(57)【要約】【課題】検体と予備処理用の物質との少なくとも２つの被混合物質をマイクロ流路内で混合する場合に、これらの被混合物質相互の混合を促進して、より短時間に均質な混合状態を得ることができるマイクロ流路内混合方法を提供することである。【解決手段】マイクロ流路内で少なくとも２つの被混合物質を混合するマイクロ流路内混合方法であって、マイクロ流路内で前記被混合物質相互を重力方向に重なるように接触させ、これら被混合物質が重なる位置でマイクロ流路を加熱することで、被混合物質相互の混合を促進する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流路内で少なくとも２つの被混合物質を混合するマイクロ流路内混合方法であって、
前記マイクロ流路内で前記被混合物質相互を重力方向に重なるように接触させ、
これら被混合物質が重なる位置で前記マイクロ流路を加熱するマイクロ流路内混合方法。
【請求項２】
前記マイクロ流路内で密度のより大きい被混合物質を重力方向上側に配置する請求項１記載のマイクロ流路内混合方法。
【請求項３】
前記被混合物質の一つが固形物であり、被混合物質が重なる位置の前記マイクロ流路内上部に固着装備して、その下方を流れる液状被混合物質に接触させる請求項１又は２のいずれか記載のマイクロ流路内混合方法。
【請求項４】
前記マイクロ流路の加熱がこのマイクロ流路の底面からである請求項１〜３のいずれか１項記載のマイクロ流路内混合方法。
【請求項５】
前記被混合物質の一つにプライマー及び/又は酵素が含まれている請求項１〜４のいずれか１項記載のマイクロ流路内混合方法。
【請求項６】
前記被混合物質に熱溶解性結合剤が混合されている請求項１〜５のいずれか１項記載のマイクロ流路内混合方法。
【請求項７】
前記熱溶解性結合剤がゼラチンまたはヒドロキシプロピルセルロースの少なくとも一方である請求項６記載のマイクロ流路内混合方法。
【請求項８】
前記マイクロ流路の加熱温度が３５℃〜６０℃である請求項１〜７のいずれか１項記載のマイクロ流路内混合方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流路内で、少なくとも２つの被混合物質を混合するマイクロ流路内混合方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、微量の検体の分析や化学反応処理を安価に、且つ迅速に実現するシステムとして、マイクロ流路チップを使用する方法が提案されている。
【０００３】
前記マイクロ流路チップはこのチップへ液体を供給して検査を実行する検査装置に適用される物である。この検査装置として例えば特許文献１に開示される生化学処理装置等があり、チャンバとチャンバ間を連通する流路とを有する生化学反応カートリッジ（マイクロ流路チップ）を載置するステージと、流路を介して液体を移動させるための移動手段と、チャンバ内の液体の有無或いは液量を検出する検出手段と、検出手段により検出されたチャンバ内の液体の情報により液体の移動の結果を判定する判定手段とを設けることにより、前記マイクロ流路内で予備処理した検体を前記チャンバ内に誘導して、チャンバ内の検査試薬と検体との化学反応又は生化学反応から、検体の分析を行う。
【０００４】
前記マイクロ流路内での検体の予備処理とは、例えば、前記チャンバ内に保持した検査試薬と検体とが効率良く反応するように、検体に反応促進物質（試薬）を混合したり、あるいは検体中の特定成分を単離させたり溶解・増幅させるために検体に所定の反応物質を混合する処理である。
【０００５】
このような予備処理や分析用の反応処理に使う物質と検体とを混合させるマイクロ流路内混合方法として、予め、マイクロ流路の内壁面の一部に予備処理や分析用の反応処理に使う物質を乾燥状態で担架させておき、マイクロ流路に検体を流して、マイクロ流路内に担架された物質と検体との接触により、予備処理や分析用の反応処理用の物質を検体中に溶解させて混合させる方法が提案されている（例えば、特許文献２，３参照）。
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１７０６５４号公報
【特許文献２】特開２００４−１９４６５２号公報
【特許文献３】特開２００６−１３３００３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところが、マイクロ流路内に検体を流して、マイクロ流路内に担架された物質に検体を単純に接触させるというだけでは、予備処理や分析用の反応処理用の物質の検体への溶解が遅く、処理が遅延するという問題があった。
また、溶解した予備処理や分析用の反応処理用の物質が検体内に十分に拡散せず、予備処理や分析用の反応処理用の物質と検体との混合が均質にならないため、分析結果等にばらつきを招く虞があった。
【０００８】
そこで、本発明の目的は上記課題を解消することに係り、検体と予備処理や分析用の反応処理用の物質との少なくとも２つの被混合物質をマイクロ流路内で混合する場合に、これらの被混合物質相互の混合を促進して、より短時間に均質な混合状態を得ることができ、マイクロ流路チップでの混合処理に適用することで、マイクロ流路チップにおける分析処理の迅速化や、分析処理の精度向上を実現することができるマイクロ流路内混合方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（１）本発明の上記課題の解決は、マイクロ流路内で少なくとも２つの被混合物質を混合するマイクロ流路内混合方法であって、
前記マイクロ流路内で前記被混合物質相互を重力方向に重なるように接触させ、
これら被混合物質が重なる位置で前記マイクロ流路を加熱するマイクロ流路内混合方法により達成される。
【００１０】
上記構成によれば、マイクロ流路内で重力方向の上層に配置された被混合物質は、その下に配置された被混合物質に溶解した際に、被混合物質が重なる位置で加熱されることによって、マイクロ流路内に対流が発生し、両被混合物質の接触位置付近に滞留せず、この対流による撹拌作用によって、より均質な混合が実現される。
即ち、例えば、検体と予備処理や分析用の反応処理用の物質との少なくとも２つの被混合物質をマイクロ流路内で混合する場合に、これらの被混合物質相互の混合を促進して、より短時間に均質な混合状態を得ることができる。
そして、マイクロ流路チップでの混合処理に適用することで、マイクロ流路チップにおける分析処理の迅速化や、分析処理の精度向上を実現することができる。
【００１１】
（２）なお、好ましくは、上記（１）に記載のマイクロ流路内混合方法において、前記マイクロ流路内で密度のより大きい被混合物質を重力方向上側に配置する構成とすると良い。
このような構成にすると、対流作用と密度の違いによる沈降作用によって上層の被混合物質が下層の被混合物質中に拡散し易くなり、混合を促進するために特にマイクロ流路の構造に工夫をせずとも、被混合物質相互の均質な混合を効率よく実現できる。
【００１２】
（３）また、好ましくは、上記（１）又は（２）に記載のマイクロ流路内混合方法において、前記被混合物質の一つが固形物であり、被混合物質が重なる位置の前記マイクロ流路内上部に固着装備して、その下方を流れる液状被混合物質に接触させる構成とすると良い。
このような構成にすると、例えば、検体である液状の被混合物質に、固化されている予備処理や分析用の反応処理用の被混合物質を溶解させて、被混合物質相互の混合物を生成する場合、固化された被混合物質は、予めマイクロ流路内上部に固着装備しておくことで、混合のための操作は、マイクロ流路に検体である液状の被混合物質を注入するだけで良く、被混合物質相互を混合させるための作業を単純にできる。
【００１３】
また、検体である液状の被混合物質よりも固化された被混合物質の方が密度が高い場合、固化されている被混合物質をマイクロ流路内上部に固着装備することによって、密度のより大きい被混合物質を重力方向上側に配置して被混合物質相互を接触させるという上記（２）に記載の混合条件が確保されて、混合の促進を担保することができる。
【００１４】
（４）また、好ましくは、上記（１）乃至（３）のいずれか一つに記載のマイクロ流路内混合方法において、前記マイクロ流路の加熱がこのマイクロ流路の底面からである構成とすると良い。
このような構成にすると、加熱によってマイクロ流路内に発生する対流は、上昇流となり、密度の高い方の被混合物質の重力による沈降作用との相乗で、被混合物質相互の撹拌・混合を効果的に促進することができ、被混合物質相互の均質な混合が容易になる。
【００１５】
（５）また、好ましくは、上記（１）乃至（４）のいずれか一つに記載のマイクロ流路内混合方法において、前記被混合物質の一つにプライマー及び/又は酵素が含まれている構成とすると良い。
このような構成にすると、試薬の担架位置での試薬の溶解開始が、核酸増幅反応の開始とすることが可能となるため、反応時間の管理等が容易になり、核酸増幅反応を容易に制御・進行させることができる。
【００１６】
（６）また、好ましくは、上記（１）乃至（５）のいずれか一つに記載のマイクロ流路内混合方法において、前記被混合物質に熱溶解性結合剤が混合されている構成とすると良い。
【００１７】
上記構成によればマイクロ流路内の所定位置に担架された試薬は、混合される熱溶解性結合剤として、付着性（接着性）を有したものを採用しておくことで、流路壁面との間の接着強度を大幅に向上させることができる。
【００１８】
そのため、マイクロ流路内に送給される被検査液の接触だけで担架位置から剥離して流されることがない。しかも、被検査液の温度が熱溶解性結合剤の溶解促進温度である規定温度まで昇温されていないときには、熱溶解性結合剤の溶解が促進されないため、試薬の溶解も促進されない。そして、試薬の担架位置に導入される被検査液の温度を規定温度に昇温させれば、その被検査液に接触した熱溶解性結合剤の溶解促進が溶解促進温度に達して直ぐに始まり、試薬の溶解・混合の促進が始まり、当初の担架位置で溶解・混合処理が開始・継続されることが担保されるため、例えば、試薬の担架位置を挟む一定区間に一定時間被検査液を滞留させたり、あるいは試薬の担架位置を挟む一定区間で被検査液を往復させることで、被検査液に確実に溶解・混合させて、溶解・混合処理の精度を向上させることができる。
【００１９】
（７）また、好ましくは、上記（６）に記載のマイクロ流路内混合方法において、前記熱溶解性結合剤がゼラチンまたはヒドロキシプロピルセルロースの少なくとも一方である構成とすると良い。
このような構成にすると、ゼラチンやヒドロキシプロピルセルロースは、上記（６）を満足する熱溶解性を有すると同時に、付着性（接着性）も強いので、マイクロ流路上の所定位置への試薬の担架が容易になり、上記（６）に記載の作用・効果を容易に実現することができる。
【００２０】
（８）また、好ましくは、上記（１）乃至（７）のいずれか一つに記載のマイクロ流路内混合方法において、前記マイクロ流路の加熱温度が３５℃〜６０℃である構成とすると良い。
このような構成にすると、溶解開始促進温度を常温からずらして溶解促進開始のタイミングを管理できる同時に、例えば、試薬が血液中の標的核酸の増幅及び検出を目的として使用される乾燥プライマーである場合に、この乾燥プライマーの反応温度を維持して、反応促進を図ることもできる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係るマイクロ流路内混合方法では、マイクロ流路内で重力方向の上層に配置された被混合物質は、その下に配置された被混合物質に溶解した際に、両被混合物質の接触位置付近に滞留せず、重力による沈降作用により下層の被混合物質内に拡散するため、接触している被混合物質相互の混合が促進される。
更に、被混合物質が重なる位置で加熱されることによって、マイクロ流路内に対流が発生し、この対流による撹拌作用によって、より均質な混合が実現される。
即ち、例えば、検体と予備処理や分析用の反応処理用の物質との少なくとも２つの被混合物質をマイクロ流路内で混合する場合に、これらの被混合物質相互の混合を促進して、より短時間に均質な混合状態を得ることができる。
そして、マイクロ流路チップでの混合処理に適用することで、マイクロ流路チップにおける分析処理の迅速化や、分析処理の精度向上を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明に係るマイクロ流路内混合方法の好適な実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
図１は本発明に係るマイクロ流路内混合方法により少なくとも２つの被混合物質を混合するマイクロ流路を具備したマイクロ流路チップの一実施の形態の分解斜視図、図２は図１に示したマイクロ流路チップを構成する流路基板の構成の説明図で、図２（ａ）は前記流路基板の平面図、図２（ｂ）は図２（ａ）のＭ矢視図、図２（ｃ）は図２（ｂ）のＮ矢視図、図３は図２（ｃ）に示したマイクロ流路のＣ−Ｃ断面図である。
【００２３】
図１及び図２に示したマイクロ流路チップ（以下、単に「チップ」とも称す。）１は、検査装置（図示せず）にセットされて使用され、一回の使用後に廃棄される。本実施の形態は、検体である血液（全血）がマイクロ流体チップ１に注入される。マイクロ流体チップ１は、検査装置にセットされることで、チップ外部からの物理的作用力によって検体液がハンドリングされ、例えば一塩基多型の複数ターゲット遺伝子が検査されるものであり、特開２００５−１６０３８７に示されているような、ターゲット配列の核酸を等温で特異的に増幅するための反応とその検出をチップ１上で実現可能とするものである。これにより、例えば、標的核酸を増幅してこれを検出することで、感染症の原因となる病原体に特異的な標的核酸の増幅及び検出が可能となり、検体中の該病原体の存否等が判定可能となる。
【００２４】
本実施の形態において、物理的作用力は、液流路の始点と終点に設けたポート部ＰＴからエア供給又はエア吸引することにより発生する空気圧作用力（空圧駆動力）である。したがって、液流路内に供給された液体が、液流路の始点と終点とに作用されるエア供給又はエア吸引により、液流路内の所望位置へ移動制御可能となる。この際、液体は、始点と先端部、後端部と終点との間に介在する気体に挟持された状態で保持され、引っ張り力の作用により途中で分断されることがない。
【００２５】
なお、ＤＮＡ増幅反応は、等温増幅反応により、使用する酵素の活性が一定に維持できる温度に保たれる。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度をいう。さらに、「ほぼ一定の温度」とは、酵素及びプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。
【００２６】
また、マイクロ流体チップ１は熱可塑性の高分子ポリマーの射出成形により製作される。使用する高分子ポリマーは、特に限定されないが、光学的に透明であり、耐熱性が高く、化学的に安定であり、射出成形が容易なものが望ましく、ＣＯＰ、ＣＯＣ、ＰＭＭＡ等が好適である。光学的に透明とは、検出に用いる励起光や蛍光の波長において透過性が高く、散乱が小さく、自家蛍光が少ないことである。チップ１は、蛍光を検出可能とする透光性を有していることで、検出試薬に例えばサイバーグリーンが用いられ、反応によって増幅された２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることで発する蛍光が測定可能となる。これにより、ターゲットとする遺伝子配列の存在の有無が検出可能となる。
【００２７】
図１及び図２（ａ）において、流路基板３は、その厚さ寸法ｔ、幅寸法Ｗ、長さ寸法Ｌが、省スペースで持ち運び可能な適度の大きさに設定されている。そして、流路基板３の表面には、外部の加熱手段を装備するための凹みである掘り込み１１，１２と、後述するマイクロ流路１４の一端に連通して設けられた検体投入用のポートＰ１と、マイクロ流路１４に連通して設けられてマイクロ流路１４内における検体の移動を制御する制御用ポートＰ２，Ｐ３と、マイクロ流路１４の途中に連通して設けられてマイクロ流路１４内に予備処理用の試薬等の被混合物質を投入する試薬投入用のポートＰ４とが形成されている。
流路基板３は、外形が例えば縦横Ｗ，Ｌが５５×９１ｍｍであり、厚さｔが２ｍｍ程度で形成される。
【００２８】
流路基板３の各ポートの役割を説明すると、生体細胞を含む検体液と前処理試薬（第１液）とを投入する第１ポートＰ１と、反応増幅試薬（第２液）を投入する第４ポートＰ４と、流路内に空気圧を供給する第２ポートＰ２と、減圧される流路終端の第３ポートＰ３とからなる。
そして、流路基板３は、第１ポートＰ１から投入された検体液と前処理試薬とを混合して第１混合液を生成する第１の流路（検体混合部）Ａと、第１混合液を加熱して生体細胞よりＤＮＡを抽出し１本鎖に分解する第２の流路（被加熱部）Ｂと、被加熱部Ｂで処理された第１混合液に反応増幅試薬を合流させる第３の流路（試薬合流部）Ｃと、試薬合流部Ｃで合流された第２混合液が通過することにより溶解が進む酵素（第１固体）を固化実装した第４の流路（酵素保持部）Ｄと、酵素保持部Ｄで処理される第２混合液への酵素の混合を助長する第５の流路（酵素混合部）Ｅと、酵素混合部Ｅに接続され、流路内に固化実装されたプライマー（第２固体）の溶解、加熱によるＤＮＡ増幅、ＤＮＡ増幅の検出を同一位置で行う複数の第６の流路（反応部）Ｆと、反応部Ｆの流路に接続され酵素混合部Ｅで処理された第２混合液を反応部Ｆの複数の反応検出セル２７それぞれに定量分注するための第７の流路（定量分注流路）Ｇとに区分分けできる。
【００２９】
流路基板３の表面に開口する各ポートＰ１〜Ｐ４の周囲は、流路基板３の他の部分より隆起したリング状の隆起部１８ａ，１８ｂ，１８ｃ，１８ｄとなっており（図２（ｂ）参照）、この隆起部１８ａ，１８ｂ，１８ｃ，１８ｄには、ポートパッドを介して配管が接続され、各配管にはバルブを介して、検査装置による送液駆動（マイクロ流路１４内での検体の移動操作）のためのポンプが接続される。
【００３０】
各ポートＰ１〜Ｐ４は、流路基板３を貫通する貫通孔として形成され、流路基板３の裏面に形成されたマイクロ流路１４に連通している。マイクロ流路１４は、流路基板３に溝として形成され、その開放面が蓋材５によって封止されることで流路となる。このマイクロ流路１４は、第１のマイクロ流路用溝２１と、この第１のマイクロ流路用溝２１に複数の分岐流路２３を介して連通した第２のマイクロ流路用溝２２とで構成されている。
【００３１】
蓋材５と流路基板３は接着剤や粘着剤により接合される。蓋材５としては、流路基板同様、光学的に透明であり、耐熱性が高く、化学的に安定であるシート状の高分子ポリマーを用いる。本実施の形態では、１００μｍの厚みのＰＣＲ用プレートシールを用いた（プラスチックフィルムに粘着剤が塗布されている）。
【００３２】
第１のマイクロ流路用溝２１は、基端が検体投入用のポートＰ１に連通し、前述のＡ〜Ｅの区分を通って終端が制御用ポートＰ２に連通していている。第２のマイクロ流路用溝２２は、基端側が複数の分岐流路２３（前述のＦの区分）を介して第１のマイクロ流路用溝２１の途中に接続されており、終端が制御用ポートＰ３に連通している。
【００３３】
第１のマイクロ流路用溝２１の基端であるポートＰ１寄りの位置には、第１の混合部２４（前述のＡの区分）が設けられ、更に、試薬投入用のポートＰ４が第１のマイクロ流路用溝２１に連通する合流部２５（前述のＣの区分）と前述の第１の混合部２４との間の第１のマイクロ流路用溝２１には、加熱部２６（前述のＢの区分）が設定されている。
【００３４】
第１の混合部２４は、第１のマイクロ流路用溝２１の溝幅を広げた複数個の亀甲型の混合セル２４ａを流れ方向に沿って所定の間隔で直列に配置している。
そして、マイクロ流路１４の底面を提供する蓋材５の下方には、外部（検査装置）の加熱手段が配置され、マイクロ流路１４の底面から加熱可能にされている。
【００３５】
加熱部２６は、流路基板３の表面側に配置した掘り込み１２位置の底面側である蓋材５に装着した加熱手段により、マイクロ流路１４内を流れる被混合物質を所定の温度に昇温させる部位である。
【００３６】
前述の区分Ｅである酵素混合部は、第４ポートＰ４から順に第１混合部Ｅ１と、酵素保持部（前述の区分Ｄ）と、第２混合部Ｅ２とが配置されてなる。
第１混合部Ｅ１は、液体が流動する方向の垂直断面積が他の流路における垂直断面積に比して大きい第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂと、第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂより垂直断面積が小さい第２流路部１１３，１１５とが交互に形成されている。すなわち、上流側から前段の第１流路部１１１Ａ、前段の第２流路部１１３、後段の第１流路部１１１Ｂ、後段の第２流路部１１５の順で配設されている。
【００３７】
また、第２混合部Ｅ２は、液体が流動する方向の垂直断面積が他の流路における垂直断面積に比して大きい第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄと、第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄより垂直断面積が小さい第２流路部１１７，１１９とが交互に形成されている。すなわち、上流側から前段の第１流路部１１１Ｃ、前段の第２流路部１１７、後段の第１流路部１１１Ｄ、後段の第２流路部１１９の順で配設されている。
【００３８】
第１混合部Ｅ１における第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂの垂直断面積は、第２混合部Ｅ２における第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄの垂直断面積より小さく形成されている。本実施の形態では、各混合部内の深さ（図２の紙面垂直方向深さ）を同一とし、第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂの幅を、第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄの幅より小さく形成している。また、第１混合部Ｅ１における第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂの流路方向長さは、第２混合部Ｅ２における第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄの流路方向長さより長く形成している。本実施の形態では、第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂ，１１１Ｃ，１１１Ｄが互いに平行に形成され、第２流路部１１３，１１５，１１７，１１９が上記第１流路部を連結するように形成されているが、これに限らず、任意の配置であって構わない。
【００３９】
このように、本実施の形態による酵素混合部Ｅは、第２混合部Ｅ２の前段に第１混合部Ｅ１が設けられている。本構成によれば、メニスカス曲面液端の進行度合いに差異の生じ難い第１混合部Ｅ１にて複数種の液体が予備混合される。これにより、混合性能の高い第２混合部Ｅ２において、異なる濡れ性の液体が流路面に接触することにより生じる、メニスカス曲面液端の進行度合いの差異が抑制されるようになっている。
【００４０】
また、前段の第１流路部１１１Ａおよび後段の第１流路部１１１Ｂの各容積は、第４ポートＰ４から送液される１回分の液体全体を収容可能な容積とすることが好ましく、送液される液体全体の容積の８０％以上であることが好ましい。これにより、第１混合部Ｅ１において、前段の第１流路部１１１Ａに液体全体が収容された後、前段の第２混合部１１３を通過して後段の第１流路部１１１Ｂへ収容され、広幅流路部と狭幅流路部とを交互に通過することで、オリフィス作用による撹拌が複数回行われ、複数種の液体同士の混合を促進させることができる。
【００４１】
第１流路部１１１Ａと１１１Ｂとの間の第２流路部１１３には、酵素保持部Ｄが配置される。酵素保持部Ｄは、混合部Ａと同様に、液体が流動する方向に沿って広幅流路部１１５Ａと狭幅流路部１１５Ｂとが交互に形成された流路で構成される。広幅流路部１１５Ａの一部は試薬保持用のセルとなり、水溶解液状態の試薬を点着後、凍結乾燥により乾燥、固化した試薬４７、４９がそれぞれ保持される。
酵素混合部Ｅでは、血液、前処理試薬、反応増幅試薬の合流液を第１混合部Ｅ１の第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂの間を往復させることにより、第１の酵素である試薬４７、第２の酵素である試薬４９を溶解し、前記合流液を混合する。
なお、図示例では各混合部Ｅ１，Ｅ２で第１流路部がそれぞれ２つずつ設けてあるが、これに限らず、さらに複数の第１流路部が第２流路部と交互に形成されていてもよい。
【００４２】
酵素保持部Ｄの試薬４７，４９が保持された広幅流路部１１５Ａの上流と下流の流路は、その保持部より細くなっており、乾燥固化した試薬４７，４９の流路への密着力が無い場合でも、チップ１の保存、運搬等の振動により固化試薬４７，４９が剥がれ落ちて前後の流路へ流出してしまうことを防いでいる。
【００４３】
分注部２８（前述のＧの区分）を構成している複数本の分岐流路２３は、第１のマイクロ流路用溝２１と第２のマイクロ流路用溝２２に並列に接続されていて、その途中に、亀甲型に流路を拡幅した複数の反応検出セル３７を有している。各反応検出セル３７は、その内部の重力方向の最上位置となる上面部に、検出用の固化試薬３９としてのプライマーが担架されており、予備処理を終えた検体が流入すると、検体と固化試薬の反応により、検体を分析する。
【００４４】
各分岐流路２３の反応検出セル３７には、互いに成分の異なる固化試薬３９を担架させておくことで、検体に対する多種の分析を一度に実施することができる。その際、セル内で反応、検出が完了することが必要となるが、プライマーにゼラチン又はヒドロキシプロピルセルロースを含有させることにより常温の液体が流入した際もプライマーが流れ方向下流に流されることは無く、プライマー反応温度である６０℃に昇温させることにより本実施の形態を利用することで固化試薬３９を素早く溶解させることができる。なお、プライマー（本実施形態では固化試薬３９）とは検体である血液に拡散増幅反応を起こす起点を決定する試薬である。
【００４５】
以上のマイクロ流路チップ１は、制御用ポートＰ２，Ｐ３に接続された検査装置配管のバルブの開閉、又はバルブに接続されたポンプによる加圧、又は吸引を適宜に制御することで、検体投入用のポートＰ１からマイクロ流路１４に投入された検体の位置を、マイクロ流路１４の任意位置に移動させることができ、各混合部２４，３１，３２等での予備処理用の混合処理を済ませた検体を、各反応検出セル３７に分注することで、検体に対する多種の分析を行う。
【００４６】
分注部２８は、流路基板３の表面側に形成された掘り込み１１位置の底面側である蓋材５に当接する検査装置の加熱手段によって加熱可能になっていて、分析用の固化試薬の反応促進に適した温度に、加熱される。
【００４７】
次に、各分岐流路２３の反応検出セル３７において実施する場合のマイクロ流路内混合方法について、説明する。
各分岐流路２３の反応検出セル３７では、図３に示したように、重力方向上面に担架（固着装備）された固化試薬３９（プライマー）と被混合物質とを、重力方向に重なるように接触させ、更に、これら被混合物質が重なる位置である掘り込み１１では、蓋材５の外側に配置した不図示の加熱手段によって、前記マイクロ流路を加熱している。
【００４８】
各分岐流路２３の反応検出セル３７内では、密度のより大きい被混合物質を重力方向上側に配置するようにしており、本実施の形態では、検体である被混合物質（予備処理後の血液）よりも密度の高い固化試薬３９（プライマー）を、各反応検出セル３７の上面に固着装備している。
【００４９】
また、各分岐流路２３におけるマイクロ流路の加熱は、このマイクロ流路の底面からとなるように配慮している。
【００５０】
以上に説明した各分岐流路２３の反応検出セル３７において実施されるマイクロ流路内混合方法では、各反応検出セル３７内で重力方向の上層に配置された被混合物質（固化試薬３９としてのプライマー）は、その下に配置された被混合物質（検体）に溶解した際に、両被混合物質の接触位置付近に滞留せず、重力による沈降作用により下層の被混合物質内に拡散するため、接触している被混合物質相互の混合が促進される。
【００５１】
更に、複数の被混合物質が重なる位置で加熱されることによって、各反応検出セル３７内に対流が発生し、この対流による撹拌作用によって、より均質な混合が実現される。
即ち、例えば、検体としての血液と固化試薬３９（プライマー）との少なくとも２つの被混合物質を反応検出セル３７内で混合する場合に、これらの被混合物質相互の混合を促進して、より短時間に均質な混合状態を得ることができる。
そして、マイクロ流路チップ１での混合処理に適用することで、マイクロ流路チップ１における分析処理の迅速化や、分析処理の精度向上を実現することができる。
【００５２】
更に、上記実施の形態では、各分岐流路２３の反応検出セル３７内では、密度のより大きい被混合物質を重力方向上側に配置しているため、重力による沈降作用によって上層の被混合物質が下層の被混合物質中に拡散し易くなり、混合を促進するために特に各反応検出セル３７の構造に工夫をせずとも、被混合物質相互の均質な混合を効率よく実現できる。従って、マイクロ流路チップ１において、各反応検出セル３７の構造の複雑化を招かず、安価に、混合の促進を達成することができる。
【００５３】
更に、本実施の形態では、固化されている被混合物質である固化試薬３９（プライマー）は、被混合物質相互が重なる位置の各反応検出セル３７内上部に固着装備して、その下方を流れる他の被混合物質である検体に接触させている。
そのため、例えば、検体である液状の被混合物質に、固化されている予備処理や分析用の反応処理用の被混合物質を溶解させて、被混合物質相互の混合物を生成する場合、固化された被混合物質は、予め各反応検出セル３７内上部に固着装備しておくことで、混合のための操作は、各反応検出セル３７に検体である液状の被混合物質を注入するだけで良く、被混合物質相互を混合させるための作業を単純にできる。
また、検体である液状の被混合物質よりも固化された被混合物質の方が密度が高い場合、固化されている被混合物質を各反応検出セル３７内上部に固着装備することによって、密度のより大きい被混合物質を重力方向上側に配置して被混合物質相互を接触させるという理想的な混合条件が確保されて、混合の促進を担保することができる。
【００５４】
更に、本実施の形態では、各分岐流路２３の反応検出セル３７での加熱がこの各反応検出セル３７の底面からであるため、加熱によって各反応検出セル３７内に発生する対流は、上昇流となり、密度の高い方の被混合物質の重力による沈降作用との相乗で、被混合物質相互の撹拌・混合を効果的に促進することができ、被混合物質相互の均質な混合が更に容易になる。
【００５５】
本発明の発明者は、上記実施の形態のマイクロ流路内混合方法における各反応検出セル３７の底面からの加熱と、密度の高い方の被混合物質の重力による沈降作用との相乗効果を確認するために実験を行った。
【００５６】
図４（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）、図５に実験に用いたマイクロ流路チップ５０の構造を示す。実験に用いたマイクロ流路チップ５０は図２（ｃ）に示した反応検出セル３７を模した構造となっている。図４（ａ）はマイクロ流路チップ５０の全体形状を示す図、図４（ｂ）は（ａ）のＹ−Ｙ断面を示す断面図、図４（ｃ）は固化試薬が担架されたマイクロ流路チップ５０の全体形状を示す図、図４（ｄ）は（ｃ）のＹ−Ｙ断面を示す断面図である。図５はＹ−Ｙ断面を拡大した断面図である。
【００５７】
マイクロ流路チップ５０の中央には反応検出セル５２が配置され、両端位置に配置された貫通の送液ポート５８が連通されている。マイクロ流路チップ５０の側面６０の少なくとも反応検出セル５２位置は鏡面仕上げなっており、反応検出セル５２内が検出できるようになっている。更に、反応検出セル５２の開口側は底面となる蓋５６により、閉ざす構造となっている。反応検出セル５２の大きさとしては、幅２．０ｍｍ，深さ１．０ｍｍに設定されている。この寸法は実際の反応検出セル３７を模したものであるが、適宜に設計変更可能で、これに限定されるものではない。
【００５８】
次に、固化試薬３９を反応検出セル５２に担架させる手順を示す。
反応検出セル５２に担架させる試薬３９として液体状の合成プライマー（OPERON社製）を用い、溶解・混合特性を定量化するために蛍光標識されたプライマーであるPanomerTM 9 ランダムオリゴデオキシヌクレオチド、Alexa FluorR 488 Conjugate（インビトロジェン社製）を100μＭとなるように滅菌水で溶解したものを体積比で5％混合して、プライマー溶液を作製した。
【００５９】
更に前記プライマー溶液とゼラチン溶液［牛骨ゼラチン（新田ゼラチン社製）を2.5％（Weight / Volume）となるように10mM Trisバッファー｛トリス-塩酸、pH 7.5 （1M）（インビトロジェン社製）を滅菌水で100倍希釈に溶解｝で溶解したもの］を体積比で４：１に混合して、熱溶解性結合剤であるゼラチンを含有した液体状プライマー溶液を作製した。なお、前記ゼラチン溶液は常温では固化してしまうため、４５℃に加熱してゲル化した後、前記プライマー溶液と混合した。混合後の溶液はゼラチン濃度が0.5％（Weight / Volume）となっているため、常温で固化することはない。
続いて、熱溶解性結合剤であるゼラチンを混合した前記液体状プライマー溶液1.0μLを反応検出セル内壁面５４にピペットにて点着させた後、シリカゲル入りデシケータ内で２時間乾燥させることにより、固化試薬３９である合成プライマーを反応検出セル５２に担架させた。（図４（ｃ），（ｄ）参照）
【００６０】
次に、底面からの加熱と、密度の高い方の被混合物質の重力による沈降作用との相乗効果を確認するために実験方法を示す。
上記の固化試薬３９を担架させたマイクロ流路チップ５０に粘着シールであるseal-TSRT2（Excel Scientific社製）を用いて蓋５６をした。蓋５６側を下にして送液ポート５８からピペットで0.2％Tween20水溶液｛10％Tween20（和光純薬社製）を滅菌水で50倍希釈｝を送液して検出セル５２内を満たした後、底面（蓋５６側）から不図示のプレートヒーターでプライマーの反応温度である60℃に加熱（図５参照）して、重力方向の蛍光輝度分布を測定した。なお、測定は実体蛍光顕微鏡システムVB-G25（KEYENCE社製）を用いて鏡面加工を施した検出セル側面６０側から測定を行った。
【００６１】
図６は，本発明のマイクロ流路内混合方法で，反応検出セル５２の底面側からプライマーの反応温度である６０℃に加熱した場合に，反応検出セル５２の底面からの離間距離を変えて，反応検出セル５２内の各所の重力方向輝度分布を測定したもので，反応検出セル５２内の各所の輝度分布ばらつきが，加熱時間の経過と共に低減し，120秒経過後には，輝度のばらつきが±20％以内に収束していて，反応検出セルの略全域に渡って，固化試薬（プライマー）３９の成分が略均等に拡散し，被混合物質相互が良好に混合していることが確認できた。
【００６２】
次に、本発明の発明者は固化試薬３９を反応検出セル３７に担架させた上記実施の形態における試薬の反応性を確認するための実験を行った。
熱溶解性結合剤としてゼラチンおよびヒドロキシプロピルセルロース（HPC）を混合して乾燥固化させたプライマーを用いた場合の核酸増幅反応を図７、図８に、液体プライマーを用いた場合の核酸増幅反応を図９にそれぞれ示す。なお、反応検出セル５２に担架させる試薬３９として液体状の合成プライマー（OPERON社製）を用い、ゼラチン溶液［牛骨ゼラチン（新田ゼラチン社製）を2.5％（Weight / Volume）となるように10mM Trisバッファー｛トリス-塩酸、pH 7.5 （1M）（インビトロジェン社製）を滅菌水で100倍希釈に溶解｝で溶解したもの］およびヒドロキシプロピルセルロース溶液[ヒドロキシプロピルセルロース（日本槽達社製）を2.5％（Weight / Volume）となるように10mM Trisバッファー｛トリス-塩酸、pH 7.5 （1M）（インビトロジェン社製）を滅菌水で100倍希釈に溶解｝で溶解したもの］を前記プライマー溶液に体積比で４：１混合して、熱溶解性結合剤であるゼラチンおよびヒドロキシルプロピルセルロース（HPC）を含有した液体状プライマー溶液を作製し、反応検出セル５２内壁面５４にピペットにて点着させた後、シリカゲル入りデシケータ内で２時間乾燥させることにより、固化試薬３９である合成プライマーを反応検出セル７２に担架させた。
熱溶解性結合剤としてゼラチンおよびヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を用いた場合はいずれも液体プライマーを用いた場合と同様に反応開始から１8min程度で蛍光強度の立ち上がりが認められ、核酸増幅反応が液体プライマーと同様に進行することが分かった。
【００６３】
なお、本発明に係るマイクロ流路内混合方法の適用は、上記実施の形態に示したマイクロ流路チップ１の反応検出セル３７における被混合物質相互の混合に限らない。毛細管状の所謂マイクロ流路内で２種又はそれ以上の複数種の被混合物質相互を混合する状況であれば、同様に適用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明に係るマイクロ流路内混合方法により少なくとも２つの被混合物質を混合するマイクロ流路を具備したマイクロ流路チップの一実施の形態の分解斜視図である。
【図２】図１に示したマイクロ流路チップを構成する流路基板の構成の説明図で、（ａ）は前記流路基板の平面図、（ｂ）は（ａ）のＭ矢視図、（ｃ）は（ｂ）のＮ矢視図である。
【図３】図２（ｃ）に示したマイクロ流路のＣ−Ｃ断面図である。
【図４】（ａ）はマイクロ流路チップ５０の全体形状を示す図、（ｂ）は（ａ）のＹ−Ｙ断面を示す断面図、（ｃ）は固化試薬が担架されたマイクロ流路チップ５０の全体形状を示す図、（ｄ）は（ｃ）のＹ−Ｙ断面を示す断面図である。
【図５】図４のＹ−Ｙ断面で蓋56側を底面として拡大した断面図である。
【図６】マイクロ流路の底面から加熱を実施した場合に、マイクロ流路内上部に固着装備された被混合物質が、その下層を流れる被混合物質に溶解して、重力による沈降作用と加熱による対流によって、下層の被混合物質中へ拡散して混合が進行していく状況を、マイクロ流路内の輝度分布により測定したグラフである。
【図７】熱溶解性結合剤としてゼラチンを混合して乾燥固化させたプライマーを用いた場合の核酸増幅反応を示す図である。
【図８】熱溶解性結合剤としてヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を混合して乾燥固化させたプライマーを用いた場合の核酸増幅反応を示す図である。
【図９】液体プライマーを用いた場合の核酸増幅反応を示す図である。
【符号の説明】
【００６５】
１  マイクロ流路チップ
３  流路基板
５  蓋材
１１，１２  掘り込み
１４  マイクロ流路
１８  隆起部
２１  第１のマイクロ流路用溝
２２  第２のマイクロ流路用溝
２３  分岐流路
２４  第１の混合部
２４ａ  混合セル
２６  加熱部
３１  第２の混合部
３２  第３の混合部
３７  反応検出セル
Ｐ１〜Ｐ４  ポート
【図１】
2008151773.tif 000003
【図２】
2008151773.tif 000004
【図３】
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【図４】
2008151773.tif 000006
【図５】
2008151773.tif 000007
【図６】
2008151773.tif 000008
【図７】
2008151773.tif 000009
【図８】
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【図９】
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