(57)【要約】      （修正有）【課題】キャリアに接合された修正Ｃ群髄膜炎菌多糖を含んだ高度免疫原性ワクチンの提供、更にＯＡｃ陰性変異体に由来する修正多糖とキャリアとの複合体を含有した高度免疫原性ワクチンを提供する。【解決手段】キャリア分子にカップリングされた修正Ｃ群髄膜炎菌多糖（ＧＣＭＰ）からなる免疫原性複合体。ＧＣＭＰは様々な程度までＯ−脱アセチル化により修正される。この修正ＧＣＭＰ複合体は強い免疫原性応答を促進する。この複合体による免疫で生産された抗血清は天然多糖と交差反応する。加えて、これらの抗血清は強力な殺菌活性を有するクラスの抗体を誘導する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
適切なキャリア物質又は分子に共有結合された、シアル酸残基の７及び８基の少くとも３０％がヒドロキシル基であるＯ−脱アセチル化Ｃ群髄膜炎菌多糖又はその断片又は断片化された非脱アセチル化Ｃ群髄膜炎菌多糖からなる免疫原性複合体。
【請求項２】
キャリア物質又は分子がタンパク質である、請求項１に記載の免疫原性複合体。
【請求項３】
キャリアが破傷風菌トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳毒素、百日咳トキソイドと、β−溶血連鎖球菌、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、肺炎双球菌及び大腸菌から選択される細菌に由来する免疫原性タンパク質からなる群より選択される、請求項１に記載の免疫原性複合体。
【請求項４】
キャリアが破傷風菌毒素又はトキソイドである、請求項１に記載の免疫原性複合体。
【請求項５】
共有結合が還元アミノ化反応により得られる、請求項１に記載の免疫原性複合体。
【請求項６】
多糖がＯＡｃ＋株に由来して、約３０〜１００％の程度までＯ−脱アセチル化されている、請求項１に記載の免疫原性複合体。
【請求項７】
約８０％以上のＯ−脱アセチル化度を有する、請求項６に記載の免疫原性複合体。
【請求項８】
多糖がＯＡｃ−株に由来する、請求項１に記載の免疫原性複合体。
【請求項９】
多糖が接合前に断片化されている、請求項１、５又は８に記載の免疫原性複合体。
【請求項１０】
断片化された非脱アセチル化Ｃ群多糖が約５０００〜約２００００ドルトンの分子量を有する、請求項１に記載の免疫原性複合体。
【請求項１１】
ｉ）マイルドな塩基性反応条件下で髄膜炎菌Ｃ群多糖又はその断片をＯ−脱アセチル化する；
ii）脱アセチル化多糖をカップリング用に活性化する；及び 
iii）脱アセチル化多糖をキャリア分子とカップリングさせるステップからなる、免疫原性複合体の製造方法。
【請求項１２】
過ヨウ素酸ナトリウムを用いた多糖の解重合により髄膜炎菌Ｃ群多糖断片を形成することを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
多糖の活性化がメタ過ヨウ素酸ナトリウムで行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
カップリングが還元アミノ化で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
還元アミノ化が水素化シアノホウ素の存在下で行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
免疫学上適切なタンパク質に接合された、シアル酸残基の７及び８基の約３０％以上がヒドロキシル基である髄膜炎菌のＣ群多糖又はその断片からなる抗原性複合体。
【請求項１７】
タンパク質が破傷風菌トキソイド、ジフテリアトキソイド、交差反応物質（ＣＲＭ）、百日咳毒素、百日咳トキソイド又は細菌タンパク質キャリアである、請求項１又は１６に記載の複合体。
【請求項１８】
タンパク質及び多糖が−ＣＨ2−ＮＨ−タンパク質結合鎖で共有結合されている、請求項１、１６又は１７に記載の複合体。
【請求項１９】
請求項１又は１６に記載の複合体の免疫原性量と製薬上許容される注射用賦形剤を含んだワクチン。
【請求項２０】
生理学上許容されるアジュバントを更に含んだ、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
アジュバントが水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム又はステアリルチロシンである、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
アジュバントが水酸化アルミニウムである、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２３】
感染しやすい哺乳動物被治療体に請求項１９に記載のワクチンの治療上有効量を投与するステップからなる、髄膜炎菌感染に対する哺乳動物の免疫方法。
【請求項２４】
ワクチンを非経口投与することからなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ワクチンが体重ｋｇ当たり約１〜２５μｇの投与量で投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
哺乳動物を請求項１９に記載のワクチンで免疫して、γ−グロブリンを上記哺乳動物から回収することにより製造する、Ｃ群髄膜炎菌に起因する髄膜炎に対して受動保護できるγ−グロブリン分画。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Ｃ群髄膜炎菌に対するワクチン
発明の分野 
この出願は１９９２年８月３１日付で出願された米国出願第０７／９３８，３６７号の一部継続である。
本発明はＣ群髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)に対して有用なワクチンの製造に関し、これらのワクチンは修正Ｃ群莢膜多糖の複合体を含んでいる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景 
Ｃ群髄膜炎菌は世界中における細菌性髄膜炎の大部分の原因である。この病気を予防する現行手段は、精製されたＣ群莢膜多糖から構成されるワクチンからなる。これらのワクチンは成人に有効であるが、子供では免疫原性に乏しい。幼児で乏しいという結果が非常に望ましくないのは、人口のこのセクションがこれら感染の最高罹患率を有しているからである。
Ｃ群髄膜炎菌多糖（ＧＣＭＰ）は弱い免疫原であり、このためこれら多糖の免疫原性を高めてワクチンとしてそれらの有効性を拡大させようという努力があった。この目標を達成する１つの可能な方法は、少し見込みがあったが、これらの多糖とタンパク質のようなキャリアとの接合によるものである。
様々な研究者が完全な莢膜多糖を単離及び精製して、それらをキャリアタンパク質に共有結合させた。これらの複合体はその多糖単独よりも免疫原性である。
【０００３】
多くの例がこれら複合体抗原の成功について示す文献でみられる。１つのこのような例、米国特許第４，６７３，５７４号明細書は、免疫原性化合物を形成するために、キャリアタンパク質に接合された細菌莢膜多糖の使用について記載している。もう１つの例、米国特許第４，３５６，１７０号明細書は、キャリアタンパク質にカップリングされた特異的多糖、Ａ群髄膜炎菌多糖（ＧＡＭＰ）からなる複合体の免疫原性について記載している。これらの複合体は有効レベルの抗原を宿主に送達する上で改善された方法を提供する。これら特許双方の開示は参考のためすべて本明細書に組み込まれる。
【０００４】
免疫原性を増加させるもう１つの方法は、米国特許第４，７２７，１３６号明細書でみられるように、Ｂ群髄膜炎菌多糖（ＧＢＭＰ）抗原で見込みがあった。
この方法では多糖のシアリル部分のＮ−アセチル基をＮ−プロペニル基で置き換え、その後修正された多糖をキャリアタンパク質に接合させている。これらの複合体は良い免疫原であって、天然ＧＢＭＰと効果的に交差反応する。この発見は、多糖抗原への置換基の付加が抗体による認識用に追加の免疫原性部位又はエピトープを形成できることを証明している。
【０００５】
Ｏ−アセチル陽性Ｃ群髄膜炎菌から現在製造されているワクチンは、免疫原性に乏しいことが知られている。Ｏ−アセチル陰性変異体に由来するワクチンは免疫原性であるという報告があった。Glode ら,The Journal ofInfectionsDisease,Vol.139,No.1,Jan.1979,pp52-59;Steinkoff ら，Infection and Immunity,Oct.1981,pp.144-145 ;Arakere ら,Infection and Immunity,Dec.1991,pp.4349-4356 参照。
【０００６】
ほとんどのＣ群髄膜炎菌株は、Ｏ−アセチル基がシアル酸残基のＣ−７とＣ−８との間にもっぱら分布するＯ−アセチル陽性（ＯＡｃ＋）多糖を生産する。既知ＯＡｃ−陰性（ＯＡｃ−）株の中には髄膜炎菌Ｃ群ＭＣ１９細菌がある。
本発明の目的は、キャリアに接合された修正Ｃ群髄膜炎菌多糖を含んだ高度免疫原性ワクチンを提供すること、更にＯＡｃ陰性変異体に由来する修正多糖とキャリアとの複合体を含有した高度免疫原性ワクチンを提供することである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の要旨
本発明は、ＯＡｃ＋株に由来する髄膜炎菌Ｃ群多糖（ＧＣＭＰ）のＯ−脱アセチル化による化学的修正と、高免疫原性物質を得るためキャリアへの脱アセチル化多糖の接合に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、これら多糖の有効サイズを減少させるために、ＯＡｃ＋株からの脱アセチル化多糖を断片化し、しかもＯＡｃ−株からの多糖を断片化する方法に更に関する。
【０００９】
本発明は、高免疫原活性を有するもっと低分子量の断片を得るために、天然のままか又は脱アセチル化されたＣ群多糖の解重合に更に関する。
本発明は、キャリア物質に直接又はキャリア物質に結合分子を介してカップリングさせるための反応部位を与える残基をＯＡｃ＋株からの脱アセチル化多糖内に形成する方法にも関する。
【００１０】
加えて、本発明は、Ｏ−脱アセチル化髄膜炎菌Ｃ群多糖、ＯＡｃ−株からの多糖をキャリア物質にカップリングさせて作られた免疫原性複合体、又は多糖とキャリアが共有結合された断片化髄膜炎菌Ｃ群多糖に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明では、キャリア物質と髄膜炎菌のＯ−脱アセチル化Ｃ群多糖、ＯＡｃ−株からの多糖、これら多糖の断片又は非脱アセチル化多糖の断片とを共有結合させることからなる免疫原性複合体の製造方法が開示されている。
本発明は、細菌性髄膜炎にかかりやすい哺乳動物で強力な殺菌性ワクチンとしての、Ｏ−脱アセチル化Ｃ群多糖又はＯＡｃ−多糖の複合体の用途に更に関する。ワクチンは水酸化アルミニウム又はステアリルチロシンのようなアジュバントを含有していてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の具体的な説明 
Ｃ群髄膜炎菌多糖（ＧＣＭＰ）の免疫原性を高めるために、修正ＧＣＭＰが作られ、キャリア分子に共有結合される。更に、単離されたままか又は修正形いずれかのＯＡｃ−株からの多糖がキャリア分子に共有結合される。多糖複合体は様々な化学的、物理的又は酵素的カップリング反応から形成することができる。用いられるカップリング技術は、用いられる結合剤と、キャリア物質又は分子上の反応基に依存している。様々なカップリング操作が当業者に知られており、容易に使用できる。
【００１３】
キャリア物質又は分子とは、多糖分子にカップリングされうる基を有したあらゆる物質又は分子として本発明では定義される。ポリマーキャリアは天然又は合成物質であり、水溶性でも又は非水溶性であってもよい。キャリア物質又は分子は、最も一般的には種類上タンパク質である。タンパク質キャリアの場合に、タンパク質はカップリングに使える反応基を有した生理学上許容されるタンパク質であれば何でもよい。一級又は二級アミノ基を含んだいかなるタイプのキャリアも使用できる。反応性遊離アミノ基は、ヒドロキシル、アルデヒド、カルボン酸等のような部分を介して多糖にうまくカップリングさせることができる。適切なタンパク質には天然ペプチド及びタンパク質、例えば牛血清アルブミン、合成修正により細菌毒素から誘導される細菌トキソイド、例えばジフテリアトキソイド、破傷風菌トキソイド、百日咳毒素又は百日咳トキソイド、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa) 組換えエキソプロテインＡ及びウェルチ菌(Clostridium perfringens) 外毒素がある。細菌に由来する他のタンパク質も用いてよい。細菌源は、例えばインフルエンザ菌(Hemophilus influenza)、髄膜炎菌、肺炎双球菌、β−溶血連鎖球菌及び大腸菌(E.coli)であってもよい。
【００１４】
合成ポリリジンのようなリジン残基を含む他のタンパク質も有用である。他のタンパク質キャリアと他の非タンパク質キャリア分子も当業者によく知られており、本発明でキャリア分子として使用できる。非水溶性キャリアの例はアミノアルキル−セファロース、例えばアミノプロピル又はアミノヘキシルセファロースと、アミノプロピル−ガラスである。化学的に結合されたアミノ基を含むように修正された他のキャリアも用いてよい。このようなキャリアは、アミノアルキル基が共有結合鎖を介して結合された多糖から誘導してもよい。
本発明の一面によれば、ＯＡｃ＋株からのＣ群多糖におけるシアリル基の７及び／又は８位のＯ−アセチル基は、適切な試薬との処理で髄膜炎菌Ｃ群多糖から様々な程度で選択的に除去される。多くの脱アセチル化試薬が当業者に知られている。好ましくは、脱アセチル化は水性媒体中マイルドな塩基性条件下で、例えば約０．０１〜０．５Ｎ水酸化ナトリウム、好ましくは０．１Ｎ水酸化ナトリウム中約０〜５０℃、好ましくは２５℃で行われる。水酸化カリウム、水酸化アンモニウム等のような他の塩基性溶液もこの反応に使用できる。その反応で用いられる脱アセチル化反応温度及び塩基濃度は、マイルドな条件が維持されることだけに注意すれば、変えることができる。反応条件は、Ｃ群多糖の脱アセチル化だけが望ましい程度に達するように制御されることが好ましい。Ｏ−脱アセチル化は、望ましい脱アセチル化度に達するまで、即ち０．１Ｎ ＮａＯＨ中で約１〜２５時間、好ましくは約１６時間かけて行われる。
【００１５】
マイルドな条件を用いる脱アセチル化反応からのＯ−脱アセチル化多糖の収率は、典型的には８０％を超える。Ｏ−脱アセチル化度は、用いられる条件に応じて、約３０〜１００％である。典型的には、温度及び反応時間を変えれば、多糖のＯ−脱アセチル化度を変えることができる。好ましくは８０％以上の範囲のＯ−脱アセチル化、最も好ましくは１００％の脱アセチル化が行われる。
キャリア分子への接合前に（脱アセチル化の前又は後で）多糖鎖を断片化又は解重合させることも望ましい。多糖は多くの試薬に感受性であり、酢酸のような弱酸で加水分解されるか又はメタ過ヨウ素酸塩のような試薬で酸化される。本発明の好ましい態様において、非脱アセチル化多糖、脱アセチル化多糖又はＯＡｃ−株からの多糖はメタ過ヨウ素酸塩酸化による接合のために断片化及び活性化される。当業者であれば、このステップの反応を行うため他の方法についてもわかるであろう。
【００１６】
本発明の免疫原性複合体は、Ｏ−脱アセチル化ＧＣＭＰ又はＯＡｃ−株からの多糖の断片上に還元性末端基を最初に形成し、その後還元性末端基を還元アミノ化でキャリア物質又は分子のアミノ基と反応させることにより製造される。還元性末端基はいずれか適切な方法で、例えば選択的加水分解、即ち酸又は酵素によるか、あるいは酸化開裂、即ちメタ過ヨウ素酸塩により形成される。接合は水素化シアノホウ素アニオンのような還元剤を含有した水性溶液中で還元アミノ化により行われることが好ましい。多糖をキャリア分子にカップリングさせる他の方法は当業者に知られている。
【００１７】
好ましいカップリング方法では２ステップ反応を要する。多糖はアルデヒド部分を形成するためにメタ過ヨウ素酸塩酸化され、その後キャリア分子上に遊離アミノ基の存在下及び適切な還元剤の存在下で反応させる。適切な還元剤には、典型的には、重要な還元性末端を還元しないばかりかキャリア分子又は物質に悪影響を与えない、水素化シアノホウ素、水素化ホウ素ナトリウム又は他の還元剤がある。還元剤は、加水分解されたＧＣＭＰ断片のカルボニル基とキャリア分子又は物質のアミノ基との間で形成されるシッフ塩基中間体のマイルドな選択的還元剤として作用する。このタイプの接合に関して典型的な反応条件はJenningsらの米国特許第４，３５６，１７０号明細書で示されており、これは参考のためすべて組み込まれる。
【００１８】
しかしながら、本発明の複合体ワクチンは還元アミノ化で生産されたものに限定されないことが理解されるべきである。このため、ワクチンは Scheerson,R．ら，Preparation,Characterization and Immunogeniciiy ofHaemophilus influenzae Type b PolysaccharideーProtein Conjugates（Ｂ型インフルエンザ菌多糖−タンパク質複合体の製造、特徴及び免疫原性），J.Exp.Med.,1952,361-476(1980) 及びLance K.Gordonの米国特許第４，６４４，０５９号明細書で記載されるように、アジピンジヒドラジドスペーサーを用いて多糖をキャリアタンパク質と接合させることにより製造してもよい。一方、Marburg,S.ら，"Biomolecular Chemistry of Macromolecules: Synthesis of Bacterial Polysaccharide Conjugaieswith Neisseria meningitides Membrane Protein"（高分子の生体分子化学：髄膜炎菌膜タンパク質との細菌多糖複合体の合成），J.Am.Chem.Soc.,108,5282-5287(1986)に記載されたような二元スペーサー技術、又は可能であればAndersonの米国特許第４，６７３，５７４号明細書で言及されるような還元性末端法も用いてよい。これら引用文献の開示は参考のためすべて本明細書に組み込まれる。
【００１９】
本発明の免疫原性複合体は、１種以上の製薬上許容される賦形剤及び場合により他の成分と共に処方してもよい。製薬上許容される賦形剤は、処方物の他成分と適合して、そのレシピエントに有害でないという意味で“許容”されねばならない。処方物は便宜上単位剤形で供与され、製薬業界で周知のいずれかの方法で製造される。
【００２０】
活性成分として多糖複合体を含有したワクチンの製法は当業界でよく知られている。典型的には、このようなワクチンは液体溶液又は懸濁液いずれかの注射剤として製造される；注射前に液体中への溶解又は懸濁に適した固体形態も製造してよい。製剤は乳化させてもよい。活性な免疫原性成分は、製薬上許容されて活性成分と適合する賦形剤とよく混合される。適切な賦形剤は、例えば水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等及びそれらの組合せである。加えて、所望であれば、ワクチンは湿潤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤又はワクチンの有効性を高めるアジュバントのような補助物質を少量で含有してもよい。当業者に知られるいかなる適切なアジュバントも使用できる。適切なアジュバントには、特にステアリルチロシン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及び硫酸アルミニウムがある。水酸化アルミニウムアジュバントで作られたワクチンは特に有効であることがわかった。ワクチンは通常非経口で注射により、例えば皮下又は筋肉内いずれかに投与される。他の投与様式に適した追加処方には坐剤と、一部の場合には経口処方がある。坐剤の場合、伝統的な結合剤及びキャリアには例えばポリアルカレングリコール又はトリグリセリドがある；このような坐剤は活性成分を０．５〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲で含有した混合物から形成される。経口処方は、例えば製薬グレードのマンニトール、セルロース、炭酸マグネシウム等のような常用賦形剤を含有している。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性処方又は粉末の形態をとり、１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含有している。
【００２１】
ワクチンは投薬処方と適合したやり方で、治療上有効でかつ免疫原性であるような量で投与される。投与される量は被治療体、抗体を合成する被治療体免疫系の能力と、望まれる保護の程度に依存している。投与が要求される活性成分の正確な量は担当者の判断に依存し、各個体毎に異なる。しかしながら、適切な投与量範囲は個体当たり活性成分が数百マイクログラム程度である。初回投与及びブースターショットに適した方法も様々であり、これは初回投与の後１又は２週間隔の注射又は他の投与で代表される。
【００２２】
本発明のワクチンは哺乳動物で抗ＧＣＭＰ抗体を有効レベルで誘導させる。このワクチンはどの年齢の哺乳動物に注射投与してもよく、病気にかかりやすい哺乳動物に免疫原性量の複合体を投与することで髄膜炎菌に起因する全身感染に対して活性な免疫を誘導するために利用される。
【００２３】
通常、約５〜約１００μｇ、好ましくは約１０〜５０μｇを含有したワクチンが、若い哺乳動物でＧＣＭＰに対する抗体を有効レベルで誘導させるために適している。正確な投与量は実験で決定される。少ない用量を数回かけて連続的に与えることが、１回の注射として同量の複合体を与えるよりも優れていると予想される。
更にもう１つの面において、本発明はＣ群髄膜炎菌に起因する髄膜炎から保護できるγ−グロブリン分画を提供する。その分画は本発明のワクチンで哺乳動物を免疫することにより生産される。次いでその分画は上記生物に起因する進行性感染から保護するか又はそれを治療するために個体に投与される。このことから、本発明の免疫原性ワクチン複合体がそれらの好ましい免疫原性からみて治療抗血清源となることは明らかであろう。本発明の複合体はモノクローナル抗体及び可能であれば抗イディオタイプ抗体を作る上でも有用である。
髄膜炎菌Ｃ群多糖のＯ−脱アセチル化は、約０〜５０℃、好ましくは２５℃で約１〜２５時間、好ましくは約１６時間にわたる０．０１〜 ０．５Ｎ ＮａＯＨ、好ましくは０．１Ｎ ＮａＯＨのようなマイルドな塩基での処理により行える。７及び／又は８位からアセチル基の除去はＮＭＲスペクトル測定で確認される。
【００２４】
後のステップで、多糖はスーパーデックス(Superdex)２００プレップグレードでのようなゲル濾過により精製される。過ヨウ素酸ナトリウムを用いる還元部分解重合は、最大免疫応答を示す上で最適のサイズを有した活性化多糖を得るために、ＯＡｃ＋株からの非脱アセチル化多糖、脱アセチル化多糖と、ＯＡｃ−株からの多糖で行われる。多糖はゲル濾過により精製され、塩を除去するために透析され、凍結乾燥される。次いでそれは還元アミノ化反応により破傷風菌トキソイドのような適切なタンパク質キャリアにカップリングされる。得られた複合体はゲル濾過により精製し、チャールズ・リバーズ(Charles Rivers)から購入したＦＲＷ異型交配スイス・ウエブスター(Swiss Webster)マウスで免疫原性について分析する。
【実施例１】
【００２５】
Ｃ群髄膜炎菌多糖（ＧＣＭＰ）のＯ−脱アセチル化
天然髄膜炎菌Ｃ群多糖（１８８mg）を０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液（３０ml）に溶解した。混合液を２５℃で１６時間攪拌した。次いでそれを４℃で水に対して透析し、凍結乾燥した。白色綿毛状固体物として得た多糖（１４４mg、７７％）は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定（５００MHz）によると、Ｏ−脱アセチル化されていることを示した。
【実施例２】
【００２６】
Ｏ−脱アセチル化Ｃ群多糖（ＧＣＭＰ）−（−）の精製
Ｏ−脱アセチル化多糖（１４１mg）をダルベッコのＰＢＳ（１０ml）に溶解し、スーパーデックス２００プレップグレード（２．６×１００cm）カラムでゲル濾過により精製した。カラムを１００ml/hrで溶出させ、５．０ml分画を集めた。溶出液を示差屈折計及びＵＶ（２８０nm）検出器でモニターした。示差屈折計で検出される第一の主ピークを含有して、ＵＶ吸収物質を実質上含有しない分画を合わせた。水に対する透析と凍結乾燥後に、精製ＧＣＭＰ−（−）（１０８mg、７７％）を白色綿毛状固体物として得た。その固体物質はブラッドフォード(Bradford)法によりタンパク質について及び２６０nmでＵＶ吸光度により核酸について分析した。表１で示したように、これらの汚染物質はこの精製ステップで実質上減少している。加えて、スペロース(Superose) １２ゲル濾過カラム〔ファルマシア(Pharmacia) 〕を用いたＨＰＬＣによるＧＣＭＰ−（−）の分析では、それが出発天然多糖（ＧＣＭＰ）でも観察されるシャープなボイド容量ピークとして溶出することを示しており、精製された多糖が高分子量形で存在することを示唆している。
【実施例３】
【００２７】
精製ＧＣＭＰ−（−）の酸化及びサイズ分け
メタ過ヨウ素酸ナトリウムによる多糖の酸化は、後におけるタンパク質とのカップリングのために多糖を活性化して、しかも最良の免疫応答を発揮することが既に示されたもっと小さな断片に多糖を開裂するという二重目的に役立つ。異なるロットの多糖は最良の多糖鎖長にする上で異なるヨウ素酸塩酸化条件を要することも既に示されているため、これらの条件は小規模反応（５mg）で最初に決めて、その後大規模反応を行う。典型的には、反応時間及び温度を各々２時間及び２５℃で一定に保ち、メタ過ヨウ素酸ナトリウムの濃度を脱イオン水中３〜１２ミリモルで変える。小及び大規模反応時における多糖の濃度も６〜１０mg/ml で一定に保つ。２時間経過後、過剰（〜１０倍）の１．０Ｍエチレングリコール溶液を、未反応メタ過ヨウ素酸ナトリウムを破壊するために反応溶液に加える。少くとも３０分間の反応後に、溶液は酸化された多糖の平均分子量を決定するために目盛付きスペロース１２カラムを用いてＨＰＬＣにより分析する。１２０００〜１６０００ドルトンの分子量の平均を有する多糖を与える反応条件を、下記反応で示されるような大規模反応で用いる。
【００２８】
精製ＧＣＭＰ−（−）（６３mg）を脱イオン水（４．８１ml）に溶解した。この溶液に２１mmolメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液（４．８１ml）を加えて、多糖を６．５５mg/ml及びＮａＩＯ４を１０．５mmolで有する脱イオン水中の反応混合液を得た。反応を暗所中２５℃で２時間進行させ、その後１Ｍエチレングリコール（０．９６ml）で３０分間処理した。この物質は１２８００ドルトンの平均分子量を有する広域ピークとしてスペロース１２カラムから溶出する。溶液の容量を凍結乾燥機で約５mlに減少させ、物質を溶出緩衝液としてダルベッコのＰＢＳを用いるスーパーデックス２００プレップグレードカラム（２．６×１００cm）でゲル濾過により精製し、５ml分画を集めた。１００００〜１８０００の平均分子量を有する物質を含有した分画を合わせる。脱イオン水に対する透析と凍結乾燥の後に、酸化及びサイズ分けされた多糖〔ｏ〕−ＧＣＭＰ−（−）（１６．０mg、２３％）を白色綿毛状固体物として得たが、これはスペロース１２でのＦＰＬＣにより１４５００ドルトンの平均分子量を有することが示された。
【００２９】
【表１】
2008044955.tif 000002
【実施例４】
【００３０】
〔ｏ〕−ＧＣＭＰ−（＋）の製造
天然ＧＣＭＰ（３５０mg）を０．０２Ｎ ＮａＯＨ（３６ml）に溶解し、２５℃で３時間インキュベートした。次いでこの溶液に０．１Ｍ ＮａＩＯ４（３６ml）を加え、内容物を２５℃で更に５０分間インキュベートした。次いで反応液を５０％エチレングリコール（５．３ml）で２０分間処理し、混合液を５０００rpmで１０分間かけて遠心により清澄化した。上澄を脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥して、固体物３００mgを得た。その物質をバイオ−ゲル(Bio-Gel) Ａ − ０．５ｍカラムでサイズ分けして、１１５００ドルトンの分子量を有する酸化及びサイズ分けされた多糖（〔ｏ〕−ＧＣＭＰ−（＋））を得た。
【実施例５】
【００３１】
破傷風菌トキソイドタンパク質モノマー（ＴＴ）の精製
〔２．１mg/mlのタンパク質を含有している（標準としてヒトＩｇＧを用いるブラッドフォードタンパク質アッセイ）〕静かに攪拌された破傷風菌トキソイド溶液〔スタテンス・セルミンスチツ(Statens Seruminstitu)〕（７５ml）中に硫酸アンモニウム（４２．１ｇ）を少量ずつ４５分間かけて加え、８０％飽和溶液を得た。混濁溶液を４℃で一夜おいて、タンパク質の沈降を完了させた。沈殿物を１５０００rpm （２３０００ｇ）で２０分間の遠心により集め、原タンパク質１０％以下を含有した上澄を捨てた。ぺレットをダルベッコのＰＢＳ緩衝液（１０ml）に再溶解し、バイオ−ゲルＡ−０．５ｍカラムでゲル濾過により分別した。破傷風菌トキソイドモノマーに相当する主ピークをプールし、脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥して、白色綿毛状固体物としてＴＴを得た（６５．４mg、 ４１％）。
【実施例６】
【００３２】
破傷風菌トキソイド（ＴＴ）へのＯ−脱アセチル化Ｃ群髄膜炎菌多糖（〔ｏ〕−ＧＣＭＰ−(−)）のカップリング 
ｐＨ７．５の０．２０Ｍリン酸緩衝液（０．２２２ml）中に〔ｏ〕−ＧＣＭＰ−(−) （１０mg）、ＴＴ（３．３mg）及び水素化シアノホウ素ナトリウム（６．８mg）を含有した溶液を３７℃で数日保つ。反応溶液をＰＢＳ緩衝液（０．５ml）で希釈し、不溶性物質をエッペンドルフ遠心機で１００００rpmで２分間の遠心により除去した。上澄を１．６×１００cmバイオ−ゲルＡ−０．５ｍカラム上にいれて、０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０２％チメロサールにより２０ml/hrで溶出させた。ボイド容量で溶出するピークに相当する分画をプールして、Ｏ−脱アセチル化Ｃ群髄膜炎菌多糖−破傷風菌トキソイド複合体〔ＧＣＭＰ−(−)−ＴＴ〕を得た。プールした溶液をブラッドフォード法によりタンパク質に関して分析したところ、タンパク質２．８６mg（収率８７％）を含有していることを示した。その複合体中の多糖含有率をシアル酸の含有率から見積り、これをシアル酸に関してレゾルシノールアッセイにより決定したところ、０．９９７mgの多糖を含有していることが示された（収率１０％）。複合体の特徴は表２にまとめた。
【実施例７】
【００３３】
破傷風菌トキソイドへのＯ−アセチル化Ｃ群髄膜炎菌多糖（〔ｏ〕−ＧＣＭＰ−(＋)）のカップリング ｐＨ７．５の０．２０Ｍリン酸緩衝液（０．２０ml）中に〔ｏ〕−ＧＣＭＰ−(＋) （１０．２mg）、ＴＴ（２．９mg）及び水素化シアノホウ素ナトリウム（５．２mg）を含有した溶液を３７℃で５日間保つ。複合体をゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、例６で記載されたように分析した。この複合体溶液はタンパク質２．７mg（収率９３％）及び多糖１．０６mg（収率１０．４％）を含有している。この複合体の特徴は表２にまとめた。
【００３４】
【表２】
2008044955.tif 000003
【００３５】
［実施例７Ａ］
(−)−ＧＣＭＰ−ＴＴワクチンの製造 
(−)−ＧＣＭＰ−ＴＴワクチンを前記例のＧＣＭＰ−(−)−ＴＴワクチンと同様のやり方で製造するが、但し多糖は髄膜炎菌Ｃ群株ＭＣ１９細菌から得る。この細菌はＯ−アセチル部分を欠いたＧＣＭＰを生産する。
【実施例８】
【００３６】
複合体ワクチン溶液の製造及び生物学的研究
例６及び７で記載された複合体溶液を、全ワクチン中の多糖濃度が１０μg/mlであるように、塩水（０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０２％チメロサール）で希釈した。これらワクチンの半分は１．０mg/mlの濃度で水酸化アルミニウムアジュバントも含有していた。
これらワクチンの免疫原性は４〜６週齢異型交配スイス・ウエブスタ−ＦＲＷ雌性マウスで調べた。動物を０、１４及び２８日目にワクチン０．２mlで皮下注射し、抗体アッセイ用の血清を３８日目に集めた。
【実施例９】
【００３７】
髄膜炎菌Ｃ群多糖に対するマウス抗体に関する酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡは、微量滴定プレートを適切な多糖〔ＧＣＭ Ｐ−(−)又はＧＣＭＰ−(＋)〕 ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）複合体でコートし、その後ＢＳＡ阻止緩衝液で処理して行った。次いでＰＢＳ−ツイーン緩衝液による血清の希釈を行った。プレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄し、室温で３０分間にわたり第二抗体〔ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ぺルオキシダーゼ〕で処理した。この後にＰＢＳ−ツイーンで十分に洗浄し、Kirkegaard & Perry（） で記載されたように調製されたばかりのＴＭＢぺルオキシダーゼ基質で処理した。１５分間後に、酵素反応を各ウェルに加えられた１Ｍリン酸で停止させ、吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて分析した。ＥＬＩＳＡ力価は表３にまとめた。
【実施例１０】
【００３８】
髄膜炎菌Ｃ血清群に関する殺菌アッセイ
殺菌活性は、適切な希釈倍率の試験血清及びべビーウサギ血清（補体源）の存在下３７℃で１時間にわたり髄膜炎菌Ｃ群（株Ｃ１１）をインキュベートすることにより調べた。第一の場合は試験血清を欠き、第二の場合は熱不活化補体を含有している２種の陰性コントロールも同様にインキュベートした。次いでこれら溶液の一部（５０μｌ）をチョコレート寒天プレート上に重複して適用し、生存菌について調べるため５％ＣＯ２中３５〜３７℃で一夜インキュベートした。翌朝、コロニーの数を各プレート上でカウントし、平均を重複したものについて計算する。血清殺菌力価は５０％生存率を示す血清希釈倍率として報告する。異なるワクチンに関する殺菌活性は表３にまとめた。
【００３９】
【表３】
2008044955.tif 000004
【００４０】
２タイプの複合体で免疫されたマウスの各群から得られた血清のＥＬＩＳＡによる分析では、双方の群のマウスでＩｇＧ抗体の高力価の存在を示した。更に修正株に対する殺菌アッセイを用いた血清の分析でも意外な結果を示した。双方のワクチン群から得られた血清に関するＥＬＩＳＡ力価は同様であったが、修正複合体で免疫されたマウスから得られる血清は、天然複合体ワクチンをうけたマウスからの血清と比較したとき、優れたレベルの殺菌性抗体を有していた。この研究の結果は、本複合体ワクチンが強い殺菌活性を有したクラスの抗体を誘導させることを示唆している。
【００４１】
Ｃ群髄膜炎菌多糖−破傷風菌トキソイド複合体（ＧＣＭＰ−ＴＴ）の合成
Ｏ−アセチル陽性株から単離したＣ群髄膜炎菌多糖を精製し、希塩基で部分的に又は完全にＯ−脱アセチル化した。そのＯ−脱アセチル化多糖と塩基で処理されていない精製多糖ロットを部分的に解重合し、活性化し、精製した。精製及び活性化多糖ロットにおけるＯ−アセチル化の程度及び位置は高分解能核磁気共鳴（ＮＭＲ）スぺクトル分析（６００MHz）により調べ、平均分子量はゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより調べた。このデータのまとめに関しては表４参照。破傷風菌トキソイドタンパク質へのこれら活性化多糖のカップリング（４）から、表５に示されたＧＣＭＰ−ＴＴ複合体を得たが、そこではＧＣＭＰ−ＴＴ複合体の多糖含有率％についてもまとめている。
【００４２】
ワクチン溶液の製造及び生物学的研究
ＧＣＭＰ−ＴＴ複合体溶液を０．０１％チメロサール含有塩水で希釈し、免疫マウスに直接用いるか（塩水）、あるいは水酸化アルミニウム（Ａｌアジュバント）又はステアリルチロシン（Ｓｔアジュバント）に吸着させた。各最終ワクチン溶液又は混合液は、複合体多糖含有量に関して１０μg/mlで複合体を含有していた。すべてのワクチン処方は、破傷風菌トキソイド及び多糖コントロールと一緒に、０、１４及び２８日目にワクチン溶液又は混合液０．２mlの皮下注射により雌性マウス（４〜６週齢）１０匹の群で試験した。血清を３８日目に集め、それをＥＬＩＳＡ又は殺菌アッセイにより分析するまで凍結貯蔵した。
【００４３】
血清学的研究
複合体ワクチン中のＣ群髄膜炎菌多糖に対する免疫応答はそれらのＥＬＩＳＡ力価で表示する。各々の血清を２つの方法で分析した。第一にコーティング抗原（ＧＣＭＰ−ヒト血清アルブミン複合体）はＯ−アセチル陰性多糖を含有し、第二にコーティング抗原（ＧＣＭＰ−牛血清アルブミン複合体）はＯ−アセチル陽性多糖を含有していた。ＥＬＩＳＡデータは図１、２、４及び５で示されている。遊離破傷風菌トキソイドタンパク質、Ｏ−アセチル陽性多糖及びＯ−アセチル陰性多糖を含有したコントロールからの血清は、分析された最低希釈倍率時（１／１０００）に検出しうるＥＬＩＳＡ力価を何も示さなかった。すべての血清は、髄膜炎菌Ｃ群株Ｃ１１、Ｏ−アセチル陽性株に対する補体依存性殺菌活性についても分析した。図３及び６で示された殺菌力価は５０％生存率を示す血清希釈倍率である。コントロールからのすべての血清は、分析された最低希釈倍率時（１／１０００）に殺菌活性を示さなかった。
【００４４】
結果及び考察 この研究で製造された複合体のすべてに対する免疫応答は、ＥＬＩＳＡ及び補体依存性殺菌アッセイの双方を用いて、３種の異なるワクチン処方で評価した。
その処方には、複合体の塩水溶液、あるいは水酸化アルミニウム又はステアリルチロシンに吸着された混合物がある。
【００４５】
すべての複合体からの血清に関するＥＬＩＳＡは、複合体が水酸化アルミニウム上に吸着されたときに実質上最高で、それらがそれらの塩水溶液として注射されたときに最低の免疫応答を示す（図１、２、４及び５参照）。ステアリルチロシンで複合化された複合体はすべてのケースで塩水溶液よりも高い免疫応答を示したが、その免疫応答はすべてのケースで水酸化アルミニウム吸着複合体の場合よりも数倍低かった。殺菌アッセイでは３種のワクチン処方で同様の傾向を示した（図３及び６参照）。
【００４６】
複合体多糖の平均分子量が類似しているＧＣＭＰ−ＴＴ複合体（１２０００〜１４８００、表１参照）に関するＥＬＩＳＡ力価は図１及び２で示されている。
図１において、ＥＬＩＳＡ力価をＯ−アセチル陰性多糖含有のコーティング抗原（ＧＣＭＰ−ＨＳＡ）で得た。この抗原については、最高力価が最小Ｏ−アセチル化多糖で得られたというような、複合体多糖のＥＬＩＳＡ力価とＯ−アセチル化の程度との間に逆の関係がある。完全に異なるパターンが図２で観察され、そこではＯ−アセチル陽性多糖含有のコーティング抗原（ＧＣＭＰ−ＢＳＡ）で得られた力価が示されている。この場合において、ＥＬＩＳＡ力価はＯ−アセチル含有率が増加していくと増加するが、しかしながら最少量のＯ−アセチル化と最大量を含んだ複合体との間にある力価の差異は、Ｏ−アセチル陰性コーティング抗原を用いて観察されたときほど大きくはない（図１参照）。Ｏ−アセチル化の程度と髄膜炎菌Ｃ群株Ｃ１１（Ｏ−アセチル陽性株）に対する補体依存性殺菌活性との間の関係は図３で示されている。Ｏ−アセチル化の程度が増加すると、殺菌活性に著しい減少がある。このように、殺菌活性はＯ−アセチル陰性コーティング抗原で得られたＥＬＩＳＡ力価と密接に相関している（図１参照）。水酸化アルミニウム上に吸着された複合体の場合、ＥＬＩＳＡ及び殺菌アッセイの双方に関して、Ｏ−アセチル化の程度が５％から７０％に増加するときに力価で約３倍の減少が観察される。図１〜３で示されるように、ワクチンの３種の処方は３アッセイの各々で同様の傾向を示す。図１〜３で示された関係は、血清の反復分析でも観察された。
【００４７】
Ｏ−アセチル化の程度及び処方のタイプに加えて、複合体ワクチン中における多糖のサイズは免疫応答に大きな影響を有する。これは多糖が６１〜６５％Ｏ−アセチル化されたＧＣＭＰ−ＴＴ複合体に関して図４〜６で示されている。同様の傾向は２つのＥＬＩＳＡで観察される（図４及び５）。最高ＥＬＩＳＡ力価は、多糖が１２０００ドルトンの平均分子量を有する、水酸化アルミニウム及びステアリルチロシン処方中の複合体ワクチンで観察されるが、差異は水酸化アルミニウム吸着複合体の場合に特に大きい。２つのＥＬＩＳＡとは対照的に、水酸化アルミニウム及びステアリルチロシン処方に関する殺菌力価は６６００ドルトン多糖のとき最高であり、多糖のサイズが増加すると減少する（図６参照）。
【００４８】
【表４】
2008044955.tif 000005
Ｏ-アセチル化％は、シアル酸残基の７及び８位におけるメチンプロトンの積分値を３位におけるプロトンの場合と比較することにより、高分解能ＮＭＲスペクトル分析で調べる。
【００４９】
【表５】
2008044955.tif 000006
【００５０】
本明細書で記載された例及び態様は説明目的のためのみであって、それからみて様々な修正又は変更が本出願の精神及び範囲と添付された請求の範囲の中に含まれることを当業者に示唆していることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】血清ＥＬＩＳＡ力価に関するＧＣＭＰ−ＴＴ複合体中の多糖Ｏ−アセチル化の効果。ＥＬＩＳＡプレートはＯ−アセチル陰性ＧＣＭＰ−ＨＳＡ複合体でコートした。
【図２】血清ＥＬＩＳＡ力価に関するＧＣＭＰ−ＴＴ複合体中の多糖Ｏ−アセチル化の効果。ＥＬＩＳＡプレートはＯ−アセチル陽性ＧＣＭＰ−ＢＳＡ複合体でコー卜した。
【図３】補体依存性殺菌活性に関するＧＣＭＰ−ＴＴ複合体中の多糖Ｏ−アセチル化の効果。殺菌活性は髄膜炎菌Ｃ群株Ｃ１１、Ｏ−アセチル陽性株に対して調べた。
【図４】血清ＥＬＩＳＡ力価に関するＧＣＭＰ−ＴＴ複合体中の多糖サイズの効果。ＥＬＩＳＡプレー卜はＯ−アセチル陰性ＧＣＭＰ−ＨＳＡ複合体でコートした。
【図５】血清ＥＬＩＳＡ力価に関するＧＣＭＰ−ＴＴ複合体中の多糖サイズの効果。ＥＬＩＳＡプレートはＯ−アセチル陽性ＧＣＭＰ−ＢＳＡ複合体でコートした。
【図６】補体依存性殺菌活性に関するＧＣＭＰ−ＴＴ複合体中の多糖サイズの効果。殺菌活性は髄膜炎菌Ｃ群株Ｃ１１、Ｏ−アセチル陽性株に対して調べた。
【図１】
2008044955.tif 000007
【図２】
2008044955.tif 000008
【図３】
2008044955.tif 000009
【図４】
2008044955.tif 000010
【図５】
2008044955.tif 000011
【図６】
2008044955.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月18日(2007.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
適切なキャリア物質又は分子に共有結合された、シアル酸残基の７及び８位の少くとも３０％がヒドロキシル基であるＯ−脱アセチル化Ｃ群髄膜炎菌多糖又はその断片又は断片化された非脱アセチル化Ｃ群髄膜炎菌多糖からなる免疫原性複合体。
【請求項２】
キャリア物質又は分子がタンパク質である、請求項１に記載の免疫原性複合体。
【請求項３】
キャリアが破傷風菌トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳毒素、百日咳トキソイドと、β−溶血連鎖球菌、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、肺炎双球菌及び大腸菌から選択される細菌に由来する免疫原性タンパク質からなる群より選択される、請求項１に記載の免疫原性複合体。
【請求項４】
キャリアが破傷風菌毒素又はトキソイドである、請求項１に記載の免疫原性複合体。
【請求項５】
共有結合が還元アミノ化反応により得られる、請求項１に記載の免疫原性複合体。
【請求項６】
多糖がＯＡｃ＋株に由来して、約３０〜１００％の程度までＯ−脱アセチル化されている、請求項１に記載の免疫原性複合体。
【請求項７】
約８０％以上のＯ−脱アセチル化度を有する、請求項６に記載の免疫原性複合体。
【請求項８】
多糖がＯＡｃ−株に由来する、請求項１に記載の免疫原性複合体。
【請求項９】
多糖が接合前に断片化されている、請求項１、５又は８に記載の免疫原性複合体。
【請求項１０】
断片化された非脱アセチル化Ｃ群多糖が約５０００〜約２００００ドルトンの分子量を有する、請求項１に記載の免疫原性複合体。
【請求項１１】
免疫学上適切なタンパク質に接合された、シアル酸残基の７及び８位の約３０％以上がヒドロキシル基である髄膜炎菌のＣ群多糖又はその断片からなる抗原性複合体。
【請求項１２】
タンパク質が破傷風菌トキソイド、ジフテリアトキソイド、交差反応物質（ＣＲＭ）、百日咳毒素、百日咳トキソイド又は細菌タンパク質キャリアである、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
タンパク質及び多糖が−ＣＨ２−ＮＨ−タンパク質結合鎖で共有結合されている、請求項１１又は１２に記載の複合体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の複合体の免疫原性量と製薬上許容される注射用賦形剤を含んだワクチン。
【請求項１５】
生理学上許容されるアジュバントを更に含んだ、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
アジュバントが水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム又はステアリルチロシンである、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
アジュバントが水酸化アルミニウムである、請求項１５に記載のワクチン。