(57)【要約】      （修正有）【課題】従来の老化モデル動物とは異なる機構からなる、特異的な老化現象の解明に有用な、新規老化モデル動物を提供する。【解決手段】がん転移関連遺伝子として知られており、悪性度の高いがんで高発現する遺伝子として公知である、mta1遺伝子の機能が欠損した動物。具体的には、相同染色体上のmta1遺伝子の一部又は全部の改変或いは欠損のため、mta1遺伝子が正常に機能しないノックアウト非ヒト動物。該動物は、脊椎の湾曲、皮膚の萎縮等の老人性の表現型を示す。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
相同染色体上のmta1遺伝子の一部又は全部の改変或いは欠損のため、mta1遺伝子が正常に機能しないノックアウト非ヒト動物からなる老化モデル動物。
【請求項２】
mta1遺伝子の一部の改変或いは欠損が、SANTドメインを含むエクソンの改変或いは欠損である請求項１に記載の老化モデル動物。
【請求項３】
mta1遺伝子の一部の改変或いは欠損が、エクソン１０〜１３の改変或いは欠損である請求項１又は２に記載の老化モデル動物。
【請求項４】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１に記載の老化モデル動物。
【請求項５】
老化モデルが、皮膚萎縮モデル、脊柱彎曲モデル、低回転型骨粗鬆症モデル及び眼白濁モデルから選択されるいずれかである請求項１〜３のいずれか１に記載の老化モデル動物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１に記載の老化モデル動物を用いることを特徴とする薬剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
医薬品が、皮膚萎縮、脊柱彎曲、低回転型骨粗鬆症及び眼白濁のいずれかに対する予防、治療及び／又は診断用である、請求項６記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な老化モデル動物及びその作製方法に関する。さらに詳しくは、metastasis-associated gene 1（mta1）の機能が欠損した老化モデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化モデル動物として、SAM(Senescence-Accelerated Mouse)やklothoマウスが知られている。
【０００３】
SAMは、AKR/J系マウスと未知の系統との不測の交雑が生じたマウスコロニーから、老化度評点の加齢依存的な急速な増加を指標として確立されたマウス系統である。SAMのうち、促進老化・短寿命を示すSAMP (Senescence-Accelerated Mouse Prone)系統と正常老化を示すSAMR (Senescence-Accelerated Mouse Resistant)系統の２系統があり、それぞれがさらに細分化されている。SAMP系マウスは、老化アミロイドーシス、学習・記憶障害、老年性骨粗鬆症、白内障等の老化関連病態を系統特異的に発症することが明らかになっているが、老化アミロイドーシスを除き、促進老化や老化関連疾患の発症原因は依然として多くの謎に包まれている。
【０００４】
また、抗老化ホルモン（クロトー）に関連するklotho遺伝子が変異したklothoマウスは、老化に似ている症候群につながることが報告されており（非特許文献１）、老化に関連する研究等に広く用いられている。
【０００５】
一方、mta1遺伝子は、がん転移関連遺伝子として知られており、悪性度の高いがんで高発現する遺伝子として同定されている。mta1遺伝子は、mta2やmta3と同様にNuRD（nucleosome remodeling and histone deacetylase）複合体を形成する。これらの複合体は、ヒストンの脱アセチル化を介したクロマチンの構造変換に関与することが報告されている。これにより、遺伝子発現は負に制御されると考えられる。mta1は、ラット乳がんより樹立された高転移性細胞株で高発現している遺伝子として単離され、ヒトのがん（食道がん、胃がん、大腸がん）でも悪性度と対応して発現している。特に、mta1はエストロゲン受容体αと相互作用することにより、NuRDの働きによりエストロゲン受容体としての機能が抑制される。mta1ノックアウトマウスモデルを用いて、がん転移関連遺伝子mta1の生物学的機能解析に関し、報告されている（非特許文献２、３）。しかしながら、このタンパク質のがん転移や細胞機能における役割については不明な点が多い。
【０００６】
なお、mta関連のタンパク質には、mta1、mta2、mta3が既に公知であるが、mta1とmta2のアミノ酸配列の相同性は５６％、mta2とmta3のアミノ酸配列の相同性は５４％、mta1とmta3のアミノ酸配列の相同性は５２％、mta1、mta2、mta3のアミノ酸の相同性は４６％であり、これらのタンパク質は類似する名称ではあるものの、アミノ酸配列の相同性は高いとはいえず、機能についても十分に解明されているとはいえない。NuRD複合体サブユニットmta2遺伝子欠損マウスにおける早老化について報告がある（非特許文献４）が、老化モデルについては十分とはいえず、新たなモデルの開発が望まれている。
【非特許文献１】Nature 390 : 45 - 51 (1997)
【非特許文献２】第２６回日本分子生物学会、神戸、2003年12月  (4PC-077)
【非特許文献３】日本外科学学会誌(0301-4894), 105巻臨増 p.77 (2004)
【非特許文献４】第２８回日本分子生物学会年会、福岡、2005年12月7-10日  (2P-1032)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来の老化モデル動物とは異なる機構からなる新規老化モデル動物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、がん転移関連遺伝子として知られており、悪性度の高いがんで高発現する遺伝子として公知であるmta1に着目し、該遺伝子の機能が欠損した動物を作製することにより、脊椎の湾曲、皮膚の萎縮等の老人性の表現型を示すことを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．相同染色体上のmta1遺伝子の一部又は全部の改変或いは欠損のため、mta1遺伝子が正常に機能しないノックアウト非ヒト動物からなる老化モデル動物。
２．mta1遺伝子の一部の改変或いは欠損が、SANTドメインを含むエクソンの改変或いは欠損である前項１に記載の老化モデル動物。
３．mta1遺伝子の一部の改変或いは欠損が、エクソン１０〜１３の改変或いは欠損である前項１又は２に記載の老化モデル動物。
４．非ヒト動物がマウスであることを特徴とする前項１〜３のいずれか１に記載の老化モデル動物。
５．老化モデルが、皮膚萎縮モデル、脊柱彎曲モデル、低回転型骨粗鬆症モデル及び眼白濁モデルから選択されるいずれかである前項１〜３のいずれか１に記載の老化モデル動物。
６．前項１〜５のいずれか１に記載の老化モデル動物を用いることを特徴とする薬剤のスクリーニング方法。
７．医薬品が、皮膚萎縮、脊柱彎曲、低回転型骨粗鬆症及び眼白濁のいずれかに対する予防、治療及び／又は診断用である、前項６記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のmta1遺伝子が正常に機能しないノックアウト非ヒト動物からなる老化モデル動物は、皮膚萎縮、脊柱彎曲、低回転型骨粗鬆症及び眼白濁の症状を示す。本発明の老化モデル動物は、SAMやklothoの老化動物モデルとは異なる機構によるものと考えられ、各種老化モデル動物における各種検査結果を比較することにより、mta1に特異的な老化現象を特定することができ、該遺伝子を解明することで、老化現象の改善を図ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の老化モデル動物について説明する。本発明の老化モデル動物の対象となりうる動物は、特に限定されるものではないが、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス及びラットなどの哺乳動物が例示される。これらのうち実験動物としては、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットが好ましく、なかでも齧歯目がさらに好ましく、近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウス及びラットが、特に好ましい。
【００１２】
本発明のmta1の機能が欠損した老化モデル動物、即ちノックアウト動物は、自体公知の方法により作製することができる。例えば、遺伝子ターゲッティング法などの公知の方法を用いてmta1遺伝子が不活化された胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を対象動物の初期胚に導入して得られたキメラ胚を、雌動物の子宮に着床させて発生させることにより得られるキメラ動物を継代することにより、mta1遺伝子が不活化されたノックアウト動物を作製することができる。
【００１３】
また、現在ではRNA干渉(RNAi:RNA interference)技術を用いることで、mta1遺伝子が不活化されたノックアウト動物を容易に作製することができる。RNAi法は、任意の遺伝子の発現を抑制する手法であり、アンチセンス法とは異なる原理に基づく。mta1遺伝子に対して作製したオリゴヌクレオチド(shRNA)を、例えば市販のpENTR/U6ベクタープラスミドへ組み込み、アデノウイルス（Ad）へ導入し、Ad-RNAiベクターを調製する。作製したshRNA産生Ad-RNAiベクタープラスミドを常法により293細胞へ導入し、shRNAを産生するAdを調製する。293細胞を対象動物の尾静脈へ注入し、Adを感染させる。産生されたshRNAはsiRNAとなり、細胞質でRISCを形成し、ターゲット遺伝子のmRNAの配列特異的な分解を引き起す。これにより、ターゲット遺伝子、すなわちmta1遺伝子がノックアウトされた動物を作製することができる。
【００１４】
以下では、遺伝子ターゲッティング法を用いたmta1ノックアウト動物、具体的にはmta1ノックアウトマウスの作製方法について説明するが、これらに限定されるものでないことは明らかである。
【００１５】
〔１〕mta1ヘテロノックアウト細胞の樹立
マウスmta1タンパク質は、約700個のアミノ酸から成り、その構造中にいくつかの重要なタンパク質モチーフが存在する（図１参照）。具体的には、(1) SH-3 結合ドメイン、(2) ジンクフィンガーモチーフ、(3) ロイシンジッパーモチーフ、(4) SANTドメイン、(5) 核移行シグナル、(6) 酸性領域などが知られている。上記において、(1) mta1のC末に存在するプロリンリッチな領域は、SH-3 ドメイン結合モチーフと配列が一致している。SH-3 ドメインは、シグナル伝達機構におけるタンパク質相互作用に重要であり、細胞骨格成分に関与していると考えられている。(2) ジンクフィンガーモチーフは転写調節因子として働くタンパク質に存在する。(3) ロイシンジッパーモチーフはDNA結合ドメインである。(4) SANTドメインは、myb関連タンパク質におけるDNA結合ドメインである。これらの構造から、mta1はシグナル伝達、タンパク質相互作用、転写調節等に関与していると考えられるが、その機能についてはよく分かっていない。 
【００１６】
ターゲッティングベクターは、公知の方法により作製することができ、市販のプラスミドに、上記ゲノムDNAクローン、マーカー（ポジティブ及びネガティブ）などの各フラグメントを適切に連結し、作製することができる。
【００１７】
ターゲッティングベクターの作製のため、対象となるマウスのmta1遺伝子の一部を単離すればよい。mta1遺伝子の一部は、例えばマウスのゲノムDNAライブラリーからスクリーニングして得ることができる。スクリーニングの条件、方法は特に限定されず、スクリーニングに用いるプローブについてもゲノムDNAやcDNAからPCR法などを用いて容易に調製することができる。
【００１８】
mta1ヘテロノックアウト細胞を作製するためのターゲッティングベクターは、mta1タンパク質が機能しないように設計されたものであれば良く、特に限定されない。例えば、遺伝子の全てを破壊したものであってもよいし、部分的に破壊したものであっても良い。また、変異を加えることにより、フレームシフトなどにより、タンパク質が正常に合成されないように設計したものを用いることができる。具体的には、例えばロイシンジッパーモチーフやSANTドメインを含んだエクソンを、例えば抗生物質の耐性遺伝子を含むオリゴヌクレオチドのカセットで置換されたものを用いることができる。エクソンを置換することでフレームシフト変異が起こり、本来存在するタンパク質の機能を破壊する。この場合、ポジティブ選別のマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子（例えばpol II-neo(R)）を、ネガティブ選別のマーカーとして、例えばDT-A（ジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子）を用いることができる。
【００１９】
相同組換えの確認はサザンブロッティング解析により行うことができる。ターゲッティングベクターについて制限酵素で切断したとき、野生型アリル及び変異型アリルから異なる大きさのバンドが検出され、相同組換えの有無を確認することができる。
【００２０】
上記方法により作製したターゲッティングベクターを、受精卵、初期胚、又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの個体形成能（分化全能性）をもつ細胞にエレクトロポレーション法等により導入し、その後、目的とする相同組み換えが起こった細胞を選別する。選別は、ポジティブ−ネガティブ選択法により薬剤を用いて効率よくスクリーニングすることにより行うことができる。選別後、得られたコロニーの遺伝子型は、サザンブロッティング法やＰＣＲ法などによって確認することができる。
【００２１】
具体的には、例えばマウスＥＳ細胞株（E14）を用いることができる。エレクトロポレーションによりターゲッティングベクターを細胞内に導入し、例えばG418等の抗生物質により選別を行うことができる。得られたコロニーの遺伝子型はサザンブロッティング法で確認し、mta1ヘテロノックアウトＥＳ細胞を樹立することができる。
【００２２】
〔２〕キメラマウス及びmta1ノックアウトマウスの作製
ターゲッティングベクターを導入した未分化なmta1ヘテロノックアウトＥＳ細胞をマウス初期胚に導入し、偽妊娠雌マウスに移植する。初期胚に導入した未分化なＥＳ細胞は正常な胚発生のもとで分化し、ホスト胚由来の細胞とともにキメラ個体を形成する。導入したＥＳ細胞はキメラ個体内で生殖系列にも分化し、他のマウスと交配する事によりＥＳ細胞に導入された遺伝子変異が子孫マウスに伝えられる。このようにしてノックアウトマウスを作製することができる。
【００２３】
〔３〕mta1ノックアウト動物による老化モデル動物
本発明において、老化モデル動物とは、老化に関する特徴（表現型）を有するモデル動物をいい、特に限定されない。例えば、脊柱の湾曲、皮膚の萎縮、低回転型骨粗鬆症（老人性骨粗鬆症）、眼疾患等が挙げられる。特に骨粗鬆症においては、骨吸収の増加による高回転型ではなく、骨吸収及び骨形成がともに低下する低回転型の骨粗鬆を表現するものをいう。さらに眼疾患に関しては、目が白濁する症状を示し、例えば白内障などの症状を表現するものをいう。
【００２４】
本発明は、老化モデル動物の利用にも及ぶ。具体的には、本発明の老化モデル動物を用いて予防、治療及び／又は診断用に利用可能な薬剤をスクリーニングするスクリーニング方法にも及ぶ。より具体的には、上記症状に対して予防、治療及び／又は診断用に利用可能な老化モデルに対して効果を示す薬剤のスクリーニング方法にも及ぶ。
【実施例】
【００２５】
以下に実施例及び実験例を示して説明するが、これらは発明の内容をより理解するためのものであって、本発明は本実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
【００２６】
（実施例１）mta1ノックアウトマウスの作製
本実施例では、ノックアウトマウスの作製方法について詳述する。
mta1遺伝子の塩基配列は、GenBank Accession No.AB039744で示される。該mta1遺伝子について、SANTドメインを含むエクソン１０〜１３（塩基数439）をpol II-neo(R)カセット（ネオマイシン(neo)耐性遺伝子）で置換し、ターゲッティングベクターを作製した（図２）。
【００２７】
129マウスＥＳ細胞株（E14）（胚盤胞）に、エレクトロポレーションにより上記作製したターゲッティングベクターを導入した。導入した細胞はG418により選別を行った。得られたコロニーの遺伝子型をサザンブロッティング法で確認し、mta1ヘテロノックアウト細胞を樹立した。
【００２８】
相同組換えの確認はサザンブロッティング解析により行った。制限酵素XbaIで切断し、ターゲッティングベクターの5'-アウトサイドプローブを用いたときに、野生型アリルからは9.4kb、変異型アリルからは12.4kbのバンドが検出され、制限酵素HindIIIで切断し、3'-アウトサイドプローブを用いたときに、野生型アリルからは3.5kb、変異型アリルからは3.1kbのバンドが検出され、相同組換えの有無を確認した（図３）。
【００２９】
相同組換えが確認されたターゲッティングベクターを導入した未分化なmta1ヘテロノックアウトＥＳ細胞をマウス初期胚に導入し、偽妊娠雌ICRマウスに移植した。初期胚に導入した未分化なＥＳ細胞は正常な胚発生のもとで分化し、ホスト胚由来の細胞とともにキメラ個体を形成した。導入したＥＳ細胞はキメラ個体内で生殖系列にも分化し、他のマウスと交配する事によりＥＳ細胞に導入された遺伝子変異が子孫マウスに伝えられた。mta1 +/-（雄）とmta1 +/-（雌）でのＦ２での予測される出生比は、メンデル比によると、mta1 +/+：mta1 +/-：mta1 -/-の割合は、１：２：１であるが、実際には雄では68：104：12であり、雌では80：134：6であった。このようにしてmta1ノックアウトマウスを作製した（図４）。
【００３０】
（実験例１）mta1ノックアウトマウスの体重変化
野生型、ヘテロ型(mta1 +/-)及びホモ型(mta1 -/-)の各マウスについて、第３週齢から第１０週齢までの体重の増加について確認した。本実験例に使用したmta1 +/+：mta1 +/-：mta1 -/-の割合は、雄について15：21：8であり、雌については30：31：1であった。その結果、図５に示すように雄と雌について、各々明らかにホモ型において体重の増加が抑制されていることが確認された。
【００３１】
（実験例２）mta1ノックアウトマウスの形態的変化
野生型及びホモ型(mta1 -/-)の各マウスについて、第１年齢での外観及びレントゲン図による形態を確認した。その結果、図６に示すように、野生型のマウスに比べてホモ型(mta1 -/-)では、皮膚が萎縮しており毛脳襄数の減少が認められ、背骨も湾曲していた。
【００３２】
（実験例３−１）mta1ノックアウトマウスの骨密度測定（ＣＴスキャン）
野生型及びホモ型(mta1 -/-)の各マウスについて、４ヶ月、１２ヶ月及び１８ヶ月での骨密度を測定した。その結果、図７に示すように皮質骨密度については、各々についてホモ型のほうが明らかに骨密度が低下することが確認され、特に時間の経過に伴いその差が明らかであった。海綿骨密度については、４ヶ月目では野生型、ホモ型並びに雄、雌の間で殆ど差が認められなかったのに対し、１２ヶ月目、１８ヶ月目ではホモ型のほうが低い密度であった。
【００３３】
（実験例３−２）mta1ノックアウトマウスの骨形態計測
ヘテロ型(mta1 +/-)及びホモ型(mta1 -/-)の各マウスについて、骨量、骨芽細胞面、骨吸収面、破骨細胞面、破骨細胞数について各々計測し、その結果を表１に示した。これにより、ホモ型(mta1 -/-)のノックアウトマウスは骨吸収及び骨形成がともに低下する低回転型（老人性）骨粗鬆症であることが確認された。これにより、高回転型の骨粗鬆症とは区別され、老化モデルとして優れていることが確認された。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
（実験例４）mta1ノックアウトマウスの眼に及ぼす影響
野生型及びホモ型(mta1 -/-)の各マウスについて、１年半での形態を確認した。その結果、図８に示すように野生型では眼の疾患が認められなかったのに対し、図９に示すようにホモ型(mta1 -/-)では、眼の白濁が確認された。この原因は、白内障であることも考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
以上詳述したように、本発明の老化モデル動物は、SAMやklothoの老化動物モデルとは全く機構の異なるモデル動物であると考えられた。本発明の老化モデル動物は、皮膚萎縮、脊柱彎曲、低回転型骨粗鬆症及び眼白濁の症状を示すことから、骨代謝や皮膚、眼球などの検査を行うとmta1に特異的な老化現象を特定することができ、該遺伝子を解明することで、老化現象の改善を図ることが可能となる。即ち、本発明の老化モデル動物を用いると、mta1に特異的な老化現象の解明を学術的に行うことができる。
さらに、皮膚萎縮、脊柱彎曲、低回転型骨粗鬆症及び眼白濁等の老化現象の予防、改善、診断等に有効な薬剤の開発を行うことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】mta1タンパク質のモチーフを示す図である。
【図２】mta1ターゲッティングベクターを示す図である。（実施例１）
【図３】相同組換えの有無の確認のためのサザンブロット解析を示す図である。（実施例１）
【図４】mta1ノックアウトマウスの作製方法を示すフローチャートである。（実施例１）
【図５】mta1ノックアウトマウスの体重に及ぼす結果を示す図である。（実験例１）
【図６】mta1ノックアウトマウスの外観及びレントゲン結果を示す図である。（実験例２）
【図７】mta1ノックアウトマウスの骨密度結果を示す図である。（実験例３−１）
【図８】野生型マウスを示す図である。
【図９】mta1ノックアウトマウスの眼の白濁を示す図である。（実験例４）
【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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