(57)【要約】【課題】これまでの従来の技術において、平面への粘着性が比較的高い細胞を用いる際には、一旦平面上へ到達した細胞が吸引ポンプなどの手段を用いることによっても貫通孔周辺まで到達できないために、細胞の捕捉または保持の確率が著しく低下するといった課題を有する。さらに、貫通孔周辺に細胞が粘着して存在する際には、その細胞によって他の細胞が高い粘着性をもって貫通孔に保持されることが阻害され、電気生理現象を測定することが困難となる。【解決手段】基板に少なくとも１つ以上の貫通孔３を設け、この基板の両面と貫通孔３に液体を蓄積させ、貫通孔３の開口部に検体細胞４を密着保持させて、細胞の電気生理現象を測定する細胞電気生理センサであり、液体との接触部には貫通孔３を有する検体細胞４と同じ大きさの平面の底面７と、その底面７へ向けて小さくなるテーパー形状部を有する構成とするものである。【選択図】図２
2008139133.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板に少なくとも１つ以上の貫通孔を設け、この基板の両面と前記貫通孔に液体を蓄積させ、前記貫通孔の開口部に検体細胞を密着保持させて、細胞の電気生理現象を測定する細胞電気生理センサであって、前記貫通孔はすり鉢状の窪みの底に設けられ、この底の部分は前記検体細胞と略同じ大きさの平面部を有する細胞電気生理センサ。
【請求項２】
前記窪みの傾斜面は、この傾斜面と前記検体細胞間の摩擦力よりも前記検体細胞の傾斜面に平行な重力成分のほうが大きくなるように形成されている請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項３】
前記平面部の表面は、前記傾斜面の表面より水への親和性が高い請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項４】
前記平面部の表面と水との接触角は５度より小さい請求項３に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項５】
前記平面部は酸化シリコンで形成される請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項６】
前記平面部は、光触媒作用を有する材料で形成される請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項７】
前記光触媒作用を有する材料は、酸化チタン、酸化タングステン、酸化スズ、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化ビスマス、チタン酸ストロンチウムの中から選ばれた少なくとも１種を含む材料である請求項６に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項８】
前記傾斜面は、シリコンで形成されることを特徴とする請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項９】
前記窪みのある面と反対側の面に、中空の支持体が形成され、この中空の部分と前記貫通孔とがつながっている請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項１０】
少なくとも１つ以上の貫通孔を有する基板と、この基板の両面と前記貫通孔に液体を蓄積させ、前記貫通孔の開口部に検体細胞を密着保持させて細胞の電気生理現象を測定する細胞電気生理センサの、前記貫通孔はすり鉢状の窪みの底に設けられ、この底の部分は前記検体細胞と略同じ大きさの平面部を有する細胞電気生理センサの製造方法であって、基板の一方の面に貫通孔の形状と同じレジストホールを有するレジストマスクを形成するステップと、異方性のドライエッチングによってトレンチを形成するステップと、等方性のドライエッチングによってすり鉢状の空間と検体細胞と略同じ大きさの平面部を形成するステップと、平面部に貫通孔を形成するステップとを含む細胞電気生理センサの製造方法。
【請求項１１】
平面部をシリコン酸化物で、テーパー形状部をシリコンで形成した後、アルカリ溶液により表面処理を行う請求項１０に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
【請求項１２】
平面部が光触媒作用を有する材料であり、光触媒が作用する光エネルギーを照射する請求項１０に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の電気生理的活動の測定に用いられる細胞電気生理センサとその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。
【０００３】
しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて難しい操作を必要としているため、熟練作業者でさえ多くの測定をこなせない。従って高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。
【０００４】
このため、微細加工技術を利用した基板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットを挿入しない自動化システムに適している。例えば、基板の上に設けられた細胞保持手段を備えたウエルと、このウエルの電気信号を検出する測定用電極と、基準電極とを備えた細胞外電位測定用デバイスによって細胞外電位を測定する技術を開示している（例えば特許文献１参照）。図１３はこの従来の細胞電気生理センサのウエル構造を模式断面図で示したものであり、ウエル２６内に培養液２７が入れられ、検体細胞２５は基板２１に設けられた細胞保持手段によって捕捉または保持されている。細胞保持手段は基板２１に形成された窪み２２およびこの窪み２２に連絡する貫通孔２３を備えた構成となっている。
【０００５】
さらに貫通孔２３の内部にはセンサ手段である測定電極２４が配置されており、この測定電極２４は信号検出部に接続されている。
【０００６】
測定の際には検体細胞２５を貫通孔２３から吸引ポンプなどの手段により、この検体細胞２５が窪み２２に密着保持される。このようにして検体細胞２５の活動により発生する電気信号はウエル２６の内部の培養液２７に漏れることなく、貫通孔２３に設けた測定電極２４と参照電極２８によって電位の変化あるいは電流の変化として検出される。
【０００７】
このように、基板２１に形成された貫通孔２３はガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たし、高精度な細胞の電気生理現象を記録できるとともに、基板２１の裏面側からの吸引によって細胞が自動的に引きつけられ、検体細胞２５を容易に保持できるという利点を有している。このとき、検体細胞２５が高い密着性をもって保持されることは、低いバックグラウンドノイズで細胞の電気生理現象を測定するためには重要な要素である。
【特許文献１】国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記の従来の技術において、平面への粘着性が比較的高い細胞を用いる際には、一旦平面上へ到達した細胞が吸引ポンプなどの手段を用いても、貫通孔２３周辺まで到達できないために、細胞の捕捉または保持の確率が著しく低下するといった課題を有する。さらに、貫通孔２３周辺に細胞が粘着して存在する際には、その細胞によって他の細胞が高い密着性をもって貫通孔２３に保持されることが阻害され、電気生理現象を測定することが困難となる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために本発明は、基板に少なくとも１つ以上の貫通孔を設け、この基板の両面と貫通孔に液体を蓄積させ、貫通孔の開口部に検体細胞を密着保持させて、細胞の電気生理現象を測定する細胞電気生理センサであり、前記貫通孔はすり鉢状の窪みの底に設けられ、この底の部分は前記検体細胞と略同じ大きさの平面部を有する構成とするものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、細胞の電気生理的活動の測定に用いられる細胞電気生理センサとその製造方法を提供するものである。本発明の細胞電気生理センサおよびその製造方法は、細胞を粘着性の高低に限らず貫通孔周辺まで引き込むことが可能となり、また他の細胞が高い密着性をもって貫通孔に保持されることを阻害する細胞が貫通孔周辺に粘着する空間を有しないことから、細胞の捕捉または保持の確率を向上させた細胞電気生理センサとその製造方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサおよびその製造方法について、図面を参照しながら説明する。なお、本発明はこれら実施の形態に限定されるものではない。
【００１２】
（実施の形態１）
本発明の細胞電気生理センサの構成について説明する。
【００１３】
図１に示すように基板１には多くの開口部２が設けられている。この開口部２の形状等につき図２を用いて説明する。図２において、基板１は酸化シリコン層１ａとシリコン基板１ｂから形成されている。酸化シリコン層１ａの厚みは２μｍで、シリコン基板１ｂはテーパー状の開口部２を有している。開口部２の底面７は酸化シリコン層１ａまで達しており、底面７の直径は測定される検体細胞と略同じである。底面７は直径３０μｍの円形でその中心には酸化シリコン層１ａを貫通する直径３μｍの貫通孔３が形成されている。この貫通孔３の開口径は測定したい検体細胞の大きさ、形状、性質によって決定することができる。例えば、検体細胞が５〜５０μｍ程度の大きさで高い密着性を持っている時、貫通孔３に保持されるには貫通孔３の開口径は３μｍ以下であることが望ましい。このような構成により、検体細胞を貫通孔３の周辺まで引き込むことが可能となり、検体細胞４を捕捉し保持しやすくなる。
【００１４】
次に、本発明の細胞電気生理センサの動作について説明する。図３に示すように、基板１のテーパー状の開口部２の中に検体細胞４を含んだ細胞外液５ａを満たした後、開口部２を加圧するか、細胞内液５ｂ側を減圧することにより、検体細胞４は貫通孔３に密着する。テーパー状の開口部２の底面７の直径は検体細胞４と略同じ大きさであるので、一つの検体細胞４がこの底面７に密着、保持される。
【００１５】
通常、細胞内液５ｂは、例えば哺乳類筋細胞の場合、代表的にはカリウムイオン濃度が１５５ｍＭ程度、ナトリウムイオン濃度が１２ｍＭ程度、塩素イオン濃度が４．２ｍＭ程度添加された電解液であり、細胞外液５ａは、カリウムイオン濃度が４ｍＭ程度、ナトリウムイオン濃度が１４５ｍＭ程度、塩素イオン濃度が１２３ｍＭ程度添加された電解液である。
【００１６】
図３において酸化シリコン層１ａの下側から吸引、もしくは薬剤（例えばナイスタチンなど）を投入することにより検体細胞４に微細小孔を形成する。その後開口部２のほうから検体細胞４へ刺激を加える。この刺激の種類としては、例えば化学薬品、毒物などの化学的な刺激に加え、機械的変位、光、熱、電気、電磁波などの物理的な刺激なども含む。検体細胞４がこれらの刺激に対して活発に反応した場合、検体細胞４は細胞膜が保有するチャンネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。この結果として、細胞内外の電位勾配が変化するので、その変化を電極８と電極９により測定する。
【００１７】
図４に示したように、検体細胞４にかかる重力Ｇの開口部２の任意の斜面の角度の正弦成分Ａが、検体細胞４の斜面での摩擦力Ｂより大きくなる傾斜となっている。すなわち斜面と底面７のつくる角度をθ、検体細胞４と開口部２の表面との摩擦係数をμとすれば、
【００１８】
【数１】
2008139133.tif 000003
【００１９】
【数２】
2008139133.tif 000004
【００２０】
であればよい。
【００２１】
このような構成により、検体細胞４は開口部２の表面にくっつくことなく底面７のほうに落ちるという効果が得られる。
【００２２】
また開口部２の表面に比べて、底面７は水への親和性が高いほうが良い。通常、検体細胞４は水酸基を含んだ親水性の表面を有しているので、貫通孔３へ検体細胞４を密着させて保持するには、貫通孔３の表面周辺は高い親水性を示すことが好ましい。一方、検体細胞４が途中の斜面で引っかからず、一気に底面７に到達するためには、開口部２の斜面の表面は疎水性の表面が好ましい。従って開口部２の斜面の表面に比べて、底面７を親水性が高い構成にすると検体細胞４を密着して保持することが可能となる。
【００２３】
特に、底面７の表面は水との接触角が５度より小さいことが望ましい。このような構成により、貫通孔３へ検体細胞４が密着性よく保持することが可能となる。本実施の形態１において、底面７は酸化シリコンであり、その表面に吸着した炭素を含む有機化合物を洗浄した後に、アルカリ溶液で処理することにより、表面を容易に水酸基で覆うことができる。その結果底面７の表面の親水性が高まり、水との接触角を５度より小さくできる。
【００２４】
次に、本発明の細胞電気生理センサの製造方法について説明する。
【００２５】
本実施の形態１における細胞電気生理センサの製造方法は、図５に示すように酸化シリコン層１ａとシリコン基板１ｂからなる基板１を用意し、基板１の上面のシリコン面には貫通孔３と同じ形状のレジストホール１１ａを有するレジストマスク１１を形成する。
【００２６】
次に、図６のようにドライエッチングによって、シリコン基板１ｂの垂直方向にトレンチ１２ａを形成する。このときに用いるエッチング法は、ドライエッチングによる方法が最適であり、ドライエッチングの際にはエッチングを促進するガスと、エッチングを抑制するガスを用いる。このエッチングを促進するガスとしては、二フッ化キセノン、六フッ化硫黄などがある。また、エッチングを抑制するガスとしてはトリフルオロメタン、八フッ化シクロブタンなどがある。これらのガスを混合してエッチングすることにより、エッチングされた壁面にフルオロカーボンのポリマーである保護膜を作製していくことができることから、ドライエッチングによるトレンチ１２ａの形成を図６のようにレジストマスク１１の下方のみに進行させることが可能となる。
【００２７】
次に図７に示すように、レジストマスク１１のエッチングホール１１ａから、エッチングを促進するガスを導入して、所望の形状となるように窪み２ａを形成する。ここでは、エッチングを促進するガスとして二フッ化キセノンを用いることが効果的である。この場合はエッチングを抑制するガスを流さないので、シリコン基板１ｂは左右方向、下方向にエッチングされ丸い窪み２ａが形成される。
【００２８】
この窪み２ａがシリコン基板１ｂの半分程度になると、再びレジストマスク１１のエッチングホール１１ａからエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを流すことにより垂直方向にエッチングを進め、図８のように酸化シリコン層１ａまでトレンチ１２が形成される。
【００２９】
次に、図９に示すように、レジストマスク１１のエッチングホールから、酸化シリコン層１ａのエッチングを促進するガスを導入して、貫通孔３を形成する。このとき、酸化シリコン層１ａのエッチングを促進するガスにはアルゴン四フッ化炭素などを用いてプラズマエッチングをすることが望ましい。このようにして貫通孔３はレジストマスク１１のエッチングホール１１ａの直下に形成することが可能となる。
【００３０】
さらにレジストマスク１１のエッチングホール１１ａから、エッチングを促進するガスを導入する。この時、エッチングを抑制するガスを流さないのでシリコン基板１ｂは左右方向と下方向にエッチングされて図１０に示すような形状に加工することが可能になる。
【００３１】
最後にレジストマスク１１を除けば、図１１に示す細胞電気生理センサが完成する。なお、図１０においてレジストマスク１１は酸化シリコン層１ａのエッチングにおけるプラズマエッチングに対する耐性が必要であるため、アルミニウムまたはシリコン窒化物などが適している。
【００３２】
また酸化シリコン層１ａの代わりに光触媒作用を有する材料層を用いてもよい。このような構成の細胞電気生理センサは、光触媒反応が起こる最適な光エネルギーを照射することにより、底面７に吸着した炭素を含む有機化合物の分子鎖のみを分解して除去し、親水性の高い面を得ることができる。
【００３３】
なお、光触媒作用を有する材料として、酸化チタン、酸化タングステン、酸化スズ、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化ビスマス、チタン酸ストロンチウム、およびこれらの混合物のいずれかで構成することが効果的である。
【００３４】
なお図１２に示すように、基板１の酸化シリコン層１ａのほうに中空の支持体６を当接した構成としてもよい。本実施の形態１において、開口部２の底面７は厚み２μｍの酸化シリコン層１ａで形成されるため、外部から異物の接触等があれば破損する場合もあり得る。そこで基板１の酸化シリコン層１ａ表面に、貫通孔３のまわりに中空の支持体６を形成することにより酸化シリコン層１ａの破損を低減することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明の細胞電気生理センサは、検体細胞を高い密着性で且つ高確率に保持する上で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の実施の形態１による細胞電気生理センサの斜視図
【図２】同センサの断面図
【図３】同センサの動作を説明する拡大断面図
【図４】同センサの検体細胞の様子を示す断面図
【図５】同センサの製造方法を示す断面図
【図６】同センサの製造方法を示す断面図
【図７】同センサの製造方法を示す断面図
【図８】同センサの製造方法を示す断面図
【図９】同センサの製造方法を示す断面図
【図１０】同センサの製造方法を示す断面図
【図１１】同センサの製造方法を示す断面図
【図１２】本発明の実施の形態１における別の細胞電気生理センサの断面図
【図１３】従来の細胞電気生理センサの断面図
【符号の説明】
【００３７】
１  基板
１ａ  酸化シリコン層
１ｂ  シリコン基板
２  開口部
３  貫通孔
４  検体細胞
５ａ  細胞外液
５ｂ  細胞内液
６  中空の支持体
７  底面
８  電極
９  電極
１１  レジストマスク
１２  トレンチ
１２ａ  トレンチ
【図１】
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【図２】
2008139133.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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