(57)【要約】      （修正有）【課題】電気化学発光測定に関し、アッセイセルを洗浄することなく、複数の電気化学発光の測定を逐次または同時に行うための新規で費用効果の高い測定方法を提供する。また、正確性の改善のために組み込まれた対照標準物質を提供する。【解決手段】複数の結合ドメインからなるＥＣＬ反応および測定を行うカセットに関し、この別々の結合ドメインは、各々の電極と対電極の対と共に間を空けて整列される。個々の電極対に電気化学発光を引き起こすに有効な電位波形を与える電位制御手段、試料からの電気化学発光を検出する光子検出手段、および、試料走査手段からなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一核酸鎖と第二核酸鎖を有する二重鎖核酸におけるハイブリダイゼーションの程度を検出または測定する方法であって、ラベルと電極との間の電子移動を測定することを含む方法であり、該第二核酸鎖は該電極に固定化されており、該ラベルは、（i）該第一核酸鎖または該第二核酸鎖に連結している、または（ii）核酸インターカレーターであり、該電子移動は、該第一核酸鎖と該第二核酸鎖との間の相補性の程度に関連している、方法。
【請求項２】
該ラベルは該第一核酸に連結している請求項１の方法。
【請求項３】
該ラベルは該第二核酸に連結している請求項１の方法。
【請求項４】
該ラベルは核酸インターカレーターである請求項１の方法。
【請求項５】
更に、充分に相補的な二重鎖を生成するハイブリダイゼーション反応と、部分的に相補的な二重鎖を生成するハイブリダイゼーション反応とを区別する工程を含む請求項１の方法。
【請求項６】
ハイブリダイゼーション反応により核酸を検出する方法であって、
（a）第一核酸と第二核酸を含む組成物であって、該第二核酸は電極に固定化されておりそしてラベルに連結されている、組成物を形成する工程、
（b）該第一核酸が該第二核酸にハイブリダイズしたかどうかを決定するように、該ラベルと該電極との間の電子移動を測定する工程、
を含む方法。
【請求項７】
該ラベルと該電極との間の電子移動を、インピーダンス測定により測定する請求項１または６の方法。
【請求項８】
該ラベルと該電極との間の電子移動を、電気化学発光測定により測定する請求項１または６の方法。
【請求項９】
該第二核酸は、該電極に固定化された５’チオール化ＤＮＡである請求項１または６の方法。
【請求項１０】
該電極は金電極である請求項９の方法。
【請求項１１】
該第二核酸は、１０原子未満の長さのリンカーを介して該電極にカップル化されている請求項１または６の方法。
【請求項１２】
該第二核酸は、電導性リンカーを介して該電極にカップル化されている請求項１または６の方法。
【請求項１３】
該電導性リンカーはポリアセチレンを含む請求項１２の方法。
【請求項１４】
該電極は、混合単一層を含み、該混合単一層の少なくとも一つの構成成分が電位転移を促進する請求項１または６の方法。
【請求項１５】
該ラベルは該第二核酸に共有的に連結している請求項６の方法。
【請求項１６】
該ラベルは該第二核酸に非共有的に連結している請求項６の方法。
【請求項１７】
該ラベルは、該第二核酸とそれにハイブリダイズした該第一核酸との間にインターカレート化している請求項６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、１９９５年３月１０日に出願の同時係属中出願第０８／４０２，０７６号および１９９５年３月１０日に出願の同時係属中出願第０８／４０２，２７７号の一部継続出願であり、この２件は各々、その全体が参考のため本発明に引用される。
１．緒言
本発明は、電気化学発光（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）に基づく試験のためのパターン付けした多重アレイの多重特異的な表面（ＰＭＡＭＳ）、さらにはＰＭＡＭＳの製造法と使用法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
２．１．診断用測定法
迅速で感度の高い診断技術に対する強い経済的なニーズが存在する。診断技術は、医療、研究、農業、獣医学、および工業市場などの種々の経済的市場において重要である。感度、必要時間、使用の簡便さ、頑丈さ、またはコストを改良すれば、これまでいずれの技術でも市場ニーズに応えることのできなかった、全く新規な診断市場を開発することができるであろう。高感度を有する診断技術もあるが、市場ニーズに応えるには高価過ぎる。また他の技術は、費用効果が高くても、種々の市場にとって頑丈さが足りない。これらの品質を組合せることのできる新規な診断技術は、診断薬事業において顕著な進歩であり好機である。
【０００３】
診断応用では多くの異なる分析技術が使用されている。これらの技術は、放射性標識、酵素結合免疫測定法、化学比色法、蛍光標識、化学発光標識、および電気化学発光標識を含む。これらの各技術は、異なる診断市場における有用性を規定し限定する、感度レベル、使用の簡便さ、頑丈さ、迅速さおよびコストの独特の組合せを有する。これらの差は、部分的には、各技術に本来的な物理的制約によるものである。例えば放射性標識は、この標識物自体が崩壊するため、本質的に頑丈ではなく、そして生じる放射性廃棄物の処分は、多くの応用にとって経済的、安全上および環境的なコストを生み出す。
今日使用されている多くの高感度診断技術は、第一に、試験を実施するのに熟練した技術者を必要とするため、市場が限定されている。例えば今日使用されている電気化学発光法は、熟練技術者を必要とするだけでなく、洗浄の繰り返しや準備段階を必要とする。このため、コストと廃棄物処分の必要の両方が高まる。試験法を単純にし、同時に試験当たりのコストを低下させる新規な診断法は、新規な市場を開発する上にも、既存の市場の性能を改善する上にも非常に重要で有用となるであろう。
【０００４】
２．２．電気化学発光測定法
電気化学発光（「ＥＣＬ」）は、電気的に励起した分子種が、光子を放射する現象である（例えば、非特許文献１を参照のこと）。このような分子種はＥＣＬ標識物と呼ばれ、本明細書においてはＴＡＧとも呼ぶ。一般に使用されるＥＣＬ標識は、例えば金属がＲｕ含有およびＯｓ含有有機金属化合物［例えば、バード（Ｂａｒｄ）ら（特許文献１）により開示されている、Ｒｕ（２，２’−ビピリジン）３＋残基（「Ｒｕｂｐｙ」とも呼ばれる）］を含む第ＶＩＩＩ族の貴金属由来の有機金属化合物を含む。ＥＣＬ標識物により発生する光は、診断法におけるレポーターシグナルとして使用することができる（バード（Ｂａｒｄ）ら、特許文献２）。例えばあるＥＣＬ標識物は、抗体または核酸プローブのような結合物質に共有結合することができる。このＥＣＬ標識／結合物質複合体は、種々の物質の測定のために使用することができる（バード（Ｂａｒｄ）ら、特許文献１）。ＥＣＬに基づく検出系の基本は、光子を放射させるためにＥＣＬ標識物を励起させる電位が必要なことである。ある電位波形が、電極表面（典型的には金属表面）と対電極にわたるＥＣＬ測定溶液に適用される（例えば、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１を参照のこと）。
【０００５】
当該分野で公知の種々の装置が、ＥＣＬ反応を行い検出するのに利用可能である。例えば、ジャン（Ｚｈａｎｇ）ら（特許文献１２）は、ＥＣＬを行うための電気化学的セルにおいて使用するための電極の例を開示している。レヴァンティス（Ｌｅｖａｎｔｉｓ）ら（特許文献４）は、ＥＣＬ反応を実施するのに使用するための電気化学的セルを開示している。カミン（Ｋａｍｉｎ）ら（特許文献７）は、電位制御装置を含む、ＥＣＬ反応を行い検出するための装置を開示している。ゾスキ（Ｚｏｓｋｉ）ら（特許文献５）は、ＥＣＬ反応を誘導するための電位波形線図、ディジタルからアナログへの変換器、制御装置、電子制御装置にフィードバック情報を提供するため作用電極でＥＣＬ反応により発生する電流を検出するための、検出装置および方法を含む、ＥＣＬ反応を行い検出するための装置を開示している。
【０００６】
ＥＣＬ技術は、例えば、特許文献４により詳細に総説されている。簡単に述べると、ＥＣＬ技術は、ある容量の試料中で、比較的低濃度で試料中に存在している目的のアナライトを検出するための方法である。
上に引用されている発行された特許ではＴＡＧと呼ばれるＥＣＬ残基は、アナライトに結合してもしなくてもよいが、いずれの場合にも、作用電極から受ける電気エネルギーにより引き起こされる一連の化学反応の結果として、励起状態にさせられる。ＴＡＧのＥＣＬを促進する分子としては、有利には、シュウ酸塩、またはさらに好ましくは、トリプロピルアミン（特許文献１０を参照）が提供される。
【０００７】
２．３．工業用のＥＣＬ測定法
現在までのところ、全ての工業用のＥＣＬ反応は、センチメートルのスケールの電極表面で行われている。センチメートルスケールの電極は、より大きな電極から生じるＥＣＬシグナルの増強された大きさと、各測定に必要な全試料容量を低く抑える必要性との間で比較検討されている。しかし、センチメートルスケールの電極でさえ、多くの測定に必要とされる感度を達成できない。この問題を克服するために、全ての工業用のＥＣＬ系は、コーティングした磁性ビーズを使用してＥＣＬアナライトまたは試薬を捕捉することにより感度をさらに増強している。こうしてビーズは作用電極近くに移動して感度が増強される。
しかし、磁性ビーズの使用は多くの限界を有する。ビーズはこれら自体が、経時的に脱落し分解するタンパク質でコーティングされているため、シグナル変動を引き起こす。ビーズに基づく測定法の操作およびフォーマット化が複雑なため、工業用のＥＣＬ診断は、所定の試料で行われる各測定について複雑な逐次行われる一連の手順を必要とし、このため実施すべき各試験についての時間とコストが増大する。５ミクロンの大きさのビーズは、作用電極に隣り合う薄膜にビーズ結合ＥＣＬ  ＴＡＧの大部分が到達するのを防止して、ＥＣＬ  ＴＡＧの励起を非効率的なものにする。
【０００８】
レベンティス（Ｌｅｖｅｎｔｉｓ）ら（特許文献４）は、各アナライトについて異なるＥＣＬ標識物を使用することにより、２つ以上の異なるアナライトを同時に測定する方法を提案している（１回の測定で、各異なるアナライトに対して、異なる波長で光子を放射する）。しかし、この技術は、例えば、異なる波長で放射する有効なＥＣＬ標識物が十分な数だけ利用できないこと、および各ＥＣＬ標識について化学的条件を最適化する必要があることにより、制限されている。これらの実用上の制約により、このような多重波長、多重アナライトＥＣＬ検出系の工業化が妨げられている。
ＥＣＬ感度を上昇させる別のアプローチは、電極技術を改良することである。ジャン（Ｚｈａｎｇ）ら（特許文献１２）は、種々の金属および半導体表面上にＥＣＬ分子種のフィルムを直接沈積した。電極表面の大半の飽和を利用するジャン（Ｚｈａｎｇ）とバード（Ｂａｒｄ）の技術により、高感度測定には適していない一様でなくつぎはぎ状の被覆が生じた（著者らにより記載されている通り）。
【特許文献１】米国特許第５，２３８，８０８号
【特許文献２】米国特許第５，２２１，６０５号
【特許文献３】米国特許第５，０６８，０８８号
【特許文献４】米国特許第５，０９３，２６８号
【特許文献５】米国特許第５，０６１，４４５号
【特許文献６】米国特許第５，２３８，８０８号
【特許文献７】米国特許第５，１４７，８０６号
【特許文献８】米国特許第５，２４７，２４３号
【特許文献９】米国特許第５，２９６，１９１号
【特許文献１０】米国特許第５，３１０，６８７号
【特許文献１１】米国特許第５，２２１，６０５号
【特許文献１２】米国特許第５，３２４，４５７号
【非特許文献１】リーランド（Ｌｅｌａｎｄ）とパウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）、１９９０，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３７（１０）：３１２７−３１３１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＥＣＬ測定を行うための以前の方法はまた、電極を含むアッセイセルを、例えば米国特許第５，１４７，８０６号により開示されているように、希酸、希塩基、界面活性剤溶液などの使用を含む多くの方法の１つにより洗浄する必要がある。
従って本発明の目的は、複数のＥＣＬ反応を逐次または同時に行うための新規で費用効果の高い測定法を提供することであり、好適な実施態様においては、正確性の改善のために組み込まれた対照標準物質を提供することである。
本発明のさらなる目的は、これもまた処分可能な、複数の同時または逐次ＥＣＬ反応を行うのに適した１つまたはそれ以上の支持体からなるカセットを提供することである。
本発明のさらに別の関連する目的は、生物学的試料中の目的のアナライトに関する個々の測定を行う時間とコストを低減することである。
本発明のなおさらに別の関連する目的は、単一の生物学的試料中の複数の目的のアナライトについて複数の同時測定を行うための方法と装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
３．発明の要約
本発明は、支持体に固定化されている複数の別々の結合ドメインからなるＥＣＬ反応および測定を行うためのカセットに関し、この別々の結合ドメインは、１つまたはそれ以上の電極と１つまたはそれ以上の対電極の対と共に間を空けて整列している。このカセットは、好ましくは、表面に固定化されている複数の別々の結合ドメインを有する第１の支持体を含む。これは、１つまたはそれ以上の電極と１つまたはそれ以上の対電極の対を有していてよい。電極と対電極の対は、電気化学発光を引き起こすのに有効な電位波形の形の電気エネルギー源により、別々にアドレスが可能である。このカセットはまた、第１の支持体に近接して配置されてその間に試料含有手段を提供することができるように、および／または電極として機能するように、第２の支持体を含んでもよい。結合ドメインは、支持体表面状にパターン付けされて、目的のアナライトまたは試薬を結合するように作成される。
本発明はさらに、支持体またはカセット操作手段、電気化学発光を引き起こすのに有効な制御された電位波形をかけるように適合させた電位制御手段、試料からの電気化学発光を検出するための光子検出手段、および試料操作手段を提供する、試料の電気化学発光を測定するための装置に関する。
本発明はさらに、カセットの複数の結合ドメインを、複数の目的のアナライトを含有する試料にＥＣＬ測定条件下で接触させて、次に複数の電極と対電極の対の各々に電気化学発光を引き起こすのに有効な電位波形をかけて、引き起こされる電気化学発光を検出または測定することにより、試料中の電気化学発光を測定するためのカセットの使用法に関する。広い意味で、本発明は、試料が電極に接触しないＥＣＬ測定法を提供する。さらに、電極と対電極の対の使用の代替法として、本発明は、結合ドメイン上の電極と対電極の走査を提供する。
本発明はまた、同時に複数の電気化学発光反応を測定するのに適したカセット、その上に複数のドメインが固定化されている支持体表面、および化学反応を行うＥＣＬ測定の実施のための測定用媒体を含む成分からなるキットを提供する。
本発明はまた、黒鉛ナノチューブから作成された電極を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
５．発明の詳細な説明
従って本発明は、広い意味で、複数の電気化学発光測定を実施するためのカセットを含む。このカセットは、１つまたはそれ以上の目的のアナライトと特異的に結合することができる複数の結合ドメインを、その上に有する支持体より形成される。結合ドメインは、支持体上に、パターン付けされた、多重アレイの多重特異的な表面（「ＰＭＡＭＳ」）として作成される。ＰＭＡＭＳは、例えば、実施できる測定の密度の大きな上昇、および迅速にまたは同時に複数の異なる測定を実施することを可能にしたことにより、既知のＥＣＬ測定法からの有意な改良を提供する。カセットは、結合ドメインに結合したＥＣＬ標識試薬からの光のＥＣＬ放出を選択的に引き起こしうる、複数の電極を含んでもよい。図４７は、導線４７１０〜４７１６により接続された、電極４７００、４７０４、結合ドメイン４７０６を有するマトリックス４７０２、およびＥＣＬシグナルを発生および分析するためのコントローラー４７２０手段を含有するマイクロプロセッサーを有する、多重アレイのＥＣＬ装置を示している。
【００１２】
図１に示される本発明の実施態様において、カセットは、複数の結合ドメイン１４が第１の支持体１０の表面上に存在して、複数の電極／対電極の対１６が第２の支持体１２の表面上に存在する、２つの支持体１０、１２からなる。結合ドメインと電極／対電極の対は、第１および第２支持体の１０、１２を一緒にしたときに、複数の電極／対電極の対１６の各々が、複数の結合ドメイン１４の異なる１つに近接するように、整列している。結合ドメイン１４の下の第１の支持体１０は、好ましくは、金フィルム表面と透明結合ドメインを有するＰＭＡＭＳである。第２の支持体１２は、好ましくは、透明電極／対電極の対１６をその上に有する透明な平面プラスチックシートである。結合ドメイン１４は、好ましくは、有機自己組立単層（個々のモノマーよりなる）パターンを支持体表面上に微小型押し（ｍｉｃｒｏｓｔａｍｐ）することにより作成される（ここで、モノマーは、ビオチンまたは結合残基を有する）。次に暴露されたビオチンに、アビジンまたはストレプトアビジンが結合する（例えば、米国特許第５，０９３，２６８号を参照のこと）。次に結合試薬は、ビオチン標識抗体のような、目的のアナライトに選択的に結合することができる、明確な量の適切なビオチン標識結合試薬を、単層が型押しされている支持体表面上の位置に適用することにより適用される。図１Ａは、ハウジング（１１）中に含有されるカセット（図１）を含むシステムを例示する。
本発明のいくつかの実施態様において、規定量または前もって決められた量の１つまたはそれ以上の試薬を表面上に再現可能に固定化することが望ましい。固定化は、試薬が表面に結合している任意の方法に広く適用され、これらの方法は：共有化学結合；非特異的吸着；表面上の試薬の乾燥；静電相互作用；疎水性および／または親水性相互作用；液体またはゲル中の封じ込めまたは巻き込み；生物特異的結合（例えば、リガンド／受容体相互作用またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション）；金属／リガンド結合；キレート化、および／またはポリマー中の巻き込み、を含むがこれらに限定されない。
【００１３】
表面上に固定化される試薬の量は、いくつかの方法で前もって決めることができる。例えば、表面上の試薬の量は、試薬が存在する、１つまたはそれ以上の容量および／または面積要素により規定することができる。また、表面上に固定化される試薬の個々の分子の数により規定することもできる。試薬の量は、所定の領域の特定の試薬の密度によって規定することができる。試薬の量は、表面の全面積に関して、または表面上に存在する他の試薬の量に対しての、特定の試薬を有する表面の百分率として規定することができる。試薬の量はまた、測定が目的の特異性を達成するのに十分なＥＣＬ強度を与えるために、特定の表面上に存在する必要のある試薬の量として定義することができる。具体例では、金表面の１ｃｍ２の面積がアルカンチオールの単層でコーティングされていてもよい。
試薬はまた、コーティングされた表面上に再現可能に固定化されていてもよい。コーティングは、いくつかの試薬の固定化を増強するのに役立ち、および／または他の試薬の固定化を低減または妨害するのに役立つことがある。表面は完全にコーティングされるか、または表面は部分的にコーティング（すなわち、パターン付けされたコーティング）することができる。コーティングは、組成が均一であるか、または異なる組成の要素を含有してもよい。具体例において、コーティングは、ある領域では免疫グロブリンＧを共有化学結合により固定化し、他の領域ではその固定化を防止する、パターン付けされた単層フィルムであってよい。
コーティングはまた、後の工程またはプロセスにおいて表面上に固定化される１つまたはそれ以上の試薬の量を前もって決めるのにも役立つ。あるいは、特定試薬の量は、沈積される試薬の量を制限することにより制御することができる。
定量的に再現可能な方法で固定化された試薬（またはコーティング）を有する表面であれば、試料からのＥＣＬシグナルを再現可能かつ定量的に測定する能力が得られ、こうして較正が可能になる。
【００１４】
好ましくは、電極／対電極の対１６は、センチメートル未満のサイズであり、そして液晶ディスプレイおよびエレクトロクロミックディスプレイパネルの組立に関して周知の方法により、電極導線２０（例えば、透明金属フィルムの）と共に組み立てられる。電極導線２０は、電気接続線１９により波形発生手段１８に接続される。有利には、電極／対電極の対は、電位を選択的に別々の結合ドメインに適用することができるように、コンピュータ制御下で個々にアドレスが可能である。光検出手段２２およびディジタルコンピュータ手段２４は、結合ドメインに結合した適切なラベルからＥＣＬ発光が促進されたとき、結果を記録し解析するために提供される。
図１Ａは、ハウジング１１に含有されている、図１に記載された、カセット、導線、波形発生器、光検出手段およびディジタルコンピュータからなるシステムを例示する。カセットは、開口部１５によりハウジング内に挿入される。
別の実施態様において、１つの作用電極が、同時に複数の結合ドメインでＥＣＬシグナルを生成するために使用される。この実施態様において、各結合ドメインからのＥＣＬシグナルは、光イメージング装置の使用により同定される。
概して、本発明のカセットを使用して実施される測定は、複数の別々の結合ドメインの使用が有効な測定である。例えば、このようなカセットの使用により、広い範囲の目的のアナライトの迅速および／または同時の検出または測定が可能になる。好適な実施態様において、本発明の測定法はまた、ＥＣＬ標識試薬、アナライトまたは結合表面の使用が有効な測定法である。本発明のＥＣＬ測定は、複数の結合ドメインを、目的のアナライトを含有することが疑われる試料と接触させて、結合したＥＣＬ標識物からのＥＣＬ発光を引き起こすことを含んでなり、ここでＥＣＬ標識物は、アナライト上にあるか、またはアナライトの競合物質上にある、または複数の結合ドメインの上にある。
【００１５】
本発明はまた、（ａ）１つまたはそれ以上の支持体の表面に固定化されている、１つまたはそれ以上の複数の別々の結合ドメインを、電気化学発光標識物に結合した分子からなる試料と接触させて（ここで、前記試料は、前記接触の工程中、電極または対電極のいずれにも接触しない）；（ｂ）電極を前記１つまたはそれ以上の複数の結合ドメインに接近させて；（ｃ）前記１つまたはそれ以上の複数の結合ドメインにＥＣＬを引き起こすのに有効な電位波形を適用して；そしてＥＣＬを検出または測定することからなる、目的のアナライトを検出または測定するためのＥＣＬ測定法を提供する。
【００１６】
別の実施態様において、本発明は、（ａ）（ｉ）１つまたはそれ以上の支持体の表面に固定化されており、そして（ｉｉ）複数の電極と対電極の対と共に、これらと接近させて、間を空けて整列している１つまたはそれ以上の複数の別々の結合ドメインを、電気化学発光標識に結合した分子からなる試料と接触させて；（ｂ）電極と対電極を、前記１つまたはそれ以上の複数の結合ドメインに接近させて；（ｃ）前記１つまたはそれ以上の複数の結合ドメインに電気化学発光を引き起こすのに有効な電位波形を適用して；そして（ｄ）電気化学発光を検出または測定するための、ＥＣＬ測定法を提供する。
支持体上の複数の結合ドメインを、測定すべき試料と相互作用させる。ＰＭＡＭＳはさらに、測定を完了するのに必要な試薬を含有する溶液と接触してもよい。次に結合表面は、相補的な電極（好ましくは、清浄な、または新しい電極）の表面と接触（例えば、圧力をかけて）させて、次にこれは、ＥＣＬを促進するための電位をかけるのに使用される。
【００１７】
図１の装置を使用して測定を行う好適な方法において、目的のアナライトを含有することが疑われる試料は、アナライトを検出するのに適切なＥＣＬ標識試薬と共に複数の結合ドメイン１４に適用される。次に支持体１１と支持体１２は、各々の複数の結合ドメイン１４が、複数の電極／対電極の対１６の異なる１つの電極と対電極の間に位置するように一緒にして、そして試料はこれらの間に含有させる。電極と対電極の対は、電極と対電極の対にわたって適切な電位がかけられるとき、ＥＣＬを促進するために結合ドメインと機械的に接触させる必要はない。ＥＣＬ発光を引き起こすのに適切な電位波形は、電気接続線１９を介して波形発生手段１８から複数の電極／対電極の対１６に適用される。複数の結合ドメイン１４上に存在するＥＣＬ標識物により放出されるどのシグナルも、光検出手段２２により検出されて、ディジタルコンピュータ手段２４により記録および解析される。
本発明は、多成分の液体試料のある容量中の、試料中に種々の濃度で存在するかもしれない目的の複数のアナライトを検出する方法を提供する。
概して、複数のアナライトは、１０−３モル濃度未満で多成分試料から検出することができる。好ましくは、複数のアナライトは、多成分試料から１０−１２モル濃度未満で検出することができる。
【００１８】
本発明は、不均一系測定法、すなわち、結合した標識試薬を電気化学エネルギーに暴露する前に、複数の非標識試薬が複数の結合標識試薬から分離される測定法、および均一系測定法、すなわち、複数の非結合標識試薬と結合標識試薬が、一緒に電気化学エネルギーに暴露される測定法として実施することができる、多成分試料からの検出法を提供する。
本発明の測定において、特定のアナライトを検出するために使用される電磁線は、ＰＭＡＭＳ内の結合ドメインのパターンに対応するパターンの１つまたはそれ以上の特徴としてその位置および／または配置を同定することにより、他のアナライトに対応する電磁線から識別可能である。
本発明の均一系測定において、電磁線は、非結合試薬に比較した結合標識試薬により放出される電磁線の量の増加または減少として結合標識試薬により放出される、あるいはＰＭＡＭＳ内の結合ドメインのパターンに対応するパターンの１つまたはそれ以上の特徴に空間的に対応する、光源から放出される電磁線の検出により、測定される。
【００１９】
図２０に示される本発明の方法の具体例において、サンドイッチ測定法は、特定のアナライト（Ａｎ）の結合に特異的な複数の結合ドメイン（ＢＤ）をその表面上に有する支持体（５）上で行われる。アナライトを含有することが疑われる試料が結合ドメインに適用されると、アナライトは結合ドメインに結合する。アナライト（Ａｎ）を選択的に結合するのに適切で、かつＥＣＬ残基（ＴＡＧ）で標識されてＡｂ−ＴＡＧを形成する抗体（Ａｂ）は、次に結合ドメイン上のアナライトに適用される。過剰の未結合Ａｂ−ＴＡＧを結合ドメインから洗浄後、電気化学発光を引き起こすのに適切な電位波形を電極によりＴＡＧに適用して（示していない）、結合ドメイン上の任意のＴＡＧからのＥＣＬ発光を引き起こす。ＥＣＬシグナルは、光検出手段により検出されて、ディジタルコンピュータ手段により記録される（例えば、図１の２２および２４で図示されるように）。
本発明のさらなる実施態様、特徴および変法は、後述のように提供される。
【００２０】
５．１．結合表面の作成
本発明をさらに理解するために、支持体上の結合ドメインの作成をさらに詳細に説明する。複数のアナライトに特異的な、表面上の結合ドメインのパターン付けされたアレイは、本明細書ではパターン付けした多重アレイの多重特異的な表面またはＰＭＡＭＳと呼ばれる。ＰＭＡＭＳは、例えば、自己組立単層（「ＳＡＭ」）のパターン付けにより、支持体上に作成される（ファーガソン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）ら、１９９３，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６（２２）：５８７０−５８７５：プライム（Ｐｒｉｍｅ）ら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１１６４−１１６７：ライビニス（Ｌａｉｂｉｎｉｓ）ら、１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：８４５−８４７：クマール（Ｋｕｍａｒ）ら、１９８４，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １０（５）：１４９８−１５１１：バイン（Ｂａｉｎ）ら、１９８９，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１０１：５２２−５２８）。表面パターン付け法はまた、物理的エッチング（例えば、ミクロ機械加工）（アボット（Ａｂｂｏｔｔ）ら、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１３８０−１３８２：アボット，１９９４，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．６（５）：５９６−６０２）、ミクロ石版術（ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）（ライビニス（Ｌａｉｂｉｎｉｓ）ら、１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：８４５−８４７）、光活性化化学の使用による表面への化学基の結合（サンドバーグ（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ）ら、１９９５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７（４９）：１２０５０−１２０５７）、および微小型押し法（ｍｉｃｒｏ−ｓｔａｍｐｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）（クマール（Ｋｕｍａｒ）ら、１９９４，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １０（５）：１４９８−１５１１：クマールら、１９９３，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．６３（１４）：２００２−２００４）の使用を含む。その他の表面パターン付け法は、流体または粒子の空間的に制御された分散のための方法（例えば、マイクロペン沈積（ｍｉｃｒｏｐｅｎ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）（例えば、Ｘ−Ｙ平行移動を使用する表面上に送達するための微量流体ガイドを使用して））、毛細管充填（キム（Ｋｉｍ）ら、１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：５８１）、インクジェット法（Ｉｎｋ−Ｊｅｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、またはシリンジディスペンサーを含む。これらの方法の組合せを使用して複雑な表面パターンを提供することができる。図５Ａにおいて、異なる結合特異性が、単一の支持体上に存在してもよいことを示す、単に説明目的で幾何学図形６０２として表される形非依存性結合ドメインを有する支持体６００が示される。結合ドメイン間の表面６０４は、結合試薬の沈積物を閉じこめて結合ドメインを形成するために、疎水性であるか、あるいは親水性であってよい。結合ドメインおよび／または結合ドメイン間の表面は、非特異的結合に対して交互に感受性であるか耐性であり、および／またはこれらは共有または非共有相互作用により結合試薬の付加に対して交互に感受性または耐性でもよい。疎水性相互作用による非特異的結合が、表面に結合化学種を結合させる所望の付加方法でない場合、偶発的な非特異的結合が起こるのを防止するために、洗浄剤を添加してもよい。
【００２１】
結合ドメインは、このドメインの幾何学形状に依存して、大体０．１μｍ〜１ｍｍの幅または直径または最も大きな寸法である。表面は、例えば、ＥＣＬ測定溶液に暴露される特異的な結合成分を有するように、選択的に誘導体化される。さらには、結合ドメインでの非特異的相互作用は、別々の結合ドメインの暴露された表面上にポリエチレングリコールのような残基を導入することにより、特異的結合残基を維持しながら低下する（プライム（Ｐｒｉｍｅ）ら、１９９３，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：１０７１４−１０７２１：プライムら、１９９１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１１６４−１１６７：パレ−グロスデマンゲ（Ｐａｌｅ−Ｇｒｏｓｄｅｍａｎｇｅ）ら、１９９１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：１２−２０）。
ＰＭＡＭＳは、大体２〜１０８の結合ドメインを含有してよい。好ましくは、結合ドメインの数は、５０〜５００である。さらに他の実施態様において、結合ドメインの数は、２５〜１００である。
【００２２】
支持体は、ガラス、プラスチック、セラミック、ポリマー材料、エラストマー材料、金属、合金、複合箔（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｆｏｉｌｓ）、半導体、絶縁体、ケイ素および／または積層材料（ｌａｙｅｒｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ）などを含むが、これらに限定されない、種々の材料であってよい。誘導体化エラストマー支持体は、例えば、ファーガソン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）ら、１９９３，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６：５８７０−５８７５：ファーガソンら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：７７６−７７８：ショウドハリー（Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ）ら、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１２３０−１２３２）に記載されているように作成することができる。
ＰＭＡＭＳがその上に作成される支持体の表面は、種々の材料、例えば、網、フェルト、繊維材料、ゲル、固体（例えば、金属から形成される）、エラストマーなどを含有してもよい。支持体表面は、種々の構造的、化学的および／または光学的性質を有してもよい。例えば、表面は、剛性または可撓性、扁平であるかまたは変形しており、透明、半透明、部分的にまたは完全に反射するかまたは不透明であってよく、そして複合性、異なる性質の領域を有してもよく、そして２つ以上の材料の複合体であってもよい。表面は、パターン付けした表面の結合領域、および／または１つまたはそれ以上の表面上で本発明の触媒作用が起こるパターン付けした領域、および／または１つまたはそれ以上の表面上の電極のアドレスが可能なアレイを有してもよい。支持体の表面は、平面状、球状、立方体状、および円筒状を含む、任意の適切な形に形作ることができる。具体例において、ＰＭＡＭＳを有する支持体は、ディップスティックである。別の具体例において、ＰＭＡＭＳを有する支持体は、炭素、例えば、黒鉛、グラッシーカーボンまたはカーボンブラックを含有している。
【００２３】
１つの実施態様において、ＰＭＡＭＳを有する支持体は、１つまたはそれ以上の炭素繊維を含有している。これらの繊維は、無定形炭素または黒鉛炭素であってよい。これらはまた、カーボンナノチューブ（ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ）、バッキーチューブ（ｂｕｃｋｅｙｔｕｂｅｓ）またはフラーレン（ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ）ファミリーのメンバーであってもよい。
好適な実施態様において、ＰＭＡＭＳを有する支持体は、１つまたはそれ以上の炭素小繊維（ハイパーイオン・小繊維（Ｈｙｐｅｒｉｏｎ  Ｆｉｂｒｉｌｓ）（登録商標））を含有する（米国特許第４，６６３，２３０号）。個々の炭素小繊維（米国特許第４，６６３，２３０号、５，１６５，９０９号、および５，１７１，５６０号に開示されるようなもの）は、約３．５ｎｍ〜７０ｎｍの範囲の直径と、直径の１０２倍より大きい長さ、順序付けられた炭素原子の多くの本質的に連続的な層の外部領域および明確な内部コア領域を有してもよい。単に例示目的で述べると、炭素小繊維の典型的な直径は、約７〜２５ｎｍの間であり、そして典型的な範囲の長さは、１μｍ〜１０μｍであろう。
【００２４】
炭素材料は、凝集体を形成するように製造してもよい。米国特許第５，１１０，６９３号とその引用文献に開示されるように、２つまたはそれ以上の個々の炭素小繊維は、もつれた小繊維の微視的凝集体を形成する。これらの凝集体は、５ｎｍ〜数ｃｍの範囲の寸法を有してよい。単に説明目的で述べると、微視的凝集体の１つの型（「綿菓子（ｃｏｔｔｏｎ  ｃａｎｄｙ）またはＣＣ」）は、５ｎｍ〜２０μｍの範囲の直径と、０．１μｍ〜１０００μｍの範囲の長さを有する、もつれた繊維の紡錘または棒に似ている。再び例示目的で述べると、小繊維の微視的凝集体の別の型（「鳥の巣（ｂｉｒｄｓ  ｎｅｓｔ）、またはＢＮ」）は、０．１μｍ〜１０００μｍの範囲の直径を有するほぼ球形であってもよい。各型のさらに大きな凝集体（ＣＣおよび／またはＢＮ）または各々の混合物が形成されることもある（下記を参照のこと）。
【００２５】
支持体に使用することができる小繊維は、個々の小繊維、１つまたはそれ以上の小繊維の凝集体、１つまたはそれ以上の小繊維の懸濁液、小繊維の分散液、小繊維と他の材料（例えば、油、パラフィン、蝋、ポリマー、ゲル、プラスチック、接着剤、エポキシド、テフロン（登録商標）、金属、有機液体、有機固体、酸、塩基、セラミック、ガラス、ゴム、エラストマー、生体分子および媒体など）との混合物、並びにこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。
小繊維は、ある場合には磁性であり、別の場合には磁性でない。小繊維が磁性または非磁性に作られる程度は、米国特許第４，６６３，２３０号、５，１６５，９０９号、および５，１７１，５６０号に開示されるような、小繊維製造プロセスの結果として小繊維中にある触媒の量により制御される。ＰＭＡＭＳは、上述の支持体の上、中、またはこれに接近させて配置される。
【００２６】
ＰＭＡＭＳは、異なる型の表面結合基から生成することができる。これらが結合する表面上の単層を形成するのに使用することができる自己組立単層は、アルカンチオール（金および他の金属に結合する）、アルキルトリクロロシラン（例えば、ケイ素／二酸化ケイ素に結合する）、アルカンカルボン酸（例えば、酸化アルミニウムに結合する）、並びにこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。この単層は最初に形成され、次に結合化学種が結合試薬を付加するのに使用される。自己組立後の誘導体化により、さらにピンホールまたは欠陥の少ない、支持体表面上の単層のより完全な二次元結晶性パッキングが生成する。単層は、自己組立の前にまたは後に、結合試薬により誘導体化することができる。単層における規則的な欠陥は望ましく、そして単層または支持体表面の自己組立の前の誘導体化により得ることができる。結合試薬上の誘導体基（例えば、暴露される結合基）が立体的に大きいなら、暴露される末端で密にパッキングされた表面を作り出すが、金属表面に規則的な間隙を作り出す。このことは、電荷が、これらの規則的な間隙を通って、試料溶液と接触している部分に結合したＥＣＬ標識残基まで流れさせるのに有用である。
不完全な単層の作成法は、当該分野で公知である。不完全な単層の作成のためのその他の方法は、結合試薬の希釈溶液からの単層の形成、完了前の単層形成反応の停止、照射（例えば、イオン性粒子）、光試薬または化学試薬によるより完全な単層に損傷を与えることを含むが、これらに限定されない。１つの実施態様において、再び型押しに墨入れすることなく反復型押し操作を行うと、ある範囲の欠陥のある単層が得られる（ウィルバー（Ｗｉｌｂｕｒ）ら、１９９５，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１１：８２５）。
【００２７】
ＰＭＡＭＳは、マトリックスの表面上で生成することができる。マトリックスは、非常に導電性の高い、例えば、金属電極または導電性ポリマーフィルムであるか；またはマトリックスは、絶縁体であるか；またはマトリックスは、半導体および／または中程度の導電性の材料であってよい。マトリックス材料は、イオン導電体または多孔性材料であってよい。このような多孔性材料は、支持体材料および／または導電性材料および／またはフィルター材料および／またはチャネリング材料（例えば、流体、イオン性分子種の通過を可能にする）として利用することができる。
多孔性材料は、さらなる材料と組合せてもよい。例えば、さらなる多孔性材料、導電性材料、半導体材料、チャネリング構造および／または溶液（例えば、イオン性流体）と共に多孔性材料から複合構造を組み立てることができる。このような複合体は、積層構造、サンドイッチ構造、および／または分散した複合体であってよい。金属電極上に支持された多孔性材料である、固体マトリックスを使用することができる。あるいは、多孔性材料は、導電性材料、半導体材料、または半導体材料と導電性材料の組合せたものの間にサンドイッチされる。１つまたはそれ以上の結合ドメインは、多孔性材料の１つの連続するスラブ上に封じ込めるか、および／または各々１つまたはそれ以上の結合ドメインを有する支持体上の複数の別々の物体に配置してもよい。多孔性材料（例えば、ゲル）の表面は、平面状、半球上であっても、または任意の規則的な若しくは不規則な形をとってもよく、および／または種々の物理的な性質（例えば、エラストマー性、剛性、低密度、高密度、密度の勾配、乾燥、湿潤など）および／または光学的性質（例えば、透明、半透明、不透明、反射性、屈折性など）および／または電気的性質（例えば、導電性、半導体性、絶縁性、可変導電性、例えば、湿潤対乾燥など）を有してもよい。
【００２８】
チャネルのパターンは、マトリックス中に形成されてよい。多孔性材料層は、厚さ５ミクロン〜２０００ミクロンであってよい。多孔性材料層はまた、２ｍｍより厚い場合もある。
孔は、部分的および／または材料全体に拡大しているか、または孔の網の一部であってもよい。これらの孔は、５０Å〜１００００μｍの広い範囲の寸法を有してよい。好適な実施態様において、この材料は、２００Å〜５００Åの範囲の寸法のいくつかの孔と、０．５μｍ〜１００μｍの範囲の寸法のいくつかの孔を有する。
材料の多孔度は、材料全体で一定であるか、または材料の位置の関数として増大または減少していてもよい。材料は、無秩序におよび／またはランダムに分配された異なるサイズの種々の孔を有してもよい。
多孔性材料は、２つ以上の材料の複合体であってもよい。
例えば、材料は、生物の細胞のように大きな物体を通過させるのに十分なほど大きいいくつかの孔、タンパク質または抗体のような大きな生物学的媒体を通過させることのできるいくつかの孔、有機低分子（分子量＜１０００）のみを通過させることのできるいくつかの孔、および／またはこれらの組合せを有してよい。
材料の多孔度は、１つまたはそれ以上の分子、液体、固体、エマルション、懸濁液、気体、ゲルおよび／または分散液が、材料の中に、材料の中で、および／または材料を通り抜けて拡散することができる程度であってよい。材料の多孔度は、生物学的媒体が、材料の中に、材料の中で、および／または材料を通り抜けて（能動的にまたは受動的に）拡散することができるか、あるいは何らかの手段により強制的にこれを起こすことのできる程度である。生物学的媒体の例は、全血、分画血液、血漿、血清、尿；タンパク質、抗体またはその断片、細胞、細胞より小さい粒子、ウイルス、核酸、抗原、リポタンパク質、リポサッカリド、脂質、糖タンパク質、炭水化物、ペプチド、ホルモンまたは薬剤の溶液を含むが、これらに限定されない。多孔性材料は、生物学的媒体が、１つまたはそれ以上の層を通過できるが、その他の層は通過できないような、異なる多孔度の１つまたはそれ以上の層を有してもよい。
【００２９】
多孔性材料はまた、イオン性分子種の流れによる電流を維持することができる。さらに詳細には、多孔性材料は、多孔性の水膨潤性ゲル、例えば、ポリアクリルアミドまたは寒天である。種々のその他のゲル組成物も利用可能である（例えば、ディー・エス・ソーン（Ｓｏａｎｅ，Ｄ．Ｓ．）の「バイオテクノロジーへのポリマー応用（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」；ディー・エス・ソーン編；サイモンとシュスター（Ｓｉｍｏｎ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ）：エングルウッド・クリフス（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｌｉｆｆｓ）、ニュージャージー州、１９９２年、または「医学および薬学におけるヒドロゲル（Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」第Ｉ巻〜ＩＩＩ巻；エヌ・エイ・ペッパス（Ｐｅｐｐａｓ，Ｎ．Ａ．）編；シーアールシー出版（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）；ボカレイトン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）、フロリダ州、１９８７年を参照のこと）。結合ドメインは、共有および非共有結合によりマトリックスに結合させることができる。（この主題に関する多くの総説および本が書かれている；数例をあげれば、ジェイ・タンピオン（Ｔａｍｐｉｏｎ  Ｊ．）およびエム・ディー・タンピオン（Ｔａｍｐｉｏｎ  Ｍ．Ｄ．）の「固定化細胞：原理と応用（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」ケンブリッジ大学出版（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）：ニューヨーク州、１９８７年；「固相生化学：分析および合成の側面（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｓｐｅｃｔｓ）」、ダブリュー・エイチ・スカウテン（Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ｗ．Ｈ．）編、ジョンワイリーとサンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）：ニューヨーク州、１９８３年；「酵素学の方法、固定化酵素および細胞（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ）」、パートＢ、ケイ・モスバッハ（Ｍｏｓｂａｃｈ，Ｋ．）編、エルゼビア・アプライド・サイエンス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）：ロンドン、１９８８年；「酵素学の方法、固定化酵素および細胞（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ）」、パートＣ、ケイ・モスバッハ（Ｍｏｓｂａｃｈ，Ｋ．）編、エルゼビア応用科学（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）：ロンドン、１９８７年；「酵素学の方法、固定化酵素および細胞（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ）」、パートＣ、ケイ・モスバッハ（Ｍｏｓｂａｃｈ，Ｋ．）編、エルゼビア・アプライド・サイエンス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）：ロンドン、１９８７年；また、「医学および薬学におけるヒドロゲル（Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、上記文献も参照のこと）。例えば、タンパク質はポリアクリルアミドとＮ−アクリロイルスクシ���イミドの架橋コポリマーに、タンパク質の溶液による処理によって結合させることができる。結合ドメインはまた、重合またはゲル化の前の工程において多孔性マトリックス中に組み込むことができる。１つの実施態様において、結合ドメインは、種々のカップリング化学種を使用することにより、架橋していないポリマーに結合することができる。次にこのポリマーを架橋させることができる（例えば、アミド結合、ジスルフィド、エポキシドへの求核攻撃などを含む化学種を使用して）（例えば、ポラック（Ｐｏｌｌａｃｋ）ら、１９８０，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０２（２０）：６３２４−３６を参照のこと）。結合ドメインは、モノマー分子種に結合することができ、次にこれは重合の間にポリマー鎖に組み込まれる（オー・アダルスタインソン（Ａｄａｌｓｔｅｉｎｓｓｏｎ，Ｏ．），１９７９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．６（３）：１９９−２２５を参照のこと）。さらに別の実施態様において、結合ドメインは、重合／ゲル化の間に孔に結合ドメインを捕捉することにより、または多孔性マトリックスおよび／またはフィルム中への結合ドメインの浸透により、ゲル中に取り込まれてもよい。さらに、結合ドメインは、例えば、疎水性および／またはイオン性相互作用により引き起こされる非特異的な吸着により、多孔性マトリックス（例えば、ポリマーゲルおよびフィルム）の表面上に吸着されてもよい。架橋または結合剤として、有利にはビオチンが使用される。アビジン、ストレプトアビジンまたは他のビオチン結合物質も結合ドメイン中に取り込むことができる。
【００３０】
ＰＭＡＭＳは、種々の孔サイズおよび溶媒含量を有する多孔性材料（例えば、ゲル）上に生成することができる。例えば、種々の孔サイズのポリアクリルアミドゲルは、アクリルアミドの濃度と架橋の程度を変化させることにより調製することができる。
アナライトよりも小さな孔サイズを有するＰＭＡＭＳ上では、結合反応は実質的にゲルの表面上で起こる。この場合、ゲルによる濾過および／または電気泳動を利用して、ゲルの表面でアナライトを濃縮し、結合反応の速度を調節する（例えば、速度を増大させる）ことができる。速度を高めると迅速な測定（例えば、結果が出るまで短時間）において有利であり、短い時間で高感度が得られる。
アナライトよりも大きな孔サイズのＰＭＡＭＳでは、結合反応は、大量のゲルの中と同様に表面上で起こりうる。この場合に、濾過および／または電気泳動を利用して、結合の速度を増大させて、表面から未結合種を除去することができる。
ゲル上に形成されるＰＭＡＭＳは、湿潤状態で保存しても、および／または乾燥状態で保存して測定の間に再構成してもよい。ＥＣＬ測定法に必要な試薬は、保存の前にゲルに組み込まれるか（ゲル中への浸透またはゲルの形成中の取り込みにより）、および／またはこれらは測定中に添加してもよい。
【００３１】
ＰＭＡＭＳのパターン付けした結合ドメインは、液体のマトリックス中に各結合ドメインを含有する液滴または微小液滴の基質への適用により、生成することができる。次に液体の凝固および／またはゲル化は、種々の公知の方法（重合、架橋、ゲル化遷移点以下の冷却、加熱）により引き起こすことができる。凝固またはゲル化を引き起こす物質がこの液滴に含まれているため、適用後のある時点で、この液滴は凝固および／またはゲル化する。次の処理（例えば、光、放射線および／または酸化還元電位への暴露）を利用して凝固および／またはゲル化を起こしてもよい。その他の実施態様において、このような液滴または微小液滴は、スラリー、重合前混合物、粒子群、および／または実質的に固体の液滴であってよい。さらに気相析出（ｖａｐｏｒ  ｐｈａｓｅ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）を利用することができる。
パターン付けはまた、各々１つまたはそれ以上の結合ドメインを含有するマトリックスの積層構造を形成することにより、達成することができる。例えば、抗体に結合（標準的化学による）したアガロースを容器に注ぎ入れて、冷却することによりゲル化させた。次に他の抗体を含有する次の層を最初の層上に注ぎ入れて、ゲル化させた。この積層構造の横断面は、複数の別々の結合ドメインを提示する連続表面を与える。このような横断面を積み重ねて、もう１つの横断面を切断してさらに高密度の結合ドメインを有するＰＭＡＭＳ表面を作り出すことができる。あるいは、所定の結合要素を含有するマトリックスの線を相互に接近させて作るか、かつ／あるいは積み重ねる。このような構造はまた、横断面で切断して、ＰＭＡＭＳ表面として使用することができる。
【００３２】
パターン付けはまた、分離を達成するいくつかのマトリックスの能力を利用することにより達成することができる。例えば、核酸プローブの混合物を、ポリアクリルアミドスラブ中での電気泳動により分離して、複数の別々の結合ドメインを提示する表面を生成することができるであろう。
微量流体ガイド（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｇｕｉｄｅ）も、支持体上のＰＭＡＭＳ結合ドメインを作成するのに使用することができる。微量流体ガイドの部分的な一覧は、中空毛細管、マトリックス（例えば、多孔性または溶媒膨潤性媒体）から作られたか、および／またはマトリックスで充填された毛細管、薄膜または液滴を支持することができる固体支持体を含む。毛細管は固体であってよく、そして試薬は毛細管の外表面に沿って流れ、試薬流体リザーバーは、ＰＭＡＭＳ表面と接触させられる多孔性マトリックス先端に露出してもよい。例えば、試薬リザーバーは、所定の多孔性マトリックス先端が、何回も試薬（例えば、単層および／または結合試薬などを形成するためのアルカンチオール）を再現可能に沈積することができるように、連続的にまたは周期的に再充填される。さらに、この先端の多孔度を変化させると、表面への試薬の流れを制御することができる。異なるかまたは同一の結合試薬は、複数の毛細管中に存在してもよく、および／または多数の別別の結合物質は、所定の毛細管中に存在してもよい。毛細管をＰＭＡＭＳ（例えば、パターン付けしたＳＡＭ）表面と接触させて、そのため、ある領域が結合試薬に暴露されて、別々の結合ドメインが作り出される。各々異なる微量流体ガイド中に存在する異なる結合試薬は、同時に流体ガイドアレイから、必要に応じて金属表面、ＳＡＭなどに送達される。微量流体ガイドはまた、支持体表面への適用の前に、微小型押しに目的の分子を補充するために使用することができる。例えば、個々の微量流体ガイドは、支持体の表面への吸着を促進してＰＭＡＭＳを形成する残基（例えば、炭化水素リンカー上の遊離チオールであり、これは金への吸着を促進する）に結合した、異なる結合試薬を適用するために使用することができる。すなわち、例えば、微量流体ガイドの使用により異なる特異性の抗体を充填した微小型押しは、金表面上の目的の領域にこのような抗体を適用して、ＰＭＡＭＳの別々の結合ドメインを形成するために使用することができる。
【００３３】
パターン付けした流体送達への別のアプローチは、小さなオリフィスを通って液滴の放出による流体の微小液滴を送達するミクロプリント装置（例えば、インクジェットプリンタ（Ｉｎｋ−Ｊｅｔ  ｐｒｉｎｔｅｒ））の使用に関する。これらの装置の放出液滴は、加熱、静電荷、および／またはピエゾ装置からの圧力などの異なる機構により引き起こされる。２つ以上の液体のパターン付けは、多数のオリフィスおよび／または１つのオリフィスおよび適切なバルブ調節の使用により達成することができる。
ＰＭＡＭＳの１つの作成方法において、微量流体ガイドを使用して、表面上の別々の領域に、目的の結合試薬を含有する液滴を直接（好ましくは同時に）送達して別々の結合ドメインを形成する。結合試薬は、これが適用される表面上の化学基と結合する化学官能基を含有してもよい。別の変法において、液滴中の結合試薬は、表面に非特異的に吸着または結合される（例えば、表面上で乾燥する）。
あるいは、表面上に沈積した液滴は、マトリックスを形成することができる試薬を含有してもよい。このマトリックスは、固体、ポリマーまたはゲルであってよい。マトリックスの形成は、溶媒の留去によってもよい。モノマー分子種の重合でもよい。前もって形成されたポリマーの架橋でもよい。温度の調節（例えば、冷却および／または加熱）でもよい。他の方法でもよい。例えば、ポリマー分子種を冷却遷移（ｃｏｏｌｉｎｇ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）により、またはゲル化を起こす試薬の添加により冷却してもよい。固体マトリックスの形成は、光（または他の放射線）、凝固またはゲル化を誘導する試薬の添加、冷却または加熱による、電極での反応性分子種（基質を含む）の生成により誘導することができる。さらに、表面は、マトリックス形成（例えば、ゲル化または重合）を開始することができる触媒を含有してもよい。
【００３４】
好適な方法において、適用した流体またはゲルの拡散を防止するために、パターン付けした親水性／疎水性領域を使用することができる。このような流体またはゲルは、支持体の表面に結合してＰＭＡＭＳの結合ドメインを形成する結合試薬を含有してもよい。この場合、このような親水性／疎水性境界の使用は、別々の領域に生成した結合ドメインを閉じこめる助けとなる。あるいは、流体は、表面上にマトリックスを形成することができる試薬を含有し、そして結合試薬は、表面上に沈積されるとき規定される領域内に含有される。例えば、親水性／疎水性境界の助けは、液滴を規定される領域に閉じこめるために使用することができる。さらに、親水性または疎水性領域のいずれかは、マトリックスに組み込まれて（例えば、共有または非共有結合して）、基質へのマトリックスのより安定な接着を可能にする基を提示することができる（イタヤ（Ｉｔａｙａ）とバード（Ｂａｒｄ），１９７８，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５０（１１）：１４８７−１４８９）。別の方法において、適用される流体またはゲルは、目的のアナライトを含有する試料であり、この試料を作成したＰＭＡＭＳに適用する。１つの好適な例において、親水性溶液を含有する毛細管を使用して溶液を別々の領域に沈積して、疎水性領域に囲まれた親水性ドメインを作り出すことができる。あるいは、親水性領域に囲まれた疎水性結合ドメインを、結合試薬あるいはアナライトを含有する疎水性流体と共に使用することができる。疎水性および親水性とは、相互について、および／または適用される試料についての、すなわち、結合ドメインに適用される流体あるいはゲル試料の拡散または湿潤が制御されるための、相対的な用語である。さらに、微量流体アレイからの制御された溶液の沈積は、物理的表面の特徴（例えば、表面上のウェルまたはチャネル）を使用して達成することができる。微量流体ガイドは、カセットに含まれ、またはさらに好ましくは、使用の前に支持体に特異的な試薬を適用するのに使用することができる。
【００３５】
多数の型押しを使用して、同じ支持体表面に２つ以上の結合化学種を適用することができるか、および／または親水性および疎水性結合ドメインの両方を有する表面を作り出すことができる。例えば、親水性結合ドメインを位置１に、そして疎水性結合ドメインを位置２に必要とする領域は、以下の通り作成することができる。最初の親水性型押しは、位置１に円盤を、そして位置２により大きな環を有するように作られる。第２の疎水性型押しは、位置２に型押し１により残される環状単層の内側に適合する円盤を有するように作られる。最後に、表面を単層成分の疎水性溶液で洗浄する。
詳細には、ＰＭＡＭＳは、ミクロコンタクトプリンティング、すなわち、型押しにより生成する。こうして適用された単層は、表面結合基から構成され、これは、例えば、金表面については、アルカン（（ＣＨ２）ｎ）スペーサーを有するチオール基が好適である。スペーサー基は、結合基Ａに結合（好ましくは共有結合）される。「Ａ」は、例えば、アビジン、ストレプトアビジンまたはビオチン、あるいは利用可能な相補的結合パートナーの「Ｂ」との任意の他の適切な結合試薬であってよい。Ａ：Ｂ結合は、共有または非共有であってよく、使用可能な当該分野で公知のいくつかの結合化学種は、例えば、バード（Ｂａｒｄ）ら（米国特許第５，２２１，６０５号および５，３１０，６８７号）により開示されている。「Ｂ」はさらに、抗体、抗原、核酸、薬剤、または試験すべき試料中の目的の１つまたはそれ以上のアナライトに結合することができる結合ドメインを形成するために適切な他の物質のような、結合試薬に結合している。Ｂはまた、ＥＣＬ  ＴＡＧまたは標識物に結合していてもよい。結合基Ｂは、異なる結合表面特異性を有する複数の「Ｂ」試薬を、単層「Ａ」結合上に配置することができる、毛細管または微量流体ガイドアレイ（図５Ａ〜５Ｃ）によりＳＡＭに送達することができる。ＡとＢはまた、単層に結合する前に結合することができる。図５Ａでは、考察したように単に例示の目的で幾何学図形６０２として、異なる結合特異性が、単一支持体６００上に存在しうることを示すために、形に非依存性の結合ドメインが表される。図５Ｂは、微量流体ガイド（例えば、毛細管）アレイ６０６の平面図を提供する。ドット６１０は、横断面のガイドである。図５Ｃは、微量流体ガイドアレイ６０８の側面図を提供する。上部と底部から出ている線は、個々の微量流体ガイド６１０である。下面の幾何学図形６１２は、個々の毛細管からの結合試薬の送達により形成される特異的な結合ドメインを表す。
【００３６】
例として、上述の最初の型押し後、露出した表面（例えば、金）領域は、結合化学種Ａを含まず、上記最初の単層と反対の親水性／疎水性である、第２のアルカンチオールと反応することができる。このように、特異的結合ドメインは表面上に作成される。
１つの目的のアナライトに特異的な結合試薬を各結合ドメインに使用することができるか、または多数の目的のアナライトに特異的に結合する結合試薬を使用することができる。
さらに別の変法において、支持体表面は、上記図５Ａに示されるように、異なる結合化学種および／または結合残基を有する物質（例えば、結合試薬、ＥＣＬ標識、ＳＡＭ）により何度も型押しすることができる。
パターン付けした結合試薬は、安定であるか、および／または頑丈な化学基（例えば、これらが受ける条件に耐えて残る基）であってよく、これが後であまり安定でないかまたは強い結合基に結合する。ＰＭＡＭＳ表面の作成における各工程の条件を最適化するために、および／またはＰＭＡＭＳ表面の製造法を単純化するために、多数の結合の仕方を利用することができる。例えば、最初のＰＭＡＭＳ表面は、一般的な方法で組み立てて、次に異なるＰＭＡＭＳ表面を作り出すために修飾してもよい。別の例において、一般的なＰＭＡＭＳ表面を、それ自体がＰＭＡＭＳ表面上の特定領域（例えば、結合ドメイン）に向ける結合ドメインを含有する結合試薬の溶液混合物と反応させることができる。例えば、各々異なるオリゴ（ヌクレオチド）配列を提示する結合ドメインのパターンを表面に結合する。次にこの表面を、各々表面上の配列に相補的なオリゴ（ヌクレオチド）配列に結合している、二次結合試薬の混合物を含有する溶液で処理する。このように、これらの二次結合要素のパターン付けを達成することができる。好ましくは、オリゴ（ヌクレオチド）配列は、６〜３０量体のＤＮＡである。あるセットの６〜３０量体配列は、実質的に同様な配列相補性を有するため、ハイブリダイゼーションのおよその結合定数は、所定のセット内で同様であり、相補性の低い配列とは識別可能に異なっている。別の実施態様において、二次結合要素はタンパク質（例えば、抗体）である。
【００３７】
下記セクション５．１３に記載されるように、表面上に適用された試薬または試料の湿潤または拡散を阻害するための記載された方法はまた、ＰＭＡＭＳの作成（および／または試料の適用）においても使用することができる。適用される電位（例えば、電極／対電極の対から）を使用して、試薬および／または試料の沈積および／または拡散をさらに制御することができる（例えば、アボット（Ａｂｂｏｔｔ）ら、１９９１，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １０（５）：１４９３−１４９７を参照のこと）。
ＰＭＡＭＳ結合試薬は、炭素を含有する材料上に存在してもよい。これらはまた、個々の炭素小繊維に存在するか、またはＰＭＡＭＳ結合試薬は、１つまたはそれ以上の小繊維の凝集体に存在してもよい。多くの実施態様において、ＰＭＡＭＳ結合試薬は、１つまたはそれ以上の小繊維の懸濁液、小繊維の分散液、小繊維と他の材料との混合物（例として上に記載されるような）並びにその組合せに存在してもよい。
【００３８】
ＰＭＡＭＳ結合試薬は、支持体上にまたは支持体内にまたはこれに接近して存在する複数の個々の小繊維および／または小繊維の凝集体に存在してもよい。１つの例において、結合試薬は、分散した個々の小繊維または小繊維凝集体に存在する。これらの小繊維または小繊維の凝集体は、支持体上の別々のドメイン中に間を空けて配置することができ、そして本出願で定義される結合ドメインを構成することができる。
別の例において、個々のこのような結合ドメインまたは複数のこのような結合ドメインは、支持体の間の空いた別々の領域内に存在する。非限定的な例として、個々のこのような結合ドメインまたは結合ドメインの集合は、支持体の凹部、くぼみおよび／または穴に存在してもよい。さらに別の例において、個々の結合ドメインまたは複数のドメインは、支持体の表面上に局在化している、水、ゲル、エラストマー、プラスチック、油などの液滴に存在してもよい。また別の例において、個々の結合ドメインは、異なる結合試薬および／または結合試薬／小繊維全体に対して異なる結合親和性を有するコーティング（パターン付けされていてもよい）により、支持体上に局在化してもよい。
【００３９】
結合ドメインは望ましくは、複数の個々の小繊維上に配置されるか、および／または小繊維の凝集体は、１つまたはそれ以上の微量流体ガイド（例えば、毛細管）により支持体上に作成することができる。異なるかまたは同一の結合試薬は、複数の微量流体ガイドの中または上に存在するか、および／または多数の別々の結合試薬が、所定の微量流体ガイドの中または上に存在してもよい。毛細管は、支持体と接触（スポット付け）させるか、および／または、微量流体ガイドおよび／または表面をもう一方に対して走査または移動させながら（すなわち、字を書くときのペン様の方法）、試薬を送達することができる。微量流体ガイドは、小繊維上に存在する結合試薬を支持体に送達して、別々の結合ドメインを作り出すように、支持体のある領域が小繊維結合試薬複合体に暴露されるようにしてもよい。好適な面において、各々異なる微量流体ガイドに存在する異なる結合試薬は、ガイドアレイから同時に支持体に送達される。１つの例において、結合試薬および／またはこれらが局在化される小繊維は、支持体の表面への結合（例えば、共有または非共有相互作用）を形成する化学官能基により誘導体化される。いくつかの実施態様において、結合試薬と小繊維は、表面に非特異的に結合するか、または吸着される。さらに別の面において、小繊維上に局在化される結合試薬は、支持体の表面の凹部、くぼみおよび／または穴に送達することができる。別の例において、結合試薬は、ある結合試薬または結合試薬／小繊維全体に対してより強いかまたは弱い結合親和性を有するため、他の結合試薬と間を空けて別々に局在化される試薬のドメインを作り出す、材料でコーティングされている表面に送達される。
【００４０】
結合試薬は、磁性の１つまたはそれ以上の個々の小繊維または小繊維の凝集体上に局在化される。このような場合、磁性支持体は、磁性小繊維上に局在化した結合試薬を支持体に引きつけることができる。
支持体は、磁性でない領域に囲まれている、磁性であるいくつかの別々の領域を含有することができる。磁性小繊維上に局在化される結合試薬は、支持体の磁性領域上に局在化することができる。１つの例において、支持体は、かつ磁性でない領域に囲まれている、磁性である１つまたはそれ以上の領域を含有してよく、磁性領域の磁界の強さは調節するか、または切り替えることができる。この面において、このような調節された、または切り替え可能な磁界の使用は、支持体の表面から小繊維上に局在化される結合試薬を付加または放出する際に助けとなり、このため、前記ドメインを撹拌または混合するのに役立つ。
大体２〜１０８の結合ドメインが存在し、好ましくは２５〜５００ドメインが存在する。
【００４１】
結合ドメインは、作用電極および／または対電極上に存在することができる。
異なる型のＰＭＡＭＳ、支持体、および電極並びにそれらの配置について本明細書に記載される異なる実施態様はまた、相互の組合せで実施することができる。
ＰＭＡＭＳ支持体は、後の使用のために保存（例えば、保護表面コーティング、表面の乾燥、真空下または不活性雰囲気下の頑丈な包装、冷蔵および関連方法）することができる。
【００４２】
５．２．結合試薬
本発明の結合ドメインは、少なくとも１つの目的のアナライト（リガンド）に特異的に結合する結合試薬を含有するように作成される。別々の結合ドメイン内の結合試薬は、結合ドメインが目的の結合特異性を有するように選択される。結合試薬は、目的のアナライトを特異的に結合することができるか、またはできることが推定されることが当該分野で公知の任意の分子の中から選択することができる。目的のアナライトは、下記セクション５．１０の「実施することができるＥＣＬ測定法」に記載されるものの中から選択することができる。すなわち、結合試薬は、受容体、受容体のリガンド、抗体またはその結合部分（例えば、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）’２）、タンパク質またはその断片、核酸、オリゴヌクレオチド、糖タンパク質、多糖、抗原、エピトープ、細胞および細胞成分、細胞内粒子、炭水化物残基、酵素、酵素基質、レクチン、プロテインＡ、プロテインＧ、有機化合物、有機金属化合物、ウイルス、プリオン、ウイロイド、脂質、脂肪酸、リポ多糖、ペプチド、細胞内代謝物、ホルモン、薬剤、トランキライザー、バルビツール酸、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖類、非生物学的ポリマー、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ポリマー樹脂のような有機結合化合物、リポタンパク質、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、合成ポリマー、有機および無機分子などを含むが、これらに限定されない。核酸とオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはオリゴヌクレオチド類似体を意味し、これらには、修飾塩基または修飾糖を含有するオリゴヌクレオチド、ホスホジエステル結合以外の基本骨格化学種を含有するオリゴヌクレオチド（例えば、ピー・イー・ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．）（１９９５）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｃｌ．Ｓｔｒｅｅｔ．２４  １６７−１８３を参照のこと）、および／または他の分子への結合（共有または非共有）を形成するのに使用することができる化学基を提示するように合成または修飾されているオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない（ここで、我々は核酸またはオリゴ（ヌクレオチド）を２つまたはそれ以上の核酸塩基および／または核酸塩基の誘導体を含有するとして定義している）。
【００４３】
本発明のＰＭＡＭＳは、異なる結合ドメインにより目的の異なるアナライトの結合を与えるために、相互に同一であり、かつ他の結合ドメインに含まれる結合試薬とは特異性の異なる結合試薬を含有する、少なくとも１つの結合ドメインからなる、複数の別々の結合ドメインを有してもよい。例として、このようなＰＭＡＭＳは、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する抗体を含有する結合ドメイン、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）にハイブリダイズするオリゴを含有する結合ドメイン、ＨＩＶにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する結合ドメイン、ＨＩＶタンパク質または糖タンパク質に対する抗体を含有する結合ドメイン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）に対する抗体を含有する結合ドメイン、およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する抗体を含有する結合ドメイン、または前記の任意の部分集合からなる。
【００４４】
ＰＭＡＭＳは、単一の結合ドメインが多数の目的のアナライトに結合することができるように、結合特異性の異なる結合試薬をその中に含有する、少なくとも１つの結合ドメインからなる、複数の結合ドメインを有してよい。例として、このようなＰＭＡＭＳは、Ｔ細胞抗原受容体に対する抗体とＣＤ４のようなＴ細胞表面抗原に対する抗体の両方を含有する、結合ドメインからなる。
ＰＭＡＭＳは、（ｉ）相互に同一であり、かつ他の結合ドメインに含まれる少なくとも１つの結合試薬とは特異性の異なる結合試薬を含有する、少なくとも１つの結合ドメイン；および（ｉｉ）結合特異性が異なる結合試薬をその中に含有する少なくとも１つの結合ドメインからなる、複数の別々の結合ドメインを有してよい。例として、（ａ）単一の本体（例えば、Ｔ細胞抗原受容体、例えば、α、β−Ｔ細胞抗原受容体またはγ、δ−Ｔ細胞抗原受容体に対する抗体）の結合試薬を含有するため、この少なくとも１つの結合ドメインが、このＴ細胞抗原受容体を発現する全ての細胞に結合することができる、少なくとも１つの結合ドメイン；および（ｂ）２つの異なる結合試薬、例えば、Ｔ細胞抗原受容体に対する抗体とＣＤ４に対する抗体を含有するため、その少なくとも１つの結合ドメインが、そのＴ細胞抗原受容体を発現するＣＤ４＋Ｔリンパ球（すなわち、Ｔリンパ球の部分集団）に結合することができる、少なくとも１つの結合ドメインを有するＰＭＡＭＳが製造される。
【００４５】
別の実施態様において、少なくとも１つの結合ドメインは、異なる分子であるが同じ結合特異性を有する結合試薬（例えば、上皮成長因子と上皮成長因子受容体に対する抗体のような結合試薬）を含有する。
複数の結合試薬は、これらの試薬が、異なっており、異なる結合特異性を有するとしても、同じアナライトを認識するように、選択することができる（別の実施態様においては、異なるアナライトが認識される）。例えば、アナライトが、多くの結合残基を有するアナライト（例えば、異なる細胞表面抗原を有する細胞）である場合は、異なる結合残基に結合する異なる結合試薬は、同じアナライトを認識するであろう。別の例として、単一細胞上の異なる細胞表面抗原に対する抗体は同じ細胞を認識するであろう。さらに別の例として、単一抗原の異なるエピトープに対する抗体は、その抗原を認識するための結合試薬として使用することができる。
【００４６】
なおさらなる実施態様において、目的の単一アナライトに特異的に結合する結合試薬のみが、１つまたはそれ以上の結合ドメインに存在する。あるいは、２つ以上の目的のアナライトに特異的に結合する結合試薬は、１つまたはそれ以上の結合ドメインに存在する（例えば、交差反応性抗体）。特定の設計において、あるクラス（例えば、同様の特徴を有する）のアナライトに結合する結合試薬を使用することができる。
結合ドメインはまた、目的の標準的アナライトに特異的で、内部標準として利用される結合試薬を含有するＰＭＡＭＳ中に組み込むことができる（例えば、結合試薬が結合するアナライトの明確な量を含有する試料と接触させることのできる結合ドメイン）。同じアナライトに特異的な結合試薬を含有する多数の結合ドメインはまた、分析結果の統計的平均化が可能になるように、ＰＭＡＭＳ中に組み込むことができる。結合試薬は、同じアナライトに特異的であるだけでなく、同一であり、このため、アナライト上の同じ結合残基を認識する。すなわち、ＥＣＬの読みを変量について照合し、正確度を改善するために統計的に平均化することができるように、同じ結合残基に特異的に結合する複数の結合ドメイン（例えば、２〜１０８個の範囲内の）を作成することができる。ＰＭＡＭＳ上の複数の結合ドメインは、単一の支持体上の、対照のアナライトまたは目的のアナライト、あるいは両方に特異的であってもよい。
【００４７】
別の例として、１つまたはそれ以上の別々の結合ドメインは、既知の初期濃度数のＥＣＬ標識物で作成することができる。組み込まれたＥＣＬ層は、例えば、標識物の分解および温度効果をモニターするための対照として役立つ。
基質（この基質は、目的のアナライトである）に対して特異的な酵素である結合試薬を使用することができ、そして基質上のこの酵素反応の産物は、レポーター物質（検出可能な物質）、例えば、ＥＣＬ反応を引き起こす産物、蛍光分子、適切な酵素との接触により色を変化する基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼの発色性基質）などである。このような実施態様の例において、結合試薬として使用される酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）であり、これは、試料中のグルコースを検出または測定するために使用することができる。ＥＣＬ標識物は、ＧＤＨを含有する結合ドメイン内、またはその近くに位置する。ＮＡＤＨは、グルコースへの酵素の作用により産生し、ＮＡＤＨはＥＣＬ標識と反応して、ＥＣＬを促進することができる（マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、１９９３，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ２８１：４７５）。
バックグラウンド結合を増大させる結合試薬（すなわち、目的のアナライトだけでなく試料中の他のアナライト上に存在する結合残基にも結合する）を含有する結合ドメインを、電気化学発光の検出または測定の間のシグナル対ノイズ比を増大させるために使用することができる。例として、目的のアナライトが特異的な細胞の部分集団（例えば、ＣＤ４＋細胞）であり、かつ試料が患者からの細胞を含有する液体試料（例えば、血液）である場合、シアル酸に対する抗体を試料中の実質的に全ての細胞に対するバックグラウンド結合を増大させる結合試薬として使用し（シアル酸は、実質的に全ての細胞表面糖タンパク質の成分であるため）、そしてその細胞の部分集団に対して特異的な細胞表面糖タンパク質に対する抗体（例えば、ＣＤ４に対する抗体）を結合試薬（シアル酸に対する抗体を含有する結合ドメインと同じかまたは異なる結合ドメイン中の）として使用することができる。
【００４８】
５．３．電位波形
ＥＣＬセルの複数の電極および対電極の対にかけられる電位波形（電位／時間の変化）は、ＥＣＬ反応を引き起こすのに十分なものである必要がある。この電位波形は通常、第１の電位で開始して、着実に第２の電位に移行し、第１の電位を通過して第３の電位に移行し、再度第１の電位に戻す、一定の掃引電位の形である。例えば、波形は、−０．５〜０．５ボルトの範囲の第１の電位で開始し、１〜２．５ボルトに上げて、第１の電位を通過して、０．０〜−１ボルトの範囲の第３の電位に移行してもよい。別の例として、より単純な波形で、電位を０．０〜＋３．５〜０．０に変更することができる。電位波形は、線形傾斜路、階段関数、および／またはその他の関数を組み込むことができる。電位波形は、電位が１つの電位に固定されて留まる時間を組み込むことができる。適用される電位は、１つまたはそれ以上の参照電極に対して制御されるか、または参照電極を使用しなくてもよい。さらに、負電位を使用することができる。従って、本発明のカセットからのＥＣＬ発光を誘導するために使用される電位は、ＥＣＬラベルに対する最適なＥＣＬシグナル強度と特異性、および測定媒体について、容易に選択されるであろう。
いくつかの適用において、電位は、好ましくは結合ドメインから放出される光が測定されるにつれ変化する。このことは、結合ドメインに光を放出させるのに必要な電場の閾値を決定するために特に重要である。この場合、結合ドメインに適用される電位は、光を放出するのに必要な閾値以下であると考えられる値で開始して、最初の測定が放出される光により行われる。光が測定されなければ、または光が、前もって決めた閾値以下であるならば、電極対間に適用される電位は、コンピュータ制御電位供給源によるなどして、コンピュータ制御下で増大させて、もう一度光測定を行う。このプロセスは、前もって決めた適切な量の光が受けられるまで、反復することができる。このように、適用される電位は、測定シグナルとして使用することができる。
【００４９】
ＥＣＬシグナルは、電極対に適用されるＡＣ電位から生成することができる。
例えば、米国特許第５，３２４，４５７号および５，０６８，０８８号に開示されるような、電位および電流の設定に詳しい普通の技術者であれば、ＥＣＬ発光を引き起こすための最適な操作電位および掃引電位を容易に選択することができるであろう。
ＥＣＬを生成するために要する電位は、作用電極が半導体であるか、または光に応答して電流を生成する別の残基を含有するならば、作用電極表面の発光により生成することができる。
【００５０】
５．４．アドレスが可能な電極およびその使用法
複数の電極／対電極の対をアドレスするために多くの方法を使用することができる。このような方法のいくつかを図１４〜１８に例示する。これらの図面に例として４つの電極／対電極の対１０１、１０２、１０３、１０４、および典型的にはディジタルコンピュータであり、かつ検出手段により検出されるＥＣＬを処理するために使用されるのと同じコンピュータである波形発生器が示される。
図１４において、各電極／対電極の対１０１〜１０４は、波形発生器に接続される線の対により個々にアドレスされている。例として、線１０５、１０６は、電極／対電極の対１０１にアクセスしている。適切な波形は、種々の電極／対電極の対に接続されている任意の１つまたはそれ以上の線の対に、任意の所定の時間に適用することができる。
【００５１】
電極対をアドレスするのに要する接続部の数を低減するために、図１４の直接接続概略図の代替法が提供される。例えば、いくつかのまたは全ての電極に電気的エネルギーを与えるための、行と列のアクセス概略図が図１５に例示されている。この概略図において、複数の電極／対電極の対の各行の１つの電極２０１、２０２は、支持体２００上の共通の導電体２０５に接続されており、複数の電極／対電極の対の各行の対電極の各々は、支持体２００上の導電体２０７、２０８に接続されている。導電体２０５、２０６は、支持体２００の縁で各々接続部Ｃ１、Ｃ２に接続し、そして導電体２０７、２０８は、各々接続部Ｒ１、Ｒ２に接続する。これらの各接続部は、次に、別々の線により波形発生器に接続されている。この結果、図１５の構成において、必要な接続部および波形発生器からのシグナル線の数は、８から４に減少した。
各電極対の迅速で一連のエネルギー付与を可能にするために、コンピュータ制御切り替え装置は有益である。図１６の構成は、第１のマルチプレクサー３１０に接続した複数の電極を示している。複数の対電極は第２のマルチプレクサー３２０に接続している。第１のマルチプレクサーはまた、典型的には後述される時間変動電位を供給する、電位供給源３３０の第１の極にも接続されている。第２のマルチプレクサーも、電位供給源の第２の極にも接続されている。各マルチプレクサーに電気的に接続され、ラッチ３４０に接続されている線Ａ０〜Ａ３のアドレスを使用して、コンピュータプロセッサー３５０は、任意のまたは全ての第１電極を電位供給源の第１の極に、任意のまたは全ての第２の電極を電位供給源の第２の極に選択的に接続するために、マルチプレクサーを管理することができる。
【００５２】
図１７に示されるように、複数の電位供給源が、各電極への別々のセットのマルチプレクサーにより接続されている。第１の電位または電位の範囲が特定の電極対で必要であれば、その電位を提供する電位供給源４３０につながったマルチプレクサー４１０、４２０が、典型的にはラッチ３４０により、コンピュータプロセッサー３５０にアドレスされて、こうして問題の電極対にその特定の電位供給源を接続する。別々の電極対に異なる電位または電位の範囲が必要であるならば、異なる電位供給源４６０につながったマルチプレクサー４４０、４５０がコンピュータプロセッサーによりアドレスされて、こうして電位供給源が、つながったマルチプレクサー４４０、４５０により、電極対に接続される。
この実施態様の電極アレイが、独立に駆動可能な電極対の少なくとも一部を有するならば、図１４または１５に示されるように、例えば、１つの電極対は、１つの電位供給源により駆動することができ、一方もう１つの電極対は同時に別の電位供給源で駆動される。あるいは、図１７の２つの電位供給源は、両方のセットのマルチプレクサーと並列に接続された単一の電位供給源で置換されて、同じ電位供給源から２つの電極対が駆動可能であってもよい。
【００５３】
図１７に示される各電位供給源の二重のセットのマルチプレクサーの代わりに、図１８に示されるように複数の電位供給源５２０、５３０を提供することができる。これらの電位供給源は、コンピュータ制御電気スイッチ５１０または１セットのマルチプレクサー３１０、３２０に対するスイッチにより接続することができる。図１８に示されるように、コンピュータは、特定の電位供給源をマルチプレクサーに接続するようにスイッチ５１０を管理し、また、選択される電位供給源を目的の特定の電極対に接続するようにマルチプレクサーを管理する（これらのアドレス線Ａ０〜Ａ３にシグナルを送ることにより）。
あるいは、任意の実施態様において各電極対に適用される電位を変化させることができる。これは、複数の異なる結合ドメインを有するカセットが使用されるときには特に有益である。このようなカセットは、異なる結合ドメインで異なる範囲の適用電位を必要とするかもしれない。各電極に適用される電位を変化させることのできるいくつかの異なる実施態様が企図される。
有利には、コンピュータ制御電位供給源が使用される。コンピュータ制御電位供給源は、コンピュータによりアドレスを行って供給すべき特定の電位を選択することができるものである。あるいは、前もって決めた時間にわたり、特定の範囲の電位を順に適用するようにプログラムすることができる。このようなシステムにおいて、コンピュータに接続されるアドレス線および電位供給源は、コンピュータが、エネルギーを与えるべき電極対に適用される特定の電位を生成するように電位供給源をプログラムすることを可能にする。
【００５４】
複数の電極対をアドレスするためのさらなる方法も使用することができる。例えば、そこに適用される電位を検知するように、複数の参照電極を、各複数の電極と対電極の対に接近させて配置することができる。このように、電位波形のさらなる制御を維持することができる。
図３６は、本発明の別の実施態様を示している；電極のアレイ（３６００，３６０１）は、絶縁体３６０４中の間隙のパターン（例えば、穴３６０５を開けたプラスチックのシート）により分離される各々２つの表面（３６０２，３６０３）上に支持されている。各電極は、複数の間隙を横切ってもよい。各表面上の１つの電極間に電位が適用されるならば、電流は、両方の電極に接触している間隙を通過できるだけであり、このため、発生する任意の電気化学すなわちＥＣＬの位置を限定することになる。図に示される好適な実施態様において、電極（３６００，３６０１）は、支持体上の線のアレイである。この２つの表面上の２セットの電極は、相互に垂直に向いている。絶縁シートの間隙は、各表面からの電極の交差部分にのみ位置する。
この実施態様は、導電性の低い導線を必要とする電極を個々にアドレスするには有利である。
【００５５】
別の実施態様において、絶縁体３６０４は省かれ、表面は２つの表面の間に狭い間隙のみが存在するように、非常に接近させて配置される。この実施態様において、各表面上の電極間に適用される電位は、優先的に電極の交差部分で電流を通過させ（すなわち、電極間の距離が最小である場合）、このため、発生する任意の電気化学すなわちＥＣＬの位置を限定することになる。
【００５６】
５．５．光の検出
引き起こされたＥＣＬ発光により生成される光は、本発明の装置に隣接して置かれる適切な光検出器により検出される。光検出器は、例えば、フィルム、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、電荷結合素子（「ＣＣＤ」）あるいは他の光検出器またはカメラであってよい。光検出器は、順に発光を検出するための単一の検出器であっても、または放出光の単一または多数の波長での同時放出を検出し空間的に解像するために複数の検出器であってもよい。放出され検出される光は、可視光であっても、または赤外線または紫外線のような非可視光として放出されてもよい。検出器は、静置型であってもまたは移動可能であってもよい。放出される光または他の放射線は、カセットの結合表面の上、またはこれに隣接して位置する、レンズ、鏡および光ファイバーのガイドまたは光コンジット（単一の、多数の、固定の、または移動可能な）により、検出器に導くことができるか、あるいは検出器は光を直接受けることができる。さらに、支持体、ＰＭＡＭＳおよび電極表面自体を利用して、光の伝搬をガイドするか、または可能にすることができる。
【００５７】
ＰＭＡＭＳは、各検出器が、１つの結合ドメインからの光のみを受けるように、光検出器のアレイの表面上に形成することができる。光検出器のアレイは、ＣＣＤチップであってよく、そして結合ドメインは、半導体装置の表面に結合されていてもよい（標準的なカップリング化学種を使用して）。
結合ドメイン上、または近くの第２の表面上に沈積される液滴は、放出される光を管理または制御するためのマイクロレンズとして使用することができる。あるいは、光検出器は、カセットの前に直接向けることができ；そして、放物面反射装置またはレンズのような種々の光焦点調整装置を、任意の複数の結合ドメインからの光を検出器に向けるために光コンジットの代わりに利用することができる。少なくとも２つの別々の結合ドメインから放出される光は、同時にまたは順に測定することができる。
【００５８】
熱ドリフト、装置の老化、または光検出器に固有の電気的ノイズによるエラーは、光測定装置と測定される結合ドメインの間の「チョッパー」手段により制御することができる。チョッパーは、光の通過を可能にする溝穴または切り抜き部を有する回転円盤のような、当業者には周知の普通の機械的なチョッパーの任意のものであってよい。あるいは光は、ＬＣＤシャッター、ＬＣＤシャッターのアレイ、固体光弁などによりチョップすることができる。あるいはＬＣＤシャッターの平面アレイ、または光学計算の分野で公知の固体光弁を使用することができる。これらの装置は、好ましくはカセットの面と、光コンジット（単数または複数）または結合ドメインからの光を光検出器に向ける光焦点調整装置との間に配置される。ある実施態様において、シャッターは、各結合ドメインの上に配置される。ＬＣＤシャッターまたは光弁を使用するとき、シャッターは、異なる光放出結合ドメインについて異なるチョッピング速度を同時に提供するために、異なる周波数で調節することができる。この方法を使用して、複数の異なる光シグナルを重ね合わせて、単一の検出器により同時に測定することができる。次に光検出器に電気的に接続した電子帯通過フィルターを使用して、電気的な単一シグナルを、各々複数の個々の光成分の１つに対応する、いくつかの電気的成分に分離することができる。上記のように、または当該分野で公知の他の機構を使用して、光をチョップすることにより、ＡＣ光波形が作り出され、これでＤＣノイズ成分を電子的に取り除くことが可能になる。
また、ＥＣＬシグナルは、試薬の消耗によるシグナル変調を修正するため、標準試薬で前に測定した結果と比較して較正することができる。
【００５９】
５．６．ＥＣＬシグナルの解析
所定の結合ドメインから発生するシグナルは、ある範囲の値を有しており、これらの値は、「アナログ」シグナルを提供する定量測定と相関している。別の方法において、各ドメインから、アナライトが存在するかまたは存在しないかのいずれかを示す「ディジタル」シグナルが得られる。
統計解析は、両方の方法について使用され、そして定量的な結果を提供するために複数のディジタルシグナルを変換するのに特に有用である。しかしいくつかのアナライトは、閾値濃度を示すディジタルの存在／非存在のシグナルを必要とする。「アナログ」および／または「ディジタル」フォーマットは、別々にまたは組合せて利用することができる。他の統計的方法をＰＭＡＭＳで利用することができる。例えば、表面上のＰＭＡＭＳの濃度勾配を作ることが可能である（ショウドハリー（Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ）ら、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１５３９−１５４１）。この方法は、濃度勾配にわたる結合の統計解析により濃度を決定するのに使用される。濃度勾配を有するＰＭＡＭＳの多数の線形アレイは、非常に多数の異なる特異的結合試薬により生成することができる。濃度勾配は、異なる濃度の結合試薬を提示する、別々の結合ドメインよりなっていてよい。
【００６０】
カセットの結合表面上の対照測定システムの存在もまた、シグナル変動（例えば、カセットおよび他の成分の、分解、揺らぎ、老化、温度シフト、電気回路のノイズおよび光検出装置のノイズなど）に関して対照に対する各解析の均一性を確保するために重要である。例えば、同じアナライトについての多数の重複する結合ドメイン（同じアナライトに特異的な、同一の結合試薬または異なる結合試薬を含有する）を使用することができる。別の例において、既知濃度のアナライトを使用するか、またはＰＭＡＭＳの対照ドメインを既知量のＥＣＬ標識に共有結合させるか、または溶液中の既知量のＥＣＬ標識を使用する。
本発明により実施される測定により、迅速かつ効率的に大量のデータを集め、そしてこれらを、例えば、臨床情報または研究情報の集合よりなるデータベースの形で保存することができる。集められるデータはまた、迅速な法医学的または個人的な同定に使用することができる。例えば、ヒトＤＮＡ試料に暴露されるときに複数の核酸プローブを使用すると、臨床試料または研究試料を同定するために容易に使用することができる、署名（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）のＤＮＡフィンガープリントに使用することができる。
【００６１】
５．７．マルチ電極アレイの作成
電極は、大体０．００１〜１０ｍｍの幅または直径であってよい。電極対の好適な範囲では、０．０１〜１ｍｍの大きさ（幅または直径または電極対の形状に依存して最も広い寸法）である。
好ましくは、電極は、透明金属フィルムまたは半導体（例えば、各々、金またはインジウム−酸化スズ）のような適切な導電性材料から、当該分野で周知のように、例えば、液晶ディスプレイなどの組立のように、組み立てられる。カセットの組立た形において、例えば、薄膜または湿潤表面のように、第１支持体と第２支持体の間に、分析用試料を含有するのに十分な空間が残る。
電極は、炭素、炭素繊維、カーボンナノチューブおよび／または上記の凝集体を含有する材料から組み立てることができる。
電極は、炭素小繊維から組み立てることができる。１つまたはそれ以上の個々の小繊維および／または１つまたはそれ以上の小繊維の凝集体は、より大きな凝集体を形成するために加工することができる（米国特許第５，１２４，０７５号）。
【００６２】
この大きな凝集体は、小繊維がもつれているかまたは絡み合っている、マットまたは網である（本明細書で以降「小繊維マット」と呼ぶ）。小繊維マットは典型的には５０〜４００Ｍ２／グラムの間の表面積を有する。
例として、小繊維マットは、分析用および／または分取用の電気化学において、作用電極、対電極または参照電極として使用することができる。１つの例において、小繊維マットは、電気化学発光（ＥＣＬ）用の電極として使用される。
ＰＭＡＭＳの結合ドメインは、小繊維マットにより支持されてよい。本発明のＰＭＡＭＳは、複数の別々の結合ドメインを有し、この内２つまたはそれ以上は、相互に同一であっても、または異なっていてもよい。小繊維マットは、１つまたはそれ以上の結合ドメインを支持する。
１つまたはそれ以上の微量流体ガイドを使用して、小繊維マット上に複数の結合ドメインを作成することができる。異なるかまたは同一の結合試薬が、複数の微量流体ガイドに存在しても、および／または多数の別々の結合試薬が微量流体ガイドに存在してもよい。
【００６３】
図２２Ａおよび２２Ｂにおいて、複数の微量流体ガイド２２０１（好ましくはアレイ内）は、小繊維マット２２００の領域に、目的の結合試薬を含有する液滴を（好ましくは同時に）送達するために使用して、別々の結合ドメイン２２０２を形成する。結合試薬は、小繊維マット上に存在する残基との結合する。結合試薬は、マットに非特異的に吸着しても、または表面上で乾燥してもよい。
目的の結合試薬は、マットに吸引濾過を適用しながら、小繊維マットに送達される。この場合に、吸引濾過は、結合試薬を全く引かないか、少しまたは全ての結合試薬をマット中にまたはマットを通して吸引し、そうすることで、パターン付けプロセス中のマットの表面上の結合試薬の横への拡散の量を低下させる。
小繊維マットは、懸濁液の液体が通り抜けることのできる基質（例えば、フィルター）上に炭素小繊維の懸濁液を圧縮することにより、作成される。小繊維マットを形成するのに使用することができるフィルターの例は、濾紙、ポリマー性（例えば、ナイロン）膜から形成されるフィルター、金属マイクロメッシュ、セラミックフィルター、ガラスフィルター、エラストマーフィルター、ガラス繊維フィルターおよび／またはこのようなフィルター材料の２つまたはそれ以上の組合せを含む。濾過の分野の当業者であれば、これらの材料が、固体の懸濁液の濾過に適した多くの可能な材料の一例にすぎないことを認識するであろう。
図２３Ａおよび２３Ｂは、小繊維マットが、吸引濾過により作成される実施態様を例示する。炭素小繊維の分散液および／または懸濁液２３０１を、場合によりフィルター膜２３０３および／またはフィルター支持体２３０２を取りつけたフィルター２３００を使用して濾過する。懸濁液は、例えばフィルターフラスコ２３０６によって、真空供給源２３０５によりフィルターに適用される吸引を使用して濾過される。小繊維マット２３０４は、フィルター膜２３０３および／またはフィルター支持体２３０２のいずれかまたは両方の上に集まる。小繊維マット２３０４は、フィルター膜２３０３と共にまたは膜なしに、フィルターから除去することができる。
【００６４】
別の実施態様において、小繊維の懸濁液は、圧力の使用によりフィルターを通過させられる。１つの例において、懸濁液の上の空気および／または液体の閉じこめられた層をピストンで圧縮することにより、小繊維の閉じこめられた懸濁液上に圧力がかけられる。具体例において、小繊維の懸濁液は、シリンジ内に閉じこめられ、ピストンがシリンジプランジャーであり、そしてフィルターは、使い捨てのシリンジフィルターである（多くのこのようなフィルターは、当業者には周知である）。
小繊維の懸濁液は、毛細管作用によりフィルターを通過させられるか、またはフィルター中へのまたはフィルターを通っての懸濁液の吸上作用により濾過される。
別の実施態様において、個々の小繊維または小繊維の凝集体は、マット中に共有結合で架橋結合される。露光されると重合する光感受性残基で誘導体化した小繊維に、光を照射する。
フィルターは、その孔に小繊維を捕捉するために使用して、フィルターが支持体として作用する複合マットを形成することができる。図２４において、小繊維マット２４００は、供給源２４０２により２つの大きなローラー２４０３の間に送達される小繊維のスラリー２４０１を通過させることにより作成することができる。紙またはポリマーシートの作成において見い出されるプロセスに類似している、このプロセスにおいて、ローラーは、懸濁液から液体を絞り出して、小繊維の大きな連続したマットが生成して、ここから小さなマットを切り出すことができる。
小繊維マットは、自立構造（例えば、支持されていない）であるか、または支持されている。
【００６５】
濾過の速度は、マットにおける目的の性質を達成するために変化させることができる。例えば、変化させうる性質は、構造の均一性または非均一性、小繊維または小繊維の凝集体のもつれの程度、厚み、マットの多孔度、および／またはこれらの組合せを含む。
炭素小繊維の懸濁液は閉じこめられて、小繊維が懸濁している液体は除去される。１つの例において、小繊維が懸濁している液体は蒸発除去させられる。別の例において、液体は加熱により除去される。さらに別の例において、懸濁液は遠心分離にかけられて、生じた液体（例えば、上清）は除去される。別の例において、液体は吸引により除去される。
懸濁液は、上述の１つまたはそれ以上のフィルター上に置かれて、懸濁液を蒸発により乾燥させる。懸濁液は、加熱またはオーブンで加熱乾燥して乾燥させるか、または液体は、凍結および液体の抽出により除去することができる。さらに別の例において、液体は、ポンプで排気して除去される。当業者には周知の多くの他の方法が、懸濁液から液体を除去するために利用可能である。
濾過により小繊維マットを形成するのに適した小繊維の懸濁液は、１つまたはそれ以上の炭素小繊維を適切な液体、半固体またはゲルに分散させることにより形成することができる。適切な液体の例は、水、エタノール、メタノール、ヘキサン、塩化メチレン、緩衝液、界面活性剤、有機溶媒、生物学的媒体を含有する溶液（例えば、タンパク質、抗体またはその断片、抗原、リポタンパク質、リポサッカリド、脂質、糖タンパク質、炭水化物、ペプチド、ホルモンまたは薬剤、低分子の溶液、ポリマー前駆体、酸または塩基の溶液、油および／またはこれらの組合せ）を含むが、これらに限定されない。
小繊維の懸濁液は、音波破砕により、炭素小繊維を水性溶液に分散させることにより調製することができる。別の実施態様において、界面活性剤および／または洗浄剤を添加してもよい。
小繊維マットは、大体０．０１μｍ〜１０，０００μｍの間の厚みを有してよい。
【００６６】
好適な実施態様において、小繊維マットは、１μｍ〜１００μｍの間の厚みを有する。特に好適な実施態様において、小繊維マットは、幅または直径が１０ｍｍ〜２００ｍｍの範囲である。
小繊維マットは、懸濁液から残った残渣物質を除去するために、繰り返し洗浄し再濾過することができる。
濾過または蒸発により作成される小繊維マットは、加熱（例えば、オーブン内で）して、濾過により除去されない懸濁液からの残渣の液体を除去する。
連続濾過工程を使用して、１つまたはそれ以上の別々の層からなる小繊維のマットを形成することができる。層は、多孔度、密度、厚み、個々の小繊維および／または小繊維の微視的凝集体の粒度分布、型、小繊維凝集体の数および／またはサイズ、小繊維の化学的誘導体化（下記を参照のこと）、および／または小繊維に結合している他の物質の存在を含むが、これらに限定されない、いくつかの性質により区別することができる。
図２５の多層小繊維マット２５００は、連続濾過工程により作成される。未処理の小繊維の０．５μｍ〜１００μｍの厚さの層２５０１が第１の層を形成し；ポリ−（エチレングリコール）のような残基を組み込み、タンパク質および他の分子の吸着に抵抗する、小繊維の０．５〜１０μｍの厚さの層２５０２が第２の層を形成し；１つまたはそれ以上の結合ドメイン（上記を参照のこと）を組み込む、０．５〜５μｍの厚さの層２５０３が第３の層を形成する。結合ドメインは、１つまたはそれ以上の抗体２５０４を含有し、この抗体がアナライト２５０５に結合しうる。この抗体／アナライト複合体は、標識抗体に結合することができる。標識物は、ＥＣＬ標識物であってよい。他の実施態様において、標識物は、本出願の他の部分で記載される、１つまたはそれ以上の複数の標識物であってよい。このような多層マットは、自立構造であるか、または上述の複数の可能な支持体の１つの上に支持されていてもよい。
層の組合せが存在し、いくつかのまたは全ての層が異なる多層マットが形成されてよい。
【００６７】
小繊維マットを形成するのに使用されるフィルター、小繊維、および／または小繊維マットは、コーティングされていてもよい。特定の実施態様において、コーティングは金属である。これらのコーティングは、ある部分がコーティングされ、その他の部分がコーティングされないように、パターン付けしてもよい。１つの例において、コーティングは電着により適用される。別の例において、コーティングは無電解メッキにより適用される。
フィルターは、金属でコーティングされ、そして小繊維は、前記金属と結合を形成する化学官能基で誘導体化される。フィルターは、金属スクリーンまたは金属シートである。
小繊維マットは、平板であるかまたは変形され、規則的であるかまたは不規則であり、円形、楕円形、長方形、または多くの形の１つ、剛性または可撓性、透明、半透明、部分的にまたは完全に不透明であってよく、かつ複合性または異なる個々のまたは複合性の領域を有してもよい。
マットは、円盤状であるか、またはシートから取られる断片であってよい。
【００６８】
複数の小繊維マットは、好ましくは同時に、かつ好ましくは１つのアレイに組み立てることができる。１つの例において、微量流体ガイドのアレイは、上述のように、支持体上に複数の小繊維マットを形成する。別の例において、フィルターのアレイまたはパターン付けしたフィルター（例えば、異なる多孔度の領域を有する）が、小繊維マットのアレイを作成するのに使用される。
穴のアレイを有するマスク（例えば、スクリーン）が、フィルターまたは支持体のある部分を覆うために使用され、複数の別々の小繊維マットが濾過および／または蒸発のいずれかにより同時に作られる。
小繊維マットは、０．１〜３．０グラム／ｃｍ２の密度を有してよい。マットは、可変的な密度を有してもよい。例えば、機械的な力または圧力を、異なる時間にマットに適用して、密度を増大または減少させることができる。
小繊維マットは孔を有してもよい。これらの孔は、部分的におよび／またはマット全体に拡張されてもよく、または孔の網の一部であってもよい。これらの孔は、大体５０Å〜１０００μｍの範囲の寸法を有してよい。好適な実施態様において、小繊維物質は、２００Å〜５００Åの範囲の寸法の孔を有する。マットの多孔度は、他の因子の中でも、マットの密度に依存するようである。
マットの多孔性はマット全体で一定であるか、またはマット内の位置の関数として増加または減少する。小繊維マットは、不規則におよび／またはランダムに分散した異なるサイズの広範囲の多孔を有する。
【００６９】
小繊維マットは異なる多孔性の明確な領域を含有する。例えば、小繊維マットは、それぞれが異なる多孔性を有する１つまたはそれ以上の層を有する。小繊維マットは、マット全体の異なる多孔性のカラムを有してもよい。
マットの多孔性は、異なるサイズ、形、組成、または組合せを有する、炭素小繊維の凝集物の異なる量を含有させることにより変化させてもよい。具体例において、マットはＣＣ小繊維（前述）およびＢＮ小繊維（前述）、または異なる組合せである各小繊維から作成される。例えば、小繊維マットのある孔は生物細胞のような大きな物体を通過させるのに充分なほど大きく、ある孔はタンパク質または抗体の大きさの生物学的媒体を通過させることができ、ある孔は小さな（＜１０００分子量）有機分子のみを通過させることができ、および／またはこれらの組合せである。
マットの多孔性は、１つまたはそれ以上の分子、液体、固体、エマルジョン、懸濁物、気体、ゲルおよび／または分散物が、マット中に、この内部、および／またはこれを通過するようなものである。小繊維マットの多孔性は、生物学的媒体がマット内、この内部、および／またはこれを通過して分散する（能動的にまたは受動的に）か、または何らかの手段で強制されるようなものである。生物学的媒体の例としては、分画した血液、血漿、血清、尿、タンパク質溶液、抗体またはその断片、細胞、細胞内粒子、ウイルス、核酸、抗原、リポタンパク質、リポ多糖、脂質、糖タンパク質、炭水化物、ペプチド、ホルモンまたは薬剤があるが、これらに限定されない。小繊維マットは、物質が１つまたはそれ以上の層を通過し、他の層は通過しないように、多孔性の異なる１つまたはそれ以上の層を含有してもよい。
【００７０】
小繊維マットは、別の物質によりまたはその上で支持される。例えば、支持体物質は、金属、プラスチック、ポリマー、エラストマー、ゲル、紙、セラミック、ガラス、液体、蝋、油、パラフィン、有機固体、炭素、またはこれらの２つまたはそれ以上の混合物であってよい。物質は固体または液体である。固体の場合は、１つまたは複数の穴または孔を有する。具体例では、支持体は金属メッシュ、ナイロン濾過膜または濾紙がある。支持体は、導電体、半導体および／または絶縁体でもよい。
米国特許第５，３０４，３２６号および５，０９８，７７１号に開示の実施態様では、小繊維は別の物質に分散される。例えば、小繊維は、油、蝋、パラフィン、プラスチック（例えば、ＡＢＳ、ポリスチレン、ポリエチレン、アクリロニトリルなど）、セラミックス、テフロン（登録商標）、ポリマー、エラストマー、ゲル、および／またはこれらの組合せ中に分散される。他の物質中の小繊維の分散物は、成形、圧縮、二次成形、注型、遠心分離、編み込み、および／または投入により、所望の形および／または型に成形される。小繊維マットは、マットの導電性を上げるために別の物質、例えば金属の薄い線維、破片、または球を含有してもよい。別の例では、小繊維マットは、小繊維単独で得られるものとは異なる多孔性を作成するために、種々のサイズ、形および密度の炭素、ガラスおよび／または金属線維を含有してよい。別の面において、マットは磁気ビーズ（例えば、ダイナル（ＤＹＮＡＬ）ビーズ）を含有する。後の例で、ビーズはマットの多孔性を変化させるのに有用であるか、またはそれ自身が結合ドメインを固定化するための支持体として使用される。
【００７１】
他の炭素線維（例えば、炭素ナノストラクチャー、炭素ナノチューブ、バックミンスターフラーレン、バッキーチューブ、フラーレン、またはこれらの組合せ）が、炭素小繊維の代わりに使用できる。
炭素小繊維は、その表面に共有結合した化学官能基を用いて作成される。国際特許公報第９０／１４２２１号に記載のように、これらの官能基は、ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−エステル、ポリ−（エチレングリコール）、チオール、アルキル（（ＣＨ２））ｎ）基、および／またはこれらの組合せがあるが、これらに限定されない。これらおよび他の化学官能基が、小繊維の表面に他の物質を結合させるのに利用できる。
ある化学官能基（例えば、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨＳ−エステル）が、小繊維に他の小分子を結合させるのに利用できる。このような化学的官能基と小分子の複数の可能な組合せがある。
多くの実施態様においてＮＨＳ−エステル基は、求核性化学官能基が、天然のおよび／または化学的修飾により、生体分子上および／またはその中に存在する。適当な生体分子の例には、アミノ酸、タンパク質およびその断片、抗体、抗体の結合性断片、酵素、核酸、およびこれらの組合せがあるが、これらに限定されない。これは多くの可能な方法の１つであり、本明細書に記載の例および他の類似の物質および／または生体分子に一般的に適用できる。好適な実施態様において、ＥＣＬに使用される試薬は、ＮＨＳ−エステル基を介して小繊維に結合してよい。
ＥＣＬ測定法に使用できる抗体は、共有結合（例えば、ＮＨＳ−エステルとの反応）により、適当なリンカー（上記）により、非特異結合により、および／またはこれらの組合せにより、１つまたはそれ以上の小繊維または小繊維マットに結合することができる。小繊維に結合したＮＨＳ−エステルに共有結合により、小繊維または小繊維マットに、核酸および／または細胞を結合することができる。
小繊維および／または小繊維マットへの物質の非特異結合の程度を調節することが好ましいことがある。非限定例として、タンパク質、抗体、抗体の断片、細胞、細胞内粒子、ウイルス、血清および／または１つまたはそれ以上のその成分、ＥＣＬ標識物（例えば、ＲｕＩＩ（ｂｐｙ）３およびＲｕＩＩＩ（ｂｐｙ）３誘導体）、シュウ酸塩、トリアルキルアミン、Ａｇ、アナライトおよび／またはこれらの組合せの非特異結合吸着を低下または防止することが好ましい。別の例では、生体分子の結合を増強させることが好ましい。
【００７２】
非特異結合を低下または防止する１つまたはそれ以上の化学残基が、１つまたはそれ以上の小繊維、１つまたはそれ以上の小繊維凝集物および／または小繊維マットの中、上または近傍に存在してもよい。非特異結合は、１つまたはそれ以上の小繊維および／または小繊維マットにＰＥＧを共有結合することにより調節される。荷電残基（例えば、リン酸塩、アンモニウムイオン）が、１つまたはそれ以上の小繊維または小繊維マットに共有結合してもよい。
支持体、電極および／または結合ドメインに使用される物質は、非特異結合を低下させるために、界面活性剤で処理される。例えば、小繊維または小繊維マットは、当業者に公知の界面活性剤および／または洗浄剤で処理される（例えば、ツイーンシリーズ、トリトン、スパン、ブリジ（Ｂｒｉｊ））。小繊維または小繊維マットは、界面活性剤および／または洗浄剤の溶液で洗浄、浸漬、インキュベーション、音波処理、またはこれらの組合せ処理を行われる。ＰＥＧおよびＰＥＧと同様の挙動を示す分子（例えば、オリゴ糖または多糖、他の親水性オリゴマーまたはポリマー）（「ポリエチレングリコールの化学：生体工学および生体医学的応用（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、ジェイ・エム・ハリス（Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．）編、１９９２、プレヌムプレス（Ｐｒｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ））の溶液を、界面活性剤および／または洗浄剤の代わりにおよび／またはこれとともに使用することができる。
前記したようなある物質の好ましくない非特異吸着は、競合的非特異吸着により阻止される。この競合的結合種は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）でもよい。
【００７３】
ＥＣＬ−ＴＡＧの非特異結合は、ＴＡＧの化学修飾により低下させることができる。例えば、親水性を上昇させて（例えば、親水性結合、極性結合、水素結合、および／または荷電官能基を、Ｒｕ（ｂｐｙ３）中のビピリジルリガンドに付加することにより）、こうして他の表面へのＴＡＧの非特異結合を低下させるように、修飾してもよい。
小繊維または小繊維マットに生体分子または他の媒体を固定化することが好適であり得る。抗体、抗体の断片、タンパク質、酵素、酵素基質、インヒビター、補助因子、抗原、ハプテン、リポタンパク質、リポ糖、細胞、細胞成分、細胞受容体、ウイルス、核酸、抗原、脂質、糖タンパク質、炭水化物、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、タンパク質結合リガンド、薬剤、および／またはこれらの組合せを結合させてもよい。
エラストマー、ゲル、コーティング、ＥＣＬ標識物、酸化還元活性種（例えば、トリプロピルアミン、シュウ酸塩）、無機物質、キレート化剤、リンカーなどの物質（但し、これらに限定されない）を、小繊維に結合させることが好ましい。
１つまたはそれ以上のすなわち複数の種を、小繊維または小繊維マットの表面に非特異的に結合（例えば、吸着）してもよい。
【００７４】
生体分子または他の媒体を、非特異的吸着により小繊維または小繊維マットに結合することができる。特定の小繊維についての非特異的吸着の程度は、それぞれの性質により決定される。小繊維上に存在するある化学官能基または生体分子は、非特異結合を低下または上昇させることができる。タンパク質の表面上の疎水性および／または親水性斑点の存在は、小繊維または小繊維マットへのタンパク質の非特異結合を上昇または低下させる。親水性および／または疎水性斑点は、調節された場所での非特異結合を調節するのに使用される。
小繊維はアルキル（ＣＨ２）鎖および／またはカルボン酸基で誘導体化して、生体分子または媒体もしくは他の物質の非特異結合を上昇させることができる。
図２６は、単一の小繊維の場合の前記実施態様の略図である。小繊維２６００はアルキル鎖２６０１により誘導体化される。生体分子２６０２、２６０３、および２６０４は、アルキル鎖に非特異的に結合する。ポリマー／エラストマー２６０５もまた結合する。
誘導体化していない小繊維、小繊維凝集物および／または小繊維マットは、非特異結合により生体分子、生物学的媒体、および他の物質の固定化に使用される。
ＥＣＬ  ＴＡＧは荷電残基を含有する。ＥＣＬ  ＴＡＧは、支持体および／または電極に選択的に結合するように作成される。例えば、正味の陰性荷電を有する誘導体化したＥＣＬ  ＴＡＧは、より還元性の電位の電極には親和性が比較的小さく、電極電位がより酸化性になると電極に対する親和性が大きくなる。電極に対するＥＣＬ  ＴＡＧおよび／または結合試薬の親和性は、調節できるように作成される（例えば、結合および／または洗浄工程で親和性を低下させ、そしてＥＣＬ  ＴＡＧおよび／または結合試薬の親和性を増加させて、ＥＣＬ読みとり時のＥＣＬ  ＴＡＧにより感知される有効電位を増加させる）。
【００７５】
図２８では、共有結合により分子（生物学的または非生物学的）が小繊維に結合される。ＮＨＳ−エステル化学官能基を有する小繊維２８００は、生体分子または生物学的媒体２８０２、２８０３に対する共有結合２８０１を形成する。これらの生物学的媒体はＮＨＳ−エステル基との反応により共有結合を形成するためにアミノ基を使用する。当業者は、分子のカプリング剤としてのＮＨＳ−エステル基の一般性を認識し、固定化を達成するための適切な生体分子および適切な反応条件を選択することができる。
【００７６】
一対の残基および／または分子「Ｍ１」と「Ｓ１」（このうち１つまたはそれ以上は小繊維に結合している）は、共通の親和性または結合能力を示す。Ｍ１／Ｓ１は、抗体／抗原、抗体／ハプテン、酵素／基質、酵素／補助因子、酵素／インヒビター、レクチン／炭水化物、受容体／ホルモン、受容体／エフェクター、核酸／核酸、タンパク質／核酸、ウイルス／リガンド、細胞／細胞受容体などであってよい。「結合対」Ｍ１／Ｓ１の多くの組合せは、所望の結合を達成するための組合せの選択を可能にする。Ｍ１とＳ１のいずれかまたは両方が、１つまたはそれ以上の小繊維に結合してもよい。
【００７７】
図２７と２８は、本例で可能な多くの可能な配置の一部を例示する。図２７では、アルキル鎖２７０１で非特異的に誘導体化された小繊維２７００は、別の分子２７０３に対して共通の親和性または結合能力を有する分子２７０２に結合する。分子２７０３はまた、別の分子２７０４に結合している。阻止分子２７０５は、非特異的に小繊維に吸着される。分子２７０９に対して親和性を有するリガンド２７０８を有する阻止ポリマー２７０６および／またはポリマー２７０７は、非特異的に吸着される。
【００７８】
図２８では、小繊維２８００は２８０１を介して、生体分子２８０２と２８０３、およびリンカー分子２８０４に共有結合している。リンカー分子２８０４は、別の生体分子２８０５に対して共通の親和性または結合能力を有する。生体分子２８０３は、別のリンカー分子２８０６に対して共通の親和性または結合能力を有し、これは２８０７に共有結合している。結合パートナー２８０９に対して特異的なリガンド２８１２を有するポリマー２８０８は、小繊維に共有結合している。阻止分子（例えば、ＢＳＡ）２８１１および阻止ポリマー２８１０は、共有結合している。
【００７９】
小繊維は、ビオチンおよび／またはビオチン化リンカーにより誘導体化され、アビジンおよび／またはストレプトアビジンがこのリンカーに結合してもよい。アビジンおよび／またはストレプトアビジンは、小繊維に結合し、ビオチン化抗体および／またはタンパク質が結合してもよい。アビジンおよび／またはストレプトアビジンは、非特異結合、共有結合、別のもしくは同じカプリング対、またはこれらの組合せにより、小繊維上に固定化されてよい。「結合対」としての（ストレプト）アビジンおよびビオチンの使用は、生体分子または生物学的媒体を他の物質に結合するために広く応用されている方法であり、当業者に公知である（スピンケ（Ｓｐｉｎｋｅ）ら、１９９３、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）９：１８２１）。
【００８０】
結合対は、モノクローナル抗体とこの抗体に結合する抗原であってよい。
複数の結合対（例えば、Ｍ１／Ｓ１／Ｍ２）が形成されてよい。Ｍ１はモノクローナル抗体、Ｓ１はＭ１に対する抗原、そしてＭ２はＳ１に結合する抗体である。この複合体は、抗体／抗原／抗体「サンドイッチ」複合体（そのような抗体は、モノクローナル抗体であってもでなくてもよい）でもよい。Ｍ２はＥＣＬ活性標識物（前述）、蛍光標識物、放射性標識物、酵素標識物、および／またはこれらの組合せでもよい。
【００８１】
Ｍ１は、金属、金属イオン、または有機金属化合物（「キレート化剤」）と複合体を形成する残基であり、Ｓ１はＭ１と複合体を形成する金属、金属イオン、または有機金属化合物（「キレート物質」）であり、そしてＭ２はＭ１／Ｓ１複合体に結合する生体分子上の残基であってよい（ゲルション（Ｇｅｒｓｈｏｎ）とキルコ（Ｋｈｉｌｋｏ）、１９９５、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７３７１）。
表面上の電極に電流を分配するための金属性電極パターンと導電性成分の作成は、当該分野で公知の方法により行われる（例えば、レベンティス（Ｌｅｖｅｎｔｉｓ）ら、米国特許第５，１８９，５４９号を参照）。透明な表面上の金属フィルムの作成は、液晶ディスプレイを製造するために使用されており、本発明の電極の作成に容易に適用できる。ハネコ（Ｈａｎｅｋｏ）、１９８７、液晶テレビディスプレイ、液晶ディスプレイの原理と応用（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ  ＴＶ  Ｄｉｓｐｌａｙｓ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｌｉｑｕｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙｓ）、ケーティーケー・サイエンティフックパバリッシャーズ（ＫＴＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、トーキョー、ディー・レイデルパブリシング（Ｄ．Ｒｅｉｄｅｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。透明電極表面もまた、例えばディミラ（ＤｉＭｉｌｌａ）らの方法（１９９４、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６（５）：２２２５−２５２６）に従って作成できる。０．５ｎｍのチタンと５ｎｍの金を透明な基板（ガラスまたはプラスチック）の上に沈積させる。ディミラ（ＤｉＭｉｌｌａ）らの方法（前述）により作成した薄い金の層を用いて、クマール（Ｋｕｍａｒ）の方法により透明な電気的構造を作成する。透明性を維持しながら、電流運搬性の改良のために導電性層の厚さを増加させるようにこの方法を修飾することが好ましく、これは当業者に公知である。そのような方法は、ＰＭＡＭＳの別々の結合ドメインに整列または近傍にある電極表面の作成に使用される。
【００８２】
さらにフィルムおよび／または単層は、ジャン（Ｚｈａｎｇ）とバード（Ｂａｒｄ）の教示するような絶縁残基（例えば、アルキル鎖）を用いるより、電極表面からＥＣＬ標識物への電位の移動を促進する残基よりなる。例えば、広範な共役系のパイ軌道重複は電子移動に使用される。このようなパイ軌道電子移動は、ポリ−ピロール又は他の結合環または２重結合構造により提供される。
オリゴヌクレオチドは、電子移動を調節するために使用される。例えば、２本鎖ＤＮＡ中の重複パイ結合は、電子移動速度を増加させるために使用される。電極表面に結合したオリゴヌクレオチドは、結合ドメイン中の結合物質として使用される。相補的なオリゴヌクレオチド配列に結合すると、整然とした重複パイ結合を有する２重結合が形成される。具体例において、第１のまたは第２の固定化（例えば、支持体への共有結合）されたオリゴヌクレオチドがＥＣＬ標識される。別の実施態様において、第１のオリゴヌクレオチドに相補的な第２のオリゴヌクレオチドまたは部分的に相補的なオリゴヌクレオチド配列がＥＣＬ標識する。第２のオリゴヌクレオチドに相補的なまたは部分的に相補的な三次オリゴヌクレオチドが標識される（例えば、サンドイッチ測定法）。分岐したオリゴヌクレオチド鎖も使用することができる。種々のオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド模倣物が使用できる（例えば、修飾塩基、および／または例えば窒素及び／もしくはイオウを有する修飾骨格を有するオリゴヌクレオチド）。差別的試験を行ってもよい。オリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド複合体中のパイ重複の安定性の変動は、電子移動により追跡できる。パイ結合で安定したＥＣＬ標識２重らせんオリゴヌクレオチド対から生成するシグナル（例えば、発生するＥＣＬ光および／またはインピーダンス測定）は、より不規則な１本鎖オリゴヌクレオチドからのシグナルまたは予測されるシグナルに対して相関付けられる。完全に相補的なＥＣＬ標識２本鎖オリゴヌクレオチドと部分的に相補的なＥＣＬ標識２本鎖オリゴヌクレオチドの間のＥＣＬシグナルは相関し得る。さらに複数オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド複合体が利用できる。例えば、三重らせんが利用できる。
【００８３】
電子移動速度の変化は、ＥＣＬ検出並びに電子的手段を用いて測定される。ＥＣＬ標識物は、オリゴヌクレオチド鎖に共有結合するか、および／または非共有結合的に会合（例えば、挿入）してよい。ＤＮＡから電極への電子移動に対する小さい抵抗を確保するために、ＤＮＡはリンカーを使わずに（例えば、５’チオール化ＤＮＡまたは金）または短い（＜１０原子）リンカーを用いて電極に結合されてよい。電極からＤＮＡ鎖に効率的に電子を運搬できる結合鎖が使用される（例えば、ポリアセチレン鎖）。
場合により単層またはフィルムの少なくとも１つの成分が電位の移動を促進する、混合単層および／またはフィルムが使用される。あるいは、電位の移動を促進する分子または粒子が、単層またはフィルムに吸着される。前記の例として、電極表面に吸着するかおよび／またはそれに近いパイ共役単層および／または導電性微粒子が、使用される。パターン付けされた規則的な間隙が単層および／もしくはフィルム中で形成される。ＥＣＬ標識物が次に結合される長鎖アルカンチオール（すなわち、絶縁性）からなる規則的な実質的に直角のＳＡＭ中の間隙の調節パターンを用いて、ＥＣＬ標識物に付加される有効な電位が調節される。例えば図１１は、金属層１２０４を有する１つの支持体１２０２から形成されるカセット１２００、ＳＡＭパターン１２０６およびＳＡＭパターンの間の間隙１２０８を示す。
ＥＣＬ標識タンパク質は、単層表面に非共有結合してもよい。ＥＣＬ標識タンパク質は、メチルが末端にあるアルカンチオールで誘導体化した金表面に吸着してもよい。金表面は、作用電極または対電極として作用する。図１１〜１３に記載のように、複数の結合ドメインが１つの支持体に導入されてよい。好適な実施態様では、結合ドメインは標識および／または非標識タンパク質および／または核酸および／または細胞および／または化学的分子種を含有する。
【００８４】
あるいは、単層の成分の長さ（例えば、アルカンチオール単層中のアルカン鎖の長さ）を変えて、単層の予測される表面の有効電位を調節できる。
広い意味でアルカンチオールは、１炭素〜１００炭素の長さの炭素鎖を有してもよい。好適な実施態様において、アルカンチオールの炭素の長さは、２〜２４炭素を含有する。アルカンチオールの炭素鎖の長さは、２〜１８炭素である。炭素鎖の長さは７〜１１炭素である。このようなアルカンチオールは、測定媒体に暴露された種々の頭部の基（例えば、メチル基、水酸基、アミン、カルボン酸、オリゴ（エチレングリコール）、リン酸基、ホスホリル基、ビオチン、ニトリロ三酢酸、グルタチオン、エポキシド、ジニトロフェニル、および／またはＮＨＳ−エステル）を含有する。他の頭部の基には、組換え融合蛋白の精製と固定化に通常使用されるリガンドがある（例えば、サッセンフェルト（Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ）、１９９０、ＴＩＢＴＥＣＨ  ８：８８−９３）。結合ドメインは、種々の密度の結合試薬を得るために、種々の程度に誘導体化される。例えば、異なる密度の活性化可能な化学種が使用されるか、および／または種々の程度に誘導体化が行われる。所望の結合密度を作成するために、種々の化学が使用される。活性化可能な基および／または結合試薬の密度を調節するために、種々の単層を使用してもよい。結合基の密度は、ＥＣＬシグナル対ノイズ比を最適化するために調節される。他の結合ドメインからの他のＥＣＬ光シグナルに関して（そのＥＣＬ光シグナルが順番にまたは同時に、および／または光検出手段で検出されようが）、電気化学的光シグナルの強度を最適化するために、結合ドメイン内の結合部位の総数が調節される。
【００８５】
ＰＭＡＭＳ内の結合ドメインに関連するＥＣＬ標識物を１回またはそれ以上活性化するために、電位波形が適用される。複数のＥＣＬ光シグナルを生成するために、ＥＣＬ標識物が結合した同じアルカンチオール誘導体化表面に、ＥＣＬ光生成を活性化するのに充分な電位が複数回適用される。電位は、ＥＣＬを可逆的に生成するのに充分なだけ適用される。電位は、ＥＣＬを擬可逆的に生成するように適用される。電位波形の擬可逆シリーズにおいて、その中でＥＣＬ標識物が会合（例えば、結合）する結合ドメインは、化学的および／または物理的に改変されてよい。適用される電位波形シリーズは、不可逆性のＥＣＬ光生成を与える。
さらに、単層の成分を放出するのに充分な電位が適用される。電極表面上の容量が小さい単層成分を放出することが好ましい（例えば、電極表面上の他の支持体またはプレート）。こうして単層が破壊されると、効率的に励起されていない一部のＥＣＬ標識物さえ電極表面で励起されて電気化学発光シグナルが生成し、ＥＣＬ標識物は小さな容量に限定され、電極からの拡散が制限される。ある電位の単層破壊の程度を調節するために、種々の単層組成が使用される。強い成分間親和性を有する成分を有する単層は、単層破壊に対してより耐性がある。長いアルカン鎖チオールは、短いアルカン鎖チオールより、有効に破壊に耐える。鎖の長さを変えることにより、所望の安定性が達成される。
【００８６】
ＥＣＬシグナルを調節するために、ＰＭＡＭＳ内の結合ドメインの修飾を行ってもよい。複数のＥＣＬシグナルを生成するために、一連の電位波形が適用される。上記複数のＥＣＬシグナルは、追加のおよび／またはより良い結果を得るために使用される。ＥＣＬシグナルの変化速度の統計解析では、１つまたはそれ以上の結合ドメインの全体の質に関連付けられる。さらに上記複数のＥＣＬシグナルは、例えばあるシリーズのうちのあるＥＣＬシグナルをフィルターして、シグナル対ノイズ比を上げるのに使用される。さらに複数電位波形パルスは、非特異結合による好ましくないシグナルの調節を低下させるために使用される。ある荷電分子種の非特異結合を防ぐために電位が加えられる。さらに、あるアナライトまたは目的の化学分子種の結合ドメインの近くの局在化を促進するために、電位が加えられる。加えられるブイ電位波形が大きな過電位（例えば、ＥＣＬの生成に必要な以上の高い電位）を与える。電位波形シリーズのまたは単一の電位波形パルスのＥＣＬシグナルを調節するために、過電位が加えられる。さらに、ＥＣＬ反応動力学および／または結合電位を化学的および／または物理的に調節するために、過電位が使用される。さらに、電極の性質および／または電子的性質に関する情報を評価および／または関連付けおよび／または外挿するために、当業者に公知の１つまたはそれ以上の電位波形および／または他の電子的プローブが使用される。
【００８７】
好ましくは、電極と接触する追加の導電性手段を用いて、作用電極表面積を拡大することにより、ＥＣＬ反応の効率を上昇させられる。導電性物質または導電性粒子の電極の突起部分または延長部分（例えば、ワイヤーまたは針電極）は、電界がより密接にＥＣＬ標識に近づくように、電極表面積を増加させるのに使用してもよい。あるいは、電極構造のへこみまたは穴は同じ目的に役立つ。
特に、図１２に示すように、ＥＣＬ標識物の周りの電界の絶対値が増加するように、導電性粒子は電極表面の間隙を埋めるかおよび／または支持体または単層をカバーする。これらの導電性粒子は、電極表面積を拡大し、従ってＥＣＬ反応の効率を増加させる。図１２は、金属層１３０４上のパターン付けしたＳＡＭ１３０６を有する支持体１３０２を有するカセット１３００を示し、ＳＡＭパターンの間の間隙を埋める導電性微粒子（例えば、図１１の１２０８）を示し、および金属表面上に拡大していることを示す。磁性導電性粒子については、磁石または磁界を、粒子を表面に引きつけるために使用できる。導電性粒子はまた、電極表面と２つの近接した支持体を有するＰＭＡＭＳの結合ドメインの間の電位を拡大するために使用することもできる。図８では、カセット９００は、多重アレイの電極を有する第１の支持体９０２から構成され、第２の支持体９０４は、ＰＭＡＭＳを有する。導電性微粒子９０６は、電位を結合ドメイン上のＥＣＬ標識物に拡大するために、反対の表面の間に位置する（データは示していない）。
あるいは、導電性ポリマーは、図１３に示すＳＡＭのＥＣＬ標識物の周りの電位の拡大を促進するために、電極表面上の露出した間隙から成長する。図１３は、パターン付けしたＳＡＭ表面１４０６上に金属層１４０４を有する支持体１４０２を有するカセット１４００を示す。導電性ポリマー１４０８は、多重アレイの電極（示していない）により提供される電界を、ＳＡＭ表面上の結合ドメイン（示していない）に拡大するために、ＳＡＭ表面上で成長する。導電性ポリマーはまた、前述のように図７に示す２つの近接する支持体の電極表面とＰＭＡＭＳの間の電位を拡大するために使用される。図７では、カセット８００は、近接する支持体８０２と８０４からなる。導電性ポリマー８０６は、結合ドメイン（示していない）上のＥＣＬ標識物に向けて電位を拡大するために、反対の表面の間で成長する。
【００８８】
図９は、複数電極アレイを有する第１の支持体１００２を有する形成されるカセット１０００を例示し、第２の支持体１００４はＰＭＡＭＳ結合表面を有し、ここで作用電極の導電性突起部分（１００６）（例えば、細いワイアーまたは他の突起部分）は、ＰＭＡＭＳ結合ドメイン中のＥＣＬ標識物の周りの電界を拡大する。
電極対は、種々の構成で作成される。最も簡単な構成（本明細書の添付図面に記載されている）は、非導電性の平らな表面上の金属および／または金属酸化物フィルムおよび／または半導体フィルムで作成される。これらの電極対の電極は、好ましくはこれらの間の比較的一定の幅の領域を規定し、こうして比較的一定の電界を提供する。
電極の他の構成が提供される。これらの構成のいくつかは、図１９（ａ）〜（ｅ）に示される。図１９（ａ）は、互いにかみ合った櫛様の電極対を示す。この構造では、各電極は、導電体から延びる複数の指を有し、櫛様構造を形成している。電極と対電極の対は、結合ドメインに隣接して位置するか、または結合ドメインが電極と対電極の間に位置してもよい。図１９（ｂ）は、１対の同心円電極（１つは環状で１つは半環状である）を示す。図１９（ｃ）は、その直線的な端が互いに向かい合っている２つの半環状電極を示す。図１９（ｄ）は、１対の長方形の電極を示す。図１９（ｅ）は、相補的な反対に曲がった表面を有してその間に波形の間隙を形成している互いにかみ合った１対の電極を示す。
電極／対電極対はまた、整列のためのＰＭＡＭＳ結合表面上の形に相補的な特異的な形に作成されてもよい。形の例を図６Ｂに示す。電極対７１４−７２０を有する支持体７１２を示す。電極対は例えば、環状７１４、互いにかみ合う７１６、三角にかみ合う７１８、または複数の電極が互いにかみ合う７２０でもよい。
前記した図１４〜１９に示す実施態様において、電極対は１つの支持体の上に位置する。あるいは、図２に示すように電極対は第１および第２の反対の支持体上に位置する。
【００８９】
５．８．カセット
カセットは、本発明の１つまたはそれ以上の支持体を含有する。カセットは、複数の結合ドメインおよび１つまたはそれ以上の作用電極を含有してもよい。
図２は、支持体２６上の複数の結合ドメイン３０のそれぞれが複数の電極３２の異なる１つに隣接しているカセットを示す。対電極３８は、第２の支持体２８上で形成される。ＥＣＬ測定は、前述のように試料を結合ドメイン３０の上に置き、次に支持体２６と２８を一緒に動かして対電極３８が結合ドメイン３０のそれぞれに隣接するようにして、前述のように導線３４を介して波形発生手段によりＥＣＬ反応を開始させ、ＥＣＬシグナルを光検出手段４０、ワイアー４１、およびデジタルコンピューター手段４２を用いて検出し記録する。
図３は、複数の結合ドメイン４８のそれぞれが、支持体４４上で複数の電極／これに隣接する対電極対５０の異なる１つを有するカセットを示す。支持体４６は、支持体４６が、複数の結合ドメイン４８と複数の電極５０に隣接する試料封じ込め手段を形成するように、随時支持体４４に隣接して置かれる。すなわち、ＥＣＬ反応は、電気的接続５２を介して波形発生手段５４により開始させ、ＥＣＬシグナルを光検出手段５６を用いて検出し、デジタルコンピューター手段４２を用いて記録する。
【００９０】
図２１に示す１つまたはそれ以上の支持体を含有するカセットが提供され、各対の支持体は、結合ドメインを含有する第１の支持体１５０１の表面が、第２の支持体１５０２の上に結合ドメインを含有する表面に向かい合うように位置し、ここで各表面は電極１５０４と結合ドメイン１５０６を含有し；そのため、第１の支持体上の各結合ドメインが第２の支持体上の電極に向かい合いこれと整列し、第２の支持体の各結合ドメインは第１の支持体上の電極と向かい合いこれと整列する。
図４は、ＥＣＬ電極が随時提供されるカセットを例示する。支持体６０上の結合ドメイン６４を、アナライトを含有することが疑われる試料と接触させる。支持体６２上の領域６６は、目的のアナライトを検出もしくは測定するためまたは目的の反応を実施するための反応媒体を含有する。支持体６０と支持体６２は、一緒に近づけ、そのため結合ドメイン６４と領域６６は接触し、アナライトまたは反応生成物の存在は、レポーター系（例えば、フォト検出手段６８により検出される光学的、化学発光もしくは蛍光シグナル）により測定され、疑似コンピューター手段７０により分析される。
【００９１】
好適な実施態様において、本発明のカセットまたは装置は、複数の別々の結合ドメイン上への試料送達のための手段からなる（例えば、米国特許第５，１４７，８０６号の図１の要素１；米国特許第５，０６８，０８８号の図１の要素１を参照のこと；いずれもその全体が引用により本明細書に組み込まれる）。試料送達の手段は、静置型であってもまたは移動可能であってもよく、かつ１つまたはそれ以上の入口、穴、孔、チャネル、パイプ、微量流体ガイド（例えば、毛細管）、チューブ、スピゴットなどを含むが、これらに限定されない当該分野で公知の任意のものであってよい。流体は、例えば、ポンプ、ピペット、シリンジ、落下流、毛細管作用、吸上作用、電気泳動、圧力、真空などの種々の周知の方法により、システムを移動することができる。流体移動の手段は、カセット上に配置しても、または分離したユニット上に配置してもよい。試料は、全ての結合ドメイン上に一緒に置くことができる。あるいは、試料は、支持体上のＰＭＡＭＳへ直接流体試料を送達するための自動ピペッターにより支持体上に載せるか、または結合表面へ後から直接送達するためのカセットまたはカセットホルダー内のリザーバー中に入れることができる。
【００９２】
支持体は、ガラス、プラスチック、セラミック、重合性材料、エラストマー材料、金属、炭素または炭素含有材料、合金、複合箔、ケイ素および／または積層材料を含む材料から調製することができるが、これらに限定されない。支持体は、非常に多様な構造的、化学的および／または光学的性質を有してよい。これらは、剛性または可撓性であり、平面であるかまたは変形しており、透明、半透明、部分的にまたは完全に反射性または不透明であってよく、そして複合性、異なる性質を有する領域を有してよく、２つ以上の材料の複合材料であってもよい。
測定を実施するための試薬は、カセット上で、かつ／または分離した容器中で保存することができる。試薬は、乾燥および／または湿潤状態で保存することができる。１つの実施態様において、カセット内の乾燥試薬は、試験試料の添加により再水和される。別々の実施態様において、試薬は、移動可能なローラーまたはピストンからの圧力により破裂開封される「ブリスターパック」中の溶液で保存される。カセットは、測定の終了後の廃棄物区画または液体廃棄物の保存用のスポンジを含有してよい。１つの実施態様において、カセットは、試験すべき生物学的試料の調製用の装置を含む。血液から細胞を除去するためのフィルターを含んでもよい。別の例において、カセットは、試料の計量用の精密毛細管のような装置を含んでもよい。
【００９３】
支持体上の、複数の結合ドメインおよび複数の電極／対電極は、典型的には機械的手段、例えば、ガイドポスト、整列ピン、ヒンジ（各支持体間の）またはガイドエッジにより、登録された相互に近い位置に置かれる。光学ガイド手段は、支持体上に画定された光学ガイドマークを利用する支持体と電子的手段の両方の位置決めに使用することができる。電気的または磁気的登録手段を使用する他のシステムも利用可能である。
カセットの支持体は、ＥＣＬ反応を引き起こす必要が生じるまで、電極対が試料に接触するのを保護するように配列することができる。例えば、電極は、取り外し可能な電極保護手段のような種々の機械的手段を使用することにより、電極の試料との接触が必要となるまで、結合ドメイン表面から分離して維持することができる。
本発明のカセットまたは装置は、参照電極、例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌまたは飽和カロメル電極（ＳＣＥ）からなる。
支持体は、クリップ、接着剤、リベット、ピンまたは任意の他の適切な機械的保持機構により結合させることができる。これらはまた、液体試料の表面張力により、または２つの支持体の反対側に取り外し可能に置かれた圧縮手段により結合させることができる。
【００９４】
カセットはまた、例えば、結合ドメインと電極の交互の層、または結合表面と電極表面の両方を単一支持体上に含んでなる多数の支持体を有する、３つ以上の支持体を含んでなってもよい。これは、ＥＣＬ分析セルの三次元アレイを形成する。カセットの前記の全ての成分は、場合により結合ドメイン間のいくつかの領域を除いて透明である。例えば、多数の透明結合表面、電極表面、および支持体を積み重ねることができる。
第１および第２の支持体は、平面状でかつその間に試料保持容量を規定するように向かい合わせることができる。あるいは、第１および第２の支持体層は、２つの支持体およびその任意の他の成分の形が一致するならば、球形、立方体、円筒形を含む他の適切な形に構成させることができる。例えば、図１０は、２つの隣接する非平面状支持体１１０２および１１０４から形成されるカセット１１００を示している。各支持体は、形態がもう一方に対して相補的な表面を有する。いずれかの支持体も、ＰＭＡＭＳ表面または多数の電極アレイまたはその両方を有してよい。支持体の一方または両方が、もう一方の支持体の形に一致するように、エラストマー性であってよい。支持体またはカセットはまた、プレカット（ｐｒｅｃｕｔ）型に作成されても、または回転ディスペンサーから適切な長さに提供してもよい。カセットは、試料保持容量のような試料受容手段および試料分配溝、チャネル、くぼみなどをさらに含んでもよい。
図３７は、マトリックス（３７０３）の中および／または上の結合ドメイン（３７０２）が表面（３７０１）上に提示されているカセットを示す。作用電極（３７０４）および対電極（３７０５）を支持する第２の表面（３７００）は、結合ドメインが作用電極にかなり近づくように置かれる。結合ドメインに結合したＥＣＬ標識から光生成をもたらす条件下で、光はいずれかの表面または両方の表面から検出することができる。光検出器のアレイ（３７０６、例えば、ＣＣＤアレイ、増強ＣＣＤアレイ、またはアバランシェフォトダイオードアレイ）は、同時に各結合ドメインからの複数の光シグナルを測定するのに使用される。光検出器アレイは、結合ドメインから生成する光を撮像する。レンズ、反射器および／または光学ガイドを利用して撮像を増強することができる。他の例において、光検出器（例えば、光検出ピクセル）のゾーンまたは領域から検出される光は、結合ドメインに相関する。画像分析を使用して、検出される光の結合ドメインとの相関を促進することができる。１つの好ましい実施態様において、表面は、エラストマー性すなわち柔軟であり、このため、電極表面と密接な接触を作ることができる。結合ドメインは、対電極から作用電極にイオン電流を運ぶことができるポリマーに結合している。さらに好ましい実施態様において、この物体は、対電極から作用電極にイオン電流を運ぶことができる水膨潤性ポリマーである。
図３８は、結合ドメイン（３８０５，３８０６，３８０７）が、対電極（３８００）上に支持される別々の物体（３８０８，３８０９，３８１０）の表面上に提示されるカセットを示している。作用電極（３８０１）は、この物体の表面に接近して置かれる。結合ドメインに結合したＴＡＧ標識した基からＥＣＬを導く条件下で、光は、いずれかまたは両方の電極（もし一方または両方の電極が透明または半透明であれば）を通して、かつ／または側面から検出することができる。光検出器のアレイ（３８０２）は、各結合ドメインからの複数の光シグナルを同時に測定するのに使用される。この物体は、エラストマー性であるか、かつ／または柔軟であり、このため、作用電極と密接な接触を形成することができる。この物体は、対電極から作用電極にイオン電流を運ぶことができるポリマーであってよい。この物体は、対電極から作用電極にイオン電流を運ぶことができる水膨潤性ポリマーであってよい。
【００９５】
１つまたはそれ以上の結合ドメインを含有する透明支持体を、小繊維マット電極に接触させる。試薬は、支持体／結合ドメインと小繊維マットの間を、またはマットを通って結合ドメインに流れることができる。光は、結合ドメインから、透明支持体を通って検出器まで通過することができる。
別の好適な実施態様において、電極は、電極の有効表面積が増大するように、光学的に半透明または透明な炭素小繊維の層でコーティングされる。
本発明のＰＭＡＭＳ支持体および／またはカセットは、キットとして包装することが有利である。キットは、測定物、対照などを含む、ＥＣＬ反応を実施するための、本発明により調製される１つまたはそれ以上のＰＭＡＭＳ支持体からなる。対照試薬、ＥＣＬ測定用および較正用試薬などを含む試薬は、場合によりキットに含まれる。複数の異なるアナライトに特異的な複数の結合試薬を含有する試薬混合物が含まれてもよい。
【００９６】
５．９．ＥＣＬを行うための装置
反応
１つの実施態様において、支持体上のＰＭＡＭＳ、およびこれを含有するカセットは、ＰＭＡＭＳ結合ドメイン上に１つまたはそれ以上の試験試料を適用するための手段、および複数のＥＣＬ反応を開始させるための手段を含有する装置中に挿入されるように設計される。このような装置は、支持体またはカセットに基づいて複数のＥＣＬ測定を行うために、本発明により適切に変更された従来型の装置から得ることができる。本発明は、上述のセクションに記載されたＰＭＡＭＳの各具体的な実施態様を使用して、ＥＣＬ測定を行うために適合させた種々の装置を提供する。ＥＣＬ反応を行うための装置は、ゾスキ（Ｚｏｓｋｉ）ら（米国特許第５，０６１，４４５号）により開示されている。必要とされる変更は、支持体および／またはカセットの操作、多数の試料送達、電圧波形の供給源による多数の電極のアドレス呼び出しおよび多数のＥＣＬシグナルの獲得および処理のための手段を含む。
本発明の例示的装置の要素は図６Ａに示される。このような装置７００は、上部および下部支持体７０２、７０４、および電極ガード７１０からなる。上部支持体は、複数の電極／対電極の対（図示していない）を有する。下部支持体は、結合ドメイン７０６を有する。この装置は、カセットから電極ガードを取り外し、結合ドメインに結合したアナライトと接触させるように電極／対電極を配置することができる。試薬または流体の流路空間７０８は、結合ドメインを有する支持体の隣にある。この装置はまた、同一または個々の決められた電圧波形を、複数の各電極／対電極の対に同時または順に送って、カセット内のＥＣＬ反応を引き起こし、次に放出されるＥＣＬ放射を光子検出器（例えば、光検出手段）により測定することができる。装置はさらに、支持体および／またはカセット、またはその周囲の温度を維持し、ＥＣＬ反応条件を最適化するために必要に応じて温度を調整するための温度制御手段を含んでもよい。温度制御手段は、好ましくは加熱および冷却手段、例えば、電気抵抗性発熱体、冷却ファン、冷凍手段、および加熱もしくは冷却の任意の他の適切な供給源である。温度制御手段はまた、温度センサー、例えば、サーモスタットまたは熱電対装置、および検出される温度変化に応答して加熱または冷却手段のスイッチを入れるかまたは切るための手段をも含む。
【００９７】
この装置はまた、ＥＣＬ反応を行うため、１つまたはそれ以上の支持体またはカセットを保持、移動および操作するための手段を提供する。装置はさらに、カセットについて上述したように、ＰＭＡＭＳ結合ドメイン上に試料を載せるための、静置型または移動可能な試料送達手段を含んでもよい。
装置はまた、カセットの別々にアドレス呼び出し可能な電極接続部のアレイを、電子的電圧波形発生手段、例えば、ポテンシオスタットに電気的に接続することができる電極接触手段を含んでもよい（例えば、米国特許第５，０６８，０８８号の図５を参照のこと）。波形発生手段は、順にまたは同時に、カセット内の複数のＥＣＬ反応を独立に引き起こすための、シグナルを送達する。
ＥＣＬ測定の間、作用電極と対電極の間のイオン電流は、イオンにより導電性になった液体（例えばイオン性塩を含有する水）を通って、このような液体の薄膜を通って、かつ／またはイオンにより導電性の固体マトリックスを通って流れることができる。
【００９８】
すなわち、試料中の電気化学発光を測定するための装置は、少なくとも１つの試料を保持するための複数のセル（ここで、セルは、１つまたはそれ以上の電極と１つまたはそれ以上の対電極から形成することができる）、および複数の別々の結合ドメインからなる第１の支持体を含んでよい。電極と対電極は、第１の支持体の表面上に、または第２の支持体（ここで、第２の支持体は、第１の支持体上の結合ドメインに非常に接近している）の表面上に提供することができる。電極と対電極は対で存在してもよい。セルはさらに、作用電極に近い電圧を検出するための複数の検出電極を含んでもよい。カセットはさらに、参照電極を含有するセルを含んでもよい。
装置はさらに、例えば、１つまたはそれ以上の検出手段により、カセット内で行われるＥＣＬ反応を検出することができる光検出手段を含んでもよい。このような検出手段は、単に例として、光検出手段のアレイに接続された、または放出されるとＥＣＬシグナルのアレイを走査することができる単一の光検出手段に接続された電極アレイに合い、これと隣接する位置に置かれる光ファイバーチャネルのアレイを含む。
【００９９】
装置は、場合により、装置の種々の部品の機能を制御するために、デジタルコンピュータまたはマイクロプロセッサーを含んでもよい。
装置はまた、シグナル処理手段も含む。１つの実施態様において、かつ単に例として、シグナル処理手段は、各ＥＣＬ測定の結果の移動、記録、分析および／または表示のためのデジタルコンピュータを含む。
あるいは、装置は、例えば、結合表面上にわたって順にＥＣＬを引き起こすために、１つまたはそれ以上の電極／対電極の対を走査するための、電極移行手段を含む。
ＰＭＡＭＳの平行アレイにおいてサイズ排除フィルターを使用することができる。
【０１００】
５．１０．実施することができるＥＣＬ測定法
本発明で使用されるＥＣＬ標識物は、当該分野で公知のＥＣＬ標識物から選択される（前記セクション２．２、および米国特許第５，３１０，６８７号を参照）。ＥＣＬ標識物は例えば、金属含有有機化合物からなり、ここで金属は、ルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、パラジウム、モリブデン、テクネチウムおよびタングステンよりなる群から選択される。ＥＣＬ  ＴＡＧ試薬を調製するのに適した結合化学は公知であり、例えばバード（Ｂａｒｄ）ら（米国特許第５，３１０，６８７号および第５，２２１，６０５号）により開示されている。結合試薬へのＥＣＬ標識物の結合手段は、共有結合および／または非共有結合でもよい。ＥＣＬ標識物は結合試薬に非共有結合（例えば、疎水性作用またはイオン性相互作用）をしてもよい。非共有結合の他の例では、ＥＣＬ標識物が（共有結合または非共有結合で）複合体に結合し、次にこれが非共有結合で結合試薬に結合する。より具体的な例は、Ｒｕ（ｂｐｙ）３がリンカーを介してＮｉ（ＩＩ）−トリニトリロ三酢酸錯体に共有結合することであろう。この分子は、複数のヒスチジンを含有するペプチド配列などの結合試薬に結合する。他の受容体リガンド対は、当該分野で公知であり、同様に使用することができる（サセンフェルト（Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ）、１９９０、ＴＩＢＴＥＣＨ  ８：８８−９３）。さらに、分岐ネットワーク（例えば、炭化水素リンカーを介して）として構成されている複数の有機金属化合物（例えば、Ｒｕ−含有）を含有するＥＣＬ標識物が使用できる。ＥＣＬが可能な複数の有機金属化合物残基を含有するこのような分岐ネットワークは、ＥＣＬ標識される分子上で１回または複数の位置で結合してもよい。別の実施態様において、化合物は、ポリマー鎖の長さに沿う複数の位置で結合する有機金属基を有する線状ポリマーである（例えば、線状、分岐または環状ポリマー）。
【０１０１】
当該分野で公知の種々の追加ＥＣＬ測定フォーマットで、複数の結合ドメインを使用することができる。定量測定では、既知量のＥＣＬ標識試薬が使用され、測定されるＥＣＬの量は、存在するアナライトの量を計算するために既知の標準物質に対する関係を計算する。当業者に公知の方法で前進（ｆｏｒｗａｒｄ）、後退（ｒｅｖｅｒｓｅ）、競合およびサンドイッチ測定法を行うことができる。競合測定法では例えば、ある量の多成分液体試料中の目的のアナライトの定量は以下のように行われる。結合表面を、同時に（ａ）結合ドメイン上に存在する結合試薬への結合において、目的のアナライトと競合することができる既知量のＥＣＬ標識リガンド、および（ｂ）目的のアナライトを含有することが疑われる試料と接触させ、ここでこの接触は、目的のアナライトとリガンドが結合試薬に対して競合して結合できる適切な条件下で行われる。試料中にアナライトが存在すると、結合ドメインに結合する競合性のＥＣＬ標識リガンドの量が減少し、このため得られるＥＣＬの量が（試料中にアナライトが存在しない場合に比較して）減少する。得られる結合ドメイン中のＥＣＬの反応を開始させ、放出される光の量を定量的に測定し、こうして試料中に存在するアナライトの量を定量する。あるいは、試料を結合表面と接触させ、次に結合表面をＥＣＬ標識リガンドに接触させてもよく、次にＥＣＬ標識リガンドは、ＰＭＡＭＳ表面上で試料からのあらかじめ結合したアナライトと競合し、あらかじめ結合したアナライトの一部を置換する。別の実施態様では、ＥＣＬ標識した物質／分子を含有するように試料を処理し、標準量の非標識アナライトを結合表面と接触させ、次にまたは同時に結合表面を試料と接触させて競合測定を行う。
【０１０２】
サンドイッチ測定法では、ＥＣＬ標識リガンドは、目的のアナライト上の２つの結合残基に特異的に結合する結合パートナーである。すなわち、ＰＭＡＭＳの結合ドメイン中の結合試薬に特異的に結合するアナライトが試料中に存在すると、ＥＣＬ標識結合パートナーに結合した、試料からのアナライトに結合した、結合ドメイン上の結合試薬から構成される「サンドイッチ」が形成される。別の競合サンドイッチ測定法では、アナライト自身のコピーが多重アレイ結合表面の結合ドメインに結合し、次に試料と接触される。次に試料を結合表面と接触させる。ＥＣＬ標識した結合パートナー（これはアナライトに特異的に結合する）は、測定溶液中に遊離のアナライト（試料から）が存在しない場合は、アナライトに結合するが、測定溶液中に遊離のアナライト（試料から）が存在する場合は競合的に阻害されるであろう。
【０１０３】
別の実施態様において、連続的標識が行われる。例えば、サンドイッチ測定法の具体例では、結合ドメインに結合したアナライトは、アナライトの複数のＥＣＬ標識した結合パートナーと順に接触される。ＥＣＬ測定と随時洗浄工程が、各異なる結合パートナーと接触させる間に行われる。こうしてアナライトの複数の異なる結合分子のＥＣＬ測定が行われる（例えば、ＣＤ８＋、ａ，ｂ  Ｔ細胞抗原受容体陽性Ｔ細胞）。あるいは、それぞれが区別可能な波長で発光する複数のＥＣＬ標識物が、アナライト上の異なる残基に特異的な異なる結合試薬にそれぞれ結合する。さらに、アナライトの異なる結合残基に特異的な異なる結合試薬にそれぞれ結合した区別可能なレポーター手段（例えば、ＥＣＬ標識物、蛍光標識物および酵素結合標識物）を用いて、例えばＣＤ４＋、ａ，ｂ  Ｔ細胞抗原受容体−陽性細胞をＣＤ８＋、ａ，ｂ  Ｔ細胞抗原受容体−陽性細胞と区別することができる。
【０１０４】
好適な実施態様において、結合ドメインは、標識タンパク質および／または核酸および／または細胞および／または化学的分子種を含有する。このような標識成分（例えば、ＥＣＬ標識物）は、作成の間、測定開始の前、測定中および／または測定の終了時に添加される。例えば、複数の標識成分は種々の時間に添加され、連続的読みとりが行われる。このような読み値は累積情報を与える。別の実施態様において、ＰＭＡＭＳの結合ドメインは何回も再使用できる。ある測定の終了後、ＰＭＡＭＳ表面の１つまたはそれ以上の結合ドメインの活性を再活性化させる条件下で表面を洗浄してもよい。例えば、ある結合反応は反応溶液のイオン強度を変えることにより逆転することができる。あるいは熱を用いて、結合複合体を解離させてもよい。本質的に自己再生能を有する結合ドメインもある。触媒性（例えば、酵素）官能基を含有する結合ドメインは、１回以上使用される。結合ドメインは順に使用され、こうしてバイオセンサーに応用することができる。
あるいは、多重アレイ多重特異的パターン付け表面に結合した結合試薬が、ＥＣＬ標識されるように、測定法をフォーマット化してもよい。試料中の目的のアナライトに結合すると、ＥＣＬ標識シグナルは定量的に変化する。例えば、この表面に結合したＥＣＬ標識結合試薬は、細胞表面上のアナライト（例えば、αおよびβＴ細胞抗原受容体抗原、またはＣＤ４もしくはＣＤ８抗原）に特異的であってよい。細胞の混合物に暴露すると、表面に結合した細胞は、多重アレイ多重特異的パターン付け表面の接近した電極表面がＥＣＬ標識した結合試薬を励起する能力を立体的に妨害し、こうしてＥＣＬシグナルを下方に変化させる。
【０１０５】
均一および不均一測定法を行うことができる。不均一測定法では、非結合標識試薬を結合した標識試薬から分離（例えば、洗浄工程により）し、次に結合または非結合標識試薬を電位に暴露する。均一測定法では、非結合標識試薬および結合標識試薬が一緒に、電位に暴露される。均一測定法では、結合標識試薬により放出されるシグナルの強度またはスペクトル特性は、非結合標識試薬により放出されるシグナルの強度より大きいかまたは小さい。この強度の差を測定することにより、各結合および非結合成分の有無を測定することができる。
結合試薬をアナライトまたはその競合物およびその結合パートナーに接触させ所望の工程が終了すると、次にＥＣＬ標識物を確実にＥＣＬ誘導性の環境に置く。適切なＥＣＬ測定媒体は当該分野で公知である。そのような測定媒体は、ＥＣＬ標識物のＥＣＬを促進する分子（シュウ酸、ＮＡＤＨ、および最も好ましくはトリプロピルアミンがあるが、これらに限定されない）を含有することが有利である。このような「プロモーター」分子は溶液中で遊離状態で提供されるか、またはＰＭＡＭＳ表面、表面上の単層、結合ドメイン、電極表面、結合試薬および／またはＥＣＬ標識物などにあらかじめ結合させるかもしくはこの表面上で産生させることにより提供される。接触工程から得られる結合ドメインに結合したＥＣＬ標識物の周りの媒体がＥＣＬ誘導性の場合は、媒体を変化させる必要はない。あるいは、ＥＣＬ誘導性の媒体を提供するように調整または置換をすることができる。電極または対電極は、すでに結合ドメインのすぐ近傍にあるか、または結合ドメインに接近させるかもしくは接触させて、電位波形を適用し、ＥＣＬを検出または測定する。
【０１０６】
本発明の好適な実施態様において、結合試薬をアナライトもしくはその競合物およびその任意の結合パートナーに接触させる上記工程は、電極または対電極の非存在下で行い、すなわち試料が電極または対電極に接触しないようにする。これらの接触工程後、電極および対電極を、結合ドメインに結合したＥＣＬ標識物の充分近くに持ってきて、ＥＣＬ反応を開始させる。
ＰＭＡＭＳを有する支持体は、核酸鎖の配列決定に使用してもよい。例えば、複数の結合ドメインを有するＰＭＡＭＳは、異なる結合ドメイン中の結合試薬として、既知のヌクレオチド配列の異なるオリゴヌクレオチドを用いて作成することができる。すなわち、異なる結合ドメインは、異なる既知のヌクレオチド配列の結合試薬を含有する。配列決定されるオリゴヌクレオチドの断片のオリゴヌクレオチド鎖は、次にＰＭＡＭＳ結合ドメインに結合（ハイブリダイズ）させる。配列決定される核酸はＥＣＬ標識される。ＰＭＡＭＳ上で結合測定法を行い、ＰＭＡＭＳ上の別々の結合ドメインからのＥＣＬシグナルの分布を用いて、オリゴヌクレオチド鎖の配列を決定する。
上記方法は、短いオリゴヌクレオチドが、別の核酸分子中のその相補的なまたは実質的に相補的な配列にハイブリダイズする能力に基づく（例えば、ストレゾスカ（Ｓｔｒｅｚｏｓｋａ）ら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０８９−１０９３：バインズ（Ｂａｉｎｓ）、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７５７−５８を参照。これらは参考のため本明細書に引用される）。ハイブリダイゼーションの成功のためには所望の程度の配列相補性の程度が必要であるように、条件が選択される。あらかじめ配列の決定されたプローブへの、配列が未知のＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡ分子中の相補的な配列の存在が検出される。この方法は好ましくは、ハイブリダイゼーション反応が結合ドメインに結合したオリゴヌクレオチドプローブと溶液中の試料ＤＮＡで行われるように行う。
【０１０７】
ＰＭＡＭＳはまた、目的の機能（例えば、結合または触媒）を有する新規分子または複合体を単離、スクリーニング、および／または選択するのに利用できる。ＰＭＡＭＳは、治療のために化合物および／または鉛化合物を単離するのに使用してもよい。本発明の方法を用いて、種々の化学種の組合せにより合成される複数のペプチド、核酸、ウイルスベクター、またはポリマーを含有するＰＭＡＭＳを作成することができる。このような多種類のＰＭＡＭＳ処理した支持体は、例えばＥＣＬ標識細胞受容体への結合の迅速なスクリーニングに利用できる。１つの方法では、鉛結合ペプチド配列を単離するために、多様な関連のないペプチド配列を有する第１のＰＭＡＭＳを用いる。次に第１のＰＭＡＭＳ上の目的の分子（例えば、細胞受容体）に結合性を示すものと関係のある配列のペプチドを有するＰＭＡＭＳを使用する。このプロセスは、目的の結合特性を有するペプチドが見いだされるまで繰り返す。
【０１０８】
目的のアナライトは、例えば試料中に存在する全細胞、細胞内粒子、ウイルス、プリオン、ウイロイド、核酸、タンパク質、抗原、リポ蛋白、リポ多糖、脂質、糖タンパク質、炭水化物残基、セルロース誘導体、抗体またはその断片、ペプチド、ホルモン、薬剤、細胞または細胞成分、有機化合物、非生物学的ポリマー、合成有機分子、有機金属化合物、または無機分子がある。
試料は、例えば固体、エマルジョン、懸濁物、液体または気体から得られてもよい。さらに、試料は、例えば体液または組織、水、食物、血液、血清、血漿、尿、便、組織、唾液、油、有機溶媒または空気から得られてもよい。試料は還元剤または酸化剤を含有してもよい。
以下の物質に特異的な結合試薬を、本発明の結合表面の結合ドメインに導入することにより、本発明により以下の物質を検出または測定するための測定を行ってもよい：アルブミン、アルカリ性ホスファターゼ、ａｌｔ／ＳＧＰＴ、アンモニア、アミラーゼ、ＡＳＴ／ＳＧＯＰ、総ビリルビン、血液尿素窒素、カルシウム、二酸化炭素、塩素、総コレステロール、クレアチニン、ＧＧＴ、グルコース、ＨＤＬコレステロール、鉄、ＬＤＨ、マグネシウム、リン、カリウム、総タンパク質、ナトリウム、トリグリセリド、尿酸、耽溺薬物、ホルモン、心血管系調節物質、腫瘍マーカー、感染症抗原、アレイ誘発性抗原、免疫タンパク質、サイトカイン、貧血／代謝マーカー、カルバマゼピン、ジゴキシン、ゲンタマイシン、リチウム、フェノバルビタール、フェニトイン、プロカインアミド、キニジン、テオフィリン、トブラマイシン、バルプロ酸、バンコマイシン、アンフェタミン、抗うつ剤、バルビタール酸、ベンゾジアゼピン、カナビノイド、コカイン、ＬＳＤ、メタドン、メタクアロン、アヘン、フェニリジン、フロポキシフェン、エタノール、サリチル酸、アセトアミノフェン、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、ｈＣＧ／ｂｈＣＧ、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、プロラクチン、甲状腺ホルモン（例えば、甲状腺刺激ホルモン、Ｔ４、ＴＵＰ、総Ｔ３、遊離Ｔ４、遊離Ｔ３）、コルチゾール、クレアチニンキナーゼ−ＭＢ、総クレアチニンキナーゼ、ＰＴ、ＡＰＴＴ／ＰＴＴ、ＬＤＩＳＯｓ、クレアチニンキナーゼＩＳＯｓ、ミオグロビン、ミオ軽鎖、トロポニン１、トロポニンＴ、クラミジア、淋菌、ヘルペスウイルス、ライム病、エプスタインバーウイルス、ＩｇＥ、風疹−Ｇ、風疹−Ｍ、ＣＭＶ−Ｇ、ＣＭＶ−Ｍ、トキソ−Ｇ、トキソ−Ｍ、ＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎表面抗原）、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、抗−ＨＢｃ、抗−ＨＢｓ、ＨＣＶ、抗−ＨＡＶ  ＩｇＭ、抗−ＨＢｃ  ＩｇＭ、抗−ＨＡＶ、ＨＢｅＡｇ、抗−ＨＢｅＡｇ、ＴＢ、前立腺特異抗原、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＰＡＰ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ｂ２−マイクログロブリン、ヘモグロビン、赤血球、ＨＢｃＡｂ、ＨＴＬＶ、ＡＬＴ、ＳＴＳ−梅毒、ＡＢＯ血液型抗原および他の血液型抗原、サイトメガロウイルス、フェリチン、Ｂ−１２、葉酸、グリコシル化ヘモグロビン、アンフェタミン、抗うつ剤および他の向精神薬。
異なる結合ドメインでのＥＣＬの測定は、順にまたは同時に行われる。
【０１０９】
細胞表面タンパク質である目的のアナライトに特異的なＰＭＡＭＳは、まず細胞を含有する試料に暴露され、ここで試料中の細胞を計測することが好ましい。好適な実施態様において、既知の容量の試料および／または希釈した試料は、少なくとも１つの細胞表面抗原に特異的な複数の結合ドメインを有するＰＭＡＭＳに暴露される。結合した細胞は、次にＥＣＬ標識物に結合した第２の結合基を結合させることにより定量できる。これは、広範囲の型の細胞と相互作用することができる基（例えば、細胞膜に挿入できる疎水性基もしくは細胞表面の糖に対するレクチンに結合したＥＣＬ標識物）である。ＥＣＬ標識物は、細胞表面抗体に対する第２の抗体に結合される。より具体的な実施態様において、同じドメインに結合した数種類の型の細胞が、複数のＥＣＬ標識物で標識した第２抗体を用いることにより区別できる。細胞表面上のあるアナライトに特異的な別々の結合ドメインの数が、試料中に存在する結合性の細胞の平均数より多いことを確認することが好ましい。次に統計的方法を用いて、試料容量当たりの細胞の数を求める。この方法は、例えばウイルスのような他の粒子（ここで、結合試薬はウイルスの抗原を認識する）を計測するのに使用することもできる。ドメインは細胞のサイズに比較して小さくすることができ、こうして各ドメインについてデジタルシグナルが得られ、次にこれを統計的方法を用いてドメインの合計に対して解析することができる。ドメインは細胞の大きさに比較して大きく、従って細胞はドメインに結合することができる。この場合、各ドメインからのシグナルのレベルは、試料の容量当たりの細胞の数を与えるように較正することができる。光検出器のアレイ（例えば、ＣＣＤカメラまたはアバランシュフォトダイオードアレイ）を用いる画像解析により、細胞を計測し、細胞の形態を測定することができる。
本発明は好ましくは、また５〜１５分間で１０００ＥＣＬ反応の速度でＥＣＬ反応を行う方法（例えば、測定法）を与える。
【０１１０】
５．１１．他の分析方法および／またはＥＣＬとともに使用されるＰＭＡＭＳ
ＥＣＬベースの前記方法は、他の測定法とともに使用することができる（例えば、触媒反応や他の化学反応が起きるドメインとして）。本発明の別々の結合ドメインは、他の測定法（例えば、電解質測定のような臨床化学的化学物質測定法、臨床酵素測定、血液タンパク質測定、グルコース、尿およびクレアチニン測定など）で使用することができる。ＥＣＬ測定法と組合せるかまたは本発明のＰＭＡＭＳとともに単独で使用される他の測定法には、化学発光ベースの標識、蛍光ベースの測定法、酵素結合測定系、電気化学測定法（例えば、ヒックマン（Ｈｉｃｋｍａｎ）ら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：６８８−６９１を参照）、および／または共鳴検出（例えば、表面プラズモンおよび音響法）測定系がある。
液滴のアレイの中に複数の異なる化学物質を有する、液滴を有するＰＭＡＳ支持体を使用することができる。各液滴は、異なる結合試薬および／または異なる化学物質を含有してもよい（すなわち、この反応媒体）。例えば、疎水性表面領域に囲まれた親水性表面結合ドメイン上にあり、液滴は親水性でもよい。液滴は、表面を覆う疎水性溶液により保護される。測定される親水性溶液は、疎水性領域に囲まれた親水性結合ドメインを有する第２のＰＭＡＭＳ上に沈積される。２つの表面は決められた近傍に来て、反対の表面の親水性ドメインと接触し、スペクトル解析を行って化学的測定の反応生成物を検出する。
【０１１１】
小繊維マットは、疎水性および／または親水性ドメインに囲まれた複数の不連続な疎水性および／または親水性ドメインがあるように、パターン付けされる。結合試薬を含有する水溶液の液滴が親水性領域上にのって、周りの疎水性領域に閉じこめられる。これらの液滴は、例えば小繊維、小繊維の凝集物、結合試薬、ＥＣＬ試薬、測定試薬、界面活性剤、ＰＥＧ、洗浄剤、例として前述した複数の生物学的分子、および／またはこれらの組合せを含有してもよい。
第１のＰＭＡＭＳを覆う疎水性溶液は、上面の親水性液滴の一部のみが環境に暴露されるように、調節して除去する（例えば、蒸発、はじき）。光学化学反応のために測定される親水性溶液は次に、ＰＭＡＭＳ表面に暴露され、親水性の微小液滴と測定される溶液を混合し、分析（例えば、スペクトル）を行う。
ＰＭＡＭＳ結合ドメインはまた、プレフィルターまたはフィルターとして使用される。例えば細胞特異的なＰＭＡＭＳは、ある場合にはある型の細胞のフィルターとして単独で、およびサイズ排除フィルターとともに使用できる。得られるアナライト溶液は次に、細胞内顆粒物質（例えば、ウイルス）に特異的なＰＭＡＭＳに暴露される。顆粒細胞内ＰＭＡＭＳおよび／またはサイズ排除フィルターを用いて、小分子（例えば、タンパク質、小さな化学的物質）アナライト溶液を形成させる。非特異的なアナライト相互作用を低下させるために、連続的ＰＭＡＭＳ測定系を使用して、アナライト溶液を順に精製する。
支持体、電極および／または結合ドメインに使用される材料の光学的不透明度は、所望の性質を得るように変化させることができる。このような材料は、材料の厚さ、組成および／または光学密度により、半透明、透明もしくは実質的に不透明であってよい。
【０１１２】
小繊維マットの光学不透明度は、マットの厚さが増加すると増加する。非常に薄いマットは実質的に透明である。厚いマットは、実質的に不透明である。ある場合には、０．０１μｍ〜０．５μｍの範囲の厚さのマットは実質的に透明である。他の例では、２０μｍを超える厚さのマットは実質的に不透明である。０．５μｍ〜２０μｍの間の厚さのマットは中間の不透明度を有し、これは小繊維マットの厚さが増加すると増加する。マットの具体的な厚さは、マット中に分散される材料の組成、密度、誘導体化、層の数、型および量、および／またはこれらの組合せに依存する。これはまた、使用される光の波長に依存する。
ある材料がある厚さで実質的に透明であり、別の厚さでは実質的に不透明であるなら、その材料のある深さから放出される光は通過するが、別の（例えば、より深い）深さから放出される光は、材料に実質的に吸収されるかまたは分散される。１つの例では、ある材料は種々の不透明度により、光学フィルターとして使用することが可能である。
【０１１３】
小繊維マットのある深さから放出される光は、実質的にマットを通過し、小繊維マットの近傍または表面に置いた検出器で観察することができる。別の深さから放出される光は、吸収されるかおよび／またはマットにより分散され、マットの近傍または表面に置いた検出器で観察することができない。小繊維マット（および／または、光学的に類似の材料）のこの性質は、ＥＣＬ測定法において結合試薬および非結合試薬を区別するのに使用することができる。
ある試薬は、多孔性材料中で充分な深さまで拡散（能動的または受動的）されるか、はじかれるか、圧力により押されて、これらの試薬からの光の放出はマットにより実質的にまたは完全に吸収されるかまたは拡散される。１つの例では、小繊維マットは、マットの表面またはその近傍で、ある試薬が通過し、ある試薬が捕捉され、および／またはある試薬が非常に薄い層に結合する、物理的および光学的フィルターの両方として作用する。１つまたはそれ以上の結合ドメインに結合した試薬および／または１つまたはそれ以上の結合ドメインに結合した分子種（これらのドメインは、小繊維マットの表面のいずれかに位置するか、またはＰＭＡＭＳ上のマットの表面の近くの層に位置する）は、マット内もしくはマットを介して拡散したり、引っ張られたりするのを妨害される。試薬がマットの表面の非常に薄い層にのみ結合するように、試薬および／または他の溶液は、小繊維マットの表面を流れるか、懸濁されるかおよび／または離れている。試薬は、１つまたはそれ以上の方向に、マットを介して１回またはそれ以上洗浄される。試薬は、小繊維マット、１つまたはそれ以上の結合ドメイン、１つまたはそれ以上の結合ドメインに結合した他のもしくは同じ試薬に結合してもよく、マット内に混入、マットを通過してもよく、またはこれらの組合せでもよい。
【０１１４】
支持体および／または電極に使用される多孔性材料は、上層が結合ドメインを有し、マット内の別の層が結合ドメインを有さない２つ以上の層を有してもよい。ある例では、小繊維マット（図２９に模式図として示す）、上層２９００は充分厚く、この層の下の層２９０１、２９０２から発生する光の通過を妨害する。この上層に結合した光源２９０４、２９０５から発生する光２９０３は、マットの表面またはその近傍に位置する検出器２９０６により検出することができる。下層２９０１、２９０２中の光源２９０７、２９０８、２９０９から発生する光は、いずれかの層またはすべての層により吸収されるかおよび／または拡散され、検出器２９０６、２９１０により検出することができない。
マットを作成する前に、小繊維および／または小繊維凝集物の特定のサイズ、型、派生物を選択するのに、前濾過工程が使用される。小繊維の懸濁物を濾過するのに使用されるフィルター物質は、１つのまたは多くの孔を有する小繊維のマットである。
多孔性材料（例えば、小繊維マット）は、結合ドメインのための支持体、ＥＣＬもしくは他の電気化学的応用に使用される電極、試薬の送達を調節するために使用されるフィルター、および／または種々の程度に光を伝搬、吸収および／または拡散することができる光学フィルターとして作用することができる。
【０１１５】
５．１２．エレクトロクロミックＥＣＬディスプレーパネル
本発明はまた、平面パネルディスプレーに使用される単離された電気化学的ピクセルの製造を提供する。電気的にアドレスされた時に隣接ピクセルに対して限定された作用（すなわち、限定クロストーク）を有するピクセルを作成するために、エレクトロクロミックおよび電気化学発光ベースの平面パネルディスプレーで使用するために、リトグラフ法が提唱されている（米国特許第５，１８９，５４９号を参照）。そのようなクロストークを減少させるためのリトグラフ法の限界は、電解質材料が、露光された時に導電率を変化することができなければならないことである。光誘導性の導電率調節が可能な材料を使用することなく、ピクセル間のクロストークを低下させ、こうして広範囲の異なる溶液、ゲルまたはフィルムの使用を可能にすることが、本発明の特徴である。
ピクセルの活性領域である２つの電極表面は、サンドイッチ型で互いに向かい合っている２つの表面上にある。電極表面は、例えば相補的なエレクトロクロミックな材料でコーティングされる。クロストークを減少させるために、異なる電極対の間に非導電性領域を有する電極表面の間（すなわち、ピクセル要素の間）に、導電性電解性フィルムを置く。コーティングされた電極表面が親水性の場合は、電極の周りの表面の領域は疎水性にされ（例えば、マスクを介する型押しまたは沈積）、親水性導電性液滴を第１の表面上の電極にのせ（例えば、流体アレイにより）、次に第２の表面をロボットで整列させ、第１の表面と接触させ、こうして電極がそろう。こうして電解性液滴は、ピクセルの間に導電性材料を入れることなく１つのピクセル内に拘束される。ピクセルの電極対は、同じ表面上で近接して並ぶ。コーティングされた電極が親水性の場合は、両方の電極を含む領域は、親水性電極の周りで疎水性環を形成するように作成される（例えば、マスクの打ち出し法または沈積法により）。前述の２つの実施態様で記載した液滴は、疎水性溶液を用いて安定化される。溶液の粘度は、液滴アレイの安定性を上げるために上げられる。親水性と疎水性が逆転する。他の実施態様では、電極対の間またはその上のフィルムの安定性および／または導電性（例えば、導電性ポリマー）を上げるために、重合可能な溶液を含有する。さらに、ピクセル間のクロストークを制限するために、構造的特徴を利用する。例えば、電極ピクセル対に限界を規定することができる環形の型押し突起を有する弾性打ち出し（例えば、ポリ（ジメチルシロキサン））を使用して、フィルム間の電解溶液、ゲル、またはピクセルを単離する。あるいは並んだ電極ピクセル対を、上記電極のウェル内に置いたある表面、電解溶液、ゲルまたはフィルム上の電気的絶縁性ウェル様構造中に入れ、全表面を覆うかまたはコーティングして、各ピクセルの電解成分を単離または封じこめる。
【０１１６】
５．１３．他の化学反応に使用されるＰＭＡＭＳ
本発明のＰＭＡＭＳはまた、ＥＣＬと組合せずに化学反応を行うのに使用できる。例えば、前記セクション５．１１に記載した方法および非ＥＣＬ測定法が利用できる。
試料中の目的のアナライトを検出または測定するためにカセットが提供され、該カセットは、（ａ）別々の結合ドメインの少なくとも一部は他の結合ドメインとは異なる結合特異性を有し、複数の別々の結合ドメインのそれぞれは親水性でありそして疎水性領域に囲まれている、少なくとも１つの結合表面を形成するための、その表面上の複数の別々の結合ドメインを有する第２の支持体、および（ｂ）測定表面を形成するためにその上で化学的測定法を行うのに適した反応媒体からなる複数の親水性ドメインを有する第２の支持体（ここで、複数の別々の結合ドメインと複数の反応媒体は、接触させることができ、その結果各結合ドメイン上に存在する分析される試料は反応媒体と接触されて、目的のアナライトが検出または測定される）からなる。あるいは、結合ドメインは疎水性であり、第２の支持体は、反応媒体を含有する複数の疎水性ドメインを有する。
本発明は、試料中の目的のアナライトを検出または測定するための方法を提供し、該方法は、（ａ）検出または測定すべきアナライトを含有する試料の液滴を、支持体表面上の複数の別々の結合ドメインにのせて、この複数の別々の結合ドメインは、他の結合ドメイン内に封じ込められた結合試薬と特異性が互いに同一である結合試薬、かつこれとは異なる結合試薬を含有する少なくとも１つの結合ドメインからなり、各別々の結合ドメインは、疎水性であるかまたは親水性であることを特徴とするが、但し各結合ドメインの周りの支持体表面の領域は、試料中の１つまたはそれ以上の目的のアナライトが結合ドメインに結合できるようにするために、（ｉ）結合ドメインが親水性なら疎水性であり、そして（ｉｉ）結合ドメインが疎水性なら親水性であり、そして
（ｂ）第１の支持体上の液滴を、化学的測定法を行うのに適した反応媒体からなる複数の別々の親水性ドメインをその上に有する第２の支持体の表面に接触させ、そして
（ｃ）結合ドメインに結合した目的のアナライトの存在を測定する、ことからなる。
【０１１７】
また試料中の目的のアナライトを検出または測定するための方法が提供され、この方法は、（ａ）検出または測定すべきアナライトを含有する試料の液滴を、支持体表面上の複数の別々の結合ドメインにのせて、この複数の別々の結合ドメインは、他の結合ドメイン内に封じ込められた結合試薬と特異性が互いに同一である結合試薬、かつこれとは異なる結合試薬を含有する少なくとも１つの結合ドメインからなり、各別々の結合ドメインは、疎水性であるかまたは親水性であることを特徴とするが、但し各結合ドメインの周りの支持体表面の領域は、試料中の１つまたはそれ以上の目的のアナライトが結合ドメインに結合できるようにするために、（ｉ）結合ドメインが親水性なら疎水性であり、そして（ｉｉ）結合ドメインが疎水性なら親水性であり、そして
（ｂ）試料の液滴上に反応媒体の液滴をのせ、そして
（ｃ）結合ドメインに結合した目的のアナライトの存在を測定する、ことからなる。
【０１１８】
本発明のこの面の１つの具体例においてそれぞれが、基質として化学反応の順に中間体を使用する異なる酵素を取り込んで有する結合ドメインは、ＰＭＡＭＳ表面上に位置し、そのため、次の酵素の基質となるある酵素反応の生成物は、反応経路中の次に酵素の方に流れる。本発明はまた、前記方法を用いて、自己組立単層上の酵素の大量固定化（例えば、工業的応用のために）を提供する。
例えば、片面または両面に酵素が固定化されたシートは、溶液容量に対する高表面積比を達成するために重ねられる。あるいは、そのような固定化酵素は、多孔性材料に結合される。さらに、そのような固定化酵素は、ディプスティック、化学反応物質、試験管または毛細管の壁面、またはインキュベーターチャンバーのような容器の壁面上でもよい。
【０１１９】
本発明の別の面において、前述したような非ＥＣＬ測定法がＰＭＡＭＳ類似体上で行われ、ＰＭＡＭＳ類似体は、非ＥＣＬ反応を行うための別々のドメインを含有し、別々のドメインは必ずしも結合試薬を取り込んでおらず、従って必ずしも結合ドメインではないという点で、該ＰＭＡＭＳ類似体は前記ＰＭＡＭＳとは異なる。このようなＰＭＡＭＳ類似体は、反応を行うための別々のドメインを有し、別々のドメインに適用される液体の分散および／または拡散を阻害するように作成される。ある実施態様において、反応媒体および／または試料を別々のドメインに封じこめるのを助けるために、ドメインは支持体表面上の周りの領域に対して疎水性または親水性である。分散または拡散を阻害するために、ウェルの使用、フェルトもしくは多孔性材料上の反応媒体または試料の沈積、ゲル、フィルムなどの上の反応媒体または試料の沈積または乾燥が行われる。このような各別々のドメインの直径または幅は１ｍｍ未満、好ましくは５０ｎｍ〜１ｍｍの範囲であり、最も好ましくは１ミクロン〜１ｍｍの範囲である。同じであるかまたは異なる反応媒体は、各別々のドメインに沈積されてから試料が適用されるか、または反応媒体の沈積の前に試料の適用が行われる。
【０１２０】
非ＥＣＬ測定法を行うためのＰＭＡＭＳ類似体の使用の好適な面において、複数の別々のドメイン上に反応媒体の液滴をのせ、好ましくは微量液体ガイドのアレイから同時に送達され、次に随時、安定性を向上させるかおよび／または液滴を保護するために、より粘性の高い溶液（例えば、油）を反応媒体の上にのせるか、あるいは別々のドメインの間にのせ、次に、各別々のドメインに別々に適用するか、または大量に、ドメインを含有するＰＭＡＭＳ類似体の全表面を液体試料に暴露することにより、検出または測定されるアナライトを含有する試料を各ドメインに適用する。結合ドメイン中で生じる反応を進行させ、当該分野で公知のものから選択されるレポーターおよび検出系を用いて、結果を観察する。
以下の例により本発明をさらに説明するが、これらは決して本発明の範囲を限定するものではない。
【０１２１】
６．例
６．１．微量型押しによるＭＡＢ  ＰＭＡＭＳ表面の作成
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４（ポリ（ジメチルシロキサン）；ダウコーニグ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）から入手できる）と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液（１〜１０ｍＭ）中の親水性ＯＨが末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＨに暴露して「墨入れ」を行い、整列した金表面にロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に基板を、疎水性ＣＨ３が末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ２）１０−ＣＨ３（エタノール中１〜１０ｍＭ）の溶液で数秒間（例えば、２〜１０秒間）洗浄する（クマール（Ｋｕｍａｒ）ら、前述、およびプライム（Ｐｒｉｍｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１１６４−７）。得られる表面を次に、窒素流中で静かに乾燥させる。親水性溶液を含有する毛細管アレイを次に、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させ毛細管をＳＨ（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＨドメインで整列させる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、アミド結合を介して親水性ドメイン上の反応性ＯＨ基に共有結合することができるモノクローナル抗体（ＭＡＢ）を含有する。
【０１２２】
６．２．微量型押しによるＭＡＢおよび核酸ＰＭＡＭＳ表面の作成
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液（１〜１０ｍＭ）中の親水性ＯＨが末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＨに暴露して「墨入れ」を行い、整列した金表面にロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に基板を、疎水性ＣＨ３が末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ２）１０−ＣＨ３（エタノール中１〜１０ｍＭ）の溶液で数秒間（例えば、２〜１０秒間）洗浄する（クマール（Ｋｕｍａｒ）ら、前述、およびプライム（Ｐｒｉｍｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１１６４−７）。得られる表面を次に、窒素流中で静かに乾燥させる。親水性溶液を含有する毛細管アレイを次に、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させ毛細管をＳＨ（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＨドメインで整列させる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、アミド結合を介して親水性ドメイン上の反応性ＯＨ基に共有結合することができる抗体または修飾核酸を含有する。
【０１２３】
６．３．エッチングによるＰＭＡＭＳ表面の作成
きれいな金表面を、エタノール性溶液（１〜１０ｍＭ）中の親水性ＯＨが末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＨに暴露させる（プライム（Ｐｒｉｍｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１１６４−７）。先が細くとがった器具を線状に並べたものを、並べた金表面とロボットで光学レジスター接触させ、線状アレイを使用して、表面のＸ方向とＹ方向にエッチングして、ＳＨ（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＨドメインの二次元の格子アレイを作成する。次に基板を、疎水性ＳＨ（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＣＨ３（エタノール中１〜１０ｍＭ）の溶液で数秒間（例えば、２〜１０秒間）洗浄する。得られる表面を次に、窒素流中で静かに乾燥させる。親水性溶液を含有する毛細管アレイを次に、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させ毛細管をＳＨ（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＨドメインで整列させる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、親水性ドメイン上の反応性ＯＨ基に共有結合することができる抗体または核酸を含有する。
【０１２４】
６．４．ＰＭＡＭＳ表面上でのサンドイッチ測定法
パターン付けされた多重特異的アレイの一次抗体を表面に結合して含有する実質的に透明の、透明ＰＭＡＭＳ表面を前述のように作成する。支持体、電極アッセイ、モノログ（ｍｏｎｏｌｏｇｕｅｓ）表面の使用が透明であるとして選択される。次にＰＭＡＭＳ表面を、測定すべき目的のアナライトを含有することが疑われる溶液試料に暴露する。次に試料を洗浄して、抗体の結合したアナライトを表面に残す。次にＰＭＡＭＳ表面を、表面に結合したアナライトに特異的な第２ＥＣＬ標識抗体を含有する溶液に暴露する。次にこの溶液をＰＭＡＭＳ表面から洗浄して、アナライトが存在するドメインに結合したＥＣＬ標識第２抗体を残す。
汚染作用を避けるために、試料と電極表面との早すぎる接触を防ぐため、取り外し可能なバリアーにより電極アッセイを保護する。次にこのバリアーをはずして、測定緩衝液で濡れた電極アレイを、ＰＭＡＭＳ表面と並べて接触させる。電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極／対電極対に電位をかける。次に放出される光をＣＣＤで読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
【０１２５】
６．５．第１および第２ＰＭＡＭＳ表面上での測定
パターン付けされた多重特異的アレイの第１抗体を表面に結合して含有する、透明ＰＭＡＭＳ表面を前述のように作成する。次にＰＭＡＭＳ表面を、測定すべき目的のアナライトを含有することが疑われる溶液試料に暴露する。次に試料を洗浄して、抗体の結合したアナライトを表面に残す。
ＥＣＬ標識物で標識した複数の第２抗体のパターン付けされた微小液滴が上にある、疎水性／親水性パターンが交互に存在する、保護カバーの下の第２のＰＭＡＭＳが提供される。
第１のＰＭＡＭＳと位置の合っている第２のＰＭＡＭＳを保護するバリアーを取り外し、微小液滴を、第１抗体の位置に合わせる。第２ＰＭＡＭＳを取り外し、電極アレイを第１のＰＭＡＭＳ表面と整列させて接触させる。電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極／対電極対に電位をかける。次に放出される光を光電子増倍管で読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
【０１２６】
６．６．ＰＭＡＭＳ表面での核酸測定
パターン付けされた多重特異的アレイの１本鎖核酸プローブを表面に結合して含有する、透明ＰＭＡＭＳ表面を前述のように作成する。プローブは、目的の核酸アナライトの５’領域に相補的である。次にＰＭＡＭＳ表面を、測定すべき目的のハイブリダイズ可能な核酸アナライトを含有することが疑われる溶液試料に暴露する（試料は、あらかじめ変性させておく、すなわち、目的のアナライトを１本鎖にしておく）。次に試料を洗浄して、ハイブリダイズしたアナライトを表面に残す。次にＰＭＡＭＳ表面を、表面に結合した核酸アナライトの３’末端に特異的な第２ＥＣＬ標識核酸プローブを含有する溶液に暴露する。次にこの溶液をＰＭＡＭＳ表面から洗浄して、アナライトが存在するドメインに結合したＥＣＬ標識核酸プローブを表面に残す。
第１のＰＭＡＭＳと位置の合っている第２のＰＭＡＭＳを保護するバリアーを取り外し、微小液滴を、第１のＰＭＡＭＳ上の第１抗体結合ドメインの位置に合わせる。第２ＰＭＡＭＳを取り外し、電極アレイを第１のＰＭＡＭＳ表面と整列させて接触させる。
電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極／対電極対に電位をかける。次に放出される光をＣＣＤで読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
【０１２７】
６．７．光電増幅検出器を用いるＰＭＡＭＳ表面での競合的測定
目的のアナライトに特異的な、パターン付けされた多重特異的アレイの一次抗体を表面に結合して含有する、透明ＰＭＡＭＳ表面を前述のように作成する。次にＰＭＡＭＳ表面を、目的のアナライトを含有することが疑われる試料と、抗体への結合に関して目的のアナライトと競合する既知のＥＣＬ標識分子を含有する試料の混合物である溶液試料に暴露する。試料を洗浄して、抗体の結合したアナライトおよび／または標識した競合的結合物を表面に結合して残す。
汚染作用を避けるために、試料と電極表面との接触を防ぐため、取り外し可能なバリアーにより電極アレイを保護する。次にこのバリアーをはずして、測定緩衝液で濡れた電極アレイを、ＰＭＡＭＳ表面と並べて接触させる。電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極／対電極対に電位をかける。次に放出される光を光電増幅管で読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
【０１２８】
６．８．ＣＣＤ検出器を用いるＰＭＡＭＳ表面での競合的測定
パターン付けされた多重特異的アレイの第１抗体を表面に結合して含有する、透明ＰＭＡＭＳ表面を前述のように作成する。次にＰＭＡＭＳ表面を、測定すべき目的のアナライトを含有することが疑われる溶液試料に暴露する。次に試料を洗浄して、抗体の結合したアナライトを表面に残す。
目的のアナライトと競合する複数の既知のＥＣＬ標識分子のパターン付けされた微小液滴が上にある、疎水性／親水性パターンが交互に存在する、保護カバーの下の第２のＰＭＡＭＳが提供される。
第１のＰＭＡＭＳと位置の合っている第２のＰＭＡＭＳを保護するバリアーを取り外し、微小液滴を、第１のＰＭＡＭＳ上の第１抗体結合ドメインの位置に合わせる。第２ＰＭＡＭＳを取り外し、電極アレイをＰＭＡＭＳ表面と整列させて接触させる。電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極／対電極対に電位をかける。次に放出される光をＣＣＤで読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
【０１２９】
６．９．ＳＨ（ＣＨ２）１０−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＣＨ３アルカンチオールを用いる微量微小型押しによるＭＡＢ  ＰＭＡＭＳ表面の作成
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４（ポリ（ジメチルシロキサン）；ダウコーニグ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）から入手できる）と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液（１〜１０ｍＭ）中の親水性ＯＨが末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ２）１１ＯＨに暴露して「墨入れ」を行い、整列した金表面にロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に基板を、疎水性ＣＨ３が末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ２）１０ＣＨ３（エタノール中１〜１０ｍＭ）の溶液で数秒間（例えば、２〜１０秒間）洗浄する（クマール（Ｋｕｍａｒ）ら、前述）。次に得られる表面を、窒素流中で静かに乾燥させる。次に親水性溶液を含有する毛細管アレイを、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させ毛細管をＳＨ（ＣＨ２）１１ＯＨドメインで整列させて、特異的抗体を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、親水性ドメイン上の反応性ＯＨ基に共有結合することができるモノクローナル抗体（ＭＡＢ）を含有する。
【０１３０】
６．１０．ＳＨ（ＣＨ２）１０ＣＨ３アルカンチオールを用いる微量微小型押しによるＭＡＢと核酸ＰＭＡＭＳ表面の作成
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液（１〜１０ｍＭ）中の親水性ＯＨが末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ２）１１ＯＨに暴露して「墨入れ」を行い、整列した金表面にロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に基板を、疎水性ＣＨ３が末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ２）１０ＣＨ３（エタノール中１〜１０ｍＭ）の溶液で数秒間（例えば、２〜１０秒間）洗浄する（クマール（Ｋｕｍａｒ）ら、前述）。次に得られる表面を、窒素流中で静かに乾燥させる。次に親水性溶液を含有する毛細管アレイを、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させ毛細管をＳＨ（ＣＨ２）１１ＯＨドメインで整列させて、特異的抗体を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、アミド結合を介して親水性ドメイン上の反応性ＯＨ基に共有結合することができるモノクローナル抗体または修飾核酸を含有する。
【０１３１】
６．１１．ストレプトアビジン−ビオチンリンカーを用いるＰＭＡＭＳ表面の作成
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、メルカプトウンデカノールと１２−メルカプト（８−ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル）ドデカンアミドの混合物（ここで、ビオチン化チオールのモル分率は０．１である）に暴露して「墨入れ」を行う（スピンケ（Ｓｐｉｎｋｅ）ら、１９９３、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）９：１８２１−５およびスピンケ（Ｓｐｉｎｋｅ）ら、１９９３、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．９９（９）：７０１２−９を参照）。次に基板を、疎水性ＣＨ３が末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ２）１０ＣＨ３アルカンチオール（エタノール中１〜１０ｍＭ）の溶液で数秒間（例えば、２〜１０秒間）洗浄する（クマール（Ｋｕｍａｒ）ら、前述）。次に得られる表面を、窒素流中で静かに乾燥させる。次に各毛細管中にストレプトアビジンの溶液を含有する毛細管アレイを、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させる。毛細管アレイ中の各毛細管を整列させて、ビオチン化ドメインと接触させ、毛細管アレイを除去し、表面を洗浄する。次に複数のビオチン化抗体とビオチン化核酸溶液を含有する第２の毛細管アレイを、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させて、各ドメイン上に特異的抗体と核酸を入れる。
【０１３２】
６．１２．ＭＡＢ単一表面の作成
ケイ素表面上の金の上の交互にあわさった作用電極／対電極対の電極アレイを、当該分野で公知の方法により作成する（例えば、クマール（Ｋｕｍａｒ）ら、前述、を参照）。この例では、電極アレイと別々の結合ドメインアレイは、支持体の同じ表面に存在する。厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、作用電極のパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４（ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）；ダウコーニグ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）から入手できる）と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液（１〜１０ｍＭ）中の親水性ＯＨが末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＨに暴露して「墨入れ」を行い、電極アレイ表面上の整列した作用電極にロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に親水性溶液を含有する毛細管アレイを、電極アレイ表面上のＳＨ（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＨドメインを有する毛細管を整列させて、ロボットでピンレジスター接触させて、特異的抗体を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、アミド結合を介して親水性ドメイン上の反応性ＯＨ基に共有結合することができるモノクローナル抗体を含有する。
【０１３３】
６．１３．ＭＡＢ単一表面で行われる測定
６．１２に記載の支持体（前述）を作成する。それぞれが作用電極／対電極の範囲を限定する環としてパターン付けしたフォトレジストマスターから、前述のようにＰＤＭＳ型押しを作成する。電極アレイ表面を、分析される試料に暴露し、ＥＣＬ標識第２抗体の混合物で洗浄し、次にトリプロピルアミンを含有する測定緩衝液溶液で洗浄する。次にＰＤＭＳ型押しを整列させ、レジスター接触させてＰＤＭＳ型押しの管を整列させ、各電極対の上の測定緩衝液の各容量成分を限定および規定する。電極対に過電位をかけて、表面から単層を放出させて、作用電極をＥＣＬ標識第２抗体に暴露する。次に透明ＰＤＭＳから放出される光を光電増幅管で読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
【０１３４】
６．１４．作用電極および対電極を有する単一表面の作成
ケイ素支持体上の金の上の交互にあわさった電極の間の、結合ドメインを有する交互にあわさった作用および対金電極対の電極アレイを、当該分野で公知の方法により作成する（例えば、クマール（Ｋｕｍａｒ）ら、前述、を参照）。この例では、電極アレイと別々の結合ドメインアレイは、支持体の同じ表面に存在する。厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、交互にあわさった電極対の間の結合ドメインのパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４（ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）；ダウコーニグ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）から入手できる）と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液（１〜１０ｍＭ）中の親水性ＯＨが末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＨに暴露して「墨入れ」を行い、電極アレイ表面上の整列した金結合ドメインにロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に親水性溶液を含有する毛細管アレイを、電極アレイ表面上のＳＨ（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＨドメインを有する毛細管を整列させて、ロボットでピンレジスター接触させて、特異的抗体を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、アミド結合を介して親水性ドメイン上の反応性ＯＨ基に共有結合することができる抗体を含有する。
【０１３５】
６．１５．作用電極および対電極を有する単一表面上で行われる測定法
前記６．１４に記載の支持体表面を記載した方法（前述）により作成する。作成された表面を、分析される試料に暴露し、ＥＣＬ標識第２抗体の混合物で洗浄し、次にトリプロピルアミンを含有する測定緩衝液で洗浄する。電極アレイを、電位波形発生器に接続し、作用電極／対電極対に電位をかける。次に放出される光を光電子増倍管で読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
【０１３６】
６．１６．対電極を有する表面の作成
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液（１〜１０ｍＭ）中の親水性ＯＨが末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＨに暴露して「墨入れ」を行い、金表面上の整列したパターン付け対電極と角結合ドメインにロボットでピンレジスター接触させ、除去する。パターン付けした金表面は、結合ドメインを限定するアドレスが可能な環対電極から構成される。各単層結合ドメインについて、各金対電極と各金表面の間に間隙すなわち分離スペースが存在する。次に結合試薬溶液を含有する毛細管アレイを、ＳＨ（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＨドメインを有する毛細管を示す表面を、ロボットでピンレジスター接触させて、特異的抗体または核酸を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、親水性ドメイン上の反応性ＯＨ基に共有結合することができる抗体または核酸を含有する。
【０１３７】
６．１７．異なる表面に作用電極および対電極を有する単一の表面上で行われる測定
例６．１６に記載した支持体表面を分析すべき試料溶液に暴露させる。次に支持体表面を洗浄し、異なる特異性を有する複数のＥＣＬ標識ＭＡＢまたはＥＣＬ標識核酸を含有する溶液に暴露し、次にトリプロピルアミンを含有する測定緩衝液で洗浄する。セクション６．１６に記載のように支持体上の別々の結合ドメイン／対電極領域に対応するアレイ中に各作用電極を有する透明なアドレスが可能な作用電極アレイを作成する。２つの支持体を測定緩衝液で濡らし、ロボットでレジスターで整列したコンフォーマル接触を行う。電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極／対電極対に電位をかけ、２つの支持体の間に電界を発生させる。次に透明の作用電極から放出される光をＣＣＤで読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
【０１３８】
６．１８．真空濾過によるＣＣ（分散）小繊維マットの作成
０．１％ｗ／ｗ  ＣＣ小繊維／脱イオン水を混合して、１ｍｇ／ｍｌ溶液を有するＣＣ小繊維の水性スラリーを作成した。スラリー中に４００ワットの音波ホーンを１０分〜１時間沈めて、ＣＣ小繊維をスラリーに分散させた（大きなミクロンサイズの凝集物は、小さな凝集物または個別の線維に分散される）。分散の程度は、光学顕微鏡で追跡した。
ナイロンのフィルター膜（孔径０．４７μｍ、直径２５ｍｍ）を、直径２５ｍｍのガラス濾過器に入れた。分散した小繊維スラリーを、吸引濾過により膜／フィルター装置を通して濾過した（図２３Ａ）。スラリーのアリコート（５ｍｌ）を２０ｍｌの脱イオン水で希釈し、次に膜／フィルター装置で濾過する。約０．２５〜０．３ｇ／ｃｃの平均的なマットについて、約１００μｍのマットは６つのアリコートが必要であった。
分散物のすべての水がマットから除去されるまで吸引濾過を続けた（肉眼で判定）。フィルター膜から直接マットを（手で）はがした。
オーブン中で６０℃で１０〜１５分間マットを乾燥した。使用のためにマットを切断し、穴をあけたか、または切片にした。
【０１３９】
６．１９．蒸発による金属メッシュ支持体上の小繊維マットの作成
０．１％ｗ／ｗ  ＣＣ小繊維／脱イオン水を混合して、１ｍｇ小繊維／ｍｌ溶液を有するＣＣ小繊維の水性スラリーを調製した。スラリー中に４００ワットの音波ホーンを１０分〜１時間沈めて、ＣＣ小繊維をスラリーに分散させた（大きなミクロンサイズの凝集物は、小さな凝集物または個別の線維に分散される）。分散の程度は、光学顕微鏡で追跡した。
ステンレスメッシュの１ｃｍ２切片（４００カウント）を、直径２５ｍｍの紙フィルターに入れる。スラリーの５ｍｌのアリコートを、スクローン／フィルター紙組合せ物の表面にピペットでのせた。スラリー中の水を室温と圧力、または加熱オーブン中で蒸発させた。
小繊維マットが乾燥したら、アリコートをさらに加えた。濾紙から１つのユニットとして小繊維とスクリーンをはがした。
使用のためにマットを切断し、穴をあけたか、または切片にした。
【０１４０】
６．２０．ＮＨＳ−エステル官能基を有する小繊維上のアビジンの固定化
ＣＯＯＨで誘導体化した小繊維（ハイペリオンキャタリスト社（Ｈｙｐｅｒｉｏｎ  Ｃａｔａｌｙｓｔｓ  Ｉｎｃ．）から提供された）を、絶えず攪拌しながらジオキサン水溶液に〜１０ｍｇ／ｍｌで懸濁した。２０倍モル過剰のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを加え、溶解させた。次に、２０倍モル過剰のエチル−ジアミノ−プロピル−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。
攪拌後、上清を吸引し、固体を無水ジオキサンで３回、無水メタノールで１回洗浄し、０．４５μｍのポリスルホン膜で濾過した。濾過物をさらにメタノールで洗浄し、ガラスバイアル中に入れて、重量の減少が観察されなくなるまで真空で引いた。
１０．４ｍｇのＮＨＳ−エステル小繊維をＰＢＳ−１（約７０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭＮａＣｌ）（オリゲン（ＯＲＩＧＥＮ）試薬４０２−１３０−０１、ｐＨ７．８、イゲン社（ＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．））で洗浄した。洗浄した小繊維を２．３ｍｌのアビジン溶液に懸濁した（８．３ｍｇアビジン／ｍｌＰＢＳ−１）。
フラスコを絶えず回転させて懸濁物を室温で１．５時間置いた。
１．５時間後、懸濁物を４℃で１６時間保存し、次に室温に戻し、ＰＢＳ−１で洗浄し、ＰＢＳ−１中で４℃で懸濁物として保存した。
【０１４１】
６．２１．炭素小繊維上のモノクローナル（抗ＡＦＰ）の固定化
炭素小繊維をＮＨＳ−エステルで官能基化して、例６．２０に記載のように作成した。
１４ｍｇの小繊維−ＮＨＳ−エステルを５００ｍｌのＰＢＳ−１緩衝液と混合した。混合物が粘性のスラリーになるまで、２０分間音波処理した。さらに５００ｍｌのＰＢＳ−１緩衝液を加えた。
８０ｍｌのＰＢＳ−１中全部で１．６ｍｇの抗ＡＦＰ（アルファフェトプロテイン）抗体を、上記スラリーに加えた。室温で２．５時間反応させた。
６ｍｌのＰＢＳ−１緩衝液を加え、反応混合物を４℃で５分間遠心分離した。この操作を９回繰り返した。
最後の洗浄後、上清を除去し、小繊維−抗ＡＦＰ生成物を４℃で保存した。
６．２２．小繊維マットのサイクリックボルタングラム：小繊維マットと金箔電極との比較
０．５Ｍ  Ｋ２ＳＯ４中の６ｍＭ  Ｆｅ３＋／２＋（ＣＮ）６のサイクリックボルタングラムを測定した。図３０Ａにおいて、ＣＣ（分散した）の未処理の小繊維マットのＣＶは、１０，２５および５０ｍＶ／秒での測定値は０．１０ｍＡ／ｃｍであった。例６．１８に記載のようにマットを作成した。図３０Ｂにおいて、金箔電極について測定したＣＶは、１０，２５および５０ｍＶ／秒で０．０５ｍＡ／ｃｍであった。すべての電位は、Ａｇ／ＡｇＣｌに対する電位である。
【０１４２】
６．２３．小繊維マット電極の電気化学的性質：陽極ピーク電流とマットの厚さの比較
同じ面積（０．２０ｃｍ２）であるが異なる厚さの小繊維マットについて、０．５Ｍ  Ｋ２ＳＯ４中の６ｍＭ  Ｆｅ３＋／２＋（ＣＮ）６のサイクリックボルタングラムを測定した。陽極ピーク電流（図３１）は、２４μｍ〜４２５μｍの範囲内でマットの厚さの増加とともに増加した。各厚さについての陽極ピーク電流もまた、走査速度の増加とともに増加した（１０ｍＶ／秒〜１５０ｍＶ／秒の範囲）。厚さの関数としての陽極ピーク電流の増加速度もまた、厚さとともに増加した。厚さ２４μｍの小繊維マットは、金箔電極と同等の挙動を示した。
６．２４．小繊維へのタンパク質の非特異結合
炭素小繊維（ＣＣ）へのタンパク質の非特異結合を以下のように測定した：（ｉ）Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３２＋（「ＴＡＧ１」）標識タンパク質の溶液を、平衡に達するまで既知量の炭素小繊維に暴露した；（ｉｉ）標識タンパク質／小繊維溶液を遠心分離し、上清を採取し、そして（ｉｉｉ）上清中に残存している標識タンパク質の量を電気化学発光（ＥＣＬ）を用いて測定した。
図３２に示す曲線を作成するために、３μｇ／ｍｌの誘導体化ＴＡＧ１に結合した抗ＣＥＡ抗体（誘導体化ＴＡＧ１  ＥＣＬ標識物に結合した癌胎児性抗原に対する抗体）を、０．１Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ７）中の連続希釈ＣＣ（未処理）小繊維に加えた。２０分間ボルテックス混合した後、遠心分離により小繊維を除去した。上清中に残存するタンパク質（非結合）の量を測定するＥＣＬ測定は、オリゲン（ＯＲＩＧＥＮ）測定緩衝液で５倍希釈した反応混合物上清のアリコートについてオリゲン（ＯＲＩＧＥＮ）アナライザーで行った。高濃度の炭素小繊維が存在する時に、（小繊維に暴露しなかった反応混合物の物体についてのＥＣＬシグナルに対する）ＥＣＬシグナルの低下は、誘導体ＴＡＧ１で標識したタンパク質の結合の増加により得られた。
【０１４３】
６．２５．洗浄剤／界面活性剤による小繊維へのタンパク質の非特異結合の減少
例６．２．４に記載の方法を使用して、小繊維へのタンパク質結合に及ぼす界面活性剤の影響を調べた。誘導体化ＴＡＧ１／小繊維混合物に結合した抗ＣＥＡにトリトンＸ−１００を加え、溶液を２０分間インキュベートし、管を遠心分離し、オリゲン（ＯＲＩＧＥＮ）測定緩衝液で５倍希釈した上清のアリコートをＥＣＬで分析した。結果を下記表と図３３に示す。
チューフ゛No.      [T-X100]    ヒ゜ーク強度        Prot-TAG1            [GF]
ｐｐｍ                         μｇ／ｍｌ          ｐｐｍ
１９            １６７４        １６１１          ２．６５            ５２
１８              ８３７        １６３４          ２．６５            ５２
１７              ４１８        １６９７          ２．６５            ５２
１６              ２０９        １５８３          ２．６５            ５２
１５              １０５        １７７２          ２．６５            ５２
１４                ５２        １４６３          ２．６５            ５２
１３                ２６          ６２７          ２．６５            ５２
１２                １３            ２３          ２．６５            ５２
トリトンＸ−１００対誘導体化したＴＡＧ１で標識したタンパク質溶液のＥＣＬ強度をプロットして得られた曲線を図３３に示す。大きい電気化学的シグナルは、上清中の誘導体化−ＴＡＧ１−標識タンパク質が多いことに対応し、小繊維に結合した誘導体化−ＴＡＧ１−標識タンパク質が少ないことを示す。１０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍまでの濃度のトリトンＸ−１００は、結合の程度を減少させ、
【０１４４】
６．２６．小繊維マット電極による溶液中の遊離ＴＡＧのＥＣＬ
例６．１８のように作成した小繊維マットを、図３４に示す「小繊維セル」固定具の作用電極ホルダー３４０１の取り付け部３４０３に取り付けた。ホルダー３４０１を、電気化学的セル区画３４００の底にはめた。３Ｍ  Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極（サイプラス（Ｃｙｐｒｕｓ）＃ＥＥ００８）を、参照セルホール３４０２を介して電気化学的セル区画に取り付けた。セルに測定緩衝液（イゲン（ＩＧＥＮ）＃４０２−００５−０１、ロット番号＃５２９８）を充填し、ＰＭＴホルダー３４０４に取り付けた。イージーアンドジー（ＥＧ＆Ｇ）、パークモデル１７５ユニバーサルプログラマーとイージーアンドジー（ＥＧ＆Ｇ）、モデル１７５ポテンショスタット／ガルバノスタットを使用して、１００ｍＶ／秒で電位を０Ｖ〜＋３Ｖで掃引した。パシフィックインストルメンツ（Ｐａｃｉｆｉｃ  ＩＮｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）モデル１２６光度計により９００Ｖの電位をかけたハママツ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）Ｒ５６００Ｕ−０１により測定した。ＨＥＭスナップマスター（ＨＥＭ  Ｓｎａｐ−Ｍａｓｔｅｒ）により駆動したＣＩＯ−ＤＡＳ−１６０１Ａ／Ｄボードにより、アナログデータをデジタル化した。小繊維セルの水分を切り、瞬間的に１０００ｐＭのＴＡＧ１（イゲン（ＩＧＥＮ）＃４０２−００４−Ｃ，ロット＃４２９７）で洗浄し、１０００ｐＭのＴＡＧ１を充填した。測定緩衝液のように電位を掃引した。図３５は、測定緩衝液３５０１と１０００ｐＭＴＡＧ１  ３５０２についてのＥＣＬトレース（２４．０±０．２Ｃで測定した）を示す。暗補正ＥＣＬピーク面積は、測定緩衝液については２２．１０ｎＡで、１０００ｐＭ  ＴＡＧ１については４６．４０ｎＡであった。
【０１４５】
６．２７．小繊維マット電極による加えた標識抗体のＥＣＬ
例６．２８に記載の方法で未処理のｃｃ−分散小繊維から０．００３５インチの厚さの小繊維マットを作成した。次に乾燥したマットを３ｍｍのディスクにパンチし、支持体の上にのせた。この実験で使用した支持体は、スクリーン印刷した導電性金インクによりパターン付けした０．０３０インチのポリエステルシートから作成した。この導電性金インクは対電極、参照電極を形成し、作用電極および他の電極の導線を提供した。炭素含有導電性両面テープ（アドヒーシブズリサーチ（Ａｄｈｅｓｅｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を使用して、各パターン付け支持体に２つのマットディスクを取り付けた。取り付け後、誘導体化ＴＡＧ１に結合した脱イオン水中１０μｇ／ｍｌの抗ＴＳＨ抗体水溶液（Ｒｕ−ＴＨＳモノ１：２  ２６ＪＵＮ９５、イゲン（ＩＧＥＮ））０．５μｌ、または脱イオン水中１０μｇ／ｍｌのＴＡＧ１誘導体化しない抗ＴＳＨ捕捉抗体抗体水溶液を（ＴＨＳポリ２６ＪＵＮ９５、イゲン（ＩＧＥＮ））ディスクにスポットし、乾燥させた。乾燥後、マットをイゲン（ＩＧＥＮ）測定緩衝液に浸した。支持体上の浸したマットを、イゲン（ＩＧＥＮ）オリゲン（ＯＲＩＧＥＮ）１．５ベースの装置に入れ、０〜４５００ｍＶまで５００ｍＶ／秒の走査速度を用いて、ＥＣＬを読んだ。図４３は、マット４３０１を含有するＴＡＧ１−抗体からと、マット４３０２を含有するＴＡＧ１化していない捕捉抗体からのピークＥＣＬシグナルを比較する。
６．２８．サンドイッチ測定法のための小繊維マット電極を用いるＥＣＬ
前述のように抗ＡＦＰ捕捉抗体をフィルター上に固定化した。抗ＡＦＰ小繊維を脱イオン水（ｄＩ）で洗浄し、１ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。例６．１８に記載のように真空濾過を使用して４層の小繊維マットを作成した。未処理ＣＣ分散小繊維３ｍｇに２ｍｇの抗ＡＦＰ小繊維を加え、混合物をｄＩ中で総量２０ｍｌに希釈した。希釈した混合物を０．４５μｍナイロンフィルターで濾過した。次にこの最初のマット層の後に、それぞれ５ｍｇの未処理ＣＣ分散小繊維で構成される２つのコア層が続く。次にマットのコアに、最初の層と同じ混合フィルター層をのせた。こうして、上部と下部に〜４０％抗ＡＦＰ小繊維と、コア内に〜１００％未処理小繊維のマットが得られた。この混合マットを真空下で空気乾燥し、３ｍｍのディスクにパンチした。次にこれらのディスクを、例６．２７に記載のように支持体にのせた。乾燥し支持体にのせた抗ＡＦＰマットを、ＡＦＰカリブレーターＡ、Ｃ、およびＦ（イゲン社（ＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．））に浸し、実験台で室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、支持した電極をｄＩ流で１０秒間洗浄し、次にけばのないワイプでブロットして乾燥した。次に小繊維マットを、誘導体化ＴＡＧ１イゲン社（ＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．））で標識した抗体に血液グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ抗ＡＦＰに浸し、実験台で室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、支持した電極をｄＩ流で洗浄し、ワイプで乾燥した。次に、小繊維マットをイゲン（ＩＧＥＮ）測定緩衝液に浸し、例６．２７に記載のように読んだ。
【０１４６】
６．２９．ポリアクリルアミド表面上のＴＡＧ１標識アビジンのＥＣＬ検出
アクリルアミド、ビス−アクリルアミド、およびＮ−アクリロイル−Ｎ’−ビオチニル−３，６−ジオキサオクタン−１，９−ジアミン（ビオチンはトリ（エチレングリコール）リンカーを介してアクリルアミド残基に結合している）を、公知の方法（過硫酸アンモニアとＴＥＭＥＤで開始する）を用いて、共有結合したビオチンを含有する架橋ポリアクリルアミドゲルを調製した。この実験で、３つのモノマー種の濃度は、それぞれ２．６Ｍ、０．０６５Ｍ、および０．０２３Ｍであった（アクリルアミドとビス−アクリルアミドのこれらの濃度により、孔径がほとんどのタンパク質より小さいゲルが得られることが報告されている）。約０．７ｍｍの距離で離して固定した２つのガラスプレートの間にモノマーを含有する溶液の重合により、同じ厚さのスラブゲルが生成した。重合反応終了後、ゲルをＰＢＳに浸して４回交換して、取り込まれていないビオチンを洗い流した。ＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌの濃度のタンパク質を含有する溶液中でゲルを２０分間浸すことにより、誘導体化ＴＡＧ１で標識されたアビジン（ここで、アビジンは、ＮＳＢの低い修飾アビジンであるＮｅｕｔｒｏＡｖｉｄｉｎを意味し、この実験に使用した）が、ゲルの表面に結合した。ゲルをＥＣＬ測定緩衝液（２００ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭトリプロピルアミン、０．０２％（ｗ／ｖ）ツイーン２０、ｐＨ７．２）に浸して４回交換して、過剰のＴＡＧ１標識アビジンを洗い流した。図３９に示すように、ゲル（３９００）を、ガラス支持体（３９０３）にパターン付けした金の作用電極（３９０１）と対電極（３９０２）に接触させた。２つの電極の間で５００ｍＶ／秒の速度で０．０〜３．０Ｖまでそして０．０Ｖまでもどる電位勾配をつけて、ＥＣＬ光シグナルを得て、これをゲルの上に置いたＰＭＴ（３９０４）で測定した（図４０）。ビオチン含有アクリルアミド誘導体を含まないで調製したゲルは、ＥＣＬシグナルを示さなかった（図４１）。ビオチン含有ポリマーについて得られるこのシグナルは、ゲルの表面にほぼ完全に近いタンパク質の単層が存在することを示した。
【０１４７】
６．３０．ポリアクリルアミド表面でのＥＣＬサンドイッチ免疫測定
例６．２９のように、共有結合したビオチンを含有する架橋ポリアクリルアミドゲルを調製した。ストレプトアビジンをゲルの表面に吸着させて、ビオチン標識分子種を捕捉することができる結合ドメインを形成させる。表面を、トリプロピルアミン、未知濃度のアナライト、アナライトに対するビオチン標識抗体、およびアナライトに対する異なるＥＣＬ  ＴＡＧ１標識抗体を含有する溶液で処理する。アナライトが存在すると、アナライトと２つの抗体の複合体が形成され、これは次に、ストレプトアビジン表面に捕捉される。表面に存在する第２抗体に結合したＥＣＬ標識物を、例６．２９に記載のように測定する。
６．３１．電極上に支持されたポリアクリルアミド表面上の多重ＥＣＬサンドイッチ免疫測定
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、ＨＳ−（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６−ＯＨ（１〜１０ｍＭ）に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールＨＳ−（ＣＨ２）１０−ＣＨ３（エタノール中１〜１０ｍＭ）の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、およびアミノ基を提示する抗体の混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、特異的抗体を含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的な抗体を含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンとＥＣＬ−ＴＡＧ１標識第２抗体を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の１つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができるアナライトの混合物で基板を処理して、測定を行う。次に金電極（４２３２）上のポリアクリルアミド液滴（４２０３）上の結合ドメイン（４２００，４２０１、４２０２）を、図４２Ａ−Ｂに記載のように、ＩＴＯ作用電極（４２０４）に接近させる。各結合ドメインから放出される光をＣＣＤカメラ（４２０５）で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
【０１４８】
６．３２．電極上に支持されたポリアクリルアミド表面上の多重ＥＣＬ競合免疫測定
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、ＨＳ−（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６−ＯＨ（１〜１０ｍＭ）に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールＨＳ−（ＣＨ２）１０−ＣＨ３（エタノール中１〜１０ｍＭ）の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、および抗体の混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、特異的抗体を含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的な抗体を含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンとアナライトのＥＣＬ−ＴＡＧ１標識類似体を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の１つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができるアナライトの混合物で基板を処理して、測定を行う（すなわち、結合ドメインに対して、ＥＣＬ−ＴＡＧ１で標識したアナライトおよび標識していないアナライトの競合を起こさせる）。次に金電極（４２３２）上のポリアクリルアミド液滴（４２０３）上の結合ドメイン（４２００，４２０１，４２０２）を、図４２に記載のように、ＩＴＯ作用電極（４２０４）に接近させる。各結合ドメインから放出される光をＣＣＤカメラ（４２０５）で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
【０１４９】
６．３３．電極上に支持されたポリアクリルアミド表面上のセルの結合に対する多重ＥＣＬ測定
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、ＨＳ−（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６−ＯＨ（１〜１０ｍＭ）に暴露して、整列した金基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールＨＳ−（ＣＨ２）１０−ＣＨ３（エタノール中１〜１０ｍＭ）の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、および細胞表面に対する抗体の混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、プレポリマー溶液を各ドメインに入れる。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。結合ドメインをまず細胞の懸濁物で処理して、次にトリプロピルアミンとＥＣＬ−ＴＡＧ１標識第２抗体および／またはアナライトに特異的な他の結合試薬を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面に結合した１つまたはそれ以上のセルに結合することができる結合試薬の混合物で基板を処理して、測定を行う。次に金電極（４２３２）上のポリアクリルアミド液滴（４２０３）上の結合ドメイン（４２００，４２０１，４２０２）を、図４２に記載のように、ＩＴＯ作用電極（４２０４）に接近させる。各結合ドメインから放出される光をＣＣＤカメラ（４２０５）で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
【０１５０】
６．３４．電極上に支持されたポリアクリルアミド表面上のセルへのアナライトの結合の多重ＥＣＬ測定
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、ＨＳ−（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６−ＯＨ（１〜１０ｍＭ）に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールＨＳ−（ＣＨ２）１０−ＣＨ３（エタノール中１〜１０ｍＭ）の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、および細胞の混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、各細胞型を含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、異なるアナライトに結合する異なる表面構造を有する細胞を含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンとＥＣＬ−ＴＡＧ標識抗体および／またはアナライトに特異的な他の結合試薬を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の１つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができるアナライトの混合物を含有する試料でゲルを処理して、測定を行う。次に金電極（４２３２）上のポリアクリルアミド液滴（４２０３）上の結合ドメイン（４２００、４２０１、４２０２）を、図４２に記載のように、ＩＴＯ作用電極（４２０４）に接近させる。各結合ドメインから放出される光をＣＣＤカメラ（４２０５）で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
【０１５１】
６．３５．電極上に支持されたポリアクリルアミド表面上の多重ＥＣＬ競合ハイブリダイゼーション測定
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、ＨＳ−（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６−ＯＨ（１〜１０ｍＭ）に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールＨＳ−（ＣＨ２）１０−ＣＨ３（エタノール中１〜１０ｍＭ）の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、およびアミノ酸で官能基化した核酸プローブの混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、特異的プローブを含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的の核酸配列に特異的なプローブを含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンと表面への結合について目的のアナライトと競合することができるＥＣＬ−ＴＡＧ１標識配列を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の１つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができる配列を含有する試料混合物で基板を処理して、測定を行う。次に金電極（４２３２）上のポリアクリルアミド液滴（４２０３）上の結合ドメイン（４２００，４２０１，４２０２）を、図４２に記載のように、ＩＴＯ作用電極（４２０４）に接近させる。各結合ドメインから放出される光をＣＣＤカメラ（４２０５）で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
【０１５２】
６．３６．電極上に支持されたポリアクリルアミド表面上の多重ＥＣＬハイブリダイゼーションサンドイッチ測定
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、ＨＳ−（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６−ＯＨ（１〜１０ｍＭ）に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールＨＳ−（ＣＨ２）１０−ＣＨ３（エタノール中１〜１０ｍＭ）の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、およびアミノ基で官能基化した核酸プローブの混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、特異的プローブを含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的の核酸配列に特異的なプローブを含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンと表面結合プローブに相補的でない配列でアナライトに結合することができるＥＣＬ−ＴＡＧ１標識配列を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の１つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができる配列を含有する試料混合物で基板を処理して、測定を行う。次に金電極（４２３２）上のポリアクリルアミド液滴（４２０３）上の結合ドメイン（４２００、４２０１、４２０２）を、図４２に記載のように、ＩＴＯ作用電極（４２０４）に接近させる。各結合ドメインから放出される光をＣＣＤカメラ（４２０５）で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
【０１５３】
６．３７．電極上に支持されたポリアクリルアミド表面上の異なる型の多重測定
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、ＨＳ−（ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６−ＯＨ（１〜１０ｍＭ）に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールＨＳ−（ＣＨ２）１０−ＣＨ３（エタノール中１〜１０ｍＭ）の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、および例６．３１〜６．３６に記載の任意の結合試薬の混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、特異的プローブを含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的な結合ドメインを含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンと結合ドメインへの結合についてアナライトと競合するアナライトのＥＣＬ−ＴＡＧ１標識類似体および／または目的のアナライトに対するＥＣＬ−ＴＡＧ１標識第２結合試薬を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の１つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができるアナライトを含有する試料混合物で基板を処理して、測定を行う。次に金電極（４２３２）上のポリアクリルアミド液滴（４２０３）上の結合ドメイン（４２００，４２０１，４２０２）を、図４２に記載のように、ＩＴＯ作用電極（４２０４）に接近させる。各結合ドメインから放出される光をＣＣＤカメラ（４２０５）で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
【０１５４】
６．３８．高度に可逆性のＥＣＬ
多結晶性金電極（バイオ−アナリティカルサービシーズ（Ｂｉｏ−Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）から購入、２ｍｍ２）を、０．５μｍと０．０３μｍのアルミナスラリーで連続して手で磨き、次に１：３  Ｈ２Ｏ２／Ｈ２ＳＯ４で化学的エッチングし、そしてＡｇ／ＡｇＣｌに対して−０．２Ｖ〜１．７Ｖの間で希硫酸中で電気化学的サイクリングできれいにした。次にきれいな電極を、エタノールに溶解したオクチルチオール（Ｃ８ＳＨ）の希薄溶液に一晩浸した。Ｃ８ＳＨ修飾電極を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．１Ｍ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．２）に溶解した２０μｌのＴＡＧ１標識ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で覆い、１０分間インキュベーション後表面を同じ緩衝液で充分洗浄した。
ＥＣＬは、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極、白金線対電極およびイージーアンドジー（ＥＧ＆Ｇ）ポテンシオスタットを有する３電極セル中で行った。光の強度は、底に置いたパシフィックインストルメンツ（Ｐａｃｉｆｉｃ  ＩＮｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）光度計とハママツ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）光電子増倍管で測定した。タンパク質を吸着した電極を、０．１Ｍ  ＴＰＡと０．２Ｍリン酸塩（ｐＨ７．２）の溶液に浸した。電極電位を図４４Ａに示すように、０．０Ｖと１．２Ｖの間にサイクルをさせると、高度に可逆性のＥＣＬ応答（前進および後退走査と実質的に同じ強度）が観察され、ＥＣＬプロセスの可逆性と電極上でのチオールとタンパク質層の安定性を示していた。
ＰＭＴや光度計を使用せずに、ＥＣＬの場合と同じ装置を使用してサイクリックボルタン実験を行った。実験では、Ｃ８ＳＨで覆った電極（タンパク質なし）を１ｍＭフェリシアン化カリウムの溶液（ＰＢＳ中）に入れ、電極を＋０．５Ｖ〜１．２Ｖそして逆に走査し、＋０．５Ｖ〜−０．３Ｖでもう一度走査した。＋０．５Ｖ〜−０．３Ｖの間のボルタングラムでは容量性電流のみでフェリシアンカ物のファラデー電流はなかったため、単層はそのままで１．２Ｖで脱着がないことを示している（図４４Ｂ）。
【０１５５】
６．３９．擬可逆性ＥＣＬ
電極修飾とタンパク質吸着を、前述のように行った。ＥＣＬ実験では、電位を０．０ｖと１．５Ｖの間で走査し、対応する光の強度を記録した。図４５Ａに示すように、同じサイクルの前進と後退走査の間では、異なるサイクルの間と同様に、ＥＣＬの喪失があった。１．５Ｖで酸化した後のフェリシアン化物中のチオール／Ａｕのサイクリックボルタングラムは、多量のファラデー電流を示し、１．５Ｖでのチオール単層の少なくとも部分的な脱着を示した（図４５Ｂ）。
６．４０．可逆性ＥＣＬ
これらの実験では、電極修飾とタンパク質吸着を例６．３８に記載のように行った。ＥＣＬを測定するために、電極電位を２．０Ｖまでそして逆方向に０．０Ｖまで走査した。前進走査で強い光が観察された（例６．３８の可逆性条件下で観察されたものより強い光）が、図４６Ａに示すように逆走査でバックグランドまで低下した。２．０Ｖで酸化した後のフェリシアン化物中の修飾電極のサイクリックボルタングラムは、チオール単層のほとんどが脱着していることを示した（図４６Ｂ）。
【０１５６】
６．４１．パターン付け金電極上に固定化された第１抗体を用いるＥＣＬサンドイッチ免疫測定
この例では、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）に対する抗体が、ＰＳＡの免疫測定法で使用するためのパターン付け金電極上に固定化される。
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、１ｍｍ×１ｍｍ平方の斑点（ここでフォトレジストが除去される）を有するケイ素支持体上のフォトレジストの層が得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応する硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、ＨＳ−（ＣＨ２）１１（ＯＣＨ２ＣＨ２）６−ＯＨおよびニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）末端−チオールＨＳ−（ＣＨ２）１１（ＯＣＨ２ＣＨ２）３ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）２を含有する溶液に暴露して、「墨入れ」を行う。「墨入れ」を行った型押しは、金の基板と接触させ、除去して１ｍｍ×１ｍｍＳＡＭを形成させる。基板を、エタノール中にヒドロキシルを末端に有するチオールのみを含有する溶液で数秒間洗浄して、型押し構造以外の領域へのタンパク質の非特異結合を防止する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ＮｉＣｌ２の溶液で表面を処理し、次に抗ＰＳＡマウスモノクローナル抗体とペプチド（ＨＩｓ）６の結合部位を提示する融合蛋白を含有する溶液で処理すると、調節された方法で表面に融合蛋白が固定化される。この方法は、表面上の固定化されたタンパク質の再現性のあるあらかじめ決められた量を与える。表面上のタンパク質の配置は、融合蛋白の一次構造中の（Ｈｉｓ）６配列の位置により調節される。固定化されたタンパク質の絶対量は、型押しされたＳＡＭ中のＮＥＡ末端チオールとヒドロキシル末端チオールの比、および型押しされた構造の表面積により調節される。ＰＳＡの較正曲線は、血清中に既知量のＰＳＡを含有する溶液を調製することにより測定される（１ｆＭ〜１μＭの範囲の濃度）。前述のように作成される多くの表面をＰＳＡ較正標準物質で処理し、次に最適濃度でＰＳＡに対する第２抗体（ＴＡＧ１の誘導体で標識されている）を含有する溶液で処理される。０．１Ｍ  ＴＰＡと０．２Ｍリン酸塩（ｐＨ７．２）を含有する溶液に表面を浸して、金表面の電位を０．５Ｖ／秒の速度で０．０〜２．０Ｖの間でサイクルした時放出される光のピーク強度を測定することにより、較正曲線が測定される。試料の血清中のＰＳＡの未知濃度の測定は、ＰＳＡの濃度は、較正曲線に対する参照によりピークＥＣＬシグナルから計算される以外は、同じ方法により行われる。
【０１５７】
７．文献の引用
本発明は、本明細書に記載の具体例に限定されるものではない。前記説明と添付図面から、本発明の種々の改変が可能であることは当業者には明らかであろう。このような改変は本発明の請求の範囲に包含される。本明細書においては種々の文献が引用され、それらの開示内容は参考のためそれらの全体が本明細書に引用される。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、複数の結合ドメイン１４が支持体１０上に存在し、複数の対応する電極１６が支持体１２上に存在しているため、支持体の接近により、電極対が各結合ドメインに近接するように配置される、本発明のカセットを形成する２つの支持体を例示する。
【図１Ａ】図１Ａは、複数の結合ドメイン１４が支持体１０上に存在し、複数の対応する電極１６が支持体１２上に存在しているため、支持体の接近により、電極が各結合ドメインに近接するように配置される、本発明のカセットを形成する２つの支持体を例示する。
【図２】図２は、支持体２６上の複数の結合ドメイン３０が、各単一の電極３２に近接しているため、支持体２６と２８の接近により、各対電極３８が各結合ドメイン３０に近接するように配置される、本発明のカセットを形成する２つの支持体を例示する。
【図３】図３は、複数の結合ドメイン４８が、支持体４４上でこれらに近接する電極と対電極の対を有する、本発明のカセットを形成する２つの支持体を例示する。支持体４６は、場合により支持体４４に近接して配置されて、このため、支持体４６が結合ドメイン４８と電極５０に近接する試料含有手段を提供してもよい。
【図４】図４は、支持体６０上の複数の結合ドメイン６４が、アナライトを含有することが疑われる試料と接触される、本発明のカセットを形成する２つの支持体を例示する。支持体６２は、目的のアナライトを検出または測定するための反応媒体を含有する領域６６を有しているため、支持体６０と支持体６２の接近により、結合ドメイン６４と領域６６が相互に接触する。
【図５Ａ】図５Ａは、多重アレイの多重特異的な結合表面のためにパターン付けされた結合ドメインの平面図を例示する。幾何学図形の三角形、四角形および円形は、異なるアナライトに特異的な結合ドメインを表す。結合ドメインは、疎水性であっても親水性であってもよい。周囲の表面は、結合ドメインからの結合試薬またはアナライトの拡散を少なくするために、結合ドメインの反対の性質（親水性または疎水性）を有していてよい。
【図５Ｂ】図５Ｂは、別々の結合ドメインに結合試薬および／またはアナライトを送達するための微量流体ガイド（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｇｕｉｄｅ）の平面図を例示する。各ドットは、微量流体ガイド（例えば、毛細管）の断面図を例示する。
【図５Ｃ】図５Ｃは、微量流体ガイドの側面図を例示しており、パターン付けされた結合ドメインの多重アレイに結合試薬および／またはアナライトを送達するための、合わせたまたは整列させた微量流体ガイドの接近を示す。各微量流体ガイドは、別々の結合ドメインに異なる結合試薬を送達してもよい。
【図６Ａ】図６Ａは、パターン付けした多重アレイの多重特異的な結合ドメインを有する表面との、合わせた電極の多重アレイの接近を例示する。取り外し可能な電極保護バリアが、電極アレイと結合表面アレイとの間に示される。全体の組立品は、複数のＥＣＬ反応を実施するためのカセットからなる。
【図６Ｂ】図６Ｂは、合わせたまたは整列させた、アドレスが可能な作用電極と対電極のアレイの接近を例示する。電極は、結合ドメインと相補的な形であっても他の形（例えば、相互にかみ合う形）であってもよい。
【図７】図７は、合わせたまたは整列させた、アドレスが可能な作用電極と対電極、および相補的な結合表面の、接近したアレイの側面図を例示しており、ここで、導電性ポリマーが電極の表面から、電極アレイと結合ドメインの間の間隙を横切って成長して、試料のＥＣＬ標識周囲の電位の場を拡大してＥＣＬ反応の効率を増大させる。
【図８】図８は、合わせたまたは整列させた、アドレスが可能な作用電極と対電極、および相補的な結合表面の、接近したアレイの側面図を例示しており、ここで導電性粒子が両方の成分の間に散在して電位の場を拡大する。試料のＥＣＬ標識の周囲の電位の場を拡大することにより、ＥＣＬ反応の効率は増強される。導電性粒子は、容易な操作が可能になるよう磁気を帯びていてもよい。
【図９】図９は、合わせたまたは整列させた、アドレスが可能な作用電極と対電極、および相補的な結合表面の、接近したアレイの側面図を例示しており、ここで電極は、電極表面と結合ドメインとの間の間隙中に延びる微細な突起を有して、これにより試料のＥＣＬ標識の周囲の電位の場を拡大してＥＣＬ反応の効率を増大させる。
【図１０】図１０は、合わせたまたは整列させた、アドレスが可能な作用電極と対電極、および相補的な結合表面の、接近したアレイの側面図を例示しており、ここでこれらの表面は、平行ではないが、代わりに相補的な形で一方を他方に適合させている。
【図１１】図１１は、その上に、カセットの形で単一の電極と結合表面組立品を提供する金属層を有する支持体の側面図を例示する。金属層上に自己組立単層（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）（「ＳＡＭ」）のアレイがパターン付けられている。
【図１２】図１２は、カセットの形で単一の電極と結合表面組立品を提供する金属層をその上に有する支持体の側面図を例示する。金属層上にＳＡＭのアレイがパターン付けられており、導電性微粒子がパターン付けされたＳＡＭの間の散在が示され、これにより、試料のＥＣＬ標識の周囲の電位の場を拡大して、ＥＣＬ反応の効率を増大させる。
【図１３】図１３は、カセットの形で単一の電極と結合表面組立品を提供する金属層をその上に有する支持体の側面図を例示する。金属層上に自己組立単層すなわちＳＡＭのアレイがパターン付けられており、試料のＥＣＬ標識の周囲の電位の場を拡大してＥＣＬ反応の効率を増大させるように、ＥＣＬ標識からの導電性ポリマーおよび／または繊維の成長が例示される。
【図１４】図１４は、コンピュータにより制御される電極対のアレイを有する支持体の線図である。
【図１５】図１５は、電極対のアレイを有する支持体の線図である。
【図１６】図１６は、電極対のアレイを有する支持体、および各電極対のエネルギー補給を制御するためのコンピュータシステムの線図である。
【図１７】図１７は、電極対のアレイを有する支持体、および各電極対のエネルギー補給を制御するための、複数の電位供給源とマルチプレクサーを有するコンピュータシステムの線図である。
【図１８】図１８は、電極対のアレイを有する支持体、および各電極対のエネルギー補給を制御するための、複数の切り替え電位供給源を有するコンピュータシステムの線図である。
【図１９ａ】図１９（ａ）〜（ｅ）は、いくつかの代替の電極−対電極の対の組合せの平面図である。
【図１９ｂ】図１９（ａ）〜（ｅ）は、いくつかの代替の電極−対電極の対の組合せの平面図である。
【図１９ｃ】図１９（ａ）〜（ｅ）は、いくつかの代替の電極−対電極の対の組合せの平面図である。
【図１９ｄ】図１９（ａ）〜（ｅ）は、いくつかの代替の電極−対電極の対の組合せの平面図である。
【図１９ｅ】図１９（ａ）〜（ｅ）は、いくつかの代替の電極−対電極の対の組合せの平面図である。
【図２０】図２０は、サンドイッチ測定法が完了した支持体を例示する。
【図２１】図２１は、支持体上の２つの逆のＰＭＡＭＳ表面を例示する。
【図２２Ａ】図２２Ａは、微量流体ガイド（２２０１）と小繊維マット（２２００）のアレイを例示する。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、結合ドメイン（２２０２）を例示する。
【図２３Ａ】図２３Ａは、真空濾過により小繊維マットを形成するための装置を例示する。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、濾過膜（２３０３）上の小繊維マット（２３０４）を例示する。
【図２４】図２４は、小繊維マットを製造するためのローラーの使用を例示する。
【図２５】図２５は、上層が測定のために使用される結合ドメインを有する、多層小繊維マットの略図を示す。
【図２６】図２６は、非特異的な結合を増強する残基で誘導体化した小繊維の略図を示しており、生物学的および非生物学的ないくつかの種が表面に結合する。
【図２７】図２７は、非特異的な結合を増強する残基で誘導体化した小繊維の略図を示しており、誘導体化した小繊維に結合したいくつかの種を示し、いくつかの種はさらにリガンドに結合している。
【図２８】図２８は、小繊維に共有結合したいくつかの種を例示しており、いくつかの種は、さらに追加の物質に結合する。
【図２９】図２９は、マット上またはマット内の光の供給源の位置に依存して、光を通過させるか、および／または光を吸収するか、および／または光を散乱することができる光学フィルターとしての、多層小繊維マットの使用を例示する。
【図３０Ａ】図３０Ａは、炭素小繊維マット電極上の電気化学的測定からの周期的ボルタンモグラムを例示する。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、金箔電極上の電気化学的測定からの周期的ボルタンモグラムを例示する。
【図３１】図３１は、マットの厚さの関数としての小繊維マットの電気化学的性質と、走査速度を比較する。
【図３２】図３２は、小繊維上の非特異的な結合は、タンパク質溶液中の小繊維の濃度が上昇するに従い、一般に上昇することを例示するプロットを示す。
【図３３】図３３は、界面活性剤の使用により、ＥＣＬ−ＴＡＧ１標識タンパク質と炭素小繊維との間の非特異的な結合を低減させることができることを証明する。
【図３４】図３４は、電気化学的性質および小繊維マット電極上のＥＣＬを測定するのに使用される、実験的セルの平面略図を示す。
【図３５】図３５は、電極として小繊維マットおよび１０００ｐＭのＴＡＧ１（実線）溶液を使用して得られたＥＣＬシグナル、および測定緩衝液からのシグナル（ＴＡＧ１なし）（点線）を示す。
【図３６】図３６は、支持される電極の２つのアレイが、パターン付けされた誘電層により分離されている、２つの表面のＰＭＡＭＳ装置の略図を示す。
【図３７】図３７は、一方の支持体上に複数の結合ドメイン（３７０２）を、そしてもう一方の支持体上に電極と対電極を有する装置を例示する。
【図３８】図３８は、結合ドメインが、対電極上に支持された別個の物体の表面に提示されている、カセットを示す。
【図３９】図３９は、作用電極および対電極と接触するゲルを示す。
【図４０】図４０は、作用電極および対電極と接触するＥＣＬ標識ゲルからの、ＥＣＬ強度と周期的ボルタンモグラムを示す。
【図４１】図４１は、作用電極および対電極と接触する非ＥＣＬ標識ゲルからの、ＥＣＬ強度と周期的ボルタンモグラムを示す。
【図４２Ａ】図４２は、ＥＣＬに使用される２つの表面のカセットの略図を示す。
【図４２Ｂ】図４２は、ＥＣＬに使用される２つの表面のカセットの略図を示す。
【図４３】図４３は、小繊維マットが、マットに吸着した抗体−ＴＡＧ１のＥＣＬのための電極として使用することができることを証明する。
【図４４Ａ】図４４Ａは、電極に固定化されたＴＡＧ１標識タンパク質のＥＣＬ強度を示す。
【図４４Ｂ】図４４Ｂは、コーティングされた電極の周期的ボルタンモグラムを示す。
【図４５Ａ】図４５Ａは、固定化ＥＣＬ  ＴＡＧ１標識タンパク質からのＥＣＬシグナルの準可逆的反復発生を示す。
【図４５Ｂ】図４５Ｂは、コーティングの部分的保存を示す、コーティングされた電極の周期的ボルタンモグラムを示す。
【図４６Ａ】図４６Ａは、固定化ＥＣＬ  ＴＡＧ１標識タンパク質からのＥＣＬシグナルの不可逆的発生を示す。
【図４６Ｂ】図４６Ｂは、コーティングの実質的な消失を示す、コーティングされた電極の周期的ボルタンモグラムを示す。
【図４７】図４７は、多重アレイのＥＣＬ装置と、ＥＣＬシグナルの発生および分析のためのコントローラー手段を有するマイクロプロセッサーを示す。
【図１】
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【図１Ａ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図１９ｃ】
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【図１９ｄ】
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【図１９ｅ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年10月24日(2007.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一核酸鎖と第二核酸鎖を有する二重鎖核酸におけるハイブリダイゼーションの程度を検出または測定する方法であって、ラベルと電極との間の電子移動を測定することを含む方法であり、該第二核酸鎖は該電極に固定化されており、該ラベルは、（i）該第一核酸鎖に連結している、または（ii）核酸インターカレーターであり、該電子移動は、該第一核酸鎖と該第二核酸鎖との間の相補性の程度に関連している、方法。
【請求項２】
該ラベルは該第一核酸に連結している請求項１の方法。
【請求項３】
該ラベルは核酸インターカレーターである請求項１の方法。
【請求項４】
更に、充分に相補的な二重鎖を生成するハイブリダイゼーション反応と、部分的に相補的な二重鎖を生成するハイブリダイゼーション反応とを区別する工程を含む請求項１の方法。
【請求項５】
ハイブリダイゼーション反応により核酸を検出する方法であって、
（a）第一核酸と第二核酸を含む組成物であって、該第二核酸は電極に固定化されておりそしてラベルに連結されている、組成物を形成する工程、
（b）該第一核酸が該第二核酸にハイブリダイズしたかどうかを決定するように、該ラベルと該電極との間の電子移動を測定する工程、
を含む方法。
【請求項６】
該ラベルと該電極との間の電子移動を、インピーダンス測定により測定する請求項１または５の方法。
【請求項７】
該ラベルと該電極との間の電子移動を、電気化学発光測定により測定する請求項１または５の方法。
【請求項８】
該第二核酸は、該電極に固定化された５’チオール化ＤＮＡである請求項１または５の方法。
【請求項９】
該電極は金電極である請求項８の方法。
【請求項１０】
該第二核酸は、１０原子未満の長さのリンカーを介して該電極にカップル化されている請求項１または５の方法。
【請求項１１】
該第二核酸は、電導性リンカーを介して該電極にカップル化されている請求項１または５の方法。
【請求項１２】
該電導性リンカーはポリアセチレンを含む請求項１１の方法。