(57)【要約】【課題】本発明の課題は、簡便迅速で高感度のイムノクロマトグラフキットを提供することである。【解決手段】分析対象物及びそれと特異的に結合する抗体又は抗原による免疫反応を利用し、固定化された免疫複合体に由来する標識の信号を分析するイムノクロマトグラフキットであって、有機銀塩粒子、銀イオンの為の還元剤、および金属コロイド標識または金属硫化物標識を含有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物及びそれと特異的に結合する抗体又は抗原による免疫反応を利用し、固定化された免疫複合体に由来する標識の信号を分析するイムノクロマトグラフキットであって、有機銀塩粒子、銀イオンの為の還元剤、および金属コロイド標識または金属硫化物標識を含有することを特徴とするイムノクロマトグラフキット。
【請求項２】
前記有機銀塩粒子の溶剤を含むことを特徴とする請求項１に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項３】
前記有機銀塩粒子が、カルボン酸銀もしくは含窒素複素環銀塩を含有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項４】
前記有機銀塩の相転位温度が４０℃以上１００℃以下である事を特徴とする請求項１〜請求項３記載のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項５】
前記有機銀塩粒子および前記銀イオンの為の還元剤、および前記金属コロイド標識または前記金属硫化物標識を同一のキット内に含有する事を特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項６】
前記有機銀塩粒子および前記銀イオンの為の還元剤を含有する層、および前記金属コロイド標識または前記金属硫化物標識を含有する層を、同一のキット内に含む事を特徴とする請求項５に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項７】
前記金属コロイドが金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、もしくはこれらの複合コロイドである事を特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【請求項８】
前記金属コロイドの平均粒径が５ｎｍ以上１００ｎｍ以下である事を特徴とする請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析対象物を含む試料を、簡易、迅速、正確に定性及び定量を行うことができる免疫化学的分析材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物、毒素、ホルモン、又は農薬等の生理活性物質又は環境汚染物質の中には、極微量で作用するものが非常に多い。従って、これらの物質の定性的及び定量的測定には、従来、高感度分析が可能な機器分析法が広く用いられてきた。しかし、機器分析法は、特異性が低く、試料の前処理工程を含め、分析に時間を要する上、操作が煩雑なため、近年要求されている迅速簡便測定目的には不都合である。一方、免疫学的測定法は、特異性も高く、操作も機器分析よりはるかに簡便であることから、生理活性物質又は環境汚染物質の測定分野に徐々に普及してきた。しかし、９６穴プレ−トを用いた酵素免疫測定法やラテックス凝集法のような従来の免疫学的測定法は、必ずしも測定の迅速簡便性又は検出感度を満たすものではなかった。
【０００３】
また他のニ−ズとしては、現在スワブ液や血液と言った比較的侵襲的な検体を用いている検査においても、高感度化が達成されることで、鼻水やうがい液、尿、といった比較的低侵襲的な検体中にごく少量含まれる被検試料を検出することが出来るようになることで、患者の負担の少ない検査方法が可能となることも期待できる。
【０００４】
近年、特に迅速な診断が求められる感染症の検査に、イムノクロマトグラフ法を用いた検査キット（以後の説明において、イムノクロマトグラフキットと記す。）が多く使用されるようになってきている。これらキットの普及により、患者の感染を迅速・簡便な方法で特定することができ、その後の診断、治療を素早く的確に行うことが可能となってきている。例えば、サンドイッチ法を利用したイムノクロマトグラフ法では、分析対象物（例えば、抗原）に特異的に結合する第１抗体を特定の領域に固定した不溶性薄膜状支持体（例えば、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜など）中に、分析対象物と特異的に結合する標識化第２抗体と、分析対象物を含む可能性のある検体溶液とを展開し、不溶性薄膜状支持体の第１抗体を固定した領域上で、分析対象物との免疫複合体を形成させ、標識の着色又は発色などの信号を検出し、分析対象物を測定することができる。なお、前記標識としては、例えば、酵素を含むタンパク質、着色ラテックス粒子、金属コロイド、又は炭素粒子を使用することができる。
【０００５】
イムノクロマトグラフ法は、その判定・測定に重厚な設備・機器を必要とせず、操作が簡便であり、例えば、分析対象物を含む可能性のある検体溶液を滴下した後、約５分〜１０分間静置するだけで測定結果が得られるほど迅速であるので、簡便・迅速・特異性の高い判定・測定手法として、多くの場面、例えば病院における臨床検査、研究室における検定試験等に広く使われている。
【０００６】
また、天然物、毒素、ホルモン、又は農薬等の生理活性物質又は環境汚染物質は、従来の一般的イムノクロマトグラフ法では検出できない極微量で作用する物質が多く、それらを迅速、簡便、且つ高感度に検出できるイムノクロマトグラフ法の開発が求められている。
【０００７】
従来、展開の手段を工夫した技術（例えば、特許文献１，２参照。）、着色粒子を工夫した技術（例えば、特許文献３，４参照。）、展開部材を工夫した技術（例えば、特許文献５参照。）、アビジン−ビオチン結合を利用した技術（例えば、特許文献６参照。）、及び酵素免疫法を利用した技術（例えば、特許文献７参照。）、触媒作用のある金属コロイドを用いた技術（例えば、特許文献８参照。）、金属イオンを沈着させる技術（例えば、特許文献９参照。）等、高感度化を目指した数多くの技術が開示されている。
【０００８】
しかしながら、これらの技術の進歩によりイムノクロマトグラフ法は、分析対象物の検出感度が高くなり酵素免疫測定法に近づいたとは言え、さらなる高感度化が要望されている。
【特許文献１】特開平１−３２１６９号公報
【特許文献２】特開平４−２９９２６２号公報
【特許文献３】特開平５−１０９５０号公報
【特許文献４】特開平５−１３３９５６号公報
【特許文献５】特開平７−３１８５６０号公報
【特許文献６】特開平１０−６８７３０号公報
【特許文献７】特開平１１−６９９９６号公報
【特許文献８】特開２００２−２６２６３８号公報
【特許文献９】特開２００２−２０２３０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、イムノクロマトグラフ法の簡便迅速というメリットを保ちつつ、その高感度化をはかることである。
一般に、従来のイムノクロマトグラフ法の検出感度は細菌の場合、１０５ＣＦＵ／ｍＬ〜１０７ＣＦＵ／ｍＬである。最近の高感度な検出法として遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）が挙げられ、その検出感度は１０３ＣＦＵ／ｍＬ〜１０４ＣＦＵ／ｍＬまで達成されている。しかしながら、ＰＣＲ法は、重厚な設備、機器および煩雑な操作が必要であり、しかも検出までに数時間という長時間を要すため、簡便・迅速な測定方法とは言えない。従来のイムノクロマトグラフ法を１桁〜４桁程度高感度化することは、つまりこれまでＰＣＲ法により行っていたような簡便・迅速とは言えなかった検査を、簡便・迅速に行うことを可能にすると考えられる。
【００１０】
また、既にイムノクロマトグラフ法による測定法が確立されている感染症の検査においても高感度化が求められている。例えば、イムノクロマトグラフ法によるインフルエンザ検査は近年その簡便・迅速な検査方法として普及しているが、この検査において、感染初期のウイルス量が比較的少ない際には、その検出感度不足から偽陰性が出てしまい再検査が必要となることがある。一般にインフルエンザウイルスは４時間で１０倍に増殖するとされることから、例えば１桁の感度アップにより、従来よりも４時間前の時点で感染を判定できるようになる。何度も通院するという患者の負担を低減するという観点から、イムノクロマトグラフ法のような簡便迅速でさらに高感度な検査法の開発が求められている。
【００１１】
従って、本発明の課題は、迅速且つ簡便であって、しかも、従来公知のイムノクロマトグラフ法による検査キットよりも更に高感度なイムノクロマトグラフキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の上記課題は、下記の手段により解決された。
【００１３】
＜１＞  分析対象物及びそれと特異的に結合する抗体又は抗原による免疫反応を利用し、固定化された免疫複合体に由来する標識の信号を分析するイムノクロマトグラフキットであって、有機銀塩粒子、銀イオンの為の還元剤、および金属コロイド標識または金属硫化物標識を含有することを特徴とするイムノクロマトグラフキット。
＜２＞  前記有機銀塩粒子の溶剤を含むことを特徴とする＜１＞に記載のイムノクロマトグラフキット。
＜３＞  前記有機銀塩粒子が、カルボン酸銀もしくは含窒素複素環銀塩を含有することを特徴とする＜１＞又は＜２＞に記載のイムノクロマトグラフキット。
＜４＞  前記有機銀塩の相転位温度が４０℃以上１００℃以下である事を特徴とする＜１＞〜＜３＞記載のいずれかに記載のイムノクロマトグラフキット。
＜５＞  前記有機銀塩粒子および前記銀イオンの為の還元剤、および前記金属コロイド標識または前記金属硫化物標識を同一のキット内に含有する事を特徴とする＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載のイムノクロマトグラフキット。
＜６＞  前記有機銀塩粒子および前記銀イオンの為の還元剤を含有する層、および前記金属コロイド標識または前記金属硫化物標識を含有する層を、同一のキット内に含む事を特徴とする＜５＞に記載のイムノクロマトグラフキット。
＜７＞  前記金属コロイドが金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、もしくはこれらの複合コロイドである事を特徴とする＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載のイムノクロマトグラフキット。
＜８＞  前記金属コロイドの平均粒径が５ｎｍ以上１００ｎｍ以下である事を特徴とする＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載のイムノクロマトグラフキット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、分析対象物を含む試料を、簡易、迅速、正確に定性及び定量を行うことができる高感度のイムノクロマトグラフキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
１．イムノクロマト
一般に、イムノクロマトグラフ法とは以下のような手法で被分析物を簡便・迅速・特異的に判定・測定する手法である。すなわち、被分析物と結合可能な固定化試薬（抗体、抗原等）を含む少なくとも１つの反応部位を有するクロマトグラフ担体を固定相として用いる。このクロマトグラフ担体上で、分析対象物結合可能な試薬によって修飾された検出用標識物が分散されてなる分散液を移動相として前記クロマトグラフ担体中をクロマトグラフ的に移動させる際に、前記分析対象物と検出用標識物とが特異的に結合しながら、前記反応部位まで到達する。前記反応部位において、前記分析対象物と検出用標識物の複合体が前記固定化試薬に特異的結合することにより、被分析液中に分析対象物が存在する場合にのみ、前記固定化試薬部に検出用標識物が濃縮されることを利用し、それらを目視または適当な機器を用いて検出することで被分析液中に被検出物が存在することを定性および定量的に分析する手法である。
【００１６】
本発明におけるイムノクロマトグラフキットは、有機銀塩および銀イオンのために還元剤を内蔵し、前記固定化試薬に結合した前記分析対象物と検出用標識物の複合体を核として増幅反応によって、シグナルを増幅し、結果として高感度化を達成することを特徴とする。本発明によれば、従来のイムノクロマトグラフキットで必要とされた外部からの増幅のための金属イオンや還元剤溶液の供給を必要とせず、一段と簡便で、迅速な高感度イムノクロマトグラフキットが提供される。
【００１７】
２．被検試料
本発明のイムノクロマトグラフキットで分析することのできる被検試料としては、分析対象物を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる搾過検体（スワブ）、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。
【００１８】
３．被検試料の前処理
本発明のイムノクロマトグラフキットでは、前記被検試料をそのままで、あるいは、前記被検試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、前記抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは前記抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。前記抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等）、あるいは、前記溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
【００１９】
４．構成
本発明のイムノクロマトグラフキットに使用することのできるイムノクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のイムノクロマトグラフ法に用いることができるイムノクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。例えば、図１に模式的に従来のイムノクロマトグラフ用ストリップの平面図を模式的に示す。図２に図１で示されたイムノクロマトグラフキットの縦断面を模式的に示す縦断面図である。図３は本発明のイムノクロマトグラフ用ストリップの縦断面図を模式的に示す。
本発明のムノクロマトグラフ用ストリップ１０は、展開方向（図１において矢印Ａで示す方向）の上流から下流に向かって、試料添加パッド５、標識化物質保持パッド（例えば金コロイド抗体保持パッド）２、クロマトグラフ担体（例えば抗体固定化メンブレン）３、及び吸収パッド４がこの順に、粘着シ−ト１上に配置されている。
【００２０】
前記クロマトグラフ担体３は、捕捉部位３ａを有し、分析対象物と特異的に結合する抗体又は抗原を固定化した領域である検出ゾ−ン（検出部と記載することもある）３１を有し、所望により、コントロ−ル用抗体又は抗原を固定化した領域であるコントロ−ルゾ−ン（コントロ−ル部と記載することもある）３２を更に有する。さらに、検出ゾ−ン３１およびコントロ−ルゾ−ン３２は、増幅のための有機銀塩と銀イオンのための還元剤を含有する。
【００２１】
前記標識化物質保持パッド２は、標識化物質を含む懸濁液を調製し、その懸濁液を適当な吸収パッド（例えば、グラスファイバ−パット）に塗布した後、それを乾燥することにより調製することができる。
【００２２】
前記試料添加パッド５としては、例えばグラスファイバ−パットを用いることができる。
【００２３】
４−１．検出用標識物
検出用標識物は、免疫凝集反応に用いられている着色粒子を使用することができる。例えば、金属コロイドのような金属等を用いることができる。担体粒子（又はコロイド）の平均粒径は、０．０２〜１０μｍの範囲が好ましい。色素を含有したリポゾ−ムやマイクロカプセル等も着色粒子として使用することができる。従来公知の着色金属コロイドはいずれも標識用着色粒子として使用することができる。例えば、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、およびこれらの複合コロイドなどが挙げられ、好ましくは、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、およびこれらの複合コロイドである。特に、金コロイドと銀コロイドが適当な粒径において、金コロイドは赤色、銀コロイドは黄色を示す点で好ましい。金属コロイドの平均粒径としては、約１ｎｍ〜５００ｎｍが好ましく、特に強い色調が得られる５ｎｍ〜１００ｎｍがさらに好ましい。金属コロイドと特異結合物質との結合は、従来公知の方法（例えばＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．７，ｐｐ６９１−６９６，（１９８２））に従い、行うことができる。すなわち、金属コロイドと特異結合物質（例えば抗体）を適当な緩衝液中で室温下５分以上混合する。反応後、遠心分離により得た沈殿を、ポリエチレングリコ−ル等の分散剤を含む溶液中に分散させることにより、目的の金属コロイド標識特異結合物質を得ることができる。金属コロイドとして金コロイド粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈｙｓ．  Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４１，２０，（１９７３）等）により金コロイド粒子を調製することができる。
【００２４】
本発明によれば、検出用標識物として金属コロイド標識又は金属硫化物標識、その他金属合金標識（以下、金属系標識と称することがある）、また金属を含むポリマ−粒子標識を用いるイムノクロマトグラフキットにおいて、前記金属系標識の信号を増幅させることができる。具体的には、前記分析対象物と検出用標識物の複合体の形成後に、有機銀塩から供給される銀イオンおよび銀イオンのために還元剤を接触させ、還元剤によって銀イオンを還元して銀粒子を生成させると、その銀粒子が前記金属系標識を核として前記金属系標識上に沈着するので、前記金属系標識が増幅され、分析対象物の分析を高感度に実施することができる。従って、本発明のイムノクロマトグラフキットは、還元剤による銀イオンの還元作用により生じた銀粒子を免疫複合体の標識上に沈着させる反応を実施し、こうして増幅された信号を分析することを除けば、それ以外の点では従来公知のイムノクロマトグラフ法をそのまま適用することができる。
【００２５】
本発明のイムノクロマトグラフキットでは、分析対象物（抗原又は抗体）と特異的に結合する抗体若しくは抗原、又は標準化合物を標識するのに用いる標識として、金属コロイド標識又は金属硫化物標識を用いる。前記金属コロイド標識又は金属硫化物標識としては、通常のイムノクロマトグラフ法に用いることができる標識である限り、特に限定されるものではなく、金属コロイド標識としては、例えば、白金コロイド、金コロイド、パラジウムコロイド、又は銀コロイドそして、それらの混合物を挙げることができ、金属硫化物標識としては、例えば、鉄、銀、パラジウム、鉛、銅、カドミウム、ビスマス、アンチモン、錫、又は水銀の各硫化物を挙げることができる。本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、これらの金属コロイド標識及び／又は金属硫化物標識の１又はそれ以上を標識として用いることができる。
【００２６】
４−２．抗体
本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、分析対象物に対して特異性を有する抗体として、特に限定されるものではないが、例えば、その分析対象物によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その分析対象物によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクロ−ナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。
【００２７】
４−３．クロマトグラフ担体
クロマトグラフ担体としては、多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロ−ス膜、セルロ−ス膜、アセチルセルロ−ス膜、ポリスルホン膜、ポリエ−テルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましい。
通常クロマトグラフ担体の一部に検出用物質を固定化させて検出ゾ−ンを作製する。検出用物質の固定は、検出用物質をクロマトグラフ担体の一部に物理的または化学的結合により直接固定化させてもいいし、検出用物質をラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒子をクロマトグラフ担体の一部にトラップさせて固定化させてもいい。なお、クロマトグラフ担体は、検出用物質を固定化後、不活性蛋白による処理等により非特異的吸着防止処理をして用いるのが好ましい。
【００２８】
４−４．試料添加パッド
試料添加パッドの材質は、セルロ−ス濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテ−ト、酢酸セルロ−ス、ナイロン、及び綿布等の均一な特性を有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。試料添加部は、添加された分析対象物を含む試料を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる。また、分析の際、試料中の分析対象物が試料添加部の材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもある。
【００２９】
４−５．標識化物質保持パッド
標識化物質保持パッドの素材としては、例えば、セルロ−ス濾紙、グラスファイバ−、及び不織布等が挙げられ、前述のように調製した検出用標識物を一定量含浸し、乾燥させて作製する。
【００３０】
４−６．吸収パッド
吸収パッドは、添加された試料がクロマト移動により物理的に吸収されると共に、クロマトグラフ担体の検出部に不溶化されない未反応標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロ−スアセテ−ト等吸水性材料が用いられる。添加された試料のクロマト先端部が吸収部に届いてからのクロマトの速度は、吸収材の材質、大きさなどにより異なるので、その選定により分析対象物の測定に合った速度を設定することができる。
【００３１】
５．免疫検査の方法
以下、本発明に用いられるイムノクロマトグラフ法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法、抗体固定化競合法、抗原固定化競合法、及び固定抗原法にそれぞれ適用した各態様に基づいて、順に説明する。
【００３２】
５−１．サンドイッチ法
本発明のイムノクロマトグラフキットにサンドイッチ法を適用した態様（以下、単に、サンドイッチ法と称する）では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施することができる。まず、分析対象物（抗原）に対して特異性を有する第１抗体及び第２抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、第２抗体を、予め標識化しておく。第１抗体を、適当な不溶性薄膜状支持体（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定し、分析対象物（抗原）を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と接触させると、その被検試料中に分析対象物が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。前記抗原抗体反応と同時又は反応後に、過剰量の標識化第２抗体を更に接触させると、被検試料中に分析対象物が存在する場合には、固定化第１抗体と分析対象物（抗原）と標識化第２抗体とからなる免疫複合体が形成される。
【００３３】
サンドイッチ法では、固定化第１抗体と分析対象物（抗原）と第２抗体との反応が終了した後、前記免疫複合体を形成しなかった標識化第２抗体を除去し、続いて、例えば、不溶性薄膜状支持体における固定化第１抗体を固定した領域に、金属イオン及び還元剤を供給することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第２抗体の標識からの信号を増幅する。あるいは、標識化第２抗体に金属イオン及び還元剤を添加し、同時にこれらを薄膜状支持体に添加することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第２抗体の標識からの信号を増幅する。
【００３４】
５−２．抗体固定化競合法
本発明のイムノクロマトグラフキットに抗体固定化競合法を適用した態様（以下、単に、抗体固定化競合法と称する）では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施することができる。まず、分析対象物（抗原）に対して特異性を有する抗体を、先に述べた方法により予め調製しておき、その抗体を、適当な不溶性薄膜状支持体（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定しておく。また、標準化合物を、予め標識化しておく。分析対象物（抗原）を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と、前記標識化標準化合物とを展開させながら接触させ、それと同時に、あるいは、その終了後に、前記固定化抗体に、前記標識化標準化合物を展開させながら接触させると、その被検試料中に分析対象物が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。
【００３５】
抗体固定化競合法では、前記不溶性薄膜状支持体上の固定化抗体と、標識化標準化合物（すなわち、標識化抗原）との反応が終了した後、固定化抗体と結合した標識化標準化合物と、固定化抗体と結合しなかった標識化標準化合物とを分離し、続いて、例えば、不溶性薄膜状支持体における固定化抗体を固定した領域に、金属イオン及び還元剤を供給することにより、固定化抗体と結合した標識化抗原の標識からの信号を増幅する。あるいは、標識化標準化合物に金属イオン及び還元剤を添加し、同時にこれらを薄膜状支持体に添加することにより、固定化抗体と結合した標識化標準化合物の標識からの信号を増幅する。前記分離は、例えば、緩衝液による洗浄によって行なうことができる。
【００３６】
５−３．抗原固定化競合法
本発明のイムノクロマトグラフキットに抗原固定化競合法を適用した態様（以下、単に抗原固定化競合法と称する）では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施することができる。まず、分析対象物（抗原）に対して特異性を有する抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、前記抗体を、予め標識化しておく。更に、既知量の標準化合物（抗原）を、適当な不溶性薄膜状支持体（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定しておく。
【００３７】
抗原固定化競合法では、前記不溶性薄膜状支持体上の固定化標準化合物（すなわち、固定化抗原）と、標識化抗体との反応が終了した後、固定化標準化合物と結合した標識化抗体と、固定化標準化合物と結合しなかった標識化抗体とを分離し、続いて、例えば、不溶性薄膜状支持体における固定化標準化合物を固定した領域に、金属イオン及び還元剤を供給することにより、固定化標準化合物と結合した標識化抗体の標識からの信号を増幅する。あるいは、標識化抗体に金属イオン及び還元剤を添加し、同時にこれらを薄膜状支持体に添加することにより、固定化標準化合物と結合した標識化抗体の標識からの信号を増幅する。前記分離は、例えば、緩衝液による洗浄によって行なうことができる。
【００３８】
５−４．固定抗原法
本発明のイムノクロマトグラフキットに固定抗原法を適用した態様（以下、単に、固定抗原法と称する）では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施することができる。まず、分析対象物（抗体）に対して特異性を有する第２抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、前記第２抗体を、予め標識化しておく。分析対象物（抗体）が特異的に結合する抗原を、適当な不溶性薄膜状支持体（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定し、分析対象物（抗体）を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と接触させると、その被検試料中に分析対象物が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。前記抗原抗体反応と同時又は反応後に、過剰量の標識化第２抗体を更に接触させると、被検試料中に分析対象物が存在する場合には、固定化抗原と分析対象物（抗体）と標識化第２抗体とからなる免疫複合体が形成される。
【００３９】
固定抗原法では、固定化抗原と分析対象物（抗体）と第２抗体との反応が終了した後、前記免疫複合体を形成しなかった標識化第２抗体を除去し、続いて、例えば、不溶性薄膜状支持体における固定化抗原を固定した領域に、金属イオン及び還元剤を供給することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第２抗体の標識からの信号を増幅する。あるいは、標識化第２抗体に金属イオン及び還元剤を添加し、同時にこれらを薄膜状支持体に添加することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第２抗体の標識からの信号を増幅する。
【００４０】
６．有機銀塩
本発明に用いられる有機銀塩は、還元可能な銀イオンを含む有機化合物である。好ましくは、還元剤の存在下で５０℃以上まで加熱されると、光に比較的に安定な金属銀を形成する銀塩または配位化合物である。
本発明に用いられる有機銀塩は、アゾ−ル化合物の銀塩およびメルカプト化合物の銀塩より選ばれる化合物が好ましい。好ましくは、アゾ−ル化合物としては含窒素ヘテロ環化合物であり、より好ましくはトリアゾ−ル化合物およびテトラゾ−ル化合物である。メルカプト化合物は、メルカプト基またはチオン基を分子内に少なくとも１つ有する化合物
である。
【００４１】
本発明における窒素含有ヘテロ環化合物の銀塩は、好ましくはイミノ基を有する化合物の銀塩である。代表的な化合物としては次にあげるものであるが、これらの化合物に限定されることはない。１，２，４−トリアゾ−ルの銀塩、又はベンゾトリアゾ−ルおよびその誘導体の銀塩（例えば、メチルベンゾトリアゾ−ル銀塩又は５−クロロベンゾトリアゾ−ル銀塩）、米国特許第４，２２０，７０９に記載されているフェニルメルカプトテトラゾ−ルのような１Ｈ−テトラゾ−ル化合物、米国特許第４，２６０，６７７に記載のイミダゾ−ルおよびイミダゾ−ル誘導体。この種の銀塩のうち、特に好ましい化合物はベンゾトリアゾ−ル誘導体の銀塩、又はこれらの２つ以上の混合物である。
本発明に用いられる窒素含有ヘテロ環化合物の銀塩として最も好ましくは、ベンゾトリアゾ−ル誘導体の銀塩である。
【００４２】
本発明におけるメルカプト基またはチオン基を持つ化合物は、好ましくは５つまたは６つの原子を含むヘテロ環化合物である。この場合に環中の原子の少なくとも１つは窒素原子であり、その他の原子は炭素、酸素、硫黄原子である。このようなヘテロ環化合物としてはトリアゾ−ル類オキサゾ−ル類、チアゾ−ル類、チアゾリン類、イミダゾ−ル類、ジアゾ−ル類、ピリジン類、およびトリアジン類が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００４３】
メルカプト基またはチオン基を持つ化合物の銀塩のうち代表的な化合物を以下に挙げるが、これらに限定されるわけではない。
３−メルカプト−４−フェニル−１，２，４−トリアゾ−ルの銀塩、２−メルカプト−ベンズイミダゾ−ルの銀塩、２−メルカプト−５−アミノチアゾ−ルの銀塩、２−（２−エチルグリコ−ルアミド）ベンゾチアゾ−ルの銀塩、５−カルボキシ−１−メチル−２−フェニル−４−チオピリジンの銀塩、メルカプトトリアジンの銀塩、２−メルカプトベンゾオキサゾ−ルの銀塩、米国特許第４，１２３，２７４記載の化合物の銀塩（例えば１，２，４−メルカプトチアゾ−ル誘導体の銀塩、３−アミノ−５−ベンジルチオ−１，２，４−チアゾ−ルの銀塩）、およびチオン化合物の銀塩［例えば米国特許Ｎｏ．３，７８５，８３０に記載の３−（２−カルボキシエチル）−４−メチル−４−チアゾリン−２−チオンの銀塩］。
【００４４】
本発明におけるメルカプト基またはチオン基を持つ化合物としては、ヘテロ環を含まない化合物を用いることも出来る。ヘテロ環を含まないメルカプトまたはチオン誘導体としては、総炭素数が１０以上の脂肪族または芳香族炭化水素化合物が好ましい。
ヘテロ環を含まないメルカプトまたはチオン誘導体のうち有用な化合物としては以下に挙げるものがあるが、これらに制限されるわけではない。
チオグリコ−ル酸銀塩（例えば炭素原子数１２から２２までのアルキル基を持つＳ−アルキルチオグリコ−ル酸の銀塩）、ジチオカルボン酸の銀塩（たとえばジチオ酢酸の銀塩又はチオアミドの銀塩）
【００４５】
カルボン酸の銀塩を持つ有機化合物もまた好ましく用いられる。例えば、直鎖のカルボン酸である。具体的には、Ｃ数６〜２２のカルボン酸が好ましく用いられる。加えて芳香族カルボン酸の銀塩である。芳香族カルボン酸とその他のカルボン酸の例として、以下の化合物が挙げられるが、これらに限定されることはない。
置換または無置換の安息香酸銀（例えば３，５−ジヒドロキシ安息香酸銀、ｏ−メチル安息香酸銀、ｍ−メチル安息香酸銀、ｐ−メチル安息香酸銀、２，４−ジクロロ安息香酸銀、アセタミド安息香酸銀、およびｐ−フェニル安息香酸銀）、タンニン酸銀、フタル酸銀、テレフタル酸銀、サリチル酸銀、フェニル酢酸銀、又はピロメリット酸銀。
【００４６】
本発明においては米国特許第３，３３０，６６３に記載されたようなチオエ−テル基を含む脂肪酸銀もまた好ましく用いられる。エ−テルまたはチオエ−テル結合を含む炭化水素鎖を有するか、α−位（炭化水素基の上）またはオルト位（芳香族基の上）に立体的に遮蔽された置換基を有する可溶性のカルボン酸銀も用いることができる。これらは、塗布溶媒中で溶解性が向上し、光散乱が少ない塗布物になる。
【００４７】
そのような銀のカルボン酸塩は、米国特許第５，４９１，０５９に記載されている。ここで記載されている銀塩の混合物はどれでも、本発明においては必要に応じて使うことができる。
【００４８】
米国特許第４，５０４，５７５に記載のスルホン酸塩の銀塩もまた、本発明の態様においては使用することが出来る。ＥＰ−Ａ−０２２７１４１に記載のｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎａｔｅｓの銀塩もまた、本発明において有用である。
【００４９】
さらに、本発明においては例えば米国特許第４，７６１，３６１と米国特許第４，７７５，６１３に記載のアセチレンの銀塩も使用することが出来る。米国特許第６，３５５，４０８に記載のコア−シェル型銀塩として提供されることもできる。これらの銀塩は、一つ以上の銀塩から成るコアと一つ以上の異なる銀塩からなるシェルで構成される。
【００５０】
本発明中において、非感光性銀源としてもう一つ有用なものは米国特許６４７２１３１に記載の２つの異なった銀塩から構成される銀の二量体合成物である。そのような非感光性の銀の二量体合成物は２つの異なる銀塩から成る。前記二種の銀塩が直鎖の飽和炭化水素基を銀の配位子として含む場合にはそれら配位子の炭素原子数の差が６以上である。
【００５１】
有機銀塩は、銀として一般に０．００１モル／ｍ２〜０．２モル／ｍ２、好ましくは０．００１モル／ｍ２〜０．０５モル／ｍ２含有される。
【００５２】
７．還元剤
銀イオンのための還元剤は、銀（Ｉ）イオンを銀に還元することができるいかなる材料でも用いることができる。
湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬（例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、３−ピラゾリドン類、ｐ−アミノフェノ−ル類、ｐ−フェニレンジアミン類、ヒンダ−ドフェノ−ル類、アミドキシム類、アジン類、カテコ−ル類、ピロガロ−ル類、アスコルビン酸（またはその誘導体）、およびロイコ色素類）、および本分野での技術に熟練しているものにとって明らかなその他の材料は、たとえば米国特許第６，０２０，１１７号（バウア−ほか）で記述されるように、本発明において用いることができる。
【００５３】
「アスコルビン酸還元剤」はアスコルビン酸、及びその誘導体を意味する。アスコルビン酸還元剤は下記のように多くの文献において記載されており、例えば米国特許第５，２３６，８１６号（Ｐｕｒｏｌほか）とその中で引用されている文献が挙げられる。
【００５４】
本発明における還元剤として、アスコルビン酸還元剤が好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸と類似物、異性体とその誘導体を含む。そのような化合物は以下にあげるものを含むが、これらに限定されるわけではない。
Ｄ−またはＬ−アスコルビン酸とその糖誘導体（例えばｓｏｒｂｏａｓｃｏｒｂｉｃ酸、ｇａｍｍａ．−ｌａｃｔｏａｓｃｏｒｂｉｃ酸、６−ｄｅｓｏｘｙ−Ｌアスコルビン酸、Ｌ−ｒｈａｍｎｏａｓｃｏｒｂｉｃ酸、ｉｍｉｎｏ−６−ｄｅｓｏｘｙ−Ｌアスコルビン酸、ｇｌｕｃｏａｓｃｏｒｂｉｃ酸、ｆｕｃｏａｓｃｏｒｂｉｃ酸、ｇｌｕｃｏｈｅｐｔｏａｓｃｏｒｂｉｃ酸、ｍａｌｔｏａｓｃｏｒｂｉｃ酸、Ｌ−ａｒａｂｏｓａｓｃｏｒｂｉｃ酸）、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸（またはＬ−エリスロアスコルビン酸）、その塩（例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩または当技術分野において知られている塩）、ｅｎｄｉｏｌタイプのアスコルビン酸、ｅｎａｍｉｎｏｌタイプのアスコルビン酸、チオエノ−ルタイプのアスコルビン酸、たとえば米国特許第５，４９８，５１１、ＥＰ−Ａ−０５８５，７９２、ＥＰ−Ａ−０５７３７００、ＥＰ−Ａ−０５８８４０８、米国特許第５，０８９，８１９、米国特許第５，２７８，０３５、米国特許第５，３８４，２３２、米国特許第５，３７６，５１０、ＪＰ７−５６２８６、米国特許第２，６８８，５４９、およびＲｅｓｅａｃｈ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ３７１５２（１９９５年３月）に記載されているような化合物。
【００５５】
これらの化合物のうち、好ましくは、Ｄ、ＬまたはＤ，Ｌ−アスコルビン酸（そして、そのアルカリ金属塩）かイソアスコルビン酸（またはそのアルカリ金属塩）であり、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。
【００５６】
ヒンダ−ドフェノ−ル類も単独で、または一つ以上の硬調化還元剤とコントラスト強化剤と組み合わせて好ましく用いられる。
ヒンダ−ドフェノ−ルは、ベンゼン環上に一つだけの水酸基を有し、少なくとも一つの置換基を水酸基に対してオルト位に有する化合物である。ヒンダ−ドフェノ−ル還元剤は複数の水酸基を別々のベンゼン環に持っていれば、複数の水酸基を有していて構わない。
ヒンダ−ドフェノ−ル還元剤は、たとえば、ビナフト−ル類（すなわちジヒドロキシビナフト−ル類）、ビフェノ−ル類（すなわちジヒドロキシビフェノ−ル類）、ビス（ヒドロキシナフチル）メタン類、ビス（ヒドロキシフェニル）メタン類（すなわちビスフェノ−ル類）、ヒンダ−ドフェノ−ル類、およびヒンダ−ドナフト−ル類が挙げられ、これらは置換されていて構わない。
【００５７】
代表的なビナフト−ル類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
１，１’−ｂｉ−２−ナフト−ル、１，１’−ｂｉ−４−メチル−２−ナフト−ル、６，６’−ジブロモ−ｂｉ−２−ナフト−ル、および米国特許第３，０９４，４１７号と米国特許第５，２６２，２９５号に記載されている化合物。
【００５８】
代表的なビフェノ−ル類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
２，２’−ジヒドロキシ−３，３’−ｄｉ−ｔ−ブチル−５，５’−ジメチルビフェニル、２，２’−ジヒドロキシ−３，３’，５，５’−テトラ−ｔ−ブチルビフェニル、２，２’−ジヒドロキシ−３，３’−ｄｉ−ｔ−ブチル−５，５’−ジクロロビフェニル、２−（２−ヒドロキシ−３−ｔ−ブチル−５−メチルフェニル）−４−メチル−６−ｎ−ヘキシルフェノ−ル、４，４’−ジヒドロキシ−３，３’，５，５’−テトラ−ｔ−ブチルビフェニル、４，４’−ジヒドロキシ−３，３’，５，５’−テトラメチルビフェニル、および米国特許第５，２６２，２９５号に記載の化合物。
【００５９】
代表的なビス（ヒドロキシナフチル）メタン類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
４，４’−メチレンビス（２−メチル−１−ナフト−ル）、米国特許第５，２６２，２９５号に記載の化合物。
【００６０】
代表的なビス（ヒドロキシフェニル）メタン類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
ビス（２−ヒドロキシ−３−ｔ−ブチル−５−メチルフェニル）メタン（ＣＡＯ−５）、１，１’−ビス（２−ヒドロキシ−３，５−ジメチルフェニル）−３，５，５−トリメチルヘキサン（ＮＯＮＯＸまたはＰＥＲＭＡＮＡＸ  ＷＳＯ）、１，１’−ビス（３，５−ｄｉ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）メタン、２，２’−ビス（４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル）プロパン、４，４’−エチリデン−ビス（２−ｔ−ブチル−６−メチルフェノ−ル）、２，２’−イソブチリデン−ビス（４，６−ジメチルフェノ−ル）（ＬＯＷＩＮＯＸ  ２２１Ｂ４６）、２，２’−ビス（３，５−ジメチル−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、および米国特許第５，２６２，２９５号に記載の化合物。
【００６１】
代表的なヒンダ−ドフェノ−ルは以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
２，６−ジ−ｔ−ブチルフェノ−ル、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノ−ル、２，４−ジ−ｔ−ブチルフェノ−ル、２，６−ジクロロフェノ−ル、２，６−ジメチルフェノ−ル、および２−ｔ−ブチル−６−メチルフェノ−ル。
【００６２】
代表的なヒンダ−ドナフト−ルは以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
１−ナフト−ル、４−メチル１−ナフト−ル、４−メトキシ１−ナフト−ル、４−クロロ１−ナフト−ル、２−メチル１−ナフト−ル、および米国特許第５，２６２，２９５号に記載の化合物。
【００６３】
その他、下記の化合物も還元剤として開示されている。
アミドキシム類（例えばフェニルアミドキシム）、２−チエニルアミドキシム、ｐ−フェノキシフェニルアミドキシム、アジン類（たとえば４−ヒドロキシ−３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｒａｚｉｎｅ）、脂肪族カルボン酸アリルヒドラジドとアスコルビン酸の組み合わせ（例えば２，２’−ｂｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−β−ｐｈｅｎｙｌヒドラジドとアスコルビン酸の組み合わせ）、ポリヒドロキシベンゼンとヒドロキシルアミン、レダクトンおよびヒドラジンの少なくとも一方の組合せ（たとえばヒドロキノンとビス（エトキシエチル）ヒドロキシルアミンの組合せ）、ピペリジ−４−メチルフェニルヒドラジン、ヒドロキサム酸（例えばフェニルヒドロキサム酸、ｐ−ヒドロキシフェニルヒドロキサム酸、およびｏ−アラニンヒドロキサム酸）、アジンとスルホンアミドフェノ−ル類の組合せ（たとえばフェノチアジンと２，６−ジクロロ−４−ベンゼンスルホンアミドフェノ−ル）、α−シアノフェニル酢酸誘導体（例えばエチル−α−シアノ−２−メチルフェニル酢酸、エチル−α−シアノフェニル酢酸）、ビス−ｏ−ナフト−ル（例えば２，２’−ジヒドロキシ−１−ビナフチル、６，６’−ジブロモ−２，２’−ジヒドロキシ−１，１’−ビナフチル、ビス（２−ヒドロキシ−１−ナフチル）メタン］、
【００６４】
ビス−ｏ−ナフト−ルと１，３−ジヒドロキシベンゼン誘導体の組み合わせ（例えば２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２，４−ジヒドロキシアセトフェノン）、５−ピラゾロン（例えば３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン）、レダクトン類（例えばジメチルアミノヘキソ−スレダクトン、アンヒドロジヒドロ−アミノヘキソ−スレダクトン、またはアンヒドロジヒドロ−ピペリドン−ヘキソ−スレダクトン）、スルホンアミドフェノ−ル還元剤（例えば２，６−ジクロロ−４−ベンゼンスルホンアミドフェノ−ル、ｐ−ベンゼンスルホンアミドフェノ−ル）、インダン−１，３−ジオン類（例えば２−フェニルインダン−１，３−ジオン）、クロマン類（例えば２，２−ジメチル−７−ｔ−ブチル−６−ヒドロキシクロマン）、１，４−ジヒドロキシピリジン類（例えば２，６−ジメトキシ−３，５−ジカルベトキシ−１，４−ジヒドロピリジン）、アスコルビン酸誘導体（１−アスコルビン酸パルミテ−ト、アスコルビン酸ステアレ−ト）、不飽和アルデヒド（ケトン）、３−ピラゾリドン類。
【００６５】
本発明に用いることのできる還元剤として、米国特許第５，４６４，７３８に記載されるようなスルホニルヒドラジンを含む置換ヒドラジンがある。この他の有用な還元剤は、例えば、米国特許第３，０７４，８０９、米国特許第３，０９４，４１７、米国特許第３，０８０，２５４および米国特許第３，８８７，４１７に記載されている。米国特許第５，９８１，１５１に記載の補助還元剤もまた有用である。
【００６６】
還元剤として、ヒンダ−ドフェノ−ル還元剤とその他以下に挙げるような様々な補助還元剤から選ばれる化合物と組み合わせて用いられる場合もある。さらにコントラスト強化剤を加えた３成分の還元剤の混合物もまた有用である。補助還元剤としては米国特許第５，４９６，６９５に記載のトリチルヒドラジド、ホルミル−フェニルヒドラジドを用いることができる。
【００６７】
コントラスト強化剤を還元剤とともに用いることができる。コントラスト強化剤としては例えば、下記の化合物が有用であるが、これらに限定されるわけではない。
ヒドロキシルアミン（ヒドロキシルアミンとａｌｋｙｌ−とアリ−ル置換誘導体を含む）、米国特許第５，５４５，５０５に記載のａｌｋａｎｏｌａｍｉｎｅｓとフタル酸アンモニウム、米国特許第５，５４５，５０７に記載のヒドロキサム酸化合物、米国特許第５，５５８，９８３に記載のＮ−アシルヒドラジン化合物、米国特許第５，６３７，４４９に記載の水素原子ドナ−化合物。
【００６８】
全ての還元剤と有機銀塩の組み合わせが等しく効果があるわけではない。好ましい組合せの一つは、有機銀塩としてベントリアゾ−ルの銀塩又はその置換化合物、又はその混合物と、還元剤としてアスコルビン酸型還元剤である。
【００６９】
本発明における還元剤は、有機銀中の銀に対して１質量％〜１０質量％（乾燥質量）含まれる。多層構造において、還元剤が有機銀塩を含む層以外の層に加えられるならば、わずかに割合は高く、およそ２質量％〜１５質量％がより望ましい。補助還元剤は、およそ０．００１質量％〜１．５質量％（乾燥重）含まれる。
【００７０】
本発明のキットは被検試料の展開後に加熱することが好ましい。好ましい加熱温度は４０℃〜９０℃であり、好ましい加熱時間は１秒〜１２０秒である。
【実施例】
【００７１】
実施例１
実施例１では、ｈＣＧ検出系で本発明のイムノクロマトグラフキットが高感度であることを以下に実証する。
【００７２】
１．検出用標識物である抗ｈＣＧ抗体修飾金コロイドの作製
直径５０ｎｍ金コロイド溶液（ＥＭ．ＧＣ５０、ＢＢＩ社）９ｍＬに５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４バッファ−（ｐＨ＝７．０）１ｍＬを加えることでｐＨを調整した金コロイド溶液に、５０μｇ／ｍＬの抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ  ５００８  ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液１ｍＬを加え攪拌した。１０分間静置した後、１質量％ポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ、Ｍｗ．２００００、品番１６８−１１２８５、和光純薬）水溶液を５５０μＬ加え攪拌し、続いて１０質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ  ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、品番Ａ−７９０６、ＳＩＧＭＡ）水溶液を１．１ｍＬ加え攪拌した。この溶液を８０００Ｇ、４℃、３０分間遠心（ｈｉｍａｃＣＦ１６ＲＸ、日立（株））した後、１ｍＬ程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、２０ｍＬの金コロイド保存液（２０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ−（ｐＨ＝８．２），０．０５質量％ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００），１５０ｍＭＮａＣｌ，１質量％ＢＳＡ，０．１質量％ＮａＮ３）に分散し、再び８０００Ｇ、４℃、３０分間遠心した後、１ｍＬ程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（平均粒径５０ｎｍ）溶液を得た。
【００７３】
２．金コロイド抗体保持パットの作製
１で作製した各抗体修飾金コロイドを、金コロイド塗布液（２０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌバッファ−（ｐＨ＝８．２），０．０５質量％ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００），５質量％スクロ−ス）及び水により希釈し、５２０ｎｍのＯＤが１．５となるように希釈した。この溶液を、８ｍｍ×１５０ｍｍに切ったグラスファイバ−パッド（Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ、ミリポア社）１枚あたり０．８ｍＬずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。
【００７４】
３．抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作製
２５ｍｍ×２００ｍｍに切断したニトロセルロ−スメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、ＨｉＦｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  ＨＦ１２０ミリポア社）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作製した。メンブレンの長辺を下にし、下から８ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した固定化用抗ｈＣＧモノクロ−ナル抗体（Ａｎｔｉ−Ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ６６０１  ＳＰＲ−５、Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液をインクジェット方式の塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社）を用いて幅１ｍｍ程度のライン状に塗布した（「検出部」を形成する。）。同様に、下から１２ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製したコントロ−ル用抗マウスＩｇＧ抗体（抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ウサギＦ（ａｂ’）２，品番５６６−７０６２１、和光純薬）溶液をライン状に塗布した（「コントロール部」を形成する。）。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で５０℃、３０分間乾燥した。ブロッキング液（０．５質量％カゼイン（乳由来、品番０３０−０１５０５、和光純薬）含有５０ｍＭホウ酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ＝８．５））５００ｍＬをバットに入れ、そのまま３０分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（０．５質量％スクロ−ス、０．０５質量％コ−ル酸ナトリウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ＝７．５））５００ｍＬに移して浸し、そのまま３０分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンを得た。
【００７５】
４．有機銀塩含有シ−トの作製
４−１．塗布用材料の準備
【００７６】
１）脂肪酸銀分散物の調製
＜脂肪酸銀分散物の調製＞
ラウリン酸１５０ｇ、蒸留水４２２ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌ濃度のＮａＯＨ水溶液４９．２ｍＬ、ｔ−ブチルアルコ−ル１２０ｍＬを混合し、７５℃にて１時間攪拌し反応させ、ラウリン酸ナトリウム溶液を得た。別に、硝酸銀４０．４ｇの水溶液２０６．２ｍＬ（ｐＨ４．０）を用意し、１０℃にて保温した。６３５ｍＬの蒸留水と３０ｍＬのｔ−ブチルアルコ−ルを入れた反応容器を３０℃に保温し、十分に撹拌しながら先のラウリン酸ナトリウム溶液の全量と硝酸銀水溶液の全量を流量一定でそれぞれ９３分１５秒と９０分かけて添加した。このとき、硝酸銀水溶液添加開始後１１分間は硝酸銀水溶液のみが添加されるようにし、そのあとラウリン酸ナトリウム溶液を添加開始し、硝酸銀水溶液の添加終了後１４分１５秒間はラウリン酸ナトリウム溶液のみが添加されるようにした。このとき、反応容器内の温度は３０℃とし、液温度が一定になるように外温コントロ−ルした。また、ラウリン酸ナトリウム溶液の添加系の配管は、２重管の外側に温水を循環させる事により保温し、添加ノズル先端の出口の液温度が７５℃になるよう調製した。また、硝酸銀水溶液の添加系の配管は、２重管の外側に冷水を循環させることにより保温した。ラウリン酸ナトリウム溶液の添加位置と硝酸銀水溶液の添加位置は撹拌軸を中心として対称的な配置とし、また反応液に接触しないような高さに調製した。
【００７７】
ラウリン酸ナトリウム溶液を添加終了後、そのままの温度で２０分間撹拌放置し、３０分かけて３５℃に昇温し、その後２１０分熟成を行った。熟成終了後直ちに、遠心濾過で固形分を濾別し、固形分を濾過水の伝導度が３０μＳ／ｃｍになるまで水洗した。こうして脂肪酸銀塩を得た。得られた固形分は、乾燥させないでウエットケ−キとして保管した。
得られたラウリン酸銀粒子の形態を電子顕微鏡撮影により評価したところ、平均値で厚さ＝０．１μｍ、縦＝０．２μｍ、横＝０．２μｍ、平均アスペクト比１．９球相当径の変動係数１１％の結晶であった。
【００７８】
乾燥固形分２６０ｋｇ相当のウエットケ−キに対し、ポリビニルアルコ−ル（商品名：ＰＶＡ−２１７）１９．３ｋｇ及び水を添加し、全体量を１０００ｋｇとしてからディゾルバ−羽根でスラリ−化し、更にパイプラインミキサ−（みづほ工業製：ＰＭ−１０型）で予備分散した。
【００７９】
次に予備分散済みの原液を分散機（商品名：マイクロフルイダイザ−Ｍ−６１０、マイクロフルイデックス・インタ−ナショナル・コ−ポレ−ション製、Ｚ型インタラクションチャンバ−使用）の圧力を１１５０ｋｇ／ｃｍ２に調節して、三回処理し、ベヘン酸銀分散物を得た。冷却操作は蛇管式熱交換器をインタラクションチャンバ−の前後に各々装着し、冷媒の温度を調節することで１８℃の分散温度に設定した。
【００８０】
２）還元剤分散物の調製
《還元剤−２分散物の調製》
還元剤−２（６，６’−ジ−ｔ−ブチル−４，４’−ジメチル−２，２’−ブチリデンジフェノ−ル）１０ｋｇと変性ポリビニルアルコ−ル（クラレ（株）製、ポバ−ルＭＰ２０３）の１０質量％水溶液１６ｋｇに、水１０ｋｇを添加して、良く混合してスラリ−とした。このスラリ−をダイアフラムポンプで送液し、平均直径０．５ｍｍのジルコニアビ−ズを充填した横型サンドミル（ＵＶＭ−２：アイメックス（株）製）にて３時間３０分分散したのち、ベンゾイソチアゾリノンナトリウム塩０．２ｇと水を加えて還元剤の濃度が２５質量％になるように調製した。この分散液を４０℃で１時間加熱した後、引き続いてさらに８０℃で１時間加熱処理し、還元剤−２分散物を得た。こうして得た還元剤分散物に含まれる還元剤粒子はメジアン径０．５０μｍ、最大粒子径１．６μｍ以下であった。得られた還元剤分散物は孔径３．０μｍのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納した。
【００８１】
３）水素結合性化合物−１分散物の調製
水素結合性化合物−１（トリ（４−ｔ−ブチルフェニル）ホスフィンオキシド）１０ｋｇと変性ポリビニルアルコ−ル（クラレ（株）製、ポバ−ルＭＰ２０３）の１０質量％水溶液１６ｋｇに、水１０ｋｇを添加して、良く混合してスラリ−とした。このスラリ−をダイアフラムポンプで送液し、平均直径０．５ｍｍのジルコニアビ−ズを充填した横型サンドミル（ＵＶＭ−２：アイメックス（株）製）にて４時間分散したのち、ベンゾイソチアゾリノンナトリウム塩０．２ｇと水を加えて水素結合性化合物の濃度が２５質量％になるように調製した。この分散液を４０℃で１時間加熱した後、引き続いてさらに８０℃で１時間加温し、水素結合性化合物−１分散物を得た。こうして得た水素結合性化合物分散物に含まれる水素結合性化合物粒子はメジアン径０．４５μｍ、最大粒子径１．３μｍ以下であった。得られた水素結合性化合物分散物は孔径３．０μｍのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納した。
【００８２】
４）還元促進剤−１分散物の調製
還元促進剤−１を１０ｋｇと変性ポリビニルアルコ−ル（クラレ（株）製、ポバ−ルＭＰ２０３）の１０質量％水溶液２０ｋｇに、水１０ｋｇを添加して、良く混合してスラリ−とした。このスラリ−をダイアフラムポンプで送液し、平均直径０．５ｍｍのジルコニアビ−ズを充填した横型サンドミル（ＵＶＭ−２：アイメックス（株）製）にて３時間３０分分散したのち、ベンゾイソチアゾリノンナトリウム塩０．２ｇと水を加えて現像促進剤の濃度が２０質量％になるように調製し、現像促進剤−１分散物を得た。こうして得た還元促進剤分散物に含まれる還元促進剤粒子はメジアン径０．４８μｍ、最大粒子径１．４μｍ以下であった。得られた還元促進剤分散物は孔径３．０μｍのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納した。
５）還元促進剤−２の分散物調製
還元促進剤−２の固体分散物についても還元促進剤−１と同様の方法により分散し、２０質量％の分散液を得た。
【００８３】
６）ポリハロゲン化合物の調製
《有機ポリハロゲン化合物−１分散物の調製》
有機ポリハロゲン化合物−１（トリブロモメタンスルホニルベンゼン）１０ｋｇと変性ポリビニルアルコ−ル（クラレ（株）製ポバ−ルＭＰ２０３）の２０質量％水溶液１０ｋｇと、トリイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウムの２０質量％水溶液０．４ｋｇと、水１４ｋｇを添加して、良く混合してスラリ−とした。このスラリ−をダイアフラムポンプで送液し、平均直径０．５ｍｍのジルコニアビ−ズを充填した横型サンドミル（ＵＶＭ−２：アイメックス（株）製）にて５時間分散したのち、ベンゾイソチアゾリノンナトリウム塩０．２ｇと水を加えて有機ポリハロゲン化合物の濃度が２６質量％になるように調製し、有機ポリハロゲン化合物−１分散物を得た。こうして得たポリハロゲン化合物分散物に含まれる有機ポリハロゲン化合物粒子はメジアン径０．４１μｍ、最大粒子径２．０μｍ以下であった。得られた有機ポリハロゲン化合物分散物は孔径１０．０μｍのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納した。
【００８４】
《有機ポリハロゲン化合物−２分散物の調製》
有機ポリハロゲン化合物−２（Ｎ−ブチル−３−トリブロモメタンスルホニルベンゾアミド）１０ｋｇと変性ポリビニルアルコ−ル（クラレ（株）製ポバ−ルＭＰ２０３）の１０質量％水溶液２０ｋｇと、トリイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウムの２０質量％水溶液０．４ｋｇを添加して、良く混合してスラリ−とした。このスラリ−をダイアフラムポンプで送液し、平均直径０．５ｍｍのジルコニアビ−ズを充填した横型サンドミル（ＵＶＭ−２：アイメックス（株）製）にて５時間分散したのち、ベンゾイソチアゾリノンナトリウム塩０．２ｇと水を加えて有機ポリハロゲン化合物の濃度が３０質量％になるように調製した。この分散液を４０℃で５時間加温し、有機ポリハロゲン化合物−２分散物を得た。こうして得たポリハロゲン化合物分散物に含まれる有機ポリハロゲン化合物粒子はメジアン径０．４０μｍ、最大粒子径１．３μｍ以下であった。得られた有機ポリハロゲン化合物分散物は孔径３．０μｍのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納した。
【００８５】
７）フタラジン化合物−１溶液の調製
８ｋｇのクラレ（株）製変性ポリビニルアルコ−ルＭＰ２０３を水１７４．５７ｋｇに溶解し、次いでトリイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウムの２０質量％水溶液３．１５ｋｇとフタラジン化合物−１（６−イソプロピルフタラジン）の７０質量％水溶液１４．２８ｋｇを添加し、フタラジン化合物−１の５質量％溶液を調製した。
【００８６】
８）メルカプト化合物の調製
《メルカプト化合物−１水溶液の調製》
メルカプト化合物−１（１−（３−スルホフェニル）−５−メルカプトテトラゾ−ルナトリウム塩）７ｇを水９９３ｇに溶解し、０．７質量％の水溶液とした。
【００８７】
《メルカプト化合物−２水溶液の調製》
メルカプト化合物−２（１−（３−メチルウレイドフェニル）−５−メルカプトテトラゾ−ル）２０ｇを水９８０ｇに溶解し、２．０質量％の水溶液とした。
【００８８】
９）ＳＢＲラテックス液の調製
ガスモノマ−反応装置（耐圧硝子工業（株）製ＴＡＳ−２Ｊ型）の重合釜に、蒸留水２８７ｇ、界面活性剤（パイオニンＡ−４３−Ｓ（竹本油脂（株）製）：固形分４８．５質量％）７．７３ｇ、１ｍｏｌ／Ｌ、ＮａＯＨ１４．０６ｍｌ、エチレンジアミン４酢酸４ナトリウム塩０．１５ｇ、スチレン２５５ｇ、アクリル酸１１．２５ｇ、ｔｅｒｔ−ドデシルメルカプタン３．０ｇを入れ、反応容器を密閉し撹拌速度２００ｒｐｍで撹拌した。真空ポンプで脱気し窒素ガス置換を数回繰返した後に、１，３−ブタジエン１０８．７５ｇを圧入して内温６０℃まで昇温した。ここに過硫酸アンモニウム１．８７５ｇを水５０ｍｌに溶解した液を添加し、そのまま５時間撹拌した。さらに９０℃に昇温して３時間撹拌し、反応終了後内温が室温になるまで下げた後、１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨとＮＨ４ＯＨを用いてＮａ＋イオン：ＮＨ４＋イオン＝１：５．３（モル比）になるように添加処理し、ｐＨ８．４に調整した。その後、孔径１．０μｍのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納し、ＳＢＲラテックスＴＰ−１を７７４．７ｇ得た。
イオンクロマトグラフィ−によりハロゲンイオンを測定したところ、塩化物イオン濃度３ｐｐｍであった。高速液体クロマトグラフィ−によりキレ−ト剤の濃度を測定した結果、１４５ｐｐｍであった。
【００８９】
上記ラテックスは、ゲル化率７３質量％、平均粒径９０ｎｍ、Ｔｇ＝１７℃、固形分濃度４４質量％、２５℃６０％ＲＨにおける平衡含水率０．６質量％、イオン伝導度４．８０ｍＳ／ｃｍ（イオン伝導度の測定は東亜電波工業（株）製伝導度計ＣＭ−３０Ｓ使用し２５℃にて測定）であった。
【００９０】
４−２．塗布液の調製
【００９１】
１）有機銀塩含有層塗布液の調製
上記で得た脂肪酸銀分散物１０００ｇ、水１３５ｍＬ、有機ポリハロゲン化合物−１分散物２５ｇ、有機ポリハロゲン化合物−２分散物３９ｇ、フタラジン化合物−１溶液１７１ｇ、ＳＢＲラテックス液１０６０ｇ、還元剤−２分散物１５３ｇ、水素結合性化合物−１分散物２２ｇ、還元促進剤−１分散物４．８ｇ、還元促進剤−２分散物５．２ｇ、およびメルカプト化合物−２水溶液８ｍＬを順次添加し、そのままコ−ティングダイへ送液し、塗布した。
【００９２】
２）中間層塗布液の調製
ポリビニルアルコ−ルＰＶＡ−２０５（クラレ（株）製）１０００ｇ、スルホコハク酸ジ（２−エチルヘキシル）ナトリウム塩５質量％水溶液２７ｍｌ、メチルメタクリレ−ト／スチレン／ブチルアクリレ−ト／ヒドロキシエチルメタクリレ−ト／アクリル酸共重合体（共重合質量比５７／８／２８／５／２）ラテックス１９質量％液４２００ｍＬにエアロゾ−ルＯＴ（アメリカンサイアナミド社製）の５質量％水溶液を２７ｍＬ、フタル酸二アンモニウム塩の２０質量％水溶液を１３５ｍｌ、総量１００００ｇになるように水を加え、ｐＨが７．５になるようにＮａＯＨで調整して中間層塗布液とし、８．９ｍＬ／ｍ２になるようにコ−ティングダイへ送液した。
【００９３】
３）第２の保護層塗布液の調製
イナ−トゼラチン１００ｇ、ベンゾイソチアゾリノン１０ｍｇを水８４０ｍＬに溶解し、メチルメタクリレ−ト／スチレン／ブチルアクリレ−ト／ヒドロキシエチルメタクリレ−ト／アクリル酸共重合体（共重合質量比５７／８／２８／５／２）ラテックス１９質量％液１８０ｇ、フタル酸の１５質量％メタノ−ル溶液を４６ｍＬ、スルホコハク酸ジ（２−エチルヘキシル）ナトリウム塩の５質量％水溶液を５．４ｍＬを加えて混合し、塗布直前に４質量％のクロムみょうばん４０ｍＬをスタチックミキサ−で混合したものを塗布液量が２６．１ｍＬ／ｍ２になるようにコ−ティングダイへ送液した。
【００９４】
【化１】
2008139297.tif 000002
【００９５】
【化２】
2008139297.tif 000003
【００９６】
【化３】
2008139297.tif 000004
【００９７】
４）第１の保護層塗布液の調製
イナ−トゼラチン１００ｇ、ベンゾイソチアゾリノン１０ｍｇを水８００ｍＬに溶解し、流動パラフィンの１０質量％乳化物を１０ｇ、ヘキサイソステアリン酸ジペンタエリスリットの１０質量％乳化物を３０ｇ、メチルメタクリレ−ト／スチレン／ブチルアクリレ−ト／ヒドロキシエチルメタクリレ−ト／アクリル酸共重合体（共重合質「量比５７／８／２８／５／２）ラテックス１９質量％液１８０ｇ、フタル酸１５質量％メタノ−ル溶液４０ｍＬ、フッ素系界面活性剤（Ｆ−１）の１質量％溶液を５．５ｍＬ、フッ素系界面活性剤（Ｆ−２）の１質量％水溶液を５．５ｍＬ、スルホコハク酸ジ（２−エチルヘキシル）ナトリウム塩の５質量％水溶液を２８ｍＬ、ポリメチルメタクリレ−ト微粒子（平均粒径０．７μｍ、体積加重平均の分布３０％）４ｇ、ポリメチルメタクリレ−ト微粒子（平均粒径３．６μｍ、体積加重平均の分布６０％）２１ｇを混合したものを最外層塗布液とし、８．３ｍＬ／ｍ２になるようにコ−ティングダイへ送液した。
【００９８】
４−３．有機銀塩含有シ−トの塗布
仮支持体（厚み１００μｍのＰＥＴ）上に有機銀塩層、中間層、第２保護層、および第１保護層の順番でスライドビ−ド塗布方式にて同時重層塗布し、熱現像感光材料の試料を作製した。このとき、有機銀塩層と中間層の塗布液は３１℃に、第２の保護層塗布液は３６℃に、第１保護層塗布液は３７℃に温度調整した。
有機銀塩層の各化合物の塗布量（ｇ／ｍ２）は以下の通りである。
【００９９】
・脂肪酸銀                                              ３．０９
・ポリハロゲン化合物−１                                ０．１４
・ポリハロゲン化合物−２                                ０．２８
・フタラジン化合物−１                                  ０．１８
・ＳＢＲラテックス                                      ９．４３
・還元剤−２                                            ０．７７
・水素結合性化合物−１                                  ０．１１２
・還元促進剤−１                                        ０．０１９
・還元促進剤−２                                        ０．０１６
・メルカプト化合物−２                                  ０．００３
【０１００】
塗布乾燥条件は以下のとおりである。
塗布はスピ−ド１６０ｍ／ｍｉｎで行い、コ−ティングダイ先端と支持体との間隙を０．１０ｍｍ〜０．３０ｍｍとし、減圧室の圧力を大気圧に対して１９６Ｐａ〜８８２Ｐａ低く設定した。支持体は塗布前にイオン風にて除電した。
引き続くチリングゾ−ンにて、乾球温度１０℃〜２０℃の風にて塗布液を冷却した後、無接触型搬送して、つるまき式無接触型乾燥装置にて、乾球温度２３℃〜４５℃、湿球温度１５℃〜２１℃の乾燥風で乾燥させた。
乾燥後、２５℃で湿度４０％ＲＨ〜６０％ＲＨで調湿した後、膜面を７０℃〜９０℃になるように加熱した。加熱後、膜面を２５℃まで冷却した。
【０１０１】
４−４．増感シートの作製
得られた塗布試料を２００ｍｍ×７０ｍｍに裁断し、その保護層表面にポリエステル粘着テ−プ（日東電工（株）製  Ｎｏ３１Ｂ  ７１ハイ）を貼り付け、仮支持体より有機銀塩層を含む塗布層を粘着テープに貼り付けて剥離し、増感シートを得た。
【０１０２】
５．イムノクロマトグラフキットの作製
５−１．キットＡ（比較例）の組み立て
図１に示すように、バック粘着シ−ト１（ＡＲｃａｒｅ９０２０、ニップンテクノクラスタ社）に、抗体固定化メンブレン３を貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗ｈＣＧ抗体ライン側を下側とする。抗体固定化メンブレンの下側に約２ｍｍ重なるように金コロイド抗体保持パッド２を貼り付け、約４ｍｍ重なるようにして金コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド５（１８ｍｍ×１５０ｍｍに切ったグラスファイバ−パッド（Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約５ｍｍ重なるように吸収パッド４（２０ｍｍ×１５０ｍｍに切ったセルロ−ス膜（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材を、部材の長辺側を５ｍｍ幅になるように短辺に平行にギロチン式カッタ−（ＣＭ４０００、ニップンテクノクラスタ社）切断していくことで、５ｍｍ×５５ｍｍのイムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。これらをプラスチックケ−ス（ニップンテクノクラスタ社）に入れ、試験用イムノクロマトグラフキットＡとした。捕捉部位３ａは、検体の抗体を検出する検出部３１とプロセスのノイズを示すコントロール部３２よりなり、これらの部の発色（黒化）濃度の差から判定を下すことができる。抗体固定化メンブレン３の固定化用抗ｈＣＧモノクロ−ナル抗体をライン状に塗布した箇所が検出部３１であり、コントロ−ル用抗マウスＩｇＧ抗体をライン状に塗布した箇所がコントロール部３２である。
【０１０３】
５−２．キットＢ（本発明）の組み立て
バック粘着シ−ト１（ＡＲｃａｒｅ９０２０、ニップンテクノクラスタ社）に、３で作製した抗体固定化メンブレン３を貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗ｈＣＧ抗体ライン側を下側とする。その上に増感シ−ト６を有機銀塩層面を抗体固定化メンブレン面に対面するように貼り付けた。抗体固定化メンブレンの下側に約２ｍｍ重なるように２で作製した金コロイド抗体保持パッド２を貼り付け、約４ｍｍ重なるようにして金コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド５（１８ｍｍ×１５０ｍｍに切ったグラスファイバ−パッド（Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約５ｍｍ重なるように吸収パッド４（２０ｍｍ×１５０ｍｍに切ったセルロ−ス膜（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材を、部材の長辺側を５ｍｍ幅になるように短辺に平行にギロチン式カッタ−（ＣＭ４０００、ニップンテクノクラスタ社）切断していくことで、５ｍｍ×５５ｍｍのイムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。これらをプラスチックケ−ス（ニップンテクノクラスタ社）に入れ、試験用イムノクロマトグラフキットＢとした。
【０１０４】
６．性能評価
１）最小検出感度試験法
１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファ−にｈＣＧ（リコンビナントｈＣＧ  Ｒ−５０６、ロ−ト製薬（株）製）を溶解し、各濃度の試験用ｈＣＧ溶液を作製した。
各試験用イムノクロマトグラフキットに、各濃度の試験用ｈＣＧ溶液を１００μＬ滴下し、１５分後に抗体固定メンブレンの抗ｈＣＧ抗体を塗布した部位（捕捉部位）を目視した際の着色度合いを、着色が濃い「＋＋＋」、着色がある「＋＋」、薄い着色がある「＋」、着色がない「−」、の４段階で判別した。
最も薄い濃度で判別できた濃度をそのキットでの最小検出感度とした。
尚、キットＢは滴下１３分後に、キットの表面温度が６０℃になる様にホットプレートで３０秒間熱をかけた。
【０１０５】
２）結果
【０１０６】
【表１】
2008139297.tif 000005
【０１０７】
表１から明らかなように、本発明によるキットＢは比較のキットＡに比較して、極めて高感度にｈＣＧを検出できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】比較のイムノクロマトグラフキットの一態様を模式的に示す平面図である。
【図２】図１で示されたイムノクロマトグラフキットの縦断面を模式的に示す縦断面図である。
【図３】本発明のイムノクロマトグラフキットの縦断面を模式的に示す縦断面図である。
【符号の説明】
【０１０９】
１：バック粘着シート
２：金コロイド抗体保持パッド
３：抗体固定化メンブレン
３ａ：  捕捉部位  
３１：検出部
３２：コントロール部
４：吸収パッド
５：試料添加パッド
６：増感シート
１０：イムノクロマトグラフキット
【図１】
2008139297.tif 000006
【図２】
2008139297.tif 000007
【図３】
2008139297.tif 000008