(57)【要約】【課題】従来のウシ由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母よりも高い対糖収率でＬ−乳酸を製造可能なＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を提供する。更には、該酵母を培養することを含むＬ−乳酸の製造方法を提供する。【解決手段】カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を培養することにより、従来より高い対糖収率でＬ−乳酸の製造ができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母。
【請求項２】
前記Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
前記Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、配列番号１に示す核酸配列を有する遺伝子であることを特徴とする、請求項１または２に記載の酵母。
【請求項４】
前記酵母がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかの項に記載の酵母。
【請求項５】
前記酵母がサッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかの項に記載の酵母。
【請求項６】
前記Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、該遺伝子の発現を可能とするプロモーターの下流に導入されたことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかの項に記載の酵母。
【請求項７】
前記Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１遺伝子）のプロモーターの下流に発現可能な状態で導入されたことを特徴とする、請求項１〜６いずれかの項に記載の酵母。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかの項に記載の酵母を培養することを含む、Ｌ−乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、L−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母及び該酵母を培養することを含むＬ−乳酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、資源循環型社会の構築に向け、植物を原料としたポリマーに注目が集まっている。その中でも、ポリ乳酸（以下、ＰＬＡと略すことがある。）が、植物原料のポリマーとして優れた性質を有することが明らかになってきている。
【０００３】
ＰＬＡの原料である乳酸は、従来ラクトバチラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属やラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に代表される、いわゆる乳酸菌と総称される微生物を培養することにより製造されている。これらの乳酸菌は、糖からの乳酸の収率には優れているものの酸に対する耐性が低いことから、酸性物質である乳酸を多量に蓄積させるためには、炭酸カルシウムや水酸化アンモニウム、あるいは水酸化ナトリウムなどのアルカリで中和をしながら、培養を行わなければならない。
【０００４】
しかしながら、この手段ではアルカリによる中和操作により、乳酸ナトリウムや乳酸カルシウムなどの乳酸塩が生じるため、その後の精製工程において乳酸塩を乳酸に戻す操作が必要になり、その処理にコストがかかっている。
【０００５】
そこで中和コスト低減を目的として、酸に耐性のある酵母に乳酸を生産させる試みが報告されている（特許文献１〜５、非特許文献１〜３）。酵母は本来乳酸生産能を持たないことから、酵母による乳酸生産を可能にするためには、ピルビン酸をＬ−乳酸に変換する酵素であるＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（以下、Ｌ−ｌｄｈ遺伝子と略すことがある。）を遺伝子組み換え技術を用い酵母に導入しなければならない。
【０００６】
酵母に導入するＬ−ｌｄｈ遺伝子としては、従来よりウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が検討されており（特許文献３、特許文献５及び非特許文献1〜３）、乳酸菌由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子よりも適していることが報告されている（非特許文献３）。
【特許文献１】特開２００１−２０４４６４号公報
【特許文献２】特開２００１−２０４４６８号公報
【特許文献３】特表２００１−５１６５８４号公報
【特許文献４】特開２００３−９３０６０号公報
【特許文献５】特開２００３−２５９８７８号公報
【非特許文献１】ダニロ・ポロ（Danilo Porro）ら:「バイオテクノロジー  プログレス（Biotechnol.Prog）」, 11 : p294-298 (1995)
【非特許文献２】ダニロ・ポロ（Danilo Porro）ら:「アプライド  アンド  エンバイオロンメンタル  マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology）」, 65(9) : p4211-4215(1999)
【非特許文献３】サトシ・サイトウ（Satoshi Saitoh）ら:「アプライド  アンド  エンバイオロンメンタル  マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology ）」,71(5) : p2789-2792 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来のウシ由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を培養することによるＬ−乳酸の製造においては、例えばグルコースなどの原料糖からＬ−乳酸への変換効率、例えば対糖収率は、乳酸菌を培養して得られるＬ−乳酸の対糖収率よりも低く、低コストでＬ−乳酸を製造可能にするためには対糖収率を上昇させる必要があった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、カエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母を培養することにより、従来のウシ由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母を培養することよりも高い対糖収率でＬ−乳酸を製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、カエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母を提供するものである。カエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母は、好ましくはゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母であり、より好ましくは、配列番号１に示す核酸配列を有する遺伝子が導入された酵母である。
【００１０】
本発明の別の好ましい態様によれば、カエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母であり、さらに好ましくはサッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００１１】
本発明の別の好ましい態様によれば、カエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１遺伝子）のプロモーターの下流に発現可能な状態で導入された酵母である。
【００１２】
また、本発明は、上記カエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素が導入された酵母を培養することを含む、Ｌ−乳酸の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、カエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母を培養することにより、従来のウシ由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母を培養することよりも高い対糖収率でＬ−乳酸を製造することができる。
【００１４】
本発明のカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を既知の方法により改良し、該酵母を培養することにより更に高い対糖収率でＬ−乳酸を製造することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、カエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）が導入された酵母である。
【００１６】
本発明において、Ｌ−ｌｄｈ遺伝子とは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とピルビン酸をＬ−乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）に変換する活性を持つＬ−乳酸脱水素酵素をコードしている遺伝子である。
【００１７】
本発明で使用するＬ−ｌｄｈ遺伝子としては、カエル由来であれば特に限定されるわけではないが、アオガエル科（Ｒｈａｃｏｐｈｏｒｉｄａｅ）、アカガエル科（Ｒａｎｉｄａｅ）、アマガエル科（Ｈｙｌｉｄａｅ）、ジムグリガエル科（Ｍｉｃｒｏｈｙｌｉｄａｅ）、ヒキガエル科（Ｂｕｆｏｎｉｄａｅ）、クサガエル科（Ｈｙｐｅｒｏｌｉｉｄａｅ）、スキアシガエル科（Ｐｅｌｏｂａｔｉｎａｅ）、スズガエル科（Ｄｉｓｃｏｇｌｏｓｓｉｄａｅ）、コモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が挙げられる。これらの中でもコモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を用いることが好ましく、コモリガエル科に属するカエルの中でも、入手が容易であるゼノプス・レービス由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子であることが好ましい。
【００１８】
具体的には、本発明で使用するカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子は、好ましくは、配列番号１に示す核酸配列を有するＬ−ｌｄｈ遺伝子である。
【００１９】
本発明で使用するカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子には、遺伝的多型性や、変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。ここでいう遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものである。また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を導入することをいい、例えば、部位特異的変異導入用キット（Mutan-K（タカラバイオ社製））を用いる方法や、ランダム変異導入用キット（BD Diversify PCR Random Mutagenesis（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製））を用いる方法などがある。
【００２０】
本発明で使用する酵母は、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を導入しうる酵母であれば制限はないが、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属又はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母が挙げられる。好ましくは、サッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であって、具体的には、ＮＢＲＣ１０５０５株、ＮＢＲＣ１０５０６株が好ましい。
【００２１】
本発明のカエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を酵母に導入する方法としては、例えば、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子をクローニングし、クローニングした該遺伝子を組み込んだ発現ベクターを酵母に形質転換する方法、クローニングした該遺伝子を染色体上の目的箇所に相同組換えで挿入する方法等が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００２２】
本発明で使用するカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子をクローニングする方法としては特に制限はなく、既知の手法を用いることができる。例えば、既知の遺伝子情報に基づき、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法を用いて必要な遺伝領域を増幅取得する方法や、ゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーより相同性や酵素活性を指標としてクローニングする方法などが挙げられる。また、既知のタンパク質情報に基づき化学合成的又は遺伝子工学的に合成する方法も可能である。
【００２３】
クローニングしたカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を組み込む発現ベクターとしては、酵母で汎用的に利用される発現ベクターを用いることができる。酵母で汎用的に利用される発現ベクターとは、酵母細胞内での自立的複製に必要な配列、大腸菌細胞内での自立的複製に必要な配列、酵母選択マーカー及び大腸菌選択マーカーを有しており、また、組み込んだカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を発現させるために、その発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター又はエンハンサー等のいわゆる調節配列をも有していることが望ましい。
【００２４】
ここで、酵母細胞内での自立的複製に必要な配列とは、例えば、酵母の自立複製開始点（ＡＲＳ１）とセントロメア配列の対もしくは酵母の２μmプラスミドの複製開始点であり、大腸菌内での自立的複製に必要な配列とは、例えば、大腸菌のＣｏｌＥ１複製開始点である。また、酵母選択マーカーとしては、ＵＲＡ３又はＴＲＰ１等の栄養要求性相補的遺伝子もしくはＧ４１８耐性遺伝子又はネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられ、大腸菌の選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【００２５】
調節配列としては、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を発現可能なものであれば特に制限はないが、一例として酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ５）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ１，２，３）、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ１，２，３，４，５，６，７）遺伝子、ガラクトース代謝系遺伝子（ＧＡＬ１，７，１０）、シトクロムｃ遺伝子（ＣＹＣ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ＴＰＩ１）、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）、ホスホフルクトースキナーゼ遺伝子（ＰＦＫ１）、ピルビンデカルボキシラーゼ遺伝子（ＰＤＣ１，５，６）などのプロモーター配列及びＴＤＨ３遺伝子などのターミネーター配列が挙げられる。
【００２６】
上記発現ベクターのプロモーター下流にカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を導入することにより、該遺伝子を発現可能なベクターが得られる。得られたカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターを、後述する方法により酵母に形質転換することにより、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を酵母に導入することができる。
【００２７】
また、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を染色体上に挿入することで、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を酵母に導入することができる。カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を染色体中に挿入する方法に特に制限はないが、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を含むＤＮＡを後述する方法により酵母に形質転換し、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を非相同組み換えによって染色体中のランダムな位置に挿入する方法や、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を含むＤＮＡを相同組み換えにより目的とする箇所に挿入する方法などを用いることができる。好ましくは、相同組み換えによる方法である。
【００２８】
カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を含むＤＮＡを染色体中の目的箇所に、好ましくはＰＤＣ１遺伝子のプロモーターの下流に相同組み換えで挿入する方法としては、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を含むＤＮＡの上流及び下流に、導入目的箇所に相同的な部分を付加するようにデザインしたプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片を後述する方法により酵母に形質転換する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、形質転換株の選択を容易にするために、上記ＰＣＲ断片には酵母選択マーカーが含まれることが好ましい。
【００２９】
ここで用いるＰＣＲ断片の調製は、例えば、下記（１）〜（３）のステップ１〜３の工程により行うことができる。その概略を図１に示す。
【００３０】
（１）ステップ１：カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子の下流にターミネーターがつながったプラスミドを鋳型とし、プライマー１，２をセットとしてカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子及びターミネーターを含む断片をＰＣＲで増幅する。プライマー１は、導入目的箇所の上流側に相同的な配列４０ｂｐ以上を付加するようデザインし、プライマー２は、ターミネーターより下流のプラスミド由来の配列をもとにデザインする。好ましくは、プライマー１に付加する導入目的箇所の上流側に相当する配列は、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１遺伝子）の上流に相当する配列である。
【００３１】
（２）ステップ２：酵母選択マーカーを持つプラスミド、例えばｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２６等を鋳型として、プライマー３，４をセットとして酵母選択マーカーを含む断片をＰＣＲで増幅する。プライマー３は、ステップ１のＰＣＲ断片のターミネーターより下流の配列と相同性のある配列が３０ｂｐ以上を付加するようにデザインし、プライマー４には、導入目的箇所の下流側に相当する配列４０ｂｐ以上を付加するようデザインする。好ましくは、プライマー４に付加する導入目的箇所の下流側に相当する配列は、ＰＤＣ１遺伝子の下流に相当する配列である。
【００３２】
（３）ステップ３：ステップ１，２で得られたＰＣＲ断片を混合したものを鋳型とし、プライマー１，４をセットとしてＰＣＲを行うことにより、両末端に導入目的箇所の上流側及び下流側に相当する配列が付加された、カエル由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子、ターミネーター及び酵母選択マーカーを含むＰＣＲ断片が得られる。好ましくは、前記ＰＣＲ断片は、両末端にＰＤＣ１遺伝子の上流及び下流に相当する配列が付加された、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子、ターミネーター及びマーカー遺伝子を含むＰＣＲ断片である。
【００３３】
上記で得られたカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターまたはＰＣＲ断片を酵母に導入するには、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクションまたはエレクトロポレーション等の方法を用いることができる。具体的には、例えば、酢酸リチウムを用いる方法やプロトプラスト法等がある。
【００３４】
得られた形質転換株の培養方法としては、例えば、「M.D. Rose et al.,"Methods In Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)」等に記載されている既知の方法を用いることができる。カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクター又はＰＣＲ断片が導入された酵母は、発現ベクター又はＰＣＲ断片が有する酵母選択マーカーによって、栄養非添加培地又は薬剤添加培地で培養することにより選択することができる。
【００３５】
本発明のカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を培養することにより、培地中にＬ−乳酸を製造することができる。
【００３６】
本発明のＬ−乳酸の製造方法で使用する乳酸生産培地は、酵母が資化し得る炭素源、窒素源および無機塩類等を含有し、酵母の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地および合成培地のいずれを用いても良い。
【００３７】
培地に含有される炭素源は、シュクロース、フラクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース等の糖類、これら糖類を含有するデンプン、及び、デンプン加水分解物、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、ケーンジュース、ケーンジュース抽出物または濃縮液、ケーンジュースからの精製または結晶化された原料糖、ケーンジュースからの精製または結晶化された精製糖、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリン等の糖の原料、またはこれらから選ばれる少なくとも１種類を含むものが好ましい。
【００３８】
前記の炭素源は、培養開始時に一括して添加してもよいし、培養中分割してあるいは連続的に添加することもできる。
【００３９】
本発明のＬ−乳酸の製造方法において、炭素源の濃度は、好ましくは、１Ｌ培養液に１０ｇ以上１０００ｇ以下であり、より好ましくは、１Ｌ培養液に５０ｇ以上３００ｇ以下であり、特に好ましくは、１Ｌ培養液に５０ｇ以上２００ｇ以下である。炭素源の濃度が、１Ｌ培養液に１０ｇ以上１０００ｇ以下であると、乳酸合成能力を有する酵母が正常に生育し、酵母の乳酸生産が効率的であるので、好ましい。
【００４０】
本発明のＬ−乳酸の製造方法では、使用する乳酸生産培地が、シュクロース、フラクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトースから選ばれる少なくとも１種類を含む乳酸生産培地であることが、より好ましい。また、乳酸の製造方法で使用する乳酸生産培地が、デンプン、及び、デンプン加水分解物、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、ケーンジュース、ケーンジュース抽出物または濃縮液、ケーンジュースからの精製または結晶化された原料糖、ケーンジュースからの精製または結晶化された精製糖、酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンから選ばれる少なくとも１種類を含む乳酸生産培地であることが、より好ましい。本発明では、これら発酵原料を必要に応じて希釈して用いることができる。
【００４１】
また、発酵原料に含有される窒素源は、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが好ましく使用される。
【００４２】
また、発酵原料に含有される無機塩として、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。
【００４３】
本発明のＬ−乳酸の製造方法で使用する乳酸生産培地は、必要に応じて、ポリエーテル系、アルコール系又はシリコン系等の消泡剤を使用することができる。
【００４４】
導入する発現ベクターを酵母内に保持させるのであれば、選択マーカーによる選択圧をかけた培地を用いることが好ましい。培地としては、例えば、ベクターの持つ選択マーカーに符号するアミノ酸を除去した合成培地などが挙げられる。特に好ましい培地は、炭素源としてグルコースを１〜１０％、窒素源として「Yeast Nitrogen Base without amino acid」（DIFCO社製）を０．６７％含有し、適切なアミノ酸を添加した合成培地である。
【００４５】
Ｌ−乳酸の製造に際しては、まず、本発明の酵母を前培養し、前培養液を新しい培地に移して本培養することにより、培養液中にＬ−乳酸を製造することができる。培養温度は、菌株の増殖が実質的に阻害されず乳酸を生産し得る範囲であれば特に制限されるものでないが、好ましくは２０〜４０℃の範囲の温度であり、より好ましくは２５〜３５℃の範囲の温度であり、さらに好ましくは３０℃である。培養には、静置、撹拌または振とうのいずれの方法も採用し得る。
【００４６】
上記のような条件で本発明の酵母を培養することにより、培養液中にＬ−乳酸が得られる。得られたＬ−乳酸の測定法に特に制限はないが、例えば、ＨＰＬＣを用いる方法や、Ｆ−キット（ロシュ社製）を用いる方法などがある。
【００４７】
本発明において、Ｌ−乳酸脱水素酵素活性とは、ピルビン酸とＮＡＤＨをＬ−乳酸とＮＡＤ＋に変換する活性を示す。また限定されるわけではないが、Ｌ−乳酸脱水素酵素活性は比活性を指標として比較できる。すなわち、Ｌ−ｌｄｈ遺伝子導入方法及び遺伝的バックグラウンドが同じ酵母を同条件で培養し、培養菌体から抽出したタンパク質を用いてＮＡＤＨの減少に伴う３４０ｎｍにおける吸光度の変化を測定する。その際に、室温において１分間当たりに１μｍｏｌのＮＡＤＨを減少させる酵素量を１単位（Ｕｎｉｔ）と定義する事により、Ｌ−乳酸脱水素酵素の比活性は式（１）であらわせる。ここで、Δ３４０は１分間あたりの３４０ｎｍの吸光度の減少量、６．２２はＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数である。
【００４８】
【数１】
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【実施例】
【００４９】
以下、実施例をもって本発明の実施の態様を説明するが、これらは例示であり、本発明を何等制限するものではない。
【００５０】
（実施例１： カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターの作製）
本発明では、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子として、配列番号１に示す核酸配列を有するゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を使用した。カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングはＰＣＲ法により行った。ＰＣＲには、ゼノプス・レービスの腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（STRATAGENE社製）より付属のプロトコールに従い調製したファージミドＤＮＡを鋳型とした。
【００５１】
ＰＣＲ増幅反応には、KOD-Plus polymerase（東洋紡社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。上記のように付属のプロトコールに従い調整したファージミドＤＮＡを５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びKOD-Plus polymeraseを１ユニット／サンプルになるように５０μlの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、５５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：１分を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号３，４）には、５末端側にはＳａｌＩ認識配列、3末端側にはＮｏｔＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【００５２】
ＰＣＲ増幅断片を精製し、末端をT4 polynucleotide Kinase（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いて行った。ライゲーション溶液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ社製）に形質転換し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されているプラスミドを選抜した。これら一連の操作は、全て付属のプロトコールに従い行った。
【００５３】
上記カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、定法に従いカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を含む断片を精製した。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子を含む断片を、図２に示す発現ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位にライゲーションし、上記と同様な方法でプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断することにより、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入された発現ベクターを選抜した。以後、このようにして作製したカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を組み込んだ発現ベクターをｐＴＲＳ１０２とする。
【００５４】
（比較例１： ウシ由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターの作製）
比較例として、ウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を作成した。
【００５５】
ウシ由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子（配列番号２）のクローニングはＰＣＲ法にて行った。ＰＣＲには、ウシの骨格筋由来ｃＤＮＡライブラリー（STRATAGENE社製）より付属のプロトコールに従い調製したファージミドＤＮＡを鋳型とし、実施例１と同条件の増幅反応を行った。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号５，６）には、５末端側にはＸｈｏＩ認識配列、3末端側にはＮｏｔＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【００５６】
以下、実施例１で制限酵素ＳａｌＩを用いる箇所において制限酵素ＸｈｏＩを用いることを除き、実施例１と同様な方法でウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入された発現ベクターを作製した。以後、このようにして作製したウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を組み込んだ発現ベクターをｐＴＲＳ４９とする。
【００５７】
（実施例２：カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターの酵母への導入）
実施例１のようにして得られたｐＴＲＳ１０２を酵母サッカロミセス・セレビセＮＢＲＣ１０５０５株のｐｄｃ１遺伝子を破壊した株（以下、２９−１Ｂ株と示す。）に形質転換した。形質転換は、YEASTMAKER YEAST Transformation System（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた酢酸リチウム法により行い、詳細は付属のプロトコールに従った。宿主とする２９−１Ｂ株はウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＲＳ１０２の持つＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＲＳ１０２の導入された形質転換株の選択が可能である。このようにして得られた形質転換株へのカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクター導入の確認は、形質転換株から、ゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）によりプラスミドＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてPremix Taq（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲにより行った。確認用プライマーには、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子をクローニングした際に用いたプライマー（配列番号３，４）を使用した。その結果、ｐＴＲＳ１０２を形質転換した株において、カエル由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子が導入されていることを確認した。以下、上記ｐＴＲＳ１０２が導入された形質転換株を２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ１０２株とする。
【００５８】
（比較例２：ウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターの酵母への導入）
比較例１のようにして得られたｐＴＲＳ４９を、実施例２と同様な方法で２９−１Ｂに形質転換した。また、ウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子導入の確認も実施例２と同様な方法で行い、プライマーとして配列番号５，６に示すオリゴヌクレオチドを用いた。以下、上記ｐＴＲＳ４９が導入された形質転換株を２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ４９株とする。
【００５９】
（実施例３：カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子のＰＤＣ１遺伝子座への導入）
実施例１で得られたｐＴＲＳ１０２を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号７，８）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子及びＴＤＨ３ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した（図１のステップ１に相当）。ここで配列番号７は、ＰＤＣ１遺伝子の開始コドンから上流６５ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【００６０】
次に、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１０，１１）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＴＲＰ１遺伝子を含む１．２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した（図１のステップ２に相当）。ここで、配列番号１１は、ＰＤＣ１遺伝子の終始コドンから下流６５ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【００６１】
それぞれのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた各１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号７，１１）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子、ＴＤＨ３ターミネーター及びＴＲＰ１遺伝子が連結された約２．５ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した（図１のステップ３に相当）。
【００６２】
上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、酵母サッカロミセス・セレビセＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換し、トリプトファン非添加培地で培養することにより、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
【００６３】
上記のようにして得られた形質転換株が、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１１，１２）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約２．１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、Ｂ２株とする。なお、ＰＤＣ１遺伝子の上流及び下流配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（URL: http://www.yeastgenome.org/）より取得することができる。
【００６４】
（比較例３：ウシ由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子のＰＤＣ１遺伝子座への導入）
比較例１で得られたｐＴＲＳ４９を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号８，９）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子及びＴＤＨ３ターミネーターを含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで配列番号９は、配列番号７と同様にＰＤＣ１遺伝子の開始コドンから上流６５ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【００６５】
上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製し、実施例３で得られたＴＲＰ１遺伝子を含む１．２ｋｂのＰＣＲ断片と混合し、オリゴヌクレオチド（配列番号９，１１）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、ウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子、ＴＤＨ３ターミネーター及びＴＲＰ１遺伝子が連結された約２．５ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。
【００６６】
上記のＰＣＲ断片を実施例３と同様な方法でＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換し、トリプトファン非添加培地で培養することにより、ウシ由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
【００６７】
上記のようにして得られた形質転換株が、ウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は、実施例３と同様の方法で行った。以下、上記ウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、Ｌ５株とする。
【００６８】
（実施例４、比較例４：Ｌ−乳酸生産性テスト１）
実施例２、比較例２のようにして得られた２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ１０２株及び２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ４９株を用いてＬ−乳酸生産性テストを行った。
【００６９】
表１に示した組成の培地（以下、ＳＣ３−Ｕｒａ培地と略す。）１０ｍＬを試験管に取り、そこに少量の２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ１０２株及び２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ４９株を植菌し、３０℃で一晩培養した（前々培養）。次に、ＳＣ３−Ｕｒａ培地１００ｍＬを５００ｍｌ容三角フラスコにいれ、各前々培養液をそれぞれ全量植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した（前培養）。続いて、ＳＣ３−Ｕｒａ培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養開始から２４時間後の前培養液をそれぞれ全量植菌し、攪拌速度（１２０ｒｐｍ）、通気量（０．１Ｌ／ｍｉｎ）、温度（３０℃）、ｐＨ（ｐＨ５）を一定にして培養を行った（本培養）。本培養開始後４０時間の培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、下記に示す条件でＨＰＬＣによりＬ−乳酸量を測定した。
【００７０】
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ（島津社製）
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM ＥＤＴＡ・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【００７１】
測定結果から算出したＬ−乳酸の対糖収率を表２に示す。
【００７２】
【表１】
2008029329.tif 000003
【００７３】
【表２】
2008029329.tif 000004
【００７４】
（実施例５、比較例５：Ｌ−乳酸生産性テスト２）
実施例３、比較例３のようにして得られたＢ２株及びＬ５株を用いて、実施例４と同様な方法でＬ−乳酸生産性テストを行った。培地として、表１に示したものに１５２ｍｇ／Ｌのウラシルを追加した培地（以下、ＳＣ３培地と略す。）を用いた。
【００７５】
ＳＣ３培地１０ｍＬを試験管に取り、そこに少量のＢ２株及びＬ５株を植菌し、３０℃で一晩培養した（前々培養）。次に、ＳＣ３培地１００ｍＬを５００ｍｌ容三角フラスコにいれ、各前々培養液を全量植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した（前培養）。続いて、ＳＣ３培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養開始から２４時間後の前培養液を全量植菌し、攪拌速度（１２０ｒｐｍ）、通気量（０．１Ｌ／ｍｉｎ）、温度（３０℃）、ｐＨ（ｐＨ５）を一定にして培養を行った（本培養）。本培養開始後３０時間の培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、実施例４と同様な条件でＨＰＬＣによりＬ−乳酸量を測定した。測定結果から算出したＬ−乳酸の対糖収率を表３に示す。
【００７６】
【表３】
2008029329.tif 000005
【００７７】
表２及び表３の結果から、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を培養することにより、ウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を培養することよりも高い対糖収率でＬ−乳酸を製造することができた。
【００７８】
（実施例６：カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子のＴＤＨ３遺伝子座への導入）
染色体中に挿入するカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子をＴＤＨ３プロモーターの下流に導入することで乳酸生産性の向上が可能であるか検討を行った。
【００７９】
実施例３と同様な方法でカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子をＴＤＨ３遺伝子座に導入するために、ｐＴＲＳ１０２のＴＤＨ３ターミネーターをＡＤＨ１ターミネーターに変更したプラスミドを作製した。
【００８０】
まず、ＮＢＲＣ１０５０５株からゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）によりゲノムＤＮＡを抽出し、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＡＤＨ１ターミネーターのクローニングをＰＣＲ法により行った。ＰＣＲ増幅反応には、KOD-Plus polymerase（東洋紡社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。上記のように付属のプロトコールに従い調整したゲノムＤＮＡを５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びKOD-Plus polymeraseを１ユニット／サンプルになるように５０μlの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、６０℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：１分を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号１３，１４）には、５末端側にはＮｏｔＩ認識配列、3末端側にはＨｉｎｄＩＩＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【００８１】
ＰＣＲ増幅断片を精製し、末端をT4 polynucleotide Kinase（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いて行った。ライゲーション溶液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ社製）に形質転換し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＡＤＨ１ターミネーターが挿入されているプラスミドを選抜した。これら一連の操作は、全て付属のプロトコールに従い行った。作製したプラスミドをｐＵＣ１１８−ＡＤＨ１ｔとする。
【００８２】
次にｐＵＣ１１８−ＡＤＨ１ｔを制限酵素ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、定法に従いＡＤＨ１ターミネーターを含む断片を精製した。得られたＡＤＨ１ターミネーターを含む断片を、ｐＴＲＳ１０２のＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位にライゲーションし、上記と同様な方法でプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、ＴＤＨ３ターミネーターがＡＤＨ１ターミネーターに変更されたプラスミドを選抜した。以後、このようにして作製したプラスミドをｐＴＲＳ１５０とする。
【００８３】
このｐＴＲＳ１５０を鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号８，１５）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子及びＡＤＨ１ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで配列番号１５のプライマーは、ＴＤＨ３遺伝子の開始コドンから上流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【００８４】
次に、プラスミドｐＲＳ４２６を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１０，１６）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＵＲＡ３遺伝子を含む１．２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで、配列番号１６のプライマーは、ＴＤＨ３遺伝子の終始コドンから下流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【００８５】
それぞれのＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた各１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１５，１６）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子、ＡＤＨ１ターミネーター及びＵＲＡ３遺伝子が連結された約２．５ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。
【００８６】
上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子がｐｄｃ１遺伝子座に導入されたＢ２株に形質転換し、ウラシル非添加培地で培養することにより、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＴＤＨ３遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
【００８７】
上記のようにして得られた形質転換株が、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＴＤＨ３遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１７，１８）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約２．１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＴＤＨ３遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株をＢ３株とする。なお、ＴＤＨ３遺伝子座の上流及び下流配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（URL:http://www.yeastgenome.org/）より取得することができる。
【００８８】
（実施例７：Ｌ−乳酸生産性テスト３）
実施例６のようにして得られたＢ３株を用いて、実施例４，５と同様な方法でＬ−乳酸生産性テストを行った。培地として、実施例５と同様ＳＣ３培地を用いた。
【００８９】
ＳＣ３培地１０ｍＬを試験管に取り、そこに少量のＢ３株を植菌し、３０℃で一晩培養した（前々培養）。次に、ＳＣ３培地１００ｍＬを５００ｍｌ容三角フラスコにいれ、各前々培養液を全量植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した（前培養）。続いて、ＳＣ３培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養開始から２４時間後の前培養液を全量植菌し、攪拌速度（１２０ｒｐｍ）、通気量（０．１Ｌ／ｍｉｎ）、温度（３０℃）、ｐＨ（ｐＨ５）を一定にして培養を行った（本培養）。本培養開始後３０時間の培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、実施例４と同様な条件でＨＰＬＣによりＬ−乳酸量を測定した。測定結果から算出したＬ−乳酸の対糖収率及び実施例５で得られたＢ２株の対糖収率を表４に示す。
【００９０】
【表４】
2008029329.tif 000006
【００９１】
表４の結果から、カエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子のプロモーターの下流に発現可能な状態で導入された酵母を改良することにより、より高い対糖収率でＬ−乳酸を製造可能な酵母が作出できた。
【００９２】
また、本発明のカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を既知の方法で更に改良し、該酵母を培養することでより高い対糖収率でＬ−乳酸を製造することが可能である。
【００９３】
（実施例８、比較例６：Ｌ−乳酸脱水素酵素の活性）
実施例２、比較例２で得られた２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ１０２株及び２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ４９株を用いて、ｐＨ５〜７におけるカエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素活性及びウシ由来のＬ−乳酸脱水素酵素活性を比較した。
【００９４】
（ａ）菌体からのタンパク質抽出
ＳＣ−Ｕｒａ培地１０mLを試験管に入れ、そこに少量の２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ１０２株及び２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ４９株を植菌し、３０℃で一晩培養した（前培養）。次に、ＳＣ−Ｕｒａ培地２０ｍＬを１００ｍＬ容坂口フラスコに入れ、そこに前培養液を２％植菌し、２４時間振とう培養した（本培養）。本培養液１０ｍＬを遠心により集菌、１０ｍＬのリン酸バッファーで洗浄後、１ｍＬのリン酸バッファーに懸濁した。上記菌体懸濁液をエッペンドルフチューブに移し、さらに等量のガラスビーズ（ＳＩＧＭＡ社製、直径０．６ｍｍ）を加え、Ｍｉｃｒｏ  Ｔｕｂｅ  Ｍｉｘｅｒ（ＴＯＭＹ社製）を用い４℃で菌体を破砕した。上記のようにして菌体を破砕した後、遠心して得られる上清をＬ−乳酸脱水素酵素液（以下、Ｌ−ＬＤＨ酵素液と略す。）とした。
【００９５】
（ｂ）Ｌ−乳酸脱水素酵素活性測定
（ａ）で得られたＬ−ＬＤＨ酵素液の濃度を、ウシＩｇＧ（１．３８ｍｇ／ｍＬ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）をスタンダードとして作製した検量線をもとにＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）により測定し、各Ｌ−ＬＤＨ酵素液が０．５ｍｇ／ｍＬになるように滅菌水で希釈した。次に、表５に示した割合の６水準の混合液（Ｌ−ＬＤＨ酵素液及びＮＡＤＨを除く）をセミミクロキュベットに分注し、測定を始める直前にＬ−ＬＤＨ酵素液及びＮＡＤＨを加え混合した。ここで、２ｘＢＲバッファーとは、０．０８Ｍ酢酸、リン酸、ホウ酸溶液を５ＮＮａＯＨでｐＨ５，６，７にそれぞれ調節した緩衝バッファーである。
【００９６】
【表５】
2008029329.tif 000007
【００９７】
各水準での３４０ｎｍにおける吸光度の減少を分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００Ｐｒｏ  アマシャム社製）で測定し、得られたΔ３４０の値を式（１）にあてはめ、それぞれ比活性を算出した。測定はｐＨ５，６，７の３水準で行った。上記測定において、比較対象とするＬ−乳酸脱水素酵素の比活性がウシ由来のＬ−乳酸脱水素酵素の比活性よりも、ｐＨ３水準のうち２水準以上で高い場合、その比較対象とするＬ−乳酸脱水素酵素は、ｐＨ５〜７においてウシ由来のＬ−乳酸脱水素酵素活性よりも高い活性を持つとする。算出結果を表６に示す。
【００９８】
【表６】
2008029329.tif 000008
【００９９】
この結果から、ｐＨ５〜７において、カエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素活性は、ウシ由来のＬ−乳酸脱水素酵素の活性よりも高いことがわかった。また、表２及び表３の結果から、本発明のカエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を培養することにより、ウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を培養することよりも高い対糖収率でＬ−乳酸を製造することができることがわかった。
【０１００】
表２、表３及び表６に示す結果から、ｐＨ５〜７におけるＬ−乳酸脱水素酵素活性がウシ由来のＬ−乳酸脱水素酵素活性よりも高いＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母を培養することにより、ウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を培養することよりも高い対糖収率でＬ−乳酸を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、ＰＤＣ１遺伝子プロモーター下流にＬ−ｌｄｈ遺伝子を導入する方法を説明する概略図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる酵母発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。
【図１】
2008029329.tif 000009
【図２】
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【配列表】
2008029329000001.app