(57)【要約】【課題】造血幹細胞移植療法を施行する及び／又は施行した患者の病態の把握方法及びその把握用キットを提供する。【解決手段】前記把握方法では、フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）切断酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）の量及び／又は酵素活性（好ましくは、更にｖＷＦの量）を分析する。前記把握用キットは、ＡＤＡＭＴＳ１３に特異的に結合する抗体又はその断片を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞移植療法を施行する及び／又は施行した患者において、フォンヴィルブランド因子切断酵素の量及び／又は酵素活性を分析することを特徴とする、病態の把握方法。
【請求項２】
フォンヴィルブランド因子切断酵素の量の分析を、フォンヴィルブランド因子切断酵素に特異的に結合する抗体又はその断片を使用する免疫学的手法により行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フォンヴィルブランド因子切断酵素の酵素活性の分析を、フォンヴィルブランド因子又はその断片を使用することにより行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
フォンヴィルブランド因子切断酵素に特異的に結合する抗体又はその断片を含む、造血幹細胞移植療法を施行する及び／又は施行した患者の病態の把握用キット。
【請求項５】
フォンヴィルブランド因子又はその断片を含む、造血幹細胞移植療法を施行する及び／又は施行した患者の病態の把握用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞移植療法を施行する及び／又は施行した患者の病態把握方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞移植はすでに定着した治療方法であり、患者にとっては治療法の選択肢の１つになっている。現在では同種骨髄移植、自己骨髄移植、同種末梢血幹細胞移植と自己末梢血幹細胞移植を合わせると、全世界で年間２００００例を超える移植が行われている。造血幹細胞移植の著しい増加は、主として骨髄非破壊的前処置による移植（いわゆるミニ移植）の普及、移植の適応基準の緩和、特に患者の適応年齢の上限の引き上げと適応疾患の拡大によるものである。移植の結果は、移植前の治療、疾患の種類と進展状態、患者の年齢、ドナーと患者間の組織適合性、ドナーと患者の性別、組織適合抗原（ＨＬＡ）に対するドナーの同種感作の有無、ドナーの年齢、患者の全身状態などによって決まる。
【０００３】
移植の治療原理としては、以下に述べる４つの効果を期待し、これを実施する。第１に、造血幹細胞輸注により抗がん剤等の大量化学療法が可能とすることができること、第２に、量的あるいは質的に異常のある造血系・リンパ系幹細胞を健常なものに置換することができること、第３に、造血幹細胞は同種抗原に対して反応するリンパ球を生成するので、移植片対白血病効果が期待でき、この効果により白血病の再発を抑制する免疫療法としての効果が挙げられること、将来的ではあるが第４に、或る遺伝子導入細胞を移植に用いる場合であるが、これにより自己複製能をもたせ、終生導入した遺伝子を機能させることである。
【０００４】
造血幹細胞移植に関連する諸問題は実に多岐に及んでおり、代表的なものとしては移植前治療法の副作用、移植された幹細胞の生着不全、原疾患の再発、移植片対宿主病（graft-versus-host disease；ＧＶＨＤ）、感染症、遅発性合併症などが挙げられる。移植のため来院した患者は、原疾患の寛解導入のために、すでに強力な治療を受けている。患者はさらに移植の前治療として、強力な免疫抑制作用と細胞毒性のある薬物の投与を受け、抗生物質やＧＶＨＤの予防薬を投与されている。これらの治療は全て臓器に障害を起こし得る。特に、これらの薬物が同時に投与されると毒性は増強され、単一臓器だけでなく多臓器に影響が及ぶ。このように造血幹細胞移植の症例では、移植に関連する合併症、多臓器不全をはじめとして、致命的な病態に進展する可能性を常にはらんでおり、移植技術が進んだ近年においても生命予後不良の転帰をたどる患者が後をたたない。
【０００５】
造血幹細胞移植の施行前後に際しては組織適合性検査、生着確認のためのマーカー、悪性腫瘍の進展段階の評価、各種分子マーカーあるいは肝機能、肺機能、心電図などによる臓器機能検査などが行われるが、前記のように種々の合併症を引き起こし、複合的に病態を形成するファクターが存在する経過不良症例においては、それを完全に把握し治療につなげることができる検査方法は未だ確立されていない。
【０００６】
一方、フォンヴィルブランド因子（von Willebrand factor；以下、ｖＷＦと称する）切断酵素［以下、ＡＤＡＭＴＳ１３（ｖＷＦ切断酵素の別称）と称する］は、元来、血栓性血小板減少性紫斑病（thrombotic thrombocytopenic purpura；以下、ＴＴＰと称する）の発症に関与することが示唆され、血漿からｖＷＦ切断酵素が精製され（非特許文献１）、ｃＤＮＡクローニングによりその遺伝子が決定された（非特許文献２）。ＴＴＰでは細小動脈に血小板の凝集塊（血小板血栓）が形成され、血管内に狭くなった部位を多数生じる。ここを無理に通過した赤血球は機械的に破砕されるため溶血が起こる。これをはじめとし、各臓器の虚血、あるいは梗塞性障害などによる多彩な症状を惹起し、ＴＴＰは非常に重篤な致死率の高い病態を形成する。現在までに先天性ＴＴＰについてはＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子変異の報告（非特許文献３）がなされ、また後天性ＴＴＰではＡＤＡＭＴＳ１３に対するＩｇＧ型のインヒビターができることが報告されている（非特許文献４）。血中に放出されて間もない超巨大分子ｖＷＦマルチマー（ultra large vWF multimer；ＵＬ−ｖＷＦＭ）は末梢細小動脈や毛細血管などに移行すると、そこでは絶えず「高ずり応力」が生じており伸展構造に転じると推定されている。この伸展構造のｖＷＦはＡＤＡＭＴＳ１３の酵素作用を受けやすく、正常人では速やかに切断されるが、先天性あるいは後天性ＴＴＰではＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性が欠如し、ＵＬ−ｖＷＦＭを切断することができず、これを起点として血小板凝集塊が形成され、末梢での動脈血栓とともにＴＴＰを来たすと考えられている。実際、ＴＴＰの治療法としては、特に後天性・特発性ＴＴＰにおいては血漿交換（plasma exchange；ＰＥ）療法が第一選択でありこれにより救命される患者も多く、その有用性が認められている。このことからもＡＤＡＭＴＳ１３の欠如とＴＴＰ発症は密接に連関し、ＴＴＰの病因としては現在疑うべくもない。
【０００７】
ここで、造血幹細胞移植後に先に述べたＴＴＰ様の病態として血栓性微小血管症（thrombotic microangiopathy；ＴＭＡ）といわれる症状が高頻度に出現し、移植後の予後に影響する因子として注目されている。造血幹細胞移植に関連したＴＭＡは、その症状や標的臓器が急性ＧＶＨＤと同様であり、また両者が合併することも多いことが知られている。ＴＭＡの発症には、移植前の強力な前処置、ＧＶＨＤ、ＧＶＨＤ予防のための免疫抑制剤、ウイルス感染等の多岐にわたる因子が関与し、病態的には、ＴＭＡの発症の引き金になるのは、血管内皮傷害に基づく微小血管の血小板血栓形成と考えられている。血管内皮傷害をきたす原因としては、移植前処置としての大量の抗がん剤、放射線、シクロスポリンやタクロリムス等の免疫抑制剤、急性ＧＶＨＤ等が挙げられる。これらにより傷害をうけ血小板血栓が形成され、それに伴って、通過する赤血球の破砕、溶血が生じ、また各臓器の虚血による多彩な症状が惹起される。
【０００８】
しかし、造血幹細胞移植に関連したＴＭＡはその病態こそＴＴＰに非常に酷似しているが、ＡＤＡＭＴＳ１３との関連という点においては未だ議論の域をでない。実際、同種骨髄幹細胞移植施行後の患者におけるＴＭＡ合併例ではそのＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性が健常人コントロールと有意差を認めず（非特許文献５）、また同種骨髄幹細胞移植施行後のＴＭＡが疑われる患者においてＰＥを施行したところその治療効果が得られず、患者１７名に対しわずか１名しか救命できなかったとの報告もある（非特許文献６）。恐らくは造血幹細胞移植後に発症するＴＭＡにはＡＤＡＭＴＳ１３が直接関与するものとその病態形成への関与は希薄なものとの２通りが考えられると思われる。
【０００９】
【非特許文献１】ケー・フジカワ（K. Fujikawa）ら，「ブラッド（Blood）」,（米国），２００１年，第９８巻，ｐ．１６６２−６
【非特許文献２】ケー・ソエジマ（K. Soejima）ら，「ザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（The Journal of Biochemistry）」，２００１年，第１３０巻，ｐ．４７５−８０
【非特許文献３】コカメ・ケー（Kokame K）ら，「Proc Natl Acad Sci USA」，２００２年，第９９巻，ｐ．１１９０２−１１９０７
【非特許文献４】エム・フルラン（M.Furlan）ら，「N Engl J Med」，１９９８年，第３３９巻，ｐ．１５７８−１５８４
【非特許文献５】片桐尚子ら，「臨床病理」，（日本），２００３年，第６巻５１，ｐ．５１６−２１
【非特許文献６】ロイ・ブイ（Roy.V）ら，「Bone Marrow Transplant」,（米国），２００１年，第２７巻，ｐ．６４１−６４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
前記のように、現在のところ造血幹細胞移植に関連した問題は多岐に渡っており、その病態をできるだけ早期に把握することは極めて重要なことである。現在は各種既存マーカー測定値を使用した診断及び臨床所見などにより患者の病態や症状を診察するが、重篤な病態への進展を把握し、これを的確にモニタリングする上ではまだまだ不充分である。また、病態のメカニズムやその成因となる物質はすべて解明されたわけではなく、生命予後不良の転帰をとる患者が後を絶たない。造血幹細胞移植療法を施行する及び／又は施行した患者において、このように重篤な症状に陥る可能性のある患者をいち早く察知し適切な治療を早期に行うことにより、多臓器不全を含む重度な進展病態を防御することができる可能性も考えられる。
【００１１】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、造血幹細胞移植療法を行った患者においてＡＤＡＭＴＳ１３量（濃度）とＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性の一方又はそれらを組み合わせて測定することにより、それぞれの量が予後（死亡の転帰例あるいは治療奏効例）と密接に関連し、また造血幹細胞移植特有の移植治療関連毒性（regimen related toxicity：ＲＲＴ）、急性ＧＶＨＤなどの病態の程度、重篤な敗血症、これらの合併症による多臓器不全を含む重度な進展病態を表す指標として極めて有用であることを見出した。先にも述べた造血幹細胞移植に際してのいくつかの諸問題（例えば移植前療法の副作用）に関しＡＤＡＭＴＳ１３の血液中濃度及びその酵素活性が、とりわけ特異的な挙動を示し、常に病態の進行あるいは改善に極めて鋭敏に追随することを今回新たに発見した。これらのことは種々の血液疾患や腫瘍性疾患を基礎疾患とし、それに対して造血幹細胞移植療法を行う場合において、全身の血液中ＡＤＡＭＴＳ１３が何らかのダウンレギュレーションを受け血栓素因傾向が高まる中で、その程度により予後良好と不良が決定されることが少なからず示唆できるものである。今回得られた事実をもとにＡＤＡＭＴＳ１３濃度及び活性を造血幹細胞移植の前後において常にモニタリングすることが、重篤な病態へ進行することの予測と予後の管理に極めて有用であるという知見を得、ここに本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明の課題は、臨床所見や従来のマーカーだけからでは不充分であった造血幹細胞移植療法を施行する及び／又は施行した患者の病態をより的確に把握することのできる方法及びキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題は、本発明による、造血幹細胞移植療法を施行する及び／又は施行した患者において、フォンヴィルブランド因子切断酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）の量（濃度）及び／又は酵素活性を分析することを特徴とする、病態の把握方法により解決することができる。
本発明の検出方法の好ましい態様によれば、ＡＤＡＭＴＳ１３量の分析を、ＡＤＡＭＴＳ１３に特異的に結合する抗体又はその断片を使用する免疫学的手法により行う。
本発明の検出方法の別の好ましい態様によれば、ＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性の分析を、フォンヴィルブランド因子又はその断片を使用することにより行う。
また、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３に特異的に結合する抗体若しくはその断片、又はフォンヴィルブランド因子若しくはその断片を含む、造血幹細胞移植療法を施行する及び／又は施行した患者における病態の検出用キットに関する。
【００１４】
本明細書における用語「分析」には、分析対象物質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量（濃度）又は活性を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。
【発明の効果】
【００１５】
造血幹細胞移植の前後において、ＡＤＡＭＴＳ１３の量（濃度）及び／又は酵素活性を測定しそこから得られた測定値は、そのときの患者の全身状態を正確に反映するので、予後の管理及びモニタリングとして非常に有用である。また、多臓器不全の発症などを伴う重篤な症状に陥る可能性のある患者をいち早く察知することを可能としたものであり、その臨床的価値は非常に高いものと考える。本発明によれば、簡便性、迅速性、及び特異性に優れた造血幹細胞移植療法を施行する及び／又は施行した患者の病態の把握が可能となる。これは例えば各種マーカーあるいは臨床所見からＴＭＡの臨床診断を下すことに加えて、それがどの程度重篤で危険な状況かを直接的に診断することが可能となる。このことは逆に造血幹細胞移植後に施された或る治療法が奏効し、結果としてその経過が順調であることを確認しうる指標にもなりえる。
【００１６】
また、後述する実施例より、病態の悪化する成因として“ＡＤＡＭＴＳ１３の著減”が示唆でき、ＡＤＡＭＴＳ１３を増やす、あるいは減らさないような治療方法［新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）の輸注、血漿交換など］を行えば病状の悪化を食い止められる可能性が考えられる。ここで重要なのは恐らくＡＤＡＭＴＳ１３補充のタイミングであり、ＡＤＡＭＴＳ１３測定値に基づいた治療を施行することが好ましいと推定される。適切な補充のタイミングを失してしまえば、これらの治療効果が充分に発揮されず、患者を死亡の転機におとしめてしまう可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
［１］本発明の把握方法
本発明方法では、ＡＤＡＭＴＳ１３の量（濃度）又はその酵素活性の少なくとも一方を分析（好ましくは測定又は定量）し、健常人のＡＤＡＭＴＳ１３の量（濃度）又はその酵素活性と比較することにより、あるいは、量（濃度）及び活性を経時的に測定又は定量することにより、造血幹細胞移植療法を施行する及び／又は施行した患者における病態の把握を行うことができる。
本発明方法は、（１）被検試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の量（濃度）又は酵素活性を分析する工程、及び（２）前記分析値を健常人の値と比較する工程を含むことができる。
あるいは、本発明方法は、（１）被検試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の量（濃度）又は酵素活性を経時的に分析する工程、及び（２）前記分析値の経時的傾向を解析する工程を含むことができる。
【００１８】
本明細書において「フォンヴィルブランド因子切断酵素（ｖＷＦ切断酵素）」とは、フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）のＡ２ドメインに存在するチロシン（８４２）とメチオニン（８４３）を特異的に切断し、ＡＤＡＭＴＳ１３とも称されるメタロプロテアーゼである。
【００１９】
本発明方法では、健常人と比較して、ＡＤＡＭＴＳ１３の量（濃度）及び／又はその酵素活性の低下を指標とすることができる。また、本発明方法では、ＡＤＡＭＴＳ１３の量（濃度）及び／又は酵素活性を経時的に測定し、その減少傾向を指標とすることができる。
【００２０】
本発明方法では、ＡＤＡＭＴＳ１３濃度及び／又はその酵素活性を測定又は定量し、健常者の正常値範囲よりも低値を示す場合（例えば、閾値を超える場合）、あるいは、経時的にＡＤＡＭＴＳ１３の濃度及び／又は酵素活性を測定又は定量し、その測定値が減少傾向を示す場合には、造血幹細胞移植療法を施行する及び／又は施行した患者の予後の状態が非常に悪く、多臓器不全など致死的な病態の発症の危険性が高いと判定又は予測することができる。また、造血幹細胞移植に関わる各種症状［例えば、ＲＲＴ、ＧＶＨＤ、感染症、ＴＭＡ、及びこれら合併症］の重篤度が高いと判定することができ、各種症状（例えば、ＲＲＴ、ＧＶＨＤ、感染症、ＴＭＡ、及びこれら合併症）の予後の状態が不良であると予測することができる。
【００２１】
一方、ＡＤＡＭＴＳ１３濃度及び／又はその酵素活性が正常値範囲内である場合、あるいは、経時的にＡＤＡＭＴＳ１３の濃度及び／又は酵素活性を測定又は定量し、その測定値が増加傾向を示す場合には、造血幹細胞移植療法を行う患者の状態が非常に良く、移植療法が奏効しており、致死的な病態の発症が低いと判定又は予測することができる。また、造血幹細胞移植に関わる各種症状や合併症［例えば、ＲＲＴ、ＧＶＨＤ、感染症、ＴＭＡ］の重篤度が低いと判定することができ、各種症状や合併症［例えば、ＲＲＴ、ＧＶＨＤ、感染症、ＴＭＡ］の状態が良好であると予測することができる。
【００２２】
本発明方法を適用することのできる対象（被験者）としては、造血幹細胞移植療法を施行する及び／又は施行した患者である。造血幹細胞移植の対象疾患としては、例えば、後天性の悪性疾患、後天性の非悪性疾患、先天性疾患としての免疫不全疾患、血液疾患、それ以外の疾患を挙げることができる。後天性の悪性疾患として、例えば、急性骨髄芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群、非Hodgkinリンパ腫、Hodgkin病、多発性骨髄腫、骨髄線維症、有毛細胞白血病、神経芽細胞腫、乳がん、他の固形腫瘍などが挙げられる。後天性の非悪性疾患として、例えば、再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿症、真性赤血球系無形成症、後天性免疫不全症候群、自己免疫疾患、好酸球増多症候群、アミロイドーシスなどが挙げられる。先天性疾患のなかで免疫不全疾患として、例えば、重症複合免疫不全症、複合免疫不全症（細網異形成症、軟骨毛低形成症、不全リンパ球症候群）、白血球粘着不全症、アクチン欠損症、Omenn症候群、Griscelli症候群、高IgM症候群などが挙げられる。血液疾患として、例えば、Wiscott-Aldrich症候群、Fanconi貧血、Blackfan-Diamond貧血、サラセミア、鎌状赤血球症、Glanzman血小板無力症、先天性無巨核芽球症、血小板減少−橈骨欠損症候群、家族性赤芽球貪食リンパ組織球症、Gaucher病、慢性肉芽腫症、先天性好中球減少症、Chediak・東症候群、先天性角化異常症などが挙げられる。それ以外の疾患として、例えば、大理石骨病、Hurler症候群、Hunter症候群、Maroteaux-Lamy症候群、異染性白質ジストロフィー、他のリピド症、副腎脳白質ジストロフィー、Lesch-Nyhan症候群、タイプIIａグリコーゲン蓄積症などが挙げられる。
【００２３】
本発明方法では、健常者と被験者から、それぞれ検体を採取し、それぞれのＡＤＡＭＴＳ１３濃度及び／又はその酵素活性を測定した後、測定値を比較することにより、前記検出及び／又は予測を行うこともできるが、通常は、健常者から採取した検体を用いてＡＤＡＭＴＳ１３濃度及び／又は酵素活性の正常値範囲又は判定用閾値を予め決定しておくことが好ましい。正常値範囲又は判定用閾値が予め決定されている場合には、予測対象である被験者に関してＡＤＡＭＴＳ１３の分析を行うだけで、前記被験者における前記検出及び／又は予測を行うことができる。前記正常値範囲又は判定用閾値は、種々条件、例えば、基礎疾患、性別、年齢などにより変化することが予想されるが、当業者であれば、被験者に対応する適当な母集団を適宜選択して、その集団から得られたデータに統計学的処理を行うことにより、正常値範囲又は判定用閾値を決定することができる。例えば、後述の実施例に示す母集団においては、ＡＤＡＭＴＳ１３濃度に関して、ＲＯＣ曲線からカットオフ値を設定したところ異常とみなせる値は５０％以下であり、ＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性に関しては異常とみなせる値は４０％以下であった。
【００２４】
本発明方法において、ＡＤＡＭＴＳ１３の濃度又はその酵素活性を分析する方法としては、ＡＤＡＭＴＳ１３の濃度又は酵素活性を定量的又は半定量的に決定することができるか、あるいは、ＡＤＡＭＴＳ１３の存在の有無を判定することができる限り、特に限定されるものではない。
【００２５】
ＡＤＡＭＴＳ１３濃度を分析する方法としては、例えば、抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体又はその断片を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色、又はウエスタンブロット等）、生化学的手法（例えば、酵素学的測定法）、又はｍＲＮＡ量を測定する分子生物学的手法などを挙げることができる。
【００２６】
ＡＤＡＭＴＳ１３濃度の分析方法として免疫学的手法を用いる場合には、抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体又はその断片は、公知の方法、例えば、国際公開第２００４／０２９２４２号パンフレットに記載の方法に従って調製することができ、各種免疫学的測定も、例えば、国際公開第２００４／０２９２４２号パンフレットに記載の方法に従って実施することができる。
【００２７】
ＡＤＡＭＴＳ１３濃度を測定する方法としては、感度及び簡便性から免疫学的方法が好ましい。ここで免疫学的方法とは、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する抗体を用いて、ＡＤＡＭＴＳ１３を、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス法、又はイムノクロマトグラフ法で分析する方法である。免疫学的方法としては、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３を標識する競合法、抗体を標識するサンドイッチ法、抗体をコートしたビーズの凝集を観察するラテックスビーズ法、あるいは、金コロイドなどの着色粒子に結合した抗体を用いる方法等、様々な方法があるが、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する抗体を用いた方法であれば、本発明の好ましい態様に含まれる。抗体は、モノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でも良い。また、抗体断片、例えば、Ｆａｂ’，ｓｃＦｖ，Ｖ−ドメインプロテイン（ｄｏｍａｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）等を用いることもできる。免疫学的方法以外でもこれを認識することができる性質を有しているものであれば特に限定されるものではなくアフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アプタマー等が挙げられる。
【００２８】
ＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性を分析する方法としては、例えば、ｖＷＦ又はその断片を用いる生化学的手法［例えば、ＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動及とオートラジオグラフィー又はウエスタンブロット法とを組み合わせたｖＷＦ巨大マルチマーの検出法（非特許文献４）、ｖＷＦのＡ２ドメイン中のＡｓｐ１５９６−Ａｒｇ１６６８に相当する７３残基に相当する合成ペプチドに蛍光基［2-(N-methylamino)benzoyl, Nma］と消光基（2,4-dinitrophenyl, Dnp）を導入した方法によるｖＷＦ切断活性を検出する方法（非特許文献５）、あるいは、ｖＷＦ又はその断片と、ｖＷＦのＡＤＡＭＴＳ１３切断部位を特異的に認識する抗体又はその断片を用いる免疫学的手法などを挙げることができる。
【００２９】
ＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性を分析する方法としては、合成基質を用いる測定法や免疫測定法を挙げることができる。これらは、例えば、特願２００５−１４８７９３号明細書に記載の方法に従って実施することができ、具体的には、（１）ＡＤＡＭＴＳ１３を含有する可能性のある被検試料と、ｖＷＦ又はその断片を不溶性担体に結合させた固定化基質とを液中で接触させる工程、（２）前記液と不溶性担体とを分離する工程、並びに（３）不溶性担体に残存するｖＷＦ又はその断片、及び／又は、不溶性担体から遊離した液中のｖＷＦ断片を分析する工程を含む分析方法により実施することができる。また、前記分析方法において、不溶性担体に結合するｖＷＦ又はその断片が、ＡＤＡＭＴＳ１３の切断により不溶性担体から遊離する基質断片側において、標識物質で標識されている態様も可能である。
【００３０】
またｖＷＦ又はその断片を不溶性担体に結合させないで、その基質の両末端に他の物質により認識されうる配列又は構造を有している場合、これを認識することができる性質を有しているものを不溶性担体に固定化する、あるいは標識化するものを用意し、（Ａ１）ＡＤＡＭＴＳ１３を含有する可能性のある被検試料と、他の物質により認識されうる配列又は構造を末端に有している基質とを液中で接触させる工程、（Ａ２）前記液と不溶性担体と標識化パートナーとを混合し、更に不溶性担体とこれ以外の液とを分離する工程、並びに（Ａ３）切断されずに不溶性担体に捕捉される基質、及び／又は、切断を受けて不溶性担体に捕捉されずに遊離した液中の基質断片を分析する工程を含む分析方法により実施することができる。
更に、ＡＤＡＭＴＳ１３の切断で生じるネオアンチゲン（切断面のアミノ酸を含む部分配列）と特異的に結合する抗体若しくはその断片又はアプタマー等を用い、これらを標識物質で標識し、前記分析工程で使用することにより、酵素活性を分析することができる。
【００３１】
本発明で用いる標識物質としては、公知の各種標識物質を用いることができ、例えば、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼなど）、蛍光物質（例えば、フルオレッセイン誘導体、ローダミン誘導体など）、時間分解蛍光測定が可能な希土類若しくは希土類錯体（例えば、ユーロピウム、ユーロピウム錯体など）、化学発光物質（例えば、アクリジニウムエステル等）、ラジオアイソトープ（例えば、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐなど）、発色物質［例えば、パラニトロアニリン（ｐＮＡ）］を用いることができる。すなわち、発色、蛍光、時間分解蛍光、化学発光、電気化学発光、放射活性等を測定する方法を用いることができる。
【００３２】
標識物質由来のシグナル強度の変化を検出する手段としては、標識物質の種類及び測定機器の特性によって適宜選択され、周知の方法、例えば、比色法、蛍光法、又は発光法などを利用することができる。例えば、標識物質としてペルオキシダーゼを用いた場合、ルミノールを基質として化学発光法で検出することも可能で、特に微量測定に好適である（例えば、田中弘一郎、石川榮治：西洋ワサビペルオキシダーゼを標識とする酵素免疫測定法における蛍光法と発光法の比較、臨床検査機器・試薬、１１：５６７−５６９，１９８８）。また、標識物質としてアルカリホスファターゼを用いた場合、ジオキセタン系基質であるＡＭＰＰＤ［3-(2’-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3”phosphoroxy)phenyl-1,2-dioxetane］、ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ［1,2-dioxetane（トロピックス社）］等の公知基質を用いると、より好感度に検出することができるため、好ましい。
【００３３】
不溶性担体としては、例えば、各種プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、又はポリテトラフルオロエチレン）からなるラテックス粒子、ガラス粒子、磁性粒子、又はマイクロタイターウェルなどを挙げることができる。
【００３４】
本発明方法において、被検試料としては、例えば、血漿又は血清形態の血液が好ましいが、それ以外にも、例えば、細胞組織液、リンパ液、胸腺水、腹水、羊水、胃液、尿、膵臓液、骨髄液、又は唾液等の各種体液を用いることもできる。
【００３５】
［２］本発明の検出用キット
本発明の検出用キットは、本発明方法を実施するのに用いることができる。本発明の検出用キットには、その分析対象に応じて、ＡＤＡＭＴＳ１３濃度を分析することにより前記造血幹細胞移植療法を施行する及び／又は施行した患者における病態を把握することができるキット（以下、濃度分析型キット）と、ＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性を分析することにより造血幹細胞移植療法を施行する及び／又は施行した患者における病態を把握することができるキット（以下、酵素活性分析型キット）とが含まれる。
【００３６】
本発明の濃度分析型キットは、例えば、抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体又はその断片を少なくとも含み、異なる２種類以上の抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体を含むことが好ましい。前記抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであることもできる。また、異なる２種類以上の抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体を含む場合には、いずれか一方（第２抗体）を標識抗体とすることもできるし、あるいは、標識化の代わりに、第２抗体に対する抗体に標識を結合させた標識抗体を更にキットに追加することもできる。
【００３７】
本発明の酵素活性分析型キットは、ｖＷＦ又はその断片を少なくとも含む。また、ｖＷＦ又はその断片が標識されているものをキットに使用することもできる。あるいは、ｖＷＦ又はその断片を標識する代わりに、例えばＡＤＡＭＴＳ１３の切断で生じるネオアンチゲン（切断面のアミノ酸を含む部分配列）と特異的に結合する抗体又はその断片をキットに追加することもできる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３９】
《実施例１：造血幹細胞移植療法試行例の予後とＡＤＡＭＴＳ１３の関連》
種々の血液疾患や腫瘍性疾患で造血幹細胞移植療法を行った患者由来の血漿を被検試料として、ＡＤＡＭＴＳ１３抗原量及び活性量を測定した。ＡＤＡＭＴＳ１３抗原量は、市販キット（ADAMTS-13 ELISA Kit；三菱化学ヤトロン）を使用して測定した。ＡＤＡＭＴＳ１３活性は、ＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動法［エム・フルラン（M.Furlan）ら，「ブラッド（Blood）」,（米国），１９９７年，第８９巻，ｐ．３０９７−３１０３］により測定した。
【００４０】
患者群として骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血移植を含む種々の造血幹細胞移植例を対象にした。健常人群及び造血幹細胞移植予後とＡＤＡＭＴＳ１３抗原量との関連を調べるため、健常人群及び、患者群では観察した最終のＡＤＡＭＴＳ１３抗原量と測定後の患者の予後（生存又は生命予後不良）で群に分けた。
【００４１】
結果を図１に示す。図１のＹ軸［ＡＤＡＭＴＳ１３：Ａｇ（％）］は、健常人プール血漿のＡＤＡＭＴＳ１３抗原量を１００％とした場合の、ＡＤＡＭＴＳ１３抗原量（単位＝％）である。健常人及び生存群と比較し、生命予後不良群（死亡群）ではＡＤＡＭＴＳ１３抗原量が顕著に低下していた。また、健常人群に対して生存群でも若干のＡＤＡＭＴＳ１３抗原量が低下しており、このことは生命予後不良群とはその程度の差こそあるが造血幹細胞移植療法を行った患者全てにおいて、これに関わる各種症状からＡＤＡＭＴＳ１３がダウンレギュレーションを受けることが示唆される。このダウンレギュレーションの程度如何が予後の方向性を決定する一因とはならないか、即ち、より大きなダウンレギュレーションを受けた場合、種々の合併症を含む重篤な病態へと進展する危険性があると推察される。
【００４２】
また、この結果をもとに受診者動作特性曲線（Receiver operating characteristic curve：以下、ＲＯＣ曲線と称する）を作成した（図２）。図２に示す「感度」とは、或るカットオフ値を段階的に設定した場合に、各カットオフ値に関して、生命予後不良となった患者のうちでＡＤＡＭＴＳ１３抗原量が異常値とでる人の割合を表し、「特異度」とは、生存している患者のうちでＡＤＡＭＴＳ１３抗原量が正常値とでる人の割合を表す。図２に示す「ＡＵＣ」とは、図に示す曲線下の面積（area under curve：ＡＵＣ）であり、この面積が広いほど（１に近いほど）優位である。ここから得られた値（＝０．８８１）からも非常に優位な検査特性を発揮していることが示された。
【００４３】
また、ＲＯＣ曲線の結果から感度と特異度がほぼ均等になる値（カットオフ値）が算出され、患者の生死を分けるＡＤＡＭＴＳ１３抗原量のカットオフ値としては５０％程度が適当と考えられた。カットオフ値を５０％としたときの、実際の診断結果を表１に示す。表１に示すとおり、ＡＤＡＭＴＳ１３抗原量は造血幹細胞移植例の予後の良、不良を判定する上で極めて精度の高い診断結果をもつと考えられた。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
更に、造血幹細胞移植療法試行の前後においてのＡＤＡＭＴＳ１３抗原量の挙動を以下４群に分類した。
（１）ＡＤＡＭＴＳ１３抗原量が正常レベル（５０％以上）から異常値（５０％未満）へ
（２）ＡＤＡＭＴＳ１３抗原量が異常値をキープ
（３）ＡＤＡＭＴＳ１３抗原量が異常値から正常レベルへ
（４）ＡＤＡＭＴＳ１３抗原量が正常値をキープ
これらに分類した４群と実際の生存率を対応させた結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
これらにより、ＡＤＡＭＴＳ１３抗原量が正常レベルであっても異常値へ低下すると重篤な状態に陥り、極めて生命予後不良の危険に晒されることが判明した。また逆にＡＤＡＭＴＳ１３抗原量が異常値を経験し一旦重篤な状態に陥っても正常レベルへ回復するとそのような状態を脱し一命をとりとめる可能性が高いことが示唆される。
この結果から、単純に測定したＡＤＡＭＴＳ１３抗原量の終末値と予後が明確に関連することのみならず、造血幹細胞移植の前後においてＡＤＡＭＴＳ１３抗原量の挙動が患者の状態を極めて正確に反映することが示唆された。このことはＡＤＡＭＴＳ１３抗原量が減少すれば多臓器不全の発症などを伴う重篤な症状に陥る可能性が高いと判断され、逆にＡＤＡＭＴＳ１３抗原量が増加すれば予後として非常に良好な経過を辿っており、造血幹細胞移植療法にまつわる治療法が奏効し、結果としてその治療経過が良いことを確認することができるといえる。すなわち、造血幹細胞移植の前後で経時的にＡＤＡＭＴＳ１３を測定することが予後の管理及びモニタリングとして非常に有用であることが示される。
【００４８】
また、抗原量と同様ＡＤＡＭＴＳ１３活性量に関しても、健常人レベルに対し非常に低値に減少した場合これが死亡の転帰と密接に関連する結果が得られた。結果を表３に示す。表３に示すとおり、抗原量に比して活性量はやや低い測定値が得られ、上記抗原量と同様にＡＤＡＭＴＳ１３活性量は造血幹細胞移植例の予後の良、不良を判断し、予後の管理及びモニタリングとして非常に有用であることが示された。
【００４９】
【表３】
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【００５０】
《実施例２：個別症例における各種病態とＡＤＡＭＴＳ１３の関連》
死亡の転帰となった造血幹細胞移植症例における病態の進行とＡＤＡＭＴＳ１３抗原量の関係を調べた。結果を図３に示す。
図３に示す本症例は、基礎疾患として骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の患者（３４歳、男性）であり、これに対し非血縁骨髄移植（ｕ−ＢＭＴ；記号Ａ）を行ったものの移植片を拒絶（記号Ｂ）し、再度、臍帯血移植（ＣＢＴ；記号Ｃ）を行った症例である。前処置として、抗腫瘍効果及び免疫抑制効果を目的として用いられる薬剤ブスルファン及び薬剤シクロフォスファミドを投与し、また全身放射線照射を行った（記号ａ）。骨髄移植（記号Ａ）を実施し、その８〜２０日後に発熱、体重増加、全身に小出血を伴う皮膚発疹（skin rash）が見られ、これらは造血幹細胞移植後に特有に発症する移植治療関連毒性（ＲＲＴ）あるいは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）と診断された（記号ｂ）。ＡＤＡＭＴＳ１３抗原量はこの病態に極めて鋭敏に追従し、代表的な炎症マーカーであるＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）の上昇とともに低下していく現象が見られた。次にこれら症状の沈静化とともにＡＤＡＭＴＳ１３抗原量は増加傾向を呈した。次に前処置として、抗腫瘍効果及び免疫抑制効果を目的として用いられる薬剤フルダラビン及び薬剤メルファランを投与し、また全身放射線照射を行った（記号ｃ）後、再度、臍帯血移植（記号Ｃ）を試行した後に感染症を発症、これによる敗血症、薬物による肝障害、腎機能低下など多臓器不全の様相（記号ｄ）を呈し結果として死亡（記号Ｄ）の転帰となったが、ここでもＡＤＡＭＴＳ１３抗原量はその病態の進行とともに先に示したカットオフ値以下にまで減少し、実際の症状を極めて正確に反映する結果となった。
【００５１】
これらは造血幹細胞移植に関わる各種症状及び合併症（例えば、ＲＲＴ、ＧＶＨＤ、感染症、ＴＭＡ）特有に観測され、こういった症状を形成する病態のメカニズムに全身の血液中ＡＤＡＭＴＳ１３に何らかのダウンレギュレーションを与えるものが存在すると考えられる。このようにして“ＡＤＡＭＴＳ１３の著減”が起こると、このことがさらに病態を悪化させる成因となると考えられ、測定結果に即したＡＤＡＭＴＳ１３補充が今後、造血幹細胞移植療法の予後改善に有効であると期待されるものである。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、造血幹細胞移植療法を施行する及び／又は施行した患者の適切な治療の用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＡＤＡＭＴＳ１３抗原量（ＡＤＡＭＴＳ１３：Ａｇ）と患者の予後との関連を示すグラフである。
【図２】図１に示す実験データに基づき作成した受診者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）である。
【図３】個別症例における病態の進行とＡＤＡＭＴＳ１３抗原量との関連を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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