(57)【要約】【課題】腫瘍細胞に対する高い選択性を有しかつ副作用が小さい抗癌剤を実現する。【解決手段】極性溶媒を用いてヤナギの葉から抽出された抽出物を含む医薬組成物を用いて固形腫瘍を処置する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
極性溶媒を用いてヤナギの葉から抽出された抽出物を含有することを特徴とする固形腫瘍を処置するための医薬組成物。
【請求項２】
前記極性溶媒が水であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記固形腫瘍が膀胱癌、腎癌、皮膚扁平上皮癌、頭頚部癌、肺癌、消化管腫瘍、神経膠腫または中皮腫であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
経口投与形態であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
極性溶媒を用いてヤナギの葉から抽出された抽出物を被験体に投与する工程を包含する固形腫瘍を処置する方法。
【請求項６】
前記投与する工程が経口投与によることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
極性溶媒を用いてヤナギの葉から抽出された抽出物を得る工程を包含する、固形腫瘍を処置するための医薬を製造する方法。
【請求項８】
極性溶媒を用いてヤナギの葉から抽出された抽出物を含有することを特徴とする食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学療法に用いる抗癌剤に関するものであり、より詳細には、植物に含まれる物質を主成分とする抗癌剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、腫瘍に対する治療法としては、腫瘍の外科的な摘出；放射線により生物学的損傷を与える治療法；抗癌剤を用いた化学療法；抗腫瘍効果を発揮する物質などを発現するＤＮＡを組み込んだベクターを用いる遺伝子治療；弱毒化および／または改変したウイルスを接種し、選択的に腫瘍細胞を傷害する方法、などが知られている。
【０００３】
腫瘍に対する実際の治療では、これらを組み合わせて行われることが一般的であり、例えば、外科的摘出後に抗癌剤を用いるケース、放射線治療後に抗癌剤を用いるケースなどが挙げられる。
【０００４】
従来の化学合成により開発された抗癌剤は、「抗腫瘍効果が高い場合は副作用が大きくなり、副作用が小さい場合は抗腫瘍効果が低くなる」というものが一般的である。このように、化学合成された抗癌剤は副作用が大きいという欠点を有している。このため、このような欠点を有さない、腫瘍に対する治療薬の開発が望まれている。
【０００５】
近年、高い抗癌作用を有しかつ深刻な副作用を引き起こさない物質として、植物由来の天然成分が注目されている。例えば、ブドウ由来のＲｅｓｖｅｒａｔｒｏｌが、癌の発生、促進および進行をインビトロで阻害し、さらにマウスの乳房において腫瘍発生の前段階における病変の拡大と関与する細胞内でのプロセスを阻害することが報告されている（非特許文献２を参照のこと）。
【０００６】
ヤナギ（Ｓａｌｉｘ属ｓａｆｓａｆ種）は、種々の作用（例えば、抗菌活性、抗真菌活性、抗ウイルス活性、および抗寄生虫活性）を有する生理活性物質を含んでいる。近年、ヤナギの葉から水で抽出して得られた抽出物が、インビトロで白血病細胞を殺傷するという報告がなされている（非特許文献２を参照のこと）。特許文献２によれば、上記抽出物に含まれるサリシンが、白血病細胞を殺傷する効果の主成分である。
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：  ２１８−２２０  （１９９７）
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３６  （４）：  ３８７−３８９  （２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、非特許文献２に開示されていることは、白血病細胞という特定の細胞に対するサリシンの効果をインビトロで確認したにすぎない。高い抗癌作用を有しかつ副作用が小さい抗癌剤、特に固形腫瘍に対して効果を奏する抗癌剤の開発は進んでいない。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、固形腫瘍に対して高い抗癌作用を有しかつ副作用が小さい抗癌剤を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る医薬組成物は、固形腫瘍を処置するために、極性溶媒を用いてヤナギの葉から抽出された抽出物を含有することを特徴としている。
【００１０】
本発明に係る医薬組成物において、上記極性溶媒は水であることが好ましい。
【００１１】
本発明に係る医薬組成物において、上記固形腫瘍は膀胱癌、腎癌、皮膚扁平上皮癌、頭頚部癌、肺癌、消化管腫瘍、神経膠腫または中皮腫であることが好ましい。
【００１２】
本発明に係る医薬組成物は、経口投与形態であることが好ましい。
【００１３】
本発明に係る固形腫瘍を処置する方法は、極性溶媒を用いてヤナギの葉から抽出された抽出物を被験体に投与する工程を包含することを特徴としている。
【００１４】
本発明に係る固形腫瘍を処置する方法において、上記投与する工程は経口投与によることが好ましい。
【００１５】
本発明に係る固形腫瘍を処置するための医薬を製造する方法は、極性溶媒を用いてヤナギの葉から抽出された抽出物を得る工程を包含することを特徴としている。
【００１６】
本発明に係る食品組成物は、極性溶媒を用いてヤナギの葉から抽出された抽出物を含有することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明を用いれば、副作用を生じさせることなく患者の固形腫瘍を処置することができる。また、本発明を用いれば、固形腫瘍に対して高い抗癌作用を有しかつ副作用が小さい医薬を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
上述したように、非特許文献２には、白血病細胞という特定の細胞に対するサリシンの効果をインビトロで確認したことが開示されている。しかし、本発明者らは、このような開示からは容易に予想し得なかった事項、すなわち、ヤナギの葉から水で抽出して得られた抽出物が、白血病細胞とは全く関連性のない固形腫瘍に対してインビボで実際に抗腫瘍作用を奏することを見出して、本発明を完成するに至った。なお、植物由来の天然成分を用いた抗癌剤は、これまでに開発されていない。
【００１９】
本発明は、ヤナギ葉水抽出物を含有する医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、固形腫瘍を処置するために有効である。
【００２０】
本発明において使用されるヤナギとしては、Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ科に属する植物であれば特に限定されないが、Ｓａｌｉｘ属に属する植物が好ましく、ｓａｆｓａｆ種に属する植物が最も好ましい。ヤナギは、野生種のものであってもよいが、人工的に培養されたものが使用されてもよい。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「ヤナギ葉水抽出物」は「ヤナギの葉から極性溶媒を用いて抽出された抽出物」であることが意図され、「極性溶媒を用いて抽出してヤナギの葉から得られた抽出物」または「極性溶媒を用いてヤナギの葉から抽出された抽出物」と交換可能に使用される。極性溶媒としては、例えば、水、アルコール水溶液（例えば、メタノール、エタノール、プロパノールなど）が好ましく、ヤナギ葉水抽出物が医薬品、食品などに使用される観点から、熱水が最も好ましい。必要に応じて、超音波、攪拌機などを用いて抽出液を攪拌してもよい。
【００２２】
「腫瘍」は新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）としても知られ、新生物細胞を含む新生物（ｎｅｗ  ｇｒｏｗｔｈ）である。また「新生物細胞」は増殖疾患を有する細胞としても知られており、異常に高速に増殖する細胞が意図される。新生物は異常な組織成長物であり、概して別個の集団を形成し、それらは正常な組織成長物よりもより急速な細胞増殖により成長する。新生物は部分的または全体的に、正常組織との構造的な組織化、および／または機能的協調の欠陥を呈する。
【００２３】
腫瘍は良性（良性腫瘍）または悪性（悪性腫瘍または癌）であり得る。悪性腫瘍は、大きく３つの主要タイプに分類され得る。上皮構造から発生した悪性腫瘍は、癌腫と呼ばれる。筋肉、軟骨組織、脂肪、または骨のような結合組織由来の悪性腫瘍は肉腫と呼ばれ、免疫系成分を含む造血構造（血液細胞形成に関連する構造）に影響する悪性腫瘍は白血病またはリンパ腫と呼ばれる。他の新生物として、神経線維腫が挙げられるが、これに限定されない。
【００２４】
癌（腫瘍）には、白血病のように造血組織またはリンパ組織であっても、悪性化したあとは常時血液中を移動しながら増殖して、全身の造血組織およびその他の臓器に広がるもの、ならびに、白血病以外の多くの腫瘍のように特定の組織臓器に腫瘍塊として存在しているものとが存在する。本明細書中で使用される場合、用語「固形腫瘍」は、白血病以外の腫瘍が意図されるが、本発明に係る医薬組成物が適用され得る固形腫瘍としては、膀胱癌、腎癌、皮膚扁平上皮癌、頭頚部癌（例えば、扁平上皮細胞頭頚部癌）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、消化管腫瘍（例えば、食道腫瘍、胃癌、小腸腫瘍、および大腸腫瘍（例えば、結腸および縁部のポリープならびに肛門直腸癌））、神経膠腫、および中皮腫などが特に意図される。
【００２５】
「固形腫瘍を処置する」とは、固形腫瘍の成長（増殖）を抑制または阻止することが意図される。固形腫瘍を処理する方法を適用することにより、固形腫瘍が、この方法により処理されていない同一の腫瘍と比較して、低重量化または小型化することが意図される。腫瘍の成長（増殖）は、腫瘍の重量または大きさにおける正味の減少が生じる程度まで抑制されることが好ましい。
【００２６】
本発明に係る医薬組成物は、ヤナギ葉水抽出物以外に薬学的に受容可能な担体を含んでもよい。医薬組成物中に使用される薬学的に受容可能な担体は、医薬組成物の投与形態および剤型に応じて選択され得る。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、薬理学的に受容可能な担体としては、製剤素材として使用可能な各種有機または無機の担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、または崩壊剤、あるいは、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、または無痛化剤などとして配合される。
【００２８】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ-マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプン、結晶セルロースなどが挙げられ、滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
【００２９】
結合剤としては、例えば、α化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ-マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００３０】
崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
【００３１】
溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、トリカプリリンなどが挙げられる。
【００３２】
溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ-マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００３３】
懸濁剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、あるいは、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子が挙げられる。
【００３４】
等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ-マンニトールなどが挙げられる。
【００３５】
緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
【００３６】
無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
【００３７】
防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
【００３８】
抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００３９】
本発明に係る医薬組成物は、製薬分野における公知の方法により製造され得る。本発明に係る医薬組成物におけるヤナギ葉水抽出物の含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該医薬組成物を用いて後述の投与量範囲でヤナギ葉水抽出物を投与し得るような量であれば特に限定されない。
【００４０】
本実施形態に係る医薬組成物の形態は、血中にて高濃度をもたらし得る形態、すなわち、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射に適切な「注入可能な形態」であることが好ましいがこれらに限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含むが、徐放性であることが好ましい）、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口剤、あるいは、注射剤、坐剤、ペレット、点滴剤などの非経口剤であってもよい。本発明に係る医薬組成物は、毒性が低いので経口的または非経口的に投与され得る。用語「非経口」は、本明細書中で使用される場合、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【００４１】
本発明に係る医薬組成物が経口剤である場合、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが医薬用担体として利用される。また経口剤を調製する際、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合してもよい。
【００４２】
非経口剤である場合、本発明に係る医薬組成物は、当該分野において公知の方法に従って、本発明の有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解ないし懸濁させ、所望により殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製され得る。
【００４３】
本発明に係る医薬組成物は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与され得る。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内などに投与され得る。よって、本発明に係る医薬組成物は、流体であっても固体であってもよく、エアロゾルの形態で適用されてもよい。
【００４４】
本発明に係る医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一般には、製剤中に含有される有効成分の投与量で、好ましくは成人１日当り０．１〜２０００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。また、本発明に係る医薬組成物はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【００４５】
一実施形態において、本発明に係る医薬組成物に使用され得る薬学的に受容可能な賦形剤は、一般に、組成物の重量の５％〜９９．９％、好ましくは２５％〜８０％を構成し、そして、他の補助剤の不存在においては、組成物の残余部分を構成する。好ましくは、賦形剤の重量の少なくとも８０重量％が水である。好ましくは、水が、新規組成物の少なくとも５０重量％、最も好ましくは６０〜８０重量％を構成する。
【００４６】
このように、本発明に係る医薬組成物がヤナギ葉水抽出物を含んでいればよく、経口投与に好ましい形態をしていればより好ましいといえることを、当業者は容易に理解する。
【００４７】
なお、被験体に投与する工程を包含する固形腫瘍を処置する方法、および、極性溶媒を用いてヤナギの葉から抽出された抽出物を得る工程を包含する、固形腫瘍を処置するための医薬を製造する方法もまた、本発明の範囲内であることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。これらの方法におけるヤナギの葉から抽出された抽出物については、医薬組成物に関するものと同様である。
【００４８】
（２−２）食用組成物
本発明は、ヤナギ葉水抽出物を含有、添加および／または希釈してなる食用組成物（すなわち、食品、飲料または飼料）を提供する。本発明に係る食用組成物は、ヤナギ葉水抽出物の有する生理作用に起因して極めて有用である。
【００４９】
本発明において、「含有」とは、食用組成物（すなわち、食品、飲料、または飼料）中にヤナギ葉水抽出物が含まれるという態様を、「添加」とは、食用組成物の原料に、ヤナギ葉水抽出物を添加するという態様を、「希釈」とはヤナギ葉水抽出物を、食用組成物の原料で希釈するという態様をいう。
【００５０】
本発明に係る食用組成物の製造法は特に限定されるものではなく、調理、加工および一般に用いられている食品または飲料の製造法による製造を挙げることができ、製造された食品または飲料に本発明に係るヤナギ葉水抽出物が含有、添加および／または希釈されていればよい。
【００５１】
本発明に係る食用組成物としては特に限定はないが、菓子類（例えば、チューインガム、キャンディー、ゼリー、ビスケット、チョコレート、米菓）、乳製品（例えば、ヨーグルト）、健康食品（例えば、カプセル、タブレット、粉末）、飲料（例えば、清涼飲料、乳飲料、野菜・果汁飲料、茶）、ドリンク剤などが挙げられるがこれらに限定されない。菓子類は、携行利便性の観点から好ましく、乳製品は、菓子類と比較すると1回当たりの摂取量が多く、毎日摂取しやすいという観点からより好ましい。
【００５２】
本発明に係る食用組成物（食品、飲料または飼料）としては、ヤナギ葉水抽出物が含有、添加および／または希釈されており、その生理作用を発現させるための有効量が含有されていれば特にその形状に限定はなく、タブレット状、顆粒状、カプセル状などの経口的に摂取可能な形状物も包含する。
【００５３】
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。
【実施例】
【００５４】
〔実施例１：ヤナギ葉水抽出物の抗腫瘍作用〕
エジプトのギザにあるカイロ大学農学部のヤナギの農場（ｔｈｅ  Ｓａｌｉｘ  ｆａｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ,  Ｃａｉｒｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｇｉｚａ，  Ｅｇｙｐｔ）で収穫した若いヤナギの葉を実験に供した。以下に従って熱水抽出を行った：ヤナギの葉１０ｇを１００ｍｌの蒸留水に浸潤し、２０分間煮沸して成分を抽出した；抽出液を滅菌したＭｉｒａｃｌｏｔｈに通し、濾液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。
【００５５】
カイロ大学国立がん研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｃａｉｒｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に承認された白血病患者（１８〜６５歳）、およびＥＡＣＣ（Ｅｈｒｌｉｃｈ  Ａｓｉｔｅｓ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ：エーリッヒ腹水癌細胞）を移植された動物に対して、本研究を行った。抗癌剤の種々の実験モデルに適応され得るマウスＥＡＣＣは、急速に成長する優れた腫瘍モデルとしてよく用いられている。
【００５６】
健常ボランティア（６サンプル）、ならびにＡＬＬ（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（７サンプル）、およびＡＭＬ（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ，  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）（１５サンプル）を、必要に応じて、末梢血および骨髄の検査、細胞化学、ならびに免疫学的マーカーにより診断した。
【００５７】
健常ボランティアおよび患者からのサンプルを、Ｆｉｃｏｌｌ  ｈｙｐａｑｕｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）に従って行う単核細胞分離に供した。次いで、これらの細胞をＰＢＳで３回洗浄し、細胞数を１０５細胞／０．１ｍｌに調整した（成熟細胞および未成熟細胞の両方）。培養培地を、１．２ｇ／ｌの炭酸ナトリウムとＬ−グルタミン(Ｇｉｂｃｏ，  Ｇｒａｎｄ  ｉｓｌａｎｄ，  ＵＳＡ)、１０％非働化ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｒｌｅｓ−ｓａｌｔを用いて調製した。次いで、この培地を０．２２μｍ孔のミリポアフィルターを通して濾過し、その１ｍｌを１．８ｍｌのスクリューキャップ式滅菌済プラスティックチューブに移した。次に、１０５個の細胞が含まれている細胞懸濁液０．１ｍｌを５つのチューブに加えた。これらのチューブの内の３つに対して、ヤナギ抽出物０．１ｍｌを加え、一方、他の２本のチューブを陰性コントロールおよび陽性コントロールとして用いた。陰性コントロールのために、ヤナギ抽出物の代わりに培養培地を用いた。陽性コントロールとして、健常ボランティアからの細胞にヤナギ抽出物を加えた。これらのチューブを、５％ＣＯ２存在下にて３７℃で２４時間インキュベートした。ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｔｅｓｔ  （Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７６）を用いて、これらの細胞の生存率について試験した。２００個の細胞を計数し、次いで、生存細胞の百分率を見積もった。ＥＡＣＣの生存率に対しても上記プロトコルを行った。
【００５８】
種々の細胞の生存率および死亡率を調べた結果を図１〜３に示す。縦軸は生存および死亡率を示し、横軸は検体の番号を示している。図中に用いられている記号は右端の枠内の記述に順ずる。
【００５９】
図１に示すように、ＡＬＬ細胞を、２４時間培養したときの生存率の平均は９２．９％であるのに対し、ＡＬＬ細胞とヤナギ葉水抽出物を混合し、２４時間培養したときの生存率の平均は２２．９％であった。よって、ヤナギ葉水抽出物を加えた場合、ＡＬＬ細胞の生存率は有為に低下することが明らかになった。
【００６０】
図２に示すように、ＡＭＬ細胞を、２４時間培養したときの生存率の平均は９６．１％であるのに対し、ＡＭＬ細胞とヤナギ葉水抽出物物を混合し、２４時間培養したときの生存率の平均は２６．２％であった。よって、ヤナギ葉水抽出物を加えた場合、ＡＭＬ細胞の生存率は有為に低下することが明らかになった。
【００６１】
図３に示すように、２４時間培養したときの生存率の平均は９８．０％であるのに対し、ＥＡＣＣ細胞とヤナギ葉水抽出物を混合し、２４時間培養したときの生存率の平均は２２．０％であった。よって、ヤナギ葉水抽出物を加えた場合、ＥＡＣＣの生存率は有為に低下することが明らかになった。なお、図には示していないが、正常細胞を、２４時間培養したときの生存率の平均は９２．２％および９３．３％であるのに対し、正常細胞とヤナギ葉水抽出物を混合し、２４時間培養したときの生存率の平均は９６．９％であった。ヤナギ葉水抽出物を加えた場合であっても正常細胞の生存率は、有為な差はなかった。
【００６２】
これらの結果より、ヤナギ葉水抽出物は、殺腫瘍効果を有しており、かつ癌細胞に対する選択性を有していることがわかった。
【００６３】
〔実施例２：種々の抽出物の抗腫瘍作用〕
実施例１に記載した若いヤナギの葉を用いて以下に従って溶媒抽出を行った：４０〜６０℃の石油エーテル、ジエチルエーテル、クロロフォルム、アセトン、最後に７０％エタノールを連続的に用いて、ヤナギの葉８０ｇの葉を、室温で抽出した；各抽出物中の溶媒を、低温での蒸留により除去し、各クラスの植物粗抽出物を分離した。
【００６４】
一連の溶媒抽出による種々の葉抽出物（Ｓａｌｉｘ  ｓａｆｓａｆ）を、ＡＭＬ細胞およびＡＬＬに対する抗白血病効果について調べた。各粗抽出物の画分を、溶媒の除去後に生理食塩水中に溶解した。次いで、各画分を白血病細胞と培養した。その結果、無極性溶媒（石油エーテル、エーテル、およびクロロフォルム）ではそれぞれ９０、８３および８０という高い生存率を示し、これらを用いて抽出したヤナギ葉の画分は、腫瘍細胞に対する破壊効果が非常に低いことを示した。各抽出物の破壊は各抽出物のうちの１．５〜２．９％の範囲であった。しかし、極性溶媒（水および７０％エタノール）の画分において、ＡＭＬ細胞、ＡＬＬ細胞、およびＥＡＣＣに対して大きな破壊効果が得られた。
【００６５】
ヤナギ葉の水抽出物とインキュベートした後の腫瘍細胞（ＥＡＣＣ）の生存率は、未処理の細胞（２％の細胞死）と比較して非常に影響を受けた（８０％の細胞死）。この観察から、ヤナギ葉の抗腫瘍活性は、水および／またはエタノールに可溶性の化合物に起因するものがほとんどであったということ、ならびに、これらの活性成分は容易に熱水に溶解したので、天然の抗癌剤として用いることができるということがわかった。
【００６６】
〔実施例３：固形腫瘍に対するヤナギ葉水抽出物の抗腫瘍作用〕
正常な雄のＳｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏマウス３６匹（体重２０〜２５ｇ）を以下のように用いた：通常の食餌を与えた第１グループを、コントロール（陰性）として使用した；通常の食餌を与えた第２グループでは、２×１０６ｃｅｌｌｓ（０．２ｍｌ）の濃度でＥＡＣＣを各マウスの腹腔内に移植した（陽性コントロール）；通常の食餌を与えかつＥＡＣＣを接種された第３グループでは、各マウスに、ヤナギの水抽出物０．２ｍｌ（７％）を胃管によって毎日経口投与した；第４グループでは、ヤナギの抽出物０．６ｍｌを毎日与えた。ヤナギの水抽出物を給餌しながら毒性実験を行い、そして被験体正常コントロールおよび移植された動物の血液サンプル中のｇｌｕｔａｍｉｃ  ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ  （ＧＯＴ）、ｇｌｕａｍｉｃ  ｐｙｒｕｖｉｃ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ  （ＧＰＴ）、ｂｌｏｏｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  （ＢＧ）、およびａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  （ＡＰ）を試験した。
【００６７】
結果を図４に示す。縦軸は、マウスの生存個体数を示しており、１週間ごとに色分けされている。色分けの詳細は、図の左上に示した通りである。横軸は、マウスに対して行った処置の種類を示す。
【００６８】
ＥＡＣＣを移植されていないＮｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ群（第１グループ）は、５週間後まですべてが生存した。ＥＡＣＣを移植し、通常の食餌を与えたＥＡＣＣ  ｃｏｎｔｒｏｌ群（第２グループ）では、２週間後まで３匹が生存し、３週間後まで生存していたマウスはいなかった。ＥＡＣＣを移植し、通常の食餌を与え、毎日０．２ｍｌのヤナギ葉水抽出物を経口摂取させた群（第３グループ）は、ＥＡＣＣ  ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して、生存日数が延長しており、４匹が５週間後まで生存していた。ＥＡＣＣを移植し、通常の食餌を与え、毎日０．６ｍｌのヤナギ葉水抽出物を経口摂取させた群（第４グループ）は、６匹が５週間後まで生存しており、さらに生存個体数が増加していた。すなわち、２週間以内に死んでしまう未処置の腫瘍移植マウスと比較して、ヤナギの葉の水抽出物は腫瘍を移植されたマウスの死を遅らせ、腫瘍の成長を阻害した。
【００６９】
ヤナギ葉水抽出物を経口摂取させたとき、マウスの正常な細胞が損傷を受けるのかどうかについて調べた（結果は示さず）。ヤナギ葉水抽出物を経口投与しても、マウスの正常な細胞は損傷を受けていなかった。特に、血中のグルコース、ＧＯＴ、ＧＰＴ、およびアルカリヌクレアーゼ活性は変化が見られなかった。よって、ヤナギ葉水抽出物は、家庭薬として実用的であることがわかった。
【００７０】
これらの結果から、ヤナギ葉水抽出物は、正常な細胞に対する有害性を有することなく、癌細胞を移植した個体の生存日数を延長させる効果を有することが示された。
【００７１】
〔実施例４：ヤナギ葉水抽出物が有する白血病細胞傷害効果の機序〕
ＤＮＡを、ヤナギ抽出物の処置前および後の成熟白血球（正常細胞）および未成熟白血球（白血病細胞）から抽出し、１％のアガロースゲル電気泳動で分離してＤＮＡ断片化を測定した。
【００７２】
細胞から抽出したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分離した結果を図５に示す。図５に示すように、ヤナギ葉水抽出物と混合培養していない白血病細胞のＤＮＡは１本のバンドとして検出されているが、ヤナギ葉水抽出物と混合培養した白血病細胞のＤＮＡは、帯状に検出された。左図は、白血病細胞のＤＮＡが、ヤナギ葉水抽出物との混合培養により変化するか否かを示したものである。ヤナギ葉水抽出物により白血病細胞のＤＮＡが損傷を受け、断片化していることが示された。右図は、正常細胞でも白血病細胞で見られた、ＤＮＡの断片化が起こっているのかを見たものである。正常細胞はヤナギ葉水抽出物と混合培養しても、ＤＮＡが損傷を受けないことが明らかになった。
【００７３】
このように、ヤナギ葉水抽出物と培養した白血病細胞では、ＤＮＡが大きく損傷を受けていたが、ヤナギ葉水抽出物と培養した正常細胞の場合、ＤＮＡは影響を受けていなかった。これらの結果より、ヤナギ葉水抽出物は選択的な殺腫瘍効果を有していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明を用いれば、固形腫瘍に対して高い抗癌作用を有しかつ副作用が小さい医薬を提供することができるので、医薬分野の発展に大いに寄与することができる。また、本発明を用いれば、副作用を生じさせることなく患者の固形腫瘍を処置することができるので、医学の発展に大いに寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、ＡＬＬ細胞の生存率に関するヤナギ若葉抽出物の効果を示すグラフである。
【図２】図２は、ＡＭＬ細胞の生存率に関するヤナギ若葉抽出物の効果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＥＡＣＣの生存率に関するヤナギ若葉抽出物の効果を示すグラフである。
【図４】図４は、ＥＡＣＣ移植動物の生存に関するヤナギ水抽出物の効果を示すグラフである。
【図５】図５は、白血病患者における未成熟白血球のＤＮＡに関するヤナギ水抽出物の効果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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