(57)【要約】【課題】プラス荷電を有するタンパク質又は化合物の非特異吸着を抑制したバイオセンサー基板を提供すること。【解決手段】ｐＫａ（酸解離定数）が９以下である解離性基を有しない親水性高分子で修飾された基板から成るバイオセンサー基板において、該親水性高分子に、タグ分子とＫｄ（結合定数）が１０-12Ｍ以下の結合を形成するリガンドが固定されている、上記のバイオセンサー基板。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＫａ（酸解離定数）が９以下である解離性基を有しない親水性高分子で修飾された基板から成るバイオセンサー基板において、該親水性高分子に、タグ分子とＫｄ（結合定数）が１０-12Ｍ以下の結合を形成するリガンドが固定されている、上記のバイオセンサー基板。
【請求項２】
タグ分子がビオチンであり、リガンドがビオチン結合蛋白質である、請求項１に記載のバイオセンサー基板。
【請求項３】
ビオチン結合蛋白質がアビジン類である、請求項２に記載のバイオセンサー基板。
【請求項４】
親水性高分子が、ビニルスルホン基又はその前駆体、ジクロロトリアジン基、又はアセトアセチル基から選ばれる少なくとも１種の反応性基を含有する親水性高分子であり、リガンドが該反応性基を介して親水性高分子に固定されている、請求項１から３の何れかに記載のバイオセンサー基板。
【請求項５】
非電気化学的検出に使用される、請求項１から４の何れかに記載のバイオセンサー基板。
【請求項６】
光学的検出に使用される、請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサー基板。
【請求項７】
表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項１から６の何れかに記載のバイオセンサー基板。
【請求項８】
タグ分子で修飾された生理活性物質が該リガンドに結合している、請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサー基板。
【請求項９】
タグ分子で修飾された生理活性物質が該リガンドに結合している請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサー基板と、被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
【請求項１０】
生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜８に記載のバイオセンサー基板を含む、バイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサー基板及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。特に本発明は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに用いるためのバイオセンサー基板及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
特許第３０７１８２３号には、バイオセンサー表面にアビジンを介してビオチン化蛋白を固定することが記載されている。また、特許第２８１５１２０号には、金基板に自己組織化膜（ＳＡＭ）を介してデキストランを結合させ、さらにブロモ酢酸を繰り返し反応させることで、デキストランにカルボキシル基を導入することが記載されている。この蛋白固定化膜は、３次元マトリクスを形成しているので、多量の蛋白を固定化できるメリットを有している。しかしながら、解離性基であるカルボキシル基を多く含有しており、通常のブロッキング処理を行っても、一定量のカルボキシル基が残存する。一般に、アビジンを介してビオチン化蛋白を固定化する場合、さらに、そのビオチン化蛋白質に対するアナライトの結合測定を行う場合は、その固定化膜のカルボキシル基は解離して、基板表面はマイナス荷電を有することになる。そのため、特にプラス荷電を有するビオチン化蛋白、アナライトそのもの、あるいは種々の夾雑物が基板に非特異吸着を起し、正確な結合測定に支障をきたすことがあった。
【０００６】
【特許文献１】特許第３０７１８２３号
【特許文献２】特許第２８１５１２０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、プラス荷電を有するタンパク質又は化合物の非特異吸着を抑制したバイオセンサー基板を提供することを解決すべき課題とした。特に本発明は、マイナスのベースライン変動が小さく、低分子検体の結合検出が可能であるバイオセンサー基板を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ｐＫａ（酸解離定数）が９以下である解離性基を有しない親水性高分子で修飾された基板において、該親水性高分子に、タグ分子とＫｄ（結合定数）が１０-12Ｍ以下の結合を形成するリガンドを固定することによって、生理活性物質を固定化し得るバイオセンサー基板を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、ｐＫａ（酸解離定数）が９以下である解離性基を有しない親水性高分子で修飾された基板から成るバイオセンサー基板において、該親水性高分子に、タグ分子とＫｄ（結合定数）が１０-12Ｍ以下の結合を形成するリガンドが固定されている、上記のバイオセンサー基板が提供される。
【００１０】
好ましくは、タグ分子はビオチンであり、リガンドはビオチン結合蛋白質である。
好ましくは、ビオチン結合蛋白質はアビジン類である。
【００１１】
好ましくは、親水性高分子は、ビニルスルホン基又はその前駆体、ジクロロトリアジン基、又はアセトアセチル基から選ばれる少なくとも１種の反応性基を含有する親水性高分子であり、リガンドは該反応性基を介して親水性高分子に固定されている。
【００１２】
好ましくは、本発明のバイオセンサー基板は、非電気化学的検出に使用され、さらに好ましくは光学的検出に使用され、特に好ましくは表面プラズモン共鳴分析に使用される。
【００１３】
本発明の別の側面によれば、タグ分子で修飾された生理活性物質が該リガンドに結合している、上記した本発明のバイオセンサー基板が提供される。
【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、タグ分子で修飾された生理活性物質が該リガンドに結合している上記した本発明のバイオセンサー基板と、被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
【００１５】
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定し、さらに好ましくは生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のバイオセンサー基板は、ｐＫａが９以下の解離性基を含有しないので、中性以下のバッファーでは荷電が発生せず、種々のタンパク質や化合物の非特異吸着が抑制される。特に本発明のバイオセンサー基板によれば、マイナスのベースライン変動が小さく、低分子検体の結合検出が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明のバイオセンサー基板は、ｐＫａ（酸解離定数）が９以下である解離性基を有しない親水性高分子で修飾された基板から成り、該親水性高分子に、タグ分子とＫｄ（結合定数）が１０-12Ｍ以下の結合を形成するリガンドが固定されていることを特徴とする。
【００１８】
本発明で用いる、ｐＫａ（酸解離定数）が９以下である解離性基を有しない親水性高分子の一例としては、ハロゲン化銀写真用の高分子硬膜剤を用いることができる。以下、本発明で用いることができる高分子硬膜剤について説明する。高分子硬膜剤とは、ゼラチン等の親水性コロイドと結合反応する反応性官能基を分子内に複数有している高分子化合物であり、特開昭５６−６６８４１号公報３頁８段落９行〜６頁１９段落４行、特開平７−６４２２６号公報〔００７０〕〜〔００９４〕，特開平７−１４０５９６号公報〔００６４〕〜〔００９９〕， 特開平１０−１１１５４５号公報〔００３９〕〜〔００４６〕， 特開２００４−２０９１９号公報〔０１３５〕〜〔０１５４〕、英国特許１，３２２，９７１号公報、米国特許３，６７１，２５６号公報等の特許文献、及びジェームズ著ザ・セオリー・オブ・ザ・フォトグラフィック・プロセス（Ｊａｍｅｓ， Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）第４版、８４頁（１９７７、マクミラン社）、キャンプベル他著ポリメリック・アミン・アンド・アンモニウム・ソルツ（Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｔａｌ；Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ａｍｉｎｅ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓａｌｔｓ）３２１〜３３２頁（１９７９、パーガモンプレス社）などの成書に記載されている。
【００１９】
本発明に用いられる高分子硬膜剤は、バイオセンサー表面の官能基と結合可能な反応性官能基を有する高分子化合物であり、好ましくは下記の式（１）〜式（９）で表される反応性官能基を有する高分子化合物である。
式（１）：  −ＳＯ2ＣＨ＝ＣＨ2 
式（２）：  −ＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2Ｘ
式（２）中、Ｘは、式（２）で表される官能基が求核試薬あるいは塩基と反応する際、置換反応あるいは脱離反応によって離脱する基（例えば、−Ｃｌ、−ＯＳＯ2ＣＨ3、−ＯＳＯ2Ｃ6Ｈ4ＣＨ3、−ＯＣＯＣＨ3、ピリジニウム等）である。
式（３）
【００２０】
【化１】
2008076378.tif 000002
【００２１】
式（３）中、Ｘは単結合、−Ｏ−、−ＮＲ−を表し、Ｒは水素原子、アルキル基、アラルキル基を表す。Ｙ、Ｚはハロゲン原子（例えば塩素原子、臭素原子）、アルコキシ基（例えばメトキシ）、水酸基及びその塩、置換されていてもよいアミノ基を表し、Ｙ，Ｚの少なくとも１つはハロゲン原子である。
【００２２】
式（４）：  −ＣＨＯ
式（５）：
【００２３】
【化２】
2008076378.tif 000003
【００２４】
式（６）：  −ＮＣＯ
式（７）：  −ＮＨＣＯＮＨＣＯＣＨ＝ＣＨ2 
式（８）：  −ＮＨＣＯＮＨＣＯＣＨ2ＣＨ2Ｘ
式中、Ｘは式（２）のＸと同義である。
式（９）：  −ＣＯＸ
式中、Ｘは、式（９）で表される官能基がアミノ基と反応した際に容易に脱離する基（例えば、
【００２５】
【化３】
2008076378.tif 000004
【００２６】
であり、式（９）は一般的に活性エステル基あるいは混合酸無水物として知られているものを表す。
【００２７】
本発明に用いられる高分子硬膜剤を製造するに当たり、重合方法については特に制約はないが、例えば縮重合法によって製造されていてもよく、またエチレン性不飽和結合を有する化合物を用いてラジカル重合、アニオン重合等の方法によって製造されていてもよい。さらには天然高分子（例えば、デンプン、デキストラン、ゼラチン等）に前記の反応性官能基を導入することによって製造されていてもよい。本発明に用いられる親水性コロイドと反応可能な官能基（上記式（１）〜式（９）で表される官能基、以後反応性官能基と称する）の導入方法についても特に制約はなく、反応性官能基を有するモノマーを用いて重合反応を行って重合体を製造してもよいし、予め重合体を製造した後にいわゆる高分子反応により、前記の反応性官能基を導入してもよい。さらには反応性官能基の前駆体を有するモノマー化合物を用いて重合反応を行い、その後に適切な方法によって反応性官能基を生成させる方法も有効である。
【００２８】
本発明に用いられる高分子硬膜剤は、前記の反応性官能基（またはその前駆体）とエチレン性不飽和結合を同一分子内に有するモノマーをラジカル重合することによって製造されても良い。反応性官能基を持つモノマーとしては以下に示す化合物が代表的な例である。
【００２９】
【化４】
2008076378.tif 000005
【００３０】
【化５】
2008076378.tif 000006
【００３１】
【化６】
2008076378.tif 000007
【００３２】
本発明に用いられる重合体は反応性官能基を持つモノマーの単独重合体であってもよく、また他の１種あるいは２種以上のモノマーとの共重合体であってもよい。共重合体の場合、反応性官能基を持つモノマーの割合は１質量％以上であり、５質量％以上が好ましい。ラジカル共重合をする場合、他のモノマーはラジカル重合が可能であれば特に制限はないが、以下のモノマーを具体例として挙げることができる。また、他のモノマーが反応可能な官能基を有する場合、前記式（１）〜（９）で表される官能基と共重合時に反応を起こさない範囲内で、適宜モノマーの組合わせを選択することが好ましい。
【００３３】
アクリル酸、メタクリル酸のエステル類：例えば、メチルアクリレート、ブチルアクリレート、ベンジルアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＲ（Ｒは、水素原子、アルキル基、ｎは１以上の整数）、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ベンジルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、２−メトキシエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、２−スルホエチルメタクリレート等、
エチレン性不飽和カルボン酸のアミド類：アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド等、
芳香族単量体：スチレン、ビニルトルエン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ビニルナフタレン等、
その他のビニル単量体：エチレン、プロピレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、トリフロロエチレン、トリフロロクロロエチレン、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ビニルアルコール、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルアセトアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等。
【００３４】
以下に本発明に用いられる高分子硬膜剤の具体例を示すが、本発明がこれらに限定されるものではない。それぞれの化合物の共重合比率は質量百分率比を表す。
【００３５】
Ｐ−１：Ｍ−１／メチルメタクリレート共重合体（２０／８０）
Ｐ−２：Ｍ−２／２−ヒドロキシエチルメタクリレート共重合体（２０／８０）
Ｐ−３：Ｍ−３／ブチルアクリレート共重合体（６０／４０）
Ｐ−４：Ｍ−６／エチルアクリレート共重合体（６０／４０）
Ｐ−５：Ｍ−７／Ｎ−ビニルピロリドン共重合体（２０／８０）
【００３６】
Ｐ−６：Ｍ−７／ジアセトンアクリルアミド共重合体（１０／９０）
Ｐ−７：Ｍ−１０／メチルアクリレート／メチルメタクリレート共重合体（２０／４０／４０）
Ｐ−８：Ｍ−１２／エチルメタクリレート共重合体（３３／６７）
Ｐ−９：Ｍ−１３／メチルメタクリレート共重合体（３３／６７）
Ｐ−１０：Ｍ−１３／Ｎ−アクリロイルモルホリン共重合体（２０／８０）
Ｐ−１１：Ｍ−１３／メトキシポリエチレングリコール（２３量体）モノメタクリレート共重合体（５０／５０）
Ｐ−１２：Ｍ−１８／Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド共重合体（５／９５）
【００３７】
Ｐ−１３：Ｍ−１８／ブチルメタクリレート共重合体（３０／７０）
Ｐ−１４：Ｍ−１８／スチレン／ブチルアクリレート共重合体（２０／３０／５０）
Ｐ−１５：Ｍ−２３／メチルアクリレート共重合体（２０／８０）
Ｐ−１６：Ｍ−２４／エチルアクリレート／スチレン共重合体（２０／５０／３０）
Ｐ−１７：Ｍ−２６／アクリルアミド共重合体（２５／７５）
Ｐ−１８：Ｍ−２６／Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体（３０／７０）
【００３８】
【化７】
2008076378.tif 000008
【００３９】
本発明に用いられる高分子硬膜剤の反応性官能基としては、好ましくは、活性オレフィン型高分子硬膜剤、ｓ−トリアジン型高分子硬膜剤、活性ハロゲン型高分子硬膜剤、アルデヒド型高分子硬膜剤、グリシジル型高分子硬膜剤等が用いられ、さらに好ましくは活性オレフィン型高分子硬膜剤あるいはその前駆体、ｓ−トリアジン型高分子硬膜剤、グリシジル型高分子硬膜剤が用いられ、ビニルスルホン型高分子硬膜剤あるいはその前駆体、ジクロロトリアジン型高分子硬膜剤が特に好ましい。
【００４０】
本発明で用いる、ｐＫａ（酸解離定数）が９以下である解離性基を有しない親水性高分子の別の例としては、アセトアセチル基含有親水性高分子を挙げることができる。アセトアセチル基含有親水性高分子は、複数のアルデヒド基、アミノ基、ヒドラジド基などを有する架橋剤と、室温で反応して硬化する性質がある。それゆえ、基材の一面にアセトアセチル基含有水溶性高分子を、他の基材の一面に架橋剤を塗付し、その両面を押付けることで、２つの基材を瞬間的に接着することが可能となる。また、アセトアセチル基含有水溶性高分子の水溶液に架橋剤を添加混合することにより、含水率が極めて大きく壊れにくいゲルを室温で容易に得ることが可能となる。このように、アセトアセチル基含有水溶性高分子は、水溶性接着剤として極めて優れた性質を有していることが、特開平5-112771、特開平5-156220、特開2002-285117等に開示されている。
【００４１】
アセトアセチル基含有親水性高分子の製造法を説明する。アセトアセチル基含有親水性高分子の代表的な化合物であるアセトアセチル化ポリビニルアルコールを製造するための方法としては、酢酸中にポリビニルアルコール系樹脂を分散させた状態でジケテンガスを添加する方法、ジメチルホルムアミド、ジオキサンなどの溶媒にポリビニルアルコール系樹脂を溶解させた状態でジケテンガスを添加する方法、ポリビニルアルコール粉末とジケテンガスを直接反応させる方法、ポリビニルアルコールとアセト酢酸エステルを溶液中で反応させエステル交換する方法、などが知られている。本発明におけるアセトアセチル化ポリビニルアルコールは、例えば特開2002-285117号〔００２１〕〜〔００３０〕に記載されている手法で合成することが可能であり、また、市販されているアセトアセチル化ポリビニルアルコール、たとえば日本合成化学工業(株)製ゴーセファイマーZ100、Z200、Z200H、Z210、Z320等を購入して用いることも可能である。
【００４２】
アセトアセチル基含有親水性高分子は、アセトアセチル基含有モノマーを水溶性モノマーと共重合することによっても製造することができる。アセトアセチル基含有モノマーとしては、アセトアセトキシエチルアクリレート、アセトアセトキシエチルメタクリレート、アセトアセトキシエチルクロトナート、アセトアセトキシプロピルアクリレート、アセトアセトキシプロピルメタクリレート、アセトアセトキシプロピルクロトナート、２−シアノアセトアセトキシエチルメタクリレート、Ｎ−（２−アセトキシエチル）アクリルアミド、Ｎ−（２−アセトキシアミノエチル）メタクリルアミド、アセト酢酸アリル、アセト酢酸ビニルなどが挙げられる。これらのモノマーは、官能基含有エチレン系不飽和単量体とジケテンとの反応、該単量体にアセトアセトキシアルキルエステルをエステル交換反応等により製造される。本発明におけるアセトアセチル化水溶性高分子は、例えば特許2777732号3頁5段落31行〜7頁7段落39行に記載されている手法で合成することが可能である。
【００４３】
本発明において、アセトアセチル基含有親水性高分子は、アセトアセチル基含有モノマー以外に、様々なモノマーとの共重合体を用いることが可能である。このような共重合モノマー単位として、以下のようなモノマーが挙げられる。
【００４４】
アクリル酸、メタクリル酸のエステル類：例えば、メチルアクリレート、ブチルアクリレート、ベンジルアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＲ（Ｒは、水素原子、アルキル基、ｎは１以上の整数）、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ベンジルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、２−メトキシエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、２−スルホエチルメタクリレート等、
エチレン性不飽和カルボン酸のアミド類：アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（もしくはその塩）等、
芳香族単量体：スチレン、ビニルトルエン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ビニルナフタレン等、
その他のビニル単量体：エチレン、プロピレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、トリフロロエチレン、トリフロロクロロエチレン、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ビニルアルコール、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルアセトアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等。
【００４５】
本発明において、親水性高分子は、バイオセンサー表面に固定化されヒドロゲルを形成することを目的として使用される。
【００４６】
また、本発明に使用する親水性高分子は、水溶液中の膜厚が１ｎｍ以上300ｎｍ以下であることが好ましい。膜厚が薄いと生理活性物質固定量が減少し、またセンサー表面の水和層が薄くなるため生理活性物質自身の変性で被検体物質との相互作用が検出しにくくなる。膜厚が厚いと被検体物質が膜内に拡散する障害となり、また特にセンサー基板の親水性高分子固定面の反対側から相互作用を検出する場合は検出表面から相互作用形成部までの距離が長くなり、検出感度が低くなる。水溶液中の親水性高分子膜厚はＡＦＭ、エリプソメトリーなどで評価することができる。
【００４７】
本発明において、バインディングマトリックスである親水性高分子と金属表面との結合法については、公知の手法を用いることが可能である。本明細書中に以下に説明するような疎水性ポリマーを介してバインディングマトリックスを金属表面に結合する方法（特開２００４−２７１５１４号公報を参照））、特許第２８１５１２０号に開示されている、Ｘ−Ｒ−Ｙ（Ｘは金属に結合し、Ｙはバインディングマトリックスと結合する）の密に詰め込まれた単層を介してバインディングマトリックスを金属表面に結合する方法、などを適用することができる。好ましくは、末端に反応性基を有するアルカンチオール（あるいはその酸化体であるジスルフィド）を用いて金属表面に密な層を形成させた後、アルカンチオール末端の反応性基と高分子硬膜剤を反応させる結合法である。
【００４８】
本発明で用いる親水性高分子は、ｐＫａ（酸解離定数）が９以下である解離性基を有しない。ｐＫａ（酸解離定数）が９以下である解離性基としては、カルボン酸、スルホン酸、リン酸などを挙げることができる。
【００４９】
また、本発明のバイオセンサー基板においては、親水性高分子に、タグ分子とＫｄ（結合定数）が１０-12Ｍ以下の結合を形成するリガンドが固定されている。タグ分子／リガンドの組み合わせとしては、ビオチン／ビオチン結合蛋白質、ジゴキシゲニン／ジゴキシゲニン抗体、さらにはSCIENCE,280,708-711(1998)に記載のD-Ala-D-Ala誘導体／バンコマイシン3量体誘導体などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。ビオチン結合蛋白質の具体例としては、アビジン類（アビジン、ストレプトアビジン、又はそれらの改変体など）を挙げることができる。
【００５０】
本発明の好ましい態様によれば、親水性高分子は、ビニルスルホン基又はその前駆体、ジクロロトリアジン基、又はアセトアセチル基から選ばれる少なくとも１種の反応性基を含有する親水性高分子であり、リガンドは、該反応性基を介して親水性高分子に固定されている。
【００５１】
本発明のバイオセンサー基板の表面に対し、タグ分子で修飾された生理活性物質を接触させることにより、バイオセンサー基板のリガンドと、生理活性物質に結合しているタグ分子が相互作用することにより、バイオセンサー基板に対して生理活性物質を固定化することが可能となる。
【００５２】
タグ分子で修飾された生理活性物質を固定化する時に用いるバッファー、あるいは、タグ分子で修飾された生理活性物質への低分子検体の結合を測定する時に用いるバッファーとしては、中性領域のバッファーを用いることが好ましい。ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が好ましく、ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５がさらに好ましい。具体的には、以下のバッファー剤が好ましく用いられる。リン酸、MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid, momohydrate)、Bis-Tris(Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane)、PIPES(Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)、MOPSO(2-Hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid)、BES(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid)、MOPS(3-Morpholinopropanesulfonic acid)、HEPES(2-[4-(2-Hydroxyetyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)、POPSO(Piperazine-1,4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonic acid),dihydrate)、HEPPSO(2-Hydroxy-3-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propanesulfonic acid,monohydrate)、EPPS(3-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propanesulfonic acid)。バッファー剤の濃度は、1mM〜200mMで用いることが好ましく、5mM〜100ｍＭがより好ましい。適宜、NaClを添加することができる。NaCl濃度は、10mM〜500mMで用いることが好ましく、50mM〜200ｍＭがより好ましい。また、EDTA等のキレート試薬を添加することができる。さらに、生理活性物質の活性調整のため、Ca、K、Na、Mn、Fe、Zn等の金属イオンを添加することができる。
【００５３】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００５４】
本発明のバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００５５】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００５６】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００５７】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００５８】
本発明において、親水性高分子は、金属層に、直接又は中間層を介して結合している。中間層としては、疎水性高分子化合物又は自己組織化膜から成る層などを使用することができる。以下、疎水性高分子化合物、及び自己組織化膜について説明する。
【００５９】
疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。
【００６０】
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００６１】
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００６２】
疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００６３】
浸漬法は、基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させた後に、前記疎水性高分子化合物溶液を含まない液に接触させる方法でコーティングを行う。好ましくは、疎水性高分子化合物溶液の溶剤と疎水性高分子化合物を含まない液の溶剤とは、同一の溶剤である。
【００６４】
浸漬法では、疎水性高分子化合物のコーティング用溶剤を適切に選択することで、基板の凹凸、曲率、形状などに依らず基板表面に均一なコーティング厚みの疎水性高分子化合物層が得られる。
【００６５】
浸漬法のコーティング用溶剤は特に限定されず、疎水性高分子化合物の一部を溶解すれものであれば任意の溶剤を用いることができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のホルムアミド系溶剤、アセトニトリル等のニトリル系溶剤、フェノキシエタノール等のアルコール系溶剤、２−ブタノン等のケトン系溶剤、トルエン等のベンゼン系溶剤などを使用することができるが、これらに限定されない。
【００６６】
基板に接触させる疎水性高分子化合物の溶液は、疎水性高分子化合物が完全に溶解しても、疎水性高分子化合物の不溶解成分を含む懸濁液でもよい。液温は、疎水性高分子化合物の一部が溶解する液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を疎水性高分子化合物の溶液に接触させている間に液温を変動させても良い。溶液の疎水性高分子化合物濃度に特に制限はないが、好ましくは０．０１％以上３０％以下、さらに好ましくは０．１％以上１０％以下である。
【００６７】
固体基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。
【００６８】
疎水性高分子化合物を含まない液としては、溶剤自身のＳＰ値（単位：(Ｊ／ｃｍ３)１／２）と疎水性高分子化合物のＳＰ値との差が、１以上２０以下であることが好ましく、３以上１５以下であることがさらに好ましい。ＳＰ値は、分子間の凝集エネルギー密度の平方根で表され、溶解度パラメーターとも呼ばれる。本発明では、ＳＰ値δは下記式で算出した。各官能基の凝集エネルギーＥｃｏｈとモル容積Ｖは、Ｆｅｄｏｒｓが規定した値を使用した（Ｒ．Ｆ．Ｆｅｄｏｒｓ、Ｐｏｌｙｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．、１４（２）、Ｐ１４７、Ｐ４７２（１９７４））。
δ＝（ΣＥｃｏｈ／ΣＶ）１／２
例として、疎水性高分子化合物および溶剤のＳＰ値を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー（１：１）：２１.０に対する溶剤２−フェノキシエタノール：２５.３、ポリメチルメタクリレート：２０.３に対する溶剤アセトニトリル：２２.９、ポリスチレン：２１.６に対する溶剤トルエン：１８.７である。
【００６９】
基板を、疎水性高分子化合物を含まない液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。液温は、溶剤が液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を溶剤に接触させている間に液温を変動させてもよい。揮発させにくい溶剤を使用する場合、溶剤を除去する目的で、該溶媒に接触させた後、互いに溶解する揮発性溶剤で置換してもよい。
【００７０】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、特に好ましくは１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。
【００７１】
次に、自己組織化膜について説明する。チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。本発明では、例えば、自己組織化化合物として、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。
【００７２】
また、本発明において使用可能な自己組織化化合物として、一般式Ａ−１（一般式Ａ−１において、ｎは３から２０の整数を示し、Ｘは官能基を示す）に示すアルカンチオール誘導体を好ましく用いることができる。一般式Ａ−１において例えば、X=NH2である化合物を用いて自己組織化膜を形成させることで、アミノ基を有する有機層で金表面を被覆することが可能となる。
【００７３】
【化８】
2008076378.tif 000009
【００７４】
末端にアミノ基を有するアルカンチオールを使用する場合、アルキル鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物（一般式１−１）（一般式１−１において、ｎは３から２０の整数を示す）でもよく、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式１−２、１−３）（一般式１−２においてｎは３から２０の整数を示し、一般式４においてｎはそれぞれ独立に１から２０の整数を示す）と大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させた化合物でもよい。末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールと大過剰のヒドラジドまたはジアミンとの反応は、溶液状態で行ってもよく、また、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールを基板表面に結合した後、大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させてもよい。
【００７５】
【化９】
2008076378.tif 000010
【００７６】
１−１〜１−３のアルキル基の繰返し数は、3以上20以下が好ましく、さらに3以上16以下が好ましく、4以上8以下が最も好ましい。アルキル鎖が短いと自己組織化膜を形成しにくく、アルキル鎖が長いと水溶性が低下し、ハンドリングが困難になる。
【００７７】
本発明に用いるジアミンとしては、任意の化合物を用いることが可能であるが、バイオセンサー表面に用いる場合、水溶性ジアミンが好ましい。水溶性ジアミンとしては具体的に、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ピペラジン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ジヘキサメチレントリアミン、１．４−ジアミノシクロヘキサン等の脂肪族ジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、パラキシリレンジアミン、メタキシリレンジアミン、４，４’−ジアモノビフェニル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルケトン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン酸等の芳香族ジアミンが挙げられる。バイオセンサー表面の親水性を向上させるという観点から、２つのアミノ基をエチレングリコールユニットで連結した化合物（一般式１−４）を用いることも可能である。本発明に用いるジアミンとしては、好ましくはエチレンジアミンまたは一般式１−４（一般式１−４において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）で表される化合物であり、より好ましくは、エチレンジアミンまたは1,2-ビス(アミノエトキシ)エタン（一般式１−４において、n=2,m=1）である。
【００７８】
【化１０】
2008076378.tif 000011
【００７９】
これらのアルカンチオールは、単独で自己組織化膜を形成することも可能であり、また、他の種類のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成することも可能である。バイオセンサー表面に用いる場合、他の種類アルカンチオールとしては、生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な化合物を用いることが好ましい。生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な自己組織化膜に関しては、前述のWhitesides教授らにより詳細に検討されており、親水性基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化膜が非特異吸着抑制に有効であることが報告されている（Langmuir,17,2841-2850, 5605-5620, 6336-6343 (2001)）。例えば、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールは、前記論文に記載された化合物を好ましく用いることが可能である。非特異吸着抑制能に優れ、入手が容易であることから、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールとしては、水酸基を有するアルカンチオール（一般式１−５）あるいはエチレングルコールユニットを有するアルカンチオール（一般式１−６）（一般式１−５において、ｎは３から２０の整数を示し、一般式１−６において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）を用いることが好ましい。
【００８０】
【化１１】
2008076378.tif 000012
【００８１】
アミノ基を有するアルカンチオールを他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成する場合、１−１〜１−３のアルキル基の繰返し数は、4以上20以下が好ましく、さらに4以上16以下が好ましく、4以上10以下が最も好ましい。また、１-５,１-６のアルキル基の繰返し数は、3以上16以下が好ましく、さらに5以上12以下が好ましく、5以上11以下が最も好ましい。
【００８２】
混合単分子膜の場合、例えば、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールは、任意の割合で混合することが可能であるが、アミノ基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には活性化されたカルボキシル基含有ポリマーの結合量が低下し、親水性基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には非特異吸着抑制能が減少する。それゆえ、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールの混合比は、１／１〜１／１，０００，０００の範囲であることが好ましく、１／４〜１／１０，０００の範囲であることがより好ましく、１／１０〜１／１，０００の範囲であることがさらに好ましい。活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーと反応する場合の立体障害低減の観点から、アミノ基を有するアルカンチオールの分子長は、親水性基を有するアルカンチオールの分子長よりも長いことが好ましい。
【００８３】
本発明で用いるアルカンチオールは、Northwestern大学のGrzybowski教授らによる総説（Curr. Org. Chem., 8, 1763-1797(2004).）およびその引用文献に基づいて合成された化合物を用いても良く、また市販の化合物を用いてもよい。これらの化合物は、同仁化学（株）、Aldrich社、SensoPath Technologies社、Frontier Scientific Inc.社等から購入可能である。本発明においてアルカンチオールの酸化生成物であるジスルフィド化合物は、アルカンチオールと同様に用いることが可能である。
【００８４】
本発明のセンサー用基板に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００８５】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００８６】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００８７】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００８８】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００８９】
これらの生理活性物質は、生理活性物質を含む溶液を親水性高分子が固定された基板上に塗布し、乾燥することによって固定化することが好ましい。
【００９０】
生理活性物質を含む溶液（塗布液）の濃度は、基板表面に固定する生理活性物質の濃度が高い方が好ましい。生理活性物質により異なるが、０.１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬで使用することが好ましく、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬである。
【００９１】
生理活性物質を含む溶液の乾燥過程において、生理活性物質は塗布した溶液の外周部または、塗布液が乾固直前まで液が残った部分に析出する傾向がある。これにより基板表面に固定される生理活性物質の量に分布が発生し好ましくない。基板表面の生理活性物質固定量を均一にするため、塗布液の粘度は生理活性物質の基板表面への結合を阻害しない範囲で高くすることが好ましい。塗布液粘度を高くすることで、乾燥過程における塗布液中の生理活性物質の基板表面に対して水平方向の移動が抑えられ、結果として生理活性物質固定量のばらつきを抑えられる。乾燥過程における塗布液の粘度は０．９ｃＰ以上に保つことが好ましい。
【００９２】
本発明の乾燥する工程とは、生理活性物質を含む溶液の塗布後、その溶液を、静置することによる自然乾燥や、加熱や送風などによって溶液が乾燥する速度を上げ、意図的に乾燥させる工程をいう。ここで、生理活性物質を含む溶液（塗布液）の乾燥速度を上げることは生理活性物質固定量のばらつきを抑えることに効果がある。乾燥速度を上げ、生理活性物質の水平方向の移動速度に対して、十分早く乾燥を終了させることで、生理活性物質が実質的に移動する前に乾燥が終了し、ばらつきを抑えることが可能となる。乾燥速度を上げる方法は特に限定されないが、塗布液温度、乾燥環境温度を上げる、赤外線、レーザーなどの照射で蒸発エネルギーを加える、送風などで乾燥時の溶媒蒸気圧を下げる、溶液を薄層塗布して塗布量に対する蒸発面積を大きくするなどの方法が挙げられる。特に、塗布液が水を含む場合、乾球温度と湿球温度差の大きい環境で乾燥させることで乾燥速度は早くなる。乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の環境で乾燥させることが好ましく、さらに好ましくは１０℃以上、さらに好ましくは１３．５℃以上である。また、製造工程上、乾燥時間としては１０分以内が好ましく、より好ましくは５分以内、特に好ましくは１分以内である。
【００９３】
生理活性物質を含む溶液を塗布する方法としては、特に塗布液を定量吐出するディスペンサーを使用する方法が挙げられる。ディスペンサーの吐出口を基板上で一定速度、一定間隔で動作させることで基板上の任意の場所に均一塗布することが可能である。ディスペンサーで塗布する場合、基板と吐出口の間隔を極力狭くし、塗布液厚みを薄くすることで生理活性物質の厚みを均一にすることができ、また乾燥速度を上げることができ、好ましい。また生理活性物質を含む溶液を塗布する好ましい方法として、スピンコートも挙げられる。この方法は、特に塗布膜厚を薄くする場合に好ましい。均一厚みの溶液を形成した後に乾燥させるため、スピンコーターは回転中の溶媒の蒸発を防ぐことが好ましい。このため、回転時に基板を密閉容器に入れておくなどの方法で、基板周辺の溶媒濃度が高い環境に保つことで、回転中の薄膜形成と薄膜形成後の乾燥速度を制御できるため、特に好ましい。これらの塗布工程後、温度・湿度を一定に保った条件下で乾燥させることが好ましい。
【００９４】
生理活性物質と被検体物質との相互作用を検出する場合、センサー表面の生理活性物質の固定量の変動は相互作用の定量的、速度論的評価の誤差の原因となる。この誤差を最小限に抑える目的で、生理活性物質の固定量を均一にすることが好ましい。相互作用の検出に使用される基板表面の生理活性物質の固定量のばらつきがＣＶ値（変動係数）（標準偏差／平均値）で１５％以下が好ましく、さらに好ましくは１０％以下である。ＣＶ値は、基板表面の少なくとも２点以上、好ましくは１０点以上、さらに好ましくは１００点以上の固定量から算出することができる。均一性は、生理活性物質を固定する前後のセンサー基板上の物質の量を定量することでも評価可能であるが、生理活性物質と結合することが知られている物質を蛍光標識して、この標識物質をセンサー基板に固定した後に蛍光顕微鏡などを用いて蛍光強度を測定することでも可能である。また、ＳＰＲイメージャー、エリプソメーター、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ、ＡＴＲ−ＩＲ装置などで生理活性物質の定量も可能である。
【００９５】
また、本発明において、基板上に固定化した生理活性物質の保存安定性を向上させる目的で、水素結合を形成しうる残基を有する化合物（以下、化合物Ｓとする）を使用してもよい。
【００９６】
一般に蛋白質などの生理活性物質は水溶液中で水分子が配位することで三次元構造を維持しているが、乾燥されると三次元構造を保持できず失活する。また、基板表面の親水性高分子中に担持されている場合には、乾燥されることで生理活性物質同士が接近し凝集が発生する。本発明の水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水分子に代って生理活性物質の三次元構造を保持することで失活を抑制、または生理活性物質を被覆して立体効果で凝集を抑制する目的で使用することができる。
【００９７】
本発明において水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水溶液で基板上の生理活性物質を固定した層に添加することが好ましい。添加方法としては、生理活性物質との混合溶液として基板表面に塗布しても良く、生理活性物質を基板表面に固定した後オーバーコートなどによりして添加しても良い。化合物Ｓと生理活性物質との混合溶液として塗布した場合、生理活性物質の固定量ばらつきを抑えることもできる。化合物Ｓ水溶液は薄膜状態で基板に添加することが好ましい。基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。
【００９８】
化合物Ｓの塗布液濃度は塗布性、生理活性物質を含む層への浸透の問題がない範囲で特に限定されないが、０．１重量％以上５重量％以下であることが好ましい。また、塗布液は、塗布性、ｐＨ調整の観点で界面活性剤、緩衝剤、有機溶剤、塩などを添加してもよい。
【００９９】
水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、常温常圧で不揮発性のものが好ましく、平均分子量が３５０より大きく５００万より小さいものが好ましく、さらに好ましくは１２００以上２００万以下であり、最も好ましくは１２００以上７万以下である。分子内に水酸基を含む化合物Ｓは糖類が好ましく、糖類は、単糖、多糖類でも良い。ｎ糖類の場合ｎが４以上１２００以下であることが好ましく、さらに好ましくはｎが２０以上６００以下である。
【０１００】
化合物Ｓの平均分子量が低いと基板表面で結晶化して、生理活性物質を固定した親水性高分子層の破壊および生理活性物質の三次元構造の破壊の原因となり、反対に平均分子量が高いと生理活性物質の基板への固定の障害となったり、生理活性物質を含む層に含浸できない、層分離を発生するなどの問題が発生する。
【０１０１】
基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、デキストラン骨格、又はポリエチレンオキシド骨格を有することが好ましく、本発明の目的を達成する範囲において、どの置換基を使用してもよい。また、基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、解離性基を有しないノニオン性化合物であることが好ましい。また、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは水分子との親和性の高い化合物が好ましく、水とｎ-オクタノールとの分配係数ＬｏｇＰ値が１以上であることが好ましい。ＬｏｇＰ値は、ＪＩＳ規格のＺ７２６０−１０７（２０００）「分配係数（1-オクタノール/水）の測定―振とう法」などに記載の方法で測定することができる。
【０１０２】
具体的な水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、ポリビニルアルコールなどの多価アルコール類、コラーゲン、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク質、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、デンプン、セルロース、アルギン酸、デキストランなど多糖類、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド、プルロニックなどポリエチレンキシ-ポリプロピレンオキシド縮合物などのポリエーテル類、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０などの２種以上の残基から成る化合物、またはこれら化合物の誘導体および重合体などが挙げられる。その内、多糖類、ポリエーテル類が好ましく、多糖類がより好ましい。具体的には、デキストラン、セルロース、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０が好ましく用いられる。さらに、特開２００６−１７０８３２に記載の不揮発性モノマー、不揮発性水溶性オリゴマーを用いることもできる。例えば不揮発性モノマーとしては水酸基が保護基で保護されていてもよいテトロース、ペントース、ヘプトース、ヘキトース及びそのグリコキシドでも良く、メチルグルコシドや水酸基が保護基で保護されていてもよいサイクリトール類でもよい。また不揮発性水溶性オリゴマーが、式（１）、（２）または（３） -[CH2-CH(CONH2)-]n- （１） -[CH2-CH2-O-]n- （２） -[CH2-CH(OH)-]n- （３）（式（１）〜（３）中、ｎは１０〜２００のいずれかの整数を示す。）で表されるオリゴマー、水酸基が保護基で保護されていてもよいｎ糖（但し、２≦ｎ≦１０）のオリゴ糖を用いることもできる。さらに、US２００３／０１７５８２７、DE２０３０６４７６A1に記載の糖類、例えば、トレハロース、スクロース、マルトース、ラクトース、キシリトール、フルクトース、マニトール、グルコース、キシロール、マルトデキストラン、サッカロース、ポリビニルピロリドンなどを使用しても良い。また、これらの化合物Ｓは、本発明において使用している親水性高分子の基本骨格と実質同一であることが好ましい。ここで、基本骨格とは、例えば、糖の環構造のことをいい、官能基や長さが異なっていても、環構造が同一であれば、実質同一であるという。
【０１０３】
基板上の、水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓの含有量としては、平均分子量の比で、親水性高分子の平均分子量に対する前記化合物Ｓの平均分子量の割合が０．００５以上０．２以下であることが好ましい。割合がこれよりも低い場合は化合物Ｓが結晶化しやすく、高い場合は親水性高分子層への浸透が困難であり、この範囲内に設定することでこれらの問題を解消し、生理活性物質の失活抑制効果、凝集抑制効果をより高く得ることができる。
【０１０４】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【０１０５】
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【０１０６】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【０１０７】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【０１０８】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【０１０９】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【０１１０】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【０１１１】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【０１１２】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【０１１３】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【０１１４】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【０１１５】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【０１１６】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【０１１７】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【０１１８】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【０１１９】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【０１２０】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【０１２１】
また、本発明のバイオセンサーは、例えば基板表面に導波路構造を保持した、屈折率変化を導波路を用いて検出するバイオセンサーとして用いることができる。この場合、基板表面の導波構造物は、回折格子と場合によっては付加層とを有している、この導波構造物は、薄い誘電層からなる平面的な導波体から成る。導波体に集光された光線は全反射によりこの薄い層内に導かれる。この導かれる光波（以降モードと呼ぶ）の伝播速度は、Ｃ／Ｎの値をとる。ここでＣは、真空中での光速であり、Ｎは導波体内を導かれるモードの有効屈折率である。有効屈折率Ｎは、一面では導波体の構成により、他面では薄い導波層に隣接する媒体の屈折率により決まる。光波の伝導は、薄い平面層内のみでなく、別の導波構造物、特にストリップ状の導波体によっても行われる。その場合は、導波構造物はストリップ状のフィルムの形状にされる。有効屈折率Ｎの変化は、導波層に隣接する媒体の変化と導波層自身もしくは導波層に隣接する付加層の屈折率および厚さの変化とにより生じることがバイオセンサーにとって重要な要素である。
【０１２２】
この方式のバイオセンサーの構成については、例えば特公平６−２７７０３号公報４ページ４８行目から１４ページ１５行目および第１図から第８図、米国特許第 6,829,073号のcolumn6の31行目からcolumn7の47行目および第9図A,Bに記載されている。
【０１２３】
例えば、一つの実施形態として、薄層が平面状の導波路層が基材（たとえばパイレックス（登録商標）・ガラス）上に設けられている構造がある。導波路層と基材とは、一緒にいわゆる導波体を形成する。導波路層は、たとえば酸化物層（ＳｉＯ2，ＳｎＯ2、Ｔａ2Ｏ5，ＴｉＯ2，ＴｉＯ2-ＳｉＯ2，ＨｆＯ2，ＺｒＯ2，Ａｌ2Ｏ3，Ｓｉ3Ｎ4，ＨｆＯＮ，ＳｉＯＮ，酸化スカンジウムまたはこれらの混合物）、プラスチック層（例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネートなど）、など多層の積層体が可能である。光線が全反射により導波路層内を伝播するには、導波路層の屈折率が隣接媒体（たとえば基材や後述の付加層）の屈折率より大でなければならない。基材もしくは測定物質に向いた導波路層表面もしくは導波路層体積内には、回折格子が配置されている。回折格子は、型押し、ホログラフィまたはその他の方法によって基板内に形成することができる。次いでより高い屈折率を有する薄い導波路膜を回折格子の上表面に被覆する。回折格子は導波路層への入射光線を集束したり、既に導波路層内を導かれているモードを放出したり、そのモードの一部を進行方向へ透過させ、一部を反射させたりする機能を持つ。導波路層は、格子域を付加層でカバーしておく。付加層は必要に応じて多層膜とすることができる。この付加層は、測定物質に含まれている物質の選択的検知を可能にする機能を持たせることができる。好ましい態様として付加層の最表面に、検知機能を持つ層を設けることができる。このような検知機能を持つ層として、生理活性物質を固定化し得る層を用いることができる。
【０１２４】
別の実施形態として、回折格子導波路のアレイがマイクロプレートのウェル内に組み込まれる形態も可能である（特表2007-501432）。すなわち回折格子導波路がマイクロプレートのウェル底面にアレイ状に配列されていれば、スループットの高い薬物または化学物質のスクリーニングを可能にすることができる。
【０１２５】
回折格子導波路は、回折格子導波路の上層（検知領域）上の生理活性物質検出を可能にするために、入射光線、および反射光を検出して屈折特性の変化を検出する。この目的のため、１つまたはそれより多くの光源（例えば、レーザ、ダイオード）及び１つまたはそれより多くの検出器（例えば、分光計、ＣＣＤカメラまたはその他の光検出器）を用いることができる。屈折率変化を測定するための方法として、２つの異なる動作モード−分光法、及び角度法がある。分光法においては、入射光として広帯域ビームが回折格子導波路に送られ、反射光が集められて、例えば分光計で測定される。共鳴波長（ピーク）のスペクトル位置を観測することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。また、角度法においては、公称上単一波長の光がある範囲の照射角を生じるように集束されて、回折格子導波路内に向けられる。反射光がＣＣＤカメラまたはその他の光検出器によって測定される。回折格子導波路によって反射された共鳴角の位置を測定することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。
【０１２６】
以下の実施例により、本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１２７】
以下の実験は、特願２００６−１６７８５５号明細書の段落００２５から００４９と図１から図８に記載の装置を用いて行った。具体的には、以下の装置である。
【０１２８】
本実施形態のスクリーニング装置としてのバイオセンサー１０は、金属膜の表面に発生する表面プラズモンを利用して、生理活性物質Ｄと化合物との相互作用を測定する、いわゆる表面プラズモンセンサーである。本実施形態では、このバイオセンサー１０を、生理活性物質Ｄと特異的に結合する化合物を大量の化合物Ａの中から選別するために使用される。
【０１２９】
図１に示すように、バイオセンサー１０は、トレイ保持部１２、搬送部１４、容器載置台１６、液体吸排部２０、光学測定部５４及び制御部６０を備えている。
【０１３０】
トレイ保持部１２は、載置台１２Ａ及びベルト１２Ｂを含んで構成されている。載置台１２Ａは、矢印Ｙ方向に架け渡されたベルト１２Ｂに取り付けられており、ベルト１２Ｂの回転により矢印Ｙ方向に移動可能とされている。載置台１２Ａ上には、２枚のトレイＴが位置決めして載置される。トレイＴには、センサースティック４０が８本収納されている。センサースティック４０は、生理活性物質Ｄが固定されるチップであり、詳細については後述する。載置台１２Ａの下には、センサースティック４０を後述するスティック保持部材１４Ｃの位置まで押し上げるための押上機構１２Ｄが配置されている。
【０１３１】
センサースティック４０は、図２及び図３に示すように、誘電体ブロック４２、流路部材４４、及び、保持部材４６、で構成されている。
【０１３２】
誘電体ブロック４２は、光ビームに対して透明な透明樹脂等で構成されており、断面が台形の棒状とされたプリズム部４２Ａ、及び、プリズム部４２Ａの両端部にプリズム部４２Ａと一体的に形成された被保持部４２Ｂを備えている。プリズム部４２Ａの互いに平行な２面の内の広い側の上面には、金属膜５７が形成されている。誘電体ブロック４２は、いわゆるプリズムとして機能し、バイオセンサー１０での測定の際には、プリズム部４２Ａの対向する互いに平行でない２つの側面の内の一方から光ビームが入射され、他方から金属膜５７との界面で全反射された光ビームが出射される。
【０１３３】
金属膜５７の表面には、図４に示すように、リンカー層５７Ａが形成されている。リンカー層５７Ａは、生理活性物質Ｄを金属膜５７上に固定化するための層である。
【０１３４】
プリズム部４２Ａの両側面には、上側の端辺に沿って保持部材４６と係合される係合凸部４２Ｃが形成されている。また、プリズム部４２Ａの下側には、側端辺に沿って図示しない搬送用レールと係合されるフランジ部４２Ｄが形成されている。
【０１３５】
図３に示すように、流路部材４４は、６個のベース部４４Ａを備え、ベース部４４Ａの各々に４本の円筒部材４４Ｂが立設されている。ベース部４４Ａは、３個のベース部４４Ａ毎に、立設された円筒部材４４Ｂのうちの１本の上部が連結部材４４Ｄによって連結されている。流路部材４４は、軟質で弾性変形可能な材料、例えば非晶質ポリオフィレンエラストマーで構成されている。
【０１３６】
ベース部４４Ａには、図５及び図６に示すように、底面側に略Ｓ字状の２本の流路溝４４Ｃが形成されている。流路溝４４Ｃは、端部の各々が１の円筒部材４４Ｂの中空部と連通されている。ベース部４４Ａは、底面が誘電体ブロック４２の上面と密着され、流路溝４４Ｃと誘電体ブロック４２の上面との間に構成される空間と前記中空部とで、液体流路４５が構成される。１個のベース部４４Ａには、２本の液体流路４５が構成される。各々の液体流路４５において、円筒部材４４Ｂの上端面に液体流路４５の出入口４３が構成される。
【０１３７】
ここで、２本の液体流路４５のうち、１本は測定流路４５Ａとして用いられ、他の１本は参照流路４５Ｒとして用いられる。測定流路４５Ａの金属膜５７上には生理活性物質Ｄが固定され、参照流路４５Ｒの金属膜５７上には生理活性物質Ｄが固定されない状態で測定が行われる。測定流路４５Ａ及び参照流路４５Ｒには、図５に示すように、各々光ビームＬ１、Ｌ２が入射される。光ビームＬ１、Ｌ２は、ベース部４４Ａの中心寄りに配置されるＳ字の屈曲部分に照射される。以下、流路４５Ａにおける光ビームＬ１の照射領域を測定領域Ｅ１、流路４５Ｒにおける光ビームＬ２の照射領域を参照領域Ｅ２という。参照領域Ｅ２は、生理活性物質Ｄの固定された測定領域Ｅ１から得られるデータを補正するための測定を行う領域である。
【０１３８】
保持部材４６は、長尺とされ、上面部材４７及び２枚の側面板４８が蓋状に構成された形状とされている。側面板４８には、誘電体ブロック４２の係合凸部４２Ｃと係合される係合孔４８Ｃ、及び、光ビームＬ１、Ｌ２の光路に対応する部分に窓４８Ｄが形成されている。保持部材４６は、係合孔４６Ｃと係合凸部４２Ｃとが係合されて、誘電体ブロック４２に取り付けられる。なお、流路部材４４は、後述するように保持部材４６と一体成形されており、保持部材４６と誘電体ブロック４２の間に配置される。
【０１３９】
上面部材４７には、流路部材４４の円筒部材４４Ｂに対応する位置に、受部４９が形成されている。受部４９は、図４に示すように、略円筒状とされ、中空の下部分に円筒部材４４Ｂが配置されている。また、前記中空の円筒部材４４Ｂよりも上側に、出入口４３と連通する凹部４９Ａが構成されている。凹部４９Ａには、ピペットチップ５０が挿入される。
【０１４０】
保持部材４６は、流路部材４４よりも硬質の材料、例えば、晶質ポリオフィレンで構成されている。
【０１４１】
ピペットチップ５０は、図６に示すように、略錐筒状とされ、先端部５１、本体部５２、及び保持部５３で構成されている。先端部５１は円筒状とされ、挿入方向の最先端に液体を吐出または吸入する開口５１Ａが構成されている。本体部５２は、先端部５１より外周が大径の錐筒状とされ、先端部５１との間に外周段差部５２Ａが構成されている。外周段差部５２Ａは、先端部５１側が小径のテーパー状とされている。保持部５３は、本体部５２よりも外周が大径とされ、本体部５２との間に保持段差部５３Ａが構成されている。保持段差部５３Ａは、不図示の保持孔の構成された上面板を有するピペットチップストッカにピペットチップ５０を保持する際に用いられる部分である。
【０１４２】
受部４９の凹部４９Ａは、流路部材４４側の第１内壁部４９Ｂ及び、第２内壁部４９Ｃで囲まれて構成されている。第１内壁部４９Ｂは、ピペットチップ５０の挿入方向Ｚが、ピペットチップ５０の先端部５１よりも僅かに長く、先端部５１の外径よりも僅かに大径とされ、先端部５１に沿った形状とされている。
【０１４３】
第２内壁部４９Ｃは、第１内壁部４９Ｂとの間の内周段差部４９Ｄ、内周段差部４９Ｄと隣接する中央内壁部４９Ｅ、最上部の上部内壁部４９Ｆで構成されている。内周段差部４９Ｄは、第１内壁部４９Ｂから連続され、ピペットチップ５０の外周段差部５２Ａに沿って上方が大径となるテーパー状とされている。中央内壁部４９Ｅは、内周段差部４９Ｄと連続され、ピペットチップ５０の上方が大径となるテーパー状とされている。上部内壁部４９Ｆは、中央内壁部４９Ｅと連続され、ピペットチップ５０の上方がさらに大径となるテーパー状とされている。
【０１４４】
保持部材４６と流路部材４４とは、同一金型内で異材料同士を組み合わせて成形する、いわゆる二色成形法（ダブルモールド）によって一体成形されている。
【０１４５】
図１に示すように、バイオセンサー１０の搬送部１４は、上部ガイドレール１４Ａ、下部ガイドレール１４Ｂ、及び、スティック保持部材１４Ｃ、を含んで構成されている。上部ガイドレール１４Ａ及び下部ガイドレール１４Ｂは、トレイ保持部１２及び光学測定部５４の上部で、矢印Ｙ方向と直交する矢印Ｘ方向に水平に配置されている。上部ガイドレール１４Ａには、スティック保持部材１４Ｃが取り付けられている。スティック保持部材１４Ｃは、センサースティック４０の両端部の被保持部４２Ｂを保持可能とされていると共に、上部ガイドレール１４Ａに沿って移動可能とされている。スティック保持部材１４Ｃに保持されたセンサースティック４０の係合溝４２Ｅと下部ガイドレール１４Ｂとが係合され、スティック保持部材１４Ｃが矢印Ｘ方向に移動することにより、センサースティック４０が光学測定部５４上の測定部５６に搬送される。また、測定部５６には、測定時にセンサースティック４０を押さえる押さえ部材５８が備えられている。押さえ部材５８は、図示しない駆動機構によりＺ方向に移動可能とされ、測定部５６に配置されたセンサースティック４０を上側から押圧する。
【０１４６】
容器載置台１６には、アナライト溶液プレート１７、バッファー液ストック容器１８、廃液容器１９が載置されている。アナライト溶液プレート１７は、マトリクス状に区画されており、各種のアナライト溶液がストックされている。バッファー液ストック容器１８は、複数の容器で構成されており、複数種類の異なる屈折率のバッファー液がストックされている。バッファー液ストック容器１８には、後述するピペットチップ５０を挿入可能な開口Ｋが形成されている。廃液容器１９は、複数の容器で構成されており、バッファー液ストック容器と同様にピペットチップ５０を挿入可能な開口Ｋが形成されている。
【０１４７】
液体吸排部２０は、図１に示すように、ヘッド２４、及び、吸排駆動部２６を含んで構成されている。ヘッド２４は、図示しない搬送レールに沿って矢印Ｙ方向（図１参照）に移動可能とされている。また、ヘッド２４は、ヘッド２４内部の図示しない駆動機構により、鉛直方向（矢印Ｚ方向）にも移動可能とされている。
【０１４８】
ヘッド２４での液体流路４５への液体の供給は、２本のピペットチップ５０を１つの液体流路４５の２つの開口へ各々挿入し、一方のピペットチップ５０から液体を吐出させると共に、他方のピペットチップ５０で液体流路４５中の液体を吸引することにより行われる。
【０１４９】
なお、本実施形態においてはセンサースティック４０への液体供給はピペットチップ５０により行われるが、ピペットチップの代わりに、一端が上記各溶液プレートに接続され、他端がセンサースティック４０に接続可能とされたインジェクションチューブを設け、送液ポンプにより液体の供給を行ってもよい。
【０１５０】
光学測定部５４は、図７に示すように、光源５４Ａ、第１光学系５４Ｂ、第２光学系５４Ｃ、受光部５４Ｄ、信号処理部５４Ｅを含んで構成されている。光源５４Ａからは、発散状態の光ビームＬが出射される。光ビームＬは、第１光学系５４Ｂを介して、２本の光ビームＬ１、Ｌ２となり、測定部５６に配置された誘電体ブロック４２の測定領域Ｅ１と参照領域Ｅ２に入射される。測定領域Ｅ１及び参照領域Ｅ２において、光ビームＬ１、Ｌ２は、金属膜５０と誘電体ブロック４２との界面に対して種々の入射角成分を含み、かつ全反射角以上の角度で入射される。光ビームＬ１、Ｌ２は、誘電体ブロック４２と金属膜５０との界面で全反射される。全反射された光ビームＬ１、Ｌ２も、種々の反射角成分をもって反射される。この全反射された光ビームＬ１、Ｌ２は、第２光学系５４Ｃを経て受光部５４Ｄで受光されて、各々光電変換され、光検出信号が信号処理部５４Ｅへ出力される。信号処理部５４Ｅでは、入力された光検出信号に基づいて所定の処理が行なわれ、測定領域Ｅ１の測定データＧ１及び参照領域Ｅ２の参照データＧ２が求められる。この測定データＧ１、参照データＧ２が制御部６０へ出力される。
【０１５１】
制御部６０は、バイオセンサー１０の全体を制御する機能を有し、図７に示すように、光源５４Ａ、信号処理部５４Ｅ及びバイオセンサー１０の図示しない駆動系と接続されている。制御部６０は、図８に示すように、バスＢを介して互いに接続される、ＣＰＵ６０Ａ、ＲＯＭ６０Ｂ、ＲＡＭ６０Ｃ、メモリ６０Ｄ、及びインターフェースＩ／Ｆ６０Ｅを有し、各種の情報を表示する表示部６２及び、各種の指示、情報を入力するための入力部６４と接続されている。
【０１５２】
メモリ６０Ｄには、バイオセンサー１０を制御するための各種プログラムや、各種データが記憶されている。
【０１５３】
〔実施例１〕
（１）金表面基板の作成
ゼオネックス（日本ゼオン社製）を射出成形して得られた誘電体ブロック基板に、平行平板型６インチ用スパッタ装置（アルバック（株）社製ＳＨ−５５０）を用いて基板上にクロムの厚さが１ｎｍ、さらにクロム上に金の厚さが５０ｎｍになるようにスパッタ製膜を行った。この基板をModel-208UV-オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で３０分処理し、金表面基板を作製した。
【０１５４】
（２）試料１（本発明）の作成：  ビニルスルホン基含有親水性高分子修飾基板
（１）で作成した金表面基板に対して、エタノール／水（８０／２０：容量比）で溶解した１１−アミノ−１−ウンデカンチオール（同仁化学製）の１．０ｍＭ溶液を接触させ、２５℃で１時間表面処理を行った。その後、エタノールで５回、エタノール／水混合溶媒で１回、水で５回洗浄を行った。
次に、高分子硬膜剤P-2を１０質量％溶解したアルカリ溶液（pH１０．０、NaOHにより調整）を接触させ、６０℃の振盪インキュベーターで１６時間反応を進行させた。その後、表面を水で洗浄し、試料１を得た。
【０１５５】
（３）試料２（本発明）の作成：  ジクロロトリアジン基含有親水性高分子修飾基板
試料１の高分子硬膜剤P-2を高分子硬膜剤P-5に変更した以外は同様の操作を行うことで、試料２を得た。
【０１５６】
（４）試料３（本発明）の作成：  アセトアセチル基含有親水性高分子修飾基板
（１）で作成した金表面基板に対して、エタノール／水（８０／２０：容量比）で溶解した８−ヒドロキシ−１−オクタンチオール（同仁化学製）４．０ｍＭ／１１−アミノ−１−ウンデカンチオール（同仁化学製）１．０ｍＭ混合溶液を接触させ、２５℃で１時間表面処理を行った。その後、エタノールで５回、エタノール／水混合溶媒で１回、水で５回洗浄を行った。
【０１５７】
次に、アセトアセチル化ポリビニルアルコールであるゴーセファイマーＺ２００Ｈ（日本合成化学社製）を１０質量％溶解したアルカリ溶液（pH１０．０、NaOHにより調整）を接触させ、６０℃の振盪インキュベーターで１６時間反応を進行させた。その後、表面を水で洗浄し、試料３を得た。
【０１５８】
（５）試料４（比較例）の作成：  カルボキシル基含有親水性高分子修飾基板
（１）で作成した金表面基板に対して、エタノール／水（８０／２０：容量比）で溶解した１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオール（同仁化学製）の５．０ｍＭ溶液を接触させ、２５℃で１時間表面処理を行った。その後、エタノールで５回、エタノール／水混合溶媒で１回、水で５回洗浄を行った。
【０１５９】
次に、１０重量（質量）％のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：０．４Ｍ水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの１：１混合溶液）を接触させ、２５℃の振盪インキュベーター中で４時間反応を進行させた。その後、表面をエタノールで２回、水で５回洗浄した。次に、２５重量％のデキストラン（Ｔ５００，Pharmacia）水溶液４０．５ｍｌに４．５ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを添加し、その溶液を上記エピクロロヒドリン処理表面に接触させ、２５℃の振盪インキュベーター中で２０時間反応を進行させた。その後、表面を５０℃の水で１０回洗浄した。続いて、ブロモ酢酸３．５ｇを２７ｇの２Ｍ水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させ、２５℃の振盪インキュベーター中で１６時間反応を進行させた。その後、表面を水で洗浄した。さらにもう一度、上記のブロモ酢酸処理を繰り返し、試料４を得た。
【０１６０】
（６）試料１〜３に対するニュートラルアビジンの固定化
表面プラズモン共鳴測定装置に、上記の試料１〜３をセットし、以下の手順でニュートラルアビジン（PIERCE社製）を固定化した。５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）／１５０ｍＭ ＮａＣｌを用いて、ニュートラルアビジン１００μｇ／ｍｌ溶液を調製した。
次に、ランニングバッファー（５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を添加し、ベースラインをとった。次に、作成したニュートラルアビジン溶液を添加し３０分間静置後、ランニングバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄した。
【０１６１】
（７）試料４に対するニュートラルアビジンの固定化
ＳＰＲ測定装置に、上記の試料１〜３をセットし、以下の手順でニュートラルアビジン（PIERCE社製）を固定化した。酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を用いて、ニュートラルアビジン１００μｇ／ｍｌ溶液を調製した。
【０１６２】
次に、ランニングバッファー（５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を添加し、ベースラインをとった。次に、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液を添加し、７分間静置後、ランニングバッファーで洗浄した。次に、作成したニュートラルアビジン溶液を添加し３０分間静置後、ランニングバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄した。次に、エタノールアミン・ＨＣｌ溶液（１Ｍ，ｐＨ８．５）を添加し７分静置後、１０ｍＭ  ＮａＯＨランニングバッファーで３回洗浄、さらにランニングバッファーで３回洗浄した。
【０１６３】
（８）カルボニックアンハイドラーゼのビオチン化
カルボニックアンハイドラーゼ（Bovine由来、SIGMA製）を以下の手順でビオチン化した。2mg/ml カルボニックアンハイドラーゼの1×PBS(pH7.4)溶液が0.5ml入った1.5mlマイクロチューブに0.045mg/ml SNHS-LC-LC-Biotin(PIERCE製) の1×PBS(pH7.4)溶液0.5mlを4℃で加え、4℃で2時間反応させた。反応液をマイクロチューブ上に載せたMicroconフィルター(Millipore製YM-10)に0.5ml入れ、4℃/14000g/60分遠心させた。マイクロチューブに落ちた溶液を捨て、フィルター上に0.2mlの1×PBS(pH7.4)を入れ、4℃/14000g/30分遠心させた。マイクロチューブに落ちた溶液を捨て、フィルター上に0.2mlの1×PBS(pH7.4)を入れ、4℃/14000g/30分遠心させた。フィルターを上下反転させて新しいマイクロチューブにセットし、4℃/1000g/3分遠心させてフィルター上に残った溶液を回収した。更にフィルターに0.1mlの1×PBS(pH7.4)を入れ、4℃/1000g/3分遠心させた。回収した溶液を合わせ、ビオチン化カルボニックアンハイドラーゼ溶液を得た。Microconフィルター操作により、未反応のビオチン化試薬が除かれる。カルボニックアンハイドラーゼ１分子に対して約１分子のビオチン化試薬が修飾された（ビオチン化比率約１）。蛋白の回収率はおよそ70％であった。
【０１６４】
（９）ニュートラルアビジンを固定化した試料１〜４に対するビオチン化カルボニックアンハイドラーゼの固定化
ニュートラルアビジンを固定化した試料１〜４に対して、以下の手順でビオチン化カルボニックアンハイドラーゼを固定化した。
ランニングバッファー（５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を添加し、ベースラインをとった。次に、作成したビオチン化カルボニックアンハイドラーゼ溶液を添加し３０分間静置後、ランニングバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄した。最初のベースラインからの信号変化分をビオチン化カルボニックアンハイドラーゼの固定量（ＲＵ）とした。
【０１６５】
試料４に対するビオチン化カルボニックアンハイドラーゼの固定量を１として、試料１〜３に対して固定化したビオチン化カルボニックアンハイドラーゼの固定量を相対値として表１に記載した。
【０１６６】
（１０）ベースライン変動の測定
ビオチン化カルボニックアンハイドラーゼを固定化した試料１〜４に対して、以下の手順でベースラインの変動を測定した。
ランニングバッファー（５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を添加しベースライン値（ＲＵ）を記録した。そのまま静置して１０分後に再度ベースライン値（ＲＵ）を記録した。そのベースライン値の差をベースライン変動値とし、表１に記載した。
【０１６７】
ベースライン変動値（ＲＵ）＝１０分後のベースライン値（ＲＵ）−初期のベースライン値（ＲＵ）
１０分間のベースライン変動が５ＲＵを超えると、低分子検体の結合測定に大きな支障をきたす。
【０１６８】
（１１）低分子検体の結合測定
ビオチン化カルボニックアンハイドラーゼを固定化した試料１〜４に対して、以下の手順でIndapamide（SIGMA製）の結合測定を行った。Indapamideは、カルボニックアンハイドラーゼに特異的に結合することが知られている低分子阻害剤である。まず、ランニングバッファー（５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＤＭＳＯ １０容量％）を調整した。ランニングバッファーで、Indapamideが１０μＭになるように溶解した。
【０１６９】
表面プラズモン共鳴測定装置に、ビオチン化カルボニックアンハイドラーゼを固定化した試料１〜４をセットし、ランニングバッファーを添加し、ベースラインをとった。次に、調製したIndapamide溶液を添加して１０分間静置し、さらにランニングバッファーを添加した直後の信号変化（ＲＵ）を記録した。以下の式によりIndapamide結合量（ＲＵ）を算出し、表１に記載した。
Indapamide結合量（ＲＵ）＝洗浄後の信号値（ＲＵ）−初期のベースライン値（ＲＵ）
【０１７０】
【表１】
2008076378.tif 000013
【０１７１】
表１の結果から、試料４はマイナスのベースライン変動が極めて大きく、低分子検体の結合検出が困難なことがわかる。このベースライン変動は、ビオチン化カルボニックアンハイドラーゼが、試料４表面の多量のカルボキシル基が原因で非特異吸着しており、それが徐々に解離するために起こるものと推測される。本発明の試料１〜３では、マイナスのベースライン変動は極めて小さく、低分子検体の結合検出が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】本実施形態にかかるバイオセンサーの全体斜視図である。
【図２】本実施形態にかかるセンサースティックの斜視図である。
【図３】本実施形態のセンサースティックの分解斜視図である。
【図４】本実施形態のセンサースティックの１の液体流路部分の断面図である。
【図５】本実施形態のセンサースティックの測定領域、参照領域へ光ビームが入射している状態を示す図である。
【図６】本実施形態にかかるピペットの斜視図である。
【図７】本実施形態にかかるバイオセンサーの光学測定部付近の概略図である。
【図８】本実施形態にかかる制御部とその周辺の概略ブロック図である。
【符号の説明】
【０１７３】
１０ バイオセンサー
４０ センサースティック
５４ 光学測定部
６０Ｄ  メモリ
６０ 制御部
Ｄ 生理活性物質
Ｇ１ 測定データ
Ｇ２ 参照データ
【図１】
2008076378.tif 000014
【図２】
2008076378.tif 000015
【図３】
2008076378.tif 000016
【図４】
2008076378.tif 000017
【図５】
2008076378.tif 000018
【図６】
2008076378.tif 000019
【図７】
2008076378.tif 000020
【図８】
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