(57)【要約】【課題】白血球に対して刺激が小さく、細胞損傷の少ない、小動物の白血球分離方法及び該方法に使用する分離液の提供。【解決手段】比重を調整した分離液を用いる密度勾配遠心分離法により小動物の白血球を分離する方法であって、比重が１．１２４２〜１．１３９０である分離液を用いることを特徴とする小動物の白血球分離方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
比重を調整した分離液を用いる密度勾配遠心分離法により小動物の白血球を分離する方法であって、比重が１．１２４２〜１．１３９０である分離液を用いることを特徴とする小動物の白血球分離方法。
【請求項２】
比重１．０７７の分離液及び比重１．０８３の分離液と併用する請求項１記載の白血球分離方法。
【請求項３】
比重が１．１２４２〜１．１３９０である小動物の白血球分離液。
【請求項４】
請求項３記載の分離液と、比重１．０７７の分離液及び１．０８３の分離液とを含んで構成される小動物の白血球分離用キット。
【請求項５】
比重１．１２４２〜１．１３９０の分離液、比重１．０７７の分離液及び比重１．０８３の分離液を用いて密度勾配遠心分離することにより分離した白血球画分中の活性酸素を検出する活性酸素検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、実験用小動物の白血球分離方法及び白血球活性酸素の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血球は、細菌やウイルスなどの有害外来因子に対して、活性酸素を産生して無害化する、各種生理活性物質を分泌して体内の免疫系を賦活化する、あるいは炎症反応を調整するなど生体防御における重要な役割を担っている。特に、白血球の活性酸素産生量は生体内で最大であり、且つ生体の応答を経時的に観察する重要な試料であるから、白血球が産生する活性酸素量を正確に測定することは極めて重要である。
【０００３】
活性酸素量の測定は、白血球を分離してから測定するが、活性酸素はその性質上、刺激に敏感に反応して産生量が変動してしまうため、従来、白血球の分離には、赤血球を溶血除去する溶血法ではなく、細胞への刺激が小さいフィコール溶液などを用いて比重を調整した分離液を使用する密度勾配遠心分離法が利用されてきた。ヒトの白血球分離用として、比重１．０７７及び１．１１９に調整した分離液が市販されており、これを重層することで効率良くヒト白血球各画分を得ることができる。
【０００４】
しかしながら、ラットやマウスなどの実験用小動物を用いた試験は、ヒトの臨床試験に先立って行われる頻度が高い試験であり、小動物の血液試料は実験材料として頻繁に使用されているにもかかわらず、小動物の白血球分離には、単核球（単球及びリンパ球混在）分離液（比重１．０８３）の及びリンパ球分離液（比重１．０９０）が市販されているのみで、多核球（好中球、好酸球、好塩基球）画分を分取するにはリンパ球以外の細胞成分が混在する画分をとり、画分中の赤血球を溶血除去する溶血法を採用しなければならなかった。
溶血法は白血球に対して刺激が大きく、細胞を損傷してしまうため、この方法で得た多核球の活性酸素産生量は安定せず再現性に欠ける、信頼性の低いものであった。そのため、活性酸素産生検出方法の改良が求められていたが、実験用小動物の白血球各粗画分の比重に関するデータは全く知られていないのが現状であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、白血球に対して刺激が小さく、細胞損傷の少ない、小動物の白血球分離方法及び該方法に使用する分離液を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、小動物の多核球分離用に新たな比重液を調製し、これを従来の比重液と併用すれば、細胞を傷つけることなく小動物の白血球を分離でき、単核球及び多核球を同時に分取できることを見出した。また、得られた白血球画分を用いて活性酸素産生を検出したところ、従来の方法に比較して極めて高感度で検出できることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、比重を調整した分離液を用いる密度勾配遠心分離法により小動物の白血球を分離する方法であって、比重が１．１２４２〜１．１３９０である分離液を用いることを特徴とする小動物の白血球分離方法を提供するものである。
また、本発明は、比重が１．１２４２〜１．１３９０である小動物の白血球分離液を提供するものである。
また、本発明は、上記分離液と、比重１．０７７の分離液及び１．０８３の分離液とを含んで構成される小動物の白血球分離用キットを提供するものである。
さらに、本発明は、比重１．１２４２〜１．１３９０の分離液、比重１．０７７の分離液及び比重１．０８３の分離液を用いて密度勾配遠心分離することにより分離した白血球画分中の活性酸素を検出する活性酸素検出方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、細胞に損傷を与えることなく、簡便且つ迅速に小動物の白血球各画分を得ることができる。また、本発明の活性酸素検出方法は再現性があり、且つ検出感度が高いので、抗酸化剤の効果などをより明確に検証することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において用いる分離液は、室温（２０〜２５℃）における比重が１．１２４２〜１．１３９０の範囲であり、好ましくは１．１２４３〜１．１３２３の範囲、より好ましくは、１．１２８３〜１．１２８９の範囲である。
【００１０】
分離液は、細胞に悪影響を及ぼさず、刺激が小さい上記の比重を呈する液体であればその組成は特に限定されないが、例えばりん酸緩衝生理食塩水等の緩衝液に、細胞への刺激が小さい高分子化合物、例えば、ショ糖とエピクロロヒドリンの共重合体であるフィコール（商標、ＳＩＧＭＡ社）、ポリエチレングリコール、デキストラン等を用いて、比重を上記範囲になるように調整した溶液を用いることができる。また、市販の血球分離液、例えばヒト用リンパ球比重分離液（比重１．１１９；Sigma-Aldrich社）を用いて、該分離液と高分子化合物を１ｍＬ：０．００５ｇ〜０．０２０ｇ、好ましくは１ｍＬ：０．０１０ｇ〜０．０１５ｇ、より好ましくは１ｍＬ：０．０１２９ｇ〜０．０１３０ｇの割合で正確に混合し、比重を上記範囲に調整することにより調製してもよい。
分離液の調製に用いられる高分子化合物としては、細胞への刺激が小さいものであれば特に限定されず、例えばフィコール、デキストランなどが挙げられ、特にフィコールが好ましく、フィコールを用いる場合は分子量４０万のものが特に好ましい。また、分離液には、各種塩類、生理活性物質、抗酸化物などを適宜配合することができる。
【００１１】
上記の分離液と比重１．０７７の分離液及び比重１．０８３の分離液を用いて、密度勾配遠心分離することにより小動物の白血球を分離することができる。具体的には、遠心チューブに最下層から、本発明の分離液、比重１．０７７の分離液、比重１．０８３の分離液の順にそれぞれ重層し、血液を添加して遠心分離することにより行われる。そのため、本発明の分離液は、予め比重１．０７７の分離液と比重１．０８３の分離液とキット化しておくのが好ましい。
なお、比重１．０７７の分離液及び比重１．０８３の分離液は、それぞれヒト単核球分離液（Sigma-Aldrich社）及び小動物単核球分離液（Sigma-Aldrich社）として市販されており、これを購入して用いてもよいし、フィコール溶液、コンレイ液、蒸留水などを混合して調製してもよい。
【００１２】
上記白血球の分画に際しては、より正確な分離を可能にする観点から、本発明の比重１．１２４２〜１．１３９０の分離液１容量に対し、比重１．０７７の分離液及び比重１．０８３の分離液をそれぞれ０．５〜１．５容量ずつ重層するのが好ましく、特に０．７５〜１．２５容量ずつ重層するのが好ましく、さらにそれぞれ１容量ずつ重層するのが好ましい。
【００１３】
本発明において小動物から採取された血液は、１．５倍から４倍、好ましくは２倍から３倍、さらに好ましくは２倍に希釈することが望ましい。希釈に用いる溶液はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）が好ましい。また希釈に用いる溶液は天然物、化合物、天然由来の生理活性物質などを含むことができる
【００１４】
活性酸素の測定結果は、中枢神経系の興奮や抑制によって大きく影響されるため、添加する血液は、採血終了とほぼ同時に麻酔から覚醒するようにセボフレンなどの導入が速やかで覚醒後の影響が少ない薬剤を使用して用いて浅く麻酔した小動物から迅速に頚静脈から採血した全血を用いるのが好ましい。
希釈全血はより正確な分離を可能にする観点から、本発明の比重１．１２４２〜１．１３９０の分離液１容量に対し、１＜かつ≦４容量重層するのが好ましく、特に２〜３容量重層するのが好ましい。
【００１５】
本発明において、血液を遠心分離する方法は、２０００〜２１００ｒ／ｍｉｎ、１７〜２５℃で２０〜４０分、より好ましくは２０２０〜２０５０ｒ／ｍｉｎで２０〜４０分行う。また、遠心チューブは、例えば市販のディスポーザブル遠沈管等を用いることができる。
【００１６】
後記実施例で示すとおり、本発明の分離方法を用いれば、小動物の血液は遠心分離により赤血球画分、多核球画分、単核球画分及び血漿にそれぞれ分離する。このうち多核球画分及び単核球画分を分取して活性酸素の検出に用いることができる。
ここで、活性酸素とは、スーパーオキシドアニオンラジカルやヒドロキシラジカル等のラジカル、過酸化水素、一重項酸素、一酸化窒素、二酸化窒素、オゾン、過酸化脂質（ＬＯＯＨ又はＬＯＯ・のラジカル等）、ハロゲン化酸素などが挙げられる。
【００１７】
活性酸素の検出は、従来知られている方法が用いられ、例えば蛍光試薬を添加してフローサイトメトリーにて測定する方法、化学発光試薬を用いてルミノメーターにて測定する方法などが挙げられる。
【００１８】
本発明において小動物とは、ヒト以外の小型哺乳類であれば特に限定されず、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類を例示できる。
【実施例】
【００１９】
１）実験材料及び方法
（ａ）白血球分離液の調整
フィコール４００（ｔｙｐｅ４００−ＤＬ、ＳＩＧＭＡ社）約１．２５から１．３５ｇを正確に測り取り、比重１．１１９の血球分離液（Sigma-Aldrich社）１００ｍＬに加えて静かに室温（２５℃）で溶解した。このときの室温における比重は約１．１２４２から１．１３９０であった。
また、同様にフィコール４００（ｔｙｐｅ４００−ＤＬ、ＳＩＧＭＡ社）１．２ｇを正確に測り取り、比重１．１１９の血球分離液（Sigma-Aldrich社）１００ｍＬに加えて、比重１．１２４０〜１．１３２３（１．１８１）の分離液を調製した。なお、比重は電子天秤（Ｍｅｔｔｌｅｒ  ＡＧ−２８５）で測定した。
【００２０】
（ｂ）ラット全血試料の準備
12週齢のSHR  雄性ラット（ｎ＝３）をセボフレンを用いて浅く麻酔した。血液試料は浅い麻酔下のラットを解剖台に固定し、採血終了とほぼ同時に麻酔から覚醒するように迅速に頸静脈から採取した。採取した血液試料はヘパリン加燐酸緩衝生理食塩水（５〜５０Ｕ／ｍｌ）で３倍容量に希釈した。
【００２１】
（ｃ）遠心分離方法
下記表１に示すように、各比重の分離液を遠心チューブ（Ｆａｌｃｏｎ社）に下層から、最下層（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の順序でそれぞれ１容ずつ静かに重層し、さらに最上層（ｄ）に希釈全血を２〜３容静かに重層した。２０４０ｒｐｍで３０分、２１℃で遠心分離した。
結果を表１に示す。
【００２２】
＜分離状態の評価＞
○：各分画分離
△：一部分離不十分
×：分離せず
【００２３】
【表１】
2008076156.tif 000002
【００２４】
２）結果
本発明の分離液、比重１．０７７の分離液及び比重１．０８３の分離液を用いて遠心分離操作を行った場合は、希釈全血は、遠心チューブの下層から比重の重い赤血球画分、多核球画分、単核球画分、血漿の順にそれぞれ分離し、白血球各画分を分取することができた。
【００２５】
３）活性酸素の検出
上記（１）、（２）で分離した試料４、５及び６の各画分から単核球画分及び多核球画分をパスツールピペットで分取した。回収した単核球画分及び多核球画分に蛍光試薬H2−DCFDA（Molecular Probes社）１０μMをそれぞれ添加し、室温で３０分間反応させた後、白血球中の活性酸素量をフローサイトメトリー（日本ベクトンディッキンソン社）にて測定した。
結果を図１に示す。図１から明らかなように、本発明による活性酸素の検出ピーク強度は１０3〜１０4であり、従来法の検出ピーク強度１０2と比べて約１００倍の感度で検出できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、従来法と本発明の方法による活性酸素の検出結果を示したものである。Ｘ軸は蛍光強度、Ｙ軸はその蛍光強度を示す細胞の数を示す。
【図１】
2008076156.tif 000003