(57)【要約】【課題】ＥＳ細胞から直接セロトニン神経を作製する方法であって、再生医療に適用する際の妨げとなる因子を排した方法を提供すること。【解決手段】骨形成タンパク質のアンタゴニストを添加した培地を用いて、ゲル化させた細胞外マトリクスタンパク質上にてＥＳ細胞を培養する。また、骨形成タンパク質のアンタゴニスト及び細胞外マトリクスタンパク質を備えている、セロトニン神経を作製するためのキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロトニン神経を作製する方法であって、
ゲル化させた細胞外マトリクスタンパク質上にてＥＳ細胞を培養する工程、および
該ＥＳ細胞に骨形成タンパク質のアンタゴニストを添加する工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項２】
上記ＥＳ細胞を培養する工程の前段に、細胞外マトリクスタンパク質をゲル化する工程をさらに包含することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記細胞外マトリクスタンパク質が、ラミニン、コラーゲン、エンタクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ナイドジェン、フィブロネクチン、ゼラチン、ビトロネクチン、エラスチンおよびテネイシンからなる群より選択されるタンパク質の少なくとも１つであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記骨形成タンパク質のアンタゴニストが、ｎｏｇｇｉｎ、ｃｈｏｒｄｉｎ、ｃｈｏｒｄｉｎ−ｌｉｋｅ１、ｃｈｏｒｄｉｎ−ｌｉｋｅ２、ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、ｇｒｅｍｌｉｎ、ＤＡＮ、ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ及びｆｅｔｕｉｎからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
セロトニン神経を作製するためのキットであって、
細胞外マトリクスタンパク質、および
骨形成タンパク質のアンタゴニスト
を備えていることを特徴とするキット。
【請求項６】
ＥＳ細胞をさらに備えていることを特徴とする請求項５に記載のキット。
【請求項７】
上記細胞外マトリクスタンパク質が、ラミニン、コラーゲン、エンタクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ナイドジェン、フィブロネクチン、ゼラチン、ビトロネクチン、エラスチンおよびテネイシンからなる群より選択されるタンパク質の少なくとも１つであることを特徴とする請求項５に記載のキット。
【請求項８】
上記骨形成タンパク質のアンタゴニストが、ｎｏｇｇｉｎ、ｃｈｏｒｄｉｎ、ｃｈｏｒｄｉｎ−ｌｉｋｅ１、ｃｈｏｒｄｉｎ−ｌｉｋｅ２、ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、ｇｒｅｍｌｉｎ、ＤＡＮ、ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ及びｆｅｔｕｉｎからなる群より選択されることを特徴とする請求項５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セロトニン神経を作製するための方法に関するものであり、より詳細には、骨形成タンパク質のアンタゴニストを用いてＥＳ細胞からセロトニン神経を作製する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
セロトニン神経は、セロトニンをトリプトファンから合成し、神経終末から放出して、標的神経のセロトニン受容体に作用する神経である。セロトニン含有神経、あるいはセロトニン作動性神経（ｓｅｒｏｔｏｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎ）と呼ばれることも多い。セロトニン神経の細胞体は、後脳縫線核群に分布している。
【０００３】
セロトニン神経の活動の低下は、攻撃性および衝動性の増加や摂食障害等の一因であることが知られている。また、セロトニン神経は、幾つかの精神疾患の原因の一つである。例えば、うつ病、双極性障害、統合失調症、不安症、強迫神経症等の精神疾患において、セロトニン神経の機能が変化することが知られている。また、パーキンソン病においては、セロトニン神経の機能が低下することが知られている。
【０００４】
上記のような疾患の治療法として、薬物投与による治療が存在するが、継続的な投与が必要であったり、効果が徐々に低下したりする場合がある。そこで、上記疾患に対して再生医療を適用することで、低下したあるいは失われたセロトニン神経の機能を回復させることが検討されている。
【０００５】
再生医療とは、未分化の細胞を人為的に目的の細胞へと分化させることで、損傷した組織の細胞を補う技術である。未分化の細胞を分化させるのは体内においてであっても対外においてであってもよい。未分化の細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を始めとする各種の幹細胞が想定されるが、特に、ＥＳ細胞を直接目的の細胞へと分化させることが望ましい。ＥＳ細胞はほぼ無限に増殖させることができるので、容易に供給することができると考えられる。
【０００６】
現在までに知られている、ＥＳ細胞をセロトニン神経へと分化させる方法として、非特許文献１や非特許文献２に記載の方法が存在する。
【０００７】
非特許文献１に記載の方法は、ＥＳ細胞をストローマ細胞とともに培養し、培養後期に所定の因子を添加することによりセロトニン神経へと分化させる方法である。
【０００８】
非特許文献２に記載の方法は、まず、ＥＳ細胞に胚様体を形成させ、所定の成長因子を所定の時期に添加することによって、セロトニン神経へと分化させる方法である。
【０００９】
なお、神経幹細胞からセロトニン神経への分化に関与する因子としては、Ｓｈｈ、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８，ＢＤＮＦなどが知られている。
【００１０】
ところで、骨形成タンパク質（ＢＭＰ：Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、当初、異所性骨形成を誘導する物質として発見されたが、近年、個体の発生における様々な局面に関与することが判明した。いくつか例を挙げれば、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化、上皮の胃腺形成や予定心臓領域の誘導、切歯の発生場所の決定等に関与していることが知られている。また、ＥＳ細胞の中胚葉への分化を誘導することも知られている。
【００１１】
また、ＢＭＰのアンタゴニストとしては、ｎｏｇｇｉｎ等が知られている。ＢＭＰのアンタゴニストは、例えば、異所性骨形成又は石灰沈着を伴う骨代謝性疾患の症状を抑える医薬品（特許文献１）や、避妊薬（特許文献２）等に利用されている。さらに、ｎｏｇｇｉｎを用いて、ＥＳ細胞を特定の神経細胞に分化させたことが非特許文献３に記載されている。
【００１２】
非特許文献３に記載の方法を以下に詳しく説明する。まず、ＥＳ細胞を培養する際に、培地として、ＥＳ細胞を神経へと分化誘導するための培地であるＮ２Ｂ２７にｎｏｇｇｉｎを添加したものが用いられた。そして、ＥＳ細胞は、ポリＬリジンもしくはマトリゲルによってコートされた培養皿上にて培養された。その結果、ＧＡＢＡおよびＧＡＤ６５を発現するＧＡＢＡ神経が作製された。なお、上記培養においては、フィーダー細胞は用いられず、また、ＥＳ細胞は胚様体を形成していない。
【特許文献１】特開平８−１７６１９１（平成８年７月９日公開）
【特許文献２】特表２００１−５１７９２７（平成１３年１０月９日公開）
【非特許文献１】Berberi et al., Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice, nature biotechnology 2003, 21:1200-07
【非特許文献２】Salli et al., Serotonin neurons derived from rhesus monkey embryonic stem cells: similarities to CNS serotonin neurons, Experimental Neurology 2004, 188:351-364
【非特許文献３】Gerrard et al., Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Neural Lineages in Adherent Culture by Blocking Bone Morphogenetic Protein Signaling, Stem cells 2005, 23:1234-41
【非特許文献４】Galter et al., Differential regulation of distinct phenotypic features of serotonergic neurons by bone morphogenetic proteins, European Journal of Neuroscience 1999, 11:2444-2452
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
非特許文献１に記載の方法は、異種の、あるいは株化した細胞であるストローマ細胞とともにＥＳ細胞を培養するため、得られた神経を再生医療に用いる場合、異種細胞由来の病原体の感染や株化細胞の混入による腫瘍化のリスクが存在する。
【００１４】
非特許文献２に記載の方法における、胚様体を形成させ神経幹細胞を得る工程は、一般に制御することが難しく、結果が安定しない。また、非特許文献２では、用いた工程よりも、用いたＥＳ細胞が特殊なものであったことがセロトニン神経への分化に寄与したことが示唆されており、他のＥＳ細胞を用いた検討はなされていない。
【００１５】
非特許文献３に記載の方法は、病原体の感染のリスクがなく、胚葉体を形成させる工程がないため好ましいが、得られるのは主としてＧＡＢＡ神経である。
【００１６】
ＧＡＢＡ神経は、前脳を含む広範囲の脳に存在し、主に抑制性の介在神経であることが知られている。一方、セロトニン神経は、主に後脳縫線核群に存在する神経である。そのため、両神経の分化機構は全く異なると考えられる。
【００１７】
さらに、セロトニン神経が存在する後脳縫線核では骨形成タンパク質が発現している。さらに、マウス胎児の後脳縫線核から単離した細胞に対して、骨形成タンパク質を添加することによりセロトニン神経数が増加することを示唆する報告も知られている（非特許文献４）。以上より、セロトニン神経を作製するために、骨形成タンパク質のアンタゴニストを用いた神経の分化系を用いることは、当業者が容易に想到するものではなかった。
【００１８】
本発明の目的は、ＥＳ細胞から直接セロトニン神経を作製する方法であって、再生医療に適用する際の妨げとなる因子を排した方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、鋭意検討の結果、ＥＳ細胞の培養に骨形成タンパク質のアンタゴニストを添加した培地を用いること、及び、ＥＳ細胞の培養をゲル化させた細胞外マトリックス上で行うことによって、セロトニン神経を作製することができることを見出し、発明を完成させた。
【００２０】
すなわち、本発明に係る方法は、セロトニン神経を作製する方法であって、ゲル化させた細胞外マトリクスタンパク質上にてＥＳ細胞を培養する工程および該ＥＳ細胞に骨形成タンパク質のアンタゴニストを添加する工程を包含することを特徴としている。
【００２１】
上記方法は、細胞外マトリクスタンパク質をゲル化する工程をさらに包含することが好ましい。
【００２２】
上記方法では、上記細胞外マトリクスタンパク質が、ラミニン、コラーゲン、エンタクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ナイドジェン、フィブロネクチン、ゼラチン、ビトロネクチン、エラスチンおよびテネイシンからなる群より選択されるタンパク質の少なくとも１つであることが好ましい。
【００２３】
上記方法では、上記骨形成タンパク質のアンタゴニストが、ｎｏｇｇｉｎ、ｃｈｏｒｄｉｎ、ｃｈｏｒｄｉｎ−ｌｉｋｅ１、ｃｈｏｒｄｉｎ−ｌｉｋｅ２、ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、ｇｒｅｍｌｉｎ、ＤＡＮ、ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ及びｆｅｔｕｉｎからなる群より選択されることが好ましい。
【００２４】
上記方法では、上記細胞外マトリクスタンパク質をゲル化する工程が、該細胞外マトリクスタンパク質を加温するサブ工程を含むことが好ましい。
【００２５】
本発明に係るキットは、セロトニン神経を作製するためのキットであって、細胞外マトリクスタンパク質および骨形成タンパク質のアンタゴニストを備えていることを特徴としている。
【００２６】
上記キットは、ＥＳ細胞をさらに備えていることが好ましい。
【００２７】
上記キットでは、上記細胞外マトリクスタンパク質が、ラミニン、コラーゲン、エンタクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ナイドジェン、フィブロネクチン、ゼラチン、ビトロネクチン、エラスチンおよびテネイシンからなる群より選択されるタンパク質の少なくとも１つであることが好ましい。
【００２８】
上記キットでは、上記骨形成タンパク質のアンタゴニストが、ｎｏｇｇｉｎ、ｃｈｏｒｄｉｎ、ｃｈｏｒｄｉｎ−ｌｉｋｅ１、ｃｈｏｒｄｉｎ−ｌｉｋｅ２、ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、ｇｒｅｍｌｉｎ、ＤＡＮ、ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ及びｆｅｔｕｉｎからなる群より選択されることが好ましい。
【発明の効果】
【００２９】
本発明に係る方法を用いれば、再生医療に適用可能なセロトニン神経を作製することができる。また、本発明に係る方法を用いれば、セロトニン神経を、供給が容易であるＥＳ細胞から直接作製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
〔１：セロトニン神経を作製する方法〕
本発明は、一局面において、セロトニン神経を作製する方法を提供する。本発明に係るセロトニン神経の作製方法は、ゲル化させた細胞外マトリクスタンパク質上にてＥＳ細胞を培養する工程、および、該ＥＳ細胞に骨形成タンパク質のアンタゴニストを添加する工程を包含することを特徴としている。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「ＥＳ細胞」は、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）が意図される。胚性幹細胞とは、胚盤胞に存在する胚へと分化する細胞（内部細胞塊）を取り出し、培養したものである。ＥＳ細胞は、体を構成する全ての細胞に分化する能力があり、培養皿でほぼ無限に増殖させることが可能である。ＥＳ細胞は、ヒト、マウスを含む様々な哺乳類から樹立可能である（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．３６５：２００３及びＮａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．：Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００３を参照）。また、例えば、ヒトＥＳ細胞であれば、ＥＳＩ社のｈＥＳ１〜６や、京都大学再生医科学研究所付属幹細胞医学研究センターのＫｈＥシリーズ等が既に樹立されており、これらを入手することが可能である。ヒトＥＳ細胞を未分化状態で培養する方法としては、マウスの胎仔繊維芽細胞をフィーダー細胞として用い、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを添加する周知の方法などを用いることができるが、これに限られない。マウスＥＳ細胞であれば、ＥＳ−Ｅ１４ＴＧ２ａ、ＥＳ−Ｄ３、ＥＳ−Ｄ３ＧＬ、Ｈ１及びＲ１等の細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ等の細胞バンクから入手することができる。また、マウスＥＳ細胞は市販されているものを購入しても良い。マウスＥＳ細胞を未分化状態で培養する方法としては、マウスの胎仔繊維芽細胞をフィーダー細胞として用いる方法や、ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）を添加する周知の方法を用いることができるが、これに限られない。その他のＥＳ細胞を入手、未分化状態で培養する方法は当業者であれば容易に理解する。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「ゲル化」は、コロイド粒子が連なったり、高分子鎖が架橋したりして網目構造をつくり運動性を失った状態になることが意図される。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞外マトリクスタンパク質」は、細胞の外側の空間を構成するタンパク質が意図される。細胞外マトリクスタンパク質は、細胞接着作用を有し、正常な細胞の機能維持や自己増殖及び分化において重要な役割を果たすことが知られている。代表的な細胞外マトリクスタンパク質としては、ラミニン、コラーゲン、エンタクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ナイドジェン、フィブロネクチン、ゼラチン、ビトロネクチン、エラスチンおよびテネイシンが知られている。特に、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ラミニン、ナイドジェン、エンタクチンおよびフィブロネクチンは基底膜を構成する細胞外マトリクスタンパク質である。基底膜とは、上皮と結合組織との間に存在する細胞外の膜状構造であり、上皮や内皮細胞の結合組織側細胞に密着している他、末梢神経細胞、筋繊維、脂肪細胞などを取り囲んでいる。また、マトリゲル（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された基底膜成分である。主成分はラミニンであり、続いてコラーゲンＩＶ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、ナイドジェン等を成分としている。上記のタンパク質は高分子であり、ゲル化させることができることを当業者は理解する。
【００３４】
本発明に係る方法において用いられる場合、細胞外マトリクスタンパク質は、ラミニン、コラーゲン、エンタクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ナイドジェン、フィブロネクチン、ゼラチン、ビトロネクチン、エラスチンおよびテネイシンからなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質であることが好ましく、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ラミニン、ナイドジェン、エンタクチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質であることがより好ましいが、これに限られない。細胞接着作用を有し、ゲル化させることできるタンパク質であればよい。ゲル化された細胞外マトリクスタンパク質にＥＳ細胞が接着することにより、該細胞外マトリクスタンパク質がＥＳ細胞の分化に適切な微小環境を提供するものと考えられる。
【００３５】
また、本発明に係る方法において用いられる場合、細胞外マトリクスタンパク質は、ゲル化された状態で提供されていても、ゲル化されていない状態で提供されていても良い。ゲル化されていない状態で提供される場合、本発明に係る方法は、細胞外マトリクスタンパク質をゲル化する工程をさらに包含することが好ましい。
【００３６】
細胞外マトリクスタンパク質をゲル化させる工程は、該タンパク質をほどく、又は、変性させることによって行うことができる。殆どの場合、加温することにより行うことができるが、機械的な攪拌やタンパク質溶液のｐＨまたはイオン強度を変化させることによっても可能である。例えば、コラーゲンゲルの場合、食塩濃度０．１４Ｍ、ｐＨ７．４の条件で３７℃に加温することによりゲル化させることができる。マトリゲル（登録商標）の場合、希釈倍率を３倍以下とし、１０分間３５℃に加温することによりゲル化させることができる。当業者であれば、その他のタンパク質のゲル化条件についても容易に理解する。
【００３７】
一実施形態において、上記ゲル化させた細胞外マトリクスタンパク質上にてＥＳ細胞を培養する工程は、ゲル化させた細胞外マトリクスタンパク質上に、培地に懸濁したＥＳ細胞を播種した後、インキュベートすることにより行うことができる。
【００３８】
上記培地は、市販されている培地を用いることができる。例えば、ＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ａｌｐｈａ−ＭＥＭ、ＢＭＥ、ＥＳ  ｍｅｄｉｕｍ又はＲＰＭＩ１６４０等を用いることができるが、これらに限られない。動物細胞を培養するために用いることができる培地であれば良い。
【００３９】
本実施形態において、ＥＳ細胞は、例えば、１．０×１０３の密度で播種し、ＣＯ２の濃度５％、３７℃にて１２〜１４日間培養することもできるが、これに限られない。ＥＳ細胞を播種する密度、培養する条件、培養日数は、当業者であれば適宜選択することができる。
【００４０】
一実施形態において、上記該ＥＳ細胞に骨形成タンパク質のアンタゴニストを添加する工程は、該ＥＳ細胞を培養する培地にｎｏｇｇｉｎを添加することによって行うことができるが、これに限られない。また、培地にｎｏｇｇｉｎを添加するのは、ゲル化させた細胞外マトリクスタンパク質上にてＥＳ細胞を培養する工程を開始してから少なくとも５日以内に開始することが好ましく、該培養工程の開始と共に添加することがより好ましい。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「骨形成タンパク質」は、Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎファミリーに属するタンパク質が意図され、「骨形成タンパク質のアンタゴニスト」は、骨形成タンパク質の働きを阻害する物質が意図される。
【００４２】
本発明に係る方法では、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のアンタゴニストとして、例えば、ｎｏｇｇｉｎ、ｃｈｏｒｄｉｎ、ｃｈｏｒｄｉｎ−ｌｉｋｅ１、ｃｈｏｒｄｉｎ−ｌｉｋｅ２、ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、ｇｒｅｍｌｉｎ、ＤＡＮ、ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ又はｆｅｔｕｉｎを用いることができる。ｎｏｇｇｉｎは、２３２アミノ酸残基からなる分泌タンパク質であり、細胞外でＢＭＰ二量体に結合し、受容体との結合領域を覆い隠すことでＢＭＰ活性を阻害する。Ｃｈｏｒｄｉｎは、９５５アミノ酸残基からなる分泌タンパク質であり、システィン残基に富む領域（ＣＲドメイン）を有し、ＣＲドメインを介してＢＭＰと結合することによりＢＭＰ活性を阻害する。Ｃｈｏｒｄｉｎ−ｌｉｋｅ１（ｖｅｎｔｒｏｐｔｉｎ）及び、Ｃｈｏｒｄｉｎ−ｌｉｋｅ２は、Ｃｈｏｒｄｉｎと非常に高い相同性を有し、ＣＲドメインを備えている。ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎは、２１３アミノ酸残基からなるタンパク質であり、システイン・ノットと呼ばれる特徴的な構造を有している。ｇｒｅｍｌｉｎ、ＤＡＮおよびｃｅｒｂｅｒｕｓは、ｃｅｒｂｅｒｕｓ／ＤＡＮ関連分子群に属する分泌タンパク質であり、システイン・ノットを有している。ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎは、３１７あるいは３４４アミノ酸残基のたんぱく質であり、受容体に結合することでＢＭＰの作用を阻害する。ｆｅｔｕｉｎは３６７アミノ酸からなる糖タンパク質で、ＢＭＰに結合して活性を阻害する。以上のように、本発明に係る方法で用いる骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のアンタゴニストは、ＢＭＰの活性を阻害するものであれば良い。上述したようにＢＭＰは、幹細胞の分化に大きく影響しており、これを阻害することにより、本発明の効果が得られると考えられる。
【００４３】
上述した骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のアンタゴニストは、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃから購入することができる。また、以下に示すアクセッション番号（ＧｅｎＢａｎｋ）を参照すれば、所望のタンパク質のアミノ酸配列および塩基配列を容易に入手することができるので、当業者は周知の組換えタンパク質技術を用いて該アンタゴニストを容易に作製することができる：ｎｏｇｇｉｎ（例えば、Ｎｐ＿０３２７３７（ヒト）、ＡＡＨ３４０２７（マウス））；ｃｈｏｒｄｉｎ（例えば、Ｎｐ＿０３４０２３（ヒト）、Ｎｐ＿００３７３２（マウス））；ｃｈｏｒｄｉｎ−ｌｉｋｅ１（例えば、Ｎｐ＿６６０２７５（ヒト）、Ｎｐ＿１１２５４８（マウス））；ｃｈｏｒｄｉｎ−ｌｉｋｅ２（例えば、Ｎｐ＿０５６２３９（ヒト）、Ｎｐ＿５９８４７０（マウス））；ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ（例えば、ＡＡＫ１３４５４（ヒト）、ＡＡＫ１３４５５（マウス））；ｇｒｅｍｌｉｎ（例えば、ＡＡＣ３９７２５（ヒト）、ＡＡＣ４０１１１（マウス））；ＤＡＮ（例えば、ＢＡＡ９２２６５（ヒト）、ＢＡＡ０８８１７（マウス））；ｃｅｒｂｅｒｕｓ（例えば、ＮＰ＿００５４４５（ヒト）、ＡＡＣ０２４３０（マウス））；ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ（例えば、ＡＨ０４１０７（ヒト）、Ｎｐ＿０３２０７２（マウス））；又はｆｅｔｕｉｎ（例えば、Ｎｐ＿００１６１３（ヒト）、Ｎｐ＿０３８４９３（マウス））など。
【００４４】
一つの局面において、本発明に係る方法は、セロトニン神経が作製されたか否かを検証する工程をさらに包含する。
【００４５】
上記セロトニン神経が作製されたか否かを検証する工程では、（１）セロトニン量を計測すること又は（２）セロトニン神経のマーカーを免疫染色することの少なくともいずれか一方を行ってもよいが、これに限られない。セロトニン神経が存在することを検証できればよい。
【００４６】
セロトニン量の計測は、これに限るものではないが、既存の生体アミン量の測定方法（Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １９８９，１７０：７５−８２）を用いて行うことができる。すなわち、培養したＥＳ細胞に対し、高濃度（例えば５６ｍＭ）のＫ＋を含む溶液を加えてインキュベートし、該溶液をＨＰＬＣ／ＥＣＤ等により測定することで行うことができる。Ｋ＋を含む溶液としてはＨａｎｋｓ液等の緩衝塩類溶液を用いることができるが、これに限られない。
【００４７】
また、セロトニン神経のマーカーとしては、セロトニンまたはセロトニン合成酵素を用いることができるがこれに限られない。セロトニン神経に特異的に発現している公知のマーカーを用いればよい。
【００４８】
セロトニン及びセロトニン合成酵素に対する抗体を用いて免疫染色する場合、セロトニン及びセロトニン合成酵素は細胞表面には発現していないため、染色すべき細胞を周知の方法により固定化した後、界面活性剤等により細胞膜の透過性を増大させることにより抗体分子を細胞内に到達できるようにすることが好ましい。
【００４９】
なお、セロトニン神経の細胞表面に発現している適切なマーカーが存在しないため、例えばＦＡＣＳを用いて濃縮する場合、セロトニン神経特異的にＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）等を発現するように予め形質転換する方法等を用いる必要がある。ただし、本発明に係る方法を用いて作製したセロトニン神経標品を用いれば、適当な細胞表面マーカーを見出すことができる可能性がある。
【００５０】
前述したように、うつ病、双極性障害、統合失調症、不安症、強迫神経症等の精神疾患において、セロトニン神経の機能が低下または変化することが知られている。上記精神疾患に対する治療法として、セロトニン神経を患者に移植することが検討されている。また、セロトニン神経の活動低下は、攻撃性や衝動性が増す要因の一つである。このような疾患に対する治療法として、上記のようにセロトニン神経を移植する再生医療的なアプローチを取ることも考えられる。
【００５１】
本発明に係る方法を用いれば、上記のような移植に用いるセロトニン神経を得ることができる。また、本発明に係る方法は、非特許文献１に記載の方法とは異なり、フィーダー細胞を用いない。そのため、異種の、あるいは株化した細胞であるフィーダー細胞が移植に用いる神経に混入する虞がなく、異種細胞由来の病原体の感染や株化細胞の混入による腫瘍化のリスクを避けることができる。
【００５２】
さらに、本発明に係る方法を用いれば、ＥＳ細胞からセロトニン神経を作製することができるので、セロトニン神経の分化を研究することができる。すなわち、分化に影響を及ぼす因子や、培養中の各種マーカーの発現状態などを調査することができる。
【００５３】
〔２：セロトニン神経を作製するためのキット〕
本発明は、他の局面において、セロトニン神経を作製するために用いるキットを提供する。本発明に係るキットは、本発明に係るセロトニン神経を作製する方法を行うことができる試薬、器具、装置等が含まれていればよく、特に限定されるものではないが、細胞外マトリクスタンパク質及び骨形成タンパク質のアンタゴニストを備えていることが好ましい。また、さらにＥＳ細胞を備えていてもよい。本発明に係るキットを用いて、本発明に係る方法を実施することにより、セロトニン神経を作製することができる。
【００５４】
本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは該材料を使用するための指示書を備える。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明に係るキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得、ここで、組成物の形態は上述したような形態であり得、溶液形態の場合は容器中に内包されていてもよい。本発明に係るキットは、物質Ａおよび物質Ｂを同一の容器に混合して備えても別々の容器に備えてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明に係るキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、本発明に係るキットは、ＥＳ細胞を培養するために必要な器具をあわせて備えてもよい。
【００５５】
本実施形態において、タンパク質および化合物は乾燥状態で提供されても、溶液状態で提供されてもよい。
【００５６】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００５７】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００５８】
〔実施例１〕
組織培養用２４ウェル培養皿の表面に、マトリゲル（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を２０μｌ／ｃｍ２分注し、室温にて静置した。これにより、ゲル化させた細胞外マトリクスタンパク質からなる層を培養皿上に形成した。
【００５９】
ＥＳ細胞を培養する培地としては、１０％  ｋｎｏｃｋ  ｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ及びＥＳＭ（０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）と１ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｖａｔｅと０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールとを含むＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ））を用いた。上記培地にＥＳ細胞（Ｅ１４ＴＧ２ａ  ＥＢ５細胞）を懸濁し、上記培養皿上に１ウェル当たり２×１０３ｃｅｌｌｓとなるように播種した。
【００６０】
次に、上記ＥＳ細胞を５％  ＣＯ２／９５％  ａｉｒ、３７℃のインキュベーター内で１２日間培養した。培養４日目及びその後１日おきに培地交換を行った。さらに、培養中のコロニーの形状を観察した（図１）。
【００６１】
図１に示すように、４日目（図１（ａ））では、伸展した突起は観察されなかったが、８日目（図１（ｂ））、１２日目（図１（ｃ））において、伸展した突起が観察された。突起を有するコロニーの割合は培養日数の経過に伴い増加し、１２日目には約８０％に達した（図２）。
【００６２】
突起伸展したコロニーが確かに神経細胞であることを確かめるために、該コロニーに対して、神経細胞マーカーであるＮｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  β−Ｔｕｂｕｌｉｎの抗体（ＴｕＪ１、Ｂａｂｃｏ社）を用いて免疫染色を行った（図３）。
【００６３】
図３（ａ）は、突起伸展したＥＳ細胞のＤＮＡをｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を用いて染色した結果を示す写真である。図３（ｂ）は、上記ＥＳ細胞をＴｕＪ１により免疫染色した結果を示す写真である。図３（ｃ）は、ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を用いた染色結果と、ＴｕＪ１を用いた染色結果の両方を重ねて示す写真である。図３に示すように、ＤＮＡの染色結果に示される細胞の位置において、Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  β−Ｔｕｂｕｌｉｎが発現しており、上記ＥＳ細胞が神経細胞へと分化したことが確かめられた。
【００６４】
〔実施例２〕
マトリゲルの用法として、ゲル化させて用いる用法と、培養皿をコートするために用いる用法とがある。マトリゲルは冷却された溶液の状態にて提供される。これを希釈せずに、又は、希釈倍率３倍以下で希釈し、培養皿上に分注し、室温に加温することにより、ゲル化されたマトリゲルを得ることができる。一方、溶液状態のマトリゲルを、３倍を超える倍率で希釈すると、室温に加温してもゲル化しない。培養皿をマトリゲル希釈液によりコートする場合は、通常、２０〜２００倍にマトリゲルを希釈した後、培養皿を覆い、余分な溶液をアスピレートする。なお、通常、ゲル化させたマトリゲルは、血管新生あるいは肝細胞の培養に用いられる。一方、マトリゲル希釈液によりコートされた培養皿は、例えば、ＥＳ細胞を未分化状態で培養するために用いられることが知られている。
【００６５】
ここで、実施例１において、マトリゲルをゲル化させたことの影響を調べるために、マトリゲル希釈液でコートした培養皿上にてＥＳ細胞を培養し、ゲル化させたマトリゲル上にてＥＳ細胞を培養した場合と比較を行った。
【００６６】
まず、実施例で用いたものと同じマトリゲルを２０〜２００倍に希釈した。希釈したマトリゲルの溶液を用いて培養用皿を覆った後、余分な溶液をアスピレートした。これにより、５０μｇ／ｃｍ２及び５μｇ／ｃｍ２のマトリゲル希釈液でコートされた培養皿をそれぞれ調製した。
【００６７】
上記マトリゲル希釈液でコートした２種類の培養皿及び実施例１で用いた培養皿上でゲル化させたマトリゲルのそれぞれの上に、実施例１と同様にＥＳ細胞を播種し、培養した。
【００６８】
図４（ａ）は、ゲル化させたマトリゲル上においてＥＳ細胞を培養した結果を示す写真である。図４（ａ）に示すように、コロニーは突起を伸展しており、ＴｕＪ１を用いた免疫染色の結果（図４（ｄ））に示すように、神経細胞マーカーを発現していた。
【００６９】
一方、図４（ｂ）は、５０μｇ／ｃｍ２のマトリゲル希釈液でコートされた培養皿上にてＥＳ細胞を培養した結果を示す写真であり、図４（ｃ）は、５μｇ／ｃｍ２のマトリゲル希釈液でコートされた培養皿上にてＥＳ細胞を培養した結果を示す写真である。図４（ｂ）（ｃ）に示すように、マトリゲル希釈液でコートした培養皿上でＥＳ細胞を培養した場合、細胞の生着が悪く、突起伸展は全く観察されなかった。これにより、マトリゲルがゲル状態で存在し、細胞に三次元構造の足場を提供することがＥＳ細胞の分化に適切な微小環境を提供していることが示唆された。
【００７０】
〔実施例３〕
実施例１に記載の方法でゲル化させた細胞外マトリクスタンパク質からなる層を培養皿上に形成した。次に、実施例１と同様に、ＥＳ細胞を上記細胞外マトリクスタンパク質上に播種した。
【００７１】
このとき、上記培地に、骨形成タンパク質のアンタゴニストであるｎｏｇｇｉｎ（ｍｏｕｓｅ  ｎｏｇｇｉｎ／Ｆｃ  ｃｈｉｍｅｒａ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を２００ｎｇ／ｍｌ添加した。
【００７２】
その後、実施例１と同様の条件によりＥＳ細胞を培養し、コロニーを観察した。その結果、突起伸展したコロニーの割合が、実施例１に比べて有意（Ｐ＜０．０５）に増加した（図５）。有意差の検出は、ＡＮＯＶＡ検定及びＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定を用いた。
【００７３】
この結果について本発明者らは、独自の知見により、ｎｏｇｇｉｎを添加することによって、神経へと分化するＥＳ細胞が単に増加したのではなく、ｎｏｇｇｉｎを添加しなかったときには起こらなかった、特定の神経系への分化が促進された可能性があると判断した。
【００７４】
さらに、本発明者らは、独自の知見により、新たに分化した細胞がセロトニン神経であると考え、以下の実験を行った。
【００７５】
まず、培養したＥＳ細胞が含有するセロトニンの量を測定した。セロトニン量の測定は、既存の生体アミン量の測定方法（Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １９８９，１７０：７５−８２）を用いて実施した。
【００７６】
具体的には、まず、ｎｏｇｇｉｎを添加して培養したＥＳ細胞と、コントロールとして、ｎｏｇｇｉｎを添加せずに培養したＥＳ細胞を用意した。１４日間培養したそれぞれのＥＳ細胞を、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）により２度洗浄した。さらに、高濃度（５６ｍＭ）Ｋ＋を含むＨＢＳＳを加え、３７℃で１５分間インキュベートした。続いて、培地を回収した。回収した培地を、０．２２μｍのフィルターによりろ過した後、ＨＰＬＣ／ＥＣＤ（ＥＣＤ−３００、エイコム社）を用いて分析した。以上により、放出されたセロトニンの量を測定した（図６）。
【００７７】
図６に示すように、ｎｏｇｇｉｎを添加して培養したＥＳ細胞は、添加せずに培養したＥＳ細胞に比べ、放出されたセロトニン量が大幅（Ｐ＜０．０１）に増加していた。有意差の検出には、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ検定及びＤｕｎｎｅｔ検定を用いた。
【００７８】
さらに検証を進めるため、ｎｏｇｇｉｎを添加して培養したＥＳ細胞に対し、セロトニンに対する抗体（ＤｉａＳｏｒｉｎ社）を用いて免疫染色を行った（図７）。
【００７９】
図７（ａ）は、神経細胞マーカーであるＮｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  β−Ｔｕｂｕｌｉｎに対する抗体（ＴｕＪ１）を用いて免疫染色した結果を示す写真であり、図７（ｂ）は、セロトニンに対する抗体を用いて免疫染色した結果を示す写真であり、図７（ｃ）は、Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  β−Ｔｕｂｕｌｉｎに対する抗体を用いて免疫染色した結果及びセロトニンに対する抗体を用いて免疫染色した結果の両方を同時に示す写真である。図７（ｃ）に示すように、神経細胞マーカーを発現している神経細胞において、セロトニンを発現している神経が観察された。Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  β−Ｔｕｂｕｌｉｎを発現している神経細胞の数及びセロトニンを発現している神経細胞の数を計測した結果を表１に示す。
【００８０】
【表１】
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【００８１】
表１に示すように、全神経細胞に対する割合は約１４％であった。以上の結果に示すように、骨形成タンパク質のアンタゴニストを添加してゲル化させた細胞外マトリクスタンパク質上にてＥＳ細胞を培養することにより、セロトニン神経を作製できた。
【００８２】
〔実施例４〕
ｎｏｇｇｉｎの添加量および添加時期がセロトニン神経への分化にどのように影響するのかについて調べた。
【００８３】
実施例３と同様にＥＳ細胞を培養し、高濃度（５６ｍＭ）Ｋ＋を加えた際に放出されたセロトニン量を測定した。但し、培地に対するｎｏｇｇｉｎの添加濃度を（１）０ｎｇ／ｍｌ（２）１ｎｇ／ｍｌ（３）２００ｎｇ／ｍｌの３通りとした。図８に結果を示す。
【００８４】
図８に示すように、放出されたセロトニン量は、（３）が最も多く、（１）が最も少なかった。つまり、添加するｎｏｇｇｉｎの濃度が高くなるに従い、放出されたセロトニン量も増加した。
【００８５】
次に、実施例３に記載のＥＳ細胞の培養方法において、ｎｏｇｇｉｎを含む培地で培養する期間を（１）培養開始後０日目から１４日目まで（２）培養開始後０日目から５日目まで（３）培養開始後５日目から１４日目までとして培養を行い、高濃度（５６ｍＭ）Ｋ＋を加えた際に放出されたセロトニン量を測定した。図９に結果を示す。
【００８６】
図９に示すように、放出されたセロトニン量は、（２）が最も多く、（１）もほぼ同程度であり、（３）は、前２者に比べ大きく減少していた。以上の結果より、ｎｏｇｇｉｎの作用は、培養の初期段階において重要であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明に係る方法を用いれば、セロトニン神経を作製することができるので、再生医療の分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ゲル化させた細胞外マトリクスタンパク質上で培養中のＥＳ細胞の状態を示す写真である。
【図２】培養日数と突起伸展の見られたコロニーの割合との関係を示すグラフである。
【図３】（ａ）は、分化させた細胞のＤＮＡを染色した結果を示す写真であり、（ｂ）は、分化させた細胞を神経細胞マーカーにより免疫染色した結果を示す写真であり、（ｃ）は、分化した細胞を神経細胞マーカーにより免疫染色すると共に、ＤＮＡを染色した結果を示す写真である。
【図４】（ａ）は、ゲル化させた細胞外マトリクスタンパク質上で培養したＥＳ細胞を示す写真であり、（ｂ）は、細胞外マトリクスタンパク質（５０μｇ／ｃｍ２のマトリゲル希釈液）でコートした培養皿上で培養したＥＳ細胞を示す写真であり、（ｃ）は、細胞外マトリクスタンパク質（５μｇ／ｃｍ２のマトリゲル希釈液）でコートした培養皿上で培養したＥＳ細胞を示す写真であり、（ｄ）は、ゲル化した細胞外マトリクスタンパク質上で培養したＥＳ細胞を神経マーカーに対する抗体により染色した結果を示す写真である。
【図５】ｎｏｇｇｉｎを添加してＥＳ細胞を培養した結果を示すグラフである。
【図６】本発明に係る方法により得た細胞のセロトニン含有量を示すグラフである。
【図７】本発明に係る方法により得た細胞を、セロトニン神経のマーカーにより染色した結果を示す写真である。
【図８】ｎｏｇｇｉｎの添加量を変化させたときの得られた細胞のセロトニン含有量を示すグラフである。
【図９】ｎｏｇｇｉｎを添加する時期を変化させたときの得られた細胞のセロトニン含有量を示すグラフである。
【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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