(57)【要約】【課題】位相物体の分布を高速・簡便に把握することが可能となる観察装置を提供すること。【解決手段】明部と暗部とを繰り返して形成された面光源１４と、前記面光源で照明された被観察物１０からの光を結像する結像光学系１２と、前記結像光学系を介して前記被観察物の像を撮像する撮像手段１１とを有し、前記面光源が所定の条件を満足する観察装置１。【選択図】図１
2008268599.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明部と暗部とを繰り返して形成された面光源と、
前記面光源で照明された被観察物からの光を結像する結像光学系と、
前記結像光学系を介して前記被観察物の像を撮像する撮像手段とを有し、
前記面光源は、以下の条件を満足することを特徴とする観察装置。
０．５＜ｗｂ／ｗｄ＜２．０
ｄ×ｓｉｎθ０＜ｍｉｎ（ｗｂ、ｗｄ）／４
但し、
ｍｉｎ（ｗｂ、ｗｄ）：ｗｂとｗｄの小さい方の値
ｄ  ：前記面光源と前記被観察物との距離
ｓｉｎθ０：前記結像光学系の開口数、
ｗｂ：前記結像光学系の物体面上から主光線を前記面光源方向に延長したときの前記明部の前記被観察物面上における幅、
ｗｄ：前記結像光学系の物体面上から主光線を前記面光源方向に延長したときの前記暗部の前記被観察物面上における幅
【請求項２】
明部と暗部とを繰り返して形成された面光源と、
前記面光源で照明された被観察物からの光を結像する結像光学系と、
前記結像光学系を介して前記被観察物の像を撮像する撮像手段とを有し、
前記面光源は、以下の条件を満足することを特徴とする観察装置。
ｄ×ｓｉｎθ０＜（ｗｄ−ｗｂ）／４
但し、
ｄ  ：前記面光源と前記被観察物との距離
ｓｉｎθ０：前記結像光学系の開口数、
ｗｂ：前記結像光学系の物体面上から主光線を前記面光源方向に延長したときの前記明部の前記被観察物面上における幅、
ｗｄ：前記結像光学系の物体面上から主光線を前記面光源方向に延長したときの前記暗部の前記被観察物面上における幅
【請求項３】
請求項１または２に記載の観察装置において、
前記面光源を光軸に垂直な面内にシフトするシフト手段を有し、
前記シフト手段により前記面光源を少なくとも２回シフトさせ前記観察物の像をそれぞれ撮像することを特徴とする観察装置。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の観察装置において、
前記撮像手段により撮像された前記観察物の画像を処理する画像処理手段を有し、
前記画像処理手段は、前記少なくとも２回シフトさせて取得したそれぞれの画像から前記観察物の情報を取得することを特徴とする観察装置。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の観察装置において、
前記結像光学系は、前記被観察物の全領域を一度に観察可能であることを特徴とする観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞などの透明な位相物体を広い視野で観察する観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の培養に際して、培養状況の確認のためなどに、培養容器中の細胞の分布や量を確認するための観察が行われている。その際、細胞は多くの場合吸収のほとんどない位相物体であり、通常の観察では細胞の有無を観察するのは困難であり、多くの場合、光学顕微鏡による観察に際して暗視野観察または位相差観察により細胞透過による位相変化を明暗変化に変換して観察を行われる（例えば、非特許文献１、２参照）。
【非特許文献１】小松啓，「光学顕微鏡の基礎と応用（３）」，応用物理，第６０巻，第１９号，１９９１年， ｐ１０３２−ｐ１０３４
【非特許文献２】小松啓，「光学顕微鏡の基礎と応用（４）」，応用物理，第６０巻，第１１号，１９９１年， ｐ１１３６−ｐ１１３８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、顕微鏡の視野は数ｃｍ以上のサイズを持つ培養容器に比べて小さいため、被観察物の全体を見るためには視野を多数回移動させる必要があり、観察時間が掛かってしまう。また、視野の大きな観察装置を作成しようとすると、被観察物を照明する照明装置が大掛かりになる上、細胞の培養容器の端部付近では培養容器の側壁が障害となって観察が難しくなるという問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決するため、本発明は、明部と暗部とを繰り返して形成された面光源と、前記面光源で照明された被観察物からの光を結像する結像光学系と、前記結像光学系を介して前記被観察物の像を撮像する撮像手段とを有し、前記面光源は、以下の条件を満足することを特徴とする観察装置を提供する。
０．５＜ｗｂ／ｗｄ＜２．０
ｄ×ｓｉｎθ０＜ｍｉｎ（ｗｂ、ｗｄ）／４
【０００５】
但し、ｍｉｎ（ｗｂ，ｗｄ）はｗｂとｗｄの小さい方の値、ｄは前記面光源と前記被観察物との距離、ｓｉｎθ０は前記結像光学系の開口数、ｗｂは前記結像光学系の物体面上から主光線を前記面光源方向に延長したときの前記明部の前記被観察物面上における幅、ｗｄは前記結像光学系の物体面上から主光線を前記面光源方向に延長したときの前記暗部の前記被観察物面上における幅をそれぞれ表す。
【０００６】
また、本発明は、明部と暗部とを繰り返して形成された面光源と、前記面光源で照明された被観察物からの光を結像する結像光学系と、前記結像光学系を介して前記被観察物の像を撮像する撮像手段とを有し、前記面光源は、以下の条件を満足することを特徴とする観察装置を提供する。
ｄ×ｓｉｎθ０＜（ｗｄ−ｗｂ）／４
【０００７】
但し、ｄは前記面光源と前記被観察物との距離、ｓｉｎθ０は前記結像光学系の開口数、ｗｂは前記結像光学系の物体面上から主光線を前記面光源方向に延長したときの前記明部の前記被観察物面上における幅、ｗｄは前記結像光学系の物体面上から主光線を前記面光源方向に延長したときの前記暗部の前記被観察物面上における幅をそれぞれ表す。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、位相物体の分布を高速・簡便に把握することが可能となる観察装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の一実施の形態にかかる観察装置について図面を参照しつつ説明する。
【００１０】
図１は、実施の形態にかかる観察装置の全体構成図である。図２は、観察装置の光学系部分の作用を説明する概念図である。図３は、面光源の物体面における輝度分布を模式的に示す図である。
【００１１】
図１において、観察装置１は、面光源となるバックライト付きの透過型液晶パネル１４と、被観察物１０を載置するステージ（標本台）１３と、被観察物の像を結像する結像光学系１２と、結像光学系１２で結像された被観察物１０の像を撮像する撮像素子１１と、透過型液晶パネル１４の明るさや位置を制御するコントローラ１５と、撮像素子１１からの画像の画像処理やコントローラ１５の制御等を行うコンピュータ１６（以後、ＰＣと記す）と、ＰＣ１６で画像処理された被観察物１０の画像やコントローラ１５の制御情報等を表示するモニター１７などから構成されている。
【００１２】
ステージ１３に載置されている被観察物１０は、例えば、無染色の細胞が収められた透明な培養容器（例えば、径３５ｍｍのシャーレなど）である。また、ステージ１３は、透過型液晶パネル１４で照明された被観察物１０の略全域を観察可能にするために、被観察物１０を載置する領域が照明光を遮らないように、全体または培養器の載置領域、例えば、ガラス等の透明部材で構成されている。なお、培養容器が細胞領域に比べ大きい場合には、観察する領域を中空とし培養容器の周辺を支持するように構成しても良い。
【００１３】
結像光学系１２の視野は十分に大きく、被観察物１０の略全域から射出した光は、結像光学系１２によって捉えられ、撮像素子１１の撮像面上に結像する。撮像素子１１は、ＰＣ１６からの指示に応じて撮像面上の画像（輝度分布）を取得する。その画像は、ＰＣ１６へ取り込まれ、ＰＣ１６に設けられた画像処理部１８で画像処理が施されモニター１７上へ表示される。
【００１４】
なお、コンピュータ１６は、撮像素子１１で撮像された被観察物の画像処理前の画像や画像処理後の画像を不図示のメモリに必要に応じて保存することができる。また、画像処理前後の画像を必要に応じてモニター１７へ表示することができる。
【００１５】
また、コントローラ１５は、ＰＣ１６からの指示に応じて、透過型液晶パネル１４で明部と暗部とを繰り返し形成したパターンを表示する。透過型液晶パネル１４は各種の明部と暗部の周期パターンを形成可能であるが、ここでは、明部と暗部とが互いに平行に形成されたストライプパターンを用いた場合を代表として説明する。このとき、透過型液晶パネル１４によって、ストライプ状の面光源１４が形成される。また、コントローラ１５は、ＰＣ１６からの指示に基づき透過型液晶パネル１４を結像光学系１２の光軸に対して垂直な面内でシフトすることが可能である。
【００１６】
面光源１４の明暗（１４ｂ、１４ｄ）の数十ピッチが結像光学系１２の視野内に存在し、面光源１４の明部１４ｂの幅と暗部１４ｄがほぼ１対１の比（デューティー比）であり、結像光学系１２の焦点は、物体面１０ａに合っているものとする。この結果、撮像素子１１上の面光源１４の像はボケており、面光源１４の像のピッチ方向の輝度分布は図３に示すように、ほぼ一定強度の明部ｌｂ、暗部ｌｄ、及び強度が変化する遷移領域ｌｔとなる。また遷移領域ｌｔの幅は、面光源１４と被観察物１０の距離と結像光学系１２の開口数の積に比例して変化する。なお、面光源１４には、明部１４ｂ、暗部１４ｄの二値のパターンあるいはグレースケールパターンの何れも採用できるが、以下の説明では明部１４ｂ、暗部１４ｄの二値のパターンを用いた場合について説明する。
【００１７】
図３に示す、結像光学系１２の物体面１０ａにおける面光源１４の明部ｌｂ、暗部ｌｄ、遷移領域ｌｔは、以下の式（１）〜（３）で示される。
（１）  ｌｂ＝ｗｂ−２×ｄ×ｓｉｎθ０
（２）  ｌｄ＝ｗｄ−２×ｄ×ｓｉｎθ０
（３）  ｌｔ＝２×ｄ×ｓｉｎθ０
【００１８】
ここで、ｄは面光源１４と被観察物１０（物体面１０ａ）の距離、ｓｉｎθ０は結像光学系１２の物体側開口数である。ｗｂは結像光学系１２の物体面１０ａ上から主光線を面光源１４方向に延長したときの明部１４ｂの物体面１０ａ上における幅、ｗｄは結像光学系１２の物体面１０ａ上から主光線を面光源１４方向に延長したときの暗部１４ｄの物体面１０ａ上における幅をそれぞれ表す。
【００１９】
続いて、被観察物１０が存在する場合の面光源１４のストライプパターンの強度変化について説明する。被観察物１０が細胞などの位相物体である場合、この位相物体による散乱角θ（前方散乱の場合にθ＝０）への散乱効率をｓ(θ)、結像光学系１２の開口数をｓｉｎθ０、被観察物１０側からみた面光源１４の明部ｌｂ領域をΩとした場合、ストライプパターンの明部ｌｂに相当する位置で位相物体が存在することによる強度の減少量は下記の式（４）で与えられる。
【数４】
2008268599.tif 000003
【００２０】
ここで、αは面光源１４から被観察物１０への入射角、βは被観察物１０から結像光学系１２への出射角であり、両者ともベクトル量である。また、散乱効率は入射方位角には依存しないものとした。
【００２１】
続いて、ストライプパターンの暗部ｌｄに相当する位置で位相物体が存在することによる強度の増加量は下記の式（５）で与えられる。
【数５】
2008268599.tif 000004
【００２２】
細胞のような位相物体における散乱効率s(θ)は一般にθがゼロで最大で、θが大きくなると急激に減少するため、強度変化の効果を十分に得るためには物体がどの位置にあっても|α−β|が小さいことが好ましい。すなわち、物体面１０ａにおけるストライプパターンの幅ｗｂ、ｗｄは小さいことが好ましい。
【００２３】
一方、図３に示す遷移領域ｌｔでは両者の効果が混在するため、打ち消しあって強度変化量は小さくなる。したがって、この遷移領域ｌｔを観察や測定に使用することは好ましくない。この遷移領域ｌｔを狭くするには、結像光学系１２の開口数（ｓｉｎθ０）を小さくするか面光源１４と被観察物１０を接近させることが効果的であるが、両方とも強度変化に寄与できる散乱角を大きくする効果があるため、結像光学系１２の開口数を小さくしすぎたり面光源１４と被観察物１０を接近させすぎると強度変化量が低下してしまい好ましくない。
【００２４】
このように、位相物体による強度変化を大きくする条件と遷移領域ｌｔを狭くする条件は一般に相反するため、実用的には両者の最適値を用いることが要求されることがわかる。
【００２５】
本実施の形態にかかる観察装置では、培養容器中（被観察物１０）の全領域を測定することを考え、かつ遷移領域をｌｔをゼロにできないため、ストライプパターンを有する面光源１４を少なくとも２回光軸に垂直な方向にシフトさせて測定を行う構成としている。その際に、少なくとも２回の測定で遷移領域ｌｔが重ならず、かつストライプパターンの幅ｗｂ、ｗｄを比較的小さくすることが実用上は好ましい。なお、シフトする方向は、ストライプパターンｗｂ、ｗｄの長手方向に直交する方向である。
【００２６】
また、明部１４ｂと暗部１４ｄの両方が測定に使用できる場合、この条件は、ｌｂ、ｌｄがｌｔよりも大きいということに対応し、これは、以下の条件式（６）、（７）
ｄ×ｓｉｎθ０＜ｗｄ／４      （６）
ｄ×ｓｉｎθ０＜ｗｂ／４      （７）
に相当する。ここで、式（６）と（７）を１つの式にまとめ、
ｄ×ｓｉｎθ０＜ｍｉｎ（ｗｂ、ｗｄ）／４
と表す。ｍｉｎ（ｗｂ、ｗｄ）はｗｂとｗｂの小さい方の値を取ることを意味する。
【００２７】
また、被観察物１０の位置による強度変化量が位置にかかわらずに同程度であることが好ましいということから、物体面１０ａにおける明部１４ｂと暗部１４ｄの幅ｗｂ、ｗｄの比率は、以下の条件式（８）を満足することが望ましい。
０．５＜ｗｂ／ｗｄ＜２．０      （８）
【００２８】
ところで、明部ｌｂに関しては、光の強度が大きいため、測定の際にノイズが大きくなりがちである。特に、光源のムラが比較的大きい場合は、物体によるムラとの判別が困難となるため、明部ｌｂを測定に利用することは好ましくない。一方、暗部ｌｄのみを測定に利用することにすれば光源の品質が低くても測定を行うことができる。２回の測定で全体をカバーすることを考えると、暗部ｌｄの領域がストライプパターンのピッチＰの半分以上となるようにする必要があり、以下の条件式（９）を満足することが望ましい。
ｄ×ｓｉｎθ０＜（ｗｄ−ｗｂ）／４      （９）
【００２９】
この場合、（９）式から明らかなように発光部分の比率を大きく低下させる必要がある。この条件を満たそうとすると、強度変化量の位置による変化が大きくなることがある。具体的な強度変化量は細胞の性質に依存するため一概には言えないが、検出精度が大きく変化しないよう留意する必要がある。
【００３０】
以下に、実施の形態にかかる観察装置の結像シミュレーション結果について説明する。
【００３１】
図４は、シミュレーションに使用した細胞の模式図である。
【００３２】
シミュレーションを行う際の各パラメータは、面光源１４の波長５００ｎｍ,面光源１４と被観察物１０との間隙ｄ＝２５ｍｍ、結像光学系１２の開口数ｓｉｎθ０＝０．００５３とする。このときｄ×ｓｉｎθ０＝０．１３２５ｍｍである。
【００３３】
被観察物１０として、図４に示すような細胞質Ｃ１と核Ｃ２のみからなる細胞Ｃを想定し、細胞Ｃが４つ密着して横に並んでいるものとする。結像光学系１２の開口数が小さいので、個々の細胞Ｃのサイズは解像限界以下である。
【００３４】
また、細胞質Ｃ１は媒質との屈折率差ｄｎ＝０．０２、細胞Ｃの大きさを３０μｍの正方形（ただし角部分が曲率半径５μｍで丸くなっている）、細胞核Ｃ２の媒質との屈折率差ｄｎ＝０．０４、細胞核の直径１０μｍの円形としている。
【００３５】
面光源１４からの入射光は細胞Ｃを光軸に平行方向に直進し、透過時の位相差により散乱効果が生じるとして解析を行っている。
【００３６】
まず、面光源１４のストライプパターンの物体面上１０での幅ｗｂ＝ｗｄ＝１ｍｍの場合の結果を示す。この条件では、条件式（６）〜（８）を満たしている。
【００３７】
図５に結像シミュレーションによる結果の例を示す。ここでは、ｐｏｓｉｔｉｏｎ（−１）〜（０）が面光源１４の明部１４ｂに、ｐｏｓｉｔｉｏｎ（０）〜（＋１）が暗部１４ｄに対応している。４個の細胞Ｃからなる細胞群の中心がｐｏｓｉｔｉｏｎ（−０．５）、ｐｏｓｉｔｉｏｎ（０）、ｐｏｓｉｔｉｏｎ（＋０．５）にある場合の結果をそれぞれ、細い実線、太い実線、破線で示している。縦軸の値は任意である。
【００３８】
図５において、細胞群の中心が図３に示す明部ｌｂ、暗部ｌｄの中心であるｐｏｓｉｔｉｏｎ（±０．５）の位置では、図５の細い実線と、破線の変化が示すように強度変化が大きいが、遷移領域ｌｔであるｐｏｓｉｔｉｏｎ（０）にある場合は太い実線が示すように強度変化が小さいことがわかる。
【００３９】
強度変化を明らかにするために、細胞群によるトータルでの強度変化量の相対値を示したものを図６に示す。ここでの縦軸は、バックグラウンドパターンの明部ｌｂと暗部ｌｄの強度差が1となるように強度変化量を規格化したもので、強度変化量に関しては符号を除いた絶対値を取っている。強度変化量は、図５に示すグラフにおいて、｜∫（Ｉ／Ｉ０）ｄｘ｜を示す。また、横軸はｐｏｓｉｔｉｏｎ（−０．５）から（＋０．５）までを拡大して示している。
【００４０】
図６より、遷移領域ｌｔ（ｐｏｓｉｔｉｏｎ（−０．１３）〜（＋０．１３））の間では強度変化量が小さいが、明部ｌｂ（ｐｏｓｉｔｉｏｎ（＜−０．１３））や暗部ｌｄ（ｐｏｓｉｔｉｏｎ（＞＋０．１３））においては大きいことがわかる。
【００４１】
さらに、条件式（９）が満たされているｗｂ＝０．５ｍｍ、ｗｄ＝１．５ｍｍの場合のシミュレーション結果を図７に示す。縦軸は強度変化量、横軸はｐｏｓｉｔｉｏｎを示す。暗部ｌｄでの強度変化量の最低値は図６の場合よりも小さいが、暗部ｌｄではノイズが小さいことが期待できるため、強度変化量が比較的小さい領域でも検出が可能となる。
【００４２】
以上述べたように、実施の形態にかかる観察装置によれば、面光源１４で形成される明暗からなる照明光を用い、面光源１４を少なくとも２回シフトさせて被観察物の像を撮像すると共に、条件式（６）から条件式（８）または条件式（９）を満足することによって位相物体の分布状態を、高感度に検出することができる。また、位相物体の分布状態を高速かつ簡便に検出することができ、細胞培養の管理が容易になる。
【００４３】
なお、上記実施の形態では、面光源として透過型液晶パネルを示したが、これに限らず種々設計可能であり、例えばストライプパターンをマスクとして背面から均一な光を照射して面光源とすることも可能である。また、面光源はストライプパターン以外の、市松状パターン、同心円状パターンなどであっても同様の効果を奏することができる。
【００４４】
なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本実施の形態にかかる観察装置の全体構成図である。
【図２】本観察装置の光学系部分の作用を説明する概念図である。
【図３】面光源の物体面における輝度分布を模式的に示す図である。
【図４】シミュレーションに使用した細胞の模式図である。
【図５】細胞群の中心位置が変化した際の強度変化のシミュレーション結果を示す。
【図６】ストライプパターン幅がｗｂ＝１ｍｍ、ｗｄ＝１ｍｍの場合の強度変化量のシミュレーション結果。
【図７】ストライプパターン幅がｗｂ＝０．５ｍｍ、ｗｄ＝１．５ｍｍの場合の強度変化量のシミュレーション結果。
【符号の説明】
【００４６】
１    観察装置
１０  被観察物
１１  撮像素子
１２  結像光学系
１３  ステージ
１４  透過型液晶パネル（面光源）
１５  コントローラ
１６  パーソナルコンピュータ
１７  モニター
１８  画像処理部
【図１】
2008268599.tif 000005
【図２】
2008268599.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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