(57)【要約】【課題】  繁雑かつコストのかかる高圧蒸気滅菌などの滅菌手段を多用することなく、連続培養を実施することができる、簡便かつ安価な連続培養方法及び連続培養装置を提供する。【解決手段】  培地貯留槽１から供給される培地を発酵反応槽２内で連続培養する方法において、発酵反応槽２内の培養液を中和処理するための中和剤を、発酵反応槽２内に供給される前の培地に対して発酵反応槽の上流側で添加する。この中和剤の添加は、培地貯留槽１に中和剤を添加するための中和剤添加手段４により行う。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地貯留槽から供給される培地を発酵反応槽内で連続培養する方法において、発酵反応槽内の培養液を中和処理するための中和剤を、発酵反応槽内に供給される前の培地に対して発酵反応槽の上流側で添加することを特徴とする連続培養方法。
【請求項２】
中和剤を添加する位置が培地貯留槽であることを特徴とする請求項１記載の連続培養方法。
【請求項３】
発酵反応槽内に供給される前の培地に対して発酵反応槽の上流側で添加される中和剤が、発酵反応槽内の培養液を中和処理するために要する中和剤の一部とし、かつ、発酵反応槽内の培養液のｐＨに応じて中和剤を直接発酵反応槽に添加してｐＨ調整を行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の連続培養方法。
【請求項４】
連続培養系が有機酸発酵連続培養系であり、中和剤がアルカリであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の連続培養方法。
【請求項５】
培地を貯留する培地貯留槽と、該培地貯留槽から供給される培地を連続発酵する発酵反応槽とを備えた連続培養装置において、発酵反応槽に培地を供給する配管におよび／またはその上流側に中和剤を添加するための中和剤添加手段が配設されていることを特徴とする連続培養装置。
【請求項６】
培地貯留槽に中和剤添加手段が付設されていることを特徴とする請求項５記載の連続培養装置。
【請求項７】
発酵反応槽に培地を供給する配管におよび／またはその上流側の培地貯留槽に中和剤を添加するための中和剤添加手段が配設される他に、発酵反応槽に中和剤を添加するための第２中和剤添加手段が配設され、発酵反応槽内の培養液のｐＨを測定するためのｐＨセンサーが配設され、かつ、該ｐＨセンサーで測定されるｐＨ値に応じて第２中和剤添加手段による中和剤添加量を調整する手段が配設されていることを特徴とする請求項５又は６に記載の連続培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸等を製造するための連続発酵培養系において、培地及び培養系の滅菌環境を維持するために有効な連続培養方法及び連続培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌や菌類などの微生物や動物細胞などの培養細胞の培養を伴う物質生産方法もしくは菌体生産方法である発酵法は、大きく、（１）バッチ発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ発酵法）と（２）連続発酵法に分類することができる。（１）のバッチおよび流加発酵法は、設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないというメリットがある。しかし、時間経過とともに培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性及び収率が低下してくる。このため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持するのが困難である。
【０００３】
一方、（２）の連続発酵法は、発酵槽内で目的物質が高濃度に蓄積するのを回避することによって、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特長がある。しかし、（１）の方法とは異なり、連続発酵法では長期間にわたって連続的に培地を供給する必要があるため、滅菌を培養開始時だけでなく培養期間中も随時実施していく必要がある。
【０００４】
培地や培養装置を滅菌する方法としては、高圧蒸気を用いて滅菌する方法が一般的にとられている。この高圧蒸気滅菌法は、高圧蒸気を製造し供給するために大量のボイラーを併設する必要があり、用役コストが非常に高く、滅菌対象容器および配管は耐圧容器とする必要があり、しかも、配管をもれなく滅菌するためには極めて繁雑な操作を必要とする。しかし、微生物培養においては雑菌の混入を防止することは必要不可欠であるため、滅菌を避けて通ることができず、より簡易で安価な滅菌方法の開発が求められている。
【０００５】
そこで、特許文献１には、連続培養中における雑菌汚染を防止するために、滅菌手段として除菌フィルターを配管途中に設ける方法が提案されている。しかし、この方法では、ユニット間の滅菌が不十分となり易く、培養系に悪影響を与える可能性があるほか、除菌フィルターを多く必要とするため、なおコスト面で問題があった。
【特許文献１】特開平４−２１１３５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来技術における上記問題点を受けてなされたものであって、その目的は、連続発酵法において、簡易かつ安価に滅菌することができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明は以下の構成を有する。
（１）培地貯留槽から供給される培地を発酵反応槽内で連続培養する方法において、発酵反応槽内の培養液を中和処理するための中和剤を、発酵反応槽内に供給される前の培地に対して発酵反応槽の上流側で添加することを特徴とする連続培養方法。
（２）  中和剤を添加する位置が培地貯留槽であることを特徴とする請求項１記載の連続培養方法。
（３）  発酵反応槽内に供給される前の培地に対して発酵反応槽の上流側で添加される中和剤が、発酵反応槽内の培養液を中和処理するために要する中和剤の一部とし、かつ、発酵反応槽内の培養液のｐＨに応じて中和剤を直接発酵反応槽に添加してｐＨ調整を行うことを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の連続培養方法。
（４）  連続培養系が有機酸発酵連続培養系であり、中和剤がアルカリであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の連続培養方法。
【０００８】
（５）  培地を貯留する培地貯留槽と、該培地貯留槽から供給される培地を連続発酵する発酵反応槽とを備えた連続培養装置において、発酵反応槽に培地を供給する配管におよび／またはその上流側に中和剤を添加するための中和剤添加手段が配設されていることを特徴とする連続培養装置。
（６）  培地貯留槽に中和剤添加手段が付設されていることを特徴とする上記（５）記載の連続培養装置。
（７）  発酵反応槽に培地を供給する配管におよび／またはその上流側の培地貯留槽に中和剤を添加するための中和剤添加手段が配設される他に、発酵反応槽に中和剤を添加するための第２中和剤添加手段が配設され、発酵反応槽内の培養液のｐＨを測定するためのｐＨセンサーが配設され、かつ、該ｐＨセンサーで測定されるｐＨ値に応じて第２中和剤添加手段による中和剤添加量を調整する手段が配設されていることを特徴とする上記（５）又は（６）に記載の連続培養装置。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、連続発酵法において培地を継続的に供給する際に、培養液の中和用の中和剤を、予め、上流側で培地に添加しておくことにより滅菌を行うため、大きな用役コストや繁雑な作業を伴う高圧蒸気滅菌を頻繁に行うことなく滅菌した培地を供給することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００１１】
本発明法は、例えば、図１に示すような連続培養装置を用いて実施することができる。この連続培養装置には、培地を貯留する培地貯留槽１と、該培地貯留槽１から供給される培地を連続発酵する発酵反応槽２とが備えられている。培地貯留槽１には、中和剤添加用の第１中和剤添加手段４が付設されている。発酵反応槽２には、この発酵反応槽内の培養液のｐＨを一定条件に保持するためにｐＨセンサー３とこのｐＨ測定結果に応じた量で中和剤を添加する第２中和剤添加手段５が付設されている。この第２中和剤添加手段５によって、最終的に発酵反応槽のｐＨが一定に保たれる。さらに、培地貯留槽１から発酵反応槽２へと培地を送給するための培地供給配管８と培地供給ポンプ７とが設けられ、発酵反応槽２から培養液を抜き出すための配管とポンプ９とが設けられている。また、発酵反応槽２内の液を攪拌するための攪拌手段６が設けられている。
【００１２】
この連続培養装置において、まず、滅菌環境維持を厳密に行う必要のある場合には、培地貯留槽１や培地供給ポンプ７や培地供給配管８を使用前に１度、蒸気滅菌などの手段によって滅菌を行ってもよいが、本発明においては、使用する培地や培養系によってはこれを省略することができる。発酵反応槽２や、それに付設する装置、発酵反応槽２へ供給するその他の溶液は必要に応じて別途滅菌を行う。
【００１３】
次に、立ち上げ時のバッチ培養を行った後、連続発酵を開始するにあたり、培地貯留槽１から培地供給ポンプ７によって培地を発酵反応槽２に連続的もしくは断続的に投入する。ここで培地貯留槽１内に貯留されている培地に、中和剤を第１中和剤添加手段４により予め添加する。つまり、培地が発酵反応槽２に投入される際、中和剤も同時に添加されることになる。培地に予め中和剤を添加することにより、貯留された培地は通常微生物などが生育可能なｐＨ条件から大きく逸脱したｐＨ条件となるので、培地の腐敗や、培地反応槽１から発酵反応槽２に至る系内の雑菌繁殖の可能性を抑えることができる。さらに、培地貯留槽１から下流の培地供給配管８の雑菌繁殖も抑制することができる。また、中和剤を予め培地に添加して滞留させておくことによる付随的効果として、培地や発酵の種類によっては、培地中の原料成分の加水分解が一部進行し、後段の発酵反応槽での微生物による利用性が向上する効果が奏される場合もある。
【００１４】
培地貯留槽１への中和剤の添加量は、貯留した培地を発酵反応槽２内に投入する間に発酵反応槽内で必要となる中和剤の量（事前検討により算出される）を上回らない量とする。好ましくは、発酵反応槽内で必要となる中和剤の量よりも若干少ない量とし、培養液の最終的なｐＨ調整は、発酵反応槽に設けたｐＨセンサーと第２中和剤添加手段により行うことが好ましい。これにより、培地の腐敗防止に必要な中和剤添加を行いながらも、培養液のpHを所定水準に維持することができ再中和の無駄なく所期の目標を達成することができるのである。
【００１５】
実施する発酵生産の発酵条件が、発酵の進展によって変化していく液性側（酸性側もしくはアルカリ性側）に偏っている場合、中和剤としては、発酵条件の液性とは逆の液性となるように作用する薬剤を使用する。この中和剤を培地に添加することによりアルカリ側もしくは酸側となり、培地の腐敗や雑菌繁殖が与える発酵生産へ悪影響が及ぶ可能性を減らすことができる。例えば、有機酸発酵の一種であるピルビン酸発酵を行う場合には、ピルビン酸発酵の進展によってｐＨは酸性側に変化しようとするため、中和剤はアルカリを用いることになる。ここでピルビン酸発酵の発酵条件は酸性側に偏っておりｐＨ５．５であるが、アルカリを培地に予め供給しておくため培地は発酵条件とは逆のアルカリ性を呈する。万が一、耐アルカリ性の雑菌による汚染が培地貯留槽や培地供給配管で生じた場合でも、弱酸性である発酵反応槽ではこの雑菌は生育しにくいため、発酵生産への悪影響は限定されたものとなる。このことは、その他の有機酸発酵でも同様である。
【００１６】
なお、培地と中和剤との反応によって、不溶成分が生じたり、成分変化が生じたりするなど培養に悪影響を与える成分が含まれることになる場合には、その成分を個別に滅菌し別途発酵反応槽に添加することができる。また、不溶成分を生じる成分を分けることができない場合は、スクリーンなどで不溶物を取り除いた上で培地を発酵反応槽へと送液するとよい。
【００１７】
培養液の排出は、発酵反応槽２内の液量がある一定範囲内に維持できるように行う。例えば、培養液排出ポンプ９により、発酵反応槽２に流入した培地の液量だけ排出すると良い。培養液の排出は、図１に示すように培養液をそのまま排出しても良いし、図２に示すように、発酵反応槽から取り出した培養液を、膜分離装置１０によって濾液と未濾過液に分離し、濾液を所望の発酵生産物の回収用に外部へ取り出すとともに、微生物などを含む未濾過液を発酵反応槽に還流させる方法でもよいし、また、図３に示すように、発酵反応槽２内に膜分離装置１０を浸漬し、膜分離装置の分離膜を透過した濾液を排出することにしてもよい。
【００１８】
図２および図３に示す膜分離型連続培養装置は、発酵反応槽２から取り出される培養液の扱いが上記のとおり異なる以外は、図１の場合と同様な装置である。この際の膜分離装置１０で用いる分離膜としては、発酵に使用する微生物および培養細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ濾過性能が長期間安定に継続することができる多孔性膜を用いることが望ましい。例えば、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満である多孔性膜を使用することができる。平均孔径がこの範囲内にあると、菌体などがリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立でき、さらに目詰まりしにくく、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。
【００１９】
本発明は、コンタミが全く許されない厳密な生産品質が求められる医薬品などの生産に適用することもできるが、蒸気滅菌などの従来の方法と比べて本発明の方法は滅菌の信頼性がやや劣る場合もあり得る。そのため、多少の雑菌がコンタミしても生産品質上問題とならない場合や、培養液中の生産物濃度やｐＨなど培養液環境の理由から雑菌の優占リスクが低い場合など、厳密な純粋培養維持が求められない発酵生産の場合に、好適に適用することができる。例えば、厳密な生産品質が求められない例としてバイオリファイナリーと呼ばれる１０００トン／年を超えるような工業品の大規模発酵生産を挙げることができる。また、雑菌の優占リスクが低い例としては、ピルビン酸発酵などの有機酸発酵を挙げることができる。高濃度の有機酸塩が培養液中に存在しており培養液ｐHも低いため、雑菌の優占リスクが低く、本発明を好適に用いることができる。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために、連続的なピルビン酸の発酵生産工程に本発明を適用した実施例を挙げて説明する。図２に示す装置を用い、ピルビン酸を生産させる微生物として酵母トルロプシス・グラブラータ（Torulopsis glabrata）のうち、トルロプシス・グラブラータＰ１２０−５ａ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７４５）を用いた。
【００２１】
まず、上記Ｐ１２０−５ａ株を試験管内で５ｍｌのピルビン酸発酵培地（グルコース100g/L、硫酸アンモニウム5g/L、リン酸二水素カリウム１g/L、硫酸マグネシウム7水和物0.5g/Lを主成分とする）で一晩振とう培養した。得られた培養液を新鮮なピルビン酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した。
【００２２】
得られた培養液を、図２に示した膜分離型連続培養装置の１．５Ｌのピルビン酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽２を付属の攪拌機６によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽２の通気量の調整、温度調整を行い、４８時間回分培養を行った。培地の滅菌については、培養立ち上げ時についてのみ、発酵反応槽ごと高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）で滅菌した。膜分離装置の分離膜としては、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。培養液のｐＨ調整は４Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を発酵反応槽２に直接添加することでｐＨ５．５に調整した。この後、培地貯留槽内に、ビタミンなどの微量成分や硫酸アンモニウムを除いたピルビン酸発酵培地を調製した。これに水酸化ナトリウムを添加し、水酸化ナトリウム濃度５g/Lのピルビン酸発酵培地を準備した。これを１．５Ｌ／日の流量で発酵反応槽に連続供給するとともに、別途滅菌したビタミンなどの微量成分や硫酸アンモニウムも連続供給した。発酵反応槽２での発酵液量が１．５Ｌとなるように、膜分離装置１０での膜透過液量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるピルビン酸の製造を行った。発酵反応槽２内の培養液の最終的なｐＨ制御は、発酵反応槽２に直接添加する４Ｎ  ＮａＯＨ水溶液により行った。このようにして連続発酵試験を３５０時間継続して行っても、本膜分離型連続発酵装置は安定してピルビン酸の連続発酵による製造を行うことができ、顕微鏡で培養液を観察しても特にコンタミは確認されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明による連続培養装置の一実施態様を示す装置概略図である。
【図２】本発明による連続培養装置の別の一実施態様を示す装置概略図である。
【図３】本発明による連続培養装置のさらに別の一実施態様を示す装置概略図である。
【符号の説明】
【００２４】
１：培地貯留槽
２：発酵反応槽
３：ｐＨセンサー
４：中和剤添加手段
５：第２中和剤添加手段
６：攪拌手段
７：培地供給ポンプ
８：培地供給配管
９：培養液排出ポンプ
９′：濾液排出ポンプ
１０：膜分離装置
１１：環流ポンプ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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