(57)【要約】      （修正有）【課題】高純度のジオール体を効率よく製造できるジオール体の製造方法の提供。【解決手段】スクラレオール及び／又はスクラレオリドを基質として微生物変換により得られる培養液を、目開き１０〜１００μｍのフィルターを用いて濾過し、水或いはSP値８．３〜２０(cal/cm3)1/2以外の溶剤で洗浄した後、得られたケークをSP値８．３〜２０(cal/cm3)1/2の溶剤に溶解し、次いで濾過或いは遠心分離することを特徴とする式（２）2008212087.tif 000010で表されるジオール体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（１a）及び／又は（１b）
【化１】
2008212087.tif 000008
で表される化合物を基質として微生物変換により得られる培養液を、目開き１０〜１００μｍのフィルターを用いて濾過し、フィルター上の残渣を水或いはSP値８．３〜２０(cal/cm3)1/2以外の溶剤で洗浄した後、得られたケークをSP値８．３〜２０(cal/cm3)1/2の溶剤に溶解し、次いで溶解液を濾過或いは遠心分離することを特徴とする式（２）
【化２】
2008212087.tif 000009
で表されるジオール体の製造方法。
【請求項２】
前記SP値８．３〜２０(cal/cm3)1/2以外の溶剤がヘキサン、シクロヘキサン、３０％以下のエタノール水溶液又は水であり、SP値８．３〜２０(cal/cm3)1/2の溶剤がエタノール、メタノール、１-プロパノール、２−プロパノール、酢酸、トルエン、酢酸エチル、１−ペンタノール、アセトン又はジエチレングリコールである請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記培養液が、式（１a）及び／又は（１b）で表される化合物、スクラレオリド並びに式（２）で表されるジオール体を含む培養液である請求項１又は２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンブロキサンの製造中間体として有用なジオール体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンブロキサン（ドデカハイドロ−３ａ,６，６，９ａ−テトラメチルナフト［２，１−ｂ］フラン）は、抹香鯨の体内に生ずる病的分泌物アンバーグリースに含まれている香気成分で、アンバー系合成香料として欠かせない重要化合物である。アンブロキサンは、主にクラリーセージ（Salvia sclarea L.）から抽出されたスクラレオールを出発原料として化学合成法により製造されている。アンブロキサンの中間体としては、スクラレオリド（デカハイドロ−３ａ,６，６，９ａ−テトラメチルナフト［２，１−ｂ］フラン−２（１Ｈ）−オン）及びジオール体（１，１，４ａ，６−テトラメチル−５−（β−ハイドロキシエチル）−６−ハイドロキシ−デカハイドロナフタレン）が知られている。
しかしながら、上記化学合成法では環境負荷が大きく、また収率、純度を十分に確保できないという問題があった。そこで、スクラレオールから微生物変換によりアンブロキサン中間体を得、これを環化させてアンブロキサンを製造する方法が報告されている（例えば特許文献１及び２）。
【特許文献１】特開平３−２２４４７８号公報
【特許文献２】特開昭６２−７４２８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記特許文献１及び２において、微生物変換により得られたジオール体の分離・精製は、培養液を酢酸エチルにより溶剤抽出した後、乾燥して得られた抽出物を温ヘキサン／酢酸エチル又はヘキサン／クロロホルムに溶解し、溶解液から結晶化することにより行っている。しかしながら、培養液中にはジオール体の他に未反応のスクラレオールやスクラレオリド、培地成分等が混在しており、酢酸エチル等を用いた従来の溶剤抽出法では、ジオール体以外の成分も同時に回収されてしまい、ジオール体のみの分離・精製は非常に困難であることが判明した。また、スクラレオリドの精製方法（米国特許第５，９４５，５４６号明細書）を参考に溶剤抽出後、酸やアルカリ溶液で洗浄しても色相改善効果は得られるものの、組成に殆ど変化がなく、高純度のジオール体は得られないことも判明した。
従って、本発明の目的は、高純度のジオール体を効率よく製造できるジオール体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者はジオール体の分離精製手段について検討したところ、ジオール体とスクラレオリドはいずれも水に不溶であるにもかかわらず、培養液を特定メッシュのフィルターで濾過した後水洗することにより両者を分離できることを見出した。また、エタノール等特定の溶媒に対するジオール体の溶解度が大きく、水洗後得られたケークをこれら溶媒に溶解することにより不純物を除去することができ、高純度のジオール体を高収率で回収できることを見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は、次の式（１a）及び／又は（１b）
【０００６】
【化１】
2008212087.tif 000002
【０００７】
で表される化合物を基質として微生物変換により得られる培養液を、目開き１０〜１００μｍのフィルターを用いて濾過後、フィルター上の残渣を水或いはSP値８．３〜２０(cal/cm3)1/2以外の溶剤で洗浄し、次いで得られたケークをSP値８．３〜２０(cal/cm3)1/2の溶剤に溶解し、次いで溶解液を濾過或いは遠心分離することを特徴とする式（２）
【０００８】
【化２】
2008212087.tif 000003
【０００９】
で表されるジオール体の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、アンブロキサンの製造中間体として有用なジオール体を高純度で効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、微生物変換に利用できる微生物としては、前記式（１a）及び／又は(１b)で表される化合物を基質としてアンブロキサン中間体であるジオール体を生成する能力を有する微生物であれば特に限定されないが、例えば子嚢菌網（Ascomycetes）に属する微生物、クリプトコッカス（Cryptococcus）属に属する微生物、担子菌網に属する微生物、ハイホジーマ（Hyphozyma）属に属する微生物等が挙げられる。これらのうち、アンブロキサン中間体であるジオール体の生成効率の点から、子嚢菌網に属する微生物、ハイホジーマ属に属する微生物が好ましい。子嚢菌網に属する微生物としては、例えば、Ascomycete sp. KSM-JL2842と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにFERM P-20759として寄託された微生物が挙げられる。ハイホジーマ属に属する微生物としては、例えば特許第2547713号明細書に記載のATCC20624株が挙げられる。
【００１２】
上記微生物は、アンブロキサン中間体であるジオール体の生成能を指標として土壌から単離することができる。アンブロキサン中間体であるジオール体の生成能は供試微生物を前記式（１a）及び／又は(１b)で表される化合物含有培地にて培養し、培地中に含まれるアンブロキサン中間体であるジオール体を検出することで評価することができる。アンブロキサン中間体であるジオール体の検出は、例えばガスクロマトグラフィー（GC）、気液クロマトグラフィー（GLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、赤外スペクトル（IR）、核磁気共鳴（NMR）等従来公知の分析方法を用いることができる。
【００１３】
微生物を培養する際の培養条件としては特に限定されず、前記式（１a）及び／又は(１b)で表される化合物を含み、該微生物が生育可能である培地であればいかなる組成の培地をも使用することができる。使用可能な培地としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、有機酸塩等の炭素源；無機・有機アンモニウム塩、窒素含有有機物、アミノ酸等の窒素源；塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等の金属ミネラル類及びビタミン類等を含有する固体培地及び液体培地等を挙げることができる。また、培養条件等に応じて界面活性剤や消泡剤を添加してもよい。
【００１４】
至適ｐＨ範囲及び至適温度は特に限定されず、例えばｐＨ３〜８、好ましくはｐＨ４〜８、より好ましくはｐＨ５〜７で、１０〜３５℃、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは２０〜３０℃である。培養は、振盪培養、嫌気培養、静置培養、醗酵層による培養の他、休止菌体反応及び固定化菌体反応も用いることができる。
【００１５】
培地に添加する前記式（１a）及び／又は(１b)で表される化合物の濃度は、アンブロキサン中間体であるジオール体の生成効率の点から０．１〜５０質量％とすることが好ましい。基質は培養に先立って培地に添加してもよく、培養途中で添加してもよい。
【００１６】
本発明においては、先ず前記微生物変換により得られた培養液を目開き１０〜１００μｍのフィルターで濾過する。当該濾過により培養液中に含まれる菌体等の不純物を除去することができる。フィルターの口径が目開き１０μｍより小さいと目詰まりを起こし閉塞してしまい、他方目開き１００μｍより大きいとジオール体の収率が悪くなる。フィルターの口径は、ジオール体の回収率及び純度向上の点から、目開き１０〜９０μｍが好ましく、更に目開き１０〜７５μｍが好ましく、特に回収率と純度及び濾過効率の点から目開き２０〜４０μｍが好ましい。
【００１７】
濾過手段としては、吸引濾過、加圧濾過、遠心濾過のいずれでも実施可能であるが、収率の観点から特に吸引濾過が好ましい。フィルターの材質としては、種々のものを用いることができ、具体的にはポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン等の樹脂製、セラミック製、金属製等を用いることができる。
【００１８】
次いで、フィルター上の残渣を水或いはSP値８．３〜２０(cal/cm3)1/2以外の溶剤で洗浄する。当該洗浄操作により、培養液中に含まれるスクラレオールやスクラレオリド、培地成分等の不純物を除去することができる。洗浄液としてSP値が８．３〜２０(cal/cm3)1/2の範囲にある溶剤を用いると、スクラレオールやスクラレオリドを溶解するが、ジオール体も溶解してしまう。ここで用いる溶剤へのジオール体の溶解度は０．２％以下であることが好ましく、特に０．１％以下であることが好ましい。ここで、SP値とは、溶解度パラメーターを示し、例えば、参考文献「SP値基礎・応用と計算方法」（株式会社情報機構，２００５年）等に記載されている。SP値８．３〜２０(cal/cm3)1/2以外の溶剤としては、例えば、ヘキサン（SP値７．２）、シクロヘキサン（SP値８．２）、水（SP値２３．４）、３０％以下のエタノール水溶液等が挙げられる。これらは１種単独でも２種以上を組み合わせても用いることができる。また、水、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸エチル等の溶剤を適宜混合しSP値が８．３〜２０(cal/cm3)1/2以外になるように調整した混合溶剤を用いてもよい。なお、SP値は２０℃での値であり、混合溶剤の場合は混合後のSP値である。ここで混合溶媒のSP値は、各溶剤のSP値を体積比により平均した値を用いる。洗浄液は、ジオール体の回収率及び純度向上の点から、水、SP値８．３〜２０(cal/cm3)1/2以外の溶剤が好ましく、更に水、SP値７．５〜２０(cal/cm3)1/2以外の溶剤が好ましく、特に水が好ましい。
【００１９】
洗浄操作の回数は、スクラレオールやスクラレオリドを除去し、ジオール体を残存させることができる点から１〜６回が好ましく、更に２〜３回が好ましい。また、１回の洗浄に用いる洗浄液の量は、培養液１００mLあたり１００mLとするのが好ましい。洗浄液の温度は、５〜９０℃が好ましい。
【００２０】
次いで、分離・分別されて得られたケークをSP値８．３〜２０(cal/cm3)1/2の溶剤に溶解する。SP値８．３〜２０(cal/cm3)1/2以外の溶剤ではジオール体の溶解度が低く、収率が悪くなる。
SP値８．３〜２０(cal/cm3)1/2の溶剤としては、例えばメタノール（SP値１４．５）、エタノール（SP値１３．０）、１−プロパノール（SP値１２．０）、２−プロパノール（SP値１１．５）、１−ペンタノール（SP値１０．６）等の低級アルコール類；酢酸エチル（SP値９．１）、酢酸（SP値１０．５）、エチレングリコール（SP値１６．１）、ジエチレングリコール（SP値１４．６）、グリセリン（SP値１６．５）、トルエン（SP値８．９）、アセトン（SP値９．９）等が挙げられる。これらは１種単独でも２種以上を組み合わせても用いることができる。また、水、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸エチル等の溶剤を適宜混合しSP値が８．３〜２０(cal/cm3)1/2になるように調整した混合溶剤を用いてもよい。これらのうち、ジオール体の回収率及び純度向上の点から、SP値８．９〜１８．１(cal/cm3)1/2の溶剤が好ましく、更にSP値１０．５〜１７(cal/cm3)1/2の溶剤が好ましく、特にエタノール又はエタノール水溶液が好ましい。エタノール水溶液中のエタノール濃度は、ジオール体の溶解性の点から６０〜９９．５％濃度であることが好ましい。
ケーク溶解に用いる溶剤の量は、ジオール体の溶解性の点から、ケーク１００ｇに対して１００〜５００mLとするのが好ましい。また、溶剤の温度は、２０〜６０℃が好ましい。
【００２１】
次いで、溶解液を濾過或いは遠心分離し、微生物断片等の不純物を除去する。
フィルターの大きさは、ジオール体の回収率及び純度向上の点から、目開き０．１〜１０μｍが好ましく、特に目開き０．２〜１μｍが好ましい。濾過手段及びフィルターの材質としては、前記と同様のものを挙げることができる。
また、遠心分離機は、分離板型、円筒型、デカンター型等の一般的な機器が好ましい。遠心分離条件としては、温度が５〜６０℃、更に２０〜３０℃であるのが好ましく、回転数と時間は、例えば円筒型の場合、２０００〜１２０００ｒ／ｍｉｎ、更に３０００〜１２０００ｒ／ｍｉｎ、特に１００００〜１２０００ｒ／ｍｉｎで、１〜３０分、更に２〜１０分、特に５〜１０分であるのが好ましい。
【００２２】
得られた濾過液又は上澄み液から、乾燥することにより高純度のジオール体を収率よく得ることができる。乾燥温度は室温〜９０℃が好ましく、減圧乾燥を行ってもよい。
ジオール体は、酸性触媒、例えばｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸クロリド、触媒量の硫酸及び酸性イオン交換体を用いて、種々の溶媒中で脱臭環化によりアンブロキサンに変換される。
【実施例】
【００２３】
［微生物変換１］
Hyphozyma roseoniger ATCC20624株を２．１％YMブロスに１白金耳植菌し、25℃にて３日間振盪培養したものを種菌とした。次いで、２．１％YMブロス、0.1％硫酸マグネシウムからなる培地に植菌し、１L培養槽にて25℃、０．５vvm、４００r/minにて2日通気撹拌培養を行った後、１０％Tween８０、２０％スクラレオールからなる基質を最終濃度が、スクラレオール４％になるように適時添加し、基質添加から５日間１N  NaOHおよび１N  HClによるｐH６．０制御の通気撹拌培養を行った。得られた培養液を培養液１とした。
【００２４】
［微生物変換２］
Ascomycete sp. KSM-JL2842株を２．１％YMブロスに１白金耳植菌し、25℃にて３日間振盪培養したものを集菌し、生理食塩水にて3回洗浄した後、0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)、0.1％硫酸マグネシウム、３％Tween80、６％スクラレオールからなる培地と混合し、１L培養槽にて25℃、０．５vvm、４００r/minにて１０日間休止菌体反応を行った。
得られた培養液を培養液２とした。
【００２５】
［微生物変換３］
菌株をAscomycete sp. KSM-JL2842株とした以外は、微生物変換１と同じ方法にて培養を行った。得られた培養液を培養液３とした。
【００２６】
［分析法］
スクラレオール、スクラレオリドおよびジオール体の分析法は、酢酸エチルにて抽出し、適宜希釈してガスクロマトグラフィー（GC）分析を行った。GC分析装置は6890N GC System（Agilent technologies社）で行い、分析条件は以下のとおりである。検出器としてはFID（Flame Ionization Detector）（Agilent technologies社）を使用し、注入口温度を250℃とし、注入法をスプリットモード（スプリット比100：1）とし、トータルフローを200ml/分とし、カラム流速を0.4ml/分とし、カラムはDB-WAX（φ0.1mm×10m）（Ｊ＆Ｗ社）を使用し、オーブン温度を250℃とした。
【００２７】
実施例１〜４
ATCC20624株を用い微生物変換して得られた培養液１(30mL)を、それぞれ表１に示す口径のフィルターで吸引濾過した後、３０mLの蒸留水（SP値２３．４）を用いて３回洗浄を繰り返した。次いで、得られたケークをエタノール(和光純薬工業（株）、特級試薬)（SP値１３．０）(30mL)にそれぞれ溶解し、各溶解液を0.2μmのフィルターで濾過した後、濾過液を減圧乾燥することによりジオール体の結晶を得た。結果を表１に示す。
【００２８】
比較例１及び２
ATCC20624株を用い微生物変換して得られた培養液１を目開き５μm、150μmのフィルターでそれぞれ吸引濾過した以外は、実施例１と同様にしてジオール体の結晶を得た。結果を表１に示す。
【００２９】
比較例３
ATCC20624株を用い微生物変換して得られた培養液１(20mL)と酢酸エチル(和光純薬工業（株）、特級試薬)（60mL）を混合し、遠心分離（3000rpm、５分間）した後上清(54mL)を回収した。次いで、更に遠心分離（3000rpm、５分間）した後上清を回収し、減圧乾燥することによりジオール体の結晶を得た。結果を表１に示す。
【００３０】
比較例４
ATCC20624株を用い微生物変換して得られた培養液１(20mL)を遠心分離（3000rpm、５分間）した後沈殿を回収し、酢酸エチル(和光純薬工業（株）、特級試薬)（60mL）と混合した。次いで、この混合液を更に遠心分離（3000rpm、５分間）した後上清を回収し、減圧乾燥することによりジオール体の結晶を得た。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
2008212087.tif 000004
【００３２】
表１の結果から、培養液を口径１０〜１００μmのフィルターを用いて吸引濾過することにより、高純度のジオール体を収率よく得られるのに対し、口径５μmのフィルターでは閉塞してしまいジオール体を回収することができず、口径150μmのフィルターではジオール体の収率が悪くなることが分かった。また、培養液を直接酢酸エチルにより抽出した場合は、培養液中のスクラレオールやスクラレオリドとジオール体を分離できず、高純度のジオール体を得ることはできないことが分かった。更に、培養液を遠心分離した後上清を除去し、酢酸エチルにより抽出した場合は高純度のジオール体を得られないばかりか、収率も悪くなることが分かった。
【００３３】
実施例５〜９
Ascomycete sp. KSM-JL2842を用い微生物変換して得られた培養液２（30mL）を、それぞれ表２に示す口径のフィルターで吸引濾過した後、３０mLの蒸留水（SP値２３．４）を用いて３回洗浄を繰り返した。次いで、得られたケークをエタノール(和光純薬工業（株）、特級試薬)（SP値１３．０）、(30mL)にそれぞれ溶解し、各溶解液を0.2μmのフィルターで濾過した後、濾過液を減圧乾燥することによりジオール体の結晶を得た。結果を表２に示す。
【００３４】
比較例５
Ascomycete sp. KSM-JL2842株を用い、微生物変換して得られた培養液２（20mL）と酢酸エチル(和光純薬工業（株）、特級試薬)（60mL）を混合し、遠心分離（3000rpm、５分間）した後上清（54mL）を回収した。次いで、更に遠心分離（3000rpm、５分間）した後上清を回収し、減圧乾燥することによりジオール体の結晶を得た。結果を表２に示す。
【００３５】
比較例６
Ascomycete sp. KSM-JL2842株を用い、微生物変換して得られた培養液２（20mL）を遠心分離（3000rpm、５分間）した後沈殿を回収し、酢酸エチル(和光純薬工業（株）、特級試薬)（60mL）と混合した。次いで、混合液を更に遠心分離（3000rpm、５分間）した後上清を回収し、減圧乾燥することによりジオール体の結晶を得た。結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
2008212087.tif 000005
【００３７】
以上の結果から、培養液を口径１０〜１００μmのフィルターを用いて濾過し水洗浄した後、得られたケークをエタノールに溶解し、次いでフィルター濾過することにより、高純度のジオール体を収率よく得られることが分かった。
【００３８】
実施例１０
Ascomycete sp. KSM-JL2842を用い微生物変換して得られた培養液２（30mL）を、口径10μmのフィルターで吸引濾過した後、20％エタノール水溶液（SP値２１．３）３０mLを用いて３回洗浄を繰り返した。次いで、得られた各ケークをエタノール(和光純薬工業（株）、特級試薬)（SP値１３．０）(30mL)に溶解した。この溶解液を0.2μmのフィルターで濾過した後、減圧乾燥することによりジオール体の結晶を得た。結果を表３に示す。
【００３９】
実施例１１
30％エタノール溶液（SP値２０．３）３０mLを用いて３回洗浄を繰り返し、得られたケークをエタノール(和光純薬工業（株）、特級試薬)（SP値１３．０）(30mL)に溶解した後、溶解液を0.2μmのフィルターで濾過した以外は、実施例１０と同様にしてジオール体の結晶を得た。結果を表３に示す。
【００４０】
比較例７及び８
培養液をそれぞれ表３に示す口径のフィルターで吸引濾過し、40％エタノール水溶液（SP値１９．３）３０mLを用いて洗浄した以外は、実施例１０と同様にしてジオール体の結晶を得た。結果を表３に示す。
【００４１】
【表３】
2008212087.tif 000006
【００４２】
表３の結果から、SP値８．３〜２０(cal/cm3)1/2以外の溶剤で洗浄することにより、ジオール体のみ分離・精製できるのに対し、SP値が８．３〜２０(cal/cm3)1/2の範囲にある溶剤を用いて洗浄すると、スクラレオールやスクラレオリドと共にジオール体も溶解してしまい、高純度のジオール体を収率よく得ることはできないことが分かった。
【００４３】
実施例１２
Ascomycete sp. KSM-JL2842を用い微生物変換して得られた培養液３（200mL）を、４００メッシュ(３４μｍ)のフィルターで吸引濾過した後、２００mLの蒸留水（SP値２３．４）を用いて６回洗浄を繰り返した。結果を表４及び図１に示す。
【００４４】
比較例９
実施例１２と同じAscomycete sp. KSM-JL2842を用い微生物変換して得られた培養液３（100mL）を、酢酸エチル(和光純薬工業（株）、特級試薬)（150mL）と混合し、酢酸エチル層(145mL)を回収した。次いで、0.2μｍのフィルターで濾過し、濾液を回収し、減圧乾燥することによりジオール体の結晶を得た。結果を表４及び図１に示す。
【００４５】
【表４】
2008212087.tif 000007
【００４６】
表４の結果から、酢酸エチル抽出法による精製に比べ、本発明の方法により精製することによりジオール体の純度が高くなる事が分かった。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】培養液３、濾過後、水洗後（実施例１２）及び酢酸エチル抽出法（比較例９）による抽出液の組成を示す図である。
【図１】
2008212087.tif 000011