(57)【要約】      （修正有）【課題】ジアホラーゼの活性やその耐熱性の程度が、所定レベル以上の変異型タンパク質を提供する。【解決手段】特定の天然型アミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、酵素活性値２４５以上のジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質、さらには、酵素活性値２４５以上であって、かつ、加熱処理後の残存酵素活性率が４１％以上のジアホラーゼ活性を有する耐熱性変異型タンパク質。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の天然型アミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、
酵素活性値２４５以上のジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質。
【請求項２】
立体構造中における補酵素結合部位近傍の疎水性を野生型タンパク質よりも高くする変異構造を有することを特徴とする請求項１記載の変異型タンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質の補酵素に対する構造保護性を強固にする変異構造を有することを特徴とする請求項１記載の変異型タンパク質。
【請求項４】
加熱処理後の残存酵素活性率が２７％以上であることを特徴とする請求項３記載の変異型タンパク質。
【請求項５】
加熱処理後の残存酵素活性率が４１％以上であることを特徴とする請求項３記載の変異型タンパク質。
【請求項６】
配列番号１の天然型アミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、
酵素活性値１７０以上のジアホラーゼ活性を有し、かつ、加熱処理後の前記残存酵素活性率が４１％以上である変異型タンパク質。
【請求項７】
好熱性バチルス属細菌由来のジアホラーゼ活性を有するタンパク質の変異型である請求項１記載の変異型タンパク質。
【請求項８】
好熱性バチルス属細菌由来のジアホラーゼ活性を有するタンパク質の変異型である請求項６記載の変異型タンパク質。
【請求項９】
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のジアホラーゼ活性を有するタンパク質の変異型である請求項７記載の変異型タンパク質。
【請求項１０】
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のジアホラーゼ活性を有するタンパク質の変異型である請求項８記載の変異型タンパク質。
【請求項１１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに該当する請求項２記載の変異型タンパク質。
（ａ）配列番号２〜７、９、１２、１５、１６、１８、１９、２２、２５、２６、２９、３０、３２〜４０、４２〜５６のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）前記（ａ）のいずれかのアミノ酸配列において、一若しくは複数のアミノ酸残基が、さらに欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに該当する請求項４記載の変異型タンパク質。
（ａ）配列番号２〜５、９、１８、２２、２６、３２〜３７、３９、４０、４２、４３、４４〜４９、５１〜５６のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）前記（ａ）のいずれかのアミノ酸配列において、一若しくは複数のアミノ酸残基が、さらに欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに該当する請求項５記載の変異型タンパク質。
（ａ）配列番号２、３、１８、２６、３２〜３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４５〜４９、５１、５３〜５５のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）前記（ａ）のいずれかのアミノ酸配列において、一若しくは複数のアミノ酸残基が、さらに欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに該当する請求項６記載の変異型タンパク質。
（ａ）配列番号２、３、１８、２３、２６、２７、３２〜３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４５〜４９、５１、５３〜５５のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）前記（ａ）のいずれかのアミノ酸配列において、一若しくは複数のアミノ酸残基が、さらに欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質に関する。より詳しくは、酵素活性、さらには耐熱性の程度が所定レベル以上のジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、生命の維持に係わる多くの反応を生体内の温和な条件下で円滑に進める生体内触媒である。この酵素は、生体内で代謝回転し、生体内で必要に応じて生産されて、その触媒機能を発揮する。
【０００３】
現在、この酵素を生体外で利用する技術が、既に実用化されたり、あるいは実用化に向けた検討が行われたりしている。例えば、有用物質の生産、エネルギー関連物質の生産、測定又は分析、環境保全、医療などの様々な技術分野において、酵素の利用技術が進展している。比較的近年では、燃料電池の一種である酵素電池（例えば、特許文献１参照）、酵素電極、酵素センサー（酵素反応を利用して化学物質を計測するセンサー）などの技術も提案されている。
【０００４】
この酵素の化学的本体はタンパク質であるので、酵素は、熱やｐＨの程度によって変性する性質を有する。このため、酵素は、金属触媒などの他の化学的触媒に比べて生体外での安定性が低い。従って、酵素を生体外で利用する場合は、環境の変化に対して酵素をより安定的に働かせて、その活性を持続させるようにすることが重要である。
【０００５】
酵素を生体外で利用する場合、酵素自体の性質や機能を人工的に改変させる方法や酵素の働く場所の環境を工夫する方法などのアプローチが採用されることになる。前者の方法では、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を人工的に変化させ、この変化させた遺伝子を大腸菌等の生物の中で発現させることによって人工的に変異したタンパク質を作製し、そして、利用目的にあった機能や性質を備える変異型タンパク質を選別（スクリーニング）することが一般的に行われている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００４−７１５５９号公報。
【特許文献２】特開２００４−２９８１８５号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ジアホラーゼの生体外での広範な利用可能性を視野に入れ、ジアホラーゼの活性やその耐熱性の程度が所定レベル以上の変異型タンパク質を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、配列番号１の天然型アミノ酸配列（アミノ酸残基数２１１）において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、酵素活性値２４５以上のジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質を提供し、さらには、酵素活性値２４５以上であって、かつ、加熱処理後の残存酵素活性率２７％以上、さらに好適には、加熱処理後の残存酵素活性率４１％以上のジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質を提供する。
【０００８】
また、配列番号１の天然型アミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、酵素活性値１７０以上のジアホラーゼ活性を有し、かつ、加熱処理後の前記残存酵素活性率が４１％以上である変異型タンパク質を提供する。
【０００９】
これらの変異型タンパク質は、例えば、好熱性バチルス属細菌、特にバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のジアホラーゼ活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であり、より具体的には、配列番号２〜５６のアミノ酸配列を有する変異型タンパク質を挙げることができる。
【００１０】
なお、配列番号２のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１３９番位置のリシン（Lysine）がアスパラギン（Asparagine）に置換されているとともに、Ｎ末端から１８７番位置のアラニン(Alanine)がグルタミン酸(Glutamic asid)に置換されている（以下、略記号Ｋ１３９Ｎ／Ａ１８７Ｅ）。配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１０５番目位置のフェニルアラニン(Phenylalanine)がロイシン(Luecine)に置換されている（以下、略記号Ｆ１０５Ｌ）。配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１２２番位置のグリシン（Glycine）がアスパラギン酸（Aspartic acid）に置換されている（以下、略記号Ｇ１２２Ｄ）。配列番号５のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１３１番位置のグリシン（Glycine）がグルタミン酸（Glutamic asid ）に置換されている（以下、略記号Ｇ１３１Ｅ）。配列番号６のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１４６番位置のアラニン（Alanine）がグリシン（Glycine）に置換されている（以下、略記号Ａ１４６Ｇ）。配列番号７のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１４７番位置のアルギニン（Arginine）がヒスチジン（Histidine）に置換されている（以下、略記号Ｒ１４７Ｈ）。
【００１１】
配列番号８のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から３４番位置のヒスチジンがグルタミンに置換されている（以下、略記号Ｈ３４Ｑ）。配列番号９のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１０５番位置のフェニルアラニンがヒスチジンに置換されている（以下、略記号Ｆ１０５Ｈ）。配列番号１０のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１１３番位置のアラニンがグルタミン酸に置換されている（以下、略記号Ａ１１３Ｅ）。
【００１２】
配列番号１１のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１２３番位置のリシンがグルタミン酸に置換されている（以下、略記号Ｋ１２３Ｅ）。配列番号１２のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１３９番位置のリシンがアスパラギンに置換されている（以下、略記号Ｋ１３９Ｎ）。配列番号１３のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１４７番位置のアルギニンがセリンに置換されている（以下、略記号Ｒ１４７Ｓ）。配列番号１４のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１４９番位置のグリシンがアスパラギン酸に置換されている（以下、略記号Ｇ１４９Ｄ）。配列番号１５のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１５４番位置のグリシンがアスパラギン酸に置換されている（以下、略記号Ｇ１５４Ｄ）。配列番号１６のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１５６番位置のアラニンがグルタミン酸に置換されている（以下、略記号Ａ１５６Ｅ）。配列番号１７のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１５９番位置のメチオニンがスレオニンに置換されている（以下、略記号Ｍ１５９Ｔ）。配列番号１８のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１８７番位置のアラニンがグルタミン酸に置換されている（以下、略記号Ａ１８７Ｅ）。配列番号１９のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１８７番位置のアラニンがスレオニンに置換されている（以下、略記号Ａ１８７Ｔ）。配列番号２０のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１８７番位置のアラニンがバリンに置換されている（以下、略記号Ａ１８７Ｖ）。
【００１３】
配列番号２１のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から６４番位置のアルギニンがヒスチジンに、１４６番位置のアラニンがスレオニンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｒ６４Ｈ／Ａ１４６Ｔ）。配列番号２２のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から８５番位置のグルタミン酸がアスパラギン酸に、１４７番位置のアルギニンがヒスチジンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｅ８５Ｄ／Ｒ１４７Ｈ）。配列番号２３のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１０５番位置のフェニルアラニンがロイシンに、１８７番位置のアラニンがグルタミン酸に、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｆ１０５Ｌ／Ａ１８７Ｅ）。配列番号２４のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１１３番位置のアラニンがグルタミン酸に、１２６番位置のリシンがアスパラギンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ａ１１３Ｅ／Ｋ１２６Ｎ）。配列番号２５のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１５１番位置のチロシンがヒスチジンに、１８７番位置のアラニンがグルタミン酸に、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｙ１５１Ｈ／Ａ１８７Ｅ）。配列番号２６のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１２２番位置のグリシンがアスパラギン酸に、１８７番位置のアラニンがグルタミン酸に、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｇ１２２Ｄ／Ａ１８７Ｅ）。配列番号２７のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１４９番位置のグリシンがアスパラギン酸に、１８７番位置のアラニンがグルタミン酸に、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｇ１４９Ｄ／Ａ１８７Ｅ）。配列番号２８のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１４９番位置のグリシンがセリンに、１８７番位置のアラニンがグルタミン酸に、２０７番位置のロイシンがトリプトファンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｇ１４９Ｓ／Ａ１８７Ｅ／Ｌ２０７Ｗ）。配列番号２９のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１０５番位置のフェニルアラニンがロイシンに、１８７番位置のアラニンがグルタミン酸に、２０７番位置のロイシンがトリプトファンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｆ１０５Ｌ／Ａ１８７Ｅ／Ｌ２０７Ｗ）。配列番号３０のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から６６番位置のグリシンがアルギニンに、１０５番位置のフェニルアラニンがロイシンに、１８７番位置のアラニンがグルタミン酸に、１９２番位置のリシンがアルギニンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｇ６６Ｒ／Ｆ１０５Ｌ／Ａ１８７Ｅ／Ｋ１９２Ｒ）。
【００１４】
配列番号３１のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１４６番位置のアラニンがグリシンに、２０７番位置のロイシンがトリプトファンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ａ１４６Ｇ／Ｌ２０７Ｗ）。配列番号３２のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１０５番位置のフェニルアラニンがロイシンに、１８７番位置のアラニンがグルタミン酸に、１７１番位置のグルタミンがプロリンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｆ１０５Ｌ／Ａ１８７Ｅ／Ｑ１７１Ｐ）。配列番号３３のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から７８番位置のアラニンがグルタミン酸に、１０５番位置のフェニルアラニンがロイシンに、１８７番位置のアラニンがグルタミン酸に、それぞれ置換されている（以下、略記号Ａ７８Ｅ／Ｆ１０５Ｌ／Ａ１８７Ｅ）。配列番号３４のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１０５番位置のフェニルアラニンがロイシンに、１４９番位置のリシンがアスパラギンに、１６８番位置のバリンがロイシンに、１８７番位置のアラニンがグルタミン酸に、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｆ１０５Ｌ／Ｋ１４９Ｎ／Ｖ１６８Ｌ／Ａ１８７Ｅ）。配列番号３５のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１５４番位置のグリシンがアスパラギン酸に、１８０番位置のグリシンがアルギニンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｇ１５４Ｄ／Ｇ１８０Ｒ）。配列番号３６のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１０７番位置のフェニルアラニンがイソロイシンに置換されている（以下、略記号Ｆ１０７Ｉ）。配列番号３７のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１８５番位置のグリシンがアルギニンに置換されている（以下、略記号Ｇ１８５Ｒ）。配列番号３８のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１５１番位置のチロシンがヒスチジンに、１８５番位置のグリシンがアルギニンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｙ１５１Ｈ／Ｇ１８５Ｒ）。配列番号３９のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１２２番位置のグリシンがアスパラギン酸に、１８５番位置のグリシンがアルギニンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｇ１２２Ｄ／Ｇ１８５Ｒ）。配列番号４０のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１４９番位置のグリシンがアスパラギン酸に、１８５番位置のグリシンがアルギニンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｇ１４９Ｄ／Ｇ１８５Ｒ）。
【００１５】
配列番号４１のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１４９番位置のグリシンがアスパラギン酸に、１８５番位置のグリシンがアルギニンに、２０８番位置のアラニンがバリンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｇ１４９Ｄ／Ｇ１８５Ｒ／Ａ２０８Ｖ）。配列番号４２のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１０７番位置のフェニルアラニンがイソロイシンに、１８５番位置のグリシンがアルギニンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｆ１０７Ｉ／Ｇ１８５Ｒ）。配列番号４３のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１０７番位置のフェニルアラニンがイソロイシンに、１８５番位置のグリシンがアルギニンに、２０８番位置のアラニンがバリンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｆ１０７Ｉ／Ｇ１８５Ｒ／Ａ２０８Ｖ）。配列番号４４のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１０７番位置のフェニルアラニンがイソロイシンに、１８５番位置のグリシンがアルギニンに、１７１番位置のグルタミンがプロリンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｆ１０７Ｉ／Ｇ１８５Ｒ／Ｑ１７１Ｐ）。配列番号４５のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から８０番位置のバリンがアスパラギン酸に、１０７番位置のフェニルアラニンがイソロイシンに、１８５番位置のグリシンがアルギニンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｖ８０Ｄ／Ｆ１０７Ｉ／Ｇ１８５Ｒ）。配列番号４６のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１０７番位置のフェニルアラニンがイソロイシンに、１３９番位置のリシンがアスパラギンに、１６８番位置のバリンがロイシンに、１８５番位置のグリシンがアルギニンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｆ１０７Ｉ／Ｋ１３９Ｎ／Ｖ１６８Ｌ／Ｇ１８５Ｒ）。配列番号４７のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１３９番位置のリシンがアスパラギンに置換されている（以下、略記号Ｆ１５０Ｖ）。配列番号４８のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１９３番位置のアラニンがグルタミン酸に置換されている（以下、略記号Ａ１９３Ｅ）。配列番号４９のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１５０番位置のフェニルアラニンがバリンに、１９３番位置のアラニンがアルギニンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｆ１５０Ｖ／Ａ１９３Ｅ）。配列番号５０のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１５１番位置のチロシンがヒスチジンに、１９３番位置のアラニンがグルタミン酸に、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｙ１５１Ｈ／Ａ１９３Ｅ）。
【００１６】
配列番号５１のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１２２番位置のグリシンがアスパラギン酸に、１９３番位置のアラニンがグルタミン酸に、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｇ１２２Ｄ／Ａ１９３Ｅ）。配列番号５２のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１４９番位置のグリシンがアスパラギン酸に、１９３番位置のアラニンがグルタミン酸に、２０８番位置のアラニンがバリンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｇ１４９Ｄ／Ａ１９３Ｅ／Ａ２０８Ｖ）。配列番号５３のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１５０番位置のフェニルアラニンがバリンに、１９３番位置のアラニンがグルタミン酸に、２０８番位置のアラニンがバリンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｆ１５０Ｖ／Ａ１９３Ｅ／Ａ２０８Ｖ）。配列番号５４のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１５０番位置のフェニルアラニンがバリンに、１９３番位置のアラニンがグルタミン酸に、１７１番位置のグルタミンがプロリンに、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｆ１５０Ｖ／Ａ１９３Ｅ／Ｑ１７１Ｐ）。配列番号５５のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から８０番位置のバリンがアスパラギン酸に、１５０番位置のフェニルアラニンがバリンに、１９３番位置のアラニンがグルタミン酸に、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｖ８０Ｄ／Ｆ１５０Ｖ／Ａ１９３Ｅ）。配列番号５６のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１３９番位置のリシンがアスパラギンに、１５０番位置のフェニルアラニンがバリンに、１６８番位置のバリンがロイシンに、１９３番位置のアラニンがグルタミン酸に、それぞれ置換されている（以下、略記号Ｋ１３９Ｎ／Ｆ１５０Ｖ／Ｖ１６８Ｌ／Ａ１９３Ｅ）。
【００１７】
以上の変異型タンパク質には、配列番号２〜５６のアミノ酸配列からなる変異型タンパク質のほか、そのいずれかのアミノ酸配列において、一若しくは複数のアミノ酸残基が、さらに欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質も包含される。
【００１８】
ここで、本発明に関連する主たる技術用語について説明する。
【００１９】
「ジアホラーゼ（Diaphorase）」は、NADH又はNADPHをフェリシアン化カリウム、メチレンブルー、2,6-ジクロルインドフェノール、テトラゾリウム塩等の色素で酸化する反応を触媒する活性（即ち、ジアホラーゼ活性）を持つ酵素であり、細菌、酵母等の微生物から哺乳類動物まで広く分布する。このジアホラーゼは、生体内の電子伝達系において重要な役割を果たし、このジアホラーゼによって、NAD+又はNADP+依存性の脱水素酵素類による基質からの脱水素反応により生成されるNADH又はNADPHは、電子受容体で酸化され、電子受容体は還元型となる。
【００２０】
「変異型タンパク質」とは、タンパク質を構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基の並び順を人工的に変えることにより得られた遺伝子から発現させたタンパク質である。
【００２１】
「酵素活性値」とは、一般には、ある定まった条件におけるある反応の触媒反応速度のことを意味する。本発明においては、Nicotinamide dinucleotide, reduced form (NADH)による2-amino-1,4-naphthoquinone(ANQ)の還元反応により、Nicotinamide dinucleotide, oxidized form (NAD+)及び2-amino-1,4-dihidroxynaphtheneを生じる反応の触媒反応速度であり、具体的には、25℃、アルゴン雰囲気下ないしは窒素雰囲気下、0.1Mリン酸カリウム緩衝液中、0.3mM ANQ、40mM NADH存在下において単位時間当たり1molの酵素が触媒する反応によって生じる生成物のmol数（したがって単位はsec-1）である。なお、酵素活性値２４５以上は、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のジアホラーゼ活性を有する天然型タンパク質の約１．５倍以上に相当する。
【００２２】
「加熱処理後の残存酵素活性率（residual activity）」は、「酵素活性残存率」、あるいは「酵素活性維持率」と称してもよく、酵素に対して所定の加熱処理を施したときに、その前後で活性がどのように変化するかを表した値である。すなわち、加熱処理の前後において、同一条件で酵素活性測定を行い、加熱処理後の活性値が処理前に比べてどれだけ存在するかを百分率で表した値である。本発明においては、前記「加熱処理」は、緩衝液中８０℃での１０分間静置処理であり、この加熱処理前後における、前記酵素活性値の比を百分率で表している。なお、加熱処理後の残存酵素活性率４１％以上は、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のジアホラーゼ活性を有する天然型タンパク質の約１．５倍以上に相当する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る変異型タンパク質は、ジアホラーゼの活性又はその耐熱性、あるいはその両方の程度が所定レベル以上である。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）。
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のジアホラーゼ（Diaphorase）のクローニングと発現及び精製。
【００２５】
（１-１）Bacillus stearothermophilusからゲノムDNAの単離・精製。
Bacillus stearothermophilusは、理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）から分譲を受けた（JCM No.2501,NCBIのdiaphorase geneのaccession number:AF112858）。Bacillus stearothermophilusの凍結乾燥体を寒天培地Ａ上、55℃で一晩培養した。
【００２６】
このようにして得られたコロニーを新しい寒天培地Ａ上にて同様に培養して、清浄なコロニーとして、ここから一部を取り出して液体培地Ａ中55℃で一晩培養した。遠心分離により集菌し、Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega社)を使用して、ゲノムDNAを単離した(方法の詳細は製品添付の取扱説明書)。なお、培地Ａの組成は次の「表１」のとおり(１Ｌ中、pH7.0-7.2に調整)。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
（１-２）ジアホラーゼ（Diaphorase）遺伝子のクローニング。
前記（１-１）で得られたゲノムDNAからPCRによりジアホラーゼ遺伝子をクローニングした。DNA polymeraseにはPfu DNA polymerase (Stratagene社)を使用し、プライマーとしては、以下の「表２」の配列のものを使用した。
【００２９】
【表２】
2008048703.tif 000004
【００３０】
次に、ＰＣＲ産物のジアホラーゼ遺伝子をPCR Cleanup Kit（Qiagen社）を使って精製し、アガロース電気泳動により確認した。また、ＤＮＡシーケンサーにより塩基配列の確認を行った。
【００３１】
（１-３）ジアホラーゼ遺伝子のベクターへの導入。
ジアホラーゼ遺伝子のクローニングした断片をBamH IとNde Iにより処理し、PCR Cleanup Kit（Qiagen社）を使って精製した。また、ベクターpET12a (Novagen社)をBamH IとNde Iにより処理し、同様に精製した。これら２種類の断片をT4 ligaseによりligationし、産物によってXL1-blue electrocompetent cell (Stratagene社)を形質転換してLB-amp培地で培養を行い、増産した。
【００３２】
得られたプラスミドをBss Iで処理し、アガロース電気泳動でジアホラーゼ遺伝子の挿入を確認し、塩基配列を測定・解析した。すると、データベース(ＮＣＢＩ)の塩基配列との間に若干の差があった。これは、理化学研究所の微生物系統保存施設より取得した株とデータベースの株に若干の違いがあったために、クローニングしたDIとデータベースのDIの遺伝子配列に不一致があったためと思われる。遺伝型（塩基配列）については１１箇所、そのうち表現型（アミノ酸配列）において２残基にて不一致があった（表３参照）。
【００３３】
【表３】
2008048703.tif 000005
【００３４】
そこで、この２箇所のアミノ酸残基をデータベースのもの同様に修正した遺伝子を、Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene社)を使って作成した。なお、この遺伝子を「pET12a-BsDI」と命名した。
【００３５】
（１-４）大腸菌の形質転換。
前記pET12a-BsDIをE. coli BL21 (DE3) (Novagen社)にヒートショック法により導入、形質転換を行った。SOC中で１hr、37℃で前培養後、LB-amp寒天培地に展開、コロニーの一部を液体培養し、ジアホラーゼの発現をSDS-pageで確認した。
【００３６】
（１-５）形質転換体の凍結保存サンプル。
前記（１-４）で得られた形質転換体培養液３ｍＬを遠心分離し、大腸菌ペレットに2XYT培地を加えて分散させて-80℃で保存した。
【００３７】
（１-６）大量培養とタンパク質精製。
BL21 (DE3)/pET12a-BsDIの凍結サンプルから、LB-amp agar培地に展開し、コロニーをピックアップして100mL LB-ampでOD600が１程度になるまで前培養し、これを18LのLB-ampに展開して、37℃でOD600が２程度で飽和するまでしんとう培養した。この培養液から菌体を遠心分離(5kG)により回収した（ウェットで収量20 g）。菌体ペレットを-80℃で凍結した後溶解し、0℃で200mLの50mM Tris-HCl, pH7.8, 1mM EDTA, 1mM DTT, 1mM PMSF溶液中で超音波処理して溶菌し、遠心分離(9.5 kG)により溶液画分を回収した。
【００３８】
次に、硫安沈殿法による精製を行った。35%飽和溶液になるまで撹拌しながら徐々に粉状の硫酸アンモニウムを添加し、一晩静置した。沈殿物を遠心分離(9.5 kG)により取り除き、透析膜チューブを使って脱塩処理した（最終溶液：5 mM Tris-HCl, pH 7.8）。限外濾過法で濃縮したサンプル50 mLを陰イオン交換カラム(Sepharose Q FastFlow, Amersham Bioscience)にかけ、diaphorase含有画分を回収して限外濾過法で濃縮した(溶液量20 mL、Centriplus 遠心式フィルターユニット YM-30、Millipore)。次いで、このサンプルをゲル濾過カラム(Sephacryl S-200, Amersham Bioscience)にかけ、diaphorase含有画分を集めた。
【００３９】
（実施例２）。
Bacillus stearothermophilus由来のジアホラーゼのランダムミューテーションによる変異体ライブラリーの作成と耐熱性変異体のスクリーニング。
【００４０】
まず、本実施例２で行った実験の流れを図１に示す。Error-prone PCRによるdiaphoraseミュータントの遺伝子ライブラリー作成を行い、この遺伝子をベクターDNAに導入して大腸菌中で発現させた。このライブラリーを耐熱性スクリーニングにかけ、目的とする耐熱性diaphorase変異体を抽出した。
【００４１】
（２-１）GeneMorph（登録商標）によるError-Prone PCR。
「Error-prone PCR法」とは、PCRによるDNA断片複製反応の際に、DNA polymeraseが塩基配列の読み間違いを起こすことを利用して、複製されたDNA断片に変異をランダムに起こす方法である。種々の方法が報告されているが、ここでは製品化されているものの中から、Stratagene社のGeneMorph（登録商標）を選択した。Template DNAは、Bacillus stearothermophilusのジアホラーゼ遺伝子を組み込んだ上記pET12a-BsDIを用いた。プライマーもこの遺伝子のクローニングに用いたものを使用した。
【００４２】
プライマーの配列は、以下の「表４」に示すとおりであり、codingの5’端にNde I配列を、complementaryの5’端にBamH I配列をそれぞれ有している(下線部)ため、error-prone PCR産物をこれら制限酵素処理によりpET12aのマルチクローニングサイトに挿入することができる(天然型ジアホラーゼのクローニングと同様)。
【００４３】
【表４】
2008048703.tif 000006
【００４４】
GeneMorph（登録商標）のマニュアルにしたがって、以下の「表５」に示すような反応液の調製、温調サイクルに基づいてPCRを行った。
【００４５】
【表５】
2008048703.tif 000007
【００４６】
【表６】
2008048703.tif 000008
【００４７】
（２-２）ベクターへのジアホラーゼ遺伝子の導入。
Error-prone PCR産物はアガロースゲル電気泳動に用いた分以外全量をNde IとBamH Iによる制限酵素処理に用いた。37℃で2時間反応を行ったのち、反応生成物をQiaquick PCR purification Kit（Qiagen社）により精製した。一方、ベクターはpET12aをPCR産物同様、Nde IとBamH Iによる制限酵素処理した（37℃で2時間）。
【００４８】
これら制限酵素処理反応産物を低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、対応する開環状態のベクターDNAをQiaquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。次いで、精製したベクターの制限酵素処理産物をアルカリフォスファターゼで処理することにより、5’末端を脱リン酸化した。反応生成物をQiaquick PCR purification Kit（Qiagen社）により精製した。このようにして得られたerror-prone PCR産物（即ち、ジアホラーゼ変異体遺伝子ライブラリー）を制限酵素・脱リン酸化処理されたベクターにライゲーションした。ライゲーション反応はLigation Kit Mighty Mix(タカラバイオ社)を使用した。反応生成物は、エタノール沈殿法により精製した。
【００４９】
（２-３）Competent Cellの作成と形質転換。
Competent Cellは自前で調製したBL21(DE3)のelectrocompetent cell (competency 〜108/ng)を用いた。40 μLのcompetent cell凍結サンプルを氷上にて融解し、1μg/μL程度の濃度のDNAサンプルを0.5μL混合し、0.1 cmギャップのelelctroporation cuvetteに全量をセットし、1800 kVの電圧を印加することにより形質転換した。これに960μLのSOC培地を加え、１時間37℃でしんとうして前培養を行い、この培養液を5〜50μL LB-amp寒天培地へ植菌し、37℃で一晩インキュベーションを行った。
【００５０】
（２-４）スクリーニング方法。
前記（２-３）で得られた寒天培地上のシングルコロニーをそれぞれ96ウェルプレートのLB-amp液体培地（150μL）に爪楊枝を使って植菌した。２ウェルを、野生型を産生する大腸菌株に当てた。ウェルプレート上面をガスパーマブル粘着シート(ABgene)でシールし、さらに付属のふたをして37℃で一晩（〜14時間）しんとう培養を行った。この培養液25μLずつを新しいウェルプレートで同量の0.2N NaOH aq(あらかじめ分注)とピペッティングによりよく混合した後プレートにふたをし、37℃で15分インキュベーション（インキュベーター）することにより溶菌した。
【００５１】
次に室温で100μLの0.1M K-pi, pH6.8を加え、液を中和した。このとき非加熱のコントロールサンプルとして野生型のサンプル２つのうち１つをマイクロチューブに取り分けて室温でとりおいた。プレートを市販のOPPテープでシールし、80℃で75分加熱処理を行い（恒温器）、室温に静置して冷まして取り分けておいた野生型のサンプルをプレートに戻した。各サンプルに10μLの20mM anthraquinone sulfonic acid(AQS) 20% DMSO溶液、直前に調製した80 mM NADH水溶液を50 μLを順次加え、プレートをOPPテープでシールしてvortex mixerで5秒攪拌した。顕色する様子をカメラで記録し、野生型サンプルと比
較して前記AQSの還元による発色が強いものを耐熱性候補として選択した。
【００５２】
（２-５）サンプル保存。
スクリーニングをくぐり抜けた検体については、96ウェルプレートに残っている培養液の一部を4.5mLのLB培地に植菌して１晩培養しプラスミドを精製し冷凍庫で保存した。また、別途4mLのLB培地に植菌してO.D.600が0.4程度にまで培養し、遠心分離により集菌し、2mLの2xYT培地に懸濁させて液体窒素により凍結して-80℃で保存した。
【００５３】
（２-６）ジアホラーゼ変異体の大量発現と精製。
ジアホラーゼ変異体の大量発現と精製は以前に報告した方法により行った。ただし、大量発現におけるE.coliの培養は1L LB-ampで行い、培養スケールに合わせて、その後の精製の各段階における容積等を調整した。
【００５４】
（２-７）活性評価試験。
ジアホラーゼ変異体の活性評価を以下の条件で行った。反応溶液は100mM K-pi, pH8.0で、[ANQ]=0.3 mM、[NADH]=40mM、[diaphorase]=48nMである。測定前にアルゴンバブリングにより十分除酸素を行い、反応はアルゴン雰囲気で行った。ジアホラーゼの添加により反応を開始し、反応進行を520ｎｍにおけるANQの吸光度(モル吸光係数680M-1cm-1)の減少によりモニターし、反応速度を算出した。
【００５５】
（２-８）耐熱性試験。
精製したジアホラーゼ変異体サンプルの5 0mM Tris-HCl, pH 7.8, 300 mM NaCl溶液を限外濾過法による濃縮／バッファー交換を行って、0.1 M K-pi, pH 8.0溶液とした。この溶液を適宜薄めてジアホラーゼの460 nm の吸光度が0.1となるように調製した(酵素濃度8.3μMの溶液となる)。この溶液をアルミブロックヒーター等で、80℃・10分インキュベートし、すぐに氷上で冷却し、十分冷ましてから活性測定を行った。また、前記インキュベーションを行わなかったサンプルで対照実験を行った。
【００５６】
（２−９）結果。
総計約8000コロニーを上記の方法にそってスクリーニングにかけた。実際例としてウェルプレートの写真の一部を図２に示す。なお、図２には、スクリーニングにおける活性を維持しているジアホラーゼの検出例が示されており、矢印(Ａ、Ａ)がこのプレートで検出された耐熱性変異体候補の検体、対照実験として矢印(Ｂ)が野生型検体、矢印(Ｃ)が加熱処理を行っていない野生型検体をそれぞれ示している。
【００５７】
プレート間の誤差、株間のジアホラーゼ発現量の違いなど、可能性のある誤差を考慮して、選択された検体を一度にまとめて再スクリーニングを行った。即ち、凍結保存した大腸菌サンプルをLB寒天培地上に画線培養し、得られたコロニーを96ウェルプレートに植菌して同様に加熱実験を行った。但し、誤差を極力小さくするために、一つの検体につき、８つのコロニーを取り上げスクリーニングにかけた。
【００５８】
このダブルチェック実験の結果の写真の一部を図３に示す。この図３は、縦列に同一の変異体サンプルを配置し、参照として、列番号１１及び２４の上４ウェルが熱処理後の野生型、列番号１２及び２４の下４ウェルが熱処理を加えていない野生型サンプルである。この図３に示す写真の例では、列番号７、１４、１７、１９、２０、２１を陽性として、耐熱性変異体候補として選出した。
【００５９】
上で得た耐熱性ジアホラーゼ変異体候補について耐熱性試験を行った結果を表７から表１２に示す。
【表７】
2008048703.tif 000009
【表８】
2008048703.tif 000010
【表９】
2008048703.tif 000011
【表１０】
2008048703.tif 000012
【表１１】
2008048703.tif 000013
【表１２】
2008048703.tif 000014
【００６０】
その結果、例えば、配列番号２〜７、９、１２、１５、１６、１８、１９、２２、２５、２６、２９、３０、３２〜４０、４２〜５６などのアミノ酸配列からなる変異型タンパク質では、野生型（ＷＴ）と比較して、酵素活性（反応速度）が特に向上した。また、例えば、配列番号２、３、１８、２３、２６、２７、３２〜３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４５〜４９、５１、５３〜５５などのアミノ酸配列からなる変異型タンパク質では、野生型（ＷＴ）と比較して、加熱処理後の酵素残存活性率が特に優れていた。
【００６１】
その他、本実験系では、目的とする耐熱性の向上したジアホラーゼ変異体を得ることに成功した。よって、今回用いたerror-prone PCRによるランダムミューテーションで生じさせた変異体ライブラリーの作成と熱処理によるスクリーニングのための方法が実際に有効であるということが確認できた。
【００６２】
（実施例３）。
ジアホラーゼ耐熱性変異体に関する詳細な検討。
【００６３】
上記の研究によって得られた変異体のうち、野生型に比べて酵素活性が向上したＧ１２２Ｄについて、酵素反応速度論に基づいた検討を行った。
【００６４】
まず、NADH 40mM という条件においてANQの濃度をさまざまに変化させたときの酵素反応速度をプロットした。また、ANQ 2.2 mMという条件においてNADHの濃度をさまざまに変化させたときの酵素反応速度をプロットした。それらの結果はMichaelis-Mentenの式によく一致した。その式に基づいてkcatおよびKM(NADH)、KM(ANQ)を求めた。
【００６５】
比較として野生型（天然型）ジアホラーゼ（ＤＩ（ＤＨ“Ａｍａｎｏ”３）のkcatおよびKM(NADH)、KM(ANQ)をあわせて示す。ジアホラーゼは、いわゆるping-pong型の反応形式をとる。ここで、kcatは触媒反応の単位時間当たりのターンオーバー数、KM(NADH)、KM(ANQ)はそれぞれの基質に対するMichaelis定数であり、酵素のそれぞれの基質に対する活性部位への基質の結合のし易さを反映するファクターである。以上をまとめると、添付した図４（図面代用表）のようになる。
【００６６】
この結果から、変異体のミディエーターANQの結合部位が野生型（天然型）に比べてより結合し易い性質を有することがわかり（図４のANQ関連表参照）、一方、NADHの結合サイトに関しては野生型（天然型）と比較して特に変化がないか、むしろ低下していると考えられる（図４のNADH関連表参照）。したがって、これら変異体（変異型タンパク質）に置けるより高い触媒能は、基質ANQに対する親和性の獲得によるものと予測できる。
【００６７】
このことは、高濃度におけるより高い触媒活性を示さないが、低濃度において優位性を示すことを意味しており、例えば、酵素電池においてミディエーターANQの濃度をおさえることができるというメリットにつながると考えられる。
【００６８】
（実施例４）
分子動力学シミュレーションによる検討。
【００６９】
本実施例では、変異型タンパク質Ｒ１４７Ｈ及びＧ１２２Ｄについて、分子動力学シミュレーションにより、その立体構造を推定した。そして、野生型と変異型のタンパク質立体構造を比較し、変異型ジアホラーゼの立体構造と、その酵素活性及び耐熱性との関係について検討した。
【００７０】
分子動力学シミュレーションの計算方法及び計算モデルの概略を以下に示す。
【００７１】
このシミュレーションでは、市販のタンパク質モデリングソフトウエアである「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ（以下、「ＤＳ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ」とする。）」を用いた。同シミュレーション中、タンパク質の立体構造の初期モデリングには「ＤＳ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  １．１」を、力場を用いた計算及び解析には「ＤＳ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  １．５」を、それぞれ用いた。
【００７２】
まず、野生型ジアホラーゼについて、ＰＳＴ−ＢＬＡＳＴ（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ＢＬＡＳＴ）法により、Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  Ｓｅａｒｃｈを行い、類似性の高いタンパク質を探索した。そして、同検索において最もスコアの高かったタンパク質を鋳型とし、３−Ｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ法により、野生型及び各変異型ジアホラーゼの初期モデリングを行った。その際、補酵素（ＦＡＤ）の初期モデリングも同時に行った。
【００７３】
次に、その初期モデリング構造について、ＣＨＡＲＭｍ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｔ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）力場を各原子に割り当て、分子力学計算による構造最適化を行った。構造の最適化は、まず、Ｓｔｅｅｐｅｓｔ  Ｄｅｃｅｎｔ法（最急降下法）で１０００ステップ、次に、Ａｄａｐｔｅｄ  Ｂａｓｉｓ  Ｎｅｗｔｏｎ−Ｒａｐｈｓｏｎ法で５０００ステップ、それぞれ計算を行うことにより行った。
【００７４】
次に、熱力学的条件を考慮するため、設定条件を５０Ｋから３００Ｋまで２０００ステップ（１ステップは１フェムト秒）でもっていき、３００Ｋにおける構造を計算した。
【００７５】
次に、粒子数ｎ、体積Ｖ、温度Ｔを一定に設定し（ＮＶＴアンサンブル）、３００Ｋでの平衡化計算を１ナノ秒（１ステップは１フェムト秒）行った。
【００７６】
次に、ＭＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）計算を、ＮＶＴアンサンブルで、１ナノ秒（１ステップは１フェムト秒）行い、各原子の運動を追跡してエネルギー解析を行った。
【００７７】
以上のステップで、野生型及び各変異型のジアホラーゼについて、その立体構造をシミュレーションした。結果を、図５から図１１に示す。
【００７８】
図５は、シミュレーションにより得られた野生型ジアホラーゼの立体構造を示す図である。この立体構造は、ＭＤ計算後の最終構造である。図５中、「ＦＡＤ」はＦＡＤ（補酵素）の位置を、「Ｒ１４７」、「Ｇ１２２」はそれぞれ変異型タンパク質において置換したアミノ酸残基の位置を、それぞれ表す。
【００７９】
図５に示す通り、「Ｒ１４７」は、ＦＡＤの近傍、即ち、酵素反応活性サイトの近傍に位置する。一方、「Ｇ１２２」は、酵素反応活性サイトからは離れた位置に存在する。但し、「Ｇ１２２」は、３つのα−へリックスが集まった位置に存在しており、このタンパク質の立体構造上の要の位置に存在している。
【００８０】
図６及び図７は、酵素反応の活性点近傍の構造解析の結果を表す図面代用写真である。
【００８１】
図６はシミュレーションにより得られたＲ１４７Ｈ変異型ジアホラーゼの立体構造のうち、ＦＡＤの近傍を示す図、図７は同じくＧ１２２Ｄ変異型ジアホラーゼの立体構造のうち、ＦＡＤの近傍を示す図である。なお、両図において、（Ａ）の図面は前方視構造図、（Ｂ）の図面は上方視構造図である。
【００８２】
上述の酵素活性解析において、シミュレーションを行った変異型タンパク質は、野生型ジアホラーゼと比較して、酵素活性（反応速度）が高かった。一方、図６及び図７に示す通り、変異型ジアホラーゼは、野生型ジアホラーゼ（図５参照）と比較して、Ｔｒｐ１０３の位置が相違する。
【００８３】
即ち、野生型では、Ｔｒｐ１０３の位置がＦＡＤ中のフラビンから離れているのに対し、変異型では、Ｔｒｐ１０３の位置がフラビンの下側になっている。これに伴い、野生型では、Ａｓｎ１０４の位置がフラビンの面の上側にあり、フラビンの活性中心（中央のＮ原子）に近づいているのに対し、野生型ではＡｓｎ１０４の位置がフラビンの面の下側になり、フラビンの活性中心から遠ざかっている。
【００８４】
以上の結果は、ジアホラーゼの立体構造中、アミノ酸配列の１０４番目に位置するアミノ酸残基（Ａｓｎ１０４）を、補酵素（ＦＡＤ）のフラビンの活性中心から遠ざける変異を加えることにより、ジアホラーゼの酵素活性が向上することを示唆する。即ち、これらの結果は、立体構造中、アミノ酸配列の１０４番目に位置するアミノ酸残基を、補酵素のフラビンの活性中心から遠ざけた変異構造を有する変異型タンパク質の酵素活性が、野生型のジアホラーゼよりも高いことを示唆する。
【００８５】
続いて、図８から図１０は、静電ポテンシャル面に基づく構造解析の結果を示す図面代用写真である。
【００８６】
図８はシミュレーションにより得られた野生型ジアホラーゼの静電ポテンシャル面及び立体構造を示す図である。一方、図９はシミュレーションにより得られたＲ１４７Ｈ変異型ジアホラーゼの静電ポテンシャル面及び立体構造を示す図、図１０は同じくＧ１２２Ｄ変異型ジアホラーゼの静電ポテンシャル面及び立体構造を示す図である。なお、図８から図１０の各図中、左側の図面は静電ポテンシャル面を示す立体構造図であり、それぞれ、カラー図面中の赤色部分が負電荷の部位、青色部分が正電荷の部位、白色部分が無極性の部位を表す。また、図中、「Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ」は親水性部位を、「Ｄｉｓａｐｐｅａｒ  Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ」は疎水性部位を、それぞれ表す。
【００８７】
図８に示す通り、野生型のジアホラーゼでは、フラビン結合部位の近傍はほとんどが疎水性であるが、一部に親水性の部位が存在した。一方、変異型のジアホラーゼでは、その親水性の部位が消失していた。
【００８８】
ジアホラーゼの基質であるANQは疎水性の試薬である。従って、以上の結果は、ジアホラーゼの立体構造中、補酵素結合部位近傍の構造が疎水性に変異することにより、ANQとの相互作用が増大し、ジアホラーゼの酵素活性が向上することを示唆する。即ち、これらの結果は、立体構造中における補酵素結合部位近傍の疎水性を野生型タンパク質よりも高くする変異構造を有する変異型タンパク質の酵素活性が、野生型のジアホラーゼよりも高いことを示唆する。
【００８９】
続いて、図１１及び図１２は、ジアホラーゼの立体構造中における水素結合の様子を表す図面代用写真である。
【００９０】
図１１はシミュレーションにより得られた野生型及びＲ１４７Ｈ変異型ジアホラーゼにおける水素結合の様子を示す立体構造図、図３２は同じく野生型及びＧ１２２Ｄ変異型ジアホラーゼにおける水素結合の様子を示す立体構造図である。各図中、左側の立体構造図が野生型ジアホラーゼにおける水素結合の様子を表し、右側の立体構造図が変異型ジアホラーゼにおける水素結合の様子を表す。
【００９１】
図１１及び図１２に示す通り、このシミュレーションの結果、Ｒ１４７Ｈ変異型ジアホラーゼでは水素結合数が減少し、Ｇ１２２Ｄ変異型ジアホラーゼでは水素結合数が増加した。
【００９２】
一方、上述の耐熱性解析において、Ｒ１４７Ｈ変異型ジアホラーゼでは耐熱性が低下したのに対し、Ｇ１２２Ｄ変異型では耐熱性がやや増加した。
【００９３】
これらの結果は、ジアホラーゼの耐熱性に関する以下の知見を示唆する。
【００９４】
Ｒ１４７Ｈ変異型ジアホラーゼの場合、ＦＡＤ結合部位の近傍における変異であり、その変異により、その部位における水素結合数が減少するため、耐熱性が低下する。
【００９５】
Ｇ１２２Ｄ変異型ジアホラーゼの場合、水素結合数は増加するが、ＦＡＤ結合部位の近傍における変異ではないため、耐熱性はあまり増加しない。但し、Ｇ１２２はジアホラーゼの立体構造中、３つのα−へリックスの集まった位置に存在するため、水素結合数の増加が各へリックスを介してＦＡＤ結合部位の近傍に影響を与え、耐熱性がある程度増加する。
【００９６】
以上の事項を総合すると、これらの結果は、補酵素（ＦＡＤ）に対する構造保護性を強固にする変異を加えることにより、ジアホラーゼの耐熱性を向上できることを示唆する。即ち、これらの結果は、補酵素に対する構造保護性を強固にする変異構造を有する変異型タンパク質の耐熱性が、野生型のジアホラーゼよりも高いことを示唆する。
【００９７】
具体的には、例えば、ジアホラーゼの立体構造中、ＦＡＤ結合部位の近傍を、水素結合数が増加する構造に変異させたり、ＦＡＤ結合部位の近傍におけるコンホメーション変化が起きにくくなるように変異させたりすることにより、ジアホラーゼの耐熱性を向上できることを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明に係るジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質は、例えば、NADHあるいはNADPHのアッセイキット、NADHあるいはNADPHのセンサー、NADHあるいはNADPHの測定方法、酵素を固定化して電極に用いた燃料電池、キノン類などの色素の還元反応触媒などの分野において利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】実施例２に係わる実験の流れ（ランダムミューテーションによるライブラリー作成とスクリーニング）を示す模式図である。
【図２】総計約8000コロニーをスクリーニングにかけたときのウェルプレートの写真（図面代用写真）の一部である。
【図３】ダブルチェック実験の結果のウェルプレート写真の一部である。
【図４】野生型とＧ１２２Ｄ変異型のジアホラーゼ酵素のそれぞれの基質に対する活性部位への基質の結合のしやすさを反映するファクターをまとめた図面代用表である。
【０１００】
【図５】シミュレーションにより得られた野生型ジアホラーゼの立体構造を示す図である。
【図６Ａ】シミュレーションにより得られたＲ１４７Ｈ変異型ジアホラーゼの立体構造のうち、ＦＡＤの近傍を示す前方視構造図である。
【図６Ｂ】シミュレーションにより得られたＲ１４７Ｈ変異型ジアホラーゼの立体構造のうち、ＦＡＤの近傍を示す上方視構造図である。
【図７Ａ】シミュレーションにより得られたＧ１２２Ｄ変異型ジアホラーゼの立体構造のうち、ＦＡＤの近傍を示す前方視構造図である。
【図７Ｂ】シミュレーションにより得られたＧ１２２Ｄ変異型ジアホラーゼの立体構造のうち、ＦＡＤの近傍を示す上方視構造図である。
【図８】シミュレーションにより得られた野生型ジアホラーゼの静電ポテンシャル面及び立体構造を示す図である。
【図９】シミュレーションにより得られたＲ１４７Ｈ変異型ジアホラーゼの静電ポテンシャル面及び立体構造を示す図である。
【図１０】シミュレーションにより得られたＧ１２２Ｄ変異型ジアホラーゼの静電ポテンシャル面及び立体構造を示す図である。
【図１１】シミュレーションにより得られた野生型及びＲ１４７Ｈ変異型ジアホラーゼにおける水素結合の様子を示す立体構造図である。
【図１２】シミュレーションにより得られた野生型及びＧ１２２Ｄ変異型ジアホラーゼにおける水素結合の様子を示す立体構造図である。
【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【配列表】
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