(57)【要約】【課題】  植物への導入により、植物に乾燥に対する耐性を付与することができる新たなベクターを用いて、乾燥に対する耐性を有する植物を製造する方法を提供する。【解決手段】  ＬＫＰ２遺伝子を含むベクターを、植物に乾燥ストレスに対する耐性能を付与するための乾燥耐性ベクターとして使用する。前記ベクターにおいて、ＬＫＰ２遺伝子は、発現プロモーターの制御下に挿入されていることが好ましい。また、アグロバクテリウム法により植物に導入する場合には、乾燥耐性ベクターは、例えば、Ｔ−ＤＮＡの右側境界配列（ＲＢ）と左側境界配列（ＬＢ）との間に、前記発現プロモーターとＬＫＰ２遺伝子とが挿入されていることが好ましい。このような乾燥耐性ベクターをアグロバクテリルムに導入し、これを目的の植物に感染させれば、乾燥耐性能が向上した植物を作出することができる。【選択図】  図１
2008212063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物に、乾燥ストレスに対する耐性能を付与するための乾燥耐性ベクターであって、
ＬＫＰ２遺伝子を含むことを特徴とする乾燥耐性ベクター。
【請求項２】
前記ＬＫＰ２遺伝子が発現プロモーターの制御下に挿入されている、請求項１記載の乾燥耐性ベクター。
【請求項３】
前記乾燥耐性ベクターが、プラスミドベクターである、請求項１または２記載の乾燥耐性ベクター。
【請求項４】
前記乾燥耐性ベクターが、Ｔｉプラスミドベクターである、請求項１から３のいずれか一項に記載の乾燥耐性ベクター。
【請求項５】
前記乾燥耐性ベクターが、Ｔ−ＤＮＡの右側境界配列（ＲＢ）と左側境界配列（ＬＢ）との間に、ＬＫＰ２遺伝子が挿入されたベクターである、請求項１から４のいずれか一項に記載の乾燥耐性ベクター。
【請求項６】
前記乾燥耐性ベクターが、アグロバクテリウム法に使用するベクターである、請求項１から５のいずれか一項に記載の乾燥耐性ベクター。
【請求項７】
乾燥ストレスに対する耐性能を有する乾燥耐性植物の製造方法であって、
植物に、請求項１から６のいずれか一項に記載の乾燥耐性ベクターを導入することを特徴とする製造方法。
【請求項８】
前記植物が、アブラナ科の植物である、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
前記アブラナ科の植物が、シロイヌナズナである、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項７から９のいずれか一項に記載の製造方法により得られる乾燥耐性植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物に乾燥ストレスに対する耐性能を付与するためのベクターで、乾燥耐性能を有する植物の製造方法、および、乾燥耐性植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの植物は、水や無機物を吸収するために、土壌に根を発達させている。このため、外部が植物にとって不利な環境に変化しても、植物自身はそこから移動することができない。そこで、植物は、環境変化によるストレスに速やかに応答し、適応するシステムを備えている。しかしながら、環境ストレスの中でも、乾燥や塩分濃度の上昇によって引き起こされるストレス（水分ストレス）は、植物の生育に直接的に影響を与えることが多い。そこで、例えば、乾燥ストレスに応答する遺伝子（ＤＲＥＢＩＡ）を改変し、乾燥ストレスへの応答を阻害することによって、乾燥ストレスに耐性を示す植物を作出することが試みられている（非特許文献１および非特許文献２）。
【０００３】
また、近年、地球の砂漠化や温暖化が深刻な問題となっており、特に、砂漠や水資源に乏しい地域においては、植物の生育が極めて困難な状況にある。このような環境問題を改善するためにも、乾燥ストレスに対する耐性能を付与し、水分の供給が困難である厳しい環境においても生育可能な植物を作出することが求められている。
【非特許文献１】Ｋａｓｕｇａ  ｅｔ  ａｌ．，；Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４５（３）：３４６−３５０（２００４）
【非特許文献２】Ｋａｓｕｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（３）：２８７−２９１（１９９９）
【非特許文献３】Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１３，２６５９−２６７０，（２００１）
【非特許文献４】Ｙａｓｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ，Ｖｏｌ．５５，Ｎｏ．４０５，ｐｐ．２０１５−２０２７，（２００４）
【非特許文献５】Ｆｕｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４６（８）：１３４０−１３４９（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、植物への導入により、植物に乾燥ストレスに対する耐性能を付与することができる新たなベクター、乾燥ストレスに対する耐性能を有する植物の製造方法ならびに乾燥ストレスに対する耐性能を有する植物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明のベクターは、植物に、乾燥ストレスに対する耐性能を付与するための乾燥耐性ベクターであって、ＬＫＰ２遺伝子を含むことを特徴とする。
【０００６】
本発明の製造方法は、乾燥ストレスに対する耐性能を有する乾燥耐性植物の製造方法であって、植物に、本発明の乾燥耐性ベクターを導入することを特徴とする。また、本発明の植物は、本発明の製造方法により得られる乾燥耐性植物である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、植物体において人為的にＬＫＰ２遺伝子を発現させることによって、植物体の乾燥に対する耐性能を向上できることを見出し、本発明に到った。ＬＫＰ２遺伝子は、ＬＯＶ  ｋｅｌｃｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ２（以下、「ＬＫＰ２」という）の遺伝子である。ＬＫＰ２は、（１）青色光受容部でありタンパク質−タンパク質間相互作用に関わるＬＯＶドメインと、（２）ユビキチンプロテアソーム系を介したタンパク質分解に関与するＳＣＦ複合体の構成因子Ｆ−ｂｏｘ  ｍｏｔｉｆ、および、（３）ユビキチン化の基質タンパク質の認識領域と考えられているｋｅｌｃｈ  ｒｅｐｅａｔ、という３つのドメインからなるタンパク質である。そして、ＬＫＰ２遺伝子ならびにＬＫＰ２については、以下のことが報告されている（非特許文献３〜５）。まず、ＬＫＰ２を過剰発現させることで、明所下で胚軸が伸長すること、長日条件下で花芽形成が遅延すること、連続明所・連続暗所下での概日リズムが失われることが報告されている。また、ＬＫＰ２全長、および、その各機能ドメイン（ＬＯＶ、Ｆ−ｂｏｘ、ｋｅｌｃｈ）を過剰発現させることで、シロイヌナズナの開花時期、１個体当たりの乾燥重量、種子収量が変わること、ＬＫＰ２が核内で機能し、概日時計中心振動体構成因子のＴＯＣ１（Ｔｉｍｉｎｇ  ｏｆ  ＣＡＢ１）、ＰＲＲ５（Ｐｓｅｕｄｏ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ５）、Ｄｉ１９（Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  １９）、ＣＯ（ＣＯＮＳＴＡＮＳ）、ＣＯＬ（ＣＯＮＳＴＡＮＳ−Ｌｉｋｅ）等と相互作用することが報告されている。しかしながら、このような機能を示すＬＫＰ２遺伝子ならびにＬＫＰ２が、植物の乾燥に対する耐性と直接的または間接的に関係する可能性は何ら報告されておらず、そのような示唆もされていない。このような技術常識の中、本発明者らは、鋭意研究の結果、メカニズムは不明であるが、植物中で人為的にＬＫＰ２を発現させることで、植物の乾燥ストレスに対する耐性能（乾燥耐性能）を向上させることを実現した。したがって、本発明のＬＫＰ２遺伝子を含む乾燥耐性ベクターや製造方法によれば、例えば、水分の供給が困難である厳しい環境においても生育可能な植物を作出することができる。このため、本発明は、農業の分野や、近年、深刻化している砂漠化等の環境問題に対しても、極めて有用な技術といえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
＜乾燥耐性ベクター＞
本発明の乾燥耐性ベクターは、前述のように、植物に、乾燥ストレスに対する耐性能を付与するための乾燥耐性ベクターであって、ＬＫＰ２遺伝子を含むことを特徴とする。なお、本発明において、「機能的に配置」、「機能的に結合」とは、それが意図する機能を発揮しうる状態で配置または結合していることを意味する。また、本発明において、ＬＫＰ２遺伝子の発現とは、例えば、ＬＫＰ２遺伝子の転写および翻訳（ＬＫＰ２の合成）を含む。
【０００９】
本発明において、ＬＫＰ２遺伝子は、例えば、ゲノムＤＮＡの配列でもよいし、ｃＤＮＡ配列であってもよい。ＬＫＰ２遺伝子としては、例えば、以下の（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡがあげられる。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）前記（Ａ）において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記ＬＫＰ２と同様の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１０】
前記（Ａ）のＤＮＡは、ＬＫＰ２遺伝子のＣＤＳ（ＬＫＰ２のアミノ酸配列をコードする、終止コドンを含む配列）である。前記（Ｂ）において、前記塩基数は制限されないが、例えば、５０塩基に対して、１〜６個が好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個である。また、前記（Ｂ）のＤＮＡは、ＬＫＰ２と同様の機能を喪失しない範囲であれば、例えば、前記（Ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよいし、前記いずれかのＤＮＡとの相同性が９０％以上のＤＮＡでもよい。ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、各配列番号で示された塩基配列のＴｍ値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、１０分の洗浄（２回）があげられる。また、相同性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。
【００１１】
また、ＬＫＰ２遺伝子は、例えば、配列番号２に示すＬＫＰ２のアミノ酸配列をコードする他の塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。
【００１２】
なお、シロイヌナズナのＬＫＰ２遺伝子ならびにＬＫＰ２の配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＡＢ０３８７９７にコードされている。本発明において、ＬＫＰ２遺伝子は、ＬＫＰ２と同様の機能を有するファミリータンパク質（例えば、ＺＴＬ）をコードする遺伝子であってもよい。
【００１３】
本発明の乾燥耐性ベクターは、植物に導入された際に、ＬＫＰ２遺伝子を発現するものであればよく、ＬＫＰ２遺伝子以外の構造は制限されない。乾燥耐性ベクターとしては、例えば、さらに発現プロモーターを有し、前記発現プロモーターの制御下にＬＫＰ２遺伝子が挿入されていることが好ましい。この場合、乾燥耐性ベクターは、目的の植物体に導入した際に、例えば、植物体の染色体に組み込まれてもよいし、植物体の染色体には組み込まれず、植物体において独立したエピソームとして存在してもよい。前者の場合、ＬＫＰ２遺伝子は、発現プロモーターの制御下に位置する状態で、植物体のゲノムに組み込まれることが好ましい。また、乾燥耐性ベクターは、植物体に導入され、組換えによって植物体の染色体に組み込まれることにより、ＬＫＰ２遺伝子が発現プロモーターの制御下に配置するような構造であってもよい。この場合、前記発現プロモーターは、例えば、植物体の染色体が本来備えるプロモーターであってもよいし、予め、染色体に組み込んだ外来の発現ベクターであってもよい。
【００１４】
前記発現プロモーターとしては、制限されないが、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター（Ｐ３５Ｓ）、マンノピン合成酵素遺伝子プロモーター、アクチン遺伝子プロモーター等があげられる。本発明の乾燥耐性ベクターにおいて、ＬＫＰ２遺伝子の位置は、例えば、発現プロモーターの制御下であればよく、通常、プロモーターの下流側（３’側）に機能的に配置される。
【００１５】
本発明の乾燥耐性ベクターは、種々のベクターにＬＫＰ２遺伝子が挿入されていればよく、前記ベクターの種類は、制限されず、例えば、後述するようなベクターの導入方法に応じて適宜決定できる。前記ベクターとしては、例えば、プラスミドベクターがあげられる。
【００１６】
後述するようなアグロバクテリウムを介した形質転換（アグロバクテリウム法）を行う場合は、例えば、バイナリーベクターが好ましく、これにＬＫＰ２遺伝子を挿入すれば、本発明の乾燥耐性ベクターとして使用できる。前記バイナリーベクターの種類は特に制限されないが、Ｔｉプラスミドベクターや、Ｔ−ＤＮＡの右側境界配列（ＲＢ）と左側境界配列（ＬＢ）とを有するベクター等があげられる。このようなバイナリーベクターは、前記Ｔ−ＤＮＡのＲＢとＬＢとの間に目的のＬＫＰ２遺伝子を挿入すれば、植物に導入した際に、ＲＢからＬＢの領域を植物の染色体に組み込むことができる。この場合、前述のようにＲＢとＬＢとの間には、さらに発現プロモーターが挿入され、この発現プロモーターの制御下にＬＫＰ２遺伝子が機能的に配置されていることが好ましい。ＬＫＰ２遺伝子を挿入するバイナリーベクターとしては、例えば、ｐＢＥ２１１３、ｐＢＩＮ１９等が使用できる。また、例えば、プロトプラスト法（エレクトロポレーション法）やパーティクルガン法を行う場合には、従来これらの方法に使用されている各種プラスミドを使用することもできる。
【００１７】
本発明の乾燥耐性ベクターは、さらに、植物への導入の有無を確認できることから、選択マーカーをコードする配列（選択マーカー配列）を有することが好ましい。選択マーカー配列としては、特に制限されず、公知の薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー等のマーカーをコードする配列があげられる。前記薬剤耐性マーカーとしては、特に制限されず、例えば、カナマイシン耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、ゼオシン耐性マーカー、ピューロマイシン耐性マーカー、ハイグロマイシン耐性マーカー等があげられる。前記蛍光タンパク質マーカーとしては、例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＧＦＰ（変異型ＧＦＰ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＧＦＰ）等があげられる。これらの選択マーカー配列は、その配列にしたがってＰＣＲ等により合成してもよいし、前記選択マーカーコード配列を有する市販のベクターから調製することもできる。
【００１８】
＜乾燥耐性植物の製造方法＞
本発明の製造方法は、乾燥耐性能を有する植物の製造方法であって、植物に、本発明の乾燥耐性ベクターを導入することを特徴とする。このような製造方法により、乾燥ストレスに対して耐性を示す本発明の乾燥耐性植物を生産することができる。
【００１９】
本発明の製造方法においては、本発明の乾燥耐性ベクターを目的の植物に導入すればよく、例えば、ベクターの導入方法や条件等は制限されない。
【００２０】
本発明の乾燥耐性ベクターの導入方法は、制限されず、アグロバクテリウム法、プロトプラスト法（エレクトロポレーション法）、パーティクルガン法等があげられる。これらの導入方法は、従来公知の方法に従って行うことができる。
【００２１】
アグロバクテリウム法を採用する場合、例えば、以下のようにして本発明の乾燥耐性植物を生産することができる。本発明の乾燥耐性ベクターとしては、例えば、前述のような、ＬＫＰ２遺伝子を挿入したバイナリーベクターが好ましい。この本発明の乾燥耐性ベクターを、Ｖｉｒ領域を有するプラスミドを持つアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入する。そして、目的の植物体に前記アグロバクテリウムを感染させ、培地で培養を行う。この際、前述のように乾燥耐性ベクターが選択マーカー配列を有していれば、例えば、薬剤等を含有する培地で培養することによって、乾燥耐性ベクターが導入された形質転換体を容易に選択できる。このようにして得られた形質転換体は、導入されたＬＫＰ２遺伝子の発現によって、乾燥に対して耐性を示す。
【００２２】
本発明において、本発明の乾燥耐性ベクターを導入する目的の植物は、制限されない。具体例としては、例えば、アブラナ科の植物等があげられ、前記アブラナ科の植物としては、例えば、シロイヌナズナ、ブロッコリー等があげられる。
【００２３】
このようにして得られる本発明の植物（形質転換体）は、導入されたＬＫＰ２遺伝子の発現によって、乾燥に対して耐性を示す。このため、本発明の植物であれば、例えば、砂漠のような、雨量が少なく水資源が少ない地域等であっても、生育が可能である。なお、本発明において植物とは、例えば、植物体全体でも、葉、種子等の植物体の一部でもよく、また、プロトプラスト、カルス等の植物細胞であってもよい。
【００２４】
［実施例］
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
【実施例１】
【００２５】
シロイヌナズナにＬＫＰ２遺伝子発現ベクターを導入し、乾燥に対する耐性が向上されているか否かを確認した。
【００２６】
＜乾燥耐性ベクターの構築＞
（１）ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＧＦＰ−ＬＫＰ２
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ、以下同様）のｃＤＮＡから、下記プライマーセット１を用いたＰＣＲによって、ＬＫＰ２コード領域を増幅させた。なお、下記プライマーセット１は、フォワードプライマー（配列番号３）が５’側にＳｔｕＩサイトを、リバースプライマー（配列番号４）が５’側にＢａｍＨＩサイトを備える。ＰＣＲによって得られた増幅物をＬＫＰ２遺伝子増幅物という。
（プライマーセット１）
フォワードプライマー（ＳｔｕＩサイト）
５’−GAGATCTAGACAATGAGTAAAGGAGAAGAA−３’ （配列番号３）
リバースプライマー（ＢａｍＨＩサイト）
５’−TCTCAGGCCTTTGTATAGTTCATCCATGCC−３’ （配列番号４）
【００２７】
他方、プラスミドｐｓｍＲＳ−ＧＦＰから、下記プライマーセット２を用いたＰＣＲによって、Ｓ６５Ｔで修飾されたシロイヌナズナのＲＳ−ＧＦＰ（ｓｍＲＳ−ＧＦＰ）コード領域を増幅させた（Davis  SJ,  Vierstra  RD.  1998.  Soluble,  highly  fluorescent  variants  of  green  fluorescent  protein  (GFP)  for  use  in  higher  plants.  Plant  Molecular  Biology  36,  521−528.）。なお、下記プライマーセット２は、フォワードプライマーが５’側にＸｂａＩサイトを、リバースプライマーが５’側にＳｔｕＩサイトを備える。ＰＣＲによって得られた増幅物をＧＦＰ遺伝子増幅物という。
（プライマーセット２）
フォワードプライマー（ＸｂａＩサイト）
５’−GAGAAGGCCTTATGCAAAATCAAATGGAGT−３’ （配列番号５）
リバースプライマー（ＳｔｕＩサイト）
５’−TCTCGGATCCGATCAAGTACTTGCAGTGGT−３’ （配列番号６）
【００２８】
そして、ＬＫＰ２遺伝子増幅物とＧＦＰ遺伝子増幅物とをＳｔｕＩで処理し、両者をライゲーションした。これにより、ＧＦＰ遺伝子の下流にＬＫＰ２遺伝子が結合した断片（以下、「ＧＦＰ−ＬＫＰ２断片」という）が得られた。なお、図１（Ｂ）に、ＧＦＰ−ＬＫＰ２断片の概略を示す。同図（Ｂ）における数値は、ＬＫＰ２遺伝子がコードするＬＫＰ２のアミノ酸残基数を示す。このＧＦＰ−ＬＫＰ２断片をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで処理し、バイナリーベクターｐＢＥ２１１３のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した。この組換え発現ベクターをｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＧＦＰ−ＬＫＰ２という。ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔの構成の一部の概略を図１（Ａ）に示す。同図に示すように、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔは、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターを備える発現ベクターである。同図（Ａ）において、「Ｅ１２」は、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター上流領域Ｅ１２配列（−４１９〜−９０ｂｐの２回繰り返し配列）であり、「Ｐ３５Ｓ」は、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターであり、「Ω」は、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）の５’非翻訳領域エンハンサーΩ領域であり、「ＮＯＳ−Ｔ」は、ノパリン合成酵素遺伝子ｎｏｓ３’非翻訳領域終止シグナル（転写ターミネーター及びｍＲＮＡポリアデニル化シグナル）であり、「ＲＢ」は、アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡの右側境界配列（Ｒｉｇｈｔ  Ｂｏｒｄｅｒ：２５ｂｐ）であり、「ＬＢ」は、前記Ｔ−ＤＮＡの左側境界配列（Ｌｅｆｔ  Ｂｏｒｄｅｒ：２５ｂｐ）である。ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＧＦＰ−ＬＫＰ２は、前述のように制限酵素で処理したＧＦＰ−ＬＫＰ２断片をｐＢＥ２１１３のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入しているため、ＧＦＰ−ＬＫＰ２断片が、Ｔ−ＤＮＡのＲＢとＬＢとに挟まれた構造となる。
【００２９】
（２）ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＬＫＰ２−ＧＦＰ
また、ＧＦＰ遺伝子とＬＫＰ２遺伝子の配置を逆にした組換え発現ベクターｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＬＫＰ２−ＧＦＰを構築した。これには、ＬＫＰ２遺伝子用の前記プライマーセット１に代えて、下記制限酵素サイトを含むプライマーセット３を、ＧＦＰ遺伝子用の前記プライマーセット２に代えて、下記制限酵素サイトを含む下記プライマーセット４を使用した。そして、同様にＰＣＲ反応を行い、ＬＫＰ２遺伝子のＰＣＲ産物とＧＦＰ遺伝子の増幅産物を得た。ＧＦＰ遺伝子の増幅産物をＳｍａＩおよびＮｏｔＩで処理し、バイナリーベクターｐＢＥ２１１３のＳｍａＩ、ＮｏｔＩサイトに挿入した。ＬＫＰ２遺伝子のＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで処理し、これを、ＧＦＰ遺伝子の増幅産物を挿入した前記バイナリーベクターｐＢＥ２１１３のＢａｍＨＩサイトに挿入した。この組換え発現ベクターをｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＬＫＰ２−ＧＦＰという。
（プライマーセット３）
フォワードプライマー（ＢａｍＨＩサイト）
５’−AGGATCCGTATGCAAATCAAATGGAGTGGG−３’ （配列番号７）
リバースプライマー（ＢａｍＨＩサイト）
５’−GGATCCAGTACTTGCAGTGGTAGAAGTTGC−３’ （配列番号８）
（プライマーセット４）
フォワードプライマー（ＳｍａＩサイト）
５’−CCCGGGTACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA−３’ （配列番号９）
リバースプライマー（ＮｏｔＩサイト）
５’−GCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG−３’ （配列番号１０）
【００３０】
なお、ＧＦＰ遺伝子増幅物をｐＢＥ２１１３に挿入して、コントロール発現ベクター（ＬＫＰ２遺伝子（−））を作製した。
【００３１】
これらの発現ベクターは、ＲＢとＬＢとの間に、プロモーターＰ３５ＳとＬＫＰ２遺伝子（および／またはＧＦＰ遺伝子）とが挿入され、前遺伝子は前記プロモーターの制御下に配置されている。したがって、従来公知の方法に従って、これらの発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを植物体に感染させれば、ＲＢからその下流に位置するＬＢまでの領域が、組換えにより植物体のゲノム中に組み込まれる。そして、組み込まれた発現プロモーターＰ３５Ｓの制御下にあるＬＫＰ２遺伝子（および／またはＧＦＰ遺伝子）が過剰に発現することとなる。
【００３２】
＜形質転換体の作製＞
作製した各種組換え発現ベクター（ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＧＦＰ−ＬＫＰ２、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＬＫＰ２−ＧＦＰ、コントロール発現ベクター）を、アグロバクテリウム法によりシロイヌナズナの植物体に導入した。なお、特に示さない限り、アグロバクテリウム法は、インプランタインフィルトレーション法（Clough  SJ,  Bent  AF.  1998.  Floral  dip:  a  simplified  method  for  Agrobacterium−mediated  transformation  of  Arabidopsis  thaliana.  The  Plant  Journal  16,  735−743.）に従って行った。まず、花序の多数出来たシロイヌナズナの花茎を、前記各組換え発現ベクターを保有するアグロバクテリウムの懸濁溶液に浸し、さらに育成して種子を収穫した。そして、収穫した種子を、前記アグロバクテリウムを除去するためのカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）と、遺伝子導入植物を選択するための選択薬剤カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）とを含む１／２ＭＳ寒天培地で生育させ、遺伝子（ＲＢからＬＢの領域）が導入された植物体を選択した。
【００３３】
＜水分含量測定＞
選択した植物体を、１／２ＭＳ寒天培地で、２２℃、白色光下（９０−１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）の長日条件（１６時間明、８時間暗）下、２週間生育させた。得られた植物体を培地から抜き取って、プラスチックシャーレに移し、２２℃で放置した。そして、前記植物体における水分量の経時的な減少を確認した。具体的には、放置開始時における植物体全体の重量を１００％として、これに対する各時点での植物体全体の重量の割合（％）の割合を求めた。なお、植物体全体の重量減少が少ない程（前記割合の低下が緩やかな程）、水分の減少が少なく、乾燥耐性に優れることを意味する。これらの結果を図２に示す。同図のグラフは、横軸が時間（分）、縦軸が、放置開始時の植物体全体の重量（１００％）に対する各時点での植物体全体の重量の割合（％）を示す（ｍｅａｎ±ＳＥ，ｎ＝８）。同図において、ＧＦＰ（◆）は、コントロール発現ベクター（ＬＫＰ２遺伝子（−））を導入した形質転換体、ＬＫＰ２−ＧＦＰ＃１（■）および＃２（▲）は、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＬＫＰ２−ＧＦＰを導入した形質転換体、ＧＦＰ−ＬＫＰ２（●）は、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＧＦＰ−ＬＫＰ２を導入した形質転換体の結果を示す。
【００３４】
同図に示すように、コントロール発現ベクターを導入した形質転換体と比較して、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＬＫＰ２−ＧＦＰｇおよびｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＧＦＰ−ＬＫＰ２を導入した形質転換体は、重量の減少が抑制された。つまり、植物体中の水分の減少が抑制されていることから、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＬＫＰ２−ＧＦＰまたはｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＧＦＰ−ＬＫＰ２を導入して、ＬＫＰ２遺伝子を過剰発現させることによって、乾燥に対する耐性が向上したといえる。
【００３５】
＜乾燥ストレス耐性試験＞
選択した植物体をポットに植え、短日条件下で生育させた。そして、３０日間育成させた後、短日条件下、水の供給を停止して生育状態を観察した。この結果を、図３に示す。図３は、所定時期における植物体の外観を示す写真である。同図において上段の写真は、コントロール発現ベクターを導入した形質転換体（ＧＦＰ）の結果であり、下段は、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＧＦＰ−ＬＫＰ２を導入した形質転換体の結果である。また、「Ｂｅｆｏｒｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」は、水の供給を停止した時点の外観、「Ｄｒｏｕｇｈｔ  ３０ｄａｙｓ」は、水の供給を停止してから３０日目の外観、「Ｄｒｏｕｇｈｔ  ３６ｄａｙｓ」は、水の供給を停止してから３６日目の外観である。
【００３６】
同図に示すように、コントロール発現ベクターを導入した形質転換体（ＧＦＰ）とｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＧＦＰ−ＬＫＰ２を導入した形質転換体は、水の供給を停止してから３０日目までは、生育に顕著な差は見られなかった。しかしながら、３６日目には、コントロールの形質転換体は、生存率が０％となったのに対して、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＧＦＰ−ＬＫＰ２を導入した形質転換体は、２６％が生存していた。このことから、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＧＦＰ−ＬＫＰ２の導入により、ＬＫＰ２遺伝子を過剰発現させることによって、乾燥に対する耐性が向上したといえる。
【００３７】
また、長日条件においても同様の生育を行った。この結果を、図４に示す。図４は、所定時期における植物体の外観を示す写真である。同図において上段の写真は、コントロール発現ベクターを導入した形質転換体（ＧＦＰ）の結果であり、下段は、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＧＦＰ−ＬＫＰ２を導入した形質転換体の結果である。また、「Ｂｅｆｏｒｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」は、水の供給を停止した時点の外観、「Ｄｒｏｕｇｈｔ  ７ｄａｙｓ、１３ｄａｙｓ、１６ｄａｙｓ」は、水の供給を停止してから７、１３、１６日目の外観、「Ｒｅｗａｔｅｒ  ２ｄａｙｓ」は、さらに、水の供給を再開してから２日目の外観である。
【００３８】
同図に示すように、コントロールの形質転換体（ＧＦＰ）とｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＧＦＰ−ＬＫＰ２を導入した形質転換体は、水の供給を停止してから７日目までは、生育に顕著な差は見られなかった。しかしながら、１３日目には、コントロールの形質転換体の多くにしおれが観察され、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＧＦＰ−ＬＫＰ２を導入した形質転換体には、しおれが観察されなかった。そして、１６日目には、両方の形質転換体にしおれが確認された。しかしながら、再度水の供給を開始したところ、コントロールの形質転換体は、全てが枯死したのに対して、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ／ＧＦＰ−ＬＫＰ２を導入した形質転換体は、５０％が回復した。これらの結果からも、ＬＫＰ２遺伝子を過剰発現させることで乾燥耐性が向上していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明のＬＫＰ２遺伝子を含む乾燥耐性ベクターや製造方法によれば、例えば、水分の供給が困難である厳しい環境においても生育可能な植物を作出することができる。このようにして得られる植物は、乾燥耐性能に優れることから、本発明は、農業の分野や、近年、深刻化している砂漠化等の環境問題に対しても、極めて有用な技術といえる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、本発明の一実施例における乾燥耐性ベクターの構築の一例を示す概略図である。
【図２】図２は、本発明の他の実施例において、植物体における水分量の経時的な減少を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明のさらにその他の実施例において、水の供給を停止した際の植物体の外観の変動を示す写真である。
【図４】図４は、本発明のさらにその他の実施例において、水の供給を停止した際ならびに水の供給を再開した際の植物体の外観の変動を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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