(57)【要約】      （修正有）【課題】宿主根物根へ共生されることなしに増殖させることができなかったＶＡ菌根菌の、胞子からの人工寒天培地平板上又は液体培養法での株化、継代も可能である、生菌ＶＡ菌根菌の培養法の提供。【解決手段】ＶＡ菌根菌、Ｇｉｇａｓｐｏｒａ  ｍａｒｇａｒｉｔａ（ギガスポラ・マルガリータ）及びＧｌｏｍｕｓ  ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ（グロムス・エチュニカタム）の胞子からの人工培養法。これらのＶＡ菌根菌を適当な保持剤に保持されるＶＡ菌根菌生菌資材の製造法。野外応用試験においても従来のＶＡ菌根菌資材より極めて早く本菌が作物根への定着し、作物の成長も良好なものとすることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＡ菌根菌の生菌分離培養法（変異相を含む）及び培養菌体（変異相を含む）の生菌資材の製造法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は菌の増殖に関する。
【背景技術】
【０００２】  ＶＡ菌根菌は、これまで人工培地上に培養することは不可能とされ、従ってこれまで分離された報告例はない。
【特許文献１】
【非特許文献１】
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  本発明はＶＡ菌根菌の胞子から２つの方法で人工寒天培地平板上又は液体培養法で生菌ＶＡ菌根菌の培養法を確立し、分離菌株は株化、継代し保存も可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】  特殊組織培養液、コーンベース培地及びポテトベース培地の調整及び各種の滅菌方法は次のようにして行った。
特殊組織培養液
硫酸アンモニウム０．０１７ｇ・硝酸アンモニウム０．０６ｇ・塩化カリウム０．０６ｇ・塩化カルシウム０．８ｇ・硫酸マグネシウム０．０５ｇ・塩化マンガン０．００１ｇ・酸化ほう素０．００５ｇ・硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．０００１ｇ・硫酸銅０．００１ｇ・モリブデン酸ナトリウム０．００１ｇ・硝酸コバルト０．００１ｇ・グルコース２ｇ・蒸留水１０００ｍｌ  ｐＨ５．０
コーンベース培地
冷凍コーン１００ｇを１０００ｍｌの割合に加え１２０℃２５分浸出しろ過したもの又はコーンスティープリカー（Ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  Ｌｉｑｕｅ）１％溶液を一度煮沸しろ過しｐＨ５．０に補正した。
ポテトベース培地
ジャガイモ１００ｇをミキサーで処理し１０００ｍｌとし、しばらく放置し上澄みをろ過し、一度煮沸してろ過したものにグルコース１０ｇを加えｐＨ５．０に補正した。
胞子及び牧草（ソルゴー等）は適当な濃度の殺菌剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム溶液、過酸化水素などの適当な殺菌剤を用いて滅菌し、特殊組織培養液は無菌ろ過法、培地類は１２０℃１５分間、その他の培養土、器具及び器財はいずれも１２０℃３０分間滅菌を行った。
以下の２つの方法はいずれも自然光線下で実施した。
１．  特殊組織培養液を用いて牧草（ソルゴー等）を無菌発芽発根し培養した牧草根に無菌胞子を接種し感染した感染根をコーンベース寒天培地平板上又はポテトベース寒天培地平板上に２０℃３〜４日間培養すると１〜２種の集落を形成する。
２．  絶対無菌牧草（ソルゴー等）と無菌胞子を植え込み隔離ポット栽培し、経時的培養土中の胞子の発芽状態を調べたが、極めて複雑過程をとり約１ヶ月後には胞子、幼若胞子と円盤状の仮称感染粒子が確認され、この仮称感染粒子は適当な時期を見計らいながら上記の寒天培地平板上に培養すると同様に本菌の集落が形成される。尚、仮称感染粒子以外に同時分離される胞子及び幼若胞子は全く発育しない。
【発明の効果】
【０００５】  本菌は２つの方法で分離し、その際ポテトベース寒天培地平板上にコーンベース寒天培地平板上に２〜３種の集落を形成することがある。これについて細菌学的、並びに生化学的諸性状を検討した結果、Ｓｍｏｏｔｈ（スムース）・Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔ（インターメデート）・Ｒｏａｇｈ（ラフ）及びＭｕｃｏｉｄ（ムコイド）のＭｕｔａｔｉｏｎａｌｐｈａｓｅ（変異相）が存在することを確認した。変異相によって形成される集落も異なりＳｍｏｏｔｈの場合ポテトベース寒天培地平板上には盛り上がった多型の集落を形成し、培地深部に菌糸が深入する。コーンベース寒天培地平板上での集落は菌糸の深部深入と同時に寒天培地平板上に長い菌糸が伸長する。突然変異率はやや高く、Ｒ（ラフ）・Ｍ（ムコイド）株は変異誘起物質を含む勾配寒天培地平板法等によってｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ（誘発変異）によってＳ（スムース）が出現する。
以上２法で分離したＴＣ−１Ｎｏ１（Ｇｉｇａｓｐｏｒａ  ｍａｒｇａｒｉｔａ）・ＴＣ−１  ２Ｎｏ２０（Ｇｉｇａｓｐｏｒａ  ｍａｒｇａｒｉｔａ）及びＴＣ−７Ｎｏ２（Ｇｌｏｍｕｓ  ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ）株と命名した。本菌株の保存は胞子の保存菌株の維持のような植物栽培による必要はなくＮＩＨ（ＵＳＡ）処方の凍結保存液に菌体を浮游させ凍結すれば長期にわたり保存は可能である。
【発明を実施するための最良の状態】
【０００６】  ＴＣ−１Ｎｏ１及びＴＣ−７Ｎｏ２株は例えばポテトベース培養液又はコーンベース培養液に２０℃〜２５℃で４〜５日間培養すると、菌体はフロック状に沈降する。菌体の純粋実験を行って確認したのち、例えば滅菌パーライト、フヨーライトその他の保持剤に保持させ、適度の湿度を保ち、更に保持剤で混和希釈する。従って共生率も自由に変えることができる。
【手続補正書】
【提出日】平成18年10月13日(2006.10.13)
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】  特殊組織培養液、コーンベース培地及びポテトベース培地の調整及び各種の滅菌方法は次のようにして行った。特殊組織培養液  硫酸アンモニウム０．００１５ｇ・硝酸アンモニウム０．００１５ｇ・リン酸水素二カリウム０．００６ｇ・塩化カリウム０．００６ｇ・塩化カルシウム０．００４ｇ・硫酸マグネシウム０．００１ｇ・塩化マンガン０．００１ｇ・酸化ほう素０．０００１ｇ・硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．０００１ｇ・硫酸銅０．０００５ｇ・硫酸亜鉛０．０００５ｇ・モリブデン酸ナトリウム０．０００１ｇ・硝酸コバルト０．０００１ｇ・グルコース２ｇ・蒸留水１０００ｍｌコーンベース培地  冷凍コーン１００ｇを１０００ｍｌの割合に加え１２０℃２５分浸出しろ過したもの又はコーンスティープリカー（Ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  Ｌｉｑｕｅ）１％溶液を一度煮沸しろ過しｐＨ５．０に補正した。ポテトベース培地  ジャガイモ１００ｇをミキサーで処理し１０００ｍｌとし、しばらく放置し上澄みをろ過し、一度煮沸してろ過したものにグルコース１０ｇを加えｐＨ５．０に補正した。  胞子及び牧草（ソルゴー等）は適当な濃度の殺菌剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム溶液、過酸化水素などの適当な殺菌剤を用いて滅菌し、特殊組織培養液は無菌ろ過法、培地類は１２０℃１５分間、その他の培養土、器具及び器材はいずれも１２０℃３０分間滅菌を行った。以下の２つの方法はいずれも自然光線下で実施した。１．  特殊組織培養液を用いて牧草（ソルゴー等）を無菌発芽発根し培養した牧草根に無菌胞子を接種し感染した感染根をコーンベース寒天培地平板上又はポテトベース寒天培地平板上に２０℃３〜４日間培養すると１〜２種の集落を形成する。２．  絶対無菌牧草（ソルゴー等）と無菌胞子を植え込み隔離ポット栽培し、経時的培養土中の胞子の発芽状態を調べたが、極めて複雑過程をとり約１ヶ月後には胞子、幼若胞子と円盤状の仮称感染粒子が確認され、この仮称感染粒子は適当な時期を見計らいながら上記の寒天培地平板上に培養すると同様に本菌の集落が形成される。尚、仮称感染粒子以外に同時分離される胞子及び幼若胞子は全く発育しない。