(57)【要約】【課題】生体試料から取得した軟骨試料を脱水・乾燥させることなく、３次元的に軟骨の変位を測定できる方法を提供すること。３次元情報を用いた軟骨の表面粗さを評価することによって、客観的に軟骨変性の進行程度を定量的に評価できる方法を提供すること。【解決手段】分解能が１０μｍ未満の変位センサを用いて、被験生体試料から取得した軟骨の表面の変性を評価する方法であって、（i）該変位センサを用いて軟骨の表面の変位を測定する工程、（ii）測定により得られた数値から、軟骨表面の３次元的表面構造情報を出力する工程を含む軟骨表面変性を評価する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０μｍ未満の分解能を有する変位センサを用いて、被験生体試料から取得した軟骨の表面の変性を評価する方法であって、
（i）該変位センサを用いて軟骨の表面の変位を測定する工程、
（ii）測定により得られた数値から、軟骨表面の３次元的表面構造情報を出力する工程を含む軟骨表面変性を評価する方法。
【請求項２】
１０μｍ未満の分解能を有する変位センサが、レーザ式変位センサである請求項１記載の軟骨表面変性を評価する方法。
【請求項３】
（iii）軟骨表面の３次元的表面構造情報を基に、軟骨表面の３次元画像を出力する工程を、さらに含む請求項１または２記載の軟骨表面変性を評価する方法。
【請求項４】
（iv）軟骨表面の３次元的表面構造情報を基に軟骨表面の近似曲線を出力し、軟骨表面の３次元的表面構造情報の近似曲線からの変位値を出力する工程を、さらに含む請求項１〜３のいずれかに記載の軟骨表面変性を評価する方法。
【請求項５】
（v）正常動物の軟骨表面の３次元的表面構造情報を基に軟骨表面の近似曲線を出力し、被験軟骨表面の３次元的表面構造情報の、正常動物の軟骨表面に基づく近似曲線からの変位値を出力する工程を、さらに含む請求項１〜３のいずれかに記載の軟骨表面変性を評価する方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法を用いる、軟骨変性の治療のための薬剤を評価する方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法を用いる、軟骨変性の進行の程度を診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な軟骨表面構造の解析手法に関する。より詳細には、軟骨表面構造の解析により動物の変形性関節症（Osteoarthritis：以下、OA）モデルの病態進行を評価する手法に関する。さらに、この方法を用いて選別されたOAの病態進行を抑制する薬剤の評価方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
正常な関節は体重や運動による負荷などの強い荷重に耐えるとともに、その摩擦係数は0.001〜0.03と非常に低く、生体の迅速かつ柔軟な動きに対応した構造をもっている。このような関節の機能に対応するために重要な組織としては関節軟骨が挙げられる。関節軟骨は粘弾性的な性質を示す組織であり、コラーゲン、プロテオグリカンおよび軟骨細胞等を含有しているが、その重量の約８０％は水分である。変形性関節症の初期の病態形成においては、関節軟骨に外傷、過使用、老化、感染・代謝・内分泌等病理的原因などによって表面構造の破壊や変性などの構造変化が起こり、関節の潤滑性に障害をきたす現象が起こっているのではないかと考えられている。さらに、関節軟骨は自己修復能力が非常に低く、自然に修復されることがほとんど無いため、そのような軟骨表面の構造変化を起こした部位から更に磨耗または変性が進行し、最終的には病態部における軟骨のほとんどが失われる形になり、重篤な病態が形成される。しかしながら、そのような病態初期における軟骨表面の構造変化については、詳細な検討がなされた経緯はない。
【０００３】
近年、OAに対する治療薬を開発するために種々の動物モデルが開発され、該動物モデルがヒトの病変と同じように軟骨表面の線維化・裂溝形成・びらんや骨棘の形成が認めらることから、動物モデルを用いて薬剤や栄養補助食品の効能評価が実施されている。このような薬効評価では、主に、組織切片(H&E stain, safranin-O stain, truidinblue stain etc.)を用いたスコアリング(modified Mankin scoring system)による方法がなされている。このスコアリング方法による病態進行の評価は、1)ヒトの症例との比較がなされている、2)経時的な変化が調べられているなどといった理由から信頼性が高い。しかし、1)切片作製の時間・手間がかかる、2)切片では組織の1部分しか評価できず、病変の全体像を把握できない、3)切片を多数作製することにより、ある程度全体的な評価は可能であるが、切片作製の時間・手間がさらにかかる、4)評価者によるスコア付けのため、評価結果に評価者の主観が入る恐れがある、などの欠点も存在する（非特許文献１）。そのため、この評価法のみで完全にOA病態を評価するのは難しかった。
【０００４】
一方、病変の全体像を把握するための手法として、肉眼による全体像の評価や走査型電子顕微鏡(Scanning Electron Microscope：以下、SEM)を用いた全体像の詳細な評価などが実施されてきた。しかし、肉眼では詳細な病変(軟骨表面の線維化など)を捉えることができず、SEMによる評価では軟骨表面の線維化や裂溝形成は捉えられるものの、試料を脱水・乾燥する必要があり、その工程の間で本来の形状とは異なってくる可能性があるという難点がある（非特許文献２）。
【０００５】
その他の病態進行を評価する方法としては、軟X線およびMicro-focused X-ray computed tomography(以下、マイクロCT)撮像による関節間隙の測定や骨棘形成の評価、磁気共鳴画像診断装置（以下、MRI）を用いた軟骨の評価（非特許文献３、４）などが報告されている。しかし、軟X線やマイクロCTによる撮像からは軟骨下骨や石灰化した部分を測定できるだけで、軟骨自体を測定することはできない。また、MRI撮像から得られる結果については解像度が１０μｍと低く、病態との関連がまだ明確にはされていない。
【０００６】
一方、非測定物からの反射光を受光して、受光した受光量に基づいて被測定物の表面の変位を測定する変位計として、レーザ式変位センサが知られるが、該レーザ式変位センサは、金属、樹脂、紙、セラミック等の被測定物に対しては使用実績があるが、軟骨表面を測定できるかどうかについては検討されていなかった（特許文献１）。
【０００７】
さらに、切片を用いたスコアリングに比べて軟骨をより定量的に評価する手法として、染色した切片からのプロテオグリカンの定量（非特許文献５）や、切片を用いて軟骨表面の粗雑さを評価する方法(正常軟骨の推定曲線と実測値との二乗平均平方根粗さで評価する)（非特許文献６）、SEM撮像結果からの表面粗さの定量化などがこれまでに報告されている。しかし、プロテオグリカンの定量や表面粗さの定量化では、その切片を作製した断面については定量的に評価できるものの、スコアリングによる方法と同様、全体像の病変を正確に捉えるのは困難である。SEMを用いた表面粗さの定量化では3次元的に軟骨表面を定量化することはできているが、やはり試料を脱水・乾燥させる必要があり、評価結果が生理的な状況と食い違ってくる危険性を否定できない。
【０００８】
【非特許文献１】Osteoarthritis and Cartilage (1997) 5, 343-355
【非特許文献２】European Cells and Materials Vol. 9. 2005 (pages 68-84)
【非特許文献３】Osteoarthritis and Cartilage (2004) 12, 614-626
【非特許文献４】Osteoarthritis and Cartilage (2004) 12, 986-996
【非特許文献５】Osteoarthritis and Cartilage (2003) 11, 412-423
【非特許文献６】Osteoarthritis and Cartilage (2003) 11, 636-643
【特許文献１】特開平７−１１３６１７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これまでは、生体試料から取得した軟骨の変位を３次元的に測定しようとする場合、SEMを用いての表面構造の解析しか手段が無く、しかもこの方法においては試料を脱水・乾燥させる必要があり、生理的な状況での正確な評価結果を得ることができなかった。また、軟骨の変性程度を定量化する方法については、切片を用いた２次元上での表面粗さの定量化しか行われていない。このような切片を用いた２次元上での評価では、OAにおける軟骨の変性は軟骨全体に渡って均一に起こるのではなく、ある部位では線維化が起こり他の部分では裂溝形成やびらんが生じたりするのを考慮すると、作製した切片によっては、本来の病変よりも過大に評価されたり過小評価されたりする危険性がある。さらに、その操作は評価者によるスコア付けによるため、評価結果に評価者の主観が入る恐れがあり、客観的な評価を行なうことができないという問題があった。
【００１０】
本発明が解決しようとする課題は、生体試料から取得した軟骨試料を脱水・乾燥させることなく、３次元的に軟骨の表面の変位を測定できる方法を提供することである。さらには、３次元情報を用いた軟骨の表面粗さを評価することによって、客観的に軟骨変性の全体像について進行程度を定量的に評価できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、１０μｍ未満の分解能を有する変位センサを用いて、被験生体試料から取得した軟骨の表面の変性を評価する方法であって、
（i）該変位センサを用いて軟骨の表面の変位を測定する工程、
（ii）測定により得られた数値から、軟骨表面の３次元的表面構造情報を出力する工程を含む軟骨表面変性を評価する方法に関する。
【００１２】
１０μｍ未満の分解能を有する変位センサとしては、レーザ式変位センサが好ましい。
【００１３】
本発明の軟骨表面変性を評価する方法は、軟骨表面の３次元的表面構造情報を基に、軟骨表面の３次元画像を出力する工程を、さらに含むことができる。
【００１４】
さらに、本発明の軟骨表面変性を評価する方法は、（iv）軟骨表面の３次元的表面構造情報を基に軟骨表面の近似曲線を出力し、軟骨表面の３次元的表面構造情報の近似曲線からの変位値を出力する工程を、さらに含むことができる。
【００１５】
また、本発明の軟骨表面変性を評価する方法は、（v）正常動物の軟骨表面の３次元的表面構造情報を基に軟骨表面の近似曲線を出力し、被験軟骨表面の３次元的表面構造情報の、正常動物の軟骨表面に基づく近似曲線からの変位値を出力する工程を、さらに含むこともできる。
【００１６】
本発明は、前記軟骨表面変性を評価する方法を用いる、軟骨変性の治療のための薬剤を評価する方法にも関する。
【００１７】
本発明は、前記軟骨表面変性を評価する方法を用いる、軟骨変性の進行の程度を診断する方法にも関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、軟骨表面の３次元的表面構造情報を取得し、軟骨表面の変形・表面粗さの程度を定量化することで、OAの進行程度など軟骨変性の進行を客観的に評価することができる。また本発明の評価方法は、コンピュータを使用することにより、定量的かつ客観的な指標を高速かつ再現性よく解析可能である。さらに、本発明の評価方法を用いて、OAなどの軟骨変性の進行を抑制する治療薬または治療方法を評価することができる。また、関節軟骨の表面構造情報を生体から直接取得することにより、本発明をOA病態など軟骨変性の進行の程度を診断することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、１０μｍ未満の分解能を有する変位センサを用いて、被験生体試料から取得した軟骨の表面の変性を評価する方法であって、
（i）該変位センサを用いて軟骨表面変性を測定する工程、
（ii）測定により得られた数値から、軟骨表面の３次元的表面構造情報を出力する工程を含む軟骨表面の変性を評価する方法に関する。
【００２０】
本発明によって被験される軟骨とは、生体試料から取得された軟骨もしくは生体試料より取得しホルマリンにて固定した軟骨であり、本発明においては、OA、関節リウマチ（rheumatoid arthritis：以下、RA）、またはその他の外傷性軟骨損傷などの現状または進行程度を評価する際に、これらの関節軟骨を用いることができる。また、該関節軟骨としては、大腿骨顆部の軟骨、大腿骨頭の軟骨、脛骨骨端軟骨部位、上腕骨骨端軟骨、トウ骨骨端軟骨、尺骨骨端軟骨などが挙げられる。本発明によれば、生体試料から取得された軟骨をそのままの形、もしくは変形・乾燥を防ぐためにホルマリンにて固定した形で使用することができ、より生理的状況下に近い状態の軟骨を評価することができる。そのため、通常切片作製時に必要な包埋・薄切といった工程やSEM撮影時に必要な脱水・乾燥といった工程を必要としない。
【００２１】
本件明細書において、「軟骨の表面の変性」、「軟骨の変性」または「軟骨変性」とは、軟骨表面の線維化・裂溝形成・びらんが生じたことをいう。また、本件明細書において、「軟骨の変形」または「軟骨変形」とは、裂溝形成やびらんなどの症状が進行することにより軟骨そのものが変形してしまうことをいう。
【００２２】
本発明において、「１０μｍ未満の分解能を有する変位センサ」を用いることによって、軟骨を評価することができる。ここで、本発明に用いられる変位センサは、分解能が１０μｍ未満であれば特に限定されないが、かかる変位センサとしては、例えば、レーザ式変位センサがあげられる。また、分解能が１０μｍ未満を達成するものであれば、核ＭＲＩ、超音波測定装置も用いることができる。
【００２３】
本明細書において、レーザ式変位センサとは、発光部が出射した光を対物レンズを通して被測定物に投射し、被測定物からの反射光を受光して、その受光した受光量に基づいて被測定物の表面の変位を測定する変位計を意味し、発光素子として半導体レーザが用いられているものが好ましい。このような変位計としては、たとえば、キーエンスLT-9010M、キーエンスLT9030Mなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。該レーザ式変位センサを使用することによって、生理的条件に近い軟骨を被験試料として使用することができ、生理的条件に近い軟骨表面の正確な構造情報を取得し、簡便かつ正確に病変の全体像を評価することができる。また、分解能が１μｍを超えるような「高解像度ズームレンズ」も適用が可能であり、さらには核MRI、超音波測定装置なども分解能が１μｍを超えるような機種が開発された場合には適用可能である。
【００２４】
本発明の評価方法において、変位センサを用いた測定により得られた数値から、軟骨表面の３次元的表面構造情報を得ることができる。軟骨表面の３次元的表面構造情報とは、測定範囲の全てにおけるＸ、Ｙ座標に伴うＺ座標の集合体を意味する。
【００２５】
また、本件明細書において、「出力」とは、画面または紙等に出力される等狭義に解釈されるべきものではなく、情報処理可能な程度にコンピュータ内部に情報が得られている等広義に解釈されるべきものである。そのため、例えば、工程（ii）ののち工程（iii）が行われる際、工程（ii）における３次元的表面構造情報の出力は、画面または紙等で出力される必要はない。
【００２６】
本発明の評価方法は、（iii）軟骨表面の３次元的表面構造情報を基に、軟骨表面の３次元画像を出力する工程を、さらに含むことができる。該工程により、軟骨表面の３次元画像を視覚的に捉えることができる。
【００２７】
また、本発明の評価方法は、（iv）軟骨表面の３次元的表面構造情報を基に軟骨表面の近似曲線を出力し、軟骨表面の３次元的表面構造情報の近似曲線からの変位値を出力する工程を、さらに含むことができる。軟骨表面の近似曲線は、変位センサにより測定された座標をプロットし、それらの点を２次曲線で近似することにより出力することができる。該２次曲線の出力指示は、Excelを用いて2次曲線の近似式を計算させることによりなされる。例えば、近似曲線は、測定により得られた軟骨表面情報の１ｍｍ四方の座標データを抜粋し、該データLateral方向の１ｍｍ×１００μｍ毎に２次曲線を出力することにより作成できる。また、かかる座標データとしては、より変性が起こりうる荷重部（体重のかかる部分）を選択することが好ましい。大腿骨遠位端の軟骨のうち荷重部の座標データは、大腿骨顆部軟骨について、半月板に接触していると考えられる部位を上に向けて変位センサで軟骨表面構造を測定し、その座標をプロットした時に、最も座標が高い点を含む1mm四方を抜き出すことにより選択することができる。
【００２８】
軟骨表面の変性の程度は、変位センサにより測定された座標と３次元的表面構造を基にした近似曲線との間の差（または計測した点と理想曲線との差）の二乗平均平方根粗さとして表すことができ、軟骨変形の程度は、変位センサにより測定された座標と該近似曲線（もしくは理想曲線）との差の総和で表すことができる。なお、理想曲線とは、本件明細書においては、例えば、ラットの解析の場合、複数の健常ラット（同週齢が好ましい）の軟骨表面構造情報を取得し、その情報を基に一般的な軟骨表面形状を構築、その一般的な軟骨形状から抽出した２次曲線のことをいう。ここで、計測した点と該近似曲線（もしくは理想曲線）との二乗平均平方根粗さは、以下の式で求めることができる。
【００２９】
【化１】
2008089538.tif 000002
【００３０】
さらに、「変位センサにより測定された座標と３次元的表面構造を基にした近似曲線との間の差（または計測した点と理想曲線との差）」は、それを総和することによって、軟骨の変形体積を数値的に表すことができ、客観的な解析が可能となる。近似曲線からの変位合計値は、
【化２】
2008089538.tif 000003
で表すことができる。「二乗平均平方根粗さ」および「変位合計値」はいずれも、数値が高くなればなるほど、軟骨変性および変形が進行している傾向にあることが分かる。
【００３１】
また、本発明の評価方法において、被験軟骨の代わりに正常動物の軟骨を用いて、（v）正常動物の軟骨表面の３次元的表面構造情報を基に軟骨表面の近似曲線を出力し、被験軟骨表面の３次元的表面構造情報の、正常動物の軟骨表面に基づく近似曲線からの変位値を出力する工程を、さらに含むことにより、正常動物の軟骨表面との比較による軟骨表面粗さを数値的に表すこともできる。
【００３２】
さらに、本発明は、前記評価方法を用いる、軟骨変性の治療のための薬剤を評価する方法にも関する。軟骨変性の治療のための薬剤とは、軟骨変性の進行を抑制するための薬剤、変性してしまった軟骨を治療するための薬剤を言い、例えば、OA、RA、またはその他の外傷性軟骨損傷などの進行を抑制するための、または治療のための薬剤をいう。軟骨変性の治療のための薬剤を評価する方法により、該薬剤による治療法の有効性、該薬剤の治療効果を評価することができる。
【００３３】
さらに、本発明は、前記評価方法を用いる、軟骨変性の進行の程度を診断する方法にも関する。軟骨変性の進行程度の診断とは、OA、RAまたはその他の外傷性軟骨損傷などの現状または進行の程度を診断することを言う。
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００３４】
実施例１
SDラットを用いて、内側副側靭帯および内側半月板を切除することによって、ラット半月板切除モデル(MNX, n=6)を作製した。明らかに病変が生じていると考えられる半月板切除後４週間後のラットを麻酔下で安楽死させ、被験生体試料として使用した。なお、Sham群（SHM, n=3）は内側側副靭帯のみを切除することにより作製した。被験生体試料から大腿骨を摘出し、ホルマリンにて組織を固定することにより、被検生体試料を取得した。得られた被験生体試料をレーザ式変位センサ（LT-9500, LT-9010M, KS-1100、株式会社キーエンス社製；分解能  ０．０１μｍ）を用いて、大腿骨顆部軟骨の表面の変位を測定し、測定により得られた数値から、軟骨表面の３次元的表面構造情報を出力した。MNX群およびSham群の結果を図１に示す（図１：大腿骨顆部。図１ＡおよびＣ：MNX群；図１ＢおよびＤ：Sham群）
その結果、図１Ａにおいて白矢印で示される部分に、軟骨表面の線維化と考えられる表面の粗雑化が認められた。また、図１Ｃにおいて黒矢印で示される部分には、裂溝の形成が認められた。
【００３５】
参考例１
実施例1で得られた画像が、正確に軟骨の表面構造（凹凸など）を捉えられているかを確認するために、得られた情報の一部を抜き出し、２次元上にプロットしたものを図２に示す（図２ＡおよびＣ：MNX群；図２ＢおよびＤ：Sham群）。
【００３６】
参考例２
実施例１で得られた情報が、軟骨の変性(線維化・裂溝形成・びらん)を３次元的な局在も含めて正確に反映しているかを確認するために、レーザ式変位センサに供した生体試料について脱水・乾燥処理を行い、低真空SEMを用いて軟骨表面構造を解析した。結果を、図３に示す（図３ＡおよびＣ：MNX群；図３ＢおよびＤ：Sham群）。
その結果、図３Ａにおいて白矢印で示される部分に、軟骨の線維化が確認でき、図３Ｃにおいて黒矢印で示される部分は、裂溝が生じているのが確認された。一方、SHM群ではそれらの変化は認められなかった。
【００３７】
参考例３
実施例１で得られた情報が軟骨の変性(線維化・裂溝形成・びらん)を正確に捉えられているのかを確かめるために、レーザ式変位センサに供した生体試料について組織学的評価を行なった。詳細には、レーザ式変位センサによる軟骨表面構造解析に使用した大腿骨内側顆部を用いて組織切片を作製し、ＨＥ染色およびトルイジンブルー染色を行なった。結果を、図４に示す（図４Ａ、ＣおよびＥ：MNX群；図４Ｂ、ＤおよびＦ：Sham群）。
その結果、MNX群では軟骨表面の線維化、軟骨基質の欠損が認められ、OA様の軟骨変性が進行しているのが確認でき、レーザ式変位センサにより得られた情報はその表面構造の変化を捉えられているのが確認できた。一方、SHM群ではそれらの変化は認められず、それに応じてレーザ式変位センサにより得られた情報も滑らかな表面構造を表しているのが確認できた。この結果により、レーザ式変位センサによる軟骨表面構造解析は、切片で確認される軟骨の変性を正確に反映していることが確認できた。
【００３８】
以上より、レーザ式変位センサでは、軟骨表面の線維化は表面の粗雑化として、裂溝形成・びらんはレーザ式変位センサにおいても裂溝・びらんとして捉えられることが判明した。これらの結果はレーザ式変位センサによる軟骨表面構造の情報取得は、軟骨の表面形状という点に限られるが、これまでの手法(切片作製、SEM撮影など)を代替し、なおかつ簡便に評価可能な新たな手法になりうることを表している。さらにこの手法は、これまでの切片作製時に必要な包埋・薄切といった工程やSEM撮影時に必要な脱水・乾燥といった工程を必要としないため、より生理的な状態に近い情報を取得できるという点でもこれまでの評価法よりも優れている。
【００３９】
比較例１
実施例１と同様、SDラットを用いて、内側副側靭帯および内側半月板を切除することによって、ラット半月板切除モデル(MNX, n=6)を作製した。明らかに病変が生じていると考えられる半月板切除後４週間後のラットを麻酔下で安楽死させ、被験生体試料として使用した。なお、Sham群（SHM, n=3）は内側側副靭帯のみを切除することにより作製した。被験生体試料から脛骨を摘出し、ホルマリンにて組織を固定することにより、被検生体試料を取得した。被験生体試料についてマイクロCT撮像し、軟骨下骨および骨棘を計測した（図５Ａ：MNX群；図５Ｂ：Sham群）。その後切片を作製し、組織学的手法により病態の進行について評価した。結果を、図６に示す。
【００４０】
マイクロＣＴを用いた解析では、MNX群において内側軟骨下骨の骨量増加および骨棘の形成が認められたが、Sham群ではそのような変化が認められなかった。組織学的解析の結果、MNX群では軟骨表面の線維化、軟骨基質の欠損、骨棘の形成が認められ、OA様の軟骨変性が進行しているのが確認できた。一方、Sham群ではそれらの変化はなかった。図５，６の結果を併せて考えると、組織切片で認められた軟骨の変化に対して、マイクロＣＴから得られた像では軟骨像が認められておらず、マイクロＣＴを用いた解析では軟骨の変化を評価できないと考えられる。
【００４１】
実施例２
大腿骨顆部の荷重部位1mm x 1mmの軟骨表面情報を抜粋し、「二乗平均平方根粗さ」および「変位値合計」についての解析を行った。Lateral方向の構造情報を用いて軟骨表面の近似曲線を、Excelを用いた2次曲線の近似式計算により作成し、その軟骨表面の近似曲線とレーザ式変位センサにより測定された座標を用いて、「二乗平均平方根粗さ」および「変位値合計」について計算を行った。図７に実施例１におけるMNX群の解析過程に用いたグラフの一部（100μｍおきに抜粋したもの）を、図8に実施例１におけるSham群の解析過程に用いたグラフの一部（100μｍおきに抜粋したもの）を示す。計算結果は
【表１】
2008089538.tif 000004
となり、軟骨変性が現れているMNX群でこれらの値が大きくなっていることが確認できた。
【００４２】
実施例３
半月板切除後４週間後のラットの代わりに、半月板切除後１，２，３週間後のラットを使用する以外は、実施例２と同様にしてレーザ式変位センサにより軟骨表面構造情報を取得し、「二乗平均平方根粗さ」および「変位値合計」について計算を行った。その結果、
【表２】
2008089538.tif 000005
となり、経時的にこれらのパラメータが上昇していくのがわかった。Sham群に対するこれらのパラメータの経時的な変化をグラフ化したものを図９に示す（図９Ａ：二乗平均平方根粗さ、図９Ｂ：変位値合計）。
【００４３】
以上の結果より、レーザ式変位センサを用いて軟骨表面構造を解析する手法は、軟骨の変性程度を簡便に定量化できる手法になりうると考えられる。また、これらの定量化の過程はすべてコンピュータで制御するため、より客観的な評価が可能になるという点で、この手法はこれまでの手法（Modified Mankin Scoreによるスコア化）よりも優れている。
【００４４】
比較例２
実施例１の半月板切除後４週間後のラットから取得した軟骨表面構造情報を用いて、２次元的に「二乗平均平方根粗さ」および「変位値合計」について計算を行った。その結果、わずか200μｍずれただけで、軟骨表面の変性度合いは大きく変化した（図１０）これらのデータに対して「二乗平均平方根粗さ」および「変位値合計」について計算を行ったところ、
【表３】
2008089538.tif 000006
となった。
【００４５】
以上の結果より、これまでの病態評価手法では切片作製位置がすこしずれただけで、出てくる評価結果が大きく異なってくる可能性が高いと考えられる。複数枚の切片を作製して評価を行えば、この問題については回避が可能ではあるが、その分手間が大幅に増え、それでも全体像を把握することは難しいと考えられる。しかし、レーザ変位計を用いた軟骨構造評価法では表面的な情報に限られるが、全体像を把握可能な評価手法であり、その点でこの手法は画期的な評価法であり、既存の評価方法に対して非常に優れている。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によって、関節軟骨表面の構造情報を取得し、その変形・表面粗さの程度を定量化することで、OA、RAまたはその他の外傷性軟骨損傷などの現状または進行の程度を客観的に評価することができる。これを用いてOAに対する治療薬または治療方法を評価することで軟骨変性の進行を抑制する物質もしくは手法を見出し、OA等の治療に用いることが期待できる。また、関節軟骨の表面構造情報を生体から直接取得することにより、本発明をOA病態の診断に利用することも期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、レーザ式変位センサを用いて得られた大腿骨顆部の軟骨表面の３次元的表面構造情報を示す。図１ＡおよびＣはMNX群の結果を、図１ＢおよびＤはSham群の結果を示す。
【図２】図２は、レーザ式変位センサを用いて得られた大腿骨顆部の軟骨表面の２次元情報を示す。図２ＡおよびＣはMNX群の結果を、図２ＢおよびＤはSham群の結果を示す。図２Ａ〜Ｄは、それぞれ図１Ａ〜Ｄに対応する２次元情報である。
【図３】図３は、レーザ式変位センサに供した生体試料についての低真空SEMを用いた解析評価を示す。図３ＡおよびＣはMNX群の結果を、図３ＢおよびＤはSham群の結果を示す。図３Ａ〜Ｄは、それぞれ図１Ａ〜Ｄに対応する低真空SEM像である。
【図４】図４は、レーザ式変位センサを用いて得られた大腿骨顆部の軟骨表面の２次元情報と、それに対応する生体試料の組織切片を示す。図４Ａ、ＣおよびＥはMNX群の結果を、図４Ｂ、ＤおよびＦはSham群の結果を示す。また、図４ＡおよびＢはレーザ式変位センサを用いて得られた大腿骨顆部の軟骨表面の２次元情報を、図４ＣおよびＤはＨＥ染色による結果を、図４ＥおよびＦはトルイジンブルー染色による結果を示す。
【図５】図５は、マイクロCTを用いて得られた、半月板切除後４週間のラット脛骨軟骨下骨のレントゲン像を示す。図５ＡはMNX群の結果を、図５ＢはSham群の結果を示す。
【図６】図６は、半月板切除後４週間のラット脛骨の組織切片を示す。図６ＡおよびＣはMNX群の結果を、図６ＢおよびＤはSham群の結果を示す。また、図６ＡおよびＢはＨＥ染色による結果を、図６ＣおよびＤはサフラニンＯ染色による結果を示す。
【図７】図７は、半月板切除後４週間のラット（MNX）の大腿骨顆部（荷重部、1mm x 1mm）について、レーザ式変位センサを用いて得られた軟骨表面の３次元情報から一部を抜粋し、２次元情報としてグラフ化したものである。全体像を把握できるように、Lateral方向の1mm x 100μｍおきの１１本として示す。
【図８】図８は、Sham手術後４週間のラット（SHM）の大腿骨顆部（荷重部、1mm x 1mm）について、レーザ式変位センサを用いて得られた軟骨表面の３次元情報から一部を抜粋し、２次元情報としてグラフ化したものである。全体像を把握できるように、Lateral方向の1mm x 100μｍおきの１１本として示す。
【図９】図９は、二乗平均平方根粗さ（Ａ）および変位値合計（Ｂ）の経時的な変化を表したグラフを示す。
【図１０】図１０は、半月板切除後４週間のラット（MNX）の大腿骨顆部（荷重部、1mm x 1mm）について、レーザ式変位センサを用いて得られた軟骨表面の３次元情報から一部を抜粋し、２次元情報としてグラフ化したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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