(57)【要約】【課題】効率的にγ−グルタミルシステインを生産する酵母、及び、γ−グルタミルシステインを蓄積した酵母の製造方法、並びに同酵母を利用した飲食品の製造方法を提供する。【解決手段】γ−グルタミルシステイン生産能、及び、セルレニン耐性を有する酵母を培地で培養して得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することにより、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有飲食品を製造する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−グルタミルシステイン生産能、及び、セルレニン耐性を有する酵母。
【請求項２】
１０μＭ以上のセルレニンに耐性を有する請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下又は消失するように改変された請求項１又は２に記載の酵母。
【請求項４】
サッカロマイセス属に属する請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項５】
サッカロミセス・セレビシエであることを特徴とする請求項４に記載の酵母。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵母を培地で培養することを特徴とする、γ−グルタミルシステインを蓄積した酵母の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵母を培地で培養して得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することを特徴とする、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有飲食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−グルタミルシステインを生産する酵母及びγ−グルタミルシステインを蓄積した酵母の製造法に関するものである。γ−グルタミルシステインは飲食品、医薬品、化成品、特に調味料分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
現在、含硫化合物は、その高い効能から食品、医薬品、化成品などの幅広い分野で使用されている。例えば、グルタミン酸、システイン、グリシンからなるトリペプチドであるグルタチオン（GSH）は、医薬品としての薬効を有することが知られている。現在、医薬品としてのGSH製剤は、解毒剤及び眼科用剤として位置づけられており、各種の中毒、慢性肝臓疾患、抗癌剤の副作用や放射線療法による障害の防止、皮膚疾患および白内障や角膜損傷の治療に用いられている（非特許文献１）。また、食品用途として、グルタチオンは食品にコク味を付与する物質であることが知られており（非特許文献２）、グルタチオンを高含有する酵母エキスが調味料用途に用いられている。
【０００３】
ところで近年、グルタチオンの前駆体であり、グルタミン酸とシステインからなるジペプチドであるγ−グルタミルシステインの有用性が報告されつつある。例えば、γ−グルタミルシステインに糖類を添加して加熱処理することにより、良好なフレーバー組成物が得られることが報告されている（特許文献１）。更に、γ−グルタミルシステインを加熱又は酵素処理することにより風味改良素材として幅広く用いられているシステインが生成することが報告されている（特許文献２）。この他にも、グルタチオン、システイン、グルタミルシステイン等の含硫化合物を２〜２０重量％含有する酵母エキスに糖類を加えて脂肪酸非存在下で加熱処理することによりローストミートフレーバー様の調味料が得られることが報告されている（特許文献３）。
【０００４】
しかしながら、γ−グルタミルシステインに関する有用性はグルタチオンと比較して明らかになり始めたばかりであり、これを効率的に生産する手段はあまり検討されてこなかった。現在までの先行知見等は以下のとおりである。
【０００５】
例えば、本発明者らは、γ−グルタミルシステインとグリシンを基質としてグルタチオンを生合成するグルタチオン合成酵素を破壊又は弱化させることにより、γ−グルタミルシステインを高含有する酵母を取得したことを報告している（特許文献２、特許文献４〜７）。これらの技術では、γ−グルタミルシステインからグルタチオンへの代謝を抑制し、前駆体としてのγ−グルタミルシステインを酵母に高含有させることを目的としているが、γ−グルタミルシステインの含有量は１〜２重量％であり、更に効率化させる余地がある。
【０００６】
また、本発明者等は、γ−グルタミルシステイン産生能を有しパントテン酸要求性の酵母を、パントテン酸含有培地で培養後、パントテン酸を含まない培地で培養することにより、菌体内のγ−グルタミルシステインを上昇させる技術を開示している（特許文献８）。同文献では、γ−グルタミルシステインを４％弱含有した酵母が示されており、γ−グルタミルシステインを効率的に生産する手段と考えられる。しかしながら、同酵母に安定的にγ−グルタミルシステインを高含有させるためには培養途中のパントテン酸量を制御する必要がある。
【０００７】
さらに、本発明者らは、遺伝子によってコードされる蛋白質の569位のセリン残基が他のアミノ酸残基に変異したMET30遺伝子産物を保持させることにより、γ−グルタミルシ
ステインの蓄積量と酵母の生育速度を共に満たすことができることを報告している（特許文献９）。
【０００８】
一方で、酵母のセルレニン耐性に関する研究が行われ、少なくともYAP1遺伝子（別名としてPDR4遺伝子）（非特許文献３）やFAS2遺伝子（非特許文献４）がセルレニン耐性に関与していると報告されている。YAP1遺伝子は、GSH1遺伝子（γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子）やGSH2遺伝子（グルタチオン合成酵素遺伝子）の転写因子であることが報告されているが（非特許文献５）、YAP1遺伝子の改変により酵母菌体内のGSH又はγ−グルタミルシステインの含有量がどのように変化するかは確かめられていない。また、FAS2遺伝子は脂肪酸合成酵素遺伝子であるが、同遺伝子の変異によって酵母にセルレニン耐性が付与されることから、必ずしもセルレニン耐性がγ−グルタミルシステイン含有量の変化につながるともいえない。また、セルレニン耐性酵母を清酒生産に利用しようとの報告（特許文献１０）はあるが、グルタチオン合成酵素活性が低下又は消失した酵母にセルレニン耐性を付与したとの報告はない。
【特許文献１】特許第２８３０４１５
【特許文献２】ＷＯ  ００／３０４７４
【特許文献３】特許第２９０３６５９
【特許文献４】ＷＯ０１／０９０３１０
【特許文献５】特開２００３−１５９０４８
【特許文献６】特開２００３−１５９０４９
【特許文献７】ＷＯ２００３／０８０８３２
【特許文献８】特開２００４−２０１６７７
【特許文献９】特開２００４−１１３１５５
【特許文献１０】特開平８−２３９５４
【非特許文献１】蛋白質核酸酵素 1988-7 VOL.33 NO.9 ISSN 003909450臨時増刊  「グルタチオン研究のエポック」p1626
【非特許文献２】Y. Ueda et al., Biosci. Biotech. Biochem., 61, 1977-1980 (1997)
【非特許文献３】Nobusige Nagazawa et al., Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.76, No 1, 60-63, 1993
【非特許文献４】Kazuo Aritomi et al., Biosci. Biotechnol. Bochem., 68(1), 206-214, 2004
【非特許文献５】Sugiyama et al., Journal of Biological Chemistry (2000), 275(20), 15535-15540
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、効率的にγ−グルタミルシステインを生産する酵母を提供すること、及び、γ−グルタミルシステインを蓄積した酵母の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意検討を行った結果、γ−グルタミルシステイン生産能、及び、セルレニン耐性を有する酵母が、安定的かつ効率的にγ−グルタミルシステインを生産することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）γ−グルタミルシステイン生産能、及び、セルレニン耐性を有する酵母。
（２）１０μＭ以上のセルレニンに耐性を有する前記酵母。
（３）細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下又は消失するように改変された前記酵母。
（４）サッカロマイセス属に属する前記酵母。
（５）サッカロミセス・セレビシエであることを特徴とする前記酵母。
（６）前記酵母を培地で培養することを特徴とする、γ−グルタミルシステインを蓄積した酵母の製造方法。
（７）前記酵母を培地で培養して得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することを特徴とする、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有飲食品の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の酵母は、効率的にγ−グルタミルシステインを生産することができる。特に、好適な形態では、高密度で培養した場合、経時的なγ−グルタミルシステインの蓄積量の上昇が、セルレニン耐性を有さない酵母に比べて良好である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
＜１＞本発明の酵母
本発明の酵母は、γ−グルタミルシステイン生産能を有し、かつ、セルレニン耐性を有する酵母である。
本発明の酵母は、γ−グルタミルシステイン生産能を有する酵母にセルレニン耐性を付与することにより取得することができる。また、本発明の酵母は、セルレニン耐性を有する酵母にγ−グルタミルシステイン生産能を付与するか、あるいは、セルレニン耐性を有する酵母のγ−グルタミルシステイン生産能を高めることによっても取得することができる。
【００１４】
本発明において、「γ−グルタミルシステイン生産能を有する」とは、γ−グルタミルシステインを生産し、菌体内に蓄積する能力を有することをいい、好ましくは、酵母野生株よりも多量のγ−グルタミルシステインを菌体内に蓄積することをいう。より好ましくは、本発明の酵母を最小培地で培養したとき、その対数増殖期に、乾燥酵母菌体当たり１重量％以上、さらに好ましくは１．４重量％以上のγ−グルタミルシステインを蓄積することをいう。また、乾燥酵母菌体当たりのグルタチオン蓄積量が０．１重量％以下であることが好ましい。
【００１５】
本発明の酵母は、γ−グルタミルシステイン生産能を有する限り特に制限されない。サッカロミセス・セレビシエ等のサッカロミセス属、キャンディダ・ユティリス等のキャンディダ属、ピピア・パストリス等のピピア属、シゾサッカロミセス・ポンベ等のシゾサッカロミセス属等を例示することができる。上記の酵母の中では、γ−グルタミルシステイン生産能を向上させる技術、例えばグルタチオン合成酵素の破壊や弱化の方法が知られており、さらにγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子がクローニングされているものが、本発明の酵母を構築する上で好適である。そのような酵母として、サッカロミセス・セレビシエやキャンディダ・ユティリスが挙げられる。
【００１６】
γ−グルタミルシステイン生産能を有する酵母としては、例えば、細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下又は消失した酵母、もしくは、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が増強されるように改変された酵母、又は、細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下又は消失し、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が増強されるように改変された酵母が挙げられる。
【００１７】
細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下又は消失した酵母は、例えば、グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子（GSH2）の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素を産生しないように改変した遺伝子、又は酵素活性が低下するような変異を有する遺伝子（以下、単に「変異型GSH2遺伝子」という）を含むＤＮＡを用いた遺伝子置換により創製することができる。また、細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下又は消失した酵母は、実施例
に記載したのと同様に、野生型酵母を、通常の変異処理、例えばUV照射、あるいはN−メチル−N−ニトロソグアニジン（NTG）、エチルメタンスルホネート（EMS）、亜硝酸、アクリジン等の変異剤による処理によって、取得することもできる。得られた変異株が目的の変異を有していることは、例えばＰＣＲ法等により確認することができる。
【００１８】
前記のようなグルタチオン合成酵素活性が低下するような変異としては、例えば、370位のアルギニン残基を終止コドンに変更する変異が挙げられる。
【００１９】
また、グルタチオン合成酵素活性が低下する他の変異としては以下の変異が挙げられる（国際公開０３／０４６１５５号パンフレット参照）。
（１）４７位のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換する変異。
（２）３８７位のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換する変異。
（３）５４位のプロリン残基がロイシン残基に置換する変異。
上記変異は、少なくとも（１）または（２）を含む限り、単独でも、任意の組合せでもよいが、（１）と（３）の組合せ、及び（２）と（３）の組合せが好ましい。
【００２０】
グルタチオン合成酵素遺伝子への目的の変異の導入は、合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異法によって行うことができる。
【００２１】
前記遺伝子置換は、以下のようにして行うことができる。変異型GSH2遺伝子を含む組換えＤＮＡで酵母を形質転換し、変異型GSH2遺伝子と染色体上のGSH2遺伝子との間で組換えを起こさせる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。また、前記組換えＤＮＡは、制限酵素で切断する等により直鎖状にし、さらに、酵母で機能する複製制御領域を除いておくと、染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株を効率よく取得することができる。
【００２２】
酵母の形質転換は、プロトプラスト法、ＫＵ法、ＫＵＲ法、エレクトロポレーション法等、通常酵母の形質転換に用いられる方法を採用することができる。
【００２３】
上記のようにして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、変異型GSH2遺伝子と染色体上にもともと存在するGSH2遺伝子との組換えを起こし、野生型GSH2遺伝子と変異型GSH2遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分及びマーカー遺伝子）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。
【００２４】
融合遺伝子２個のうち、変異型GSH2遺伝子のみを残すために、２個のGSH2遺伝子の組換えにより１コピーのGSH2遺伝子を、ベクター部分（マーカー遺伝子を含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、野生型GSH2遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、変異型GSH2遺伝子が切り出される場合と、反対に変異型GSH2遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、野生型GSH2遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合もマーカー遺伝子が脱落するので、２回目の組換えが生じたことは、マーカー遺伝子に対応する表現形質によって確認することができる。また、目的とする遺伝子置換株は、PCRによりGSH2遺伝子を増幅し、その構造を調べることによって、選択することができる。
【００２５】
尚、遺伝子置換に用いる変異型GSH2遺伝子は、グルタチオン合成酵素タンパク質全長をコードするものであってもよいが、欠失部位を含む限り、タンパク質の一部をコードする遺伝子断片であってもよい。
【００２６】
サッカロマイセス・セレビシエのグルタチオン合成酵素遺伝子（GSH2）は塩基配列が報告されており（Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998) 315-320、GenBank
accession Y13804、配列番号１）、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチド
をプライマーとするPCRにより、サッカロマイセス・セレビシエ染色体ＤＮＡから取得することができる。また、導入する遺伝子は、サッカロマイセス属以外の微生物に由来する遺伝子を用いることができる。
【００２７】
本発明に用いる変異型GSH2遺伝子は、前記４７位、３８７位、５４位の変異以外に、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１又は数箇所の位置における１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有するGSH2産物をコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には例えば、前記「数個」は、２〜10個、好ましくは、２〜６個、より好ましくは２〜３個である。あるいは、変異型GSH2遺伝子は、GSH2産物のアミノ酸配列全体に対し、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００２８】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、GSH2遺伝子を保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。
【００２９】
尚、GSH2遺伝子を破壊する場合は、遺伝子置換に用いる変異型GSH2遺伝子は必ずしも全長を含む必要はなく、遺伝子破壊を起こすのに必要な長さを有していればよい。また、GSH2遺伝子の取得に用いる微生物は、同遺伝子が、遺伝子破壊株の創製に用いる微生物の相同遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していれば特に制限されない。
【００３０】
前記サッカロマイセス・セレビシエのGSH2遺伝子と相同組換えを起こし得るＤＮＡとして具体的には、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡと、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。より具体的には、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。ストリンジェントな条件としては、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で洗浄が行われる条件が挙げられる。
【００３１】
また、グルタチオン合成酵素活性が低下又は消失した酵母は、実施例に記載したのと同様に、野生型酵母を、通常の変異処理、例えばUV照射、あるいはN−メチル−N−ニトロソグアニジン（NTG）、エチルメタンスルホネート（EMS）、亜硝酸、アクリジン等の変異剤による処理によって、取得することもできる。
【００３２】
また、酵母細胞内のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を増強する方法としては、同酵素遺伝子（GSH1）（例えば、Saccharomyces cerevisiaeのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子： GenBank Accession No. D90220）を挿入したプラスミドで酵母を形質転換し、同遺伝子の細胞内のコピー数を高めるか、染色体上のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子のプロモーターを強転写プロモーターで置換する方法（大竹康之ら、バイオサイエンスとインダストリー、第50巻第10号、第989〜994頁、1992年）が挙げられる。γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子としては、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子も知られており（特開２００５−０７３６３８）、本発明に使用することができる。
【００３３】
細胞内のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性及びグルタチオン合成酵素性は、それぞれ、Jacksonの方法（Jackson, R.C., Biochem. J., 111, 309 (1969)）、及びGushimaらの方法（Gushima, T. et al., J. Appl. Biochem., 5, 210 (1983)）によって測定することができる。
また、ＭＮＮＧ耐性の付与（特開２００３−１５９０４８）、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を保持させること（特開２００４−１１３１５５）、ＭＥＴ２５遺伝子発現を脱抑制させること（特開２００４−２０１６７７）、パントテン酸要求性を付与すること（特開２００４−２０１６７７）によって、酵母のγ−グルタミルシステイン生産能を向上させること、あるいは酵母に好ましい性質を付与することができる。
【００３４】
本発明の酵母は、上記のようなγ−グルタミルシステイン生産能を有し、かつ、セルレニン耐性を有するように改変された酵母菌株である。本発明において「セルレニン耐性を有する」とは、酵母の非改変株、例えば野生株、又は本発明の酵母の取得に用いる親株が増殖できない濃度のセルレニンを含む培地で増殖できることをいう。また、酵母の非改変株、例えば野生株又は親株が増殖できる濃度のセルレニンを含む培地で、非改変株よりも速く増殖する酵母は、セルレニン耐性を有する。具体的には例えば、セルレニンを含むYPDプレート等の寒天培地に酵母懸濁液を広げ、好適な温度、例えば３０℃で培養したときに、非改変株がコロニーを形成せず、改変株がコロニーを形成すれば、同改変株はセルレニン耐性を有する。ここで、「コロニー」とは、肉眼により確認できるコロニーをいう。
【００３５】
〔YPD培地組成〕
グルコース        ２％
ペプトン          ２％
酵母エキス        １％
(pH5.0)
（寒天培地の場合、寒天２％）
【００３６】
酵母がサッカロマイセス・セレビシエである場合、より具体的には、酵母をYPD培地に植菌し、生育至適温度、例えば３０℃で３日間培養した培養液を、ある濃度のセルレニンを含むYPDプレートに広げ、生育指摘温度で培養したときに、５日以内にコロニーを形成すれば、前記酵母はその濃度のセルレニンに耐性を有する。セルレニン耐性を付与されるように改変されていないサッカロマイセス・セレビシエ、例えば実施例に記載のAJ14800株では、少なくとも７μＭのセルレニンを含むYPDプレートでは、３日以内にほとんどコロニーを形成しない。本発明の酵母は、好ましくは１０μＭ以上、より好ましくは１５μＭ以上、特に好ましくは２０μＭ以上のセルレニンに耐性を有することが好ましい。
【００３７】
セルレニン耐性を有する酵母は、例えば、酵母の野生株又はγ−グルタミルシステイン生産能を有する酵母を変異処理し、野生株が生育できない濃度のセルレニンを含む寒天培地に接種し、コロニーを形成する株を選択することによって、取得することができる。また、こうして取得された株の培養液を再度セルレニンを含む寒天培地に広げ、コロニー形成能を有する株を選択する操作を、２回又はそれ以上繰返してもよい。さらに、取得されたセルレニン耐性を有する酵母を、再度変異処理し、前記選択操作を行ってもよい。変異処理としては、グルタチオン合成酵素活性が低下又は消失した酵母について記載したのと同様に、通常の変異処理、例えばUV照射、あるいはN−メチル−N−ニトロソグアニジン（NTG）、エチルメタンスルホネート（EMS）、亜硝酸、アクリジン等の変異剤による処理が挙げられる。
【００３８】
また、セルレニン耐性を有する酵母は、変異処理を行わず、野生株から上記と同様にしてセルレニンを含む培地で培養することによっても、自然変異株として取得することができる。
【００３９】
本発明の酵母は、１倍体でもよいが、２倍性またはそれ以上の倍数性を有することが、生育が良好である点で好ましい。２倍性またはそれ以上の倍数性を有する酵母は、倍数性を有する酵母を変異処理しγ−グルタミルシステインを生産する株を選択すること、或い
はγ−グルタミルシステイン生産株の育種に用いた１倍体酵母と、野生型酵母の１倍体を接合させ、得られた２倍体酵母を胞子形成させ、γ−グルタミルシステインを生産する株を選択し、相異なる接合型を有するγ−グルタミルシステイン生産１倍体酵母２株を接合させることによって、取得することができる。同様にして、３倍性又はそれ以上の倍数性を有する酵母を取得することができる。
【００４０】
上記のような酵母の育種、改変に関する操作は、「化学と生物  実験ライン31  酵母の実験技術」初版  廣川書店；「バイオマニュアルシリーズ10  酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社、「METHODS in YEAST GENETICS 2000 Edition」Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載されている。
【００４１】
上記のように、セルレニン耐性を有する酵母は、効率的にγ−グルタミルシステインを生産する。したがって、セルレニン耐性を指標として、γ−グルタミルシステインを効率よく生産する菌株をスクリーニング又は育種することができる。
【００４２】
＜２＞本発明の酵母の利用
本発明の酵母を培地で培養することにより、γ−グルタミルシステインを菌体内に蓄積した酵母、及びその培養物を製造することができる。
【００４３】
本発明の酵母の培養に用いる培地は、本発明の酵母が良好に生育し、かつ、γ−グルタミルシステインを効率よく生産するものであれば特に制限されず、通常、工業的に用いられる培地を用いることができる。尚、必要に応じて、用いる酵母の形質にしたがって必要な栄養素を培地に添加する。
【００４４】
例えば、パン酵母では、対数増殖期又は定常期まで培養した培養液を、２％となるように栄養培地に接種し、３０℃で８〜２４時間、振とう培養すれば、対数増殖期の菌体が得られる。
【００４５】
目的とするγ−グルタミルシステイン蓄積量に達したら、培養を終了する。通常は、好適な条件下では、培養時間は10〜30時間、好ましくは15〜27時間である。
【００４６】
本発明においては、培養の形態として、高密度培養を採用することができる。本発明において「高密度培養」とは、液体培養における細胞密度が、１×１０8個細胞／ｍｌ以上、好ましくは２．５×１０8個細胞／ｍｌ以上、より好ましくは４×１０8個細胞／ｍｌ以上であることをいう。あるいは、液体培養における菌体乾燥重量が、１ｇ／１００ｍｌ以上、好ましくは２．５ｇ／１００ｍｌ以上、より好ましくは４ｇ／１００ｍｌ以上である場合も、高密度培養に含まれる。培養の全期間が高密度培養である必要はなく、少なくとも一部の期間において前記細胞密度に達していればよい。例えば、培養期間の１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上で、前記細胞密度に達していることが好ましい。
【００４７】
本発明の酵母は、高密度培養において、経時的に菌体当りのγ−グルタミルシステイン含有量が上昇する。セルレニン耐性を有さない従来のγ−グルタミルシステイン酵母も、高密度培養でγ−グルタミルシステイン含有量は上昇するものがあるが、培養期間の経過かと共にγ−グルタミルシステイン含有量の上昇が頭打になる傾向がある。それに対して、本発明の酵母は、好的な形態では、従来の酵母に比べてγ−グルタミルシステイン含有量の上昇が顕著である。
【００４８】
上記のようにして得られる培養物又はその分画物は、γ−グルタミルシステインを含有する。培養物は、酵母菌体を含む培養液であってもよいし、それから採取された酵母菌体
、菌体破砕物、又は菌体抽出物（酵母エキス）であってもよい。菌体破砕物又は酵母エキスから、γ−グルタミルシステインを含む画分を得てもよい。
【００４９】
上記γ−グルタミルシステインを含む培養物又はその分画物を加熱することにより、γ−グルタミルシステインからシステインを遊離させることができる。
酵母エキス等の調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものを処理したものでもよいし、酵母菌体を消化したものを処理したものでもよい。
【００５０】
上記γ−グルタミルシステイン又はシステインを含む培養物又はその分画物は、飲食品の製造に用いることができる。飲食品としては、アルコール飲料、パン食品、又は発酵食品調味料等の飲料又は食品が挙げられる。熱処理によるγ−グルタミルシステインからシステインの生成は、飲食品の製造中、又は製造の後に行われてもよい。
【００５１】
上記飲食品は、γ−グルタミルシステイン又はシステインを含む培養物又はその分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することによって製造される。本発明の飲食品は、前記培養物又は分画物を使用すること以外は、通常の飲食品と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。このような原料としては、例えばアルコール飲料では、米、大麦、コーンスターチ等、パン食品では小麦粉、砂糖、食塩、バター、発酵用酵母菌等が、発酵食品調味料では大豆、小麦等が挙げられる。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。なお、本発明は以下実施例になんら限定されるものではない。
【００５３】
〔参考例１〕YAP1遺伝子高発現による高γ-GC酵母の分子育種
γ−グルタミルシステイン生産酵母AJ14800株から、YAP1遺伝子が高発現する株を育種した。
AJ14800株は、野生型サッカロマイセス・セレビシエに由来するグルタチオン合成酵素活性が弱化した菌株AJ14809株と、サッカロマイセス・セレビシエ野生株AJ14810株（MATa）を接合させ、グルタチオン合成酵素活性が弱化し、γ−グルタミルシステインを生産する株を選択することにより取得された２倍体酵母（gsh2/gsh2）である（特開2003-159048、米国特許公開2004-0214308A1）。
【００５４】
AJ14809株は、2001年10月1日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、FERM P-18546の受託番号で寄託され、2002年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-8228が付与されている。また、AJ14810株は、2001年10月1日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、FERM P-18547の受託番号で寄託され、2002年11月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-8229が付与されている。
【００５５】
まず、常法に基づき、YAP1遺伝子を高発現するベクター(YAP1/pAUR123)を、以下のようにして作製した。AJ14800株をYPD培地で培養し、その対数増殖期に染色体DNAを回収した。回収した染色体DNAを鋳型として、Pyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社)、プライマー１（配列番号３）及びプライマー２（配列番号４）を用いてYAP1遺伝子のORF領域を増幅した。プライマーの末端にはSmaIサイト又はXbaIサイトが付加されるように設計されているため、PCR産物のN末端側にはSmaIサイトが、C末端側にはXbaIサイトが付加される。このPCR産物を精製し、精製産物と、酵母用のタンパク発現型シャトルベクターpAUR123
（タカラバイオ社）を各々制限酵素SmaI、XbaIで切断し、TaKaRa DNAライゲーションキット ver.2（タカラバイオ社）を用いて連結した。連結物でエシェリヒア・コリJM109を形質転換して、形質転換体を取得した。目的の発現ベクターを保持する形質転換体を選抜し、得られた株からYAP1/pAUR123ベクターを大量調製した。
【００５６】
上記のようにして作製したYAP1/pAUR123ベクター及びpAUR123で各々AJ14800株を形質転換した。具体的には次のような操作を行った。AJ14800株をYPD培地で培養し、その対数増殖期に集菌した。1Mソルビトール溶液で２回洗浄した菌体を、以下の組成の溶液に懸濁し、5℃で1時間放置した。
【００５７】
（組成）
0.1 M LiCl
10 mM DTT
10 mM Tris-HCl(pH7.5)
1 mM EDTA
【００５８】
その後、1Mソルビトール溶液で菌体を２回洗浄した。このようにして調製した菌体に上述のようにして作製したPCR産物を混合し、エレクトロポレーションを行った(「バイオマニュアルシリーズ10  酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社)。その後、混合物をYPD培地に接種し、30℃で16時間振とう培養した。培養物を、pAUR123ベクターの選択マーカーであるオーレオバシジンＡ（宝酒造 code9000）を0.2μg/ml含有するYPD寒天培地にスプレッドし、３日間30℃で培養した。尚、AJ14800株のオーレオバシジンＡに対する最小生育阻止濃度は0.05μg/mlである。出現したコロニーを0.2μg/mlのオーレオバシジンＡを含有するYPD寒天培地に塗布し、オーレオバシジンＡに対する耐性を有するコロニーを選抜した。それらのコロニーから、目的のベクターを保持している形質転換体を選抜し、各々AJ14800/YAP1/pAUR123株及びAJ14800/pAUR123株を取得した。
【００５９】
上記２株を、各々0.2μg/mlのオーレオバシジンＡを含むYPD培地（4ml、試験管）に植菌し、30℃で振とう培養した。その前培養液を各々0.2μg/mlのオーレオバシジンＡを含むSD培地（50ml、坂口フラスコ）に2%シードし、30℃で振とう培養した。対数増殖期（シード後16時間）に集菌し、乾燥菌体当りのγ−グルタミルシステイン含有量を測定したところ、AJ14800/YAP1/pAUR123株は1.7重量%、AJ14800/pAUR123株は1.4重量%であった。
以上より、YAP1遺伝子の発現量を向上させることにより、菌体内のγ−グルタミルシステイン含有量が上昇することが確認された。
【００６０】
〔SD培地組成〕
グルコース     ２％
Nitrogen Base  １倍濃度
（10倍濃度Nitrogen Baseは、1.7gのBacto Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and
Ammonium Sulfate (Difco社)と5gの硫酸アンモニウムを混合したものを100mlの滅菌水に溶解し、pHを5.2程度に調整し、フィルター濾過滅菌したもの）
【００６１】
また、各種濃度のセルレニンを含有するYPD寒天培地を作製し、前述の２株に対するセルレニンの最小生育阻止濃度を測定した。具体的には、各菌株をYPD液体培地で、３０℃で振とう培養し、定常期に達した培養液３μlをセルレニンを含有する寒天培地にスポットし、３０℃で３日間培養し、コロニー形成の有無により菌体の生育を評価した。その結果、最小生育阻止濃度は、AJ14800/YAP1/pAUR123株は9μM、AJ14800/pAUR123株は7μMであった。このことより、YAP1遺伝子の発現量を向上させることにより、セルレニン耐性が上昇することが確認された。
【００６２】
〔実施例１〕
（セルレニン耐性株の取得）
参考例１と同様にしてAJ14800株のセルレニンに対する最小生育阻止濃度を調べたところ7μMであった。
【００６３】
次に、AJ14800株をYPD培地に植菌し、30℃で3日間培養した。その培養物を、YPDプレート、セルレニンを７μM含有するYPDプレート、セルレニンを10μM含有するYPDプレートにスプレッドし、セルレニン耐性株を取得した。耐性株の出現率を、YPDプレート上及びセルレニンを含有するYPDプレートに上に形成されたコロニーの数を比較することにより評価したところ、7μMのプレートで100株に1株、10μMのプレートで2000株に1株であった。
【００６４】
〔実施例２〕セルレニン耐性株の分類
実施例１で取得したセルレニン耐性株について、セルレニン耐性度（生育阻止濃度）を調べたところ、以下のとおりであった。
【００６５】
セルレニン耐性度  7μM以上10μM未満：420株
セルレニン耐性度  10μM以上：613株
【００６６】
これらの菌株のγ−グルタミルシステイン含有量を測定し、親株よりもγ−グルタミルシステイン含有量が上昇しかつ生育が良好な菌株を選抜したところ、各群について、以下のような数の菌株が選抜された。
【００６７】
セルレニン耐性度  7μM以上10μM未満：８株
セルレニン耐性度  10μM以上：１８株
【００６８】
各々の群から最優良株として、7-46株（セルレニン耐性度  7μM以上10μM未満の群から選抜）、10-29株（セルレニン耐性度  10μM以上の群から選抜）を選抜した。これらの菌株をSD培地で培養し、その対数増殖期のγ−グルタミルシステイン含有量を測定したところ、AJ14800株は1.50%、7-46株は1.68%（親株比1.1倍）、10-29株は1.80%（親株比1.2倍）であった。
【００６９】
AJ14800株と10-29株のYAP1遺伝子の塩基配列を決定したところ、相違点は見出せなかった。このことより、10-29株のγ−グルタミルシステイン含有量が上昇した原因はYAP1遺伝子の変異以外にあると推測された。なお、10-29株はセルレニン25μMのプレート上でも生育可能であった。
【００７０】
〔実施例３〕高密度培養時のγ−グルタミルシステイン含有量
AJ14800株、7-46株、10-29株をミニジャーを用いて高密度培養し、γ−グルタミルシステイン含有量を測定した。
【００７１】
YPD培地50ml（500ml容坂口フラスコ）に各々の菌株を１エーゼ植菌し、30℃、120rpmで振とう培養することによりプレシード培養を行った。次に、プレシード培養物5mlをYPD培地500ml（2Lバッフル付三角フラスコ）に植菌し、30℃、120rpmで48時間振とう培養することによりシード培養を行った。シード培養物200mlをメイン培地に植菌し、ミニジャーを用いて以下の条件で培養を行った。
【００７２】
【表１】
2008061525.tif 000003
【００７３】
A区、B区、C区は各々別々にオートクレーブ殺菌（120℃20分）後、混合した。また、Yeast Extractは総窒素量が0.23g/dlになるように添加した。培養温度は30℃、通気量は1/1VVM、攪拌数は800rpmで培養を行った。糖フィード液として、46.7%（W/V）のグルコース液を用い、培養ブロスのpHが6.0になったらフィードを開始した。培養途中のpHは、糖フィード開始後、アンモニアガスを用いてpH6.0に制御した。糖フィード後３時間毎に培養液の吸光度（OD660nm）を測定し、0.2μg-グルコース/乾燥菌体重量（DCW）g/hrとなるようにグルコースを添加した。換算式としてDCW=0.22×OD660nmを使用した。
【００７４】
一定時間毎にγ−グルタミルシステイン含有量を測定した結果を図１に示す。また、培養48時間目の乾燥菌体重量(DCW)及びγ−グルタミルシステイン含有量（γ-GC）を測定した結果を以下に示す。
【００７５】
AJ14800株  ：γ-GC 2.10%  DCW3.65g/dl
7-46株     ：γ-GC 2.66%  DCW3.23g/dl
10-29株    ：γ-GC 3.48%  DCW3.16g/dl
【００７６】
10-29株は、顕著に経時的にγ−グルタミルシステイン含有量が上昇した。また、セルレニン耐性度10μM以上の群から選抜した別の菌株も、高密度培養下で顕著に経時的にγ−グルタミルシステイン含有量が上昇した。
【００７７】
〔実施例４〕10-29株のグルタチオン合成酵素活性の更なる低下検討
次に、10-29株のグルタチオン合成酵素遺伝子を破壊することにより、更にグルタチオン合成酵素活性を低下させた場合の影響を検討した。特開２００４−２０１６７７の実施例３に記載された方法と同様の方法により、10-29株のグルタチオン合成酵素遺伝子の破壊を行った。得られた菌株は、プライベートナンバーAJ14892が付与され、２００６年８月２５日付けで、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１００７として寄託されている。
【００７８】
上記のようにして取得したAJ14892株を実施例３と同様に高密度培養を行った。糖フィード液として60%グルコース溶液を用い、ブロスのpHが6.0になったときに糖フィードを開始した。糖フィード流量は、糖フィード開始0.5時間後までは20μl/min、5.9時間後までは75μl/min、それ以降は135μl/minに設定した。
一定時間毎にγ−グルタミルシステイン含有量を測定した結果を図２に示す。また、培培養48時間目の乾燥菌体重量(DCW)及びγ−グルタミルシステイン含有量（γ-GC）は、以下のとおりであった。
【００７９】
γ-GC： 4.12%
DCW  ： 5.02g/dl
【００８０】
本菌株も10-29株と同様に、顕著に高密度培養で経時的にγ−グルタミルシステイン含有量が上昇した。この結果より、グルタチオン合成酵素活性を更に低下させてもγ−グルタミルシステイン含有量は経時的に上昇することがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】酵母の培養時間とγ−グルタミルシステイン含有量との関係を示す図。
【図２】酵母の培養時間とγ−グルタミルシステイン含有量との関係を示す図。
【図１】
2008061525.tif 000004
【図２】
2008061525.tif 000005
【配列表】
2008061525000001.app