(57)【要約】【課題】海藻類の抽出物からのフコイダンを有効成分とし、その生理活性を利用するヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤を提供すること。【解決手段】本発明は、オキナワモズクから得られたアセチルフコイダンまたはその硫酸化物を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤を提供するものである。このアセチルフコイダンは、オキナワモズクを希塩酸水溶液等により抽出して得られたものである。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキナワモズク（Cladosiphon okamuranus TOKIDA）から得られたアセチルフコイダンまたはそのアセチルフコイダンを硫酸化することにより得られる硫酸化アセチルフコイダンを有効成分とすることを特徴とする、ヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤。
【請求項２】
アセチルフコイダンが、オキナワモズクから希塩酸により抽出して得られたものであることを特徴とする、請求項１記載のヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤。
【請求項３】
アセチルフコイダンの硫酸化が、Ｎ,Ｎ’−ジメチルホルムアミドおよび三酸化イオウ−トリメチルアミンを用いて行われるものであることを特徴とする、請求項１又は２記載のヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかの項に記載のヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤を含有することを特徴とする飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オキナワモズクから抽出したアセチルフコイダンを有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
沖縄地方は、わが国のなかで歴史的に特異な衣食住の文化を創造してきており、この特異性が沖縄地方に住む人の長寿の大きな要因になっていると考えられている。これらのうちでも食文化について沖縄独特なものが多く見られ、特にコンブやモズクなどの海藻類を多く利用している点が特徴的である。
【０００３】
近年になってこれらの海藻類に含まれているフコイダンやその他の硫酸化多糖がさまざまな生理活性を有することがわかり、有用な生物資源として注目され、種々の研究が行われている。このフコイダンは、モズク、コンブ、ワカメ、ヒジキ等に多く含まれている硫酸化多糖類の１種であり、Ｌ−フコースに加え、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースおよびＤ−グルクロン酸を構成糖とし、更にエステル結合した硫酸基を持つ多糖類である。
これまでフコイダンには、抗コレステロ−ル作用、抗血液凝固作用等の効果が見出されており、健康補助食品の素材としてすでに利用開発され、市場で販売されている。
【０００４】
本発明者らは、海藻類に含まれる多糖類に焦点をあてて研究を行い、沖縄に自生する海藻類から機能性多糖類を分離同定し、そのゲル化機構や腫瘍細胞に対するアポトーシス誘導効果を報告している（非特許文献１参照）。また、ナガコンブからのアルギン酸について、その化学特性を報告している（非特許文献２参照）。
【０００５】
更に、本発明者らは、オキナワモズク（Cladosiphon okamuranus TOKIDA）から分子量が５００,０００で、Ｌ−フコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸、酢酸および硫酸の構成比がそれぞれ３.０〜４.０、０.１〜０.３、０.８〜１.２、０.５〜１.０、０.８〜１.２であるアセチルフコイダンを見出し、既に特許を取得しており（特許文献１参照）、このアセチルフコイダンが優れた抗腫瘍活性を有することを見出し、特許出願を行っている（特許文献２参照）。
【０００６】
本発明者らは、海藻類の種々の医薬品への利用の可能性を調べるため、このような海藻類からの抽出物、特にフコイダンについて、その生理活性を幅広く検討した。
【特許文献１】特許第３３７１１２４号
【特許文献２】特願２００５−２３６４５６号明細書
【非特許文献１】田幸正邦ら、「応用糖質科学」43、143-148(1996)
【非特許文献２】田幸、中山、「日本応用糖質学会大会講演要旨集」30頁、鹿児島、(2004年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
即ち、本発明は、ある種の海藻類の抽出物からのフコイダンを有効成分とし、その生理活性を利用する種々の治療剤を提供することをその目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、種々の海藻類の抽出物の生理活性について鋭意研究を行ったところ、オキナワモズクから希塩酸等により抽出して得られるアセチルフコイダンまたはその硫酸化物が優れた生理活性を示すことを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、オキナワモズク（Cladosiphon okamuranus TOKIDA）から得られたアセチルフコイダンまたはそのアセチルフコイダンを硫酸化することにより得られる硫酸化アセチルフコイダンを有効成分とすることを特徴とする、ヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤を提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、アセチルフコイダンが、オキナワモズクから希塩酸により抽出して得られたものであることを特徴とする、ヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤である。
【００１１】
また、本発明は、アセチルフコイダンの硫酸化が、Ｎ,Ｎ’−ジメチルホルムアミドおよび三酸化イオウ−トリメチルアミンを用いて行われるものであることを特徴とする、ヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤を提供するものである。
【００１２】
更に、本発明は、上記ヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤を含有することを特徴とする飲食品を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のオキナワモズクから得られたアセチルフコイダンまたはその硫酸化物を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤は、優れたヒアルロニダーゼ阻害活性を示し、アトピー性皮膚炎の症状を和らげ、アトピー性皮膚炎に対して優れた治療効果を示す。
【００１４】
従って、本発明のオキナワモズクから得られたアセチルフコイダンを有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤及びアトピー性皮膚炎治療剤は優れたヒアルロニダーゼ阻害活性を示すので、その作用を利用して抗アレルギー剤やアトピー性皮膚炎の治療等に用いることができるとともに、日常的にこれらの治療剤を含む飲食品としてこれを摂取することにより、アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患の発生を抑制することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤は、オキナワモズク由来のアセチルフコイダンまたはこのアセチルフコイダンを硫酸化することにより得られる硫酸化アセチルフコイダンを有効成分とするものである。
【００１６】
原料となるオキナワモズク（Cladosiphon okamuranus TOKIDA）は、沖縄地方に生育する天然のオキナワモズクのほかに、人工的に養殖される養殖オキナワモズクを使用することができる。
【００１７】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤は、このオキナワモズクを希塩酸水溶液等の酸性溶液により抽出して得られる多糖の一種であるアセチルフコイダンまたはこのアセチルフコイダンを硫酸化することにより得られる硫酸化アセチルフコイダンを有効成分とするものである。
【００１８】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤の有効成分であるオキナワモズク由来のアセチルフコイダンは、酢酸基を含むフコイダンであり、概ね酢酸基を３.９〜８.０質量％含有するものである。また、このアセチルフコイダンの組成の一例を挙げれば、概ねＤ−フコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸、酢酸および硫酸の構成比がそれぞれ３.０〜４.０、０.１〜０.３、０.８〜１.２、０.５〜１.０および０.８〜１.２のものである。このオキナワモズクからアセチルフコイダンを得る方法は特には限定されないが、例えば、本発明者らの特許３３７１１２４号に記載の方法が挙げられる。また、このアセチルフコイダンは陽イオン交換樹脂等により陽イオン交換されたものであっても良い。
【００１９】
具体的に、オキナワモズクからアセチルフコイダンを得る方法を示せば次の通りである。まず、オキナワモズクの乾燥体を粉砕した後、塩酸等の酸を加えて攪拌する。次に、これを濾過し、ろ液を水酸化ナトリウム等のアルカリで中和した後、セライト５４５層（ナカライテスク製）等のカラムに通して、濃縮を行い、更にエタノールを添加し、沈殿させる。この沈殿物をエタノール等のアルコール脱水を数回行い、更に減圧乾燥を行い粗アセチルフコイダンを得る。この粗アセチルフコイダンを塩化カルシウム等の塩水溶液に溶解し、ろ過後、ろ液をセライト５４５層等のカラムに通して一晩透析を行い、さらに凍結乾燥を行ってアセチルフコイダンを得ることができる。また、このアセチルフコイダンをアンバーライトＩＲ−１２０（Rohm & Haas社製）等の陽イオン交換樹脂に通し、陽イオン交換を行った後、水酸化ナトリウム等のアルカリで中和、透析、凍結乾燥を行い、Ｎａ型のアセチルフコイダンを得ることができる。
【００２０】
また、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤のもう一つの有効成分である硫酸化アセチルフコイダンは、上記オキナワモズク由来のアセチルフコイダンを硫酸化することにより得ることができるものであり、概ね硫酸含量が１３〜３３質量％、好ましくは１５〜３３質量％含有するものである。また、この硫酸化アセチルフコイダンの組成の一例を挙げれば、概ねＤ−フコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸、酢酸および硫酸の構成比がそれぞれ３.０〜４.０、０.１〜０.３、０.８〜１.３、０.５〜１.０および０.８〜３.６である。
【００２１】
この硫酸化アセチルフコイダンを得るための硫酸化の方法としては、多糖の水酸基をスルホン化可能な公知の方法であれば特に限定されないが、例えば、クロロスルホン酸−ピリジン錯体、ジシクロヘキシルカルノジイミド−硫酸、三酸化硫黄−トリメチルアミン錯体、Ｎ,Ｎ’−ジメチルホルムアミド−三酸化イオウ−トリメチルアミン等を用いる方法等が挙げられる。これらの方法の中でも、アセチルフコイダンにＮ,Ｎ’−ジメチルホルムアミド中、三酸化イオウ−トリメチルアミンを用いる方法が好ましい。
【００２２】
具体的にアセチルフコイダンに三酸化イオウ−トリメチルアミンを作用させて硫酸化アセチルフコイダンを得る方法の例を示せば次の通りである。まず、アセチルフコイダンをＮ,Ｎ’−ジメチルホルムアミド等の溶媒に分散させ、これに三酸化イオウ−トリメチルアミンを加えて静置する。静置後、酢酸ナトリウム等の酢酸塩を加えてエタノールで沈殿させる。この沈殿物をエタノールで洗浄後、蒸留水に溶解し、アンバーライトＩＲ−１２０（Rohm & Haas社製）等の陽イオン交換樹脂を充填したカラムを通して脱塩する。最後に水酸化ナトリウム等のアルカリ溶液で中和を行い、透析後、凍結乾燥することにより硫酸化アセチルフコイダンを得ることができる。
【００２３】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤は、オキナワモズクから得られるアセチルフコイダンまたはその硫酸化物をそのままあるいは公知の適当な医薬担体と組み合わせ、製剤化することにより製造することができる。本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤におけるオキナワモズクから得られるフコイダンまたはその硫酸化物の含有量は、ヒアルロニダーゼ阻害活性やアレルギー抑制効果が発揮される量であれば特に制限されないが、例えばオキナワモズクから得られるフコイダンまたはその硫酸化物が１３〜３３質量％、好ましくは１５〜３３質量％である。
【００２４】
以上のように、オキナワモズクから得られるアセチルフコイダンまたはその硫酸化物は、ヒアルロニダーゼ阻害活性を有するものであり、このような硫酸化多糖が食物因子としてアレルギー抑制作用を有する。従って、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤は、通常の飲食品に含有せしめ、日常的に摂取することができる。このような飲食品の製造方法は、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤を飲食品の原料素材等に有効量添加すればよく、それ以外の点は、通常の飲食品の製造方法に準じればよい。
【００２５】
これら飲食品の例としては茶飲料、栄養補助飲料等の飲料、カプセル状、錠剤状、粉末状等の栄養補助食品等の食品が挙げられる。
【００２６】
次に、本発明を実施例によって更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、実施例中の「％」及び「部」は、いずれも特に注記しない限り質量基準である。
【実施例】
【００２７】
（１）アセチルフコイダンの製造：
沖縄県知念漁業共同組合で収穫され、冷凍保存されていた養殖オキナワモズクを解凍して用いた。この藻体１００ｇをミキサーで５分間粉砕した。この粉砕物に全量が６００ｍＬとなるように０.０５Ｍの塩酸を加え、室温で４時間撹拌した。次にこれを８０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を吸引ろ過し、ろ液を０.０５Ｍの水酸化ナトリウムで中和した。次いで、セライト５４５層に通して、濃縮を行い、さらに２倍量のエタノールを添加し、沈殿させた。沈殿物をエタノール脱水を数回行い、更に減圧乾燥を行い粗アセチルフコイダンを得た。この粗アセチルフコイダンを０.１Ｍの塩化カルシウム水溶液に溶解し、吸引ろ過後、ろ液をセライト５４５層に通して一晩透析、凍結乾燥を行って精製アセチルフコイダンを得た。
【００２８】
この精製アセチルフコイダンを陽イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−１２０）に通し、陽イオン交換を行った後、トリエチルアミンによりｐＨ５．５〜６．０に調整し、凍結乾燥を行い、ＴＥＡ型の精製アセチルフコイダン（以下、単に「アセチルフコイダン」または「ネイティブアセチルフコイダン」という）を得た。
【００２９】
上記で得られたアセチルフコイダンの組成はＤ−フコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸、酢酸の構成比がそれぞれ４.０、０.２、１.１および０.８であった。また、バリウム沈殿法によりアセチルフコイダンの硫酸含量を測定したところ１３.２質量％であった。
【００３０】
（２）硫酸化アセチルフコイダンの製造：
上記（１）で製造したＴＥＡ型アセチルフコイダン２００ｍｇをＮ,Ｎ’−ジメチルホルムアミド２０ｍｌに溶解させ、硫酸基供与体である三酸化イオウピリジン錯体（４．５ｇ／４０ｍＬＤＭＦ）を２０ｍＬ加えて、５０℃で６時間反応させた。反応後、等量の冷水を加えて反応をとめて中和し、陽イオン交換樹脂を通して陽イオン交換を行い、透析、凍結乾燥を行って、硫酸化アセチルフコイダンを得た。
【００３１】
上記で得られた硫酸化アセチルフコイダンの組成は、Ｄ−フコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸および酢酸の構成比がそれぞれ４.０、０.２、１.１および０.８であった。また、この硫酸化アセチルフコイダンの硫酸含量をバリウム沈殿法により測定したところ、３２.２質量％であった。
【００３２】
（３）脱硫酸化アセチルフコイダンの製造：
上記（１）で製造したＴＥＡ型アセチルフコイダンを陽イオン交換樹脂を通して陽イオン交換を行い、ピリジンによりｐＨ７．０に調整してから濃縮し、２４時間透析を行い、凍結乾燥してピリジン型フコイダン（Ｐｙ型フコイダン）とした。Ｐｙ型フコイダンを、メタノールを含むジメチルスルフォキシドに溶解させ、８０℃で４時間反応させ、その後３０時間透析を行い、陽イオン交換樹脂を通して陽イオン交換を行い、中和、濃縮、凍結乾燥を行って、脱硫酸化アセチルフコイダンを得た。
【００３３】
上記で得られた脱硫酸化アセチルフコイダンの組成は、Ｄ−フコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸および酢酸の構成比がそれぞれ４．０、０．３、１．５および０．５であった。また、この脱硫酸化アセチルフコイダンの硫酸含量は０．０６質量％であった。
【００３４】
以上の３種類のアセチルフコイダンの組成及び硫酸含量をまとめると、次の表１に示すとおりである。
【００３５】
【表１】
2008044913.tif 000003
【００３６】
（４）ヒアルロニダーゼ阻害活性の評価
上記（１）〜（３）で得られた３種類のアセチルフコイダンについて、ヒアルロニダーゼ阻害活性を測定した。
ヒアルロニダーゼ０．１ｍＬ（３ｍｇ／ｍＬ）に、濃度の異なるネイティブアセチルフコイダン、硫酸化アセチルフコイダン、および脱硫酸化アセチルフコイダンをそれぞれ０．１ｍＬ加え、室温で２０分間インキュベートした。ヒアルロニダーゼは牛の精巣から分離したもの（シグマ社）を使用した。次に、この溶液にヒアルロニダーゼ活性化因子として１．５ＭＮａＣｌ０．１ｍＬ、及び基質であるヒトのヘソ由来のヒアルロン酸（MP Biomedicals）０．７ｍＬを加えて、３７℃で４０分間反応させ、ヒアルロニダーゼを失活させるために１００度に加熱した後、Mogan-Elson法により定量した。
【００３７】
各試料について、ヒアルロニダーゼを失活させた溶液に、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを溶解させた濃硫酸を１０倍希釈したものを加え、３７℃で２０分間インキュベートした後、この溶液を波長５８５ｎｍで吸光度を測定して、次式により阻害率を求めた。
【００３８】
【数１】
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【００３９】
各試料についての種々の希釈濃度での阻害率を図１に示す。比較のために既にヒアルロニダーゼ阻害活性が見出されているヘパリン（Celsus Laboratory）を陽性対照として同様にして阻害試験を行った。その結果も併せて図１に示す。
この結果から、ネイティブアセチルフコイダンは阻害活性を示し、２５μｇ／ｍＬで阻害率は約８０％であった。硫酸化アセチルフコイダンは更に高い活性を示し、２５μｇ／ｍＬでほぼ１００％の阻害率であり、その半分の濃度である１２．５μｇ／ｍＬでも約８０％の阻害率であり、ヘパリンよりも高い活性が認められた。一方、脱硫酸化アセチルフコイダンはほとんど阻害活性が認められなかった。
【００４０】
次に、図１の結果から５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求め、その結果を図２に示す。ネイティブアセチルフコイダンのＩＣ５０は２５．６μｇ／ｍＬ、硫酸化アセチルフコイダンのＩＣ５０は３．６μｇ／ｍＬ、ヘパリンのＩＣ５０は８．９μｇ／ｍＬであった。脱硫酸化アセチルフコイダンのＩＣ５０は算出することができなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、優れたヒアルロニダーゼ阻害活性を有するヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤として有用である。  更に、本発明はヒアルロニダーゼ阻害剤又はアトピー性皮膚炎治療剤であるとともに、これを各種飲食品に配合することにより優れた健康食品とすることができ、日常の飲食品として摂取することによって種々のアトピー性皮膚炎を防止することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、アセチルフコイダン類及びヘパリンの種々の濃度でのヒアルロニダーゼ阻害率を示すグラフである。
【図２】図２は、アセチルフコイダン類及びヘパリンのＩＣ５０を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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