(57)【要約】【課題】洗浄工程を必要とすることなく、高価な測定機器が不要あり、そして高感度かつ迅速な測定が可能な被験物の測定方法を提供すること。【解決手段】（１）（ａ）被験物、（ｂ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び検出可能な部位を有する第１反応体、並びに（ｃ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び担体に固定化された物質と結合できる部位を有する第２反応体、を反応させて、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を得る工程；（２）上記工程（１）で生成した第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を、担体に固定化された物質に結合させる工程；及び（３）担体に固定化された物質に結合している第１反応体と被験物と第２反応体との結合物に光を作用させることにより、該被験物を測定する工程；を含む、被験物の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）（ａ）被験物、（ｂ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び検出可能な部位を有する第１反応体、並びに（ｃ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び担体に固定化された物質と結合できる部位を有する第２反応体、を反応させて、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を得る工程；
（２）上記工程（１）で生成した第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を、担体に固定化された物質に結合させる工程；及び
（３）担体に固定化された物質に結合している第１反応体と被験物と第２反応体との結合物に光を作用させることにより、該被験物を測定する工程；
を含む、被験物の測定方法。
【請求項２】
第２反応体と担体に固定化された物質との結合が実質的に不可逆である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
第２反応体と担体に固定化された物質との結合のＫｄ（結合定数）が１０-12Ｍ以下である、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
担体に固定化された物質と結合できる部位と、担体に固定化された物質との組み合わせが、ビオチンとアビジン類の組み合わせ、またはジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体の組み合わせである、請求項１から３の何れかに記載の測定方法。
【請求項５】
第１反応体の検出可能な部位が、光を受光して散乱する光散乱物質、光を受光して蛍光を発するする蛍光物質、又は光を吸光する吸光物質である、請求項１から４の何れかに記載の測定方法。
【請求項６】
光散乱物質が、磁性粒子あるいは金ナノ粒子である、請求項５に記載の測定方法。
【請求項７】
蛍光物質が、ウンベリフェロン、Cy5、フルオレセイン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、又はテキサスレッドである、請求項５又は６に記載の測定方法。
【請求項８】
工程（３）において、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物に作用させる光が近接場光である、請求項１から７の何れかに記載の測定方法。
【請求項９】
工程（３）において、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物に作用させる光が、プラズモンで増強された光である、請求項１から８の何れかに記載の測定方法。
【請求項１０】
少なくとも、被験物と特異的に結合する反応部位及び検出可能な部位を有する第１反応体、並びに該被験物と特異的に結合する反応部位及び担体に固定化された物質と結合できる部位を有する第２反応体を含む、請求項１から９の何れかに記載の測定方法に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
定量しようとする成分（被験物）とそれ以外の成分を含む試料中から、被験物のみを定量する方法としては、医療検査分野において、免疫測定法が普及している。免疫測定法は、ELISAに代表されるように、被験物と特異的反応をする一次抗体を用いて、試料中の被験物と特異的に反応させて両者の結合物（一次抗体−被験物結合物）を得、次いで、被験物と特異的に反応し且つ標識付けられた二次抗体を過剰に添加し、一次抗体−被験物結合物と二次抗体とを反応させて得られた一次抗体−被験物−二次抗体結合物を定量する方法である。
【０００３】
しかしながら、結合物（Ｂ）と未反応の二次抗体（Ｆ）の分離操作（以下、単に「Ｂ／Ｆ分離操作」ということがある）は手間がかかり、測定に時間がかかる原因となる。またＢ／Ｆ分離操作、次いで行う洗浄工程で、被験物の一部は廃棄される上清とともに除去されることもあるため、被験物が微量成分の場合には、検出感度の低下をもたらす場合がある。（超高感度酵素免疫測定法、学会出版センター：石川栄治著）
【０００４】
B/F分離を行わない方法としては、近接場光を用いる方法が知られている。具体的には一次抗体を固定化し、被験物と蛍光標識された二次抗体を添加する手法があるが、固相反応のため反応が遅いという問題点がある。（特許文献１）
【０００５】
一方、液相反応を用いる手法として、磁性粒子に固定した一次抗体、蛍光色素標識した二次抗体と抗原を混合し、磁気を用いて被験物を表面に固定化する方法が開示されている（特許文献２）。しかし、磁性粒子を外部の力で集めるため、高価な機器が必要である。
【０００６】
【非特許文献１】超高感度酵素免疫測定法、学会出版センター：石川栄治著
【特許文献１】特開平５−２０３５７４号公報
【特許文献２】特開２００５−７７３３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、洗浄工程を必要とすることなく、高価な測定機器が不要あり、そして高感度かつ迅速な測定が可能な被験物の測定方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、被験物と特異的に結合する反応部位及び検出可能な部位を有する第１反応体と被験物と特異的に結合する反応部位及び担体に固定化された物質と結合できる部位を有する第２反応体とを被験物に反応させて第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を得た後、この結合物を担体に結合させて光を作用させることによって被験物を高感度かつ迅速に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明によれば、（１）（ａ）被験物、（ｂ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び検出可能な部位を有する第１反応体、並びに（ｃ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び担体に固定化された物質と結合できる部位を有する第２反応体、を反応させて、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を得る工程；
（２）上記工程（１）で生成した第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を、担体に固定化された物質に結合させる工程；及び
（３）担体に固定化された物質に結合している第１反応体と被験物と第２反応体との結合物に光を作用させることにより、該被験物を測定する工程；
を含む、被験物の測定方法が提供される。
【００１０】
好ましくは、第２反応体と担体に固定化された物質との結合は実質的に不可逆である。
好ましくは、第２反応体と担体に固定化された物質との結合のＫｄ（結合定数）は１０-12Ｍ以下である。
好ましくは、担体に固定化された物質と結合できる部位と、担体に固定化された物質との組み合わせは、ビオチンとアビジン類の組み合わせ、またはジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体の組み合わせである。
【００１１】
好ましくは、第１反応体の検出可能な部位は、光を受光して散乱する光散乱物質、光を受光して蛍光を発するする蛍光物質、又は光を吸光する吸光物質である。
好ましくは、光散乱物質は、磁性粒子あるいは金ナノ粒子である。
好ましくは、蛍光物質は、ウンベリフェロン、Cy5、フルオレセイン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、又はテキサスレッドである。
【００１２】
好ましくは、工程（３）において、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物に作用させる光は近接場光である。
好ましくは、工程（３）において、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物に作用させる光は、プラズモンで増強された光である。
【００１３】
本発明の別の側面によれば、少なくとも、被験物と特異的に結合する反応部位及び検出可能な部位を有する第１反応体、並びに該被験物と特異的に結合する反応部位及び担体に固定化された物質と結合できる部位を有する第２反応体を含む、本発明の測定方法に用いるためのキットが提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の測定方法においては、磁気などの外部力を用いることなく、担体の基板の表面に被験物を集積することができ。即ち、本発明においては、磁気などの外部力を用いないため、高価な測定機器が不要である。また、本発明においては、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を、担体に固定化された物質に結合させる際に不可逆反応を利用するため、測定の高感度、高速化が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明の被験物の測定方法においては、先ず、（ａ）被験物、（ｂ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び検出可能な部位を有する第１反応体、並びに（ｃ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び担体に固定化された物質と結合できる部位を有する第２反応体、を反応させて、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を得る工程を行い、その後に、上記で生成した第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を、担体に固定化された物質に結合させる工程、及び担体に固定化された物質に結合している第１反応体と被験物と第２反応体との結合物に光を作用させることによって該被験物を測定する工程を行う。本発明の方法の概要を図１に示す。
【００１６】
本発明で用いることができる被験物の種類は特に限定されないが、例えば、抗原、抗体、酵素、ホルモン、サイトカイン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、血球、細胞、細菌、又はウィルスなどが挙げられる。また、環境ホルモンなど自然界に存在する物質であってもよい。被験物としては、上記した被験物を含有する血液、尿、唾液、骨髄液、脳脊髄液などの体液；河川水、又は廃液などを用いてもよい。
【００１７】
本発明で用いる第１反応体は、被験物と特異的に結合する反応部位及び検出可能な部位を有するものである。また、本発明で用いる第２反応体は、被験物と特異的に結合する反応部位及び担体に固定化された物質と結合できる部位を有するものである。
【００１８】
第１反応体及び第２反応体における被験物と特異的に結合する反応部位は、例えば、抗原、抗体、抗体フラグメント、種々の受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、これらを結合した血球などの細胞性物質を挙げることができる。反応部位は、上記の中でも、抗体又は抗体フラグメントであることが好ましい。
【００１９】
本発明による被験物の測定方法は、サンドイッチ法の原理を採用している。従って、第１反応体及び第２反応体における被験物と特異的に結合する反応部位はそれぞれ、被験物の異なる部位に特異的に結合するものであることが必要である。
【００２０】
第1反応体における検出可能な部位としては、光を受光して散乱する光散乱物質（例えば、磁性粒子あるいは金ナノ粒子）、光を受光して蛍光を発するする蛍光物質（例えば、ウンベリフェロン（同仁化学）、Cy5(GE healthcarebioscience社)、fluorescein(Invitrogen社)、Rhodamine Green(Invitrogen社)、Rhodamine Red(Invitrogen社)、Texas Red(Invitrogen社)）、又は光を吸光する吸光物質（例えば、3,3',5,5'-tetramethylbenzidine）などを挙げることができる。上記の中でも、検出可能な部位は、好ましくは、蛍光物質である。
【００２１】
第２反応体における担体に固定化された物質と結合できる部位は、固定化された物質と実質的に不可逆的に結合できるような部位であることが好ましい。第２反応体と担体に固定化された物質との結合のＫｄ（結合定数）は１０-12Ｍ以下であることが好ましい。担体に固定化された物質と結合できる部位と、担体に固定化された物質との組み合わせの具体例としては、ビオチンとアビジン類（アビジン、ストレプトアビジン、又はそれらの改変体など）の組み合わせ、またはジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体の組み合わせなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
第１反応体における被験物と特異的に結合する反応部位と検出可能な部位との結合は、共有結合、イオン結合又は配位結合等の化学結合でもよいし、物理的吸着でもよい。また、同様に、第２反応体における被験物と特異的に結合する反応部位と担体に固定化された物質と結合できる部位との結合も、共有結合、イオン結合又は配位結合等の化学結合でもよいし、物理的吸着でもよい。
【００２３】
本発明においては、被験物と、第１反応体と、第２反応体とを反応させて、第１反応体−被験物−第２反応体結合物を得る。反応の順番は特に限定されない。即ち、被験物と第１反応体と第２反応体とを同時に混合して反応させて、第１反応体−被験物−第２反応体の結合物を得てもよいし、被験物と第１反応体を反応させて第１反応体−被験物の結合物を得た後に第２反応体を反応させて第１反応体−被験物−第２反応体の結合物を得てもよいし、あるいは被験物と第２反応体を反応させて被験物−第２反応体の結合物を得た後に第１反応体を反応させて第１反応体−被験物−第２反応体の結合物を得てもよい。
【００２４】
本発明によれば、本発明の測定方法に用いるためのキットが提供される。本発明のキットは、少なくとも被験物と特異的に結合する反応部位及び検出可能な部位を有する第１反応体、並びに該被験物と特異的に結合する反応部位及び担体に固定化された物質と結合できる部位を有する第２反応体を含む。上記したキットの各構成成分は、溶液状態、乾燥状態、凍結状態、凍結乾燥状態等で提供することができる。保存安定性の点から、凍結乾燥状態であることが好ましいが、液状で安定な物質である場合、液状試薬として提供することが好ましい。
【００２５】
本発明では、担体に固定化された物質に結合している、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物に、光を作用させることにより、該被験物を測定する。光としては、近接場光であることが好ましく、近接場光は、プラズモンで増強された光であることがさらに好ましい。近接場光としては、例えば、エバネッセント光を用いることができる。エバネッセント光とは、光が全反射したときに第２媒質中にわずかに滲み出した光で、伝搬せず、第２媒質との境界面から１００ｎｍ程度の領域にだけ発生する。試料収容部と接触させた光導波路又はプリズムに臨界角度以上で光を入射することにより、試料収容部との境界面でエバネッセント波を生じさせることができる。
【００２６】
また、本発明で用いることができる表面プラズモン共鳴方式免疫測定装置の構造としては、多角形もしくは半円形のプリズムの一つの側面の上に金属薄膜を形成したものを使用することができる。プリズムとは、石英やガラスやポリメチルメタタリレートなど、紫外、可視、近赤外領域の光に対して透明で、しかも液体試料より大きな屈折率を有する材質より成る光学部品である。プリズムの形状に特に限定されないが、半円柱、三角柱、台形柱などである。金属薄膜としては厚さ１０ｎｍ〜１００ｎｍ程度の金の薄膜を用ることができる。また、ガラスと金属薄膜との密着性を向上させる目的で１〜１０ｎｍ程度のクロム層を間に形成することもできる。プリズム型の表面プラズモン共鳴デバイスは、半導体レーザー（ＬＤ）又は発光ダイオード（ＬＥＤ）等の単色光源、電荷結合素子（ＣＣＤ）あるいはフォトトランジスタ等の光検出器、並びに偏光板と組み合わせて一体化された装置として使用することができる。表面プラズモン共鳴デバイス、単色光源、および光検出器は、単色光源の光がプリズムのガラス面から入射され、金属薄膜形成面で全反射し、再びガラス面から出射されて偏光板を通り光検出器で検出される様に配置することができる。表面プラズモン共鳴デバイスを組み込んだ免疫反応検出装置は、フローセルを金属薄膜の上に形成し、フローシステムとして用いることもできる。
【００２７】
本発明で用いることができる表面プラズモン増強蛍光センサーの別の例としては、所定波長の励起光を発する光源と、前記励起光を透過させる材料から形成された誘電体ブロック（プリズム）と、この誘電体ブロックの一表面に形成された金属膜と、疎水性材料からなり前記金属膜の上に形成された、膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲にある不撓性膜と、前記誘電体ブロックと反対側から前記不撓性膜に試料が接するように該試料を保持する試料保持部と、前記励起光を、前記誘電体ブロックと金属膜との界面に向けて、全反射条件を満たすように誘電体ブロックを通して入射させる入射光学系と、前記界面に前記励起光が入射したとき、該界面から染み出すエバネッセント波に励起されて、前記試料中に含まれる物質が発した蛍光を検出する蛍光検出手段とからなることを特徴とする表面プラズモン増強蛍光センサーを挙げることができる。この表面プラズモン増強蛍光センサーにおいては、金属膜の上に膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲にある不撓性膜が設けられていることを特徴とするものである。
【００２８】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
（実施例）
（1-1）基盤の作製
ゼオネクス製の基盤（プリズム。屈折率1.50）の表面に金膜50nmをスパッタにて形成する。更に金膜上にポリスチレン系のポリマ膜（プリズム。屈折率、1.59）20nmをスピンコートにて形成し、更に５アミノ吉草酸を固定化する。上記の表面上で、Ｎアビジンをアミンカップリング法にて固定する。
【００３０】
（1-2）反応系
ビオチン標識した一次抗体（１μg/ml、Fitzgerald社, M7111422）50μl、ＣＲＰ(C-Reactive Protein、オリエンタル酵母社) 50μl、Cy5標識した二次抗体（１μg/ml、Fitzgerald社, M701289）50μlを混合し、５分間室温で静置する。この反応混合物をＮアビジンが固定化された基盤に添加し、プラズモンで増強された光で検出する。励起光としては、630nmの半導体レーザーを用い、蛍光の検出には、fujifilm社製ＬＡＳ-1000plusを用いる。その結果、ＣＲＰを1pMまで検出できる。一方、同じ反応をビオチン標識していない一次抗体を用いて行ったところ、1nMでさえ検出できない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明の方法の概要を示す図である。
【図１】
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