(57)【要約】【課題】神経細胞内におけるMOCAの機能を解明し、この知見に基づいて、新規医薬組成物及び新規治療薬のスクリーニング方法等を提供する。【解決手段】本発明の医薬組成物は、MOCA（Modifier of cell adhesion protein）、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を有効成分として含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
MOCA、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項２】
緑内障を予防及び／又は治療するための請求項１記載の組成物。
【請求項３】
網膜虚血性疾患を予防及び／又は治療するための請求項１記載の組成物。
【請求項４】
アルツハイマー病を予防及び／又は治療するための請求項１記載の組成物。
【請求項５】
MOCA、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を含有することを特徴とする、神経細胞の軸索伸長剤。
【請求項６】
神経細胞が網膜神経節細胞又は海馬神経細胞である、請求項５記載の伸長剤。
【請求項７】
MOCA、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を含有することを特徴とする、神経細胞のストレス耐性付与剤。
【請求項８】
神経細胞が網膜神経節細胞又は海馬神経細胞である、請求項７記載の付与剤。
【請求項９】
神経細胞にMOCA遺伝子を導入する、あるいはMOCA、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を接触させることを特徴とする、神経細胞の軸索伸長方法。
【請求項１０】
神経細胞にMOCA遺伝子を導入する、あるいはMOCA、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を接触させることを特徴とする、神経細胞のストレス耐性付与方法。
【請求項１１】
神経細胞が網膜神経節細胞又は海馬神経細胞である、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
神経細胞に候補物質を接触させて及び／又は導入して培養し、接触後の当該細胞の軸索伸長変化を測定し、得られる測定結果を指標として神経細胞の軸索伸長作用を有する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
神経細胞に候補物質を接触させて及び／又は導入して培養し、培養後の当該細胞にストレスを付加し、付加後に培地中のLDHを検出し、得られる検出結果を指標として神経細胞にストレス耐性を付与する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１４】
ストレスが酸化ストレスである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
神経細胞が、MOCA遺伝子を破壊した又は発現抑制した形質転換細胞である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
神経細胞が網膜神経節細胞又は海馬神経細胞である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞の軸索伸長方法及びストレス耐性付与方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Modifier of cell adhesion protein（以下、MOCAという）は、アルツハイマー病の原因遺伝子産物であるプレセニリンに結合する新規タンパク質として、酵母ツーハイブリッドシステムにより発見された。その後の研究により、MOCAが、アルツハイマー病の原因遺伝子産物であるアミロイド前駆体タンパク質（以下、APPという）の分解を促進すること（非特許文献１）、アルツハイマー病患者脳では可溶性画分のMOCAが減少していること（非特許文献２）、及び培養神経細胞内で不溶性のタンパク質凝集体（aggresome）を形成すること（非特許文献３）などが明らかとなり、MOCAがアルツハイマー病患者の脳内における凝集体形成に関与する可能性が示唆された。実際に、アルツハイマー病に特有な病理像である神経原繊維変化には、MOCA凝集体の沈着が認められている（非特許文献４）。こうしたMOCA凝集体の形成は、MOCA本来の機能を喪失させ、APP代謝に影響を及ぼすと考えられるため、アルツハイマー病発症の一因となる可能性が推測されている。
【０００３】
このような技術背景から、MOCAが神経細胞内においてどのような機能を有するものであるかについて、詳細な解明が切望されている。
ところで、上述のごとく、MOCAの細胞内での機能については不明点が多いが、近年、MOCAが細胞の神経様突起の成長に関与することが示された（非特許文献５）。しかしながら、当該文献に記載の知見は、褐色細胞腫由来細胞株（PC12細胞株）に関するものであり、神経細胞に関するものではない。
【０００４】
【非特許文献１】Chen Q, et al., A novel mechanism for the regulation of amyloid precursor protein metabolism., J. Cell Biol., 158:79-89, 2002
【非特許文献２】Kashiwa A, et al., Isolation and characterization of novel presenilin binding protein., J. Neurochem., 75:109-16, 2000
【非特許文献３】Namekata K, et al., Presenilin-binding protein forms aggresomes in monkey kidney COS-7 cells., J. Neurochem., 82:819-27, 2002
【非特許文献４】Chen Q, et al., Presenilin binding protein is associated with neurofibrillary alterations in Alzheimer's disease and stimulates tau phosphorylation., Am. J. Pathol., 159:1597-602, 2001
【非特許文献５】Chen Q, et al., Modifier of cell adhesion regulates N-cadherin-mediated cell-cell adhesion and neurite outgrowth., J. Neurosci., 25:281-90, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、神経細胞内におけるMOCAの機能を解明し、この知見に基づいて、新規医薬組成物及び新規治療薬のスクリーニング方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、MOCAが、神経細胞の軸索伸長作用を有すること、及び神経細胞に対してストレス耐性を付与する（つまり細胞保護作用を有する）ことを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1) MOCA、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を有効成分として含有する医薬組成物。
上記(1)記載の医薬組成物としては、例えば、緑内障を予防及び／又は治療するための組成物、網膜虚血性疾患を予防及び／又は治療するための組成物、並びにアルツハイマー病を予防及び／又は治療するための組成物が挙げられる。
(2) MOCA、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を含有することを特徴とする、神経細胞の軸索伸長剤。
上記(2)記載の軸索伸長剤としては、例えば、神経細胞が網膜神経節細胞又は海馬神経細胞であるものが挙げられる。
【０００８】
(3) MOCA、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を含有することを特徴とする、神経細胞のストレス耐性付与剤。
上記(3)記載のストレス耐性付与剤としては、例えば、神経細胞が網膜神経節細胞又は海馬神経細胞であるものが挙げられる。
(4) 神経細胞にMOCA遺伝子を導入する、あるいはMOCA、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を接触させることを特徴とする、神経細胞の軸索伸長方法。
【０００９】
(5) 神経細胞にMOCA遺伝子を導入する、あるいはMOCA、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を接触させることを特徴とする、神経細胞のストレス耐性付与方法。
上記(4)又は(5)記載の方法としては、例えば、神経細胞が網膜神経節細胞又は海馬神経細胞である方法が挙げられる。
(6) 神経細胞に候補物質を接触させて及び／又は導入して培養し、接触後の当該細胞の軸索伸長変化を測定し、得られる測定結果を指標として神経細胞の軸索伸長作用を有する物質をスクリーニングする方法。
【００１０】
(7) 神経細胞に候補物質を接触させて及び／又は導入して培養し、培養後の当該細胞にストレスを付加し、付加後に培地中のLDHを検出し、得られる検出結果を指標として神経細胞にストレス耐性を付与する物質をスクリーニングする方法。
上記(6)又は(7)記載の方法としては、例えば、神経細胞が、MOCA遺伝子を破壊した又は発現抑制した形質転換細胞である方法が挙げられ、また、神経細胞が網膜神経節細胞又は海馬神経細胞である方法が挙げられる。さらに上記(7)記載の方法としては、例えば、ストレスが酸化ストレスである方法が挙げられる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、神経細胞の軸索伸長及びストレス耐性付与に優れた効果を発揮し得る医薬組成物を提供することができる。また、本発明によれば、神経細胞の軸索伸長方法及びストレス耐性付与方法、並びに、神経細胞の軸索伸長作用を有する物質のスクリーニング方法及び神経細胞にストレス耐性を付与する物質のスクリーニング方法を提供することができる。
【００１２】
本発明は、各種神経細胞障害に関わる疾患の予防及び／又は治療において有用なものである。なかでも特に、緑内障（特に正常眼圧緑内障）及び網膜虚血性疾患等の網膜神経節細胞の障害に関わる疾患の予防及び／又は治療、並びに、アルツハイマー病等の海馬神経細胞の障害に関わる疾患の予防及び／又は治療において極めて有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
【００１４】
１．本発明の概要
MOCA（modifier of cell adhesion protein）の細胞内での機能、特に神経細胞内での機能については、詳細は不明であった。これに対し、本発明者は、MOCAが、神経細胞に特異的に発現すること及びRhoファミリー低分子量Gタンパク質であるRac1を活性化することを明らかにした。
Rac1は細胞膜上に存在し、アクチン繊維の再構成を介して神経軸索伸長やシナプス形成などに必須の機能を持つことが知られている。本発明者は、MOCAが、神経細胞内でも特に神経軸索先端の成長円錐に局在することを初めて明らかにした。この局在性から、MOCAは、Rac1の活性化を制御することにより神経細胞の形態形成に関与している可能性が高いと推測できる。また本発明者は、MOCAの細胞内動態についての検討も行った。MOCAは通常細胞質内においてElmoと呼ばれるタンパク質と結合することによって安定化し、分解されにくいタンパク質となっている。このようなMOCA-Elmoの複合体は、通常細胞膜上に存在し、神経突起伸長を促進する因子であるRhoGも結合していることから、このMOCA-Elmo-RhoGの三量体形成がRac1活性化を制御することを見出した。このように、Rac1の活性化を直接的に制御するMOCAは、神経細胞の軸索伸長のメカニズムにおいて重要な働きを担うものである。
【００１５】
また本発明者は、MOCAが、網膜では、緑内障（正常眼圧緑内障など）及び網膜虚血性疾患、並びに老化及びフリーラジカル等により障害を受けやすい、網膜神経節細胞に顕著に発現していることを初めて見出した。さらに、MOCAは、上述した軸索伸張作用に加え、神経細胞の保護作用を有することも確認した。
以上の知見から、MOCA及びそのシグナル伝達に関わる分子等を標的にすることにより、特に緑内障を標的とした神経再生及び神経保護を目的とする新たな創薬及び治療法の開発が可能となる。このような新しいアプローチによる緑内障等への治療技術は、超高齢化社会への移行が危惧される現在又は将来において、極めて有用なものである。例えば、日本においては、正常眼圧緑内障は緑内障患者の90％を占めるとの報告もあり、本発明は、その社会的ニーズにおいても極めて重要度及び緊急性が高いものである。
【００１６】
２．医薬組成物
MOCAは、前述したように、各種神経細胞の軸索伸長及びストレス耐性付与に優れた効果を発揮し得るものである。そのため、各種神経細胞障害の予防及び／又は治療薬の含有成分として用いることができる。すなわち、本発明は、MOCAを有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物に関する。
本発明の医薬組成物は、具体的には、緑内障（特に正常眼圧緑内障）及び網膜虚血性疾患等の網膜神経節細胞の障害に関わる疾患の予防及び／又は治療、並びに、アルツハイマー病等の海馬神経細胞の障害に関わる疾患の予防及び／又は治療に使用するためのものが好ましく挙げられる。
本発明の医薬組成物の有効成分であるMOCAは、必要に応じ、薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物の状態で用いることができる。また、MOCAは、治療剤としての保存安定性（特に活性維持）を考慮して適当な化学的修飾がなされた状態で用いられてもよく、限定はされない。
【００１７】
薬理学的に許容し得る塩としては、限定はされないが、例えば、ハロゲン化水素酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、及びヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（例えば、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、及び重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩（例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、及びクエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えば、メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、及びカンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えば、アスパラギン酸塩、及びグルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、及びカリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム塩、及びカルシウム塩など）、有機アミン塩（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、アルギニン及びリジンなどの有機塩基との塩）、アンモニウム塩などが好ましく挙げられ、なかでも塩酸塩が特に好ましい。
【００１８】
本発明の医薬組成物において、有効成分であるMOCA、若しくはその塩、又はそれらの水和物の含有割合は、限定はされず、適宜設定することができるが、例えば、組成物全体に対し、90.0重量％以上であることが好ましく、より好ましくは99.0重量％以上、さらに好ましくは99.9重量％以上である。また、有効成分であるMOCA、若しくはその塩、又はそれらの水和物は、より高純度に精製されたものであることが好ましく、限定はされないが、例えば、90.0％以上の純度が好ましく、より好ましくは99.0％以上、さらに好ましくは99.9％以上である。
本発明の医薬組成物は、MOCA、若しくはその塩、又はそれらの水和物以外に他の成分を含むことができる。他の成分としては、当該組成物の用法（使用形態）に応じて必要とされる製薬上の各種成分（薬学的に許容し得る各種担体等）が挙げられる。他の成分は、MOCA、若しくはその塩、又はそれらの水和物により発揮される効果が損なわれない範囲で適宜含有することができる。
【００１９】
本発明の医薬組成物は、ヒト又は非ヒト哺乳動物に対し、種々の投与経路で投与することができるが、通常、非経口（例えば静脈注射など）で投与することができる。有効成分として用いるMOCA、若しくはその塩、又はそれらの水和物は、単独で用いることも可能であるが、投与経路に応じて慣用される方法により薬学的に許容し得る担体を用いて適当な剤形に製剤化することができる。
好ましい剤形としては、例えば、注射剤（点滴剤を含む）及びリポソーム剤等が好ましく挙げられる。これら製剤の製剤化に用い得る担体としては、通常用いられる賦形剤、その塩又はそれらの水和物のほか、必要に応じ、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、及び無痛化剤等が挙げられ、医薬品製剤の原料として用いることができる公知の成分を配合して常法により製剤化することが可能である。
上記公知の成分として使用可能な無毒性のものとしては、例えば、大豆油及び牛脂等の動植物油；流動パラフィン等の炭化水素；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の界面活性剤；ポリエチレングリコール等の水溶性高分子；エタノール及びグリセリン等の低級又は多価アルコール；グルコース等の糖；塩化ナトリウム等の無機塩；精製水等が挙げられ、いずれもその塩またはその水和物であってもよい。
【００２０】
本発明の医薬組成物を非経口投与（例えば注射投与）する場合、その有効な投与量は、例えば、症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態、塩の種類、及び疾患の具体的な種類等に応じて異なり、限定はされないが、例えば、成人の場合は体重60kgの人で１日あたり、100μg〜1,000mg、好ましくは1,000μg〜1,000mgを、それぞれ１回で又は複数回に分けて投与することができる。なお、投与経路の違いにより治療等の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動し得ることが予測される。そのため、実際に用いられる投与法は、本明細書に記載の好ましい投与法から逸脱することがあってもよい。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的かつ経験的な最適化手順を用いて適宜調整することができる。
なお本発明は、医薬組成物、例えば、緑内障（特に正常眼圧緑内障）及び網膜虚血性疾患等の網膜神経節細胞の障害に関わる疾患の予防及び／又は治療用の医薬組成物、あるいはアルツハイマー病等の海馬神経細胞の障害に関わる疾患の予防及び／又は治療用の医薬組成物の製造のための、MOCA、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物の使用をも含むものである。
【００２１】
また本発明は、MOCA、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物の有効量を患者に投与することを特徴とする、緑内障（特に正常眼圧緑内障）及び網膜虚血性疾患等の網膜神経節細胞の障害に関わる疾患の予防及び／又は治療方法、並びに、アルツハイマー病等の海馬神経細胞の障害に関わる疾患の予防及び／又は治療方法をも含むものである。
【００２２】
３．神経細胞の軸索伸長方法及びストレス耐性付与方法
本発明においては、MOCAが神経細胞の軸索伸長及びストレス耐性付与に優れた効果を発揮し得ることに基づいて、神経細胞の軸索を伸長する方法、及びストレス耐性を付与する方法を提供することができる。
すなわち、本発明の神経細胞の軸索伸長方法、及びストレス耐性付与方法は、神経細胞にMOCA遺伝子を導入する、あるいは、神経細胞にMOCA、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を接触させることを特徴とする方法である。
本方法において、対象となる神経細胞は、ヒト及び非ヒト神経細胞のいずれであってもよい。また、神経細胞の種類は、限定はされないが、例えば、網膜神経節細胞等の視神経細胞、並びに、海馬、扁桃体、大脳皮質、嗅球、線条体、脳幹、小脳又は脊髄由来の神経細胞が好ましく、なかでも網膜神経節細胞及び海馬神経細胞がより好ましい。
【００２３】
本方法において、神経細胞へのMOCA遺伝子の導入は、公知の遺伝子組換え技術や遺伝子導入方法を用いて、in vitro及びin vivoのいずれで行ってもよく、限定はされない。なお、MOCAをコードする塩基配列（配列番号１）の情報は、例えばNCBIのウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）に「Accession number：NM_004947」（GenBankではDock3として登録）として公表されている。本方法は、神経細胞にMOCA遺伝子を導入する工程以外に、必要に応じ、任意の他の工程を含むことができる。
また本方法において、神経細胞に接触させるMOCA、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物は、前記２.の医薬組成物の項において説明したものと同様のものが使用できる。当該接触は、例えば、in vitroの場合は細胞培養液にMOCA等を添加することにより、in vivoの場合はMOCA等を前記２.の医薬組成物と同様の形態で投与することにより行うことができるが、これらに限定はされず、公知の方法及び手段を適宜採用して行うことができる。本方法は、MOCA等を神経細胞に接触させる工程以外に、必要に応じ、任意の他の工程を含むことができる。
【００２４】
なお本発明は、上記本方法に使用し得る神経細胞の軸索伸長剤及びストレス耐性付与剤をも含むものである。すなわち、本発明は、MOCA、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を含有することを特徴とする、神経細胞の軸索伸長剤並びにストレス耐性付与剤を含むものである。
【００２５】
４．軸索伸長作用を有する物質のスクリーニング方法
本発明は、前述したように、神経細胞の軸索伸長作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供するものである。具体的には、本スクリーニング方法は、神経細胞に候補物質を接触させ及び／又は導入して培養し（接触／導入工程）、接触後の当該細胞の軸索伸長変化を測定し（測定工程）、得られる測定結果を指標として神経細胞の軸索伸長作用を有する物質をスクリーニングするというものである。
【００２６】
接触／導入工程において使用し得る神経細胞は、ヒト及び非ヒト神経細胞のいずれであってもよい。また、神経細胞の種類は、限定はされないが、例えば、網膜神経節細胞等の視神経細胞、並びに、海馬、扁桃体、大脳皮質、嗅球、線条体、脳幹、小脳又は脊髄由来の神経細胞が好ましく、なかでも網膜神経節細胞及び海馬神経細胞がより好ましい。
さらに、使用する神経細胞としては、例えば、公知の遺伝子組換え技術によりMOCA遺伝子を破壊した形質転換細胞、又は、アンチセンス法及びRNAi法等によりMOCA遺伝子の発現を抑制した形質転換細胞であることが好ましい。このような形質転換細胞を用いれば、神経細胞の軸索伸長が候補物質に起因するものかどうか、すなわち候補物質が軸索伸長作用を有する物質であるかどうかをより明確に確認することができる。
【００２７】
接触／導入工程は、通常、in vitro培養系で行い、候補物質の種類に応じ、神経細胞に接触させ及び／又は導入する。上記接触させる場合は、候補物質を神経細胞の培養液中に添加することにより神経細胞に候補物質を接触させ、その後エンドソーム等によって神経細胞内部に候補物質を取り込ませることが好ましい。また上記導入する場合は、候補物質が後述する核酸等である場合に好適であり、公知の遺伝子組換え技術や遺伝子導入方法を用いて行うことができる。候補物質としては、例えば、天然又は人為的に合成された各種ペプチド、タンパク質（酵素又は抗体を含む）、核酸（ポリヌクレオチド(DNA, RNA)、オリゴヌクレオチド(siRNA等)、ペプチド核酸(PNA)など）、低分子又は高分子有機化合物等を使用することができるが、これらに限定はされない。
候補物質の接触及び／又は導入後は、それ以前と同様の培養条件で培養を継続することが好ましい。具体的な培養条件は、限定はされず、使用する神経細胞の種類等に応じて適宜設定することができる。
【００２８】
測定工程では、候補物質を接触させ及び／又は導入した神経細胞の軸索伸長変化を測定する。軸索伸長変化とは、候補物質の接触及び／又は導入時から測定時までの神経細胞軸索の長さの変化量を意味する。軸索伸長変化を測定するタイミングは、限定はされないが、例えば、候補物質の接触及び／又は導入時から24〜96時間後が好ましく、より好ましくは48〜96時間後である。
軸索伸長変化の測定は、例えば各種顕微鏡観察下における測定など、公知の測定方法により行うことができる。
【００２９】
本スクリーニング方法は、測定工程で得られた結果を指標として行う。具体的には、上述のように候補物質を接触させ及び／又は導入して培養した神経細胞と、候補物質の接触及び導入を行わずに同様に培養した神経細胞（コントロール）とについて、軸索伸長変化を比較し、前者の神経細胞の軸索伸長変化が後者の神経細胞の軸索伸長変化に対して有意に大きいと判断できる場合は、使用した候補物質は、神経細胞の軸索伸長作用を有する物質であると評価することができる。
【００３０】
５．ストレス耐性を付与する物質のスクリーニング方法
本発明は、前述したように、神経細胞にストレス耐性を付与する物質をスクリーニングする方法を提供するものである。具体的には、本方法は、神経細胞に候補物質を接触させ及び／又は導入して培養し（接触／導入工程）、培養後の当該細胞にストレスを付加し（付加工程）、付加後に培地中のLDHを検出し（検出工程）、得られる検出結果を指標として神経細胞にストレス耐性を付与する物質をスクリーニングするというものである。
【００３１】
接触／導入工程において使用し得る神経細胞及びその種類等については、上記４.のスクリーニング方法における説明が同様に適用できる。なお、神経細胞として前記形質転換細胞を用いた場合は、神経細胞のストレス耐性が候補物質に起因するものかどうか、すなわち候補物質がストレス耐性を付与する物質であるかどうかをより明確に確認することができる。
【００３２】
接触／導入工程は、通常、in vitro培養系で行い、候補物質の種類に応じ、神経細胞に接触させ及び／又は導入する。上記接触させる場合及び導入する場合については、上記４.のスクリーニング方法における説明が同様に適用できる。候補物質としては、上記４.のスクリーニング方法において記載したものと同様のものを好ましく使用することができるが、限定はされない。
候補物質の接触及び／又は導入後は、それ以前と同様の培養条件で培養を継続することが好ましい。具体的な培養条件は、限定はされず、使用する神経細胞の種類等に応じて適宜設定することができる。
【００３３】
付加工程では、候補物質を接触させた神経細胞にストレスを付加する。付加し得るストレスとしては、例えば、酸化ストレス、小胞体ストレス、熱ストレス及び高浸透ストレス等が挙げられるが、酸化ストレス、特に過酸化水素による酸化ストレスが好ましく適用される。過酸化水素によるストレスを付加する場合は、通常、培養液中に過酸化水素水を添加することにより行う。当該添加の際は、培養液中の最終H2O2濃度が50〜300μMとなるようにすることが好ましく、より好ましくは100〜200μMであるが、特に限定はされない。また、付加工程において、ストレスを付加するタイミングは、限定はされないが、例えば、候補物質の接触及び／又は導入時から16〜48時間後が好ましく、より好ましくは16〜24時間後である。
【００３４】
検出工程では、神経細胞にストレスを付加した後の培地（培養液）中のLDH（乳酸脱水素酵素）を検出する。LDHの検出及び定量は、例えばLDH検出キットなど、公知の各種測定方法により行うことができる。培養液中のLDH量は、通常、培地中の細胞死した細胞数と相関するため、付加したストレスにより細胞死した細胞数が多いほどLDH量は増加すると考えられる。また、検出工程において、LDH量を検出するタイミングは、限定はされないが、例えば、ストレスの付加時から16〜48時間後が好ましく、より好ましくは16〜24時間後である。
【００３５】
本スクリーニング方法は、検出工程で得られた結果を指標として行う。具体的には、上述のように候補物質を接触させ及び／又は導入した後ストレスを付加して培養した神経細胞と、候補物質の接触及び導入を行わずにストレスを付加して同様に培養した神経細胞（コントロール）とについて、検出されたLDH量を比較し、前者の神経細胞のLDH量が後者の神経細胞のLDH量に対して有意に少ないと判断できる場合は、使用した候補物質は、神経細胞のストレス耐性を付与する物質（すなわち細胞保護作用を有する物質）であると評価することができる。
【００３６】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
＜MOCAの発現分布＞
マウス網膜組織について、抗MOCA抗体を用いた免疫組織染色を行った。免疫染色の結果、MOCAは逆行性にラベリングされた網膜神経節細胞に発現することが認められ、また網膜神経節細胞の特異的マーカーによって二重染色されることが認められた。但し網膜神経節細胞以外のマーカーとMOCAとの二重染色は認められなかった。以上の結果から、マウス網膜組織において、MOCAが、神経細胞の中でも特に網膜神経節細胞に強く発現していることが示された。
【００３８】
さらに、培養したマウス網膜組織片について、上記と同様に抗MOCA抗体を用いた免疫組織染色を行い、網膜神経節細胞の軸索中のMOCAを検出した。その結果、MOCAは、軸索先端部分の成長円錐（growth cone）に多く局在することが示された。
【実施例２】
【００３９】
＜MOCAによる神経細胞の軸索伸長効果＞
マウス網膜神経節細胞の初代培養細胞にMOCA遺伝子を導入した後、３日間培養を継続した。培養後の細胞を固定した後、軸索の長さを測定したところ、MOCA過剰発現細胞では軸索伸長効率がおよそ２倍に促進されることが認められた。
また、MOCA遺伝子を導入したマウス網膜神経節細胞へBDNF（脳由来神経栄養因子）を投与すると、その軸索伸長効率が３倍程度にまで促進され、MOCAとBDNFとの相乗効果が認められた（図１）。
【００４０】
一方、マウス網膜神経節細胞の初代培養細胞に、Rac結合部位を欠損させたMOCA変異体（delMOCA）遺伝子を導入した後、上記と同様に、３日間培養を継続し、培養後の細胞を固定して軸索の長さを測定したところ、軸索伸長効率の促進は認められなかった。また、BDNFによる軸索伸長効果は、MOCA変異体によって抑制されていた。
以上から、MOCAは、Rac1の活性化を介して軸索伸長を促進すること、及びMOCAの活性化の一部はBDNFによって制御されることを明らかにした。
【実施例３】
【００４１】
＜MOCAによる神経細胞のストレス耐性の付与＞
以下のように、MOCAの過剰発現により、神経細胞にストレス耐性が付与されることを確認した。
マウス網膜神経節細胞の初代培養細胞へMOCA遺伝子を導入し、２日間培養を継続した後、細胞へのストレス（酸化ストレス）付与として、培養液中に過酸化水素水を添加し（約200μM H2O2）、さらに１日培養した。細胞死により培地中に放出されたLDH（乳酸脱水素酵素）の量を測定することによって、ストレス付与による細胞死の割合への影響を評価した。その結果、MOCA遺伝子を導入してMOCAを過剰発現させた細胞群は、MOCA遺伝子を導入しなかった細胞群に比べてLDH量が有意に減少しており、MOCAが、過酸化水素による酸化ストレスに対して耐性を付与し得ることが確認された（図２）。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】MOCAによる軸索の伸長促進効果を示すグラフである。培養網膜神経節細胞にMOCA遺伝子を導入し、３日間培養を継続した後に軸索の長さを測定した。MOCAを発現させた神経細胞では軸索の長さが約２倍に促進された。BDNFの投与により軸索の長さが約３倍に促進された。MOCA変異体（delMOCA）では軸索伸長効果が消失していた。
【図２】MOCAによるストレス耐性獲得効果を示すグラフである。培養網膜神経節細胞にMOCA遺伝子を導入後、過酸化水素によって酸化ストレスを与えた。MOCAを過剰に発現させた細胞群では細胞死の割合が減少していた。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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