(57)【要約】【課題】治療上、胃腸運動を低下させるまたは胃内容排出を遅らせるのに有効である医薬組成物を提供すること。【解決手段】胃腸運動を低下させるまたは胃内容排出を遅らせるのに治療上有効である量のエキセンジン−３、エキセンジン−４またはそれらの組合せを含む、胃腸運動を低下させることまたは胃内容排出を遅らせることを必要とする対象において胃腸運動を低下させるまたは胃内容排出を遅らせるための医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一または分割用量で投与する、胃腸運動を低下させるまたは胃内容排出を遅らせるのに治療上有効である量のエキセンジン−３、エキセンジン−４またはそれらの組合せを含む、胃腸運動を低下させることまたは胃内容排出を遅らせることを必要とする対象において胃腸運動を低下させるまたは胃内容排出を遅らせるための医薬組成物。
【請求項２】
該エキセンジンがエキセンジン−４である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
該対象が食後落下症候群を有する請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
該対象が１型真性糖尿病に関連する食後高血糖症を有する請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
該対象が２型真性糖尿病に関連する食後高血糖症を有する請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
該対象が耐糖能障害に関連する食後高血糖症を有する請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
該治療上有効量のエキセンジンまたはエキセンジン・アゴニストが、９ｍＭ以下まで食後グルコースレベルを低下する請求項１ないし６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
該対象が胃腸診断手法を受けている請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
該胃腸診断手法が放射線医学検査または磁気共鳴イメージング検査である請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
該対象が毒を摂取した請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１１】
エキセンジンまたはエキセンジン・アゴニスト・アナログの該治療有効量が、単一用量または分割用量で一日当たり０.００１ｍｇ／７０ｋｇおよび１ｍｇ／７０ｋｇの用量である請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
エキセンジンまたはエキセンジン・アゴニスト・アナログの該治療有効量が、単一用量または分割用量で一日当たり０.００１ｍｇ／７０ｋｇおよび０.０５ｍｇ／７０ｋｇの用量である請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
エキセンジンまたはエキセンジン・アゴニスト・アナログの該治療有効量が、単一用量または分割用量で一日当たり０.００１ｍｇ／７０ｋｇおよび０.０１ｍｇ／７０ｋｇの用量である請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
該エキセンジンまたはエキセンジン・アゴニスト・アナログが、さらにｐＨ５.６ないし７.４の等張緩衝液を含む請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
該緩衝液が酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液である請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、１９９６年８月８日に出願された米国特許出願第08／694，954号の一部継続出願であり、その内容は出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０００２】
発明の分野
本発明は、胃腸運動を調節するための方法に関する。より詳細には、本発明は、胃内容排出を遅らせる、および／または遅めるのに有用な剤で恩恵を受けるであろう疾患を治療するための、エキセンジン（exendin）ならびにそのアナログおよびアゴニストの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
以下の記載には、本発明を理解するのに有用となり得る情報が含まれる。本明細書中に供するいずれの情報もここに特許請求する発明に対する先行技術であったり、具体的または黙示的に参照するいずれの刊行物も本発明に対する先行技術であるということを、認めるものではない。
本明細書を説明するために用いる特許および特許出願を包含する刊行物および他の材料は出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０００４】
エキセンジン
エキセンジンは、アリゾナで見出されたトカゲの一種であるアメリカドクトカゲの毒液中に見出されたペプチドである。エキセンジン−３[配列番号１]は、ヘロデルマ・ホリダム(Heloderma horridum)の毒液中に存在し、エキセンジン−４[配列番号２]はヘロデルマ・サスペクタム(Heloderma suspectum)の毒液中に存在する（Eng, J.らによるJ. Biol. Chem.，265：20259-62，1990；Eng， J.らによるJ. Biol. Chem.，267：7402-05，1992）。エキセンジンは、グルカゴン様ペプチド・ファミリーの幾つかのメンバーに対してある程度の配列類似性を有し、ＧＬＰ-１[７-３６]ＮＨ２に対しては５３％の最高の相同性を有する(GokeらによるJ. Biol. Chem.，268：19650-55，1993)。ＧＬＰ-１[７-３６]ＮＨ２[配列番号３]はプログルカゴン[７８-１０７]としても知られており、あるいは単純に“ＧＬＰ-１”と略され、本出願全体を通してはＧＬＰ-１[７-３６]ＮＨ２と相互変換可能に用いる。エキセンジン-３、エキセンジン-４およびＧＬＰ-１の配列を図１に示す。ＧＬＰ-１は、膵臓β-細胞からのインスリン分泌を刺激する向インスリン性効果を有し；ＧＬＰ-１は膵臓α-細胞からのグルカゴン分泌をも阻害する（OrskovらによるDiabetes， 42：658-61，1993；D’AlessioらによるJ. Clin. Invest.，97：133-38，1996）。ＧＬＰ-１は胃内容排出 (Willms，B.らによるJ. Clin. Endocrinol. Metab.，81(1)：327-32，1996；Wettergren，A.らによるDig.Dis.Sci.，38(4)：665-73，1993)を、および胃酸分泌(Schjoldager BTらによるDig.Dis.Sci.，34(5)：703-8，1989；O'Halloran DJらによるJ.Endocrinol.，126(1)：163-73，1990；Wettergren，A.らによるDig.Dis.Sci.，38(4)：665-73，1993)をも阻害することが報告されている。そのカルボキシ末端にさらなるグリシン残基を有するＧＬＰ-１[７-３７]も、ヒトにおいてインスリン分泌を刺激する（OrskovらによるDiabetes，42：658-61，1993）。
【０００５】
ＧＬＰ−１の向インスリン性効果に寄与すると考えられている貫膜Ｇ蛋白質アデニル酸シクラーゼ共役型受容体は、β−細胞系からクローン化されており(ThorensによるProc.Natl.Acad.Sci.USA,89：8641−45(1992))、以後、本明細書中では“クローン化ＧＬＰ−１受容体”という。報告によると、エキセンジン−４はモルモット膵臓からの分散膵腺房細胞および胃からの壁細胞において、インスリン−分泌βＴＣ１細胞上のＧＬＰ−１受容体の強力なアゴニストであり；該ペプチドは、単離された胃においてソマトスタチン放出を刺激し、ガストリン放出を阻害することも報告されている(GokeらによるJ.Biol.Chem.，268：19650−55，1993；ScheppらによるEur.J.Pharmacol.，69：183−91，1994；EisseleらによるLife Sci.，55：629−34，1994)。エキセンジン−３およびエキセンジン−４は膵腺房細胞におけるｃＡＭＰ産生刺激および膵腺房細胞からのアミラーゼ放出におけるＧＬＰ−１アゴニストであることが見出された(Malhotra，R.らによるRegulatory Peptides，41：149−56，1992；RaufmanらによるJ.Biol.Chem.，267：21432−37，1992；SinghらによるRegul.Pept.，53：47−59，1994)。エキセンジン−３およびエキセンジン−４の向インスリン活性に基いて、真性糖尿病の治療および高血糖症の予防のためのそれらの使用が提唱されている(Eng.による米国特許第5，424，286号)。
【０００６】
完全長エキセンジンとは反対に、エキセンジン[９−３９]、カルボキシアミド化分子、およびエキセンジンのフラグメント３−３９ないし９−３９のごとき切頭エキセンジンペプチドがＧＬＰ−１の強力かつ選択的なアンタゴニストであることが報告されている（Gokeらによる、Ｊ.Biol.Chem.，268：19650−55,1993；Schepp，W.らによるEur.J.Pharm..，269：183−91，1994；Montrose−RafizadehらによるDiabetes，45(増刊2)：152A，1996）。報告によれば、配列を図１に示すエキセンジン[９−３９]は、イン・ビボ（in vivo）で内因的ＧＬＰ−１をブロックし、その結果、インスリン分泌を低下させる（WangらによるＪ.Clin.Invest.，95：417−21，1995；D’AlessioらによるJ.Clin.Invest.，97：133−38，1996）。エキセンジンおよびエキセンジン[９−３９]は、クローン化ＧＬＰ−１受容体に結合する(Fehmann，HCらによるPeptides，15(3)：453−６，1994；Thorens,B.らによるDiabetes，42(11)：1678−82，1993)。クローン化ＧＬＰ−１受容体でトランスフェクトした細胞においては、エキセンジン−４はアゴニストであり、すなわちそれはｃＡＭＰを上昇させ、一方エキセンジン[９−３９]はアンタゴニストであり、すなわちそれはエキセンジン−４およびＧＬＰ−１の刺激作用をブロックする。
【０００７】
エキセンジン[９−３９]は完全長エキセンジンのアンタゴニストとして作用することも報告されており、エキセンジン−３およびエキセンジン−４による膵腺房細胞の刺激を阻害する（RaufmanらによるJ.Biol.Chem.，266：2897−902，1991；RaufmanらによるJ.Biol.Chem.，266：21432−37，1992）。エキセンジン[９−３９]はエキセンジン−４による血漿インスリンレベルの刺激を阻害し、エキセンジン−４およびＧＬＰ−１のソマトスタチン放出−刺激活性およびガストリン放出−阻害活性を阻害するといわれている（Kolligs，F.らによるDiabetes，44：16−19，1995；EisseleらによるLife Science，55：629−34，1994）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
胃内容排出を遅らせるよう作用する剤は、胃腸放射線検査における診断助剤として医学における場所が見出されている。例えば、グルカゴンはランゲルハンスの膵島α細胞により産生されるポリペプチドホルモンである。それは、肝臓のグリコーゲン分解を活性化することによりグルコースを代謝する高血糖症剤である。それは、より低い程度で、膵臓インスリンの分泌を刺激する。グルカゴンはグルコースの静脈内投与が不可能な場合に、インスリン−誘導性低血糖症の治療に用いられる。しかしながら、グルカゴンは胃腸管の運動を低下させるため、それは胃腸放射線検査における診断助剤としても用いられる。グルカゴンは痙攣と関連する種々の疼痛性胃腸疾患を治療するための幾つかの実験においても用いられている。Danielらは、鎮痛薬または鎮痙薬で処理した患者と比較して、グルカゴンで処理した患者における急性憩室炎のより迅速な症候援助を報告している（Br.Med.J.,1974，3，720）。Glauserらによる概説(J.Am.Coll.Emergency Physns，8：228，1979)は、グルカゴン療法後の急性食道食物閉鎖の援助を記載している。もう１の実験においては、プラセボで処理した２２患者と比較して胆道疾病を有する２１患者において、グルカゴンは疼痛および圧痛を顕著に軽減した（M.J.StowerらによるBr.J.Surg.，69：591−2，1982）。
【０００９】
アミリン・アゴニストを用いる胃腸運動を調節するための方法は、１９９５年３月１６日に公開された国際出願PCT／US94／10225に記載されている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明は、エキセンジンが胃内容排出の強力なインヒビターであるという驚くべき発見に関する。エキセンジンおよびエキセンジン・アゴニストは、例えば、真性糖尿病、肥満症、毒の摂取を治療するための、または診断目的の胃内容排出のインヒビターとして有用である。
【００１１】
本発明は、エキセンジン、例えばエキセンジン３[配列番号１]、エキセンジン４[配列番号２]、またはそこでエキセンジンが胃運動および胃内容排出に対するその作用を発揮する受容体に有効に結合する他の化合物を投与することを含む、胃運動を低下させ、胃内容排出を遅めるための新規の方法に指向される。
【発明の効果】
【００１２】
これらの方法は、例えば、食後高血糖症、１型真性糖尿病（インスリン依存性）および２型真性糖尿病（非−インスリン依存性）に関連する合併症の治療に有用であろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
第１の態様において、本発明は、治療有効量のエキセンジンまたはエキセンジン・アゴニストを対象に投与することにより、該対象における胃腸運動を有利に調節する方法をその要旨とする。“エキセンジン・アゴニスト”とは、胃運動および胃内容排出に対するエキセンジンの効果を模倣する化合物、すなわち、そこでエキセンジンが胃運動および胃内容排出に対するその作用を発揮する受容体に有効に結合する化合物を意味し、好ましくはエキセンジンのアナログまたは誘導体である。
【００１４】
本発明において有用なエキセンジン・アゴニスト化合物には、式（Ｉ）[配列番号４]：
【００１５】
【化１】
2008044964.tif 000002
【００１６】
[式中、Xaa１はHis、ArgまたはTyrであり；Xaa２はSer、Gly、AlaまたはThrであり；Xaa３はAspまたはGluであり；Xaa４はPhe、Tyrまたはナフトアラニンであり；Xaa５はThrまたはSerであり；Xaa６はSerまたはThrであり；Xaa７はAspまたはGluであり；Xaa８はLeu、Ile、Val、ペンチルグリシンまたはMetであり；Xaa９はLeu、Ile、ペンチルグリシン、ValまたはMetであり；Xaa１０はPhe、Tyrまたはナフトアラニンであり；Xaa１１はIle、Val、Leu、ペンチルグリシン、tert−ブチルグリシンまたはMetであり；Xaa１２はGluまたはAspであり；Xaa１３はTrp、Phe、Tyrまたはナフチルアラニンであり；Xaa１４、Xaa１５、Xaa１６およびXaa１７は独立して、Pro、ホモプロリン、３Hyp、４Hyp、チオプロリン、Ｎ−アルキルグリシン、Ｎ−アルキルペンチルグリシンまたはＮ−アルキルアラニンであり；Xaa１８はSer、ThrまたはTyrであって；Ｚは−ＯＨまたは−ＮＨ２であり；
但し、当該化合物は配列番号１または２いずれかの式を有することはない]
で示される化合物が含まれる。また、本発明において有用なのは、式（Ｉ）で示される化合物の医薬上許容される塩である。
【００１７】
１の具体例において、本発明の方法は胃運動を低下させることに指向される。もう１の具体例において、本発明は胃内容排出を遅らせる方法に指向される。
【００１８】
これらの方法は、胃腸診断法、例えば放射線医学検査または磁気共鳴イメージングを受けている対象に対して用い得る。別法として、これらの方法は、胃腸疾患、例えば（急性憩室炎、胆道の疾患またはオッジ括約筋の疾患と関連し得る）痙攣に苦しむ対象における胃運動を低下させるために用いることができる。
【００１９】
もう１の態様において、本発明は、治療有効量のエキセンジンまたはエキセンジン・アゴニストを対象に投与することにより該対象における食後落下症候群を治療する方法に指向される。
【００２０】
なおもう１の態様において、本発明は、治療有効量のエキセンジンまたはエキセンジン・アゴニストを対象に投与することにより食後高血糖症を治療する方法に指向される。好ましい具体例において、該食後高血糖症は２型真性糖尿病の結果である。他の好ましい具体例において、該食後高血糖症は１型真性糖尿病または耐糖能障害の結果である。
【００２１】
もう１の態様において、治療有効量のアミリン・アゴニストをも該対象に投与する。好ましい態様において、該アミリン・アゴニストはアミリン、または２５，２８，２９Pro−ヒト−アミリンのごときアミリン・アゴニストである。食後高血糖症を治療するための、ならびに胃腸運動を有利に調節するためのアミリン・アゴニストの使用は、出典明示して本明細書の一部とみなす１９９５年３月１６日に公開された国際特許出願PCT／US94／10225に記載されている。
【００２２】
なおもう１の態様において、治療有効量のインスリンまたはインスリン・アナログをも、エキセンジンまたはエキセンジン・アゴニストと別々または一緒に該対象に投与する。
【００２３】
もう１の態様において、本発明は、胃内容物の腸への通過を防ぐかまたは減少させるのに有効な量のエキセンジンまたはエキセンジン・アゴニストを投与し、次いで該胃内容物を吸引することにより毒の摂取を治療する方法に指向される。
【００２４】
定義
本発明による、および本明細書中で用いる以下の用語は、別段明言しない限り、以下の意味を有するよう定義される。
”アミノ酸”なる語は、天然系アミノ酸、非天然系アミノ酸、およびアミノ酸アナログをいい、その構造がかかる立体異性体型を許容する場合にはそれらのすべてのＤおよびＬ立体異性体をいう。天然系アミノ酸には、アラニン(Ala)、アルギニン(Arg)、アスパラギン(Asn)、アスパラギン酸(Asp)、システイン(Cys)、グルタミン(Gln)、グルタミン酸(Glu)、グリシン(Gly)、ヒスチジン(His)、イソロイシン(Ile)、ロイシン(Leu)、リジン(Lys)、メチオニン(Met)、フェニルアラニン(Phe)、プロリン(Pro)、セリン(Ser)、スレオニン(Thr)、トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)およびバリン(Val)が含まれる。非天然系アミノ酸には、限定されるものではないが、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、第三級ブチルグリシン、２,４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２,２'−ジアミノピメリン酸、２,３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフトアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸およびチオプロリンが含まれる。アミノ酸アナログには、それらのＮ−末端アミノ基上またはそれらの側鎖基上で、可逆的または不可逆的に化学的にブロックされた、または修飾された天然系および非天然系のアミノ酸が含まれ、例えば、メチオニンスルフォキシド、メチオニンスルホン、Ｓ−(カルボキシメチル)−システイン、Ｓ−(カルボキシメチル)−システインスルフォキシドおよびＳ−(カルボキシメチル)−システインスルホンが含まれる。
【００２５】
“アミノ酸アナログ”なる語は、そのＣ−末端カルボキシ基、そのＮ−末端アミノ基またはその側鎖官能基のいずれかが他の官能基に化学的に修飾されているアミノ酸をいう。例えば、アスパラギン酸−(ベータ−メチル エステル)はアスパラギン酸のアミノ酸アナログであり；Ｎ−エチルグリシンはグリシンのアミノ酸アナログであり；または、アラニンカルボキサミドはアラニンのアミノ酸アナログである。
“アミノ酸残基”なる語は、構造：
（１)−Ｃ(Ｏ)−Ｒ−ＮＨ−
[式中、Ｒは典型的には−ＣＨ(Ｒ')−であり、ここにＲ'はアミノ酸側鎖、典型的にはＨまたは炭素含有置換基である]；または
（２）
【００２６】
【化２】
2008044964.tif 000003
【００２７】
[式中、ｐは１、２もしくは３であり、各々、アゼチジンカルボン酸、プロリンまたはピペコリン酸残基を表す]
を有する基をいう。
【００２８】
“低級”なる語は、本明細書中ではアルキル基のごとき有機基と結合していい、約６以下、好ましくは４以下、有利には１もしくは２の炭素原子を有するかかる基を定義する。かかる基は直鎖または分岐鎖であってもよい。
【００２９】
“医薬上許容される塩”には、かかる化合物と有機酸または無機酸の組合わせに由来する本発明の化合物の塩が含まれる。実際には、塩形態の使用は塩基形態の使用に事実上等しい。本発明の化合物は、遊離塩基および塩形態の双方において有用であり、双方の形態とも本発明の範囲内にあると考えられる。
【００３０】
加えて、以下の略号は以下のものを表す：
“ＡＣＮ”または“ＣＨ３ＣＮ”とはアセトニトリルをいう。
“Ｂｏｃ”、“ｔＢｏｃ”または“Ｔｂｏｃ”とはｔ−ブトキシカルボニルをいう。
“ＤＣＣ”とはＮ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミドをいう。
“Ｆｍｏｃ”とはフルオレニルメトキシカルボニルをいう。
“ＨＢＴＵ”とは２−(１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１,１,３,３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルロホスフェートをいう。
“ＨＯＢｔ”とは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物をいう。
“ｈｏｍｏＰ”または“ｈＰｒｏ”とはホモプロリンをいう。
“ＭｅＡｌａ”または“Ｎｍｅ”とはＮ−メチルアラニンをいう。
“ｎａｐｈ”とはナフチルアラニンをいう。
“ｐＧ”または“ｐＧｌｙ”とはペンチルグリシンをいう。
“ｔＢｕＧ”とは第三級ブチルグリシンをいう。
“ＴｈｉｏＰ”または“ｔＰｒｏ”とはチオプロリンをいう。
【００３１】
図面の簡単な説明
図１は三文字アミノ酸記号よりも標準的な一文字記号を用いた、エキセンジン３、エキセンジン４、およびエキセンジン[９−３９]のアミノ酸配列の比較を示す。
【００３２】
図２は正常ラット(各時点についてｎ＝３−１７)における胃栄養法後２０分の胃内容物の保持に対する、先の皮下注射のＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２、エキセンジン−３およびエキセンジン−４の用量−応答効果を示す。記号は平均±ＳＥＭであり、曲線は最適合論理関数(best fitting logistic function)を定義する。“ゼロ”は非処理正常ラット中に保持された胃内容物の画分を示す。
【００３３】
図３は正常ラットにおける胃栄養法後２０分の胃内容物の保持に対する、先の注射のエキセンジン−４(ｎ＝２９)、エキセンジン−４酸（ｎ＝３６）および
１４Leu,２５Pheエキセンジン−４(ｎ＝３６)の用量−応答効果を示す。記号は平均±平均の標準誤差を意味し、曲線は最適論理関数を定義する。“ゼロ”は非処理正常ラット中に保持された胃内容物の画分を示す。
【００３４】
図４は胃栄養法後２０分の胃内容物の保持に対する、先の注射の１.０μｇのエキセンジン−４(ｓｃ)、ｎ＝６；１.０μｇのエキセンジン−４（ｓｃ）＋０.３ｍｇのエキセンジン[９−３９]（ｓｃ）、ｎ＝６；および０.３ｍｇのエキセンジン[９−３９]（ｓｃ）、ｎ＝６の効果を示す。また、ｔ＝０およびｔ＝２０分における塩類溶液対照も示す。エラーバーは平均の標準誤差を示す。図４に示すごとく、エキセンジン−４は単独で胃内容排出を強力に阻害した。エキセンジン[９−３９]（ｓｃ）は単独で胃内容排出に対して何ら効果を有していなかった。エキセンジン−４と共に注射した場合、エキセンジン[９−３９]は、胃内容排出阻害に対するエキセンジン−４の効果に拮抗しなかった。
【００３５】
図５は胃栄養法後２０分の胃内容物の保持に対する、先の注射の０.３μｇのエキセンジン−４（ｓｃ）、ｎ＝５および０.３μｇのエキセンジン−４（ｓｃ）＋０.５ｍｇのエキセンジン[９−３９]（ｉｖ）、ｎ＝５の効果を示す。また、ｔ＝０およびｔ＝２０における塩類溶液対照も示す。エラーバーは平均の標準誤差を示す。図５に示すごとく、エキセンジン−４は単独で胃内容排出を強力に阻害した。エキセンジン−４と共に注射した場合、エキセンジン[９−３９]（ｉｖ）は、胃内容排出阻害に対するエキセンジン−４の効果に拮抗しなかった。
【００３６】
図６は胃栄養法後２０分の胃内容物の保持に対する、先の注射の１０μｇのＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２（ｓｃ）、ｎ＝８；１０μｇのＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２（ｓｃ）＋３ｍｇのエキセンジン[９−３９]（ｓｃ）、ｎ＝６；および０.３ｍｇのエキセンジン[９−３９]（ｓｃ）、ｎ＝６の効果を示す。また、ｔ＝０およびｔ＝２０における塩類溶液対照も示す。エラーバーは平均の標準誤差を示す。図６に示すごとく、ＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２は、胃内容排出を強力に阻害した。エキセンジン−[９−３９]（ｓｃ）は単独で胃内容排出に対して何ら影響を有していなかった。ＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２と共に注射した場合、エキセンジン[９−３９]は、胃内容排出阻害に対するＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２の効果に拮抗しなかった。
【００３７】
図７は胃栄養法後２０分の胃内容物の保持に対する、先の注射の１０μｇのＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２（ｓｃ）、ｎ＝８および１０μｇのＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２（ｓｃ）＋０.５ｍｇのエキセンジン[９−３９]（ｉｖ）、ｎ＝３の効果を示す。また、ｔ＝０およびｔ＝２０における塩類溶液対照も示す。エラーバーは平均の標準誤差を示す。図７に示すごとく、ＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２は単独で胃内容排出を強力に阻害した。ＧＬＰ−[７−３６]ＮＨ２と共に注射した場合、エキセンジン−[９−３９]（ｉｖ）は、胃内容排出阻害に対するＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２の効果に拮抗しなかった。
【００３８】
図８−１および８−２は、ある種のエキセンジン・アゴニストのアミノ酸配列を図示する[配列番号５−３５]。
【００３９】
発明の詳細な説明
エキセンジンおよび(エキセンジン・アナログおよびエキセンジン誘導体を含む)エキセンジン・アゴニストは、それらの薬理学的特性の見地より本発明において有用である。エキセンジン・アゴニストとしての活性は下記のアッセイにおける活性によって示すことができる。胃運動および胃内容排出に対するエキセンジンまたはエキセンジン・アゴニストの効果は、実施例１−３で後記する方法、または胃運動を判定する他の当該技術分野で公知のもしくは同等の方法を用いて、同定し、評価し、またはそれにつきスクリーニングすることができる。ＧＬＰ−１受容体調製物のごときエキセンジン・アゴニスト化合物または候補エキセンジン・アゴニスト化合物についてのネガティブ受容体アッセイまたはスクリーニング、出典明示して本明細書の一部とみなす１９９３年１１月２３日に発行された米国特許第5,264,372号に記載されているアミリン受容体調製物を用いるアミリン受容体アッセイ／スクリーニング、例えばアデニルシクラーゼ活性の刺激に共役するカルシウム受容体を含むＴ４７ＤおよびＭＣＦ７肺癌細胞を用いる１またはそれを超えるカルシトニン受容体アッセイ／スクリーニング、ならびに／あるいは、例えばＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を用いるＣＧＲＰ受容体アッセイ／スクリーニングを用いてエキセンジン・アゴニスト活性を評価し、および／または確認することができる。
【００４０】
胃運動を遅める化合物の能力を同定または評価することにおいて使用するための１のかかる方法は：
（ａ）試験試料および試験系を一緒にし、ここに該試験試料は１またはそれを超える試験化合物を含み、該試験系は胃運動を評価するための系を含み、該系は例えばそれがグルコースまたは食事の当該系への導入に応答して血漿グルコースの上昇を示すことを特徴とし；次いで、
（ｂ）該系における血漿グルコースの上昇の存在またはその量を判定することを含む。ポジティブおよび／またはネガティブ対照を用いることもできる。
本明細書中に記載するエキセンジンならびにエキセンジン・アナログおよびエキセンジン誘導体のごときエキセンジン・アゴニスト化合物は、例えば、出典明示して本明細書の一部とみなすEngらによるJ.Biol.Chem.,265：20259-62，1990；およびEngらによるJ.Biol.Chem.，267：7402-05，1992に記載されているペプチド精製を通して調製することができる。別法として、エキセンジンおよびエキセンジン・アゴニストペプチドは、標準的な固相ペプチド合成技術および好ましくは自動化または半自動化ペプチドシンセサイザーを用いて、例えば、出典明示して本明細書の一部とみなすRaufmanらによるJ.Biol.Chem.，267：21432-37，1992に記載されているごとき、当業者に知られている方法によって調製することができる。典型的には、ジイソプロピルエチルアミンのごとき塩基、ならびにジシクロヘキシルカルボジイミドおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾールのごときカップリング剤存在下、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリジノンまたは塩化メチレンのごとき不活性溶媒中、α−Ｎ−カルバモイル保護アミノ酸および樹脂上の伸長しているペプチド鎖に結合したアミノ酸を、室温にてカップリングさせる。トリフルオロ酢酸またはピペリジンのごとき試薬を用いてα−Ｎ−カルバモイル保護基を得られたペプチド−樹脂から除去し、次いで該ペプチド鎖に付加すべき次の目的のＮ−保護アミノ酸で該カップリング反応を繰返す。適当なＮ−保護基は当該技術分野でよく知られているが、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）およびフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）がここにおいては好ましい。
【００４１】
ペプチドシンセサイザーで用いる溶媒、アミノ酸誘導体および４−メチルベンズヒドリル−アミン樹脂はApplied Biosystems Inc.社（Foster City，CA）から購入し得る。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（ＢｒＺ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｂｚｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、およびＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）のごとき側鎖保護アミノ酸は、Applied Biosystems，Inc.社から購入し得る。Ｂｏｃ−Ｈｉｓ(ＢＯＭ)はApplied Biosystems，Inc.社またはBachem Inc.社（Torrance，CA）から購入し得る。アニソール、メチルスルフィド、フェノール、エタンジオールおよびチオアニソールは、Aldrich Chemical Company社(Milwaukee，WI)から得ることができる。Air Products and Chemicals社(Allentown，PA)はＨＦを供給している。エチルエーテル、酢酸およびメタノールはFisher Scientific社(Pittsburgh，PA)から購入し得る。
【００４２】
固相ペプチド合成は、ＮＭＰ／ＨＯＢｔ(オプション１)系およびキャッピングしたｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学を用いて自動ペプチドシンセサイザー(Model 430A，Applied Biosystems Inc.社，Foster City，CA)で行うことができる（１９８８年７月１日発行、Applied Biosystems社のABI 430A Peptide Synthesizer使用者マニュアル、Version 1.3B、Section ６、pp.49−70、Applied Biosystems，Inc.社, Foster City, CAを参照されたし）。Ｂｏｃ−ペプチド−樹脂はＨＦで切断することができる(−５℃〜０℃にて、１時間)。交互の水および酢酸を用いて該ペプチドを樹脂から抽出し、その濾液を凍結乾燥することができる。Ｆｍｏｃ−ペプチド樹脂は標準的な方法（Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc.社, 1990, pp.6-12）に従って切断することができる。ペプチドはAdvanced Chem Tech Synthesizer(Model MPS 350，Louisville，Kentucky)を用いても組み立てることができる。ペプチドは、Waters Delta Prep 3000 systemを用いる(分取および分析用)ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製することができる。Ｃ４、Ｃ８またはＣ１８分取用カラム(１０μ、２.２×２５ｃｍ；Vydac社，Hesperia，CA)を用いてペプチドを単離することができ、その純度はＣ４、Ｃ８またはＣ１８分析用カラム(５μ、０.４６×２５ｃｍ；Vydac社)を用いて判定することができる。溶媒（Ａ＝０．１％ ＴＦＡ／水およびＢ＝０.１％ ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）は分析用カラムには１.０ｍｌ／分の流速で、分取用カラムには１５ｍｌ／分の流速で送ることができる。アミノ酸分析はWaters Pico Tag system上で行い、Maxima programを用いてプロセシングし得る。該ペプチドは気−相酸加水分解（１１５℃、２０−２４時間）によって加水分解することができる。加水分解物は標準的な方法によって誘導化および分析し得る（Cohen，S.A.，Meys，M.およびTarrin，T.L.による(1989)，The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, pp. 11-52, Millipore Corporation社, Milford, MA）。高速原子衝突分析はM−Scan，Incorporated社(West Chester，PA)によって行うことができる。質量較正（mass calibration）はヨウ化セシウムまたはヨウ化セシウム／グリセリンを用いて行うことができる。飛行時間型検出を用いるプラズマデソープションイオン化分析は、Applied Biosystems Bio-Ion 20 質量分析器上で行うことができる。
【００４３】
本発明において有用なペプチド化合物は、当該技術分野で現在知られている方法を用いる組換えＤＮＡ技術を用いても調製し得る（例えば、SambrookらによるMolecular Cloning：A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor （1989）を参照されたし）。別法として、かかる化合物は均一相ペプチド合成法によっても調製することができる。
【００４４】
エキセンジンのアナログまたは誘導体の使用は本発明の方法の範囲内に含まれる。エキセンジンのアナログまたは誘導体とは、同様のアミノ酸配列を有し、ある程度まで、関連するエキセンジンの少なくとも胃運動−および胃内容排出−関連活性を保持している機能性バリアントである。“機能性バリアント”とは、特定のエキセンジンの１またはそれを超える活性に代ることができる活性を有するアナログまたは誘導体を意味する。好ましい機能性バリアントは特定のエキセンジンのすべての活性を保持しているものであるが、該機能性バリアントは、例えば本明細書中に開示するもののごとく、定量的に測定した場合にエキセンジン機能アッセイにおいて測定されるよりもより強いか、またはより弱い活性を有していてもよい。好ましい機能性バリアントは、関連エキセンジンの活性の約１％〜約１０,０００％、より好ましくは約１０％〜約１０００％の間、およびよりさらに好ましくは約５０％〜約５００％内にある活性を有するものである。誘導体は、該関連エキセンジンに対して、少なくとも約１５％、好ましくは約７０％、より好ましくは約９０％、なおより好ましくは約９５％の配列類似性を有する。“配列類似性”とは、ポリペプチドの起源にかかわりなく、２の異なるポリペプチドにおけるアミノ酸配列の間に認められる“相同性”をいう。
【００４５】
幾分かの活性を保持する該アナログまたは誘導体の能力は、本明細書中に記載する技術を用いて測定することができる。
【００４６】
誘導体には、例えばリン酸化、グリコシル化、架橋形成、アシル化、蛋白質加水分解切断、ならびに抗体分子、膜分子または他のリガンドへの結合による、翻訳中または翻訳後に起こる修飾が含まれる（FergusonらによるAnnu. Rev. Biochem.,57：285−320，1988を参照されたし）。
【００４７】
特異的なタイプのアナログには、欠失、置換、付加、およびアミノ酸修飾のごときアミノ酸改変が含まれる。“欠失”とは、関連ポリペプチド中における１またはそれを超えるアミノ酸残基（群）の不存在をいう。“付加”とは関連ポリペプチド中における１またはそれを超えるアミノ酸残基（群）の存在をいう。ポリペプチドへの付加および欠失はアミノ末端、カルボキシ末端、および／または鎖内部に存在し得る。アミノ酸“修飾”とは、非天然発生アミノ酸を生成する天然発生アミノ酸の改変をいう。“置換”とは当該ポリペプチド中における他のアミノ酸残基（群）による１またはそれを超えるアミノ酸残基（群）の置換わりをいう。アナログには、１を超える改変および異なるタイプの改変を含む改変の異なる組合わせを含むことができる。
【００４８】
好ましいアナログは、エキセンジン・アゴニスト活性に大きく影響を及ぼさない１またはそれを超えるアミノ酸改変（群）を有するものである。エキセンジン・アゴニスト活性に必要でないエキセンジンの領域においては、活性に影響を及ぼすより少ない危険性で、アミノ酸は欠失、付加または置換していてもよい。エキセンジン・アゴニスト活性に必要な領域においては、エキセンジン活性に影響を及ぼすより大きな危険性が存在するため、アミノ酸改変はあまり好ましくない。かかる改変は同類改変（conservative alternation）であるべきである。例えば、該配列内の１またはそれを超える配列を、機能性バリアントとして作用する同様の極性の他のアミノ酸によって置換することができる。
【００４９】
保存領域は非−保存領域よりも蛋白質活性についてより重要である傾向である。イン・ビトロ（in vitro）突然変異技術または欠失分析を用い、次いで本開示により記載する受容体活性を測定して、公知の手法を用いて受容体活性に重要な保存および非保存領域を判定し得る。
【００５０】
特異的なポリペプチドに対する修飾は、部位特異的突然変異および固相合成の間のアミノ酸置換を通すごとく熟慮することができ、あるいは当該ポリペプチドを産生する宿主または系中の突然変異を通すごとく偶発的であってもよい。
本発明により特に有用な化合物は式（Ｉ）[配列番号４]：
【００５１】
【化３】
2008044964.tif 000004
【００５２】
[式中、Xaa１はHis、ArgまたはTyrであり；Xaa２はSer、Gly、AlaまたはThrであり；Xaa３はAspまたはGluであり；Xaa４はPhe、Tyrまたはナフトアラニンであり；Xaa５はThrまたはSerであり；Xaa６はSerまたはThrであり；Xaa７はAspまたはGluであり；Xaa８はLeu、Ile、Val、ペンチルグリシンまたはMetであり；Xaa９はLeu、Ile、ペンチルグリシン、ValまたはMetであり；Xaa１０はPhe、Tyrまたはナフトアラニンであり；Xaa１１はIle、Val、Leu、ペンチルグリシン、tert−ブチルグリシンまたはMetであり；Xaa１２はGluまたはAspであり；Xaa１３はTrp、Phe、Tyrまたはナフチルアラニンであり；  Xaa１４、Xaa１５、Xaa１６およびXaa１７は独立して、Pro、ホモプロリン、３Hyp、４Hyp、チオプロリン、Ｎ−アルキルグリシン、Ｎ−アルキルペンチルグリシンまたはＮ−アルキルアラニンであり；Xaa１８はSer、ThrまたはTyrであって；およびＺは−ＯＨまたは−ＮＨ２であり；
但し、当該化合物は配列番号１または２いずれかの式を有することはない]
で示されるエキセンジン・アゴニストである。Ｎ−アルキルグリシン、Ｎ−アルキルペンチルグリシンおよびＮ−アルキルアラニンについての好ましいＮ−アルキル基には、好ましくは１〜６の炭素原子、より好ましくは１〜４の炭素原子の低級アルキル基が含まれる。適当な化合物には、配列番号５〜３５で示されるアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【００５３】
好ましいエキセンジン・アゴニスト化合物には、Xaa１がHisまたはTyrであるものが含まれる。より好ましくはXaa１はHisである。
好ましいのは、Xaa１がGlyである化合物である。
好ましいのは、Xaa９がLeu、ペンチルグリシンまたはMetである化合物である。
好ましい化合物には、Xaa１３がTrpまたはPheであるものが含まれる。
また、好ましいのは、Xaa４がPheまたはナフトアラニンであり；Xaa１１がIleまたはValであって、Xaa１４、Xaa１５、Xaa１６およびXaa１７が独立して、Pro、ホモプロリン、チオプロリンまたはＮ−アルキルアラニンから選択される化合物である。好ましいＮ−アルキルアラニンは、１〜約６の炭素原子のＮ−アルキル基を有する。
【００５４】
特に好ましい態様によれば、Xaa１５、Xaa１６およびXaa１７は同一のアミノ酸残基である。
好ましいのは、Xaa１８がSerまたはTyr、より好ましくはSerである化合物である。
好ましいＺは−ＮＨ２である。
【００５５】
１の態様によれば、好ましいのは、式中、Xaa１がHisまたはTyr、より好ましくはHisであり；Xaa２がGlyであり；Xaa４がPheまたはナフトアラニンであり；Xaa９がLeu、ペンチルグリシンまたはMetであり；Xaa１０がPheまたはナフトアラニンであり；Xaa１１がIleまたはValであり；Xaa１４、Xaa１５、Xaa１６およびXaa１７が独立して、Pro、ホモプロリン、チオプロリンまたはＮ−アルキルアラニンから選択され；Xaa１８がSerまたはTyr、より好ましくはSerである式（Ｉ）で示される化合物である。より好ましくはＺは−ＮＨ２である。
【００５６】
特に好ましい態様によれば、特に好ましい化合物には、式中、Xaa１がHisまたはArgであり；Xaa２がGlyであり；Xaa３がAspまたはGluであり；Xaa４がPheまたはナフチルアラニンであり；Xaa５がThrまたはSerであり；Xaa６がSerまたはThrであり；Xaa７がAspまたはGluであり；Xaa８がLeuまたはペンチルグリシンであり；Xaa９がLeuまたはペンチルグリシンであり；Xaa１０がPheまたはナフチルアラニンであり；Xaa１１がIle、Valまたはｔ-ブチルチルグリシンであり；Xaa１２がGluまたはAspであり；Xaa１３がTrpまたはPheであり；Xaa１４、Xaa１５、Xaa１６およびXaa１７が独立して、Pro、ホモプロリン、チオプロリンまたはＮ−メチルアラニンであり； Xaa１８がSerまたはTyrであって；Ｚが-ＯＨまたは-ＮＨ２であり；但し、当該化合物は配列番号１または２いずれかの式を有することはない式（Ｉ）で示されるものが含まれる。より好ましくはＺは−ＮＨ２である。特に好ましい化合物には、配列番号５、６、１７、１８、１９、２２、２４、３１、３２および３５で示されるアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【００５７】
特に好ましい態様によれば、提供するのは式中、Xaa９がLeu、Ile、Valまたはペンチルグリシン、より好ましくはLeuまたはペンチルグリシンであって、Xaa１３がPhe、Tyrまたはナフチルアラニン、より好ましくはPheまたはナフチルアラニンである化合物である。これらの化合物は、イン・ビトロおよびイン・ビボの双方において、ならびに当該化合物の合成の間に、作用の有利な継続を示し、酸化的分解をより受けることが少ないと考えられる。
【００５８】
前記に参照した化合物は、種々の無機および有機の酸および塩基と塩を形成する。かかる塩には、有機酸および無機酸、例えばＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ２ＳＯ４、Ｈ３ＰＯ４、トリフルオロ酢酸、酢酸、ギ酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、マレイン酸、フマル酸およびカンファスルホン酸で調製する塩が含まれる。塩基で調製する塩には、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩およびカリウム塩、ならびにアルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩およびマグネシウム塩が含まれる。酢酸塩、塩酸塩およびトリフルオロ酢酸塩が好ましい。該塩は、塩が不溶性である溶媒もしくは媒質中または水のごとき溶媒中にて、遊離酸または塩基形態の生成物と１またはそれを超える当量の適当な塩基または酸とを反応させ、次いでこれを真空下にて、または凍結乾燥もしくは適当なイオン交換樹脂上で存在する塩のイオンを他のイオンに交換することによって除去することによるごとき、慣用技術によって形成することができる。
【００５９】
前記に参照した化合物は、種々の無機および有機の酸および塩基と塩を形成する。かかる塩には、有機酸および無機酸、例えばＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ２ＳＯ４、Ｈ３ＰＯ４、トリフルオロ酢酸、酢酸、ギ酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、マレイン酸、ギ酸およびカンファスルホン酸で調製する塩が含まれる。塩基で調製する塩には、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩およびカリウム塩、ならびにアルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩およびマグネシウム塩が含まれる。酢酸塩、塩酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩が好ましい。該塩は、塩が不溶性である溶媒または媒質中、または水のごとき溶媒中にて、遊離酸または塩基形態の生成物と１またはそれを超える当量の適当な塩基または酸とを反応させ、次いでこれを真空下にて、または凍結乾燥もしくは適当なイオン交換樹脂上で存在する塩のイオンを他のイオンに交換することによるごとき、慣用技術によって形成することができる。
【００６０】
前記した化合物はそれらの薬理学的特性の見地から有用である。特に、本発明の化合物は、哺乳動物において胃内容排出レベルを阻害する能力によって明らかにされるごとく、胃運動を調節し、胃内容排出を遅める剤としての活性を有する。
【００６１】
実施例１に記載するごとく、胃内容排出は胃管栄養法によって送るフェノールレッドを含有する無カロリーメチルセルロースゲルの保持を用いて、正常スプラーグ・ドーリーラット(Sprague Dawley rat)で測定した。２０分後に殺した後に取出した胃中の染料内容物を分光的に測定し、胃管栄養法直後に殺したラット中のものと比較して内容排出を評価した。エキセンジン、エキセンジン３およびエキセンジン４は、用量依存的に胃内容排出を阻害した。エキセンジン３およびエキセンジン４に対する応答のＥＤ５０は、各々、０.１および０.０８μｇであり、このことは胃内容排出においてエキセンジンがＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２よりも〜１７０−２９０倍より強力であることを実証している。
【００６２】
実施例２に記載するごとく、胃内容排出の阻害に対するエキセンジン−４およびエキセンジン−４アナログ、エキセンジン−４酸および１４Leu,２５Pheエキセンジン−４の効果を検査した。エキセンジン−４およびエキセンジン−４アナログは用量依存的に胃内容排出を阻害した。エキセンジン−４のＥＤ５０は０.２７μｇであった。エキセンジン−４酸および１４Leu,２５Pheエキセンジン−４のＥＤ５０は、各々、０.１２μｇおよび０.２９μｇであり、このことは該アナログの活性がエキセンジン−４のものに匹敵することを示している。
【００６３】
実施例３に記載するごとく、胃内容排出に対するエキセンジン−４およびクローン化ＧＬＰ−１受容体アンタゴニスト、エキセンジン[９−３９]の効果を検査した。２０分後に、エキセンジン−４で処理した動物は胃内容排出の強力な阻害を示し、これはエキセンジン[９−３９]によって逆転しなかった。このことは、エキセンジン[９−３９]をｓｃで、またはｉｖで投与するかにかかわりなく起こった。エキセンジン[９−３９]単独では胃内容排出に対して何ら効果を有していなかった。
【００６４】
前記に注記したごとく、エキセンジン[３−３９]はクローン化ＧＬＰ−１受容体において結合するＧＬＰ−１の強力なアンタゴニストである（Fehmann HCらによるPeptides，15(3)：453−6,1994；Thorens，B.らによるDiabetes，42(11)：1678−82，1993）。しかしながら、驚くべきことには、エキセンジン[９−３９]は胃内容排出に対するエキセンジン−４の効果をブロックしなかった(図４および５を参照されたし)。これらの結果は、胃内容排出に対するエキセンジンおよびエキセンジン・アゴニストの効果がクローン化ＧＬＰ−１受容体におけるエキセンジンの結合に起因するものでなく、エキセンジンおよびエキセンジン・アゴニストの胃内容排出効果が別々の受容体に対するそれらの作用に起因することを示している。
【００６５】
クローン化ＧＬＰ−１受容体に寄与するもの以外の機構を介してエキセンジンが作用し得ることは、ＧＬＰ−１のかかる分泌に対する阻害効果にかかわらず、ペンタガストリン−誘導胃酸分泌の阻害に対してエキセンジン−４が効果を有しないという報告によってさらに明らかにされている(GedulinらによるDiabetologia，40（増刊１）：A300（Abstract 1181）(1997))。さらに、１９９７年１月７日に出願された“Use of Exendins and Agonists Therefor for the Reduction of Food Intake”なる発明の名称の正常に割当てられた米国仮特許出願第６０／０３４,９０５に記載されているごとく、末梢注射したエキセンジンはマウスにおける食物摂取を阻害し、これはＧＬＰ−１で認められなかった作用である。
【００６６】
本発明において有用な組成物は、（静脈内、筋肉内および皮下を包含する）非経口投与または鼻内投与もしくは経口投与に好適な処方形態で簡便に提供し得る。場合によっては、共に投与するための単一の組成物または溶液中で、エキセンジンまたはエキセンジン・アゴニストとグルカゴンもしくはアミリンのごとき他の抗−内容排出剤またはアミリン・アゴニストとを供することが簡便であろう。また他の場合によっては、該エキセンジンまたはエキセンジン・アゴニストと別々に他の抗−内容排出剤を投与することがより有利となり得る。適当な投与形式は、各患者の医学実施者によって個々に判定される最良のものとし得る。適当な医薬上許容される担体およびそれらの処方は標準処方論文、例えばE.W.Martinによる“Remington’s Pharmaceutical Sciences”に記載されている。また、Wang，Y.J.およびHanson，M.A.による“Parenteral Formulations of Proteins and Peptides：Stability and Stabilizers”，Journal of Parenteral Science and Technology，Technical Report No.10，増刊42：2S(1988)も参照されたし。
【００６７】
本発明において有用な化合物は、注射または点滴用の非経口組成物のごときで提供することができる。それは、例えば、不活性油性物、好適にはゴマ油、落花生油もしくはオリーブ油のごとき植物油、または他の許容し得る担体の中に懸濁することができる。好ましくは、それは、水性担体中、例えば、約ｐＨ５.６〜７.４のｐＨの等張緩衝液中に懸濁する。これらの組成物は慣用的な滅菌技術によって滅菌することができ、あるいは濾過滅菌することができる。該組成物には、ｐＨ緩衝化剤のごとき生理学的条件に近づけるために必要な医薬上許容し得る補助物質が含まれ得る。有用な緩衝液には、例えば酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液が含まれる。持続性または“デボー(depot)”徐放調製物の形態は、治療有効量の当該調製物が皮内の注射またはデリバリーの後数時間または数日を超えて血流に送られるように用いることができる。
【００６８】
目的の等張圧は、塩化ナトリウム、またはデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、(マンニトールおよびソルビトールのごとき)ポリオールまたは他の無機もしくは有機の溶質のごとき他の医薬上許容し得る剤を用いて達成することができる。ナトリウムイオン含有緩衝液については、塩化ナトリウムが特に好ましい。
【００６９】
特許請求する組成物は、その医薬上許容される塩(例えば、酸付加塩)および／または錯体としても処方化することができる。医薬上許容される塩は、それを投与する濃度で無毒な塩である。かかる塩の調製により、当該組成物がその生理学的効果を発揮することを妨害することなく当該組成物の物理−化学的特徴を改変することによって、薬理学的使用が容易となり得る。生理学的特性における有用な改変の例には、融点を低下させて皮内投与を促進すること、および溶解性を上昇させてより高濃度の当該薬剤の投与を容易にすることが含まれる。
【００７０】
医薬上許容される塩には、硫酸塩、塩酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩およびキニン酸塩を含有するもののごとき酸付加塩が含まれる。医薬上許容される塩は、塩酸、硫酸、リン酸、スルファミン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸およびキニン酸のごとき酸から得ることができる。かかる塩は、例えば、塩が不溶性である溶媒または媒質中、または水のごとき溶媒中にて、遊離酸または塩基形態の生成物と１またはそれを超える当量の適当な塩基または酸とを反応させ、次いでこれを、真空下もしくは凍結乾燥によって、または適当なイオン交換樹脂上で存在する塩のイオンを他のイオンに交換することにより除去することによって調製し得る。
【００７１】
担体または賦形剤を用いて、該化合物の投与を促進することもできる。担体および賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはラクトース、グルコースもしくはスクロースのごとき種々の糖、またはデンプン型のもの、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および生理学的に和合性の溶媒が含まれる。該組成物または医薬組成物は、静脈内、腹膜内、皮下および筋肉内、経口、局所または粘膜内を含む種々の経路によって投与することができる。
【００７２】
望なら、前記組成物の溶液は、メチルセルロースのごとき粘結剤で増粘させることもできる。それは、油中水型または水中油型いずれかの乳化形態で調製することができる。広範な種々の医薬上許容される乳化剤を用いることができ、これには例えば、アカシア粉末、(Tweenのごとき)非イオン性界面活性剤、または（アルカリポリエーテルアルコールの硫酸塩またはスルホン酸塩、例えばTritonのごとき）イオン性界面活性剤が含まれる。
【００７３】
本発明において有用な組成物は、一般的に受容されている手法に従って該成分を混合することによって調製する。例えば、選択した構成成分をブレンダーまたは他の標準的なデバイス中にて単純に混合して濃縮混合物を製造し、次いで、水または粘結剤、あるいはｐＨを制御するための緩衝液または浸透圧を制御するためのさらなる溶質を添加することによって、その濃縮混合物を最終的な濃度および粘度に調整することができる。
【００７４】
医師による使用に関しては、該組成物は、他の抗内容排出剤と共にまたはそれなしに、一定量のエキセンジンまたはエキセンジン・アゴニスト、例えばエキセンジン３、エキセンジン４を含有する投与量ユニット形態で供されるであろう。胃内容排出の制御で、および胃内容排出を有利に遅めるかまたは調節する条件で使用するためのエキセンジンまたはエキセンジン・アゴニストの治療有効量は、食後血中グルコースレベルを低下させるものであり、好ましくは約８もしくは９ｍＭ以下、または目的どおりに血中グルコースレベルが低下するようなものである。糖尿病または非耐糖能の個体においては、血漿グルコースレベルが正常な個体におけるよりもより高い。かかる個体においては、食後血中グルコースレベルの有利な低下または“スムーシング”を得ることができる。当業者には認識されるであろうごとく、治療剤の有効量は、患者の年齢および体重、患者の身体的状態、血中糖レベル、または得るべき胃内容排出の阻害のレベルを含む多くの要因および他の要因で変動するであろう。
【００７５】
かかる医薬組成物は、対象において胃低運動を引き起こすのに有用であり、胃運動を有利に低下するところの他の疾患でも用いることができる。
【００７６】
該化合物の有効日抗−内容排出用量は、典型的には、７０ｋｇの患者については単一または分割用量で投与する、０.００１または０.００３〜約５ｍｇ／日、好ましくは約０.００１または０.０５〜２ｍｇ／日、およびより好ましくは約
０.００１または０.０１〜１ｍｇ／日の範囲内であろう。投与すべき正確な用量は、担当臨床医師によって決定され、前記に引用した範囲内でどこに特定の化合物が存在するか、ならびに該個体の年齢、体重および症状に依存する。投与は症状の初期徴候時または真性糖尿病の診断のすぐ後に開始すべきである。投与は注射、好ましくは皮下または筋肉内によって行うことができる。経口的に活性な化合物は経口的に摂取することができるが、投与量は５−１０倍増加すべきである。
【００７７】
一般的には、上昇した、適当でない、または望ましくない食後血中グルコースレベルを治療または予防することにおいて、本発明の化合物は前記した投与量範囲と同様な範囲でかかる治療を必要とする患者に投与することができるが、該化合物をより頻繁に、例えば１日に１回、２回または３回投与することもできる。
【００７８】
患者への本願の化合物の最適な処方および投与の様式は、特定の疾病または疾患、目的の効果、および患者のタイプのごとき当該技術分野において知られている要因に依存する。典型的には該化合物を用いてヒト患者を治療するであろうが、それを用いて、他の霊長類動物、ブタ、ウシおよび家禽のごとき家畜動物ならびにウマ、イヌおよびネコのごときスポーツ動物およびペットのごとき他の脊椎動物における同様または同一の疾病を治療することもできる。
【実施例】
【００７９】
本発明を理解するのを援助するために、以下の実施例を含める。本発明に関連する実験は、勿論、本発明を特異的に限定することを意図するものではなく、当業者の視野の範囲内に存在するであろう現在知られているかまたは後に開発される本発明のかかる変形も、本明細書に記載し後記に特許請求する本発明の範囲内に入ると考える。
【００８０】
実施例１
以下の実験を行なって、ラットにおいて、胃内容排出に対するエキセンジン‐３およびエキセンジン‐４の効果を調べ、該効果をＧＬＰ-１[７-３６]ＮＨ２処理と比較した。この実験はScarpignato らの方法[Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 246:286-94 (1980)]の修正法に準じた。
【００８１】
雄のハーラン・スプラーグ・ドーリー（Harlan Sprague Dawley:HSD）ラットを使用した。全動物を２２．７±０．８Ｃにて１２：１２時間の明：暗サイクル（実験は明サイクルの間に実行される）で飼育し、自由に飲食させた(Diet LM-485, Teklad, Madison, WI)。エキセンジン-３およびエキセンジン-４を標準ペプチド合成法に準じて合成した。
【００８２】
分光吸光度測定を妨害するであろう糜汁が胃に含有されていないことを保証するために、〜２０時間の絶食後に下記の方法による胃内容排出の測定を実行した。
【００８３】
意識のあるラットに胃管栄養法によって、１．５％のメチルセルロース（M-0262, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）および０．０５％のフェノールレッドインジケータを含有する１．５ｍｌのアカロリック・ゲル（acaloric gel）を摂取させた。胃管栄養法から２０分後、５％のハロセンを用いてラットに麻酔をかけ、該胃を暴露し、動脈鉗子を用いて幽門および食道下部の括約筋のところでクランプし、取りだし、一定の体積にしたアルカリ性溶液中に開けた。胃中含有量は、５６０ｎｍの波長における吸光度測定による該アルカリ性溶液中のフェノールレッドの強度から導いた。７匹のラットについての別々の実験において、該胃および小腸を共に切り取り、アルカリ性溶液中に開けた。胃管栄養法から２０分以内に該胃腸管上部から回収し得たフェノールレッドの量は８０±４％であった；残りは消化管内腔表面に結合して回収できなかった色素とみなされた。１００％未満の最大色素回収量の理由を説明するため、２０分後に残っている胃の含有量のパーセンテージを、同じ実験において胃管栄養法直後に犠牲にした対照ラットから回収した胃の含有量の比で表した。
残留胃中含有量パーセント＝（２０分後の吸光度）/（０分後の吸光度）×１００。
【００８４】
薬物処理しない、ベースライン実験において、２０分にわたる胃内容排出を測定した。用量−応答実験において、０、０．０１、０．１、０．３、１、５、１０または１００μｇのエキセンジン‐３、エキセンジン‐４またはＧＬＰ‐１(７‐３６)ＮＨ２でラットを処理した。結果を図２に示す。図２は、エキセンジン‐３および４がほぼ同一の０．１μｇのＥＤ５０にて胃内容排出を阻害することを示し、一方、ＧＬＰ‐１(７‐３６)ＮＨ２は約９μｇのＥＤ５０を有していることを示しており、それは、胃内容排出の阻害において、該エキセンジンがＧＬＰ‐１よりも〜９０倍効力があることを示唆する。
【００８５】
表Ｉに示したごとく、エキセンジン‐３およびエキセンジン‐４は、胃内容排出の効果的なインヒビターであることが見出された。胃内容排出に対するラット・アミリンの効果も、第２の陽性対照および比較の目的で提供される。
【００８６】
【表１】
2008044964.tif 000005
【００８７】
実施例２
胃内容排出の阻害に対するエキセンジン‐４アナログの効果を、実施例１に記載した方法に準じて調べ、エキセンジン‐４の効果と比較した。０．０１、０．１、０．３、１、１０および１００μｇのエキセンジン‐４、０．０１、０．０３、０．１、１、１０および１００μｇのエキセンジン‐４酸、ならびに０．１、０．３、１、１０および１００μｇの１４Ｌｅｕ，２５Ｐｈｅエキセンジン‐４で雄ＭＨＤラットを処理した。エキセンジン‐３、エキセンジン‐４酸および１４Ｌｅｕ、２５Ｐｈｅを標準ペプチド合成法に準じて合成した。図３および表IIに示した結果は、該エキセンジン・アゴニスト、エキセンジン‐４酸および１４Ｌｅｕ，２５Ｐｈｅエキセンジン‐４が胃内容排出の効果的なインヒビターであることを示す。エキセンジン‐４のＥＣ５０は０．２７μｇであった。エキセンジン‐４酸および１４Ｌｅｕ，２５Ｐｈｅエキセンジン‐４のＥＣ５０は同等であった（それぞれ、０．１２μｇおよび０．２９μｇ）。
【００８８】
【表２】
2008044964.tif 000006
【００８９】
実施例３
エキセンジン[９‐３９]（該クローン化ＧＬＰ‐１受容体におけるエキセンジン効果のアンタゴニスト）がエキセンジン‐４およびＧＬＰ‐１[７‐３６]ＮＨ２の胃内容排出阻害効果を拮抗する能力を、実施例１に記載した方法に準じて調べた。１．０μｇエキセンジン‐４、０．３ｍｇエキセンジン[９‐３９]と共に１．０μｇエキセンジン‐４、１０μｇＧＬＰ‐１[７‐３６]ＮＨ２、０．３ｍｇエキセンジン[９‐３９]と共にＧＬＰ‐１[７‐３６]ＮＨ２または０．３ｍｇエキセンジン９‐３９単体でラットを処理する。これらの研究において、エキセンジン[９‐３９]を皮下的（ｓｃ）および静脈的（ｉｖ)の両方で与える。これらの実験の結果を図４〜７に示す。
【００９０】
図４および５に示したごとく、２０分後、エキセンジン‐４で処理した動物は非常に効果的な胃内容排出阻害を示し、それはエキセンジン[９‐３９]によって覆されなかった。このことは、該エキセンジン[９‐３９]がｓｃでまたはｉｖで投与されたかにかかわらず生じた。
【００９１】
上で議論したごとく、エキセンジン[９‐３９]は、該クローン化ＧＬＰ‐１受容体に結合する効果的なアンタゴニストである［Fehmann HC, et al. Peptides 15(3): 453-6, 1994; Thorens B, et al., Diabetes 42(11): 1678-82, 1993］。驚くべきことに、しかしながら、エキセンジン[９‐３９]は、胃内容排出に対するエキセンジン‐４の効果をブロックしなかった（図４および５参照）。これらの結果は、胃内容排出に対するエキセンジンの効果が該クローン化ＧＬＰ‐１受容体における該エキセンジンの結合によるものではないが、その代わり、エキセンジンの胃内容排出効果が異なる受容体によるものであるということを示唆する。
エキセンジン[９‐３９]が胃内容排出に対するＧＬＰ‐１[９−３９]ＮＨ２の効果をブロックしなかったこと（図６および７）は、その胃内容排出に対する効果において、ＧＬＰ‐１も該クローン化ＧＬＰ‐１受容体以外の受容体において（そこにおいて、エキセンジン[９‐３９]は効果的なアンタゴニスト）作用している。
【００９２】
実施例４
配列番号[５]を有するアミド化ペプチドの調製
表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組み立てた。一般的に、該合成を通して、単一のカップリングサイクルを用い、高速Ｍｏｃ（ＨＢＴＵ活性化）化学を採用した。しかしながら、いくつかの位置では、カップリングは予想よりも低い効率であり、二重カップリングが必要であった。特に、残基Ａｓｐ９、Ｔｈｒ７およびＰｈｅ６の全てが二重カップリングを必要とした。ピペリジンを用いた成長ペプチド鎖の脱保護（Ｆｍｏｃ基除去）は、常に効率的ではなかった。Ａｒｇ２０、Ｖａｌ１９およびＬｅｕ１４の位置において、二重脱保護が要求された。トリエチルシラン（０．２ｍＬ）、エタンジチオール（０．２ｍＬ）、アニソール（０．２ｍＬ）、水（０．２ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）の混合物を用い、標準方法（Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc.）に準じて、該完成ペプチド樹脂の最終脱保護を達成した。該ペプチドをエーテル/水（５０ｍＬ）中で沈殿させ、遠心した。沈殿を氷酢酸中で復元し、凍結乾燥した。凍結乾燥したペプチドを水に溶解した。粗純度は約５５％であった。
【００９３】
精製工程および合成において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。
ペプチドを含有した該溶液を分取用Ｃ-１８カラムに負荷し、精製した（４０分間で溶液Ａ中１０％ないし４０％の溶液Ｂ）。単一溶媒系でＣ-１８カラムを用い、画分の純度を測定した。純粋な画分を貯めて、表記のペプチドを得た。該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）により、１４．５分の観測保持時間を有する生成物ペプチドを得た。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４１３１．７；観測値  ４１２９．３。
【００９４】
実施例５
配列番号[６]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組み立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中２５％ないし７５％の溶液Ｂの勾配）により、２１．５分の観測保持時間を有する生成物ペプチドを得た。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４１６８．６；観測値  ４１７１．２。
【００９５】
実施例６
配列番号[７]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組み立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）により、１７．９分の観測保持時間を有する生成物ペプチドを得た。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４１４７．６；観測値  ４１５０．２。
【００９６】
実施例７
配列番号[８]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３５％ないし６５％の溶液Ｂの勾配）により、１９．７分の観測保持時間を有する生成物ペプチドを得た。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４２１２．６；観測値  ４２１３．２。
【００９７】
実施例８
配列番号[９]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし５０％の溶液Ｂの勾配）により、１６．３分の観測保持時間を有する生成物ペプチドを得た。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４２６２．７；観測値  ４２６２．４。
【００９８】
実施例９
配列番号[１０]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。次いで、該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）を行なって、該生成物ペプチドの保持時間を測定した。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４１７２．６。
【００９９】
実施例１０
配列番号[１１]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。次いで、該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）を行なって、該生成物ペプチドの保持時間を測定した。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４２２４．７。
【０１００】
実施例１１
配列番号[１２]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。次いで、該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）を行なって、該生成物ペプチドの保持時間を測定した。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４１７２．６。
【０１０１】
実施例１２
配列番号[１３]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。次いで、該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）を行なって、該生成物ペプチドの保持時間を測定した。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４１８６．６。
【０１０２】
実施例１３
配列番号[１４]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。次いで、該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）を行なって、該生成物ペプチドの保持時間を測定した。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４２００．７。
【０１０３】
実施例１４
配列番号[１５]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。次いで、該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）を行なって、該生成物ペプチドの保持時間を測定した。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４２００．７。
【０１０４】
実施例１５
配列番号[１６]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。次いで、該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）を行なって、該生成物ペプチドの保持時間を測定した。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４２０２．７。
【０１０５】
実施例１６
配列番号[１７]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。次いで、該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）を行なって、該生成物ペプチドの保持時間を測定した。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４１４５．６。
【０１０６】
実施例１７
配列番号[１８]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。次いで、該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）を行なって、該生成物ペプチドの保持時間を測定した。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４１８４．６。
【０１０７】
実施例１８
配列番号[１９]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。次いで、該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）を行なって、該生成物ペプチドの保持時間を測定した。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４１４５．６。
【０１０８】
実施例１９
配列番号[２０]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。次いで、該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）を行なって、該生成物ペプチドの保持時間を測定した。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４２２４．７。
【０１０９】
実施例２０
配列番号[２１]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。次いで、該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）を行なって、該生成物ペプチドの保持時間を測定した。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４１７２．６。
【０１１０】
実施例２１
配列番号[２２]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。次いで、該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）を行なって、該生成物ペプチドの保持時間を測定した。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４１１５．５。
【０１１１】
実施例２２
配列番号[２３]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。次いで、該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）を行なって、該生成物ペプチドの保持時間を測定した。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４１８８．６。
【０１１２】
実施例２３
配列番号[２４]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。次いで、該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）を行なって、該生成物ペプチドの保持時間を測定した。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４１３１．６。
【０１１３】
実施例２４
配列番号[２５]を有するペプチドの調製
実施例４と同様の方法で、表記のペプチドをＦｍｏｃ‐保護アミノ酸（Applied Biosystems, Inc.）を用いて４‐(２’‐４’‐ジメトキシフェニル)‐Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, 0.55 mmole/g）上で組立て、該樹脂から切断し、脱保護および精製した。分析において、溶液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および溶液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を用いた。次いで、該凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ（３０分間で溶液Ａ中３０％ないし６０％の溶液Ｂの勾配）を行なって、該生成物ペプチドの保持時間を測定した。
電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値  ４１７２．６。
【０１１４】
実施例２５
配列番号［２６］を有するペプチドの調製
実施例１と同様の方法にて、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸 (Applied Biosystems, Inc.)を用いて、表記のペプチドを4-(2'-4'-ジメトキシフェニル)-Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂 (Novabiochem, ０.５５ミリモル/ｇ)上で組立て、樹脂から切断し、脱保護および精製する。溶媒Ａ(水中０.１％ ＴＦＡ)および溶媒Ｂ(ＡＣＮ中０.１％ ＴＦＡ)を分析に用いる。次いで、凍結乾燥ペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（３０分間にわたる溶媒Ａ中の３０％ないし６０％溶媒Ｂの勾配）を行って、生成物ペプチドの保持時間を測定する。電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値４１４５.６。
【０１１５】
実施例２６
配列番号［２７］を有するペプチドの調製
実施例１と同様の方法にて、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸 (Applied Biosystems, Inc.)を用いて、表記のペプチドを4-(2'-4'-ジメトキシフェニル)-Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂 (Novabiochem, ０.５５ミリモル/ｇ)上で組立て、樹脂から切断し、脱保護および精製する。チオプロリン位３８、３７、３６および３１でさらに二重カップリングが必要である。溶媒Ａ(水中０.１％ ＴＦＡ)および溶媒Ｂ(ＡＣＮ中０.１％ ＴＦＡ)を分析に用いる。次いで、凍結乾燥ペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（３０分間にわたる溶媒Ａ中の３０％ないし６０％溶媒Ｂの勾配）を行って、生成物ペプチドの保持時間を測定する。電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値４２６６.８。
【０１１６】
実施例２７
配列番号［２８］を有するペプチドの調製
実施例１と同様の方法にて、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸 (Applied Biosystems, Inc.)を用いて、表記のペプチドを4-(2'-4'-ジメトキシフェニル)-Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂 (Novabiochem, ０.５５ミリモル/ｇ)上で組立て、樹脂から切断し、脱保護および精製する。チオプロリン位３８、３７および３６でさらに二重カップリングが必要である。溶媒Ａ(水中０.１％ ＴＦＡ)および溶媒Ｂ(ＡＣＮ中０.１％ ＴＦＡ)を分析に用いる。次いで、凍結乾燥ペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（３０分間にわたる溶媒Ａ中の３０％ないし６０％溶媒Ｂの勾配）を行って、生成物ペプチドの保持時間を測定する。電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値４２４６.８。
【０１１７】
実施例２８
配列番号［２９］を有するペプチドの調製
実施例１と同様の方法にて、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸 (Applied Biosystems, Inc.)を用いて、表記のペプチドを4-(2'-4'-ジメトキシフェニル)-Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂 (Novabiochem, ０.５５ミリモル/ｇ)上で組立て、樹脂から切断し、脱保護および精製する。ホモプロリン位３８、３７、３６および３１でさらに二重カップリングが必要である。溶媒Ａ(水中０.１％ ＴＦＡ)および溶媒Ｂ(ＡＣＮ中０.１％ ＴＦＡ)を分析に用いる。次いで、凍結乾燥ペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（３０分間にわたる溶媒Ａ中の３０％ないし６０％溶媒Ｂの勾配）を行って、生成物ペプチドの保持時間を測定する。電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値４２５０.８。
【０１１８】
実施例２９
配列番号［３０］を有するペプチドの調製
実施例１と同様の方法にて、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸 (Applied Biosystems, Inc.)を用いて、表記のペプチドを4-(2'-4'-ジメトキシフェニル)-Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂 (Novabiochem, ０.５５ミリモル/ｇ)上で組立て、樹脂から切断し、脱保護および精製する。ホモプロリン位３８、３７および３６でさらに二重カップリングが必要である。溶媒Ａ(水中０.１％ ＴＦＡ)および溶媒Ｂ(ＡＣＮ中０.１％ ＴＦＡ)を分析に用いる。次いで、凍結乾燥ペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（３０分間にわたる溶媒Ａ中の３０％ないし６０％溶媒Ｂの勾配）を行って、生成物ペプチドの保持時間を測定する。電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値４２３４.８。
【０１１９】
実施例３０
配列番号［３１］を有するペプチドの調製
実施例１と同様の方法にて、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸 (Applied Biosystems, Inc.)を用いて、表記のペプチドを4-(2'-4'-ジメトキシフェニル)-Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂 (Novabiochem, ０.５５ミリモル/ｇ)上で組立て、樹脂から切断し、脱保護および精製する。チオプロリン位３８、３７、３６および３１でさらに二重カップリングが必要である。溶媒Ａ(水中０.１％ ＴＦＡ)および溶媒Ｂ(ＡＣＮ中０.１％ ＴＦＡ)を分析に用いる。次いで、凍結乾燥ペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（３０分間にわたる溶媒Ａ中の３０％ないし６０％溶媒Ｂの勾配）を行って、生成物ペプチドの保持時間を測定する。電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値４２０９.８。
【０１２０】
実施例３１
配列番号［３２］を有するペプチドの調製
実施例１と同様の方法にて、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸 (Applied Biosystems, Inc.)を用いて、表記のペプチドを4-(2'-4'-ジメトキシフェニル)-Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂 (Novabiochem, ０.５５ミリモル/ｇ)上で組立て、樹脂から切断し、脱保護および精製する。ホモプロリン位３８、３７、３６および３１でさらに二重カップリングが必要である。溶媒Ａ(水中０.１％ ＴＦＡ)および溶媒Ｂ(ＡＣＮ中０.１％ ＴＦＡ)を分析に用いる。次いで、凍結乾燥ペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（３０分間にわたる溶媒Ａ中の３０％ないし６０％溶媒Ｂの勾配）を行って、生成物ペプチドの保持時間を測定する。電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値４１９３.７。
【０１２１】
実施例３２
配列番号［３３］を有するペプチドの調製
実施例１と同様の方法にて、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸 (Applied Biosystems, Inc.)を用いて、表記のペプチドを4-(2'-4'-ジメトキシフェニル)-Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂 (Novabiochem, ０.５５ミリモル/ｇ)上で組立て、樹脂から切断し、脱保護および精製する。Ｎ-メチルアラニン位３８、３７、３６および３１でさらに二重カップリングが必要である。溶媒Ａ(水中０.１％ ＴＦＡ)および溶媒Ｂ(ＡＣＮ中０.１％ ＴＦＡ)を分析に用いる。次いで、凍結乾燥ペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（３０分間にわたる溶媒Ａ中の３０％ないし６０％溶媒Ｂの勾配）を行って、生成物ペプチドの保持時間を測定する。電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値３８５８.２。
【０１２２】
実施例３３
配列番号［３４］を有するペプチドの調製
実施例１と同様の方法にて、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸 (Applied Biosystems, Inc.)を用いて、表記のペプチドを4-(2'-4'-ジメトキシフェニル)-Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂 (Novabiochem, ０.５５ミリモル/ｇ)上で組立て、樹脂から切断し、脱保護および精製する。Ｎ-メチルアラニン位３８、３７および３６でさらに二重カップリングが必要である。溶媒Ａ(水中０.１％ ＴＦＡ)および溶媒Ｂ(ＡＣＮ中０.１％ ＴＦＡ)を分析に用いる。次いで、凍結乾燥ペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（３０分間にわたる溶媒Ａ中の３０％ないし６０％溶媒Ｂの勾配）を行って、生成物ペプチドの保持時間を測定する。電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値３９４０.３。
【０１２３】
実施例３４
配列番号［３５］を有するペプチドの調製
実施例１と同様の方法にて、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸 (Applied Biosystems, Inc.)を用いて、表記のペプチドを4-(2'-4'-ジメトキシフェニル)-Ｆｍｏｃアミノメチル=フェノキシ=アセトアミド=ノルロイシンＭＢＨＡ樹脂 (Novabiochem, ０.５５ミリモル/ｇ)上で組立て、樹脂から切断し、脱保護および精製する。Ｎ-メチルアラニン位３８、３７、３６および３１でさらに二重カップリングが必要である。溶媒Ａ(水中０.１％ ＴＦＡ)および溶媒Ｂ(ＡＣＮ中０.１％  ＴＦＡ)を分析に用いる。次いで、凍結乾燥ペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（３０分間にわたる溶媒Ａ中の３０％ないし６０％溶媒Ｂの勾配）を行って、生成物ペプチドの保持時間を測定する。電子スプレイ質量分析（Ｍ）：計算値３８０１.１。
【０１２４】
実施例３５
前記Ｃ末端アミド配列に対応するＣ末端カルボン酸ペプチドの調製
実施例１と同様の方法にて、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸 (Applied Biosystems, Inc.)を用いて、表記のペプチドをいわゆるワング（Ｗａｎｇ）樹脂 (p-アルコキシベンジルアルコール樹脂 (Bachem, ０.５４ミリモル/ｇ))上で組立て、樹脂から切断し、脱保護および精製する。溶媒Ａ(水中０.１％ ＴＦＡ)および溶媒Ｂ(ＡＣＮ中０.１％ ＴＦＡ)を分析に用いる。次いで、凍結乾燥ペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（３０分間にわたる溶媒Ａ中の３０％ないし６０％溶媒Ｂの勾配）を行って、生成物ペプチドの保持時間を測定する。電子スプレイ質量分析は、実験的に測定された（Ｍ）を供する。 
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は三文字アミノ酸記号よりも標準的な一文字記号を用いた、エキセンジン３、エキセンジン４、およびエキセンジン[９−３９]のアミノ酸配列の比較を示す。
【図２】図２は正常ラット(各時点についてｎ＝３−１７)における胃栄養法後２０分の胃内容物の保持に対する、先の皮下注射のＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２、エキセンジン−３およびエキセンジン−４の用量−応答効果を示す。記号は平均±ＳＥＭであり、曲線は最適合論理関数(best fitting logistic function)を定義する。“ゼロ”は非処理正常ラット中に保持された胃内容物の画分を示す。
【図３】図３は正常ラットにおける胃栄養法後２０分の胃内容物の保持に対する、先の注射のエキセンジン−４(ｎ＝２９)、エキセンジン−４酸（ｎ＝３６）および１４Leu,２５Pheエキセンジン−４(ｎ＝３６)の用量−応答効果を示す。記号は平均±平均の標準誤差を意味し、曲線は最適論理関数を定義する。“ゼロ”は非処理正常ラット中に保持された胃内容物の画分を示す。
【図４】図４は胃栄養法後２０分の胃内容物の保持に対する、先の注射の１.０μｇのエキセンジン−４(ｓｃ)、ｎ＝６；１.０μｇのエキセンジン−４（ｓｃ）＋０.３ｍｇのエキセンジン[９−３９]（ｓｃ）、ｎ＝６；および０.３ｍｇのエキセンジン[９−３９]（ｓｃ）、ｎ＝６の効果を示す。また、ｔ＝０およびｔ＝２０分における塩類溶液対照も示す。エラーバーは平均の標準誤差を示す。図４に示すごとく、エキセンジン−４は単独で胃内容排出を強力に阻害した。エキセンジン[９−３９]（ｓｃ）は単独で胃内容排出に対して何ら効果を有していなかった。エキセンジン−４と共に注射した場合、エキセンジン[９−３９]は、胃内容排出阻害に対するエキセンジン−４の効果に拮抗しなかった。
【図５】図５は胃栄養法後２０分の胃内容物の保持に対する、先の注射の０.３μｇのエキセンジン−４（ｓｃ）、ｎ＝５および０.３μｇのエキセンジン−４（ｓｃ）＋０.５ｍｇのエキセンジン[９−３９]（ｉｖ）、ｎ＝５の効果を示す。また、ｔ＝０およびｔ＝２０における塩類溶液対照も示す。エラーバーは平均の標準誤差を示す。図５に示すごとく、エキセンジン−４は単独で胃内容排出を強力に阻害した。エキセンジン−４と共に注射した場合、エキセンジン[９−３９]（ｉｖ）は、胃内容排出阻害に対するエキセンジン−４の効果に拮抗しなかった。
【図６】図６は胃栄養法後２０分の胃内容物の保持に対する、先の注射の１０μｇのＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２（ｓｃ）、ｎ＝８；１０μｇのＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２（ｓｃ）＋３ｍｇのエキセンジン[９−３９]（ｓｃ）、ｎ＝６；および０.３ｍｇのエキセンジン[９−３９]（ｓｃ）、ｎ＝６の効果を示す。また、ｔ＝０およびｔ＝２０における塩類溶液対照も示す。エラーバーは平均の標準誤差を示す。図６に示すごとく、ＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２は、胃内容排出を強力に阻害した。エキセンジン−[９−３９]（ｓｃ）は単独で胃内容排出に対して何ら影響を有していなかった。ＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２と共に注射した場合、エキセンジン[９−３９]は、胃内容排出阻害に対するＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２の効果に拮抗しなかった。
【図７】図７は胃栄養法後２０分の胃内容物の保持に対する、先の注射の１０μｇのＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２（ｓｃ）、ｎ＝８および１０μｇのＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２（ｓｃ）＋０.５ｍｇのエキセンジン[９−３９]（ｉｖ）、ｎ＝３の効果を示す。また、ｔ＝０およびｔ＝２０における塩類溶液対照も示す。エラーバーは平均の標準誤差を示す。図７に示すごとく、ＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２は単独で胃内容排出を強力に阻害した。ＧＬＰ−[７−３６]ＮＨ２と共に注射した場合、エキセンジン−[９−３９]（ｉｖ）は、胃内容排出阻害に対するＧＬＰ−１[７−３６]ＮＨ２の効果に拮抗しなかった。
【図８Ａ】図８Ａは、ある種のエキセンジン・アゴニストのアミノ酸配列を図示する[配列番号５−３５]。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ある種のエキセンジン・アゴニストのアミノ酸配列を図示する[配列番号５−３５]。
【図１】
2008044964.tif 000007
【図２】
2008044964.tif 000008
【図３】
2008044964.tif 000009
【図４】
2008044964.tif 000010
【図５】
2008044964.tif 000011
【図６】
2008044964.tif 000012
【図７】
2008044964.tif 000013
【図８Ａ】
2008044964.tif 000014
【図８Ｂ】
2008044964.tif 000015
【配列表】
2008044964000001.app