(57)【要約】【課題】生産現場での検査および食品検査において、LAMP法を用いて、エントロトキシンAを産生するエンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌を迅速かつ高感度に検出する。【解決手段】黄色ブドウ球菌エンテロトキシンA配列SEAに特異的な遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるLAMP用プライマー、該プライマーを用いた増幅法、SEA遺伝子の増幅を検出することによるエンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌の検出法を提供する。【選択図】図４
2008125376.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌検出のためのLAMP法に用いるエンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌検出用プライマーであって、黄色ブドウ球菌エントロトキシンAの特異的な塩基配列から選ばれた以下の塩基配列（配列番号２〜２１）あるいはそれと相補的な塩基配列の中、
（１）配列番号２の塩基配列に相補的な配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（２）配列番号５の塩基配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号６の塩基配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド、
（３）配列番号１０の塩基配列に相補的な配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（４）配列番号１３の塩基配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号１４の塩基配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド、
（５）配列番号１６の塩基配列に相補的な配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号１７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（６）配列番号１９の塩基配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号２０の塩基配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット。
TTCAAGCAAGACGTTATTTACAGGA      配列番号２
CAGTACCTTTGGAAACGG             配列番号３
GCCGATCAATTTATGGCTAG           配列番号４
CTGATGTTTTTGATGGGAAGGTT        配列番号５
AGAACCTTCGGTTAATTACG           配列番号６
GCTCAAGGACAGTATTCAA            配列番号７
ACGAATAAGAAAAATGTAACTGT        配列番号８
CAGAGGGGATTAATCGTGT            配列番号９
ATTTGCGAAAAAAGTCTGAATTGC       配列番号１０
CCACTTGTAAATGGTAGCG            配列番号１１
TTGCCCTAACGTTGACAA             配列番号１２
GGAACAGCTTTAGGCAATCTTAAA       配列番号１３
ACTGAAAATAAAGAGAGTCACG         配列番号１４
GCATACTATATTGTTTAAAGGCT        配列番号１５
AAAATACAGTACCTTTGGAAACGG       配列番号１６
AAGAGAAAAAAGTGCCGAT            配列番号１７
CATGATAATAATCGATTGACCG         配列番号１８
CTTCAAGCAAGACGTTATTTACAGG      配列番号１９
TGATGGGAAGGTTCAGAG             配列番号２０
ATCGTGTTTCATACTTCTACAG         配列番号２１
【請求項２】
請求項１のプライマーセットを用いることを特徴とする、ＬＡＭＰ法による黄色ブドウ球菌エントロトキシンAに特異的なエンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌検出塩基配列の核酸の増幅法。
【請求項３】
請求項２の黄色ブドウ球菌エントロトキシンAに特異的なエンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌検出塩基配列の核酸の増幅を検出することを特徴とする、エンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンA配列SEA上の特異的塩基配列に基づいて設計された新規プライマーと該プライマーを用いたLAMP法によるエンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌の遺伝子検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌による食中毒は、代表的な毒素型食中毒で、黄色ブドウ球菌が食品中で増殖するときに産生するエンテロトキシン（腸管毒）を食品とともに摂取することによって起こる。ブドウ球菌エンテロトキシンは熱に強く100℃３０分間の加熱でも失活しない。また、胃酸やトリプシンなどの消化酵素によっても分解されない。したがって、食品中で菌が増殖しエンテロトキシンが産生されると、調理で菌が死滅しても毒素の分解は困難であり、嘔吐、腹痛、下痢等の中毒を発症させる。
エンテロトキシンには抗原性の異なる型があり、抗原型が確認された順にSEA（エンテロトキシンA）、SEB（エンテロトキシンB）、SEC（エンテロトキシンC）、〜とアルファベット順に命名されている。
食中毒の事例には、SEA単独あるいはSEAを含むいくつかのエンテロトキシンの複合型によるものが多いことが明らかにされている（以下の文献参照）。
【０００３】
【非特許文献１】食品衛生研究  ３１巻、第３号、３７−４５、１９８１年発行
【０００４】
また、黄色ブドウ球菌は、人をとりまく環境や各種動物に広く分布しており、健康人の鼻腔、咽頭（のど）、腸管、皮膚（手指）、毛髪などに常在している。黄色ブドウ球菌による食中毒は、この菌が常在菌であり、手指を介して食品を汚染することから、気温の低い冬季でも発生するのが特徴である。
黄色ブドウ球菌は、腸炎ビブリオ菌、サルモネラ属菌とともに、三大食中毒菌とよばれており、2000年夏に発生した低脂肪乳などによる大規模な食中毒事件のように、衛生管理を怠ると思わぬ被害を招くことになり、黄色ブドウ球菌は依然として食品衛生上重要な原因菌と考えられている。
【０００５】
従来、食品は、培養法による微生物検査が行われている。黄色ブドウ球菌についても、培養によって検査されているが、検出までに２４時間〜２日間の時間を要することや種々の培地を使用する。また、黄色ブドウ球菌のエンテロトキシンの検出は、酵素免疫法のELISA法が行われている。これらの検査法は時間と多くの労力を必要とすることから、簡易で迅速な微生物検査法が開発されてきている。特に、迅速性、検出感度に優れている遺伝子増幅法による検査法が注目されてきている。
【０００６】
現在、報告されている遺伝子増幅法にPCR法がある。PCR法は、相補的な２本鎖の核酸を１本鎖の核酸に変性し、次に、１本鎖核酸にプライマーを相補的に結合させ、耐熱性DNAポリメレース（合成酵素）により結合したプライマーからDNAを伸長させて、増幅したい遺伝子配列の特定領域を２倍に増幅する。この一連の工程を繰り返し行うことにより遺伝子配列の特定領域を指数関数的に増幅することができる。
しかし、PCR法は各段階で反応温度が異なるため、反応の段階に応じて温度を制御する必要があり、また、増幅産物（PCR産物）をアガロース電気泳動にかけて、細菌を検出しなければならない。
このような従来例としては、例えば以下の特許文献に開示のものがある。
【０００７】
【特許文献１】特開平６−３０３９７６号公報
【０００８】
すなわち、PCR法を用いた細菌の検出法は、反応を行うために特別な大型機器を必要とし、最終判定にはPCR産物を確認するために電気泳動の特殊な方法や、紫外線照射装置などが必要となる。また、このPCR法による検査は、開始から判定まで４〜５時間を要し、生産現場や食品工場で用いるためには更に簡便で迅速な方法が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
最近、PCR法に替わる遺伝子増幅法として、ループ媒介等温増幅法（Loop-mediated isothermal AMPlification：LAMP法）が開発された。LAMP法は鋳型となるヌクレオチドに自身の３’末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応が可能となっている。
またLAMP法では、プライマーの３’末端が常に試料に由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能し、その結果、特異性の高い遺伝子増幅反応が可能となっている。
このような従来例としては、例えば以下の特許文献に開示のものがある。
【００１０】
【特許文献２】国際公開ＷＯ００／２８０８２
【００１１】
LAMP法は、２本鎖DNA、６つの領域を認識する４つのプライマーを用いる遺伝子増幅技術であり、耐熱性DNAポリメレースではなく、鎖置換型DNAポリメレースを用い、65°Ｃ付近の一定温度で、増幅から検出までを１ステップで行うことができる。増幅効率が高く、また、極めて高い特異性をもつため、目的とするDNA配列は、増幅産物を電気泳動することなく濁度あるいは蛍光だけで判定することができる。そのため、LAMP法は、反応を行うために特別な大型機器を必要とせず、反応時間も短く簡便であり、迅速な結果が得られると考えられる。
【００１２】
本発明は、生産現場での検査および食品検査において、LAMP法により、エントロトキシンAを産生するエンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌を簡便、迅速かつ高感度に検出することができるプライマー、およびそれを用いたエンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌の検出法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記問題を解決するため鋭意研究を行なった結果、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンA配列SEAに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとしてLAMP法により黄色ブドウ球菌エンテロトキシンA配列SEAに特異的な配列を増幅することにより、エンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌を検出できることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち本発明は、エンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌検出のための核酸増幅法に用いる、エンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌検出用プライマーであって、黄色ブドウ球菌エントロトキシンA配列SEA（配列番号１）またはその相補鎖上から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
（１）第１領域として、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンA配列SEA上の特異的塩基配列にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列、および
（２）第２領域として、第１領域の３’側の塩基配列に相補的であり、第１領域の５’側に位置する塩基配列
を含むことを特徴とする、新規プライマーを提供する。
【００１５】
また本発明は、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンA配列SEAに特異的な黄色ブドウ球菌エントロトキシンA遺伝子検出の塩基配列を増幅できる、LAMP法用プライマーセットの好適な例として、以下のＡ、Ｂ、Ｃの３組のプライマーセットを提供する。
＜プライマーセットＡ＞
インナープライマーＦ：
5’−TCCTGTAAATAACGTCTTGCTTGAACAGTACCTTTGGAAACGG−3’（配列番号２２）
インナープライマーＲ：
5’−CTGATGTTTTTGATGGGAAGGTTCGTAATTAACCGAAGGTTCT−3’（配列番号２３）
アウタープライマーＦ：
5’−GCCGATCAATTTATGGCTAG−3’（配列番号４）
アウタープライマーＲ：
5’−TTGAATACTGTCCTTGAGC−3’（配列番号２４）
ループプライマーＦ：
5’−ACAGTTACATTTTTCTTATTCGT−3’（配列番号２５）
ループプライマーＲ：
5’−CAGAGGGGATTAATCGTGT−3’（配列番号９）
＜プライマーセットＢ＞
インナープライマーＦ：
5’−GCAATTCAGACTTTTTTCGCAAATCCACTTGTAAATGGTAGCG−3’（配列番号２６）
インナープライマーＲ：
5’−GGAACAGCTTTAGGCAATCTTAAACGTGACTCTCTTTATTTTCAGT−3’（配列番号２７）
アウタープライマーＦ：
5’−TTGCCCTAACGTTGACAA−3’（配列番号１２）
アウタープライマーＲ：
5’−AGCCTTTAAACAATATAGTATGC−3’（配列番号２８）
＜プライマーセットＣ＞
インナープライマーＦ：
5’−CCGTTTCCAAAGGTACTGTATTTTAAGAGAAAAAAGTGCCGAT−3’（配列番号２９）
インナープライマーＲ：
5’−CTTCAAGCAAGACGTTATTTACAGGCTCTGAACCTTCCCATCA−3’（配列番号３０）
アウタープライマーＦ：
5’−CATGATAATAATCGATTGACCG−3’（配列番号１８）
アウタープライマーＲ：
5’−CTGTAGAAGTATGAAACACGAT−3’（配列番号３１）
【００１６】
さらに本発明は、核酸増幅法がLAMP法である前記プライマー、および該プライマーを用いたLAMP法による黄色ブドウ球菌エンテロトキシンA配列SEA上の特異的塩基配列の増幅法を提供する。
さらにまた、本発明は前記増幅法を利用して、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンA配列SEA上の特異的塩基配列を検出することを特徴とするエンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌の検出法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。
核酸増幅法によるエンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌の遺伝子検出用の試料としては、食品検査材料、たとえば乳牛から搾乳された生乳およびチーズ等の畜産物など、また食品材料やふき取り検体を使用する。LAMP法の試料としては、この生乳やチーズ等から、熱、蛋白質分解酵素、界面活性剤、アルカリ等を用いた処理法により抽出された核酸が使用される。
【００１８】
本発明において標的配列とは、増幅すべきポリヌクレオチドの塩基配列を意味する。一般にポリヌクレオチドの塩基配列は、５’側から３’側に向けてセンス鎖の塩基配列を記載する。本発明において、連続的に新たな標的塩基配列が合成されることを増幅と呼ぶ。更に本発明において、相補鎖合成の起点を与えることとは、鋳型となるポリヌクレオチドに対して、相補鎖合成に必要なプライマーとして機能するポリヌクレオチドの３’末端をハイブリダイズさせることを言う。また本発明において、３’末端、あるいは５’末端とは、単にいずれかの末端の１塩基のみならず、末端の１塩基を含み、かつ末端に位置する領域を意味する。本発明において、プライマーセットとは同時に用いられるプライマーの組み合せをいう。
【００１９】
ＬＡＭＰ法は、プライマーとして少なくとも４種類のオリゴヌクレオチドを用いる核酸増幅法で、２種類はインナープライマー（Inner Primer）、残りの２種類はアウタープライマー（Outer Primer）である。ＬＡＭＰ法は、これら４種類のプライマー、鎖置換型DNAポリメレース、及び基質を用い、熱変性を必要とせずに、終始等温で速やかに特異性の高い遺伝子増幅反応が進行することを特徴とする。
【００２０】
ＬＡＭＰ法においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、ループプライマー（Loop Primer）がある。これを用いると核酸合成の起点を増やすことになり、反応時間の短縮と検出感度の上昇ができる。
【実施例】
【００２１】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
１．プライマーの合成
プライマーはSEAの塩基配列（配列番号１）に基づいてその塩基配列を設定し、DNA合成を専門に取り扱う機関に委託して、当該機関所有のDNA合成機で、ホスホアミダイド法により化学合成した。合成したプライマーは、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーでさらに精製した。
こうして、プライマーセットA、B、Cを合成した。これらの各セットは図１，２，３に示される。すなわち、図１はプライマーセットA、図２はプライマーセットB、図３はプライマーセットCをそれぞれ示している。
【００２３】
２．LAMP法で使用する試料および試薬の調整
１）試料の調整（核酸抽出法）
エンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌株を培養して、形成されたコロニーを掻き取り、
Insta GeneMatrix (BioRad社)で抽出した溶液を試料とした。
【００２４】
２）対照試料
陰性対照として滅菌水を使用した。また陽性対照の鋳型DNAとしてエンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌株から抽出したDNA（ゲノムDNA）あるいはSEAの遺伝子をクローニングしたプラスミドDNA（クローニングベクター）を試料とした。
【００２５】
３．LAMP法に用いる試薬組成及び濃度
上述の試料及びプライマーセットA、B、Cを用いて下記の表１に示す組成のLAMP反応液を調整し、プログラム可能な温度調整機（LA-200、テラメックス社製）を用いてLAMP反応を行った。LAMP反応は栄研化学社製のLoopampDNA増幅試薬キットを用いた。
【００２６】
【表１】
2008125376.tif 000003
【００２７】
LAMP反応条件は、６０℃〜６５℃（６１℃が特に好ましい。）で１時間保持して反応させ、その後、８０℃で２分間の酵素変性処理を行った。
反応終了後の各試料10 μlについて、３％アガロースゲルによる電気泳動により増幅産物を確認した。
【００２８】
４．結果
図４に示すように、SEAのプラスミドDNA、エンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌標準株および黄色ブドウ球菌野外株（エンテロトキシンA産生）から抽出したDNAは同様のラダーバンドが検出された。陰性対照においては、DNAの増幅は見られなかった。これらのことから本発明のプライマーセットを用いることにより、エンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌のSEA遺伝子の増幅が可能であった。
【００２９】
実施例２ 
プライマーの特異性
下記の表２にLAMP法によるエンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌及び他の細菌を試料としたLAMP反応結果を示す。LAMP反応条件は実施例１と同様に行った。
【００３０】
【表２】
2008125376.tif 000004
【００３１】
SEA遺伝子を保有するエンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌においてDNAの増幅がみられ、SEA遺伝子を保有しない黄色ブドウ球菌及びその他の細菌の菌株においてはDNAの増幅は見られなかった。これらのことから、本発明のプライマーセットを用いることにより、エンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌を特異的に検出することが可能であった。
【００３２】
実施例３
ループプライマーを用いた検出系
プライマーセットAについてループプライマー（配列番号２５及び９）を設計した。エンテロトキシンA産生黄色ブドウ球菌から抽出したDNAを試料として、配列番号２２、２３、４および２４に示したプライマー及び配列番号２５および９に示したプライマーを用いて表３に示す組成のLAMP反応液を調整し、プログラム可能な温度調整機（LA-200、テラメックス社製）を用いてLAMP反応を行った。LAMP反応は栄研化学社製のLoopampDNA増幅試薬キットを用いた。
【００３３】
【表３】
2008125376.tif 000005
【００３４】
LAMP反応条件は、６０℃〜６５℃（６１℃が特に好ましい。）で１時間保持して反応させ、その後、８０℃で２分間の酵素変性処理を行った。
【００３５】
図５にプライマーセットAについてループプライマーの有無による増幅時間の違いを示すグラフを掲載する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】プライマーセットＡを示す図である。
【図２】プライマーセットＢを示す図である。
【図３】プライマーセットＣを示す図である。
【図４】ＤＮＡ検出結果を説明する図である。
【図５】プライマーの有無による増幅時間の違いを示す図である。
【図１】
2008125376.tif 000006
【図２】
2008125376.tif 000007
【図３】
2008125376.tif 000008
【図４】
2008125376.tif 000009
【図５】
2008125376.tif 000010
【配列表】
2008125376000001.app