(57)【要約】【課題】有機酸の新たな用途を提供すること。【解決手段】ピログルタミン酸、コハク酸、リンゴ酸、乳酸及び酢酸といった有機酸が細胞外マトリックス分解酵素阻害剤として機能することが見出された。この細胞外マトリックス分解酵素阻害剤はゼラチナーゼＡ阻害剤として特に有効に機能する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸からなる細胞外マトリックス分解酵素阻害剤。
【請求項２】
前記有機酸が、ピログルタミン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、酢酸、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種を含有する、請求項１に記載の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤。
【請求項３】
ゼラチナーゼＡ阻害剤である、請求項１又は２に記載の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外マトリックス分解酵素阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピログルタミン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、乳酸、酢酸、酒石酸といった有機酸は、自然食品等に含有されており、食品分野や化学分野等において工業的に広く使用されている。
【０００３】
ピログルタミン酸は、アミノ酸の一種であり、ＰＣＡ（Ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ）とも呼ばれる。生体内で、遊離グルタミン酸が温度やｐＨの影響を受けることにより、そのアミノ基と側鎖のカルボキシル基とが結合して環化し、ピログルタミン酸が生成する。ピログルタミン酸は、野菜、果物、乳製品、肉等の食品素材に広く含まれており、人間の脳や脊髄液、血液の中にも大量に存在する。従来、ピログルタミン酸は、神経伝達物質の活動や産生と関わり、脳を刺激して記憶力を強化することが知られている（特許文献１参照）。
【０００４】
クエン酸、コハク酸、乳酸、酒石酸等は、食品添加物として醸造工業や飲料、食品の製造に用いられる。リンゴ酸は、酸味料として清涼飲料や加工食品に、また乳化安定剤や消臭剤、洗剤、中和剤として工業用途に用いられる。酢酸は、写真、試薬、染色、食用、医薬等に幅広く用いられる（非特許文献１）。
【特許文献１】特開平５−１１７２３２号公報
【非特許文献１】１５１０７の化学商品、２００７年１月、化学工業日報社
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、このように多くの自然食品素材に含まれ、安全性が高く入手が容易な有機酸には、更なる有用な用途が見出されることが期待されている。
【０００６】
すなわち、本発明の目的は、有機酸の新たな用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、有機酸について、更なる有用な用途に関する検討を行なった結果、有機酸が細胞外マトリックス分解酵素活性阻害作用を有することを発見し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、有機酸からなる細胞外マトリックス分解酵素阻害剤を提供するものである。
【０００８】
有機酸は、ピログルタミン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、酢酸、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種を含有することが好ましい。これら有機酸を用いることにより、阻害活性のすぐれた細胞外マトリックス分解酵素阻害剤を提供することができる。
【０００９】
本発明の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤は、特にゼラチナーゼＡ阻害活性を有することによって、優れた抗シワ効果を発揮する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、有機酸の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤としての新たな用途を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１２】
本発明の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤は、有機酸からなる。
【００１３】
本発明における有機酸の内、ピログルタミン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、その立体異性体及び互変体を含むものである。すなわち、ピログルタミン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンには２つの立体異性体（Ｄ及びＬ）があるが、いずれも細胞外マトリックス分解酵素阻害剤として機能する。従って、本発明の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤は、一方の立体異性体のみからなっていても、２つの立体異性体の任意の比の混合物であってもよい（例えば、ラセミ体であってもよい）。
【００１４】
なお、Ｄ−ピログルタミン酸は、Ｄ−ピロリドンカルボン酸等の名称でも知られ、Ｌ−ピログルタミン酸は、Ｌ−ピロリドンカルボン酸等の名称でも知られている。
【００１５】
細胞外マトリックス分解酵素阻害剤は、細胞外マトリックス分解酵素活性阻害作用を有する物質である。細胞外マトリックス分解酵素は、マトリックスメタロプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ：Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）等とも呼ばれる、細胞外マトリックスの代謝に関わる酵素である。
【００１６】
一般に、動物の結合組織は、コラーゲンやプロテオグリカンを主成分とする細胞外マトリックスにより構成されている。細胞外マトリックスの代謝は、細胞外マトリックス分解酵素（以下「ＭＭＰ」という。）と生体内阻害因子（ＴＩＭＰ：Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌｌｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）とのバランスにより調節されているが、このうち、ＭＭＰは、細胞外マトリックスを分解又は変性することにより、皮膚の弾力性の低下、及びそれに伴うシワやタルミの発生の原因となると考えられている。
【００１７】
ＭＭＰのうち、ＭＭＰ１（コラゲナーゼ）は、真皮に分布する膠原繊維であるＩ型コラーゲン等を基質とし、ＭＭＰ２（ゼラチナーゼＡ）は、基底膜に分布するＩＶ型コラーゲンや変性コラーゲンであるゼラチン、真皮に分布するＶ型コラーゲンや弾性繊維であるエラスチン、軟結合組織及び基底膜に分布する糖タンパク質であるフィブロネクチン等を基質とする。
【００１８】
ＭＭＰ１及びＭＭＰ２は、このように、皮膚のハリを保つ上で重要な基質を分解又は変性するため、皮膚のシワやタルミの発生と特に関わりがあると考えられている。また、ＭＭＰ１及びＭＭＰ２は、皮膚に紫外線が当たると活性化されるため、紫外線による皮膚マトリックスの損傷にも関わっていると考えられている。
【００１９】
本発明のＭＭＰ阻害剤は、これらＭＭＰの中でも特にＭＭＰ２（ゼラチナーゼＡ）の活性を阻害することにより、皮膚のシワやタルミの発生を防止し、皮膚のハリを保つ効果を発揮する。すなわち、本発明のＭＭＰ阻害剤は、皮膚シワ防止剤、皮膚タルミ防止剤、皮膚ハリ改善剤等として機能する。
【００２０】
本発明のＭＭＰ阻害剤は、皮膚外用剤として用いることができる。その場合、直接皮膚に塗布することもできるし、他の物質を混ぜて用いてもよい。
【００２１】
本発明のＭＭＰ阻害剤は、化粧品、トイレタリー、オーラルケア製品、食品、飲料又は医薬品に含ませて用いることができる。本発明のＭＭＰ阻害剤を含む化粧品、食品、飲料又は医薬品は、有効成分である有機酸の他、浸潤剤、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、分散助剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤、香料、樹脂、賦形剤、防菌防黴剤、消臭・脱臭剤、酵素、精製水、アルコールを含んでもよい。また、他のＭＭＰ阻害剤を添加してもよい。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、特に明記しない限り、「％」は「質量％」を表す。
【００２３】
（実施例１）
有機酸のＭＭＰ２阻害活性
試料として、乳酸、酢酸、蟻酸、プロピオン酸、ピルビン酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸及びピログルタミン酸を用いた。
【００２４】
反応容器に、５８ｍＵ／μＬのＥ．ｃｏｌｉ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ（大腸菌組み換えヒト）ＭＭＰ２酵素液と、試料を緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％  Ｂｒｉｊ−３５、１ｍＭ  ＤＴＮＢ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液と、を添加し、１％濃度の試料を含有する反応液を調製した。３７℃にて６０分間インキュベートした後、細胞外マトリックス模擬基質溶液として１ｍＭ  Ｔｈｉｏｐｅｐｔｏｌｉｄｅ溶液（主成分はオリゴタンパク質Ａｃ−ＰＬＧ−［２−ｍｅｒｃａｐｔｏ−４−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｅｎｔａｎｏｙｌ］−ＬＧ−ＯＣ２Ｈ５）を反応液に加えた。ＭＭＰ２がＴｈｉｏｐｅｐｔｏｌｉｄｅを切断して生じるｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ（スルフヒドリル）基がＤＴＮＢ（５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）のジスルフィド結合を切断して生じるチオールを、４１２ｎｍの吸光度で検出した。試料の緩衝液溶液の代わりに緩衝液を加えたものをコントロールとして用いた。
【００２５】
インキュベーション後に細胞外マトリックス模擬溶液を加えた時点から、４１２ｎｍにおける吸光度を６０分間測定した。６０分間の経時的な吸光度の上昇を一次式で近似し、その傾きを吸光度変化量とした。得られた吸光度変化量を用いて、下記式により阻害率を求めた。下記式において、ΔＡＢＳ試料及びΔＡＢＳコントロールはそれぞれ、試料（反応液）及びコントロールについて得られた吸光度変化量を表す。
阻害率（％）＝［（ΔＡＢＳコントロール−ΔＡＢＳ試料）／ΔＡＢＳコントロール］×１００
【００２６】
表１は、各試料の、１％濃度におけるＭＭＰ２阻害活性を、上記阻害率（％）で示したものである。
【表１】
2008285472.tif 000002
【００２７】
表１に示されるように、各有機酸の１％溶液におけるＭＭＰ２阻害活性が確認された。中でも、ピログルタミン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、酒石酸及びクエン酸の１％溶液におけるＭＭＰ２阻害活性は他の有機酸と比べて高かった。
【００２８】
（実施例２）
更に、阻害活性の高かった有機酸のうち、ピログルタミン酸、クエン酸、リンゴ酸及びコハク酸について、種々の濃度でのＭＭＰ２活性を測定した。
【００２９】
表２は、ＭＭＰ２活性を５０％阻害するときの各試料の濃度（ＩＣ５０値：５０％阻害濃度）を示したものである。
【表２】
2008285472.tif 000003
【００３０】
表２に示されるように、ピログルタミン酸、クエン酸、リンゴ酸及びコハク酸は、ＩＣ５０値が非常に低く、ＭＭＰ２阻害剤として有用であることが確認された。
【００３１】
（実施例３）
試料として、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−チロシンを用いた。
【００３２】
反応容器に、５８ｍＵ／μＬのＥ．ｃｏｌｉ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ（大腸菌組み換えヒト）ＭＭＰ２酵素液と、試料を緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％  Ｂｒｉｊ−３５、ｐＨ７．５）に溶解した溶液と、を添加し、表３に示す濃度の試料を含有する反応液を調製した。３７℃にて３０分間インキュベートした後、細胞外マトリックス模擬基質溶液として０.４ｍＭの「ＯｍｎｉＭＭＰ  ｆｕｌｏｒｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ」（ＢＩＯＭＯＬ社製、商品名）を反応液に加えた。ＭＭＰ２により切断された基質から３４０ｎｍの励起光により生じる３８０ｎｍの蛍光を検出した。試料の緩衝液溶液の代わりに緩衝液を加えたものをコントロールとして用いた。
【００３３】
インキュベーション後に細胞外マトリックス模擬基質溶液を加えた時点から、３８０ｎｍにおける蛍光強度を２０分間測定した。２０分間の経時的な蛍光強度の上昇を一次式で近似し、その傾きを蛍光強度変化量とした。一方で、上記基質溶液が加えられていない反応液又はコントロールに標準蛍光試薬「ＯｍｎｉＭＭＰ  ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ」（ＢＩＯＭＯＬ社製、商品名）を濃度段階的に加えた溶液を用いて検量線を作製し、その傾きを変換係数とした。得られた蛍光強度変化量及び変換係数を用いて、下記式により阻害率を求めた。下記式において、ΔＡＢＵ試料及びΔＡＢＵコントロールはそれぞれ、試料（反応液）及びコントロールについて得られた蛍光強度変化量を表す。また、ＣＦ試料及びＣＦコントロールはそれぞれ、試料（反応液）及びコントロールについて得られた変換係数を表す。
阻害率（％）＝[（（ΔＡＢＵコントロール／ＣＦコントロール）−（ΔＡＢＵ試料／ＣＦ試料））／（ΔＡＢＵコントロール／ＣＦコントロール）]×１００
【００３４】
表３は、各試料の、表に示す濃度（％）におけるＭＭＰ２阻害活性を、上記阻害率（％）で示したものである。
【表３】
2008285472.tif 000004
【００３５】
表３に示されるように、フェニルアラニン及びトリプトファンは、ＩＣ５０値がそれぞれ０．２４％及び０．１６％と非常に低く、チロシンは、０．０４％という非常に低い濃度において、４１％という高いＭＭＰ２阻害活性を有することが確認された。すなわち、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンがＭＭＰ２阻害剤として有用であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明により提供されるＭＭＰ阻害剤は、化粧品、トイレタリー、オーラルケア製品、食品、飲料又は医薬品として好適に用いられる。