(57)【要約】【課題】コムギにおける導入された目的遺伝子の発現効率を向上させる方法を提供すること。【解決手段】コムギの未熟胚を低温乾燥し、形質転換操作により未熟胚またはその細胞に目的遺伝子を導入し、未熟胚またはその細胞を０．２５〜１．０Ｍの浸透圧調節物質を含む培地で選抜培養することを含む、導入された目的遺伝子の発現効率を向上させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コムギの未熟胚を低温乾燥し、形質転換操作により未熟胚またはその細胞に目的遺伝子を導入し、該未熟胚またはその細胞を０．２５〜１．０Ｍの浸透圧調節物質を含む培地で培養することを含む、コムギの未熟胚またはその細胞において導入された目的遺伝子の発現効率を向上させる方法。
【請求項２】
形質転換されたコムギの未熟胚またはその細胞が、導入された目的遺伝子のコピーを１つまたは２つ含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
低温乾燥を０〜１０℃で行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
浸透圧調節物質が、マルトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール、パーコールおよびフィコールからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
形質転換操作がパーティクルガン法である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法によって作製された形質転換コムギ未熟胚またはその細胞を用いて植物体を再生することを含む、導入された目的遺伝子の発現効率が向上した植物の作出方法。
【請求項７】
植物体に導入された目的遺伝子が後代に伝達されることを含む、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コムギにおける導入された目的遺伝子の発現効率を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に植物の形質転換方法は、植物細胞または組織に目的遺伝子を導入し、それを培養し、植物体を再生する。
【０００３】
しかし、コムギでは、このような一般的な方法を用いて形質転換された植物体を得ることが難しいことが知られている。
【０００４】
コムギの形質転換については、例えばＶａｓｉｌら（非特許文献１）による直接導入法、Ｃｈｅｎｇら（非特許文献２）によるアグロバクテリウム法で成功した例が報告されおり、その後も、例えばパーティクルガン法などの直接導入法で成功した例が多く報告されているが、遺伝子の導入効率などで表される成功率は非常に低い。またコムギでは、目的遺伝子が細胞または組織に導入されたとしても、組織培養が困難で、植物体を再生して形質転換を確認することは難しい。
【０００５】
コムギでは、遺伝子を導入する組織（外植片）として未熟胚が最もよく用いられているが、その形質転換効率は植物の生育環境による外植片の状態に大きく左右されるため、日本国外などで確立された形質転換系を日本国内で再現することが困難である。
【０００６】
またコムギでは、遺伝子導入法としてパーティクルガン法がよく用いられているが、そのような直接導入法では、導入遺伝子の再構成などにより、導入遺伝子が正常に発現している形質転換体が得られにくい。
【０００７】
コムギの形質転換における再分化効率については、例えば非特許文献３で、開花後１２日目に採取して１７〜１９日間４℃に保存した穂の胚盤を、約２〜３％のスクロースを含む培地で培養したところ、再分化効率が高くなったことが開示されている。
【０００８】
また、コムギの形質転換効率については、例えば非特許文献４で、デュラムコムギの外植片に高温または乾燥ストレス処理を行って未熟胚に除草剤耐性遺伝子を含むプラスミドで形質転換したところ、形質転換効率が向上したことが開示されている。
【０００９】
しかしながら、これらの非特許文献は、再分化効率の向上、または選抜マーカー遺伝子の発現を調べて遺伝子導入効率が向上したことを開示しているが、目的遺伝子の発現効率については開示していない。
【００１０】
形質転換体を作製する場合、目的遺伝子が導入できたとしても、その目的遺伝子が実際に発現しなければ意味がない。従って、目的遺伝子の発現効率を向上させることが形質転換体の作製にとって重要である。
【非特許文献１】Ｖａｓｉｌら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：６６７−６７４（１９９２）
【非特許文献２】Ｃｈｅｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １１５：９７１−９８０（１９９７）
【非特許文献３】Ｉｎ  Ｖｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  ３９：２０−２３，Ｊａｎｕａｒｉ−Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００３
【非特許文献４】Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ（２００２）２０：９５５−９６０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、コムギにおける導入された目的遺伝子の発現効率を向上させる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、コムギを形質転換する外植片を低温処理し、外植片に目的遺伝子を導入し、従来よりも高浸透圧の培地で外植片を選抜培養することにより、導入された目的遺伝子の発現効率を向上できることを見出し、また、高浸透圧の培地を用いることにより、従来の低浸透圧培地と比べて導入遺伝子のコピー数が少なく、導入遺伝子が発現する確率が高くなることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
本発明の特徴は、要約すると以下の通りである。
（１）コムギの未熟胚を低温乾燥し、形質転換操作により未熟胚またはその細胞に目的遺伝子を導入し、該未熟胚またはその細胞を０．２５〜１．０Ｍの浸透圧調節物質を含む培地で培養することを含む、コムギの未熟胚またはその細胞において導入された目的遺伝子の発現効率を向上させる方法。
（２）形質転換されたコムギの未熟胚またはその細胞が、導入された目的遺伝子のコピーを１つまたは２つ含む、（１）に記載の方法。
（３）低温乾燥を０〜１０℃で行う、（１）または（２）に記載の方法。
（４）浸透圧調節物質が、マルトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール、パーコールおよびフィコールからなる群から選択される、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）形質転換操作がパーティクルガン法である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の方法によって作製された形質転換コムギ未熟胚またはその細胞を用いて植物体を再生することを含む、導入された目的遺伝子の発現効率が向上した植物の作出方法。
（７）植物体に導入された目的遺伝子が後代に伝達されることを含む、（６）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、コムギの形質転換体における目的遺伝子の発現効率を向上させることができる。また、コムギ植物の生育環境による外植片の状態に大きく左右されることなく、形質転換系を再現することが容易になる。さらに、導入された目的遺伝子の発現効率が向上したコムギ植物およびその後代を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のコムギの未熟胚またはその細胞において導入された目的遺伝子の発現効率を向上させる方法は、コムギの未熟胚を低温乾燥し、形質転換操作により未熟胚またはその細胞（カルスなどの培養細胞を含む）に目的遺伝子を導入し、該未熟胚またはその細胞を０．２５〜１．０Ｍの糖または糖アルコールなどの浸透圧調節物質を含む培地で培養することを含むことを特徴する。
【００１６】
形質転換を行う外植片としてコムギの未熟胚を用いる。未熟胚は、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）の開花後１０〜１７日に穂を採取して得ることが好ましい。未熟胚であれば特に限定されないが、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ｖｏｌ．７０，ｐｐ３０８−３１１に記載されている形態的な観察でのｓｔａｇｅＩＩの終わり頃の未熟胚が好ましい。
【００１７】
好ましくは、コムギの茎ごと穂を採取し、外から水分を与えずにそのまま低温暗所に立て、乾燥処理を行う。温度は、好ましくは０〜１０℃、より好ましくは４〜６℃とし、好ましくは１〜２０日間、より好ましくは５〜７日間乾燥させる。０℃よりも低いと凍結してしまい、１０℃よりも高いと未熟胚の登熟・乾燥が急速に進んでしまい、好ましくない。また低温下では未熟胚の発達が遅くなるため、未熟胚の発達ステージを調節しやすくなるという利点がある。乾燥は、風乾、デシケーター内でのシリカゲルによる脱水などの方法で速めたり調節してもよい。
【００１８】
なお、外植片（未熟胚）の前処理以前の植物体への水分の与え方、登熟温度を調節して、乾燥処理による未熟胚の細胞内の変化を穏やかに適度に進めることにより、前処理の期間を調節することも可能である。
【００１９】
コムギの一般的な温室栽培条件（２５／２０℃）では、細胞の活性が高く、登熟が進みやすく、乾燥も進みやすい。出穂・開花から登熟初期には水分を最も要するので、少しの水不足で急激に乾燥が進み、胚の発達ステージも急激に進んでしまうため、適期がすぐ過ぎてしまう。例えば１８／１０℃の温室で育てた場合、開花１５〜１６日後に刈り取り、５℃で５日間乾燥させている（２０日）が、２５／２０℃の温室では、開花１０日後では処理を始めるには早すぎ、１１日後では遅すぎることがあり得、また、１８／１０℃の温室で育てて水分を控えておき、開花１４日後に水を抜いておけば、開花１６〜１７日後に刈り取り、５℃で３日間の乾燥で（１９日）同様な状態の胚が得られるので、このように温度や水分の与え方を調節すると、導入処理を行う日程を調整することができる。また、穂・種子の大きさや穂の中の種子の位置によっては水の抜け方が違う（大きい種子では水が抜けにくい、穂の上の方は水が抜けやすく下の方は抜けにくいなど）ため、植物の生育状況に合わせて調節することが好ましい。
【００２０】
上記のようにしてコムギの未熟胚を低温乾燥し、３〜６時間カルス誘導培地で前培養した後、目的遺伝子を未熟胚またはその細胞に導入する。
【００２１】
目的遺伝子の導入には、公知の遺伝子工学的手法を用いることができ、特に限定されない。一般的には、目的遺伝子を含むベクターを作製して、未熟胚またはその細胞、あるいはそれらから誘導したカルスに、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、リポソーム法、マイクロインジェクション法などでベクターを導入するが、コムギでは、植物体への再生効率から、パーティクルガン法を用いて未熟胚に導入する方法が好ましい。パーティクルガン法は、金属微粒子に遺伝子をコーティングして細胞組織に打ち込む方法であり、コムギのように再分化能力が低い植物に有用であると考えられている。
【００２２】
目的遺伝子を含むベクターは、例えば以下のようにして作製することができる。
【００２３】
ベクターは特に限定されず、ｐＡＬ系（ｐＡＬ５１、ｐＡＬ１５６など）、ｐＵＣ系（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等）、ｐＢＩ系（ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１．２等）、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系、中間ベクター系（ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ等）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等を用いることができる。
【００２４】
ベクターに目的遺伝子を挿入するには、例えば、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法を用いることができる。
【００２５】
目的遺伝子は特に限定されず、その遺伝子の発現が望まれるものであればよく、対象となる植物の内因性遺伝子または外来遺伝子でもよい。そのような遺伝子として、例えば、糖代謝関連遺伝子、有用物質（医薬、色素、芳香成分など）生産遺伝子、植物生長制御（促進/抑制）遺伝子、耐病虫害性（昆虫食害抵抗性、カビ（菌類）及び細菌病抵抗性、ウイルス（病）抵抗性等）遺伝子、環境ストレス（低温、高温、乾燥、塩、光障害、紫外線）抵抗性遺伝子、トランスポーター遺伝子、製粉特性・製パン特性・製麺特性関連遺伝子等が挙げられる。
【００２６】
ベクターには、目的遺伝子のほかに、例えばプロモーター、エンハンサー、イントロン、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、選抜マーカー遺伝子などを連結することができる。
【００２７】
プロモーターとしては、植物体内または植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。具体例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター等が挙げられる。
【００２８】
ターミネーターとしては、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ  ３５Ｓ  ターミネーター等が挙げられる。
【００２９】
選抜マーカー遺伝子としては、例えば、除草剤耐性遺伝子（ビアラホス耐性遺伝子）、薬剤耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）、蛍光または発光レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニターゼ（ＧＵＳ）、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）など）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ  ＩＩ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどの酵素遺伝子が挙げられる。
【００３０】
上記目的遺伝子を含むベクターを、パーティクルガン法でコムギの未熟胚またはその細胞（カルスなどの培養細胞でもよい）に撃ち込む。
【００３１】
まず、金粒子を洗浄滅菌し、金粒子、ベクター、ＣａＣｌ２、スペルミジンをボルテックスミキサーなどで攪拌しながら加えて、ベクターを金粒子にコーティングし、エタノールで洗浄する。その金粒子をマクロキャリヤーフィルムに塗布して乾燥させる。そして、マクロキャリヤーフィルム、ターゲットの未熟胚またはその細胞をパーティクルガン装置に設置し、ガス加速管から高圧ヘリウムガスをマクロキャリヤーフィルムに向かって発射する。マクロキャリヤーフィルムはストッピングプレートで止まるが、金のパーティクルはストッピングプレートを通過して、ストッピングプレートの下に設置したターゲットに貫入し、目的遺伝子が導入される。
【００３２】
次に、目的遺伝子を導入したコムギの未熟胚またはその細胞をカルス誘導培地で培養する。カルス誘導培地は、従来の培地よりも高浸透圧になるように、培地に０．２５〜１．０Ｍ、好ましくは０．３〜０．６５Ｍ、より好ましくは０．４〜０．５Ｍの浸透圧調節物質を加える。浸透圧調節物質が０．２５Ｍ未満であると細胞質が流出するなど遺伝子導入処理に耐えられなくなり、１．０Ｍを超えると細胞活性が過度に抑制されるので好ましくない。また、浸透圧調節物質は特に限定されないが、例えば糖または糖アルコールなどが好ましく、具体的にはマルトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パーコール（商品名、アマシャムバイオサイエンス社、ポリビニルピロリドン被膜を持つコロイドシリカ製品）、フィコール（商品名、ファルマシア社、ショ糖とエピクロロヒドリンを共重合した水溶性の合成品）を用いることができる。これらを単独で用いてもよいし、複数の糖などを組み合わせて用いてもよいが、コムギでは通常マルトースが好ましく用いられる。
【００３３】
また、カルス誘導培地のベースとなる組成は、コムギの培養に適していれば特に限定されず、寒天、無機要素、ビタミン、炭素源、および高濃度（例えば２ｍｇ／Ｌ）の２，４−Ｄなどのオーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモン（植物生長調節物質）等を含めることができる。カルス誘導培地では、遺伝子導入後、例えば約１〜３日間培養する。
【００３４】
形成されたカルスを、例えばカルス誘導培地よりも濃度を低くした２，４−Ｄ（例えば０．５ｍｇ／Ｌ）などのオーキシン等の植物生長調節物質を含む、新しいカルス維持培地に移しかえて培養する。カルス維持培地にも、高浸透圧条件になるように上記濃度の浸透圧調節物質（マルトースが好ましい）を加えることが好ましい。
【００３５】
また、選抜のために、ベクターに導入した選抜マーカーに対応する除草剤や薬剤を培地に添加することが好ましい。カルス維持培地では、カルス誘導後、例えば約２〜４週間培養する。
【００３６】
なお、従来の培地は、０．０８８〜０．１２Ｍのマルトースを含み、本発明で用いる培地よりも低浸透圧条件である。本発明の高浸透圧条件下で選抜培養すると、低浸透圧条件と比べて、培養細胞または再生された植物体に含まれる導入遺伝子の正常な発現ユニットのコピー数が１または２つ程度と少ないことがわかり（実施例２の５．導入遺伝子のコピー数の推定を参照）、導入遺伝子が発現する確率が高くなると考えられる。
【００３７】
培養したカルスを適当な条件下で更に培養することにより、器官の再分化を誘導し、最終的に完全な植物体を再生させることができる。再分化誘導は、培地における２，４-Ｄなどのオーキシンやゼアチンなどのサイトカイニン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。再分化誘導により、不定胚、不定芽、不定茎葉等が形成される。更に、オーキシンやサイトカイニンを含まない発根培地に移植して、完全な植物体へと育成させる。
【００３８】
以上の手法により、導入された目的遺伝子の発現効率が向上した植物を作出することができる。また、このようにして作出された植物は、導入目的遺伝子のコピー数が少なく、安定的に目的遺伝子が発現し、後代に正常に遺伝する（伝達される）。
【００３９】
コムギへの遺伝子導入効率および目的遺伝子発現効率（形質転換効率）は、以下のようにして調べることができる。
【００４０】
遺伝子の導入効率は、例えば上記ベクターに導入した外来遺伝子としての除草剤耐性遺伝子に対応する除草剤などを含む培地で選抜しつつ培養して再分化させ、再分化個体からＤＮＡを抽出してＰＣＲ法および電気泳動により、該遺伝子を検出することができ、導入に用いた外植片数と外来遺伝子を有していた再分化個体数から、遺伝子導入効率を算出する。
【００４１】
目的遺伝子の発現効率は、遺伝子の導入が確認された再分化個体について、目的遺伝子から発現されたタンパク質の有無を調べる。タンパク質の有無は、例えば植物片の染色、電気泳動、ウエスタンブロット法などで確認することができる。そして導入に用いた外植片数と目的遺伝子から発現されたタンパク質の存在が確認された再分化個体数から、目的遺伝子発現効率（形質転換効率）を算出する。
【００４２】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００４３】
試薬と使用培地の調製
１．試薬
（１）マルトースストック液（０．５ｇ／ｍｌ）
蒸留水６００ｍｌに、ｍａｌｔｏｓｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（Ｗａｋｏ）５００ｇを加え、ホットスターラーで加熱しながら溶解した。蒸留水で１Ｌにフィルアップし、組織培養フィルターユニット（０．２μｍ  ＰＥＳ）（ＮＡＬＧＥＮＥ）でフィルター滅菌した。これをストック液とし、４℃で保存した。
（２）１０００×ＭＳビタミンストック溶液
蒸留水５０ｍｌに、ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｗａｋｏ）を２００ｍｇ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ｗａｋｏ）を５０ｍｇ、ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ−ＨＣｌ（Ｗａｋｏ）を５０ｍｇ、ｔｈｉａｍｉｎ−ＨＣｌ（Ｗａｋｏ）を１００ｍｇ、ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ（Ｗａｋｏ）を１０ｇ加え、溶解した。その後、蒸留水を加えて１００ｍｌにフィルアップし、これをストック溶液とし、１．５ｍｌチューブに１ｍｌずつ小分けにして、−３０℃で保存した。
【００４４】
（３）２，４−Ｄストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）
２，４−Ｄ（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｗａｋｏ）５０ｍｇを、９９．５％ＥｔＯＨ（Ｗａｋｏ）で溶解し、５０ｍｌにフィルアップし、Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（０．２２μｍ  ＰＥＳ）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）でフィルター滅菌した。これをストック溶液とし、−３０℃で保存した。
（４）ｐｉｃｌｏｒａｍストック溶液（２ｍｇ／ｍｌ）
１Ｎ  ＫＯＨ（Ｗａｋｏ）５ｍｌに、ｐｉｃｌｏｒａｍ（４−ａｍｉｎｏ−３，５，６−ｔｒｉｃｈｌｏｒｏ−ｐｙｒｉｄｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ＳＩＧＭＡ）を１００ｍｇ加え、溶解した。その後、蒸留水を加えて５０ｍｌにフィルアップし、Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（０．２２μｍ  ＰＥＳ）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）でフィルター滅菌した。これをストック溶液とし、滅菌済みの１．５ｍｌチューブに１ｍｌずつ小分けにして、−３０℃で保存した。
【００４５】
（５）ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄストック溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）
ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ（Ｗａｋｏ）２ｇを蒸留水１８ｍｌに加え、溶解した。その後、蒸留水を加えて２０ｍｌにフィルアップし、Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（０．２２μｍ  ＰＥＳ）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）でフィルター滅菌した。これをストック溶液とし、滅菌済みの１．５ｍｌチューブに１ｍｌずつ小分けにして、−３０℃で保存した。
（６）ビアラフォスストック溶液（５ｍｇ／ｍｌ）
蒸留水４０ｍｌに、ビアラフォス（進陽産業株式会社）を２５０ｍｇ加え、溶解した。その後、蒸留水を加えて５０ｍｌにフィルアップし、Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（０．２２μｍ  ＰＥＳ）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）でフィルター滅菌した。これをストック溶液とし、滅菌済みの１．５ｍｌチューブに１ｍｌずつ小分けにして、−３０℃で保存した。
【００４６】
（７）Ｌ培地ＫＨ２ＰＯ４ストック溶液
蒸留水２００ｍｌにＫＨ２ＰＯ４（Ｗａｋｏ）を２０ｇ加え、溶解した。その後、蒸留水を加えて２５０ｍｌにフィルアップし、オートクレーブした。これをストック溶液として４℃で保存した。
（８）Ｌ培地ＣａＣｌ２ストック溶液
蒸留水９０ｍｌにＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（Ｗａｋｏ）を１５ｇ加え、溶解した。その後、蒸留水を加えて１００ｍｌにフィルアップし、オートクレーブした。これをストック溶液として４℃で保存した。
（９）Ｌ培地ＭｇＳＯ４ストック溶液
蒸留水９０ｍｌにＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（Ｗａｋｏ）を２５ｇ加え、溶解した。その後、蒸留水を加えて１００ｍｌにフィルアップし、オートクレーブした。これをストック溶液として４℃で保存した。
【００４７】
（１０）Ｌ培地Ｆｅ・Ｎａ・ＥＤＴＡストック溶液
蒸留水９０ｍｌにＦｅ・Ｎａ・ＥＤＴＡ（同仁）を４ｇ加え、溶解した。その後、蒸留水を加えて１００ｍｌにフィルアップし、オートクレーブした。これをストック溶液として４℃で保存した。
（１１）Ｌ培地マイクロ無機塩ストック液
蒸留水９０ｍｌにＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（Ｗａｋｏ）を１１２０ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（Ｗａｋｏ）を８６０ｍｇ、Ｈ３ＢＯ４（Ｗａｋｏ）を６２０ｍｇ、ＫＩ（Ｗａｋｏ）を８３ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（Ｗａｋｏ）を２．５ｍｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（Ｗａｋｏ）を２．５ｍｇ加え、溶解した。その後、蒸留水を加えて１００ｍｌにフィルアップし、オートクレーブした。これをストック溶液として４℃で保存した。
【００４８】
（１２）１０００×Ｌビタミンストック溶液
蒸留水４０ｍｌに、ｔｈｉａｍｉｎ−ＨＣｌ（Ｗａｋｏ）を５００ｍｇ、ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ−ＨＣｌ（Ｗａｋｏ）を５０ｍｇ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ｗａｋｏ）を５０ｍｇ、Ｃａｌｃｉｕｍ（＋）−ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ（Ｗａｋｏ）を５０ｍｇ、ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ（Ｗａｋｏ）を５０ｍｇ加え、溶解した。その後、蒸留水を加えて５０ｍｌにフィルアップし、Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（０．２２μｍ  ＰＥＳ）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）でフィルター滅菌した。これをストック溶液とし、滅菌済みの１．５ｍｌチューブに１ｍｌずつ小分けにして、−３０℃で保存した。
（１３）ｚｅａｔｉｎストック溶液（５ｍｇ／ｍｌ）
１Ｎ  ＨＣｌ（Ｗａｋｏ）２ｍｌに、ｚｅａｔｉｎ（６−（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔ−２−ｅｎｙｌａｍｉｎｏ）ｐｕｒｉｎｅ）（ＳＩＧＭＡ）を５０ｍｇ加え、溶解した。その後、蒸留水を加えて１０ｍｌにフィルアップし、Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（０．２２μｍ  ＰＥＳ）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）でフィルター滅菌した。これをストック溶液とし、滅菌済みの１．５ｍｌチューブに１ｍｌずつ小分けにして、−３０℃で保存した。
【００４９】
２．培地
（１）カルス誘導マンニトール含有培地（ＣＩ−０．２Ｍａｎ：Ｃａｌｌｕｓ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ−０．２Ｍ  Ｍａｎｎｉｔｏｌ）
蒸留水６５０ｍｌに、ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（日本製薬）を１包、Ｄ（−）−ｍａｎｎｉｔｏｌ（Ｗａｋｏ）を７．３ｇ、Ｌ（＋）−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｗａｋｏ）を５００ｍｇ、Ｌ（−）−ｐｌｏｒｉｎｅ（Ｗａｋｏ）を１１５ｍｇ、Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（Ｗａｋｏ）を１５０ｍｇ、ｃａｓｅｉｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（ＤＵＣＨＥＦＡ）を１００ｍｇ、ＭＥＳ（２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（同仁）を１．９５ｇ、１０００×ＭＳビタミンストック溶液を１ｍｌ添加し、５Ｎ  ＫＯＨを加えてｐＨを５．８に調整した。蒸留水で７００ｍｌにフィルアップし、ｐｈｙｔａｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ）を２ｇ添加した。オートクレーブ後すぐにクリーンベンチ内でマルトースストック溶液３００ｍｌを加えよく撹拌し、その後５０℃ぐらいに冷めてから、２，４−Ｄストック溶液を２ｍｌ、ｐｉｃｌｏｒａｍストック溶液を１ｍｌ、ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄストック溶液１ｍｌを添加した。
【００５０】
（２）カルス維持選抜培地（ＣＭ−５Ｂ：Ｃａｌｌｕｓ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ−５ｍｇ／Ｌ  Ｂｉａｌａｐｏｓ）
ＣＩ−０．２Ｍａｎ培地とは、マンニトールを加えず、マルトース濃度と２，４−Ｄ濃度が低く、選抜薬剤であるビアラフォスを加えているところが異なる。
【００５１】
蒸留水９００ｍｌに、ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（日本製薬）を１包、ｍａｌｔｏｓｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（Ｗａｋｏ）を４０ｇ、Ｌ（＋）−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｗａｋｏ）を５００ｍｇ、Ｌ（−）−ｐｌｏｒｉｎｅ（Ｗａｋｏ）を１１５ｍｇ、Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（Ｗａｋｏ）を１５０ｍｇ、ｃａｓｅｉｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（ＤＵＣＨＥＦＡ）を１００ｍｇ、ＭＥＳ（２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（同仁）を１．９５ｇ、１０００×ＭＳビタミンストック溶液を１ｍｌ添加し、５Ｎ  ＫＯＨを加えてｐＨを５．８に調整した。蒸留水で１Ｌにフィルアップし、ｐｈｙｔａｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ）を２ｇ添加した。オートクレーブ後５０℃ぐらいに冷めてから、２，４−Ｄストック溶液を０．５ｍｌ、ｐｉｃｌｏｒａｍストック溶液を１ｍｌ、ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄストック溶液１ｍｌ、ビアラフォスストック溶液１ｍｌを添加した。
【００５２】
（３）高浸透圧カルス維持選抜培地（ＣＭ−５Ｂ−１５０Ｍａｌ：Ｃａｌｌｕｓ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ−５ｍｇ／Ｌ  Ｂｉａｌａｐｏｓ−１５０ｇ／Ｌ  Ｍａｌｔｏｓｅ）
ＣＭ−５Ｂ培地とは、マルトース濃度のみが異なる。
【００５３】
蒸留水６５０ｍｌに、ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（日本製薬）を１包、Ｌ（＋）−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｗａｋｏ）を５００ｍｇ、Ｌ（−）−ｐｌｏｒｉｎｅ（Ｗａｋｏ）を１１５ｍｇ、Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（Ｗａｋｏ）を１５０ｍｇ、ｃａｓｅｉｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（ＤＵＣＨＥＦＡ）を１００ｍｇ、ＭＥＳ（２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（同仁）を１．９５ｇ、１０００×ＭＳビタミンストック溶液を１ｍｌ添加し、５Ｎ  ＫＯＨを加えてｐＨを５．８に調整した。蒸留水で７００ｍｌにフィルアップし、ｐｈｙｔａｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ）を２ｇ添加した。オートクレーブ後すぐにクリーンベンチ内でマルトースストック溶液３００ｍｌを加えよく撹拌し、その後５０℃ぐらいに冷めてから、２，４−Ｄストック溶液を０．５ｍｌ、ｐｉｃｌｏｒａｍストック溶液を１ｍｌ、ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄストック溶液１ｍｌ、ビアラフォスストック溶液１ｍｌを添加した。
【００５４】
（４）再分化培地（ＳＧ−２Ｂ：Ｓｈｏｏｔ  Ｇｒｏｗｔｈ−２ｍｇ／Ｌ  Ｂｉａｌａｐｈｏｓ）
蒸留水９００ｍｌに、ＫＮＯ３（Ｗａｋｏ）を１．４ｇ、ＮＨ４ＮＯ３（Ｗａｋｏ）を３００ｍｇ、Ｌ培地  ＫＨ２ＰＯ４ストック溶液を２．５ｍｌ、Ｌ培地ＣａＣｌ２ストック溶液を３ｍｌ、Ｌ培地ＭｇＳＯ４ストック溶液を１．４ｍｌ、Ｌ培地Ｆｅ・Ｎａ・ＥＤＴＡストック溶液を１ｍｌ、Ｌ培地マイクロ無機塩ストック液を１ｍｌ、ｍａｌｔｏｓｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（Ｗａｋｏ）を３０ｇ、ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ（Ｗａｋｏ）を２００ｍｇ添加し、１Ｎ  ＫＯＨを加えてｐＨを５．７に調整した。蒸留水で１Ｌにフィルアップし、Ａｇａｒ（Ｐｏｗｄｅｒ）植物培地用（Ｗａｋｏ）を５ｇ添加した。オートクレーブ後５０℃ぐらいに冷めてから、２，４−Ｄストック溶液を０．１ｍｌ、１０００×Ｌビタミンストック溶液１ｍｌ、ｚｅａｔｉｎストック溶液を１ｍｌ、ビアラフォスストック溶液０．４ｍｌを添加した。
【００５５】
（５）発根培地（ＲＧ−５Ｂ：Ｒｏｏｔ  Ｇｒｏｗｔｈ−５ｍｇ／Ｌ  Ｂｉａｌａｐｈｏｓ）
ＳＧ−２Ｂ培地とは、２，４−Ｄ、ｚｅａｔｉｎが含まれず、ビアラフォス濃度、ｐＨが高いところが異なる。
【００５６】
蒸留水９００ｍｌに、ＫＮＯ３（Ｗａｋｏ）を１．４ｇ、ＮＨ４ＮＯ３（Ｗａｋｏ）を３００ｍｇ、Ｌ培地  ＫＨ２ＰＯ４ストック溶液を２．５ｍｌ、Ｌ培地ＣａＣｌ２ストック溶液を３ｍｌ、Ｌ培地ＭｇＳＯ４ストック溶液を１．４ｍｌ、Ｌ培地Ｆｅ・Ｎａ・ＥＤＴＡストック溶液を１ｍｌ、Ｌ培地マイクロ無機塩ストック液を１ｍｌ、ｍａｌｔｏｓｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（Ｗａｋｏ）を３０ｇ、ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ（Ｗａｋｏ）を２００ｍｇ添加し、１Ｎ  ＫＯＨを加えてｐＨを５．８に調整した。蒸留水で１Ｌにフィルアップし、Ａｇａｒ（Ｐｏｗｄｅｒ）植物培地用（Ｗａｋｏ）を５ｇ添加した。オートクレーブ後５０℃ぐらいに冷めてから、１０００×Ｌビタミンストック溶液１ｍｌ、ビアラフォスストック溶液１ｍｌを添加した。
【００５７】
コムギ未熟胚への遺伝子導入
１．植物材料
植物材料としては、コムギ品種「Ｂｏｂｗｈｉｔｅ」の中で特に形質転換に適している系統としてＣＩＭＭＹＴで選抜された系統名「Ｂｏｂｗｈｉｔｅ  ＳＨ  ９８  ２６」（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｅｓｃｈｉら，２００２  Ｇｅｎｏｍｅ  ４５：４２１−４３０）を用いた。
【００５８】
２．植物材料の育成
種子を毎週２ポットに４粒ずつ播種し、植物材料を準備した。培養土は２種類の培養土、サカタソイルミックス（サカタのタネ）：クレハ園芸培土（呉羽化学）を、２：１の割合で混ぜて篩をかけ、篩を抜けた土と篩を抜けない土をそれぞれ用意した。直径１８ｃｍ高さ１５ｃｍのポリポットの底の穴に５ｃｍ四方のガーゼ２枚を置き、篩を抜けない土をポットの下に体積で４５０ｍｌ分敷き、篩いにかけた土を１６５０ｍｌ分入れた。中心９ｃｍの円上に種子を４粒置き、篩いにかけた土４５０ｍｌ分を覆土し、その上に篩いを抜けなかった土を２５０ｍｌ分敷いた。土は強く押さえつけないようにし、短日の温室（１５±２℃、８時間日長（自然光））で約１２週間生育させた。４週間後にポットの土を上から押し固めた。６週間後から土を乾燥させないようにポットをバットの上に置き、８週間後から開花が始まるまで毎週追肥した。８・９週目はハイポネックス原液６：１０：５（ハイポネックス）の５００培希釈液を、それ以降は３３３倍希釈液を５００ｍｌ与えた。開花前の１２週間後に長日の人工気象室（１８℃／１０℃、１６時間日長（４００Ｗメタルハライドランプ三菱ネオＢＯＣランプ８００μｍｏｌ／ｍ2ｓ）、湿度５０−７０％）に移して、開花・登熟させた。
【００５９】
３．乾燥前処理
穂毎に開花日をチェックし、初めに穂が開花して１週間後から気象室の床に直に置き、水は葉がしおれない程度に控えめに与えた（１日４００ｍｌ程度）。開花１２日後（処理３日前）から水を与えることを止め、開花１５日後に茎の根元から切り５℃、暗黒の部屋で５〜７日立てて、低温でゆっくり乾燥させた。前処理を行わない対照としては、水を与え続けたもので、開花後１８日後のものを用いた。
【００６０】
４．未熟胚の摘出
未熟胚に遺伝子導入を行うために、未熟種子を滅菌し、未熟胚を摘出してＣＩ−０．２Ｍａｎ培地で前培養した。
【００６１】
穂から未熟種子を取り出し、ガーゼで包んで輪ゴムで口を縛った。７０％エタノールで約１分間濯ぎ、次亜塩素酸ナトリウム溶液（Ｗａｋｏ）１５ｍｌを蒸留水で１０倍に希釈し（有効塩素濃度  ０．５％）、ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎ（２０）  ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ  （Ｔｗｅｅｎ  ２０）（Ｗａｋｏ）を７０μｌ加えた溶液に入れ、スターラーバーで１５分間撹拌して滅菌した。以後、無菌操作で作業をした。滅菌水１００ｍｌで未熟種子を３回洗浄した。実体顕微鏡で見ながら幼芽幼根をメスで切り取った未熟胚を摘出し、胚盤側を上にしてＣＩ−０．２Ｍａｎ培地の中心１ｃｍの円上に、１プレートあたり３２個を置床し、２５℃、暗所にて３〜５時間前培養した。図１に、培地上に置床した未熟胚の写真を示す。
【００６２】
５．遺伝子導入
コムギ未熟胚への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行った。
（１）導入遺伝子
実施例においては、導入遺伝子は除草剤耐性遺伝子（ｂａｒ：ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）および／レポーター遺伝子（ＧＵＳ：β−ｇｌｕｃｒｏｎｉｄａｓｅ）を含むプラスミドＤＮＡ（ｐＡＬ１５６）を用いた。ｐＡＬ１５６は英国Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  ＣｅｎｔｒｅのＨａｒｗｏｏｄ博士らが開発したものであり、ｂａｒ遺伝子とＧＵＳ遺伝子がそれぞれトウモロコシのユビキチンプロモーターと第一イントロン(ＰＵｂｉ＋Ｉｎ)の制御下で発現するよう設計されたものである（図２）。図２に、ＤｒａＩ切断部位および切り出される断片のサイズ、サザン分析でプローブとして用いた領域を示す。
【００６３】
除草剤の有効成分であるビアラフォスにより、ｂａｒ遺伝子が発現している細胞がビアラフォスに耐性となり選抜されるが、同一プラスミド上にある他の遺伝子は、ビアラフォス耐性の細胞で発現している保証はない。言い換えれば、従来、形質転換させたい（発現させたい）遺伝子（目的遺伝子）を導入する多くの場合で、目的遺伝子が発現している細胞は選抜されていなかった。そこで、発現していることの確認が容易であるＧＵＳ遺伝子を目的遺伝子と見立てて、選抜されるｂａｒ遺伝子が導入されている遺伝子導入個体が得られる割合と、ＧＵＳ遺伝子が発現している形質転換体が得られる割合を評価の指標として用いることとした。
【００６４】
（２）金粒子の滅菌
１μｍ金粒子４０ｍｇをはかり取り、９９．５％ＥｔＯＨ  １ｍｌを加え、ｖｏｒｔｅｘにてよく懸濁した。その後、遠心により、金粒子を沈殿させ、エタノールを除去した。その後、滅菌水１ｍｌを加え滅菌金粒子溶液とした。
【００６５】
（３）ＤＮＡのコーティング
滅菌金粒子含有溶液は使用前に、超音波発生器（トミー精工ＵＲ−２０Ｐ）を使って念入りに懸濁し、１．５  ｍｌチューブに１ｓｈｏｔあたり１０μｌ入れた。その後、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製したプラスミドＤＮＡ溶液（１μｇ／μｌ）を１ｓｈｏｔあたり１μｇになるように入れピペッティングにより攪拌した。次に１．５ｍｌチューブのフタに１ｓｈｏｔあたりＣａＣｌ２（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）（２．５Ｍ）１０μｌをのせ、Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎ（ＳＩＧＭＡ）（０．１Ｍ）４μｌを加えてチューブのフタの上でピペッティングにより攪拌し、フタを閉めて全ての液を混合した。ここまでの操作はすべて氷上にて行った。混合後すぐに、ｖｏｌｔｅｘにより５分間激しく懸濁した。３分間室温にて放置後、上清を除去し、７０％エタノールで１回、モレキュラーシーブス３Ａ（Ｗａｋｏ）により脱水した１００％エタノールで２回洗浄した。上清を除去して脱水１００％エタノールを１ｓｈｏｔあたり１０μｌ添加してよく懸濁した。クリーンベンチ内でマクロキャリアーの中央に注ぎ、風乾させた。
【００６６】
（４）導入
パーティクルガンは、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用し、撃ち込み時の圧力は約６３．３ｋｇ／ｃｍ２（９００ｐｓｉ）とし、標的組織までの距離は６ｃｍとした。１シャーレにつき２回ずつ撃ち込んだ。
【００６７】
６．遺伝子導入細胞の増殖と選抜
培養には直径９ｃｍ厚さ２ｃｍのプラスチックシャーレ（Ｉｗａｋｉ）を用い、培養中のシールは全てサージカルテープ（３Ｍ）を用いた。パーティクルガンで遺伝子導入後、２５℃、暗所にてＣＩ−０．２Ｍａｎ培地でカルスを誘導し、導入処理３日後に選抜薬剤であるビアラフォスを含むＣＭ−５ＢもしくはＣＭ−５Ｂ−１５０Ｍａｌ培地に移植し２５℃、暗所にて選抜培養した。選抜培養では、１シャーレに置床するカルスの数は１６個までとした。２週間後にカルスを新しい選抜培地に移植しさらに２週間選抜培養した。ＣＭ−５Ｂ培地とＣＭ−５Ｂ−１５０Ｍａｌ培地で選抜培養した場合の再分化培地に移植する直前のカルスの写真を図３Ａ〜Ｂに示した。ＣＭ−５Ｂ培地で選抜培養した場合は、カルスの体積は大きく増加するが、浸水状の部位の割合が多く（図３Ａ、矢印は浸水状部位を示す）、浸水状の部位からはその後再分化したシュートが得られなかった。ＣＭ−５Ｂ−１５０Ｍａｌ培地で選抜培養した場合は、ＣＭ−５Ｂ培地に比べて、体積の増加は小さいが、浸水状の部位の割合は小さかった（図３Ｂ）。
【００６８】
７．再生
４週間の選抜培養後、再分化培地に移植した。培養条件を２５℃、明所に移し再分化を促し、３週間培養した。再分化培地では、１シャーレに置床するカルスの数は８個までとした。再分化培地で再生シュートが形成され発根してくるような個体（図３Ｃ）が、遺伝子導入されている個体である確率が高かった。
【００６９】
再生シュートのみ発根培地に移植した（図３Ｄ）。発根培地では、再生シュートは由来する未熟胚毎で区別できるようにし、１シャーレに置床する再生シュートは４個の未熟胚由来のものとした。発根培地での培養３週間後に旺盛に生育してきている個体を選び、クレハ園芸培土（呉羽化学）を入れたポットに植え替えた。長日の人工気象室（１８℃／１０℃、１６時間日長（４００Ｗメタルハライドランプ三菱ネオＢＯＣランプ８００μｍｏｌ／ｍ2ｓ）、湿度５０−７０％）で育成し、出穂後すぐにパラフィン紙材の交配袋を掛け自殖させた。約５ヶ月後には自殖種子が収穫できた。
【実施例２】
【００７０】
遺伝子導入の確認及び遺伝子導入効率と実質的形質転換効率
１．遺伝子導入の確認
得られた植物体において、選抜マーカー遺伝子であるｂａｒ遺伝子の有無をＰＣＲ法により調査した。鉢上げ２週間後の植物体の葉１００ｍｇからＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてゲノミックＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、ｂａｒ遺伝子に特異的な配列から作製したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。
プライマーの配列：ＧＧＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＧＴＣＡＡＣＣ（配列番号１）
プライマーの配列：ＧＴＣＡＴＧＣＣＡＧＴＴＣＣＣＧＴＧＣＴ（配列番号２）
【００７１】
ＰＣＲ反応液には、ゲノミックＤＮＡ１０ｐｇ、ＥｘＴａｑ（タカラ）０．２５Ｕ、１０×添付バッファー１μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、プライマー対各２．５ｐｍｏｌ、ＰＣＲｘ  ｅｎｈａｎｃｅｒ（インビトロジェン）１μｌを加え、滅菌蒸留水で合計１０μｌにフィルアップした。
【００７２】
ＰＣＲは、ＴａＫａｒａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（タカラ）を用いて、９５℃を２０秒、６０℃を３０秒及び７２℃を３０秒の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。ＰＣＲ反応後、１．２％のアガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ  ＬＯ３「ＴａＫａＲａ」）電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色してＰＣＲ産物を検出し、予想される４２１ｂｐのｂａｒ遺伝子断片が検出されたものを、遺伝子導入個体と判断した。
【００７３】
２．遺伝子導入効率
乾燥前処理の有無とカルス選抜維持培養でのマルトース濃度（０．１２Ｍと０．４４Ｍ）の組合せ４通りにおいて、それぞれ得られた遺伝子導入個体数から遺伝子導入処理を行った未熟胚数当たりの遺伝子導入効率（遺伝子導入個体数／処理未熟胚数×１００）を算出した。それぞれの条件で９回の独立した実験における遺伝子導入効率の結果を表１に示す。
【００７４】
【表１】
2008212048.tif 000002
【００７５】
遺伝子導入効率については、誤差が大きいためそれぞれの条件間の平均値の差は有意ではなかったが、カルス選抜維持培養中の浸透圧条件に関わらず、乾燥前処理を行うことにより効率が向上した。また、乾燥前処理を行わない場合、カルス選抜維持培養での高浸透圧条件により、遺伝子導入効率は低下した。
【００７６】
３．導入遺伝子の発現の確認
ＰＣＲ法の結果より遺伝子導入個体と判断した植物体について、レポーター遺伝子であるＧＵＳ遺伝子の発現を葉のＧＵＳ染色により調べた。ＧＵＳ活性（組織化学的方法）は以下の通り行った。数ｍｍ幅の葉片約１０枚を１００μｌのＧＵＳ反応液（１００ｍＭ  ｐＨ７．０リン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＭ  Ｘ−ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−グルクロン酸）、０．５ｍＭフェリシアン化カリウム、０．５ｍＭフェロシアン化カリウム、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に浸し、真空ポンプで５分間吸引して反応液を浸潤させた後、３７℃で一晩インキュベートした。反応終了後、７０％エタノールで脱色し、青く染色されているものをＧＵＳ発現個体と判断した。ＧＵＳ活性の検出の一例を図４に示す。
【００７７】
４．実質的形質転換効率
乾燥前処理の有無とカルス選抜維持培養でのマルトース濃度（０．１２Ｍと０．４４Ｍ）の組合せ４通りにおいて、ＧＵＳ遺伝子の発現している実質的な形質転換体の数から遺伝子導入処理を行った未熟胚数当たりの実質的形質転換効率（ＧＵＳ遺伝子発現個体数／処理未熟胚数×１００）を算出した。それぞれの条件で９回の独立した実験における実質的形質転換効率（ＧＵＳ遺伝子発現効率）の結果を上記表１に示し、表１をグラフ化したものを図６に示す（エラーバーは標準誤差）。実質的形質転換効率は、乾燥前処理を行い、高浸透圧条件でカルス選抜維持培養を行った場合のみ、従来法の条件（乾燥前処理なし、浸透圧条件（低）０．１２Ｍ）を対照として５％水準で有意差が認められ（図６の＊）、約７倍に効率が向上した。
【００７８】
５．導入遺伝子のコピー数の推定
ＰＣＲ法の結果より遺伝子導入個体と判断した植物体について、サザンブロッティング法により、導入遺伝子のコピー数を分析した。
【００７９】
鉢上げ約１ヶ月後に０．５ｇの若葉をサンプリングし、ＣＴＡＢ法によりゲノミックＤＮＡを抽出した。微量分光高度計ＮａｎｏＤｒｏｐ（スクラム）によりＤＮＡ濃度を測定し、各遺伝子導入個体のゲノミックＤＮＡ（３０μｇ）を制限酵素ＤｒａＩで消化した。コピー数の推定のための標準として、コムギのゲノムサイズを１６，０００，０００ｋｂｐとして、３０μｇのゲノミックＤＮＡに対する２、４、８コピー相当の導入プラスミドＤＮＡ（１１ｋｂｐ）量、それぞれ２１ｐｇ、４２ｐｇ、８４ｐｇを非形質転換体のゲノミックＤＮＡ（３０μｇ）と混合して制限酵素ＤｒａＩで消化したものを用意した。０．９％アガロースゲル電気泳動した後、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎに記載された定法に従い、アルカリ変性処理、中和処理をしてナイロンメンブレンポジティブチャージ（Ｒｏｃｈｅ）にブロッティングした。ＰＣＲ  ＤＩＧ  ｐｒｏｂｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）によりＧＵＳ遺伝子特異的なプローブ（図２に示す領域）を作製した。プローブ作製に用いたプライマーは以下の通りで、ＰＣＲ反応を利用してジゴキシゲニンラベルした。
プライマーの配列：ＴＴＧＡＡＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＣＧＧＡＴ（配列番号３）
プライマーの配列：ＡＣＴＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＧＴＡＣＡＧ（配列番号４）
【００８０】
ＤＩＧイージーハイブ（Ｒｏｃｈｅ）をハイブリダイゼーション液に用いて、４２℃で一晩プローブをハイブリダイズさせた。６５℃で０．１×ＳＳＣの洗浄２０分を２回行い、ＤＩＧ洗浄およびブロックバッファーセット（Ｒｏｃｈｅ）、ＡＰ標識抗ジゴキシゲニン抗体、Ｆａｂフラグメント（Ｒｏｃｈｅ）、発光基質としてＣＤＰ−ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、Ｘ−ｒａｙフィルムに露光してバンドを可視化した。
【００８１】
サザン分析の結果を図５に示す。図５において、各条件とＧＵＳ活性の有無を図の上側に、ＤｒａＩにより切り出される４．６３ｋｂのバンドの位置を図の右側に示し、また、ＭはλＨｉｎｄＩＩＩ分子量マーカー、ＮＴは非導入個体、２Ｃ、４Ｃ、８Ｃはそれぞれ２コピー、４コピー、８コピー相当のプラスミドＤＮＡを非導入個体のゲノムＤＮＡと混合してＤｒａＩで消化したものを示す。
【００８２】
非形質転換体ではバンドが検出されないのに対して、調べた全ての遺伝子導入個体で何らかのバンドが検出された。ＧＵＳ活性が検出された全個体で、レポーター遺伝子の発現ユニットが正常に導入されていることを示す４．６３ｋｂｐの位置のバンドが検出された。それ以外のバンドは導入遺伝子が再構成されて導入されたものや導入遺伝子の一部が切り取られて組み込まれたと考えられる。４．６３ｋｂｐのバンドの濃さとコピー数の推定のための標準のバンドの濃さの比較から正常な発現ユニットのコピー数は、乾燥前処理の有無に関わらず０．４４Ｍの浸透圧条件でカルス選抜維持培養を行った場合は１コピー程度であるのに対し、０．１２Ｍの浸透圧条件の場合は３〜１０コピーとコピー数が多かった。
【００８３】
乾燥前処理を行なわずに高浸透圧条件でのカルス選抜維持培養を行った場合、遺伝子導入効率への悪影響が大きかった。乾燥前処理を行うことにより、この悪影響は改善されており、乾燥前処理は高浸透圧条件でのカルス選抜維持培養に耐えられるような馴化のような効果を持っていることが考えられる。高浸透圧条件でのカルス選抜維持培養により導入される遺伝子のコピー数が抑えられており、これにより、導入遺伝子が発現する確率が高まったことが考えられる。これらのことより、乾燥前処理と高浸透圧条件での選抜培養を組み合わせることにより、実質的形質転換効率の向上が達成されたと考えられる。
【００８４】
６．導入遺伝子の遺伝分離
得られた形質転換体について、導入遺伝子の遺伝分離状況を調査した。導入遺伝子のコピー数が少なく、ＧＵＳ遺伝子の発現が確認された２系統と、導入遺伝子のコピー数が多く、ＧＵＳ遺伝子の発現が確認された１系統について、自殖種子２４粒を播種し、前述の方法でｂａｒ遺伝子の有無をＰＣＲ法により調べた。その結果、導入遺伝子のコピー数が少なかった系統の後代では、ｂａｒ遺伝子を保持する個体：ｂａｒ遺伝子を保持しない個体の分離状況は、１５：９と１６：７（１粒発芽せず）となった。この分離比は、１遺伝子座の３：１の分離比に適合した（χ２検定）。さらに、ＧＵＳ活性を調べたところ、ｂａｒ遺伝子を保持する個体でのみＧＵＳ活性が検出された。一方、導入遺伝子のコピー数が多かった系統の後代では、２４の全個体がｂａｒ遺伝子を保持していたが、そのうち３個体でのみかすかなＧＵＳ活性が検出された。
【００８５】
このように、前処理を行い、高浸透圧条件でカルス選抜培養を行って得られた導入遺伝子のコピー数が少ない系統では、目的とする導入遺伝子の安定的な発現が正常に遺伝していた。形質転換系では、導入遺伝子が安定的に発現し、これが導入遺伝子の分離遺伝状況に伴って安定的に遺伝してはじめて遺伝子機能解析への利用が可能となる。改良された条件では、こうした遺伝子機能解析に利用可能な形質転換体を効率的に作出することができた。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明は、コムギにおいて導入された目的遺伝子の発現効率を高めることを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】培地に置床した、遺伝子導入処理直後のコムギ未熟胚を示す。
【図２】導入遺伝子を含むプラスミドｐＡＬ１５６の構造を示す。
【図３Ａ】０．１２Ｍマルトースを含むカルス維持選抜培地（ＣＭ−５Ｂ培地）での選抜培養４週間後のカルスを示す。
【図３Ｂ】０．４４Ｍマルトースを含むカルス維持培地（ＣＭ−５Ｂ−１５０Ｍａｌ培地）での選抜培養４週間後のカルスを示す。
【図３Ｃ】再分化培地での培養３週間後に再生してきたシュートを示す。
【図３Ｄ】発根培地での培養３週間後の再分化植物体を示す。
【図４】再分化植物体の葉でのＧＵＳ活性の検出を示す。
【図５】サザンブロッティング法による導入遺伝子の検出を示す。
【図６】処理外植片（未熟胚）当たりの遺伝子導入効率と導入遺伝子の発現効率を示す。
【図１】
2008212048.tif 000003
【図２】
2008212048.tif 000004
【図３Ａ】
2008212048.tif 000005
【図３Ｂ】
2008212048.tif 000006
【図３Ｃ】
2008212048.tif 000007
【図３Ｄ】
2008212048.tif 000008
【図４】
2008212048.tif 000009
【図５】
2008212048.tif 000010
【図６】
2008212048.tif 000011
【配列表】
2008212048000001.app