(57)【要約】【課題】アトピー性皮膚炎等のそう痒性皮膚疾患を治療又は予防できる新規な手段を提供すること。【解決手段】反発性神経軸索ガイダンス分子として知られるセマフォリン３Ａタンパク質又はその特定の誘導体等を有効成分として含有するそう痒性皮膚疾患の治療又は予防剤を提供した。【効果】本発明のそう痒性皮膚疾患の治療又は予防剤は、従来の標準的な治療薬であるステロイド剤等とは機序が異なるため、従来のステロイド剤に対し抵抗性となって難治化したアトピー性皮膚炎に対しても有効であり得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(a)ないし(c)のいずれかのポリペプチドから成る領域を含み、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するポリペプチドを有効成分として含有するそう痒性皮膚疾患の治療又は予防剤。
(a)  配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続する７０個以上のアミノ酸から成り、配列番号４中の166aa〜235aaの領域を含むポリペプチド。
(b)  配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続する７０個以上のアミノ酸から成り、配列番号２中の166aa〜235aaの領域を含むポリペプチド。
(c)  (a)又は(b)のポリペプチドと８０％以上の配列相同性を有するポリペプチド。
【請求項２】
前記(c)のポリペプチドが、前記(a)又は前記(b)のポリペプチドと９５％以上の配列相同性を有するポリペプチドである請求項１記載の治療又は予防剤。
【請求項３】
前記そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するポリペプチドが下記(a)又は(b)のポリペプチドである請求項１記載の治療又は予防剤。
(a)  配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続する７０個以上のアミノ酸から成り、配列番号４中の166aa〜235aaの領域を含むポリペプチド。
(b)  配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続する７０個以上のアミノ酸から成り、配列番号２中の166aa〜235aaの領域を含むポリペプチド。
【請求項４】
前記そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのいずれかと８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドである請求項１ないし３のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
【請求項５】
前記そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのいずれかと９５％以上の配列相同性を有するポリペプチドである請求項４記載の治療又は予防剤。
【請求項６】
前記そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項５記載の治療又は予防剤。
【請求項７】
前記そう痒性皮膚疾患がアトピー性皮膚炎である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アトピー性皮膚炎等のそう痒性皮膚疾患の治療又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎（atopic dermatitis; AD）は、本邦における有症率が約１０％にも上る疾患である。ADは近年増加傾向にあり、患者に多くの精神的・身体的苦痛を強いている皮膚科領域の重要疾患である。
【０００３】
ADの治療方法としては、ステロイド外用剤、タクロリムス外用剤、抗ヒスタミン／アレルギー内服薬、また最重症の場合にはステロイド内服薬を用いるのが基本である（非特許文献１）。
【０００４】
ステロイド剤や抗ヒスタミン／アレルギー薬の作用機序は、アレルギー反応の結果遊離される各種起痒・炎症物質を抑えることである。すなわち、これらの薬剤を用いた治療方法は対症療法であって、根本的治療方法ではない。AD患者の中には、上記した従来の標準的治療薬が無効な難治性AD患者も少なくない。また、ADでは、痒みの伝達神経であるC線維が皮膚表面の角層近くまで伸長し、痒みに対し過敏な状態となっていることが知られているが、ステロイド剤や抗ヒスタミン／アレルギー薬のような従来の薬剤では、この神経過敏状態を根本的に改善することはできない。従来の薬剤を用いた方法とは異なる新規なADの治療方法の確立が望まれているが、現在までのところ、ADの治療方法として満足できる方法は知られていない。
【０００５】
【非特許文献１】アトピー性皮膚炎治療ガイドライン2005（平成8年度厚生省長期慢性疾患総合研究事業アレルギー総合研究および平成9−16年度厚生労働科学研究）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、アトピー性皮膚炎等のそう痒性皮膚疾患を治療又は予防できる新規な手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、反発性神経軸索ガイダンス分子として知られるセマフォリン３Ａタンパク質をＡＤモデルマウスであるNC/Ngaに投与すると、皮疹が改善し、更には掻破痕も減少すなわちそう痒も軽減することを見出し、本願発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記(a)ないし(c)のいずれかのポリペプチドから成る領域を含み、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するポリペプチドを有効成分として含有するそう痒性皮膚疾患の治療又は予防剤を提供する：(a)  配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続する７０個以上のアミノ酸から成り、配列番号４中の166aa〜235aaの領域を含むポリペプチド、(b)  配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続する７０個以上のアミノ酸から成り、配列番号２中の166aa〜235aaの領域を含むポリペプチド、(c)  (a)又は(b)のポリペプチドと８０％以上の配列相同性を有するポリペプチド。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、従来の標準的な治療薬とは異なる、アトピー性皮膚炎等のそう痒性皮膚疾患を治療又は予防できる新規な治療又は予防剤が提供された。下記実施例に具体的に示されるとおり、上記ポリペプチドをアトピー性皮膚炎モデルマウスの皮疹部に投与することにより、皮疹が改善し、掻破痕も減少すなわちそう痒も軽減する。従って、本発明の治療又は予防剤は、アトピー性皮膚炎等のそう痒性皮膚疾患の治療又は予防に有用である。本発明の治療又は予防剤は、従来のステロイド剤等とは機序が異なるため、従来のステロイド剤に対し抵抗性となって難治化したアトピー性皮膚炎に対しても有効であり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のそう痒性皮膚疾患の治療又は予防剤に有効成分として含まれるポリペプチドは、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するポリペプチドである。具体的には、下記(a)ないし(c)のいずれかのポリペプチドから成る領域を含み、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するポリペプチドである。
(a)  配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続する７０個以上のアミノ酸から成り、配列番号４中の166aa〜235aa（「第166番アミノ酸〜第235番アミノ酸」を意味する）の領域を含むポリペプチド。
(b)  配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続する７０個以上のアミノ酸から成り、配列番号２中の166aa〜235aaの領域を含むポリペプチド。
(c)  (a)又は(b)のポリペプチドと８０％以上の配列相同性を有するポリペプチド。
【００１１】
ここで、「そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性」とは、そう痒性皮膚疾患（例えばアトピー性皮膚炎等）の皮膚病変部の症状を改善又は該症状の増悪を防止する活性を意味する。ポリペプチドが該活性を有するか否かは、例えば、アトピー性皮膚炎（AD）を発症している動物に皮内注射等によりポリペプチドを投与し、病変部の症状が改善するか否かを評価することによって調べることができる。AD発症動物としては、例えば、下記実施例に記載されるNC/NgaマウスのようなADモデル動物を用いることができる。NC/Ngaマウスは、アトピー性皮膚疾患の動物モデルとして、当該分野において広く用いられているモデルであり、通常飼育条件下で飼育すると、約７週齢ごろから顔、耳、上背部などにアトピー性皮膚炎に類似した皮膚炎を発症する。NC/Ngaマウスを用いたそう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性の評価は、下記実施例に具体的に記載するように、例えば、NC/Ngaマウスの皮膚病変部に皮内注射により一定期間ポリペプチドを投与し、病変部の症状の改善の有無を評価することにより行なうことができる。皮膚病辺部の症状の改善の有無は、例えば、下記実施例に記載されるように、クリニカルスキンスコア（Leung、Clin Exp Immunol 107 (Suppl. 1), 25-30, 1997; Suto et al., Int Arch Allergy Immunol 120 (Suppl. 1), 70-75, 1999）を指標として評価することができる。クリニカルスキンスコアとは、皮疹について、紅斑/出血、浮腫、びらん、落屑/乾燥、の４項目に分け、それぞれの項目について0から3までの4段階(0(なし)、1(軽度)、2(中度)、3(重度))で評価し、合計を算出するものであり、最高スコアは12点になる。例えば、無処置のAD発症個体群のクリニカルスキンスコア平均値と比較して、一定期間ポリペプチドを投与したAD発症個体群のクリニカルスキンスコア平均値が有意に低下した場合、又は、例えば、ポリペプチド投与群のスコア平均値が無処置個体群のスコア平均値の約３分の２以下、好ましくは約２分の１以下となった場合には、該ポリペプチドはそう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有すると判断できる。
【００１２】
また、AD発症動物を用いた上記活性の評価に先立ち、対象のポリペプチドを、後根神経節（ＤＲＧ）の成長円錐を用いたインビトロでの退縮アッセイ（collapse assay）（Luo et al., Cell vol.75, 217-227, 1993）に付してもよい。退縮アッセイにより、ポリペプチドがSema3Aタンパク質の生理活性と同様の活性を有しているかを確認できるが、Sema3Aタンパク質は下記実施例に示される通りそう痒性皮膚疾患であるＡＤの皮膚病変部の症状を改善する作用を有するため、該退縮アッセイによれば、ポリペプチドがそう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するか否かを検討することができる。具体的には、該アッセイは、例えば下記実施例に記載されるようにして行うことができる。すなわち、例えば、胚性７日目程度のニワトリ等の卵胚からDRGを摘出し、該DRGを神経成長因子(NGF)含有培地入りのガラス底面にのせ、37℃で24時間程度静地培養することにより、NGF感受性DRGニューロンを伸長させる。これに様々な希釈倍率のポリペプチド溶液を投与し、37℃で30分程度静地培養し、固定後DRGの退縮を観察して、全NGF感受性DRGニューロンのうち、成長円錐が退縮しているニューロンの割合(%)を算出する。より低濃度（高希釈倍率）で多くのニューロンを退縮させるポリペプチドほど、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性が高いと予想される。なお、本発明において、50％以上のニューロンの退縮を認める最も希釈されたポリペプチド溶液の希釈倍率がX倍希釈であるときの、該ポリペプチドの力価をX U/mlとする。退縮アッセイでは、特に限定されないが、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を調べるべきポリペプチドが由来する生物種と同一種の由来の成長円錐を用いると、上記治療又は予防作用の評価の精度を高めることができるため好ましく、例えばニワトリSema3Aタンパク質断片（すなわち上記(a)のポリペプチドの一例）の上記治療又は予防活性を調べる場合には、ニワトリ成長円錐を用いることが好ましい。上記(a)のポリペプチドについて、退縮アッセイにより上記治療又は予防活性を調べる場合には、例えば、上記(a)のポリペプチドのＤＲＧ成長円錐の５０％退縮濃度（EC50）を測定し、該濃度に基づいて上記活性を評価する。この際、陽性コントロールとして、好ましくは配列番号４に示されるアミノ酸配列の全長から成るニワトリSema3Aタンパク質を用いることが望ましい。特に限定されないが、通常、対象ポリペプチドのEC50が陽性コントロールのEC50の５倍以内、特に２倍以内であれば、該ポリペプチドはそう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有する可能性が高い。
【００１３】
なお、本発明において、「ポリペプチド」とは、複数（２以上）のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が多い高分子量の分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）や、タンパク質も包含される。
【００１４】
また、本発明において、「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、Met Gly Trp Leu ・・・（中略）・・・Pro Arg Ser Valのアミノ酸配列を持つ７７１アミノ酸残基のサイズのポリペプチドを意味する。
【００１５】
配列番号２及び４に示されるアミノ酸配列は、セマフォリン３Ａタンパク質（それぞれヒト及びニワトリ）の配列であり、それぞれGenBankにアクセッション番号NM006080及びU02528として登録されている。セマフォリンとは、神経軸索の伸長をガイドする分子として同定されたタンパク質である。神経突起の先端にある成長円錐を退縮（collapse）させる活性をもとに発見されたことから、コラプシンと呼ばれることもある。セマフォリンは、分泌型又は膜貫通型のタンパク質ファミリーを構成し、現在までに線虫などの無脊椎動物からヒトなどの脊椎動物までで３０種類を超えるメンバーが同定されている。セマフォリン３Ａ（Sema3A）は、セマフォリンの分泌型タンパク質メンバーの１つであり、反発性神経軸索ガイダンス分子として知られるタンパク質分子である。Sema3A等の分泌型セマフォリンは、〜500aaアミノ末端のセマフォリン（sema）ドメイン、Ｃ−２型免疫グロブリン（Ig）ドメイン、及び塩基性末端ドメインの３つの構造ドメインを有する。Sema3Aが神経伸長抑制作用等の生理活性を発揮するのに必要な領域は、semaドメインのうち、特に１６６〜２３５番目にあたる７０アミノ酸の領域であることが知られている（Koppel et al., Neuron, Vol.19, 531-537, 1997）。該７０アミノ酸の領域（以下「70aa領域」という）は、配列番号２及び配列番号４のいずれにおいても166aa〜235aaの領域である。Sema3Aは、ヒト、ニワトリ、マウス、ラット等の種々の動物から同定されている。これらのSema3Aの相同性は、タンパク質全体として比較するとおおよそ８５％前後と高く、上記した７０アミノ酸の領域のみで比較すると、９５％程度以上とさらに高い。なお、配列番号４のアミノ酸配列を有するニワトリSema3Aでは、semaドメインは61aa〜567aa、Igドメインは592aa〜655aa、塩基性末端は726aa〜772aaである（Feiner et al., Neuron, Vol.19, 539-545, 1997参照）。配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトSema3Aでは、semaドメインは61aa〜567aa、Igドメインは591aa〜654aa、塩基性末端ドメインは726aa〜771aaである。
【００１６】
上記(a)のポリペプチドとは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するニワトリSema3Aタンパク質のうちの少なくとも70aa領域を含む領域から成るポリペプチドであり、具体的には、配列番号４の全長から成るポリペプチド又は70aa領域を含むその断片である。本発明の治療又は予防剤に有効成分として含有されるポリペプチドの１つの例は、(a)のポリペプチドから成る領域を含み、かつ、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するポリペプチドである（以下、便宜的に「有効成分ポリペプチドa」と呼ぶ）。有効成分ポリペプチドaとしては、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有する限り、(a)のポリペプチドのみから成るものであってもよく、また、(a)のポリペプチドの一端又は両端にアミノ酸又はポリペプチドが付加されたものであってもよい。
【００１７】
(a)のポリペプチドのみから成る有効成分ポリペプチドaの具体例としては、特に限定されないが、例えば、配列番号４に示されるアミノ酸配列の全長から成るポリペプチド（すなわちニワトリSema3Aタンパク質）が挙げられる。ニワトリSema3Aタンパク質がそう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有することは、下記実施例に具体的に記載される通りである。また、ニワトリSema3Aタンパク質のN末端又はC末端の一部を欠失した断片であっても、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有する限り、有効成分ポリペプチドaとして本発明の範囲に包含される。
【００１８】
また、(a)のポリペプチドにポリペプチド等が付加された有効成分ポリペプチドaの具体例としては、特に限定されないが、例えば、配列番号４の70aa領域をSema3A以外の分泌型セマフォリンの対応領域に入れ替えて構築したキメラタンパク質、及び(a)のポリペプチドにHisタグ、ＦＬＡＧタグ、mycタグ等の各種タグ等が付加されたポリペプチド等が挙げられる。上記Sema3A以外の分泌型セマフォリンとしては、例えばコラプシン２、コラプシン３、コラプシン５等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、コラプシン２、コラプシン３及びコラプシン５のアミノ酸配列は、Feiner et al., Neuron, vol.19, 539-545 (1997)に記載される通り公知である。Koppelらの上記論文に開示される通り、Sema3Aの少なくとも70aa領域を含む領域をコラプシン２の対応領域に入れ替えて構築したキメラタンパク質は、Sema3Aが有するＤＲＧ退縮活性を保持しており、Sema3Aと同様の生理活性を発揮する。従って、このようなキメラタンパク質も、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するので、有効成分ポリペプチドaとして本発明の範囲に包含される。さらに、Igドメインを欠失したSema3AもＤＲＧ退縮活性を有するが（Koppel et al., 1997）、このようなポリペプチドも、Sema3AのうちIgドメインよりもN末端側の70aaを含む領域にSema3Aの塩基性ドメインを付加したポリペプチドとして、有効成分ポリペプチドaに包含され、本発明の範囲に含まれる。なお、上記した具体例は単なる例示であり、(a)のポリペプチドにいかなるアミノ酸又はポリペプチドが付加されたものであっても、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有する限り、有効成分ポリペプチドaとして本発明の範囲に包含される。
【００１９】
上記(b)のポリペプチドとは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するヒトSema3Aタンパク質のうちの少なくとも70aa領域を含む領域から成るポリペプチドであり、具体的には、配列番号２の全長から成るポリペプチド又は70aa領域を含むその断片である。本発明の治療又は予防剤に有効成分として含有されるポリペプチドのもう１つの例は、(b)のポリペプチドから成る領域を含み、かつ、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するポリペプチドである（以下、便宜的に「有効成分ポリペプチドb」と呼ぶ）。ニワトリのSema3A（配列番号４）とヒトのSema3A（配列番号２）との相同性は、タンパク質全長では８６％であり、Sema3Aの生理活性に重要な70aa領域のみで比較すると９５％と更に高い。下記実施例に記載される通り、ニワトリのSema3AがニワトリではないマウスのＡＤを治療又は予防できるのであるから、ニワトリのSema3Aを用いてヒト等のニワトリ及びマウス以外のＡＤを治療又は予防することも可能である。従って、ヒトSema3Aタンパク質等の有効成分ポリペプチドbも、ニワトリSema3Aタンパク質等の上記有効成分ポリペプチドaと同様に、AD等のそう痒性皮膚疾患の治療又は予防剤の調製に有用である。有効成分ポリペプチドbも、上記した有効成分ポリペプチドaと同様に、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有する限り、(b)のポリペプチドのみから成るものであってもよく、また、(b)のポリペプチドの一端又は両端にアミノ酸又はポリペプチドが付加されたものであってもよい。このようなポリペプチドの具体例は、上記有効成分ポリペプチドaと同様であり、例えば、特に限定されないが、配列番号２の全長から成るポリペプチド（すなわちヒトSema3Aタンパク質）、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するその断片、Sema3A以外の分泌型セマフォリンとの上記態様によるキメラタンパク質、(b)のポリペプチドに各種タグ等が付加されたポリペプチド等が挙げられる。これらの具体例も単なる例示であり、(b)のポリペプチドにいかなるアミノ酸又はポリペプチドが付加された態様のものであっても、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有する限り、有効成分ポリペプチドbとして本発明の範囲に包含される。
【００２０】
上記(c)のポリペプチドは、上記(a)又は(b)のポリペプチドのうちの少数（好ましくは１ないし数個）のアミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入されたポリペプチドであって、元の配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有するポリペプチドである。一般に、タンパク質において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換され、欠失され又は挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ機能を有している場合があることは、当業者において広く知られている。従って、上記(c)のポリペプチドから成る領域も、上記した70aa領域と同様にSema3Aタンパク質の生理活性をもたらし得るため、上記(c)のポリペプチドから成る領域を含み、かつ、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するポリペプチド（以下、便宜的に「有効成分ポリペプチドc」と呼ぶ）も、上記有効成分ポリペプチドa及びbと同様に、本発明の治療又は予防剤の調製に有用である。
【００２１】
ここで、アミノ酸配列の「相同性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を、全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばBLAST、FASTA、CLUSTAL W等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、相同性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、上記(a)又は(b)のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、有効成分として用いるポリペプチドのそう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を維持できる可能性が高くなる。
【００２２】
上記(c)のポリペプチドとは、具体的には、配列番号２若しくは配列番号４で示されるアミノ酸配列の全長から成るポリペプチド（すなわちSema3Aタンパク質）と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチド、又は、70aa領域を含むSema3Aタンパク質断片と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドである。従って、上記有効成分ポリペプチドcとは、これらのポリペプチドのみから成るポリペプチド、又は、(c)のポリペプチドの一端又は両端にアミノ酸又はポリペプチドが付加されたものであって、かつ、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するポリペプチドである。これらの具体例は、上記有効成分ポリペプチドa及びbと同様であり、特に限定されないが、例えば、配列番号２又は４の全長から成るポリペプチド（すなわちSema3Aタンパク質）と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチド、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有するSema3Aタンパク質断片と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチド、70aa領域を含む領域と８０％以上の配列相同性を有する領域と、Sema3A以外の分泌型セマフォリンのその他の領域とを融合させたキメラタンパク質、(c)のポリペプチドに各種タグ等が付加されたポリペプチド等が挙げられる。これらの具体例も単なる例示であり、(c)のポリペプチドにいかなるアミノ酸又はポリペプチドが付加された態様のものであっても、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有する限り、有効成分ポリペプチドcとして本発明の範囲に包含される。
【００２３】
有効成分ポリペプチドcとしては、特に、70aa領域における相同性が、(c)のポリペプチドから成る領域全体の相同性よりも高いポリペプチドが好ましい。例えば、有効成分ポリペプチドcが、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと８０％の相同性を有するポリペプチドである場合、70aa領域における相同性が８０％を超えるものが好ましく、特に、70aa領域における相同性が９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは70aa領域における配列が同一であるポリペプチドが好ましい。また、例えば、有効成分ポリペプチドcが、ヒトSema3Aタンパク質のsemaドメインと８０％の配列相同性を有する領域と、Sema3A以外の分泌型セマフォリンのsemaドメイン以外の領域とを融合させたキメラタンパク質である場合、semaドメイン中の70aa領域における相同性が８０％を超えるものが好ましく、特に、70aa領域における相同性が９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは70aa領域における配列が同一であるキメラタンパク質が好ましい。
【００２４】
上記した有効成分ポリペプチドaないしcの中でも、特に、配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有するポリペプチドが好ましく、この中でも、上記したように、70aa領域における相同性がポリペプチド全体としての相同性よりも高いポリペプチドが好ましい。最も好ましくは、本発明の治療又は予防剤に有効成分として含まれるポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００２５】
一般に、ポリペプチドから成る医薬において、生体内でのポリペプチドの安定性を高めるために、ポリペプチドに糖鎖やポリエチレングリコール(PEG)鎖を付加したり、ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部としてＤ体アミノ酸を用いたりする技術が広く知られており、用いられている。糖鎖やPEG鎖を付加したり、ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部としてＤ体アミノ酸を用いたりすることにより、生体内でのペプチダーゼによる分解を受けにくくなり、生体内におけるポリペプチドの半減期が長くなる。本発明のポリペプチドは、そう痒性皮膚疾患の治療又は予防活性を有する限り、生体内安定化のためのこれらの公知の修飾を施したものであってもよく、本明細書及び特許請求の範囲における「ポリペプチド」という語は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、生体内安定化のための修飾を施したものも包含する意味で用いている。
【００２６】
ポリペプチドに対する糖鎖付加は周知であり、例えば、Sato M, Furuike T, Sadamoto R, Fujitani N, Nakahara T, Niikura K, Monde K, Kondo H, Nishimura S., "Glycoinsulins: dendritic sialyloligosaccharide-displaying insulins showing a prolonged blood-sugar-lowering activity.",J Am Chem Soc. 2004 Nov 3;126(43):14013-22やSato M, Sadamoto R, Niikura K, Monde K, Kondo H, Nishimura S,"Site-specific introduction of sialic acid into insulin.", Angew Chem Int Ed Engl. 2004 Mar 12;43(12):1516-20等に記載されている。糖鎖は、Ｎ末端、Ｃ末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であるが、ポリペプチドの活性を阻害しないためにＮ末端又はＣ末端に結合することが好ましい。また、付加する糖鎖の個数は、１個又は２個が好ましく、１個が好ましい。糖鎖は、単糖から４糖が好ましく、さらには２糖又は３糖が好ましい。糖鎖は、ポリペプチドの遊離のアミノ基又はカルボキシル基に直接又は例えば炭素数１〜１０程度のメチレン鎖等のスペーサー構造を介して結合することができる。
【００２７】
ポリペプチドに対するPEG鎖の付加も周知であり、例えば、Ulbricht K, Bucha E, Poschel KA, Stein G, Wolf G, Nowak G., "The use of PEG-Hirudin in chronic hemodialysis monitored by the Ecarin Clotting Time: influence on clotting of the extracorporeal system and hemostatic parameters.", Clin Nephrol. 2006 Mar;65(3):180-90.やDharap SS, Wang Y, Chandna P, Khandare JJ, Qiu B, Gunaseelan S, Sinko PJ, Stein S, Farmanfarmaian A, Minko T., "Tumor-specific targeting of an anticancer drug delivery system by LHRH peptide.", Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Sep 6;102(36):12962-7."等に記載されている。PEG鎖は、Ｎ末端、Ｃ末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であり、通常、１個又は２個のPEG鎖が、ポリペプチド上の遊離のアミノ基やカルボキシル基に結合される。PEG鎖の分子量は、特に限定されないが、通常3000〜7000程度、好ましくは5000程度のものが用いられる。
【００２８】
ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部をＤ体とする方法も周知であり、例えば、Brenneman DE, Spong CY, Hauser JM, Abebe D, Pinhasov A, Golian T, Gozes I., "Protective peptides that are orally active and mechanistically nonchiral.", J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun;309(3):1190-7やWilkemeyer MF, Chen SY, Menkari CE, Sulik KK, Charness ME., "Ethanol antagonist peptides: structural specificity without stereospecificity.", J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun;309(3):1183-9.等に記載されている。ポリペプチドを構成するアミノ酸の一部をＤ体としてもよいが、ポリペプチドの活性をできるだけ阻害しないため、一部のみをＤ体にするよりは、ポリペプチドを構成するアミノ酸の全てをＤ体アミノ酸とすることが好ましい。
【００２９】
本発明で有効成分として用いられる上記ポリペプチドは、例えば市販のペプチド合成機を用いて常法により容易に調製することができる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて容易に調製することができる。例えば、Sema3A遺伝子を発現している組織から抽出したＲＮＡから、Sema3A遺伝子のcDNAをＲＴ−ＰＣＲにより調製し、該cDNAの全長又は所望の一部を発現ベクターに組み込んで、宿主細胞中に導入し、目的とするポリペプチドを得ることができる。ＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲ、ベクターへのcDNAの組み込み、ベクターの宿主細胞への導入は周知の方法により行なうことができる。また、用いるベクターや宿主細胞も周知であり、種々のものが市販されている。キメラタンパク質の作製方法もこの分野で周知であり、例えば上記Koppelらの論文に記載される方法でキメラタンパク質を作製することができる。また、上記安定化修飾も、上記各文献に記載されているような周知の方法により容易に行なうことができる。
【００３０】
下記実施例に示される通り、ADモデルマウスの皮疹部にSema3Aを投与すると、皮疹が改善し、掻破痕も減少する。また、組織学的レベルでも、表皮肥厚の改善や、リンパ球及び好酸球等を中心とする炎症細胞の浸潤の減少が認められる。Sema3AのADに対する作用機序の詳細は不明であるが、以下のことが考えられる。ADの病態とは、免疫過剰状態、神経系の過敏状態、及び皮膚の増殖・修復過程の異常を含む複雑な病態である。近年では、ADにおいては、掻破刺激で角化細胞から産生された神経成長因子（NGF）によりC線維が増加し、その結果「痒み過敏状態」を引き起こし、更なる掻破を誘発して皮疹・そう痒の悪化をきたすという悪循環、すなわちitch-scratch circleが生じ、これが原因となってADの慢性化・難治化が生じていると考えられている。Sema3Aが反発性神経軸索ガイダンス分子であり、神経軸索の伸長に関与する分子であることから推察すると、Sema3Aは、C線維の増加に何らかの形で影響を及ぼしてitch-scratch circleを断ち切る作用を示し、これがADの治療又は予防に寄与しているものと考えられる。このような作用は、従来のステロイド剤や抗ヒスタミン／アレルギー薬の作用、すなわちアレルギー反応の結果遊離される各種起痒・炎症物質を抑える作用とは異なるものである。従って、本発明の治療又は予防剤は、従来の標準的な薬剤が無効となった難治性のADに対しても有効であり得る。また近年、Sema３AにT細胞抑制作用があることが報告されており、Sema3A投与によりアレルギー反応が抑制される可能性も考えられる。
【００３１】
また、itch-scratch circleは、程度の差こそあれ、AD以外にもほとんどのそう痒性皮膚疾患に関与している。従って、本発明で有効成分として用いられる上記したポリペプチドは、アトピー性皮膚炎のみならず、その他のそう痒性皮膚疾患、例えば湿疹・皮膚炎群全般(接触皮膚炎、皮脂欠乏性湿疹、Vidal苔癬など)、痒疹群(痒疹、色素性痒疹など)、皮膚そう痒症、そう痒を伴う炎症性角化症(尋常性乾癬、扁平苔癬など)、全身性疾患 (内分泌代謝疾患(糖尿病、甲状腺機能異常など)、血液疾患、内臓悪性腫瘍、肝障害、腎障害、心因性など) に伴う皮膚そう痒症などの治療又は予防にも有用である。ただし、そう痒性皮膚疾患のうち感染症によるものは、そう痒の原因が主に感染した病原体にあり、itch-scratch circleの寄与する割合は低い。従って、本発明の治療又は予防剤が対象とするそう痒性皮膚疾患は、感染症以外のそう痒性皮膚疾患である。
【００３２】
本発明の治療又は予防剤の投与対象は哺乳動物であり、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター等が挙げられる。なお、治療又は予防対象の患者と同一の生物種由来のSema3Aを用いた方が、治療又は予防効果も高いと考えられるし、臨床応用上の安全性の観点からも望ましい。従って、例えば、本発明の治療又は予防剤の投与対象がヒトの場合には、上記した有効成分ポリペプチドbを有効成分とする治療又は予防剤が特に好ましい。
【００３３】
本発明の治療又は予防剤は、上記ポリペプチドのみから成っていてもよいし、各投与形態に適した薬理学的に許容される賦形剤、安定化剤、保存剤、緩衝剤、溶解補助剤、乳化剤、希釈剤、等張化剤などの添加剤を適宜混合させて製剤することもできる。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。
【００３４】
本発明の治療又は予防剤は、治療すべき皮膚病変部又は予防すべき皮膚部に局部投与して用いられる。局部投与方法としては、注射剤・点滴剤等による皮内投与、軟膏剤・クリーム剤・貼付剤等による局部投与等が挙げられ、中でも注射による皮内投与が好ましい。投与量は、症状、年齢、体重、投与方法等に応じて適宜選択され、特に限定されないが、通常、対象動物に対し有効成分量として１日1.5 U〜1.5×106 U程度、特に1.5×10 U〜1.5×105 U程度であり、１回ないし数回に分けて投与される。ここで、「1 U」とは、常法により得られる精製ポリペプチド溶液の原液でNGF感受性DRGニューロンの50％の成長円錐を退縮(collapse)させるセマフォリン力価のことであり、上記した退縮アッセイにより調べることができる。好ましくは、症状の改善の程度に応じ、数日ないし数ヶ月間にわたり、毎日１回若しくは数回、ないしは数日おきに１日若しくは数回、定期的に投与される。
【００３５】
本発明の治療又は予防剤は、単独で用いてもよいし、他のそう痒性皮膚疾患の治療又は予防剤等と併せて用いることもできる。本発明の治療又は予防剤は、上記した通り、従来の標準的治療薬であるステロイド剤や抗ヒスタミン／アレルギー薬とは作用機序が異なるため、これらと併用することもできる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
【００３７】
１．  材料及び方法
(1)  動物
上背部に皮膚炎を発症しているNC/Ngaマウス(12週齢、オス、日本SLC)を24匹用意し、全匹上背部を剃毛した。これを、皮疹重症度の平均がそろうように4群に分けた。アトピー性皮膚炎は体質だけでなく環境因子も関わる疾患であることを考慮して、飼育環境を揃えるために、全実験期間にわたり、24匹は同一のケージ内で飼育した。個体の識別は、尾へのマーキングにより行った。
【００３８】
(2)  セマフォリン3Aの調製
ニワトリセマフォリン3A安定発現株を培養し、常法により、培養上清に生産されたセマフォリン3Aタンパク質を精製した。なお、該セマフォリン3A安定発現株は、ニワトリのセマフォリン3A遺伝子（配列番号３）をHEK293細胞に組み込んだものである。
【００３９】
得られたセマフォリン3Aタンパク質の活性は、ニワトリの後根神経節を用いた退縮アッセイ（collapse assay）により測定した。退縮アッセイは、以下の方法により行なった。
【００４０】
胚性7日目のニワトリ卵胚から後根神経節(DRG)を摘出した。摘出したDRGをNGF含有メディウム入りのガラス底面にのせ、37℃のインキュベーター内で24時間静地培養した。NGF感受性DRGニューロンが伸長しているのを確認後、上記の通り精製して得たセマフォリン3Aの溶液を1倍（原液）〜10万倍に希釈して投与し、37℃で30分静地培養後固定した。顕微鏡下にて、全NGF感受性DRGニューロンのうち、成長円錐が退縮(collapse)しているニューロンの割合(%)を算出し、50％のcollapseを認めるセマフォリン3A濃度(X倍希釈)をX U/mlとした。
【００４１】
退縮アッセイの結果、上記で得られたセマフォリン3Aの力価は3万 U/mLであった。このセマフォリン3Aを生理食塩水で４０倍希釈してセマフォリン3A剤とし、NC/Ngaマウスへの投与に用いた。
【００４２】
また、セマフォリン3AをトランスフェクトしないHEK293T細胞の培養上清を、上記と同様の手順で精製した。該精製物を退縮アッセイに付し、活性がないことを確認した。該精製物を生理食塩水で４０倍希釈してコントロール剤とし、NC/Ngaマウスへの投与に用いた。
【００４３】
(3)  皮内注射
４群に分けたNC/Ngaマウスは、(i)無処置群（n＝6）、(ii)生理食塩水投与群（n＝5）、(iii)コントロール投与群（n＝7）、及び(iv)セマフォリン3A投与群（n＝6）とし、(ii)、(iii)及び(iv)の各群のマウスの剃毛した上背部の皮疹部に、それぞれ生理食塩水1 mL、コントロール剤1 mL及びセマフォリン3A剤1 mLを皮内注射した。皮内注射は、１日２回の注射を５日間連続して行なった。セマフォリン3A剤は、上記した通り3万 U/mLのセマフォリン3Aを４０倍希釈したものを1 mL注射したので、１回の注射で投与されたセマフォリン3Aの量は約750Uとなった。
【００４４】
初回の皮内注射を行なった日を第１日目とし、第１日目から第１１日目までの期間にわたり、上背部の皮疹の経過観察を行なった。皮疹は、Leung(Clin Exp Immunol 107 (Suppl. 1), 25-30, 1997)、Sutoら(Int Arch Allergy Immunol 120 (Suppl. 1), 70-75, 1999)の方法に則り、クリニカルスキンスコアで評価した。すなわち、各個体について、皮疹を、紅斑/出血、浮腫、びらん、落屑/乾燥、の４項目にわけて、それぞれ0から3までの4段階(0(なし)、1(軽度)、2(中度)、3(重度))で評価し、合計スコアを算出した。各群ごとにスコアの平均値を算出し、各群のスコアとした。皮疹の経過を追うために、毎日1回、カメラで皮疹を撮影した。
【００４５】
(4)  組織学的検討
セマフォリン3Aの効果について、組織学的な検討も行なった。上記した(i)ないし(iv)の各群のマウスから、皮疹部の皮膚組織を第１１日目に採取した。また、非発症皮膚組織コントロールとして、皮疹を発症していないNC/Ngaマウスの上背部からも皮膚組織を採取した。採取した皮膚組織は、20％ホルマリン溶液中で24〜48時間固定を行い、パラフィンに包埋した。これを3μｍ厚に切断し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)で染色して顕微鏡観察を行なった。
【００４６】
２．  結果
(1)  セマフォリン3AはNC/Ngaマウスの皮疹を臨床的に改善した
上記(i)ないし(iv)の４群についてのスコア評価結果を図１に示す。図１中のクロス記号は、マウスの死亡を表す。例えば、無処置群では、実験期間中の第2日目に1個体が死亡し、該群の個体数は観察終了時には5個体となった。
【００４７】
セマフォリン3A投与群(iv)では、投与直後から皮疹の改善を認めた。これに対し、他の3群、すなわち無処置群（i）、生理食塩水投与群(ii)及びコントロール投与群(iii)では、皮疹の改善は認められなかった。また、セマフォリン3A投与群では、他の群に比べ掻破痕も減少しており、そう痒も低減していることが考えられた。セマフォリン3A投与群での皮疹の改善効果は、第5日目で投与が終了した後も3日間程度持続したが、第8日目からは皮疹は若干再燃傾向となった。セマフォリン3Aの効果は局所的であり、皮内注射しなかった顔面や耳介部の皮疹には変化は認められなかった。
【００４８】
(2)  セマフォリン3A投与群は組織学的レベルでも改善を認めた
皮疹を発症していないNC/Ngaマウス皮膚組織では、表皮は１〜２層の角化細胞から構成され、真皮部分にわずかな細胞浸潤が認められた。無処置群、生理食塩水投与群及びコントロール投与群では、角化細胞の増殖による表皮の肥厚と、真皮への稠密な炎症細胞浸潤が認められた。これらの所見は、ヒトのアトピー性皮膚炎でも見られる特徴的な所見と同様であった。一方、セマフォリン3A投与群では、表皮の肥厚は改善され、炎症細胞の浸潤も減少していた。以上より、組織学的レベルにおいてもセマフォリン3Aの効果が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】4群のNC/Ngaマウスについてのクリニカルスキンスコアの評価結果を示す。(i)は無処置群、(ii)は生理食塩水投与群、(iii)はコントロール投与群、(iv)はセマフォリン3A投与群を示す。図中のクロス記号はマウスの死亡を表し、クロス記号に付された文字は死亡したマウスが属する群を表す。
【図１】
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【配列表】
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