(57)【要約】      （修正有）【課題】複数の免疫学的凝集反応試薬を含有し、それぞれ単項目で調製された試薬を用いてそれぞれ別々に検査を行う必要がなく、検査が多項目におよぶ場合であっても煩雑ではなく、多量の検体が必要とならない検査試薬の提供。【解決手段】複数の免疫学的凝集反応試薬を含有する検査試薬であって、個々の免疫学的凝集反応試薬がそれぞれ異なる色に着色された微粒子で調製されている検査試薬。この検査試薬は、検査試薬と検体を混合して凝集した微粒子の単色または混合色を観察することにより、あるいは、凝集しなかった微粒子の単色または混合色を観察することにより、または、凝集した微粒子と凝集しなかった微粒子の単色または混合色を観察することにより、検体中の物質、例えば抗原または抗体の存在を、多項目同時に検査することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の免疫学的凝集反応試薬を含有する検査試薬であって、個々の免疫学的凝集反応試薬がそれぞれ異なる色に着色された微粒子で調製されている検査試薬。
【請求項２】
３色の着色微粒子を用いる請求項１に記載の検査試薬。
【請求項３】
検査試薬が血液型検査試薬である請求項１または２に記載の検査試薬。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の検査試薬を用いて、免疫学的凝集反応を行い、凝集した微粒子の色調から、複数の被検物質の存否を同時に判定する検査方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の検査試薬を用いて、免疫学的凝集反応を行い、凝集しなかった微粒子の色調から、複数の被検物質の存否を同時に判定する検査方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の検査試薬を用いて、免疫学的凝集反応を行い、凝集した微粒子の色調と、凝集しなかった微粒子の色調から、複数の被検物質の存否を同時に判定する検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学的凝集反応を利用して項目毎にそれぞれ異なる色に着色した微粒子を用いて凝集試薬を調製し、それらを複数混合した検査試薬を用いて複数項目を同時に検査する検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、血液、尿あるいは唾液などの体液中に存在する免疫学的物質である抗原あるいは抗体を検出するために、一般的に下記の検査方法が行われている。
【０００３】
天然由来微粒子またはポリスチレンラテックス、（メタ）アクリル酸エステルを主成分とする重合体などのポリマー微粒子担体に抗原または抗体を吸着、イオン結合あるいは共有結合により固定化して免疫学的凝集反応試薬を調製する（図１参照）。次いで、免疫学的凝集反応試薬を検体（抗原または抗体を含有）と混合して微粒子が凝集するか否かを観察する（図１、図２参照）。
【０００４】
免疫学的凝集反応試薬は、無色あるいは着色微粒子を用いてそれぞれ単項目で調製された試薬を用い、それぞれの試薬で、別々に検査が行われている。例えば、ＨＢｓ抗原、HBs抗体、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｃ−反応性プロテイン（ＣＲＰ）、抗ストレプトリジン−Ｏ（ＡＳＯ）、リウマチ因子（ＲＦ）、ヒト胎児性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＡＢＯ式血液型等の検査試薬が、実際に使用されている（非特許文献１、特許文献１参照）。例えば、非特許文献１、特許文献１には、ＡＢＯ式血液型検査試薬が開示されている。
【非特許文献１】河原均、矢澤伸、「モノクローナル抗体固定化染色微粒子を利用したヒト唾液中の血液型抗原の簡便な検出法」、科警研報告、４３：１０１−１０７（１９９０）．
【特許文献１】特許第２９１８５９３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
それぞれ単項目で調製された試薬を用い、それぞれ別々に検査を行う場合、検査が多項目におよぶ場合はそれに応じて手技が煩雑になり、多数の容器が必要となって検査費用がかさむとともに、多量の検体が必要となり、被験者に負担を強いることになる。本発明は、このような問題を解決し、より有利な検査試薬と検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
項目毎にそれぞれ異なる色に着色した微粒子を用いて凝集試薬を調製し、それらを複数混合した検査試薬を用いて複数項目を同時に検査するために、本発明に想到した。
【０００７】
すなわち、本発明は、複数の免疫学的凝集反応試薬を含有する検査試薬であって、個々の免疫学的凝集反応試薬がそれぞれ異なる色に着色された微粒子で調製されている検査試薬である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の検査試薬は、複数の免疫学的凝集反応試薬を含有する検査試薬であり、それぞれ単項目で調製された試薬を用いて、それぞれ別々に検査を行う必要がなく、検査が多項目におよぶ場合であっても、煩雑ではなく、多量の検体が必要とならない。
【０００９】
本発明の検査試薬は、生物学的検査の分野で利用することができる。本発明の検査試薬は、例えば、インフルエンザウイルス、サイトカイン、血液型などの検査に利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の検査試薬は、複数の免疫学的凝集反応試薬を含有する検査試薬である。
【００１１】
さらに、本発明の検査試薬は、個々の免疫学的凝集反応試薬がそれぞれ異なる色に着色された微粒子で調製されている。
【００１２】
本発明の検査試薬では、微粒子は、血球（ホルマリン等により固定）、菌体などの天然由来微粒子、またはポリスチレンラテックス、（メタ）アクリロニトリルを主成分とする重合体、（メタ）アクリル酸エステルを主成分とする重合体などのポリマー微粒子である。本発明の検査試薬では、微粒子は、それぞれ異なる色に着色されている。微粒子の着色は、好ましくは、顔料または染料により行われる。本発明の検査試薬では、微粒子は、好ましくは、顔料または染料を混入、含浸、吸着、イオン結合あるいは共有結合により着色する。本発明の検査試薬は、微粒子が、共有結合により着色していることがより好ましい。
【００１３】
本発明の検査試薬では、微粒子に、抗原、抗体などの物質を固定化して、免疫学的凝集反応試薬を調製する（図１参照）。本発明の検査試薬において、固定化する物質は特に限定されないが、具体的には肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）ウイルス、ＡＩＤＳウイルス、ＡTLウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、麻疹ウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、ＳＶ４０ウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、マールブルグ病ウイルス、アデノウイルス、デングウイルス、ＥＢウイルス、マンプスウイルス、ワクシニアウイルス、パルボウイルス、ロタウイルス、タナポックスウイルス、ヤバウイルス、ラッサ熱ウイルス、タバコモザイクウイルス、マイコプラズマウイルス、ツツガムシリケッチャ、Ｑ熱リケッチャ、発疹チフスリケッチャ、クラミディアトラコーマチス、クラミディアプシタコシス、リン菌、破傷風菌、黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、結核菌、緑膿菌、炭疽菌、肺炎球菌、サルモネラ菌、コレラ菌、チフス菌、パラチフス菌、ボツリヌス菌、ブルセラ菌、赤痢菌、腸炎ビブリオ菌、ペスト菌、大腸菌、カンピロバクター、カンジダ菌、トキソプラズマ、マラリア原虫、トレポネーマパリダムなどのウイルスあるいは細菌、真菌、原生動物などの微生物由来の抗原、Ｃ反応性蛋白、癌胎児性抗原、α−フェトプロテイン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、熱凝集イムノグロブリンＧ、ヘモグロビン、核蛋白、核酸、エストロゲン、補体成分、ストレプトリジンＯ、血液型抗原（Ａ型、Ｂ型、Ｈ型）など、あるいはそれらを抗原とする抗体などがある。
【００１４】
本発明の検査試薬では、これらの抗原または抗体の中で、好ましくは、関連する、或いは、同一のグループの物質が用いられる。
【００１５】
本発明の検査試薬では、好ましくは、インターフェロン、ＩＬ−６、ＩＬ−８などのサイトカイン類、鳥インフルエンザなどインフルエンザウイルス、あるいは，Ａ型、Ｂ型、Ｈ型の血液型抗原などの免疫学的凝集反応試薬が用いられる。
【００１６】
本発明の検査試薬では、免疫学的凝集反応試薬を、好ましくは，２〜４種類、更に好ましくは，２〜３種類、含有する。
【００１７】
本発明の検査試薬を、例を挙げて説明する。
【００１８】
本発明の検査試薬は、検査試薬と検体を、好ましくは、ガラス、プラスチックなどの平板上または窪みのある板の窪みの中で混合する。本発明の検査試薬は、検査試薬と検体を混合して、凝集した微粒子の単色または混合色を観察することにより、あるいは、凝集しなかった微粒子の単色または混合色を観察することにより、または、凝集した微粒子と凝集しなかった微粒子の単色または混合色を観察することにより、検体中の物質、例えば、抗原または抗体の存在を、多項目同時に検査することができる。
【００１９】
以下、赤色、青色、黄色の各微粒子にそれぞれ異なる抗体を固定化して調製した検査試薬を例にあげて説明する。
【００２０】
赤色、青色、黄色の各微粒子にそれぞれ異なる抗体を固定化して調製した場合、３種類の免疫学的凝集反応試薬を混合すると黒色（赤色と青色と黄色の混合色）になる。
【００２１】
赤色と黄色の微粒子に固定化した各抗体に対する抗原が存在する検体を混合したとき、凝集した微粒子が集合する場合は、青色の視野に橙色（赤色と黄色の混合色）の凝集塊が認められる（図３（１））。この場合、青色の微粒子は、凝集していない。
【００２２】
青色と黄色の微粒子に固定化した各抗体に対する抗原が存在する検体を混合したときは、赤色の視野に緑色（青色と黄色の混合色）の凝集塊が認められる（図３（２））。この場合、赤色の微粒子は、凝集していない。
【００２３】
青色と赤色の微粒子に固定化した各抗体に対する抗原が存在する検体を混合したときは、黄色の視野に紫色（青色と赤色の混合色）の凝集塊が認められる（図３（３））。この場合、黄色の微粒子は、凝集していない。
【００２４】
黄色の微粒子に固定化した抗体に対する抗原が存在する検体を混合したときは、紫色（青色と赤色の混合色）の視野に黄色の凝集塊が認められる（図３（４））。この場合、青色の微粒子と赤色の微粒子は、凝集していない。
【００２５】
赤色の微粒子に固定化した抗体に対する抗原が存在する検体を混合したときは、緑色（青色と黄色の混合色）の視野に赤色の凝集塊が認められる（図３（５））。この場合、青色の微粒子と黄色の微粒子は、凝集していない。
【００２６】
青色の微粒子に固定化した抗体に対する抗原が存在する検体を混合したとき、橙色（赤色と黄色の混合色）の視野に青色の凝集塊が認められる（図３（６））。この場合、赤色の微粒子と黄色の微粒子は、凝集していない。
【００２７】
青色と赤色と黄色の微粒子に固定化した各抗体に対する抗原が全て存在しない検体を混合したときは、黒色の視野に凝集塊は認められない（図３（７））。この場合、赤色の微粒子、青色の微粒子、黄色の微粒子は、凝集していない。
【００２８】
さらに、青色と赤色と黄色の微粒子に固定化した各抗体に対する抗原が全て存在する検体を混合したときは、無色の視野に黒色の凝集塊が認められる（図３（８））。この場合、赤色の微粒子、青色の微粒子、黄色の微粒子は、凝集している。
以上記載したように、赤色、青色、黄色の各微粒子にそれぞれ異なる抗体を固定化して調製した検査試薬を用いると、８通りの色調の組み合わせで、３種類の免疫学的凝集反応を一度に判定することができる。本発明の検査試薬は、上記のように、３色の着色微粒子を用いることが好ましい。
【００２９】
本発明の検査方法は、複数の免疫学的凝集反応試薬を含有する検査試薬であって、個々の免疫学的凝集反応試薬がそれぞれ異なる色に着色された微粒子で調製されている検査試薬を用いて、免疫学的凝集反応を行い、凝集した微粒子の色調から、複数の被検物質の存否を同時に判定する。
【００３０】
本発明の検査方法は、好ましくは、免疫学的凝集反応を行い、凝集しなかった微粒子の色調から、複数の被検物質の存否を同時に判定する。
【００３１】
本発明の検査方法は、好ましくは、免疫学的凝集反応を行い、凝集した微粒子の色調と、凝集しなかった微粒子の色調から、複数の被検物質の存否を同時に判定する。
【００３２】
本発明の検査試薬では、検査試薬が、血液型検査試薬であることが好ましい。以下に、本発明の検査試薬を用いた血液型判定の例を示す。
【００３３】
動物の体液、特にヒトの血清、血漿、精液、唾液などの体液中には血液型抗原すなわちＡ型はＡ抗原とH抗原が、Ｂ型はＢ抗原とＨ抗原が、ＡＢ型はＡ抗原とＢ抗原とＨ抗原が、Ｏ型はＨ抗原のみが存在する。
【００３４】
例えば、青色の微粒子にＡ型の抗原に対する抗体を固定化し、赤色の微粒子にＢ型の抗原に対する抗体を固定化し、さらに黄色の微粒子にＨ型の抗原に対する抗体を固定化して調製する。次いで、青色の微粒子（Ａ型の抗原に対する抗体を固定化）、赤色の微粒子（Ｂ型の抗原に対する抗体を固定化）、黄色の微粒子（Ｈ型の抗原に対する抗体を固定化）した試薬を混合して黒色（青色と赤色と黄色の混合色）の試薬を調製する。
【００３５】
血液検査用プレートの穴の中で、本試薬と検体を混合しない場合は黒色（青色と赤色と黄色が非凝集）の視野に凝集塊はみとめられない（図３（７））。
【００３６】
Ａ型の検体を混合したとき、Ａ型にはＡ抗原とＨ抗原が存在するので、赤色（赤色が非凝集）の視野に凝集塊（青色と黄色が凝集）が認められる（図３（２））。
【００３７】
B型の検体を混合したとき、Ｂ型にはＢ抗原とＨ抗原が存在するので、青色（青色が非凝集）の視野に凝集塊（赤色と黄色が凝集）が認められる（図３（１））。
【００３８】
また、ＡＢ型の検体を混合したとき、ＡＢ型にはＡ抗原とＢ抗原とＨ抗原が存在するので、無色の視野に凝集塊（青色と赤色と黄色が凝集）が認められる（図３（８））。
【００３９】
さらに、O型の検体を混合したとき、O型はＨ抗原のみが存在するので、紫色（赤色と青色が非凝集）の視野に凝集塊（黄色が凝集）が認められる（図３（４））。
【００４０】
上記のように、本発明の検査試薬により、血液型検査を行うことができる。  
【実施例】
【００４１】
１．ポリマー微粒子の調製
グリシジルメタアクリレート１３．９６ｇ、２−ヒドロキシエチルメタアクリレート１．４２ｇ、トリエチレングリコールジメタアクリレート１．５６ｇ、プロピオン酸エチル３０g、四塩化炭素３０ｇおよび２，２’−アゾビス(２，４−ジメチルバレロニトリル)０．０６ｇを混合して２本の試験管に採り、窒素で試験管内を置換後密封して４５℃で１６時間加温静置した。試験管内容物をアセトン中に取り出して超音波破砕機でポリマー微粒子を分散させつつ遠心分離によりアセトンで３回洗浄して直径約2μmのポリマー微粒子約１５gを得た。
【００４２】
赤色反応性染料ロータスFカラー赤[（有）林ケミカル製]２ｇをジメチルフォルムアミド８０ mLに溶解して遠心し、上澄を染料溶液採って染料溶液を調製した。ポリマー微粒子５ｇを１５０ｍLのジメチルフォルムアミドに分散して遠心し、上澄を除去して染料溶液７５mLにポリマー微粒子を分散させる。１N NａOH溶液１６mLを加え５０℃で1時間攪拌した。遠心分離によりジメチルフォルムアミドで３回洗浄後蒸留水で３回洗浄して蒸留水２５０mLに分散してアンモニア水（２８％）１２５mLを加え、４０℃で１．５時間攪拌した。遠心によりポリマー微粒子を蒸留水で３回洗浄して蒸留水２５０mLに分散して濃硫酸０．４ mＬを加えて５０℃で２４時間攪拌した。遠心によりポリマー微粒子を蒸留水で３回洗浄後０．1M重炭酸ナトリウム１２５mＬに分散して遠心し、蒸留水で３回遠心によりポリマー微粒子を洗浄して蒸留水１００mＬに分散して赤色ポリマー微粒子を調製した。
【００４３】
黄色反応性染料ロータスFカラー黄[（有）林ケミカル製]を用いて赤色ポリマー微粒子と同様に黄色ポリマー微粒子を調製した。
【００４４】
青色ポリマー微粒子は、（株）鎌倉テクノサイエンス製のＧＮ（青）を用いた。
２．検査試薬の調製
赤色ポリマー微粒子、黄色ポリマー微粒子および青色ポリマー微粒子[市販品（株）鎌倉テクノサイエンス製  ＧＮ（青）]をそれぞれ１５０μＬ採り、それぞれに蒸留水６００μLとグルタルアルデヒド水溶液（２５％）１５μＬを添加して３０℃で１５分間攪拌後遠心分離によりＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、それぞれのポリマー微粒子を３００μLのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に分散した。
【００４５】
抗ヒトBlood Group Ａモノクローナル抗体（特殊免疫研究所製）をＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液（０．０５％）で８０倍希釈した溶液３００μLをグルタルアルデヒド処理した青色ポリマー微粒子分散液３００μLに添加して３０℃で1時間攪拌後遠心分離によりＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の ＰＢＳ溶液（１%）３．６mＬに分散して抗Ａ抗体固定化青色ポリマー微粒子分散液を調製した。
【００４６】
脱アルブミン処理したモノクローナル抗Ｂワコー（和光純薬）をＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液（０．０５%）で５倍希釈した溶液３００μＬをグルタルアルデヒド処理した赤色ポリマー微粒子分散液３００μLに添加して３０℃で１時間攪拌後遠心分離によりＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液（１%）３．６mＬに分散して抗Ｂ抗体固定化赤色ポリマー微粒子分散液を調製した。
【００４７】
抗Hモノクローナル抗体[（株）鎌倉テクノサイエンス製]をＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液（０．０５%）で２０倍希釈した溶液３００μLをグルタルアルデヒド処理した黄色ポリマー微粒子分散液３００μLに添加して３０℃で１時間攪拌後遠心分離によりＰBSで3回洗浄し、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液（１％）３．６mLに分散して抗H抗体固定化黄色ポリマー微粒子分散液を調製した。
【００４８】
抗Ａ抗体固定化青色ポリマー微粒子分散液、抗Ｂ抗体固定化赤色ポリマー微粒子分散液
および抗H抗体固定化黄色ポリマー微粒子分散液をそれぞれ４００μLずつ採って混合し、遠心して上澄８００μLを除いた後ポリマー微粒子を分散して黒色の混合分散液を調製した。
３．血液型検査
Ａ型、Ｂ型、ＡＢ型およびO型のヒトの唾液を採取してＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液（０．１%）でＡ型、B型およびO型は１０００倍に、ＡＢ型は1００倍に希釈して血液検査用プレート（旭テクノグラス  １８８４−０２４）に４０μＬずつ採った。それぞれに上記黒色の混合分散液４０μＬずつを添加して水平回転攪拌して静置後プレートの垂直上部から各混合液を観察した結果、本試薬と検体を混合しない場合は黒色（青色と赤色と黄色が非凝集）の視野に凝集塊はみとめられなかった（図４（１））。Ａ型の検体を混合したとき、赤色（赤色が非凝集）の視野に凝集塊（青色と黄色が凝集）が認められた（図４（２））。Ｂ型の検体を混合したとき、青色（青色が非凝集）の視野に凝集塊（赤色と黄色が凝集）が認められた（図４（３））。また、ＡＢ型の検体を混合したとき、白色（プレートの色）の視野に凝集塊（青色と赤色と黄色が凝集）が認められた（図４（４））。さらに、Ｏ型の検体を混合したとき、紫色（赤色と青色が非凝集）の視野に凝集塊（黄色が凝集）が認められた（図４（５））。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】微粒子凝集の概要図である。
【図２】免疫学的凝集反応検査の概要図である。
【図３】本発明の一つの形態である免疫学的凝集反応検査結果の概要図である。
【図４】本発明の実施例の結果の概要図である。
【図１】
2008089415.tif 000002
【図２】
2008089415.tif 000003
【図３】
2008089415.tif 000004
【図４】
2008089415.tif 000005