(57)【要約】      （修正有）【課題】工業的に十分なタンパク質生産性を保有し、且つ優れた洗浄性能を有するアルカリプロテアーゼの提供。【解決手段】バチルス属由来の特定なアミノ酸配列の（ａ）9位、（ｂ）49位、（ｃ）194位、（ｄ）212位、（ｅ）237位、（ｆ）245位、（ｇ）281位、（ｈ）313位、（ｉ）379位、（ｊ）427位のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；（ａ）位置；グルタミン、（ｂ）位置；グルタミン、（ｃ）位置；リジン又はアルギニン、（ｄ）位置；アルギニン、アスパラギン又はグルタミン、（ｅ）位置；アスパラギン、（ｆ）位置；アスパラギン、（ｇ）位置；アルギニン、（ｈ）位置；アスパラギン、（ｉ）位置；リジン、アルギニン、グルタミン酸又はアスパラギン酸、（ｊ）位置；アルギニン、から選ばれたアルカリプロテアーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の（ａ）9位、（ｂ）49位、（ｃ）194位、（ｄ）212位、（ｅ）237位、（ｆ）245位、（ｇ）281位、（ｈ）313位、（ｉ）379位、（ｊ）427位のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置；グルタミン
（ｂ）位置；グルタミン
（ｃ）位置；リジン又はアルギニン
（ｄ）位置；アルギニン、アスパラギン又はグルタミン
（ｅ）位置；アスパラギン
（ｆ）位置；アスパラギン
（ｇ）位置；アルギニン
（ｈ）位置；アスパラギン
（ｉ）位置；リジン、アルギニン、グルタミン酸又はアスパラギン酸
（ｊ）位置；アルギニン
から選ばれたアルカリプロテアーゼ。
【請求項２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２の（ａ）9位、（ｂ）49位、（ｃ）194位、（ｄ）212位、（ｅ）237位、（ｇ）281位、（ｉ）379位に相当する位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置；グルタミン
（ｂ）位置；グルタミン
（ｃ）位置；リジン又はアルギニン
（ｄ）位置；アスパラギン又はグルタミン
（ｅ）位置；アスパラギン
（ｇ）位置；アルギニン
（ｉ）位置；グルタミン酸又はアスパラギン酸
から選ばれたアルカリプロテアーゼ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載のベクターを含有する形質転換体。
【請求項６】
宿主が微生物である請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項１又は２記載のアルカリプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は洗浄剤配合酵素として有用なアルカリプロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業分野でのプロテアーゼ利用の歴史は古く、衣料用洗剤をはじめとする洗浄剤から繊維の改質剤、皮革処理剤、化粧料、浴剤、食品改質剤或いは医薬品としての利用まで非常に多岐にわたっている。中でも最も工業的に大量に生産されているものが洗剤用プロテアーゼであり、例えば、アルカラーゼ、サビナーゼ（登録商標；ノボザイムズ）、マクサカル（登録商標；ジェネンコア）、ブラップ（登録商標；ヘンケル）、及びＫＡＰ（花王）等が知られている。
【０００３】
洗剤中にプロテアーゼを配合する目的は、衣料に付着したタンパク質を主成分とする汚れを分解して低分子化し、界面活性剤による可溶化を促進することであるが、実際の汚れはタンパク質だけでなく皮脂由来の脂質や固体粒子等、有機物と無機物が入り混じった複数の成分を内包する複合汚れであり、このような複合汚れに対する洗浄性の高い洗浄剤が望まれていた。
【０００４】
斯かる観点から本発明者らは、高濃度の脂肪酸存在下でも十分なカゼイン分解活性を保持し、タンパク質だけでなく皮脂等の混在する複合汚れに対しても優れた洗浄性を有する分子量約43,000のアルカリプロテアーゼを数種見出した（特許文献１）。当該アルカリプロテアーゼ群は、その分子量、一次構造、酵素学的性質、特に非常に強い酸化剤耐性を有する点で、従来から知られているバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼであるズブチリシンとは異なり、新しいズブチリシンサブファミリーに分類することが提唱されている（非特許文献１）。
斯かるアルカリプロテアーゼ群は、皮脂汚れ等の混在する条件下でも高い洗浄性能を有するものであるが、更に、洗浄性能に加え、十分な生産性能をもつアルカリプロテアーゼが求められている。
【０００５】
一般に、酵素は活性部位にその活性発現に必須の酸性或いは塩基性の解離基を持つアミノ酸残基を有しているため、pH依存的に活性が変化する。従って、荷電アミノ酸残基を改変することにより酵素活性のpH依存性を人為的に改変する試みは、タンパク質工学の重要なターゲットの一つである。
例えば、ズブチリシンBPN’の特定のアミノ酸残基を置換して酵素の表面電荷を変更し、ｐH依存性を変化させること（非特許文献２−４）、また、高アルカリ耐性プロテアーゼであるＭ−プロテアーゼが、表面アミノ酸残基が変更されて高い等電点と新たなイオン結合ネットワークを獲得した場合に、高アルカリ適応すること（非特許文献５）、ズブチリシンの等電点と洗浄性能には一定の関係があること（特許文献２）、等が報告されている。
【０００６】
しかしながら、上記の報告は、いずれも分子量約28,000のバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼであるズブチリシンBPN’やズブチリシン309等に関するものであり、分子量約28,000のプロテアーゼ群が有しないギャップ領域やＣ末端の伸長領域を有する分子量約43,000のセリンプロテアーゼ群に対しては、有効な情報を与えるものではない。
また、酵素の洗浄性能を高めるアミノ酸残基の改変によって、タンパク質の生産性が如何なる影響を受けるか否かを予測することは不可能であり、ある変異の導入によって洗浄性能に好ましい変化を与えたとしても、それによってタンパク質生産性が低下すれば、実生産においては非常に大きな障害となる。
【０００７】
【特許文献１】国際公開第99／18218号パンフレット
【特許文献２】特許第3343115号公報
【非特許文献１】Saekiら,Biochem.Biophys.Res.Commun., 279, 313-319, 2000
【非特許文献２】Nature, 318, 375-376, 1985
【非特許文献３】J.Mol.Biol., 193, 803-813, 1987
【非特許文献４】Nature, 328, 496-500, 1987
【非特許文献５】Protein Engineering, 10, 627-634, 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、工業的に十分なタンパク質生産性を保有し、且つ優れた洗浄性能を有するアルカリプロテアーゼを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、分子量約43,000のアルカリプロテアーゼ群の性能向上について、種々検討したところ、酵素タンパク質表面に露出しているアミノ酸配列中の特定位置に特定のアミノ酸残基が存在することにより、工業的に十分なタンパク質生産性を維持あるいは向上しつつ、更にその洗浄性能が向上することを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
１）配列番号２の（ａ）9位、（ｂ）49位、（ｃ）194位、（ｄ）212位、（ｅ）237位、（ｆ）245位、（ｇ）281位、（ｈ）313位、（ｉ）379位、（ｊ）427位のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置；グルタミン
（ｂ）位置；グルタミン
（ｃ）位置；リジン又はアルギニン
（ｄ）位置；アルギニン、アスパラギン又はグルタミン
（ｅ）位置；アスパラギン
（ｆ）位置；アスパラギン
（ｇ）位置；アルギニン
（ｈ）位置；アスパラギン
（ｉ）位置；リジン、アルギニン、グルタミン酸又はアスパラギン酸
（ｊ）位置；アルギニン
から選ばれたアルカリプロテアーゼ。
【００１１】
２）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２の（ａ）9位、（ｂ）49位、（ｃ）194位、（ｄ）212位、（ｅ）237位、（ｇ）281位、（ｉ）379位に相当する位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置；グルタミン
（ｂ）位置；グルタミン
（ｃ）位置；リジン又はアルギニン
（ｄ）位置；アスパラギン又はグルタミン
（ｅ）位置；アスパラギン
（ｇ）位置；アルギニン
（ｉ）位置；グルタミン酸又はアスパラギン酸
から選ばれたアルカリプロテアーゼ。
３）上記アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。
４）上記遺伝子を含有する組換えベクター、該ベクターを含有する形質転換体。
５）上記アルカリプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、工業的に有利に生産可能で、優れた洗浄性能を有するアルカリプロテアーゼを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼとは、プロテアーゼＫＰ４３〔バチルス  エスピーKSM-KP43（FERM BP-6532）由来、WO99/18218パンフレット,GenBank accession no.AB051423〕を意味する。本発明のアルカリプロテアーゼは、配列番号２の（ａ）9位、（ｂ）49位、（ｃ）194位、（ｄ）212位、（ｅ）237位、（ｆ）245位、（ｇ）281位、（ｈ）313位、（ｉ）379位、（ｊ）427位のアミノ酸残基が下記のアミノ酸残基；
（ａ）位置；グルタミン
（ｂ）位置；グルタミン
（ｃ）位置；リジン又はアルギニン
（ｄ）位置；アルギニン、アスパラギン又はグルタミン
（ｅ）位置；アスパラギン
（ｆ）位置；アスパラギン
（ｇ）位置；アルギニン
（ｈ）位置；アスパラギン
（ｉ）位置；リジン、アルギニン、グルタミン酸又はアスパラギン酸
（ｊ）位置；アルギニン
から選ばれるものであり、野生型、野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【００１４】
また、本発明のアルカリプロテアーゼには、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２の（ａ）9位、（ｂ）49位、（ｃ）194位、（ｄ）212位、（ｅ）237位、（ｇ）281位、（ｉ）379位に相当する位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置；グルタミン
（ｂ）位置；グルタミン
（ｃ）位置；リジン又はアルギニン
（ｄ）位置；アスパラギン又はグルタミン
（ｅ）位置；アスパラギン
（ｇ）位置；アルギニン
（ｉ）位置；グルタミン酸又はアスパラギン酸
から選ばれたものが包含され、これらは野生型、野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【００１５】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性、好ましくは８７％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼが挙げられ、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼとは異なるアルカリプロテアーゼ（他種アルカリプロテアーゼということもある）が包含される。
斯かる他種アルカリプロテアーゼは、以下の１）又は２）の性質を有するものが好ましい。
１）酸化剤耐性を有し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法による分子量が４３，０００±２，０００である。
２）ｐＨ８以上のアルカリ性領域で作用し、酸化剤耐性を有し、５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存活性を示し、ジイソプロピルフルオルリン酸（ＤＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で阻害され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００である。
ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテアーゼを５０ｍＭ過酸化水素、５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭブリットンロビンソン緩衝液（ｐＨ１０）中で、３０℃、２０分間の放置後の残存活性が少なくとも５０％以上を保持していることをいう。
【００１６】
当該他種アルカリプロテアーゼとしては、具体的には、プロテアーゼKP9860[バチルス エスピーKSM-KP9860（FERM BP-6534）由来、WO99/18218パンフレット,GenBank accession no.AB046403]；プロテアーゼE-1[バチルス No．D-6（FERM P-1592）由来、特開昭49-71191号公報, GenBank accession no.AB046402]；プロテアーゼYa[バチルス エスピーY（FERM BP-1029）由来、特開昭61-280268号公報, GenBank accession no.AB046404]；プロテアーゼSD521[バチルスSD521（FERM P-11162）由来、特開平3-191781号公報, GenBank accession no.AB046405]；プロテアーゼA-1[NCIB12289由来、WO88/01293パンフレット, GenBank accession no.AB046406]；プロテアーゼA-2[NCIB12513由来、WO98/56927パンフレット]；プロテアーゼ9865〔バチルス  エスピーKSM-9865（FERM P-18566）由来, GenBank accession no.AB084155〕や、特開2002-218989号公報、特開2002-306176号公報、特開2003-125783号公報、特開2004-000122号公報、特開2004-057195号公報、特開2004-305175号公報、特開2004-305176号公報、特開2006-129865号公報に記載の変異プロテアーゼ等が挙げられる。
【００１７】
なお、アミノ酸配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメータであるUnit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１８】
また、上記の配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）の各位置に相当する位置のアミノ酸残基を特定する方法としては、例えば上記のリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いて、配列番号２で示されるアミノ酸配列と他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列を比較し、各アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。プロテアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各プロテアーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のプロテアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００１９】
すなわち、配列番号２で示されるアミノ酸配列における１９４位のアミノ酸残基はリジン残基であるが、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記方法でアミノ酸配列を整列させることにより、例えばプロテアーゼＥ−１においては１９３位のセリン残基、プロテアーゼＫＰ９８６０においては１９４位のセリン残基、プロテアーゼＹａにおいては１９３位のセリン残基、というように特定することができる。
表１に、プロテアーゼＫＰ４３のアミノ酸配列（配列番号２）の（ａ）9位、（ｂ）49位、（ｃ）194位、（ｄ）212位、（ｅ）237位、（ｇ）281位、（ｉ）379位のアミノ酸残基に相当する位置及びアミノ酸残基の具体例を、上記の他種アルカリプロテアーゼのうちの好適に用いられるもので示す。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
また、本発明アルカリプロテアーゼにおけるアミノ酸残基の（ａ）〜（ｊ）等の選択は、酵素特性が変化しない限り、（ａ）〜（ｊ）等から選ばれる置換が２個所以上同時になされていても良い。
【００２２】
本発明のアルカリプロテアーゼが変異体である場合、変異を施す前のアルカリプロテアーゼ（親アルカリプロテアーゼということがある）としては、「配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼ」又は「配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ」として示したものが該当し、これに目的部位の変異を施すことにより本発明のアルカリプロテアーゼが得られる。例えば、プロテアーゼＫＰ４３の配列番号２で示されるアミノ酸配列の前記（ａ）〜（ｊ）より選ばれる位置のアミノ酸残基又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼのアミノ酸配列において前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）より選ばれる位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得られる。
【００２３】
本発明アルカリプロテアーゼは、例えば以下の方法により得ることができる。すなわち、クローニングされた親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子（配列番号１）に対して変異を施し、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えば国際公開第９９／１８２１８号パンフレット、国際公開第９８／５６９２７号パンフレットに記載の方法に従って行えばよい。
【００２４】
親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われている部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えばSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット(タカラ)等を用いて行うことができる。また、リコンビナントPCR（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic Press, New York, 1990）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を、他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【００２５】
得られた変異遺伝子を用いた本発明プロテアーゼの生産方法としては、例えば当該変異遺伝子を安定に増幅できるDNAベクターに連結させ宿主菌を形質転換する、或いは当該変異遺伝子を安定に維持できる宿主菌の染色体DNA上に導入させる、等の方法が採用できる。この条件を満たす宿主としては例えばバチルス属細菌、大腸菌、カビ、酵母、放線菌などが挙げられ、これらの菌株を用い、資化性の炭素源、窒素源その他必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養すればよい。
【００２６】
得られた培養液中からのアルカリプロテアーゼの採取、及び精製は、一般の酵素の採取、及び精製方法に準じて行うことができる。例えば、培養液を遠心分離、又は濾過することで菌体を除き、培養上清液から常法の精製手段により目的酵素を得る。このようにして得られる酵素液は、そのまま用いることもできるが、更に公知の方法により精製、結晶化、粉末化、又は顆粒化することもできる。
【００２７】
斯くして得られた本発明のアルカリプロテアーゼは、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、SDS-PAGEにより認められる分子量が43,000±2,000であり、アルカリ性域で活性を有すると共に、洗浄性能が向上に加え、工業生産的に十分な生産性を示す。すなわち、天然に存在する酵素の場合、配列番号２で示されるプロテアーゼＫＰ４３のタンパク質生産性が少なくとも９０％以上維持される、好ましくは９５％以上維持される、あるいはプロテアーゼＫＰ４３よりも向上する、又、変異体の場合においては、その親とする酵素のタンパク質生産性が少なくとも９０％以上維持される、好ましくは９５％以上維持される、あるいは更に好ましくは親アルカリプロテアーゼと同等以上のタンパク質生産性得られるという性質を新に獲得したものである。
【００２８】
従って、本発明のアルカリプロテアーゼは、各種洗剤組成物配合用酵素として有用である。
洗浄剤組成物中への本発明品プロテアーゼの配合量は、アルカリプロテアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり０．１〜５０００ＰＵが配合できるが、経済性等を考慮し、５００ＰＵ以下が好ましい。
本発明の洗浄剤組成物は本発明品プロテアーゼ以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等である。このうち、本発明以外のプロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。プロテアーゼとしては市販のアルカラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ、カンナーゼ（登録商標；ノボザイムズ社）、プロペラーゼ、プラフェクト（登録商標；ジェネンコア社）、またＫＡＰ（花王）、等が挙げられる。セルラーゼとしてはセルザイム、ケアザイム（登録商標；ノボザイムズ社）、またＫＡＣ、特開平１０−３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ、特願２００２−１１６５５３号公報記載の変異アルカリセルラーゼ（以上、花王）等が挙げられる。アミラーゼとしてはターマミル、デュラミル（登録商標；ノボザイムズ社）、プラスター（登録商標；ジェネンコア社）、またＫＡＭ（花王）、等が挙げられる。リパーゼとしてはリポラーゼ、リポラーゼウルトラ（登録商標；ノボザイムズ社）が挙げられる。
【００２９】
洗浄剤組成物中で本発明品プロテアーゼ以外のプロテアーゼを併用する場合の配合量は、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり０．１〜５００ＰＵが好ましい。セルラーゼを併用する場合は、特開平１０−３１３８５９号公報の段落〔００２０〕に記載の酵素活性測定方法より決定される単位（ＫＵ）に基づき、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり３００〜３００００００ＫＵが好ましい。
【００３０】
またアミラーゼを併用する場合は、特開平１１−４３６９０号公報の段落〔００４０〕記載のアミラーゼ活性測定方法より決定される単位（ＩＵ）に基づき、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり５０〜５０００００ＩＵが好ましい。
さらにリパーゼを併用する場合は、特表平８−５０００１３号公報の実施例１記載のリパーゼ活性測定方法より決定される単位（ＬＵ）づき、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり１００００〜１００００００ＬＵが好ましい。
【００３１】
本発明の洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。
（１）界面活性剤
界面活性剤は洗浄剤組成物中０．５〜６０質量％配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については１０〜４５質量％、液体洗浄剤組成物については２０〜５０質量％配合することが好ましい。また本発明洗浄剤組成物が漂白剤、又は自動食器洗浄機用洗剤である場合、界面活性剤は一般に１〜１０質量％、好ましくは１〜５質量％配合される。
本発明洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の１種又は組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。
陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０〜１４の、より好ましくは１２〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５〜１５．０、好ましくは１１．０〜１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００３２】
（２）二価金属イオン捕捉剤
二価金属イオン捕捉剤は０．０１〜５０質量％、好ましくは５〜４０質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１〜１０μｍ、特に０．１〜５μｍのものが好適に使用される。
【００３３】
（３）アルカリ剤
アルカリ剤は０．０１〜８０質量％、好ましくは１〜４０質量％配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。
【００３４】
（４）再汚染防止剤
再汚染防止剤は０．００１〜１０質量％、好ましくは１〜５質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千〜１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
【００３５】
（５）漂白剤
例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は１〜１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０質量％配合することができる。
【００３６】
（６）蛍光剤
本発明洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ−Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２質量％配合するのが好ましい。
【００３７】
（７）その他の成分
本発明品洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩など）、抑泡剤（シリコーンなど）、香料、その他の添加剤を含有させることができる。
【００３８】
本発明の洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明品プロテアーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形などにすることができる。
斯くして得られる本洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などとして使用することができる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。
実施例１
【００４０】
バチルス  エスピー KSM-KP43株由来のアルカリプロテアーゼ構造遺伝子の終止コドンまでを含む約2.0kb（配列番号１）に対して成熟酵素領域の（１）9位、（２）49位、（３）194位、（４）212位、（５）237位、（６）245位、（７）281位、（８）313位、（９）379位、（１０）427位に部位特異的変異を導入するプライマーをそれぞれデザインした。
（１）9位にグルタミンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー３（配列番号５）及びプライマー４（配列番号６）とプライマー２（配列番号４）を、
（２）49位にグルタミンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー５（配列番号７）及びプライマー６（配列番号８）とプライマー２（配列番号４）を、
（３）194位にリジンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー７（配列番号９）及びプライマー８（配列番号１０）とプライマー２（配列番号４）を、
194位にアルギニンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー７（配列番号９）及びプライマー９（配列番号１１）とプライマー２（配列番号４）を、
（４）212位にアルギニンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー１０（配列番号１２）及びプライマー１１（配列番号１３）とプライマー２（配列番号４）を、212位にアスパラギンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー１０（配列番号１２）及びプライマー１２（配列番号１４）とプライマー２（配列番号４）を、212位にグルタミンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー１０（配列番号１２）及びプライマー１３（配列番号１５）とプライマー２（配列番号４）を、
（５）237位にアスパラギンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー１４（配列番号１６）及びプライマー１５（配列番号１７）とプライマー２（配列番号４）を、
（６）245位にアスパラギンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー１４（配列番号１６）及びプライマー１６（配列番号１８）とプライマー２（配列番号４）を、
（７）281位にアルギニンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー１７（配列番号１９）及びプライマー１８（配列番号２０）とプライマー２（配列番号４）を、
（８）313位にアスパラギンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー１９（配列番号２１）及びプライマー２０（配列番号２２）とプライマー２（配列番号４）を、
（９）379位にリジンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー２１（配列番号２３）及びプライマー２２（配列番号２４）とプライマー２（配列番号４）を、379位にアルギニンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー２１（配列番号２３）及びプライマー２３（配列番号２５）とプライマー２（配列番号４）を、379位にアスパラギン酸を導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー２１（配列番号２３）及びプライマー２４（配列番号２６）とプライマー２（配列番号４）を、379位にグルタミン酸を導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー２１（配列番号２３）及びプライマー２５（配列番号２７）とプライマー２（配列番号４）を、
（１０）427位にアルギニンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー２６（配列番号２８）及びプライマー２７（配列番号２９）とプライマー２（配列番号４）を、それぞれ用いPCRを行った。
【００４１】
プライマー１にはセンス鎖の5’末端側にBamHIリンカーを、プライマー２にはアンチセンス鎖の5’末端側にXbaIリンカーを付与し、プライマー３とプライマー４、プライマー５とプライマー６、プライマー７とプライマー８、プライマー７とプライマー９、プライマー１０とプライマー１１、プライマー１０とプライマー１２、プライマー１０とプライマー１３、プライマー１４とプライマー１５、プライマー１４とプライマー１６、プライマー１７とプライマー１８、プライマー１９とプライマー２０、プライマー２１とプライマー２２、プライマー２１とプライマー２３、プライマー２１とプライマー２４、プライマー２１とプライマー２５、プライマー２６とプライマー２７はそれぞれの５’末端から10〜15bpの長さで互いに相補するようにデザインした。PCRのDNAポリメラーゼとして、Pyrobest (タカラ)を用い、PCRの条件は94℃で2分間鋳型DNAを変性させた後、94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で1分間を1サイクルとし30サイクル反応させた。増幅したDNA断片をPCR product purification kit（ロッシュ）にて精製後、それぞれ対応する増幅断片のみで、94℃で2分間DNAを変性させた後、94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で1分間を1サイクルとし30サイクル反応させ、リコンビナントPCRを行なった。得られた増幅断片に対し、プライマー１とプライマー４によりPCRを行なった。94℃で2分間鋳型DNAを変性させた後、94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で2分間を1サイクルとし30サイクル反応させ、変異が導入された全長遺伝子を得た。増幅断片を精製後、末端に付与されている制限酵素リンカーを、BamHI、XbaI（ロッシュ）により切断した。増幅DNA断片を予めBamHI、XbaIで処理したプラスミドpHA64（特許第349293号：プロモーター64の下流にBamHI、XbaI切断部位を有する）と混合した後、Ligation High（東洋紡）により、リガーゼ反応を行った。反応液からエタノール沈殿により回収したプラスミドを用い宿主菌であるバチルス  エスピー  KSM9865株（FERM P-18566）を形質転換した。
【００４２】
9865株の形質転換体をスキムミルク含有アルカリ寒天培地[スキムミルク(ディフコ)1%（w/v）、バクトトリプトン(ディフコ)1%、酵母エキス（ディフコ）0.5%、塩化ナトリウム1%、寒天1.5%、炭酸ナトリウム0.05%、テトラサイクリン15ppm]に生育させ、ハローの形成状況により、変異プロテアーゼ遺伝子導入の有無を判定した。形質転換体は、5mlの種母培地[6.0%（w/v）ポリペプトンS、0.05%酵母エキス、1.0%マルトース、0.02%硫酸マグネシウム7水和物、0.1%リン酸2水素カリウム、0.25%炭酸ナトリウム、30ppmテトラサイクリン]に植菌し、30℃で16時間振盪培養を行った。次いで30mlの主培地[8%ポリペプトンS、0.3%酵母エキス、10%マルトース、0.04%硫酸マグネシウム7水和物、0.2%リン酸2水素カリウム、1.5%無水炭酸ナトリウム、30ppmテトラサイクリン]に種母培養液を1%（v/v）植菌し、30℃で3日間振盪培養を行った。
【００４３】
得られた培養液を遠心分離し、タンパク質量をプロテインアッセイキット（和光純薬）を用いて測定した。親酵素遺伝子を有する形質転換体を同条件で培養した場合の培養上清の値と比較することにより、変異プロテアーゼ遺伝子の生産性を評価した（表２）。得られた酵素液のpH10及びpH10.5での洗浄評価結果を表３に示す。
【００４４】
上記の本発明アルカリプロテアーゼ変異体は洗浄力を向上させる以外は親アルカリプロテアーゼの特性、すなわち、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、SDS-PAGEにより認められる分子量が43,000±2,000であり、アルカリ性域で活性を有する性質を保持していることを確認した。
【００４５】
＜プロテアーゼ活性測定法（カゼイン法）＞
カゼイン（ハンマーステイン氏法：メルク）1%（W/V）を含む50mMホウ酸緩衝液（pH10.5）1mlを30℃、5分間恒温した後、0.1mlの酵素液を添加し反応を開始した。15分間反応させた後、2mlの反応停止液（0.11Mトリクロロ酢酸/0.22M酢酸ナトリウム/0.33M酢酸）を加えた。室温で30分間放置し、沈殿物をワットマンNo.2濾紙を用いて濾過した。分解産物はLowryらの方法により定量した。即ち、0.5mlの濾液に2.5mlのアルカリ性銅溶液（1%ロッシェル塩：1%硫酸銅・5水和物：2%炭酸ナトリウム/0.1N水酸化ナトリウム溶液＝1：1：100）を加え、30℃で10分間恒温した後、0.25mlのフェノール試薬［市販のフェノール試薬（関東化学）を脱イオン水にて2倍に希釈した溶液］を添加、よく攪拌し、30℃で30分間放置した。その後、660nmにおける吸光度を測定した。プロテアーゼ1単位（1PU）は、上記反応条件下において1分間に1mmolのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質を生成するのに必要な酵素量とした。
【００４６】
＜相対洗浄率＞
変異酵素の洗浄力評価は、ターゴトメーター（上島製作所製）を用いて行った。市販の衣料用洗剤を所定の使用濃度になるように調製した溶液に、必要に応じて10% （w/v）硫酸或いは10N 水酸化ナトリウムにてpHを調整した。酵素を最終濃度で40mPU/lになるように添加した。次いで、汚染布EMPA117（EMPA社製、血液／ミルク／カーボン）を6×6cmに裁断したものを添加し、特に断りのない限り20℃で洗浄（80rpm）を行った。水道水によるすすぎを行った後、色彩色差計（MINOLTA、CM3500d）を用いて明度を測定し、洗浄前後における明度の変化から洗浄率を算出した（下式）。
【００４７】
洗浄率（％）＝（L2−L1）／（L0−L1）×100
L0：汚染布の原布の明度
L1：洗浄前の汚染布の明度
L2：洗浄後の汚染布の明度
【００４８】
相対洗浄率は下式から算出した。
相対洗浄率（％）＝（変異酵素の洗浄率−酵素無添加の洗浄液の洗浄率）／（親酵素の洗浄率−酵素無添加の洗浄液の洗浄率）×100
【００４９】
【表２】
2008212084.tif 000003
【００５０】
【表３】
2008212084.tif 000004
【配列表】
2008212084000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月6日(2008.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
すなわち、配列番号２で示されるアミノ酸配列における１９４位のアミノ酸残基はセリン残基であるが、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記方法でアミノ酸配列を整列させることにより、例えばプロテアーゼＥ−１においては１９３位のセリン残基、プロテアーゼＫＰ９８６０においては１９４位のセリン残基、プロテアーゼＹａにおいては１９３位のセリン残基、というように特定することができる。
表１に、プロテアーゼＫＰ４３のアミノ酸配列（配列番号２）の（ａ）9位、（ｂ）49位、（ｃ）194位、（ｄ）212位、（ｅ）237位、（ｇ）281位、（ｉ）379位のアミノ酸残基に相当する位置及びアミノ酸残基の具体例を、上記の他種アルカリプロテアーゼのうちの好適に用いられるもので示す。