(57)【要約】【課題】  一本鎖に変性させられたときに、標的塩基配列部分で高次構造が形成されないＰＣＲ産物の生成を可能にするプライマーＤＮＡを提供することを目的とする。【解決手段】  本発明のプライマーＤＮＡ１０は第1の領域１１と第２の領域１２からなる。第1の領域１１は、プライマーＤＮＡ１０を用いてＰＣＲにより増幅される増幅対象ＤＮＡ鎖の５’末端と同じ配列を有し、第２の領域１２は第１の領域１１とは異なる塩基配列を有する。さらに、第２の領域１２は、前記増幅対象ＤＮＡ鎖内の標的塩基配列１４に相補的な塩基配列とは異なる塩基配列を有し、かつ、増幅対象ＤＮＡ鎖内の、標的塩基配列１４以外の領域１６に相補的な塩基配列を有する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）において用いる２つのプライマーＤＮＡのうちの１つのプライマーＤＮＡであって、
該プライマーＤＮＡは、第１の領域と第２の領域とからなり、
前記第１の領域は、前記プライマーＤＮＡを用いてＰＣＲにより増幅される増幅対象ＤＮＡの５’末端部分と同じ塩基配列を有し、
前記第２の領域は、前記第１の領域より前記増幅対象ＤＮＡの５’末端側に配置され、前記第１の領域の塩基配列、および前記増幅対象ＤＮＡ内の標的塩基配列に相補的な配列とは異なる塩基配列を有し、かつ、前記増幅対象ＤＮＡ内の、前記標的塩基配列以外の一部に相補的な塩基配列を有する、
ことを特徴とするプライマーＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーＤＮＡにおいて、
前記第１の領域は１６〜２4塩基からなり、前記第２の領域は６〜１４塩基からなる、
ことを特徴とするプライマーＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のプライマーＤＮＡにおいて、
前記第２の領域と前記第１の領域とは、３塩基以上同一の配列を持たず、
前記第２の領域と前記標的塩基配列に相補的な塩基配列とは、３塩基以上同一の配列を持たない、
ことを特徴とするプライマーＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載のプライマーＤＮＡを用いて、ＤＮＡをＰＣＲによって増幅する方法であって、
鋳型となるＤＮＡを一本鎖に変性する変性ステップと、
前記一本鎖の鋳型ＤＮＡ、前記２つのプライマーＤＮＡ、及びｄＮＴＰを、ＤＮＡポリメラーゼを含む緩衝液中で反応させて、前記一本鎖の鋳型ＤＮＡに前記２つのプライマーＤＮＡをアニールさせて、第１のプライマー伸長反応を行う第１のプライマー伸長ステップと、
前記第１のプライマー伸長ステップで得られたプライマー伸長物を一本鎖に変性し、該一本鎖に変性されたプライマー伸長物に前記２つのプライマーＤＮＡをアニールさせて、第２のプライマー伸長反応を行う第２のプライマー伸長ステップとを含み、
前記第２のプライマー伸長ステップは予め設定された回数繰り返し行う、
ことを特徴とするＤＮＡ増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲに用いられるプライマーＤＮＡと前記プライマーＤＮＡを用いたＤＮＡ増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与が正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まっている。
【０００３】
ＤＮＡに関しては、現在ＳＮＰｓ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。その理由として、ＳＮＰｓの分類により、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や感受性を予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓを持つ人間は絶対に存在しないことから個人の完全な特定ができると考えられているからである。
【０００４】
従来、ＳＮＰｓを含む標的塩基配列を検出する方法として、例えば、ＡＳＯ（ａｌｌｅｌｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ‐ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ法、小さな基板上に複数のＤＮＡ断片が固定化されたＤＮＡチップを用いる方法、及びアフィニティキャピラリー電気泳動法（特許文献１参照）が提案されている。
【０００５】
ＡＳＯ法は、標的塩基配列を有するＤＮＡ断片と相補関係にあるプローブＤＮＡが、完全に相補的なＤＮＡに対しては確実にハイブリッドを形成するが、１塩基でもミスマッチがあるとハイブリッド形成が弱く、低い温度で解離しやすい性質があることを利用して、ＤＮＡ試料から標的塩基配列を検出する方法である。
【０００６】
また、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ法は、５’末端が蛍光物質で修飾されたヘアピン構造をとりうるプローブＤＮＡ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎプローブ）をＰＣＲ反応系に加える方法である。前記ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎプローブは、ＰＣＲのアニーリングステップで、一本鎖の鋳型ＤＮＡの相補的な塩基配列にハイブリダイすると、蛍光を発する性質を有することから、このｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎプローブによって、ＤＮＡ試料から標的塩基配列を検出できる。
【０００７】
また、ＤＮＡチップを用いる方法では、標的塩基配列と相補的な配列を有するＤＮＡ断片（プローブＤＮＡ）を固定化したＤＮＡチップを作製し、このＤＮＡチップに、ＰＣＲ法で増幅され、かつ、一本鎖に変性された、標的塩基配列を含むＤＮＡ試料を添加する。このとき、ＤＮＡ試料中に標的塩基配列が含まれていれば、その塩基配列がプローブＤＮＡとハイブリダイズすることから、ＤＮＡチップ上のプローブＤＮＡへのＤＮＡ試料の結合状態によって、ＤＮＡ試料から標的塩基配列を検出できる。
【０００８】
また、アフィニティキャピラリー電気泳動法では、ＰＣＲで増幅され、かつ、一本鎖に変性された標的塩基配列を含むＤＮＡ試料と、標的塩基配列に相補的な配列を有するプローブＤＮＡを含むアフィニティリガンドとをキャピラリー管中に添加し、該キャピラリー管中で前記ＤＮＡ試料を電気泳動させる。これにより、標的塩基配列を含むＤＮＡ試料はアフィニティリガンドと結合して、電気泳動速度に変化を生じるので、標的塩基配列を含むＤＮＡ試料を分離することができる。なお、アフィニティキャピラリー電気泳動法では、アフィニティリガンドとして、標的塩基配列と相補的な配列を有するプローブＤＮＡに電気非泳動物質を結合させたコンジュゲートＤＮＡを用いる。電気非泳動物質とは、ＤＮＡ試料の電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動するものであることから、標的塩基配列を含むＤＮＡ試料は電気泳動されずにキャピラリー管に留まるので、標的塩基配列を含むＤＮＡ試料を容易に分離できる。
【特許文献１】特開２００２−３４０８５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来、ＳＮＰｓを含む標的塩基配列を検出する方法として、ＡＳＯ法、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ法、ＤＮＡチップを用いる方法、または、キャピラリー電気泳動法が提案されている。これらの方法では、ＳＮＰｓを含む標的塩基配列を検出するために、ＤＮＡ試料をＰＣＲによって増幅し、増幅したＤＮＡを二本鎖の状態から一本鎖に変性して、プローブＤＮＡを標的塩基配列にハイブリダイズさせる必要がある。しかし、ＤＮＡは一本鎖の状態では構造的に不安定であり、ＤＮＡ鎖内の相補的な配列同士が結合して高次構造を形成する可能性がある。この高次構造の形成はＤＮＡ断片が長くなるほど顕著に表れる現象である。そして、標的塩基配列がＤＮＡ鎖内の相補的な領域と結合して高次構造を形成すると、標的塩基配列にプローブＤＮＡをハイブリダイズさせることができないため、ＤＮＡ試料中の標的塩基配列を検出できないという問題が生じる。
【００１０】
よって、本発明では、一本鎖に変性したときに、標的塩基配列部分で高次構造が形成されないＰＣＲ産物の生成を可能にするプライマーＤＮＡ、及び該プライマーＤＮＡを用いたＤＮＡ増幅方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）において用いる２つのプライマーＤＮＡのうちの１つのプライマーＤＮＡであって、該プライマーＤＮＡは、第１の領域と第２の領域とからなり、前記第１の領域は、前記プライマーＤＮＡを用いてＰＣＲにより増幅される増幅対象ＤＮＡの５’末端部分と同じ塩基配列を有し、前記第２の領域は、前記第１の領域より前記増幅対象ＤＮＡの５’末端側に配置され、前記第１の領域の塩基配列、および前記増幅対象ＤＮＡ内の標的塩基配列に相補的な配列とは異なる塩基配列を有し、かつ、前記増幅対象ＤＮＡ内の、前記標的塩基配列以外の一部に相補的な塩基配列を有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明のプライマーＤＮＡは、前記第１の領域が１６〜２4塩基からなり、前記第２の領域は６〜１４塩基からなることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明のプライマーＤＮＡは、前記第２の領域と前記第１の領域とが、３塩基以上同一の配列を持たず、前記第２の領域と前記標的塩基配列に相補的な塩基配列とが、３塩基以上同一の配列を持たないことを特徴とする。
【００１４】
また、本発明は、前記プライマーＤＮＡを用いて、ＤＮＡをＰＣＲによって増幅する方法であって、鋳型となるＤＮＡを一本鎖に変性する変性ステップと、前記一本鎖の鋳型ＤＮＡ、前記２つのプライマーＤＮＡ、及びｄＮＴＰを、ＤＮＡポリメラーゼを含む緩衝液中で反応させて、前記一本鎖の鋳型ＤＮＡに前記２つのプライマーＤＮＡをアニールさせて、第１のプライマー伸長反応を行う第１のプライマー伸長ステップと、前記第１のプライマー伸長ステップで得られたプライマー伸長物を一本鎖に変性し、該一本鎖に変性されたプライマー伸長物に前記２つのプライマーＤＮＡをアニールさせて、第２のプライマー伸長反応を行う第２のプライマー伸長ステップとを含み、前記第２のプライマー伸長ステップは予め設定された回数繰り返し行うことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のプライマーＤＮＡは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）において用いる２つのプライマーＤＮＡのうちの１つのプライマーＤＮＡであって、第１の領域と第２の領域とからなり、前記第１の領域は、前記プライマーＤＮＡを用いてＰＣＲにより増幅される増幅対象ＤＮＡの５’末端部分と同じ塩基配列を有し、前記第２の領域は、前記第１の領域より前記増幅対象ＤＮＡの５’末端側に配置され、前記第１の領域の塩基配列、および前記増幅対象ＤＮＡ内の標的塩基配列に相補的な配列とは異なる塩基配列を有し、かつ、前記増幅対象ＤＮＡ内の、前記標的塩基配列以外の一部に相補的な塩基配列を有する。これにより、本発明のプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲによって生成されるＰＣＲ産物は、一本鎖に変性させられたときに、前記第２の領域が標的塩基配列以外の領域で高次構造を形成して、標的塩基配列を、プローブＤＮＡがハイブリダイズ可能な状態に保つことができる。
【００１６】
また、本発明のプライマーＤＮＡは、前記第１の領域が１６〜２4塩基からなり、前記第２の領域が６〜１４塩基からなるので、前記第２の領域より長い前記第１の領域からＰＣＲの増幅を開始させることができる。また、前記第２の領域はＤＮＡ鎖内で高次構造を形成するには十分な長さであるので、電気泳動を行っている間、高次構造は乖離することなく、安定した状態を保つことができ、標的塩基配列部分で高次構造が形成されることを回避できる。
【００１７】
また、本発明のプライマーＤＮＡは、前記第２の領域と前記第１の領域とが、少なくとも３塩基以上同一の塩基配列を持たず、前記第２の領域と前記標的塩基配列に相補的な塩基配列とが、３塩基以上同一の塩基配列を持たないので、前記プライマーＤＮＡの第２の領域が、第1の領域及び標的塩基配列に結合することを回避することができる。
【００１８】
また、本発明のＤＮＡ増幅方法は、前記プライマーＤＮＡを用いてＰＣＲによって、標的塩基配列を含むＤＮＡを増幅させるので、本発明のＤＮＡ増幅方法によって増幅されたＤＮＡ断片は、一本鎖に変性させられたときに、前記第２の領域が標的塩基配列以外の領域で高次構造を形成して、標的塩基配列を、プローブＤＮＡがハイブリダイズ可能な状態に保つことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（実施の形態１）
本実施の形態１について図１〜図４を用いて説明する。
図１は、本実施の形態１に係るプライマーＤＮＡ１０の塩基配列を示す図である。
【００２０】
図１において、プライマーＤＮＡ１０は第1の領域１１と第２の領域１２からなる。第1の領域１１は、プライマーＤＮＡを用いてポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により増幅されるＤＮＡ鎖の５’末端と同じ塩基配列を有し、第２の領域１２は第１の領域１１とは異なる塩基配列を有する。
【００２１】
図２は、プライマーＤＮＡ１０を用いてＰＣＲによって増幅したＰＣＲ産物１３の塩基配列を示す図である。図２においては、ＰＣＲ産物１３のフォワード側にＳＮＰｓを含む標的塩基配列１４が含まれ、標的塩基配列１４に該配列と相補的な関係を有するプローブＤＮＡ１５をハイブリダイズさせることとする。
【００２２】
プライマーＤＮＡ１０の第２の領域１２は、標的塩基配列１４に相補的な塩基配列とは異なる塩基配列を有し、かつ、同じＤＮＡ鎖内の、標的塩基配列１４以外の一部分の領域（ここでは領域１６）に相補的な塩基配列を含む。これにより、ＰＣＲ産物１３を一本鎖に変性させたときに、第２の領域１２と領域１６とが結合して高次構造を形成するので、それ以上の高次構造が形成されにくくなり、標的塩基配列１４を、プローブＤＮＡ１５とハイブリダイズさせることのできるフリーの状態に保つことができる。
【００２３】
なお、第１の領域１１は１６〜２４塩基からなり（６ｍｅｒ以上）、第２の領域１２は６〜１４塩基からなることが好ましい。これにより、第1の領域１１は第２の領域１２より長いため、ＰＣＲでの増幅は第1の領域１１から開始され、また、第２の領域１２はＤＮＡ鎖内で高次構造を形成するには十分な長さとなる。
【００２４】
また、第２の領域１２と第１の領域１１とが結合することを回避するため、第２の領域１２と第１の領域１１とは、少なくとも３塩基以上同一の配列を持たない。
【００２５】
さらに、第２の領域１２と標的塩基配列１４とが結合することを回避するため、第２の領域１２とは標的塩基配列１４とは、少なくとも３塩基以上同一の配列を持たない。
【００２６】
図３は、プライマーＤＮＡ１０を用いて増幅したＰＣＲ産物１３を一本鎖ＤＮＡ１７に変性したときの状態図である。プライマーＤＮＡ１０を用いて増幅したＰＣＲ産物１３を、二本鎖から一本鎖に変性させたとき、第２の領域１２と、第２の領域１２に相補的な領域１６とがＤＮＡ鎖内で高次構造１８を形成する。このように、ＰＣＲ産物１３をのうちの、標的塩基配列１４の部分とは別の領域で高次構造を形成しておくことで、それ以上の高次構造が形成されにくくなり、標的塩基配列１４にプローブＤＮＡ１５をハイブリダイズさせることができる。
【００２７】
一方、図４は、従来のプライマーＤＮＡを用いて増幅したＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ１９に変性したときの状態図である。従来のプライマーＤＮＡ、すなわち、プライマーＤＮＡ１０の第１の領域１１のみからなるプライマーＤＮＡを用いて、ＰＣＲ産物１３を生成すると、一本鎖ＤＮＡ１９内の標的塩基配列１４が、該配列に相補的な領域と高次構造２０を形成し、塩基配列１４にプローブＤＮＡ１５をハイブリダイズさせることができなくなる。よって、従来のプライマーＤＮＡを用いて生成したＰＣＲ産物は、上述したＡＳＯ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ法、ＤＮＡチップを用いる方法、またはコンジュゲートＤＮＡを用いるキャピラリー電気泳動法などの方法において、使用することができない。
【００２８】
以下、本実施の形態１に係るプライマーＤＮＡ１０を用いてＰＣＲによってＤＮＡを増幅して、ＰＣＲ産物１３から標的塩基配列１４を検出する手順について説明する。ここでは、コンジュゲートＤＮＡを利用するキャピラリー電気泳動法によって標的塩基配列１４を検出する場合を例に挙げて説明する。
【００２９】
まず、プライマーＤＮＡを作製する。プライマーＤＮＡは、公知のオリゴヌクレオチド合成法などを用いて人工的に作製する。ここでは、フォワード側のＤＮＡ鎖に標的塩基配列１４が含まれるものとする。よって、フォワード側のプライマーＤＮＡを第１の領域１１と第２の領域１２を有するプライマーＤＮＡ１０とする。すなわち、フォワード側のプライマーＤＮＡの配列を、５’（Ｃｙ５）−ＡＣＡ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＴＧＴ  ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＡＣＧ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  −３’（配列番号１）とする。一方、リバース側のプライマーＤＮＡの配列は、通常のＰＣＲで用いるプライマーの設計方法によって設計される５’−ＴＣＴ  ＴＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＣＣＴ  ＡＧＧ  ＧＴ−３’（配列番号２）とする。
【００３０】
次に、以上のような２つのプライマーＤＮＡを含むＰＣＲ用の試料を調整して、ＰＣＲを行う。
【００３１】
ここでは、鋳型となるＤＮＡと、５００ｎＭの２つのプライマーＤＮＡと、１０ｘＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒとしての２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と、１００ｍＭのＫＣｌと、０．１ｍＭのＥＤＴＡと、１ｍＭのＤＴＴと、０．５％のＴｗｅｅｎ２０と、０．５％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０と、５０％のＧｌｙｃｅｒｏｌを容器に１×になるように加え、次に、その容器に、終濃度が１．５ｍＭになるようにＭｇＣｌ2を加え、次に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ終濃度が２００μＭになるように加え、そして、ＤＮＡポリメラーゼを終濃度が０．０５Ｕ／μｌになるように加えて、試料を調整する。
【００３２】
次に、試料５０μｌをＰＣＲにかける。ＰＣＲは以下のステップからなる。すなわち、試料中の鋳型ＤＮＡを二本鎖から一本鎖に熱変性する（９５℃、１０分）第１のステップと、一本鎖の鋳型ＤＮＡにプライマーＤＮＡをアニールさせて（５０℃、０．５分）、プライマーの伸長反応を行う（７２℃、０．５分、目安として増やす長さ１ｋｂあたり１分）第２のステップと、前記第２のステップで得られたプライマー伸長物を一本鎖に変性し（９５℃、０．５分）、一本鎖の第１のプライマー伸長物にプライマーＤＮＡをアニールさせて（５０℃、０．５分）、第２のプライマーの伸長反応を行う（７２℃、０．５分）工程を、予め設定された回数（例えば、３０〜４０回）繰り返す第３のステップと、ＰＣＲを停止させる（７２℃で５分加熱後、４℃に急冷）第４のステップとからなる。
【００３３】
プライマーＤＮＡ１０を用いてＰＣＲを行うと、図２に示すように５’末端に第１の領域１２が一本鎖の状態で突起したＰＣＲ産物１３が産生される。
【００３４】
次に、ＰＣＲ産物１３をコンジュゲートＤＮＡとハイブリダイズさせるために、ＰＣＲ産物１３を一本鎖の状態にする。具体的には、脱イオン化処理を施したホルムアミド２０μｌに対して、２μｌのＰＣＲ産物を加えて、該ＰＣＲ産物を９５℃で１０分間熱変性した後、４℃に急冷することで、一本鎖のＤＮＡ試料に変性する。
【００３５】
次に、塩化マグネシウムなどの結合制御剤を加えることで、ＤＮＡ試料内で相補的な塩基配列部位同士が高次構造（ヘアピンループ構造）を形成するようにさせる。
【００３６】
図５は、プライマーＤＮＡ１０を用いて生成したＰＣＲ産物の一本鎖変性時の状態と（図５の上側）、従来のプライマーＤＮＡを用いて生成したＰＣＲ産物の一本鎖変性時の状態と（図５の下側）、コンジュゲートＤＮＡとの関係を示す図である。
【００３７】
本実施の形態１に係るプライマーＤＮＡ１０を用いて生成したＰＣＲ産物１３を一本鎖ＤＮＡ１７に変性すると、一本鎖ＤＮＡ試料１７の第２の領域１２は同じ鎖内で相補的な領域１６と結合して、高次構造１８を形成する。これにより、標的塩基配列１４、すなわち、コンジュゲートＤＮＡ結合領域がフリーな状態の一本鎖ＤＮＡ試料が生成される。このように、本実施の形態１に係るプライマーＤＮＡ１０を用いることでコンジュゲートＤＮＡとの結合を阻害しないＰＣＲ産物１３を得ることができる。一方、通常のプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ法によって増幅したＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ１９に変性すると、標的塩基配列１４はＤＮＡ鎖内で相補的な配列を有する領域と高次構造２０を形成してしまい、コンジュケートＤＮＡをハイブリダイズさせることができない。
【００３８】
次に、ＰＣＲ産物１３から生成した一本鎖ＤＮＡ１７にコンジュゲートＤＮＡ２１をハイブリダイズさせる。
【００３９】
コンジュゲートＤＮＡ２１は、ＤＮＡ試料の標的塩基配列に相補的な配列を有するプローブＤＮＡ２２に電気非泳動物質２３を結合させて作製する。
【００４０】
プローブＤＮＡ２２は、標的塩基配列１４に相補的な配列を有するＤＮＡ断片として作製する。プローブＤＮＡ２２は、公知のオリゴヌクレオチド合成法などを用いて人工的に作製する。ここでは、プローブＤＮＡの配列を５’−ＣＧＧ  ＣＴＣ−３’（配列番号３）とする。
【００４１】
電気非泳動物質２３は、電気泳動時のＤＮＡ試料の電気泳動に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動を行う物質である。例えば、内径が７５μｍ、長さ３８ｃｍのキャピラリー管内を用いて電気泳動させる場合、ＤＮＡ試料が８分で移動するのに対して、コンジュゲートＤＮＡ２１は６０分以上で移動する物質であり、電気泳動時にほとんど泳動しないとみなすことができる物質である。電気非泳動物質２３は、電気泳動時にほとんど泳動しない物質であればよく、例えば、ポリエチレングリコールなどのリニアポリマー、ガラス、または磁気ビーズなどが例に挙げられる。  例えば、電気非泳動物質２３がポリエチレングリコールの場合、ポリエチレングリコールの末端をカルボン酸化し、更にそのカルボン酸化された部分とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとを反応させてエステル化し、一方、プローブＤＮＡ２２は、その５’末端をアミノ化し、アミノ化したプローブＤＮＡ２２と、前記エステル化したポリエチレングリコールとをアミド結合させてコンジュゲートＤＮＡ２１を作製する。
【００４２】
次に、ＤＮＡ試料とコンジュゲートＤＮＡをキャピラリー管に充填して、ＤＮＡ試料をキャピラリー電気泳動させる。
【００４３】
図６は、キャピラリー電気泳動を説明するための図である。
図６に示すように、内径１００μｍの全長５０センチメートル（有効長４０センチメートル）のキャピラリー管６０に、緩衝液６１と、コンジュゲートＤＮＡ６２と、ＤＮＡ試料６３を充填して、５ｋＶの電圧をかけて、２５℃で、電気泳動を行う。
【００４４】
緩衝液は５０ｍＭのトリス−ホウ酸（ＴＢ）バッファである。なお、緩衝液は、ＴＢバッファに限るものではなく、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、トリス−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液、またはトリス−塩化ナトリウム−ＥＤＴＡ（ＳＳＣ）緩衝液でもよい。
【００４５】
以上のような条件でキャピラリー電気泳動を行うと、コンジュゲートＤＮＡ６２とハイブリダイズする標的塩基配列を含むＤＮＡ試料は移動せずにキャピラリー管６０内に留まり、標的塩基配列を含まないＤＮＡ試料は移動してキャピラリー管６０の外に流れ出るため、標的塩基配列を含むＤＮＡ試料のみを分離できる。
【００４６】
以上のように、本実施の形態１のプライマーＤＮＡ１０は、第1の領域１１と第２の領域を含み、第１の領域１１が、プライマーＤＮＡ１０を用いてＰＣＲにより増幅される増幅対象ＤＮＡ鎖の５’末端部分と同じ塩基配列を有し、第２の領域１２が、第１の領域１１より増幅対象ＤＮＡ鎖の５’末端側に配置され、増幅対象ＤＮＡ鎖の標的塩基配列１４に相補的な塩基配列とは異なる塩基配列を有し、かつ、増幅対象ＤＮＡ鎖内の、標的塩基配列１４以外の領域１６と相補的な配列を有する。これにより、本実施の形態１のプライマーＤＮＡ１０を用いて生成されるＰＣＲ産物は、一本鎖に変性させられたときに、標的塩基配列１４の部分で高次構造が形成されず、標的塩基配列１４を、プローブＤＮＡがハイブリダイズ可能な状態に保つことができる。
【００４７】
さらに、本実施の形態１に係るＤＮＡ断片の増幅方法によれば、試料中の鋳型ＤＮＡを二本鎖から一本鎖に熱変性する第１のステップと、一本鎖の鋳型ＤＮＡにプライマーＤＮＡ１０をアニールさせて、第１のプライマーの伸長反応を行う第２のステップと、プライマー伸長物を一本鎖に変性して、一本鎖のプライマー伸長物にプライマーＤＮＡをアニールさせて、第２のプライマーの伸長反応を行う第３のステップと、第３のステップが予め設定された回数繰り返された後に、ＰＣＲを停止させる第４のステップを含むことを特徴とする。これにより、本実施の形態１に係るＤＮＡ増幅方法によって増幅されたＤＮＡ断片は、一本鎖に変性させられたときに、標的塩基配列１４部分で高次構造を形成せず、標的塩基配列１４を、プローブＤＮＡがハイブリダイズ可能な状態に保つことができる。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明に係るプライマーＤＮＡは、ＰＣＲによってＤＮＡ試料を増幅して、増幅したＤＮＡ試料から標的塩基配列を検出して、ＳＮＰｓを検出する方法に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の実施の形態１に係るプライマーＤＮＡの塩基配列を示す図である。
【図２】本発明の実施の形態１に係るプライマーＤＮＡを用いて生成したＰＣＲ産物の塩基配列を示す図である。
【図３】本発明の実施の形態１に係るプライマーＤＮＡを用いて生成したＰＣＲ産物の一本鎖変性時の状態を示す図である。
【図４】従来のプライマーＤＮＡを用いて生成したＰＣＲ産物の一本鎖変性時の状態を示す図である。
【図５】本発明の実施の形態１に係るプライマーＤＮＡを用いて生成したＰＣＲ産物の一本鎖変性時の状態と、従来のプライマーＤＮＡを用いて生成したＰＣＲ産物の一本鎖変性時の状態と、コンジュゲートＤＮＡとの関係を示す図である。
【図６】キャピラリー電気泳動を説明するための図である。
【符号の説明】
【００５０】
１０  プライマーＤＮＡ（フォワード側）
１１  第１の領域
１２  第２の領域
１３  ＰＣＲ産物
１４  標的塩基配列
１５  プローブＤＮＡ
１６  第２の領域と相補的な領域
１７、１９  一本鎖ＤＮＡ
１８、２０  高次構造
２１  コンジュゲートＤＮＡ
２２  プローブＤＮＡ
２３  電気非泳動物質  
６０  キャピラリー管
６１  緩衝液
６２  コンジュゲートＤＮＡ
６３  ＤＮＡ試料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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