(57)【要約】【課題】メチル化ＤＮＡの検出において、迅速かつ安定して検出結果を得られる、簡便なＤＮＡメチル化検出用試料の調製方法、ＤＮＡメチル化検出方法、生体試料前処理液及び試薬キットを提供する。【解決手段】本発明のＤＮＡメチル化検出用のＤＮＡメチル化検出用試料を調製するための生体試料前処理液はプロテアーゼを含み、生体試料から核酸試料を調製する工程を省き、生体試料の溶解液を亜硫酸水素塩で直接処理することでＤＮＡのメチル化を検出する際に、安定した検出結果を得ることができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡメチル化検出用試料を調製するための生体試料前処理液であって、プロテアーゼを含む水溶液からなる生体試料前処理液。
【請求項２】
界面活性剤及び／又はカオトロピック剤をさらに含む、請求項１に記載の生体試料前処理液。
【請求項３】
前記界面活性剤及び／又はカオトロピック剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、尿素、及び／又は塩酸グアニジンである、請求項２に記載の生体試料前処理液。
【請求項４】
ＤＮＡを切断することのできる切断剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体試料前処理液。
【請求項５】
ｐＨが７〜１０である請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体試料前処理液。
【請求項６】
ＤＮＡメチル化検出用試料を調製するための試薬キットであって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体試料前処理液からなる第１試薬と、ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する変換剤を含む第２試薬とからなる試薬キット。
【請求項７】
前記変換剤が、亜硫酸水素塩である請求項６に記載の試薬キット。
【請求項８】
前記亜硫酸水素塩の濃度が、４〜８ｍＭである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡメチル化検出用試料の調製方法であって、
プロテアーゼを含む水溶液からなる生体試料前処理液と細胞を含む生体試料を混合する工程と、
得られた混合液に、変換剤を添加して混合物中のＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する工程からなるＤＮＡメチル化検出用試料の調製方法。
【請求項１０】
前記生体試料が、血清、血漿、生体組織又は乳腺分泌液である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が腫瘍細胞である請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
生体試料前処理液と生体試料を混合する工程の前に、細胞を含む生体試料を界面活性剤及び／又はカオトロピック剤を含む溶解液で溶解する工程、を含む請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
生体試料におけるＤＮＡメチル化検出方法であって、
プロテアーゼを含む水溶液からなる生体試料前処理液と細胞を含む生体試料を混合する工程と、
得られた混合液に、ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換するための変換剤を添加してＤＮＡメチル化検出用試料を調製する工程と、
他の塩基への変換前のＤＮＡの所定領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いて、ＤＮＡメチル化検出用試料に含まれるＤＮＡのメチル化を検出する工程と、からなるＤＮＡメチル化検出方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡの所定領域が、遺伝子のＣｐＧアイランドを含む領域である請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡのメチル化を検出するために用いられる試料（ＤＮＡメチル化検出用試料）の調製方法、ＤＮＡのメチル化を検出する方法、これらの方法に用いられる生体試料前処理液及び試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
高等真核生物の染色体ＤＮＡでは、ＤＮＡを構成する塩基のうちＣ（シトシン）の５位がメチル化修飾を受けていることがある。この高等真核生物におけるＤＮＡのメチル化は、原核生物の場合とは異なり、遺伝情報の発現抑制機構として機能している。例えば、ある遺伝子のＣｐＧを多く含む領域（ＣｐＧアイランド、ＣＧ島）がメチル化されていると、その遺伝子の転写が抑制される。それに対して、ＣｐＧアイランドがメチル化を受けていないと、プロモーター領域に転写因子が結合可能となり、遺伝子が転写可能な状態になる。このように、ＤＮＡのメチル化は、遺伝子発現の制御機構の１つであり、初期胚発生、組織特異的な遺伝子の発現、哺乳動物に特徴的な現象である遺伝子刷り込みやＸ染色体の不活性化、染色体の安定化、ＤＮＡ複製のタイミング等の様々な生理的、病理的な現象に重要な役割を果たしている。さらに近年、がんやその他の疾病にこのＤＮＡのメチル化が強く関与することが明らかになってきている。
【０００３】
ＤＮＡのメチル化を解析する方法として、一般的にメチル化特異的ＰＣＲ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下「ＭＳ−ＰＣＲ」という）が用いられている（非特許文献１参照）。この従来用いられている方法（以下、「標準法」という）は、通常、１）生体試料からのゲノムＤＮＡ抽出（約３時間）、２）抽出されたゲノムＤＮＡの亜硫酸水素塩処理（約１６時間）、３）修飾されたゲノムＤＮＡの精製（約１時間）、及び４）ＰＣＲ（約２時間）の４ステップで行われており、非常に時間がかかっていた（合計約２２時間）。特に、ＰＣＲに至るまでの生体試料の前処理（ＤＮＡメチル化検出用試料の調製）が煩雑であり、前処理（上記１〜３）だけで約２０時間かかることが問題であった。
【０００４】
長時間かかる前処理時間を短縮させるべく、上記２）の亜硫酸水素塩処理を、高濃度の亜硫酸水素塩で行う方法が提案された（非特許文献２参照）。非特許文献２の方法（以下、「迅速法」という）によれば、標準法で約１６時間かかっていた亜硫酸水素塩処理を約２０分で行うことができるため、前処理時間が約２０時間から約４時間へと短縮される。しかし、この迅速法を用いても、前処理に約４時間を要する。
【０００５】
このように、検体から核酸試料を調製する工程を省き、容易にかつ微量の細胞検体からメチル化されたＤＮＡを検出することができる方法の開発が強く望まれている。
【０００６】
また、近年、極微量の細胞検体をグアニジンチオシアネート、ヨウ化ナトリウム、尿素、ＳＤＳ等の従来公知のタンパク質変性剤を含む溶液で溶解した後に、調製した細胞検体溶解液を、標準法により亜硫酸水素塩で直接処理することで、タンパク質除去等の過程を行わずに細胞検体に含まれるＤＮＡを修飾するメチル化ＤＮＡを検出する方法が知られている（特許文献１参照）。
【非特許文献１】Ｊａｍｅｓ  Ｇ．ＨＥＲＭＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  Ｖｏｌ．９３，  ｐｐ．９８２１−９８２６，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９６
【非特許文献２】Ｍａｓａｈｉｋｏ  ＳＨＩＲＡＩＳＨＩ  ａｎｄ  Ｈｉｋｏｙａ  ＨＡＹＡＴＳＵ，  Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｔｏ  Ｕｒａｃｉｌ  ｉｎ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，  ＤＮＡ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  １１，４０９−４１５（２００４）
【特許文献１】特開２００５−０５８２１７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、生体試料から核酸試料を調製する工程を省き、生体試料の溶解液を、亜硫酸水素塩で直接処理することでＤＮＡのメチル化を検出する際に、安定して検出結果を得ることができる、簡便なＤＮＡメチル化検出用試料の調製方法、ＤＮＡメチル化検出方法、生体試料前処理液及び試薬キットを提供することを目的とする。
【０００８】
また本発明のＤＮＡメチル化検出用試料の調製方法、ＤＮＡメチル化検出方法、生体試料前処理液及び試薬キットは、細胞を含む生体試料のタンパク含量が高い場合、特に迅速法を用いてＤＮＡのメチル化検出を行う場合に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、特許文献１に記載の方法では、生体試料中のタンパク含量が多い場合、ＤＮＡメチル化検出の検出結果に不良が出ること、及び特に迅速法を用い高濃度の亜硫酸水素塩で処理した際、生体試料中のタンパク質の塩析が検出結果に影響を与えることを見出し、プロテアーゼを含む生体試料前処理液で生体試料を処理することで、安定した検出結果を得るに至り、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）ＤＮＡメチル化検出用試料を調製するための生体試料前処理液であって、プロテアーゼを含む水溶液からなる生体試料前処理液；
（２）界面活性剤及び／又はカオトロピック剤をさらに含む、（１）に記載の生体試料前処理液；
（３）前記界面活性剤及び／又はカオトロピック剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、尿素、及び／又は塩酸グアニジンである、（２）に記載の生体試料前処理液；
（４）ＤＮＡを切断することのできる切断剤をさらに含む、（１）〜（３）のいずれか１に記載の生体試料前処理液；
（５）ｐＨが７〜１０である（１）〜（４）のいずれか１に記載の生体試料前処理液；
（６）ＤＮＡメチル化検出用試料を調製するための試薬キットであって、（１）〜（５）のいずれか１に記載の生体試料前処理液からなる第１試薬と、ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する変換剤を含む第２試薬とからなる試薬キット；
（７）前記変換剤が、亜硫酸水素塩である（６）に記載の試薬キット；
（８）前記亜硫酸水素塩の濃度が、４〜８ｍＭである（７）に記載の方法；
（９）ＤＮＡメチル化検出用試料の調製方法であって、プロテアーゼを含む水溶液からなる生体試料前処理液と細胞を含む生体試料を混合する工程と、得られた混合液に、変換剤を添加して混合物中のＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する工程からなるＤＮＡメチル化検出用試料の調製方法；
（１０）前記生体試料が、血清、血漿、生体組織又は乳腺分泌液である（９）に記載の方法；
（１１）前記細胞が腫瘍細胞である（９）又は（１０）に記載の方法；
（１２）生体試料前処理液と生体試料を混合する工程の前に、細胞を含む生体試料を界面活性剤及び／又はカオトロピック剤を含む溶解液で溶解する工程、を含む（９）〜（１１）のいずれか１に記載の方法；
（１３）生体試料におけるＤＮＡメチル化検出方法であって、プロテアーゼを含む水溶液からなる生体試料前処理液と細胞を含む生体試料を混合する工程と、  得られた混合液に、ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換するための変換剤を添加してＤＮＡメチル化検出用試料を調製する工程と、他の塩基への変換前のＤＮＡの所定領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いて、ＤＮＡメチル化検出用試料に含まれるＤＮＡのメチル化を検出する工程と、からなるＤＮＡメチル化検出方法；
（１４）前記ＤＮＡの所定領域が、遺伝子のＣｐＧアイランドを含む領域である（１３）に記載の方法；
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、メチル化ＤＮＡの検出において、特に生体試料の量や迅速法の使用に係わらず、迅速かつ安定して検出結果を得られる、簡便なＤＮＡメチル化検出用試料の調製方法、ＤＮＡメチル化検出方法、生体試料前処理液及び試薬キットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本実施形態のＤＮＡメチル化検出用試料の調製方法は、プロテアーゼを含む水溶液からなる生体試料前処理液と細胞を含む生体試料を混合する工程（混合工程）と、得られた混合液に、変換剤を添加して混合物中のＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する工程（変換工程）、を含んでいる。
【００１３】
本実施形態において、水溶液とは、溶媒として水を含むものであれば特に限定されず、アルコール等の有機溶媒を含んでいても良い。
【００１４】
本実施形態におけるプロテアーゼとしては、タンパク質を分解する酵素であれば、特に制限されるものではないが、例えば、サーモリシン、サーモアーゼ、パパイン、トリプシン、プロナーゼ、α−キモトリプシン、ズブチリシン、ペプシン、プラスミン及びプロテイナーゼＫなどが挙げられ、特にプロテイナーゼＫが好ましい。
【００１５】
生体試料前処理液に含まれるプロテアーゼの濃度は、使用されるプロテアーゼにより適宜選択すれば良く、特に制限されるものではないが、例えばプロテイナーゼＫを使用する場合、生体試料前処理液中の濃度としては、０．５〜４０ｍｇ／ｍｌが好ましい。
【００１６】
本実施形態において生体試料としては、生体から採取される細胞を含んだ試料であれば、特に制限されるものではないが、例えば、ヒト等の動物から採取したリンパ節や血液等の組織、血漿、血清、尿、唾液、体液、乳腺分泌物、ヒト等の動物から採取した組織、培養組織、及び培養細胞等が挙げられ、特に血清、血漿、生体組織、及び乳腺分泌液が好ましい。
【００１７】
本実施形態における、生体試料前処理液としては、細胞を含む生体試料からＤＮＡメチル化検出に用いられるＤＮＡメチル化検出用試料を調製するためのものであって、プロテアーゼを含む水溶液であれば、特に制限されないが、界面活性剤及び／又はカオトロピック剤をさらに含む水溶液が好ましい。
【００１８】
界面活性剤としては、細胞を可溶化できるものであれば、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤のうち、いずれを使用してもよく、その中でも陰イオン性界面活性剤が好ましい。
【００１９】
陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、テトラデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、テトラデシルスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム（ＣＨＯ）、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等が挙げられ、この中でもタンパク質に対して高い親和性を有するドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が好ましい。
【００２０】
生体試料前処理液に含まれる界面活性剤の濃度は、使用する界面活性剤の種類に応じて好適な濃度を選択することが望ましい。例えば、生体試料前処理液に含まれる陰イオン性界面活性剤の濃度は、０．１〜１０体積％が好ましく、０．５〜５体積％がより好ましい。
【００２１】
カオトロピック剤としては、水の分子構造を不安定化する性質を持ち、疎水性分子に作用する疎水結合が弱められ、水溶性が増加するものであれば、特に制限されないが、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、塩酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム及び尿素等が挙げられ、塩酸グアニジン及び尿素が好ましい。
【００２２】
生体試料前処理液に含まれるカオトロピック剤の濃度は、使用されるカオトロピック剤により適宜選択すれば良く、特に制限されるものではない。より具体的には、例えばカオトロピック剤として、塩酸グアニジンを使用する場合、生体試料前処理液中の濃度としては、０．５〜８Ｍが好ましく、１〜６Ｍがより好ましい。また、カオトロピック剤として、尿素を使用する場合、生体試料前処理液中の濃度としては、１〜２４Ｍが好ましい。
【００２３】
また、生体試料前処理液のｐＨは、プロテアーゼの酵素反応が働くことができれば、特に制限されるものではないが、生体試料と混合したときに、細胞に含まれるＲＮＡの分解を促進するためにも中性から弱アルカリ性、特にｐＨ７〜１０が好ましい。さらに、前記ｐＨを一定に保つために、前記生体試料前処理液は、公知の緩衝液を含んでもよい。
【００２４】
本実施形態における、混合工程としては、生体試料と生体試料前処理液が十分に混合され、生体試料のタンパク質が、生体試料前処理液中のプロテアーゼと反応できれば、特に制限されるものではないが、例えば２５〜７０℃で５〜１２０分間攪拌することにより行うことができる。
【００２５】
生体試料前処理液の添加量としては、生体試料の量や生体試料前処理液中のプロテアーゼの濃度等に応じて適宜調節することができ、特に制限されるものではないが、例えば、１００〜１０００μｌ、好ましくは２００〜６００μｌが、その後の変換工程における、操作性等の観点から好ましい。
【００２６】
また、混合工程の前に、細胞を含む生体試料を界面活性剤及び／又はカオトロピック剤を含む溶解液で溶解する、溶解工程を行うこともできる。このように、予め生体試料に含まれる細胞を可溶化した後に、混合工程を行うことによって、好適にプロテアーゼによるタンパク質の分解を行うことができる。
【００２７】
溶解工程の条件としては、界面活性剤及び／又はカオトロピック剤により、細胞が可溶化できるものであれば、特に制限されるものではないが、例えば２５〜７０℃で５〜１２０分間攪拌することにより行うことができる。
【００２８】
溶解液の添加量としては、生体試料の量や溶解液中の界面活性剤及び／又はカオトロピック剤の濃度等に応じて適宜調節することができ、特に制限されるものではないが、例えば、１００〜１０００μｌ、好ましくは２００〜６００μｌが、その後の変換工程における、操作性等の観点から好ましい。
【００２９】
更に、混合工程及び／又は溶解工程の前後において、生体試料に含まれる細胞を物理的に破砕する、破砕工程を行っても良い。例えば、生体試料として切除組織などの細胞塊を用いる場合は、細胞塊と生体試料前処理液又は溶解液との混合後に細胞塊をホモジナイズする等が挙げられる。
【００３０】
本実施形態における、変換工程としては、上記混合工程で得られた混合液に変換剤を添加することにより、ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換することができれば、特に制限されるものではないが、上述の迅速法が反応時間の短縮の観点から好ましい。
【００３１】
ここで、非メチル化シトシン変換剤とは、ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する、即ち、非メチル化シトシンを、シトシン以外の塩基（ウラシル、チミン、アデニン又はグアニン）に変換するものである。このような非メチル化シトシン変換剤として、亜硫酸水素塩（バイサルファイト）が好ましく用いられる。亜硫酸水素塩としては、亜硫酸水素のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などを用いることができる。これらのうち何れか１つ以上を用いてＤＮＡを処理すると、ＤＮＡ中の非メチル化シトシンは脱アミノ化によってウラシルへ変換される。一方、上記のような非メチル化シトシン変換剤はＤＮＡ中のメチル化シトシンには作用せず、変換は起こらない。この非メチル化シトシン変換剤は、溶媒に溶解し、溶液として用いることが好ましい。
【００３２】
非メチル化シトシン変換剤として亜硫酸水素塩を用いる場合、生体試料中のＤＮＡの非メチル化シトシンを充分に変換できる程度であれば添加量は特に限定されないが、例えば、１Ｍ以上、好ましくは１〜１５Ｍ、より好ましくは３〜１０Ｍである。例えば、生体試料に４Ｍの亜硫酸水素ナトリウムを添加する場合、１０〜９０分間、５０〜８０℃でインキュベートすることにより非メチル化シトシンのウラシルへの変換を行うことができる。また、亜硫酸水素塩を低濃度（例えば１０Ｍの亜硫酸水素ナトリウムの水溶液４００μｌ）で用いる場合は、非メチル化シトシンを充分に変換できる程度の時間及び温度で変換を行えばよい。非メチル化シトシン変換剤は亜硫酸水素塩に限られるものではなく、メチル化シトシンではなく非メチル化シトシンを選択的に他の塩基に変換する他の非メチル化シトシン変換剤を使用することもできる。
【００３３】
ＤＮＡメチル化検出に用いられるＤＮＡメチル化検出用試料を上記の混合工程及び変換工程で調製することにより、特に、生体試料が多量に存在する場合、及び上述の迅速法を使用した場合に、従来の特許文献１に記載のタンパク質変性剤のみで調製したＤＮＡメチル化検出用試料では検出できなかったＤＮＡのメチル化を検出することができる。
【００３４】
また、本実施形態のＤＮＡメチル化検出用試料の調製方法は、ゲノムＤＮＡの抽出を省略することができるため、短時間でＤＮＡメチル化検出用試料を調製することが可能である。更に、前処理を１つの容器内で行えるため、分注の必要がない。そのため、分注の際に生じる試料のロスを減らすことができ、検出感度を上げることができる。
【００３５】
さらに、この方法は少ない工程で簡便に実行され得るため、装置等によるＤＮＡメチル化検出用試料調製の自動化に非常に適している。また、本法を用いると、標準法で長時間かけて非メチル化シトシンのウラシルへの変換を行った場合と同等又はそれ以上の効率で非メチル化シトシンからウラシルへの変換を行うことができる。
【００３６】
本実施形態において、変換工程を行う前に、ＤＮＡを切断する工程を含むこともできる。生体試料に含まれるＤＮＡを予め適当な長さに切断して断片化しておくことにより、変換工程での非メチル化シトシンの変換を効率よく行うことができる。ＤＮＡの切断は、超音波処理（ソニケーション）等の物理的処理、アルカリ処理等の化学的処理、制限酵素等を用いる酵素処理等により行うことができる。これらのうち水酸化ナトリウムや制限酵素等のＤＮＡを切断できる物質（切断剤）を用いることが好ましい。例えば、切断剤として水酸化ナトリウムを用いる場合、５〜１５Ｎの水酸化ナトリウム溶液を、混合工程で得られた混合液に５〜３０μｌ添加し、５〜１５分間１０〜４０℃でインキュベートすることによりＤＮＡの切断を行うことができる。
【００３７】
ＤＮＡの切断に上記化学的処理又は酵素処理を行う場合には、アルカリ処理に用いる物質（例えば、水酸化ナトリウム）又は酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）を切断剤として、上記生体試料前処理液に添加することも可能である。この場合、生体試料と生体試料前処理液との混合を行うだけで、試料の可溶化と、切断工程とを一度の操作で行うことができるため、ＤＮＡメチル化検出用試料の調製時間（前処理時間）をさらに短縮することができる。水酸化ナトリウムを用いる場合、生体試料前処理液中の水酸化ナトリウム濃度は、好ましくは０．１〜１Ｎ、より好ましくは０．２〜０．５Ｎである。ＤＮＡの切断は、変換剤の添加前であれば、どの時点で行ってもよい。
【００３８】
また、本実施形態において、変換工程を行う前に、生体試料中に含まれる二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにする工程を含むこともできる。二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにすることによって、変換工程での非メチル化シトシンの変換を効率よく行うことができ、また、後述するメチル化特異的ＰＣＲ等の際、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡに結合しやすくなりメチル化ＤＮＡの検出をより円滑に行うことができる。
【００３９】
二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにする方法としては、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにすることができるものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、ＤＮＡヘリカーゼ等の酵素を用いる方法、ＤＮＡを含む溶液の温度を上げる等の物理的な方法、及び水酸化ナトリウムでＤＮＡをアルカリ処理する化学的方法等の公知の方法が挙げられ、特に水酸化ナトリウムでＤＮＡをアルカリ処理する化学的方法が、ＤＮＡの切断も同時に行うことができ好ましい。
【００４０】
本実施形態における、ＤＮＡメチル化検出用試料を調製するための試薬キットとしては、上記の生体試料前処理液からなる第１試薬及び変換剤を含む第２試薬からなるＤＮＡメチル化検出用試料の試薬キットを用いることができる。この試薬キットを用いることにより、メチル化ＤＮＡの検出において、特に生体試料中のタンパク含有量や迅速法の使用に係わらず、安定して検出結果を得ることができ、ＤＮＡメチル化検出用試料を短時間で調製することができる。
【００４１】
また、本実施形態の試薬キットは、上記の溶解液及び／又は切断剤をさらに含んでいても良い。この際、生体試料前処理液、変換剤、溶解液及び切断剤はそれぞれ別の容器に収容しても良いし、生体試料前処理液と切断剤とを同一の容器に収容し、変換剤を別の容器に収容しても良い。
【００４２】
図１に試薬キットの一例を示す。図１の試薬キットは第１試薬及び第２試薬を備える。生体試料前処理液１からなる第１試薬は、試薬容器２に収容されている。変換剤３からなる第２試薬は、試薬容器４に収容されている。尚、上述のごとく、溶解液及び／又は切断剤を別の試薬容器に収容したものを更に備えても良い。
【００４３】
本実施形態の生体試料におけるＤＮＡメチル化検出方法は、上述したＤＮＡメチル化検出用試料の調製方法に加え、変換工程前のＤＮＡの所定領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド用いて、ＤＮＡメチル化検出用試料に含まれるＤＮＡのメチル化を検出する工程（検出工程）を含んでいる。また、検出結果の信頼性の観点から、非メチル化シトシンから変換された他の塩基を有するＤＮＡの所定領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに用いることが好ましい。
【００４４】
本実施形態のＤＮＡメチル化検出用試料の調製方法により調製されたＤＮＡメチル化検出用試料は、生体試料と生体試料前処理液との混合液に変換剤を添加して得られる試料であって、この中には変換剤によって非メチル化シトシンから変換された他の塩基と５−メチルシトシンとが存在している。この変換された他の塩基と５−メチルシトシンとを識別するため、ＤＮＡメチル化検出用試料についてＤＮＡの増幅、検出、又はこの両方の方法を行い、ＤＮＡの所定領域のメチル化状態を決定することができる。
【００４５】
ＤＮＡメチル化検出は、非メチル化シトシンを他の塩基に変換する前の配列（即ち、メチル化シトシンを含む配列：以下、非変換配列とする）に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、必要に応じ変換後の配列（以下、変換配列とする）に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドとを用いて行われる。該ポリヌクレオチドをプライマーとして用い、ＰＣＲ等の核酸増幅を行うことによりメチル化を検出することができる。また、該ポリヌクレオチドを基板に固定したＤＮＡチップを用いてメチル化検出を行ってもよい。
【００４６】
例えば、メチル化又は非メチル化のいずれかに変換したＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＰＣＲプライマーを用いるメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳ−ＰＣＲ）、亜硫酸水素塩ゲノム配列決定、ＣＯＢＲＡ（Combined Bisulfite Restriction Analysis）、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（Methylation-sensitive Single-Nucleotide Primer Extension）等が挙げられる。また、上記のポリヌクレオチドを用いてＬＡＭＰ法（ＵＳＰ６４１０２７８号参照）を行うことによりメチル化の検出を行ってもよい。
【００４７】
ＭＳ−ＰＣＲを用いる場合、具体的には以下のようにしてメチル化を検出することができる。
１）生体試料から調製されたＤＮＡメチル化検出用試料を２つのチューブに分注する（これらをＤＮＡメチル化検出用試料１及びＤＮＡメチル化検出用試料２とする）。
２）ＤＮＡメチル化検出用試料１に変換配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、及びｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ）を添加し、ＰＣＲ反応液１を調製する。
３）ＤＮＡメチル化検出用試料２に非変換配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、及びｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ）を添加し、ＰＣＲ反応液２を調製する。
４）ＰＣＲ反応液１及び２を用いて、ＰＣＲを行う。
５）アガロースゲル電気泳動など、後述の検出方法で目的とする配列が増幅しているか否かを確認する。
【００４８】
５）の結果、ＰＣＲ反応液１でＤＮＡの増幅が確認され、ＰＣＲ反応液２でＤＮＡの増幅が確認されなかった場合、ポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域がメチル化されていないことがわかる。逆に、ＰＣＲ反応液１でＤＮＡの増幅が確認されず、ＰＣＲ反応液２でＤＮＡの増幅が確認された場合、ポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域がメチル化されていることがわかる。
【００４９】
増幅されたＤＮＡを検出する方法は、特に限定されず、公知の方法によって検出することができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法、蛍光標識を使用したプローブにより検出するリアルタイム検出法（この場合、上記４）及び５）を同時に行うことができる）、ＤＮＡ合成の際の副生成物（ピロリン酸マグネシウム）の濁り（濁度）を測定する濁度測定法、必要に応じて酵素による切断パターンの確認や、直接シークエンス解析で塩基配列を決定する方法等を用いることができる。また、非特異的な増幅バンドが多くて特異バンドの判別が困難な場合は、標的とする増幅域内のプローブを用いたサザンブロット法等により特異バンドを確認することができる。
【００５０】
ここで、上記ポリヌクレオチドはプライマーとして働くことができ、修飾型又は非修飾型ＤＮＡの相補鎖と配列特異的なハイブリダイゼーション（アニーリング）が可能な、直線状の一本鎖のオリゴマーのＤＮＡ又はＲＮＡであり、増幅過程の間、特異的且つ効率的な重合反応（プライマー伸長）の開始を提供するような適当な配列および十分な長さを有するものである。プライマーの長さとしては、特に限定されないが、ＰＣＲに用いる場合は、５〜５０ｍｅｒが好ましく、１０〜３０ｍｅｒがより好ましい。プライマーは一本鎖が好ましいが、鎖が最初に分離されるならば二本鎖を使用することも可能である。プライマーは、任意の適当な方法、例えば常用のホスホトリエステル法及びホスホジエステル法又は当業界で一般的に知られている自動化された態様を用いて調製することができる。
【００５１】
使用するプライマーは、上述のＤＮＡの所定領域に実質的に相補的になるように、しかも適切なＧＣ含量となるようにデザインされることが好ましい。すなわち、上記ポリヌクレオチドは、上記変換工程の後で、特に、未処理又は非修飾ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、及び非メチル化ＤＮＡを識別する。センスプライマー中にはＣが存在せず、アンチセンスプライマー中にはＧが存在しないであろうから、通常、本発明の方法で使用するオリゴヌクレオチドプライマーには、その配列中に比較的少量のＣ又はＧが含まれる。
【００５２】
ここでは、変換工程で変換剤として亜硫酸水素塩を用いた場合について説明する。第２工程で、亜硫酸水素塩によって非メチル化シトシンは、ウラシルに変換されるが、５−メチルシトシンは変換されることなくそのまま残っている。従って、変換されたウラシルを有する（非メチル化）ゲノムＤＮＡを鋳型として、ウラシルを有する領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いて核酸増幅を行うことにより、増幅産物が生成されるが、５−メチルシトシンを含む領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドでは増幅されずに産物が得られない。その一方で、５−メチルシトシンを有する（メチル化）ゲノムＤＮＡは、ウラシルを有する領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドでは増幅されずに産物が得られないが、５−メチルシトシンを含む領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって増幅されて産物を与える。この産物を、例えばアガロースゲル電気泳動法によって検出することにより、ＤＮＡの所定領域がメチル化されていたか否かを解析することができる。
【００５３】
本実施形態において、ＤＮＡの所定領域としては、生体試料に含まれるＤＮＡの所望の領域でよく、特に制限されるものではないが、遺伝子のＣｐＧアイランドが好ましい。ＣｐＧアイランドは遺伝子の転写に関係するＤＮＡ配列であり、主に遺伝子のエクソンの上流領域（プロモーター領域）に存在し、イントロンやエクソンに存在することもある。ＣｐＧアイランドがメチル化されている場合は、遺伝子の転写が抑制されていることを示し、メチル化されていない場合はプロモーター領域に転写因子が結合可能であるため、この遺伝子が転写されている、或いは転写可能な状態であることを示す。
【００５４】
ここで、遺伝子としては、がん抑制遺伝子、がん遺伝子、及び腫瘍マーカーをコードする遺伝子（以下、腫瘍マーカー遺伝子とする）からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。がん抑制遺伝子としては、ＲＢ１（網膜芽細胞腫タンパク質：Retinoblastoma 1 protein）遺伝子、ＲＲＣＡ１遺伝子、ＡＰＣ（大腸腺腫症：Adenomatous polyosis of the colon）遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ１６遺伝子、ｐ１５遺伝子、ＥＲα（エストロゲンレセプター１：Estrogen Receptor 1）遺伝子、Ｅ−ｃａｄ（Ｅカドヘリン）遺伝子、ＶＨＬ（von Hipple-Lindau病）遺伝子、ＲＡＳＳＦ１Ａ（RASassociation domain family protein）遺伝子等が挙げられ、がん遺伝子としては、ＲＡＳ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、ＭＹＣ遺伝子等が挙げられる。腫瘍マーカー遺伝子としては、ＣＥＡ（癌胎児性抗原：Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5）遺伝子、ＰＳＡ（前立腺特異抗原：Prostate specific antigen）遺伝子、ＣＡ１５−３遺伝子、ＥｐＣＡＭ（Epithelial cellular adhesion molecule）遺伝子等が挙げられる。
【００５５】
本実施形態の生体試料におけるＤＮＡメチル化検出方法を用いて、これらの遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化を検出することにより、疾患に罹患するリスクや薬剤感受性の予測などの遺伝子検査に応用することができる。
【００５６】
例えば、所定の腫瘍細胞のがん抑制遺伝子のＣｐＧアイランドがメチル化されている場合及び／又はがん遺伝子のＣｐＧアイランドがメチル化されていない場合、この腫瘍細胞は悪性であると予測することができる。また、抗がん剤などの特定の薬剤を細胞外に排出する遺伝子や薬剤を分解する遺伝子のＣｐＧアイランドがメチル化されている場合、この細胞は薬剤に対する耐性が低い、即ち、この薬剤に対して感受性であると判定することができる。また、所定の腫瘍細胞の腫瘍マーカー遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化を検出することにより、腫瘍の種類を特定する（原発巣を特定する）ことも可能である。また、がん細胞の存否が不明な生体試料を用いて上述の遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化を検出することにより、この生体試料に腫瘍細胞が含まれているか否かを判定することができ、腫瘍の早期発見や腫瘍に罹患するリスクの判定などを行うことができる。
【００５７】
このように、疾患に罹患するリスクや薬剤感受性の予測などの遺伝子検査に応用するばあい、患者から採取した血清等のタンパク含有量が高い生体試料を用いる場合が多々あるため、従来の特許文献１に記載のタンパク質変性剤のみで調製したＤＮＡメチル化検出用試料によりＤＮＡメチル化検出を行った場合、十分な検出結果を得られない可能性が高い。また、遺伝子検査を迅速に行うべく、迅速法用いることで、更に検出結果の十分な取得ができず、臨床への応用が困難であった。
【００５８】
本実施形態のＤＮＡメチル化検出方法は、短時間且つ簡便な操作で、安定した検出結果を得ることができるため、上述のような遺伝子検査などの臨床検査に好適に用いることができる。また、迅速且つ簡便な本発明の方法を用いることにより、ＤＮＡのメチル化に関する研究スピードを向上させることができる。
【００５９】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６０】
＜生体試料の調製＞
１ｎｇのヒト乳癌由来の培養細胞であるＭＤＡ２３１由来のゲノムＤＮＡに、３００μｌのヒト血清を加え、生体試料とした。また、コントロールとして、ＭＤＡ２３１由来のゲノムＤＮＡを含まない、ヒト血清３００μｌのみの生体試料を用いた。
【００６１】
＜生体試料前処理液の調製＞
以下に示す、生体試料前処理液Ａ〜Ｆを調整した。尚、コントロールは３２０μｌの蒸留水を使用した。
生体試料前処理液Ａ：
最終濃度４Ｍの尿素の水溶液３００μｌと、２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫの水溶液２０μｌを混合し、３２０μｌの生体試料前処理液Ａを得た。
生体試料前処理液Ｂ：
最終濃度４Ｍの塩酸グアニジンの水溶液３００μｌと、２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫの水溶液２０μｌを混合し、３２０μｌの生体試料前処理液Ｂを得た。
生体試料前処理液Ｃ：
最終濃度１％のＳＤＳの水溶液３００と、２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫの水溶液２０μｌを混合し、３２０μｌの生体試料前処理液Ｃを得た。
生体試料前処理液Ｄ：
最終濃度１％のＳＤＳの水溶液３００と、蒸留水２０μｌを混合し、３２０μｌの生体試料前処理液Ｄを得た。
生体試料前処理液Ｅ：
最終濃度４Ｍの尿素の水溶液３００μｌと、蒸留水２０μｌを混合し、３２０μｌの生体試料前処理液Ｅを得た。
生体試料前処理液Ｆ：
最終濃度４Ｍの塩酸グアニジンの水溶液３００μｌと、蒸留水２０μｌを混合し、３２０μｌの生体試料前処理液Ｆを得た。
【００６２】
＜ＤＮＡメチル化検出の操作手順＞
調製した生体試料前処理液Ａ〜Ｆを用いて、ヒト乳癌由来の培養細胞であるＭＤＡ２３１のＥＲα遺伝子及びＥ−ｃａｄ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化を、以下の操作手順で行った。
１）  生体試料及び生体試料前処理液Ａ〜Ｆのいずれか１を混合し、５０℃で１時間撹拌する。
２）  ２０μｌの１０Ｎ ＮａＯＨの水溶液を加え、３７℃で１０分間インキュベートする。
３）  ６００μｌの１０Ｍ  亜硫酸水素ナトリウムの水溶液を加え、８０℃で４０分間インキュベートする。
４）  亜硫酸水素塩処理されたゲノム溶液（ＤＮＡメチル化検出用試料）を、ＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製ＱｌＡｑｕｉｋ（商品名））を用いて回収する。
５）  回収したＤＮＡメチル化検出用試料２．０μｌを用いて、ＰＣＲを行う。また、反応後の反応液は４℃で保存する。
６）  ＰＣＲ反応後の反応液を２％アガロースゲルのウェルに収容し、電気泳動を行う。
７）  電気泳動後のアガロースゲルを臭化エチジウムで染色し、ＥＲα遺伝子及びＥ−ｃａｄ遺伝子のそれぞれのバンドの確認を行う。
【００６３】
＜ＰＣＲ反応液を調製＞
上記操作手順４）で回収したＤＮＡメチル化検出用試料２．０μｌと、以下の物質とを混合し、上記操作手順５）におけるＰＣＲのＰＣＲ反応液２５μｌを調製した。
１０×  ＰＣＲバッファー（２．５μｌ）
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（２μｌ）
１０μＭ  センスプライマー（１．０μｌ）
１０μＭ  アンチセンスプライマー（１．０μｌ）
ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．２μｌ、Ｒｏｃｈｅ  １２０３２９０２００１）
水（１６．３μｌ）
【００６４】
ＥＲα遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化検出用プライマーとして、以下の配列番号１及び２に示される、非変換配列に特異的なプライマーセット（以下、メチル化プライマーセットとする）を用いた。
＜メチル化プライマーセット＞
センスプライマー：TTTTGGGATTGTATTTGTTTTCGTC  （配列番号１）
アンチセンスプライマー：AACAAAATACAAACCGTATCCCCG  （配列番号２）
【００６５】
上記ＥＲα遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化検出のために調製したＰＣＲ反応液を用いて下記条件でＰＣＲを行った。
９５℃、９．５分
以下の工程i)〜iii)を４５サイクル；
i)  ９５℃、３０秒
ii) ６０℃、１５秒
iii)７２℃、３０秒
【００６６】
Ｅ−ｃａｄ遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化検出用プライマーとして、以下のメチル化プライマーセットを用いた。
＜メチル化プライマーセット＞
センスプライマー：5'-TTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT-3'  （配列番号３）
アンチセンスプライマー：5'-TAACTAAAAATTCACCTACCGAC-3'  （配列番号４）
【００６７】
上記Ｅ−ｃａｄ遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化検出のために調製したＰＣＲ反応液を用いて下記条件でＰＣＲを行った。
９５℃、９．５分
以下の工程i)〜iii)を４５サイクル；
i)  ９５℃、３０秒
ii) ６０℃、１５秒
iii)７２℃、３０秒
【００６８】
（実施例１）
生体試料前処理液Ａ、生体試料前処理液Ｂ及びコントロールを用いた場合の、メチル化ＤＮＡの検出結果を図２に示す。図２から明らかなように、プロテアーゼであるプロテイナーゼＫと、カオトロピックイオンである尿素又は塩酸グアニジンを含有した生体試料前処理液Ａ及び生体試料前処理液Ｂでは、ＥＲα遺伝子及びＥ−ｃａｄ遺伝子のいずれもメチル化ＤＮＡを検出することができたが、コントロールである蒸留水では、メチル化ＤＮＡを検出することができなかった。また、ＭＤＡ２３１由来のゲノムＤＮＡを含まない生体試料については、生体試料前処理液Ａ及び生体試料前処理液Ｂいずれも、メチル化ＤＮＡは検出されなかった。
【００６９】
（実施例２）
生体試料前処理液Ａ〜Ｆ及びコントロールを用いた場合の、ＭＤＡ２３１由来のゲノムＤＮＡが含まれている生体試料の、メチル化ＤＮＡの検出結果を図３に示す。図３から明らかなように、プロテアーゼであるプロテイナーゼＫを含有する生体試料前処理液Ａ〜Ｃは、ＥＲα遺伝子及びＥ−ｃａｄ遺伝子のいずれもメチル化ＤＮＡを検出することができたが、プロテイナーゼＫを有さない生体試料前処理液Ｄ〜Ｆはコントロールと同様に、メチル化ＤＮＡを検出することができなかった。
【００７０】
以上の結果から、ＤＮＡメチル化検出用試料を調製するための生体試料前処理液において、ＳＤＳ等の界面活性剤や尿素及び塩酸グアニジン等のカオトロピック剤のみでプロテイナーゼＫ等のプロテアーゼを含有しない生体試料前処理液では、特に血清等の高濃度のタンパク質を有する生体試料のメチル化ＤＮＡの検出結果を十分得ることができないが、生体前処理液にプロテアーゼを含有することで、安定したメチル化ＤＮＡの検出結果を得ることが可能となることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ＤＮＡメチル化検出用試料を調製するための試薬キットの模式図である。
【図２】生体試料前処理液Ａ、生体試料前処理液Ｂ及びコントロールを用いた、ＥＲα遺伝子及びＥ−ｃａｄ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化検出結果を示す図である。
【図３】生体試料前処理液Ａ〜Ｆ及びコントロールを用いた、ＥＲα遺伝子及びＥ−ｃａｄ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化検出結果を示す図である。
【図１】
2008212009.tif 000003
【図２】
2008212009.tif 000004
【図３】
2008212009.tif 000005