(57)【要約】【課題】  第一の検体に含まれる疾患関連細胞またはこれに由来する細胞を第二の検体において迅速かつ正確に検出する方法の提供。【解決手段】  被験者からの第一の検体に含まれる疾患に関連する細胞またはこれに由来する細胞を、第二の検体において検出する方法であって、（ａ）第一の検体に含まれるゲノムにおいて、前記疾患に関連する遺伝子変異を検出する工程、（ｂ）第二の検体に含まれるゲノムにおいて、前記遺伝子変異を検出する工程、ならびに（ｃ）第一の検体から検出された遺伝子変異と第二の検体から検出された遺伝子変異とを比較する工程を含んでなる方法が提供される。この方法では、検出された遺伝子変異が相互に同一である場合に、第一の検体に含まれる疾患関連細胞またはこれに由来する細胞が第二の検体から検出されたことが示される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者からの第一の検体に含まれる疾患に関連する細胞またはこれに由来する細胞を、第二の検体において検出する方法であって、
（ａ）第一の検体に含まれるゲノムにおいて、前記疾患に関連する遺伝子変異を検出する工程、
（ｂ）第二の検体に含まれるゲノムにおいて、前記遺伝子変異を検出する工程、ならびに
（ｃ）第一の検体から検出された遺伝子変異と第二の検体から検出された遺伝子変異とを比較する工程
を含んでなり、検出された遺伝子変異が相互に同一である場合に、第一の検体に含まれる疾患関連細胞またはこれに由来する細胞が第二の検体から検出されたことが示される、方法。
【請求項２】
第一の検体が前記疾患の治療前に採取されたものであり、第二の検体が前記疾患の治療中または治療後に採取されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療が、薬物療法、放射線療法、温熱療法、ホルモン療法、免疫療法、および外科的治療からなる群より選択されるものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第一の検体が前記疾患の病巣部から採取されたものであり、第二の検体が他の部位から採取されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患関連細胞が、癌細胞または類癌腫細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子変異の検出が核酸増幅法によって行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸増幅法が、等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
核酸増幅法に用いられるプライマーセットが、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも２種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プライマーセットが、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする第三のプライマーであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しない第三のプライマーをさらに含んでなるものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸増幅法において鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
核酸増幅法が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸増幅反応がミスマッチ結合タンパク質の存在下で行われる、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、疾患に関連する細胞または組織の迅速な遺伝子診断法に関する。
【０００２】
背景技術
様々な疾患において、その疾患に特異的な性質を有する細胞が知られている。例えば、癌細胞としては、同じ組織の癌においても様々な性質のものが知られている。さらに、このような癌細胞の性質によって、治療用薬剤の効果、癌の進行、予後などが異なることが知られている。よって、癌細胞の性質を調べて癌を分子生物学的手法により分類することにより、薬剤の選択、治療法の選択、手術の際の術式の選択などに関連する重要な情報が提供される。
【０００３】
疾患に関連する細胞の性質を診断するためには、その疾患の病巣部から組織を採取し、これに含まれる細胞の特性を検査することが考えられる。例えば、癌の診断を行なうためには、癌組織を生検によって採取し、該組織に含まれる細胞の特性を調べることが考えられる。しかし、従来の検査技術では、検査結果が得られるまでに長時間を要する。従って、疾患に関連する細胞または組織の迅速な検査を可能とする技術が必要とされている。
【０００４】
近年、癌などの疾病の分子生物学的な研究が進んでおり、癌細胞などの疾患関連細胞に特異的な遺伝子変異などが数多く見出されている。
【０００５】
一方で、遺伝子中の標的領域を増幅しうる様々な核酸増幅法が開発されており、このような方法としては、最も良く知られているＰＣＲ法（特許文献１：米国特許第４６８３１９５号明細書；特許文献２：米国特許第４６８３２０２号明細書；および特許文献３：米国特許第４８００１５９号明細書）をはじめとして、ＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法（非特許文献１：Trends in Biotechnology 10, pp146-152, 1992）などが知られている。
【０００６】
核酸増幅方法としてはまた、ＰＣＲ法のような複雑な温度調節を必要としない等温増幅法が知られており、例えば、鎖置換増幅法（ＳＤＡ法；特許文献４：特公平７−１１４７１８号公報）、自己維持配列増幅法（３ＳＲ法）、Ｑβレプリカーゼ法（特許文献５：日本国特許第２７１０１５９号公報）、ＮＡＳＢＡ法（特許文献６：日本国特許第２６５０１５９号公報）、ＬＡＭＰ法（特許文献７：国際公開第００／２８０８２号パンフレット）、ＩＣＡＮ法（特許文献８：国際公開第０２／１６６３９号パンフレット）、ローリングサークル法、国際公開第２００４／０４００１９号パンフレット（特許文献９）に記載の方法などが知られている。
【０００７】
さらに、核酸増幅法を利用した遺伝子変異の検出法として、上記のＬＡＭＰ法を用いた変異検出法（特許文献１０：特開２００３−１５９１００号公報）、国際公開第０１／３４８３８号パンフレット（特許文献１１）に記載の方法などが知られている。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４６８３１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４６８３２０２号明細書
【特許文献３】米国特許第４８００１５９号明細書
【特許文献４】特公平７−１１４７１８号公報
【特許文献５】日本国特許第２７１０１５９号公報
【特許文献６】日本国特許第２６５０１５９号公報
【特許文献７】国際公開第００／２８０８２号パンフレット
【特許文献８】国際公開第０２／１６６３９号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２００４／０４００１９号パンフレット
【特許文献１０】特開２００３−１５９１００号公報
【特許文献１１】国際公開第０１／３４８３８号パンフレット
【非特許文献１】Trends in Biotechnology 10, pp146-152, 1992
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、被験者から得られた第一の検体および第二の検体をサンプルとして、疾患に関連する遺伝子変異を検出し、前記第一の検体と第二の検体との間で検出結果を比較することにより、第一の検体に含まれる疾患に関連する細胞またはこれに由来する細胞を第二の検体において迅速かつ正確に検出することができることを見出した。本発明はこれら知見に基づくものである。
【００１０】
従って、本発明の目的は、第一の検体に含まれる疾患関連細胞またはこれに由来する細胞を第二の検体において迅速かつ正確に検出する方法を提供することにある。
【００１１】
そして、本発明による疾患関連細胞の検出法は、被験者からの第一の検体に含まれる疾患に関連する細胞またはこれに由来する細胞を、第二の検体において検出する方法であって、
（ａ）第一の検体に含まれるゲノムにおいて、前記疾患に関連する遺伝子変異を検出する工程、
（ｂ）第二の検体に含まれるゲノムにおいて、前記遺伝子変異を検出する工程、ならびに
（ｃ）第一の検体から検出された遺伝子変異と第二の検体から検出された遺伝子変異とを比較する工程
を含んでなり、検出された遺伝子変異が相互に同一である場合に、第一の検体に含まれる疾患関連細胞またはこれに由来する細胞が第二の検体から検出されたことが示される方法である。
【００１２】
本発明によれば、異なる時期に採取された複数の検体、または生体中の異なる部位から採取された複数の検体において、一つの検体に含まれる疾患関連細胞またはこれに由来する細胞が他の検体に含まれているか否かを迅速かつ正確に調べることが可能となる。特に、本発明による検出法は短時間で実施できるため、手術中に検出結果を得ることも可能である。
【発明の具体的説明】
【００１３】
本発明による疾患関連細胞の検出法では、被験者からの第一の検体および第二の検体について、それぞれに含まれるゲノムから、疾患に関連する遺伝子変異が検出される。
【００１４】
第一の検体は、目的とする疾患に関連する細胞を含むものであればよく、その疾患に応じて当業者であれば適宜選択することができる。このような第一の検体としては、例えば、目的とする疾患の治療前における病巣の中心部から採取した組織を用いることができる。第二の検体は、第一の検体に含まれる疾患関連細胞またはこれに由来する細胞の有無またはその量を調べる対象となる検体であり、目的とする疾患に応じて当業者により適宜選択される。例えば、目的とする疾患が癌である場合には、第二の検体は、その癌の原発巣の周辺組織または転移の疑われる部位の組織などとすることができる。また、疾患の病巣部を外科的手術により摘出する場合には、第一の検体を手術の前にバイオプシー等によって採取し、第二の検体を手術中に採取してもよく、あるいは、第一の検体を手術中に採取し、第二の検体を手術後にバイオプシー等によって採取してもよい。
【００１５】
本発明の一つの実施態様によれば、第一の検体は目的とする疾患の治療前に採取されたものとされ、第二の検体は前記疾患の治療中または治療後に採取されたものとされる。このような治療は目的とする疾患に応じて当業者により適宜選択されるが、例えば、薬物療法、放射線療法、温熱療法、ホルモン療法、免疫療法、外科的治療等が挙げられる。この実施態様では、治療前に存在していた疾患関連細胞がその疾患の治療により消滅したか否か、または治療による該細胞の数の変化を調べることができ、これにより治療効果を評価することが可能となる。
【００１６】
本発明の他の実施態様によれば、第一の検体は目的とする疾患の病巣部から採取されたものとされ、第二の検体は他の部位から採取されたものとされる。この実施態様では、目的とする疾患の病巣部に見られる疾患関連細胞が、病巣部の周辺をはじめとする他の部位に存在するか否か、またはその存在量を調べることができ、これにより該疾患の原発巣から他の部位への転移（例えば、癌転移）を評価することが可能となる。
【００１７】
疾患に関連する細胞は、その疾患に関連する遺伝子変異、好ましくはその疾患に特異的な遺伝子変異を有するものであり、目的とする疾患に応じて当業者により適宜選択される。様々な疾患についてこれに関連する遺伝子変異が知られており、当業者であればこれらの疾患と遺伝子変異との組み合わせを適宜利用することが可能である。このような遺伝子変異としては、例えば、癌に特異的なｐ５３遺伝子における変異が挙げられる。また、疾患関連細胞に由来する細胞は、疾患関連細胞そのものではないものの、該疾患の原発巣以外の部位において疾患関連細胞から分裂し、増殖した細胞である。従って、疾患関連細胞に由来する細胞は、疾患関連細胞と同じ遺伝子型を有する。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様によれば、疾患関連細胞は癌細胞または類癌腫細胞とされる。この実施態様では、第一の検体および第二の検体に含まれるゲノムにおいて、癌に特異的な遺伝子変異が検出される。第一の検体を原発巣の癌組織とし、第二の検体を原発巣の周辺部からの組織とすることにより、癌の浸潤または転移を評価することができる。また、第一の検体を原発巣の癌組織とし、第二の検体を他の部位からの組織とすることにより、その部位への癌の転移を評価することができる。さらに、第一の検体を原発巣の癌組織とし、第二の検体を他の部位に存在する癌組織とすることにより、その部位に存在する癌組織が前記原発巣からの転移癌であるか否かを評価することができる。
【００１９】
癌細胞に特異的な遺伝子変異は数多く知られているが、中でも最も多いのがｐ５３遺伝子の変異である。この遺伝子から発現するｐ５３タンパク質は転写因子の一つであり、細胞周期、アポトーシス、およびＤＮＡ修復の制御を行ない、個体レベルでの変異の蓄積（癌化など）を防ぐ役割を果たしている。ヒトの癌では、その５０％以上の症例においてｐ５３遺伝子の変異が見られ、その中の８０％がアミノ酸置換を伴う点突然変異である。この変異率は他に知られている癌遺伝子と比較してかなり高くなっている。ｐ５３タンパク質はＤＮＡ結合タンパク質であり、癌で見られる変異の多くはＤＮＡ結合ドメインに集中している。さらに、ｐ５３遺伝子の中でも際だって変異の集中するホットスポットが報告されている（Lopez M et al., Use of cytological specimens for p53 gene alteration detection in oral squamous cell carcinoma risk patients. Clin. Oncol. (R Coll Radiol). 2004 Aug; 16(5): 366-70；Soussi T et al., Reassessment of the TP53 mutation database in human disease by data mining with a library of TP53 missense mutations, Hum. Mutat. 25(1): 6-17, 2004；Sudhir Srivastava, et al., Biomarkers for Early Detection of Colon Cancer, Clinical Cancer Research vol. 7, 1118, 2001；Thierry Soussi, et al., Significance of TP53 Mutation in Human Cancer: A Critical Analysis of Mutations at CpG Dinucleotides, Human. Mutation Vol.21, 192, 2003）。また、臓器によって変異の頻度や変異のおこりやすい位置は異なる。ヒトの癌の中で、ｐ５３遺伝子の変異の頻度が高いものは、肺癌、大腸癌、膵臓癌などであり、これらの癌の７０％近くに変異が見られる。例えば、大腸癌に多く見られるｐ５３遺伝子中の変異は、第１７５コドン、第２４８コドン、および第２７３コドンに見られるＣＧでの変異であり、次いで第１９６コドン、第２１３コドン、第２４５コドン、第２８２コドンなどに変異が集中する傾向がある。点突然変異の種類にも明確な傾向があり、圧倒的にＧＣからＡＴへのトランスバージョンが多い。本発明による検出法においては、このような遺伝子変異のいずれか１つまたは２以上の組み合わせを用いることができる。
【００２０】
癌組織を摘出するための外科的手術では、実際の病巣部を直接観察することができ、より正確で細かな組織像の観察が可能となる。その際に医師が知りたい情報は、例えば、浸潤の程度、複数個の病巣が観察される場合におけるそれらの起源の同一性、転移の可能性などである。本発明による検出法によれば、これらの情報を手術中に得ることが可能となる。例えば、肺癌の摘出手術においては、原発巣の癌組織を第一の検体とし、胸腔内を洗浄して得られる洗浄液を第二の検体とすることにより、洗浄液中に存在する原発巣由来の癌細胞の有無を調べることができ、これにより、癌転移について正確に把握することが可能となる。癌転移についての正確な情報は、術式の決定に非常に有用である。また、原発巣の癌組織を第一の検体とし、原発巣の周辺部からの組織を第二の検体とすることにより、癌の浸潤および転移の有無を調べることができる。このような情報は、術式の決定、術後の治療法の選択、投与薬剤の選択、治療効果の判定などに有用である。
【００２１】
遺伝子変異の検出は、当技術分野において周知の標準的な方法、例えば、ＰＣＲを用いる方法、マイクロアレイを用いる方法、インベーダー法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、プライマーエクステンション法などによって行なうことができる。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様によれば、遺伝子変異の検出は、核酸増幅法によって行なわれる。核酸増幅法では、変異にかかるヌクレオチド残基を含む少なくとも一種のプライマーを用いることにより、増幅産物の有無によってその変異を検出することが可能となる。例えば、変異にかかるヌクレオチド残基として変異型のものを含むプライマーを用いる場合には、増幅産物の存在により該変異の存在が示される。このような方法では、目的とする遺伝子変異の有無が検出されるだけでなく、存在する変異型遺伝子を定量することも可能である。また、変異にかかるヌクレオチド残基として野生型のものを含むプライマーを用いる核酸増幅反応を同時に行なうことにより、野生型遺伝子と変異型遺伝子の存在比率を知ることも可能である。
【００２３】
核酸増幅法としては、当業者に公知のいかなる方法を用いてもよいが、好ましくは等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするものとされる。このような等温核酸増幅法としては、例えば、ＬＡＭＰ法（国際公開第００／２８０８２号パンフレット）、ＩＣＡＮ法（国際公開第０２／１６６３９号パンフレット）、ＳＤＡ法（特公平７−１１４７１８号公報）、自立複製法、ＮＡＳＢＡ法（日本国特許第２６５０１５９号公報）、ＴＭＡ法、Ｑβレプリカーゼ法（日本国特許第２７１０１５９号公報）、国際公開第２００４／０４００１９号パンフレットに記載の方法等が挙げられる。
【００２４】
ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。さらに、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。一定の温度条件下での核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、この核酸増幅反応において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。
【００２５】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、等温核酸増幅法として、本発明者らによって開発された核酸増幅法が用いられる。該方法では、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも２種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである前記プライマーセットが用いられる。
【００２６】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、プライマーがストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明によるプライマーとその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、プライマーを標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、市販のプライマー構築ソフト、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（Whitehead Institute for Biomedical Research社製）などを用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーは、その標的核酸に相補的な核酸分子の全部または一部の配列を含んでなるものである。
【００２７】
前記第一のプライマーによる核酸合成の作用機序を図１に模式的に示す。まず、鋳型となる核酸中の標的核酸配列を決定し、その標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）、および配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）を決定する。第一のプライマーは、配列（Ac'）を含んでなり、さらにその５’側に配列（B'）を含んでなる。配列（Ac'）は、配列（A）にハイブリダイズするものであり、配列（B'）は、配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズするものである。ここで、第一のプライマーは、前記配列（Ac'）と前記配列（B'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を含んでいてもよい。このようなプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせると、プライマー中の配列（Ac'）が標的核酸配列の配列（A）にハイブリダイズした状態となる（図１(a)）。この状態でプライマー伸長反応が起こると、標的核酸配列の相補配列を含む核酸が合成される。そして、合成された核酸の５’末端側に存在する配列（B'）が、同核酸中に存在する配列（Bc）にハイブリダイズし、これにより、合成された核酸の５’末端部分においてステム−ループ構造が形成される。その結果、鋳型核酸上の配列（A）が一本鎖となり、この部分に先の第一のプライマーと同一の配列を有する他のプライマーがハイブリダイズする（図１(b)）。その後、鎖置換反応により、新たにハイブリダイズした第一のプライマーからの伸長反応が起こると同時に、先に合成された核酸が鋳型核酸から分離される（図１(c)）。
【００２８】
上記の作用機序において、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズする現象は、典型的には、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。上記第一のプライマーによる伸長反応で生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステム−ループ構造を形成することができる。このステムループ構造は安定的には存在しないが、その構造の形成により剥き出しとなった相補鎖部分（鋳型核酸上の配列（A））に同一の他のプライマーが結合し、すぐさまポリメラーゼが伸長反応を行うことにより、先に合成された鎖が置換されて遊離すると同時に、新たな二本鎖核酸を生成することができる。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様における第一のプライマーの設計基準は次のとおりである。まず、プライマーの伸長により鋳型核酸の相補鎖が合成された後に新たなプライマーが効率よく同鋳型核酸にアニーリングするためには、合成された相補鎖の５’末端におけるステム−ループ構造形成により、鋳型核酸上の前記配列（A）の部分を一本鎖とする必要がある。そのためには、配列（Ac'）の塩基数Ｘと標的核酸配列中における前記配列（A）と前記配列（B）に挟まれた領域の塩基数Ｙとの差（Ｘ−Ｙ）の、Ｘに対する割合（Ｘ−Ｙ）／Ｘが重要となる。ただし、鋳型核酸上において配列（A）よりも５’側に存在する、プライマーのハイブリダイズとは関係無い部分まで一本鎖とする必要はない。また、新たなプライマーが効率よく鋳型核酸にアニーリングするためには、上述のステム−ループ構造形成を効率よく行なうことも必要となる。そして、効率の良いステム−ループ構造形成、すなわち、効率の良い配列（B'）と配列（Bc）とのハイブリダイゼーションには、前記配列（B'）と前記配列（Bc）との間の距離（Ｘ＋Ｙ）が重要となる。一般に、プライマー伸長反応のための最適温度は最高でも７２℃付近であり、そのような低い温度では、伸長鎖が長い領域にわたって解離することは困難である。従って、配列（B'）が配列（Bc）に効率よくハイブリダイズするためには、両配列の間の塩基数は少ないほうが好ましいと考えられる。一方で、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズして鋳型核酸上の前記配列（A）の部分を一本鎖とするためには、配列（B'）と配列（Bc）との間の塩基数は多い方が好ましいと考えられる。
【００３０】
以上のような観点から、本発明の好ましい実施態様による前記第一のプライマーは、プライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の間に介在配列が存在しない場合において、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは５０以下、さらに好ましくは４８以下、さらに好ましくは４２以下とされる。
【００３１】
また、プライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の間に介在配列（塩基数はＹ’）が存在する場合には、本発明の好ましい実施態様による前記第一のプライマーは、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ＋Ｙ’）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは１００以下、さらに好ましくは７５以下、さらに好ましくは５０以下とされる。
【００３２】
前記第一のプライマーは、与えられた条件下で必要な特異性を維持しながら標的核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を有するものである。このプライマーの鎖長は、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは２０〜６０ヌクレオチドとする。また、前記第一のプライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の長さは、それぞれ、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは７〜３０ヌクレオチドである。また、必要に応じて、配列（Ac'）と配列（B'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
【００３３】
前記第二のプライマーは、上述のように、前記標的核酸配列の相補配列（第一のプライマーがハイブリダイズする鎖に対して反対側の鎖）の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである。このような第二のプライマーの構造は、例えば、図２に示すようなものであるが、図２に示される配列やヌクレオチド数に限定されるものではない。第二のプライマーを構成する配列（Cc'）の長さは、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。また、前記折返し配列（D-Dc'）の長さは、好ましくは２〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは２〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは４〜６０ヌクレオチド、さらに好ましくは６〜４０ヌクレオチドであり、折返し配列の内部におけるハイブリダイゼーションによって形成される塩基対のヌクレオチド数は、好ましくは２〜５００ｂｐ、より好ましくは２〜５０ｂｐ、さらに好ましくは２〜３０ｂｐ、さらに好ましくは３〜２０ｂｐである。折返し配列（D-Dc'）のヌクレオチド配列はいかなる配列であってもよく、特に限定されるものではないが、好ましくは標的核酸配列にハイブリダイズしない配列とされる。また、必要に応じて、配列（Cc'）と折返し配列（D-Dc'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
【００３４】
これら第一のプライマーおよび第二のプライマーによる核酸増幅反応について考えられる作用機序を、図３（図３ａおよび図３ｂ）を用いて説明する。なお、図３では、説明を簡略化するため、ハイブリダイズする２つの配列を相互に相補的な配列としているが、これにより本発明が限定されるものではない。まず、第一のプライマーが標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし、該プライマーの伸長反応が起きる（図３(a)）。次いで、伸長鎖（−）上においてステム−ループ構造が形成され、これにより一本鎖となった標的核酸センス鎖上の配列（A）に新たな第一のプライマーがハイブリダイズし（図３(b)）、該プライマーの伸長反応が起きて、先に合成された伸長鎖（−）が脱離する。次に、脱離した伸長鎖（−）上の配列（C）に第二のプライマーがハイブリダイズし（図３(c)）、該プライマーの伸長反応が起き、伸長鎖（＋）が合成される（図３(d)）。生成した伸長鎖（＋）の３’末端と伸長鎖（−）の５’末端ではステム−ループ構造が形成され（図３(e)）、遊離型の３’末端である伸長鎖（＋）のループ先端から伸長反応が起こると同時に、前記伸長鎖（−）が脱離する（図３(f)）。ループ先端からの前記伸長反応により、伸長鎖（＋）の３’側に配列（A）および配列（Bc）を介して伸長鎖（−）が結合したヘアピン型の二本鎖核酸が生成し、その配列（A）および配列（Bc）に第一のプライマーがハイブリダイズし（図３(g)）、その伸長反応により伸長鎖（−）が生成する（図３(h)および(i)）。また、前記ヘアピン型二本鎖核酸の３’末端に存在する折返し配列によって遊離型の３’末端が提供され（図３(h)）、そこからの伸長反応により（図３(i)）、両端に折返し配列を有し、第一および第二のプライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図３(j)）。この一本鎖核酸では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図３(k)）、同様の伸長反応が繰り返され、１回の伸長反応あたり２倍の鎖長となる（図３(l)および(m)）。また、図３(i)において脱離した第一のプライマーからの伸長鎖（−）では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図３(n)）、そこからの伸長反応により、両端にステム−ループ構造が形成され、プライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図３(o)）。この一本鎖核酸においても、３’末端におけるループ形成によって相補鎖合成起点が順次提供されるため、そこからの伸長反応が次々に起こる。このようにして自動的に延長される一本鎖核酸には、第一のプライマーおよび第二のプライマーに由来する配列が伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）との間に含まれているため、各プライマーがハイブリダイズして伸長反応を起こすことが可能であり、これにより標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖が顕著に増幅される。
【００３５】
前記プライマーセットは、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする第三のプライマーであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しない第三のプライマーをさらに含んでなるものとしてもよい。
【００３６】
本発明において「競合しない」とは、そのプライマーが標的核酸にハイブリダイズすることによって他のプライマーによる相補鎖合成起点の付与が妨げられないことを意味する。
【００３７】
第一のプライマーおよび第二のプライマーにより標的核酸が増幅された場合には、上述のように、増幅産物は標的核酸配列とその相補配列とを交互に有するものとなる。その増幅産物の３’末端には折返し配列またはループ構造が存在し、これにより提供される相補鎖合成起点から次々に伸長反応が起こっている。第三のプライマーは、このような増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的配列にアニ−リングすることができる。これにより、増幅産物中の標的核酸配列内に新たな相補鎖合成起点が提供され、そこからの伸長反応が起こるため、核酸増幅反応がより迅速に行われるようになる。
【００３８】
第三のプライマーは必ずしも１種類に限定されるわけではなく、核酸増幅反応の迅速性および特異性を向上させるためには２種類以上の第三のプライマーを同時に用いてもよい。これら第三のプライマーは、典型的には第一のプライマーおよび第二のプライマーとは異なる配列からなるが、これらのプライマーと競合しない限りにおいて、部分的に重なる領域にハイブリダイズするものとしてもよい。第三のプライマーの鎖長は、好ましくは２〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは７〜３０ヌクレオチドとされる。
【００３９】
第三のプライマーは、第一のプライマーおよび第二のプライマーによる核酸増幅反応をより迅速に進めるための補助的な働きをその主目的とするものである。従って、第三のプライマーは、第一のプライマーおよび第二のプライマーの各３’末端のＴｍよりも低いＴｍを有するものとすることが好ましい。また、第三のプライマーの増幅反応液への添加量は、第一のプライマーおよび第二のプライマーのそれぞれの添加量よりも少ない方が好ましい。
【００４０】
前記プライマーセットを利用して遺伝子変異の有無を判定するためには、変異部位が前記配列（A）、前記配列（B）または前記配列（C）に含まれるようにプライマーセットを設計することができる。これにより、増幅産物の有無を確認することによって前記変異の有無を判定することが可能となり、また、増幅産物を定量することにより前記変異を有する遺伝子の量を決定することが可能となる。
【００４１】
本発明の一つの実施態様によれば、前記プライマーセットは、変異に係るヌクレオチド残基が前記配列（A）に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（A）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中に、変異部位において標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（A）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。変異に係るヌクレオチド残基は、好ましくは前記配列（A）の５’末端（第一のプライマーにおける３’末端に対応する）に含まれるものとされる。また、第一のプライマーに含まれる配列（Ac'）は、前記配列（A）に相補的な配列とすることが好ましい。
【００４２】
本発明の他の実施態様によれば、前記プライマーセットは、変異に係るヌクレオチド残基が前記配列（C）に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（C）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中に、変異部位において標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（C）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。変異に係るヌクレオチド残基は、好ましくは前記配列（C）の５’末端（第二のプライマーにおける３’末端に対応する）に含まれるものとされる。また、第二のプライマーに含まれる配列（Cc'）は、前記配列（C）に相補的な配列とすることが好ましい。
【００４３】
本発明の他の実施態様によれば、前記プライマーセットは、変異に係るヌクレオチド残基が前記配列（B）に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上の配列（Bc）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中に、変異部位において標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応における上記ステム−ループ構造の形成が困難となるため、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。第一のプライマーに含まれる配列（B'）は、前記配列（B）と同一の配列とすることが好ましい。
【００４４】
上述の配列（B）における変異の検出について、さらに詳細に説明する。図１に示す作用機序において、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズする現象は、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。第一のプライマーによる伸長反応によって生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステム−ループ構造を形成することができる。しかし、このステム−ループ構造は安定的には存在せず、特に、そのステムを形成する配列（B'）と配列（Bc）部分との間に相補的でないヌクレオチドが存在する場合には、非常に不安定となり、あるいは、ステムが全く形成されない。この場合には、鋳型上の配列（A）とプライマー中の配列（Ac'）とのハイブリダイゼーションの方が優位となり、配列（A）の部分が一本鎖とならないため、次の第一のプライマーがアニーリングできなくなる。そのため、図１に示される連続した反応を起こすことが極めて困難となる。
【００４５】
さらに、前記プライマーセットを利用して核酸配列における配列の欠失または挿入の有無を検出するためには、欠失または挿入に係る部位が、配列（A）、配列（B）もしくは配列（C）に含まれるか、または配列（A）と配列（B）との間に配置されるようにプライマーセットを設計することができる。これにより、増幅産物の有無を確認することによって配列の欠失または挿入の有無を判定することが可能となり、また、増幅産物を定量することにより前記欠失または挿入を有する遺伝子の量を決定することが可能となる。
【００４６】
本発明の一つの実施態様によれば、前記プライマーセットは、欠失または挿入に係る部位が前記配列（A）に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（A）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（A）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。第一のプライマーに含まれる配列（Ac'）は、前記配列（A）に相補的な配列とすることが好ましい。
【００４７】
本発明の他の実施態様によれば、前記プライマーセットは、欠失または挿入に係る部位が前記配列（C）に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（C）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（C）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。第二のプライマーに含まれる配列（Cc'）は、前記配列（C）に相補的な配列とすることが好ましい。
【００４８】
本発明の他の実施態様によれば、前記プライマーセットは、欠失または挿入に係る部位が前記配列（B）に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上の配列（Bc）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応における上記ステム−ループ構造の形成が困難となるため、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。その詳細は、本発明による変異検出について上述したとおりである。また、第一のプライマーに含まれる配列（B'）は、前記配列（B）と同一の配列とすることが好ましい。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットは、欠失または挿入に係る部位が前記配列（A）と前記配列（B）との間に配置されるように設計される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上の配列（Bc）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、第一のプライマーに含まれる配列（B'）と伸長鎖上の配列（Bc）とが適切な距離を維持していないため、核酸増幅反応における上記ステム−ループ構造の形成が困難となる。従って、この場合には、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。
【００５０】
本発明の他の実施態様によれば、前記プライマーセットは、欠失または挿入に係る部位が前記配列（A）と前記配列（C）との間に配置されるように設計される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上の配列（Bc）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。例えば、配列（A）と配列（C）との間における長い配列の挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が核酸試料中に含まれている場合には、核酸増幅の速度（効率）が著しく低減されるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。また、配列（A）と配列（C）との間における配列の欠失により標的核酸配列とは異なる核酸配列が核酸試料中に含まれており、かつこの欠失により配列（B）の一部または全部が失われている場合には、第一のプライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上にハイブリダイズできないため、ステム−ループ構造の形成が不可能となるか、または困難となるため、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。さらに、配列（A）と配列（C）との間における配列の欠失により標的核酸配列とは異なる核酸配列が核酸試料中に含まれており、かつこの欠失による配列（B）の部分的欠失が生じない場合にも、核酸増幅の速度（効率）が低減されるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。
【００５１】
核酸増幅反応に用いられるポリメラーゼは、鎖置換（strand displacement）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus、以下「Ｂ．ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Bacillus caldotenax、以下「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。核酸増幅反応において使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、Vent DNAポリメラーゼ、Vent (Exo-) DNAポリメラーゼ、DeepVent DNAポリメラーゼ、DeepVent (Exo-) DNAポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Z-Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Pfu turbo DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、9°Nm DNAポリメラーゼ、Therminater DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
【００５２】
核酸増幅反応に用いられるその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド(dimethyl sulfoxide)やベタイン（N,N,N-trimethylglycine）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。
【００５３】
核酸増幅反応において、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度（Tm）は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、この融解温度を変化させることができ、従って、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。一般的な融解温度調整剤は、融解温度を下げる効果を有する。このような融解温度調整剤を添加することにより、２本の核酸の間の二本鎖形成部分の融解温度を下げることができ、換言すれば、その二本鎖形成の強度を下げることが可能となる。従って、前記核酸増幅反応においてこのような融解温度調整剤を反応溶液中に添加すると、強固な二本鎖を形成するＧＣの豊富な核酸領域や複雑な二次構造を形成する領域において効率的に二本鎖部分を一本鎖とすることが可能となり、これにより、プライマーによる伸長反応が終わった後に次のプライマーが目的領域にハイブリダイズしやすくなるため、核酸の増幅効率を上げることができる。本発明において用いられる融解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適切に選択される。従って、融解温度調整剤は特に制限されるものではないが、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせとされ、より好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とされる。
【００５４】
さらに、核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類などの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。
【００５５】
さらに、核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されないが、好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの２種以上の混合物とされる。
【００５６】
本発明の好ましい実施態様によれば、核酸増幅反応はミスマッチ認識タンパク質の存在下で行なわれ、これにより、より正確に変異を検出することが可能となる。
【００５７】
細菌や酵母等には、ＤＮＡの２本鎖において部分的に対合できない（ミスマッチ）塩基対が生じたときに、これを修復するための機構があることが既に知られている。この修復は「ミスマッチ結合タンパク質」（「ミスマッチ認識タンパク質」とも称される）と呼ばれるタンパク質によって行なわれるものであり、ＭｕｔＳタンパク質（特表平９−５０４６９９号公報）、ＭｕｔＭタンパク質（特開２０００−３００２６５号公報）、ＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）に結合したＭｕｔＳタンパク質（国際公開第９９／０６５９１号パンフレット）などの様々なミスマッチ結合タンパクの使用が報告されている。さらに、近年、ミスマッチ結合タンパク質を利用してミスマッチを検出する遺伝子診断法が開発されている（M. Gotoh et al., Genet. Anal., 14, 47-50, 1997）。核酸中における特定のヌクレオチドにおける多型および突然変異の検出法としては、例えば、変異のない対照核酸と、変異が存在することが疑われる被検核酸とをハイブリダイズさせ、そこにミスマッチ認識タンパク質を導入することによりミスマッチを検出する方法が知られている。
【００５８】
本発明において「ミスマッチ」とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））から選択される一組の塩基対が正常な塩基対（ＡとＴの組み合わせ、またはＧとＣの組み合わせ）ではないことを意味する。ミスマッチには、１つのミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチ、１または複数の塩基の挿入および／または欠失により生じるミスマッチ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
【００５９】
遺伝子変異の検出のための核酸増幅反応においても、これらのミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、その特異性（正確さ）を向上させることができる。核酸増幅反応においては、相互に相補的でない２つのヌクレオチド配列の間で少量のヘテロ二本鎖構造が生ずることがある。本発明において「ヘテロ二本鎖構造」とは、実質的には相補的な二本鎖構造であるが、１または複数のミスマッチを有することにより非相補的な領域を含む二本鎖構造を意味する。このようなヘテロ二本鎖構造により、本来的には生成しないはずの誤った増幅産物がもたらされる。そこで、核酸増幅反応に用いられる反応液中にミスマッチ結合タンパク質を添加しておけば、上記のようなヘテロ二本鎖構造にこのミスマッチ結合タンパク質が結合し、その後の増幅反応が妨げられる。従って、ミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、誤った増幅産物の生成を防ぐことが可能となる。
【００６０】
本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸におけるミスマッチを認識し、そのミスマッチの部位に結合することが可能なタンパク質であればよく、例えば、当業者に公知のいずれのものであってもよい。また、本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸中のミスマッチを認識しうる限り、野生型タンパク質のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質（変異体）であってもよい。このような変異体は、自然界において生じることもあるが、人為的に作製することも可能である。タンパク質にアミノ酸変異を導入する方法としては、多くの方法が知られている。例えば、部位特異的変異導入法としては、 W.P. DengとJ.A. Nickoloffの方法（Anal. Biochem., 200, 81, 1992）、K.L. MakamayeとF. Ecksteinの方法（Nucleic Adids Res., 14, 9679-9698, 1986）などが知られており、ランダム変異導入法としては、基本的な修復系を欠損した大腸菌 XL1-Red 株（Stratagene社）を用いる方法、亜硝酸ナトリウム等を用いて化学的に塩基を修飾する方法（J.-J. Diaz et al., BioTechnique, 11, 204-211, 1991）などが知られている。このようなミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＭ、ＭｕｔＳおよびそれらの類似体など、多くのものが知られている（Radman,M.et al.,Annu.Rev.Genet.20:523-538(1986);Radaman,M.etal.,Sci.Amer.,August 1988,pp40-46;Modrich,P.,J.Biol.Chem.264:6597-6600(1989)； Lahue,R.S. et al.,Science 245:160-164(1988);Jiricny,J.et al,.Nucl.Acids Res.16:7843-7853(1988);Su,S.S.et al.,J.Biol.Chem.263;6829-6835(1988);Lahue,R.S.et al.,Mutat.Res.198:37-43(1988);Dohet,C.et al.,Mol.Gen.Gent.206:181-184(1987); Jones,M.et al.,Gentics 115:605-610(1987)； Salmonella typhimuriumのＭｕｔｓ（Lu,A.L.,Genetics 118:593-600(1988);HaberL.T. et al.,J.Bacteriol.170:197-202(1988);Pang,P.P.et al.,J.Bacteriol.163:1007-1015(1985)）；およびPriebe S.D.et al.,J.Bacterilo.170:190-196(1988)）。本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、好ましくはＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、または酵母に由来するものとされ、より好ましくはＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、またはＭｕｔＬとされる。
【００６１】
ミスマッチ結合タンパク質は、一本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマッチ結合タンパク質の一本鎖核酸への結合は、一本鎖結合タンパク質により阻害されることが知られている。従って、核酸増幅反応においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、一本鎖結合タンパク質を併用することが好ましい。また、ミスマッチ結合タンパク質は、ミスマッチを含まない二本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマッチ結合タンパク質の誤った結合は、あらかじめ活性剤を用いてミスマッチ結合タンパク質を活性化しておくことにより阻害されることが知られている。従って、核酸増幅反応においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、活性剤によりあらかじめ活性化されたものを用いることが好ましい。
【００６２】
一本鎖核酸にミスマッチ結合タンパク質が結合するのを阻害するために使用する一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）は、当技術分野において公知の任意のＳＳＢとすることができる。好ましいＳＳＢとしては、エシェリキア・コリ、ショウジョウバエ、およびアフリカツメガエルに由来する一本鎖結合タンパク質、およびＴ４バクテリオファージ由来の遺伝子３２タンパク質、ならびに他の種に由来するこれらの相当物が挙げられる。この場合に使用されるミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、ＨｅｘＡ、ＭＳＨ１〜６、Ｒｅｐ３、ＲＮａｓｅＡ、ウラシル−ＤＮＡグリコシダーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼVII、レゾルバーゼなどが挙げられ、好ましくはＭｕｔＳ、ＭＳＨ２もしくはＭＳＨ６、またはこれらの２種以上の混合物とされ、より好ましくはＭｕｔＳとされる。
【００６３】
ミスマッチ結合タンパク質を活性化するための活性剤は、当業者であれば適宜選択することができるため、特に限定されないが、好ましくは、ＡＴＰ(アデノシン５'−三リン酸)、ＡＤＰ(アデノシン５'−二リン酸)、ＡＴＰ−γ−Ｓ(アデノシン５'−Ｏ−(３−チオ三リン酸))、ＡＭＰ−ＰＮＰ(アデノシン５'−[β,γ−イミド]三リン酸)などの化合物とされ、あるいは、ミスマッチ結合タンパク質に結合できるヌクレオチドの一つとされる。ミスマッチ結合タンパク質の活性化は、ミスマッチ結合タンパク質と活性剤とを、室温で数秒間から数分間インキュベートすることにより行うことができる。
【００６４】
核酸増幅法によって得られた増幅産物の存在は、多くのあらゆる方法により検出が可能である。一つの方法は、一般的なゲル電気泳動による特定のサイズの増幅産物の検出である。この方法では、例えば、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン等の蛍光物質により検出できる。他の方法としては、ビオチンのような標識を有する標識プローブを用い、これを増幅産物にハイブリダイズさせることにより検出することもできる。ビオチンは、蛍光標識されたアビジン、ペルオキシダーゼのような酵素に結合したアビジン等との結合により検出可能である。さらに別の方法としては、免疫クロマトグラフを用いる方法がある。この方法では、肉眼で検出可能な標識を利用したクロマトグラフ媒体を用いることが考案されている（イムノクロマトグラフィー法）。上記増幅断片と標識プローブとをハイブリダイズさせ、該増幅断片のさらに異なる配列とハイブリダイズ可能な捕捉用プローブをクロマト媒体に固定しておけば、その固定した部分でトラップすることができ、クロマト媒体での検出が可能となる。その結果、肉眼的にシンプルな検出が可能となる。さらに、本発明者らによる核酸増幅法では、核酸増幅反応における増幅効率が非常に高いため、増幅の副産物としてピロリン酸が生じることを利用して、増幅産物を間接的に検出することもできる。このような方法としては、例えば、ピロリン酸が反応溶液中のマグネシウムと結合することによりピロリン酸マグネシウムの白色沈澱が生じることを利用して、反応溶液の白濁を目視で観察する方法がある。また、他の方法としては、ピロリン酸がマグネシウムなどの金属イオンと強く結合して不溶性塩を形成することにより、反応溶液中のマグネシウムイオン濃度が著しく減少することを利用する方法がある。この方法では、マグネシウムイオン濃度に応じて色調が変化する金属指示薬（例えば、Eriochrome Black T、Hydroxy Naphthol Blue等）を反応溶液に添加しておくことにより、反応溶液の色の変化を目視で観察することにより、増幅の有無を検出することが可能となる。さらに、Calceinなどを利用することにより、増幅反応に伴う蛍光の増大を目視で観察することができるため、リアルタイムでの増幅産物の検出が可能となる。
【００６５】
本発明による検出法では、次いで、第一の検体から検出された遺伝子変異と第二の検体から検出された遺伝子変異とが比較される。この比較において、検出されたこれらの遺伝子変異が相互に同一である場合には、第一の検体に含まれる疾患関連細胞またはこれに由来する細胞が第二の検体から検出されたことが示される。
【００６６】
本発明による検出法によれば、目的とする疾患の治療前に採取された検体を第一の検体とし、該疾患の治療中または治療後に採取された検体を第二の検体とすることにより、その治療効果を評価することが可能となる。従って、本発明によれば、被験者における疾患の治療の効果を評価する方法が提供され、該方法は、（ａ）被験者から前記疾患の治療前に採取した第一の検体に含まれるゲノムにおいて、前記疾患に関連する遺伝子変異を検出する工程、（ｂ）被験者から前記疾患の治療中または治療後に採取した第二の検体に含まれるゲノムにおいて、前記遺伝子変異を検出する工程、ならびに（ｃ）第一の検体から検出された遺伝子変異と第二の検体から検出された遺伝子変異とを比較する工程を含んでなる。この方法では、検出された遺伝子変異が相互に異なるか、または第二の検体において前記遺伝子変異が検出されない場合に、治療の効果が高いものと評価される。前記治療は、目的とする疾患に応じて当業者により適宜選択されるが、例えば、薬物療法、放射線療法、温熱療法、ホルモン療法、免疫療法、外科的治療等が挙げられる。
【００６７】
また、本発明による検出法によれば、目的とする疾患の病巣部から採取された検体を第一の検体とし、他の部位から採取された検体を第二の検体とすることにより、該疾患の原発巣から他の部位への転移（例えば、癌転移）を評価することが可能となる。従って、本発明によれば、被験者における疾患の原発巣から他の部位への転移を評価する方法が提供され、該方法は、（ａ）被験者の前記疾患の原発巣から採取した第一の検体に含まれるゲノムにおいて、前記疾患に関連する遺伝子変異を検出する工程、（ｂ）被験者の他の部位から採取した第二の検体に含まれるゲノムにおいて、前記遺伝子変異を検出する工程、ならびに（ｃ）第一の検体から検出された遺伝子変異と第二の検体から検出された遺伝子変異とを比較する工程を含んでなる。この方法では、検出された遺伝子変異が相互に同一である場合に、疾患の原発巣から他の部位への転移があるものと評価される。本発明の好ましい実施態様によれば、前記疾患は癌または腫瘍とされ、これらの他の部位への転移が評価される。また、原発巣の癌組織または腫瘍組織を第一の検体とし、原発巣の周辺部の組織を第二の検体とすることにより、癌または腫瘍の浸潤を評価することもできる。さらに、原発巣の癌組織を第一の検体とし、他の部位に存在する癌組織を第二の検体とすることにより、その部位に存在する癌組織が前記原発巣からの転移癌であるか否かを評価することができる。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６９】
実施例１：ｐ５３遺伝子の変異を指標とした大腸癌の原発病巣部とその周辺組織の分析
本実施例では、大腸癌患者から得た組織を検体として用いて、核酸増幅法によりヒトｐ５３遺伝子（配列番号１）中の変異を調べた。検査の対象とする変異は、同遺伝子中の第１７５コドン、第２１３コドン、第２４５コドン、第２４８コドン、および第２７３コドン（図４中の囲み部分）におけるヌクレオチド置換とした。
【００７０】
核酸増幅反応には、下記の配列を有するプライマーを用いた。
【００７１】
フォワードプライマー：
175F-W：5'-GGCAGCGCCTTCTACAAGCAGTCACAGCAC-3'（配列番号２）；
175F-M：5'-GGCAGTGCCTTCTACAAGCAGTCACAGCAC-3'（配列番号３）；
213F-W：5'-ATGTCGAAAAAATTTGCGTGTGGAGTATTT-3'（配列番号４）；
213F-M：5'-ATGTCAAAAAAATTTGCGTGTGGAGTATTT-3'（配列番号５）；
245F-W：5'-GATGCCGCCCATCCACTACAACTACATGTG-3'（配列番号６）；
245F-M1：5'-GATGTCGCCCATCCACTACAACTACATGTG-3'（配列番号７）；
245F-M2：5'-GATGCTGCCCATCCACTACAACTACATGTG-3'（配列番号８）；
248F-W：5'-CCTCCGGTTCAACTACATGTGTAACAGTTC-3'（配列番号９）；
248F-M1：5'-CCTCTGGTTCAACTACATGTGTAACAGTTC-3'（配列番号１０）；
248F-M2：5'-CCTCCAGTTCAACTACATGTGTAACAGTTC-3'（配列番号１１）；
273F-W：5'-AAACACGCACTGGTAATCTACTGGGACGGA-3'（配列番号１２）；
273F-M1：5'-AAACATGCACTGGTAATCTACTGGGACGGA-3'（配列番号１３）；
273F-M2：5'-AAACACGCACTGGTAATCTACTGGGACGGA-3'（配列番号１４）。
【００７２】
リバースプライマー：
R1：5'-GGATATATATATATCCAGATTCTCTTCCTCTGTGCG-3'（配列番号１５）；
R2：5'-GGATATATATATATCCCTGGAGTCTTCCAGTGTGAT-3'（配列番号１６）；
R3：5'-GGATATATATATATCCCTCAGGCGGCTCATAGGGCA-3'（配列番号１７）；
R4：5'-GGATATATATATATCCCATCGCTATCTGAGCAGCGC-3'（配列番号１８）。
【００７３】
フォワードプライマーの名称の最初に付された番号は、検査の対象となるｐ５３遺伝子中のコドン番号を示している。また、フォワードプライマーの配列中、下線を付した箇所は検査対象の変異にかかるヌクレオチド残基である。さらに、「Ｆ」はフォワードプライマーを示し、「Ｒ」はリバースプライマーを示す。また、「Ｗ」はそのプライマーが野生型の配列を含むことを意味し、「Ｍ」はそのプライマーが変異型の配列を含むことを意味する。
【００７４】
フォワードプライマーは、その３’末端側にある配列（約２０ｍｅｒ）が鋳型にアニーリングし、５’末端側にある配列（１０ｍｅｒ）がそのプライマーによる伸長鎖上の、該プライマーの３’末端残基の１６塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするように設計されている。リバースプライマーは、その３’末端側にある配列（２０ｍｅｒ）が鋳型にアニーリングし、５’末端側にある配列（１６ｍｅｒ）がその領域内で折り畳まれる構造をとるように設計されている。フォワードプライマーは変異にかかるヌクレオチド残基を含んでいるため、核酸増幅反応による増幅産物の有無によって、変異にかかる残基がそのフォワードプライマーに含まれているものか否かを判定することが可能となる。
【００７５】
２名の大腸癌患者（症例１および症例２）から手術によって摘出されたヒト大腸癌組織の原発病巣中心部、近縁部、遠隔部、転移部などの部位から生検針を用いて癌組織を採取し、それぞれの組織を１ｍｌの水に懸濁した。これらのサンプルにつき、それぞれ１μｌの懸濁液を核酸増幅反応に用いた。
【００７６】
上述の組織懸濁液（１μｌ）を、次の組成を有する反応液（２４μＬ）：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ，ｐＨ８．８）、ＫＣｌ（１０ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（８ｍＭ）、ＤＭＳＯ（３％）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（１％）、ｄＮＴＰ（１．４ｍＭ）、ＭｕｔＳ（１μｇ）、それぞれ２０００ｎＭのプライマー対、サイバーグリーン（０．０１μｌ／ｍｌ）、および８ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）を含有；に添加し、これを６０℃で２０分間インキュベートした。この増幅反応は、リアルタイムＰＣＲ装置（ストラタジーン社製）を用いて行った。
【００７７】
図５に示すグラフは、症例１の原発巣中心部の組織における増幅反応の経時変化を示す。下記の表１および表２は、それぞれ症例１および症例２について、増幅反応を行った結果をまとめたものである。これらの表において、増幅反応の結果は、増幅産物の増加速度が速いもの（グラフにおいて曲線の立ち上がりが速いもの）から順に、＋＋＋，＋＋，＋，および±とし、全く増幅が見られなかったものを−とした。
【００７８】
【表１】
2008029205.tif 000002
【００７９】
【表２】
2008029205.tif 000003
【００８０】
症例１では、癌病巣の中心部には第２４８コドン（アルギニンをコードするコドン）に点突然変異が見つかり、病巣近縁部からも同様の突然変異が見つかったことから、近縁部への癌細胞の浸潤があると考えられた。遠隔部には癌細胞を示す突然変異は観察されなかった。
【００８１】
症例２では、主な病巣と近縁部に第２４５コドン（グリシンをコードするコドン）に点突然変異が見つかったが、すこし離れた位置にあった転移巣と思われる組織からはこの変異は検出されず、第２４８コドンに変異が見つかった。このことから、転移巣の癌組織は原発巣からの転移ではなく、由来が異なる癌細胞であることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、第一のプライマーを用いた核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図である。
【図２】図２は、第二のプライマーの構造を例示した図である。
【図３ａ】図３ａは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを用いた核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図である。
【図３ｂ】図３ｂは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを用いた核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図である。
【図４】図４は、ヒトｐ５３遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）中の変異部位を示す図である。
【図５】図５は、症例１の原発巣中心部の組織における増幅反応の経時変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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