(57)【要約】【課題】  植物ウイルスに対して高い抵抗性を有する植物ウイルス抵抗性植物を提供する。【解決手段】  本発明の植物ウイルス抵抗性植物の製造方法は、植物体内において、植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合して当該植物ウイルスの増殖を抑制するポリペプチドによる、植物ウイルスの増殖抑制活性を、昂進させる工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体内において、植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合して当該植物ウイルスの増殖を抑制するポリペプチドによる、植物ウイルスの増殖抑制活性を昂進させる工程を含むことを特徴とする植物ウイルス抵抗性植物の製造方法。
【請求項２】
上記ポリペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の植物ウイルス抵抗性植物の製造方法：
（ａ）配列番号１もしくは２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１もしくは２に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物ウイルス増殖抑制活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
上記工程は、植物体内において、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することにより行なうことを特徴とする請求項１に記載の植物ウイルス抵抗性植物の製造方法。
【請求項４】
上記ポリヌクレオチドは、以下の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項３に記載の植物ウイルス抵抗性植物の製造方法：
（ｃ）配列番号３もしくは４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３もしくは４に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号３もしくは４に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項５】
上記植物ウイルスは、トバモウイルスであることを特徴とする請求項１に記載の植物ウイルス抵抗性植物の製造方法。
【請求項６】
植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを備えていることを特徴とする植物ウイルス抵抗性植物の製造キット。
【請求項７】
植物体内の、植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドの蓄積量及び植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量のうち、少なくとも一方の量を測定する工程を含むことを特徴とする植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法。
【請求項８】
植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドと特異的に結合する抗体及び植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的に結合するプローブのうち、少なくとも一方を備えることを特徴とする植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニングキット。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物ウイルス抵抗性植物の製造方法により製造されることを特徴とする植物ウイルス抵抗性植物。
【請求項１０】
植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドによる植物ウイルスの増殖抑制活性が、昂進されていることを特徴とする植物ウイルス抵抗性植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物ウイルス抵抗性植物の製造方法及びその利用に関するものである。より詳細には、植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合して植物ウイルスの増殖を抑制する活性を有するポリペプチドを利用した、植物ウイルス抵抗性植物の製造方法及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物ウイルスによる病害は、作物の収量や質に重篤な影響を与える。これまで、ウイルス病に対抗する策として、罹病株の早期発見・除去による感染拡大阻止、媒介昆虫の防除、弱毒ウイルスによるクロスプロテクション等が活用されている。また、自然界には特定のウイルスに対する抵抗性を賦与する遺伝子座が知られ、それらのうちいくつかは実際に作物に導入されて実績を上げている。ウイルスゲノムの一部を植物ゲノムに導入することにより植物にウイルス抵抗性を賦与する手法（pathogen-derived resistance）も、有効な対抗策のひとつとして期待されている。
【０００３】
病害の原因となる植物ウイルスとして、例えばトバモウイルス（Tobamovirus）が挙げられる。トバモウイルスは、アルファウイルス・スーパーファミリーに属するプラス鎖ＲＮＡウイルスである。トバモウイルスのメンバーとしては、例えば、タバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic virus）及びトマトモザイクウイルス（Tomato mosaic virus、以下「ＴｏＭＶ」ともいう）を挙げることができる。
【０００４】
プラス鎖ＲＮＡウイルスは、ウイルス粒子内にｍＲＮＡとして機能する１本鎖ＲＮＡ（極性のＲＮＡ）をゲノムとしてもつ。トバモウイルスを含む植物ウイルスの大多数、及びＣ型肝炎ウイルスやポリオウイルス等の動物ウイルスの多くは、プラス鎖ＲＮＡウイルスである。プラス鎖ＲＮＡウイルスが宿主細胞内に侵入すると、ゲノムＲＮＡより複製に関与するタンパク質（複製タンパク質）が翻訳される。複製タンパク質は自身のゲノムＲＮＡを認識し、宿主細胞のオルガネラ膜の細胞質側表面にＲＮＡ複製複合体を形成する。ＲＮＡ複製複合体は、プラス鎖と相補的なマイナス鎖ＲＮＡを介して、ゲノムプラス鎖ＲＮＡ（子孫ゲノムＲＮＡ）を複製する（非特許文献１及び２を参照）。また、複製の際に生じたサブゲノムＲＮＡを介してウイルスの移行タンパク質及び外被タンパク質が翻訳される。この移行タンパク質が発現するとウイルスゲノムＲＮＡは植物のプラズモデスマータを通って隣接する細胞へと移行する（非特許文献３を参照）。
【０００５】
トバモウイルスを原因とする病害を防ぐ方法としては、例えば、トバモウイルスの移行タンパク質に結合するタンパク質を植物で発現させる方法や（例えば特許文献１）、ウイルスの増殖に必要な宿主因子を同定し、それらの発現抑制により植物にウイルス抵抗性を賦与する方法（例えば非特許文献３を参照）等が提案されている。
【特許文献１】国際公開第０３／０２２０３９号パンフレット（２００３年３月２０日公開）
【非特許文献１】Buck, K. W., Comparison of the replication of positive-stranded RNA viruses of plants and animals., Adv. Vrius Res., 1996, 47, 159-251
【非特許文献２】Schwartz, M., Chen, J., Janda, M., Sullivan, M., den Boon, J., and Ahlquist, P., A positive-strand RNA virus replicationcomplex parallels form and function of retrovirus capsids., Mol. Cell, 2002, 9, 505-514
【非特許文献３】Lucas, W. J., Plant viral movement proteins: Agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes., Virology, 2006,344,169,184
【非特許文献４】Asano et al., Tobamovirus-resistant tobacco generated by RNA interference directed against host genes.,FEBS Lett., 2005, 579(20), 4479-4484
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、現在、植物に対して遺伝的にウイルス抵抗性を賦与することの可能な、宿主遺伝子に関する知見はわずかである。そして、将来、抵抗性を打破するウイルスが出現する可能性を考慮すると、標的遺伝子の幅広いレパートリーを確保しておくことが要求される。つまり、現在、ウイルス抵抗性賦与のために利用されている宿主遺伝子も、将来、当該抵抗性を打破するウイルスの出現によって無効になる可能性を有する。例えば特許文献１や非特許文献３の方法で、植物に賦与された抵抗性に関しても、将来、当該抵抗性を打破するウイルスが現われる可能性は否定できない。
【０００７】
また、Pathogen-derived resistanceは植物種を選ばずにウイルス抵抗性の賦与ができる利点をもつが、導入配列との組み換え等により新しいウイルスが生み出されてしまう危険性も指摘されている（例えば、Goldbach et al., Resistance mechanisms to plant viruses: an overview. Virus Res., 2003, 92, 207-212を参照）。
【０００８】
そこで、ウイルス抵抗性を賦与することが可能な遺伝子をできるだけ多く揃えておき、それらを複合的に使用することが要求される。
【０００９】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物ウイルスに対して高い抵抗性を有する植物ウイルス抵抗性植物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、トバモウイルスのゲノムＲＮＡに結合してトバモウイルスの増殖を抑制するタンパク質を新たに見出した。そして、当該タンパク質を過剰発現させることでトバモウイルスの増殖を抑制することができることを見出して、本発明の完成に至った。即ち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００１１】
本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物の製造方法は、植物体内において、植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合して植物ウイルスの増殖を抑制するポリペプチドによる、植物ウイルスの増殖抑制活性を昂進させる工程を含むことを特徴としている。
【００１２】
本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物の製造方法では、上記ポリペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のポリペプチドであることがより好ましい：
（ａ）配列番号１もしくは２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１もしくは２に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物ウイルス増殖抑制活性を有するポリペプチド。
【００１３】
本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物の製造方法では、上記工程は、植物体内において、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することにより行なうことがより好ましい。
【００１４】
本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物の製造方法では、上記ポリヌクレオチドは、以下の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）に記載のポリヌクレオチドであることがより好ましい：
（ｃ）配列番号３もしくは４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３もしくは４に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号３もしくは４に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００１５】
本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物の製造方法では、上記植物ウイルスは、トバモウイルスであることがより好ましい。
【００１６】
本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物の製造キットは、上記課題を解決するために、植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。
【００１７】
本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法は、上記課題を解決するために、植物体内の、植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドの蓄積量、及び植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量のうち、少なくとも一方の量を測定する工程を含むことを特徴としている。
【００１８】
本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニングキットは、上記課題を解決するために、植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドと特異的に結合する抗体、及び植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的に結合するプローブのうち、少なくとも一方を備えることを特徴としている。
【００１９】
本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物は、上記課題を解決するために、上記のいずれかに記載の本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物の製造方法により製造されることを特徴としている。また、植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドによる植物ウイルスの増殖抑制活性が、昂進されていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物の製造方法は、以上のように、植物体内において、植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合して植物ウイルスの増殖を抑制するポリペプチドによる、植物ウイルスの増殖抑制活性を昂進させる工程を含むので、植物ウイルスに対して高い抵抗性を有する植物ウイルス抵抗性植物を提供することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２２】
＜１．植物ウイルス抵抗性植物の製造方法＞
本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物の製造方法は、植物体内において、植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合して植物ウイルスの増殖を抑制するポリペプチドによる、植物ウイルスの増殖抑制活性を昂進させる工程を含めばよい。
【００２３】
植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合して、かつ当該植物ウイルスの増殖を阻害するポリペプチドの活性を昂進することで、植物ウイルスの増殖を抑制することができる。これにより、植物ウイルスに対する抵抗性が向上した植物を製造することができる。これにより、様々な植物ウイルスに対する抵抗性が賦与された植物ウイルス抵抗性植物を製造することができる。
【００２４】
本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物の製造方法で、植物に賦与する抵抗性の対象となる植物ウイルスとしては、ゲノムをＲＮＡとするウイルスである限り限定されるものではなく、例えば、プラス鎖ＲＮＡウイルス等が挙げられるが、中でも後述するＢＴＲポリペプチド等を用いれば、トバモウイルスに対する抵抗性を好適に賦与することができる。
【００２５】
そこで、本実施の形態では、トバモウイルスに対する抵抗性を賦与したトバモウイルス抵抗性植物を製造する方法について説明するが、本発明の精神の範囲内で、様々な植物ウイルスに対する抵抗性を賦与した植物ウイルス抵抗性植物を製造することができる。
【００２６】
ここで、トバモウイルスとは、トバモウイルス属に属するウイルスをいう。トバモウイルス属に属するウイルスとしては、例えば、Cucumber green mottle mosaic virus（ＣＧＭＭＶ）、Frangipani mosaic virus（ＦｒＭＶ）、Kyuri green mottle mosaic virus（ＫＧＭＭＶ）、Obuda pepper virus（ＯｂＰＶ、）、Odontoglossum ringspot virus（ＯＲＳＶ）、Paprika mild mottle virus（ＰａＭＭＶ）、Pepper mild mottle virus（ＰＭＭＶ）、Ribgrass mosaic virus（ＲＭＶ）、Sammons’s Opuntia virus（ＳＯＶ）、Sunn-hemp mosaic virus（ＳＨＭＶ）、Tobacco mild green mosaic virus（ＴＭＧＭＶ）、Tobacco mosaic virus（ＴＭＶ）、Tomato mosaic virus（ＴｏＭＶ）、Turnip vein-cleaning virus（ＴＶＣＶ）、Ullucus mild mottle virus（ＵＭＭＶ）、Yucari mosaic virus（ＹｏＭＶ）等が挙げられる。
【００２７】
また、トバモウイルスのゲノムＲＮＡに結合してトバモウイルスの増殖を抑制する活性を有するポリペプチドを、以下「ＢＴＲポリペプチド」と表記し、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを「ｂｔｒポリヌクレオチド」と表記する。また、トバモウイルスのゲノムＲＮＡに結合してトバモウイルスの増殖を抑制する活性を「ＢＴＲ活性」と表記する。なお、「ＢＴＲ」又は「ｂｔｒ」とは「Binding to Tobamovirus RNA」を略記したものである。また、本明細書において、「トバモウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドによるトバモウイルスの増殖抑制活性を、昂進させる」とは、ＢＴＲポリペプチドによるトバモウイルス増殖抑制活性を、野生株よりも昂進させることを意図するものであり、その昂進の程度を限定するものではない。
【００２８】
〔１−１．ＢＴＲポリペプチド及びｂｔｒポリヌクレオチド〕
本発明において、トバモウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチド（ＢＴＲポリペプチド）とは、トバモウイルスのゲノムＲＮＡに結合してトバモウイルスの増殖を抑制する活性を示すものである限り、限定されるものではない。
【００２９】
ＢＴＲポリペプチドとしては、以下の（ａ）に記載のポリペプチドを挙げることができる。
（ａ）配列番号１もしくは２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００３０】
配列番号１及び２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋに、アクセッション番号ＮＭ＿１２０５２５、アクセッション番号ＮＭ＿１８０４３３で登録されている。また、配列番号１及び２に示すアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、アクセッション番号ＮＣ＿００３０７６で登録されているシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のゲノムＤＮＡの内、Ｌｏｃｕｓ ｔａｇ Ａｔ５ｇ０４４３０で示される遺伝子の塩基配列から生じる２種類のスプライシングバリアントである。
【００３１】
後の実施例で詳述するように、配列番号１及び２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれＫＨドメインを３個有している。ＫＨドメインはＲＮＡ結合ドメインとして知られている。しかし、従来、配列番号１及び２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能は全く不明であった。本発明者らは、後の実施例で説明するように、シロイヌナズナが、ＴｏＭＶのゲノムＲＮＡに結合してＴｏＭＶの増殖を抑えるタンパク質を有することを見出した。そして、これを同定した結果、当該タンパク質は配列番号１及び２に示すアミノ酸配列を有することを見出した。本発明は、この全く新たな知見に基づく、当業者といえども容易に想到し得ない発明である。
【００３２】
なお、動物では、ポリＣ結合タンパク質の一種でＫＨドメインを有するＰＣＢＰ２（αＣＰ２）が、ポリオウイルスＲＮＡの５’末端領域に結合して、当該ＲＮＡの翻訳効率を高めることが報告されている（Blyn, L. B., Swiderek, K. M., Richards, O., Stahl, D. C., Semler, B. L. and Ehrenfeld, E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 11115-11120、Blyn, L. B., Towner, J. S., Semler, B. L. and Ehrenfeld, E., J. Virol., 1997, 71, 6243-6246を参照）。つまり、ＫＨドメインを有するポリペプチドとして、従来は、ウイルスのゲノムＲＮＡの翻訳効率を高めるポリペプチドが知られていた。これでは、配列番号１及び２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを活性化させることには、当業者といえども容易に想到し得ない。なぜなら、様々なウイルスを原因とした病気が問題となる植物において、ＫＨドメインを有するアミノ酸配列からなるポリペプチドの活性を高めることは、病原となるウイルスを増殖させる恐れすらあるからである。
【００３３】
また、一実施形態においてＢＴＲポリペプチドは、ＢＴＲポリペプチドの変異体である。このような変異体としては、以下の（ｂ）に記載のポリペプチドを挙げることができる。
（ｂ）配列番号１もしくは２に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトバモウイルス増殖抑制活性を有するポリペプチド。
【００３４】
このような変異体には、欠失、挿入、逆転、反復及びタイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が含まれる。
【００３５】
ポリペプチドを構成するアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００３６】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体又は付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載されるＢＴＲポリペプチドの蓄積量やｂｔｒポリヌクレオチドの発現量を測定する方法等を用いれば、作製した変異体が所望のトバモウイルスの増殖を抑制するか否かを容易に決定することができる。
【００３７】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの中での１つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基Ｓｅｒ及びＴｈｒの交換、酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの交換、アミド残基Ａｓｎ及びＧｌｎの間の置換、塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの交換、並びに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００３８】
上述の（ａ）及び（ｂ）に記載のＢＴＲポリペプチドは、トバモウイルスのゲノムＲＮＡの５’末端領域に結合するものである。より具体的には、上記（ａ）及び（ｂ）に記載のＢＴＲポリペプチドは、トバモウイルスのゲノムＲＮＡの、５’末端の１〜２７７位のＲＮＡに結合するものである。ただし、ＢＴＲ活性を有するポリペプチドが結合するトバモウイルスのゲノムＲＮＡ上の領域はこれに限定されるものではない。つまり、トバモウイルスのゲノムＲＮＡに結合した上で、トバモウイルスの増殖を抑制するものであればよい。例えば、トバモウイルスではウイルスのゲノムＲＮＡの５’末端領域に加えて３’末端非翻訳領域（６２８０〜６３８４位）も自身の増殖に必須の役割を果たしている（Takamatsu, N., Watanabe, Y., Meshi, T. and Okada, Y., J. Virol., 1990, 64, 3686-3693、Takamatsu, N., Watanabe, Y., Iwasaki, T., Meshi, T. and Okada, Y., J. Virol., 1991, 65, 1619-1622を参照）。従って、３’末端非翻訳領域に結合してその機能を阻害するＢＴＲポリペプチドであっても、効率よくウイルス増殖を抑制することができる。
【００３９】
また、上記（ａ）及び（ｂ）のＢＴＲポリペプチドは、トバモウイルスに特異的に結合する。本発明においてＢＴＲポリペプチドは、トバモウイルスに結合してトバモウイルスの増殖を抑制するものであれば特に限定されるものではないが、上記（ａ）及び（ｂ）のＢＴＲポリペプチドのように、トバモウイルスに特異的に結合して増殖を抑制するものであることが好ましい。トバモウイルスに特異的に結合して増殖を抑制するＢＴＲポリペプチドであれば、当該ＢＴＲポリペプチドにより植物自体の成長を阻害することがない。つまり、植物自体の成長を阻害することなく、トバモウイルスに対する抵抗性が向上したトバモウイルス抵抗性植物を提供することができる。実際に、後で述べる実施例において本発明者らは、植物の成長が阻害されることなく、トバモウイルスに対する抵抗性が向上した植物を作製している。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」又は「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。また、本明細書中で使用される場合、用語「ＢＴＲポリペプチド」は、植物体内でｂｔｒポリヌクレオチドの発現により産生されたもの、天然供給源より単離されたもの、化学合成して得たものをも包含する。なお、用語「単離された」ポリペプチド又はタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチド又はタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチド及びタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然又は組換えのポリペプチド及びタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００４１】
また、ＢＴＲポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、及び原核生物宿主又は真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、グリコシル化され得るか、又は非グリコシル化され得る。さらに、ＢＴＲポリペプチドは、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００４２】
ＢＴＲポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖及びイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００４３】
また、ＢＴＲポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００４４】
本明細書中においてポリペプチド又はタンパク質に関して用いられる場合、用語「変異体」は、ＢＴＲ活性を有するポリペプチド（すなわち、トバモウイルスのゲノムＲＮＡに結合して増殖を抑制するポリペプチド）が意図され、例えば「配列番号に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体」は、トバモウイルスの増殖を抑制するポリペプチドであって、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが意図される。
【００４５】
また、一実施形態においてＢＴＲポリペプチドは、ＢＴＲ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを挙げることができる。
（ｃ）配列番号３もしくは４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号３もしくは４に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号３もしくは４に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００４６】
配列番号３及び４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋに、アクセッション番号ＮＭ＿１２０５２５、アクセッション番号ＮＭ＿１８０４３３で登録されており、それぞれ、配列番号１及び２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００４７】
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００４８】
上記ハイブリダイゼーションは、Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring  Harbor  Laboratory, 1989に記載されている方法のような周知の方法で行なうことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ  塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５×デンハルト液；０．１％  牛血清アルブミン、０．１％  フィコール、０．１％  ポリビニルピロリドン）が挙げられる。
【００４９】
なお、本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。また、本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴと省略される）の配列として示される。
【００５０】
〔１−２．ＢＴＲポリペプチドによるトバモウイルスの増殖抑制活性を、昂進させる工程〕
本実施の形態に係るトバモウイルス抵抗性植物の製造方法は、上述のように、ＢＴＲポリペプチドによるトバモウイルスの増殖抑制活性を、昂進させる工程を包含していればよい。
【００５１】
このような工程は、植物体内において、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することにより行なうことや、予め植物体内に内在しているｂｔｒポリヌクレオチドの発現量を向上させる方法や、精製したＢＴＲポリペプチドを導入する方法等が挙げられる。中でも、上記工程は、植物体内において、ＢＴＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することにより行なうことが好ましい。ｂｔｒポリヌクレオチドを導入すれば、植物体内のｂｔｒポリヌクレオチドの発現を長期間維持することができ、その子孫を得ることによっても、トバモウイルス抵抗性を有する植物を得ることができる。
【００５２】
植物にｂｔｒポリヌクレオチドを導入する場合、当該ポリヌクレオチドが導入される植物の部位や組織は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルス等のいずれでもよい。また、ｂｔｒポリヌクレオチドの導入に用いる植物の種類としては、特に限定されず、単子葉植物綱又は双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
【００５３】
植物へのｂｔｒポリヌクレオチドの導入は、当該ポリヌクレオチドを備えたベクターを導入する等の従来公知の方法を好適に利用することができる。
【００５４】
ここで、本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物の製造方法で利用可能な、植物へのポリヌクレオチドの導入方法を例示するが、これに限定されるものではない。
【００５５】
植物へのポリヌクレオチドの導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられ、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法とに大別される。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)）に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７〜３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌらの方法(Micribiol. Lett., 1990, 67, 325）が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをPlant Molecular Biology Manual(S.B.Gelvinら、Academic Press Publishers)に記載の方法で植物細胞又は植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換する場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクター（例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１及びｐＰＺＰ２０２など）が使用され得る。
【００５６】
また、ｂｔｒポリヌクレオチド等の外来ポリヌクレオチドを直接、植物細胞又は植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ‐１０００（ＢＩＯ‐ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行なう。
【００５７】
外来ポリヌクレオチドが導入された細胞又は植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行なうことが可能である。選択マーカーとしては、ハイグロマイシン耐性に限定されず、例えば、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコールなどに対する薬剤耐性が挙げられる。
【００５８】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法などによって組換えベクターが培養細胞に導入されて形質転換される。形質転換の結果として得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
【００５９】
ポリヌクレオチドが植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等によって行なうことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行なう。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行なうことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動などを行ない、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行ない、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００６０】
ｂｔｒポリヌクレオチド等の外来ポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖又は無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体又はその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、本発明にかかるポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、又はこれら由来の組織も含まれる。
【００６１】
なお、植物に導入する外来ポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列またはベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００６２】
また、植物に導入する外来ポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、生物材料であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。後述する実施例においては、シロイヌナズナを用いてｂｔｒポリヌクレオチドを得ているが、これに限定されない。
【００６３】
また、ＢＴＲポリペプチドによるトバモウイルスの増殖抑制活性を、昂進させる方法としては、上述のように、予め植物体内に内在しているｂｔｒポリヌクレオチドの発現量を向上させてもよい。例えば、植物に内在されるｂｔｒポリヌクレオチド及び／又はその調節遺伝子に変異を与えて、ＢＴＲポリペプチドのＢＴＲ活性を昂進させてもよい。
【００６４】
つまり、本実施の形態に係るトバモウイルス抵抗性植物の製造方法で得られる植物は植物変異体であり得る。このような植物の変異体としては、例えば、天然に存在する変異体から、ＢＴＲポリペプチドのＢＴＲ活性が昂進した植物を選抜することによって得ることができる。また、上記植物変異体は、化学的突然変異原である公知な化合物で種子などを処理する方法（化学的突然変異誘発法）によっても取得することができる。上記化学的突然変異原としては、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、アジドグリセロール（ＡＧ、３−アジド−１，２−プロパンジオール）、メチルニトロソ尿素（ＭＮＵ）、及びマレイン酸ヒドラジド（ＭＨ）などが例示できる。また、ＵＶ照射を用いてもよい。このような変異によって、例えば、ｂｔｒポリヌクレオチドのリプレッサーをコードする領域において１ヌクレオチド以上の変異が導入されることにより、リプレッサーとしての機能が低下すると、ｂｔｒポリヌクレオチドの発現性を向上させて、ＢＴＲポリペプチドのＢＴＲ活性を昂進させることができる。
【００６５】
また、ＢＴＲポリペプチドによるトバモウイルスの増殖抑制活性を、昂進させる方法としては、上述のように、植物体外で製造したＢＴＲポリペプチドを外部導入してもよい。
【００６６】
ＢＴＲポリペプチドを外部導入する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、直接散布してもよく、葉脈に投与してもよい。
【００６７】
ここで、外部導入に用いるＢＴＲポリペプチドの生産方法について説明する。ＢＴＲポリペプチドの生産方法は、特に限定されるものではなく、例えばｂｔｒポリヌクレオチドを含むベクターを用いればよい。当該ベクターは、無細胞タンパク質合成系において用いられることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットが用いられ得る。
【００６８】
無細胞タンパク質合成系としては、コムギ胚芽抽出液を用いる系、ウサギ網状赤血球抽出液を用いる系、大腸菌Ｓ３０抽出液を用いる系、及び植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液が挙げられる。一般的には、真核生物由来遺伝子の翻訳には真核細胞の系、すなわち、コムギ胚芽抽出液を用いる系又はウサギ網状赤血球抽出液を用いる系のいずれかが選択されるが、翻訳される遺伝子の由来（原核生物／真核生物）や、合成後のタンパク質の使用目的を考慮して、上記合成系から選択されればよい。
【００６９】
ＢＴＲポリペプチドを上記ベクターを用いて合成した後は、当該ＢＴＲポリペプチドを含む細胞又は組織の抽出液から、従来公知の方法で精製すればよい。ＢＴＲポリペプチドの精製は、従来公知の方法（例えば、細胞又は組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。
【００７０】
また、ＢＴＲポリペプチドは化学合成によって得てもよい。当業者は、本明細書中に記載されるＢＴＲポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、ＢＴＲポリペプチドを化学合成できることを、容易に理解する。
【００７１】
このように、ＢＴＲポリペプチドの生産方法は、少なくとも、ＢＴＲポリペプチドのアミノ酸配列又はｂｔｒポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよい。
【００７２】
上記のような方法で製造した植物から、トバモウイルス増殖抑制活性が昂進した植物を選抜する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、ノーザンブロット法等によって、ＢＴＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量を測定してもよく、また、ＢＴＲポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などの免疫学的方法によって、当該ポリペプチドの蓄積量を測定してもよい。なお、ＢＴＲポリペプチドを特異的に認識する抗体については、本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニングキットの説明において詳述する。
【００７３】
以上に説明した本実施の形態に係るトバモウイルス抵抗性植物の製造方法によって、トバモウイルス抵抗性が向上したトバモウイルス抵抗性植物を得ることができる。このようにして得られたトバモウイルス抵抗性植物は、トバモウイルスに対する抵抗性が向上しているため、当該ウイルスが原因の植物病を予防した植物を得ることができる。
【００７４】
＜ＩＩ．本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物の製造キット＞
本発明はまた、植物ウイルス抵抗性植物の製造キットを提供する。本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物の製造キットは、植物体内における植物ウイルス増殖抑制活性を昂進させることが可能なものを備えていればよいが、植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを備えていることが好ましい。例えば、トバモウイルス抵抗性植物の製造キットであれば、ｂｔｒポリヌクレオチドを備えているものが好ましい。
【００７５】
なお、本発明に係る製造キットは、ｂｔｒポリヌクレオチド等の、植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド以外に、上述した植物の製造方法を実行するために必要とされる試薬等を備えていることが好ましい。このような試薬としては、例えば、上述のアグロバクテリウム法等を実施するための試薬が挙げられる。
【００７６】
＜ＩＩＩ．植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法及びスクリーニングキット＞
〔３−１．本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法〕
本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法は、植物体内の、植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドの蓄積量及び植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量のうち、少なくとも一方の量を測定する工程を含めばよい。例えば、トバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法であれば、植物体内の、ＢＴＲポリペプチドの蓄積量及びｂｔｒポリヌクレオチドの発現量のうち、少なくとも一方の量を測定する工程（以下、「測定工程」ともいう）を含めばよい。本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法でスクリーニングされた植物は、天然であっても、形質転換体であっても、変異体であってもよい。
【００７７】
以下、本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法の一実施形態として、トバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法について以下に説明するが、これに限定されるものではなく、本発明の精神の範囲で、様々な植物ウイルスに対して抵抗性を有する植物をスクリーニングすることが可能なスクリーニング方法を提供することができる
本実施の形態に係るトバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法において、上記測定工程としては、例えば、目的の植物から抽出したＢＴＲポリペプチド（粗抽出物であってもよいし、部分精製物であってもよいし、精製物であってもよい）を、ＢＴＲポリペプチドに対する抗体と反応させて、植物体内におけるＢＴＲポリペプチドの蓄積量を測定する工程を挙げることができる。より具体的には、ウエスタンブロット法や、ＥＬＩＳＡ法を用いて、植物体内におけるＢＴＲポリペプチドの蓄積量を測定する工程を行なえばよい。当該工程によれば、野生株との比較により、植物体内におけるＢＴＲポリペプチドの蓄積量が高い植物体を容易に検出（スクリーニング）することができる。このようなＢＴＲポリペプチドの蓄積量が高い植物体は、多くの場合、植物におけるトバモウイルス増殖抑制活性が昂進している。そのため、当該工程により、トバモウイルスに対する抵抗性が向上した植物を容易にスクリーニングできる。上記工程において用いる抗体としては、後述する抗体を用いることができる。
【００７８】
また、上記測定工程としては、例えば、ｂｔｒポリヌクレオチドの塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列の、少なくとも一部の塩基配列を有するプローブを、目的の植物由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡに対するｃＤＮＡにハイブリダイズさせ、当該プローブにハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出することによって、ｂｔｒポリヌクレオチドの発現量を測定する工程を挙げることができる。このような工程によれば、野生株との比較により、ｂｔｒポリヌクレオチドの発現量が向上した植物体を容易に検出（スクリーニング）することができる。ｂｔｒポリヌクレオチドの発現量が向上した植物体は、多くの場合、植物におけるトバモウイルス増殖抑制活性が向上しているため、当該工程により、トバモウイルス増殖抑制活性が昂進した植物を容易にスクリーニングできる。
【００７９】
上記測定工程として例示した工程は、単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。単独で用いることにより、迅速にトバモウイルス抵抗性植物をスクリーニングすることができる。一方、複数を組み合わせて用いることにより、スクリーニングの精度を高めることができる。
【００８０】
本実施の形態に係るトバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法において用いられる上記プローブは、ｂｔｒポリヌクレオチド又はそのフラグメントを得るためのＰＣＲプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとしても用いることができる。また、当該プローブは、以下のような用途に用いることもできる。：（１）ｃＤＮＡライブラリー中のｂｔｒポリヌクレオチド又はその対立遺伝子もしくはスプライシング改変体の単離；（２）ｂｔｒポリヌクレオチドの正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Verma et al., Human Chromosomes:A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, 1988を参照）；及び（３）特定の組織におけるｂｔｒポリヌクレオチドのｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。なお、当業者は、上述した用途がいずれも、本実施の形態に係るトバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法において用いられるプローブと目的の遺伝子（ポリヌクレオチド）との間で生じるハイブリダイゼーションに起因しており、当該プローブが、目的の遺伝子（ポリヌクレオチド）とハイブリダイズさせるために用いられることを容易に理解する。
【００８１】
本実施の形態に係るトバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法において用いられる上記プローブは、少なくとも７ｎｔ（ヌクレオチド）、１０ｎｔ、１２ｎｔ、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なお、より好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメント（プローブ）が意図されるが、当業者は、上述した用途に応じて好ましい長さを適宜設定し得る。「少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメント」によって、例えば、配列番号３に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基配列又はその相補配列を含むフラグメント（プローブ）が意図される。本明細書を参照すれば配列番号３に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号３に基づくプローブを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断又は超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメントが、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ （ABI, 850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA 94404）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。また、当該プローブは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。
【００８２】
このように、本実施の形態に係るトバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法において用いられるプローブを、ｂｔｒポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーション用プローブ又は当該ポリヌクレオチドを増幅するためのＰＣＲ用プライマーとして利用することによって、ｂｔｒポリヌクレオチドの発現量が向上した植物体又は組織を容易に検出（スクリーニング）することができる。
【００８３】
〔３−２．本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニングキット〕
本発明はまた、植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニングキットを提供する。本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニングキットは、植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドと特異的に結合する抗体及び植物ウイルスのゲノムＲＮＡに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的に結合するプローブのうち、少なくとも一方を備えていればよい。例えば、トバモウイルス抵抗性植物のスクリーニングキットであれば、ＢＴＲポリペプチドと特異的に結合する抗体、及びｂｔｒポリヌクレオチドと特異的に結合するプローブのうち、少なくとも一方を備えていればよい。
【００８４】
以下、本発明に係る植物ウイルス抵抗性植物のスクリーニングキットの一実施形態として、トバモウイルス抵抗性植物のスクリーニングキットについて以下に説明するが、これに限定されるものではなく、本発明の精神の範囲で、様々な植物ウイルスに対して抵抗性を有する植物をスクリーニングすることが可能な、スクリーニングキットを提供することができる
本実施の形態に係るトバモウイルス抵抗性植物のスクリーニングキットは、ＢＴＲポリペプチドと特異的に結合する抗体や、ｂｔｒポリヌクレオチドと特異的に結合するプローブ以外に、上述したトバモウイルス抵抗性植物のスクリーニング方法を実行するために必要とされる試薬などを備えていることが好ましい。例えば、上記抗体及び／又は上記プローブと、スクリーニングされる植物組織とを混合する際に用いる緩衝液を備えてもよく、上記抗体及び／又は上記プローブを安定に保持するための試薬や緩衝液を備えてもよい。
【００８５】
（ＢＴＲポリペプチドと特異的に結合する抗体）
ここで、ＢＴＲポリペプチドと特異的に結合する抗体について説明する。ＢＴＲポリペプチドと特異的に結合する抗体は、本実施の形態に係るスクリーニングキットに包含するのみでなく、種々の利用が可能である。例えば、上述の本発明の一実施形態に係るトバモウイルス抵抗性植物の製造方法により製造した植物から、トバモウイルス増殖抑制活性が昂進した植物を選抜するときや、製造したトバモウイルス抵抗性植物体内における、ＢＴＲポリペプチドの蓄積又はｂｔｒポリヌクレオチドの発現の確認にも利用可能である。
【００８６】
ＢＴＲポリペプチドと特異的に結合する抗体としては、ＢＴＲポリペプチドと特異的に結合し得るものであれば限定されない。例えば、ＢＴＲポリペプチドに対するポリクローナル抗体等でもよいが、ＢＴＲポリペプチドに対するモノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、性質が均一で供給しやすい、ハイブリドーマとして半永久的に保存ができるなどの利点を有する。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体及び抗イディオタイプ抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８８】
ＢＴＲポリペプチドに特異的な抗体の製造方法としては、上述のＢＴＲポリペプチドの生産方法によって得たＢＴＲポリペプチドを抗原として、種々の公知の方法を好適に用いることができる。
【００８９】
例えば、モノクローナル抗体であれば、ハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature, 1975 256, 495‐497を参照）、トリオーマ法、ヒトＢ‐細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, Immunology Today, 1983, 4, 72を参照)及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., 1985, 77‐96を参照)等を用いることができる。
【００９０】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００９１】
また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００９２】
〔実施例１：ＢＴＲ１の同定〕
プラス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡの５’及び３’末端領域はウイルスＲＮＡの翻訳及び複製に重要な役割を果たしている。本発明者らは、本実施例において、トバモウイルスの増殖制御に関わる宿主因子を同定するため、これら末端領域と結合する植物細胞由来因子の同定を試みた。
【００９３】
より具体的には、ＴｏＭＶのゲノムＲＮＡのうち５’末端又は３’末端の領域を含むＲＮＡに結合するタンパク質を、シロイヌナズナの細胞抽出液から得て、これを同定した。
【００９４】
（ストレプトタグ付加ＲＮＡプローブの合成）
本実施例では、ＴｏＭＶのゲノムＲＮＡに結合するタンパク質を得るため、ＴｏＭＶのゲノムＲＮＡのうち５’末端又は３’末端の領域を含むＲＮＡをストレプトタグに結合させたＲＮＡプローブ（以下、「ストレプトタグ付加ＲＮＡプローブ」を用いた。
【００９５】
なお、ストレプトタグとは、４６塩基のストレプトマイシン結合性のＲＮＡモチーフを意味しており、Bachler, M., Schroeder, R. and von Ahsen, U., RNA, 1999, 5, 1509‐1516に記載の方法により合成した。
【００９６】
ストレプトタグ付加ＲＮＡプローブは以下のようにして作製した。
【００９７】
まず、ＳａｃＩ認識部位、ストレプトタグ、ＳｐｈＩ認識部位、ＮｏｔＩ認識部位、ＭｌｕＩ認識部位、ＸｂａＩ認識部位を、この順で有するＤＮＡ断片を合成した。
【００９８】
次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）（ＴＯＹＯＢＯ社製、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｘ５２３２８）のＳａｃＩ、ＸｂａＩ認識部位に、上記ＤＮＡ断片を挿入して、ベクター（ｐＳｔＭ）を作製した。
【００９９】
次に、ＴｏＭＶゲノムＲＮＡ（６３８４塩基、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｘ０２１４４）のうち、１〜５１０位の領域、６１６６〜６３８４位の領域のＲＮＡに対応する塩基配列を有するＤＮＡを、それぞれｐＳｔＭのＳｐｈＩ、ＭｌｕＩ認識部位に挿入してプラスミドを作製した。また、比較のため、７６４〜１００４位の領域のＲＮＡに対応する塩基配列を有するＤＮＡを用いて同様の操作を行なった。上記１〜５１０位の領域、７６４〜１００４位の領域、６１６６〜６３８４位の領域のＲＮＡに対応する塩基配列を有するＤＮＡに由来するプラスミドを、それぞれｐＬ５‐５、ｐＬＲ１、ｐＬ３‐２とする。なお、「ＲＮＡに対応する塩基配列を有するＤＮＡ」とは、当該ＲＮＡの塩基配列のＵ（ウラシル）をＴ（チミン）に置換した以外は、当該塩基配列と全く同じ塩基配列を有するＤＮＡを意図する。
【０１００】
次に、ｐＬ５‐５をＥｃｏＲＩで直鎖化した。また、ｐＬＲ１及びｐＬ３‐２をＭｌｕＩで直鎖化した。
【０１０１】
次に、それぞれのプラスミドを直鎖化したＤＮＡの転写を、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼを用いて行なった。これにより、ＴｏＭＶゲノムの１〜２７７位、７６４〜１００４位又は６１６６〜６３８４位の領域を含み、５’末端側にストレプトタグが付加された転写物を得た。
【０１０２】
ここで、図１を用いて、本実施例で得たストレプトタグ付加ＲＮＡプローブの構造について説明する。図１は、本実施例で得たストレプトタグ付加ＲＮＡプローブの構造を模式的に示した図であり、上段はＴｏＭＶのゲノムＲＮＡの構造を示し、下段がストレプトタグ付加ＲＮＡプローブの構造を示している。
【０１０３】
図１のストレプトタグ付加ＲＮＡプローブの３’末端に示す「Ｐｒｏｂｅ ＲＮＡ」の箇所には、図１において「Ｌ５」と示す１〜２７７位の領域、「ＬＲ」と示す７６４〜１００４位の領域、及び「Ｌ３」と示す６１６６〜６３８４位の領域からなるＲＮＡ断片のうちのいずれかが入る。つまり、上述の方法で、いずれかの領域のＲＮＡ断片が３’末端に結合したストレプトタグ付加ＲＮＡプローブを得ることができるのである。
【０１０４】
以下、ＴｏＭＶゲノムＲＮＡの１〜２７７位の塩基配列を有するストレプトタグ付加ＲＮＡプローブを「Ｌ５」と表記し、７６４〜１００４位の塩基配列を有するストレプトタグ付加ＲＮＡプローブを「ＬＲ」と表記し、６１６６〜６３８４位の塩基配列を有するストレプトタグ付加ＲＮＡプローブを「Ｌ３」と表記する。
【０１０５】
（シロイヌナズナの細胞抽出液）
細胞抽出液の材料として、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）エコタイプ Ｃｏｌ‐０株（以下、単に「Ｃｏｌ‐０」と表記する）を用いた。
【０１０６】
Ｃｏｌ‐０の細胞抽出液は、以下のようにして調製した。まず、Ｃｏｌ‐０のＭＭ２ｄ培養細胞を脱液胞化した後、破砕バッファー(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ (ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＤＴＴ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ）中で破砕した。破砕によって得られた抽出液を３０，０００×ｇ、１５分間遠心して、生体膜成分を除いた上清（Ｓ３０）を、Ｃｏｌ‐０の細胞抽出液として、以後の実験に用いた。なお、ＭＭ２ｄ培養細胞は、Menges, M. and Murray, J. A. H., Plant J., 2002, 30, 203−212に記載の方法により得た。また、脱液胞化は、Sonobe, S., J. Plant Res., 1996, 109, 437−448に記載の方法により行なった。
【０１０７】
（Ｃｏｌ‐０の細胞抽出液とＲＮＡプローブとの混合）
次に、Ｃｏｌ‐０の細胞抽出液と、Ｌ５、ＬＲ、Ｌ３のそれぞれのＲＮＡプローブとを以下の条件で混合して、ＲＮＡ‐タンパク質複合体を形成させた。
【０１０８】
まず、タンパク質濃度１５ｍｇ／ｍｌに調整したＣｏｌ‐０の細胞抽出液４００μｌに、上記ＲＮＡプローブを添加した。添加したＲＮＡプローブの量は、Ｌ５では５０μｇ、Ｌ３及びＬＲでは２０μｇとした。ＲＮＡプローブを添加した後、氷上で２０分静置した。その後、ヘパリン（１００ｍｇ／ｍｌ）を８μｌ添加して、さらに氷上で３０分静置した。
【０１０９】
（アフィニティー精製）
上記それぞれのＲＮＡプローブから得たＲＮＡ‐タンパク質複合体を、ストレプトマイシンを結合したセファロースビーズを用いてアフィニティー精製した。
【０１１０】
アフィニティー精製はBachler, M., Schroeder, R. and von Ahsen, U., RNA, 1999, 5, 1509‐1516に記載の方法に従った。具体的には、上記セファロースビーズ０．８ｍｌをカラムに充填して、７ｍｌカラムバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２）で平衡化させた後、サンプルを添加した。洗浄は２ｍｌのカラムバッファーで１０回行ない、３ｍｌの１０μＭストレプトマイシンをさらに含有させた上記カラムバッファーで溶出した。溶出サンプルはアセトン沈殿で濃縮後、全量の１／１５を８‐１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、銀染色で検出した。操作は全て４℃で行なった。
【０１１１】
サンプルとしては、Ｌ５、ＬＲ、Ｌ３のそれぞれのＲＮＡプローブから得たＲＮＡ−タンパク質複合体に、それぞれフェノール／クロロホルム抽出を施したものと、施していないものとを用いた。その結果を図２に示す。図２は、本実施例で得たＲＮＡ−タンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す図である。図２に示す「Ｐ／Ｃ」の「＋」、「−」は、それぞれ、上記フェノール／クロロホルム抽出を行なったサンプル、行なっていないサンプルを示す。
【０１１２】
図２中の黒三角印に示すように、Ｌ５から得たＲＮＡ−タンパク質複合体では、フェノール/クロロホルム抽出によって消失するタンパク質のバンドが確認された。
【０１１３】
（ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ解析）
図２の黒三角印に示したバンドのタンパク質をＬＣ‐ＭＳ／ＭＳにより解析した。当該タンパク質としては、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルより切り出して、トリプシン処理して得たサンプルを用いた。ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳによる解析はアプロサイエンス株式会社の受託解析サービスを利用した。
【０１１４】
この結果、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ解析に供したタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＬｏｃｕｓ ｔａｇ Ａｔ５ｇ０４４３０のアミノ酸配列に一致した。以下、このタンパク質を「ＢＴＲ１」と表記する。Ｌｏｃｕｓ ｔａｇ Ａｔ５ｇ０４４３０に示されるアミノ酸配列は、シロイヌナズナの有するアミノ酸配列の一つである。
【０１１５】
ここで、本実施例で得たＢＴＲ１の構造を、図３を用いて説明する。図３は、Ｌｏｃｕｓ ｔａｇ Ａｔ５ｇ０４４３０の塩基配列から生じる二種類のスプライシングバリアント、及び本実施例のＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ解析の結果を示す図である。なお、当該二種類のスプライシングバリアントにより得られるアミノ酸配列を有するタンパク質を、それぞれ「ＢＴＲ１Ｓ」、「ＢＴＲ１Ｌ」と表記する。つまり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド及び配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドはＢＴＲ１Ｓである。また、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドはＢＴＲ１Ｓである。また、図３中のＩ、ＩＩ、ＩＩＩは、ＫＨドメインを示している。図３中の下線を引いたアミノ酸は、上述のＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ解析によって検出されたペプチド断片のアミノ酸配列を示している。
【０１１６】
図３に示すように、ＢＴＲ１Ｓ及びＢＴＲ１Ｌのアミノ酸配列は、ＫＨドメインＩＩ及びＩＩＩの間に存在する２１のアミノ酸残基の有無以外は同一である。
【０１１７】
図３の下線部に示すように、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ解析の結果、ＢＴＲ１Ｓのアミノ酸配列の一部に一致する１１のペプチド断片が検出された。そして、ペプチド断片の一つは、図３に示すように、ＢＴＲ１Ｌに特異的な上記２１のアミノ酸残基をまたいだアミノ酸配列を有するものであった。そして、上記２１のアミノ酸残基を有する領域は検出されなかった。このことから本実施例で得られたＢＴＲ１はＢＴＲ１Ｓであるといえる。
【０１１８】
〔実施例２：ＢＴＲ１Ｓのトバモウイルスに対する結合性の評価〕
本実施例では、大腸菌で発現させたＢＴＲ１Ｓの、ＴｏＭＶのゲノムＲＮＡに対する結合性をゲルシフトアッセイによって評価した。ＴｏＭＶのゲノムＲＮＡの塩基配列としては、実施例１と同様にＧｅｎＢａｎｋにアクセッションナンバーＸ０２１４４で登録されている配列を用いた。
【０１１９】
（ＴｏＭＶの５’末端領域３００塩基を有する転写物及びＴｏＭＶの３’末端領域２１８塩基を有する転写物の調整）
ＴｏＭＶの５’末端領域３００塩基を有する転写物及びＴｏＭＶの３’末端領域２１８塩基を有する転写物を、以下の方法で作製した。
【０１２０】
Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流に、ＴｏＭＶの５’末端領域３００塩基に対応する塩基配列を有するＤＮＡ、又はＴｏＭＶ３’末端領域２１８塩基に対応する塩基配列を有するＤＮＡを連結した。さらに、それぞれの３’末端にＭｌｕＩ認識部位を結合させて、ｃＤＮＡを合成した。次に、当該ｃＤＮＡを、ｐＣＲ‐Ｂｌａｎｔ ＩＩ‐ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてクローニングした。以下、ＴｏＭＶの５’末端領域３００塩基を有する転写物を「ＴｏＭＶ５’」、ＴｏＭＶ３’末端領域２１８塩基を有する転写物を「ＴｏＭＶ３’」と表記する。
【０１２１】
クローニングにより得られたｃＤＮＡを、ＭｌｕＩで直鎖化した後、３２Ｐ ＣＴＰ存在下でＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ３ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて転写を行なった。
【０１２２】
また、ゲルシフトアッセイの比較に用いるため、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端領域３１８塩基を有する転写物を、ｐＳＰ‐ｌｕｃ＋ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をＣｆｒ１０Ｉで直鎖化して、３２Ｐ ＣＴＰ存在下でＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写させることで得た。以下、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端領域３１８塩基を有する転写物を「ｌｕｃ５’」と表記する。
【０１２３】
（大腸菌によるＢＴＲ１Ｓの合成）
ヒスチジンタグをＮ末端に融合したＢＴＲ１Ｓを、ｐＤＥＳＴ‐Ｈｉｓベクター（Ｔｓｕｎｏｄａ ｅｔ ａｌ．，２００５）を用いて、大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）において発現させた。
【０１２４】
次に、Ｈｉｓ Ｓｅｌｅｃｔ Ｎｉｃｋｅｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌ (Ｓｉｇｍａ社製)を用いて精製して、ＢＴＲ１Ｓを得た。
【０１２５】
（ゲルシフトアッセイ）
２０μｌの反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ イミダゾール、５％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２ｍｇ／ｍｌヘパリン）に、上述の大腸菌に発現させたＢＴＲ１Ｓを終濃度０、２００、４００、６００ｎＭとなるように添加した。次に、３０℃で１０分静置後、３２Ｐ標識したＴｏＭＶ５’、ＴｏＭＶ３’又はｌｕｃ５’（０．１ｐｍｏｌ／μｌ）を１μｌ、及び２．５μlのＧｌｙｃｅｒｏｌ‐ＢＰＢ液（５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％ ブロムフェノールブルー）を加えた。
【０１２６】
次に、４％ＴＢＥゲルで１００Ｖ、１．５〜２時間電気泳動した。３２Ｐ−ＲＮＡの検出はＢＡＳ−２５００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）で行なった。
【０１２７】
また、３２Ｐ標識したＴｏＭＶ５’と、非標識のＴｏＭＶ５’、ＴｏＭＶ３’又はｌｕｃ５’とを上記反応液に混合して競合実験を行なった。競合実験では、ＢＴＲ１Ｓの終濃度を６００ｎＭ、３２Ｐ標識したＴｏＭＶ５’の混合量を５ｎＭとして、非標識のＴｏＭＶ５’、ＴｏＭＶ３’又はｌｕｃ５’を１、３、１０ｐｍｏｌとした。これら非標識の転写物の混合量は、混合した３２Ｐ標識したＴｏＭＶ５’の１０倍、３０倍、１００倍のモル数となる。次に、４％ ＴＢＥゲルで１００Ｖ、１．５〜２時間電気泳動した。３２Ｐ−ＲＮＡの検出はＢＡＳ−２５００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）で行なった。
【０１２８】
これらの結果を図４に示す。図４は、本実施例におけるゲルシフトアッセイの結果を示す図であり、（ａ）は、３２Ｐ標識したＴｏＭＶ５’、ＴｏＭＶ３’又はｌｕｃ５’を用いた、ＢＴＲ１Ｓに対する結合性を検討した結果を示し、（ｂ）は、３２Ｐ標識したＴｏＭＶ５’と、非標識の、ＴｏＭＶ５’、ＴｏＭＶ３’又はｌｕｃ５’とを用いた、ＢＴＲ１Ｓに対する結合性を検討した結果を示す図である。また、図４において、「Ｆ」を付した領域はタンパク質と結合していないＲＮＡを示すバンドが現われる大よその領域を示し、「Ｃ」を付した領域は、ＲＮＡ及びタンパク質が結合した複合体を示すバンドが現われる大よその領域を示す。
【０１２９】
図４（ａ）に示すように、３２Ｐ標識したＴｏＭＶ５’でのみ、「Ｃ」の領域にバンドが確認された。また、図４（ｂ）に示すように、非標識のＴｏＭＶ５’のみが、３２Ｐ標識したＴｏＭＶ５’に対して競合的に機能して、ＢＲＴ１Ｓに結合することが確認された。このことから、ＢＴＲ１Ｓは、ＴｏＭＶ ＲＮＡの５’末端領域に特異的に結合することが確認された。
【０１３０】
〔実施例３：ＢＴＲ１のウイルス増殖への影響〕
植物体内における、ＢＴＲ１のウイルス増殖に対する関与を、ＢＴＲ１のノックアウト株及びＢＴＲ１Ｓを過剰発現させた株を用いて確認した。
【０１３１】
（ＢＴＲ１ノックアウト株の作製）
シロイヌナズナのＢＴＲ１ノックアウト株は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ（ＡＢＲＣ）のＴ−ＤＮＡタグラインより入手した（ＳＡＬＫ＿００７９２４）。以下このＢＴＲ１ノックアウト株を、単に「ＳＡＬＫ＿００７９２４」と表記する。ＳＡＬＫ＿００７９２４は、Ｌｏｃｕｓ ｔａｇ Ａｔ５ｇ０４４３０の位置にＴ‐ＤＮＡが挿入されている。これにより、ＢＴＲ１がノックアウトされている。
【０１３２】
なお、ＡＢＲＣより入手した株は、ホモ個体及びヘテロ個体の混在状態である。よって、ホモ個体を同定するために、プライマーＬＰ（５’‐ＡＣＧＣＴＴＡＡＣＣＡＣＣＡＡＡＴＡＴＣ‐３’：配列番号５）、プライマーＲＰ（５’‐ＡＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＡＣＡＣＴＴＧＡＣ‐３’:配列番号６）、プライマーＬＢ（５’‐ＣＧＴＧＧＡＣＣＧＣＴＴＧＣＴＧＣＡＡＣＴ‐３’：配列番号７）を用いたゲノミックＰＣＲに、ＳＡＬＫ＿００７９２４を供することで確認した。プライマーＬＰ、ＲＰ、ＬＢは次のようにして設計したものである。つまり、シロイヌナズナのゲノム配列情報を元に、Ｔ−ＤＮＡの挿入部位を中心として、前後約４００ｂｐ（計約８００ｂｐ）離れた部位に相同なプライマーを作製して、さらに、これらのプライマーと、Ｔ−ＤＮＡ挿入領域内のプライマーを設計した。
【０１３３】
なお、シロイヌナズナゲノムＤＮＡは、以下の方法に従い取得した。播種後約３週間のロゼット葉１〜２枚に、ＤＮＡ抽出バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳ）を加え、Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて葉を破砕した。１５，０００×ｇ、室温、５分間の遠心処理により得られた上清から、イソプロパノール沈殿により全ＤＮＡを回収した。
【０１３４】
（ＢＴＲ１過剰発現株の作製）
シロイヌナズナのＢＴＲ１過剰発現株は以下のようにして作製した。植物材料としては、シロイヌナズナの野生株であるＣｏｌ‐０を用いた。
【０１３５】
まず、ＸｂａＩ、ＳａｃＩ認識部位を利用して、ｐＢＩ１２１（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッションナンバー  ＡＦ４８５７８３）の３５Ｓプロモータの下流に、配列番号３又は配列番号４からなるポリヌクレオチドが挿入されたプラスミドを構築した。次に、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefacience）を用いて、シロイヌナズナに当該プラスミドを導入することで、シロイヌナズナの形質転換を行なった。形質転換はＦｌｏｒａｌ ｄｉｐ法（Clough, S. J. and Bent, A. F., Plant J., 1998, 16, 735‐743を参照)により行なった。このようにして得られたシロイヌナズナのＢＴＲ１過剰発現株のうち、ＢＴＲ１Ｓの過剰発現株を、以下「３５Ｓ：ＢＴＲ１Ｓ」と表記し、ＢＴＲ１Ｌの過剰発現株を、以下「３５Ｓ：ＢＴＲ１Ｌ」と表記する。
【０１３６】
（ＢＴＲ１とウイルス増殖との関係に関する検討）
ウイルス増殖の測定には、各形質転換植物を、カナマイシン選抜することで得たＴ２世代のものを用いた。
【０１３７】
播種して４〜５週間後の各形質転換植物のロゼット葉に、ＴｏＭＶ（０．１ｍｇ／ｍｌ）又はＣＭＶ ＲＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を接種した。ＴｏＭＶを接種したＳＡＬＫ＿００７９２４では接種から７日後に接種葉を採取した。ＴｏＭＶを接種した３５Ｓ：ＢＴＲ１Ｓ及び３５Ｓ：ＢＴＲ１Ｌでは接種から４日後に接種葉を採取した。また、キュウリモザイクウイルス（以下、「ＣＭＶ」と表記する）を接種した各形質転換植物では接種から２日目に、接種葉を採取した。
【０１３８】
採取した接種葉を、次のように調整してＳＤＳ‐ＰＡＧＥに供した。まず、葉の湿重量の５倍量のゲルサンプル緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％  ＳＤＳ、５％  β-メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．０２％  ＢＰＢ）を加えて破砕した後、１００℃、３分間加熱したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルとした。
【０１３９】
ＳＡＬＫ＿００７９２４におけるＴｏＭＶの外被タンパク質（以下、「ＣＰ」と表記する）の蓄積を、クマシーブリリアントブルー染色によって検出し、ＢＴＲ１過剰発現株（３５Ｓ：ＢＴＲ１Ｓ及び３５Ｓ：ＢＴＲ１Ｌ）におけるＴｏＭＶのＣＰの蓄積や、ＳＡＬＫ＿００７９２４及びＢＴＲ１過剰発現株におけるＣＭＶのＣＰの蓄積はウエスタンブロット法によって検出した。
【０１４０】
また、３５Ｓ：ＢＴＲ１Ｓ及び３５Ｓ：ＢＴＲ１Ｌから採取した接種葉では、ウエスタンブロット法によって、それぞれＢＴＲ１Ｓ及びＢＴＲ１Ｌの発現を検出した。ＢＴＲ１特異的抗体は、上述のヒスチジンタグをＮ末端に融合させたＢＴＲ１Ｓを抗原として、シバヤギ株式会社の受託サービスを利用して作製した。
【０１４１】
この結果を図５に示す。図５は、ＢＴＲ１とウイルス増殖との関係に関する検討した結果を示す図であり、（ａ）はＣｏｌ‐０及びＳＡＬＫ＿００７９２４の葉に含まれるウイルスのＣＰを検出した結果を示し、（ｂ）はＣｏｌ‐０及び３５Ｓ：ＢＴＲ１Ｓの葉に含まれるウイルスのＣＰを検出した結果、及びそれぞれの葉におけるＢＴＲ１Ｓの発現を検出した結果を示し、（ｃ）はＣｏｌ‐０及び３５Ｓ：ＢＴＲ１Ｌの葉に含まれるＴｏＭＶのＣＰを検出した結果、及びそれぞれの葉におけるＢＴＲ１Ｌの発現を検出した結果を示す。
【０１４２】
図５（ａ）に示すように、ＳＡＬＫ＿００７９２４におけるＴｏＭＶの増殖は、野生型Ｃｏｌ‐０に比べて昂進していた。また、図５（ｂ）に示すように、３５Ｓ：ＢＴＲ１Ｓでは、ＴｏＭＶの増殖が低下することが確認できた。また、このようなウイルスの増殖の低下は、ＣＭＶについては確認されなかった。また、図５（ｃ）に示すように、３５Ｓ：ＢＴＲ１Ｌでも、ＴｏＭＶの増殖を抑制する効果が得られることが確認できた。
【０１４３】
（ＢＴＲ１の発現による植物体形成への影響）
ＢＴＲ１の発現が、シロイヌナズナの植物体の形成に与える影響について確認した。
【０１４４】
まず、Ｃｏｌ‐０、ＳＡＬＫ＿００７９２４、３５Ｓ：ＢＴＲ１Ｓ及び３５Ｓ：ＢＴＲ１Ｌのそれぞれに、ＴｏＭＶ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を播種した。次に、２３℃日長１６時間の長日条件下で４週間育成した。そして、育成後の植物体を観察した。この結果を図６に示す。図６は、ＴｏＭＶを播種して育成した後のシロイヌナズナを観察した結果を示す図である。
【０１４５】
図６に示すように、ＢＴＲ１Ｓ及びＢＴＲ１Ｌの過剰発現は、植物の生育に目立った影響を及ぼさなかった。
【０１４６】
以上の結果から、ＢＴＲ１はＴｏＭＶ ＲＮＡの５’末端領域に結合して、ＴｏＭＶの増殖を特異的に阻害することが示された。
【０１４７】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
以上のように、本発明によれば、植物ウイルス抵抗性が賦与された植物体を作製することができるので、種々の作物において植物ウイルスを防除し得る。したがって、本発明は、育種分野に用いることができるだけではなく、植物ウイルスが感染する植物を用いる農業や園芸等の産業分野に適用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】実施例で作製したストレプトタグ付加ＲＮＡプローブの構造を模式的に示した図である。
【図２】実施例において、ＲＮＡ−タンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す図である。
【図３】Ｌｏｃｕｓ ｔａｇ Ａｔ５ｇ０４４３０の塩基配列から生じる二種類のスプライシングバリアント、及び本実施例のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析の結果を示す図である。
【図４】実施例において、ゲルシフトアッセイを行なった結果を示す図であり、（ａ）は、３２Ｐ標識したＴｏＭＶ５’、ＴｏＭＶ３’又はｌｕｃ５’を用いた、ＢＴＲ１Ｓに対する結合性を検討した結果を示し、（ｂ）は、３２Ｐ標識したＴｏＭＶ５’と、非標識の、ＴｏＭＶ５’、ＴｏＭＶ３’又はｌｕｃ５’とを用いた、ＢＴＲ１Ｓに対する結合性を検討した結果を示す。
【図５】実施例において、ＢＴＲ１とウイルス増殖との関係に関する検討した結果を示す図であり、（ａ）はＣｏｌ−０及びＳＡＬＫ＿００７９２４の葉に含まれるウイルスのＣＰを検出した結果を示し、（ｂ）はＣｏｌ−０及び３５Ｓ：ＢＴＲ１Ｓの葉に含まれるウイルスのＣＰを検出した結果、及びそれぞれの葉におけるＢＴＲ１Ｓの発現を検出した結果を示し、（ｃ）はＣｏｌ−０及び３５Ｓ：ＢＴＲ１Ｌの葉に含まれるＴｏＭＶのＣＰを検出した結果、及びそれぞれの葉におけるＢＴＲ１Ｌの発現を検出した結果を示す。
【図６】実施例において、ＴｏＭＶを播種して育成した後のシロイヌナズナを観察した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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