(57)【要約】      （修正有）【課題】膜マイクロドメイン又はコレステロール認識タンパク質を、高感度で、精度良く検出できるプローブを提供する。【解決手段】ビオチン、ベンゾフェノン、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、BODIPY、Alexa Fluor、NBD、Texas Redからなる群れより選ばれる１種で標識化されたアミド化コレステロールを用いて、蛍光による可視化、光反応によるラベル化、ビオチンによるラベル化に伴う精製の簡便化を目的とする膜マイクロドメイン又はコレステロール認識タンパク質検出用分子プローブ。【選択図】図８
2008139299.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2008139299.tif 000066
（式中、Ｒは、ビオチン、ベンゾフェノン、ビオチン化ベンゾフェノン、ローダミン付加ベンゾフェノン、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、BODIPY、Alexa Fluor、NBD、Texas Redからなる群れより選ばれる１種を表す。）
で表されるアミド化コレステロールを用いた膜マイクロドメインおよびコレステロール認識タンパク質検出用分子プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜マイクロドメインまたは膜ラフトおよびコレステロール認識タンパク質とコレステロールと同様の機序により、コレステロールよりも強く相互作用することにより、これらを蛍光による可視化、光反応によるラベル化、ビオチンによるラベル化に伴う精製の簡便化を目的とする膜マイクロドメインおよびコレステロール認識タンパク質検出用高感度分子プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
膜マイクロドメイン（または膜ラフト）は、細胞膜および細胞内膜系に形成される脂質（コレステロールを含む）およびタンパク質分子の相分離した集合体であり、周囲の膜より強くパッキングされた状態であると考えられ、コレステロールおよびスフィンゴ脂質等が周辺の膜よりも高い濃度で含まれていると考えられている。
この膜マイクロドメイン（または膜ラフト）の形成は、細胞によって厳密にコントロールされており、細胞増殖、細胞分化、分子の輸送、免疫反応およびホルモンなどによるシグナル伝達の制御に関係している。また、様々なウイルスの感染の入り口および出口になっていることが示唆されている。
以上の性質を有することから膜マイクロドメイン（または膜ラフト）に関する研究は、極めて重要であるという認識が広く細胞に関する研究者の間に行き届いており、しかし、その取り扱いの難しさから全貌の解明には至っておらず研究が急がれている分野である。
【０００３】
また、コレステロールは、恒常性維持のために極めて重要な働きをしており、コレステロールなしでは動物は生きられない必須の成分である。一方で、個体、臓器、組織、細胞、細胞内器官、それぞれの場においてコレステロールの濃度は厳密にコントロールされており、それぞれの固有の至適濃度より高くても、低くても、細胞や個体に障害を与える。コレステロールの分布、輸送や濃度の維持に働くタンパク質は、現在でも新たに発見され続けており、このようなタンパク質に対応する遺伝子に以上がある場合には重篤な症状を生じるものが多い（動脈硬化からの心筋梗塞および脳梗塞、ニーマンピック症、タンジール病など）。
従って、コレステロールを認識するタンパク質を発見し、この機能を調べる研究は重要である。このようなタンパク質を検出するための分子プローブの開発は、この分野の研究を大きく進展させる主要なファクターの１つである。
【０００４】
膜マイクロドメインまたは膜ラフトを構成する分子およびコレステロール認識タンパク質は、コレステロール（図１）の化学的特徴を認識して相互作用している。これらの場合のコレステロールの特徴とは、疎水性である末端のアルキル鎖、疎水性の平板で剛直な環状構造、および水酸基であると考えられている。疎水性である末端のアルキル鎖とは疎水性相互作用が働き、疎水性の平板で剛直な環状構造とは疎水結合と強い分子間力と環状構造の形状認識（鍵と鍵穴の関係）が働き、水酸基は水素結合における水素供与部として働き強い水素結合を形成する。
このようなコレステロールを分子プローブとして用いる場合には、コレステローブ分子に可視化のための蛍光基、標識化のための反応性基（架橋剤や光反応性基）またはアフィニティ精製のためのビオチン基などを付加してやる必要がある。
現在、モレキュラーブローブズ社（インビトロジェン社）、アバンチポーラーリピッド社によって、このような蛍光プローブが市販されている。代表例が22-NBD-cholesterol（図２）とBODIPY-FL C5 cholesteryl ester（図３）である。しかし、22-NBD-cholesterol の場合には、コレステロール認識タンパク質を高感度で検出することができない。また、BODIPY-FL C5 cholesteryl esterの場合には、水酸基がエステル結合によって水素を失っているために水素結合で形成出来なくなっており（図３および図６）、細胞内への局在も膜マイクロドメインというより、リピッドボディというエステル化されたコレステロールを貯蔵する細胞内器官になっている。従って、相互作用する相手は、コレステロールとはかなり異なることが予測される。
【０００５】
また、近年コレステロールを認識した状態のタンパク質構造がNature誌に発表されたが（非特許文献１）、この論文ではコレステロールの水酸基および環状構造に加えて、疎水性である末端アルキル鎖が相互作用において重要であることが明らかにされた。
一方、アミド化コレステロール関連の分子プローブは、すでに２０００年頃から米国ペンシルバニア州立大学のピーターソン教授らによって合成され、細胞へ導入する実験が行われている（非特許文献２、非特許文献３）。彼らの目的は、抗体が認識することの出来る化合物を細胞膜表面に効率よく埋め込むことのためにその化合物のアンカー（細胞膜にささり込む錨の役割）としてコレステロールを用いている。エンドサイトーシスによって一度細胞内へ取り込まれた化合物が再び細胞膜へ戻って来るシステムを作り出したことを主要な成果として発表している。このとき、アミド化コレステロールは細胞内のゴルジ体へ集積してしまうためにピーターソン教授らの目的には適さないために、アミド化でなく、コレステロールのアミノ基をアルキルアミン化合物に変換して抗体が認識する化合物を結合させた分子の方が機能的に良いと判断している。本来、コレステロールのゴルジ体への集積は、膜マイクロドメインや膜ラフトへの集積性を示すものであるが、この現象に関連してアミド化コレステロールの分子プローブが有効であることに言及しておらず、その有効性に気付いていない。
【０００６】
【非特許文献１】Y.J. Im, S. Raychaudhuri, W.A. Prinz and J.H. Hurley, Nature 2005, 437, 154-158.
【非特許文献２】S.L. Hussey and B.R. Peterson, J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 6265-6273.
【非特許文献３】S. Boonyarattanakalin, S.E. Martin, S.A. Dykstra and B.R. Peterson, , J. Am. Chem. Soc. 2004, 126,16379-16386.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、膜マイクロドメインおよびコレステロール認識タンパク質を、高感度で、精度良く検出できるプローブを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために本発明は、アミド化コレステロールに着目し、これを用いると、膜マイクロドメイン又はコレステロール認識タンパク質が高感度で検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、
一般式（１）
【化２】
2008139299.tif 000003
（式中、Ｒは、ビオチン、ベンゾフェノン、ビオチン化ベンゾフェノン、ローダミン付加ベンゾフェノン、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、BODIPY、Alexa Fluor、NBD、Texas Redからなる群れより選ばれる１種を表す。）
で表されるアミド化コレステロールを用いた膜マイクロドメインおよびコレステロール認識タンパク質検出用分子プローブである。コレステロール骨格３位の置換基であるアミノ基は、天然コレステロールの水酸基と同じベータ位である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のアミド化コレステロールを用いた膜マイクロドメインおよびコレステロール認識タンパク質検出用高感度分子プローブは、高感度で精度良く膜マイクロドメインを認識することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本件発明では、コレステロールの水酸基をアミノ基へ変換し（図４）、このアミノ基に対して蛍光基、光反応性基、ビオチン等を、アミド結合を形成させることで付加することができる（図５）。
アミド結合は、水酸基よりも強い水素結合を形成することがタンパク質の水素結合から理解される。従って、アミド化コレステロールは、コレステロールよりも従来の相手と強く相互作用すると考えられ、高感度な分子プローブとなる。分子プローブを細胞内に導入し相互作用する相手を検出する場合には、細胞内在性のコレステロールと競合することとなるので、この性質は高感度を実現するためには重要な技術である。
また、近年コレステロールを認識した状態のタンパク質構造がNature誌に発表されたが（非特許文献１）、この論文ではコレステロールの疎水性アルキル鎖が相互作用において重要であることが明らかにされた。従来の分子プローブである22-NBD-cholesterolでは、この疎水性アルキル鎖が蛍光基に置換されていることから、このようなタンパク質との相互作用を検出するには非常に問題である。
一方、本件発明では、コレステロールの疎水性アルキル鎖を変化させないので、問題は生じない。このNature誌の論文が指摘するタンパク質と相互作用する際のコレステロールの構造のもう一つはコレステロールの水酸基が水素結合を形成していることであるが、本件発明では、この水素結合がより強くなることから、分子プローブとしての検出により適していることが示唆される。
【実施例１】
【００１１】
本発明について実施例を用いてさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
分子プローブ（分子構造は図２、５および６）とスフィンゴ脂質との相互作用の強さを測定するために、人工脂質膜（リポソーム）を作成し、密度勾配遠心分離によって分子プローブの分布を解析した。その結果、アミド化コレステロールの分子プローブは、エステル化タイプや22-NBD-cholesterolよりもスフィンゴ脂質を含む膜マイクロドメインと強く相互作用することが示された。
その結果を図９（結果１）に示す。
【実施例２】
【００１２】
三口フラスコ（１００ｍＬ）に３β−アミノコレステロール２０．４ｍｇ（０．０５３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン７．１ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）、脱水ＴＨＦ３０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。ジメトキシキノキサリノン酸クロライド１０ｍｇ（０．０３５ｍｍｏｌ）の脱水ＴＨＦ溶液３０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１５０ｍＬに注ぎ、クロロホルム１００ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム１００％）で目的物（分子構造は図５）を精製した。
黄色固体
収率８６％
Ｃ39Ｈ59Ｎ3Ｏ4、Ｍ＝６３３．９１
【実施例３】
【００１３】
分子プローブ（分子構造は図５）を細胞内へ導入した場合の細胞内局在性をその蛍光を使って共焦点顕微鏡にて観察した。比較として、エステル化タイプのコレステロール蛍光分子プローブ（分子構造は図６）22-NBD-cholesterol（分子構造は図２）、および膜マイクロドメインにおいてコレステロールと相互作用する相手だと考えられている脂質の１種であるセラミドの蛍光分子プローブ（構造は図７）を同様に細胞内へ導入して観察を行った。その結果、アミド化コレステロールは、エステル化タイプの脂質よりも22-NBD-cholesterolやセラミドの蛍光分子プローブと同じような局在性を示した。
分子構造図５及び図７について、ＨｅLａ（ヒト上皮系腫瘍培養細胞）を用いた例を図９（結果２−１）、図１０（結果２−２）及び図１１（結果２−３）に示す。
分子構造図２及び図５について、ＨｅLａ（ヒト上皮系腫瘍培養細胞）を用いた例を図１２（結果２−４）、図１３（結果２−５）に示す。
分子構造図６及び図７について、ＨｅLａ（ヒト上皮系腫瘍培養細胞）を用いた例を図１４（結果２−６）、図１５（結果２−７）に示す。
【００１４】
出願人は、さらに一般式（１）で表されるアミド化コレステロールの置換基Ｒが異なる次のような化合物群を用意した。
１．ジメトキシメチルキノキサリノン（ＤＭＥＱ）系プローブ
（１−１）コレステロールアミド−ジメトキシメチルキノキサリノンプローブ
２．ローダミン系プローブ
（２−１）コレステロールアミド−ローダミンプローブ
（２−２）コレステロールアミドスクシン酸ローダミンプローブ
（２−３）コレステロールアミドグリシルグリシンローダミンプローブ
（２−４）コレステロールアミドグリシルグリシンアミドスクシン酸ローダミンプローブ
（２−５）コレステロールアミドセバシン酸ローダミンプローブ
（２−６）コレステロールアミドテトラエチレングリコール酸ローダミンプローブ
（２−７）コレステロールアミドスクシン酸ドデカエチレングリコールスクシン酸ローダミンプローブ
（３−１）コレステロールアミド−ベンゾフェノンローダミンプローブ
（３−２）コレステロールアミド−ベンゾフェノンローダミンプローブ
４．フルオレセイン系プローブ
（４−１）コレステロールアミドスクシン酸フルオレセインプローブ
５．ベンゾフェノン−フルオレセイン系プローブ
（５−１）コレステロールアミドベンゾフェノンフルオレセインプローブ
６．ニトロベンゾジアゾール系プローブ
（６−１）コレステロールアミド−ニトロベンゾジアゾールプローブ
また、アミド化コレステロール系ではない次のような化合物についても用意し、性能比較用の化合物とした。
７．コレステロールエステルローダミン系プローブ
（７−１）コレステロールエステルスクシン酸ローダミンプローブ
８．コレステロールエステルフルオレセイン系プローブ
（８−１）コレステロールエステルスクシン酸フルオレセインプローブ
９．コレステロールアミンニトロベンゾジアゾール系プローブ
（９−１）コレステロールアミノニトロベンゾジアゾールプローブ
これらの化合物について、順次化合物とその合成方法そして代表的なものについてのテスト結果について示す。
【実施例４】
【００１５】
１．ジメトキシメチルキノキサリノン（ＤＭＥＱ）系プローブ
本発明のコレステロール、ジメトキシメチルキノキサリノンからなる蛍光分子プローブは、文献未記載の新規化合物であり、細胞内のコレステロール分子の分布およびその動きを蛍光顕微鏡により可視化するものである。
下記反応式に従って、キノキサリノン誘導体と３β−アミノコレステロールを反応させることによってプローブを合成することができる。
【化３】
2008139299.tif 000004
この反応に使用される溶媒としては、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ベンゼン、クロロホルム、ジクロロメタン、等の溶媒、好ましくはＴＨＦが使用される。触媒としては、トリエチルアミン、ピリジン、ジイソプロピルエチルアミン等の塩基性化合物を用いて行うことができる。好ましくはトリエチルアミンが使用される。アミノコレステロールに対するキノキサリノン誘導体の反応割合は、前者１ミリモルに対して後者を０．２ミリモル以上、好ましくは０．３〜３ミリモルとすればよい。触媒の使用量は、アミノコレステロール１ミリモルに対して０．５ミリモル以上、好ましくは１〜３ミリモル程度とすればよい。反応温度は０〜８０℃程度、好ましくは室温とすればよい。反応時間は２〜２４時間程度とすればよい。
【００１６】
（１−１）コレステロールアミド−ジメトキシメチルキノキサリノンプローブ
【化４】
2008139299.tif 000005
で示されるコレステロールアミド−ジメトキシメチルキノキサリノンは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）に３β−アミノコレステロール２０．４ｍｇ（０．０５３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン７．１ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）、脱水ＴＨＦ３０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。ジメトキシキノキサリノン酸クロライド１０ｍｇ（０．０３５ｍｍｏｌ）の脱水ＴＨＦ溶液３０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１５０ｍＬに注ぎ、クロロホルム１００ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム１００％）で目的物を精製した。
黄色固体
収率８６％
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.68 (3H, s), 0.86 (3H, d, J=2.3 Hz), 0.87 (3H, d, J=2.3 Hz), 0.92 (3H, d, J=6.9 Hz), 0.88〜1.75 (27H, m), 1.76〜2.40 (7H, m), 3.80 (3H, s), 3.96 (3H, s), 3.97〜4.05 (1H, m), 4.07 (3H, s), 5.37〜5.43 (1H, m), 6.71 (1H, s), 7.63 (1H, s)
Ｃ39Ｈ59Ｎ3Ｏ4、Ｍ＝６３３．９１
ローダミン系プローブ
本発明のコレステロール、ジメトキシメチルキノキサリノンからなる蛍光分子プローブは、文献未記載の新規化合物であり、細胞内のコレステロール分子の分布およびその動きを蛍光顕微鏡により可視化するものである。
【実施例５】
【００１７】
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。
（２−１）コレステロールアミド−ローダミンプローブ
（２−１−１）３β−コレステロールプロパルギルアミドの合成
【化５】
2008139299.tif 000006
で示される３β−コレステロールプロパルギルアミドは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）にアミノコレステロール３８６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、プロパルギル酸８４ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）１６２ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）１５５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、脱水ＴＨＦ５０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。ベンゾトリアゾールイルテトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ）４１７ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ溶液２０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１５０ｍＬに注ぎ、クロロホルム１００ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム１００％）で目的物を荒分けした。得られた固体をエタノール１０ｍＬで再結晶し、目的物を精製した。
淡黄色固体
収率４３％
（２−１−２）コレステロールアミド−ローダミンプローブの合成
【化６】
2008139299.tif 000007
三口フラスコ（３００ｍＬ）にコレステロールプロパルギルアミド２６３ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、アジドエチルローダミン２７４ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、脱水ＤＭＦ４０ｍＬ、脱水ＴＨＦ４０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。アスコルビン酸ナトリウム１９８ｍｇ（１ｍｍｏｌ）と硫酸銅五水和物１２５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を加え、さらに室温で３日間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１５０ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：１０）で目的物を精製した。
紫色固体
収率８２％
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.66 (3H, s), 0.8〜2.4 (52H, m), 3.54〜3.69 (8H, m), 3.82〜3.95 (1H, m), 4.50 (2H, t, J=4.8 Hz), 4.70 (2H, t, J=4.8 Hz), 5.32〜5.38 (1H, m), 6.78 (2H, s), 6.91 (2H, d, J=9.2 Hz), 7.03 (2H, d, J=9.2 Hz), 7.23 (1H, d, J=6.4 Hz), 7.32 (1H, d, J=7.4 Hz), 7.70〜7.81 (2H, m), 8.20 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.44 (1H, s)
【実施例６】
【００１８】
（２−２）コレステロールアミドスクシン酸ローダミンプローブ
（２−２−１）プロパルギルスクシン酸エステルの合成
【化７】
2008139299.tif 000008
で示されるプロパルギルスクシン酸エステルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）にプロパルギルアルコール１．１２ｇ（２０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン３．０３ｇ（３０ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ１００ｍＬを入れ、室温で撹拌した。無水スクシン酸３．００ｇ（３０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液５０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。水５０ｍＬを加えてさらに室温で１２時間撹拌した後、反応液を５ｗｔ％塩酸２００ｍＬに注ぎ、クロロホルム３００ｍＬで抽出した。クロロホルムを留去し、得られた固体をヘキサン５０ｍＬで洗浄し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
無色固体
粗収率１００％
（２−２−２）プロパルギルスクシン酸クロライドの合成
【化８】
2008139299.tif 000009
で示されるプロパルギルスクシン酸クロライドは、次のようにして合成した。
ナスフラスコ（３００ｍＬ）にプロパルギルスクシン酸エステル６２４ｍｇ（４ｍｍｏｌ）、オキザリルクロライド２．５４ｇ（２０ｍｍｏｌ）、ベンゼン２００ｍＬを入れ、室温で撹拌した。ＤＭＦ４滴を加え、さらに室温で６時間撹拌した。ベンゼンを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
淡黄色固体
粗収率１００％
（２−２−３）コレステロールアミドスクシン酸プロパルギルエステルの合成
【化９】
2008139299.tif 000010
で示されるコレステロールアミドスクシン酸プロパルギルエステルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）にアミノコレステロール１．１６ｇ（３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン１．５２ｇ（１５ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ１５０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。粗プロパルギルスクシン酸クロライド６９８ｍｇ（４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液５０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１００ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦを留去し、メタノール６０ｍＬで再結晶して目的物を精製した。
無色固体
収率７０％
（２−２−４）コレステロールアミドスクシン酸ローダミンプローブの合成
【化１０】
2008139299.tif 000011
で示されるコレステロールアミドスクシン酸ローダミンプローブは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）に窒素雰囲気下コレステロールアミドスクシン酸プロパルギルエステル３１４ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、アジドエチルローダミン２７４ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、脱水ＤＭＦ４０ｍＬ、脱水ＴＨＦ４０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。アスコルビン酸ナトリウム２３８ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）と硫酸銅五水和物１５０ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下さらに室温で３日間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１５０ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：５〜１０）で目的物を精製した。
紫色固体
収率６９％
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.64 (3H, s), 0.8〜2.3 (52H, m), 2.61〜2.74 (4H, m), 3.54〜3.69 (9H, m), 4.56 (2H, t, J=5.0 Hz), 4.73 (2H, t, J=5.0 Hz), 5.19 (2H, s), 5.23〜5.29 (1H, m), 6.75 (2H, s), 6.89 (2H, d, J=9.2 Hz), 7.06 (2H, d, J=9.2 Hz), 7.23 (1H, d, J=6.4 Hz), 7.52 (1H, d, J=8.3 Hz), 7.71〜7.82 (2H, m), 8.28 (1H, d, J=6.9 Hz), 8.54 (1H, s)
【実施例７】
【００１９】
（２−３）コレステロールアミドグリシルグリシンローダミンプローブ
（２−３−１）Ｂｏｃグリシルグリシンの合成
【化１１】
2008139299.tif 000012
で示されるＢｏｃグリシルグリシンは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍｌ）にグリシルグリシン１３．２ｇ（１００ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム４．０ｇ（１００ｍｍｏｌ）、ジオキサン１００ｍｌ、水１００ｍｌを入れ、０℃で撹拌した。ジ−ｔ−ブチルジカーボネート２４．０ｇ（１１０ｍｍｏｌ）を滴下し、さらに室温で１２時間撹拌した。クエン酸２８．８ｇ（１５０ｍｍｏｌ）を加え、ジオキサンを留去し、酢酸エチル１５０ｍｌで三回抽出した。酢酸エチル溶液を水２００ｍｌで水洗し、無水硫酸ナトリウムを加えて１２時間脱水し、酢酸エチルを留去した。得られた固体を酢酸エチル２００ｍＬで再結晶して目的物を単離した。
白色固体
収率４６％
（２−３−２）コレステロールアミドＢｏｃグリシルグリシンの合成
【化１２】
2008139299.tif 000013
で示されるコレステロールアミドＢｏｃグリシルグリシンは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）にアミノコレステロール３８６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃグリシルグリシン２７９ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）１６２ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）１５５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、脱水ＴＨＦ５０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。ベンゾトリアゾールイルテトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ）４１７ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ溶液２０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１５０ｍＬに注ぎ、クロロホルム１００ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：５）で目的物を精製した。
無色固体
収率８３％
（２−３−３）コレステロールアミドグリシルグリシンの合成
【化１３】
2008139299.tif 000014
で示されるコレステロールアミドグリシルグリシンは、次のようにして合成した。
ナスフラスコ（２００ｍＬ）にコレステロールアミドＢｏｃグリシルグリシン６００ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を入れ、氷冷した。トリフルオロ酢酸１５ｍＬを加え、さらに室温で２時間撹拌した。トリフルオロ酢酸を留去し、クロロホルム１００ｍＬと５ｗｔ％炭酸ナトリウム水溶液１００ｍＬを加え、抽出した。クロロホルムを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
無色固体
粗収率８７％
（２−３−４）コレステロールアミドグリシルグリシンプロパルギルアミドの合成
【化１４】
2008139299.tif 000015
で示されるコレステロールアミドグリシルグリシンプロパルギルアミドは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）にコレステロールアミドグリシルグリシン５００ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、プロパルギル酸８４ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）１６２ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）１５５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、脱水ＴＨＦ５０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。ベンゾトリアゾールイルテトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ）４１７ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ溶液２０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１５０ｍＬに注ぎ、クロロホルム１００ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：５）で目的物を荒分けし、得られた固体をエタノール２０ｍＬで再結晶して目的物を精製した。
無色固体
収率３２％
（２−３−５）コレステロールアミドグリシルグリシンローダミンプローブの合成
【化１５】
2008139299.tif 000016
で示されるコレステロールアミドグリシルグリシンローダミンプローブは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）に窒素雰囲気下コレステロールグリシルグリシンプロパルギルアミド３３１ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、アジドエチルローダミン２７４ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、脱水ＤＭＦ８０ｍＬ、脱水ＴＨＦ４０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。アスコルビン酸ナトリウム２３８ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）と硫酸銅五水和物１５０ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下さらに室温で３日間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１５０ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：１０）で目的物を精製した。
紫色固体
収率６７％
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.65 (3H, s), 0.8〜2.4 (52H, m), 3.54〜3.74 (9H, m), 3.93 (2H, d, J=6.0 Hz), 4.27 (2H, d, J=6.0 Hz), 4.51 (2H, t, J=4.4 Hz), 4.60 (2H, t, J=4.4 Hz), 5.23〜5.29 (1H, m), 6.76 (2H, s), 6.86 (2H, d, J=9.6 Hz), 7.01 (2H, d, J=9.6 Hz), 7.20 (1H, d, J=6.9 Hz), 7.49 (1H, d, J=8.3 Hz), 7.72〜7.85 (2H, m), 8.21 (1H, t, J=6.2 Hz), 8.34 (1H, d, J=7.3 Hz), 8.87 (1H, s), 9.18 (1H, t, J=5.7 Hz)
【実施例８】
【００２０】
（２−４）コレステロールアミドグリシルグリシンアミドスクシン酸ローダミンプローブ
（２−４−１）コレステロールアミドグリシルグリシンアミドスクシン酸プロパルギルエステルの合成
【化１６】
2008139299.tif 000017
で示されるコレステロールアミドグリシルグリシンアミドスクシン酸プロパルギルエステルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）にコレステロールアミドグリシルグリシン５００ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン５０５ｍｇ（５ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ５０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。粗プロパルギルスクシン酸クロライド３４９ｍｇ（２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液２０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１５０ｍＬに注ぎ、クロロホルム１００ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：２〜４）にて荒分けし、ＧＰＣにて目的物を精製した。
無色固体
収率２５％
（２−４−２）コレステロールアミドグリシルグリシンアミドスクシン酸ローダミンプローブの合成
【化１７】
2008139299.tif 000018
で示されるコレステロールアミドグリシルグリシンアミドスクシン酸ローダミンプローブは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）に窒素雰囲気下コレステロールアミドグリシルグリシンアミドスクシン酸プロパルギルエステル３８３ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、アジドエチルローダミン２７４ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、脱水ＤＭＦ４０ｍＬ、脱水ＴＨＦ４０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。アスコルビン酸ナトリウム２３８ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）と硫酸銅五水和物１５０ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下さらに室温で３日間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１５０ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：５〜１０）で目的物を精製した。
紫色固体
収率５３％
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.65 (3H, s), 0.8〜2.4 (52H, m), 2.71〜2.84 (4H, m), 3.54〜3.70 (9H, m), 3.80 (2H, t, J=5.6 Hz), 3.90 (2H, d, J=4.6 Hz), 4.53 (2H, t, J=4.6 Hz), 4.67 (2H, t, J=4.8 Hz), 5.19 (2H, s), 5.21〜5.28 (1H, m), 6.76 (2H, s), 6.87 (2H, d, J=9.6 Hz), 7.07 (2H, d, J=9.2 Hz), 7.21〜7.26 (1H, m), 7.30 (1H, d, J=8.3 Hz), 7.75〜7.88 (3H, m), 8.23〜8.31 (1H, m), 7.34 (1H, s), 9.58 (1H, s)
【実施例９】
【００２１】
（２−５）コレステロールアミドセバシン酸ローダミンプローブ
（２−５−１）プロパルギルセバシン酸エステルの合成
【化１８】
2008139299.tif 000019
で示されるプロパルギルセバシン酸エステルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）にセバシン酸クロライド１．２０ｇ（５ｍｍｏｌ）とＴＨＦ５０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。プロパルギルアルコール２８０ｍｇ（５ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン１．０１ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液２０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液に水３０ｍＬを加え、さらに室温で６時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１５０ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム１００％）で目的物を精製した。
・ジエステル体との分離は困難、この精製条件では１：１の混合物が得られる。
無色固体
収率２１％
（２−５−２）コレステロールアミドセバシン酸プロパルギルエステルの合成
【化１９】
2008139299.tif 000020
で示されるコレステロールアミドセバシン酸プロパルギルエステルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）にアミノコレステロール３８６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、プロパルギルセバシン酸エステル５７２ｍｇ（５０％、１．２ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）１６２ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）１５５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、脱水ＴＨＦ５０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。ベンゾトリアゾールイルテトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ）４１７ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ溶液２０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１５０ｍＬに注ぎ、クロロホルム１００ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦを留去し、ＧＰＣで目的物を荒分けし、エタノール１０ｍＬで再結晶して目的物を精製した。
無色固体
収率５０％
（２−５−３）コレステロールアミドセバシン酸ローダミンプローブの合成
【化２０】
2008139299.tif 000021
で示されるコレステロールアミドセバシン酸ローダミンプローブは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）に窒素雰囲気下コレステロールアミドセバシン酸プロパルギルエステル３６５ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、アジドエチルローダミン２７４ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、脱水ＤＭＦ４０ｍＬ、脱水ＴＨＦ４０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。アスコルビン酸ナトリウム２３８ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）と硫酸銅五水和物１５０ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下さらに室温で３日間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１５０ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：５〜１０）で目的物を精製した。
紫色固体
収率７８％
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.64 (3H, s), 0.8〜2.3 (68H, m), 3.52〜3.74 (9H, m), 4.52 (2H, t, J=5.1 Hz), 4.75 (2H, t, J=5.3 Hz), 5.14 (2H, s), 5.28〜5.33 (1H, m), 6.04 (1H, d, J=5.3 Hz), 6.75 (2H, s), 6.91 (2H, d, J=9.2 Hz), 7.03 (2H, d, J=9.7 Hz), 7.25 (1H, d, J=7.4 Hz), 7.71 (1H, t, J=7.8 Hz), 7.77 (1H, t, J=7.4 Hz), 8.16 (1H, s), 8.21 (1H, d, J=7.8 Hz)
【実施例１０】
【００２２】
（２−６）コレステロールアミドテトラエチレングリコール酸ローダミンプローブ
（２−６−１）ジアゾ酢酸エチルの合成
【化２１】
2008139299.tif 000022
で示されるジアゾ酢酸エチルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１ｌ）に亜硝酸ナトリウム３８．０７ｇ（０．５５ｍｏｌ）、グリシンエチルエステル塩酸塩６８．３９ｇ（０．４９ｍｏｌ）、酢酸ナトリウム１．３６ｇ、水２５０ｍｌを入れ、溶かした後に０℃に冷却する一方で、１０ｗｔ％硫酸水溶液２００ｍｌ、１０ｗｔ％炭酸ナトリウム水溶液５００ｍｌを調製し、同様に０℃に冷却した。冷却したジクロロメタン８０ｍｌと１０ｗｔ％硫酸水溶液３ｍｌを加え、０℃で５分間撹拌した後に分液ロートにてジクロロメタン層を分離し、水溶液は三口フラスコに、ジクロロメタン層は直ちに冷却した炭酸ナトリウム水溶液５０ｍｌで洗浄した後０℃で保存した。再び冷却したジクロロメタン８０ｍｌを加え、１０ｗｔ％硫酸水溶液１５ｍｌを３分かけて滴下し、０℃で３分間撹拌した後に分液ロートにてジクロロメタン層を分離し、水溶液は三口フラスコに、ジクロロメタン層は直ちに冷却した炭酸ナトリウム水溶液５０ｍｌで洗浄した後０℃で保存した。この操作をジクロロメタン層に黄色い着色がなくなるまで繰り返した（７〜８回）。集めたジクロロメタン層をまとめて等量の水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて一晩脱水し、溶液のまま次の反応に用いた。
黄色液体
粗収率８０％
Ｃ4Ｈ7Ｎ2Ｏ2、Ｍ＝１１５．１１
（２−６−２）ジエチレングリコールビスグリコール酸エチルエステルの合成
【化２２】
2008139299.tif 000023
で示されるジエチレングリコールビスグリコール酸エチルエステルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（２Ｌ）にジエチレングリコール１３．９ｇ（１３１ｍｍｏｌ）、粗ジアゾ酢酸４５．１ｇ（３９２ｍｍｏｌ、ジクロロメタン溶液）、ジクロロメタン合計１．２Ｌを入れ、室温で撹拌した。三フッ化ホウ素エチルエーテル錯体エーテル溶液１．５ｍＬを還流が維持できる速度で滴下し、さらに室温で３時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１Ｌに注ぎ、ジクロロメタン層を分離した。ジクロロメタンを留去し、減圧蒸留にて目的物を精製した。
無色液体、ｂ．ｐ．１４５〜１５０℃／０．３ｍｍＨｇ
収率１８％
（２−６−３）ジエチレングリコールビスグリコール酸の合成
【化２３】
2008139299.tif 000024
で示されるジエチレングリコールビスグリコール酸は、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）にジエチレングリコールビスグリコール酸エチルエステル２．７９ｇ（１０ｍｍｏｌ）とエタノール１００ｍＬを入れ、室温で撹拌した。水酸化ナトリウム８．００ｇ（１００ｍｍｏｌ）の水溶液１００ｍＬを加え、１２時間加熱還流した。放冷後反応液に濃塩酸を加えて酸性にした。エタノール、水を留去し、残渣にＴＨＦ１００ｍＬを加えて不溶物を除去した。ＴＨＦを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
淡褐色液体
粗収率１００％
（２−６−４）ジエチレングリコールビスグリコール酸クロライドの合成
【化２４】
2008139299.tif 000025
で示されるジエチレングリコールビスグリコール酸クロライドは、次のようにして合成した。
ナスフラスコ（２００ｍＬ）に粗ジエチレングリコールビスグリコール酸２．２２ｇ（１０ｍｍｏｌ）、オキザリルクロライド１２．７ｇ（１００ｍｍｏｌ）、ベンゼン１５０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。ＤＭＦ４滴を加え、さらに６時間加熱還流した。放冷後ベンゼンを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
褐色液体
粗収率１００％
（２−６−５）ジエチレングリコールビスグリコール酸モノプロパルギルエステルの合成
【化２５】
2008139299.tif 000026
で示されるジエチレングリコールビスグリコール酸モノプロパルギルエステルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）に粗ジエチレングリコールビスグリコール酸クロライド２．５９ｇ（１０ｍｍｏｌ）とＴＨＦ２００ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。プロパルギルアルコール５６１ｍｇ（１０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン３．０３ｇ（３０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液５０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液に水３０ｍＬを加え、さらに室温で６時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１００ｍＬで２回抽出した。クロロホルム、ＴＨＦを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
・粗生成物組成はモノエステルとジエステルの混合物、モル比２：３。
褐色液体
粗収率３０％
（２−６−６）ジエチレングリコールビスグリコール酸プロパルギルエステルクロライドの合成
【化２６】
2008139299.tif 000027
で示されるジエチレングリコールビスグリコール酸プロパルギルエステルクロライドは、次のようにして合成した。
ナスフラスコ（２００ｍＬ）に粗ジエチレングリコールビスグリコール酸モノプロパルギルエステル２６０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、オキザリルクロライド６３５ｍｇ（５ｍｍｏｌ）、ベンゼン５０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。ＤＭＦ３滴を加え、さらに室温で６時間撹拌した。ベンゼンを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
無色液体
粗収率１００％
（２−６−７）コレステロールアミドジエチレングリコールビスグリコール酸プロパルギルエステルの合成
【化２７】
2008139299.tif 000028
で示されるコレステロールアミドジエチレングリコールビスグリコール酸プロパルギルエステルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）にアミノコレステロール１９３ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン３０３ｍｇ（３ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ５０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。粗ジエチレングリコールビスグリコール酸プロパルギルエステルクロライド６９８ｍｇ（４０％、１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液２０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１５０ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＴＨＦを留去し、ＧＰＣにて目的物を荒分けし、シリカゲルカラム（クロロホルム）にて目的物を精製した。
無色固体
収率４５％
（２−６−８）コレステロールアミドジエチレングリコールビスグリコール酸ローダミンプローブの合成
【化２８】
2008139299.tif 000029
で示されるコレステロールアミドジエチレングリコールビスグリコール酸ローダミンプローブは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）に窒素雰囲気下コレステロールアミドジエチレングリコールビスグリコール酸プロパルギルエステル３７７ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、アジドエチルローダミン２７４ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、脱水ＤＭＦ４０ｍＬ、脱水ＴＨＦ４０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。アスコルビン酸ナトリウム２３８ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）と硫酸銅五水和物１５０ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下さらに室温で３日間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１５０ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：５〜１０）で目的物を精製した。
紫色液体
収率１４％
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.66 (3H, s), 0.8〜2.3 (52H, m), 3.56〜3.77 (17H, m), 3.95 (2H, s), 4.15 (2H, s), 4.55 (2H, t, J=4.6 Hz), 4.78 (2H, t, J=5.0 Hz), 5.24 (2H, s), 5.31〜5.37 (1H, m), 6.76 (2H, s), 6.91 (2H, d, J=9.6 Hz), 7.06 (2H, d, J=9.2 Hz), 7.23 (1H, d, J=7.4 Hz), 7.71〜7.80 (2H, m), 8.24 (1H, d, J=7.3 Hz), 8.37 (1H, s)
【実施例１１】
【００２３】
（２−７）コレステロールアミドスクシン酸ドデカエチレングリコールスクシン酸ローダミンプローブ
（２−７−１）ドデカエチレングリコールモノプロパルギルスクシン酸エステルの合成
【化２９】
2008139299.tif 000030
で示されるドデカエチレングリコールモノプロパルギルスクシン酸エステルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）にドデカエチレングリコール１．６４ｇ（３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン１．５２ｇ（１５ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ５０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。粗プロパルギルスクシン酸クロライド５２４ｍｇ（３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液２０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１００ｍＬで二回抽出した。クロロホルム、ＴＨＦを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
・生成物はＮＭＲではモノエステル：ジエステル４：５の混合物。
褐色液体
粗収率４４％
（２−７−２）ドデカエチレングリコールプロパルギルスクシン酸エステルスクシン酸の合成
【化３０】
2008139299.tif 000031
で示されるドデカエチレングリコールプロパルギルスクシン酸エステルスクシン酸は、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）に粗ドデカエチレングリコールモノプロパルギルスクシン酸エステル１．５６ｇ（４４％、１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン５０５ｍｇ（５ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ５０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。無水スクシン酸１．００ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液２０ｍＬを滴下し、さらに室温で１２時間撹拌した。反応液に水２０ｍＬを加え、さらに室温で６時間撹拌した。ＴＨＦ、水を留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：２〜５）にて目的物を精製した。
無色液体
収率４９％
（２−７−３）ドデカエチレングリコールプロパルギルスクシン酸エステルスクシン酸クロライドの合成
【化３１】
2008139299.tif 000032
で示されるドデカエチレングリコールプロパルギルスクシン酸エステルスクシン酸クロライドは、次のようにして合成した。
ナスフラスコ（２００ｍＬ）にドデカエチレングリコールプロパルギルスクシン酸エステルスクシン酸７８５ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、オキザリルクロライド６３５ｍｇ（５ｍｍｏｌ）、ベンゼン１００ｍＬを入れ、室温で撹拌した。ＤＭＦ３滴を加え、さらに室温で６時間撹拌した。ベンゼンを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
無色液体
粗収率１００％
（２−７−４）コレステロールアミドスクシン酸ドデカエチレングリコールスクシン酸プロパルギルエステルの合成
【化３２】
2008139299.tif 000033
で示されるコレステロールアミドスクシン酸ドデカエチレングリコールスクシン酸プロパルギルエステルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）にアミノコレステロール３８６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン５０５ｍｇ（５ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ５０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。粗ドデカエチレングリコールプロパルギルスクシン酸エステルスクシン酸クロライド９６４ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液２０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１００ｍＬで２回抽出した。クロロホルム、ＴＨＦを留去し、ＧＰＣにて荒分けをし、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：０〜２）にて目的物を精製した。
無色固体
収率３３％
（２−７−５）コレステロールアミドスクシン酸ドデカエチレングリコールスクシン酸エステル−トリアゾールローダミンプローブの合成
【化３３】
2008139299.tif 000034
で示されるコレステロールアミドスクシン酸ドデカエチレングリコールスクシン酸エステル−トリアゾールローダミンプローブは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）に窒素雰囲気下コレステロールアミドスクシン酸ドデカエチレングリコールスクシン酸プロパルギルエステル６９２ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、アジドエチルローダミン２７４ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、脱水ＤＭＦ４０ｍＬ、脱水ＴＨＦ４０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。アスコルビン酸ナトリウム２３８ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）と硫酸銅五水和物１５０ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下さらに室温で３日間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１５０ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：５〜１０）で目的物を精製した。
紫色液体
収率６１％
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.66 (3H, s), 0.8〜2.3 (52H, m), 2.45 (2H, t, J=6.9 Hz), 2.61〜2.70 (6H, m), 3.56〜3.70 (53H, m), 4.19〜4.24 (4H, m), 4.53 (2H, t, J=5.0 Hz), 4.75 (2H, t, J=5.0 Hz), 5.19 (2H, s), 5.31〜5.36 (1H, m), 5.94 (1H, d, J=8.2 Hz), 6.77 (2H, s), 6.92 (2H, d, J=9.7 Hz), 7.06 (2H, d, J=9.6 Hz), 7.25 (1H, d, J=7.3 Hz), 7.71〜7.80 (2H, m), 8.16 (1H, s), 8.23 (1H, d, J=7.8 Hz)
【００２４】
３．ベンゾフェノン−ローダミン系プローブ
本発明のコレステロール、ベンゾフェノン、ローダミンからなる光反応性蛍光分子プローブは、文献未記載の新規化合物であり、細胞内のコレステロール分子の分布およびその動きを蛍光顕微鏡により可視化し、かつ光照射によってコレステロールが集積する細胞内部位のタンパク質および脂質等を標識するものである。
（式３−１）
【化３４】
2008139299.tif 000035
で示される化合物は、次のようにして合成した。
（式中Ｒ、Ｒ’はアルキル鎖、ペプチド鎖、オリゴエチレングリコール鎖等のリンカー）で表されるコレステロール、ベンゾフェノン、ローダミンからなる光反応性蛍光分子プローブ。
上記（式３−１）で表される化合物において、Ｒ、Ｒ’はアルキル鎖、ペプチド鎖、オリゴエチレングリコール鎖等のリンカーである。以下、本発明化合物の製造法を説明する。
まず下記反応式に従って、ローダミンＢとエチレングリコールを反応させることによってローダミンＢエチレングリコールエステルを得ることができる。
【化３５】
2008139299.tif 000036
この反応は、触媒として硫酸、リン酸、トルエンスルホン酸等の酸性化合物を用いて行うことができる。好ましくは硫酸が使用される。ローダミンＢに対するエチレングリコールの反応割合は、前者１ミリモルに対して後者を１ｍＬ以上、好ましくは１５〜３５ｍＬ程度とすればよい。触媒の使用量は、ローダミンＢ１ミリモルに対して５ミリモル以上、好ましくは２０〜３０ミリモル程度とすればよい。反応温度は、０〜１２０℃程度、好ましくは９０〜１１０℃とすればよい。反応時間は１〜６時間程度とすればよい。
次に下記反応式に従って、ローダミンＢエチレングリコールエステルとＢｏｃグリシンを反応させることによってローダミンＢエチレングリコールＢｏｃグリシンを得ることができる。
【化３６】
2008139299.tif 000037
この反応は、触媒としてＥＤＣ、ＨＢＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣ等のカルボン酸活性化剤を用いて行うことができる。好ましくはＥＤＣが使用される。さらに助触媒としてＨＯＢｔを用いる。使用される溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル等の有機溶媒、好ましくはジメチルホルムアミドが使用される。ローダミンＢエチレングリコールエステルに対するＢｏｃグリシンの反応割合は、前者１ミリモルに対して後者を０．８ミリモル以上、好ましくは１．１〜１．３ミリモル程度とすればよい。触媒の使用量は、ローダミンＢエチレングリコールエステル１ミリモルに対して０．８ミリモル以上、好ましくは１．１〜１．３ミリモル程度とすればよい。助触媒の使用量は０．８ミリモル以上、好ましくは１．２モル程度とすればよい。反応温度は、０〜６０℃程度、好ましくは０〜４０℃とすればよい。反応時間は６〜３６時間程度とすればよい。
次に下記反応式に従って、ローダミンＢエチレングリコールＢｏｃグリシンとトリフルオロ酢酸を反応させることによってローダミンＢエチレングリコールグリシンを得ることができる。
【化３７】
2008139299.tif 000038
この反応は、トリフルオロ酢酸、硫酸、塩酸等の酸性化合物を用いて行うことができる。好ましくはトリフルオロ酢酸が使用される。ローダミンＢエチレングリコールＢｏｃグリシン１ミリモルに対するトリフルオロ酢酸の反応割合は２ｍＬ以上、好ましくは１５〜２５ｍＬ程度とすればよい。反応温度は、０〜６０℃程度、好ましくは０〜４０℃とすればよい。反応時間は１０分〜３時間程度とすればよい。
次に下記反応式に従って、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノンとブロモ酢酸エチルを反応させることによって、４，４’−ベンゾフェノンビスエステルを得ることができる。
【化３８】
2008139299.tif 000039
この反応は、触媒として水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の塩基性化合物を用いて行うことができる。好ましくは炭酸カリウムが使用される。使用される溶媒としては、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等の有機溶媒、好ましくはアセトニトリルが使用される。４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノンに対するブロモ酢酸エチルの反応割合は、前者１ミリモルに対して後者を２ミリモル以上、好ましくは５〜１５ミリモル程度とすればよい。触媒の使用量は、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン１ミリモルに対して２モル以上、好ましくは９〜１１ミリモル程度とすればよい。反応温度は、０〜１２０℃程度、好ましくは７０〜９０℃とすればよい。反応時間は６〜７２時間程度とすればよい。
次に下記反応式に従って４，４’−ベンゾフェノンビスエステルを、水酸化ナトリウムを用いて加水分解することによって、４，４’−ベンゾフェノンビスカルボン酸を得ることができる。
【化３９】
2008139299.tif 000040
この反応に使用される溶媒としては、水、エタノール、ジオキサン、テトラヒドロフラン等の溶媒、好ましくは水−テトラヒドロフラン混合溶媒が使用される。４，４’−ベンゾフェノンビスエステルに対する水酸化ナトリウムの反応割合は、前者１ミリモルに対して後者を２ミリモル以上、好ましくは３〜５ミリモル程度とすればよい。反応温度は、０〜１２０℃程度、好ましくは７０〜９０℃とすればよい。反応時間は６〜２４時間程度とすればよい。
次に下記反応式に従って４，４’−ベンゾフェノンビスカルボン酸とアミノコレステロールを反応させることによって、ベンゾフェノンコレステロールアミドを得ることができる。
【化４０】
2008139299.tif 000041
この反応は、触媒としてＥＤＣ、ＨＢＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣ等のカルボン酸活性化剤を用いて行うことができる。好ましくはＥＤＣが使用される。さらに助触媒としてＨＯＢｔを用いる。使用される溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル等の有機溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド−テトラヒドロフラン混合溶媒が使用される。４，４’−ベンゾフェノンビスカルボン酸に対するアミノコレステロールの反応割合は、前者１ミリモルに対して後者を０．７〜１．３ミリモル、好ましくは等ミリモル程度とすればよい。触媒の使用量は、４，４’−ベンゾフェノンビスカルボン酸１ミリモルに対して０．８ミリモル以上、好ましくは１．１〜１．３ミリモル程度とすればよい。助触媒の使用量は０．８ミリモル以上、好ましくは１．２モル程度とすればよい。反応温度は、０〜６０℃程度、好ましくは０〜４０℃とすればよい。反応時間は６〜３６時間程度とすればよい。
次に下記反応式に従ってベンゾフェノンコレステロールアミドとローダミンＢエチレングリコールグリシンを反応させることによって、本発明の一般式（１）で表されるコレステロール、ベンゾフェノン、ローダミンからなる光反応性蛍光分子プローブを得ることができる。
【化４１】
2008139299.tif 000042
この反応は、触媒としてＥＤＣ、ＨＢＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣ等のカルボン酸活性化剤を用いて行うことができる。好ましくはＥＤＣが使用される。さらに助触媒としてＨＯＢｔを用いる。使用される溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル等の有機溶媒、好ましくはジメチルホルムアミドが使用される。ベンゾフェノンコレステロールアミドに対するローダミンＢエチレングリコールグリシンの反応割合は、前者１ミリモルに対して後者を０．７〜１．３ミリモル、好ましくは等ミリモル程度とすればよい。触媒の使用量は、４，４’−ベンゾフェノンビスカルボン酸１ミリモルに対して０．８ミリモル以上、好ましくは１．１〜１．３ミリモル程度とすればよい。助触媒の使用量は０．８ミリモル以上、好ましくは１．２モル程度とすればよい。反応温度は、０〜６０℃程度、好ましくは０〜４０℃とすればよい。反応時間は６〜３６時間程度とすればよい。このようにして得られる本発明化合物は、慣用されている分離精製手段に従って反応混合物から容易に単離、精製できる。
本発明のコレステロール、ベンゾフェノン、ローダミンからなる分子プローブは、ラフト部位に分散してラフト部位を可視化し、光照射によってラフト部位のタンパク質や脂質を標識するものであり、ラフト部位における生体機能を探る光反応性分子プローブとして有効に利用できる。
【実施例１２】
【００２５】
（３−１）コレステロールアミド−ベンゾフェノンローダミンプローブ
（３−１−１）ローダミンＢエチレングリコールエステルの合成
【化４２】
2008139299.tif 000043
で示されるローダミンＢエチレングリコールエステルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）にローダミンＢ９５８ｍｇ（２ｍｍｏｌ）とエチレングリコール５０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。濃硫酸４．９ｇ（５０ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で４時間撹拌した。放冷後反応液を５ｗｔ％塩化カルシウム水溶液１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム２００ｍＬで抽出した。クロロホルム層を５ｗｔ％塩化カルシウム水溶液１００ｍＬで洗浄した。クロロホルムを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
紫色固体
粗収率１００％
（３−１−２）ローダミンＢエチレングリコールＢｏｃグリシンの合成
【化４３】
2008139299.tif 000044
で示されるローダミンＢエチレングリコールＢｏｃグリシンは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）にローダミンＢエチレングリコールエステル５２３ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃグリシン２１０ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）１６２ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、脱水ＤＭＦ５０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）２３０ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ溶液２０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩化カルシウム水溶液２００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１００ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１０：１）にて目的物を精製した。
紫色固体
収率６２％
（３−１−３）ローダミンＢエチレングリコールグリシンの合成
【化４４】
2008139299.tif 000045
で示されるローダミンＢエチレングリコールグリシンは、次のようにして合成した。
ナスフラスコ（２００ｍＬ）にローダミンＢエチレングリコールＢｏｃグリシン３４０ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を入れ、氷冷した。トリフルオロ酢酸１０ｍＬを加え、さらに室温で２時間撹拌した。トリフルオロ酢酸を留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
紫色液体
粗収率１００％
（３−１−４）ベンゾフェノンビスエステルの合成
【化４５】
2008139299.tif 000046
で示されるベンゾフェノンビスエステルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）に４，４’−ビスヒドロキシベンゾフェノン２．１４ｇ（１０ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸エチル１６．７ｇ（１００ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム１３．８ｇ（１００ｍｍｏｌ）、アセトニトリル２００ｍＬを入れ、窒素雰囲気下４８時間加熱還流した。放冷後アセトニトリルを留去し、５ｗｔ％塩酸２００ｍＬを加え、クロロホルム１００ｍＬで抽出した。クロロホルムを留去し、ヘキサン（５０ｍＬ）−酢酸エチル（２５ｍＬ）で再結晶を行い、目的物を精製した。
無色固体
収率７８％
（３−１−５）ベンゾフェノンビスカルボン酸の合成
【化４６】
2008139299.tif 000047
で示されるベンゾフェノンビスカルボン酸は、次のようにして合成した。
三口フラスコ（５００ｍＬ）に４，４’−ベンゾフェノンビスエステル３．８６ｇ（１０ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム１．６ｇ（４０ｍｍｏｌ）、水１５０ｍＬ、エタノール３００ｍＬを入れ、１２時間加熱還流した。放冷後反応液を５ｗｔ％塩酸２５０ｍＬに注ぎ、クロロホルム２５０ｍＬで抽出した。クロロホルムを留去し、えられた固体をクロロホルムで洗浄し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
無色固体
収率８５％
（３−１−６）ベンゾフェノンコレステロールアミドの合成
【化４７】
2008139299.tif 000048
で示されるベンゾフェノンコレステロールアミドは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）にベンゾフェノンビスカルボン酸３３０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）とヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）１６２ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ溶液１００ｍＬ、３β−アミノコレステロール３８６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液１００ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）２１１ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ溶液３０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸３００ｍＬに注ぎ、クロロホルム３００ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＴＨＦ、ＤＭＦを留去し、ＧＰＣにて目的物を精製した。
無色固体
収率３２％
（３−１−７）コレステロール、ベンゾフェノン、ローダミンからなる反応性蛍光分子プローブの合成
【化４８】
2008139299.tif 000049
で示されるコレステロール、ベンゾフェノン、ローダミンからなる反応性蛍光分子プローブは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）にローダミンＢエチレングリコールグリシン２９０ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、ベンゾフェノンコレステロールアミド３１４ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）１０８ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）、脱水ＤＭＦ溶液５０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）１１５ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ溶液２０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩化カルシウム水溶液２００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１００ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１０：１）にて目的物を精製した。
紫色固体
収率１７％
1H NMR (CDCl3, 500MHz) δ 0.66 (3H, s), 0.8〜2.4 (52H, m), 3.61 (8H, q, J=7.0 Hz), 3.74〜3.88 (1H, m), 3.92〜3.98 (2H, m), 4.07 (2H, d, J=5.5 Hz), 4.18〜4.24 (2H, m), 4.54 (2H, s), 4.75 (2H, s), 5.34〜5.40 (1H, m), 6.53 (1H, d, J=8.3 Hz), 6.88〜6.96 (4H, m), 6.99 (2H, d, J=8.7 Hz), 7.04〜7.12 (4H, m), 7.25 (1H, d, J=6.9 Hz), 7.72〜7.80 (6H, m), 8.32 (1H, d, J=8.0 Hz), 8.98 (1H, t, J=5.7 Hz)
【実施例１３】
【００２６】
（３−２）コレステロールアミド−ベンゾフェノンローダミンプローブ
（３−２−１）ベンゾフェノンビスエステルの合成
【化４９】
2008139299.tif 000050
で示されるベンゾフェノンビスエステルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）に４，４’−ビスヒドロキシベンゾフェノン２．１４ｇ（１０ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸エチル１６．７ｇ（１００ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム１３．８ｇ（１００ｍｍｏｌ）、アセトニトリル２００ｍＬを入れ、窒素雰囲気下４８時間加熱還流した。放冷後アセトニトリルを留去し、５ｗｔ％塩酸２００ｍＬを加え、クロロホルム１００ｍＬで抽出した。クロロホルムを留去し、ヘキサン（５０ｍＬ）−酢酸エチル（２５ｍＬ）で再結晶を行い、目的物を精製した。
無色固体
収率７８％
（３−２−２）ベンゾフェノンビスカルボン酸の合成
【化５０】
2008139299.tif 000051
で示されるベンゾフェノンビスカルボン酸は、次のようにして合成した。
三口フラスコ（５００ｍＬ）にベンゾフェノンビスエステル３．８６ｇ（１０ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム１．６ｇ（４０ｍｍｏｌ）、水１５０ｍＬ、エタノール３００ｍＬを入れ、１２時間加熱還流した。放冷後反応液を５ｗｔ％塩酸２５０ｍＬに注ぎ、クロロホルム２５０ｍＬで抽出した。クロロホルムを留去し、えられた固体をクロロホルムで洗浄し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
無色固体
収率８５％
（３−２−３）ベンゾフェノンビスカルボン酸クロライドの合成
【化５１】
2008139299.tif 000052
で示されるベンゾフェノンビスカルボン酸クロライドは、次のようにして合成した。
ナスフラスコ（３００ｍＬ）にベンゾフェノンビスカルボン酸１．６５ｇ（５ｍｍｏｌ）、オキザリルクロライド６．３５ｇ（５０ｍｍｏｌ）、ベンゼン２５０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。ＤＭＦ４滴を加え、さらに室温で１２時間撹拌した。ベンゼン、過剰のオキザリルクロライドを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
淡褐色固体
粗収率１００％
（３−２−４）ベンゾフェノンビスカルボン酸モノプロパルギルエステルの合成
【化５２】
2008139299.tif 000053
で示されるベンゾフェノンビスカルボン酸モノプロパルギルエステルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）にプロパルギルアルコール２８０ｍｇ（５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン２．５３ｇ（２５ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ１５０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。粗ベンゾフェノンビスカルボン酸クロライド１．８４ｇ（５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液５０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。酸クロライドを分解するために反応液に水５０ｍＬを加え、さらに室温で６時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸２００ｍＬに注ぎ、クロロホルム２００ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＴＨＦを留去し、得られた残渣にクロロホルム５０ｍＬを注ぎ、不溶であるベンゾフェノンビスカルボン酸を濾別した。クロロホルムを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
・ＮＭＲではモノ−：ジエステルモル比２：３。
淡褐色液体
粗収率４１％
（３−２−５）ベンゾフェノンビスカルボン酸クロライドモノプロパルギルエステルの合成
【化５３】
2008139299.tif 000054
で示されるベンゾフェノンビスカルボン酸クロライドモノプロパルギルエステルは、次のようにして合成した。
ナスフラスコ（２００ｍＬ）に粗ベンゾフェノンビスカルボン酸モノプロパルギルエステル１．８４ｇ（４０％、７３７ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、オキザリルクロライド１．２７ｇ（１０ｍｍｏｌ）、ベンゼン１５０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。ＤＭＦ４滴を加え、さらに室温で１２時間撹拌した。ベンゼン、過剰のオキザリルクロライドを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
淡褐色固体
粗収率１００％
（３−２−６）コレステロールアミドベンゾフェノンビスカルボン酸プロパルギルエステルの合成
【化５４】
2008139299.tif 000055
で示されるコレステロールアミドベンゾフェノンビスカルボン酸プロパルギルエステルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）にアミノコレステロール６４３ｍｇ（１．６７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン８３５ｍｇ（８．２７ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ８０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。粗ベンゾフェノンビスカルボン酸クロライドモノプロパルギルエステル１．９３ｇ（４０％、７７６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液２０ｍＬを滴下し、さらに室温で２４時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１００ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＴＨＦを留去し、ＧＰＣにて目的物を精製した。
無色固体
収率４０％
（３−２−７）コレステロールアミドベンゾフェノンビスカルボン酸ローダミンプローブの合成
【化５５】
2008139299.tif 000056
で示されるコレステロールアミドベンゾフェノンビスカルボン酸ローダミンプローブは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）にコレステロールアミドベンゾフェノンビスカルボン酸プロパルギルエステル４４８ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、アジドエチルローダミン２７４ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、脱水ＤＭＦ４０ｍＬ、脱水ＴＨＦ４０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。アスコルビン酸ナトリウム２３８ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）と硫酸銅五水和物１５０ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を加え、さらに室温で３日間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１５０ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：５〜１０）で目的物を精製した。
紫色固体
収率４８％
1H-NMR (500 MHz, DMSO) δ 0.66 (3H, s), 0.8〜2.4 (61H, m), 3.52〜3.68 (8H, m), 3.74〜3.86 (1H, m), 4.52〜4.58 (4H, m), 4.73 (2H, s), 4.78 (2H, t, J=5.0 Hz), 5.31 (2H, s), 5.33〜5.38 (1H, m), 6.68 (2H, d, J=8.3 Hz), 6.74 (2H, s), 6.88 (2H, d, J=9.6 Hz), 6.93 (2H, d, J=8.7 Hz), 6.99 (2H, d, J=8.7 Hz), 7.04 (2H, d, J=9.6 Hz), 7.22 (1H, d, J=7.8 Hz), 7.67〜7.79 (6H, m), 8.22 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.43 (1H, s)
【実施例１４】
【００２７】
４．フルオレセイン系プローブ
本発明のコレステロール、フルオレセインからなる蛍光分子プローブは、文献未記載の新規化合物であり、細胞内のコレステロール分子の分布およびその動きを蛍光顕微鏡により可視化するものである
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。
（４−１）コレステロールアミドスクシン酸フルオレセインプローブ
（４−１−１）コレステロールアミドスクシン酸フルオレセインプローブの合成
【化５６】
2008139299.tif 000057
で示されるコレステロールアミドスクシン酸フルオレセインプローブは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）に窒素雰囲気下コレステロールエステルスクシン酸プロパルギルエステル３１５ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、アジドエチルフルオレセイン２０１ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、脱水ＤＭＦ４０ｍＬ、脱水ＴＨＦ４０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。アスコルビン酸ナトリウム２３８ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）と硫酸銅五水和物１５０ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下さらに室温で２日間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１５０ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦを留去し、生成した固体をアセトン２０ｍＬで洗浄した。アセトン：クロロホルム＝３０：７．５ｍＬにて得られた固体を再結晶し、目的物を精製した。
黄色固体
収率４７％
1H-NMR (500 MHz, DMSO/D2O) δ 0.62 (3H, s), 0.8〜2.1 (41H, m), 2.30 (2H, t, J=7.5 Hz), 2.46 (2H, t, J=7.5 Hz), 3.29〜3.40 (1H, m), 4.36 (2H, t, J=5.0 Hz), 4.52 (2H, t, J=5.0 Hz), 5.06 (2H, s), 5.20〜5.26 (1H, m), 6.85 (2H, d, J=10.0 Hz), 6.97 (2H, s), 7.04 (2H, d, J=10.0 Hz), 7.46 (1H, d, J=7.0 Hz), 7.82 (1H, t, J=7.5 Hz), 7.89 (1H, t, J=7.5 Hz), 8.05 (1H, s), 8.16 (1H, d, J=7.5 Hz)
【実施例１５】
【００２８】
５．ベンゾフェノン−フルオレセイン系プローブ
本発明のコレステロール、ベンゾフェノン、フルオレセインからなる光反応性蛍光分子プローブは、文献未記載の新規化合物であり、細胞内のコレステロール分子の分布およびその動きを蛍光顕微鏡により可視化し、かつ光照射によってコレステロールが集積する細胞内部位のタンパク質および脂質等を標識するものである。
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。
（５−１）コレステロールアミドベンゾフェノンフルオレセインプローブ
（５−１−１）コレステロールアミドベンゾフェノンビスカルボン酸フルオレセインプローブの合成
【化５７】
2008139299.tif 000058
で示されるコレステロールアミドベンゾフェノンビスカルボン酸フルオレセインプローブは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）にコレステロールアミドベンゾフェノンビスカルボン酸プロパルギルエステル４４８ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、アジドエチルフルオレセイン２０１ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、脱水ＤＭＦ４０ｍＬ、脱水ＴＨＦ４０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。アスコルビン酸ナトリウム２３８ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）と硫酸銅五水和物１５０ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を加え、さらに室温で４８時間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１５０ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦを留去し、アセトン３０ｍＬで再結晶して目的物を精製した。母液はさらにアセトン１０ｍＬで再結晶を行い、目的物を得た。
黄色固体
収率２４％
1H-NMR (500 MHz, DMSO) δ 0.64 (3H, s), 0.8〜2.3 (52H, m), 4.39 (2H, t, J=5.0 Hz), 4.51〜4.59 (4H, m), 4.93 (2H, s), 5.24 (2H, s), 5.27〜5.32 (1H, m), 6.77 (2H, d, J=8.7 Hz), 6.86 (2H, s), 6.96 (2H, d, J=9.2 Hz), 7.05 (2H, d, J=8.7 Hz), 7.08 (2H, d, J=8.7 Hz), 7.47 (1H, d, J=6.9 Hz), 7.66 (2H, d, J=9.2 Hz), 7.70 (2H, d, J=9.2 Hz), 7.80 (1H, t, J=7.1 Hz), 7.88 (1H, t, J=6.9 Hz), 8. 06 (1H, d, J=8.3 Hz), 8.13 (1H, d, J=8.3 Hz), 8.14 (1H, s)
【実施例１６】
【００２９】
６．ニトロベンゾジアゾール系プローブ
本発明のコレステロール、ニトロベンゾジアゾールからなる蛍光分子プローブは、文献未記載の新規化合物であり、細胞内のコレステロール分子の分布およびその動きを蛍光顕微鏡により可視化するものである
下記反応式に従って、ニトロベンゾジアゾール（ＮＢＤ）誘導体と３β−アミノコレステロールを反応させることによってニトロベンゾジアゾール（ＮＢＤ）系アミドプローブを合成することができる。
この反応に使用される溶媒としては、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、クロロホルム、等の溶媒が使用される。触媒としては、ジイソプロピルエチルアミン等の塩基性化合物およびＥＤＣ、ＨＢＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣ等のカルボン酸活性化剤を用いて行うことができる。好ましくはジイソプロピルエチルアミンとＨＢＴＵが使用される。さらに助触媒としてＨＯＢｔを用いる。アミノコレステロールに対するＮＢＤ誘導体の反応割合は、前者１ミリモルに対して後者を０．１ミリモル以上、好ましくは１．２〜２ミリモルとすればよい。触媒の使用量は、アミノコレステロール１ミリモルに対して０．５ミリモル以上、好ましくは２〜３ミリモル程度とすればよい。反応温度は０〜７０℃程度、好ましくは室温とすればよい。反応時間は２〜２４時間程度とすればよい。
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。
（６−１）コレステロールアミド−ニトロベンゾジアゾールプローブ
（６−１−１）ニトロベンゾジアゾール−βアラニンtブチルエステルの合成
【化５８】
2008139299.tif 000059
で示されるニトロベンゾジアゾール−βアラニンtブチルエステルは、次のようにして合成した。
ナス型フラスコ（２５ｍＬ）にβアラニンtブチルエステル塩酸塩２２ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）、フルオロニトロベンゾジアゾール１８ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）３９ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）、アセトニトリル１０ｍＬを入れ、７０℃で１時間撹拌した。反応液を飽和クエン酸水溶液４００ｍＬに注ぎ、ジエチルエーテル４００ｍＬで抽出した。ジエチルエーテル、アセトニトリルを留去し、シリカゲルカラム（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で目的物を精製した。
橙色固体
収率９９％
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.48 (9H, s), 2.72 (2H, t, J=6.2 Hz), 3.78 (2H, t, J=6.2 Hz), 6.23 (1H, d, J=8.7 Hz), 6.81 (1H, broad s), 8.50 (1H, d, J=8.7 Hz)
（６−１−２）ニトロベンゾジアゾール−βアラニンの合成
【化５９】
2008139299.tif 000060
で示されるニトロベンゾジアゾール−βアラニンは、次のようにして合成した。
ナス型フラスコ（２５ｍＬ）にニトロベンゾジアゾール−βアラニンtブチルエステル２６ｍｇ（０．０８４ｍｍｏｌ）、４規定塩酸ジオキサン溶液１０ｍＬを入れ、室温で１５時間撹拌した。反応液にトルエンを加え、共沸による塩酸およびジオキサンの除去を５回繰り返し目的物を精製した。
橙色固体
収率９９％
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 2.76 (2H, t, J=6.7 Hz), 3.76 (2H, t, J=6.7 Hz), 6.36 (1H, d, J=8.7 Hz), 7.37 (1H, broad s), 8.50 (1H, d, J=8.7 Hz)
（６−１−３）コレステロールアミド−ニトロベンゾジアゾールプローブの合成
【化６０】
2008139299.tif 000061
で示されるコレステロールアミド−ニトロベンゾジアゾールプローブは、次のようにして合成した。
ナス型フラスコ（２５ｍＬ）にニトロベンゾジアゾール−βアラニン１８ｍｇ（０．０７０ｍｍｏｌ）、３β−アミノコレステロール２６ｍｇ（０．０６８ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）１３ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾールイルテトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ）３８ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）１水和水２３ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）、クロロホルム１ｍＬ、ＤＭＦ１０ｍＬを加え、室温で２時間撹拌した。反応液を飽和クエン酸水溶液２００ｍＬに注ぎ、クロロホルム２００ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝２０：１）で目的物を精製した。
橙色固体
収率９２％
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.67 (3H, s), 0.86 (3H, d, J=2.3 Hz), 0.87 (3H, d, J=2.3 Hz), 0.91 (3H, d, J=6.4 Hz), 0.88〜1.70 (27H, m), 1.75〜2.40 (7H, m), 2.62 (2H, t, J=6.0 Hz), 3.69〜3.76 (1H, m), 3.84 (2H, t, J=6.0 Hz), 5.33〜5.39 (1H, m), 5.48 (1H, d, J=8.2 Hz), 6.20 (1H, d, J=8.7 Hz), 7.36 (1H, broad s), 8.48 (1H, d, J=8.7 Hz) ), FAB MAS calcd: 620.4(M+H+), Found: 620.
【００３０】
以下の化合物（７〜９）は、上記アミド化コレステロール（１〜６）の性能を比較評価するために合成したアミド化ではないコレステロールからなる蛍光分子プローブである。
（参考例１）
７．コレステロールエステルローダミン系プローブ
本発明のエステル化コレステロール、ローダミンからなる蛍光分子プローブは、文献未記載の新規化合物であり、エステル化された貯蔵型コレステロール分子の分布およびその動きを蛍光顕微鏡により可視化するものである。
以下、参考例を挙げる。
（７−１）コレステロールエステルスクシン酸ローダミンプローブ
（７−１−１）コレステロールエステルスクシン酸プロパルギルエステルの合成
【化６１】
2008139299.tif 000062
で示されるコレステロールエステルスクシン酸プロパルギルエステルは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（１００ｍＬ）にコレステロール７７４ｍｇ（２ｍｍｏｌ）とトルエン６０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。粗プロパルギルスクシン酸クロライド３４９ｍｇ（２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液２０ｍＬを加え、２４時間加熱還流した。放冷後トルエン、ＴＨＦを留去し、メタノール３０ｍＬで再結晶して目的物を精製した。
無色固体
収率５７％
（７−１−２）コレステロールエステルスクシン酸ローダミンプローブの合成
【化６２】
2008139299.tif 000063
で示されるコレステロールエステルスクシン酸ローダミンプローブは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）に窒素雰囲気下コレステロールエステルスクシン酸プロパルギルエステル３１５ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、アジドエチルローダミン２７４ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、脱水ＤＭＦ４０ｍＬ、脱水ＴＨＦ４０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。アスコルビン酸ナトリウム２３８ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）と硫酸銅五水和物１５０ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下さらに室温で３日間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１５０ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：５〜１０）で目的物を精製した。
紫色固体
収率４７％
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.66 (3H, s), 0.8〜2.1 (50H, m), 2.25〜2.33 (2H, m), 2.54〜2.66 (4H, m), 3.55〜3.71 (8H, m), 4.53 (2H, t, J=5.0 Hz), 4.52〜4.63 (1H, m), 4.76 (2H, t, J=5.0 Hz), 5.18 (2H, s), 5.31〜5.37 (1H, m), 6.76 (2H, s), 6.92 (2H, d, J=10.0 Hz), 7.05 (2H, d, J=9.6 Hz), 7.25 (1H, d, J=7.3 Hz), 7.70〜7.79 (2H, m), 8.17 (1H, s), 8.23 (1H, d, J=7.8 Hz)
【００３１】
（参考例２）
８．コレステロールエステルフルオレセイン系プローブ
本発明のエステル化コレステロール、フルオレセインからなる蛍光分子プローブは、文献未記載の新規化合物であり、エステル化された貯蔵型コレステロール分子の分布およびその動きを蛍光顕微鏡により可視化するものである。
以下、参考例を挙げる。
（８−１）コレステロールエステルスクシン酸フルオレセインプローブ
（８−１−１）コレステロールエステルスクシン酸フルオレセインプローブの合成
【化６３】
2008139299.tif 000064
で示されるコレステロールエステルスクシン酸フルオレセインプローブは、次のようにして合成した。
三口フラスコ（３００ｍＬ）に窒素雰囲気下コレステロールエステルスクシン酸プロパルギルエステル３１５ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、アジドエチルフルオレセイン２０１ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、脱水ＤＭＦ４０ｍＬ、脱水ＴＨＦ４０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。アスコルビン酸ナトリウム２３８ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）と硫酸銅五水和物１５０ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下さらに室温で２日間撹拌した。反応液を５ｗｔ％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１５０ｍＬで抽出した。クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦを留去し、アセトン２５ｍＬで再結晶して目的物を精製した。
黄色固体
収率３６％
1H-NMR (500 MHz, DMSO) δ 0.64 (3H, s), 0.8〜2.0 (39H, m), 2.20 (2H, m), 2.48〜2.56 (4H, m), 4.38 (2H, t, J=10.0 Hz), 4.34〜4.46 (1H, m), 4.54 (2H, t, J=10.0 Hz), 5.09 (2H, s), 5.29〜5.35 (1H, m), 6.82 (2H, d, J=10.0 Hz), 6.93 (2H, s), 7.01 (2H, d, J=10.0 Hz), 7.49 (1H, d, J=10.0 Hz), 7.82 (1H, t, J=7.5 Hz), 7.90 (1H, t, J=7.5 Hz), 8.10 (1H, s), 8.16 (1H, d, J=7.5 Hz)
【００３２】
（参考例３）
９．コレステロールアミンニトロベンゾジアゾール系プローブ
本発明のアミン系コレステロール、ニトロベンゾジアゾールからなる蛍光分子プローブは、文献未記載の新規化合物であり、エステル化された貯蔵型コレステロール分子の分布およびその動きを蛍光顕微鏡により可視化するものである。
下記反応式に従って、ニトロベンゾジアゾール（ＮＢＤ）フルオロ誘導体と３β−アミノコレステロールを反応させることによってニトロベンゾジアゾール（ＮＢＤ）系アミノプローブを合成することができる。
この反応に使用される溶媒としては、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、クロロホルム等の溶媒、好ましくはアセトニトリルが使用される。触媒としては、トリエチルアミン、ピリジン、ジイソプロピルエチルアミン等の塩基性化合物を用いて行うことができる。好ましくはジイソプロピルエチルアミン使用される。アミノコレステロールに対するニトロベンゾジアゾール（ＮＢＤ）フルオロ誘導体の反応割合は、前者１ミリモルに対して後者を０．２ミリモル以上、好ましくは０．３〜０．５ミリモルとすればよい。触媒の使用量は、アミノコレステロール１ミリモルに対して０．５ミリモル以上、好ましくは１〜３ミリモル程度とすればよい。反応温度は２５〜８０℃程度、好ましくは７０℃とすればよい。反応時間は０．５〜２時間程度とすればよい。
以下、参考例を挙げる。
（９−１）コレステロールアミノニトロベンゾジアゾールプローブ
（９−１−１）コレステロールアミノニトロベンゾジアゾールプローブの合成
【化６４】
2008139299.tif 000065
で示されるコレステロールアミノニトロベンゾジアゾールプローブは、次のようにして合成した。
ナス型フラスコ（２５ｍＬ）にフルオロニトロベンゾジアゾール１５ｍｇ（０．０８２ｍｍｏｌ）、３β−アミノコレステロール３０ｍｇ（０．０７８ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）２０ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）、アセトニトリル１ｍＬ、クロロホルム１ｍＬ、ＤＭＦ５ｍＬを入れ、７０℃で０．５時間撹拌した。反応液を飽和クエン酸水溶液２００ｍＬに注ぎ、クロロホルム２００ｍＬで抽出した。アセトニトリル、クロロホルム、ＤＭＦを留去し、シリカゲルカラム（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）で目的物を精製した。
橙色固体
収率７０％
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.70 (3H, s), 0.86 (3H, d, J=2.3 Hz), 0.88 (3H, d, J=2.3 Hz), 0.93 (3H, d, J=6.4 Hz), 0.88〜1.75 (27H, m), 1.79〜1.92 (1H, m), 1.95〜2.40 (6H, m), 3.54〜3.68 (1H, m), 5.44〜5.51 (1H, m), 6.17 (1H, d, J=7.3 Hz), 6.19 (1H, d, J=8.7 Hz), 8.49 (1H, d, J=8.7 Hz), FAB MAS calcd: 549.4(M+H+), Found: 549.
【００３３】
細胞内におけるコレステロールは細胞内器官である細胞膜、輸送小胞（エンドソーム、リソゾーム）、ゴルジ体、小胞体に分布し、かつ各小器官を細胞の状態に応じて行き来している。特に細胞膜およびゴルジ体に多く存在し、小胞体には比較的少ない。また、過剰なコレステロールはエステル化され貯蔵型コレステロール（エステル化コレステロール）として、細胞内の脂肪顆粒に蓄積される。このようなエステル化コレステロールと区別する意味で、コレステロールは遊離コレステロールと呼ばれることもある。このような細胞内における遊離コレステロールの分布および動きは厳密に制御されており、この分布および動きの乱れは様々な疾患を引き起こすことが知られている（ニーマンピック病C型、タンジール病、動脈硬化症、様々な神経性疾患、等々）。細胞内のコレステロールの分布および動きを顕微鏡などで観察することは、細胞機能および疾患発症機構の解明および薬剤の探索に利用されることが期待されている。
しかし、これまでに学術論文にて報告および市販されてきたコレステロールを原料にした蛍光分子プローブのうち、細胞を生きたまま観察しながらコレステロールの分布を観察するために合成されたもの（図２および図３など）は、脂肪顆粒におもに分布し、細胞膜における分布は観察されず（図１６および図１７）、ゴルジ体における分布も非常にわずかである。
【実施例１７】
【００３４】
アミド化コレステロールの性状：
本発明のアミド化コレステロール（実施例４〜１６参照）は、細胞膜によく分布し（図１８）、またゴルジ体および輸送小胞へも分布している（図１９）ことが蛍光顕微鏡観察により確認された。特に、細胞どうしが接触している箇所の細胞膜において強いシグナルが観察される。一方で、脂肪顆粒における分布はほとんど観察されなかったことから、細胞内における遊離コレステロールの分布および動きをよく反映していると結論づけられる。その一方で、比較のために合成したエステル化コレステロール（参考例１〜２参照）およびアミノ基コレステロール（参考例３参照）からなる蛍光分子プロールは、いづれも細胞膜には分布せず、脂肪顆粒に多く分布することが蛍光顕微鏡により確認された（図２０）。従って、本特許申請で発明したアミド化コレステロールのアミド結合は、当該蛍光分子プロールの遊離コレステロールの分布および動きをよく反映するために必要であることが結論づけられた。
本特許申請で発明したアミド化コレステロール（実施例４〜１６参照）は、遊離コレステロールが集積する膜領域（膜マイクロドメイン）を可視化し、コレステロール認識タンパク質検出用高感度分子プローブとして利用できる。
【００３５】
以上の結果から、本発明のアミド化コレステロール分子プローブは、膜マイクロドメインおよびコレステロール認識タンパク質の検出のためのより高感度な分子プローブの目的を十分満たすものである。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明のアミド化コレステロール分子プローブは、膜マイクロドメインおよびコレステロール認識タンパク質の検出の正確な検出ができるため、医療技術の開発におおいに寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】コレステロール分子構造
【図２】２２ＮＢＤ−コレステロール
【図３】ＢＯＤＩＰＹＦＬ  Ｃ１２コレステリルエステル分子構造
【図４】３−アミノ−コレステン分子構造
【図５】ＤＭＥＱ−３−アミノ−コレステロール分子構造
【図６】ＤＭＥＱ−コレステロール分子構造
【図７】ＢＯＤＩＰＹＦＬ  Ｃ５セラミイド
【図８】分子プローブ（分子構造は図２、５および６）の比較結果（結果１）
【図９】図５の分子構造プローブと図７の分子構造プローブの細胞内局在性（遠心分離の結果）
【図１０】図５の分子構造プローブと図７の分子構造プローブの細胞内局在性（共焦点レーザー走査型微鏡写真、蛍光観察）（結果２−２）
【図１１】図５の分子構造プローブと図７の分子構造プローブの細胞内局在性（共焦点レーザー走査型微鏡写真、蛍光観察）（結果２−３）
【図１２】図２の分子構造プローブと図５の分子構造プローブの細胞内局在性（共焦点レーザー走査型微鏡写真、蛍光観察）（結果２−４）
【図１３】図２の分子構造プローブと図５の分子構造プローブの細胞内局在性（共焦点レーザー走査型微鏡写真、蛍光観察）（結果２−５）
【図１４】図６の分子構造プローブと図７の分子構造プローブの細胞内局在性（共焦点レーザー走査型微鏡写真、蛍光観察）（結果２−６）
【図１５】図６の分子構造プローブと図７の分子構造プローブの細胞内局在性（共焦点レーザー走査型微鏡写真、蛍光観察）（結果２−７）
【図１６】図２のアミド化コレステロールでない市販の蛍光分子プローブの特性
【図１７】図３のアミド化コレステロールでない市販の蛍光分子プローブの特性
【図１８】実施例１４の蛍光分子プローブの特性
【図１９】実施例１４の蛍光分子プローブの特性
【図２０】参考例３の蛍光分子プローブの特性
【図１】
2008139299.tif 000067
【図２】
2008139299.tif 000068
【図３】
2008139299.tif 000069
【図４】
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【図５】
2008139299.tif 000071
【図６】
2008139299.tif 000072
【図７】
2008139299.tif 000073
【図８】
2008139299.tif 000074
【図９】
2008139299.tif 000075
【図１０】
2008139299.tif 000076
【図１１】
2008139299.tif 000077
【図１２】
2008139299.tif 000078
【図１３】
2008139299.tif 000079
【図１４】
2008139299.tif 000080
【図１５】
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【図１６】
2008139299.tif 000082
【図１７】
2008139299.tif 000083
【図１８】
2008139299.tif 000084
【図１９】
2008139299.tif 000085
【図２０】
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