(57)【要約】【課題】蛍光標識された検体を光学的に検出する従来方式に代わる方式として、反応前後の誘電率の変化を電気的に検出する方法であって、簡単な構成で安価な生化学物質の検出方法を提供する。【解決手段】プローブ核酸が保持された位置の静電容量を取り出す手段とこの静電容量を用いるＬＣ発振回路と発振周波数の変化をみてターゲットの有無を検出する。【選択図】図３
2008139083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の標的生化学物質を該標的生化学物質と特異的に結合するプローブが固定された担体を用いて検出する方法において、
前記検体を前記担体に固定されたプローブと接触させて、該プローブと前記標的生化学物質との反応を行い、該反応の前後での該担体上のプローブ固定位置の誘電率の変化分を検出することにより、前記標的生化学物質を検出することを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記誘電率の変化分の検出は、前記反応の前後で前記担体上のプローブ固定位置を挟んで対向するように保持した電極対の静電容量の変化分を検出することにより行う請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記静電容量の変化分は、前記反応の前後で前記電極対の静電容量をＣ成分とする発振回路の発振周波数を計数して得られる計数値の変化分より検出することを特徴とする請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記標的生化学物質と前記プローブとの反応を前記担体を設置可能な反応チャンバを備えるカートリッジを用いて該担体を設置した該反応チャンバで行い、該反応の前後で前記電極対を該カートリッジを挟んで対向配置して前記静電容量の変化分を検出することを特徴とする請求項２または３に記載の検出方法。
【請求項５】
前記電極対の少なくとも一方が独立可動に操作できる電極プローブであって、該電極プローブを前記カートリッジ表面に接触または接近させて前記静電容量の変化分を検出することを特徴とする請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
前記標的生化学物質および前記担体に固定されたプローブが核酸であり、前記反応が核酸のハイブリダイゼーション反応であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
プローブ固定担体を用いて検体中の標的生化学物質を検出するために用いる装置であって、
該プローブ固定担体を設置可能な反応チャンバと、
該反応チャンバで行われる反応を制御する手段と、
該プローブ固定担体上のプローブ固定位置を挟んで対向するように配置可能な電極対と、
該電極対の静電容量を検出する手段と、
該静電容量の変化分を検出する手段と、を有することを特徴とする生化学物質検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡなど生化学物質の検出を行う方法であって、ターゲットの生化学物質を特異的に結合するプローブと反応させ、その結果を安価な構成の装置で検出する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学及び生命科学の進歩により、核酸（ＤＮＡ等）の解析により個々人に最適な医療を提供するテーラーメード医療や感染症の診断に応用するための研究が行われている。生化学物質の検出には、核酸の塩基配列を同定することも含まれる。その手法のひとつとしてターゲットの核酸と相補的な塩基配列のプローブ核酸をハイブリダイゼーションさせる方法があり、その手段としてハイブリダイゼーションの結果をチェックする装置が用いられている。これらの装置にはターゲット核酸に付けられた標識が発する微弱な蛍光を光電子増倍管で光学的に検出するものや電極上でハイブリダイゼーションを行わせて電極に流れる電流変化を検出するものなどがある（特許文献１および２参照）。
【特許文献１】特開２００１−２４２０８２号公報
【特許文献２】特開平５−１９９８９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、ハイブリダイゼーション結果をチェックする装置の構成として、光学的な検出を行うには高価な光学センサーや励起のための照明手段が必要であり、ラスター走査をするための高精度な機構系も持たなくてはならない。従って検出する装置は構造が複雑であったり、極めて高価のものとなってしまう。また電気的な検出を行う場合もハイブリダイゼーション反応を電極上でする必要がある。このような形態で検出するには装置が高価なだけでなく、使い捨て可能な手段（ＤＮＡチップ等）を提供することも困難である。本発明は、以上のような状況を鑑みてなされたものであり、安価に核酸などの生化学物質の検出を行う方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は前述の状況に鑑みてなされたものであり、本発明にかかる方法は、検体中の標的生化学物質を該標的生化学物質と特異的に結合するプローブが固定された担体を用いて検出する方法において、
前記検体を前記担体に固定されたプローブと接触させて、該プローブと前記標的生化学物質との反応を行い、該反応の前後で該担体上のプローブ固定位置の誘電率の変化分を検出することにより、前記標的生化学物質を検出することを特徴とする検出方法である。
【０００５】
本発明にかかる装置は、プローブ固定担体を用いて検体中の標的生化学物質を検出するために用いる装置であって、
該プローブ固定担体を設置可能な反応チャンバと、
該反応チャンバで行われる反応を制御する手段と、
該プローブ固定担体上のプローブ固定位置を挟んで対向するように配置可能な電極対と、
該電極対の静電容量を検出する手段と、
該静電容量の変化分を検出する手段と、を有することを特徴とする生化学物質検出装置である。
【発明の効果】
【０００６】
以上、説明したように本発明によれば、従来方法に比べハイブリダイゼーション前後のプローブ核酸が保持されている近傍の誘電率変化の大小を極めて簡便・安価な電気回路で検出可能な方法を提供できる。よって、いわゆるＤＮＡチップ等のバイオチップを用いて生化学物質の検出を行うときに適用して有効なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、核酸などの生化学物質が高分子である事に着目し、生化学物質をこれと特異的に結合するプローブを介して固相上に保持して、結合の前後でプローブ固定位置の誘電率の変化分を検出するものである。誘電率の変化分は電気的な方法で検出する。したがって、検体中の標的生化学物質をプローブが固定された担体（以下、プローブ固定担体という）を用いて検出する方法において、本発明の電気的な検出方法を好適に用いることができる。この場合、検体をプローブ固定担体上のプローブと接触させてプローブと標的生化学物質とを結合させるための反応を行う。この反応を行う前と後でプローブ固定担体上のプローブが固定された位置（以下、プローブ固定位置という）の誘電率の変化分を検出することにより標的生化学物質を検出する。誘電率の変化分の検出は、プローブ固定担体上のプローブ固定位置を挟んで対向するように保持した電極対の静電容量の変化分を当該反応の前後で検出することにより行うことができる。静電容量の変化分は、当該反応の前後で電極対の静電容量をＣ成分とする発振回路の発振周波数を計数して得られる計数値の変化分より検出することができる。発振回路としてＬＣ発振回路が好適に用いることができる。また、電極対として、少なくとも一方が独立可動に操作できる電極プローブを用い、該電極プローブをカートリッジ表面に接触または接近させて電極対の静電容量の変化分を検出することができる。電極対として平行平板電極を用い、電極間にプローブ固定位置を挿入保持して電極対の静電容量の変化分を検出することもできる。本発明における標的生化学物質とプローブとの反応は、プローブ固定担体を設置可能な反応チャンバを備えるカートリッジを用いて、プローブ固定担体を設置した反応チャンバ内で行うことができる。この場合、この反応の前後で電極対の間にカートリッジに収容されたプローブ固定担体のプローブ固定位置を挟んで、電極対の静電容量の変化分を検出する。カートリッジに収容した状態での静電容量の検出は、一定条件のカートリッジ内の環境において行われればよく、反応液等の液体を収容していない状態について行ってもよいし、あるいは液体で満たされた状態について行ってもよい。
【０００８】
標的物質の結合による以外の変化を極力除くため、反応後にプローブと結合した標的生化学物質以外の検体に含まれる成分を除くための洗浄等の操作を必要に応じて行う。カートリッジの材料は、電極間の静電容量に影響を与えないために誘電体であればよく、特に限定されない。
【０００９】
本発明に係る標的生化学物質として、例えばアミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖質、脂質、核酸などが挙げられ、タンパク質には酵素、抗体等、核酸にはＤＮＡ、ＲＮＡ等などが含まれる。標的生化学物質の分子量が大きいほど誘電率の変化は大きくなるため、標的生化学物質は生体高分子であることが好ましい。生体高分子とは、生体内に存在する高分子の有機化合物であり、タンパク質、核酸および糖質等を含む。
【００１０】
プローブは標的生化学物質と特異的に結合して標的生化学物質のみを担体上に保持することで担体上のプローブが固定された位置の誘電率を変化させる。これより、プローブと標的生化学物質との結合とは、プローブによって標的生化学物質を担体上に保持した状態にあれば問題なく、塩基間の水素結合を介した核酸鎖のハイブリッド形成や、抗体−抗原もしくは酵素−基質の親和的相互作用などを含む。プローブと標的生化学物質との反応とは両者を結合させる反応であり、例えば標的生化学物質が核酸の場合は核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション反応や、標的生化学物質がタンパク質の場合は抗体をプローブとする抗原抗体反応などが挙げられる。それ以外にも、核酸とタンパク質との相互作用を利用する標的生化学物質とプローブの組合せであってもよい。本発明のプローブを固定する担体の材料は、反応前後の誘電率の変化を検出することを阻害しない材料であれば特に限定されないが、誘電体を好適に用いることができ、例えばガラス、石英、ポリカーボネートなどが挙げられる。本発明ではプローブ固定担体は電極対の間に挿入可能な形状であり、電極対の間隔が短いほど静電容量が大きく望ましいため、基板形状のもの（プローブ固定基板）を好適に用いることができる。プローブが固定される所定の位置（以下、プローブ固定位置という）には、単一のスポットを含むものに限定されず、複数のプローブのスポットを含む場合もある。例えばプローブが複数種である場合は互いに隔離された複数のスポットを含む場合や、ＤＮＡチップなどのバイオチップのように多数のプローブがアレイ状に固定されているものを含んでもよい。プローブ固定位置とは、これらのプローブスポットをすべて包含する領域をいう。複数のスポットからなるプローブ固定基板として、核酸、タンパク質などを高密度に固定したＤＮＡチップやプロテインチップなどのバイオチップが挙げられ、これらは本発明において好適に用いられる。プローブ固定位置に複数のプローブスポットを含む場合は、検出が可能な範囲でスポット間を区別して各スポットもしくはスポット群について誘電率の変化分を検出する態様も本発明に含まれる。
【００１１】
本発明により検出する標的生化学物質およびそのプローブが核酸であり、それらを結合させる反応がハイブリダイゼーション反応である態様を説明する。プローブ核酸とターゲット核酸がハイブリッドを形成する前後で誘電率の変化分を電気的な方法で検出するものである。電極対を用い、電極間の誘電率の変化分は発振回路の出力する発振周波数の変化に変換して検出する。
【００１２】
プローブ核酸とサンプル核酸の各々の塩基配列が相補的でハイブリダイゼーションが成立すると、プローブ核酸近傍の高分子密度は上昇するので誘電率変化は大きくなる。一方、各々の塩基配列が相補的でなくハイブリゼーションが成立しない場合はその前後の誘電率変化は無いか、あるいは検体成分の残留もしくは検出状態の誤差に起因する微小なものとなる。そのためハイブリダイゼーション前後の発振周波数の変化の大小をみることで目的の着目する生化学物質の有無を検出することが出来る。一つの好ましい態様では、ＤＮＡチップはカートリッジに収納され、検査用サンプルに含まれるターゲット核酸はＤＮＡチップ上でプローブ核酸とのハイブリダイゼーション反応に供せられ、その結果はカートリッジの外側から検出用電極により電気的に検出する。ターゲット核酸を含む検体やプローブ核酸が固定された担体を収容するカートリッジの外側から静電容量検出用の電極を予めカートリッジの所定位置に固定されているプローブ核酸の近傍に接近または接触させて保持する。ターゲット核酸とプローブ核酸との間でハイブリッド形成が行われると高分子の密度が上がり誘電率が変化するので電極の静電容量も変化する。電極両端の静電容量を発振回路の静電容量成分（Ｃ成分）となるように電気回路を形成することで発振周波数の変化として検出することができる。本発明の方法に用いる当該発振回路として、電極対の静電容量をＣ成分とするＬＣ発振回路を用いることが好ましい。そして、この発振回路からの出力を計数する公知の計数手段に接続して発振周波数の変化分を検出することができる。計数手段としては例えば、計数回路にマイクロプロセッサを接続して時間当たりの計数信号を読み取る態様が挙げられる。
【００１３】
本発明は上記で説明した検出方法を利用する検出装置も包含する。当該装置の一態様は、プローブ固定担体を用いて検体中の標的生化学物質を検出するために用いる装置であって下記の（１）乃至（５）を少なくとも有する。
（１）プローブ固定担体を設置可能な反応チャンバ。
（２）反応チャンバで行われる反応を制御する手段。
（３）プローブ固定担体上のプローブ固定位置を挟んで対向するように配置可能な電極対。
（４）該電極対の静電容量を検出する手段。
（５）該静電容量の変化分を検出する手段。
電極対の静電容量を検出する手段として、該電極対の静電容量をＣ成分とする発振回路を用いることが好ましい。発振回路としてＬＣ発振回路が好適に用いることができる。この場合、静電容量の変化分を検出する手段として、該発振回路と接続した計数手段を用いることが好ましく、計数手段としては例えば、計数回路とこれに接続されたマイクロプロセッサとを用いることができる。
【００１４】
また、反応チャンバは装置本体から分離可能なカートリッジであることが好ましく、反応の前後で該カートリッジに収容された状態でプローブ固定担体のプローブ固定位置の静電容量の変化を検出することができる。電極対は、平行平板電極を用いて、設置してこれらの中にカートリッジを挿入してもよい。本装置が核酸を標的として核酸プローブとハイブリダイゼーション反応を行う場合、反応を制御する手段は、ハイブリダイゼーション反応の温度、時間等のパラメータを柔軟に切り替えられるようにソフトウェアによって制御してもよい。本発明の検出装置を構成する電極対をＣ成分とする発振回路、およびこの出力の検出手段（例えば、計数回路、マイクロチップ等）は簡便な構造であり、持ち運ぶことができる程度の軽量な装置とすることが可能である。このような特徴から装置を固定位置に設置して用いる以外に携帯して検体のサンプリングと同時に検査を行うなどの用途が可能となる。電極対としては、平行平板電極を装置上に備え、プローブ固定担体を少なくともプローブ固定位置が平行平板電極の間に保持されるように設置して静電容量を検出する構成を用いることができる。あるいは、少なくとも一方が可動性の電極プローブからなる電極対を用い、プローブ固定位置を挟んで対向するように電極対を接近させて一定に保持する。プローブ固定担体をカートリッジに収容して検出すれば、電極プローブをカートリッジ表面に接触させることで、容易に一定位置に保持することができるので好ましい。
【実施例】
【００１５】
以下に本発明の実施形態を説明する。
【００１６】
本発明の実施形態は、ターゲット核酸とプローブ核酸とのハイブリッド形成の有無を誘電率の変化として電極でピックアップし、当該誘電率の変化をＬＣ発振回路が出力する発振周波数の変化に変換して検出するものである。
【００１７】
ＤＮＡは、４種類の塩基［アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）］のいずれか一つと糖とリン酸とからなるヌクレオチドが、糖とリン酸との間で互いにつながり鎖状になって高分子をなしている。図１はその様子を表している。
【００１８】
１本の鎖からなるＤＮＡ分子は、Ａ−Ｔ，Ｃ−Ｇの組み合わせで相補的な塩基の対を形成する。ある配列の分子の鎖に対しては、当該相補的な塩基対からなる相補的な配列を有する分子の鎖のみが対になる特性を持っている。ここで、相補的な配列とは、すべての塩基配列が相補的である完全相補の配列だけでなく、ハイブリダゼーション反応での温度、時間又は溶液の塩濃度等の条件において、ハイブリッド体の形成が十分可能な程度に相補性を有しているものであればよい。よって、プローブ配列の相補性はハイブリダゼーション反応の目的において、適宜、設定することができる。
【００１９】
図１にはプローブ核酸１が基板２に固定されたＤＮＡの形態が示されている。この例はプローブ核酸の塩基配列がＡＴＣＧＧＣＴＡとしたときのものである。プローブ核酸は所定の位置に所定の密度で基板上のスポットに固定されている。符号３はプローブ核酸１の塩基Ａであり、符号４は塩基Ｔである。これらの塩基群が鎖状になって高分子としてプローブ核酸１が基板に固定されている。符号５は検体に含まれるターゲット核酸であり、その塩基配列はプローブ核酸と相補的なＴＡＧＣＣＧＡＴである。
【００２０】
図１は基板に固定されたプローブ核酸と検定のためにプローブ核酸近傍に投入されたターゲット核酸のイメージを例示したものであり、プローブ核酸とターゲット核酸がハイブリダイゼーションする前の様子を示したものである。
【００２１】
図２は図１の状態から時間が進行しプローブ核酸１と投入されたターゲット核酸５のハイブリゼーションが成立した時の状態を表している。プローブ核酸１の塩基配列と相補的な塩基配列のターゲット核酸５の各々はＡ−Ｔ，Ｃ−Ｇの組み合わせで対になり水素結合により結び合っている。もしプローブ核酸の塩基配列と相補的でない塩基配列の核酸がプローブ核酸に接近してもハイブリダイゼーションはおこらない。
【００２２】
次にカートリッジの部分断面図を含む図３により本発明の検出方法について説明する。
【００２３】
符号１０は基板上に保持されたプローブ核酸がスポットされた位置であり、符号１１と符号１２はプローブ核酸のスポット位置１０をカートリッジの外側から挟む電極である。また、符号１３と符号１４は電極リード線、符号１５はＬＣ発振回路、符号１６は計数回路、符号１７はマイクロプロセッサ、符号１８はカートリッジの一方の側、符号１９はカートリッジの他の側である。
【００２４】
基板上のプローブ核酸が保持されたスポット位置１０にはハイブリダイゼーションが行われる前は図１のように所定の密度で高分子であるプローブ核酸のみが存在している。この状態でのプローブ核酸が保持されたスポット位置１０の誘電率をε０とし、図２のようにプローブ核酸とターゲット核酸がハイブリダイゼーションした後の高分子密度が高まった状態での誘電率をε１とする。そうすると、当該位置の両側から所定の面積を有する電極１１及び１２で挟み込むとそのときの電極リード線１３及び１４には静電容量としてハイブリダイゼーション前はＣ０ファラド、ハイブリダイゼーション後はＣ１ファラドが生じる。つまりハイブリダイゼーション前後で電極リード線１３及び１４の両端の静電容量はＣ０とＣ１の差分だけ変化する。もちろんハイブリダイゼーションはプローブ核酸の塩基配列と配列が相補的なターゲット核酸のみとの間で成立する。そのため、プローブ核酸の近傍に漂っているターゲット核酸以外は洗い流すことにより、検出しようとしているターゲット核酸のみがハイブリダイゼーション後もプローブ核酸と結びついた形で存在することになる。従って検定にあたりプローブ核酸に検査用サンプルを混じり合わせハイブリダイゼーションさせた後さらに洗浄を行いそのときの静電容量とハイブリダイゼーションさせる前の静電容量の差をみることでターゲットの生化学物質を検出するものである。
【００２５】
電極間の誘電率が大きくなると電極両端の静電容量は大きくなる。つまりハイブリダイゼーションが成立したときはプローブ核酸のスポットされた位置（プローブ固定位置）近傍では分子密度が高くなり、ハイブリダイゼーション前の状態やハイブリゼーションしなかったときの静電容量よりも大きくなる。
【００２６】
電極リード線はＬＣ発振回路１５につながれてＣ成分として動作に供される。ＬＣ発振回路の発振周波数は静電容量の平方根に反比例するからハイブリダイゼーションが成立したときの発振周波数はハイブリダイゼーションする前よりも低くなる。
【００２７】
ハイブリダイゼーション前の電極リード線１３及び１４にＣ０ファラドの静電容量のときの発振周波数がｆ０であり、ハイブリダイゼーション反応後にハイブリダイゼーションが成立したときには静電容量は上昇しＣ１ファラドとなる。そのとき発振回路が出力する発振周波数はｆ１となる。前述したようにｆ１はｆ０よりも低くなる。
【００２８】
発振回路１５からの出力は計数回路１６の入力につながれている。そして計数回路が出力する計数値はマイクロプロセッサ１７に読み取られる。ここでマイクロプロセッサは計数回路に対して計数スタート信号送信リード線２０を介して信号を送信するように構成する。計数スタートから所定の時間、例えば１秒間の計数値は発振周波数として直読できる。
【００２９】
このように構成することにより生化学物質の検出を行うには、先ずＤＮＡチップにプローブ核酸が固定されたのみの状態つまりハイブリダイゼーションを行う前の状態についてＬＣ発振回路の出力する信号を計数回路を介してマイクロプロセッサで読み取っておく。
【００３０】
次にハイブリダイゼーションを行い、その後同様にマイクロプロセッサで発振周波数を読み取る。両方の読み取りデータを比較し、ハイブリダイゼーション前よりも後での発振周波数が低くなおかつ所定の値よりも周波数の変化幅が大きかったときはターゲットの核酸が存在したと判断する。そうでなければターゲットの核酸はサンプル中には存在しなかったと決定することが出来る。以上のようにＬＣ発振回路の出力を読み取り発振周波数の変化幅を見ることによって生化学物質の検出を行うことが出来る。当該周波数変化幅の所定値は、プローブ固定量、電極面積、電極間隔等によって定まる検出感度、および発振回路に起因する周波数のばらつきなどを考慮して、十分に信頼のある値を設定する。
【００３１】
ここで示した実施形態ではプローブ及び標的生化学物質ともにＤＮＡであり、反応がハイブリダイゼーション反応である場合について説明したが本発明はこれに限定されず、ＲＮＡまたは抗原もしくは酵素等のタンパク質などの生化学物質も検出の対象として含む。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】基板上でのプローブ核酸と標的核酸のハイブリダイゼーション前の状態を示す図である。
【図２】基板上でのプローブ核酸と標的核酸のハイブリダイゼーション成立後の状態を示す図である。
【図３】本発明にかかるカートリッジの断面を含む全体構成図である。
【符号の説明】
【００３３】
１  プローブ核酸
２  基板
３  塩基Ａ
４  塩基Ｔ
５  ターゲット核酸
１０  保持されたプローブ核酸のスポット位置
１１  静電容量を作る電極
１２  静電容量を作る電極
１３  電極リード線
１４  電極リード線
１５  ＬＣ発振回路
１６  計数回路
１７  マイクロプロセッサ
１８  カートリッジの一方の側
１９  カートリッジの他の側
２０  計数スタート信号送信リード線
【図１】
2008139083.tif 000003
【図２】
2008139083.tif 000004
【図３】
2008139083.tif 000005