(57)【要約】【課題】本発明により、食品等にも使用することができて優れた安全性を有し、高い製造効率を有するホスファチジルイノシトールの製造方法を提供する。【解決手段】本発明は、（ａ）ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含有するリン脂質を媒体中に溶解または分散させて溶液または分散液を提供する工程、（ｂ）該溶液または分散液にホスホリパーゼＤを加えて、該ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンの分解反応または変換反応を行う工程、および（ｃ）該溶液または分散液から、ホスファチジルイノシトールを分離、精製する工程、を含むことを特徴とするホスファチジルイノシトールの製造方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含有するリン脂質を媒体中に溶解または分散させて溶液または分散液を提供する工程、
（ｂ）該溶液または分散液にホスホリパーゼＤを作用させて、該ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンの分解反応を行う工程、および
（ｃ）該溶液または分散液から、ホスファチジルイノシトールを分離、精製する工程
を含むことを特徴とするホスファチジルイノシトールの製造方法。
【請求項２】
前記反応が、アルカリ金属塩またはアルカリ土類塩の存在下に行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記分解反応による分解物が、ホスファチジン酸である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記媒体が、無溶剤であるか、或いは、ヘキサンおよびアセトンから成る群から選択される１種または２種の混合物である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記（ｃ）工程が、溶剤抽出法、再結晶法によって行われる請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記（ｃ）工程が、カラムクロマト法によって行われる請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファチジルイノシトールの製造方法に関し、特に食品等にも使用することができて優れた安全性を有し、高い製造効率を有するホスファチジルイノシトールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスファチジン酸とイノシトールとのエステルであるホスファチジルイノシトール（ＰＩ）は、医薬、化粧品、リポソーム基材などの分野に使用されてきた。近年、ホスファチジルイノシトールには、抗肥満、抗高脂血症、コレステロール低減など有用な生理活性が認められており、機能性食品としての利用が期待されている。
【０００３】
従来、ホスファチジルイノシトールは動物、植物、菌類に広く存在することが知られており、これらから取り出された粗製リン脂質には各種のリン脂質が混在している。上記粗製リン脂質からホスファチジルイノシトールを分離精製するためには、これまで、イオン交換樹脂、ケイ酸、アルミナカラムなどを用いたカラムクロマト分離法が一般に行われてきた。しかしながら、この方法は一度に少量のリン脂質しか処理できず、また、吸着したリン脂質を溶出分離精製するには、溶媒組成を複雑に変化させながら長時間かけて溶出しなければならず、工業的規模で考えた場合、設備の大型化、低い処理効率などの問題があった。また、上記溶出溶媒の一部に用いられる酢酸や塩酸が、その後の精製工程においてリン脂質の分解を促進し、迅速に処理したとしても、得られる精製品が低品質化し易い等の問題もあった。
【０００４】
リン脂質を大量生産するために、出発物質のリン脂質を化学的あるいは酵素的にホスファチジル基転移置換し、これから濃縮、分画等精製する方法がこれまでに種々提案されてきた。（特許文献１〜７等。）
【０００５】
酵素としてのホスホリパーゼＤを用いてホスファチジル基転移反応を利用してリン脂質の塩基部分を交換しようとする場合、一般的には水相と有機溶媒相とからなる二相系で反応が行われる。即ち、主として酵素、反応受容体、ｐＨ緩衝液、無機塩等を含む水相と、主として親油性であるリン脂質等を含む有機溶媒相とを適宜に撹拌、混合して接触させる方法を利用してきた。
【０００６】
このような酵素反応系において、ホスファチジル基転移反応を促進させる有機溶媒としては、石油エーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタン、四塩化炭素、ジクロロエタン、ｎ−オクタン、イソオクタン、酢酸エチル、ジオキサン、ベンゼン等、あるいはこれらの混合溶媒が知られている。しかし、これらの有機溶媒はリン脂質を溶解することはできるが、上記転移反応を促進させる効果は十分に満足できるものではなく、また、目的物を食品等に利用しようとする場合には安全性などの点から前記有機溶媒を使用することができないという問題があった。
【特許文献１】特開昭６３−４２６９１号公報
【特許文献２】特開昭６３−４４８９３号公報
【特許文献３】特開平１−１５３０９０号公報
【特許文献４】特開平２−４９５９３号公報
【特許文献５】特開平２−２９５９９２号公報
【特許文献６】特開２０００−３３３６８９号公報
【特許文献７】特開２００１−１８６８９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記のような従来のホスファチジルイノシトールの製造方法の有する問題点を解決し、食品等にも使用することができて優れた安全性を有し、高い製造効率を有するホスファチジルイノシトールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は上記目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含有する原料リン脂質を、特定溶剤または無溶剤系中に溶解または分散させて溶液または分散液とし、そこへホスホリパーゼＤを加えて、上記ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンの分解反応を行い、上記溶液または分散液から、ホスファチジルイノシトールを分離、精製することによって、食品等にも使用することができて優れた安全性を有し、高い製造効率を有するホスファチジルイノシトールの製造方法が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、
（ａ）ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含有するリン脂質を媒体中に溶解または分散させて溶液または分散液を提供する工程、
（ｂ）該溶液または分散液にホスホリパーゼＤを作用させて、該ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンの分解反応を行う工程、および
（ｃ）該溶液または分散液から、ホスファチジルイノシトールを分離、精製する工程
を含むことを特徴とするホスファチジルイノシトールの製造方法に関する。
【００１０】
更に、本発明を好適に実施するためには、
上記反応が、アルカリ金属塩またはアルカリ土類塩の存在下に行われ；
上記分解反応による分解物が、ホスファチジン酸であり；
上記媒体が、無溶剤であるか、或いは、ヘキサンおよびアセトンから成る群から選択される１種または２種の混合物であり；
上記（ｃ）工程が、溶剤抽出法、再結晶法によって行われ；
上記（ｃ）工程が、カラムクロマト法によって行われる；
ことが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明では、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含有する原料リン脂質を媒体中に溶解または分散させて溶液または分散液とし、そこへホスホリパーゼＤを加えて、上記ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンの分解反応を行い、上記溶液または分散液から、ホスファチジルイノシトールを分離、精製することによって、食品等にも使用することができて優れた安全性を有し、高い製造効率を有するホスファチジルイノシトールの製造方法を提供し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のホスファチジルイノシトールの製造方法は、前述のように、（ａ）リン脂質を媒体中に溶解または分散させて溶液または分散液を提供する工程、（ｂ）上記溶液または分散液にホスホリパーゼＤを加えて、ホスファチジルイノシトール以外のホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを分解させる工程、および（ｃ）上記溶液または分散液から、ホスファチジルイノシトールを分離、精製する工程を含むものである。
【００１３】
本発明のホスファチジルイノシトールの製造方法に用いる上記リン脂質としては、ホスファチジルイノシトールを含有するものであれば特に限定されないが、通常、ホスファチジルイノシトールに加えて、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含有する天然に存在するリン脂質が挙げられる。それらの具体例として、大豆、菜種、米、コーン、麦芽などの植物由来のリン脂質；牛、豚などの脳や肝臓、鶏卵黄、魚類などの動物由来のリン脂質；パン酵母などの微生物由来のリン脂質；等が挙げられる。これらの内、大豆由来のリン脂質や豚肝臓由来のリン脂質、ユーグレナ由来のリン脂質等が好ましい。
【００１４】
上記媒体は、無溶剤であるか、或いは、ヘキサンおよびアセトンから成る群から選択される１種または２種の混合物であることが望ましい。即ち、本発明の製造方法により得られたホスファチジルイノシトールを食品等に利用しようとする場合には、安全性などの点から、無溶剤系の水性媒体、例えば緩衝液等であるか、または上記ヘキサンおよびアセトン以外の溶剤を使用せずに行うことが望ましい。上記緩衝液の例としては、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸−リン酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。
【００１５】
本発明のホスファチジルイノシトールの製造方法では、上記（ａ）工程において、上記リン脂質を、上記媒体として安全性の優れた溶剤に溶解するか、または無溶剤系の媒体中に分散させて、溶液または分散液とするが、混合装置等は特に限定されず当業者に公知のものを使用することができる。
【００１６】
上記ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）としては、キャベツ、米糠、ピーナッツなどの植物由来のホスホリパーゼＤや、ストレプトマイセス属の放線菌などの微生物由来のホスホリパーゼＤが挙げられるが、一般に市販されているものを使用することができる。これらの内、ストレプトマイセス由来のホスホリパーゼＤやアクチノマジューラ由来のホスホリパーゼＤが好ましい。また、上記微生物由来のホスホリパーゼＤを使用する場合、上記ホスホリパーゼＤを含む微生物の培養液をそのまま使用してもよい。上記ホスホリパーゼＤの配合量は、基材となるリン脂質をベースとして、０．１〜２０ｗｔ％、好ましくは１〜１０ｗｔ％、より好ましくは２〜５ｗｔ％である。上記ホスホリパーゼＤの配合量が０．１ｗｔ％未満では分解反応が進まず、２０ｗｔ％を超えると酵素費用による製造価格が高くなりすぎるという問題がある。
【００１７】
次に、本発明のホスファチジルイノシトールの製造方法における上記（ｂ）工程について詳述する。まず、上記（ａ）工程にて作製した溶液または分散液に、上記ホスホリパーゼＤを加える。この際に上記ホスホリパーゼＤは、リン脂質を加水分解してホスファチジン酸を生成する反応（分解反応）の触媒として作用する。
【００１８】
以下に化学式を用いて簡単に説明する。まず、本発明の製造方法により得られるホスファチジルイノシトールは、以下の式（１）：
【化１】
2008061546.tif 000002
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、飽和、モノ不飽和またはポリ不飽和のＣ１０〜Ｃ３０のアシル基である。）
において、Ｘが以下の式（２）：
【化２】
2008061546.tif 000003
で表されるリン脂質である。同様に上記式（１）において、Ｘが
‐ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ＋(ＣＨ３)３
の場合にはホスファチジルコリンであり、Ｘが
‐ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２
である場合にはホスファチジルエタノールアミンである。
【００１９】
以下の式（３）：
【化３】
2008061546.tif 000004
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、飽和、モノ不飽和またはポリ不飽和のＣ１０〜Ｃ３０のアシル基である。）
に示すように、リン脂質がホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンの場合には、ホスホリパーゼＤ（式中ではＰＬＤ）は、リン脂質を加水分解して、ＸがＨであるホスファチジン酸を生成する反応（分解反応）の触媒として作用する。
【００２０】
上記のような分解反応によってホスファチジン酸を生成させて、本発明の製造方法において目的とするホスファチジルイノシトールを他と分離し易い状態とすることによって、容易に高い製造効率でホスファチジルイノシトールを製造することが可能となる。
【００２１】
ホスファチジルイノシトールを含有するリン脂質に含まれるホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン以外のリン脂質は、現在知られるホスホリパーゼＤによっては分解を受けにくく、特にホスファチジルイノシトールはほとんどそのままの形で残存する。従って、その分解物であるホスファチジン酸とホスファチジルイノシトールとを含むリン脂質を分離回収した後、ホスファチジン酸とホスファチジルイノシトールとの溶解度が異なる溶媒を用いて、それらの内の一方を洗浄溶解して分別することによって、ホスファチジルイノシトールを分離、精製することができる。そのような分離、精製を行う具体的な方法として、後述するような、溶剤抽出法、再結晶法、カラムクロマト法などがある。上記分別するための溶媒としては、分別効果を有するものであれば特に限定されないが、メタノール、エタノール、ｎ‐プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等のアルコール類、ヘキサン、ヘプタン、オクタンなどの炭化水素、アセトン、ＭＥＫ、ＭＩＢＫ等のケトン類やクロロフォルムやトルエンなどを例示することができるが、安全上ヘキサン、アセトン、エタノールなどの食品用に用いられる溶剤を用いることが好ましい。
【００２２】
更に、上記のような酵素反応を行う際には、酵素であるホスホリパーゼＤの活性を高めるために、カルシウム等のイオンを活性化剤として添加することがより望ましい。即ち、上記反応は、塩化カリウム、塩化ナトリウムなどのアルカリ金属塩または塩化マグネシウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウムなどのアルカリ土類塩の存在下に行われることが望ましい。上記アルカリ金属塩またはアルカリ土類塩の配合量は、リン脂質の配合量をベースとして、０．１〜３００ｗｔ％、好ましくは５〜２００ｗｔ％、より好ましくは２０〜１００ｗｔ％である。上記アルカリ金属塩またはアルカリ土類塩の配合量が、０．１ｗｔ％未満では、反応の進行が遅く経済的な時間での製造が出来ないか、酵素量が大量に必要となり、３００ｗｔ％を超えると使用する緩衝液ではｐＨの低下が抑えられず、ｐＨが低くなり酵素の活性が低下する。例えば酵素ホスホリパーゼＤの反応では、好適なｐＨは３〜７であり、好適な温度は、２０〜５０℃であり、この範囲で反応することが望ましい。
【００２３】
ここで、上記（ｂ）工程における上記反応の条件としては、前述のように温度は、ホスホリパーゼＤに適する温度範囲が好ましく、かつ、目的とするリン脂質、即ち、ホスファチジルイノシトールが加水分解や熱履歴により着色しない範囲が好ましい。具体的には反応温度は、２０〜５０℃の範囲が好ましい。上記反応温度が２０℃未満の場合は、反応速度が遅くて反応効率が悪くなる傾向にあり、上記反応温度が５０℃より高い場合は、酵素の失活が起こり反応が進まなくなり、また反応中に酸化や加水分解が著しくなる傾向にあるので好ましくない。また反応時間は反応溶液の組成により異なるが、３０分間〜２４時間、好ましくは２〜１２時間である。反応の終点としては、反応液中のホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンの残存量をチェックし、最低点で反応を停止することにより、最大の収率を得ることが望ましい。
【００２４】
本発明の製造方法では、上記（ｃ）工程において、上記反応後の溶液または分散液から目的とするホスファチジルイノシトールを分離、精製するが、前述のように、その方法は特に限定されず当業者に公知の従来の方法を用いることができるが、溶剤抽出法、再結晶法またはカラムクロマト法によって行われることが望ましい。
【００２５】
上記溶剤抽出法は、得られたリン脂質固体からホスファチジルイノシトールを選択的に抽出する方法や溶液にして液‐液抽出する方法などがある。上記溶剤抽出法に用いる溶剤としては、石油エーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、クロロホルム、ジクロルメタン、四塩化炭素、ジクロロエタン、ｎ−オクタン、イソオクタン、酢酸エチル、ジオキサン、ベンゼン等が挙げられるが、食品の安全性の点でヘキサン、アセトン、エタノールが好ましい。
【００２６】
上記カラムクロマト法は、通常のオープンカラムや中圧のカラムクロマト法、ＨＰＬＣタイプのカラム分離が考えられるが、量産性や価格面でオープンカラムを用いることが望ましい。上記カラムクロマト法に用いるカラム充填材料としてはイオン交換樹脂、シリカゲル、アルミナ、珪藻土などが挙げられるが分離能や使用のし易さの点でシリカゲルによる方法が好ましい。更に上記カラムクロマト法に用いる溶離液としては石油エーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタン、四塩化炭素、ジクロロエタン、ｎ−オクタン、イソオクタン、酢酸エチル、ジオキサン、ベンゼン等が挙げられるが、食品の安全性の点でヘキサン、アセトン、エタノールが好ましい。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
撹拌装置の付いた２Ｌの反応容器に原料である大豆リン脂質［辻製油製レシチンＳＰＬ−ホワイト（ホスファチジルイノシトール含有量１６．３％、ホスファチジルエタノールアミン３１．２％、ホスファチジルコリン２８．１％、ホスファチジン酸７．３％）］５０ｇを酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（０．１モル酢酸溶液：０．１モル酢酸ナトリウム溶液＝２：１混合液）３００ｍＬに加え分散させた。４５℃で１０分撹拌した後、これにホスホリパーゼＤ（名糖産業製アクチノマジューラ）１．６０ｇと塩化カルシウム２９．０ｇを、上記酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液と同一の組成のもの８００ｍＬに溶解し、２Ｌの反応容器に加え４５℃で２０時間反応した。得られた分散液から濾過して固形物Ａを得た。水にて洗浄後、減圧下５０℃で乾燥する。得られた固形物Ａは４８．６ｇで、脂質の組成はホスファチジルイノシトール含有量１６．５％、ホスファチジルエタノールアミン２０．９％、ホスファチジルコリン６．３％、ホスファチジン酸３７．３％であった。脂質組成の分析は基準油脂分析試験法に従って、高速液体クロマトグラフ法を用いて行った。分析機は、島津製作所製ＬＣ−１０ＡＴを用いその他カラム、溶離液は基準油脂分析試験法に従った。
【００２９】
撹拌装置の付いた３Ｌの反応容器に原料である大豆リン脂質（辻製油製レシチンＳＰＬ−ホワイト（ホスファチジルイノシトール含有量１６．３％、ホスファチジルエタノールアミン３１．２％、ホスファチジルコリン２８．１％、ホスファチジン酸７．３％）２５ｇをヘキサン８４０ｍＬ、アセトン２１０ｍＬ（０．１モル酢酸溶液：０．１モル酢酸ナトリウム溶液＝２：１混合液）に加え溶解させた。４５℃で１０分撹拌した後、これにホスホリパーゼＤ（名糖産業製アクチノマジューラ）１．６０ｇと塩化カルシウム６．０ｇを酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液８００ｍＬに溶解し、上記３Ｌの反応容器に加え４５℃で２４時間反応した。得られた溶液水相から分液後、洗浄濾過して溶剤を減圧下５０℃で留去後、固形物Ｂを得た。得られた固形物Ｂは２３．５ｇで、脂質の組成はホスファチジルイノシトール含有量１６．２％、ホスファチジルエタノールアミン１５．３％、ホスファチジルコリン検出されず、ホスファチジン酸５２．４％であった。
【００３０】
撹拌装置の付いた２００ｍＬの反応容器に原料である豚肝臓リン脂質（ホスファチジルイノシトール含有量６．３％、ホスファチジルエタノールアミン１６．２％、ホスファチジルコリン７０．１％、ホスファチジン酸痕跡量、脂肪酸組成の内アラキドン酸を１６．０％含有する）５．００ｇを酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（０．１モル酢酸溶液：０．１モル酢酸ナトリウム溶液＝２：１混合液）３０ｍＬに加え分散させた。４５℃で１０分撹拌した後、これにホスホリパーゼＤ（名糖産業製アクチノマジューラ）１６０ｍｇと塩化カルシウム２．９０ｇを上記酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液と同一の組成のもの８０ｍＬに溶解し、２００ｍＬの反応容器に加え４５℃で２４時間反応させた。得られた分散液から濾過して固形物Ｃを得た。水にて洗浄後、減圧下５０℃で乾燥した。得られた固形物Ｃは４．８６ｇで、脂質の組成はホスファチジルイノシトール含有量６．５％、ホスファチジルエタノールアミン１０．９％、ホスファチジルコリン６．３％、ホスファチジン酸５７．６％であった。
【００３１】
各２ｇの固形物Ａ〜Ｃをヘキサン１０ｍＬに溶解し、エタノールを４０ｍＬ加え、不溶解部分を濾別した。得られた固形分Ａ＊：６１０ｍｇ，Ｂ＊：７３０ｍｇ，Ｃ＊：５４０ｍｇを得た。それぞれを上記と同様に分析した。
固形分Ａ＊の脂質組成はホスファチジルイノシトール含有量４０．５％、ホスファチジルエタノールアミン１０．９％、ホスファチジルコリン５．３％、ホスファチジン酸２３．６％であった。
固形分Ｂ＊の脂質組成はホスファチジルイノシトール含有量４１．６％、ホスファチジルエタノールアミン８．９％、ホスファチジルコリン痕跡量、ホスファチジン酸２６．６％であった。
固形分Ｃ＊の脂質組成はホスファチジルイノシトール含有量２１．５％、ホスファチジルエタノールアミン８．９％、ホスファチジルコリン５．３％、ホスファチジン酸３８．６％であった。
【００３２】
カラムクロマト用のシリカゲル（７０〜２３０メッシュ）１５ｇをヘキサンに分散させて２０ｍｍのカラムに充填し、各２００ｍｇの固形物Ａ〜Ｃをヘキサン１ｍＬに溶解し、カラムに添加し、ヘキサン／アセトンの等量混合物を溶離液としてカラム分離した。各フラクションを３〜５ｍＬで採取し、各フラクションの脂質の組成を分析した。固形分Ｂについて得られたフラクションＢ−５において、脂質組成はホスファチジルイノシトール含有量４１．５％、ホスファチジルエタノールアミン９．８％、ホスファチジルコリン痕跡量、ホスファチジン酸２８．６％であった。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の製造方法は、優れた安全性および高い製造効率を有し、ホスファチジルイノシトールの製造方法として有用である。本発明の製造方法により得られるホスファチジルイノシトールは、医薬、化粧品、リポソーム基材、機能性食品などに利用することができる。