(57)【要約】【課題】粘度の高い骨髄穿刺液を、短時間で簡便にかつ安全に濾過することを可能にする器具及び方法を得ることを課題とする。【解決手段】有底筒状容器からなる骨髄穿刺液収容具であって、一端に骨髄穿刺液を受け入れる開口を有し、開口と底の間に、骨髄穿刺液に含まれる目的細胞が通過可能で且つ骨片を保留可能なフィルターを有するフィルター部材が着脱可能に配置されたことを特徴とする骨髄穿刺液収容具及び該骨髄穿刺液収容具を用いる骨髄穿刺液濾過方法により、上記の課題を解決する。【選択図】図１
2008139106.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有底筒状容器からなる骨髄穿刺液収容具であって、
一端に骨髄穿刺液を受け入れる開口を有し、開口と底の間に、骨髄穿刺液に含まれる目的細胞が通過可能で且つ骨片を保留可能なフィルターを有するフィルター部材が着脱可能に配置されたことを特徴とする骨髄穿刺液収容具。
【請求項２】
フィルター部材が、両端に開口を有する筒状部材と、この筒状部材の第１の開口に設けられたフィルターとからなり、このフィルター部材は、フィルターが設けられた端部から有底筒状容器の開口に挿入することにより着脱可能に配置される請求項１に記載の骨髄穿刺液収容具。
【請求項３】
筒状部材の第２の開口の外径が有底筒状容器の開口の内径よりも大きくなるように、筒状部材の第２開口側に段差部が設けられており、
フィルター部材は、フィルターが設けられた端部から有底筒状容器の開口に挿入し、段差部を有底筒状容器の開口に掛けることにより着脱可能に配置される請求項２に記載の骨髄穿刺液収容具。
【請求項４】
有底筒状容器が、筒状部材の第２の開口及び／又は有底筒状容器の開口を封止する蓋を備える請求項２又は３に記載の骨髄穿刺液収容具。
【請求項５】
骨髄穿刺液収容具により得られた濾液が、フローサイトメトリを利用した細胞分析装置用の分析試料として用いられ、
フィルターが、細胞分析装置が備えている検出部の細胞が通過する細孔部の内径よりも小さい孔径又は保留粒子径を有する請求項１〜４の何れか１つに記載の骨髄穿刺液用収容具。
【請求項６】
前記フィルターの孔径又は保留粒子径が、３０μｍ以上１００μｍ以下である請求項１〜５の何れか１つに記載の骨髄穿刺液収容具。
【請求項７】
前記骨髄穿刺液の凝固を抑制する抗凝固剤を備える請求項１〜６の何れか１つに記載の骨髄穿刺液収容具。
【請求項８】
前記目的細胞が、骨髄系細胞、リンパ系細胞、赤芽球系細胞及び巨核球からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１〜７の何れか１つに記載の骨髄穿刺液収容具。
【請求項９】
一端に骨髄穿刺液を受け入れる開口を有し、開口と底の間に、骨髄穿刺液に含まれる目的細胞は通過可能で且つ骨片を保留可能なフィルターを有するフィルター部材が着脱可能に配置された有底筒状容器からなる骨髄穿刺液収容具の開口から骨髄穿刺液を入れる工程、及び
骨髄穿刺液収容具を遠心することにより、骨髄穿刺液をフィルターで濾過する工程を含む骨髄穿刺液濾過方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄穿刺液用収容具、及び該骨髄穿刺液用収容具を用いた骨髄穿刺液濾過方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄は、各種血球、特に骨髄系細胞を生成する造血器官である。末梢血液検査でいずれかの血球に何らかの異常が認められた場合、骨髄における造血の状態を観察することは、血液の異常の原因を判断する上で重要である。また、癌や悪性リンパ腫の骨髄転移が疑われる場合や疾患の治療経過のモニタリングをする場合にも、骨髄の細胞の状態を観察することが有用な検査方法となり得る。
【０００３】
骨髄における造血の状態を観察するためにはまず、一般に、骨髄に針を穿刺して骨髄穿刺液を採取することが行われる。
骨髄穿刺は、穿刺箇所に局所麻酔をした後、胸骨又は腸骨に穿刺針を穿刺し、注射器を接続して約０．２ｍＬ程度の骨髄液を採取することにより行われる。なお、これ以上の骨髄液を採取すると、末梢血など骨髄液以外の成分が混入するので、通常、一回の骨髄穿刺により、約０．２ｍＬ程度の骨髄穿刺液が得られる。
【０００４】
そして、得られた骨髄穿刺液から塗抹標本を作製し、顕微鏡で観察しながら有核細胞の計数や腫瘍細胞の存在の有無などについて分析される。しかしながら、骨髄穿刺液に含まれる細胞（骨髄系細胞、リンパ系細胞、赤芽球系細胞、巨核球など）の種類は多く、これら細胞の分類や計数を顕微鏡による目視検査で行うと、１検体につき３０分以上の時間が必要とされたり、また、多種の細胞を分類することができる検査技官の熟練した能力が必要とされる。そこで、近年、フローサイトメトリの原理を応用した全自動血球分類計数装置を用いて骨髄穿刺液の細胞の分類や計数を行う方法が検討されている。
【０００５】
しかし、骨髄穿刺液は、胸骨又は腸骨に直接針を穿刺して採取される検体であるので、骨片が混入していたり、穿刺時の血液凝固により形成される凝集塊が混入していることが多い。このような骨片や凝集塊を含む骨髄穿刺液をフローサイトメータに直接供することは、フローサイトメータのフローセルの損傷や詰まりなどの原因となるので、これらの骨片や凝集塊を除去するための処理が必要となる。
【０００６】
例えば、非特許文献１（Laboratory Hematology, 3: 146〜153）には、骨髄穿刺液をフローサイトメータ（CELL-DYN 4000）で測定する際に、骨髄穿刺液を１００ミクロンの孔径のフィルターを用いて濾過し、固形物を除去したことが記載されている。しかし、骨髄穿刺液は、末梢血と比較すると粘度が高い場合が多い。このような場合、フィルター上に単に放置しても骨髄穿刺液がフィルターを通過しにくく、濾過することは困難である。
【０００７】
つまり、骨髄穿刺液をフローサイトメータによる測定に供するために、短時間で安全かつ簡便に骨髄穿刺液を濾過することができる器具及び方法は、今まで存在していなかった。
【非特許文献１】G.d'Onofrio et.al, Laboratory Hematology,3:146〜153
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の現状に鑑み、本発明は、粘度の高い骨髄穿刺液を、短時間で簡便にかつ安全に濾過することを可能にする器具及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、有底筒状容器からなる骨髄穿刺液収容具であって、
一端に骨髄穿刺液を受け入れる開口を有し、開口と底の間に、骨髄穿刺液に含まれる目的細胞が通過可能で且つ骨片を保留可能なフィルターを有するフィルター部材が着脱可能に配置されたことを特徴とする骨髄穿刺液収容具を提供する。
【００１０】
また、本発明は、一端に骨髄穿刺液を受け入れる開口を有し、開口と底の間に、骨髄穿刺液に含まれる目的細胞は通過可能で且つ骨片を保留可能なフィルターを有するフィルター部材が着脱可能に配置された有底筒状容器からなる骨髄穿刺液収容具の開口から骨髄穿刺液を入れる工程、及び
骨髄穿刺液収容具を遠心することにより、骨髄穿刺液をフィルターで濾過する工程を含む骨髄穿刺液濾過方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の骨髄穿刺液収容具は、遠心機に設置して、遠心により骨髄穿刺液収容具内で骨髄穿刺液を濾過することが可能である。これにより、粘度の高い骨髄穿刺液であっても短時間、簡便にかつ安全に濾過することができる。
また、本願発明の骨髄穿刺液濾過方法は、従来、短時間、安全かつ簡便に濾過する手段がなかった骨髄穿刺液を、上記の骨髄穿刺液収容具を用いて遠心することにより短時間、安全かつ簡便に濾過することを可能とするものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において、「骨髄穿刺液」とは、被験者の胸骨又は腸骨の骨髄に骨髄穿刺針を穿刺することにより採取される骨髄液のことをいう。このように採取された骨髄穿刺液は、目的細胞だけでなく、骨片や細胞の凝集塊などの目的細胞よりもサイズが大きい物質を含む場合が多い。該骨髄穿刺液は、濾過工程に付されていないものであれば、骨髄液に通常添加される成分、例えば抗凝固剤、キレート剤、緩衝剤などを加えたものであってもよい。
【００１３】
本明細書において、「目的細胞」とは、本発明の骨髄穿刺液収容具を用いて濾過された濾液を用いて行う分析において、調査対象となる細胞である。具体的には、該目的細胞は、骨髄系細胞、リンパ系細胞、赤芽球系細胞及び巨核球からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。骨髄系細胞としては、例えば、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、好中級、好酸球、好塩基球などが挙げられる。リンパ系細胞としては、例えば、リンパ芽球、リンパ球などが挙げられる。赤芽球系細胞としては、例えば、前赤芽球、塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球などが挙げられる。
【００１４】
本発明の骨髄穿刺液収容具は、遠心により骨髄穿刺液を濾過して、骨髄穿刺液に含まれる、フローサイトメータによる測定において不要な骨片などを除くとともに、濾液が少なくとも目的細胞を含むこととなるようにする処理において用いられる。骨髄穿刺液収容具は、遠心機に設置可能なサイズや形状を有している。
【００１５】
骨髄穿刺液は、末梢血と比較して粘度が高い場合が多い。このような骨髄穿刺液は、自然濾過では濾過を行うのが困難であり、濾過に長時間を要する上に濾液の回収率が低くなる。それに対して、遠心濾過では、遠心力により骨髄穿刺液の濾過を行うので、短時間で、濾液の回収率も高い。
一般に、粘度が高い試料を濾過する方法としては、遠心濾過以外に減圧濾過や加圧濾過が知られている。しかしながら、減圧濾過や加圧濾過では、減圧機や加圧機による減圧や加圧を行うために濾過に使用する用具の構成が複雑になり、小型化が難しく、ゆえに骨髄穿刺液のような容量が非常に少ない試料の濾過を行うには不向きである。また、減圧濾過や加圧濾過では、容量が少ない試料については、手動でシリンジを動かすことにより減圧や加圧を行い、フィルターに試料を通過させて濾過する場合もあるが、このような方法では、減圧や加圧を行う際に、骨片や凝集塊によるフィルターの目詰まり等が原因で骨髄穿刺液が飛散する危険性があり、バイオハザードの点で問題がある。これに対して、遠心濾過では、比較的簡単な構成の濾過具により濾過を行うことができ、骨髄穿刺液のような容量が少ない試料にでも対応できるほど小型化が可能である。さらに、遠心を行う際に骨髄穿刺液が飛散する危険性が非常に低い。ゆえに、骨髄穿刺液の濾過を行う上で、遠心濾過は減圧濾過や加圧濾過と比べて非常に簡便で安全である。
【００１６】
このようにして得られる濾液は、濾液を用いて行う分析の障害となる骨片などの物質を含まずに目的細胞を含むこととなればよく、該濾液を用いて行う分析において調査対象とならない細胞などをも含んでいてもよい。また、本発明の骨髄穿刺液収容具を用いて除去される物質は、骨片だけでなく、目的細胞よりもサイズが大きい、骨片以外の物質であってもよい。このような物質としては、骨髄穿刺液に含まれる細胞が凝集した凝集塊などが挙げられる。
【００１７】
本発明の骨髄穿刺液収容具は有底筒状容器からなり、一端に骨髄穿刺液を受け入れる開口を有し、開口と底の間に、骨髄穿刺液に含まれる目的細胞が通過可能で且つ骨片を保留可能なフィルターを有するフィルター部材が着脱可能に配置されている。
【００１８】
上記のフィルター部材は、両端に開口を有する筒状部材を有することが好ましい。該筒状部材の第１の開口には、上記のフィルターが設けられていることが好ましい。このような形態とすることにより、該筒状部材の第２の開口から骨髄穿刺液を入れ、第１の開口に設けられたフィルターを通して骨髄穿刺液を濾過することができる。
【００１９】
また、筒状部材の第２の開口の外径が有底筒状容器の開口の内径よりも大きくなるように、筒状部材の第２開口側に段差部が設けられていることが好ましい。このような形態とすることにより、フィルター部材を有底筒状容器に挿入した際に、段差部を有底筒状容器の開口に掛けて、フィルター部材全体が有底筒状容器の内部に入り込んでしまうことを防ぐことができ、フィルター部材の着脱操作を行う上で有利である。
【００２０】
フィルター部材の大きさは、臨床現場において、分析に使用される骨髄穿刺液の容量を保持できる程度であれば、特に限定されない。臨床現場においては、通常、約０．２ｍＬ程度の骨髄穿刺液が採取される。また、採取された骨髄穿刺液は必要に応じて適当な希釈液により希釈される場合がある。これらのことから、骨髄穿刺液保持部の大きさとしては、具体的には、約２ｍＬ程度の液体を保持できる大きさが好ましく、約１ｍＬ程度の液体を保持できる大きさがより好ましく、約０．３〜０．５ｍＬ程度の液体を保持できる大きさが最も好ましい。採取された骨髄穿刺液をそのまま濾過する場合であっても希釈してから濾過する場合であっても、上記の範囲の容積を有するフィルター部材であれば、骨髄穿刺液を充分に保持できる。
【００２１】
上記のフィルターは、骨髄穿刺液中の骨片などの分析の障害となる物質を保留すると共に目的細胞を通過させる孔径又は保留粒子径を有する。該孔径又は保留粒子径は、３０μｍ以上１００μｍ以下が好ましい。フィルターの孔径又は保留粒子径をこのような範囲とすることにより、骨髄系細胞、リンパ系細胞、赤芽球系細胞及び巨核球などの目的細胞をフィルターに通過させることが可能であり、かつ骨片や凝集塊などの分析の障害となる物質をフィルターに保留して骨髄穿刺液から除くことができる。また、フィルターの孔径又は保留粒子径を１００μｍ以下とすることにより、一般的なフローサイトメトリを利用した細胞分析装置における検出部の細胞が通過する細孔部の内径よりも大きな物質を確実に骨髄穿刺液から除くことができるので、フローサイトメトリを利用した細胞分析装置を用いた分析において、検出部の細孔部の損傷や詰まりを生じさせることなく目的細胞を良好に分析することができる。本明細書において、「孔径」とは、フィルターの孔のうち最大の孔のことをいい、これは、例えばバブルポイント法により測定することができる。また、「保留粒子径」とは、フィルターを通過する粒子の直径の最大値のことをいい、これは、例えばＪＩＳ  ３８０１で規定される硫酸バリウムなどを自然濾過したしたときの漏洩粒子径の最大値により求めることができる。保留粒子径は、実質的にはフィルターの孔径に相当する。
【００２２】
該フィルターは、１種類だけではなく、材質の異なるもの、孔径又は保留粒子径の異なるものをいくつか組み合わせても良い。その場合、フィルターを構成するもののうち、最も小さな孔径又は保留粒子径のものが、そのフィルターの孔径又は保留粒子径となる。従って、複数のフィルターを組み合わせて用いる場合、その組み合わせのうち一つでも、上述したような孔径又は保留粒子径を有するフィルターであればよい。
【００２３】
該フィルターの材質としては、目的細胞を吸着しないものであれば特に限定されず、例えばナイロン、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）などが挙げられる。目的細胞の吸着がより少ない点で、ナイロンがより好ましい。
【００２４】
上記の有底筒状容器の大きさは、臨床現場において使用される容量の骨髄穿刺液を濾過して得られる濾液を収容する程度であれば、特に限定されない。具体的には、約２ｍＬ程度の液体を保持できる大きさが好ましく、約１ｍＬ程度の液体を保持できる大きさがより好ましく、約０．３〜０．５ｍＬ程度の液体を保持できる大きさが最も好ましい。採取された骨髄穿刺液をそのまま用いる場合であっても希釈して用いる場合であっても、上記の範囲の容積を有する有底筒状容器であれば、骨髄穿刺液を濾過して得られる濾液を充分に保持できる。
【００２５】
上記の有底筒状容器は、フィルター部材の筒状部材の第２の開口及び／又は有底筒状容器の開口を封止する蓋を有するものが好ましい。このような蓋を有することにより、濾過された濾液をそのまま、有底筒状容器内で保存することができる。さらに、例えば、筒状部材の第２の開口を封止する蓋を有する場合は、骨髄穿刺液収容具を当該蓋で密閉した状態で遠心を行うことが可能になる。有底筒状容器の開口を封止する蓋を有する場合は、遠心後にフィルター部材を外して濾液を骨髄穿刺液収容具内で保存することができる。フィルター部材の筒状部材の第２の開口及び有底筒状容器の開口を封止する蓋を有する場合は、骨髄穿刺液収容具を当該蓋で密閉した状態で遠心を行うことが可能であり、フィルター部材を付けた状態でも外した状態でも濾液を骨髄穿刺液収容具内で保存することができる。なお、筒状部材の第２の開口の内径と有底筒状容器の開口の内径とを同じにすることが、蓋を共有できるので有利である。
【００２６】
上記のフィルター部材は、上記のフィルターが設けられた端部から上記の有底筒状容器の開口に挿入することにより着脱可能に配置されることが好ましい。このような形態であることにより、フィルター部材のフィルターを通して濾過された濾液が、有底筒状容器内に収容されることとなる。
【００２７】
本発明の骨髄穿刺液収容具は、上記のフィルター上又は上記の有底筒状容器内に、骨髄穿刺液の凝固を抑制する抗凝固剤を有していてもよい。フィルター上に抗凝固剤を有する形態としては、固形の抗凝固剤をフィルター上に配置する形態が好ましい。有底筒状容器内に抗凝固剤を有する形態としては、有底筒状容器内であって、フィルター部材の挿入の支障とならない箇所に液体又は固体の抗凝固剤を配置する形態が好ましい。
【００２８】
上記の抗凝固剤は、当該分野において通常用いられる抗凝固剤を用いることができ、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム塩（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）、エチレンジアミン四酢酸２カリウム塩（ＥＤＴＡ−２Ｋ）及びエチレンジアミン四酢酸３カリウム塩（ＥＤＴＡ−３Ｋ）からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
【００２９】
本発明の別の観点は、上記の骨髄穿刺液収容具を用いて行う骨髄穿刺液濾過方法である。
本発明の方法においては、まず、上記の骨髄穿刺液収容具の開口から骨髄穿刺液を入れて保持させる。該骨髄穿刺液は、濾過の工程に付していないものであれば特に限定されず、骨髄穿刺により骨髄穿刺液を採取した後に抗凝固剤を添加したものであってもよい。また、骨髄穿刺液に通常添加できる成分、例えばキレート剤、緩衝剤などを加えたものでもよい。
【００３０】
次いで、骨髄穿刺液を保持した骨髄穿刺液収容具を遠心する。遠心は、当該技術において通常用いられる遠心分離機を用いて行うことができる。このような遠心分離機としては、例えば、遠心機ミニスピン（エッペンドルフ製）などが挙げられる。遠心の条件としては、目的細胞に損傷を与えない条件であれば特に限定されないが、通常、４℃〜室温程度の温度で３０〜３００×ｇ、５〜３０秒程度の条件が用いられる。
【００３１】
上記の遠心により、フィルター部材に保持された骨髄穿刺液はフィルターを通過して濾過され、濾過された濾液が有底筒状容器に収容されることとなる。また、フィルターの孔径又は保持粒子径よりも大きい骨片などの物質は、フィルターを通過することができないのでフィルター部材に残ることとなる。
【００３２】
上記の骨髄穿刺液収容具が、フィルター上に抗凝固剤を有する形態である場合、骨髄穿刺液をフィルター部材に入れたとき及び遠心の間に骨髄穿刺液が抗凝固剤と接触することとなり、抗凝固処理を行うことができる。骨髄穿刺液に抗凝固剤を添加することが必要な場合は、このような形態とすることにより、抗凝固処理に別途要する時間が不要となるので、好ましい。
【００３３】
次いで、有底筒状容器に収容された濾液を回収する。この際、フィルター部材は、そこに含まれる骨片などの不要な物質とともに、バイオハザードの規定を遵守した適切な処理を行って廃棄することができる。このように、上記の骨髄穿刺液収容具を用いた濾過方法によると、骨髄穿刺液に圧力などを加えることなく濾過して骨片などを除去することができるので、骨髄穿刺液を無理に濾過しようとして骨髄穿刺液が飛散する危険性を最小限にすることができ、バイオハザードの観点から有利である。
【００３４】
上記の骨髄穿刺液収容具が、有底筒状容器内に抗凝固剤を有する形態である場合、濾液が遠心により有底筒状容器内に収容されたときに骨髄穿刺液の濾液が抗凝固剤と接触することとなり、抗凝固処理を行うことができる。骨髄穿刺液の濾液に抗凝固剤を添加することが必要な場合は、このような形態とすることにより、抗凝固処理に要する時間が不要となるので、好ましい。
【００３５】
上記のようにして回収された濾液は、そのまま有底筒状容器内に収容した状態で、好ましくは蓋をして保存や輸送を行うことができる。
【００３６】
上記の濾過方法により回収された濾液を用いて、該濾液中に含まれる目的細胞の分析を行う細胞分析方法も、本発明の別の観点である。
目的細胞の分析は、当該技術において公知の分析であればよく、細胞形態観察、染色体検査、免疫学的検査、遺伝子検査、タンパク質分析などを行うことができる。上記の濾液は骨片などが除去されたものであるので、フローサイトメトリを利用した細胞分析装置を用いて行う分析に特に好適に用いることができる。
【００３７】
フローサイトメトリを利用した細胞分析装置としては、当該技術において通常用いられる装置であれば特に限定されない。ここで、フローサイトメトリを利用した細胞分析装置とは、検出部に細胞が通過するための細孔部が設けられており、この細孔部に細胞が通過する際に電気的情報又は光学的情報を検出して、それに基づいて細胞の分析を行う装置である。例えば、電気的情報を検出する装置であれば、細孔部に細胞が通過する際の電気抵抗を検出する電気抵抗方式の細胞分析装置が挙げられ、具体的には、ｐｏｃｈ−１００ｉ（シスメックス製）、ＸＥ−２１００（シスメックス製）などが挙げられる。また、光学的情報を検出する装置であれば、細孔部を有する光学セル（フローセル）を備えた細胞分析装置が挙げられ、具体的には、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンデッキンソン製）、ＥＰＩＣＳ  ＸＬ（ベックマンコールター製）、ＸＥ−２１００（シスメックス製）などが挙げられる。
【００３８】
上述したような細胞分析装置を用いる分析は、当該技術において公知である。具体的には、目的細胞を特異的に認識する標識抗体や目的細胞を特異的に染色する色素などを用いて目的細胞を染色し、染色された目的細胞を、フローセルを備えた細胞分析装置に供して光学的情報を取得し、得られた情報に基づいて目的細胞を検出、分類、計数などする分析が挙げられる。このような分析は、例えば、特開２００２−２２３７９１号、特開２００３−３２９６６８号、特開２００６−２７５９８５号などに記載される方法が挙げられるが、特にこれらには限定されない。
【００３９】
本発明の細胞分析方法においては、骨髄穿刺液収容具の多孔性のフィルターの孔径又は保留粒子径は、上記の細胞分析装置の検出部の細孔部の内径よりも小さい。フィルターの孔径又は保留粒子径をこのような大きさとすることにより、フローサイトメトリを利用した細胞分析装置を用いる分析において、検出部の細孔部を損傷することなく、目的細胞を良好に分析することができる。該フィルターの孔径又は保留粒子径は、より好ましくは、３０μｍ以上１００μｍ以下である。
【００４０】
以下、本発明の骨髄穿刺液収容具及び骨髄穿刺液濾過方法の好ましい実施形態を図面を用いて説明する。図面や以下の記述中で示す構成は，例示であって，本発明の範囲は，図面や以下の記述中で示すものに限定されない。
図１は、本発明の骨髄穿刺液収容具の一実施形態を横から見た図であり、（Ａ）：フィルター部材、及び（Ｂ）：有底筒状容器を示す。図２は、図１の骨髄穿刺液収容具について、フィルター部材を有底筒状容器に挿入したときの図である。図３は、（Ａ）：フィルターを有さない筒状部材、及び（Ｂ１）〜（Ｂ３）：（Ａ）のＩ−Ｉ断面図の例を示す。図４は、本発明の骨髄穿刺液収容具の一実施形態の斜視図であり、（Ａ）：フィルター部材、及び（Ｂ）：有底筒状容器を示す。
【００４１】
本発明の骨髄穿刺液収容具２０は、骨髄穿刺液を受け入れて一時的に保持する骨髄穿刺液保持部１と保持された骨髄穿刺液を濾過する多孔性のフィルター２とを有するフィルター部材３と、該骨髄穿刺液が濾過された濾液を収容する濾液収容容器４とを備える。本実施形態において、上記の骨髄穿刺液濾過部材は、両端に開口５及び６を有する筒状部材７を有する。筒状部材７の開口５及び６は、図３の断面図及び図４の斜視図に示すような円形であることが好ましい。
【００４２】
上記のフィルター２は、該筒状部材７の一方の開口６に取り付けられている。
フィルター部材３の筒状部材７の開口６は、図３（Ｂ）に示すように、フィルター２を保持できるようにその一部分にフィルター支持部１４を有することが好ましい。フィルター支持部１４の形状は、骨髄穿刺液の濾過に影響を及ぼさずにフィルターを支持できるものであれば特に限定されず、図３（Ｂ１）に示すような線状、（Ｂ２）に示すような網目状、（Ｂ３）に示すような線状と円形状を組み合わせたものなどのいずれであってもよい。
フィルター２は、上記の開口６に例えば適切な接着剤などを用いて接着させることができる。なお、これらの図面においてはフィルター２をわかりやすく図示するために厚みを持たせて記載するが、実際は、３０〜２００μｍ程度の厚みを有するフィルターを好適に用いることができる。
【００４３】
本実施形態において、上記の濾液収容容器４は、一端に開口８を有する有底筒状部材９からなる。上記の筒状部材７は、図２に示すように、フィルター２の側から有底筒状部材内に挿入される。図１に示すように、筒状部材７の開口５の内径を開口６の内径よりも大きくすることにより、段差部１０を設けることができ、図２に示すように該筒状部材７を上記の有底筒状部材９に挿入したときに、段差部１０を有底筒状部材９の開口８に掛けて、筒状部材７全体が有底筒状部材９の内部に入り込んでしまうことを防ぐことができ、フィルター部材の着脱操作を行う上で有利である。
【００４４】
図１に示すように、濾液収容容器４の底部１１の内径を開口８の内径よりも小さくすることにより、フィルター２を通過して濾過された濾液を例えばマイクロピペットなどにより回収しやすい容器の形状とすることができるので好ましい。また、このような形状とすることにより、当該技術において用いられる遠心分離機のローターの形状にあう骨髄穿刺液収容具とすることができる。なお、底部１１は、図面において平底として記載しているが、丸底であってもよい。
濾液収容容器４は、好ましくはフィルター部材の筒状部材の第２の開口及び有底筒状容器の開口を封止する蓋部１２を有することにより、濾液を濾液収容容器４内で保存したり輸送したりすることができる。
【００４５】
本発明の骨髄穿刺液収容具は、フィルター２上又は濾液収容容器４内に抗凝固剤を有することが好ましい。図１では、フィルター２上に固体の抗凝固剤１３を有する形態を示すが、濾液収容容器４の内部、特に底の部分に固体又は液体の抗凝固剤を有することもできる。
【００４６】
本発明の骨髄穿刺液濾過方法においては、骨髄穿刺液保持部１に骨髄穿刺液を入れる。このとき、フィルター部材３は、濾液収容容器４に挿入していてもよいし、挿入していなくてもよい。該骨髄穿刺液は、目的細胞と目的細胞よりもサイズが大きい骨片とを少なくとも含む。該骨髄穿刺液は、通常、約０．２ｍＬ程度採取されるものである。
【００４７】
次いで、フィルター部材３を挿入した濾液収容容器４からなる骨髄穿刺液収容具を、適切な遠心分離機のローターに挿入して、遠心する。遠心は、例えば１５０×ｇで約５〜２０秒程度行うことができる。この遠心により、骨髄穿刺液保持部１に保持された骨髄穿刺液がフィルターを通過して濾過され、得られる濾液が濾液収容容器４に収容される。
【００４８】
遠心の後に、骨髄穿刺液収容具を遠心分離機から取り出し、フィルター部材３を取り出す。このフィルター部材は、フィルター２を通過しなかった骨片を有しているので、フィルター部材３ごと、バイオハザードの観点から適切な処理、例えばオートクレーブなどを行って廃棄することができる。
一方、濾液収容容器４に収容された濾液は、濾液収容容器４に収容したまま保存や輸送してもよいし、濾液収容容器４から例えばマイクロピペットなどにより取り出して、濾液中に含まれる目的細胞の分析に供することもできる。
【実施例１】
【００４９】
本例では、孔径３０μｍのフィルターを装着した骨髄穿刺液収容具で骨髄穿刺液を濾過し、得られた濾液をフローサイトメータで測定して骨髄芽球を検出した。
【００５０】
骨髄穿刺液にＥＤＴＡ−２Ｋを１．２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように添加した。この骨髄穿刺液２００μＬを、孔径３０μｍのナイロンネットフィルター（ミリポア製）を装着した骨髄穿刺液収容具を用いて、遠心機ミニスピン（エッペンドルフ製）において３００×ｇ、１０秒で濾過した。得られた濾液５μＬに、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ標識抗体（ベクトンデッキンソン製）１０μＬ、ＣＤ１３−ＰＥ標識抗体（ベクトンデッキンソン製）１０μＬ及びＣＤ４５−ＰｒｅＣＰ標識抗体（ベクトンデッキンソン製）１０μＬを添加し、３０分間暗所で反応させた。反応後の混合液に、１０倍希釈したＦＡＣＳ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ベクトンデッキンソン製）２ｍＬを添加し、５分間反応させた後、３００×ｇで５分間遠心して、ペレットを壊さないように上清を除去した。このペレットをＰＢＳ１ｍＬに浮遊させて、これをＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンデッキンソン製）で測定して細胞を分析した。
【００５１】
結果を図５に示した。図５のＡは、縦軸に側方散乱光強度を、横軸にＣＤ４５−ＰｒｅＣＰ標識抗体の蛍光強度をとった場合のスキャッタグラムである。図５のＢは、図５ＡのＣＤ４５弱陽性の領域（領域Ａ）に出現した細胞について作成されたスキャッタグラムであり、縦軸がＣＤ３４−ＦＩＴＣ標識抗体の蛍光強度、横軸がＣＤ１３−ＰＥ標識抗体の蛍光強度である。骨髄芽球は、ＣＤ４５弱陽性、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１３陽性の細胞である。そして、ＣＤ４５弱陽性の細胞について作成された図５ＢのＣＤ３４陽性及びＣＤ１３陽性の領域である領域Ｂにおいて骨髄芽球の出現が見られた。このことから、孔径３０μｍのフィルターを装着した骨髄穿刺液収容具を用いて得られた骨髄穿刺液の濾液を用いて、骨髄芽球の評価を実施することが可能であることがわかった。
【実施例２】
【００５２】
本例では、孔径３０μｍのフィルターを装着し、フィルター上に抗凝固剤を備えた骨髄穿刺液収容具で骨髄穿刺液をろ過し、得られた濾液をフローサイトメータで測定して赤芽球を検出した。
【００５３】
孔径３０μｍのナイロンネットフィルター（ミリポア製）を装着し、フィルター上に抗凝固剤であるＥＤＴＡ−２Ｋ  ０．２４ｍｇを備えた骨髄穿刺液収容具を用いて、遠心機ミニスピン（エッペンドルフ製）において３００×ｇ、１０秒で骨髄穿刺液２００μＬを濾過した。得られた濾液を、Tomohiro Tsujiらの文献（"New rapid flow cytometric method for the enumeration of nucleated red blood cells"、Cytometry、Volume 37、 Issue 4、Pages 247〜326、1999） に記載されている方法に従って、ＣＤ４５ＦＩＴＣ標識抗体及び核酸蛍光色素（ヨウ化プロピジウム（ＰＩ））を用いて処理し、これをＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンデッキンソン製）で測定して、細胞を分析した。
【００５４】
結果を図６に示した。図６は、縦軸にＰＩの蛍光強度を、横軸にＣＤ４５ＦＩＴＣ標識抗体の蛍光強度をとった場合のスキャッタグラムである。赤芽球は、ＣＤ４５陰性の細胞であり、且つ、核を有するためにＰＩ陽性となる。さらに、骨髄系細胞及びリンパ系細胞は、ＣＤ４５陽性の細胞である。そして、図６のＣＤ４５陰性でＰＩ陽性の領域である領域Ｃにおいて赤芽球の出現が見られた。さらに、ＣＤ４５陽性の領域である領域Ｄにおいて骨髄系細胞及びリンパ系細胞の出現が見られた。このことから、孔径３０μｍのフィルターを装着した骨髄穿刺液収容具を用いて得られた骨髄穿刺液の濾液を用いて、赤芽球や骨髄系細胞及びリンパ系細胞骨髄芽球の評価を実施することが可能であることがわかった。
【実施例３】
【００５５】
本例では、孔径１００μｍのフィルターを装着し、フィルター上に抗凝固剤を備えた骨髄穿刺液収容具で骨髄穿刺液をろ過し、得られた濾液をフローサイトメータで測定して巨核球を検出した。
【００５６】
孔径１００μｍのナイロンネットフィルター（ミリポア製）を装着し、フィルター上に抗凝固剤であるＥＤＴＡ−２Ｋ  ０．２４ｍｇを備えた骨髄穿刺液収容具を用いて、遠心機ミニスピン（エッペンドルフ製）において３００×ｇ、１０秒で骨髄穿刺液２００μＬを濾過した。得られた濾液５０μＬに、ＣＤ４１a−ＦＩＴＣ標識抗体（ベクトンデッキンソン製）１０μＬ及びＣＤ６１−ＦＩＴＣ標識抗体（ベクトンデッキンソン製）１０μＬを添加し、１５分間暗所で反応させた。反応後の混合液に、１ｍＬのリン酸緩衝液生理食塩水（和光純薬製）を加えて細胞を洗浄した後、３００×ｇで５分間遠心して、ペレットを壊さないように上清を除去した。このペレットに２％パラフォルムアルデヒド溶液２５μＬを添加し、１５分間暗所で反応させて細胞を固定した。この反応後の混合液に、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液５μＬを添加して１分間反応させた後、５０μｇ／ｍＬ  ヨウ化プロピジウム溶液１ｍＬを加えて１分間反応させて核酸染色処理を行った。この反応後の混合液に、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液を溶血が完了するまで徐々に加えた。得られた試料をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンデッキンソン製）で測定して細胞を分析した。
【００５７】
結果を図７に示した。図７のＡは、縦軸にＣＤ４１a−ＦＩＴＣ標識抗体＋ＣＤ６１−ＦＩＴＣ標識抗体の蛍光強度を、横軸にＰＩの蛍光強度をとった場合のスキャッタグラムである。図７のＢは、図７ＡのＣＤ４１a＋ＣＤ６１陽性でＰＩ陽性の領域（領域Ｅ）に出現した細胞について作成された図であり、縦軸がカウント数で横軸がＰＩの蛍光強度である。巨核球は、ＣＤ４１a＋ＣＤ６１陽性の細胞であり、且つ、核を有するためにＰＩ陽性となる。そして、図７ＡのＣＤ４１a＋ＣＤ６１陽性でＰＩ陽性の領域である領域Ｅにおいて巨核球の出現が見られた。また、巨核球は細胞質分裂を伴わないで染色体数が増加するため、８倍体（８Ｎ）、１６Ｎ、３２Ｎ、６４Ｎといった巨核球が生じる。図７Ｂにおいて、領域Ｅに出現した細胞が、巨核球特有の倍数体 （８Ｎ、１６Ｎ、３２Ｎ、６４Ｎ）となっている様子が確認できた。これらのことから、孔径１００μｍのフィルターを装着した骨髄穿刺液収容具を用いて得られた骨髄穿刺液の濾液を用いて、巨核球の評価を実施することが可能であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の骨髄穿刺液収容具の一実施形態を横から見た図である。
【図２】本発明の骨髄穿刺液収容具のフィルター部材を、濾液収容容器に挿入したときの図である。
【図３】（Ａ）：フィルターを有さない筒状部材を横から見た図である。（Ｂ１）〜（Ｂ３）：（Ａ）のＩ−Ｉ断面図である。
【図４】本発明の骨髄穿刺液収容具の一実施形態の斜視図である。
【図５】本発明の骨髄穿刺液収容具を用いて濾過した骨髄穿刺液をフローサイトメータで測定したときのスキャッタグラムである。
【図６】本発明の骨髄穿刺液収容具を用いて濾過した骨髄穿刺液をフローサイトメータで測定したときのスキャッタグラムである。
【図７】本発明の骨髄穿刺液収容具を用いて濾過した骨髄穿刺液をフローサイトメータで測定したときのスキャッタグラムである。
【符号の説明】
【００５９】
１    骨髄穿刺液保持部
２    フィルター
３    フィルター部材
４    濾液収容容器
５    開口
６    開口
７    筒状部材
８    開口
９    有底筒状部材
１０  段差部
１１  底部
１２  蓋部
１３  抗凝固剤
１４  フィルター支持部
２０  骨髄穿刺液収容具
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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