(57)【要約】【課題】複数のパルス光の照射位置を、分析対象物表面の凹凸に応じて一致させる顕微鏡装置を提供する。【解決手段】互いに異なる波長成分を含む複数のパルスレーザ光Ｐ１２、Ｐ１４´を発生する光源部２１、２３、４１と、複数のパルスレーザ光Ｐ１２、Ｐ１４´を分析対象６０に照射する光学系３５と、複数のパルスレーザ光Ｐ１２、Ｐ１４´の照射によって分析対象６０から発せられる第１の光Ｐ１５を検出する第１の検出部６２と、複数のパルスレーザ光Ｐ１２、Ｐ１４´の照射によって分析対象６０から発せられる第２の光Ｐ１６を検出する第２の検出部６１と、第２の検出部６１によって検出される第２の光Ｐ１６の強度に基づいて複数のパルスレーザ光Ｐ１２、Ｐ１４´の照射位置を一致させるための調整部６５、３１とを備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに異なる波長成分を含む複数のパルスレーザ光を発生する光源部と、
前記複数のパルスレーザ光を分析対象に照射する光学系と、
前記複数のパルスレーザ光の照射によって前記分析対象から発せられる第１の光を検出する第１の検出部と、
前記複数のパルスレーザ光の照射によって前記分析対象から発せられる第２の光を検出する第２の検出部と、
前記第２の検出部によって検出される第２の光の強度に基づいて前記複数のパルスレーザ光の照射位置を一致させるための調整部と
を備えることを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記光源部は、
第１の波長を持つ第１のパルスレーザ光と前記第１の波長とは異なる第２の波長及び前記第１及び第２の波長とは異なる第３の波長を持つ第２のパルスレーザ光とを発生することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記第２の検出器によって検出される第２の光は、前記分析対象に普遍的に存在する物質から発せられる光であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記普遍的に存在する物質は、脂質であることを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記第２の検出器によって検出される第２の光の波長と前記複数のパルスレーザ光のいずれかの波長との差が波数換算で２８００ｃｍ−１乃至３２００ｃｍ−１の間にあることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記調整部は、前記第２の検出器によって検出される第２の光の強度が一定値以上となるように前記複数のパルスレーザ光の照射位置を相対的に調整することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
前記分析対象から発せられる第１及び第２の光は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項８】
前記分析対象から発せられる第１及び第２の光は、誘導パラメトリック蛍光であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項９】
前記パルスレーザ光の半値幅は１０フェムト秒乃至１０ピコ秒の間にあることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項１０】
互いに異なる波長成分を含む複数のパルスレーザ光を発生する光源部と、
前記複数のパルスレーザ光を分析対象に照射する光学系と、
前記複数のパルスレーザ光の照射によって前記分析対象から発せられる第１の光を検出する第１の検出部と、
前記複数のパルスレーザ光の照射によって前記分析対象から発せられる第２の光を検出する第２の検出部と、
前記第２の検出部によって検出される第２の光の強度に基づいて前記複数のパルスレーザ光の照射位置を一致させるための調整部と、
前記第１の検出部の検出結果に基づいて前記分析対象に含まれる物質を分析する分析部と
を備えることを特徴とする分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異なる波長成分を含む複数のパルスレーザ光を分析対象に入射し、その結果分析対象から発せられる光を観察することにより、分析対象に含まれる物質を分析するための顕微鏡装置及び分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
顕微分光法による微量物質の検出は、分析装置における基本技術としての重要性が高く、多くの技術開発が行われてきた。一方、昨今の医療技術の進歩と共に、診断技術にもより一層の向上が求められることとなり、微量物質検出技術の医療診断技術への応用が試みられている。
【０００３】
係る顕微分光技術として、コヒーレントアンチストークスラマン散乱法（Coherent Anti-stokes Raman Scattering;ＣＡＲＳ）が知られている。これは、二種類又はそれ以上の光パルスを試料に入射し、それらの間に起こる非線形光学過程によって試料から発せられるシグナル光を観察するものである。
【０００４】
例えば、図７に示されるようなエネルギー準位を持った分子をＣＡＲＳによって観察することを考えると、まず、初期状態のエネルギー準位Ｌ１において、角周波数ω１を持った第１のパルス光の入射によって試料の分子が仮想的に励起され、そのエネルギー準位が矢印Ａで示すようにＬ３まで上がる。そして、角周波数ω２を持った第２のパルス光を入射させることにより、分子のエネルギー準位は、仮想的な光子放出により矢印Ｂで示すようにＬ３からＬ２に下がる。さらに角周波数ω３を持った第３のパルス光を入射させることにより、分子のエネルギー準位は、矢印Ｃで示すように、Ｌ３からＬ４に仮想的に上昇し、シグナル光の発生によって矢印Ｄで示すように、Ｌ４からＬ１に下がる。
【０００５】
このように、角周波数ω１、ω２、ω３を持った三種のパルス光の入射によって、いわゆる四光波混合過程が生じ、結果として角周波数ω１＋ω３−ω２を持つシグナル光が発生する。このようなシグナル光は、入射パルスの周波数差Δω=ω１−ω２が、観察すべき分子のエネルギー準位差に共鳴するときに特に強く現れる。現実に用いることの可能な光パルスを考慮すると、Δωが分子の振動モード周波数に一致するときに強いシグナルが得られることが考えられるため、このような振動モードを持つ分子の検出が可能となる。また、この手法は二種のパルス光を用いて上記第3のパルス光によって生ずる光学過程を第１のパルス光によって起こすことにより、2ω１―ω２の角周波数を持つシグナル光を検出することによっても実現される。
【０００６】
このような原理を利用した顕微分光装置としては、例えば、図８に示される通り、二種のレーザパルス光源１１、１２、この光源からのパルス光を試料１３の同一箇所に照射するための光学系１４、試料１３より放出されるＣＡＲＳ光を検出する装置１５から構成されている。パルスレーザ光源１１及び１２から発せられるパルスレーザの波長を変化させることにより、試料１３に含まれる特定分子から発せられるＣＡＲＳ光を選択的に検出することができる。
【０００７】
非線形光学効果を用いる場合、一般に照射光に対して物質から発せられるシグナル光の強度は弱いため、パルス光を絞り込んで単位堆積あたりの強度を大きくする必要がある。この場合、例えば非特許文献１に示されているように、平面状にある対象物をスキャンしてＣＡＲＳ光による画像を得るようになされている。
【非特許文献１】Proc. Natl. Aca. Sci, Vol. 102, 16807-16812 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、対象物上をスキャンする装置においては、分析対象の表面に凹凸がある場合、複数のパルス光の照射位置が分析対象表面の凹凸によって変化することとなり、正確な分析を行うことが困難であった。
【０００９】
このような技術的課題を解決するためになされた本発明の目的は、互いに異なる波長成分を含む複数のパルスレーザ光を分析対象に照射した際に非線形光学効果により発生する光を検出する顕微鏡装置及び分析装置において、複数のパルス光の照射位置を、分析対象物表面の凹凸に応じて一致させることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の実施の形態に係る特徴は、顕微鏡装置において、互いに異なる波長成分を含む複数のパルスレーザ光を発生する光源部と、複数のパルスレーザ光を分析対象に照射する光学系と、複数のパルスレーザ光の照射によって分析対象から発せられる第１の光を検出する第１の検出部と、複数のパルスレーザ光の照射によって分析対象から発せられる第２の光を検出する第２の検出部と、第２の検出部によって検出される第２の光の強度に基づいて複数のパルスレーザ光の照射位置を一致させるための調整部とを備えることである。
【００１１】
また、本発明の実施の形態に係る特徴は、分析装置において、互いに異なる波長成分を含む複数のパルスレーザ光を発生する光源部と、複数のパルスレーザ光を分析対象に照射する光学系と、複数のパルスレーザ光の照射によって分析対象から発せられる第１の光を検出する第１の検出部と、複数のパルスレーザ光の照射によって分析対象から発せられる第２の光を検出する第２の検出部と、第２の検出部によって検出される第２の光の強度に基づいて複数のパルスレーザ光の照射位置を一致させるための調整部と、第１の検出部の検出結果に基づいて分析対象に含まれる物質を分析する分析部とを備えることである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、互いに異なる波長成分を含む複数のパルスレーザ光を分析対象に照射した際に非線形光学効果により発生する光を検出する顕微鏡装置及び分析装置において、複数のパルスレーザ光の照射位置を、分析対象物表面の凹凸に応じて一致させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。以下の図面の記載において、同一の部分には同一の符号を付し、重複する記載は省略する。また、図面は模式的なものであり、各部の寸法等は現実のものと異なる。
【００１４】
（第１の実施の形態）
図１に示すように、本実施の形態に係る顕微鏡装置２０は、互いに異なる波長成分を含む複数のパルスレーザ光Ｐ１２、Ｐ１４´を発生する光源部（２１、２３、４１）と、複数のパルスレーザ光を分析対象（６０）に照射する光学系（２５、３５、３１、４３、５１）と、複数のパルスレーザ光の照射によって分析対象（６０）から発せられる第１の光（Ｐ１５）を検出する第１の検出部６２と、複数のパルスレーザ光の照射によって分析対象（６０）から発せられる第２の光（Ｐ１６）を検出する第２の検出部（６１）と、第２の検出部（６１）によって検出される第２の光（Ｐ１６）の強度に基づいて複数のパルスレーザ光Ｐ１２、Ｐ１４´の照射位置を一致させるための調整部（６５、５１、５３）とを備える。また、分析装置は、顕微鏡装置２０に加えて分析対象（６０）に含まれる物質を分析する分析部（６６）を備える。
【００１５】
図１において、光源２１は、中心波長８００ｎｍ、半値幅１００ｆｓｅｃ（フェムト秒）、繰り返しレート８０ＭＨｚ、平均出力３００ｍＷのパルスレーザ光Ｐ１１を発する。因みに、光源２１において発せられるパルスレーザ光Ｐ１１の半値幅は、１０ｆｓｅｃから１０ｐｓｅｃ（ピコ秒）の間の値が好ましい。すなわち、パルス光を用いた測定においては、周波数領域での信号取得と、時間領域での信号取得とが考えられ、周波数領域での信号取得では、パルス光スペクトルが狭帯域であるほうが測定周波数の精度が高く、時間領域での信号取得では、広帯域光を用いるほうが時間分解能を高くすることができ、取得方法によって最適なパルス光源を用いることが要求される。本実施の形態において、周波数領域での信号取得を行う場合は、測定対象である分子の振動周波数を１０ｍｅＶ（振動モードエネルギー）以内の精度で求めることが要求されるため、スペクトル幅が数ｍｅＶ（振動モードエネルギー）である数ｐｓｅｃ（半値幅）程度のパルス光を用いることが好ましい。また、時間領域での測定を行う場合は、分子の振動周期が１００ｆｓｅｃ以上であることから、時間分解能として数十ｆｓｅｃ程度の精度が必要となる。この場合は、パルス光の時間幅は１０ｆｓｅｃ程度が得られていることが望ましい。従って、パルス幅としては、１０ｆｓｅｃ〜１０ｐｓｅｃのレーザ光を用いることが好ましく、さらに必要とされる精度によってそれらの中間にあたるパルス幅のレーザ光を用いることも可能となる。
【００１６】
ビームスプリッタ２２は、光源２１から発せられたパルスレーザ光Ｐ１１を２分割し、その一方（パルスレーザ光Ｐ１２）をガルバノミラー２５に導くとともに、他方（パルスレーザ光Ｐ１３）をフォトニック結晶ファイバ２３に導く。
【００１７】
ガルバノミラー２５は、モータ２６によって矢印ａで示す方向に回動し得る回動軸２７に支持されており、ビームスプリッタ２２から到来したパルスレーザ光Ｐ１２を反射させてポリゴンミラー３１へ導くとともに、モータ２６による回動軸２７の回動動作によって、ポリゴンミラー３１へ導かれるパルスレーザ光Ｐ１２を、ｙ方向に走査させる。
【００１８】
ポリゴンミラー３１は、モータ３３によって矢印ｂで示す方向に回動し得る回動軸３２に支持されており、ガルバノミラー２５から到来したパルスレーザ光Ｐ１２を反射させて対物レンズ３５に導くとともに、モータによる回動軸３２の回動動作によって、対物レンズ３５に導かれるパルスレーザ光Ｐ１１を、ｘ方向に走査させる。
【００１９】
このように、対物レンズ３５に入射される第１のパルスレーザ光Ｐ１２は、ガルバノミラー２５及びポリゴンミラー３１の回動動作によって、ｘ方向及びｙ方向に走査可能となっている。
【００２０】
一方、フォトニック結晶ファイバ２３は、入力パルス強度に応じて該入力パルスを広帯域化して出力する光ファイバであり、ビームスプリッタ２２から得られるパルスレーザ光Ｐ１３を、波長が６００ｎｍ〜１２００ｎｍのスーパーコンティニュウム光（超広帯域光）Ｐ１４に変換する。
【００２１】
フィルタ４１は、フォトニック結晶ファイバ２３から出射されるスーパーコンティニュウム光Ｐ１４の波長を９００ｎｍ〜１２００ｎｍの範囲に制限する。この波長域が制限されたパルスレーザ光Ｐ１４´は、ミラー４２において反射されてガルバノミラー４３に導かれる。
【００２２】
ガルバノミラー４３は、モータ４４によって矢印ｃで示す方向に回動し得る回動軸４５に支持されており、フィルタ４１から到来したパルスレーザ光Ｐ１４´を反射させてポリゴンミラー５１へ導くとともに、モータ４４による回動軸４５の回動動作によって、ポリゴンミラー５１へ導かれるパルスレーザ光Ｐ１４´をｙ方向に走査させる。
【００２３】
ポリゴンミラー５１は、モータ５３によって矢印ｄで示す方向に回動し得る回動軸５２に支持されており、ガルバノミラー４３から到来したパルスレーザ光Ｐ１４´を反射させて対物レンズ３５に導くとともに、モータによる回動軸５２の回動動作によって、対物レンズ３５に導かれるパルスレーザ光Ｐ１４´をｘ方向に走査させる。
【００２４】
このように、対物レンズ３５に入射されるパルスレーザ光Ｐ１４´は、ガルバノミラー４３及びポリゴンミラー５１の回動動作によって、ｘ方向及びｙ方向に走査可能となっている。対物レンズ３５は、パルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´を分析対象物６０の表面に集光させる。
【００２５】
かくして、図２に示すように、顕微鏡装置２０を制御するコンピュータ６５は、モータ３３、５３を駆動制御してポリゴンミラー３１、５１を回転させることにより、パルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´をｘ方向に主走査させるとともに、モータ２６、４４を駆動制御してガルバノミラー２５、４３を断続的に回動させることにより、これらのパルスレーザ光をｙ方向に副走査させることができる。これにより、分析対象物６０の表面に照射されるこれら２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´を走査させることができる。この場合、この顕微鏡装置２０を制御するコンピュータ６５は、ポリゴンミラー３１、５１及びガルバノミラー２５、４３の回転量を調整することにより、分析対象物６０の表面が平面である限りにおいて、２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´を分析対象物６０の表面の一点に集光させながらこれらを走査させるとともに、この走査制御に加えて後述する照射位置の調整処理により、分析対象物６０の表面に凹凸がある場合にも、２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´を常に一点に集光させながらこれらを走査させるようになされている。
【００２６】
このように、分析対象物６０の表面の一点に２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´を集光させることにより、非線形光学過程によりコヒーレントアンチストークスラマン散乱光（ＣＡＲＳ光）Ｃ１が発生する。このコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ１は、対物レンズ３５及びハーフミラー５５を介してダイクロイックミラー５６に導かれる。
【００２７】
ダイクロイックミラー５６は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ１を、波長６５０ｎｍの光Ｐ１６と波長７２０ｎｍの光Ｐ１５とに分ける。波長６５０ｎｍの光Ｐ１６は、検出器６１に入射され、また、波長７２０ｎｍの光Ｐ１５は、検出器６２に入射される。検出器６１は、入射した波長６５０ｎｍの光Ｐ１６をフォトダイオード又は光電子増倍管等によって光電変換することにより、ＣＡＲＳ光信号Ｓ１を得る。また、検出器６２は、入射した波長７２０ｎｍの光Ｐ１５をフォトダイオード又は光電子増倍管等によって光電変換することにより、ＣＡＲＳ光信号Ｓ２を得る。ＣＡＲＳ光信号Ｓ１は、コンピュータ６５に入力され、また、ＣＡＲＳ光信号Ｓ２は、コンピュータ６６に入力される。
【００２８】
コンピュータ６６は、ＣＡＲＳ光信号Ｓ２に基づいて、分析対象物６０に含まれる検出対象である物質の分布を画像表示する。
【００２９】
すなわち、２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´が分析対象物６０の表面に集光されると、その集光位置に検出対象である物質が存在する場合には、２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´の角周波数ω０及びω２に対して、ω１＝2ω０―ω２で表される角周波数ω１を持つシグナル光が発生する。この角周波数の関係を波長λの関係式で表すと、パルスレーザ光Ｐ１２（すなわちパルスレーザ光Ｐ１１）の波長をλ０、パルスレーザ光Ｐ１４´の波長をλ２、検出器６１、６２において検出するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ１（シグナル光）の波長をλ１とすると、１／λ１＝２／λ０−１／λ２となる。この波長λ１を持つシグナル光が発生した場合に、検出対象である物質が分析対象に存在することが分かり、その強度によって濃度が分かる。
【００３０】
この実施の形態の場合、波長λ１が７２０ｎｍであるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ１（シグナル光）を発生する物質を検出対象としており、これに応じて、パルスレーザ光Ｐ１１の波長λ０を８００ｎｍに設定するとともに、波長λ２として９００ｎｍを含むパルスレーザ光Ｐ１４´をフォトニック結晶ファイバ２３によって得るようになされている。なお、フォトニック結晶ファイバ２３から出力されるスーパーコンティニュウム光Ｐ１４は、６００ｎｍ〜１２００ｎｍの波長を含むが、検出対象から発せられるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ1(シグナル光)の波長が７２０ｎｍであることにより、分析対象物６０に入射されるパルスレーザ光Ｐ１４´と分析対象物６０から発せられるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ1(シグナル光)との波長が重複しないように、フィルタ４１によって６００ｎｍ以上９００ｎｍ未満の波長帯域を制限している。
【００３１】
かくして、分析対象物６０に照射されるパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´は、ガルバノミラー２５、４３及びポリゴンミラー３１、５１の回転動作によって分析対象物６０の表面を走査し、コンピュータ６６は、検出器６２において検出されたＣＡＲＳ光信号Ｓ２に基づいて、分析対象物６０の表面の状態を画像表示する。この画像のなかで波長が７２０ｎｍの光が発生している部分が他の部分に比べて明るく表示されることとなり、この部分に検出対象である物質が存在することが分かり、さらにその輝度によって物質の濃度を判断することができる。
【００３２】
ここで、この実施の形態においては、検出対象である物質に加えて、分析対象物６０の全体に亘って常時存在する物質（例えば、細胞膜を形成する脂質分子）を検出するようになされており、この物質の検出結果に基づいて２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´の照射位置を一致させる調整を行う。
【００３３】
すなわち、フォトニック結晶ファイバ２３及びフィルタ４１によって得られるパルスレーザ光Ｐ１４´の波長帯域（９００ｎｍ〜１２００ｎｍ）は、波長１０４０ｎｍを含むように設定されている。この波長をλ２として、上述の波長λの関係式から、波長λ１＝６５０ｎｍのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ1(シグナル光)がそれに対応した特定の物質の存在により発生することが分かる。この波長λ１＝６５０ｎｍのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ1(シグナル光)を発生させる特定の物質が脂質分子である。因みに、脂質分子のＣ−Ｈ伸縮運動に由来するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ１(シグナル光)は、照射光（パルスレーザ光Ｐ１２）からの周波数シフトが、波数換算で２８００ｃｍ−１乃至３２００ｃｍ−１の間にある。この波長のコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ1(シグナル光)は、ダイクロイックミラー５６によって検出器６１に入射され、この検出機６１によってＣＡＲＳ光信号Ｓ１に変換された後、コンピュータ６５に入力される。
【００３４】
かくして、ガルバノミラー２５、４３及びポリゴンミラー３１、５１の回転動作によって、パルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´が分析対象物６０の表面を走査すると、波長が６５０ｎｍのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ１（シグナル光）が常に発生することになり、ＣＡＲＳ光信号Ｓ１が検出器６１から常時出力される。
【００３５】
分析対象物６０においては、照射される２つのパルスレーザ光（パルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´）が同一箇所に照射される場合に、発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ１（シグナル光）の光強度が最大となり、その結果ＣＡＲＳ光信号Ｓ１の出力が最大となる。
【００３６】
従って、コンピュータ６５は、検出器６１から得られるＣＡＲＳ光信号Ｓ１の値が常に最大となるようにポリゴンミラー５１の回転位置を調整して、２つのパルスレーザ光（パルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´）が互いに同一箇所を照射するように制御しながら、これら２つのパルスレーザ光が分析対象物６０の表面を走査するようになされている。この場合、コンピュータ６５は、ポリゴンミラー５１を回転させるためのモータ５３を制御することにより、一方のパルスレーザ光Ｐ１４´の照射位置を調整するようになされている。
【００３７】
図３は、コンピュータ６５による照射位置の制御手順を示し、コンピュータ６５は、ステップＳＴ１１において、ガルバノミラー２５、４３及びポリゴンミラー３１、５１を回転させることにより、２つのパルスレーザ光（パルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´）を走査させる。なお、図２に示す制御手順を実行する前処理として、コンピュータ６５は、ステップＳＴ１１において、ガルバノミラー２５、４３及びポリゴンミラー３１、５１の回転位置を調整することにより、２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´が分析対象物６０の同一箇所を照射するように調整されているものとする。
【００３８】
ステップＳＴ１１において２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´が分析対象物６０の表面を走査すると、コンピュータ６５は、ステップＳＴ１２に移って、検出器６１から得られるＣＡＲＳ光信号Ｓ１の信号レベルを測定し、続くステップＳＴ１３において、ＣＡＲＳ光信号Ｓ１の信号レベルが１０ｎＷよりも小さいか否かを判断する。ここで否定結果が得られると、このことは、分析対象物６０の表面を走査する２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´が同じ位置を照射していることを意味しており、コンピュータ６５は、ステップＳＴ１３からステップＳＴ１４に移って、検査を終了するか否かを判断する。
【００３９】
ステップＳＴ１４において否定結果が得られると、このことは、２つのパルスレーザ光が分析対象物６０の表面を走査中であることを意味しており、コンピュータ６５は、ステップＳＴ１４から上述のステップＳＴ１１に戻って、２つのパルスレーザ光による走査を続行する。
【００４０】
これに対してステップＳＴ１４において肯定結果が得られると、このことは、分析対象物６０に対する２つのパルスレーザ光の走査が終了したことを意味しており、コンピュータ６５は、当該制御手順を終了する。因みに、コンピュータ６５は、ガルバノミラー２５、４３及びポリゴンミラー３１、５１の回転位置に基づいて、分析対象物６０に対する２つのパルスレーザ光の照射位置を把握しており、この照射位置に基づいて、分析対象物６０の表面の全てを走査終了したか否かを判断することができる。
【００４１】
一方、ステップＳＴ１３において肯定結果が得られると、このことは、２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´の照射位置がずれていることを意味しており、コンピュータ６５は、ステップＳＴ１３からステップＳＴ１５に移って、２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´の照射位置を調整する。
【００４２】
このステップＳＴ１５において、コンピュータ６５は、まず、モータ５３を制御することにより、ポリゴンミラー５１の回転位置を微調整して、一方のパルスレーザ光Ｐ１４´の照射位置をｘ方向に微調整する。このようにして、２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´の相対的な照射位置を微調整する。そして、コンピュータ６５は、ステップＳＴ１６に移って、この一方のパルスレーザ光Ｐ１４´の照射位置が微調整された状態で、検出器６１から出力されるＣＡＲＳ光信号Ｓ１の信号レベルを測定し、続くステップＳＴ１７においてＣＡＲＳ光信号Ｓ１の信号レベルが１０ｎＷよりも小さいか否かを判断する。
【００４３】
このステップＳＴ１７において肯定結果が得られると、このことは、上述のステップＳ１５における調整では２つのパルスレーザ光の照射位置が一致しないことを意味しており、この場合、コンピュータ６５は、上述のステップＳＴ１５に戻って、さらにパルスレーザ光Ｐ１４´の照射位置を微調整する。この微調整において、コンピュータ６５は、例えば、パルスレーザ光Ｐ１４´の照射位置を前回微調整した方向（ｘ方向）と同一方向にさらに移動させる調整、又は逆方向に移動させる調整等を行う。ステップＳＴ１７において肯定結果が得られる間は、ステップＳＴ１５においてパルスレーザ光Ｐ１４´の照射位置の微調整を繰り返すことにより、２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´は、やがて照射位置が一致することとなる。そして、この場合、コンピュータ６５は、ステップＳＴ１７において否定結果を得ることにより、ステップＳＴ１７からステップＳＴ１８に移って、検査を終了するか否かを判断する。ここで否定結果が得られると、このことは、２つのパルスレーザ光が分析対象物６０の表面を走査中であることを意味しており、コンピュータ６５は、ステップＳＴ１８から上述のステップＳＴ１１に戻って、２つのパルスレーザ光による走査を続行する。
【００４４】
これに対してステップＳＴ１８において肯定結果が得られると、このことは、分析対象物６０に対する２つのパルスレーザ光の走査が終了したことを意味しており、コンピュータ６５は、当該制御手順を終了する。
【００４５】
以上説明した構成の顕微鏡装置２０において、２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´の照射位置を検出器６１からのフィードバックによって調整する処理を行わずに、これら２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´を分析対象物６０の表面に照射して走査させると、分析対象物６０の表面の凹凸に応じて２つのパルスレーザ光の照射位置が変化する。この変化が発生すると、分析対象物６０の表面にこれら２つのパルスレーザ光が集中しなくなることにより、これら２つのパルスレーザ光の照射により発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ1(シグナル光)の発光強度も小さくなる。この結果、検出器６１、６２から出力されるＣＡＲＳ光信号Ｓ１、Ｓ２の信号レベルが低くなる。
【００４６】
このように検出器６１からのフィードバックによる照射位置の調整が行われていない状態においては、分析対象物６０の表面の凹凸によってＣＡＲＳ光信号Ｓ１、Ｓ２の信号レベルが変化する。
【００４７】
ここで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ1(シグナル光)により、分析対象物６０に含まれる特定物質の検出を行う場合、検出器６２から出力されるＣＡＲＳ光信号Ｓ２の信号レベルに基づいてこの特定物質の濃度分布を検出することができるが、分析対象物６０の表面の凹凸によってコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ1(シグナル光)の強度が変化すると、正確な濃度分布を検出することが困難になる。そこで、本実施の形態に係る顕微鏡装置２０においては、分析対象物６０の全体に亘って常時存在する普遍的な物質（例えば脂質）からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ1(シグナル光)を検出器６１によって検出することにより、該物質の分布による強度変化が含まれないコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ1(シグナル光)を得ることができる。すなわち、この検出器６１において検出されるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ1(シグナル光)の強度は、分析対象物６０の表面の凹凸の状態を反映するものであり、コンピュータ６５は、検出器６１から出力されるＣＡＲＳ光信号Ｓ１をモニタ信号として用い、この信号のレベルが１０ｎＷを下回った場合に、２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´の照射位置が分析対象物表面の凹凸によりずれているものとしてパルスレーザ光の照射位置を調整する。これに対して、ＣＡＲＳ光信号Ｓ１が１０ｎＷを超えている場合は、２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´の照射位置が一致していることになり、この場合は走査を続行する。因みに、分析対象物６０に常時存在する物質（例えば脂質）の濃度が一様でない場合であっても、２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´の照射位置が一致していれば、ＣＡＲＳ光信号Ｓ１が１０ｎＷ以上のレベルを維持しながら、その濃度に応じて変化することになり、また検出器６１及び６２に導かれる光は、ダイクロイックミラー５６によって分けられていることにより、検出器６２において検出目的である物質の分布を正しく反映したＣＡＲＳ光信号Ｓ２を得ることができる。
【００４８】
このように、本実施の形態においては、本来の目的とするＣＡＲＳ光（放出光）とは異なる波長を持つＣＡＲＳ光（放出光）を参照信号として用いて２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´の照射位置を一致させる点を特徴としている。一般に、分析対象中における特定分子の分布を画像化して得るためには、放出光強度が分子の濃度に応じて増加することを利用して、放出光強度を画像の濃淡として表現するようになされている。放出光の波長は、検出すべき目的分子、例えばタンパク分子によって決定されるが、この波長を持つ放出光の強度は、複数のパルスレーザ光の照射位置が一致しているか否かに依存するため、一致していることが保証されなければ正確な分布状況を画像情報として取り出すことはできない。ここで、一般に生体試料においては、例えば細胞膜を形成している脂質分子のように、分析対象物以外の物質で普遍的に存在するものがある。本実施の形態においては、このような普遍的に存在する分子に由来する放出光をモニタ信号として取り出し、パルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´による照射位置の誤差を補正する。このような放出光は、例えば脂質分子のＣ−Ｈ伸縮運動に由来する信号として、ＣＡＲＳ光では照射されるパルスレーザ光からの周波数シフトが波数換算で２８００ｃｍ−１乃至３２００ｃｍ−１の間にある。この信号強度を一定にするような調整機構を備えることにより、分析対象物６０の凹凸によらず分析対象物６０の表面の同一箇所にパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´を照射することが可能となり、分析対象物６０中の目的分子の分布状況を精密に測定することが可能となる。なお、本実施の形態においては、分析対象物６０の表面にパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´を集光する場合について述べたが、これに限らず、例えば表面から一定の深さにある箇所に集光させるようにしてもよい。
【００４９】
なお、分析対象物６０として、例えば図４に示すように、深さＤ＝２０μｍ、凹部幅Ｗ１＝５０μｍ、凸部幅Ｗ２＝６０μｍの凹凸が形成された表面に、直径が１μｍのポリスチレン球７１を並べ、さらに該表面にキャスターオイルを塗布したものを用い、この分析対象物６０の表面に顕微鏡装置２０によってパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´を照射し、走査させることにより、コンピュータ６６においてポリスチレン球７１の分布状況を画像表示することができた。
【００５０】
以上の構成によれば、分析対象物６０の全体に亘って常に存在する物質から発せられるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ1(シグナル光)の強度に基づいて、２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´の照射位置を相対的に調整するようにしたことにより、分析対象物６０の表面の凹凸状態の影響を受けることなく、検出対象である物質の分布状況を測定することができる。
【００５１】
（第２の実施の形態）
図５に示すように、第２の実施の形態に係る顕微鏡装置１２０は、誘導パラメトリック蛍光（ＳＰＦ；stimulated parametric fluorescence）方式の顕微鏡装置であり、第１の実施の形態に係る顕微鏡装置２０の場合と同様にして、分析対象物６０において普遍的に存在する物質から発せられる蛍光（ＳＰＦ光）を抽出して、２つのパルスレーザ光の照射位置を相対的に調整するようになされている。なお、図５において、図１との対応部分には同一符号を付し、重複した説明は省略する。因みに、この実施の形態において、顕微鏡装置１２０に分析部（コンピュータ６６）を加えることにより分析装置が構成される。
【００５２】
図５において、光源１２１は、中心波長６００ｎｍ、半値幅１００ｆｓｅｃ、繰り返しレート８０ＭＨｚ、平均出力３００ｍＷのパルスレーザ光Ｐ１０１を発する。このパルスレーザ光Ｐ１０１は、ガルバノミラー２５及びポリゴンミラー３１を介して対物レンズ３５に入射される。
【００５３】
また、光源１２２は、中心波長８００ｎｍ、半値幅１００ｆｓｅｃ、繰り返しレート８０ＭＨｚ、平均出力３００ｍＷのパルスレーザ光Ｐ１０２を発する。このパルスレーザ光Ｐ１０２は、ミラー１１１において反射してハーフミラー１１２に導かれる。
【００５４】
さらに、光源１２３は、中心波長６２１ｎｍ、半値幅１００ｆｓｅｃ、繰り返しレート８０ＭＨｚ、平均出力３００ｍＷのパルスレーザ光Ｐ１０３を発する。このパルスレーザ光Ｐ１０３は、ハーフミラー１１２に入射される。ハーフミラー１１２は、光源１２２からのパルスレーザ光Ｐ１０２と、光源１２３からのパルスレーザ光Ｐ１０３とを合わせることによりパルスレーザ光Ｐ１０４を得る。
【００５５】
ハーフミラー１１２によって合わせられたパルスレーザ光Ｐ１０４は、ミラー４２、ガルバノミラー４３及びポリゴンミラー５１を介して対物レンズ３５に入射され、分析対象物６０の表面に照射される。
【００５６】
分析対象物６０の表面に照射されるパルスレーザ光Ｐ１０１及びＰ１０４は、ポリゴンミラー３１、５１による主走査と、ガルバノミラー２５及び４３による副走査により、分析対象物６０の表面を走査する。
【００５７】
本実施の形態に係る顕微鏡装置１２０は、誘導パラメトリック蛍光法により分析対象物６０に含まれる物質の検出を行うようになされている。この誘導パラメトリック蛍光法は、図６のエネルギーダイアグラムに示すように、２本のパルスレーザ光Ｐ１０１及びＰ１０４を分析対象物６０に照射することにより、該照射位置に存在する物質に応じて、ＳＰＦ光（蛍光）Ｋ１を得るものである。このＳＰＦ光Ｋ１は、ダイクロイックミラー５６によって２つのＳＰＦ光Ｐ１０５、Ｐ１０６に分けられて、その一方のＳＰＦ光Ｐ１０６は検出器６１に入射され、他方のＳＰＦ光Ｐ１０５は、検出器６２に入射される。この場合、パルスレーザ光Ｐ１０１の角周波数をω０、パルスレーザ光Ｐ１０２（Ｐ１０３）の角周波数をω２、とすると、角周波数がω１＝２ω０−ω２であるＳＰＦ光Ｐ１０５（Ｐ１０６）を得る。
【００５８】
この角周波数の関係を波長λの関係式で表すと、パルスレーザ光Ｐ１０１の波長をλ０、パルスレーザ光Ｐ１０２（Ｐ１０３）の波長をλ２、分析対象から得られるＳＰＦ光Ｋ１（すなわちダイクロイックミラー５６において分けられたＳＰＦ光Ｐ１０５（Ｐ１０６）の波長をλ１とすると、１／λ１＝２／λ０−１／λ２となる。この波長λ１を持つＳＰＦ光が発生した場合に、検出対象である物質が分析対象に存在することが分かり、その強度によって濃度が分かる。
【００５９】
この実施の形態の場合、波長λ１が４８０ｎｍであるＳＰＦ光Ｋ１（Ｐ１０５）を発生する物質を検出対象としており、これに応じて、光源１２１から出力されるパルスレーザ光Ｐ１０１の波長λ０を６００ｎｍに設定するとともに、光源１２２は、波長λ２が８００ｎｍであるパルスレーザ光Ｐ１０２を出力するようになされている。波長λ１が４８０ｎｍであるＳＰＦ光Ｐ１０５は、分析対象物６０において得られるＳＰＦ光Ｋ１からダイクロイックミラー５６によって分けられて検出器６２に入射される。検出器６２は、このＳＰＦ光Ｐ１０５を光電変換することにより、ＳＰＦ光信号Ｓ１０２を得、これをコンピュータ６６に出力する。コンピュータ６６は、このＳＰＦ光信号Ｓ１０２に基づいて、検出対象である物質の分布を得ることができる。
【００６０】
また、この実施の形態の場合、分析対象物６０に普遍的に存在する物質（例えば脂質）から得られるＳＰＦ光Ｐ１０６を検出器６１によって検出し、この検出結果に基づいて、２つのパルスレーザ光Ｐ１０１及びＰ１０４の照射位置を一致させるようになされている。この普遍的に存在する物質から得られるＳＰＦ光Ｐ１０６の波長λ１は５８０ｎｍであり、これに応じて、光源１２１から出力されるパルスレーザ光Ｐ１０１の波長λ０を６００ｎｍに設定するとともに、光源１２３は、波長λ２が６２１ｎｍであるパルスレーザ光Ｐ１０３を出力するようになされている。波長λ１が５８０ｎｍであるＳＰＦ光Ｐ１０６は、分析対象物６０において得られるＳＰＦ光Ｋ１からダイクロイックミラー５６によって分けられて検出器６１に入射される。検出器６１は、ＳＰＦ光Ｐ１０６を光電変換することにより、ＳＰＦ光信号Ｓ１０１を得る。このＳＰＦ光信号Ｓ１０１は、ＳＰＦ光Ｐ１０６の強度に応じて信号レベルが変化する。
【００６１】
コンピュータ６５は、図３において上述した処理と同様にして、検出器６１から得られるＳＰＦ光信号Ｓ１０１の信号レベルを検出し、この信号レベルが１０ｎＷ未満である場合には、ポリゴンミラー５１の回転位置を調整することにより、信号レベルが常に１０ｎＷ以上となるように制御する。これにより、分析対象物６０の表面に凹凸がある場合であっても、分析対象物６０の表面を走査する２つのパルスレーザ光Ｐ１０１及びＰ１０４の照射位置を常に一致させることができる。
【００６２】
このように照射位置が調整されたパルスレーザ光Ｐ１０１及びＰ１０４によって分析対象物６０から得られるＳＰＦ光Ｐ１０５は、検出対象である物質の分布及び濃度を正確に表すこととなる。
【００６３】
以上の構成によれば、分析対象物６０の全体に亘って常に存在する物質から発せられるＳＰＦ光Ｋ１（Ｐ１０６）の強度に基づいて、２つのパルスレーザ光Ｐ１０１及びＰ１０４の照射位置を相対的に調整するようにしたことにより、分析対象物６０の表面の凹凸状態の影響を受けることなく、検出対象である物質の分布状況を測定することができる。
【００６４】
（他の実施の形態）
なお上述の実施の形態においては、分析対象物６０に普遍的に存在する物質として脂質を選択し、この脂質において発生するＣＡＲＳ光またはＳＰＦ光を基に２つのパルスレーザ光の照射位置を相対的に調整する場合について述べたが、脂質に限らず、分析対象物６０の全体にわたって常に存在する物質であればよく、その物質においてＣＡＲＳ光またはＳＰＦ光が発生するような波長のパルスレーザ光を照射するようにすればよい。
【００６５】
また上述の実施の形態においては、分析対象物６０に照射する２つのパルスレーザ光のうちの一方を調整することによりこれら２つのパルスレーザ光の相対的な照射位置を調整してこれらの照射位置を一致させるようにしたが、２つのパルスレーザ光の照射位置をそれぞれ調整することにより、それらの照射位置を一致させるようにしてもよい。
【００６６】
また上述の実施の形態においては、２つのパルスレーザ光の照射位置をポリゴンミラー５１により一致させる場合について述べたが、ガルバノミラー４３による調整を加えるようにしてもよい。
【００６７】
また上述の実施の形態においては、分析対象物６０の表面に２つのパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´（Ｐ１０１及びＰ１０４）を集光させる場合について述べたが、これに限らず、例えば表面から一定の深さにある箇所に集光させるようにしてもよい。
【００６８】
また上述の実施の形態においては、分析対象物６０において発生したＣＡＲＳ光またはＳＰＦ光をパルスレーザ光の入射側において取り込む場合について述べたが、本発明はこれに限られるものではなく、パルスレーザ光の入射側とは反対側において取り込むようにしてもよい。
【００６９】
また上述の実施の形態においては、ポリスチレン球の分布を測定する場合について述べたが、本発明はこれに限られるものではなく、他の種々の物質を検出する場合に広く適用することができる。この場合、分析対象物６０に照射するパルスレーザ光の波長を検出目的の物質に対応させればよい。
【００７０】
また上述の実施の形態においては、２種類のパルスレーザ光Ｐ１２及びＰ１４´（Ｐ１０１及びＰ１０４）を分析対象物６０に照射する場合について述べたが、本発明はこれに限られるものではなく、３種類以上のパルスレーザ光を照射する場合においても適用することができる。例えば３種類のパルスレーザ光の照射位置を一致させる場合、まず２つのパルスレーザ光の照射位置を一致させた後、残りのパルスレーザ光の照射位置をこれらに一致させるようにすればよい。
【００７１】
また上述の実施の形態においては、分析対象物６０に２つのパルスレーザ光を照射するとともに、検出対象である物質からＣＡＲＳ光またはＳＰＦ光を生じさせるための波長と、普遍的に存在する物質からＣＡＲＳ光またはＳＰＦ光を生じさせるための波長とを一方のパルスレーザ光に含むようにしたが、これら２つの波長成分を別々のパルスレーザ光によって照射するようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】第１の実施の形態に係る顕微鏡装置を示すブロック図である。
【図２】２つのパルスレーザ光による分析対象物の表面の走査状態を示す概略図である。
【図３】図１の顕微鏡装置のコンピュータによる照射位置の制御手順を示すフローチャートである。
【図４】分析対象物の構成を示す側面図である。
【図５】第２の実施の形態に係る顕微鏡装置を示すブロック図である。
【図６】図５の顕微鏡装置における誘導パラメトリック蛍光法の説明に供するエネルギーダイアグラムである。
【図７】コヒーレントアンチストークスラマン散乱法の説明に供する概略図である。
【図８】コヒーレントアンチストークスラマン顕微鏡を示すブロック図である。
【符号の説明】
【００７３】
２０、１２０、２２０  顕微鏡装置
２１、１２１、１２２、１２３  光源
２２  ビームスプリッタ
２３  フォトニック結晶ファイバ
２５、４３  ガルバノミラー
２６、３３、４４、５３  モータ
３１、５１  ポリゴンミラー
３５  対物レンズ
４１  フィルタ
４２、１１１  ミラー
５５、１１２  ハーフミラー
５６  ダイクロイックミラー
６０  分析対象物
６１、６２  検出器
６５  コンピュータ
Ｃ１  コヒーレントアンチストークスラマン散乱光（ＣＡＲＳ光）Ｃ１
Ｋ１  ＳＰＦ光
【図１】
2008076361.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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