(57)【要約】 【課題】          ＲＮＡポリメラーゼの基質となる蛍光標識ポリヌクレオチドおよび該蛍光標識ポリヌクレオチドを用いたRNAポリメラーゼ阻害剤を同定する方法を提供することを目的とする。【解決手段】        ＲＮＡポリメラーゼの基質となる蛍光標識ポリヌクレオチドオを設計、調製し、被検物質の共存下または非共存下、該蛍光標識ポリヌクレオチドとＲＮＡポリメラーゼ反応させ、蛍光強度を測定することを手段とするＲＮＡポリメラーゼ阻害剤の同定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
Ｃａｐ（Ｎ．．．Ｎ）ａ（Ｎ．．．Ｎ）ｂ    （Ｉ）
（式中、Ｃａｐはキャップ構造を示し、
（Ｎ．．．Ｎ）ａは９個の単一または複数種類の塩基からなる塩基配列であって、該塩基配列を構成する塩基のうちいずれか１つが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質により標識されている塩基配列を示し、
（Ｎ．．．Ｎ）ｂは、５ないし５１個の単一または複数種類の塩基からなる塩基配列を示す。
ただし、（Ｎ．．．Ｎ）ａ以降の塩基配列中、５’側から数えて９番目〜１３番目の間にある標識されていない塩基のうちの少なくとも１つがアデニンまたはグアニンである。）
で表されるポリヌクレオチド。
【請求項２】
（Ｎ．．．Ｎ）ｂを構成する塩基のうち、（Ｎ．．．Ｎ）ａ以降の塩基配列中、５’側から数えて１４番目以降のいずれか１つの塩基が蛍光物質、消光物質およびビオチンから選択されるいずれか１の標識物質により標識されている請求項１に記載のポリヌクレオチド（ただし、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中の標識物質と（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中の標識物質の組合わせは、ともに消光物質、あるいは、ともにビオチンであることはない）。
【請求項３】
（Ｎ．．．Ｎ）ｂを構成する塩基のうち、標識物質により標識されている塩基が３’末端の塩基である請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
（Ｎ．．．Ｎ）ａ中の標識物質と（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中の標識物質の組合わせが、エネルギートランスファーを生じるドナーとアクセプターの組合わせである請求項２〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
（Ｎ．．．Ｎ）ａ中の標識物質により標識されている塩基から（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中の標識物質により標識されている塩基までの塩基数が６〜６０個である請求項２〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
Ｃａｐがキャップ０である請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
Ｃａｐがキャップ１である請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
Ｃａｐがキャップ２である請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
ポリヌクレオチドを構成する塩基のうち、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中の標識物質により標識されている塩基がウリジン又はシトシンであり、他の塩基はグアニンまたはアデニンである請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドを構成する塩基のうち、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中の標識物質により標識されている塩基がウリジンであり、（Ｎ．．．Ｎ）ｃ中の標識物質により標識されている塩基がシトシンであり、他の塩基はグアニンまたはアデニンである請求項２〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドを構成する塩基のうち、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中の標識物質により標識されている塩基がシトシンであり、（Ｎ．．．Ｎ）ｃ中の標識物質により標識されている塩基がウリジンであり、他の塩基はグアニンまたはアデニンである請求項２〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１８】
配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１９】
配列表の配列番号８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２０】
配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２１】
配列表の配列番号１０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２３】
配列表の配列番号１２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２４】
配列表の配列番号１３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２５】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から６番目のシトシンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から６番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
【請求項２７】
配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から６番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
【請求項２８】
配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から８番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
【請求項２９】
配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から８番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
【請求項３０】
配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から８番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
【請求項３１】
配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から８番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
【請求項３２】
配列表の配列番号８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から８番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
【請求項３３】
配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から８番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
【請求項３４】
配列表の配列番号１０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から８番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
【請求項３５】
配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から８番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
【請求項３６】
配列表の配列番号１２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から９番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
【請求項３７】
配列表の配列番号１３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から１６番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
【請求項３８】
キャップ構造がキャップ０である請求項２５〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
キャップ構造がキャップ１である請求項２５〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４０】
キャップ構造がキャップ２である請求項２５〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
蛍光物質が、Ｃｙ５、アレキサフローラ４８８、アレキサフローラ６４７、フルオレセインのうちのいずれか１つである請求項２５〜４０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４２】
３’末端の塩基がビオチン化されている請求項２５〜４１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
３’末端の塩基にさらにランタニドが結合している請求項２５〜４２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４４】
請求項１〜１１、２５〜４３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とするＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質の同定方法。
【請求項４５】
請求項１〜１１、２５〜４３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを用い、ＲＮＡポリメラーゼの活性を変性ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動法を利用して測定する工程を含む、ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質の同定方法。
【請求項４６】
請求項１〜１１、２５〜４３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを用い、ＲＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を蛍光偏光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ＦＰ）法を利用して測定する工程を含む、ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質の同定方法。
【請求項４７】
請求項１〜１１、２５〜４３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを用い、ＲＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）法を利用して測定する工程を含む、ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質の同定方法。
【請求項４８】
請求項１〜１１、２５〜４３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを用い、ＲＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＴＲ−ＦＲＥＴ）法を利用して測定する工程を含むＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質の同定方法。
【請求項４９】
ＲＮＡポリメラーゼがインフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼである請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の同定方法。
【請求項５０】
配列表の配列番号１４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５１】
配列表の配列番号１５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５２】
配列表の配列番号１６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５３】
配列表の配列番号１７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５４】
配列表の配列番号１８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５５】
配列表の配列番号１９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５６】
配列表の配列番号２０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５７】
配列表の配列番号２１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５８】
配列表の配列番号２２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５９】
配列表の配列番号２３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項６０】
配列表の配列番号２４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項６１】
配列表の配列番号２５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項６２】
配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光標識ポリヌクレオチドに関する。より詳細にはＲＮＡポリメラーゼの基質として用いることができる蛍光標識ポリヌクレオチドに関する。さらには、該ポリヌクレオチドを用いたＲＮＡポリメラーゼ阻害剤の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、毎年流行を繰り返し、重篤な風邪として他の風邪と区別されている。高齢者の肺炎、小児の脳症等の重篤な合併症を引き起こす場合もあり、毎年多数の死亡者も報告されている。
【０００３】
現在、臨床的に使用されている抗インフルエンザ薬は、プロトンポンプインヒビター（ＰＰＩ）とノイラミニダーゼインヒビター（ＮＡＩ）の２種類に分類され、特に、ＮＡＩであるタミフル（登録商標）は近年急速に普及してきた。しかし、タミフル耐性ウイルスの出現、Ａ型ウイルスに比したＢ型ウイルスに対する治療効果の弱さ、さらには、因果関係は明確ではないものの異常行動等の重篤な副作用発現などが報告されるなど、問題点が明らかになりつつあり、ＰＰＩやＮＡＩとは異なる薬理作用をもつ薬剤の開発が望まれている。
【０００４】
ＰＰＩやＮＡＩとは異なる薬剤標的として、ＲＮＡポリメラーゼに注目した研究が進行している。インフルエンザウイルスは感染細胞中で宿主のｍＲＮＡを利用して自己のＲＮＡの転写・複製を行う。これらの転写・複製を担う酵素がＲＮＡポリメラーゼであり、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡの３つのサブユニットからなる。インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、宿主ｍＲＮＡのキャップ構造を認識し、キャップ構造を含む９〜１３塩基（キャップ構造の塩基は数に含めない）の断片を切断するエンドヌクレアーゼ活性と、宿主ｍＲＮＡから切断した断片をプライマーにしてウイルス蛋白質をコードするｍＲＮＡを転写するエロンゲーション活性を有する。宿主ｍＲＮＡのキャップ構造を認識し、キャップ構造を含む９〜１３塩基（キャップ構造の塩基は数に含めない）の断片を切断する過程は、ｃａｐ  ｓｎａｔｃｈｉｎｇといわれ、宿主が有さないウイルス特異的な活性であるため、抗インフルエンザ薬の創薬標的になると考えられている（非特許文献１）。
【０００５】
ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質としては、ｆｌｕｔｉｍｉｄｅやＴ−７０５、４−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ２，４−ｄｉｏｘｏｂｕｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄなどが報告されているが、未だ臨床で抗インフルエンザ薬として使用されるには到っていない。
【０００６】
一方で、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質のスクリーニング系としては、ラジオアイソトープを用いた系がいくつか報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。しかし、ラジオアイソトープを用い、かつ、スループットが比較的低い系のみであり、安全面、施設面、効率面等において多くの問題を有していた。
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ２１：１１８７−１１９５，１９７７
【非特許文献２】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２３１，３０９−３１４，  １９５５
【非特許文献３】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４０，１１８９−１１９３，１９９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、既存の抗インフルエンザ薬とは異なる作用機序を有する新規な抗インフルエンザ薬の獲得に有用なツールおよび当該ツールを用いた薬剤の同定方法を提供するものである。より具体的には、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質の同定に有用なＲＮＡポリメラーゼの基質、およびそれを用いたＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質の同定方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は鋭意研究を重ね、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼの基質となり得るポリヌクレオチドを設計し、さらにこれに蛍光物質を附してもＲＮＡポリメラーゼの酵素活性に影響がないことを見出した。さらに、当該蛍光標識ポリヌクレオチドを用いることにより、ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質の同定が効率よくかつ安全に行えることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（６２）を提供する。
（１）一般式（Ｉ）
Ｃａｐ（Ｎ．．．Ｎ）ａ（Ｎ．．．Ｎ）ｂ    （Ｉ）
（式中、Ｃａｐはキャップ構造を示し、
（Ｎ．．．Ｎ）ａは９個の単一または複数種類の塩基からなる塩基配列であって、該塩基配列を構成する塩基のうちいずれか１つが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質により標識されている塩基配列を示し、
（Ｎ．．．Ｎ）ｂは、５ないし５１個の単一または複数種類の塩基からなる塩基配列を示す。
ただし、（Ｎ．．．Ｎ）ａ以降の塩基配列中、５’側から数えて９番目〜１３番目の間にある標識されていない塩基のうちの少なくとも１つがアデニンまたはグアニンである。）
で表されるポリヌクレオチド。
（２）（Ｎ．．．Ｎ）ｂを構成する塩基のうち、（Ｎ．．．Ｎ）ａ以降の塩基配列中、５’側から数えて１４番目以降のいずれか１つの塩基が蛍光物質、消光物質およびビオチンから選択されるいずれか１の標識物質により標識されている上記（１）に記載のポリヌクレオチド（ただし、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中の標識物質と（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中の標識物質の組合わせは、ともに消光物質、あるいは、ともにビオチンであることはない）。
（３）（Ｎ．．．Ｎ）ｂを構成する塩基のうちの標識物質により標識されている塩基が３’末端の塩基である上記（２）に記載のポリヌクレオチド。
（４）（Ｎ．．．Ｎ）ａ中の標識物質と（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中の標識物質の組合わせが、エネルギートランスファーを生じるドナーとアクセプターの組合わせである上記（２）〜（３）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（５）（Ｎ．．．Ｎ）ａ中の標識物質により標識されている塩基から（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中の標識物質により標識されている塩基までの塩基数が６〜６０個である上記（２）〜（４）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（６）Ｃａｐがキャップ０である上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（７）Ｃａｐがキャップ１である上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（８）Ｃａｐがキャップ２である上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（９）ポリヌクレオチドを構成する塩基のうち、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中の標識物質により標識されている塩基がウリジン又はシトシンであり、他の塩基はグアニンまたはアデニンである上記（１）〜（８）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（１０）ポリヌクレオチドを構成する塩基のうち、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中の標識物質により標識されている塩基がウリジンであり、（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中の標識物質により標識されている塩基がシトシンであり、他の塩基はグアニンまたはアデニンである上記（２）〜（９）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（１１）ポリヌクレオチドを構成する塩基のうち、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中の標識物質により標識されている塩基がシトシンであり、（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中の標識物質により標識されている塩基がウリジンであり、他の塩基はグアニンまたはアデニンである上記（２）〜（９）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（１２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（１３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（１４）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（１５）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（１６）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（１７）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（１８）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（１９）配列表の配列番号８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２０）配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２１）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２２）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２３）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２４）配列表の配列番号１３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２５）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から６番目のシトシンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
（２６）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から６番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
（２７）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から６番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
（２８）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から８番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
（２９）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から８番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
（３０）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から８番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
（３１）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から８番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
（３２）配列表の配列番号８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から８番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
（３３）配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から８番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
（３４）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から８番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
（３５）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から８番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
（３６）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から９番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
（３７）配列表の配列番号１３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端から１６番目のウリジンが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されており、さらに、５’末端にキャップ構造が結合しているポリヌクレオチド。
（３８）キャップ構造がキャップ０である上記（２５）〜（３７）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（３９）キャップ構造がキャップ１である上記（２５）〜（３７）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（４０）キャップ構造がキャップ２である上記（２５）〜（３７）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（４１）蛍光物質が、Ｃｙ５、アレキサフローラ４８８、アレキサフローラ６４７、フルオレセインのうちのいずれか１つである、上記（２５）〜（４０）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（４２）３’末端の塩基がビオチン化されている上記（２５）〜（４１）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（４３）３’末端の塩基にさらにランタニドが結合している上記（２５）〜（４２）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（４４）上記（１）〜（１１）、（２５）〜（４３）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とするＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質の同定方法。
（４５）上記（１）〜（１１）、（２５）〜（４３）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを用い、ＲＮＡポリメラーゼの活性を変性ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動法を利用して測定する工程を含む、ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質の同定方法。
（４６）上記（１）〜（１１）、（２５）〜（４３）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを用い、ＲＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を蛍光偏光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ＦＰ）法を利用して測定する工程を含む、ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質の同定方法。
（４７）上記（１）〜（１１）、（２５）〜（４３）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを用い、ＲＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）法を利用して測定する工程を含む、ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質の同定方法。
（４８）上記（１）〜（１１）、（２５）〜（４３）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを用い、ＲＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＴＲ−ＦＲＥＴ）法を利用して測定する工程を含むＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質の同定方法。
（４９）ＲＮＡポリメラーゼがインフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼである上記（４４）〜（４８）のいずれか１つに記載の同定方法。
（５０）配列表の配列番号１４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（５１）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（５２）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（５３）配列表の配列番号１７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（５４）配列表の配列番号１８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（５５）配列表の配列番号１９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（５６）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（５７）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（５８）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（５９）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（６０）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（６１）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（６２）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【００１１】
本発明を用いることにより、ＲＮＡポリメラーゼ阻害物質の同定を効率的かつ安全に行うことができ、ひいては、新規な抗インフルエンザ薬を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、一つの態様として、ＲＮＡポリメラーゼの基質として用いることができるポリヌクレオチドに関する。より具体的には、一般式（Ｉ）
Ｃａｐ（Ｎ．．．Ｎ）ａ（Ｎ．．．Ｎ）ｂ    （Ｉ）
（式中、Ｃａｐはキャップ構造を示し、
（Ｎ．．．Ｎ）ａは９個の単一または複数種類の塩基からなる塩基配列であって、該塩基配列を構成する塩基のうちいずれか１つが蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質により標識されている塩基配列を示し、
（Ｎ．．．Ｎ）ｂは、５ないし５１個の単一または複数種類の塩基からなる塩基配列を示す。
ただし、（Ｎ．．．Ｎ）ａ以降の塩基配列中、５’側から数えて９番目〜１３番目の間にある標識されていない塩基のうちの少なくとも１つがアデニンまたはグアニンである。）
で表されるポリヌクレオチドに関する。本発明のポリヌクレオチドはポリリボヌクオチドであることが好ましいが、ＲＮＡポリメラーゼの基質としての機能を保持し得る限りにおいては、デオキシリボヌクレオチドを含有していてもよく、また、構成する塩基としては、一般的なｍＲＮＡの構成塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、ウリジンまたは必要に応じてメチル化されているこれらの塩基であることが好ましいが、チミンやイノシン等の塩基、糖修飾体やジヒドロキシ体、その他の天然のもしくは人工的な化学修飾を受けた塩基であってもよい。
【００１３】
本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡポリメラーゼの基質として用いることを目的として設計されたため、上記一般式（Ｉ）に示したとおり、５’末端にキャップ構造を有している。真核生物や真核生物を宿主とするウイルスのｍＲＮＡの大部分の５’末端には７−メチルグアノシンが３個のリン酸基を介して結合している。この構造はｍ７Ｇ５’ｐｐｐ−で表され（ここで、ｍ７Ｇ５は７メチルグアノシンを意味し、ｐはリン酸基を意味する。）、ＲＮＡの頭部の帽子という意味でキャップ構造とよばれる。なお、本発明において、「キャップ構造」はここに説明するキャップ構造を意味する。キャップ構造を含めたｍＲＮＡの核酸成分の表式としては、ｍ７Ｇ５’ｐｐｐ−５’Ｎ１（ｍ）ｐＮ２（ｍ）ｐＮ３ｐＮ４ｐ・・・（ここで、ｍ７Ｇ５は７メチルグアノシンを意味し、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４は塩基、ｍはメチル化構造、ｐはリン酸基を意味する。）と表される。Ｎ１およびＮ２のヌクレオシドの糖の２’位置にメチル基がついているか否かはｍＲＮＡによって異なっており、Ｎ１およびＮ２いずれにもメチル基がついていない場合はキャップ０、Ｎ１のみにメチル基がついている場合はキャップ１、Ｎ１およびＮ２いずれにもメチル基がついている場合はキャップ２とよばれる。キャップ構造は蛋白質合成に際し、ｍＲＮＡがリボソームと結合する際に結合効率を高める働きがある。
【００１４】
インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、宿主のｍＲＮＡのキャップ構造を認識し結合する。そして、宿主ｍＲＮＡからこのキャップ構造を含む５’末端から９〜１３塩基（キャップ構造の塩基は数に含めない）を切断し、この切断したキャップ構造を含む５’末端から９〜１３塩基（キャップ構造の塩基は数に含めない）からなるポリヌクレオチドを引き続くインフルエンザウイルスのｍＲＮＡの転写のプライマーとすることが知られている。また、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、５’末端から９〜１３番目（キャップ構造の塩基は数に含めない）のアデニン塩基またはグアニン塩基の後方を切断することが知られている。
【００１５】
上記一般式（Ｉ）で表される本発明のポリヌクレオチドはキャップ構造を有し、（Ｎ．．．Ｎ）ａ以降の塩基配列中、５’側から数えて９番目〜１３番目の間にある塩基のうちの少なくとも１つがアデニンまたはグアニンであるので、ＲＮＡポリメラーゼの切断を受け、切断されたキャップ構造を有する９〜１３塩基からなるポリヌクレオチドは引き続き起こる転写のプライマーとなる。
【００１６】
本発明のポリヌクレオチドのキャップ構造はキャップ０、キャップ１、キャップ２のいずれでもよいが、より好ましくはキャップ０またはキャップ１である。
【００１７】
また、本発明のポリヌクレオチドは、ループ構造等の複雑な高次構造を形成しないように構成塩基配列を選定するとさらに好ましい。ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質のスクリーニング系においては、従来、複雑な高次構造を有するＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼの基質として用いられてきたため、核酸のインターカレーター作用を有すると思われる化合物がヒット化合物として獲得されることが少なくなかった。本発明のポリヌクレオチドは塩基数（キャップ構造の塩基は数に含めない）が１４〜６０個、好ましくは１４〜５０個、より好ましくは１４〜４０個、さらに好ましくは１４〜２９個であるので、ＲＮＡポリメラーゼ特異的でない化合物をヒット化合物から除外できる複雑な高次構造を形成しないポリヌクレオチドの設計が容易である。そのように設計された高次構造を形成しないポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される。
【００１８】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、キャップ構造を含まない塩基配列の５’側から数えて１〜９番目、好ましくは４〜９番目、より好ましくは６〜９番目のいずれかの位置に蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質により標識された塩基を含んでいる。本発明のポリヌクレオチドにおける標識物質による標識部位は、インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼによるキャップ構造認識部位と切断部位の間に位置する。本発明者は、酵素であるインフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼの認識部位および切断部位の近傍にかさ高い化合物の修飾を行うと、立体障害等により酵素活性に影響が出ることを当初予測していた。しかし、本発明者が設計、作製した本発明のポリヌクレオチドは、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼにより効率よく切断され、標識物質による修飾の影響を受けなかった。
【００１９】
修飾に用いる蛍光物質としては、ポリヌクレオチドの塩基に修飾可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フルオレセイン類（フルオレセイン、オレゴングリーン、エオシン、エリスロシン）、ローダミン類（テトラメチルローダミン誘導体、テキサスレッド誘導体、ローダミンＢ  ｂａｓｅ、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ）、クマリン類、ダンシル型（ジメチルアミノナフタレンスルホン酸型）蛍光色素、ＮＢＤ型色素、ピレン、フィコビリプロテイン（Ｒ−フィコエリスリン、フロフィコシアニン、アロフィコシアニン）、ＢＯＤＩＰＹ誘導体、Ｃｙ（登録商標）色素（Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、アレキサ（登録商標）フローラ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、４０５、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６３３、６４７、６８０、７００、７５０）、好適にはフルオレセイン類（フルオレセイン、オレゴングリーン、エオシン、エリスロシン）、ローダミン類（テトラメチルローダミン誘導体、テキサスレッド誘導体、ローダミンＢ  ｂａｓｅ、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ）、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、またはアレキサフローラ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、４０５、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６３３、６４７、６８０、７００、７５０）、さらに好ましくはフルオレセイン類（フルオレセイン、オレゴングリーン、エオシン、エリスロシン）、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、またはアレキサフローラ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、４０５、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６３３、６４７、６８０、７００、７５０）、特に好ましくはフルオレセイン、Ｃｙ５、アレキサフローラ４８８、またはアレキサフローラ６４７が挙げられる。
また、修飾に用いる消光物質としては、ポリヌクレオチドの塩基に修飾可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ（登録商標）、Ｃｙ５Ｑ、Ｃｙ３Ｑ等が挙げられる。
【００２０】
上記の蛍光物質または消光物質の塩基への標識は、直接または間接的に、例えば、ビオチン―ストレプトアビジン結合を介して標識物質を結合できる。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドの修飾に用いるビオチンは、ストレプトアビジンとの結合を介して、上記の蛍光物質や消光物質を標識できるので有用である。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドは、一般式（Ｉ）の（Ｎ．．．Ｎ）ａ中のいずれか１の塩基が蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質で標識されているので、ＲＮＡポリメラーゼによるポリヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ活性またはエロンゲーション活性を、蛍光を検出する工程を含む系を用いることにより、効率よく検出することができる。
【００２３】
これまでは、インフルエンザのＲＮＡポリメラーゼ活性を測定する系としては、感度とスループットの観点から、ラジオアイソトープ（ＲＩ）を用いた系が汎用されており、実験者の危険を伴うばかりでなく、ＲＩを取り扱うための特殊な実験設備を要するなどの多大な問題点を有していた。これに対し、本発明のポリヌクレオチドは蛍光を検出する工程を含む系に用いることができるので、非常に安全かつ高感度なＲＮＡポリメラーゼ活性測定を可能にする。
具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、例えば次に示すアッセイ系で用いることができる。
【００２４】
好ましい系の１つとして、電気泳動を利用した系が挙げられる。このアッセイ系で使用する本発明のポリヌクレオチドは、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中のいずれか１の塩基を標識する標識物質が蛍光物質であることが好ましい。該蛍光物質は、直接的または間接的に、例えばビオチン―ストレプトアビジン結合を介して塩基に標識されていてもよい。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドにＲＮＡポリメラーゼを反応させ、反応液全体を変性アクリルアミドゲルを用いた電気泳動等により分離した後、ＦＬＡ−３０００（フジフィルム社）などの蛍光強度を画像で検出できる機器等を用いて、修飾した蛍光物質に合わせた励起波長（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）および吸収波長（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）を選択して、蛍光強度をイメージとして検出する。切断されたポリヌクレオチドは切断されていないポリヌクレオチドより移動度が大きいため、切断されたポリヌクレオチドと切断されていないポリヌクレオチドは移動度の異なるバンドとして検出されるので、バンド濃度等を測定することにより、エンドヌクレアーゼ活性を検出することができる。
【００２６】
また、上記のアッセイ系はＲＮＡポリメラーゼのエロンゲーション活性も検出することが可能である。ここでエロンゲーション活性とは、ＲＮＡポリメラーゼにより切断されたポリヌクレオチドをプライマーとして、ウイルスタンパクをコードするｍＲＮＡを転写する活性を意味する。切断されたポリヌクレオチドをプライマーとしてｍＲＮＡの転写が行われた場合、種々の塩基長のｍＲＮＡが生じ、これをアクリルアミドゲルを用いた電気泳動等で分離すると、移動度の異なるバンドとして検出されるので、バンドを検出することによりエロンゲーション活性を検出することができる。エロンゲーション活性が認められなければ、ＲＮＡポリメラーゼ活性が阻害されていることが確認できる。
【００２７】
さらに、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中のいずれか１の塩基を標識する標識物質がビオチンである本発明のポリヌクレオチドを用いて、上記のアッセイ系でエンドヌクレアーゼ活性を検出できる。具体的には、該ポリヌクレオチドにＲＮＡポリメラーゼを反応させ、反応液全体を変性アクリルアミドゲルを用いた電気泳動等により分離した後、蛍光物質、ＡＬＰ（アルカリフォスフォターゼ）またはＨＲＰ（ホースラデッシュペルオキシダーゼ）などの標識物質が標識されたストレプトアビジンを反応させ、ビオチンで標識されたポリヌクレオチドのバンドを検出することができる。例えば、蛍光物質が標識されたストレプトアビジンを用いた場合、ビオチンを有するポリヌクレオチドのバンドは、蛍光標識ストレプトアビジンと反応するので、ＦＬＡ−３０００（フジフィルム社）などの蛍光強度を画像で検出できる機器等を用いて、蛍光物質に合わせた励起波長（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）および吸収波長（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）を選択して、蛍光強度をイメージとして検出する。切断されたポリヌクレオチドは切断されていないポリヌクレオチドより移動度が大きいため、切断されたポリヌクレオチドと切断されていないポリヌクレオチドは移動度の異なるバンドとして検出されるので、エンドヌクレアーゼ活性を検出することができる。ＡＬＰ−ストレプトアビジンやＨＲＰ−ストレプトアビジンは市販品として生化学工業社などから入手可能である。
【００２８】
他の好ましい系の１つとして、蛍光偏光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ＦＰ）法を利用した系が挙げられる。このアッセイ系で使用する本発明のポリヌクレオチドは、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中のいずれか１の塩基を標識する標識物質が蛍光物質であることが好ましい。該蛍光物質は直接的または間接的に、例えばビオチン―ストレプトアビジン結合を介して標識されていてもよいが、直接的に標識されていることが好ましい。
【００２９】
ＦＰ法は、分子の相対的な大きさを蛍光偏光度（ＦＰ値）を用いて測定する方法である。蛍光偏光度（ＦＰ値）は蛍光物質が励起されてから蛍光を発するまでの間に回転する度合いを数値化（単位：ｍＰ）したものであり、小さな分子ほど運動性が激しいため偏光が解消され、低いＦＰ値として表される。ＦＰ値の測定には、Ａｎａｌｙｓｔ  ＡＤ（モルキュラーデバイス社）やＢＥＡＣＯＮ（インビトロジェン社）等の蛍光偏光度測定装置が使用できる。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドは、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼ非存在下ではＦＰ値としては低い値が得られるのに対し、ＲＮＡポリメラーゼ存在下では、ＲＮＡポリメラーゼがポリヌクレオチドのキャップ構造部分に結合することにより分子として大きくなり、ＦＰ値としては値が高くなる。この原理を利用し、ＲＮＡポリメラーゼとＣａｐｐｅｄ  ＲＮＡの結合を阻害する化合物を検出する事ができる。
他の好ましい系の１つとして、蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）法が挙げられる。このアッセイ系で使用する本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは上記の本発明のポリヌクレオチドにおいて、さらに（Ｎ．．．Ｎ）ｂを構成する塩基のうち、（Ｎ．．．Ｎ）ａ以降の塩基配列中、５’側から数えて１４番目以降のいずれか１つの塩基が、蛍光物質、消光物質およびビオチンから選択されるいずれか１の標識物質により標識されている後述のポリヌクレオチドである。
【００３１】
ＦＲＥＴとは、励起された蛍光分子（ドナー）が発する蛍光が他の蛍光分子（アクセプター）の励起光となり、アクセプターから蛍光が放出される現象である。また、アクセプターが消光分子である場合は、励起された蛍光分子（ドナー）が発する蛍光が他の消光分子（アクセプター）により除去または消光される。このエネルギー転移は、ドナーとアクセプターがある一定の距離内に近接している条件下でのみ認められる。さらに、類似な方法として、蛍光寿命が長いランタニド、例えばユーロピウムを用いることで、バックグラウンドの低減を実現した時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＴＲ−ＦＲＥＴ）法がある。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドの別の一つの態様は、上記の本発明のポリヌクレオチドにおいて、さらに（Ｎ．．．Ｎ）ｂを構成する塩基のうち、（Ｎ．．．Ｎ）ａ以降の塩基配列中、５’側から数えて１４番目以降のいずれか１つの塩基が、蛍光物質、消光物質およびビオチンから選択されるいずれか１の標識物質により標識されているポリヌクレオチドである（以下、「（Ｎ．．．Ｎ）ｂを構成する塩基のうち、（Ｎ．．．Ｎ）ａ以降の塩基配列中、５’側から数えて１４番目以降のいずれか１つの塩基」を「（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中のいずれか１の塩基」という）。２箇所が標識された本発明のポリヌクレオチドは、上述のＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴを含む）を利用した系に好適に用いることができる。ただし、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中のいずれか１の塩基を標識する標識物質と（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中のいずれか１の塩基を標識する標識物質がともに消光物質、あるいはビオチンであることはない。
【００３３】
（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中のいずれか１の塩基を標識する標識物質は、上記の蛍光物質、消光物質またはビオチンと同じである。また、（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中のいずれか１の塩基を標識する該蛍光物質または該消光物質は、直接的または間接的に、例えばビオチン―ストレプトアビジン結合を介して塩基に標識されていてもよい。
【００３４】
（Ｎ．．．Ｎ）ａ中のいずれか１の塩基を標識する標識物質と（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中のいずれか１の塩基を標識する標識物質の組合わせは、ＦＲＥＴに対応できるようエネルギートランスファーを生じるドナーとアクセプターの関係にある組合わせを選択する。ドナーとアクセプターの関係にある標識物質の組合わせであれば、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中のいずれか１の塩基を標識する標識物質がドナーであり、（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中のいずれか１の塩基を標識する標識物質がアクセプターであってもよく、逆に（Ｎ．．．Ｎ）ａ中のいずれか１の塩基を標識する標識物質がアクセプターであり、（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中のいずれか１の塩基を標識する標識物質がドナーであってもよい。ドナーとアクセプターの関係にある標識物質の組合わせは、蛍光物質と蛍光物質、蛍光物質と消光物質の組合わせが例示できる。
【００３５】
ＴＲ−ＦＲＥＴとして測定するためには、ドナーが、長い蛍光寿命を有することが必要であり、具体的には、ランタニドまたはその塩若しくは錯体が望ましい。ランタニドとしては、好ましくはユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、サマリウム（Ｓｍ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、特に好ましくはユーロピウム、テルビウムが挙げられる。ランタニドの塩または錯体としては、例えばＭａｔｈｉｓらのユーロピウム・クリプテート錯体（Ｌｏｐｅｚ−Ｃｒａｐｅｚ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２９，  ｅ７０）や、通常のＢＨＨＣＴ（４，４’−ｂｉｓ（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ｈｅｐｔａｆｌｕｏｒｏ−４”，６”−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｎ−６”−ｙｌ）−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏ−ｏ−ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ）などのβジケトン類のユーロピウム錯体が挙げられる。
【００３６】
ＴＲ−ＦＲＥＴとして測定するためのドナーとアクセプターの組合わせ例としては、ユーロピウム（Ｅｕ）錯体とアロフィコシアニン（ＡＰＣ）、あるいはユーロピウム（Ｅｕ）錯体とＣｙ５の組合わせが好ましい例として挙げられる。
【００３７】
ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴを含む）で有用なドナーとアクセプターの組合わせ（以下、ドナー／アクセプターと記載する）は、ドナー発光波長スペクトルがアクセプター吸収波長スペクトルと重なるドナーおよびアクセプターを選択すればよい。例えば、Ａｌｅｘａ４８８／Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５６８／Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ５９４／Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ６４７／Ａｌｅｘａ５９４、Ｃｙ３／Ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、フルオレセイン／ＴＭＲ、ＩＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、フルオレセイン／フルオレセイン、フルオレセイン／ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、Ｃｙ３／Ｃｙ５Ｑ、テルビウム／フルオレセイン、テルビウム／ＧＦＰ、テルビウム／ＴＭＲ、テルビウム／Ｃｙ３、テルビウム／Ｒフィコエリトリン、ユーロピウム／Ｃｙ５、およびユーロピウム／ＡＰＣなどを例示できる。当該分野で知られた、または知られるようになった、ドナーおよびアクセプターを含む他の組合わせを用いることもできる。
【００３８】
蛍光物質または消光物質の塩基への標識は、直接または間接的に、例えば、ビオチン―ストレプトアビジン結合を介して標識物質を結合できる。
【００３９】
さらに本発明のポリヌクレオチドは、分子としての塩基配列の長さもＦＲＥＴに対応できる長さに設計されているので、ＦＲＥＴの原理を利用して、ＲＮＡポリメラーゼの活性を測定することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを標識するドナーとアクセプターが蛍光物質と蛍光物質である場合、ドナーの励起波長にあわせた励起光を照射し、アクセプターの発光波長における蛍光強度をＡＲＶＯｍｘ（パーキンエルマー社）などの蛍光測定装置で検出する。ＲＮＡポリメラーゼを本発明のポリヌクレオチドと反応させると、ＲＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性により該ポリヌクレオチドが切断され、ドナーからアクセプターへのエネルギートランスファーが解消され、アクセプターの発光が検出されなくなる。
【００４０】
また、本発明のポリヌクレオチドを標識するドナーとアクセプターが、蛍光物質と消光物質である場合、ドナーの励起波長にあわせた励起光を照射し、ドナーの発光波長における蛍光強度をＡＲＶＯｍｘ（パーキンエルマー社）などの蛍光測定装置で検出する。ＲＮＡポリメラーゼを本発明のポリヌクレオチドと反応させると、ＲＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性により該ポリヌクレオチドが切断され、ドナーからアクセプターへのエネルギートランスファーが解消されるため、ドナーの発光がアクセプターによって除去されなくなり、ドナーの発光が検出される。
【００４１】
ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴを含む）に用いる本発明のポリヌクレオチドにおける、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中のいずれか１の塩基を標識する標識物質と（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中のいずれか１の塩基を標識する標識物質の距離は、１〜１０ナノメートル、好ましくは１〜７ナノメートル、より好ましくは１〜５ナノメートルである。標識物質の距離は、塩基への標識物質の標識が直接的にされているのか、ビオチンーストレプトアビジン結合などを介して間接的にされているのかによって異なるが、塩基数で表すと、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中の標識された塩基から（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中の標識された塩基までの数は、６〜６０個、好ましくは６〜５０個、より好ましくは６〜４０個、さらに好ましくは７〜２２個である。
【００４２】
また本発明のポリヌクレオチドにおいて、（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中のいずれか１の塩基を標識する標識物質は、該ポリヌクレオチドの３’末端に標識されることが好ましい。３’末端を標識することで、合成収量を向上させることが可能である。
本発明のポリヌクレオチドの作製方法は限定されないが、例えば、特表平１１−５０６７５６号に記載の方法によりキャップ構造、標識物質、ビオチン化塩基を含むポリヌクレオチドの合成が可能である。また、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼを利用して目的のポリヌクレオチドを得ることもできる。
【００４３】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼはアンビオン社等から入手できる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼにより目的の配列のＲＮＡを得る場合は、各ＲＮＡポリメラーゼ特有のプライマーを有するテンプレート配列鎖を通常のポリヌクレオチド合成方法等によって作製し、各ヌクレオチド存在下で転写反応を行う。目的のポリヌクレチド配列を構成する塩基のうち、例えば（Ｎ．．．Ｎ）ａ中の標識される塩基がウリジンであり、（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中の標識される塩基がシトシンであり、他の塩基はグアニンまたはアデニン（５’末端の塩基および５’末端から２番目の塩基はメチル化されていてもよい。）である場合は、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中の標識される塩基のみにウリジン、（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中の標識される塩基のみにシトシンが入り、他の塩基はアデニンまたはグアニンになるようにテンプレートＤＮＡを設計し、当該テンプレートＤＮＡとアミノアリル化ＵＴＰ、ビオチン化ＣＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ存在下で上記のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写反応を行えば、所望位置にアミノアリル化ＵＴＰ、ビオチン化ＣＴＰが取り込まれたポリヌクレオチドを得ることができる。
【００４４】
合成収量を向上させるために、（Ｎ．．．Ｎ）ｂ中の標識される塩基は、３’末端の塩基であることが好ましく、（Ｎ．．．Ｎ）ａ中の標識される塩基のみにウリジン、３’末端の塩基のみにシトシンが入り、他の塩基はアデニンまたはグアニンになるようにテンプレートＤＮＡを設計し、上述の転写反応を行えば、所望位置にアミノアリル化ＵＴＰ、ビオチン化ＣＴＰが取り込まれたポリヌクレオチドを得ることができる。アミノアリル化ＵＴＰ、ビオチン化ヌクレオチドはアンビオン社、インビトロジェン社などから入手できる。
【００４５】
かくして得られた目的配列を有するポリヌクレオチドは変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動等で精製等した後に、標識物質による標識工程に利用できる。蛍光標識物質のサクシニミルジエステル体を該ポリヌクレオチドに用いることにより、アミノアリル化された所望の塩基位置に蛍光標識物質を容易に導入可能である。さらに、ストレプトアビジンが結合した標識物質を該ポリヌクレオチドに反応させることにより、ビオチン化された所望の塩基位置に標識物質を容易に導入可能である。蛍光標識のサクシニミルジエステル体はＣｙ５（ＧＥヘルスケア社）、アレキサフローラ（インビトロジェン社）などが市販品として入手できる。また、ストレプトアビジンが結合した標識物質は、ユーロピウム（パーキンエルマー社）、アレキサフローラ（インビトロジェン社）などが市販品として入手可能である。
【００４６】
また、アミノアリル化ＵＴＰ、ビオチン化ＣＴＰを用いず、直接Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写反応に、蛍光標識ヌクレオチドたとえば蛍光標識ＵＴＰや蛍光標識ＣＴＰを添加して所望位置に蛍光標識を導入することが可能である。蛍光標識ヌクレオチドはパーキンエルマー社などから市販品として入手できる。
【００４７】
５’末端のキャップ構造の付加は、グアニリルトランスフェラーゼを用いて行うことができる。グアニリルトランスフェラーゼはアンビオン社などから入手できる。該グアニリルトランスフェラーゼにより、５’末端にキャップ構造を付加するためには、５’末端の塩基がグアニンかアデニンであり、さらに５’末端の塩基に３リン酸基か２リン酸基が結合している必要がある。かくして得られるポリヌクレオチドは、キャップ０である。キャップ１のポリヌクレオチドは、ワクチニアウイルスのｍＲＮＡ（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ−２’−）−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを用いて作成が可能である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３，７６９８−７７０２，１９７８）。
【００４８】
また本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ合成機を用いて合成することも可能である。ＲＮＡ合成機を用いれば、標識物質やビオチンを所望の塩基位置に導入したポリヌクレオチドの合成が可能である。該方法により合成されたポリヌクレオチドは、５’末端にリン酸基を持たないため、化学的にこの５’末端に３リン酸基を導入した後、グアニリルトランスフェラーゼを作用させてキャップ構造を付加するとよい（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３４２，４５１−４６６，２００１）。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは、また、３’末端の塩基にランタニドが結合しているポリヌクレオチドであり得る。３’末端の塩基にランタニドが結合しているポリヌクレオチドは、ＦＲＥＴ法、ＴＲ−ＦＲＥＴ法に有用である。ランタニドの塩基への結合の様式は限定されず、共有結合であってもよいし、介在物質等を介した間接的な結合であってもよい。例えば、３’末端の塩基がビオチン化されている場合は、ストレプトアビジンが結合しているランタニドを用いることにより、ビオチン―ストレプトアビジン結合を利用した間接的な結合が実現できる。上記のポリヌクレオチドの作製法において、３’末端の塩基にユーロピウムが結合した塩基が取り込まれるように合成あるいは転写を行ってもよい。ランタニドの種類は限定されないが、ユーロピウム、テルビウムが好ましい。各種ランタニド、ストレプトアビジンが結合しているランタニドはパーキンエルマー社、インビトロジェン社から入手できる。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドには、より具体的には、配列表の配列番号１〜１３のいずれか１に記載の配列からなるポリヌクレオチドが包含される。これらのポリヌクレオチドは、さらにそれぞれのウリジン塩基部分および／またはシトシン塩基部分は蛍光物質、消光物質およびビオチンからなる群から選択されるいずれか１の標識物質により標識されていてもよく、また、５’末端にキャップ構造が結合していていもよい。配列番号１〜１３のいずれか１に記載の配列からなるポリヌクレオチドを標識する蛍光物質、消光物質またはビオチンは、上述の蛍光物質、消光物質またはビオチンと同じであり、該蛍光物質または該消光物質は直接的あるいは間接的に、例えばビオチン―ストレプトアビジン結合を介して塩基に標識されていてもよい。これらの標識物質やキャップ構造の付加は前述の手法によりそれぞれ行うことができる。これらのポリヌクレオチドはインフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼにより切断され、また、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡの伸長反応の基質になり得ることが確認されている。
【００５１】
配列表の配列番号１〜１３のいずれか１に記載のポリヌクレオチドの作製には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプライマーを含むテンプレート配列である、配列番号１４〜２６のいずれか１に記載の配列からなるポリヌクレオチドを好適に用いることができ、これらのポリヌクレオチドも本発明に一態様として包含される。
【００５２】
上記手段により作製した本発明のポリヌクレオチドはより均一化させるためには、アクリルアミドゲルなどを用いた電気泳動により分離精製することが好ましい。例えば、２０％の変性アクリルアミドゲルを用いて作製した粗ポリヌクレオチドを分離し、目的バンドを切り出し、引き続きゲルからのＲＮＡの抽出を行う。ゲルからのＲＮＡの抽出はＳｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）などのキットを用いて行えば簡便であるがこれに限定されない。また、ｆｌａｓｈＰＡＧＥ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ（アンビオン社、Ｃａｔ＃１３１００）を用いることもできる。
【００５３】
本発明は、別の一つの態様として、上記の本発明のポリヌクレオチドを用いることを特徴とするＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質の同定方法に関する。本発明のポリヌクレオチドを用いると、簡便かつ安全に、また、効率よく、ＲＮＡポリメラーゼ活性を検出することができるので、ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質の同定に有用である。
【００５４】
本発明の同定方法が適用可能なＲＮＡポリメラーゼとしては、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。インフルエンザウイルスは抗原性の違いにより、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型に分類され、Ａ型ウイルスはさらに、表面抗原の違いによりＨＡ（Ｈ１〜Ｈ１５）、ＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）の亜型に分類されているが、ＲＮＡポリメラーゼは型間の差異はなく保存されていることが知られている。
【００５５】
インフルエンザＲＮＡポリメラーゼは、発育鶏卵を用いてインフルエンザウイルスを培養し、ウイルス粒子を精製後、界面活性剤処理してウイルス粒子を破壊し、ＲＮＡポリメラーゼとウイルスＲＮＡ、ＮＰ（ヌクレオプロテイン）からなるＲＮＰ（リボヌクレオプロテイン）をグリセロール密度勾配遠心処理で精製することにより得ることができるがこれに限定されない。
【００５６】
被検物質の存在または非存在下で、ＲＮＰと本発明のポリヌクレオチドをＲＮＡポリメラーゼが反応し得る緩衝液中で反応させ、上記のような電気泳動と画像解析を組合わせた系やＦＰ法やＦＲＥＴ法などを利用してＲＮＡポリメラーゼ活性を測定し、被検物質非存在下と比較して被検物質存在下のＲＮＡポリメラーゼ活性が低い場合、その被検物質はＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質であるとして同定できる。反応時間は十分なＲＮＡポリメラーゼ活性が検出できる時間であれば特に限定されないが１分〜１２時間程度が好ましく、１０分〜３時間程度がより好ましく、３０分〜２時間程度がさらに好ましい。インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼはマグネシウム（Ｍｇ）要求性であるので、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼを用いる場合は、Ｍｇの添加、非添加や、ＥＤＴＡなどのキレート剤の添加により、酵素反応の開始や停止を制御することができる。
【００５７】
反応温度も特には限定されないが、０℃〜７０℃が好ましく、１０℃〜５０℃がより好ましく、２５℃〜４０℃がさらに好ましい。
【００５８】
被検物質は天然物、合成物など特に限定されず、また、高分子化合物であっても低分子化合物であってもよいが、医薬品として用いることを考慮すれば低分子化合物であることが好ましい。これらの被検物質はその物質に対応して適宜溶媒を選択して溶解後、アッセイ系に添加することが好ましい。被検物質非存在下の対照群には被検物質の溶媒を同量添加するとよい。ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質としてＣａｐアナログ（ｍ７ＧｐｐｐＧ）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２，６２３４−６２４０，２００３）、Ｆｌｕｔｉｍｉｄｅ（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４０，１１８９−１１９３，１９９６）、Ｌ７３５８８２（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４０，１３０４−１３０７，１９９６）などが知られているが、これらの誘導体なども好ましい。被検物質の添加は、酵素、基質と同時添加であってもよいし、基質を添加する前に事前に添加して、数分〜数時間程度、酵素とプレインキュベーションさせてもよい。
【００５９】
本発明の同定方法はＨｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｇ（ＨＴＳ）にも好適に用いることができる。例えば、ＦＲＥＴ法またはＴＲ−ＦＲＥＴ法を利用する場合、容器を移し変えたり、反応液をフィルターにトラップしてシンチレーターを加えるといった煩雑および／または危険な作業はなく、反応から蛍光測定まで単一のウェルで行うことができるホモジニアスなアッセイが可能である。ＨＴＳに本発明のポリヌクレオチドを使用する場合には、ＲＮＡポリメラーゼ活性の検出感度を向上するために、さらに精製した本発明のポリヌクレオチドを使用するとよい。具体的には、合成した蛍光標識ポリヌクレオチドにキャップ構造を付加した後、さらに２０％の変性アクリルアミドゲルを用いて、作製した蛍光標識Ｃａｐｐｅｄポリヌクレオチドを分離する。キャップ構造が付加された蛍光標識ポリヌクレオチドのバンドは１塩基分ほど上にシフトするので、このバンドを切り出し、引き続きゲルからのＲＮＡの抽出を行うことにより、より精製された蛍光標識ポリヌクレオチドを得ることができる。ゲルからのＲＮＡの抽出はＳｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）などのキットを用いて行えば簡便であるがこれに限定されない。
【００６０】
さらに、本発明のポリヌクレオチドとして予めユーロピウムなどのランタニドを直接または間接的に結合させているものを用いることによりさらにアッセイ系の簡略化を図ることができる。また、ＥＤＴＡを用いて反応を停止させる工程を含む場合は、ＥＤＴＡに抵抗性であるランタニド試薬を用いるとよい。例えば、ＬＡＮＣＥ  Ｅｕ−Ｗ１０２４  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（パーキンエルマー社）はＥＤＴＡ感受性であるので、ＬＡＮＣＥ  Ｅｕ−Ｗ８０４４  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（パーキンエルマー社）などのＥＤＴＡ抵抗性のものを選択する方がよい。
【００６１】
また、本発明の同定方法を実施する際においては、本発明の同定方法により得られた阻害物質の特異性を確認するために、他の酵素系における確認試験（カウンタースクリーニング）を行ってもよい。例えば、同様にポリヌクレオチドに作用する酵素として、ヌクレアーゼやＤＮＡ複製酵素、ＲＮＡ転写酵素、制限酵素などに対する阻害活性を測定するとよい。特に、リボヌクレアーゼが好ましく、中でも、リボヌクレアーゼＴ１（以下、Ｒｎａｓｅ  Ｔ１と記載する）はＲＮＡポリメラーゼと同様にグアニン塩基の３’側を特異的に切断するエンドヌクレアーゼであることから、ＲＮＡポリメラーゼのカウンタースクリーニングに用いる酵素として好適である。本発明のポリヌクレオチドは、Ｒｎａｓｅ  Ｔ１の基質にもなり得ることが確認されており、同一の基質を用いて異なる酵素系のアッセイ系を施行でき、特異性の高い阻害物質を獲得しやすくなる点からも、本発明のポリヌクレオチドは有用である。
【実施例】
【００６２】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。
【００６３】
本明細書中、ＸＮＴＰ（Ｙ）（ただし、ＸおよびＹは整数、Ｎは塩基である）の記載は５’末端からＸ番目の塩基がＮＴＰであり、総塩基数がＹ個のポリヌクレオチドを表す。例えば、８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡは、５’末端から８番目の塩基がＵＴＰであり総塩基数が１８であるＲＮＡを意味する。また、Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡは該ＲＮＡにさらにキャップ構造が付加されたＲＮＡを意味し、蛍光標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡはキャップ構造が付加された該ＲＮＡの８番目のＵＴＰが蛍光物質で標識されていることを意味する。また、蛍光標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘは、上記の蛍光標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡの３’末端の塩基にビオチン―ストレプトアビジン結合を介して、ユーロピウム（Ｅｕ）が結合している複合体を意味する。また、例えば、Ｔ７−８ＵＴＰ（１８）ＤＮＡは８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡのテンプレートＤＮＡを表す。
（実施例１：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＮＰ）の調製）
１）インフルエンザウイルスの培養
ウイルス株はＡ／ＰＲ／８／３４株（Ｈ１Ｎ１）を用い、３．０×１０８ＰＦＵ／ｍＬのシードウイルス保存液を希釈培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ（イワキ社）、６０μｇ／ｍＬゲンタシン）で１０，０００倍に希釈し、接種用ウイルス希釈液を２．５ｍＬシリンジ（＋２３Ｇ針）に用意した。１０日齢の発育鶏卵について生死の確認を行い、卵殻を消毒し、気嚢部分の卵殻に感染用の穴を開け、用意した１０３〜４ＰＦＵ／ｍＬのウイルスを０．２ｍＬ／ｅｇｇの割合で尿膜腔へ接種した。卵殻の穴をアルコール綿で消毒後、木工用ボンドで封をして３４〜３５℃で７２時間インキュベートした後、４℃にて１８時間インキュベーションし、胚を殺した。
【００６４】
気嚢部分の卵殻を取り除き、尿膜液を回収用漏斗もしくは１８Ｇ針付１０ｍＬシリンジを用いて回収した。回収した尿膜液は、８０００ｒｐｍで２０分間遠心して夾雑物を取り除いた後、３０，０００ｒｐｍで６０分間、超遠心し（Ｒｏｔｏｒ  Ｐ４５ＡＴ、日立工機社）、ウイルス粒子を沈殿させた。得られた沈渣を３ｍＬ／ｔｕｂｅのＮＥＴ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再浮遊（４℃、一晩）させ、濃縮ウイルス液とした。濃縮ウイルス液をホモジナイザーで懸濁後、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心して上清を回収した。濃縮ウイルス液を３０％、６０％  ｗ／ｖのショ糖／ＮＥＴ  ｂｕｆｆｅｒ密度勾配上に重層し、２５，０００ｒｐｍで９０分間遠心し（Ｒｏｔｏｒ  ＳＰＲ２８ＳＡ、日立工機社）、ウイルス層（３０％と６０％の境界面）を回収した。
【００６５】
２）ＲＮＰの精製
１）で回収したウイルス層をＮＥＴ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、Ｖｉｒｕｓ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（１．５  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、１  ％  ｌｙｓｏｌｅｃｉｔｈｉｎ、１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１．５ｍＭ  ＤＴＴ）１ｍＬを添加し、氷上でゆるやかに１時間振盪した。その後、３０−７０％グリセロール（ｗｔ／ｖｏｌ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ  ＤＴＴ）密度勾配上に重層し、４５，０００ｒｐｍ、４時間４℃で遠心し、ＲＮＰ画分を回収した。
（実施例２：蛍光標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡの合成）
１）Ｔ７  ｏｌｉｇｏ  ＤＮＡ（ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ）およびＴｅｍｐｌａｔｅ  ｏｌｉｇｏ  ＤＮＡ（ＧＴＣＴＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＡＴＴ）を合成委託（シグマ社）した。なおＴｅｍｐｌａｔｅ  ｏｌｉｇｏ  ＤＮＡは転写ＲＮＡがインフルエンザポリメラーゼの基質となるよう設計した。
【００６６】
１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｐｍｏｌ／μＬ（２０μＭ）  Ｔ７  ｏｌｉｇｏ  ＤＮＡ、２０ｐｍｏｌ／μＬ（２０μＭ）  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｏｌｉｇｏ  ＤＮＡ溶液を調製し、９４℃、３分間加熱した後、緩やかに（約１〜２時間かけて）室温に戻した。上記反応溶液を、８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡのＴｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎとして以降の操作に供した。
【００６７】
２）Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＲＮＡの転写
ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（アンビオン社、ＡＭ１３５４）を用いてＲＮＡへの転写を行った。ただし、ＵＴＰには５−（３−ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ）−ＵＴＰ（アンビオン社、８４３７）を、ＣＴＰにはｂｉｏｔｉｎ−１４−ＣＴＰ（インビトロジェン社１９５１９−０１６）を用い、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡには１）のＴｅｍｐｌａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いた。転写反応は３７℃、４時間の条件下で行った。
【００６８】
３）  合成ＲＮＡの精製
２）の転写産物を２０％変性アクリルアミドゲルを用いた電気泳動により分離し、Ｇｅｌｌ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ＲＮＡ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（バイオダイナミックスラボラトリー社、ＤＭ５９５）を用いて染色した後、目的の画分を切り出してＳｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社、９１０６）を用いてＲＮＡを精製した。
【００６９】
４）Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡの調製
Ｃｙ５Ｍｏｎｏ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｄｙｅ（アマシャムバイオサイエンス社、ＰＡ２５００１）を用いて、３）で得られた８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡのａｍｉｎｏａｌｌｙｌ部位にＣｙ５標識した。方法はＣｙ５Ｍｏｎｏ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｄｙｅ添付の取扱説明書に従った。得られた蛍光標識８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ（約１００ｐｍｏｌ）の５’端を、Ｇｕａｎｙｒｉｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（アンビオン社）を用いてＣａｐｐｉｎｇした。反応産物は、酸性フェノールクロロホルムを用いて抽出した後、エタノール沈殿を行い精製して５０μＬの水に溶解し基質ＲＮＡとして試験に供した。
【００７０】
５）Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ−Ｅｕ（ユーロピウム）ｃｏｍｐｌｅｘの調製
Ｃｙ５Ｍｏｎｏ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｄｙｅ（アマシャムバイオサイエンス社、ＰＡ２５００１）を用いて、３）で得られた８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡのａｍｉｎｏａｌｌｙｌ部位にＣｙ５標識した。方法はＣｙ５Ｍｏｎｏ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｄｙｅ添付の取扱説明書に従った。０．０５μｇ／ｍＬ  Ｃｙ５標識８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ、０．５μｇ／ｍＬ  ＬＡＮＣＥ  Ｅｕ−Ｗ８０４４  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（パーキンエルマー社、ＡＤ００６１）溶液を作製し、氷上で１０分間反応させた。得られた蛍光標識ＲＮＡ（約１００ｐｍｏｌ）の５’末端を、Ｇｕａｎｙｒｉｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（アンビオン社、Ｃａｔ＃２０３２）を用いてＣａｐｐｉｎｇした。反応産物は、酸性フェノールクロロホルムを用いて抽出した後、エタノール沈殿を行い精製し、５０μＬの水に溶解し基質ＲＮＡとして試験に供した。
【００７１】
６）上記の方法と同様の方法で、Ａｌｅｘａ４８８標識６ＵＴＰ（２２）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識６ＵＴＰ（２２）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ４８８標識６ＵＴＰ（２１）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識６ＵＴＰ（２１）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ６４７標識８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ４８８標識８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ  、Ａｌｅｘａ６４７標識８ＵＴＰ（１６）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識８ＵＴＰ（１６）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識８ＵＴＰ（２２）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ４８８標識８ＵＴＰ（１４）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ４８８標識８ＵＴＰ（１５）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識８ＵＴＰ（２６）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識８ＵＴＰ（２１）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識８ＵＴＰ（２９）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ６４７標識９ＵＴＰ（１７）ＲＮＡ  、Ａｌｅｘａ４８８標識１６ＵＴＰ（１６）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１６）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２２）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１４）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１５）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２６）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２９）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘおよびＣｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２１）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘを調製した。
【００７２】
なお、精製した合成ＲＮＡへのＡｌｅｘａ６４７またはＡｌｅｘａ４８８の標識は、Ａｌｅｘａ６４７またはＡｌｅｘａ４８８のサクシニミルジエステル体（インビトロジェン社）を得られた合成ＲＮＡのａｍｉｎｏａｌｌｙｌ部位に、添付の取扱説明書に従って標識した。
【００７３】
また、Ａｌｅｘａ４８８標識６ＵＴＰ（２２）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識６ＵＴＰ（２２）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ４８８標識６ＵＴＰ（２１）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識６ＵＴＰ（２１）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ６４７標識８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ４８８標識８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ  、Ａｌｅｘａ６４７標識８ＵＴＰ（１６）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識８ＵＴＰ（１６）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識８ＵＴＰ（２２）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ６４７標識９ＵＴＰ（１７）ＲＮＡ  、Ａｌｅｘａ４８８標識１６ＵＴＰ（１６）ＲＮＡ  、Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１６）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘおよびＣｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２２）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘは、２）で得られた転写産物の精製において、ｆｌａｓｈＰＡＧＥ（アンビオン社、Ｃａｔ＃１３１００）を用い、その後の４）または５）の調製に供した。精製はｆｌａｓｈＰＡＧＥ添付の取扱い説明書に従って行った。
【００７４】
７）フルオレセイン標識Ｃａｐｐｅｄ６ＣＴＰ（２４）ＲＮＡを調製した。方法は１）に準じてＴｅｍｐｌａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを調製し、２）のＴ７−ＲＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによるＲＮＡ転写において、ＣＴＰにＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ＣＴＰ  （パーキンエルマー社、ＮＥＬ−４３４）を使用してフルオレセイン標識ＲＮＡを合成した。その後、ｆｌａｓｈＰＡＧＥ（アンビオン社、Ｃａｔ＃１３１００）を用いて精製し、４）に準じた方法でキャップ付加を行い試験に供した。
（実施例３：電気泳動によるエンドヌクレアーゼアッセイ１）
精製を行っていない合成ＲＮＡには、目的のＲＮＡと異なる長さのＲＮＡが多く含まれていることが２０％変性アクリルアミドゲルを用いた電気泳動により確認されている（図１、Ｐｒｅ）。感度の高いスクリーニング系構築のためには、均一なＲＮＡの精製が必要であるため、２０％変性アクリルアミドゲルを用いて均一な目的ＲＮＡの精製を試みた。具体的には、実施例２−２）に準じて得られた転写後の８ＵＴＰ（２９）ＲＮＡを２０％変性アクリルアミドゲルを用いた電気泳動により分離し、Ｇｅｌｌ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ＲＮＡ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（バイオダイナミックスラボラトリー社、ＤＭ５９５）を用いて染色した後、目的の画分を切り出してＳｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社、９１０６）を用いてＲＮＡを精製した。２０μｇ（約３．３μｍｏｌ）以上のＲＮＡが効率よくゲルから抽出でき、精製後のＲＮＡは単一なバンドとして確認することができた（図１、Ｐｏｓｔ）。
【００７５】
精製した８ＵＴＰ（２９）ＲＮＡを用いてＣｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２９）ＲＮＡを作製し、エンドヌクレアーゼ活性評価を実施した。具体的には、Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２９）ＲＮＡ１μＬ（約２ｐｍｏｌ）と、実施例１において調製されたウイルスＲＮＰ（対照として５０％グリセロール）１μＬをＲＮＰ反応溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ）中で３１℃で３０分間反応させた。反応後のＲＮＡは、酸性フェノール／クロロホルム処理し、エタノールで沈殿、続いて水に溶解させた後、２０％変性アクリルアミドゲルを用いた電気泳動により分離し、ＦＬＡ−３０００（フジフィルム社）を用いて、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：６３３ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ：６７５ｎｍの条件で検出した。
【００７６】
Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２９）ＲＮＡはＲＮＡポリメラーゼによって切断され（図２）、ＲＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性評価に供試可能であることが確認された。
【００７７】
また、同様にＡｌｅｘａ４８８標識６ＵＴＰ（２２）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識６ＵＴＰ（２２）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ４８８標識６ＵＴＰ（２１）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識６ＵＴＰ（２１）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ６４７標識８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ４８８標識８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ  、Ｃｙ５標識８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ６４７標識８ＵＴＰ（１６）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識８ＵＴＰ（１６）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識８ＵＴＰ（２２）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ４８８標識８ＵＴＰ（１４）ＲＮＡ  、Ａｌｅｘａ４８８標識８ＵＴＰ（１５）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識８ＵＴＰ（２６）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識８ＵＴＰ（２１）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ６４７標識９ＵＴＰ（１７）ＲＮＡ、Ａｌｅｘａ４８８標識１６ＵＴＰ（１６）ＲＮＡ、Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘおよびフルオレセイン標識Ｃａｐｐｅｄ６ＣＴＰ（２４）ＲＮＡを用いてエンドヌクレアーゼ活性評価を行い、いずれの蛍光標識ＣａｐｐｅｄＲＮＡにおいてもＲＮＡポリメラーゼによるエンドヌクレアーゼ活性が認められた（図３、４、５）。
（実施例４：電気泳動によるエンドヌクレアーゼアッセイ２）
実施例２−２）で得られた転写産物のａｍｉｎｏａｌｌｙｌ部位にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒａ  ６４７  サクシニミルジエステル体（インビトロジェン社）を標識した。方法はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒａ  ６４７添付の取扱説明書に従った。得られたＡｌｅｘａ６４７標識８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ（約１００ｐｍｏｌ）の５’端を、Ｇｕａｎｙｒｉｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＣａｐｐｉｎｇした。反応産物は、酸性フェノールクロロホルムを用いて抽出した後、エタノール沈殿を行い精製して５０μＬの水に溶解し基質ＲＮＡとして試験に供した。
【００７８】
Ａｌｅｘａ６４７標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ１μＬ（約２ｐｍｏｌ）と、実施例１で調製したウイルスＲＮＰ（対照として５０％グリセロール）１μＬをＲＮＰ反応溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ）中で３１℃で３０分間反応させた。反応後のＲＮＡは２０％変性アクリルアミドゲルを用いた電気泳動により分離し、ＦＬＡ−３０００（フジフィルム社）を用いて、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：６３３ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ：６７５ｎｍの条件で検出した。
ウイルスＲＮＰ非添加時には約２０ｂａｓｅの位置にバンドが確認できるのに対して、ウイルスＲＮＰ添加時には、１０〜１３ｂａｓｅ前後の短い位置に２本のバンドが認められ、精製を行っていないポリヌクレオチドにおいてもＲＮＡポリメラーゼによるエンドヌクレアーゼ活性が認められた（図６）。
（実施例５：電気泳動によるエロンゲーション活性評価）
０．５μｇ／ｍＬ  Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２９）ＲＮＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＮＴＰの溶液５０μＬに対し、実施例１で調製したＲＮＰ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を０、０．５、１．０、２．０、４．０μＬの各条件で添加し、反応溶液とした。
【００７９】
３１℃で１時間、反応させた後、得られた反応産物について２０％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動法を用いて解析した。検出は、イメージアナライザー：ＦＬＡ−３０００（フジフィルム社）で行った。
【００８０】
ＲＮＡポリメラーゼ添加量に依存したエロンゲーション活性が認められ、蛍光標識ＣａｐｐｅｄＲＮＡがＲＮＰの基質になりうることが確認された（図７）。
（実施例６：ＴＲ−ＦＲＥＴ法によるエンドヌクレアーゼ活性阻害評価系）
Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２９）ＲＮＡおよび実施例１で調製したＲＮＰを使用した。×２  ＲＮＰ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、０．０４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、４ｍＭ  ＤＴＴ）１０μＬに、ｄｄＨ２Ｏ  ８．５  μＬ、ＲＮＡ  １μＬ（約０．３ｐｍｏｌ）を添加後、ＲＮＰ０．５μＬ（対照として５０％グリセロール溶液０．５μＬ）を添加して反応液とした。３１℃、３０分間インキュベーションした後、１０２４  Ａｖｉｄｉｎ−Ｅｕｒｏｐｉｕｍ（パーキンエルマー社）２０μＬを添加して３０分間反応させ、反応後のサンプルは３４０ｎｍ励起時の６６５ｎｍにおける蛍光強度を測定した（パーキンエルマー社、ＡＲＶＯｍｘ）。
【００８１】
Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２９）ＲＮＡを用いてＴＲ−ＦＲＥＴを実施した結果を図８に示した。ＲＮＰ非添加時において、ＦＲＥＴ値が約３５００ｃｐｓを示すのに対してＲＮＰ添加時には約４００ｃｐｓを示し、明らかな値の解離が認められ、ＴＲ−ＦＲＥＴによるエンドヌクレアーゼ活性が検出可能であることが確認された。
さらにＣｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１６）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２２）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１４）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１５）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２６）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘおよびＣｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２１）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘを用いて同様の検討を行い、これらのｃｏｍｐｌｅｘを用いてＴＲ−ＦＲＥＴによるエンドヌクレアーゼ活性の検出が可能であることを確認した。
（実施例７：ＴＲ−ＦＲＥＴ法によるＣａｐ  Ａｎａｌｏｇを用いたエンドヌクレアーゼ活性阻害試験）
ＰＢ２へのＣａｐ  ｂｉｎｄｉｎｇを阻害することが報告されているＣａｐ  Ａｎａｌｏｇ（Ｌｉｓａ  Ｈｏｏｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２，６２３４−６２４０，２００３）と、ＲＮＡポリメラーゼの基質となることが知られているｒａｂｂｉｔ  ｇｌｏｂｉｎ  ｍＲＮＡをｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒとして用い、エンドヌクレアーゼ活性阻害効果の評価を実施した。
【００８２】
Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡおよび実施例１で調製したＲＮＰを供試した。ＲＮＡ５μＬ（約０．３ｐｍｏｌ）に、段階希釈したＣａｐ  Ａｎａｌｏｇもしくはｒａｂｂｉｔ  ｇｌｏｂｉｎ  ｍＲＮＡ  ５μＬを添加後、インフルエンザウイルスＲＮＰ含有×２  ＲＮＰ反応溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ）を１０μＬ添加した。３１℃で３０分間反応後、２０００倍希釈した１０２４  Ａｖｉｄｉｎ−Ｅｕｒｏｐｉｕｍ（パーキンエルマー社）２０μＬを添加して３０分間反応させた。反応後のサンプルは３４０ｎｍ励起時の６６５ｎｍにおける蛍光強度を測定した（パーキンエルマー社、ＡＲＶＯｍｘ）。
【００８３】
Ｃａｐ  ａｎａｌｏｇ、ｒａｂｂｉｔ  ｇｌｏｂｉｎ  ｍＲＮＡを当該ｃａｐｐｅｄ  ＲＮＡのｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒとして添加した際には、濃度依存的なＦＲＥＴ値の上昇が認められ、Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇおよびｒａｂｂｉｔ  ｇｌｏｂｉｎ  ｍＲＮＡによるエンドヌクレアーゼ活性阻害効果を確認することができた（図９）。また、これまでに報告のあるＵＶクロスリンク法を用いたＰＢ２へのＣａｐ  ｂｉｎｄｉｎｇ阻害試験では、Ｃａｐ  ＡｎａｌｏｇのＩＣ５０値が１２０μＭ程度であるのに対し（Ｌｉｓａ  Ｈｏｏｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２，６２３４−６２４０，２００３）、当該試験系におけるＣａｐ  ＡｎａｌｏｇのＩＣ５０値は２６．８μＭであり、当該評価系は比較的感受性の高い評価方法であると考えられた。さらに、ｒａｂｂｉｔ  ｇｌｏｂｉｎ  ｍＲＮＡ添加時のＩＣ５０値にあたる１．２５μｇ／ｍＬでは、反応液中ｒａｂｂｉｔ  ｇｌｏｂｉｎ  ｍＲＮＡ（約６５０ｂｓ相当）のモル数が当該ＲＮＡの添加モル数とほぼ同等であり、当該評価系の妥当性を支持する結果が得られた。
（実施例８：ＴＲ−ＦＲＥＴ試験系のＨＴＳ化検証）
ＨＴＳ実施に向けた当該評価系反応スケールの縮小化について検証した。
【００８４】
実施例２の方法に準じ、０．０１３μＭ  ＬＡＮＣＥ  Ｅｕ−Ｗ１０２４  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（パーキンエルマー社）を用いて、Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２９）ＲＮＡ−Ｅｕ  Ｃｏｍｐｌｅｘ溶液を調製した。ＲＮＰは実施例１で調製したものを供試した。Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３８４  ｗｅｌｌ  Ｂｌａｃｋ  Ｐｌａｔｅ上で５％  ＤＭＳＯもしくは希釈したＣａｐ  Ａｎａｌｏｇ（３２０、２４０、１２０μＭ）５μＬに、ＲＮＡ−Ｅｕ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ５μＬを添加後、ＲＮＰ含有もしくは不活化ＲＮＰ含有×３  ＲＮＰ反応溶液（１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭもしくは３ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、０．０６％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、６ｍＭ  ＤＴＴ）を５μＬ添加して、室温にて２時間反応させた。反応後のサンプルは３４０ｎｍ励起時の６６５ｎｍにおける蛍光強度を測定した（パーキンエルマー社、ＡＲＶＯｍｘ）。
【００８５】
１５μＬスケールで実施したエンドヌクレアーゼ活性評価結果を図１０に示した。不活化ＲＮＰ添加時；ＲＮＰ（−）では約５０００ｃｏｕｎｔｓのＴＲ−ＦＲＥＴ値が得られるのに対してＲＮＰ添加時；ＲＮＰ（＋）では約３００ｃｏｕｎｔｓ程度の低い値を示し、４０μＬ反応系と同等のＳ／Ｎ比（≒１６）を得ることができた。アッセイ系の質を表現するＺ’−ｆａｃｔｏｒ（Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ４，６７−７３，１９９７）を算出したところ、Ｚ’＞  ０．８５でありＨＴＳ実施が可能であることが示された。また、Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇのエンドヌクレアーゼ活性阻害効果についても、４０μＬ反応系における値と大きな差は認められず、濃度依存的な活性阻害効果を確認することができた。
（実施例９：ＴＲ−ＦＲＥＴ法によるＲＮＰおよびＲＮａｓｅ  Ｔ１を用いたエンドヌクレアーゼ活性阻害評価系）
ＲＮａｓｅ  Ｔ１に対する阻害評価系（カウンタースクリーニング系）の構築を目的として、ＴＲ−ＦＲＥＴ法によるＲＮＰおよびＲＮａｓｅ  Ｔ１を用いたエンドヌクレアーゼ活性阻害評価を行った。
【００８６】
実施例２の方法に準じ、Ｔ７−８ＵＴＰ（２９）を用いてＣｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２９）ＲＮＡ−Ｅｕ  ｃｏｍｐｌｅｘ溶液を調製した。ＲＮＰは実施例１で調製したものを供試した。阻害剤にはＣａｐ  Ａｎａｌｏｇを用い、無処置対照には５％  ＤＭＳＯを用いた。  
Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３８４  ｗｅｌｌ  Ｂｌａｃｋ  Ｐｌａｔｅ上で５％  ＤＭＳＯもしくは希釈したＣａｐ  Ａｎａｌｏｇ（３２０、２４０、１２０μＭ）５μＬに、ＲＮＡ−Ｅｕ  Ｃｏｍｐｌｅｘ５μＬを添加後、ＲＮＰ含有もしくは不活化ＲＮＰ含有×３  ＲＮＰ反応溶液（１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭもしくは３ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、０．０６％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、６ｍＭ  ＤＴＴ）を５μＬ添加して、室温にて２時間反応させた。反応後のサンプルは３４０ｎｍ励起時の６６５ｎｍにおける蛍光強度を測定し（パーキンエルマー社、ＡＲＶＯｍｘ）、Ｔ／Ｃ値を算出し阻害曲線をプロットした。Ｔ／Ｃ値は式Ｔ／Ｃ＝１−（阻害剤添加ウェルの蛍光強度−ＤＭＳＯ添加対照ウェルの蛍光強度）／（不活化酵素添加対照ウェルの蛍光強度−ＤＭＳＯ添加対照ウェルの蛍光強度）により算出した。また、供試酵素をＲＮＰからＲＮａｓｅ  Ｔ１に置換する事により、ＲＮａｓｅ  Ｔ１のエンドヌクレアーゼ活性阻害評価を同様に実施した。
【００８７】
Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇは濃度依存的にウイルスＲＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を阻害した（図１１）。当該Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇは、その構造から、ＰＢ２によるｃａｐ  ｂｉｎｄｉｎｇ活性を阻害することで、引き続いて起こるＰＢ１のエンドヌクレアーゼ活性を阻害したものと考察される。一方、ＲＮａｓｅ  Ｔ１は当該評価系において、酵素濃度依存的なエンドヌクレアーゼ活性を示し、当該ＲＮＡがＲＮａｓｅ  Ｔ１の基質としても有用であることが確認された。また、ＲＮａｓｅ  Ｔ１のエンドヌクレアーゼ活性に対してＣａｐ  Ａｎａｌｏｇは２０００μＭでも阻害することはなく、ＲＮａｓｅ  Ｔ１を用いたエンドヌクレアーゼ活性阻害評価系が、ＲＮＰを用いたエンドヌクレアーゼ活性評価系（ＴＲ−ＦＲＥＴ）のカウンタースクリーニングに有用であると考えられた。
（実施例１０：ＦＰ法を利用したＣａｐ  Ｂｉｎｄｉｎｇ阻害評価）
実施例２−４）で調製した蛍光標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ１μＬ（約０．１５ｐｍｏｌ）と、実施例１で調製したＲＮＰ１μＬをＲＮＰ反応溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ）中で３１℃、３０分間反応後、Ａｎａｌｙｓｔ  ＡＤ（モルキュラーデバイス社）にてＦＰ値を測定した。
【００８８】
ＲＮＰ非存在下（ＲＮＰ−）では９０ｍＰ前後の低いＦＰ値を示すのに対して、ＲＮＰ添加時（ＲＮＰ＋）にはＦＰ値が上昇（約３５０ｍＰ）し、ＲＮＡとＲＮＰが結合していることを確認することができた（図１２）。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】Ｔ７−８ＵＴＰ（１８）ＤＮＡを転写した８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡと、転写後さらに精製した８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡの電気泳動像である。ｐｒｅは精製前のＲＮＡを、Ｐｏｓｔは精製後のＲＮＡのレーンを表し、矢頭は８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡのバンド位置を示す。
【図２】精製後の８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡを使用したＡｌｅｘａ４８８標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡを用いたエンドヌクレアーゼ活性評価結果を示した図である。（＋）はマグネシウム（Ｍｇ２＋）添加を、（−）はマグネシウム（Ｍｇ２＋）非添加を表し、＊はＲＮＡポリメラーゼにより切断されたＲＮＡのバンド位置を示す。
【図３】フルオレセイン標識Ｃａｐｐｅｄ６ＣＴＰ（２４）ＲＮＡを用いたエンドヌクレアーゼ活性評価結果を示した図である。（＋）はＲＮＰ添加を、（−）はＲＮＰ非添加を表す。
【図４】Ａｌｅｘａ４８８で標識されたＣａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ、Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１４）ＲＮＡ  、Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１５）ＲＮＡおよびＣａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２１）ＲＮＡを用いたエンドヌクレアーゼ活性評価結果を示した図である。（＋）はＲＮＰ添加を、（−）はＲＮＰ非添加を表す。
【図５】Ｃｙ５で標識されたＣａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡ、Ｃａｐｐｅｄ  ８ＵＴＰ（２１）ＲＮＡ  、Ｃａｐｐｅｄ  ８ＵＴＰ（２６）ＲＮＡおよび  Ｃａｐｐｅｄ  ８ＵＴＰ（２９）ＲＮＡを用いたエンドヌクレアーゼ活性評価結果を示した図である。（＋）はＲＮＰ添加を、（−）はＲＮＰ非添加を表す。
【図６】未精製の８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡを用いて調製したＡｌｅｘａ６４７標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（１８）ＲＮＡを用いたエンドヌクレアーゼ活性評価結果を示した図である。（＋）はＲＮＰ添加を、（−）はＲＮＰ非添加を表す。
【図７】Ｃｙ５標識Ｃａｐｐｅｄ８ＵＴＰ（２９）ＲＮＡを用いたエロンゲーション活性評価結果を示した図である。電気泳動像の上部の数値は各レーンにおけるＲＮＰ添加量を示す。
【図８】ＴＲ−ＦＲＥＴ法によるエンドヌクレアーゼ活性評価結果を示した図である。縦軸は蛍光強度を表し、ＲＮＰ（＋）はＲＮＰ添加を、ＲＮＰ（−）はＲＮＰ非添加を表す。
【図９】ＴＲ−ＦＲＥＴ法によるＲＮＡポリメラーゼ阻害剤存在下におけるエンドヌクレアーゼ活性評価結果を示した図である。左図はＣａｐ  ａｎａｌｏｇ存在下におけるエンドヌクレアーゼ活性評価結果を示し、縦軸は蛍光強度を、横軸は添加したＣａｐ  ａｎａｌｏｇの濃度を表す。右図はＲａｂｂｉｔ  Ｇｌｏｂｌｉｎ  ｍＲＮＡ存在下におけるエンドヌクレアーゼ活性評価結果を示し、縦軸は蛍光強度を、横軸は添加したＲａｂｂｉｔ  Ｇｌｏｂｌｉｎ  ｍＲＮＡの濃度を表す。
【図１０】ＴＲ−ＦＲＥＴ法によるエンドヌクレアーゼ活性評価結果を示した図である。縦軸は蛍光強度を表し、ＲＮＰ（＋）はＲＮＰ添加を、ＲＮＰ（−）はＲＮＰ非添加を表す。
【図１１】ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  Ｔ１のエンドヌクレアーゼ活性評価結果を示した図である。縦軸はＴ／Ｃ値を、横軸はＣａｐ  Ａｎａｌｏｇ添加濃度を表す。
【図１２】ＦＰ法によるＣａｐ  ｂｉｎｄｉｎｇ評価結果を示した図である。縦軸は蛍光偏光度（ＦＰ値）を表し、ＲＮＰ（＋）はＲＮＰ添加を、ＲＮＰ（−）はＲＮＰ非添加を表す。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】
配列番号１：６ＣＴＰ（２４）と称するインフルエンザＲＮＡポリメラーゼの基質となるよう設計されたＲＮＡの塩基配列。
配列番号２：６ＵＴＰ（２１）と称するインフルエンザＲＮＡポリメラーゼの基質となるよう設計されたＲＮＡの塩基配列。
配列番号３：６ＵＴＰ（２２）と称するインフルエンザＲＮＡポリメラーゼの基質となるよう設計されたＲＮＡの塩基配列。
配列番号４：８ＵＴＰ（１４）と称するインフルエンザＲＮＡポリメラーゼの基質となるよう設計されたＲＮＡの塩基配列。
配列番号５：８ＵＴＰ（１５）と称するインフルエンザＲＮＡポリメラーゼの基質となるよう設計されたＲＮＡの塩基配列。
配列番号６：８ＵＴＰ（１６）と称するインフルエンザＲＮＡポリメラーゼの基質となるよう設計されたＲＮＡの塩基配列。
配列番号７：８ＵＴＰ（１８）と称するインフルエンザＲＮＡポリメラーゼの基質となるよう設計されたＲＮＡの塩基配列。
配列番号８：８ＵＴＰ（２１）と称するインフルエンザＲＮＡポリメラーゼの基質となるよう設計されたＲＮＡの塩基配列。
配列番号９：８ＵＴＰ（２２）と称するインフルエンザＲＮＡポリメラーゼの基質となるよう設計されたＲＮＡの塩基配列。
配列番号１０：８ＵＴＰ（２６）と称するインフルエンザＲＮＡポリメラーゼの基質となるよう設計されたＲＮＡの塩基配列。
配列番号１１：８ＵＴＰ（２９）と称するインフルエンザＲＮＡポリメラーゼの基質となるよう設計されたＲＮＡの塩基配列。
配列番号１２：９ＵＴＰ（１７）と称するインフルエンザＲＮＡポリメラーゼの基質となるよう設計されたＲＮＡの塩基配列。
配列番号１３：１６ＵＴＰ（１６）と称するインフルエンザＲＮＡポリメラーゼの基質となるよう設計されたＲＮＡの塩基配列。
配列番号１４：６ＣＴＰ（２４）のテンプレートＤＮＡの塩基配列。
配列番号１５：６ＵＴＰ（２１）のテンプレートＤＮＡの塩基配列。
配列番号１６：６ＵＴＰ（２２）のテンプレートＤＮＡの塩基配列。
配列番号１７：８ＵＴＰ（１４）のテンプレートＤＮＡの塩基配列。
配列番号１８：８ＵＴＰ（１５）のテンプレートＤＮＡの塩基配列。
配列番号１９：８ＵＴＰ（１６）のテンプレートＤＮＡの塩基配列。
配列番号２０：８ＵＴＰ（１８）のテンプレートＤＮＡの塩基配列。
配列番号２１：８ＵＴＰ（２１）のテンプレートＤＮＡの塩基配列。
配列番号２２：８ＵＴＰ（２２）のテンプレートＤＮＡの塩基配列。
配列番号２３：８ＵＴＰ（２６）のテンプレートＤＮＡの塩基配列。
配列番号２４：８ＵＴＰ（２９）のテンプレートＤＮＡの塩基配列。
配列番号２５：９ＵＴＰ（１７）のテンプレートＤＮＡの塩基配列。
配列番号２６：１６ＵＴＰ（１６）のテンプレートＤＮＡの塩基配列。
【図１】
2008212033.tif 000002
【図２】
2008212033.tif 000003
【図３】
2008212033.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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