(57)【要約】【課題】サンプル分離結果の判定を妨害せずリアルタイムかつ複雑な操作を行わずに分離場のｐＨ分布を正確に決定することのできるｐＨ勾配の決定方法、またこの方法を利用した等電点分離方法を提供する。【解決手段】キャリアアンフォライトを含む等電点分離用分離場におけるｐＨ勾配を決定する等電点分離用分離場のｐＨ勾配決定方法であって、相異なる既知の等電点を有する蛍光成分を複数含有するキャリアアンフォライトを用い、蛍光成分を等電点マーカーとして利用することによりｐＨ勾配を決定する、または、分離場に沿って蛍光強度分布を測定する工程と蛍光強度分布のピークを与える位置と既知の等電点とから分離場におけるｐＨ勾配を決定する工程を有する。このように決定されたｐＨ勾配を用いて被解析物の等電点を求める工程を有する等電分離方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャリアアンフォライトを含む等電点分離用分離場におけるｐＨ勾配を決定する等電点分離用分離場のｐＨ勾配決定方法であって、
相異なる既知の等電点を有する蛍光成分を複数含有するキャリアアンフォライトを用い、
該蛍光成分を等電点マーカーとして利用することによりｐＨ勾配を決定する
等電点分離用分離場のｐＨ勾配決定方法。
【請求項２】
キャリアアンフォライトを含む等電点分離用分離場におけるｐＨ勾配を決定する等電点分離用分離場のｐＨ勾配決定方法であって、
相異なる既知の等電点を有する蛍光成分を複数含有するキャリアアンフォライトを用い、
該分離場に沿って蛍光強度分布を測定する工程；および、
該蛍光強度分布のピークを与える位置と、該既知の等電点とから、該分離場におけるｐＨ勾配を決定する工程
を有する等電点分離用分離場のｐＨ勾配決定方法。
【請求項３】
前記分離場がキャピラリーである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
相異なる既知の等電点を有する蛍光成分を複数含有するキャリアアンフォライトと、被解析物とを含む試料を、分離場において等電点分離する工程；
該分離場に沿って蛍光強度分布を測定する工程；
該蛍光強度分布のピークを与える位置と、該既知の等電点とから、該分離場におけるｐＨ勾配を決定する工程；および
該ｐＨ勾配を用いて被解析物の等電点を求める工程
を有する等電分離方法。
【請求項５】
前記被解析物がタンパク質もしくはペプチドである請求項４記載の等電点分離方法。
【請求項６】
前記蛍光強度分布を測定する工程において、４００ｎｍ以上７８０ｎｍ以下の波長帯の蛍光強度を測定する請求項４または５記載の等電点分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の分析などに利用される等電点分離実行時の、分離場における水素イオン濃度（ｐＨ）勾配を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質やペプチド等の両性成分混合物を等電点分離すると、各成分固有の等電点位置に各成分が収束し分離される。このとき、見かけ上電荷がゼロとなる水素イオン濃度（ｐＨ）が等電点であり、また分離場としてはポリアクリルアミドや寒天等の固体、あるいはキャピラリー中等の液体が用いられる。分離場において、どのようにｐＨの分布が起こっているのかを知ることにより、等電点未知成分の場合にはそれらの等電点を決定することができ、等電点既知成分の場合には、分離が正しく行われているかどうかを知ることができる。
【０００３】
固体分離場の場合、最も直接的なｐＨ測定方法として、等電点分離完了後にそのスライスを作成し、各断片のｐＨを測定する方法を取ることができる。しかし液体分離場の場合には直接測定することは困難である。そこで、いずれの場合にも通常は等電点既知の物質（等電点マーカー）を同一分離場で分離し、分離終了後にそれらを用いて作成したｐＨの検量線を標準値として、分離場におけるｐＨ勾配を決定する方法が用いられる。特許文献１には蛍光検出等電点電気泳動法に好適な等電点マーカーが開示され、特許文献２には紫外線吸収検出等電点電気泳動法に好適な等電点マーカーが開示される。
【０００４】
同一成分を用いて同一条件の等電点分離を行ったとしても、毎回分離場中での絶対的位置が異なってしまうため、分離の都度ｐＨを測定しないと、今回の分離においてどの位置がどのｐＨ値を取っているのか分からない。これに加え、液体分離場を用いる場合には溶液のドリフト現象が発生し、相対的なｐＨの位置関係を保ったまま溶液自体が略平行移動するため、ある時刻における分離場のｐＨ勾配は、測定によってしか判定できない。
【特許文献１】特開平１０−１９７４８１号公報
【特許文献２】特開平１１−２３５３１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
通常１つのレーンで等電点分離が行われるため、サンプルと等電点マーカーは混合されて等電点分離される。このとき、サンプルとなる成分と同一種類の成分、例えばタンパク質やペプチドを等電点マーカーとして混合すると、サンプル中の成分とマーカー成分の区別が付けにくくなる。さりとて区別を容易にするために、等電点マーカーを大量に混合すると、それらの影響を受け等電点分離が乱れることもある。また通常これらの成分は、分離終了後に染色することにより可視化される。この場合、分離途中の段階で分離場のｐＨ分布をリアルタイムに知ることができない。
【０００６】
本発明の目的は、サンプル分離結果の判定を妨害せず、リアルタイムに、かつ複雑な操作を行わずに、分離場のｐＨ分布を正確に決定することのできるｐＨ勾配決定方法を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、等電点マーカーによってサンプル分離結果が判定されず、リアルタイムに、かつ複雑な操作を必要とせずに被解析物の等電点を知ることのできる等電点分離方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明により、キャリアアンフォライトを含む等電点分離用分離場におけるｐＨ勾配を決定する等電点分離用分離場のｐＨ勾配決定方法であって、
相異なる既知の等電点を有する蛍光成分を複数含有するキャリアアンフォライトを用い、
該蛍光成分を等電点マーカーとして利用することによりｐＨ勾配を決定する
等電点分離用分離場のｐＨ勾配決定方法が提供される。
【０００９】
本発明により、キャリアアンフォライトを含む等電点分離用分離場におけるｐＨ勾配を決定する等電点分離用分離場のｐＨ勾配決定方法であって、
相異なる既知の等電点を有する蛍光成分を複数含有するキャリアアンフォライトを用い、
該分離場に沿って蛍光強度分布を測定する工程；および、
該蛍光強度分布のピークを与える位置と、該既知の等電点とから、該分離場におけるｐＨ勾配を決定する工程
を有する等電点分離用分離場のｐＨ勾配決定方法が提供される。
【００１０】
前記分離場がキャピラリーであることができる。
【００１１】
本発明により、相異なる既知の等電点を有する蛍光成分を複数含有するキャリアアンフォライトと、被解析物とを含む試料を、分離場において等電点分離する工程；
該分離場に沿って蛍光強度分布を測定する工程；
該蛍光強度分布のピークを与える位置と、該既知の等電点とから、該分離場におけるｐＨ勾配を決定する工程；および
該ｐＨ勾配を用いて被解析物の等電点を求める工程
を有する等電分離方法が提供される。
【００１２】
前記被解析物がタンパク質もしくはペプチドであることができる。
【００１３】
前記蛍光強度分布を測定する工程において、４００ｎｍ以上７８０ｎｍ以下の波長帯の蛍光強度を測定することができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、サンプル分離結果の判定を妨害せず、リアルタイムに、かつ複雑な操作を行わずに、分離場のｐＨ分布を正確に決定する方法が提供される。
【００１５】
本発明により、等電点マーカーによってサンプル分離結果が判定されず、リアルタイムに、かつ複雑な操作を必要とせずに被解析物の等電点を知ることのできる等電点分離方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
リアルタイムに分離場のｐＨ分布を決定するとともに、サンプルの分離結果の判定を妨害しないための理想的な方法は、余分の成分を全く混合することなく、分離場のｐＨ勾配を決定できる方法である。これが実現できれば、被解析成分本来の分離パターンを観測することができるからである。
【００１７】
本発明でいうｐＨ勾配は、等電点分離を行う分離場に沿って、すなわち分離場の分離方向に、形成されるｐＨ分布を意味する。
【００１８】
等電点分離を行うための最少混合物は、被解析物とキャリアアンフォライトの水溶液である。キャリアアンフォライトは各種等電点を持つ化合物の混合体である。キャリアアンフォライトを満たした分離場の両端に、酸とアルカリの電極液を各々セットし、酸側に陽極、アルカリ側に負極の直流電圧をかけることにより、キャリアアンフォライトに含まれる各化合物は各々の等電点に収束する。その結果として分離場にｐＨ勾配が形成される。被解析物は、前記形成済ｐＨ勾配に従いそれ自身の等電点に相当するｐＨの位置へ電気泳動し停止する。
【００１９】
このことから、常にサンプル溶液に含まれており、かつ分離場のｐＨ勾配を形成するキャリアアンフォライトの等電点分布を、何らかの方法で知ることができれば、他の混合成分に関係なく、分離場のｐＨ勾配を決定できることになる。本発明者は、キャリアアンフォライトを構成する成分化合物の中に、蛍光を発する成分が複数あることを発見した。これらの等電点は不変であることから、これらの蛍光する位置を測定することにより、分離場内の絶対的ｐＨ位置を複数特定できることになり、それらを元に作成した検量線を用いれば、分離場のｐＨ勾配を決定できることになる。
【００２０】
例えばキャリアアンフォライトの蛍光成分の等電点が、ｐＨ５．０、７．０および９．０であるとする。分離場のｐＨ勾配が線形であることを別に確認してある系においては、これら３つの蛍光位置を測定すれば、その位置を元にして、少なくとも分離場における５．０〜９．０のｐＨ勾配を決定できることになる。このため液体分離場において、一度出来上がったｐＨ勾配の場がドリフト現象により、通常アルカリ側へ平行移動していくような場合にあっても、ある時刻における分離場でのｐＨ勾配を知ることが可能になる。キャリアアンフォライトの種類によっては、ｐＨ勾配が線形でなく曲線状となる物もあるが、この場合にもあらかじめ分布曲線の近似式を求めておくことにより、キャリアアンフォライトの蛍光成分の等電点情報を用いて、ある時刻における分離場でのｐＨ勾配を知ることが可能になる。
【００２１】
この方法は、市販のキャリアアンフォライト構成成分が有する蛍光性を利用して行うことができる。またキャリアアンフォライトの成分のうちの特定の等電点成分のみに意図して蛍光性を付与することにより、等電点マーカー機能を有するキャリアアンフォライトを得ることもできる。
【００２２】
タンパク質やペプチドを検出する場合には、これらの検出のために通常用いる紫外線光（２０５ｎｍ〜２８０ｎｍ付近）においては吸収特性をもたず、その他の波長帯において蛍光特性を有するキャリアアンフォライトを用いることが好ましい。
【００２３】
以上説明したように本発明によれば、通常の等電点分離を行うときに、キャリアアンフォライトの発する蛍光を測定するだけで分離場のｐＨ勾配を決定できるため、各時刻における分離場のｐＨ勾配を知ることができる。またキャリアアンフォライトは分離場のｐＨ勾配を規定する物であるから、最も信頼できる指標となる。また別のマーカーを混合しないのでサンプルの分離に悪影響を与えることもない。さらに、別のマーカーを混合しないため安価であり、導入液の準備にも余分な時間がかからない。以上のように、正確、安価、高速な等電点分離場内ｐＨ決定方法を提供することができる。
【００２４】
以下、本発明の一形態について図面を参照して説明する。なお、すべての図面において、共通の構成要素には同じ符号を付し、適宜説明を省略する。
【００２５】
本発明の方法は、キャピラリー（マイクロチップの微細流路を含む）を用いた分離場で用いることができる。しかしこれ以外の分離場においても使用できることはいうまでもない。
【００２６】
ここでは本発明の方法をマイクロチップ上の微細流路を用いて実施する場合について説明する。図１に、基板１００に形成された分離用流路１０１を有するマイクロチップを示す。分離用流路１０１の両端には液溜１５０と１５１が作製されている。分離用流路の形状は直線に特定されず、たとえば屈曲部を有してもよい。また２以上の分離用流路を有するマイクロチップであってもかまわない。分離用流路は、例えば幅５０μｍ以上１０ｍｍ以下、深さは０．３μｍ以上１ｍｍ以下に設定される。基板１００の材料として、たとえば石英もしくはガラス、プラスチック等の材料が好適に用いられる。前記分離用流路は単純な凹型構造であっても良いし、分離をより良好にするためのピラーや壁型の微細構造を有しても良く、また各種コーティングを施してあっても良い。この基板は、基板と同一材質もしくは異なる材質の板状物質もしくはシールによって覆われ、封止される。封止のための部材の材料や基板の材料として、微細流路内に入れるサンプルに照射する光およびサンプルから発せられる蛍光を透過可能な材料、例えば透明な材料を、適宜選ぶことができる。
【００２７】
等電点分離を行うためのサンプルとして、例えば、タンパク質等の被解析物とキャリアアンフォライトを含む水溶液を調製する。通常１分離あたり、１０ｐｇから１００μｇの被解析物を溶解した０．０４体積％から４体積％程度のキャリアアンフォライト水溶液を用いることができる。一般に、水よりも粘性の高い溶液における分離結果の方が良いため、ゲル成分を混合することもある。前記調製液（サンプル）を液溜１５０から導入し、毛細管現象を用いて、あるいは真空ピンセット等の外力を用いて分離用流路１０１に満たす。その後、液溜１５０に残っている余分な調製液を除去した後、液溜１５０に酸性溶液、液溜１５１にアルカリ性溶液を満たす。酸性溶液としては、希薄リン酸等が、アルカリ性溶液としては、希薄水酸化ナトリウム等を用いることができる。液溜１５０に陽極電極を、液溜１５１に陰極電極をセットし、１００〜８００ボルト／ｃｍの直流電圧を印加すると、分離用流路１０１に満たされた調製液は等電点分離を開始する。
【００２８】
このとき、分離用流路１０１を特定の波長の光で励起する機構、および前記調製液から発せられる蛍光を検出する機構を備えた装置を準備しておく。この装置としては、蛍光顕微鏡の電動ステージ上に電気泳動装置をセットし、蛍光強度測定装置を付加したシステムを用いることができ、また専用の蛍光スキャナーを用いることができる。励起用光源の例としては、レーザー、ＬＥＤ、フィルターを付加したキセノンランプなどが挙げられる。また検出装置の例としては、光電子増倍管（ＰＭＴ）、フォトダイオードアレイ、ＡＰＤ（アバランシェフォトダイオード）等が挙げられる。このような蛍光検出機構を用いることにより、各時刻における分離用流路１０１内での蛍光強度をモニタすることができる。例えば、蛍光検出波長として生物実験でよく用いられるＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の蛍光観察用フィルターセットを装着した蛍光顕微鏡と電動ステージの組み合わせを利用することができる。
【００２９】
キャリアアンフォライトとして、ベックマンコールター社製のｃＩＥＦ  Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ  ３−１０（製品コード４７７４９１）（商品名）を用いて調製したサンプルを観察すると、等電点分離が進むにつれて、複数の蛍光バンドが観察される。
【００３０】
一方、前記ｃＩＥＦ  Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ  ３−１０（製品コード４７７４９１）（商品名）を用いて調製したサンプル中にＦｌｕｋａ社製の蛍光等電点マーカーセット（Ｐ／Ｎ１７９５１；  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＩＥＦ−Ｍａｒｋｅｒ−Ｍｉｘ  ｆｏｒ  ＣＥ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（商品名）を混合した溶液をサンプルとして用い、これらマーカーの等電点分布からｐＨ勾配を決定する。すると、このキャリアアンフォライトを用いると、分離場でのｐＨ勾配はほぼ線型となることが分かる。したがって、一度キャリアアンフォライト由来蛍光バンドの各等電点を決定しておけば、ｐＨ勾配に関する検量線を描くことができる。この検量線から、あらかじめ有効と判明しているｐＨレンジで、分離場でのｐＨ分布を決定できる。
【００３１】
ＧＦＰの蛍光観察用フィルターセットを透過する蛍光の波長は、４３０ｎｍ以上５１０ｎｍ以下であり、通常タンパク質やペプチドを検出するために用いる紫外線光（２０５ｎｍ〜２８０ｎｍ付近）とは異なる波長である。従ってこの波長帯の蛍光と、被解析物のシグナルとを混同することはなく、タンパク質やペプチドの分析のために好適である。ここでは蛍光波長としてＧＦＰを例に挙げたが、他の波長を利用しても構わない。例えば、蛍光強度分布を測定する工程において、４００ｎｍ以上７８０ｎｍ以下の波長帯の蛍光強度を測定することができる。
【実施例】
【００３２】
（実施例１）
以下においては、前述の形態のマイクロチップの場合を例に、具体的な実施例を説明する。
【００３３】
マイクロチップとして、マイクロ化学技研社製のＩＣＣ−ＤＩ  ０５型（商品名）ガラスチップを用いた。このマイクロチップは、基板１００の材料としてほう珪酸ガラスを用い、基板１００上に直線状の微細流路を作製し、さらに分離用流路１０１が微細流路となるように、ほう珪酸ガラス板を接着して封止したマイクロチップである。このマイクロチップには平行した２本の直線流路があるが、同時に１本しか使用せず、実際には図１と同様の構成であるため図１を用いて説明する。
【００３４】
実際には、マイクロチップは、分離用流路１０１の液溜部１５０と１５１にガラスリザーバを接着してから使用した。
【００３５】
導入サンプル溶液として、キャリアアンフォライト、サンプルに粘性を与えるためのゲル、紫外線励起で蛍光を発する等電点マーカーの混合物を用いた。具体的にはベックマンコールター社製のｃＩＥＦ  Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ  ３−１０（製品コード４７７４９１）（商品名）２体積％、ベックマンコールター社製のｃＩＥＦゲル（製品コード４７７４９７）（商品名）９６体積％、Ｆｌｕｋａ社製の蛍光等電点マーカーセット（Ｐ／Ｎ１７９５１；  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＩＥＦ−Ｍａｒｋｅｒ−Ｍｉｘ  ｆｏｒ  ＣＥ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（商品名）２体積％を混合した溶液をサンプルとして用いた。
【００３６】
等電点分離の様子を蛍光観察するために、上記マイクロチップを、ツァイス社製蛍光顕微鏡（商品名：ＡｘｉｏＰｌａｎ  ２  Ｉｍａｇｉｎｇ）に取り付けたＸＹ電動ステージ上に設置し、あらかじめマイクロチップ上に設けておいた位置合わせ用マークを用いて、ＸＹ方向のアライメントを行った。また蛍光顕微鏡には２種類の蛍光フィルターをセットし、それらを入れ替えて異なる波長に対する蛍光を観察できるようにした。その１つはキャリアアンフォライトが発する蛍光を検出するためのものであり、ＧＦＰ観察用として販売されているＮｏ．０９［励起フィルター（ＢＰ４５０−４９０）、ダイクロイックミラー（ＦＴ５１０）、バリアフィルター（ＬＰ５１５）］である（ツァイス社製の商品名）。もう１つの蛍光フィルターは蛍光等電点マーカーを観察するための物で、波長に合わせて３枚を特に組み合わせたフィルターセットであり、［励起フィルター（３３０ＷＢ６０）、ダイクロイックミラー（４００ＤＣＬＰ）、バリアフィルター（４００ＡＬＰ）］（オメガオプティカル社製の商品名）である。
【００３７】
次にプラス側の液溜１５０にはリン酸水溶液（濃度：０．１Ｍ（濃度の単位のＭはモル／リットルを示す））、マイナス側の液溜１５１には水酸化ナトリウム（濃度：０．０２Ｍ）を満たした。液溜１５０、液溜１５１中に電極（不図示）を配置し、これら分離用流路電極間に直流電圧を印加した。具体的には、流路長約６０ｍｍに対し、両端の液溜間に直流電圧３５００Ｖを印加した。
【００３８】
通電開始から約２分後に等電点分離が完了した。分離用流路１０１内においては、キャリアアンフォライトによるｐＨ勾配が作成されるとともに、蛍光等電点マーカーセットの５つの成分が、各々の等電点に収束バンドを形成した。この等電点分離が進む様子は、３０秒ごとに通電を停止し、流路に沿ってＸＹ電動ステージを移動させることにより、蛍光顕微鏡に取り付けた光電子増倍管（ＰＭＴ）が受光した蛍光量をプロットすることで実施した。
【００３９】
まず、蛍光等電点マーカーの分離検出を行った。分離完了後に分離用流路１０１に沿って蛍光強度分布の測定を行い、各マーカー成分が示したピーク（各バンドの中で最も蛍光の強い位置）と、流路端（マイナス側）からの距離をプロットしたものが図２である。このように５つのマーカーはほぼ直線の検量線に乗る。したがって少なくともｐＨ４．０〜９．０の範囲では、流路中の位置を用いて対応するｐＨの値を逆算できることになる。
【００４０】
次にＧＦＰ用の蛍光フィルターに切り替えて分離用流路１０１に沿った蛍光強度分布を測定すると、キャリアアンフォライト由来の蛍光分布が観察される。
【００４１】
ただし、前記蛍光マーカーの蛍光シグナルと干渉するため、複雑な蛍光強度パターンを示す。そこで、蛍光等電点マーカーを入れないサンプルを調製して、蛍光強度パターンの確認を行った。具体的にはベックマンコールター社製のｃＩＥＦ  Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ  ３−１０  （製品コード４７７４９１）（商品名）２体積％、ベックマンコールター社製のｃＩＥＦゲル（製品コード４７７４９７）（商品名）９８体積％のみを混合した溶液をサンプルとして用いた。このサンプルについて流路端（マイナス側）からの距離を横軸、蛍光強度を縦軸にとった蛍光強度パターンを得た。そして流路端からの距離を図２に示される相関を用いて等電点（ｐＨ）に換算することによって横軸を等電点にした。この結果を図３に示す。各ピークが酸性側に寄った位置（ｐＨ４．３−６．２）にあることが判明したため、等電点分離完了後も通電を継続し、各ピークが観察しやすい流路中央部に来るまでドリフト現象を利用して、液をアルカリ側へ移動させてある。
【００４２】
また、前記蛍光マーカーを混合したサンプルを用いた実験において、ドリフト現象によりアルカリ側へ液全体が平行移動していく場合にあっても、ｐＨ勾配の直線関係が崩れないことを確認している。
【００４３】
図３に示すように４つの特徴的なピークを観測でき、これらは再現性良く観測された。酸性側の端に現れた、検量線を用いた外挿値でｐＨ２．３となるピークは、何に由来するか明らかでなかったので、マーカーとして利用しなかった。よってこれら４つのピークのうちの３つである、４．３、４．６および６．２の３ピークについては絶対的内部等電点標準として利用できる。したがって少なくとも４．３〜６．２の等電点範囲における、等電点標準として用いることが可能であり、実用上はさらに広い範囲で利用可能であると考えられる。
【００４４】
実際にタンパク質サンプルを用いて実験を行った。タンパク質の分離位置を確認するため、蛍光色素Ｃｙ３（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）で染色した物を用いた。手順として、まず本タンパク質と蛍光マーカーを混合したサンプルを用い、蛍光マーカーを指標としてタンパク質の等電点を確認した。次に本タンパク質のみを用いたサンプルにより、キャリアアンフォライトの蛍光性によりその等電点を測定し、ほぼ一致する値が得られることを確認した。以下具体的に説明する。
【００４５】
タンパク質としてトリプシンインヒビター（シグマアルドリッチ社製）を用意し、そのシステイン残基をＣｙ３でラベルして用いた。１５ｍｇ／ｍｌに溶解したタンパク質溶液１０μｌに対し、２ｍＭ  ＴＣＥＰ（リン酸トリス２−クロロエチル）水溶液（インビトロジェン社製。商品名：Ｔ−２５５６）を１．５μｌ、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス−塩酸緩衝液）（ｐＨ８．０）（ナカライテスク社製。商品名：０２４３５−１５）を１８．５μｌ混合し、３７℃で１時間反応した。続いて２ｍＭ  Ｃｙ３溶液（溶媒：ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド））（関東化学社製。商品名：１０３４４−０７）を２μｌ混合し、３７℃で３０分反応した。反応後透析により過剰溶液を除去したものを、蛍光タンパク質とした。これを１．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液として調製した。
【００４６】
まず、上記タンパク質と蛍光マーカーを混合したサンプル溶液として、ｃＩＥＦ  Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ  ３−１０（製品コード４７７４９１）（商品名）２体積％、ベックマンコールター社製のｃＩＥＦゲル（製品コード４７７４９７）（商品名）９４体積％、Ｆｌｕｋａ社製の蛍光等電点マーカーセット（Ｐ／Ｎ１７９５１；  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＩＥＦ−Ｍａｒｋｅｒ−Ｍｉｘ  ｆｏｒ  ＣＥ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（商品名）２体積％、前記タンパク質水溶液２体積％を混合した溶液をサンプルとして用いた。等電点分離の様子を蛍光観察するために、前述のマイクロチップを、ツァイス社製蛍光顕微鏡（商品名：ＡｘｉｏＰｌａｎ  ２  Ｉｍａｇｉｎｇ）に取り付けたＸＹ電動ステージ上に設置し、あらかじめマイクロチップ上に設けておいた位置合わせ用マークを用いて、ＸＹ方向のアライメントを行った。また蛍光顕微鏡には２種類の蛍光フィルターをセットし、それらを入れ替えて異なる波長に対する蛍光を観察できるようにした。その１つは前記蛍光タンパク質が発する蛍光を検出するためのものであり、波長に合わせて３枚を特に組み合わせたフィルターセットであり、［励起フィルター（ＢＰ５２５／４５）、ダイクロイックミラー（ＦＴ５６０）、バリアフィルター（ＢＰ５９５／６０）］（オメガオプティカル社製）である。もう１つの蛍光フィルターは蛍光等電点マーカーを観察するための物で、波長に合わせて３枚を特に組み合わせたフィルターセットであり、［励起フィルター（３３０ＷＢ６０）、ダイクロイックミラー（４００ＤＣＬＰ）、バリアフィルター（４００ＡＬＰ）］（オメガオプティカル社製の商品名）である。
【００４７】
プラス側の液溜１５０にはリン酸水溶液（濃度：０．１Ｍ）、マイナス側の液溜１５１には水酸化ナトリウム（濃度：０．０２Ｍ）を満たした。液溜１５０、液溜１５１中に電極（不図示）を配置し、これら分離用流路電極間に直流電圧を印加した。具体的には、流路長約６０ｍｍに対し、両端の液溜間に直流電圧３５００Ｖを印加した。通電開始から約２分後に等電点分離が完了した。分離用流路１０１内においては、キャリアアンフォライトによるｐＨ勾配が作成されるとともに、蛍光等電点マーカーセットの５つの成分が、各々の等電点に収束バンドを形成した。さらに蛍光タンパク質がその等電点に収束バンドを形成した。図２と同様の結果を得て、ｐＨ４．０〜９．０の範囲の検量線を作成した。次に蛍光タンパク質用の蛍光フィルターに切り替えて分離用流路１０１に沿った蛍光強度分布を測定すると、トリプシンインヒビター由来の蛍光分布が観察される。このピーク位置から推定されるトリプシンインヒビターの等電点は４．６であった。
【００４８】
次に、前記タンパク質のみのサンプル溶液として、ｃＩＥＦ  Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ  ３−１０（製品コード４７７４９１）（商品名）２体積％、ベックマンコールター社製のｃＩＥＦゲル（製品コード４７７４９７）（商品名）９６体積％、前記タンパク質水溶液２体積％を混合した溶液をサンプルとして用いた。等電点分離の様子を蛍光観察するために、前述のマイクロチップを、ツァイス社製蛍光顕微鏡（商品名：ＡｘｉｏＰｌａｎ  ２  Ｉｍａｇｉｎｇ）に取り付けたＸＹ電動ステージ上に設置し、あらかじめマイクロチップ上に設けておいた位置合わせ用マークを用いて、ＸＹ方向のアライメントを行った。また蛍光顕微鏡には２種類の蛍光フィルターをセットし、それらを入れ替えて異なる波長に対する蛍光を観察できるようにした。その１つはキャリアアンフォライトが発する蛍光を検出するためのものであり、ＧＦＰ観察用として販売されているＮｏ．０９［励起フィルター（ＢＰ４５０−４９０）、ダイクロイックミラー（ＦＴ５１０）、バリアフィルター（ＬＰ５１５）］である（ツァイス社製の商品名）。もう１つの蛍光フィルターは［励起フィルター（ＢＰ５２５／４５）、ダイクロイックミラー（ＦＴ５６０）、バリアフィルター（ＢＰ５９５／６０）］（オメガオプティカル社製の商品名）である。
【００４９】
プラス側の液溜１５０にはリン酸水溶液（濃度：０．１Ｍ）、マイナス側の液溜１５１には水酸化ナトリウム（濃度：０．０２Ｍ）を満たした。液溜１５０、液溜１５１中に電極（不図示）を配置し、これら分離用流路電極間に直流電圧を印加した。具体的には、流路長約６０ｍｍに対し、両端の液溜間に直流電圧３５００Ｖを印加した。通電開始から約２分後に等電点分離が完了した。分離用流路１０１内においては、キャリアアンフォライトによるｐＨ勾配が作成されるとともに、蛍光タンパク質がその等電点に収束バンドを形成した。まず、キャリアアンフォライトの発する蛍光検出を行った。分離完了後に分離用流路１０１に沿って蛍光強度分布の測定を行い、図３と同様の結果を得た。これらのピークにより、ｐＨ４．３〜６．２の検量線を描くことが出来た。次に蛍光タンパク質用の蛍光フィルターに切り替えて分離用流路１０１に沿った蛍光強度分布を測定すると、トリプシンインヒビター由来の蛍光分布が観察された。この結果、トリプシンインヒビターの等電点を４．６と推定することが出来た。このことから、タンパク質サンプルについても本手法が適用でき、ペプチドに対しても同様に適用可能である。
【００５０】
以上説明したように、本発明によれば、相異なる既知の等電点を有する蛍光成分を複数含有するキャリアアンフォライトを用い、この蛍光成分を等電点マーカーとして利用することによりｐＨ勾配を決定することができる。蛍光成分の化合物を特定する必要はない。分離場においてｐＨ勾配を形成した状態のキャリアアンフォライトについて分離場に沿った蛍光強度分布を測定した際に、複数の位置において蛍光ピークが観察されるキャリアアンフォライトを用いればよい。これら複数の位置における等電点（ｐＨ）を予め知っておく。
【００５１】
キャリアアンフォライトの蛍光成分に由来する等電点を知るには、先に述べたようにすればよい。つまり、別途用意した等電点マーカーとキャリアアンフォライトとを含む試料を等電点分離し、分離場において等電点マーカーの収束位置からｐＨ勾配を決定し、このｐＨ勾配からキャリアアンフォライトの蛍光成分に由来する等電点を知ることができる。
【００５２】
このようなキャリアアンフォライトを用いれば、実際に被解析物を等電点分離する際においても、次のようにしてｐＨ勾配を決定することができる。すなわち、ｐＨ勾配が形成された分離場に沿って蛍光強度分布を測定し、キャリアアンフォライトの蛍光成分に由来する蛍光強度分布のピークを与える位置と、その蛍光成分の既知の等電点とから分離場の或る位置におけるｐＨを知ることができる。キャリアアンフォライトが相異なる既知の等電点を有する蛍光成分を複数含有すれば、分離場の複数の位置においてｐＨを知ることができる。よって分離場のｐＨ勾配を決定することができる。このｐＨ勾配に基づいて、分離場における被解析物の集束位置のｐＨを求めれば、そのｐＨが被解析物の等電点である。
【００５３】
従って、相異なる既知の等電点を有する蛍光成分を複数含有するキャリアアンフォライトを用いた等電点電気泳動法によって、キャリアアンフォライトとは別に等電点マーカーを用いずとも、分離場のｐＨを決定でき、さらにはタンパク質等の被解析物の等電点を求めることができる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の方法は、タンパク質やペプチドなどを等電点によって分離もしくは同定する際に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明において用いることのできるマイクロチップの構成を示す平面図である。
【図２】実施例において蛍光性等電点マーカーにより作成した検量線を示す。
【図３】実施例において測定した、キャリアアンフォライトの発する分離用流路における蛍光強度分布を示す。
【符号の説明】
【００５６】
１００  基板
１０１  分離用流路
１０２  分離用流路
１５０  液溜
１５１  液溜
【図１】
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【図２】
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【図３】
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