカで単鎖Ｆｖ断片を形成するように結合されることもある。そしてｓｃＦＶ遺伝子は、最終的には所望の発現ベクター又はファージゲノムにクローン化される。McCafferty et al.Nature(1990)348:552-554に一般的に述べられているように、抗体の完全なＶH及びＶLドメインは、柔軟性（Ｇlｙ4−Ｓｅｒ）3リンカで結合され、抗原の親和性に基づいて、表示パッケージを分離可能にできる単鎖抗体を作成するのに用いられる。Ｂリンパ球抗原の活性を持つペプチドと免疫反応する分離ｓｃＦＶ抗体は、この方法で用いられる薬剤調合に最終的に配合される。
【０１０２】
表示パッケージ（例えば、糸状ファージ）の表面上に一旦表示されると、Ｂリンパ球抗原に特異性を持つ抗原を発現するパッケージを特定して分離するために、抗体ライブラリは、Ｂリンパ球抗原タンパク質またはその断片ペプチドで選別される。選択された抗原を符号化する核酸は、表示パッケージから（例えばファージゲノムから）回収でき、標準的な組換えＤＮＡ技術で他の発現にサブクローン化できる。
【０１０３】
本発明の抗体は、遮断レセプターを介してＴ細胞活性を抑制するために治療に使用できる（Ｔ細胞の相互促進に必要なリガンド相互作用）。これらの所謂「遮断（阻止）抗体」は、それが試験管内で相互促進アッセイに上述されたように加えられると、Ｔ細胞の増殖及び／又はシトキン生成を抑制する能力があるので、これで識別できる。Ｔ細胞の機能を抑制する遮断抗体の能力は、これらの抗体が生体内に投与された時に免疫抑制及び／又は耐性を引き起こすかもしれない。
【０１０４】
Ｃ． タンパク質精製 
Ｂ７−２活性又はＢ７−３活性を有した組換え型又は合成ペプチドに特に反応する抗体のような、本発明での多クローン性又は単クローン性の抗体も、細胞から本来のＢリンパ球抗原を分離するために用いられる。例えばペプチドに反応する抗体は、自然的発生又は生得Ｂ７−２形態を免疫親和性クロマトグラフィーにより活性Ｂリンパ球から分離するのに用いられる。加えて、Ｂ７−３の生得形態はＢ細胞から免疫親和性クロマトグラフィーにより単クローン抗体ＢＢ−１を用いて分離することができる。
【０１０５】
Ｄ． その他治療上の試薬 
ここに述べられる核酸配列と新規Ｂリンパ球抗原は、Ｔ細胞媒介免疫反応を上方調整する（例えば増幅する）か下方調整する（例えば抑制したり耐性化する）
かのいずれかの能力を備えた治療上の試薬の開発に用いることができる。例えばＢ７−２抗原の可溶性単量体形や、Ｂ７−２Ｉｇ及び第１活性信号を受け取ったＴ細胞に供促進信号を送達することができない抗Ｂ７−２抗体などのＢ７−２融合タンパク質を含むＢ７−２活性を有するペプチドは、Ｔ細胞のＢ７−２リガンドを阻止し、そのため患者の免疫抑制の原因となる及び／又は耐性を誘発する特定の方法を提供するために用いられることができる。このようなＢリンパ球抗原と融合タンパク質の阻止又は抑制形態と抗体阻止は、先にここで述べられているように試験管内で供促進アッセイに加えられたとき、Ｔ細胞増殖抑制及び／又はシトキン生成の能力により同定される。単量体形態に対し、完全な細胞表面Ｂ７−２のようなＢ７−２の促進形態は、Ｔ細胞に供促進信号を送達する能力を保持する。その結果２次信号を受け取らなかった活性Ｔ細胞と比べシトキン分泌が増加する。
【０１０６】
更に他のＢリンパ球抗原（Ｂ７−１等）の活性を有する第２ペプチドと融解したＢ７−２の活性を有する第１ペプチドを構成する融合タンパク質は、Ｔ細胞に媒介された免疫反応を改質するのに用いられる。換わりに例えばＢ７−２とＢ７−１のようなＢリンパ球抗原を有する２つの別のペプチドか、阻止抗原の結合（例えば、抗Ｂ７−２及び抗Ｂ７−１単クローン抗体）は、患者のＴ細胞媒介免疫反応を上方調整又は下方調整するために、単一構成物として結合されたり、個別に（同時か又は連続して）投与される。さらに、Ｂ７−２活性及び／又はＢ７−１活性を有した一つかそれ以上のペプチドの治療的活性量は、免疫反応に影響するように他の免疫調整試薬と結合して用いることができる。他の免疫調整試薬の例としては、ＣＤ２８かＣＴＬＡ４に対するか、その他Ｔ細胞標識かシトキンに対するような阻止抗体、ＣＴＬＡ４Ｉｇのような融合タンパク質、シクロスポリンＡかＦＫ５０６のような免疫抑制薬が含まれる。
【０１０７】
本発明の核酸分子から生成されたペプチドは、Ｔ細胞の破壊によって、Ｔ細胞機能を阻止する治療学的作用因子の構造にも利用できるかもしれない。例えば、ここで述べられているように、Ｂリンパ球抗原の分泌形は標準の遺伝子工学技術で組立てられることができる。Ｂ７−１，Ｂ７−２又はＢ７−３の可溶性形態とリシン等の毒素を結合させることにより、Ｔ細胞活性を防止する能力のある作用因子を作成することができる。患者への例えばＢ７−２リシン、Ｂ７−１リシン等の抗毒素の一つ又は組み合せの混入は、Ｔ細胞の、特にＣＤ２８とＣＴＬＡ４Ｔの高い値を発現する活性Ｔ細胞の死の起因となるかもしれない。上記に述べられるようにキャリヤー分子も使用されるような場合であれば、単量体形態のＢ７−２の可溶性形態だけでもＢ７−２機能の阻止に役立つかもしれない。
【０１０８】
Ｂリンパ球抗原機能を防止する別の方法は、アンチセンスか三重オリゴヌクレオチドの使用を通してである。例えば、Ｂ７−１，Ｂ７−２又はＢ７−３の翻訳誘導部位（例えば、Ｂ７−１にはＴＧＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡＧＡ（配列同定番号２０番）ヌクレオチド３２６−３０９、Ｂ７−２にはＧＣＣＡＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＣＣＡ（配列同定番号２１番））の周りの部分に相補的なオリゴヌクレオチドが合成される。一つ又はそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞媒体に、典型的には２００μＧ／ｍｌで加えられるか、患者にＢ７−１,Ｂ７−２又はＢ７−３合成を防止するために投与することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞によって引致され、翻訳を防止するため適切なＢリンパ球抗原ｍＲＮＡと交雑する。換わりに、ＤＮＡの巻戻しと転写を防止する三重構造を形成するための二重鎖のＤＮＡを結合するオリゴヌクレオチドを用いることができる。いずれかの結果、一つ又はそれ以上のＢリンパ球抗原の合成が阻止される。
【０１０９】
ある特定の実施例では、Ｔ細胞が患者からとられ、Ｔ細胞の個体数を増加させるため生体外で培養された。更なる実施例では、そのＴ細胞はその後患者に投与された。Ｔ細胞は、実例に詳細が述べられている通り、例えばＴ細胞に第１活性信号と供促進信号を供給することにより、試験管内で増殖する刺激を受けることができる。活性Ｔ細胞の増殖を促進するのに好適な供促進分子、例えばＴ細胞レセプターを通して促進されたＴ細胞はａｂ７−２ＶＩｇ融合タンパク質である。
しかし、Ｂ７−２Ｉｇ融合タンパク質のその他の形態もまたＴ細胞増殖を供促進するのに用いることができる。本発明のある特定の実施例では、活性Ｔ細胞がＢ７−２ＶＩｇタンパク質に供促進され、それでその活性Ｔ細胞による反応が促進される。一つの実施例では、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２９４３６で述べられる方法で、Ｂ７−２Ｉｇ又はもっと好適なＢ７−２ＶＩｇを供促進分子として使い、Ｔ細胞が生体外で培養された。供促進分子は可溶性で細胞膜組織に付着されるか、ビードのように固体表面に付着されることもできる。好適な実施例では、Ｔヘルパータイプ２（Ｔｈ２）反応が優先的に促進される。
【０１１０】
Ｅ． 免疫反応の下方調整による治療的使用 
ここに開示される新規のＢリンパ球抗原の構造と機能を前提とすれば、Ｂリンパ球抗原の機能を下方調整することが可能で、従って多くの方法で免疫反応を下方調整することが可能である。下方調整は、すでに進行中の免疫反応を抑制したり阻止したりする方法で行われるかもしれないし、免疫反応の誘発を防止することに関わるかもしれない。活性Ｔ細胞の機能はＴ細胞反応を抑制することにより又はＴ細胞の特異耐性を誘発することにより抑制されるかもしれないし、その両方かもしれない。Ｔ細胞反応の免疫抑制は一般的に活発で、非抗原特異性のプロセスであり、これはＴ細胞が抑制作用因子に継続的に接触していることが要求される。耐性はＴ細胞内の非反応性又はアネルギーを誘発することに関わり、一般的に、抗原特異である点において免疫抑制と識別され、耐性作用因子への接触後にも存続する。操作上、耐性は耐性作用因子の欠如において、特定の抗原に再接触した時に、Ｔ細胞反応の不足により立証される。
【０１１１】
一つ又はそれ以上のＢリンパ球抗原機能を下方調整又は防止すること、例えば活性Ｔ細胞による高レベルリンフォカイン合成を防止する等、は組織、皮膚、臓器移植の際と対宿主制移植片病（ＧＶＨＤ）に有用になる。例えば、Ｔ細胞機能の阻止は組織移植の際の組織破壊を減少させる結果となるはずである。典型的に組織移植では、移植物の拒否反応はＴ細胞により異物の認識を通して開始され、その後引続き移植物を破壊する免疫反応が起る。移植に先立ち、Ｂ７リンパ球抗原が免疫細胞（例えば、Ｂ７−２活性を有するペプチドの可溶性単量体形態のみ又は他のＢリンパ球抗原（例えばＢ７−１、Ｂ７−３）の活性を有するペプチドの単量体形態と共に又は阻止抗体）上での本来のリガンドとの相互作用を抑制したり阻止したりする分子の投与は、対応する供促進信号を伝達することなく免疫細胞上での本来のリガンドとその分子の結合を導く。Ｂリンパ球抗原機能をこの方法で阻止することは、Ｔ細胞のような免疫細胞によるシトキン合成を防止し、それにより免疫抑制剤として作用する。さらに供促進不足はＴ細胞のアネルギー化にも十分かもしれず、そのため患者の耐性を誘発する。Ｂリンパ球抗原阻止試薬による長期耐性の誘発により、これら阻止試薬の反復的投与の必要性が避けられるかもしれない。患者が十分な免疫抑制又は耐性を達成するため、複数のＢリンパ球抗原の機能を阻止する必要もあるかもしれない。例えば、移植に先立ちＢ７−２とＢ７−１、Ｂ７−２とＢ７−３、Ｂ７−１とＢ７−３又はＢ７−２、Ｂ７−１とＢ７−３の各活性を有したペプチドの組合せの可溶性形態、又は阻止抗体を（別々に又は一つの組成物として）投与することにより、これら抗原の機能を阻止することが望ましいかもしれない。換わりに、Ｂリンパ球抗原の抑制形態を他のＴ細胞標識に対する又はシトキンに対する阻止抗体のような他の抑制作用因子、他の融合タンパク質、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ、又は免疫抑制薬と共に用いられることができる。
【０１１２】
特定の阻止試薬の臓器移植拒否反応やＧＶＨＤを防止する効力は、ヒトの体内での効力を予想できる動物モデルを用いて評価することができる。Ｂ７−１の機能上重要な側面は種間で構造的に一定に保たれ、そのため他のＢリンパ球抗原が種を越えて機能すると考えられ、そのためヒトのタンパク質で構成された試薬を動物のシステムで使用することを可能にする。使用できる適切なシステムの例には、ラットの改良心性移植、マウスの異種汎反応生島細胞移植が含まれ、両者ともLenscho et al.,257:789-792(1992)及びTurka et al.,Proc.Natl.Sct.USA,89:11102-11105に述べられるように試験管内でＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質の免疫抑制効果を調べるのに使用されている。加えて、ＧＶＨＤのマウスモデル(Paul ed.,Fundamental Immunology,Raven Press,New York,1989,pp.846-847を参照）はその疾病の進行における生体内でのＢリンパ球抗原機能の阻止効果を測定するため使用することもできる。
【０１１３】
Ｂリンパ球抗原機能の阻止は、例えばＢ７−２活性を有するペプチドのみで、又はＢ７−１活性を有するペプチド及び／又はＢ７−３活性を有するペプチドとを組み合わせてを使用することにより、自己免疫疾患の治療にも治療学上有用かもしれない。多くの自己免疫障害は、自己組織に対して反応するＴ細胞の不適切活性の結果によるもので、それは疾病の病理学に関わるシトキンと自己抗体の生成を促進するものである。自己反応性Ｔ細胞活性を防止することは疾病の症状を減少させるか、削除するかもしれない。Ｂリンパ球抗原のレセプター：リガンド相互作用を妨害することによってＴ細胞の供促進を阻止する試薬を投与すれば、Ｔ細胞の活性を抑制し、疾病の進行に関わるかもしれない自己抗体又はＴ細胞誘発シトキンの生成を防止ことができるかもしれない。加えて、阻止試薬は疾病からの長期軽減につながる可能性のある自己反応性Ｔ細胞の抗原特異耐性を誘発するかもしれない。自己免疫障害を防止したり緩和したりする阻止試薬の効力は、ヒト自己免疫疾患の特徴が良く現れた動物モデルを多く使用して決定することができるだろう。例の中にはマウス実験自己免疫脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウス又はＮＺＢハイブリッドマウスでの組織的老壮狼そう、マウス自己免疫コラーゲン関節炎、NＮＯＤマウスとＢＢラットでの糖尿メリタス、マウスの実験的重症性筋無力症が含まれる(Paul ed.,Fundamental Immunology,Raven Press,NewYork,1989,pp.840-856を参照）。
【０１１４】
アトピー性アレルギーのＩｇＥ抗体反応は、高度にＴ細胞に依存しており、このためＢリンパ球抗原に誘発されるＴ細胞活性をの抑制が治療上アレルギーとアレルギー反応の治療に有用であるかもしれない。Ｂ７−２タンパク質の抑制形態、例えばＢ７−２活性を有するペプチドのみで、又は他のＢ７−１のような他のＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドとの組合せは、患者のＴ細胞媒介アレルギー反応を抑制するためアレルギー性の患者に投与することができる。Ｔ細胞のＢリンパ球抗原供促進の抑制は、適切なＭＨＣ分子と共にアレルゲンへの接触を伴うかもしれない。アレルギー反応は、アレルゲンの進入経路とマスト細胞又は好塩基性細胞のＩｇＥ沈着のパターン次第で、組織的又は局所的なものかもしれない。そのためＢ７−２タンパク質の抑制形態の適切な投与による局所的又は組織的なＴ細胞媒介アレルギー反応を抑制することが必要かもしれない。
【０１１５】
Ｂリンパ球抗原機能の阻止を通してのＴ細胞活性抑制は、Ｔ細胞のウイルス感染にかんして治療学上にも重要かもしれない。例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）において、ウイルスの複製はＴ細胞活性により促進される。Ｂ７−２機能の阻止はウイルス複製のレベルを低下させる事につながり、それによりＡＩＤＳの進行を改善するかもしれない。加えて、Ｂリンパ球抗原、例えばＢ７−１とＢ７−２、Ｂ７−３、の結合の機能を阻止する必要もあるかもしれない。驚くべき事に、ＨＴＬＶ−Ｉに感染したＴ細胞はＢ７−１とＢ７−２を発現する。この発現は、ＨＴＬＶ−Ｉ誘発白血病の成長に重要かもしれない。また、Ｂ７−２及び／又はＢ７−３機能とともに、Ｂ７−１機能の阻止が、ＨＴＬＶ−Ｉに感染したＴ細胞の成長を減速させるかもしれない。又、Ｔ細胞活性によるウイルス複製の促進は、Ｂ７−２タンパク質の供促進形との接触に誘発されるかもしれなく、分離と使用のために十分な量のレトロウイルス（例えば種々のＨＩＶの分離されたウイルス）の発生が目的である。
【０１１６】
Ｆ． 免疫反応の上方調整による治療的使用 
免疫反応を上方調整する手段としてのＢリンパ球抗原機能の上方調整も、治療上有用かもしれない。免疫反応の上方調整は、既存の免疫反応を高めるか又は初期免疫反応を顕在化させる形態をとるかもしれない。例えば、Ｂリンパ球抗原機能を促進することにより免疫反応を高めることは、ウイルス感染の事例に有用かもしれない。ウイルス感染は第１には、細胞融解反応性Ｔ細胞により浄化される。本発明によると、Ｂ７−２と、従ってＴ細胞上に本来のリガンドを備えるＢ７−１とＢ７−３は、少なくともあるＴ細胞の細胞融解反応性活性での増加が結果として起こるかもしれないと思われている。又Ｂ７−２、Ｂ７−１、Ｂ７−３はＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞の初期活性と生成に関わりがあると思われている。多価の形態での、供促進経路を通してのＴ細胞活性を促進するためのＢ７−２活性を有する可溶性ペプチドのみ、又は他のＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドとの組合せによる付加は、ウイルスのより急速な又は完全な浄化が有益であろう状況においては治療学上有用であるだろう。これらには、場合のヘルペスや帯状庖疹等のウイルス性皮膚疾患が含まれる。こうした場合は、Ｂ７−２活性を有する多価の可溶性ペプチド又はそのようなペプチド及び／又はＢ７−１活性を有するペプチド及び／又はＢ７−３活性を有するペプチドとの組合せが局所的に皮膚に加えられる。加えて、インフルエンザや一般の風邪、脳炎のような全体性のウイルス性疾患は、Ｂリンパ球抗原の供促進形態を規則正しく投与することにより緩和されるかもしれない。
【０１１７】
又、抗ウイルス免疫反応は感染した患者からＴ細胞をその患者から除去することにより高められるかもしれない。それは試験管内のＴ細胞を、Ｂ７−２活性を有するペプチド（それだけで又はＢ７−１活性を有するペプチド及び／又はＢ７−３活性を有するペプチドとの結合）又はＢ７−２活性を有する可溶性ペプチド（それだけで又はＢ７−１活性を有するペプチド及び／又はＢ７−３活性を有するペプチドとの結合）の供促進形態とともに発現するウイルス適用抗原ＡＰＣｓと供促進し、試験管内活性Ｔ細胞を患者に再導入することによる。抗ウイルス免疫反応を高めるその他の方法は、患者から感染細胞を分離し、それらをＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをここに述べるように符号化する核酸で細胞感染（トランスフェクト）し、その際に、細胞がその表面でＢリンパ球抗原の全て又は一部を発現（例えばＢ７−２又はＢ７−３）し、トランスフェクションされた細胞を患者に再導入するようにする。感染細胞はこれで供促進信号をＴ細胞に伝達し、従ってＴ細胞を生体内で活性化することが可能になるだろう。
【０１１８】
Ｂリンパ球抗原の供促進形態はまた、種々の病原体に対しワクチンとして予防的に使用されるかもしれない。病原体、例えばウイルス、に対する免疫は、ウイルス性タンパク質がＢ７−２活性を有するペプチド、又はＢリンパ球抗原の活性を有するその他のペプチドの供促進形態と共に適切な補助的薬剤で予防接種をすることにより誘発されるかもしれない。又は、病原性抗原とＢリンパ球抗原の活性を有するペプチド（例えばウイルス性タンパク質を符号化する核酸とここで述べられるＢ７−２活性を有するペプチドを符号化する核酸を発現するために高められたワクチンウイルス発現ベクター）の両者の遺伝子を符号化する発現ベクターは、ワクチンとして使用されることができる。例えば、Ｂ７−２活性を有するペプチドとＭＨＣクラスＩα連鎖タンパク質とβ２マイクログロブリンを相互発現するためにトランスフェクションされた細胞、によりクラスＩＭＨＣタンパク質を伴うＢ７−２を与えると、細胞融解反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性の原因となり、ウイルス性感染からの免疫を提供するかもしれない。そのワクチンが有用かもしれない病原体は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エプスタイン−バーウイルス（Ｅ−Ｂウイルス）、巨細胞ウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、結核、マラリア、住血吸虫症を含む。
【０１１９】
その他の応用例として、Ｂリンパ球抗原機能の上方調整又は増強は腫瘍免疫の誘発に有用かもしれない。Ｂリンパ球抗原活性を有する少なくとも一つのペプチド、例えばＢ７−２、を符号化する核酸でトランスフェクションされた腫瘍細胞（例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経芽細胞腫、癌腫）は患者の腫瘍特異性耐性を克服するために患者に投与されることができる。所望ならば、腫瘍細胞は多くのＢリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１やＢ７−２、Ｂ７−３）の活性を有するペプチドの組合せを発現するのにトランスフェクションできる。例えば、患者から取った腫瘍細胞は、Ｂ７−２活性を有するペプチドのみか、又はＢ７−１活性及び／又はＢ７−３活性を有するペプチドとの組合せの発現を命令する発現ベクターで生体外でトランスフェクションできる。トランスフェクションされた腫瘍細胞は患者に戻され、結果としてトランスフェクションされた細胞の表面でペプチドの発現がおこる。又は、遺伝子治療技術を生体内でトランスフェクションのために腫瘍細胞を目標にするのに使用されることができる。
【０１２０】
腫瘍細胞表面のＢリンパ球抗原活性を有するぺプチドの存在は、Ｔ細胞への必要な供促進信号を提供してトランスフェクションされた腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介免疫反応を誘発する。加えて、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスII分子を欠くか又は、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスII分子の十分な量を発現することが出来ない腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩα連鎖タンパク質とβ２マイクログロブリンタンパク質、又はＭＨＣクラスIIα連鎖タンパク質とＭＨＣクラスIIβ連鎖タンパク質の全て又は一部（例えば細胞質ドメイン斜切頭部）を符号化する核酸とトランスフェクションすることができ、その結果として細胞表面でＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスIIタンパク質を発現する。Ｂリンパ球抗原活性を有するペプチド（例えばＢ７−１やＢ−２、Ｂ７−３）と関連した適切なクラスＩ又はクラスIIＭＨＣの発現は、トランスフェクションされた腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介免疫反応を誘発する。任意に、ＭＨＣクラスIIに連結したタンパク質、例えば不変連鎖、の発現を阻止するアンチセンスの構成を符号化する遺伝子は、Ｂリンパ球抗原活性を有するペプチドを符号化するＤＮＡとのも供トランスフェクションして、腫瘍連結抗原の存在を促進し腫瘍特異免疫を誘発することができる。Ｂ７ネガティブマウス腫瘍細胞によるＢ７−１の発現は、マウス内で腫瘍拒否反応と腫瘍からの攻撃への増殖保護を伴うＴ細胞媒介特異免疫を誘発することが示されてきている(Chen,L.et al.,（1992）Cell 71，1093-1102; Townsend,S.E.；Allison，J.P.（1993）Science 259，368-370: Basker，S．et al．（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．90，5687-5690)。そのためヒト患者内のＴ細胞媒介免疫反応の誘発は、患者の腫瘍特異耐性を克服するに十分かもしれない。
【０１２１】
その他の側面では、Ｂリンパ球抗原活性を有する可溶性ペプチドの一つ又はそれ以上の供促進形態は、抗腫瘍免疫を誘発するためにＴ細胞への供促進信号を提供するため、腫瘍保持患者へ投与することができる。
【０１２２】
Ｇ．Ｂリンパ球抗原の治療用形態による投与 
本発明によるペプチドは、Ｔ細胞の媒介する免疫反応を高める又は抑えるべく、生体内における薬剤投与に生物学的適合性のある形態で患者に投与されるものである。「生体内投与にとって生物学的に適合性のある形態」とは、投与しようとするタンパク質の持つ治療効果が、その毒性効果よりも価値が大きいような形態を言う。患者という表現は、例えば哺乳類など、免疫反応を引き起こすことのできるあらゆる生物組織を含むものとして意図されている。患者の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びこれらの遺伝子導入種が含まれる。ここで述べるような新規のＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドの投与は、治療上有効量のペプチドを単体で、又は、別のＢリンパ球の活性を有するペプチドと治療上容認可能な担体と組み合わせて投与する形態を含む、いかなる薬理学的形態における投与であってもよい。本発明による治療用組成物の治療上有効量の投与とは、投薬量において、かつ、所望の成果を得るのに必要な時間有効である量として定義されるものである。例えば、Ｂ２−７活性を有するペプチドの治療上の有効量は、疾患の状態、年齢、性別、及び個人の体重といった因子や、その個人において所望の反応を引き出すペプチドの能力といった因子によっても異なるであろう。投薬状態を、最適な治療反応が得られるよう調整してもよい。例えば、治療状態の緊急性から判明した場合には、一日数回に分けて投薬しても、あるいは投薬量を比率的に減らしてもよい。
【０１２３】
有効化合物（例えばペプチド）は、例えば注射（皮下、静脈、等々）経口投与、吸入、経皮適用、又は直腸内適用など、都合に合った方法で投与してもよい。
投与の経路に応じては、酵素による作用、酸による作用等、有効化合物を不活性化しかねない条件からその化合物を保護する材料で有効化合物に被膜を施してもよい。Ｂ７−２活性を有するペプチドを非経口投与以外の方法で投与するには、ペプチドの不活性化を防止するような材料でペプチドを被膜するか、又はそのような材料と共にペプチドを投与しなければならないこともあろう。例えば、Ｂ７−２活性を有するペプチドを、個人に対して、適した担体、希釈剤又は補助剤中で投与したり、酵素抑制物質と一緒に投与したり、リポソーム等の適した担体中で投与してもよい。薬学上容認可能な希釈剤には、生理食塩水及び水性緩衝液が含まれる。補助剤とはここでは広い意味で用いられており、インターフェロンなどの免疫促進化合物が含まれる。ここで考えられる補助剤には、レゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテル等の非イオン界面活性剤、及びｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルが含まれる。酵素抑制物質には、膵臓トリプシン抑制物質、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＥＰ）及びトラジロールが含まれる。リポソームには、水中油中水型乳剤並びに通常のリポソームが含まれる（Strejanet al．（1984）J．Neuroimmunol7:27）。
【０１２４】
さらに有効化合物を非経口的又は腹腔内投与してもよい。分散系はグリセロール、液体ポリエチレングリコール及びこれらの混合物を用いて調剤しても、又は油脂中に作成してもよい。通常の保管及び使用条件下では、これらの調剤に保存剤を含有させて微生物の成長を抑えてもよい。
【０１２５】
注射可能な使用法に適した薬学的組成物には、無菌水性溶液（可溶性の場合）
又は分散剤、あるいは、無菌の注射可能な溶液又は分散系用の即時調合のための無菌粉末が含まれる。いずれの場合も、組成物は無菌でなければならず、また注射器による適用が容易となる程度の流動性を有していなければならない。製造及び保管条件において安定しており、バクテリア及びカビ類等の微生物の汚染作用から守られていなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、等々）、及びこれらの適した混合物等を含有した溶媒又は分散媒であってもよい。適した流動性は、例えば、レシチン等の被膜を用いたり、分散系の場合には必要とされる粒子の大きさを維持したり、界面活性剤を用いるなどして維持することができる。微生物の活性の抑制は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、等々の多種の抗菌及び抗カビ物質により達成することができる。多くの場合、例えば砂糖、マンニトール等の多価アルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどの等張性物質を組成物中に含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の吸収時間を長くするには、組成物中に吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等を含めることで行うことができる。
【０１２６】
無菌の注射可能な溶液は、必要な量の有効化合物（例えばＢ７−２活性を有するペプチド）を、必要な場合は上に羅列した成分の一つ又は組合せと共に適した溶媒中に加えた後にフィルタ滅菌処理することで作成することができる。一般的には、分散系は、基本的な分散媒と、上に羅列したもののうち必要なその他の成分とを含んだ無菌賦形剤に有効化合物を加えることで作成される。無菌の注射可能な溶液を作成するための無菌粉末に関しては、好適な作成方法は真空乾燥法及び凍結乾燥法であり、この方法により、有効成分（ペプチド）に所望の成分が加わった粉末が、予め無菌フィルタ処理したこれらの溶液から生じる。
【０１２７】
有効化合物を上述のように適切に保護すれば、本タンパク質を、例えば不活性の希釈剤又は同化性の食用担体と共に経口投与してもよい。ここで言う「薬学上容認可能な担体」には、いかなる溶媒、分散媒、被膜剤、抗菌及び抗カビ物質、等張性及び吸収遅延物質、等々が含まれる。薬学上有効な物質のためのこのような媒体及び物質の使用法は当業において公知である。通常の媒体又は物質が本有効化合物に対して不適合である場合を除き、治療用組成物へのその使用は考察されている。補助的な有効化合物を組成物に加えることも可能である。
【０１２８】
投与を容易とするため、また用量を均一とするために、非経口用組成物を用量単位形態で作成すると特に有利である。ここで言う用量単位形態とは、処置を施す対象となる哺乳類の患者への一回分の用量として適切な物理的に個別の単位であって、各単位が、所用の薬学的担体と関連して所望の治療効果を生じるよう計算された所定量の有効化合物を含有するものを言う。本発明の用量単位形態の詳細は、（ａ）本化合物特有の特徴と達成しようとする特定の治療効果と、（ｂ）
個人の感受性の治療のためのこのような有効化合物を合成する技術に内在する限界とから明らかになるものであり、これらに応じたものである。
【０１２９】
Ｈ． 相互促進により誘導されたシトキンの同定 
ここで述べられた新規のＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドを符号化する核酸の配列を用いて、Ｂリンパ球抗原の一形態、例えばＢ７−２による刺激に反応してＴ細胞の生じたシトキンを同定することができる。次善の候補として、ホルボールエステル、抗ＣＤ３抗体、又は、好ましくは、ＭＨＣクラスIIの分子と結合した抗原等の第１次活性化信号等により、Ｔ細胞を試験管内で刺激することができ、さらに、例えばＢ７−２活性を有するペプチドを符号化すると共にそのペプチドを表面上で発現する核酸により形質移入した細胞によるもの等、Ｂ７−２抗原の促進形態による相互促進信号、又は可溶性の促進形態のペプチドによる相互促進信号を与えられる。媒体中に解放された公知のシトキンは、ＥＬＩＳＡ検定で同定したり、又は、シトキンを阻害することで、シトキンの誘導するＴ細胞の増殖又はその他の細胞種の増殖を抑える抗体の能力により同定することができる。ＩＬ−４ＥＬＩＳＡ検定器具は、ＩＬ−７阻害抗体と同様、Genzyme社（Cambridge，MA）から入手できる。ＩＬ−９及びＩＬ−１２に対する阻害抗体はGenetics Institute社（Cambridge，MA）から入手可能である。
【０１３０】
上述の試験管内Ｔ細胞相互促進検定は、相互促進により誘導されたと考えられる新規のシトキンを同定する方法にも用いることができる。相互促進により誘導された特定の活性、例えばＴ細胞の増殖を公知のシトキンに対する阻害抗体を加えることで阻害できない場合、その活性は未知のシトキンの作用から生じたと考えられる。相互促進に続いて、このシトキンを媒体から従来の方法により精製し、その活性を、Ｔ細胞の増殖を誘導するその能力により測定することができるであろう。
【０１３１】
耐性の誘導を妨げるシトキンを同定するために、上述の試験官外Ｔ細胞相互促進検定を用いることができる。この場合、Ｔ細胞には第１次活性化信号を与え、所定のシトキンに接触させるが、相互促進信号は与えないこととなろう。洗浄後にＴ細胞を休止させた後、この細胞に第１次活性化信号及び相互促進信号の両方を与えることとなろう。Ｔ細胞が反応しない（例えば増殖する又はＩＬ−２を生じる）場合、これらは耐性化され、シトキンが耐性の誘導を妨げなかったこととなる。しかしＴ細胞が反応すれば、耐性の誘導がシトキンにより妨げられたこととなる。耐性の誘導を妨げることのできるこのようなシトキンを、より効率的な手段としてＢリンパ球抗原を阻害する試薬と関連させて生体内での阻害の標的とすれば、自己免疫疾患を持つ移植レシピエント又は患者の耐性を誘導することができる。例えば、Ｂ７−２阻害試薬をシトキン阻害抗体と共に対象に投与することが可能であろう。
【０１３２】
Ｉ．相互促進を阻害する分子の同定 
本発明による新規なＢリンパ球抗原（Ｂ７−２及びＢ７−３）の活性を有するペプチドのもう一つの用法は、これらのペプチドの一つ又は複数を、相互促進後の相互促進リガンド結合の阻害物質、及び／又は、Ｔ細胞の細胞内信号伝達を阻害する物質である未知の分子を発見しようとするスクリーニング検定に使用することである。例えば、Ｂ７−２等のＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドを用いた固相結合検定を利用して、この抗原が適したＴ細胞リガンド（例えばＣＴＬＡ４、ＣＤ２８）と結合することを阻害する分子を同定することができよう。更に、上述の試験管内Ｔ細胞相互促進検定を用いると、相互促進後のＴ細胞内の細胞内信号伝達に干渉する分子を、これらの分子の、Ｔ細胞の増殖及び／又はシトキンの生成を阻害する（しかしＢリンパ球抗原がそのレセプターに結合することは妨げない）能力から決定することで同定することができると考えられる。例えば、化合物シクロスポリンＡは、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路を介してではなくＴ細胞のレセプター経路を介した刺激を通じて、Ｔ細胞の活性化を阻害する。従って、相互促進には異なる細胞内信号伝達経路が関係している。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路を介して細胞内信号伝達経路に干渉する分子は、生体内における免疫抑制物質として効果的であろう（シクロスポリンＡの効果と同様）。
【０１３３】
Ｊ．Ｂリンパ球抗原の発現を調節する分子の同定 
本発明によるタンパク質及びペプチドを用いて生じさせた単クローン抗体を、細胞上でのＢリンパ球抗原の発現を調節する分子のスクリーニング検定に用いることができる。例えば、Ｂ７−２、Ｂ７−３等のＢリンパ球抗原の誘導を引き起こす細胞内信号伝達を行う分子を、細胞表面上での一つ又は複数のＢリンパ球抗原の発現を検定することで同定することができる。分子があるときに抗Ｂ７−２抗体による免疫蛍光の着色が減じていれば、その分子が細胞内信号伝達を阻害したこととなろう。Ｂリンパ球抗原の発現を上方調節する分子では、免疫蛍光の着色が増加することとなる。あるいは、Ｂ７−２等のＢリンパ球抗原の発現に対する分子の作用を、Ｂ７−２ｃＤＮＡを探触子として用いて細胞のＢ７−２ｍＲＮＡのレベルを検出することで調べることができる。例えば、Ｂ７−２の活性を有するペプチドを発現する細胞を、調べようとする分子に接触させて、その細胞内のＢ７−２ｍＲＮＡのレベルの増加又は減少を、例えばノーザン交雑分析法や、検出可能な標識で標識付けしたＢ７−２ｃＤＮＡ探触子を用いた、ｍＲＮＡ又は全ポリ（Ａ+）ＲＮＡの通常のドットブロット法により検出することができる。
Ｂリンパ球抗原の発現を調節する分子は、免疫反応のみを上方調節又は下方調節する上で、あるいは可溶性の阻害又は刺激試薬と関連させて調節する際に、治療上有用であろう。例えば、免疫抑制を目的としてＢ７−２の発現を阻害する分子をＢ７−２阻害試薬と共に投与することもできよう。上述の検定で調べることのできる分子には、ＩＬ−４等のシトキン、γＩＮＦ、ＩＬ−１０，ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ及びプロスタグランジンが含まれる。
【０１３４】
本発明は以下の例により更に示されるが、この例は限定的なものとして捉えられてはならない。本出願を通じて引用された引例及び発行済の特許の内容はすべて、参考文献としてここに編入されたものである。
【０１３５】
以下の方法を例１、２及び３で用いた。
（方法及び材料）
Ａ．細胞 
単核細胞を、フィコール−ハイパック比重遠心法によりヒトの脾臓の単個細胞懸濁液から分離して、ヤギの赤血球でロゼットすることでＥ−及びＥ＋断片に分けた（Boyd，A.W.，et al．（1985）J．Immunol．134，1516）。単球をプラスチックに密着させ、単クローン抗体、抗ＣＤ−４、−ＣＤ８、−ＣＤ１１ｂ、−ＣＤ１４、及び−ＣＤ１６を用いた、抗ＭｓＩｇＧ及び抗ＭｓＩｇＭで被膜した磁気ビード（Advanced Magnetics社，Cambridge，MA）による二回の処理により、残りのＴ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）及び残りの単球を除去することで、Ｅ−断片からＢ細胞を精製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＮＫ、Ｂ細胞及び残りの単球をプラスチックヘ密着させて磁気ビード及び単一クローン性の抗体、抗−ＣＤ２０、−ＣＤ１１ｂ、−ＣＤ８及び−ＣＤ１６を用いて除去することで同じ脾臓のＥ+断片から分離した。ＣＤ２８＋Ｔ細胞も同様に、抗−ＣＤ２０、−ＣＤｌｌｂ、−ＣＤ１４及び−ＣＤ１６の単クローン抗体を用いてＥ+断片から分離した。精製の効率を、間接的免疫蛍光法及びＥＰＩＣＳフローサイトメータ（Coulter社）を用いたフローサイトメトリにより分析した。Ｂ細胞の精製は、＞９５％ＣＤ２０＋、＜２％ＣＤ３＋、＜１％ＣＤ１４＋であった。ＣＤ４＋Ｔ細胞の精製は、＞９８％ＣＤ３＋、＞９８％ＣＤ４＋、＜１％ＣＤ８＋、＜１％ＣＤ２０＋、＜１％ＣＤ１４＋であった。ＣＤ２８＋Ｔ細胞の精製は、＞９８％ＣＤ３＋、＞９８％ＣＤ２８＋、＜１％ＣＤ２０＋、＜１％ＣＤ１４＋であった。
【０１３６】
Ｂ．単クローン抗体及び融合タンパク質 
特にそうでないと示す場合を除き、単クローン抗体を精製Ｉｇとして用いた。
抗Ｂ７：１３３、ＩｇＭは阻害性の抗体であり、既に説かれて（Freedman,A.S.eta.（1987）Immunol.137,3260-3267）おり、抗Ｂ７:Ｂ１．１ＩｇＧ１（RepliGenCorp.,Cambridge,MA）（Nickoloff,B.,et al(1993)Am.J.Pathol.142.1029-1040）は非阻害性の単クローン抗体であり、ＢＢ−１：ＩｇＭは阻害性の抗体であり（Dr.E.Clark,University of Washington,Seatt1e,WA）（Yokochi,t.,et al.（1982）J.Immunol.128,823-827）、抗ＣＤ２０：Ｂ１、ＩｇＧ２ａ（Stashenko,P.,etal.（1980）J.Immunol.125,1678-1685）、抗Ｂ５：ＩｇＭ（Freedman,A.,etal.（1985）J．Immunol．134,2228-2235）、抗ＣＤ８：７ＰＴ３Ｆ９、ＩｇＧ２ａ、抗−ＣＤ４：１９Ｔｈｙ５Ｄ７、ＩｇＧ２ａ、抗ＣＤ１１ｂ：Ｍｏl、ＩｇＭ及び抗ＣＤ１４：Ｍｏ２、ＩｇＭ（Todd,R.,et al.（1981）J.Immunol.126,1435-1442)、抗ＭＨＣクラスII：９−４９、ＩｇＧ２ａ（Dr.R.Todd,Universityof Michigan,Ann Arbor）（Todd.R.I.,et al.（1984）IIum Immunol，10,23-40；
抗ＣＤ２８：９．３,ＩｇＧ２ａ（Dr.C.June,Naval Research Institute,Bethesda）（Hansen,J.A.，et al.（1980）Immunogenetics，10,247-260）；抗ＣＤ１６：３Ｇ８，ＩｇＧ１（腹水として用いる）（Dr.J.Ritz,Dana-FarberCancer Institute, Boston）；抗ＣＤ３：ＯＫＴ３,ＩｇＧ２ａハイブリドーマを米国代表菌株培養収集から得て、精製された単一クローン性の抗体を、濃度１μｇ／ｍｌでプラスチック板に密着させ、メーカーの指示に基づき（Pierce社Rockford，IL）、パパイン分解及びタンパク質Ａカラム上の精製により、抗ＣＤ２８Ｆａｂ断片を９．３単クローン抗体から生じさせた。ヒトＣＴＬＡ４融合タンパク質（ＣＴＬＡ４Ｉｇ）及び対照融合タンパク質（対照Ｉｇ）を前述のように作成した（Gimmi，C.D..，et al．（1993）Proc．Natl．Acad．Sci USA90:6586-6590）；Boussiotis，V.，et al．J．Exp．Med．（公開容認済））。
【０１３７】
Ｃ．ＣＨＯ細胞の形質移入 
Ｂ７−１トランスフェクタント（ＣＨＯ−Ｂ７）をＢ７−１ネガティブチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞系から作成し、パラホルムアルデヒドで固定し、前述のように用いた（Gimmi，C.D..，et al．Proc．Natl．Acad．Sci USA88,6575-6579）。
【０１３８】
Ｄ． 試験管内Ｂ細胞活性化及びＢ７＋及びＢ７−細胞の選別 
脾臓Ｂ細胞を、組織培養フラスコ内の完全培地｛１０％の加熱不活性化したウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及び硫酸ゲンタマイシン（５μｇ／ｍｌ）を含んだＲＰＭＩ１６４０｝で２×１０６細胞／ｍｌで培養し、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ７Ｏ２ビード(Bio-Rad社)Richmond,CAに結合させた親和性精製ウサギ抗ヒトＩｇＭとのｓＩｇの架橋結合により（Boyd，A.W.，et al.（1985）J．Immunol．134,1516）、又は、Ａｆｆｉ−Ｇｅ１７０２ビードに結合した９−４９抗体とのＭＨＣクラスIIの架橋結合により、活性化させた。７２時間活性化させたＢ細胞を、活性化したＢ細胞集団全体として用いるか、又は、抗Ｂ７（Ｂ１．１）単クローン抗体、及び、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識付けしたヤギ抗マウス免疫グロブリン（Fisher，Pittsburgh，PA）で間接的に着色して、フローサイトメトリによる細胞分類（EPICS Elite flow cytometer，Coulter）によりＢ７−１＋及びＢ−７−１集団に分けた。
【０１３９】
Ｅ． 免疫蛍光及びフローサイトメトリ− 
表面表現型分析のために、ｓＩｇ又はＭＨＣクラスIIのいずれかとの架橋結合により６、１２、２４、４８、７２及び９６時間活性化したＢ細胞集団を、抗Ｂ７（１３３）、ＢＢ−１単クローン抗体、対照ＩｇＭ抗体、ＣＴＬＡ４Ｉｇ又は対照Ｉｇで着色した。細胞懸濁液に対して、１０μｇ／ｍｌの第１次単クローン抗体による着色及び適した第２次試薬による着色という二段階の間接的な膜着色により着色を施した。具体的には、抗Ｂ７（１３３）及びＢＢ−１単クローン抗体との免疫反応性を、ヤギ抗マウスＩｇ又は免疫グロブリンＦＩＴＣ（Fisher社）を第２次試薬として用いた間接的な着色を行うことで調べ、融合タンパク質との免疫反応性を、ビオチン処理したＣＴＬＡ４Ｉｇ又はビオチン処理した対照Ｉｇ及び、第２次試薬としてストレプタビジン−フィコエリトリンを用いて調ベた。１０％のＡＢ血清を含んだＰＢＳを希釈剤及び洗浄媒体として用いた。細胞を０．１％のパラホルムアルデヒドで固定した後、フローサイトメータ（EPICSElite Coulter）で分析した。
【０１４０】
Ｆ． 増殖検定 
Ｔ細胞を、溜め当り１×１０５細胞の濃度で９６溜めを有する底が平らな微量定量プレートで三日間、５％の二酸化炭素中で３７℃で培養した。同系の活性化したＢ細胞（Ｂ細胞全集団又はＢ７＋及びＢ７−分団）を照射（２５００ラド）
して、溜め当り１×１０5細胞の濃度で培養物に加えた。調査の対象となる因子を所用の濃度に加えて、溜め当りの最終的な全容量を２００μｌとした。特に示した場合には、Ｔ細胞を、抗ＣＤ２８Ｆａｂ（１０μｇ／ｍｌの最終濃度）と共に３０分間４℃でインキュベートし、実験用プレートに加えた。同様に、ＣＨＯ−７又はＢ細胞を、ＣＴＬＡ４Ｉｇ又は対象Ｉｇ（１０μｇ／ｍｌ）と共に３０分間４℃でインキュベートした。培養の最後１５時間は１μＣi（３７ｋＢｑ）
の｛メチル−３Ｈ｝チミジン（Du Pont，Boston，MA）と共にインキュベートして、分裂促進活性の指数としてチミジンの取込みを評価した。細胞をフィルタに回収し、乾燥したフィルタの放射活性をファーマシアベータプレート液体シンチレーション計数器で計測した。
【０１４１】
Ｇ．ＩＬ−２及びＩＬ−４検定 
培養の開始後２４時間で収集された培養上澄み液のＩＬ−２及びＩＬ−４濃度をＥＬＩＳＡ検定した（R＆D Systems，Minneapolis，MN及びBioSource,Camarillo，CA）。
【０１４２】
[例１]
Ｔ細胞の増殖を誘発する活性化Ｂ細胞上の新規なＣＴＬＡ４リガンドの発現 
架橋結合する表面Ｉｇは、ヒトの休止Ｂ細胞に、７２時間の時点でＢ７−１を最大（５０−８０％）に発現させるよう誘導するため、活性化したヒトＢリンパ球の、亜ミトゲン的に活性化したＴ細胞を増殖させてＩＬ−２を分泌させるよう誘導する能力を調べた。図１は、Ｂ７（Ｂ７−１）形質移入したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｂ７）又は、抗Ｉｇで７２時間活性化させた同系の脾臓Ｂ細胞のどちらかに対する、抗ＣＤ３単クローン抗体で亜ミトゲン的に活性化させたヒト脾臓ＣＤ２８＋Ｔ細胞の相互促進反応を示す。３Ｈ−チミジンの取込みを７２時間のうち最後の１５時間について評価した。ＩＬ−２は、２４時間の培養後上澄み液のＥＬＩＳＡ検定で評価した（検定の検出限度：３１−２０００μｇ／ｍｌ）。図１は１７の実験結果を表すものである。
【０１４３】
亜ミトゲン的に活性化したＣＤ２８＋Ｔ細胞は、ＣＨＯ−Ｂ７のもたらしたＢ７−１相互促進に反応して、増殖し、かつ高レベルのＩＬ−２を分泌した（図１、表ａ）。増殖及びＩＬ−２の分泌の両方は、抗Ｂ７−１単クローン抗体又は、親和性の高いそのレセプターである融合タンパク質、ＣＴＬＡ４によりＣＨＯ細胞上でＢ７−１分子を阻止することで完全に阻害された。同様に、増殖及びＩＬ−２の分泌は、Ｆａｂ抗ＣＤ２８単クローン抗体によりＢ７−１のＣＤ２８を介した信号伝達を阻止することで妨げられた。対照単クローン抗体又は対照融合タンパク質は何の作用も有していなかった。増殖及びＩＬ−２分泌のほとんど同一の相互促進が、抗Ｉｇで７２時間活性化した脾臓Ｂ細胞によりもたらされた（ｂ表）。抗Ｂ７−１単クローン抗体はＣＨＯ−Ｂ７のもたらす増殖及びＩＬ−２分泌を完全に妨げると考えられたが、抗Ｂ７−１単クローン抗体は、活性化したＢ細胞の誘導する増殖を一貫して僅かに５０％阻害したのみであり、一方ＩＬ−２の分泌は完全に阻害されていた。抗Ｂ７−１単クローン抗体により誘導される増幅の部分的阻止とは対照的に、ＣＴＬＡ４Ｉｇ及びＦａｂ抗ＣＤ２８単クローン抗体の両方が、増幅及びＩＬ−２の分泌を完全に阻止していた。これらの結果は、活性化したヒトＢ細胞は一つ又は複数の更なるＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドを発現し、このリガンドがＴ細胞の増幅及びＩＬ−２の分泌を誘導することができるという仮説と一致するものである。
【０１４４】
[例２]
活性化したヒト脾臓Ｂ細胞はＢ７−１とは異なるＣＴＬＡ４リガンドを発現する   上述の観察を鑑み、その他のＣＴＬＡ４結合対レセプターが活性化したＢ細胞上で発現するかどうかを調べた。この目的のために、ヒト脾臓Ｂ細胞を７２時間、抗Ｉｇで活性化させた後、Ｂ７−１の媒介する相互促進を阻害しない抗Ｂ７−１単クローン抗体（Ｂ１．１）で着色した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びｍＡｂＢ１．１をフローサイトメトリ細胞分類法に用いてＢ７−１＋及びＢ７−１−分団を分離した。その結果、分類後の陽性の集団は９９％がＢ７−１＋であり、分類後の陰性の集団は９８％がＢ７−１−であった（図２）。
【０１４５】
各集団の相互促進能力を調べるために、ヒト脾臓ＣＤ２８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３単クローン抗体を用いて、照射したＢ７−１＋又はＢ７−１−抗Ｉｇ活性化した（７２時間）脾臓Ｂ細胞のあるところで亜ミトゲン的に刺激した。３Ｈ−チミジンの取込みを７２時間の培養の最後の１５時間について評価した。ＩＬ−２については、ＥＬＩＳＡ検定により上澄み液を２４時間の培養後に評価した（検定の検出限度：３１−２０００μｇ／ｍｌ）。図３の結果は１０の実験結果を表すものである。Ｂ７−１＋Ｂ細胞は、抗ＣＤ３で活性化したＴ細胞を誘導して増殖及びＩＬ−２の分泌を行わせ（図３ａ）たが、ＩＬ−４の分泌は起きていない。分団化されていない活性化Ｂ細胞集団で観察されたように、抗Ｂ７−１単クローン抗体（１３３）は増殖を僅かに５０％阻害したが、ＩＬ−２の分泌は一貫して妨げていた。上述したように、ＣＴＬＡ４Ｉｇ結合又はＦａｂ抗ＣＤ２８単クローン抗体によるＣＤ２８の阻止の結果、増殖及びＩＬ−２分泌の両方が完全に阻害された。対照単クローン抗体及び対照Ｉｇでは阻害は見られなかった。Ｂ７＋Ｂ細胞のもたらすＢ７が媒介していない残りの増殖を説明すると思われる、ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８結合相互促進リガンドのその他のものを明らかにしようと、ＢＢ−１単クローン抗体の増殖及びＩＬ−２分泌に対する作用を調べた。見られるように、ＢＢ−１単クローン抗体は増殖及びＩＬ−２分泌の両方を完全に阻害していた（図３ａ）。図３ｂはＢ７−１で活性化したヒト脾臓Ｂ細胞の相互促進能力を示す。照射されたＢ７−１活性化（７２時間）Ｂ細胞はまた、著しい相互促進信号を亜ミトゲン的に活性化したＣＤ４＋リンパ球に送ると考えられる。この相互促進には、検出可能なＩＬ−２（図３ｂ）又はＩＬ−４の蓄積が伴っておらず、また、抗Ｂ７−１単クローン抗体は増殖を阻害していなかった。しかしながら、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｆａｂ抗ＣＤ２８単クローン抗体、及びＢＢ−１単クローン抗体は全て、増殖を完全に阻害していた。
【０１４６】
Ｂ７−１＋及びＢ７−１−活性化脾臓Ｂ細胞の表現型分析から、上記の機能的結論が裏付けられた。図４は、分団化されたＢ７−１＋及びＢ７−１−活性化Ｂ細胞上でのＢ７−１、Ｂ７−２及びＢ７−３の細胞表面発現を示すものである。
図４に見られるように、Ｂ７−１＋活性化脾臓Ｂ細胞は、抗Ｂ７−１（１３３）
単クローン抗体、ＢＢ−１単クローン抗体、及び結合したＣＴＬＡ４−Ｉｇで着色していた。対照的に、Ｂ７−活性化脾臓Ｂ細胞は抗Ｂ７−１（１３３）単クローン抗体では着色せず、ＢＢ−１単クローン抗体及びＣＴＬＡ４Ｉｇで着色していた。これらの表現型及び機能的結果は、Ｂ７−１＋及びＢ７−１−活性化（７２時間）ヒトＢリンパ球の両方がＣＴＬＡ４結合対レセプターを発現し、このレセプターは、
１）活性化Ｔ細胞を亜ミトゲン的に誘導して検出可能なＩＬ−２を分泌させることなく増殖させることができ、また
２）ＢＢ−１単クローン抗体で同定できるが抗Ｂ７−１単クローン抗体ではできない。
このように、これらのＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドは、Ｂ細胞の活性化後のこれらの一
時的な発現と、ＣＴＬＡ４Ｉｇ及び抗Ｂ７単クローン抗体とのこれらの反応性に基づいて区別することができる。図４の結果は５つの実験を示すものである。
【０１４７】
[例３]
三つの別個のＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドはヒトＢ細胞活性化後に発現する 
ＣＴＬＡ４結合対レセプターの活性化後の発現順を調べるために、ヒト脾臓Ｂ細胞を、表面Ｉｇ又はＭＨＣクラスIIのいずれかと架橋結合させることで活性化し、Ｂ７−１、Ｂ７−３及びＢ７−２結合タンパク質の発現をフローサイトメトリ分析法により調べた。Ｉｇ又はＭＨＣクラスIIとの架橋結合により、類似のパターンのＣＴＬＡ４Ｉｇ結合が誘導された（図５及び６）。図５は、抗Ｂ７−１及びＢＢ−１結合に関する２５の実験、及び、ＣＴＬＡ４Ｉｇ結合に関する５つの実験の結果を表すものである。図６は、抗Ｂ７−１結合に関する２５の実験、及び、ＣＴＬＡ４Ｉｇ結合に関する５つの実験を示すものである。これらの実験の結果から、２４時間より前では、これらの分子のいずれも発現しないことが推論される。活性化後２４時間の時点では、細胞の大部分が、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（Ｂ７−２）と結合したタンパク質を発現するが、２０％に満たないものがＢ７−１又はＢ７−３のどちらかを発現する。ＭＨＳクラスIIの架橋結合は、４８時間の時点で最大となるＢ７−１及びＢ７−３の発現及び強度を誘導するが、一方、Ｉｇの架橋結合の誘導する発現は７２時間の時点で最大となりその後発現が減少していく。これらの結果から、２４時間の間にさらにＣＴＬＡ４結合対レセプターが発現し、それぞれ別個であるＢ７−１及びＢ７−３タンパク質の一時的発現が一致して見えるのだということが分かる。
【０１４８】
ＣＴＬＡ４結合対レセプターの一時的発現が、Ｔ細胞の増殖及び／ＩＬ−２分泌を相互促進するその能力に対して示差的な相関関係にあったのかを判定すべく、一連の実験を行った。抗ＣＤ３で亜ミトゲン的に刺激したヒト脾臓ＣＤ２８＋Ｔ細胞を、試験管内でｓＩｇ架橋結合により２４、４８、又は７２時間予め活性化した照射ヒト脾臓Ｂ細胞のあるところで７２時間培養した。２４時間後、上澄み液でＩＬ−２分泌をＥＬＩＳＡ検定により評価し、Ｔ細胞の増殖を、７２時間の培養の最後１５時間について３Ｈ−チミジンの取込みにより評価した。図７の結果は五つの実験を表すものである。図７ａで見られるように、２４時間活性化されたＢ細胞は、まあまあのレベルのＩＬ−２生成を伴った相互促進信号を呈していたが、その増殖の程度は、４８及び７２時間活性化したヒトＢ細胞で観察されたものより著しく低かった（３Ｈ−チミジン取込みについては差が一定であることに注目されたい）。増殖又はＩＬ−２蓄積のどちらも抗Ｂ７−１（１３３）
又はＢＢ−１で阻害されなかった。対照的に、ＣＴＬＡ４Ｉｇ及び抗ＣＤ２８Ｆａｂ単クローン抗体では増殖及びＩＬ−２の蓄積を完全に妨げていた。４８時間活性化したＢ細胞のもたらした相互促進は、最大に近い増殖及びＩＬ−２分泌を起こしていた（図７ｂ）。ここで、抗Ｂ７−１（１３３）単クローン抗体は、増殖を約５０％阻害したが、ＩＬ−２の蓄積は完全に阻止していた。ＢＢ−１単クローン抗体は増殖及びＩＬ−２分泌の両方を完全に阻害していた。上述したように、ＣＴＬＡ４Ｉｇ及びＦａｂ抗ＣＤ２８もまた、増殖及びＩＬ−２生成の両方を完全に阻止していた。最後に、７２時間活性化したＢ細胞の誘導したＴ細胞の反応は、４８時間活性化したＢ細胞の誘導したものと同一であった。亜ミトゲン的信号がホルボールミリスチン酸（ＰＭＡ）によりもたらされれば、そしてヒト脾臓Ｂ細胞がＩｇではなくＭＨＣクラスII架橋結合により活性化すれば、同じような結果が観察される。これらの結果から、活性化したＢ細胞上で一時的に発現する三つのＣＴＬＡ４結合分子があり、各々が、亜ミトゲン的に刺激されたＴ細胞を増殖するよう誘導することができることが分かる。これらの分子のうち二つ、初期のＣＴＬＡ４結合対レセプター（Ｂ７−２）及びＢ７−１（１３３）はＩＬ−２生成を誘導するが、Ｂ７−３は、検出可能なＩＬ−２生成を伴わずに増殖を誘導する。
【０１４９】
これまでの研究では、抗Ｂ７単クローン抗体、１３３、及び単クローン抗体ＢＢ−１が同じ分子を同定したかについて食い違う証拠が提示されている（Freedman，A.S．et al.（1987）Immunol．137，3260-3267;Yokochi，T.，et al.(1982) J．Immunol．128,823-827; Freeman,G.J.，et al.（1989）J．Immunol.143,2714-2722.）。両方の単クローン抗体は、ヒトＢ細胞活性化後４８時間で発現する分子を同定したが、いくつかの報告では、Ｂ７（Ｂ７−１）と単クローン抗体ＢＢ−１により同定された分子とは異なる、なぜならこれらは細胞系及びＢ細胞腫瘍上で示差的に発現したからだ、と示唆している（Freedman,A.S.,et al.（1987）Immunol．137,3260-3267; Yokochi，T.，et al.（1982）J．Immunol.128,823-827;Freeman,G．J.，et al.（1989）J．Immunol．143,2714-2722; ClarkE．及びYokochi，T.（1984）Leukocyte Typing，1st International ReferencesWorkshop．339-346; Clark，E.，et al.（1984）Leukocyte Typing，1stInternational References Workshop．740）。更に、免疫沈降法及びウェスタンブロット法をこれらのＩｇＭ単クローン抗体を用いて行うと、これらが異なる分子を同定することが分かる(C1ark E.及びYokochi,T.（1984）Leukocyte Typing,1st International References Workshop．339-346; C1ark, E., et al.（1984）Leukocyte Typing, 1st International References Workshop．740)。元々の抗Ｂ７単クローン抗体、１３３、は、抗免疫グロブリンで活性化したヒトＢリンパ球による免疫処理により生じさせたものだが、ＢＢ−１単クローン抗体は、ヒヒの細胞系を用いた免疫処理で生じさせたものである。このようにＢＢ−１単クローン抗体は、ヒヒとヒトとの間で保れたヒト細胞上のエピトームを同定するに違いない。
【０１５０】
ヒトＢ７遺伝子（Ｂ７−１）の分子クローニング及び発現に続き、Ｂ７形質移入したＣＯＳ細胞が、抗Ｂ７（１３３）及びＢＢ−１単クローン抗体で全く同じように着色し、これらが同じ分子を同定することを強く示す、同一の幅広い分子帯（４４−５４ｋＤ）をこれらが沈降させたことが判明した（Freeman,G.J.et al.（1989）J．Immunol．143,2714-2722）。この観察は予期されたものではない。なぜなら、ＢＢ−１単クローン抗体により同定される分子を符号化する遺伝子は、既に、染色体１２に地図作成されて（Katz，F.E．et al.（1985）Eur．J．Immunol.103-6）いるが、Ｂ７遺伝子は、染色体３上の二つのグループから位置が判明していたからである（Freeman,G.J.,et al（1992）Blood 79.489-494;Selvakumar,A，et al.（1992）Immunogenetics 36，175-181.）。次に、Ｂ７（Ｂ７−１）と、ＢＢ−１単クローン抗体により同定された分子との表現型発現の更なる食い違いが注目された。ＢＢ−１単クローン抗体は胸腺上皮細胞（Turka，L.A.，et al.（1991）J．Immunol．146，1428-36; Munro，J.M．，et al．Blood提出済）及び表皮細胞(Nickoloff,B.,et al.（1993）Am.J.Pathol.142,1029-1040;Augustin,M.，et al.（1993）J．Invest．Dermato1．100,275-281)を着色したが、抗Ｂ７はしなかった。最近、Nickoloff et al.（1993）Am．J．Pathol．142,1029-1040で、ＢＢ−１及び抗Ｂ７（Ｂ１．１及び１３３）単クローン抗体を用いた表皮細胞上でのＢＢ−１単クローン抗体及びＢ７により同定された分子の逆行性の発現を報告している。更にNickoloff et alは、これらのＢＢ−１ポジティブ細胞が、Ｂ７ｍＲＮＡを発現しなかったが、結合ＣＤ２８形質移入ＣＯＳ細胞を発現したため、単クローン抗体ＢＢ−１と結合する別個のタンパク質の存在が裏付けられたとしている。
【０１５１】
本発見は、ＢＢ−１単クローン抗体、により同定される更なるＣＴＬＡ４対レセプター、Ｂ７−３、があり、このタンパク質がＢ７−１（１３３）とは機能的に異なると考えられることを確証するものである。Ｂ細胞活性化後のＢ７−１及びＢ７−３の発現はＢ７ポジティブＢ細胞上では同向性であると思われるが、これらの研究は、Ｂ７−３分子はＢ７ネガティブの活性化Ｂ細胞でも発現することを示す。より重要なことは、Ｂ７−３分子が、検出可能なＩＬ−２又はＩＬ−４の生成を起こさずにＴ細胞の増殖を誘導することができると考えられることである。この結論は、ＩＣＡＭ−１が、検出可能なＩＬ−２又はＩＬ−４の生成を起こさずにＴ細胞増殖を相互促進するであろう（Boussiotis,V.,et al.J.Exp.Med.(公開容認済)）というそれまでの観察と同様である。これらのデータは、ＢＢ−１単クローン抗体がＢ７−１タンパク質上のエピトープを認識し、このエピトープは更に、これもまた相互促進機能を有する別のＢ７−３タンパク質でも見られるということを示す。表現型及び阻止作用の研究は、ＢＢ−１単クローン抗体はこれらのタンパク質の一方（Ｂ７ネガティブ細胞上）又は両方（Ｂ７ポジティブ細胞上）を検出するのではないかということを示唆する。対照的に、抗Ｂ７単クローン抗体、１３３、及びＢ１．１は、Ｂ７−１タンパク質しか検出しない。まとめると、これらの結果は、表面免疫グロブリン又はＭＨＣクラスIIの架橋結合によるＢ細胞活性化後４８時間で、Ｂ細胞は少なくとも二つの個別のＣＴＬＡ４結合対レセプターを発現し、そのうち一つは抗Ｂ７及びＢＢ−１単クローン抗体で同定され、他方はＢＢ−１単クローン抗体でのみ同定されるものであることを示す。
【０１５２】
Ｂ７−２抗原は活性化Ｂ細胞上で１２時間後では検出不能であるが、２４時間で強く発現し機能的となる。この分子は、ＣＤ２８を介して信号伝達を行うように思われるが、それはなぜなら、増殖及びＩＬ−２生成がＦａｂ抗ＣＤ２８単クローン抗体により完全に阻止されるからである。抗Ｂ７単クローン抗体はＩＬ−２生成を完全に阻害するため、活性化後４８時間の時点では、ＩＬ−２分泌はＢ７−１の相互促進で説明されると思われる。
【０１５３】
ここで提供されるこれまでの研究及び結論では、Ｂ７（Ｂ７−１）が、Ｂ細胞活性化後４８時間までは発現せず（Freedman，A.S．et al.（1987）Immunol.137,3260-3267; Freedman，A.S．et al.（1991）Cell．Immunol．137,429-437）、またＴ細胞増殖又はＩＬ−２分泌を相互促進することができないことを示すものである。これまでの研究では、相互促進のない状態でのＴＣＲを介したＴ細胞の活性化（Gimmi,C.D.,et al.（1993）Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:6586-6590;Schwartz,R.H.,et al.（1989）Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol 54,605-10;Beverly，B．et al.（1992）Int．Immunol．4.661-671）及びＩＬ−２の欠如（Boussitois,V.,et al J.Exp.Med．（提出済）；Beverly,B.,et al.（1992）Int．Immunol．4.661-671;Wood，M.，et al.（1993）J．Exp．Med．177,597-603）はアネルギーを引き起こすことが示されている。もし、Ｂ７−１が、ＩＬ−２分泌を誘導することのできる唯一の相互促進分子であるなら、 ＩＬ−２生成を相互促進するＢ７−１がないために活性化後２４時間以内にＴ細胞はアネルギー化されるであろう。従って、最初の２４時間内にＩＬ−２分泌を相互促進することのできる、初期に誘導可能な相互促進分子が更に別に存在することが、アネルギーではなく効果的な免疫反応を誘導するには必要であろう。Ｂ細胞活性化後１２時間から２４時間の間に表れる、初期のＣＴＬＡ４結合対レセプターであるＢ７−２はこの働きを充たすものである。
【０１５４】
これら更なる二つのＣＴＬＡ４結合対レセプターの生物学的及び臨床学的意義に、二つの観察が光を投げかけた。第１に、Ｂ７（Ｂ７−１）欠損マウスが生み出され、その抗原提供細胞がＣＴＬＡ４Ｉｇに不動結合していることが判明した（Freeman及びSharpeが原稿作成中）。このマウスは生育可能であり、分離された単核細胞は、Ｔ細胞と共に試験管内で培養したときに検出可能なレベルのＩＬ−２を誘導する。従って、代替的なＣＤ２８相互促進対レセプター又は代替的なＩＬ−２生成経路が機能しているに違いない。第２に、マウス又はヒトの組織で抗原特定アネルギーを誘導するのにこれまで最も効果的な試薬はＣＴＬＡ４Ｉｇ及びＦａｂ抗ＣＤ２８であるが、抗Ｂ７単クローン抗体はそれほど効果的でなかった（Harding,F.A.,et al.（1992）Nature 356,607-609;Lenschow,D.J.,etal.（1992）Science,257789-792;Chen,L.,et al.（1992）Cell.71,1093-1102;Tan，P.，et al.（1993）J．Exp．Med．177,165-173）。これらの観察は、ＩＬ−２を誘導することのできる代替的なＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドが存在するという仮説とも一致するものであり、ここで述べる結論とまとめると、三つのＣＴＬＡ４結合対レセプターはすべて、Ｔ細胞免疫性の誘導にとって重要であろうということが示唆される。更に、これらの阻止作用はＴ細胞のアネルギーの誘導に必要であろう。同一の結果がマウスの組織において、ヒトＢ７−１及びＢ７−２分子に相当する二つのＣＴＬＡ４結合リガンドの同定により観察されている。Ｂ７欠損マウスのＡＰＣはＣＴＬＡ４に結合子、ＩＬ−２分泌を誘導することができる。まとめると、これらの観察から、マウスの組織では多数のＣＴＬＡ−４結合対レセプターが存在し、Ｔ細胞の活性化を順に相互促進していることが分かる。
【０１５５】
[例４]
Ｂ７−２抗原のクローニング、配列決定及び発現
Ａ． ｃＤＮＡライブラリの構成 
ｃＤＮＡのライブラリを、説かれたようにヒト抗ＩｇＭ活性化Ｂ細胞から得たポリ（Ａ）+ＲＮＡを用いてｐＣＤＭ８ベクタ（Seed，Nature 329:840(1987)）
中に構成した（Aruffo et al．Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84:3365(1987)）
。脾臓Ｂ細胞を、組織培養フラスコ中の完全培地｛１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及び硫酸ゲンタマイシン（５μｇ／ｍｌ）を含有したＲＰＭＩ１６４０｝で２×１０６細胞／ｍｌで培養し、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ７０２ビーズ（Bio-Rad社）Richmond,CA）に結合させた親和性生成ウサギ抗ヒトＩｇＭにｓＩｇを架橋結合させることで活性化した（Boyd，A.W.，et al.（1985）J．Immunol．134,1516）。活性化したＢ細胞を１／６、１／２、４、８１２、２４、４８、７２及び９６時間後に回収した。
【０１５６】
４Ｍのチオシアン酸グアニジン、０．５％のサルコシル、２５ｍＭのＥＤＴＡ、ペーハーは７．５、０．１３％のSigma社製アンチ・フォームＡ、及び０．７％のメルカプトエタノールの溶液中に活性化したＢ細胞を均質化してＲＮＡを作成した。このホモジネートから、２４時間、３２，０００ｒｐｍの遠心分離により、５．７ＭのＣｓＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＮａアセテート、ペーハーは７の溶液を通じてＲＮＡを精製した。ＲＮＡのパレットを５％のサルコシル、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリス、ペーハーは７．５に溶解させて、二つの等量の５０％のフェノール、４９％のクロロホルム、１％のイソアミルアルコールに抽出した。ＲＮＡにはエタノール沈降を二回行った。ｃＤＮＡのライブラリ構成に用いたポリ（Ａ）+ＲＮＡを、二回のサイクルのオリゴ（ｄＴ）−セルロース選別により精製した。
【０１５７】
補助ＤＮＡの合成を、５０ｍＭのトリス、ペーハーは８．３、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのジチオスレイトール、５００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５０μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）１２−１８、１８０単位／ｍｌのＲＮａｓiｎ、及び１０，０００単位／ｍｌのモロニー−ＭＬＶ逆トランスクリプターゼを含んだ、３７℃の総量５５μｌ中における、５．５μｇの抗ＩｇＭ活性化ヒトＢ細胞ポリ（Ａ）+ＲＮＡの１時間の反応により行った。逆転写反応後、このｃＤＮＡの二本鎖のＤＮＡへの変換を、溶液を２５ｍＭのトリス、ペーハーは８．３、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、それぞれ２５０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５ｍＭのジチオスレイトール、２５０単位／ｍｌのＤＮＡポリメラーゼＩ、８．５単位／ｍｌのリボヌクレアーゼＨに調節して１６度で２時間インキュベートすることで行った。ＥＤＴＡを１８ｍＭまで加え、等量の５０％のフェノール、４９％のクロロホルム、１％のイソアミルアルコールにこの溶液を出した。２．５Ｍの酢酸アンモニウムのある状態で二容量のエタノールと、及び、担体として４ミクログラムの線形ポリアクリルアミドとによりＤＮＡを沈降させた。更に、５０ｍＭのトリス、ペーハーは８．８、５０μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）１２−１８、３２７単位／ｍｌのＲＮａｓｉｎ、及び９５２単位／ｍｌＡＭＶ逆トランスクリプターゼを含んだ、４２℃の総量１００μｌ中における、４μｇの抗ＩｇＭ活性化ヒトＢ細胞ポリ（Ａ）+ＲＮＡの０．６７時間の反応からｃＤＮＡを合成した。逆転写後、逆トランスクリプターゼを７０度で１０分間加熱して不活性化した。ｃＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの変換を、３２０μｌのＨ２Ｏと、０．１Ｍのトリス、ｐＨは７．５、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ＭのＫＣｌ、２５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、及び５０ｍＭのジチオスレイトールの溶液８０μｌとを加えて、この溶液を、それぞれ２００ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５０単位／ｍｌのＤＮＡポリメラーゼＩ、８単位／ｍｌのリボヌクレアーゼＨに調節し、１６℃で２時間インキュベートすることで行った。ＥＤＴＡを１８ｍＭまで加え、等量の５０％のフェノール、４９％のクロロホルム、１％のイソアミルアルコールにこの溶液を抽出した。２．５Ｍの酢酸アンモニウムのある状態で二容量のエタノールと、及び、担体として４ミクログラムの線形ポリアクリルアミドとによりＤＮＡを沈降させた。
【０１５８】
４μｇのＡＭＶ逆転写と２μｇのモロニーＭＬＶ逆転写とから得たＤＮＡを組み合わせた。非自己補完的ＢｓｔＸＩアダプターを以下のようにＤＮＡに加えた。６μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡからの二本鎖のｃＤＮＡを、配列ＣＴＴＴＡＧＡＧＣＡＣＡ（配列同定番号第１５番）のキナーゼ処理したオリゴヌクレオチド３．６μｇ、及び、配列ＣＴＣＴＡＡＡＧ（配列同定番号第１６番）のキナーゼ処理したオリゴヌクレオチド２．４μｇを用いて、６ｍＭのトリス、ｐＨは７．５、６ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＣｌ、３５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、７ｍＭのメルカプトエタノール、０．１ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのスペルミジン、及び６００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有した、総量０．４５ｍｌの溶液中で１５℃で１６時間インキュベートした。ＥＤＴＡを３４ｍＭまで加えて、等量の５０％のフェノール、４９％のクロロホルム、１％のイソアミルアルコールにこの溶液を抽出した。２．５Ｍの酢酸アンモニウムのある状態で二容量のエタノールによりＤＮＡを沈降させた。
【０１５９】
６００ｂｐより大きいＤＮＡを以下のようにして選別した。アダプターＤＮＡを、１０ｍＭのトリス、ｐＨは８、１ｍＭのＥＤＴＡ、６００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のサルコシル中で再溶解させ、同じ緩衝液中でセファロースＣＬ−４Ｂカラム上でクロマトグラフィーを行った。カラムのボイド容量中のＤＮＡ（６００ｂｐよりも大きいＤＮＡを含む）を貯留してエタノール沈降を行った。
【０１６０】
ｃＤＮＡのクローンニングに向けて、ｐＣＤＭ８ベクターを、ＢｓｔＸＩによる蒸解及びアガロースゲル上での精製により作成した。ポリ（Ａ）+ＲＮＡからのアダプターＤＮＡを、６ｍＭのトリス、ｐＨは７．５、６ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＣｌ、３５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、７ｍＭのメルカプトエタノール、０．１ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのスペルミジン、及び６００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有した、総量１．５ｍｌの１５℃の溶液中で２．２５μｇのＢｓｔＸＩ切断ｐＣＤＭ８に２４時間結紮した。結紮反応混合物は、コンピテント大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３に転換され、総数４，２９０，０００の独立したｃＤＮＡクローンが得られた。
【０１６１】
プラスミドＤＮＡを、ｃＤＮＡライブラリの原転換の培養株５００ｍｌから作成した。プラスミドＤＮＡを、アルカリ融解させ、次いでＣｓＣｌ平衡勾配で二回のバンデイングにより精製した（Maniatis et al．Molecular Cloning; ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY(1987)）。
【０１６２】
Ｂ．クローニングの手続 
初回のスクリーニングでは、５０％集密ＣＯＳ細胞の３０枚の１００ｍｍの皿に、０．０５μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭ活性化ヒトＢ細胞のライブラリＤＮＡをＤＥＡＥデクストラン法を用いて形質移入させた（Seed et al,Proc.Natl.Acad.SciUSA，84:3365(1987)）。２４時間後、細胞をトリプシン処理した後、再度平板培養した。４７時間後、ＰＢＳ／０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨは７．４／０．０２％のアジ化ナトリウム中で３７℃で３０分間インキュベートして細胞を剥がした。剥がした細胞を４５分間、４℃で１０μｇ／ｍｌ／ＣＴＬＡ４Ｉｇ及びＣｄ２８Ｉｇにより処理した。細胞を洗浄した後、親和性精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で被膜したパニング皿に流し込み、室温で付着させた。３時間後、ＰＢＳ／０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨは７．４／０．０２％のアジ化ナトリウム、５％のＦＣＳで二回、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１ＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨは７．４、５％のＦＣＳで一回、皿を優しく洗浄した。パニングした細胞からエピソームのＤＮＡを回収して大腸菌ＤＨ１０Ｂ／Ｐ３に転換した。プラスミドＤＮＡを、説かれたように（Seed et al，Proc．Natl．Acad．Sci USA,84:3365(1987)）スフェロプラスト融合を通じてＣＯＳ細胞に再導入し、発現及びパニングのサイクルを二回繰り返した。第２回目及び三回目の選別では、４７時間後、剥がしたＣＯＳ細胞をまず、α−Ｂ７−１ｍＡｂｓ（１３３及びＢ１．１、１０μｇ／ｍｌ）でインキュベートし、Ｂ７−１を発現するＣＯＳ細胞を、α−マウスＩｇＧ及びＩｇＭで被膜した磁気ビードで取り除いた。次にＣＯＳ細胞を１０μｇ／ｍｌのヒトＣＴＬＡ４Ｉｇ（ｈＣＴＬＡ４Ｉｇ）及びヒトＣＤ２８Ｉｇ（ｈＣＤ２８Ｉｇ）で処理して、ヒトＢ７−２を発現するＣＯＳ細胞を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体板より皿上でパニングすることによって選別した。三回目の後で、プラスミドＤＮＡを個々のコロニーから作成し、ＤＥＡＥ−デクストラン法でＣＯＳ細胞に形質移入させた。形質移入されたＣＯＳ細胞上でのＢ７−２の発現を、ＣＴＬＡ４Ｉｇを用いた間接免疫蛍光法により分析した。
【０１６３】
最終回の選別後、プラスミドＤＮＡを個々のコロニーから作成した。４８の候補クローンのうち合計４つのものが、約１．２ｋｂのｃＤＮＡインサートを含んでいた。これら四つのクローンからのプラスミドＤＮＡをＣＯＳ細胞に形質移入させた。四つのクローン全てが、ＣＴＬＡ４Ｉｇを用いた間接免疫蛍光法及びフローサイトメトリ分析法で、Ｂ７−２の発現について強度の陽性を示した。
【０１６４】
Ｃ．配列決定 
クローン２９のＢ７−２ｃＤＮＡインサートの配列を、ｐＣＤＭ８発現ベクタにおいて以下の方法により決定した。最初の配列決定は、クローン化Ｂ７−２ｃＤＮＡに隣接するｐＣＤＭ８ベクター配列の相同である配列決定プライマーＴ７、ＣＤＭ８Ｒ（インビトロゲン）を用いて行った（表Ｉを参照されたい）。配列決定は、ダイターミネータ化学法及びＡＢＩ自動化ＤＮＡシーケンサを用いて行った（ABI，Foster City，CA）。これらのプライマーを用いて得られたＤＮＡ配列を用いて、更なる配列決定プライマーを設計した（表Ｉを参照されたい）。配列決定及び更なるプライマーの選択というこのサイクルを、Ｂ７−２ｃＤＮＡの両方の鎖について完全に配列決定するまで続行した。
表１
T7(F)        （配列同定番号第３番） 5'd[TAATACGACTCACTATAGGG]3’
CDM8(R)     （配列同定番号第４番） 5'd[TAAGGTTCCTTCACAAAG]3’
CDM8RGV(2)  （配列同定番号第５番） 5'd[ACTGGTAGGTATGGAAGATCC]3’
HBX29-5P(2R) （配列同定番号第６番） 5'd[ATGCGAATCATTCCTGTGGGC]3’
HBX29-5P(2F) （配列同定番号第７番） 5'd[AAAGCCACAGGAATGATTCG]3’
HBX29-5P     （配列同定番号第８番） 5'd[CTCTCAAAACCAAABCCTGAG]3’
5PA          （配列同定番号第９番） 5'd[TTAGGTCACAGCAGAAGCAGC]3’
5PA(3FA)    （配列同定番号第１０番） 5'd[TCTGGAAACTGACAAGACGCG]3’
HBX29-5P(IR) （配列同定番号第１１番）5'd[CTCAGGCTTTGGTTTTGAGAG]3’
HBX29-3P(IR) （配列同定番号第１２番）5'd[CACTCTCTTCCCTCTCCATTG]3’
HBX29-5P(3R) （配列同定番号第１３番）5'd[GACAAGCTGATGGAAACGTCG]3’
HBX29-3P(IP) （配列同定番号第１４番）5'd[CAATGGAGAGGGAAGAGAGTG]3’ 
【０１６５】
ヒトＢ７−２クローン２９は、９８７のヌクレオチドの一本の長い開放読み枠と、３’非符号配列の約２７のヌクレオチドとからなる１，１２０個の塩基対のインサートを含んでいた（図８Ａ−Ｃ（配列同定番号第１番））。図８Ａ−Ｃにおいて、タンパク質の開放読み枠により符号化される、予測されたアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列の下に示す。符号化されたタンパク質、つまりヒトＢ７−２は、長さで３２９個のアミノ酸であると予測される（配列同定番号第２番）。このタンパク質の配列は、その他の種類ＩのＩｇの上科エンブレーンタンパク質と共通の特徴を数多く呈する。タンパク質の翻訳は、ＡＴＧコードン（ヌクレオチド１０７−１０９）において、コンセンサス真核性翻訳開始域を備えたこの部位のＤＮＡ同族関係に基づいて開始すると予測されている（Kozak,M.（1987）Nucl.Acids Res.15:8125-8148）。ヒトＢ７−２タンパク質（アミノ酸１から２３まで）のアミノ末端は、位置２３のアラニンと位置２４のアラニンとの間で分裂の予測される分泌信号ぺプチドという特徴を有する（von Heijne（1986）Nucl．Acids Res.14:4683）。この域での処理の結果、約３４ｋＤａの分子量を改変しないまま、３０６のアミノ酸から成るヒトＢ７−２膜結合タンパク質が生じるであろう。このタンパク質は、アミノ酸残基約２４−２４５の細胞外Ｉｇ上科Ｖ及びＣ様ドメイン、アミノ酸残基約２４６−２６８の疎水性膜内外ドメイン、及び、約２６９−３２９アミノ酸残基の長い細胞質ドメインから構成されるであろう。Ｉｇ上科に対する同族関係は、システインにより位置４０から１１０及び１５７から２１８で結合される細胞外部位の中の二つの近接するＩｇ様のドメインのためである。
この細胞外ドメインは更に、８個の潜在Ｎ連結グリコシレーション部位を含んでいた。ヒトＢ７−２タンパク質を符号化するクローン２９のｃＤＮＡインサートを含有するベクターで形質移入させた大腸菌は、米国代表菌株培養収集（ＡＴＣＣ）に、登録番号６９３５７で１９９３年７月２６日に寄託されている。
【０１６６】
ヒトＢ７−２のヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方を、GenBank及びEMBLのデータベースと比較すると、ヒト及びマウスのＢ７−１タンパク質だけが関連していることが分かった。三つのＢ７タンパク質配列のアラインメント（図１３ＡとＢを参照されたい）から、ヒトＢ７−２が約２６％のアミノ酸同一性をヒトＢ７−１に対して有していることが分かる。図１３ＡとＢは、ヒトＢ７−２（ｈＢ７−２）（配列同定番号第２番）、ヒトＢ７−１（ｈＢ７−１）（配列同定番号第２８番及び第２９番）及びマウスＢ７（ｍＢ７）（配列同定番号第３０番及び第３１番）についてのアミノ酸配列の比較を表したものである。ヒトＢ７−１及びマウスＢ７（以下マウスＢ７−１と呼ぶ）のアミノ酸配列は、それぞれ登録番号＃Ｍ２７５３３及びＸ６０９５８でGenBankで見ることができる。図１３ＡとＢの縦の線は、ｈＢ７−２及びｈＢ７−１又はｍＢ７の間で同一のアミノ酸配列があることを示す。
ｈＢ７−１とｍＢ７との間の同一のアミノ酸は示していない。ｈＢ７−２タンパク質は、Ｉｇ上科がドメインとする共通のシステイン（位置４０及び１１０、ＩｇＶドメイン；位置１５７及び２１７、ＩｇＣドメイン）及びその他数多くの共通のアミノ酸により規定される、ｈＢ７−１と同じ一般的構造を呈する。ｈＢ７−１及びｍＢ７の両方はヒトＣＴＬＡ４及びヒトＣＤ２８の両方に結合することが示されているため、これら二つの関連するタンパク質の間に共通するアミノ酸は、ＣＴＬＡ４又はＣＤ２８結合配列を成すために必要なものであろう。このような配列の一例は、ＫＹＭＧＲＴＳＦＤ（位置８１−８９、ｈＢ７−２）（配列同定番号第１７番）又はＫＳＱＤＮＶＴＥＬＹＤＶＳ（位置１８８−２００、ｈＢ７−２）（配列同定番号第１８番）であろう。関連する配列の更なるものは配列を比較すれば明らかであり、その他のものは、アスパラギン酸及びグルタミン酸、アラニン及びグリシン等、同族関係にあるアミノ酸や、認識されている機能的に関連のあるアミノ酸を考慮することで推定することができる。Ｂ７の配列は、おそらくは細胞内信号伝達に関連するものである細胞質部分ＷＫＷＫＫＫＫＲＰＲＮＳＹＫＣ（位置２６９−２８２、ｈＢ７−２）（配列同定番号第１９番）を備えた高正電荷ドメインを共有している。
【０１６７】
[例５]
組換えＢ７−２抗原の特徴
Ａ．Ｂ７−２はＣＴＬＡ４Ｉｇとは結合するが抗Ｂ７−１及び抗Ｂ７−３単クローン抗体とはしない 
ベクタ−ＤＮＡ（ｐｃＤＮＡＩ）又は、Ｂ７−１（Ｂ７−１）又はＢ７−２（Ｂ７−２）を含有する発現プラスミドのいずれかで形質移入したＣＯＳ細胞を作成した。７２時間後、形質移入したＣＯＳ細胞を、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０２％のアジ化ナトリウムを含んだＰＢＳで３０分間、３７℃でインキュベートして切り離した。間接免疫蛍光法及びフローサイトメトリ分析をフルオレセインイソチオシアネート共役（ＦＩＴＣ）ヤギ抗マウスＩｇ又はヤギ抗ヒトＩｇＧＦＩＴＣを用いて細胞表面発現に関して細胞を分析した（図９）。Ｂ７−１の細胞表面発現は、ｍＡｂｓ１３３（抗Ｂ７−１）とＢＢ−１（抗Ｂ７−１及び抗Ｂ７−３）、及びＣＴＬＡ４Ｉｇで検出されたが、Ｂ７−２はＣＴＬＡ４Ｉｇででしか反応しなかった。どちらのＢ７トランスフェクタントも、アイソタイプ対照試薬（ＩｇＭ又は対照Ｉｇ）では着色を示さなかった。ベクターで形質移入したＣＯＳ細胞はいずれの検出試薬でも着色を示さなかった。更に、細胞のうちいずれも、ＦＩＴＣで標識付けした検出試薬及び単体では着色を示さなかった。このことは、Ｂ７−２の符号化するタンパク質はＣＴＬＡ４対レセプターであり、Ｂ７−１及びＢ７−３とは異なることを示唆するものである。
【０１６８】
Ｂ． 刺激を受けていない、及び活性化されたヒトＢ細胞、細胞系、及び骨髄種におけるＢ７−２発現のＲＮＡブロット分析 
ヒト脾臓Ｂ細胞を、前述したようにＴ細胞及び単核細胞を取り除いて分離した（Freedman, A.S.，Freeman, G.J., Horowitz, J.C.,Da1ey, J.,Nadler, L.M.,J.Immunol．(1987)137:3260-3267）。脾臓Ｂ細胞を抗Ｉｇビードを用いて活性化し、細胞を示された時点で回収した（Freedman，et al.，(1987)，上述）。骨髄標本からのヒト骨髄種を、前述したようにＥロゼット及び付着法を用いてＴ細胞及び単核細胞を取り除いて濃縮した（Freeman，G.J.，et al.,J.Immunol．(1989)143:2714-2722）。グアニジンチオシアネートの均質化及び塩化セシウムの遠心分離によりＲＮＡを作成した。等量のＲＮＡ（２０μｇ）をアガロースゲル上で電気泳動処理し、ブロットし、３２Ｐ標識付Ｂ７−２ｃＤＮＡに交雑した。図１０の表ａは、未刺激の、及び抗Ｉｇで活性化したヒト脾臓Ｂ細胞のＲＮＡブロット分析、及びRaji（Ｂ細胞バーキットリンパ腫）、daudi（Ｂ細胞バーキットリンパ腫）、ＲＰＭＩ８２２６（骨髄腫）、Ｋ５６２（赤白血球病）、及びＲＥＸ（Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病）を含む細胞系のＲＮＡブロット分析を示す。図１０の表ｂはヒト骨髄腫標本のＲＮＡブロット分析を示す。
【０１６９】
１．３５、１．６５及び３．０ｋｂの三つの伝令ＲＮＡのトランスクリプトを、Ｂ７−２ｃＤＮＡへの交雑により同定した（図１０、表ｂ）。ＲＮＡブロット分析の結果、Ｂ７−２伝令ＲＮＡは未刺激のヒト脾臓Ｂ細胞で発現し、活性化後４倍に増加することが示された（図１０、表ａ）。Ｂ７−２伝令ＲＮＡはＢ細胞腫瘍株（Raji及びDaudi）及び骨髄腫（ＲＰＭＩ８２２６）で発現したが、赤白血球病Ｋ５６２及びＴ細胞系ＲＥＸではしなかった。対照的に、我々は前に、Ｂ７−１伝令ＲＮＡは休止Ｂ細胞では発現せず、活性化後過渡的に発現することを示している（G.J．Freeman et al.（1989）上述）。ヒト骨髄腫から分離した伝令ＲＮＡを調べた結果、Ｂ７−２伝令ＲＮＡは６の患者中６のもので発現するが、Ｂ７−１はこれらの６のうち１でしか見られなかった（G.J．Freeman et al.（1989）上述）。このように、Ｂ７−１及びＢ７−２の発現は個別に調節されているようである。
【０１７０】
Ｃ． 相互促進 
前述したように、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージに命令型の単クローン抗体を用いた免疫磁気ビード除去法により、ヒトＣＤ２８+Ｔ細胞を分離した（Gimmi，C.D.，et al.(1993)Proc．Natl．Acad．Sci．USA90,6586-6590）。Ｂ７−１、Ｂ７−２及びベクターで形質移入したＣＯＳ細胞を、形質移入から７２時間後に回収し、２５μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで１時間インキュベートし、よく洗浄した。１０５ＣＤ２８+及びＴ細胞を、１ｎｇ／ｍｌのホルボールミスチリン酸（ＰＭＡ）及び示された数のＣＯＳトランスフェクタントでインキュベートした（図１１）。図１１表ａに示されるように、Ｔ細胞の増殖を、７２時間のインキュベーションのうち最後の１２時間について３Ｈチミジン（１μＣｉ）の取込みで計測した。図１１の表ｂは、培養開始後２４時間で回収した上澄み液を用いてＥＬＩＳＡ（Blosource，CA）により計測したときの、Ｔ細胞によるＩＬ−２生成を示す。
【０１７１】
Ｄ． Ｂ７−２の相互促進は抗Ｂ７−１及び抗Ｂ７−３ｍＡｂでは阻止されないが ＣＴＬＡ４Ｉｇ及び抗ＣＤ２８Ｆａｂで阻止される 
前述したように、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージに向けたｍＡｂｓを用いた免疫磁気ビード除去法により、ヒトＣＤ２８＋Ｔ細胞を分離した（Gimmi,C.D.,Freeman,G.J.,Gribben,J.G.,Gray,G.,Nadler,L.M.（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA90,6586-6590）。 Ｂ７−１、Ｂ７−２及びベクターで形質移入したＣＯＳ細胞を、形質移入から７２時間後に回収し、２５μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで１時間インキュベートし、よく洗浄した。１０５ＣＤ２８+Ｔ細胞を、１ｎｇ／ｍｌのホルボールミスチリン酸（ＰＭＡ）及び２×１０４のＣＯＳトランスフェクタントでインキュベートした。阻止物質（１０μｇ／ｍｌ）は、図１２ＡとＢの左側に示されているが、１）単クローン抗体以外（阻止物質以外で）、２）ｍＡｂ１３３（抗Ｂ７−１ｍＡｂ）、３）ｍＡｂＢＢ１（抗Ｂ７−１及び抗Ｂ７−３ｍＡｂ）、４）ｍＡｂＢ５（対照ＩｇＭｍＡｂ）、５）抗Ｃｄ２８Ｆａｂ（ｍＡｂ９．３）、６）ＣＴＬＡＩｇ、及び７）対照Ｉｇを含むものである。図１２ＡとＢの表ａは、増殖を、７２時間のインキュベーションのうち最後の１２時間について３Ｈチミジン（１μＣｉ）の取込みで計測したものを示す。図１２ＡとＢの表ｂは、培養開始後２４時間で回収した上澄み液を用いてＥＬＩＳＡ（Biosource，CA）により計測したときのＩＬ−２生成を示す。
【０１７２】
Ｂ７−１及びＢ７−２で形質移入したＣＯＳ細胞は、様々な刺激物対反応物比でテストしたときに同等レベルのＴ細胞増殖を相互促進した（図１１）。Ｂ７−１と同様、Ｂ７−２で形質移入したＣＯＳ細胞の相互促進の結果、幅広い範囲の刺激物対反応物細胞比に渡ってＩＬ−２の生成があった（図１１）。対照的に、べクターで形質移入したＣＯＳ細胞はＴ細胞増殖又はＩＬ−２生成を相互促進しなかった。
【０１７３】
Ｅ． Ｂ７−２相互促進は抗Ｂ７−１及び抗Ｂ７−３ｍＡｂｓでは阻止されないが、ＣＴＬＡ４Ｉ 及び抗ＣＤ２８Ｆａｂによって阻止される 
前述したように、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージ命令型のｍＡｂｓを用いた免疫磁気ビード除去法により、ヒトＣＤ２８＋Ｔ細胞を分離した（Gimmi,C.D.,Freeman,G.J.,Gribben,J.G.,Gray,G.,Nadler,L.M.（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA90,6586-6590）。 Ｂ７−１、Ｂ７−２及びベクターで形質移入したＣＯＳ細胞を、形質移入から７２時間後に回収し、２５μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで１時間インキュベートし、よく洗浄した。１０５ＣＤ２８+Ｔ細胞を、１ｎｇ／ｍｌのホルボールミスチリン酸（ＰＭＡ）及び２×１０４のＣＯＳトランスフェクタントでインキュベートした。阻止物質（１０μｇ／ｍｌ）は、図１２ＡとＢの左側に示されているが、１）単クローン抗体以外（阻止物質以外で）、２）ｍＡｂ１３３（抗Ｂ７−１ｍＡｂ）、３）ｍＡｂＢＢ１（抗Ｂ７−１及び抗Ｂ７−３ｍＡｂ）、４）ｍＡｂＢ５（対照ＩｇＭｍＡｂ）、５）抗Ｃｄ２８Ｆａｂ（ｍＡｂ９．３）、６）ＣＴＬＡＩｇ、及び７）対照Ｉｇを含むものである。図１２ＡとＢの表ａは、増殖を、７２時間のインキュベーションのうち最後の１２時間について３Ｈチミジン（１μＣｉ）の取込みで計測したものを示す。図１２ＡとＢの表ｂは、培養開始後２４時間で回収した上澄み液を用いてＥＬＩＳＡ（Biosource，CA）により計測したときのＩＬ−２生成を示す。
【０１７４】
Ｂ７−１及びＢ７−３からＢ７−２を区別するために、Ｂ７−１及びＢ７−３に命令型のｍＡｂを用いて、亜ミトゲン的に活性化したヒトＣＤ２８+Ｔ細胞の増殖及びＩＬ−２生成を阻害した。Ｂ７−１及びＢ７−２ＣＯＳトランスフェクタントの両方が、Ｔ細胞増殖及びＩＬ−２生成を相互促進した（図１２ＡとＢ）。ｍＡｂ１３３（Freedman，A.S.，et al．(1987)上述）（抗Ｂ７−１）及びＢＢＩ（Boussiotis,V.A.,et al.,（再掲）Proc.Natl.Acad.Sci,USA;Yokochi,T.,Hol1y，R.D.，Clark，E.A.，（1982）J．Immnol．128,823-827）（抗Ｂ７−１及び抗Ｂ７−３）は、Ｂ７−１の誘導した増殖及びＩＬ−２分泌を完全に阻害していたが、Ｂ７−２で形質導入したＣＯＳ細胞による相互促進には何の影響も与えていなかった。アイソタイプが適合した対照Ｂ５ｍＡｂでも何の影響もなかった。Ｂ７−２がＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路を介して信号伝達を行うのかどうかを調ベるため、抗ＣＤ２８Ｆａｂ及びＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質をテストしてこれらがＢ７−２の相互促進を阻害したかどうかを調べた。抗ＣＤ２８Ｆａｂ及びＣＴＬＡ４Ｉｇの両方が、Ｂ７−１又はＢ７−２ＣＯＳトランスフェクタントのどちらかが誘導した増殖及びＩＬ−２生成を阻害していたが、対照Ｉｇ融合タンパク質では何の影響もなかった（図１２ＡとＢ）。ＣＴＬＡ４Ｉｇは増殖のＢ７−２相互促進を僅かに９０％阻害していたが、別の実験では阻害はより顕著であった（９８−１００％）。阻害物質のいずれも、ＰＭＡ及びフィトヘムアグルチニンの組合せにより誘導されたＴ細胞増殖又はＩＬ−２生成を阻害しなかった。
Ｂ７−１と同様、Ｂ７−２はＣｄ２８及びＣＴＬＡ４Ｔ細胞表面分子にとっての対レセプターである。両方のタンパク質は次の点で類似している：１）ＡＰＣの表面で発現する、２）２６％のアミノ酸同一性を共有するＩｇＶ及びＩｇＣドメインを持つＩｇ超遺伝子科に構造上関連がある、３）Ｔ細胞を相互促進してＩＬ−２の生成及び増殖を行わせることができる。しかしながら、Ｂ７−１及びＢ７−２は、いくつかの基本的点で異なる。第１に、Ｂ７−２伝令ＲＮＡは未刺激のＢ細胞で構成的に発現するが、Ｂ７−１伝令ＲＮＡは４時間まで表れないため、細胞表面タンパク質は２４時間まで検出されない(Freedman,A.S.,et al.（1987）上述；Freeman，G.J.，et al.（1989）上述）。未刺激のヒトＢ細胞は細胞表面上でＣＴＬＡ４対レセプターを発現せず、また、Ｔ細胞増殖を相互促進しない（Boussiotis，V.A.，et al.,上述）。従って末刺激のＢ細胞でのＢ７−２伝令ＲＮＡの発現により、おそらくは蓄えられた伝令ＲＮＡ又はタンパク質から、細胞表面でのＢ７−２タンパク質の発現を活性化後迅速に行えるであろう。Ｂ７−２トランスフェクタントによる相互促進は一部、パラホルムアルデヒドの固定に感受性があるが、Ｂ７−２の相互促進は抵抗性である（Gimmi,C.D.,et al.（1991）Proc．Natl．Acad．Sci．USA88,6575-6579）。第２に、細胞系及びヒトＢ細胞新生物におけるＢ７−１及びＢ７−２の発現は大きく異なる。第三に、Ｂ７−２タンパク質はＢ７−１よりも長い細胞質ドメインを含有しており、このことがＢ細胞の分化を信号伝達する上で役割を果たしている可能性がある。これらの表現型及び機能的違いは、これらの同族分子が生物学的には異なる働きを有するかもしれないということを示唆するものである。
【０１７５】
[例６]
マウスＢ７−２抗原のクローニング及び配列決定
Ａ． ｃＤＮＡライブラリの構成 
ｃＤＮＡのライブラリを、説かれたように、dibutryl環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）
活性化Ｍ１２細胞（マウスＢ細胞腫瘍株）からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いてｐＣＤＭ８ベクター（seed,Nature,329:840(1987)）中に構成した（Aruffo et al.Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84:3365(1987)）。
【０１７６】
Ｍ１２細胞を、組織培養フラスコ中の完全培地｛１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、ぺニシリン（１００単位／ｍｌ）硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及び硫酸ゲンタマイシン（５μｇ／ｍｌ）を含有したＲＰＭＩ１６４０｝で１×１０６細胞／ｍｌで培養し、３００μｇ／ｍｌのdibutryl環状ＡＭＰで活性化した（Nabavl，N.，et al.（1992）Nature 360,266-268）。活性化したＭ１２細胞を０、６、１２、１８、２４及び３０時間後に回収した。
【０１７７】
４Ｍのチオシアン酸グアニジン、０．５％のサルコシル、２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨは７．５、０．１３％のSigma社製アンチ・フォームＡ、及び０．７％のメルカプトエタノールの溶液中に活性化したＭ１２細胞を均質化してＲＮＡを作成した。このホモジネートから、２４時間、３２，０００ｒｐｍの遠心分離により、５．７ＭのＣｓＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＮａアセテート、ｐＨは７の溶液を通じてＲＮＡを精製した。ＲＮＡのペレットを５％のサルコシル、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリス、ｐＨは７．５に溶解させて、二つの量の５０％のフェノール、４９％のクロロホルム、１％のイソアミルアルコールに抽出した。ＲＮＡにはエタノール沈降を二回行った。ｃＤＮＡのライブラリ構成に用いたポリ（Ａ）+ＲＮＡを、二回のサイクルのオリゴ（ｄＴ）−セルロース選別により精製した。
【０１７８】
補助ＤＮＡの合成を、５０ｍＭのトリス、ｐＨは８．３、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのジチオスレイトール、５００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５０μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）１２−１８、１８０単位／ｍｌのＲＮａｓｉｎ、及び１０，０００単位／ｍｌのモロニー−ＭＬＶ逆トランスクリプターゼを含んだ、３７℃の総量５５μｌ中における、５．５μｇのdibutryl環状ＡＭＰ活性化マウスＭ１２細胞ポリ（Ａ）+ＲＮＡの１時間の反応により行った。逆転写反応後、このｃＤＮＡの二本鎖のＤＮＡへの変換を、溶液を２５ｍＭのトリス、ｐＨは８．３、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、それぞれ２５０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５ｍＭのジチオスレイトール、２５０単位／ｍｌのＤＮＡボリメラーゼＩ、８．５単位／ｍｌのリボヌクレアーゼＨに調節して１６度で２時間インキュベートすることで行った。ＥＤＴＡを１８ｍＭまで加え、等量の５０％のフェノール、４９％のクロロホルム、１％のイソアミルアルコールにこの溶液を抽出した。２．５Ｍの酢酸アンモニウムのある状態で二容量のエタノールと、及び、担体として４ミクログラムの線形ポリアクリルアミドとによりＤＮＡを沈降させた。逆転写後、逆転写酵素を７０℃で１０分間加熱して不活性化した。このｃＤＮＡの二本鎖のＤＮＡへの変換を、３２０μｌのＨ２Ｏと、０．１Ｍのトリス、ｐＨは７．５、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ＭのＫＣｌ、２５０μｇ／ｍｌのウシ胎児血清、及び５０ｍＭのジチオスレイトールの８０μｌの溶液とを加えた後、この溶液を、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５０単位／ｍｌのＤＮＡボリメラーゼＩ、８単位／ｍｌのリボヌクレアーゼＨに調節して１６度で２時間インキュベートすることで行った。ＥＤＴＡを１８ｍＭまで加え、等量の５０％のフェノール、４９％のクロロホルム、１％のイソアミルアルコールにこの溶液を抽出した。２．５Ｍの酢酸アンモニウムのある状態で二容量のエタノールと、及び、担体として４ミクログラムの線形ポリアクリルアミドとによりＤＮＡを沈降させた。
【０１７９】
２μｇの非自己補完的ＢｓｔＸＩアダプターを以下のようにＤＮＡに加えた。
５．５μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡからの二本鎖のｃＤＮＡを、配列ＣＴＴＴＡＧＡＧＣＡＣＡ（配列同定番号第１５番）のキナーゼ処理したオリゴヌクレオチド３．６μｇ、及び、配列ＣＴＣＴＡＡＡＧ（配列同定番号第１６番）のキナーゼ処理したオリゴヌクレオチド２．４μｇを用いて、６ｍＭのトリス、ｐＨは７．５、６ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＣｌ、３５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、７ｍＭのメルカプトエタノール、０．１ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのスペルミジン、及び６００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有した、総量０．４５ｍｌの溶液中で１５℃で１６時間インキュベートした。ＥＤＴａを３４ｍＭまで加えて、等量の５０％のフェノール、４９％のクロロホルム、１％のイソアミルアルコールにこの溶液を抽出した。２．５Ｍの酢酸アンモニウムのある状態で二容量のエタノールによりＤＮＡを沈降させた。
【０１８０】
６００ｂｐより大きいＤＮＡを以下のようにして選別した。アダプターＤＮＡを、１０ｍＭのトリス、ｐＨは８、１ｍＭのＥＤＴＡ、６００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のサルコシル中で再溶解させ、同じ緩衝液中でセファロースＣＬ−４Ｂカラム上でクロマトグラフィーを行った。カラムのボイド容量中のＤＮＡ（６００ｂｐよりも大きいＤＮＡを含む）を貯留してエタノール沈降を行った。
ｃＤＮＡのクローンニングに向けて、ｐＣＤＭ８ベクターを、ＢｓｔＸＩによる蒸解及びアガロースゲル上での精製により作成した。５．５μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡからのアダプターＤＮＡを、６ｍＭのトリス、ｐＨは７．５、６ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＣｌ、３５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、７ｍＭのメルカプトエタノール、０．１ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのスペルミジン、及び６００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有した、総量１．５ｍｌの１５℃の溶液中で２．２５μｇのＢｓｔＸＩ切断ｐＣＤＭ８に２４時間結紮した。結紮反応混合物は、コンピテント大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３に転換され、総数２００×１０６の独立したｃＤＮＡクローンが得られた。
【０１８１】
プラスミドＤＮＡを、ｃＤＮＡライブラリの原転換の培養株５００ｍｌから作成した。プラスミドＤＮＡを、アルカリ融解法とこれに次ぐＣｓＣｌ平衡勾配で二回のバンディングとにより精製した（Maniatis et al．Molecular Cloning; ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor，NY (1987)）。
【０１８２】
Ｂ．クローニングの手続 
初回のスクリーニングでは、５０％集密ＣＯＳ細胞の３０枚の１００ｍｍの皿に、０．０５μｇ／ｍｌの活性化Ｍ１２マウスＢ細胞のライブラリＤＮＡをＤＥＡＥデクストラン法を用いて形質移入させた（Seed et al,Proc.Natl.Acad.SciUSA，84:3365(1987)）。２４時間後、細胞をトリプシン処理した後、再度平板培養した。４７時間後、ＰＢＳ／0．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨは７．４／０．０２％のアジ化ナトリウム中で３７℃で３０分間インキュベートして細胞を剥がした。剥がした細胞を４５分間、４℃で１０μｇ／ｍｌ／ヒトＣＴＬＡ４Ｉｇ及びマウスＣＤ２８Ｉｇにより処理した。細胞を洗浄した後、親和性精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で被膜したパニング皿に流し込み、室温で付着させた。３時間後、ＰＢＳ／０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨは７．４／０．０２％のアジ化ナトリウム、５％のＦＣＳで二回、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１ＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨは７．４、５％のＦＣＳで一回、皿を優しく洗浄した。パニングした細胞からエピソームのＤＮＡを回収して大腸菌ＤＨ１０Ｂ／Ｐ３に転換した。プラスミドＤＮＡを、説かれたようにスフェロプラスト融合を通じてＣＯＳ細胞に再導入し（Seed et al，Proc．Natl．Acad．Sci USA,84:3365(1987)）、発現及びパニングのサイクルを二回繰り返した。第２回目及び三回目の選別では、４７時間後、剥がしたＣＯＳ細胞をまず、α−マウスＢ７−１ｍＡｂ（１６−１０Ａ１、１０μｇ／ｍｌ）でインキュベートし、Ｂ７−１を発現するＣＯＳ細胞を、α−マウスＩｇＧ及びＩｇＭで被膜した磁気ビードで取り除いた。次にＣＯＳ細胞を１０μｇ／ｍｌのヒトＣＴＬＡ４Ｉｇ及びマウスＣＤ２８Ｉｇで処理して、マウスＢ７−２を発現するＣＯＳ細胞を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で被膜された皿上でパニングすることによって選別した。三回目の後で、プラスミドＤＮＡを個々のコロニーから作成し、ＤＥＡＥ−デクストラン法でＣＯＳ細胞に形質移入させた。形質移入されたＣＯＳ細胞上でのＢ７−２の発現を、ＣＴＬＡ４Ｉｇを用いた間接免疫蛍光法により分析した。
【０１８３】
最終回の選別後、プラスミドＤＮＡを個々のコロニーから作成した。８つの候補クローンのうち合計６つが、約１．２ｋｂのｃＤＮＡインサートを含んでいた。これら８つのクローンからのプラスミドＤＮＡをＣＯＳ細胞に形質移入させた。１．２ｋｂのｃＤＮＡインサートを持つこれら６つのクローンすべてが、ＣＴＬＡ４Ｉｇを用いた間接免疫蛍光法及びフローサイトメトリ分析法により、Ｂ７−２の発現について強度の陽性であった。
【０１８４】
Ｃ．配列決定 
クローン４のＢ７−２ｃＤＮＡインサートの配列を、ｐＣＤＭ８発現ベクタにおいて以下の方法により決定した。最初の配列決定は、クローン化Ｂ７−２ｃＤＮＡに隣接するｐＣＤＭ８ベクター配列の相同である配列決定プライマーＴ７、ＣＤＭ８Ｒ（インビトロゲン）を用いて行った（表IIを参照されたい）。配列決定は、ダイターミネータ化学法及びＡＢＩ自動化ＤＮＡシーケンサを用いて行った（ABI，Foster City，CA）。これらのプライマーを用いて得られたＤＮＡ配列を用いて、更なる配列決定プライマーを設計した（表IIを参照されたい）。配列決定及び更なるプライマーの選択というこのサイクルを、マウスＢ７−２ｃＤＮＡの両方の鎖について完全に配列決定するまで続けた。
表II
T7(F)    （配列同定番号第３番）  5'd[TAATACGACTCACTATAGGG]3’
CDM8(R)（配列同定番号第４番）  5'd[TAAGGTTCCTTCACAAAG]3’
MBX4-IF（配列同定番号第２４番） 5'd[ACATAAGCCTGAGTGAGCTGG]3’
MBX4-2R（配列同定番号第２５番） 5'd[ATGATGAGCAGCATCACAAGG]3’
MBX4-14（配列同定番号第２６番） 5'd[TGGTCGAGTGAGTCCGAATAC]3’
MBX4-2F（配列同定番号第２７番） 5'd[GACGAGTAGTAACATACAGTG]3’ 
【０１８５】
９２７のヌクレオチドの一本の長い開放読み枠と、３’非符号配列の約１２６のヌクレオチドを持つ１，１６３個の塩基対のインサートを含んだマウスＢ７−２クローン（ｍＢ７−２、クローン４）を得た。(図１４Ａ−Ｄ（配列同定番号第２２番））。図１４Ａ−Ｄにおいて、タンパク質の開放読み枠により符号化される、予測されたアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列の下に示す。符号化されたマウスＢ７−２タンパク質は、長さで３０９個のアミノ酸残基であると予測される（配列同定番号第２３番））。このタンパク質の配列は、その他の種類ＩのＩｇの上科膜タンパク質と共通の特徴を数多く呈する。タンパク質の翻訳は、メチオニンコードン（ＡＴＧ）ヌクレオチド１１１から１１２）において、コンセンサス真核性翻訳開始域を備えたこの部位のＤＮＡ同族関係に基づいて開始すると予測されている（Kozak，M.(1987)Nucl．Acids Res．15:8125-8148を参照されたい）。マウスＢ７−２タンパク質（アミノ酸１から２３まで）のアミノ末端は、位置２３のアラニンと位置２４のバリンとの間で分裂の予測される分泌信号ぺプチドという特徴を有する（von Heijne(1986)Nucl．Acids Res．14:4683）。この域での処理の結果、約３２ｋＤａの分子量を改変しないまま有する、２８６のアミノ酸から成るマウスＢ７−２膜結合タンパク質が生じるであろう。このタンパク質は、約２４から２４６までのアミノ酸残基で成る細胞外Ｉｇ上科Ｖ及びＣ様ドメイン、約２４７から２６５までのアミノ酸残基で成る疎水性膜内外ドメイン、及び、約２６６から３０９までのアミノ酸残基で成る長い細胞質ドメインから構成されるであろう。Ｉｇ上科に対する同族関係は、システインにより位置４０から１１０及び１５７から２１８で結合される細胞外部位の中の二つの近接するＩｇ様のドメインのためである。この細胞外ドメインは更に、９つの潜在Ｎ連結グリコシレーション部位を含むが、マウスＢ７−１と同様、おそらくは糖付加を行っているであろう。マウスＢ７−２タンパク質のグリコシレーションにより、分子量は約５０から７０ｋＤａに増加するであろう。マウスＢ７−２の細胞質ドメインは、おそらくはＡＰＣ内で信号伝達又は調節ドメインとして機能する正電荷アミノ酸を引き連れたシステインを有する共通域を含んでいる。マウスＢ７−２のヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方をGenBank及びEMBLのデータベースに比較すると、ヒト及びマウスＢ７−１に対して著しい同族関係（約２６％のアミノ酸配列が同一）にあることが分かった。マウスＢ７−２は、そのヒト同族体であるｈＢ７−２に対して約５０％の同一性及び約６７％の類似性を呈する。マウスＢ７−２（クローン４）を符号化するｃＤＮＡインサートを含有するベクター（プラスミドｐｍＢ×４）で形質移入させた大腸菌（ＤＨ１０６／ｐ３）は、米国代表菌株培養収集（ＡＴＣＣ）に、登録番号６９３８８で１９９３年８月１８日に寄託されている。
【０１８６】
Ｄ． 相互促進 
トリス−ＮＨ４Ｃｌによる処理により、まず赤血球を除去してＣＤ４＋マウスＴ細胞を精製した。Ｔ細胞を、ナイロンウールカラム上を通過させて濃縮した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＭＨＣクラスII及び抗Ｃｄ２８ｍＡｂ並びにウサギ補体の混合物による二回の処理で精製した。マウスＢ７−１（Dr．Gordon Freeman,Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MAより入手；Freeman,G.J.,et al.（1991）J.Exp．Med．174,625-631も参照されたい）マウスＢ７−２、及びベクターで形質移入したＣＯＳ細胞を、形質移入から７２時間後に回収し、２５μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで１時間インキュベートし、よく洗浄した。１０５マウスＣＤ４＋Ｔ細胞を、１ｎｇ／ｍｌのホルボールミスチリン酸（ＰＭＡ）及び２×１０４のＣＯＳトランスフェクタントでインキュベートした（表II）。Ｔ細胞の増殖を、７２時間のインキュベーションのうち最後の１２時間について３Ｈチミジン（１μＣｉ）の取込みで計測した。
表III 
３Ｈチミジン取込み（ｃｐｍ）ＣＤ４＋Ｔ細胞                                                            １７５
ＣＤ４＋Ｔ細胞＋１ｎｇ／ｍｌＰＭＡ                                          ４９
ＣＤ４＋Ｔ細胞＋ＣＯＳベクター                                          １７５０
ＣＤ４＋Ｔ細胞＋ＣＯＳＢ７−１                                          ４４００
ＣＤ４＋Ｔ細胞＋ＣＯＳＢ７−２                                          ２２３６
ＣＤ４＋Ｔ細胞＋１ｎｇ／ｍｌＰＭＡ＋ＣＯＳベクター                      ２３５４
ＣＤ４＋Ｔ細胞＋１ｎｇ／ｍｌＰＭＡ＋ＣＯＳＢ７−１                    ６７９３５
ＣＤ４＋Ｔ細胞＋１ｎｇ／ｍｌＰＭＡ＋ＣＯＳＢ７−２                    ４３８４７
【０１８７】
[例７]
ヒトＢ７−２免疫グロブリン融合タンパク質の構成及び特徴
Ａ． ヒトＢ７−２１融合タンパク質の作成 
ヒトＢ７−２の細胞外部分を、免疫グロブリン不変部と結合した融合タンパク質として作成した。免疫グロブリン不変部には、免疫グロブリンの構造に内在するエフェクター活性を減じる又は無くすものを含む遺伝子的改変が含まれていることがある。簡単に言うと、ｈＢ７−２の細胞外部分を符号化するＤＮＡを、命令された変異誘発により改変されたヒトＩｇＣγ１又はＩｇＣγ４の蝶番、ＣＨ２及びＣＨ３域を符号化するＤＮＡに接続した。これは以下の小項で説明した方法で達成された。
【０１８８】
Ｂ． 遺伝子融合の準備 
対象ＤＮＡ配列に対応するＤＮＡ断片を、いかに述べるプライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作成した。概要としては、ＰＣＲ反応は、プライマー（それぞれ１μＭ）、ｄＮＴＰ（それぞれ２００μＭ）１ｎｇの鋳型ＤＮＡ、及びＴａｑ、ポリメラーゼを含んだ、１００μｌ最終容量のＴａｑポリメラーゼ緩衝液（Gene Amp PCR Kit，Perkin-E1mer/Cetus，Norwalk，CT）で作成した（Saiki，R.K.，et al.（1988） Science 239:487-491）。ＰＣＲ ＤＮＡ増幅をサーモサイクラー（Ericomp，San Diego，CA）で２５から３０サイクル行ったが、このサイクルはそれぞれ、変性ステップ（９４℃で１分間）と、復元ステップ（５４℃で３０秒間）と、鎖延長ステップ（７２℃で１分間）とからなるものである。各ｈＢ７−２Ｉｇ遺伝子融合の構造は、分泌を容易にする信号
配列が、Ｂ７−２の細胞外ドメイン及びその蝶番に接続したもの、ヒトＩｇＣγ１又はＩｇＣγ４のＣＨ２及びＣＨ３ドメインから構成されていた。ＩｇＣガンマ１及びＩｇＣガンマ４の配列は、ジスルフィド結合形成に利用できるシステイン残留分とセリン残留分とを交換するためにヌクレオチド変更を蝶番域に含んでいたが、Ｆｃレセプターに結合するＩｇＣ及び活性化を補助するのに必要だと考えられる、ＣＨドメイン内のアミノ酸を取り換えるためのヌクレオチド変更も含まれているかも知れない。
配列分析を行ったことで、ｍγ４及びγ１クローンの両方の構造が確認でき、各構成物を用いて、過渡的発現をテストするべく２９３細胞を形質移入させた。
ｈＩｇＧのＥＬＩＳＡ検定の結果、過渡的発現レベルはほぼ、両方の構成物について１００ｎｇタンパク質／ｍ細胞上澄み液に等しいことを計測／確認した。ＮＳＯ細胞系は、融合タンパク質永久発現する形質移入を行った。
【０１８９】
Ｃ． ｈＢ７−２Ｉｇ融合タンパク質の遺伝子構造
（１）信号配列の作成 
ＰＣＲ増幅法を用いて、咄乳類の細胞からＢ７−２Ｉｇ融合タンパク質を分泌させるのに適した免疫グロブリン信号配列を生じさせた。Ｉｇ信号配列は、オリゴヌクレオチド5'-GGCACTAGGTCTCCAGCTTGAGATCACAGTTCTCTCTAC-3’(＃01)（配列同定番号第３２番）を前方プライマーとして、及びオリゴヌクレオチド5'-GCTTGAATCTTCAGAGGAGCGGAGTGGACACCTGTGG-3’(＃02)（配列同定番号第３３番）を逆ＰＣＲプライマーとして用いて、マウスＩｇＧＨ鎖遺伝子（Orlandi，R.et al.(1989)Proc．Natl．Acad．Sci USA,86:38333837）を含むプラスミドから作成した。
前方ＰＣＲプライマー（配列同定番号第３２番）は、制限酵素ＢｓａＩのための認識配列を含み、Ｉｇ信号配列の配列５’から開始メチオニンまでは相同関係にある。逆ＰＣＲプライマー（配列同定番号第３３番）は、ｈＢ７−２の細胞外ドメインの５’端部から得た配列と、Ｉｇ信号配列の３’端部から得たものとから構成されている。これらのプライマーを用いた、マウスＩｇ信号鋳型ＤＮＡをＰＣＲ増幅した結果、ｈＢ７−２の細胞外ドメインの符号化配列のうち最初の２０のヌクレオチドに融合したＩｇ信号域の配列を引き連れたＢｓａＩ制限部位から成る２２４ｂｐ生成物が生じた。信号配列とｈＢ７−２との間の接合部は、信号
配列で開始したタンパク質翻訳が、正しい読み枠のｈＢ７−２に続いていくようになっている。
【０１９０】
（２）ｈＢ７−２遺伝子セグメントの作成
ｈＢ７−２遺伝子の細胞外ドメインを、発現ベクターｐＣＤＮＡＩに挿入されたｈＢ７−２ｃＤＮＡを含むプラスミドのＰＣＲ増幅により作成した（Freemanet al．Science 262:909-11(1994)）。
【０１９１】
ｈＢ７−２の細胞外ドメインを、オリゴヌクレオチド5'-GCTCCTCTGAAGATTCAAGC-3'(＃03)（配列同定番号第３４番）を前方プライマーとして、及びオリゴヌクレオチド5'-GGCACTATGATCAGGGGGAGGCTGAGGTCC-3'(＃04)（配列同定番号第３５番）を逆プライマーとして用いてＰＣＲ増幅により作成した。前方プライマーは、Ｂ７−２細胞外ドメインのうち最初の２０のヌクレオチドに対応する配列を含み、逆ＰＣＲプライマーは、ＢｅｌＩ制限部位及び７つの非符号ヌクレオチドを引き連れたＢ７−２細胞外ドメインの最後の２２のヌクレオチドに対応する配列を含んでいた。プライマー＃３（配列同定番号第３４番）及び＃４（配列同定番号第３５番）によるＰＣＲ増幅は、特異なＢｅｌＩ制限部位を引き連れたｈＢ７−２の細胞外ＩｇＶ及びＩｇＣ様ドメインに対応する６７３ｂｐ生成物を生じる。
【０１９２】
信号配列は以下のようにしてＰＣＲによりｈＢ７−２の細胞外部分に付着させた。信号配列に対応する上で得たＤＮＡ−ＰＣＲ生成物と、ｈＢ７−２細胞外ドメインとを等モル量混合し、１００℃まで加熱した後５４℃で３０℃維持して変性させて補助端部をアニールし、ｄＮＴＰ及びＴａｑポリメラーゼを用いて鎖のすき間を埋めた。ＰＣＲプライマー＃１（配列同定番号第３２番）及び＃４（配列同定番号第３５番）を加えて、断片全体をＰＣＲ増幅により生成して、ＢｅｌＩ制限部位を引き連れた、ｈＢ７−２の細胞外ドメインに融合した信号配列を引き連れたＢｓａＩ制限部位から成る８８０までの断片を生じさせた。
【０１９３】
（３）免疫グロブリン融合ドメインのクローニング及び改変 
ヒトＩｇＧＩＨ鎖ゲノムＤＮＡの２０００ｂｐ-セグメント（Ellison,J.W.,etal.（1982）Nucl．Acids．Res．10:4071-4079）を、クローニングベクターｐｓＰ７２（Promega，Madison，WI）の複数のクローニング部位にクローニングすることで、プラスミドｐＳＰ７２ＩｇＧｌを作成した。プラスミドｐＳＰ７２１ＩｇＧｌは、ＣＨ１と、蝶番と、Ｈ鎖ヒトＩｇＣγ１遺伝子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインとを符号化するゲノムＤＮＡを含んでいた。介在するＤＮＡに沿ったＨ鎖の蝶番−ＣＨ２−ＣＨ３部分を増幅するよう設計されたＰＣＲプライマーは、以下のようにして作成した。前方ＰＣＲプライマー5'-GCATTTTAAGCTTTTTCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCTCCACCGTCTCCAGGTAAGCC-3’（配列同定番号第３６番）は、HindIII及びＢｅｌＩ制限部位を含み、三つのシステイン残留分をセリンに変えることとなるであろう５つのヌクレオチドの置換を除いて蝶番ドメイン配列と同族関係にあった。逆ＰＣＲプライマー5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3'（配列同定番号第３７番）は、市販されているＴ７プライマー（Promega，Madison，WI）と同一であった。これらのプライマーによる増幅の結果、HindIII及びＢｃｌＩ制限部位により５’端部上に、そしてBamHI、Smal、Kpnl、Sacl、 EcoRｌ、Clal、EcoR5及びBgIII制限部位により３’端部上に結合した１０５０ｂｐ断片が生じた。この断片はＩｇＣ蝶番ドメインを含んでいたが、このドメインでは三つのシステインコードンが、イントロン、ＣＨ２ドメイン、イントロン、ＣＨ３ドメイン及び更なる３’配列を引き連れたセリンコードンに置き換えられていた。ＰＣＲ増幅後、ＤＮＡ断片を、HindIII及びEcoR1で蒸解させて同じ制限酵素で蒸解された発現ベクターｐＮＲＤＳＨにクローン化した。これでプラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１が生じた。
【０１９４】
同じようなＰＣＲを基にした方法を用いて、ヒトＩｇＣガンマ４不変部の蝶番−ＣＨ２−ＣＨ３−ドメインをクローンした。完全なＩｇＣガンマ４Ｈ鎖ゲノム配列（Ellison，J．Buxbaum，J．及びHood，L.E．（1981）DNA1:11-18）を含んだプラスミド、ｐ４２８Ｄ(Medical Research Council, London, England)を鋳型として用い、オリゴヌクレオチド5'GAGCATTTTCCTGATCAGGAGTCCAAATATGGTCCCCCATCCCATCATCCCCAGGTAAGCCAACCC-3'（配列同定番号第３８番）を前方プライマーとして、及びオリゴヌクレオチド5'GCAGAGGAATCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCCAGTGTGGGGACAGTGGGACCGCTCTGCCTCCC-3'（配列同定番号第３９番）を逆ＰＣＲプライマーとして用いてＰＣＲ増幅を行った。前方ＰＣＲプライマー（配列同定番号第３８番）は、ＩｇＣガンマ４の蝶番ドメインのための符号配列を引き連れたＢｃｌＩ制限部位を含む。ヌクレオチドの置き換えは蝶番域で行われてシステイン残分をセリンと置き換えていた。逆ＰＣＲプライマー（配列同定番号第３９番）は、ＰｓｐＡＩ制限部位(5'CCCGGG-3')を含む。これらのプライマーを用いたＰＣＲ増幅の結果、１１７９ｂｐＤＮＡ断片を生じる。このＰＣＲ生成物をＢｃｌＩ及びＰｓｐＡＩで蒸解し、同じ制限酵素で蒸解させたｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１に結紮してプラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４を生じさせた。この反応では、ＩｇＣγ４ドメインは、 ｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１にあるＩｇＣγ１ドメインと置き換わった。
【０１９５】
Ｆｃレセプターに対する結合に関係があると考えられるアミノ酸と置き換えるためのＩｇＣ中のＣＨ２ドメインの改変は、以下のようにして達成した。プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１をＩｇＣγ１ＣＨ２ドメインの改変の鋳型として働かせ、そしてプラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４をＩｇＣｖ４ＣＨ２ドメインの改変の鋳型として働かせた。プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１は、前方ＰＣＲプライマー（配列同定番号第３６番）と、逆ＰＣＲプライマーとしてオリゴヌクレオチド5'-GGGTTTTGGGGGGAAGAGGAAGACTGACGGTGCCCCCTCGGCTTCAGGTGCTGAGGAAG-3'（配列同定番号第４０番）とを用いてＰＣＲ増幅した。前方プライマー（配列同定番号
第３６番）は前述しており、逆ＰＣＲプライマー（配列同定番号第４０番）は、アミノ酸２３４、２３５及び２３７（Canfield,S.M.及びMorrison,S.L.（1991）
J．Exp．Med．173:1483-1491）の、それぞれLeuからAlaへ、LeuからGluへ、GlyからAlaへ変更するよう設計された５つのヌクレオチド置換を除き、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメインのアミノ末端部分と相同関係にあった。これらのＰＣＲプライマーによる増幅により、改変した蝶番ドメインと、イントロンと、ＣＨ２ドメインの改変部分とから成る２３９ｂｐＤＮＡ断片が生じるであろう。プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１は更に、前方プライマーとしてオリゴヌクレオチド5'-CATCTCTTCCTCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCC-3'（配列同定番号第４１番）と、逆ＰＣＲプライマーとしてオリゴヌクレオチド（配列同定番号第３７番）とによりＰＣＲ増幅された。前方ＰＣＲプライマー（配列同定番号
第４１番）はプライマー（配列同定番号第４０番）に対して補完的なものであり、ＣＨ２アミノ酸置き換えのために必要な５つの補完的ヌクレオチド変更を含んでいる。逆ＰＣＲプライマー（配列同定番号第３７番）は前述した。これらのプライマーによる増幅で、ＣＨ２ドメインの改変部分、イントロン、ＣＨ３ドメイン及び３’追加配列から成る８７５ｂｐ断片が生まれる。改変された蝶番ドメイン、改変されたＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインから成る完全なＩｇＣγ１セグメントを、更なるＰＣＲ反応により作成した。上述の二つのＰＣＲ反応の精製生成物を混合し、変性（９５℃で１分間）した後、復元（５４℃で３０秒間）させて、二つの断片の補完端部をアニールさせた。ｄＮＴＰ及びＴａｑポリメラーゼを用いて鎖のすき間を埋め、前方ＰＣＲプライマー（配列同定番号第３６番）
及び逆ＰＣＲプライマー（配列同定番号第３７番）を用いて、断片全体をＰＣＲ増幅した。その結果得られた１０５０ｂｐの断片を精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲ１で蒸解し、同じ制限酵素で予め蒸解させたｐＮＲＤＳＨに結紮してプラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧｌｍを生じさせた。
【０１９６】
免疫グロブリン位置２３５及び２３７の二つのアミノ酸を、それぞれ、LeuからGluへ、GlyからAlaへＩｇＣγ４ＣＨ２ドメインで変更してＦｃレセプター結合を消滅させた。プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４は、前方プライマー（配列同定番号第３８番）、及び、逆プライマーとしてオリゴヌクレオチド5'-CGCACGTGACCTCAGGGGTCCGGGAGATCATGAGAGTGTCCTTGGGTTTTGGGGGGAACAGGAAGACTGATGGTGCCCCCTCGAACTCAGGTGCTGAGG-3’（配列同定番号第４２番）を用いてＰＣＲ増幅した。前方プライマーは前述しており、逆プライマーは、上述のアミノ酸を置き換えるよう設計された三つのヌクレオチド置換を除き、ＣＨ２ドメインのアミノ末端部分に対して同族関係にあった。このプライマーは更に、次のクローニングのためのＰｍｌＩ制限部位を含んでいた。これらのプライマーを用いた増幅により、改変された蝶番域、及びイントロン、並びにＣＨ２ドメインの改変５’部分から成る２６５ｂｐ断片が生じる。
【０１９７】
プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４を更に、前方プライマーとしてオリゴヌクレオチド5'- CCTCAGCACCTGAGTTCGAGGGGGCACCATCAGTCTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCG-3’（配列同定番号第４３番）、及び逆ＰＣＲプライマーとしてオリゴヌクレオチド（配列同定番号第３９番）を用いてＰＣＲ増幅した。前方ＰＣＲプライマー（配列同定番号第３９番）はプライマー（配列同定番号第４２番）に対して補完的であり、ＣＨ２アミノ酸置換に必要な三つの補完的ヌクレオチド変更を含んでいる。逆ＰＣＲプライマー（配列同定番号第３９番）は前述した。これらのプライマーを用いた増幅により、ＣＨ２ドメインの改変された部分、イントロン、ＣＨ３ドメイン、及び３’追加配列から成る１０１２ｂｐ断片が生じる。二つの上述のＰＣＲ反応の精製生成物を混合し、変性し（９５℃で１分間）、その後復元させ（５４℃で３０秒）ることで、二つの断片の補完端部をアニールさせた。ｄＮＴＰ及びＴａｑポリメラーゼを用いて鎖のすき間を埋め、前方ＰＣＲプライマー（配列同定番号第３８番）及び逆ＰＣＲプライマー（配列同定番号第３９番）を用いて、断片全体を増幅した。その結果得られた１１７９ｂｐの断片を精製し、ＢｃＩＩ及びＰｓｐＡＩで蒸解し、同じ制限酵素で予め蒸解させたｐＮＲＤＳＨに結紮してプラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４ｍを生じさせた。
【０１９８】
（４）最終ｎＢ７−２Ｉｇ遺伝子の組立 
上で作成したＩｇ信号−ｈＢ７−２遺伝子融合に対応するＰＣＲ断片をＢｓａＩ及びＢｃＩＩ制限酵素で蒸解させ、予めHindIII及びBcllで蒸解させたｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１、ｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１ｍ、ｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４、及びｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４ｍに結紮した。結紮されたプラスミドを、Ｃａｃ１２コンピテント細胞を用いて大腸菌ＪＭ１０９に転換し、転換体を、アンピシリン含有Ｌ−寒天（５Oμｇ／ｍｌ;Molecular Clonlng:A Laboratory Manual(1982)Eds．Man1atis, T., Fritsch,E.E., 及び Sambrook, J.Cold Spring HarborLaboratory）上で選別した。転換した大腸菌から分離したプラスミドを、制限酵素蒸解により分析した。信号ｈＢ７−２ＩｇＧ遺伝子融合セグメントの全ての部分を確認すべく、予期した制限プラスミドを持つプラスミドを配列決定した。
【０１９９】
Ｄ． ｈＢ７−２Ｖ−ＩｇＧ１及びｈＢ７−２ＣＩｇＧ１の発現クローンニング 
ヒトのＢ７−２の可変及び不変ドメインは、別々にｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１にクローンニングされた。これらのクローンニングは、ＰＣＲを用いて達成された。可変及び不変部に対応するｈＢ７−２部分は、イントロン／エキソン遺伝子地図及び以前に出版された遺伝子構造分析によって測定された。
ヒトのＢ７−２の可変ドメイン
2008142084.tif 000003
【０２００】
（１） ｈＢ７−２ＶＩｇのアセンブリ 
ｈＢ７−２ＶドメインＩｇ配列は上に示されたものと同様にＰＣＲ法を用いて組立てられた。信号配列は、オリゴヌクレオチド５’ＧＣＡＡＣＣＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＧー３’（＃０５）（配列同定番号第４８番）を正ＰＣＲプライマーとして、又５’ＡＧＴＣＴＣＡＴＴＧＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧ−３’（＃０６）（配列同定番号第４９番）を逆プライマーとして用いて、オンコＭ遺伝子を含むプラスミドをＰＣＲ増幅することによってオンコＭ遺伝子から誘導された。正ＰＣＲプライマー（＃０５）（配列同定番号第４８番）は、オンコＭ信号配列のハインドＩＩＩ制限部位及びアミノ酸末端部分を含む。逆ＰＣＲ（＃０６）（配列同定番号第４９番）は、ｈＢ７−２ＩｇＶ様のドメインの５’端と融合されたオンコＭ信号配列の３’部分に対応する配列を含む。 ｈＢ７−２ＩｇＶ様のドメインは、オリゴヌクレオチド５’−ＣＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＡＴＴＴＣＡＡＴＧＡＧＡＣ−３’（＃０７）（配列同定番号第５０番）を正ＰＣＲプライマーとして、オリゴヌクレオチド５’−ＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＣＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＣＴＧＡＣＡＧＴＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣ−３’（＃０８）（配列同定番号第５１番）を逆ＰＣＲプライマーとして用いて、又ｈＢ７−２ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅することによって得られた。これらのプライマーによるＰＣＲ増幅は、５’端上のオンコＭ信号配列の３’端の部分及び３’端上のＢｃｌ 制限部位で、ｈＢ７−２ＩｇＶドメインを生じる。信号及びＩｇＶドメインは、等モル量のオンコＭ信号及びＩｇＶドメインＤＮＡ断片が混合、変性、アニール化され、そしてストランドが組込まれたＰＣＲ反応に於いて共に連結された。正プライマー＃０５（配列同定番号第４８番）及び逆プライマー＃０８（配列同定番号第５１番）を用いて、引き続きＰＣＲ増幅すると、ＢｃｌＩ制限部位が連なるｈＢ７−２ＩｇＶドメインと融合されたオンコＭ信号に連なって、ハインドＩＩＩ制限部位を含んでいるＤＮＡ断片を生じた。このＰＣＲ断片は、ハインドＩＩ及びＢｃｌＩで蒸解され、ｐＮＲＤＳＨ／Ｂ７−２ＣＩｇを作るために、同じ制限酵素で蒸解された発現べクタ−ｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１にクローンニングされた。
【０２０１】
（２） ｈＢ７−２ＣＩｇのアセンブリ 
ｈＢ７−２ＩｇＣドメインのための発現プラスミドは、ＩｇＣドメインに特定的なＰＣＲプライマーを用いること以外は、上記説明のように、ＩｇＶドメインために作成された。オノコＭ信号配列は、オリゴヌクレオチド＃０５（配列同定番号第４８番）を正ＰＣＲプライマーとして、又オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＡＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＣＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧ−３’（＃９）（配列同定番号第５２番）を、逆ＰＣＲプライマーとして用いて作成された。ｈＢ７−２ＩｇＣドメインは、オリゴヌクレオチド５’−ＣＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＴＣＡＡＣＣＴＧＡＡＡＴＡＧＴＡＣＣＡＡＴＴＴＣ−３’（＃１１）（配列同定番号第５３番）を、逆ＰＣＲプライマーとして用いて作成された。その２つのＰＣＲ生成物は、オンコＭ信号配列をｈＢ７−２ＩｇＣドメインで組立てるために、プライマー＃５（配列同定番号第４８番）及び＃１１（配列同定番号第５３番）で、混合及び増幅された。ＰＣＲ生成物は、最終発現プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ｈＢ７−２ＣＩｇＧ１を生成するために、引き続いてハインドＩＩＩ及びＢｃｌＩで蒸解され、又同様の制限酵素で蒸解されたｐＮＲＤＳＨ／ｈＢ７−２ＣＩｇＧ１と結さつされた。
【０２０２】
Ｅ． ヒトのＢ７−２Ｉｇ融合タンパク質による競合的結合アッセイ 
ＣＴＬＡ４に対する、様々な型をとる可溶性Ｂ７−１及びＢ７−２タンパク質の結合親和性を測定するために、競合的結合アッセイが、これらのタンパク質で実施された。これらのアッセイで用いられた可溶性Ｂ７−２ＶＩｇ、Ｂ７−２ＣＩｇ、Ｂ７−２Ｉｇ及びＢ７−ｌＩｇ融合タンパク質が、次ぎのように発現され、又純化された。
【０２０３】
ヒトのＢ７−２ＶＩｇ、Ｂ７−２ＣＩｇ及びＢ７−２Ｉｇ融合タンパク質を符号化する発現ベクターの作成は上記に説明されている。Ｂ７−１の細胞外ドメインに連結されたオンコＭリーダー配列を含んでいるＢ７−1Ｉｇ融合タンパク質を符号化する発現ベクターは同様に、ＰＣＲプライマーオンコＭＢ７１Ｆ（５’ＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＴＧＣＡＣＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＡＴＧＧＣＧＡＧＡＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＡＣＴＴＣ３’、配列同定番号第５４番）及びＢ７１／ＢｃｌＩ（５’ＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡＡＡＡＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＴＧ３’、配列同定番号第５５番）を用いて作成された。ヒトのＢ７−１ｃＤＮＡ配列（ヒトのＢ７−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、Freeman、G.J.等、(1989)J.Immunol.143:2714-2722に開示されている）に連結されたオンコＭリーダー配列を含んでいるプラスミドは、このＰＣＲ反応に於ける鋳型として用いられた。
【０２０４】
Ｂ７Ｉｇ融合タンパク質は、ＣＯＳ細胞或いはチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞のトランスフェクション及びそのインキュベーション液の上澄み液からのタンパク質の純化によって作成された。細胞インキュベーション試薬は、Giboco-BRL，Gaithersburg）MD.から得られた。ＣＨＯ細胞は、１０％のウシの胎児の血清（ＦＢＳ）及びグルタミンが補充されたアルファＭＥＭに於いて保存された。ぺニシリン、ストレプトマイシン及びフンギソンが、典型的に加えられた。ＣＯＳ細胞は、１０％ＦＢＳが加えられたＤＭＥＭに於いて保存され、又ＣＨＯ細胞に関して説明されたように補充された。細胞はすべて、温度摂氏３７度、二酸化炭素濃度５％で、加湿されたインキュベーション器の中で保存された。ｈＢ７−ｌＩｇ構成体以外のすべての融合構成体は、ＣＯＳ細胞中で過渡的に発現された。典型的な過渡的トランスフェクションは、血清が含まれていないＤＭＥＭに於いて、２００μｇｓ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン、１００μＭのクロロキン及び１０ｃｍのディッシュ当たり５μｇｓのＤＮＡを用いて実施された。細胞は空胞が認められるまで処理され、又細胞は苦しんでいるように見受けられた（約３時間）。細胞は、２分間、１０％のＤＭＳＯ／ＰＢＳでショックを与えられ、その後一晩ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳでインキュベーションされた。翌朝、その媒体はＤＭＥＭ／無血清へと変化し、トランスフェクション後７２時問で摘出されるまでそのままに置かれた。ｈＢ７−ｌＩｇ構成体は、リン酸カルシウムでのトランスフェクションによってＣＨＯ細胞にトランスフェクションされた。
その系(line)は、ゲネティシン（Ｇ４１８）抵抗選択を用いて安定化され、発現は、メトトレキサート及びヌクレオチドを含まないアルファＭＥＭを用いて増幅された。
【０２０５】
全ての過渡的にトランスフェクションされた構成体（即ち、ｈＢ７−１I以外の全ての構成体）ために、過渡的にトランスフェクションされたホスト細胞によって作られたＩｇ融合タンパク質ために強化された媒体は、トランスフェクション後７２時間で摘出された。ホスト細胞によって作られたＩｇ融合タンパク質の量は、インキュベーション液の上澄み液で、抗ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡアッセイを実施することによって測定された。このアッセイのために、マキシソーププレート（Nunc、Denmark）は、ＰＢＳに於いて２０μｇｓ／ｍｇのヤギの抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Zymed、San Francisco、CA）で、一晩被覆された。そのプレートは、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで１時間遮断され、その後もう一時間、トランスフェクションされた細胞からの細胞インキュベーション上澄み液でインキュベーションされた。ＰＢＳ／０．０５％トイーンで５回洗浄された後、ＨＲＰ結合されたヤギの抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Zymed）が、ＰＢＳに於いて、１：１０００の希釈度で加えられた。一時間のインキュベーション後、そのプレートは再度洗浄され、その後上記説明のように、ＡＢＴＳキット（Zymed）を用いて酵素によって顕色させた。
【０２０６】
発現水準は、その構成体に対しておよそ３μｇ／ｍｌであった。Ｂ７Ｉｇ融合タンパク質は、次のようにＡタンパク質純化によってトランスフェクションされたホスト細胞の上澄み液から純化された。Ａタンパク質セファローズＩＰＡ３００（RePligen）Cambrige、 MA）は、ＯＢＢ（１．５Ｍグリシン、３Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．９）に於いて洗浄され、ＤＭＥＭに於いて再懸濁され、又１ｍｌ／ｌの上澄み液の比率で、細胞インキュベーション上澄み液に加えられた。その溶液は、徐々に混合するために一晩摂氏４度でそのままにされた。その後、Ａタンパク質セファローズは粒状にされ、大部分の上澄み液は取除かれ、そしてその残存上澄み液は、ポリプレップコラム（BioRad、Hercules、CA）上へ負荷する前に、Ａタンパク質セファローズを再懸濁させるために用いられた。その列は、ＯＢＢで強力に洗浄され、又免疫グロブリン融合タンパク質は、０．１Ｍクエン酸ナトリウムで溶出された。半分の量の列の洗浄液は、１／１０の量の１Ｍトリス（ｐＨ９．０）の中へ集められた。断片を含むタンパク質は、標準的な比色計による反応（BloRad）によって確認され、貯留され、そして６０００から８０００ＫＤの透析管でのＰＢＳに対して一晩透析された。純化されたタンパク質は、期待どおりの大きさと高い純度があり、アクリルアミッドゲルでコマッシーブルーによって着色された全タンパク質の９０％以上に相当していた。
【０２０７】
生チニレート化されたＣＴＬＡ４Ｉｇを，不活性化されたＢ７−２Ｉｇに結合させるのを競合的に阻害する様々なＢ７族Ｉｇ融合タンパク質の能力が測定された。競合結合アッセイは、以下のように実施され、又マクファーソン（McPherson）G.A.(1985)J.Pharmacol.Methods14:213-228）に準拠して分析された。可溶性ｈＣＴＬＡ４Ｉｇは、およそ２ｘ１０６ｃｐｍ／ｐｍｏｌの特定的な活動に対して１２５Ｉで標識付けされた。ｈＢ７−２−Ｉｇ融合タンパク質は、１０ｍＭ３ＨＣｌ、ｐＨ８．０、ウエル当り５０ｍｌの中で１０ｍｇ／ｍｌの比率で、マイクロタイタープレート上に一晩被覆された。そのウエルは、室温で２時間、結合緩衝液（熱によって不活性化された１０％のＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ、及びｐＨ６．８の５０ｍＭＢＥＳを含むＤＭＥＭ）で遮断された。完全な長さのＢ７−２（ｈＢ７−２Ｉｇ）、完全な長さのＢ７−１（ｈＢ７−１Ｉｇ）、Ｂ７−２可変部様のドメイン（ｈＢ７−２ＶＩｇ）及びＢ７−２不変部様のドメイン（ｈＢ７−２Ｃｌｇ）を含む標識付けされていない競合Ｉｇ融合タンパク質の存在如何に拘わらず、標識付されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ（４ｎＭ）は、各々のウエルに加えられ、又室温で２．５時間、結合が可能であった。そのウエルは、十分冷却された結合緩衝液で一回洗浄され、その後十分冷却されたＰＢＳで４回洗浄された。結合された放射能は、０．５Ｎの水酸化ナトリウムによってウエルを５分間処理することで回復され、そして可溶化された物質は、取除かれ、又ガンマカウンターで計測された。ｈＢ７−２Ｉｇ（１０から２０ｎＭ）及びｈＢ７−２ＶＩｇ（３０から４０ｎＭ）の双方が、ＣＴＬＡ４Ｉｇと不活性化されたＢ７−２タンパク質との結合を競合して阻害するこれらのアッセイの結果が、図１５に示されている。ｈＢ７−２ＣＩｇは、可溶性ＣＴＬＡ４と競合することができ、Ｂ７−２結合部は可変部様のドメインで見いだされることを示している。
【０２０８】
Ｆ． Ｂ７−１及びＢ７−２融合タンパク質のための競合的結合アッセイ 
組替えＣＴＬＡ４ＩｇのｈＢ７−１或いはｈＢ７−２に結合する能力が、次のように競合的結合ＥＬＩＳＡアッセイで評価された。純化された組替えＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＰＢＳに於いて２０μｇ／ｍｌ）は、５０μＬの中で、室温で一晩、コスターＥＩＡ／ＲＩＡ９６ｗｅｌｌ マイクロタイターディッシュ（Costar Corp、Cambridge MA、USA）に結合された。ウエルは２００μＬのＰＢＳで３回洗浄され、又その非結合部位は、室温で１時間、ＰＢＳに１％のＢＳＡ（２００μｌ／ｗｅｌｌ）を加えることで遮断された。ウエルは、上記のように洗浄された。
ビオチニル化されたＢ７−ｌＩｇ或いはＢ７−２Ｉｇ（１μｇ／ｍｌが、２段階で１５．６ｎｇ／ｍｌまで連続的に希釈された。即ち、５０μＬ）が、各ウエルに加えられ、室温で２．５時間インキュベーションされた。ウエルは、上記のように洗浄された。結合されたビオチニル化Ｂ７−Ｉｇは、室温で３０分間、ストレプトアビジンＨＲＰ(Pierce Chemical Co.,Rockford、IL）の１：２０００の希釈度の５０μｌ／ｗｅｌｌ加えることで、検出された。ウエルは、上記のように洗浄され、５０μｌのＡＢＴＳ（Zymed、California）が加えられ、そして次第に顕われてくる青色が、４０５ｎｍの波長で３０分後、観察された。標識付けされていないＢ７−１Ｉｇ或いはＢ７−２Ｉｇが、ビオチニル化されたＢ７−１Ｉｇ成いはＢ７−２Ｉｇと競合する能力は、上記説明のように非飽和状態（即ち、７０ｎｇ／ｍｌ、つまり１．５ｎＭ）であり、又結合アッセイを実施していることが示されたビオチニル化Ｂ７−１Ｉｇ或いはＢ７−２Ｉｇの量と、様々な量の競合するタンパク質を混合することで、それぞれ評価された。ビオチニル化されたＢ７ー１Ｉｇ成いはＢ７−２Ｉｇに予期された信号の減少（Ａｂｓ４０５ｎｍ）は、不活性化されたＣＴＬＡ４Ｉｇに結合するための競合を示していた。
【０２０９】
ＣＴＬＡ４は、Ｂ７−１に対する高親和性のレセプターであったという前記の証拠を考慮しながら、上記説明のように、ＣＴＬＡ４及びＣＤ２８とＢ７−１及びＢ７−２との結合の親和力が比較された。第１の実験では、Ｂ７−１Ｉｇ或いはＢ７−２Ｉｇは、ビオチンで標識付され、標識付されていないＢ７−１Ｉｇ或いはＢ７−２Ｉｇの濃縮度の増大如何に拘わらず、不活性化されたＣＴＬＡ４−Ｉｇに結合された。その実験は、１２５Ｉで標識付されたＢ７−１Ｉｇ或いはＢ７−２Ｉｇによって繰り返された。代表的な結果が、図１６に示されている（パネルＡではＢ７−１Ｉｇ、パネルＢではＢ７−２Ｉｇ）。この固体相での結合アッセイを用いることで、ＣＴＬＡ４に対するＢ７−２（２．７ｎＭ）の親和力は、Ｂ７−１（４．１ｎＭ）に対して観察された親和力よりもおよそ２倍ほど低いことが測定された。その実験によって測定されたＩＣ５０値は、パネルの右上の隅に示されている。Ｂ７−１及びＢ７−２双方のＣＤ２８に対する新和性は、比較的低かったが、確定的に測定するのは困難であった。
【０２１０】
Ｇ． ＣＴＬＡ４Ｉｇへの改質型Ｂ７族構成体の直接的結合アッセイ 
直接的結合ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｉｇ融合タンパク質のようなＢ７族構成体のＣＴＬＡ４に対する結合水準を測定するために実施された。これらのアッセイのために、免疫グロブリン融合タンパク質がプレートに付着され、そのプレートに、ビオチニル化されたＣＴＬＡ４が結合する量が以下の説明のように測定された。ヌンクのマキシソーププレートは、様々なＢ７Ｉｇ融合タンパク質２０μｇ／ｍｌの株のウエル当たり５０μｌで、或いは上記説明のようなＰＢＳに於ける純化されたヒトのＩｇＧ（Zymed）で、室温で一晩被覆された。ヒトのＣＴＬＡ４Ｉｇ（Repligen）は、ＮＨＳ−ＬＣビオチン（Pierce、Rockford、IL）を用いてビオチニル化された。ビオチニル化されたＣＴＬＡ４Ｉｇが、その量を様々に変化させて、そのプレートに加えられ、室温で２時間インキュベーションされた。そのプレートは、ＰＢＳで５回洗浄され、その後１：１０００の希釈度のストレプトアビジンＨＲＰ（Zymed）が加えられ、３０分間プレート上にそのままにされた。ＰＢＳで更に一連の洗浄が行われた後で、ＨＲＰの反応性が、上記説明のように、ＡＢＴＳキット（Zymed）を用いて測定された。
【０２１１】
図２０で示されているように、その結果で分かることは、半飽和が生じるのは、それぞれ、Ｂ７−１Ｉｇに関しては５００ｐＭで、Ｂ７−２ＶＩｇ及びＢ７−２Ｉｇに関しては５ｎＭ及び８ｎＭで、半飽和が生じたことである。このように、ＣＴＬＡ４Ｉｇは、同様な程度で、Ｂ７−２ＶＩｇ及びＢ７−２Ｉｇ融合タンパク質に結合する。したがって、Ｂ７−２の様々なドメインは、ＣＴＬＡ４に結合するのに十分である。
【０２１２】
Ｈ． ＣＨＯ−ＣＴＬＡ４細胞へのＢ７−２ＶＩｇ、Ｂ７−２Ｉｇ及びＢ７−１Ｉｇの結合 
例７のＦ及びＧ節に示された例では、Ｂ７−２ＶＩｇ及びＢ７−２Ｉｇは、可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇを結合することである。本例は、Ｂ７−２ＶＩｇ及びＢ７−２Ｉｇも同じように、細胞上に発現されたＣＴＬＡ４に結合することが示されている。
【０２１３】
この例のために、標識付けられたＢ７−１Ｉｇ及びＢ７−２Ｉｇ融合タンパク質が、ＣＴＬＡ４を発現するためにトランスフェクションされたＣＨＯ細胞でインキュベーションされ、次のようにフローサイトメトリーによって測定された。
【０２１４】
上記説明のように作成されて、Ｂ７−１及びＢ７−２免疫グロブリン融合タンパク質は、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で２０μｇ／ｍｌに希釈され、ＣＴＬＡ４を発現するようにトランスフェクションされた１０６ＣＨＯ細胞によって、ＣＨＯ／ＣＴＬＡ４細胞表面上で、３０分間氷に付けて、インキュベーションされた。その細胞は、冷却されたＰＢＳ／ＢＳＡで２回洗浄されて、１：５０の希釈度のヤギの抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Zymed）で、３０分間氷に付けて、インキュベーションされた。その細胞は、冷却されたＰＢＳ／ＢＳＡで１回、冷却されたＰＢＳで１回、その後、冷却されたＰＢＳ２５０μｌ中で再懸濁された。その細胞はその後、ＰＢＳに於いて２５０μｌの２％パラフォルムアルデヒド溶液を加えることで、又最低１時間インキュベーションすることで固定され、ＦＡＣＳ（BectonDickinson、SanJose、CA）を用いて、その蛍光性が分析された。同様に、その２次抗体のみを受容する処理済みのＣＨＯ／ＣＴＬＡ４細胞は、背景着色を測定するのに使用された。
【０２１５】
フローサイトメトリーの結果が図２１に示されている。その結果から分かることは、Ｂ７−２Ｉｇ及びＢ７−２ＶＩｇ融合タンパク質は、同程度にＣＴＬＡ４陽性細胞に結合すること（図２１のそれぞれパネルＣ及びＤに示されている）、及びその結合は、ｈＢ７−１ＩｇのＣＨＯ／ＣＴＬＡ４細胞への結合（パネルＥ）より強いことである。
【０２１６】
Ｉ． Ｂ７−２ＶＩｇは、Ｂ７−１Ｉｇ及びＢ７−２Ｉｇに比べてＣＤ２８に対してより大きな親和性を持って結合する 
前節で示された例では、Ｂ７−２ＶＩｇ及びＢ７−２Ｉｇ融合タンパク質が、同様な親和性を持って、ＣＴＬＡ４に結合された細胞膜に結合することが分かった。この例が示しているのは、融合タンパク質は、異なる親和性をもってＣＤ２８に結合すること、また特に、Ｂ７−２ＶＩｇは、Ｂ７−２Ｉｇに比べてより大きな親和性を持って、ＣＤ２８に結合することである。
【０２１７】
ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で２０μｇ／ｍｌで希釈されたＢ７−１及びＢ７−２免疫グロブリン融合タンパク質は、ＣＨＯ／ＣＤ２８細胞表面上で、ＣＤ２８を発現させるためにトランスフェクションされた１０６ＣＨＯ細胞で、３０分聞氷に付けてインキュベーションされた。その細胞は、冷却されたＰＢＳ／ＢＳＡで２回洗浄されて、１：５０の希釈度のヤギの抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Zymed）で、３０分間氷に付けて、インキュベーションされた。その細胞は、冷却されたＰＢＳ／ＢＳＡで１回、冷却されたＰＢＳで１回、その後、冷却されたＰＢＳ２５０μｌ中で再懸濁された。その細胞はその後、ＰＢＳに於いて２５０μｌの２％パラフォルムアルデヒド溶液を加えることで、又最低１時間インキュベーションすることで固定され、ＦＡＣＳ（Becton Dickinson、SanJose、CA）を用いて、その蛍光性が分析された。
【０２１８】
図２２に示されたように、その代表的な結果では、Ｂ７−２Ｉｇ及びＢ７−２ＶＩｇ融合タンパク質は、特にＣＨＯ−ＣＤ２８細胞に結合することが分かる。
更にその結果から分かるのは、Ｂ７−２ＶＩｇタンパク質は、Ｂ７−２Ｉｇ及びＢ７−１Ｉｇに比べて、より大きな親和性を持ってＣＤ２８に結合することである。
【０２１９】
したがって、Ｂ７−２ＶＩｇ融合タンパク質は、Ｂ７−２Ｉｇに比べて、より大きな親和性を持って、ＣＤ２８に結合するが、一方両方の融合タンパク質とも同様の親和性を持ってＣＴＬＡ４に結合する。
【０２２０】
Ｊ．Ｂ７−２ＶＩｇは、ＣＤ２８＋Ｔ細胞の相互促進的増殖に於いてＢ７−２Ｉｇ及びＢ７−１Ｉｇに比べてより能力がある 
Ｂ７−２ＶＩｇ融合タンパク質は、Ｂ７−２Ｉｇに比べて、より大きな親和性を持ってＣＤ２８に結合するので、Ｂ７−２ＶＩｇ融合タンパク質が、Ｂ７−２Ｉｇ融合タンパク質に比べて、Ｔ細胞の増殖を促進するに際して、同様に、より能力があるかどうかが次に調べられた。
【０２２１】
ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、上記説明のように、周辺の血液の白血球から分離された。Ｔ細胞の増殖を測定するために、１．２ｘ１０５ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、９６ウエルプレートの中で２００μｌのインキュベーション媒体でインキュベーションされ、１ｎｇ／ｍｌの割合のＰＭＡ及び以下の相互促進信号のどれかで、刺激された。即ち、６ｘ１０４ＣＨＯ／Ｂ７−１成いはＣＨＯ／Ｂ７−２細胞（マイトマイシンＣで一晩、前処理され、その後強力に洗浄された）、３０或いは１００μｇ／ｍｌのＢ７−１Ｉｇ、Ｂ７−２Ｉｇ或いはＢ７−２ＶＩｇのいずれかである。別の実施例では、融合タンパク質は、３倍を超える（ｗ／ｗ）親和性を有する純化されたヤギの抗ヒトＩｇＧＦｃ（Cappel）で、使用に先立って、まず３０分間インキュベーションされた。６０時間のインキュベーション後、Ｔ細胞は、上記説明のように、３Ｈチミジン（Dupont/NEN）で、一晩パルス標識され、測定後摘出された。
【０２２２】
増殖アッセイの結果は、図２３のグラフで表されている。その結果が示しているのは、ＣＨＯ発現されたＢ７−１及びＢ７−２は、Ｔ細胞の増殖を強力に誘発したことである。ＣＨＯ／Ｂ７−１及びＣＨＯ／Ｂ７−２細胞ほど能力はないが、純化されたＢ７−１Ｉｇ、Ｂ７−２Ｉｇも同様に増殖を誘発した。しかしながら、Ｂ７−２ＶＩｇは、ＣＨＯ／Ｂ７−１及びＣＨＯ／Ｂ７−２細胞と同じ程度に増殖を誘発した。したがって、Ｂ７−２ＶＩｇは、Ｔ細胞の相互促進的増殖に於いて、ＣＨＯ／Ｂ７−１及びＣＨＯ／Ｂ７−２細胞と同程度の能力を有する。
【０２２３】
もう一つの例では、ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、上記で説明されたように作成された抗ＣＤ３被覆されたプレートで、活性化され、又様々な量のＢ７−１Ｉｇ，Ｂ７−２Ｉｇ及びＢ７−２ＶＩｇで相互促進された。ＣＤ２８＋Ｔ細胞の増殖は、６０時間後及び一晩に亘る３Ｈチミジンによるその細胞のパルス標識を行った後に測定された。図２４でグラフによって示された結果は、抗ＣＤ３が第１活性化剤として用いられる場合、Ｂ７−２ＶＩｇ融合タンパク質も又、ＣＤ２８＋Ｔ細胞の増殖に於いてＢ７−２Ｉｇ及びＢ７−１Ｉｇに比べて、より能力があることである。更に、低濃縮度のタンパク質が用いられる場合のＣＤ２８＋Ｔ細胞増殖に際しては、Ｂ７−２ＶＩｇは、Ｂ７−２Ｉｇ及びＢ７−１Ｉｇより能力があることが結果に示されている。これは、インキュベーションされた細胞に組入れられたチミジンの量と１μｇ／ｍｌの相互促進融合タンパク質とを比較すると明白である。更には、Ｂ７−２ＶＩｇは、１０ｎｇ／ｍｌ（２５０ｐＭ）程度の低量で、Ｔ細胞増殖を相互促進する。
したがって、Ｂ７−１Ｉｇに対するＢ７−１ＩｇのＣＤ２８（例７、Ｉ節）に対するより高度の結合親和性は、Ｂ７−２Ｉｇに対するＢ７−２ＶＩｇのＴ細胞増殖に対するより高度の相互促進活性と相関している。
【０２２４】
Ｋ． Ｂ７−２ＶＩｇは、ＣＤ２８＋Ｔ細胞によるＩＬの相互促進的生成に於いて、Ｂ７−１Ｉｇ及びＢ７−２Ｉｇより能力を有する 
次に調べられたのは、ＩＬの生成のために、活性化されたＴ細胞を相互促進するに際して、Ｂ７−２ＶＩｇは同様に、Ｂ７−１Ｉｇ及びＢ７−２Ｉｇより能力があるかどうかである。前節（例７のＪ節）で説明された第２の例では、上澄み液中のＩＬ−２水準が、ＥＬＩＳＡキット（End0gen、Cambridge、MA）を用いて、１８時間の刺激後、測定された。尚、そこではＣＤ２８＋Ｔ細胞が、抗ＣＤ３で活性化され、様々な量のＢ７−１Ｉｇ、Ｂ７−２Ｉｇ及びＢ７−２ＶＩｇで相互促進され、そして細胞増殖が測定された。図２４で示された結果では、ＩＬ−２の量は、Ｂ７−２ＶＩｇで相互促進されたＴ細胞によって生成された方が、Ｂ７−１Ｉｇ或いはＢ７−２Ｉｇで相互促進されたＴ細胞によって生成された方よりも多い。これは、相互促進的タンパク質の低濃縮度に於いて、最も顕著であった。
【０２２５】
もう一つの例が、ＣＨＯ／Ｂ７−２細胞で相互促進されるか、成いはＢ７−２ＶＩｇタンパク質で相互促進されるＣＤ２８＋Ｔ細胞からのＩＬ−２の生成物を比較するために実施された。ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３で被覆されたプレートで、ＣＨＯ／Ｂ７−２細胞或いはＢ７−２ＶＩｇタンパク質の存在下で、１日、２日成いは３日間インキュベーションされ、ＩＬ−２の量が、上澄み液の中で測定された。図２５で示されたその結果では、Ｂ７−２ＶＩｇは、ＣＨＯ／Ｂ７−２細胞に比べて、ＩＬ−２の生成のためにＴ細胞を相互促進する際に、より能力を有することが分かる。
【０２２６】
更にもう一つの例では、抗ＣＤ３、Ｂ７−１Ｉｇ、Ｂ７−２Ｉｇ或いはＢ７−２ＶＩｇで相互促進されたＣＤ２８＋Ｔ細胞によって生成されたＩＬ−２の量が、１日、２日成いは５日間の相互促進後に、比較された。ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ２８抗体或いはＢ７−１Ｉｇ、Ｂ７−２Ｉｇ成いはＢ７−２ＶＩｇ融合タンパク質で、活性化され、又相互促進された。上澄み液中のＩＬ−２の量は、１日、２日或いは５日間の相互促進後に測定された。Ｔ細胞によって生成されたＩＬ−２の量がグラフによって表されている図２６は、ＣＤ２８＋Ｔ細胞によるＩＬ−２の生成を相互促進する際に、Ｂ７−２ＶＩｇの方が、Ｂ７−１Ｉｇ及びＢ７−２Ｉｇよりも能力を持っていること、更には又、５日間のインキュベーション後、Ｂ７−２Ｉｇ或いはＢ７−２ＶＩｇ融合タンパク質で相互促進されたＴ細胞のみがＩＬ−２を生成していることを示している。更に、Ｂ７−２ＶＩｇで相互促進されたＴ細胞は、５日間のインキュベーション後、Ｂ７−２Ｉｇで相互促進されたＴ細胞より多くのＩＬ−２を生成した。
したがって、Ｂ７−２ＶＩｇは、最低５日間のインキュベーション後であっても、Ｔ細胞を相互促進して、高水準のＩＬ−２を生成させる。
【０２２７】
Ｌ． Ｂ７−２ＶＩｇは、サイトカインの生成に対して、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞の強力な相互促進剤である 
この例では、Ｂ７−２ＶＩｇ、Ｂ７−２Ｉｇ成いはＢ７−１Ｉｇで相互促進されたＴ細胞によって生成されたＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＣＳＦの量が比較された。ＣＤ４＋ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体のみで、或いは抗ＣＤ２８ｍＡｂ９．３で、或いは融合タンパク質Ｂ７−１Ｉｇ、Ｂ７−２Ｉｇ或いはＢ７−２ＶＩｇの内の１つで被覆されたＴ７５のフラスコに於いて、２ｘ１０６細胞／ｍｌの割合でインキュベーションされた。１８時間のインキュベーションの後、ＩＬ−２、ＩＬ−４、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）及び顆粒白血球マクロファージ株促進因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の量が、市販品キット（ＩＬ−２（BioSource、Camarillo、CA）、ＩＬ−４（Endogen、Cambridge、MA）、ＩＦＮ−γ（BioSource、Camarillo、CA）及びＧＭ-ＣＳＦ（R＆DSystems、Minneapolis、MN））を用いるＥＬＩＳＡによって、計測された。ＩＬ−２及びＩＬ−４の量は、１２０時間相互促進された細胞内で同様に測定された。
【０２２８】
その結果は表ＶＩで示されている。その結果では、Ｂ７−２ＶＩｇでの相互促進によって、高水準のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＣＳＦが生成されることが分かる。更には、Ｂ７−２ＶＩｇで相互促進されたＴ細胞から生成された全４種のサイトカインの量は、Ｂ７−１Ｉｇで相互促進されたＴ細胞から生成されたサイトカインの量より高水準であった。Ｂ７−１Ｉｇと比較されると、Ｂ７−２ＶＩｇは又、より高水準のＩＬ−２、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦそして同量のＩＦＮ−γの生成を相互促進した。
【０２２９】
更に、１２０時間のインキュベーションの後、Ｂ７−２ＶＩｇで相互促進されたＴ細胞は、Ｂ７−２Ｉｇで相互促進されたＴ細胞によって生成された２倍量以上のＩＬ−４を、又Ｂ７−１Ｉｇで相互促進されたＴ細胞によって生成されたおよそ８倍量以上のＩＬ−４を生成した。したがって、Ｂ７−２ＶＩｇ融合タンパク質で相互促進されたＴ細胞は、高水準のＩＬ−４の生成を誘発し、またこの生成は長く持続する。したがって、Ｂ７−２ＶＩｇによるＴ細胞の相互促進は、長時間のインキュベーションに於いて、Ｔ細胞をＴへルパー２（Th2）の状態にまですることができた。
表ＶＩ
Ｂ７＝２ＶＩｇ、Ｂ７−２Ｉｇ、Ｂ７−１Ｉｇ或いは抗ＣＤ２８抗体で相互促進されたＣＤ４＋ＣＤ２８＋Ｔ細胞によるサイトカインの生成
2008142084.tif 000004
【０２３０】
Ｍ． Ｂ７−１Ｉｇではなくて、Ｂ７−２Ｉｇ及びＢ７−２ＶＩｇが、持続的Ｔ細胞の増殖を促進する 
この例では、Ｂ７Ｉｇ融合タンパク質が、長期間に亘ってＴ細胞の増殖を促進する能力が分析された。
ＣＤ２８＋Ｔリンパ細胞は、ビードで不活性化された抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８、成いはＢ７−１Ｉｇ、Ｂ７−２Ｉｇ或いはＢ７−２ＶＩｇの存在下でインキュベーションされ、又総細胞数が、１２日間の期間に亘って観察された。その結果は、図２７に示されている。抗ＣＤ３のみで促進された細胞は増殖できず、死滅する。抗ＣＤ３＋Ｂ７−２Ｉｇで促進された細胞は、１サイクルの複製には耐えたが、その後アポプトーゼする。抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８成いはＢ７−２Ｉｇ或いはＢ７−２ＶＩｇで促進された細胞は複製し続ける。したがって、Ｂ７−１Ｉｇにではなく、Ｂ７−２Ｉｇ及びＢ７−２ＶＩｇ融合タンパク質には、ＣＤ２８＋Ｔ細胞の持続的増殖を促進する能力がある。
【０２３１】
[例８]
ヒトのＢ７−２に対する単クローン抗体の生成と特性付け
Ａ． 免疫法及び細胞融合 
Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（Taconic Labs）Germantown、NYから得られた）
は、完全なフロイントのアジュバント（Sigma ChemicalCo.、St.Louis、MO）で乳化された５０μｇのヒトＢ７．２−Ｉｇで、或いはマウス１匹当たり１０６のＣＨＯ−ヒトＢ７．２細胞で腹膜内で免疫性を与えられた。これらのマウスは、完全なフロイントのアジュバント（Sigma ChemicalCo.、St.Louis、MO）で乳化された１０から２５μｇのヒトＢ７．２−Ｉｇで、或いはＣＨＯ−ヒトＢ７．２細胞で、最初の免疫性付与に引き続いて、次の２カ月間に１４日間の間隔を置いて、２回免疫促進された。マウスは、眼窩後方出血によって血を抜かれ、その血清には、ヒトＢ７．２−Ｉｇに対して免疫原に反応する抗体が存在するかどうかを、ＥＬＩＳＡによってアッセイされた。ｈＣＴＬＡ４−Ｉｇに対するＥＬＩＳＡは、同様に抗体反応を命ずるＩｇテールを抑制するのに用いられた。血清学的な反応を強く示しているマウスは、ｐＨ７．２のリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）（GIBC0、Grand Island、NY）で希釈された２５μｇのヒトｈＢ７．２−Ｉｇで、その尾の静脈から静脈注射によって刺激された。この刺激に引き続いて３日から４日間、これらのマウスの脾臓は、ＳＰ２／０マイクローマ細胞（American Type Culture Collection、Rockville、MD、NO.CRL80O6）で５：１の割合で融合された。尚、これらの細胞は、Ｈ及びＬ免疫グロブリン鎖の双方を分泌することはできない（Kearneyら(1979)J.Tmmunol.123:1548）。コーラー及びミルスタインによって開発されたこれらの方法（Nature(1975)256:498）に基づいた標準的な方法が用いられた。
【０２３２】
Ｂ． 抗体検査 
１０から２１日後、融合によって得られた融合細胞コロニーが入っているウエルから得られた上澄み液は、以下のように、ヒトＢ７．２に反応する抗体が存在するかどうかが検査された。即ち、９６ウエルの底が平らなプレート（CostarCorp.,Cat.＃3590）の各ウエルは、ウエル当たり５０μｌの１μｇ／ｍｌヒトＢ７．２−Ｉｇ溶液で、或いはｐＨ７．２のＰＢＳ中のリジン被覆されたプレートの５ｘ１０4３Ｔ３−ｈＢ７．２細胞で、一晩摂氏４度に保たれて被覆された。
ヒトＢ７．２−Ｉｇ溶液は、全て吸い出されるか、或いはその細胞はグルタルアルデヒドでプレートに交差連結された。そしてその細胞はＰＢＳで３回洗浄され、その後、室温で１時間１％ＢＳＡ溶液（ＰＢＳ中で）（ウエル当たり１００μｌ）で遮断された。この遮断インキュベーションに続いて、そのウエルはＰＢＳで３回洗浄され、ウエル当たり５０μｌの融合細胞上澄み液が加えられて、室温で１．５時間インキュベーションされた。このインキュベーションに続いて、ウエルはＰＢＳで３回洗浄され、その後、ウエル当たり５０μｌの１：４０００の希釈度の、ペルオキシダーゼ共役され、親和性純化されたワサビダイコンで、ヤギの抗マウスＩｇＧで、或いはＩｇＭＨ及びＬ鎖特定抗体（ＨＲＰ；ZymedLaboratories,San Francisco,CA）で、室温状態にして１.５時間インキュベーションされた。ウエルはその後ＰＢＳで３回洗浄された後、結合された抗体を検出するために、１：１０００の希釈度の３０％過酸化水素がＨＲＰの基質として加えられていたｐＨ４．２の０．１Ｍのクエン酸ナトリウム中に含まれたウエル当たり５０μｌの１ｍＭ２，２−アジノービス−エチノレベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）の中で、３０分間インキュベーションされた。吸収剤はその後、分光測光器による自動読取り装置(Dynatech、Virginia）のＯＤ410で測定された。
【０２３３】
ヒトのＢ７．２−Ｉｇに対して抗体を作った３種の融合細胞、即ち、ＨＡ３．
１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７及びＨＦ２．３Ｄ１が確認された。ＨＡ３．１Ｆ９は、ＩｇＧ１アイソタイプであることが測定され、ＨＡ５．２Ｂ７は、ＩｇＧ２ｂアイソタイプであることが測定され、又、ＨＦ２．３Ｄ１は、ＩｇＧ２ａとして測定された。これら３種の融合細胞のそれぞれは、単クローンであることを確かめるために更に２回サブクローンされた。融合細胞は、米国代表菌株培養収集で保管された。尚、このコレクションは、１９９４年７月１９日のブタペスト条約の要求条件を、米国代表菌株培養収集（ＡＴＣＣ）に、登録番号第ＨＢ１１６８８号（融合細胞ＨＡ３．１Ｆ９）、ＡＴＣＣ登録番号第ＨＢ１１６８７号（ＨＡ５．２Ｂ７）及びＡＴＣＣ登録番号第ＨＢ１１６８６号（ＨＦ２．３Ｄ１）で満たしている。
【０２３４】
Ｃ． 競合的ＥＬＩＳＡ 
融合細胞ＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７及びＨＦ２．３Ｄ１からの上澄み液は、更に、競合的ＥＬＩＳＡによって更に特性化された。尚、そこではビオチニル化されたｈＣＴＬＡ４Ｉｇが不活性化されたｈＢ７−２免疫グロブリン融合タンパク質に結合するのを阻害する単クローン抗体の能力が検査された。ｈＣＴＬＡ４Ｉｇのビオチニル化は、ピアスイミュノピュアＮＨＳ−ＬＣビオチン（Cat.No.21335）を用いて実施された。用いられたＢ７−２免疫グロブリン融合タンパク質は、ｈＢ７．２−Ｉｇ（完全な長さのｈＢ７−２）、ｈＢ７．２−ＶＩｇ（ｈＢ７−２可変ドメインのみ）及びｈＢ７．２−ＣＩｇ（Ｂ７−２不変ドメインのみ）であった。ｈＢ７．１−Ｉｇ融合タンパク質は、抑制子として用いられた。ＥＬＩＳＡに対して、９６ウエルプレートは、Ｉｇ融合タンパク質（ウエル当たり５０μｌの２０μｇ／ｍｌ溶液）で、室温で一晩被覆された。そのウエルはその後ＰＢＳで３回洗浄され、ＰＢＳ中で１０％のウシの胎児血清（ＦＢＳ）、０．１％の胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）で、室温状態に保たれて１時間遮断されて、その後再度ＰＢＳで３回洗浄された。それぞれのウエルには、５０μｌの生体ｈＣＴＬＡ４−Ｉｇ（７０ｎｇ／ｍｌ）及び５０μｌの競合単クローン抗体の上澄み液が加えられた。抑制抗体は、抗Ｂ７．１ｍＡｂ（ＥＷ３．５Ｄ１２）及び抗Ｂ７−２ｍＡｂＢ７０（Pharmingenから得られたＩｇＧ２ｂκ）であった。そのウエルは再度洗浄され、ストレプトアビジン共役されたワサビダイコンのぺロキシダーゼ（Pierce、Cat.No.21126から得られた、１：２０００の希釈度）が加えられて、室温で３０分間インキュベーションされた。そのウエルは再度洗浄された後、希釈度１：１０００の３０％過酸化水素が、結合された抗体を検出するために、１：１０００の希釈度の３０％過酸化水素がＨＲＰの基質として加えられていたｐＨ４．２の０．１Ｍのクエン酸ナトリウム中に含まれたウエル当たり５０μｌのＡＢＴＳの中で、３０分間インキュベーションされた。吸収剤はその後、分光測光器による自動読取り装置（Dynatech、Virginia）のＯＤ４１０で測定された。その結果は下記の表ＩＶに示されており、融合細胞ＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７及びＨＦ２．３Ｄ１によって作られたｍＡｂは、それぞれ、ｈＣＬＴＡ４Ｉｇが、完全な長さのｈＢ７．２−Ｉｇ、或いはｈＢ７．２−ＶＩｇ（ｈＣＴＬＡ４ＩｇはｈＢ７．２ＣＩｇには結合しない）に結合するのを競合的に阻害することができることが証明される。
2008142084.tif 000005
【０２３５】
Ｄ． フローサイトメトリー 
ハイブリドーマＨＡ３．１Ｆ９とＨＡ５．２Ｂ７、ＨＦ２．３Ｄ１からの上清はフローサイトメトリーでも特性化された。クローンから収集した上清はｈＢ７．２（おのおのＣＨＯ−ｈＢ７．２と３Ｔ３−ｈＢ７．２）を発現するようトランスフェクションされたＣＨＯと３Ｔ３細胞上又は制御トランスフェクションされた３Ｔ３細胞（３Ｔ３−ネオ）上でフローサイトメトリーにより分離された。フローサイトメトリーは下記の通り実行された：１ｘ１０６細胞はＰＢＳの１％ＢＳＡで３回洗浄され、その後その細胞は５０μｌハイブリドーマ上清又は１ｘ１０６細胞につき３０分間４℃のインキュベーション媒体でインキュベーションされた。インキュベーションに続き、細胞はＰＢＳの１％ＢＳＡで３回洗浄され、１ｘ１０６細胞につき３０分間４℃の１：５０希釈において５０μｌフレオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ又はＩｇＭ抗体（Zymed Laboratories、Sac Francisco CA）でインキュベーションされた。細胞はその後ＰＢＳの１％ＢＳＡで３回洗浄され１％パラホルムアルデヒド液剤に固定された。細胞サンプルはその後ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Becton Dickenson，San Jose CA）で分析された。図１７、１８、１９に現れる結果は、ハイブリドーマＨＡ３． １Ｆ９とＨＡ５． ２Ｂ７、ＨＦ２．３Ｄ１によって産出される単クローン抗体は各々細胞表面でｈＢ７−２に結合することを示す。
【０２３６】
Ｅ． 抗ｈＢ７−２ｍＡＢｓによるヒトＴ細胞の増殖抑制 
抗ヒトｈＢ７−２ｍＡＢｓを含有するハイブリドーマ上清は、ヒトＴ細胞のｈＢ７−２供促進を抑制する能力のテストがなされた。このアッセイでは精製ＣＤ２８＋ヒトＴ細胞が、初期信号を送達するＰＭＡ（１ｎｇ／ｍｌ）の亜ミトゲン量と処理され、供促進信号を送達するため表面でｈＢ７−２を発現するＣＨＯ細胞と処理された。Ｔ細胞の増殖は、残り１８時間３Ｈチミジンを加えることによりインキュベーションされ３日後に測定された。表Ｖに示されるように、休止Ｔ細胞は３Ｈチミジン結合（５１０ｐｍ）により測定されたようにほとんど増殖しない。ＰＭＡによる信号１の送達はいくらかの増殖（３８００ ｐｍ）が結果として生じ、初期（ＰＭＡ）と供促進（ＣＨＯ／ｈＢ７−２）信号の両方を受け取るＴ細胞は最も効果的に増殖する（９０２０ｃｐｍ）。テストされた３種全ての抗ｈＢ７−２ｍＡＢｓは増殖を誘発する供促進を減少させ、ＰＭＡ処理細胞のみで、これらｍＡＢｓがＢ７／ＣＤ２８供促進経路を阻止することによりＴ細胞増殖を抑制すると示すことがわかる。
表Ｖ 
ＣＤ２８＋Ｔ細胞への追加             ｈＢ７−２ｍＡＢ               ＣＰＭ 
−−−                             −−−                   ５１０ 
＋ＰＭＡ                             −−−                 ３８００ 
＋ＰＭＡ＋ＣＨＯ／ｈＢ７−２               −−−                 ９０２０ 
＋ＰＭＡ＋ＣＨＯ／ｈＢ７−２           ＨＦ２．３０１             ３０３０ 
−−−                         ＨＡ５．２Ｂ７             １４６０ 
−−−                         ＨＡ３．ＩＦ９             ２９８０
【０２３７】
Ｆ． Ｂ７−２可変ドメイン阻止Ｂ７−２機能の抗体 
当例証では、Ｔ細胞増殖を阻止するためのＢ７−２のＩｇ可変又はＩｇ不変ドメインに結合するＢ７−２への単クローン抗体の一連の能力を分析した。
ヒトＢ７−１及びＢ７−２への単クローン抗体はＳＰ２／０細胞と標準プロトコルを使用したＢＡＩＢ／Ｃマウスから調製された。暫時、ＢＡＩＢ／Ｃメスマウス（Taconic Labs，Germantown，NY）は腹膜内に、ＣＦＡ（Sigma，St．Louis,MO）に乳化された５０μｇｓ Ｂ７−２Ｉｇ又は１０６ＣＨＯ／Ｂ７−２細胞で免疫処理された。初期免疫処置とＰＢＳでのＢ７−２Ｉｇタンパク質とで一回に引き続き、１４日間の間隔後マウスは２倍に増加した。ハイブリドーマコロニーは９６ウェル組織インキュベーションプレートに定着し、インキュベーション上清はＢ７−２Ｉｇとの直接結合をアッセイされた。全てのｍＡＢｓは上記に述べられるようタンパク質Ａセファローズ上の腹水から精製された。ＭＡＢ Ｂ７０はPharMingen（San Diego，CA）から購入された。
【０２３８】
精製ｍＡＢｓは下記のように種々のＢ７−Ｉｇ形態と結合する能力につきテストされた。マキシソーププレートプレート（Nunc）は一晩ＰＢＳの精製Ｂ７−２Ｉｇタンパク質２０ μｇ／ｍｌと室温でコートされた。プレートはその後一時間ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで閉塞された。精製抗体（ＰＢＳ で５ μｇｓ／ｍｌ）はテストウェルに加えられ、プレートは一時間インキュベーションされ、その後ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄された。５回の洗浄後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ）が加えられ１時間反応させておかれた。
プレートは上記に述べるように進展した。
【０２３９】
抗体の結合特性は表ＶＩＩに「認知」の表題で示されている。表ＶＩＩに示されている通り、抗体はＢ７−２Ｉｇを認知する。Ｂ７−２ＶＩｇ及びＢ７−２ＣＩｇ融合タンパク質との抗体の結合は、抗体は可変部構成又は不変部構成のいずれかを認知するが両方の構成をではない、ことを示す。
【０２４０】
抗体はさらにＢ７−２ＩｇのＣＴＬＡ４及びＣＤ２８との結合を抑制する、そしてＴ細胞増殖を抑制する能力について分析された。競合ＥＬＩ ＳＡフォーマットを使用して、ｍＡＢｓ量を変えてＢ７−２Ｉｇコートされ生チレニート化ＣＴＬＡ４Ｉｇ又はＣＤ２８Ｉｇ ３５ ｎｇｓ／ｍｌを含有するウェルに加えられた。結合を中断させるｍＡＢｓの能力は捕獲された生チレニート化ＣＴＬＡ４Ｉｇ又はＣＤ２８Ｉｇの特定の信号で減少すると測定された。Ｔ細胞増即を抑制する抗体の能力は、抗体のうち一つが加えられたという上記記載のように、実施増殖アッセイにより決定する。
【０２４１】
結果は表ＶＩＩに「抑制」という表題で提示されている。一般的に、Ｂ７−２のＶドメインの抗体はＢ７−２ＩｇのＣＤ２８及びＣＴＬＡ４への結合を抑制し、そしてＴ細胞増殖によってのＣＨＯ／Ｂ７−２を抑制する。Ｃドメインの抗体は抑制的ではないが、Ｂ７−２機能性はＶドメインに残留する、と暗示している。
2008142084.tif 000006
さらに、テストされた抗Ｂ７−１及び抗Ｂ７−２ｍＡＢｓ全ては、テストされたところのＣＨＯ細胞表面と活性ヒトＢ細胞の表面で発現したとき、それらの各リガンドも認知した。いかなる抗Ｂ７−１及び抗Ｂ７−２ｍＡＢｓも他のＢ７タンパク質との交差反応は示さなかった。
【０２４２】
同等物 本分野の技能を備えた者であれば、本発明のここで説明された実施例の同等物を、通常の実験を行なって、理解し特定することは可能なはずである。こうした同等物は、以下の特許請求の範囲で網羅することが意図されている。
【０２４３】
以下、配列表にかかるデータを記載する。
SEQUENCE LISTING 
(1) GENERAL INFORMATION:
(i) APPLICANT:
(A) NAME: DANA-FARBER CANCER INSTITUTE
(B) STREET: 44 BINNEY STREET
(C) CITY: BOSTON
(D) STATE: MASSACHUSETTS
(E) COUNTRY: USA
(F) POSTAL CODE (ZIP): 02115
(G) TELEPHONE: (617) 632-4016
(H) TELEFAX: (617) 632-4012
(A) NAME: REPLIGEN CORPORATION
(B) STREET: ONE KENDALL SQUARE, BLDG 700
(C) CITY: CAMBRIDGE
(D) STATE: MASSACHUSETTS
(E) COUNTRY: USA
(F) POSTAL CODE (ZIP): 02139
(G) TELEPHONE: (617) 225-6000
(H) TELEFAX: (617) 494-1975
(ii) TITLE OF INVENTION: Novel CTLA4/CD28 Ligands and
Uses Therefor
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 55 
(iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:
(A) ADDRESSEE: LAHIVE & COCKFIELD
(B) STREET: 60 State Street, Suite 510
(C) CITY: Boston
(D) STATE: Massachusetts
(E) COUNTRY: USA
(F) ZIP: 02109
(v) COMPUTER READABLE FORM:
(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) CURRENT APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER: 
(B) FILING DATE: 
(vii) PRIOR APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER: 08/479,744
(B) FILING DATE:  7-JUN-1995
(viii) PRIOR APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER: 08/280,757
(B) FILING DATE: 26-JUL-1994
(ix) PRIOR APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER:  08/101,624
(B) FILING DATE:  26-JUL-1993
(x) PRIOR APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER: 08/109,393
(B) FILING DATE:  19-AUG-1993
(xi) PRIOR APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER: 08/147,773
(B) FILING DATE: 03-NOV-1993
(xii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:
(A) NAME: Mandragouras, Amy E.
(B) REGISTRATION NUMBER: 36,207
(C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: RPI-004C3PC
(xiii) TELECOMMUNICATION INFORMATION:
(A) TELEPHONE: (617) 227-7400
(B) TELEFAX: (617) 227-5941
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1120 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 107..1093
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1:
CACAGGGTGA AAGCTTTGCT TCTCTGCTGC TGTAACAGGG ACTAGCACAG ACACACGGAT      60
GAGTGGGGTC ATTTCCAGAT ATTAGGTCAC AGCAGAAGCA GCCAAA ATG GAT CCC        115
Met Asp Pro  
1          
CAG TGC ACT ATG GGA CTG AGT AAC ATT CTC TTT GTG ATG GCC TTC CTG       163
Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met Ala Phe Leu  
5                  10                  15                  
CTC TCT GGT GCT GCT CCT CTG AAG ATT CAA GCT TAT TTC AAT GAG ACT       211
Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr  
20                  25                  30                  35  
GCA GAC CTG CCA TGC CAA TTT GCA AAC TCT CAA AAC CAA AGC CTG AGT       259
Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser  
40                  45                  50      
GAG CTA GTA GTA TTT TGG CAG GAC CAG GAA AAC TTG GTT CTG AAT GAG       307
Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu  
55                  60                  65          
GTA TAC TTA GGC AAA GAG AAA TTT GAC AGT GTT CAT TCC AAG TAT ATG       355
Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met  
70                  75                  80              
GGC CGC ACA AGT TTT GAT TCG GAC AGT TGG ACC CTG AGA CTT CAC AAT       403
Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn  
85                  90                  95                  
CTT CAG ATC AAG GAC AAG GGC TTG TAT CAA TGT ATC ATC CAT CAC AAA       451
Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys  
100                 105                 110                 115  
AAG CCC ACA GGA ATG ATT CGC ATC CAC CAG ATG AAT TCT GAA CTG TCA       499
Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser  
120                 125                 130      
GTG CTT GCT AAC TTC AGT CAA CCT GAA ATA GTA CCA ATT TCT AAT ATA       547
Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile  
135                 140                 145          
ACA GAA AAT GTG TAC ATA AAT TTG ACC TGC TCA TCT ATA CAC GGT TAC       595
Thr Glu Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr  
150                 155                 160              
CCA GAA CCT AAG AAG ATG AGT GTT TTG CTA AGA ACC AAG AAT TCA ACT       643
Pro Glu Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr  
165                 170                 175                  
ATC GAG TAT GAT GGT ATT ATG CAG AAA TCT CAA GAT AAT GTC ACA GAA       691
Ile Glu Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu  
180                 185                 190                 195  
CTG TAC GAC GTT TCC ATC AGC TTG TCT GTT TCA TTC CCT GAT GTT ACG       739
Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr  
200                 205                 210      
AGC AAT ATG ACC ATC TTC TGT ATT CTG GAA ACT GAC AAG ACG CGG CTT       787
Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu  
215                 220                 225          
TTA TCT TCA CCT TTC TCT ATA GAG CTT GAG GAC CCT CAG CCT CCC CCA       835
Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro  
230                 235                 240              
GAC CAC ATT CCT TGG ATT ACA GCT GTA CTT CCA ACA GTT ATT ATA TGT       883
Asp His Ile Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val Ile Ile Cys  
245                 250                 255                  
GTG ATG GTT TTC TGT CTA ATT CTA TGG AAA TGG AAG AAG AAG AAG CGG       931
Val Met Val Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp Lys Lys Lys Lys Arg  
260                 265                 270                 275  
CCT CGC AAC TCT TAT AAA TGT GGA ACC AAC ACA ATG GAG AGG GAA GAG       979
Pro Arg Asn Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu Arg Glu Glu  
280                 285                 290      
AGT GAA CAG ACC AAG AAA AGA GAA AAA ATC CAT ATA CCT GAA AGA TCT      1027
Ser Glu Gln Thr Lys Lys Arg Glu Lys Ile His Ile Pro Glu Arg Ser  
295                 300                 305          
GAT GAA GCC CAG CGT GTT TTT AAA AGT TCG AAG ACA TCT TCA TGC GAC      1075
Asp Glu Ala Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys Thr Ser Ser Cys Asp  
310                 315                 320              
AAA AGT GAT ACA TGT TTT TAATTAAAGA GTAAAGCCCA AAAAAAA                1120
Lys Ser Asp Thr Cys Phe 
325                 
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 329 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:
Met Asp Pro Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met 
1               5                  10                  15     
Ala Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe 
20                  25                  30         
Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln 
35                  40                  45             
Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val 
50                  55                  60                 
Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser 
65                  70                  75                  80 
Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg 
85                  90                  95     
Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile 
100                 105                 110         
His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser 
115                 120                 125             
Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile 
130                 135                 140                 
Ser Asn Ile Thr Glu Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile 
145                 150                 155                 160 
His Gly Tyr Pro Glu Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys 
165                 170                 175     
Asn Ser Thr Ile Glu Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn 
180                 185                 190         
Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro 
195                 200                 205             
Asp Val Thr Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys 
210                 215                 220                 
Thr Arg Leu Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln 
225                 230                 235                 240 
Pro Pro Pro Asp His Ile Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val 
245                 250                 255     
Ile Ile Cys Val Met Val Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp Lys Lys 
260                 265                 270         
Lys Lys Arg Pro Arg Asn Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu 
275                 280                 285             
Arg Glu Glu Ser Glu Gln Thr Lys Lys Arg Glu Lys Ile His Ile Pro 
290                 295                 300                 
Glu Arg Ser Asp Glu Ala Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys Thr Ser 
305                 310                 315                 320 
Ser Cys Asp Lys Ser Asp Thr Cys Phe 
325                 
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:
TAATACGACT CACTATAGGG                                                  20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:
TAAGGTTCCT TCACAAAG                                                    18
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:
ACTGGTAGGT ATGGAAGATC C                                                21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6:
ATGCGAATCA TTCCTGTGGG C                                                21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:
AAAGCCCACA GGAATGATTC G                                                21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8:
CTCTCAAAAC CAAAGCCTGA G                                                21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9:
TTAGGTCACA GCAGAAGCAG C                                                21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10:
TCTGGAAACT GACAAGACGC G                                                21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11:
CTCAGGCTTT GGTTTTGAGA G                                                21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12:
CACTCTCTTC CCTCTCCATT G                                                21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13:
GACAAGCTGA TGGAAACGTC G                                                21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14:
CAATGGAGAG GGAAGAGAGT G                                                21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 12 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15:
CTTTAGAGCA CA                                                          12
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 8 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16:
CTCTAAAG                                                                8
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 9 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17:
Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp
5
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:18:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 13 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18:
Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Lys Tyr Asp Val Ser
5                  10
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:19:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:19:
Trp Lys Trp Lys Lys Lys Lys Arg Pro Arg Asn Ser Tyr Lys Cys
5                  10                  15
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:20:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 17 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:20:
TGGCCCATGG CTTCAGA                                                     17
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:21:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 17 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21:
GCCAAAATGG ATCCCCA                                                     17
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:22:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1163 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 111..1040
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:22:
CCCACGCGTC CGGGAGCAAG CAGACGCGTA AGAGTGGCTC CTGTAGGCAG CACGGACTTG      60
AACAACCAGA CTCCTGTAGA CGTGTTCCAG AACTTACGGA AGCACCCACG ATG GAC        116
Met Asp  
1      
CCC AGA TGC ACC ATG GGC TTG GCA ATC CTT ATC TTT GTG ACA GTC TTG       164
Pro Arg Cys Thr Met Gly Leu Ala Ile Leu Ile Phe Val Thr Val Leu  
5                  10                  15              
CTG ATC TCA GAT GCT GTT TCC GTG GAG ACG CAA GCT TAT TTC AAT GGG       212
Leu Ile Ser Asp Ala Val Ser Val Glu Thr Gln Ala Tyr Phe Asn Gly  
20                  25                  30                  
ACT GCA TAT CTG CCG TGC CCA TTT ACA AAG GCT CAA AAC ATA AGC CTG       260
Thr Ala Tyr Leu Pro Cys Pro Phe Thr Lys Ala Gln Asn Ile Ser Leu  
35                  40                  45                  50  
AGT GAG CTG GTA GTA TTT TGG CAG GAC CAG CAA AAG TTG GTT CTG TAC       308
Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Gln Lys Leu Val Leu Tyr  
55                  60                  65      
GAG CAC TAT TTG GGC ACA GAG AAA CTT GAT AGT GTG AAT GCC AAG TAC       356
Glu His Tyr Leu Gly Thr Glu Lys Leu Asp Ser Val Asn Ala Lys Tyr  
70                  75                  80          
CTG GGC CGC ACG AGC TTT GAC AGG AAC AAC TGG ACT CTA CGA CTT CAC       404
Leu Gly Arg Thr Ser Phe Asp Arg Asn Asn Trp Thr Leu Arg Leu His  
85                  90                  95              
AAT GTT CAG ATC AAG GAC ATG GGC TCG TAT GAT TGT TTT ATA CAA AAA       452
Asn Val Gln Ile Lys Asp Met Gly Ser Tyr Asp Cys Phe Ile Gln Lys  
100                 105                 110                  
AAG CCA CCC ACA GGA TCA ATT ATC CTC CAA CAG ACA TTA ACA GAA CTG       500
Lys Pro Pro Thr Gly Ser Ile Ile Leu Gln Gln Thr Leu Thr Glu Leu  
115                 120                 125                 130  
TCA GTG ATC GCC AAC TTC AGT GAA CCT GAA ATA AAA CTG GCT CAG AAT       548
Ser Val Ile Ala Asn Phe Ser Glu Pro Glu Ile Lys Leu Ala Gln Asn  
135                 140                 145      
GTA ACA GGA AAT TCT GGC ATA AAT TTG ACC TGC ACG TCT AAG CAA GGT       596
Val Thr Gly Asn Ser Gly Ile Asn Leu Thr Cys Thr Ser Lys Gln Gly  
150                 155                 160          
CAC CCG AAA CCT AAG AAG ATG TAT TTT CTG ATA ACT AAT TCA ACT AAT       644
His Pro Lys Pro Lys Lys Met Tyr Phe Leu Ile Thr Asn Ser Thr Asn  
165                 170                 175              
GAG TAT GGT GAT AAC ATG CAG ATA TCA CAA GAT AAT GTC ACA GAA CTG       692
Glu Tyr Gly Asp Asn Met Gln Ile Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu  
180                 185                 190                  
TTC AGT ATC TCC AAC AGC CTC TCT CTT TCA TTC CCG GAT GGT GTG TGG       740
Phe Ser Ile Ser Asn Ser Leu Ser Leu Ser Phe Pro Asp Gly Val Trp  
195                 200                 205                 210  
CAT ATG ACC GTT GTG TGT GTT CTG GAA ACG GAG TCA ATG AAG ATT TCC       788
His Met Thr Val Val Cys Val Leu Glu Thr Glu Ser Met Lys Ile Ser  
215                 220                 225      
TCC AAA CCT CTC AAT TTC ACT CAA GAG TTT CCA TCT CCT CAA ACG TAT       836
Ser Lys Pro Leu Asn Phe Thr Gln Glu Phe Pro Ser Pro Gln Thr Tyr  
230                 235                 240          
TGG AAG GAG ATT ACA GCT TCA GTT ACT GTG GCC CTC CTC CTT GTG ATG       884
Trp Lys Glu Ile Thr Ala Ser Val Thr Val Ala Leu Leu Leu Val Met  
245                 250                 255              
CTG CTC ATC ATT GTA TGT CAC AAG AAG CCG AAT CAG CCT AGC AGG CCC       932
Leu Leu Ile Ile Val Cys His Lys Lys Pro Asn Gln Pro Ser Arg Pro  
260                 265                 270                  
AGC AAC ACA GCC TCT AAG TTA GAG CGG GAT AGT AAC GCT GAC AGA GAG       980
Ser Asn Thr Ala Ser Lys Leu Glu Arg Asp Ser Asn Ala Asp Arg Glu  
275                 280                 285                 290  
ACT ATC AAC CTG AAG GAA CTT GAA CCC CAA ATT GCT TCA GCA AAA CCA      1028
Thr Ile Asn Leu Lys Glu Leu Glu Pro Gln Ile Ala Ser Ala Lys Pro  
295                 300                 305      
AAT GCA GAG TGAAGGCAGT GAGAGCCTGA GGAAAGAGTT AAAAATTGCT              1077
Asn Ala Glu                                             
TTGCCTGAAA TAAGAAGTGC AGAGTTTCTC AGAATTCAAA AATGTTCTCA GCTGATTGGA    1137
ATTCTACAGT TGAATAATTA AAGAAC                                         1163
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:23:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 309 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:23:
Met Asp Pro Arg Cys Thr Met Gly Leu Ala Ile Leu Ile Phe Val Thr 
1               5                  10                  15     
Val Leu Leu Ile Ser Asp Ala Val Ser Val Glu Thr Gln Ala Tyr Phe 
20                  25                  30         
Asn Gly Thr Ala Tyr Leu Pro Cys Pro Phe Thr Lys Ala Gln Asn Ile 
35                  40                  45             
Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Gln Lys Leu Val 
50                  55                  60                 
Leu Tyr Glu His Tyr Leu Gly Thr Glu Lys Leu Asp Ser Val Asn Ala 
65                  70                  75                  80 
Lys Tyr Leu Gly Arg Thr Ser Phe Asp Arg Asn Asn Trp Thr Leu Arg 
85                  90                  95     
Leu His Asn Val Gln Ile Lys Asp Met Gly Ser Tyr Asp Cys Phe Ile 
100                 105                 110         
Gln Lys Lys Pro Pro Thr Gly Ser Ile Ile Leu Gln Gln Thr Leu Thr 
115                 120                 125             
Glu Leu Ser Val Ile Ala Asn Phe Ser Glu Pro Glu Ile Lys Leu Ala 
130                 135                 140                 
Gln Asn Val Thr Gly Asn Ser Gly Ile Asn Leu Thr Cys Thr Ser Lys 
145                 150                 155                 160 
Gln Gly His Pro Lys Pro Lys Lys Met Tyr Phe Leu Ile Thr Asn Ser 
165                 170                 175     
Thr Asn Glu Tyr Gly Asp Asn Met Gln Ile Ser Gln Asp Asn Val Thr 
180                 185                 190         
Glu Leu Phe Ser Ile Ser Asn Ser Leu Ser Leu Ser Phe Pro Asp Gly 
195                 200                 205             
Val Trp His Met Thr Val Val Cys Val Leu Glu Thr Glu Ser Met Lys 
210                 215                 220                 
Ile Ser Ser Lys Pro Leu Asn Phe Thr Gln Glu Phe Pro Ser Pro Gln 
225                 230                 235                 240 
Thr Tyr Trp Lys Glu Ile Thr Ala Ser Val Thr Val Ala Leu Leu Leu 
245                 250                 255     
Val Met Leu Leu Ile Ile Val Cys His Lys Lys Pro Asn Gln Pro Ser 
260                 265                 270         
Arg Pro Ser Asn Thr Ala Ser Lys Leu Glu Arg Asp Ser Asn Ala Asp 
275                 280                 285             
Arg Glu Thr Ile Asn Leu Lys Glu Leu Glu Pro Gln Ile Ala Ser Ala 
290                 295                 300                 
Lys Pro Asn Ala Glu 
305                 
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:24:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:24:
ACATAAGCCT GAGTGAGCTG G                                                21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:25:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:25:
ATGATGAGCA GCATCACAAG G                                                21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:26:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:26:
TGGTCGAGTG AGTCCGAATA C                                                21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:27:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:27:
GACGAGTAGT AACATACAGT G                                                21
(2)  INFORMATION FOR SEQ ID NO:28:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1491 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(iii) HYPOTHETICAL: no
(iv) ANTI-SENSE: no
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Homo sapien
(F) TISSUE TYPE: lymphoid
(G) CELL TYPE: B cell
(H) CELL LINE: Raji
(vii) IMMEDIATE SOURCE:
(A) LIBRARY: cDNA in pCDM8 vector
(B) CLONE: B7, Raji clone #13
(viii) POSITION IN GENOME:
(A) CHROMOSOME/SEGMENT: 3
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY:  Open reading frame (translated region)
(B) LOCATION:  318 to 1181 bp
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity to other pattern
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY:  Alternate polyadenylation signal
(B) LOCATION:  1474 to 1479 bp
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity to other pattern
(x) PUBLICATION INFORMATION:
(A) AUTHORS: FREEMAN, GORDON J.
FREEDMAN, ARNOLD S.
SEGIL, JEFFREY M.  
LEE, GRACE
WHITMAN, JAMES F.
NADLER, LEE M.
(B) TITLE:  B7, A New Member Of The Ig Superfamily With
Unique Expression On Activated And Neoplastic B Cells
(C) JOURNAL: The Journal of Immunology
(D) VOLUME: 143
(E) ISSUE: 8
(F) PAGES: 2714-2722
(G) DATE: 15-OCT-1989
(H) RELEVANT RESIDUES In SEQ ID NO:28: FROM 1 TO 1491
(xi)  SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:28: 
CCAAAGAAAA AGTGATTTGT CATTGCTTTA TAGACTGTAA GAAGAGAACA TCTCAGAAGT   60
GGAGTCTTAC CCTGAAATCA AAGGATTTAA AGAAAAAGTG GAATTTTTCT TCAGCAAGCT  120 
GTGAAACTAA ATCCACAACC TTTGGAGACC CAGGAACACC CTCCAATCTC TGTGTGTTTT  180
GTAAACATCA CTGGAGGGTC TTCTACGTGA GCAATTGGAT TGTCATCAGC CCTGCCTGTT  240
TTGCACCTGG GAAGTGCCCT GGTCTTACTT GGGTCCAAAT TGTTGGCTTT CACTTTTGAC  300
CCTAAGCATC TGAAGCC ATG GGC CAC ACA CGG AGG CAG GGA ACA TCA CCA TCC 353
Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser
-30                 -25
AAG TGT CCA TAC CTG AAT TTC TTT CAG CTC TTG GTG CTG GCT GGT CTT    401
Lys Cys Pro Tyr Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu
-20                 -15                 -10           
TCT CAC TTC TGT TCA GGT GTT ATC CAC GTG ACC AAG GAA GTG AAA GAA    449 
Ser His Phe Cys Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu
-5                   1               5                  10
GTG GCA ACG CTG TCC TGT GGT CAC AAT GTT TCT GTT GAA GAG CTG GCA    497
Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala
15                  20                  25
CAA ACT CGC ATC TAC TGG CAA AAG GAG AAG AAA ATG GTG CTG ACT ATG    545
Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met
30                  35                  40      
ATG TCT GGG GAC ATG AAT ATA TGG CCC GAG TAC AAG AAC CGG ACC ATC    593
Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile
45                  50                  55
TTT GAT ATC ACT AAT AAC CTC TCC ATT GTG ATC CTG GCT CTG CGC CCA    641
Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro
60                  65                  70
TCT GAC GAG GGC ACA TAC GAG TGT GTT GTT CTG AAG TAT GAA AAA GAC    689
Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp
75                  80                  85                  90
GCT TTC AAG CGG GAA CAC CTG GCT GAA GTG ACG TTA TCA GTC AAA GCT    737
Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala
95                 100                 105
GAC TTC CCT ACA CCT AGT ATA TCT GAC TTT GAA ATT CCA ACT TCT AAT    785
Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn
110                 115                 120
ATT AGA AGG ATA ATT TGC TCA ACC TCT GGA GGT TTT CCA GAG CCT CAC    833
Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His
125                 130                 135
CTC TCC TGG TTG GAA AAT GGA GAA GAA TTA AAT GCC ATC AAC ACA ACA    881
Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr
140                 145                 150
GTT TCC CAA GAT CCT GAA ACT GAG CTC TAT GCT GTT AGC AGC AAA CTG    929
Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu  
155                 160                 165                 170
GAT TTC AAT ATG ACA ACC AAC CAC AGC TTC ATG TGT CTC ATC AAG TAT    977
Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr 
175                 180                 185
GGA CAT TTA AGA GTG AAT CAG ACC TTC AAC TGG AAT ACA ACC AAG CAA   1025
Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln
190                 195                 200
GAG CAT TTT CCT GAT AAC CTG CTC CCA TCC TGG GCC ATT ACC TTA ATC   1073
Glu His Phe Pro Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile
205                 210                 215                 
TCA GTA AAT GGA ATT TTT GTG ATA TGC TGC CTG ACC TAC TGC TTT GCC   1121
Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala
220                 225                 230
CCA AGA TGC AGA GAG AGA AGG AGG AAT GAG AGA TTG AGA AGG GAA AGT   1169
Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser 
235                 240                 245                 250
GTA CGC CCT GTA  TAACAGTGTC CGCAGAAGCA AGGGGCTGAA AAGATCTGAA      1221
Val Arg Pro Val
GGTAGCCTCC GTCATCTCTT CTGGGATACA TGGATCGTGG GGATCATGAG GCATTCTTCC 1281
CTTAACAAAT TTAAGCTGTT TTACCCACTA CCTCACCTTC TTAAAAACCT CTTTCAGATT 1341
AAGCTGAACA GTTACAAGAT GGCTGGCATC CCTCTCCTTT CTCCCCATAT GCAATTTGCT 1401
TAATGTAACC TCTTCTTTTG CCATGTTTCC ATTCTGCCAT CTTGAATTGT CTTGTCAGCC 1461
AATTCATTAT CTATTAAACA CTAATTTGAG                                  1491
(3) INFORMATION FOR SEQ ID NO:29:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 288 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(A) DESCRIPTION: B cell activation antigen; natural ligand 
for CD28 T cell surface antigen; transmembrane protein
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: signal sequence
(B) LOCATION: -34 to -1
(C) IDENTIFICATION METHOD: amino terminal sequencing of
soluble protein 
(D) OTHER INFORMATION: hydrophobic
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: extracellular domain 
(B) LOCATION: 1 to 208
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: transmembrane domain 
(B) LOCATION: 209 to 235
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: intracellular domain 
(B) LOCATION: 236 to 254
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: N-linked glycosylation 
(B) LOCATION: 19 to 21
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: N-linked glycosylation 
(B) LOCATION: 55 to 57
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: N-linked glycosylation 
(B) LOCATION: 64 to 66
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: N-linked glycosylation 
(B) LOCATION: 152 to 154
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: N-linked glycosylation
(B) LOCATION: 173 to 175
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: N-linked glycosylation 
(B) LOCATION: 177 to 179
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: N-linked glycosylation 
(B) LOCATION: 192 to 194
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: N-linked glycosylation 
(B) LOCATION: 198 to 200
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: Ig V-set domain 
(B) LOCATION: 1 to 104
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: Ig C-set domain
(B) LOCATION:  105 to 202
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(x) PUBLICATION INFORMATION:
(A) AUTHORS: FREEMAN, GORDON J.
FREEDMAN, ARNOLD S.
SEGIL, JEFFREY M.
LEE, GRACE 
WHITMAN, JAMES F. 
NADLER, LEE M.
(B) TITLE: B7, A New Member Of The Ig Superfamily With 
Unique Expression On Activated And Neoplastic B Cells
(C) JOURNAL: The Journal of Immunology
(D) VOLUME: 143
(E) ISSUE: 8
(F) PAGES: 2714-2722
(G) DATE:  15-OCT-1989
(H) RELEVANT RESIDUES IN SEQUENCE ID NO:29: From -26 to 262
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:29:
Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr
-30                 -25                 -20
Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys
-15                 -10                  -5
Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu
-1   1               5                  10
Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile
15                  20                  25                  30
Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp
35                  40                  45   
Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr
50                  55                  60
Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly
65                  70                  75
Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg
80                  85                  90
Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr
95                 100                 105                 110
Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile
115                 120                 125
Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu
130                 135                 140
Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp
145                 150                 155
Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met
160                 165                 170
Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg
175                 180                 185                 190
Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro
195                 200                 205
Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly
210                 215                 220
Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg
225                 230                 235
Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val
240                 245                 250  
(4)  INFORMATION FOR SEQ ID NO:30:
(i)  SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1716 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii)  MOLECULAR TYPE: cDNA to mRNA
(iii) HYPOTHETICAL: no
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Mus musculus
(D) DEVELOPMENTAL STAGE: germ line
(F) TISSUE TYPE: lymphoid
(G) CELL TYPE: B lymphocyte
(H) CELL LINE: 70Z and A20
(vii) IMMEDIATE SOURCE:
(A) LIBRARY: cDNA in pCDM8 vector
(B) CLONE: B7 #'s 1 and 29
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: translated region
(B) LOCATION: 249 to 1166 bp
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity to other pattern
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: Alternate ATG initiation codons
(B) LOCATION: 225 to 227 and 270 to 272
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity to other pattern
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:30:
GAGTTTTATA CCTCAATAGA CTCTTACTAG TTTCTCTTTT TCAGGTTGTG AAACTCAACC   60
TTCAAAGACA CTCTGTTCCA TTTCTGTGGA CTAATAGGAT CATCTTTAGC ATCTGCCGGG  120
TGGATGCCAT CCAGGCTTCT TTTTCTACAT CTCTGTTTCT CGATTTTTGT GAGCCTAGGA  180
GGTGCCTAAG CTCCATTGGC TCTAGATTCC TGGCTTTCCC CATCATGTTC TCCAAAGCAT  240
CTGAAGCT ATG GCT TGC AAT TGT CAG TTG ATG CAG GAT ACA CCA CTC CTC   290
Met Ala Cys Asn Cys Gln Leu Met Gln Asp Thr Pro Leu Leu
-35                 -30                 -25
AAG TTT CCA TGT CCA AGG CTC AAT CTT CTC TTT GTG CTG CTG ATT CGT    338
Lys Phe Pro Cys Pro Arg Leu Ile Leu Leu Phe Val Leu Leu Ile Arg
-20                 -15                 -10
CTT TCA CAA GTG TCT TCA GAT GTT GAT GAA CAA CTG TCC AAG TCA GTG    386
Leu Ser Gln Val Ser Ser Asp Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys Ser Val
-5              -1   1               5
AAA GAT AAG GTA TTG CTG CCT TGC CGT TAC AAC TCT CCT CAT GAA GAT    434
Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His Glu Asp
10                  15                  20                  25
GAG TCT GAA GAC CGA ATC TAC TGG CAA AAA CAT GAC AAA GTG GTG CTG    482
Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val Val Leu
30                  35                  40
TCT GTC ATT GCT GGG AAA CTA AAA GTG TGG CCC GAG TAT AAG AAC CGG    530
Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg
45                  50                  55
ACT TTA TAT GAC AAC ACT ACC TAC TCT CTT ATC ATC CTG GGC CTG GTC    578
Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly Leu Val
60                  65                  70
CTT TCA GAC CGG GGC ACA TAC AGC TGT GTC GTT CAA AAG AAG GAA AGA    626
Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys Glu Arg
75                  80                  85
GGA ACG TAT GAA GTT AAA CAC TTG GCT TTA GTA AAG TTG TCC ATC AAA    674
Gly Thr Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys
90                  95                 100                 105
GCT GAC TTC TCT ACC CCC AAC ATA ACT GAG TCT GGA AAC CCA TCT GCA    722
Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro Ser Ala
110                 115                 120
GAC ACT AAA AGG ATT ACC TGC TTT GCT TCC GGG GGT TTC CCA AAG CCT    770
Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro 
125                 130                 135
CGC TTC TCT TGG TTG GAA AAT GGA AGA GAA TTA CCT GGC ATC AAT ACG    818
Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile Asn Thr
140                 145                 150
ACA ATT TCC CAG GAT CCT GAA TCT GAA TTG TAC ACC ATT AGT AGC CAA    866
Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Gln
155                 160                 165
CTA GAT TTC AAT ACG ACT CGC AAC CAC ACC ATT AAG TGT CTC ATT AAA    914
Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu Ile Lys
170                 175                 180                 185
TAT GGA GAT GCT CAC GTG TCA GAG GAC TTC ACC TGG GAA AAA CCC CCA    962
Tyr Gly Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys Pro Pro
190                 195                 200
GAA GAC CCT CCT GAT AGC AAG AAC ACA CTT GTG CTC TTT GGG GCA GGA   1010
Glu Asp Pro Pro Asp Ser Lys Asn Thr Leu Val Leu Phe Gly Ala Gly
205                 210                 215
TTC GGC GCA GTA ATA ACA GTC GTC GTC ATC GTT GTC ATC ATC AAA TGC   1058
Phe Gly Ala Val Ile Thr Val Val Val Ile Val Val Ile Ile Lys Cys
220                 225                 230
TTC TGT AAG CAC AGA AGC TGT TTC AGA AGA AAT GAG GCA AGC AGA GAA   1106
Phe Cys Lys His Arg Ser Cys Phe Arg Arg Asn Glu Ala Ser Arg Glu
235                 240                 245
ACA AAC AAC AGC CTT ACC TTC GGG CCT GAA GAA GCA TTA GCT GAA CAG   1154
Thr Asn Asn Ser Leu Thr Phe Gly Pro Glu Glu Ala Leu Ala Glu Gln
250                 255                 260                 265
ACC GTC TTC CTT TAGTTCTTCT CTGTCCATGT GGGATACATG GTATTATGTG  1206
Thr Val Phe Leu
GCTCATGAGG TACAATCTTT CTTTCAGCAC CGTGCTAGCT GATCTTTCGG ACAACTTGAC 1266
ACAAGATAGA GTTAACTGGG AAGAGAAAGC CTTGAATGAG GATTTCTTTC CATCAGGAAG 1326
CTACGGGCAA GTTTGCTGGG CCTTTGATTG CTTGATGACT GAAGTGGAAA GGCTGAGCCC 1386
ACTGTGGGTG GTGCTAGCCC TGGGCAGGGG CAGGTGACCC TGGGTGGTAT AAGAAAAAGA 1446
GCTGTCACTA AAAGGAGAGG TGCCTAGTCT TACTGCAACT TGATATGTCA TGTTTGGTTG 1506
GTGTCTGTGG GAGGCCTGCC CTTTTCTGAA GAGAAGTGGT GGGAGAGTGG ATGGGGTGGG 1566
GGCAGAGGAA AAGTGGGGGA GAGGGCCTGG GAGGAGAGGA GGGAGGGGGA CGGGGTGGGG 1626
GTGGGGAAAA CTATGGTTGG GATGTAAAAA CGGATAATAA TATAAATATT AAATAAAAAG 1686
AGAGTATTGA GCAAAAAAAA AAAAAAAAAA                                  1716
(5)  INFORMATION FOR SEQ ID NO:31:
(i)  SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 306 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(A) DESCRIPTION: B lymphocyte activation antigen; Ig
superfamily member; T cell costimulatory signal
via activation of CD28 pathways, binds to CD28+
T cells, transmembrane protein
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: signal sequence
(B) LOCATION: -37 to -1
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known 
sequence 
(D) OTHER INFORMATION: hydrophobic
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: extracellular domain 
(B) LOCATION: 1 to 210
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: transmembrane domain 
(B) LOCATION: 211 to 235
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: intracellular (cytoplasmic) domain 
(B) LOCATION: 236 to 269
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: Ig V-set domain 
(B) LOCATION: 1 to 105
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: Ig C-set domain
(B) LOCATION:  106 to 199
(C) IDENTIFICATION METHOD: similarity with known
sequence
(x) PUBLICATION INFORMATION:
(A) AUTHORS: FREEMAN, GORDON J.
GRAY, GARY S. 
GIMMI, CLAUDE D.
LOMBARD, DAVID B.
ZHOU, LIANG-JI
WHITE, MICHAEL
FINGEROTH, JOYCE D.
GRIBBEN, JOHN G.
NADLER, LEE M.
(B) TITLE: Structure, Expression, and T Cell Costimulatory
Activity Of The Murine Homologue Of The Human B
Lymphocyte Activation Antigen B7
(C) JOURNAL: Journal of Experimental Medicine
(D) VOLUME: 
(E) ISSUE: 
(F) PAGES: 
(G) DATE: IN PRESS
(H) RELEVANT RESIDUES IN SEQUENCE ID NO:31: From -37 to 269
(xi)  SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:31:
Met Ala Cys Asn Cys Gln Leu Met Gln Asp Thr Pro Leu Leu Lys Phe
-35                 -30                 -25 
Pro Cys Pro Arg Leu Ile Leu Leu Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ser
-20                 -15                 -10       
Gln Val Ser Ser Asp Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys Ser Val Lys Asp
-5              -1   1               5                  10
Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His Glu Asp Glu Ser
15                  20                  25
Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val Val Leu Ser Val
30                  35                  40
Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Leu
45                  50                  55
Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly Leu Val Leu Ser
60                  65                  70                  75
Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys Glu Arg Gly Thr
80                  85                  90
Tyr Gly Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Ala Asp
95                 100                 105
Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro Ser Ala Asp Thr
110                 115                 120
Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro Arg Phe
125                 130                 135
Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile Asn Thr Thr Ile
140                 145                 150                 155
Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Gln Leu Asp
160                 165                 170
Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu Ile Lys Tyr Gly
175                 180                 185
Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys Pro Pro Glu Asp
190                 195                 200
Pro Pro Asp Ser Lys Asn Thr Leu Val Leu Phe Gly Ala Gly Phe Gly
205                 210                 215
Ala Val Ile Thr Val Val Val Ile Val Val Ile Ile Lys Cys Phe Cys
220                 225                 230                 235
Lys His Arg Ser Cys Phe Arg Arg Asn Glu Ala Ser Arg Glu Thr Asn
240                 245                 250
Asn Ser Leu Thr Phe Gly Pro Glu Glu Ala Leu Ala Glu Gln Thr Val
255                 260                 265
Phe Leu
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:32:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 39 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:32:
GGCACTAGGT CTCCAGCTTG AGATCACAGT TCTCTCTAC                             39
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:33:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 37 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:33:
GCTTGAATCT TCAGAGGAGC GGAGTGGACA CCTGTGG                               37
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:34:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:34:
GCTCCTCTGA AGATTCAAGC                                                  20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:35:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:35:
GGCACTATGA TCAGGGGGAG GCTGAGGTCC                                       30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:36:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 78 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:36:
GCATTTTAAG CTTTTTCCTG ATCAGGAGCC CAAATCTTCT GACAAAACTC ACACATCTCC      60
ACCGTCTCCA GGTAAGCC                                                    78
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:37:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:37:
TAATACGACT CACTATAGGG                                                  20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:38:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 66 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:38:
GAGCATTTTC CTGATCAGGA GTCCAAATAT GGTCCCCCAT CCCATCATCC CCAGGTAAGC      60
CAACCC                                                                 66
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:39:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 66 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:39:
GCAGAGGAAT CGAGCTCGGT ACCCGGGGAT CCCCAGTGTG GGGACAGTGG GACCGCTCTG      60
CCTCCC                                                                 66
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:40:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 59 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:40:
GGGTTTTGGG GGGAAGAGGA AGACTGACGG TGCCCCCTCG GCTTCAGGTG CTGAGGAAG       59
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:41:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 56 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:41:
CATCTCTTCC TCAGCACCTG AAGCCGAGGG GGCACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCC          56
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:42:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 99 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:42:
CGCACGTGAC CTCAGGGGTC CGGGAGATCA TGAGAGTGTC CTTGGGTTTT GGGGGGAACA      60
GGAAGACTGA TGGTGCCCCC TCGAACTCAG GTGCTGAGG                             99
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:43:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 98 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: oligonucleotide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:43:
CCTCAGCACC TGAGTTCGAG GGGGCACCAT CAGTCTCCTG TTCCCCCCAA AACCCAAGGA      60
CACTCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACGTGCG                              98
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:44:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 330 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..330
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:44:
GCT CCT CTG AAG ATT CAA GCT TAT TTC AAT GAG ACT GCA GAC CTG CCA        48
Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro  
1               5                  10                  15      
TGC CAA TTT GCA AAC TCT CAA AAC CAA AGC CTG AGT GAG CTA GTA GTA        96
Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val  
20                  25                  30          
TTT TGG CAG GAC CAG GAA AAC TTG GTT CTG AAT GAG GTA TAC TTA GGC       144
Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly  
35                  40                  45              
AAA GAG AAA TTT GAC AGT GTT CAT TCC AAG TAT ATG GGC CGC ACA AGT       192
Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser  
50                  55                  60                  
TTT GAT TCG GAC AGT TGG ACC CTG AGA CTT CAC AAT CTT CAG ATC AAG       240
Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys  
65                  70                  75                  80  
GAC AAG GGC TTG TAT CAA TGT ATC ATC CAT CAC AAA AAG CCC ACA GGA       288
Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly  
85                  90                  95      
ATG ATT CGC ATC CAC CAG ATG AAT TCT AGG CTG TCA GTG CTT               330
Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Arg Leu Ser Val Leu 
100                 105                 110 
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:45:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 110 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:45:
Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro 
1               5                  10                  15     
Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val 
20                  25                  30         
Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly 
35                  40                  45             
Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser 
50                  55                  60                 
Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys 
65                  70                  75                  80 
Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly 
85                  90                  95     
Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Arg Leu Ser Val Leu 
100                 105                 110 
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:46:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 306 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..310
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:46:
GCT AAC TTC AGT CAA CCT GAA ATA GTA CCA ATT TCT AAT ATA ACA GAA        48
Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu  
1               5                  10                  15      
AAT GTG TAC ATA AAT TTG ACC TGC TCA TCT ATA CAC GGT TAC CCA GAA        96
Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu  
20                  25                  30          
CCT AAG AAG ATG AGT GTT TTG CTA AGA ACC AAG AAT TCA ACT ATC GAG       144
Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu  
35                  40                  45              
TAT GAT GGT ATT ATG CAG AAA TCT CAA GAT AAT GTC ACA GAA CTG TAC       192
Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr  
50                  55                  60                  
GAC GTT TCC ATC AGC TTG TCT GTT TCA TTC CCT GAT GTT ACG AGC AAT       240
Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn  
65                  70                  75                  80  
ATG ACC ATC TTC TGT ATT CTG GAA ACT GAC AAG ACG CGG CTT TTA TCT       288
Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser  
85                  90                  95      
TCA CCT TTC TCT ATA GAG                                                306
Ser Pro Phe Ser Ile Glu
100        
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1               5                  10                  15     
Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu 
20                  25                  30         
Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu 
35                  40                  45             
Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr 
50                  55                  60                 
Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn 
65                  70                  75                  80 
Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser 
85                  90                  95     
Ser Pro Phe Ser Ile Glu 
100         
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TGTGTGTGGA ATTCTCATTA CTGATCAGGA AAATGCTCTT GCTTG                      45
【図面の簡単な説明】
【０２４４】
【図１】図１Ａ及びＢは、媒体中で、抗ＤＣ３中のみ、又は単クローン抗体又は組換えタンパク質（αＢ７（１３３、抗Ｂ７−１）；ＣＴＬＡ４Ｉｇ；ＦａｂαＣＤ２８；制御Ｉｇ融合タンパク質（ＣＴＬＡ４Ｉｇに対するアイソタイプ制御）；又はαＢ５、（抗Ｂ５、抗Ｂ７−１に対するアイソタイプ制御））の存在下の抗ＤＣ３中で培養されたＣＨＯ細胞にトランスフェクションされたＢ７（Ｂ７−１）（パネルａ）或は同質遺伝子的活性化Ｂリンパ球（パネルｂ）によって提供された相互促進に対するＣＤ２８＋Ｔ細胞の反応を、３Ｈ−チミジン組み込み又はＩＬ−２分泌による推定で示したグラフである。
【図２】図２Ａ乃至Ｃは、表面免疫グロブリン（ｓＩｇ）架橋で活性化した脾Ｂ細胞上のＢ７−１の細胞表面発現のログ蛍光強度を表したグラフである。全体（パネルａ）活性化Ｂ細胞、Ｂ７−１ポジティブ（パネルｂ）活性化Ｂ細胞、Ｂ７−１ネガティブ（パネルｃ）活性化Ｂ細胞は、抗Ｂ７−１単クローン抗体（１３３）及び蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンで着色され、フローサイトメトリーで分析された。
【図３】図３Ａ及びＢは、媒体中で、抗ＤＣ３中のみ、又は単クローン抗体又は組換えタンパク質（αＢＢ−１（１３３、抗Ｂ７−１及び抗Ｂ７−３）；αＢ７（抗Ｂ７−１）；ＣＴＬＡ４Ｉｇ；ＦａｂαＣＤ２８；制御Ｉｇ融合タンパク質又はαＢ５、（抗Ｂ５））の存在下の抗ＤＣ３中で培養されたＢ７−１+（パネルａ）又はＢ７−１-（パネルｂ）活性化同質遺伝子的活性化Ｂリンパ球によって提供された相互促進に対するＣＤ２８＋Ｔ細胞の反応を、3Ｈ−チミジン組み込み及びＩＬ−２分泌による推定で示したグラフである。
【図４】図４は、分割Ｂ７−１+Ｂ及び７−１-活性化Ｂリンパ球上でのＢ７−１、抗Ｂ７−３、及び全ＣＴＬＡ４対レセプターの細胞表面発現を表したグラフである。
【図５】図５は、ｓＩｇ架橋によって活性化された脾Ｂ細胞上の、Ｂ７−１（ＣＴＬＡ４Ｉｇ及びｍＡｂｓＢＢ−1及び１３３）、Ｂ７−３（ＣＴＬＡ４Ｉｇ及びｍＡｂＢＢ−１）、Ｂ７−２（ＣＴＬＡ４Ｉｇ）対レセプターの一時性表面発現を表したグラフである。
【図６】図６は、ＭＨＣクラスＩＩ架橋によって活性化された脾Ｂ細胞上の、Ｂ７−１（ＣＴＬＡ４Ｉｇ及びｍＡｂｓＢＢ−１及び１３３）、Ｂ７−３（ＣＴＬＡ４Ｉｇ及びｍＡｂＢＢ−１）、Ｂ７−２（ＣＴＬＡ４Ｉｇ）対レセプターの一時性表面発現を表したグラフである。
【図７】図７Ａ及びＢは、２４時間（パネルａ）又は４８時問（パネルｂ）ｓＩｇ架橋によって活性化され、媒体中か、抗ＤＣ３中のみ、又は単クローン抗体又は組換えタンパク質（αＢ７（１３３、抗Ｂ７−１）；αＢＢ１（抗Ｂ７−１及び抗Ｂ７−３）；ＣＴＬＡ４Ｉｇ；ＦａｂαＣＤ２８；及びαＢ５（抗Ｂ５））の存在下の抗ＤＣ３中で培養された同質遺伝子的Ｂリンパ球によって提供された相互促進に対するＣＤ２８＋Ｔ細胞の反応を、３Ｈ−チミジン組み込み及びＩＬ−２分泌による推定で示したグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、ヒトＢリンパ球抗原Ｂ７−２（ｈＢ７−２−クローン２９）のヌクレオチド及び論理的に推定したアミノ酸配列の一部分である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ヒトＢリンパ球抗原Ｂ７−２（ｈＢ７−２−クローン２９）のヌクレオチド及び論理的に推定したアミノ酸配列の一部分である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ヒトＢリンパ球抗原Ｂ７−２（ｈＢ７−２−クローン２９）のヌクレオチド及び論理的に推定したアミノ酸配列の一部分である。
【図９】図９は、制御プラスミド、Ｂ７−１（Ｂ７−１）を発現するプラスミド、又はＢ７−２（Ｂ７−２）を発現するプラスミドでトランスフェクションされ、制御ｍＡｂ（ＩｇＭ）、抗Ｂ７−１（ｍＡｂｓ１３３及びＢＢ−１）、組換えタンパク質ＣＴＬＡ４Ｉｇ、又はアイソタイプ一致制御Ｉｇタンパク質とその後適切名第２ＦＩＴＣ標識免疫グロブリンで着色し、フローサイトメトリーで分析されたＣＯＳ細胞のグラフである。
【図１０】図１０Ａ及びＢは、未促進及び抗Ｉｇ活性化ヒト脾細胞及び細胞系（パネルａ）及びヒト骨髄腫（パネルｂ）内のＢ７−２発現のＲＮＡブロット分析を示す。
【図１１】図１１は、ベクターのみか、Ｂ７−１又はＢ７−２発現を指示するベクターでトランスフェクションされたホルボールミリスチン酸（ＰＭＡ）及びＣＯＳ細胞による亜ミトゲン促進に対するＣＤ２８＋Ｔ細胞の増殖を、3Ｈ−チミジン組み込み又はＩＬ−２分泌による推定で示したグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ベクターのみか、Ｂ７−１（Ｂ７−１）又はＢ７−２（Ｂ７−２）発現を指示するベクターでトランスフェクションされたＰＭＡ及びＣＯＳ細胞による促進に対するＣＤ２８＋Ｔ細胞の増殖のｍＡｂｓ及び組換えタンパク質による抑制を、3Ｈ−チミジン組み込み又はＩＬ−２分泌による推定で示したグラフである。抑制研究は、抗体を添加せず（ｍＡｂ無し）か、抗Ｂ７ｍＡｂ１３３（１３３）か、抗Ｂ７ｍＡｂＢＢ−１（ＢＢ−１）か、抗Ｂ５ｍＡｂ（Ｂ５）か、抗Ｆａｂ断片ＣＤ２８（ＣＤ２８Ｆａｂ）か、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＣＴＬＡ４Ｉｇ）か、Ｉｇ制御タンパク質（制御Ｉｇ）を用いて、ＰＭＡ促進こＳ細胞混合ＣＤ２８＋Ｔ細胞に対して行われた。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、図１２Ａの続きの結果を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ヒトＢ７−２タンパク質（ｈＢ７−２）論理的に推定したアミノ酸配列（配列同定番号第２番）と、ヒトＢ７−１タンパク質（ｈＢ７−１）論理的に推定したアミノ酸配列（配列同定番号第２８及び２９番）とマウスＢ７−１タンパク質（ｍＢ７−１）論理的に推定したアミノ酸配列（配列同定番号第３０及び３１番）との間の配列相同関係を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、図１３Ａの続きの配列を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、マウスＢ７−２抗原（ｍＢ７−２）（配列同定番号第２２及び２３番）のヌクレオチド及び論理的に推定したアミノ酸配列の一部分である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、マウスＢ７−２抗原（ｍＢ７−２）（配列同定番号第２２及び２３番）のヌクレオチド及び論理的に推定したアミノ酸配列の一部分である。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、マウスＢ７−２抗原（ｍＢ７−２）（配列同定番号第２２及び２３番）のヌクレオチド及び論理的に推定したアミノ酸配列の一部分である。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、マウスＢ７−２抗原（ｍＢ７−２）（配列同定番号第２２及び２３番）のヌクレオチド及び論理的に推定したアミノ酸配列の一部分である。
【図１５】図１５は、生チニレート化ＣＴＬＡ４Ｉｇが、Ｂ７属Ｉｇ融合タンパク質によって、固定されたＢ７−２Ｉｇへ結合することへの競合的阻害を表したグラフである。
【図１６】図１６Ａ及びＢは、生チニレート化Ｂ７−１−Ｉｇ（パネルＡ）又はＢ７−２−Ｉｇ（パネルＢ）が、未標識Ｂ７−１−Ｉｇ（パネルＡ）又はＢ７−２−Ｉｇ（パネルＢ）の濃度増加によって固定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇへ結合することへの競合的阻害を表したグラフである。実験的に確かめられたＩＣ50値が、表の右上に示されている。
【図１７】図１７は、抗ｈＢ７−２単クローン抗体ＨＡ３．１Ｆ９で着色した細胞のフローサイトメトリープロフィールを示す。この抗体で着色した細胞は、ヒトＢ７−２（ＣＨＯ−ｈＢ７．２）を発現するためトランスフェクションされたＣＨＯ細胞と、ヒトＢ７−２（３Ｔ３−ｈＢ７．２）を発現するためトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞と、制御トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞（３Ｔ３−ｎｅｏ）であった。抗ｈＢ７．２抗体Ｂ７０は、ポジティブ制御として使用された。
【図１８】図１８は、抗ｈＢ７−２単クローン抗体ＨＡ５．２Ｂ７で着色した細胞のフローサイトメトリープロフィールを示す。この抗体で着色した細胞は、ヒトＢ７−２（ＣＨＯ−ｈＢ７．２）を発現するためトランスフェクションされたＣＨＯ細胞と、ヒトＢ７−２（３Ｔ３−ｈＢ７．２）を発現するためトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞と、制御トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞（３Ｔ３−ｎｅｏ）であった。抗ｈＢ７．２抗体Ｂ７０は、ポジティブ制御として使用された。
【図１９】図１９は、抗ｈＢ７−２単クローン抗体ＨＦ２．３Ｄ１で着色した細胞のフローサイトメトリープロフィールを示す。この抗体で着色した細胞は、ヒトＢ７−２（ＣＨＯ−ｈＢ７．２）を発現するためトランスフェクションされたＣＨＯ細胞と、ヒトＢ７−２（３Ｔ３−ｈＢ７．２）を発現するためトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞と、制御トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞（３Ｔ３−ｎｅｏ）であった。抗ｈＢ７．２抗体Ｂ７０は、ポジティブ制御として使用された。
【図２０】図２０は、可溶性生チニレート化ＣＴＬＡ４Ｉｇの、プレートに接合されたＢ７−１Ｉｇ、Ｂ７−１ＶＩｇ、Ｂ７−１ＣＩｇ、Ｂ７−２Ｉｇ、Ｂ７−２ＶＩｇ、Ｂ７−２ＣＩｇ、又はヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）への直接接合を示したグラフである。
【図２１】図２１Ａ乃至Ｅは、Ｂ７−２Ｉｇ（パネルＣ）、Ｂ７−２ＶＩｇ（パネルＤ）、Ｂ７−１Ｉｇ（パネルＥ）、又は２次抗体のみ（パネルＢ）のＣＴＬＡ４＋ＣＨＯ細胞への結合のフローサイトメトリープロフィールを示す。表Ａは、トランスフェクションされてないＣＨＯ細胞を表すネガティブ制御である。
【図２２】図２２は、制御Ｉｇ、Ｂ７−１Ｉｇ、Ｂ７−２Ｉｇ、Ｂ７−２ＶＩｇ、及び抗ＣＤ２８の、ＣＤ２８を表すＣＨＯ細胞への結合のフローサイトメトリープロフィールを示す。
【図２３】図２３は、１ｎｇ／ｍｌのＰＭＡのみ、又は以下の相互促進信号（ＣＨＯ／Ｂ７−１細胞、ＣＨＯ／Ｂ７−２細胞、制御Ｉｇ（３０μｇ／ｍｌ）、Ｂ７−１Ｉｇ、Ｂ７−２Ｉｇ、Ｂ７−２ＶＩｇ（各３０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ）のいずれかで促進されたＣＤ２８＋Ｔ細胞の増殖を表すヒストグラムである。
【図２４】図２４は、プレートに接着された抗ＣＤ３、Ｂ７−１Ｉｇ（１０）３、又は１μｇ／ｍｌ）、又はＢ７−２Ｉｇ（１９、３、又は１μｇ／ｍｌ）、Ｂ７−２ＶＩｇ（３．０乃至０．０１μｇ／ｍｌ）で培養したＣＤ２８＋Ｔ細胞の増殖と、ＣＤ２８＋Ｔ細胞によるＩＬ−２の生成を表すヒストグラムである。
【図２５】図２５は、抗ＣＤ３のみ、又はＣＨＯ／Ｂ７−２細胞又はＢ７−２ＶＩｇ融合細胞の何れかと共に１、２又は３日間培養した後のＣＤ２８＋Ｔ細胞によるＩＬ−２の生成量を表す。
【図２６】図２６は、抗ＣＤ３のみ、又は抗ＣＤ２８、Ｂ７−１Ｉｇ、Ｂ７−２Ｉｇ、又はＢ７−２ＶＩｇの何れかと共に１、２又は３日間培養した後のＣＤ２８＋Ｔ細胞によるＩＬ−２の分泌量を表す。
【図２７】図２７は、抗ＣＤ３のみ、又は抗ＣＤ２８、Ｂ７−１Ｉｇ、Ｂ７−２Ｉｇ、又はＢ７−２ＶＩｇの何れかと、又は抗ＣＤ２８と培養した後のＣＤ２８＋Ｔ細胞の成長を示したグラフである。
【図１】
2008142084.tif 000007
【図２】
2008142084.tif 000008
【図３】
2008142084.tif 000009
【図４】
2008142084.tif 000010
【図５】
2008142084.tif 000011
【図６】
2008142084.tif 000012
【図７】
2008142084.tif 000013
【図８Ａ】
2008142084.tif 000014
【図８Ｂ】
2008142084.tif 000015
【図８Ｃ】
2008142084.tif 000016
【図９】
2008142084.tif 000017
【図１０】
2008142084.tif 000018
【図１１】
2008142084.tif 000019
【図１２Ａ】
2008142084.tif 000020
【図１２Ｂ】
2008142084.tif 000021
【図１３Ａ】
2008142084.tif 000022
【図１３Ｂ】
2008142084.tif 000023
【図１４Ａ】
2008142084.tif 000024
【図１４Ｂ】
2008142084.tif 000025
【図１４Ｃ】
2008142084.tif 000026
【図１４Ｄ】
2008142084.tif 000027
【図１５】
2008142084.tif 000028
【図１６】
2008142084.tif 000029
【図１７】
2008142084.tif 000030
【図１８】
2008142084.tif 000031
【図１９】
2008142084.tif 000032
【図２０】
2008142084.tif 000033
【図２１】
2008142084.tif 000034
【図２２】
2008142084.tif 000035
【図２３】
2008142084.tif 000036
【図２４】
2008142084.tif 000037
【図２５】
2008142084.tif 000038
【図２６】
2008142084.tif 000039
【図２７】
2008142084.tif 000040