(57)【要約】      （修正有）【課題】爪、ひずめ、または鉤爪の異常を処置する方法の提供。【解決手段】Ｒ−スポンジン、あるいはそれの変異体、誘導体、フラグメント、相同体、パラログ、擬態物またはペプチド擬態物を含む組成物。Ｒ−スポンジンが、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、Ｒ−スポンジン４より構成される群から選択される。Ｗｎｔ信号伝達経路は、動物発生における膨大な過程で重要な役割を果たし、そしてそのため、Ｗｎｔ経路に関係したタンパク質の新規Ｒ−スポンジン系の構成要素が、爪発生に必須である。爪等の異常が、先天的無爪症、先天的爪床炎、コック症候群、爪膝蓋症候群、外胚葉性形成異常、および表皮水疱症より構成される群から選択される遺伝性の異常、細菌、真菌、酵母、カビおよびウイルスより構成される群から選択される感染により引起される異常、弱体化、成長または修復が遅いかまたは不在であることによる異常である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に、Ｒ−スポンジン、あるいはそれの変異体、誘導体、フラグメント、相同体、パラログ、擬態物またはペプチド擬態物を含む組成物を投与することを含む、対象における爪、ひずめ、または鉤爪の異常を処置する方法。
【請求項２】
異常が、遺伝性の異常である請求項１記載の方法。
【請求項３】
遺伝性の異常が、先天的無爪症、先天的爪床炎、コック症候群、爪膝蓋症候群、外胚葉性形成異常、および表皮水疱症より構成される群から選択される請求項２記載の方法。
【請求項４】
異常が、爪、ひずめ、または鉤爪の感染により引起される請求項１記載の方法。
【請求項５】
感染が、細菌、真菌、酵母、カビおよびウイルスより構成される群から選択される因子により引起される請求項４記載の方法。
【請求項６】
異常が、爪、ひずめ、または鉤爪の弱体化により特徴付けられる請求項１記載の方法。
【請求項７】
異常が、爪、ひずめ、または鉤爪の成長または修復が遅いかまたは不在であることにより特徴付けられる請求項１記載の方法。
【請求項８】
Ｒ−スポンジンが、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、およびＲ−スポンジン４より構成される群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項９】
組成物が、Ｒ−スポンジン遺伝子のエキソン３によりコードされるペプチド、あるいは、それの変異体、誘導体、フラグメント、相同体、パラログ、擬態物またはペプチド擬態物を含む請求項１記載の方法。
【請求項１０】
組成物が、Ｒ−スポンジン遺伝子のエキソン５によりコードされるペプチド、あるいは、それの変異体、誘導体、フラグメント、相同体、パラログ、擬態物またはペプチド擬態物を含む請求項１記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ−スポンジンが、哺乳類Ｒ−スポンジンである請求項１記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ−スポンジンが、鳥類Ｒ−スポンジンである請求項１記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ−スポンジンが、ウニのＲ−スポンジンである請求項１記載の方法。
【請求項１４】
対象が、哺乳類である請求項１記載の方法。
【請求項１５】
対象が、ヒトである請求項１記載の方法。
【請求項１６】
対象が、家庭用愛玩動物である請求項１記載の方法。
【請求項１７】
対象が、農業用途のために飼育された哺乳類である請求項１記載の方法。
【請求項１８】
対象が、ネコである請求項１記載の方法。
【請求項１９】
対象が、イヌである請求項１記載の方法。
【請求項２０】
対象が、ウマである請求項１記載の方法。
【請求項２１】
対象が、ウシである請求項１記載の方法。
【請求項２２】
対象が、ヒツジである請求項１記載の方法。
【請求項２３】
対象が、ブタである請求項１記載の方法。
【請求項２４】
対象が、鳥類である請求項１記載の方法。
【請求項２５】
対象が、ニワトリである請求項１記載の方法。
【請求項２６】
多くの爪、ひずめまたは鉤爪の内の１つに、または周辺に、組成物を投与する請求項１記載の方法。
【請求項２７】
組成物を、局所的に投与する請求項１記載の方法。
【請求項２８】
組成物を、クリームまたはローションとして処方する請求項１記載の方法。
【請求項２９】
組成物を、油状物として処方する請求項１記載の方法。
【請求項３０】
組成物を、塗料またはラッカーとして処方する請求項１記載の方法。
【請求項３１】
組成物が、１つまたは複数の担体、賦形剤、溶媒または基剤を含む請求項１記載の方法。
【請求項３２】
組成物が、治療上または化粧品上有効な量のＲ−スポンジンを含む請求項１記載の方法。
【請求項３３】
投与が、爪、ひずめまたは鉤爪の成長における増大を生じる請求項１記載の方法。
【請求項３４】
投与が、爪、ひずめまたは鉤爪の強度における増大を生じる請求項１記載の方法。
【請求項３５】
投与が、爪、ひずめまたは鉤爪の修復を生じる請求項１記載の方法。
【請求項３６】
対象に、Ｒ−スポンジン、あるいはそれの変異体、誘導体、フラグメント、相同体、パラログ、擬態物またはペプチド擬態物を含む組成物を投与することを含む、対象における爪、ひずめまたは鉤爪の成長を強化、修復または刺激する方法。
【請求項３７】
Ｒ−スポンジンが、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、およびＲ−スポンジン４より構成される群から選択される請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
組成物が、Ｒ−スポンジン遺伝子のエキソン３によりコードされるペプチド、あるいは、それの変異体、誘導体、フラグメント、相同体、パラログまたは擬態物を含む請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
組成物が、Ｒ−スポンジン遺伝子のエキソン５によりコードされるペプチド、あるいは、それの変異体、誘導体、フラグメント、相同体、パラログまたは擬態物を含む請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
Ｒ−スポンジンが、哺乳類Ｒ−スポンジンである請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
Ｒ−スポンジンが、鳥類Ｒ−スポンジンである請求項３６記載の方法。
【請求項４２】
Ｒ−スポンジンが、ウニのＲ−スポンジンである請求項３６記載の方法。
【請求項４３】
対象が、哺乳類である請求項３６記載の方法。
【請求項４４】
対象が、ヒトである請求項３６記載の方法。
【請求項４５】
対象が、家庭用愛玩動物である請求項３６記載の方法。
【請求項４６】
対象が、農業用途のために飼育された哺乳類である請求項３６記載の方法。
【請求項４７】
対象が、ネコである請求項３６記載の方法。
【請求項４８】
対象が、イヌである請求項３６記載の方法。
【請求項４９】
対象が、ウマである請求項３６記載の方法。
【請求項５０】
対象が、ウシである請求項３６記載の方法。
【請求項５１】
対象が、ヒツジである請求項３６記載の方法。
【請求項５２】
対象が、ブタである請求項３６記載の方法。
【請求項５３】
対象が、鳥類である請求項３６記載の方法。
【請求項５４】
対象が、ニワトリである請求項３６記載の方法。
【請求項５５】
組成物を、多くの爪、ひずめまたは鉤爪の内の１つに、または周辺に投与する請求項３６記載の方法。
【請求項５６】
組成物を、局所的に投与する請求項３６記載の方法。
【請求項５７】
組成物を、クリームまたはローションとして処方する請求項３６記載の方法。
【請求項５８】
組成物を、油状物として処方する請求項３６記載の方法。
【請求項５９】
組成物を、塗料またはラッカーとして処方する請求項３６記載の方法。
【請求項６０】
組成物が、１つまたは複数の担体、賦形剤、溶媒または基剤を含む請求項３６記載の方法。
【請求項６１】
組成物が、治療上または化粧品上有効な量のＲ−スポンジンを含む請求項３６記載の方法。
【請求項６２】
投与が、爪、ひずめまたは鉤爪の成長における増大を生じる請求項３６記載の方法。
【請求項６３】
投与が、爪、ひずめまたは鉤爪の強度における増大を生じる請求項３６記載の方法。
【請求項６４】
投与が、爪、ひずめまたは鉤爪の修復を生じる請求項３６記載の方法。
【請求項６５】
対象に、Ｒ−スポンジンの活性を阻害する因子を含む組成物を投与することを含む、対象における爪、ひずめまたは鉤爪の成長を阻害するか、または弱体化する方法。
【請求項６６】
Ｒ−スポンジンが、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、およびＲ−スポンジン４より構成される群から選択される請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
対象が、哺乳類である請求項６５記載の方法。
【請求項６８】
対象が、ヒトである請求項６５記載の方法。
【請求項６９】
対象が、家庭用愛玩動物である請求項６５記載の方法。
【請求項７０】
対象が、農業用途のために飼育された哺乳類である請求項６５記載の方法。
【請求項７１】
対象が、ネコである請求項６５記載の方法。
【請求項７２】
対象が、イヌである請求項６５記載の方法。
【請求項７３】
対象が、ウマである請求項６５記載の方法。
【請求項７４】
対象が、ウシである請求項６５記載の方法。
【請求項７５】
対象が、ヒツジである請求項６５記載の方法。
【請求項７６】
対象が、ブタである請求項６５記載の方法。
【請求項７７】
対象が、鳥類である請求項６５記載の方法。
【請求項７８】
対象が、ニワトリである請求項６５記載の方法。
【請求項７９】
組成物を、多くの爪、ひずめまたは鉤爪の内の１つに、または周辺に投与する請求項６５記載の方法。
【請求項８０】
組成物を、局所的に投与する請求項６５記載の方法。
【請求項８１】
組成物を、クリームまたはローションとして処方する請求項６５記載の方法。
【請求項８２】
組成物を、油状物として処方する請求項６５記載の方法。
【請求項８３】
組成物を、塗料またはラッカーとして処方する請求項６５記載の方法。
【請求項８４】
組成物が、１つまたは複数の担体、賦形剤、溶媒または基剤を含む請求項６５記載の方法。
【請求項８５】
組成物が、治療上または化粧品上有効な量のＲ−スポンジンを含む請求項６５記載の方法。
【請求項８６】
投与が、爪、ひずめまたは鉤爪の成長が減少される結果になる請求項６５記載の方法。
【請求項８７】
投与が、爪、ひずめまたは鉤爪の強度が減少される結果になる請求項６５記載の方法。
【請求項８８】
対象に、Ｒ−スポンジンの発現を阻害する因子を含む組成物を投与することを含む、対象における爪、ひずめまたは鉤爪の成長を阻害するか、または弱体化する方法。
【請求項８９】
因子が、ＲＮＡ干渉を介してＲ−スポンジンの発現を阻害する請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
因子が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である請求項８８記載の方法。
【請求項９１】
因子が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項８８記載の方法。
【請求項９２】
Ｒ−スポンジンが、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、およびＲ−スポンジン４より構成される群から選択される請求項８８記載の方法。
【請求項９３】
対象が、哺乳類である請求項８８記載の方法。
【請求項９４】
対象が、ヒトである請求項８８記載の方法。
【請求項９５】
対象が、家庭用愛玩動物である請求項８８記載の方法。
【請求項９６】
対象が、農業用途のために飼育された哺乳類である請求項８８記載の方法。
【請求項９７】
対象が、ネコである請求項８８記載の方法。
【請求項９８】
対象が、イヌである請求項８８記載の方法。
【請求項９９】
対象が、ウマである請求項８８記載の方法。
【請求項１００】
対象が、ウシである請求項８８記載の方法。
【請求項１０１】
対象が、ヒツジである請求項８８記載の方法。
【請求項１０２】
対象が、ブタである請求項８８記載の方法。
【請求項１０３】
対象が、鳥類である請求項８８記載の方法。
【請求項１０４】
対象が、ニワトリである請求項８８記載の方法。
【請求項１０５】
組成物を、多くの爪、ひずめまたは鉤爪の内の１つに、または周辺に投与する請求項８８記載の方法。
【請求項１０６】
組成物を、局所的に投与する請求項８８記載の方法。
【請求項１０７】
組成物を、クリームまたはローションとして処方する請求項８８記載の方法。
【請求項１０８】
組成物を、油状物として処方する請求項８８記載の方法。
【請求項１０９】
組成物を、塗料またはラッカーとして処方する請求項８８記載の方法。
【請求項１１０】
組成物が、１つまたは複数の担体、賦形剤、溶媒または基剤を含む請求項８８記載の方法。
【請求項１１１】
組成物が、治療上または化粧品上有効な量のＲ−スポンジンを含む請求項８８記載の方法。
【請求項１１２】
投与が、爪、ひずめまたは鉤爪の成長が減少される結果になる請求項８８記載の方法。
【請求項１１３】
投与が、爪、ひずめまたは鉤爪の強度が減少される結果になる請求項８８記載の方法。
【請求項１１４】
Ｒ−スポンジン、あるいは、それの変異体、誘導体、フラグメント、相同体、パラログ、擬態物またはペプチド擬態物を含む組成物を、対象に投与することを含む、対象におけるｗｎｔ信号伝達経路を活性化させる方法。
【請求項１１５】
Ｒ−スポンジンが、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、およびＲ−スポンジン４より構成される群から選択される請求項１１４記載の方法。
【請求項１１６】
組成物が、Ｒ−スポンジン遺伝子のエキソン３によりコードされるペプチド、あるいは、それの変異体、誘導体、フラグメント、相同体、パラログ、擬態物またはペプチド擬態物を含む請求項１１４記載の方法。
【請求項１１７】
組成物が、Ｒ−スポンジン遺伝子のエキソン５によりコードされるペプチド、あるいは、それの変異体、誘導体、フラグメント、相同体、パラログ、擬態物またはペプチド擬態物を含む請求項１１４記載の方法。
【請求項１１８】
組成物が、Ｒ−スポンジン、あるいは、それの変異体、誘導体、フラグメント、相同体、パラログ、擬態物またはペプチド擬態物を含む医薬用、獣医学用、または化粧品用組成物。
【請求項１１９】
Ｒ−スポンジンが、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、およびＲ−スポンジン４より構成される群から選択される請求項１１８記載の組成物。
【請求項１２０】
組成物が、Ｒ−スポンジン遺伝子のエキソン３によりコードされるペプチド、あるいは、それの変異体、誘導体、フラグメント、相同体、パラログ、擬態物またはペプチド擬態物を含む請求項１１８記載の組成物。
【請求項１２１】
組成物が、Ｒ−スポンジン遺伝子のエキソン５によりコードされるペプチド、あるいは、それの変異体、誘導体、フラグメント、相同体、パラログ、擬態物またはペプチド擬態物を含む請求項１１８記載の組成物。
【請求項１２２】
組成物が、多くの爪、ひずめまたは鉤爪の内の１つに、または周辺に投与するために処方される請求項１１８記載の組成物。
【請求項１２３】
組成物を、局所的に投与するために処方する請求項１１８記載の組成物。
【請求項１２４】
組成物を、クリームまたはローションとして処方する請求項１１８記載の組成物。
【請求項１２５】
組成物を、油状物として処方する請求項１１８記載の組成物。
【請求項１２６】
組成物を、塗料またはラッカーとして処方する請求項１１８記載の組成物。
【請求項１２７】
さらに、１つまたは複数の担体、賦形剤、溶媒または基剤を含む請求項１１８記載の組成物。
【請求項１２８】
Ｒ−スポンジンが治療上または化粧品上有効な量で存在する請求項１１８記載の組成物。
【請求項１２９】
Ｒ−スポンジン遺伝子中の突然変異について対象を試験することを含む、対象である先天性無爪症を診断する方法。
【請求項１３０】
対象がヒトである請求項１２９記載の方法。
【請求項１３１】
突然変異が、Ｒ−スポンジン４遺伝子における突然変異である請求項１２９記載の方法。
【請求項１３２】
突然変異が、Ｒ−スポンジン４タンパク質の弱化機能、または切断Ｒ−スポンジンタンパク質の産生を生じる請求項１２９記載の方法。
【請求項１３３】
突然変異が、（ａ）エクソン２中の１６塩基対欠失、（ｂ）２６ｂｐ欠失エキソン１、（ｃ）エキソン３中の残基６５でのシステインのチロシンへのミスセンス突然変異、または（ｄ）付随の明細書および図面で記述および例示される何らかの突然変異より構成される群から選択される請求項１２９記載の方法。
【請求項１３４】
請求項１１８−１３３のいずれか１項で説明されるとおりの突然変異を検出するためのプライマーおよび／またはプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Ｗｎｔ信号伝達に関係した分泌タンパク質であるＲ−スポンジン４（ＲＳＰＯ４）は、遺伝性無爪症で突然変異される
ダイアナ・シー．ブライドン1*、ヨシユキ・イシイ2*、エーデル・エイ．オトール1、ハリエット・シー．ウンスワース1、ミュイ−テック・テ1、フランツ・ルシェンドルフ3、クライアー・シンクレア1、バイハ・ケイ．ホプス−ハブ4、ニコラス・ティッドマン5、セリア・モス6、ロセマリー・ワトソン7、デイビッド・デ・バーカー8、ムハンマド・ワジド2、アンジェラ・エム．クリスチアノ2、デイビッド・ピー．ケルゼル1。
【０００２】
1  英国Ｅ１  ４ＡＴ、ロンドン、ホワイト・チャペルのロンドン大学、クイーン・マリー、クイーン・マリー医科歯科専門課程、細胞および分子科学研究所、皮膚研究センター；2  米国ニューヨーク、ＶＣ１５２６  ウエスト１６８番ストリート  ６３０のコロンビア大学内科および外科専門課程、皮膚科学および遺伝学および発生学科；3  ドイツ国ベルリンＤ−１３０９２、ロバート−ロッスル−ストラッセ、分子医学のマックス−デルブルック・センター、機能性遺伝学およびゲノム学科；4  フィンランド国５２ツルク  ２０５２０、ユニバーシティー・セントラル・ホスピタル、皮膚科；5  英国ＷＣ２Ａ  ３ＰＸロンドン、リンカーンズ・イン・フィールズ  ４４、英国癌研究所；6  英国Ｂ４  ６ＮＨバーミンガム、スチールハウス・レーン、バーミンガム小児科病院；7  アイルランド、ダブリン、クルムリン、アワ・レディース・チルドレンズ病院、小児皮膚科；8  英国ブリストル、ブリストル・ロイヤル診療所、ブリストル皮膚センター
*共同第一著者と見なされるべき
通信：デイビッド・ピー・ケルゼル博士に（Ｅメール：ｄ．ｐ．ｋｅｉｓｅｌｌ＠ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ）宛
【背景技術】
【０００３】
先天性無爪症／爪床炎（ＯＭＩＭ２０６８００）は、唯一現れる表現型が、全ての指の爪および足の爪の欠如または重度形成不全である希な常染色体劣性症状である。ゲノム全体のマッピング用アフィメトリックス１０Ｋ  ＳＮＰアレイは、１家族のパキスタン人、１家族のフィンランド人および１家族のアイルランド人で、＞４．０の最大ＬＯＤスコアで、染色体２０ｐ１３上に連鎖の領域を示した。関連のないパキスタン人家族での別の組換えマッピングは、その疾患遺伝子の潜む最小領域を、わずか４つの遺伝子を含む小型の〜３００ｋｂ領域に減少させた。同型または化合物異型の突然変異は、ｗｎｔ信号伝達に関連した新規分泌タンパク質であるＲＳＰＯ４をコードする遺伝子における８つの無爪症系統で一致した。ＲＳＰＯ４発現は、特に、発生中のｅ１４．５マウスの爪間葉に局在化され、そして爪形態形成に重要な役割を示唆した。
【０００４】
先天性無爪症／爪床炎（ＯＭＩＭ２０６８００）は、希で、通常には常染色体劣性の症状である。無爪症のほとんどの場合は、特に例えばコック症候群（ＯＭＩＭ１０６９９５）のような末節骨の形成異常または欠損に関連して、症候群の一部として起こる。隔てられた（非症候群性）無爪症では、まったく爪領域のない個体から、爪原基なしかまたは小さな爪原基を伴うサイズの減少した爪領域までの範囲にあるさまざまな爪表現型の発現がある。爪板（爪の可視部分）は、爪母基（甘皮の底部に配置される発生上皮）の成熟化およびケラチン化により継続的に成長するケラチン化構造である。爪板は、爪床（爪板の底部の皮膚）に密接に付着しており、そして爪床の真皮は、指の末節骨に付着している。したがって、爪の形成不全が、下にある骨の変形と合わせて頻繁に見られる。爪板は、爪の底部（爪の下）の組織と、その周り（爪の周辺）とを隔て、それにより、爪領域の寸法を維持する。爪板が、無爪症でのように、欠損しているか、または形成不全である場合、爪領域は、サイズがそれに続いて減少される。
【０００５】
爪の発生に関与した分子信号については、ほとんど知られていない。ヒトの一組の爪の形成は、懐胎の９週目に始まり、２０週までに完了し、そして足の爪の発生は、指の爪からおよそ４週遅れる。この過程に関与した遺伝子について知られていることの多くは、爪形成異常が表現型の一部を形成するヒト遺伝的障害並びに、マウスのモデルの研究から推測された。
【０００６】
下にある骨並びに皮膚内両方の適切な上皮−間葉相互作用は、Ｗｎｔ７Ａのような信号伝達分子およびソニックヘッジホグと同様に、爪発生および骨形態形成タンパク質−４および繊維芽細胞成長因子−４のような成長因子にとって重要であるように見え、そして全てが、重要な役割を果たす1。ＬＭＸ１ＢおよびＭＳＸ１のような転写因子の発現も、それらが、それぞれ、爪膝蓋症候群（ＮＰＳ、ＯＭＩＭ２５６０２０）およびウィットコップ症候群（ＯＭＩＭ１８９５００）で突然変異を発生するときに見られるとおり必須である2-4。エングレイルド（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ）のようなマウスモデルでの転写因子の除去または転位発現も、爪発生に対して深い理解を供した5。
【０００７】
我々は、隔てられた無爪症／爪床炎の組合せの劣性遺伝を示す多数の家族について研究した。パキスタン人起源（Ｐ１）の血縁家族によって、２名の罹患した兄弟姉妹と、罹患した第一のいとこが現れた。先に報告6された血縁のフィンランド人家族（Ｆ）は、１０名中罹患した４名の兄弟姉妹を有した。３名の罹患した兄弟姉妹を伴うアイルランド人家系の別の家族は、血縁の証拠を示さなかった。全ての患者が、爪板の完全な欠損を示し、そして爪床のみがあり、そして膨張した爪母基が存在する（図１ＡおよびＢ）。
【０００８】
４００マイクロサテライトのマーカーを用いて行われた、パキスタン人（Ｐ１）、フィンランド人およびアイルランド人家族出身の罹患した個人のみの初期ゲノム全体連鎖解析は、いずれの連鎖領域も示さなかった。したがって、アフィメトリックス・ヒューマン・マッピング１０Ｋｖ２  ＳＮＰアレイを使用した全ゲノムサンプル採取解析（ＷＧＳＡ）7アプローチで、高解像度のマッピングを、同じ罹患した個人に、並びに２名の罹患していない人に使用した。データ管理および浄化は、ＡＬＯＨＯＭＯＲＡパッケージ8、ＧＲＲ9およびペッドチェック10で行った。パラメトリック多点連鎖解析を、劣性モデルおよび完全浸透度を用いたアレグロ11で行った。無爪症家族の３つの解析は、染色体２０ｐ１３上で４のＬＯＤスコアを示す単独領域を示した（図１Ｃ）。血縁のパキスタン人およびフィンランド人家族で、ＳＮＰデータを、初期マイクロサテライト・データと合わせることによって、ホモ接合性の最小領域が、１２９２Ｋｂｐの領域である染色体２０ｐ１３上の１６１，４２３ｂｐ（ＳＮＰｒｓ１３４２８４１）および１，４５３，５７６ｂｐ（Ｄ２０Ｓ９０６）の間にマッピングされた（図１Ｄ）。それぞれ、２８、７および６名の罹患した個人を含む非症候群性爪床炎を有する３つの別の血縁のパキスタン人家族（Ｐ２−Ｐ４）は、染色体２０ｐ１３上の同じ領域に対してマッピングするのがみられた。Ｐ２ファミリーでの組換えは、マイクロサテライトマーカーＤ２０Ｓ１１７とＤ２０Ｓ９０６の間の８５０Ｋｐｂに、その領域を減らした。その領域における別のマイクロサテライトマーカー（プライマー配列についての補足表１）は、ファミリーＰ２で遺伝子型が形成され、そして別の有益な組換え事象が、その疾患遺伝子の宿る最小領域を、染色体２０ｐ１３上の７９６，１４０ｐｂと１，１１１，８９８ｂｐとの間のおよそ３００Ｋｐｂの小さな領域に狭めた（図２ＡおよびＢ、および補足図１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
最小領域は、３つの遺伝子；ＡＮＧＰＴ４、ＲＳＰＯ４、ＰＳＭＦ１、および開放読取枠、Ｃ２０ｏｒｆ４６（図２Ｂ）を含んだ。興味深いことに、ＲＳＰＯ４は、新規分類のフリズルド・リガンドとして作用し、そしてＷｎｔ／ベータカテニン経路を活性化するように見える分泌タンパク質のＲ−スポンジン・ファミリーの構成要素であるＲ−スポンジン４をコードし、そしてＴＣＦ依存性標的遺伝子転写促進を導いた12-14。したがって、有望な発生の信号伝達分子として、ＲＳＰＯ４は、爪発生での役割を果たす最高の候補であり、そして最初に解析された。５つのエキソン全てを、ＰＣＲにより増幅させ、そして配列決定した（プライマー配列については補足表１）。ホモ接合突然変異は、４つ全てのパキスタン人家族、並びにフィンランド人家族におけるＲＳＰＯ４で一致した一方で、化合物異種接合突然変異は、英国出身の３つの家族で一致した（表１）。突然変異のいくつかの配列跡の例は、図２Ｃで示される。家族Ｐ１は、枠移動および下流の早期終止コドンを引起すことが予想されるエキソン２内に１６ｂｐ欠失を示す。家族Ｐ２は、ホモ接合性２６ｐｂ欠失を示し、そしてそれは、エキソン１にメチオニン開始コドンを含み、そして最初の１６アミノ酸残基を欠くタンパク質の発現に至ることが予想される。家族Ｐ３は、エキソン３中でチロシンへのシステインのホモ接合性ミスセンス突然変異を示す（Ｃ１１８Ｙ）。家族Ｐ４は、ホモ接合５’供与スプライス部位突然変異を示し、そしてフィンランド人家族は、エキソン２中にアルギニン残基へのグルタミンのミスセンス突然変異を示す（Ｑ６５Ｒ）。さらに、非血縁のアイルランド人家族および英国出身の別の２家族からの罹患した個人は、エキソン３でのシステイン残基に関与するスプライス部位突然変異とミスセンス突然変異の組合せについて化合物異種接合であることがわかった。８家族の群で一致した突然変異のいくつは、再発性である。
【００１０】
ヒトとマウスのゲノムの両方で４つの構成要素があるＲ−スポンジン系のタンパク質は、共通のゲノムおよびタンパク質ドメイン組織を共有し、そして脊椎動物進化を通して保存される。各々は、Ｎ末端信号ペプチド（エキソン１）をコードし、続いて、２つのフリン型システイン富化ドメイン（エキソン２および３）、トロンボスポンジン型ドメイン（エキソン４）をコードし、そして推定核局在化信号（エキソン５）として高いスコアをつけるＣ末端塩基領域で終止すると推定される５つのコーディングエキソンより構成される（図２Ｄ）。エキソン２および３によりコードされるフリン様反復は、ベータカテニンの活性化および安定化のために必要とされると思われる15。したがって、そのフリン様ドメインを中断する突然変異は、ベータ−カテニンを通して信号伝達に影響を及ぼしうる。この点で、３つ全てのシステイン突然変異が、エキソン３での残基を識別したことは注目すべきである。ここで同定されたミスセンス突然変異の各々で影響を受けた残基は、４つ全てのヒトＲ−スポンジンパラログに渡って、並びに、４つ全てのマウスＲ−スポンジンパラログで、そして無脊椎動物ウニのムラサキウニ（Ｓ．ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ）13,14から得た推定タンパク質で非常に保存される。残基９５、１０７、１１８で突然変異されたシステイン（Ｃ９５Ｆ、Ｃ１０７ＲおよびＣ１１８Ｙ）の保存は、図２Ｅで示される。
【００１１】
ここで識別されたスプライス部位突然変異は、全て、それぞれ、イントロンの５’および３’末端に見られる非常に保存されたＧＴまたはＡＧ共通配列を改変し、したがって、成熟ｍＲＮＡ転写物における不適切なエキソン・スキッピングまたはイントロン封入に至ることが予測されるであろう。家族Ｐ２で識別された２６ｂｐ欠失は、第一のＡＴＧコドンを包含するが、しかし、タンパク質翻訳が、第二のＡＴＧコドンから開始し、そして推定信号ペプチドをコードする最初の１６残基を欠くタンパク質を生じることが予測される。最終的に、家族Ｐ１での１６ｂｐ欠失は、枠移動および下流の早期終止コドンを生じる。合成された場合、切断タンパク質は、残基３２の後のミスセンスコーディングから生じ、そしてＲ−スポンジンタンパク質のいずれの特徴も欠く推定２２０−残基切断タンパク質を生じることが予測される。
【００１２】
初期爪発生でのＲＳＰＯ４の発現を可視化するために、５９８ｂｐ  ｃＤＮＡネズミＲＳＰＯ４プローブを使用して、ホールマウント原位置ハイブリッド形式を行った。公表されている詳細なプロトコル16によるとおり、ｅ１５．５胚で原位置ハイブリッド形式を行った。ＲＳＰＯ４の発現パターンは、非常に特異的で、そして爪が誘導される間葉でのみ検出可能であり、そしてウィスカーパッドでいくぶん発現した（図２Ｆ）．さらに、ＲＳＰＯ４発現が、胚発生１４．５日目にマウス組織中にはなく、そして１５．５日目に、最初に、前足で、そして後に後ろ足で初めて現れたことも注目された。この発現データは、さらに、爪発生におけるＲＳＰＯ４についての非常に特異的で、そして不可欠な役割を支持する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
Ｗｎｔ信号伝達経路は、動物発生における膨大な過程で重要な役割を果たし、そしてそのため、Ｗｎｔ経路に関係したタンパク質の新規Ｒ−スポンジン系の構成要素が、爪発生に必須であることは驚くべきことでない。Ｒ−スポンジン系の他の構成要素は、最近、脊椎動物の発生に関係づけられてきた12、13、15が、これは、ヒトの疾患におけるＲ−スポンジンについての第一の証拠である。罹患した個人が、末節骨に内在する骨変形をもたない上に、爪床、並びに爪床の先端の輪郭を描く爪郭は、全て十分に形成されているように見えるので、Ｒ−スポンジン４は、胚性爪発生の後期相および／または成人期中の維持にほぼ明らかに関与しているといえる。
謝辞
本研究に参加してくれたことについてその家族の人達に感謝し、そしてコロンビア大学、遺伝学および発生学部からのキャサリン・ファンタウゾおよびヒシャム・バジの支援に謝辞を送りたい。本研究は、ＡＩＣＲ（ＤＰＫ）、国立ゲノム研究ネットワーク（ＦＲ）を通してドイツ連邦科学教育省、日本国文部科学省（ＹＩ）、および国立公衆衛生研究所ＮＩＨ／ＵＳＰＨＳ認可Ｒ０１Ｒ４４９２４（ＡＭＣ）によって部分的に支援された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
図１
ＡおよびＢ。無爪症患者の臨床表現型。爪領域は、サイズの上で減少し、爪板は存在せず、爪母基は膨張しており（パネルＡ、矢印を参照）、そして爪床は保護的角質増殖症を示しうる（ＡおよびＢ両方に見られる）。Ｃ．３つの無爪症家族（Ｐ１、ＦおよびＩ）についてのアレグロを用いたゲノム全体ＳＮＰ遺伝子型のパラメータ性ＬＯＤスコア解析。Ｄ．２０ｐ１３に対するマイクロサテライト／ＳＮＰマッピングの遺伝子型を有する２つの家系（Ｐ１およびＦ）。
【００１５】
図２
ＡおよびＢ。家族Ｐ２のハプロタイプ、および組換えマッピングに基づいた無爪症遺伝子を宿す最小領域を示す略図。ＲＳＰＯ４は、この間隔内の４つの遺伝子マッピングの内の１つである。Ｃ。無爪症家族で検出される突然変異の内の２つの例。Ｄ。検出された突然変異全ての位置を示すＲＳＰＯ４遺伝子のゲノム構造の略図。Ｅ。Ｒ−スポンジンパラログの間のミスセンス突然変異の保存を示すアミノ酸配列。Ｆ。爪発生の部位での特異的発現を示すマウスの胚形成（ｅ１５．５）におけるＲＳＰＯ４のホールマウント原位置。ＲＳＰＯ４プローブは、標識ＡＳ（アンチセンス）であり、そして負の対照は、標識Ｓ（センス）である。区分は、発現が爪中胚葉に限定されることを示す。
【００１６】
補足データ
補足図１  遺伝子型データを示す家系Ｐ２
補足表１
微細マッピングのために使用される新規マイクロサテライト・プライマー、および突然変異解析のために使用されるプライマーの配列を示す。
【００１７】
資料
１．チャング，シー．エム．、ワイデリッツ・アール．ビー．、チン−ベレス、エス．およびジャン，ティー．エックス．、鳥類皮膚外肢再生の間の初期事象：表皮−間葉相互作用における依存性および分子再現の順序。Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １０７巻、６３９−４６頁（１９９６年）。
２．ドレイヤー，エス．ディー．ら、ＬＭＸＩＢにおける突然変異は、爪膝蓋症候群における異常な骨格パターン化および腎臓形成異常を引起す。Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９巻、４７−５０頁（１９９８年）。
３．チェン，エイチら、Ｌｍｘ１ｂ突然変異体マウスでの肢および腎臓欠損は、ヒトの爪膝蓋症候群におけるＬＭＸ１Ｂの関与を示唆する。Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９巻、５１−５頁（１９９８年）。
４．ジャンロングラス，ディー．ら、ＭＳＸ１におけるナンセンス突然変異は、ウィトコップ症候群を引起す。Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６９巻、６７−７４頁（２００１年）。
５．ルーミス，シー．エイ．ら、マウスのエングレイルド−１遺伝子および下面肢パターン化。Ｎａｔｕｒｅ  ３８２巻、３６０−３頁（１９９６年）。
６．ホプス−ハブ，ブイ．ケイ．およびジャンセン，シー．ティー．、先天性無爪症。Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １０７巻、７５２−３頁（１９７３年）。
７．ケネディー，ジー．シー．ら、複合ＤＮＡの大規模遺伝子型化。Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１巻、１２３３−７頁（２００３年）。
８．ルッシェンドルフ，エフ．およびナンバーグ，ピー．ＡＬＯＨＯＭＯＲＡ：１０Ｋ  ＳＮＰアレイ・データを使用した連鎖解析のための道具。Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１巻、２１２３−５頁（２００５年）。
９．アベカシス，ジー．アール．、チャーニー，エス．エス．、クックソン，ダブリュ．オー．およびカードン，エル．アール．、ＧＲＲ：関係誤差のグラフ表現。Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７巻、７４２−３頁（２００１年）。
１０．オコーネル，ジェイ．アール．およびウィークス，ディー．イー．、ペドチェック：連鎖解析における遺伝子型不適合性の同定のためのプログラム。Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６３巻、２５９−６６頁（１９９８年）。
１１．ガッドブジャルトソン，ディー．エフ．、ジョナソン，ケイ．、フリッジ，エム．エル．およびコング，エイ．、アレグロ．多点連鎖解析のための新規コンピュータプログラム。Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２５巻、１２−３頁（２０００年）。
１２．カマタ，ティー．ら、Ｒ−スポンジン、１型トロンボスポンジンドメインを有する新規遺伝子は、遠位神経管で発現され、そしてＷｎｔ突然変異体で影響される。Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６７６巻、５１−６２頁（２００４年）。
１３．ナム，ジェイ．エス．、ツルコット，ティー．ジェイ．、スミス，ピー．エフ．、チョイ，エス．およびユン，ジェイ．ケイ．マウスのクリスチン／Ｒ−スポンジン系タンパク質は、フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）８およびＬＲＰ６受容体についての新規リガンドであり、そしてベータカテニン依存性遺伝子発現を活性化させる。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１巻、１３２４７−５７頁（２００６年）。
１４．キム，ケイ．エイ．ら、Ｒ−スポンジンタンパク質：ベータカテニン活性化に対する新規リンク。Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ５巻、２３−６頁（２００６年）。
１５．カザンスカヤ，オー．ら、Ｒ−スポンジン２は、Ｗｎｔ／ベータカテニン信号伝達の分泌アクチベーターであり、そしてキセノプス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）筋形成のために要求される。Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ７巻、５２５−３４頁（２００４年）。
１６．ウィルキンソン，ディー．ジー．原位置ハイブリッド化：実施アプローチ。オックスフォード・ユニバーシティー・プレス（１９９２年）。
表１  解析された全無爪症家族で検出された突然変異の要約
【００１８】
【表１】
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第一ＡＴＧコドンから出発するヌクレオチド番号付けを示すＮＭ＿００１０２９８７１によるＲＳＰＯ４  ｍＲＮＡおよびタンパク質配列。アミノ酸置換は、タンパク質配列ＮＰ＿００１０２５０４２に関連して括弧で示される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】無爪症患者の臨床表現型である。
【図１Ｂ】無爪症患者の臨床表現型である。
【図１Ｃ】３つの無爪症家族についてのアレグロを用いたゲノム全体ＳＮＰ遺伝子型のパラメータ性ＬＯＤスコア解析である。
【図１Ｄ】２０ｐ１３に対するマイクロサテライト／ＳＮＰマッピングの遺伝子型を有する２つの家系（Ｐ１およびＦ）である。
【図２Ａ】家族Ｐ２のハプロタイプである。
【図２Ｂ】組換えマッピングに基づいた無爪症遺伝子を宿す最小領域を示す略図である。
【図２Ｃ】無爪症家族で検出される突然変異の内の２つの例である。
【図２Ｄ】検出された突然変異全ての位置を示すＲＳＰＯ４遺伝子のゲノム構造の略図である。
【図２Ｅ】Ｒ−スポンジンパラログの間のミスセンス突然変異の保存を示すアミノ酸配列である。
【図２Ｆ】爪発生の部位での特異的発現を示すマウスの胚形成（ｅ１５．５）におけるＲＳＰＯ４のホールマウント原位置。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【外国語明細書】
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【図１】
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【図２】
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