(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、試験管の中で培養された植物組織をパッケージする、特に体胚の輸送に適し、かつ非常に小さな技術的手段および実施時間だけを必要とする、新しい非常に簡単な方法を供することである。【解決手段】  インビトロで培養した植物組織を、無菌の容器の中で、液体栄養培地を浸み込ませた２つの固体の支持体の間に置き、その植物組織を少なくとも１つの支持体の表面に毛管現象によって堅く付着させ、又少なくとも１つ支持体の他の表面を毛管現象によって容器の面の１つに堅く付着させて、組織を保存する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
無菌容器中、インビトロで培養された植物組織を、液体栄養培地を含浸させた２つの固体支持体の表面の間に置き、その植物組織を少なくとも１つの支持体の表面に毛管現象によって堅く付着させ、又他の支持体面の少なくとも１つを毛管現象によって容器の面の１つに堅く付着させ、そして組織を保存することを特徴とする、インビトロで培養された植物組織をパッケージする方法。
【請求項２】
支持体は、部分的に又は完全に液体を含む繊維状の物質、又は液体を保持し得る物質から成る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの支持体に含浸させた液体の量は、容器の中の相対湿度を少なくとも９５％に、少なくとも１から５日間確保することを可能にする量である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
１０倍の大きさとなる期間が、１週より長く２ヶ月以下の範囲である胚を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
２つの支持体の１つを最初に乾燥する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
脱水した胚を使用する、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
１０倍の大きさとなる期間が、４日以上１週以下の範囲である胚を使用する、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
胚を−４℃から３５℃で保存する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
インビトロで培養された植物組織を含むパッケージ器具において、パッケージ器具は密閉可能な無菌の容器から成り、その容器の中で、インビトロで培養された植物組織を液体栄養培地を浸み込ませた２つの固体の支持体の表面の間に置き、その植物組織を少なくとも１つの支持体の表面に毛管現象で堅く付着させ、又少なくとも１つの支持体の他の表面を容器の１つの面に毛管現象によって堅く付着させることを特徴とする、上記の植物組織を含むパッケージ器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインビトロで培養された植物組織をパッケージする新しい方法に関し、その方法は植物組織の保存状態を高めることが出来、且つ特に植物材料の輸送に適する。
【背景技術】
【０００２】
インビトロで培養された植物組織の輸送は適当なパッケージを必要とする。例えば植物組織は、液体培地の中に又は半固体の寒天培地の上にそれらを置くことによってパッケージすることができ、これらの培地はペトリ皿又は瓶のようなインビトロ培養のための通常の容器に含まれている。残念なことにこの形式のパッケージは、個々の包装品が輸送途上に受ける次のような危険に対応し得ない。即ち、（１）液体培養の場合に攪拌の欠如による組織の窒息、（２）過剰な振盪により寒天で組織を覆うことにより生ずる組織の窒息、（３）培地と容器の外側の間の接触から生ずる汚染、および（４）ある種の場合の組織の過剰の成長。
【０００３】
インビトロで培養された植物組織を冷蔵温度の油層下でパッケージすることも可能である。ＥＰ特許第４０８９２２号明細書（ネスレ社）には、胚を油層下で、液浸による低酸素状態に維持し、ついで冷却し、考えられる胚の低温感受性閾値より大きな温度に保存する方法を開示する。このように保存された胚は数日の保存後に満足すべき生存力を示すが、この方法はなお輸送期間中の冷蔵温度の変化の危害を受ける。
【０００４】
又インビトロで培養された植物組織をアルジネートおよびスクロースの混合物で被覆する時、その植物組織を輸送することが可能である（Hasan等、「植物遺伝学資源公報  Plant Genetic Resources Newsletter」、103号、32-35ページ、1995年）。
【０００５】
インビトロで培養された植物組織を凍結することも可能である。例として、Chen等は、ソルビトール（脱水剤）およびジメチルスルホキシド（凍結保護物質）の存在下でカルスを培養し、それらを−４０℃でゆっくりと凍結し、ついで液体窒素の中で凍結することを提案している（「植物生理学  Plant Physiol.」、75号、726-731ページ、1984年）。同様に、Delvallee等は、未成熟な接合体胚をスクロース（脱水剤）およびジメチルスルホキシドの存在下で培養し、ついでそれらを液体窒素の中で凍結することを提案している（「植物科学  Plant Science」、60号、129-136ぺージ、1989年）。最後に、ＥＰ特許第３９９１５８号明細書（ネスレ社）は、体胚を浸透圧剤を含む培地上で予備処理し、ついでそれら冷却し、つぎにそれらを−１５℃から−４０℃温度で凍結する方法を開示する。凍結は、組織の死滅に導く温度障害のために、植物組織の輸送に必ずしも適しているわけではない。
【０００６】
更に、異なる技術分野において、切断植物又は種子を保存する方法が知られている。ＥＰ特許第６６５８１号明細書（Piquepaille等）は、例えば、種子を発芽させるための又は切断植物を保存するための装置について提案しており、その提案の中で生物学的物質を第１の粘着性支持体および液状成分を浸み込ますことができる第２の柔軟な支持体の間に置き、両者の支持体は第１の支持体の粘着性表面によって堅く付着し、そして２つの支持体は接着剤によって容器の側面に保持される容器から成ることを記載する。この装置は接着剤が存在するために滅菌できないことに注目すべきである。更に、第１の支持体の粘着面はインビトロで培養された植物組織のような軟らかい組織を損傷しやすく、更にこの装置の特徴は本発明の枠内を限定する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それ故に今までのところ、使用が簡単で、かつ植物組織を十分に保護することができる、インビトロで培養される植物組織をパッケージする装置は知られていない。このように本発明は、インビトロで培養された植物組織をパッケージする、特に体胚の輸送に適し、かつ非常に小さな技術的な手段および実施時間だけを必要とする、新しい非常に簡単な方法を供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的のために、本発明は、無菌の容器の中で、インビトロで培養された植物組織を液体の栄養培地を浸み込ませた２つの固体の支持体の表面の間に起き、その植物組織を支持体の少なくとも１つの表面に毛管現象により堅く付着させ、支持体の少なくとも１つの他の表面を容器の１つの面に毛管現象によって堅く付着させ、そしてそれらの状態を変えずに組織を保存する、インビトロで培養された植物組織をパッケージする新しい方法に関する。
【０００９】
本発明は又、インビトロで培養された植物組織を液体栄養培地を浸み込ませた２つの固体の支持体の間に置き、その植物組織を少なくとも１つの支持体の表面に毛管現象によって堅く付着させ、又少なくとも１つの支持体の他の表面を容器の１つの面に毛管現象によって堅く付着させることを特徴とする、インビトロで培養された、密閉可能な無菌の容器からなるパッケージ装置に関する。
【００１０】
先行技術はかなり更に複雑化した技術を推奨しているが、本発明によるパッケージ条件下でインビトロで培養された植物組織は、１から１００日の範囲の輸送時間の間に完全に生き残ることが分かった。このように本発明の方法は、実行するのが容易であり、汚染の危険が減少し、組織は栄養培地の中に完全に浸漬する危険がなく、組織を支持体の間への挿入による衝撃から保護するが故に先行技術の欠点が回避され、かつ組織は例えば半固形の寒天培地又は液体の栄養培地の中に単に置くだけなので組織は保存の後に非常に容易に培養される。
【００１１】
驚くべきことに、例えば、木質植物のようにゆるやかに成長する植物種の多くは、そのようなパッケージ条件によって生育が阻害されることが分かった。これに反して、豆科植物のような急速に成長する植物種の成長を制限することが望ましい場合に、例えばそれらをパッケージする前に脱水することもできる。
【００１２】
驚くべきことに、本発明によるパッケージ条件は、体胚を小植物に発育させる能力を高めることすらできることが分かった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
それ故に、本発明を行うために、インビトロの培養から得た植物組織、即ちカルス、カルス上に発育された芽、体胚および根を使用することができる。しかし、本発明は、特に、環境条件に敏感であることが知られている、植物の体胚の保存を目的にするのが望ましい。
【００１４】
使用される容器は、例えば滅菌することができ、かつ可逆的に密閉することができる容器でよい。当業者に知られており、かつ大量に入手し得る容器はペトリ皿であり、ぺトリ皿は例えばプラスチックフイルム、ワックス又は当業者に既知の他の適切な物質によって密閉することができる。
【００１５】
使用する固体支持体は、柔軟な物質から成るのが望ましい。しかし必ずでなく、植物組織の集合体の形態をとることができ、かつ保存時間中に崩壊しないものである。この目的のために、この物質は部分的に又は完全に繊維質であることができ、かつ液体を保持し得る物質を含むことができ、前記の繊維質は例えばこの保持機能を満たし得るものである。これらの支持体は、単独で又は組合せで、例えば、セルロース（吸取紙）、シリカ、ガラス、デキストラン又はキチンの重合体、絹のようなタンパク質、又は、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニルおよびナイロンのようなポリアミドの合成重合体で構成することができる。更に、水を保持し、かつ繊維の中に含まれることが可能な物質は、例えばポリアクリルアミド又は寒天のような多糖類のように水性液体を吸収してヒドロゲルを形成する、有機又は無機の化合物で構成することができる。しかし、この物質は支持体から流出してはならない。
【００１６】
支持体は、組織の生存のために必須の栄養要素を含む液体を浸み込ませることができるべきである。当業者に知られている栄養培地の中に、例として、Skoog又はLinsmayerからビタミンを補足したMurashigeおよびSkoog培地について述べることができる（「Physiol. Plant.」、1962年、15号、473ページ、「Physiol. Plant.」、1965年、18号、100ページ）。
【００１７】
望ましくは、少なくとも１つの支持体は、栄養液を支持体の最高の水分保持閾値（その後液をより長く保持できない）まで浸み込ませる。栄養液の含浸量は少なくとも９５から１００％の容器中の相対湿度、望ましくは少なくとも９８％で、少なくとも１から５日間確保するような量が望ましい。植物組織を乾燥した支持体と第２の液を浸み込ませた支持体の間に置く作業は、組織のゆっくりとした制御された脱水を行うことを可能にし、前記の乾燥した支持体は実に、浸み込ませた支持体から乾燥した支持体に移動する液体を、ゆっくりと浸み込ませる。
【００１８】
組織を損傷しないように、かつ又酸素の良好な拡散、および毛管現象による支持体のお互いのおよび容器の表面への付着を増進するように、厚みも重量も小さい支持体を使用するのが有利である。例として、０．０３から１ｇの重量の、例えば０．０３から０．１ｇの重量で例えばそれらの最初の重量の２から１０倍以上の栄養液を吸収することが可能なフィルターを使用することができる。
【００１９】
植物組織は、支持体の間に多数で又は個々に、組織の生存能力をそれにより影響されることなく置くことができる。組織を置く前に、植物組織から残余の培養液を例えばフィルターを通す真空吸引等によって分離する必要はない。しかし、上記のような組織の更に著しい脱水を確実に行うことが望ましい場合には、残余の培養液を分離することもできる。最後に、インビトロで培養した植物組織を支持体のｃｍ２当たり１から１００の割合で置き、その組織は０．０５から１ｃｍの長さで、かつ例えば魚雷型胚の発育段階からとった体胚の場合に０．０５から０．３ｃｍの長さであることができることが分かっている。
【００２０】
支持体は、毛管現象によって均等に、かつ堅く付着し続けることが望ましい。そのために、支持体に、植物組織を置く範囲の周辺に全ての組織が残留していない、且つ支持体が相互に良好な付着を確保する、組織周辺の少なくとも１ｃｍの水準の充分に広い円形帯を供することができる。
【００２１】
最後に、インビトロで培養された植物組織を含む両方の支持体は、適切な容器入れ、少なくとも１つの支持体は、その支持体の１つの表面との毛管現象によって、容器の１つの表面に単に保持される。
【００２２】
本発明の方法は小型の対象物に使用することができ、それは多数の対象物を容易に輸送できるから商業的配送と両立できる。例えば植物種の大量の体胚を配送しようと望む場合、本発明の方法により、直径５．５ｃｍおよび高さ１ｃｍの標準のペトリ皿の中に、長さが０．０５から０．２ｃｍの約１００の胚を置くことが可能である。このように１ｍ３の包みは３２８０個のペトリ皿を含み、即ち約３２８，０００の胚を含む。比較のために、根と１対の葉を有する葉のある小植物の輸送は、一般に例えばｍ３あたり５，０００から１０，０００の小植物を含む。
【００２３】
本発明の方法は、全ての種類の植物に、特にコーヒーの木、カカオの木、パラゴムの木、バナナの木、ココナツの木およびオイルパームの木のような木質植物、および特にトマト、ニンジン、エンドウ、セロリおよびウイキョウのような野菜植物に使用する。当業者は、インビトロで培養された植物組織を得るための多くの技術を有し、かつそれらを、例えば、胚、芽又は根のようなある種の組織を得ることに関して特殊な条件を必要とする各植物の種類に使用することができる。指針として、カカオの木、コーヒーの木、オイルパームの木のおよびニンジンの体胚の発生は、それぞれ、ＵＳ特許第５，３１２，８０１号明細書に、Zamarripaによる(「CafeCacao et The」、35号、233-244ページ、1991年）に、Engelmann等による（「Oleagineux」、41号、169-172ページ、1986年）に、およびＥＰ特許第３９９１５８号明細書に記載されている方法により、行うことができる。
【００２４】
本発明の方法は、特にインビトロで培養において、例えば週当たり１０未満の増殖速度、即ち毎週１０倍以下の更に新鮮な物質を特徴とするゆるやかな成長をもつ全の植物種、特に木質植物に適用する。基準として、ゆっくりとした成長を有する胚は、１から２ヶ月あたり１ｍｍから１０ｍｍの大きさ（最大の長さとみなされる) に推移する。
【００２５】
ゆっくりと成長する植物組織は、輸送期間中（１から１００日）、好ましくは暗所で、および／又は１０℃から３５℃の温度で、特に１５から３０℃で保存される。
【００２６】
組織が脱水されている場合、本発明による組織を暗所でおよび／又は冷蔵又は冷凍温度（例えば−４℃）から３０−３５℃迄で保存することも可能である。しかし、そのような処理は組織を不可逆的に損傷しがちであるから、葉緑素を含有する組織が脱水しないような注意が必要である。
【００２７】
組織を脱水するために、さらに上記の技術以外にあるいは加えて、例えば伝統的培養基に、浸透圧剤を加え、またビタミンＢ１、ニコチン酸又はアデニンのようなある種の有機物質も加えて、組織は充分に培養される。この試剤は、細胞膜の浸透性に影響することなく細胞の満足すべき脱水を得るように、組織に浸透しかつ適当な浸透圧を確保し得る物質から当業者によって選択することができる。この試剤は、スクロース又はトレハロースのような糖、又は同様な機能を行うことが知られている他の物質であることができる。培養基中の浸透圧剤の濃度は、細胞の満足すべき脱水を確保するように、余り低すぎないのが望ましい。それは、組織を損傷しないよう、又保存後再び成長するのを防止するために余り高過ぎないようにすべきである。基準として、組織を５０から１９０ｇ／ｌの、特に１００から１５ｇ／ｌのスクロースを含有する培養基で脱水することができる。
【００２８】
本発明による方法が組織の成長を充分に抑制するのに充分でないと思われる時に、組織の脱水も組織の成長を可逆的に抑制する手段である。この目的のために、週当たり１０より大きな増殖速度（１０倍のさらに新しい物質）を有する組織を、上記のごとく脱水するのが望ましい。基準として、急速に成長する胚は、例えば１ｍｍの大きさから１０ｍｍに、４から６日に推移する（最も大きな長さとみなされる）。インビトロの培養で急速な成長をする植物の中に、例えばニンジン、セロリ、ウイキョウの名が挙げられる。
【００２９】
輸送後、組織の取出しは非常に容易である。培養基をおおう支持体を充分に振動して組織をそれから取出す。組織は、当業者に既知の器具で移植することができる。
【実施例】
【００３０】
本発明は、下文に示す適用例においておよび本発明による装置を図示する図１を参照しながら、更に詳細に記述する。本発明による方法の特徴は、下記の特定例に限定せず、当業者によってある植物種と組織に採用することができる。
【００３１】
図１において、栄養液を浸みこませた支持体１（ガラス繊維で作られたフィルター）は、毛管現象によってペトリ皿の底部２に可逆的に取り付けられ、その支持体の他の表面は、インビトロで培養された植物組織３を受け入れる。栄養液を浸み込ませることができる、第２の支持体４（ガラス繊維で作られたフィルター）は組織３および第１の支持体２と接触する。最後にペトリ皿のカバー５は容器を閉じることを可能にし、例えばプラスチックフイルムによって最終的な密閉を行うことができる。
【００３２】
例１
ロバスタコーヒーの木（Coffea canephora）の１００の体胚を、魚雷型胚の段階で、Zamarripa等の方法（「Cafe Cacao et The」、35号、233-244ページ、1991年)により得、それを１つずつ、MurashigeおよびSkoogの液体培地を浸み込ませた、ガラス繊維で作られた２つのフィルター（Whatman GFC、直径５ｃｍ、０．０１ｇの乾燥重量）の間に置く。浸み込ませたフィルターは液を放出しないことを認めることがきる。フィルターをペトリ皿の中に配置する。コーヒーの木の胚を含む数個のペトリ皿を同様な方法で調製し、それらを２０℃で保存し、ついで定期的にそれらの胚を、培養皿の半固体の培地の上に入れ、生き残っている胚の数（生存能力）および小植物に発育することができる胚の数（転換）を測定する。下記の表に示された結果は、全ての胚が１５日の保存で完全に生き残り、且つ１から３０日保存された胚の小植物への転換は、魚雷型胚の段階で得た、パッケージしていない胚の転換よりかなり良好であることを示している。
【表１】
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【００３３】
例２
Zamarripa等の方法により魚雷型胚の段階で得た、１ｇのロバスタコーヒーの木（Coffea canephora）の体胚を、集塊として、MurashigeおよびSkoogの液体培地を浸み込ませた２つのガラスフィルター（Whatman GFC、直径５ｃｍ、０．０１ｇの乾燥重量）の間に置く。ついでフィルターをペトリ皿に入れる。コーヒーの木の胚を含む数個のペトリ皿を同じ方法で調製し、それらを２０℃で４週間保存し、ついで２４５０個の胚を半固体の培地の上に入れ、小植物に発育することができる胚の数（転換）を測定する。結果は５カ月間に７９４の小植物が発育することを示す。それ故に、包装された胚は３２％の転換率を示し、それは伝統的な包装していないコーヒーの胚が示す転換率に類似する（表参照）。
【００３４】
例３
例２と同様な方法で、ロバスタコーヒーの木（Coffea canephora）からの０．１ｇのカルスをペトリ皿ごとにパッケージし、カルスを２０℃で１月間保存する。ついでこのようにして得た植物物質の重量を測定し（０．５５±０．２３ｇの新鮮な物質）、次にそれを対照の、０．１ｇの新鮮なカルスを摂取してパッケージせずに１月間培養した植物物質の重量（０．５９±０．１８ｇの新鮮物質）と比較する。結果は、コーヒーの木のカルスがそのパッケージで完全に生き残ることを示す。
【００３５】
例４
ＥＰ特許第３９９１５８号明細書に記載のごとく、魚雷型胚の段階でとった体胚を、浸透圧剤を含む培地で前もって処理し、ついでそれらを例２に記載のごとくパッケージする。このようにパッケージしたニンジンの胚は数日間、生存能力およびパッケージしていないニンジンの胚に匹敵する小植物に生育する能力を保持する。
【００３６】
例５
魚雷型胚の段階で取ったニンジンの体胚を例２に記載の如くパッケージし、唯一の差は、胚を前もって１００ｇ／ｌのスクロースを含む培地で脱水することである。ついで、それらを栄養液を浸み込ませたガラス繊維製のフィルターと他の乾燥したフィルターの間に置く。このようにパッケージしたニンジンの胚は数日間、生存能力およびパッケージしていないニンジンの胚に匹敵する小植物に成長する能力を保持する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の装置の概要の図である。
【符号の説明】
【００３８】
１  栄養液を浸み込ませた第１の支持体（ガラス繊維で作ったフィルター）
２  ペトリ皿の底部
３  試験管の中で培養された植物組織
４  栄養液を浸み込ませることのできる第２の支持体（ガラス繊維で作ったフィルター）
５  ペトリ皿のカバー
【図１】
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