(57)【要約】      （修正有）【課題】ファインケミカルまたはタンパク質の製造方法を発展させ、あるいはファインケミカルまたはタンパク質の既存の製造方法の生産性を増大しまたは改良した生合成産物の調製方法を提供する。【解決手段】多重プロモーターおよび発現ユニット、遺伝子の転写および発現を調節するためのそれらの使用、この種の多重プロモーターまたは発現ユニットを含む発現カセット、そのような発現カセットを含むベクター、この種のベクターおよび／または発現ユニットを含む遺伝子改変した微生物、ならびに、前記遺伝子改変した微生物を培養することにより生合成産物を調製する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式I:
5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3'    (I)
（式中、
nは、0〜10の整数であり；
AxおよびAyは、同一または異なり、かつ化学結合またはリンカーの核酸配列であり；
P1、PxおよびPyは、少なくとも1つのRNAポリメラーゼ結合部分を含む、同一のまたは異なるプロモーター配列をコードし；また
少なくともPyは、リボソーム結合媒介性3'末端配列部分を含む）
の配列モジュールを5’から3’方向に含む、多重プロモーター含有型発現ユニット。
【請求項２】
P1、PxおよびPyが、それぞれ、同一のまたは異なる真核生物もしくは原核生物に由来するプロモーター配列または人工プロモーター配列である、請求項１に記載の発現ユニット。
【請求項３】
P1、PxおよびPyが、それぞれ、前記生物のゲノム中のタンパク質コーディング配列の5'上流に位置する35〜500ヌクレオチド残基の連続した配列に由来する、請求項２に記載の発現ユニット。
【請求項４】
前記生物がコリネフォルム細菌である、請求項２または３に記載の発現ユニット。
【請求項５】
P1、PxおよびPyが、互いに独立して、生物中に多量に存在するタンパク質のコーディング配列用のプロモーター配列のなかから選択される、請求項１〜４のいずれか1項に記載の発現ユニット。
【請求項６】
P1、PxおよびPyが、互いに独立して、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４のなかから選択される、請求項１〜５のいずれか1項に記載の発現ユニット。
【請求項７】
前記プロモーターが、強力な、構成的プロモーターまたは調節可能プロモーターのなかから選択される、請求項１〜６のいずれか1項に記載の発現ユニット。
【請求項８】
以下の式II:
5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-G-3'    (II)
（式中、
n、Ax、Ay、P1、PxおよびPyは、上記に定義されるとおりであり、かつ
Gは、5'上流の調節配列に機能的に連結された少なくとも1つのコーディング核酸配列である）
の配列モジュールを5’から3’方向に含む、発現カセット。
【請求項９】
Gが、以下：
a.  タンパク質構成アミノ酸および非タンパク質構成アミノ酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
b.  ヌクレオチドおよびヌクレオシドの生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
c.  有機酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
d.  脂質および脂肪酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
e.  ジオールの生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
f.  炭水化物の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
g.  芳香族化合物の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
h.  ビタミンの生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
i.  補因子の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
j.  酵素の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；および
k.  中央代謝のタンパク質をコードする核酸、
から選択される、請求項８に記載の発現カセット。
【請求項１０】
前記核酸が、以下：
アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンテターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、転写調節因子LuxR、転写調節因子LysR1、転写調節因子LysR2、リンゴ酸キノンオキシドレダクターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、ホモセリン-O-アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニン-γ-シンターゼ、シスタチオニン-β-リアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、ホスホセリンホスファターゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニン輸送担体、トレオニンデヒドラターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、リシンエクスポーター、ビオチンリガーゼ、システインシンターゼI、システインシンターゼII、補酵素B12依存性メチオニンシンターゼ、補酵素B12非依存性メチオニンシンターゼ活性、スルフェートアデニリルトランスフェラーゼサブユニット1および2、ホスホアデノシンホスホ硫酸レダクターゼ、フェレドキシン亜硫酸レダクターゼ、フェレドキシンNADPレダクターゼ、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、RXA00655調節因子、RXN2910調節因子、アルギニルtRNAシンテターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、トレオニン排出タンパク質（threonine efflux protein）、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ、硫酸還元タンパク質RXA077、硫酸還元タンパク質RXA248、硫酸還元タンパク質RXA247、OpcAタンパク質、1-ホスホフルクトキナーゼ、6-ホスホフルクトキナーゼ、テトラヒドロピコリン酸スクシニラーゼ、スクシニルアミノケトピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、スクシニルジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、およびリンゴ酸酵素、
から選択される、アミノ酸生合成経路のタンパク質をコードする、請求項９のa.に記載の発現カセット。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか1項に記載の発現カセットの少なくとも1つを含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターの少なくとも1つで形質転換されているか、または請求項８〜１０のいずれか1項に記載の発現カセットを少なくとも1つ含む、遺伝子改変微生物。
【請求項１３】
コリネフォルム細菌に由来する、請求項１２に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１４】
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の細菌に由来する、請求項１３に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１５】
統合型発現カセットを少なくとも1つ含む、請求項１２〜１４のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物を培養すること、および該培養物から所望の産物を単離することを含んでなる、生合成産物の調製方法。
【請求項１７】
前記生合成産物が、有機酸、タンパク質、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、タンパク質構成アミノ酸および非タンパク質構成アミノ酸の両方、脂質および脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミンおよび補因子、酵素およびタンパク質のなかから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
産物の生合成を調節するための、請求項１〜７のいずれか1項に記載の発現ユニットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多重プロモーター、および多重プロモーターを含む発現ユニット；遺伝子の転写および発現を調節するための多重プロモーターの使用；この種類の多重プロモーターまたは発現ユニットを含む発現カセット；このような発現カセットを含むベクター；この種類のベクターおよび/または発現ユニットを含む遺伝子改変微生物；ならびに該遺伝子改変微生物を培養することによる生合成産物の調製方法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞において、天然の代謝プロセスを経て様々な生合成産物が生産され、多くの産業分野、例えば食品産業、飼料産業、化粧品産業、飼料、食品および製薬産業において使用されている。これらの物質は、略式でファインケミカル/タンパク質と呼ばれ、特に、有機酸、タンパク質構成アミノ酸および非タンパク質構成アミノ酸の両方、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、脂質および脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミンおよび補因子が含まれ、タンパク質および酵素も含まれる。これらはいずれも、所望の物質を大量に生産および分泌させるために開発された細菌の菌株または他の微生物を増殖させることによって、最も都合よく大量生産される。この目的に特に好適な生物は、コリネフォルム細菌、グラム陽性の非病原性細菌である。
【０００３】
コリネフォルム細菌、特にコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)の菌株の発酵により、アミノ酸を製造できることが知られている。この製法は非常に重要であるため、該生産方法の改良について継続的な研究が行われている。製法の改良は、発酵技術の手段（例えば、攪拌および酸素供給）、または栄養培地の組成（例えば、発酵中の糖濃度）、または生産物を取得するための精密検査（例えば、イオン交換クロマトグラフィーもしくはスプレードライ）、または微生物自体の固有の性能特性に関連し得る。
【０００４】
同様に、数年にわたって組換えDNA技術を用いて、個々の遺伝子を増幅し、これらがファインケミカル/タンパク質の生産に与える影響を研究することにより、コリネバクテリウム菌株のファインケミカル/タンパク質産生を改良している。
【０００５】
ファインケミカルまたはタンパク質の製造方法を発展させ、あるいはファインケミカルまたはタンパク質の既存の製造方法の生産性を増大しまたは改良する他の方法は、1つ以上の遺伝子の発現を増大または変更させること、および/または好適なポリヌクレオチド配列によりmRNAの翻訳に影響を及ぼすことを含んでなる。本発明において、影響を及ぼすこととは、遺伝子発現の増大、減少、または他のパラメーター、例えば時間に関連した発現パターンを含み得る。
【０００６】
様々な細菌の調節因子配列の構成成分が当業者に公知である。調節因子の結合部位（オペレーターとしても知られる）、RNAポリメラーゼホロ酵素の結合部位（-35領域および-10領域としても知られる）、およびリボソーム16S-RNAの結合部位（リボソーム結合部位(RBS)またはシャイン-ダルガーノ配列としても知られる）は、区別される。
【０００７】
文献(E.coli and S. typhimurium, Neidhardt F.C. 1995 ASM Press)においては、シャイン・ダルガーノ配列のポリヌクレオチド配列およびその塩基配列の構成、またシャイン・ダルガーノ配列に含まれるポリヌクレオチド配列の、開始コドンに対する距離も、翻訳開始速度に実質的に影響を及ぼすと報告されている。
【０００８】
プロモーター活性を有する核酸配列は、mRNAの形成に様々な様式で影響を及ぼし得る。活性が生物の生理学的な増殖期とは無関係なプロモーターを、構成的プロモーターと呼ぶ。他のプロモーターは、酸素、代謝産物、熱、pH等の外部の化学的刺激および物理的刺激に応答する。他のプロモーターの活性は、異なる増殖期に依存性を示す。微生物の指数増殖期、またはちょうど微生物の増殖静止期の間に特に顕著な活性を示すプロモーターの例が、文献に記載されている。これら両方のプロモーターの特性は、代謝経路に応じて、ファインケミカルおよびタンパク質製造の生産性に有益な影響を及ぼし得る。
【０００９】
遺伝子発現を増大または減少させるために利用し得るこれらのヌクレオチド配列は、コリネバクテリウム種で既に単離されている。これらの調節プロモーターは、細胞の内部および/または外部の条件に応じて遺伝子が転写される速度を増大または減少させ得る。誘導因子として知られる特定の因子の存在が、プロモーターによる転写速度を刺激し得る場合がある。誘導因子は、プロモーターによる転写に直接的または間接的に影響を及ぼし得る。抑制因子として知られる別の種類の因子は、プロモーターによる転写を減少、または阻害することができる。誘導因子と同様に、抑制因子もまた直接的または間接的に作用することができる。しかし、熱調節されるプロモーターも知られており、細胞の正常な増殖温度以上の増殖温度の上昇は、このようなプロモーターの転写レベルを増大、または減少させ得る。
【００１０】
現在までに、コリネバクテリウム・グルタミクムに由来するプロモーターが少数報告されている。コリネバクテリウム・グルタミクムのリンゴ酸シンターゼ遺伝子のプロモーターは、DE-A-44 40 118において報告された。このプロモーターは、タンパク質をコードする構造遺伝子の上流に配置されていた。この構築物を用いてコリネフォルム細菌を形質転換すると、このプロモーターの下流の構造遺伝子の発現は調節される。構造遺伝子の発現は、対応する誘導因子が培地に添加されるとすぐに誘導される。
【００１１】
Reinscheidら, Microbiology 145:503 (1999)は、コリネバクテリウム・グルタミクムに由来するpta-ackプロモーターとレポーター遺伝子(クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ)との間の転写融合について報告している。このような転写融合を含むコリネバクテリウム・グルタミクム細胞は、アセテート含有培地上で増殖させたとき、レポーター遺伝子の発現の増大を示した。これに対して、グルコース上で増殖させた形質転換細胞は、該レポーター遺伝子の発現の増大を示さなかった。
【００１２】
Patekら, Microbiology 142:1297 (1996)は、コリネバクテリウム・グルタミクム細胞中でレポーター遺伝子の発現を増大させることができる幾つかのコリネバクテリウム・グルタミクムDNA配列について報告している。コリネバクテリウム・グルタミクムのプロモーターのコンセンサス配列を明確にするため、これらの配列を互いに比較した。
【００１３】
遺伝子発現の調節に利用し得る他のコリネバクテリウム・グルタミクムDNA配列は、WO 02/40679に報告されている。これらの単離されたポリヌクレオチドは、遺伝子発現の増大または減少のいずれにも利用し得る、コリネバクテリウム・グルタミクムに由来する発現ユニットである。この刊行物にはさらに、コリネバクテリウム・グルタミクムに由来する上記の発現ユニットが異種遺伝子と結合している組換えプラスミドが報告されている。ここに報告されている、コリネバクテリウム・グルタミクムのプロモーターを異種遺伝子と融合させる方法は、とりわけ、アミノ酸生合成遺伝子を調節するために用いることができる。
【００１４】
さらに古い、公開されていない特許出願DE-A-103 59 594、DE-A-103 59 595、DE-A-103 59 660およびDE-A-10 2004 035 065には、コリネバクテリウム・グルタミクムに由来する特有のシングルプロモーターが開示されている。
【特許文献１】DE-A-44 40 118
【特許文献２】WO 02/40679
【特許文献３】DE-A-103 59 594
【特許文献４】DE-A-103 59 595
【特許文献５】DE-A-103 59 660
【特許文献６】DE-A-10 2004 035 065
【非特許文献１】E.coli and S. typhimurium, Neidhardt F.C. 1995 ASM Press
【非特許文献２】Reinscheidら, Microbiology 145:503 (1999)
【非特許文献３】Patekら, Microbiology 142:1297 (1996)
【非特許文献４】Proteomics in Practice - A Laboratory Manual of Proteome Analysis (著者：R. Westermeier, T. Naven;発行者: Wiley-VCH Verlag GmbH, 2002)
【非特許文献５】Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1
【非特許文献６】Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.著、Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 9.31-9.57頁
【非特許文献７】Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
本発明は、さらなる調節核酸配列、特にプロモーター構築物ならびに/または有利な特性、例えば、元のプロモーターと比較して増大もしくは変化した転写活性および/もしくは翻訳活性を有する発現ユニットを提供する目的に基づくものであった。
【００１６】
上記の目的は、以下の式I:
5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3'    (I)
（式中、
nは0〜10の整数であり、
AxおよびAyは、同一または異なり、かつ化学結合またはリンカーの核酸配列であり；
P1、PxおよびPyは、少なくとも1つのRNAポリメラーゼ結合領域、例えばコア領域を含む、同一のまたは異なるプロモーター配列をコードし；かつ、少なくともPyは、リボソーム結合媒介性3'末端配列部分を含み；P1および個々のまたは全てのPxは、互いに独立して、リボソーム結合を媒介する種類の配列部分を有していてもよい）
の配列モジュールを5’から3’方向に含む、多重プロモーター含有型発現ユニットを提供することにより、本発明によって達成された。
【００１７】
1つの実施形態によれば、P1、PxおよびPyは、同一のまたは異なる、真核生物もしくは特に原核生物に由来する。人工プロモーターも使用することができる。
【００１８】
好ましい実施形態によれば、P1、PxおよびPyはそれぞれ、前記生物のゲノム中のタンパク質、例えば、該生物の生合成経路に関与するタンパク質のコーディング配列の5'上流に位置する、35〜500ヌクレオチド残基、好ましくは35〜300ヌクレオチド残基、さらに好ましくは35〜210ヌクレオチド残基、そして極めて特に好ましくは35〜100ヌクレオチド残基の連続配列に由来する。
【００１９】
別の実施形態によれば、前記発現ユニットのP1、PxおよびPyは、コリネフォルム細菌に由来する。
【００２０】
好ましい実施形態によれば、発現ユニットのP1、PxおよびPyは、互いに独立して、真核生物または原核生物、特に、例えばコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の1種、例えば表3のリストの種または菌株のようなコリネフォルム細菌中に多量に存在するタンパク質のコーディング配列用のプロモーター配列から選択される。
【００２１】
さらに、個々のまたは全てのこれらプロモーター配列は、表1にリストされている、生物のアミノ酸生合成に関与するタンパク質のコーディング配列用のプロモーター配列から選択することができる。しかしながら、本発明による発現ユニットのプロモーターの少なくとも1つは、本明細書において定義されるように多量でなければならない。
【００２２】
別の好ましい実施形態によれば、発現ユニットのP1、PxおよびPyは、互いに独立して、図１に示され、または後でさらに詳しく説明するヌクレオチド配列から選択され、これらは、配列番号1(pGRO)、配列番号2(pEFTs)、配列番号3(pEFTu)および配列番号4(pSOD)に由来する。
【００２３】
別の実施形態によれば、発現ユニットのP1、PxおよびPyは、互いに独立して、強力な、構成的プロモーターまたは調節可能プロモーターから選択される。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、以下の式II:
5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-G-3'    (II)
（式中、
n、Ax、Ay、P1、PxおよびPyは、上記に定義されるとおりであり、かつ
Gは、5'上流の調節配列に機能的にまたは操作可能に連結された少なくとも1つのコーディング核酸配列である）
の配列モジュールを5’から3’方向に含む、発現カセットに関する。
【００２５】
発現カセットの好ましい実施形態によれば、Gは、以下： 
a)  タンパク質構成アミノ酸および非タンパク質構成アミノ酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
b)  ヌクレオチドおよびヌクレオシドの生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
c)  有機酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
d)  脂質および脂肪酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
e)  ジオールの生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
f)  炭水化物の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
g)  芳香族化合物の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
h)  ビタミンの生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
i)  補因子の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
j)  酵素の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；および
k)  中央代謝のタンパク質をコードする核酸、
から選択される。
【００２６】
発現カセットの特に好ましい実施形態によれば、Gは、以下：
アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンテターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、転写調節因子LuxR、転写調節因子LysR1、転写調節因子LysR2、リンゴ酸キノンオキシドレダクターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、ホモセリン-O-アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニン-γ-シンターゼ、シスタチオニン-β-リアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、ホスホセリンホスファターゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニン輸送担体、トレオニンデヒドラターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、リシンエクスポーター、ビオチンリガーゼ、システインシンターゼI、システインシンターゼII、補酵素B12依存性メチオニンシンターゼ、補酵素B12非依存性メチオニンシンターゼ活性、スルフェートアデニリルトランスフェラーゼサブユニット1および2、ホスホアデノシンホスホ硫酸レダクターゼ、フェレドキシン亜硫酸レダクターゼ、フェレドキシンNADPレダクターゼ、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、RXA00655調節因子, RXN2910調節因子、アルギニルtRNAシンテターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、トレオニン排出タンパク質（threonine efflux protein）、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ、硫酸還元タンパク質RXA077、硫酸還元タンパク質RXA248、硫酸還元タンパク質RXA247、OpcAタンパク質、1-ホスホフルクトキナーゼおよび6-ホスホフルクトキナーゼ、テトラヒドロピコリン酸スクシニラーゼ、スクシニルアミノケトピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、スクシニルジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、およびリンゴ酸酵素、から選択されるアミノ酸生合成経路のタンパク質をコードする核酸から選択される。
【００２７】
他の態様において、本発明は、上記の発現カセットを少なくとも1つ含むベクターに関する。
【００２８】
さらに別の態様によれば、本発明は、上記のベクターの少なくとも1つを用いて形質転換されているか、または、好ましくは統合型の上記発現カセットを少なくとも1つ含む、遺伝子改変微生物に関する。
【００２９】
1つの実施形態によれば、遺伝子改変微生物は、コリネフォルム細菌に由来する。
【００３０】
好ましい実施形態によれば、遺伝子改変微生物は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の細菌に由来する。
【００３１】
他の態様によれば、本発明は、上記の遺伝子改変微生物のいずれかを培養すること、および該培養物から所望の生成物を単離することを含んでなる、生合成産物の調製方法に関する。
【００３２】
前記方法の1つの実施形態によれば、生合成産物は、有機酸、タンパク質、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、タンパク質構成アミノ酸および非タンパク質構成アミノ酸の両方、脂質および脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミンおよび補因子、酵素およびタンパク質から選択される。極めて特に好ましくは、生合成産物は、リジン、メチオニン、トレオニンおよびトレハロースである。
【００３３】
他の態様によれば、本発明は、産物の生合成を調節するための本発明の発現ユニットの使用に関する。
【００３４】
発明の詳細な説明
I.  一般的定義：
本発明において、「生合成産物」とは、細胞において天然の代謝過程(生合成経路)を経て生産されるものを意味する。これらは多くの異なる方法、特に食品産業、飼料産業、化粧品産業、飼料、食品および製薬産業において使用される。これらの物質は、略式で、ファインケミカル/タンパク質と呼ばれ、特に、有機酸、タンパク質構成アミノ酸および非タンパク質構成アミノ酸の両方、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、脂質および脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミンおよび補因子が含まれ、さらにタンパク質や酵素も含まれる。
【００３５】
本発明において、「プロモーター」、「プロモーター活性を有する核酸」または「プロモーター配列」とは、転写される核酸に機能的に連結され、該核酸の転写を調節する核酸を意味する。
【００３６】
本発明において、「プロモーター」という用語は、「シングルプロモーター」と明示する場合を除き、文脈に応じて、1つ以上の核酸配列(すなわち、「多重プロモーター」)の連続的な配置を含み、各核酸配列は、転写される核酸配列に機能的に連結されている場合、該核酸配列の転写を調節することができる。
【００３７】
従って、「シングルプロモーター」という用語は、転写される核酸の転写を調節することができ、転写される核酸に機能的に連結されている場合、該核酸を転写することができる単一の核酸配列を指す。
【００３８】
「多重プロモーター」とは、少なくとも2つの、同一のまたは異なる核酸配列を指し、各々は、転写される核酸に機能的に連結されている場合、該核酸の転写を調節することができ(シングルプロモーター)、上記核酸配列の任意の1つの核酸配列による転写開始により、転写される上記核酸を含む転写産物を産生することができるような方法で連続的に連結されている。本発明において、プロモーター機能を有さない他の配列、例えば、1つ以上の制限切断部位を有するリンカーはいずれも、2つのシングルプロモーターの間に挿入することができる。場合により、各事例において、2つのシングルプロモーターを直接互いに連結させてもよい。好ましくは、前記多重プロモーターは、特にプロモーターの3'末端領域に、1つのリボソーム結合部位(RBS)のみを含む。
【００３９】
「多量」に存在するタンパク質のコーディング配列用のプロモーター配列とは、特定の「強力プロモーター」を意味する。遺伝子発現量を増大させるために多重プロモーターを利用することを意図する場合、このような強力なプロモーターを適した方法で組み合わせることが好ましい。強力プロモーターは、生物の大部分の遺伝子よりも上記のコーディング配列の方がRNAポリメラーゼによって頻繁に読み取られるように遺伝子の転写を調節する。多くの場合、強力プロモーターの存在により、細胞中に大量の転写産物を生じる。該転写産物のパーセンテージが、他の細胞転写産物と比較して高い場合、これを「多量の転写産物」と呼ぶ。細菌では、転写産物の量とこれによりコードされる対応タンパク質の量とは、通常相関している。すなわち、「多量の転写産物」は大抵の場合、「多量のタンパク質」を生じる。例として、多量のタンパク質により「強力プロモーター」を同定する方法を以下に記載する。この方法手順の詳細およびさらなる参考文献は、例えば、Proteomics in Practice - A Laboratory Manual of Proteome Analysis (著者：R. Westermeier, T. Naven;発行者: Wiley-VCH Verlag GmbH, 2002)に記載されている。細菌細胞を粉砕し、2次元ゲル電気泳動により細胞抽出物のタンパク質を分画する。その後、このタンパク質を、慣用の方法、例えば、クマシー（Coomassie）染色、銀染色または蛍光色素染色を用いて染色する。ここでは、個々のタンパク質スポットを後で定量できるようにするため、タンパク質の過剰染色は避けるべきである。その後、ゲルをスキャンし、好適なソフトウェア(例えば、Melanie, Amersham Biosciences)を用いて得られた画像を解析する。この目的のため、最初に、検出可能なスポットを全て同定し、スポット量を測定する。全てのスポット量の合計は、最初の概算で全タンパク質量に相当する。その後、特に大きなスポット量を、画像解析ソフトを用いて選択することができる。例えば、全スポット量の0.1％以上を占める量のスポットは、多量と言える。続いて、特に多量のタンパク質を含むスポットをゲルから切り出す。通常、ゲル切片に含まれるタンパク質は、その後タンパク質分解により消化され(例えば、トリプシンを用いて)、得られたペプチドのモル質量を、例えばMALDI-ToF MS(マトリクス支援レーザー脱離イオン飛行時間型質量分析法)を用いて測定する。その後、該タンパク質の幾つかのトリプシンペプチドのモル質量に基づいて、対応タンパク質をデータベース検索で同定することができる。これは特に、コリネバクテリウム・グルタミクム、大腸菌および多くの他の細菌のように、研究対象の生物のゲノムが配列決定されている場合に可能である。前記タンパク質をコードするORF(オープン・リーディング・フレーム)は、その後、該タンパク質の同一性に基づいて決定することができる。細菌では、上記遺伝子を調節するプロモーターは、通常、開始コドンのすぐ上流に位置している。したがって、「強力」プロモーターが、「多量」タンパク質の開始コドンの約200ヌクレオチド上流の領域にも存在している場合が多い。
【００４０】
本発明において、「人工」プロモーターは特に、in situでは転写活性を有しておらず、別の配列コンテキスト、例えば、特に、本発明の発現ユニットまたは発現カセットの下では転写活性がある配列を含む。
【００４１】
本発明において、「プロモーター活性」とは、特定の時間内にプロモーターにより形成されるRNAの量、すなわち転写速度を意味する。
【００４２】
本発明において、「特異的」プロモーター活性とは、各プロモーターについて、特定の時間内に、プロモーターにより形成されるRNAの量を意味する。
【００４３】
ある遺伝子について、野生型と比較して、「もたらされた」プロモーター活性、または「もたらされた」転写速度とは、野生型と比較して、野生型ではこの形で存在しないRNAの形成を生じる。
【００４４】
ある遺伝子について、野生型と比較して、「変更された」プロモーター活性、または「変更された」転写速度とは、野生型と比較して、特定の時間内に形成されるRNAの量が変化する。
【００４５】
本発明との関連において、「変更された」とは、好ましくは増大または減少を意味する。
【００４６】
本発明との関連において、「機能的な」または「操作可能な」連結とは、例えば、本発明によるプロモーター活性を有する核酸と転写される核酸、適切な場合、さらに例えば、核酸の転写を確実にする核酸配列である他の調節エレメント、およびターミネーターからなる連続的な配置であって、それによって各調節エレメントが、核酸配列の転写においてその機能を果たすことができる、上記配置を意味する。これは、必ずしも化学的な意味での直接結合を要するものではない。例えば、エンハンサー配列のような遺伝子制御配列は、さらに離れた位置からでも、あるいは他のDNA分子からであっても標的配列に対してその機能を果たすことができる。転写される核酸配列を含む配列は、本発明のプロモーター配列の後ろ（すなわち、3'末端）に位置していることが好ましく、これによって上記の2つの配列は、互いに共有結合する。ここで、プロモーター配列とトランスジェニック発現させる核酸配列との間の距離は、好ましくは、200塩基対未満、特に好ましくは100塩基対未満、極めて特に好ましくは50塩基対未満である。
【００４７】
本発明において、「リボソーム結合部位(RBS)」(またはシャイン・ダルガーノ配列と呼ばれる)の配列は、翻訳開始コドンから30塩基上流の範囲までに位置するA/Gリッチなポリヌクレオチド配列を意味する。
【００４８】
本発明において、「転写」とは、DNAテンプレートから、相補的なRNA分子を産生する過程を意味する。この過程には、RNAポリメラーゼ、「σ因子」および転写調節タンパク質などのタンパク質が関与する。合成されたRNAは、その後、翻訳過程においてテンプレートとして機能し、生合成的に活性なタンパク質を生じる。
【００４９】
本発明において、プロモーターの「コア領域」とは、少なくとも1つの潜在的「-10領域」を含む、約20〜80、あるいは30〜60ヌクレオチドの連続的な核酸配列を意味する。本明細書において、潜在的-10領域の例は、個々の好適なプロモーター配列について記載されており、特に図1において対比される。「-10領域」は、TATAボックスまたはプリブナウ-シャーラー（Pribnow-Schaller)配列とも呼ばれる。使用する各プロモーターは、これらの潜在的-10領域を少なくとも1つ、例えば1つ、2つ、3つ、4つまたは5つ含んでいなければならない。コア領域は、RBSの5'上流に位置し、RBSから1〜200または10〜150または20〜100ヌクレオチド残基だけ離れていてもよい。
【００５０】
本発明において、「発現ユニット」とは、本明細書において定義される多重プロモーターを含み、かつ発現される核酸すなわち遺伝子に機能的に連結された後、該核酸すなわち遺伝子の発現、つまり転写および翻訳を調節する、発現活性を有する核酸を意味する。したがって、本発明との関連において、該核酸配列は、「調節核酸配列」とも呼ばれる。多重プロモーター構築物に加えて、例えば、エンハンサーのような他の調節エレメントも含み得る。
【００５１】
本発明において、「発現カセット」とは、発現される核酸すなわち発現される遺伝子に機能的に連結された発現ユニットを意味する。発現ユニットとは対照的に、発現カセットは、転写および翻訳を調節する核酸配列のみならず、転写および翻訳の結果、タンパク質として発現される核酸配列をも含む。
【００５２】
本発明において、「発現活性」とは、特定の時間内に発現カセットまたはその発現ユニットにより形成されるタンパク質の量、すなわち発現速度を意味する。
【００５３】
本発明において、「特異的発現活性」とは、特定の時間内に、各発現ユニットについて、発現カセットまたはその発現ユニットにより形成されるタンパク質の量を意味する。
【００５４】
ある遺伝子について、野生型と比較して、「もたらされた発現活性」、または、発現速度については、野生型と比較して、野生型においてはこの形で存在しないタンパク質の形成が生じる。
【００５５】
ある遺伝子について、野生型と比較して、「変更された」発現活性、または、発現速度については、野生型と比較して、特定の時間内に形成されるタンパク質の量が変化する。本発明との関連において、「変更された」とは、好ましくは増大または減少を意味する。これは、内因性発現ユニットの特異的活性を、例えば変異させることにより、または刺激もしくは阻害することにより増大または減少させることによって生じ得る。発現活性、すなわち発現速度は、例えば、発現ユニットに関してその遺伝子が異種である本発明の発現ユニットによって微生物中の遺伝子の発現を調節することにより、変更することができる。
【００５６】
生合成的に活性なタンパク質が産生される「形成速度」は、転写および翻訳の速度の積である。本発明において、その両方の速度は共に影響を受ける可能性があり、そのため微生物中の生成物/ファインケミカルの形成速度に影響を与える。
【００５７】
本発明において、「野生型」という用語は、適切な出発微生物を意味するが、必ずしも天然の生物に相当するものではない。
【００５８】
文脈に応じて、「微生物」という用語は、出発微生物（野生型）もしくは本発明の遺伝子改変微生物またはその両方を意味し得る。
【００５９】
好ましくは、特に微生物すなわち野生型を明確に指定することができない場合、プロモーター活性すなわち転写速度を変更、または生じさせるための「野生型」、発現活性すなわち発現速度を変更、または生じさせるための「野生型」、また生合成産物量を増大させるための「野生型」は、各場合において、「参照生物」を意味する。好ましい実施形態において、この「参照生物」は、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC 13032、または特異的変異または非特異的変異によりATCC 13032から派生した微生物である。
【００６０】
特に、所望の生成物(ファインケミカル/タンパク質)を既に産生することができる「出発微生物」が利用される。
【００６１】
本発明において、「誘導された」配列、例えば、誘導されたプロモーター配列は、他の情報が与えられていない場合、出発配列との同一性が、少なくとも80％または少なくとも90％、特に91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％および99％の配列を意味する。
【００６２】
各場合において、2つの核酸の間の「同一性」は、核酸の全長にわたるヌクレオチドの同一性を意味し、特に、Informax (USA)製のVector NTI Suite 7.1ソフトウェアを用いて、Clustal法(Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1)を適用し、以下のパラメーター：
多重アラインメントパラメーター：
ギャップオープニングペナルティー            10
ギャップエクステンションペナルティー        10
ギャップセパレーションペナルティー範囲      8
ギャップセパレーションペナルティー          off
アラインメント・ディレイについての％同一性  40
残基特異的ギャップ                          off
親水性残基ギャップ                          off
転移計量                                    0
ペアワイズアラインメントパラメーター：
FASTアルゴリズム                            on
K-タプルサイズ                              1
ギャップペナルティー                        3
ウィンドウサイズ                            5
最適ダイアゴナル数                          5
を設定して、比較により計算される同一性を意味する。
【００６３】
「ハイブリダイズする」とは、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、ストリンジェントな条件下で実質的に相補的な配列に結合する能力を意味し、この条件下では非相補的パートナー間の非特異的結合は形成されない。これに関連して、配列同士は、90〜100％相補的であることが好ましい。互いに特異的に結合することができる相補配列の特性は、例えば、ノーザンブロッティングもしくはサザンブロッティング技術において、またはPCRもしくはRT-PCRのプライマー結合にも利用される。
【００６４】
本発明において、「ハイブリダイゼーション」は、ストリンジェントな条件下で起こる。この種のハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.著の、Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 9.31-9.57頁、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に報告されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、特に：
50％ホルムアミド、5 × SSC(750 mM NaCl、75 mMクエン酸三ナトリウム)、50 mMリン酸ナトリウム(pH 7.6)、5 × デンハルト溶液、10％硫酸デキストランおよび20 g/mlの変性させた、せん断サケ精子DNAを含む溶液中で、42℃において一晩インキュベーションし、その後、0.1 × SSCを用いて、65℃においてフィルターを洗浄することを意味する。
【００６５】
「機能的に同等の断片」とは、出発配列と比較して、同一のまたは変更された、低特異的または高特異的プロモーター活性を本質的に有するプロモーター活性断片を含む核酸配列を意味する。
【００６６】
「本質的に同一」とは、出発配列の特異的プロモーター活性を、少なくとも50％、例えば、少なくとも60％、70％、80％、90％、または少なくとも95％有する特異的プロモーター活性を意味する。
【００６７】
II.  発現ユニット、発現カセットおよびそれらの構成要素
a)発現ユニット
本発明は、特に、以下の式I:
5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3'
（式中、
nは、0〜10の整数（例えば、1、2、3、4、5または6）であり；
AxおよびAyは、同一または異なり、かつ化学的結合（特に共有結合）であり、あるいは化学的に（特に共有結合的に）組み込まれたリンカーの核酸配列であり；
P1、PxおよびPyは、少なくとも1つのRNAポリメラーゼ結合領域（例えばコア領域）を含む、同一のまたは異なるプロモーター配列をコードし；かつ少なくともPy（例えば、Pyのみ）が、リボソーム結合媒介性3'末端配列部分を含む）
の配列モジュールを5’から3’方向に含む、多重プロモーター含有型発現ユニットの提供に関する。
【００６８】
プロモーター配列P1、PxおよびPyは、生物に由来する遺伝子であって、該生物の生合成経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子に由来する。このプロモーター配列は、該生物のゲノム中の、特定のタンパク質のコーディング配列から、20〜500ヌクレオチド残基、または20〜300ヌクレオチド残基、例えば20〜210ヌクレオチド残基、および特に20〜100または35〜100ヌクレオチド残基分、5'上流に位置する。
【００６９】
プロモーター配列P1、PxおよびPyが由来し得る配列の例は、以下の表1に挙げられる遺伝子である。
【００７０】
特有のプロモーター配列の非限定的な例としては、配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4、ならびに図1に記載される核酸配列に由来する配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７１】
本発明に関して、配列番号1は、GroESシャペロニンのコーディング領域の上流に位置する配列に相当し(pGRO)、配列番号2は、タンパク質伸長因子TSのコーディング領域の上流に位置する配列に相当し(pEFTs）、配列番号3は、タンパク質伸長因子TUのコーディング領域の上流に位置する配列に相当し(pEFTu)、配列番号4は、スーパーオキシド・ディスミュターゼのコーディング領域の上流に位置する配列に相当し(pSOD)、いずれの配列もコリネバクテリウム・グルタミクムに由来する。配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4は、野生型のプロモーター配列に相当する。
【００７２】
本発明において、「由来する」配列とは、少なくとも80％または少なくとも90％、例えば91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、および特に99％、出発配列と同一の配列を意味する。この同一性の程度は特に、上記に定義される特定のプロモーターの「コア領域」に対して適用される。ここで、特定のコア領域の外側の同一性の程度は、さらに低くてもよく、0〜80％、例えば、10〜80％、20〜70％、30〜60％または40〜50％の範囲であってよい。
【００７３】
利用可能なコア領域は、例えば、
pGROについては、配列番号1の50位〜80位の範囲；
pEFTsについては、配列番号2の130位〜170位の範囲；
pEFTuについては、配列番号3の30位〜110位の範囲；
pSODについては、配列番号4の50位〜100位の範囲、
に位置する。
【００７４】
本発明の発現ユニットは特に、
プロモーター活性を有する核酸配列を2つ以上含み、
a)  好ましくは、配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4のなかから選択される同一のまたは異なる配列に由来し；または他の、同程度もしくはより多い存在量の遺伝子のプロモーター配列に由来し；
b)  適切な場合、ヌクレオチドの置換、挿入、逆位、欠失または付加により誘導される配列を表す1つ以上の上記配列を有し、この配列は、特にコア領域において、好ましくは配列番号1、2、3もしくは4または他の、同程度もしくはより多い存在量の遺伝子のプロモーター配列から選択される配列に対して核酸レベルで少なくとも80％同一であり、
c)  あるいは、適切な場合、ストリンジェントな条件下で配列番号1、2、3もしくは4の核酸配列の1つに対しておよび/または他の、同程度もしくはより多い存在量の遺伝子のプロモーター配列に相補な配列に対してハイブリダイズすることを示すこれらの核酸配列を1つ以上有し、
d)  あるいは、適切な場合、a)、b)またはc)の配列の「機能的に同等の断片」であることを示すこれらの核酸配列を1つ以上有する。
【００７５】
本発明の多重プロモーターの構成要素として使用可能な他の天然プロモーターは、例えばゲノム配列が知られている種々の生物から容易に同定することができ、これは、データベースからの核酸配列と、上記配列番号1、2、3もしくは4の配列または図1に記載の配列または他の同程度もしくはより多い存在量の遺伝子のプロモーター配列との同一性を比較することにより行う。
【００７６】
さらに、適当な天然プロモーターは、ゲノム配列の知られていない種々の生物から容易に同定することができ、これは、上記核酸配列、特に配列番号1、2、3もしくは4および／または同程度もしくはより多い存在量の遺伝子のプロモーター配列から出発して、それ自体知られた方法でハイブリダイゼーション技術を利用することにより行う。
【００７７】
さらに適当な天然プロモーターはまた、当業者に知られた方法、例えば、Cadenasら(1991) Gene 98, 117-121; Eikmannsら, (1991) Gene 102, 93-98.; Patekら(1996) Microbiology 142, 1297-1309またはSantamariaら(1987) Gene 56, 199-208に記載の方法により単離することができる。これは通常、対象のゲノム由来のゲノム断片を挿入した「プロモータープローブ」ベクターを使用することに関する。次に、個々の断片のプロモーター活性を、下流レポーター遺伝子、例えばクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼの活性を測定することにより、記載された実験方法により決定することができる。
【００７８】
したがって本発明はまた、本明細書において名称としてリストされていないプロモーターの組み合わせをも包含する。このことは、例えば、Patekら(2003). J of Biotechnology 104, 311-323; Vasicovaら (1999) J. Bacteriol 181, 6188-6191に記載のような既知のシングルプロモーターの組み合わせにも当てはまる。
【００７９】
したがって本発明はまた、本発明の多重プロモーター含有型発現ユニットに組込むためのプロモーター活性を有する核酸に関し、前記プロモーター活性を有する核酸は、配列番号1、2、3もしくは4の核酸配列または同程度もしくはより多い存在量の遺伝子のプロモーター配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む。この核酸配列は、少なくとも10、好ましくは12、15、30、50より多く、または150より多くのヌクレオチドを含む。
【００８０】
本発明の多重プロモーター含有型発現ユニットに組込むための人工プロモーター配列は、配列番号1、2、3もしくは4または図1の配列および/または同程度もしくはより多い存在量の遺伝子のプロモーター配列から出発して、人工的変更および突然変異により、例えば1つ以上の、個別のもしくは連続したヌクレオチド残基の付加、置換、挿入、反転もしくは欠失(Patekら(2003). J of Biotechnology 104, 311-323; Vasicovaら (1999) J. bacteriol 181, 6188-6191およびそこに記載されている文献)により容易に作製することができる。
【００８１】
プロモーター配列 Pyのリボソーム結合媒介性3’末端配列部分の適当な例は、pGROのRBS: GGAGGGA; pEFTsのRBS : AGGAGGA; pEFTuのRBS: AGGAGGA; およびpSODのRBS: GGAGGGA (添付の図1も参照のこと)である。理論的に最適なRBS、すなわちコリネバクテリウム・グルタミクム 16S rRNAのアンチ-シャイン・ダルガーノ配列に100％相補的である配列は: 5’GAAAGGAGG 3’である。他の適当なRBS配列部分は、例えば人工的変更および突然変異により、例えばヌクレオチドの置換、挿入、反転、付加もしくは欠失により、またはデータベース中のプロモーター配列との相同性比較により容易に同定することができる。
【００８２】
本発明の多重プロモーター含有型発現ユニットの非限定的例は次から選択される。すなわち：
e)  
PeftuPsod、配列番号45中の18位〜390位由来、
PsodPeftu、配列番号52中の18位〜395位由来、
PgroPsod、配列番号55中の18位〜369位由来、
PgroPsodPefts、配列番号59中の11位〜538位由来、
PeftuPsodPefts、配列番号60中の11位〜559位由来、
をコードする配列、または
f)  ヌクレオチドの置換、挿入、反転、付加もしくは欠失によりe)に記載の配列から誘導され、かつ前記出発配列と比較して核酸レベルで少なくとも80％もしくは少なくとも90％同一である配列、または
g)  ストリンジェントな条件下で、e)に相補的な配列とハイブリダイズする核酸配列、あるいは
h)  上記e)、f)およびg)の配列の「機能的等価断片」。
【００８３】
「機能的等価断片」は、特に実施形態d)およびh)において、発現ユニットについて、実質的に出発配列と同じまたはより高い特異的発現活性を有する断片を意味する。
【００８４】
「本質的に同一」とは、出発配列の特異的発現活性の少なくとも50％、好ましくは60％、より好ましくは70％、より好ましくは80％、より好ましくは90％、特に好ましくは95％の特異的発現活性を有するの特異的発現活性を意味する。
【００８５】
「断片」とは、実施形態 a)〜h)に記載の配列の部分配列を意味する。前記断片は、好ましくは出発配列の好ましくは10より多い、より好ましくは12、15、30、50より多い、または特に好ましくは150より多い連続ヌクレオチドを有する。
【００８６】
本発明の発現ユニットは好ましくは、次の遺伝的エレメント、すなわち-10領域、転写開始領域、エンハンサー領域、およびオペレーター領域の1つ以上を含みうる。
【００８７】
こうした遺伝的エレメントは好ましくはコリネバクテリアの種、特にコリネバクテリウム グルタミクムに特異的である。
【００８８】
細菌のプロモーターは通常、３つのRNAポリメラーゼ認識部位、すなわち-10領域、-35領域およびUPエレメントからなる。こうしたプロモーターエレメントは大腸菌において高度に保存されているが、コリネバクテリウム・グルタミクムでは保存されていない。これは特に-35領域について当てはまる。したがって、-35領域は、できるにしてもほとんど不確かな程度にしか該配列から誘導することができない。-10領域もまた、ATリッチなゲノムを有する生物におけるのと比較してさほど高度に保存されてはいない。本明細書において先に記載されたコンセンサス配列は、TGNGNTA(C/T)AATGGおよびGNTANAATNG (Patekら(2003), J. of Biotechnology 104, 311-323; Vasicovaら (1999) J. Bacteriol 181, 6188-6191)である。 
中程度または高いGC含量を有する細菌(例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム)のコンセンサス配列には、一般に高度の変動が生じることはよく知られている(Bourn and Babb, 1995., Bashyamら, 1996)。このことは特に-35領域に当てはまり、そのため-35領域は多くの場合予測することができない。このことは例えばPatekら(2003). J of Biotechnology 104, 325-334に記載されている。
【００８９】
b)発現カセット
本発明はさらに、翻訳可能な核酸配列に機能的に連結された本発明の多重プロモーター含有型発現ユニットに関する。遺伝子を発現することのできるこうした構築物を、本発明において、発現カセットとも言う。
【００９０】
これに関連して「機能的結合」とは、例えば本発明の任意の発現ユニットおよび組換え発現させる核酸配列、および適当であればターミネーターのようなさらなる調節エレメントの連続的配置であって、前記核酸配列の組換え発現においてそれぞれの前記調節エレメントが機能を果たしうるような前記連続的配置を意味する。このことは、化学的な意味での直接結合を必ずしも必要としない。エンハンサー配列のような遺伝子制御配列は、より離れた位置から、または他のDNA分子からさえも、標的配列に対してその機能を果たしうる。組換え発現させる核酸配列が本発明の発現ユニット配列の後(すなわちその3'末端)に配置され、そのことにより該２つの配列が互いに共有結合で連結される配置は好ましい。このとき、発現ユニット配列と組換え発現させる核酸配列との距離は、好ましくは200塩基対未満、特に好ましくは100塩基対未満、非常に好ましくは50塩基対未満である。
【００９１】
本発明の多重プロモーター含有型発現カセットは、元の発現活性と比較して異なる発現活性を達成し、そのことにより所望の遺伝子の発現を細かく調節することを可能にする。
【００９２】
本発明の発現ユニットによる、微生物の遺伝子の発現調節は、好ましくは次の方法により達成される。すなわち、
1つ以上の本発明の発現ユニット(適当であれば変更された特異的発現活性を有する)を微生物のゲノムに導入して、1つ以上の内在性遺伝子が、導入された本発明の発現ユニットの制御下で発現されるようにすること、または
本発明の発現ユニット(適当であれば変更された特異的発現活性を有する)および、機能的に連結された、1つ以上の発現すべき核酸、すなわち発現カセットを含む1つ以上の核酸構築物を微生物内に導入すること。
【００９３】
本発明の発現カセットについて、発現すべき遺伝子に対する該発現ユニットの物理的位置は、前記発現ユニットが発現すべき遺伝子の転写および好ましくは翻訳をも調節し、そのことにより1つ以上のタンパク質の形成を可能にするように選択される。ここでの「形成を可能にする」には、前記形成を構成的に増大させること、特定の条件下で前記形成を減衰または遮断すること、および／または特定の条件下で前記形成を増大させることが含まれる。ここでの「条件」には、(1)ある成分を培地に添加すること、(2)ある成分を培地から除去すること、(3) 培地中のある成分を第２の成分で置き換えること、(4) 培地の温度を上昇させること、(5) 培地の温度を低下させること、および(6) 培地を維持する大気の条件、例えば酸素濃度または窒素濃度を調節すること、が含まれる。
【００９４】
c)一般情報:
プロモーター活性を有するすべての上記核酸および発現ユニットおよび発現カセットは、さらに、ヌクレオチド構成単位からの化学合成により、例えば二重螺旋の個々のオーバーラップする相補的核酸構成単位の断片縮合によりそれ自体知られた方法で作製することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、既知の方法によりホスホアミダイト法を用いて行うことができる(Voet, Voet, 第2版, Wiley Press New York, pp. 896-897)。合成オリゴヌクレオチドの組立およびDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントによるギャップの穴埋めおよび連結反応ならびに一般的クローニング方法は、Sambrookら (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【００９５】
本発明に利用する方法および技術は、微生物学および組換えDNA技術に精通した当業者に知られている。かかる技術および方法の例は、細菌を増殖させること、単離DNA分子を宿主細胞内に輸送すること、ならびに単離核酸分子を単離、クローニング、および配列決定することなどのための方法および技術である。こうした方法は多くの標準的文献に記載されている。Davisら, Basic Methods In Molecular Biology (1986); J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1972); J.H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1992); M. Singer and P. Berg, Genes & Genomes, University Science Books, Mill Valley, California (1991); J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); P.B. Kaufmannら, Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Florida (1995); Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B.R. Glick and J.E. Thompson, 編者, CRC Press, Boca Raton, Florida (1993); およびP.F. Smith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, New York, NY (1989)。
【００９６】
本発明のあらゆる核酸分子は、好ましくは単離された核酸分子の形態である。「単離された」核酸分子は、前記核酸の天然の供給源中に存在する他の核酸分子から除かれ、また、さらに、組換え技術により調製されたならば実質的に他の細胞性材料または培地を含まず、あるいは化学合成されたならば化学的前駆体または他の化学物質を含まないものでありうる。
【００９７】
本発明はさらに、特に記載されたヌクレオチド配列またはその一部に相補的な核酸分子をさらに包含する。
【００９８】
本発明のヌクレオチド配列はまた、他の細胞型および微生物中の相同配列を同定および／またはクローニングするのに使用可能な、プローブおよびプライマーの作製を可能にする。この種類のプローブおよびプライマーは通常、ストリンジェントな条件下で、本発明の核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の少なくとも約12、好ましくは少なくとも約25、例えば約40、50もしくは75連続ヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【００９９】
本発明はまた、「サイレント突然変異」を有する核酸配列、または特に記載された配列と比較して特殊な供給源または宿主細胞のコドン使用頻度に従い変更された核酸配列、ならびにその天然の変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体を含む。
【０１００】
III.  発現ベクター
本発明はまた、上記本発明の発現カセットを含む発現ベクターに関する。
【０１０１】
ベクターは当業者に周知であり、例えば、“Cloning Vectors” (Pouwels P. H.ら, 編者, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)に記載されている。ベクターは、プラスミドの他に、当業者に知られたあらゆる他のベクター、例えばファージ、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド、および線状または環状DNAをも意味する。前記ベクターは宿主生物内で自律的に複製しても、染色体内で複製されても良い。
【０１０２】
好ましいプラスミドは、特に好ましくはコリネフォルム細菌中で複製されるものである。多数の既知のプラスミドベクター、例えばpZ1(Menkelら, Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554)、pEKEx1(Eikmannsら, Gene 102: 93-98 (1991))またはpHS2-1(Sonnenら, Gene 107: 69-74 (1991))は、未解明の(cryptic)プラスミド pHM1519、pBL1またはpGA1に基づく。他のプラスミドベクター、例えばpCLiK5MCS (実施例1を参照)またはpCG4(US-A 4,489,160)もしくはpNG2(Serwold-Davisら, FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990))もしくはpAG1(US-A 5,158,891)に基づくものも同様に使用可能である。 
その助けを借りることにより染色体内への組込みによる遺伝子増幅の方法に応用可能なプラスミドベクターはさらに適当であり、こうしたものは、例えばRemscheidらにより(Applied and Environmental Microbiology 60,126-132 (1994))においてhom-thrBオペロンの複製と増幅について記載されている。この方法において、完全遺伝子は、宿主(典型的には大腸菌)では複製できるがコリネバクテリウム・グルタミクムでは複製できないプラスミドベクターにクローニングされる。適当なベクターの例は、pSUP301 (Sirnonら, Bio/ Technology 1, 784-791 (1983))、pK18mobもしくはpK19mob (Schaeferら, Gene 145, 69-73 (1994)), Bernardら, Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993))、pEM1 (Schrumpfら 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510--4516)またはpBGS8 (Sprattら,1986, Gene 41: 337-342)である。その後、増幅すべき遺伝子を有するプラスミドベクターを形質転換により所望のコリネバクテリウム・グルタミクム菌株内に導入する。形質転換方法は、例えばThierbachら (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican and Shivnan (Biotechnology 7, 1067-1070 (1989))および Tauchら (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994))に記載されている。
【０１０３】
IV.  遺伝子および該遺伝子によりコードされるタンパク質
微生物の遺伝子の転写速度および/または翻訳速度は、野生型と比較して、本発明の発現ユニットにより前記微生物の遺伝子の転写を調節することにより変更または生じるようにすることが可能であり、このとき前記遺伝子は前記発現ユニットに対して異種性(heterologous)である。
【０１０４】
これは好ましくは、
プロモーター活性を有する本発明の核酸の1つ以上を微生物のゲノム内に導入して、1つ以上の内在性遺伝子が前記プロモーター活性を有する導入された核酸(適切であれば変更された特異的プロモーター活性を有する)の制御下で転写されるようにすること、あるいは
プロモーター活性を有する本発明の核酸およびそれに機能的に連結された転写されるべき1つ以上の外来性または内在性核酸を含有する1つ以上の核酸構築物を該微生物に導入すること、により達成される。
【０１０５】
1つ以上の導入遺伝子が本発明の核酸の制御下で転写されるように1つ以上の遺伝子が微生物のゲノムに導入される場合、挿入は、組み込まれる遺伝子(または複数の遺伝子)がコーディング領域または非コーディング領域に組み込まれるようになされうる。挿入は好ましくは非コーディング領域になされる。
【０１０６】
これに関連して、核酸構築物は染色体内にまたは染色体外に挿入されうる。核酸構築物は好ましくは染色体内に挿入される。「染色体内」への組込みとは、宿主細胞の染色体内へのDNA断片の挿入のことである。
【０１０７】
「内在性(内因性)」とは、例えば既に野生型ゲノムに存在する遺伝子のような遺伝情報を意味する(上に特定したとおり)。
【０１０８】
「外来性(外因性)」とは、例えば野生型ゲノムに存在しない遺伝子のような遺伝情報を意味する。外来性遺伝情報、例えば本発明の多重プロモーター含有型発現ユニットが野生型菌株のゲノムに導入され、そのことにより遺伝子改変菌株が作製されたならば、この遺伝情報は、最初に作製された遺伝的菌株およびその子孫と比較すると内在性であるが、前記遺伝情報を有しなかった元の野生型菌株と比較すると外来性である。
【０１０９】
プロモーター活性を有する本発明の核酸による転写の調節に関して、「遺伝子」という用語は、好ましくは、転写されるべき領域、すなわち、例えば翻訳調節領域、コーディング領域および適当であればターミネーターのようなさらなる調節エレメントを含む核酸を意味する。
【０１１０】
本発明の発現ユニットによる発現の調節に関して、「遺伝子」という用語は、好ましくは、コーディング領域および適切な場合、ターミネーターのようなさらなる調節エレメントを含む核酸を意味する。
【０１１１】
「コーディング領域」は、タンパク質をコードする核酸配列を意味する。
【０１１２】
プロモーター活性を有する核酸および遺伝子に関して、「異種性(Heterologous)」とは、使用される遺伝子が、プロモーター活性を有する本発明の核酸の調節により野生型において転写されることはなく、野生型には存在しない新しい機能的結合が生じ、かつプロモーター活性を有する本発明の核酸と特定遺伝子との機能的組み合わせが野生型には存在しないことを意味する。
【０１１３】
発現ユニットおよび遺伝子に関して、「異種性(Heterologous)」とは、使用される遺伝子が本発明の発現ユニットの調節により野生型において発現されることはなく、野生型には存在しない新しい機能的結合が生じ、かつ本発明の発現ユニットと特定遺伝子との機能的組み合わせが野生型には存在しないことを意味する。
【０１１４】
微生物の遺伝子の転写速度および/または発現速度を変更するまたは該遺伝子の転写および／または発現を引き起こす本発明の上記方法の好ましい実施形態において、遺伝子はファインケミカルの生合成経路のタンパク質をコードする核酸からなる群より選択され、このとき適当であれば前記遺伝子はさらに調節エレメントを含むことも可能である。
【０１１５】
微生物の遺伝子の転写速度および/または発現速度を変更するまたは該遺伝子の転写および／または発現を引き起こす本発明の上記方法の特に好ましい実施形態において、遺伝子は次から選択され、このとき適当であればこれらの遺伝子はさらに調節エレメントを含むことも可能である：タンパク質構成アミノ酸および非タンパク質構成アミノ酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの生合成経路のタンパク質をコードする核酸、有機酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸、脂質および脂肪酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸、ジオールの生合成経路のタンパク質をコードする核酸、炭水化物の生合成経路のタンパク質をコードする核酸、芳香族化合物の生合成経路のタンパク質をコードする核酸、ビタミンの生合成経路のタンパク質をコードする核酸、補因子の生合成経路のタンパク質をコードする核酸、ならびに酵素の生合成経路のタンパク質をコードする核酸、中央代謝のタンパク質をコードする核酸。
【０１１６】
特に好ましい実施形態において、タンパク質はアミノ酸の生合成経路から選択される。すなわち：アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンテターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、転写調節因子 LuxR、転写調節因子 LysR1、転写調節因子 LysR2、リンゴ酸-キノンオキシドレダクターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、ホモセリン-O-アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニン-γ-シンターゼ、シスタチオニン-β-リアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、ホスホセリンホスファターゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニン輸送キャリアー、トレオニンデヒドラターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、リシンエクスポーター、ビオチンリガーゼ、システインシンターゼ I、システインシンターゼ II、補酵素B12依存性メチオニンシンターゼ、補酵素B12非依存性メチオニンシンターゼ活性、スルフェートアデニリルトランスフェラーゼサブユニット1および2、ホスホアデノシンホスホ硫酸レダクターゼ、フェレドキシン亜硫酸レダクターゼ、フェレドキシンNADPレダクターゼ、3-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ、RXA00655 調節因子、RXN2910 調節因子、アルギニルtRNAシンテターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、トレオニン排出タンパク質（threonine efflux protein）、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ、硫酸還元タンパク質 RXA077、硫酸還元タンパク質 RXA248、硫酸還元タンパク質 RXA247、OpcA タンパク質、1-ホスホフルクトキナーゼ、6-ホスホフルクトキナーゼ、テトラヒドロピコリン酸スクシニラーゼ、スクシニルアミノケトピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、スクシニルジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、ならびにリンゴ酸酵素から選択される。
【０１１７】
好ましいタンパク質、および該タンパク質をコードする核酸は、それぞれ、微生物由来、好ましくはコリネバクテリウム属もしくはブレビバクテリウム属の細菌由来、、好ましくはコリネフォルム細菌由来、特に好ましくはコリネバクテリウム グルタミクム由来のタンパク質配列および核酸配列である。
【０１１８】
アミノ酸の生合成経路のタンパク質の配列および該タンパク質をコードする対応する核酸配列の特に好ましいものの例、それらに言及する文献、および該参考文献中でのそれらの指示名称(designation)を表１にリストする：
【表１】
2008212157.tif 000002
2008212157.tif 000003
2008212157.tif 000004
2008212157.tif 000005
2008212157.tif 000006
【０１１９】
本発明によれば、上で一覧表にした遺伝子のうち、調節すべき標的遺伝子Gを選択することが好ましい。
【０１２０】
さらに、アミノ酸の生合成経路からの特に好ましいタンパク質配列は、各事例においてこのタンパク質について表1に示すアミノ酸配列を有し、ただしそれぞれのタンパク質はこのアミノ酸配列について表2のカラム2に示すアミノ酸の位置の少なくとも１つにおいて、表2の同じ行のカラム3に示されるそれぞれのアミノ酸とは異なるタンパク質構成アミノ酸を有する。さらに好ましい実施形態において、タンパク質は、アミノ酸配列についての表2中のカラム2に示される位置の少なくとも１つのアミノ酸の位置において、表2中の同じ行のカラム4に示されるアミノ酸を有する。表2に示すタンパク質は、アミノ酸の生合成経路に関する突然変異タンパク質であり、特に有利な性質を有し、そのため、本発明のプロモーター構築物を介して対応する核酸を発現することおよびアミノ酸を産生することに特に適当である。例えば、突然変異T311Iは、askがスイッチオフされるというフィードバック抑制をもたらす。
【０１２１】
表2に上述した突然変異タンパク質をコードする対応する核酸は、慣用の方法により作製することができる。
【０１２２】
突然変異タンパク質をコードする核酸配列を作製するための適当な出発点は、例えば、指定番号 ATCC 13032としてAmerican Type Culture Collectionから得ることができるコリネバクテリウム グルタミクム菌株のゲノム、または表1で言及された核酸配列である。突然変異タンパク質のアミノ酸配列をこうしたタンパク質をコードする核酸配列に逆翻訳するためには、該核酸配列を導入する生物または該核酸配列が存在する生物のコドン使用頻度を利用することが好都合である。例えば、コリネバクテリウム グルタミクムのためにはコリネバクテリウム グルタミクムのコドン使用頻度を利用することが有利である。特定の生物のコドン使用頻度は、所望の生物由来の少なくとも１つのタンパク質およびこのタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を開示するデータベースまたは特許出願からそれ自体(per se)知られた方法により確認することができる。
【０１２３】
表2の情報は次のように理解すべきである。
【０１２４】
カラム1「識別記号(identification)」には、表1に関連して各配列の一義的な表示記号を示す。
【０１２５】
カラム2「アミノ酸位置(AA-POS)」では、それぞれの数は、表1からの対応するポリペプチド配列のアミノ酸の位置を表す。したがって、カラム「AA-POS」における「26」は対応して示されるポリペプチド配列のアミノ酸位置26を意味する。位置のナンバリングはN末端の+1から始まる。
【０１２６】
カラム3「AA野生型」では、それぞれの文字は、表１からの配列の対応する野生型菌株における、カラム2中に示される位置のアミノ酸(１文字記号で表す)を指定する。
【０１２７】
カラム4「AA突然変異体」では、それぞれの文字は、対応する突然変異菌株におけるカラム2に示す位置のアミノ酸(１文字記号で表す)を指定する。
【０１２８】
カラム5「機能」には、対応するポリペプチド配列の生理学的機能を示す。
【０１２９】
特定の機能(カラム5)および特定の初期アミノ酸配列(表1)を有する突然変異タンパク質について、カラム2、3および4は、少なくとも１つの突然変異、およびいくつかの配列については複数の突然変異を記載する。この複数の突然変異は必ず、各事例において上に最も近い初期アミノ酸配列を参照する(表1)。特定のアミノ酸配列の「少なくとも１つのアミノ酸位置」という用語は、好ましくはカラム2、3および4においてこのアミノ酸配列について記載されている少なくとも１つの突然変異を意味する。
【０１３０】
2008212157.tif 000007
【表２】
2008212157.tif 000008
2008212157.tif 000009
2008212157.tif 000010
【０１３１】
遺伝子改変された微生物
本発明の発現ユニット、上記遺伝子および上記核酸構築物または発現カセットは、当業者に知られた方法、例えばコンジュゲーション法またはエレクトロポレーション法(例えば、Lieblら (1989) FEMS Microbiology Letters 53, 299-303)を用いて、微生物、特にコリネフォルム細菌に導入する。
【０１３２】
組込まれた(Integrated)発現カセットは、好ましくはSacB法により選択される。SacB法は当業者に知られており、例えば、Schaefer A, Tauch A, Jaeger W, Kalinowski J, Thierbach G, Puehler A.; Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebaterium glutamicum、Gene. 1994 Jul 22;145(1):69-73およびBlomfield IC, Vaughn V, Rest RF, Eisenstein BI.; Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSC101 replicon; Mol Microbiol. 1991 Jun;5(6):1447-57に記載されている。
【０１３３】
本発明によれば、出発微生物として、所望の可変産物(ファインケミカル/タンパク質)をすでに産生する微生物を用いることが好ましい。
【０１３４】
したがって、本発明はまた、本発明の発現カセットまたは本発明の発現カセットを含むベクターを有する遺伝子改変微生物に関する。
【０１３５】
本発明は特に好ましくは、本発明の発現カセットを少なくとも１つ有するベクター(特にシャトルベクターまたはプラスミドベクター)を含む遺伝子改変微生物、特にコリネフォルム細菌に関する。
【０１３６】
好ましい微生物または遺伝子改変微生物は、細菌、藻類、菌類または酵母である。
【０１３７】
特に好ましい微生物は、とりわけ、コリネフォルム細菌である。
【０１３８】
好ましいコリネフォルム細菌は、コリネバクテリウム属の細菌、特にコリネバクテリウム グルタミクム、コリネバクテリウム アセトグルタミクム(Corynebacterium acetoglutamicum)、コリネバクテリウム アセトアシドフィルム(Corynebacterium acetoacidophilum)、コリネバクテリウム サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)、コリネバクテリウム メラッセコラ(Corynebacterium melassecola)およびコリネバクテリウム エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)の種の細菌、またはブレビバクテリウム属の細菌、特にブレビバクテリウム フラブム(Brevibacterium flavum)、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)およびブレビバクテリウム ディヴァリカタム(Brevibacterium divaricatum)の種の細菌である。
【０１３９】
特に好ましいコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属の細菌は、コリネバクテリウム グルタミクム ATCC 13032、コリネバクテリウム アセトグルタミクム ATCC 15806、コリネバクテリウム アセトアシドフィルムATCC 13870、コリネバクテリウム サーモアミノゲネスFERM BP-1539、コリネバクテリウム メラッセコラATCC 17965、コリネバクテリウム エフィシエンスDSM 44547、コリネバクテリウム エフィシエンスDSM 44548、コリネバクテリウム エフィシエンスDSM 44549、ブレビバクテリウム フラブムATCC 14067、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタムATCC 13869、ブレビバクテリウム ディヴァリカタムATCC 14020、コリネバクテリウム グルタミクムKFCC10065およびコリネバクテリウム グルタミクムATCC 21608、ならびにこれらから誘導される菌株、例えば古典的突然変異および選択または特異的突然変異(directed mutation)により誘導される菌株からなる群より選択される。
【０１４０】
KFCCという略語はKorean Federation of Culture Collectionを意味し、ATCCという略語はAmerican type strain culture collectionを意味し、そしてDSM (またはDSMZ)という略語はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen)を意味する。
【０１４１】
コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属のさらに特に好ましい細菌を表3に示す。
【表３】
2008212157.tif 000011
2008212157.tif 000012
2008212157.tif 000013
2008212157.tif 000014
2008212157.tif 000015
2008212157.tif 000016
【０１４２】
略語は次の意味を有する：
ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA
FERM: Fermentation Research Institute, Chiba, Japan
NRRL: ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, IL, USA
CECT: Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Valencia, Spain
NCIMB: National Collection of Industrial and Marine bacteria Ltd., Aberdeen, UK
CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, NL
NCTC: National Collection of Type Cultures, London, UK
DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen, Braunschweig, Germany
【０１４３】
本発明において特に好ましいのは、コリネバクテリウム属の細菌の微生物、特にすでにL-リシン、L-メチオニンおよび/またはL-トレオニンを産生する能力のあるコリネバクテリウム属細菌である。これらは特に、アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子(ask遺伝子)が、調節解除(deregulated)されているかまたはフィードバック抑制が消去されているまたは低下しているコリネバクテリアである。例えば、かかる細菌は、ask遺伝子内に、フィードバック抑制の低下または消去をもたらす突然変異(例えば突然変異T311I)を有する。
【０１４４】
本発明の発現ユニットは、上記の本発明の遺伝子改変微生物における特定の生合成産物に関する代謝経路の調節を可能にする。
【０１４５】
この目的のためには、例えば、特定の生合成産物を生じる代謝経路を、この生合成経路の遺伝子の発現もしくは転写を引き起こす、または該遺伝子の発現速度もしくは転写速度を増加させることにより増強する。このとき、タンパク質の量の増加は、所望の生合成経路に関するこうしたタンパク質の全活性の増加をもたらし、そのことにより所望の生合成産物に向かう増加した代謝流量(metabolic flux)をもたらす。
【０１４６】
さらに、特定の生合成産物から分岐する代謝経路を、この分岐する生合成経路の遺伝子の転写速度または発現速度を減少させることにより、弱めることができる。このとき、タンパク質の量の低下は、望ましくない生合成経路のこうしたタンパク質の全活性の低下をもたらし、そのことによりさらに所望の生合成産物に向かう増加した代謝流量(metabolic flux)をもたらす。
【０１４７】
本発明の遺伝子改変微生物は、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースから、またはグリセロールとエタノールから生合成産物を産生することができる。
【０１４８】
したがって、本発明は、本発明の遺伝子改変微生物を培養することにより生合成産物を製造する方法に関する。
【０１４９】
所望の生合成産物に応じて、種々の遺伝子の転写速度または発現速度を増加または減少させなければならない。通常は複数の遺伝子の転写速度もしくは発現速度を変更することは好都合である。すなわちある組み合わせの遺伝子の転写速度もしくは発現速度を増加させ、かつ／またはある組み合わせの遺伝子の転写速度もしくは発現速度を減少させることは好都合である。
【０１５０】
本発明の遺伝子改変微生物における、少なくとも１つの変更された、すなわち増加または減少した、遺伝子の転写速度または発現速度は、プロモーター活性を有する本発明の核酸または本発明の発現ユニットが原因でありうる。
【０１５１】
その上、遺伝子改変微生物における、さらに変更された、すなわち追加的に増加または追加的に減少した、別の遺伝子の転写速度または発現速度は、プロモーター活性を有する本発明の核酸または本発明の発現ユニットに由来しうる(由来しなくてもよい)。
【０１５２】
したがって本発明はさらに、本発明の遺伝子改変微生物を培養することによる生合成産物の製造方法に関する。
【０１５３】
V.  本発明の応用分野
本発明の多重プロモーター含有型発現ユニット、発現カセットおよびベクターは、例えば下に説明するように、生合成産物の発酵産生の改良方法において特に都合良く使用することができる。
【０１５４】
本発明の多重プロモーター含有型発現ユニットまたはそれを含む発現カセットは、機能的に連結された構造遺伝子の発現のモジュレーションを可能にするという特別な利点を有する。
【０１５５】
本発明の発現ユニットまたはそれを含む発現カセットは、野生型と比較して、微生物における遺伝子の発現速度を変更、すなわち増加または減少させるために使用することができる。このことは、発現速度の増加の場合には、対象の遺伝子の発現を最大化する可能性を提供する。しかしながらまた、適当な発現ユニットを選択することにより、発現は、別の発現ユニットにより得られうる最大強度よりも低い強度であるが、しかしそのとき発現産物を発現微生物にとってより適合可能な量で発現産物を送達する強度であってもよい。これは、高すぎる発現産物濃度が発現微生物にとって有毒であるときに特に有利である。それぞれ異なる発現強度を有する発現ユニットから選択することにより、本発明の発現ユニットは、発現を(特に長期発現について)最適値へと細かく調節することを可能にする。
【０１５６】
本発明の発現ユニットまたは前記発現ユニットを含む発現カセットはまた、微生物、特にコリネバクテリウム種において、種々の生合成産物、例えば、ファインケミカル、タンパク質、特にアミノ酸の形成を調節および増強するために使用することができる。
【０１５７】
したがって本発明は、産物生合成を調節するための本発明の多重プロモーター含有型発現ユニットの使用に関する。このとき産物生合成の調節に関わるタンパク質の遺伝子を、そのような発現ユニットの制御下におく。前記産物生合成は、選択された多重プロモーター含有型発現ユニットの転写速度に応じて影響を受ける。あるいはまた、産物生合成の調節に関わるタンパク質の遺伝子を、本発明の発現カセットの構成要素として微生物中に発現させ、その結果発現される該タンパク質により前記産物生合成を調節することができる。多重プロモーターの活性が内在性プロモーターの活性よりも弱いときは、特に望ましくない生合成経路を弱めるために多重プロモーターをも利用することが可能である。
【０１５８】
本発明の多重プロモーター含有型発現ユニットの転写速度は、前記多重プロモーターを構成する個々のプロモーターの１つ以上を特異的に突然変異させることによりさらに調節することができる。増大または低下するプロモーター活性は、RNAポリメラーゼホロ酵素結合部位(当業者には-10領域および-35領域としても知られている)の結合部位のヌクレオチドを置換することにより達成されうる。RNAポリメラーゼホロ酵素結合部位の間の距離を減少もしくは伸長させる(ヌクレオチド欠失またはヌクレオチド挿入として表される)ことにより、さらには、調節タンパク質(当業者にはリプレッサーおよびアクチベーターとして知られている)用の結合部位(当業者にはオペレーターとしても知られている)をRNAポリメラーゼホロ酵素の結合部位と空間的に近接するように配置して、これらの調節因子がプロモーター配列への結合後に、RNAポリメラーゼホロ酵素の結合および転写活性を弱めるもしくは増強する、あるいは前記結合および転写活性を新しい調節因子の影響に供するようにすることにより、さらなる影響を及ぼすことができる。本発明の多重プロモーター含有型発現ユニット内のシングルプロモーターPyのリボソーム結合媒介性3’末端配列部分を突然変異させることにより翻訳活性に影響を及ぼすことも可能である。
【０１５９】
VI.  生合成産物および好適な製造方法
本発明により製造される好ましい生合成産物はファインケミカルである。
【０１６０】
「ファインケミカル」という用語は当業者によく知られており、生物により産生され、様々な産業分野、例えば限定するものではないが、製薬産業、農業、化粧品、食品および飼料産業、において使用される化合物を含む。こうした化合物には、有機酸、例えば乳酸、コハク酸、酒石酸、イタコン酸およびジアミノピメリン酸、ならびにタンパク質構成アミノ酸および非タンパク質構成アミノ酸、プリン塩基およびピリミジン塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチド(例えばKuninaka, A. (1996) nucleotides and related compounds, pp. 561-612に, Biotechnology 6巻, Rehm ら, 編者, VCH: Weinheimおよびそれに記載されている文献に記載されている)、脂質、飽和および不飽和脂肪酸(例えばアラキドン酸)、ジオール(例えばプロパンジオールおよびブタンジオール)、炭水化物 (例えばヒアルロン酸およびトレハロース)、芳香族化合物(例えば芳香族アミン、バリニンおよびインジゴ)、ビタミンおよび補因子(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, A27巻, “Vitamins”, pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim およびそれに記載されている文献; ならびにOng, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) “Nutrition, Lipids, Health and Disease” Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, 1994年9月1〜3日にPenang, Malaysiaにて開催, AOCS Press (1995)に記載されている)、酵素、ならびにGutcho (1983)によりChemicals by fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086およびそれに記載されている文献に記載されているあらゆる他の化学物質が含まれる。
【０１６１】
特に好ましい生合成産物は、有機酸、タンパク質、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、タンパク質構成アミノ酸および非タンパク質構成アミノ酸の両方、脂質および脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミンおよび補因子、酵素ならびにタンパク質からなる群より選択される。
【０１６２】
好ましい有機酸は、乳酸、コハク酸、酒石酸、イタコン酸およびジアミノピメリン酸である。
【０１６３】
好ましいヌクレオシドおよびヌクレオチドは、例えばKuninaka, A. (1996) nucleotides and related compounds, pp. 561-612に、Biotechnology, 6巻, Rehm ら, 編者VCH: Weinheimにおよびそれらに掲載されている参考文献に記載されている。
【０１６４】
好ましい生合成産物は、さらに脂質、飽和および不飽和脂肪酸例えば、アラキドン酸、ジオール、例えばプロパンジオールおよびブタンジオール、炭水化物、例えばヒアルロン酸およびトレハロース、芳香族化合物、例えば、芳香族アミン、バリニンおよびインジゴ、ビタミンおよび補因子(例えばUllmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, A27巻, “vitamins”, pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim およびそれに記載されている文献; および Ong, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) “Nutrition, Lipids, Health and Disease” Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, 1994年9月1〜3日にPenang, Malaysiaで開催, AOCS Press (1995)に記載されている)、酵素、ポリケチド(Caneら (1998) Science 282: 63-68)、ならびにGutcho (1983)によりChemicals by fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086およびそれに記載されている文献に記載されているあらゆる他の化学物質である。
【０１６５】
特に好ましい生合成産物は、アミノ酸、特に好ましくは必須アミノ酸、特にL-グリシン、L-アラニン、L-ロイシン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン、L-リシン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-セリン、L-プロリン、L-バリン、L-イソロイシン、L-システイン、L-チロシン、L-ヒスチジン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸ならびにL-トレオニン、L-ホモセリン、特にL-リシン、L-メチオニンおよびL-トレオニンである。アミノ酸、例えばリシン、メチオニンおよびトレオニンは、本明細書において以下、各事例においてアミノ酸のL体およびD体の両方、好ましくはL体、すなわち例えばL-リシン、L-メチオニンおよびL-トレオニンを意味する。
【０１６６】
次のセクションは、リシン、メチオニンおよびトレオニンの特に好ましい製造をより詳細に説明する。
【０１６７】
a) リシンの調製
本発明は特に、野生型と比べ少なくとも１つの遺伝子の発現速度が増大するまたはかかる遺伝子の発現が生じるように遺伝子改変した微生物を培養することによりリシンを産生する方法に関し、ここで
- 微生物中の少なくとも１つの内在性遺伝子の発現活性は、本発明の発現ユニットにより調節され、または
- 微生物中の少なくとも１つの遺伝子の発現は、前記微生物に前記遺伝子を含む本発明の発現カセットを導入することにより生じるまたは改変される。
【０１６８】
本発明において、遺伝子は特に、アスパラギン酸キナーゼをコードする核酸、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸、ジヒドロジピコリン酸シンテターゼをコードする核酸、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする核酸、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする核酸、3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする核酸、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする核酸、転写調節因子LuxRをコードする核酸、転写調節因子LysR1をコードする核酸、転写調節因子LysR2をコードする核酸、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼをコードする核酸、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、トランスケトラーゼをコードする核酸、トランスアルドラーゼをコードする核酸、リシンエクスポーターをコードする核酸、ビオチンリガーゼをコードする核酸、アルギニルtRNAシンテターゼをコードする核酸、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼをコードする核酸、タンパク質OpcAをコードする核酸、1-ホスホフルクトキナーゼをコードする核酸、6-ホスホフルクトキナーゼをコードする核酸、テトラヒドロピコリン酸スクシニラーゼをコードする核酸、スクシニルアミノケトピメリン酸アモノトランスフェラーゼをコードする核酸、スクシニルジアミノピメリン酸デスクシニラーゼをコードする核酸、ジアミノピメリン酸エピメラーゼをコードする核酸、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、グルコースリン酸イソメラーゼをコードする核酸、ホスホグリセレートムターゼをコードする核酸、エノラーゼをコードする核酸、ピルビン酸キナーゼをコードする核酸、アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする核酸およびリンゴ酸酵素をコードする核酸の中から選択される。
【０１６９】
上記リシンの調製方法のさらに好ましい実施形態は、アスパラギン酸キナーゼ活性、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性、ジヒドロジピコリン酸シンテターゼ活性、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ活性、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ活性、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性、トリオースリン酸イソメラーゼ活性、転写調節因子LuxR活性、転写調節因子LysR1活性、転写調節因子LysR2活性、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼ活性、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ活性、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性、トランスケトラーゼ活性、トランスアルドラーゼ活性、リシンエクスポーター活性、アルギニルtRNAシンテターゼ活性、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ活性、タンパク質OpcA活性、1-ホスホフルクトキナーゼ活性、6-ホスホフルクトキナーゼ活性、ビオチンリガーゼ活性、およびテトラヒドロピコリン酸スクシニラーゼ活性、スクシニルアミノケトピメリン酸アモノトランスフェラーゼ活性、スクシニルジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ活性、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ活性、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性、グルコースリン酸イソメラーゼ活性、ホスホグリセレートムターゼ活性、エノラーゼ活性、ピルビン酸キナーゼ活性、アスパラギン酸トランスアミナーゼ活性およびリンゴ酸酵素活性の中から選択される少なくとも１つの活性について、野生型と比べ更に増大した活性を有する遺伝子改変した微生物を含む。
【０１７０】
上記リシンの調製方法のさらに特別に好ましい実施形態は、トレオニンデヒドラターゼ活性、ホモセリン-0-アセチルトランスフェラーゼ活性、0-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性、ピルビン酸オキシダーゼ活性、ホモセリンキナーゼ活性、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性、トレオニンエクスポーター活性、トレオニン排出タンパク質活性、アスパラギナーゼ活性、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性およびトレオニンシンターゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性について、野生型と比べ更に低下した活性を有する遺伝子改変した微生物を含む。
【０１７１】
b) メチオニンの調製
本発明はさらに、野生型と比べ少なくとも１つの遺伝子の発現速度が増大しているまたは発現を生じる遺伝子改変した微生物を培養することによりメチオニンを調製する方法に関し、ここで
- 微生物中の少なくとも１つの内在性遺伝子の発現活性は、本発明の発現ユニットにより調節され、または
- 微生物中の少なくとも１つの遺伝子の発現は、前記微生物に前記遺伝子を含む本発明の発現カセットを導入することにより生じるまたは改変される。
【０１７２】
本発明において、遺伝子はアスパラギン酸キナーゼをコードする核酸、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする核酸、3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする核酸、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする核酸、ホモセリン-O-アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸、シスタチオニン-γ-シンターゼをコードする核酸、シスタチオニン-β-リアーゼをコードする核酸、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする核酸、O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする核酸、メチレンテトラヒドロフォレートレダクターゼをコードする核酸、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする核酸、ホスホセリンホスファターゼをコードする核酸、セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする核酸、システインシンターゼ活性Iをコードする核酸、システインシンターゼ活性IIをコードする核酸、補酵素B12依存性メチオニンシンターゼ活性をコードする核酸、補酵素B12非依存性メチオニンシンターゼ活性をコードする核酸、硫酸アデニリルトランスフェラーゼ活性をコードする核酸、ホスホアデノシンホスホスルフェートレダクターゼ活性をコードする核酸、フェレドキシン亜硫酸レダクターゼ活性をコードする核酸、フェレドキシンNADPHレダクターゼ活性をコードする核酸、フェレドキシン活性をコードする核酸、硫酸還元タンパク質RXA077をコードする核酸、硫酸還元タンパク質RXA248をコードする核酸、硫酸還元タンパク質RXA247をコードする核酸、RXA0655調節因子をコードする核酸およびRXN2910調節因子をコードする核酸、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼまたはリンゴ酸酵素をコードする核酸の中から特に選択される。
【０１７３】
上記メチオニンの調製方法のさらに好ましい実施形態は、アスパラギン酸キナーゼ活性、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ活性、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ活性、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性、トリオースリン酸イソメラーゼ活性、ホモセリン-O-アセチルトランスフェラーゼ活性、シスタチオニン-γ-シンターゼ活性、シスタチオニン-β-リアーゼ活性、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性、メチレンテトラヒドロフォレートレダクターゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリンアセチルトランスフェラーゼ活性、システインシンターゼI活性、システインシンターゼII活性、補酵素B12依存性メチオニンシンターゼ活性、補酵素B12非依存性メチオニンシンターゼ活性、硫酸アデニリルトランスフェラーゼ活性、ホスホアデノシンホスホスルフェートレダクターゼ活性、フェレドキシン亜硫酸レダクターゼ活性、フェレドキシンNADPHレダクターゼ活性、フェレドキシン活性、硫酸還元タンパク質RXA077の活性、硫酸還元タンパク質RXA248の活性、硫酸還元タンパク質RXA247の活性、RXA655調節因子の活性およびRXN2910調節因子の活性、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの活性、グルコースリン酸イソメラーゼの活性、ホスホグリセレートムターゼの活性、エノラーゼの活性、ピルビン酸キナーゼの活性、アスパラギン酸トランスアミナーゼの活性ならびにリンゴ酸酵素の活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性について、野生型と比べ更に増大した活性を有する遺伝子改変した微生物を含む。
【０１７４】
上記メチオニンの調製方法のさらに特別に好ましい実施形態は、ホモセリンキナーゼ活性、トレオニンデヒドラターゼ活性、トレオニンシンターゼ活性、メソ-ジアミノピメリン酸D-デヒドロゲナーゼ活性、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性、ピルビン酸オキシダーゼ活性、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ活性、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性およびジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性について、野生型と比べ更に低下した活性を有する遺伝子改変した微生物を含む。
【０１７５】
c) トレオニンの調製
本発明はさらに、野生型と比べ少なくとも１つの遺伝子の発現速度が増大しているまたは発現が生じている遺伝子改変した微生物を培養することによりトレオニンを調製する方法に関し、ここで
- 微生物中の少なくとも１つの内在性遺伝子の発現活性は、本発明の発現ユニットにより調節され、あるいは
- 微生物中の少なくとも１つの遺伝子の発現は、前記微生物に前記遺伝子を含む本発明の発現ユニットを導入することにより生じるかまたは改変される。
【０１７６】
本発明において、遺伝子はアスパラギン酸キナーゼをコードする核酸、アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする核酸、3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする核酸、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする核酸、ホモセリンキナーゼをコードする核酸、トレオニンシンターゼをコードする核酸、トレオニン輸送担体をコードする核酸、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、トランスアルドラーゼをコードする核酸、トランスケトラーゼをコードする核酸、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼをコードする核酸、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、リシンエクスポーターをコードする核酸、ビオチンリガーゼをコードする核酸、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、トレオニン排出タンパク質をコードする核酸、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼをコードする核酸、OpcAタンパク質をコードする核酸、1-ホスホフルクトキナーゼをコードする核酸、6-ホスホフルクトキナーゼをコードする核酸、およびホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸、ならびに6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼおよびリンゴ酸酵素をコードする核酸から特に選択される。
【０１７７】
上記トレオニンの調製方法のさらに好ましい実施形態は、アスパラギン酸キナーゼ活性、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ活性、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ活性、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性、トリオースリン酸イソメラーゼ活性、トレオニンシンターゼ活性、トレオニン輸送担体の活性、トランスアルドラーゼ活性、トランスケトラーゼ活性、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ活性、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼ活性、ホモセリンキナーゼ活性、ビオチンリガーゼ活性、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、トレオニン排出タンパク質活性、タンパク質OpcA活性、1-ホスホフルクトキナーゼ活性、6-ホスホフルクトキナーゼ活性、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ活性、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性および6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの活性、グルコースリン酸イソメラーゼの活性、ホスホグリセレートムターゼの活性、エノラーゼの活性、ピルビン酸キナーゼの活性、アスパラギン酸トランスアミナーゼの活性ならびにリンゴ酸酵素の活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性について、野生型と比べ更に増大した活性を有する遺伝子改変した微生物を含む。
【０１７８】
上記トレオニンの調製方法のさらに特別に好ましい実施形態は、トレオニンデヒドラターゼ活性、ホモセリン-O-アセチルトランスフェラーゼ活性、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性、メソ-ジアミノピメリン酸D-デヒドロゲナーゼ活性、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性、ピルビン酸オキシダーゼ活性、ジヒドロジピコリン酸シンテターゼ活性、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性、アスパラギナーゼ活性、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性、リシンエクスポーター活性、アセト乳酸シンターゼ活性、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性、側鎖アミノトランスフェラーゼ活性、補酵素B12依存性メチオニンシンターゼ活性、補酵素B12非依存性メチオニンシンターゼ活性、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性およびジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性について、野生型と比べ更に低下した活性を有する遺伝子改変した微生物を含む。
【０１７９】
d) 本発明によるバイオ産物の調製に関する詳細情報
上記活性のうち少なくとも１つが更に増大または低下した当該活性は、必ずしも必要ではないが、本発明の発現ユニットまたは本発明の発現カセットにより生じさせることができる。
【０１８０】
タンパク質の「活性」という用語は、酵素に関しては対応するタンパク質の酵素活性を意味し、また他のタンパク質、例えば構造または輸送タンパク質に関してはタンパク質の生理活性を意味する。
【０１８１】
酵素は通常、基質を産物に転換するか、この転換ステップを触媒することができる。したがって、酵素の「活性」とは、所定の時間内に酵素によって転換される基質の量または形成される産物の量を意味する。
【０１８２】
したがって、野生型と比べ活性が増大すると、所定の時間内に酵素によって転換される基質の量または形成される産物の量は、野生型と比べ増加する。
【０１８３】
この「活性」の増大量とは、すなわち、例えば前後述した全ての活性について「野生型の活性」の少なくとも1〜5％、例えば少なくとも20％、少なくとも50％、少なくとも100％、少なくとも300％、または少なくとも500％、または少なくとも600％などを指す。
【０１８４】
したがって、野生型と比べ活性が低下すると、所定の時間内に酵素によって転換される基質の量または形成される産物の量は野生型と比べ減少する。
【０１８５】
活性の低下とは、好ましくは様々な細胞生物学的メカニズムに基づいて、微生物中で前記酵素の機能が部分的にまたは実質上完全に、抑制や遮断されることを意味する。
【０１８６】
この活性の低下には、酵素が実質上全く存在しない(すなわち、対応する活性が検出できないまたは酵素を免疫学的に検出できない)範囲にまで、酵素の量が減少することが含まれる。微生物中の活性は、好ましくは野生型と比べ少なくとも5％少なく、例えば少なくとも20％、少なくとも50％、または約100％少ない。「低下」は特定の場合において、対応する活性が全く存在しないことも意味する。
【０１８７】
遺伝子改変した微生物内およびその野生型内の所定の酵素の活性、ならびにその酵素活性の増大または低下は、例えば酵素アッセイ等の公知の方法により測定することができる。
【０１８８】
活性は、様々な方法、例えば発現やタンパク質レベルの阻害性調節メカニズムのスイッチを切ることにより、または野生型と比べ上記タンパク質をコードする核酸の遺伝子発現を増加させることにより、さらに増大させることができる。
【０１８９】
上記タンパク質をコードする核酸の遺伝子発現は、様々な方法、例えば活性化因子によりもしくは上記のとおり遺伝子を誘導することにより、プロモーター活性を増大させるか発現活性を増大させることにより、または1以上の遺伝子コピーを微生物に導入することにより野生型と比べ増加させることができる。
【０１９０】
タンパク質をコードする核酸の遺伝子発現の増加とは、本発明により微生物に固有な内因性タンパク質の発現を操作することも意味する。これは例えば上記のとおり、遺伝子のプロモーター配列を改変すること、遺伝子を調節管理するために本発明の発現ユニットを導入することおよびここで導入した本発明の発現ユニットを改変することにより、達成できる。遺伝子の発現速度を増大させるこのような改変は、例えばDNA配列の欠失または挿入によってもたらされる。
【０１９１】
上記のとおり、外部刺激を用いて内因性タンパク質の発現を改変させることができる。これは特定の物理的条件、すなわち異物の適用によりもたらすことができる。
【０１９２】
当業者であれば、さらに別の方法を単独または組み合わせることにより、遺伝子発現を増大させることができる。したがって、例えば最適な遺伝子のコピー数を増加させることができ、または構造遺伝子の上流に位置するプロモーターおよび調節領域もしくはリボソーム結合部位を突然変異させることができる。さらに、誘導プロモーターにより、発酵産生において、発現を増加させることができる。mRNAの寿命を延ばす方法によっても同様に、発現は改良される。そのうえ、酵素活性は酵素タンパク質の分解を抑制することでも増強させることができる。遺伝子もしくは遺伝子構築物は、様々なコピー数をプラスミド中に存在させるかまたは染色体内に組込んで増幅させることができる。別の方法としては、培地の組成や培養物の管理を改善することにより、関連遺伝子を過剰発現させることもできる。
【０１９３】
当業者であれば、上記に関する手引きを特にMartinら(Biotechnology 5, 137-146 (1987))、Guerreroら(Gene 138, 35-41 (1994))、TsuchiyaおよびMorinaga(Bio/Technology 6, 428-430 (1988))、Eikmannsら(Gene 102, 93-98 (1991))、EP-A 0472869、US -A4,601,893、SchwarzerおよびPueler(Biotechnology 9, 84-87 (1991)、Reinscheidら(AppliedおよびEnvironmental Microbiology 60,126-132 (1994)、LaBarreら(Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))、WO96/15246、Malumbresら(Gene 134, 15-24 (1993))、JP-A-10-22989、JensenおよびHammer(BiotechnologyおよびBioengineering 58, 191-195 (1998))、Makrides(Microbiological Reviews 60 : 512-538 (1996)ならびに周知の遺伝学および分子生物学のテキストに記載されている。
【０１９４】
生合成産物、特にL-リシン、L-メチオニンおよびL-トレオニンの産生では、遺伝子の発現および増加に加え、望ましくない副反応を排除することがさらに有利な場合がある（Nakayama, 「Breeding of Amino Acids Producing Organism」、Overproduction of Microbial productions, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982)。
【０１９５】
好ましい実施形態において、上記タンパク質の１つをコードする核酸の遺伝子発現は、対応するタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を微生物に導入することにより増化させる。核酸の導入は、染色体的にまたは染色体外的に、すなわち染色体上のコピー数および／または宿主微生物中で複製するプラスミド上の遺伝子コピーを増加させることにより行うことができる。
【０１９６】
核酸の導入は、例えば核酸を含む本発明の発現カセットの形態で、好ましくは染色体的に、特に上記SacB法によりなされる。上記タンパク質のうち１つをコードする任意の遺伝子をこの目的で使用することが原理上可能である。
【０１９７】
イントロンを含む真核生物の供給源に由来するゲノム核酸配列に関して、宿主微生物が対応するタンパク質を発現できないまたは発現可能とならない場合には、事前に処理された核酸配列、例えば対応するcDNAを使用するのが好ましい。
【０１９８】
対応する遺伝子の例を、表１および２に示す。
【０１９９】
微生物における上記活性は、好ましくは次の方法のうちの少なくとも１つにより低下される：
・共抑制を誘導するための少なくとも１つのセンスリボ核酸配列の導入、またはその発現を確保する発現カセットの導入
・対応する遺伝子、RNAもしくはタンパク質に対する少なくとも１つのDNAやタンパク質結合因子の導入、またはその発現を確保する発現カセットの導入
・RNAを分解するウイルス核酸配列の少なくとも１つの導入、またはその発現を確保する発現カセットの導入
・例えば遺伝子の終止コドンの生成やリーディングフレームにおけるシフト、例えば遺伝子において挿入、欠失、逆位または突然変異を生じさせることなど機能を喪失させるための少なくとも１つの構築物の導入。相同組換えまたは標的遺伝子に対し配列特異的なヌクレアーゼの導入により、所望の標的遺伝子に目的とする挿入をしてノックアウト変異体を作製することが可能でありかつ好ましい。
【０２００】
・プロモーター活性が低下したプロモーターまたは発現活性が低下した発現ユニットの導入
・センスRNA(mRNA)の翻訳を減少させるアンチセンスRNAの導入
当業者であれば、本発明の目的の範囲内でこの活性または機能を低下させるために、更なる方法も適用できることを理解できる。例えば、タンパク質のドミナント・ネガティブ変異体またはそれらの発現を確保する発現カセットの導入が有利なこともある。
【０２０１】
これらの工程のうち単一の工程のそれぞれで、タンパク質量、mRNA量および／またはタンパク質活性を低下させることも可能である。また、組み合わせて使用する場合もある。さらなる方法が当業者には公知であり、該方法にはタンパク質のプロセシングを妨害または抑制すること、タンパク質またはそのmRNAの輸送を阻害または抑制すること、リボソームとの結合の阻害、RNAスプライシングの阻害、RNA分解酵素の誘導および／または翻訳の伸長もしくは停止の阻害が含まれることがある。
【０２０２】
VII. 微生物の培養および生成物の単離
本発明の生合成産物を調製する方法では、遺伝子改変した微生物を培養するステップに続いて、好ましくは生合成産物を微生物および／または発酵ブロスから単離する。このステップは前記培養ステップと同時および／または好ましくは前記培養ステップの後に実施され得る。
【０２０３】
本発明の遺伝子改変した微生物を、バッチ処理(バッチ培養)またはフェドバッチもしくは反復フェドバッチ処理により、連続的または不連続的に培養して、生合成産物、特にL-リシン、L-メチオニンおよびL-トレオニンを産生させることができる。公知の培養方法についての概要は、Chemiel (Bioprozessetechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))によるテキストまたはStorhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))によるテキストに記載されている。
【０２０４】
使用する培地は、それぞれの株が必要とする条件を好適な方法で満たさなければならない。様々な微生物のための培地については、American Society for Bacteriologyのハンドブック「Manual of Methods for General Bacteriology」(Washington D.C., USA, 1981)に詳細が記されている。
【０２０５】
本発明で用いることができる当該培地は、通常1以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含む。
【０２０６】
好ましい炭素源は、単糖、二糖、または多糖等の糖類である。非常に良好な炭素源は、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、でんぷんまたはセルロースである。糖類は、糖蜜のような複合化合物または他の糖精製の副産物として培地に添加されることもある。様々な炭素源の混合物を添加することが有利な場合もある。他に想定される炭素源は、例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナツ油等の油脂と脂質、例えばパルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸等の脂肪酸、例えばグリセロール、メタノールまたはエタノール等のアルコール、および例えば酢酸または酪酸等の有機酸である。
【０２０７】
窒素源は通常、有機もしくは無機窒素化合物またはこれらの化合物を含む物質である。窒素源には、例えばアンモニアガスまたは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムもしくは硝酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ニトレート、尿素、アミノ酸またはコーンスチープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキスおよびその他等の複合窒素源が含まれる。これらの窒素源は、単独でまたは混合物として使用され得る。
【０２０８】
培地に存在し得る無機塩化合物には、塩化物、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄のリン酸塩または硫酸塩が含まれる。
【０２０９】
ファインケミカル、特にメチオニンを調製するためには、硫黄源として、例えば硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジオチン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物等の無機化合物だけでなく、メルカプタンおよびチオール等の有機硫黄化合物を使用することができる。
【０２１０】
リン源として、リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたはこれらに対応するナトリウム含有塩を使用することができる。
【０２１１】
キレート剤を培地へ加えることにより、溶液中で金属イオンを保持することができる。特に好適なキレート剤には、カテコールやプロトカテケート等のジヒドロキシフェノール、またはクエン酸等の有機酸が含まれる。
【０２１２】
本発明で用いられる発酵培地には通常、ビタミン等の他の成長因子、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸およびピリドキシンを含む成長促進物質も含まれる。成長因子および塩は、酵母エキス、糖蜜、コーンスチープリカー等のような培地の複合成分に由来することが多い。また、好適な前駆物質を培地へ添加しても良い。培地中の化合物の厳密な成分は特定の実験ごとに全く異なり、それぞれの特別なケースごとに決定されるであろう。培地の最適化に関する情報は、テキスト「Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach」(著者P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)に記載されている。成長培地は、Standard 1 (Merck)またはBHI (Brain heart infusion, DIFCO)など民間供給業者から購入することもできる。
【０２１３】
全ての培地成分は、熱(1.5バール、20分間 121℃)によりまたは濾過滅菌により滅菌される。この成分は、共にまたは必要であれば別々に滅菌することができる。全ての培地成分は、培養の開始時点でまたは場合によって、継続的にもしくはバッチ式に加え、揃えることができる。
【０２１４】
培養温度は通常15℃〜45℃、好ましくは25℃〜40℃で、実験中は一定に保持または変更することができる。培地のpHは5〜8.5の範囲、好ましくは約7.0にしなければならない。培養用のpHは、培養の間、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水等の塩基性化合物、またはリン酸もしくは硫酸等の酸性化合物を添加することによって調整することができる。気泡の発生は、例えば脂肪酸ポリグリコールエステル等の消泡剤を用いることにより抑えることができる。プラスミドの安定性は、例えば抗生物質等の選択的作用を有する好適な基質を培地に加えることにより維持することができる。好気条件は、酸素または酸素を含有する混合ガスを導入することにより、例えば周囲外気を培養物に導入することなどにより維持される。培養温度は通常、20℃〜45℃である。培養は、所望の産物が最大限に形成されるまで継続される。このためには通常10時間〜160時間を要する。
【０２１５】
この方法で取得される発酵ブロスの乾物含量は通常、7.5〜25重量％である。
【０２１６】
少なくとも最後に、但し特別には発酵時間の少なくとも30％より長い時間、糖を制限して発酵させることもさらに有利である。これは、当該時間にわたり発酵培地において利用可能な糖濃度を0〜3 g/lに維持または低下させることを意味する。
【０２１７】
生合成産物は、発酵ブロスおよび／または微生物からそれ自体公知の方法で、入手したい生合成産物および生合成副産物の物理的/化学的特性により単離される。
【０２１８】
該発酵ブロスはその後、例えばさらに処理することができる。バイオマスは、必要に応じて全体または一部を例えば遠心分離、濾過、デカンテーションまたはこれらの方法の組合せ等の分離方法により発酵培養液から除去し得、あるいはその中に完全に残され得る。
【０２１９】
発酵ブロスは、例えば回転式エバポレーター、薄膜エバポレーター、薄膜流下式エバポレーターを用いて逆浸透圧によりもしくはナノ濾過によるなど公知の方法により濃化や濃縮することができる。この濃縮発酵ブロスはその後、凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧造粒により、または他の工程により成熟させることができる。
【０２２０】
しかしながら、生合成産物、特にL-リシン、L-メチオニンおよびL-トレオニンをさらに精製することもできる。これを目的として、バイオマスの除去後に産物を含有するブロスを好適な樹脂を用いたクロマトグラフィーに供すると、所望の産物もしくは不純物の全てまたは一部がクロマトグラフィー樹脂上に保持される。これらのクロマトグラフィーステップは、同一または異なるクロマトグラフィー樹脂を用いて必要に応じて繰り返し行うことができる。当業者であれば、好適なクロマトグラフィー樹脂を選択することやそれらを最も効率的に使用することに熟達しているであろう。精製した産物は、濾過または限外濾過により濃縮し、さらに産物の安定性を最大にする温度で保存することができる。
【０２２１】
生合成産物は多様な形態、例えばその塩やエステルの形態で生じることがある。
【０２２２】
単離した化合物(１つまたは複数)の同定および精製は、先行技術にしたがって実施することができる。これには、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、分光学的方法、染色法、薄層クロマトグラフィー、NIRS、酵素アッセイまたは微生物学的アッセイが含まれる。これらの分析方法は、Patekら(1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140、Malakhovaら (1996) Biotekhnologiya 11 27-32、およびSchmidtら (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, pp.89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581 およびpp. 581-587、Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of BiochemistryおよびMolecular Biology, John WileyおよびSons、Fallon, A.ら (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in BiochemistryおよびMolecular Biology, vol. 17.に要約されている。
【０２２３】
本発明は、以下の非限定的な例により、詳細に説明される。
【実施例】
【０２２４】
[実施例１]
ベクターpCLiK5MCSの調製
第１に、ベクターpBR322のアンピシリン耐性および複製起点を、配列番号5および配列番号6のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR)により増幅した。
【０２２５】
配列番号5:
5'-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3'
配列番号6:
5'-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3'
pBR322と相補的な配列の他に、配列番号5のオリゴヌクレオチドプライマーは5’から3’方向に制限エンドヌクレアーゼSmaI、BamHI、NheIおよびAscIの切断部位を含み、また配列番号6のオリゴヌクレオチドプライマーは5’から3’方向に制限エンドヌクレアーゼXbaI、XhoI、NotIおよびDraIの切断部位を含む。PCR反応は、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))などの標準的方法により、PfuTurboポリメラーゼ (Stratagene, La Jolla, USA)を用いて行った。得られたDNA断片のサイズは約2.1kbで、該DNA断片はGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitand Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。DNA断片の平滑末端は、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて、互いにライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、アンピシリン(50μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０２２６】
それぞれのクローンのプラスミドDNAを、Qiaprep Spin Miniprep Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて単離し、制限酵素による消化により確認した。この方法で得られたプラスミドをpCLiK1で示す。
【０２２７】
プラスミドpWLT1 (Lieblら,1992)をPCR反応用のテンプレートとして、カナマイシン耐性カセットを配列番号7および配列番号8のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。
【０２２８】
配列番号7：
5'-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3'
配列番号8：
5'-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3'
pWLT1と相補的な配列の他に、配列番号7のオリゴヌクレオチドプライマーは5’から3’方向に制限エンドヌクレアーゼXbaI、SmaI、BamHI、NheIの切断部位を含み、また配列番号8のオリゴヌクレオチドプライマーは5’から3’方向に制限エンドヌクレアーゼAscIおよびNheIの切断部位を含む。PCR反応は、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))などの標準的方法により、PfuTurboポリメラーゼ (Stratagene, La Jolla, USA)を用いて行った。得られたDNA断片のサイズは約1.3kbで、該DNA断片はGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。DNA断片を制限エンドヌクレアーゼXbaIおよびAscI (New England Biolabs, Beverly, USA)により切断し、続いてGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて再度精製した。pCLiK1ベクターも同様にXbaIおよびAscI制限エンドヌクレアーゼで切断し、さらにアルカリホスファターゼ(I (Roche Diagnostics, Mannheim))を製造業者の記載情報のとおり用いて脱リン酸化した。0.8％強度のアガロースゲルで電気泳動後、線状化ベクター(約2.1 kb)を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて単離した。このベクター断片を、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて、切断したPCR断片とライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、アンピシリン(50μg/ml)およびカナマイシン（20μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０２２９】
それぞれのクローンのプラスミドDNAを、Qiaprep Spin Miniprep Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて単離し、制限酵素による消化により確認した。この方法で得られたプラスミドをpCLiK2で示す。
【０２３０】
pCLiK2ベクターを、制限エンドヌクレアーゼDraI (New England Biolabs, Beverly, USA)で切断した。0.8％強度のアガロースゲルで電気泳動後、約2.3 kbのベクター断片をGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて単離した。このベクター断片を、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて、切断したPCR断片にライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０２３１】
それぞれのクローンのプラスミドDNAを、Qiaprep Spin Miniprep Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて単離し、制限酵素による消化により確認した。この方法で得られたプラスミドをpCLiK3で示す。
【０２３２】
プラスミドpWLQ2 (Lieblら,1992)をPCR反応の鋳型として、pHM1519複製起点を配列番号9および配列番号10のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。
【０２３３】
配列番号9:
5'-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3'
配列番号10:
5'-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3'
pWLQ2と相補的な配列の他に、配列番号9および配列番号10のオリゴヌクレオチドプライマーは制限エンドヌクレアーゼNotIの切断部位を含む。PCR反応は、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))などの標準的方法により、PfuTurboポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, USA)を用いて行った。得られたDNA断片のサイズは約2.7 kbで、該DNA断片はGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。DNA断片を制限エンドヌクレアーゼNotI (New England Biolabs, Beverly, USA)で切断し、続いてDNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて再度精製した。pCLiK3ベクターも同様にNotI制限エンドヌクレアーゼで切断し、そしてアルカリホスファターゼ(I (Roche Diagnostics, Mannheim))を製造業者の記載情報のとおり用いて脱リン酸化した。0.8％強度のアガロースゲルで電気泳動後、線状化ベクター(約2.3 kb)を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて単離した。このベクター断片を、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて、切断したPCR断片とライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０２３４】
それぞれのクローンのプラスミドDNAを、Qiaprep Spin Miniprep Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて単離し、制限酵素による消化により確認した。この方法で得られたプラスミドをpCLiK5で示す。
【０２３５】
「多重クローニングサイト」(MCS)でpCLiK5を伸長させるため、制限エンドヌクレアーゼSwaI、XhoI、AatI、ApaI、Asp718、MluI、NdeI、SpeI、EcoRV、SalI、ClaI、BamHI、XbaIおよびSmaIの切断部位を含む本質的に相補的な2種類の合成オリゴヌクレオチド（配列番号11および配列番号12）を共に95℃で加熱し、次にゆっくりと冷却することにより二本鎖DNA断片となるよう結合させた。
【０２３６】
配列番号11：
5'-TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATATGACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAACAATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3'
配列番号12：
5'-GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAGCATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCGGGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3'
pCLiK5ベクターを制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびBamHI(New England Biolabs, Beverly, USA)で切断し、そしてアルカリホスファターゼ(I (Roche Diagnostics, Mannheim))を製造業者の記載情報のとおり用いて脱リン酸化した。0.8％強度のアガロースゲルで電気泳動後、線状化ベクター(約5.0 kb)を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて単離した。このベクター断片と前記合成二本鎖DNA断片を、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の記載情報のとおり用いてライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いてSambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン (20μg/ml)含有LB寒天 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０２３７】
それぞれのクローンのプラスミドDNAを、Qiaprep Spin Miniprep Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて単離し、制限酵素による消化により確認した。この方法で得られたプラスミドをpCLiK5MCSで示す。
【０２３８】
配列決定反応は、Sangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467のとおり実施した。配列決定反応物は、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)により分離し評価した。
【０２３９】
得られたプラスミドpCLiK5MCSを、配列番号13に示す。
【０２４０】
[実施例２]
プラスミドPmetA metAの調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。配列番号14および配列番号15のオリゴヌクレオチドプライマー、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、非コーディング5’領域を含むmetA遺伝子を増幅した。
【０２４１】
配列番号14：
5'-GCGCGGTACCTAGACTCACCCCAGTGCT-3'
および
配列番号15：
5'-CTCTACTAGTTTAGATGTAGAACTCGATGT-3'
得られた約1.3 kbのDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて単離した。続いて、制限酵素Asp718およびSpeI (Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、そしてDNA断片をGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製した。
【０２４２】
ベクターpClik5MCS（配列番号13）を、Asp718およびSpeI制限酵素で切断し、電気泳動後、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて5 kbの断片を単離した。
【０２４３】
前記ベクター断片を、Rapid DNA Ligation Kit(Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の記載情報のとおり用いて、PCR断片とライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０２４４】
プラスミドDNAを、Quiagenから入手した方法によりおよび材料を用いて調製した。配列決定反応は、Sangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467のとおり実施した。配列決定反応物は、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)により分離し評価した。
【０２４５】
得られたプラスミドpCLiK5MCS PmetA metAを、配列番号16に示す。
【０２４６】
[実施例３]
プラスミドpCLiK5MCS Psod metAの調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。配列番号17および配列番号18のオリゴヌクレオチドプライマー、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、スーパーオキシド・ジスムターゼ(Psod)の非コーディング5’領域（発現ユニット領域）由来の約200塩基対のDNA断片を増幅した。
【０２４７】
配列番号17：
5'-GAGACTCGAGAGCTGCCAATTATTCCGGG-3'
および
配列番号18：
5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGGGTAAAAAATCCTTTCG-3'
得られたDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。
【０２４８】
配列番号16のPmetA metAプラスミドをPCR反応の鋳型として、metAを配列番号19および配列番号20のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて部分的に増幅した。
【０２４９】
配列番号19
5'-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3'
および
配列番号20
5'-CTGGGTACATTGCGGCCC-3'
得られた約470塩基対のDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
【０２５０】
得られた上記2つの断片を、さらなるPCR反応において鋳型として共に使用した。PCR反応の過程において、配列番号18のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて誘導されたmetA-相同性配列は前記2つの断片を互いに結合させ、ポリメラーゼにより伸長され、連続的なDNA鎖を生じる。標準的方法に関しては、使用した配列番号17および配列番号20のオリゴヌクレオチドプライマーを2サイクル目の開始時に反応混合物に加える点のみを改良した。
【０２５１】
増幅した約675塩基対のDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。続いて、制限酵素XhoIおよびNcoI(Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、さらにゲル電気泳動で分画した。約620塩基対のDNA断片をその後、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いてアガロースから精製した。
【０２５２】
PmetA metAプラスミド（配列番号16）を、制限酵素NcoIおよびSpeI(Roche Diagnostics, Mannheim)で切断した。ゲル電気泳動により分画した後、約0.7 kbのmetA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いてアガロースから精製した。
【０２５３】
pClik5MCSベクター（配列番号13)を、制限酵素XhoIおよびSpeI(Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、そして電気泳動による分画の後、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて5 kbの断片を単離した。
【０２５４】
前記ベクター断片を、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の記載情報のとおり用いて、PCR断片およびmetA断片とライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０２５５】
プラスミドDNAは、Quiagenから入手した方法によりおよび材料を用いて調製した。配列決定反応は、Sangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467のとおり実施した。配列決定反応物は、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)を用いて分離し評価した。
【０２５６】
得られたプラスミドpCLiK5MCS PSODmetAを、配列番号21に示す。
【０２５７】
[実施例４]
プラスミドpCLiK5MCS P EF-TU metAの調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。配列番号22および配列番号23のオリゴヌクレオチドプライマー、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、スーパーオキシド・ジスムターゼ(Psod)の非コーディング5’領域（プロモーター領域）由来の約200塩基対のDNA断片を増幅した。
【０２５８】
配列番号22：
5'-GAGACTCGAGGGCCGTTACCCTGCGAATG-3'
および
配列番号23：
5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATTGTATGTCCTCCTGGAC-3'
得られたDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
【０２５９】
配列番号16のPmetA metAプラスミドをPCR反応の鋳型として、metAを配列番号24および配列番号25のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて部分的に増幅した。
【０２６０】
配列番号24：
5'-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3'
および
配列番号25：
5'-CTGGGTACATTGCGGCCC-3'
得られた約470塩基対のDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
【０２６１】
得られた上記2つの断片を、さらなるPCR反応で鋳型として共に使用した。PCR反応の過程で、配列番号18のオリゴヌクレオチドプライマーにより導入されたmetA-相同性配列は前記2つの断片を互いに結合させ、ポリメラーゼにより伸長され、連続的DNA鎖を生じる。標準的方法に関しては、配列番号22および配列番号25の使用したオリゴヌクレオチドプライマーを2サイクル目の開始時に反応混合物に加える点のみを改良した。
【０２６２】
増幅した約675塩基対のDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。続いて、制限酵素XhoIおよびNcoI(Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、そしてゲル電気泳動で分画した。約620塩基対のDNA断片をその後、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いて、アガロースから精製した。
【０２６３】
PmetA metAプラスミド（配列番号16）を、制限酵素NcoIおよびSpeI(Roche Diagnostics, Mannheim)で切断した。ゲル電気泳動により分画した後、約0.7 kbのmetA断片をGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いてアガロースから精製した。
【０２６４】
pClik5MCSベクター（配列番号13)を、制限酵素XhoIおよびSpeI(Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、そして電気泳動による分画の後、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて5 kbの断片を単離した。
【０２６５】
前記ベクター断片を、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の記載情報のとおり用いて、PCR断片およびmet A断片とともにライゲートした。ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０２６６】
プラスミドDNAを、Quiagenから入手した方法によりおよび材料で調製した。配列決定反応は、Sangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467のとおり実施した。配列決定反応物は、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)を用いて分離し評価した。
【０２６７】
得られたプラスミドpCLiK5MCS P_EFTUmetAを、配列番号26に示す。
【０２６８】
[実施例５]
プラスミドpCLiK5MCS Pgro metAの調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。配列番号27および配列番号28のオリゴヌクレオチドプライマー、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、GroES遺伝子（Pgro)の非コーディング5’領域（プロモーター領域）由来の約200塩基対のDNA断片を増幅した。
【０２６９】
配列番号27：
5'-GAGACTCGAGCGGCTTAAAGTTTGGCTGCC-3'
配列番号28：
5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGATGAATCCCTCCATGAG-3'
得られたDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
【０２７０】
PmetA metAプラスミドをPCR反応の鋳型として、metAを配列番号29および配列番号30のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて部分的に増幅した。
【０２７１】
配列番号29：
5'-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3'
配列番号30：
5'-CTGGGTACATTGCGGCCC-3'
得られた約470塩基対のDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
【０２７２】
得られた上記2つの断片を、さらなるPCR反応で鋳型として共に使用した。PCR反応の過程で、配列番号28のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて導入されたmetA-相同性配列は前記2つの断片を互いに結合させ、ポリメラーゼにより伸長され、連続的DNA鎖を生じる。標準的方法に関しては、配列番号27および配列番号30の使用したオリゴヌクレオチドプライマーを2サイクル目の開始時に反応混合物に加える点のみを改良した。
【０２７３】
増幅した約675塩基対のDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。続いて、制限酵素XhoIおよびNcoI(Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、さらにゲル電気泳動で分画した。約620塩基対のDNA断片をその後、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いて、アガロースから精製した。
【０２７４】
PmetA metAプラスミド（配列番号16）を、制限酵素NcoIおよびSpeI(Roche Diagnostics, Mannheim)で消化した。ゲル電気泳動により分画した後、約0.7 kbのmetA断片をGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いてアガロースから精製した。
【０２７５】
pClik5MCSベクター（配列番号13)を、制限酵素XhoIおよびSpeI(Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、そして電気泳動による分画の後、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて5 kbの断片を単離した。
【０２７６】
前記ベクター断片を、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の記載情報のとおり用いて、PCR断片およびmet A断片とともにライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０２７７】
プラスミドDNAを、Quiagenから入手した方法によりおよび材料で調製した。配列決定反応は、Sangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467のとおり実施した。配列決定反応物は、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)により分離し評価した。
【０２７８】
得られたプラスミドpCLiK5MCS Pgro metAを、配列番号31に示す。
【０２７９】
[実施例６]
プラスミドP EF-TS metAの調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。オリゴヌクレオチドプライマーBK 1849 (配列番号32)およびBK 1862 (配列番号33)、鋳型として染色体DNAならびにPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、ホモセリン-O-アセチルトランスフェラーゼをコードするMetaA遺伝子を増幅した。
【０２８０】
BK 1849 (配列番号32)
5'- GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG-3'
および
BK 1862 (配列番号33)
5'-ATGCCCACCCTCGCGCC-3'
得られた約1134 bpのDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
【０２８１】
オリゴヌクレオチドプライマーHaf 26 (配列番号34)およびHaf 27 (配列番号35)、鋳型として染色体DNAならびにPfu Turbo ポリメラーゼ (Stratagene)を用いて、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、伸長因子TSをコードする遺伝子の非コーディング5’領域（発現ユニット領域）由来の約200塩基対のDNA断片を増幅した。
【０２８２】
Haf 26 (配列番号34)
5'-GAGAGGATCCCCCCCACGACAATGGAAC-3'
および
Haf 27 (配列番号35)
5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATTACGGGGCGATCCTCCTTATG-3'
得られた約195 bpのDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
【０２８３】
Haf 27およびBK 1862プライマーは重複配列を含み、またその5'末端が互いに相同である。
【０２８４】
上記で得られたPCR産物を、プライマーBK 1849 (配列番号32)およびHaf 26 (配列番号34)を使用する別のPCRで鋳型として使用した。
【０２８５】
この方法により、予想サイズが1329 bpに相当するDNA断片を増幅した。このP EF-TS/metA融合体をその後、BamHIおよびSalI制限切断部位を介してpClik 5a MCSベクター(配列番号13)にクローニングした。
【０２８６】
前記ベクター断片を、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の記載情報のとおり用いて、PCR断片とともにライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０２８７】
プラスミドDNAを、Quiagenから入手した方法によりおよび材料を用いて調製した。配列決定反応は、Sangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467のとおり実施した。配列決定反応物は、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)を用いて分離し評価した。
【０２８８】
得られたプラスミドを、pClik 5a MCS P EF-TS metA（配列番号36）と示した。
【０２８９】
[実施例７]
プラスミドP EF-Tu pSOD metA (H473)の調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。オリゴヌクレオチドプライマーBK 1753 (配列番号37)およびBK 1754 (配列番号38)、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、GroELターミネーターを増幅した。
【０２９０】
BK 1753 (配列番号37)
GGATCTAGAGTTCTGTGAAAAACACCGTG
BK 1754 (配列番号38)
GCGACTAGTGCCCCACAAATAAAAAACAC
得られた約77 bpのDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製し、XbaIおよびBcuI制限酵素で切断し、再度精製した。
【０２９１】
pClik5MCSベクター(配列番号13)をXbaI制限酵素で線状化し、さらにGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。
【０２９２】
線状化ベクターは、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の記載情報のとおり用いて、PCR断片とともにライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０２９３】
プラスミドDNAは、Quiagenから入手した方法によりおよび材料を用いて調製した。配列決定反応は、Sangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467のとおり実施した。配列決定反応物は、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)を用いて分離し評価した。
【０２９４】
得られたプラスミドを、H247 (配列番号39)と示した。
【０２９５】
このプラスミドをBcuIおよびSalI制限酵素で処理し、さらにGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。
【０２９６】
オリゴヌクレオチドBK 1848 (配列番号40)およびBK 1849 (配列番号41)、鋳型としてpClik5MCS Psod metA (配列番号21)プラスミドおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を用いたPCRを、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により行った。増幅した断片は予測される長さが約1350 bpであり、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製し、BcuIおよびSalI制限酵素で切断し、再度精製した。
【０２９７】
この断片を、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の記載情報のとおり用いて、H247プラスミド（BculおよびSall切断部位）とライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, beschrieben(1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０２９８】
プラスミドDNAを、Quiagenから入手した方法によりおよび材料を用いて調製した。配列決定反応は、Sangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467のとおり実施した。配列決定反応物は、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)を用いて分離し評価した。
【０２９９】
得られたプラスミドはpG A4 (H344)とし、配列番号42に示す。
【０３００】
配列番号40 (BK 1848)
GAGAACTAGTAGCTGCCAATTATTCCGGG
配列番号41 (BK 1849)
GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG
pG A4 (配列番号42)プラスミドをXhoIおよびBcuI制限酵素で切断し、さらにGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。
【０３０１】
H473の構築:
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。オリゴヌクレオチドプライマーBK 1695 (配列番号43)およびHaf16 (配列番号44)、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、EF Tu遺伝子(Peftu)の非コーディング5’領域（発現ユニット領域）由来の約182塩基対のDNA断片を増幅した。
【０３０２】
配列番号43 (BK1695)
GAGACTCGAGGGCCGTTACCCTGCGAATG
配列番号44 (Haf16)
GAGAACTAGTGTGGCTACGACTTTCGCAGC
得られた約200 bpのDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製し、XhoIおよびBcuI制限酵素で切断し、再度精製した。
【０３０３】
この断片を、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の記載情報のとおり用いて、pG A4 (H344) プラスミド (XhoIおよびBcuI切断部位)とライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン (20μg/ml)含有LB寒天 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０３０４】
得られたプラスミドを、pClik5MCS PeftuPsod metA (H473)とした。これを配列番号45に示す。また、これは(5’から3’方向に)Peftuプロモーター、Psod発現ユニットおよびそれらのすぐ下流にmetAオープンリーディングフレームを含む。
【０３０５】
[実施例８]
プラスミドPsodPeftu metA (H505)の調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。オリゴヌクレオチドプライマー配列番号46(Haf64)および配列番号47(Haf65)、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、EF Tu遺伝子 (Peftu)の非コーディング5'領域（発現ユニット領域）由来の約200塩基対のDNA断片を増幅した。
【０３０６】
配列番号46 (Haf64)
GAGAACTAGTGGCCGTTACCCTGCGAATG
配列番号47 (Haf65)
GCGCGAGGGTGGGCATTGTATGTCCTCCTGGACTTC
得られた約200 bpのDNA 断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。
【０３０７】
オリゴヌクレオチドプライマー BK1862 (配列番号48)およびBK1849(配列番号49)、ならびに鋳型としてH344プラスミド (配列番号42)を用いた第２のPCRでは、metAオープンリーディングフレームをInnisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により増幅した。得られた約1140 bpの断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。
【０３０８】
配列番号48 (BK1862)
ATGCCCACCCTCGCGCC
配列番号49 (BK1849)
GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG
得られた上記2つの断片を、さらなるPCR反応で鋳型として共に使用した。
【０３０９】
PCR反応の過程で、配列番号47のオリゴヌクレオチドプライマーHaf65により導入されたmetA-相同性配列は前記2つの断片を互いに結合させ、ポリメラーゼにより伸長され、連続的なDNA鎖を生じる。標準的方法に関しては、使用したHaf 64およびBK 1849（配列番号46および配列番号49）のオリゴヌクレオチドプライマーを2サイクル目の開始時に反応混合物に加える点のみを改良した。
【０３１０】
増幅した約1350塩基対のDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。続いて、制限酵素BcuIおよびSalI(Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、さらにゲル電気泳動で分画した。約1340塩基対のDNA断片はその後、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いてアガロースから精製した。この断片は、metA ORFと融合したPeftu発現ユニット(= Peftu-metA断片)を含む。
【０３１１】
オリゴヌクレオチドプライマーBK 1697 (配列番号50)およびHaf17(配列番号51)、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turbo ポリメラーゼ (Stratagene)を用いて、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、SOD遺伝子(Psod)の非コーディング5’領域（発現ユニット領域）由来のDNA断片(全長: 193 bp、うち173 bpはpSOD)を増幅した。
【０３１２】
配列番号50 (BK 1697)
GAGACTCGAGAGCTGCCAATTATTCCGGG
配列番号51 (Haf 17)
GAGAACTAGTTAGGTTTCCGCACCGAGC
増幅したDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。続いて、制限酵素XhoIおよびBcuI (Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、さらにゲル電気泳動で分画した。約180塩基対のDNA断片をその後、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いてアガロースから精製した(これがPsod断片に相当する)。
【０３１３】
(H344) pG A4プラスミド（配列番号42)を、制限酵素XhoIおよびSalI (Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、さらにゲル電気泳動で分画した。その後、線状化ベクターを、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いてアガロースから精製した。
【０３１４】
この線状化ベクターを、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の記載情報のとおり用いて、２つの断片(Peftu-metA断片およびPsod断片）とライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０３１５】
プラスミドDNAを、Quiagenから入手した方法によりおよび材料を用いて調製した。配列決定反応は、Sangerら、Proceedings of the National Academy of Science USA 74:5463-5467 (1977)に従って実施した。配列決定反応は、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)を用いて分離し評価した。
【０３１６】
得られたプラスミドpClik5MCS PsodPeftu metAを、配列番号52に示す。
【０３１７】
[実施例９]
プラスミドpClik5MCS Pgro Psod metA (H472)の調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。オリゴヌクレオチドプライマー配列番号53 (BK1701)および配列番号54 (Haf18)、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法でポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、約175ヌクレオチドのDNA断片を増幅した。これは、GRO EL遺伝子(Pgro)の非コーディング5’領域 (発現ユニット領域)由来の155塩基対ならびに5’および3’末端にそれぞれ１つの制限酵素切断部位(それぞれXhoIおよびBcuI)を含む。
【０３１８】
配列番号53 (BK1701)
GAGACTCGAGCGGCTTAAAGTTTGGCTGCC
配列番号54  (Haf018)
GAGAACTAGTATTTTGTGTGTGCCGGTTGTG
得られた約175bpのDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。続いて、制限酵素XhoIおよびBcuI(Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、DNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製した。
【０３１９】
H344(配列番号42)プラスミドを、制限酵素XhoIおよびBcuIで切断し、そして電気泳動による分画の後、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて約6.4 kbの断片を単離した。
【０３２０】
PCR産物と開裂したH344プラスミドを、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の記載情報のとおり用いて、ライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０３２１】
プラスミドDNAを、Quiagenから入手した方法によりおよび材料を用いて調製した。配列決定反応は、Sangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467のとおり実施した。
【０３２２】
配列決定反応物は、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)を用いて分離し評価した。
【０３２３】
得られたプラスミドは、Psod発現ユニットおよびmetA ORFの直前にPgroプロモーターを含む。これはpCLiK5MCS PgroPsod metA (H472)として配列番号55に示す。
【０３２４】
[実施例１０]
プラスミドPgroPsod Pefts metA (H501)の調製
オリゴヌクレオチドプライマーBK1782 (配列番号56)およびHaf63 (配列番号57)、ならびに鋳型としてpClik5MCS Pgro Psod metA (配列番号55 (H472))プラスミドを用いたPCRを、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により実施した。増幅した断片は、約474の塩基対および3'末端にAcc65I切断部位を有するPgro-Psodカセットを含む。得られたDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。続いて、XhoIおよびAcc65I制限酵素で切断し、そしてDNA断片(333塩基対)を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製した。
【０３２５】
配列番号56 (BK1782)
TCGAGAGATTGGATTCTTAC
配列番号57 (Haf 63)
TCTCGGTACCCCGCACCGAGCATATACATC
H479(配列番号58)プラスミドは、metA ORFに融合したPefts発現ユニットを含む。これを（Peftsのすぐ上流で）XhoIおよびAcc65I制限酵素で切断し、そして電気泳動による分画の後、GFXTM  PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて約6.4 kbの断片を単離した。
【０３２６】
これをその後、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の記載情報のとおり用いて、PCR断片 (Pgro-Psodカセット)とライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０３２７】
プラスミドDNAを、Quiagenから入手した方法によりおよび材料を用いて調製した。配列決定反応物は、Sangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467のとおり実施した。配列決定反応物は、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)を用いて分離し評価した。
【０３２８】
得られたプラスミドは、metA ORFに融合した3個のプロモーターPgro、PsodおよびP EF -Tsを含む。これをpCLiK5MCS Pgro Psod Pefts metA (H501)として、配列番号59に示す。
【０３２９】
[実施例１１]
プラスミドPeftu Psod Pefts metA (H502)の調製
オリゴヌクレオチドプライマーBK1782 (配列番号56)およびHaf63 (配列番号57)、ならびに鋳型としてpClik5MCS Peftu Psod (配列番号45 (H473))プラスミドを用いたPCRを、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により実施した。増幅した断片は、約495塩基対であり3'末端にAcc65I切断部位を有するPeftu-Psodカセットを含む。得られたDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。続いて、制限酵素XhoIおよびAcc65Iで切断し、さらにDNA断片(354塩基対)を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製した。
【０３３０】
配列番号56 (BK1782)
TCGAGAGATTGGATTCTTAC
配列番号57 (Haf 63)
TCTCGGTACCCCGCACCGAGCATATACATC
H479(配列番号58)プラスミドは、metA ORFに融合したPefts発現ユニットを含む。これを（Peftsのすぐ上流で）XhoIおよびAcc65I制限酵素で切断し、そして電気泳動による分画の後、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて約6.4 kbの断片を単離した。
【０３３１】
その後、これをRapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の記載情報のとおり用いて、PCR断片(Peftu-Psodカセット)とライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０３３２】
プラスミドDNAを、Quiagenから入手した方法によりおよび材料を用いて調製した。配列決定反応は、Sangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467のとおり実施した。配列決定反応物は、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)を用いて分離し評価した。
【０３３３】
得られたプラスミドは、metA ORFに融合した3個の調節配列Peftu、PsodおよびP EF-Tsを含む。これをpCLiK5MCS Peftu Psod Pefts metA (H501)として配列番号60に示す。
【０３３４】
[実施例１２]
metA活性の測定
コリネバクテリウム・グルタミクム株 ATCC13032を、Lieblら, (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303に記載の方法により、プラスミドpClik5 MCS、pClik MCS Psod metA、pClik MCS Peftu metA、pClik5 MCS Pefts metA、pClik5 MCS Peftu Psod metA、pClik5 MCS Psod Peftu metA、pClik5 MCS Pgro Psod meta、pClik5 MCS Pgro Psod Pefts metA、pClik5 MCS Peftu Psod Pefts metAのいずれかを用いて形質転換した。形質転換混合物は、プラスミド保有細胞の選択を確実に行うために20 mg/l カナマイシンをさらに含むCMプレート上にプレーティングした。得られたカナマイシン耐性クローンを選出し、間引きした。
【０３３５】
前記プラスミド構築物のいずれかを含有するコリネバクテリウム・グルタミクム株を、MMA培地(40 g/lスクロース、20 g/l (NH4)2SO4、1 g/l KH2PO4、1 g/l K2HPO4、0.25 g/MgSO4×7H2O、54 gのAce、1 mlのCaCl2 (10 g/l)、1 mlのプロトカテケート (300 mg/10 ml)、1 mlの微量元素溶液(10 g/l FeSO4×/H2O、10 g/l MnSO4×H2O、2 g/l ZnSO4×7 H2O、0.2 g/l CuSO4、0.02 g/l NiCl2×6 H2O),100μg/l ビタミン B12, 0.3 mg/lチアミン、1mMロイシン、1 mg/lピリドキサール HCl、1 mlのビオチン (100 mg/l), pH 7.0)で、30℃で一晩生育した。細胞を4℃で遠心分離して取りだし、低温のTris-HCl緩衝液(0.1％, pH 8.0)で2回洗浄した。もう１度遠心分離した後、細胞を低温のTris-HCl緩衝液 (0.1％, pH 8.0)中にとり、そしてOD600を160に調整した。細胞を、この細胞懸濁液1mlを2 mlのHybaid Ribolyserチューブへ移すことによって分け、Hybaid Ribolyser内でそれぞれ30秒間、3回溶解させることを6.0回繰り返した。溶解物を、エッペンドルフ遠心分離管内で15000 rpm、4℃にて30分間遠心分離することで清澄化した。そして、この上澄液を新たなエッペンドルフチューブに移した。タンパク質成分を、Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72:248-254により定量した。
【０３３６】
MetAの酵素活性の測定は、次のとおりに行った。1 ml 反応混合物は、100 mMリン酸カリウム緩衝液 (pH 7.5)、5 mM MgCl2、100μMアセチル-CoA、5 mM L-ホモセリン、500μM DTNB (エルマン試薬)および細胞抽出物を含んでいた。アッセイは関連するタンパク質溶解物を加えて開始し、室温でインキュベートした。その後、反応速度を412 nmで10分間記録した。
【０３３７】
結果を表１aに示す。
【表１ａ】
2008212157.tif 000017
プロモーター/発現ユニットの様々な組合せを利用して、MetA活性を調節することができた。
【０３３８】
[実施例１３]
プラスミドpCIS lysCの構築
リシン産生株を作製するために、lysC野生型遺伝子の対立遺伝子をコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC1303中で置換した。この置換には、生成タンパク質中の311位のThrをIleで置換するように、lysC遺伝子中でヌクレオチドを置換することを含んでいた。染色体DNA（ATCC13032）をPCR反応の鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号61および配列番号62を用いて、製造業者の記載情報に基づきPfu-Turbo PCR Systems (Stratagene USA)を用いて、lysCを増幅した。
【０３３９】
配列番号61
5'-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3'
配列番号62
5'-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3'
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。増幅した断片は、その5’末端をSalI制限酵素で切断し、その3'末端をMluI制限酵素で切断することによりフランクにした。クローニングする前に、増幅した断片をこれら２つの制限酵素で消化し、そしてGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit（Amersham Pharmacia, Freiburg）を用いて精製した。
【０３４０】
得られたポリヌクレオチドを、制限酵素SalIおよびMluIによる切断により下記のとおりpCISと称されるpCLIK5 MCS組み入れSacB(配列番号63)にクローニングし、それを用いてE.coli XL-1 blueを形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。プラスミドを単離し、そして予測されるヌクレオチド配列を配列決定により確認した。プラスミドDNAを、Quiagenから入手した方法によりおよび材料を用いて調製した。配列決定反応は、Sangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467のとおり実施した。配列決定反応物は、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)を用いて分離し評価した。得られたプラスミドpCIS lysCを、配列番号64に示す。
【０３４１】
[実施例１４]
コリネバクテリウム・グルタミクム lysC遺伝子の突然変異生成
コリネバクテリウム・グルタミクム lysC遺伝子を、Quick-Change Kit (Stratagene/USA) を製造業者の記載情報のとおり用いて、特異的に突然変異生成させた。突然変異生成は、pCIS lysC（配列番号64）プラスミド内で行った。Quick-Change方法 (Stratagene)を用いて311位のThrを311位のIleで置換するために、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した:
配列番号65
5'-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3'
配列番号66
5'-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG-3'
これらのオリゴヌクレオチドプライマーをQuick-Change反応に使用し、lysC遺伝子（配列番号67）の932位のヌクレオチドを(CからTへ)置換した。lysC遺伝子中のアミノ酸置換（311位のThr→Ile）は、E.coli XL1-blueの形質転換およびプラスミドの調製後に、配列決定反応により確認した。プラスミドはpCIS lysC Thr311Ileとして示され、配列番号68に示す。
【０３４２】
pCIS lysC Thr311Ileプラスミドを、Lieblら, (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303に記載のエレクトロポーレーション法によりコリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032へ形質転換した。プロトコールの改良については、DE 10046870に記載されている。それぞれの形質転換体のlysC遺伝子座の染色体配置は、Sambrookら (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harborの記載のようにサザンブロットおよびハイブリダイゼーションによる標準的方法により確認した。これにより、形質転換体は、相同組換えによってlysC遺伝子座に形質転換したプラスミドが組み込まれていることが確認された。抗生物質を全く含まない培地でそのようなコロニーを一晩成長させた後、細胞をスクロースCM-寒天培地 (10％スクロース、10 g/lグルコース、2.5 g/l NaCl、2 g/l尿素、10 g/l Bacto Peptone (Difco)、10 g/l 酵母エキス、22.0 g/L寒天(Difco))上へプレーティングし、そして30℃で24時間インキュベートした。
【０３４３】
pCIS lysC thr311ile ベクター中に存在するsacB遺伝子はスクロースを毒性産物へと転換するので、野生型lysC遺伝子と突然変異したlysC thr311ile遺伝子の間の第２の相同組換えステップにより、sacB遺伝子を欠損させた場合にのみ、それらのコロニーは成長することができる。相同組換えでは、野生型遺伝子または突然変異遺伝子のいずれかについてsacB遺伝子と共に欠損させることが可能である。sacB遺伝子を野生型遺伝子と共に取り除いた場合には、変異した形質転換体がもたらされる。
【０３４４】
成長コロニーを取り出し、そしてカナマイシン感受性の表現型について調べる。sacB遺伝子を欠失したクローンは、同時にカナマイシン感受性の成長挙動を提示しなければならない。そのようなカナマイシン感受性クローンを、振とうフラスコ内で、そのリシン産生能について、試験した(実施例19を参照)。コントロールとして、未処理のコリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032を成長させた。コントロールと比べて、リシン産生能が向上したクローンを選択し、染色体DNAを回収し、lysC遺伝子に対応する領域をPCR反応で増幅して配列決定した。リシン合成能が向上した特性を有し、lysCの932位に突然変異を認めるこの種のクローンを、ATCC13032 lysCfbrと表した。
【０３４５】
[実施例１５]
プラスミドpCIS Peftu ddhの調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032 染色体DNAをTauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら(1994) Microbiology 140:1817-1828により調製した。オリゴヌクレオチドプライマー配列番号69 (Old38)および配列番号70 (Old 39)、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turbo ポリメラーゼ (Stratagene)を用いて、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法によってポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、EFTu遺伝子の非コーディング5’領域 (発現ユニット領域)由来の約200塩基対のDNA断片(Peftu)を増幅した。
【０３４６】
配列番号69 (Old38)
ACATCCATGGTGGCCGTTACCCTGCGAAT
配列番号70 (Old 39)
TGTATGTCCTCCTGGACTTC
得られた約200 bpのDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
【０３４７】
第２のPCRにおいて、オリゴヌクレオチドプライマーOld40 (配列番号71)および配列番号72 (Old 37)、ならびに鋳型としてコリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032 染色体DNAを用いて、ddhオープンリーディングフレームをInnisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により増幅した。得られた約1017 bpの断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
【０３４８】
Old 40 (配列番号71) 
GAAGTCCAGGAGGACATACAATGACCAACATCCGCGTAGC
Old 37 (配列番号72) 
GAAACCACACTGTTTCCTTGC
得られた上記2つの断片を、さらなるPCR反応にて鋳型として共に使用した。PCR反応の過程で、オリゴヌクレオチドプライマーOld40（配列番号71）を用いて導入されたPeftu-相同性配列は前記2つの断片を互いに結合させ、ポリメラーゼにより伸長され、連続的なDNA鎖を生じさせる。標準的方法に関しては、使用したオリゴヌクレオチドプライマーOld37およびOld 38(配列番号72および配列番号69)を2サイクル目の開始時に反応混合物に加える点のみを改良した。
【０３４９】
増幅した約1207塩基対のDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。続いて、制限酵素NcoIおよびXhoII(Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、そしてゲル電気泳動で分画した。その後、約1174塩基対のDNA断片をGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いて、アガロースから精製した。この断片は、ddh ORFに融合したPeftu発現ユニット(= Peftu-ddh断片)を含む。
【０３５０】
オリゴヌクレオチドプライマー Old 32(配列番号73)およびOld 33 (配列番号74)、鋳型として染色体DNA、ならびにPfu Turbo ポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法によってポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、ddh遺伝子の非コーディング5’領域由来のDNA断片を増幅した。
【０３５１】
配列番号73 (Old32)
ATCAACGCGTCGACACCACATCATCAATCAC
配列番号74 (Old33)
ATCACCATGGGTTCTTGTAATCCTCCAAAATTG
増幅したDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。続いて、制限酵素MluIおよびNcoI (Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、そしてゲル電気泳動で分画した。その後、約720塩基対のDNA断片をGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いて、アガロースから精製した（5’ dhh断片に相当する）。
【０３５２】
pCIS (配列番号63)プラスミドは制限酵素MluIおよびXhoI (Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、そしてゲル電気泳動で分画した。その後、線状化ベクターをGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いてアガロースから精製した。
【０３５３】
線状化ベクターを、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の記載情報のとおり用いて、2つの断片(Peftu-ddh断片および5’ ddh断片)とライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０３５４】
プラスミドDNAは、Quiagenから入手した方法によりおよび材料を用いて調製した。配列決定反応は、Sanger ら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467に従って実施した。配列決定反応物は、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)を用いて分離し評価した。
【０３５５】
得られたプラスミド pCIS Peftu ddhは、配列番号75に示す。
【０３５６】
[実施例１６]
pCIS PeftuPsod ddhの調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。配列番号76および配列番号77のオリゴヌクレオチドプライマー、鋳型として染色体DNAならびにPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法によりポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、ddh遺伝子の5’領域由来の約677塩基対のDNA断片を増幅した（5’dhh断片）。
【０３５７】
配列番号76 (CK461)
CCTGACGTCGCAATATAGGCAGCTGAATC
配列番号77 (CK466)
GCCCAATTGGTTCTTGTAATCCTCCAAAA
得られたDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。続いて、制限酵素AatIIおよびMunI (Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、そしてゲル電気泳動で分画した。その後、約661塩基対のDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いて、アガロースから精製した。得られた断片は、dhh ORFの5’領域を含む。
【０３５８】
P EF-Tu pSOD metA (H473) プラスミド(配列番号45)をPCR反応の鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号78および配列番号79を用いてPeftuPsodカセットを増幅した。
【０３５９】
配列番号78 (CK426)
CGCCAATTGTCGAGGGCCGTTACCCT
配列番号79 (CK463)
GCTACGCGGATGTTGGTCATGGGTAAAAAATCCTTTCGTA
得られた約378塩基対のDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
【０３６０】
ddh ORFは後続のPCRで増幅した。この目的のために、コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) プラスミド 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。オリゴヌクレオチドプライマー配列番号80 (CK464)および配列番号81 (CK467)、鋳型として染色体DNAならびにPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法によりポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、約992塩基対のDNA断片(ddh ORF)を増幅した。増幅したDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。
【０３６１】
配列番号80 (CK464)
TACGAAAGGATTTTTTACCCATGACCAACATCCGCGTAGC
配列番号81 (CK467)
AGACCCGGGTTAGACGTCGCGTGCGATCA
得られた上記2つの断片(PeftuPsodカセットおよびddh ORF)を、さらなるPCR反応において鋳型として共に使用した。PCR反応の過程で、配列番号80 (CK464)のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて導入されたPsod-相同性配列は前記2つの断片を互いに結合させ、ポリメラーゼにより伸長され、連続的なDNA鎖を生じさせる。標準的方法に関しては、使用した配列番号79 (CK426)および配列番号81 (CK467)のオリゴヌクレオチドプライマーを2サイクル目の開始時に反応混合物に加える点のみを改良した。
【０３６２】
増幅した約1359塩基対のDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。
【０３６３】
続いて、これを制限酵素MunIおよびSmaI(Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、そしてゲル電気泳動で分画した。約1359 塩基対のDNA断片をその後、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いて、アガロースから精製した。
【０３６４】
得られた断片は（5’から3’方向に)Peftuプロモーター、Psod発現ユニットおよびそれらのすぐ下流にddhオープンリーディングフレームを含む(PeftuPsod ddh)。
【０３６５】
pCISベクターをAatIIおよびSmaI制限エンドヌクレアーゼで切断し、アルカリホスファターゼ(I (Roche Diagnostics, Mannheim))を製造業者の記載情報のとおり用いて脱リン酸化した。0.8％強度のアガロースゲルで電気泳動後、線状化ベクター(約4.2 kb)をGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて、単離した。このベクター断片を、Rapid DNA Ligation1 Kit (Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の記載情報のとおり用いて、２つの切断PCR断片(5’ddhおよびPeftuPsod ddh)とライゲートした。そして、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
【０３６６】
それぞれのクローンのプラスミドDNAは、Qiaprep Spin Miniprep Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて単離し、また制限酵素による消化により確認した。2つの正確なプラスミドを配列決定した。配列決定反応は、Sangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467のとおり実施した。配列決定反応物は、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)を用いて分離し評価した。生成したプラスミド（pClik Peftu Psod ddh）は、2つの連続的な組換え事象によりddh ORFの染色体上流にPeftuPsodカセットを組み込むのに、好適である。pCIS PeftuPsod ddhプラスミドは、配列番号82に示す。
【０３６７】
[実施例１７]
ATCC13032 lysCfbr Peftu ddh株およびATCC13032 lysCfbr PeftuPsod ddh株の作製
E. coli株 Mn522 (Stratagene, Amsterdam, The Netherlands)の細胞を、プラスミドpCIS Peftu ddhおよびpCIS PeftuPsod ddhのいずれか、またプラスミド pTc15AcglMを用いて、Lieblら (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303のとおりに形質転換した。pTc15AcglMプラスミドは、コリネバクテリウム・グルタミクムのメチル化パターンに従って、DNAをメチル化することができる(DE 10046870)。このメチル化により、コリネバクテリウム・グルタミクム細胞中のpCIS Peftu ddhおよびpCIS PeftuPsod ddhプラスミドの安定性が向上する。次に、プラスミドDNAをMn522細胞から標準的方法により単離し、そしてエレクトロポーレーション法により上記コリネバクテリウム・グルタミクム株 ATCC 13032 ask (fbr)に導入した。このエレクトロポーレーションおよび後続のカナマイシン (25μg/ml)含有CMプレー上での選択により、複数のトランスコンジュガント（transconjugant）を生じた。ベクターの切除を必要とする第２の組換え事象について選択するために、該トランスコンジュガントはカナマイシンを含まないCM培地で一晩生育し、続いて選択のため10％スクロース含有CMプレート上にプレーティングした。pCISベクター上に存在するsacB遺伝子は酵素レバンスクラーゼをコードし、スクロース上で成長し、レバンの合成を導く。レバンはコリネバクテリウム・グルタミクムに対し毒性があるので、第２の組換えステップにより組み込みプラスミドを失ったコリネバクテリウム・グルタミクム細胞のみがスクロース含有培地上で成長した(Jaegerら, Journal of Bacteriology 174 (1992) 5462-5466)。100個のスクロース耐性クローンをそのカナマイシン感受性について調べた。試験した複数のクローンでは、スクロースに対する耐性に加え、ベクター配列の所望な切除に伴うと予測されるカナマイシンへの感受性も検出された。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用して、PeftuまたはPeftuPsod発現ユニットが所望されるように取込まれたか否かを確認した。PCRの最後に、特定のクローンを寒天プレートから爪楊枝を使用して取り出し、100μlの水に懸濁し、そして95℃で10分間煮沸した。得られた10μlの溶液をその都度、PCRの鋳型として使用した。使用したプライマーは、導入される発現ユニットおよびddh遺伝子と相同的なオリゴヌクレオチドであった。PCR条件は以下のとおり選択した:最初の変性：95℃で5分間;変性：95℃で30秒間;ハイブリダイゼーション：55℃で30秒間;増幅：72℃で2分間;30サイクル：最後の伸長：72℃で5分間。開始株のDNAを含む反応混合物では、オリゴヌクレオチドを選択してもいかなるPCR産物も産生しなかった。第２の組換えの結果として、PeftuまたはPeftuPsod発現ユニットがddh遺伝子の5'末端と隣接して組み込まれた場合にのみ、クローンのバンドが得られると予測された。ここで、試験で陽性だったクローンに組み込むことができた場合には、さらに（例えばSambrookら (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989))に記載の標準的方法により）サザンブロット解析による確認も行った。ここで、制限酵素を用いて2つの異なる加水分解を、作製しようとする株それぞれについて行った。この加水分解により、開始株(ATCC13032 ask (fbr))と所望の株を明確に区別することができる。さらに、得られた株は染色体にカナマイシン遺伝子を含まないという事実を、カナマイシン耐性遺伝子と相同的なプローブを用いて確認した。このように、以下の株を作製した:
ATCC13032 lysCfbr Peftu ddh
ATCC13032 lysCfbr PeftuPsod ddh
これらの株は全てフィードバック調節を解除するask遺伝子を含んでいるので、リシンを産生する。これらは、ddh遺伝子の転写を制御する調節ユニットのみが互いに異なる。
【０３６８】
[実施例１８]
リシン産生における二重プロモーターによるddh増強効果
二重プロモーターを用いたddh遺伝子の増強効果について調べるため、次の株をリシン産生について調べた。
【０３６９】
ATCC13032 lysCfbr  
ATCC13032 lysCfbr  Peftu ddh
ATCC13032 lysCfbr  Peftu Psod ddh
この目的のため、株はCMプレート(10.0 g/L D-グルコース、2.5 g/L NaCl、2.0 g/L 尿素、10.0 g/L Bacto Peptone (Difco)、5.0 g/L 酵母エキス(Difco)、5.0 g/L牛肉エキス(Difco)、22.0 g/L寒天(Difco)、20分間121℃で加熱滅菌)上で、30℃で3日間生育した。その後、細胞をプレートから擦り取り、生理食塩水に再懸濁した。100 ml三角フラスコ中にて、主培養液（10 mlの培養液Ｉおよび0.5 gの加熱滅菌したCaCO3 (Riedel de Haen)）に、OD600が1.5になるように細胞懸濁液を接種し、そしてInfors AJ118 (Infors, Bottmingen, Switzerland)にて220 rpm、40時間インキュベートした。その後、培養液中へ分泌されたリシンの濃度を測定した。
【０３７０】
培養液 I:
40 g/l  スクロース    
60 g/l  (100％糖成分に基づく)糖蜜
10 g/l  (NH4)2SO4
0.4 g/l  MgSO4*7H2O
0.6 g/l  KH2PO4
0.3 mg/l  チアミン*HCl
1 mg/l  ビオチン(濾過滅菌し、NH4OHでpH 8.0に調製した1 mg/mlの原液から)
2 mg/l  FeSO4
2 mg/l  MnSO4
NH4OHでpH 7.8に調製し、加熱滅菌した(121℃、20分間)。
【０３７１】
さらに、ビタミンB12 (ヒドロキシコバラミン, Sigma Chemicals)を、原液(濾過滅菌した200μg/ml)から最終濃度100μg/lとなるように加えた。
【０３７２】
アミノ酸濃度は、Agilent 1100 Series LC System HPLCにおいて、アジレント社の説明書のとおり、高圧液体クロマトグラフィー法により測定した。オルト-フタルアルデヒドを用いたガードカラム誘導体化により、形成されたアミノ酸の定量を行うができ、またアミノ酸混合物はHypersil AA カラム(Agilent)で分画する。本試験の結果を以下の表に示す。
【０３７３】
2008212157.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【０３７４】
【図１】図１は、例示的実施形態に記載した多重プロモーターの作製に用いた４つのプロモーターの特異的配列を表す。pEFTu(図1A)、プロモーターpGRO(図1B)、プロモーターpEFT(図1C)およびプロモーターpSOD(図1D)のプロモーター配列が示される。各プロモーターにつき2つの配列が示され、長い方の配列（上の配列）はいずれの場合にも、リボソーム結合部位(RBS)を含む完全なプロモーター配列を示し、太字のイタリック体で印刷されている。本発明の多重プロモーター構築物における特定のプロモーターの3'末端配列についてはいずれの場合にも、長い方のヌクレオチド配列(RBSを含む)を用いることが好ましい。3'末端プロモーターユニットの5'上流のプロモーター配列は、いずれのRBSも含まず、いずれの場合にも第2ポジション（RBSを含まない）に示される切断核酸配列に使用した。短い方のプロモーター配列もまた、適切な場合、大文字の太字で示される3'末端部分配列を欠いていてもよい。潜在的「-10領域」には下線を引いた。
【図１】
2008212157.tif 000019
【配列表】
2008212157000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月22日(2008.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式I:
5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3'    (I)
（式中、
nは0〜10の整数であり、
AxおよびAyは、同一または異なり、かつ化学結合またはリンカーの核酸配列であり；
P1、PxおよびPyは、少なくとも1つのRNAポリメラーゼ結合部分を含む、同一のまたは異なるコリネフォルム細菌に由来する同一のまたは異なるプロモーター配列をコードし；また
少なくともPyは、リボソーム結合媒介性3'末端配列部分を含む）
の配列モジュールを5'から3'方向に含む、多重プロモーター含有型組換発現ユニット。
【請求項２】
P1、PxおよびPyが、それぞれ、前記生物のゲノム中のタンパク質コーディング配列の5'上流に位置する35〜500ヌクレオチド残基の連続配列に由来する、請求項１に記載の発現ユニット。
【請求項３】
P1、PxおよびPyが、互いに独立して、生物中に多量に存在するタンパク質のコーディング配列用のプロモーター配列のなかから選択される、請求項１または２に記載の発現ユニット。
【請求項４】
P1、PxおよびPyが、互いに独立して、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４のなかから選択される、請求項１〜３のいずれか1項に記載の発現ユニット。
【請求項５】
前記プロモーターが、強力な、構成的プロモーターまたは調節可能プロモーターのなかから選択される、請求項１〜４のいずれか1項に記載の発現ユニット。
【請求項６】
以下の式II:
5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-G-3'    (II)
（式中、
n、Ax、Ay、P1、PxおよびPyは、上記に定義されるとおりであり、かつ
Gは、5'上流の調節配列に機能的に連結された少なくとも1つのコーディング核酸配列である）
の配列モジュールを5'-3'方向に含む、発現カセット。
【請求項７】
Gが、以下：
a)  タンパク質構成アミノ酸および非タンパク質構成アミノ酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
b)  ヌクレオチドおよびヌクレオシドの生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
c)  有機酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
d)  脂質および脂肪酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
e)  ジオールの生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
f)  炭水化物の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
g)  芳香族化合物の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
h)  ビタミンの生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
i)  補因子の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；
j)  酵素の生合成経路のタンパク質をコードする核酸；および
k)  中央代謝のタンパク質をコードする核酸、
から選択される、請求項６に記載の発現カセット。
【請求項８】
核酸が、以下：
アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンテターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、転写調節因子LuxR、転写調節因子LysR1、転写調節因子LysR2、リンゴ酸キノンオキシドレダクターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、ホモセリン-O-アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニン-γ-シンターゼ、シスタチオニン-β-リアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、ホスホセリンホスファターゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニン輸送担体、トレオニンデヒドラターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、リシンエクスポーター、ビオチンリガーゼ、システインシンターゼI、システインシンターゼII、補酵素B12依存性メチオニンシンターゼ、補酵素B12非依存性メチオニンシンターゼ活性、スルフェートアデニリルトランスフェラーゼサブユニット1および2、ホスホアデノシンホスホ硫酸レダクターゼ、フェレドキシン亜硫酸レダクターゼ、フェレドキシンNADPレダクターゼ、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、RXA00655調節因子、RXN2910調節因子、アルギニルtRNAシンテターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、トレオニン排出タンパク質（threonine efflux protein）、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ、硫酸還元タンパク質RXA077、硫酸還元タンパク質RXA248、硫酸還元タンパク質RXA247、OpcAタンパク質、1-ホスホフルクトキナーゼ、6-ホスホフルクトキナーゼ、テトラヒドロピコリン酸スクシニラーゼ、スクシニルアミノケトピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、スクシニルジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、およびリンゴ酸酵素、
から選択される、アミノ酸生合成経路のタンパク質をコードする、請求項７のa)に記載の発現カセット。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか1項に記載の発現カセットを少なくとも1つ含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターの少なくとも1つで形質転換されているか、または請求項６〜８のいずれか1項に記載の発現カセットを少なくとも1つ含む、遺伝子改変微生物。
【請求項１１】
コリネフォルム細菌に由来する、請求項１０に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１２】
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の細菌に由来する、請求項１１に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１３】
統合型発現カセットを少なくとも1つ含む、請求項１０〜１２のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物を培養すること、および該培養物から所望の産物を単離することを含んでなる、生合成産物の調製方法。
【請求項１５】
前記生合成産物が、有機酸、タンパク質、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、タンパク質構成アミノ酸および非タンパク質構成アミノ酸の両方、脂質および脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミンおよび補因子、酵素およびタンパク質のなかから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
産物の生合成を調節するための、請求項１〜５のいずれか1項に記載の発現ユニットの使用。