(57)【要約】【課題】難水溶性物質の感作性インビトロ評価方法、及び感作性物質を活性化又は抑制する難水溶性物質の評価方法。【解決手段】ゲル状の温度感応性ハイドロゲル培地に難水溶性被験物質が浸潤することにより、該被験物質が培地中のヒト単核球細胞を暴露させることを特徴とする、難水溶性物質の感作性インビトロ評価方法、及び温度感応性ハイドロゲル培地に難水溶性感作性試料と難水溶性被験物質を一緒に適用し、これらがゲル状の温度感応性ハイドロゲル培地内に浸潤することにより培地中のヒト単核球細胞を暴露させることを特徴とする、該難水溶性被験物質が該難水溶性感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤であるか否かを評価する方法を供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト単核球細胞上で発現される分子を指標として難水溶性物質の感作性をインビトロ評価する方法において、ゲル状の温度感応性ハイドロゲル培地に難水溶性被験物質を浸潤させることにより、該被験物質により培地中のヒト単核球細胞を暴露させ、ヒト単核球細胞上で発現される分子を検出する前に、温度を下げることにより温度感応性ハイドロゲル培地をゾル化させてヒト単核球細胞を回収し、そして通常培地で培養することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ヒト単核球細胞上で発現される分子が、ＣＤ８６分子、ＣＤ５４分子、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＣＣＲ７、ＩＬ−２３、ＡＴＦ−３、又はこれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ゲル状の温度感応性ハイドロゲル培地におけるヒト単核球細胞の培養時間が約２時間である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
通常培地中の培養時間が約２２時間である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ヒト単核球細胞がＴＨＰ−１細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
温度感応性ハイドロゲルがメビオールジェル（登録商標）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度感応性ハイドロゲルを使用する難水溶性物質の感作性インビトロ評価方法及び感作性物質を活性化又は抑制する難水溶性物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体においてアレルギー等を誘発する物質（感作性物質）を評価する方法としては、実験動物に被験物質を適用し、そして該実験動物の皮膚などに生ずる反応を視察する方法が行われている。しかしながら、この方法は動物愛護等の見地から見直しがせまられている。
【０００３】
外来物質によりアレルギー反応が惹起される最初の段階では、抗原提示細胞が感作性物質に暴露されると、抗原は該細胞により従属リンパ節に運ばれる。そこで、該細胞は、その細胞表面に抗原を担持したＭＨＣクラスＩＩタンパク質や、ＣＤ８６分子などを発現し、Ｔ細胞に抗原提示を行う。これにより、抗原特異的な獲得性免疫応答が成立する。この一連の過程では、該細胞は多くのサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２など）やケモカイン（ＭＩＰ−１αやＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなど）を産生することで、活性化し、従属リンパ節への遊走が可能になる。このような抗原提示細胞としては樹状細胞やヒト単核球細胞株が知られている。しかしながら、樹状細胞の性質には個人差があり、また再現性に問題があり、一定の特性を有する樹状細胞を安定的に入手することが困難である。また、樹状細胞はその調製に困難さが伴う。
【０００４】
他方、ヒト単核球細胞株は細胞の取扱いは、比較的容易であり、現時点ではヒト単核球細胞株に感作性物質を作用させた場合、該細胞表面に感作性物質の量や特性を反映してＣＤ８６分子が発現されることが明らかとなっている。特開２００１−２２１７９６号公報はＣＤ８６の発現を指標とする感作性物質のインビトロ評価方法を開示する。また、金属ニッケルやコバルトのように、ヒト単核球細胞株に作用させてもＣＤ８６の発現を亢進させない場合については、特開２００５−２７８６２８号公報において、刺激を受けた白血球や他の組織細胞、腫瘍細胞で生産されるペプチドであり、ＣＣケモカインの一つであるＭＩＰ−１の発現を指標とする評価方法が開示されている。更に、特開２００６−１３６２１５号公報においては、ケモカインレセプターの一つであるＣＣＲ７、樹状細胞などで発現しているサイトカインの一種であるＩＬ−２３、及び多くの細胞でＵＶなどのストレスに応答して発現する転写因子であるＡＴＦ−３を指標とする評価方法が開示されている。しかしながら、これらの試験方法においては、被験物質を培養水溶液中で適用することから、被験物質が難水溶性物質である場合にはその適用が困難であるという問題があり、その改良が強く望まれていた。
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−２２１７９６号公報
【特許文献２】特開２００５−２７８６２８号公報
【特許文献３】特開２００６−１３６２１５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は、温度感応性ハイドロゲルを使用する難水溶性物質の感作性インビトロ評価方法及び感作性物質を活性化又は抑制する難水溶性物質の評価方法を供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記問題を解決するために、本発明者は、ハイドロゲル培地中でヒト単核球細胞を三次元培養し、かかる培養ゲルにおいて難水溶性物質を適用すると、該難水溶性物質がゲル中に浸潤することにより、ゲル内の細胞を暴露させることを見出した。しかしながら、難水溶性物質の感作性を評価するためには、細胞の回収が容易であり、且つ高い細胞生存率を得る必要がある。かかる課題を解決するために、培地として環境変化（温度変化及びｐＨ変化）によりゾル−ゲル化が生じるハイドロゲルを使用することを試みた。本発明者は、ヒト単核球細胞がｐＨ変化よりも温度変化に対して抵抗性を有し、更にｐＨ感応性ハイドロゲルよりも、温度感応性ハイドロゲルを使用した場合のほうが、回収が容易であることを見出し、かかる温度感応性ハイドロゲル培地を利用することにより、再現性及びコストパフォーマンスに優れ、かつ簡単に行うことができる難水溶性物質の感作性の評価を可能にした。尚、ハイドロゲル培地とは、ハイドロゲルと細胞培養培地を混合して得られる細胞支持体（scaffold)を意味する。
【０００８】
温度感応性ハイドロゲルには、例えば、メビオールジェル（登録商標）があり、これはポリマー素材を使用した温度に反応する細胞・組織培養用マトリックス、寒天ゲルやゼラチンゲルとは逆に、低温（１５℃以下）で水溶液、高温（２５℃以上）で透明なゲル状になり、立体的な培養が可能で、温度を下げることにより融解する温度感応性ハイドロゲル培地であり、細胞の回収が容易な培地として知られている（例えば、H. N. MadhavanらのA study on the growth of continuous culture cell lines embedded in Mebiol gelを参照のこと）。かかる温度感応性ハイドロゲル培地を培地として利用することにより、ゲル化状態において難水溶性物質に細胞を暴露させ、そして温度を低下させてゾル化（液状化）させることにより高い生存率において細胞の回収を可能にした。
【０００９】
従って、本発明の第一の観点において、ヒト単核球細胞上で発現される分子を指標として難水溶性物質の感作性をインビトロ評価する方法において、ゲル状の温度感応性ハイドロゲル培地に難水溶性被験物質を浸潤させることにより、該被験物質により培地中のヒト単核球細胞を暴露させ、ヒト単核球細胞上で発現される分子を検出する前に、温度を下げることにより温度感応性ハイドロゲル培地をゾル化させてヒト単核球細胞を回収し、そして通常培地で培養することを特徴とする方法、を供する。
【００１０】
本発明の第二の観点において、ヒト単核球細胞上で発現される分子を指標として難水溶性物質の感作性をインビトロ評価する方法であって、ゾル状の温度感応性ハイドロゲル培地にヒト単核球細胞を混合し、昇温することにより該ハイドロゲル培地をゲル化させて該細胞を培養する工程、該細胞を含むゲル状の培地に難水溶性被験物質を適用する工程、そして該細胞上で発現される分子を検出する工程、を含んで成る方法、を供する。
【００１１】
本発明の第三の観点において、ヒト単核球細胞上で発現される分子を指標として難水溶性被験物質が難水溶性感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤であるか否かを評価する方法であって、温度感応性ハイドロゲル培地に難水溶性感作性試料と難水溶性被験物質を一緒に適用し、これらをゲル状の温度感応性ハイドロゲル培地内に浸潤させることにより培地中のヒト単核球細胞を暴露させることを特徴とする方法、を供する。
【００１２】
本発明の第一から第三の観点の好適な態様において、前記ヒト単核球細胞上で発現される分子が、ＣＤ８６分子、ＣＤ５４分子、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＣＣＲ７、ＩＬ−２３、ＡＴＦ−３、又はこれらの組み合わせであることを特徴とする。
【００１３】
本発明の第一から第三の観点の更に好適な態様において、ゲル状の温度感応性ハイドロゲル培地におけるヒト単核球細胞の培養時間が約２時間である。
【００１４】
本発明の第一から第三の観点の更に好適な態様において、通常培地中の培養時間が約２２時間である。
【００１５】
本発明の第一から第三の観点の更に好適な態様において、ヒト単核球細胞がＴＨＰ−１細胞である。
【００１６】
本発明の第一から第三の観点の更に好適な態様において、温度感応性ハイドロゲルがメビオールジェル（登録商標）である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、難水溶性物質の感作性をインビトロにおいて評価することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明において用いる細胞としては、感作性物質の特性を反映して、ＣＤ８６分子、ＣＤ５４分子、ＭＩＰ−１分子、即ち、ＭＩＰ−１α及び／又はＭＩＰ−１β、ＣＣＲ７、ＩＬ−２３、及び／又はＡＴＦ−３を放出するものであれば特に限定されず、哺乳動物の単核球細胞、特にヒト単核球細胞等であってよく、具体例としてＴＨＰ−１細胞が挙げられる。ＴＨＰ−１細胞は樹立された培養細胞であって、当業界の研究者により広く用いられており、容易に入手することができる。具体的には、ＴＨＰ−１細胞は公的な細胞バンクまたは民間企業より入手することができる。
【００１９】
ＣＤ８６分子及びＣＤ５４分子は、ヒト単核球細胞に感作性物質を作用させた場合に、該細胞の表面に、感作性物質の量や特性を反映して発現される単鎖膜貫通型タンパクであり、感作性の指標と使用することができる。
【００２０】
ＭＩＰ−１（マクロファージ由来炎症性タンパク質１）（ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１β）は、ヒト単核球細胞に感作性物質を作用させた場合に、感作性物質の量や特性を反映して放出される、白血球や他の組織細胞、腫瘍細胞で生産されるペプチドであり、これはＣＣケモカインの１つであり、感作性の指標と使用することができる。
【００２１】
ＣＣＲ７は、ケモカインレセプターの一つであり、活性化した樹状細胞表面に発現しているタンパク質であり、樹状細胞の所属リンパ節への遊走に関与している。ＩＬ−２３は、樹状細胞などで発現しているサイトカインの一種であり、メモリーＴ細胞やナイーブＴ細胞の増殖に関与している。ＡＴＦ−３は、多くの細胞でＵＶなどのストレスに応答して発現する転写因子である。ヒト単核球細胞株に感作性物質を作用させた場合、感作性物質の量や特性に反映してこれらの分子が発現され、感作性の指標と使用することができる。
【００２２】
本発明において用いる温度感応性ハイドロゲルは、温度変化によりゲル−ゾル化するハイドロゲルであり、好ましくはメビオールジェル（登録商標）である。メビオールジェル（登録商標）は（株）池田理研から購入することができ、細胞や組織の培養試薬であり、低温（１５℃以下）下においてゾル上のメビオールジェル（登録商標）を含有する培地中に細胞を混合し、昇温（２５℃以上）することによりゲル化させることができ、細胞を三次元培養することが可能である。温度を下げることによりメビオールジェル（登録商標）培地は再びゾル化するために容易に回収することができ、細胞へのストレスを抑えることが可能である。
【００２３】
メビオールジェル（登録商標）培地は、クリーンベンチ内でメビオールジェル（登録商標）を含むフラスコに１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０を加え、１５℃以下で３時間以上静置し、その後振盪してメビオールジェル（登録商標）を培地中に完全に溶解させ、泡消するまで低温下で静置することにより調製する。
【００２４】
本明細書でいう、通常培地とは、細胞を培養するために一般的に用いられる培地を意味し、上述のメビオールジェル（登録商標）培地の調製に使用される培地も含む。例えば具体例としてＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地等が挙げられる。これらの培地にはおよそ１０％程度のウシ胎児血清が添加されていてよい。
【００２５】
低温下、好ましくは１５℃以下において、ＴＨＰ−１細胞数が１×１０6細胞／５００μＬ／ウェル、２×１０6細胞／５００μＬ／ウェル、又は４×１０6細胞／５００μＬ／ウェルとなるように上述のメビオールジェル（登録商標）培地と混合し、該混合液を２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルで播種し、好ましくは２５℃以上に昇温することにより、該混合液をゲル化させる。一方難水溶性の被験物質を適当な溶媒、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、適当な担体、好ましくは、流動パラフィンを用いて被験物質溶液を調製し、該調製液を５００μＬ／ウェルにおいて上記のゲル状培地に適用し、３７℃でインキュベーションする。かかるインキュベーション（培養）時間は、好ましくは２時間である。その後培養プレートを氷冷することでゾル化させた細胞混合液をエッペンドルフチューブに回収して、遠心分離を行う。その後１ｍＬのＲＰＭＩ培地で洗浄し、上清を除去した後、１ｍＬのＲＰＭＩ培地を加え、２４ウェルプレートに移す。通常培地、好ましくはＲＰＭＩ培地にて、２２時間培養後、感作性物質に起因するＴＨＰ−１細胞由来の発現物質を検出又は測定する。感作性物質に起因して指標とされるＴＨＰ−１細胞由来の発現物質は、好ましくはＣＤ８６分子、ＣＤ５４分子、ＭＩＰ−１分子、例えば、ＭＩＰ−１α若しくはＭＩＰ−１β、ＣＣＲ７、ＩＬ−２３、及び／又はＡＴＦ−３であり、より好ましくはＣＤ８６分子、及び／又はＣＤ５４分子であり、最も好ましくはＣＤ８６分子である。
【００２６】
細胞の表面に発現されたＣＤ８６分子又はＣＤ５４分子の検出又は測定方法は特に限定されないが、抗ヒトＣＤ８６抗体又は抗ヒトＣＤ５４抗体を用いた免疫測定が好ましく、フローサイトメトリー法が特に好ましい。抗ヒトＣＤ８６／ＣＤ５４抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、ＣＤ８６又はＣＤ５４を表面に発現している細胞を免疫原として用いた常法に従って調製することができる。フローサイトメトリー法も常法に従って行うことができる（特開２００１−２２１７９６号公報を参照のこと）。
【００２７】
ＭＩＰ−１の検出又は測定方法は、細胞における遺伝発現を検出する定量的又は定性的ＲＴ−ＰＣＲ法、マイクロアレイ、ノーザンブロッティング等の方法やＭＩＰ−１に対する抗体との反応性に基づくエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウスタンブロッティング等の方法を用いることができる。いずれの方法によってもＭＩＰ−１の測定が可能であるが、操作の簡便性、感度、設備等の点からヒト単核球細胞から培地中に放出されたＭＩＰ−１分子をエンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ法）で測定するのが好ましい（特開２００５−２７８６２８号公報を参照のこと）。
【００２８】
ＣＣＲ７、ＩＬ−２３及び／又はＡＴＦ−３の検出又は測定方法は、ＣＣＲ７、ＩＬ−２３及び／又はＡＴＦ−３分子を発現する細胞における遺伝発現を検出する定量的又は定性的ＲＴ−ＰＣＲ法、マイクロアレイ、ノーザンブロッティング等の方法を用いることができる。また、ＣＣＲ７については、ＣＣＲ７に対する抗体との反応性に基づくフローサイトメトリー法等の方法を用いることができ、ＩＬ−２３については、ＩＬ−２３に対する抗体との反応性に基づくエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング等の方法を用いることができる。測定については、操作の簡便性、感度、設備等の点からＣＣＲ７、ＩＬ−２３、ＡＴＦ−３を発現する細胞から発現されるＣＣＲ７、ＩＬ−２３、ＡＴＦ−３をコードする遺伝子、例えば、対応のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法で測定するのが好ましい（特開２００６−１３６２１５号公報を参照のこと）。
【００２９】
感作性物質の評価においては、好ましくは、被験物質を加えないで、上記の同様の培養を行い対照とする。
【００３０】
また難水溶性感作性物質を阻害又は活性化する難水溶性物質の評価においては、ゲル状の温度感応性ハイドロゲル培地、例えば、メビオールジェル（登録商標）培地中のヒト単核球細胞、好ましくはＴＨＰ−１を、既知の難水溶性感作性物質とともに難水溶性被験物質に暴露し、好ましくは２時間後、好ましくは通常培地中で２２時間培養を行い、そして上述の難水溶性物質の感作性インビトロ評価方法と同様にヒト単核球細胞由来の発現物質、好ましくはＣＤ８６分子、ＣＤ５４分子、ＭＩＰ−１分子、例えば、ＭＩＰ−１α若しくはＭＩＰ−１β、ＣＣＲ７、ＩＬ−２３、及び／又はＡＴＦ−３、より好ましくはＣＤ８６分子、及び／又はＣＤ５４分子を検出又は測定する。この場合も、好ましくは被験物質を加えないで上記と同様の培養を行い、対象とする。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００３２】
実験１：メビオールジェル（登録商標）（温度感応性ハイドロゲル）及びＢＤ  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲル（ｐＨ感応性ハイドロゲル）の比較
本発明における培養担体として温度感応性のメビオールジェル（登録商標）とｐＨ感応性ハイドロゲルのＢＤ  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲルのどちらが適しているかを、細胞生存率及び細胞の回収方法について以下のとおり比較検討を行った。
【００３３】
材料
細胞：ＴＨＰ−１（３３７４０５３）
培地：ＲＰＭＩ１６４０
試薬：メビオールジェル（登録商標）（（株）池田理研、型番：ＰＭＷ２０−１００５）、ＢＤ  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲル（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、商品番号３５４２５０）、１０％ショ糖溶液（和光社）
【００３４】
方法
（１）メビオールジェルを用いた細胞培養
メビオールジェル（登録商標）培地の準備
クリーンベンチ内でメビオールジェル（登録商標）入りのフラスコに上記培地１０ｍＬを加え、低温下（１５℃以下）で３時間以上静置し、その後、振盪してメビオールジェル（登録商標）に完全に溶解させた。完全に溶解したら消泡するまで低温下で数時間〜数日間、静置し保存した。
【００３５】
メビオールジェル（登録商標）培地と細胞の混合
計算盤を用いてＴＨＰ−１の細胞数を計測し、２×１０6細胞／５００μＬ／ウェルになるように、低温下においてあるメビオールジェル（登録商標）で調整した。
【００３６】
播種及び培養
調整したＴＨＰ−１細胞・メビオールジェル（登録商標）培地混合液を２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルで播種した。その後、培地を５００μＬ／ウェルずつ加え、３７℃のインキュベーターで培養した。
【００３７】
（２）ＢＤ  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲルを用いた細胞培養
ＢＤ  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲルの準備
ＢＤ  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲルを３０分間ソニケーションする。
【００３８】
細胞の準備
計算盤を用いてＴＨＰ−１の細胞数を計測し、１０％ショ糖溶液で洗浄後、２×１０6細胞／５００μＬ／ウェルになるように、１０％ショ糖溶液に懸濁した。
【００３９】
ＢＤ  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲルと細胞の混合
ＢＤ  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲルと細胞／ショ糖混合液を等量ずつとり混合した。これを２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルずつ加えた。５〜１０分後、培地を交換した。３０分以内に該培地交換を２回行った後、３７℃のインキュベーターで培養した。
【００４０】
（３）細胞の回収
メビオールジェル（登録商標）
培養終了後、培地を５００μＬ／ウェルずつ加え、プレートごと５分間氷冷した。完全にゾル状になったらエッペンドルフチューブに回収し、遠心を行った。上清を除去し、新しい培地を１ｍＬ加えた。
【００４１】
ＢＤ  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲル
ピペッティングを行いゲルを破壊した。滑らかになったらエッペンドルフチューブに回収し、遠心を行った。上清を除去し、新しい培地１ｍＬを加えた。
【００４２】
（４）トリパンブルー染色
細胞溶解液と０．４％トリパンブルー（GIBCO社）を（１：１）で混合し、計算盤で生細胞数を計測した。
【００４３】
その結果を表１に示す。
【表１】
2008125453.tif 000002
【００４４】
ＢＤ  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲル及びメビオールジェル（登録商標）のいずれにおいても、８０％以上の生存率が得られた。しかしながら、細胞の回収において、ＢＤ  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲルは何度洗浄を行っても、ゲルと完全には分離しなかった。
【００４５】
考察
培養後にインビトロ皮膚感作性試験法を用いて感作性を評価することを考えると、細胞の回収が容易なメビオールジェル（登録商標）が培養担体として適している可能性が示唆された。
【００４６】
結論
インビトロ皮膚感作性試験法を用いた感作性評価試験においては、培養担体としてメビオールジェル（登録商標）の方がＢＤ  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲルより適している。
【００４７】
実験２：播種細胞数・培養時間の検討
メビオールジェル（登録商標）を培養担体としたときの播種細胞数及び培養時間の最適条件を設定する。
【００４８】
材料
細胞：ＴＨＰ−１（３３７４０５３）
培地：ＲＰＭＩ１６４０
試薬：メビオールジェル（登録商標）（（株）池田理研、型番：ＰＭＷ２０−１００５）
【００４９】
方法
（１）メビオールジェル（登録商標）培地の準備
クリーンベンチ内でメビオールジェル（登録商標）入りのフラスコに上記培地１０ｍＬを加え、低温下（１５℃以下）で３時間以上静置し、その後、振盪してメビオールジェル（登録商標）に完全に溶解させた。完全に溶解したら消泡するまで低温下で数時間〜数日間、静置し保存した。
【００５０】
メビオールジェル（登録商標）培地と細胞の混合
計算盤を用いてＴＨＰ−１の細胞数を計測し、１×１０6、２×１０6、及び４×１０6細胞／５００μＬ／ウェルになるように、低温下においてあるメビオールジェル（登録商標）で調整した。
【００５１】
播種及び培養
調整したＴＨＰ−１細胞・メビオールジェル（登録商標）培地混合液を２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルで播種した。その後、培地を５００μＬ／ウェルずつ加え、３７℃のインキュベーターで培養した。
【００５２】
細胞の回収と生存率測定
１２、２４、及び４８時間経過したプレートを氷冷することにより培地をゾル化させ、細胞をエッペンドルフチューブに回収し、ＦＡＣＳ用バッファーで洗浄した。その後ヨウ化プロピジウムで核染色し、フローサイトメトリーにて細胞の生存率を測定した。
【００５３】
その結果を表２に示す。
【表２】
2008125453.tif 000003
【００５４】
播種細胞数については、０．５×１０6、１．０×１０6、及び２．０×１０6細胞／１ｍＬ／ウェルで播種した試料で良好な生存率が得られた。培養時間については２４時間で最も生存率が良好であった。しかしながら、現行のインビトロ皮膚感作試験では無処置群で９０％の生存率が得られない場合、データとして採用されないことから、培養時間については再度検討が必要であると考えられた。
【００５５】
結論
播種細胞数は１．０×１０6細胞／１ｍＬ／ウェル、培養時間は２４時間が最適であった。
【００５６】
実験３：ゲル内での培養時間の検討
生存率が９０％以上となる、培養時間の最適条件を検討する。
【００５７】
材料
細胞：ＴＨＰ−１（３３７４０５３）
培地：ＲＰＭＩ１６４０
試薬：メビオールジェル（登録商標）（（株）池田理研、型番：ＰＭＷ２０−１００５）
【００５８】
方法
（１）メビオールジェル（登録商標）培地の準備
クリーンベンチ内でメビオールジェル（登録商標）入りのフラスコに上記培地１０ｍＬを加え、低温下（１５℃以下）で３時間以上静置し、その後、振盪してメビオールジェル（登録商標）に完全に溶解させた。完全に溶解したら消泡するまで低温下で数時間〜数日間、静置し保存した。
【００５９】
メビオールジェル（登録商標）培地と細胞の混合
計算盤を用いてＴＨＰ−１の細胞数を計測し、１×１０6、２×１０6、及び４×１０6細胞／５００μＬ／ウェルになるように、低温下においてあるメビオールジェル（登録商標）で調整した。
【００６０】
播種及び培養
調整したＴＨＰ−１細胞・メビオールジェル（登録商標）培地混合液を２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルで播種した。その後、培地を５００μＬ／ウェルずつ加え、３７℃のインキュベーターで培養した。
【００６１】
細胞の回収と生存率測定
２時間経過したプレートを氷冷することでゾル状にした細胞混合液を、エッペンドルフチューブに回収し、遠心を行った。その後ＲＰＭＩ培地１ｍＬで洗浄し、上清を除去した後、ＲＰＭＩ培地を１ｍＬ加え、２４ウェルプレートに移した。ＲＰＭＩ培地で２２時間培養後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で核染色し、フローサイトメトリーにて細胞の生存率を測定した。
【００６２】
２４時間経過したプレートを氷冷することでゾル状にした細胞混合液をエッペンドルフチューブに回収し、フローサイトメトリーバッファーで洗浄した。その後ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で核染色し、フローサイトメトリーにて細胞の生存率を測定した。
【００６３】
その結果を表３に示す。
【表３】
2008125453.tif 000004
【００６４】
ゲル内で２時間培養した後、通常の液体培地であるＲＰＭＩ培地で２２時間培養した場合、生存率が９０％以上となることがわかった。
【００６５】
考察
ゲル内で長時間（２４時間）培養を行うと、剪断応力などトラップされることによる影響が細胞の生存率を低下させる可能性が示唆された。
【００６６】
結論
ゲル内での培養時間は２時間とし、その後ＲＰＭＩ培地で２２時間培養することが好ましい。
【００６７】
実験４：被験物質適用条件の検討（ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ））
代表的な感作性物質であるジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）の適用でＣＤ８６値が上昇するかを確認する。
【００６８】
材料
細胞：ＴＨＰ−１（３３７４０５３）
培地：ＲＰＭＩ１６４０
試薬：メビオールジェル（登録商標）（（株）池田理研、型番：ＰＭＷ２０−１００５）
【００６９】
方法
（１）メビオールジェル（登録商標）培地の準備
クリーンベンチ内でメビオールジェル（登録商標）入りのフラスコに上記培地１０ｍＬを加え、低温下（１５℃以下）で３時間以上静置し、その後、振盪してメビオールジェル（登録商標）に完全に溶解させた。完全に溶解したら消泡するまで低温下で数時間〜数日間、静置し保存した。
【００７０】
ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）の調製
ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）（最終濃度２、２．４、２．９、３．４、４．２、５、６、及び７．２μｇ／ｍＬ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、ＲＰＭＩ培地を用いて調製した。
【００７１】
メビオールジェル（登録商標）培地と細胞の混合
計算盤を用いてＴＨＰ−１の細胞数を計測し、１×１０6、２×１０6、及び４×１０6細胞／５００μＬ／ウェルになるように、低温下においてあるメビオールジェル（登録商標）で調整した。
【００７２】
播種及び培養
調整したＴＨＰ−１細胞・メビオールジェル（登録商標）培地混合液を２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルで播種した。その後、無処理群には上記培地を、ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）処理群には上記で調製したジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）調製液をそれぞれ５００μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃のインキュベーターで培養した。
【００７３】
細胞の回収と生存率測定
２時間経過したプレートを氷冷することでゾル状にした細胞混合液を、エッペンドルフチューブに回収し、遠心を行った。その後ＲＰＭＩ培地１ｍＬで洗浄し、上清を除去した後、ＲＰＭＩ培地を１ｍＬ加え、２４ウェルプレートに移した。２２時間培養後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で核染色し、フローサイトメトリーにて細胞の生存率を測定した。
【００７４】
ＣＤ８６値及びＣＤ５４値の測定
ＣＤ８６値及びＣＤ５４値の測定において、培養後の細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣで蛍光標識した抗ヒトＣＤ８６抗体又は抗ヒトＣＤ５４抗体を用いて氷水中で３０分間染色し、そして染色した細胞をＰＢＳで洗浄し、洗浄後の細胞を１％ＢＳＡを含むＰＢＳに浮遊させた。その細胞浮遊液を用いてフローサイトメトリーにより生細胞の蛍光強度を測定し、被験物質無処理のコントロールを比較した。
【００７５】
その結果を表４に示す。
【表４】
2008125453.tif 000005
明らかなＣＤ８６値の上昇が認められた。
【００７６】
考察
ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）の感作性を評価できる可能性が示唆された。更に二次元培養時とは異なる濃度反応性を示したことから、三次元培養にすることで二次元培養とは物質の浸透性等が異なる可能性が示唆され、三次元培養独自の濃度設定が必要であることが考えられた。
【００７７】
結論
該三次元培養モデルにおいてジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）の適用によりＣＤ８６値の上昇が認められた。
【００７８】
実験５：被験物質適用条件の検討
感作性物質であるニッケルやグルタルアルデヒドの適用でＣＤ８６値が上昇するか、また非感作性物質であるラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）でＣＤ８６値が上昇しないかを確認する。
【００７９】
材料
細胞：ＴＨＰ−１（３３７４０５３）
培地：ＲＰＭＩ１６４０
試薬：メビオールジェル（登録商標）（（株）池田理研、型番：ＰＭＷ２０−１００５）
【００８０】
方法
（１）メビオールジェル（登録商標）培地の準備
クリーンベンチ内でメビオールジェル（登録商標）入りのフラスコに上記培地１０ｍＬを加え、低温下（１５℃以下）で３時間以上静置し、その後、振盪してメビオールジェル（登録商標）に完全に溶解させた。完全に溶解したら消泡するまで低温下で数時間〜数日間、静置し保存した。
【００８１】
被験物質の調製
ニッケル（最終濃度：７２．３、８６．８、１０４．２、１２５、１５０、１８０、２１６、及び２５９．２μｇ／ｍＬ）を生理食塩水に溶解させた後、ＲＰＭＩ培地を用いて調製した。
【００８２】
グルタルアルデヒド（最終濃度：２．７、３．２、３．９、４．６、５．６、６．７、８、及び９．６μｇ／ｍＬ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、ＲＰＭＩ培地を用いて調製した。
【００８３】
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）（最終濃度：２４、２９、３５、４２、５０、６０、及び７２μｇ／ｍＬ）を生理食塩水に溶解させた後、ＲＰＭＩ培地を用いて調製した。
【００８４】
メビオールジェル（登録商標）培地と細胞の混合
計算盤を用いてＴＨＰ−１の細胞数を計測し、１×１０6、２×１０6、及び４×１０6細胞／５００μＬ／ウェルになるように、低温下においてあるメビオールジェル（登録商標）で調整した。
【００８５】
播種及び培養
調整したＴＨＰ−１細胞・メビオールジェル（登録商標）培地混合液を２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルで播種した。その後、無処理群には培地を、ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）処理群には上で調製した被験物質調製液をそれぞれ５００μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃のインキュベーターで培養した。
【００８６】
細胞の回収と生存率測定
２時間経過したプレートを氷冷することでゾル状にした細胞混合液を、エッペンドルフチューブに回収し、遠心を行った。その後ＲＰＭＩ培地１ｍＬで洗浄し、上清を除去した後、ＲＰＭＩ培地を１ｍＬ加え、２４ウェルプレートに移した。２２時間培養後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で核染色し、フローサイトメトリーにて細胞の生存率を測定した。
【００８７】
ＣＤ８６値及びＣＤ５４値の測定
ＣＤ８６値及びＣＤ５４値の測定において、培養後の細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣで蛍光標識した抗ヒトＣＤ８６抗体又は抗ヒトＣＤ５４抗体を用いて氷水中で３０分間染色し、そして染色した細胞をＰＢＳで洗浄し、洗浄後の細胞を１％ＢＳＡを含むＰＢＳに浮遊させた。その細胞浮遊液を用いてフローサイトメトリーにより生細胞の蛍光強度を測定し、被験物質無処理のコントロールを比較した。
【００８８】
その結果を表５に示す。
【表５】
2008125453.tif 000006
感作性物質であるニッケルやグルタルアルデヒドの適用では、明らかなＣＤ８６値の上昇が認められたのに対し、非感作性物質であるラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）ではＣＤ８６値の上昇は認められなかった。
【００８９】
考察
生存率から考えると、濃度をもう少し振り、用量依存性を検討する必要がある。
【００９０】
実験６：被験物質適用条件の検討（難水溶性物質）
難水溶性物質の適用条件について検討を行う。
【００９１】
材料
細胞：ＴＨＰ−１（３３７４０５３）
培地：ＲＰＭＩ１６４０
試薬：メビオールジェル（登録商標）（（株）池田理研、型番：ＰＭＷ２０−１００５）
【００９２】
方法
（１）メビオールジェル（登録商標）培地の準備
クリーンベンチ内でメビオールジェル（登録商標）入りのフラスコに上記培地１０ｍＬを加え、低温下（１５℃以下）で３時間以上静置し、その後、振盪してメビオールジェル（登録商標）に完全に溶解させた。完全に溶解したら消泡するまで低温下で数時間〜数日間、静置し保存した。
【００９３】
被験物質の調製
ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）（最終濃度：８．６μｇ／ｍＬ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、ｉ）流動パラフィン、ii）ワセリン、iii ）ミエルナイトクリーム、iv）ＲＰＭＩ培地、を用いて調製した。
【００９４】
メビオールジェル（登録商標）培地と細胞の混合
計算盤を用いてＴＨＰ−１の細胞数を計測し、１×１０6、２×１０6、及び４×１０6細胞／５００μＬ／ウェルになるように、低温下においてあるメビオールジェル（登録商標）で調整した。
【００９５】
播種及び培養
調整したＴＨＰ−１細胞・メビオールジェル（登録商標）培地混合液を２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルで播種した。その後、無処理群には培地を、ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）処理群には上で調製した被験物質調製液をそれぞれ５００μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃のインキュベーターで培養した。
【００９６】
細胞の回収と生存率測定
２時間経過したプレートを氷冷することでゾル状にした細胞混合液を、エッペンドルフチューブに回収し、遠心を行った。その後ＲＰＭＩ培地１ｍＬで洗浄し、上清を除去した後、ＲＰＭＩ培地を１ｍＬ加え、２４ウェルプレートに移した。２２時間培養後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で核染色し、フローサイトメトリーにて細胞の生存率を測定した。
【００９７】
ＣＤ８６値及びＣＤ５４値の測定
ＣＤ８６値及びＣＤ５４値の測定において、培養後の細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣで蛍光標識した抗ヒトＣＤ８６抗体又は抗ヒトＣＤ５４抗体を用いて氷水中で３０分間染色し、そして染色した細胞をＰＢＳで洗浄し、洗浄後の細胞を１％ＢＳＡを含むＰＢＳに浮遊させた。その細胞浮遊液を用いてフローサイトメトリーにより生細胞の蛍光強度を測定し、被験物質無処理のコントロールを比較した。
【００９８】
その結果を表６に示す。
【表６】
2008125453.tif 000007
【００９９】
ＲＰＭＩ培地及び流動パラフィンにジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）を混合した試料においてＣＤ８６値の上昇が認められた。
【０１００】
考察
生存率を見ると、ワセリン及びクリームではゲルにジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）が移行していないことがわかる。今後、媒体の移行性等、更なる検討が必要であるが、難水溶性物質を直接適用できる可能性も示唆された。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】メビオールジェル（登録商標）培地及びＢＤ  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲル培地における、トリパンブルー染色による細胞生存率の比較を示す。
【図２】播種細胞数及び培養時間における細胞生存率の比較を示す。
【図３】ゲル状のメビオールジェル（登録商標）培地中で２４時間培養した場合と、ゲル状のメビオールジェル（登録商標）培地中で２時間、その後ＲＰＭＩ培地中で２２時間培養した場合の細胞生存率の比較を示す。
【図４】感作性物質ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）の濃度に対する、ＣＤ８６値及びＣＤ５４値、並びに細胞生存率を示す。
【図５】グルタルアルデヒド、ニッケル、又はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を適用した場合のＣＤ８６値及びＣＤ５４値、並びに細胞生存率を示す。
【図６】被験物質をそれぞれ、流動パラフィン、ワセリン、ミエルナイトクリーム、ＲＰＭＩ培地を用いて調製した場合のＣＤ８６値及びＣＤ５４値、並びに細胞生存率を示す。
【図１】
2008125453.tif 000008
【図２】
2008125453.tif 000009
【図３】
2008125453.tif 000010
【図４】
2008125453.tif 000011
【図５】
2008125453.tif 000012
【図６】
2008125453.tif 000013