(57)【要約】【課題】比較的短時間で、測定試料に前処理を施さなくても非破壊的に測定できる、β−グルカンの（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を定量する方法を提供する。【解決手段】試料に含まれるβ−グルカンの（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を定量する方法であって、試料の固体13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定し、当該測定結果に基づいて、グルコースのＣ−１炭素ピークの積分強度Ａと、（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの積分強度Ｂとの間の積分強度比Ａ／Ｂを算出し、当該算出値に基づいて、（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を求めることを特徴とする定量方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれるβ−グルカンの（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を定量する方法であって、該試料の固体13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定し、該測定結果に基づいて、グルコースのＣ−１炭素ピークの積分強度Ａと、（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの積分強度Ｂとの間の積分強度比Ａ／Ｂを算出し、該算出値に基づいて、（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を求めることを特徴とする、定量方法。
【請求項２】
前記積分強度比Ａ／Ｂの算出値を、前記積分強度比Ａ／Ｂと（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比との関係式に当てはめることにより、（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を求めることを特徴とする請求項１に記載の定量方法。
【請求項３】
前記関係式は、下記式（１）で表されることを特徴とする請求項２に記載の定量方法。
（１→６）結合グルコース／（１→３）結合グルコース比
＝（Ａ／Ｂ）×Ｘ−１                  （１）
ここで、Ｘは、実質的に（１，３）結合グルコースのみからなるβ−（１，３）−グルカンについて、前記試料について行なわれる固体13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルと同一の測定条件にて固体13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル測定を行なった場合の、Ｃ−６炭素ピークの積分強度Ｂ0とＣ−１炭素ピークの積分強度Ａ0との比Ｂ0／Ａ0である。
【請求項４】
前記固体13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル測定における13Ｃ共鳴周波数は、７５ＭＨｚ以上である請求項１〜３のいずれかに記載の定量方法。
【請求項５】
前記固体13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル測定の測定モードは、13Ｃ−ＣＰ／ＭＡＳ法またはＤＰ／ＭＡＳ法である請求項１〜４のいずれかに記載の定量方法。
【請求項６】
前記試料は、パン酵母菌の細胞壁である請求項１〜５のいずれかに記載の定量方法。
【請求項７】
前記試料に含まれるβ−グルカンは、（１，６）結合グルコースおよび（１，３）結合グルコースから構成されるβ−グルカンであるか、β−（１，３）−グルカンおよびβ−（１，６）−グルカンの混合物であるか、または該混合物と（１，６）結合グルコースおよび（１，３）結合グルコースから構成されるβ−グルカンとの混合物である請求項１〜６のいずれかに記載の定量方法。
【請求項８】
前記（１，６）結合グルコースおよび（１，３）結合グルコースから構成されるβ−グルカンは、β−（１，６）分岐β−（１，３）グルカンである請求項７に記載の定量方法。
【請求項９】
前記試料は、固体13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定するにあたり、前処理を施さない請求項１〜８のいずれかに記載の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−グルカンの（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比の定量方法に関し、より詳しくは、固体13Ｃ−核磁気共鳴（以下、核磁気共鳴をＮＭＲと略称することがある）法を用いた、β−グルカンの（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルカンは、グルコースを構成単位とする多糖類であり、グルカンの１種であるβ−グルカンは、免疫賦活活性や抗腫瘍活性等の種々の生理活性を有していることが知られている。なかでも、β−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカンは、パン酵母やキノコ類等から抽出することのできる天然に存在する多糖類であるが、優れた生理活性を有していることから、健康食品や医薬等の有効成分として注目を浴びている。ここで、本明細書中において「β−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカン」とは、β−（１，３）グリコシド結合したグルコースを構成単位とするβ−グルカンであって、その構造の一部にβ−（１，６）グリコシド結合による架橋点を有するβ−グルカンを意味する。
【０００３】
直鎖状のβ−（１，３）−グルカンやβ−（１，６）−グルカンが水等に可溶である一方、β−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカンは、３次元的に広がった架橋構造を有していることから、一般的に水やジメチルスルホキシド、その他の溶媒に不溶である。
【０００４】
β−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカンを健康食品や医薬に適用する場合、β−グルカンとしての純度やβ−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカンの（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を決定することは非常に重要である。これらは、製品の安全性や効能に非常に大きな影響を与え得るからである。
【０００５】
β−グルカンの純度を測定する方法としては、一般的に、化学分解した後、ＧＳ−ＭＳ（ガスクロマトグラフ−マススペクトラム）による分析方法や特殊な酵素を用いた酵素分析法が用いられている。
【０００６】
一方、β−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカンの（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を決定する方法としては、たとえば、結合位置に特異的に働き、結合を切断する酵素を用いて、切断された単一糖鎖を吸収スペクトルで分析する方法や蛍光標識した物質と複合体を形成して分析する方法がある（たとえば、特許文献１および非特許文献１参照）。これらの方法は、β−グルカンの純度を分析する方法としても用いられる。
【０００７】
しかしながら、上記の方法はいずれもβ−グルカンを切断するという前処理を必要とし、操作が非常に煩雑であるという問題がある。また、分析に非常に長い時間を要するという問題がある。
【０００８】
また、β−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカンを含む試料を分解して、その一部の可溶部を溶媒に溶解させ、溶液ＮＭＲを用いて、β−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカンの（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を決定するという方法も考え得る。しかし、溶媒に溶解させたβ−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカン分解物ついて、溶液ＮＭＲ測定を行なった例はあるものの（たとえば、非特許文献２参照）、このＮＭＲ測定データに基づいて（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を決定した例はない。
【０００９】
このような、溶液ＮＭＲを用いた方法は、上述したように、β−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカンが一般的に水やジメチルスルホキシド等の溶媒に不溶であるという問題を有している。また、β−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカンのような分岐部分を含むグルカンの混合物を溶媒に溶解させることができる場合であっても、個々のグルコース単位の３次元的な空間配置の微妙な差異や隣接原子から受ける影響の差異等により、極端にいえば、グルコース単位ごとに異なるピークが生じる可能性がある。このことは、得られるＮＭＲスペクトルが非常に複雑で、解析が困難になるという問題をもたらす。β−グルカンが不純物を含んでいる場合、これらの問題はさらに深刻となり得、場合によっては測定サンプルを精製、すなわちβ−グルカン成分のみを抽出する操作を行なわなければならない。
【特許文献１】米国特許第６００８０５４号
【非特許文献１】Ｂ．Ｖ．ＭｃＣｌｅａｒｙ，Ｒ．Ｃｏｄｄ，Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．，５５，３０３−３１２（１９９１）
【非特許文献２】Ｙ．Ｔ．Ｋｉｍ，Ｅ．Ｈ．Ｋｉｍ，Ｃ．Ｃｈｅｏｎｇ，Ｄ．Ｌ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ｗ．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｔ．Ｌｉｍ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３２８，３３１−３４１（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、比較的短時間で、測定試料に前処理を施すことなく、また非破壊的に測定することができるような、β−グルカンの（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を定量する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、試料に含まれるβ−グルカンの（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を定量する方法であって、試料の固体13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定し、当該測定結果に基づいて、グルコースのＣ−１炭素ピークの積分強度Ａと、（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの積分強度Ｂとの間の積分強度比Ａ／Ｂを算出し、当該算出値に基づいて、（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を求めることを特徴とする。
【００１２】
ここで、上記積分強度比Ａ／Ｂの算出値を、積分強度比Ａ／Ｂと（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比との関係式に当てはめることにより、（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を求めることが好ましい。
【００１３】
上記関係式は、下記式（１）であることが好ましい。
（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比
＝（Ａ／Ｂ）×Ｘ−１              （１）
ここで、Ｘは、実質的に（１，３）結合グルコースのみからなるβ−（１，３）−グルカンについて、前記試料について行なわれる固体13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルと同一の測定条件にて固体13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル測定を行なった場合の、Ｃ−６炭素ピークの積分強度Ｂ0とＣ−１炭素ピークの積分強度Ａ0との比Ｂ0／Ａ0である。
【００１４】
上記固体13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル測定における13Ｃ共鳴周波数は、７５ＭＨｚ以上であることが好ましい。
【００１５】
また、上記固体13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル測定の測定モードは、13Ｃ−ＣＰ（Ｃｒｏｓｓ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）／ＭＡＳ法またはＤＰ／ＭＡＳ法（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  13Ｃ  ｗｉｔｈ  1Ｈ  Ｄｅｃｏｕｐｌｅ法）であることが好ましい。
【００１６】
上記試料は、パン酵母菌の細胞壁であってもよく、試料に含まれるβ−グルカンは、（１，６）結合グルコースおよび（１，３）結合グルコースから構成されるβ−グルカンであるか、β−（１，３）−グルカンおよびβ−（１，６）−グルカンの混合物であるか、または該混合物と（１，６）結合グルコースおよび（１，３）結合グルコースから構成されるβ−グルカンとの混合物であってもよい。
【００１７】
上記（１，６）結合グルコースおよび（１，３）結合グルコースから構成されるβ−グルカンは、β−（１，６）分岐β−（１，３）グルカンであってもよい。
【００１８】
上記試料は、固体13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定するにあたり、前処理を施さなくてもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法によれば、試料に含まれるβ−グルカンの（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を、比較的短時間で、正確に定量することができる。また、本発明の方法は、測定試料が、架橋構造を有し、溶媒に溶解しないβ−グルカンを含む試料であっても、前処理を施す必要がなく、非破壊的に、固体状態のまま直接測定できるため非常に簡便である。さらに、固体状態のまま直接測定できることから、固体試料の本来の状態を忠実に反映した定量値を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、試料に含まれるβ−グルカンの（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を定量する方法であって、試料の固体13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定し、当該測定結果に基づいて、グルコースのＣ−１炭素ピークの積分強度Ａと、（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの積分強度Ｂとの間の積分強度比Ａ／Ｂを算出し、当該算出値に基づいて、（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を求めることを特徴とするものである。ここで、（１，６）結合グルコースとは、β−グルカンの構成単位であるグルコースであって、他のグルコースとＣ−６位でβ−（１，６）結合しているグルコースを意味する。このとき、当該（１，６）結合グルコースは、β−（１，６）結合しているグルコースとは別のグルコースとβ−（１，３）結合していてもよい。また、（１，３）結合グルコースとは、β−グルカンの構成単位であるグルコースであって、他のグルコースとβ−（１，３）結合のみで結合しているグルコースを意味する。また、（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比とは、これらのグルコースの、数としての比を意味する。また、本明細書中において、単に「グルコース」という場合には、（１，６）結合グルコースおよび（１，３）結合グルコースの双方を含むものとする。
【００２１】
以下、実施の形態を示して本発明を詳細に説明する。
＜試料＞
本発明の（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を定量する方法に供される試料は、β−グルカンを含む試料である。当該β−グルカンは、単一化合物であるか、混合物であるかにかかわらず、β−グルカン全体として（１，６）結合グルコースおよび（１，３）結合グルコースを含むものであることが好ましい。（１，６）結合グルコースを含まないβ−グルカン（たとえば、β−（１，３）−グルカン）や（１，３）結合グルコースを含まないβ−グルカン（たとえば、β−（１，６）−グルカン）を測定の対象とすることも勿論可能である。前者の場合、（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比は０となる。β−グルカンが混合物である場合には、混合物全体としての（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比が定量されることになる。
【００２２】
β−グルカン全体として（１，６）結合グルコースおよび（１，３）結合グルコースを含むβ−グルコースの例を挙げれば、特に制限されないが、（１，６）結合グルコースおよび（１，３）結合グルコースから構成されるβ−グルカン、β−（１，３）−グルカンおよびβ−（１，６）−グルカンの混合物、ならびに当該混合物と（１，６）結合グルコースおよび（１，３）結合グルコースから構成されるβ−グルカンとの混合物などである。（１，６）結合グルコースおよび（１，３）結合グルコースから構成されるβ−グルカンとしては、たとえば、β−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカンが挙げられる。
【００２３】
図１は、β−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカンの一例の一部を示す構造式である。図１に示されるように、β−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカンは、β−（１，３）グリコシド結合したグルコースを構成単位とするβ−グルカンであり、β−（１，６）グリコシド結合１０１による架橋点を有する。このように、β−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカンは、他のグルコースとβ−（１，３）結合のみで結合する（１，３）結合グルコース１０２と、β−（１，６）グリコシド結合１０１を有する（１，６）結合グルコース１０３を含む。ここで、（１，３）結合グルコース１０２のＣ−６炭素は、アルコール性ＯＨ基を有する一方、（１，６）結合グルコース１０３のＣ−６炭素は、エーテル性酸素原子を有する。本発明の定量方法は、このような（１，３）結合グルコース１０２のＣ−６炭素と（１，６）結合グルコース１０３のＣ−６炭素との環境の差異を利用するものである。すなわち、固体13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて、これらＣ−６炭素ピークは、上記環境の差異に起因して異なる位置に現れるため、グルコースのＣ−１炭素ピークの積分強度Ａと、（１，３）結合グルコース１０２のＣ−６炭素ピークの積分強度Ｂとの間の積分強度比Ａ／Ｂを算出することによって、（１，６）結合グルコース１０３／（１，３）結合グルコース１０２の比を求めることが可能となる。
【００２４】
ここで、試料に含まれるβ−グルカンは、Ｄ−体であるかＬ−体であるかを問わない。ただし、天然から抽出されるβ−グルカンは主にＤ−体であるため、本発明の定量方法は、Ｄ−体に対して用途が広いといえる。
【００２５】
また、本発明の定量方法に供されるβ−グルカンを含む試料は、β−グルカン以外のものを含んでいてもよい。そのようなものとしては、たとえば水分や天然物からβ−グルカンを抽出する際にβ−グルカンと同伴するβ−グルカン以外の物質等が挙げられる。
【００２６】
本発明の定量方法の利点の１つは、β−グルカンを含む試料を、β−グルカンを抽出する等の前処理を施さなくても、直接分析することができる点にある。したがって、たとえばパン酵母菌の細胞壁等の、β−グルカンとともにリン脂質やタンパク質を含む試料であっても、リン脂質やタンパク質の加水分解等の前処理を行なうことなく定量分析を行なうことができる。
【００２７】
なお、本発明の定量方法は、試料の前処理を何ら制限するものではない。たとえば試料がパン酵母菌の細胞壁である場合、有機溶媒等を用いた抽出精製、アルカリによるリン脂質やタンパク質の加水分解などの前処理を行なってもよい。また、測定対象の試料が水を含まない試料である場合、ピークの分離をよりよくすることを目的として、若干量の水を試料に添加してもよい。
【００２８】
試料は、固体であることが必要であるが、固体ＮＭＲ測定における通常の温度範囲である−１２０〜１６０℃の範囲内、好ましくは０〜８０℃の範囲内のいずれかの温度で固体状態であればよい。また、試料の形態は、特に制限されるものではなく、たとえばゲル状や粉末状等であってもよい。
【００２９】
＜（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比の定量方法＞
次に、本発明に従う（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比の定量方法について説明する。本発明の（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比の定量方法は、基本的に次の（１）〜（３）の工程を含む。以下、これら（１）〜（３）の工程について説明する。
（１）固体13Ｃ−ＮＭＲスペクトルの測定、
（２）グルコースのＣ−１炭素ピークの積分強度Ａと、（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの積分強度Ｂとの間の積分強度比Ａ／Ｂの算出、
（３）積分強度比Ａ／Ｂと（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比との関係式への積分強度比Ａ／Ｂ値の当てはめ。
【００３０】
（１）固体13Ｃ−ＮＭＲスペクトルの測定
本発明の（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を定量する方法においては、まず測定対象となる試料について固体13Ｃ−ＮＭＲスペクトルの測定を行なう。固体13Ｃ−ＮＭＲスペクトルの測定は、固体ＮＭＲの測定に広く用いられている通常の測定条件を採用することができるが、具体的には以下のような測定条件とすることが好ましい。
【００３１】
測定モードは、13Ｃ−ＣＰ（Ｃｒｏｓｓ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）／ＭＡＳ法であることが好ましい。13Ｃ−ＣＰ／ＭＡＳ法で測定することにより、グルコースの炭素ピークの積分強度が向上し、短時間で測定することが可能となる。ここで、グルコースの炭素ピークの積分強度は、当該グルカン中の構造的に堅い部分と柔らかい部分とでは差異がある。たとえば、（１，３）結合グルコースのＣ−１炭素とＣ−６炭素とを比較した場合、試料中のこれらの炭素数が同じであっても、一般的にはＣ−６炭素の積分強度は、Ｃ−１炭素の積分強度よりも小さい。したがって、測定モードが13Ｃ−ＣＰ／ＭＡＳ法である場合、単純に炭素ピークの積分強度比を炭素数の比とみなすことができず、実際の炭素数の比を知るためには、固体ＮＭＲ測定から得られる炭素ピークの積分強度比に補正因子Ｘを乗じる必要がある。なお、補正因子Ｘについては後述する。
【００３２】
測定モードが13Ｃ−ＣＰ／ＭＡＳ法の場合、パルスディレイ時間（ＰＤ）は、０．５〜２００ｓとすることができるが、測定時間を短縮できるという理由から、０．５〜２０ｓとすることが好ましい。なお、ＰＤが０．５〜２０ｓの範囲内においては、グルカンの炭素ピークの積分強度はほとんど変化しない。また、コンタクト時間（ＣＴ）は、たとえば０．１〜１０ｍｓとすることが可能である。この範囲の中でも、後述するように、実質的に（１，３）結合グルコースのみからなる基準β−（１，３）−グルカンおよび測定対象となる試料について、固体13Ｃ−ＮＭＲスペクトル測定を行なった場合の、Ｃ−６炭素ピークの積分強度Ｂ0およびＢ、ならびにＣ−１炭素ピークの積分強度Ａ0およびＡが最大となり、したがってその比Ｂ0／Ａ0およびＡ／Ｂの精度が高くなることから、コンタクト時間（ＣＴ）は、０．５〜２ｍｓの範囲内であることが好ましく、１ｍｓ程度とすることが特に好ましい。以上のような測定条件を選択することにより、短時間で、精度の高い定量値を得ることができる。
【００３３】
また、ＤＰ／ＭＡＳ法（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  13Ｃ  ｗｉｔｈ  1Ｈ  Ｄｅｃｏｕｐｌｅ法）も測定モードとして好適に用いられる。一般的に、ＤＰ／ＭＡＳ法では感度が低く、ノイズが大きいが、積算を長時間行なうことにより、本発明の（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比の定量方法に十分適用可能となる。ＰＤを十分長くした場合、上記補正因子Ｘは１．０となる。すなわち補正の必要は必ずしもない。しかし、β−グルカンのように１分子中に堅い部分と柔らかい部分の双方を有する化合物の場合には、プロトン照射が不完全になり、プロトンからの双極子が残って、13Ｃピークがブロードになることから、見かけ上積分強度が低下する傾向にある。したがって、測定モードがＤＰ／ＭＡＳ法である場合であって、ＰＤが十分長くない場合には、13Ｃ−ＣＰ／ＭＡＳ法の場合と同様に、固体ＮＭＲ測定から得られる炭素ピークの積分強度比に補正因子Ｘを乗じて補正することが好ましい。
【００３４】
具体的には、ＤＰ／ＭＡＳ法による測定では、ＰＤは、０．５〜２００ｓとすることができるが、上記理由から、十分長い時間、たとえば１００〜２００ｓとすることが好ましい。すなわち、β−（１，３）−グルカンのＣ−１〜Ｃ−６のピークの緩和時間Ｔ１が、１．４〜１４．７ｓ程度であることから、最も大きな値である１４．７ｓの約６倍以上に相当する１００ｓ程度以上であることが好ましい。
【００３５】
また、13Ｃ共鳴周波数は、測定モードに関わらず、７５ＭＨｚ以上であることが好ましい。このような13Ｃ共鳴周波数としては、たとえば７５．５６９ＭＨｚ、１７５．９４６ＭＨｚ、２３１．５１０ＭＨｚが挙げられる。13Ｃ共鳴周波数が７５ＭＨｚ未満であると、グルコースの炭素ピークの分離性が悪く、積分強度比の算出が困難となる傾向にある。
【００３６】
固体13Ｃ−ＮＭＲスペクトルの測定温度は、測定モードに関わらず、固体ＮＭＲ測定における通常の温度範囲である−１２０〜１６０℃の範囲内のいずれかの温度を採用することができるが、試料に含まれる水分の変動が起こりにくい０〜８０℃の範囲内の温度で測定を行なうことが好ましい。試料が水分を含む場合には、試料中のグルカンはその水分により比較的柔軟な構造をとるため、炭素ピークの分離性がよりよくなる傾向にあるが、このように、試料が水分を含む場合であっても、測定温度を０〜８０℃とすることにより、炭素ピークの分離がよりよい状態で測定を行うことができる。
【００３７】
試料を入れる試料管の直径は、特に制限されないが、たとえば通常の固体ＮＭＲ測定で用いられている３．５ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍまたは７ｍｍのものを使用することができる。データの積算時間の短縮のためには、直径の大きいものを使用することが好ましい。
【００３８】
また試料管の回転速度は、できる限り高いことが好ましいが、たとえば直径５ｍｍの試料管を用いた場合、５〜１０ｋＨｚとすることができる。なお、試料管は、外部磁場に対してマジック角（５４．７°）で回転させる必要がある。
【００３９】
化学シフトの外部標準物質としては、測定モードに関わらず、固体ＮＭＲ測定において通常用いられているものを使用することができ、たとえばヘキサメチルベンゼンを好適に使用することができる。ヘキサメチルベンゼンを化学シフトの外部標準物質として使用する場合、ヘキサメチルベンゼンのメチル基の炭素のピークは、ＴＭＳ（テトラメチルシラン）スケールで１７．３６ｐｐｍに現れる。
【００４０】
（２）グルコースのＣ−１炭素ピークの積分強度Ａと、（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの積分強度Ｂとの間の積分強度比Ａ／Ｂの算出
次に、得られた固体13Ｃ−ＮＭＲスペクトルに基づき、グルコースのＣ−１炭素ピークの積分強度Ａと、（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの積分強度Ｂとの間の積分強度比Ａ／Ｂを算出する。グルコースのＣ−１炭素ピーク、（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークは、他の炭素ピークと十分に分離している場合が多く、比較的容易に積分強度比Ａ／Ｂを算出することができる。なお、たとえばβ−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカンを測定した場合、上記いずれの測定モードにおいても、（１，３）結合グルコースのＣ−１炭素ピークと（１，６）結合グルコースのＣ−１炭素ピークは区別されず、同一のピークとして現れる。
【００４１】
ここで、パン酵母β−グルコースの13Ｃ−ＣＰ／ＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルの具体例を示す。図２は、β−Ｄ−（１，６）分岐β−Ｄ−（１，３）グルカンを含むパン酵母菌の細胞壁の13Ｃ−ＣＰ／ＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルの一例である。当該試料は、ＮＭＲ測定にあたり前処理はなされておらず、そのままの状態で測定したものであり、若干の水を含んでいる。なお、当該試料は水に不溶である。
【００４２】
なお、図２の13Ｃ−ＣＰ／ＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルの測定条件は、次のとおりである。装置  Ｃｈｅｍａｇｎｅｔｉｃ社製ＪＮＭ−ＣＭＸ３００Ｘ、試料管直径４ｍｍ、試料管回転数１０ｋＨｚ、測定温度  ３０℃、13Ｃ共鳴周波数  ７５．５６９ＭＨｚ、スキャン  ２５６回、パルスディレイ（ＰＤ）時間  ５ｓ、コンタクト時間（ＣＴ）  １．０ｍｓ。
【００４３】
図２に示されるように、上記試料を測定した場合、グルコース環領域には、１０４．３、８７．３、７７．７、７４．９、６８．８、６１．６ｐｐｍに６つのピークが観測される。１０４．３ｐｐｍのピークは、（１，３）結合グルコースおよび（１，６）結合グルコースのＣ−１炭素のピークである。８７．３、７７．７、７４．９、６８．８ｐｐｍの４つのピークは、グルコースのＣ−２〜Ｃ−５炭素および（１，６）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの重なりである。また、６１．６ｐｐｍのピークは、（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素のピークである。
【００４４】
なお、試料が含有する水分量に依存して、分離能は幾分変化するが、スペクトルのプロファイル自体に変化はほとんどなく、特にグルコースのＣ−１炭素および（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素のピーク位置は変化しないため、（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比の定量性に影響はない。
【００４５】
本工程（２）においては、上記のような固体ＮＭＲスペクトルから積分強度Ａ／Ｂを算出する。炭素ピークの積分強度は、ＮＭＲ測定において通常用いられている、Ｄｅｌｔａ（米国日本電子社製）やスピンサイト（Ｃｈｅｍａｇｎｅｔｉｃｓ社製）などの波形分離ソフトを用い、波形分離されたピークの面積を求めることにより得ることができる。
【００４６】
具体的には次のようにして得られた固体ＮＭＲスペクトルから積分強度Ａ／Ｂを算出する。まず、上記ソフトを用いて、ＮＭＲ測定により得られた各炭素ピークを、化学シフト値が同じである、独立したＣ−１〜Ｃ−６炭素ピークに波形分離する。その際、波形分離された炭素ピークの積分強度およびピーク幅を調整して、波形分離された炭素ピークの合成が、得られたスペクトルを同じになるようにする（なお、波形分離処理により、観測されたピーク位置と波形分離後のピーク位置が若干異なる場合があり得る）。ここで、たとえば（１，６）結合グルコースのＣ−６炭素ピークのように、重複するピークの中に隠れてしまっているピークが存在し得るが、このようなピークについては、別途、ピーク位置を確認することができる物質（たとえば、β−（１，６）−グルカン）について固体13Ｃ−ＮＭＲ測定を行なってピーク位置を確認し、このピーク位置に、隠れたピークが存在するものとして波形分離処理を行なうようにしてもよい。たとえば、β−（１，６）−グルカンにおけるＣ−６炭素ピークは、７２．０ｐｐｍに現れることがわかっている。あるいは、このようなピークは、波形分離処理においては単に無視してもよい。本発明においては、この波形分離されたグルカンのＣ−１炭素ピークの積分強度Ａと（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの積分強度Ｂを用いる。
【００４７】
次に、波形分離されたグルコースのＣ−１炭素ピークの積分強度Ａと、（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの積分強度Ｂより積分強度比Ａ／Ｂを算出する。ここで、グルコースのＣ−１炭素ピークおよび（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークが他のピークと重なっていない場合には、ＮＭＲ装置の積分測定値をそのまま用いることができるため、上記のような波形分離処理を行なわなくてもよい。
【００４８】
たとえば、図２に示す例の場合、グルコースのＣ−１炭素ピークおよび（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークは他のピークと重なっている。したがって、波形分離処理を要する。図２に示されるＮＭＲスペクトルを、Ｄｅｌｔａ（米国日本電子社製）の波形分離ソフトを用い、波形分離した結果を図３に示す。図３は、図２のスペクトルを波形分離した結果である。図３に示されるように、図２のスペクトルは、１０４．１ｐｐｍのグルコースのＣ−１炭素ピーク、６１．５ｐｐｍの（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピーク、ならびに８７．３〜６８．７ｐｐｍに現れるグルコースのＣ−２〜Ｃ−５炭素および（１，６）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの重なりから構成されることがわかる。これより、波形分離されたグルコースのＣ−１炭素ピークの積分強度Ａは、２２３．４であり、波形分離された（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの積分強度Ｂは、１７６．７であることから、積分強度比Ａ／Ｂは、１．２６と算出される。
【００４９】
ここで、図２において、１０４ｐｐｍ付近のピークがグルコースのＣ−１炭素に帰属されるピークであり、６２ｐｐｍ付近のピークが（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素に帰属されるピークであることは、（１，３）結合グルコースのみからなるβ−（１，３）−グルカンであるカードランの溶液13Ｃ−ＮＭＲスペクトルと固体13Ｃ−ＣＰ／ＭＡＳスペクトルを比較することにより行なった。これらのスペクトルはよい対応関係を示し、容易に帰属することができる。
【００５０】
（３）積分強度比Ａ／Ｂと（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比との関係式への積分強度比Ａ／Ｂ値の当てはめ
次に、上記のようにして得られた積分強度比Ａ／Ｂの値を、積分強度比Ａ／Ｂと（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比との関係式に当てはめることにより、目的とする（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を求める。
【００５１】
当該関係式としては、次の式を好適に用いることができる。
（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比
＝（Ａ／Ｂ）×Ｘ−１                      （１）
ここで、Ｘは補正因子であり、上記したように、一般的に試料中に同じ炭素数で存在していても、それら炭素のピークの積分強度は同じにはならないため、これを補正し、積分強度比を炭素の数の比に変換するためのものである。
【００５２】
補正因子Ｘは、好適には、実質的に（１，３）結合グルコースのみからなるβ−グルカンを標準物質とし、（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を定量しようとする試料について行なわれる固体13Ｃ−ＮＭＲ測定と同一の測定条件にて、当該標準物質の固体13Ｃ−ＮＭＲ測定を行なうことにより得られる。上記標準物質としては、実質的に（１，３）結合グルコースのみからなるβ−グルカンが好ましいが、たとえば、当該実質的に（１，３）結合グルコースのみからなるβ−グルカンを標準物質として、（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を定量した試料を、２次標準物質として使用することも可能である。実質的に（１，３）結合グルコースのみからなるβ−グルカンを標準物質とした場合、具体的には次のとおりである。
【００５３】
まず、標準物質として実質的に（１，３）結合グルコースのみからなるβ−（１，３）−グルカンを用意し、（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を定量しようとする試料について行なわれる固体13Ｃ−ＮＭＲ測定と同一の測定条件にて、当該標準物質の固体13Ｃ−ＮＭＲ測定を行なう。当該標準物質が（１，３）結合グルコースのみからなるβ−（１，３）−グルカンであることは、溶液1Ｈ−ＮＭＲや溶液13Ｃ−ＮＭＲ測定よりわかる。次に、得られた固体13Ｃ−ＮＭＲスペクトルから、Ｃ−６炭素のピークの積分強度Ｂ0とグルコースのＣ−１炭素のピークの積分強度Ａ0との比Ｂ0／Ａ0を算出する。このＢ0／Ａ0が、標準物質として（１，３）結合グルコースのみからなるβ−（１，３）−グルカンを用いる場合の補正因子Ｘである。一般的には、実際の炭素数は同じであるにもかかわらず、Ｃ−６炭素のピークの積分強度Ｂ0は、グルコースのＣ−１炭素のピークの積分強度Ａ0より小さいため補正因子Ｘは１より小さくなる。ただし、上記したように、固体13Ｃ−ＮＭＲの測定モードがＤＰ／ＭＡＳ法であって、ＰＤが十分長い場合には、補正因子Ｘは１．０であるか、これに極めて近い値となることが多い。
【００５４】
グルコースのＣ−１炭素ピークの積分強度Ａと（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの積分強度Ｂとの間の積分強度比Ａ／Ｂに補正因子Ｘ（＝Ｂ0／Ａ0）を乗じることにより、グルコースのＣ−１炭素数／（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素数比に変換することができる。すなわち、グルコースのＣ−１炭素数／（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素数比は、（Ａ／Ｂ）×Ｘとなる。
【００５５】
ここで、補正因子Ｘは、基本的には固体13Ｃ−ＮＭＲの測定条件によって変動するため、測定条件を変える場合には、そのたびに補正因子Ｘを算出する必要があるが、当該標準物質におけるＣ−１炭素の積分強度とＣ−６炭素ピークの積分強度との比は、ＰＤ値が０．５〜２０ｓの範囲内である限り、ＰＤに依存しないことがわかった。したがって、ＰＤ値を上記範囲内で変化させる場合であっても、同じ補正因子を用いることが可能である。一方、コンタクト時間（ＣＴ）を、たとえば０．１〜１０ｍｓの範囲で変化させると、個々の炭素ピークの積分強度は大きく変化する。図４は、パン酵母β−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカンの固体13Ｃ−ＣＰ／ＭＡＳ−ＮＭＲ測定における、Ｃ−１〜Ｃ−６炭素ピークの積分強度とＣＴとの関係を示すグラフである。図４から明らかなように、Ｃ−１〜Ｃ−６炭素ピークの積分強度は、ＣＴが１ｍｓ付近である場合に最大値をとることがわかる。したがって、本発明の定量方法においては、積分強度比Ａ／ＢおよびＢ0／Ａ0を精度よく得るためには、ＣＴを１ｍｓ程度とすることが好ましい。また、図４に示されるように、ＣＴを０．１〜１０ｍｓの範囲で変化させると、個々の炭素ピークの積分強度は大きく変化することから、ＣＴを変化させる場合には、その度に補正因子を算出することが好ましい。
【００５６】
次に、積分強度比Ａ／Ｂと（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比との関係が上記関係式（１）で表される根拠について説明する。もし仮に試料中のβ−グルカンが（１，６）結合グルコースを含まず、（１，３）結合グルコースのみからなる場合には、Ｃ−１炭素の数と（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素の数は同じ数となるが、試料中のβ−グルカンが（１，６）結合グルコースを含むことにより、（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素数は、Ｃ−１炭素数よりも小さくなる。これら炭素数の関係、すなわち、グルコースのＣ−１炭素数／（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素数比は、上記したように（Ａ／Ｂ）×（Ｂ0／Ａ0）＝（Ａ／Ｂ）×Ｘである。試料中のβ−グルカンが（１，６）結合グルコースを含むことによる（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素数の減少分、すなわち、Ａ−（Ｂ／Ｘ）は、試料中に含まれる（１，６）結合グルコースの数に相当する。一方、Ｂ／Ｘは、Ｃ−６位において（１，６）結合を有さないグルコース、すなわち（１，３）結合グルコースの数に相当する。したがって、（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比は、｛Ａ−（Ｂ／Ｘ）｝／（Ｂ／Ｘ）＝（Ａ／Ｂ）×Ｘ−１となる。
【００５７】
以上より、対象となる試料について固体13Ｃ−ＮＭＲ測定を行ない、得られた積分強度比Ａ／Ｂを上記関係式（１）に代入することにより、容易に当該試料の（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を求めることができる。
【００５８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５９】
＜実施例１＞
まず、β−Ｄ−（１，６）分岐β−Ｄ−（１，３）グルカンを含むノルウェー産パン酵母菌の細胞壁の粉末を前処理を施すことなく、そのままの状態で試料管にいれ、固体13Ｃ−ＮＭＲ測定を行なった。なお、該試料は、若干の水を含む。測定条件は次のとおりである。装置  Ｃｈｅｍａｇｎｅｔｉｃ社製ＪＮＭ−ＣＭＸ３００Ｘ、試料管直径４ｍｍ、試料管回転数１０ｋＨｚ、測定モード  ＣＰ／ＭＡＳ法、測定温度  ３０℃、13Ｃ共鳴周波数  ７５．５６９ＭＨｚ、スキャン  ２５６回、ＰＤ  ５ｓ、コンタクト時間（ＣＴ）  １．０ｍｓ。図２は、得られたＮＭＲスペクトルである。図２に示されるように、グルコース環領域には、１０４．３、８７．３、７７．７、７４．９、６８．８、６１．６ｐｐｍに６つのピークが観測された。１０４．３ｐｐｍのピークは、（１，３）結合グルコースおよび（１，６）結合グルコースのＣ−１炭素のピークである。８７．３、７７．７、７４．９、６８．８ｐｐｍの４つのピークは、グルコースのＣ−２〜Ｃ−５炭素および（１，６）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの重なりである。また、６１．６ｐｐｍのピークは、（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素のピークである。
【００６０】
次に、Ｄｅｌｔａ（Ｖｅｒ４．３．４）（米国日本電子社製）の波形分離ソフトを用い、波形分離した。波形分離した結果を図３に示す。波形分離処理により、図２のスペクトルは、１０４．１ｐｐｍのグルコースのＣ−１炭素ピーク、６１．５ｐｐｍの（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピーク、ならびに８７．３〜６８．７ｐｐｍに現れるグルコースのＣ−２〜Ｃ−５炭素および（１，６）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの重なりから構成されることがわかった。なお、積分強度比から、（１，６）結合グルコースのＣ−６炭素ピークは、Ｃ−２炭素ピークと重なっていることがわかる。上記波形分離された各炭素ピークのうち、図２における１０４．３ｐｐｍのグルコースのＣ−１炭素ピークおよび６１．６ｐｐｍのＣ−６炭素ピークに相当するピークを用いて、積分強度比Ａ／Ｂを算出した。すなわち、波形分離されたグルコースのＣ−１炭素ピークの積分強度Ａは、２２３．４であり、波形分離された（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの積分強度Ｂは、１７６．７であることから、積分強度比Ａ／Ｂは１．２６と算出した。
【００６１】
次に、補正因子Ｘを次のようにして得た。まず、（１，３）結合グルコースのみからなるβ−（１，３）−グルカンであるカードラン（武田製薬（株）製）について、上記と同一の測定条件で固体13Ｃ−ＮＭＲ測定を行なった。得られたスペクトルを図５に示す。図５において、１０３．８ｐｐｍのピークはＣ−１炭素、８９．３ｐｐｍのピークはＣ−３炭素、７５．３ｐｐｍのピークはＣ−５炭素、７２．７ｐｐｍのピークはＣ−２炭素、６９．１ｐｐｍのピークはＣ−４炭素、６１．３ｐｐｍのピークはＣ−６炭素のピークである。次に、Ｄｅｌｔａ（Ｖｅｒ４．３．４）（米国日本電子社製）の波形分離ソフトを用い、上記と同様にして波形分離処理を行なった。波形分離した結果を図６に示す。図６において、１０３．５ｐｐｍのピークはＣ−１炭素ピーク、８９．７および８７．５ｐｐｍのピークはＣ−３炭素ピーク、７５．３ｐｐｍのピークはＣ−５炭素ピーク、７２．７ｐｐｍのピークはＣ−２炭素ピーク、６８．７ｐｐｍのピークはＣ−４炭素ピーク、６１．１ｐｐｍのピークはＣ−６炭素ピークである。補正因子Ｘ、すなわち、Ｃ−６炭素のピークの積分強度Ｂ0とＣ−１炭素のピークの積分強度Ａ0との比Ｂ0／Ａ0は、Ａ0＝３５１．１、Ｂ0＝３２４．０であることから、０．９２３と算出した。最後に、得られた積分強度比Ａ／Ｂを関係式（１）に当てはめることにより、（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を得た。
【００６２】
（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比＝（１．２６）×０．９２３−１＝０．１６３。
【００６３】
＜実施例２＞
測定モードをＤＰ／ＭＡＳ法とし、ＰＤを１００ｓにしたこと以外は、実施例１と同様にして（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を算出した。まず、実施例１と同じ試料を前処理を施すことなく、そのままの状態で試料管にいれ、固体13Ｃ−ＮＭＲ測定を行なった。測定条件は次のとおりである。装置  Ｃｈｅｍａｇｎｅｔｉｃ社製ＪＮＭ−ＣＭＸ３００Ｘ、試料管直径４ｍｍ、試料管回転数１０ｋＨｚ、測定モード  ＤＰ／ＭＡＳ法、測定温度  ３０℃、13Ｃ共鳴周波数  ２３１．５１０ＭＨｚ、スキャン  ２５６回、ＰＤ  １００ｓ。図７が得られたＮＭＲスペクトルである。図７に示されるように、グルコース環領域には、１０３．６、８６．７、８５．４、７６．６、７４．４、６９．０、６１．７ｐｐｍに７つのピークが観測された。１０３．６ｐｐｍのピークは、（１，３）結合グルコースおよび（１，６）結合グルコースのＣ−１炭素のピークである。８６．７および８５．４ｐｐｍのピークは、Ｃ−３炭素ピーク、７６．６、７４．４および６９．０ｐｐｍのピークは、グルコースのＣ−２、Ｃ−４、Ｃ−５炭素および（１，６）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの重なりである。また、６１．７ｐｐｍのピークは、（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素のピークである。
【００６４】
次に、Ｄｅｌｔａ（Ｖｅｒ４．３．４）（米国日本電子社製）の波形分離ソフトを用い、波形分離した。波形分離処理においては、（１，６）結合グルコースのＣ−６炭素のピークとの重なりは無視した。波形分離した結果を図８に示す。波形分離処理により、図７のスペクトルは、１０５．６および１０３．７ｐｐｍのグルコースのＣ−１炭素ピーク、８７．５および８５．２ｐｐｍのＣ−３炭素ピーク、７６．９ｐｐｍのＣ−５炭素ピーク、７４．１ｐｐｍのＣ−２炭素ピーク、６８．９ｐｐｍのＣ−４炭素ピーク、および６１．６ｐｐｍの（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの重なりから構成されることがわかった。これより、波形分離されたグルコースのＣ−１炭素ピークの積分強度Ａは、５９３．３であり、波形分離された（１，３）結合グルコースのＣ−６炭素ピークの積分強度Ｂは、５２７．５であることから、積分強度比Ａ／Ｂは１．１３と算出した。
【００６５】
次に、補正因子Ｘを次のようにして得た。まず、（１，３）結合グルコースのみからなるβ−（１，３）−グルカンであるカードラン（武田製薬（株）製）について、上記と同一の測定条件で固体13Ｃ−ＮＭＲ測定を行なった。得られたスペクトルを図９に示す。図９に示されるように、１０３．８、８９．３、７５．３、７２．７、６９．１、６１．３ｐｐｍに６つのピークが認められた。次に、Ｄｅｌｔａ（Ｖｅｒ４．３．４）（米国日本電子社製）の波形分離ソフトを用い、上記と同様にして波形分離処理を行なった。波形分離した結果を図１０に示す。図１０において、１０３．８ｐｐｍのピークはＣ−１炭素ピーク、８９．３および８６．２ｐｐｍのピークはＣ−３炭素ピーク、７５．３ｐｐｍのピークはＣ−５炭素ピーク、７２．７ｐｐｍのピークはＣ−２炭素ピーク、６９．１ｐｐｍのピークはＣ−４炭素ピーク、６１．３ｐｐｍのピークはＣ−６炭素ピークである。補正因子Ｘ、すなわち、Ｃ−６炭素のピークの積分強度Ｂ0とＣ−１炭素のピークの積分強度Ａ0との比Ｂ0／Ａ0は、Ａ0＝６６８．１、Ｂ0＝６９４．１であることから、１．０４と算出した。最後に、得られた積分強度比Ａ／Ｂを関係式（１）に当てはめることにより、（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比を得た。
【００６６】
（１，６）結合グルコース／（１，３）結合グルコース比＝（１．１３）×１．０４−１＝０．１７５。
【００６７】
実施例１および２の結果から明らかなように、測定モードを変えても、ほぼ同等の結果が得られることがわかった。
【００６８】
＜参考例１＞
（固体13Ｃ−ＣＰ／ＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルにおける炭素ピークの帰属）
固体13Ｃ−ＣＰ／ＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルにおける炭素ピークが、グルコースのどの炭素に帰属されるかは次のようにして決定した。まず、（１，３）結合グルコースのみからなるβ−（１，３）−グルカンであるカードラン（武田製薬（株）製）のＮａＯＤ／Ｄ2Ｏ中でのＣ−Ｈ／ＭＱＣ−２Ｄ−ＮＭＲスペクトルを測定した。図１１にそのスペクトルを示す。図１１のスペクトルのＣ−Ｈ相間より、各ピークがグルコースのどの炭素のピークかを判断した。すなわち、図１１におけるピーク１がＣ−１炭素、ピーク２がＣ−３炭素、ピーク３がＣ−５炭素、ピーク４がＣ−２炭素、ピーク５がＣ−４炭素、ピーク６がＣ−６炭素であることがわかった。
【００６９】
次に、同試料について溶液13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ溶液）を測定した。図１２にそのスペクトルを示す。図１１のピーク位置と図１２のピーク位置を比較することにより、図１２の溶液13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおける各ピークが、グルコースのどの炭素のピークかを判断した。すなわち、図１２における１０３．９ｐｐｍのピークがＣ−１炭素、８７．３ｐｐｍのピークがＣ−３炭素、７７．０ｐｐｍのピークがＣ−５炭素、７４．１ｐｐｍのピークがＣ−２炭素、６９．１ｐｐｍのピークがＣ−４炭素、６１．６ｐｐｍのピークがＣ−６炭素のピークであることがわかった。なお、図１２に示される溶液13Ｃ−ＮＭＲスペクトル、図１１に示されるＣ−Ｈ／ＭＱＣ−２Ｄ−ＮＭＲスペクトルおよび別途測定した溶液1Ｈ−ＮＭＲのいずれも、当該カードランが（１，３）結合グルコースのみからなるβ−（１，３）−グルカンであることを示している。このことは、たとえば溶液13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて、Ｃ−１炭素ピーク積分強度／Ｃ−６炭素ピーク積分強度が１．０であることからわかる。
【００７０】
次に、同試料について、固体13Ｃ−ＣＰ／ＭＡＳスペクトルを測定した。図５がそのスペクトルである。図５の炭素ピークと図１２の炭素ピークは、非常により対応を示し、図５の固体13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおける各ピークが、グルコースのどの炭素のピークかを容易に判断できる。すなわち、図５における１０３．８ｐｐｍのピークがＣ−１炭素、８９．３ｐｐｍのピークがＣ−３炭素、７５．３ｐｐｍのピークがＣ−５炭素、７２．７ｐｐｍのピークがＣ−２炭素、６９．１ｐｐｍのピークがＣ−４炭素、６１．３ｐｐｍのピークがＣ−６炭素のピークであることがわかった。
【００７１】
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】β−（１，６）分岐β−（１，３）−グルカンの一例の一部を示す構造式である。
【図２】13Ｃ共鳴周波数７５．５６９ＭＨｚにおける、β−Ｄ−（１，６）分岐β−Ｄ−（１，３）グルカンを含むパン酵母菌の細胞壁の13Ｃ−ＣＰ／ＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図３】図２のスペクトルを波形分離した結果を示す図である。
【図４】（１，３）結合グルコースのみからなるβ−（１，３）−グルカンの固体13Ｃ−ＣＰ／ＭＡＳ−ＮＭＲ測定における、Ｃ−１〜Ｃ−６炭素ピークの積分強度とＣＴとの関係を示すグラフである。
【図５】実施例１における（１，３）結合グルコースのみからなるβ−（１，３）−グルカンであるカードラン（武田製薬（株）製）の固体13Ｃ−ＣＰ／ＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルである。
【図６】図５のスペクトルを波形分離した結果を示す図である。
【図７】実施例２における、β−Ｄ−（１，６）分岐β−Ｄ−（１，３）グルカンを含むパン酵母菌の細胞壁のＤＰ／ＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルである。
【図８】図７のスペクトルを波形分離した結果を示す図である。
【図９】実施例２における（１，３）結合グルコースのみからなるβ−（１，３）−グルカンであるカードラン（武田製薬（株）製）のＤＰ／ＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０】図９のスペクトルを波形分離した結果を示す図である。
【図１１】（１，３）結合グルコースのみからなるβ−（１，３）−グルカンであるカードラン（武田製薬（株）製）のＮａＯＤ／Ｄ2Ｏ中でのＣ−Ｈ／ＭＱＣ−２Ｄ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１２】（１，３）結合グルコースのみからなるβ−（１，３）−グルカンであるカードラン（武田製薬（株）製）の溶液13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ溶液）である。
【符号の説明】
【００７３】
１０１  β−（１，６）グリコシド結合、１０２  （１，３）結合グルコース、１０３  （１，６）結合グルコース。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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