(57)【要約】【課題】アミダーゼの保存方法、活性賦活方法及び失活予防方法を提供する。【解決手段】本発明は、亜鉛又はその塩を含むアミダーゼの保存剤、活性賦活剤及び失活予防剤を提供する。亜鉛又はその塩を用いて酵素液を加熱処理すると、効果的にアミダーゼを保存して、活性を賦活するとともに失活を予防する。【選択図】 なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜鉛又はその塩を含む、アミダーゼの保存剤。
【請求項２】
亜鉛又はその塩を含む、アミダーゼの活性賦活剤。
【請求項３】
亜鉛又はその塩を含む、アミダーゼの失活予防剤。
【請求項４】
亜鉛又はその塩を含む、アミダーゼ保存用キット。
【請求項５】
亜鉛又はその塩を含む、アミダーゼ活性賦活用キット。
【請求項６】
亜鉛又はその塩を含む、アミダーゼ失活予防用キット。
【請求項７】
アミダーゼを、亜鉛又はその塩を用いて処理することを特徴とするアミダーゼの保存方法。
【請求項８】
アミダーゼを、亜鉛又はその塩を用いて処理することを特徴とするアミダーゼの活性賦活方法。
【請求項９】
アミダーゼを、亜鉛又はその塩を用いて処理することを特徴とするアミダーゼの失活予防方法。
【請求項１０】
処理に際し加熱することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
処理に際し加熱することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
処理に際し加熱することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、亜鉛又はその塩を含むアミダーゼの保存剤、活性賦活剤、活性保存剤、保存キット、活性賦活キット及び活性保存キット並びにその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性なα−アミノ酸やα−ヒドロキシ酸は各種工業製品等の中間体、食品添加物及び医薬品等として重要である。微生物あるいは微生物由来の酵素をα−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドの加水分解触媒として用いることにより、光学活性なα−アミノ酸やα−ヒドロキシ酸を製造できることが知られている。例えば、光学活性なα−アミノ酸の製造については、特開昭６１−２９３３９４号公報、特開昭６２−５５０９７号公報、光学活性なα−ヒドロキシ酸の製造については、特開平２−８４１９８号公報等に記載されている。近年、アミダーゼ遺伝子が導入された組換え体を用いた反応も報告されてきている（ＷＯ００／６３３５４、特表２００４−５３６６０８、Appl. Environ. Microbiol (2005) 71, 7961-7973）。
【０００３】
このような加水分解反応において、アミダーゼ活性を効率的に発現させるため、培養液中や反応液中に亜鉛塩などの金属塩を添加する試みがなされている。例えば、ＷＯ００／６３３５４においては、Enterobacter Cloacae N-7901株由来のアミダーゼについて、培養液中に亜鉛塩を添加している。
また、Ochrobactrum anthropi NCIMB40321由来のアミダーゼについて、特表２００４−５３６６０８においては反応液中への亜鉛塩の添加効果、培養液中への亜鉛塩の添加効果が示されている。さらに、同菌株ついて、Appl. Environ. Microbiol (2005) 71, 7961-7973においては亜鉛、マグネシウム、マンガンの金属塩の反応液中への添加効果の記載がある。
【０００４】
しかしながら、これらの金属塩の反応液中への添加は、アミダーゼによる加水分解反応時の反応促進効果を目的としたものであり、アミダーゼの保存や活性の向上に関して得られた効果ではない。
【０００５】
【特許文献１】特開昭６１−２９３３９４号公報
【特許文献２】特開昭６２−５５０９７号公報
【特許文献３】特開平２−８４１９８号公報
【特許文献４】国際公開第００／６３３５４号パンフレット
【特許文献５】特表２００４−５３６６０８
【特許文献６】国際公開第００／６３３５４号パンフレット
【非特許文献１】Appl. Environ. Microbiol (2005) 71, 7961-7973
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、アミダーゼの保存方法、活性賦活方法及び失活予防方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、亜鉛又はその塩を用いて酵素液を加熱処理すると、効果的にアミダーゼを保存して、活性を賦活するとともに失活を予防し得ること見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）亜鉛又はその塩を含む、アミダーゼの保存剤。
（２）亜鉛又はその塩を含む、アミダーゼの活性賦活剤。
（３）亜鉛又はその塩を含む、アミダーゼの失活予防剤。
（４）亜鉛又はその塩を含む、アミダーゼ保存用キット。
（５）亜鉛又はその塩を含む、アミダーゼ活性賦活用キット。
（６）亜鉛又はその塩を含む、アミダーゼ失活予防用キット。
（７）アミダーゼを、亜鉛又はその塩を用いて処理することを特徴とするアミダーゼの保存方法。
（８）アミダーゼを、亜鉛又はその塩を用いて処理することを特徴とするアミダーゼの活性賦活方法。
（９）アミダーゼを、亜鉛又はその塩を用いて処理することを特徴とするアミダーゼの失活予防方法。
上記方法においては、処理に際し加熱することが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、亜鉛又はその塩を含むアミダーゼの保存剤、活性賦活剤、活性保存剤、保存キット、活性賦活キット及び活性保存キット並びにその使用方法を提供することができる。本発明の保存剤等は、アミダーゼ活性の低下を抑制して、アミダーゼ酵素液を安定的に保存、使用することができる。従って、本発明の保存剤等は極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、亜鉛又はその塩を含むアミダーゼの保存剤、活性賦活剤、活性保存剤、保存キット、活性賦活キット及び活性保存キット並びにその使用方法である。
アミダーゼ酵素液に亜鉛又はその塩を添加して、亜鉛又はその塩の存在下で熱処理することにより、亜鉛を添加しないで熱処理した場合に比べて活性が数倍向上することが示された。また、加熱処理後に亜鉛塩を添加した場合も活性向上は認められた。本発明は、このような知見に基づいて完成されたものである。
【００１１】
１．アミダーゼの調製
本発明において、アミダーゼは、好熱菌由来、常温菌由来、好冷菌由来及び低温菌由来のいずれのものでもよい。
ここで、「好熱菌」とは、一般には５５℃以上で生育可能な細菌をいう（極限環境微生物ハンドブック、大島泰郎監修、株式会社サイエンスフォーラム）。また、一般に「好冷菌」とは最適生育温度が１５℃以下であって生育限界温度が２０℃前後の菌を、「低温菌」とは最適生育温度が１５℃以下であって生育限界温度が２０℃以上のものをいう。
「常温菌」とは、上記好熱菌、好冷菌及び低温菌の定義に当てはまらないものを言い、従って、最適生育温度が１５〜４５℃であって５５℃以上で生育不可能な細菌を指す。現在単離されている微生物の多くは常温菌であるが、常温菌の例としては、限定されるわけではないが、エンテロバクター（Enterobacter属）に属する細菌、エッシェリヒア（Escherichia）属に属する細菌、クレブシエラ（Krebsiella）属に属する細菌、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属に属する細菌、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する細菌、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属に属する細菌等を挙げることができる。
【００１２】
本発明において、アミダーゼは、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質であって、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質を含む。
【００１３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアミダーゼは、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）由来のアミダーゼであり、配列番号１で示されるアミダーゼ遺伝子の塩基配列によりコードされる。
【００１４】
また、本発明で用いられるアミダーゼには、配列番号２で示されるアミノ酸配列と６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列を含み、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質も含まれる。
【００１５】
さらに、本発明におけるアミダーゼには、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、アミダーゼ活性を有するタンパク質も含まれる。
配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列としては、例えば、(i) 配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iv）上記（i）〜（iii）を組み合わせたアミノ酸配列が挙げられる。
【００１６】
本発明で用いられるアミダーゼは、酸アミド基を加水分解してカルボン酸とアミン又はアンモニアを生ずる反応（ＲＣＯＮＨＲ’＋Ｈ2Ｏ→ＲＣＯＯＨ＋ＮＨ2Ｒ’）を触媒する加水分解酵素であり、好ましくはα−アミノ酸アミド又はα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解する活性を有する酵素である。したがって、本発明において、「アミダーゼ活性」とは、酸アミド基を加水分解してカルボン酸とアミン又はアンモニアとを生ずる反応を触媒する活性、好ましくはα−アミノ酸アミド又はα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解して、Ｌ−α−アミノ酸又はＬ−α−ヒドロキシ酸と、アンモニアとを生ずる反応を触媒する活性を意味する。アミダーゼ活性の測定方法については、後述する。
【００１７】
また、本発明で用いられるアミダーゼは、形質転換体、形質転換体懸濁液、形質転換体破砕物、粗精製アミダーゼ酵素液又はアミダーゼ酵素液を７０℃で１時間処理した後も、処理前の活性と比較して、例えば、７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の活性を保持していることを特徴とする。
【００１８】
本発明のアミダーゼ遺伝子は、本発明で用いられるアミダーゼをコードする遺伝子である。本発明のアミダーゼ遺伝子は、例えば、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１９】
本発明のアミダーゼ遺伝子には、配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。
このような遺伝子の例として、配列番号１で示される塩基配列と６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の相同性（同一性）を有する塩基配列を含み、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２０】
上記遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列からなるDNAの一部をプライマーとして、公知の核酸増幅方法又はプライマーウォーキング法により取得することができる。また、本発明のアミダーゼ遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列からなるDNAの一部をプローブとして、コロニーハイブリダーゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロットなどの公知のハイブリダイゼーション法により取得することもできる。
上記方法には、アミダーゼ遺伝子を含むベクター、mRNA、total RNA、cDNA、ゲノムDNA、又はそれらのライブラリーを用いることができる。また、市販のライブラリーを使用しても良い。
本明細書において、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件として、例えば、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば、「1×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、50℃」等の条件を挙げることができる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法によって行うことができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons（1987-1997））等を参照することができる。
【００２１】
さらに、本発明のアミダーゼ遺伝子には、配列番号１で示される塩基配列において、１又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列を含み、かつ、アミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。
配列番号１で示される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列としては、例えば、(i) 配列番号１で示される塩基配列において、１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が欠失した塩基配列、（ii）配列番号１で示される塩基配列の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、（iii）配列番号１で示される塩基配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が付加した塩基配列、（iv）上記（i）〜（iii）を組み合わせた塩基配列が挙げられる。
【００２２】
配列番号１で示される塩基配列において１又は数個の核酸に欠失、置換又は付加などの変異の生じた塩基配列を含むDNAは、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press (1989))、「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley & Sons (1987-1997))、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
【００２３】
また、DNAに変異を導入するには、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
【００２４】
本発明のアミダーゼ遺伝子の塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463）等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することもできる。
【００２５】
上述のアミダーゼを発現させるための宿主−ベクター系の選択は下記のようにして行われる。
【００２６】
宿主に導入するベクターとしては、上記の酵素遺伝子を保持し、且つ複製可能であれば、特段の制約を受けるものではなく、それぞれの宿主に適したベクターを使用することができる。例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージ等が挙げられる。
プラスミドDNAとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pBluescriptなどのColE系プラスミド等）、放線菌由来のプラスミド（pIJ486等）、酵母由来のプラスミド（YEp13、YEp 24、Ycp50等）が挙げられる。ファージDNAとしては、λファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11等）、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNA等が挙げられる。
【００２７】
宿主としては、上記の酵素遺伝子が発現するものであれば良い。例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌、枯草菌、酵母、カビ、ロドコッカス属細菌、植物等を挙げることができる。好ましくは、大腸菌及びロドコッカス属細菌である。
大腸菌宿主としては、例えば大腸菌Ｋ１２株やＢ株、あるいはそれら野生株由来の派生株であるJM109株、XL1-Blue株、C600株、W3110株等を挙げることができる。その他、これら菌株の変異体、組換え体及び遺伝子工学的手法による誘導体等も用いられ得る。
酵母宿主としては、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等を挙げることができる。
ロドコッカス属細菌としては、例えばロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC 12674株やロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J-1株（FERM BP-1478）等を挙げることができる。
【００２８】
以下、より詳細にアミダーゼ遺伝子が導入された形質転換（導入）体（以下、単に「形質転換体」と称す）の作製方法について説明する。
【００２９】
プラスミドDNAは、宿主細胞中にてプラスミドが増殖するために必要なDNA配列、プロモーター、リボソーム結合配列、転写ターミネーター（転写終結配列）、更に好ましくは形質転換体の選択マーカーとなる遺伝子を含む。
プロモーター配列としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター、ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーター、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）、α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等を挙げることができる。また、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーターのように独自に改変、設計された配列も利用できる。
リボソーム結合配列としては、SD配列やKozak配列が知られており、これらの配列を変異遺伝子の上流に挿入することができる。原核生物を宿主に用いるときにはSD配列を、真核細胞を宿主に用いるときにはKozak配列をPCR法等により付加してもよい。SD配列としては、大腸菌由来、ロドコッカス属細菌又は枯草菌由来の配列等を挙げることができるが、所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。例えば、16SリボゾームRNAの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をDNA合成により作製してこれを利用してもよい。
転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。
選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等を挙げることができる。
【００３０】
大腸菌を宿主に用いた場合には、特に有用なベクターとしては、pTrc99A、pKK233-2、pFY529、pET-12、pET-26b等が例示される。
これらのベクターにアミダーゼをコードする遺伝子断片を組み込むには、アミダーゼ遺伝子を含むDNAを適当な制限酵素で切断し、必要であれば適当なリンカーを付加した後、適当な制限酵素で切断したベクターと結合させることにより行うことができる。
【００３１】
このように作製した発現ベクターを宿主細胞に導入すれば、アミダーゼを高度に発現する形質転換体が得られる。当該形質転換体を培養することにより、これらの酵素を発現させることができる。
【００３２】
発現ベクターの宿主への導入方法としては、DNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。
酵母への発現プラスミドの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００３３】
次に、上記のように作製した形質転換体を培養する方法を説明する。培養に際し使用する培地には特に制限は無く、宿主菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。また培養条件に関しても、形質転換体が生育、増殖可能で且つ酵素産生が良好に行える条件を選択し、培養すればよい。
培養培地に用いる炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、グリセリン等のアルコール類を挙げることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物を挙げることができる。その他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、酵母エキス、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム、硫酸亜鉛等を挙げることができる。その他、ビタミン等を必要に応じて適宜添加してもよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３４】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現プラスミドを導入した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターを有する発現プラスミドを導入した形質転換体を培養するときは、ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現プラスミドを導入した形質転換体を培養するときは、ＩＡＡ等を培地に添加することができる。
【００３５】
大腸菌の培養に際し、通常の固体培養法で培養してもよいが、液体培養法を採用して培養することが好ましい。培地の初発ｐＨは７〜９に調整することが適当である。また、培養は、５℃〜４０℃、好ましくは１０℃〜３７℃で５〜１００時間行う。通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養、流加培養等により実施することが好ましい。
ロドコッカス属細菌の培養は、４〜３６℃、好ましくは２０〜３０℃で１８〜９６時間行う。
【００３６】
（破砕処理方法）
こうして得られた培養物から菌体や細胞を回収するには、遠心分離法や膜ろ過法を用いることができる。回収した形質転換体を、必要に応じて、リン酸−ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等で洗浄し、懸濁することができる。
菌体又は細胞の破砕方法としては、超音波処理、フレンチプレスやホモジナイザーによる高圧処理、ガラスビーズなどによる磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ、ペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。破砕処理は、必要に応じて氷冷下で行う。破砕処理を行ったサンプルを「形質転換体破砕物」、「破砕物」又は「細胞抽出液全画分」とも称する。
破砕後、形質転換体破砕物から、必要に応じて菌体又は細胞の破砕残渣（細胞抽出液不溶性画分を含む）を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが上げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。残渣を除去した後に得られた上清は、「細胞抽出液可溶性画分」であり、「粗精製したアミダーゼ溶液」とすることができる。
【００３７】
２．亜鉛又はその塩によるアミダーゼ液の処理
（１）亜鉛又はその塩とアミダーゼとの接触処理
本発明において、「接触」とは、亜鉛又はその塩とアミダーゼとを共存させること、すなわち亜鉛又はその塩とアミダーゼとを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、アミダーゼ酵素液を含む容器に亜鉛又はその塩を添加すること、亜鉛又はその塩を含む培養液中でアミダーゼ遺伝子を含む菌体（形質転換体）を培養すること、アミダーゼ遺伝子を含む菌体（形質転換体）又はその破砕物を含有する溶液中に亜鉛又はその塩を添加することなどが含まれる。亜鉛塩の濃度は、好ましくは0.01 mM〜30 mM、好ましくは0.1 mM〜15 mMであり、より好ましくは2 mM〜15 mMであり、さらに好ましくは5 mM〜12 mMである。
亜鉛塩としては、特に限定されるものではなく、例えば硫酸亜鉛(ZnSO4)、塩化亜鉛(ZnCl2)、等が挙げられる。
このように、アミダーゼと亜鉛又はその塩とを接触させることにより、アミダーゼの活性を増加（賦活化）させることができる。このことは、アミダーゼの活性低下（失活）を防止することを意味するものであり、これによりアミダーゼを有効に保存することができる。
【００３８】
（２）活性の測定
アミダーゼ活性は、DL−α−アミノ酸アミドやDL−α−ヒドロキシ酸アミドを基質として一定時間反応させた後、生成するα−アミノ酸やα−ヒドロキシ酸を高速液体クロマトグラフィー等により定量し、その定量値を活性の指標として測定することができる。
【００３９】
（３）加熱処理
本発明においては、アミダーゼを亜鉛又はその塩で処理する際に、加熱処理を行なうことにより、高活性アミダーゼを得ることができる。加熱処理とは、アミダーゼと亜鉛又はその塩との混合物を、６０℃〜８０℃、好ましくは６５℃〜７５℃の温度範囲内の環境下に曝すことを意味し、例えば、アミダーゼ溶液に亜鉛塩を添加した後、上記温度条件で５〜３６０分、好ましくは３０〜６０分処理する態様が挙げられる。
アミダーゼを上記亜鉛塩による処理、又は亜鉛塩処理と加熱処理を施すことにより、アミダーゼを２４時間〜３００日、好ましくは１０〜１００日保存することができる。また、アミダーゼ活性は、上記処理を施さないアミダーゼと比較して、１１０〜４００％の活性に上昇させることが可能となる。その結果、アミダーゼの失活予防効果をより高くすることができる。
【００４０】
３．キット
本発明において、亜鉛又はその塩は、アミダーゼの保存用キット、アミダーゼの活性賦活用キット、又はアミダーゼの失活予防用キットとして使用される。
本発明のキットは、上記亜鉛又はその塩に加えて、一般の測定において慣用的な成分、例えば緩衝液、生理食塩水、pH調整剤等を含んでいてもよい。また、本発明のキットは、アミダーゼを保存する方法及び/又は活性の測定方法を記載した取扱説明書等を含んでいてもよい。
【００４１】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
プラスミドpLA301の作製
（１）アミダーゼ遺伝子断片の調製
アミダーゼ遺伝子を含むプラスミドpLA205（WO00/63354号公報参照）を鋳型として、配列番号３に示す合成DNA(LTL-03)及び配列番号４に示す合成DNA(RV)をプライマーとして用い、ポリメラーゼ伸長鎖反応(PCR)により、アミダーゼ遺伝子を含むDNA断片を増幅した。
LTL-03：GAAAGCTTACATAACGCTCCTAATTAAACACGCTGTTGGG（配列番号３）
M13 primer RV：CAGGAAACAGCTATGAC（配列番号４)
【００４３】
PCR用の反応混合物は、5μlの 10×Pfu Turboバッファー、4μlのdNTP mix(2.5mM each)、1μlの Pfu Turbo DNAポリメラーゼ、37μlの蒸留水、１μlの各プライマー、並びに鋳型としてpLA205を１μl添加したものを用いた。PCRは、95℃で1分の変性を行った後、94℃で1分、60℃で1分、72℃で5分の反応を30サイクル行った。反応終了後、１μｌの反応終了液を1.5%アガロースゲル電気泳動により分析し、増幅産物を確認した。増幅産物をGFX  PCR DNA and Gel Band Purification Kit（GEヘルスケア  バイオサイエンス（株））を用いて精製し、約50μlのDNA溶液を得た。43μｌのDNA溶液に、10×Kバッファー（タカラバイオ（株））を5μｌ、制限酵素BamHI及びHindIIIを各１μｌ加え、37℃で2時間反応後、エタノール沈殿によりDNA断片を回収した。反応終了後1.5%アガロースゲル電気泳動を行い、約1.3kbの目的バンドを切り出し、GFX  PCR DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製した。
【００４４】
（２）ベクター断片の調製とライゲーション
一方、5μｌのベクターpUC118（タカラバイオ株式会社）に10×Kバッファー（タカラバイオ（株））を3μｌ、滅菌水を23μｌ、制限酵素BamHI及びHindIIIを各１μｌ加え、37℃で2時間反応後、アルカリフォスファターゼ処理（Shrimp Alkaline Phosphatase、プロメガ株式会社）を行い、エタノール沈殿によりDNA断片を回収した。
BamHIとHindIIIにより切断されたこれらのDNA断片を各2μｌと、solution I（DNA Ligation Kit ver.2（タカラバイオ株式会社））（10μｌ）を混合してライゲーション混合物を作った。該混合物を、16℃で2時間インキュベートすることでアミダーゼ遺伝子断片とベクターpUC118を結合させた。
【００４５】
（３）大腸菌 JM109株のコンピテントセルの作製
大腸菌 JM109株をLB培地(1% バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、0.5% NaCl) 1mlに接種し37℃、5時間好気的に前培養した。得られた前培養液 0.4mlをSOB培地 40ml(2%バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、10mM NaCl 、2.5mM KCl 、1mM MgSO4 、1mM MgCl2 ) に加え、18℃で20時間培養した。当該培養物を遠心分離（3,700×g、10分間、4℃）により集菌した後、冷TF溶液 (20 mM PIPES−KOH (pH 6.0)、200 mM KCl 、10 mM CaCl2 、40mM MnCl2)を13 ml加え、0℃で10分間放置した。その後、再度遠心分離（3,700×g、10分間、4℃）し、上清を除いた。沈殿した大腸菌を冷TF溶液 3.2 mlに懸濁し、0.22 mlのジメチルスルホキシドを加え0℃で10分間放置した。その後、液体窒素下で冷凍した後、-80℃で保存した。
【００４６】
（４）組換えプラスミドの調製
上記（３）で作製したコンピテントセル 200μl を氷上で解凍し、上記（２）で作製したライゲーション産物10μlに加え、0℃で30分放置した。続いて、当該コンピテントセルに42℃で30秒間ヒートショックを与え、0℃で2分間冷却した。その後、SOC 培地 (20 mM グルコース、2%バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、10 mM NaCl 、2.5 mM KCl 、1 mM MgSO4 、1mM MgCl2) 1mlを添加し、37℃にて1時間振盪培養した。培養後の培養液を各200μlずつ、 LB Amp寒天培地（アンピシリン 100mg/L 、1.5％寒天を含有するLB培地）にまき、37℃で一晩培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニー複数個を 1.5mlのLB Amp培地（アンピシリン 100mg/Lを含有するLB培地）にて37℃で一晩培養した。得られた培養液を各々集菌後、Flexi Prep（GEヘルスケア  バイオサイエンス社製）を用いて組換えプラスミドを回収した。得られたプラスミドの塩基配列をCEQ DTCS Quick Start Kitおよび蛍光シーケンサCEQ 2000XL DNA Analysis system（いずれもBECKMAN COULTER、米国）を用いて解析した。目的とするプラスミドをpLA301と命名した。
【実施例２】
【００４７】
大腸菌K-12/pLA301の菌体懸濁液の調製
（１）培養
実施例１と同様にして、大腸菌K-12株(NBRC3308)のコンピテントセルを作製し、プラスミドpLA301による形質転換を行った。得られた形質転換体K-12/pLA301のコロニーを、以下に示す培地（500ml容三角フラスコ中の100ml）で3７℃で12時間前振盪培養（回転数：210rpm）を行った。
前培養培地組成（pH7.2）：ポリペプトンN（20g/L）、酵母エキス（5g/L）、KH2PO4（1.5g/L）、アンピシリン（0.1g/L）。
得られた前培養液20mlを以下に示す本培養培地（3Lジャーファーメンター中の2L）に植菌し、37℃または25℃で20〜52時間本培養を行った。
【００４８】
本培養培地組成
ポリペプトンN             20g/L
酵母エキス                5g/L
KH2PO4                    1.5g/L
MgSO4・7H2O                0.5g/L
MnSO4・5H2O                0.2g/L
ZnSO4・7H2O                0.02g/L
CaCl2・2H2O                0.02g/L
プルロニック L-61         0.5g/L
フルクトース              40g/L
アンピシリン              0.1g/L
回転数は750rpm、空気流量は2L/min、内圧は常圧、pHは6.8-7.2制御（3N NaOHと5N H2SO4使用）で行った。培養の途中、適時サンプリングを行い、菌濃度（OD630）の測定、および菌体懸濁液の調製後、アミダーゼ活性測定を行った。菌体懸濁液の調製は、サンプリングして得られた培養液から遠心分離（５，８００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、１０ｍＭ  リン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁することにより行った。
【００４９】
（２）活性測定
活性測定は下記のようにして行った。40℃で10分間プレインキュベートした0.5mlの菌体懸濁液又は培養液（50mMリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）により適当な濃度に希釈）に、予め40℃で加温していた0.5mlの2%ラセミ体tert-ロイシンアミド（50mM 緩衝液）を加え、40℃にて20分間反応させた後、1Mリン酸溶液を0.2ml添加して反応を停止させた。遠心(15000rpm / 5min）により菌体を除去し上清を取得し、更に0.45μｍのフィルターにより菌体を完全に除去した。こうして得られた反応終了液5μｌを高速液体クロマトグラフィー（分析カラム  Inertsil ODS-3V（４．６ｘ２５０ｍｍ GLサイエンス社製）40℃、キャリヤー：0.1％リン酸水溶液、ＵＶ検出波長＝220nm）にて分析した。光学純度の測定は、上記反応終了液を高速液体クロマトグラフィー（分析カラム  スミキラルOA-5000  住友化学社製、キャリアー：2mM硫酸銅水溶液／メタノール(85:15) 40℃  UV検出波長=254nm）にて分析することにより行った。
【００５０】
（３）菌体懸濁液の調製
培養終了後、約２Ｌの培養液より遠心分離（５，８００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、１０ｍＭ  リン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、菌体を約２００ｍｌの同緩衝液に懸濁した。亜鉛塩（終濃度10mM）を含む菌体懸濁液は、10mlの菌体懸濁液に500mMの塩化亜鉛溶液又は硫酸亜鉛を0.2ml添加した後、撹拌することにより調製した。菌濃度は分光光度計を用いて６３０ｎｍの波長で測定することにより算出した。
【実施例３】
【００５１】
菌体の保存による活性低下及び亜鉛塩による安定化効果
実施例２−（３）で調製した菌体懸濁液（菌濃度１５０ｍｇ乾燥菌体（以下DCと表記）/ml、活性  １．９U/mg DC）５ｍｌを低温下（４〜７℃）で保存し、随時  ５０μｌずつサンプリングしながら、３００倍に希釈後、実施例２−（２）に記載の方法により活性測定を行った。その結果、図２に示されるように、硫酸亜鉛を含まない菌体懸濁液の場合には活性が低下していくのに対し、10mM硫酸亜鉛を含む菌体懸濁液の場合にはむしろ活性が向上する傾向にあることを見出した。反応時には最終的に菌体懸濁液が６００倍に希釈されるため、反応時の硫酸亜鉛濃度は約17μMとなるが、反応時にこの濃度で硫酸亜鉛を添加した場合には、硫酸亜鉛を含まない懸濁液とほぼ同等の活性を示した。
【実施例４】
【００５２】
長期保存により活性低下した菌体の亜鉛塩による活性回復効果
低温下での長期保存により活性が培養直後の半分程度にまで低下した菌体に亜鉛塩を添加することにより活性が回復するかどうかを調べた。菌懸濁液を実施例２−（３）と同様に調製した後（活性２．８U/mg DC、菌濃度１６０ｍｇ／DC）、低温下で約１５ヶ月保存し活性が低下した菌体（活性  １．５U/mg DC）10mlに500mM硫酸亜鉛を0.2ml添加し（終濃度10mM）、更に保存を継続した。実施例３と同様にして活性測定した結果、図３に示されるように、硫酸亜鉛を添加しない場合には活性が低い状態で維持されるのに対し、硫酸亜鉛を添加した場合にはしだいに活性が向上していくことが見出された。
【実施例５】
【００５３】
菌体の加熱処理による活性低下及び亜鉛塩による安定化効果
実施例３及び４に示されるように、低温での保存により活性が次第に低下し、最終的には培養直後の半分程度にまで低下するが、それ以上は低下せずに維持されることが見出された。
次に、実施例２−（３）と同様にして調製した菌体懸濁液６０ｍｌをウオーターバス内で加熱処理（７０℃１時間）し、処理前後の活性を比較した。活性測定は実施例２−（２）に記載の方法により行った。その結果、図４に示されるように、加熱処理によっても活性が半分程度にまで低下しすることが見出され、更に加熱処理を継続してもそれ以上の低下は認められなかった。
加熱処理時に500mM硫酸亜鉛を１．２ｍｌ添加した場合（終濃度約10mM）、活性の低下は認められず、むしろわずかに向上する傾向が見られ、亜鉛塩が加熱処理による失活に対しても防止効果並びに賦活効果があることが明らかとなった。
【実施例６】
【００５４】
保存により部分的に活性低下した菌体の加熱処理及び亜鉛塩による安定化効果
保存により部分的に活性低下した菌体を用いて実施例５と同様の実験を行い、亜鉛塩のみを添加したもの、加熱処理後に亜鉛塩を添加したものについての実験を追加した。実験に供した菌体懸濁液の菌濃度は１６０ｍｇDC／ｍｌ、処理スケールは１ｍｌで行った。結果を図５に示した。部分的に活性が低下した菌体では、加熱処理時に終濃度約10mMの硫酸亜鉛を添加しておくことで、活性が回復した。加熱処理により活性が低下した菌体に後で硫酸亜鉛を添加した場合、活性は加熱処理前のレベルにまで回復したが、培養直後のレベルにまでは回復しなかった。
【実施例７】
【００５５】
長期保存により活性が大きく低下した菌体の加熱処理及び亜鉛塩による安定化効果
２５ヶ月の長期保存により活性が大きく低下した菌体を用いて、実施例６と同様の実験を行った。実験に供した菌濃度は２０ｍｇDC／ｍｌ、処理スケールは１ｍｌで行った。結果を図６に示した。本菌体懸濁液では加熱処理によってもそれ以上の活性低下は認められなかった。本菌体懸濁液及び加熱処理菌体懸濁液では硫酸亜鉛により活性の部分的回復が認められた。加熱処理時に硫酸亜鉛を添加した場合、活性は培養直後のレベル以上に回復した。
【実施例８】
【００５６】
亜鉛塩濃度の影響
本実施例では、亜鉛塩濃度の影響を調べるために、実施例２−（３）と同様にして調製した菌体懸濁液に２〜１０ｍMの硫酸亜鉛を添加し、添加当日、６日後及び２３０日後に活性を測定した。実験に供した菌濃度は１６０ｍｇDC／ｍｌ、処理スケールは１ｍｌで行った。その結果を図７に示す。図７に示す通り、２ｍM以上の硫酸亜鉛濃度で活性賦活効果が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】プラスミドpLA301の作製構築図。
【図２】菌体の保存による活性低下及び亜鉛塩による安定化効果を示す図。
【図３】長期保存により活性低下した菌体の亜鉛塩による活性賦活効果を示す図。
【図４】菌体の加熱処理による活性低下及び亜鉛塩による安定化効果を示す図。
【図５】保存により部分的に活性が低下した菌体の加熱処理及び亜鉛塩添加効果を示す図。
【図６】長期保存により活性低下した菌体の加熱処理及び亜鉛塩添加効果を示す図。
【図７】菌体保存時の亜鉛塩濃度の影響を示す図。
【配列表フリーテキスト】
【００５８】
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
【図１】
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【図２】
2008212027.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2008212027.tif 000007
【図７】
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【配列表】
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