(57)【要約】【課題】  ベシクルを反応器として用い、ベシクル懸濁液中の個々のベシクルの中で並列に反応を行うことにより、分析やスクリーニング操作の際の多数の反応器への物質の導入操作を並列に簡便に行う手法を提供する。【解決手段】並列反応に供する複数の反応性物質を用意し、それぞれの反応性物質を複数個の一方の荷電を有するベシクルに内包化し、反応性物質と反応する物質を、複数個の他方の荷電を有するベシクルに内包化し、水系溶媒中で、一方の荷電を有するベシクルと、他方の荷電を有するベシクルとを、静電的相互作用により結合せしめ、両ベシクルの融合を引き起こすことにより、再生成したベシクル中で各ベシクルの内容物を接触させることにより、反応を行うことを特徴とする並列反応方法。【選択図】  図２
2008029952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
並列反応に供する複数の反応性物質を用意し、それぞれの反応性物質を複数個の一方の荷電を有するベシクルに内包化し、反応性物質と反応する物質を、複数個の他方の荷電を有するベシクルに内包化し、水系溶媒中で、一方の荷電を有するベシクルと、他方の荷電を有するベシクルとを、静電的相互作用により結合せしめ、両ベシクルの融合を引き起こすことにより、再生成したベシクル中で各ベシクルの内容物を接触させることにより、反応を行うことを特徴とする並列反応方法。
【請求項２】
一方の荷電を有するベシクルを構成する物質は、リン脂質類、ステロール類、長鎖脂肪酸又は分子内に親水性基と疎水性基を有する非イオン性両親媒性分子、両イオン性両親媒性分子から選ばれる１種以上のベシクル形成剤及びアニオン性電荷担体であり、他方の荷電を有するベシクルを構成する物質は、リン脂質類、ステロール類、長鎖脂肪酸又は分子内に親水性基と疎水性基を有する非イオン性両親媒性分子、両イオン性両親媒性分子から選ばれる１種以上のベシクル形成剤及びカチオン性電荷担体である請求項１に記載した並列反応方法。
【請求項３】
ベシクル形成剤が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール又はスフィンゴ脂質から選ばれるリン脂質類、ステロール類又は長鎖脂肪酸、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、セファリン、カルジオリピン、セレブロシド、リン酸ジセチル又はコレステロールヘミコハク酸塩、アルキルポリグリセリンエーテル、アルキルグルコシド類、ソルビタン脂肪酸エステルから選ばれる１種以上であり、さらに、アニオン性電荷担体が、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸もしくはホスファチジルイノシトールから選ばれるリン脂質、長鎖脂肪酸、ジセチルホスフェート、アルキルスルフェート、コレステロールヘミコハク酸塩から選ばれる１種以上であり、カチオン性電荷担体が、リン脂質誘導体の第四級アンモニウム誘導体、長鎖アミンの第四級アンモニウム誘導体、ポリオキシエチレン化脂肪アミン、 長鎖アミノアルコールのエステルおよびそれらの第四級アンモニウム塩から選ばれる１種以上である請求項２に記載した並列反応方法。
【請求項４】
ベシクルの融合を誘発するために融合誘発性物質を添加する請求項１から請求項3のいずれか一つに記載した並列反応方法。
【請求項５】
ベシクルの融合を誘発するために添加する融合誘発性物質がポリエチレングリコール類である請求項4に記載した並列反応方法。
【請求項６】
ベシクルの融合を誘発するために電気穿孔法を用いる請求項１から請求項５のいずれか一つに記載した並列反応方法。
【請求項７】
再生成したベシクル中で各ベシクルの内容物を接触させることにより起る反応が、化学反応、生化学反応および細胞の解析である請求項１から請求項６のいずれか一つに記載した並列反応方法。
【請求項８】
ベシクルのサイズが0.05から200マイクロメートルである請求項１から請求項７のいずれか一つに記載した並列反応方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本件発明は、多数のベシクル内で複数の化学反応、生化学反応および細胞の解析を並列に行うのに好適な並列反応方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の細胞の中から目的物質の分泌量の多い細胞を取得したり、ランダムに変異の入った多くの候補タンパク質の中から目的とする活性を有する酵素を探索したり、多くの候補物質の中から目的の活性を持つ触媒を探索したりする手法は、創薬や新規化学物質の探索においてしばしば用いられる。例えば、ある目的のタンパク質を発現する細胞をクローニングする際に、限界希釈法により１つの容器に１細胞が入る濃度から細胞を培養し、目的のタンパク質を発現するクローンを取得する方法がある（非特許文献１参照）。
また、ある酵素の一部のアミノ酸をランダムに置換してライブラリーを作製し、このライブラリーから産業上有用な活性を有する酵素を探索する研究が行われている（非特許文献２及び非特許文献３参照）。
これらの手法では一般的に96穴ウエルプレートなどの数百マイクロリットルから数ミリリットル程度の容積の反応器を使用する。例えば、目的の細胞を含む細胞懸濁液を96穴ウエルプレートに分注し、抗体などを含む分析用試薬類を順次添加して細胞表面に発現、もしくは細胞から分泌される物質の量を定量する。また、多様なアミノ酸置換を含む酵素を発現するライブラリーの中から活性の高い酵素を発現するクローンを選択する際に、96穴ウエルプレート等の反応器の中で酵素を発現させ、酵素の反応基質等を添加することにより酵素の活性を測定する。つまり、これらの手法でスクリーニングを行う際には多数の反応器に順次、複数の試薬を分注する必要がある。そのため、分析対象となる酵素や細胞の数の増加に伴い、必要となる反応器が増大し、それに伴う溶液・試薬の分注操作が煩雑となると言った問題点が生じる。
【０００３】
近年、この様な問題を解決するために、半導体加工技術を用いて作製した微小なチャンバーの中で細胞の解析を行う方法も提案されている（非特許文献４参照）。
一方、リン脂質などの分子集合体によって形成されるベシクルを反応場として利用しようという試みがすでに行われている。Blocher らはベシクル内酵素反応のモデルとしてα-Chymotrypsin を用いベシクル内で加水分解反応を行っている（非特許文献５参照）。これら既存の技術においては、ベシクル内への基質の供給がベシクル膜を介した基質の透過により制限されているという点が問題となってくる。また、基質の分子サイズによっては膜を透過し難い可能性もある。これらを克服する方法として膜の透過性の制御が考えられ、Yoshimoto らはglucose oxidase やproteinase K を内包したベシクルの膜透過性をコール酸ナトリウムにより制御することができたと報告している（非特許文献６及び非特許文献７参照）。また、Graff らはチャンネル物質であるOmpF をベシクル膜に再構成することで膜の透過性を向上することができたと報告している（非特許文献８参照）      
また、エマルション液滴を反応場として利用する方法も提案されている。微量の分子を操作するために油中水滴エマルションに親水性分子を内包化し、エマルション液滴を機械的操作、静電気力、光圧力などにより操作することにより、液滴中で化学反応を行う方法を提案している（特許文献１参照）。
【０００４】
一方、リン脂質によって構成されるベシクルの融合は、生体内での現象の解明や、細胞融合や遺伝子導入の方法として、様々な方法で試みられている。ベシクルを融合させる方法として、外部から融合誘発性物質や物理的刺激を加えて融合させる方法が提案されている。また、これまでに荷電を有するベシクルは主に細胞に遺伝子を導入するために用いられてきた。細胞に遺伝子を導入するモデルとして、荷電を有するベシクル同士の融合について検討している報告もある（非特許文献９及び特許文献１０参照）。
また、細胞融合のモデルとしてベシクルの融合を検討するために、ポリエチレングリコール（PEG）を添加して融合を誘発している研究も報告されている（非特許文献１１参照）。
さらにまた、細胞融合のモデルとしてベシクルの融合を検討するために、電気穿孔法を利用して融合を誘発している研究も報告されている（非特許文献１２参照）。
【０００５】
【特許文献１】特開2000-271475号公報
【非特許文献１】バイオ実験イラストレイテッド, 6, 128-130
【非特許文献２】AISTToday 5(4):18-19, 2005
【非特許文献３】生化学,vol.72(12) pp.14730-1433, 2000
【非特許文献４】Analytical Chemistry, vol.77(24): pp.8050-8056, 2005
【非特許文献５】Biotechnologyand Bioengineering, 62(1):36-43, 1999
【非特許文献６】Biotechnologyand Bioengineering, 81(6):695-704,2003
【非特許文献７】Biotechnology  and  Bioengineering，85（2）:222-233，2004
【非特許文献８】Langmuir,17(3):919-923, 2001
【非特許文献９】Journal of Membrane Biology, 194: 129-139, 2003
【非特許文献１０】Journal of Membrane Biology, 170(1): 27-38, 1999
【非特許文献１１】Biochemistry, 40(14): 4340-4348, 2001
【非特許文献１２】Biochimie 82(5): 511-518, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、分析やスクリーニングの際に、多数の反応器を並列に操作する作業は反応器の数の増大に伴い、溶液や試薬の分注操作が煩雑となると言った問題点が生じる。本件発明では、ベシクルを反応器として用い、ベシクル懸濁液中の個々のベシクルの中で並列に反応を行うことにより、分析やスクリーニング操作の際の多数の反応器への物質の導入操作を並列に簡便に行う手法を提供する。
また、上述のように、これまでにベシクルを反応場として利用する試みが行われてきているが、既存の研究ではベシクル内への物質の供給は膜透過の制御のみにより行われている。しかし、膜透過性を制御する方法では、ベシクル外に過剰量の反応基質を加える必要がある点や、膜透過性の制御に界面活性剤を用いている点などが問題となっている。また、各種処理の後、透過性が向上したままになってしまう問題もある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本件発明では荷電を有するベシクルを反応器として用い、反応器のベシクルと反対の荷電を有するベシクルを反応器のベシクルに融合させることにより、反応基質や分析用試薬などの物質を反応器のベシクルに並列に供給する方法を提供する。つまり、反応器のベシクルと物質導入のためのベシクルとの静電的相互作用によりベシクル同士を結合させ、融合誘発性物質を添加して融合を引き起こすことにより、それぞれの反応器ベシクルに並列に外部から物質を導入することができる。これにより、反応器としてのベシクルの膜透過性を変化させることなく、外部から反応基質などの物質を並列に導入する方法を提供する。
すなわち、本件発明は、
並列反応に供する複数の反応性物質を用意し、それぞれの反応性物質を複数個の一方の荷電を有するベシクルに内包化し、反応性物質と反応する物質を、複数個の他方の荷電を有するベシクルに内包化し、水系溶媒中で、一方の荷電を有するベシクルと、他方の荷電を有するベシクルとを、静電的相互作用により結合せしめ、両ベシクルの融合を引き起こすことにより、再生成したベシクル中で各ベシクルの内容物を接触させることにより、反応を行うことを特徴とする並列反応方法である。
また、本件発明においては、一方の荷電を有するベシクルを構成する物質を、リン脂質類、ステロール類、長鎖脂肪酸又は非イオン性両親媒性分子から選ばれる１種以上の分子内に親水性基と疎水性基を有するベシクル形成剤及びアニオン性電荷担体とし、他方の荷電を有するベシクルを構成する物質を、リン脂質類、ステロール類、長鎖脂肪酸又は非イオン性両親媒性分子から選ばれる１種以上の分子内に親水性基と疎水性基を有するベシクル形成剤及びカチオン性電荷担体とすることができる。
さらに、本件発明においては、分子内に親水性基と疎水性基を有するベシクル形成剤分子を、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール又はスフィンゴ脂質から選ばれるリン脂質類、ステロール類又は長鎖脂肪酸、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、セファリン、カルジオリピン、セレブロシド、リン酸ジセチル又はコレステロールヘミコハク酸塩、アルキルポリグリセリンエーテル、アルキルグルコシド類から選ばれる１種以上とし、さらに、アニオン性電荷担体を、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸もしくはホスファチジルイノシトールから選ばれるリン脂質、長鎖脂肪酸、ジセチルホスフェート、アルキルスルフェート、コレステロールヘミコハク酸塩から選ばれる１種以上とし、カチオン性電荷担体を、リン脂質誘導体の第四級アンモニウム誘導体、長鎖アミンの第四級アンモニウム誘導体、ポリオキシエチレン化脂肪アミン、
長鎖アミノアルコールのエステルおよびそれらの第四級アンモニウム塩から選ばれる１種以上とし、融合誘発性物質をPEG類とすることができる。
また、本件発明においては、一方の荷電を有するベシクルと、他方の荷電を有するベシクルとを、別々の水系溶媒中で作成し、各々の水系溶媒に並列反応に供する反応性物質を溶解ないし分散させ、各々のベシクル中に取り込ませることができる。
さらに、本件発明においては、並列反応に供する複数の反応性物質を用意し、それぞれの反応性物質を複数個の一方の荷電を有するベシクルに内包化し、反応性物質と反応する物質を、複数個の他方の荷電を有するベシクルに内包化し、両ベシクルを混合することができる。
また、本件発明においては、再生成したベシクル中で各ベシクルの内容物を接触させることにより起る反応を、化学反応、生化学反応および細胞の解析とすることができる。また本件発明においては、ベシクルのサイズを0.05から200マイクロメートルとすることができる。
さらに、本件発明においては、ベシクルの融合を誘発するために電気穿孔法を用いることができる。
【発明の効果】
【０００８】
本件発明の並列反応方法は、数ｍｌの液体中に106から1012程度の反応器を構築でき、数万種類、数億種類、数兆種類の物質の反応を並列に調べる上で優れており、効率的にスクリーニングや解析を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本件発明において用いることが出来るベシクル形成剤としては、一般的に文献に記載されている脂質や両親媒性分子である。
本件発明において用いることが出来る脂質の代表例として、リン脂質類、例えばPC、PG、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール又はスフィンゴ脂質を挙げることができる。またコレステロールのようなステロール類又は長鎖脂肪酸（例えば、ステアリン酸、パルミチン酸）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、セファリン、カルジオリピン、セレブロシド、リン酸ジセチル又はコレステロールヘミコハク酸塩のような他の組成物も併用することが出来る。本件発明において用いることが出来るベシクル形成剤として例えば，アルキルポリグリセリンエーテルやアルキルグルコシド類のような両親媒性物質を挙げることが出来る。この場合、非イオン性ベシクル形成剤から構成されるベシクルであるいわゆるニオソームが得られる。非イオン性ベシクル形成剤としてソルビタンオレイン酸モノエステルなどのソルビタン脂肪酸エステル等も使用することができる。
【００１０】
ベシクルに表面電荷を保持させるためには、様々な添加剤を脂質またはベシクル形成剤と混合することができる。
本件発明において用いることが出来るアニオン性電荷担体として、天然もしくは合成リン脂質（例えばホスファチジルセリン、ホスファチジン酸もしくはホスファチジルイノシトール）、脂肪酸（例えばステアリン酸、パルミチン酸）、ジセチルホスフェート、アルキルスルフェート、コレステロールヘミコハク酸塩のような化合物を用いることができる。
本件発明において用いることが出来るカチオン性電荷担体として、リン脂質誘導体（例えば1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン）長鎖アミンおよびそれらの第四級アンモニウム誘導体（例えばステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ジメチルジオクタデシルアンモニウム）、ポリオキシエチレン化脂肪アミン； 長鎖アミノアルコールのエステルおよびそれらの塩のような化合物を用いることができる。
また、本件発明においては、アニオン性もしくはカチオン性電荷担体としてポリペプチドなどの特定のポリマーや蛋白質を併用することが出来る。
本件発明の実施例ではベシクルに荷電を持たせるために、アニオン性脂質としてPGを、カチオン性脂質としてジオレイルトリメチルアンモニウムプロパン (DOTAP)、[3β-N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル] コレステロール(DC-Chol) の２
種類を用いた。
また、本件発明で用いるベシクルのサイズは、0.05から200マイクロメートル、好ましくは、1から20マイクロメートルのオーダーである。
本件発明ではベシクルの融合を誘発するために融合誘発性物質を用いることが出来る。代表的にはPEGを挙げることができる。
ベシクルの融合を誘発するために電気穿孔法を用いることも可能である。
電気穿孔法はエレクトロポレーション法とも呼ばれ、主に遺伝子導入に用いられている方法で、高電圧の直流電場により細胞やベシクルに孔を生じさせ、細胞に物質を挿入する方法である。
【００１１】
従来の技術では、細胞の分析や酵素のスクリーニングを行う場合、試験管やマイクロプレート上に形成された96穴ウエル、もしくはマイクロチップ上に形成されたマイクロチャンバーで反応を行い、目的の活性を持つ細胞や酵素を選抜していた。
本件発明では、このような分析をベシクルの懸濁液の中で行い、個々のベシクルの中で並列に反応を行うことにより、効率的にスクリーニングや解析を行うことができるようになる。
従来の反応系では試験管を用いた場合は101程度の反応器を用い、96穴ウエルを用いた場合には102程度の反応器を用い、半導体加工技術で作製されたマイクロチャンバーの中で反応を行う場合には104程度の反応器を用いるのが一般的である。
本件発明では、ベシクルを反応器として利用することにより、ベシクルのサイズを考えると、数ｍｌの液体中に106から1012程度の反応器を構築でき、半導体加工技術で作成したマイクロアレイよりも、10２から108程度多くの数の反応器を構築できる。図１に本件発明で開示するベシクルを利用した反応実施方法の概念を示す。(a)それぞれの反応器を用いて同時に取り扱うことのできる反応器数を比較すると、試験管を用いた場合10通り程度、マイクロプレートを用いた場合100通り程度、マイクロチップを用いた場合1万通り程度の反応を並列に扱うことが可能である。一方、ベシクルを反応器として用いた場合、百万通りから１兆通りの反応を並列に扱うことが可能となる。(b)試験管を反応器として用いて３種類の反応を並列に実施する場合の操作。３本の試験管を反応器として用い、それぞれの試験管に３種類の酵素溶液を分注した後に、それぞれの試験管に基質溶液を分注し、３種類の酵素の反応を並列に調べることができる。(c)ベシクルを反応器として用いて、多数の反応を並列に実施する場合の操作。多数のベシクルを反応器として用い、それぞれのベシクルに多種類の酵素を内包化した後に、それぞれのベシクルに基質溶液をベシクルの融合によって導入し、多数のベシクル内での反応を１回の操作で並列に実施することができる。
【００１２】
本件発明で、例えば、スクリーニングに応用した場合に、従来法よりも数桁多い候補物質からスクリーニングを行うことができる。細胞の解析に応用した場合も、従来法より数桁多い細胞源の解析を同時に行うことができるようになる。
また、ベシクルの融合により反応基質などを反応器に導入することにより、一回の操作で全ての反応器に反応基質などの溶液を導入することができる。つまり、溶液を分注する操作を効率化することができる。いずれの場合も従来法に比べて格段に作業が効率化できる。
また、本件発明では、前述したベシクルをリアクターとして用いる上での物質供給についての問題点を克服するために、ベシクルの融合によりベシクル内へ物質を供給する方法を提案している。この方法では、ベシクルの膜透過性を変化させることなく、外部からの物質の導入が可能となる。従って、反応生成物をベシクル内に留めておくことができる。
【００１３】
図２に荷電ベシクルの融合を利用してベシクル内で反応を行う様子を示す。反応器としてのベシクルに荷電を持たせることにより、反応器としてのベシクルどうしの凝集や融合を防ぐことができる。つまり、アニオン性ベシクル同士および、カチオン性ベシクル同士は反発し、アニオン性ベシクルとカチオン性ベシクルは凝集し、融合する。あらかじめアニオン性ベシクルに多種類の酵素や細胞を内包化しておくことにより、多種類の酵素や細胞の反応を並列に処理することが可能になる。アニオン性ベシクル同士および、カチオン性ベシクル同士は反発し、アニオン性ベシクルとカチオン性ベシクルは凝集し、融合する。あらかじめアニオン性ベシクルに多種類の酵素を内包化しておくことにより、多種類の酵素の反応を並列的に処理することが可能になる。
以下に本件発明について実施例を用いてさらに詳しく説明するが、本件発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１４】
中性脂質であるPCとアニオン性脂質としてPG、カチオン性脂質としてDOTAP、もしくはDC-Cholをベシクル構成脂質として使用した。
使用した脂質の構造式を図３に示す。中性脂質とアニオン性脂質もしくはカチオン性脂質をモル比7:3の割合で混合して調整した脂質薄膜に、pH7.5 Tris-HCl緩衝液を加え振盪することで荷電ベシクルの懸濁液を得た。この懸濁液を均一な孔径の膜に透過させ、粒径約100nmの一枚膜ベシクルを調製した。
（アニオン性ベシクル１の製造）
クロロホルム：メタノールを2:1 で混合した溶媒に中性脂質であるPC＜図３（a）＞およびアニオン性脂質してPG＜図３（b）＞を溶解し、それぞれの脂質溶液を得た。PCとPGの脂質溶液をモル比７：３で加え、共栓付き試験管内で適宜比率で混合し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を減圧除去することにより、試験管の底面に脂質薄膜を形成させた。一晩減圧下に置いた後、100 mM
NaCl、50 mM Tris-HCl (pH 7.5)緩衝液より構成される水系溶媒を加え、 ボルテックスミキサーにより薄膜を水和させた。その後、この懸濁液を液体窒素中で凍結、常温にて融溶させた。この操作を5 回繰り返した後、孔径0.1 マイクロメートルのポリカーボネートフィルターを10 回強制的に透過させることで、粒径の揃ったアニオン性ベシクルの懸濁液を得た。
（カチオン性ベシクル１の製造）
クロロホルム：メタノールを2:1 で混合した溶媒に中性脂質であるPC＜図３（a）＞およびカチオン性脂質としてDOTAP  ＜図３（ｃ）＞を溶解し、それぞれの脂質溶液を得た。PCとDOTAP の脂質溶液をモル比７：３で加え、共栓付き試験管内で適宜比率で混合し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を減圧除去することにより、試験管の底面に脂質薄膜を形成させた。一晩減圧下に置いた後、100 mM NaCl、50
mM Tris-HCl (pH 7.5)緩衝液より構成される水系溶媒を加え、ボルテックスミキサーにより薄膜を水和させた。その後、この懸濁液を液体窒素中で凍結、常温にて融溶させた。この操作を5 回繰り返した後、孔径0.1 マイクロメートルのポリカーボネートフィルターを10 回強制的に透過させることで、粒径の揃ったカチオン性ベシクル１の懸濁液を得た。
（カチオン性ベシクル２の製造）
クロロホルム：メタノールを2:1 で混合した溶媒に中性脂質であるPC＜図３（a）＞およびカチオン性脂質としてDC-Chol＜図３（ｄ）＞を溶解し、それぞれの脂質溶液を得た。PCとDC-Cholの脂質溶液をモル比７：３で加え、共栓付き試験管内で適宜比率で混合し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を減圧除去することにより、試験管の底面に脂質薄膜を形成させた。一晩減圧下に置いた後、100 mM NaCl、50
mM Tris-HCl (pH 7.5)緩衝液より構成される水系溶媒を加え、ボルテックスミキサーにより薄膜を水和させた。その後、この懸濁液を液体窒素中で凍結、常温にて融溶させた。この操作を5 回繰り返した後、孔径0.1 マイクロメートルのポリカーボネートフィルターを10 回強制的に透過させることで、粒径の揃ったカチオン性ベシクル２の懸濁液を得た。
（アニオン性ベシクルとカチオン性ベシクルの融合）
アニオン性ベシクル１とカチオン性ベシクル１とからなるベシクル懸濁液を混合し、静電的相互作用によりベシクルを凝集させた後、融合誘発性物質を添加してベシクルの融合を試みた。ベシクルの融合の程度を検討するために、ベシクル構成脂質の混合を蛍光共鳴エネルギー移動で評価した。アニオン性ベシクルとカチオン性ベシクルの懸濁液を等量ずつ、全体の脂質濃度を0.5 mmol/Lで混合し、懸濁液混合後1分後に融合誘発性物質であるPEG（分子量8000）を添加した。
カチオン性ベシクルに蛍光脂質ローダミンーフォスファチジルエタノールアミン、NBD-フォスファチジルエタノールアミンを組み込み、両蛍光脂質の蛍光共鳴エネルギー移動の変化を測定し、ベシクル膜の混合の指標とした。
アニオン性脂質にPGを使用して調製したベシクル（アニオン性ベシクル1）と、カチオン性脂質にDOTAPもしくはDC-Cholを使用して調製したベシクル（カチオン性ベシクル1もしくは2）を融合した際の膜構成脂質の混合を評価した結果をそれぞれ図４および図５に示す。
カチオン性脂質の種類によらず同様の傾向がみられ、PEG を10% 添加した場合では脂質の混合は経時的に増加したが、20% 添加した場合では混合直後にほぼ最大となり、80-90% と非常に高い値を示した。また、10% 添加した場合、長時間攪拌を続けることで、脂質の混合は20% 添加した場合の最大値に近づくという結果が得られた。以上の結果より、PEGを20% 以上の濃度で添加した際に、PEG によるベシクル融合の誘発効果が高くなることが明らかとなった。
【実施例２】
【００１５】
（一方の荷電を有するベシクルと、他方の荷電を有するベシクルの内部にそれぞれ反応物を封じ込め、融合誘発性物質を添加して両ベシクルの融合を引き起こすことにより、反応器ベシクル中で反応を並列に行う具体例）
ベシクル内での並列反応のモデルとして蛍光物質8-aminonaphthalene-1,3,6,-trisulfonic
disodium salt (ANTS)の消光反応を試みた。ANTSは大過剰のp-xylene-bis-pyridinium bromide (DPX) 存在下でDPX
と複合体を形成し、消光する。
本実施例では、この反応をベシクル内でベシクルの融合により行った。図６にベシクル内でANTSの消光反応を行う様子の略図を示す。
実施例１のアニオン性ベシクル１を製造するに際して、水系溶媒中に蛍光物質ANTSを添加して、アニオン性ベシクル１に蛍光物質ANTSを25 mmol/Lの濃度で内包したアニオン性ベシクルを得た。
さらに、実施例１のカチオン性ベシクル１及びカチオン性ベシクル２を製造するに際して、水系溶媒中に蛍光物質ANTSの消光剤DPXを添加して、カチオン性ベシクルにANTSの消光剤であるDPXを90 mmol/Lの濃度で内包したカチオン性ベシクルをそれぞれ得た。
それぞれのベシクル懸濁液を等量ずつ、全体の脂質濃度を0.5 mmol/Lで混合し、ベシクル懸濁液混合後、1分後にPEGを20%の濃度で添加し、ベシクルを融合させた。蛍光強度はPEG混合の10分後に測定した。アニオン性脂質にはPGを使用したアニオン性ベシクル1と、カチオン性脂質にDC-CholもしくはDOTAPを使用したカチオン性ベシクル1もしくはカチオン性ベシクル2を混合した後、PEGを添加した場合と添加しなかった場合のANTSの蛍光強度変化を測定した結果を図７に示す。図７は、アニオン性脂質にPGを用いてANTSを内包化したアニオン性ベシクルを調製し、カチオン性脂質にDC-CholもしくはDOTAPを用いてDPXを内包化したカチオン性ベシクルを調製し、PEGを添加して荷電ベシクル同士を融合させ、ベシクル内でANTSの消光反応を実施した際の蛍光強度変化を示すものである。
いずれのカチオン性脂質を使用した場合もPEGの添加により、蛍光強度が15% 程度減少し、ベシクルの融合に基づくDPXによるANTSの消光反応が観測された。また、ANTSの消光を引き起こすためにはDPXがある程度の濃度以上で存在するが必要であり、ベシクル外にDPXが漏出した場合はベシクル外の水相により、DPXが1000倍程度に希釈されてしまうためにANTSの消光反応は起こらないことが確認されている。つまり、ANTSの消光反応はベシクル外に漏出したANTSおよびDPXの漏出により引き起こされているものではないことが確認されている。以上の結果より、荷電ベシクルの融合に基づいてベシクル内で反応を実施することができることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
本件発明の手法を用いることにより、細胞や酵素の効率的なスクリーニングおよび解析が可能になる。細胞のスクリーニングとしては、抗体を産生するハイブリドーマの中でも抗体価の高い抗体を産生する細胞を選抜したり、遺伝子組み換えによって複数のタンパクを発現する細胞群の中から目的の活性を有するタンパクを発現する細胞を選抜したりする際に利用できる可能性がある。また、耐熱性を有する酵素や触媒活性の高い酵素など天然には無く、産業上有用な酵素を取得する際にも利用できる可能性がある。微粒子の表面に固定化した触媒のスクリーニングにも応用可能である。
発明を適用できる製品として、ベシクルの中で並列反応を行うための、ベシクル構成材料やベシクルの融合を誘発する試薬などの試薬やキットとしての販売を期待している。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ベシクルを利用した反応実施方法の概念図。
【図２】荷電ベシクルの融合を利用してベシクル内で反応を行う概念図。
【図３】実施例で用いた脂質の化学構造式。(a) PC。 (b) PG。(c)DOTAP。(d) DC-Chol。
【図４】カチオン性脂質としてDOTAPを用いた場合のPEG添加による変化。●はPEG 0% 、▲はPEG 10% 、■はPEG 20% における脂質の混合を示す。
【図５】カチオン性脂質としてDC-Cholを用いた場合のPEG添加による変化。  ●はPEG 0% 、▲はPEG 10% 、■はPEG 20% における脂質の混合を示す。
【図６】蛍光物質ANTSとその消光剤DPXを用いたベシクル内での並列反応の模式図。アニオン性ベシクルとカチオン性ベシクルが融合することによって、ANTSとDPXが接触し、ANTSが消光する。
【図７】PEG添加によって誘発されるベシクルの融合に基づくベシクル内での並列反応。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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