(57)【要約】      （修正有） 【課題】ポリグルタミン配列によるタンパク質の重合体の形成を阻害し、MJD等のポリグルタミン病における神経細胞死を抑制し、治療効果を奏する新たな物質の提供。【解決手段】下記のａ）、ｂ）又はｃ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド。ａ）特定のアミノ酸配列；ｂ）特定のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列；ｃ）ａ）又はｂ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有するポリペプチド。該ポリペプチドは、ポリグルタミン配列を有するタンパク質の重合体、特に異常ポリグルタミン配列を有するAtaxin-3の凝集を顕著に阻害することができ、ポリグルタミン病、特にMJDの治療薬として利用可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のａ）、ｂ）又はｃ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列；
ｃ）ａ）又はｂ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
ｂ）の部分アミノ酸配列が配列番号２〜５の何れかより選ばれるアミノ酸配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ヒト由来の核移行シグナル配列が付加されている、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
核移行シグナル配列が配列番号６に記載のアミノ酸配列である、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項６】
配列番号７に記載の塩基配列又はその部分塩基配列からなる、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
部分塩基配列が配列番号８〜１１の何れかより選ばれる塩基配列である、請求項６に記載の核酸
【請求項８】
請求項５〜７の何れか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
下記のｄ）〜ｇ）のポリペプチドの一種以上を有効成分とする、ポリグルタミン病治療薬。
ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、配列番号１２に記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｆ）配列番号１の記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｇ）ｄ）〜ｆ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有するポリペプチド。
【請求項１１】
ｆ）の部分アミノ酸配列が配列番号２〜５の何れかより選ばれるアミノ酸配列である、請求項１０に記載のポリグルタミン病治療薬。
【請求項１２】
ポリグルタミン病がマカド−ジョセフ病である、請求項１０又は１１に記載のポリグルタミン病治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有するポリペプチド、及び該ポリペプチドを有効成分とするポリグルタミン病治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、神経変性疾患は、その殆どが記憶の喪失を伴って最終的に死に至る重篤な疾患であるとして理解される。代表例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病（HD）変異型クロイツフェルトヤコブ病、脊髄小脳運動失調（例えば、SCA1〜SCA7）などである。これらの疾患の病因は依然として完全には理解されていないが、多くの神経変性疾患において、神経系細胞に特殊なポリペプチドが産生、蓄積することが原因である可能性が指摘されている。例えば、ハンチントン病は、異常伸長したポリグルタミン配列を有するタンパク質が形成されることが発症原因である可能性が指摘されている。ハンチントン病の他にも、脊髄延髄筋萎縮症、歯状赤核淡蒼球萎縮症、ならびにSCA1〜SCA３、およびSCA6といった脊髄小脳運動失調においてポリグルタミンの形成が認められている（非特許文献１、非特許文献２）。こうしたポリグルタミン配列を有するタンパク質の発生あるいは蓄積が関与する神経変性疾患は、一般にポリグルタミン病と呼ばれている。
【０００３】
ポリグルタミン病の一つである３型脊髄小脳運動失調（SCA3）は、小脳性運動失調、錐体及び錐体外路徴候、末梢神経障害および眼筋麻痺によって臨床的に特徴づけられる常染色体優性遺伝の脊髄小脳変性症であり、マカド・ジョゼフ病（Machado-Joseph disease、MJD）とも呼ばれている。日本では、MJDは脊髄小脳運動失調の中でもっとも発生頻度が高く、かつ治療法の全くない難病である。MJDの発症原因は、Ataxinと呼ばれるタンパク質をコードしているMJD1遺伝子内の翻訳領域にあるCAGの繰り返し配列（CAGリピート）の数の伸長であると理解されている。CAGリピート数は、正常人では１３〜３６であるが、リピート数がＭＪＤ患者において確認されている６２〜８２へと伸長される結果、AtaxinのC末端領域に異常なポリグルタミン（ポリQ)領域が形成され、この異常ポリＱ領域によってAtaxin同士が凝集体を形成し、この重合体が核内に移行して核内結合タンパク質と結合することで核の機能障害、特に転写障害が生じて神経細胞が死滅すると考えられている。
【０００４】
このAtaxin同士の凝集体の形成を阻害することができれば、MJDに対する有効且つ簡単な治療手段となり得ると期待される。その様な手段の一つとして、Val-Pro-X-Leu-YあるいはPro-X-Leu-Y-Yからなるペプチド（Xは非極性側鎖を持つアミノ酸あるいは電荷を持たない極性側鎖を持つアミノ酸、Yは電荷を有する極性側鎖を持つアミノ酸）が提唱されている（特許文献１）。また、凝集体を形成することができるポリペプチドに、当該凝集を最小限にするように該ポリペプチドに特異的に結合して細胞内凝集体の形成を阻害するポリペプチド結合分子を接触させる段階を含む、ポリペプチドの細胞内凝集体の形成を阻害する方法（特許文献２）が報告されており、ポリペプチド結合分子として、凝集体を形成することができるポリペプチドに対する抗体が開示されている。また、ポリグルタミン配列を有するタンパク質の凝集を抑制する機能を有する分子として、HSP40ファミリータンパク質を指摘している報告があり（非特許文献３）、本発明者らはHSP40スーパーファミリータンパク質の一つであるDNAJC8（非特許文献４）がポリグルタミン配列を有するタンパク質の凝集を抑制することを確認している（非特許文献５）。
【非特許文献１】Batesら、Human Mol.. Genet.、1997年、第6巻、第1633〜1637頁
【非特許文献２】Trottierら、Nature、1995年、第378巻、第403〜406頁
【非特許文献３】Kazemi-Esfarjaniら、Science、2000年、第287巻、第1837~1840頁
【非特許文献４】Ohtsukaら、Cell Stress & Chaperones 2000、 第５巻、第98-112頁
【非特許文献５】第９５回日本病理学会総会講演予稿集、第231頁、3-E-11、2006年3月18日発行
【特許文献１】特開２００５−３２０２７６
【特許文献２】特表２００３−５３１５７０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ポリQ配列によるタンパク質の重合体の形成を阻害し、MJD等のポリグルタミン病における神経細胞死を抑制し、治療効果を奏する新たな物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ポリQ配列によるタンパク質の重合体の形成を阻害する機能を有するポリペプチドを探索した結果、大腸菌のDnaJ (Hsp40) ホモログサブファミリー・タンパク質であるDNAJC8と呼ばれるタンパク質、そのC末端に相当する部分配列からなるポリペプチド、さらにはそのポリペプチドの部分配列からなるポリペプチドが、ポリQ配列を有するタンパク質の重合体の形成を阻害する機能（以下、ポリグルタミン凝集体形成阻害活性とする）を有していることを見いだし、下記の各発明を完成した。
【０００７】
１）下記のａ）、ｂ）又はｃ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【０００８】
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列；
ｃ）ａ）又はｂ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有するポリペプチド。
【０００９】
２）ｂ）の部分アミノ酸配列が配列番号２〜５の何れかより選ばれるアミノ酸配列である、１）に記載のポリペプチド。
【００１０】
３）ヒト由来の核移行シグナル配列が付加されている、１）又は２）に記載のポリペプチド。
【００１１】
４）核移行シグナル配列が配列番号６に記載のアミノ酸配列である、３）に記載のポリペプチド。
【００１２】
５）１）〜４）のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
【００１３】
６）配列番号７に記載の塩基配列又はその部分塩基配列からなる、５）に記載の核酸。
【００１４】
７）部分塩基配列が配列番号８〜１１の何れかより選ばれる塩基配列である、６）に記載の核酸
８）５）〜７）の何れかに記載の核酸を含むベクター。
【００１５】
９）８）に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【００１６】
１０）下記のｄ）〜ｇ）のポリペプチドの一種以上を有効成分とする、ポリグルタミン病治療薬。
【００１７】
ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、配列番号１２に記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｆ）配列番号１の記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｇ）ｄ）〜ｆ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有するポリペプチド。
【００１８】
１１）ｇ）の部分アミノ酸配列が配列番号２〜５の何れかより選ばれるアミノ酸配列である、１０）に記載のポリグルタミン病治療薬。
【００１９】
１２）ポリグルタミン病がマカド−ジョセフ病である、１０）又は１１）に記載のポリグルタミン病治療薬。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のポリペプチドは、ポリQ配列を有するタンパク質の重合体、特に異常ポリQ配列を有するAtaxinの凝集を顕著に阻害することができ、ポリグルタミン病、特にMJDの治療薬として利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列、又はｃ）ａ）又はｂ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有するポリペプチドに関する。
【００２２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列は、DNAJC8（前記非特許文献４）の216番目〜265番目の部分アミノ酸配列である。DNAJC8は、ESTデータベースを基に特定された遺伝子にコードされている、全長265アミノ酸残基からなるヒト由来のタンパク質（配列番号１２）である。このDNAJC8はHSP40（Heat Shock Protein 40）ファミリーに属するタンパク質として知られている既知タンパク質である。
【００２３】
本発明者らは、後に実施例において説明するように、DNAJC8のＣ末端部分である216番目〜265番目の部分アミノ酸配列（配列番号１）を有するポリペプチドがポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有すること、特に異常ポリQ配列を有するAtaxin-3の凝集を阻害し得ることを明らかにした。DNAJC8のポリグルタミン凝集体形成阻害活性が、HSP40ファミリータンパク質に保存されているN末端部分のJドメインには存在せず、DNAJC8に特異的なC末端領域配列中に存在することは予期せぬことであった。さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列のさらなる部分アミノ酸配列からなるポリペプチドもポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有すると考えられる。この様に、本発明であるポリペプチドについての配列番号１に記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において連続する５残基、好ましくは１０残基、より好ましくは２０残基以上のアミノ酸配列からなり、ポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有するポリペプチドを意味する。その好適な例は配列番号２〜５に記載のアミノ酸配列は配列番号１に記載のアミノ酸配列の部分配列であり、配列番号２はDNAJC8の216〜235番目に、配列番号３のアミノ酸配列はDNAJC8の226〜245番目に、配列番号４はDNAJC8の236〜255番目に、配列番号５はDNAJC8の246〜264番目に、それぞれ相当する。
【００２４】
なお、ポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有する限り、配列番号１〜５に記載されたアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドも、本発明の一態様である。機能性ポリペプチドにおいては、アミノ酸残基の電荷、大きさ、疎水性等の物理化学的性質について、保存性の高い変異が許容されることが、経験的に認められている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Gly）とプロリン（Pro）、Glyとアラニン（Ala）またはバリン（Val）、ロイシン（Leu）とイソロイシン（Ile）、グルタミン酸（Glu）とグルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）とアスパラギン（Asn）、システイン（Cys）とスレオニン（Thr）、Thrとセリン（Ser）またはAla、リジン（Lys）とアルギニン（Arg）等が挙げられる。また、上述の意味の保存性を超えた場合でも、なおそのタンパク質の本質的な機能を失わない変異が存在し得ることも当業者において経験されるところである。従って、配列番号１〜４に記載されたアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドであっても、ポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有する場合もあり、これらは本発明の一態様として理解される。
【００２５】
アミノ酸の変異部位および個数は、ポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有するポリペプチドを与える限りにおいて特に制限はないが、変異個数は通常十数アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内である。アミノ酸配列の同一性の程度で改変の許容範囲を表せば、本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１〜５に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の同一性を有していればよい。
【００２６】
また、本発明のポリペプチドは、配列番号１〜５に記載のアミノ酸配列にさらに核移行シグナル配列が付加されているアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。この核シグナル配列の付加によって、当該ポリペプチドが核に移行し、ポリQ配列を有するタンパク質の核内での重合体の形成を抑制することができる。好ましい核シグナル移行配列としては、Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val（配列番号６）を挙げることができるが、これには限定されない。
【００２７】
本発明のポリペプチドは、比較的鎖長の短いポリペプチドであり、公知の種々の有機合成化学的手法を用いて製造することができる。かかる各種合成法とその操作の詳細は広く当業者に知られており、本発明においていずれの方法も利用可能である。また、後に説明する本発明の核酸を用いて、組み換えタンパク質として製造することもできる。また本発明のポリペプチドに、蛍光物質や放射性物質等の適当な標識化合物を付したり、種々の化学修飾物質やポリエチレングリコール等の高分子と結合させたり、不溶性担体へ結合させたりすることもできる。
【００２８】
本発明のポリペプチドが有するポリグルタミン凝集体形成阻害活性は、ポリグルタミン病の病因とされている異常なポリQ配列を有するタンパク質が凝集を形成する条件下に本発明のポリペプチドを共存させ、当該タンパク質の凝集形成を測定して確認することができる。また簡便な方法としては、マーカータンパク質、好ましくはGFP（green fluorescence protein）等の蛍光タンパク質にポリQ配列を付加させた融合タンパク質を人為的に製造し、この融合タンパク質の凝集形成を指標としたアッセイ系を用いて確認することができる。
【００２９】
本発明の核酸は、配列番号１〜５に記載された何れかのアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列において上記に述べた様なアミノ酸の置換等を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸であり、好ましくは配列番号７（配列番号１のアミノ酸配列をコードする）、配列番号８（配列番号２のアミノ酸配列をコードする）、配列番号９（配列番号３のアミノ酸配列をコードする）、配列番号１０（配列番号４のアミノ酸配列をコードする）、配列番号１１（配列番号５のアミノ酸配列をコードする）にそれぞれ記載された塩基配列からなる核酸である。本発明の核酸は、公知の様々な方法によって得ることができる。例えば、DNAJC8をコードするcDNAを公知の方法によってクローニングするか各種のバンクやプロバイダより入手し、ここから制限酵素あるいはPCR法などを利用して調製してもよく、あるいはホスホアミダイト法などの有機化学合成的手法を用いたり、細胞抽出物からPCR法を用いたりすることによって直接調製してもよい。アミノ酸の置換等を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸の調製は、有機化学合成的手法を直接利用するほか、本明細書に記載された核酸から、ＮＴＧなどの変異誘発剤を用いた突然変異誘発法や、種々の組み換え遺伝子手法を用いた部位特異的変異導入法を利用して調製することもできる。
【００３０】
また本発明の核酸は、これを当業者が利用可能な遺伝子組み換え手法によって適当なベクターに組み込み、宿主細胞を形質転換させて、当該形質転換細胞に配列番号１〜５に記載された何れかのアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列において上記に述べた様なアミノ酸の置換等を有するポリペプチドを組み換えポリペプチドとして製造させる際に有用である。また、かかる組み換え生産において使用可能な宿主発現系、プロモーター配列等の機能性核酸配列等の選択と利用、また本発明のポリペプチドに適当なタグ配列やマーカータンパク質のアミノ酸配列が付加された融合ポリペプチドの製造などは、本発明の開示を受けた当業者が通常行い得る作業である。また、本発明の核酸を用いた無細胞系の合成方法も、組み換えポリペプチドを生産する方法の１つである。上記の各種手法は、SambrookらのMolecular Cloning第2版（1989年）その他の組み換えタンパク質の生産において当業者に広く知られている各種実験マニュアルに記載されている方法を利用することができる。またアデノウイルスやAAVなどの遺伝子治療用のベクターに本発明の核酸を組み込むことで、本発明の核酸をポリグルタミン病の遺伝子治療に用いることもできる。
【００３１】
本発明は、下記のｄ）〜ｇ）のポリペプチドの一種以上を有効成分とする、ポリグルタミン病治療薬を提供する。
【００３２】
ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、配列番号１２に記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｆ）配列番号１の記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｇ）ｄ）〜ｆ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有するポリペプチド。
【００３３】
上記ｄ）は配列番号１すなわちDNAJC8の216番目〜265番目のアミノ酸配列を有する、DNAJC8の部分アミノ酸配列からなるポリペプチドである。ｅ）及びｆ）の配列番号１〜５の何れかのアミノ酸配列からなるポリペプチドは前記で説明した通りである。またｇ）は、上記ｄ）〜ｆ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記本発明のポリペプチドについて説明した様な１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有するポリペプチドである。
【００３４】
この様に、本発明であるポリグルタミン病治療薬の有効成分の一つであるｄ）の部分アミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ｆ）の部分アミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において連続する５残基、好ましくは１０残基、より好ましくは２０残基以上のアミノ酸配列からなり、ポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有するポリペプチドである。ｆ）の好適な例は配列番号２〜５に記載のアミノ酸配列は配列番号１に記載のアミノ酸配列の部分配列である。
【００３５】
これらのポリペプチドはいずれもポリグルタミン凝集体形成阻害活性を有しており、異常なポリQ配列を有するタンパク質が凝集を形成することが発症の原因として想定されているポリグルタミン病に対する治療薬となり得る。
【００３６】
本発明におけるポリグルタミン病としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、変異型クロイツフェルトヤコブ病、SCA1〜SCA7等の脊髄小脳運動失調、脊髄延髄筋萎縮症、歯状赤核淡蒼球萎縮症などを挙げることができる。本発明の治療剤は特にMJDの治療に有効である。
【００３７】
本発明の治療剤は、本発明のポリペプチドの他に、剤型に応じて選択される薬学的に許容される種々の担体、ポリペプチドを含む治療剤に好適な種々の賦形剤、及び／又は本発明のポリペプチド以外の薬物などから、必要に応じて適宜選択される成分を含んでいてもよい。その様な成分の選択は、本発明の開示を受けた当業者が通常行い得る操作である。
【００３８】
次に、非限定的な実施例を示して本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００３９】
下記の実施例におけるSH-SY5Y細胞及びその形質転換体の培養は、10％牛胎児血清、2mM グルタミン、100μg/ml ペニシリン−ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（GibcoBRL社）を用い、５％CO2、37℃の条件で行った。
【００４０】
１）ポリQ配列を有するマーカータンパク質を発現するベクターの構築
健常人の肝臓由来cDNAからAtaxin-3タンパク質をコードするｃDNAをPCR法にて増幅し、市販のプラスミドベクターpcDNA3（Invitrogen社）のBamHIとNotIサイトにクローニングした。当該ベクターを基にして、Ataxin -3タンパク質のC末端にAequorea victoria由来のGFP を連結させた融合タンパク質(以下Q26-EGFPとする) を発現するプラスミドベクターataxin-3-Q26-EGFPを作成した。この融合タンパク質Q26-EGFPは、正常なCAGリピート数（26個）を有するAtaxin-3とGFPとからなる。次に、プラスミドベクターataxin-3-Q26-EGFPを鋳型にしてRT-PCR法を行い、82個まで伸長されたCAGリピートを有するAtaxin -3タンパク質とGFPとからなる融合タンパク質(以下Q82-EGFPとする) を発現するプラスミドベクターataxin-3-Q82-EGFPを作成した。この融合タンパク質Q82-EGFPは、異常なCAGリピート数（82個）を有するAtaxin-3とGFPとからなる。
【００４１】
さらに、ataxin-3-Q82-EGFPを基に、Ataxin-3のN末端80残基が欠失され、かつCAGリピート数が82個まで伸長されたAtaxin-3タンパク質とGFPとからなる融合タンパク質(以下T-Q82-EGFPとする)を発現するプラスミドベクター ataxin-3-Q82-EGFP を作成した。融合タンパク質Q26-EGFP、Q82-EGFP及びT-Q82-EGFPそれぞれの構造を模式図（図１）に示す。
【００４２】
２）マーカータンパク質を発現する形質転換細胞の調製
１）で構築した３種類のプラスミドベクターとLipofectamin2000 reagent (Invitrogen社) を用いて、同reagentのプロトコールに従い、SH-SY5Y細胞を形質転換した。48時間のインキュベーション後、形質転換細胞をpuromycin (SIGMA社) 3.5μg/mLを含むDMEM培地に移して、各融合タンパク質を安定に発現している3種類の細胞（Q26-EGFP/SH-SY5Y、Q82-EGFP/SH-SY5Y及びT-Q82-EGFP/SH-SY5Y）を得た。
【００４３】
３）共焦点レーザー顕微鏡観察
２）で調製した3種類の形質転換細胞それぞれ5×104個をカバーガラスに置き、4%パラホルムアルデヒドで5分間固定し、PBSで3回洗浄して、ミクロスライドガラスに免疫組織化学染色試薬 (Thermo Shandon) で固定した後、共焦点レーザー顕微鏡 (LSM510, Carl Zeiss, Tokyo, Japan) で観察した（図2ａ〜図２ｃ）。
【００４４】
その結果、Q26-EGFP/SH-SY5Yでは凝集体は非常に小さく、またその出現頻度も非常に低い（図２ａ）一方、Q82-EGFP/SH-SY5Y及びT-Q82-EGFP/SH-SY5Yでは高輝度の凝集体が観察された（図２ｂ、図２ｃ）。凝集体は、Q82-EGFP/SH-SY5YよりもT-Q82-EGFP/SH-SY5Yの方が多く蓄積していた（図３）。
【００４５】
４）DNAJC8とその部分アミノ酸配列からなるポリペプチド（改変体）の発現ベクターの構築
ヒトESTデータベースを基に、DNAJC8の全長をコードするcDNAを市販ベクターpcDNA3.1mycHis（Invitrogen社）のXhoIとBamHIサイトにクローニングした。制限酵素NotIとEcoRIを用いて、当該ベクターからC末にmyc配列が付加された全長ヒトDNAJC8 をコードするcDNAを切り出し、同制限酵素で開環した市販ベクターpIRESpuro  (Invitrogen社) に組み込んで、ヒト全長DNAJC8を発現するプラスミドDNAJC8-myc-pIRESpuroを作成した。さらに、DNAJC8-myc-pIRESpuroを基に、下記のDNAJC8の置換改変体及び配列番号１２の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド（欠失改変体）を発現するプラスミドを構築した。
【００４６】
JC8QPD：  DNAJC8の96番目のHisをGlnに置換した置換改変体
JC8ΔJ：    DNAJC8の68番目〜124番目のアミノ酸の欠失改変体
JC8ΔNTΔJ：DNAJC8の1番目〜124番目のアミノ酸の欠失改変体
JC8 NLSCT：DNAJC8の1番目〜186番目のアミノ酸の欠失改変体
JC8 CT：  DNAJC8の1番目〜215番目のアミノ酸の欠失改変体
JC8ΔNTΔJΔCT：DNAJC8の1番目〜124番目のアミノ酸及び216番目〜265番目のアミノ酸の欠失改変体
JC8NSL：  DNAJC8の1番目〜186番目のアミノ酸及び216番目〜265番目のアミノ酸の欠失改変体
JC8NT：    DNAJC8の68番目〜265番目のアミノ酸の欠失改変体
上記の各DNAJC8改変体の構造を模式図（図３）に示す。
【００４７】
５）DNAJC8とその改変体の凝集体形成阻害活性の確認
４）で構築したDNAJC8-myc-pIRESpuro、DNAJC8の改変体を発現する８種類のベクター、及びヒトDNAJC8 をコードするcDNAを含まないブランク（pIRESpuro）を用いて、１）で作製した形質転換株であるT-Q82-EGFP/SH-SY5Yを１）と同様の方法によって形質転換して、融合タンパク質T-Q82-EGFPとDNAJC8又はその改変体を共発現する形質転換細胞を調製し、１）と同様の方法によって共焦点レーザー顕微鏡で観察した（図４ａ及び図４ｂ）。また凝集体の発生頻度（全形質転換細胞中に1μm2以上の凝集体を持つ形質転換細胞の割合）と、細胞１個あたりの凝集体の面積を解析した。
【００４８】
融合タンパク質T-Q82-EGFPとブランク（pIRESpuro）を有する形質転換細胞では高輝度の凝集体が観察される（図４ａ）が、融合タンパク質T-Q82-EGFPとDNAJC8を共発現する形質転換細胞（JC8wt）では、凝集体形成阻害が観察された（図４ｂ）。また凝集体の発生頻度は、ブランク（T-Q82-EGFPが発現している形質転換細胞）では80％以上であったが、DNAJC8を共発現させた形質転換細胞では40％以下に低下していた（図５ａ）。さらに凝集体の面積は、ブランクが約30μｍ２であるのに対して、DNAJC8を共発現させた形質転換細胞では10μｍ２以下であった（図５ｂ）。
【００４９】
また、融合タンパク質T-Q82-EGFPと配列番号１（DNAJC8の216番目〜264番目のアミノ酸配列）のアミノ酸配列を有する改変体とを共発現する形質転換細胞でも、凝集体形成阻害が確認された（図３、図６）。また改変体は核に局在していた。
【００５０】
６）Filter retardation assay
５）で調製した融合タンパク質T-Q82-EGFPとブランク（pIRESpuro）を有する形質転換細胞、融合タンパク質T-Q82-EGFPとDNAJC8（IC8wt）を共発現する形質転換細胞、融合タンパク質T-Q82-EGFPとJC8NLSCTを共発現する形質転換細胞の３種類を48時間培養した後に、50mM Tris-HCl(pH8.8), 100mM NaCl, 5mM MgCl2, 0.5%(w / v) Nonidet P-40 (NP-40), 1mM EDTAを含む緩衝液100μLを用いて氷上で30分間細胞を溶解した。遠心分離後の沈殿をDNase I (Roche社)、20mM Tris-HCl(pH8.0)、 15mM MgCl2を含むDNase 緩衝液100μL に懸濁させて、37℃で60分間反応させた。反応後2%SDSと50mM DTTを入れて98℃で５分間加熱した。Hybri-Slot 24 (biometra社) を使って0.2μmのセルロースアセテートメンブレン(advantec社) でフィルトレーションした。メンブレンに補捉された凝集体に1:1000希釈した1C2抗体(CHEMICON社) を加えて反応させた後に、1:10000希釈したgoat peroxidase-conjugated anti-mouse IgG抗体 (KPL社) を反応させた。反応後、enhanced chemiluminescence detaction system (Amersham Biosciences) を用い、マニュアルプロトコールに従ってタンパク質を検出した。
【００５１】
その結果、融合タンパク質T-Q82-EGFPとブランク（pIRESpuro）を有する形質転換細胞から凝集体がメンブレン上に回収される（図７、レーン１）が、融合タンパク質T-Q82-EGFPとDNAJC8（IC8wt）を共発現する形質転換細胞（図７、レーン２）及び融合タンパク質T-Q82-EGFPとJC8NLSCTを共発現する形質転換細胞（図７、レーン３）からは殆ど凝集体は回収されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】CAGリピートを有するマーカータンパク質の構造を模式的に表した図である。図中、QはポリQ配列部分を表す。
【図２ａ】形質転換細胞Q26-EGFP/SH-SY5Yの共焦点レーザー顕微鏡観察写真である。
【図２ｂ】形質転換細胞Q82-EGFP/SH-SY5Yの共焦点レーザー顕微鏡観察写真である。
【図２ｃ】形質転換細胞T-Q82-EGFP/SH-SY5Yの共焦点レーザー顕微鏡観察写真である。
【図３】DNAJC8の改変体の構造、細胞内局在性、ポリグルタミン凝集体形成阻害活性の有無を表す図である。
【図４ａ】融合タンパク質T-Q82-EGFPを発現している形質転換細胞（ブランク）の共焦点レーザー顕微鏡観察写真である。
【図４ｂ】融合タンパク質T-Q82-EGFPとDNAJC8とを共発現している形質転換細胞の共焦点レーザー顕微鏡観察写真である。
【図５ａ】融合タンパク質T-Q82-EGFPを発現している形質転換細胞（左）と融合タンパク質T-Q82-EGFPとDNAJC8とを共発現している形質転換細胞（右）の凝集体の発生頻度を表す。縦軸は％である。
【図５ｂ】融合タンパク質T-Q82-EGFPを発現している形質転換細胞（左）と融合タンパク質T-Q82-EGFPとDNAJC8とを共発現している形質転換細胞（右）の、発生した凝集体の１細胞当たりの面積を表す。縦軸は面積（μｍ２）を表す。
【図６】実施例で作製したDNAJC8とその改変体の構造と、細胞内局在性、凝集体形成阻害能の有無を纏めた図である。
【図７】融合タンパク質T-Q82-EGFPとブランク（pIRESpuro）を有する形質転換細胞（レーン１）、融合タンパク質T-Q82-EGFPとDNAJC8（IC8wt）を共発現する形質転換細胞（レーン２）、融合タンパク質T-Q82-EGFPとJC8NLSCTを共発現する形質転換細胞（レーン３）についてのFilter retardation assayの結果を示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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