(57)【要約】【課題】酵素増幅を利用した高感度な方法であると同時に洗浄工程を必要としない免疫測定方法を提供すること。【解決手段】検体中の被験物を該被験物に対する抗体又は抗体フラグメントを用いて測定する免疫測定方法において、（１）被験物と該被験物に対する抗体又は抗体フラグメントとを反応させ、該反応に依存して活性な酵素を生成させる工程、（２）工程（１）で生成した活性な酵素を用いて酵素反応を行う工程、（３）工程（２）の酵素反応で生成した反応生成物をセンサー表面又はセンサー表面に固定化された物質に結合させて光によって検出する工程、を含む、免疫測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の被験物を該被験物に対する抗体又は抗体フラグメントを用いて測定する免疫測定方法において、
（１）被験物と該被験物に対する抗体又は抗体フラグメントとを反応させ、該反応に依存して活性な酵素を生成させる工程、
（２）工程（１）で生成した活性な酵素を用いて酵素反応を行う工程、
（３）工程（２）の酵素反応で生成した反応生成物をセンサー表面又はセンサー表面に固定化された物質に結合させて光によって検出する工程、
を含む、免疫測定方法。
【請求項２】
前記工程（１）において、（ａ）被験物、（ｂ）該被験物に対する抗体又は抗体フラグメント、及び（ｃ）酵素ドナーと被験物との複合体を反応させて、該抗体又は抗体フラグメントに対して、該被験物と該複合体とを競合させ、さらに酵素アクセプターを混合して、遊離した該複合体と該酵素アクセプターとの複合体を形成させることによって、活性な酵素を生成させる、請求項１に記載の免疫測定方法。
【請求項３】
前記工程（１）において、（ａ）酵素ドナーが結合した一次抗体、（ｂ）被験物、及び（ｃ）酵素アクセプターが結合した二次抗体を混合して、該一次抗体と該被験物と該二次抗体の複合体を形成することによって、活性な酵素を生成させる、請求項１に記載の免疫測定方法。
【請求項４】
工程（３）において、反応生成物を、センサー表面又はセンサー表面に固定化された物質に、不可逆的な結合により結合する、請求項１から３の何れかに記載の免疫測定方法。
【請求項５】
反応生成物と、センサー表面又はセンサー表面に固定化された物質との結合が、共有結合である、請求項１から４の何れかに記載の免疫測定方法。
【請求項６】
反応生成物と、センサー表面又はセンサー表面に固定化された物質との結合が、アビジンとビオチンとの結合、又はジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体との結合である、請求項１から４の何れかに記載の免疫測定方法。
【請求項７】
酵素が、βガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼのいずれか又はその組み合わせである、請求項１から６の何れかに記載の免疫測定方法。
【請求項８】
工程（２）の酵素反応で生成する反応生成物が、センサー表面又はセンサー表面に固定化された物質と結合できる部位、及び検出可能な部位を有する物質である、請求項１から７の何れかに記載の免疫測定方法。
【請求項９】
検出可能な部位が、光を受光して散乱する光散乱物質、光を受光して蛍光を発するする蛍光物質、又は光を吸光する吸光物質である、請求項８に記載の免疫測定方法。
【請求項１０】
光散乱物質が、磁性粒子あるいは金ナノ粒子である請求項９に記載の免疫測定方法。
【請求項１１】
蛍光物質が、ウンベリフェロン、Cy5、フルオレセイン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、又はテキサスレッドである、請求項１から１０の何れかに記載の免疫測定方法。
【請求項１２】
工程（３）において、工程（２）の酵素反応で生成した反応生成物を近接場光によって検出する、請求項１から１１の何れかに記載の免疫測定方法。
【請求項１３】
近接場光が、プラズモンで増強された光である、請求項１２に記載の免疫測定方法。
【請求項１４】
少なくとも（ａ）被験物に対する抗体又は抗体フラグメント、（ｂ）酵素ドナーと被験物との複合体、（ｃ）酵素アクセプターを含む、請求項２に記載の免疫測定方法に用いるためのキット。
【請求項１５】
少なくとも（ａ）酵素ドナーが結合した、被験物に対する一次抗体、及び（ｃ）酵素アクセプターが結合した、被験物に対する二次抗体を含む、請求項３に記載の免疫測定方法に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物の免疫測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ測定において、エバネッセント波を用いた蛍光法が提案されている。プリズムを用いた全反射光により表面近傍に染みだしたエバネッセント波を用いる測定では、励起光は下方に全反射されるため上方から光検出する場合、信号に対するバック・グラウンドにならない。
【０００３】
また、エバネッセント光は表面近傍の数百nmの領域しか照射しないため、浮遊物等からの散乱によるノイズを減らす事ができる。そのためエバネッセント蛍光法は、従来の蛍光法に較べ光ノイズを大幅に低減できる方法として注目されている。また、表面近傍に結合した物質しか励起しないので、浮遊している２次抗体を洗浄せずに測定できるため（B(Bound)/ F(Free)分離が不要。）、操作が大幅に簡易化できるメリットもある。
【０００４】
さらなる高感度化の方法としては、プリズム上に金属薄膜を設け、薄膜中に生じた表面プラズモンによる電場増強を利用し、蛍光の増幅を図る方法が知られている（ＳＰＦＳ。Ｓurface-Ｐlasmon field-enhanced Ｆluorescence Ｓpectroscopy）。検出限界は10ng/cm2 ≒100RUである（Anal.Chem. 75(2003)2610 W.Knoll）。しかし酵素増幅を利用した蛍光ELISA測定の検出限界 100 fM（0.1〜１RU相当）に大きく及ばないのが実状である。
【０００５】
特許文献１には、局在化が可能な第１反応体と被検物を反応させて得られた結合物を、光標識した第２反応体と反応させ、得られた第１反応体−被検物−第２反応体結合物を、局在化させた後、局在化領域を含む所定の領域のみに光を導入し、標識に基づいて第１反応体−被検物−第２反応体結合物を定量することにより、被検物を定量する方法が記載されている。しかし、この方法は、酵素増幅を利用した方法ではない。
【０００６】
酵素増幅を利用して、表面プラズモン共鳴で測定する免疫測定法が公開されているが（特許文献２）、複雑な微小流路を用いてB/F分離（洗浄操作）を行っている。近接場光で測定する系で、酵素増幅を利用し、かつB/F分離操作を行わない測定系は難しく、従来技術では達成されていない。
【０００７】
【非特許文献１】Anal.Chem. 75(2003), 2610
【特許文献１】特開２００５−７７３３８号公報
【特許文献２】特開２００５−２４４８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、酵素増幅を利用した高感度な方法であると同時に洗浄工程を必要としない免疫測定方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、被験物と該被験物に対する抗体とを反応させ、該反応に依存して活性な酵素を生成させて酵素反応を行い、この酵素反応で生成した反応生成物をセンサー表面又はセンサー表面に固定化された物質に結合させて光によって検出することによって、検体中の被験物を、洗浄工程を行うことなしに高感度に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明によれば、検体中の被験物を該被験物に対する抗体又は抗体フラグメントを用いて測定する免疫測定方法において、
（１）被験物と該被験物に対する抗体又は抗体フラグメントとを反応させ、該反応に依存して活性な酵素を生成させる工程、
（２）工程（１）で生成した活性な酵素を用いて酵素反応を行う工程、
（３）工程（２）の酵素反応で生成した反応生成物をセンサー表面又はセンサー表面に固定化された物質に結合させて光によって検出する工程、
を含む、免疫測定方法が提供される。
【００１１】
好ましくは、前記工程（１）において、（ａ）被験物、（ｂ）該被験物に対する抗体又は抗体フラグメント、及び（ｃ）酵素ドナーと被験物との複合体を反応させて、該抗体又は抗体フラグメントに対して、該被験物と該複合体とを競合させ、さらに酵素アクセプターを混合して、遊離した該複合体と該酵素アクセプターとの複合体を形成させることによって、活性な酵素を生成させる。
【００１２】
好ましくは、前記工程（１）において、（ａ）酵素ドナーが結合した一次抗体、（ｂ）被験物、及び（ｃ）酵素アクセプターが結合した二次抗体を混合して、該一次抗体と該被験物と該二次抗体の複合体を形成することによって、活性な酵素を生成させる。
【００１３】
好ましくは、工程（３）において、反応生成物を、センサー表面又はセンサー表面に固定化された物質に、不可逆的な結合により結合する。
好ましくは、反応生成物と、センサー表面又はセンサー表面に固定化された物質との結合は、共有結合である。
好ましくは、反応生成物と、センサー表面又はセンサー表面に固定化された物質との結合は、アビジンとビオチンとの結合、又はジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体との結合である。
【００１４】
好ましくは、酵素は、βガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼのいずれか又はその組み合わせである。
【００１５】
好ましくは、工程（２）の酵素反応で生成する反応生成物は、センサー表面又はセンサー表面に固定化された物質と結合できる部位、及び検出可能な部位を有する物質である。
好ましくは、検出可能な部位は、光を受光して散乱する光散乱物質、光を受光して蛍光を発するする蛍光物質、又は光を吸光する吸光物質である。
【００１６】
好ましくは、光散乱物質は、磁性粒子あるいは金ナノ粒子である。
好ましくは、蛍光物質は、ウンベリフェロン、Cy5、フルオレセイン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、又はテキサスレッドである。
【００１７】
好ましくは、工程（３）において、工程（２）の酵素反応で生成した反応生成物を近接場光によって検出する。
好ましくは、近接場光は、プラズモンで増強された光である。
【００１８】
本発明の別の側面によれば、少なくとも（ａ）被験物に対する抗体又は抗体フラグメント、（ｂ）酵素ドナーと被験物との複合体、（ｃ）酵素アクセプターを含む、本発明の免疫測定方法に用いるためのキットが提供される。
【００１９】
本発明のさらに別の側面によれば、少なくとも（ａ）酵素ドナーが結合した、被験物に対する一次抗体、及び（ｃ）酵素アクセプターが結合した、被験物に対する二次抗体を含む、本発明の免疫測定方法に用いるためのキットが提供される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の免疫測定方法においては、B／F分離操作が不要であり、簡便かつ短時間での測定が可能である。また。本発明の免疫測定方法においては、酵素反応により検出シグナルを増幅することができるので高感度な測定が可能である、
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明は、検体中の被験物を該被験物に対する抗体又は抗体フラグメントを用いて測定する免疫測定方法において、
（１）被験物と該被験物に対する抗体又は抗体フラグメントとを反応させ、該反応に依存して活性な酵素を生成させる工程、
（２）工程（１）で生成した活性な酵素を用いて酵素反応を行う工程、
（３）工程（２）の酵素反応で生成した反応生成物をセンサー表面又はセンサー表面に固定化された物質に結合させて光によって検出する工程、
を含む方法である。本発明の方法の概要を図１に示す。
【００２２】
上記工程（１）は、図１の左側に示すように、以下の２通りの方法の何れかで行うことができる。
（図１の左側の上段）
（ａ）被験物、（ｂ）該被験物に対する抗体又は抗体フラグメント、及び（ｃ）酵素ドナーと被験物との複合体を反応させて、該抗体又は抗体フラグメントに対して、該被験物と該複合体とを競合させ、さらに酵素アクセプターを混合して、遊離した該複合体と該酵素アクセプターとの複合体を形成させることによって、活性な酵素を生成させる。
【００２３】
（図１の左側の下段）
（ａ）酵素ドナーが結合した一次抗体、（ｂ）被験物、及び（ｃ）酵素アクセプターが結合した二次抗体を混合して、該一次抗体と該被験物と該二次抗体の複合体を形成することによって、活性な酵素を生成させる。
【００２４】
本発明で用いることができる被験物の種類は特に限定されないが、例えば、抗原、酵素、ホルモン、サイトカイン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、血球、細胞、細菌、又はウィルスなどが挙げられる。また、環境ホルモンなど自然界に存在する物質であってもよい。被験物としては、上記した被験物を含有する血液、尿、唾液、骨髄液、脳脊髄液などの体液；河川水、又は廃液などを用いてもよい。
【００２５】
本発明では、被験物に対する抗体又は抗体フラグメントを使用する。抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の何れでもよい。また、図１の左側の下段に示すように、酵素ドナーが結合した一次抗体と酵素アクセプターが結合した二次抗体を使用する場合は、一次抗体と二次抗体はそれぞれ、被験物の異なるエピトープを認識して、一次抗体と被験物と二次抗体の複合体が形成されるような抗体を使用する。
【００２６】
本発明では、ある酵素を２つの断片に分割して、それぞれを酵素ドナー及び酵素アクセプターとして使用する。即ち、酵素ドナーは、ある酵素を２つの断片に分割した場合の片方の断片を意味し、酵素アクセプターは、ある酵素を２つの断片に分割した場合の他方の断片を意味する。酵素ドナー及び酵素アクセプターは、互いに相互作用して複合体を形成することにより、活性な酵素を形成することができるようなものである。酵素を２つの断片に分割してそれぞれを酵素ドナー及び酵素アクセプターとして使用することについては、例えば、特開平7-179495号公報、並びに上記公報中に記載の引用文献に記載されており、本発明においてもそれらの内容を参照することができる。
【００２７】
本発明で用いることができる酵素の具体例としては、βガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、又はアルカリフォスファターゼなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
本発明によれば、本発明の免疫測定方法に用いるためのキットが提供される。本発明のキットの第一の形態は、少なくとも（ａ）被験物に対する抗体又は抗体フラグメント、（ｂ）酵素ドナーと被験物との複合体、（ｃ）酵素アクセプターを含むキットである。また、本発明のキットの第二の形態は、少なくとも（ａ）酵素ドナーが結合した、被験物に対する一次抗体、及び（ｃ）酵素アクセプターが結合した、被験物に対する二次抗体を含むキットである。上記したキットの各構成成分は、溶液状態、乾燥状態、凍結状態、凍結乾燥状態等で提供することができる。保存安定性の点から、凍結乾燥状態であることが好ましいが、液状で安定な物質である場合、液状試薬として提供することが好ましい。また、本発明のキットには、酵素反応を行うための他の試薬（即ち、酵素の基質など）を含めることもできる。
【００２９】
本発明では、被験物と該被験物に対する抗体又は抗体フラグメントとを反応させ、該反応に依存して活性な酵素を生成させた後に、上記で生成した活性な酵素に基質を作用させて酵素反応を行う。この酵素反応で生成する反応生成物は、好ましくは、センサー表面又はセンサー表面に固定化された物質と結合できる部位、及び検出可能な部位を有する物質である。上記した酵素反応で用いる基質としては、上記したような反応生成物を酵素反応により生じさせるものを用いることが好ましい。
【００３０】
検出可能な部位としては、光を受光して散乱する光散乱物質（例えば、磁性粒子あるいは金ナノ粒子）、光を受光して蛍光を発するする蛍光物質（例えば、ウンベリフェロン（同仁化学）、Cy5(GE healthcarebioscience社)、fluorescein(Invitrogen社)、Rhodamine Green(Invitrogen社)、Rhodamine Red(Invitrogen社)、Texas Red(Invitrogen社)）、又は光を吸光する吸光物質（例えば、3,3',5,5'-tetramethylbenzidine）などを挙げることができる。
【００３１】
上記の中でも、検出可能な部位は、好ましくは、蛍光物質である。この場合、例えば、（ｉ）酵素が作用する基質部位、（ｉｉ）蛍光物質部位、及び（ｉｉｉ）センサー表面又はセンサー表面に固定化された物質と結合できる部位を有する物質を、基質として使用して酵素反応を行うことができる。
【００３２】
本発明では、酵素反応で生成した反応生成物をセンサー表面又はセンサー表面に固定化された物質に結合させる。反応生成物は、センサー表面又はセンサー表面に固定化された物質に、不可逆的な結合（例えば、共有結合など）により結合することが好ましい。また、反応生成物は、アビジンとビオチンとの結合、又はジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体との結合を介して、センサー表面に結合することも好ましい。この場合、反応生成物自体がアビジン又はビオチンの片方を有しており、センサー表面にアビジン又はビオチンの他方が固定化されている。または、反応生成物自体がジゴキシゲニン又は抗ジゴキシゲニン抗体の片方を有しており、センサー表面にジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体の他方が固定化されている。
【００３３】
本発明では、酵素反応で生成した反応生成物を光によって検出する。光としては、近接場光であることが好ましく、近接場光は、プラズモンで増強された光であることがさらに好ましい。近接場光としては、例えば、エバネッセント光を用いることができる。エバネッセント光とは、光が全反射したときに第２媒質中にわずかに滲み出した光で、伝搬せず、第２媒質との境界面から１００ｎｍ程度の領域にだけ発生する。試料収容部と接触させた光導波路又はプリズムに臨界角度以上で光を入射することにより、試料収容部との境界面でエバネッセント波を生じさせることができる。
【００３４】
また、本発明で用いることができる表面プラズモン共鳴方式免疫測定装置の構造としては、多角形もしくは半円形のプリズムの一つの側面の上に金属薄膜を形成したものを使用することができる。プリズムとは、石英やガラスやポリメチルメタタリレートなど、紫外、可視、近赤外領域の光に対して透明で、しかも液体試料より大きな屈折率を有する材質より成る光学部品である。プリズムの形状に特に限定されないが、半円柱、三角柱、台形柱などである。金属薄膜としては厚さ１０ｎｍ〜１００ｎｍ程度の金の薄膜を用ることができる。また、ガラスと金属薄膜との密着性を向上させる目的で１〜１０ｎｍ程度のクロム層を間に形成することもできる。プリズム型の表面プラズモン共鳴デバイスは、半導体レーザー（ＬＤ）又は発光ダイオード（ＬＥＤ）等の単色光源、電荷結合素子（ＣＣＤ）あるいはフォトトランジスタ等の光検出器、並びに偏光板と組み合わせて一体化された装置として使用することができる。表面プラズモン共鳴デバイス、単色光源、および光検出器は、単色光源の光がプリズムのガラス面から入射され、金属薄膜形成面で全反射し、再びガラス面から出射されて偏光板を通り光検出器で検出される様に配置することができる。表面プラズモン共鳴デバイスを組み込んだ免疫反応検出装置は、フローセルを金属薄膜の上に形成し、フローシステムとして用いることもできる。
【００３５】
本発明で用いることができる表面プラズモン増強蛍光センサーの別の例としては、所定波長の励起光を発する光源と、前記励起光を透過させる材料から形成された誘電体ブロック（プリズム）と、この誘電体ブロックの一表面に形成された金属膜と、疎水性材料からなり前記金属膜の上に形成された、膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲にある不撓性膜と、前記誘電体ブロックと反対側から前記不撓性膜に試料が接するように該試料を保持する試料保持部と、前記励起光を、前記誘電体ブロックと金属膜との界面に向けて、全反射条件を満たすように誘電体ブロックを通して入射させる入射光学系と、前記界面に前記励起光が入射したとき、該界面から染み出すエバネッセント波に励起されて、前記試料中に含まれる物質が発した蛍光を検出する蛍光検出手段とからなることを特徴とする表面プラズモン増強蛍光センサーを挙げることができる。この表面プラズモン増強蛍光センサーにおいては、金属膜の上に膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲にある不撓性膜が設けられていることを特徴とするものである。
【００３６】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
（実施例）
（1-1）基盤の作製
ゼオネクス製の基盤（プリズム、屈折率1.50）の表面に金膜50nmをスパッタにて形成する。更に金膜上にポリスチレン系のポリマ膜（プリズム、屈折率、1.59）20nmをスピンコートにて形成し、更に５アミノ吉草酸を固定化する。上記の表面上で、Ｎアビジンをアミンカップリング法にて固定する。
【００３８】
（1-2）反応系（DiscoverX社：HitHunter Cortisol Assay Kitを使用）
15μlのコルチゾール溶液に10μlのコルチゾール抗体、10μlのβ―ガラクトシダーゼ断片とコルチゾールの複合体を添加する。60分間、室温で放置する。更に、10μlのβ-galactosyl-umbelliferone-biotin、もう片方のβ―ガラクトシダーゼ断片を10μl添加する。60分間、室温で放置する。この反応溶液をＮアビジンが固定化された基盤に添加し、プラズモンで増強された光で検出する。400nmの励起光を用い、蛍光検出には、fujifilm社製LAS-1000plusを用いる。その結果、100aMの超高感度検出を行うことができる。
【００３９】
（比較例）
同様の反応をβ-galactosyl-umbelliferoneを用いて行う。その結果、100fMも検出できない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、本発明の方法の概要を示す図である。
【図１】
2008139245.tif 000002