(57)【要約】【課題】  遺伝子多型を検出することにより、摂食障害の発症の危険度を判定する方法  の提供を目的とする。【解決手段】  本発明は、ゲノムワイドに設定したマイクロサテライトマーカーを用いて関連分析を行い関連の認められる領域を狭め、さらにその領域において特に強い関連を示すＳＮＰマーカーを設定し、当該ＳＮＰマーカーおよび特に強い関連を示した前記マイクロサテライトマーカーについて連鎖不平衡を解析しこれらの多型の連鎖不平衡を解析することで、摂食障害感受性候補領域および摂食障害感受性遺伝子を同定する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者からＤＮＡサンプルを採集し、当該サンプルの染色体ＤＮＡにおいて、０１０６Ｇ０６，１１０５Ｄ１２，１６０３Ｇ０４，０１０５Ｇ０７，０１１７Ｈ０９，０５１２Ｅ０９，１１０９Ｄ０２，１２０２Ｆ０３，１２０７Ｂ０３，１８０２Ｂ０６，又は９９０１Ｂ０９で表されるマイクロサテライトのいずれかの前後４００ｋｂに存在する１以上の遺伝子多型を検出すること、又は２以上の遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプを検出することにより、該染色体ＤＮＡが由来する被検者の摂食障害の発症危険度を判定する方法。
【請求項２】
前記遺伝子多型が一塩基多型であり、ＣＮＴＮ５−Ｕ０１，ＣＮＴＮ５−０００８，ＣＮＴＮ５−００１２＋，ＣＮＴＮ５−００１３，ＣＮＴＮ５−００２２，ＣＮＴＮ５−００２３，ＣＮＴＮ５−００２６，ＣＮＴＮ５−００２６＋，ＣＮＴＮ５−００２７，ＣＮＴＮ５−００２７−，ＣＮＴＮ５−００２８，１ｐ３６−００１１＋，１ｐ３６−００１８，１ｐ３６−００１９，１ｐ３６−００２０，１ｐ３６−００２３，１ｐ３６−００２９，１ｐ３６−００２９＋，１ｐ３６−００３５，１ｐ３６−００３６，１ｐ３６−００４０，１ｐ３６−００５１，１ｐ３６−００５２，１ｐ３６−００５３，１ｐ３６−００５５，１ｐ３６−００５６，１ｐ３６−００５７，１ｐ３６−００５８，１ｐ３６−００５９，１ｐ３６−００６０，１ｐ３６−００６１，１ｐ３６−００６３，１ｐ３６−００６８，１ｐ３６−００６９，１ｐ３６−００７０，１ｐ３６−００７１，１１−００１０，１１−００１６＋，１１−００１８，ＮＥＴＯ１−００１８，ＮＥＴＯ１−００２３，ＮＥＴＯ１−００２７，ＮＥＴＯ１−００２８，１ｑ４１−００２４，１ｑ４１−００２５，１ｑ４１−００２７，１ｑ４１−００２８，１ｑ４１−００２９，１ｑ４１−００３０，１ｑ４１−００３１，１ｑ４１−００３２，１ｑ４１−００３３，１ｑ４１−００３４，１ｑ４１−００３５，１ｑ４１−００３６，１ｑ４１−００３７，１ｑ４１−００３８，１６−０００５，１６−００１１，１６−００１４，１６−００１７，１６−００２３，１６−００２４，１６−００２６，１６−００２７，１６−００３０，１６−００３２，１６−００３３，１ｑ３２−０００１，１ｑ３２−０００２，１ｑ３２−０００３，１ｑ３２−０００４，１ｑ３２−０００５，１ｑ３２−０００６，１ｑ３２−０００７，１ｑ３２−００４１，１ｑ３２−００４５，１ｑ３２−００４６，１ｑ３２−００５０，１ｑ３２−００５１，１ｑ３２−００５２，０５−００２５，１６−０００５，０５−００２９，０５−００３１で表される一塩基多型からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一塩基多型が、ＣＮＴＮ５−Ｕ０１，ＣＮＴＮ５−００２２，ＣＮＴＮ５−００２３，ＣＮＴＮ５−００２６，ＣＮＴＮ５−００２６＋，ＣＮＴＮ５−００２７−，ＣＮＴＮ５−００２７，ＣＮＴＮ５−００２８，１ｐ３６−００１１＋，１ｐ３６−００１８，１ｐ３６−００３６，１ｐ３６−００４０，１ｐ３６−００５１，１ｐ３６−００５２，１ｐ３６−００５６，１ｐ３６−００５８，１ｐ３６−００５９，１ｐ３６−００６０，１ｐ３６−００６１，１ｐ３６−００６３，１ｐ３６−００６８，１ｐ３６−００６９，１ｐ３６−００７０，１１−００１６＋，１１−００１８，ＮＥＴＯ１−００２７，ＮＥＴＯ１−００２８，１ｑ４１−００２７，１ｑ４１−００２８，１ｑ４１−００２９，１ｑ４１−００３２，１ｑ４１−００３３，１ｑ４１−００３４，１ｑ４１−００３８，１６−０００５，１６−００１１，１６−００１４，１６−００１７，１６−００２３，１６−００２４，１６−００２６，１６−００２７，１６−００３０，１６−００３２，１６−００３３，１ｑ３２−０００７，１ｑ３２−００４１，１ｑ３２−００４５，１ｑ３２−００４６，１ｑ３２−００５０，１ｑ３２−００５１，１ｑ３２−００５２，０５−００２５で表される一塩基多型からなる群から選択されるものであり、前記摂食障害が、神経性食欲不振症であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記一塩基多型が、ＣＮＴＮ５−Ｕ０１，ＣＮＴＮ５−００２２，ＣＮＴＮ５−００２６，ＣＮＴＮ５−００２６＋，ＣＮＴＮ５−００２７−，ＣＮＴＮ５−００２７，ＣＮＴＮ５−００２８，１ｐ３６−００１１＋，１ｐ３６−００１８，１ｐ３６−００３６，１ｐ３６−００４０，１ｐ３６−００５１，１ｐ３６−００５２，１ｐ３６−００５６，１ｐ３６−００５８，１ｐ３６−００５９，１ｐ３６−００６０，１ｐ３６−００６１，１ｐ３６−００６３，１ｐ３６−００６８，１ｐ３６−００６９，１ｐ３６−００７０，１１−００１６＋，１１−００１８，ＮＥＴＯ１−００２７，ＮＥＴＯ１−００２８，１ｑ４１−００２７，１ｑ４１−００２９，１ｑ４１−００３３，１ｑ４１−００３４，１ｑ４１−００３８，１６−０００５，１６−００１１，１６−００１４，１６−００２３，１６−００２４，１６−００２６，１６−００２７，１６−００３０，１６−００３２，１ｑ３２−００４１，１ｑ３２−００４２，１ｑ３２−００４３，１ｑ３２−００４４，１ｑ３２−００４５，１ｑ３２−００４６，１ｑ３２−００４７，１ｑ３２００４８，１ｑ３２−００５０，１ｑ３２−００５１，１ｑ３２−００５２で表される一塩基多型からなる群から選択されるものであり、前記摂食障害が、神経性食欲不振症の制限型であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記一塩基多型が、ＣＮＴＮ５−０００８，ＣＮＴＮ５−００１２＋，ＣＮＴＮ５−００１３，ＮＥＴＯ１−００１８，ＮＥＴＯ１−００２３，１６−０００５，０５−００２９，０５−００３１で表される一塩基多型からなる群から選択されるものであり、前記摂食障害が、神経性大食症であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記一塩基多型の２以上の組合せが、ＣＮＴＮ５−００２６＋，ＣＮＴＮ５−００２７−，ＣＮＴＮ５−００２７，ＣＮＴＮ５−００２８の組合せであり、そのハプロタイプが、Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃであって、前記摂食障害が神経性食欲不振症の制限型であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記一塩基多型の２以上の組合せが、１ｐ３６−００１８，１ｐ３６−００１９，１ｐ３６−００２０の組合せであり、そのハプロタイプが、Ａ−Ｔ−Ｃであって、前記摂食障害が神経性食欲不振症の制限型であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記一塩基多型の２以上の組合せが、１ｐ３６−００２３，１ｐ３６−００２９，１ｐ３６−００２９＋，１ｐ３６−００３５の組合せであり、そのハプロタイプが、Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇであって、前記摂食障害が神経性食欲不振症の制限型であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記一塩基多型の２以上の組合せが、１ｐ３６−００５２，１ｐ３６−００５３，１ｐ３６−００５５，１ｐ３６−００５６，１ｐ３６−００５７の組合せであり、そのハプロタイプが、Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔであって、前記摂食障害が神経性食欲不振症の制限型であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記一塩基多型の２以上の組合せが、１ｐ３６−００５８，１ｐ３６−００５９，１ｐ３６−００６０，１ｐ３６−００６１，１ｐ３６−００６３，１ｐ３６−００６８，１ｐ３６−００６９，１ｐ３６−００７０，１ｐ３６−００７１の組合せであり、そのハプロタイプが、Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａであって、前記摂食障害が神経性食欲不振症の制限型であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記一塩基多型の２以上の組合せが、１１−００１６＋，１１−００１８の組合せであり、そのハプロタイプが、Ａ−Ｔであって、前記摂食障害が神経性食欲不振症の制限型であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記一塩基多型の２以上の組合せが、ＮＥＴＯ１−００２７，ＮＥＴＯ１−００２８の組合せであり、そのハプロタイプが、Ｔ−Ａであって、前記摂食障害が神経性食欲不振症の制限型であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記一塩基多型の２以上の組合せが、１ｑ３２−０００１，１ｑ３２−０００２，１ｑ３２−０００３，１ｑ３２−０００４，１ｑ３２−０００５，１ｑ３２−０００６，１ｑ３２−０００７の組合せであり、そのハプロタイプが、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇであって、前記摂食障害が神経性食欲不振症の制限型であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記一塩基多型の２以上の組合せが、１ｑ３２−００４１，１ｑ３２−００４２，１ｑ３２−００４３，１ｑ３２−００４４，１ｑ３２−００４５，１ｑ３２−００４６，１ｑ３２−００４７，１ｑ３２００４８，１ｑ３２−００５０の組合せであり、そのハプロタイプが、Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔであって、前記摂食障害が神経性食欲不振症の制限型であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記一塩基多型の２以上の組合せが、１ｑ４１−００２４，１ｑ４１−００２５，１ｑ４１−００２７，１ｑ４１−００２８，１ｑ４１−００２９，１ｑ４１−００３０，１ｑ４１−００３１の組合せであり、そのハプロタイプが、Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇであって、前記摂食障害が神経性食欲不振症（制限型を含む）であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記一塩基多型の２以上の組合せが、１ｑ４１−００３４，１ｑ４１−００３５，１ｑ４１−００３６，１ｑ４１−００３７，１ｑ４１−００３８の組合せであり、そのハプロタイプが、Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇであって、前記摂食障害が神経性食欲不振症（制限型を含む）であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記一塩基多型の２以上の組合せが、１６−００２３，１６−００２４，１６−００２６，１６−００２７の組合せであり、そのハプロタイプが、Ｔ−Ａ−Ａ−Ｔであって、前記摂食障害が神経性食欲不振症の制限型であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記一塩基多型の２以上の組合せが、１６−００３０，１６−００３２の組合せであり、そのハプロタイプが、Ｇ−Ｇであって、前記摂食障害が神経性食欲不振症（制限型を含む）であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
ヒト染色体ＤＮＡにおける、０１０６Ｇ０６，１１０５Ｄ１２，１６０３Ｇ０４，０１０５Ｇ０７，０１１７Ｈ０９，０５１２Ｅ０９，１１０９Ｄ０２，１２０２Ｆ０３，１２０７Ｂ０３，１８０２Ｂ０６，又は９９０１Ｂ０９で表されるマイクロサテライトのいずれかの前後４００ｋｂに存在する遺伝子多型を１以上含有する領域の塩基は配列と同一又は実質的に同一な塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる、摂食障害の診断用マーカー遺伝子。
【請求項２０】
前記遺伝子多型が一塩基多型であり、ＣＮＴＮ５−Ｕ０１，ＣＮＴＮ５−０００８，ＣＮＴＮ５−００１２＋，ＣＮＴＮ５−００１３，ＣＮＴＮ５−００２２，ＣＮＴＮ５−００２３，ＣＮＴＮ５−００２６，ＣＮＴＮ５−００２６＋，ＣＮＴＮ５−００２７，ＣＮＴＮ５−００２７−，ＣＮＴＮ５−００２８，１ｐ３６−００１１＋，１ｐ３６−００１８，１ｐ３６−００１９，１ｐ３６−００２０，１ｐ３６−００２３，１ｐ３６−００２９，１ｐ３６−００２９＋，１ｐ３６−００３５，１ｐ３６−００３６，１ｐ３６−００４０，１ｐ３６−００５１，１ｐ３６−００５２，１ｐ３６−００５３，１ｐ３６−００５５，１ｐ３６−００５６，１ｐ３６−００５７，１ｐ３６−００５８，１ｐ３６−００５９，１ｐ３６−００６０，１ｐ３６−００６１，１ｐ３６−００６３，１ｐ３６−００６８，１ｐ３６−００６９，１ｐ３６−００７０，１ｐ３６−００７１，１１−００１０，１１−００１６＋，１１−００１８，ＮＥＴＯ１−００１８，ＮＥＴＯ１−００２３，ＮＥＴＯ１−００２７，ＮＥＴＯ１−００２８，１ｑ４１−００２４，１ｑ４１−００２５，１ｑ４１−００２７，１ｑ４１−００２８，１ｑ４１−００２９，１ｑ４１−００３０，１ｑ４１−００３１，１ｑ４１−００３２，１ｑ４１−００３３，１ｑ４１−００３４，１ｑ４１−００３５，１ｑ４１−００３６，１ｑ４１−００３７，１ｑ４１−００３８，１６−０００５，１６−００１１，１６−００１４，１６−００１７，１６−００２３，１６−００２４，１６−００２６，１６−００２７，１６−００３０，１６−００３２，１６−００３３，１ｑ３２−０００１，１ｑ３２−０００２，１ｑ３２−０００３，１ｑ３２−０００４，１ｑ３２−０００５，１ｑ３２−０００６，１ｑ３２−０００７，１ｑ３２−００４１，１ｑ３２−００４５，１ｑ３２−００４６，１ｑ３２−００５０，１ｑ３２−００５１，１ｑ３２−００５２，０５−００２５，１６−０００５，０５−００２９，０５−００３１で表される一塩基多型からなる群から選択される請求項１９に記載のマーカー遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、摂食障害に関連する遺伝子多型を特定し、当該遺伝子多型を検出することにより摂食障害の発症の危険度を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
摂食障害（ｅａｔｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）は診断基準により、神経性食欲不振症（拒食症；ａｎｏｒｅｘｉａ  ｎｅｒｖｏｓａ、以下ＡＮと略す）と神経性大食症（過食症；ｂｕｌｉｍｉａ  ｎｅｒｖｏｓａ、以下ＢＮと略す）、いずれにも分類不能のもの（ｅａｔｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｎｏｔ  ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）の大きく３つのグループに分類される。いずれの群も1990年代後半より、若い女性を中心に発症率が急激に増加してきている。若い女性の有病率は、拒食症では約０．５〜１％、過食症では約１〜３％と言われ、また特に拒食症では、患者は回復と再発の周期を繰り返し、死亡率も他の精神疾患と比べても平均６％と非常に高い。この重大な有病率や死亡率からも、摂食障害の病因・病態の解明および有効な予防法・治療法の確立が早急に検討されるべきである。
これまで摂食障害の主な原因は母子関係にあるとされており、遺伝要因についてはほとんど考慮されていなかったが、近年の疫学的研究により遺伝要因が摂食障害の発症に深く関わっていることが示唆されており、拒食症患者の一親等の家族では、拒食症や気分障害を発症する危険性が高いことや双生児研究における一卵性双生児の一致率が５２〜５６％と二卵性双生児の一致率５〜１１％より有意に高いことが、遺伝要因との関係を裏付けている。
【０００３】
また、摂食障害は多因子疾患で、複数の遺伝子変異と複数の環境因子が共存したときに発症すると考えられている。個々の疾患関連遺伝子変異は、それ単独では発症に至らないが、複数の特定の遺伝子多型が組み合わさり、更に環境因子が加わった場合に初めて摂食障害としての表現型を示すものと推察される。従来、このような弱い効果の遺伝子変異の場合には、罹患者を２人以上もつ家系を多数集めて、マイクロサテライトマーカーによる連鎖解析（ノンパラメトリック連鎖解析）をゲノムワイドに行うことで候補遺伝子座を同定していくのが有効とされてきたが、未だ摂食障害ではゲノムワイドに家系解析を行ってきた例が極めて少なく、報告としてはＢｏｕｃｈａｒｄらのグループによる１報とＫａｙｅらのグループにおける２報のみである（非特許文献１〜３）。Ｂｏｕｃｈａｒｄらのグループでは、１９４組の家系サンプルにおいてＢＭＩ（ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ｉｎｄｅｘ）を指標とした肥満にもとづき、第７番（７ｐ１５．３）および第１５番（１５ｑ２５−ｑ２６）染色体上に連鎖を認めている。７ｐ１５．３領域に連鎖が認められた候補遺伝子はＮｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙ（ＮＰＹ）とＧｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧＨＲＨ）受容体の２つで、これらは摂食行動に関与する多くの制御因子の１つであり、ともに摂食行動を促進させる働きが知られている。１５ｑ２５−ｑ２６領域ではインシュリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）遺伝子の５’側非翻訳領域に存在するＣＡリピート上にＬＯＤ値＝３．５６の連鎖を認めている。
【０００４】
またＫａｙｅらのグループでは、１９６組の拒食症の家系サンプルから第１番（１ｐ３３−３６および１ｑ３１）、第２番、そして第１３番染色体上に有意な連鎖を見出している。特に１ｐ３３−３６領域においては３．４５という非常に高いｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ  ＮＰＬスコアから、後に候補遺伝子としてセロトニン１Ｄ受容体（ＨＴＲ１Ｄ）遺伝子とオピオイドδ受容体（ＯＰＲＤ１）遺伝子に関するＳＮＰ解析が行われた。その統計学的な証明とともにセロトニンとオピオイドの神経伝達に関わる特性も含め、摂食障害との関連が強く示唆されている（非特許文献４）。これまでの摂食障害感受性遺伝子の解析においては、機能面から疾患に関与すると推定される遺伝子の多型性を検出し、それに基づいた患者‐対照群における相関解析、いわゆる候補遺伝子解析が主として行われてきたために、実際にはセロトニンとオピオイドに代表されるような神経伝達物質系や神経成長因子に関与するノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）遺伝子（１６ｑ１２．２）やエストロゲン受容体２（ＥＳＲ２）遺伝子（１４ｑ）などの一部の染色体領域に報告が限られていた（非特許文献５〜７、特許文献１）。
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｒｉｃｅら，Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２００２；７０：７８７−９２．
【非特許文献２】Ｃｈａｇｎｏｎら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．２０００  Ｆｅｂ；４９（２）：２０３−７．
【非特許文献３】Ｄｅｖｌｉｎら，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２００２；１１（６）：６８９−９６．
【非特許文献４】Ｂｅｒｇｅｎら，Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２００３  Ａｐｒ；８（４）：３９７−４０６．
【非特許文献５】Ｕｒｗｉｎら，Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２００２；７（６）：６５２−７．
【非特許文献６】Ｕｒｗｉｎら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２００３  Ｓｅｐ  ２４；１１（１２）：９４５−５０．
【非特許文献７】Ｅａｓｔｗｏｏｄら，  Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．  ２００２  ；７（１）：８６−９．
【特許文献１】ＷＯ２００３／０１２１４３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、上記事情に鑑み、より有効な摂食障害の治療及び予防法の開発に資するべく、ゲノムワイドな多型解析を精力的におこなった結果、ゲノム上の１１の特定領域において、摂食障害感受性マーカー、及び摂食障害感受性遺伝子、を同定することに成功した。
よって、本発明は、特定のマーカ近傍に存在する遺伝子多型を検出することにより、摂食障害の発症の危険度を判定する方法の提供を目的とする。また、本発明は、摂食障害感受性遺伝子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これまでに、ヒトゲノムの全塩基配列が決定され、ゲノムの多型性情報の蓄積にもとづく遺伝的マーカーの利用によって、ゲノム全体にわたって高解像度かつ排他的に感受性遺伝子の同定が可能となった。そこで、本疾患感受性遺伝子の探索にあたっては、プール化ＤＮＡ法を導入し、多型性情報に基づき全ゲノムにわったって設定された約２３，５００の多型マイクロサテライトマーカーを利用して、初めてのゲノムワイドなケース・コントロール型遺伝的相関解析を行うことを試みた。更に同定された摂食障害感受性候補マーカーの近傍領域に座上する遺伝子の機能・発現パターンなどを考慮し、脳神経系機能を持つことが知られている既知の遺伝子が含まれる候補領域を中心にＳＮＰ高密度マッピングを行うことで摂食障害感受性領域・遺伝子の絞込みを行った。
【０００８】
すなわち、本発明は、０１０６Ｇ０６，１１０５Ｄ１２，１６０３Ｇ０４，０１０５Ｇ０７，０１１７Ｈ０９，０５１２Ｅ０９，１１０９Ｄ０２，１２０２Ｆ０３，１２０７Ｂ０３，１８０２Ｂ０６，及び９９０１Ｂ０９で表されるマイクロサテライトが、摂食障害の発症と有意な相関を示すことを明らかにし、当該マイクロサテライトのいずれかの前後４００ｋｂに存在する遺伝子多型（特に一塩基多型）と摂食障害との相関を解析した結果、請求項２に掲げた一塩基多型の１以上を検出すること、又は２以上の遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプを検出することにより、摂食障害の発症危険度を判定することができることを見出した。
従って、当該多型部分を含むＤＮＡ鎖は、摂食障害発症の診断のためのマーカー遺伝子として用いることができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る判定方法により、摂食障害の危険度を事前に予測することができる。
【００１０】
さらに、本発明において同定された摂食障害感受性遺伝子の詳細な機能解析により、摂食障害に対する新たな治療方法、治療薬の開発を促進することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明における摂食感受性領域及び摂食障害感受性遺伝子は、マイクロサテライトマーカー及びＳＮＰｓマーカーを用いた遺伝子マッピングによって同定を行った。一般に、遺伝子マッピングを行なう場合の遺伝子多型マーカーとしては、ＳＮＰｓ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｕｐｈｉｓｍｓ）マーカーとマイクロサテライトマーカーが知られている。マイクロサテライトマーカーは、対立遺伝子数が多いため目的の領域又は遺伝子からある程度離れた位置に設定されたマーカーであっても相関を示す特徴があるため、ゲノムワイドな分析において検索領域の絞込みを行なう上で極めて有効である。一方、ＳＮＰｓマーカーは、ある程度絞り込まれた領域内において関連遺伝子を詳細に特定する際に有効なマーカーである。本発明における摂食障害感受性領域及び摂食障害感受性遺伝子は、マイクロサテライトマーカーおよびＳＮＰｓマーカーの両方を使用することで特定することができた。
【００１２】
マイクロサテライトを用いた遺伝子マッピングの一般的な方法に関し、以下に簡単に説明する。
遺伝子多型とは、対象遺伝子座に関する対立遺伝子の種類が２種類以上存在し、主要な対立遺伝子の頻度が９９％以下であることを意味する。また遺伝子座とはゲノム上の領域であればどの領域であってもよく、遺伝子が発現している領域に限定されない。マイクロサテライトとは、２塩基から６塩基が繰り返した配列のことを意味し、この繰り返しの回数は個人間で異なる場合があり、繰り返しのばらつきがＳＴＲ（Ｓｈｏｒｔ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｒｅｐｅａｔ）と呼ばれる多型を形成している。この繰り返し数がマイクロサテライト多型を決定している。典型的なマイクロサテライトはＣＡリピートである。
【００１３】
まず、比較的多型性に富むマイクロサテライトマーカーをゲノムワイドに適当な密度で、例えば、５０ｋｂ〜１５０ｋｂ、好ましくは、８０ｋｂ〜１２０ｋｂ、より好ましくは、９０〜１１０ｋｂに１個の割合で設定することができる。マイクロサテライトマーカーは対立遺伝子数（アレル数）が多いほどヘテロ接合度が高く、解析における情報量が増大する。各マイクロサテライト座におけるアリル頻度の分布およびハーディ−ワインベルグ平衡からの偏差に関し、統計解析を実施して相関解析を行なうことで、強い相関を示すマイクロサテライトマーカーを検索することができる。関連性の強いマイクロサテライトマーカーの近傍に、より高密度にマーカーを設定し、さらに関連分析を行なうことで摂食障害感受性領域及び摂食障害感受性遺伝子のマッピングをより正確に行なうことができる。
【００１４】
マイクロサテライトの多型検出には、例えば、マイクロサテライトマーカー領域を増幅し得るようなＰＣＲ用プライマーセットを使用することができる。ＰＣＲを用いた多型検出法としては、ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法の他にも、ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＳＳＯＰ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅ）法、ＲＮアーゼプロテクション法、ＲＤＡ（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）法、ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）法、ＡＦＬＰ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法などを用いることができる。
【００１５】
マイクロサテライトマーカーによる遺伝子マッピングによって摂食障害感受性領域及び摂食障害感受性遺伝子が存在すると思われる候補領域をある程度狭めた後に、適当な間隔でＳＮＰマーカーを設定し、さらに関連分析を進める。基本的には、摂食障害と相関するマイクロサテライトマーカーを中心とする約４００ｋｂ程度を解析対象とし、その領域にほぼ等間隔にＳＮＰが配置されるように、ＳＮＰを５０個程度選択する。ここで、適切なＳＮＰを選択するにあたり、種々のＳＮＰデータベースよりその情報を入手することができる。選択したＳＮＰのタイピングを行い、各検体のアレルタイプを決定し、得られたデータに基づいて、各ＳＮＰについてのケース・コントロール相関解析を行い、摂食障害又は特定の診断分類群との関連性を決定することができる。さらに、連鎖不平衡解析、Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ−Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ法を用いてハプロタイプを推定することにより、摂食障害又は特定の診断分類群と相関を示すハプロタイプブロックを同定することができる。
【００１６】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
１．方法
１−１．摂食障害検体の収集
血液サンプルを用いて遺伝子解析を実施するにあたり、社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム倫理審査委員会ならびに国立国際医療センター・倫理審査委員会、国立精神神経センター・倫理審査委員会において審査を受け、研究実施の承認を受けた上で研究開発を行った。
これまでに収集されたサンプルは、多数の弧発例および２３組の罹患同胞対サンプルを合わせて、拒食症（ＡＮ）３９９例および過食症（ＢＮ）１３６例の合計５３５例となった。近年の摂食障害における診断基準の明確な細分化により、これらの症例はさらに分類され、拒食症３９９例はそれぞれ摂食制限型（ＡＮ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｎｇ  ｔｙｐｅ、以下ＡＮ−Ｒと略す）２６１例、排出型（ＡＮ  ｗｉｔｈ  ｐｕｒｇｉｎｇ  ｔｙｐｅ、以下ＡＮ−Ｐと略す）２３例、また無茶食いを伴う排出型（ＡＮ  ｗｉｔｈ  ｂｉｎｇｅ  ｅａｔｉｎｇ  ／  ｐｕｒｇｉｎｇ  ｔｙｐｅ、以下ＡＮ−Ｂ／Ｐと略す）１１５例となった。同様に過食症１３６例についても、拒食症既往歴のあるグループ（ＢＮ  ｗｉｔｈ  ＡＮ）と既往歴のないグループ（ＢＮ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ＡＮ）として、それぞれ４５例および９１例に大別した。２３組の罹患同胞対サンプル（表１）については、診断基準をもとに分類された摂食制限型（ＡＮ−Ｒ）のＰｒｏｂａｎｄのみを弧発例と合わせて、今回の解析に供試することとした。
また今回のプール化ＤＮＡ法に対照群として供試するため、比較的平均年齢の低い女性集団が必要であったことから、平均３４．５歳の女性集団のサンプル１８０例（９０例＋９０例）が一次・二次スクリーニング用に遺伝子タイピング自己免疫疾患部門より提供された。
【００１８】
【表１】
2008048730.tif 000002
【００１９】
１−２．ＤＮＡの抽出・定量とプール化ＤＮＡの作製
遺伝子タイピングに使用するゲノムＤＮＡは、国立国際医療センター研究所において収集された全ての各末梢血サンプルより、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）あるいはＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡ抽出および精製を行った。ＤＮＡ抽出の際、最終の溶出ステップにおいては、続くＰＣＲ反応時の増幅効率への影響を考慮し、通常の１０分の１濃度のＥＤＴＡを含むＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ  ８．０）を使用した。
抽出されたＤＮＡは摂食障害部門に送付され、まず分光光度計によって、紫外線波長２６０ｎｍの吸収率からおおよその濃度を測定し、各サンプルの収量を確認した。またさらに、ＤＮＡの分解がないこととＲＮＡの混入がないこともアガロースゲル電気泳動によって確認した。さらに拒食症の中のＡＮ−Ｒグループの１２５例については、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）と蛍光プレートリーダーＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ）あるいはＭＴＰ−１００Ｆ（コロナ電気）を用いて、既知濃度のλファージＤＮＡにおける検量線を作成の上、サンプル中のニ本鎖ＤＮＡを高感度かつ特異的に定量した。ＡＮ−Ｒサンプル中、比較的収量の多かった９０サンプルを一次スクリーニング用のプール化ＤＮＡ作製に使用した。また、健常者集団９０例についてもＤＮＡ抽出後、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光試薬により正確な定量を行い、プール化ＤＮＡの作製に供試した。患者９０例、健常者９０例共に、ＤＮＡ濃度の決定には各サンプルについて最低３回以上の定量を行い、それぞれの測定結果をもとに平均値と標準偏差および変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を求め、変動係数が５％以下となる場合のみの平均値をＤＮＡ濃度として採用した。ＤＮＡ濃度から算出された１サンプル当たり８μｇ分（３０，０００反応分）の各ＤＮＡをそれぞれ等量ずつ混合し、患者群、健常者群の２種類のプール化ＤＮＡ（８ｎｇ／μｌ）を作製した。二次スクリーニング用のプール化ＤＮＡも後に同要領で作製した。
【００２０】
１−３．プール化ＤＮＡ精度確認
作製されたプール化ＤＮＡの精度を調べるため、発明者らが所有する他疾患用マイクロサテライトマーカーを指標に、患者および健常者のプール化ＤＮＡと各９０例の個別検体に対してそれぞれタイピングを行い、プール化ＤＮＡを用いた場合と個別検体を用いた場合の各アレル頻度を比較し、プール化ＤＮＡでのタイピング結果が、個別検体での結果を反映しているかどうかを２ ｘ ２および２ ｘ ｎ分割表でのχ２検定を行うことにより確認した。
【００２１】
１−４．マイクロサテライトマーカーを用いたプール化ＤＮＡ及び個別検体のタイピング
プール化ＤＮＡ法の導入により、タイピングに使用するマイクロサテライトマーカー（全２３，４６５マーカー）は、ゲノムワイドに約１００ｋｂに１個の間隔で設定・配置されたものを使用した。これらの各マーカーのプライマーペアは、Ｆｏｒｗａｒｄプライマーの５’末端側が６−ＦＡＭによって蛍光標識されたものである。
ＰＣＲ反応に使用するＤＮＡ合成酵素は、数種のマーカーにおいて、従来のＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と新規のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でのタイピング結果を比較検討し、増幅バンドの明瞭さと得られるシグナル値の高さから、後者のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用することとした。
ＰＣＲ反応溶液は、添付の１０ｘＢｕｆｆｅｒの２μｌに最終濃度１．５ｍＭとなるようにＭｇＣｌ２を添加し、２ｍＭｄＮＴＰ  Ｍｉｘを２．５μｌ、ＦｏｒｗａｒｄプライマーおよびＲｅｖｅｒｓｅプライマーを各２ｐｍｏｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．５ｕｎｉｔと２４ｎｇのプール化ＤＮＡをテンプレートに用いて、総量２０μｌ系で調整した。またＰＣＲ反応条件は、９６℃，１５分間の変性に続き、５７℃，１分、７２℃，１分ののち、９６℃，４５秒、５７℃，４５秒、７２℃，１分のサイクルを４０回繰り返した。
【００２２】
ＰＣＲ反応終了後、増幅産物をそれぞれの増幅効率に応じ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）を用いて４０倍あるいは８０倍に希釈し、さらにＨｉＤｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＧｅｎｅＳｃａｎ  ５００  ＬＩＺ  Ｓｉｚｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と混合したものを９６℃，５分間の熱変性後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて電気泳動を行った。
個別検体における電気泳動の結果は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて解析を行うことで、それぞれのマーカーにおける各アレルのピークおよびサイズを同定し、患者および健常者におけるアレル数ならびアレル毎の所有人数を求めた。それに対しプール化ＤＮＡを用いた場合は、同ソフトウェアにて増幅効率や波形パターンの確認を行った後、解析工程でのＡｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｔｈｏｄに関する設定値を一部変更し、サイジングのみを行った。このデータをＦｓａ２Ｆｓｂ３７３０ソフトウェア（遺伝子タイピング自己免疫疾患部門にて開発）において情報変換を行うことで、従来のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）での解析に用いるＰｉｃｋＰｅａｋ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１１ソフトウェア（遺伝子タイピング自己免疫疾患部門にて開発）でのアレルの同定作業および各ピークのシグナル値の取得が可能となった。
【００２３】
１−５．統計計算
個別検体を使用した場合は、遺伝子タイピングの結果として得られた患者および健常者におけるアレル毎の所有人数と総サンプルのアレル数から、各マーカーについてのアレル頻度を算出した。
プール化ＤＮＡにおいては、アレルの同定と同時に得られたアレルピーク毎のシグナル値より総和を求め、各シグナル値を総シグナル値で除することで、各マーカーについて患者集団および健常者集団内での推定アレル頻度を求めた。
プール化ＤＮＡの精度確認においては、上記の個別検体でのアレル頻度とプール化ＤＮＡにおけるアレル頻度に対して、２ ｘ ２および２ ｘ ｎ分割表を作成しχ２検定を行った。
各マーカーにおける遺伝的相関解析にあたっては、上記のプール化ＤＮＡの推定アレル頻度に総アレル数の１８０を乗算することによって、各アレル毎の患者集団および健常者集団内での所有人数を求め、これに対して２ ｘ ２および２ ｘ ｎ分割表を作成しχ２検定ならびにＦｉｓｈｅｒの直接確率検定を行った。これらの遺伝的相関解析における検定には、ＵＮＩＸ(登録商標)機とｃｒｅａｔｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０、ｃｈｅｃｋ  ｃｒｅａｔｅｄ  Ｄａｔａ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１、ＡＳｔａｔ  ｆｏｒｍａｔ  Ｔｏ  Ｆｉｌｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．２およびＡｓｔａｔ２  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．２の４つのソフトウェアを導入し、解析の高速化を図った。
【００２４】
１−６．ＳＮＰの選択とタイピング
マイクロサテライトマーカーによるゲノムワイドな遺伝的相関解析で同定された摂食障害感受性候補マーカーのうち、近傍に既知の脳神経関連遺伝子（群）が存在するものを優先的にＳＮＰ高密度マッピングによる感受性領域・遺伝子の絞込みの解析対象とした。
基本的には疾患と相関するマイクロサテライトマーカーを中心とする約４００ｋｂ程度を解析対象とし、その領域になるべくＳＮＰが均等間隔に配置されるように５０個程度を選択した。解析対象の４００ｋｂ内に存在する既知の脳神経関連遺伝子についてはより高密度にＳＮＰを選択した。ＳＮＰは、ＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰ／）およびＪＳＮＰ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ＿ｊａ．ｈｔｍｌ）より入手した情報をもとに選択し、特に後者から日本人集団での多型性およびアレル頻度情報が入手できたものは優先的に選択した。
【００２５】
摂食障害患者４５６例（ＡＮ−Ｒ  ２１８例，ＡＮ−ＢＰ  ９５例，ＡＮ−Ｐ  １８例，  ＢＮ  １２５例）とコントロール８７２例をＳＮＰタイピングの解析対象とした。各検体のＤＮＡ濃度はＰｉｃｏＧｒｅｅｎ定量法で測定し、５ｎｇのＧｅｎｏｍｉｐｈｉ増幅ＤＮＡを一反応に用いた。複数のＳＮＰプローブでテストタイピングを行い本解析に先駆けて各検体の増幅効率を確認し効率の悪いものは除外するなどしてタイピング成功率の向上に努めた（その結果、概ね９９％以上のタイピング成功率を維持できた）。
ＳＮＰタイピングに用いる鋳型ＤＮＡはＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による増幅ＤＮＡを使用した。予備実験でＰｉｃｏｇｒｅｅｎ定量済みの検体ＤＮＡ  １０ｎｇから４μｇ相当（２００ｎｇ／μｌ）の増幅ＤＮＡが得られる条件を確立し、その条件での増幅ＤＮＡと増幅前の検体ＤＮＡとで比較ＳＮＰタイピングを行い、増幅ＤＮＡの使用によるタイピング成功率の低下やタイピング結果の相違がないことを確認した。そこで確立した条件で全摂食障害患者検体を増幅し、５ｎｇ相当の増幅ＤＮＡを一反応に用いた。各検体の１  ｎｇ／μｌ溶液を含むマスタープレートを作製し、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で９６穴ＰＣＲプレートに５ｎｇ／ｗｅｌｌを自動分注した。分注済みプレートは一晩室温で放置し風乾した。乾燥ＤＮＡ入りプレートは使用時まで−２０℃で保存した。プローブミックスとＡＢｓｏｌｕｔｅ  Ｑ−ＰＣＲ  Ｍｉｘ（ＡＢｇｅｎｅ）を含む反応液５μｌを加え、ＰＣＲ反応（９５℃  １０分の後，  ９５℃  １０秒と６０℃  １分を３５−４０  サイクル）をＡＢＩ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍで行った。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００  ＨＴ  ＤｅｔｅｃｔｏｒでＴｑａＭａｎプローブ蛍光強度（ＶＩＣ，  ＦＡＭ）を検出し、プレート毎に個々の検体のアレルタイプを決定した。
【００２６】
１−７．ＳＮＰ相関解析
一候補領域の全てのＳＮＰタイピングデータをＥｘｃｅｌで集計し、患者群およびコントロール群でのアレル・遺伝子型頻度をカウントした。コントロール集団でのマイナーアレル頻度が５％以下のＳＮＰ、およびコントロール集団でのＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡検定値がＰ＜０．０５示すＳＮＰは次に述べる単一ＳＮＰについてのケース・コントロール相関解析の対象外とした。
摂食障害全体あるいは特定の診断分類群（ＡＮ，ＡＮ−Ｒ，ＢＮ）と相関を示すＳＮＰを同定するために、各ＳＮＰについてのケース・コントロール相関解析（χ２検定ならびにＦｉｓｈｅｒ直接確立検定）を、摂食障害患者４５６例（ＡＮ−Ｒ  ２１８例，ＡＮ−ＢＰ  ９５例，ＡＮ−Ｐ  １８例，ＢＮ  １２５例）対コントロール８７２例、ＡＮ  ３３１例対コントロール８７２例、ＡＮ−Ｒ  ２１８例対コントロール８７２例、およびＢＮ  １２５例対コントロール８７２例で行った。
更に、摂食障害全体あるいは特定の診断分類群と相関を示すハプロタイプブロックを検索するために、連鎖不平衡解析、Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ−Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ法を用いたハプロタイプ推定、ハプロタイプを考慮したケースコントロール相関解析を行った。ハプロタイプブロックの構築にはＧａｂｒｉｅｌ法（Ｇａｂｒｉｅｌら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００２  ２９６（５５７６）：２２２５−２２２９）を採用した。ハプロタイプブロック解析で同定されたブロック情報をもとに、ブロック単位でのハプロタイプを考慮したケース・コントロール相関解析を行い、その検定結果（χ２値）の有意性をＰｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ法（反復回数１０００あるいは１００００）で評価した。これらのハプロタイプ推定を伴う統計解析には主にＳＮＰ解析用統合ソフトウェアＳＮＰ Ａｌｙｚｅ（ダイナコム社）を用いた。
【００２７】
２．結果
２−１．摂食障害検体ＤＮＡサンプルの濃度定量
プール化ＤＮＡ法において集団でのアレル頻度推定を高い精度で行うためには、プールする個々のＤＮＡサンプルの濃度を正確に測定することが肝要である。そこで、摂食障害検体および対照として用いる健常人検体のＤＮＡ濃度測定にはＰｉｃｏＧｒｅｅｎ定量法を採用した。
抽出ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡの分解とＲＮＡの混入がないことを確認し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）と蛍光プレートリーダーＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ）あるいはＭＴＰ−１００Ｆ（コロナ電気）を用いて定量を行った。既知濃度のλファージＤＮＡにおける検量線を作成の上、サンプル中に混在する一本鎖ＤＮＡやタンパク質などの夾雑物の影響を受けることなく、二本鎖ＤＮＡを高感度かつ特異的に定量した。
【００２８】
２−２．ＡＮ−Ｒ検体を用いたプール化ＤＮＡの作製および精度確認
サンプル集団内の遺伝的異質性は、疾患感受性領域の絞込みにおいて、その検出力を低下させ第１種あるいは第２種のエラーを増加させる危険性がある。近年のＥ−ＴＤＴ（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｔｅｓｔ）による家系解析からも、Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ受容体遺伝子（ＣＮＲ１）のＡＡＴリピートにおいて、摂食制限型（ＡＮ−Ｒ）の患者と無茶食いを伴う排出型（ＡＮ−Ｂ／Ｐ）の患者間での伝達ａｌｌｅｌｅ数の違いが報告されている。そこで、一次・二次スクリーニングでプール化ＤＮＡ法に使用する検体は広義の摂食障害検体ではなく、拒食症の中でも特に摂食制限型（ＡＮ−Ｒ）のサンプルのみを限定して使用した。
一次スクリーニングのためプール化ＤＮＡを例に、その作製ならびに精度確認の方法を述べる。ＤＮＡ回収量が１６μｇ以上のＡＮ−Ｒ  ９０例をプール化ＤＮＡの作製に供した。１反応あたりのプール化ＤＮＡの使用量を減少させてもＰＣＲ反応および波形パターンに影響のないことを確認した上で、使用量を通常量の４８ｎｇから２４ｎｇに半減させ、各サンプルあたりのＤＮＡ混合量を８μｇ（３０，０００反応分）に抑えた。  健常者サンプル９０例についても同量の各８μｇを混合し、対照となるプール化ＤＮＡを作製した。
【００２９】
次に本解析に先立ち、プール化ＤＮＡの精度確認を行った。当研究グループが所有する他疾患のゲノム解析用マイクロサテライトマーカーシリーズの内、遺伝子タイピングにおける波形判別が容易かつ明瞭で、多数のアレルが存在するマーカー数種を選抜し、患者および健常者のプール化ＤＮＡに対するＰＣＲ反応と同時に、各々のプール化ＤＮＡの作製時に混合した９０例の個別検体に対してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応終了後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて電気泳動をし、得られたＲａｗ  ＤａｔａをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析することにより、アレルの同定および各アレルのピークシグナル値の取得を行った。プール化ＤＮＡにおけるタイピングデータが個別検体での結果を忠実に反映しているかを調べるため、それぞれ個別検体のアレル情報から患者集団内と健常者集団内でのアレル頻度を集計・算出し、プール化ＤＮＡタイピングでのアレル頻度との２ ｘ ｎのχ２検定を行い、その統計量を求めた。その結果、患者、健常者共に、個別検体とプール化ＤＮＡの間で０．８６〜０．９９と非常に高いＰ値を示し、プール化ＤＮＡでのタイピングデータが個別検体のデータを反映している極めて質の高いプール化ＤＮＡを調整できたことを確認した（表２）。
【００３０】
【表２】
2008048730.tif 000003
【００３１】
２−３．ＡＢＩ ３７３０ ＤＮＡアナライザにおける高速タイピングシステムの構築
本研究においては、電気泳動の条件を従来のプール化ＤＮＡ法のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に変更することで、タイピング系のハイスループット化を図った。
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡ  ＡｎａｌｙｚｅｒはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒに比べ、単位時間当たりのＰｌａｔｅ処理枚数が多いのみならず、より微量な反応産物でより高感度に蛍光標識物の検出ができ、また機械の構造上の違いから故障の発生率が極端に少なく、メンテナンスも容易であるという利点がある。検出感度の点では、従来の方法のままＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒで電気泳動を行うと一部のピークが飽和してしまい、プール化ＤＮＡのタイピングによって得られたアレル頻度が個別検体でのアレル頻度を反映しなくなってしまうため、電気泳動に用いる反応産物の希釈率を上げ、４０倍あるいは８０倍と２段階に設定することにより各ピークのシグナル値を１０，０００未満に下げて、この問題を解消した。
【００３２】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  で得られた結果は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で増幅効率・波形パターンを確認し、アレルのサイズを決定を行った。Ｆｓａ２Ｆｓｂ３７３０ソフトウェア（遺伝子タイピング自己免疫疾患部門にて開発）にてファイル形式変換を行った後に、各マーカーについてのアレル同定およびシグナル値の獲得をプール化ＤＮＡ解析用ソフトウェアＰｉｃｋＰｅａｋ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１１で行った。
【００３３】
２−４．ＵＮＩＸ(登録商標）機および新規ソフトウェア導入による統計処理の高速化
プール化ＤＮＡ法に用いる全２３，４６５マーカーついての遺伝的相関解析にあたり、ＵＮＩＸ(登録商標）機と次に述べる４つの新規ソフトウェアを用いた。
ＰｉｃｋＰｅａｋ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１１ソフトウェアによる解析によって出力されたマーカー毎のアレルのログ情報をｃｒｅａｔｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０ソフトウェアとｃｈｅｃｋ  ｃｒｅａｔｅｄ  Ｄａｔａ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１ソフトウェアにより、修正を加えながら整列化させ、各アレルピークのシグナル値を確定した。次いでＡＳｔａｔ  ｆｏｒｍａｔ  Ｔｏ  Ｆｉｌｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．２ソフトウェアにより、各アレルピークのシグナル値と総アレル集計シグナル値の比率から、各マーカーについて患者集団および健常者集団内での推定アレル頻度（％）を求め、このプール化ＤＮＡの推定アレル頻度（％）に総アレル数（１８０）を乗算し、各アレル毎の患者集団および健常者集団内での推定所有人数を求めた。これに対してＡｓｔａｔ２  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．２ソフトウェアを用いて２ ｘ ２および２ ｘ ｎ分割表を作成し、χ２検定ならびにＦｉｓｈｅｒの直接確立検定を行った。これらのＵＮＩＸ(登録商標）機での解析・検定システムの導入により、９５マイクロサテライトマーカー単位の統計計算が可能となり、有意差検定における統計処理の高速化が実現した。
【００３４】
２−５．２３，４６５個のマイクロサテライトマーカーとプール化ＤＮＡ法を用いた全ゲノム相関解析による摂食障害感受性候補座位の同定
拒食症制限型（ＡＮ−Ｒ）とコントロール群のプール化ＤＮＡを用いた一次・二次スクリーニング、個別タイピングによる三次スクリーニング、および確認タイピングにより、効率的な疾患感受性候補領域の同定を行ったので、以下にその詳細を述べる（図２参照）。各段階で、患者集団および健常者集団における各アレル頻度の解析と２ ｘ ２、２ ｘ ｎ分割表を用いたχ２検定ならびにＦｉｓｈｅｒの直接確立検定による有意差の検定を行った。
【００３５】
２−５−１．有意水準Ｐ＜０．０５での段階的スクリーニング（図２の経路１参照）
（１）一次スクリーニング：ＡＮ−Ｒ  ９０例とコントロール９０例のプール化ＤＮＡタイピング
上記２−２．の要領で作製したプール化ＤＮＡを２３，４６５個のマイクロサテライトマーカーでタイピングし、各マーカーについて推定アレル頻度を決定し有意差検定を行った。１４１４個（２３，４６５個のうちの６．０３％）のマイクロサテライトマーカーにおいて、一つまたは複数のアレルでの有意差（Ｐ＜０．０５）が認められた（表３）。これらのマイクロサテライトマーカーを２次スクリーニングの解析対象とした。
【００３６】
【表３】
2008048730.tif 000004
【００３７】
（２）二次スクリーニング：一次スクリーニングとは独立なＡＮ−Ｒ９０例とコントロール９０例のプール化ＤＮＡタイピング
新たなプール化ＤＮＡを作製し段階的なタイピングを行うことで、解析の際に統計的な閾値について特別な補正を入れることなく偽陽性を効果的に減少させることが期待されるため、一次スクリーニングとは独立なＡＮ−Ｒ９０例とコントロール９０例のプール化ＤＮＡを二次スクリーニングに用いた。
一次スクリーニングで有意差（Ｐ＜０．０５）が認められた１４１４個のマイクロサテライトマーカーに関して二次スクリーニングを行った。２７３個（１４１４個のうちの１９．３１％）のマイクロサテライトマーカーにおいて、一つまたは複数のアレルでの有意差（Ｐ＜０．０５）が認められた（表４）。
この２７３個のマイクロサテライトマーカーについて、有意差を示すアレルは、（ｉ）その推定アレル頻度のＡＮ−Ｒ群とコントロール群間での大小関係が一次・二次スクリーニングで一致しているか、（ｉｉ）  Ｍａｊｏｒアレルであるか、の二つの条件について個別に検討した。これらの条件を満たす１４５個のマイクロサテライトマーカーを選抜し、三次スクリーニングの解析対象とした（図２）。
【００３８】
【表４】
2008048730.tif 000005
【００３９】
（３）三次スクリーニング：一次・二次スクリーニングとは独立なＡＮ  １４０例とコントロール１６１例に対する個別タイピング
二次スクリーニングで選抜した１４５個のマイクロサテライトマーカーについて、一次・二次スクリーニングとは独立なＡＮ１４０例（ＡＮ−Ｒ  ３２例、ＡＮ−Ｐ  ３２例、ＡＮ−ＢＰ  ８９例）とコントロール１６１例に対して個別タイピングを行った。各マーカーのＡＮ群・コントロール群でのアレル頻度を確定し有意差検定を行った結果、４０個（１４５個のうちの２７．５９％）が少なくとも一つのアレルでＰ＜０．０５を示した（表５）。
この４０個のマイクロサテライトマーカーについて、三次スクリーニングで有意差（Ｐ＜０．０５）を示したアレルが、（ｉ）患者群（ＡＮ−Ｒ群あるいはＡＮ群）とコントロール群の間でのアレル頻度の大小関係にプール化ＤＮＡタイピング（一次・二次スクリーニング）と個別タイピング（三次スクリーニング）で一貫性を示すか、（ｉｉ）  Ｍａｊｏｒアレルであるか、などの条件を検討し、８個のマイクロサテライトマーカーを選抜した。この８個を確認個別タイピングの解析対象とした。
【００４０】
【表５】
2008048730.tif 000006
【００４１】
（４）確認個別タイピング：ＡＮ  ３２０例とコントロール３４１例（一次・二次・三次スクリーニングで使用した全ての患者群およびコントロール群検体）を対象とした個別タイピング
三次スクリーニングで選抜した８個のマイクロサテライトマーカーについて、一次・二次・三次スクリーニングで使用した全ての患者検体（３２０例）およびコントロール検体（３４１例）に対して個別タイピングを行った（患者群の内訳は、ＡＮ−Ｒ  ２１２例、ＡＮ−Ｐ  ３２例、ＡＮ−ＢＰ  ８９例）。各マーカーの患者・コントロール群でのアレル頻度を確定し有意差検定を行った結果、３個のマイクロサテライトマーカーが少なくとも一つのアレルで疾患との相関（Ｐ＜０．０５）を示した（表６）。よって、これら３個のマイクロサテライトマーカーを摂食障害感受性候補マーカーとみなした。これら３マーカーは一次・二次・三次スクリーニングおよび確認個別タイピングで一貫して少なくとも一つのアレルがＰ＜０．０５を示したマーカーである。
【００４２】
２−５−２．タイプ２エラー等を考慮した摂食障害感受性候補マーカーの更なる抽出
（図２の経路２および３参照）
二次スクリーニングでの有意差検定で０．０５≦Ｐ＜０．１を示すマーカーから、有意差を示すアレルが（ｉ）その推定アレル頻度のＡＮ−Ｒ群とコントロール群間での大小関係が一次・二次スクリーニングで一致しているか、（ｉｉ）Ｍａｊｏｒアレルであるか、を基準として１３個のマイクロサテライトマーカーを選抜した。これらに対し上記（３）と同じ要領で三次スクリーニングを行った。一次・二次スクリーニングで有意差を示したアレルの推定アレル頻度のＡＮ−Ｒ群とコントロール群間での大小関係が、三次スクリーニング（ＡＮ群対コントロール群）でも一致しているかを指標に１３個のうち４個のマーカーを選抜し、それらを上記（４）と同じ要領の確認個別タイピングの対象とした。その結果、４マーカーとも少なくとも一つのアレルで疾患との相関（Ｐ＜０．０５）を示した（表６）。これら４個のマイクロサテライトマーカーも摂食障害感受性候補マーカーとみなした（図２の経路２参照）。
さらに、一次・二次スクリーニングでは有意水準Ｐ＜０．０５で残ったが、三次スクリーニングでは０．０５≦Ｐを示した１０５個のマイクロサテライトマーカーについて、一次・二次スクリーニングで有意差を示したアレルの推定アレル頻度のＡＮ−Ｒ群とコントロール群間での大小関係が、三次スクリーニング（ＡＮ群対コントロール群）でも一致しているかを指標に４個のマーカーを選抜し、それらを確認個別タイピングの対象とした。その結果、４マーカーとも少なくとも一つのアレルで疾患との相関（Ｐ＜０．０５）を示した（表６）。これら４個のマイクロサテライトマーカーも摂食障害感受性候補マーカーとみなした（図２の経路３参照）。
【００４３】
【表６】
2008048730.tif 000007
【００４４】
２−５−３．１１個の摂食障害（拒食症）感受性マーカー
以上のようにして、確認個別タイピング（ＡＮ  ３２０例・コントロール３４１例）において摂食障害（拒食症）と相関（Ｐ＜０．０５）を示す１１個のマイクロサテライトマーカーを同定した（図３）。１１個のマーカーについて確認個別タイピングでのＰ値および近傍遺伝子情報（遺伝子数ならびに脳神経関連遺伝子の有無）を表６にまとめた。
【００４５】
２−６．４つの摂食障害候補感受性領域に対するＳＮＰ高密度マッピングと統計解析
マイクロサテライトマーカーによる全ゲノム相関解析により同定された１１箇所の摂食障害候補感受性領域のうち、（１）神経細胞接着関連分子をコードするＣＮＴＮ５遺伝子領域（１１ｑ２２）、（２）神経伝達物質放出制御分子をコードするＳＹＴ１２遺伝子領域（１１ｑ１３）、（３）神経細胞膜貫通分子をコードするＮＥＴ０１遺伝子領域（１８ｑ２２）、（４）ＣＡＭＴ１、ＰＥＲ３、ＰＡＲＫ７などの脳関連遺伝子クラスター（１ｐ３６）、（５）ＣＤＨ１８遺伝子近傍領域、（６）ＩＱカルモジュリン−結合モチーフ遺伝子領域、（７）ＴＮＲＣ９遺伝子を含む領域、（８）ＮＲ５Ａ及びＺＮＦ２８１遺伝子を含む領域に着目した。具体的には、ＭＳ１１ａ（１１０５Ｄ１２），  ＭＳ１ｂ（０１０５Ｇ０７），  ＭＳ１１ｂ（１１０９Ｄ０２），  ＭＳ１８ａ（１８０２Ｂ０６）、ＭＳ１ａ（０１０６Ｇ０６），ＭＳ５ａ（０５１２Ｅ０９），ＭＳ１６ａ（１６０３Ｇ０４）及びＭＳ１ｃ（０１１７Ｈ０９）の８つのマイクロサテライトを含む領域をＳＮＰ高密度マッピングの解析対象とした結果を以下に示す。なお、残りの３つのマイクロサテライト（１２０２Ｂ０３、１２０７Ｂ０３及び９９０１Ｂ０９）についても同様の手法によりマッピングできる。いずれの領域についても摂食障害（拒食症）と相関を示したマイクロサテライトマーカーの両隣のマイクロサテライトマーカーは相関を示さなかったことから、基本的には相関を示したマイクロサテライトマーカーを中心とする４００ｋｂ程度の範囲をＳＮＰ高密度マッピングの解析対象とした。各領域から選択したＳＮＰについて、摂食障害（ＥＤ）患者４５６例（ＡＮ−Ｒ  ２１８例，  ＡＮ−ＢＰ  ９５例，  ＡＮ−Ｐ  １８例，  ＢＮ  １２５例）とコントロール８７２例をタイピングし、相関解析を行った。コントロール集団でのマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）が５％以下、またはコントロール集団でのＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡（ＨＷＥ）検定でＰ＜０．０５を示すＳＮＰはケース・コントロール相関解析の対象外とした。
【００４６】
２−６−１．ＭＳ１１ａ（１１０５Ｄ１２）（１１ｑ２２上）  
マイクロサテライトマーカー１１０５Ｄ１２は、ＣＮＴＮ５遺伝子の第８イントロンに位置し（図４）、この遺伝子は神経細胞接着分子ｃｏｎｔａｃｔｉｎ  ５をコードする。１１０５Ｄ１２を中心とする４４０ｋｂの範囲から選んだ６６個のＳＮＰについてタイピングを行い、合計で１１個のＳＮＰを相関解析の対象外とした（５個は多型性が無く、４個がＭＡＦ＜５％、２個がＨＷＥ  Ｐ−ｖａｌｕｅ＜０．０５）。残った５５個の各ＳＮＰについてケース・コントロール相関解析を行ったところ、アレル頻度についての検定では、コントロール（８７２例）対ＥＤ（４５６例）で３ＳＮＰ、対ＡＮ（３３１例）で３ＳＮＰ、対ＡＮ−Ｒ（２１８例）で７ＳＮＰが疾患との相関（Ｐ＜０．０５）を示した（図６）。これら相関を示したものはいずれもイントロニックＳＮＰだった。対ＡＮ−Ｒで相関を示した７ＳＮＰのうちのひとつであるＳＮＰ＃２６はＭＳ１１０５Ｄ１２よりおよそ３３ｋｂ離れていた。また対ＡＮ−Ｒで相関を示したＳＮＰ＃３０−３４が位置する領域内にＭＳ１１０５Ｄ１２が含まれていた。ハプロタイプブロック解析により８個のブロックを同定し（図５および６）、各ブロック毎にハプロタイプを考慮したケース・コントロール相関解析を行ったところ、ＳＮＰ＃３１−３４からなるＢｌｏｃｋ４（サイズは約１４．３  ｋｂで＃３１がｔａｇ  ＳＮＰ）のＡ−Ｔ−Ａ−ＣハプロタイプがＡＮ−Ｒとの相関を示した（Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｐ＝０．０１３１）（図７）。
ＳＮＰ＃２６は、イントロニックＳＮＰだがエキソン８から２１８ｂｐの距離に位置し、対ＥＤ、対ＡＮ、対ＡＮ−Ｒのいずれでも相関を示した。また、ＡＮ−Ｒとの相関を示したＢｌｏｃｋ４内のＳＮＰ＃３３と＃３４の間にエキソン９が位置している。従って、エキソン８および９を含む領域内の既知ＳＮＰおよびＡＮ−Ｒ検体を用いた配列決定を行うことで同定されるかもしれない新規ＳＮＰを対象とした更なるＳＮＰタイピング情報を取得し、ケース・コントロール相関解析を実施することで、この領域とＡＮ−Ｒとの相関について更なる評価が可能となる。
【００４７】
２−６−２．ＭＳ１ｂ  （０１０５Ｇ０７）（１ｐ３６上）
マイクロサテライトマーカー０１０５Ｇ０７を中心とする約４００ｋｂの領域には、脳組織で非常に強く発現しているＣＡＭＴＡ１（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  １）遺伝子、サーカディアンリズムに関与するＰＥＲ３遺伝子、パーキンソン病の原因遺伝子の一つであるＰＡＲＫ７遺伝子など、複数の脳神経系遺伝子が含まれている（図８）。０１０５Ｇ０７を中心とする３４４ｋｂから選んだ７６個のＳＮＰについてタイピングを行い、合計で２８個のＳＮＰを相関解析の対象外とした（２２個は多型性が無く、２個はプローブ合成不可、２個がＭＡＦ＜５％、２個がＨＷＥ  Ｐ−ｖａｌｕｅ＜０．０５）。残った４８個の各ＳＮＰについてケース・コントロール相関解析を行ったところ、アレル頻度についての検定で、コントロール（８７２）対ＥＤ（４５６）で１ＳＮＰ、対ＡＮ（３３１）で２ＳＮＰ、対ＡＮ−Ｒ（２１８）で１５  ＳＮＰが疾患との相関（Ｐ＜０．０５）を示した（図９および１０）。ハプロタイプブロック解析により９個のブロックを同定し（図９、１１及び１２）、各ブロック毎にハプロタイプを考慮したケースコントロール相関解析を行ったところ、Ｂｌｏｃｋ３（ＳＮＰ＃１４−１６）のＡ−Ｔ−Ｃハプロタイプ（Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｐ＝０．０２９６）、Ｂｌｏｃｋ４（ＳＮＰ＃１７−２０）のＧ−Ｃ−Ｇ−Ｇハプロタイプ（Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｐ＝０．０２７４）、Ｂｌｏｃｋ８（ＳＮＰ＃３５−３９）のＴ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔハプロタイプ（Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｐ＝０．０２６９）、  Ｂｌｏｃｋ９（ＳＮＰ＃４０−４８）のＣ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａハプロタイプ（Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｐ＝０．０１１２）がＡＮ−Ｒとの相関を示した（図１１および１２）。Ｂｌｏｃｋ３を形成する３つのＳＮＰはＰＥＲ３遺伝子のイントロンに位置し、Ｂｌｏｃｋ４を形成する４つのＳＮＰのうち、＃１７と＃１９はＰＥＲ３のイントロンに、＃２０はＰＥＲ３とＵＴＳ２のインタージェニック領域に位置し、＃１８はＰＥＲ３のエキソン１７に位置するミスセンスＳＮＰであった。Ｂｌｏｃｋ８を形成する５個のＳＮＰはＴＮＦＲＳＦ９遺伝子のイントロンあるいは５’上流に位置した。またＢｌｏｃｋ９を形成する９個のＳＮＰのうちの一つ＃４０はＰＡＲＫ７遺伝子の５’ＵＴＲに位置し、ほかはイントロニックあるいはインタージェニックＳＮＰであった。
【００４８】
単一ＳＮＰに対するケース・コントロール相関解析で最も低いＰ−ｖａｌｕｅ（対ＡＮ−ＲでＰ＝０．００４６）を示したＳＮＰ＃３４は、マイクロサテライトマーカー０１０５Ｇ０７のごく近傍に位置した。Ｂｌｏｃｋ３とＢｌｏｃｋ４のおよびＢｌｏｃｋ８とＢｌｏｃｋ９のブロック間連鎖不平衡係数（Ｄ’値）は０．９７７９と０．８８７９で、Ｂｌｏｃｋ３−４とＢｌｏｃｋ８−９はそれぞれ一つのより大きなブロックとみなすことができる。Ｂｌｏｃｋ３−４領域はＰＥＲ３遺伝子のほぼ全体を含み、Ｂｌｏｃｋ８−９はＴＮＦＲＳＦ９  （Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ９  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）、ＰＡＲＫ７、ＭＩＧ−６  （ｍｉｔｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ６）遺伝子を含む。統計遺伝学的にはハプロタイプブロックのＢｌｏｃｋ３−４およびＢｌｏｃｋ８−９内の遺伝子が摂食障害（拒食症）感受性遺伝子の候補となるが、遺伝子機能を考慮するとＰＥＲ３とＰＡＲＫ７が有力な候補と考えられる。これら二つの遺伝子を主な対象とした更なるＳＮＰタイピングとケース・コントロール相関解析が待たれる。ＳＮＰ＃１８はＰＥＲ３のｅｘｏｎ  １７に位置するｍｉｓｓｅｎｓｅ  ＳＮＰであるが、それ単独ではＥＤ、ＡＮ．ＡＮ−Ｒと相関を示さず、ＳＮＰ＃１７−２０のハプロタイプでみた時にＡＮ−Ｒとの相関が検出された。然るにＳＮＰ＃１８は摂食障害感受性を規定する機能ＳＮＰではなく、そのハプロタイプブロック内で疾患感受性を規定する機能ＳＮＰを探索することが必要である。Ｂｌｏｃｋ９のＳＮＰ＃４０はそれ単独でもＡＮ−Ｒとの相関を示し、ＰＡＲＫ７のエキソン１の約２０ｂｐ上流に位置する。従って、ＳＮＰ＃４０がＰＡＲＫ７の転写レベル調節に関与しているかどうかは興味深い点である。
【００４９】
２−６−３．ＭＳ１１ｂ  （１１０９Ｄ０２）（１１ｑ１３上）
マイクロサテライトマーカー１１０９Ｄ０２を中心とする約４００ｋｂには神経伝達物質放出に関与することが知られているＳＹＴ１２（ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ  ＸＩＩ）遺伝子が含まれている（図１３）。１１０９Ｄ０２を中心とする４４１ｋｂの範囲から選んだ３４個のＳＮＰについてタイピングを行い、合計で１４個のＳＮＰを相関解析の対象外とした（８個は多型性が無く、１個はＳＮＰプローブ合成不可、５個がＭＡＦ＜５％）。残った２０個の各ＳＮＰについてケース・コントロール相関解析を行ったところ、アレル頻度についての検定で、コントロール（８７２）対ＥＤ（４５６）で１  ＳＮＰ、対ＡＮ（３３１）で２ＳＮＰ、対ＡＮ−Ｒ（２１８）で２ＳＮＰが疾患との相関（Ｐ＜０．０５）を示した（図１４および１５）。対ＡＮおよび対ＡＮ−Ｒで相関を示したＳＮＰ＃１１および＃１２は、両方ともＳＹＴ１２遺伝子のイントロンに位置し、ハプロタイプブロック（Ｂｌｏｃｋ３、図１４および１６）を形成していた。このブロックはハプロタイプを考慮したケース・コントロール相関解析ではＡ−Ｔハプロタイプが相関を示した（Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｐ＝０．０２４５）。
神経伝達物質放出に関与する膜タンパクをコードするＳＹＴ１２遺伝子内に位置するＳＮＰが対ＡＮおよび対ＡＮ−Ｒで相関を示したことは興味深い。ＳＹＴ１２の拒食症への関与をより明確にするために、この遺伝子領域に対する高密度ＳＮＰマッピングの実施が待たれる。
【００５０】
２−６−４．ＭＳ１８ａ（１８０２Ｂ０６）（１８ｑ２２上）
マイクロサテライトマーカー１８０２Ｂ０６を中心とする約４００ｋｂにはｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎをコードするＬＯＣ４００６５５のみが含まれるが（図１７）、１８０２Ｂ０６よりセントロメア側に約２７０ｋｂ離れた位置に神経伝達物質の放出に関与する膜タンパクをコードするＮＥＴＯ１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−  ａｎｄ  ｔｏｌｌｏｉｄ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）遺伝子が存在した。そこで、１８０２Ｂ０６を中心にＮＥＴＯ１を含む約１０３０ｋｂの領域より、３８個のＳＮＰを選択した（うち２３個はＮＥＴＯ１遺伝子座位より選択）。ＳＮＰタイピングの結果、合計で１２個のＳＮＰを相関解析の対象外とした（５個は多型を示さないかＳＮＰプローブ合成不可、４個がＭＡＦ＜５％、３個がＨＷＥ  Ｐ−ｖａｌｕｅ＜０．０５）。残った２６個の各ＳＮＰについてケース・コントロール相関解析を行ったところ、アレル頻度についての検定でコントロール対ＥＤ（４５６）、対ＡＮ（３３１）、あるいは対ＡＮ−Ｒ（２１８）で相関を示すＮＥＴＯ１遺伝子座由来のＳＮＰは無かった（図１８および１９）。しかしながら、１８０２Ｂ０６からセントロメア側に約４０ｋｂ離れた（ＮＥＴＯ１遺伝子からは２３０ｋｂ上流）ＳＮＰ＃１９，２０が対ＥＤ、対ＡＮ、対ＡＮ−Ｒで相関を示した。これらのＳＮＰはハプロタイプブロックを形成しており（Ｂｌｏｃｋ４、図１８および２０）、ハプロタイプを考慮したケース・コントロール相関解析ではＡ−Ｔハプロタイプが対ＥＤ，対ＡＮ，対ＡＮ−Ｒで相関を示した（Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｐ＝０．００８（ＥＤ），０．００４１（ＡＮ），０．０１０８（ＡＮ−Ｒ））。
【００５１】
対ＥＤ、対ＡＮ、対ＡＮ−Ｒで相関を示したＳＮＰ＃１９，２０は、マイクロサテライトマーカー１８０２Ｂ０６の比較的近傍（約４０ｋｂ）に位置している。先に述べた領域を含む４領域全てについて、摂食障害（拒食症）感受性マーカーとして同定されたマイクロサテライトマーカーの近傍ＳＮＰ（あるいはＳＮＰ群）で拒食症（特にＡＮ−Ｒ）との相関が認められた。この結果は、既に複数の論文で報告されているように、マイクロサテライトマーカーの連鎖不平衡ブロック長は１００ｋｂ程度（引用文献１９参照）であることをよく反映していると考えられる。ＳＮＰ＃１９，２０はＮＥＴＯ１遺伝子からは２３０ｋｂも離れており、両者を関連付けるようなエビデンスは今のところない。しかしながら、例えばＳＮＰ＃１９，２０が含まれるハプロタイプブロック内にＮＥＴＯ１の組織特異的エンハンサーエレメントなどが存在し遺伝子発現調節に関与しているような可能性も考えられる。
【００５２】
２−６−５．ＭＳ１ａ（０１０６Ｇ０６）（１ｑ４１上）
マイクロサテライトマーカー０１０６Ｇ０６を中心とする約４００ｋｂにはＬＯＣ１２８１５３及びＵＢＢＰ２という２つの既知の遺伝子が含まれる（図２１）。ＳＮＰタイピングの結果、３０個のＳＮＰについてケース・コントロール相関解析を行ったところ、ＳＮＰ＃１９−２２、２３−２５及び３０が対ＡＮで相関を示した（図２３及び２４）。これらのＳＮＰはハプロタイプブロックを形成しており（Ｂｌｏｃｋ４及び５；図２５）、Ｂｌｏｃｋ４についてはＧ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ、Ｂｌｏｃｋ５についてはＴ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇのハプロタイプが対ＥＤ，対ＡＮ，対ＡＮ−Ｒで相関を示した。
【００５３】
２−６−６．ＭＳ５ａ（０５１２Ｅ０９）（５ｐ１５上）
マイクロサテライトマーカー０５１２Ｅ０９を中心とする約４００ｋｂにはカドヘリン１８（ＣＤＨ１８）という既知の遺伝子が含まれる（図２２）。ＳＮＰタイピングの結果、２７個のＳＮＰについてケース・コントロール相関解析を行ったところ、ＳＮＰ＃１１対ＡＮ（ＡＮ−Ｒではない）で相関を示し、ＳＮＰ＃１４、１５が対ＢＮで相関を示した（図２３及び２６）。これらのＳＮＰはハプロタイプブロックを形成していたが（図２７及び２８）、ハプロブロックと疾患との間に相関はみられなかった。
【００５４】
２−６−７．ＭＳ１６ａ（１６０３Ｇ０４）（１６ｑ１２上）
マイクロサテライトマーカー１６０３Ｇ０４を中心とする約４００ｋｂにはＬＯＣ３８８２７７、ＬＯＣ２８３８５４及びＴＮＲＣ９という３つの既知の遺伝子が含まれる（図２９）。ＳＮＰタイピングの結果、３３個のＳＮＰについてケース・コントロール相関解析を行ったところ、ＳＮＰ＃４、１０、１１、１４、１８−２１、２３−２５が対ＡＮ（又はＡＮ−Ｒ）で相関を示した（図３１及び３２）。これらのＳＮＰはハプロタイプブロックを形成しており（図３３のＢｌｏｃｋ４及び図３４のＢｌｏｃｋ５）、Ｂｌｏｃｋ４についてはＣ−Ｔ−Ｇ−Ａのハプロタイプが対ＡＮ−Ｒで相関を示し、Ｂｌｏｃｋ５についてはＧ−Ｇのハプロタイプが対ＥＤ，対ＡＮ，対ＡＮ−Ｒで相関を示した。
【００５５】
２−６−８．ＭＳ１ｃ（０１１７Ｈ０９）（１ｑ３２上）
マイクロサテライトマーカー０１１７Ｈ０９を中心とする約４００ｋｂにはＮＲ５Ａ、ＬＯＣ３３９５２１、ＬＯＣ３９１１５０及びＺＮＦ２８１という４つの既知の遺伝子が含まれる（図３０）。ＳＮＰタイピングの結果、４６個のＳＮＰについてケース・コントロール相関解析を行ったところ、ＳＮＰ＃７、３３、３７−３８、４１−４３が対ＡＮ（又はＡＮ−Ｒ）で相関を示した（図３１及び３５）。これらのＳＮＰはハプロタイプブロックを形成しており（図３６のＢｌｏｃｋ１及び図３７のＢｌｏｃｋ８）、Ｂｌｏｃｋ１についてはＧ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａのハプロタイプが、Ｂｌｏｃｋ８についてはＴ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔのハプロタイプが対ＡＮ−Ｒで相関を示した。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ＭＳ１１ａ（１１０５Ｄ１２）領域、ＭＳ１ｂ（０１０５Ｇ０７）領域、ＭＳ１１ｂ（１１０９Ｄ０２）領域及びＭＳ１８ａ（１８０２Ｂ０６）領域において摂食障害と関連性を示したＳＮＰのＳＮＰ名、ｄｂＳＮＰ、ＡＢＩアッセイＩＤ、ＪＳＮＰ ＩＤおよびＣｅｌｅｒａ ＲｅｆＳＮＰ ＩＤを示す表である。
【図２】摂食障害（拒食症）感受性マーカーの同定手順を示す説明図である。
【図３】１１個の摂食障害（拒食症）感受性マーカーの染色体上の位置を示す図である。
【図４】マイクロサテライトマーカー１１０５Ｄ１２の染色体上の位置を示す図である。
【図５】ＭＳ１１ａ（１１０５Ｄ１２）領域における、ハプロブロック解析によって同定されたハプロブロックの位置を示す図である。
【図６】ＭＳ１１ａ（１１０５Ｄ１２）領域のＳＮＰ相関解析を行った結果を示す表である。
【図７】ＭＳ１１ａ（１１０５Ｄ１２）領域における、ハプロブロック解析を行った結果を示す図表である。
【図８】マイクロサテライトマーカー０１０５Ｇ０７の染色体上の位置を示す図である。
【図９】ＭＳ１ｂ（０１０５Ｇ０７）領域における、ハプロブロック解析によって同定されたハプロブロックの位置を示す図である。
【図１０】ＭＳ１ｂ（０１０５Ｇ０７）領域のＳＮＰ相関解析を行った結果を示す表である。
【図１１】ＭＳ１ｂ（０１０５Ｇ０７）領域における、ハプロブロック解析を行った結果を示す図表である。
【図１２】ＭＳ１ｂ（０１０５Ｇ０７）領域における、ハプロブロック解析を行った結果を示す図表である。
【図１３】マイクロサテライトマーカー１１０９Ｄ０２の染色体上の位置を示す図である。
【図１４】ＭＳ１１ｂ（１１０９Ｄ０２）領域における、ハプロブロック解析によって同定されたハプロブロックの位置を示す図である。
【図１５】ＭＳ１１ｂ（１１０９Ｄ０２）領域のＳＮＰ相関解析を行った結果を示す表である。
【図１６】ＭＳ１１ｂ（１１０９Ｄ０２）領域における、ハプロブロック解析を行った結果を示す図表である。
【図１７】マイクロサテライトマーカー１８０２Ｂ０６の染色体上の位置を示す図である。
【図１８】ＭＳ１８ａ（１８０２Ｂ０６）領域における、ハプロブロック解析によって同定されたハプロブロックの位置を示す図である。
【図１９】ＭＳ１８ａ（１８０２Ｂ０６）領域のＳＮＰ相関解析を行った結果を示す表である。
【図２０】ＭＳ１８ａ（１８０２Ｂ０６）領域における、ハプロブロック解析を行った結果を示す図表である。
【図２１】マイクロサテライトマーカー０１０６Ｇ０６の染色体上の位置を示す図である。
【図２２】マイクロサテライトマーカー０５１２Ｅ０９の染色体上の位置を示す図である。
【図２３】ＭＳ１ａ（０１０６Ｇ０６）領域及びＭＳ５ａ（０５１２Ｅ０９）領域における、ハプロブロック解析によって同定されたハプロブロックの位置を示す図である。
【図２４】ＭＳ１ａ（０１０６Ｇ０６）領域のＳＮＰ相関解析を行った結果を示す表である。
【図２５】ＭＳ１ａ（０１０６Ｇ０６）領域における、ハプロブロック解析を行った結果を示す図表である。
【図２６】ＭＳ５ａ（０５１２Ｅ０９）領域のＳＮＰ相関解析を行った結果を示す表である。
【図２７】ＭＳ５ａ（０５１２Ｅ０９）領域における、ハプロブロック解析を行った結果を示す図表である。
【図２８】ＭＳ５ａ（０５１２Ｅ０９）領域における、ハプロブロック解析を行った結果を示す図表である。
【図２９】マイクロサテライトマーカー１６０３Ｇ０４の染色体上の位置を示す図である。
【図３０】マイクロサテライトマーカー０１１７Ｈ０９の染色体上の位置を示す図である。
【図３１】ＭＳ１６ａ（１６０３Ｇ０４）領域及びＭＳ１ｃ（０１１７Ｈ０９）領域における、ハプロブロック解析によって同定されたハプロブロックの位置を示す図である。
【図３２】ＭＳ１６ａ（１６０３Ｇ０４）領域のＳＮＰ相関解析を行った結果を示す表である。
【図３３】ＭＳ１６ａ（１６０３Ｇ０４）領域における、ハプロブロック解析を行った結果を示す図表である。
【図３４】ＭＳ１６ａ（１６０３Ｇ０４）領域における、ハプロブロック解析を行った結果を示す図表である。
【図３５】ＭＳ１ｃ（０１１７Ｈ０９）領域のＳＮＰ相関解析を行った結果を示す表である。
【図３６】ＭＳ１ｃ（０１１７Ｈ０９）領域における、ハプロブロック解析を行った結果を示す図表である。
【図３７】ＭＳ１ｃ（０１１７Ｈ０９）領域における、ハプロブロック解析を行った結果を示す図表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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