(57)【要約】      （修正有）【課題】粒径など所望の物性を制御しつつ、所望の物質の高い内包率が達成できるベシクルの製造方法を提供する。【解決手段】内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、乳化剤を含む油相とからＷ/Ｏエマルションを作成し、次いで、前記Ｗ/Ｏエマルションの水溶液が凍結粒子となり油相は液体の状態を維持する温度まで冷却して油相を除去し、この後、前記凍結粒子にベシクル構成脂質を含む油相を添加し、攪拌することで凍結粒子表面の乳化剤をベシクル構成脂質に置換し、そして、脂質膜によって表面が覆われた凍結粒子に外水相を添加し、外水相と脂質膜とを水和させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）--〜（４）の工程からなることを特徴とするベシクルの製造方法。
（１）内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、乳化剤を含む油相とからＷ/Ｏエマルションを作成する工程。
（２）前記Ｗ/Ｏエマルションの水溶液が凍結粒子となり、油相は液体の状態を維持する温度まで冷却して油相を除去する工程。
（３）前記凍結粒子にベシクル構成脂質を含む油相を添加し、攪拌することで凍結粒子表面の乳化剤をベシクル構成脂質に置換する工程。
（４）脂質膜によって表面が覆われた凍結粒子に外水相を添加し、外水相と脂質膜とを水和させることを特徴とするベシクルの製造方法。
【請求項２】
以下の（１）--〜（３）の工程からなることを特徴とするベシクルの製造方法。
（１）内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、乳化剤として機能する脂質を含む油相とからＷ/Ｏエマルションを作成する工程。
（２）前記Ｗ/Ｏエマルションの水溶液が脂質膜によって表面が覆われた凍結粒子となり、油相は液体の状態を維持する温度まで冷却して油相を除去する工程。
（３）前記凍結粒子に外水相を添加し、外水相と凍結粒子表面の脂質膜とを水和させることを特徴とするベシクルの製造方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のベシクルの製造方法において、前記外水相を添加する際に、同じ脂質膜にて覆われた微細なベシクルを混合することを特徴とするベシクルの製造方法。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載のベシクルの製造方法において、前記外水相を添加する際に、グリセロールなどの外水相の凝固点を下げる物質を天下することを特徴とするベシクルの製造方法。
【請求項５】
請求項１または請求項２に記載のベシクルの製造方法において、前記油相の除去は減圧蒸発にて行い、このときの容器内側は疎水化しておくことを特徴とするベシクルの製造方法。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５のいずれかに記載のベシクルの製造方法にて製造されたことを特徴とするベシクル。
【請求項７】
以下の（１）--〜（３）の工程からなることを特徴とするベシクルの製造するための凍結粒子の製造方法。
（１）内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、乳化剤を含む油相とからＷ/Ｏエマルションを作成する工程。
（２）前記Ｗ/Ｏエマルションの水溶液が凍結粒子となり、油相は液体の状態を維持する温度まで冷却して油相を除去する工程。
（３）前記凍結粒子にベシクル構成脂質を含む油相を添加し、攪拌することで凍結粒子表面の乳化剤をベシクル構成脂質に置換する工程。
【請求項８】
以下の（１）及び-（２）の工程からなることを特徴とするベシクルの製造するための凍結粒子の製造方法。
（１）内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、乳化剤として機能する脂質を含む油相とからＷ/Ｏエマルションを作成する工程。
（２）前記Ｗ/Ｏエマルションの水溶液が脂質膜によって表面が覆われた凍結粒子となり、油相は液体の状態を維持する温度まで冷却して油相を除去する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はベシクルの製造方法に関し、特にＷ/Ｏエマルションを基材とし、その内部水相に水溶性物質、固体粒子、あるいは細胞など種々の物質を内包し、平均粒径が数十ｎｍ〜数百μｍのベシクル（以下、「本発明ベシクル」ともいう）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベシクルはリポソームとも言われ両親媒性の脂質分子により形成される閉鎖小包体であり、研究用のモデル細胞膜やＤＤＳ製剤およびマイクロリアクターなどの様々な用途への利用が期待されている。
【０００３】
ベシクル作製法の一例として、固体表面上に形成した脂質薄膜を水和する方法がある。例えば、ガラス基材上に脂質薄膜を形成し、これに水溶液を加えて激しく振盪することで、ベシクルを調製することができる。しかし、この方法で得られるベシクルの粒径は一般に不均一であり、また所望の物質のベシクル内への内包効率は極めて低い。さらに、粒径がマイクロメートルスケールの大きなベシクルを調製することは困難である。
【０００４】
一方、大きなベシクルの作製に頻繁に用いられている方法として、非特許文献１に開示されるエレクトロフォーメーション法が知られている。この方法は、白金電極上に形成した脂質薄膜に水溶液中で電圧を印加して脂質薄膜の水和を行うことで直径数十μｍ〜数百μｍ程度のベシクルを作製するものである。
【０００５】
一方、内包率が比較的高いベシクルを作成する手法として、エマルションを利用する方法が非特許文献２に提案されている。
ここで、本発明では、ベシクルに内包される物質を「内包物質」と呼び、「内包率」とは、最終的に得られたベシクル懸濁液全体に含まれる内包物質のうち、ベシクルに内包されたものの割合をパーセントで表したものである。また、「平均粒径」とは、ベシクル粒径の数分布において、個数基準の幾何平均として算出される粒径を指す。
【０００６】
また特許文献１には高分子電解質溶液の周囲に電解質複合体からなるゲル層を形成するマイクロカプセルの製造方法が提案されている。この方法はマイクロチャネルの一方の側に所定の物質を内包した高分子電解質溶液（分散相）を、他方の側に当該高分子電解質溶液と反応してゲルを形成する溶液（連続相）を配置し、分散相に圧力を加えることで連続相に微細な粒子として分散相を送り込み、分散相表面での反応でゲル層を形成するようにしている。
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０２６４５７
【非特許文献１】Wick et al.: Chemistry & Biology, Vol. 3. 277-285, 1996
【非特許文献２】Szoka et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 75, No. 9, 4194-4198, 1978
【０００８】
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
非特許文献１に開示される方法の場合、得られたベシクルの内部水相に物質を封入するためには、マイクロインジェクションシステムなどの特殊な装置を用いて、一つ一つのベシクルに物質を注入する操作が必要となり、量産化は期待できない。
【００１０】
非特許文献２に開示されるエマルションを利用した製造技術では、得られるベシクルのサイズを制御することが難しく、特に１０μｍを超える大きなベシクルの作成は困難である。その他にも、これまで報告されている技術においては、ベシクル内への物質の封入効率は数％〜数十％程度が普通であり、粒子径の制御と、高い内包率を同時に達成できない。
【００１１】
特許文献１に開示される方法によれば、所定の物質を内包し且つ粒径が数百μｍの均一なマイクロカプセルが得られる。しかしながら、この方法では所定の物質を溶解或いは内包する水溶液がアルギン酸水溶液などの特定の高分子電解質溶液に限られ、また反応によって形成されるゲル層が破損しやすいなどの問題がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題を解消するため、第１発明に係るベシクルの製造方法は、内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、乳化剤を含む油相とからＷ/Ｏエマルションを作成し、次いで、前記Ｗ/Ｏエマルションの水溶液が凍結粒子となり油相は液体の状態を維持する温度まで冷却して油相を除去し、この後、前記凍結粒子にベシクル構成脂質を含む油相を添加し、攪拌することで凍結粒子表面の乳化剤をベシクル構成脂質に置換し、そして、脂質膜によって表面が覆われた凍結粒子に外水相を添加し、外水相と脂質膜とを水和させるようにした。
【００１３】
本願の第２発明は特に乳化剤としてベシクルを構成できる物質を選定することで乳化剤とベシクル構成物質との置換工程を省略している。
具体的には、内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、乳化剤として機能する脂質（フォスファチジルコリン、ソルビタン脂肪酸エステルなど）を含む油相とからＷ/Ｏエマルションを作成し、次いで、前記Ｗ/Ｏエマルションの水溶液が脂質膜によって表面が覆われた凍結粒子となり油相は液体の状態を維持する温度まで冷却して油相を除去し、この後、前記凍結粒子に外水相を添加し、外水相と凍結粒子表面の脂質膜とを水和させるようにした。
【００１４】
前記外水相を添加する際に同じ脂質膜にて覆われた微細なベシクルを混合することが好ましい。同じ脂質膜にて覆われた微細なベシクルを混合することで、当該微細なベシクルの脂質膜が大きな粒径のベシクル表面の脂質膜に形成されている傷を修復することが判明した。
更に、外水相を添加する際に、グリセロールなどの外水相の凝固点を下げる物質を添加することで、例えば凍結粒子を−２℃で凍結させたままで脂質膜の水和を行い内包率の向上を図ることができる。
【００１５】
また、油相の除去は減圧蒸発にて行う場合、使用する容器内側を疎水化しておくことが好ましい。疎水化しておくことで容器内側面と凍結粒子とが直接接触せず、これらの間にも脂質層が形成され、水和完了まで粒子が壊れず球形を維持するので、内包率が高くなる。
更に、本願発明には上記方法によって得られたベシクルが含まれ、さらに当該ベシクルになる前の中間品である、凍結粒子の製造方法も含まれる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、粒径など所望の物性を制御しつつ、所望の物質の高い内包率が達成できるベシクルを製造することができ、また研究用のモデル細胞膜やＤＤＳ製剤およびマイクロリアクターとして要求される強度（形状維持性）も十分に備えたベシクルを製造することができる。具体的に挙げることができる効果は例えば以下の通りである。
【００１７】
（１）従来は困難であった、粒径が制御されたマイクロメートルオーダーのベシクルを提供することが可能である。しかも、０．０３μｍ〜２００μｍ程度の範囲で、所望する平均粒径を持ったベシクルを製造できる。
（２）粒径が制御されたベシクルの内部水相に、高い内包率で物質を封入することが可能である。とくに、従来技術では顕微鏡下で一つ一つ作成していた水溶性物質内包ジャイアントベシクルが、同時に比較的多量に提供できる。
（３）Ｗ／Ｏエマルションの油相に溶解する両親媒性脂質種を変えることで、種々の脂質組成のベシクルを比較的容易に調製できる。
（４）Ｗ／Ｏエマルションの分散水相内に溶解または分散可能な物質であれば、内包物質の種類を問わず、ベシクル内に内包することができる。従って、本発明により製造したベシクルは、親水性および疎水性薬物のキャリアーとしてＤＤＳ医療に用いることができる。また、ベシクル内で遺伝子やタンパク質に係る反応を行うマイクロリアクターとして、有用な遺伝子やタンパク質のスクリーニングにも利用することができる。
（５）製造工程で使用する薬品類は全て食品用途に利用できる安全性の高いものであるため、本発明により製造されるベシクルは高い安全性を有していることが期待できる。従って、本発明ベシクルは、薬物、機能性食品成分、および化粧品関連成分のキャリアーとしても好適である。例えば、各種ビタミン類の酸化を抑制できる機能性食品用カプセルの作製や、保湿成分を内包したベシクルを利用した、保湿効果の高い化粧水などに応用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
図１（ａ）〜（ｄ）は本発明におけるベシクル作製過程の概略を示す図である。尚、各図において右側の引き出し部分は、左側の図の要部を拡大した図である。本発明にあっては、先ず図１（ａ）に示すように、内包物質を含む水相とヘキサン等の油相からＷ／Ｏエマルションを作成する。
【００１９】
次いで、Ｗ／Ｏエマルションを凍結し、図１（ｂ）に示すように、凍結水滴表面の乳化剤を洗浄除去するとともにベシクル構成脂質（ＰＣ）を添加し、乳化剤とベシクル構成脂質とを置換する。
【００２０】
この後、図１（ｃ）に示すように、油相（ヘキサン）を除去する。この時点で凍結水滴表面には脂質二分子膜が形成されている。そして、図１（ｄ）に示すように、外水相を添加してベシクル懸濁液とする。
【００２１】
ここで、本発明ベシクルには、脂質二分子膜により構成されるベシクルのほか、ベシクルを構成する脂質種を壁素材とするマイクロカプセル構造をもつ粒子も含める。
【００２２】
本発明ベシクルを構成する脂質種（ベシクル構成脂質）は、両親媒性の脂質分子であれば良く、フォスファチジルコリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジン酸、フォスファチジルセリンのようなリン脂質やスフィンゴ脂質類、ソルビタン脂肪酸エステルおよびポリグリセリン脂肪酸エステルなどの食品用乳化剤、オレイン酸などの脂肪酸を構成成分とするベシクルも包含する。
【００２３】
また、本発明の効果を妨げない範囲で、脂質二分子膜に他の成分を含んでいても良い。例えば、コレステロールおよびエルゴステロールなどのステロール類、ステアリルアミンのような荷電性脂質、オレイン酸、ステアリン酸およびパルミチン酸などの長鎖脂肪酸類、ならびに脂質二分子膜と相互作用しうるペプチド類や糖質なども併用できる。
【００２４】
よりサイズの均一性が高いベシクルを得るためには、特許文献１に開示されるような極めて単分散性の高いＷ／Ｏエマルションを作製できるマイクロチャネル乳化法が最も効果的である。
【００２５】
Ｗ／Ｏエマルションの水相には、純水もしくは塩類をふくむ緩衝液を用いることができる。水相には、ベシクル作製後にベシクル内水相に内包する内包物を含ませておくことができる。内包物は、水相に溶解する物質や水相に懸濁可能な物質で、Ｗ／Ｏエマルションの製造を妨げない物質であれば、その種類を制限されない。したがって、糖類、塩類などの低分子物質、酵素やＤＮＡなどの高分子物質、ゲル微粒子や磁性微粒子などの固体物質も利用できる。
【００２６】
Ｗ／Ｏエマルションの油相には、ヘキサンなど、水と混和しない有機溶媒を用いることができる。油相中には、マイクロチャネル乳化法においてエマルションの作製が可能な乳化剤および安定化剤を含ませておく。乳化剤としては、リン脂質、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖エステルなどを利用できる。安定剤としては、オレイン酸などの脂肪酸や、ステアリルアミンなどの荷電性脂質を利用できる。
【００２７】
マイクロチャネル乳化法によりＷ／Ｏエマルションを作製する際には、（ａ）疎水化したシリコン製マイクロチャネル基板あるいはアクリル製マイクロチャネルプレート、（ｂ）疎水化したガラス板あるいはアクリル板、およびマイクロチャネル乳化装置モジュールを使用する。
【００２８】
そして、（ａ）および（ｂ）により形成される溝型マイクロチャネルあるいは（ａ）上に加工された貫通孔型マイクロチャネルの出口側に上記油相を満たしておき、マイクロチャネルの入口側から内包物を含む上記水相を圧入することで、粒径のバラツキが１０％以内の均一径Ｗ／Ｏエマルションを調製できる。
【００２９】
マイクロチャネル基板としては、デッドエンド型、クロスフロー型、貫通型など、種々の形態のものを用いることができる。厳密な粒径制御を要しない場合、および極めて微細なベシクルの作製を望む場合には、既存の膜乳化法、超音波乳化法および高圧ホモジナイザー等を利用して得られたＷ／Ｏエマルションを利用して、以下の工程によりベシクルを作製することも可能である。
【００３０】
作製したＷ／Ｏエマルションは、水相液滴の合一を防ぐために、速やかに液体窒素により凍結させ、低温環境で「水相は固体（氷）、油相は液体」の状態で保存する。同温度下で、静置により水相を沈降させ、油相上清を吸引除去する。
【００３１】
つづいて、フォスファチジルコリンなどのベシクル構成脂質を含む油相を添加し、懸濁液全体をよく撹拌する。同様の操作を、当初含まれる乳化剤の濃度が所望の程度に希釈されるまで繰り返すことで、系に含まれる乳化剤がベシクル構成脂質へと置換される。このとき、水相液滴量に対するベシクル構成脂質量の比を適切に調整することで、後に得られるベシクルの脂質二分子膜の多層性と内包物質の内包率を制御することができる。
【００３２】
乳化剤をベシクル構成脂質に置換したＷ／Ｏエマルションから、水相を凍結させたままの状態で、油相溶媒をエバポレーターにより減圧蒸発除去する。このとき、減圧蒸発操作中にＷ／Ｏエマルションを入れておく容器の内壁が疎水的であれば、後に得られるベシクルへの内包物の内包率を高めることができる（実施例参照）。疎水的な内壁素材としては、オクタデシルトリエトキシシランなどのシランカップリング剤で表面疎水化したガラス容器やフッ素樹脂系の撥水容器を用いることができる。
【００３３】
Ｗ／Ｏエマルションから油相溶媒を除去すると、ベシクル構成脂質に表面を覆われた水相滴が得られる。これに、外水相を添加することで、水相滴を覆うベシクル構成脂質の層が水和され、ベシクルを得ることができる。
【００３４】
上記工程を統合することで、各種成分を装置内に導入するだけで、半自動的にベシクルを作製できる装置を作製することができる。図２（ａ）に装置のフローを図２（ｂ）に装置の構成例を示した。
【００３５】
外水相として用いる水溶液は、ベシクル構成脂質層の水和およびベシクルの形成を妨げないものであれば、その組成を制限されない。ただし、１０％程度のグリセロール等を添加した不凍水溶液および粒径５０ｎｍ程度のリン脂質ベシクル懸濁液を外水相として用いると、内包物質の内包率を高めることができる。
【００３６】
従来の技術では、マイクロメートルスケールのベシクルに物質を効率よく内包させ、かつ同時に多数の同様なベシクルを製造することは困難であった。本発明技術によれば、数十％程度の内包率で所望の物質を内包したマイクロメートルスケールのベシクルを、同時に多数得ることができる。
【００３７】
これにより、ベシクルを利用した生化学反応などの効率化が期待できる。すなわち、反応原料Ａを含むベシクルを本発明技術により製造し、これにＡと反応する反応原料Ｂをベシクル外からの膜透過により供給するか、Ａを含むベシクルとＢを含むベシクルをそれぞれ本発明技術により製造し、それぞれを融合させるなどの方法により、ベシクルの内部で反応を行うことができる。たとえば、反応が起こると蛍光を発する物質を反応成分として用いると、反応が進行したベシクルの内部で蛍光が観察される。
【００３８】
本発明により得られるベシクルはマイクロメートルスケールの大きさを持つので、細胞の選別などに用いられるセルソーターのような装置を用いれば、反応が進み蛍光を発するベシクルと、反応が進行しなかったベシクルを容易に選別・分取することができる。この様な原理により、有用な酵素、抗体、核酸などのスクリーニングを行うことが可能になる。
【００３９】
以下に具体的な実施例を説明する。
[実施例１]
（ベシクル構成脂質）
中性リン脂質であるフォスファチヂルコリン（以下ＰＣと記す）、代表的なステロール類であるコレステロール（Chol）およびカチオン性脂質であるステアリルアミン（SA）の混合物をベシクル構成脂質として用いた。
【００４０】
（均一径Ｗ／Ｏエマルションの製造）
３ｗｔ％のソルビタンモノオレエート（商標名Span80）および０．１ｗｔ％のSAを含むヘキサンを油相として、ｐＨ９のTris-HCl緩衝液を水相として用いた。内包物質は、Ｗ／Ｏエマルション作製用の水相に溶解又は分散させておく必要がある。ベシクルに内包するモデル内包物質としては、蛍光色素カルセインを用い、水相に０．４ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で溶解した。
【００４１】
Ｗ／Ｏエマルションの製造には、図３に示す実験用クロスフロー型マイクロチャネル乳化装置モジュールを使用した。マイクロチャネル基板としては、オクタデシルトリエトキシシラン処理により疎水化したシリコン製のものを用いた。
【００４２】
マイクロチャネル基板のテラス長、チャネル深さおよびチャネル幅はそれぞれ約１５，２，５μｍであった。オクタデシルトリエトキシシランにより疎水化処理を行ったガラス板にマイクロチャネル基板を圧着させ、形成したチャネルの出口側に油相ヘキサン溶液を満たしておき、チャネルの入り口側から水相を供給して、均一径Ｗ／Ｏエマルションを製造した。
【００４３】
図４は得られたエマルションの顕微鏡写真であり、得られたエマルションの直径は４〜６μｍでほぼ均一であり、図５に示す蛍光顕微鏡観察の結果、水相液滴のみが蛍光を発していることが観察され、内包物質カルセインはエマルションの水相液滴中に含まれていることが確認された。
【００４４】
（カルセイン内包ベシクルの製造）
上記の方法により得られたＷ／Ｏエマルションを液体窒素中で凍結させ、−１０℃の低温室内に保存した。この処理により、油相が液体、水相が固体（氷）の状態のエマルションを得ることができた。温度を−１０℃に保ったまま、エマルションを３０分間静置し、水相滴を沈降させた後、上清（油相）の９５％（体積割合）を吸引除去した。残ったエマルションを、ＰＣ、Chol、ＳＡを含むヘキサン溶液で２０倍に希釈し、全体をよく撹拌した。ＰＣ、Chol、ＳＡのモル比は５：５：１とし、総脂質濃度は１．６ｇ／Ｌとした。
【００４５】
再びエマルションを３０分間静置し、上清の９０％を除去後、残ったエマルションを上記ベシクル構成脂質を含むヘキサン溶液で１０倍に希釈し、エマルション全体を撹拌した。
【００４６】
さらにエマルションを３０分間静置して水相を沈降させ、上清の６０%を除去し、残渣を上記ベシクル構成脂質を含むヘキサン溶液で２．５倍に希釈した。エマルション中の水相濃度を調整した後、エマルションを同ヘキサン溶液で２倍に希釈し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で水相を含むＷ／Ｏエマルションを得た。
【００４７】
この操作によりＷ／Ｏエマルションの作製に用いたSpan 80はおよそ１０００分の１の濃度にまで希釈され、エマルションに含まれる全脂質（乳化剤も含む）の９５％以上がベシクル構成脂質に置換されていることを、高速液体クロマトグラフィーにより確認した。
【００４８】
温度を−１０℃に保ったまま、乳化剤の置換操作後のＷ／Ｏエマルションを任意濃度のベシクル構成脂質を含むヘキサン溶液で１０倍に希釈し、脂質濃度０．０２〜１．６ｍｇ／ｍＬ、水相濃度１ｍｇ／ｍＬのＷ／Ｏエマルションとした。    
【００４９】
このエマルション中に含まれる油相溶媒ヘキサンを、−５〜−１０℃、１５〜２０ hPaの条件下でロータリーエバポレーターにより蒸発除去した。図６（ａ）と（ｂ）は凍結操作前の水滴の状態を示す蛍光顕微鏡写真であり、（ｃ）と（ｄ）は水滴を凍結しヘキサンを蒸発除去した後の凍結粒子の状態を示す顕微鏡写真である。この写真から凍結した水滴は連続相除去後にもその形状を維持していることが分かる。
【００５０】
上記につづいて４℃下で外水相として５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９Tris-HCl緩衝液を０．０５〜１ｍＬ添加して、凍結した水相滴を覆う脂質薄膜を水和した。同様の緩衝液により全量を任意の割合で希釈した後、室温下で静置してベシクル懸濁液を得た。
【００５１】
本実施例により製造されたベシクルの顕微鏡写真を図７下段に示す。得られたベシクルの多くは、直径が１〜１０μｍの範囲にあり、基材として用いたＷ／Ｏエマルション（図７上段）の大きさを反映していた。また、ベシクルの内部にカルセインの蛍光が認められ、内包物質として用いたカルセインがベシクルに内包されていることが確認された。Okuらの方法（Oku et al.: Biochim. Biophys. Acta, vol. 691, 332-340, 1982）により測定したカルセインの内包率は、約１２％だった。
【００５２】
[実施例２]
実施例１の手順を改良し、カルセインの内包率の向上を図った。使用する外水相としては、２０ｍｍｏｌ／ＬのＰＣによりなる５０ｎｍのベシクル懸濁液および１０ｗｔ％のグリセロール溶液を用いた。また、ヘキサンの蒸発除去および脂質膜の水和の際に用いる容器として、表面を疎水化したガラス製容器を使用した。
【００５３】
（５０ｎｍのベシクル懸濁液の製造）
２ｗｔ％のＰＣを含むクロロホルムをガラス容器中に入れ、減圧下でクロロホルムを蒸発除去し、ガラス容器底面にＰＣの薄膜を形成させた。これに、Tris-HCl緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９）をＰＣ濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、激しく振盪撹拌することでＰＣ薄膜を水和し、多層ベシクル懸濁液を得た。この懸濁液に対し、液体窒素中で凍結後、室温水槽中で融解させる操作を5回繰り返した。得られた懸濁液を４００、２００、１００および５０ｎｍのポリカーボネートフィルターに順次それぞれ１０回ずつ強制透過し、直径５０ｎｍのベシクル懸濁液を得た。
【００５４】
（１０ｗｔ％グリセロール溶液の製造）
グリセロールを、10wt%の濃度になるようにTris-HCl緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９）に溶解し、グリセロール溶液とした。
【００５５】
（ガラス容器表面の疎水化処理）
パイレックスガラス製試験管内に、５ｗｔ％のオクタデシルトリエトキシシランを含むトルエンを満たし、１１０℃の油浴中で６０分間、トルエンを還流させながら試験管内の疎水化処理を行った。処理後は、トルエン、ヘキサン、50%エタノール水溶液、脱イオン水の順で洗浄した。
【００５６】
（プロセスの改良による内包率の向上）
実施例1と同様にしてマイクロチャネル乳化法により調製し、同様の手順で乳化剤の置換、油相溶媒の除去を行った。つづく脂質薄膜の水和処理においては、次のような操作を行った。
・  Tris-HCl緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９）を添加して脂質薄膜を水和（＝実施例１）
・  系に添加する外水相として上記の直径５０ｎｍのベシクル懸濁液を使用して脂質薄膜を水和
・  −２℃の温度下で１０％グリセロール溶液を用いて脂質薄膜を水和したのち、上記の直径５０ｎｍのベシクル懸濁液を添加
・  上記（３）と同様の操作を上記疎水化ガラス容器中で行い脂質薄膜を水和
これらの各処理によって得られたベシクルへのカルセインの内包率を図８に示した。図中のデータに添えられた数字（１）〜（４）は、上記操作（１）〜（４）の結果と対応している。図に示したように、上記の改良によりカルセインの内包率は向上し、（４）の方法では実施例１における値の３．６倍に相当する４３％もの高い内包率を達成することができた。
【００５７】
[実施例３]
実施例１において使用したＷ／Ｏエマルションを製造するために使用するマイクロチャネル基板として、テラス長、チャネル深さおよびチャネル幅がそれぞれ３０、１１および１６μｍのものを用いたところ、平均粒径３６μｍの均一径Ｗ／Ｏエマルションが得られた。これを基材として、実施例1と同様の手順でベシクルを作製したところ、ベシクル内にカルセインを内包し、ほぼ４０μｍに直径のピークを持つベシクルを得ることができた（図９）。
【００５８】
すなわち、本発明技術は、種々のマイクロチャネル基板を用いて異なるサイズのＷ／Ｏエマルションを製造し、これを基材としてベシクルを作製することで、所望の大きさのベシクルを効率的に製造できるものであることが示された。
【００５９】
[実施例４]
ベシクルに内包する内包物質として、多糖類デキストラン（蛍光標識品、分子量約４０００〜４０,０００）および酵素α−キモトリプシン（分子量２５３１０）を用いた。実施例１と同様の手順で、Ｗ／Ｏエマルション作製用の水相にこれらを溶解して、実施例１と同様の操作によりベシクルを製造した。その結果、デキストランでは、６〜１０％、α−キモトリプシンでは４５％の内包率で、それぞれを内包したベシクルがえられ、本発明がカルセインのみではなく、高分子物質の内包化にも適用できることが示された。なお、内包されたα−キモトリプシンの比活性は、内包前の８０％以上であったことから、本発明技術は、酵素などの生体成分の活性を高く維持したまま内包化できる技術であることも確認できた。
【００６０】
[実施例５]
Ｗ／Ｏエマルションを製造する際の乳化剤として、ソルビタン脂肪酸エステルを用いずに、ベシクル構成脂質を直接用いて均一径Ｗ／Ｏエマルションを製造することで、ベシクル製造工程の効率化を図った。
【００６１】
マイクロチャネル基板として、テラス長、チャネル深さおよびチャネル幅がそれぞれ２０、２および１０μｍのものを用い、実験用クロスフロー型マイクロチャネルモジュールを利用して実施例１と同様にＷ／Ｏエマルションを製造した。ただし、油相としてはPC、Chol、SAをヘキサン中にモル比５：５：０または５：５：１、総脂質濃度１．６〜８ｍｇ／ｍＬになるように溶解したもの、水相としては０．４ｍｍｏｌ／Ｌのカルセインおよび０〜０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含むTris-HCl緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９）を使用した。
【００６２】
ＰＣおよびCholのみを含むヘキサン溶液を油相とした場合、均一径のＷ／Ｏエマルションは得られなかった。また、ＰＣ：Chol：ＳＡ＝５：５：１の脂質を用いた場合、脂質濃度が１．３ｍｇ／ｍＬのときには図１０（ａ）に示すように均一径のエマルションが得られなかったが、同様の脂質組成で脂質濃度を６．５ｍｇ／ｍＬに増加させると、図１０（ｂ）に示すように均一系Ｗ／Ｏエマルションを得ることができた。
【００６３】
内水相中にＮａＣｌを添加しておくと、より低い脂質濃度でも均一径Ｗ／Ｏエマルションが得られた。以上の結果を表１にまとめた。この結果から、ＳＡ（５０ｎｍベシクル）などの荷電脂質の添加およびＮａＣｌなどの塩の添加が、Ｗ／Ｏエマルションを安定に作製するために有効であることが示された。
【００６４】
【表１】
2008212813.tif 000003
【００６５】
このＷ／Ｏエマルションを液体窒素中で凍結させ、−２０℃の低温室に保存することで、油相は液体、水相は固体の状態のエマルションとした。任意量の油相を除去後、任意濃度のベシクル構成脂質を含むヘキサンを添加してエマルション中の水相濃度と脂質濃度を調整したのち、実施例1と同様にして−５〜−１０℃、１５〜２０hPaでヘキサンを除去した。これに、４℃の条件下でTris-HCl緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９）を添加して水相滴を覆う脂質薄膜を水和したのち、同緩衝液をさらに添加してベシクル懸濁液を得た。本手順によっても、カルセインを内包したベシクルが得られることが蛍光顕微鏡観察により確認できた。このときのカルセインの内包率は約１８％であった。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】（ａ）〜（ｄ）は本発明におけるベシクル作製過程の概略を示す図
【図２】（ａ）は装置のフローを示す図、（ｂ）は装置の構成例を示す図
【図３】（ａ）はクロスフロー型マイクロチャネル乳化装置モジュールの斜視図、（ｂ）は同モジュールの要部拡大図
【図４】実施例１のＷ／Ｏエマルションの顕微鏡写真
【図５】水相液滴のみが蛍光を発している状態を示すＷ／Ｏエマルションの顕微鏡写真
【図６】（ａ）、（ｂ）は凍結前の水滴、（ｃ）、（ｄ）は凍結してヘキサンを蒸発除去した後の凍結水滴の状態を示す顕微鏡写真
【図７】実施例１により製造されたベシクルの顕微鏡写真
【図８】実施例２により製造されたベシクルへのカルセインの内包率を示す図
【図９】実施例３により製造されたベシクルへの流液分布を示す図
【図１０】（ａ）及び（ｂ）は脂質濃度によるＷ／Ｏエマルションの均一性への影響を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2008212813.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月7日(2007.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
【図１】（ａ）〜（ｄ）は本発明におけるベシクル作製過程の概略を示す図
【図２】（ａ）は装置のフローを示す図、（ｂ）は装置の構成例を示す図
【図３】（ａ）はクロスフロー型マイクロチャネル乳化装置モジュールの斜視図、（ｂ）は同モジュールの要部拡大図
【図４】実施例１のＷ／Ｏエマルションの顕微鏡写真
【図５】水相液滴のみが蛍光を発している状態を示すＷ／Ｏエマルションの顕微鏡写真
【図６】（ａ）、（ｂ）は凍結前の水滴、（ｃ）、（ｄ）は凍結してヘキサンを蒸発除去した後の凍結水滴の状態を示す顕微鏡写真
【図７】実施例１により製造されたベシクルの顕微鏡写真
【図８】実施例２により製造されたベシクルへのカルセインの内包率を示す図
【図９】実施例３により製造されたベシクルへの粒径分布を示す図
【図１０】（ａ）及び（ｂ）は脂質濃度によるＷ／Ｏエマルションの均一性への影響を示す図
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月19日(2007.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（５）の工程からなることを特徴とするベシクルの製造方法。
（１）内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、乳化剤を含む油相とからＷ/Ｏエマルションを作成する工程。
（２）前記Ｗ/Ｏエマルションの水溶液が凍結粒子となり、油相は液体の状態を維持する温度まで冷却する工程。
（３）前記凍結粒子にベシクル構成脂質を含む油相を添加し、攪拌することで凍結粒子表面の乳化剤をベシクル構成脂質に置換する工程。
（４）前記凍結粒子表面の乳化剤をベシクル構成脂質に置換した後に油相を除去する工程。
（５）脂質膜によって表面が覆われた凍結粒子に外水相を添加し、外水相と脂質膜とを水和させることを特徴とするベシクルの製造方法。
【請求項２】
以下の（１）--〜（３）の工程からなることを特徴とするベシクルの製造方法。
（１）内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、乳化剤として機能する脂質を含む油相とからＷ/Ｏエマルションを作成する工程。
（２）前記Ｗ/Ｏエマルションの水溶液が脂質膜によって表面が覆われた凍結粒子となり、油相は液体の状態を維持する温度まで冷却して油相を除去する工程。（３）前記凍結粒子に外水相を添加し、外水相と凍結粒子表面の脂質膜とを水和させることを特徴とするベシクルの製造方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のベシクルの製造方法において、前記外水相を添加する際に、同じ脂質膜にて覆われた前記ベシクルよりも微細なベシクルを混合することを特徴とするベシクルの製造方法。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載のベシクルの製造方法において、前記外水相を添加する際に、グリセロールなどの外水相の凝固点を下げる物質を添加することを特徴とするベシクルの製造方法。
【請求項５】
請求項１または請求項２に記載のベシクルの製造方法において、前記油相の除去は減圧蒸発にて行い、この減圧蒸発及び引き続き行う水和に用いる容器内側は疎水化しておくことを特徴とするベシクルの製造方法。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５のいずれかに記載のベシクルの製造方法にて製造されたことを特徴とするベシクル。
【請求項７】
以下の（１）--〜（４）の工程からなることを特徴とするベシクルを製造するための凍結粒子の製造方法。
（１）内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、乳化剤を含む油相とからＷ/Ｏエマルションを作成する工程。
（２）前記Ｗ/Ｏエマルションの水溶液が凍結粒子となり、油相は液体の状態を維持する温度まで冷却する工程。
（３）前記凍結粒子にベシクル構成脂質を含む油相を添加し、攪拌することで凍結粒子表面の乳化剤をベシクル構成脂質に置換する工程。
（４）前記凍結粒子表面の乳化剤をベシクル構成脂質に置換した後に油相を除去する工程。
【請求項８】
以下の（１）及び-（２）の工程からなることを特徴とするベシクルを製造するための凍結粒子の製造方法。
（１）内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、乳化剤として機能する脂質を含む油相とからＷ/Ｏエマルションを作成する工程。
（２）前記Ｗ/Ｏエマルションの水溶液が脂質膜によって表面が覆われた凍結粒子となり、油相は液体の状態を維持する温度まで冷却して油相を除去する工程。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
（プロセスの改良による内包率の向上）
実施例1と同様にしてマイクロチャネル乳化法により調製し、同様の手順で乳化剤の置換、油相溶媒の除去を行った。つづく脂質薄膜の水和処理においては、次のような操作を行った。
（１）Tris-HCl緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９）を添加して脂質薄膜を水和（＝実施例１）
（２）系に添加する外水相として上記の直径５０ｎｍのベシクル懸濁液を使用して脂質薄膜を水和
（３）−２℃の温度下で１０％グリセロール溶液を用いて脂質薄膜を水和したのち、上記の直径５０ｎｍのベシクル懸濁液を添加
（４）上記（３）と同様の操作を上記疎水化ガラス容器中で行い脂質薄膜を水和
これらの各処理によって得られたベシクルへのカルセインの内包率を図８に示した。図中のデータに添えられた数字（１）〜（４）は、上記操作（１）〜（４）の結果と対応している。図に示したように、上記の改良によりカルセインの内包率は向上し、（４）の方法では実施例１における値の３．６倍に相当する４３％もの高い内包率を達成することができた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
2008212813.tif 000014
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
2008212813.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月11日(2007.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（５）の工程からなることを特徴とするベシクルの製造方法。
（１）内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、乳化剤を含む油相とからＷ/Ｏエマルションを作成する工程。
（２）前記Ｗ/Ｏエマルションの水溶液が凍結粒子となり、油相は液体の状態を維持する温度まで冷却する工程。
（３）前記凍結粒子にベシクル構成脂質を含む油相を添加し、攪拌することで凍結粒子表面の乳化剤をベシクル構成脂質に置換する工程。
（４）前記凍結粒子表面の乳化剤をベシクル構成脂質に置換した後に油相を除去する工程。
（５）脂質膜によって表面が覆われた凍結粒子に外水相を添加し、外水相と脂質膜とを水和させる工程。
【請求項２】
以下の（１）〜（３）の工程からなることを特徴とするベシクルの製造方法。
（１）内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、乳化剤として機能する脂質を含む油相とからＷ/Ｏエマルションを作成する工程。
（２）前記Ｗ/Ｏエマルションの水溶液が脂質膜によって表面が覆われた凍結粒子となり、油相は液体の状態を維持する温度まで冷却して油相を除去する工程。
（３）前記凍結粒子に外水相を添加し、外水相と凍結粒子表面の脂質膜とを水和させる工程。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のベシクルの製造方法において、前記外水相を添加する際に、同じ脂質膜にて覆われた前記ベシクルよりも微細なベシクルを混合することを特徴とするベシクルの製造方法。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載のベシクルの製造方法において、前記外水相を添加する際に、グリセロールなどの外水相の凝固点を下げる物質を添加することを特徴とするベシクルの製造方法。
【請求項５】
請求項１または請求項２に記載のベシクルの製造方法において、前記油相の除去は減圧蒸発にて行い、この減圧蒸発及び引き続き行う水和に用いる容器内側は疎水化しておくことを特徴とするベシクルの製造方法。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５のいずれかに記載のベシクルの製造方法にて製造されたことを特徴とするベシクル。
【請求項７】
以下の（１）〜（４）の工程からなることを特徴とするベシクルを製造するための凍結粒子の製造方法。
（１）内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、乳化剤を含む油相とからＷ/Ｏエマルションを作成する工程。
（２）前記Ｗ/Ｏエマルションの水溶液が凍結粒子となり、油相は液体の状態を維持する温度まで冷却する工程。
（３）前記凍結粒子にベシクル構成脂質を含む油相を添加し、攪拌することで凍結粒子表面の乳化剤をベシクル構成脂質に置換する工程。
（４）前記凍結粒子表面の乳化剤をベシクル構成脂質に置換した後に油相を除去する工程。
【請求項８】
以下の（１）及び-（２）の工程からなることを特徴とするベシクルを製造するための凍結粒子の製造方法。
（１）内包させる物質を溶解あるいは懸濁状態で含む水溶液と、乳化剤として機能する脂質を含む油相とからＷ/Ｏエマルションを作成する工程。
（２）前記Ｗ/Ｏエマルションの水溶液が脂質膜によって表面が覆われた凍結粒子となり、油相は液体の状態を維持する温度まで冷却して油相を除去する工程。