(57)【要約】【課題】伸展刺激介在メラニン生成に関する被験物質による効果を評価することができる手段を提供すること。【解決手段】被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下におけるメラノサイトの培養を行なうステップ、生成したメラニンの量を測定するステップ、および測定されたメラニンの量と、被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下に培養されたメラノサイトにより生成されたメラニンの量とを比較するステップ、を含む、伸展刺激介在メラニン生成の制御物質の評価方法；ならびに被験物質を、該評価方法に供し、該被験物質をシミ形成阻害物質として選別する、シミ形成阻害物質のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｉ）被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下におけるメラノサイトの培養を行なうステップ、
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で生成したメラニンの量を測定するステップ、および
（ＩＩＩ）前記ステップ（ＩＩ）で測定されたメラニンの量と、被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下に培養されたメラノサイトにより生成されたメラニンの量とを比較するステップ、
を含む、伸展刺激介在メラニン生成の制御物質の評価方法。
【請求項２】
前記ステップ（Ｉ）と並行して、（Ｉ’）被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下におけるメラノサイトの培養を行なうステップを行なう、請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
前記メラノサイトの培養を、ケラチノサイトの共存下に行なう、請求項１または２記載の評価方法。
【請求項４】
前記ステップ（ＩＩ）において、被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下にケラチノサイトで生成した顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の量と、被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下にケラチノサイトで生成した顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の量とを、さらに測定する、請求項３記載の評価方法。
【請求項５】
被験物質を、請求項１〜３いずれか１項に記載の評価方法に供し、それにより、該被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下に生成したメラニンの量よりも、該被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下に生成したメラニンの量が減少することを指標として、該被験物質をシミ形成阻害物質として選別する、シミ形成阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
被験物質を、請求項４記載の評価方法に供し、それにより、
（ａ）  該被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下に生成したメラニンの量よりも、該被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下に生成したメラニンの量が減少すること、または
（ｂ）  該被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下にケラチノサイトで生成した顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の量よりも、該被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下にケラチノサイトで生成した顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の量が減少すること、または
（ｃ）  前記（ａ）および（ｂ）の両方の事象、
を指標として、該被験物質をシミ形成阻害物質として選別する、シミ形成阻害物質のスクリーンニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、伸展刺激介在メラニン生成の制御物質の評価方法およびシミ形成阻害物質のスクリーニング方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、伸展刺激がかかる部位でのメラニン生成の制御物質の単離などに有用な、伸展刺激介在メラニン生成の制御物質の評価方法、および伸展刺激がかかる部位でのシミ形成の抑制に有用な、シミ形成阻害物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚における色素異常には、しみ（肝斑）、そばかす（雀卵斑）、老人性色素斑などの色素増加症；尋常性白斑、脱色素性母斑、白皮症などの色素脱失症などが知られている。
【０００３】
前記色素異常は、例えば、皮膚の表皮基底層などに存在するメラノサイトで生成される色素であるメラニンの沈着により生じることが知られている。また、前記メラニンは、例えば、紫外線の曝露により生成されることが知られている。
【０００４】
現在、色素異常の予防または改善には、Ｌ−アスコルビン酸誘導体（例えば、特許文献１などを参照のこと）、グルタチオン（例えば、特許文献２などを参照のこと）などのメラニン生成抑制物質などが用いられている。
【０００５】
しかしながら、前記Ｌ−アスコルビン酸誘導体およびグルタチオンは、メラニン生成の抑制効果を十分に発揮できない場合があるという欠点がある。
【特許文献１】特開２００３−１０４８６４号公報
【特許文献２】特開平１１−２６９０５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、伸展刺激介在メラニン生成に対する被験物質による効果を評価することができ、伸展刺激介在メラニン生成に対して抑制効果を発揮する物質を選別することができる、伸展刺激介在メラニン生成の制御物質の評価方法を提供することに関する。また、本発明は、伸展刺激がかかる部位でのシミ形成の抑制に有用な物質を選別することができる、シミ形成阻害物質のスクリーニング方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  （Ｉ）被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下におけるメラノサイトの培養を行なうステップ、
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で生成したメラニンの量を測定するステップ、および
（ＩＩＩ）前記ステップ（ＩＩ）で測定されたメラニンの量と、被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下に培養されたメラノサイトにより生成されたメラニンの量とを比較するステップ、
を含む、伸展刺激介在メラニン生成の制御物質の評価方法、
〔２〕  前記ステップ（Ｉ）と並行して、（Ｉ’）被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下におけるメラノサイトの培養を行なうステップを行なう、前記〔１〕記載の評価方法、
〔３〕  前記メラノサイトの培養を、ケラチノサイトの共存下に行なう、前記〔１〕または〔２〕記載の評価方法、
〔４〕  前記ステップ（ＩＩ）において、被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下にケラチノサイトで生成した顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の量と、被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下にケラチノサイトで生成した顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の量とを、さらに測定する、前記〔３〕記載の評価方法、
〔５〕  被験物質を、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の評価方法に供し、それにより、該被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下に生成したメラニンの量よりも、該被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下に生成したメラニンの量が減少することを指標として、該被験物質をシミ形成阻害物質として選別する、シミ形成阻害物質のスクリーニング方法、ならびに
〔６〕  被験物質を、前記〔４〕記載の評価方法に供し、それにより、
（ａ）  該被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下に生成したメラニンの量よりも、該被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下に生成したメラニンの量が減少すること、または
（ｂ）  該被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下にケラチノサイトで生成した顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の量よりも、該被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下にケラチノサイトで生成した顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の量が減少すること、または
（ｃ）  前記（ａ）および（ｂ）の両方の事象、
を指標として、該被験物質をシミ形成阻害物質として選別する、シミ形成阻害物質のスクリーンニング方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の伸展刺激介在メラニン生成の制御物質の評価方法によれば、伸展刺激介在メラニン生成に対する被験物質による効果を評価することができ、伸展刺激介在メラニン生成に対して抑制効果を発揮する物質を選別することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のシミ形成阻害物質のスクリーニング方法によれば、伸展刺激がかかる部位でのシミ形成の抑制に有用な物質を選別することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の伸展刺激介在メラニン生成の制御物質の評価方法は、
（Ｉ）被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下におけるメラノサイトの培養を行なうステップ、
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で生成したメラニンの量を測定するステップ、および
（ＩＩＩ）前記（ＩＩ）で測定されたメラニンの量と、被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下に培養されたメラノサイトにより生成されたメラニンの量とを比較するステップ、
を含む方法である。
【００１０】
本発明の評価方法は、従来、一般的にメラニンの生成の原因として考えられている紫外線の曝露とは異なる、伸展刺激によるメラニン生成に影響を与える物質を評価できる方法である。
【００１１】
前記「伸展刺激介在メラニン生成」とは、伸展刺激の負荷に起因するメラノサイトによるメラニンの生成をいう。かかる伸展刺激介在メラニン生成には、メラノサイト以外の細胞への伸展刺激の負荷を介してメラノサイトに作用し、メラニンを生成する概念をも包含する。
【００１２】
前記被験物質としては、特に限定されないが、例えば、植物などの抽出物、天然化合物、合成化合物などが挙げられる。
【００１３】
前記ステップ（Ｉ）では、前記被験物質の存在下に、伸展刺激をメラノサイトに負荷しながら、該メラノサイトを培養する。本発明の評価方法では、かかるステップ（Ｉ）が行なわれているため、メラノサイトに伸展刺激介在メラニン生成を促すことができる。
【００１４】
本発明の評価方法では、目尻、額、口元などの皮膚の収縮が生じやすい部位におけるシミの形成などの原因となるメラニンの生成に影響を与える物質を評価することができる。
【００１５】
前記伸展刺激は、細胞を所定間隔で伸展させることができる手段、例えば、培養細胞伸展装置などにより行なわれうる。前記伸展刺激は、皮膚における伸縮の方向性と頻度の観点から、好ましくは、周期的に１軸方向に細胞を伸展させる刺激であることが望ましい。前記伸展の度合いは、皮膚における伸縮割合の観点から、通常の培養条件（伸展刺激を負荷しない条件）での培養容器の大きさに対して、１．０１〜１．４０倍、好ましくは、１．０４〜１．２０倍となる条件が望ましい。
【００１６】
前記伸展刺激を、培養細胞伸展装置の１つである商品名：ＳＴ−１４０、ストレックス株式会社製を用いて行なう場合、例えば、前記伸展刺激の条件としては、１分間に２回、１軸方向に１０％の伸展刺激を１６時間行なう条件などが挙げられる。
【００１７】
前記ステップ（Ｉ）は、例えば、伸展刺激負荷下におけるメラノサイトの培養を行なうに際して、前記被験物質を含有した培地を用いて、該メラノサイトを培養することなどにより行なわれうる。
【００１８】
前記メラノサイトとしては、特に限定されないが、例えば、マウスのメラノサイト、ヒトのメラノサイト、Ｂ１６メラノーマ細胞、ヒトメラノーマ細胞などが挙げられる。なかでも、試験の簡便性やコストの観点から、前記メラノサイトは、好ましくは、株化細胞が望ましい。前記株化細胞としては、例えば、Ｂ１６メラノーマ細胞、ヒトメラノーマ細胞などが挙げられる。
【００１９】
前記培地としては、用いられる細胞の培養に適した培地が挙げられる。前記培地は、起源などに応じて、適宜選択されうる。具体的には、前記培地としては、特に限定されないが、例えば、ウシ胎仔血清を含有したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎仔血清を含有したイーグル培地、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）など各種成長因子を含むメディウム１５３培地などが挙げられる。なかでも、株化細胞を用いる場合、ウシ胎仔血清を含有したダルベッコ改変イーグル培地またはウシ胎仔血清を含有したイーグル培地が望ましい。
【００２０】
前記ステップ（Ｉ）において、培養に用いられる培養容器としては、伸展刺激の負荷を行なうことができる容器であればよく、例えば、タイプＩ  コラーゲンで被覆したシリコーンゴム容器、ニトリルゴム容器、天然ゴム容器などが挙げられる。前記伸展刺激が伸展刺激である場合、培養に用いられる培養容器は、伸展刺激を効率よく負荷できる観点から、好ましくは、シリコーンゴム容器が望ましい。
【００２１】
ついで、前記ステップ（Ｉ）で生成したメラニンの量を測定する〔ステップ（ＩＩ）〕。
【００２２】
メラニンの量の定量方法としては、例えば、培養容器中のメラノサイトを、トリプシンとエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）との混合物（１：１）、ＥＤＴＡなどにより、該培養容器から剥離させ、回収し、回収されたメラノサイトを、３Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、得られた溶解液の吸光度（４０５ｎｍ）を測定する方法などが挙げられる。なお、前記４０５ｎｍの吸光度を測定する方法では、既知濃度のメラニンを３Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、得られた試料の吸光度を測定することにより得られた検量線に基づき、メラニン量を算出する。
【００２３】
その後、前記ステップ（ＩＩ）で測定されたメラニンの量と、被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下に培養されたメラノサイトにより生成されたメラニンの量とを比較する〔ステップ（ＩＩＩ）〕。
【００２４】
被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下に培養されたメラノサイトにより生成されたメラニンの量は、被験物質を含有しない培地を用いることを除き、前記ステップ（Ｉ）と同様の手法により、メラノサイトの培養を行ない、ついで、前記メラニンの量の定量方法を行なうことにより決定されうる。かかるメラニンの量は、予め決定されていてもよく、前記ステップ（Ｉ）と並行して、ステップ（Ｉ’）被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下におけるメラノサイトの培養を行ない、被験物質の存在下の場合のメラニンの量の定量と同時に決定されてもよい。
【００２５】
本発明の評価方法は、被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下に、メラノサイトの培養を行なうことにより生成したメラニンの量（以下、「メラニン生成量Ｘ1」ともいう）と、被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下に、メラノサイトの培養を行なうことにより生成したメラニンの量（以下、「メラニン生成量Ｘ0」ともいう）とを比較することに１つの特徴がある。そのため、本発明の評価方法によれば、被験物質が、伸展刺激の負荷を介するメラニン生成を制御しうる物質であるかどうかの評価を行なうことができる。
【００２６】
前記ステップ（ＩＩＩ）では、前記メラニン生成量Ｘ1が、メラニン生成量Ｘ0よりも小さい場合、被験物質が、伸展刺激の負荷を介するメラニン生成を減少させる方向に制御しうる物質であることの指標となる。一方、前記メラニン生成量Ｘ1が、メラニン生成量Ｘ0よりも大きい場合、被験物質が、伸展刺激の負荷を介するメラニン生成を増加させる方向に制御しうる物質であることの指標となる。
【００２７】
なお、本発明の評価方法では、前記ステップ（Ｉ）において、前記メラノサイトの培養に際して、ケラチノサイトを共存させることができる。前記ステップ（Ｉ）において、メラノサイトとケラチノサイトとを共存させることにより、本発明の評価方法によれば、伸展刺激の負荷による生じたケラチノサイトの動態に基づくメラノサイトにおけるメラニンの生成に影響を与える物質を評価することができる。
【００２８】
前記ステップ（Ｉ）において、メラノサイトとケラチノサイトとを共存させる場合、前記培地は、メラノサイトおよびケラチノサイトの両方の培養に適した培地であればよい。
【００２９】
また、前記ステップ（Ｉ）において、メラノサイトとケラチノサイトとを共存させる場合、該メラノサイトに対するケラチノサイトの細胞数の割合が、ケラチノサイトの影響を検出する観点から、１／１〜９９／１であり、ヒトの皮膚におけるメラノサイトとケラチノサイトの比率の観点から、９／１〜１９／１であることが望ましい。
【００３０】
なお、前記ステップ（Ｉ）において、メラノサイトとケラチノサイトとを共存させる場合、ステップ（ＩＩ）におけるメラニン生成量Ｘ1およびメラニン生成量Ｘ0それぞれの測定は、メラノサイトをＥＤＴＡで処理することにより選択的に得、得られたメラノサイトを、３Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、得られた溶解液の吸光度（４０５ｎｍ）を測定する方法などにより行なわれうる。
【００３１】
前記ステップ（Ｉ）において、メラノサイトとケラチノサイトとを共存させる場合、前記ステップ（ＩＩ）において、被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下にケラチノサイトで生成した顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の量（以下、「ＧＭ−ＣＳＦ生成量ｘ1」ともいう）と、被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下にケラチノサイトで生成した顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の量（以下、「ＧＭ−ＣＳＦ生成量ｘ0」ともいう）とを、さらに測定することができる。本発明の評価方法によれば、このように、前記ＧＭ−ＣＳＦ生成量ｘ1およびＧＭ−ＣＳＦ生成量ｘ0を測定した場合、被験物質が、伸展刺激の負荷によりケラチノサイトで生成する顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を介するメラニン生成を制御しうる物質であるかどうかの評価を行なうことができる。
【００３２】
前記ステップ（Ｉ）において、メラノサイトとケラチノサイトとを共存させる場合、前記ステップ（ＩＩＩ）で、前記ＧＭ−ＣＳＦ生成量ｘ1とＧＭ−ＣＳＦ生成量ｘ0とを比較して、前記ＧＭ−ＣＳＦ生成量ｘ1が、ＧＭ−ＣＳＦ生成量ｘ0よりも小さい場合、被験物質が、伸展刺激の負荷によりケラチノサイトで生成するＧＭ−ＣＳＦを介するメラニン生成を減少させる方向に制御しうる物質であることの指標となる。一方、前記ＧＭ−ＣＳＦ生成量ｘ1が、ＧＭ−ＣＳＦ生成量ｘ0よりも大きい場合、被験物質が、伸展刺激の負荷によりケラチノサイトで生成するＧＭ−ＣＳＦを介するメラニン生成を増加させる方向に制御しうる物質であることの指標となる。
【００３３】
生成したＧＭ−ＣＳＦの量は、例えば、培養後の培地上清を回収し、該培地上清に含まれるＧＭ−ＣＳＦを、ＧＭ−ＣＳＦに対するモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡにより定量化する方法；培養後の培地上清を回収し、該培地上清に含まれるＧＭ−ＣＳＦを、該抗体を用いたウエスタンブロット法により半定量的に調べる方法などにより測定されうる。
【００３４】
本発明の評価方法によれば、例えば、伸展刺激がかかる部位におけるメラニン生成を制御、例えば、抑制することなどに用いうる、伸展刺激介在メラニン生成の制御物質の選別、該物質の単離、該物質の候補物質の評価などが可能になる。
【００３５】
本発明の評価方法により、被験物質が、伸展刺激の負荷を介するメラニン生成を減少させる方向に制御しうる物質、または伸展刺激の負荷によりケラチノサイトで生成するＧＭ−ＣＳＦを介するメラニン生成を減少させる方向に制御しうる物質であると評価された場合、当該被験物質は、シミ形成阻害物質の候補物質の１つとなる。したがって、本発明には、前記評価方法に基づく、シミ形成阻害物質のスクリーニング方法も包含される。
【００３６】
本発明のスクリーニング方法によれば、伸展刺激の負荷により生成するメラニンおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの量の変動が指標とされているため、本発明のスクリーニング方法により得られるシミ形成阻害物質は、伸展刺激に起因するシミの形成を効果的に阻害することが期待される。
【００３７】
また、本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、伸展刺激がかかる部位におけるメラニン生成を抑制し、シミ形成を抑制することができるシミ形成阻害物質の選別、該シミ形成阻害物質の単離、該シミ形成阻害物質の候補物質の評価などが可能になる。
【００３８】
前記評価方法のステップ（Ｉ）において、メラノサイトを単独で用いる場合、本発明のシミ形成阻害物質のスクリーニング方法は、１つの実施態様では、
被験物質を、前記評価方法に供し、それにより、該被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下に生成したメラニンの量よりも、該被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下に生成したメラニンの量が減少することを指標として、該被験物質をシミ形成阻害物質として選別することを特徴とする方法（以下、「実施態様１の方法」ともいう）、
である。
【００３９】
前記実施態様１の方法により選別されるシミ形成阻害物質は、メラノサイトに直接作用して伸展刺激存在下で増加するメラニン量を減少させる効果を発揮することが期待されうる。
【００４０】
また、前記評価方法のステップ（Ｉ）において、メラノサイトの培養を、ケラチノサイトの共存下に行なう場合、本発明のシミ形成阻害物質のスクリーニング方法は、他の実施態様では、被験物質を、前記評価方法に供し、それにより、
（ａ）  該被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下に生成したメラニンの量よりも、該被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下に生成したメラニンの量が減少すること、または
（ｂ）  該被験物質の非存在下かつ伸展刺激負荷下にケラチノサイトで生成した顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の量よりも、該被験物質の存在下かつ伸展刺激負荷下にケラチノサイトで生成した顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の量が減少すること、または
（ｃ）  前記（ａ）および（ｂ）の両方の事象、
を指標として、該被験物質をシミ形成阻害物質として選別することを特徴とする方法（以下、「実施態様２の方法」ともいう）、
である。
【００４１】
前記実施態様２の方法は、ケラチノサイトの共存下でメラノサイトの培養を行なわれているため、該実施態様２の方法により選別されるシミ形成阻害物質は、メラノサイトへの直接的作用もしくはケラチノサイトを介したメラノサイトへの間接的作用、またはそれらの両者により、伸展刺激存在下で増加するメラニン量を減少させる効果を発揮することが期待されうる。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法によれば、特に限定されないが、例えば、リョウヨウイリョウサイ抽出物、エイジツ抽出物なども、シミ形成阻害物質として選別される。
【００４３】
本発明のスクリーニング方法により選別されたシミ形成阻害物質は、シミ形成を抑制することによる美白効果などが期待されるため、化粧料の美白成分としての使用が可能である。
【００４４】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４５】
〔調製例１〕
リョウヨウイリョウサイ（Ｐｏｔｅｎｔｉｌｌａ  ｆｕｌｇｅｎｓ）の全草の粗破砕物  １０ｇに、５０体積％  エタノール水溶液  １００ｍｌを添加し、得られた混合物を室温（約２５℃）で５日間維持して、エタノール抽出物を得た。得られたエタノール抽出物を、ろ紙で濾過した。その後、得られた濾液を、４０℃で減圧下にて濃縮し、さらに減圧乾燥機で乾燥して、リョウヨウイリョウサイ抽出物を得た。また、エイジツ（Ｒｏｓａ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａ  Ｔｈｕｎｂｅｒｇ）の果実の粗破砕物  １０ｇを用いたことを除き、リョウヨウイリョウサイ抽出物の場合と同様の手法により、エイジツ抽出物を得た。
【００４６】
〔実施例１〕
（１）  Ｂ１６メラノーマ細胞に対する影響の評価系
タイプＩコラーゲン被覆シリコーンチャンバーに、Ｂ１６メラノーマ細胞  １×１０5細胞を播種し、培地として、１０質量％  ウシ胎仔血清を含有したダルベッコ改変イーグル培地（以下、「ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ」という）  ５ｍｌを用いて、該Ｂ１６メラノーマ細胞を、５体積％  ＣＯ2、３７℃の条件で２４時間培養した。前記シリコーンチャンバー中の培地を除去し、その後、前記シリコーンチャンバーを、培養細胞伸展装置〔商品名：ＳＴ−１４０、ストレックス株式会社製〕にセットした。
【００４７】
一方、前記調製例１で得られたリョウヨウイリョウサイ抽出物を、終濃度５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌとなるように、前記ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭに添加し、培地を得た。同様に、前記調製例１で得られたエイジツ抽出物を、終濃度５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌとなるように、前記ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭに添加し、培地を得た。
【００４８】
前記培地を、前記培養細胞伸展装置にセットしたシリコーンチャンバーに添加し、１分間に２回、１軸方向に１０％の伸展刺激を１６時間加えた（実験番号：１〜６）。ここで、前記「１０％の伸展刺激」とは、左右にシリコーンチャンバーを伸展させることにより、培養面積が１．１０倍になることをいう。また、前記ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ単独（実験番号：７）を、前記培養細胞伸展装置にセットしたシリコーンチャンバーに添加し、同様に伸展刺激を加えた。その後、トリプシンとＥＤＴＡとの混合液（１：１）を用いて、細胞を、シリコーンチャンバーから剥離させ、回収した。回収された細胞を、３Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、得られた溶解液の吸光度（４０５ｎｍ）を測定することによりメラニン量を定量した。なお、前記４０５ｎｍの吸光度が、１．０である場合を、メラニン量として１５０μg／ｍｌと定義した。また、伸展刺激なしで培養した場合（実験番号：８）のメラニン量を１００として、メラニン生成率を算出した。その結果を表１に示す。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
その結果、表１に示されるように、伸展刺激を加えることによりＢ１６メラノーマ細胞のメラニン生成は顕著に増加することがわかる。また、リョウヨウイリョウサイ抽出物を含有した培地およびエイジツ抽出物を含有した培地それぞれを用いた場合、リョウヨウイリョウサイ抽出物およびエイジツ抽出物のいずれも含有しない培地を用いた場合に比べ、伸展刺激を行なったＢ１６メラノーマ細胞におけるメラニン生成率が低くなることがわかる。
【００５１】
（２）  Ｂ１６メラノーマ細胞とＨａＣａＴ細胞との混合培養系による検討
タイプＩ  コラーゲンで被覆したシリコーンチャンバーに、Ｂ１６メラノーマ細胞とＨａＣａＴ細胞とを、１：９の割合になるように、合計１×１０5細胞を播種し、１０質量％  ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭで２４時間、混合培養を行なった。ついで、前記シリコーンチャンバー中の培地を、０．５質量％  ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地に交換し、Ｂ１６メラノーマ細胞とＨａＣａＴ細胞とを、さらに２４時間培養した。前記シリコーンチャンバーから、培地を除去し、その後、前記シリコーンチャンバーを、培養細胞伸展装置〔商品名：ＳＴ−１４０、ストレックス株式会社製〕にセットした。ついで、０．５質量％  ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地  ５ｍｌを、前記培養細胞伸展装置にセットしたシリコーンチャンバーに添加し、１分間に２回、１軸方向に１０％の伸展刺激を１６時間加えた（実験番号：９）。また、終濃度５μｇ／ｍｌ（実験番号：１０）、１０μｇ／ｍｌ（実験番号：１１）もしくは２０μｇ／ｍｌ（実験番号：１２）でリョウヨウイリョウサイ抽出物を含有したウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ、または終濃度５μｇ／ｍｌ（実験番号：１３）、１０μｇ／ｍｌ（実験番号：１４）もしくは２０μｇ／ｍｌ（実験番号：１５）でエイジツ抽出物を含有したウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ  ５ｍｌを、前記培養細胞伸展装置にセットしたシリコーンチャンバーに添加し、同様に伸展刺激を加えた。
【００５２】
その後、ＥＤＴＡを用いて、Ｂ１６メラノーマ細胞を、シリコーンチャンバーから剥離させ、回収した。回収された細胞を、３Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、得られた溶解液の吸光度（４０５ｎｍ）を測定することによりメラニン量を定量した。なお、前記４０５ｎｍの吸光度が、１．０である場合を、メラニン量として１５０μｇ／ｍｌと定義した。また、伸展刺激なしでＢ１６メラノーマ細胞とＨａＣａＴ細胞の混合培養を行なった場合のメラニン量（実験番号：１６）を１００として、メラニン生成率を算出した。結果を、表２に示す。
【００５３】
また同時に、シリコーンチャンバーから培地を回収し、該培地に含まれる因子を解析した。その結果、伸展刺激により、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の生成量が上昇することがわかった。
【００５４】
そこで、終濃度１μｇ／ｍｌの抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体〔アール  アンド  ディー  システムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）社製〕を含有したウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ  ５ｍｌを、前記培養細胞伸展装置にセットしたシリコーンチャンバーに添加し、前記と同様に伸展刺激を加えた（実験番号：１７）。
【００５５】
ＧＭ−ＣＳＦ量の測定は、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙキット〔アール  アンド  ディー  システムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）社製〕を用いて、添付の説明書に記載の方法に準じて行なった。伸展刺激なしで培養した場合のＧＭ−ＣＳＦ量を１００として、ＧＭ−ＣＳＦ生成率を算出した。結果を、表２に示す。
【００５６】
【表２】
2008029215.tif 000003
【００５７】
その結果、Ｂ１６メラノーマ細胞の単独培養の場合、伸展刺激によるメラニン生成率が１６１％であるのに対し（実験番号：７）、表２に示されるように、Ｂ１６メラノーマ細胞とＨａＣａＴ細胞との混合培養の場合、メラニン生成率が２０４％であることがわかる。このように、伸展刺激によるＢ１６メラノーマ細胞のメラニン生成促進作用が、ＨａＣａＴ細胞の共存により、さらに高まることがわかる。したがって、伸展刺激により、ＨａＣａＴ細胞がＢ１６メラノーマ細胞のメラニン生成を高める何らかの因子を産生していることが示唆される。さらに、Ｂ１６メラノーマ細胞とＨａＣａＴ細胞との混合培養の場合、伸展刺激により、ＧＭ−ＣＳＦ生成率が増加した。また、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体により、メラニン生成率が、１６３％となり、ほぼＢ１６メラノーマ細胞の単独培養の場合と同等まで低下した。したがって、ＨａＣａＴ細胞が産生するＢ１６メラノーマ細胞のメラニン生成を高める因子は、ＧＭ？ＣＳＦであることが示唆される。
【００５８】
また、Ｂ１６メラノーマ細胞とＨａＣａＴ細胞とを混合培養した場合の伸展刺激存在下でのＧＭ−ＣＳＦ生成は、リョウヨウイリョウサイ抽出物またはエイジツ抽出物非存在下の場合に比べ、リョウヨウイリョウサイ抽出物またはエイジツ抽出物の存在下で減少し、さらに、メラニン生成率も低くなることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明により、伸展刺激によるメラニン形成を制御する手段を開発することが可能になる。また、本発明により、伸展刺激によるシミの形成を抑制する手段を開発することが可能になる。