(57)【要約】【課題】有機スズ化合物を特異的に検出できる方法を実施するのに必要な検出物質を提供することを目的とする。【解決手段】核内受容体スーパーファミリーに属するレチノイドＸ受容体(retinoid X receptor; RXR)において極性官能基が結合する領域に変異を加えることによって、有機スズ化合物と特異的に結合し、かつ、極性官能基を有する内因性リガンドおよびその類似体が結合しない変異型ＲＸＲを作製し、有機スズ化合物のみを高い感度で検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンド結合領域の極性官能基結合部位が変異した変異型レチノイドＸ受容体。
【請求項２】
レチノイドと反応せず、式（ＩＩＩ）：
【化１】
2008044902.tif 000014
［式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、またはＲ；
Ｒは、炭素数３〜７の脂肪族アルキル基、シクロアルキル基、フェニル基またはビニル基；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、炭素数３〜７の脂肪族アルキル基、シクロアルキル基またはフェニル基である。］で表される有機スズ化合物に反応するリガンド結合領域を有する請求項１に記載の変異型レチノイドＸ受容体。
【請求項３】
配列番号：１５で示されるアミノ酸配列もしくは配列番号：１５で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上のホモロジーを有する２０３残基のアミノ酸配列において、前記リガンド結合領域の極性官能基結合部位に存在する１または複数のアミノ酸残基が欠失もしくは置換されているか、または１もしくは複数のアミノ酸残基が挿入されているアミノ酸配列を有する請求項１に記載の変異型レチノイドＸ受容体。
【請求項４】
配列番号：１５で示されるアミノ酸配列または配列番号：１５で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上のホモロジーを有する２０３残基のアミノ酸配列において、１２位、１６位、５７位、６７位または６８位のアミノ酸残基のいずれか１または複数が置換されているアミノ酸配列を有する請求項１に記載の変異型レチノイドＸ受容体。
【請求項５】
配列番号：１５で示されるアミノ酸配列または配列番号：１５で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上のホモロジーを有する２０３残基のアミノ酸配列において、５７位および６７位のアミノ酸残基がアラニン残基に置換されているアミノ酸配列を有する請求項１に記載の変異型レチノイドＸ受容体。
【請求項６】
配列番号：４で示されるアミノ酸配列を有する請求項１に記載の変異型レチノイドＸ受容体。
【請求項７】
請求項１ないし６いずれか１に記載の変異型レチノイドＸ受容体を含む、有機スズ化合物の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機スズ化合物を高感度で検出するのに有用な変異型レチノイドＸ受容体に関する。本発明の変異型レチノイドＸ受容体は、特に、トリアルキルスズ化合物やトリアリールスズ化合物と特異的に結合するが、野生型レチノイドＸ受容体に対するビタミンＡ代謝物等の内因性リガンドとは結合しない。
【背景技術】
【０００２】
トリブチルスズ（ＴＢＴ）やトリフェニルスズ（ＴＰＴ）に代表される有機スズ化合物は、船底防汚塗料、漁網防汚剤、ビニールの可塑剤、木材資料の防菌剤、工業用冷却水の防菌剤、農薬など様々な分野において多用されてきた。
しかしながら、ＴＢＴやＴＰＴには急性毒性や変異原性などの毒性が認められ、非常に低濃度（１０−１２ｇ／ｍＬ）のＴＢＴを含む海水中で、雌巻貝類の雄化現象（インポセックス）が引き起こされることが確認された［非特許文献１］。
【０００３】
現在では、有機スズ化合物は環境汚染を引き起こす内分泌攪乱物質として認識され、わが国において、環境庁が優先してリスク評価に取り組むべき物質として挙げている。環境庁が作成した暫定マニュアル［非特許文献２］には、環境試料中の有機スズの分析方法が定められている。この方法では、海水１Ｌに含まれる有機スズ化合物を有機溶媒で抽出し、誘導化して最終的に０．２ｍＬにまで濃縮する。この濃縮試料をガスクロマトグラフ−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）やスズのフィルター付き炎光光度測定（ＦＰＤ）で測定する。しかしながら、この方法は、多段階からなる工程を含むため、煩雑であり、高価で大がかりな機器、高度な測定技術および長い処理時間を要する。
また、環境試料中に存在する有機スズ化合物は非常に微量であるため、抽出や濃縮などの操作により損失があれば測定値が大きく変動する。そこで、各操作における回収率を明確にするため、目的の有機スズ化合物に同位体標識したサロゲート物質を試料に添加するが、サロゲート物質は非常に高価である。
【０００４】
誘導結合プラズマ質量計（ＩＣＰ−ＭＳ）を用いて、検出感度を１０倍に向上させ、処理時間を５分の１に短縮した分析方法も開発されているが［非特許文献３］、この方法も高価で大がかりな機器や高度な測定技術を要する点で、環境庁の定める測定方法と同様に簡便ではない。
【０００５】
それゆえ、上記のような大がかりな機器や経験を有しなくとも、簡便な機器を用いることで、実験室レベルで迅速かつ簡便に比較的高感度で有機スズ化合物の濃度を測定する方法が求められているが、そのためには、まず、有機スズ化合物に特異的な検出物質を提供する必要がある。
【０００６】
本発明者は、すでに、有機スズ化合物が核内受容体スーパーファミリーに属するレチノイドＸ受容体(retinoid X receptor; RXR)に対してアゴニスト作用を有することを報告している。したがって、ＲＸＲは有機スズ化合物に特異的な検出物質としての可能性を有している。
【０００７】
ＲＸＲは、貝類から脊椎動物まで種を越えて保存されていることが知られている。例えば、ヒト(Homo sapience)、チンパンジー(Pan troglodytes)、イヌ(Canis familialis)、ウシ（Bos taurus）、ブタ（Sus scrofa）、アメリカミンク（Mustela vison）、マウス(Mus musculus)、ラット(Rattus norvegicus)、ニワトリ(Gallus gallus)、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)、ヒラメ（Aedes aegypti）、トラフグ（Takifugu rubripes）、イボニシ(Thais clavigera)などの生物におけるＲＸＲのアミノ酸配列が同定され、異種の生物間で、ＲＸＲのリガンド結合領域(ligand binding domain: LBD)を構成するアミノ酸配列のホモロジーは非常に高いことが確認されている。
また、ＲＸＲには、ＲＸＲα、ＲＸＲβおよびＲＸＲγの３つのサブタイプが存在するが、サブタイプ間でも、ＬＢＤを構成するアミノ酸配列のホモロジーは非常に高いことが確認されている。
【０００８】
ＲＸＲの内因性リガンドとして、ビタミンＡの代謝物である９−シス−レチノイン酸(9-cisRA)（式Ｉ）が知られている。ＲＸＲは内因性リガンドに対して高い親和性を示すが、トリブチルスズ化合物やトリフェニルスズ化合物（式ＩＩ）とも内因性リガンドとほぼ同等の親和性を有することが報告されている。例えば、ｈＲＸＲαに３Ｈ標識した９−ｃｉｓＲＡまたは１４Ｃ標識したトリフェニルスズ水酸化物（ＴＰＴＯＨ）を加え、ｈＲＸＲαに結合した放射活性を測定し、スキャチャードプロットにより解析した結果、１４Ｃ−ＴＰＴＯＨの解離定数Ｋｄは５５．５ｎＭと算出された。この値は、３Ｈ−９−ｃｉｓＲＡの解離定数Ｋｄ（１１．７ｎＭ）と同程度であり、ＴＰＴＯＨは、９−ｃｉｓＲＡと同等の親和性でｈＲＸＲαに結合することが確認された［非特許文献４］。
【０００９】
【化１】
2008044902.tif 000002
【００１０】
【化２】
2008044902.tif 000003
【００１１】
特開２００４−６５２４８号公報［特許文献１］には、ＲＸＲなどの核内受容体を含む核内受容体リガンド検出剤が開示され、この検出剤により有機スズ化合物が検出できたことが記載されているが、この検出剤を用いた場合、９−ｃｉｓＲＡなどの内因性リガンドであるＲＸＲリガンドや、医薬品として開発されている合成ＲＸＲリガンドなども核内受容体に結合し、有機スズ化合物のみを特異的に検出することができず、有機スズ化合物を高感度で検出することができなかった。
【００１２】
【特許文献１】特開２００４−６５２４８号公報
【非特許文献１】Horiguchi, T., Shiraishi, H., Shimizu, M., Yamazaki, S., and Morita, M., Mar.Pollut.Bull., 31, 402-405 (1995)
【非特許文献２】環境庁水質保全局水質管理課「外因性内分泌攪乱化学物質調査暫定マニュアル、１９９８年１０月
【非特許文献３】H. Tao, R. Babu Rajendran, C. R. Quetel, T. Nakazato, M. Tominaga, and A. Miyazaki, Anal. Chem., 71, 4208-4215 (1999)
【非特許文献４】Nakanishi et al., Mol. Endcrinol. vol.19, 2520-2516 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
かくして、本発明は、核内受容体であるＲＸＲを用いて有機スズ化合物を特異的に検出できる方法を実施するのに必要な検出物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、内因性リガンドである９−ｃｉｓＲＡとＴＢＴやＴＰＴなどの有機スズ化合物との構造の違いに着目した。９−ｃｉｓＲＡは極性官能基であるカルボキシル基およびかさ高い疎水基がリンカーで結合された構造（式Ｉ）を有するのに対して、ＴＢＴおよびＴＰＴなどの有機スズ化合物は、かさ高い疎水基を有するが、極性官能基を有していない（式ＩＩ）。
【００１５】
そこで、本発明者は、ＲＸＲのＬＢＤのうち極性官能基が結合する部位（極性官能基結合部位）に変異を加えることによって、極性官能基を有する内因性リガンドおよびその類似体が結合しない変異型ＲＸＲを作製し、有機スズ化合物のみを高い感度で検出することに成功した。
【００１６】
より具体的には、本発明は、ＲＸＲのＬＢＤの極性官能基結合部位を構成するアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されたアミノ酸配列を有する変異型ＲＸＲを提供する。
本発明の変異型ＲＸＲは、上記のように１または複数のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されているため、レチノイドとの結合が阻害され、特定の有機スズ化合物のみと高い親和性で結合する。
本発明において、レチノイドは、９−ｃｉｓＲＡに代表される内因性リガンドやその類似体である合成リガンドを含み、極性官能基であるカルボキシル基およびかさ高い疎水基がリンカーで結合された構造を有する。
すなわち、本発明の変異型ＲＸＲを用いれば、環境試料中の有機スズ化合物を高い感度で検出することができる。
【００１７】
さらに、本発明は、本発明による変異型ＲＸＲを含む、有機スズ化合物の検出用キットも提供する。
本発明の検出用キットは、レポーターアッセイ、酵素two-hybrid法、コアクチベーター−大腸菌アルカリ性ホスファターゼ(Coactivator-Bacterial Alkaline Phosphatase; CoA-BAP)法などに適用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明に用いることができるＲＸＲは、内因性リガンドである９−ｃｉｓＲＡと反応するＬＢＤを有するＲＸＲであり、例えば、ヒト(Homo sapience)、チンパンジー(Pan troglodytes)、イヌ(Canis familialis)、ウシ（Bos taurus）、ブタ（Sus scrofa）、アメリカミンク（Mustela vison）、マウス(Mus musculus)、ラット(Rattus norvegicus)、ニワトリ(Gallus gallus)、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)、ヒラメ（Aedes aegypti）、トラフグ（Takifugu rubripes）、イボニシ(Thais clavigera)などの生物に由来するＲＸＲを含み、そのサブタイプであるＲＸＲα、ＲＸＲβおよびＲＸＲγも含む。
【００１９】
ヒト由来のＲＸＲα（ｈＲＸＲα）の完全長アミノ酸配列は配列番号：１で示される４６２残基のアミノ酸配列である。
９−ｃｉｓＲＡがｈＲＸＲαのＬＢＤに結合した状態のＸ線構造を図１に示す。この図から、９−ｃｉｓＲＡの極性官能基であるカルボキシル基が結合する部位には、ｈＲＸＲαの完全長アミノ酸配列（配列番号：１）における２７１位のアラニン（Ａ２７１）、２７５位のグルタミン（Ｑ２７５）、３１６位のアルギニン（Ｒ３１６）、３２６位のロイシン（Ｌ３２６）、３２７位のアラニン（Ａ３２７）が存在することが分かる。
【００２０】
したがって、ｈＲＸＲαのＬＢＤのうち、内因性リガンドの疎水基が結合する部位を保存しつつ、極性官能基結合部位に存在するアミノ酸残基を欠失、置換または挿入によって変異させれば、９−ｃｉｓＲＡやその類似体の結合を阻害し、有機スズ化合物のみを結合させることができると考えられる。このような変異は、極性官能基結合部位の静電相互作用、疎水性相互作用、立体形状を変化させることが目的である。
【００２１】
そこで、極性官能基結合部位に存在するアミノ酸の変異がＲＸＲと有機スズ化合物との結合能に対する影響を調べるために、ｈＲＸＲαの完全長アミノ酸配列のうちＲ３１６を中性アミノ酸であるアラニンに置換したアミノ酸配列（配列番号：２）を有する変異型ｈＲＸＲα（Ｒ３１６Ａ）、ｈＲＸＲαの完全長アミノ酸配列のうちＬ３２６を中性アミノ酸であるアラニンに置換したアミノ酸配列（配列番号：３）を有する変異型ｈＲＸＲα（Ｌ３２６Ａ）、ｈＲＸＲαの完全長アミノ酸配列のうちＲ３１６およびＬ３２６の双方を中性アミノ酸であるアラニンに置換したアミノ酸配列（配列番号：４）を有する変異型ｈＲＸＲα（Ｒ３１６Ａ／Ｌ３２６Ａ）を作製する。
【００２２】
本発明において、変異型ＲＸＲは、ポリペプチド合成法や組換えＤＮＡなどの遺伝子工学技術によって作製することができる。
【００２３】
ｈＲＸＲαの完全長アミノ酸配列（配列番号：１）のうち２２５位から４６２位までのアミノ酸配列が、ｈＲＸＲαにおいて９−ｃｉｓＲＡと反応するＬＤＢを構成するアミノ酸配列（配列番号：５）である。
【００２４】
図２に、ｈＲＸＲαのＬＢＤを構成するアミノ酸配列（配列番号：５）に対する、ヒト由来のＲＸＲβ（ｈＲＸＲβ）およびＲＸＲγ（ｈＲＸＲγ）、マウス由来のＲＸＲα（ｍＲＸＲα）、ＲＸＲβ（ｍＲＸＲβ）およびＲＸＲγ（ｍＲＸＲγ）、ならびにラット由来のＲＸＲα（ｒＲＸＲα）、ＲＸＲβ（ｒＲＸＲβ）およびＲＸＲγ（ｒＲＸＲγ）のＬＢＤを構成するアミノ酸配列（配列番号：６〜１３）のアライメントを示す。また、図３に、ｈＲＸＲαのＬＢＤを構成するアミノ酸配列（配列番号：５）に対する、イボニシ由来のＲＸＲα（ｔＲＸＲα）のＬＢＤを構成するアミノ酸配列（配列番号：１４）のアライメントを示す。
【００２５】
ｈＲＸＲαの完全長アミノ酸配列（配列番号：１）の２７１位のアラニン（Ａ２７１）、２７５位のグルタミン（Ｑ２７５）、３１６位のアルギニン（Ｒ３１６）、３２６位のロイシン（Ｌ３２６）、３２７位のアラニン（Ａ３２７）は、それぞれ、ｈＲＸＲαのＬＢＤを構成するアミノ酸配列（配列番号：５）の４７位、５１位、９２位、１０２位および１０３位のアミノ酸残基に相当する。
図２および３に示されるアライメントから、ｈＲＸＲαにおいて、極性官能基結合部位に存在する上記５つのアミノ酸残基は、生物種間およびサブタイプ間で共通することが明らかである。
【００２６】
また、図２および３に示されるアライメントから、生物に共通して、ＲＸＲαのＬＢＤは他のサブタイプのＬＢＤに比べて、長いアミノ酸配列を有することが分かる。
そこで、配列番号：５で示されるｈＲＸＲαのアミノ酸配列のうち２６０位から４６２位までの２０３残基のアミノ酸配列（配列番号：１５）に対して、他のＲＸＲのＬＢＤを構成するアミノ酸配列のうち配列番号：１５のアミノ酸配列に相当する２０３残基のアミノ酸配列のホモロジーを検討する。
この検討から、同じサブタイプの場合、異種生物間では８０％以上のホモロジーを示すことが分かる。例えば、ｈＲＸＲαに対して、同じ脊椎動物由来のｍＲＸＲαおよびｒＲＸＲαは、９９．５％のホモロジーを示し、貝類由来のｔＲＸＲαでも８２．７％のホモロジーを示す。一方、同種生物のサブタイプ間では、８５％以上のホモロジーを示す。例えば、ｈＲＸＲαに対して、ｈＲＸＲβおよびｈＲＸＲγは、それぞれ、９３．６％および８９．７％のホモロジーを示す。表１に、各ＲＸＲのホモロジーを示す。
【００２７】
【表１】
2008044902.tif 000004
【００２８】
したがって、本発明の変異型ＲＸＲは、配列番号：１５で示されるアミノ酸配列もしくは配列番号：１５で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上のホモロジー、より好ましくは８５％以上のホモロジー、さらに好ましくは９５％以上のホモロジーを有する２０３残基のアミノ酸配列において、前記リガンド結合領域の極性官能基結合部位に存在する１または複数のアミノ酸残基が欠失もしくは置換されているか、または１もしくは複数のアミノ酸残基が挿入されているアミノ酸配列を有する。
【００２９】
ｈＲＸＲαの完全長アミノ酸配列（配列番号：１）の２７１位のアラニン（Ａ２７１）、２７５位のグルタミン（Ｑ２７５）、３１６位のアルギニン（Ｒ３１６）、３２６位のロイシン（Ｌ３２６）、３２７位のアラニン（Ａ３２７）は、それぞれ、配列番号：１５で示されるアミノ酸配列の１２位、１６位、５７位、６７位および６８位のアミノ酸残基に相当する。
【００３０】
有機スズ化合物が生体に与える影響は種によって大きく異なり、一般に、ある種の生体に対する現象を他種についても適用できるとは限らないが、ＲＸＲは核内受容体スーパーファミリーのなかでも、種を越えて保存され、特に、ＬＢＤを構成するアミノ酸配列のホモロジーが非常に高いことから、ＲＸＲを介する有機スズ化合物の生体に対する影響は共通すると考えられる。
【００３１】
本発明において、ＲＸＲに対する各種の化合物の結合能は、レポータージーンアッセイ、酵素two-hybrid法、コアクチベーター−大腸菌アルカリ性ホスファターゼ(Coactivator-Bacterial Alkaline Phosphatase; CoA-BAP)法などを用いて測定することができる。
【００３２】
本発明の変異型ＲＸＲは、式（ＩＩＩ）：
【００３３】
【化３】
2008044902.tif 000005
【００３４】
［式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、またはＲ；
Ｒは、炭素数３〜７の脂肪族アルキル基、シクロアルキル基、フェニル基またはビニル基；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、炭素数３〜７の脂肪族アルキル基、シクロアルキル基またはフェニル基である。］で表される有機スズ化合物を特異的に検出するのに特に有用である。
【００３５】
実施例１：ＲＸＲを用いるレポータージーンアッセイ
（１）プラスミドの構築
ほ乳類用発現ベクターｐＢＫ−ＣＭＶ（Stratagene社）に、酵母由来転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域(DNA binding domain: DBD)（アミノ酸番号１〜９４）およびｈＲＸＲαのリガンド結合領域(ligand binding domain: LBD)を挿入した、ＧＡＬ４ＤＢＤとｈＲＸＲαが哺乳動物細胞内で融合タンパク質として発現するようなベクターを、この実施例において、野生型ベクターとした。
【００３６】
まず、ｈＲＸＲαのＬＢＤに変異を導入して、変異型ｈＲＸＲα（Ｒ３１６Ａ）、変異型ｈＲＸＲα（Ｌ３２６Ａ）および変異型ｈＲＸＲα（Ｒ３１６Ａ／Ｌ３２６Ａ）を作製するにあたり、導入部位に応じた部分（Ｒ３１６ＦＰ、Ｒ３１６ＲＰ、Ｌ３２６ＦＰ、Ｌ３２６ＲＰ）およびｈＲＸＲαのＬＢＤの両側にプライマー（ｃｏｍｍｏｎＦＰ、ｃｏｍｍｏｎＲＰ）を設計した。
【００３７】
R316FP  : 5'-TTCTCCCACGCCTCCATCGCCGTGAA-3'          （配列番号：１６）
R316RP  : 5'-AGTAGCGGAGGAAGAGGGTGCGGAGGTA-3'         (配列番号：１７)
L326FP  : 5'-TCCTCGCAGCCACCGGGCTGCA-3'               (配列番号：１８)
L326RP  : 5'-ACTTCCTGCCCTAGGAGCGTCGGTGGC-3'          (配列番号：１９)
commonFP: 5'-CGCTGACTAGGGCACATCTGACA-3'              (配列番号：２０)
commonRP: 5'-CGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAA-3'             (配列番号：２１)
塩基配列中、下線は変異を導入する部分を示す。
【００３８】
図４に示す系で、野生型ベクターを鋳型にしてＰＣＲを行い、変異が導入されたｈＲＸＲαＬＢＤの配列を得た。得られたＤＮＡ断片とベクターをＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで処理し、変異が導入されたｈＲＸＲαＬＢＤをベクターに挿入することで、３１６番目のアルギニンをアラニンに変異させたもの（Ｒ３１６Ａ）および３２６番目のロイシンをアラニンに変異させたもの（Ｌ３２６Ａ）を発現するベクターを構築した。３１６番目のアルギニンおよび３２６番目のロイシンの双方をアラニンに変異させたもの（Ｒ３１６Ａ／Ｌ３２６Ａ）を発現するベクターは、Ｒ３１６のベクターを鋳型としてＬ３２６ＦＰおよびＬ３２６ＲＰを用いてＰＣＲをすることにより構築した。
レポーター遺伝子としては、ＧＡＬ４の結合配列（ＵＡＳ）を４個並べた配列の下流に、遺伝子発現を制御するチミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターをつなげ、その下流にさらにルシフェラーゼ遺伝子をつないだもの（４ｘＵＡＳ−ｔｋ−Ｌｕｃ）を用いた（図５）。
【００３９】
（２）遺伝子導入
ヒト絨毛癌細胞であるＪＥＧ−３を、３．０×１０４細胞／ウェルとなるように２４ウェルプレート（Corning社）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した。
４ｘＵＡＳ−ｔｋ−Ｌｕｃレポーターベクター５０ｎｇ／ウェル、ＧＡＬ４ＤＢＤ／ｈＲＸＲαＬＢＤ融合タンパク発現ベクター２０ｎｇ／ウェル、内部標準に用いるウミシイタケフシフェラーゼ発現ベクターＰＧＬ４．７３（Promega社）０．５ｎｇ／ウェルとなるようにプラスミド混合溶液を調製し、リポフェクトアミン（lipofectamine）試薬（Invitrogen社）を用いて、細胞に遺伝子を導入した（図５）。
【００４０】
（３）転写活性の測定
ベクターをＪＥＧ−３細胞に導入してから２４時間後、９−ｃｉｓＲＡや有機スズ化合物などの各リガンドを培地に添加し、さらに２４時間培養を続けた（図５）。その後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、細胞を回収した。
その後、ルシフェラーゼ蛍光強度をMitras LB940（Berthold社）を用いて測定し、発光量比(fold induction)Ｘで表した。発光量比Ｘは、リガンド無添加のブランク試料の蛍光強度に対するリガンドを含む測定試料の蛍光強度の比を意味する。すなわち、発光量比Ｘが１であれば、そのリガンドはｈＲＸＲαの転写活性に影響しなかったことを意味し、発光量比Ｘが大きくなるほど、リガンドの転写活性に与える影響が大きいことを示す。
【００４１】
実施例２：ＲＸＲに対するリガンド作用を有する有機金属化合物の確認
すでに、有機スズ化合物がＲＸＲとコアクチベーターの相互作用を強力に促進することが分かっているので、ほ乳類動物細胞を用いたレポータージーンアッセイを用いて、有機金属化合物の構造が野生型ｈＲＸＲを介する転写活性に及ぼす影響を調べた。
【００４２】
（ａ）有機金属化合物における炭化水素基の影響
中心金属がスズであり、中心金属に３個の炭化水素基が配位し、前記炭化水素基が炭素数１〜４および８の脂肪族アルキル基、炭素数６のシクロアルキル基またはフェニル基であって、４番目の配位子として、Ｈ、ＯＨ、ＣｌまたはＢｒが中心金属に配位した有機金属化合物（図６）をリガンドとして用いて、ルシフェラーゼ蛍光強度を測定し、発光量比Ｘを求めることによって、ｈＲＸＲαの転写活性を調べた。対照として、９−ｃｉｓＲＡを用いた。測定結果を表２および図７に示す。
【００４３】
【表２】
2008044902.tif 000006
【００４４】
ＴＰｒＴＣｌ、ＴＢＴＣｌ、ＴＣｈＴＯＨおよびＴＰＴＯＨで処理した際に、発光量比が増大し、転写活性化が確認された。すなわち、これらの有機スズ化合物はＲＸＲリガンドとして作用することが確認された。
【００４５】
（ｂ）有機金属化合物における炭化水素基数の影響
中心金属がスズであり、中心金属に０〜４個のブチル基またはフェニル基が配位し、その他の配位子として、Ｃｌが中心金属に配位した有機金属化合物（図８）をリガンドとして用いて、ルシフェラーゼ蛍光強度を測定し、発光量比Ｘを求めることによって、ｈＲＸＲαの転写活性を調べた。対照として、９−ｃｉｓＲＡを用いた。測定結果を表３および図９に示す。
【００４６】
【表３】
2008044902.tif 000007
【００４７】
ＴＢＴＣｌ、ＴｅＢＴおよびＴＰＴＣｌで処理した際に、発光量比が増大し、転写活性化が確認された。すなわち、これらの有機スズ化合物はＲＸＲリガンドとして作用することが確認された。
【００４８】
（ｃ）有機金属化合物における炭化水素基の影響
中心金属がスズであり、中心金属に３個のブチル基またはフェニル基が配位し、４番目の配位子として、ブチル基、ビニル基、Ｈ、ＯＨ、ＣｌまたはＢｒが中心金属に配位した有機金属化合物（図１０）をリガンドとして用いて、ルシフェラーゼ蛍光強度を測定し、発光量比Ｘを求めることによって、ｈＲＸＲαの転写活性を調べた。対照として、９−ｃｉｓＲＡを用いた。測定結果を表４および図１１に示す。
【００４９】
【表４】
2008044902.tif 000008
【００５０】
４番目の配位基がＨ、Ｂｒ、Ｃｌ、ＯＨのようにかさが低い分子種であるＴＢＴＣｌ、ＴＢＴＢｒ、ＴＢＴＨ、ＴＰＴＣｌおよびＴＰＴＯＨで処理した際に、発光量比が増大し、転写活性化が確認された。すなわち、これらの有機スズ化合物はＲＸＲリガンドとして作用することが確認された。また、これらの有機スズ化合物において、ＲＸＲの転写活性化能に有意差は認められなかった。
【００５１】
（ｄ）有機金属化合物における置換基の影響
中心金属が周期表の第ＩＶ族またはＶ族に属する金属であり、中心金属に３個のブチル基またはフェニル基が配位した有機金属化合物（図１２）をリガンドとして用いて、ルシフェラーゼ蛍光強度を測定し、発光量比Ｘを求めることによって、ｈＲＸＲαの転写活性を調べた。対照として、９−ｃｉｓＲＡを用いた。測定結果は示さないが、中心金属がスズ以外の有機金属化合物は、ｈＲＸＲαの転写活性を増強しなかった。
【００５２】
（ｅ）結論
上記（ａ）から（ｄ）の結果から、式（ＩＩＩ）：
【００５３】
【化４】
2008044902.tif 000009
【００５４】
［式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、またはＲ；
Ｒは、炭素数３〜７の脂肪族アルキル基、シクロアルキル基、フェニル基またはビニル基；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、炭素数３〜７の脂肪族アルキル基、シクロアルキル基またはフェニル基である。］で表される有機スズ化合物が、ＲＸＲのリガンドとして作用することが明らかとなった。
【００５５】
比較例１：野生型ｈＲＸＲαの転写活性の評価
ＴＢＴＣｌおよびＴＰＴＯＨをリガンドとして用いて、ルシフェラーゼ蛍光強度を測定し、発光量比Ｘを求めることによって、野生型ｈＲＸＲαの転写活性を調べた。比較のため、９−ｃｉｓＲＡを用いた。測定結果を表５および図１３に示す。
【００５６】
【表５】
2008044902.tif 000010
【００５７】
有機スズ化合物（ＴＢＴＣｌおよびＴＰＴＯＨ）が野生型ｈＲＸＲαの転写活性を促進する効果は、９−ｃｉｓＲＡと同等であった。
【００５８】
比較例２：変異型ｈＲＸＲαの転写活性の評価（１）
ＴＢＴＣｌおよびＴＰＴＯＨをリガンドとして用いて、ルシフェラーゼ蛍光強度を測定し、発光量比Ｘを求めることによって、Ｒ３１６Ａの転写活性を調べた。比較のため、９−ｃｉｓＲＡを用いた。測定結果を表６および図１４に示す。
【００５９】
【表６】
2008044902.tif 000011
【００６０】
有機スズ化合物（ＴＢＴＣｌおよびＴＰＴＯＨ）がＲ３１６Ａの転写活性を促進する効果は、野生型のｈＲＸＲαに対する効果と同等であった。
一方、９−ｃｉｓＲＡがＲ３１６Ａの転写活性を促進する最低濃度は、野生型に対する最低濃度の約１００倍に上昇した。しかしながら、それよりも高い濃度領域において、９−ｃｉｓＲＡは依然として転写活性促進効果を示した。
したがって、Ｒ３１６Ａは有機スズ化合物に特異的な検出物質としては不十分である。
【００６１】
比較例３：変異型ｈＲＸＲαの転写活性の評価（２）
ＴＢＴＣｌおよびＴＰＴＯＨをリガンドとして用いて、ルシフェラーゼ蛍光強度を測定し、発光量比Ｘを求めることによって、Ｌ３２６Ａの転写活性を調べた。比較のため、９−ｃｉｓＲＡを用いた。測定結果を表７および図１５に示す。
【００６２】
【表７】
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【００６３】
有機スズ化合物（ＴＢＴＣｌおよびＴＰＴＯＨ）がＬ３２６Ａの転写活性を促進する最低濃度は、野生型に対する最低濃度の約１０倍に上昇した。しかしながら、それよりも高い濃度領域において、有機スズ化合物（ＴＢＴＣｌおよびＴＰＴＯＨ）がＬ３２６Ａの転写活性を促進する効果は、野生型のｈＲＸＲαに対する効果と同等であった。
一方、９−ｃｉｓＲＡがＬ３２６Ａの転写活性を促進する最低濃度は、野生型に対する最低濃度の約１００倍に上昇した。しかしながら、それよりも高い濃度領域において、９−ｃｉｓＲＡは依然として転写活性促進効果を示した。
したがって、Ｌ３２６Ａは有機スズ化合物に特異的な検出物質としては不十分である。
【００６４】
実施例３：変異型ｈＲＸＲαの転写活性の評価（３）
ＴＢＴＣｌおよびＴＰＴＯＨをリガンドとして用いて、ルシフェラーゼ蛍光強度を測定し、発光量比Ｘを求めることによって、Ｒ３１６Ａ／Ｌ３２６Ａの転写活性を調べた。比較のため、９−ｃｉｓＲＡを用いた。測定結果を表８および図１６に示す。
【００６５】
【表８】
2008044902.tif 000013
【００６６】
有機スズ化合物（ＴＢＴＣｌおよびＴＰＴＯＨ）がＲ３１６Ａ／Ｌ３２６Ａの転写活性を促進する最低濃度は、野生型に対する最低濃度の約１０倍に上昇した。しかしながら、それよりも高い濃度領域において、有機スズ化合物（ＴＢＴＣｌおよびＴＰＴＯＨ）がＲ３１６Ａ／Ｌ３２６Ａの転写活性を促進する効果は、野生型のｈＲＸＲαに対する効果と同等であった。
一方、９−ｃｉｓＲＡは、高濃度領域においても、Ｒ３１６Ａ／Ｌ３２６Ａの転写活性を促進しなかった。
したがって、Ｒ３１６Ａ／Ｌ３２６Ａは有機スズ化合物に特異的な検出物質として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ヒト由来の野生型ＲＸＲαのリガンド結合領域に９−ｃｉｓＲＡが結合した状態のＸ線構造。
【図２】ヒト、マウスおよびラット由来のＲＸＲサブタイプのリガンド結合領域のアミノ酸配列のアライメント。
【図３】ヒトおよびイボニシ由来のＲＸＲサブタイプのリガンド結合領域のアミノ酸配列のアライメント。
【図４】ベクター変異導入方法を説明する概略図。
【図５】レポーターアッセイ法の原理を説明する概略図。
【図６】種々の有機金属化合物の化学構造式。
【図７】ヒト由来の野生型ＲＸＲαの転写活性に対する種々の有機金属化合物の影響を比較するグラフ。
【図８】種々の有機金属化合物の化学構造式。
【図９】ヒト由来の野生型ＲＸＲαの転写活性に対する種々の有機金属化合物の影響を比較するグラフ。
【図１０】種々の有機金属化合物の化学構造式。
【図１１】ヒト由来の野生型ＲＸＲαの転写活性に対する種々の有機金属化合物の影響を比較するグラフ。
【図１２】種々の有機金属化合物の化学構造式。
【図１３】ヒト由来の野生型ＲＸＲαの転写活性に対する種々のリガンドの影響を比較するグラフ。
【図１４】比較例の変異型ＲＸＲαの転写活性に対する種々のリガンドの影響を比較するグラフ。
【図１５】比較例の変異型ＲＸＲαの転写活性に対する種々のリガンドの影響を比較するグラフ。
【図１６】本発明の変異型ＲＸＲαの転写活性に対する種々のリガンドの影響を比較するグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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