(57)【要約】【課題】標的を明確にした農薬の探索手法、即ち、昆虫や有害生物を制御しうる標的部位を化学的に調節することを目的として、特定の標的に対する活性で化合物をスクリーニングする方法等を提供すること。【解決手段】有害生物の生理状態に変化を与える薬剤であり、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼ（以下、本酵素と記す。）の活性を変化させる能力を有することを特徴とする薬剤、並びに、被験物質が有する有害生物防除能力の検定方法であって、（１）例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質等を含む群Ａから選択される本酵素と被験物質との接触系内における前記本酵素の活性を測定する第一工程、及び（２）第一工程により測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の有害生物防除能力を評価する第二工程、を有することを特徴とする方法等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有害生物の生理状態に変化を与える薬剤であり、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼ（Vesicle-fusing ATPase：EC.3.6.4.6）の活性を変化させる能力を有することを特徴とする薬剤。
【請求項２】
昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼが、ワタアブラムシ由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼであることを特徴とする請求項１記載の薬剤。
【請求項３】
有害生物の生理状態に変化を与える薬剤が、有害生物防除剤であることを特徴とする請求項１記載の薬剤。
【請求項４】
昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力が、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼとＡＴＰとの反応を阻害する能力であることを特徴とする請求項１記載の薬剤。
【請求項５】
有効成分として、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力を有する化学物質又はその農学的に許容される塩を含有することを特徴とする有害生物防除剤。
【請求項６】
前記化学物質が、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼとＡＴＰの反応を阻害する能力を有する化学物質であることを特徴とする請求項５記載の有害生物防除剤。
【請求項７】
前記化学物質が、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼとＡＴＰとの無細胞反応系において、前記化学物質の存在濃度が１０μM以上の場合に、当該化学物質が存在しない場合よりもベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性が低くなるように阻害する能力を有する化学物質であることを特徴とする請求項６記載の有害生物防除剤。
【請求項８】
前記化学物質が、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼとＡＴＰとの反応の無細胞反応系において、１００μM以下のIC50となるように阻害する能力を有する化学物質であることを特徴とする請求項６記載の有害生物防除剤。
【請求項９】
被験物質が有する有害生物防除能力の検定方法であって、
（１）下記の群Ａから選択されるベシクルフュージングＡＴＰアーゼと被験物質との接触系内における前記ベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を測定する第一工程、及び
（２）第一工程により測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の有害生物防除能力を評価する第二工程、
を有することを特徴とする方法。
＜群Ａ＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列と７５％以上の配列同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質
（ｇ）昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｈ）ワタアブラムシ由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列からなる蛋白質
【請求項１０】
請求項９記載の検定方法により評価された有害生物防除能力を有する物質を選抜することを特徴とする有害生物防除能力を有する物質の探索方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の探索方法により選抜された物質又はその農学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする有害生物防除剤。
【請求項１２】
請求項５、６、７、８又は１１記載の有害生物防除剤の有効量を、保護すべき作物、有害生物又は有害生物の生息場所に施用することを特徴とする有害生物防除方法。
【請求項１３】
請求項9記載の検定方法により評価された有害生物防除能力を有する物質を特定し、特定された有害生物防除能力を有する物質と有害生物とを接触させることを特徴とする有害生物防除方法。
【請求項１４】
下記の群Ｂのいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼ。
＜群Ｂ＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列を有するアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列と７５％以上の配列同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有するアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列に対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有するアミノ酸配列
（ｇ）ワタアブラムシ由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼが有するアミノ酸配列
【請求項１５】
有害生物防除能力を評価するための指標を提供する試薬としての、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの使用。
【請求項１６】
有害生物防除能力を評価するための指標を提供する試薬としての、請求項１４記載の昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの使用。
【請求項１７】
請求項１４記載のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号２で示される塩基配列からなることを特徴とする請求項１７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１７又は１８記載のポリヌクレオチドが有する塩基配列に対し相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１７又は１８記載のポリヌクレオチドの部分塩基配列又はその部分塩基配列に対して相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号３又は４で示される塩基配列からなることを特徴とする請求項２０記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
ベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの取得方法であって、請求項２０又は２１記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより所望のポリヌクレオチドを増幅する工程、増幅された所望のポリヌクレオチドを特定する工程、及び、特定された所望のポリヌクレオチドを回収する工程、を有することを特徴とする方法。
【請求項２３】
ベシクルフュージングアーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの取得方法であって、請求項１９、２０又は２１記載のポリヌクレオチドをプローブとして用いたハイブリダイゼーションにより所望のポリヌクレオチドを検出する工程、検出された所望のポリヌクレオチドを特定する工程、及び、特定された所望のポリヌクレオチドを回収する工程、を有することを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１７又は１８記載のポリヌクレオチドを、バクテリオファージ由来のプロモーターに機能可能な形で連結してなることを特徴とする環状ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
バクテリオファージ由来のプロモーターが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項２４記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項２４又は２５記載の環状ポリヌクレオチドであって、宿主細胞内で自己複製の為の複製開始点を有することを特徴とする環状ポリヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項１７又は１８記載のポリヌクレオチドをベクターに連結することを特徴とする環状ポリヌクレオチドの製造方法。
【請求項２８】
請求項１７又は１８記載のポリヌクレオチドが導入されてなることを特徴とする形質転換体。
【請求項２９】
形質転換体が形質転換大腸菌であることを特徴とする請求項２８記載の形質転換体。
【請求項３０】
請求項１７又は１８記載のポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体の製造方法。
【請求項３１】
請求項２８又は２９記載の形質転換体を培養し、産生された昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼを回収する工程を有することを特徴とするベシクルフュージングＡＴＰアーゼの製造方法。
【請求項３２】
研究ツールとしての、請求項１４記載の昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼ或いは請求項１７乃至２１のいずれかの請求項記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項３３】
研究ツールが有害生物防除剤をスクリーニングするための実験ツールであることを特徴とする請求項３２記載の「使用」。
【請求項３４】
被験物質について、当該被験物質が有する昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力に係るデータ情報を入力・蓄積・管理する手段、前記データ情報を所望の条件に基づき照会・検索する手段、及び、照会・検索された結果を表示・出力する手段を具備することを特徴とするシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性に関わる有害生物の生理状態に変化を与える薬剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベシクルフュージングＡＴＰアーゼは、ＮＳＦ（N-ethylmaleimide sensitive factor）とも呼ばれ、PループＡＴＰアーゼのＡＡＡ（ATPase associated with various cellular activities）サブグループに属し（例えば、非特許文献１参照）、細胞における小胞輸送において重要な役割を担っている。さらに、少なくともセキツイ動物においては、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼはＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体に結合し、その機能や細胞内分布を制御する（例えば、非特許文献２参照）。
【０００３】
セキツイ動物および無セキツイ動物に共通して、最も特徴的なベシクルフュージングＡＴＰアーゼの機能は、小胞輸送への関与である（例えば、非特許文献３参照）。小胞輸送においては、小胞は標的膜（例えば、シナプス膜）と融合し、小胞内物質（例えば、神経伝達物質）を標的膜に放出する。小胞融合は、複数のタンパク質が強く結合したＳＮＡＲＥ（soluble NSF attachment protein receptor）複合体の形成によって引き起こされる。小胞融合の後、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼ６量体がＳＮＡＲＥ複合体に結合し、ＡＴＰの加水分解によって生じるエネルギーを用いてＳＮＡＲＥ複合体の分解を触媒する。このように、複合体から分解されたＳＮＡＲＥタンパク質は次の膜融合に再利用される。ベシクルフュージングＡＴＰアーゼはアダプタータンパク質であるα−ＳＮＡＰ（soluble NSF attachment protein）が存在する場合にのみＳＮＡＲＥ複合体に結合することが可能である。
【０００４】
C. elegans やヒトの場合とは対照的に、ショウジョウバエには２つのベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子（nsf1[comt, comatose]とnsf2）が存在している。nsf1は７４５アミノ酸残基、nsf2は７５２アミノ酸残基をコードしており、８４％の相同性を示している。nsf1はプレシナプスでの役割（すなわち、ＳＮＡＲＥ複合体の分解）を担っており、nsf2はポストシナプスでの役割（すなわち、グルタミン酸受容体の制御）を有していると提唱されている（例えば、非特許文献４参照）。一方、ショウジョウバエにおける異所発現実験により、nsf1およびnsf2遺伝子産物は、互いに機能的に補完可能であることも示されている（例えば、非特許文献４参照）。昆虫においては、前胸腺刺激ホルモンと休眠ホルモンという２つの重要な神経ホルモンもまた同一の局在を示しており、両者が昆虫の成長を制御している。これらのことから、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼは昆虫における神経ホルモンの放出に関与している可能性が示唆されている（例えば、非特許文献５および６参照）。
【０００５】
C. elegans においては、ＲＮＡi解析によってnsf1の機能を欠損させると、胚性致死、幼虫期致死、幼虫期発生停止、不妊、膜性オルガネラの異常といった表現型を示す（例えば、非特許文献７参照）。
【０００６】
ショウジョウバエでは、nsf1およびnsf2遺伝子突然変異体の解析の結果、nsf1は胚、幼虫、成虫の各発生ステージにおける生育に必須であることが示され（例えば、非特許文献７参照）、nsf2は初齢幼虫において生育に必須であることが示されている（例えば、非特許文献４参照）。おそらく、nsf1はプレシナプスでの役割として神経伝達物質の放出を制御しており、nsf2はポストシナプスでの役割として機能している。
【０００７】
ショウジョウバエのＸ染色体上に存在するnsf1遺伝子について１６の劣性アリルを解析したところ、野生型と比べて形質発現効果が低いハイポモルフ突然変異は成虫に温度感受性麻痺を引き起こし、機能喪失突然変異では胚性致死又は幼虫期致死となることが示された（例えば、非特許文献８参照）。温度感受性麻痺を示す９つの変異体の中で８つの変異体は、Ｄ１ドメインにおいて保存性の高いアミノ酸が置換されていた。Ｄ１ドメインは、α−ＳＮＡＰ−ＳＮＡＲＥ複合体の分解に必要なエネルギーを供給するためのＡＴＰアーゼ活性を持つドメインである。これらの変異体の多くは数分間の３８℃処理により麻痺症状を起こし、熱処理後、ＳＮＡＲＥ複合体の劇的な蓄積を示し、小胞輸送が阻害された。また、機能喪失突然変異体はヒートショックプロモーターで発現を制御されたnsf1遺伝子を導入することで回復した。さらに、小胞輸送における特定のステージを阻害することが知られている他の遺伝子の変異体とnsf1変異体を交配することにより、条件に応じた麻痺症状を示すアリルを獲得し、その解析を行ったところ、ＮＳＦ１タンパク質は、通常、解離した状態で存在し、エキソサイトーシスとエンドサイトーシスの合間にＳＮＡＲＥタンパク質を再利用していることが示された。
【０００８】
第３染色体上のnsf2遺伝子の劣性致死アリル３種は、ヘミ接合体であれば正常に胚が発達し、卵から孵化することができ、幼虫期の運動も異常はなかった（例えば、非特許文献４参照）。しかし、最も深刻な異常を持つnsf2変異体は、移動ができず、初齢中期の生育ステージで幼虫が致死となった。これら全ての表現型はヒートショックプロモーターで発現を制御された野生型のnsf2遺伝子を導入することにより回復した（成長過程において１日に１時間の３８℃熱処理を行った）。興味深いことに、神経組織特異的なプロモーター制御下で野生型nsf2遺伝子を発現させても、これらのアリルをもつ変異体は回復しなかったが、体壁筋や内臓筋に発達する中胚葉にnsf2を発現させると成虫まで生育できた。神経組織と中胚葉との両者でnsf2を発現させると回復度が高かった。これらの結果は、ＮＳＦ２タンパク質が主として中胚葉で機能しているだけでなく、神経組織においても二次的な役割を持つことを示唆している。
【０００９】
ところで、農薬は、従来、化合物を昆虫、菌類、植物等の対象生物に直接作用させ、その生物学的活性を検定するランダムスクリーニングによって見出されてきた。この場合、農薬の安全性や環境への負荷を予測するために、有用な生物活性を有する化合物が特定された後に、その化合物がどのような作用機構で効力を有するか、その化合物が作用する標的が何であるかを分子レベルで詳細に研究する必要があった。
【００１０】
【非特許文献１】Chene, Nature Reviews Drug Discovery, 1:665-673, 2002
【非特許文献２】Hanley et al., Neuron, 34:53-67, 2002
【非特許文献３】May et al., J. Biol. Chem., 276:21991-21994, 2001
【非特許文献４】Golby et al., Genetics, 158:265-278, 2001
【非特許文献５】Cui and Xu, Peptides, 27(6):1226-1234, 2006
【非特許文献６】Cui et al., Insect Biochem Mol Biol., 36(7):603-9, 2006
【非特許文献７】WormBase, http://www.wormbase.org/
【非特許文献８】Littleton et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA , 98:12233-12238, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このような農薬開発の問題点を解決するために、標的を明確にした農薬の探索手法、即ち、昆虫や有害生物を制御しうる標的部位を化学的に調節することを目的として、特定の標的に対する活性で化合物をスクリーニングする方法等の開発を試みた。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者は、このような状況下鋭意検討を行った結果、有害生物の生理状態に変化を与える薬剤であり、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力を有することを特徴とする薬剤が有害生物を防除することを見出し、本発明に至った。
【００１３】
即ち、本発明は、
１．有害生物の生理状態に変化を与える薬剤であり、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力を有することを特徴とする薬剤；
２．昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼが、ワタアブラムシ由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼであることを特徴とする前項１記載の薬剤；
３．有害生物の生理状態に変化を与える薬剤が、有害生物防除剤であることを特徴とする前項１記載の薬剤；
４．昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力が、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼとＡＴＰとの反応を阻害する能力であることを特徴とする前項１記載の薬剤；
５．有効成分として、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力を有する化学物質又はその農学的に許容される塩を含有することを特徴とする有害生物防除剤；
６．前記化学物質が、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼとＡＴＰとの反応を阻害する能力を有する化学物質であることを特徴とする前項５記載の有害生物防除剤；
７．前記化学物質が、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼとＡＴＰとの無細胞反応系において、前記化学物質の存在濃度が１０μM以上の場合に、当該化学物質が存在しない場合よりもベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性が低くなるように阻害する能力を有する化学物質であることを特徴とする前項６記載の有害生物防除剤；
８．前記化学物質が、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼとＡＴＰとの反応の無細胞反応系において、１００μM以下のIC50となるように阻害する能力を有する化学物質であることを特徴とする前項６記載の有害生物防除剤；
９．被験物質が有する有害生物防除能力の検定方法であって、
（１）下記の群Ａから選択されるベシクルフュージングＡＴＰアーゼと被験物質との接触系内における前記ベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を測定する第一工程、及び
（２）第一工程により測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の有害生物防除能力を評価する第二工程、
を有することを特徴とする方法
＜群Ａ＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列と７５％以上の配列同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質
（ｇ）昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｈ）ワタアブラムシ由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列からなる蛋白質；
１０．前項９記載の検定方法により評価された有害生物防除能力を有する物質を選抜することを特徴とする有害生物防除能力を有する物質の探索方法；
１１．前項１０記載の探索方法により選抜された物質又はその農学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする有害生物防除剤；
１２．前項５、６、７、８又は１１記載の有害生物防除剤の有効量を、保護すべき作物、有害生物又は有害生物の生息場所に施用することを特徴とする有害生物防除方法；
１３．前項９記載の検定方法により評価された有害生物防除能力を有する物質を特定し、特定された有害生物防除能力を有する物質と有害生物とを接触させることを特徴とする有害生物防除方法；
１４．下記の群Ｂのいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼ；
＜群Ｂ＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列を有するアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列と７５％以上の配列同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有するアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列に対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有するアミノ酸配列
（ｇ）ワタアブラムシ由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼが有するアミノ酸配列
１５．有害生物防除能力を評価するための指標を提供する試薬としての、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの使用；
１６．有害生物防除能力を評価するための指標を提供する試薬としての、前項１４記載の昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの使用；
１７．前項１４記載のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド；
１８．配列番号２で示される塩基配列からなることを特徴とする前項１７記載のポリヌクレオチド；
１９．前項１７又は１８記載のポリヌクレオチドが有する塩基配列に対し相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド；
２０．前項１７又は１８記載のポリヌクレオチドの部分塩基配列又はその部分塩基配列に対して相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド；
２１．配列番号３又は４で示される塩基配列からなることを特徴とする前項２０記載のポリヌクレオチド；
２２．ベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの取得方法であって、前項２０又は２１記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより所望のポリヌクレオチドを増幅する工程、増幅された所望のポリヌクレオチドを特定する工程、及び、特定された所望のポリヌクレオチドを回収する工程、を有することを特徴とする方法；
２３．ベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの取得方法であって、前項１９、２０又は２１記載のポリヌクレオチドをプローブとして用いたハイブリダイゼーションにより所望のポリヌクレオチドを検出する工程、検出された所望のポリヌクレオチドを特定する工程、及び、特定された所望のポリヌクレオチドを回収する工程、を有することを特徴とする方法；
２４．前項１７又は１８記載のポリヌクレオチドを、バクテリオファージ由来のプロモーターに機能可能な形で連結してなることを特徴とする環状ポリヌクレオチド；
２５．バクテリオファージ由来のプロモーターが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のプロモーターであることを特徴とする前項２４記載の環状ポリヌクレオチド；
２６．前項２４又は２５記載の環状ポリヌクレオチドであって、宿主細胞内で自己複製の為の複製開始点を有することを特徴とする環状ポリヌクレオチド；
２７．前項１７又は１８記載のポリヌクレオチドをベクターに連結することを特徴とする環状ポリヌクレオチドの製造方法；
２８．前項１７又は１８記載のポリヌクレオチドが導入されてなることを特徴とする形質転換体；
２９．形質転換体が形質転換大腸菌であることを特徴とする前項２８記載の形質転換体；
３０．前項１７又は１８記載のポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体の製造方法；
３１．前項２８又は２９記載の形質転換体を培養し、産生された昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼを回収する工程を有することを特徴とするベシクルフュージングＡＴＰアーゼの製造方法；
３２．研究ツールとしての、前項１４記載の昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼ或いは前項１７乃至２１のいずれかの前項記載のポリヌクレオチドの使用；
３３．研究ツールが有害生物防除剤をスクリーニングするための実験ツールであることを特徴とする前項３２記載の「使用」；
３４．被験物質について、当該被験物質が有する昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力に係るデータ情報を入力・蓄積・管理する手段、前記データ情報を所望の条件に基づき照会・検索する手段、及び、照会・検索された結果を表示・出力する手段を具備することを特徴とするシステム；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、標的を明確にした農薬の探索手法、即ち、昆虫や有害生物を制御しうる標的部位を化学的に調節することを目的として、特定の標的に対する活性で化合物をスクリーニングする方法等が提供可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、詳細に本発明を説明する。
【００１６】
本発明において「有害生物」とは、人畜に直接害を与え、又は、作物等を害することによって人間生活に害や不快感を与える小動物を示し、例えば、昆虫やダニ等の節足動物及び線虫等の線形動物があげられ、具体的には例えば、以下に示すものがあげられる。
【００１７】
半翅目害虫：ヒメトビウンカ(Laodelphax  striatellus)、トビイロウンカ(Nilaparvata  lugens)、セジロウンカ(Sogatella  furcifera)等のウンカ類、ツマグロヨコバイ(Nephotettix  cincticeps)、チャノミドリヒメヨコバイ(Empoasca  onukii)等のヨコバイ類、ワタアブラムシ(Aphis  gossypii)、モモアカアブラムシ(Myzus  persicae)等のアブラムシ類、カメムシ類、オンシツコナジラミ(Trialeurodes  vaporariorum)、タバココナジラミ(Bemisia  tabaci)、シルバーリーフコナジラミ(Bemisia  argentifolii)等のコナジラミ類、カイガラムシ類、グンバイムシ類、キジラミ類等；
鱗翅目害虫：ニカメイガ(Chilo  suppressalis)、コブノメイガ(Cnaphalocrocis  medinalis)、ヨーロピアンコーンボーラー(Ostrinia  nubilalis)、シバツトガ(Parapediasia  teterrella)等のメイガ類、ハスモンヨトウ(Spodoptera  litura)、シロイチモジヨトウ(Spodoptera  exigua)、アワヨトウ(Pseudaletia  separata)、ヨトウガ(Mamestra  brassicae)、タマナヤガ(Agrotis  ipsilon)、トリコプルシア属(Trichoplusia  spp.)、ヘリオティス属(Heliothis  spp.)、ヘリコベルパ属(Helicoverpa  spp.)、エアリアス属(Earias  spp.)等のヤガ類、モンシロチョウ(Pieris  rapae  crucivora)等のシロチョウ類、リンゴコカクモンハマキ(Adoxophyes  orana  fasciata)、ナシヒメシンクイ(Grapholita  molesta)、コドリングモス(Cydia  pomonella)等のハマキガ類、モモシンクイガ(Carposina  niponensis)等のシンクイガ類、モモハモグリガ(Lyonetia  clerkella)等のチビガ類、キンモンホソガ(Phyllonorycter  ringoniella)等のホソガ類、ミカンハモグリガ(Phyllocnistis  citrella)等のコハモグリガ類、コナガ(Plutela  xylostella)等のスガ類、ピンクボールワーム(Pectinophora  gossypiella)等のキバガ類、ヒトリガ類、ヒロズコガ類等；
双翅目害虫：アカイエカ（Culex  pipiens pallens）、コガタアカイエカ（Culex  tritaeniorhynchus）、ネッタイイエカ（Culex  quinquefasciatus）等のイエカ類、（Aedes  aegypti）、（Aedes  albopictus）等のエーデス属、（Anopheles  sinensis）等のアノフェレス属、ユスリカ類、イエバエ（Musca  domestica）、オオイエバエ（Muscina  stabulans）等のイエバエ類、クロバエ類、ニクバエ類、ヒメイエバエ類、タネバエ（Delia  platura）、タマネギバエ（Delia  antiqua）等のハナバエ類、ミバエ類、ショウジョウバエ類、チョウバエ類、ブユ類、アブ類、サシバエ類、ハモグリバエ類等；
鞘翅目害虫：ウエスタンコーンルートワーム（Diabrotica  virgifera virgifera）、サザンコーンルートワーム（Diabrotica  undecimpunctata  howardi）等のコーンルートワーム類、ドウガネブイブイ（Anomala  cuprea）、ヒメコガネ（Anomala  rufocuprea）等のコガネムシ類、メイズウィービル（Sitophilus  zeamais）、イネミズゾウムシ（Lissorhoptrus  oryzophilus）、アズキゾウムシ（Callosobruchuys  chienensis）等のゾウムシ類、チャイロコメノゴミムシダマシ（Tenebrio  molitor）、コクヌストモドキ（Tribolium  castaneum）等のゴミムシダマシ類、イネドロオイムシ（Oulema  oryzae）、ウリハムシ（Aulacophora  femoralis）、キスジノミハムシ（Phyllotreta  striolata）、コロラドハムシ（Leptinotarsa  decemlineata）等のハムシ類、シバンムシ類、ニジュウヤホシテントウ（Epilachna  vigintioctopunctata）等のエピラクナ類、ヒラタキクイムシ類、ナガシンクイムシ類、カミキリムシ類、アオバアリガタハネカクシ（Paederus  fuscipes）等；
アザミウマ目害虫：ミナミキイロアザミウマ(Thrips  palmi)等のスリップス属、ミカンキイロアザミウマ(Frankliniella  occidentalis)等のフランクリニエラ属、チャノキイロアザミウマ(Sciltothrips  dorsalis)等のシルトスリップス属等のアザミウマ類、クダアザミウマ類等；
膜翅目害虫：ハバチ類、アリ類、スズメバチ類等；
網翅目害虫：ゴキブリ類、チャバネゴキブリ類等；
直翅目害虫：バッタ類、ケラ類等；
隠翅目害虫：ヒトノミ等；
シラミ目害虫：ヒトジラミ等；
シロアリ目害虫：シロアリ類等；
ダニ目害虫：ナミハダニ（Tetranychus  urticae）、カンザワハダニ（Tetranychus  kanzawai）、ミカンハダニ（Panonychus  citri）、リンゴハダニ（Panonychus  ulmi）、オリゴニカス属等のハダニ類、ミカンサビダニ（Aculops  pelekassi）、リンゴサビダニ（Aculus  schlechtendali）等のフシダニ類、チャノホコリダニ（Polyphagotarsonemus  latus）等のホコリダニ類、ヒメハダニ類、ケナガハダニ類、フタトゲチマダニ（Haemaphysalis  longicornis）、ヤマトチマダニ（Haemaphysalis  flava）、タイワンカクマダニ（Dermacentor  taiwanicus）、ヤマトマダニ(Ixodes  ovatus)、シュルツマダニ(Ixodes  persulcatus) 、オウシマダニ(Boophilus  microplus)等のマダニ類、ケナガコナダニ（Tyrophagus  putrescentiae）等のコナダニ類、コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides  farinae)、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides  ptrenyssnus)等のヒョウヒダニ類、ホソツメダニ(Cheyletus  eruditus)、クワガタツメダニ(Cheyletus  malaccensis)、ミナミツメダニ(Cheyletus  moorei)等のツメダニ類、ワクモ類等；
線虫類：ミナミネグサレセンチュウ（Pratylenchus  coffeae）、キタネグサレセンチュウ（Pratylenchus  fallax）、ダイズシストセンチュウ（Heterodera  glycines）、ジャガイモシストセンチュウ（Globodera  rostochiensis）、キタネコブセンチュウ（Meloidogyne  hapla）、サツマイモネコブセンチュウ（Meloidogyne  incognita）等。
【００１８】
本発明において「有害生物の生理状態に変化を与える」とは、有害生物において、生きていくために維持されている様々な体内での現象、例えば、呼吸・消化・排泄・体液循環・代謝・神経伝達等の働き、又はその仕組み等の状態を、通常の状態から逸脱した状態に変化させることを示す。例えば、呼吸を停止させることによって有害生物の体内代謝に必要な酸素等が供給されなくなるように変化させること、又は、有害生物の神経伝達の働きを停止させることによって有害生物の種々の運動等を停止させるよう変化させること、等である。
【００１９】
本発明において「有害生物の生理状態に変化を与える薬剤」とは、有害生物に投与することによって有害生物の生理状態に変化を与えることができる薬剤である。
【００２０】
本発明において「昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼ」とは、様々な生物に存在するベシクルフュージングＡＴＰアーゼの中で、昆虫に存在するベシクルフュージングＡＴＰアーゼを示す。ここで、昆虫とは、動物界、節足動物門、昆虫綱の属する動物であり、例えば、原尾目、粘菅目、双尾目、総尾目、蜉蝣目、蜻蛉目、積翅目、欠翅目、直翅目、ナナフシ目、革翅目、蟷螂目、網翅目、シロアリ目、紡脚目、噛虫目、食毛目、シラミ目、アザミウマ目、半翅目、脈翅目、長翅目、毛翅目、鱗翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、隠翅目、撚翅目等に属する節足動物が挙げられる。
【００２１】
ベシクルフュージングＡＴＰアーゼ（Vesicle-fusing ATPase、EC.3.6.4.6、シノニム：N-ethylmaleimide sensitive factor；ＮＳＦ）はＡＡＡ（ATPase associated with various cellular activities）と呼ばれるＡＴＰアーゼの一つであり、ＡＴＰの加水分解によって生じるエネルギーを利用して、小胞輸送に関わるＳＮＡＲＥ複合体を分解する機能を持つ。
【００２２】
ベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性は、in vitroアッセイにより容易に測定可能である。ベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を測定する方法は、放射能ラベルおよび非放射能ラベルのＡＴＰを用いた試験が数多く存在する。例えば、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性は放射能ラベルしたＡＴＰを用いて、Tagaya et al., J Biol Chem 268, 1993, 2662-2666 に記載されるように、[α-32P]ATPを用いて放射活性を基にした活性測定が可能である。その他に、Mueller et al., Nature Cell Biol 1, 1999, 335-340; Peters et al., EMBO J 9, 1990, 1757-1767に記載されるように、基質として[γ-32P]ATPを用いることにより、放出される[32Pi]の検出に基づいてベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を測定する例がある。
【００２３】
同様に、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を測定するために用いられる方法として、非放射能ラベルのＡＴＰを使ったアッセイが存在する。このような方法には、基質であるＡＴＰが開裂した後の生成物の測定や、開裂した基質の比色定量分析が含まれるが、これに限定されるものではない。以上のような測定方法は、Lanzetta et al., Analytical Biochemistry 100, 95-97 (1979); Lill et al., Cell 60, 271-280(1990)に記載されている。また、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼの酵素反応とカップルさせた他の酵素反応とを利用して、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を測定することが可能である。例えば、ＡＴＰを基質としてベシクルフュージングＡＴＰアーゼの酵素反応を進めた後、Kinase-Glo（登録商標） Luminescent Kinase Assay（Promega社製）を用いて、消費されなかったＡＴＰ量をルシフェラーゼの発光量として測定できる。この発光量の増加とベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性とは負に比例する。
その他に、例えばＡＴＰアーゼ活性を測定する生物学的手法（in vivo測定法）のような定法により、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を検出することも可能である。
【００２４】
以上のような様々なベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性測定方法の中で、多検体のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を機械的に効率よく測定する方法としては、前記のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの反応とカップルさせた他の酵素反応とを利用した方法が望ましい。具体的には、例えばＡＴＰを基質としたベシクルフュージングＡＴＰアーゼの酵素反応の後、Kinase-Glo（登録商標） Luminescent Kinase Assay（Promega社製）を用いて、当該キットに付属される取扱説明書に記載される方法に準じて、消費されなかったＡＴＰ量をルシフェラーゼの発光量として測定し、この発光量からベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を求める方法等が挙げられる。
【００２５】
また、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を測定する方法は、上記の方法と同様な方法で実施することができる。
【００２６】
既知の昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列は、これまでに、キイロショウジョウバエ（D. melanogaster NSF1[comt, comatose]、accession No. NP_524877；NSF2、accession No. NP_788676）、タバコスズメガ（Manduca sexta 、accession No. AAF18300）、コーンイヤーワーム（Helicoverpa zea 、accession No. AAO65962）、オオタバコガ（Helicoverpa armigera 、accession No. AAW58140）、ネッタイシマカ（Aedes aegypti 、accession No. AAQ83118）及びガンビエハマダラカ（Anopheles gambiae 、accession No. XP_307148）等のものが公共のデータベースに開示されている。また、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子の塩基配列は、これまでに、キイロショウジョウバエ（D. melanogaster nsf1[comt, comatose]、accession No. NM_080138；nsf2、accession No. NM_176499）、タバコスズメガ（Manduca sexta 、accession No. AF118384）、コーンイヤーワーム（Helicoverpa zea 、accession No. AY220909）、オオタバコガ（Helicoverpa armigera 、accession No. AY864803）、ネッタイシマカ（Aedes aegypti 、accession No. AY314995）、ガンビエハマダラカ（Anopheles gambiae 、accession No. XM_307148）及びカイコ（Bombyx mori 、accession No. AY864804）等のものが公共のデータベースに開示されている。
ここで「公共のデータベース」としては、例えば、GenBnak、、DDBL及びEMBLの各デー−タバンクが公開しているデータベース等を挙げることができ、当該データベースに登録されているデータを誰でも制限なしで利用できる。Genbankに登録されている塩基配列に関する情報は、例えば、National Center for Biotechnology Information のWEBペー−ジ（URL；http://www.ncbi.nlm.nih.gov）から、Genbankによって各遺伝子に付与されている上記の登録番号 (Accession No.)をもとに検索を行うことによって入手することができる。因みに、INSDに登録されたデータは科学資料として永久に保存され公開されることが、上記３データバンクで構成される国際塩基配列データベース（international Nucleotide Sequence Databases, INSD）の諮問機関である国際諮問委員会により作成された「DDBL/EMBL/GenBnakの登録データの取り扱い」（2002年5月23-24日）で明文化されており、GenBnak、、DDBL及びEMBLの各データバンクが公開しているデータ全てを如何なる当業者であっても登録番号 (Accession No.)に基づきデー−タの照合、検索、入手等は可能である。
【００２７】
また、後述の方法によって、これまで未知であったワタアブラムシ由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列を明らかにすることが可能であり、それらの方法によって得られたアミノ酸配列は配列番号１、遺伝子の塩基配列は配列番号２にそれぞれ開示されている。
【００２８】
一方、昆虫以外のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列は、線虫（Ceanorhabditis elegans 、accession No. NP_740892）、ヒト（Homo sapiens 、accession No. NP_006169）等において、及び遺伝子の塩基配列は、線虫（Ceanorhabditis elegans 、accession No. NM_170902）、ヒト（Homo sapiens 、accession No. NM_006178）等において、それぞれ公共のデータベースに開示されている。
【００２９】
ワタアブラムシ由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列とその遺伝子の塩基配列に対する既知配列との同一性は表１に示される。
【００３０】
【表１】
2008125378.tif 000002
【００３１】
昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力とは、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を増加又は減少させる能力をさし、即ち、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性化能力又は活性阻害能力を意味する。そして、前記のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性測定反応系に被験物質を添加して、被験物質がベシクルフュージングＡＴＰアーゼの反応に与える影響を調べることができる。現時点において、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼの特異的阻害能力を有する物質は全く発見されていないが、現在までに数種類のＡＴＰアーゼ阻害剤が同定されており（Chene, Nature reviews, 1 (2002) 665; Beukers et al., aunyn-Schmied. Arch. Pharmacol. 351: 523-528, 1995）、このようなＡＴＰアーゼ阻害剤の中には、N-エチルマレイミドのように、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼにも阻害能力を有する物質が存在することが知られている（Steel G. J. et al., Biochemistry 38, 1999, 7764-7772 and Morgan A. et al., JBC 269(7), 1994, 29347-29350）。
【００３２】
当該反応における被験物質のＩＣ５０値とは、当該反応の活性を５０％阻害する被験物質の濃度を意味する。被験物質のＩＣ５０値は、前記のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性測定反応系に異なる濃度の被験物質を添加して、各添加濃度（用量）でのベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性（反応）を算出し、用量-反応曲線（dose response curve）を作成して、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を50%阻害する被験物質の添加濃度を算出することによって決定できる。より具体的には、４パラメーターロジスティックモデル（4 Parameter Logistic Model）又はシグモイド用量-反応モデル（Sigmoidal Dose-Response Model）
【００３３】
f(x) = (A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))
【００３４】
2008125378.tif 000003
【００３５】
を用いて用量-反応曲線を作成し、ＩＣ５０を算出することができる。また実務的には、市販の計算ソフトウェアであるXLfit （IDBS社製）を用いて算出することが可能である。
【００３６】
昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力を有することを特徴とする薬剤とは、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を変化させる能力を有する物質を有効成分とする薬剤である。
【００３７】
本発明において「有害生物の生理状態に変化を与える薬剤であり、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力を有することを特徴とする薬剤」とは、前記の測定方法で昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力を特定された薬剤であり、有害生物の生理状態に変化を与えることができる薬剤を意味する。当該薬剤として、望ましくは、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼがワタアブラムシ由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼである薬剤が挙げられる。また当該薬剤として、望ましくは、有害生物の生理状態に変化を与える薬剤が、有害生物防除剤である薬剤が挙げられる。また当該薬剤として、望ましくは、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力が、ＡＴＰを基質とした反応を阻害する能力である薬剤が挙げられる。
【００３８】
本発明において「有害生物防除剤」とは、前記有害生物を防除する能力を有する薬剤を示す。
【００３９】
有害生物防除能力を測定する方法の一つとして、本発明で開示される方法の他に、例えば、前記の有害生物に対する殺虫活性を測定する方法が挙げられる。具体的には、例えば、以下の方法に従い、測定することができる。
【００４０】
下記の組成（表２）からなる滅菌済み人工飼料を調製し、供試薬剤のDMSO溶液を当該人工飼料の0.5％容量添加し、混合する以外は、Handbook of Insect Rearing Vol.1 (Elsevier Science Publisers 1985) 35頁〜36頁に記載される方法に準じてワタアブラムシを飼育し、６日後にワタアブラムシの生存数を調査し、次の式により防除価を求める。
【００４１】
【表２】
2008125378.tif 000004
【００４２】
防除価（％）＝｛１−（Ｃｂ×Ｔａｉ）／（Ｃａｉ×Ｔｂ）｝×１００
【００４３】
尚、式中の文字は以下の意味を表す。
Ｃｂ：無処理区の処理前の虫の生存数
Ｃａｉ：無処理区の観察時の虫の生存数
Ｔｂ：処理区の処理前の虫の生存数
Ｔａｉ：処理区の観察時の虫の生存数
有意に高い防除価を示す供試薬剤については、有害生物防除活性があると言える。また、より好ましくは、当該防除価が30%以上の供試薬剤は実質的な殺虫活性があると判断でき、当該防除価が30%未満の供試化合物は実質的な殺虫活性が無いと判断できる。
【００４４】
本発明における有害生物防除剤は、有効成分として昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力を有する化学物質又はその農学的に許容される塩を含んでいてもよい。
【００４５】
本発明において、農学的に許容される塩とは、防除剤としての製造、及び当該製造物の施用に関して、その製造及び施用が不可能とならない形態の塩を指し、どのような形態の塩でもあってもよい。かかる塩としては、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アルミニウム等の無期塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン等の有機塩基、リジン、オルニチン等の塩基性アミノ酸との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。
【００４６】
本発明において「有効成分として、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力を有する化学物質又はその農学的に許容される塩を含有することを特徴とする有害生物防除剤」とは、前記の測定方法で昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力を特定された化学物質又はその農学的に許容される塩を有効成分として含有することにより有害生物を防除することができる薬剤を意味する。当該化学物質として、望ましくは、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼとＡＴＰとの反応を阻害する能力を有する化学物質を挙げることができる。また、より望ましくは、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼとＡＴＰとの無細胞反応系において、化学物質の存在濃度が１０μＭ以上の場合に、当該化学物質が存在しない場合よりもベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性が低くなるように阻害する能力を有する化学物質が挙げられる。またさらに望ましくは、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼとＡＴＰとの無細胞反応系において１００μＭ以下のＩＣ５０となるようにベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を阻害する化学物質を挙げることができる。
【００４７】
本発明において「被験物質が有する有害生物防除能力の検定方法であって、群Ａから選択されるベシクルフュージングＡＴＰアーゼと被験物質との接触系内におけるベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を測定する第一工程と、第一工程により測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られる差異に基づき被験物質の有害生物防除能力を評価する第二工程を有することを特徴とする方法」とは、被験物質が有する有害生物防除能力を検定する様々な方法の中で、前記の第一工程及び第二工程を有することを特徴とする方法を示す。
【００４８】
ここで、群Ａとは、
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列と７５％以上の配列同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質
（ｇ）昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｈ）ワタアブラムシ由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列からなる蛋白質
を示す（以下、群Ａと記す。）。
【００４９】
前記の第一工程は、前記の様々なベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性測定反応系に被験物質を添加することによってベシクルフュージングＡＴＰアーゼと被験物質を接触させた状態でベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を測定する工程である。また第二工程は、被験物質を測定した時の活性と対照における活性を比較しその差異に基づいて有害生物防除能力を評価する工程である。ここで対照とは、例えば被験物質を溶媒に溶解した状態で反応系に添加した場合には、被験物質を溶解した溶媒のみを添加した試験区を意味する。
【００５０】
当該第一工程及び当該第二工程を有する、被験物質が有する有害生物防除能力の検定方法に使用されるベシクルフュージングＡＴＰアーゼは、前記群Ａに示す蛋白質である。上記の群Ａの蛋白質のうち、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、（h）に示される蛋白質のアミノ酸配列において、（a）に示されるアミノ酸配列との間に認められることのある相違は、一部のアミノ酸の欠失、置換、付加等である。これらには、例えば、上記の（a）で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシングによる欠失が含まれる。また、当該蛋白質が由来する生物の種差や個体差等により天然に生じる遺伝子変異や、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、突然変異処理等によって人為的に導入される遺伝子変異等により生じるアミノ酸の欠失、置換、付加等が含まれる。
【００５１】
かかる欠失、置換、付加等を受けるアミノ酸の数は、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼのＡＴＰアーゼ活性を見出すことのできる範囲内の数であれば良い。また、アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似したアミノ酸への置換をあげることができる。このような置換としては、具体的には例えば、(1)グリシン、アラニン；(2)バリン、イソロイシン、ロイシン；(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、(4)セリン、スレオニン；(5)リジン、アルギニン；(6)フェニルアラニン、チロシン等のグループ内での置換が挙げられる。
【００５２】
かかるアミノ酸の欠失、付加若しくは置換（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う手法としては、例えば、（a）で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。また、アミノ酸の改変を人為的に行う手法としては、例えば、（a）で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対してランダムに変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法も挙げられる。ここでランダムに変異を導入する手法としては、例えば、上記のアミノ酸配列のいずれかをコードするDNAを鋳型とし、それぞれのDNAの全長を増幅できるようなプライマー対を用い、基質に用いるdATP、dTTP、dGTP、dCTPの各々の添加濃度を通常とは変化させた反応条件や、或いはポリメラーゼの反応を促進させるMg２＋の濃度を通常よりも増加させた反応条件でＰＣＲを行う方法等が挙げられる。このようなＰＣＲの手法としては、例えば、Method in Molecular Biology, (31), 1994, 97-112 に記載される方法があげられる。また、WO0009682号公報に記載される方法をあげることもできる。
【００５３】
ここで「配列同一性」とは、２つの塩基配列又は２つのアミノ酸配列間の同一性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の塩基配列又はアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいては、付加又は欠失（例えばギャップ等）を許容してもよい。このような配列同一性は、例えば、FASTA［Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，4, 2444-2448(1988)］、BLAST［Altschulら、Journal of Molecular Biology, 215, 403-410(1990)］、CLUSTAL W［Thompson,Higgins＆Gibson, Nucleic Acid Research, 22, 4673-4680(1994a)］等のプログラムを用いて相同性解析を行いアラインメントを作成することによって算出することができる。上記のプログラムは、例えば、DNA Data Bank of Japan［国立遺伝学研究所 生命情報・ＤＤＢＪ研究センター (Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan ；CIB/DDBJ)内で運営される国際ＤＮＡデータバンク］のホームページ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）等において、一般的に利用可能である。また、配列同一性は市販の配列解析ソフトウェアを用いて求めることもできる。具体的には例えば、GENETYX-WIN Ver.5（ソフトウェア開発株式会社製）」を用い、Lipman-Pearson法［Lipman, D. J. and Pearson, W.R., Science, 227, 1435-1441,(1985)］により相同性解析を行ってアラインメントを作成することにより算出することができる。
(f)に記載される「ストリンジェントな条件」としては、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行われるハイブリダイゼーションにおいて、例えば、６×SSC（１．５M NaCl、０．１５M クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする）を含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×SSC（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×SSC（高ストリンジェンシーな条件）までの条件から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの条件から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
（h）記載の蛋白質は、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの中で、ワタアブラムシに存在するベシクルフュージングＡＴＰアーゼを示し、（a）記載のアミノ酸配列からなる蛋白質も含まれる。
【００５４】
また、群Ａの蛋白質には、（g）記載の昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列からなる蛋白質、が含まれるが、より望ましくは、最大の配列同一性が得られるよう配列番号１で示されるアミノ酸配列と整列させた場合に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の（I）314位、（II）341位、（III）343位、（IV）421位、（V）529位、（VI）547位、（VII）584位、（VIII）587位、（IX）613位、（X）623位に相当する位置のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基；（I）314位はグルタミン酸、（II）341位はバリン、（III）343位はアスパラギン、（IV）421位はイソロイシン、（V）529位はアラニン、（VI）547位はアスパラギン、（VII）584位はロイシン、（VIII）587位はアルギニン、（IX）613位はグリシン、（X）623位はトレオニンである蛋白質が用いられる。ここで、「最大の配列同一性が得られるように配列番号１で示されるアミノ酸配列と整列させる」とは、上記のFASTA、BLAST、CLUSTAL W等のプログラムを用いて配列番号１で示されるアミノ酸配列を含めて対象となる複数のアミノ酸配列の配列同一性解析を行い整列させることを意味する。このような方法で複数の配列を整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、各アミノ酸配列中における相同アミノ酸残基の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象の蛋白質の特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。例えば、本発明で配列が開示されるベシクルフュージングＡＴＰアーゼを含め、既知の昆虫のベシクルフュージングＡＴＰアーゼは、アミノ酸配列最大の配列同一性が得られるよう配列番号１で示されるアミノ酸配列と整列させた場合に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の（I）314位、（II）341位、（III）343位、（IV）421位、（V）529位、（VI）547位、（VII）584位、（VIII）587位、（IX）613位、（X）623位に相当する位置のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基；（I）314位はグルタミン酸、（II）341位はバリン、（III）343位はアスパラギン、（IV）421位はイソロイシン、（V）529位はアラニン、（VI）547位はアスパラギン、（VII）584位はロイシン、（VIII）587位はアルギニン、（IX）613位はグリシン、（X）623位はトレオニン、である。
【００５５】
有害生物防除能力を有する物質は、例えば前記の有害生物に対する殺虫活性又は防除効果を測定することによる有害生物防除能力の検定方法を用いることによって探索することができる。
【００５６】
また、前記のベシクルフュージングＡＴＰアーゼを用いた有害生物防除能力の検定方法によっても有害生物防除能力を有する物質を探索することが可能である。具体的には、前記のベシクルフュージングＡＴＰアーゼを用いた有害生物防除能力の検定方法を用いて、被験物質の有害生物防除能力がある一定値以上、又は一定値以下であることが特定された場合、当該物質を選抜することによって有害生物防除能力を有する物質を探索できる。
【００５７】
また当該探索方法によって選抜された物質は、有害生物防除能力を有することから、その物質又はその農学的に許容される塩を有効成分として含有する有害生物防除剤となり得る。
【００５８】
有害生物の防除は、通常、有害生物防除剤の有効量を保護すべき作物、有害生物又は有害生物の生息場所に施用することにより行われる。
【００５９】
有害生物防除剤を農林用として用いる場合には、その施用量は通常１０００ｍ2有害生物防除剤の量で０．１〜１０００ｇである。有害生物防除剤が乳剤、水和剤、フロアブル剤、マイクロカプセル剤等に製剤化されたものである場合には、通常有効成分濃度が１〜１００００ｐｐｍとなるように水で希釈して散布することにより施用し、有害生物防除剤が粒剤、粉剤等に製剤化されたものである場合には、通常そのまま施用する。
【００６０】
有害生物防除剤は有害生物から保護すべき作物等の植物に対して茎葉処理することにより使用することができ、作物の苗を植え付ける前の苗床や植付けの時に植穴や株元に処理することにより使用することもできる。さらに、耕作地の土壌に生息する有害生物を防除する目的で当該土壌に処理することにより使用してもよい。また、シート状やひも状等に加工した樹脂製剤を作物に巻き付ける、作物の近傍に張り渡す及び／又は株元の土壌表面に敷く等の方法で使用することもできる。
【００６１】
有害生物防除剤を防疫用害虫防除剤として用いる場合には、乳剤、水和剤、フロアブル等は、通常、有効成分濃度が０．０１〜１００００ｐｐｍになるように水で希釈して施用し、油剤、エアゾール、燻煙剤、毒餌等についてはそのまま施用する。
【００６２】
有害生物防除剤の用途の一つとして、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等の家畜、イヌ、ネコ、ラット、マウス等の小動物の外部寄生虫防除があげられ、この場合は獣医学的に公知の方法で動物に投与する事ができる。具体的な投与方法としては、全身的抑制（systemic control）を目的とする場合には、例えば錠剤、飼料混入、坐薬、注射（筋肉内、皮下、静脈内、腹腔内等）等により投与され、非全身的抑制（non-systemic control）を目的とする場合には、例えば油剤若しくは水性液剤を噴霧する、ポアオン若しくはスポットオン処理を行う、シャンプー製剤で動物を洗う又は樹脂製剤を首輪や耳札にして動物につける等の方法により用いられる。動物体に投与する場合の有害生物防除剤の量は、通常動物１ｋｇに対して、化合物Ａと化合物Ｂとの合計量で、０．１〜１０００ｍｇの範囲である。
【００６３】
これらの施用量、施用濃度は、いずれも製剤の種類、施用時期、施用場所、施用方法、有害生物の種類、被害程度の等の状況によって異なり、上記の範囲にかかわることなく増減させることができ、適宜選択することができる。
【００６４】
以上に示した有害生物防除の方法に、前記の有害生物防除剤を用いることができる。
【００６５】
また一方、前記の、群Ａから選択されるベシクルフュージングＡＴＰアーゼを用いた第一工程、第二工程を有する、被験物質が有する有害生物防除能力の検定方法、によって評価された有害生物防除能力を有する物質を特定し、特定された有害生物防除能力を有する物質と有害生物とを接触させることによって有害生物を防除することも可能である。ここで特定された有害生物防除能力を有する物質と有害生物とを接触させる方法としては、前記の製剤方法、施用方法等を用いることが出来る。
【００６６】
群Ｂで示されるアミノ酸配列は、下記の（ａ）〜（ｇ）いずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列である。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列を有するアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列と７５％以上の配列同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有するアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列に対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を有するアミノ酸配列
（ｇ）ワタアブラムシ由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼが有するアミノ酸配列
上記の群Ｂのに示されるアミノ酸配列のうち、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）に示される蛋白質のアミノ酸配列において、（a）に示されるアミノ酸配列との間に認められることのある相違は、一部のアミノ酸の欠失、置換、付加等である。これらには、例えば、上記の（a）で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシングによる欠失が含まれる。また、当該蛋白質が由来する生物の種差や個体差等により天然に生じる遺伝子変異や、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、突然変異処理等によって人為的に導入される遺伝子変異等により生じるアミノ酸の欠失、置換、付加等が含まれる。
【００６７】
かかる欠失、置換、付加等を受けるアミノ酸の数は、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼのＡＴＰアーゼ活性を見出すことのできる範囲内の数であれば良い。また、アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似したアミノ酸への置換をあげることができる。このような置換としては、具体的には例えば、(1)グリシン、アラニン；(2)バリン、イソロイシン、ロイシン；(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、(4)セリン、スレオニン；(5)リジン、アルギニン；(6)フェニルアラニン、チロシン等のグループ内での置換が挙げられる。
【００６８】
かかるアミノ酸の欠失、付加若しくは置換（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う手法としては、例えば、（a）で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。また、アミノ酸の改変を人為的に行う手法としては、例えば、（a）で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対してランダムに変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法も挙げられる。ここでランダムに変異を導入する手法としては、例えば、上記のアミノ酸配列のいずれかをコードするDNAを鋳型とし、それぞれのDNAの全長を増幅できるようなプライマー対を用い、基質に用いるdATP、dTTP、dGTP、dCTPの各々の添加濃度を通常とは変化させた反応条件や、或いはポリメラーゼの反応を促進させるMg２＋の濃度を通常よりも増加させた反応条件でＰＣＲを行う方法等が挙げられる。このようなＰＣＲの手法としては、例えば、Method in Molecular Biology, (31), 1994, 97-112 に記載される方法があげられる。また、WO0009682号公報に記載される方法をあげることもできる。
【００６９】
ここで「配列同一性」とは、２つの塩基配列又は２つのアミノ酸配列間の同一性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の塩基配列又はアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいては、付加又は欠失（例えばギャップ等）を許容してもよい。このような配列同一性は、例えば、FASTA［Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，4, 2444-2448(1988)］、BLAST［Altschulら、Journal of Molecular Biology, 215, 403-410(1990)］、CLUSTAL W［Thompson,Higgins＆Gibson, Nucleic Acid Research, 22, 4673-4680(1994a)］等のプログラムを用いて相同性解析を行いアラインメントを作成することによって算出することができる。上記のプログラムは、例えば、DNA Data Bank of Japan［国立遺伝学研究所 生命情報・ＤＤＢＪ研究センター (Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan ；CIB/DDBJ)内で運営される国際ＤＮＡデータバンク］のホームページ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）等において、一般的に利用可能である。また、配列同一性は市販の配列解析ソフトウェアを用いて求めることもできる。具体的には例えば、GENETYX-WIN Ver.5（ソフトウェア開発株式会社製）」を用い、Lipman-Pearson法［Lipman, D. J. and Pearson, W.R., Science, 227, 1435-1441,(1985)］により相同性解析を行ってアラインメントを作成することにより算出することができる。
(f)に記載される「ストリンジェントな条件」としては、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行われるハイブリダイゼーションにおいて、例えば、６×SSC（１．５M NaCl、０．１５M クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする）を含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×SSC（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×SSC（高ストリンジェンシーな条件）までの条件から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの条件から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
（h）記載の蛋白質は、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの中で、ワタアブラムシに存在するベシクルフュージングＡＴＰアーゼを示し、（a）記載のアミノ酸配列からなる蛋白質も含まれる。
【００７０】
群Ｂに示されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、例えば、群Ｂに示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いて後述の方法に従い調製することができる。
【００７１】
昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼは、有害生物防除能力を評価するための指標を提供する試薬として使用することができる。具体的には、例えば昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼは、前記のベシクルフュージングＡＴＰアーゼを用いた有害生物防除能力を検定する方法において用いるベシクルフュージングＡＴＰアーゼとして使用することによって、有害生物防除能力を評価するための指標を提供する試薬として使用することが可能である。また、より具体的な方法については、前記の、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性測定方法に従い実施できる。
【００７２】
また、有害生物防除能力を評価するための指標を提供する試薬として昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼを使用する場合において、より好ましくは、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼは、前記の群Ｂに示されるアミノ酸配列を有するベシクルフュージングＡＴＰアーゼであることが望ましい。
【００７３】
前記の群Ｂに示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド群Ｂと記すこともある。）は、生物の細胞内或いは試験管内の翻訳系において、前記の群Ｂに示されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生成できる塩基配列を持つ。ポリヌクレオチド群Ｂとしては、自然界からクローニングされたＤＮＡであってもよいし、自然界からクローニングされたＤＮＡに、例えば部位特異的変異導入法やランダム変異導入法等によって塩基の欠失、置換又は付加が導入されたＤＮＡであってもよく、また、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。具体的には、配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。
＜第１の取得方法＞
例えば、ポリヌクレオチド群Ｂに含まれる配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの取得方法を以下に示す。工程としては、ワタアブラムシから全ＲＮＡを取得し、ｃＤＮＡライブラリーを合成して、ＰＣＲ増幅を行うことによって目的のポリヌクレオチドを取得できる。
【００７４】
ポット植えのキュウリ葉上で飼育されたワタアブラムシ（Aphis gossypii）の成虫及び幼虫の混合した集団630mgを葉上から細筆又は小さなハケでかきとり、これを液体窒素中で乳鉢及び乳棒を用いて粉末状になるまで破砕し、凍結された破砕粉体からＲＮＡ抽出試薬ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いてＲＮＡを単離する。次に乳鉢中の凍結された破砕粉体に10mlのISOGENを加え10分間磨砕する。この時、乳鉢は氷上に置いた状態で操作する。磨砕後、液体状の試料をピペットにて15mlチューブに移し、2mlのクロロホルム（和光純薬工業社製）を加え、直ちに15秒間激しく混和し、室温で3分間静置する。4℃、15分間、12,000×ｇで遠心分離後、上層の水相を5mlずつ2本の新しいチューブに移し、ぞれぞれのチューブにISOGENを5ml加え、直ちに15秒間激しく混和し、室温で3分間静置する。4℃、15分間、12,000×ｇで再度遠心分離後、上層の水相10mlをそれぞれ新しい50mlチューブに移し、続いて、イソプロパノール（和光純薬工業社製）を10ml加え、氷上で30分間静置する。次に4℃、10分間、12,000×ｇで遠心分離し、ＲＮＡを沈殿させ、上清を除いて20mlの70％エタノールを加えて、4℃、5分間、10,000×ｇで遠心分離する。上清を除き、チューブの口を下にして3分間静置し、沈殿した全ＲＮＡを軽く乾燥させてから、市販のRNase-free water（ナカライテスク社製）1mlに沈殿を溶解させる。こうして調製した全ＲＮＡは260 nmの吸光度を測定し、常法に従い濃度を算出する。
【００７５】
前記の方法で得られたワタアブラムシの全ＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマー（Invitrogen社製）及びスーパスクリプトＩＩＩ（Invitrogen社製）を用いて、当該試薬に付属される説明書に従いＲＴ−ＰＣＲを実施し、cDNA第１鎖を合成する。
【００７６】
前記の方法で得られたワタアブラムシのcDNA第１鎖を鋳型として、配列番号３、及び配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとLa-Taq polymerase (タカラバイオ社製)とを用いてかつ前述のｃDNAを鋳型として、当該試薬に付属される説明書に従ってＰＣＲ増幅を行う。尚、ＰＣＲの条件は後述のようなタッチダウンＰＣＲとする。すなわち、最初に94℃、10分間、続いて94℃、20秒間、60℃から1サイクルにつき1℃の減少を伴い10サイクルで50℃まで変化させて、20秒間、72℃、2分間を10サイクルとし、さらに94℃、20秒間、50℃、20秒間、72℃、3分間を25サイクルとし、最後に72℃、7分間とする。
以上のようにして配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを取得することが可能である。
＜第２の取得方法＞
また、ポリヌクレオチド群Ｂに示されるポリヌクレオチドは、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを基にして、前記の部位特異的変異導入法であるアンバー変異を利用する方法、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等によって変異が導入されたポリヌクレオチドを作製することによっても得ることが可能である。
＜第３の取得方法＞
また、ポリヌクレオチド群Ｂに示されるポリヌクレオチドは、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド等をプローブとしたハイブリダイゼーション法によっても取得可能である。より具体的には、前記のSambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行われるハイブリダイゼーション法に従い実施可能である。
＜第４の取得方法＞
また、ポリヌクレオチド群Ｂに示されるポリヌクレオチドは、既知の昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列配列を基にプライマーを作製しＰＣＲによって取得することも可能である。具体的には、チャバネゴキブリ（Blatella germanica）等の他の昆虫種におけるベシクルフュージングＡＴＰアーゼ相同遺伝子を得るために、Codehop program（Fred Hutchinson Cancer Research Center が運営するBlocks Protein Analysis Server のウェブサイトから公的に利用可能  http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html）を利用してディジェネレートプライマーを設計する。この時、前述のワタアブラムシ由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子配列及び既に公知であるキイロショウジョウバエ(NCBI accession number NM_080138)、タバコスズメガ(AF118384)、コットンボールワーム(AY220909)、ガンビエハマダラカ(XM_307148)の配列を参考にする。選択した昆虫種におけるベシクルフュージングＡＴＰアーゼ相同遺伝子の部分配列は、当該昆虫種由来のcDNA第１鎖を鋳型とした一連のＰＣＲにより増幅する。ここで、鋳型とするcDNA第１鎖は前述のSuperscript IIIを用いた方法により調製する。ＰＣＲには、フォワード及びリバースプライマーとしてそれぞれのディジェネレートプライマーと、Amplitaq Gold (Applied Biosystems社製)とを用いて、当該試薬に付属される説明書に従って行う。ＰＣＲの条件は後述のようなタッチダウンＰＣＲとする。すなわち、最初に94℃、10分間、続いて94℃、30秒間、60℃から1サイクルにつき1℃の減少を伴い10サイクルで50℃まで変化させて、1分間、72℃、1分30秒間を10サイクルとし、さらに94℃、30秒間、50℃、1分間、72℃、1分30秒間を25サイクルとし、最後に72℃、7分間とする。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により分析・精製することにより、目的のＤＮＡ断片を取得する。さらにこのようにして取得されたＤＮＡ断片をpCR4-TOPO vector (Invitrogen社製)にクローニングした後、塩基配列を決定する。
【００７７】
次に、得られた昆虫のベシクルフュージングＡＴＰアーゼ相同遺伝子の部分配列に対する特異的プライマーを設計し、全長配列を獲得するために3' RACE PCR 又は5' RACE PCRを行う。3' 及び5' RACE PCRは昆虫の全ＲＮＡより調製したcDNA第１鎖を鋳型とし、SMART PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech社製)や5'/3' RACE Kit, 2nd Generation (Roche社製)を用いて、当該キットに付属される説明書に従って行う。
【００７８】
SMART PCR cDNA Synthesis Kitを使用する場合、3' RACE及び5' RACE反応には、SMART PCR cDNA Synthesis Kitに同梱されているuniversal primer mix (UPM)と、目的の遺伝子配列に特異的なフォワードプライマー又はリバースプライマーをそれぞれ組み合わせて用いる。ＰＣＲの条件は後述のようなタッチダウンＰＣＲとする。すなわち、最初に94℃、10分間、続いて94℃、30秒間、60℃から1サイクルにつき1℃の減少を伴い10サイクルで50℃まで変化させて、30秒間、72℃、2分間を10サイクルとし、さらに94℃、30秒間、50℃、1分間、72℃、2分間を25サイクルとし、最後に72℃、7分間とする。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により分析・精製することにより、目的のＤＮＡ断片を取得する。さらにこのようにして取得されたＤＮＡ断片をpCR4-TOPO vector (Invitrogen社製)にクローニングした後、塩基配列を決定する。
【００７９】
１回目のＰＣＲで明確な増幅産物が得られない場合には、１回目のＰＣＲ産物を鋳型としてnested PCRを行う。プライマーはSMART PCR cDNA Synthesis Kitに同梱されているNUP primerと、1回目のＰＣＲに用いた特異的プライマーよりも内側に設計した特異的フォワード及びリバースプライマーをそれぞれ組み合わせて用いる。ＰＣＲの条件は後述のようなタッチダウンＰＣＲとする。すなわち、最初に94℃、10分間、続いて94℃、30秒間、60℃から1サイクルにつき1℃の減少を伴い10サイクルで50℃まで変化させて、30秒間、72℃、2分間を10サイクルとし、さらに94℃、30秒間、50℃、1分間、72℃、2分間を25サイクルとし、最後に72℃、7分間とする。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により分析・精製することにより、目的のＤＮＡ断片を取得する。さらにこのようにして取得されたＤＮＡ断片をpCR4-TOPO vector (Invitrogen社製)にクローニングした後、塩基配列を決定する。
【００８０】
以上の配列決定により、昆虫のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのN末端領域をコードする5'末端配列及びC末端領域をコードする3'末端配列を明らかにする。
【００８１】
このようにして、ポリヌクレオチド群Ｂに示されるポリヌクレオチドは、既知の昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのアミノ酸配列を基にプライマーを作製しＰＣＲによって取得することができる。
【００８２】
ポリヌクレオチド群Ｂの塩基配列に対し相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション法を用いるポリヌクレオチド群Ｂに示されるポリヌクレオチドの取得に使用することができる。
【００８３】
本発明における取得方法には、ハイブリダイゼーションにより所望のポリヌクレオチドを検出する工程、検出された所望のポリヌクレオチドを特定する工程、及び、特定された所望のポリヌクレオチドを回収する工程、が含まれる。以降に各工程を具体的に説明する。
【００８４】
ハイブリダイゼーションにより所望のポリヌクレオチドを検出する工程、及び検出された所望のポリヌクレオチドを特定する工程は、例えば「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols In Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons,Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載される方法に準じて、ポリヌクレオチド群Ｂの塩基配列に対し相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして用いることによって実施可能である。
【００８５】
具体的には例えば、配列番号２で示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列を有するＤＮＡを、Random Primed DNA Labelling Kit（ベーリンガー社製）、Random Primer DNA Labelling Kit Ver.2（宝酒造社製）、ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Ditection System（Amersham biosciences社製）、Megaprime DNA-labelling system（Amersham biosciences社製）等を用いた公知の方法によってラジオアイソトープ標識又は蛍光標識することによって、これをプローブとして使用することができる。
【００８６】
ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、ストリンジェントな条件をあげることができ、具体的には例えば、6×SSC（0.9M NaCl、0.09Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液（0.1%(w/v) フィコール400、0.1%(w/v) ポリビニルピロリドン、0.1%BSA）、0.5%(w/v) SDS及び100μg/ml変性サケ精子DNA存在下に、又は100μg/ml変性サケ精子DNAを含むDIG EASY Hyb溶液（ベーリンガーマンハイム社）中で、65℃で保温し、次いで１×SSC（0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5%SDS存在下に、室温で15分間の保温を2回行い、さらに0.1×SSC（0.015M NaCl、0.0015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5%SDS存在下に、68℃で30分間保温する条件をあげることができる。
【００８７】
より具体的には、例えば、ポリヌクレオチド群Ｂの塩基配列に対し相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドを鋳型にしてMegaprime DNA-labelling system（アマシムファルマシアバイオテク社製）を用いてキット指定の反応液を用いることにより32Pでラベルしたプローブを作成することが出来る。このプローブを用いて定法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行い、6×SSC（0.9M NaCl、0.09Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液（0.1%(w/v) フィコール400、0.1%(w/v) ポリビニルピロリドン、0.1%BSA）、0.5%(w/v) SDS及び100μg/ml変性サケ精子DNA存在下に、又は100μg/ml変性サケ精子DNAを含むDIG EASY Hyb溶液（ベーリンガーマンハイム社）中で、65℃で保温し、次いで１×SSC（0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5%SDS存在下に、室温で15分間の保温を2回行い、さらに0.1×SSC（0.015M NaCl、0.0015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5%SDS存在下に、68℃で30分間保温することでハイブリダイズするポリヌクレオチド（を含むコロニー）を検出することができる。こうして、ハイブリダイゼーションにより所望のポリヌクレオチドを検出し、また検出された所望のポリヌクレオチドを特定することができる。
【００８８】
特定された所望のポリヌクレオチドを回収するためには、前記の方法で検出、特定されたポリヌクレオチドを含むコロニーから、例えば「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されるアルカリ法等の方法に準じて、プラスミドＤＮＡを回収することによって実施することができる。尚、回収された所望のポリヌクレオチド（プラスミドＤＮＡ）の塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M & W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 560, 1977 等に記載される)やSanger法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 1975、Sanger,F, & Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 1977等に記載される）により確認することができる。この際、例えば市販のTermo Seqenase II dye terminator cycle sequencing kit（Amersham biosciences社製）、Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）等を用いることができる。
【００８９】
ポリヌクレオチド群Ｂの塩基配列の部分塩基配列又はその部分塩基配列に対して相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドは、ＰＣＲを用いるポリヌクレオチド群Ｂに示されるポリヌクレオチドの取得に使用することができる。より具体的には、配列番号３又は４で示される塩基配列からなるポリペプチドが挙げられる。本発明における取得方法には、ＰＣＲにより所望のポリヌクレオチドを増幅する工程、増幅された所望のポリヌクレオチドを特定する工程、及び、特定された所望のポリヌクレオチドを回収する工程、が含まれる。以降に各工程を具体的に説明する。
【００９０】
ＰＣＲにより所望のポリヌクレオチドを増幅する工程では、具体的には、ポリヌクレオチド群Ｂの塩基配列の部分塩基配列又はその部分塩基配列に対して相補性を有する塩基配列から、約20bpから約40bp程度の塩基配列、例えば配列番号２及び配列番号２に対して相補性を有する配列から選択した塩基配列に基づいて設計、合成したＤＮＡをプライマーのセットとして用いることができ、例えば、配列番号３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列番号４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとのセットをプライマーのセットとして挙げることができる。ＰＣＲ反応液は例えば前記のような方法で調製したｃＤＮＡライブラリーに市販のＰＣＲキット指定の反応液を添加して調製する。反応条件は使用するプライマーセットによって変えることができるが、例えば、94℃で10秒間保温した後、94℃で15秒間、60℃で15秒間、72℃で3分間のサイクルを４０サイクル程度繰り返し、さらに72℃で3分間保温する条件や、94℃で2分間保温し、その後約８℃で3分間保温した後、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で4分間のサイクルを４０サイクル程度繰り返す条件、或いは、94℃で5秒間次いで72℃で4分間の保温を1サイクルとしてこれを5から10サイクル行い、さらに、94℃で5秒間次いで70℃で4分間の保温を1サイクルとしてこれを20から40サイクル程度行う条件を使用することができる。かかるＰＣＲには、例えば、PfuUltra High Fidelity polymerase （Stratagene社製）、Amplitaq Gold （Applied Biosystems社製）、Takara HeraculaseＴＭ（宝酒造社製）、Advantage cDNA PCR Kit（クロンテック社製）に含まれるＤＮＡポリメラーゼ、TaKaRa Ex Taq（宝酒造社製）、PLATINUMTM PCR SUPER Mix（ライフテックオリエンタル社製）等を用いることができる。
【００９１】
ＰＣＲによって増幅された所望のポリヌクレオチドを特定するためには、例えば、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載される方法等に準じたアガロースゲル電気泳動によって分子量を測定することにより実施することが可能である。また、増幅された所望のポリヌクレオチドを、市販のＤＮＡシーケンシング反応キット、例えば、Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）等を用いて、当該キットに付属される説明書に従ってシーケンシング反応を行い、ＤＮＡシーケンサー3100（Applied Biosystems社製）等を用いて解析することによって、増幅断片の塩基配列を読解することもできる。
【００９２】
特定された所望のポリヌクレオチドを回収する方法としては、例えば前記のアガロースゲル電気泳動によって特定されたポリヌクレオチドを、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載される方法等に準じてアガロースゲルから精製、回収することができる。また、こうして回収されたポリヌクレオチドやＰＣＲによって増幅された所望のポリヌクレオチドは、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press、や「Current Protocols In Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons,Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載される通常の方法に準じてベクターにクローニングすることができる。用いるベクターとしては例えば、pUCA119（宝酒造社製）、pTVA118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、ｐCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）等を利用することができる。尚、クローニングされた前記ＤＮＡの塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M & W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 560, 1977 等に記載される)やSanger法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 1975、Sanger,F, & Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 1977等に記載される）により確認することができる。この際、例えば市販のTermo Seqenase II dye terminator cycle sequencing kit（Amersham biosciences社製）、Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）等を用いることができる。
【００９３】
尚、ポリヌクレオチド群Ｂの塩基配列の部分塩基配列又はその部分塩基配列に対して相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドは、ＰＣＲ法のみならず、前記のハイブリダイゼーション法を用いるポリヌクレオチド群Ｂに示されるポリヌクレオチドの取得にも使用することが可能である。より具体的には、配列番号３又は４で示される塩基配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００９４】
前記の群Ｂに示されるアミノ酸配列を有する蛋白質を製造する方法としては、ポリヌクレオチド群Ｂが導入された形質転換体を培養し、産生された当該蛋白質を回収する方法があげられる。また、ここで用いられる形質転換体を作製するためには、ポリヌクレオチド群Ｂをバクテリオファージ由来のプロモーターに機能可能な形で連結した断片を含む環状ポリヌクレオチドを作製する等の作業が必要である。以下、当該方法について詳細に説明する。
【００９５】
また、前記のベシクルフュージングＡＴＰアーゼを用いた有害生物防除能力の検定方法に用いるベシクルフュージングＡＴＰアーゼも、用いるベシクルフュージングＡＴＰアーゼをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いて、同様の方法で群Ａに示される蛋白質を製造、取得することが可能である。
【００９６】
バクテリオファージ由来のプロモーターとは、バクテリオファージのゲノムに含まれる遺伝子のプロモーターを意味する。中でも外来遺伝子を発現するために使われるバクテリオファージのプロモーターは、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のプロモーターがあげられる。
【００９７】
本発明において「機能可能な形で連結する」とは、目的の遺伝子が使用する転写系において転写され得るように、プロモーター配列を含むポリヌクレオチド断片の下流に目的の遺伝子を含むポリヌクレオチド断片を連結させることを意味する。具体的には、例えば、後述のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のプロモーターを使用する場合には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のプロモーターの下流に目的の遺伝子を含むポリヌクレオチド断片を連結すればよい。また、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子プロモーター以外のプロモーターを用いる場合には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子プロモーター以外のプロモーター配列を含むポリヌクレオチド断片の下流に目的の遺伝子を含むポリヌクレオチドを連結することも可能である。より具体的には、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子プロモーターを利用したプラスミドpET41(b+)（Novagen社製）ベクターを用いる場合には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子プロモーターの下流に位置するNcoI、EcoRV、BamHI、EcoRI、StuI、PstI、SacI、SalI、HindIII、NotI、EagI、XhoI等の制限酵素サイトに目的の遺伝子を連結することによって、機能可能な形で連結することができる。
【００９８】
本発明において「環状ポリヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチド鎖の端が結合して環状になったポリヌクレオチドであり、具体例として、プラスミドＤＮＡ、バクミドＤＮＡ、等の他に多くの細菌の染色体DNA、があげられる。
【００９９】
プラスミドＤＮＡは、比較的低分子の環状ポリヌクレオチドであり、例としては、大腸菌での遺伝子クローニングや遺伝子発現に用いられるpET（Novagen社製）やpBluescriptII（Stratagene社製）等が挙げられる。また、バキュロウィルス発現カセットを含むpFastBac1、pFastBac HT A、pFastBac HT B、pFastBac HT C、pFastBac Dual、pBlueBacII (Invitrogen社製)、pAcSG2 (Pharmingen社製)等が挙げられる。
【０１００】
バクミドＤＮＡは、バキュロウィルスゲノムを含むＢＡＣ（bacterial artificial chromosome）からなる高分子量のＤＮＡであり、例えば大腸菌DH10BacTM に含まれるbMON14272 (136 kb) （Invitrogen社製）等が挙げられる。バクミドＤＮＡは、巨大プラスミドとして大腸菌細胞の中で自己複製し、バキュロウィルスプロモーターの制御下の外来遺伝子発現カセットを含んでいる。
【０１０１】
前記の群Ｂに示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドをバクテリオファージ由来のプロモーターに機能可能な形で連結してなる環状ポリヌクレオチドは、具体的には、例えば、バクテリオファージのＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに機能可能な形で連結されたワタアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を含む環状ポリヌクレオチドであり、例えば以下に示す方法に従い製造、取得することが可能である。
【０１０２】
上記方法に従ってクローニングされたワタアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子を含むプラスミドDNAを鋳型として、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子に特異的なプライマーとXhoI制限酵素サイトを付加したベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子に特異的なプライマーを用いて、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する。得られたＰＣＲ産物をXhoIで切断し、得られる約1.4kbpのワタアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、あらかじめEcoRV及びXhoIで処理したプラスミドベクターpET41b(+)（Novagen社製）とライゲーションする。こうして得られるプラスミドは、バクテリオファージのＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに機能可能な形で連結されたワタアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を含む環状ポリヌクレオチドの一例である。
【０１０３】
また、同様に前記群Ｂに示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチドをベクターに連結して環状ポリヌクレオチドを製造することができる。
【０１０４】
本発明において「複製開始点」とは、宿主細胞内で自らを複製するために必要とされる特定のＤＮＡ配列である。複製開始点の例として、細菌のプラスミドでは、colE1、f1、pUC等が挙げられる。
【０１０５】
形質転換体とは、外来のポリヌクレオチドが細胞に導入されることによって遺伝的に改変された真核生物細胞或いは原核生物細胞である。形質転換体としては、例えば、大腸菌での遺伝子クローニングや遺伝子発現に用いられるpET（Novagen社製）やpBluescriptII（Stratagene社製）等のプラスミドが導入されて形質転換された大腸菌細胞等が挙げられる。また、宿主細胞へのDNAの導入技術としては、トランスフォーメーション、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポーレーション等が挙げられる。
前記群Ｂに示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体とは、例えば、バクテリオファージのＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに機能可能な形で連結されたワタアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片が導入された形質転換大腸菌、が挙げられる。具体的には、以下の方法に従って作製することが可能である。
【０１０６】
前記の、ワタアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片がEcoRVサイト及びXhoIサイト間に挿入されたプラスミドベクターpET41b(+)（Novagen社製）は、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載される方法に従い大腸菌細胞に導入することによって形質転換体を作製することができる。また、前記の、バクテリオファージのＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとワタアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子を含む断片が挿入されたプラスミドDNAを用いて、大腸菌BL21(DE3)のコンピテントセル（Invitrogen社製）に付属される説明書に記載される方法に従い、大腸菌を形質転換することによって、形質転換体を得ることが可能である。
【０１０７】
前記の方法で作製された形質転換体を培養して、産生された昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼを回収することによってベシクルフュージングＡＴＰアーゼを製造することができる。
【０１０８】
例えば、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼは大腸菌発現系によって製造可能である。この発現系は、異種蛋白質の大量発現系として原核生物の発現系で最もよく使用される系である。大腸菌は遺伝的にまた生理学的にも最もよく解析された生物であり、取り扱いも容易で、多くの技術が適用可能である。また、生育が早く、安価な培地で生育するため、異種蛋白質の合成能力が極めて高い系である。
また、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼは、組換えバキュロウィルス/昆虫培養細胞Sf9発現系を用いることによっても製造することができる。この発現系は最も強力で用途の広い真核生物細胞を用いた蛋白質発現系の一つであり、かび、植物、細菌、ウイルス等多くの生物材料由来の外来遺伝子発現系である。
【０１０９】
また、形質転換体の培養によって産生された昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼは、超音波破砕やプレンチプレス、ダイノミル等の方法によって破砕され、細胞粗抽出液に含まれる形で回収し、イオン交換カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー等の、酵素精製に通常用いられる手法を用いて精製物を得ることができる。また、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼがHisタグ等のペプチド断片が結合した形で産生されるようにしておけば、細胞粗抽出液からHisタグを特異的に認識し結合するアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって迅速に精製物を得ることが可能である。このような方法によって、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼを製造することが可能である。
【０１１０】
他には、例えば、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼは組換えバキュロウィルス/昆虫培養細胞Sf9発現系を用いることによっても製造することができる。バキュロウィルスのポリヘドリンプロモーターに機能可能な形で連結されたワタアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片が導入された組み換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を培養し、さらには細胞をフレンチプレスで破砕し、カラムクロマトグラフィーを用いて精製することによって、昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼを製造することができる。
【０１１１】
より具体的には、例えば、前記の方法によって作製された、バクテリオファージのＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに機能可能な形で連結されたワタアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を含む組換え大腸菌を37℃、250rpmで一晩旋回培養する。翌朝、培養液を新しい培地で1/25に希釈し、37℃、250rpmで培養を続け、OD600が0.8になったところで、終濃度が10μMになるようにIPTGを添加する。さらに、25℃、60rpmで4日間培養後、培養液を7000rpmで10分間遠心分離することにより、大腸菌を回収する。回収された大腸菌にbreaking buffer(100mM Hepes/KOH pH 7.5, 500mM KCl, 5mM MgCl2, 2mM 2-メルカプトエタノール, 5mM ATP, 0.5mM, Pefablock, 10μg/μl Leupeptin, 1μM Pepstatin A)を添加してけん濁し、フレンチプレス（Thermo Spectronic社製）を用いて付属される説明書に記載される方法に従い、1300-1500 psiの圧力で大腸菌を破砕する。この破砕液を14,000rpm、2℃、60分間遠心分離し得られた上清を0.45μmのフィルターでろ過する。次に、HisバッファーＡの（20mM Hepes pH 7.0, 200mM KCl, 1mM MgCl2, 2mM 2-メルカプトエタノール, 0.5mM ATP, 10%グリセロール）で平衡化されたHiTrap Chelating HP (Amersham biosciences社製)又はHisTrap HP (Amersham biosciences社製)カラムにサンプルを注入した後、HisバッファーＡ85％とHisバッファーＢ（20mM Hepes pH 7.0, 200mM KCl, 1mM MgCl2, 2mM 2-メルカプトエタノール, 0.5mM ATP, 500mMイミダゾール, 10%グリセロール）15％の割合で混合したバッファーを、カラム体積の5倍量用いてカラムを洗浄する。次いで、HisバッファーＡ60％とHisバッファーＢ40%の割合で混合したバッファーを、カラム体積の15倍量用いてカラムを洗浄する。その後、HisバッファーＡ30％とHisバッファーＢ70％の割合で混合したバッファーを用意し、カラム体積の15倍量をカラムに注入する。この溶出画分を1mlずつに分画して保存し、一部をSDS-PAGEで解析して86KdaのベシクルフュージングＡＴＰアーゼが含まれる画分を特定する。それらの画分が目的のベシクルフュージングＡＴＰアーゼを多く含む溶液である。このベシクルフュージングＡＴＰアーゼを含む溶液を、GSTバッファーＡ（20mM Hepes pH 7.0, 200mM KCl, 1mM MgCl2, 2mM 2-メルカプトエタノール, 10%グリセロール）で平行化されたGSTrap FF(Amersham biosciences社製)カラムに注入し、次いでカラム体積の20倍量のGSTバッファーＡを注入して、カラムを洗浄する。最後に、カラム体積の30倍量のGSTバッファーＢ（50mM Tris-HCl, 10mM 還元型グルタチオン, 2mM 2-メルカプトエタノール, 10%グリセロール）を注入し、溶出される画分を回収する。この画分は、GSTバッファーＢに溶解した目的のベシクルフュージングＡＴＰアーゼを含んでいる。この画分の一部をSDS-PAGEで解析することにより、86KdaのベシクルフュージングＡＴＰアーゼを含んでいることを確認することができる。
【０１１２】
前記の群Ｂに示されるアミノ酸配列からなる昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼは、研究ツールとして使用することができる。例えば、前記の有害生物防除能力の検定や、有害生物防除能力を有する化学物質の探索、等の研究を実施するための研究ツールとして使用することができる。また、例えば、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼに作用する薬剤の作用機構を解析する研究においても、ベシクルフュージングＡＴＰアーゼは研究ツールとして利用可能である。
【０１１３】
また、前記の群Ｂに示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドやそれらに対して相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド、また前記の群Ｂに示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの部分塩基配列又はその部分塩基配列に対して相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号３又は４で示される塩基配列からなるポリペプチドは、研究ツールとして使用することができる。例えば、これらの一部は、前記のようにベシクルフュージングＡＴＰアーゼの製造法に用いられるポリヌクレオチドとして機能する。また一部は、前記のようにして、ＰＣＲを用いるポリヌクレオチド群Ｂに示されるポリヌクレオチドの取得、或いは、ハイブリダイゼーションを用いるポリヌクレオチド群Ｂに示されるポリヌクレオチドの取得、等を実施するための重要な研究ツールとして使用できる。
【０１１４】
特に、有害生物防除剤のスクリーニングを実施するにあたっては、スクリーニングのために実施する実験の実験ツールとして使用できる。具体的には、前記の有害生物防除能力の検定や、有害生物防除能力を有する化学物質の探索、等を実施するにあたって行う実験のための実験ツールとして使用することができる。
【０１１５】
さらに本発明は、被験物質について、当該被験物質が有する昆虫由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を変化させる能力に係るデータ情報を入力・蓄積・管理する手段（以下、手段ａと記すこともある。）、前記データ情報を所望の条件に基づき照会・検索する手段（以下、手段ｂと記すこともある。）、及び、照会・検索された結果を表示・出力する手段（以下、手段ｃと記すこともある。）を具備することを特徴とするシステム（以下、本発明システムと記すこともある。）をも含むものである。
【０１１６】
まず、手段ａについて説明する。手段ａは、前記のとおり、前記被験物質が有する昆虫由来のペプチジルジペプチダーゼＡの活性を変化させる能力に係るデータ情報を入力した後、入力された当該情報を蓄積・管理する手段である。かかる情報は、入力手段１により入力され、通常記憶手段２に記憶される。入力手段としては、例えばキーボード、マウス等の当該情報の入力可能なものが挙げられる。当該情報の入力及び蓄積・管理が完了すれば、次の手段ｂに進む。尚、当該情報の蓄積・管理には、コンピュータ等のハードウェアとＯＳ及びデータベース管理等のソフトウェアとを用いて、データ構造を有する情報を入力し、適当な記憶装置、例えば、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスク等のコンピュータ読取可能な記録媒体に蓄積することにより、大量のデータを効率良く蓄積し管理すればよい。
【０１１７】
手段ｂについて説明する。手段ｂは、前記のとおり、手段ａにより蓄積・管理された前記データ情報を所望の結果を得るための条件に基づき照会・検索する手段である。かかる情報は、入力手段１により照会・検索のための条件が入力され、通常記憶手段２に記憶された上記情報の中で当該条件に合致したものを選択すれば、次の手段ｃに進む。選択された結果は、通常、記憶手段２に記憶され、さらに表示・出力手段３により表示可能となっている。
【０１１８】
手段ｃについて説明する。手段ｃは、前記のとおり、照会・検索された結果を表示・出力する手段である。表示・出力手段３としては、例えばディスプレイ、プリンタ等が挙げられ、当該結果をコンピュータのディスプレイ装置に表示するか、印刷等により紙上に出力するか等すればよい。
【実施例】
【０１１９】
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１２０】
実施例１  （ワタアブラムシ及びチャバネゴキブリからの全ＲＮＡの抽出）
（１）ワタアブラムシからの全ＲＮＡの抽出
ポット植えのキュウリ葉上で飼育されたワタアブラムシ（Aphis gossypii）の成虫及び幼虫の混合した集団630mgを葉上から細筆又は小さなハケでかきとり、これを液体窒素中で乳鉢及び乳棒を用いて粉末状になるまで破砕した。凍結された破砕粉体からＲＮＡ抽出試薬ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いてＲＮＡを単離した。
【０１２１】
乳鉢中の凍結された破砕粉体に10mlのISOGENを加えた後、前記破砕粉体を10分間磨砕した。この時、乳鉢は氷上に置いた状態で操作した。磨砕後、液体状の試料をピペットにて15mlチューブに移し、これに2mlのクロロホルム（和光純薬工業社製）を加えた。直ちに当該混合物を15秒間激しく混和した後、これを室温で3分間静置した。次いで静置された混和物を4℃、15分間、12,000×ｇで遠心分離した後、上層の水相を5mlずつ2本の新しいチューブに移した。ぞれぞれのチューブにISOGENを5ml加え、直ちに当該混合物を15秒間激しく混和した後、これを室温で3分間静置した。次いで静置された混和物を4℃、15分間、12,000×ｇで再度遠心分離した後、上層の水相10mlをそれぞれ新しい50mlチューブに移した。続いて、ぞれぞれのチューブにイソプロパノール（和光純薬工業社製）を10ml加えた後、当該混合物を氷上で30分間静置した。静置された混合物を4℃、10分間、12,000×ｇで遠心分離することにより、ＲＮＡを沈殿させた。上清を除去した後、残渣に20mlの70％エタノールを加えた。得られた混合物を4℃、5分間、10,000×ｇで分離した。上清を除き、チューブの口を下にして3分間静置し、沈殿した全ＲＮＡを軽く乾燥させてから、当該沈殿を市販のRNase-free water（ナカライテスク社製）1mlに溶解させた。このようにして調製された全ＲＮＡの濃度（260 nmの吸光度から算出）は6.9mg/mlであった。
【０１２２】
（２）ゴキブリからの全ＲＮＡの抽出
人工飼育されたチャバネゴキブリ（Blattella germanica）を成虫、幼虫、卵鞘の３種類の試料として準備した。成虫としては雄10頭及び雌（卵鞘を取り除いた個体）10頭で1.1g、幼虫としては雄10頭及び雌10頭で1.0g、卵鞘としては26個で1.0gを用いた。３種類の試料を別々の乳鉢及び乳棒を用いて、液体窒素中で粉末状になるまで破砕した。凍結された破砕粉体からＲＮＡ抽出試薬ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いてＲＮＡを単離した。乳鉢中の凍結された破砕粉体に10mlのISOGENを加えた後、前記破砕粉体を10分間磨砕した。この時、乳鉢は氷上に置いた状態で操作した。磨砕後、液体状の試料をピペットにて15mlチューブに移し、さらに2mlのクロロホルム（和光純薬工業社製）を加えた。直ちに当該混合物を15秒間激しく混和した後、これを室温で3分間静置した。次いで静置された混和物を4℃、15分間、12,000×ｇで遠心分離した後、上層の水相を5mlずつ2本の新しいチューブに移した。ぞれぞれのチューブにISOGENを5ml加え、直ちに当該混合物を15秒間激しく混和した後、これを室温で3分間静置した。次いで静置された混和物を4℃、15分間、12,000×ｇで再度遠心分離した後、上層の水相10mlをそれぞれ新しい50mlチューブに移した。続いて、ぞれぞれのチューブにイソプロパノール（和光純薬工業社製）を10ml加えた後、当該混合物を氷上で30分間静置した。静置された混合物を4℃、10分間、12,000×ｇで遠心分離することにより、ＲＮＡを沈殿させた。上清を除去した後、残渣に20mlの70％エタノールを加えた。得られた混合物を4℃、5分間、10,000×ｇで遠心分離した。上清を除去した後、チューブの口を下にして3分間静置し、沈殿した全ＲＮＡを軽く乾燥させてから、当該沈殿を市販のRNase-free water（ナカライテスク社製）1mlに溶解させた。このようにして調製された全ＲＮＡの濃度（260 nmの吸光度から算出）は、成虫由来の全ＲＮＡの場合には1.1mg/ml、幼虫由来の全ＲＮＡの場合には2.5mg/ml、卵鞘由来の全ＲＮＡの場合には1.4mg/mlであった。
【０１２３】
実施例２  （ワタアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子の単離）
ワタアブラムシ全ＲＮＡからのcDNA第１鎖は、RT-PCR用のRandom Primers (Invitrogen社製)及びSuperscript III (Invitrogen社製)を用いて、当該試薬に付属される説明書に従って合成された。
【０１２４】
ワタアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼcDNA全長は、当該遺伝子配列に特異的なプライマーである配列番号３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとLa-Taq polymerase (タカラバイオ社製)とを用いてかつ前述のｃDNAを鋳型として、当該試薬に付属される説明書に従ってＰＣＲ増幅された。尚、ＰＣＲの条件は後述のようなタッチダウンＰＣＲとした。すなわち、最初に94℃、10分間、続いて94℃、20秒間、60℃から1サイクルにつき1℃の減少を伴い10サイクルで50℃まで変化させて、20秒間、72℃、2分間を10サイクルとし、さらに94℃、20秒間、50℃、20秒間、72℃、3分間を25サイクルとし、最後に72℃、7分間とした。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により分析・精製することにより、配列番号２に示される塩基配列からなる2421bpのＤＮＡ断片をpCR4-Topo vector (Invitrogen社製)にクローニングした。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列であった。
【０１２５】
実施例３  （ゴキブリのベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子の単離）
チャバネゴキブリ（Blatella germanica）等の他の昆虫種におけるベシクルフュージングＡＴＰアーゼ相同遺伝子を得るために、Codehop program（Fred Hutchinson Cancer Research Center が運営するBlocks Protein Analysis Server のウェブサイトから公的に利用可能  http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html）を利用してディジェネレートプライマーを設計する。この時、前述のワタアブラムシ由来のベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子配列及び既に公知であるキイロショウジョウバエ(NCBI accession number NM_080138)、タバコスズメガ(NCBI accession number AF118384)、コットンボールワーム(NCBI accession number AY220909)、ガンビエハマダラカ(NCBI accession number XM_307148)等の塩基配列を参考にする。
【０１２６】
選択された昆虫種におけるベシクルフュージングＡＴＰアーゼ相同遺伝子の部分配列は、当該昆虫種由来のcDNA第１鎖を鋳型とした一連のＰＣＲにより増幅する。ここで、鋳型とするcDNA第１鎖は、前述のSuperscript IIIを用いた方法により調製する。ＰＣＲには、フォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれのディジェネレートプライマーとAmplitaq Gold (Applied Biosystems社製)とを用いて、当該試薬に付属される説明書に従ってＰＣＲ増幅される。ＰＣＲの条件は後述のようなタッチダウンＰＣＲとする。すなわち、最初に94℃、10分間、続いて94℃、30秒間、60℃から1サイクルにつき1℃の減少を伴い10サイクルで50℃まで変化させて1分間、72℃、1分30秒間を10サイクルとし、さらに94℃、30秒間、50℃、1分間、72℃、1分30秒間を25サイクルとし、最後に72℃、7分間とする。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により分析・精製することにより、目的のＤＮＡ断片を取得する。さらにこのようにして取得されたＤＮＡ断片をpCR4-TOPO vector (Invitrogen社製)にクローニングした後、塩基配列を決定する。
【０１２７】
このようにして、チャバネゴキブリのベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子の部分配列を取得する。
【０１２８】
次に、得られた昆虫のベシクルフュージングＡＴＰアーゼ相同遺伝子の部分配列に対する特異的プライマーを設計し、当該遺伝子の全長配列を獲得するために、3' RACE PCR 又は5' RACE PCRを実施する。3’ 及び5’ RACE PCRは、昆虫の全ＲＮＡより調製されたcDNA第１鎖を鋳型としてかつSMART PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech社製)を用いて、当該キットに付属される説明書に従って実施する。
【０１２９】
3’ RACE及び5’ RACE反応には、SMART PCR cDNA Synthesis Kitに同梱されているuniversal primer mix (UPM)と、目的の遺伝子配列に特異的なフォワードプライマー又はリバースプライマーとをそれぞれ組み合わせて用いる。ＰＣＲの条件は後述のようなタッチダウンＰＣＲとする。すなわち、最初に94℃、10分間、続いて94℃、30秒間、60℃から1サイクルにつき1℃の減少を伴い10サイクルで50℃まで変化させて1分間、72℃、2分間を10サイクルとし、さらに94℃、30秒間、50℃、1分間、72℃、2分間を25サイクルとし、最後に72℃、7分間とする。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析・精製することにより、目的のＤＮＡ断片を取得する。さらにこのようにして取得されたＤＮＡ断片をpCR4-TOPO vector (Invitrogen社製)にクローニングした後、当該ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する。
【０１３０】
１回目のＰＣＲで明確な増幅産物が得られない場合には、１回目のＰＣＲ産物を鋳型としてnested PCRを行う。プライマーはSMART PCR cDNA Synthesis Kitに同梱されているNUP primerと、1回目のＰＣＲに用いた特異的プライマーよりも内側に設計された特異的フォワードプライマー及びリバースプライマーをそれぞれ組み合わせて用いる。ＰＣＲの条件は後述のようなタッチダウンＰＣＲとする。すなわち、最初に94℃、10分間、続いて94℃、30秒間、60℃から1サイクルにつき1℃の減少を伴い10サイクルで50℃まで変化させて30秒間、72℃、2分間を10サイクルとし、さらに94℃、30秒間、50℃、1分間、72℃、2分間を25サイクルとし、最後に72℃、7分間とする。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析・精製することにより、目的のＤＮＡ断片を取得した。さらにこのようにして取得されたＤＮＡ断片をpCR4-TOPO vector (Invitrogen社製)にクローニングした後、当該ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する。
【０１３１】
以上の配列決定により、昆虫のベシクルフュージングＡＴＰアーゼのN末端領域をコードする5'末端配列及びC末端領域をコードする3'末端配列を明らかにする。
【０１３２】
実施例４  （組み換えプラスミドの構築）
大腸菌発現用ベクターにクローニングするベシクルフュージングＡＴＰアーゼ遺伝子断片は、実施例２で取得されたワタアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼｃDNA全長を鋳型として、当該遺伝子配列に特異的なプライマーである配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び当該遺伝子配列に特異的なプライマーでありXhoI制限酵素サイトを付加した配列番号６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとPfuUltra High Fidelity polymerase (Stratagene社製)を用いて、当該試薬に付属される説明書に従ってＰＣＲ増幅された。ＰＣＲの条件は、最初に94℃、5分間、続いて94℃、20秒間、60℃、20秒間、72℃、2分間を40サイクルとし、最後に72℃、7分間とした。
得られたＰＣＲ産物を、Qiaquick PCR Purification Kit(Qiagen社製)を用いて当該キットに付属される説明書に従って精製し、精製後のＤＮＡ断片をXhoIで切断した。
ワタアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼのBlunt/XhoI ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分析し、単離・精製後、大腸菌発現用ベクターpET41b(+)（Novagen社製）のEcoRV/XhoIクローニングサイトにライゲーションした。以下、得られたベクターをpGAY008と名付けた。
組み換えベシクルフュージングＡＴＰアーゼタンパク質は2つのHisタグと1つのGSTタグが付加された形で翻訳されるため、769アミノ酸からなる組み換えタンパク質が得られることとなった。
Qiafilter Plasmid Maxiprepを用いて、Qiagen Plasmid Purification Handbookに記載される方法に従って、pGAY008を調製した。
【０１３３】
実施例５  （組み換え大腸菌の作製）
1ng/ulの濃度のpGAY008を1ul用いて、大腸菌BL21(DE3)のコンピテントセル（Invitrogen社製）を添付の説明書に従って形質転換した。50mg/Lのカナマイシン（Sigma社製）を含むLB寒天培地上で、37℃、一晩培養することにより、形質転換された大腸菌のコロニーを得た。
【０１３４】
実施例６  （大腸菌でのベシクルフュージングＡＴＰアーゼの発現）
pGAY008により形質転換された大腸菌BL21(DE3)を、50mg/Lのカナマイシン（Sigma社製）を含むLB培地（）にて、37℃、250rpmで一晩旋回培養した。翌朝、培養液を50mg/Lのカナマイシンを含むLB培地で1/25に希釈し、37℃、250rpmで培養を続け、OD600が0.8になったところで、終濃度が10μMになるようにIPTGを添加した。さらに、25℃、60rpmで4日間培養し、大腸菌内で組み換えベシクルフュージングＡＴＰアーゼタンパク質を生産させた。誘導および発現後、培養液を7000rpmで10分間遠心分離することにより、大腸菌を回収した。上清は廃棄し、回収した大腸菌は液体窒素により瞬間凍結後、使用時まで-80℃に保存した。
【０１３５】
実施例７  （ベシクルフュージングＡＴＰアーゼの精製）
ワタアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼを、N末端にGST（グルタチオンSトランスフェラーゼ）タグとHisタグを、C末端にもHisタグを付加した状態で、pET41(b+)中にクローニングした。ベシクルフュージングＡＴＰアーゼ組み換えタンパク質は、Hisタグを利用した1段階目の精製手順と、GSTタグを利用した2段階目の精製手順とにより精製した。
【０１３６】
（１）粗抽出液の調製
凍結保存しておいた誘導後の大腸菌BL21(DE3)を、30 ml のbreaking buffer(100mM Hepes/KOH pH 7.5, 500mM KCl, 5mM MgCl2, 2mM 2-メルカプトエタノール, 5mM ATP, 0.5mM, Pefablock, 10μg/μl Leupeptin, 1μM Pepstatin A)に再懸濁した後、当該細胞再懸濁液を試料として、フレンチプレス(Thermo Spectronic社製)を用いてbreaking buffer中で破砕した。大腸菌破砕のための圧力は1300-1500 psiであった。フレンチプレス処理後の大腸菌破砕液を14,000rpm、2℃、60分間遠心分離することにより、上清を回収し、次いで回収された上清に対して0.45μmフィルター処理を施した後、これを氷上で保存した。
【０１３７】
（２）Hisタグによる精製
HiTrap Chelating HP (Amersham biosciences社製)又はHisTrap HP (Amersham biosciences社製)カラムを用いて、当該カラムに付属される説明書に従って、金属アフィニティクロマトグラフィーにより1段階目の精製に組み換えタンパク質を供試した。大容量の精製には、Chelating Fast Flow Sepharose(Amersham biosciences社製)を充填したXK-16/20 column(Amersham biosciences社製)を用いた。尚、精製の各ステップではAEKTA-FPLC (Amersham biosciences社製)を使用した。
【０１３８】
HiTrap、HisTrap、 XK-16/20アフィニティーカラム（Amersham biosciences社製）を、当該カラムに付属される説明書に従って調製した。結合バッファーであるバッファーＡの組成は、20mM Hepes pH 7.0, 200mM KCl, 1mM MgCl2, 2mM 2-メルカプトエタノール, 0.5mM ATP, 10%グリセロールとした。溶出バッファーであるバッファーＢの組成は、20mM Hepes pH 7.0, 200mM KCl, 1mM MgCl2, 2mM 2-メルカプトエタノール, 0.5mM ATP, 500mMイミダゾール, 10%グリセロールとした。ワタアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼのHisタグによる精製は以下の手順で行った。
【０１３９】
(i)サンプルの注入
(ii)カラムの体積（CV）の5倍量の85%バッファーＡ/15%バッファーＢによる非結合サンプルの溶出
(iii)CVの15倍量の40%バッファーＢ(200mMイミダゾール)による洗浄
(iv)CV15倍量の70 %バッファーＢ(350mMイミダゾール)による精製タンパク質の溶出
(v)CVの5倍量の100 %バッファーＢ(500 mMイミダゾール)によるカラムの洗浄
【０１４０】
得られた30%バッファーＡ/70%バッファーＢの溶出画分を集め、GSTタグによる精製を開始するまで氷上で保存した。
【０１４１】
（３）GSTタグによる精製
GSTrap FF(Amersham biosciences社製)カラムを用いて、当該カラムに付属される説明書に従って、2段階目の精製に1段階目の精製で集めた溶出画分を供試した。精製の各ステップではAEKTA-FPLC (Amersham biosciences社製)を使用した。
結合バッファーであるバッファーＡの組成は、20mM Hepes pH 7.0, 200mM KCl, 1mM MgCl2, 2mM 2-メルカプトエタノール, 10%グリセロールとした。溶出バッファーであるバッファーＢの組成は、50mM Tris-HCl, 10mM 還元型グルタチオン, 2mM 2-メルカプトエタノール, 10%グリセロールとした。グルタチオンを添加後、KOHにてpH7.5に調整した。ワタアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼのGSTタグによる精製は以下の手順で行った。
【０１４２】
(i)サンプルの注入
(ii)CVの20倍量の100%バッファーＡによる非結合サンプルの溶出
(iii)CVの30倍量の100%バッファーＢによる精製タンパク質の溶出
【０１４３】
一般的なクマシー染色によるSDS-PAGE解析及びウエスタンブロット法により、得られた溶出画分を分析することにより、ワタアブラムシの組み換えベシクルフュージングＡＴＰアーゼタンパク質が存在することを確認した。発現させたベシクルフュージングＡＴＰアーゼタンパク質の分子量は86kDaであったので、電気泳動の際に最適な分解能を得るために8%ポリアクリルアミドゲルを用いた。
ポリアクリルアミドゲルのクマシー染色には、次の染色液と脱色液を用いた。染色液の組成は、1g/L クマシーブリリアントブルーR、50%(v/v)メタノール、12%(v/v)酢酸、38%(v/v)蒸留水とし、十分に混和後、ろ過により溶け残ったクマシーブリリアントブルーRを取り除いた。脱色液の組成は、25%(v/v)メタノール、10%(v/v)酢酸、65%(v/v)蒸留水とした。
ウエスタンブロット解析には、一次抗体としてanti - His(H15) sc-803 rabbit polyclonal IgG antibody (tebubio社製)を1/500に希釈して使用した。二次抗体としては、goat anti-rabbit-HRP (Pierce社製)を1/10000希釈して用いた。
【０１４４】
SDS-PAGE及びウエスタンブロットにより分析した後、目的の溶出画分を集めて、タンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度は、Pre-diluted Protein Assay Standards(Pierce社製)の Bovine Serum Albumin Fraction V Setをスタンダードとし、Bradford Bio-Rad protein assay(Bio-Rad社製)を用いて、ブラッドフォード法により測定した。手順は当該セットに付属された説明書に従った。次いで、集めた溶出画分を数本に分けて、直ちに液体窒素により瞬間凍結した後、-80℃で保存した。
【０１４５】
実施例８  （ベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を阻害する化合物の選抜）
ベシクルフュージングＡＴＰアーゼ活性を変化させる化合物の選抜は、実施例７で調製されたアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼを用いた試験管内反応系に、試験化合物を添加することによって変化するベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を測定し、評価する系で実施した。
【０１４６】
アブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性測定は、ＡＴＰを基質としたベシクルフュージングＡＴＰアーゼの酵素反応の後、Kinase-Glo（登録商標）Luminescent Kinase Assay（Promega社製）を用いて、当該キットに付属される取扱説明書に記載される方法に準じて消費されなかったＡＴＰ量をルシフェラーゼの発光量として測定し、この発光量からベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性を算出した。
【０１４７】
当該活性測定に、最終濃度が10μMとなるようにDMSOに溶解された試験化合物を含ませた時のアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性測定を実施した。また、試験化合物に代わりにDMSOを含ませた時のアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性測定を実施した。次いで試験化合物に代わりにDMSOを含ませた時のアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性測定値に対する、DMSOに溶解された試験化合物を含ませた時のアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性測定値の割合（％）を算出し、その算出値を100%から差し引いた値を阻害度（%）とした。各試験化合物における結果を、実施例９の結果と合わせて実施例９における表４に示した。
【０１４８】
また上記の活性測定に、最終濃度が各々、100μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μMとなるような濃度でDMSOに溶解された試験化合物を含ませた時のアブラムシのベシクルフュージングＡＴＰアーゼの活性測定を実施した。各試験化合物における各濃度での結果から濃度依存性試験解析ソフトXL fit（idbs社製）を用いてＩＣ５０（μM）を算出した。その結果を、実施例９の結果と合わせて実施例１０における表５に示した。
【０１４９】
実施例９  （殺虫活性試験）
下記の組成（表３）からなる滅菌済み人工飼料を調製した。次いで、最終濃度が50ppmとなるようにDMSOに溶解された試験化合物を当該人工飼料の0.5％容量添加・混合すること以外は、Handbook of Insect Rearing Vol.1 (Elsevier Science Publisers 1985) 35頁〜36頁に記載される方法と同様にしてワタアブラムシを飼育した。飼育６日後にワタアブラムシの生存数を調査し、次の式により防除価を求めることにより、有意な防除価（例えば、防除価が３０％以上）を示したものを殺虫活性有りとして判定した。
【０１５０】
防除価（％）＝｛１−（Ｃｂ×Ｔａｉ）／（Ｃａｉ×Ｔｂ）｝×１００
【０１５１】
尚、式中の文字は以下の意味を表す。
Ｃｂ：無処理区の処理前の虫の生存数
Ｃａｉ：無処理区の観察時の虫の生存数
Ｔｂ：処理区の処理前の虫の生存数
Ｔａｉ：処理区の観察時の虫の生存数
その結果を、実施例８の結果と合わせて、実施例９における表４に示した。
【０１５２】
【表３】
2008125378.tif 000005
【０１５３】
【表４】
2008125378.tif 000006
【０１５４】
実施例１０  （殺虫活性試験）
実施例９と同様にして殺虫活性試験を実施した結果を、実施例８の結果と合わせて、実施例１０における表５に示した。
【０１５５】
【表５】
2008125378.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【０１５６】
本発明により、標的を明確にした農薬の探索手法、即ち、昆虫や有害生物を制御しうる標的部位を化学的に調節することを目的として、特定の標的に対する活性で化合物をスクリーニングする方法等が提供可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【０１５７】
配列番号３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【配列表】
2008125378000001.app