(57)【要約】【課題】異なるマイクロアレイ間でも解析する生体分子の存在比率を求めることの出来るマイクロアレイ測定装置及びマイクロアレイ測定方法を提供する。【解決手段】発光性質を有するサンプル検体を定着した複数のサンプルスポット及びサンプル検体と同じ発光性質を有する基準検体を定着した基準スポットを有するマイクロアレイとマイクロアレイを撮像してデジタル画像データを一定間隔で出力する撮像部とデジタル画像データから複数のサンプルスポットと基準スポットを抽出するスポット抽出部とスポット抽出部が出力する複数のサンプルスポットと基準スポットの輝度値を累積加算して累積輝度値を出力する輝度値累積部と累積輝度値を順次記憶する第一のメモリと基準スポットの累積輝度値に基づいて撮像素子の露光時間と第一のメモリを制御する露光制御部を含む。【選択図】図１
2008139182.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光性質を有するサンプル検体を定着した複数のサンプルスポット及びサンプル検体と同じ発光性質を有する基準検体を定着した基準スポットを有するマイクロアレイと、
前記マイクロアレイを撮像して受光素子の各画素にて受光した輝度をデジタルで表したデジタル画像データを一定間隔で出力する撮像部と、
前記デジタル画像データから前記複数のサンプルスポットと前記基準スポットを抽出するスポット抽出部と、
前記スポット抽出部が出力する前記複数のサンプルスポットと前記基準スポットの輝度値を累積加算して累積輝度値を出力する輝度値累積部と、
前記複数のサンプルスポットの累積輝度値と前記基準スポットの累積輝度値を順次記憶する第一のメモリと、
前記基準スポットの累積輝度値に基づいて前記撮像素子の露光時間と前記第一のメモリを制御する露光制御部を含み、
前記露光制御部は、複数の前記マイクロアレイの定量比較を行う場合に各マイクロアレイの前記基準スポットの累積輝度値が等しくなるように各マイクロアレイを測定する際の前記露光時間を制御する、
ことを特徴とするマイクロアレイ測定装置。
【請求項２】
前記露光制御部は、
前記基準スポットの累積輝度値を順次記憶する第ニのメモリと、
前記基準スポットの累積輝度値が規定値に達した時に撮像終了信号と累積輝度値選択信号と目標累積輝度値を出力するサンプル基準アレイ判定部と、
前記サンプル基準アレイ判定部が出力する目標累積輝度値を記憶する第三のメモリと、
前記基準スポットの累積輝度値が前記第ニのメモリに記憶された目標累積輝度値に達した時に撮像終了信号と累積輝度値選択信号を出力するサンプルアレイ判定部と、
前記サンプル基準アレイ判定部あるいは前記サンプルアレイ判定部が出力する撮像終了信号と累積輝度値選択信号から前記撮像部の露光時間を制御する露光時間制御信号と前記第一のメモリに記憶されている複数の前記基準スポットの累積輝度値と前記サンプルスポットの累積輝度値の何れかを選択して出力させるように前記第一のメモリを制御する第一メモリ制御信号を生成する制御信号生成部を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ測定装置。
【請求項３】
前記サンプル基準アレイ判定部は、
前記基準スポットの累積輝度値と一時刻前の前記基準スポットの累積輝度値との差が第一の所定値よりも小さい場合に規定値に達したと判定した時刻に前記第一のメモリに記憶された累積輝度値を選択させる累積輝度値選択信号を出力し、
前記判定した時刻の前記基準スポットの累積輝度値を目標累積輝度値として出力する、
ことを特徴とする請求項２に記載のマイクロアレイ測定装置。
【請求項４】
前記サンプル基準アレイ判定部は、
前記基準スポットの累積輝度値と一時刻前の前記基準スポットの累積輝度値との差が第一の所定値よりも小さい場合に規定値に達したと判定した時刻の前記基準スポットの累積輝度値に第二の所定値を乗じた値に最も近い前記基準スポットの累積輝度値となった時刻を前記第二のメモリから特定し、特定した時刻に前記第一のメモリに記録された累積輝度値を選択させる累積輝度値選択信号を出力し、
前記特定した時刻の前記基準スポットの累積輝度値を目標累積輝度値として出力する、
ことを特徴とする請求項２に記載のマイクロアレイ測定装置。
【請求項５】
前記サンプルアレイ判定部は、
前記基準スポットの累積輝度値が前記目標累積輝度値を超えた時に前記累積輝度値に最も近い前記基準スポットの累積輝度値となった時刻を前記第二のメモリから特定し、特定した時刻に前記第一のメモリに記録された累積輝度値を選択させる累積輝度値選択信号と撮像終了信号を出力する、
ことを特徴とする請求項２に記載のマイクロアレイ測定装置。
【請求項６】
発光性質を有するサンプル検体を定着したサンプルスポット及びサンプル検体と同じ発光性質を有する基準検体を定着した基準スポットを有するマイクロアレイを撮像する撮像ステップと、
前記撮像ステップで得たデジタル画像データから前記サンプルスポット及び前記基準スポットの輝度値をそれぞれ抽出するスポット抽出ステップと、
前記スポット抽出ステップで得た輝度値を累積加算する累積加算ステップと、
前記累積加算ステップで得た累積輝度値を記憶する記憶ステップと、
前記累積加算ステップで得た累積輝度値に基づいて前記撮像ステップから前記記憶ステップまでの繰り返し回数を制御する制御ステップを含む、
ことを特徴とするマイクロアレイ測定方法。
【請求項７】
前記制御ステップは、
基準となるマイクロアレイを測定する時には、前記基準スポットの累積輝度値が規定条件を満足した場合に前記撮像ステップから前記記憶ステップまでの繰り返しを停止し、サンプルのマイクロアレイを測定する時の目標累積輝度値を設定する基準アレイ判定ステップと、
前記サンプルのマイクロアレイを測定する時には、前記基準スポットの累積輝度値が前記目標累積輝度値に達した場合に前記撮像ステップから前記記憶ステップまでの繰り返しを停止するサンプルアレイ判定ステップを含む、
ことを特徴とする請求項６に記載のマイクロアレイ測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイ測定装置に関し、より詳細には、発光反応を利用するマイクロアレイの発光状態から試料中の生体分子の定性、定量及び試料間での存在比率を測定する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のマイクロアレイは、生体分子の解析に利用され、生体分子として、主に遺伝子が広く利用されている。以下、遺伝子で例示するとマイクロアレイにより試料としての個々の細胞、組織あるいは個体での遺伝子の発現を網羅的に解析可能となっている。従来のマイクロアレイの製造方法として、１×３インチ大のガラス基板上にナノリットル単位の遺伝子溶液の液滴を点着させることによりマイクロメートル単位の微小なスポットを形成して、ガラス基板上に遺伝子断片を固定化する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
このように製造されたアレイに対して、２種類の試料より抽出した遺伝子を混合し、それぞれの細胞あるいは組織、個体等の試料中の遺伝子の発現比のプロファイリングを網羅的に解析することが可能となっている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。
【０００４】
また、従来のマイクロアレイの測定装置として、蛍光分光を利用した測定法が採用されているが、蛍光分光法より高感度の発光法が採用され、近年、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）の性能向上により、ＣＣＤを発光検出器としたマイクロアレイ測定装置とマイクロアレイ測定方法も開示されている（例えば、特許文献３参照）。
【特許文献１】特表平１０−５０３８４１号公報
【特許文献２】特開平１１−３４２０００号公報
【特許文献３】特開２００３−２２７７９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記従来の発光を利用したマイクロアレイ測定装置の構成では、一つのマイクロアレイ毎に基準となるスポットを決定しているため、一つのマイクロアレイ内では生体分子の存在比率を測定することは出来るが、複数のマイクロアレイに対してはその基準がマイクロアレイ毎に異なるため、マイクロアレイ間での生体分子の存在比率を測定することが困難であるという課題を有していた。
【０００６】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、複数のマイクロアレイ間で統一した基準値を設けて測定を行うマイクロアレイ測定装置及びマイクロアレイ測定方法を提供する事を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記従来の課題を解決するために、本発明のマイクロアレイ測定装置は、発光性質を有するサンプル検体を定着した複数のサンプルスポット及びサンプル検体と同じ発光性質を有する基準検体を定着した基準スポットを有するマイクロアレイと、前記マイクロアレイを撮像して受光素子の各画素にて受光した輝度をデジタルで表したデジタル画像データを一定間隔で出力する撮像部と、前記デジタル画像データから前記複数のサンプルスポットと前記基準スポットを抽出するスポット抽出部と、前記スポット抽出部が出力する前記複数のサンプルスポットと前記基準スポットの輝度値を累積加算して累積輝度値を出力する輝度値累積部と、前記複数のサンプルスポットの累積輝度値と前記基準スポットの累積輝度値を順次記憶する第一のメモリと、前記基準スポットの累積輝度値に基づいて前記撮像素子の露光時間と前記第一のメモリを制御する露光制御部を含み、前記露光制御部は、複数の前記マイクロアレイの定量比較を行う場合に各マイクロアレイの前記基準スポットの累積輝度値が等しくなるように各マイクロアレイを測定する際の前記露光時間を制御する、ことを特徴とするものである。
【０００８】
さらにマイクロアレイ測定装置において、前記露光制御部は、前記基準スポットの累積輝度値を順次記憶する第ニのメモリと、前記基準スポットの累積輝度値が規定値に達した時に撮像終了信号と累積輝度値選択信号と目標累積輝度値を出力するサンプル基準アレイ判定部と、前記サンプル基準アレイ判定部が出力する目標累積輝度値を記憶する第三のメモリと、前記基準スポットの累積輝度値が前記第ニのメモリに記憶された目標累積輝度値に達した時に撮像終了信号と累積輝度値選択信号を出力するサンプルアレイ判定部と、前記サンプル基準アレイ判定部あるいは前記サンプルアレイ判定部が出力する撮像終了信号と累積輝度値選択信号から前記撮像部の露光時間を制御する露光時間制御信号と前記第一のメモリに記憶されている複数の前記基準スポットの累積輝度値と前記サンプルスポットの累積輝度値の何れかを選択して出力させるように前記第一のメモリを制御する第一メモリ制御信号を生成する制御信号生成部を含む、ことを特徴とするものである。
【０００９】
さらにマイクロアレイ測定装置において、前記サンプル基準アレイ判定部は、前記基準スポットの累積輝度値と一時刻前の前記基準スポットの累積輝度値との差が第一の所定値よりも小さい場合に規定値に達したと判定した時刻に前記第一のメモリに記憶された累積輝度値を選択させる累積輝度値選択信号を出力し、前記判定した時刻の前記基準スポットの累積輝度値を目標累積輝度値として出力する、ことを特徴とするものである。
【００１０】
さらにマイクロアレイ測定装置において、前記サンプル基準アレイ判定部は、前記基準スポットの累積輝度値と一時刻前の前記基準スポットの累積輝度値との差が第一の所定値よりも小さい場合に規定値に達したと判定した時刻の前記基準スポットの累積輝度値に第二の所定値を乗じた値に最も近い前記基準スポットの累積輝度値となった時刻を前記第二のメモリから特定し、特定した時刻に前記第一のメモリに記録された累積輝度値を選択させる累積輝度値選択信号を出力し、前記特定した時刻の前記基準スポットの累積輝度値を目標累積輝度値として出力する、ことを特徴とするものである。
【００１１】
さらにマイクロアレイ測定装置において、前記サンプルアレイ判定部は、前記基準スポットの累積輝度値が前記目標累積輝度値を超えた時に前記累積輝度値に最も近い前記基準スポットの累積輝度値となった時刻を前記第二のメモリから特定し、特定した時刻に前記第一のメモリに記録された累積輝度値を選択させる累積輝度値選択信号と撮像終了信号を出力する、ことを特徴とするものである。
【００１２】
さらに本発明のマイクロアレイ測定方法において、発光性質を有するサンプル検体を定着したサンプルスポット及びサンプル検体と同じ発光性質を有する基準検体を定着した基準スポットを有するマイクロアレイを撮像する撮像ステップと、前記撮像ステップで得たデジタル画像データから前記サンプルスポット及び前記基準スポットの輝度値をそれぞれ抽出するスポット抽出ステップと、前記スポット抽出ステップで得た輝度値を累積加算する累積加算ステップと、前記累積加算ステップで得た累積輝度値を記憶する記憶ステップと、前記累積加算ステップで得た累積輝度値に基づいて前記撮像ステップから前記記憶ステップまでの繰り返し回数を制御する制御ステップを含む、ことを特徴とするものである。
【００１３】
さらにマイクロアレイ測定方法において、前記制御ステップは、基準となるマイクロアレイを測定する時には、前記基準スポットの累積輝度値が規定条件を満足した場合に前記撮像ステップから前記記憶ステップまでの繰り返しを停止し、サンプルのマイクロアレイを測定する時の目標累積輝度値を設定する基準アレイ判定ステップと、前記サンプルのマイクロアレイを測定する時には、前記基準スポットの累積輝度値が前記目標累積輝度値に達した場合に前記撮像ステップから前記記憶ステップまでの繰り返しを停止するサンプルアレイ判定ステップを含む、ことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１４】
以上のように、本発明によれば複数のマイクロアレイ間で統一した基準値を設けるようにしたため、複数のマイクロアレイ間での生体分子の存在比率を測定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に、本発明のマイクロアレイ測定装置及びマイクロアレイ測定方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１６】
（実施の形態）
図１は、本発明の実施の形態１におけるマイクロアレイ測定装置の構成を示すものである。図１においてマイクロアレイ測定装置は、複数のサンプルスポット１２及び基準スポット１３を有するマイクロアレイ１１の画像を撮像する撮像部１４と、撮像部１４が出力するデジタル画像データからサンプルスポット１２及び基準スポット１３を抜き出すスポット抽出部１５と、サンプルスポット１２及び基準スポット１３の輝度値を累積加算する輝度値累積部１６と、輝度値累積部１６の出力を順次記憶する第一メモリ１７と、輝度値累積部１６の出力信号に基づいて撮像部１４及び第一メモリ１７を制御する露光制御部１８で構成される。
【００１７】
ここで本発明のマイクロアレイ測定装置は、複数のマイクロアレイ１１のサンプル１２を測定し比較するためのものであるため、以後は測定を開始して最初に測定するマイクロアレイ１１をサンプル基準アレイと称し、２番目以降に測定するマイクロアレイ１１をサンプルアレイと称す。
【００１８】
次にマイクロアレイの各構成要素について詳細に説明する。マイクロアレイの例として、生体分子を抗原―抗体反応の原理を利用するアレイの各構成要素について以下、説明する。図２は、本発明の抗原抗体反応の原理を利用するマイクロアレイでの発光発生の過程を模式化したものである。図２（ａ）に示す通り、マイクロアレイ１１は、サンプルスポット１２及び基準スポット１３を有する。サンプルスポット１２の領域には、試料中の特定の生体分子と結合する第一の抗体２１が固定化されている。また、基準スポット１３の領域には、抗体分子と結合能を有する物質２２が固定化され、マイクロアレイ１１を構成している。
【００１９】
マイクロアレイ１１は、ガラス、シリコン等の珪素系化合物、金、銀等の貴金属、セラミック、カーボン等の無機化合物、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリメタクリレート等の高分子樹脂等の選択された何れかの材料により形成されている。さらにマイクロアレイ１１のサンプルスポット１２及び基準スポット１３を有する表面あるいは、それらのスポット領域には、第一の抗体及び抗体分子と結合能を有する物質を固定化するための固定化剤としてγ―アミノプロピルトリメトキシシラン等の官能基を有するシランカップリング剤、ニトロセルロース、ＤＥＡＥ−セルロース、ＣＭ−セルロース等のセルロース化合物、ナイロン６、ナイロン６６等のナイロン化合物、アルギン酸、ゼラチンあるいはアクリルアミド等高分子化合物の選択された何れかの物質にて表面処理を施しておく。マイクロアレイ１１の表面に第一の抗体及び抗体分子と結合能を有する物質を固定化するための方法としては、表面処理を施す固定化剤の特性に従い、疎水結合、共有結合あるいはイオン結合等の最適な固定化方法を適宜選択することが可能である。抗体分子と結合能を有する物質２２としては、プロテインＡ、プロテインＧあるいはプロテインＬ等の抗体結合タンパク質が適宜選択可能である。
【００２０】
次に上記のマイクロアレイに発光性質を有するサンプル検体のサンプルスポットへの定着及び発光性質を有する基準検体の基準スポットへの定着方法について説明する。
【００２１】
サンプル検体を試料中の生体分子とし、上記の構成により形成した図２（ａ）マイクロアレイ１１を予め、サンプルスポット１２及び基準スポット１３以外の領域に対し、非特異的な結合を生じなくさせるためブロッキング処理を施した後、様々な生体分子２３を含む試料を滴下する。次に図２（ｂ）に示す通り、サンプルスポット１２の中である生体分子２３と特異的に結合する第一の抗体２１を固定化したサンプルスポット上で生体分子２３とそれと特異的に結合する抗体２１とが結合し、サンプルスポット１２に生体分子２３が定着する。しかし基準スポット１３は、生体分子に対しての結合能を有しないため試料を滴下しても、何も結合していない状態に保持されている。
【００２２】
次に余剰の未結合の生体分子を洗浄した後、図２（ｃ）に示す通り、発光酵素を標識した第二の抗体２４を滴下する。この第二の抗体は、第一の抗体２１と同様、特異的に生体分子２３と結合するものであるが、生体分子２３に対し、第一の抗体２１とは異なる領域に結合するものであり、試料中の生体分子を各サンプルスポット１２上で、第一の抗体２１と発光酵素を有する第二の抗体２４とでサンドイッチ様に挟みこむ状態となり、サンプル検体を形成する。さらに第二の抗体２４は、抗体分子と結合能を有する物質２２にも結合し、それを固定化している基準スポット１３に定着することで、基準検体を形成する。なお、発光酵素を標識した第二の抗体２４は、マイクロアレイ１１表面の各サンプルスポット１２に対応した種類があり、それぞれのスポットに対し過剰に供給されているため、基準スポット１３に定着することで、発光酵素を標識した第二の抗体２４とサンプルスポット１２上に存在する各生体分子との結合に対して影響を与えるものではない。
【００２３】
次に余剰の未結合の発光酵素を標識した第二の抗体２４を除去する。以上の手順により発光酵素で標識した第二の抗体２４が定着することで、マイクロアレイ１１のサンプルスポット１２及び基準スポット１３上に発光性質を有するサンプル検体及び基準検体がそれぞれ定着することとなる。
【００２４】
最後に上記のサンプル検体及び基準検体を定着させたマイクロアレイに発光基質を滴下して、発光反応を開始するとサンプルスポット１２及び基準スポット１３において時間単位当たり、図２（ｄ）に示す輝度が測定可能となる。この発光反応の強度は、各サンプルスポット１２上に定着している発光酵素を標識した第二の抗体の量に依存し、すなわち、各サンプルスポット１２上に定着している生体分子の量に依存するため、生体分子の量が測定可能となる。また、基準スポット１２上では、生体分子の量に非依存的に発光酵素を標識した第二の抗体が結合するため、異なる試料による異なる量の様々な生体分子でのサンプル検体の場合においても常に一定の発光酵素を標識した第二の抗体が結合した状態となっている。また、サンプルスポット１２に固定化する抗体分子の分子量１５０，０００と比較し、基準スポット１３に固定化する抗体分子と結合能を有する物質、例えば、プロテインＡの分子量は３２，０００と分子量比が１／５と分子が小さいため、基準スポット１３領域への固定化量も非常に高くなり、発光反応による累積輝度値も各サンプルスポット１２と比較し、高値となるため、プロテインＡ等に代表される抗体分子と結合能を有する物質は、基準スポットへ固定化する物質として好適であり、基準スポット１３の発光反応による累積輝度値を基準とすることでマイクロアレイ毎の各サンプルスポットの輝度値の比較が容易となる。
【００２５】
なお、基準スポット１２に固定化する物質は、抗体分子と結合能を有する物質に限らず、第二の抗体２４が発光酵素での標識ではなく、ビオチン標識してある場合、Ｇｎｅｓｄｏｎらの方法（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２７巻、１１３１頁、１９７９年）も適用可能であり、この場合、基準スポット１３には、ビオチンを固定化すればよい。ビオチンは分子量２５０程度と抗体分子と結合能を有する物質に比してさらに低分子であり、高固定化量を実現する。また、発光反応を阻害せず、試料中の生体分子に発光酵素不含であることが確実であれば、発光酵素に対する抗体を適用することも可能である。
【００２６】
また発光酵素としては、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼあるいはルシフェラーゼ等の公知の発光酵素が、適用可能である。発光基質においても従来からのそれぞれルミノール及び過酸化水素の組合せ、フェニルリン酸で置換した１，２−ジオキセタン誘導体、β−ガラクトピラノシドで置換した１，２−ジオキセタン誘導体、アデノシン−５´−三リン酸及びルシフェリンの組合せ等が適用可能である。
【００２７】
上記の通りに構成したマイクロアレイ１１の発光を撮像部１４で撮像し、デジタル画像データを出力する。撮像は露光によって行われ、露光時間は露光制御部１８が出力する露光時間制御信号により制御される。ここで撮像部１４は、各受光素子（画素）が受光した光の強度を積分し、その値を輝度値として全受光素子のデータを出力する。この時、全受光素子が出力する輝度値はアナログデジタル変換により離散デジタルデータに変換（量子化）される。即ち、アナログデジタル変換のサンプリング時間（ΔＴ）毎に撮像部１４の全受光素子の輝度値がデジタル画像データとして出力される。本発明においては、撮像部１４は上記の如く動作するモノクロＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）カメラなどが用いられる。
【００２８】
スポット抽出部１５は、撮像部１４が１サンプリング時間毎に順次出力するマイクロアレイ１１のデジタル画像データから複数のサンプルスポット１２及び基準スポット１３の領域を抜き出して、サンプルスポット１２の輝度値及び基準スポット１３の輝度値を出力する。例えば、図２に示すようにマイクロアレイ１１が５つのサンプルスポットと１つの基準スポットを有する場合には、６つの輝度値を出力する。ここで、マイクロアレイ１１と撮像部１４の相対位置が常に一定である場合には、デジタル画像データのどの領域がサンプルスポット１２及び基準スポット１３に相当するかを予め与えておくことにより、スポット抽出部１５は常に同じ領域の輝度値を測定し、サンプルスポット１２の輝度値と基準スポット１３の輝度値とすることが出来る。この時、サンプルスポット１２及び基準スポット１３の領域が複数の画素に分布する場合には、領域に相当する全画素の輝度値を累積してそれぞれのスポットの輝度値として出力する。
【００２９】
輝度値累積部１６はスポット抽出部１５が出力する輝度値を累積加算する。輝度値の累積は撮像開始時から始め、１サンプリング時間毎にスポット抽出部１５から出力される輝度値を加算していく。この時、輝度値の累積はスポット毎に行われ、図２に示すマイクロアレイ１１の場合には、５つのサンプルスポット１２の累積輝度値と１つの基準スポット１３の累積輝度値を出力する。
【００３０】
第一メモリ１７は輝度値累積部１６が出力するサンプルスポット１２の累積輝度値と基準スポット１３の累積輝度値を記憶し、記憶した累積輝度値を外部へ出力する。記憶出力動作は露光制御部１８が出力する第一メモリ制御信号によって制御される。第一メモリ１７は、第一メモリ制御信号により記憶開始を指示された時間から記憶停止を指示されるまでの間、１サンプリング時間毎に輝度値累積部１６が出力する各スポットの累積輝度値を記憶する。第一メモリ制御信号は撮像部１４の露光時間と同期して第一メモリ１７の記憶時間を制御する。即ち第一メモリ１７には、撮像部１４が撮像を開始して終了するまでの各スポットの累積輝度値がサンプリング時間毎に順次蓄積される。また、第一メモリ１７は第一メモリ制御信号が指定するサンプリング時間の各スポットの累積輝度値を外部へ出力する。
【００３１】
露光制御部１８は、輝度値累積部１６が出力する基準スポット１３の累積輝度値に基づいて、撮像部１４の露光時間を制御する露光時間制御信号と第一メモリ１７を制御する第一メモリ制御信号を出力する。
【００３２】
さらに露光制御部１８について図３を用いて詳細に説明する。図３において、露光制御部１８は第二メモリ３１とサンプル基準アレイ判定部３２と第三メモリ３３とサンプルアレイ判定部３４と制御信号生成部３５で構成される。ここで、サンプル基準アレイを測定する時には、第二メモリ３１とサンプル基準アレイ判定部３２と第三メモリ３３と制御信号生成部３５を用いる。また、サンプルアレイを測定する時には第ニメモリ３１と第三メモリ３３とサンプルアレイ判定部３４と制御信号生成部３５を用いる。
【００３３】
第二メモリ２１は、サンプル基準アレイ測定時とサンプルアレイ測定時の両方で用いられ、撮像部１４の撮像開始から撮像終了まで輝度値累積部１６が出力する基準スポット１３の累積輝度値をサンプリング時間毎に順次記憶する。
【００３４】
サンプル基準アレイ判定部３２は、サンプル基準アレイ測定時にのみ用いられ、基準スポット１３の累積輝度値が規定条件に達した時に撮像部１４の撮像を終了させる撮像終了信号と、第一メモリ１７に記憶された累積輝度値のいずれかを選択する累積輝度値選択信号を制御信号生成部３５に出力する。さらに、サンプルアレイ測定の際に基準スポット１３の累積輝度値の目標となる目標累積輝度値を第三メモリ３３に出力する。
【００３５】
第三メモリ３３は、サンプル基準アレイ測定時にはサンプル基準判定部３２が出力する目標累積輝度値を記憶し、サンプルアレイ測定時にはサンプル基準アレイ測定時に記憶した目標累積輝度値をサンプルアレイ判定部３４に出力する。
【００３６】
サンプルアレイ判定部３４はサンプルアレイ測定時にのみ用いられ、基準スポット１３の累積輝度値が第三メモリ３３の出力する目標累積輝度値に達した時に撮像部１４の撮像を終了させる撮像終了信号と、第一メモリ１７に記憶された累積輝度値のいずれかを選択する累積輝度値選択信号を制御信号生成部３５に出力する。
【００３７】
制御信号生成部３５はサンプル基準アレイ測定時とサンプルアレイ測定時の両方で用いられ、測定開始時に撮像部１４が露光開始するように露光時間制御信号を出力し、第一メモリ１７が累積輝度値の記憶を開始するように第一メモリ制御信号を出力する。そして、サンプル基準アレイ判定部３２あるいはサンプルアレイ判定部３４の何れかが出力する撮像終了信号と累積輝度値選択信号を受信した時に、撮像部１４が露光停止するように露光時間制御信号を出力し、さらに第一メモリ１７が累積輝度値の記憶を停止するとともに第一メモリ１７が記憶した累積輝度値のうち、どのサンプリング時間に記憶した累積輝度値を外部へ出力するかを制御する第一メモリ制御信号を出力する。
【００３８】
次に、サンプル基準アレイ判定部３２の動作について詳細に説明する。まず、基準スポット１３の累積輝度値が飽和するサンプリング時間を求める。即ち、測定を開始してから基準スポット１３の発光が終息した時間までを測定する。この飽和したサンプリング時間は次のようにして求める。サンプル基準アレイ判定部３２は輝度値累積部１６が出力する基準スポット１３の累積輝度値と、第二メモリ３１に記憶された１サンプリング時間前の基準スポット１３の累積輝度値との差を求め、その差が第一の所定値よりも小さい場合に基準スポット１３の累積輝度値が飽和したと判定する。ここで第一の所定値は０とすることが好ましいが、撮像部１４に発生するノイズの影響等で累積輝度値が０に収束しない場合も考えられるため、０以上とする。実際には、撮像部１４に用いられるＣＣＤカメラの分解能や量子化された輝度値のビット数等を考慮して決定すると良い。基準スポット１３の累積輝度値の飽和を判定した後、サンプル基準アレイ判定部３２は撮像部１４の露光を停止させる撮像終了信号と、飽和と判定したサンプリング時間を累積輝度値選択信号として制御信号生成部３５に出力する。さらに、飽和と判定したサンプリング時間の基準スポット１３の累積輝度値を目標累積輝度値として第三メモリ３３に出力する。
【００３９】
次に、サンプルアレイ判定部３４の動作について詳細に説明する。まず、基準スポット１３の累積輝度値が第三メモリ３３の出力する目標累積輝度値となるサンプリング時間を求める。しかしながら、基準スポット１３の累積輝度値と目標累積輝度値が等しくなるとは限らない。そこで、基準スポット１３の累積輝度値が目標累積輝度値以上となるサンプリング時間を求める。基準スポット１３の累積輝度値と第三メモリ３３の出力する目標累積輝度値が等しくなった場合には、サンプルアレイ判定部３４は撮像部１４の露光を停止させる撮像終了信号と、等しいと判定したサンプリング時間を累積輝度値選択信号として制御信号生成部３５に出力する。基準スポット１３の累積輝度値が目標累積輝度値と等しくなることなく超えた場合には、超えたと判定した時に撮像部１４の露光を停止させる撮像終了信号を出力する。次に、超えたと判定したサンプリング時間の累積輝度値と１サンプリング時間前の累積輝度値を目標累積輝度値と比較する。そして、目標累積輝度値と近い値の累積輝度値となるサンプリング時間を累積輝度値選択信号として出力する。
【００４０】
以下、本発明のマイクロアレイ測定装置を用いたマイクロアレイ測定方法について図４はフローチャートを用いて詳細に説明する。ここで、本実施の形態においては、マイクロアレイ１１に発光基質を滴下して測定を開始するまでの時間は、サンプル基準アレイを含む全てのマイクロアレイで一定にする必要がある。
【００４１】
まず、サンプル基準アレイを測定する方法を図４（ａ）を用いて説明する。測定を開始すると、露光制御部１８内の制御信号生成部３５から撮像部１４へ撮像開始が指示され、撮像部１４は露光してマイクロアレイ１１の撮像を開始する（ステップＳ１０１）。
【００４２】
次に、スポット抽出部１５は撮像部１４が１サンプリング時間毎に出力するデジタル画像データからサンプルスポット１２の輝度値と基準スポット１３の輝度値を抽出して出力する（ステップＳ１０２）。
【００４３】
スポット抽出部１５が出力する輝度値は輝度値累積部１６に入力され、輝度値累積部１６はサンプルスポット１２と基準スポット１３それぞれの輝度値を累積加算して累積輝度値として出力する（ステップＳ１０３）。
【００４４】
第一メモリ１７は輝度値累積部１６が出力するサンプルスポット１２と基準スポット１３の累積輝度値をそれぞれ１サンプリング時間毎に記憶する（ステップＳ１０４）。
【００４５】
露光制御部１８内のサンプル基準アレイ判定部３２は輝度値累積部１６が出力する基準スポット１３の累積輝度値が規定条件に達したか否かを判定する（ステップＳ１０５）。
【００４６】
露光制御部１８内の制御信号生成部３５はステップＳ１０５が出力する判定結果を示す撮像終了信号に基づいて撮像を続けるか終了するかを決める（ステップＳ１０６）。ステップＳ１０５において規定条件に達しないと判定された場合には、制御信号生成部３５は撮像部１４と第一メモリ１７を制御する露光時間制御信号と第一メモリ制御信号を出力しない。即ち次のサンプリング時間の処理としてステップＳ１０２からステップＳ１０５を繰り返し行わせる。
【００４７】
ステップＳ１０５において規定条件に達したと判定された場合には、制御信号生成部３５は撮像部１４に露光を停止して撮像を終了させる露光時間制御信号を出力するとともに、第一メモリ１７の累積輝度値の記憶を停止させる第一メモリ制御信号を出力する（ステップＳ１０７）。
【００４８】
サンプル基準アレイ判定部３２は、サンプルアレイを測定する際の基準スポットの累積輝度値の目標値となる目標累積輝度値を第三メモリ３３に出力し、第三メモリ３３はこれを全てのサンプルアレイの測定が終了するまで保持する（ステップＳ１０８）。
【００４９】
制御信号生成部３５は、サンプル基準アレイ判定部３２が出力する累積輝度値選択信号から第一メモリ１７に記憶された累積輝度値のうち、どのサンプリング時間に記憶した累積輝度値を出力させるかを第一メモリ制御信号として第一メモリ１７に出力する。第一メモリ１７は第一メモリ制御信号が指示するサンプリング時間のサンプルスポット１２と基準スポット１３の累積輝度値を外部へ出力する（ステップＳ１０９）。
【００５０】
次に、サンプルアレイを測定する方法を図４（ｂ）を用いて説明する。ステップＳ２０１からステップＳ２０４までは図４（ａ）に示すステップＳ１０１とステップＳ１０４と同じである。測定を開始すると、露光制御部１８内の制御信号生成部３５から撮像部１４へ撮像開始が指示され、撮像部１４は露光してマイクロアレイ１１の撮像を開始する（ステップＳ２０１）。
【００５１】
次に、スポット抽出部１５は撮像部１４が１サンプリング時間毎に出力するデジタル画像データからサンプルスポット１２の輝度値と基準スポット１３の輝度値を抽出して出力する（ステップＳ２０２）。
【００５２】
スポット抽出部１５が出力する輝度値は輝度値累積部１６に入力され、輝度値累積部１６はサンプルスポット１２と基準スポット１３それぞれの輝度値を累積加算して累積輝度値として出力する（ステップＳ２０３）。
【００５３】
第一メモリ１７は輝度値累積部１６が出力するサンプルスポット１２と基準スポット１３の累積輝度値をそれぞれ１サンプリング時間毎に記憶する（ステップＳ２０４）。
【００５４】
露光制御部１８内のサンプルアレイ判定部３４は輝度値累積部１６が出力する基準スポット１３の累積輝度値が第三メモリ３３が記憶した目標累積輝度値に達したか否かを判定する（ステップＳ２０５）。
【００５５】
露光制御部１８内の制御信号生成部３５はステップＳ２０５が出力する判定結果を示す撮像終了信号に基づいて撮像を続けるか終了するかを決める（ステップＳ２０６）。ステップＳ２０５において目標累積輝度値に達しないと判定された場合には、制御信号生成部３５は撮像部１４と第一メモリ１７を制御する露光時間制御信号と第一メモリ制御信号を出力しない。即ち次のサンプリング時間の処理としてステップＳ２０２からステップＳ２０５を繰り返し行わせる。
【００５６】
ステップＳ２０５において目標累積輝度値に達したと判定された場合には、制御信号生成部３５は撮像部１４に露光を停止して撮像を終了させる露光時間制御信号を出力するとともに、第一メモリ１７の累積輝度値の記憶を停止させる第一メモリ制御信号を出力する（ステップＳ２０７）。
【００５７】
制御信号生成部３５は、サンプルアレイ判定部３４が出力する累積輝度値選択信号から第一メモリ１７に記憶された累積輝度値のうち、どのサンプリング時間に記憶した累積輝度値を出力させるかを第一メモリ制御信号として第一メモリ１７に出力する。第一メモリ１７は第一メモリ制御信号が指示するサンプリング時間のサンプルスポット１２と基準スポット１３の累積輝度値を外部へ出力する(ステップＳ２０８)。
【００５８】
上記で開示したマイクロアレイ測定装置及びマイクロアレイ測定方法による一例を以下に示す。ここでは、測定するマイクロアレイ１１として、サンプル基準アレイと一つのサンプルアレイを比較する場合を示す。
【００５９】
図５は、サンプル基準アレイの基準スポット１３の累積輝度値５１とサンプルアレイの基準スポット１３の累積輝度値５２の時間変化を表した図である。ここで、サンプリング時間ΔＴは１分としている。図５に示すように、マイクロアレイの測定毎に基準スポット１３の累積輝度値の時間変化の様子は異なる。それは、測定時における第二の抗体を標識した発光酵素の酵素活性の変動により時間当たりの輝度値が変動することによって基準スポット１３の発光度合いが変化するためである。しかしながら、全てのマイクロアレイ測定において、基準スポット１３には発光酵素が同量結合しており、さらに測定時にはマイクロアレイに同量の発光基質を滴下するため、飽和する累積輝度値はほぼ同じ値となる。
【００６０】
図５においてサンプル基準アレイの基準スポット１３の累積輝度値５１は測定開始から１１０分で累積輝度値約４４００で飽和に達し、サンプルアレイの基準スポット１３の累積輝度値５２は測定開始から１５０分で累積輝度値約４４００で飽和に達している。この時、露光制御部１８内のサンプル基準アレイ判定部３２は、１１０分で撮像部１４の露光を停止し、目標累積輝度値を４４００とする。そしてサンプルアレイ判定部３４はサンプルアレイに対して目標累積輝度値が４４００になるまで撮像部１４の露光を続け、１５０分の時間で目標累積輝度値に達したと判定して露光を停止している。
【００６１】
図６は、サンプル基準アレイとサンプルアレイにおいて、同一量の種々の生体分子を含有する試料を滴下した時のサンプル基準アレイとサンプルアレイの基準スポットと２つのサンプルスポットに対しての累積輝度値を示したのである。図６（ａ）は基準スポットの累積輝度値の時間変化を示し、図６（ｂ）は各スポットの測定終了時の累積輝度値を示したグラフである。図６（ａ）中の５１及び５２は、図５と同様にサンプル基準アレイ及びサンプルアレイの基準スポット１３をそれぞれ示している。図６（ａ）中の６１及び６２は、サンプル基準アレイ及びサンプルアレイの第一のサンプルスポット１２−１を、７１及び７２は、サンプル基準アレイ及びサンプルアレイの第二のサンプルスポット１２−２をそれぞれ示している。なお、第一のサンプルスポット１２−１及び第二のサンプルスポット１２−２は、それぞれマイクロアレイ１１上の任意のサンプルスポット１２であり、それぞれ試料中の異なる生体分子を認識するサンプルスポットである（１２−１及び１２−２は図６（ａ）中に図示せず）。図６（ａ）において、図５に示す基準スポットの累積輝度値にサンプル基準アレイ及びサンプルアレイのそれぞれのサンプルスポット１２−１の累積輝度値６１及び６２の時間変化とそれぞれのサンプルスポット１２−２の累積輝度値７１及び７２の時間変化を示している。本発明によれば、基準スポットの累積輝度値を基準に露光時間を変更し、サンプル基準アレイでは１１０分で測定を停止し、サンプルアレイでは１５０分で測定を停止しているため、同量の生体物質が結合していれば、輝度特性が異なる場合でも図６（ｂ）のように各マイクロアレイで同じ累積輝度値を得る事が出来る。
【００６２】
以上のように同一量の生体分子が結合していれば、輝度特性が異なる場合でも図６（ｂ）のように各マイクロアレイで同じ累積輝度値を得る事ができる。
【００６３】
即ち、本発明の様に基準スポット１３の累積輝度値が飽和状態となるまで測定を行うことで、マイクロアレイ毎の比較基準を統一する事が出来、各マイクロアレイのサンプルスポット１２の存在比率を求めることが出来る。
【００６４】
なお、サンプル基準アレイ判定部３２は基準スポット１３の累積輝度値が飽和したサンプル時間と累積輝度値を制御信号生成部３５と第三メモリ３３に出力するようにしたが、飽和した累積輝度値の何割かを出力するようにしても良い。例えば、飽和した累積輝度値の８割を出力する場合、サンプル基準アレイ判定部３２は飽和した累積輝度値を０．８倍した値を目標累積輝度値として第三メモリ３３に出力する。そして、サンプル基準アレイ測定時には第一メモリ１７では第一メモリ制御信号によって指定されたサンプリング時間のサンプルスポット１２及び基準スポット１３の累積輝度値を一律に０．８倍して出力する。サンプルアレイ測定時には、第一メモリの累積輝度値をそのまま出力する。このようにすれば、サンプルアレイの累積輝度値のサンプリング時間を飽和に達するまで伸張させる必要がなく、サンプリング時間が短縮可能となり、測定期間内でのサンプルアレイの処理能力を向上させるという効果がある。
【００６５】
なお、サンプル基準アレイ判定部３２は基準スポット１３の累積輝度値が飽和したサンプル時間と累積輝度値を制御信号生成部３５と第三メモリ３３に出力するようにしたが、飽和した累積輝度値の何割かに達したサンプリング時間とその時間における累積輝度値を出力するようにしても良い。例えば、飽和した累積輝度値の８割となるサンプリング時間を求める場合、まず飽和した累積輝度値を０．８倍する。次に０．８倍した飽和した累積輝度値に最も近い累積輝度値を第二メモリ３１から抽出する。そして、第二メモリから抽出した累積輝度値を目標累積輝度値として第三メモリ３３に出力するとともに、抽出した累積輝度値となるサンプリング時間を累積輝度値選択信号として制御信号生成部３５に出力する。第一メモリ１７では、累積輝度値選択信号とされたサンプリング時間のサンプルスポット１２及び基準スポット１３の累積輝度値を出力する。このようにすれば、サンプル基準アレイ及びサンプルアレイ共に累積輝度値のサンプリング時間を飽和に達するまで伸張させる必要がなく、サンプル基準アレイ及びサンプルアレイ共にサンプリング時間が短縮可能となり、測定時間内でのマイクロアレイによる試料中の生体分子の存在比率の測定までの処理能力を大幅に向上させるという効果がある。
【００６６】
上述した本発明のマイクロアレイ測定装置及びマイクロアレイ測定方法において、５つのサンプルスポット及び１つの基準スポットを有するマイクロアレイを例示したが、これに限定するものではなく、サンプルスポット数及び基準スポット数は、任意に可変可能なスポットの径、スポット間隔、マイクロアレイのサイズに従い、任意に可変可能である。
【００６７】
また、本発明のマイクロアレイ測定装置及びマイクロアレイ測定方法において、撮像部の素子として、モノクロＣＣＤを例示したが、これに限定することなく、カラーＣＣＤ、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）、電荷注入素子（ＣＩＤ）、横型埋め込み式電荷蓄積部を有する増幅型撮像センサ（ＬＢＣＡＳＴ）、フォトダイオードアレイあるいは光電子倍増管等も適用可能である。また、撮像部にイメージインテンシファイアを導入することも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明にかかるマイクロアレイ測定装置及びマイクロアレイ測定方法は、異なるマイクロアレイ間でも正確な生体分子量比を測定することが可能であり、生体分子解析装置等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明におけるマイクロアレイ測定装置のブロック図
【図２】本発明におけるマイクロアレイの構成を示す図
【図３】本発明における露光制御部のブロック図
【図４】本発明におけるマイクロアレイ測定方法のフローチャート
【図５】基準スポットの累積輝度値の時間変化を示した図
【図６】基準スポット及びサンプルスポットの累積輝度値を表す図
【符号の説明】
【００７０】
１１  マイクロアレイ
１２  サンプルスポット
１３  基準スポット
１４  撮像部
１５  スポット抽出部
１６  輝度値累積部
１７  第一メモリ
１８  露光制御部
２１  第一の抗体
２２  抗体分子と結合能を有する物質
２３  生体分子
２４  発光酵素を標識した第二の抗体
３１  第二メモリ
３２  サンプル基準アレイ判定部
３３  第三メモリ
３４  サンプルアレイ判定部
３５  制御信号生成部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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