(57)【要約】【課題】有機化合物または無機化合物等の試料の分子量分布等を検出する高感度検出方法および高感度検出装置に関する。更に詳しくは、工業製品中の有機化合物、例えば、高分子材料、天然化合物等の糖や脂質を試料とし、その分子量の詳細な解析あるいは定量のための高感度検出方法およびその検出装置に関する。【解決手段】  移動相溶媒Ａを送液している液体クロマトグラフィーのカラムに試料を導入し、カラムから流出した前記試料と前記移動相溶媒Ａに、前記移動相溶媒Ａと異なる組成を有する移動相溶媒Ｂを添加し、蒸発光散乱検出器に導入することを特徴とする高感度検出方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
移動相溶媒Ａを送液している液体クロマトグラフィーのカラムに試料を導入し、カラムから流出した前記試料と前記移動相溶媒Ａに、前記移動相溶媒Ａと異なる組成を有する移動相溶媒Ｂを添加し、蒸発光散乱検出器に導入することを特徴とする高感度検出方法。
【請求項２】
前記液体クロマトグラフィーがグラジェント液体クロマトグラフィーであることを特徴とする請求項１に記載の高感度検出方法。
【請求項３】
移動相溶媒Ａを送入するための移動相溶媒Ａ送入用ポンプと、試料を導入するための導入部と、前記試料を分離するためのカラムを順次配置した液体クロマトグラフィーを有し、前記移動相溶媒Ａと異なる組成を有する移動相溶媒Ｂを送入するための移動相溶媒Ｂ送入用ポンプが、前記カラムと蒸発光散乱検出器との間に配置された接続バルブに送入されていることを特徴とする高感度検出装置。
【請求項４】
前記液体クロマトグラフィーがグラジェント液体クロマトグラフィーであることを特徴とする請求項３に記載の高感度検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機化合物または無機化合物等の試料の分子量分布等を検出する高感度検出方法およびその検出装置に関する。更に詳しくは、工業製品中の有機化合物、例えば、高分子材料、天然化合物等の糖や脂質を試料とし、その分子量の詳細な解析あるいは定量のための高感度検出方法およびその検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、高分子材料の分子量解析においては、液体クロマトグラフィー（以下、ＬＣという）が多く用いられている。特に高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣという）にサイズ排除クロマトグラフィー用カラムを用いて、検出器をオンラインに接続した装置が多く用いられている。
【０００３】
例えば、ポリスチレンを製造する場合、所定の分子量のポリスチレンを製造しようとしても実際には分子量のばらつきができる。また、さまざまな分子量のポリスチレンが製造される。そして、ポリスチレン等の高分子は分子量分布をもっている。
【０００４】
そして、分子量分布を求めることは高分子の物性を知る上で重要である。このため、ＬＣまたはＨＰＬＣにサイズ排除クロマトグラフィー用カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィー（以下、ＳＥＣという）が用いられる。
【０００５】
前記ＳＥＣ用カラムのゲルには孔が開いている。そして、導入された成分のうち分子量の小さい成分はこの孔の奥深くまで入ることがでる。また、中間の分子量の成分は孔の途中まで入ることができる。
【０００６】
さらに、分子量の大きい成分は孔の中には入ることができない。そして、孔の奥に入ることができる成分はそれだけカラムの中に留まる時間が長くなる。このため、カラムから出てくる順序は分子量の大きい順となる。
【０００７】
このように、成分は分子量の大きさの順に分離することができる。そして、  高分子の分子量分布を求めることができる。また、分子量分布の他にポリマーの物性を表す指標として重要なものに平均分子量がある。これは標準試料の測定から求めた較正曲線から計算する。
【０００８】
前記平均分子量には、各分子量の数を平均して求める数平均分子量（以下、Ｍｎという）、数だけでなくその重量を加味して求める重量平均分子量（以下、Ｍｗという）、分子量分布のピークの頂点位置から求められるピークトップ分子量（以下、Ｍｐという）などがある。
【０００９】
また、ＳＥＣの検出器としては検出感度が化合物によらない示差屈折率計（以下、ＲＩという）を検出器として用いるが、ＬＣまたはＨＰＬＣの検出器としてよく用いられる吸光度検出器（紫外可視検出器など）と比較して感度が悪い場合が多い。
【００１０】
また、化合物は電磁波に対して、その構造によって吸収する電磁波の波長や吸収量が異なる。このため、特に、紫外線、可視光線および赤外線の電磁波に対して、その構造によって特有の波長の電磁波を吸収する。
【００１１】
また、その特有の電磁波の吸収量も化合物の構造によって異なる。従って、吸光度検出
器は化合物によって感度が異なる。そして、化合物の構造によって感度が異なると、試料によっては求めた分子量分布や平均分子量が正確ではない。
【００１２】
また、ＬＣまたはＨＰＬＣの検出器としてよく用いられる紫外可視検出器では検出されないかまたは感度が悪く測定が難しい成分、例えば、糖や脂質の分析にはＲＩ検出器を用いる。そして、天然に存在する糖や脂質のＬＣによるオンラインの網羅的一斉分析にはグラジェント分析を行う必要があるが、ＲＩ検出器ではグラジェント分析のベースラインの変動によって、測定が行えない。（例えば、非特許文献１参照。）。
【００１３】
さらに、ＲＩと同様に検出感度が化合物の構造によらないものとして、近年、ＬＣまたはＨＰＬＣによく用いられる検出器として蒸発光散乱検出器（以下、ＥＬＳＤという）がある。この検出器はカラムからの溶出液をネブライザーで窒素や空気などのガスと一緒に噴霧し、溶出液を蒸発させ、残った溶出物に光を照射してその散乱光の強度を検出する。
【００１４】
このため、気化しない化合物はすべて検出でき、化合物による感度の差が比較的小さい。また、不揮発性の塩は使用できないが、屈折率や紫外部吸収など、ＲＩや吸光度検出器のような移動相の制約がない。
【００１５】
また、グラジェント分析を用いた場合、吸光度検出器では次の測定までに安定化時間を必要とする上に、移動相の組み合わせによって、測定が困難であったり、ＲＩでは測定が困難なほどベースラインが不安定になる。そして、ＥＬＳＤではベースラインがほとんど変動しないといった利点がある。
【００１６】
さらに、ＥＬＳＤでは原理的にベースラインはきわめて安定である。そして、吸光度検出器やＲＩを用いた場合と比較してベースラインの安定化に時間を必要としない。
【００１７】
また、ＥＬＳＤネブライザー部の、高速のガスの流れは、小さな液滴を生成し、試料を気化させない低温で溶媒を気化できるが、検出部を通過する時間が短いので感度が低くなる可能性がある。そして、低速のガスの流れは、一般に大きな液滴を生成し、感度が高くなる。
【００１８】
しかし、溶媒の気化により高温を要するため試料までが気化してしまったり、溶媒の気化が不完全な場合にはノイズを引き起こす。このため、溶媒と試料の性質により最適なガス圧を設定する必要がある。また、ＥＬＳＤネブライザー部で生成された液滴は、ガスにより溶媒蒸発部に運ばれ、移動相溶媒のみを気化する。
【００１９】
また、高温のほうが溶媒を気化するためには効率的であるが、試料までが気化して感度が低下する可能性がある。さらに、低温では溶媒の気化が不完全となりノイズが大きくなる可能性がある。このため、溶媒と試料の性質により溶媒蒸発部の温度を設定する必要がある。そして、気化しにくい溶媒を移動相とした場合、気化しやすい溶媒を移動相として用いた場合よりも感度が低くなると考えられる。
【００２０】
また、気化しやすい溶媒を移動相とした場合、気化しにくい溶媒を移動相として使用した場合よりもバックグラウンドノイズを発生し、測定に悪影響を与える。さらに、水を移動相に使用しない場合、ネブライザー部で生成する液滴の形状の安定性が、水を移動相に使用した場合と比較すると悪いと考えられる、このため、測定時再現性の面で欠点がある。
【００２１】
以下に先行技術文献を示す。
【非特許文献１】検出と定量のコツ  株式会社  羊土社発行  ２００５年７月１５日第１刷発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、上記従来の問題に鑑みてなされたものであり、その課題とするところは、蒸発光散乱検出器に入った移動相によってバックグラウンドノイズが発生して、試料測定に悪影響を与えることを抑制したり、測定時の再現性や感度を向上させ、且つ、好適に使用できる高感度検出方法およびその検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上記問題点を解決するために、本発明の請求項１に係る発明は、
移動相溶媒Ａを送液している液体クロマトグラフィーのカラムに試料を導入し、カラムから流出した前記試料と前記移動相溶媒Ａに、前記移動相溶媒Ａと異なる組成を有する移動相溶媒Ｂを添加し、蒸発光散乱検出器に導入することを特徴とする高感度検出方法である。
【００２４】
次に、本発明の請求項２に係る発明は、
前記液体クロマトグラフィーがグラジェント液体クロマトグラフィーであることを特徴とする請求項１に記載の高感度検出方法である。
【００２５】
次に、本発明の請求項３に係る発明は、
移動相溶媒Ａを送入するための移動相溶媒Ａ送入用ポンプと、試料を導入するための導入部と、前記試料を分離するためのカラムを順次配置した液体クロマトグラフィーを有し、前記移動相溶媒Ａと異なる組成を有する移動相溶媒Ｂを送入するための移動相溶媒Ｂ送入用ポンプが、前記カラムと蒸発光散乱検出器との間に配置された接続バルブに送入されていることを特徴とする高感度検出装置である。
【００２６】
次に、本発明の請求項４に係る発明は、
前記液体クロマトグラフィーがグラジェント液体クロマトグラフィーであることを特徴とする請求項３に記載の高感度検出装置である。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の高感度検出方法およびその検出装置は、以上の構成からなるので、蒸発光散乱検出器に入った移動相によってバックグラウンドノイズが発生して、試料測定に悪影響を与えることを抑制したり、測定時の再現性や感度を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の高感度検出方法およびその検出装置を実施の形態に沿って以下に図面を参照にしながら詳細に説明する。
【００２９】
図１は、本発明の高感度検出方法およびその検出装置の一実施例の概略を説明するための説明概略図である。
【００３０】
図１に示すように、本発明の高感度検出装置はＬＣ用ポンプ（Ｐ）と導入部（Ｓ）とカラム（Ｋ）と移動相送液用ポンプ（ＰＰ）と接続バルブ（Ｖ）と蒸発光散乱検出器（Ｊ）から形成されている。
【００３１】
前記ＬＣ用ポンプ（Ｐ）は、試料を導入するための導入部（Ｓ）と接続され、導入部はカラム（Ｋ）に接続されている。また、高感度検出装置には、カラムに送入されている移動相溶媒と異なる組成の移動相溶媒を導入するための、移動相送入用ポンプ（ＰＰ）が配
置されている。そして、ＬＣ用ポンプ（Ｐ）から送液されカラムから溶出した移動相溶媒に、カラムから溶出した移動相溶媒とは異なる組成の移動相溶媒を導入するための移動相送液用ポンプ（ＰＰ）から送液された移動相溶媒を蒸発光散乱検出器（Ｊ）の直前で挿入するよう接続バルブ（Ｖ）が設けられている。
【００３２】
前記接続バルブ（Ｖ）とカラム（Ｋ）との間に、図２に示すように、移動相溶媒の組成の変化を検出できる検出器（以下、Ｄという）、例えば紫外可視検出器などの検出器を設けることができる。そして、移動相送液用ポンプ（ＰＰ）からの移動相溶媒の逆流等を監視することが出来る。
【００３３】
前記移動相溶媒として用いる溶媒としては、通常のＬＣに用いられるものであれば特に限定されることはない。その例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトニトリル、ヘキサン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、水、クロロホルム、ジクロロメタン、トルエン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。そして、それらは単独であってもよく、あるいは混合物であってもよい。ただし、非水溶性溶媒をカラム（Ｋ）の移動相溶媒として用いる場合は、移動相送液用ポンプ（ＰＰ）で用いる移動相溶媒と、この非水溶性溶媒との相溶性のある、水溶性溶媒と水の混合溶媒を使用しなくてはならない。前記非水溶性溶媒としては、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ジクロロメタン、トルエン等が挙げられる。
【００３４】
前記カラム（Ｋ）としては、例えば、順相系クロマトグラフィー用、逆相系クロマトグラフィー用、サイズ排除クロマトグラフィー用、吸着クロマトグラフィー用等が挙げられる。
【００３５】
また、ＬＣ用ポンプ（Ｐ）あるいは移動相送液用ポンプ（ＰＰ）としては、移動相溶媒がグラジェントされる形式であることが、幅広い種類の試料の分析を行う観点から好ましい。
【００３６】
試料は、従来、導入部（Ｓ）に導入され、カラム（Ｋ）から移動相溶媒とともに流出するが、この移動相溶媒は、そのまま蒸発光散乱検出器（Ｊ）に導入される。この移動相溶媒は、試料やカラム（Ｋ）によって選択されるが、移動相溶媒によっては蒸発光散乱検出器（Ｊ）の試料測定に悪影響を与えるおそれがあった。
【００３７】
例えば、この移動相溶媒に水が含まれていない場合には、蒸発光散乱検出器（Ｊ）のバックグラウンドノイズを発生させ、さらに、測定時の再現性を低下させる。また、この移動相溶媒に水が含まれている場合には感度が低下するおそれがあった。
【００３８】
上記に対し、本発明では、カラム（Ｋ）から流出した移動相溶媒に水が含まれていない場合には、水または水を含む組成の移動相溶媒を移動相送入用ポンプ（ＰＰ）から送液し、接続バルブ（Ｖ）を用いて、蒸発光散乱検出器（Ｊ）の直前で挿入する。ただし、非水溶性溶媒をＫの移動相溶媒として用いる場合は、移動相送入用ポンプ（ＰＰ）で用いる移動相溶媒にはこの非水溶性溶媒と相溶性のある水溶性溶媒と水の混合溶媒を使用しなくてはならない。
【００３９】
従って、蒸発光散乱検出器（Ｊ）にはＬＣ用ポンプ（Ｐ）から送液される移動相に水を含まない場合でも、水を含有した移動相が蒸発光散乱検出器（Ｊ）に導入されている状態にある。これにより、蒸発光散乱検出器（Ｊ）の溶媒蒸発部での溶媒気化が安定化すること、また、ネブライザー部で生成する液滴が安定化することによって、測定における再現性や感度が低下するという問題を回避することできる。
【００４０】
また、本発明の高感度検出装置は、カラム（Ｋ）から流出した移動相溶媒に水が含まれている場合は、水溶性溶媒または水溶性溶媒を含む組成の移動相溶媒を移動相送入用ポンプ（ＰＰ）から送液する。そして、接続バルブ（Ｖ）を用いて、蒸発光散乱検出器（Ｊ）の直前で挿入する。
【００４１】
このため、蒸発光散乱検出器（Ｊ）にはＬＣ用ポンプ（Ｐ）から送液される移動相溶媒の溶媒が水のみである場合でも、水以外の溶媒を含有した移動相溶媒が蒸発光散乱検出器（Ｊ）に導入されている状態にある。
【００４２】
また、移動相送入用ポンプ（ＰＰ）から送液する溶媒としては、水よりも沸点の低いもの、表面張力の小さいものを用いる。さらに、非水溶性溶媒を用いるときには、この溶媒と相溶性のある水溶性溶媒と混合した溶媒を用いる。これにより、蒸発光散乱検出器（Ｊ）の溶媒蒸発部での溶媒気化効率がよくなる。そして、ネブライザー部で生成する液滴が大きくなることによって、測定における感度が低下するという問題を回避することできる。
【００４３】
また、カラム（Ｋ）としては、試料と目的によって、ＬＣ用ポンプ（Ｐ）から送液される移動相溶媒により選択できるが、移動相送入用ポンプ（ＰＰ）から送液される移動相溶媒は使用できない。そして、使用するとカラム（Ｋ）に悪影響を及ぼす場合には、図３に示すようにカラム（Ｋ）と接続バルブ（Ｖ）との間にガードカラム（Ｇ）を設けることがカラム（Ｋ）保護の観点から好ましい。
【００４４】
さらに、接続バルブ（Ｖ）とガードカラム（Ｇ）との間に、図４に示すように移動相溶媒の組成の変化を検出できる検出器（Ｄ）を設けることが、移動相送液用ポンプ（ＰＰ）からの移動相溶媒の逆流を監視する観点から好ましい。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明の具体的実施例を挙げて、さらに詳しく説明するが、それに限定されるものではない。
【００４６】
〔実施例１〕
試料として、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ＩＣＮ社製、和光純薬工業輸入販売、商品名、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００を用いた。これを関東化学（株）製のＨＰＬＣ用テトラヒドロフランを用いて、５ｐｐｍに調整し、注入量は０．００２ｍｌとした。
【００４７】
カラムには、アルコール系充填剤を用いた水・有機溶媒両用サイズ排除クロマトグラフィー用カラム、サイズは内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍを用いた。カラムに送液する移動相溶媒は、関東化学（株）製のＨＰＬＣ用テトラヒドロフラン１００％を流速０．４ｍｌ／ｍｉｎで用いた。
【００４８】
カラムに送液される移動相溶媒と異なる組成を有する移動相溶媒を導入するための移動相送入用ポンプから送液する移動相溶媒には、テトラヒドロフラン／水＝１０／１  溶液を流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで用いた。なお、テトラヒドロフランは関東化学（製）のＨＰＬＣ用を、水は純水製造装置でイオン交換後蒸留を行って製造した蒸留水を用いた。
【００４９】
蒸発光散乱検出器のネブライザー温度は３０℃、ネブライザーガスは窒素ガス５ｐｓｉを用いた。溶媒蒸発部の温度は４０℃、ゲインは１０とした。検出部の光源としてはタングステンハロゲンランプを用い、温度は５０℃とした。移動相の逆流を監視する検出器としてはフォトダイオードアレイ検出器を用いた。
【００５０】
〔比較例１〕
実施例１において、移動相送入用ポンプ（ＰＰ）とバルブ（Ｖ）を用いず、移動相テトラヒドロフラン／水＝１０／１  溶液を送入しない以外は、実施例１と同様にして分析を行った。
【００５１】
〈評価結果〉
実施例１のベースラインを拡大した結果を図５に、比較例１のベースラインを拡大した結果を図６に示す。実施例１と比較例１を対比して、実施例１の方法によればベースラインノイズが減少し、安定した測定を行うことができることがわかる。
【００５２】
また、実施例１と比較例１の測定を、それぞれ５回連続して行い、ピークの面積値の標準偏差から変動係数をもとめたところ、実施例１では２％未満、比較例１では１０％以上であった。実施例１と比較例１を対比して、実施例１の方法によれば再現性よく、安定した測定を行うことができることがわかる。
【００５３】
〔実施例２〕
試料として、ポリエチレングリコール、ポリマーラボラトリーズ社製、ＳＥＣ用スタンダード  Ｍｐ＝１０８０を用いた。これを純水製造装置でイオン交換後蒸留を行って製造した蒸留水を用いて、２００ｐｐｍに調整し、注入量は０．００２ｍｌとした。
【００５４】
カラムには、アルコール系充填剤を用いた水・有機溶媒両用サイズ排除クロマトグラフィー用カラム、サイズは内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍを用いた。カラムに送液する移動相溶媒は、純水製造装置でイオン交換後蒸留を行って製造した蒸留水を流速０．３ｍｌ／ｍｉｎで用いた。
【００５５】
カラムに送液される移動相溶媒と異なる組成を有する移動相溶媒を導入するための移動相送入用ポンプから送液する移動相溶媒には、関東化学（製）のＨＰＬＣ用テトラヒドロフラン１００％を流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで用いた。
【００５６】
蒸発光散乱検出器のネブライザー温度は３０℃、ネブライザーガスは窒素ガス５ｐｓｉを用いた。溶媒蒸発部の温度は４０℃、ゲインは１０とした。検出部の光源としてはタングステンハロゲンランプを用い、温度は５０℃とした。移動相溶媒の逆流を監視する検出器としてはフォトダイオードアレイ検出器を用いた。
【００５７】
〔比較例１〕
実施例２において、移動相送入用ポンプ（ＰＰ）と接続バルブ（Ｖ）を用いず、移動相テトラヒドロフラン溶液を送入しない以外は、実施例２と同様にして分析を行った。
【００５８】
〈評価結果〉
実施例２のピーク面積は６７４１２、比較例２のピークの面積値は１８３９８３であった。実施例２と比較例２を対比して、実施例２の方法によれば比較例２に対して、約３倍のピーク面積が得られ、感度よく測定を行うことができることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の高感度検出方法およびその検出装置は、これまで測定行うことが困難であった微量高分子成分の分子量分布測定を行うことが可能となった。また、これまで分析を行うことが困難であった微量成分の定量も可能となった。このため、製品の品質管理に用いることができ、条件や工程の不具合によるバラッキの制御が可能となる。さらに、糖や脂質など特異的な吸収を持たない物質の一斉分析がより安定して高感度に行えることから、食
品の品質管理や、医薬品研究等に使用できる素晴らしい発明である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の高感度検出方法およびその検出装置の一実施例の概略を説明するための説明概略図である。
【図２】本発明の高感度検出方法およびその検出装置の他の一実施例の概略を説明するための説明概略図である。
【図３】本発明の高感度検出方法およびその検出装置のまた他の一実施例の概略を説明するための説明概略図である。
【図４】本発明の高感度検出方法およびその検出装置のさらに他の一実施例の概略を説明するための説明概略図である。
【図５】本発明の高感度検出方法による実施例１における測定結果のベースラインノズルを示す図である。
【図６】本発明の高感度検出方法による比較例１における測定結果のベースラインノズルを示す図である。
【符号の説明】
【００６１】
Ｐ・・・ＬＣ用ポンプ
Ｓ・・・試料を導入するための導入部
Ｋ・・・カラム
ＰＰ・・・移動相送入用ポンプ
Ｖ・・・接続バルブ
Ｊ・・・蒸発光散乱検出器
Ｄ・・・検出器
Ｇ・・・ガードカラム
【図１】
2008076340.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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