(57)【要約】  【課題】  多数の標的核酸中から繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ簡易に検出する方法および検出キットを提供する。  【解決手段】  本発明の繰り返し塩基配列の検出方法は、繰り返し塩基配列を有する標的核酸を、プライマーを用いて増幅する第１の工程と、前記増幅した標的核酸の繰り返し塩基配列に相補的な塩基鎖をハイブリダイズさせ、繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を形成する第２の工程と、前記標的核酸を固定化担体にハイブリダイズさせ、前記繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を固定化する第３の工程と、前記固定化された繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体からハイブリダイズした相補的塩基鎖量を定量する第４の工程とを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
繰り返し塩基配列を有する標的核酸を、プライマーを用いて増幅する第１の工程と、
前記増幅した標的核酸の繰り返し塩基配列に相補的な塩基鎖をハイブリダイズさせ、繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を形成する第２の工程と、
前記標的核酸を固定化担体にハイブリダイズさせ、前記繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を固定化する第３の工程と、
前記固定化された繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体からハイブリダイズした相補的塩基鎖量を定量する第４の工程と
を含む、繰り返し塩基配列の検出方法。
【請求項２】
前記プライマーは、タグ配列を有する、請求項１に記載の繰り返し塩基配列の検出方法。
【請求項３】
前記相補的塩基鎖は、標識体を含み、
前記複合体量の測定は、標識体の信号強度を測定して行う、請求項１または２に記載の繰り返し塩基配列の検出方法。
【請求項４】
繰り返し塩基配列の検出と、一塩基多型の検出とを同時に行う、請求項１ないし３のいずれかに記載の繰り返し塩基配列の検出方法。
【請求項５】
前記固定化担体が非天然型核酸である、請求項１ないし４のいずれかに記載の繰り返し塩基配列の検出方法。
【請求項６】
繰り返し塩基配列を有する標的核酸を増幅するためのプライマーと、
繰り返し塩基配列に相補的に結合する相補的塩基鎖と、
前記タグ配列と相補的な固定化担体と
を含む、繰り返し塩基配列の検出キット。
【請求項７】
前記プライマーは、タグ配列を有する、請求項６に記載の繰り返し塩基配列の検出キット。
【請求項８】
前記固定化担体は、基板上に固定されている、請求項６または７に記載の繰り返し塩基配列の検出キット。
【請求項９】
さらに、標識体を含む、請求項６ないし８のいずれかに記載の繰り返し塩基配列の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、繰り返し塩基配列の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の塩基配列上の差異は、核酸の置換、挿入、欠質あるいは組み替えにより生ずる。この核酸の塩基配列上の差異のうち、ある集団内で１％以上の頻度で存在する変異は、特に遺伝子多型と呼ばれている。遺伝子多型には、１個の塩基が他の塩基に置換されているＳＮＰ、繰り返し単位が数塩基から数十塩基であるＶＮＴＲ、繰り返し単位が２〜４塩基であるマイクロサテライト多型などが知られている。
【０００３】
遺伝子多型は、一定の頻度である集団内に広がっている。このため、全く形質の変化を伴わないもの、あるいは生存（生殖）に不利な形質ではなく、体質といえる形質を左右するものとして注目されている。例えば、糖尿病、高血圧症、肥満等の生活習慣病、リュウマチ、アレルギー等の免疫疾患、あるいは癌等の疾患に対する罹りやすさが、遺伝子多型に起因することが知られている。また、薬剤代謝（薬の効き方）やヒト白血球組織適合型抗原等も遺伝子多型によって支配されていると考えられている。さらに、繰り返し単位の繰り返し頻度は、ヒトによって異なるので、個人の同定を行うことができる。
【０００４】
血糖値をコントロールするインスリン遺伝子の近傍には、１４塩基の繰り返し単位を有するＶＮＴＲ配列（繰り返し単位：５’−ＡＣＡｇｇｇｇＴｇＴｇｇｇｇ−３’など数種類）が存在する。この繰り返し単位の反復数が多い場合は、少ない場合に比べて、インスリンの分泌量が多くなることが知られている。すなわち、インスリンの発現量は、ＶＴＮＲの繰り返し単位の反復数によって調節されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
また、ハンチントン病では、４番染色体短腕の第一遺伝子に存在するマイクロサテライト多型（繰り返し単位：ＣＡｇ）の繰り返し反復数が３６回以上と、異常に多い。この配列はグルタミンをコードする。このため、グルタミンの長大な鎖を生じ、これが転写機構を阻害するため、ハンチントン病を発症すると考えられている。
【０００６】
遺伝子診断、病原菌の特定、遺伝子多型の検出などの、ある種の核酸（標的核酸）を検出する場合に、多数のプローブ核酸を基材に固定したＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイが用いられている。オリゴＤＮＡがＤＮＡ合成機により容易に合成できるので、プローブ核酸としては、オリゴＤＮＡが主に使用されている。基材に固定されたプローブ核酸は、標的核酸と混合し、ハイブリダイズする。
【０００７】
プローブ核酸と標的核酸とがハイブリダイズしたか否かは、例えば、標的核酸を、標識体などを用いて検知することにより行う。標識体としては、蛍光標識体やＲＩ（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｉｓｏｔｏｐｅ）を用いる。標識体を用いない検出方法としては、水晶振動子法（ＱＣＭ）、表面プラスモン共鳴法（ＳＰＲ法）やエリプソメータを用いる方法が知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。これらの方法では、基板上に固定した標的核酸を定量する。
【０００８】
また、電気化学的手法により、標的核酸がプローブにハイブリダイズする前後の酸化還元電位差を計測して、ＳＮＰｓを測定することが試みられている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００９】
一方、繰り返し塩基配列を検出する方法としては、ゲノム中の繰り返し塩基配列を標識したプローブを用いて検出する方法が知られている（例えば、特許文献４、５参照）。特許文献４では、ハイブリダイズしたＤＮＡプローブの標識シグナルを測定して、テロメアサイズを測定する。また、また、特許文献５では、標的核酸にハイブリダイゼージョンさせた標識プローブに励起光を照射し、標識プローブの蛍光のゆらぎを検出して反復配列長を検出している。
【非特許文献１】ジョン  ディ．エイチ．ステッド（Ｊｏｈｎ  Ｄ．Ｈ．Ｓｔｅａｄ）、他１名、「インスリンミニサテライトアレルの構造的な分析は、アフリカ人と非アフリカ人との間の異常に大きな相違を明らかにする（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｍｉｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅ  Ａｌｌｅｌｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｕｎｕｓｕａｌｌｙ  Ｌａｒｇｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ａｆｒｉｃａｎｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−Ａｆｒｉｃａｎｓ）」、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティックス（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、米国、アメリカン・ソサイティ・オブ・ヒューマン・ジェネティックス（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、２００２年、第７１巻、ｐ．１２７３−１２８４
【非特許文献２】ヒー  イェーン  リー（Ｈｅａ  Ｙｅｏｎ  Ｌｅｅ）、他２名、「電気化学的センシングを用いるノンラベルオリゴヌクレチドのＳＮＰｓ実現性評価（ＳＮＰｓ  Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｎｌａｂｅｌｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅｓ  ｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｅｎｓｉｎｇ）」、エレクトロアナリシス（Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ）、ドイツ、ウィリー−ブイシーエイチ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、２００４年、第１６巻、第２３号、ｐ．１９９９−２００２
【特許文献１】特開平７−７２０６０号公報
【特許文献２】特開２００２−５１７７４号公報
【特許文献３】特開２００２−１８９０２８号公報
【特許文献４】特開２００１−９５５８６号公報
【特許文献５】特開２００５−２３７３３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１〜３、非特許文献２では、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイズした量を測定している。したがって、特許文献１〜３、非特許文献２に記載の方法を直接用いても、繰り返し塩基配列を検出することはできない。
【００１１】
一方、特許文献４、５に記載の発明では、溶液中で標識分子のゆらぎを測定する。すなわち、１つの検体について、一反応系で測定を行うため、多くの検体を同時に測定するのは容易でない。また、現在行われている繰り返し多型の検出法は、繰り返し部位をＰＣＲなどで増幅した後に、サザンハイブリダイゼーションを用いて検出するのが主流である。この方法には、１〜２日の時間が必要であり、迅速な診断を行えないという問題がある。
【００１２】
さらに、従来の検出方法では、多数の遺伝子多型を同時に検査することが容易ではない。特に、ＳＮＰｓと繰り返し多型とは密接な関係がある。したがって、これらを同時に検査診断することは、より正確な遺伝子診断をするために要求される。
【００１３】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、多数の標的核酸中から繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ簡易に検出する方法および検出キットを提供することにある。
【００１４】
また、本発明の別な目的は、ＳＮＰｓと繰り返し多型とを同時に検出する方法および検出キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、プライマーを用いて繰り返し塩基配列を増幅し、この繰り返し塩基配列に相補的に結合する相補的塩基鎖を結合したもの（複合体）を固定化して、複合体量を測定することで、多数の標的核酸中から繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ簡易に検出することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【００１６】
本発明の繰り返し塩基配列の検出方法は、繰り返し塩基配列を有する標的核酸を、プライマーを用いて増幅する第１の工程と、前記増幅した標的核酸の繰り返し塩基配列に相補的な塩基鎖をハイブリダイズさせ、繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を形成する第２の工程と、前記タグ配列と、前記タグ配列に相補的な固定化担体とをハイブリダイズさせ、前記繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を固定化する第３の工程と、前記固定化された繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体からハイブリダイズした相補的塩基鎖量を定量する第４の工程とを含む。
【００１７】
前記プライマーは、タグ配列を有していてもよい。また、前記相補的塩基鎖は、標識体を含み、前記複合体量の測定は、標識体の信号強度を測定して行うと、好ましい。
【００１８】
前記方法においては、繰り返し塩基配列の検出と、一塩基多型の検出とを同時に行うことができる。
【００１９】
前記固定化担体が非天然型核酸であるとよい。
【００２０】
本発明の繰り返し塩基配列の検出キットは、繰り返し塩基配列を有する標的核酸を増幅するためのプライマーと、繰り返し塩基配列に相補的に結合する相補的塩基鎖と、前記タグ配列と相補的な固定化担体とを含む。
【００２１】
前記プライマーは、タグ配列を有していてもよい。前記固定化担体は、基板上に固定されているとよい。また、本発明の検出キットは、さらに、標識体を含むものであると好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明では、繰り返し部位に相補的塩基鎖を結合させたものを固定化して、結合した相補的塩基鎖を定量することにより繰り返し塩基配列の反復数を検出する。この結果、迅速にかつ簡易に検出する方法および検出キットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の繰り返し塩基配列の検出方法は、（１）繰り返し塩基配列を有する標的核酸を、プライマーを用いて増幅し、（２）前記増幅した標的核酸の繰り返し塩基配列に相補的な塩基鎖をハイブリダイズさせ、繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を形成する、（３）前記標的核酸を固定化担体にハイブリダイズさせ、前記繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を固定化する、（４）前記固定化された繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体からハイブリダイズした相補的塩基鎖量を定量する。以下に、具体的に説明する。
【００２４】
［繰り返し塩基配列］
本発明で検出対象となる繰り返し塩基配列は、ゲノム中に存在する、繰り返し単位が数塩基から数十塩基であるＶＮＴＲ、繰り返し単位が２〜４塩基であるマイクロサテライト多型などである。
【００２５】
［プライマー］
前記繰り返し塩基配列を有する標的核酸は、図１に示すように、プライマー１を用いて、ＰＣＲ産物中の標的部位２から、増幅される（塩基伸張部分３）。標的核酸（塩基伸張した核酸４）は、通常は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、増幅する。使用されるプライマー１は、特に制限はなく、検出しようとする繰り返し塩基配列を増幅できるものであれば良い。以下に記載するように、タグ配列５を有するプライマーを用いることもできる。また、タグ配列を有するプライマーをフォワードプライマーとして用い、他のプライマーをリバースプライマーとして用いてもよい。
【００２６】
［相補的塩基鎖］
本発明で用いる相補的塩基鎖とは、標的核酸中の繰り返し塩基配列とハイブリダイズして、二重鎖を形成できる核酸集合体をいう。相補的塩基鎖８は、図２に示すように、標的核酸６中の繰り返し塩基配列７と結合し、繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を形成する。相補的塩基鎖は、繰り返し塩基配列の全部または一部とハイブリダイズするものであればよい。相補的塩基鎖の長さは、特に制限はないが、好ましくは５塩基以上の核酸集合体であればよい。二重鎖の安定性が向上するからである。また、核酸集合体は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの集合体であればよい。
【００２７】
［繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体の固定化］
固定化方法は、特に制限はなく、標的核酸または相補的塩基鎖のいずれかの一部がハイブリダイズする固定化担体を用いて、固定化すればよい。固定化は、例えば増幅した標的核酸の繰り返し塩基配列間の配列または標的核酸の末端の配列を利用して行うことができる。また、繰り返し塩基配列より短い相補的塩基鎖を用いて二重鎖を形成し、二重鎖を形成しなかった部分を用いて、固定化をしてもよい。例えば、図１に示すようなタグ配列を付加したプライマーを用いる。図３に示す例では、標的核酸６の繰り返し塩基配列７に相補的塩基鎖８が結合した、タグ配列を有するプライマーのタグ配列と固定化担体９とがハイブリダイズするものである。また、この図の例では、相補的塩基鎖８に標識体１０が付加されている。
【００２８】
タグ配列を有するプライマーのタグ配列は、固定化担体とハイブリダイズする。タグ配列は、プライマーの一部に含まれていればよい。タグ配列は、事前にプライマーに付加しておいてもよく、標的核酸を増幅した後に付加してもよい。このようにタグ配列を有するプライマーを用いると、増幅した標的核酸を容易に固定化することができる。
【００２９】
固定化担体は、基板やビーズなどの基材に固定化されていればよい。繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を基板上に固定化すると、複数の複合体を選択的に固定化できる。この結果、多検体の処理が可能となるので、好ましい。
【００３０】
固定化担体は、核酸であればよい。核酸であれば、上記標的核酸または相補的塩基鎖のいずれかの一部（タグ配列を含む）と相補的に結合できるからである。固定化担体および上記標的核酸または相補的塩基鎖のいずれかの一部（タグ配列を含む）は、天然型核酸であってもよく、非天然型核酸であってもよい。天然型核酸とは、核酸に含まれる糖がすべてＤ体である核酸をいう。非天然型核酸とは、自然界には存在しない核酸を意味し、核酸に含まれる糖の少なくとも１つがＬ体であるＬ型核酸をいう。非天然型核酸を用いると、選択性の高いハイブリダイゼーションが可能となる。
【００３１】
固定化担体およびこれに相補的に結合する配列（タグ配列を含む）において、天然型のＤ型の糖を有する核酸を用いると、検査したい配列以外の部分がハイブリダイゼーション（クロスハイブリ）を起こす場合がある。このため、ＤＮＡチップなどを用いて解析を行う場合に、固定化されている核酸の配列を決定するのに、細心の注意が必要であった。Ｄ体の糖とＬ体の糖とは、互いに鏡像異性体の関係になる。このため、Ｄ体の糖を有するＤ型核酸とＬ体の糖を有するＬ型核酸とは、たとえ塩基配列の相補性が高い場合でも、ハイブリダイゼーションによる二本鎖を形成しない。したがって、固定化担体およびこれに相補的に結合する配列（タグ配列を含む）にＬ型核酸を用いると、固定化担体に相補的に結合する配列部分以外のゲノム中やＰＣＲにより生成した標的核酸のＤ型部分は、ハイブリダイゼーションしない。一方、Ｌ型核酸である固定化担体およびこれに相補的に結合する配列（タグ配列を含む）とは、ハイブリダイゼーションする。このように、固定化担体およびこれに相補的に結合する配列（タグ配列を含む）にＬ型核酸を用いると、固定化された標的核酸の配列決定が非常に容易になる。
【００３２】
Ｌ型核酸の導入は、例えば、Ｌ型核酸のタグ配列を有するプライマーを用いて、ゲノム中の標的部分を増幅することにより行われる。
【００３３】
固定化担体を基材に担持させる方法としては、特に制限されず、例えば以下に示すような公知の方法を用いることができる。例えば、ナイロンシートなどの上にＤＮＡをスポッターと呼ばれる装置を用いて点着することにより高密度に固定する。あるいは、特開平１−５０５１４４号公報などに記載されているように、オリゴ核酸を、スポッターと呼ばれる装置を用いて、スライドガラスなどの平坦な基板の上に、点着することもできる。また、特開２０００−５０８５４２号公報などに記載されているように、フォトリソグラフ法という半導体製造に用いられる技術を基にして、チップ上でオリゴ核酸を合成してもよい。さらに、特開２００５−２３３７０３号公報などに記載されているように、特定の構造を有するポリマー表面に官能基を生成させ、この官能基を介して、末端アミノ核酸を共有結合により固定化することとしてもよい。
【００３４】
［相補的塩基鎖量の定量］
ハイブリダイズした相補的塩基鎖量は、（１）標識体を導入して、標識体の信号強度を測定する、（２）繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を固体表面に固定して、固定化量を測定する、ことにより、定量することができる。
【００３５】
（標識体を用いる場合）
本発明において、使用できる標識体としては、蛍光色素、りん光色素、放射線同位体など、標識に用いる公知の物質を用いることができる。好ましいのは、測定が簡便で、信号が検出しやすい蛍光色素である。具体的には、シアニン（シアニン２）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン３）、シアニン３．５、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン５）、シアニン５．５、シアニン７などの公知の蛍光色素が挙げられる。蛍光色素の検出は、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナなどを用いる。また、標識体として発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばカドミウムセレン（ＣｄＳｅ）、カドミウムテルル（ＣｄＴｅ）、インジウムガリウムリン（ＩｎＧａＰ）、シルバーインジウム硫化亜鉛（ＡｇＩｎＺｎＳ）などが挙げられる。
【００３６】
標識体は、あらかじめ相補的塩基鎖の一部に結合させておいたものを繰り返し塩基配列と結合させてもよく、繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体形成後に、標識体を導入してもよい。前者の場合には、相補的塩基鎖の末端または鎖中に標識体を結合したものを用いる。繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体形成後に、標識体を導入する方法としては、例えば以下のような方法がある。
【００３７】
（１）繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体の相補的塩基鎖の末端部分に酵素法により標識体を導入する。具体的には、塩基伸張反応、塩基連結反応、核酸の３’末端を選択的に標識するターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ反応などを用いて標識体を導入する。
【００３８】
（２）二重鎖核酸に特異的に相互作用するインターカレータを用いて、二重鎖部分に標識体を導入する。インターカレータとは、化合物中の平面構造部分が二重鎖中の拡散塩基対中に挿入することができる化合物をいう。具体的には、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイド、アントラセン、ピレン、ナフタレン、テトラセン、フルオレン、およびこれらの誘導体などを例示することができる。
【００３９】
（３）繰り返し塩基配列に結合した相補的塩基鎖に反応性官能基を導入して、反応性官能基と標識体とを化学結合させて標識体を導入する。反応性官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、シアノ基、水酸基、スクシンイミド基およびその誘導体、マレイミド基およびその誘導体などが挙げられる。
【００４０】
（４）標識体と選択的に結合する物質を、繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体に導入し、その選択結合性を利用して標識体を結合する。選択的に結合する物質としては、核酸／核酸間、核酸／タンパク質間、低分子化合物／タンパク質間（例えば、ビオチン−アビジン、グルココルチコイド−グルココルチコイドレセプターなど）、糖鎖／糖鎖間、糖鎖／タンパク質間などで選択的に結合する物質が挙げられる。
【００４１】
（固定化量を測定する場合）
固体基板への吸着量は、相補鎖核酸を固体表面に固定化し、固定化量を、ＳＰＲ法、ＱＣＭ法、エリプソメトリー法、赤外分光法、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）法などを用いて測定すればよい。
【００４２】
本発明の検出方法を用いると、標的核酸中から繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ簡易に検出することができる。繰り返し塩基配列としては、繰り返し塩基配列を有するものであれば特に制限されず、例えば、インスリン発現調節に関する繰り返し塩基配列などが検出できる。インスリン遺伝子の近傍に存在するＶＮＴＲ配列には、繰り返し単位：５’−ＡＣＡｇｇｇｇＴｇＴｇｇｇｇ−３’など数種類のものが存在する。この場合に、繰り返し塩基配列に対応して異なる相補的塩基鎖を用い、異なる標識体を用いて相補的塩基鎖を標識して、ＶＮＴＲ配列を検出すれば、同時に異なる種類の繰り返し塩基配列の反復数を検出することができる。本発明を用いれば、標的核酸中に異なる種類の繰り返し塩基配列である繰り返し塩基配列を有する場合にも、繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ簡易に検出することができる。
【００４３】
［ＳＮＰｓの検出］
本発明を用いれば、繰り返し塩基の反復数の検出とＳＮＰｓの測定を１つの基板上で行うことができる。すなわち、本発明を用いれば、少量の検体量で、複数のプライマーを用いて複数の増幅を順次行うことができる。この結果、１つの基板上で、繰り返し塩基配列の検出とＳＮＰｓの測定とを行うことができる。また、繰り返し塩基配列とＳＮＰｓとが近傍に存在する場合には、１種類の標的核酸で繰り返し塩基配列数とＳＮＰｓとを１回の増幅操作で検出することができる。ＳＮＰｓの検出は、例えば、ＳＰＲ法を用いて、上記繰り返し塩基配列中に含まれる１塩基のミスマッチを検出することで、ＳＮＰｓを測定することができる（アレキサンダー  ダブリュ．ペーターソン（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｗ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）、他２名、「表面でのミスマッチまたは部分マッチＤＮＡのハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｎ  ｏｆ  Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ｏｒ  Ｐａｒｔｉａｌｌｙ  Ｍａｔｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ａｔ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ）」、ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティ（Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、米国、アメリカン  ケミカル  ソサイエティ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、２００２年、第１２４巻、ｐ．１４６０１−１４６０７）。あるいは、塩基伸張法により塩基配列を決定して、ＳＮＰｓを測定する（トミ  パスチネン（Ｔｏｍｉ  Ｐａｓｔｉｎｅｎ）、他４名、「ミニシークエンシング：オリゴヌクレオチドアレイ上でのＤＮＡ分析と診断のための特別なツール（Ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ａ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｏｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙｓ）」、ゲノム  リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、米国、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９７年、第７巻、ｐ．６０６−６１４）。
【００４４】
［検出キット］
本発明の繰り返し塩基配列の検出キットは、繰り返し塩基配列を有する標的核酸を増幅するためのプライマーと、繰り返し塩基配列に相補的に結合する相補的塩基鎖と、前記タグ配列と相補的な固定化担体とを含んでいる。前記プライマーは、タグ配列を有していてもよい。また、前記固定化担体が、すでに基板上に固定されている検出キットであってもよい。さらに、本発明の検出キットが標識体を含んでいれば、標識体を用いて複合体量を測定することができる。このような繰り返し塩基配列の検出キットを用いることで、繰り返し塩基配列の反復数を容易に検出することができる。
【実施例】
【００４５】
以下本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４６】
以下の実施例において、Ｌ型核酸を含むＤＮＡの合成は、ＤＮＡ／ＲＮＡ  ＤＮＡ自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。また、Ｌ型核酸として、Beta-L-deoxy Adenosine (n-bz) CED phosphoramidite、Beta-L-deoxy Cytidine
(n-bz) CED phosphoramidite、Beta-L-deoxy Guanosine (n-ibu)
CED phosphoramidite、Beta-L-deoxy Thmidine  CED phosphoramidite（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を、Ｄ型核酸としてdeoxy
Adenosine (n-bz) CED phosphoramidite、deoxy Cytidine (n-bz) CED phosphoramidite、deoxy
Guanosine (n-ibu) CED phosphoramidite、Thymidine CED phosphoramidite（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いた。Ｌ型核酸を含まないＤＮＡの合成は、オペロンバイオテクノロジー株式会社に委託して行った。
【００４７】
（実施例１）
［繰り返し反復数の検出］
（タグ配列を有する繰り返し塩基配列を有する標的核酸モデルおよび相補的塩基鎖の作成）
下記表１に示す標的核酸ＤＮＡ（配列番号１〜４）および相補的塩基鎖の核酸ＤＮＡ（配列番号５）を合成した。
【００４８】
これらの核酸は、Ｄ型核酸である。表中、各配列番号の核酸において、下線部分は繰り返し塩基配列を示し、配列番号５の相補的塩基鎖と塩基対を形成する。配列番号１〜４の標的核酸ＤＮＡは、それぞれ繰り返し塩基配列を１〜４個有している。すなわち、配列番号１〜４の標的核酸ＤＮＡは、インスリン遺伝子の近傍に存在するＶＮＴＲと同じ配列を有する。また、配列番号１〜４の標的核酸ＤＮＡにおいて、四角で囲んだ配列は、タグ配列を示している。配列番号５の核酸ＤＮＡの５’末端は、シアニン３（Ｃｙ３）で標識されている。
【表１】
2008125439.tif 000002
【００４９】
（繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体の形成）
上記配列番号１〜４の標的核酸ＤＮＡ１０ｎｍｏｌをそれぞれ１００μＬの純水に溶解した。これら４種類のＤＮＡ水溶液からそれぞれ２μＬ（０．２ｎｍｏｌ）を採り、混合した。
【００５０】
配列番号５のＤＮＡ９８．２ｎｍｏｌを９８．２μＬの純水に溶解した。この水溶液６μＬ（６ｎｍｏｌ）と、上記混合液とを混合し、５×ＳＳＣ溶液（クエン酸緩衝液）（０．０７５ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム＋０．７５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０×ＳＳＣ（シグマ社製）を４倍に希釈したもの）で希釈して、総液量８０μＬの希釈液を得た。この希釈液を、以下の条件で、サーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名：ＭＹＣＹＣＬＥＲ）により加温冷却を２サイクル行った。この操作により、繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を形成した。
９４℃（１分）→８０℃（１分）→７０℃（１分）→６０℃（１分）→５０℃（１分）→４０℃（１分）→３０℃（１分）→４℃
【００５１】
（ＤＮＡ固定化担体の作成）
ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）基板（コスモグラス押し出し板、厚さ：１ｍｍ、（株）クラレ製）を、温度６５℃の１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に、１２時間浸漬した。このＰＭＭＡ基板を、純水、０．１Ｎの塩酸水溶液、純水の順で洗浄した。
【００５２】
下記表２に示す配列番号６〜１０のＤ型ＤＮＡを合成し、固定化担体とした。配列番号６〜１０のＤ型ＤＮＡは、それぞれ５’末端がアミノ化されている。また、配列番号１０のＤＮＡは、配列番号６のＤＮＡと比べ、下線部分の一塩基が異なっている（一塩基ミスマッチ）。
【表２】
2008125439.tif 000003
【００５３】
配列番号６〜１０のＤＮＡをそれぞれ純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度に溶かして、ストックソリューションとした。これらのＤＮＡ水溶液には、基板に点着する際に固定化ＤＮＡの終濃度が０．０３ｎｍｏｌ／μＬになるように、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を加えた。このＰＢＳとして、ＮａＣｌ：８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ：２．９ｇ、ＫＣｌ：０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４：０．２ｇを純水に溶かし、１Ｌにメスアップしたものに、ｐＨ調整用に塩酸を加え、ｐＨを５．５にしたものを用いた。また、基板表面のカルボン酸と固定化ＤＮＡの末端アミノ酸とを縮合させるために、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加えた。ＥＤＣの終濃度は、５０ｍｇ／ｍＬとした。
【００５４】
配列番号６〜９のＤＮＡをそれぞれ含む上記混合溶液を、アレイヤー（日本レーザー電子（株）製：Ｇｅｎｅ  Ｓｔａｍｐ−ＩＩ）を用いて、上記ＰＭＭＡ基板上面にスポットした。スポット数は、配列番号６〜９のＤＮＡに対してそれぞれ６点ずつの計２４点であった。次に、この基板を、密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で、２０時間程度インキュベートした。その後に、基板を純水で洗浄し、固定化担体が担持された基板を得た。
【００５５】
（ハイブリダイゼーション検体試薬の調整）
繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体と、上記固定化担体とのハイブリダイズは以下のように行った。配列番号１〜４のＤＮＡの四角で囲った部分は、それぞれ配列番号６〜９とハイブリダイズして結合を形成する。また、以下に用いるＳＳＣ溶液は、１５×ＳＳＣ：２０×ＳＳＣ（シグマ社製）を純水にて３／４に希釈したものをそれぞれ意味する。
【００５６】
３０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、１５×ＳＳＣ、０．３重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ（上記各濃度は、いずれも終濃度）を含む水溶液をストック溶液とした。上記繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体（以下、「検体核酸」という）を純水で希釈したものと、このストック溶液を、２：１（体積比）の割合で混合した。検体核酸の純水での希釈は、検体核酸希釈液とストック溶液との混合後に、検体核酸の最終濃度が、３．７５ｎＭになるように調整して行った。
【００５７】
（固定化担体への固定化）
上記固定化担体として核酸が固定化されている基板に、上記ハイブリダイゼーション用検体溶液２０μＬを載せ、カバーグラスで覆った。ハイブリダイゼーション用検体溶液の乾燥を防ぐために、カバーグラスの周囲をペーパーボンドでシールした。４２℃のオーブン中で、この基板を、１６時間インキュベートした。インキュベート後、基板をオーブンから取り出し、カバーグラスを剥離した後に、洗浄・乾燥した。
【００５８】
（複合体量の測定）
上記基板を、ＤＮＡチップ用のスキャナ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）にセットして、信号強度を測定した。測定条件は、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの感度を５００（最大値：１０００）に設定した。ここで、信号強度とは、各スポット内の蛍光強度をノイズで割った値の６個のスポットの平均値をいう。結果を表３に示す。
【表３】
2008125439.tif 000004
【００５９】
表３は、繰り返し塩基配列の反復数が１〜４個（配列番号４〜１にそれぞれ対応する）のものの信号強度を示している。この表から、繰り返し回数が多いほど信号強度が増加していることがわかる。
【００６０】
［一塩基ミスマッチの検出］
次に、表２の配列番号１０の核酸を固定化担体として用いた以外は、上記と同様にして、信号強度を測定した。結果を表３に示す。表３から、固定化担体として用いたＤＮＡが一塩基異なる場合には、蛍光強度が約３０％減少していることがわかる。このことから、本発明を用いれば、一塩基ミスマッチを有する標的核酸を、繰り返し塩基配列の検出と同時に、検出することが可能であることが確認された。すなわち、同一チップ基板上で、ＳＮＰｓと繰り返し塩基配列の反復数の検出が可能であることが示された。
【００６１】
（実施例２）
［非天然型核酸固定化担体］
（Ｌ型核酸固体化担体の作成）
下記表４に示す配列番号１１のＬ型ＤＮＡを固定化核酸として合成した。配列番号６の核酸と配列番号１１の核酸とは、同じ塩基配列であるが、配列番号６の核酸は糖鎖部分がＤ型であり、配列番号１１の核酸は糖鎖部分がＤ型である。配列番号６の核酸と配列番号１１の核酸とを、実施例１の方法と同様にして同一基板上に固定した。
【表４】
2008125439.tif 000005
【００６２】
（検体核酸の調整）
上記Ｌ型核酸と、Ｄ型核酸とを用いて下記表５に示す配列番号１２の標的核酸を作成した。この標的核酸は、タグ配列部分に該当する四角で囲んだ部分のみがＬ型核酸であり、他の部分はＤ型核酸である。この配列番号１２の標的核酸は、配列番号１の標的核酸に対応するものである。
【表５】
2008125439.tif 000006
【００６３】
相補鎖塩基として、配列番号５の核酸を用い、上記配列番号６の核酸と配列番号１１の核酸とが固定された基板を用いた以外は、実施例１と同様にして、複合体量を測定した。結果を表６に示す。なお、表６におけるＤ型核酸のデータは、実施例１の繰り返し塩基配列の繰り返し数が４のものである。
【表６】
2008125439.tif 000007
【００６４】
この表から、固定化担体、タグ配列に、Ｄ型核酸、Ｌ型核酸のいずれを用いた場合でも、同様の信号強度が得られることがわかった。すなわち、Ｄ型核酸、Ｌ型核酸のいずれも同様のハイブリゼーション能力を有することがわかった。したがって、固定化担体に非天然型核酸を用いることができることがわかった。
【００６５】
（実施例３）
［細胞から抽出したサンプル中のＶＮＴＲ配列の検出］
（細胞から抽出したサンプル中のＶＮＴＲ配列を含む領域のＰＣＲによる増幅）
サンプルとして、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞由来）およびＨＬ６０（ヒト前骨髄性白血病細胞由来）を用いた。プライマーとしては、下記表７に示すＤＮＡを合成して用いた。配列番号１３のＤＮＡと１４のＤＮＡにおいて、５’末端側の２０塩基は、核酸タグを有している。この核酸タグは、それぞれ配列番号７、９のＤＮＡと相補的に結合する。以下の増幅反応では、配列番号１３のＤＮＡ（ＨＥＫ２９３）と１４のＤＮＡ（ＨＬ６０）の残りの２０塩基をフォワードプライマーとして、配列番号１５のＤＮＡをリバースプライマーとして用いた。
【表７】
2008125439.tif 000008
【００６６】
配列番号１３のＤＮＡ（ＨＥＫ２９３）と１４のＤＮＡ（ＨＬ６０）の残りの２０塩基をフォワードプライマーとして、配列番号１５のＤＮＡをリバースプライマーとして、核酸抽出キット「ＱＩＡｍｐ」（（株）キアゲン製）で培養細胞（ＨＥＫ２９３およびＨＬ６０）より抽出したヒトゲノムＤＮＡ試料からインスリン遺伝子の約６００塩基対上流に存在するＶＮＴＲ部分をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲにはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績）を用い、メーカー指定の条件で３５サイクルの増幅反応を実施した。その後、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））により精製し、余剰のｄＮＴＰｓを除いた。
【００６７】
ＰＣＲのサンプルは、以下のように調整した。すなわち、３０μＭフォワードプライマー  １μｌ、３０μＭリバースプライマー（配列番号１５）  １μｌ、１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−１０μｌ、２ｍＭｄＮＴＰｓ
１０μｌ、２５ｍＭＭｇＳＯ４  ４μｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２ｕｎｉｔｓ、抽出ＤＮＡ溶液４５０ｎｇを、純粋で１００μｌにメスアップしたものを用いた。
【００６８】
ＰＣＲは、９４℃・２分、９４℃・３０秒／５５℃・３０秒／６８℃・３０秒を３５サイクル行い、反応後は４℃で保存した。
【００６９】
上記ＰＣＲ反応後増幅された部分の長さを電気泳動により評価した。電気泳動の条件は、１．５％アガロースゲルを、２×ＴＡＥ（トリス（２−アミノ−２−（ハイドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール））９．７ｇ、酢酸（氷酢酸）２．３ｍｌ、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）・２Ｎａ  ０．３ｇを１Ｌの純水に溶解した展開液を用いて、１００Ｖで３０分間泳動した。泳動後、エチジウムブロマイドで核酸を染色した。ＨＥＫ２９３由来核酸およびＨＬ６０由来核酸の部分の長さは、それぞれ１３１３および１５５７塩基対であった。これから繰り返し反復数はそれぞれ４０、５０回と見積もることができた。
【００７０】
上記で、増幅したＤＮＡを、上記失し礼と同様に、配列番号５の塩基を相補的塩基鎖として、繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を形成した。
【００７１】
次に、配列番号７と９の核酸を、実施例１と同様に、固体化担体としてＰＭＭＡ基板上に固定した。この固定化担体に、上記得られた繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を固定かした。実施例１と同様にして、繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体の信号強度を測定した。結果を表８に示す。
【表８】
2008125439.tif 000009
【００７２】
この結果から、ＨＥＫ２９３から増幅したＰＣＲ産物を用いた場合に比べ、ＨＬ６０を用いた場合の方がより強いシグナルを示す結果を得た。それらの強度比は１：１．３５となった。ＨＥＫ２９３およびＨＬ６０から採取した標的核酸中の繰り返し反復数はそれぞれ４０および５０回であるため、その繰り返し部分の全長の比は１：１．２５となる。繰り返し反復数が増加するにつれ繰り返し部分の全長は増加することから、細胞から採取した標的核酸を用いた場合でも繰り返し反復数に応じて信号強度が増加していることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、ＰＣＲ産物を用いた標的核酸の調整法を説明するための概念図である。
【図２】図２は、標的核酸中の繰り返し塩基配列に、相補核酸鎖が結合する機構を説明する概念図である。
【図３】図３は、核酸固定化担体を用いた相補核酸鎖を定量する機構を説明する概念図である。
【符号の説明】
【００７４】
１    プライマー
２    ＰＣＲ産物中の標的部位
３    塩基伸長部分
４    塩基伸長した核酸
５    タグ配列
６    標的核酸
７    繰り返し塩基配列
８    繰り返し塩基配列に対して相補的に結合する相補的塩基鎖
９    固定化担体
１０    標識体
【図１】
2008125439.tif 000010
【図２】
2008125439.tif 000011
【図３】
2008125439.tif 000012
【配列表】
2008125439000001.app