(57)【要約】【課題】  定着支持剤を安定してゲル化することが可能となる生検試料の定着支持剤、生検試料の定着支持剤の製造方法、及び生検試料の定着支持方法を提供すること。【解決手段】  生検試料の定着支持剤は、アルキルオキシダイズドグルコマンナンと、防腐剤とを有する。このような定着支持剤を用いて生検試料を支持することにより、生検試料及び定着支持剤にゲル化剤を添加した際に安定したゲル化を行うことができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルキル化高分子多糖類と、
防腐剤とを有することを特徴とする生検試料の定着支持剤。
【請求項２】
アルキルオキシダイズドグルコマンナンと、
防腐剤とを有することを特徴とする生検試料の定着支持剤。
【請求項３】
前記アルキルは、メチル、エチル、プロピルのいずれか一つであることを特徴とする請求項１または請求項２記載の生検試料の定着支持剤。
【請求項４】
前記防腐剤はホルムアルデヒドを有することを特徴とする請求項１から請求項３いずれか一項に記載の生検試料の定着支持剤。
【請求項５】
グルコマンナンを酸化し酸化グルコマンナンを生成する工程と、
前記酸化グルコマンナンを乳化し第１乳化物を生成する工程と、
前記第１乳化物を脱水する工程と、
前記脱水工程後、生成物をアルキル化する工程と
を有することを特徴とする生検試料の定着支持剤の製造方法。
【請求項６】
前記アルキル化工程は、メチル化、エチル化又はプロピル化のいずれか一つであることを特徴とする請求項５記載の生検試料の定着支持剤の製造方法。
【請求項７】
前記アルキル化工程後、生成物を精製し、これをアルコールにて乳化して第２乳化物を生成する工程と、
前記第２乳化物を乾燥、粉末とする工程と、
前記粉末を防腐剤に溶解する工程と
を有することを特徴とする請求項５または請求項６記載の生検試料の定着支持剤の製造方法。
【請求項８】
前記アルキル化工程では、前記脱水工程により得られた生成物に塩酸を加えて加温下で攪拌した後、自然放冷することを特徴とする請求項５から請求項７いずれか一項に記載の生検試料の定着支持剤の製造方法。
【請求項９】
包埋カセットに生検試料を収容する工程と、
前記生検試料の周囲の空間にメチルオキシダイズドグルコマンナンと防腐剤とを有する定着支持剤を注入する工程と、
前記生検試料及び前記定着支持剤を、ゲル化剤からなる液中に浸漬してゲル化する工程と
を有することを特徴とする生検試料の定着支持方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生検試料を変質しないように定着するための生検試料の定着支持剤、定着支持剤の製造方法、並びに生検試料の定着支持方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
病理や臨床検査分野で、高分子多糖類、例えばマンナンを用いた包埋支持剤が報告されている（例えば、特許文献１参照）。このマンナンを用いた包埋支持剤では、包埋カセットに生検試料を収容し、その生検試料の周囲の空間にマンナンと防腐剤とからなる定着支持剤を注入した後、これをメタノールとホルマリンからなるゲル化剤に浸漬することによって、定着支持剤をゲル化して生検試料と包埋カセットとを一体的に支持している。
【特許文献１】特許第３０４９５３７号公報（段落[００１９]〜［００２７］）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、上述のマンナンを用いた定着支持剤においては、定着支持剤をゲル化する際に、安定的にゲル化することができず、定着された細胞に不均一な部分が存在するために生検試料が定着支持剤内部で分散もしくは試料が破壊してしまうという問題があった。また、定着支持剤をゲル化する際の反応性に部分差が生じるという問題があった。
【０００４】
本発明は、上述の課題に鑑みてなされたもので、定着支持剤を安定してゲル化することが可能となる生検試料の定着支持剤、生検試料の定着支持剤の製造方法及び生検試料の定着支持方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明の主たる観点に係る生検試料の定着支持剤は、アルキル化高分子多糖類と、防腐剤とを有することを特徴とする。
【０００６】
本発明のこのような構成の定着支持剤を用いて生検試料を支持することにより、生検試料及び定着支持剤にゲル化剤を添加した際に安定したゲル化を行うことができる。これにより、定着支持部材内部における生検試料の分散もしくは破壊並びにゲル化時の不均一な反応を抑止又は阻止することが可能となる。従って、生検試料を変質しないよう安定して定着することができる。      
【０００７】
また、本発明の他の観点にかかる生検試料の定着支持剤は、アルキルオキシダイズドグルコマンナンと、防腐剤とを有することを特徴とする。
【０００８】
本発明は、このように高分子多糖類としてグルコマンナンを用い、これをアルキル化したアルキルオキシダイズドグルコマンナンを定着支持剤に用いることができる。本発明のこのような構成の定着支持剤を用いて生検試料を支持することにより、生検試料及び定着支持剤にゲル化剤を添加した際に安定したゲル化を行うことができる。これにより、定着支持部材内部における生検試料の分散もしくは破壊並びにゲル化時の不均一な反応を抑止又は阻止することが可能となる。従って、生検試料を変質しないよう安定して定着することができる。
【０００９】
本発明の一の形態によれば、前記アルキルは、メチル、エチル、プロピルのいずれか一つであることを特徴とする。このように、アルキルはメチル、エチル、プロピルのいずれか一つであってよい。
【００１０】
本発明の一の形態によれば、前記防腐剤はホルムアルデヒドを有することを特徴とする。このように防腐剤としてホルムアルデヒドを有するものを用いることができる。
【００１１】
本発明の主たる観点に係る定着支持剤の製造方法は、グルコマンナンを酸化し酸化グルコマンナンを生成する工程と、前記酸化グルコマンナンを乳化し第１乳化物を生成する工程と、前記第１乳化物を脱水する工程と、前記脱水工程後、生成物をアルキル化する工程とを有することを特徴とする。
【００１２】
本発明のこのような構成により製造された定着支持剤はアルキル化したアルキルオキシダイズドグルコマンナンを有する。このような定着支持剤を用いて生検試料を支持することにより、生検試料及び定着支持剤にゲル化剤を添加した際に安定したゲル化を行うことができる。これにより、定着支持部材内部における生検試料の分散もしくは破壊並びにゲル化時の不均一な反応を抑止又は阻止することが可能となる。従って、生検試料を変質しないよう安定して定着することができる。
【００１３】
本発明の一の形態によれば、前記アルキル化工程は、メチル化、エチル化又はプロピル化のいずれか一つであることを特徴とする。このようにアルキル化工程は、メチル化、エチル化又はプロピル化のいずれか一つであってよい。
【００１４】
本発明の一の形態によれば、前記アルキル化工程後、生成物を精製し、これをアルコールにて乳化して第２乳化物を生成する工程と、前記第２乳化物を乾燥、粉末とする工程と、前記粉末を防腐剤に溶解する工程とを有することを特徴とする。このように製造された定着支持剤を用いて生検試料を支持することにより、生検試料及び定着支持剤にゲル化剤を添加した際に安定したゲル化を行うことができる。これにより、定着支持部材内部における生検試料の分散もしくは破壊並びにゲル化時の不均一な反応を抑止又は阻止することが可能となる。従って、生検試料を変質しないよう安定して定着することができる。
【００１５】
本発明の一の形態によれば、前記アルキル化工程では、前記脱水工程により得られた生成物に塩酸を加えて加温下で攪拌した後、自然放冷することを特徴とする。このように、自然放冷することにより、いわゆる熟成といわれる自己反応を促進することができ、アルキル化を十分行うことができる。
【００１６】
本発明の主たる観点に係る生検試料の定着支持方法は、包埋カセットに生検試料を収容する工程と、前記生検試料の周囲の空間にメチルオキシダイズドグルコマンナンと防腐剤とを有する定着支持剤を注入する工程と、前記生検試料及び前記定着支持剤を、ゲル化剤からなる液中に浸漬してゲル化する工程とを有することを特徴とする。
【００１７】
本発明のこのような構成によれば、定着支持剤としてメチルオキシダイズドグルコマンナンと防腐剤とを有するものを用いるので、ゲル化剤によってゲル化する際に、安定したゲル化状態を得ることができる。これにより、定着支持部材内部における生検試料の分散もしくは破壊並びにゲル化時の不均一な反応を抑止又は阻止することが可能となる。従って、生検試料を変質しないよう安定して定着することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（生検試料の定着支持剤用粉末及び生検試料の定着支持剤の製造方法）
【００１９】
以下、本発明の生検試料の定着支持剤用粉末及び生検試料の定着支持剤の製造方法について図１〜図５を用いて説明する。本実施形態においては、高分子多糖類としてグルコマンナンを用いた。
【００２０】
図１は定着支持剤用粉末及び定着支持剤の製造工程図である。図２はグルコマンナン酸化工程における粘度変化を示す図である。図３は第１乳化工程におけるホモジナイザーの回転速度及び処理時間と粘度との関係を示す図である。図４はメチル化工程における本実施例及び比較例それぞれの処理条件を示す図である。
【００２１】
酸化工程（Ｓ１）においては、まず蒟蒻製粉２００ｇを５ｗｔ％過酸化水素水３リットルに溶解し、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃の処理温度条件で約７日間反応させた。溶解物は、反応初期には固化状態を示すが、酸化が進行するに従って流動性を持ち、攪拌が可能の状態となる。図２に示すように、いずれの処理温度条件でも反応開始から３日目には攪拌可能な状態、すなわち流動性が観察され、７日目以降には溶解物の粘度はほぼ横ばい状態となった。尚、溶解物の粘度の測定は、攪拌機のトルクは無視し、最低回転数１５ｒｐｍ、粘度測定条件２５℃で行った。酸化工程の終了は流動性の度合いで確認し、処理温度に関わらず、その粘度が６５０００ｍＰａ・ｓ以下となった時点で酸化工程が終了されたものと判断した。尚、酸化工程における処理温度は２０〜５０℃が好ましく、更に好ましくは３５〜４５℃の処理温度が最適である。処理温度が２０℃よりも低いと反応速度が著しく低下し酸化反応終了までは１４日を要した。逆に５０℃よりも高いと期待しない極低粘度状態を呈した。この酸化工程により酸化グルコマンナンが生成される。
【００２２】
次に、第１乳化工程（Ｓ２）においては、純度９９．５％のメタノール２リットルに等量の酸化工程で得られた酸化グルコマンナンを添加して凝集させる。この凝集物をホモジナイザーにて乳化する。この際、凝集物の塊状化を防止するため、微細化に用いるホモジナイザーはファインジェネレーター装着型とし、５０００ｒｐｍ、１５分の処理条件で乳化した。尚、１５分を越えて処理を行うと、ジェネレーターの摩擦熱により第１乳化物がガム状となり以後の工程での反応が不可能となった。尚、ホモジナイザーの機種及び処理条件によってガム状となるまでの時間が異なるので、ガム状に変化しないような処理条件を設定する必要がある。図３に示すように、いずれの回転数においても処理時間１５分でほぼ乳化の進行が終了する。乳化工程の終了は液粘度で確認し、粘度測定温度２５℃の下で、その粘度が１０００ｍＰａ・ｓ以下となった時点で第１乳化工程が終了されたものと判断した。この第１乳化工程により第１乳化物が生成される。
【００２３】
次に、脱水工程（Ｓ３）においては、第１乳化工程で得られた第１乳化物にメタノールを添加し、エバポレーターを用いた蒸留を行って、５回混合脱水を行って、これをメタノール浸漬グルコマンナンとする。脱水工程の終了は、得られた溶液の擬似アルコールランプによる着火により確認した。もし擬似アルコールランプにて着火しなかった場合は、脱水が完全に終了していないと判断した。本実施形態においては、１〜４回の脱水では、擬似アルコールランプによる着火が確認されず、脱水が完全に終了していなかった。脱水が完全に終了していない場合、メチル化工程にてメチル付加反応の阻害と反応速度の低下を引き起こす恐れがある。
【００２４】
次に、メチル化工程（Ｓ４）においては、脱水工程で得られた生成物であるメタノール浸漬グルコマンナンに１５Ｎ塩酸を加えて０．７５ｖｏｌ．％の濃度とし、これを湯煎にて６０℃下、２００ｒｐｍの回転速度で攪拌させた状態で約５時間反応させメチル化を行う。その後、加熱を停止し、湯煎につけた状態で放置し室温まで温度を下げて反応を停止させた。確実にメチル化を行うため、１５Ｎ塩酸添加後の濃度は０．５〜０．８ｖｏｌ．％、反応温度は６０〜６５℃、また撹拌は反応器から反応物が溢れ出ないような範囲の任意の回転数に設定する。反応はいわゆる熟成といわれる自己反応を促進させるため、冷水添加による反応の強制停止はせず、反応器を過熱する湯煎が自然放冷されて１５〜３０℃まで除冷されることにより反応を停止することが好ましい。これに対し、比較例として、脱水工程で得られたメタノール浸漬グルコマンナンに１５Ｎ塩酸を加えて１．０ｖｏｌ．％の濃度とし、これを湯煎にて５５℃下約２時間、無攪拌の状態で反応させてメチル化を行った。その後、水を添加して温度を下げて強制的に反応を停止させた。このように得られた比較例の生成物では系内に塊状物質の生成を確認した。この生成物から生成される定着支持剤を２４時間の経時変化を観察したところ、系の黄変と塩酸の臭気を認めた。これはメチル化が完結されていないためと考えられる。
【００２５】
次に、精製工程（Ｓ５）においては、メチル化工程で得られたメチル化物を純水中に分散させ、５５℃の加温下、エバポレーターを用いた真空状態で攪拌洗浄を行う。これにより、未反応の酸化剤である塩酸がガス化して除去され塩化物が分離される。これを常温下にて濾過し、塩酸を失ってさらに析出する残渣を除去するため、得られた溶液を再び常温下にて濾過することにより、精製物を得た。
【００２６】
次に、第２乳化工程（Ｓ６）においては、精製工程で得られた精製物を純度９９．５％以上のメタノールにて乳化し、第２乳化物を得た。
【００２７】
次に、乾燥、粉末工程（Ｓ７）においては、第２乳化工程で得られた第２乳化物を乾燥して粉末とする。これによりメチルオキシダイズドグルコマンナンからなる生検試料の定着支持剤用粉末が製造される。
【００２８】
次に、溶解工程（Ｓ８）においては、定着支持剤用粉末を、任意の濃度、例えば１５〜７５％の濃度のホルムアルデヒド水溶液に溶解する。これにより、アルキル化高分子多糖類としてのメチルオキシダイズドグルコマンナンと、防腐剤としてのホルムアルデヒド水溶液とを有する定着支持剤が得られる。
【００２９】
（生検試料の定着支持方法）
【００３０】
次に、上述の製造方法にて製造された定着支持剤を用いた生検試料の定着支持方法について図５〜図１２を用いて説明する。
【００３１】
図５は包埋カセットの斜視図であり、蓋３の図示は省略している。図６は、包埋カセット内に定着支持剤を注入する工程を示す縦断面図である。図７は、ゲル化工程を示す縦断面図である。図８は、脱水、脱脂、透徹して包埋剤を浸透する工程を示す縦断面図である。図９は、定着支持剤に埋設された生検試料の状態を示す縦断面図である。図１０は、生検試料の包埋工程を示す縦断面図である。図１１は、図１０の包埋工程を終了した後の生検試料の状態を示す縦断面図である。図１２は、図１０に示す生検試料を薄切りする状態の縦断面図である。図１３は、図１２によって得られる薄切りされた薄切り断片を示す斜視図である。
【００３２】
まず、生検試料を収容する包埋カセットについて図５〜図１３を用いて説明する。この包埋カセットは、人体から摂取した生検試料が変質しないよう収容するものである。
【００３３】
包埋カセット４は、長方形状の平面状枠体４１の中央部に扁平な容器４２の下縁部４３を平面状枠体４１の下面に向けて突設してなる。容器４２の蓋３及び底面１の少なくとも一方は透明な多孔板２で形成されている。容器４２の開口縁の周囲における平面状枠体４１の上面には突状縁４４が設けられており、容器４２の周囲における平面状枠体４１にその上下両面に通ずる連通孔４５が設けられている。包埋カセット４の前端部に前方掛止片４６を、後端部に後方掛止片４７を、それぞれ設け、これらに蓋３を着脱自在に嵌合している。包埋カセット４は合成樹脂で形成されている。
【００３４】
次に、生検試料の定着支持方法について説明する。
【００３５】
まず、図６に示すように底面１が透明な多孔板２で形成された蓋３付の扁平な包埋カセット４をシャーレ１２上に配置する。そして、包埋カセット４の内部に生検試料５を収容し、生検試料５の上方及び全周囲に、上述の製造方法にて製造した定着支持剤６を定着支持剤容器１３から矢印Ａ６に示すように流し込んで充填する。これにより生検試料５を変質しないように定着すると共に包埋カセット４に支持する。この際、検査者、例えば臨床医の希望する生検試料５の検査面が包埋カセット４の底面１に接着するように定着支持剤６で支持する。
【００３６】
ここで、定着支持剤の定着とは蛋白質の凝固作用を利用して、生の組織を経時的に変質しないように固定し、生検試料の各成分の形態を生前に近い状態に保つことである。また、支持とは、生検試料を包埋カセット内の底板上面に移動しないように確実に接着してその位置を保つことである。
【００３７】
図６に示す状態の包埋カセット４と生検試料５と定着支持剤６を、図７に示すようにカプセル１４とその蓋１５内に入れられている９９．５％メタノールとホルマリンからなるゲル化剤７に浸漬して、定着支持剤６をゲル化することによって生検試料５を包埋カセット４中に一体的に支持する。この状態で例えば臨床医室から病理室に郵送などで包埋カセット４が搬送される。ここで、ゲル化剤７に浸漬して定着支持剤６をゲル化しているが、本実施形態においては、メチルオキシダイズドグルコマンナンとホルムアルデヒド水溶液とを有する定着支持剤６を用いているため、ゲル化剤７によるゲル化の際、安定したゲル化を行うことができる。すなわち、グルコマンナンをメチル化することによって、親水性が低下して周囲の水分の浸入なしに粘弾性体となり、安定したゲル化を行うことができる。これにより、定着支持剤内部における生検試料の分散もしくは破壊並びにゲル化時の不均一な反応を抑止または阻止することが可能となる。
【００３８】
ゲル化剤７としては、上述に記載したものの他に、例えばアルコールホルマリン、アルコール、ポリエチレングリコール、グリセリン等のアルコール及びアセトンが用いられる。
【００３９】
病理室においてカプセル１４から、包埋カセット４に固定されている状態で生検試料５を取り出して、図８に示すようにそこに予め用意されている処理容器９内のアルコール等の高脱水処理剤８ａに浸して脱水処理する。その後、順次図示しない別の処理容器内の脱脂、及び透徹の各処理剤８ｂ、８ｃに順次浸す。これにより、脱水、脱脂、及び透徹し、パラフィンまたは樹脂等からなる溶融包埋剤を浸透させる。
【００４０】
その後、処理容器９内から包埋カセット４を取り出し、更にその包埋カセット４の中から前記溶融包埋剤の浸透した生検試料５を図９に示すように定着支持剤６中に埋設されているゲル状ブロック３６の状態で取り出して、そのまま図１０に示すように包埋皿１０上に載置する。
【００４１】
生検試料５の上部における包埋皿１０に空の包埋カセット４を配置し、その上からこれらに包埋剤として溶融状態のパラフィン１１を注入し、これを冷却することによって冷却固化する。この固化したパラフィン１１の中に定着支持剤に埋設された生検試料５を包埋カセット４の一部と共に包埋する。
【００４２】
パラフィン１１が硬化した後、図１０に示す状態の包埋皿１００から包埋カセット４を取り除く。これにより、図１１に示すように包埋カセット４の底面１の多孔板２をパラフィン１１で鋳込んだ状態で、しかもその中に生検試料５を包埋した生検試料の包埋ブロック１８を得る。
【００４３】
その後、包埋ブロック１８を図１２の支持台１９で保持し、ミクロトームの刃１７を矢印Ａ１７方向に往復動して薄切りし、図１３の生検試料の薄切り切片２０を得る。
【００４４】
以上のように本実施形態においては、定着支持剤としてメチルオキシダイズドグルコマンナンとホルムアルデヒド水溶液を有する定着支持剤を用いることにより、安定したゲル化を行うことができ、定着支持剤内部における生検試料の分散もしくは破壊並びにゲル化時の不均一な反応を抑止または阻止することが可能となる。
【００４５】
本実施形態においては、定着支持剤用粉末としてメチルオキシダイズドグルコマンナンを用いたが、エチルオキシダイズドグルコマンナン、プロピルオキダイズドグルコマンナンを用いることができ、同様にゲル化剤を添加した際に安定したゲル化を行うことができる。
【００４６】
また、本実施形態においては、アルキル化高分子多糖類としてメチルオキシダイズドグルコマンナンを用いたが、高分子多糖類として寒天やゼラチンなどを用いて、これをアルキル化したものを用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本実施形態における定着支持剤及び生検試料の定着支持剤用粉末の製造工程図。
【図２】グルコマンナン酸化工程における粘度変化を示す図。
【図３】第１乳化工程におけるホモジナイザーの回転速度及び処理時間と粘度との関係を示す図。
【図４】メチル化工程における本実施例及び比較例における処理条件を示す図。
【図５】包埋カセットの斜視図。
【図６】包埋カセット内に定着支持剤を注入する工程を示す縦断面図。
【図７】ゲル化工程を示す縦断面図。
【図８】脱水、脱脂、透徹して包埋剤を浸透する工程を示す縦断面図。
【図９】定着支持剤に埋設された生検試料の状態を示す縦断面図。
【図１０】生検試料の包埋工程を示す縦断面図。
【図１１】図１０の包埋工程を終了した後の生検試料の状態を示す縦断面図。
【図１２】図１０に示す生検試料を薄切りする状態の縦断面図。
【図１３】図１２によって得られる薄切りされた薄切り断片を示す斜視図。
【符号の説明】
【００４８】
６  定着支持剤
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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