(57)【要約】【課題】組織由来幹細胞と赤血球とを含む細胞懸濁液から、簡易かつ迅速に赤血球を除去する。【解決手段】組織由来幹細胞Ｃおよび赤血球Ｂを含む細胞懸濁液Ａを流動させる流路３を備え、該流路３の底面３ａに、組織由来幹細胞Ｃの粒径より狭く、赤血球Ｂの粒径より大きな複数の凹部６が設けられている組織由来幹細胞Ｃの分離装置を提供する。【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織由来幹細胞および赤血球を含む細胞懸濁液を流動させる流路を備え、
該流路の底面に、組織由来幹細胞の粒径より狭く、赤血球の粒径より大きな複数の凹部が設けられている組織由来幹細胞の分離装置。
【請求項２】
前記凹部が、前記細胞懸濁液の流通方向に交差する方向に延び、組織由来幹細胞の粒径より狭く、赤血球の粒径より大きな溝幅を有する溝であり、流通方向に間隔をあけて複数配置されている請求項１に記載の組織由来幹細胞の分離装置。
【請求項３】
前記溝の溝幅が、前記流路に面する開口部におけるより、深さ方向に進行した位置において広く形成されている請求項２に記載の組織由来幹細胞の分離装置。
【請求項４】
前記凹部が、多数の孔である請求項１に記載の組織由来幹細胞の分離装置。
【請求項５】
前記孔が流通方向に交差する方向に間隔をあけて形成された孔列を流通方向に間隔をあけて複数配置され、
各列の孔の位置が流通方向に交差する方向にずれて配置されている請求項３に記載の組織由来幹細胞の分離装置。
【請求項６】
前記孔の口径が、前記流路に面する開口部におけるより、深さ方向に進行した位置において大きく形成されている請求項５または請求項５に記載の組織由来幹細胞の分離装置。
【請求項７】
組織由来幹細胞および赤血球を含む細胞懸濁液を、底面に組織由来幹細胞の粒径より狭く、赤血球の粒径より大きな複数の凹部が設けられている流路に流動させる組織由来幹細胞の分離方法。
【請求項８】
組織由来幹細胞および赤血球を含む細胞懸濁液を、底面に組織由来幹細胞の粒径より狭く、赤血球の粒径より大きな複数の凹部が設けられている容器内に貯留し、
所定時間経過後に細胞懸濁液を流動させる組織由来幹細胞の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織由来幹細胞の分離装置および分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体組織を分解して得られる組織由来幹細胞から赤血球を分離除去する装置として、赤血球より大きく組織由来幹細胞より小さい網目を有するフィルタを備えたものが知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特開平４−６４６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の装置は、フィルタに細胞懸濁液を一方向に通過させることにより、細胞懸濁液内に含有される組織由来幹細胞をフィルタに捕捉させ、それより小さい赤血球を透過させるので、フィルタに捕捉された組織由来幹細胞を回収するには、フィルタに対して逆方向に洗浄液を流通させる工程を行う必要があり、手続きが煩雑であるという問題がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、組織由来幹細胞と赤血球とを含む細胞懸濁液から、簡易かつ迅速に赤血球を除去することができる組織由来幹細胞の分離装置および分離方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、組織由来幹細胞および赤血球を含む細胞懸濁液を流動させる流路を備え、該流路の底面に、組織由来幹細胞の粒径より狭く、赤血球の粒径より大きな複数の凹部が設けられている組織由来幹細胞の分離装置を提供する。
本発明によれば、流路に沿って組織由来幹細胞および赤血球を含む細胞懸濁液を流動させると、流路の底面に設けられた複数の凹部内に赤血球が入り込んで捕捉され、凹部より粒径が大きな組織由来幹細胞は凹部に入ることなく流動し続ける。したがって、流路を流動する間に、細胞懸濁液内の赤血球を除外し、組織由来幹細胞のみを分離回収することが可能となる。
【０００７】
上記発明においては、前記凹部が、前記細胞懸濁液の流通方向に交差する方向に延び、組織由来幹細胞の粒径より狭く、赤血球の粒径より大きな溝幅を有する溝であり、流通方向に間隔をあけて複数配置されている構成としてもよい。
このように構成することで、流動中の細胞懸濁液は流通方向に交差する方向に延びる溝からなる凹部を必ず横切ることとなるので、赤血球を効率よく捕捉することができる。また、溝を流通方向に間隔をあけて複数設けることにより、赤血球を捕捉する確率をさらに向上して、効率的に組織由来幹細胞を分離回収することができる。
【０００８】
また、上記発明においては、前記溝の溝幅が、前記流路に面する開口部におけるより、深さ方向に進行した位置において広く形成されていてもよい。
このように構成することで、溝内に一旦捕捉された赤血球が溝外に流れ出にくくすることができ、組織由来幹細胞からより確実に赤血球を分離することができる。
【０００９】
また、上記発明においては、前記凹部が、多数の孔である構成としてもよい。
このように構成することで、凹部が溝である場合と同様に、流動中の細胞懸濁液内に含まれる赤血球が孔内にそれぞれ入り込んで捕捉され、孔より大きな粒径の組織由来幹細胞については捕捉されることなく流動し続ける。したがって、細胞懸濁液から赤血球を除去して組織由来幹細胞を分離回収することができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記孔が流通方向に交差する方向に間隔をあけて形成された孔列を流通方向に間隔をあけて複数配置され、各列の孔の位置が流通方向に交差する方向にずれて配置されている。
このように構成することで、流動する細胞懸濁液内の赤血球が孔に遭遇する確率を向上し、より確実に捕捉して分離除去することができる。流動方向から見て、単一の孔列においては孔と孔との間に隙間が存在するが、その隙間の延長線上に他の孔列の孔が存在していれば、隙間を通り抜けた赤血球を他の孔で捕捉することができる。例えば、孔が千鳥配列されていればよい。
【００１１】
また、上記発明においては、前記孔の口径が、前記流路に面する開口部におけるより、深さ方向に進行した位置において大きく形成されている構成としてもよい。
このように構成することで、孔内に一旦捕捉された赤血球が孔外に流れ出にくくすることができ、組織由来幹細胞からより確実に赤血球を分離することができる。
【００１２】
また、本発明は、組織由来幹細胞および赤血球を含む細胞懸濁液を、底面に組織由来幹細胞の粒径より狭く、赤血球の粒径より大きな複数の凹部が設けられている流路に流動させる組織由来幹細胞の分離方法を提供する。
本発明によれば、流路に沿って組織由来幹細胞および赤血球を含む細胞懸濁液を流動させると、流路の底面に設けられた複数の凹部内に赤血球が入り込んで捕捉され、凹部より粒径が大きな組織由来幹細胞は凹部に入ることなく流動し続ける。したがって、流路を流動する間に、細胞懸濁液内の赤血球を除外し、組織由来幹細胞のみを分離回収することが可能となる。
【００１３】
また、本発明は、組織由来幹細胞および赤血球を含む細胞懸濁液を、底面に組織由来幹細胞の粒径より狭く、赤血球の粒径より大きな複数の凹部が設けられている容器内に貯留し、所定時間経過後に細胞懸濁液を流動させる組織由来幹細胞の分離方法を提供する。
本発明によれば、容器内に細胞懸濁液を貯留して静置することにより、細胞懸濁液に含まれる組織由来幹細胞および赤血球が沈降し、赤血球が容器の底面に設けられた凹部内に入り込む。一方、組織由来幹細胞は凹部より大きい粒径を有しているので、凹部内に入り込むことができず、凹部外に配置される。したがって、所定時間経過後に細胞懸濁液を流動させると、赤血球が凹部に捕捉された状態に維持され、凹部外に配されている組織由来幹細胞が、赤血球から分離されて回収されることになる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、組織由来幹細胞と赤血球とを含む細胞懸濁液から、簡易かつ迅速に赤血球を除去することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の一実施形態に係る組織由来幹細胞の分離装置および分離方法について、図１〜図  を参照して説明する。
本実施形態に係る組織由来幹細胞の分離装置１は、図１に示されるように、組織由来幹細胞、例えば、脂肪由来幹細胞と赤血球とを含む細胞懸濁液Ａを貯留する第１の容器２と、該第１の容器２に接続された流路部材３と、該流路部材３に接続された第２の容器４とを備えている。
【００１６】
第１の容器２と流路部材３との間には、バルブ５が設けられ、該バルブ５が開放されると、第１の容器２から細胞懸濁液Ａが流路部材３に流入して流動し、バルブ５が閉じられることにより、細胞懸濁液Ａの流動が停止するようになっている。
【００１７】
流路部材３は、図２に示されるように、平坦な底面３ａを有する管状の部材であって、第１の容器２側から第２の容器４側（流通方向）に向かって漸次下降して配置されている。前記底面３ａには、流路部材の長手方向に間隔をあけて、該長手方向に直交する方向に延びる複数の溝６が形成されている。
【００１８】
これらの溝６は、例えば、８μｍの溝幅寸法を有している。
また、溝６の深さ寸法は、８μｍ以上に設定されている。
例えば、脂肪組織から分離した細胞の粒径分布を測定すると、８μｍ以下と、１０〜１５μｍの間に特徴的にピークが得られる。血球系の細胞は８μｍ以下であり、幹細胞は１０〜１５μｍのピークに存在しているため、８μｍ以下の細胞を除去することにより脂肪組織由来幹細胞を分離回収することができることになる。
【００１９】
バルブ５を開くことにより、第１の容器２から流路部材３に流入して該流路部材３中を流動する細胞懸濁液Ａの流速は、遅ければ遅いほど好ましい。例えば、流速０．１〜１００ｍｍ／ｓｅｃ、好ましくは１から５０ｍｍ／ｓｅｃ、より好ましくは１０〜２０ｍｍ／ｓｅｃで流動させるようになっている。
【００２０】
このように構成された本実施形態に係る組織由来幹細胞の分離装置１を用いた分離方法について以下に説明する。
第１の容器２に細胞懸濁液Ａを貯留し、バルブ５を開放することにより、流路部材３内に細胞懸濁液Ａを流入させ、流路部材３の底面３ａ上において細胞懸濁液Ａをゆっくりと流動させる。
【００２１】
細胞懸濁液Ａに含まれている細胞群は細胞懸濁液Ａが流路部材３の底面３ａ上をゆっくりと流動する間に沈降して、流路部材３の底面３ａに接触しながら流動していく。流路部材３の底面３ａには複数の溝６が形成され、各溝６の溝幅寸法が８μｍに設定されているので、図３に示されるように、８μｍ以下の粒径を有する赤血球Ｂは溝６内に落下し、１０μｍ以上の粒径を有する脂肪由来幹細胞Ｃは、溝６に落下することなく流動し続ける。
【００２２】
その結果、細胞懸濁液Ａが流路部材３を流動している間に細胞懸濁液Ａ内の赤血球Ｂが溝６に捕捉されて行き、残った脂肪由来幹細胞Ｃが溝６に捕捉されることなく第２の容器４まで流動していく。特に、流路部材３には、細胞懸濁液Ａの流動方向に間隔をあけて複数の溝６が設けられているので、細胞懸濁液Ａ内の赤血球Ｂは高い確率でいずれかの溝６に捕捉されて脂肪由来幹細胞Ｃから分離除去される。これによって、細胞懸濁液Ａ中から脂肪由来幹細胞Ｃを高純度に分離回収することができる。
【００２３】
なお、本実施形態においては、流動部材３の平坦な底面３ａに、赤血球Ｂの粒径より広く脂肪由来幹細胞Ｃの粒径より狭い溝幅の複数の溝６を流動方向に間隔をあけて複数配列することにしたが、これに代えて、図４に示されるように、円管状の流路部材３の内面に周方向に延びる複数の溝６を長手方向に間隔をあけて複数設けることにしてもよい。
【００２４】
また、流動方向に複数配列された溝６に代えて、図５に示されるように、８μｍ以下の直径および深さを有する複数の孔７を形成してもよい。この場合には、図５に示されるように複数の孔７を隙間なく配列することにしてもよいし、図６に示されるように、千鳥配置して、流動方向から見て隙間をなくすことにしてもよい。
【００２５】
また、上記溝６または孔７からなる凹部（以下、凹部６，７という。）においては、図７および図８に示されるように、流路部材３の底面３ａにおける開口部よりも内側に向かって広くなる形状を有していることが好ましい。このようにすることで、凹部６，７内に一旦捕捉された赤血球Ｂを凹部６，７から飛び出さないように捕捉することが可能となる。
【００２６】
また、本実施形態においては、２つの容器２，４と、これらの容器２，４を接続する流路部材３とを有する構成を採用したが、図９に示されるように、遠心分離に使用される遠沈管１０の内面に、周方向に沿って延びる複数の溝１１を形成することにしてもよい。
このようにすることで、遠心分離により分離された細胞を含む細胞懸濁液Ａを遠沈管１０からその内面を伝って流動させつつ排出することにより、赤血球Ｂを溝１１に捕捉分離して、高純度の脂肪由来幹細胞Ｃを流出させることができるという利点がある。
【００２７】
また、本実施形態においては、凹部６，７を設けた流路部材３に沿って、細胞懸濁液Ａを流動させることにより脂肪由来幹細胞Ｃを高純度に分離回収することとしたが、これに代えて、以下の分離方法を採用することにしてもよい。すなわち、底面に凹部６，７を有する任意の容器内に細胞懸濁液Ａを貯留し、所定時間静置することにより、赤血球Ｂおよび脂肪由来幹細胞Ｃを沈降させた後、容器をゆっくりと傾けて、容器内から細胞懸濁液を流出させることにより、凹部６，７内に赤血球Ｂを捕捉し、脂肪由来幹細胞Ｃのみを分離回収することにしてもよい。
【００２８】
また、本実施形態においては、脂肪組織由来の幹細胞Ｃを分離回収する場合を例示して説明したが、これに代えて、赤血球Ｂより大きい他の任意の組織由来幹細胞Ｃの分離回収に適用することにしてもよい。
また、溝６および孔７の形状は任意でよい。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の一実施形態に係る組織由来幹細胞の分離装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の組織由来幹細胞の分離装置の流路部材を説明する斜視図である。
【図３】図１の組織由来幹細胞の分離装置の作用を説明する図である。
【図４】図２の流路部材の第１の変形例を示す斜視図である。
【図５】図２の流路部材の第２の変形例を示す斜視図である。
【図６】図２の流路部材の第３の変形例を示す斜視図である。
【図７】図２の流路部材の凹部の第１の変形例を示す縦断面図である。
【図８】図２の流路部材の凹部の第２の変形例を示す縦断面図である。
【図９】本発明の分離装置を適用した遠沈管を示す縦断面図である。
【符号の説明】
【００３０】
Ａ  細胞懸濁液
Ｂ  赤血球
Ｃ  脂肪由来幹細胞（組織由来幹細胞）
１  分離装置
３  流路部材（流路）
３ａ  底面
６  溝（凹部）
７  孔（凹部）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008212022.tif 000009
【図８】
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【図９】
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