(57)【要約】【課題】コストの高い試料溶液の使用効率を向上させて、ＤＮＡチップの生産性の向上及び歩留まりの向上を図る。【解決手段】基板の表面にpoly-L-lysine層を形成する前処理工程Ｓ１と、ＤＮＡ断片を含む試料を調製する試料調製工程Ｓ２と、得られた試料の濃度を希釈する希釈工程Ｓ３と、希釈された試料溶液を基板上に供給してＤＮＡチップを製造する供給工程Ｓ４とを有する。前記試料調製工程Ｓ２は、ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅してＰＣＲ産物を調製する増幅工程と、得られたＰＣＲ産物を乾燥してＤＮＡ粉末とする粉末生成工程と、得られたＤＮＡ粉末を緩衝液に溶かす混合工程とを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液を基板上に供給して、前記基板上に試料溶液によるスポットが多数配列されたＤＮＡチップを製造するＤＮＡチップの製造方法において、
同一スポットについて、前記試料溶液を複数回供給することを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液をインクジェット方式で供給することを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液は、ＤＮＡ断片を含む試料が所定の濃度に希釈されていることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液は、前記ＤＮＡ断片を含む試料が水又は塩化ナトリウムを含む水溶液で希釈されていることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項５】
請求項３又は４記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液は、ポリマーを含む水溶液で希釈されていることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液は、前記同一スポットに対する複数回の供給によって、１スポット当たりの最終所望塩基対を満足する程度の濃度に希釈されていることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記ＤＮＡ断片を含む試料は、
前記ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅してＰＣＲ産物を調製する工程と、
前記ＰＣＲ産物を乾燥してＤＮＡ粉末とする工程と、
前記ＤＮＡ粉末を緩衝液に溶かす工程とを踏んで調製されることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液を前記基板上に供給する際に、
少なくとも１個以上の基体に、外部から前記試料溶液を注入するための注入口と、前記試料溶液が注入・充填されるキャビティと、前記試料溶液を吐出する吐出口とが形成され、前記キャビティを形成する前記基体の少なくとも一壁面に圧電／電歪素子を備え、前記キャビティ内において前記試料溶液が移動するように構成されたマイクロピペットが複数配列されて構成され、かつ、各マイクロピペットの吐出口からそれぞれ異なる種類の試料溶液が吐出される分注装置を用いることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液を前記基板上に供給する際に、少なくとも１個以上の基体に、外部から前記試料溶液を注入するための注入口と、前記試料溶液が注入・充填されるキャビティと、前記試料溶液を吐出する吐出口とが形成され、前記キャビティ内において前記試料が移動するように構成されたマイクロピペットが複数配列されて構成され、かつ、少なくとも２つ以上の吐出口から同じ種類の試料溶液が吐出され、１つのスポット形成する分注装置を用いることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項１０】
請求項９記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記同じ種類の試料溶液が吐出される前記少なくとも２つ以上の吐出口が連結するキャビティに連通する注入口が１つであることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記同じ種類の試料溶液を前記少なくとも２つ以上の吐出口からほぼ同時に吐出することを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項１２】
請求項９又は１０に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記同じ種類の試料溶液を前記少なくとも２つ以上の吐出口からそれぞれ吐出タイミングをずらして吐出することを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
マイクロピペットは、前記キャビティ内において前記試料溶液が層流で移動するように構成されていることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液を前記基板上に供給する際に、
それぞれ種類の異なる試料溶液を吐出する前記吐出口に対応する前記注入口からそれぞれ種類の異なる試料溶液を前記複数のキャビティ内に注入した後、前記圧電／電歪素子を駆動させることにより、前記複数のキャビティ内の種類の異なる試料溶液を前記吐出口から吐出させることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項１５】
請求項８記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液を前記基板上に供給する際に、
前記複数のキャビティ内に予め置換液を充填し、次いで、種類の異なる試料溶液を前記注入口から前記複数のキャビティ内で置換させながら注入した後、前記圧電／電歪素子を駆動させることにより、前記複数のキャビティ内の異なる種類の試料溶液を前記吐出口から吐出させることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項１６】
請求項１５記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記複数のキャビティ内に予め置換液を充填し、前記圧電／電歪素子を駆動させながら種類の異なる試料溶液を前記注入口から前記複数のキャビティ内で置換させながら注入することを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記複数のキャビティ内における試料溶液の注入又は置換完了を、前記キャビティ内の流体特性の変化を検知することにより把握することを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記置換液が脱泡処理されていることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記複数のキャビティ内に予め置換液を充填し、次いで、前記試料溶液と比重をほぼ同じくするＤＮＡ断片を含まない中間液を前記注入口から前記キャビティ内で置換させながら注入した後、種類の異なる試料溶液を前記注入口から前記キャビティ内に注入し、前記圧電／電歪素子を駆動させることにより、前記複数のキャビティ内の異なる種類の試料溶液を前記吐出口から吐出させることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液を前記基板上に供給する際に、少なくとも前記試料溶液を乾燥もしくは増粘もしくは固化させながら行うことを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項２１】
請求項２０記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記乾燥もしくは増粘もしくは固化処理として、前記基板を加熱することを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項２２】
請求項２０記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記乾燥もしくは増粘もしくは固化処理として、吐出もしくは供給された前記試料溶液を加熱することを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記乾燥もしくは増粘もしくは固化処理として、レーザ光を用いることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項２４】
請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記乾燥もしくは増粘もしくは固化処理として、赤外線を用いることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項２５】
請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記乾燥もしくは増粘もしくは固化処理として、電磁波を用いることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項２６】
請求項２０記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記乾燥もしくは増粘もしくは固化処理として、基板又は吐出もしくは供給された前記試料溶液を冷却することを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液を前記基板上に供給する際に、供給位置をずらしながら供給し、１つのスポットを形成することを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液を前記基板上に供給する際に、供給量を変化させて供給し、１つのスポットを形成することを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液を前記基板上に供給する際、あるいは供給するに先立って、前記試料溶液に振動を与えることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項３０】
試料溶液を基板上にインクジェット方式で供給して、前記基板上に前記試料溶液によるスポットが多数配列されたＤＮＡチップを製造するＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液を前記基板上に供給する際に、前記試料溶液を吐出、供給する箇所の周りの湿度をその他の部分より選択的に高くして、前記試料溶液を乾燥もしくは増粘もしくは固化しないようにしたことを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記基板上に前記試料溶液が供給されてスポットが多数配列された基板を作製した後に、前記基板を０℃以下に冷却した後、湿度３０％以上の十分な体積の気体が存在する室温下に戻す工程を含むことを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項３２】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記基板上に前記試料溶液が供給されてスポットが多数配列された基板を作製した後に、前記基板を湿度８０％以上の十分な体積の気体が存在する雰囲気下にさらす工程を含むことを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項３３】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記基板上に前記試料溶液が供給されてスポットが多数配列された基板を作製した後に、前記基板をミストを含んだ水蒸気中にさらす工程を含むことを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡スライドグラス等の基板上に、数千から一万種類以上の異なる種類のＤＮＡ断片をスポットとして高密度に整列固定させたＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年における遺伝子構造の解析方法の進歩にはめざましいものがあり、ヒトの遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子構造が明らかにされてきている。このような遺伝子構造の解析には、顕微鏡スライドグラス等の基板上に数千から一万種類以上の異なる種類のＤＮＡ断片をスポットとして整列固定させたＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）が用いられるようになってきている。
【０００３】
このＤＮＡチップの製造におけるスポットの形成方法としては、ＱＵＩＬＬ方式、ピン＆リング方式、あるいはスプリングピン方式といった、いわゆるピンによる基板上へのＤＮＡ断片を含んだ試料溶液の供給（打ち込み）を行う方式が広く用いられており、いずれの方法を採用した場合であっても、各スポットの容量と形状のばらつきを低く抑えて、各スポット間の距離を一定に保つことが重要となる。
【０００４】
一方、更なる高密度化に向けて、スポットの形状制御性が良好であり、生産性に優れた新しい方法の開発に対する期待も大きい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、図１６に示すように、基板２００上に、試料溶液の滴下によるスポット２０２を形成した際、該スポット２０２は、その表面張力によって半球状となる。この場合、基板２００上に固定化される実質的な試料の量としては、基板２００に接する僅かな部分２０４だけであり、その量は、全体（半球状）のごく一部である。残りの部分２０６は、固定化されていないため、その後の洗浄工程で洗い流されてしまい、試料溶液の損失が多く、試料溶液の使用効率が低いという問題がある。
【０００６】
ＤＮＡチップを製造する際のコストは、実質的に試料溶液の量で支配され、上述の例の場合、ほとんどの試料溶液が流されてしまい、生産効率の向上の点で不利になる。
【０００７】
また、１つの基板上には、数千から一万種類以上の異なる種類の試料溶液が滴下されることになるが、種類の異なる試料溶液毎に、粘度や表面張力が異なることから、同一のスポット径を得るためには、試料溶液の滴下量を粘度や表面張力等に応じて変える必要がある。
【０００８】
しかし、従来の手法では、ピンに付着した試料溶液をピンごと基板に物理的に接触させて、試料溶液を滴下するようにしているため、基板上へのスポットの形成を１回の滴下で行うようになっており、きめ細かな滴下制御（滴下量や滴下位置の制御）を行うことができず、基板上に形成されたスポットの径にばらつきが生じるという問題がある。
【０００９】
また、試料溶液中のＤＮＡ断片の基板上への固定化をより確実なものとするため、試料溶液中に有機、あるいは無機ポリマーを混合させ、ポリマー架橋中にＤＮＡ断片を物理的に保持する方法も開発されているが、この場合、試料溶液の粘度が増大し、乾燥、増粘、固化しやすいものとなり、スポット形成時の試料のポットライフが短くなったり、１回の滴下量が増えてしまう問題がある。
【００１０】
本発明はこのような課題を考慮してなされたものであり、コストの高い試料溶液の使用効率を向上させることができ、ＤＮＡチップの生産性の向上及び歩留まりの向上を図ることができるＤＮＡチップの製造方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明の他の目的は、基板上に供給する試料溶液の種類に応じた供給制御を行うことができ、基板上に形成されるスポット径の均一化を図ることができ、ＤＮＡチップの品質並びに信頼性の向上を図ることができるＤＮＡチップの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、試料溶液を基板上に供給して、前記基板上に試料溶液によるスポットが多数配列されたＤＮＡチップを製造するＤＮＡチップの製造方法において、同一スポットについて、前記試料溶液を複数回供給することを特徴とする。
【００１３】
これにより、形状的に精度の高いスポットを基板上に多数配列することができ、ＤＮＡチップの歩留まりを向上させることができる。この場合、前記試料溶液をインクジェット方式で供給することが好ましい。
【００１４】
インクジェット方式により、基板に非接触で高速（〜１００ｋＨｚ）に多数の液滴を必要量だけ高精度に基板上に供給することが可能になる。また、試料溶液は、液滴を吐出する吐出口に連結するキャビティ及び注入口を通じて連続的に供給されることから、従来のピン式のように、スポットを形成する毎に試料溶液の供給元（試料ウェル）にピンを移動して試料溶液中にピン先を浸す必要がなくなり、多数の基板上に短時間でスポットを形成することが可能になる。
【００１５】
また、前記試料溶液は、ＤＮＡ断片を含む試料を所定の濃度に希釈することが好ましい。この場合、前記試料溶液は、前記ＤＮＡ断片を含む試料が水又は塩化ナトリウムを含む水溶液あるいはポリマーを含む水溶液で希釈されていることが好ましく、また、前記同一スポットに対する複数回の供給によって、１スポット当たりの最終所望塩基対を満足する程度の濃度に希釈されていることが好ましい。
【００１６】
試料の濃度を希釈することにより、試料溶液を基板上に供給し終わった段階での供給流路パス中に付着、残留する試料溶液中の高価なＤＮＡ断片の量を相対的に減らすことができるという利点があり、また、濃い試料溶液により、溶液が乾燥、増粘、固化し、吐出口が詰まって吐出不良を引き起こすといった不良が発生することが回避できるという効果もある。更に大きな利点としては、試料溶液を基板上に供給したとき、試料溶液は半球状にはならず、平坦な形状となる。この場合、基板に供給された試料溶液のほとんどが基板上に固定化されるため、その後の洗浄工程でも試料溶液の大半以上が流されてしまうということがなく、試料溶液の使用効率を向上させることができる。
【００１７】
また、試料溶液に含まれるＤＮＡ断片の種類に応じて希釈の度合いを変えて、試料溶液の粘度や表面張力を変化させることにより、基板上に形成される試料溶液のスポット径を均一化させることができる。
【００１８】
更にまた、前記試料溶液は、ポリマーを含む水溶液で希釈されていることが好ましい。これにより、基板上に供給された後のスポット形状の形状保持性が増し、形状が安定すると共に、スポットの乾燥収縮による形状変化を防止できる。
【００１９】
このように、本発明においては、コストの高い試料溶液の使用効率を向上させることができ、ＤＮＡチップの生産性の向上及び歩留まりの向上を図ることができる。また、滴下する試料溶液の種類に応じた滴下制御を行うことができ、基板上に形成されるスポット径の均一化を図ることができ、ＤＮＡチップの品質並びに信頼性の向上を図ることができる。
【００２０】
そして、前記製造方法において、前記ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅してＰＣＲ産物を調製する工程と、前記ＰＣＲ産物を乾燥してＤＮＡ粉末とする工程と、前記ＤＮＡ粉末を緩衝液に溶かす工程とを踏んで前記試料を調製するようにしてもよい。このような試料は希釈に際し、品質の変化がなく、水溶液への分散性がよく、希釈に適しており、また、希釈時の濃度管理が正確にできる。
【００２１】
また、前記製造方法において、前記試料溶液を前記基板上に供給する際に、少なくとも１個以上の基体に、外部から前記試料溶液を注入するための注入口と、前記試料溶液が注入・充填されるキャビティと、前記試料溶液を吐出する吐出口とが形成され、前記キャビティを形成する前記基体の少なくとも一壁面に圧電／電歪素子を備え、前記キャビティ内において前記試料溶液が移動するように構成されたマイクロピペットが複数配列されて構成され、かつ、各マイクロピペットの吐出口からそれぞれ異なる種類の試料溶液が吐出される分注装置を用いるようにしてもよい。
【００２２】
圧電／電歪素子が駆動する毎に微小量液体が吐出口より吐出され、その容積は微小、かつばらつきがなく一定である。駆動周期は、圧電／電歪素子を用いることにより、高周波対応可能となり、吐出に要する時間も短縮される。また、試料溶液を注入してから吐出に至るまでの間、試料溶液は閉空間内を移動するため、途中で乾燥することがない。更には、基体全体を小さくコンパクトに形成可能であるため、試料溶液が移動する流路を短くでき、これにより、流路壁に試料溶液が付着するという問題は最小限に抑えられ、試料溶液の使用効率の劣化を防止することができる。
【００２３】
また、前記試料溶液を前記基板上に供給する際に、少なくとも１個以上の基体に、外部から前記試料溶液を注入するための注入口と、前記試料溶液が注入・充填されるキャビティと、前記試料溶液を吐出する吐出口とが形成され、前記キャビティ内において前記試料が移動するように構成されたマイクロピペットが複数配列されて構成され、かつ、少なくとも２つ以上の吐出口から同じ種類の試料溶液が吐出され、１つのスポットを形成する分注装置を用いるようにしてもよい。
【００２４】
２つ以上の吐出口から同じ種類の試料溶液が吐出され、１つのスポットを形成することにより、スポット形成速度がより速まり、スループットが向上する。
【００２５】
一般に、試料溶液を複数回供給する場合、供給毎にスポット径は増大するが、供給間隔を遅く（長く）したり、後述するように基板上に供給した試料溶液を素早く乾燥、増粘、固化する処理を施せば、スポット径を増大させることなく、供給回数を増やすことができる。
【００２６】
ここで、供給間隔を長くすることは、吐出口の吐出側に開口した部分での試料溶液が吐出前にある程度乾燥し、粘度が上がった状態、いわゆる半乾き状態で吐出されるため、供給を重ねてもスポット径は増加しないのであるが、この方法では、結果として、スポット形成時間を増大させることになり、好ましくない。また、このような場合、いわゆる半乾き状態を定量的に管理することは制限が多く、吐出不良のノズルを発生しやすい。
【００２７】
そこで、前記２つ以上の吐出口から同じ種類の試料溶液が吐出され、１つのスポットを形成するようにすると、吐出位置まで吐出口が移動する間、即ち、吐出開始までの待機時間で、吐出口の吐出側に開口した部分での試料溶液の乾燥が進んだ吐出口が２つ以上存在することになり、これらの吐出口により同一の試料溶液を供給することができ、結果として、スポット形成時間を短縮することができる。
【００２８】
また、万一、吐出不良ノズルが発生した場合は、不良が発生していないノイズだけで吐出を行うことにより、高価な試料溶液を無駄にすることが未然に防げる。更に、同じ種類の試料溶液が吐出される少なくとも２つ以上の吐出口が連結するキャビティに連通する注入口が１つである構造は、試料溶液の注入作業の回数を削減でき好ましい。
【００２９】
また、２つ以上の吐出口から同じ種類の試料溶液を吐出するタイミングは、非接触のインクジェット方式の場合は、同時であってもよい。この場合、吐出される試料溶液の落下点を合わせるようにしてもよい。そうすることにより、スポット形成速度を向上させることができる。
【００３０】
しかし、基板上に供給される試料溶液の位置精度をより高精度にするために、吐出タイミングをずらして、それぞれの吐出口がスポット形成位置の真上に位置されたときに供給する方法がよい。
【００３１】
更にまた、前記キャビティ内を試料溶液が層流で移動するように構成されたマイクロピペットが複数配列されて構成されることが好ましい。試料溶液の移動が層流であることで、気泡等の発生が防げ、吐出不良の回避、マイクロピペットの耐久性が増加する。
【００３２】
前記分注装置を使用する場合においては、それぞれ種類の異なる試料溶液を吐出する前記吐出口に対応する前記注入口からそれぞれ種類の異なる試料溶液を前記複数のキャビティ内に注入した後、前記圧電／電歪素子を駆動させることにより、前記複数のキャビティ内の種類の異なる試料溶液を前記吐出口から吐出させることが好ましい。このような構成により、複数の異なった種類の試料溶液を同じ時期に、クロスコンタミネーションを引き起こすことなく、基板上に供給できる。
【００３３】
また、前記分注装置を使用する場合においては、複数のキャビティ内に予め置換液を充填し、次いで、種類の異なる試料を前記注入口から前記複数のキャビティ内で置換させながら注入した後、前記圧電／電歪素子を駆動させることにより、前記複数のキャビティ内の種類の異なる試料溶液を前記吐出口から吐出させるようにしてもよい。予め安価な置換液によりキャビティ内を確実に置換した後、高価な試料を置換することにより、吐出不良の発生が完全に防げ、高価な試料を効率よく吐出できる。
【００３４】
キャビティ内の置換液から試料溶液への置換は、吐出口から真空吸引等で、置換液を吸引排出することにより行ってもよいが、前記圧電／電歪素子を駆動させながら種類の異なる試料を前記注入口から前記複数のキャビティ内で置換させながら注入することが好ましい。そうすることで、排出する置換液の量を精度よく制御でき、高価な試料溶液を無駄に排出することがない。
【００３５】
置換完了の終点は、試料の移動する速度、体積を予め求めておき、置換時間、排出量等で制御してもよいが、当該キャビティ内の流体特性の変化を検知することにより把握することが、より精度よく終点が検出でき更に好ましい。
【００３６】
本発明では、キャビティ内の流体特性の変化を検知して置換完了を把握するようにしているため、流路内で試料溶液と置換液が多少混合しても、その混合している部分と混合していない部分の区別が容易、かつ精度よく判別できる。その結果、置換液と混合してパージしなければならない試料溶液の量を少なくでき、試料溶液の使用効率を上げることができる。
【００３７】
また、キャビティ内の流体特性の変化は、圧電／電歪素子に振動を励起する電圧を印加し、その振動に伴う電気的定数の変化を検出することにより把握するようにしてもよい。これにより、特別な検出素子等を設置する必要もなく、安価で、高精度な検出ができる。
【００３８】
なお、前記置換液は、予め脱泡処理されていることが好ましい。こうすることで、置換液のキャビティ内への充填が、途中で気泡等が発生、引っかかることなくスムーズにでき、これにより、試料溶液への置換が確実に行われ、吐出が安定する。更に、キャビティ内に置換液を注入、充填した後、注入口より前記試料溶液と比重をほぼ同じくするＤＮＡ断片を含まない中間液を注入し、前記キャビティ内で置換させた後、種類の異なる試料溶液を前記注入口からキャビティ内に注入し、試料溶液の充填を行ってもよい。置換液と試料溶液の間に、安価で前記試料溶液と比重をほぼ同じくするＤＮＡ断片を含まない中間液を介することにより、高価な試料溶液が、比重の異なる置換液中に混ざり込み、結果としてパージ量を多くとらなければならないという不具合を回避できる。
【００３９】
そして、本発明では、マイクロピペットを複数用いるようにしているため、一度に数多くの種類の試料を同時に供給でき、また一部不良の生じたピペットを容易に交換することができ、メンテナンスも容易である。更に、吐出口が縦横に整列配置されているため、例えば、ＤＮＡチップのように、基板上にスポットを二次元的に整列固定させる場合に最適となる。
【００４０】
また、本発明においては、前記試料溶液を前記基板上に供給する際に、少なくとも前記試料溶液を乾燥もしくは増粘もしくは固化させながら行うことが好ましい。これにより、基板上に供給された試料溶液の固定化が早まり、試料溶液の希釈に伴うだれ（スポット径が拡張する現象）を効果的に防止することができる。
【００４１】
乾燥もしくは増粘もしくは固化処理としては、基板を加熱すること、吐出もしくは供給された試料溶液を加熱すること等が挙げられるが、加熱方法としては、レーザ光、赤外線、電磁波等を用いることが好ましい。
【００４２】
これらの方法は、特に、微小領域を選択的に加熱することが可能である。本発明のように、吐出された試料溶液によるスポットは、速やかに加熱される必要がある一方、そのスポットのすぐ近くにある吐出口において、加熱による乾燥等で吐出不良が生じることを回避しなければならない。このような場合に、上述の乾燥もしくは増粘もしくは固化処理が好適である。特に電磁波は、金属シールドにより確実に遮断できるため、不要な吐出口の加熱を防ぐ場合に好適である。また、レーザ光や赤外線を用いる場合は、これらレーザ光や赤外線を基板に照射して試料溶液を間接的に加熱してもよい。
【００４３】
また、本発明においては、滴下する試料溶液の乾燥もしくは増粘もしくは固化処理として、基板又は吐出もしくは供給された試料溶液を冷却するようにしてもよい。冷却は、加熱によって、試料溶液中のＤＮＡが損傷を受ける場合や、試料溶液中の成分が加熱により軟化してしまう場合に好適に採用される。
【００４４】
また、本発明においては、前記試料溶液を前記基板上に供給する際に、供給位置をずらしながら行うようにしてもよく、供給量を変化させて行うようにしてもよい。即ち、試料溶液の種類に応じて例えば試料溶液を２〜１００回ほどそれぞれ別の位置に供給して１つのスポット径を形成する。この場合、試料溶液の種類に応じて供給数を変え、更に供給位置を決定することができるため、試料溶液の種類に拘わらず、すべてのスポット径を均一に形成することができ、ＤＮＡチップの品質の向上並びに信頼性の向上を図ることができる。
【００４５】
なお、供給位置をずらしながら１つのスポットを形成することは、従来のピン式スポットでは不可能であり、インクジェット方式で、１滴当たりの供給量をピン式に比して１／１００〜１／１０程度にできることにより、初めて可能になる手法であり、前記乾燥、増粘、固化処理と組み合わせることにより、従来の円形スポット以外のスポット形状を可能とし、ＤＮＡチップの読み取り機器（ＣＣＤ撮像装置等）とのマッチングをとることができる範囲を広げることができるという利点を有する。
【００４６】
更に、微小滴で供給位置をずらしながら１つのスポットを形成することは、スポットの高さ方向の形状も、その積み重ねる位置を調整することで制御可能であり、スポットから発光される蛍光強度パターンをスポット内で自由に設計することができるという利点を有する。
【００４７】
また、供給量の変化は、供給数の変化に加え、インクジェット方式の場合、吐出条件、即ち、圧電／電歪素子に印加する電圧パターンの変化でも可能である。
【００４８】
また、本発明においては、前記試料溶液を前記基板上に供給する際、あるいは供給するに先立って、前記試料溶液に振動を与えることが好ましい。
【００４９】
この場合、試料溶液に含まれるＤＮＡ断片が沈殿することが回避され、試料溶液中にＤＮＡ断片を均一に分散させることができる。これにより、各基板に形成される同種の試料溶液について、ＤＮＡ断片の含有量のばらつきをほとんどなくすことができ、基板毎の遺伝子解析のばらつきをなくすことができる。
【００５０】
更にまた、本発明においては、試料溶液を基板上にインクジェット方式で供給して、前記基板上に試料溶液によるスポットが多数配列されたＤＮＡチップを製造するＤＮＡチップの製造方法において、前記試料溶液を前記基板上に供給する際に、前記試料溶液を吐出、供給する箇所の周りの湿度をその他の部分より選択的に高くして、前記試料溶液が乾燥もしくは増粘もしくは固化しないようにしてもよい。これにより、特に、乾燥、増粘、固化しやすい試料溶液を用いる場合に、吐出不良を回避できる。
【００５１】
また、本発明においては、前記基板上に前記試料溶液が供給されてスポットが多数配列された基板を作製した後に、前記基板を０℃以下に冷却した後、湿度３０％以上の十分な体積の気体が存在する室温下に戻す工程を採用してもよい。
【００５２】
更に、前記基板上に前記試料溶液が供給されてスポットが多数配列された基板を作製した後に、前記基板を、湿度８０％以上の十分な体積の気体が存在する雰囲気下にさらしたり、ミストを含んだ水蒸気中にさらしてもよい。
【００５３】
これらの発明は、ポリマー等を混合させ、粘度を増加させた試料溶液を用い、試料溶液の滴下方法を調整し、基板上のスポットの形状を、例えばスポットの周縁部分が盛り上がり、中央部分が凹んだ、いわゆるドーナツ形状を呈するようにする場合に好適に採用される。
【００５４】
このようなドーナツ形状の場合、スポットの周縁部分と基板の境界が際立って観測されやすくなり、ＤＮＡ断片を含む試料溶液のように、無色透明な液体のスポットを、無色透明のガラス基板等の上に形成する場合に、そのスポット形状を観測しやすくなり、スポット形状の良否を検査しやすくなるという利点を有する。
【００５５】
しかしながら、このようなドーナツ形状を呈したスポットにおいては、多くの場合、その後の固定化時の洗浄工程で周縁の盛り上がり部分の大半が洗い流されたとしても、固定化される実質的な試料は周縁部分で多く（濃く）なることから、ＤＮＡチップとして使用したときに、スポットから発せられる蛍光発光量の分布は、スポット内でドーナツ形状を呈することになり、感度の劣化、ばらつきの一因となってしまう。
【００５６】
従って、検査のしやすさ（ドーナツ形状）と、スポット形状の良さ（非ドーナツ形状）を両立させるためには、基板に試料溶液を供給する際は、インクジェット方式等で吐出し、基板に試料溶液を滴下させ、その運動エネルギーと基板との疎水性の制御で試料溶液を、そのスポットの周縁部分に集中させるようにしてドーナツ形状を形成し、その後、液体の表面張力により球状にならない程度に、予め試料溶液の粘度を増加させる一方、検査終了後には、スポットを形成する試料溶液の流動性を増し、表面張力により、ドーナツ形状を非ドーナツ形状に変化させる方法が適している。本発明は、この方法を実現するために好適である。
【００５７】
即ち、ドーナツ形状のスポットが形成された基板を０℃以下に冷却した後、湿度３０％以上の十分な体積の気体が存在する室温下に戻すことや、前記基板を湿度８０％以上の十分な体積の気体が存在する雰囲気下にさらしたり、ミストを含んだ水蒸気中にさらしたりすることで、周りの気体から試料溶液中に水分が取り込まれたり、ミストが接触して試料溶液の流動性が増し、スポット形状が非ドーナツ形状である半球状に変化し、もって、ＤＮＡチップの感度向上、感度ばらつきの低減が図られることになる。もちろん、スポット形状が、半球状になった後は、速やかに基板を乾燥工程に投入し、形状の固定化を行ってもよい。なお、水蒸気にさらす場合は、水蒸気の温度をＤＮＡ断片が変質しない程度の温度以下にしなければならないことはもちろんである。
【発明の効果】
【００５８】
以上説明したように、本発明に係るＤＮＡの製造方法によれば、コストの高い試料溶液の使用効率を向上させることができ、ＤＮＡチップの生産性の向上及び歩留まりの向上を図ることができる。また、滴下する試料溶液の種類に応じた滴下制御を行うことができ、基板上に形成されるスポット径の均一化を図ることができ、ＤＮＡチップの品質並びに信頼性の向上を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
以下、本発明に係るＤＮＡチップの製造方法のいくつかの実施の形態例を図１〜図１５を参照しながら説明する。
【００６０】
本実施の形態に係るＤＮＡチップの製造方法は、図１に示すように、基板１０の表面にpoly-L-lysine層１２（図１０Ａ参照）を形成する前処理工程Ｓ１と、ＤＮＡ断片を含む試料を調製する試料調製工程Ｓ２と、得られた試料の濃度を希釈する希釈工程Ｓ３と、希釈された試料溶液を基板１０上に供給（滴下を含む）して、図３に示すように、基板１０上に多数のスポット８０が配列されたスポット済み基板を作成する供給工程Ｓ４と、基板１０に熱を加えてスポット８０を乾燥させる乾燥工程Ｓ５と、スポット８０中のＤＮＡ断片を基板１０上に固定化する固定化工程Ｓ６とからなり、図３に示すＤＮＡチップ２０を製造する。
【００６１】
また、試料調製工程Ｓ２は、図２に示すように、ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅してＰＣＲ産物を調製する増幅工程Ｓ１１と、得られたＰＣＲ産物を乾燥してＤＮＡ粉末とする粉末生成工程Ｓ１２と、得られたＤＮＡ粉末を緩衝液に溶かす混合工程Ｓ１３とを含む。
【００６２】
具体的に説明すると、前処理工程Ｓ１は、まず、基板１０をアルカリ溶液に浸し、室温で少なくとも２時間ゆっくりと振盪する。前記アルカリ溶液は、例えばＮａＯＨを蒸留水に溶かし、更にエタノールを加えて、完全に透明になるまで攪拌した溶液である。
【００６３】
その後、基板１０を取り出して、蒸留水中に移し、リンスして、アルカリ溶液を除去する。次いで、蒸留水中にpoly-L-lysineを加えて調製されたpoly-L-lysine液に基板１０を浸し、１時間放置する。
【００６４】
その後、基板１０を取り出して、遠心機にかけて遠心し、余分なpoly-L-lysine液を除去する。次いで、基板１０を４０℃、５分ほど乾燥させて、表面にpoly-L-lysine層１２が形成された基板１０を得る。
【００６５】
次に、試料調製工程Ｓ２は、まず、既知のＰＣＲ機で増幅したＰＣＲ産物（増幅工程Ｓ１１）に、３Ｍsodium acetateとイソプロパノールとを加え、数時間放置する。その後、このＰＣＲ産物溶液を遠心機で遠心し、ＤＮＡ断片を沈殿させる。
【００６６】
沈殿させたＤＮＡ断片をエタノールでリンスし、遠心の後、乾燥させてＤＮＡ粉末を生成する（粉末生成工程Ｓ１２）。得られたＤＮＡ粉末に緩衝液（例えばＴＥバッファ溶液）を加え、数時間放置して完全に溶かすことによって（混合工程Ｓ１３）、試料が調製される。この段階での試料の濃度は１〜１０μｇ／μリットルである。
【００６７】
そして、この実施の形態では、得られた試料の濃度を希釈する（希釈工程Ｓ３）。この希釈工程Ｓ３では、前記試料を水や塩化ナトリウムを含む水溶液や、ポリマーを含む水溶液等で希釈するようにしている。なお、希釈後の試料溶液は、必要に応じて１時間〜数時間放置するか、冷凍−解凍の混合を行って、試料と希釈液とをなじませてもよい。その後、前記希釈された試料溶液を遠心分離又は真空脱泡処理して溶液中の泡を取り除いた後、基板１０上に供給してスポット済み基板を作成する（供給工程Ｓ４）。
【００６８】
特に、この実施の形態では、供給工程Ｓ４に、図４Ａ〜図４Ｃ及び図５に示すような分注装置３０を使用する。
【００６９】
この分注装置３０は、矩形状の固定板３２の上面に例えば１０個のマイクロピペット３４を５行２列に配列し、各列方向に整列されたマイクロピペット３４群をそれぞれ固定治具３６を介して固定板３２に固定させた構成を有する。
【００７０】
マイクロピペット３４は、図４Ｃ及び図５に示すように、ほぼ直方体の形状を有する基体５０の上面に形成された試料注入口５２と、該基体５０の下面に形成された試料吐出口５４と、内部に試料注入口５２と試料吐出口５４との間に形成されたキャビティ５６と、基体５０を振動させたり、キャビティ５６の体積を変化させたりするアクチュエータ部５８とを有して構成されている。
【００７１】
従って、図５に示すように、前記固定板３２には、マイクロピペット３４の試料吐出口５４に対応する箇所にそれぞれ貫通孔４０が設けられている。これにより、マイクロピペット３４の試料吐出口５４から吐出された試料溶液が、前記貫通孔４０を通じて、例えば固定板３２の下方に固定された基板１０に供給されることになる。
【００７２】
このマイクロピペット３４は、試料注入口５２から基体５０の内部にかけて開口幅の大きいほぼＬ字状の導入穴６０が形成されている。この導入穴６０とキャビティ５６との間には、径の小さい第１の連通孔６２が形成され、試料注入口５２から注入された試料溶液が導入穴６０及び第１の連通孔６２を通じてキャビティ５６に導入されるようになっている。
【００７３】
キャビティ５６のうち、前記第１の連通孔６２とは異なる位置に、試料吐出口５４に連通し、かつ、第１の連通孔６２よりも径の大きい第２の連通孔６４が形成されている。本実施の形態では、キャビティ５６の下面のうち、試料注入口５２寄りに第１の連通孔６２を形成し、同じくキャビティ５６の下面のうち、試料吐出口５４に対応した位置に第２の連通孔６４を形成するようにしている。
【００７４】
更に、この実施の形態では、基体５０のうち、キャビティ５６の上面が接する部分が薄肉とされ、外部応力に対して振動を受けやすい構造となっており、振動部６６として機能するようになっている。振動部６６の上面に前記アクチュエータ部５８が形成されている。
【００７５】
基体５０は、複数枚のジルコニアセラミックスのグリーンシート（第１の薄板層５０Ａ、第１のスペーサ層５０Ｂ、第２の薄板層５０Ｃ、第２のスペーサ層５０Ｄ及び第３の薄板層５０Ｅ）を積層し、一体焼成して構成されている。
【００７６】
つまり、基体５０は、試料注入口５２を構成する窓部が形成され、一部において振動部６６を構成する薄肉の第１の薄板層５０Ａと、導入穴６０の一部及びキャビティ５６を構成する複数の窓部がそれぞれ形成された厚肉の第１のスペーサ層５０Ｂと、導入穴６０の一部、第１の連通孔６２及び第２の連通孔６４の一部を構成する複数の窓部がそれぞれ形成された薄肉の第２の薄板層５０Ｃと、導入穴６０の一部及び第２の連通孔６４の一部を構成する複数の窓部がそれぞれ形成された厚肉の第２のスペーサ層５０Ｄと、試料吐出口５４を構成する窓部が形成された薄肉の第３の薄板層５０Ｅとを積層し、一体焼成して構成されている。
【００７７】
アクチュエータ部５８は、前記振動部６６のほか、該振動部６６上に直接形成された下部電極７０と、該下部電極７０上に形成された圧電／電歪素子や反強誘電体等からなる圧電層７２と、該圧電層７２の上面に形成された上部電極７４とを有して構成されている。
【００７８】
下部電極７０と上部電極７４は、図４Ｃに示すように、それぞれ基体５０の上面に形成された複数のパッド７６及び７８を通じて図示しない駆動回路に電気的に接続される。
【００７９】
上記のような構成のマイクロピペット３４によれば、上部電極７４と下部電極７０との間に電界が生じると、圧電層７２が変形し、それに伴って振動部６６が変形し、振動部６６に接しているキャビティ（加圧室）５６の容積が減少又は増加することになる。
【００８０】
このキャビティ５６の容積の減少によってキャビティ５６内に充填された試料溶液がキャビティ５６に連通する試料吐出口５４から所定速度で吐出され、図３に示すように、マイクロピペット３４から吐出された試料溶液が顕微鏡スライドガラス等の基体５０上にスポット８０として整列固定されたＤＮＡチップ２０を作製することができる。また、このキャビティ５６の容積増加によって、キャビティ５６内に第１の連通孔６２から新たな試料溶液が注入、充填され、次の吐出に備えられる。
【００８１】
なお、アクチュエータ部５８の駆動によって、キャビティ５６の容積が減少する構造としては、いわゆるインクジェット方式の装置構造を採用することができる（特開平６−４００３０号公報参照）。
【００８２】
そして、キャビティ（加圧室）５６は、ＤＮＡ断片などを含む試料溶液が乱れの少ない状態下で移動するような流路寸法に形成されている。
【００８３】
つまり、キャビティ５６の寸法は、試料の種類、作成する液滴の大きさ、形成密度により異なるが、例えば、塩基対１〜１００００程度のＤＮＡ断片を１００μｇ／μリットル以下の濃度で×１ＴＥバッファ溶液（緩衝液）に溶解させ、更に等量のポリマーを含んだ水溶液と混合させた試料を５０〜６００μｍピッチで３０〜５００μｍφ液滴径の滴下を行う場合においては、図６に示すように、キャビティ長（Ｌ）は、１〜５ｍｍ、キャビティ幅（Ｗ）は、０．１〜１ｍｍ、キャビティ深さ（Ｄ）は、０．１〜０．５ｍｍが好ましい。またキャビティ５６の内壁には、流れを乱す突起物がないように滑らかであることがよく、その材質は、試料溶液と親和性の良いセラミックスからなることが好ましい。
【００８４】
このような形状にすることにより、キャビティ５６を試料注入口５２から試料吐出口５４に至る流路の一部として、試料注入口５２から導入穴６０、第１の連通孔６２を経てキャビティ５６内に移動する試料溶液の流れを乱すことなく試料吐出口５４に導くことができる。
【００８５】
なお、基体５０は、前述したように、ジルコニアセラミックスの一体積層、焼成体であるほかに、アクチュエータ部５８を形成したジルコニアセラミック焼結体と金属、樹脂フィルム等との接着体であってもよい。特に、試料吐出口５４を形成した第３の薄板層５０Ｅは、その加工法とのマッチングを考慮して、ＰＥＴフィルム等の有機樹脂をエキシマレーザ等で加工したシート、あるいはステンレスフィルム等の金属を金型等で打ち抜いたシートであることが好ましい。
【００８６】
また、試料吐出口５４と第１の連通孔６２の寸法は、吐出する試料溶液の物性、吐出量、吐出速度等によって最適設計がなされるが、１０〜１００μｍφ程度であることがよい。
【００８７】
図７は、１つの試料注入口５２とそれに連結する導入穴６０に対し、２つの第１の連通孔６２が連通し、それぞれの連通孔６２には、キャビティ５６、第２の連結孔６４及び試料吐出口５４が連続して形成された流路６５がそれぞれ独立して２つ形成されている。各キャビティ５６の上面には、それぞれ独立して配線、駆動するアクチュエータ部５８（図示せず）が形成される。このような構成のマイクロピペット３４によれば、同一の試料溶液を同時に、又はタイミングをずらして基板１０上に供給することができる。
【００８８】
ところで、図４Ａに示すように、固定板３２の上面には、マイクロピペット３４を位置決め固定するための複数のピン３８が設けられている。マイクロピペット３４を固定板３２上に固定する場合は、マイクロピペット３４の基体５０の両側に設けられた位置決め用孔９０（図４Ｃ参照）に固定板３２のピン３８を挿入させながら、マイクロピペット３４を固定板３２に載置することで、自動的に複数のマイクロピペット３４が所定の並びで配列位置決めされることになる。
【００８９】
また、各固定治具３６は、複数のマイクロピペット３４を固定板３２に押さえ付ける押さえ板１００を有する。押さえ板１００の両端には、それぞれネジ１０２が挿通される挿通孔が形成され、この挿通孔にネジ１０２を挿通して、固定板３２にねじ込むことによって、前記押さえ板１００で複数のマイクロピペット３４を一度に固定板３２に押さえ付けることができるようになっている。そして、１つの押さえ板１００で押さえ付けた複数のマイクロピペット３４で１つのユニットが構成される。図４Ａの例では列方向に配列された５つのマイクロピペット３４で１つのユニットが構成された例を示している。
【００９０】
また、押さえ板１００には、複数のマイクロピペット３４を押さえ付けたときに、各マイクロピペット３４の試料注入口５２に対応する箇所にそれぞれ試料溶液を供給するための導入孔１０４（図４Ｂ参照）が形成されており、各導入孔１０４の上端部にはそれぞれ試料溶液を導入孔１０４に導くためのチューブ１０６が保持されている。
【００９１】
なお、押さえ板１００の幅は、配線作業の効率化を考慮すると、複数のマイクロピペット３４を固定板３２に押さえ付けた際に、アクチュエータ部５８の各電極７０及び７４につながるパッド７６及び７８が上方に臨むような寸法であることが好ましい。
【００９２】
このように、上述の分注装置３０は、試料注入口５２及び試料吐出口５４を有するマイクロピペット３４の複数個をそれぞれ試料吐出口５４を下方向に向けた状態で立設させて構成されている。
【００９３】
即ち、各マイクロピペット３４は、それぞれの試料注入口５２を上側とし、試料吐出口５４を下側とし、かつ、各試料吐出口５４が縦横に配列配置されて、試料吐出口５４からそれぞれ種類の異なる試料溶液が吐出されるようになっている。
【００９４】
このような構成を有する分注装置３０において、各試料注入口５２に対応してそれぞれ種類の異なる試料溶液を供給する方法としては、図８に示すように、例えば多数の断面ほぼＶ字状の凹部（溜め部）１１０が配列されたカートリッジ１１２を使用する方法がある。この方法は、カートリッジ１１２の各凹部１１０にそれぞれ種類の異なる試料溶液を入れ、該カートリッジ１１２を各凹部１１０とチューブ１０６とがそれぞれ対応するように取り付け、針等で各凹部１１０の底を開封することによって、各凹部１１０にあった試料溶液をチューブ１０６を介して各マイクロピペット３４に供給する方法等が考えられる。
【００９５】
また、チューブ１０６を用いない場合は、カートリッジ１１２を各凹部１１０と固定治具３６の各導入孔１０４とがそれぞれ対応するように取り付け、針等で各凹部１１０の底を開封することによって、各凹部１１０にあった試料溶液を導入孔１０４を介して各マイクロピペット３４に供給する方法のほか、予め、固定治具３６における各導入孔１０４の近傍に針等を形成し、カートリッジ１１２を固定治具３６に取り付けると同時に各凹部１１０が開封されるようにしてもよい。
【００９６】
なお、開封後に気体等を圧送し、試料溶液を強制的に押し出す機構を加えてもよい。また、各マイクロピペット３４の基体５０内に形成された試料注入口５２から試料吐出口５４に至る空間を洗浄する機構を備えることは、数千から数万種類という多種類のＤＮＡ断片などを汚染なく、しかも純度よくスポット８０として吐出するために望ましい。
【００９７】
図４Ａの例では、押さえ板１００の両端をネジ１０２で固定板３２に締め付けることで行っているが、押さえ板１００の固定法は、ネジ、バネ等で機械的に行うほか、接着剤等で行ってもよい。
【００９８】
また、マイクロピペット３４を構成する基体５０は、上述したように、セラミックスで形成されており、例えば、安定化ジルコニアや部分安定化ジルコニア、アルミナ、マグネシア、窒化珪素等を用いることができる。
【００９９】
このうち、安定化／部分安定化ジルコニアは、薄板においても機械的強度が大きいこと、靱性が高いこと、圧電層７２や電極材との反応性が小さいことから最も好適に採用される。
【０１００】
そして、基体５０等の材料として安定化／部分安定化ジルコニアを使用する場合には、少なくとも、アクチュエータ部５８が形成される部分（振動部６６）には、アルミナあるいはチタニア等の添加物が含有されることが好ましい。
【０１０１】
また、アクチュエータ部５８を構成する圧電層７２は、圧電セラミックスとして、例えば、ジルコン酸鉛、チタン酸鉛、マグネシウムニオブ酸鉛、マグネシウムタンタル酸鉛、ニッケルニオブ酸鉛、亜鉛ニオブ酸鉛、マンガンニオブ酸鉛、アンチモンスズ酸鉛、マンガンタングステン酸鉛、コバルトニオブ酸鉛、チタン酸バリウム等やこれらのいずれかを組み合わせた成分を含有する複合セラミックスを用いることができるが、本実施の形態においては、ジルコン酸鉛とチタン酸鉛及びマグネシウムニオブ酸鉛からなる成分を主成分とする材料が好適に用いられる。
【０１０２】
これは、このような材料が、高い電気機械結合係数と圧電定数を有することに加え、圧電層７２の焼結時における基体材料との反応性が小さく、所定の組成のものを安定に形成することができることに基づくからである。
【０１０３】
更に、本実施の形態では、前記圧電セラミックスに、ランタン、カルシウム、ストロンチウム、モリブデン、タングステン、バリウム、ニオブ、亜鉛、ニッケル、マンガン、セリウム、カドミウム、クロム、コバルト、アンチモン、鉄、イットリウム、タンタル、リチウム、ビスマス、スズ等の酸化物、もしくはこれらいずれかの組合せ、又は他の化合物を適宜、添加したセラミックスを用いてもよい。
【０１０４】
例えば、ジルコン酸鉛とチタン酸鉛及びマグネシウムニオブ酸鉛を主成分とし、これにランタンやストロンチウムを含有するセラミックスを用いることもまた好ましい。
【０１０５】
一方、アクチュエータ部５８における上部電極７４及び下部電極７０は、室温で、固体であって導電性の金属で構成されていることが好ましく、例えば、アルミニウム、チタン、クロム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ニオブ、モリブデン、ルテニウム、パラジウム、ロジウム、銀、スズ、タンタル、タングステン、イリジウム、白金、金、鉛等の金属単体あるいはこれらのいずれかを組み合わせた合金が用いられ、更に、これらに圧電層７２や基体５０と同じ材料を分散させたサーメット材料を用いてもよい。
【０１０６】
次に、この実施の形態では、上記のような分注装置３０を用い、試料溶液を基板１０上に供給したスポット済み基板を８０℃の恒温槽に１時間程度放置してスポット８０を乾燥させた（乾燥工程Ｓ５）後、１２０ｍＪのＵＶ照射、ＮａＢｒ液中への２０分浸漬（ブロッキング処理）、煮沸２分、エタノール置換（脱水）を行って、ＤＮＡ断片を基板１０上に固定化して（固定化工程Ｓ６）、ＤＮＡチップ２０を製造する。
【０１０７】
次に、この分注装置３０を使って基板１０上に試料溶液を供給し、スポット８０を形成するいくつかの方法について図９〜図１５を参照しながら説明する。
【０１０８】
まず、第１の方法は、図９に示すように、各チューブ１０６からそれぞれ固定治具３６の導入孔１０４を介して各マイクロピペット３４のキャビティ５６内にそれぞれ種類の異なる試料溶液（希釈済み）を充填し、次いで、各アクチュエータ部５８を駆動して、各マイクロピペット３４の試料吐出口５４から試料溶液を吐出させる。
【０１０９】
ここで、アクチュエータ部５８の各電極７０及び７４に印加する電圧波形のうち、アクチュエータ部５８がオン動作して、キャビティ５６の容積を減少させる場合、各電極７０及び７４にはパルス的な電圧が印加されることになる。この場合、パルスの振幅（電圧）、単位時間当たりの変化量（電圧波形の立ち上がり角度）、パルス幅等を変化させることで、振動部６６の変形量、変形速度等が変化し、これにより、試料溶液の吐出量が制御できる。また、一定期間に発生させるパルス数を変化させることで、単位時間当たりの試料溶液の滴下回数を変更することができる。
【０１１０】
試料溶液を複数回供給して１つのスポット８０を形成する場合、通常、供給位置を固定して、供給回数を重ねるが、供給毎に供給位置をずらしてもよい。例えば図１０Ａ及び図１０Ｂに示すように、試料溶液の供給位置を適宜変えることによって、形成されるべき１つのスポット８０（二点鎖線で示す）内に複数の試料溶液による微小スポット８０ａが形成され、これら微小スポット８０ａが基板１０上で組み合わされることで（合体）、図１１Ａ及び図１１Ｂに示すように、１つのスポット８０が形成されることになる。この場合、供給する試料溶液の種類に応じて、供給回数、供給位置及び１回の供給量を制御することで、基板１０上に形成される各スポット８０の径の均一化を図ることができる。
【０１１１】
更に、この実施の形態では、試料溶液を基板１０上に供給する際に、図１２Ａ〜図１３に示すように、該試料溶液の部分を乾燥、増粘、固化するようにしている。この処理は、例えば基板１０を加熱することで実現できる。
【０１１２】
基板１０を加熱する方法としては、図１３に示すように、赤外線ランプ１２２から出射された赤外線を基板１０の裏面に照射して加熱する方法がある。また、試料溶液を直接加熱する方法としては、図１２Ａ、図１２Ｂに示すように、レーザ光源１２０、電磁波発生源１２１から出射されたレーザ光Ｌ、電磁波Ｅを、試料溶液に焦点を合わせて照射、加熱する方法がある。試料溶液は、基板１０上に供給された状態で加熱してもよいが、供給の際の形状の安定性、スポット８０の広がり防止の観点から、試料吐出口５４から吐出されて、基板１０上に落下する間に、照射、加熱することが望ましい。
【０１１３】
また、電磁波Ｅは、試料溶液のように、水分を含んだものを選択的に加熱できるため、スポット８０を形成する試料溶液（供給中の試料溶液）のみを加熱でき、より好ましい。なお、加熱に際しては、吐出を終えた試料吐出口５４は、乾燥による吐出不良を回避するため、金属シールド板等で遮蔽してもよい。
【０１１４】
更にまた、この実施の形態では、試料溶液を基板１０上に供給する際に、試料溶液及び基板１０を冷却するようにしている。冷却方法は、試料溶液が供給される基板１０を予め室温以下に冷却しておいてもよいし、試料溶液自体に、代替フロンや液体窒素等からなる冷却剤をふきかけてもよい。但し、このような冷却処理は、冷却に際し、周りの気体からの水分の露結による水滴の付着が起こり、スポット８０自体を流してしまうおそれがあるため、周りの気体の湿度管理、冷却、常温復帰の速度管理等が必要である。
【０１１５】
また、キャビティ５６に試料溶液を充填した後に、アクチュエータ部５８に振動を励起する程度の電圧を印加することが好ましい。これにより、キャビティ内に充填された試料溶液に含まれるＤＮＡ断片が均一に分散され、滴下毎のＤＮＡ断片の量にばらつきは生じなくなる。
【０１１６】
次に、分注装置３０を使った第２の方法について説明する。この第２の方法は、図１４に示すように、各チューブ１０６からそれぞれ固定治具３６の導入孔１０４を介して各マイクロピペット３４のキャビティ５６内に精製水や緩衝液などの置換液を充填し、次いで、予め希釈した試料を試料注入口５２からキャビティ５６内に置換させながら注入する。そして、アクチュエータ部５８を駆動させて、試料溶液を基板１０上に吐出供給させる。なお、置換液と試料溶液の間に、試料溶液と比重をほぼ同じくするＤＮＡ断片を含まない中間液（例えば、緩衝液とポリマーを含んだ水溶液の混合液）を介してもよい。
【０１１７】
キャビティ５６内における試料の層流置換の完了は、キャビティ５６内の流体特性の変化を検知することにより把握することが好ましい。
【０１１８】
なお、キャビティ５６内の置換液と試料の置換は層流で行われることが好ましいが、試料の種類が変わった場合や、液体の移動速度が非常に速い場合においては、キャビティ５６のうち、第１の連通孔６２の近辺部分は、必ずしも層流でなくてもよい。この場合、試料溶液と置換液の混合により試料溶液のパージ量は増大するが、キャビティ５６内の流体特性の変化を検知することにより置換完了を判断することで、パージ量の増大を最小にできる。
【０１１９】
ここで、キャビティ５６内の流体特性の変化は、アクチュエータ部５８に振動を励起する程度の電圧を印加し、その振動に伴う電気的定数の変化を検出することにより把握する。このような流体特性の変化の検知は、例えば、特開平８−２０１２６５号公報に記載されており、この内容が参照できる。
【０１２０】
具体的には、アクチュエータ部５８に対して、所定の間隔で、吐出駆動用の電源からの電気的接続をリレーで切り離し、同時に、共振周波数を測定する手段をリレーにより接続し、その時点でのインピーダンスあるいは共振周波数を電気的に測定する。
【０１２１】
これにより、液体の粘度、比重等が目的の試料（ＤＮＡ断片などを含む液体）であるかどうかを把握することができる。即ち、各マイクロピペット３４においては、マイクロピペット３４自体がセンサとして機能するため、マイクロピペット３４の構成も単純化することができる。
【０１２２】
そして、前記置換が済んだ後、アクチュエータ部５８を、求められるスポット径に応じた液適量に対応した駆動条件にて駆動し、試料溶液の基板１０上への供給を繰り返すことにより、ＤＮＡチップ２０を製造する。通常、１つのスポット８０を形成するのに、マイクロピペット３４から１〜数百滴を吐出して行う。
【０１２３】
なお、試料注入口５２中の試料の量が減少したら、緩衝液や精製水や塩化ナトリウムを含む水溶液を追加して、流路中に気泡が入らないようにし、吐出を続けることにより、試料溶液をマイクロピペット３４内に残すことなく使い切ることができる。試料から置換液への置換の完了（試料吐出の終了）は、同じく、アクチュエータ部５８を用いた液体の粘度、比重の検出で行う。
【０１２４】
また、使用する置換液、中間液、試料溶液としては、予め脱気操作を通して溶液中の溶存気体を取り除いたものを使用することが好ましい。そのような溶液を用いることにより、マイクロピペット３４の流路内に試料溶液を充填する際に、流路途中で気泡がひっかかってしまい、充填の不備が生じた場合でも、その気泡を試料溶液中に溶かし込んで不具合を回避できると共に、吐出の途中において、流体中に気泡が発生することがなく、吐出の不具合を生じることもない。
【０１２５】
また、上述の第２の方法において、試料溶液を吐出しつつ、緩衝液や精製水や塩化ナトリウムを含む水溶液のような置換液を試料注入口５２からキャビティに注入し、同様に、層流置換によりキャビティ５６内に残留する試料溶液を完全に吐出し、次の試料注入に備えることができる。
【０１２６】
そして、キャビティ５６内に試料溶液が残留しているかどうか（試料溶液として吐出できるかどうか）を検知するのにも、同じく、キャビティ５６内の流体特性の変化を検知することにより把握できる。この場合、層流置換あるいは置換完了検出機構により使用に供しない試料のパージ量を極めて少なくすることができると共に、試料溶液の使用効率を向上することができる。
【０１２７】
また、試料を試料注入口５２からキャビティ５６に充填する際に、アクチュエータ部５８を駆動させながら試料を試料注入口５２からキャビティ５６内に層流置換させてもよい。この場合、予め安価な置換液によりキャビティ５６内を確実に置換後、高価な試料を層流置換することにより、吐出不良の発生が完全に防止でき、高価な試料溶液を効率よく吐出できる。
【０１２８】
次いで、前記試料溶液が供給された基板１０上のスポット８０の厚みの形状が、図１５に示すように、周縁部分１３０で盛り上がった、いわゆるドーナツ形状になった場合は、基板１０を０℃に冷却した後、湿度３０％以上の十分な体積の気体が存在する室温下に戻す処理を行う。こうすることで、ドーナツ形状になったスポット８０に水分が供給され、スポット８０中の試料溶液の流動性が増し、表面張力により半球状に変化し、周縁部分１３０の盛り上がりがなくなる。
【０１２９】
ドーナツ形状の場合、スポット８０の周縁部分１３０と基板１０の境界が際立って観測されやすくなり、ＤＮＡ断片を含む試料溶液のように、無色透明な液体のスポット８０を、無色透明のガラス基板等の上に形成する場合に、そのスポット形状を観測しやすくなり、スポット形成の良否を検査しやすくなるという利点を有する。
【０１３０】
しかしながら、このようなドーナツ形状を呈したスポット８０においては、多くの場合、その後の固定化時の洗浄工程において、前記周縁部分１３０（盛り上がり部分）の大半が洗い流されたとしても、固定化される実質的な試料１３２は周縁部分１３０で多く（濃く）なることから、ＤＮＡチップ２０として使用したときに、スポット８０から発せられる蛍光発光量の分布は、スポット８０内でドーナツ形状を呈することになり、感度の劣化、ばらつきの一因となってしまう。
【０１３１】
従って、検査のしやすさ（ドーナツ形状）と、スポット形状の良さ（非ドーナツ形状）を両立させるためには、基板１０に試料溶液を供給する際に、インクジェット方式等で吐出して、基板１０に試料溶液を供給し、その運動エネルギーと基板１０との疎水性の制御によって、試料溶液を、そのスポット８０の周縁部分１３０に集中させるようにしてドーナツ形状を形成する。
【０１３２】
その後、液体の表面張力により球状にならない程度に、予め試料溶液の粘度を増加させる一方、検査終了後には、スポット８０を形成する試料溶液の流動性を増すようにして、表面張力により、ドーナツ形状を非ドーナツ形状に変化させる方法が適している。
【０１３３】
本実施の形態に係る方法（基板１０を０℃に冷却した後、湿度３０％以上の十分な体積の気体が存在する室温下に戻す処理）は、上述の方法を簡単に実現することができる。
【０１３４】
そして、スポット８０への水分の供給は、ミスト等を含む蒸気を直接あてるようにしてもよいが、前記冷却後、室温に戻す工程で、基板１０上に露結する水分を利用することが、過剰水分でスポットを流してしまうことなく、また、均一に細かい水滴が供給される点で好ましい。
【０１３５】
その後、基板１０を８０℃で１時間ベークすることにより、スポット８０を乾燥させる。８０℃で１時間ベークした後に、冷却−室温に戻す工程を施してもよいが、その場合は、再度ベーク処理が必要となる。
【０１３６】
このように、本実施の形態に係るＤＮＡチップの製造方法においては、試料溶液の基板１０上への供給に先立って、試料溶液の濃度を希釈するようにしているため、該試料溶液を基板１０上に供給したとき、図１１Ａに示すように、試料溶液によるスポット８０は半球状にはならず、平坦な形状となる。この場合、供給された試料溶液のほとんどが固定化されるため、その後の洗浄工程でも試料溶液の大半以上が流されてしまうということがなく、試料溶液の使用効率を向上させることができる。
【０１３７】
また、試料溶液に含まれるＤＮＡ断片の種類に応じて希釈の度合いを変えて、試料溶液の粘度や表面張力を変化させることにより、基板１０上に形成されるスポット８０の径を均一化させることができる。
【０１３８】
更にまた、基板１０上に試料溶液を供給してスポット８０を形成した後、該スポット８０に水分を供給する工程を付加することにより、スポット８０の厚み方向の形状を更に均一にすることができる。
【０１３９】
このように、本実施の形態においては、コストの高い試料溶液の使用効率を向上させることができ、ＤＮＡチップ２０の生産性の向上及び歩留まりの向上を図ることができる。また、供給する試料溶液の種類に応じた供給制御を行うことができ、基板１０上に形成されるスポット径の均一化を図ることができ、ＤＮＡチップ２０の品質並びに信頼性の向上を図ることができる。
【０１４０】
なお、この発明に係るＤＮＡチップの製造方法は、上述の実施の形態に限らず、この発明の要旨を逸脱することなく、種々の構成を採り得ることはもちろんである。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】本実施の形態に係るＤＮＡチップの製造方法を示す工程ブロック図である。
【図２】試料調製工程の内訳を示す工程ブロック図である。
【図３】製造されるＤＮＡチップを示す斜視図である。
【図４】図４Ａは本実施の形態に係るＤＮＡチップの製造方法で使用される分注装置の構成を示す平面図であり、図４Ｂはその正面図であり、図４Ｃは、分注装置を構成する１つのマイクロピペットを示す拡大平面図である。
【図５】マイクロピペットの構成を示す縦断面図である。
【図６】マイクロピペットの基体内に形成されるキャビティを含む流路の形状を示す斜視図である。
【図７】マイクロピペットの基体内に形成されるキャビティを含む流路の他の形状を示す斜視図である。
【図８】カートリッジと共に示す分注装置の分解斜視図である。
【図９】分注装置を使用してＤＮＡチップを製造する場合の第１の方法を示す説明図である。
【図１０】図１０Ａは基板上に試料溶液を供給して、形成されるべき１つのスポット内に多数の微小スポットが形成されていく過程を示す断面図であり、図１０Ｂはその平面図である。
【図１１】図１１Ａは基板上において、多数の微小スポットが合体して１つのスポットが形成された状態を示す断面図であり、図１１Ｂはその平面図である。
【図１２】図１２Ａは試料溶液又は基板を加熱する方法の一例を示す説明図であり、図１２Ｂはその他の方法を示す説明図である。
【図１３】基板を加熱する方法の一例を示す説明図である。
【図１４】分注装置を使用してＤＮＡチップを製造する場合の第２の方法を示す説明図である。
【図１５】ドーナツ形状のスポットの例を示す断面図である。
【図１６】従来例に係るＤＮＡチップの製造方法によって基板上に形成されたスポットの形状を示す断面図である。
【符号の説明】
【０１４２】
１０…基板                      ２０…ＤＮＡチップ
３０…分注装置                  ３４…マイクロピペット
５０…基体                      ５２…試料注入口
５４…試料吐出口                ５６…キャビティ
５８…アクチュエータ部          ８０…スポット
８０ａ…微小スポット            １１２…カートリッジ
１２０…レーザ光源              １２２…赤外線ランプ
Ｓ１…前処理工程                Ｓ２…試料調製工程
Ｓ３…希釈工程                  Ｓ４…供給工程
Ｓ５…乾燥工程                  Ｓ６…固定化工程
Ｓ１１…増幅工程                Ｓ１２…粉末生成工程
Ｓ１３…混合工程
【図１】
2008151798.tif 000003
【図２】
2008151798.tif 000004
【図３】
2008151798.tif 000005
【図４】
2008151798.tif 000006
【図５】
2008151798.tif 000007
【図６】
2008151798.tif 000008
【図７】
2008151798.tif 000009
【図８】
2008151798.tif 000010
【図９】
2008151798.tif 000011
【図１０】
2008151798.tif 000012
【図１１】
2008151798.tif 000013
【図１２】
2008151798.tif 000014
【図１３】
2008151798.tif 000015
【図１４】
2008151798.tif 000016
【図１５】
2008151798.tif 000017
【図１６】
2008151798.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月6日(2008.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種の試料溶液を基板上に供給して、前記基板上に前記複数種の試料溶液によるスポットが、多数配列されたＤＮＡチップを製造するＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液は、ＤＮＡ断片を含む試料を含み、
各スポットについて、スポット径が均一で、且つ、スポット間でのＤＮＡ断片を含む試料の量が均一となるように、対応する前記試料溶液をそれぞれ複数回供給することを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液をインクジェット方式で供給することを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液は、ＤＮＡ断片を含む試料が所定の濃度に希釈されていることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液は、前記ＤＮＡ断片を含む試料が水又は塩化ナトリウムを含む水溶液で希釈されていることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項５】
請求項３又は４記載のＤＮＡチップの製造方法において、
前記試料溶液は、ポリマーを含む水溶液で希釈されていることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明に係るＤＮＡチップの製造方法は、複数種の試料溶液を基板上に供給して、前記基板上に前記複数種の試料溶液によるスポットが、多数配列されたＤＮＡチップを製造するＤＮＡチップの製造方法において、前記試料溶液は、ＤＮＡ断片を含む試料を含み、各スポットについて、スポット径が均一で、且つ、スポット間でのＤＮＡ断片を含む試料の量が均一となるように、対応する前記試料溶液をそれぞれ複数回供給することを特徴とする。