(57)【要約】【課題】高３ＨＨ組成のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を従来よりも効率よく生産し、その生産収率を増大させるのに有効な微生物を提供すること。【解決手段】アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性またはβ−ケトチオラーゼ活性を減少させたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）産生微生物。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に示す（ａ）（ｂ）のいずれか一方もしくは両方の特徴を有し、かつ、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のモノマーユニットで構成される共重合ポリエステルの生産能を有するワーテルシア属、カプリアビダス属、ラルストニア属、アルカリゲネス属及びシュードモナス属からなる群より選択される微生物。
（ａ）アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の全部もしくは一部が欠失されたことにより、またはアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の開始コドンより上流１０塩基以内に存在するリボソーム結合部位の塩基配列に少なくとも１塩基以上の置換、欠失もしくは挿入がなされたことにより、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性が０．３Ｕ／ｍｇ蛋白質以下である。
（ｂ）β−ケトチオラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列に少なくとも１塩基以上の置換、欠失もしくは挿入がなされたことにより、β−ケトチオラーゼ活性が欠損又は減少されている。
【請求項２】
ワーテルシア・ユートロファであることを特徴とする、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のモノマーユニットで構成される共重合ポリエステルの重合酵素遺伝子を染色体上に保持していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
重合酵素遺伝子がアエロモナス・キャビエ由来の酵素又は変異体をコードするものである、請求項３に記載の微生物。
【請求項５】
重合酵素遺伝子が、配列番号１のアミノ酸配列で示されるアエロモナス・キャビエ由来の変異体酵素をコードするものである、請求項３に記載の微生物。
【請求項６】
配列番号２に示す遺伝子配列の１２９６番目から２０３６番目までを欠失していることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項７】
配列番号２に示す遺伝子配列の１２８７番目の塩基グアニンがシトシンに置換され、かつ１２８９番目の塩基アデニンがシトシンに置換されていることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項８】
配列番号２に示す遺伝子配列の１２８８番目の塩基グアニンがチミンに置換され、かつ１２９０番目の塩基グアニンがシトシンに置換されていることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項９】
配列番号３に示すβ−ケトチオラーゼ遺伝子の１６番目のアミノ酸であるリジンが終止コドンに置換していることを特徴とする、請求項２〜８のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
ワーテルシア・ユートロファＨ１６株の染色体上にある、配列番号２４に示す遺伝子配列の８４２番目から２６１１番目までが、配列番号２５に示す遺伝子配列に置換され、かつ配列番号２に示す遺伝子配列の１２９６番目から２０３６番目までを欠失している微生物。
【請求項１１】
ワーテルシア・ユートロファＨ１６株の染色体上にある、配列番号２４に示す遺伝子配列の８４２番目から２６１１番目までが、配列番号２５に示す遺伝子配列に置換され、配列番号２に示す遺伝子配列の１２８７番目の塩基グアニンがシトシンに置換され、かつ１２８９番目の塩基アデニンがシトシンに置換されている微生物。
【請求項１２】
ワーテルシア・ユートロファＨ１６株の染色体上にある、配列番号２４に示す遺伝子配列の８４２番目から２６１１番目までが、配列番号２５に示す遺伝子配列に置換され、配列番号２に示す遺伝子配列の１２８８番目の塩基グアニンがチミンに置換され、かつ１２９０番目の塩基グアニンがシトシンに置換されている微生物。
【請求項１３】
ワーテルシア・ユートロファＨ１６株の染色体上にある、配列番号２４に示す遺伝子配列の８４２番目から２６１１番目までが、配列番号２５に示す遺伝子配列に置換され、配列番号２に示す遺伝子配列の８５番目の塩基アデニンがチミンに置換され、かつ８８番目の塩基チミンがシトシンに置換されている微生物。
【請求項１４】
ワーテルシア・ユートロファＨ１６株の染色体上にある、配列番号２４に示す遺伝子配列の８４２番目から２６１１番目までが、配列番号２５に示す遺伝子配列に置換され、配列番号２に示す遺伝子配列の８５番目の塩基アデニンがチミンに置換され、８８番目の塩基チミンがシトシンに置換され、かつ１２９６番目から２０３６番目までを欠失している微生物。
【請求項１５】
ワーテルシア・ユートロファＨ１６株の染色体上にある、配列番号２４に示す遺伝子配列の８４２番目から２６１１番目までが、配列番号２５に示す遺伝子配列に置換され、配列番号２に示す遺伝子配列の８５番目の塩基アデニンがチミンに置換され、８８番目の塩基チミンがシトシンに置換され、１２８７番目の塩基グアニンがシトシンに置換され、かつ１２８９番目の塩基アデニンがシトシンに置換されている微生物。
【請求項１６】
ワーテルシア・ユートロファＨ１６株の染色体上にある、配列番号２４に示す遺伝子配列の８４２番目から２６１１番目までが、配列番号２５に示す遺伝子配列に置換され、配列番号２に示す遺伝子配列の８５番目の塩基アデニンがチミンに置換され、８８番目の塩基チミンがシトシンに置換され、１２８８番目の塩基グアニンがチミンに置換され、かつ１２９０番目の塩基グアニンがシトシンに置換されている微生物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の微生物を用いた、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のモノマーユニットで構成される共重合ポリエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、柔軟な性質を示す３−ヒドロキシヘキサン酸のモノマーユニットの比率が高い共重合ポリエステルを生産できるよう改良された微生物を用いる、生分解性ポリエステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカン酸は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分子ポリマーである。これらのポリマーは生分解性を有し、熱可塑性高分子であること、また、再生可能資源から産生されることから、環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている。
このポリエステルを構成するモノマー単位は一般名３−ヒドロキシアルカン酸であって、具体的には３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、あるいはよりアルキル鎖の長い３−ヒドロキシアルカン酸が単重合もしくは共重合することにより、ポリマー分子が形成されている。３−ヒドロキシ酪酸（以下３ＨＢと略す）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）は、１９２５年にバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）で最初に発見されたが、このＰ（３ＨＢ）は結晶性が高いため、硬くて脆い性質を持っており、実用的には応用範囲が限られている。
【０００３】
また、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とからなる共重合体（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）と略す）はＰ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むことが知られ、製造方法も開示されている（例えば特許文献１、特許文献２参照）。しかしながら、実際にはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は３ＨＶモル分率を増加させても、それに伴う物性の変化が乏しく、特に柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取っ手等、硬質成型体の分野にしか利用されなかった。
また、アルキル鎖の炭素数が６から１６の３−ヒドロキシアルカン酸で構成される中鎖ＰＨＡはＰ（３ＨＢ）やＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）よりも結晶性が低く、弾力に富んでいるので（非特許文献１参照）、異なる分野への用途が期待されている。中鎖ＰＨＡの製造研究は、シュードモナス属のＰＨＡ合成酵素遺伝子を、シュードモナス属、ラルストニア属、大腸菌に導入することによって行われてきたが、いずれも生産性が低く工業生産に適したものではなかった（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４参照）。
【０００４】
また、ポリヒドロキシアルカン酸の一種として、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステル（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と略す）が知られており、その製造方法が開示されている（特許文献３、特許文献４参照）。これら報告のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）を用いてオレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等の油脂から発酵生産するものであった。また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の性質に関する研究もなされている（非特許文献５参照）。この報告では炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてアエロモナス・キャビエを培養し、３ＨＨ組成が１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。すなわちＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成を変えることで、硬質ポリエステルから軟質ポリエステルまで応用可能な幅広い物性を持つため、テレビの筐体等のように硬さを要求されるものからフィルム等のように柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。しかしながら、本製造方法ではポリエステル生産性は１．２ｇ／Ｌと低いものであり、本ポリエステルの実用化に向けた生産方法としては未だ不十分と言わざるを得なかったため、実用化に向けて更に高い生産性が得られる方法が探索された。
【０００５】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の工業生産を目指した取組みもなされている。アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）を用いた培養では、オレイン酸を炭素源とした４３時間の流加培養において、ポリエステル生産性４３ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成１７％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が生産された（非特許文献６参照）。また、アエロモナス・ハイドロフィラを炭素源としてグルコース及びラウリン酸を用いて培養し、菌体生産量５０ｇ／Ｌ、ポリエステル含量５０％を達成した（非特許文献７参照）。しかしながら、アエロモナス・ハイドロフィラはヒトに対して病原性を有する（非特許文献８参照）ことから、工業生産に適した種とはいえない。また、これらの培養生産では高価な炭素源を使用するため、製造コストの観点より安価な炭素源の利用も求められている。
このため、安全な宿主での生産及び生産性の向上を目指した取組みが行なわれた。アエロモナス・キャビエよりポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子がクローニングされた（特許文献５参照）。本遺伝子をワーテルシア・ユートロファ（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、別名カプリアビダス・ニケーター、旧名ラルストニア・ユートロファ、アルカリゲネス・ユートロファス）ＰＨＢ−４株に導入した形質転換体を用いてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産を行った結果、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産性は２．９ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成４％であった。さらに、植物油脂を炭素源とした同菌株の培養条件改善によりＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産性２８ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成８．１％にまで向上したように、培養方法によって高３ＨＨ組成のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する方法も研究された（特許文献６参照）。しかしながら、工業的生産に応用するには、未だ不十分な生産性であった。
【０００６】
また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の物性を制御する方法も開示されている（特許文献６参照）。少なくとも２種類の炭素数の異なる油脂および／または脂肪酸を炭素源として用いることによって、３ＨＨ組成が１〜４０ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産することが可能となり、種々の物性を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が生産できるようになった。しかしながら、本製造方法では、３ＨＨ組成制御のために比較的高価なヘキサン酸、オクタン酸等を添加する必要があり、また高濃度のヘキサン酸は細胞毒性を示すことから菌体生産性が低下する結果となっている。また、多成分の炭素源を添加するため、生産設備が複雑・高価なものになりかねない。
【０００７】
また、フラクトースを炭素源としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産できるワーテルシア・ユートロファも構築されたが、本菌株のポリエステル生産性は低く、実生産に適しているとはいえなかった（非特許文献９参照）。
大腸菌を宿主としたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産株も構築された。アエロモナス属のＰＨＡ合成酵素遺伝子及びワーテルシア・ユートロファのＮＡＤＰ−アセトアセチルＣｏ−Ａ還元酵素遺伝子等を大腸菌に導入した株が構築された。ドデカンを炭素源として同大腸菌を培養した結果、４０．８時間培養でＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産性２１ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成１０．８％であった（非特許文献１０参照）。
アエロモナス・キャビエのＰＨＡ合成酵素遺伝子、エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子及びアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した大腸菌も構築された。同大腸菌をラウリン酸を含む培地で培養すると、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）含量約１６％、３ＨＨ組成約１６％であった（非特許文献１１参照）。これらの大腸菌では生産性は低く、工業的生産への適用は困難であった。
【０００８】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産性向上並びに３ＨＨ組成制御を目指して、ＰＨＡ合成酵素の人為的な改変が行なわれた。アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素変異体のなかで、１４９番目のアミノ酸アスパラギンがセリンに置換された変異体酵素や、１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異体酵素は、大腸菌内でのＰＨＡ合成酵素活性や３ＨＨ組成が向上していることが示された（非特許文献１２参照）。また、同酵素の５１８番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換された変異体酵素や２１４番目のバリンがグリシンに置換された変異体酵素は大腸菌でのＰＨＡ合成酵素活性やＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）含量が向上したことが報告されている（非特許文献１３参照）。しかし、これらは宿主として特殊な大腸菌を用いており未だＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）含量は低いことから、これらの変異体酵素の特徴を活かした工業的生産に向けた更なる改良が必要であった。
【０００９】
ワーテルシア・ユートロファをＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産用の宿主として用いる場合、合成経路で重要な酵素遺伝子はβ−ケトチオラーゼ遺伝子（ｐｈｂＡ）およびアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（ｐｈｂＢ）である（図１参照）。この両酵素は基質特異性の特徴から３−ヒドロキシ酪酸のモノマーユニットを優先的に供給していると考えられている。従って、両酵素の活性を低下させることによって相対的に３ＨＨ組成の高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が得られると期待できる。しかしながら宿主として頻用されているワーテルシア・ユートロファＰＨＢ−４株は、β−ケトチオラーゼ活性およびアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性が親株であるＨ１６株に比べてそれぞれ２０分の１程度に減少している（非特許文献１４参照）にもかかわらず、この株を宿主とした３ＨＨ組成が高くかつ生産性が高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産株の報告例はなく、ＰＨＢ−４株以外のβ−ケトチオラーゼ活性あるいはアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性が低下した株を用いた３ＨＨ組成が高くかつ生産性が高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産株の報告例もない。
【特許文献１】特開昭５７−１５０３９３号公報
【特許文献２】特開昭５９−２２０１９２号公報
【特許文献３】特開平５−９３０４９号公報
【特許文献４】特開平７−２６５０６５号公報
【特許文献５】特開平１０−１０８６８２号公報
【特許文献６】特開２００１−３４００７８号公報
【非特許文献１】Ｍａｄｉｓｏｎ等、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６３：２１−５３（１９９９）
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｓａｋｉ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０：６４５９−６４６７（１９９８）
【非特許文献３】Ｍａｔｓｕｓａｋｉ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３：４０１−４０９（２０００）
【非特許文献４】Ｌａｎｇｅｎｂａｃｈ等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１５０：３０３−３０９（１９９７）
【非特許文献５】Ｄｏｉ等、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２８：４８２２−４８２８（１９９５）
【非特許文献６】Ｌｅｅ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６７：２４０−２４４（２０００）
【非特許文献７】Ｃｈｅｎ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５７：５０−５５（２００１）
【非特許文献８】国立感染症研究所  病原体等安全管理規定  別表１付表１（１９９９）
【非特許文献９】Ｆｕｋｕｉ等、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３：６１８−６２４（２００２）
【非特許文献１０】Ｐａｒｋ等、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２：２４８−２５４（２００１）
【非特許文献１１】Ｌｕ等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２１：９７−１０１（２００３）
【非特許文献１２】Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８：２４１１−２４１９（２００２）
【非特許文献１３】Ａｍａｒａ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５９：４７７−４８２（２００２）
【非特許文献１４】Ｓｃｈｕｂｅｒｔ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０：５８３７−５８４７（１９８８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したようにＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の工業的生産のために多くの取り組みがなされているが、低３ＨＨ組成Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産系に比べ、柔軟な性質を活かしたフィルム等への加工に適した高３ＨＨ組成Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の安全且つ安価な生産系が確立されていないため、その高生産系開発が望まれていた。
本発明の目的は、高３ＨＨ組成のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を従来よりも効率よく生産し、その生産収率を増大させるのに有効な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究した結果、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産能を有する微生物において、そのＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の基質モノマーの一つである３ヒドロキシ酪酸ＣｏＡの生合成系酵素の活性、特にアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素及びβ−ケトチオラーゼ活性が欠損若しくは減少した変異株を作製し、これを培養して生産されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成を比較したところ、親株よりも高い３ＨＨ組成を示すことを見いだし、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
即ち本発明は以下の通りである。
［１］以下に示す（ａ）（ｂ）のいずれか一方もしくは両方の特徴を有し、かつ、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のモノマーユニットで構成される共重合ポリエステルの生産能を有するワーテルシア属、カプリアビダス属、ラルストニア属、アルカリゲネス属及びシュードモナス属からなる群より選択される微生物。
（ａ）アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の全部もしくは一部が欠失されたことにより、またはアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の開始コドンより上流１０塩基以内に存在するリボソーム結合部位の塩基配列に少なくとも１塩基以上の置換、欠失もしくは挿入がなされたことにより、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性が０．３Ｕ／ｍｇ蛋白質以下である。
（ｂ）β−ケトチオラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列に少なくとも１塩基以上の置換、欠失もしくは挿入がなされたことにより、β−ケトチオラーゼ活性が欠損又は減少されている。
［２］ワーテルシア・ユートロファであることを特徴とする、［１］に記載の微生物。
［３］３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のモノマーユニットで構成される共重合ポリエステルの重合酵素遺伝子を染色体上に保持していることを特徴とする、［１］又は［２］に記載の微生物。
［４］重合酵素遺伝子がアエロモナス・キャビエ由来の酵素又は変異体をコードするものである、［３］に記載の微生物。
［５］重合酵素遺伝子が、配列番号１のアミノ酸配列で示されるアエロモナス・キャビエ由来の変異体酵素をコードするものである、［３］に記載の微生物。
［６］配列番号２に示す遺伝子配列の１２９６番目から２０３６番目までを欠失していることを特徴とする、［２］〜［５］のいずれか１項に記載の微生物。
［７］配列番号２に示す遺伝子配列の１２８７番目の塩基グアニンがシトシンに置換され、かつ１２８９番目の塩基アデニンがシトシンに置換されていることを特徴とする、［２］〜［５］のいずれか１項に記載の微生物。
［８］配列番号２に示す遺伝子配列の１２８８番目の塩基グアニンがチミンに置換され、かつ１２９０番目の塩基グアニンがシトシンに置換されていることを特徴とする、［２］〜［５］のいずれか１項に記載の微生物。
［９］配列番号３に示すβ−ケトチオラーゼ遺伝子の１６番目のアミノ酸であるリジンが終止コドンに置換していることを特徴とする、［２］〜［８］のいずれか１項に記載の微生物。
［１０］ワーテルシア・ユートロファＨ１６株の染色体上にある、配列番号２４に示す遺伝子配列の８４２番目から２６１１番目までが、配列番号２５に示す遺伝子配列に置換され、かつ配列番号２に示す遺伝子配列の１２９６番目から２０３６番目までを欠失している微生物。
［１１］ワーテルシア・ユートロファＨ１６株の染色体上にある、配列番号２４に示す遺伝子配列の８４２番目から２６１１番目までが、配列番号２５に示す遺伝子配列に置換され、配列番号２に示す遺伝子配列の１２８７番目の塩基グアニンがシトシンに置換され、かつ１２８９番目の塩基アデニンがシトシンに置換されている微生物。
［１２］ワーテルシア・ユートロファＨ１６株の染色体上にある、配列番号２４に示す遺伝子配列の８４２番目から２６１１番目までが、配列番号２５に示す遺伝子配列に置換され、配列番号２に示す遺伝子配列の１２８８番目の塩基グアニンがチミンに置換され、かつ１２９０番目の塩基グアニンがシトシンに置換されている微生物。
［１３］ワーテルシア・ユートロファＨ１６株の染色体上にある、配列番号２４に示す遺伝子配列の８４２番目から２６１１番目までが、配列番号２５に示す遺伝子配列に置換され、配列番号２に示す遺伝子配列の８５番目の塩基アデニンがチミンに置換され、かつ８８番目の塩基チミンがシトシンに置換されている微生物。
［１４］ワーテルシア・ユートロファＨ１６株の染色体上にある、配列番号２４に示す遺伝子配列の８４２番目から２６１１番目までが、配列番号２５に示す遺伝子配列に置換され、配列番号２に示す遺伝子配列の８５番目の塩基アデニンがチミンに置換され、８８番目の塩基チミンがシトシンに置換され、かつ１２９６番目から２０３６番目までを欠失している微生物。
［１５］ワーテルシア・ユートロファＨ１６株の染色体上にある、配列番号２４に示す遺伝子配列の８４２番目から２６１１番目までが、配列番号２５に示す遺伝子配列に置換され、配列番号２に示す遺伝子配列の８５番目の塩基アデニンがチミンに置換され、８８番目の塩基チミンがシトシンに置換され、１２８７番目の塩基グアニンがシトシンに置換され、かつ１２８９番目の塩基アデニンがシトシンに置換されている微生物。
［１６］ワーテルシア・ユートロファＨ１６株の染色体上にある、配列番号２４に示す遺伝子配列の８４２番目から２６１１番目までが、配列番号２５に示す遺伝子配列に置換され、配列番号２に示す遺伝子配列の８５番目の塩基アデニンがチミンに置換され、８８番目の塩基チミンがシトシンに置換され、１２８８番目の塩基グアニンがチミンに置換され、かつ１２９０番目の塩基グアニンがシトシンに置換されている微生物。
［１７］［１］〜［１６］のいずれか１項に記載の微生物を用いた、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のモノマーユニットで構成される共重合ポリエステルの製造方法。
【００１２】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明における３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のモノマーユニットで構成される共重合ポリエステル（以下、ポリヒドロキシアルカン酸ともいう）とは、以下の一般式：
【００１３】
【化１】
2008029218.tif 000002
【００１４】
（式中、ｍおよびｎは該ポリマーのモノマー単位数を表し、１以上である。）で表される共重合ポリマーである。
本発明の方法によって製造されるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は、３ＨＨ組成が７．５ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％のものが好ましく、より好ましくは１０ｍｏｌ％から２５ｍｏｌ％である。
【００１５】
本発明に使用する微生物としては、ワーテルシア属、カプリアビダス属、ラルストニア属、アルカリゲネス属及びシュードモナス属のいずれかに属する微生物であればいかなるものでもよく、例えばＷａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ（分類学上、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒと同一）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ等の細菌類が含まれる。安全性及び生産性の観点から好ましくはワーテルシア属であり、より好ましくはＷａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａであり、更に好ましくはＷａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株である。
【００１６】
本発明に使用する微生物は、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産能を有するように、少なくともポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を細胞内に保持し、発現することが必要であるが、そのポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子は細胞内のプラスミド上で存在しても、染色体上に存在してもよい。生産能の安定性の観点から染色体上に存在する方がより好ましい。
本発明に使用する微生物に存在するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子は各種のＰＨＡ蓄積生物に由来する遺伝子のうち、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を蓄積させるものであればどのようなものでもよい。そのような遺伝子としては例えば、アエロモナス・キャビエ（特許文献５）およびアエロモナス・ハイドロフィラ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０９３６８５）などから単離されているポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子がある。
【００１７】
また、目的とする酵素活性が失われない範囲内でアミノ酸配列が改変するようにそれらの遺伝子の塩基配列の一部を改変したものも使用することができる。例えば、非特許文献１２に記載されている、１４９番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるＰＨＡ合成酵素遺伝子（Ｎ１４９Ｓ変異体遺伝子）、１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるＰＨＡ合成酵素遺伝子（Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子）、または、上記の２つのアミノ酸置換が組み合わされたアエロモナス・キャビエ由来であるＰＨＡ合成酵素遺伝子等を好ましく用いることができる。本発明で用いるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子としては、アエロモナス・キャビエ由来の酵素又は変異体をコードするものが好ましく、１４９番目のアミノ酸のアスパラギンをセリンに、かつ１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸をグリシンに置換したアエロモナス・キャビエ由来の変異体酵素をコードするもの（Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体、配列番号１）がより好ましい。ワーテルシア・ユートロファＨ１６株場合、染色体上にある配列番号２４に示す遺伝子配列の８４２番目から２６１１番目までを、配列番号２５に示す遺伝子配列に置換することが好ましい。
【００１８】
本発明の微生物は、（ａ）アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性が０．３Ｕ／ｍｇ蛋白質以下となっているか、及び／又は、（ｂ）β−ケトチオラーゼ遺伝子が不活化されている。
前記した微生物を親株として用いて、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性が欠損もしくは減少した微生物とするには、通常に行われる変異処理方法が採用される。その変異処理方法としては、公知の方法、例えば遺伝子操作による方法、細胞に変異源性のある薬剤を接触させる方法、またＸ線、紫外線、放射線、光などを照射する方法などを挙げることができる。前記の薬剤を接触させる方法に用いられる薬剤としては、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）などを挙げることができる。
【００１９】
アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素の活性を特異的に欠損又は減少させる方法としては、遺伝子操作による染色体遺伝子置換法がある。この方法によれば、目的以外の遺伝子に損傷を与えることなく、目的遺伝子の活性発現のみを欠損又は減少させることができ、目的遺伝子以外の合成経路に変動を与えることがないことから、この方法が特に好ましい。具体的には、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の発現領域を含む遺伝子断片をクローニングし、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性が欠損又は減少するようにＤＮＡ配列の変更を施して改変遺伝子を構築する。この改変遺伝子を親株に形質転換すると、親株の正常な同領域との間で相同組換えの機構によって遺伝子の組換えが起こり、改変遺伝子に置換された変異株を得ることができる。
【００２０】
改変の対象となるアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の例としてはワーテルシア・ユートロファのｐｈｂＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０４９８７）、シュードモナス  プチダのｐｈｂＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０８５８１６）、シュードモナス  ｓｐ．６１−３のｐｈｂＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０１４７５７）が挙げられる。
【００２１】
アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性が欠損するような改変の例としては、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素の構造遺伝子の内部に異種遺伝子、例えばカナマイシン耐性遺伝子断片を挿入する改変、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素の構造遺伝子内に終止コドンが生成するような塩基配列の挿入、欠失又は置換をする改変、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素の構造遺伝子の一部又は全部を欠失する改変などが挙げられる。アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の活性発現を完全に欠損させるには、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素の構造遺伝子の全部を欠失（ワーテルシア・ユートロファの場合、配列番号２に示す遺伝子配列の１２９６番目から２０３６番目までを欠失）する改変が好ましい。
配列番号２は、ＤＮＡデータベースＤＤＢＪのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ０４９８７の全配列であり、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及びβ−ケトチオラーゼ遺伝子を含む。
【００２２】
アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性が減少するような改変の例としては、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素のアミノ酸配列中の一箇所又は二箇所以上のアミノ酸が他のアミノ酸に変わるような、塩基配列の挿入、欠失又は置換をする改変、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子のプロモーターおよび／又はリボソーム結合部位への塩基配列の挿入、欠失又は置換をする改変などが挙げられる。
本発明においてはアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の開始コドンより上流１０塩基以内のＤＮＡ配列に少なくとも１塩基以上の置換、欠失もしくは挿入を行う。アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の開始コドンから上流１０塩基内に存在するリボソーム結合部位の塩基配列を置換する改変が、改変の容易さから好ましい。ワーテルシア・ユートロファの場合、配列番号２に示す遺伝子配列の１２８７番目の塩基グアニンをシトシンに置換し、かつ１２８９番目の塩基アデニンをシトシンに置換するか、又は、配列番号２に示す遺伝子配列の１２８８番目の塩基グアニンをチミンに置換し、かつ１２９０番目の塩基グアニンをシトシンに置換することが好ましい。
【００２３】
β−ケトチオラーゼ活性が欠損若しくは減少した微生物とするには、前記したアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性が欠損若しくは減少した微生物とする方法と同様の変異処理方法が採用できる。すなわちその変異処理方法としては、公知の方法、例えば遺伝子操作による方法、細胞に変異源性のある薬剤を接触させる方法、またＸ線、紫外線、放射線、光などを照射する方法などを挙げることができる。前記の薬剤を接触させる方法に用いられる薬剤としては、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）などを挙げることができる。
【００２４】
β−ケトチオラーゼ活性を特異的に欠損又は減少させる方法としては、遺伝子操作による染色体遺伝子置換法がある。この方法によれば、目的以外の遺伝子に損傷を与えることなく、目的遺伝子の活性発現のみを欠損または減少させることができ、目的遺伝子以外の合成経路に変動を与えることがないことから、この方法が特に好ましい。具体的には、β−ケトチオラーゼ遺伝子の発現領域を含む遺伝子断片をクローニングし、β−ケトチオラーゼ活性が欠損又は減少するようにＤＮＡ配列の変更を施して改変遺伝子を構築する。この改変遺伝子を親株に形質転換すると、親株の正常な同領域との間で相同組換えの機構によって遺伝子の組換えが起こり、改変遺伝子に置換された変異株を得ることができる。
【００２５】
改変の対象となるβ−ケトチオラーゼ遺伝子の例としてはワーテルシア・ユートロファのｐｈｂＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０４９８７）およびｂｋｔＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２６５４４）、シュードモナス  プチダのｐｈｂＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０８５８１６）、シュードモナス  ｓｐ．６１−３のｐｈｂＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０１４７５７）が挙げられる。
【００２６】
β−ケトチオラーゼ活性を特異的に欠損又は減少させるには、β−ケトチオラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列に少なくとも１塩基以上の置換、欠失もしくは挿入することが挙げられる。
β−ケトチオラーゼ遺伝子の活性発現が欠損するような改変の例としては、β−ケトチオラーゼの構造遺伝子の内部に異種遺伝子、例えばカナマイシン耐性遺伝子断片を挿入する改変、β−ケトチオラーゼの構造遺伝子内に終止コドンが生成するような塩基配列の挿入、欠失又は置換をする改変、β−ケトチオラーゼの構造遺伝子の一部又は全部を欠失する改変などが挙げられる。
β−ケトチオラーゼ活性が減少するような改変の例としては、β−ケトチオラーゼのアミノ酸配列中の一箇所又は二箇所以上のアミノ酸が他のアミノ酸に変わるような、塩基配列の挿入、欠失又は置換をする改変、β−ケトチオラーゼ遺伝子のプロモーターおよび／又はリボソーム結合部位への塩基配列の挿入、欠失又は置換をする改変などが挙げられる。ワーテルシア・ユートロファの場合、配列番号３に示すβ−ケトチオラーゼ遺伝子の１６番目のアミノ酸であるリジンが終止コドンに置換するように、配列番号２に示す遺伝子配列の８５番目の塩基アデニンをチミンに置換することが好ましい。この際、操作を容易にするために、上記置換と同時に、配列番号２に示す遺伝子配列の８８番目の塩基チミンをシトシンに置換することにより、制限酵素ＮｈｅＩ切断部位が生じるような塩基置換を行うこともできる。
【００２７】
ワーテルシア・ユートロファを親株とする場合は、酵素の基質特異性の観点からｐｈｂＡ遺伝子を不活化するのが好ましく、構造遺伝子内に終止コドンが生ずるような塩基配列の置換によって不活化するのがより好ましい。
β−ケトチオラーゼ活性が欠損または減少するようなβ−ケトチオラーゼ遺伝子の改変によって、染色体上でβ−ケトチオラーゼ遺伝子の下流に存在するアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の発現に影響を与え、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性が減少した菌株が得られる場合があるが、そのようにして得られた微生物も本発明の微生物として好適に用いることができる。
【００２８】
本発明の微生物の例として、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子をアエロモナス・キャビエ由来であるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素変異体遺伝子に置換した株ＫＮＫ−００５株を親株として用い、前記した遺伝子操作による方法でアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性が欠損若しくは減少した微生物の取得例を後述の実施例に示す。
取得した株は、β−ケトチオラーゼ遺伝子（ｐｈｂＡ）の構造遺伝子内に終止コドンが生成するように塩基配列を置換した株（ＫＮＫ−００５ＡＳ）、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（ｐｈｂＢ）のリボソーム結合部位の塩基配列を置換した株（ＫＮＫ−００５ＳＤＭ１およびＫＮＫ−００５ＳＤＭ２）、ｐｈｂＢ遺伝子の構造遺伝子の全部を欠失した株（ＫＮＫ−００５ΔｐｈｂＢ）、ｐｈｂＡ遺伝子の構造遺伝子内に終止コドンが生成するように塩基配列を置換し、かつｐｈｂＢ遺伝子のリボソーム結合部位の塩基配列を置換した株（ＫＮＫ−００５ＡＳＳＤＭ１およびＫＮＫ−００５ＡＳＳＤＭ２）、ｐｈｂＡ遺伝子の構造遺伝子内に終止コドンが生成するように塩基配列を置換し、かつｐｈｂＢ遺伝子の構造遺伝子の全部を欠失した株（ＫＮＫ−００５ＡＳΔｐｈｂＢ）である。親株であるＫＮＫ−００５と比べて、これらの株のアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性はいずれも低いことが確認された。そしてこれらの株を培養して得られるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成はいずれも、ＫＮＫ−００５を培養して得られるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成よりも高いことが確認された。
【００２９】
本発明の微生物を炭素源存在下で増殖させることにより、微生物体内に共重合ポリエステルを蓄積させることができる。炭素源としては、糖、油脂または脂肪酸を用いることができる。炭素源以外の栄養源として、窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を任意に用いることができる。
糖としては、例えばグルコース、フラクトース等の炭水化物が挙げられる。油脂としては、炭素数が１０以上である飽和・不飽和脂肪酸を多く含む油脂、例えばヤシ油、パーム油、パーム核油等が挙げられる。脂肪酸としては、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体が挙げられる。
【００３０】
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
【００３１】
培養温度は、その菌が生育可能な温度であればよいが、２０℃から４０℃が好ましい。培養時間は、特に制限はないが、１〜１０日間程度で良い。
得られた該培養菌体に蓄積されたポリエステルは公知の方法により回収することができる。
例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離器等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてポリエステルを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてポリエステルを回収することができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の方法によれば、高３ＨＨ組成のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を従来の方法に比べて効率よく製造することができる。そして、本発明の方法によって製造された高３ＨＨ組成のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は柔軟な性質を活かしたフィルム等への加工に適した生分解性プラスチックとして多くの分野で種々の用途に用いることができるので、産業上極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下に実施例で本発明を説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。
（実施例１）ＰＨＢＨ生産菌親株ＫＮＫ−００５株の作製
アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素の活性及びβ−ケトチオラーゼ活性を欠損又は減少させるために用いたＰＨＢＨ生産菌親株のＫＮＫ−００５株は以下のようにして作製した。
＜遺伝子置換用プラスミドの作製＞
Ｗａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株の菌体を鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号４と配列番号５で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子（ｐｈａＣＲｅ）の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）４５℃で３０秒、（４）７２℃で３分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）（東洋紡社製）を同酵素で切断した部位にサブクローニングした（ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ）。
【００３４】
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ由来のポリエステル合成酵素変異体遺伝子であるＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体は、次のように作製した。まず、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）（東洋紡社製）をＰｓｔＩ処理し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いて平滑末端化しライゲーションすることによりＰｓｔＩサイトを欠失させた。次いでこのプラスミドをＸｈｏＩ処理し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いて平滑末端化しライゲーションすることによりＸｈｏＩサイトを欠失したプラスミドｐＢｌｕｅ−Ｎｅｗを作製した。このプラスミドのＥｃｏＲＩサイトにｐＪＲＤ２１５−ＥＥ３２ｄ１３（特許文献５）より同酵素で切り出したｄ１３断片をクローニングした（ｐＢｌｕｅ−ｄ１３）。次に、理化学研究所より分与されたクローンＥ２−５０由来のプラスミド（非特許文献１３）を鋳型とし、配列番号６と７に記載のプライマーのセット及び配列番号８と９に記載のプライマーのセットを用いてそれぞれＰＣＲ法により増幅、２断片を得た。その条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７２℃で２分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）７２℃で５分である。増幅された２断片を等モル混合し再びＰＣＲ反応を行い、２断片を結合させた。その条件は（１）９６℃で５分、（２）９５℃で２分、（３）７２℃で１分、（２）から（３）を１２サイクルであり、ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ（タカラバイオ製）を用いた。目的サイズのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動ゲルより切り出しＰｓｔＩとＸｈｏＩで処理し、同酵素で処理したｐＢｌｕｅ−ｄ１３に断片を入れ替える形でクローニングした（ｐＢｌｕｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ）。塩基配列決定を、ＰＥＲＩＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、ＰＨＡ合成酵素の１４９番目のアミノ酸であるアスパラギンがセリンに、１７１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がグリシンに置換された変異遺伝子であることを確認した。
【００３５】
ｐＢｌｕｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇを鋳型として配列番号１０と配列番号１１で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体の構造遺伝子ＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲ条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）４５℃で３０秒、（４）７２℃で２分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ製）を用いた。次に、ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅを制限酵素ＳｂｆＩとＣｓｐ４５Ｉで処理し、同酵素で処理した上記増幅ＤＮＡ断片をｐｈａＣＲｅ構造遺伝子と入れ替える形でクローニングした（ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ）。
次に、プラスミドｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ３７５３３）を制限酵素ＸｈｏＩとＤｒａＩで処理してカナマイシン耐性遺伝子を含む約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を単離後、ＤＮＡブランティングキット（タカラバイオ製）を用いて末端を平滑化し、ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇを制限酵素ＳａｌＩで切断後同様に平滑末端化した部位に挿入した（ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｋｍ）。
続いて、プラスミドｐＭＴ５０７１（Ｔｓｕｄａ、ＧＥＮＥ、２０７：３３−４１（１９９８））を制限酵素ＮｏｔＩで処理してｓａｃＢ遺伝子を含む約８ｋｂのＤＮＡ断片を単離し、ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｋｍを同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子置換用プラスミドｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−ＫｍＳＡＣを作製した。
【００３６】
＜遺伝子置換株の作製＞
遺伝子置換用プラスミドｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−ＫｍＳＡＣで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７００５）を形質転換し、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＷａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株を選択して、２段階の相同組換えによりプラスミドが脱落した株を取得した。さらにＰＣＲによる解析によりｐｈａＣＲｅ遺伝子がＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子に置換された菌株を単離した。この遺伝子置換株をＫＮＫ−００５株と命名し、塩基配列決定を、ＰＥＲＩＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、染色体上のｐｈａＣＲｅ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでがＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子の開始コドンから終止コドンまでに置換された株であることを確認した（図２参照）。
【００３７】
（実施例２）β−ケトチオラーゼ遺伝子破壊株の作製
＜β−ケトチオラーゼ遺伝子の破壊用プラスミドの作製＞
プラスミドｐＪＲＤ２１５を鋳型とし、配列番号１２と配列番号１３で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約１．２ｋｂｐのカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。次にｐＭＴ５０７１を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、同酵素で処理した上記ＤＮＡ断片をクロラムフェニコール耐性遺伝子と入れ替える形でクローニングした（ｐＳＡＣＫｍ）。
ＫＮＫ−００５株の菌体を鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号１４と配列番号５で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約１．１ｋｂｐのβ−ケトチオラーゼ遺伝子（ｐｈｂＡ遺伝子）を含むＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）（東洋紡社製）を同酵素で切断した部位にサブクローニングした。配列番号１５で示される変異プライマーを用い、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ製）を利用して、配列番号２に示す遺伝子配列の８５番目の塩基アデニンがチミンに置換され、かつ８８番目の塩基チミンがシトシンに置換されることにより、開始コドンから１６残基目のアミノ酸が終止コドンとなり、同時に制限酵素ＮｈｅＩ切断部位が生じるような塩基置換を行った。このプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、ｐＳＡＣＫｍを同酵素で切断して調製した約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を（ｏｒｉＴ＋ＫｍＲ＋ｓａｃＢＲ）を挿入して染色体置換用ベクター（ｐＢｌｕｅＡＳＲＵ）とした。
【００３８】
＜染色体置換＞
実施例１の遺伝子置換株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ−００５株を親株としてｐＢｌｕｅＡＳＲＵを用いて染色体置換株ＫＮＫ−００５ＡＳ株を作製した。ＫＮＫ−００５ＡＳ株のＤＮＡ塩基配列を解析して、β−ケトチオラーゼ遺伝子がｐＢｌｕｅＡＳＲＵの相同配列部分と置き換わって終止コドンと制限酵素ＮｈｅＩ切断部位が生成していることを確認した（図３参照）。なお、図３中のアミノ酸配列は配列番号３のアミノ酸配列の一部であり、図３中の塩基配列は配列番号２の塩基配列の一部である。
【００３９】
（実施例３）アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子リボソーム結合部位変異株の作製
＜リボソーム結合部位変異置換用プラスミドの作製＞
ＫＮＫ−００５株の菌体を鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号１６と配列番号１７で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約１ｋｂｐのアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（ｐｈｂＢ）のリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）（東洋紡社製）を同酵素で切断した部位にサブクローニングした。配列番号１８および配列番号１９で示される変異プライマーを用い、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ製）を利用して、それぞれ、配列番号１８を用いた場合は制限酵素ＭｌｕＩ切断部位が生じるように、配列番号１９を用いた場合はＳｃａＩ切断部位が生じるようなリボソーム結合部位の塩基置換を行った。
配列番号１８を用いた場合は、配列番号２に示す遺伝子配列の１２８７番目の塩基グアニンがシトシンに置換され、かつ１２８９番目の塩基アデニンがシトシンに置換されて制限酵素ＭｌｕＩ切断部位が生じ、配列番号１９を用いた場合は、配列番号２に示す遺伝子配列の１２８８番目の塩基グアニンがチミンに置換され、かつ１２９０番目の塩基グアニンがシトシンに置換されてＳｃａＩ切断部位が生じる。
このプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、ｐＳＡＣＫｍを同酵素で切断して調製した約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を（ｏｒｉＴ＋ＫｍＲ＋ｓａｃＢＲ）を挿入して染色体置換用ベクター（ｐＢｌｕｅＳＤＭ１ＲＵ及びｐＢｌｕｅＳＤＭ２ＲＵ）とした。
【００４０】
＜染色体置換＞
実施例１の遺伝子置換株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ−００５株を親株としてｐＢｌｕｅＳＤＭ１ＲＵ及びｐＢｌｕｅＳＤＭ２ＲＵを用いてそれぞれ染色体置換株ＫＮＫ−００５ＳＤＭ１株及びＫＮＫ−００５ＳＤＭ２株を作製した。また、ＫＮＫ−００５ＡＳ株を親株として染色体置換株ＫＮＫ−００５ＡＳＳＤＭ１株およびＫＮＫ−００５ＡＳＳＤＭ２株を作製した。これら４株の染色体置換株のＤＮＡ塩基配列を解析して、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子のリボソーム結合部位に所定の変異が入っていることを確認した（図４参照）。
【００４１】
（実施例４）アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子破壊株の作製
＜アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の破壊用プラスミドの作製＞
ＫＮＫ−００５株の菌体を鋳型ＤＮＡの供給源として、ポリメラーゼとしてＰｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ（タカラバイオ製）を用いてＰＣＲ反応を行い、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の開始コドンより上流約４００ｂａｓｅのＤＮＡ断片と終止コドンより下流約５６０ｂａｓｅのＤＮＡ断片とを調製した。上流側の断片の調製には配列番号２０と配列番号２１で示されるプライマーを用い、下流側の断片の調製には配列番号２２と配列番号２３で示されるプライマーを用いた。両ＤＮＡ断片をそれぞれ末端リン酸化処理後、制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）のＢａｍＨＩ部位に連結挿入した。このプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、ｐＳＡＣＫｍを同酵素で切断して調製した約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を（ｏｒｉＴ＋ＫｍＲ＋ｓａｃＢＲ）を挿入して染色体置換用ベクター（ｐＢｌｕｅΔｐｈｂＢＲＵ）とした。
【００４２】
＜染色体置換＞
実施例１の遺伝子置換株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ−００５株を親株としてｐＢｌｕｅΔｐｈｂＢＲＵを用いて染色体置換株ＫＮＫ−００５ΔｐｈｂＢ株を作製した。また、ＫＮＫ−００５ＡＳ株を親株として染色体置換株ＫＮＫ−００５ＡＳΔｐｈｂＢ株を作製した。これら２株の染色体置換株のＤＮＡ塩基配列を解析して、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の開始コドンから終止コドンまでの塩基配列が脱落（配列番号２に示す遺伝子配列の１２９６番目から２０３６番目までが欠失）していることを確認した（図５参照）。
【００４３】
（実施例５）アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性およびβ−ケトチオラーゼ活性の測定
まず、前培養培地（１ｗ／ｖ％  Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％  Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％  Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８））５ｍｌに実施例２〜４で得られた菌株を植菌して３０℃で１晩培養したものを、５ｍｌの酵素活性測定用培地（１．１ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、０．２９ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｗ／ｖ％フラクトース、０．５ｖ／ｖ％  微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの））に対して０．０５ｍｌ接種して、３０℃で２４時間培養した。この培養液２ｍｌを４℃で１００００×ｇ、１分間の遠心分離を行い菌体を集めた。この菌体を緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で２回洗浄し、１ｍｌの同緩衝液に懸濁した。これを超音波処理して菌体を破砕した後、１５０００×ｇ、４℃、５分間の遠心分離した上清を粗酵素液として用いた。
【００４４】
アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性は反応液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  アセトアセチル−ＣｏＡ、０．１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ）に前記粗酵素液０．０５ｍｌを添加して、全量を０．５ｍｌとし、２５℃で反応させてＮＡＤＰＨの酸化を３４０ｎｍの吸光度で測定した。アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性は、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨを酸化する酵素量を１ユニットとした。比活性はタンパク質１ｍｇあたりのユニットとした。なお、タンパク質の定量はウシ血清アルブミンをスタンダードとして、Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ試薬（バイオラッド社製）を用いたブラッドフォード法で測定した。
β−ケトチオラーゼ活性は反応液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０６ｍＭ  アセトアセチル−ＣｏＡ、０．１ｍＭ  ＣｏＡ−ＳＨ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に前記粗酵素液０．０１ｍｌを添加して、全量を０．５ｍｌとし、２５℃で反応させてアセトアセチル−ＣｏＡの分解を３０３ｎｍの吸光度で測定した。β−ケトチオラーゼ活性は、１分間に１μｍｏｌのアセトアセチル−ＣｏＡを分解する酵素量を１ユニットとした。比活性はタンパク質１ｍｇあたりのユニットとした。なお、タンパク質の定量はウシ血清アルブミンをスタンダードとして、Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ試薬（バイオラッド社製）を用いたブラッドフォード法で測定した。
親株と実施例２、３、および４で作製した変異株のアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性とβ−ケトチオラーゼ活性を表１に示す。
【００４５】
【表１】
2008029218.tif 000003
【００４６】
表１に示すとおり、β−ケトチオラーゼ遺伝子に改変を加えたＫＮＫ−００５ＡＳ株、ＫＮＫ−００５ＡＳＳＤＭ１株、ＫＮＫ−００５ＡＳＳＤＭ２株、ＫＮＫ−００５ＡＳΔｐｈｂＢ株はいずれもβ−ケトチオラーゼ活性が親株であるＫＮＫ−００５株の１０分の１程度であった。アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性は作製したすべての変異株でＫＮＫ−００５株より低く、０．３Ｕ／ｍｇ蛋白質以下であった。中でも、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子を完全に欠失させたＫＮＫ−００５ΔｐｈｂＢ株およびＫＮＫ−００５ＡＳΔｐｈｂＢ株はアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素活性が実質的に失われていた。
【００４７】
（実施例６）ポリエステルの生産、精製および３ＨＨ組成（ｍｏｌ％）分析
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％  Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％  Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。
前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、０．２９ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％パームＷオレイン油、０．５ｖ／ｖ％  微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）とした。
【００４８】
ポリエステル生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、０・２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％  微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）、０．０５ｗ／ｖ％ＢＩＯＳＰＵＭＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン製）とした。炭素源はパーム核油を分別した低融点画分であるパーム核油オレインを単一炭素源として用い、培養全般を通じ、比基質供給速度が０．０８〜０．１（ｇ油脂）×（ｇ正味乾燥菌体重量）−１×（ｈ）−１となるように流加した。
試験菌株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養した。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
【００４９】
ポリエステル生産培養は６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−１０００型）に前培養種母を５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量３．６Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。培養は約４８時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
得られた乾燥菌体約１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のポリエステルを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が約３０ｍｌになるまで濃縮後、約９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したポリエステルをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ポリエステルの重量を測定し、菌体内のポリエステル含量を算出した。そして、培養液１Ｌあたりの乾燥菌体重量にポリエステル含量を掛けることによってポリエステル生産性を算出した。
【００５０】
生産されたポリエステルの３ＨＨ組成分析は、以下のようにガスクロマトグラフィーによって行った。
乾燥ポリエステルの約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することでポリエステル分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のポリエステル分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μｌを注入した。温度条件は、初発温度１００〜２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００〜２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。
以上のようにして親株と実施例２、３、および４で作製した変異株を培養してポリエステルを生産した成績及び３ＨＨ組成を表２に示す。
【００５１】
【表２】
2008029218.tif 000004
【００５２】
表２に示すとおり作製した変異株のポリエステル生産性は４８〜７９ｇ／Ｌと高く、３ＨＨ組成は７．５〜１６．８ｍｏｌ％の高い比率を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の方法によれば、高３ＨＨ組成のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を従来の方法に比べて効率よく製造することができる。そして、本発明の方法によって製造された高３ＨＨ組成のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は柔軟な性質を活かしたフィルム等への加工に適した生分解性プラスチックとして多くの分野で種々の用途に用いることができるので、産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ワーテルシア・ユートロファにおけるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生合成のための経路の模式図である。
【図２】ワーテルシア・ユートロファＨ１６株とＫＮＫ−００５株におけるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生合成に関与する遺伝子の染色体上の配置を示す模式図である。
【図３】実施例２で行ったβ−ケトチオラーゼ遺伝子の改変部位を示す図である。
【図４】実施例３で行ったアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子リボソーム結合部位の改変部位を示す図である。
【図５】実施例４で行ったアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の欠失部位を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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