(57)【要約】【課題】検出対象の核酸が微量でも簡便且つ高精度に検出できる核酸の検出方法の提供。【解決手段】特定の標的配列を有する二本鎖核酸の有無を検出する方法であって、（Ａ）試料中の核酸に対して、異なる種類のリガンドからなるリガンド対が結合した標的配列を有する二本鎖核酸を複製する操作を行う工程と、（Ｂ）前記リガンド対のいずれか一方と特異的に結合する受容体が固定化された固相担体、および他方のリガンドと特異的に結合する受容体が固定化された光学的に区別可能な微粒子を調製する工程と、（Ｃ）前記固相担体の受容体が固定化された領域を、複製操作後の前記試料中に挿入する工程と、（Ｄ）該受容体固定化領域を試料中に挿入したまま、前記微粒子を該試料中に添加する工程と、（Ｅ）前記固相担体を試料中より取り出す工程と、（Ｆ）前記固相担体の受容体が固定化された領域の光学的性質を検出する工程と、を含むことを特徴とする核酸の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の標的配列を有する二本鎖核酸の有無を検出する方法であって、
（Ａ）試料中の核酸に対して、異なる種類のリガンドからなるリガンド対が結合した標的配列を有する二本鎖核酸を複製する操作を行う工程と、
（Ｂ）前記リガンド対のいずれか一方と特異的に結合する受容体が固定化された固相担体、および他方のリガンドと特異的に結合する受容体が固定化された光学的に区別可能な微粒子を調製する工程と、
（Ｃ）前記固相担体の受容体が固定化された領域を、複製操作後の前記試料中に挿入する工程と、
（Ｄ）該受容体固定化領域を試料中に挿入したまま、前記微粒子を該試料中に添加する工程と、
（Ｅ）前記固相担体を試料中より取り出す工程と、
（Ｆ）前記固相担体の受容体が固定化された領域の光学的性質を検出する工程と、
を含むことを特徴とする核酸の検出方法。
【請求項２】
特定の標的配列を有する二本鎖核酸の有無を検出する方法であって、
（ａ）試料中の核酸に対して、異なる種類のリガンドからなるリガンド対が結合した標的配列を有する二本鎖核酸を複製する操作を行う工程と、
（ｂ）前記リガンド対のいずれか一方と特異的に結合する受容体が固定化された光学的に区別可能な微粒子を調製する工程と、
（ｃ）前記リガンド対の他方と特異的に結合する受容体が固定化され、さらに該固定化領域外に前記微粒子が付着された固相担体を調製する工程と、
（ｄ）前記固相担体の受容体が固定化された領域を複製操作後の前記試料中に挿入し、該受容体固定化領域を試料中に挿入したまま、さらに該固相担体の微粒子が付着された領域を試料中に挿入して、該微粒子を試料中に添加する工程と、
（ｅ）前記固相担体を試料中より取り出す工程と、
（ｆ）前記固相担体の受容体が固定化された領域の光学的性質を検出する工程と、
を含むことを特徴とする核酸の検出方法。
【請求項３】
前記微粒子の試料中への添加後に、該試料中に挿入されている前記固相担体を用いて該試料の撹拌を行うことを特徴とする請求項１または２に記載の核酸の検出方法。
【請求項４】
前記標的配列が複数種類であり、標的配列ごとに異なるリガンド対を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項５】
前記微粒子に固定化された受容体および該受容体と特異的に結合するリガンドが、前記標的配列によらずそれぞれ同一であり、前記固相担体に固定化された受容体および該受容体と特異的に結合するリガンドが、前記標的配列ごとにそれぞれ異なり、固相担体上の前記受容体が、種類ごとに区分されて固定化されていることを特徴とする請求項４に記載の核酸の検出方法。
【請求項６】
前記微粒子に固定化された受容体および該受容体と特異的に結合するリガンド並びに該微粒子の光学的性質が、前記標的配列ごとにそれぞれ異なり、前記固相担体に固定化された受容体および該受容体と特異的に結合するリガンドが、前記標的配列によらずそれぞれ同一であることを特徴とする請求項４に記載の核酸の検出方法。
【請求項７】
前記微粒子に固定化された受容体および該受容体と特異的に結合するリガンド並びに該微粒子の光学的性質が、前記標的配列ごとにそれぞれ異なり、前記固相担体に固定化された受容体および該受容体と特異的に結合するリガンドが、前記標的配列ごとにそれぞれ異なり、固相担体上の前記受容体が、種類ごとに区分されて固定化されていることを特徴とする請求項４に記載の核酸の検出方法。
【請求項８】
前記標的配列の複製操作を、ポリメラーゼ連鎖反応法またはライゲーション法により行うことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出対象の核酸が微量でも簡便且つ高精度に検出できる核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子工学の発展により、遺伝子診断は、医療分野における病原菌やウイルスの検出のみならず、犯罪捜査、親子鑑定、考古学研究、生物学などの様々な分野において頻繁に用いられるようになっている。そして、遺伝子診断を行う際は、標的である核酸を高精度に検出できることが求められる。
従来の遺伝子診断は、例えば、検体である標的ＤＮＡとこれに相補的なプローブＤＮＡを用意し、これらをハイブリダイゼーションし得る条件下でアニールし、ハイブリダイゼーションの有無を検定することで行われてきた。初期の方法では、検体をナイロン膜などの固相に固定し、標的の遺伝子配列に相補的な遺伝子の結合を調べていた。しかし、一塩基多型（ＳＮＰ）変異などを検出するような場合においては、その精度が必ずしも高くないという問題点が指摘されていた。また、診断には数時間から1日という長い時間を要する上、遺伝子結合を検知するために、放射性同位体元素を用いたり、酵素反応を利用した複雑な化学反応を用いていたため、操作が煩雑で精度が必ずしも高くないという問題点があった。特に放射性同位体元素を用いる場合には、安全性の問題もあった。そこで、安全で、より簡便且つ高精度な検出方法が求められていた。
【０００３】
これに対し最近になって、プローブＤＮＡを基盤に固定した遺伝子チップを用いる遺伝子診断法が研究、報告されている。しかし、この方法も、依然として一塩基多型変異を検出する場合の精度の問題点を解決するものではなかった。
さらに、ラテックス微粒子や金コロイド粒子とＤＮＡとの複合体の凝集を利用する遺伝子診断法が報告され（非特許文献１および２並びに特許文献１参照）、注目された。しかし、このような複合体の凝集では、検体として添加されたＤＮＡが複数の微粒子を架橋することにより凝集が促進されるため、検体ＤＮＡの複数の箇所に結合する複数種類のＤＮＡ固定化微粒子を用意する必要があり、操作が複雑であるという問題点があった。
【０００４】
このような問題点に対して、ＤＮＡコンジュゲート物質を用いる高精度で汎用性のある遺伝子診断方法（特許文献２参照）が提案されている。この方法は、一本鎖ＤＮＡと疎水性物質の複合体であるＤＮＡコンジュゲート物質と金属陽イオンを含有する水溶液に、遺伝子ＤＮＡを添加し、該水溶液の光散乱強度、または光透過率のいずれかの変化を測定することを特徴とする遺伝子診断方法である。疎水性物質としては、通常イソプロピルアクリルアミドの重合体が用いられる。
また、イムノクロマト法を用いて両末端がハプテン修飾されたＰＣＲ産物を検出する方法が開示されている（特許文献３参照）。この方法では、ハプテンと抗体の抗原抗体反応を用いて検出を行うことで、室温でも特異性良く標的ＤＮＡを検出できる。また、この方法はイムノクロマト法を応用しており、特別な装置を用いなくても毛細管現象によりＢ／Ｆ分離が行われるようになっている。
【特許文献１】特表２００３−５０３６９９号公報
【特許文献２】特開２００１−２５２０９８号公報
【特許文献３】特開２００３−１９４８１７号公報
【非特許文献１】Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔ．，１９９９，１０４１−１０４２
【非特許文献２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８，１２０，１９５９−１９６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特許文献２に記載の方法では、確かに一種類のＤＮＡコンジュゲート物質を用いることで遺伝子ＤＮＡの一塩基多型変異を検出することはできる。しかし、このＤＮＡコンジュゲート物質の調製は操作が複雑であり、また、分析時にはミセル構造をとらせるために３０℃以上の温度に加温する必要があった。さらに、特許文献２の実施例では温度を４０℃に維持しているように、この方法では、一塩基多型変異を検出するために、ＤＮＡコンジュゲート物質のＤＮＡと遺伝子ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの温度を精密に制御する必要があった。このように温度条件に制約が多く、操作が煩雑であるという問題点があった。
【０００６】
また、特許文献３に記載の方法では、金コロイドが用いられており、金コロイドは単色なので、例えば、ＳＮＰのタイピングを行うような場合、固相上の異なる二箇所にそれぞれ異なる抗体を結合させておく必要がある。そしてイムノクロマトの原理上、ある部位で反応が起こり、ハプテン標識されたＰＣＲ産物が補足されると、流れが妨げられ、その上流での反応効率が低下してしまう恐れがあるので、複数の標的ＤＮＡを検出するためにマルチプレックス化した際には、精度が良くないという問題点があった。また、イムノクロマト法では、毛細管現象を利用しており、ハプテンと抗体の抗原抗体反応を撹拌等によって促進することができないという問題点がった。さらに、抗体が付着した固相へと試料溶液を導入する必要があり、必ず試料溶液の分注操作が必要とされる。そして、特に複数の検体を処理していくような場合、この分注操作が煩雑で面倒であるだけでなく、例えば、ＰＣＲ反応後の試料溶液の入った容器と分注操作を行った固相との対応関係が失われ易いという問題点があった。
【０００７】
このように、従来の遺伝子診断法においては、簡便且つ高精度な核酸の検出方法がないのが現状であった。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、検出対象の核酸が微量でも簡便且つ高精度に検出できる核酸の検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、特定の標的配列を有する二本鎖核酸の有無を検出する方法であって、（Ａ）試料中の核酸に対して、異なる種類のリガンドからなるリガンド対が結合した標的配列を有する二本鎖核酸を複製する操作を行う工程と、（Ｂ）前記リガンド対のいずれか一方と特異的に結合する受容体が固定化された固相担体、および他方のリガンドと特異的に結合する受容体が固定化された光学的に区別可能な微粒子を調製する工程と、（Ｃ）前記固相担体の受容体が固定化された領域を、前記試料中に挿入する工程と、（Ｄ）該受容体固定化領域を前記試料中に挿入したまま、前記微粒子を該試料中に添加する工程と、（Ｅ）前記固相担体を前記試料中より取り出す工程と、（Ｆ）前記固相担体の受容体が固定化された領域の光学的性質を検出する工程と、を含むことを特徴とする核酸の検出方法である。
請求項２に記載の発明は、特定の標的配列を有する二本鎖核酸の有無を検出する方法であって、（ａ）試料中の核酸に対して、異なる種類のリガンドからなるリガンド対が結合した標的配列を有する二本鎖核酸を複製する操作を行う工程と、（ｂ）前記リガンド対のいずれか一方と特異的に結合する受容体が固定化された光学的に区別可能な微粒子を調製する工程と、（ｃ）前記リガンド対の他方と特異的に結合する受容体が固定化され、さらに該固定化領域外に前記微粒子が付着された固相担体を調製する工程と、（ｄ）前記固相担体の受容体が固定化された領域を前記試料中に挿入し、該受容体固定化領域を試料中に挿入したまま、さらに該固相担体の微粒子が付着された領域を前記試料中に挿入して、該微粒子を前記試料中に添加する工程と、（ｅ）前記固相担体を前記試料中より取り出す工程と、（ｆ）前記固相担体の受容体が固定化された領域の光学的性質を検出する工程と、を含むことを特徴とする核酸の検出方法である。
請求項３に記載の発明は、前記微粒子の試料中への添加後に、該試料中に挿入されている前記固相担体を用いて該試料の撹拌を行うことを特徴とする請求項１または２に記載の核酸の検出方法である。
請求項４に記載の発明は、前記標的配列が複数種類であり、標的配列ごとに異なるリガンド対を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸の検出方法である。
請求項５に記載の発明は、前記微粒子に固定化された受容体および該受容体と特異的に結合するリガンドが、前記標的配列によらずそれぞれ同一であり、前記固相担体に固定化された受容体および該受容体と特異的に結合するリガンドが、前記標的配列ごとにそれぞれ異なり、固相担体上の前記受容体が、種類ごとに区分されて固定化されていることを特徴とする請求項４に記載の核酸の検出方法である。
請求項６に記載の発明は、前記微粒子に固定化された受容体および該受容体と特異的に結合するリガンド並びに該微粒子の光学的性質が、前記標的配列ごとにそれぞれ異なり、前記固相担体に固定化された受容体および該受容体と特異的に結合するリガンドが、前記標的配列によらずそれぞれ同一であることを特徴とする請求項４に記載の核酸の検出方法である。
請求項７に記載の発明は、前記微粒子に固定化された受容体および該受容体と特異的に結合するリガンド並びに該微粒子の光学的性質が、前記標的配列ごとにそれぞれ異なり、前記固相担体に固定化された受容体および該受容体と特異的に結合するリガンドが、前記標的配列ごとにそれぞれ異なり、固相担体上の前記受容体が、種類ごとに区分されて固定化されていることを特徴とする請求項４に記載の核酸の検出方法である。
請求項８に記載の発明は、前記標的配列の複製操作を、ポリメラーゼ連鎖反応法またはライゲーション法により行うことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸の検出方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、検出対象の核酸が微量でも簡便且つ高精度に検出できる。
具体的には、標的核酸の検出はリガンドおよび受容体間の特異的結合に基づくので、微量の標的核酸でも高精度に検出できる。また、試料溶液の分注操作が不要であり、試料溶液の入った容器と固相単体との対応関係が明確である。また、試料溶液中に固相単体を挿入しかつ微粒子を添加した状態で該試料溶液を撹拌可能なので、特異的結合の形成をより促進することができる。さらに、複数の標的核酸を同時に検出することもでき、検出を安価かつ迅速に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について、詳しく説明する。
本発明の核酸の検出方法は、特定の標的配列を有する二本鎖核酸の有無を検出する方法であって、
（Ａ）試料中の核酸に対して、異なる種類のリガンドからなるリガンド対が結合した標的配列を有する二本鎖核酸を複製する操作を行う工程と、
（Ｂ）前記リガンド対のいずれか一方と特異的に結合する受容体が固定化された固相担体、および他方のリガンドと特異的に結合する受容体が固定化された光学的に区別可能な微粒子を調製する工程と、
（Ｃ）前記固相担体の受容体が固定化された領域を、複製操作後の前記試料中に挿入する工程と、
（Ｄ）該受容体固定化領域を試料中に挿入したまま、前記微粒子を該試料中に添加する工程と、
（Ｅ）前記固相担体を試料中より取り出す工程と、
（Ｆ）前記固相担体の受容体が固定化された領域の光学的性質を検出する工程と、
を含むことを特徴とする。
または、
（ａ）試料中の核酸に対して、異なる種類のリガンドからなるリガンド対が結合した標的配列を有する二本鎖核酸を複製する操作を行う工程と、
（ｂ）前記リガンド対のいずれか一方と特異的に結合する受容体が固定化された光学的に区別可能な微粒子を調製する工程と、
（ｃ）前記リガンド対の他方と特異的に結合する受容体が固定化され、さらに該固定化領域外に前記微粒子が付着された固相担体を調製する工程と、
（ｄ）前記固相担体の受容体が固定化された領域を複製操作後の前記試料中に挿入し、該受容体固定化領域を試料中に挿入したまま、さらに該固相担体の微粒子が付着された領域を試料中に挿入して、該微粒子を試料中に添加する工程と、
（ｅ）前記固相担体を試料中より取り出す工程と、
（ｆ）前記固相担体の受容体が固定化された領域の光学的性質を検出する工程と、
を含むことを特徴とする。
以下、本発明について、各工程ごとに詳しく説明する。
【００１１】
[標的配列が一種類の場合]
まず、標的配列が一種類の場合を中心に、以下説明する。
＜二本鎖標的核酸を複製する操作を行う工程＞
（標的配列、標的核酸）
本発明において標的配列とは、検出対象の塩基配列を含む配列のことを指し、本発明の検出方法を適用する段階では、検出に供する試料中にその存在の有無が判明していなくても良い。そして本発明は、試料中に元来含まれている標的配列自体の検出を試みるのではなく、試料を用いて、リガンド対が結合した標的配列を有する二本鎖標的核酸（以下、標的核酸と略記することがある）の複製を試み、該標的核酸の検出を試みるものである。したがって、標的配列が試料中に元々存在しなければ、標的核酸は検出されない。すなわち、本発明において「核酸の検出」とは、「標的核酸の有無の確認」をも意味する。なお、以下においては、「試料中の核酸に対して、標的核酸を複製する操作を行った試料」のことを「標的核酸を含有している可能性のある試料」と言うことにする。
【００１２】
（標的核酸を複製する操作）
試料中の核酸に対して、標的核酸を複製する操作を行う方法は特に限定されず、従来公知の種々の方法が適用できる。例えば、標的配列の存在の有無が不明でも良い試料、標的配列に静電結合、水素結合、共有結合、疎水結合等により直接または間接に結合可能で酵素による核酸合成の足がかりとなりかつリガンドが結合された化合物、標的配列の情報に従って核酸合成を行う酵素および該酵素の反応に必要な基質を緩衝液に添加した溶液を調製し、酵素の至適温度でインキュベートして酵素反応を十分に行わせれば良い。試料中に標的配列が存在すれば、前記酵素反応により、標的核酸が産生される。なお、リガンドが結合された前記化合物は、従来公知の方法で得ることができ、市販品があればこれを用いても良い。
【００１３】
前記酵素反応に供する試料としては特に限定されず、例えば、患者由来の試料そのものや、患者由来の試料から抽出したｇＤＮＡ等の核酸を含むもの等が挙げられる。患者由来の試料としては特に限定されず、好ましいものとして血液が例示できる。そして、患者由来の試料からｇＤＮＡ等の核酸を抽出する方法も特に限定されず、例えば、患者由来の試料が血液である場合には、ＱＩＡＧＥＮ社製のＥＺ１（商品名）等の自動化された核酸抽出装置を用いても良いし、市販の核酸抽出キットを用いても良い。また、島津製作所製のＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（商品名）を用いれば、核酸抽出後にそのまま後記するＰＣＲを行うこともできる。そして、ここに挙げたものは一例であり、検出環境に応じて適宜選択すれば良い。また、同様の方法で、試薬だけを変えることでＲＮＡの抽出も行えるので、必要に応じてＲＮＡを用いても良い。
【００１４】
このような方法として、具体的には、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略記する）法、ライゲーション法等が例示できる。
ＰＣＲ法では、リガンドが結合されたプライマー対を用い、標的配列を増幅する操作を行えば良い。
ライゲーション法では、リガンドが結合されたプローブ対を用い、標的配列上で連結反応を行う操作を行えば良い。
これらの中でも、微量の核酸を大量に複製できることから、ＰＣＲ法が好ましい。
【００１５】
図１に、ＰＣＲ法により標的核酸が産生する様子の模式図を例示する。
患者試料中に含まれる標的配列１０を抽出し、第一のリガンド１１０が結合されたフォワードプライマー１１、および第二のリガンド１２０が結合されたリバースプライマー１２を用意して、これらを用いてＰＣＲ増幅を行うことで第一のリガンド１１０および第二のリガンド１２０が結合された標的核酸１が得られる。
【００１６】
ＰＣＲ法では、使用するプライマーは１６〜３２ｍｅｒの長さであることが好ましく、例えば、標的核酸が遺伝子多型変異を有するものである場合は、その変異に適した配列を選択する。プライマーは、シグマアルドリッチジャパン株式会社等より入手可能である。プライマーはフォワードプライマーおよびリバースプライマーの二種が必要であり、それぞれ、異なるリガンドを結合させる。リガンドの結合位置としては５’末端、３’末端およびこれらの間より任意に選択できるが、ＰＣＲはプライマーの３’末端より伸長反応が行われるので、３’末端近傍に結合させることは好ましくない。そして、最も容易かつ経済的であることから、５’末端に結合させることが好ましい。
なお、プライマーは、リガンドが結合された状態の市販品を容易に入手できる。
【００１７】
ＰＣＲ試薬は、市販品が多数存在し、容易に入手可能である。例えば、東洋紡績株式会社製のＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（商品名）などは、ＰＣＲ酵素、ｄＮＴＰ、Ｍｇ２＋、緩衝液などが一つのキットとして含まれている。またＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（商品名）などは、酵素を含む反応溶液が混合された状態であるだけでなく、冷蔵保存が可能である。ただし、遺伝子多型の検出を目的とする場合には、誤りの少ない高フィデリティの酵素を選択することが好ましい。ＰＣＲ試薬は入手性、経済性、フィデリティなどを考慮して選択すれば良い。
【００１８】
ＰＣＲ装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（商品名）や、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製のＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＴＣ−２００（商品名）など、一般の市販品が好適である。ただし、各ＰＣＲ装置によって反応の効率が若干異なるので、それらを補正する必要が生じることもある。遺伝子多型などの定量性を必要としない検出では補正の必要はないが、遺伝子発現などを見る場合には補正を行う必要がある。
【００１９】
プライマー濃度、鋳型ＤＮＡ濃度、ＰＣＲ温度サイクル条件などは、標的核酸に応じて適切なものを選択する。これら条件の一例を、東洋紡績株式会社製のＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（商品名）を用いた場合について表１および２に示す。なおこれら条件は、一塩基多型変異を有する二つの標的配列を１ウェル内で同時に検出する競争的ＰＣＲの形態をとっている。
【００２０】
【表１】
2008125383.tif 000002
【００２１】
【表２】
2008125383.tif 000003
【００２２】
次に、図２に、ライゲーション法により標的核酸が産生する様子の模式図を例示する。
患者試料中に含まれる標的配列１０を抽出し、第一のリガンド１１０が結合された第一のプローブ２１、および第二のリガンド１２０が結合された第二のプローブ２２を用意して、これらを用いて標的配列１０上でライゲーション反応を行うことで、第一のリガンド１１０および第二のリガンド１２０が結合された標的核酸２が得られる。
【００２３】
ライゲーション法では、供する試料はＰＣＲ法と同様である。ただし、ライゲーション反応は増幅反応ではなくＳ／Ｎが確保しづらいので、反応に供する前に試料から核酸を抽出しておくことが好ましい。核酸の抽出方法は特に限定されず、検出環境に応じて適宜選択すれば良い。
【００２４】
ライゲーション反応で使用するするプローブは、１２〜３２ｍｅｒの長さであることが好ましく、例えば、標的核酸が遺伝子多型変異を有するものである場合は、その変異に適した配列を選択する。プローブはＰＣＲ法で用いるプライマー同様に、リガンドが結合された状態の市販品を容易に入手できる。
【００２５】
ライゲーション法では、隣接したプローブを連結する反応を行うため、本発明においては、下流に位置するプローブの３’末端近傍および上流に位置するプローブの５’末端近傍には、リガンドを結合させないようにする。また、上流に位置するプローブの５’末端は本来水酸基であるが、ここにはリン酸基を結合しておく必要がある。このリン酸基の結合は、従来公知の方法で行うこともできるし、リン酸基が結合された状態のプローブの市販品を用いても良い。
従って、上流に位置するプローブへのリガンドの結合は、３’末端または３’末端近傍で行うことが好ましい。プローブに結合させるリガンドは、ＰＣＲ法で用いるものと同様のもので良く、プローブの種類に応じて適宜選択すれば良い。
【００２６】
ライゲーション試薬は、市販品が多数存在し、容易に入手可能である。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製のＴａｑ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（商品名）などは、ライゲース（酵素）、緩衝液などが一つのキットとして含まれている。また、ＥＰＣＥＮＴＲＥ社製のＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（商品名）などは、長時間、高温にさらしても失活しにくい改良された耐熱性ライゲースであり、ライゲーションと熱変性を繰り返し行わせるＬＣＲ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）において有効である。このようにライゲーション試薬は、使用目的や入手性、経済性などを考慮して選択すれば良く、特に限定されるものではない。
【００２７】
ライゲーション反応は、４０℃〜６５℃程度の恒温条件でインキュベートして行うので、恒温槽を用いれば行うことができる。ただし、インキュベーションの前に熱変性を行う場合やＬＣＲを行う場合などには、ＰＣＲ法で用いるサーマルサイクラーなどを用いると良い。
【００２８】
プローブ濃度、鋳型ＤＮＡ濃度、ライゲーション温度条件などは、標的核酸に応じて適切なものを選択する。これら条件の一例を、ＥＰＣＥＮＴＲＥ社製のＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（商品名）を用いた場合について表３および４に示す。なおこれら条件は、一塩基多型変異を有する二つの標的配列を１ウェル内で同時に検出する競争的ライゲーションの形態をとっている。
【００２９】
【表３】
2008125383.tif 000004
【００３０】
【表４】
2008125383.tif 000005
【００３１】
本発明では、検出対象の標的核酸は二本鎖である。例えば、ＰＣＲ法およびライゲーション法のいずれにおいても、プライマーおよびプローブは必ず二つ一対で用いる。これにより、対となっている双方のプライマーまたはプローブが正常に機能しないと、二本鎖の標的核酸が得られない。このような特異性増強の効果により、高精度に酵素反応産物が得られる。そして、得られた酵素反応産物は、熱変性やアルカリ変性などの特別な後処理を行わない限り二本鎖の状態となる。
【００３２】
核酸はその構造上、一本鎖では直鎖形状をとり難く、特別に設計された配列でない限り、何らかの立体構造をとっている場合がほとんどである。しかし本発明では、標的核酸が二本鎖核酸なので、一本鎖核酸同士が互いに支えあう形でほぼ直鎖に近い構造をとり、固相や微粒子上に高密度に配置させることが可能となる。
さらに一本鎖の状態では、室温付近では他の一本鎖核酸とハイブリダイゼーションを起こす可能性があり、この場合、互いに絡み合って標的核酸の検出効率が著しく低下する。しかし本発明では、このような検出効率の低下は生じない。
【００３３】
（リガンド）
本発明で用いるリガンドとしては、核酸に結合可能で受容体と特異的に結合できるものであれば特に限定されず、例えば、ハプテン、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＤＮＰ、Ｃｙ、ＤＩＧ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＦＬＣ、ローダミングリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）、ＴＡＭＲＡ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、アレクサ（Ａｌｅｘａ）、ペプチド、タンパク質、抗原／抗体物質、糖鎖等が挙げられる。そして、入手性や経済性を考慮して選択すれば良い。
【００３４】
本発明において特異的結合とは、特定の物質間で選択的に形成される、特異性の高い分子間力に基づく結合を意味する。具体的には、例えば、抗原および抗体間の免疫学的反応による結合、ビオチンおよびアビジン間の結合、糖およびレクチン間の結合等を例示できるが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明では、一つの標的配列に対して、異なる二種類のリガンド（リガンド対）を用いて、標的核酸を調製する。
【００３６】
＜固相担体および微粒子を調製する工程＞
（受容体）
本発明において受容体とは、前記リガンドと特異的に結合可能なすべての物質を指す。このように特異的結合を利用することで、標的核酸が微量でも高精度な検出が可能となる。
【００３７】
（微粒子）
本発明で用いる微粒子は光学的に区別可能なものである。ここで光学的に区別可能であるとは、具体的には例えば、色が異なること、すなわち光の吸収・反射・散乱、発光、蛍光等の波長が異なること、あるいは粒径が異なること、形状が異なること、材質が異なること等を指す。例えば、微粒子の色が同じであっても、微粒子の粒径が異なれば光の透過率が異なるので、これら微粒子を光学的に区別可能となる。また、微粒子の形状が異なれば光散乱の程度が異なるので、これら微粒子を光学的に区別可能となる。また、微粒子の材質が異なれば、微粒子の表面物性が異なることで光学特性が異なるので、これら微粒子を光学的に区別可能となる。本発明において用いる微粒子には、ここに挙げたものをはじめ、光学的に区別できる要素を複数有しているものを用いることもできる。
これら微粒子の粒径、材質、形状等は、所望の光学的性質が付与されるよう、適宜選択する。
これら微粒子は、従来公知の方法で製造すれば良く、市販品を用いても良い。
【００３８】
これらの中でも、目視で色の違いが認識できるものが好ましい。このようなものを用いれば、光学的性質検出用の装置を用いる必要もなく、安価かつ迅速簡便に核酸の検出を行うことができる。そして、製造または市販品の入手も容易である。目視で色が異なる微粒子を製造する場合には、例えば、成型済みの微粒子表面を染料等で着色しても良いし、着色済みの材料を用いて微粒子に成型しても良い。
【００３９】
標的核酸をＰＣＲ法により調製する場合には、大量の標的核酸が得られるが、増幅反応を伴わないライゲーション法等により標的核酸を調製する場合には、得られる標的核酸の量は限られる。従って、光学的に区別可能な微粒子を用いる本発明の検出方法は、特に目視で検出を行うようにすることもできる点で優れた方法である。
【００４０】
目視で色の違いが認識できる微粒子の材質としては、本発明の効果を損なわない範囲で特に限定されず、検出条件に応じて適宜選択すれば良い。例えば、ラテックスビーズ、ポリスチレンビーズ等、高分子材料からなる微粒子は、市販品の入手が容易である点で好ましく、特にラテックスビーズが好ましい。
ラテックスビーズは色付きのものが市販されており、例えば、Ｓｅｒａｄｙｎ社製のＣｏｌｏｒ−Ｒｉｃｈ（Ｄｙｅｄ  Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ）（商品名）は赤色であり、視認性が高く、カルボキシル基でコートされているので、さまざまな受容体を用途に応じて固定化でき、好適である。
これら高分子材料からなる微粒子以外にも、金属コロイド、非金属コロイド等を用いることもできる。
【００４１】
またこのような色付きビーズの粒径は、０．２〜３μｍ程度が好ましく、粒径が必ずしも均一である必要はない。
【００４２】
色付きビーズの色は特に限定されないが、原色に近いほど目視による視認性が高いので好ましい。ただし、背景色となる固相担体の色に応じて適宜選択することが好ましい。
【００４３】
微粒子には、前記リガンド対の一方と特異的に結合する受容体が固定化されている。固定化されている受容体の数は特に限定されないが、本発明の効果を妨げない範囲で多い方が好ましく、微粒子１ｍｇあたり、通常は１μｇ〜１１０μｇの受容体が固定化されていることが好ましい。このような受容体の固定化量であれば、例えば、後記するようにカルボキシル基等の官能基を表面に有する微粒子に受容体を固定化することも容易である。
そして微粒子上での受容体の固定化位置も特に限定されないが、受容体の数を特定の値に固定して比較した場合に、受容体間の距離が可能な限り大きくなるようにすることが好ましい。このようにすることで、標的核酸中のリガンドとの特異的結合が一層容易となる。
【００４４】
このような受容体が固定化された光学的に区別可能な微粒子は、市販品があるのでこれをそのまま用いても良いし、従来公知の手法で調製しても良い。調製法としては、微粒子表面に露出されているカルボキシル基やアミノ基等の官能基に、受容体中の官能基を結合させる方法が例示できる。これら官能基同士を結合させる方法は、従来公知の方法を適用することができ、例えば、水溶性カルボジイミドでカルボキシル基とアミノ基を結合させるＥＤＡＣ方法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とをあらかじめ混合してカルボキシル基とアミノ基とを結合させる方法、双極性を有するリンカーを用いてアミノ基同士を架橋する方法、活性化したアルデヒド基やトシル基と官能基を結合させる方法等が挙げられる。
【００４５】
例えば、微粒子の凝集反応を利用する従来の核酸検出方法では、あらかじめ特定の塩基配列を有するプライマーやプローブを微粒子に結合させておく必要があり、このような微粒子は、標的配列が変わるとその都度調製し直す必要があった。しかし、本発明によれば、プライマーやプローブをあらかじめ微粒子に結合させることはないので、プライマーやプローブのみを調製し直せば良く、汎用性が高く、検出の簡略化および低コスト化がはかれる。
【００４６】
（固相担体）
固相担体には、前記リガンド対の他方と特異的に結合する受容体が固定化されている。固定化されている受容体の数は特に限定されないが、本発明の効果を妨げない範囲で多い方が好ましく、固相担体１ｍｇあたり、通常は１μｇ〜１１０μｇの受容体が固定化されていることが好ましい。このような受容体の固定化量であれば、例えば、後記するようにカルボキシル基等の官能基を表面に有する固相担体に受容体を固定化することも容易である。
【００４７】
固相担体の材質は特に限定されず、例えば、各種プラスチック類等を挙げることができる。中でもポリスチレンが好ましい。ポリスチレン製の固相担体は、耐久性、可搬性、微粒子の固定化のし易さに優れている。また、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）用のプレートの材質として用いられているように、抗体を固定化するための様々な手法、キットが存在しており、抗体等の受容体を固定化し易い点でも優れている。市販品であれば、例えば、フナコシ株式会社製のＩＭＭＵＮＯ−ＴＥＫ  ＥＬＩＳＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名）などが好適である。
【００４８】
固相担体の形状も特に限定されず、製造のし易さ、持ち易さ、試料中への挿入し易さ等を考慮して適宜選択すれば良い。好ましい形状としては、ストリップ状を例示できる。
ストリップ状のものについて、さらに具体例を挙げると、ＰＣＲチューブに挿入する場合には、通常の０．２ｍｌＰＣＲチューブは、内径が５．５ｍｍで先端が細くなっているので、幅および厚みは２〜３ｍｍ程度が好ましい。また、ＰＣＲチューブの底まで達し、かつ指で持ち易いことから、長さは５〜１０ｃｍ程度が好ましい。
【００４９】
固相担体上の受容体の固定化領域は、受容体が試料と接触可能な領域であれば特に限定されない。例えば、試料を０．２ｍｌＰＣＲチューブに充填している場合、または表１に示すように総液量が５０μｌ程度のＰＣＲ反応後の溶液をそのまま前記試料として用いる場合などは、固相担体の試料挿入端から１〜２ｍｍの領域を受容体の固定化領域とすることが好ましい。前記試料が５０μｌ以上、例えば、１００μｌなどの場合は、固相担体の試料挿入端からより離れた領域を受容体固定化領域しても良い。しかし、固相担体の試料挿入端から１〜２ｍｍの領域は、様々な量の前記試料に対応できるだけでなく、後記するように、微粒子も固相担体に付着させる際にも有利である。
【００５０】
固相担体上における受容体の固定化領域の数は、必ずしも一つである必要はなく、複数でも良い。
【００５１】
そして、受容体固定化領域内における受容体の固定化位置の分布も特に限定されないが、受容体の数を特定の値に固定して比較した場合に、受容体間の距離が可能な限り大きくなるようにすることが好ましい。このようにすることで、標的核酸中のリガンドとの特異的結合が一層容易となる。
【００５２】
固相担体に受容体を固定化する方法は特に限定されない。例えば、前記の固定化市販キットを用いても良いし、微粒子に受容体を固定化する方法と同様にして、固相担体表面の官能基と受容体の官能基を結合させる方法を適用しても良い。このように官能基同士を結合させる場合には、例えば、受容体を含む反応液を固相担体上の所定の領域に付着させて、官能基同士を結合させた後、緩衝液等の洗浄液を用いて洗浄すれば良い。
【００５３】
前記反応液を固相担体上へ付着させる方法は特に限定されず、所望の受容体固定化領域の形状および数に応じて適宜選択すれば良い。例えば、針を用いて前記反応液を点着する方法、インクジェット法により前記反応液をスポッティングする方法、糸などを用いて前記反応液を塗布する方法等が挙げられる。
【００５４】
本発明においては、固相担体に前記受容体を固定化した上で、さらに前記微粒子を付着させて用いることができる。すなわち、固相担体の微粒子付着領域を前記試料中に挿入して、該微粒子を試料中に放出させることで、試料中に微粒子を添加することができる。
ここで付着とは、固定化とは異なり、固相担体の微粒子付着領域を前記試料中に挿入した際に、微粒子が固相担体から離脱するように、固相担体上に微粒子が保持されていることを指す。
【００５５】
微粒子は、固相担体上の受容体固定化領域以外の領域に付着させる。固相担体上の受容体固定化領域内に微粒子を付着させることは、該領域内の受容体および微粒子の保持密度が高くなることを意味する。この場合、このように高密度に受容体を固定化および微粒子を付着させることは手間を要するだけでなく、固相担体に標的核酸を十分結合させてから該標的核酸に微粒子を結合させるという好ましい手順を経ることが困難になるので好ましくない。なお、この「好ましい手順」については後に詳しく述べる。
【００５６】
そして、固相担体上の微粒子付着領域は、固相担体の試料挿入端を基準として、前記受容体固定化領域よりも上部に位置することが好ましい。
さらに前記のように、固相担体の試料挿入端から１〜２ｍｍの領域を受容体の固定化領域とする場合には、微粒子付着領域は、少なくとも固相担体の試料挿入端から５ｍｍ以下の領域とすることが好ましい。
【００５７】
固相担体上の受容体と微粒子との位置関係をこのようにすれば、後記するように、まず受容体固定化領域を前記試料中へ挿入することで、固相担体上へリガンドおよび受容体を介して標的核酸を結合させ、次いで微粒子付着領域を前記試料中へ挿入することで、該試料中へ放出された微粒子を標的核酸へ、リガンドおよび受容体を介して結合させることができ、好ましい手順で標的核酸を検出することができる。
また、前記試料が充填されている容器が、例えばチューブ状等で、底部に近いほど細くなっている場合などは、固相担体の形状を、試料挿入端に近いほど幅が狭くなるようにしておけば、該固相担体を容器の底部近傍にまで挿入することができる。このようにしておくことで、上記のような固相担体の段階的な挿入がより行い易くなる。
【００５８】
微粒子を固相担体に付着させる方法は、例えば、該微粒子を含有する溶液を固相担体の所定領域に付着させた後、凍結乾燥、減圧乾燥、風乾等により溶媒を除去する方法が挙げられる。この場合、微粒子を含有する溶液中には、微粒子の付着を補助するものが含有されていることが好ましい。例えば、前記試料として汎用される水溶液を用いる場合には、水溶性の高分子化合物、具体的には例えば、トレハロース、デンプン等の多糖類が含有されていることが好ましい。
【００５９】
本発明においては、後記するように、固相担体に固定化されている受容体と標的核酸中のリガンドとの特異的結合が十分進行してから、前記試料中へ微粒子を添加することが好ましい。したがって、固相担体に付着されている微粒子の前記試料中への放出は、徐々に進行することが好ましく、そのためには、微粒子の固相担体への付着力を調節することが好ましい。付着力の調節方法としては、前記の微粒子の付着を補助するトレハロース等の濃度を調節する方法が例示でき、本発明の効果を妨げない範囲で溶液中の濃度を高くするなどして、微粒子が徐々に放出されるようにする方法が挙げられる。
また微粒子は、固相担体表面に薄くフィルム状に付着するように付着形態を調節することでも、徐々に放出させることができる。
そのためには、微粒子を含有する溶液を、固相担体表面の所定領域に薄く平面状に塗布すれば良い。
【００６０】
微粒子を含有する溶液を固相担体に付着させる方法は特に限定されず、例えば、前記したような受容体を含む反応液を固相担体上へ付着させる方法を適用することもできる。
【００６１】
固相担体上における微粒子の付着領域の数は、必ずしも一つである必要はなく、複数でも良い。
【００６２】
＜固相担体の受容体固定化領域を試料中に挿入する工程＞
標的核酸を含有している可能性のある試料に、固相担体の受容体固定化領域を挿入すると、試料中に標的核酸が存在すれば、該標的核酸中のリガンド対の一方が固相担体上の受容体に特異的に結合する。このように、リガンドおよび受容体の特異的結合を介して、標的核酸が固相担体に結合される。なお、本発明においては、以下、「リガンドおよび受容体の特異的結合を介した標的核酸と固相担体との結合」のことを、単に「標的核酸と固相担体との結合」と言うことがある。この時、試料中には微粒子は存在せず、標的核酸は試料中では自由に動くことができ、標的核酸自体の立体障害以外には、リガンドと受容体との特異的結合を妨げるものは無く、特異的結合形成が最も進行し易い条件下にある。
そして、固相担体を試料中に挿入した後は、試料を撹拌すると、標的核酸の固相担体への結合はより速やかかつ均一に進行する。撹拌はどのように行っても良く、例えば、固相担体自体を振倒させるなどして撹拌しても良い。
【００６３】
固相担体の受容体固定化領域を試料に挿入して、標的核酸を固相担体に十分結合させるためには、通常、室温下では1分間挿入したままにしておけば良いが、２５〜３７℃で５〜１５分間、挿入したままにしておくことが好ましい。
【００６４】
従来のイムノクロマト法などでは、毛細管現象を利用して送液を行うことが特徴であり、特異的結合の形成を促進させる手段は限られていた。しかし本発明では、このように固相担体を直接試料中に挿入するので、挿入後、必要に応じて試料を攪拌することで特異的結合の形成を均一に促進させることができる。
【００６５】
また、固相担体を直接試料中に挿入することで、従来のイムノクロマト法や凝集反応を用いる方法の問題点であった、試料の分注操作を省略できる。これにより、核酸の検出が簡便に行えるだけでなく、試料の入った容器と固相単体との対応関係が明確になるので、誤って情報処理する危険性を回避できる。
【００６６】
＜微粒子を試料中に添加する工程＞
固相単体の受容体固定化領域を前記試料中に挿入したまま、微粒子を該試料中に添加すると、固相担体に結合された標的核酸中のリガンド対の他方と、微粒子に固定化されている受容体とが特異的に結合する。このように、リガンドおよび受容体の特異的結合を介して、微粒子が標的核酸に結合される。なお、本発明においては、以下、「リガンドおよび受容体の特異的結合を介した微粒子と標的核酸との結合」のことを、単に「微粒子と標的核酸との結合」と言うことがある。この時、微粒子は試料中では自由に動くことができ、微粒子および標的核酸自体の立体障害以外には、リガンドと受容体との特異的結合を妨げるものは無く、特異的結合形成が最も進行し易い条件下にある。そして、微粒子を試料中に添加した後は、試料を撹拌すると、微粒子の標的核酸への結合はより速やかに進行する。撹拌はどのように行っても良く、例えば、固相担体自体を振倒させるなどして撹拌しても良い。
【００６７】
微粒子を試料に添加して、標的核酸に十分結合させるためには、通常、室温下では微粒子を添加してから1分間、固相担体を試料に挿入したままにしておけば良いが、微粒子を添加してから２５〜３７℃で５〜１５分間、固相担体を試料に挿入したままにしておくことが好ましい。
【００６８】
ここまでの、標的核酸を固相担体に結合し、微粒子を標的核酸に結合するまでの様子を、図３および４に模式図で例示する。図３は、ＰＣＲ法で調製した標的核酸を用いた場合を示し、図４は、ライゲーション法で調製した標的核酸を用いた場合を示す。いずれも、図１および２で用いたものと同じものについては同じ符号を付す。
いずれの場合も、ＰＣＲ法で調製した標的核酸１、ライゲーション法で調製した標的核酸２を用いていること以外は同様であり、固相担体３０に固定化されている第一の受容体１４０が第一のリガンド１１０と特異的に結合し、微粒子１３に固定化されている第二の受容体１３０が第二のリガンド１２０と特異的に結合することで、標的核酸１または２が光学的に区別可能な状態で固相単体３０に結合されている。
【００６９】
上記のように、試料中へ固相担体の受容体固定化領域を挿入し、微粒子を添加する順番は重要であるので、これについて説明する。
本発明とは異なる手順でリガンドと受容体との特異的結合を形成する場合、例えば、標的核酸と微粒子とを結合させた後、これを固相担体と接触させる場合を考えてみる。まず、標的核酸と微粒子とは高い効率で特異的に結合する。なぜなら、標的核酸および微粒子は、ともに試料中において自由に動き回ることができ、両者の衝突確立が高いからである。標的核酸および微粒子が衝突すると、微粒子に固定化されている受容体の数にもよるが、微粒子の表面が標的核酸で覆われた複合体を形成する。次いで、標的核酸および微粒子の結合に関与していないこの複合体中のリガンド、すなわち、固相担体上の受容体と特異的に結合すべき標的核酸中のリガンドが、固相担体上の受容体と接触すると、該複合体が固相担体に結合される訳である。しかし、微粒子表面の標的核酸は、そのすべてが固相担体と結合する訳ではなく、微粒子表面の標的核酸の量にもよるが、一部あるいは大部分が結合を形成することなく謂わば無駄になってしまう。
また、前記複合体は、標的核酸が結合していない状態の微粒子よりもサイズが大きく、さらに標的核酸が負電荷を帯びていることによりその静電反発力が増強される。従って、一つの複合体が固相担体に結合すると、結合した複合体はその周辺に強力な斥力を発生させ、他の複合体が固相担体の受容体固定化領域に接近するのを著しく妨げることになるのである。このような理由で、本発明の手順による時よりもはるかに低い効率でしか、標的核酸を固相担体に結合できないことになってしまうのである。
【００７０】
これに対して、本発明の手順によれば、標的核酸は微粒子と結合することがほとんどなく、試料中では自由に動くことができるので、固相担体と高い効率で結合し、無駄になるものがほとんどない。そして、標的核酸が十分固相担体と結合した後に添加された微粒子は、試料中では自由に動くことができ、固相担体表面で斥力による排斥を受けることも無いので、標的核酸と高い効率で結合する。従って、標的核酸の検出感度が最も高くなるのである。
【００７１】
微粒子を試料中に添加する時は、先に述べたように、固相担体に微粒子を付着させておき、固相担体の受容体固定化領域を前記試料中に挿入して、標的核酸を固相担体に十分結合させ、該固定化領域を試料中に挿入したまま、さらに固相担体の微粒子付着領域を試料中に挿入して、微粒子を試料中に放出させ、標的核酸に結合させても良い。この方法でも、標的核酸の検出感度を高くすることができるが、さらに、微粒子の試料中への放出が徐々に進行すれば、より検出感度を高くすることができる。そこで、先に述べたように、微粒子の固相担体への付着力や付着形態を調節しておくと良い。
【００７２】
＜固相担体を取り出す工程＞
微粒子添加後の試料中より固相担体を取り出すことで、余剰物を容易に分離（Ｂ／Ｆ分離）することができる。この時、必要に応じて、取り出し後の固相単体を緩衝液等の洗浄液を用いて洗浄しても良い。用いる洗浄液は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されない。
【００７３】
＜固相担体の受容体固定化領域の光学的性質を検出する工程＞
試料中に標的核酸が存在していれば、固相担体の受容体固定化領域には、標的核酸の存在を示す光学的特徴が示される。光学的性質の検出方法は、用いた微粒子の光学的特長に応じて検出装置を用いるなど適宜選択すれば良いが、例えば、目視で色の違いが認識できる微粒子を用いていれば、特殊な検出装置を一切必要としないので、最も安価かつ迅速簡便に検出が可能である。
また、試料から取り出した固相担体は、試料が入った容器との対応関係が明確なので、検出結果を誤って記録するなどの誤った情報処理を回避できる。
【００７４】
試料から取り出した固相担体は、例えば、激しくこするなどの操作を加えない限り微粒子は脱落しないので、乾燥に供しても良いし、保存しておいても良い。また、標的核酸が検出された場合には、これを再度ＰＣＲ法等で増幅することもでき、より詳細な解析を行うこともできる。
【００７５】
ここまでの、標的核酸を検出するまでの様子を、微粒子が付着された固相担体を用いた場合について、図５および６に模式図で例示する。図５は、ＰＣＲ法で調製した標的核酸を用いた場合を示し、図６は、ライゲーション法で調製した標的核酸を用いた場合を示す。いずれも、図１および２で用いたものと同じものについては同じ符号を付す。また、符号３５は受容体固定化領域であり、符号３６は微粒子付着領域である。
いずれの場合も、ＰＣＲ法で調製した標的核酸１、ライゲーション法で調製した標的核酸２を用いていること以外は同様であり、受容体固定化領域３５に標的核酸１または２と、微粒子１３が結合されている。
【００７６】
[標的配列が複数種類の場合の検出方法]
本発明では、標的配列が複数種類の場合でも、対応する複数種類の標的核酸を同時に検出することができる。ここで言う「標的配列が複数種類の場合」とは、（ｉ）一種類の標的配列を有する核酸が複数種類存在する場合、（ｉｉ）複数種類の標的配列を有する核酸が一種類存在する場合、（ｉｉｉ）複数種類の標的配列を有する核酸が複数種類存在する場合などを指す。
例えば、標的配列ごとに酵素反応を同時に行うなど、複数種類の標的核酸を同時に得る操作を行うことができる。この様な方法としては、例えば、複数のＰＣＲ増幅を同時に行うマルチプレックスＰＣＲ、または複数のライゲーション反応を同時に行うマルチプレックスライゲーション反応を用いる方法が挙げられる。
【００７７】
標的配列が複数の場合、リガンド対は、標的配列ごとに異なるものを用いる。この時、リガンドはすべて異なるものを用いても良く、微粒子に固定化された受容体に結合するリガンドおよび固相担体に固定化された受容体に結合するリガンドのいずれ一方を、すべてのリガンド対において同一のものにしても良い。
【００７８】
例えば、微粒子に固定化された受容体に結合するリガンドを、標的配列によらず同一とする場合には、これにあわせて微粒子に固定化する受容体もすべて同一とする。そして、複数種類の標的核酸を同時に検出するためには、固相担体に固定化された受容体と結合するリガンドを、標的配列ごとにそれぞれ異なるものとし、これにあわせて固相担体に固定化する受容体も標的配列ごとにそれぞれ異なるものとし、さらに、固相担体上には種類ごとに区分してこれら受容体を固定化する（第一の実施形態）。
【００７９】
この第一の実施形態においては、微粒子の光学的性質はすべて同じでも良い。この場合、固相担体上で検出される光学的性質はすべて同一となるが、固相担体に固定化されている受容体の種類と固定化領域との関係が明確なので、検出された領域の違いによって、検出された標的核酸の種類を判定することができる。
【００８０】
また、固相担体に固定化された受容体に結合するリガンドを、標的配列によらず同一とする場合には、これにあわせて固相担体に固定化する受容体もすべて同一とする。そして、複数種類の標的核酸を同時に検出するためには、微粒子に固定化された受容体と結合するリガンドを、標的配列ごとにそれぞれ異なるものとし、これにあわせて微粒子に固定化する受容体も標的配列ごとにそれぞれ異なるものとし、さらに、微粒子の光学的性質も、前標的配列ごとにそれぞれ異なるものとする（第二の実施形態）。
【００８１】
これにより、固相担体の受容体固定化領域内において、複数種類の標的核酸は、対応するすべての微粒子の光学的性質を重ね合わせた状態で検出される。例えば、目視で色の違いが認識できる微粒子を用いる場合には、補色の関係を利用して色の重ね合わせを強調できるように微粒子の色の組み合わせを選択すると、検出結果の確認が容易で効果的である。
【００８２】
さらに、第一および第二の実施形態を組み合わせた形態でも良い。すなわち、微粒子に固定化された受容体および該受容体と結合するリガンド並びに該微粒子の光学的性質を、標的配列ごとにそれぞれ異なるものとし、固相担体に固定化された受容体および該受容体と結合するリガンドを、標的配列ごとにそれぞれ異なるものとして、かつ固相担体上には種類ごとに区分してこれら受容体を固定化する（第三の実施形態）。
【００８３】
第一および第二の実施形態とすれば、用意するリガンドの種類を削減することができるので、特に標的配列の数が多い場合には、検出の簡略化および低コスト化がはかれる。
一方、第三の実施形態とすれば、より高精度な検出が可能である。
【実施例】
【００８４】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
［実施例１］ＰＣＲ法で調製した二本鎖標的核酸の検出
（二本鎖標的核酸の調製）
表５に示す組成の反応溶液を調製し、以下に示す材料、装置等を用いて、表６に示すＰＣＲサイクルでＰＣＲ増幅を行った。
テンプレート核酸：配列番号３に示す塩基配列を有するヒトｇＤＮＡ
プライマー：配列番号1に示す塩基配列の５’末端にＤＩＧを結合させたプライマー、配列番号２に示す塩基配列の５’末端にビオチンを結合させたプライマー
サンプル容器：取り外し可能な蓋付きの２００μｌマイクロチューブ（アシスト社製）
サーマルサイクラー： ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２００（商品名、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（現ＢｉｏＬａｄ社）製）
【００８５】
【表５】
2008125383.tif 000006
【００８６】
【表６】
2008125383.tif 000007
【００８７】
（固相担体）
固相担体を以下のように作製した。
すなわち、図７に示すように、ポリスチレン製の棒（Φ２ｍｍ、長さ１０ｃｍ）７０１のうち、試料挿入端７０５から２ｍｍほどをカルボキシル基でコートし、抗ＤＩＧ抗体７０２をエチレンジアミノカルボジイミド（ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて固定化した。また、抗ビオチン抗体（ヤギ免疫、ＳＩＧＭＡ社製）とカルボキシル基でコートされた赤色ラテックスビーズ（Φ０．３μｍ、Ｓｅｒａｄｙｎ社製）とをＳｅｒａｄｙｎ社の推奨プロトコルで反応させ、製造した抗ビオチン抗体付加赤色ラテックスビーズ７０３溶液を、前記棒７０１の試料挿入端７０５から３ｍｍ〜５ｍｍの付近に付着させて乾燥させることで、前記ビーズ７０３を前記棒７０１の所定箇所に付着させ、検出用の固相担体とした。
【００８８】
（特異的結合の形成）
ＰＣＲ増幅を行ったマイクロチューブに、前記固相担体を挿入し、手動により２５℃（室温）で１分間振倒させ混和させた。混和後、室温で５分ほど放置した。
【００８９】
（検出および判定）
混和・放置後、ゆっくりと固相担体を引き上げると、図７（ｂ）に示すように、試料挿入端７０５から２ｍｍほどの抗ＤＩＧ抗体付着領域７０４に、前記赤色ラテックスビーズ７０３が付着していることが目視によりはっきり観測された。なお、図７（ａ）は、抗ＤＩＧ抗体付着領域７０４にビーズが付着している様子を、抗ＤＩＧ抗体７０２を強調して示した図である。
これは、検出対象である配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片が、配列番号１および２に示す塩基配列からなるリガンド付きプライマーでＰＣＲ増幅され、増幅産物が、抗ＤＩＧ抗体および抗ビオチン抗体と特異的に結合していることを示すものであり、用いたテンプレート核酸中に、配列番号３に示す塩基配列が確かに存在することが確認された。
【００９０】
［実施例２］
配列番号３に示す塩基配列を有するヒトｇＤＮＡの代わりに、配列番号４に示す塩基配列を有するヒトｇＤＮＡを用いたこと以外は、実施例１と同様に検出を行った。
その結果、図７（ｃ）に示すように、前記固相担体に前記赤色ラテックスビーズの付着は見られなかった。すなわち、配列番号４に示す塩基配列は、配列番号３に示す塩基配列のＳＮＰであり、Ｃ→Ｇの変異によりＰＣＲ増幅されなかったことが確認された。
【００９１】
［実施例３］マルチプレックスＰＣＲにより調製した、二種類の二本鎖標的核酸の検出〜区分分けあり〜
（二種類の二本鎖標的核酸の調製）
表７に示す組成の反応溶液を調製し、以下に示す材料、装置等を用いて、前記表６に示すＰＣＲサイクルでＰＣＲ増幅を行った。
テンプレート核酸：配列番号３に示す塩基配列を有しかつ配列番号７に示す塩基配列を有さないヒトｇＤＮＡ
プライマー：配列番号1に示す塩基配列の５’末端にＤＩＧを結合させたプライマー、配列番号２に示す塩基配列の５’末端にビオチンを結合させたプライマー、配列番号５に示す塩基配列の５’末端にＦＩＴＣを結合させたプライマー、配列番号６に示す塩基配列の５’末端にビオチンを結合させたプライマー
サンプル容器：取り外し可能な蓋付きの２００μｌマイクロチューブ（アシスト社製）
サーマルサイクラー： ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２００（商品名、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（現ＢｉｏＬａｄ社）製）
【００９２】
【表７】
2008125383.tif 000008
【００９３】
（固相担体）
固相担体を以下のように作製した。
すなわち、図８に示すように、ポリスチレン製の棒（Φ２ｍｍ、長さ１０ｃｍ）８０１のうち、試料挿入端８０７から２ｍｍほどをカルボキシル基でコートし、抗ＤＩＧ抗体８０２および抗ＦＩＴＣ抗体８０３をエチレンジアミノカルボジイミド（ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて二つの区分に分けて固定化した。また、抗ビオチン抗体（ヤギ免疫、ＳＩＧＭＡ社製）とカルボキシル基でコートされた赤色ラテックスビーズ（Φ０．３μｍ、Ｓｅｒａｄｙｎ社製）とをＳｅｒａｄｙｎ社の推奨プロトコルで反応させ、製造した抗ビオチン抗体付加赤色ラテックスビーズ８０４溶液を、前記棒８０１の試料挿入端８０７から３ｍｍ〜５ｍｍの付近に付着させて乾燥させることで、前記ビーズ８０４を前記棒８０１の所定箇所に付着させ、検出用の固相担体とした。
【００９４】
（特異的結合の形成）
ＰＣＲ増幅を行ったマイクロチューブに、前記固相担体を挿入し、手動により２５℃（室温）で１分間振倒させ混和させた。混和後、室温で５分ほど放置した。
【００９５】
（検出および判定）
混和・放置後、ゆっくりと固相担体を引き上げると、図８（ｂ）に示すように、試料挿入端８０７から２ｍｍほどの抗ＤＩＧ抗体付着領域８０６に、前記赤色ラテックスビーズ８０４が付着していることが目視によりはっきり観測された。一方、試料挿入端８０７から３ｍｍ〜５ｍｍの付近にある抗ＦＩＴＣ抗体付着領域８０５には、前記赤色ラテックスビーズ８０４が付着していなかった。すなわち、図８のパターンＡを示した。なお、図８（ａ）は、抗ＤＩＧ抗体付着領域８０６にビーズが付着している様子を、抗ＤＩＧ抗体８０２および抗ＦＩＴＣ抗体８０３を強調して示した図である。
これは、検出対象のＤＮＡ断片の内、配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片が、配列番号１および２に示す塩基配列からなるリガンド付きプライマーでＰＣＲ増幅され、増幅産物が、抗ＤＩＧ抗体および抗ビオチン抗体と特異的に結合していること、配列番号７に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片は、配列番号５および６に示す塩基配列からなるリガンド付きプライマーではＰＣＲ増幅されなかったことを示すものである。以上により、用いたテンプレート核酸中に、配列番号３に示す塩基配列は存在するが、配列番号７に示す塩基配列が存在しないことが確認された。
【００９６】
［実施例４］
実施例３で用いたヒトｇＤＮＡの代わりに、配列番号７に示す塩基配列を有しかつ配列番号３に示す塩基配列を有さないヒトｇＤＮＡを用いたこと以外は、実施例３と同様に検出を行った。
その結果、図８（ｃ）に示すように、試料挿入端８０７から３ｍｍ〜５ｍｍの付近にある抗ＦＩＴＣ抗体付着領域８０５に、前記赤色ラテックスビーズ８０４が付着していることが目視によりはっきり観測された。一方、試料挿入端８０７から２ｍｍほどの抗ＤＩＧ抗体付着領域８０６に、前記赤色ラテックスビーズ８０４の付着は見られなかった。すなわち、図８のパターンＢを示した。
これは、検出対象のＤＮＡ断片の内、配列番号７に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片が、配列番号５および６に示す塩基配列からなるリガンド付きプライマーでＰＣＲ増幅され、増幅産物が、抗ＦＩＴＣ抗体および抗ビオチン抗体と特異的に結合していること、配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片は、配列番号１および２に示す塩基配列からなるリガンド付きプライマーではＰＣＲ増幅されなかったことを示すものである。以上により、用いたテンプレート核酸中に、配列番号７に示す塩基配列は存在するが、配列番号３に示す塩基配列が存在しないことが確認された。
【００９７】
実施例１〜４の結果から、固相担体上で検出領域を区分分けした場合、二種類のＤＮＡ断片の有無を高感度に同時検出できることが確認された。
【００９８】
［実施例５］マルチプレックスＰＣＲにより調製した、二種類の二本鎖標的核酸の検出〜区分分けなし〜
（二種類の二本鎖標的核酸の調製）
実施例３と同様の方法で、二種類の二本鎖標的核酸を調製した。
【００９９】
（固相担体）
固相担体を以下のように作製した。
すなわち、図９に示すように、ポリスチレン製の棒（Φ２ｍｍ、長さ１０ｃｍ）９０１のうち、試料挿入端９０６から２ｍｍほどをカルボキシル基でコートし、抗ビオチン抗体９０２をエチレンジアミノカルボジイミド（ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて固定化した。また、抗ＤＩＧ抗体（ヤギ免疫、ＳＩＧＭＡ社製）とカルボキシル基でコートされた赤色ラテックスビーズ（Φ０．３μｍ、Ｓｅｒａｄｙｎ社製）とをＳｅｒａｄｙｎ社の推奨プロトコルで反応させ、製造した抗ＤＩＧ抗体付加赤色ラテックスビーズ９０４溶液、および抗ＦＩＴＣ抗体（ヤギ免疫、ＳＩＧＭＡ社製）とカルボキシル基でコートされた青色ラテックスビーズ（Φ０．３μｍ、Ｓｅｒａｄｙｎ社製）とをＳｅｒａｄｙｎ社の推奨プロトコルで反応させ、製造した抗ＦＩＴＣ抗体付加青色ラテックスビーズ９０３溶液を、前記棒９０１の試料挿入端９０６から３ｍｍ〜５ｍｍの付近に付着させて乾燥させることで、前記ビーズ９０３および９０４を前記棒９０１の所定箇所に付着させ、検出用の固相担体とした。
【０１００】
（特異的結合の形成）
ＰＣＲ増幅を行ったマイクロチューブに、前記固相担体を挿入し、手動により２５℃（室温）で１分間振倒させ混和させた。混和後、室温で５分ほど放置した。
【０１０１】
（検出および判定）
混和・放置後、ゆっくりと検出担体を引き上げると、図９（ｂ）に示すように、試料挿入端９０６から２ｍｍほどの抗ビオチン抗体付着領域９０５に、前記赤色ラテックスビーズ９０４が付着していることが目視によりはっきり観測された。一方、同じ領域に、前記青色ラテックスビーズ９０３は付着していなかった。すなわち、図９のパターンＡを示した。
これは、検出対象のＤＮＡ断片の内、配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片が、配列番号１および２に示す塩基配列からなるリガンド付きプライマーでＰＣＲ増幅され、増幅産物が、抗ＤＩＧ抗体および抗ビオチン抗体と特異的に結合していること、配列番号７に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片は、配列番号５および６に示す塩基配列からなるリガンド付きプライマーではＰＣＲ増幅されなかったことを示すものである。以上により、用いたテンプレート核酸中に、配列番号３に示す塩基配列は存在するが、配列番号７に示す塩基配列が存在しないことが確認された。
【０１０２】
［実施例６］
実施例４と同様の方法で、二種類の二本鎖標的核酸を調製したこと以外は、実施例５と同様に検出を行った。
その結果、図９（ｃ）に示すように、試料挿入端９０６から２ｍｍほどの抗ビオチン抗体付着領域９０５に、前記青色ラテックスビーズ９０３が付着していることが目視によりはっきり観測された。一方、同じ領域に、前記赤色ラテックスビーズ９０４は付着していなかった。すなわち、図９のパターンＢを示した。
これは、検出対象のＤＮＡ断片の内、配列番号７に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片が、配列番号５および６に示す塩基配列からなるリガンド付きプライマーでＰＣＲ増幅され、増幅産物が、抗ＦＩＴＣ抗体および抗ビオチン抗体と特異的に結合していること、配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片は、配列番号１および２に示す塩基配列からなるリガンド付きプライマーではＰＣＲ増幅されなかったことを示すものである。以上により、用いたテンプレート核酸中に、配列番号７に示す塩基配列は存在するが、配列番号３に示す塩基配列が存在しないことが確認された。
【０１０３】
［実施例７］
テンプレート核酸として、配列番号３に示す塩基配列および配列番号７に示す塩基配列をいずれも有するヒトｇＤＮＡを用いたこと以外は、実施例５と同様に検出を行った。
その結果、図９（ｄ）に示すように、試料挿入端９０６から２ｍｍほどの抗ビオチン抗体付着領域９０５が紫色に着色し、前記赤色ラテックスビーズ９０４および青色ラテックスビーズ９０３のいずれもが該領域に付着していることが目視によりはっきり観測された。すなわち、図９のパターンＣを示した。なお、図９（ａ）は、抗ビオチン抗体付着領域９０５にビーズが付着している様子を、抗ビオチン抗体９０２を強調して示した図である。
これは、配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片が、配列番号１および２に示す塩基配列からなるリガンド付きプライマーでＰＣＲ増幅され、増幅産物が、抗ＤＩＧ抗体および抗ビオチン抗体と特異的に結合していること、さらに、配列番号７に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片が、配列番号５および６に示す塩基配列からなるリガンド付きプライマーでＰＣＲ増幅され、増幅産物が、抗ＦＩＴＣ抗体および抗ビオチン抗体と特異的に結合していることを示すものである。以上により、用いたテンプレート核酸中に、配列番号３および７に示す塩基配列がいずれも存在することが確認された。
【０１０４】
実施例５〜７の結果から、固相担体上で検出領域を区分分けせずとも、二種類のＤＮＡ断片の有無を高感度に同時検出できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明は、医療分野における病原菌やウイルスの検出のみならず、犯罪捜査、親子鑑定、考古学研究、生物学等における遺伝子診断に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ＰＣＲ法により標的核酸が産生する様子を例示する模式図である。
【図２】ライゲーション法により標的核酸が産生する様子を例示する模式図である。
【図３】ＰＣＲ法で得られた標的核酸が固相担体に結合し、微粒子が該標的核酸に結合するまでの様子を例示する模式図である。
【図４】ライゲーション法で得られた標的核酸が固相担体に結合し、微粒子が該標的核酸に結合するまでの様子を例示する模式図である。
【図５】微粒子が付着された固相担体を用いて、ＰＣＲ法で調製した標的核酸を検出するまでの様子を例示する模式図である。
【図６】微粒子が付着された固相担体を用いて、ライゲーション法で調製した標的核酸を検出するまでの様子を例示する模式図である。
【図７】実施例１および２における検出時の固相担体を例示する概念図である。
【図８】実施例３および４における検出時の固相担体を例示する概念図である。
【図９】実施例５〜７における検出時の固相担体を例示する概念図である。
【符号の説明】
【０１０７】
１、２・・・標的核酸、１０・・・標的配列、１１・・・フォワードプライマー、１２・・・リバースプライマー、１３・・・微粒子、２１・・・第一のプローブ、２２・・・第二のプローブ、３０・・・固相担体、３５・・・受容体固定化領域、３６・・・微粒子付着領域、１１０・・・第一のリガンド、１２０・・・第二のリガンド、１３０・・・第二の受容体、１４０・・・第一の受容体
【図１】
2008125383.tif 000009
【図２】
2008125383.tif 000010
【図３】
2008125383.tif 000011
【図４】
2008125383.tif 000012
【図５】
2008125383.tif 000013
【図６】
2008125383.tif 000014
【図７】
2008125383.tif 000015
【図８】
2008125383.tif 000016
【図９】
2008125383.tif 000017
【配列表】
2008125383000001.app