(57)【要約】【課題】本発明は、例えば、ポリフェノール類等のPCR阻害物質を含有する被検試料をPCRにより分析する方法において、植物DNAを含むポリビニルポリピロリドン(PVPP)をPCR阻害物質を除去する目的で使用できるようにすることを課題とする。【解決手段】本発明は、植物DNAを含有するPVPPから植物DNAを除去して得られたPVPPに関する。本発明はまた、被検試料からDNAを抽出する時に、植物DNAが除去されたPVPPを用いて被検試料中のPCR阻害物質を除去し、得られた被検試料DNA抽出物をPCRを用いて分析する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物DNAを含有するポリビニルポリピロリドンから植物DNAが除去された、ポリビニルポリピロリドン。
【請求項２】
植物DNAを含有するポリビニルポリピロリドンをオートクレーブ処理することにより植物DNAが除去された、請求項1記載のポリビニルポリピロリドン。
【請求項３】
植物DNAを含有するポリビニルポリピロリドンをDNA抽出用溶液により洗浄することにより植物DNAが除去された、請求項1記載のポリビニルポリピロリドン。
【請求項４】
ポリメラーゼ連鎖反応阻害物質を含有する被検試料をポリメラーゼ連鎖反応により分析する方法であって、
(a) 請求項1〜3のいずれか1項記載のポリビニルポリピロリドンを用いて被検試料中のポリメラーゼ連鎖反応阻害物質を除去する工程と、
(b) 被検試料中のDNAを抽出する工程と、
(c) 工程(a)及び(b)により得られた、ポリメラーゼ連鎖反応阻害物質が除去されたDNA抽出物に、プライマーセットを加え、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程とを含む、前記方法。
【請求項５】
前記工程(a)及び(b)の実施順序は、同時に行うか、又は前記工程(b)を行った後に工程(a)を行う、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ポリメラーゼ連鎖反応阻害物質がポリフェノール類である、請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNA抽出に用いるためのポリビニルポリピロリドン（本明細書では「PVPP」と略記することがある）の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（本明細書では「PCR」と略記することがある）は、微生物の分析、遺伝子組換え作物の分析、食物アレルギーを引起すとされる食品原材料の分析、穀物や肉の品種分析など、様々な食品分析の分野において用いられている技術の一つである。
【０００３】
食品のPCR分析方法としては、食品試料からDNAを抽出し、次いで、抽出物を鋳型として、適当なプライマーセットを用いてPCRを行い、検出しようとする微生物、植物、動物などに由来するDNAの存在を確認する方法がある。ところがこの方法は、食品試料中に、ポリフェノール類等のPCRを阻害する物質（本明細書では「ポリメラーゼ連鎖反応阻害物質」あるいは「PCR阻害物質」と称する）が含まれている場合には、仮にそれら検出しようとする微生物、動物、植物などのDNAが食品試料中に含まれていたとしてもPCRが阻害され増幅産物が生成されないために検出が行えないという問題がある。
【０００４】
PCR阻害物質であるポリフェノール類を除去する方法として、PVPPを用いる方法が知られている。非特許文献1及び2では、PVPPを用いることにより、PCRに供するためのDNA抽出物からPCR阻害物質を除去することができることが記載されている。
【０００５】
非特許文献3には、目的は不明であるが、PCRに供するための鋳型DNA試料を抽出する際に使用するPVPPを酸処理することが記載されている。
【０００６】
【非特許文献１】Anderson KL and Lebepe-Mazur S.「Comparison of rapid methods for the extraction of bacterial DNA from colonic and caecal lumen contents of the pig.」Journal of Applied Microbiology. 94, 988-993 (2003).
【非特許文献２】Martellossi C, Taylor EJ, Lee D, Graziosi G, and Donini P.「DNA Extraction and Analysis from Processed Coffee Beans.」J Agric Food Chem. 53, 8432-8436 (2005).
【非特許文献３】Holben WE, Jansson JK, Chelm BK, and Tiedje JM.「DNA Probe Method for the Detection of Specific Microorganisms in the Soil Bacterial Community.」APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY.  54, 703-711 (1988).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、食品試料から、PCRに供するための鋳型DNA試料を抽出する際に、PVPPを用いてPCR阻害物質を除去する方法は有用である。
【０００８】
しかしながら、使用するPVPPに、被検試料以外に由来する植物のDNAが含まれている場合には、当該DNAも抽出されてPCR系に混入してしまうため正確な分析ができない。本発明者らは驚くべきことに、通常の試験条件では、PVPP中に植物DNAが存在していることがあることを見出した。
【０００９】
そこで本発明は、ポリフェノール類等のPCR阻害物質を含有する被検試料をポリメラーゼ連鎖反応（以下、PCRという）により分析する方法において、植物DNAを含むPVPPをPCR阻害物質を除去する目的で使用できるようにすることを課題とする。この技術的課題は従来想定されていなかった新規な課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意研究の末、PVPP中に含まれる植物DNAはオートクレーブ処理等の方法により除去できること、並びにこうして処理されたPVPPを使用することにより被検試料からのDNA抽出物中のPCR阻害物質を除去でき、正確なPCRを行うことができることを見出し、本発明を完成させた。なお、上述の非特許文献3ではPVPPの酸処理を行うことが記載されているが、本発明者らが非特許文献3の条件に基づく酸処理を再現したところPVPP中の植物DNAは除去できないことが確認された。このことから、非特許文献3は本発明の課題を解決する手段を提供するものではないと言える。
【００１１】
本発明は以下の発明を包含する。
(1) 植物DNAを含有するポリビニルポリピロリドンから植物DNAが除去された、ポリビニルポリピロリドン。
(2) 植物DNAを含有するポリビニルポリピロリドンをオートクレーブ処理することにより植物DNAが除去された、(1)記載のポリビニルポリピロリドン。
(3) 植物DNAを含有するポリビニルポリピロリドンをDNA抽出用溶液により洗浄することにより植物DNAが除去された、(1)記載のポリビニルポリピロリドン。
(4) ポリメラーゼ連鎖反応阻害物質を含有する被検試料をポリメラーゼ連鎖反応により分析する方法であって、
(a) (1)〜(3)のいずれかに記載のポリビニルポリピロリドンを用いて被検試料中のポリメラーゼ連鎖反応阻害物質を除去する工程と、
(b) 被検試料中のDNAを抽出する工程と、
(c) 工程(a)及び(b)により得られた、ポリメラーゼ連鎖反応阻害物質が除去されたDNA抽出物に、プライマーセットを加え、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程とを含む、前記方法。
(5)前記工程(a)及び(b)の実施順序は、同時に行うか、又は前記工程(b)を行った後に工程(a)を行う(4)記載の方法。
(6) ポリメラーゼ連鎖反応阻害物質がポリフェノール類である、(4)記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、PCR阻害物質を含有する被検試料のPCRによる分析を精度よく行うことが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
1.植物DNAを含有するPVPP
本発明における「植物DNAを含有するPVPP」とは、何らかの原因で植物DNAが混入したPVPPを指すがこれには限定されず、人為的に植物DNAが添加されたPVPPであってもよい。
PVPP中の植物DNAの含有量は特に限定されないが、通常はごく微量である。PVPP中に植物DNAが含まれているか否かは、常法によりPVPPからのDNA抽出を試み、得られた抽出物に植物DNA検出用プライマーセットを加えてPCRを実施したときに、PCR増幅産物が得られるか否かを指標として判別することができる。
植物DNAは限定されないが、例えば植物DNA検出用プライマーセットであるCP03（配列表の配列番号1及び2）により増幅され得る植物DNAが挙げられる。植物DNAは単一の植物からのものには限定されず、複数の植物に由来するDNAが組み合わされたものであってもよい。
PVPPはポリフェノール類等のPCR阻害物質を除去しうるものである限り特に限定されない。
【００１４】
2.PVPP中の植物DNAを除去する方法
上記のPVPP中の植物DNAを除去する方法は特に限定されないが、典型的にはPVPPのオートクレーブ処理、DNase処理、紫外線照射処理、酸処理等の各種DNA分解処理によりPVPP中のDNAを除去する方法や、水性溶液によりPVPPを洗浄しDNAを除去する方法などが挙げられる。なかでもオートクレーブ処理及び水性溶液による洗浄処理が好ましく、オートクレーブ処理が最も好ましい。
オートクレーブ処理の圧力条件は、前記植物DNAを熱破壊することができる条件であれば特に限定されるものではなく、例えば１２１℃で４０分以上、好ましくは１２１℃で６０分以上という条件を例示することができる。なお、上記オートクレーブの処理条件の上限としては、PVPPのポリフェノール除去能が失われない条件、例えば１２１℃で１２０分という条件を例示することができる。
PVPPをDNA抽出用溶液により洗浄する場合、一般的にDNA抽出に使用されているものであれば特に限定されるものではなく、例えばbuffer G2 (QIAGEN社)等を例示することができる。
【００１５】
3.PCR阻害物質を含有する被検試料からのDNA抽出方法とPCR分析方法
本発明の更なる形態は、PCR阻害物質を含有する被検試料をPCRにより分析する方法に関する。
本発明のこの実施形態では、上記の手順で植物DNAが除去されたPVPPを用いて被検試料中のPCR阻害物質を除去する工程と、被検試料中のDNAを抽出する工程と、これらの工程を経て得られた、ポリメラーゼ連鎖反応阻害物質が除去されたDNA抽出物に、PCR分析しようとするDNAを増幅可能なプライマーセットを加えPCRを行う工程とを含む。増幅産物の有無は、電気泳動等の常法により容易に確認できる。
【００１６】
本発明における「被検試料」とは、特に限定されるものではなく、食品の原材料やその加工品、それらから得られる食品、更には、食品製造プラント中の残存物、医薬品、糞便等が挙げられる。特に、ポリフェノール類を多く含む試料、例えば各種果物やカカオなどの食品や、医薬品、糞便等に適用することが好ましい。また、アレルゲン性の植物が混入するおそれのあるような食品に適用することもできる。
【００１７】
PVPPを用いて被検試料中のポリメラーゼ連鎖反応阻害物質を除去する工程(a)と、被検試料中のDNAを抽出する工程(b)とは、順に又は同時に行われる。工程(a)と(b)とが順に行われる場合、工程(b)の後に工程(a)を行うことになる。また、一つの操作が工程(a)と(b)の両方の目的を兼ねる場合もありうる。被検試料又は被検試料からのDNA溶液中のPCR阻害物質をPVPPにより除去する方法は常法により行うことができる。具体的には、DNA抽出用溶液を用いて試料からDNAを抽出する際に、DNA抽出用溶液にPVPPを加えておき、DNAの抽出後、遠心分離してPVPPとともにそれに吸着したPCR阻害物質を沈殿させて除く（この場合、抽出操作は工程(a)のPCR阻害物質除去の目的も兼ねる）。または、DNA抽出用溶液にPVPPを加えずに被検試料からDNAを抽出した後、そのDNA溶液を、PVPPを充填したカラムに通してPCR阻害物質をPVPPに吸着して除く方法等がある（この場合、工程(b)が先に行われ、次いで工程(a)が行われる）。
【００１８】
本発明では、上記の手順で得られた、PCR阻害物質が除去されたDNA抽出物に、PCR分析しようとするDNAを増幅可能なプライマーセットを加えPCRを行う。プライマーセットは分析対象に応じて適宜選択できる。例えば、アレルゲン性植物の分析の場合は、図1に示すように二段階で行うことが好ましい。第一段階では、CP03プライマー（配列表の配列番号1及び2）のように植物全般に共通して存在するDNAを増幅可能なプライマー（植物DNA検出用プライマー）のセットを用いてPCRを行う。第一段階で標的増幅産物が確認された場合には更に、第二段階を行う。第二段階では、検出しようとする植物に特異的に存在するDNAを増幅可能なプライマーを用いてPCRを行う。第二段階で標的増幅産物が得られた場合は陽性と判断し、標的増幅産物が得られない場合は陰性と判断する。
【００１９】
標的増幅産物の有無は、PCR後の溶液を電気泳動するなどの常法により確認することができる。
【実施例】
【００２０】
実験1:Genomic-tip法によるDNAの抽出及びPCR増幅
本実験では、通知法であるGenomic-tip法を用いて、表3で挙げる25種類の果物の果肉からDNAを抽出した。得られた抽出物から鋳型DNA試料を調製し、植物DNA検出用プライマーであるCP03（配列表の配列番号1及び2）を用いてPCRを行った。
【００２１】
Genomic-tip法の手順は次の通りである。
(1) 凍結保存していた果物の果肉を試料とした。なお、リンゴや桃などの、加工品として使用する際に皮を剥くと考えられた果物は、皮を剥いたものを試料とした。また、いちご、ブルーベリーなどの、加工品として使用する際に皮を剥かないと考えられた果物は、皮を剥かずにそのまま試料とした。
(2) 約1 gの試料および3 mm径のジルコニアビーズを2 ml容チューブに入れ、Retsch MM 300（Retsch社）を用いて組織片が肉眼で確認できなくなるまで適宜粉砕した（1試料につき2本実施）。
(3) 粉砕後の試料2 g分を50 ml容チューブに入れ、表３の試料1〜15に関しては7.5 ml、試料16〜25に関しては20 mlのbuffer G2、200μlのProteinase K（20 mg／ml）（QIAGEN社）、20μlのRNase A（100 mg／ml）（QIAGEN社）を加え、混合した後、20〜30分おきに上下に撹拌しながら50℃で2時間保温した。
(4) 約3,000×gで10分間遠心分離し、その上清液を得た。さらに上清液を2 ml容チューブに入れ、約20,000×gで5分間遠心分離し、その上清液を得た。
(5) 得られた上清液を、予め1 mlのバッファー QBTで平衡化したGenomic-tip 20／Gに供してDNAをColumnに吸着させた。その後、4 mlのバッファーQCでColumnを洗浄し、予め50℃に加温してある1 mlのバッファーQFで溶出し、イソプロパノール沈澱により回収した沈澱物を20μlのバッファー TE(pH 8.0)に溶解した。
(6) 溶液中のDNA濃度を測定し、バッファーTE(pH 8.0)で20 ng/μlに希釈したものをPCRの鋳型DNA試料とした。20 ng/μlに満たなかったDNA試料は、原液をPCRの鋳型DNA試料とした。
【００２２】
続いて植物検出PCRを行った。CP03（配列表の配列番号1及び2）を用いたPCR法の条件は表1及び2にまとめたとおりである。
【００２３】
【表１】
2008142078.tif 000002
【００２４】
【表２】
2008142078.tif 000003
【００２５】
上記実験による結果を表3に示す。
【００２６】
【表３】
2008142078.tif 000004
【００２７】
表3に示されるように、洋ナシ、ブドウ、柿、ブルーベリー及びイチゴについてはPCR産物が得られなかった。
【００２８】
実験2:ポリビニルポリピロリドンを用いたポリフェノール類の除去
実験1で示されるように、Genomic-tip法により得られたDNA抽出物を鋳型試料としてPCRを行った場合、洋ナシ、ブドウ、柿、ブルーベリー及びイチゴについてはPCR増幅産物が得られなかった。これらの果肉にはポリフェノール類が比較的多く含まれることが知られている。ポリフェノール類はPCRを阻害する性質を有することが知られていることから、これらの果肉中のDNAをPCRするにはポリフェノール類を除去することが必要であると考えられる。
【００２９】
そこで本実験では、ブドウ、イチゴ及びブルーベリーからのGenomic-tip法によるDNAの抽出を、ポリフェノール類を除去する効果があることが知られているポリビニルポリピロリドン(PVPP)の存在下において行った場合にPCR増幅産物が得られるか否かを確認した。
【００３０】
抽出操作は実験1におけるGenomic-tip法の手順の(3)に代えて下記(3’)を行った以外は実験1と同様の方法でDNAを抽出した。
(3’)粉砕後の試料2 g分を50 ml容チューブに入れ、20 mlのbuffer G2、200μlのProteinase K（20 mg／ml）、20μlのRNase A（100 mg／ml）、および0.8gの市販のPVPPを加え、混合した後、20〜30分おきに上下に撹拌しながら50℃で2時間保温した。
【００３１】
PCR反応は実験1と同一の条件で行った。PCR反応物は2% アガロースゲルを用いて電気泳動し、増幅産物の有無を確認した。また、PVPPを加えない方法については、前記の方法から0.8gの市販のPVPPを除くこと以外は、同様の操作を行った。
【００３２】
結果を表4に示す。表中、＋はPVPPを加えていることを表し、−はPVPPを加えていないことを表す。
【００３３】
【表４】
2008142078.tif 000005
【００３４】
イチゴ、ブドウ及びブルーベリーではPVPPを使用しない場合にはPCR増幅産物を得ることは困難であったが、抽出操作をPVPPの存在下で行うことにより、100%の確率でPCR増幅産物を得ることができた。
この結果から、PVPPを用いることによりPCRを阻害する物質が除去されることが確認された。
【００３５】
実験3:PVPP中における植物DNAの有無の確認
PVPPの存在下でDNAを抽出することの有効性が実験2で示された。しかしながら、PVPP中に植物DNAが含まれている場合には、検出しようとする植物DNAの正確な検出が困難となる。そこで本実験では、実験2に使用したPVPP中に植物DNAが含まれているか否かを確認した。
【００３６】
実験は基本的に実験1に従って、次の手順で行った。
なお、ここでは試料（果物）を用いていないので、実験1の(1)、(2)の操作はない。また、(3)の「粉砕した試料」もない。陰性対照(-PVPP)は、50 ml容チューブに20 mlのbuffer G2、200μlのProteinase K（20 mg／ml）、20μlのRNase A（100 mg／ml）を加えて混合した後、20〜30分おきに上下に撹拌しながら50℃で2時間保温した。陰性対照(+PVPP)は、このバッファー類と共に、市販のPVPP 0.8 gを加えて同様に操作した。(4)以降の精製操作、PCRは実験1と同様に行った。陽性対照は、キウイDNA  50 fg (フェムトグラム)を用い、陰性対照（鋳型なし）は、DNA溶液の代わりにバッファーTE(pH 8.0)を加えた。
図2に示すとおり、試料を用いない陰性対照(+PVPP)でもCP03による標的増幅産物のバンドが検出された。このことは、本実験に使用したPVPP中に植物DNAが含まれていることを示す。
【００３７】
実験4:PVPP中の植物DNAの塩基配列決定
以上に記載のように、本明細書に記載の実験で用いたPVPP中には植物DNAが含まれていることが確認された。本実験ではPVPP中の植物DNAの塩基配列の決定を試みた。
植物DNAが含まれることが確認された2つのPVPP試料について、CP03プライマーを用い、ダイレクトシークエンスを行った。得られた塩基配列をBLASTで検索した。
2試料に由来する植物DNAの塩基配列をBLASTで検索した結果、一方はマツ科の植物、もう一方はユリ綱、マメ科の植物を中心とした多種の植物の配列がそれぞれ100%合致した。
【００３８】
実験5:buffer G2を用いたPVPPの洗浄による植物DNAの除去
本実験では、PVPP中の植物DNAをbuffer G2を用いて洗浄することを試みた。本実験の手順を図3に示す。実験手順の詳細は以下の通りである。
通常の抽出と同様、PVPP 0.8 gに対して20 ml のbuffer G2、200μlのProteinase K（20 mg／ml）、20μlのRNase A（100 mg／ml）を加え、20〜30分おきに上下に撹拌しながら50℃で2時間放置した。遠心分離後、上清を別のチューブに移し、洗浄前試料とした。残渣にbuffer G2を10 ml加えて撹拌後、遠心分離し、上清を廃棄した。この操作を4回行い、PVPPを洗浄した。4回の洗浄ステップを経たPVPP残渣に対して、再度buffer G2 、Proteinase K、RNase Aによる抽出を行い、遠心分離後、得られた上清を洗浄後試料とした。こうして得られた洗浄前試料及び洗浄後試料を鋳型として、CP03（配列表の配列番号1及び2）を用いたPCRを行った。PCR条件は実験１と同様の条件で行った。
【００３９】
抽出段階では、buffer G2による洗浄、未洗浄ともn=2、CP03を用いたPCRは、未洗浄はn=3、洗浄はn=5で行った。
【００４０】
結果を図4に示す。図4に示されるように、洗浄前試料6点のうち植物DNAが含まれていたもの（図4中の＊印）は3点であったのに対して、洗浄後試料10点のうち植物DNAが含まれていたものは1つもなかった。このことから、PVPPをbuffer G2で洗浄することによりPVPP中の植物DNAを除去できることが明らかとなった。
【００４１】
実験6:オートクレーブを用いたPVPPからの植物DNAの除去
実験5からbuffer G2で洗浄することによりPVPP中の植物DNAは除去できることが明らかとなったが、処理時間とコストがかかるため、より簡便な方法として、オートクレーブ処理を検討した。オートクレーブ処理方法は、市販のPVPP 8 gを300 mlビーカーに入れてアルミホイルで蓋をし、121℃で60分間オートクレーブ処理し、その後、105℃で一晩乾燥させた。
【００４２】
オートクレーブ処理済みのPVPPを用いている以外、行った抽出操作は、陰性対照(-PVPP)、陰性対照(+PVPP)共に実験3と同様の抽出操作である。PCRも実験3と同じ条件で実施したが、ここでのPCR陽性対照は、柿DNA 50 ngを用いた。陰性対照はバッファーTE(pH 8.0)を用いた。
【００４３】
結果を図5に示す。図5に示すとおり、121℃60分間オートクレーブ処理したPVPPからは10系列全てで植物DNAに由来する増幅産物は確認されなかった。このことは、オートクレーブ処理によりPVPP中の植物DNAが除去できたことを示す。
【００４４】
実験7:オートクレーブ処理したPVPPを用いてのDNA抽出
市販のPVPP 8 gを300 mlビーカーに入れてアルミホイルで蓋をし、121℃で60分間オートクレーブ処理した。その後、105℃で一晩乾燥させた。このPVPPを用いてイチゴ、ブドウ、ブルーベリー、柿、洋ナシからDNAを抽出し、植物検出PCRを行った。
抽出方法は、実験2の「市販のPVPP 0.8 g」に代わり、オートクレーブ処理したPVPP 0.8 gとした。それ以外は同様の操作を行った。
抽出時の陰性対照(+PVPP)は、実験6と同様である。PCRに関しても、実験6と同様の条件で行った。
【００４５】
電気泳動の結果を図6に示す。全ての果肉由来のサンプルでバンドが検出されたことから、オートクレーブ処理したPVPPもPCR阻害物質を除く効果があることが確認された。一方、抽出時の陰性対照(+PVPP)ではバンドが検出されなかったことから、オートクレーブ処理によりPVPP中の植物DNAは十分に除去されることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明による、被検試料中の植物材料の検出方法の一例を示すフロー図である。
【図２】実験3に使用したPVPP中に植物DNAが含まれていたことを示す電気泳動の結果である。
【図３】PVPPのbuffer G2による洗浄の手順のフロー図である。
【図４】PVPPのbuffer G2による洗浄によりPVPP中の植物DNAが除去できたことを示す電気泳動の結果である。
【図５】オートクレーブ処理によりPVPP中の植物DNAが除去できたことを示す電気泳動の結果である。
【図６】オートクレーブ処理によりPVPP中の植物DNAが除去できたこと、並びにこうして植物DNAが除去されたPVPPを用いてPCR阻害物質が除去できたことを示す電気泳動の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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