(57)【要約】【課題】生分解性を有する遺伝子導入剤を提供する。【解決手段】芳香族環を核とし、それから放射状に伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤であって、複数の該分岐型重合体同士が架橋鎖を介して架橋した架橋ポリマーよりなり、該架橋鎖が加水分解性結合を有することを特徴とする遺伝子導入剤。加水分解性結合としてはエステル結合が好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族環を核とし、それから伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤において、該分岐鎖が加水分解性結合を有することを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
芳香族環を核とし、それから伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤であって、
複数の該分岐型重合体同士が架橋鎖を介して架橋した架橋ポリマーよりなり、該架橋鎖が加水分解性結合を有することを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項３において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項３又は４において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項３ないし５のいずれか１項において、該分岐鎖はビニル系モノマーのホモポリマーよりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項３ないし５のいずれか１項において、前記分岐鎖は、前記ビニル系モノマーと、異なるモノマーとのランダム又はブロック共重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記加水分解性結合はエステル結合であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤に係り、特に生分解性を有する遺伝子導入剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、合成高分子ベクターとしてベンゼンなど芳香族環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを発明した（下記特許文献１，２）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合しエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【特許文献２】特開２００７−７０５７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
遺伝子治療を目指す場合には、生体内へのベクターの蓄積を防ぐ必要がある。なお、蓄積したベクターは、補体となったり、免疫活性化、毒性、発ガンなどの要因になる可能性がある。また、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏでも細胞内への残留は細胞機能に変化をきたす可能性がある。
【０００５】
本発明は、生分解性を有した遺伝子導入剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
請求項１の遺伝子導入剤は、芳香族環を核とし、それから伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤において、該分岐鎖が加水分解性結合を有することを特徴とするものである。
【０００７】
請求項２の遺伝子導入剤は、芳香族環を核とし、それから伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤であって、
複数の該分岐型重合体同士が架橋鎖を介して架橋した架橋ポリマーよりなり、該架橋鎖が加水分解性結合を有することを特徴とするものである。
【０００８】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項１又は２において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項３において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合していることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項３又は４において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項３ないし５のいずれか１項において、該分岐鎖はビニル系モノマーのホモポリマーよりなることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項３ないし５のいずれか１項において、前記分岐鎖は、前記ビニル系モノマーと、異なるモノマーとのランダム又はブロック共重合体であることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記加水分解性結合はエステル結合であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の遺伝子導入剤は、加水分解性結合を有しており、ポリマーがランダムにモノマーユニット又はオリゴマーユニットに分解されることにより分子量が小さくなる。従って、生体から排出され易く、生体への蓄積を防止ないし抑制することが期待できる。
【００１５】
加水分解性結合としてはエステル結合が好適である。
【００１６】
なお、請求項２の遺伝子導入剤は、ベンゼンなどの芳香族環を核とし、それからカチオン性分岐鎖が伸延する分岐型重合体同士を架橋鎖を介して架橋させた架橋ポリマーよりなる合成高分子ベクターである。この遺伝子導入剤は、その構造上の利点により、ＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができる。この遺伝子導入剤は、分岐型重合体が複数個架橋したものであるため、１個の分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に比べてＤＮＡなどの核酸をより広いネットワークで包蔵することができ、優れた遺伝子導入活性を示すようになる。
【００１７】
請求項２の場合、分岐型重合体同士を架橋する架橋鎖の分岐鎖への結合位置は分岐鎖の中間でも末端でも良く、また、分岐鎖を構成する主鎖、側鎖、主鎖末端のいずれでも良い。
【００１８】
前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることが好ましい。
【００１９】
このＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合しているものが好ましい。
【００２０】
このビニル系モノマーは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される１種以上が好ましい。
【００２１】
本発明では、分岐鎖は、ビニル系モノマーのホモポリマーであってもよく、２種以上のモノマーのランダム又はブロック共重合体であってもよい。
【００２２】
なお、上記のＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のブロックは、温度感応性を有しており、所定温度よりも低い温度では親水性であり、水溶性であるため、遺伝子導入剤を水に溶解させて核酸と複合させることができ、この遺伝子導入剤は、所定温度よりも高い温度になると疎水性となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の第１態様の遺伝子導入剤は、芳香族環から放射状等に伸延した複数のカチオン性分岐鎖を有したスター形分岐型重合体（スター形ポリマー）よりなり、第２態様の遺伝子導入剤は、スター型分岐型重合体を架橋鎖を介して連結した架橋ポリマー（マルチスター形ポリマー）よりなる。
【００２４】
このスター形分岐型重合体としては、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体が好適である。
【００２５】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００２６】
Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【００２７】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。
【００２８】
このイニファターに重合させるモノマーとしては、ビニル系モノマー、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等、とりわけビニル系モノマーが好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【００２９】
イニファターと上記モノマーとを反応させるには、イニファター及びモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しモノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００３０】
このモノマーの該原料溶液中の濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適である。
【００３１】
イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００３２】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適である。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【００３３】
なお、この光照射工程（第１の光照射工程）の後にさらに第２の光照射工程を行ってもよい。すなわち、この反応生成物を含む溶液をアルコール、好ましくは上記モノマーのアルコール溶液で希釈する。このアルコールとしてはメタノール又はエタノール、特にメタノールが好適である。アルコール溶液中のモノマー濃度としては、終濃度として、１００ｍＭ〜５Ｍ程度が好適である。
【００３４】
上記第１の光照射工程からの反応生成物含有液１体積部に対し、このアルコール溶液５〜５００体積部を添加するのが好ましい。
【００３５】
このようにアルコール溶液で希釈した希釈液を、第２の光照射工程に供し、上記反応生成物に対しさらに上記モノマーを重合させる。この際の照射光源としては２４０〜４００ｎｍの波長の光を含むものであればよく、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光照射時間は１０分〜１２０分程度が好適である。
【００３６】
この光照射により、反応液中に分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して分岐型重合体としてのカチオン性ホモポリマーを得る。
【００３７】
この分岐型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数によるが、2,000〜500,000、特に2,000〜150,000、とりわけ2,000〜100,000程度が好ましい。
【００３８】
本発明では、この分岐型重合体（スター形ポリマー）は、上記ホモポリマーであってもよく、さらに異なる重合体とのブロック共重合体又はランダム共重合体であってもよい。例えば、上記ホモポリマーに対し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレートなどを導入してもよい。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させて温度感応性ポリマーブロックを導入してもよい。なお、先にＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマーよりなる分岐鎖を有した分岐型重合体を形成し、その後、各分岐鎖の先端側にカチオン性ポリマーブロックを導入するようにしてもよい。
【００３９】
このＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマー鎖は、低温度では親水性、高温では疎水性となる温度依存性を有する。なお、これにより遺伝子導入剤が上記温度応答性を具備するようになる。
【００４０】
カチオン性ポリマーブロックにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドあるいはＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させるには、上記のようにして合成したスター形分岐型重合体を好ましくはアルコール例えばメタノール等の溶媒に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体を混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中における分岐型ポリマーの濃度は0.01〜10重量％程度が好適であり、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体の濃度は0.3〜30重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長250〜400ｎｍ、照射時間1〜150分、照射強度100〜10,000μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００４１】
このスター形分岐型重合体の分子量は3,000〜600,000、特に3,000〜150,000であることが好ましい。
【００４２】
第１態様では、上記イニファターに対し加水分解性結合を有する化合物を結合させてから、この化合物に対し上記主鎖を重合させて分岐型重合体を合成する（即ち、分岐鎖の基端に加水分解性結合を導入する）か、又は、この分岐型重合体を合成する途中で、成長しつつある主鎖末端に加水分解性結合を有する化合物を重合させ、その後、再度主鎖を成長させる。
【００４３】
第２態様では、上記のように合成したスター形分岐型重合体（以下、スター形ホモポリマーということがある。）を加水分解性結合を有する架橋鎖を介して架橋させることにより、マルチスター形ポリマーよりなる遺伝子導入剤を合成する。
【００４４】
この分岐型重合体（スター形ホモポリマー）の架橋を行うには、スター形ホモポリマーと、加水分解性結合を有する架橋用化合物とをメタノールなど適宜の溶媒に溶解させ、加熱するか、光を照射することにより、架橋鎖を介してスター形ホモポリマー同士を架橋するのが好ましい。
【００４５】
この架橋反応を開始させる際の溶液中のスター形ホモポリマーの濃度は0.01〜１０重量％程度が好適である。加熱条件は、３０〜３００℃、１分〜３０,０００時間程度が好適である。この架橋反応により、分岐型重合体が２〜１０個、特に２〜５個程度架橋して架橋体を構成する。
【００４６】
この加水分解性結合としてはエステル結合、エーテル結合、アミド結合などが好ましく、特にエステル結合が好ましい。エステル結合を有する架橋用化合物としては、両端にＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を有し、途中にエステル結合を有する鎖状化合物が好ましい。この鎖状化合物の炭素数は２〜１０００程度が好ましく、エステル結合の数は１〜２０個程度が好ましい。好適な架橋用化合物は、炭素数２〜２０の末端ジカルボン酸のそれぞれにＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸又はその塩（例えばナトリウム塩又はカリウム塩）を縮合させたビスチオカルバメートである。
【００４７】
スター形ホモポリマー同士をビスチオカルバメートを介して架橋反応させる架橋反応では、ビスチオカルバメートの両端のＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団のチオ基が開いて架橋鎖が分岐鎖に結合し、この架橋鎖を介して分岐鎖同士が連結されるものと推察される。
【００４８】
加熱の代わりに、又は加熱と共に、光照射することによっても架橋させることができる。光の照射条件は、光波長１８０〜７００ｎｍ、照射時間１分〜３０，０００時間、照射強度０．００１〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００４９】
上記の通り、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させた遺伝子導入剤は、約３０℃よりも高い温度で疎水性であり、約３０℃よりも低い温度で親水性である。従って、３０℃よりも低い温度で核酸と遺伝子導入剤の水溶液とを混合して遺伝子導入剤に核酸を複合させることができる。
【００５０】
約３０℃よりも高い温度では、核酸を複合した遺伝子導入剤は、温度感応性核酸よりなる疎水性部分を有し、水不溶性となる。
【００５１】
このようにして生成した遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００５２】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００５３】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００５４】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００５５】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００５６】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００５７】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００５８】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００５９】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００６０】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００６１】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００６２】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００６３】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００６４】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００６５】
実施例１
［遺伝子導入剤の合成］
Ａ）エステル結合を有するビスチオカルバメートの合成（反応式：化１）
２−クロロエタノール２５ｇとピリジン７．８ｍＬを混合し、ジメチルアミノピリジンをスパチュラ１杯加えた。ここへ氷冷下でコハク酸クロライド９．６ｇを加え、１時間攪拌後、室温へ戻してさらに１４時間攪拌した。反応溶液を１５０ｍＬの水へ投入して失活させ、３０ｍＬのクロロホルムで抽出した。分離したクロロホルム層を５０ｍＬの水で２回、５０ｍＬの炭酸水素ナトリウム飽和水溶液で２回、５０ｍＬの塩化ナトリウム飽和水溶液で２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。1Ｈ-ＮＭＲはδ4.36（ｔ，4Ｈ，ＣｌＣＨ２）、δ3.69（ｔ，4Ｈ，ＣＨ2Ｏ）、δ2.71（ｓ，4ＨＣＨ2ＣＨ2）であり、中間体のジクロライド体が生成していることを確認した。
【００６６】
ここへ、４２ｇのＮ,Ｎ−ジエチルジチオカルバモイル酸ナトリウム三水和物をメタノール２００ｍＬへ溶解した溶液を加え、室温、遮光容器中で１５０時間攪拌した。ここへクロロホルム１５０ｍＬを加えて塩類を析出させ、濾過した。
【００６７】
濾液を濃縮後、シリカゲルカラム（メルク、シリカ６０、５０ｍｍ径・１００ｍｍ長）と溶出液クロロホルム：メタノール１００：０⇒１００：０．５のグラジエント溶出カラムで精製し、褐色オイルのビスチオカルバメートを得た。1Ｈ-ＮＭＲはδ4.04（ｑ，4Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）、δ3.79（ｑ，4Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）、δ3.91（ｔ，4Ｈ，ＣＨ2Ｏ）、δ3.60（ｔ，4Ｈ，ＳＣＨ2）、δ2.64（ｓ，4Ｈ，ＣＨ2ＣＨ2）、δ1.30（ｔ，12Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）であった。
【００６８】
【化１】
2008297276.tif 000003
【００６９】
Ｂ）分岐型スターポリマーの合成
Ｂ）−１  イニファターの合成
イニファターである１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した（化２）。
【００７０】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）１．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、減圧乾燥後、クロロホルム２００ｍＬへ溶解し、１５０ｍＬの水を加えて抽出分離し、臭化ナトリウムを除去した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させて、濾過後、ｎ−ヘキサンを加え、再結晶を行って精製し、白色の１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００７１】
１Ｈ  ＮＭＲ（ｉｎ  ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００７２】
【化２】
2008297276.tif 000004
【００７３】
Ｂ）−２  カチオン性ホモポリマーの合成（化３）
１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、減圧蒸留により精製してある３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド３．０ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。石英セル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、２００Ｗ高圧水銀灯で紫外光を１０分間照射した。照射強度は照度計（ＵＶＲ−１，ＴＯＰＣＯＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して１ｍＷ／ｃｍ２（２５０ｎｍ）に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させて精製し、少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマー１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼンよりなるカチオン性ポリマーを得た（重合率４０％）。分子量はＧＰＣにより５，０００と測定された。
【００７４】
１Ｈ  ＮＭＲ（ｉｎ  Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００７５】
【化３】
2008297276.tif 000005
【００７６】
Ｃ）スター型ホモポリマーの連結による遺伝子導入剤の合成
上記Ｂ）で合成した４分岐型スター型ホモポリマー１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン０．２ｇと、Ａ）で合成したエステル結合を有するビスジチオカルバメート０．０４３ｇを４００μＬのＤＭＦで湿潤させてガラス板へ流延させた。ドクターナイフで厚み２０μｍで液切りし、２００Ｗ高圧水銀灯による紫外光を１００分間照射した。照射強度は照度計（ＵＶＲ−１，ＴＯＰＣＯＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して５ｍＷ／ｃｍ２（２５０ｎｍ）に調整した。５０ｍＬのメタノールを使用して回収し、不溶成分を濾別し、溶液をジエチルエーテルで再沈殿させて淡黄色の固体を得た。
【００７７】
ＧＰＣの測定結果によると、高分子量側へブロードな第２ピークが出現し、ジチオカルバメートの解裂により発生するラジカルの再結合によるポリマーブロックの連結体が生成していることが確認された（図１）。
【００７８】
得られた生成物は、第２ピークの部分的積算による分子量から、エステル結合を有したビスチオカルバメートを介して２個〜２０個程度のスター形ホモポリマーが連結されたマルチ形スター形ホモポリマーよりなる遺伝子導入剤であると推測された。
【００７９】
［遺伝子導入剤の加水分解］
上記Ｃ）で合成した連結体１０ｍｇを緩衝溶液へ溶解し、全量を２０ｍＬとした。緩衝溶液はリン酸（ｐＨ＝９）及びホウ酸（ｐＨ＝8）の２種類を使用して行った。
【００８０】
３７℃で６時間インキュベートし、１時間後と６時間後にＧＰＣスペクトルの経時変化を測定した（図２，３）。この結果、高分子量側のブロードな第２ピークが経時性に減少し、エステル結合が加水分解していることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】実施例の結果を示すグラフである。
【図２】実施例（加水分解１時間後）の結果を示すグラフである。
【図３】実施例（加水分解６時間後）の結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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