(57)【要約】【課題】生体内で重要な生理活性物質であるＲ−メバロン酸を標識した、標識Ｒ−メバロン酸を効率的、且つ安価に製造することのできる製造方法を提供する。【解決手段】前記製造方法は、標識された酢酸又はその塩に、アセチルＣｏＡ合成酵素、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ合成酵素、及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素を、無細胞系で作用させることを特徴とし、従来法と比較して、安価に標識Ｒ−メバロン酸を製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識された酢酸又はその塩に、アセチルＣｏＡ合成酵素、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ合成酵素、及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素を、無細胞系で作用させることを特徴とする標識Ｒ−メバロン酸の製造方法。
【請求項２】
前記アセチルＣｏＡ合成酵素、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ合成酵素、及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素が、赤パンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）由来である、請求項１に記載の標識Ｒ−メバロン酸の製造方法。
【請求項３】
前記アセチルＣｏＡ合成酵素、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ合成酵素、及び／又は３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素が、赤パンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）からクローニングした遺伝子の遺伝子組み換えにより得られる、請求項１又は２に記載の標識Ｒ−メバロン酸の製造方法。
【請求項４】
前記赤パンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）がＦＧＳＣ２４８９株である、請求項２又は３に記載の標識Ｒ−メバロン酸の製造方法。
【請求項５】
前記無細胞系に、
（ａ）コエンザイムＡ
（ｂ）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、及び／又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、並びに
（ｃ）アデノシン３リン酸、
を添加することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の標識Ｒ−メバロン酸の製造方法。
【請求項６】
前記無細胞系に、マグネシウム塩、及び／又はマンガン塩を添加することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の標識Ｒ−メバロン酸の製造方法。
【請求項７】
アセチルＣｏＡ合成酵素、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ合成酵素、及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素を含む酵素カクテル。
【請求項８】
（ａ）コエンザイムＡ
（ｂ）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、及び／又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、並びに
（ｃ）アデノシン３リン酸、
を含有することを特徴とする、請求項７に記載の酵素カクテル。
【請求項９】
マグネシウム塩、及び／又はマンガン塩を含有することを特徴とする、請求項７又は８に記載の酵素カクテル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識されたＲ−メバロン酸（以下、標識Ｒ−メバロン酸と称することがある）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メバロン酸は、重要な生理活性物質群であり多くの生命維持に必須のテルペノイドと呼ばれる物質群の生合成中間体である。メバロン酸は、天然型のＲ−メバロン酸と、非天然型であるＳ−メバロン酸が知られている。メバロン酸の製造においては、多くの場合、発酵法では天然型が得られ（特許文献１、特許文献２）、化学合成方法では天然型と非天然型の等量混合物であるラセミ体が得られる。また、メバロン酸は無水状態では容易に脱水して分子内エステル化（ラクトン化）し、メバロノラクトンとなるが、水溶液ないしアルカリ水溶液中で容易に水と反応してメバロン酸ないしメバロン酸塩となる。
【０００３】
Ｒ−メバロン酸の製造方法としては、発酵生産等の生物細胞を利用する方法、化学合成法、天然物からの抽出方法等があげられる。この内、化学合成法は安価な原料が入手可能であれば最も安く提供可能であると考えられる。しかし、一般に化学合成ではラセミ体が得られることから光学分割が必要となるなどＲ−メバロン酸の工業的な製造方法としては利用されていない。また、天然物に存在するＲ−メバロン酸としては、人を含む動物の血中や尿中に広く存在することが知られている。しかしながら、その存在濃度は数μｇ／Ｌと低いため、これらを原料として大量に抽出し、工業的に利用するには不十分な状況である。
【０００４】
メバロン酸の発酵生産方法に関しては、サッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ）を用いる方法（特許文献３）、培地成分としてカゼイン由来のペプトン及びコーン・スティープ・リカーを用いる方法（特許文献４）、ＭＬ−２３６Ｂに耐性を有するサッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ）を用いる方法（特許文献２）等が知られている。
【０００５】
一方、標識Ｒ−メバロン酸は化学合成品が試薬用途として非常に高価な価格で供給されるのみであったが、メバロン酸生産菌に標識化合物を取り込ませ培養物中に標識されたＲ−メバロン酸を蓄積させることにより標識Ｒ−メバロン酸を提供する方法が提供され工業利用されている（特許文献５）。しかし、発酵法による標識Ｒ−メバロン酸の製造方法は微生物の発酵条件を厳密に管理する必要があるなど手間がかかることや、高価な１３Ｃ６−グルコース等のラベル化原料を大量に必要とする等、効率やコストの点で問題があった。
【０００６】
Ｒ−メバロン酸は多くの生物の生命維持に必須な生理活性物質であると共に、有用なカロチノイド、植物ホルモン、ユビキノン等の各種テルペノイドの生合成中間体でもある。Ｒ−メバロン酸からテルペノイドへの生合成は全てイソペンテニル二リン酸を経由して生合成されることが知られている。イソペンテニル二リン酸の生合成は長い間メバロン酸経路のみから生合成されると信じられて来たが、瀬戸、葛山らにより、動物細胞、植物細胞の細胞質、カビ・酵母等の真菌や古細菌に存在するメバロン酸を経由する経路（メバロン酸経路）以外に、多くの真正細菌や植物の色素体に存在するメチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路を経由して生合成されることが明らかとなった（非特許文献１）。
【０００７】
一方、テルペノイドは、炭素数５のイソプレン単位を基本骨格に持つ一群の有機化合物の総称であり、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の重合によって生合成される。このイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）は、動物や酵母などの真核生物ではアセチルＣｏＡからメバロン酸を経由して生合成されることが証明されている。
【０００８】
テルペノイドは（Ｃ５Ｈ８）ｎの不飽和炭化水素以外に、それらの酸化還元生成物（アルコール、ケトン、酸等）、炭素の脱離した化合物などが多くの植物及び動物体内に見いだされている。テルペノイドは、炭素数によりヘミテルペン（Ｃ５）、モノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セスタテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、テトラテルペン（Ｃ４０、カロチノイド）及びその他のポリテルペンに分類することができる。アブシジン酸、幼若ホルモン、ジベレリン、フォルスコリン、ホルボールなど生理活性を示す化合物も多い。また、構造の一部にイソプレン構造を有する複合テルペンとしてクロロフィル、ビタミンＫ、ユビキノン、ｔＲＮＡ等があり、これらも有用な生理活性を示す。
【０００９】
例えば、テルペノイドの一種であるユビキノンは、電子伝達系の必須成分として、生体内で重要な機能を果たしており、心疾患に効果のある医薬品として使用されている他、欧米では健康食品としての需要が増大している。また、ビタミンＫは血液凝固系に関与する重要なビタミンであり、止血剤として利用されている他、最近では骨代謝への関与が示唆され、骨粗鬆症治療への応用が期待されており、フィロキノンとメナキノンは医薬品として許可されている。
【００１０】
また、ユビキノンやビタミンＫ類には船体や橋脚等の建造物への貝類の付着阻害作用が在り、貝類付着防止塗料への応用が期待される。更に、カロチノイドには抗酸化作用があり、β−カロチン、アスタキサンチン、クリプトキサンチン等、がん予防や免疫賦活活性を有するものとして期待されているものもある。このように、テルペノイドには生体にとって有用な物質が含まれているが、これらの化合物は全て基本骨格単位であるイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を経由して生合成されることが知られている。
【００１１】
メバロン酸経路は、既に説明したように動物や酵母などの真核生物に存在し、メバロン酸の産生は３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ（以下、ＨＭＧ  ＣｏＡと称することがある）還元酵素が律速酵素であると考えられているため（非特許文献２）、酵母においてＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素を高発現させて細胞内のメバロン酸レベルを上げることによりカロチノイドの生産性を向上させる試みがなされている（非特許文献３）。また、１３Ｃで標識されたメバロン酸の微生物合成も報告されており（特許文献５）、テルペノイドに係わるメタボローム研究への活用が期待される。
【００１２】
【特許文献１】特開平２−２１５３８９号公報
【特許文献２】特開平３−２１０１７４号公報
【特許文献３】特開昭６３−２１６４８７号公報
【特許文献４】特開平２−２１５３８９号公報
【特許文献５】特開平２００５−２６９９８２号公報
【非特許文献１】ルーマー、Ｍ（Ｒｏｈｍｅｒ，Ｍ．）「イン・コンプレヘンシブ・ナチュラル・プロダクト・ケミストリー、第２巻、イソプレノイズ・インクルーディングカロテノイド・アンド・ステロイド（Ｉｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．２：Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｏｉｄｓ）」（オランダ）、バートン，Ｄ（Ｂａｒｔｏｎ，Ｄ．）、ナカニシ，Ｋ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ）編、エルスバー社（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）１９９９年、ｐ．４５−６７
【非特許文献２】「モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ）（米国）１９９４年、第５巻、ｐ．６５５
【非特許文献３】三沢ら、「カロチノイド研究談話会講演要旨集」１９９７年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、効率的で安価に標識Ｒ−メバロン酸を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等は、鋭意検討を重ねた結果、標識された酢酸又はその塩に、アセチルＣｏＡ合成酵素、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素を用いて、無細胞系で作用させることで、前記目的を達成し得ることを見出し、本発明に至った。
【００１５】
従って、本発明は、標識された酢酸又はその塩に、アセチルＣｏＡ合成酵素、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ合成酵素、及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素を、無細胞系で作用させることを特徴とする標識Ｒ−メバロン酸の製造方法に関する。
本発明による標識Ｒ−メバロン酸の製造方法の好ましい態様においては、前記アセチルＣｏＡ合成酵素、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ合成酵素、及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素が、赤パンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）由来であり、特には、赤パンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）からクローニングした遺伝子の遺伝子組み換えにより得られる。
本発明による標識Ｒ−メバロン酸の製造方法の好ましい態様においては、前記赤パンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）が、ＦＧＳＣ２４８９株である。
本発明による標識Ｒ−メバロン酸の製造方法の別の好ましい態様においては、前記無細胞系に、（ａ）コエンザイムＡ、（ｂ）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、及び／又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、並びに（ｃ）アデノシン３リン酸、を添加することを特徴とし、更には、前記無細胞系に、マグネシウム塩、及び／又はマンガン塩を添加することを特徴とする。
また本発明は、アセチルＣｏＡ合成酵素、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ合成酵素、及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素を含む酵素カクテルにも関する。
本発明による酵素カクテルの好ましい態様においては、（ａ）コエンザイムＡ、（ｂ）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、及び／又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、並びに（ｃ）アデノシン３リン酸、を含有することを特徴とし、更には、マグネシウム塩、及び／又はマンガン塩を含有することを特徴とする。
【００１６】
本明細書において、「無細胞系」とは、基質に酵素を作用させ目的の生成物を産生する反応が、細胞内で行われるものではなく、細胞の存在しない系で行われることを意味する。しかし、実質的に目的の生成物の産生に影響を与えない程度の細胞が混入していることを排除するものではない。
【００１７】
また、本明細書において、「酵素カクテル」とは、基質から目的の生成物を産生させる酵素の混合物を意味する。この酵素の混合物には、基質から目的の化合物を合成するために必要な酵素が含まれていればよい。また酵素反応の補助因子や金属が必要な場合はこれを提供するための塩類が含まれていてもよい。更に酵素反応に影響を与えない不純物が含まれていてもかまわない。
【００１８】
また、本明細書において、「１から数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入されている」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入されていることを意味する。本明細書においては、「１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されている」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されていることを意味する。
【００１９】
また、本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は前記ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
【００２０】
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９．（以下、モレキュラークローニング第二版と称する）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、相同性は、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、もっとも好ましくは９８％以上である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、標識された原料から、高いモル効率で、安価で且つ比較的容易に、標識されたＲ−メバロン酸を大量に製造する方法を提供することができる。また、１−１３Ｃ１−酢酸又はその塩を用いることで１，３，５−１３Ｃ３−メバロン酸を、２−１３Ｃ１−酢酸又はその塩を用いることで２，４，（３−ＣＨ３）−１３Ｃ３−メバロン酸を、１３Ｃ２−酢酸又はその塩を用いることで１３Ｃ６−メバロン酸を、選択的に調製することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用するアセチルＣｏＡ合成酵素、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素、及び、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素は、例えば、天然に存在する酵素を用いることが可能である。例えば、メバロン酸経路を持っている動物又は真核生物などの酵素を使用することができる。具体的には、真核生物である酵母や赤パンカビの細胞抽出液に含まれる前記の酵素を使用することもでき、それらの酵素を精製して使用することもできる。更には、アセチルＣｏＡ合成酵素、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素、及び、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子を用いて、遺伝子工学的に得られる遺伝子組換えにより得られる酵素を使用することもできる。例えば、遺伝子組み換えにより、酵素遺伝子をベクターに組み込み、そのベクターを用い大腸菌などの宿主細胞を形質転換して、組換え体を得ることができる。そしてその組換え体により、大量に発現された酵素を用いることができる。更に、ベクターを宿主細胞に形質転換せずに、細胞外で酵素を発現させることも可能である。
【００２３】
本発明の製造方法において使用することのできる組換えにより得られる酵素は、以下のような手順で取得可能である。まず、Ａ）アセチルＣｏＡ合成酵素をコードするＤＮＡの取得、Ｂ）アセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）をコードするＤＮＡの取得、Ｃ）ＨＭＧ  ＣｏＡ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ）合成酵素をコードするＤＮＡの取得、及びＤ）ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素をコードするＤＮＡの取得、を行い次に、Ｅ）前記Ａ〜Ｄ）の酵素タンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体の作製及びこれら計４種の前記酵素タンパク質をコードするＤＮＡを有する計４種の形質転換体での前記酵素タンパク質の発現、を行う。得られた酵素を用いて、Ｆ）４種の酵素を含む酵素カクテルの作用による、標識された酢酸又はその塩から標識Ｒ−メバロン酸の生産を行う。
【００２４】
具体的には、例えば、以下の手順により、本発明に用いることのできる酵素を調製することができる。すなわち、それぞれの酵素をコードするＤＮＡの取得Ａ）〜Ｄ）は、赤パンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）菌体からＲＮＡキットを用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、続いて均一な超常磁性高分子ポリマービーズを用い、ｍＲＮＡの３’末端に存在するｐｏｌｙ（Ａ）＋残基とビーズ表面の残基との水素結合を形成することを利用してｍＲＮＡを精製する。高分子ビーズとしてはＤｙｎａｌ社のＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５などを使用することができる。
【００２５】
次に、逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを得、遺伝子特異的配列プライマーと市販のＰＣＲキットを用い、各酵素のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（以下、ＯＲＦと称する）を含むＤＮＡ断片を取得する。市販のＰＣＲキットとしてはＮＴＥＣＨ社製Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＨＦ２などが使用することができる。
【００２６】
ＰＣＲはプロトコールに従って実施し、得られたＤＮＡはＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒに組み込み、配列を確認する。
【００２７】
次に、Ｅ）の４種の酵素タンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体の作成、及び前記酵素タンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体での前記酵素タンパク質の発現を行う。配列を確認したＯＲＦを含むＤＮＡ断片をｐＱＥ３０ベクターに組み込み、大腸菌株等を用いて形質転換を行う。形質転換菌株に、例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと称する）を１ｍＭ（終濃度）添加し、プロモーターを活性化して、目的タンパク質の生産を誘導する。菌体回収後、リゾチームを添加し、超音波破砕処理により可溶性画分を調製し、１０％ポリアクリルアミドゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）にて目的タンパク質の生産を確認する。
【００２８】
大腸菌を形質転換体とした遺伝子組み換えを行い、メバロン酸の生合成に関与する酵素を発現させることにより、大過剰量の酵素を取得することが可能である。そのため、大腸菌を破砕して、可溶性画分を粗酵素液として、基質に作用させても、充分な反応生成物を合成させることができる。もちろん、この粗酵素液を常法により精製し、作用させることも可能である。これらの酵素の大過剰量の発現は、ベクターにより大腸菌を形質転換するのみでも可能である場合もある。しかし通常は形質転換体に、（ＩＰＴＧ）等を添加し、タンパク質の生産を誘導することが好ましい。大過剰量のタンパク質の発現は、１０％ポリアクリルアミドゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ＣＢＢ染色することにより、目視により確認することができる。
【００２９】
前記のように取得した、Ｆ）４種（アセチルＣｏＡ合成酵素、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素）の酵素カクテルを用いて、標識された酢酸から標識Ｒ−メバロン酸の生産を行う。
【００３０】
前記アセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子は、実質的にアセチルＣｏＡ合成酵素、すなわち基質として酢酸又は酢酸塩とコエンザイムＡ（ＣｏＡ−ＳＨ）及びＡＴＰからアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する活性をもつ酵素タンパク質をコードするＤＮＡ配列であればよい。例えば、赤パンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）ＦＧＳＣ２４８９株由来のアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子である配列番号２の塩基配列、あるいは配列番号２において１〜数個の塩基配列が欠失、置換、付加及び／又は挿入されている塩基配列であって、アセチルＣｏＡ合成酵素を機能させるために必要な配列をすべてコードする塩基配列、あるいは配列番号２の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、アセチルＣｏＡ合成酵素を機能させるのに必要な配列をすべてコードする塩基配列を含む。更に本発明は、これらの遺伝子を常法により発現させることにより生成する酵素タンパク質を提供するものである。また、酵素反応に、コエンザイムＡやＡＴＰ（アデノシン３リン酸）等の補助因子、マグネシウム（Ｍｇ）塩、及び／又は、マンガン（Ｍｎ）塩等の塩類が必要であれば必要量添加してもよい。
【００３１】
前記アセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）遺伝子は、実質的にアセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）、すなわち基質として二分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する活性をもつ酵素タンパク質をコードするＤＮＡ配列であればよい。例えば、赤パンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）ＦＧＳＣ２４８９株由来のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）遺伝子である配列番号６の塩基配列、あるいは配列番号６において１〜数個の塩基配列が欠失、置換、付加及び／又は挿入されている塩基配列であって、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）遺伝子を機能させるために必要な配列をすべてコードする塩基配列、あるいは配列番号６の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）遺伝子を機能させるのに必要な配列をすべてコードする塩基配列を含む。更に本発明は、これらの遺伝子を常法により発現させることにより生成する酵素タンパク質を提供するものである。
【００３２】
前記ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、実質的にＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素、すなわち基質としてアセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡからＨＭＧ  ＣｏＡを生成する反応を触媒する活性をもつ酵素タンパク質をコードするＤＮＡ配列であればよい。例えば、赤パンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）ＦＧＳＣ２４８９株由来のＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子である配列番号１０の塩基配列、あるいは配列番号１０において１〜数個の塩基配列が欠失、置換、付加及び／又は挿入されている塩基配列であってＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子を機能させるために必要な配列をすべてコードする塩基配列、あるいは配列番号１０の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子を機能させるのに必要な配列をすべてコードする塩基配列を含む。更に本発明は、これらの遺伝子を常法により発現させることにより生成する酵素タンパク質を提供するものである。
【００３３】
前記ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、実質的にＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素、すなわちＨＭＧ  ＣｏＡ及び、ＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）又はＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ）からメバロン酸を生成させる反応を触媒する活性をもつ酵素タンパク質をコードするＤＮＡ配列であればよい。例えば、赤パンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）ＦＧＳＣ２４８９株由来のＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素である配列番号１４の塩基配列、あるいは配列番号１４において１〜数個の塩基配列が欠失、置換、付加及び／又は挿入されている塩基配列であって、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素を機能させるために必要な配列をすべてコードする塩基配列、あるいは配列番号１４の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素を機能させるのに必要な配列をすべてコードする塩基配列を含む。更に本発明は、これらの遺伝子を常法により発現させることにより生成する酵素タンパク質を提供するものである。また、酵素反応に、ＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、及び／又は、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）等の補助因子が必要であれば必要量添加してもよい。
【００３４】
本発明で使用することのできるアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）遺伝子、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、いかなる生物由来であっても構わないが、真核生物であるアカパンカビ由来が好ましい。アカパンカビから目的の遺伝子の取得は、常法によるが概要は以下の通りである。
【００３５】
１）アカパンカビのゲノム情報データベースから目的の遺伝子を抽出し、得られた配列情報を基にプライマーを合成する。
２）アカパンカビ細胞からｃＤＮＡライブラリ（ゲノムライブラリ）を調製する。
３）ｃＤＮＡライブラリ（ゲノムライブラリ）からプライマーを用いて目的の遺伝子を含む配列を取得する。
以上の操作を以下の４種の酵素遺伝子、すなわちアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）遺伝子、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子について行う。
【００３６】
得られた４種類の酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片はそれぞれプラスミドベクター（発現ベクター）に組み込み、得られたプラスミドベクターで宿主（例えば大腸菌）を形質転換する。形質転換した宿主を常法で培養し、得られた菌体を遠心分離等により集菌後破砕し粗酵素溶液とする。この粗酵素溶液を、そのまま本発明の製造方法に使用することもできる。また、粗酵素溶液は必要に応じて精製可能である。また、本発明で使用することのできる酵素遺伝子を発現させる大腸菌等の宿主が目的の酵素タンパク質を活性のある形で発現させることができず、封入体等を形成するような場合は、活性発現可能なペプチドをコードする遺伝子と融合させた形で発現させてもよい。
【００３７】
前記宿主細胞は、特に限定されないが、大腸菌、枯草菌、放線菌、パン酵母、アカパンカビ等取り扱いが容易な菌株が好ましい。例えば、大腸菌の菌株としては、ＪＭ１０９株、ＤＨα株、ＸＬ１−ｂｌｕｅ株、ＨＢ１０１株などのＫ−１２株由来やＢＬ２１などのＢ株由来の大腸菌を用いることができる。更に宿主細胞として、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞などを用いることも可能である。
【００３８】
発現ベクターとしては、前記宿主である大腸菌、パン酵母等において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、外来タンパク質の発現効率の高いものが好ましい。前記ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは前記微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、前記ＤＮＡ及び転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３９】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭＢＰ−５４０７）、ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＵＣ１８〔ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８号公報）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕等を例示することができる。
【００４０】
プロモーターとしては、宿主である大腸菌、パン酵母等の細胞中で発現することができるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔＩプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００４１】
リボソーム結合配列としては、宿主である放線菌細胞中で発現することができるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【００４２】
組換えベクターの導入方法としては、前記宿主である大腸菌、パン酵母等の細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２号公報）、又はＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等を挙げることができる。
【００４３】
発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって、各酵素を取得することができる。例えば、大腸菌の場合について記載すると、大腸菌は通常用いられるＬ培地、ＹＴ培地、Ｍ９−ＣＡ培地などで培養すればよい。発現ベクターは薬剤耐性遺伝子を持っていることが多いので、それに対応する薬剤を適当な濃度になるように添加することが望ましい。酵素をコードする遺伝子を発現させる場合には、その上流のプロモーターを適当な方法で働かせて発現誘導を行えばよい。例えば、ＩＰＴＧやインドールアクリル酸（ＩＡＡ）などを添加して、発現を誘導することができる。
【００４４】
培養によって得られた、菌体から目的の酵素を取得するためには、慣用の技術、例えば、細胞のリゾチーム処理、超音波破砕、遠心分離、各種クロマトグラフィーなどを用いることができる。目的の酵素は可溶性の場合と、膜結合型の水不溶性の場合がある。目的の酵素が可溶性画分に得られた場合は、そのまま酵素液として使用可能である。またその可溶性画分を各種クロマトグラフィー、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーなどで精製することができる。目的の酵素が、膜結合型の水不溶性であった場合、例えばＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素はカビや哺乳類等の真核生物では膜結合部位を持つ水に不溶性酵素であることが知られているが、この場合は、ポラコウスキーら（Ｔ．Ｐｏｌａｋｏｗｓｋｉ，Ｕ．Ｓｔａｈｌ，Ｃ．Ｌａｎｇ（１９９８）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）が、報告しているように膜結合部位は活性に関与しないことから、遺伝子工学的に膜結合部位を除去したものを水溶性酵素として調製することも本発明の範囲である。すなわち、目的の酵素が、不溶性顆粒を形成し不溶性となった場合は、グアニジンや尿素で可溶化し、そのまま又は各種クロマトグラフィーで精製し、リフォールディングさせて、酵素液として使用することができる。
【００４５】
次に得られた各酵素を用いて、標識された酢酸又はその塩から標識されたメバロン酸を無細胞系で産生する。反応容量は、特に限定されるものではなく、少量で作用させることも可能であるし、工業用に大量に反応を行わせることもできる。
【００４６】
酵素は、前記の宿主細胞から得られた可溶性画分をそのまま用いてもよいし、精製したものを用いてもよい。基質としては、標識された酢酸又はその塩を用い、酵素液を作用させる。酵素は、アセチルＣｏＡ合成酵素、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素の順に順次作用させてもよい。また、全ての酵素を混合した酵素カクテルとして作用させることも可能であり、それによって、酵素反応で生成した反応物が次の酵素反応の基質となって効率的に反応が進む結果、最終産物が蓄積してくるために、好ましい。
【００４７】
なお、前記酵素カクテルに、補助因子として、
（ａ）コエンザイムＡ、
（ｂ）ＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、及び／又は、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、並びに
（ｃ）ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）、
を添加することが好ましい。これらの補助因子は、細胞の抽出液などに含まれており、酵素を発現させた宿主細胞の抽出液を酵素カクテルとして使用する場合は、添加しなくてもよいが、これらの補助因子を含有させることで、酵素カクテルに基質のみを添加した場合でも確実に反応生成物を得ることができる。
【００４８】
更に、前記酵素カクテルは、マグネシウム（Ｍｇ）塩、及び／又は、マンガン（Ｍｎ）塩を添加することが好ましい。これらの無機塩は、細胞の抽出液などに含まれており、酵素を発現させた宿主細胞の抽出液を酵素カクテルとして使用する場合は、添加しなくてもよいが、無機塩が少ない場合は、これらの無機塩を含有させることで、ＡＴＰが関与する反応を更に進行させることができる。
【００４９】
また、ＡＴＰの持つエネルギーはＡＤＰとリン酸に分解することにより酵素反応に利用されるため、酵素カクテルのＡＴＰ濃度が減少し、ＡＤＰ濃度が上昇する。この解決手段として再度ＡＤＰからＡＴＰを生成させるための逆反応を触媒する高エネルギー化合物、例えばフォスフォエノールピルビン酸やポリリン酸等を添加してもよい。
【００５０】
本発明で使用する基質である標識された酢酸又はその塩は、同位体で標識されているものであればいかなるものでもよい。目的物である標識Ｒ−メバロン酸の標識率（標識されたＲ−メバロン酸の全Ｒ−メバロン酸に対する比率）は、原料に用いた酢酸又は酢酸塩の標識率に限りなく等しくなるため、酢酸又はその塩の標識率を実質的に１００％とすれば、Ｒ−メバロン酸の標識率を実質的に１００％とすることが可能である。
【００５１】
標識に使用する核種は酢酸を構成する炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）及び酸素（Ｏ）のいずれか１種でも、２種あるいは３種でも良い。使用目的に応じてダブル標識体やトリプル標識体を調製してもよい。また、放射性同位体で標識された化合物を使用しても、安定同位体で標識された化合物を使用してもよく、また、放射性同位体と安定同位体の両方で標識された化合物を調製してもよい。標識に使用する核種は、安定性が良いことから、２Ｈ（Ｄ、デューテリウム）、３Ｈ（Ｔ、トリチウム）、１３Ｃ、１４Ｃ、１７Ｏ及び１８Ｏからなる群から選択される一種以上が好ましいが、その他の同位体でもよい。但し、安定同位体（Ｄ、１３Ｃ、１７Ｏ、１８Ｏ等）の場合は、使用制限がほとんどなく産業上の利用が容易であるのに対し、放射性同位体（Ｔ、１４Ｃ等）の場合は、厳密に管理することが必要であるためコスト高になる傾向にある。従来、検出感度は、放射活性を測定する放射性同位体の方が、安定同位体に比べてはるかに高いとされてきたが、最近の質量分析装置や核磁気共鳴装置等の発達により、安定同位体の検出感度及び分解能が共に改良され、安全性を含めて安定同位体の産業価値が高まっている。
【００５２】
また、基質濃度は、酵素が作用することができる濃度であれば特に限定されるものではないが、０．０１〜５０ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．０３〜１２ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは０．１〜３．０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは０．２〜１．５ｍｇ／ｍＬである。
【００５３】
酵素濃度も、それぞれの酵素が作用することができる濃度であれば特に限定されるものではないが、０．０２〜５０ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．０５〜１０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは０．１〜５．０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは０．２〜２．５ｍｇ／ｍＬである。但し、アセチルＣｏＡ合成酵素は他の酵素の１〜２０倍、好ましくは２〜１０倍使用することが好ましい。
【００５４】
補助因子も、酵素が作用することができる濃度であれば特に限定されるものではないが、（ａ）コエンザイムＡは０．０５〜５０ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．１５〜２０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは０．５〜５．０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１．０〜２．５ｍｇ／ｍＬであり、（ｂ）ＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、及び／又は、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）は０．１〜１００ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．３〜３０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは１．０〜１０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは２〜２０ｍｇ／ｍＬであり、（ｃ）ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）は２．０〜１００ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは４．０〜８０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは７．０〜５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍＬである。
【００５５】
マグネシウム（Ｍｇ）塩、及び／又は、マンガン（Ｍｎ）塩濃度も、酵素が作用することができる濃度であれば特に限定されるものではないが、０．２〜２５ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｍＬ更に好ましくは１．０〜５．０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１．５〜３ｍｇ／ｍＬである。
【００５６】
反応温度も、酵素が作用することができる温度範囲であれば、特に限定されるものではないが、好ましくは０〜８０℃であり、より好ましくは１０〜６０℃であり、最も好ましくは２０〜４０℃である。
【００５７】
〕
反応のｐＨも、酵素が作用することができる範囲であれば、特に限定されるものではないが、好ましくはｐＨ４〜９であり、より好ましくはｐＨ５〜８．５であり、最も好ましくはｐＨ６〜８である。
【００５８】
反応時間も、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜４８時間であり、より好ましくは２〜３６時間であり、最も好ましくは４〜２４時間である。反応時間が長すぎても反応自体は問題ないが、腐敗のおそれがあるため、４８時間以上の反応時間は好ましくない。
【００５９】
反応を終了した後、産生した標識Ｒ−メバロン酸は通常の酸性有機物の抽出方法に従って抽出することができる。すなわち、反応液を有機酸ないし無機酸を用いてｐＨ１．０〜４．０とした後、酢酸エチル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、酢酸ブチル、アセトン等の有機溶媒を用いて抽出する。また、必要に応じて、反応液に塩化ナトリウム等の電解質を溶解させてもよい。更に、抽出液（有機溶媒相）中に含有する水分を減らす必要があれば、無水硫酸ナトリウム等で脱水してもよい。得られた抽出液から蒸留や減圧下で抽出溶媒を留去する。なお、メバロン酸は有機溶媒で抽出すると容易に分子内エステル化（ラクトン化）しメバロノラクトンとして存在するので、メバロノラクトンと等モル量の水酸化ナトリウム等のアルカリを用いて中和することによりメバロン酸とすることができる。但し、メバロノラクトンもメバロン酸の１形態であるため、メバロノラクトンの形態のまま利用することが可能な場合は、中和しなくともよい。
【００６０】
また、精製する場合は、抽出液を、シリカゲルクロマト等のカラムクロマトグラフィーに吸着させ、ヘキサン／酢酸エチル等の溶媒を用いて溶出することで精製することが可能である。また、蒸留により直接精製することも可能である。また、適当な溶媒を用いることにより結晶化することも可能である。
【００６１】
本発明の製造方法により得ることのできる、「Ｒ−メバロン酸」は、下記の一般式（Ｉ）の化合物である。
【化１】
2008212044.tif 000002
また、「Ｒ−メバロン酸」は、前記のように有機溶媒中で、脱水して容易に分子内エステル化（ラクトン化）しメバロノラクトンとなるが、メバロノラクトンは、下記の一般式（II）の化合物である。
【化２】
2008212044.tif 000003
【実施例】
【００６２】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、実施例で示した遺伝子組換え実験は、特に言及しない限りモレキュラークローニング第二版に記載の方法（以下、常法と称する）を用いて行った。
【００６３】
《実施例１》
（Ａ）アセチルＣｏＡ合成酵素（以下、ＡＣＳと称することがある）をコードするＤＮＡの取得
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ  ＦＧＳＣ２４８９株菌体からＴａｋａｒａ社製ＥＡＳＹＰｒｅｐＲＮＡキットを用いて添付の説明書に従いｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、続いてＤＹＮＡＬ社製のＤＹＮＡＢＥＡＤＳを用い、添付の説明書に従って、ｍＲＮＡの精製を行った。このｍＲＮＡから逆転写酵素反応によりｃＤＮＡライブラリを得た。
【００６４】
遺伝子特異的配列プライマー
Ｆｗｄ：５‘−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＧＴＴＣＣＴ−３’（制限酵素サイト：ＳｐｈＩ）〔配列番号３〕
Ｒｅｖ：５‘−ＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＧＣＧＴＧＧＡＣ−３’（制限酵素サイト：ＰｓｔＩ）〔配列番号４〕
【００６５】
ｃＤＮＡライブラリを鋳型に、前記のプライマーを用いてＣＬＯＮＴＥＣＨ社製Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＨＦ２  キットを用いてＰＣＲを行い、ＯＲＦを含むＤＮＡ断片を取得した。
ＰＣＲは添付の説明書に従って反応液量５０μＬ  ｖｏｌｕｍｅで行った。条件は９２℃  ３分処理後、９２℃  ４５秒、５０℃  ４５秒、６８℃  ２．５分を３０サイクル、最後に６８℃  ５分で行った。得られたＤＮＡはＴＡｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒに組み込み、配列を確認した。配列を〔配列番号２〕に示した。
【００６６】
《実施例２》
（Ｂ）アセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）（以下、ＡＣＡＴと称することがある）をコードするＤＮＡの取得
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ  ＦＧＳＣ２４８９株菌体から実施例１と同様な操作によりｃＤＮＡを得た。
【００６７】
遺伝子特異的配列プライマー
Ｆｗｄ：５‘−ＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＡＣＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣ−３’（制限酵素サイト：ＢａｍＨＩ）〔配列番号７〕
Ｒｅｖ：５‘−ＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＣＴＧＣＡＡＧＴＴＴＴＣＧＡＴＡＡＣ−３’（制限酵素サイト：ＰｓｔＩ）〔配列番号８〕
【００６８】
ｃＤＮＡライブラリを鋳型に、前記のプライマーを用いてＣＬＯＮＴＥＣＨ社製Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＨＦ２キットを用いてＰＣＲを行い、ＯＲＦを含むＤＮＡ断片を取得した。
ＰＣＲは添付の説明書に従って反応液量５０μＬ  ｖｏｌｕｍｅで行った。条件は９２℃  ３分処理後、９２℃  ４５秒、５０℃  ４５秒、６８℃  ２．５分を３０サイクル、最後に６８℃  ５分で行った。得られたＤＮＡはＴＡｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒに組み込み、配列を確認した。配列を〔配列番号６〕に示した。
【００６９】
《実施例３》
（Ｃ）ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素（以下、ＨＭＧＳと称することがある）をコードするＤＮＡの取得
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ  ＦＧＳＣ２４８９株菌体から実施例１と同様な操作によりｃＤＮＡを得た。
【００７０】
遺伝子特異的配列プライマー
Ｆｗｄ：５‘−ＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＣＧＴＣＣＣＣＡＧＡＡＣ−３’（制限酵素サイト：ＢａｍＨＩ）〔配列番号１１〕
Ｒｅｖ：５‘−ＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＧＣＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴ−３’（制限酵素サイト：ＰｓｔＩ）〔配列番号１２〕
【００７１】
ｃＤＮＡライブラリを鋳型に、前記のプライマーを用いてＣＬＯＮＴＥＣＨ社製Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＨＦ２キットを用いてＰＣＲを行い、ＯＲＦを含むＤＮＡ断片を取得した。
ＰＣＲは添付の説明書に従って反応液量５０μＬ  ｖｏｌｕｍｅで行った。条件は９２℃  ３分処理後、９２℃  ４５秒、５０℃  ４５秒、６８℃  ２．５分を３０サイクル、最後に６８℃  ５分で行った。得られたＤＮＡはＴＡｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒに組み込み、配列を確認した。配列を〔配列番号１０〕に示した。
【００７２】
《実施例４》
（Ｄ）ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素（以下、ΔＨＭＧＲと称することがある）をコードするＤＮＡの取得
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ  ＦＧＳＣ２４８９株菌体から実施例１と同様な操作によりｃＤＮＡを得た。
【００７３】
遺伝子特異的配列プライマー
Ｆｗｄ：５‘−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣ−３’（制限酵素サイト：ＢａｍＨＩ）〔配列番号１５〕
Ｒｅｖ：５‘−ＡＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＣＧＡＣＧＣＧＡＡＣＧＣＴＣＧＡＣ−３’（制限酵素サイト：ＰｓｔＩ）〔配列番号１６〕
【００７４】
ｃＤＮＡライブラリを鋳型に、前記のプライマーを用いてＣＬＯＮＴＥＣＨ社製Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＨＦ２キットを用いてＰＣＲを行い、ＯＲＦを含むＤＮＡ断片を取得した。
ＰＣＲは添付の説明書に従って反応液量５０μＬ  ｖｏｌｕｍｅで行った。条件は９２℃  ３分処理後、９２℃  ４５秒、５０℃  ４５秒、６８℃  ２．５分を３０サイクル、最後に６８℃  ５分で行った。得られたＤＮＡはＴＡｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒに組み込み、配列を確認した。配列を〔配列番号１４〕に示した。
なお、Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ＦＧＳＣ２４８９株菌体から抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡに含まれるＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素をコードするＯＲＦは膜結合領域を含むことから、ＯＲＦの１から６６３アミノ酸残基までをコードする部分を膜結合領域として除き、６６４から１１７３アミノ酸残基までを可溶性タンパク質として設計した。なお、設計した遺伝子は、発現のために翻訳開始コドンＡＴＧを導入した。
【００７５】
《実施例５》
（Ｅ）酵素タンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体、計４種の作製と前記酵素タンパク質をコードするＤＮＡを有する計４種の形質転換体での前記酵素タンパク質の発現
配列を確認したＡＣＳをコードするＤＮＡ断片をＳｐｈＩ及びＰｓｔＩサイトを用いて、ＡＣＡＴをコードするＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩサイトを用いて、ＨＭＧＳをコードするＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩサイトを用いて、ΔＨＭＧＲをコードするＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩサイトを用いてｐＱＥ３０ベクターに組み込んだ。これらの発現ベクターにより、常法に従い大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行った。得られた形質転換大腸菌を２倍濃度のＹＴ培地を用いて３７℃、４時間培養後、１ｍＭのＩＰＴＧ（終濃度）添加して更に１８℃、２０時間培養し、目的タンパク質の生産を誘導した。遠心分離により菌体回収後リゾチームと超音波破砕処理により可溶性画分を調製し、１０％ポリアクリルアミドゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）にて目的タンパク質の生産を確認した。電気泳動のマーカーはＢｉｏｒａｄ社製Ｌｏｗ  ｍａｒｋｅｒを用いた。マーカーの分子量は大きいほうから、９７ｋＤａ、６６ｋＤａ、４５ｋＤａ、３１ｋＤａ、２１ｋＤａ、１４ｋＤａを示す。
【００７６】
ｐＱＥ３０ベクターに組み込み発現させた目的タンパク質は、アセチルＣｏＡ合成酵素が７４ｋＤａ、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）が４１ｋＤａ、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素が５０ｋＤａ、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素が５４ｋＤａ付近にそれぞれ確認することができた。
なお、得られた目的タンパク質は、アセチルＣｏＡ合成酵素の配列を〔配列番号１〕に、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）の配列を〔配列番号５〕に、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素の配列を〔配列番号９〕に、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素の配列を〔配列番号１３〕に示した。
それぞれの電気泳動写真を図１に示した。
【００７７】
〔分析例〕
メバロン酸の分析は以下に示す手順で抽出後、脱水環化させてメバロノラクトンの形として、ＨＰＬＣを用いて行った。
（抽出）メバロン酸を含む水溶液１ｍＬに８５％リン酸２滴、無水硫酸ナトリウム０．５ｇ、２−ブタノン２ｍＬを添加し３０秒間撹拌後３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次に上層である２−ブタノン層１ｍＬを別の試験菅にとり遠心エバポレーターで乾固後、油状の抽出物をイソプロパノール０．１ｍＬに溶解し試料溶液とした。
（ＨＰＬＣ）以下に示す条件により行った。
カラム：ヌクレオジル５Ｎ（ＣＨ３）２（ドイツ、Ｍ．ナーゲル社製）、サイズ直径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、４０℃
移動層：Ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速１．５ｍＬ／分
検出：示差屈折計〔昭和電工（株）製、ＳＥ−６１型〕、注入量０．０１ｍＬ
【００７８】
《実施例６》
実施例５で得られたアセチルＣｏＡ合成酵素１．６４ｍｇ、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ケトチオラーゼ）０．１１５ｍｇ、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素０．１０５ｍｇ、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素０．１３５ｍｇからなる酵素カクテルを用い、基質として１３Ｃ２−酢酸ナトリウム０．２５ｍｇ、補助因子としてコエンザイムＡ１．５３５ｍｇ、ＡＴＰ  ９．０７８ｍｇ、ＮＡＤＰＨ４．４ｍｇ、無機塩として０．５Ｍ  ＭｇＣｌ２水溶液２０μＬ（最終濃度約２０ｍＭ）を添加し、最後に、緩衝液として１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０μＬ（最終濃度約１００ｍＭ）及び水４００μＬ加えて、反応容量約０．５ｍＬで、２８℃で１２時間攪拌して反応した。反応終了後、得られた反応液を前記分析例に従って定量し、メバロノラクトン０．０６９ｍｇが合成されたことを確認した（酢酸ナトリウムからのモル收率５４％）。また、１３Ｃ６−Ｒ−メバロノラクトンであることは、ＭＳ、比旋光度及び１３Ｃ−ＮＭＲで確認した。
《比較例１》
グルコース５ｇ、ポリペプトン０．２５ｇ、酵母エキス０．１２５ｇ、リン酸１カリウム０．０５ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．０２５ｇ、及びアデカノールＬＧ−２９４を０．０２５ｇよりなる５０ｍＬの培地Ａを作成した。これにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ  ＡＤＫ８１０７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２３２０）を一白金耳接種し、２６℃、１７０ｒｐｍで４日間培養し、種培養液とした。次に、培地Ａで使用したグルコースに変えて、１３Ｃ６−グルコース５ｇを用い、炭酸カルシウム０．５ｇを追加する以外は同じ組成の培地Ｂを作成し、種培養液２ｍＬを接種し、２６℃、１７０ｒｐｍで５日間培養を行った。培養終了後、遠心分離により菌体を除き、１３Ｃ６−Ｒ−メバロン酸を含む培養ろ液４１ｍＬを得た。得られた培養ろ液を分析例に従って定量し、メバロノラクトン２２６ｍｇが合成されたことを確認した（グルコースからのモル收率６．２％）。また、１３Ｃ６−Ｒ−メバロノラクトンであることはＭＳ、比旋光度及び１３Ｃ−ＮＭＲで確認した。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
この方法で得られた標識されたＲ−メバロン酸は、医薬・化粧品・食品分野等に有用なテルペノイドが、どのような生合成経路により合成及び代謝されるかを解明するための研究用試薬として有用であり、標識された各種化合物の合成原料としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ＡＣＳ、ＡＣＡＴ、ＨＭＧＳ、ΔＨＭＧＲの各酵素の大腸菌での発現を示す図である。レーンＭＫはマーカーを示し、マーカーの分子量は、９７ｋＤａ、６６ｋＤａ、４５ｋＤａ、３１ｋＤａ、２１ｋＤａ、１４ｋＤａを示す。
【図１】
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【配列表】
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