(57)【要約】      （修正有）【課題】副作用を低減し治療効果を改善する多糖複合体およびその製造方法を提供する。【解決手段】酸素基を有する単量体アミノ酸ＡＡを多糖に共有的に結合することによる、および多糖複合体を形成するための酸素基に金属Ｍを共役することによる、多糖複合体、およびその合成方法を提供する。さらに、有効量の多糖複合体を細胞に投与することによって癌細胞を殺す方法に関する。この複合体は多糖、および多糖に共有的に結合する酸素基を有する少なくとも一つの単量体アミノ酸を有する。また複合体は、アミノ酸の酸素基によって共役された少なくとも一つの金属を有する。【選択図】図１Ａ
2008297549.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖と、
前記多糖に共有的に結合する酸素基を有する少なくとも一つの単量体アミノ酸と、
前記アミノ酸の前記酸素基によって共役される少なくとも１つの金属とからなる、多糖複合体。
【請求項２】
前記多糖複合体が約２０，０００ダルトンから約５０，０００ダルトンの間の分子量を有する、請求項１に記載の多糖複合体。
【請求項３】
前記多糖複合体がコラーゲン、コンドロイチン、ヒアルロン酸塩、キトサン、およびキチンから成る群から選択される、請求項１に記載の多糖複合体。
【請求項４】
前記多糖複合体がコンドロイチンを含む、請求項１に記載の多糖複合体。
【請求項５】
前記単量体アミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の多糖複合体。
【請求項６】
前記単量体アミノ酸がアスパラギン酸を含む、請求項１に記載の多糖複合体。
【請求項７】
前記多糖複合体が重量にして約１０％から約５０％の間の前記単量体アミノ酸を含む、請求項１に記載の多糖複合体。
【請求項８】
前記金属を含む薬剤を更に含む、請求項１に記載の多糖複合体。
【請求項９】
前記金属が治療金属である、請求項１に記載の多糖複合体。
【請求項１０】
前記金属が、白金、鉄、ガドリニウム、レニウム、マンガン、コバルト、インジウム、ガリウム、ロジウム、またはそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の多糖複合体。
【請求項１１】
前記金属が白金（ＩＩ）からなる、請求項１に記載の多糖複合体。
【請求項１２】
前記金属が白金（ＩＶ）からなる、請求項１に記載の多糖複合体。
【請求項１３】
前記多糖複合体が重量にして約１０％から約５０％の間の前記金属を含む、請求項１に記載の多糖複合体。
【請求項１４】
前記多糖複合体が重量にして約１０％から約５０％の間の前記金属を含む薬剤を含む、請求項８に記載の多糖複合体。
【請求項１５】
前記多糖複合体が重量にして約１５％から約３０％の間の白金（ＩＩ）または白金（ＩＶ）金属、および重量にしておよそ７０％のアスパラギン酸単量体アミノ酸を含むとともに、前記多糖複合体が約２６，０００ダルトンから約３０，０００ダルトンの間の分子量を有する、請求項１に記載の多糖複合体。
【請求項１６】
酸素基を有する単量体アミノ酸を多糖に共有的に結合する工程と、
多糖複合体を形成するために金属を前記酸素基に共役する工程とを備える、多糖複合体合成方法。
【請求項１７】
前記多糖複合体を粉末にするために乾燥する工程を更に備える、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、金属および多糖の単量体アミノ酸を介した複合体に関する。これらの多糖複合体は、癌細胞の死を誘導するために、また癌治療において用いられる可能性がある。
【背景技術】
【０００２】
血管新生過程は腫瘍の血管系の密度と透過性に関与する。これらの過程、ならびに細胞周期制御および細胞シグナル伝達物質に関するより一層の理解は、様々な腫瘍の治療の新しい時代を切り開いた。血管新生分野において顕著な進展がなされたにもかかわらず、血管新生の要素がある癌、腫瘍、およびその他の疾患の薬剤を介した治療には多少の重要な制限が今なお残っている。現時点で最も重要な制限の一つは細胞増殖抑制剤ではなく細胞毒性薬のインビボでの送達に関する。
【０００３】
腫瘍の活動に対する白金複合体の効果が示されている。例えば、広く用いられる抗癌剤であるシスプラチンは単独または他の薬剤との組み合わせで乳癌および卵巣癌を治療するために用いられている。ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ）としても知られるシスプラチンは、白金がＮＨ３分子に共役した単純な分子である。シスプラチンは細胞増殖の分裂停止をもたらす細胞のＳ期停止を引き起こす。またシスプラチンは、化学療法の際に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現を減少させ、ひいては血管新生を制限する。シスプラチンは大部分の固形癌の治療に有効である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、シスプラチンを用いる臨床応用は顕著な腎臓毒性、骨髄抑制、薬剤耐性、胃腸毒性、神経毒性、およびその他の副作用（例えば、嘔吐、顆粒球減少、および体重減少）のため限定される。また、シスプラチンは水への溶解性に乏しいため、溶媒中に調剤されるが、この溶媒はかさばり、治療効果を損なう。副作用を低減し治療効果を改善するために様々な白金複合体の化学修飾が行われてきたが、これらの複合体は依然として重大な欠点を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一実施形態において多糖複合体を提供する。この多糖複合体は多糖および多糖に共有結合する酸素基を有する少なくとも１つの単量体アミノ酸を有する。また多糖複合体は、アミノ酸の酸素基によって結合された少なくとも一つの金属を有する。
【０００６】
別の実施形態によると、本発明は酸素基を有する単量体アミノ酸の多糖への共有結合によって、また多糖複合体を形成するために金属を酸素基に共役することによって多糖複合体を合成する方法を提供する。
【０００７】
第三の実施形態によると、本発明は有効量の多糖複合体を細胞に投与することによって癌細胞を殺す方法に関する。この多糖複合体は、多糖および多糖に共有結合するための酸素基を有する少なくとも１つの単量体アミノ酸を有する。多糖複合体はまた、アミノ酸の酸素基によって共役された少なくとも１つの金属を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
特定の実施形態において、本発明は金属−多糖複合体、それらの合成方法、および癌細胞死の誘導およびガンの治療を含むそれらの使用を含む。具体的には、複合体は少なくと
も１つの結合された単量体アミノ酸を含む多糖を含む。このアミノ酸は次に金属を共役することができる。選択された実施形態では、金属はＮ基ではなく酸素基を介して共役することができる。一部の実施形態では、金属は遷移金属である可能性がある。多くの実施形態では、結合された複数の単量体アミノ酸があり、そのため複数の金属基の共役が可能になる。複合体は任意のサイズであってよいが、特定の実施形態において、腎臓と通じた排泄を限定するために複合体は各分子が少なくとも１０，０００ダルトン、例えば１０，０００から５０，０００ダルトンの間であるように設計される場合がある。具体的な実施例では、多糖複合体は約２０，０００ダルトンから約５０，０００ダルトンの間、より具体的には約２６，０００ダルトンから約３０，０００ダルトンの間の分子量を有する場合がある。
【０００９】
選択された多糖は、任意の多糖であってよいが、血管吸収に関与する多糖が特に有用である可能性がある。具体的には、コラーゲン、コンドロイチン、ヒアルロン酸塩、キトサン、およびキチンといった接着性分子が多糖としての使用に適している可能性がある。具体的な一実施形態では、多糖はコンドロイチンＡである場合がある。本発明は特定の作用形態に限定されないが、前記多糖は血管系を通じた吸収および癌細胞への送達を促進する。これは多くのガンなど、進行中の血管新生の領域において特に当てはまる可能性がある。２０，０００から５０，０００ダルトンの範囲の分子量の最終産物は、血管に基づく治療の達成を助ける。
【００１０】
アミノ酸は任意の安定した方法で多糖に結合することができるが、多くの実施形態では共有的に多糖に結合される。アミノ酸は個別のモノマーが別々に多糖に結合されるように、単量体の形であってよい。アミノ酸は金属の共役に利用可能な酸素基を有し、特に二つの酸素基が利用可能であってもよい。金属は、単独の単量体アミノ酸によって、もしくは二つまたはそれ以上の単量体アミノ酸を介して共役することができる。単独または組み合わせで用いることができるアミノ酸単量体の例は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニンと組み合わせたグルタミン酸、アスパラギンと組み合わせたグルタミン酸、グルタミンと組み合わせたグルタミン酸、グリシンと組み合わせたグルタミン酸、およびグリシンと組み合わせたアスパラギン酸を含む。二つのカルボン酸間の結合距離とより良い腫瘍の吸収特異性のため、アスパラギン酸が好ましい。アミノ酸はＬ型、またはＤ型、またはＬ型およびＤ型のラセミ混合物であってもよい。最適な腫瘍吸収にはＬ型のアミノ酸が好ましい。単独のアスパラギン酸単量体はそれ自体に金属を共役することができることから、アスパラギン酸が選択されても良い。更に、アスパラギン酸はほ乳類細胞によって生産されないが必須の栄養素であり、増殖中の腫瘍細胞によって迅速に吸収されるようにしていると思われる。
【００１１】
以下の図面は本明細書の部分を成し、本発明の特定の様態を更に示すために含まれる。本発明はここに示された実施形態の説明と組み合わせて、一つまたは一つ以上のこれらの図面を参照することによってより一層理解することができる。本特許または出願書は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。
【００１２】
図１Ａ〜１Ｃは、本発明の実施形態による金属多糖複合体の三つのタイプを図示する。「ＡＡ」は、アミノ酸を表す。「Ｍ」は金属を表す。図１Ａにおいて、一つだけまたはいくつかのアミノ酸基および共役された金属が示される。図１Ｂにおいて、中間の数のアミノ酸基および共役された金属が示される。図１Ｃにおいて、考えられる最大数またはほぼ最大数のアミノ酸基および共役された金属が示される。
【００１３】
アミノ酸は、多糖複合体の重量に対して約１０％から約５０％の間で含むことができる。
多糖のアミノ酸結合点の飽和度は様々であってよい。例えば、図１Ａに示されるように
、一つのみのアミノ酸が結合してもよい。５％以下、１０％以下、または２０％以下といった非常に低い飽和度が実現されても良い。図１Ｂは、およそ３０％、およそ４０％、およそ５０％、またはおよそ７０％といった中程度の飽和度の複合体を図示する。図１Ｃは、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または実質的に完全飽和といった非常に高い飽和度の複合体を図示する。図１では各アミノ酸が共役した金属を有するが、多くの実際の例では５％未満、１０％未満、または２０％未満、およそ３０％、およそ４０％、およそ５０％、またはおよそ７０％、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または実質的に完全飽和といった、金属によって利用可能なアミノ酸の飽和度がある。
【００１４】
金属は任意の金属原子または鉄またはアミノ酸モノマーの酸素基によって共役することができる金属を含む化合物であってよい。具体的な実施形態では、金属は白金、鉄、ガドリニウム、レニウム、マンガン、コバルト、インジウム、ガリウム、またはロジウムといった遷移金属であってよい。金属は治療的金属であってもよい。薬剤などのより大きな分子の一部であっても良い。金属はアミノ酸モノマーの酸素基を介して多糖−アミノ酸骨格に共役することができる。
【００１５】
一実施形態において、金属は多糖複合体の重量に対して１５％から約３０％の間であってもよい。
実施形態の一例では、複合体は、白金含有化合物においては白金を共役させるアスパラギン酸モノマーに共有的に結合したコンドロイチンＡを含む。一変形物において白金は白金（ＩＩ）であってもよく、別の変形物では白金は白金（ＩＶ）であってもよい。
【００１６】
複合体は水に可溶である場合もある。例えば、少なくともおよそ２０ｍｇ（金属当量）／水ｍｌの溶解性を有する可能性がある。複合体は水溶液または粉末といった様々な形で提供される可能性もある。複合体とその製剤は滅菌されてもよい。例えば、滅菌粉末として提供されてもよい。
【００１７】
複合体は本発明の一実施形態に従って、一つ以上のアミノ酸を多糖に別に共有的に結合させることによって合成されてもよい。次に、アミノ酸モノマーよる共役に金属が提供されてもよい。本発明の別の実施形態によると、金属がアミノ酸モノマーに共役されてもよく、次に一つ以上のアミノ酸モノマーが多糖に共有的に結合されてもよい。
【００１８】
本発明の複合体は、癌細胞または腫瘍細胞を殺すために用いることもでき、ひいては癌または腫瘍を治療することができる。複合体は腫瘍、特に固形癌を標的とすることができる。これは例えば、ガンマ線イメージングを可能にする、９９ｍＴｃに共役された多糖−アミノ酸骨格といった放射線標識した化合物の変形物を通じて実証することができる。金属成分を含む細胞毒性薬は、毒性作用を低減するために多糖−アミノ酸骨格に共役されてもよい。例えば、細胞毒性薬は急性全身毒性を低減させるために多糖から次第に放出されてもよい。また、水への可溶性が乏しい薬剤の治療指数（毒性／効果）または腫瘍ターゲッティング能は、多糖ポリマー骨格にそれらの薬剤を共役することによって増大する可能性がある。
【００１９】
実施形態の具体的な例では、白金含有複合体は癌細胞の増殖をシスプラチンより少ない用量で阻害できる可能性がある。更に、白金含有複合体はシスプラチン耐性癌細胞、特に卵巣癌細胞の細胞増殖も阻害できる可能性がある。
【００２０】
任意の種類の癌細胞または腫瘍細胞は、本発明の選択された複合体によって殺されるか増殖が阻害される可能性がある。しかし、固形癌はこれらの複合体に最もよく反応する可能性がある。本発明の特定の複合体に感受性である癌の例は、卵巣癌、シスプラチン耐性卵巣癌、膵臓癌、乳癌、肉腫、子宮癌およびリンパ腫を含む。
【００２１】
癌に加えて、本発明の特定の複合体は以下の疾患の発症と進行に関わる細胞を標的とし、阻害できる可能性がある：ＨＩＶ、自己免疫疾患（例えば、脳脊髄炎、白斑、強皮症、甲状腺炎、および穿孔性膠原病）、遺伝病（例えば、色素性乾皮症およびグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症）、代謝疾患（例えば、糖尿病）、心臓血管疾患、神経精神病、およびその他の病状（例えば、低血糖および肝硬変）。
実施例
以下の実施例は、本発明の具体的な実施例を示すために含まれている。発明者によって発見された本技術に従う実施例に開示された技術が本発明の実践において良好に機能することが、当業者により正しく理解されるはずである。しかし、開示された具合的な実施形態において多くの変更を行うことができること、また同等または類似の結果を本発明の精神および範囲から離れずに更に得ることを、当業者は本開示を踏まえて正しく理解するだろう。
【００２２】
実施例１：白金アナログ（ＩＩ）および（ＩＶ）−多糖複合体の合成
方法Ａ
ｃｉｓ−１，２−ジアミノシクロヘキサン硫酸白金（ＩＩ）（ｃｉｓ−１，２−ＤＡＣＨ−ＰｔＳＯ４）を二段階の手順を介して合成した。第一の段階では、１２０ｍＬの脱イオン水にＫ２ＰｔＣｌ４（５．００ｇ、１２ｍｍｏｌ）の濾過した溶液をＫＩ（１２ｍＬの水に２０．００ｇ、１２０ｍｍｏｌ）と混合して５分間撹拌することによって、ｃｉｓ−１，２−ＤＡＣＨ−ＰｔＩ２複合体を合成した。この溶液に１当量のｃｉｓ−１，２−ＤＡＣＨ（１．３７ｇ、１．４８７ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合液を室温で３０分間撹拌した。得られた黄色固体を濾過で分離し、次に少量の脱イオン水で洗浄した。最終生成物を真空下で乾燥したところ、ｃｉｓ−１，２−ＤＡＣＨ−ＰｔＩ２（６．４８ｇ、９６％）が得られた。第二の段階では、ｃｉｓ−１，２−ＤＡＣＨ−ＰｔＩ２（段階１から更なる精製は行っていない、６．４８ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）を固体としてＡｇ２ＳＯ４（３．４５ｇ、１１ｍｍｏｌ）の水溶液に添加した。反応混合液を室温で一晩撹拌した。ＡｇＩを濾過で除去し、濾液を真空下で凍結乾燥したところ、ｃｉｓ−１，２−ＤＡＣＨ−Ｐｔ（ＩＩ）ＳＯ４（４．８３ｇ、９９％）が得られた。元素分析でＰｔ：４４．６％（ｗ／ｗ）と示された。
【００２３】
水（５ｍｌ）にコンドロイチン（１ｇ、ＭＷ．３０，０００−３５，０００）の撹拌溶液に、硫酸ＮＨＳ（２４１．６ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）および３−エチルカルボジイミド１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣｌ（ＥＤＣ）（２１８．８ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）（ピアース・ケミカル・カンパニー社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、イリノイ州、ロックフォード）を加えた。次に、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム（３５６．８ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）を加えた。混合液を室温で２４時間撹拌した。１０，０００でカットオフしたＳｐｅｃｔｒａ／ＰＯＲ分子多孔膜（スペクトラム・メディカル・インダストリーズ社（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、テキサス州、ヒューストン）を用いて混合液を４８時間透析した。透析後、生成物を濾過し、凍結乾燥機（ラブコンコ社（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）、ミズーリ州、カンザスシティ）で凍結乾燥した。生成物である塩の形のアスパラギン酸−コンドロイチン（多糖）は、１．２９ｇの重さだった。同様の手法をグルタミン酸とアラニン、グルタミン酸とアスパラギン、グルタミン酸とグルタミン、グルタミン酸とグリシン、およびグルタミン酸と、アラニン、アスパラギン、グルタミン、およびグリシンの一つと共役したアスパラギン酸を有するコンドロイチンの調製に用いた。
【００２４】
Ｃｉｓ−１，２−ＤＡＣＨ−Ｐｔ（ＩＩ）ＳＯ４（５００ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの脱イオン水に溶解し、アスパラギン酸−コンドロイチン（１５ｍｌ脱イオン水に１．００ｇ）を添加した。溶液を室温で２４時間撹拌した。透析（ＭＷ：１０，０００
）と凍結乾燥後、ｃｉｓ−１，２−ＤＡＣＨ−Ｐｔ（ＩＩ）−多糖の収量は１．１４６２ｇだった。
【００２５】
白金−多糖複合体であるＣｉｓ−１，２−ＤＡＣＨ−ジクロロ−Ｐｔ（ＩＶ）−アスパラギン酸−コンドロイチン（ＰＣ）は、次のように合成した：上記溶液を２．５ｍＬの３０％過酸化水素水溶液に滴下した。２４時間後、ＨＣＬ（０．０２Ｎを７５ｍｌ）を添加し、室温で２４時間撹拌し、脱イオン水で一晩透析（ＭＷ：１０，０００）し、真空下で凍結乾燥した。得られた最終生成物は、１．１５ｇだった。元素分析でＰｔ：２１．８７％（ｗ／ｗ）と示された。合成の図式を図２に示す。
方法Ｂ
Ｃｉｓ−１，２−ＤＡＣＨ−Ｐｔ（ＩＩ）ＳＯ４またはＣｉｓ−１，２−ＤＡＣＨ−ジクロロ−Ｐｔ（ＩＶ）（５００ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの脱イオン水に溶解し、２ｍＬ脱イオン水にアスパラギン酸塩（６７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を溶解した溶液を添加した。溶液を室温で２４時間撹拌した。透析と凍結乾燥後、ｃｉｓ−１，２−ＤＡＣＨ−Ｐｔ−アスパラギン酸塩を、水（５ｍｌ）に溶解したコンドロイチン（１ｇ、ＭＷ．３０，０００−３５，０００）、硫酸ＮＨＳ（２４１．６ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）および３−エチルカルボジイミド１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣｌ（ＥＤＣ）（２１８．８ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）（ピアース・ケミカル・カンパニー社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、イリノイ州、ロックフォード）と反応させた。合成の図式を図３に示す。
【００２６】
実施例２：インビトロ細胞培養アッセイ
シスプラチンおよび方法Ａを用いて上述のように調製された白金（ＩＩ）−多糖複合体（ＰＣ）の乳腺腫瘍細胞に対する細胞毒性を評価するため、２００８株およびその白金耐性亜株である２００８−ｃ１３の二つのヒト腫瘍細胞株を選択した。全ての細胞を３７℃で加湿した５％ＣＯ２を含む大気中で、１０％ウシ胎仔血清およびグルタミン（２ｍＭ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。２００８または２００８．Ｃ１３細胞を９６穴プレートに播種し（４，０００細胞／ウェル）、ＲＰＭＩ１６４０培地中に２４時間維持した。次に、細胞を２．５、５、１０、２０、２５、および５０μｇ／ｍＬの濃度のＰＣまたはＣＤＤＰで４８または７２時間処理した。コントロールはＤＭＳＯまたはＰＢＳで処理した。細胞の処理後、細胞を２０μＬのテトラゾリウム基質と共に３７℃で１〜２時間インキュベートして、増殖と生存率を測定した。９６−ｗｅｌｌ  Ｓｙｎｅｒｇｙ
ＨＴ−ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  （バイオテック社（Ｂｉｏｔｅｋ）、バーモント州、ウィノオスキー）を用いて４５０ｎｍの吸収を測定した。細胞増殖の阻害率は、以下のように、パーセンテージとして表現した：％＝１００−（ＯＤコントロール−ＯＤ処理細胞）／ＯＤコントロール。実験は独立して３回反復して行った。メチレンテトラゾリウム（ＭＴＴ）色素アッセイは、生存細胞の量を測定した。細胞のタンパク質含量をローリー法で測定した。次に、細胞増殖を５０％阻害する薬剤濃度（ＩＣ−５０）を測定した。データは、コントロールと比較した差のパーセンテージとして表現する（処理後の細胞のＯＤ／処理なしの細胞のＯＤ）。例示した細胞阻害曲線を図４および５に示す。図４，５において、「Inhibition」は阻害、「Concentration」は濃度、「Saline」は生
理食塩水を示す。
【００２７】
結果は、白金感受性卵巣癌株（２００８）と異なり（図５）、白金耐性卵巣細胞株では白金−多糖複合体（ＰＣ）のＩＣ−５０に曝露する細胞の感受性がシスプラチン（ＣＤＤＰ）のＩＣ−５０への曝露の場合と比較して５．７倍高いことを示した（図４）。特に、２．５および５μｇ／ｍＬの白金−多糖複合体（ＰＣ）の濃度は、腫瘍致死を４８時間でシスプラチン（ＣＤＤＰ）と比較してそれぞれ５．９および４．６倍高め（図４Ａ）、７２時間でシスプラチン（ＣＤＤＰ）と比較してそれぞれ９．３および１．５倍高めた（図４Ｂ）。データは、低用量の白金−多糖複合体（ＰＣ）が白金耐性卵巣癌細胞の細胞増殖
を顕著に阻害することを示した。
【００２８】
白金−多糖複合体（ＰＣ）の白金耐性卵巣癌細胞に対する効果を測定するため、２００８−ｃ１３細胞（０．５×１０−６）を白金−多糖複合体（ＰＣ）で処理した。細胞をトリプシン処理し、２５００ｒｐｍで５分間遠心した。１ｘＰＢＳで２回洗浄後、細胞を７０％エタノールで一晩固定し、１×ＰＢＳで２回洗浄し、１ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液に再懸濁した（１×１０６細胞／ｍＬ）。ＲＮａｓｅ（２０μｇ／ｍＬ）溶液を添加し、次に１ｍＬのヨウ化プロピジウム溶液（ＰＩ、ＰＢＳに５０μｇ／ｍＬ）を添加した。試料を３７℃で１５分間インキュベートし、ＰＩ蛍光をＥＰＩＳ  ＸＬ解析装置で解析した。シスプラチン（ＣＤＤＰ）と比較して、白金（ＩＶ）−多糖複合体は低濃度（２．５および５μｇ／ｍＬ）で白金耐性卵巣細胞のアポトーシス作用を顕著に強化した（図６−７）。図７において、「% of apoptotic cells」はアポトーシス細胞の割合、「Concentration」は濃度、「Saline」は生理食塩水を示す。
【００２９】
これらの結果は、処理４８時間後に両薬剤に曝露後にアポトーシス細胞の用量依存性の明確な増加が検出されたことを示すＴＵＮＥＬアッセイにより確認された。しかし、各用量で比較した場合、白金−多糖複合体（ＰＣ）処理群は、更に多くの細胞がアポトーシスを起こした（Ｐ＜０．０５）（図８）。図８の縦軸はアポトーシス細胞の割合を示す。
【００３０】
実施例３：乳癌移植ラットモデルを用いた抗癌作用の評価
メスのＦｉｓｃｈｅｒ  ３４４ラット（１２５−１７５ｇ）に乳癌細胞（１３７６２ＮＦ、１０６細胞／ラット、後肢に皮下注射）を接種した。１５−２０日後、腫瘍体積１ｃｍで、腫瘍移植ラットに白金コンドロイチン（白金−多糖）複合体（ＰＣ）またはコンドロイチン単独のいずれかを１０ｍｇＰｔ／ｋｇ（白金（ＩＶ）−多糖）または４５ｍｇ／ｋｇ（コンドロイチン）の用量で投与した。腫瘍体積および体重を毎日、６日間記録した。腫瘍体積は、［長さ（１）×幅（ｗ）×厚さ（ｈ）］／２として測定した。１５％の体重減少は、化学物質に誘導された毒性作用と考えられる。結果は、白金−多糖複合体（ＰＣ）はインビボで乳癌の増殖に効果的であることを示す（図９）。ＤＹで表される腫瘍は、コンドロイチンのみを投与された動物から採取された。ＤＰ−Ａ−Ｐで表された腫瘍は、白金−多糖複合体を投与された動物から採取された。図９Ａにおいて、左の腫瘍は、（２．０８ｃｍ×２．５８ｃｍ×１．９６ｃｍ）／２で５．２５９１ｃｍ３の体積だった。右の腫瘍は、（２．２０ｃｍ×２．３７ｃｍ×２．０２ｃｍ）／２で５．２６６１ｃｍ３の体積だった。図９Ｂにおいて、左の腫瘍は、（２．９９ｃｍ×３．２９ｃｍ×２．９２ｃｍ）／２で１４．３６２２ｃｍ３の体積だった。右の腫瘍は、（１．１１ｃｍ×１．８４ｃｍ×０．８６ｃｍ）／２で０．８７８２ｃｍ３の体積だった。白金−多糖複合体処理後、腫瘍組織を切除し、ホルマリンに包埋した。腫瘍組織をパラフィンに固定し、組織学的検査のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。白金−多糖複合体の投与後９４時間で、広範囲の壊死が観察されたが、多糖単独では観察されなかった（図１０）。図１０は、本発明の実施形態における白金−多糖複合体またはコンドロイチンのみの投与後２４および９４時間の壊死を示す腫瘍のヘマトキシリン・エオジン染色を示す。
【００３１】
実施例４：腫瘍細胞死または阻害の方法
実施例１の白金−多糖複合体の腫瘍細胞に対する作用を２００８−ｃ１３乳癌細胞を複合体で処理し、ウェスタンブロットで細胞のタンパク質に対する影響を分析することによって解析した（図１１）。切断されたＰＡＲＰは、白金−多糖複合体（ＰＣ）で処理された細胞内で、シスプラチン（ＣＤＤＰ）と比較して顕著に増加し、白金−多糖複合体がカスパーゼ３に依存する経路でのアポトーシス強化を通じて２００８−ｃ１３の細胞増殖を阻害したことを示唆している。
【００３２】
作用を、薬剤曝露４８時間後と７２時間後の２００８．Ｃ１３細胞株においてフローサ
イトメトリーでテストした。フローサイトメトリー解析は、低二倍体細胞を表しアポトーシスの誘導を示すｓｕｂ−Ｇ１画分の細胞数にＰＣおよびＣＤＤＰ処理後に用量依存性の上昇があることを示した。しかし、ＣＤＤＰと比べてＰＣの使用は、同じ用量でｓｕｂ−Ｇ１画分に更に明確な上昇を生じた（図１４）。
【００３３】
ＴＵＮＥＬアッセイの三つの独立した実験により、アポトーシスに典型的なＤＮＡの断片化が更に検出された。アポトーシス細胞数の用量依存性の明確な増加が、両薬剤への曝露後に検出された。しかし、各用量で比較した場合、ＰＣ処理細胞は更に高度のアポトーシスを示した（Ｐ＜０．０５）（図１５）。図１５は、ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ）およびジアミンジカルボン酸白金（ＰＣまたはＤＤＡＰ）で誘導されたアポトーシスの薬剤曝露４８時間後のＴＵＮＥＬアッセイを示す。
【００３４】
ＰＡＲＰの切断がその後に続くカスパーゼ３依存性経路を通じてアポトーシスが誘導されるかどうかを判定するため、カスパーゼ３およびカスパーゼ３の活性化後に形成するＰＡＲＰのレベルをウェスタンブロット解析により測定した。ＰＡＲＰは、カスパーゼ３依存性のアポトーシスの際に８５ｋＤａの断片に特異的に切断されることが示されている１１３ｋＤａの核タンパク質である。細胞をＣＤＤＰまたはＰＣに４８時間曝露した後、切断されたＰＡＲＰは各用量に存在した。ＣＤＤＰ処理群では、切断されたＰＡＲＰの発現が２．５μｇ／ｍＬから２０μｇ／ｍＬへ増加し、切断されたカスパーゼ３は、ＰＡＲＰの発現と同様のパターンで発現された。ＰＣ処理群では、切断されたカスパーゼ３の発現は、ＰＣ５μｇ／ｍＬで見られた低発現を除いてＣＤＤＰ処理群での発現に匹敵した。切断されたＰＡＲＰの発現は高用量（２０μｇ／ｍＬ）のＰＣにより誘導され、低用量のＰＣによる誘導よりも低いように見えるが、その上流である切断されたカスパーゼ３の発現ではそのような差は検出されなかった（図１６）。図１６は、ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ）またはジアミンジカルボン酸白金（ＰＣまたはＤＤＡＰ）で処理された２００８．Ｃ１３細胞における、切断されたカスパーゼ３および特異的なポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断のウェスタンブロット解析を示す。ＧＡＰＤＨはグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素である。
【００３５】
２００８−ｃ１３乳癌細胞におけるインビトロでの更なるテストにおいて、フローサイトメトリー解析は、細胞が白金−多糖複合体（ＰＣ）曝露後４８時間で顕著にＳ期に停止したことを示した（図１２）。最高レベルのＳ期ブロックは、より低い用量である２．５および５μｇ／ｍｌで生じた（９０．３％および９０．１％）。シスプラチン（ＣＤＤＰ）と比較した場合、白金−多糖複合体（ＰＣ）のＳ期停止細胞に対する作用は顕著に異なる。
【００３６】
具体的に、２００８．Ｃ１３脂肪をＰＣまたはＣＤＤＰで処理した４８時間後にＤＮＡ含量をフローサイトメトリーで解析した。ＣＤＤＰへの曝露は、５μｇ／ｍＬで細胞のＳ期停止を誘導しｓｕｂ−Ｇ１画分を増加させたが、最も低い用量の２．５μｇ／ｍＬではこれらの結果は見られなかった。Ｓ期停止した細胞数およびｓｕｂ−Ｇ１画分は、ＣＤＤＰ用量の上昇と共に継続的に上昇し、２０μｇ／ｍＬで最大のＳ期停止（８４．２％）が生じた。細胞をＰＣに４８時間曝露した後、最高レベルのＳ期ブロックがより低い用量（２．５μｇ／ｍＬ［９０．３％］および５μｇ／ｍＬ［９０．１％］）で生じた。より高い用量（１０および２０μｇ／ｍＬ）では、ｓｕｂ−Ｇ１画分が増加するに従って徐々にＳ期停止のレベルが低下した。これは、高用量ＰＣの強度のストレス下で細胞が迅速に、Ｓ期に停止する直前にアポトーシスを受けるという事実で説明することができる（図１７）。図１７Ａは、２００８．Ｃ１３細胞株におけるｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ）またはジアミンジカルボン酸白金（ＰＣまたはＤＤＡＰ）で４８時間の処理後の細胞周期の分布を示す。Ｇ１、Ｇ２、Ｍ、およびＳは、細胞の位相を示す。
【００３７】
２００８．Ｃ１３細胞においてＣＤＤＰおよびＰＣにより引き起こされるＳ期停止の基礎をなす機構を明らかにするために、Ｓ期における細胞周期の調節に重要なｐ２１およびサイクリンＡの発現を、薬剤曝露４８時間後の２００８．Ｃ１３において検討した。ｐ２１もサイクリンＡも、どちらもＣＤＤＰ処理後のＳ期停止の程度には関連しなかった。しかしＰＣ処理後では、ｐ２１およびサイクリンＡの発現はＳ期停止の程度に直接的に関係し、ｐ２１は低用量ＰＣ処理後にＳ期停止を最大に上方調節されたが、高用量後では上方調節されず、サイクリンＡは、高用量ＰＣ処理後に上方調節され、低用量ＰＣ処理後には低レベルに維持された（図１７Ｂ）。図１７Ｂは、ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ）またはジアミンジカルボン酸白金（ＰＣまたはＤＤＡＰ）に４８時間曝露後の２００８．Ｃ１３細胞におけるｐ２１およびサイクリンＡの発現のウェスタンブロット解析を示す。ＧＡＰＤＨはグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素である。
【００３８】
白金−多糖複合体（ＰＣ）で処理した２００８−ｃ１３乳癌細胞は、シスプラチン（ＣＤＤＰ）で処理した細胞と比較して、転写（図１３Ａ）とタンパク発現レベル（図１３Ｂ）の両方でｐ２１発現の上昇を示した。
【００３９】
本発明の典型的な実施例のみが具体的に上述されているが、当然ながら、本発明の精神と意図する範囲から逸脱することなくこれらの実施例の修正および変形が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ】一つだけまたはいくつかのアミノ酸基および共役された金属を有する金属多糖複合体を示す模式図。
【図１Ｂ】中間の数のアミノ酸基および共役された金属を有する金属多糖複合体を示す模式図。
【図１Ｃ】考えられる最大数またはほぼ最大数のアミノ酸基および共役された金属を有する金属多糖複合体を示す模式図。
【図２】本発明の実施形態による白金アナログ（ＩＩ）および（ＩＶ）−多糖複合体合成の一つの方法（方法Ａ）を示すスキーム。
【図３】本発明の実施形態による多糖−白金アナログ（ＩＩ）および（ＩＶ）複合体合成の別の方法（方法Ｂ）を示すスキーム。
【図４】本発明の実施形態による白金耐性卵巣癌細胞（２００８  ｃ１３）の阻害における白金−多糖複合体の４８時間（Ａ）および７２時間（Ｂ）での作用を示すグラフ。
【図５】本発明の実施形態による白金感受性卵巣癌細胞（２００８）の阻害における白金−多糖複合体の４８時間（Ａ）および７２時間（Ｂ）での作用を示すグラフ。
【図６Ａ】白金耐性卵巣癌細胞株２００８−ｃ１３に対するシスプラチン（ＣＤＤＰ）でのアポトーシス作用を示すフローサイトメトリーの結果を示すグラフ。
【図６Ｂ】本発明の実施形態による白金−多糖複合体（ＰＣ）（Ｂ）の４８時間でのアポトーシス作用を示すフローサイトメトリーの結果を示すグラフ。
【図７Ａ】本発明の実施形態による白金−多糖複合体（ＰＣ）またはシスプラチン（ＣＤＤＰ）で様々な濃度で４８時間処理された白金耐性卵巣癌細胞株２００８−ｃ１３においてフローサイトメトリーにより検出されたアポトーシス細胞のパーセンテージを示すグラフ。
【図７Ｂ】本発明の実施形態による白金−多糖複合体（ＰＣ）またはシスプラチン（ＣＤＤＰ）で様々な濃度で７２時間（Ｂ）処理された白金耐性卵巣癌細胞株２００８−ｃ１３においてフローサイトメトリーにより検出されたアポトーシス細胞のパーセンテージを示すグラフ。
【図８】本発明の実施形態による白金−多糖複合体（ＰＣ）またはシスプラチン（ＣＤＤＰ）で様々な濃度で４８時間処理された白金耐性卵巣癌細胞株２００８−ｃ１３においてＴＵＮＥＬアッセイによって検出されたアポトーシス細胞のパーセンテージを示すグラフ。
【図９Ａ】乳癌の増殖に対する本発明の実施形態による白金−多糖複合体のインビボでの２４時間での作用を示す（単回投与、白金１０ｍｇ／ｋｇ）写真。
【図９Ｂ】乳癌の増殖に対する本発明の実施形態による白金−多糖複合体のインビボでの９４時間での作用を示す（単回投与、白金１０ｍｇ／ｋｇ）写真。
【図１０Ａ】コンドロイチンが投与された２４時間の乳腺腫瘍（１３７６２）を示す写真。
【図１０Ｂ】白金−多糖複合体が投与された２４時間の乳腺腫瘍（１３７６２）を示す写真。
【図１０Ｃ】コンドロイチンが投与された９４時間の乳腺腫瘍（１３７６２）を示す写真。
【図１０Ｄ】白金−多糖複合体が投与された９４時間の乳腺腫瘍（１３７６２）を示す写真。
【図１１】白金−多糖複合体（ＰＣ）またはシスプラチン（ＣＤＤＰ）のいずれかで処理された２００８−ｃ１３細胞由来のＰＡＲＰタンパク質のウェスタンブロット。
【図１２】白金−多糖複合体（ＰＣ）またはシスプラチン（ＣＤＤＰ）処理４８時間後の２００８−ｃ１３細胞の細胞周期のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフ。
【図１３Ａ】白金−多糖複合体（ＰＣ）またはシスプラチン（ＣＤＤＰ）の低用量で処理された２００８−ｃ１３細胞における、ｐ２１転写物のノーザンブロット。
【図１３Ｂ】白金−多糖複合体（ＰＣ）またはシスプラチン（ＣＤＤＰ）の低用量で処理された２００８−ｃ１３細胞における、発現されたｐ２１のウェスタンブロット。
【図１４Ａ】シスプラチン（ＣＤＤＰ）または複合体（ＰＣまたはＤＤＡＰ）に曝露４８時間後のｓｕｂ−Ｇ１画分の用量依存性の増加のフローサイトメトリー解析（白金耐性の２００８．Ｃ１３細胞において、同じ用量でＰＣはＣＤＤＰよりも大幅に多いｓｕｂ−Ｇ１細胞を誘導）を示すグラフ。
【図１４Ｂ】２００８．Ｃ１３細胞におけるＣＤＤＰまたはＰＣ（ＤＤＡＰ）への４８時間曝露後のｓｕｂ−Ｇ１画分のパーセンテージを示すグラフ。
【図１５Ａ】アポトーシス性の形態が茶色の粒子で示される、写真。
【図１５Ｂ】アポトーシス性の形態を示す細胞のパーセンテージ（カラムは、三つの独立した実験の平均、バーは標準誤差）を示すグラフ。
【図１６】ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ）またはジアミンジカルボン酸白金（ＰＣまたはＤＤＡＰ）で処理された２００８．Ｃ１３細胞における、切断されたカスパーゼ３および特異的なポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断のウェスタンブロット解析を示すグラフ。
【図１７Ａ】２００８．Ｃ１３細胞株におけるｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ）またはジアミンジカルボン酸白金（ＰＣまたはＤＤＡＰ）で４８時間の処理後の細胞周期の分布を示すグラフ。
【図１７Ｂ】ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ）またはジアミンジカルボン酸白金（ＰＣまたはＤＤＡＰ）に４８時間曝露後の２００８．Ｃ１３細胞におけるｐ２１およびサイクリンＡの発現のウェスタンブロット解析を示すグラフ。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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