(57)【要約】      （修正有）【課題】酵素内にメディエータを導入する際に、その導入位置を活性サイトの近傍になるように制御する。【解決手段】酵素１０００内の活性サイト１０３０、あるいはその近傍の制御された位置に金属錯体１０２０と配位結合するアミノ酸１０４０を導入する。酵素電極の製造方法は、金属錯体１０２０が固定化されている導電性部材１０１０を用意し、酵素をコードする遺伝子を遺伝子工学的に組替えて、該酵素内の活性サイト１０３０、あるいはその近傍の制御された位置にアミノ酸１０４０を設け、該アミノ酸１０４０と該金属錯体１０２０とを配位結合させる。【選択図】図１
2008076388.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素電極であって、
酵素と、
該酵素が固定化されている導電性部材と、
該導電性部材に電気的に接続している金属錯体と、
該酵素内の活性サイト、あるいはその近傍の制御された位置にあり、且つ該金属錯体と配位結合するアミノ酸と
を有することを特徴とする酵素電極。
【請求項２】
遺伝子工学的に前記酵素をコードする遺伝子を組替えて、該酵素内の活性サイト、あるいはその近傍に、前記アミノ酸が人為的に導入されていることを特徴とする請求項１記載の酵素電極。
【請求項３】
前記アミノ酸がヒスチジンであることを特徴とする請求項１記載の酵素電極。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の酵素電極と、前記導電性部材に電圧あるいは電位を印加するための手段を有することを特徴とする酵素センサ。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の酵素電極と、対向電極と、該酵素電極と対向電極との間に配置される電解質と、を有することを特徴とする燃料電池。
【請求項６】
酵素電極の製造方法であって、
金属錯体が固定化されている導電性部材を用意し、
酵素をコードする遺伝子を遺伝子工学的に組替えて、該酵素内の活性サイト、あるいはその近傍の制御された位置にアミノ酸を設け、
該アミノ酸と該金属錯体とを配位結合させること
を特徴とする酵素電極の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素電極とその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸化還元酵素は、基質と反応する際に、基質と補因子との間で電荷の授受を行うので、この電荷を導電性部材に取り出すことができれば、酵素の特徴を生かしたセンサ、燃料電池を実現することができる。
【０００３】
ところで、酸化還元酵素の酸化還元中心は、３次元構造からなる蛋白質内部の奥深いところに存在することが多い（なお、酸化還元中心は、活性部位、あるいは活性サイトとも呼ばれる。）。そのため、当該活性サイトと導電性部材との間の電子の授受を効率的に検出することは、一般的には困難である。
【０００４】
そこで、酵素と導電性部材との間をメディエータと呼ばれる物質によって電気的に繋ぐ手法が開発されている。メディエータは、酵素を構成するタンパク質の内部に入りこむことができるので、前記活性サイトに近い距離に位置する場合には、酸化還元反応の際に生じた電荷を、メディエータを介して導電性部材にまで取り出すことができる。つまり、酵素反応により生じた電荷は、活性サイトと電子の授受を行ったメディエータの拡散、あるいはメディエータ間の電子ホッピングにより、導電性部材にて検出されることになる。
【０００５】
特許文献１には、メディエータとして機能するフェロセンを、共有結合により酵素本体や酵素の側鎖に導入する技術が示されている。
【特許文献１】特開平８−２７１４７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、同文献に記載の技術によって酵素に導入されているメディエータは、その導入位置が制御されておらず、酵素内のランダムな位置に導入されている。
【０００７】
このようなメディエータの導入は、たまたま活性サイトの近傍にフェロセンが位置している場合を除き、活性サイトからの効率的な電荷の授受は望めない。特に、酵素センサとして使用する場合のように、被測定物質である基質の濃度を厳密にセンシングする必要があるため、更なる改良が求められている。
【０００８】
そこで、本発明は、酵素内にメディエータを導入する際に、その導入位置を活性サイトの近傍に制御することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の本発明に係る酵素電極は、
酵素と、
該酵素が固定化されている導電性部材と、
該導電性部材に電気的に接続している金属錯体と、
該酵素内の活性サイト、あるいはその近傍の制御された位置にあり、且つ該金属錯体と配位結合するアミノ酸と
を有することを特徴とする。
【００１０】
また、第２の本発明に係る酵素電極の製造方法は、
金属錯体が固定化されている導電性部材を用意し、
酵素をコードする遺伝子を遺伝子工学的に組替えて、該酵素内の活性サイト、あるいはその近傍の制御された位置にアミノ酸を設け、
該アミノ酸と該金属錯体とを配位結合させること
を特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
第１の本発明によれば、従来は、酵素内のランダムな位置にしか導入できなかったメディエータの導入位置を、実質的に制御できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（第１の実施形態：酵素電極）
本発明に係る酵素電極の概念図を図１に示す。
【００１３】
同図において、１０００は酵素、１０１０は該酵素が固定化されている導電性部材、１０２０は該導電性部材と電気的に接続している金属錯体、１０３０は酵素内の活性サイトである。そして、１０４０は酵素内の活性サイトあるいはその近傍に配置されているアミノ酸を示している。１００５は、酵素を構成する一部改変されたタンパク質を示している。
【００１４】
本実施形態に係る発明においては、酵素内の活性サイト、あるいはその近傍に、メディエータとして機能する金属錯体と結合するアミノ酸を予め設けておく。当該アミノ酸と当該金属錯体とは化学結合するので、結果として、活性サイトに対するメディエータの位置の制御が実現することになる。
【００１５】
１）アミノ酸、及び酵素について
まず、酵素内の活性サイトあるいはその近傍に配置されているアミノ酸について説明する。
【００１６】
アミノ酸のこのような配置は、例えば遺伝子組換菌を用いる該酵素の発現系において、遺伝子工学的手法を用いた該酵素の組替遺伝子への部位特異的な変異の導入により実現される。
【００１７】
ここで、「活性サイトの近傍」とは、酸化還元酵素において酸化若しくは還元を受ける酵素の基質若しくは酵素の補欠分子族、補因子を構成し、酸化還元を担う原子からの距離が、１．６ｎｍ以内、好ましくは１．２９ｎｍ以内に位置する原子という意味である。なお、活性サイトの位置は、Ｘ線結晶解析、もしくは、核磁気共鳴スペクトルにより定まるものである。例えば、酵素がグルコースオキシダーゼの場合は、フラビンアデニンジヌクレオチドが活性サイトであり、西洋ワサビペルオキシダーゼの場合は、ヘム、ラッカーゼであれば、銅原子が活性サイトである。また、この酸化還元を担う原子とは、活性サイトの中でも特に酸化還元を担う原子のことであり、例としては、フラビンアデニンジヌクレオチドであればフラビン環の１位、１０位の窒素原子、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドであれば、ニコチンアミドの４位の炭素、ピロロキノリンキノンであれば、４位、５位の酸素原子、ヘムであれば鉄原子を指す。また、１．６ｎｍ、１．２９ｎｍの距離の意味は、たんぱく質の活性中心から１．６ｎｍを超えると、急激に電子移動速度が低下するという報告  （Ｑｉｊｉｎ  Ｃｈｉ他  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２００５  年、１０２巻、１６２０３頁）、１．２９ｎｍという電子移動距離が生理的な二つの酸化還元中心間の距離として決定されたもののなかで最も長い距離の一つであるという報告（Ａｒｔｈｕｒ  Ｏｕｂｒｉｅ  他  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００２年、２７７巻、３７２７頁）に基づく。
【００１８】
アミノ酸としては、例えばヒスチジンが挙げられる。
【００１９】
酵素として、西洋ワサビペルオキシダーゼを用い、当該西洋ワサビペルオキシダーゼの活性サイトであるヘムの近傍に、ヒスチジンを設けた例を実施例１において詳述している。
【００２０】
また酵素として、グルコースオキシダーゼを用い、当該グルコースオキシダーゼの活性サイトであるフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の近傍に、ヒスチジンを設けた例を実施例２において詳述している。
【００２１】
本実施形態においては、酵素としては、上記西洋ワサビペルオキシダーゼやグルコースオキシダーゼの他に、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、チオレドキシンレダクターゼを含む他の酸化還元酵素全般が適用される。
【００２２】
酵素内の活性サイト近傍等に配置するアミノ酸としては、金属錯体と配位結合するものであれば特に制限されないが、例えば、ヒスチジンやシステイン、あるいは、金属中心への配位能を持つ非天然のアミノ酸などが挙げられる。
【００２３】
なお、本実施形態における活性サイトは、酵素内で電荷の授受が行われる部位を意味し、例としては、酸化還元中心、あるいは、その酸化還元中心から電荷を受け取る部位が挙げられる。
【００２４】
酸化還元中心としては、以下の２つの概念が包含される。
【００２５】
グルコースオキシダーゼのＦＡＤのように酵素に保持されているものと、グルコースでヒドロゲナーゼのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）のように基本的に酵素内に保持されているのではないものである。
【００２６】
また、人為的にアミノ酸が導入される位置は、活性サイトと、酵素を構成するタンパク質により間接的に接触する位置でもよいし、活性サイトに対して、近傍に位置するのであれば、所定の空間を隔てた位置であってもよい。また、必要であれば活性サイトの近傍に配置されたアミノ酸と結合する金属錯体から、電極へ電荷を輸送するための中継となる金属錯体と結合するアミノ酸をさらに酵素内に導入しても良い。
【００２７】
２）金属錯体
本実施形態に適用される金属錯体としては、以下のものが挙げられる。
【００２８】
例えば、金属中心として、鉄、コバルト、ルテニウム、オスミウム、クロム、配位子として、ビピリジン、ターピリジン、イミダゾールの複素環式化合物、シクロペンタジエニル、およびこれらの誘導体などである。この金属錯体は、導電性部材との間で高速の電荷の授受を行うものが望ましい。このために、例えば、π共役分子を配位子とした金属錯体を用いても良い。この金属錯体の中心金属は、１つでも良いし、複数でも良い。複数の場合は、同一の元素であっても良いし、複数種類の元素を含んでも良い。複数種類の元素を含む場合には、それぞれの金属中心の電位関係を考慮し、望ましい方向へ電子が輸送されるように配置することが重要である。
【００２９】
なお、金属錯体は、脱離基を有することにより、ヒスチジン等のアミノ酸と配位結合することが可能である。この脱離基の例としては、ハロゲン、四フッ化ホウ素、六フッ化リンが挙げられる。
【００３０】
金属錯体が導電性部材に結合している場合には、この金属錯体の分子長を変化させることで酵素と導電性部材との間の距離を制御することができる。これにより、以下の二因子のバランスをとることができる。（ａ）分子長を短縮すると、酵素の活性サイトから導電性部材への電荷輸送の高速化を行うことができる。（ｂ）分子長を増大させると導電性部材との相互作用により酵素の活性が低下することを防ぐことができる。分子長を変化させる方法の具体例としては、配位子の分子設計を行う方法、多核錯体の段階を増大させることが挙げられる。
【００３１】
３）導電性部材
導電性部材は、例えば、金、白金などの金属電極やカーボン電極、インジウムスズ酸化物電極などを適用できる。
【００３２】
なお、前記金属錯体と導電性部材とは、電気的に接続されていればよく、例えば、両者間に何らかの物質を介在させて、互いに電気的に接続していても、直接接続していてもよい。また、必要に応じて、物理的、化学的に結合していても良い。
【００３３】
また、導電性部材への酵素の固定化も、直接酵素が導電性部材に接触していてもよいし、金属錯体を介して固定化されていても良いし、ポリマーや、反応性の官能基を持つ架橋剤などにより、実質的に固定化を実現してもよい。
【００３４】
（第２の実施形態：酵素電極の製造方法）
次に、本実施形態に係る酵素電極の製造方法について、図２を用いて説明する。
【００３５】
まず、金属錯体が固定化されている導電性部材を用意する（Ｓ１）。
【００３６】
この工程Ｓ１では、例えば以下のようにして、前記導電性部材が用意される。
【００３７】
まず、導電性部材を、導電性物質をそのまま使用する方法や、ガラスや、ポリマーといった絶縁性物質上に導電性層を形成する手法を用いて調製する。この導電性層の形成手法の例としては、蒸着、スパッタリング、印刷などが挙げられる。
【００３８】
次に、導電性部材に金属錯体を固定する。この例として、以下の２手法を挙げる。１．配位子の官能基として、導電性部材あるいは導電性部材の表面に固定された物質に結合しうる基を持った金属錯体の溶液と、導電性部材を接触させる方法。２．導電性部材あるいは導電性部材の表面に固定された物質に結合しうる官能基を持った配位子の溶液と導電性部材を接触させ、固定化させる。その後に、脱離基をもった金属錯体の中心金属を含む化合物の溶液と導電性部材を接触させ固定化させる方法。
【００３９】
次に、酵素をコードする遺伝子を遺伝子工学的に組替えて、該酵素内の活性サイト、あるいはその近傍の制御された位置にアミノ酸を設ける（Ｓ２）。
【００４０】
より具体的には、該酵素をコードする遺伝子における、活性サイト近傍のアミノ酸に対して、目的のアミノ酸をコードするコドンに置換、若しくは目的のアミノ酸をコードするコドンを挿入する。例えば、制御された位置にヒスチジンを設けるには、ヒスチジンをコードするコドンであるＣＡＴ若しくはＣＡＣを、酵素内の活性サイト近傍のアミノ酸をコードするコドンに置換するか、挿入する。このように人為的に位置を制御して、アミノ酸を配置することで、最終的には、金属錯体を活性サイト近傍に配置できることになる。
【００４１】
なお、酵素内に位置を制御してアミノ酸を人為的に導入するということに関しては、上記実施形態１で説明した技術的事項が、本実施形態においても適用される。
【００４２】
次に、該アミノ酸と該金属錯体とを配位結合させる（Ｓ３）。
【００４３】
具体的には、例えば、該酵素の溶液を脱離基を有する金属錯体を固定した導電性部材に接触させることで行う。
【００４４】
こうして、酵素電極が得られる。
【００４５】
（第３の実施形態：センサ）
前述の第１の実施形態で説明した酵素電極を用いて構成されるセンサについて、図３を用いて説明する。
【００４６】
同図において、２０００は酵素電極、２０１０は対電極であり、これらは、２０２０のリード線を通して外部装置２０３０に接続されている。また、酵素電極と対電極とは、電解質２０４０中に配置されている。
【００４７】
また必要に応じて、参照電極や電解質を保持する機構を適用することもできる。
【００４８】
このときに酵素電極を介して、外部装置２０３０で取得される電気信号によって、電解質中に存在する被検物質の有無、濃度を調べることができる。こうして、酵素電極を利用したセンサが実現できる。なお、電気信号としては、電流、電荷量、電圧、電位、インピーダンスが含まれる。また、外部装置から酵素電極に電位、電圧等を印加しておくこともできる。予め、電気信号と特定の基質の濃度等の関係をデータベースに記憶しておき、取得される信号と、当該データベース内の情報とを比較することも可能である。
【００４９】
（第４の実施形態：燃料電池）
前述の第１の実施形態で説明した酵素電極を用いて構成される燃料電池について、図４を用いて説明する。
【００５０】
同図において、３０００はアノード、３０１０はカソードであり、酵素電極は、これらのうち少なくとも一方として用いられ、他方が対向電極となっている。これらは、リード線３０２０を通して３０３０の負荷に接続されている。
【００５１】
アノードとカソードは、３０４０の電解質中に配置されている。また、必要に応じて、さらに電解質を保持する機構を用いてもよい。電解質中に燃料が存在するときにアノードとカソードとの間に生じる起電力によって、負荷に電流を流し仕事を行わせることができる。
【００５２】
ここでいう、負荷とは、例えば薬剤を供給するためのポンプであり、電気信号を発信するための発信機である。
【実施例】
【００５３】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明の方法は、これらの実施例のみに限定されるものではない。
【００５４】
（実施例１）
実施例１で形成される酵素電極の概念図を図５に示す。
【００５５】
同図において、５０００はガラス基板、５０１０は金電極であり、これらは導電性部材を構成している。この導電性部材に金／チオール結合を通してコバルト錯体５０２０が固定化されている。そして、末端のコバルト（５０３０）に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（５０４０）の分子に導入されたヒスチジン残基（５０５０）が結合している。この導入されたヒスチジン残基は、西洋ワサビペルオキシダーゼの活性サイトであるヘム（５０６０）の近傍（５０７０）に導入されている。このために、酵素反応を通じてヘムに取り出された電子は、高速でコバルト錯体を通じて導電性部材に移動することが可能となる。
【００５６】
実施例１では、この酵素電極の調製および過酸化水素センサとしての使用例を以下の各項目に分けて記述する。
１．電極上に固定化する金属錯体配位子の合成
２．特定位置にヒスチジンを導入した西洋ワサビペルオキシダーゼの調製
３．酵素電極の調製
４．過酸化水素の測定
【００５７】
１．電極上に固定化する金属錯体配位子の合成
以下の式（１）に示す錯体配位子の合成法を記述する。
【００５８】
【化１】
2008076388.tif 000003
【００５９】
等モルの２−アセチルピリジン、４−メチルチオベンズアルデヒドのエタノール溶液に半分の体積の１．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加え反応させた後、ろ過、水、メタノールで洗浄、乾燥し中間生成物を得た。
【００６０】
窒素雰囲気下、カリウム−ｔｅｒｔ−ブトキサイドのテトラヒドロフラン溶液に、０．１ｍＬの２−アセチルピリジンを加え、室温で攪拌する。０．１６ｇの前記中間生成物を加え、室温で反応させた後に、過剰量の酢酸アンモニウム、エタノールを加え、還流を行う。その後、溶液を減圧溜去、生成物を水洗し、クロロホルムからメタノールで再沈殿させることにより式（１）に示す配位子を得た。
【００６１】
２．特定位置にヒスチジンを導入した西洋ワサビペルオキシダーゼの調製
活性サイトの近傍に、アミノ酸であるヒスチジンを特定の位置に導入し、そのヒスチジンと配位結合する金属錯体を用いた酵素電極について説明する。
【００６２】
西洋ワサビ（Ａｒｍｏｒａｃｉａ  ｒｕｓｔｉｃａｎａ）の苗より常法に従いｃＤＮＡを調製する。
ｃＤＮＡを鋳型として用い、合成オリゴヌクレオチド
５’−ＡＡＴＡＡＴＧＧＡＴＣＣＣＡＡＣＴＴＡＣＣＣＣＴＡＣＣＴＴＣＴＡＣＧＡＣＡＡＴＴＣＡ−３’（ＢａｍＨＩ）［配列番号１］、および、
５’−ＡＡＴＡＡＴＣＴＣＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧＧＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＣＴＡＣＡＡＴＴＣＡＡ−３’（ＸｈｏＩ）［配列番号２］、
をプライマーとして用い、ＰＣＲ増幅反応を行い、約９２０塩基対の増幅産物を得る。
【００６３】
増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解析することにより、このＰＣＲ増幅産物［配列番号３］は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペルオキシダーゼをコードする遺伝子（ｐｒｘＣ１ａ）を含むことを確認することができる。
【００６４】
このＤＮＡ増幅産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化切断し、約９２０塩基対のＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）の同じ制限酵素サイトに挿入する。こうすることによって、ＧＳＴ融合ペルオキシダーゼ発現ベクターｐＧＥＸ−ｐｒｘＣ１ａを作製する。
【００６５】
精製したｐＧＥＸ−ｐｒｘＣ１ａに対して、市販のキットを用い、部位特異的変異を導入することによって、変異型ペルオキシダーゼ発現ベクターｐＧＥＸ−ｍｐｒｘＣ１ａを作製する。
【００６６】
ペルオキシダーゼ遺伝子に対して導入する部位特異的変異は、以下の全ての条件に適合するアミノ酸を選択し、これらのアミノ酸をコードする遺伝子を、ヒスチジンをコードする遺伝子に置換することによって行う。
１．ペルオキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列において、電荷の授受が行われる部位であるヘムの物理的近傍に位置するアミノ酸であること。
２．酵素表面近傍に位置するアミノ酸であること。
３．該アミノ酸のヒスチジンへの置換により、酵素のペルオキシダーゼ活性を低減させないもの。
４．置換されたヒスチジンの側鎖であるイミダゾール基により酵素外部に配置される金属錯体と結合させる目的に利用できること。
【００６７】
これらの条件を満たすアミノ酸のセットとして、たとえば配列番号４で表されるアミノ酸配列における、３１番目のアルギニン、７３番目のセリン、１７６番目のグルタミンを挙げることが出来る。こうして、酵素内の活性サイトであるヘムに対して、約０．９５ｎｍという近傍に、位置を制御してヒスチジンを配置できる。
【００６８】
これらのアミノ酸のヒスチジンへの置換は、市販キット付属のマニュアルに従い、プライマーを設計し、塩基の置換をすることによって行う。
【００６９】
変異型ＧＳＴ融合ペルオキシダーゼ発現ベクターｐＧＥＸ−ｍｐｒｘＣ１ａを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【００７０】
得られた形質転換体を、抗生物質アンピシリンを添加したＬＢ培地でプレ・カルチャーした後、その一部を、ＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し振とう培養する。その後ＩＰＴＧを添加してさらに培養を続け、形質転換体を集菌、ＰＢＳに再懸濁、菌体を破砕し、遠心分離して粗酵素抽出液を取得する。
【００７１】
粗酵素抽出液からＧＳＴ融合ペルオキシダーゼをグルタチオン・セファロースビーズで精製する。予めＢＳＡを吸着させることで非特異的吸着を抑える前処理を行ったグルタチオンセファロースを、粗酵素抽出液に添加し攪拌することで、ＧＳＴ融合ペルオキシダーゼをグルタチオンセファロースに吸着させる。
【００７２】
吸着後、遠心分離でグルタチオンセファロースを回収し、ＰＢＳで洗浄した後、グルタチオンを添加し攪拌することで、吸着した融合タンパク質を溶出する。遠心分離して上清を回収した後、ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合ペルオキシダーゼを精製する。このＧＳＴ融合ペルオキシダーゼをＧＳＴ融合プロテアーゼで消化し、ＧＳＴ部位を切断した後、グルタチオン・セファロースに通してＧＳＴ融合プロテアーゼとＧＳＴを除去する。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけ、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む変異型ペルオキシダーゼの最終精製物を得る。
【００７３】
ペルオキシダーゼ活性は、以下のようにして決定できる。
例えば２，２’−ａｚｉｎｏ−ｄｉ−［３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＡＢＴＳ）を発色剤として用いる。そして、４２０ｎｍにおける吸光度変化を測定することにより決定する。
【００７４】
３．酵素電極の調製
市販のスライドグラスをアセトン中で超音波洗浄、窒素気流下で乾燥した後、チタン／金を２０／２００ｎｍの厚さで蒸着して、導電性基板を調製した。基板を切断後、過酸化水素水／濃硫酸の３／７溶液中に２０分間浸漬し、水洗、窒素気流で乾燥した。
（ａ）この基板を式（１）の配位子のクロロホルム溶液に浸漬、クロロホルムで洗浄、窒素気流下乾燥する。
（ｂ）次に、この基板を塩化コバルト（ＩＩ）水溶液に浸漬、水洗、窒素気流下乾燥をおこなう。
（ｃ）次に４’，４’’’’−（１、４−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）ｂｉｓ（２，２’：６’，２’’−ｔｅｒｐｙｒｉｄｉｎｅ）のクロロホルム溶液に浸漬を行い、クロロホルムで洗浄、窒素気流下で乾燥する。
【００７５】
さらに、ｂ，ｃの工程を、ｂ−ｃ−ｂ−ｃ−ｂと繰り返すことで、導電性基板に固定化された金属錯体を得る。
【００７６】
先に記述した、ヒスチジンを導入した西洋ワサビペルオキシダーゼの緩衝液を調製し、この金属錯体固定化導電性部材を浸漬することで金属錯体に酵素を固定化する。酵素の固定化量は、水晶振動子マイクロバランス法等により、見積もることができる。その後、緩衝液で洗浄し、錯体に配位していない酵素を除くことで酵素電極を調製する。
【００７７】
こうして、酵素内の活性サイト近傍に配置されたヒスチジンと、金属錯体の金属中心であるコバルト原子とが配位結合することにより、結果として、メディエータとして機能する金属錯体の位置を、活性サイトに対して位置を制御して配置できる。
【００７８】
４．過酸化水素濃度の測定
調製した酵素電極を作用電極とし、白金線を対電極、銀／塩化銀電極を参照電極として３電極セルを構成し、ポテンショスタットに接続、電解液として０．１Ｍのリン酸緩衝液を使用する。測定前に、既知濃度の過酸化水素の緩衝溶液を用い、作用電極に５００ｍＶ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌの電位を印加して定常電流（触媒電流）を観測、検量線を作成する。その上で、電解液に未知濃度の過酸化水素を含む物質を添加し、同様の電位を印加して定常電流を観測することで濃度を測定する。
【００７９】
（実施例２）
実施例２で形成される酵素電極の概念図を図６に示す。
【００８０】
同図において、６０００はシリコン基板、６０１０は金電極であり、これらは導電性部材を構成している。この導電性部材に金／チオール結合を通してコバルト錯体６０２０が固定化されている。そして、末端のコバルト（６０３０）に、グルコースオキシダーゼ（６０４０）の分子に導入されたヒスチジン残基（６０５０）が結合している。また、グルコースオキシダーゼ内には、さらに金属錯体を結合するためのヒスチジンが導入されており、６０６０は、これにコバルト錯体が結合されたものをさす。この６０６０のコバルト錯体を固定化しているヒスチジンは、グルコースオキシダーゼの活性サイトであるＦＡＤ（６０７０）の近傍（６０８０）に導入されている。このために、酵素反応を通じてＦＡＤに取り出された電子は、高速でコバルト錯体を通じて導電性部材に移動することが可能となる。
【００８１】
実施例２では、この酵素電極の調製およびグルコースセンサ、生物燃料電池としての使用例を以下の各項目に分けて記述する。
１．酵素固定化用金属錯体の合成（６０６０を構成するコバルト錯体）
２．特定位置へヒスチジンを導入したグルコースオキシダーゼの調製
３．酵素電極の調製
４．グルコース濃度の測定
５．生物燃料電池の動作
【００８２】
１．酵素固定化用金属錯体の合成
以下の式（２）に示す錯体の合成法を記述する。
【００８３】
【化２】
2008076388.tif 000004
【００８４】
等モルの２，２’：６’，２’’−ｔｅｒｐｙｒｉｄｉｎｅ、塩化コバルト（ＩＩ）をエチレングリコール溶媒中、窒素雰囲気下還流を行うことで反応させる。反応溶液を空冷した後、強攪拌中の５００ｍＬのジエチルエーテルに滴下し、生じた沈殿を水、ジエチルエーテルで洗浄乾燥し式（２）に示す錯体を得る。
【００８５】
２．特定位置へヒスチジンを導入したグルコースオキシダーゼの調製
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓｅ（ＡＴＣＣ  ２８６８６）を、ジャガイモ、グルコースを含む寒天プレートに接種し、２５℃で培養することにより、培養細胞を得る。得られた培養細胞をリン酸緩衝液に懸濁した後、遠心分離して回収することにより洗浄する。この培養細胞より常法に従いｃＤＮＡを調製する。このｃＤＮＡを鋳型として、合成オリゴヌクレオチド
５’−  ＡＡＴＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＡＡＣＡＧＡＴＴＧＡＴＧＴＣＣＡＧ  −３’  （ＮｄｅＩ）  ［配列番号６］、および、
５’−  ＡＡＴＡＡＴＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＧＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＡＴＡＧＴＣＡＴＣＣＡＡＡＡＴ  −３’（ＥａｇＩ）［配列番号７］、
をプライマーとして、ＰＣＲ増幅反応を行い、約１，７００塩基対の増幅産物を得る。
【００８６】
増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解析することにより、このＰＣＲ増幅産物［配列番号８］は、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるグルコースオキシダーゼをコードする遺伝子を含むことを確認することができる。
【００８７】
このＤＮＡ増幅産物を制限酵素ＮｄｅＩおよびＥａｇＩで消化切断し、約１，７００塩基対のＤＮＡ断片をｐＥＴ−２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）の同じ制限酵素サイトに挿入する。こうすることによって、グルコースオキシダーゼ発現ベクターｐＥＴ２１−ＧＯＸを作製する。
【００８８】
精製したｐＥＴ２１−ＧＯＸに対して、市販のキットを用い、部位特異的変異を導入することによって、変異型グルコースオキシダーゼ発現ベクターｐＥＴ−ｍＧＯＸを作製する。
【００８９】
グルコースオキシダーゼ遺伝子に対して導入する部位特異的変異は、次のように行う。
すなわち、以下の条件のうち、１から３、または２から４のそれぞれ全ての条件に適合するアミノ酸を選択し、これらのアミノ酸をコードする遺伝子を、ヒスチジンをコードする遺伝子に置換することによって行う。また、可能であれば、一つのアミノ酸で１から４の全ての条件に適合していても良い。
【００９０】
１．グルコースオキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列において、電荷の授受が行われる部位であるフラビンアデニンジヌクレオチドの物理的近傍に位置すること。
２．ヒスチジンへの置換によりグルコースオキシダーゼ活性を低減させないこと。
３．置換されたヒスチジンの側鎖であるイミダゾール基により金属原子と錯体を形成することが可能であること。
４．酵素表面近傍に位置するアミノ酸の中から、ヒスチジンへの置換により酵素外部に配置される金属錯体と結合させる目的に利用できること。
【００９１】
これらの条件を満たすアミノ酸のセットとして、以下のものを挙げることができる。
【００９２】
たとえば配列番号９で表されるアミノ酸配列における、１０８番目のスレオニン−２３１番目のアスパラギン酸−６１番目のセリン−６番目のグルタミン、である。また、１１２番目のグリシン−２２１番目のアスパラギン−１７７番目のセリン−１５０番目のアラニンである。更にまた、１１１番目のアスパラギン−２３１番目のアスパラギン酸−６１番目のセリン−６番目のグルタミンを挙げることが出来る。
【００９３】
本実施例においては、１０８番目のスレオニン−２３１番目のアスパラギン酸−６１番目のセリン−６番目のグルタミンの４アミノ酸を置換した例について記述する。
【００９４】
これらのアミノ酸のヒスチジンへの置換は、市販キットに付属のマニュアルに従い、プライマーを設計し、塩基の置換をすることによって行う。
【００９５】
変異型グルコースオキシダーゼ発現ベクターｐＥＴ−ｍＧＯＸを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【００９６】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリンを添加したＬＢ培地で一晩プレ・カルチャーした後、その一部をＬＢ−Ａｍｐ培地に添加、振とう培養する。その後ＩＰＴＧを添加し、さらに培養する。ＩＰＴＧ誘導した形質転換体を集菌、ＰＢＳに再懸濁し、凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心分離して封入体を含む固形夾雑物を取得する。封入体を含む固形夾雑物を、ＮａＣｌおよびＥＤＴＡを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄後、さらにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄する。つぎに尿素水溶液で洗浄することにより夾雑タンパク質を除き封入体を精製する。
【００９７】
精製された封入体をジチオスレイトールを含む８Ｍ  尿素水溶液に懸濁、氷浴上静置し可溶化する。
【００９８】
可溶化されたタンパク質を透析チューブに入れ、グルタチオン、グリセロール、ＦＡＤを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析することにより、リフォールディングさせる。
【００９９】
リフォールディングされたタンパク質溶液を遠心することにより、凝集したタンパク質を除去し、上清に含まれるタンパク質を、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したゲルろ過カラムにかけることにより分画する。グルコースオキシダーゼ活性画分を分取することにより、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む変異型グルコースオキシダーゼの精製標品とする。
【０１００】
グルコースオキシダーゼ活性は、例えば２５℃、酸素飽和条件下に、酢酸ナトリウム緩衝液中でのグルコースの酸化に伴い生成する過酸化水素量を測定することにより決定することができる。例えば２，２’−ａｚｉｎｏ−ｄｉ−［３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＡＢＴＳ）を発色剤として用い４２０ｎｍにおける吸光度変化によって、決定することが可能である。
【０１０１】
３．酵素電極の調製
シリコン基板上にチタン／金を２０／２００ｎｍの厚さで蒸着して、導電性基板を調製した。基板を切断後、過酸化水素水／濃硫酸の３／７溶液中に２０分間浸漬し、水洗、窒素気流で乾燥した。
（ａ）この基板を式（１）の配位子のクロロホルム溶液に浸漬、クロロホルムで洗浄、窒素気流下乾燥する。
（ｂ）次に、この基板を塩化コバルト（ＩＩ）水溶液に浸漬、水洗、窒素気流下乾燥をおこなう。
（ｃ）次に４’，４’’’’−（１、４−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）ｂｉｓ（２，２’：６’，２’’−ｔｅｒｐｙｒｉｄｉｎｅ）のクロロホルム溶液に浸漬を行い、クロロホルムで洗浄、窒素気流下で乾燥する。
【０１０２】
さらに、ｂ，ｃの工程を、ｂ−ｃ−ｂと繰り返すことで、導電性基板に固定化された金属錯体を得る。
【０１０３】
先に記述した、ヒスチジンを導入したグルコースオキシダーゼの緩衝液を調製し、この金属錯体固定化導電性部材を浸漬することで金属錯体に酵素を固定化する。酵素の固定化量は、水晶振動子マイクロバランス法等により、見積もることができる。その後、緩衝液で洗浄し、錯体に配位していない酵素を除く。さらに、化合物（２）の０．１Ｍリン酸緩衝液中に浸漬することで酵素電極を調製する。
【０１０４】
こうして、酵素内の活性サイト近傍に配置されたヒスチジンと、金属錯体の金属中心であるコバルト原子とが配位結合することにより、結果として、メディエータとして機能する金属錯体の位置を、活性サイトに対して位置を制御して配置できる。
【０１０５】
４．グルコース濃度の測定
調製した酵素電極を作用電極とし、白金線を対電極、銀／塩化銀電極を参照電極として３電極セルを構成し、ポテンショスタットに接続、電解液として０．１Ｍのリン酸緩衝液を使用する。必要な場合は、不活性ガスをバブリングすることで、溶液から酸素を除去する。測定前に、既知濃度のグルコースの緩衝溶液を用い、作用電極に５００ｍＶ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌの電位を印加して定常電流（触媒電流）を観測、検量線を作成する。その上で、電解液に未知濃度のグルコースを含む物質を添加し、同様の電位を印加して定常電流を観測することで濃度を測定する。
【０１０６】
５．生物燃料電池の動作
調製した酵素電極をアノードとし、白金線をカソードとして生物燃料電池を構成する。アノード、カソードから取り出したリード線に、負荷、例えば、液晶表示装置を接続する。燃料であるグルコース、酸素を含んだ電解液をアノード、カソード間に導入することで、起電力を発生し、液晶表示装置を駆動させる。
【０１０７】
実施例の効果
本発明の酵素電極においては、分子生物学的手法を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼの活性サイトであるヘム、グルコースオキシダーゼ活性サイトであるのＦＡＤの近傍に金属錯体に配位可能なヒスチジンを導入する。このヒスチジンに対し、脱離基として塩素を分子内に有するコバルト錯体を結合させることで、活性サイトの近傍にメディエータとして機能するコバルト錯体を固定化する。
【０１０８】
その結果、従来の酵素分子中にメディエータがランダムに導入された酵素を用いた酵素電極と比較して、酵素の活性サイトからメディエータ分子への電子移動が高速化する。
【０１０９】
これによって、本酵素電極では、酵素の活性中心からの電子の取出が、酵素反応の律速段階となっているような系において、律速段階を解消することができる。その結果、従来よりも高いターンオーバー数、電流値、積算電荷量を示す酵素電極を得ることができる。この特性は、以下のように利用することが可能である。
【０１１０】
１．この電極は、酵素の活性中心からの電子の取出が、酵素反応の律速段階となっているような系、すなわち基質濃度が高く、基質の拡散過程が律速段階となりにくい系において、高い電流を与えることができる。この特性を利用して、この電極を例えばセンサに応用した場合には、測定濃度範囲の上限の高いセンサを提供することができる。また、燃料電池に応用した場合には、電流密度およびそれに比例して向上する出力密度の高い燃料電池を提供することができる。
２．この電極は、酵素の活性中心からの電子の取出を高速化することで、酵素１分子あたりの電流値を高くすることができる。すなわち、少ない酵素量で必要とされる電流値を与えることができるため、酵素の使用量を低下させ、電極の製造に必要な資源、コストの削減に寄与する。
３．この電極は、酵素の活性中心からの電子の取出を高速化することで、酵素１分子あたりの電流値を高くすることができる。すなわち、少ない酵素量で必要とされる電流値を与えることができる。このため、酵素固定化電極において、従来の電極と、同じ固定化密度の電極の場合には、一定の出力電流値、電荷量を維持したまま電極面積を低減することができる。これを利用して、電極面積を低減することで、バックグラウンド電流を減少させ、シグナル／ノイズ比を向上させることができる。また、デバイスを小型化することができる。これによって、低ノイズのセンサや小型のセンサ、燃料電池を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】本発明に係る酵素電極を説明するための図である。
【図２】本発明に係る酵素電極を製造する工程を説明するための図である。
【図３】本発明に係るセンサを説明するための図である。
【図４】本発明に係る燃料電池を説明するための図である。
【図５】本実施例に係る酵素電極を説明するための図である。
【図６】本実施例に係る酵素電極を説明するための図である。
【符号の説明】
【０１１２】
１０００  酵素
１０１０  導電性基板
１０２０  金属錯体
１０３０  活性サイト
１０４０  アミノ酸
１００５  酵素を構成する、一部改変された部位をもつタンパク質
【図１】
2008076388.tif 000005
【図２】
2008076388.tif 000006
【図３】
2008076388.tif 000007
【図４】
2008076388.tif 000008
【図５】
2008076388.tif 000009
【図６】
2008076388.tif 000010
【配列表】
2008076388000001.app