(57)【要約】  【課題】  宿主の生物学的因子を考慮に入れた、真菌症の治療薬のスクリーニング法を提供する。  【解決手段】  被験物質における、組織内へ移行した被験物質による、抗真菌作用の発現度合いの鑑別するにあたり、動物（但し、人を除く）に被験物質を投与した後、標的器官を採取し、該標的器官から深度序列を有する複数の切片を切り出し、切り出した複数の切片を真菌を播種した固形培地に接触させて培養し、固形培地に生ずる阻止円の大きさを指標に、該阻止円が大きい場合には有効量を越える被験物質が切片を切り出した組織位置に存すると判断し、阻止円が小さいか生じない場合には、有効量を下回る被験物質が切片を切り出した組織位置に存すると鑑別する。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物（但し、人を除く）に被験物質を投与した後、標的器官を採取し、該標的器官から深度序列を有する複数の切片を切り出し、切り出した複数の切片を真菌を播種した固形培地に接触させて培養し、固形培地に生ずる阻止円の大きさを指標に、該阻止円が大きい場合には有効量を越える被験物質が切片を切り出した組織位置に存すると判断し、阻止円が小さいか生じない場合には、有効量を下回る被験物質が切片を切り出した組織位置に存すると鑑別する、被験物質における、組織内へ移行した被験物質による、抗真菌作用の発現度合いの鑑別法。
【請求項２】
標的組織が、爪である請求項１に記載の鑑別法。
【請求項３】
被験物質の投与が、爪の空気接触面への塗布によって行われることを特徴とする、請求項２に記載の鑑別法。
【請求項４】
爪白癬の治療のための薬剤の選択において、感染した爪における菌の分布を鑑別し、しかる後に請求項１〜３何れか１項に記載の鑑別の方で鑑別される、薬剤ごとの、感染部位における菌の分布している部分での抗真菌作用の発現度合いを求め、該抗真菌作用の発現度合いの高い薬剤を選択することを特徴とする、爪白癬治療のための薬剤の選択法。
【請求項５】
動物より採取した標的器官に、被験物質を投与し、該標的器官から深度序列を有する複数の切片を切り出し、切り出した複数の切片を真菌を播種した固形培地に接触させて培養し、固形培地に生ずる阻止円の大きさを指標に、該阻止円が大きい場合には有効量を越える被験物質が切片を切り出した組織位置に存すると判断し、阻止円が小さいか生じない場合には、有効量を下回る被験物質が切片を切り出した組織位置に存すると鑑別する、被験物質における、組織内へ移行した被験物質による、抗真菌作用の発現度合いの鑑別法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤の作用特性の把握に有用な被験物質による抗真菌作用の発現度合いの鑑別法に関する。
【背景技術】
【０００２】
白癬症などの真菌に起因する感染症は、肺などの深部における感染症以外は命に関わる重篤なものは少ないが、難治療性という点で大きな問題を抱えている。特に近代になって靴を常用するようになり、足における真菌症は重篤度はないものの、大きな広がりを見せている。加えて、爪などの硬質組織における真菌症は、更に難治性が高まっており、完治しない爪白癬が、足白癬の種菌になることも少なからず存し、この意味で爪白癬を治療することは、薬剤経済学の点からも重要な問題となっている。この為、爪白癬を治療する薬剤の開発を行うことは、早急な問題となっているが、この様な開発研究の大きな障害になっているのが、スクリーニング系、特に、in vivo乃至は生体利用性などの生物学的因子を包含したin vivoに近いスクリーニング系の不完全さであり、この不完全さ故に、爪白癬に有効な薬剤候補物質が、スクリーニングにおいて漏れていることがその大きな原因の一つとなっている。即ち、宿主の生物学的因子を考慮に入れた、真菌症の治療薬のスクリーニング法の開発が望まれていたと言える。
【０００３】
本願発明の主題に係わる疾患の一つである、爪白癬について、更に詳細に言及すれば、爪白癬は、特に近年は平均寿命が延びたことに起因して、老年における特異的な疾患、であり、これは、年齢とともに免疫機能低下や末梢循環が悪くなると、トリコフィトン・ルブルム等の通常は皮膚真菌症を引き起こす真菌が爪に感染し、繁殖することで起こる真菌症である。かかる爪白癬には様々な感染様式があり、爪の表面から感染するもの（SWO型）、爪の生え際に感染するもの（PSO型）、爪の先端から感染するもの（DLSO型）などが挙げられ、爪中の菌の局在の違いにより、薬剤の効果にも差異が認められる。つまり、感染した爪には様々な部位に菌が局在しており、感染部位での治療効果を予測できる系ができれば、組織中の薬剤の濃度とその効果について評価出来ることになる。この内、菌の分布については、リン脂質や非イオン界面活性剤の共存下、これまでに受けた治療に起因する抗真菌剤の影響を排除しながら、組織片を培養し、生育してくる菌を検量線を用いて、播種分相当の単位あたりの生子数として求めることが出来る。（例えば、特許文献１を参照）一方、爪のどの部位にどれだけ薬剤が分布しているかについては、例えば、爪などの部位をパンチで打ち抜き、抗真菌薬剤で処理し、連続薄片切片を作成し、該薄片における、投与した抗真菌剤の濃度を測定し、薬剤のディストリビューションを求める方法は既に知られている（例えば、特許文献２を参照）。この方法により、物理的物体としての爪に対する薬剤の透過性は非常に明瞭になったが、in vivo試験であるため、生物学的因子については、評価から漏れてしまう危険が存した。又、爪のみを栄養源として真菌を培養し、その条件下、爪を通過してくる薬剤の効果を鑑別する方法も既に知られている。（例えば、特許文献３を参照）この方法も爪床における抗真菌剤の効果発現のモデルにはなり、生物学的因子を除けば、爪白癬治療モデルとしては優れたものであるが、これもin vivo試験であるため、生物学的因子については、評価から漏れてしまう危険が存した。
【０００４】
他方、動物に被験物質を投与した後、標的器官を採取し、該標的器官から深度序列を有する複数の切片を切り出し、切り出した複数の切片を真菌を播種した固形培地に接触させて培養し、固形培地に生ずる阻止円の大きさを指標に、該阻止円が大きい場合には有効量を越える被験物質が切片を切り出した組織位置に存すると判断し、阻止円が小さいか生じない場合には、有効量を下回る被験物質が切片を切り出した組織位置に存すると鑑別する、被験物質における、組織内へ移行した被験物質による、抗真菌作用の発現度合いの鑑別法は全く知られていない。
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００２／０１０４４０
【特許文献２】特開２００２−６５６９５号公報
【特許文献３】特開２００１−１３３４４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、この様な状況下為されたものであり、宿主の生物学的因子を考慮に入れた、真菌症の治療薬のスクリーニング法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、宿主の生物学的因子を考慮に入れた、真菌症の治療薬のスクリーニング法を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、動物に被験物質を投与した後、標的器官を採取し、該標的器官から深度序列を有する複数の切片を切り出し、切り出した複数の切片を真菌を播種した固形培地に接触させて培養し、固形培地に生ずる阻止円の大きさを指標に、該阻止円が大きい場合には有効量を越える被験物質が切片を切り出した組織位置に存すると判断し、阻止円が小さいか生じない場合には、有効量を下回る被験物質が切片を切り出した組織位置に存すると鑑別する、被験物質における、組織内へ移行した被験物質による、抗真菌作用の発現度合いを鑑別することにより、この様なスクリーニングが為しうることを見いだし、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、以下に示すとおりである。
（１）動物（但し、人を除く）に被験物質を投与した後、標的器官を採取し、該標的器官から深度序列を有する複数の切片を切り出し、切り出した複数の切片を真菌を播種した固形培地に接触させて培養し、固形培地に生ずる阻止円の大きさを指標に、該阻止円が大きい場合には有効量を越える被験物質が切片を切り出した組織位置に存すると判断し、阻止円が小さいか生じない場合には、有効量を下回る被験物質が切片を切り出した組織位置に存すると鑑別する、被験物質における、組織内へ移行した被験物質による、抗真菌作用の発現度合いの鑑別法。
（２）標的組織が、爪である（１）に記載の鑑別法。
（３）被験物質の投与が、爪の空気接触面への塗布によって行われることを特徴とする、（２）に記載の鑑別法。
（４）爪白癬の治療のための薬剤の選択において、感染した爪における菌の分布を鑑別し、しかる後に（１）〜（３）何れか１項に記載の鑑別の方で鑑別される、薬剤ごとの、感染部位における菌の分布している部分での抗真菌作用の発現度合いを求め、該抗真菌作用の発現度合いの高い薬剤を選択することを特徴とする、爪白癬治療のための薬剤の選択法。
（５）動物より採取した標的器官に、被験物質を投与し、該標的器官から深度序列を有する複数の切片を切り出し、切り出した複数の切片を真菌を播種した固形培地に接触させて培養し、固形培地に生ずる阻止円の大きさを指標に、該阻止円が大きい場合には有効量を越える被験物質が切片を切り出した組織位置に存すると判断し、阻止円が小さいか生じない場合には、有効量を下回る被験物質が切片を切り出した組織位置に存すると鑑別する、被験物質における、組織内へ移行した被験物質による、抗真菌作用の発現度合いの鑑別法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、宿主の生物学的因子を考慮に入れた、真菌症の治療薬のスクリーニング法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の被験物質における、組織内へ移行した被験物質による、抗真菌作用の発現度合いの鑑別法は、動物に被験物質を投与した後、標的器官を採取し、該標的器官から深度序列を有する複数の切片を切り出し、切り出した複数の切片を真菌を播種した固形培地に接触させて培養し、固形培地に生ずる阻止円の大きさを指標に、該阻止円が大きい場合には有効量を越える被験物質が切片を切り出した組織位置に存すると判断し、阻止円が小さいか生じない場合には、有効量を下回る被験物質が切片を切り出した組織位置に存すると鑑別することを特徴とする。前記動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギなどの齧歯類が特に好適に例示でき、器官の大きさから、モルモット乃至はウサギなどの大型の齧歯類が特に好ましい。又、標的器官としては、主題である爪等の表部器官、肺、脳などの深部器官の何れもが好ましく例示でき、被験物質の投与経路は、通常知られている経路であれば特段の限定無く、例えば、経口投与、注射剤による、静脈内或いは皮下投与、座剤による経直腸投与、外用剤による経皮投与或いは経爪投与などが好適に例示できる。投与は実態に合わせて行うことが好ましく、通常の想定されるスケジュールで投与し、しかる後に標的器官を採取するのが好ましい。前記スケジュールとしては、１日１回投与を１回乃至は１５回連続して行うことが好ましく例示できる。標的器官は疾患の存在する臓器などが例示でき、爪、皮膚、肺、脳等が好適に例示できる。採取した標的器官は、分布する被験物質が散逸しない条件で切片に切り出す。前記の条件としては、相溶性のない固定液での固定或いは凍結切片が好ましく例示できる。特に、凍結切片が好ましい。該切片は連続して複数枚を切り出すのが好ましく、該連続切片を播種した固形培地におき、菌の生育阻害状況をコロニー形成の阻止円の大きさなどで計測する。前記切片は、ミクロトーム、コールドトーム、クライオトームなどの切片切り出し装置で切り出すことが出来、前記切片の厚さは、１〜４０μｍであることが好ましく、２〜２５μｍであることがより好ましい。真菌に対する作用は、真菌を含有した培地上に組織片を置き、真菌の種類に応じた条件で培養し、真菌の生育に及ぼす影響を観察することにより、真菌に対する生育抑制効果として鑑別することが出来る。培養条件としては、例えば、日数１〜１０日間、温度２０〜４０℃、湿度８０〜１００％で培養するような条件が例示できる。培地としては、寒天培地、サブロー培地、サブロー改変培地など、通常真菌の培養に用いられている固形培地であれば、特段の限定はされない。リン脂質や非イオン界面活性剤などの、薬剤の不活性化成分を添加することも出来るが、その必要は全く存せず、添加しない方が正しい阻止円が求められるので好ましい。前記培養の終了後、阻止円の大きさを測定し、発育抑制作用を存じたと鑑別した。また、併せて既知の薬物濃度を染みこませたパルプディスクを用いて、同様の阻止円を作製し、阻止円の大きさから理論濃度を算出する。この様にin vivoの投与を行うことにより、深部の真菌症においては、肝代謝などの代謝の影響を加味した条件での被験物質の効果が鑑別でき、爪などの局部真菌症においては、経口投与などの被験物���の投与での被験物質の効果の鑑別ができる。この様な鑑別に適した真菌の種類としては、例えば、トリコフィトン・メンタグロファイテス、トリコフィトン・ルブルム、アスペルギルス・ニガー、カンディダ・アルビカンス等が好適に例示できる。
【００１０】
この様なスクリーニングは、動物を用いたin vivoの条件に近い条件下で行うことにより、より顕著な効果を奏するが、予め動物（人を含める）より採取した、爪などの標的器官を用いて、in vitro条件へ適用することも出来る。この様なin vitroの条件下においても、標的器官の検討部位における抗真菌剤の作用を阻止円の大きさ、例えば、阻止円の直径などのような形で定量することが出来るので、従来の方法に比して格別の効果を有する。更に、標的臓器の内部に取り込まれて、抗真菌効果を奏しない被験物質も、有効性で判断するため、過剰に高い効果として認定することも避けることが出来る。この様なin vitroのスクリーニング方法も本発明の技術的範囲に属する。
【００１１】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみに限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００１２】
ヒトの爪を組織として用いて、抗真菌剤であるシクロピロクスまたはテルビナフィン製剤の有効濃度及びその有効深度の鑑別を、本発明の鑑別法により鑑別した。健常人ボランティアより提供された手指の遊離縁をアルコールで消毒後、φ２ｍｍの穴の空いたテフロン板に挟み、ガラスセルを上下に装着した。薬剤を爪甲側に１５μL/1回/1日を塗布し、２８℃のインキュベーターで保温した。この操作を7日間実施したのち、φ２ｍｍの生検用パンチで塗布部位の爪を打ち抜いた。その後、爪をコールドトームを用いて１０μｍの厚さに薄切した。一方で、この薄切した爪（以下爪スライス）を培養は湿度１００％、２８℃、３日間の条件で行い、菌の生育抑制作用を観察した。この結果を図１に示す。これよりシクロピロックスの方が爪の表面側でしか抗菌作用がないことがわかり、テルビナフィンは爪の中程まで薬剤が到達でき、更に菌の増殖を抑制する作用がある濃度分布していることが明らかとなった。
【００１３】
シクロピロックスはＳＤＡ培地では通常２〜４μｇ／ｃｍ３がＭＩＣであると言われているが、爪内ではその１００倍でもまだ有効とは言えず、組織による有効濃度の差が存することがわかる（図２）。従って、本発明の方法により、組織内での有効濃度を求めておくことが、治療を考える上では重要なことと言える。これに爪などの器官内における真菌の分布を加味すれば、より効果的な薬剤の選択が出来ることもわかる。
【産業上の利用可能性】
【００１４】
本発明は、真菌症における、抗真菌剤のスクリーニングに応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１の爪切片による抗真菌作用を示す図である。（図面代用写真）
【図２】実施例１のSDA培地でのMICを示す図である。（図面代用写真）
【図１】
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【図２】
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