(57)【要約】【課題】遺伝子の発現に着目した従来の方法とは全く異なる手法により、癌等の疾患の検出用マーカーであって、簡便、高精度に定量可能なものを容易に見出すことができる特定疾患の検出用マーカーのスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】特定の疾患の検出用マーカーのスクリーニング方法は、健常な生体及び特定の疾患に罹患した生体から分離した試料又は分子量に基づいて分画したその一部である画分を液体クロマトグラフィー／質量分析法にかけ、得られたm/zのピークを、健常な生体由来の試料と、前記特定の疾患に罹患した生体由来の試料との間で比較し、健常な生体由来の試料又は前記特定の疾患に罹患した生体由来の試料に有意に特異的なm/zのピークを選択することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
健常な生体及び特定の疾患に罹患した生体から分離した試料又は分子量に基づいて分画したその一部である画分を液体クロマトグラフィー／質量分析法にかける工程と、得られたm/zのピークを、健常な生体由来の試料と、前記特定の疾患に罹患した生体由来の試料との間で比較し、健常な生体由来の試料又は前記特定の疾患に罹患した生体由来の試料に特異的なm/zのピークを選択する工程とを含む、前記特定の疾患の検出用マーカーのスクリーニング方法。
【請求項２】
前記試料が体液である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記体液が血液又は血清若しくは血漿である請求項２記載の方法。
【請求項４】
分子量の上限が２万以下の範囲の画分を試料として用いる請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
m/zが1000以下のピークを選択する請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記疾患が癌である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記健常な生体及び特定の疾患に罹患した生体がヒトである請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
生体から採取した体液又は分子量に基づいて分画したその一部である画分を液体クロマトグラフィー／質量分析法にかける工程と、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法によりスクリーニングされたマーカーのm/zのピークの有無に基づいて前記特定の疾患を検出する工程とを含む、前記特定の疾患の検出方法。
【請求項９】
ヒトから採取した体液又は分子量に基づいて分画したその一部である画分を液体クロマトグラフィー／質量分析法にかける工程と、大腸癌患者に有意に特異的なマーカーのm/zのピーク323.04±0.5、337.16±0.5、351.04±0.5、351.05±0.5、352.05±0.5、353.05±0.5、374.20±0.5、393.13±0.5、429.23±0.5、497.06±0.5、498.08±0.5、514.10±0.5、515.13±0.5、517.29±0.5、519.06±0.5、534.31±0.5、549.99±0.5、584.11±0.5、585.13±0.5及び763.26±0.5並びに健常人に有意に特異的なマーカーのm/zのピーク500.33±0.5及び500.35±0.5から成る群より選ばれる少なくとも１つのm/zピークの有無に基づいて、大腸癌の有無を検出する、大腸癌の検出方法。
【請求項１０】
前記体液が血液又は血清若しくは血漿である請求項８記載の方法。
【請求項１１】
分子量の上限が１万以下の範囲の画分を試料として用いる請求項９又は１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の疾患の検出用マーカーのスクリーニング方法及び該マーカーを用いた疾患の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、癌患者に特異的に産生される物質を癌マーカーとして用いて癌の診断を行なうことが広く行なわれている。公知の癌マーカーは、偶然に見出されたものも少なくないが、近年では、癌細胞中で発現している遺伝子と、正常細胞中で発現している遺伝子を、例えばサブトラクション法等により比較し、癌細胞中で特異的に発現している遺伝子を同定し、その遺伝子自体や遺伝子産物を癌マーカーとして利用する手法が知られている（特許文献１）。
【０００３】
しかしながら、このような公知の手法では、癌マーカーが遺伝子産物に限定されるため、同定される癌マーカーの候補数は限られており、必ずしも特異性の高い癌マーカーが同定できるわけではない。また、同定された癌マーカーの検出や定量を簡便に行なえない場合も少なくない。さらに、特異性の優れた癌マーカーが既に知られている場合でも、特異性が100%というマーカーはまず存在せず、新規な癌マーカーが提供されれば、公知の癌マーカーとの組合せにより、診断の精度をさらに高めることが可能になる。
【０００４】
【特許文献１】特開2001-340081号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、遺伝子の発現に着目した従来の方法とは全く異なる手法により、癌等の疾患の検出用マーカーであって、簡便、高精度に定量可能なものを容易に見出すことができる特定疾患の検出用マーカーのスクリーニング方法を提供することである。また、本発明の目的は、本発明のスクリーニング方法により見出されたマーカーを利用して特定の疾患を検出する方法を提供することである。さらに、本発明のスクリーニング方法により見出されたマーカーを利用して大腸癌を検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、体液又は分子量に基づいて分画したその一部である画分を液体クロマトグラフィー／質量分析法にかけ、得られたm/zのピークを、健常な生体由来の試料と、前記特定の疾患に罹患した生体由来の試料との間で比較し、健常な生体由来の試料又は前記特定の疾患に罹患した生体由来の試料に特異的なm/zのピークを選択することにより、該特定の疾患に特異的なマーカーを見出すことができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、健常な生体及び特定の疾患に罹患した生体から分離した試料又は分子量に基づいて分画したその一部である画分を液体クロマトグラフィー／質量分析法にかける工程と、得られたm/zのピークを、健常な生体由来の試料と、前記特定の疾患に罹患した生体由来の試料との間で比較し、健常な生体由来の試料又は前記特定の疾患に罹患した生体由来の試料に有意に特異的なm/zのピークを選択する工程とを含む、前記特定の疾患の検出用マーカーのスクリーニング方法を提供する。また、本発明は、生体から採取した体液又は分子量に基づいて分画したその一部である画分を液体クロマトグラフィー／質量分析法にかける工程と、上記本発明の方法によりスクリーニングされたマーカーのm/zのピークの有無に基づいて前記特定の疾患を検出する工程とを含む、前記特定の疾患の検出方法を提供する。さらに、本発明は、ヒトから採取した体液又は分子量に基づいて分画したその一部である画分を液体クロマトグラフィー／質量分析法にかける工程と、大腸癌患者に有意に特異的なマーカーのm/zのピーク323.04±0.5、337.16±0.5、351.04±0.5、351.04±0.5、352.05±0.5、353.05±0.5、374.20±0.5、393.13±0.5、429.23±0.5、497.06±0.5、498.08±0.5、514.10±0.5、515.13±0.5、517.29±0.5、519.06±0.5、534.31±0.5、549.99±0.5、584.11±0.5、585.13±0.5及び763.26±0.5並びに健常人に有意に特異的なマーカーのm/zのピーク500.33±0.5及び500.35±0.5から成る群より選ばれる少なくとも１つのm/zピークの有無に基づいて、大腸癌の有無を検出する、大腸癌の検出方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、遺伝子の発現に着目した従来の方法とは全く異なる手法により、癌等の疾患の検出用マーカーであって、簡便、高精度に定量可能なものを容易に見出すことができる特定疾患の検出用マーカーのスクリーニング方法が初めて提供された。本発明のスクリーニング方法は、患者の体液等を前処理することなく、又は限外ろ過のような簡単な前処理を行なった後、汎用の液体クロマトグラフィー／質量分析装置にかけるだけで実施することができ、簡便に実施することができる。また、スクリーニングしたマーカーは、その理化学的性質や化学構造決定などを行なうことなく、単に特定のm/zを有するという性質を疾患の検出に利用することができるので、さらに簡便である。また、遺伝子の発現の差異を利用するものではないので、従来、全く知られていない種々のマーカーを見つけ出すことができる。また、本発明の特定の疾患の検出方法は、患者の体液等を前処理することなく、又は限外ろ過のような簡単な前処理を行なった後、汎用の液体クロマトグラフィー／質量分析装置にかけるだけで実施することができ、簡便に実施することができる。さらに、本発明の大腸癌の検出方法によれば、簡便かつ正確に大腸癌を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のスクリーニング方法に供される試料は、健常な生体及び特定の疾患に罹患した生体から分離した試料である。試料としては、血液（全血、血清、血漿を包含）、リンパ液、尿、唾液、組織液等の各種体液や、細胞又は組織の破砕液等を挙げることができる。これらのうち、採取が容易で、疾患特異的マーカーを見つけ易い血液試料が好ましい。
【００１０】
また、「特定の疾患」は、特定可能な任意の疾患でよく、好ましい例としては、癌、糖尿病、肝炎、腎炎、膵炎等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、癌としては、大腸癌、肺癌、胃癌、肝癌、膵臓癌、前立腺癌等の固形癌や、白血病、リンパ腫等の液性癌を例示することができるがこれらに限定されるものではない。
【００１１】
また、「健常な生体」とは、前記特定の疾患に罹患していない生体を意味し、前記特定の疾患以外の他の疾患に罹患している生体を包含する。もっとも、「健常な生体」は、検出可能ないずれの疾患にも罹患していないことが好ましい。また、「生体」としては、生物体であれば特に限定されないが、ヒトを含む哺乳類や鳥類等が好ましく、特にヒトが好ましい。
【００１２】
本発明のスクリーニング方法では、前記試料をそのまま、又は分子量に基づいて分画したその一部である画分を液体クロマトグラフィー／質量分析法にかける。本願発明者は、低分子量の分画中に、疾患のマーカーが多く含まれていることを見出した。従って、分子量の上限が２万以下、好ましくは上限が１万１０００以下の分画を液体クロマトグラフィー／質量分析法に供することが好ましい。このような分画は、市販の限外ろ過膜等を用いた限外ろ過等により容易に行なうことができる。下記実施例で用いたような、市販の遠心式限外ろ過ユニットを用いると便利である。
【００１３】
液体クロマトグラフィー／質量分析法(LC/MS)自体は、この分野において周知であり、種々のLC/MS装置が市販されている。本発明の方法では、試料中に含まれる物質のm/z（mは質量、zは電荷）を測定できればよいので、試料中に含まれる物質のm/z が測定できる方法であれば、いずれのLC/MS法をも採用することができる。LC/MS法は、高速液体クロマトグラフィーで分離した試料をオンラインで質量分析を用いて同定を行う手法であり、化学、生物学の分野で頻繁に利用されている。この場合、液体クロマトグラフィーと相性の良いイオン化法は、エレクトロスプレーイオン(ESI)化法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法及び高速原子衝撃イオン化法等のソフトイオン化法と呼ばれる方法であり、中でもエレクトロスプレーイオン化質量分析装置と高速液体クロマトグラフィーをオンラインで接続した装置は現在最も汎用されており、タンパク質、糖質をはじめとした生体物質等の同定に広く用いられているものである。本発明においても、このような汎用のLC/MS装置を用い、周知の方法によりLC/MSを行なうことができる。
【００１４】
LC/MSにより、m/zのピークを測定する。市販のLC/MS装置では、横軸にm/z、縦軸に相対量をプロットしたグラフを容易に出力できる。このようなグラフから、どのm/z値にピークが存在するかを容易に知ることができる。ここで、ピークとは極大値であり、通常、多数のピークが存在する。なお、LC/MSでは、前段に液体クロマトグラフィー(LC)が行なわれるため、試料を液体クロマトグラフィーカラムにかけてからの経過時間に応じて異なる分画がLCから質量分析(MS)カラムに供給される。このため、ある時点で測定したm/zピークは、その時点におけるm/zピークである。本発明の方法では、ある特定の時点におけるm/zのピークを利用するのではなく、より広い時間範囲に測定されるm/zピーク、好ましくは試料全体のm/zピーク、すなわち、LCから溶出されてくる試料全体のm/zピークを用いる。これは各時点におけるm/zを測定し、それらを積算することにより得ることができる。市販のLC/MS装置では、例えば１秒間隔程度の短い時間毎にm/zを自動的に測定することができ、それらを積算した試料全体のm/zのグラフも自動的に作成することができる。
【００１５】
次に、得られたm/zのピークを、健常な生体由来の試料と、特定の疾患に罹患した生体由来の試料との間で比較し、健常な生体由来の試料又は特定の疾患に罹患した生体由来の試料に特異的なm/zのピークを選択する。すなわち、健常な生体由来の試料では見られるが、特定の疾患に罹患した生体由来の試料では見られないピーク、及び逆に、特定の疾患に罹患した生体由来の試料では見られるが、健常な生体由来の試料では見られないピークを選択する。この場合、統計学的処理が可能な数、好ましくは合計で１０検体以上の試料について測定を行い、統計学的に有意なピークを選択することが好ましい。統計学的処理は、Studentのt検定(Student's t test)や、Fisherの直接確率検定(Fisher's exact probability test)のような周知の統計学的手法により行なうことができ、いずれかの統計学的検定で有意差があったものを選択することが好ましい。m/zのピークは、測定されたm/zの範囲全体で比較してもよいが、一部の範囲のm/zについてのみ比較してもよい。本願発明者は、m/zの値が低い範囲に、統計学的に有意差のあるピークが多数存在することを見出した。従って、少なくとも、m/z値が1000以下の範囲において上記比較を行なうことが好ましい。このような低m/z値の範囲に疾患マーカーが見つかりやすいという知見は、本願発明者が独自に見出した知見である。このような低m/z値（すなわち、概ね低分子量）のマーカーは、従来の遺伝子発現に基づく癌マーカー等とは異なるものであり、従来考慮されてこなかった新しい疾患マーカーである可能性が高い。
【００１６】
上記した方法により得られた特異的m/zピークを与える物質は、前記特定の疾患の検出用マーカーとして利用可能である。特異的ピークを与える物質の理化学的性質の調査や、化学構造の同定を行う必要はない（もちろん行なってもよいが）。見出されたマーカーは、m/z以外の理化学的性質や化学構造は不明であるが、これらが全く不明であっても、LC/MSにより測定される特定のm/zを持つため、特定の疾患の検出用マーカーとして利用可能である。すなわち、未知の被検試料を同様なLC/MSにかけて、その特異的m/zピークが現れるか否かに基づき前記特定の疾患を検出することができる。すなわち、本発明の特定の疾患の検出方法では、生体から採取した体液又は分子量に基づいて分画したその一部である画分を液体クロマトグラフィー／質量分析法にかけ、上記本発明のスクリーニング方法によりスクリーニングされたマーカーのm/zのピークの有無に基づいて前記特定の疾患を検出する。有意に特異的なマーカーが複数見つかった場合には、少なくともそのいずれか１つを利用して特定疾患の検出を行なうことができる。複数のピークの有無を組み合わせるとより精度が向上する。下記実施例のように、多数の有意に特異的なピークが見つかった場合には、できるだけ有意差の大きな（すなわち、p値が小さい）１又は２以上のピークを利用することが好ましい。有意差は、Studentのt検定によるｐ値で好ましくは0.1未満、さらに好ましくは0.05未満であり、Fisherの直接確率検定のｐ値で好ましくは0.001未満、さらに好ましくは0.0005未満である。
【００１７】
下記実施例に具体的に記載されるように、上記した本発明のスクリーニング方法により、大腸癌のマーカーを見出した。すなわち、大腸癌患者に有意に特異的なm/zピークとして、323.04±0.5、337.16±0.5、351.04±0.5、351.05±0.5、352.05±0.5、353.05±0.5、374.20±0.5、393.13±0.5、429.23±0.5、497.06±0.5、498.08±0.5、514.10±0.5、515.13±0.5、517.29±0.5、519.06±0.5、534.31±0.5、549.99±0.5、550.99±0.5、584.11±0.5、585.13±0.5及び763.26±0.5のm/zピークが見出された。また、健常人に有意に特異的なマーカーとして500.33±0.5及び500.35±0.5のm/zピークが見出された。ここで、「±0.5」は、異なる装置や条件でLC/MSを行なった場合の測定誤差範囲を示す。すなわち、LC/MSは鋭敏な測定方法であるので、全く同じ条件、同じ装置を用いた場合、m/zを0.01の精度で十分に測定可能である。異なる装置や条件でLC/MSを行なった場合でも、ピークのシフトは大きくとも「±0.5」、通常「±0.1」の範囲に入る。従って、例えば、上記のピークのうち、351.04±0.5の範囲と351.05±0.5の範囲はほとんど重複しているが、各範囲の中心となるピークは、351.04のピークと351.05のピークであり、ピークは２個存在する。
【００１８】
以上のように、本発明によれば、LC/MSという汎用されている方法により、容易に疾患マーカーを見つけ出すことができ、これらのマーカーは、各種疾患の診断に利用することができる。
【実施例】
【００１９】
健常人８例、大腸癌患者８例から血液７ml採血後、血清を分離した。分離後、10000 Da以下の分画を、遠心式限外ろ過ユニットMicrocon (商品名、Millipore社製)にて遠心(3500 rpm, 30min)で回収した。回収した分画2.0μLを以下の条件でLC/MS解析した。LC/MSはWaters社製Q-TOF Premierを用いた。LC及びMSの条件は下記の通りであった。
【００２０】
LC条件  
トラップカラム    LC Packing社製 PepMap 0.3 x 5 mm
分析カラム        Waters社製 NanoEase Column 75μｍx 150 mm
移動相            A: CH3CN/H2O = 5/95 + 0.1%ギ酸
B: CH3CN/H2O = 95/5 + 0.1%ギ酸
グラジエント      0 min (5%B) →3 min (5%B) →93 min (95%B) →95 min (5%B)
流速              5.0 μL/min (プレカラムスプリットでカラムへは約250nl/min)
移動相(Auxilary)  0.1%ギ酸
カラム温度        室温
インジェクション  2μL 
【００２１】
MS条件
イオン化モード  ESI(+)
キャピラリー電圧  3.8 kV
コーン電圧  80 V
Source Block Temp.  80℃
コーンガス流量  100L/hr
ネブライザーガス圧  3 psi（pound per square inch)
コリジョンガス  Ar
【００２２】
上記LC/MSにより、LCに供した試料全体のm/zを測定し、前記LC/MS装置により自動的にグラフ化した。グラフの横軸はm/z、縦軸は相対量である。それらを比較し、大腸癌患者では見られるが、健常人では見られないピーク、及び健常人では見られるが、大腸癌患者では見られないピークを求めた。各ピークは、それぞれの相対量を統計学的に処理し、統計学的有意差があるピークのみをピックアップした。統計処理は、Studentのt検定及びFisherの直接確率検定により行い、少なくともいずれか一方で有意差があるピークを有意に特異的なピークとした。Studentのt検定でp<0.1、Fisherの直接確率検定でp<0.001を有意差ありとした。
【００２３】
結果を表１に示す。表１に示されるように、Studentのt検定で有意差のあるピークが１７個、Fisherの直接確率検定で有意差のあるピークが２１個、いずれかの統計解析で有意差が確認されたピークが２２個見つかった。
【００２４】
なお、未知の被検試料についても、上記と同様の処理を行ない、表１に示される１又は複数のピークの有無を基準として、大腸癌の診断を行なうことができる。
【００２５】
【表１】
2008076202.tif 000002
c:大腸癌特異的（大腸癌患者において有意に特異的に検出された）
h:健常人特異的（健常人において有意に特異的に検出された）
*1:  Studentのt検定によるｐ値
*2:  Fisherの直接確率検定によるｐ値