(57)【要約】【課題】微小反応槽の数を増やすことによってスループットを向上する。【解決手段】多数の反応槽が１次元または２次元に配列したプレートと呼ぶものを具備する化学発光検出装置であり、光検出は検出画素を多数持つラインあるいはエリアセンサを用いることを特徴としており、光検出ピクセルの間隔がプレート上の反応槽の間隔がほぼ一致し、上記プレート上に反応槽からの光が検出画素に最も効率よく入射し、他の画素には分散しないように微小反応槽と画素を１対１に対応させたことを特徴とする。プレート上に配列した微小反応槽と撮像素子の画素とを１対１に対応させるためにプレート上に発光体か反射体か光吸収体をおいて位置あわせ目印とする。【選択図】図１
2008268069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の反応槽からの光を検出する化学発光検出装置であって、
複数の反応槽を１次元または２次元に配列したプレートを有するフローセルと、
複数の画素を有する光検出手段と、
前記光検出手段の画素の間隔と前記プレート上の前記反応槽の間隔とがほぼ一致しており、前記複数の反応槽の像を前記光検出手段上に結像するための光学系と、を備え、
前記複数の反応槽の個々の反応槽の発光が、前記光検出手段における異なる画素と１対１対応で検出されることを特徴とする化学発光検出装置。
【請求項２】
前記光学系は、前記反応槽の像が１倍の正立像で前記光検出手段素子上に結像させる光学レンズを具備することを特徴とする請求項１に記載の化学発光検出装置。
【請求項３】
前記反応槽の正立像の大きさが前記光検出手段の画素サイズよりも小さいことを特徴とする請求項２に記載の化学発光検出装置。
【請求項４】
前記反応槽と前記光検出手段は空間的に分離されており、
前記光学系がセルフォックレンズアレイで構成されることを特徴とする請求項１に記載の化学発光検出装置。
【請求項５】
前記セルフォックレンズアレイの被写界深度が、前記反応槽の深さよりも深いことを特徴とする請求項４に記載の化学発光検出装置。
【請求項６】
前記反応槽と前記光検出手段は空間的に分離されており、
前記光学系がファイババンドルまたはマイクロレンズアレイで構成されることを特徴とする請求項１に記載の化学発光検出装置。
【請求項７】
さらに、前記フローセルを前記光学系に固定する機構を有し、前記プレートの反応槽と前記光検出手段における画素を１対１で対応させる際に相対的な位置関係を決める位置決め手段を備えることを特徴とする請求項１に記載の化学発光検出装置。
【請求項８】
さらに、前記光検出手段の検出結果に基づいて、前記プレートの前記光検出手段に対する位置関係を調整する位置調整手段を備えることを特徴とする請求項１に記載の化学発光検出装置。
【請求項９】
前記プレートが、複数の発光素子を有し、
前記位置調整手段が、前記複数の発光素子からの光の検出結果に基づいて前記位置関係を調整することを特徴とする請求項８に記載の化学発光検出装置。
【請求項１０】
前記プレートが、複数の、光の反射率の高い反射体を有し、
さらに、前記反射体に光を照射する照明手段を備え、
前記位置調整手段は、前記反射体からの反射光の検出結果に基づいて、前記位置関係を調整することを特徴とする請求項８に記載の化学発光検出装置。
【請求項１１】
前記プレートが、光透過性の部分を有し、
さらに、前記プレートの裏面から光を照射する照明手段を備え、
前記位置調整手段は、前記光透過性の部分からの透過光の検出結果に基づいて、前記位置関係を調整することを特徴とする請求項８に記載の化学発光検出装置。
【請求項１２】
前記発光素子の発光中心が、前記プレート上の複数の反応槽の間に配置されていることを特徴とする請求項９に記載の化学発光検出装置。
【請求項１３】
前記反射体の中心が、前記プレート上の複数の反応槽の間に配置されていることを特徴とする請求項１０に記載の化学発光検出装置。
【請求項１４】
前記光透過性の部分の中心が、前記プレート上の複数の反応槽の間に配置されていることを特徴とする請求項１１に記載の化学発光検出装置。
【請求項１５】
前記位置調整手段は、前記複数の発光素子からの光の検出結果に基づいて、前記プレートの角度調整を優先して実行すべきかを判断しながら、前記位置関係を調整することを特徴とする請求項９に記載の化学発光検出装置。
【請求項１６】
前記位置調整手段は、前記複数の反射体からの光の検出結果に基づいて、前記プレートの角度調整を優先して実行すべきかを判断しながら、前記位置関係を調整することを特徴とする請求項１０に記載の化学発光検出装置。
【請求項１７】
前記位置調整手段は、前記光透過性の部分からの透過光の検出結果に基づいて、前記プレートの角度調整を優先して実行すべきかを判断しながら、前記位置関係を調整することを特徴とする請求項１１に記載の化学発光検出装置。
【請求項１８】
さらに、前記複数の反応槽に少なくとも４種の核酸と洗浄液を供給する手段を備えることを特徴とする請求項１に記載の化学発光検出装置。
【請求項１９】
前記光検出手段は、その画素サイズが1ミクロン以上30ミクロン以下のCCDアレーセンサー又はMOSアレーセンサー、或いは、30ミクロン以上150ミクロン以下のガラス基板上に作製したフラットパネルセンサであることを特徴とする請求項１に記載の化学発光検出装置。
【請求項２０】
前記複数の反応槽にはDNA試料がビーズに固定されて保持され、その状態で相補鎖合成反応が実行され、引き続き発光反応を行うことを可能とする機能を備えることを特徴とする請求項１に記載の化学発光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学発光検出装置に関し、例えば、複数の反応槽からの発光の検出結果が、核酸分析や遺伝子の塩基配列等を解析するために用いられるものに関する。
【背景技術】
【０００２】
DNA塩基配列決定にはゲル電気泳動と蛍光検出を用いた方法が広く用いられている。この方法ではまず、配列解析を行おうとするDNA断片のコピーを多数作製する。DNAの5’末端を始点として種々の長さの蛍光標識断片を作製する。また、これらDNA断片の3’末端の塩基種に応じて波長の異なる蛍光標識を付加しておく。ゲル電気泳動により長さの違いを１塩基の差で識別し、それぞれの断片群が発する発光を検出する。発光波長色から測定中のDNA断片群のDNA末端塩基種を知る。DNAは短い断片群から順次蛍光検出部を通過するので、蛍光色を計測することで短いDNAから順に末端塩基種を知ることができる。これにより、配列決定をする。このような蛍光式DNAシーケンサーは幅広く普及しており、また、ヒトゲノム解析にも大いに活躍した。この方法では、内径50μｍ程度のガラス細管を、多数本用い、さらに末端検出等の方法を利用し、一台あたりの解析処理数を増加する技術が開示されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
一方、パイロシーケンシングに代表される段階的化学反応による配列決定法（例えば、特許文献１及び２参照）は、取り扱いの簡便性から注目されている。概略は以下の通りである。ターゲットとするDNA鎖にプライマーをハイブリダイズさせ、４種の相補鎖合成核酸基質（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）を１種類ずつ順番に反応液中に加えて相補鎖合成反応を行う。相補鎖合成反応が起きるとDNA相補鎖が伸長し、副産物としてピロリン酸(PPi)が生成する。ピロリン酸は共存する酵素の働きでATPに変換され、ルシフェリンとルシフェラーゼの共存下で反応して発光を生じる。この光を検出することで加えた相補鎖合成基質がDNA鎖に取り込まれたことがわかり、相補鎖の配列情報、従ってターゲットとなったDNA鎖の配列情報がわかる。
【０００４】
この方法は、多くの反応槽を具備したフローセルを用いることにより高スループット化が可能であり、上記方法を応用して解析処理数を格段に増加させる例が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。この応用例では、複数の微小反応槽を１面に有するフローセルが反応プレートとして用いられている。ターゲットDNA鎖を種類毎に直径約35μｍのセファロース製ビーズに固定したものが多数用意され、各セファロースビーズには約108個の同じ種類のDNAが固定される。これらDNAにプライマーをハイブリダイズさせた後、各微小反応槽に１個ビーズを入れる。また、生物発光用酵素（ルシフェラーゼ）等を固定した直径0.8μｍのマイクロ粒子（microparticle）を反応槽に、充填している。これらのビーズの充填は、ビーズ含有溶液をフローセルに導入して、遠心器により沈降させることにより実施している。DNA塩基配列解析は、フローセル上流より、伸長反応用の４種の相補鎖合成核酸基質（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）を逐次導入し、相補鎖合成反応を行うが、相補鎖合成反応が進行した場合にはピロリン酸が生じる。それがATPに変換され、ルシフェラーゼ反応を行うが、その際に生じる生物発光を観測している。このような微小反応槽を多数用い、化学発光や蛍光を検出する装置は幾つか報告されている。例えば、ビーズにDNAを固定する代わりに、光ファイバプレートの１端面にアンカープローブを固定し、環状核酸鋳型（Circular nucleic acid templates）と結合させ、生物発光により配列決定や多型解析を行う例（例えば、特許文献２参照）や、また、上記光ファイバプレートをエッチングしてファイバの中心部を取り除いて反応槽を作製して、ピコタイタプレート（以下、「プレート」と略記する）を構成し、フローセルの一部に利用した例がある（例えば非特許文献３参照）。さらに、このプレート内の個々の微小反応槽内で、生成する物質、具体的にはピロリン酸などの、横方向への拡散によるコンタミネーションの減少を図るためのメンブレン等を付加したプレートが、例えば特許文献４に開示されている。
【０００５】
【非特許文献１】Anal. Chem. 2000, 72, 3423-3430
【非特許文献２】Margulies M,et al.,“Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.”, Nature, Vol.437, Sep.15; 2005, pp376-80及びSupplementary Information s1〜s3
【非特許文献３】Electrophoresis 2003, 24, 3769-3777
【特許文献１】国際公開パンフレット第98/28440号公報
【特許文献２】国際公開パンフレット第01/020039号公報
【特許文献３】国際公開パンフレット第03/004690号公報
【特許文献４】特表2003-515107号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、これらの技術では平面に分布した構造の反応層からの発光を、結合レンズを用いてエリアセンサ上に結像させて検出している。この場合、検出器上に結像した像が歪んだり、結像位置が相対的にずれたりするために１つの反応槽に対して複数の検出画素を対応させて検出することが一般的である。また、反応槽の数は検出装置の画素の数比べて数分の一から十分の一にする必要がある。このため、多くの反応セルを具備した装置を作るには非常に大きな撮像素子を必要とし、高価な装置とならざるを得ない。
【０００７】
一方、光ファイバをエッチングして凹部を作り、その凹部を反応槽として利用することもできる。この場合、ファイバ末端に設けた反応槽と反対のファイバ末端をエリアセンサの画素に結合する試みもある。しかし、この場合には一体化して撮像素子と反応槽を作製する必要があり、使い勝手が悪くさらに反応槽の温度をコントロールしにくいという難点がある。酵素反応は３５℃以上で行うことが望ましいが、撮像素子の温度を上げるとノイズが多くなるので冷却して使うことが望まれるからである。また、反応セルは洗浄したり、場合によっては使い捨てる必要があるため容易に分離できる方が都合がよいからである。さらに、光ファイバの配列は完全に規則的ではないため、完全に規則的に配列された撮像素子の画素と１対１に対応させるのは広いエリアでは不可能だからである。
【０００８】
また、例えば特許文献４には、核酸チップ上に固定された複数の核酸からの蛍光を撮像素子の画素を１対１に対応させて計測することも記述されている。
【０００９】
しかし、核酸が固定されたチップと撮像素子をどのように空間的に（精度良く）配置するかについては記載がないが、通常行うレンズ結合により倒立像を検出素子上に結像する系では像の微細な歪みが計測結果に重大な影響を与えることが多い。
【００１０】
微小反応槽を複数並列するフロースルー型検出器を用いたパイロシーケンシング解析技術は、従来のゲル電気泳動と比較して、読みとり塩基長は短いものの反応槽の数を増やすことで高スループットを実現できる。ヒトゲノム配列データーベースを初めとして種々生物の配列データーベースが整いつつある現状では短い配列でも多くのDNA断片の配列を決定できれば医療その他の分野に与える影響は大きい。
【００１１】
一方、化学発光検出の場合、実現可能な微小反応槽の数は、半導体撮像素子の画素数によって制限されている。上述の従来技術では一つの反応槽に９個の画素を対応させて検出しており、更に信号のクロストークを低減させるためにダミー画素（画素で受光する光強度をデータとして必要としない画素）が必要である。また、撮像素子（＝同一基板上に多数の画素が形成されている固体素子）の画素数より１桁少ない反応槽の使用しかできない。実際、非特許文献２よると撮像素子であるCCDの画素サイズは15×15μｍであり、１平方ｍｍあたり約4500個のピクセルを使って、１平方ｍｍあたり480個の微小反応槽を計測している。すなわち、実現された微小反応槽の数は画素数の約10分の１である。
【００１２】
確かに、撮像素子の画素数を増やすことによって計測可能な微小反応槽の数を増やすことはできるが、上述のように、撮像素子は大面積となり、撮像素子が高価となるだけでなく、撮像素子に光を導くための光学系も一般に高価となってしまう。
【００１３】
これに関し、画素数と微小反応槽の数を同じにすれば１０倍のスループット向上を図ることができるのは理解できる。
しかし、これを実現するには画素と反応槽を対応させて検出できなければならず、従来のようにレンズ結像で反応槽の像をエリアセンサ上に結像してもレンズの微細なひずみのために実際にはうまくいかない（検出精度が良くない）。また、ひずみのないレンズ系を用いたとしてもピント調整、および位置あわせは撮像素子の画素の数と反応槽の数が一致しているため、本質的に困難である。つまり、高スループットの実現と高検出精度の実現を両立するのは困難である。
【００１４】
さらに、従来例にも示した光ファイバの先端をエッチングして反応槽を構成し、他の末端を検出素子の画素に密着させる方式に関しても、反応槽を交換したり洗浄するために取り出し可能な構成を備えるシステムには不向きである。このように光ファイバの先端をエッチングして反応槽を形成した場合、反応槽の位置は光ファイバの位置で決まるが、光ファイバの位置は完全に規則的でなく、完全に規則的に配列された撮像素子上の画素と１：１に対応させることは困難である。そこで、これら従来例とは異なる新たな手法の開発が望まれている。
【００１５】
また、微小反応槽の数を増やし、撮像素子数にほぼ一致させるときには、プレートの位置決めが重要となってくる。即ち、パイロシーケンス解析を実行する装置は、解析対象である多種類の配列の核酸を異なる配列が異なる位置に固定されるようにしたプレート、及びその上の微小反応槽からの光を受光するための撮像素子と上記プレート上からの発光を撮像素子に導くための光学系を備えるが、このとき、プレートを取り替える度に、撮像素子及び光学系に対する相対的位置を調整しなければならない。ことのき、プレート上のどこで発光するかは事前に分からず、しかも、プレート上の微小反応槽が撮像素子の分解能より小さいため、ピント、傾き、画素面内方向への位置ずれいずれも、調整して、微小反応槽からの光を特定の画素だけに集光するようにできないという問題もある。  
【００１６】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、安価で高スループットを実現できると共に、高精度で蛍光検出できるパイロシーケンシング解析技術を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題を解決するために、本発明による化学発光検出装置では、反応槽１対１画像を形成できる光学手段を用いている。これと反応槽の位置制御により、撮像素子上に歪みのない１対１画像を形成できる。また、反応槽を具備したプレートと撮像素子の間に空間的に分離されたレンズ系を設けることによって相互に異なる温度で動作できるようになっている。このようなレンズ系としては、例えば、正立像を形成できるセルフォックレンズアレイまたはマイクロレンズアレイとバンドルファイバが使用できる。設計図に基づいて複数の微小反応槽が規則的に配置されたプレート、撮像素子、光学系を所定の位置に配置して、全ての微小反応槽からの光を対応する撮像素子上の個々の画素で検出できるようにする。特に、反応槽内で起こす化学反応に最適な温度に調節したときに、微小反応槽の撮像素子上の像の中心間の間隔と撮像素子の画素の中心間の間隔を一致させるように反応槽が形成されたプレートの温度膨張係数を考慮した反応槽および、レンズ系、光学系、撮像素子を配置する。
【００１８】
即ち、本発明による化学発光検出装置は、複数の反応槽からの光を検出する化学発光検出装置であって、複数の反応槽を１次元または２次元に配列したプレートを有するフローセルと、複数の画素を有する光検出手段と、光検出手段の画素の間隔とプレート上の反応槽の間隔とがほぼ一致しており、複数の反応槽の像を光検出手段上に結像するための光学系と、を備えている。そして、複数の反応槽の個々の反応槽の発光が、光検出手段における異なる画素と１対１対応で検出される。なお、複数の反応槽にはDNA試料がビーズに固定されて保持され、その状態で相補鎖合成反応が実行され、引き続き発光反応を行うことを可能とする機能を備えるようにしてもよい。
【００１９】
また、本化学発光検出装置は、さらに、反応槽を設けたプレートを配置してから、レンズ系および撮像素子および光学系の相対的位置を調整する手段を備えている。この調整する手段は、反応槽の撮像素子上での像と画素を１対１に対応させるためのプレート上に発光体または反射体または光の透過体で構成され、光の検出結果に基づいて、プレートの位置・角度を調整するものである。
【００２０】
なお、反応槽からの発光を、反応槽と１対１に対応する画素で最も効率よく計測するために、反応槽の発光面積（反応槽のサイズ）を画素面積よりも小さくなるように構成している。また、反応槽から発光を、反応槽と１対１に対応する画素で最も効率よく計測するために、反応槽の内壁に反射膜を形成することによって発光の上面への光放射効率を向上させ、プレートの上面からの光を計測するようにしてもよい。
【００２１】
また、プレート上に２次元に配列した反応槽を１次元に画素を配列したラインセンサを用い、ラインセンサの画素の配列方向に平行な方向に配列した反応槽は画素と１対１に対応するようにし、かつ、プレートを撮像素子に対して相対的に移動させることによって、２次に配列した反応槽からの化学発光を計測できるように配置してもよい。
【００２２】
さらなる本発明の特徴は、以下本発明を実施するための最良の形態および添付図面によって明らかになるものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、パイロシーケンシング解析の際に、安価で高スループット、かつ高精度で蛍光検出できる化学発光検出装置を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、添付図面を参照して本発明の実施形態について説明する。ただし、本実施形態は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
【００２５】
＜第１の実施形態＞
（１）化学発光検出装置の構成
図１は、本発明の第１の実施形態による化学発光検出装置１の概略構成を示す図である。化学発光検出装置１は、反応槽プレートから出る化学発光を、セルフォックレンズを用いて撮像素子上に１対１正立像を作り検出する例である。セルフォックレンズアレイを用いることによってプレート上の広い範囲に微小反応槽（微小反応セル）が配列していても、撮像素子の画素に対して１対１させて、微小反応槽からの化学発光像を撮像素子上に形成することができる。また、セルフォックレンズアレイは撮像素子上に倍率１倍の正立像を形成し、最も、効率よく撮像素子に微小反応槽からの発光を撮像素子上に結像すると同時に、プレートの膨張、収縮、歪みによる微小反応槽の位置ズレの影響を像上で拡大せず、影響を最小限に抑えることができる。なお、測定対象の遺伝子の配列は、パイロシーケンシング法の原理を用いて決定される。
【００２６】
図１において、化学発光検出装置１は、フローセル中の微小反応槽での化学発光を計測するシステムとして、フローセル101、発光画像を検出する冷却型CCDカメラなどの検出部である２次元撮像カメラ102、カメラ内部の（２次元）撮像素子103上に微小反応槽からの発光像を撮像素子上に結像する光学系として１倍の倍率で正立像を得ることができるセルフォックレンズアレイ127とこのセルフォックレンズアレイ127と撮像素子103の配置を固定するためのレンズホルダ126を備えている。このセルフォックレンズアレイ127を用いることによって発光像の歪みをなくし、微小反応槽と撮像素子の画素との１対１の関係を実現している。
【００２７】
また、化学発光検出装置１は、微小反応槽に試薬を送液するシステムとして、順次フローセルに試薬を分注するために４種の核酸基質（dATP、dGT、dCTP、dTTPの4種類など）を各々収める試薬槽106〜109と、伸長反応測定後にフローセル内を洗浄するための洗浄試薬を収める洗浄試薬槽110と、洗浄後にセル内の洗浄試薬成分の残留を洗い流すためのコンディショニング試薬を収めるコンディショニング試薬槽111と、それらを選択的にフローセル側に注入するための注入部（選択バルブ112及び試薬をハンドリングするためのポンプ113）と、廃液ボトル114等により構成される。また、フローセル内部の試薬溶液温度をパイロシーケンスに最適な温度に設定するために、ペルチェ素子120と、温度センサとしてのサーミスタとサーミスタで計測した温度からペルチェ素子に流す電流を制御するための温度コントローラ122が設けられている。また、撮像（CCD）素子103の暗電流によるノイズを低減するために、-20℃まで冷却している。この冷却温度は化学発光の強度や、対象となるＤＮＡの伸長に由来しない背景発光の強度に応じて決定するが、一般に室温以下に設定する。一方、ペルチェ素子120で制御するプレートの温度は化学発光に最適な温度ここでは40℃に設定する。この温度も使用する酵素によって異なるが一般に室温以上に設定される。
【００２８】
（２）フローセルの構造
次に、図２を参照して、フローセル101の構造を説明する。フローセル101は、後述の試料固定ビーズを保持するための複数の微小反応槽（凹部）201を表面に有する（ピコタイター）プレート202と、試薬流入口203と、試薬排出口204と、必要に応じて設けられる試料投入口（図示せず）を有する上板205と、流路を形成するスペーサ206とを備えている。図３は、フローセル101のCC’での断面図を示している。図３において、試薬は上板205とプレート202の間に形成された流路209内を流れ、このとき微小反応槽201中に必要な試薬が供給される。そして、微小反応槽201の中に解析対象となるＤＮＡを固定化したビーズ208を挿入する。
【００２９】
なお、微小反応槽201の形状は、例えば円柱状が好ましい。形状は、基板の素材や製作方法により決定される。例えば、基板としてステンレス材を用いて切削加工により製作したプレート、シリコンウエハーを用いてマスクとウエットエッチングにより製作したプレート、スライドガラス等のガラスを用いて粒子によるブラスタ加工で製作したプレート、及びポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン等を用いて金型の射出成型により製作したプレート等が使用可能である。ただし、これらは微小反応層の材料や製作法について制限するものではない。
【００３０】
また、例えば、プレート202上の一辺の長さ6.144cmの正方形の領域に微小反応槽を15μｍ間隔で4096×4096個形成したフローセル101を用いる。そして、例えば、ガラスを用いてプレート202を形成する場合は、微小反応槽形成時の温度とプレートを設置及び化学発光を計測するときの温度（40℃）の温度の違いによる熱膨張を考慮して作成しなければならい。すなわち、微小反応槽の温度を20℃に設定し、4096×4096個の微小反応槽を6.144cmより9.8μｍ小さい領域に形成する。また、ポリカーボネートを使用する場合は、金型を用いて200℃で成型し、金型上での微小反応槽を配置した正方形の領域は6.144cmより368.6μｍだけ大きく作製し、金型として使用する。このように、プレートの温度膨張、収縮計数を考慮して作製することによって、検出時の微小反応槽と画素の１対１の対応を確実に実現することができる。
【００３１】
（３）撮像素子の特徴
続いて、撮像素子103について説明する。撮像素子103は画素を多数具備する受光素子であればいかなる２次元撮像素子であるエリアセンサでも、１次元撮像素子であるラインセンサでもよい。ただし、特にデータの転送雑音の低いCCD（Charge Couppled Device）または製造コストの安価なCMOSセンサのいずれかを用いることが有効である。このとき暗電流ノイズを低減するために撮像素子の温度を電子冷却すると良い。実際、計測時にはCCD素子を用いて素子温度-20℃以下で測定する。
【００３２】
また、画素サイズが大きくなると素子コストが増大するだけでなく、画素数の多い撮像素子を製造歩留まりの観点から生産することができない。よって、画素サイズはCCD、CMOSいずれの場合でも15μｍとするのが好ましい。また、画素の配列形式は正方格子または直方格子が一般的であるが、六方格子でも、八角形と正方形を組み合わせたハニカム構造でもかまわない。この場合に微小反応槽も同様に配列しなければならない。本実施形態では正方格子を採用している。
【００３３】
撮像素子103の画素は、微小反応槽201の配置周期と一致しなければならないので、微小反応槽201の方が撮像素子103の画素よりも小さくするのが好ましい。ただし、このとき微小反応槽201の大きさを小さくして、微小反応槽201の間隔を小さくしていくと、化学発光の基質となるPpiやATPが露光時間内に拡散し、隣接した微小反応槽201の発光との区別が困難となる。そのため、微小反応槽201の間隔、及びこれから決まる画素サイズは、拡散距離から決まる長さよりも長くなければならない。この長さはおよそ１μｍ程度である。一方、画素サイズを所定のサイズより大きくすると、半導体基板上に作製したCCDやCMOSセンサでは撮像素子全体の大きさが大きくなり、コストの面からも製造歩留まりの面からも現実的でなくなってしまう。この大きくできる限界となる画素サイズは、おおよそ30μｍ程度である。よって、CCDやCMOSセンサなどの半導体撮像素子を使用する場合は画素サイズは、1μｍ以上30μｍ以下とするのが好ましい。
【００３４】
なお、ガラス基板上に素子を形成するフラットパネルディスプレイの場合は、画素サイズを大きくしてもコストアップにはつながらないが、冷却に制限がある。このため、十分な発光量を確保できる画素サイズとして、30μｍ以上150μｍ以下とするのが好ましい。
【００３５】
（４）光学系の特徴
上述のように本実施形態では光学系としてセルフォックレンズアレイ127を用いている。セルフォックレンズアレイ127では、円柱状のガラスの中心部分の屈折率を周辺部分に比べて高くすることにより1つのレンズが実現される。そして、この円柱を像面に対して垂直に立てた状態で１次元あるいは２次元上に配列してアレイが形成される。本実施形態では、セルフォックレンズアレイを構成する円筒レンズの直径は例えば、1.115ｍｍであり、その長さは8.42mmである。また、この円筒レンズを周辺効果も考慮して60×60個（3600個）配列させてアレイが構成されている。
【００３６】
セルフォックレンズアレイ127と微小反応槽201との間の距離と、撮像素子103とセルフォックレンズアレイ127との距離が一致した状態において、撮像素子上に微小反応槽の像が結像するようになっている。この距離は一般に数ｍｍである。ここではこの距離が4.2ｍｍのセルフォックレンズアレイ127を用いている。このようにプレート202とセルフォックレンズアレイ127との間にある程度の距離をとって像を得ることにより、図１及び３に示したように、微小反応槽201とセルフォックレンズアレイ127との間に試薬のための流路209を設けることができる。この流路209を形成すれば、プレート202内部に、発光を微小反応槽201毎に分解して計測できるようにするための構造を作る必要がなくなる。よって、この流路209を形成することは、低コストのプレート202を製造するためには重要な要件となるものである。また、このような配置すなわち、流路209を挟んでレンズアレイ127と微小反応槽201が反対側にあるように配置し、微小反応槽201の内壁に金属薄膜等で反射膜（図示せず）を形成することによって、発光の受光効率を向上させることができ、感度を向上することができる。ここでは、例えば微小反応槽201の内壁に3μｍの膜厚で金を蒸着し、撮像素子103とは反対側へ放射した光の数十％を撮像素子103のある方に放射させるようにすることができる。さらに、像の拡大率を１倍にすることは、最も効率よく光を撮像素子103上の画素に取り込める条件である。しかし、セルフォックレンズアレイ127の場合には、複数の円筒レンズからの光が重なって一つの像を形成するため、実効的なＦ値は0.7以下となり非常に明るい像を得ることができる。また、このセルフォックレンズ127の焦点深度、被写界深度ともに、0.3ｍｍ程度であるため、微小反応槽201の深さより深く、微小反応槽201からの発光を２次元像として結像させることができる。
【００３７】
（５）フローセル（プレート）の位置合わせ
微小反応槽201と撮像素子103の画素を１対１に対応させるためには、プレート202と光学系（セルフォックレンズ127）と撮像素子の位置を高精度に調整しなければならない。この調整を実現するための構成方法を以下説明する。
【００３８】
図１に示されるように、セルフォックレンズ127はレンズホルダ126に固定される。レンズホルダ126には、複数の合わせマークとして凹部124が形成されている。微小反応槽201が形成されたプレート202に対して固定された合わせマークとしての凸部（嵌合ピン）125を凹部に取り付ける。そして、プレート202を取り付けた状態で微小反応槽201と画素が１対１に対応するように撮像素子103を位置合わせした後にレンズホルダ126に撮像素子103を固定する。このとき、フローセル101中に固定されたプレート202を取り外すことが必要であるが、プレート202に嵌合ピン125を設けて凹部124に嵌合することにより、プレート202およびフローセル101を着脱しても、必ず微小反応槽201と画素とを１対１に対応させて発光像が得られるようになっている。
【００３９】
なお、本実施形態では、フローセル101と撮像素子103の位置合わせは装置製造時に実施される。使用時は上述のように、凸部125と凹部124とによって機構的に位置合わせが可能となっている。つまり、化学発光検出装置１の製造時に、数個の微小反応槽201について、その微小反応槽201に対応する位置に直径1μｍ程度のピンホールのあいた擬似プレートを作製する。そして、それをレンズホルダ126に固定して、裏面から光を照射することにより、微小反応槽201に対応する位置で発光点を配置することができる。この発光点が対応する画素で計測できるように撮像素子103の位置合わせをして撮像素子103を固定する。また、このとき、このプレート202の温度およびCCDの温度等は、上述の使用温度に設定して調整を実行する。また、レンズホルダ126は環境温度の変化によってゆがみがないように、（石英）ガラスで作製するのが好ましい。
【００４０】
（６）微小反応槽のサイズ
微小反応槽201の直径は12μｍ、深さは12μｍとし、微小反応槽201同士の間隔は3μｍである。このとき、プレート202に対する撮像素子103の位置あわせ精度は、上記間隔の半分以下、すなわち1.5μｍ以下であることが好ましい。
【００４１】
（７）その他
本実施形態では、倍率１倍でF値が１のセルフォックレンズ127を使用しているが、一般にＦ値が一定のレンズ系を結像のために用いた場合、ひとつの画素の最も効率よく微小反応槽からの光を画素に導く倍率は１倍である。このことを図４に示す。図４において、縦軸は一画素の受光効率、横軸は倍率を示している。微小反応槽201のサイズは撮像素子103の画素サイズにくらべて小さく、微小反応槽同士の間隔と画素の間隔を一致させることが実スケール上必要である。そこで、微小反応槽201の直径を画素の一辺の長さよりも小さくすることによって、微小反応槽201と撮像素子103の画素を１対１に対応させて、最も高感度に化学発光を受光することができるようにしている。
【００４２】
なお、撮像素子として２次元（エリア）センサを用いているが、１次元（ライン）センサを用いてもよい。
【００４３】
＜第２の実施形態＞
（１）化学発光検出装置の構成
図５は、本発明の第２の実施形態による化学発光検出装置2の概略構成を示す図である。化学発光検出装置2は、結像のための光学系に第１の実施形態で用いたセルフォックレンズ127ではなく、ファイババンドル123を用いた例である。化学発光検出装置2は、光学系以外の部分は第１の実施形態と同様の構成を有している。
【００４４】
ファイババンドル123は、直径が極小の光ファイバを多数束ねて固定し、片方の端面近傍の微小反応槽201からの発光をもう一方の端面近傍に結像させる。ファイババンドルはセルフォックレンズ127と同様に周辺でも像のゆがみがなく、適切に位置あわせすれば全数の微小反応槽201と撮像素子103の画素を１対１に対応させることができる。ただし、ファイババンドル123の場合には、束ねた光ファイバの直径によって解像度が制限される。また、微小反応槽201からの光を図６に示すようなフローセル101のプレート202と撮像素子103の位置関係で直接ファイババンドル123によって取り込むためには、微小反応槽201をファイババンドル123の端面に非常に接近させなければならない。このため、試薬を微小反応槽201に供給するための流路、および、フローセル101の上板205を配置するスペースがない。このような問題点を解決し、同時に化学発光の取り込み効率を大幅に向上するためにマイクロレンズアレイ1501を設けている。マイクロレンズアレイ1501はフローセル101の上板205に配置する。
【００４５】
（２）光学系の特徴
このマイクロレンズアレイ1501は、微小反応槽201と１対１に対応し、プレート202に対して固定され、画素とも１対１に対応させている。また、ファイババンドル123の焦点面は、マイクロレンズアレイ1501の後側主点（像側の主点）の像が撮像素子103上に結像するように設計、配置される。微小反応槽201の直径wは10μｍ、深さdは10μｍ、流路高さｈは5μｍ、マイクロアレイレンズの前側主点（物体側主点）とレンズの流路側表面との距離sは10μｍと設定される。また、マイクロレンズアレイ1501を構成する１つのレンズの直径Rを15μｍで、これらのマイクロレンズアレイ1501は15μｍ間隔で正方格子上に配置し、撮像素子の画素と１対１対応させる。さらに、マイクロレンズの焦点距離fは20μｍのものを用いる。ｆはs+h+d/2に従って決定する。R>wの条件の下で焦点距離ｆを出来る限り小さくすることによって、微小反応槽内で発生する生物発光を通常のカメラレンズで集光するよりも効率よく光を受光することができる。
【００４６】
なお、光ファイババンドル123の替わりにカメラレンズを用いてもよいが、この場合には像のゆがみの問題が発生する。よって、光ファイババンドル123を用いるのが好ましいといえる。
また、光学系として3μｍの直径の光ファイバを束ねたファイババンドルを用いている。
【００４７】
（３）フローセル（プレート）の位置合わせ
ファイババンドル123と撮像素子103は固定されている。一方、フローセル101は化学発光検出装置2から取り外しが可能となっている。このとき次のような手順で適切にファイババンドル123と撮像素子103の位置を調整して固定する。すなわち、ファイババンドル123に複数の位置合わせマークとして、凹部124を形成する。プレート202に、固定された合わせマークとしての凸部（嵌合ピン）125を取り付ける。そして、プレート202を取り付けた状態で微小反応槽と撮像素子103が対応するように位置合わせを行った後に、ファイババンドル123に対して撮像素子103を固定する。また、スペーサ128によってファイババンドル123の焦点面が規定される。プレート202に固定された嵌合ピン125をファイババンドル123上の凹部124に合わせることによって、プレート202上の微小反応槽と撮像素子103の画素は１対１に対応して位置合わせすることができる。このとき、フローセル101中でパイロシーケンスを行って、撮像素子103の位置あわせを行ってもよい。
【００４８】
フローセル101と撮像素子103の位置合わせは装置製造時に実施してもよい。使用時は上述のように、凸部125と凹部124とによって機構的に位置合わせが可能となっている。つまり、化学発光検出装置１の製造時に、数個の微小反応槽201について、その微小反応槽201に対応する位置に直径１μｍ程度のピンホールのあいた擬似プレートを作製する。そして、その擬似プレートを固定して、裏面から光を照射することにより、微小反応槽201に対応する位置で発光点を配置することができる。この発光点が対応する画素で計測できるように撮像素子103の位置合わせをして撮像素子103を固定する。また、このとき、このプレート202の温度およびCCDの温度等は、上述の使用温度に設定して調整を実行する。
【００４９】
（４）その他
本実施形態では、プレート上の化学発光像をCCD上に結像するためファイババンドルを用いている。これは像のゆがみがすくなく、像の中心部と周辺部で微小反応槽の像の間隔が広がったり、狭まったりすることがすくないからである。
【００５０】
なお、撮像素子として２次元（エリア）センサを用いているが、１次元（ライン）センサを用いてもよい。
【００５１】
フローセルの構造や撮像素子の特徴は、第１の実施形態と同様であるので、説明を省略する。
【００５２】
＜第３の実施形態＞
上述の第１及び第２の実施形態では、製造時にフローセル101の位置調整を行ってフローセル101を交換したとき（使用時）に調整不要にしている。しかし、フローセル101の加工精度が十分でない場合はフローセル101を交換するたびに位置合わせが必要になってくる。そこで、第３の実施形態は、使用時にフローセル101の位置合わせが可能な構成を備えた化学発光検出装置を提供する。
【００５３】
（１）化学発光検出装置の構成
図７は、第３の実施形態による化学発光検出装置3の概略構成を示す図である。化学発光検出装置3は、フロースルー型のセル（フローセル）101と、発光画像を検出する冷却型CCDカメラなどの検出部である２次元撮像カメラ102と、カメラ内部の２次元撮像素子103上に微小反応槽201からの発光像を適切な倍率で結像するためのレンズ系104と、順次に反応槽（セル）に分注するために４種の核酸基質（dATP、dGT、dCTP、dTTPの4種類など）を各々収める試薬槽106〜109と、伸長反応測定後にフローセル内を洗浄するための洗浄試薬を収める洗浄試薬槽110と、洗浄後にセル内の洗浄試薬成分の残留を洗い流すためのコンディショニング試薬を収めるコンディショニング試薬槽111と、それらを選択的にフローセル側に注入するための注入部（選択バルブ112、試薬をハンドリングするためのポンプ113）と、廃液ボトル114と、を備えている。ここで、フローセル101中の微小反応槽201が撮像素子103の画素（ピクセル）と１対１に対応するように、レンズ104を図中に示したxyz軸のうちのｚ軸方向に移動させ、倍率を調整し、フローセル101を位置調整機構105で移動xyz軸方向に移動させて、フォーカスと、像の位置を調整する。
【００５４】
（２）フローセルの構造
フローセル101は、第１の実施形態と同様、図２で示される構造を有している。図２で示されるように、フローセル101は、後述の試料固定ビーズを保持するため、複数の微小反応槽（凹部）201を表面に有する（ピコタイター）プレート202と、試薬流入口203、試薬排出口204、及び必要に応じて設ける試料投入口（図示せず）を有する上板205と、流路を形成するスペーサ206で構成される。図８は、フローセル101のCC’（図２参照）における断面図を示している。試薬は上板205とプレート202の間を流れ、このとき、微小反応槽201中に必要な化学物質が供給される。また、微小反応槽からの発光は透明な上板205を介して、撮像素子103にて受光される。図中の87は位置あわせ用発光点に対応する光透過窓である。光透過窓87の詳細については後述する。
【００５５】
（３）撮像素子の特徴
撮像素子103は、画素を多数具備する受光素子であればいかなる２次元撮像素子であるエリアセンサでも、１次元撮像素子であるラインセンサでもよい。例えば、特にデータの転送雑音の低いCCD（Charge Couppled Device）または製造コストの安価なCMOSセンサのいずれかを用いることが有効である。このとき暗電流ノイズを低減するために撮像素子の温度を電子冷却することが必要である。実際、計測時にはCCD素子を用いて素子温度-20℃以下で測定する。
【００５６】
また、画素サイズが大きくなると素子コストが増大するだけでなく、画素数の多い撮像素子103を製造歩留まりを良好に生産することができない。そこで、画素サイズはCCD、CMOSいずれの場合でも20μｍ以下とする。また、画素の配列形式は正方格子または直方格子が一般的であるが、六方格子でも、八角形と正方形を組み合わせたハニカム構造でもかまわない。この場合に微小反応槽も同様に配列しなければならない。本実施形態では正方格子を採用している。
【００５７】
（４）ピコタイタープレートの構造
図９は、ピコタイタープレート202の例を示す図である。このプレート202は、中央部に複数の微小反応槽201を有している。この例では反応層201は正方格子状に正方形の形に配列されている。この正方形の４隅の付近に発光点90を配置する（詳細は図１３参照）。発光点90からの光は、等方的に放射し、レンズ104によって、撮像素子（CCD）103上で結像される。
【００５８】
なお、微小反応槽201の形状は、例えば円柱状が好ましい。形状は、基板の素材や製作方法により決定される。例えば、基板としてステンレス材を用いて切削加工により製作したプレート、シリコンウエハーを用いてマスクとウエットエッチングにより製作したプレート、スライドガラス等のガラスを用いて粒子によるブラスタ加工で製作したプレート、及びポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン等を用いて金型の射出成型により製作したプレート等が使用可能である。ただし、これらは微小反応層の材料や製作法について制限するものではない。
【００５９】
（５）フローセル（プレート）の位置合わせ
図１０は、微小反応槽201の２次元撮像素子103上の像と画素の関係を示す図である。微小反応槽201の像は画素よりも小さく、微小反応槽201と画素は１対１に対応している。この例では微小反応槽201と画素の数は両方ともM×Nである。微小反応槽201および画素を左上からラベルしてそれぞれ（k、l）、[k、l] （k=1・・・M、l=1・・・N）とする。ピコタイタープレート202上の(2、2)、(M-1、2)、(2、N-1)、(M-1、N-1)の座標の位置に４つの発光点を形成し、それをS1、 S2、 S3、 S4と記す。また、対応する画素[2、2]、[M-1、2]、[2、N-1]、[M-1、N-1]の中心位置をそれぞれP1、 P2、 P3、 P4とする。このとき発光点Si(i=1…4)の撮像素子（CCD）103上の像をQ1、 Q2、 Q3、 Q4の４つとすると、プレート202、即ちフローセル101の位置およびフォーカス調整はPiとQiの中心が一致し、Qiの大きさがSiの大きさと一致させることによって実現できる。本実施形態では、Siの大きさは画素のサイズよりも小さいので、位置調整とフォーカス調整が適切な状態にするためには、PiとQiの位置を一致し、Qiに対応するコントラストをPiで最大化することによって実現できる。Qiに対応するコントラストは式１で定義される。
【００６０】
【数１】
2008268069.tif 000003
【００６１】
フローセル101を機械的にある程度適切な位置にくるように設置した状態から、図１１のフローチャートに従ってX、Y、Z、η、φ、θの調整をする。それゆえ、調整前の段階で同じiについてPiに最も近い点はQiである状態が実現できている。式１においてI[k、l]は画素[k、l]の受光強度であり、MaxはQiに対応する領域Ri中で[k、l]を変えた場合での最大値である。ここで領域Riは本実施例の場合は、図１０においてQ1、 Q2、 Q3、 Q4それぞれについて左上、右上、左下、右下４分の一の領域を指す。式１の括弧の中は領域の中で[k、l]を変化させたとき最大値を必ずとる。この最大値をとる位置がQiの中心に対応させることで、PiとQiの位置あわせが実現できる。また、この最大値の値はＺなどの調整を行って、一般にはさらに増大でき、これらのパラメータに対するコントラスト関数の最大化を実行することによって、フォーカス調整ができる。
【００６２】
具体的な調整手順は図１１に従って実行される。まず、フローセル101に設けられた凹凸構造や貫通孔などを使ってプレート202上の微小反応槽と撮像素子103の画素（ピクセル）が凡そ一致するようにプレート20を位置決めする（プロセス１）。この工程のみが操作者によって行われ、他の工程は、自動的に図示しない記憶手段に格納された処理プログラムに従って図示しないCPUによって実行される。
【００６３】
位置合わせ用の光源90が点灯される（プロセス２）。次に、位置調整機構（駆動部）105を駆動してフローセル101をx及びy軸方向に移動し、Q1とP1を一致させる（プロセス３）。続いて、フローセル101をz軸方向に移動させて、Q1のコントラストを極大化する（プロセス４）。Z軸方向にフローセル101を移動させると、xy軸方向ではフローセル101の位置がずれるので、再度プロセス３が実行される（プロセス５）。つまり、プロセス３乃至プロセス５では、次のような動作が実行される。コントラスト関数を、フローセルの位置を図７中の座標に示すようなXYZ方向に移動させる。また、フローセル101中のプレート202の傾きおよび回転（η、φ、θ）を変えることによって、Piの中心とQiの中心を一致させ、Qiに対応するコントラストContrast1(Qi)を最大化して、位置あわせとフォーカス調整を実行する。ここで、図１２に角度η、φ、θに対応する角度を図示した。131がプレート面に対応する面である。この面とYZ平面との交線をY’軸とし、面131とXZ平面との交線をX’軸とするとき、Y軸とY’軸のなす角をηとし、X軸とX’軸とのなす角をφとする。θは微小反応槽の配列の面131ないでの回転を示すとする。
【００６４】
本調整動作では、４点のQiの配置の形によってηと、φの調整を優先的に実施することができるようになっている（プロセス６及び８）。仮にこのプロセスがない場合にはηまたはφの調整を行うべきところをX、Y、Zとθの組合せで調整するプロセスが先行してしまい、真の最大値に到達できずに、位置あわせ、フォーカス調整が不十分に終了する可能性がある。この複数の発光点のCCD面での像Qiの配置の形状から角度調整を優先的に実行するかどうかを判断するプロセスはコントラスト関数の真の最大値に到達し、正しく調整が終了できるようにするために欠くことができないプロセスである。
【００６５】
プロセス６の後は、Q3及びQ4のコントラストが改善しなくなるまでプロセス４乃至６が繰り返される（プロセス７）。また、プロセス８の後は、Q2及びQ4のコントラストが改善しなくなるまでプロセス４、５及び８が繰り返される（プロセス９）。
【００６６】
そして、θをdθだけ移動させて、Q2とP2を接近させる（プロセス１０）。次に、プロセス６乃至９が実行される（プロセス１１）。さらに、プロセス１０及び１１が繰り返し実行され、Q2とP2を一致させる（プロセス１２）。Q3とP3およびQ4とP4が一致していなければ、dη＝dη/2、ｄφ=dφ/2、ｄθ=dθ/2と再設定してプロセス３乃至１２が再度実行される（プロセス１３）。
【００６７】
Q1乃至Q4のコントラスト値が最終的に求まったら、その値がメモリに保存される（プロセス１４）。また、dη＝dη/2、ｄφ=dφ/2、ｄθ=dθ/2と再設定して、プロセス３乃至１２が再度実行され、 Q1乃至Q4のコントラスト値がメモリに保存される（プロセス１５）。最後に、プロセス１５実行前後でのQ1乃至Q4のコントラストの差が事前に設定した値より大きければdη＝dη/2、ｄφ=dφ/2、ｄθ=dθ/2と再設定して、プロセス３乃至１２が再度実行される。そうでなければ調整処理が終了する（プロセス１６）。
【００６８】
なお、図１１のフローチャートで示される調整処理では、QiQjの距離を計測することによって、処理順序が選択されるようにしているが、この他にもいろいろな可能性はある。なお、QiQjの距離の算出は対応する座標と三平方の定理から導出した値を用いている。また凡そ等しいとはその差が２分の一ピクセル以下である場合を意味するものである。
また、フローチャート中に記載のある事前に設定したdη、dφ、dθはそれぞれ0.01ラジアンとしたが、これは微小反応槽の大きさなど修正すべきであることはいうまでもない。さらに、ここでは発光点90は４点としたが、３点以上であればさらに多くても構わない。
【００６９】
（６）発光点の構成
上述の位置合わせ処理において、複数の発光点90において、それぞれの発光強度は凡そ一致し、時間的に変化しないことが必要である。このような発光を実現するために、(i)ピコタイタープレート内に発光デバイスを導入する方法、(ii)ピコタイタープレートに対して撮像素子とは反対側に照明を配置し、ピコタイタープレートの発光点に対応する部分だけこの照明からの光が撮像素子で観測できるようにする方法、(iii)照明をピコタイタープレートに対して撮像素子と同じ側に配置し、発光点に対応する位置に反射鏡を配置し、ピコタイタープレート上の他の領域にくらべて効果的に照明光が撮像素子に入るようにする方法がある。以下具体的方法について説明する。
【００７０】
図１３は、発光点を備えたフローセル中のピコタイタープレートの断面図を示す。断面に位置は図９中の直線AA’である。なお、図１３(a)乃至(c)は、上記(i)乃至(iii)の方法にそれぞれ対応する。
【００７１】
まず、(i)の場合のピコタイタープレート71の断面を示す（図１３(a)参照）。プレート材料はポリカーボネートが用いられる。図中に示したように、プレート71中に緑の発光ダイオード72が、発光点の位置に対応するように裏面の整形した凹部73に配置される。発光ダイオードを用いた理由は、コヒーレンス長が短く発光効率が高いため、発熱が少なく、微小反応槽への温度を上昇させにくいようにできるからである。また、緑色を用いた理由は、生物発光同程度の波長を用いることによってフォーカス調整時の色収差の影響を低減するためである。発光ダイオードに一定の電流を流し、一定の強度の光が発するように定電流源83をつなぐ。発光の位置がピコタイタープレート71の表面付近の小さい領域からの等方的な発光が得られるように、凹み部の適切な位置に直径10μｍ程度の貫通孔74が設けられている。そして、貫通孔74からの液漏れを防止するために、直径１μｍのガラスビーズを混入させた透明樹脂接着剤でこの穴が封止される。光はアルミ蒸着層を通過しないため、貫通孔透過散乱した光が撮像される。貫通孔74の大きさが発光点の大きさとなるため、ピクセルサイズ20μｍよりも小さな直径の貫通孔74を形成する。ここでプレート材料はポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンなどの樹脂を用いてもよい。また蒸着材料はその他の金属材料を用いてもよい。また、プレート材料はステンレスなどの金属で作製してもよいこのときには凹み部への蒸着層は不要である。
【００７２】
次に、(ii)の場合のピコタイタープレート75の断面を示す（図１３(b)参照）。図１３(b)において、76は蛍光灯などで構成したバックライトである。いま、撮像素子はプレート75を挟んで反対側に配置されており、裏面に2μｍ程度の厚さのアルミニウム蒸着が施され、蒸着層77が形成されている。発光点の裏面側に凹部78を形成し、発光点に位置に直径10μｍの貫通孔74を形成した。貫通孔は上記と同様にビーズを混入した透明接着剤84で封止する。発光点に対応する位置に光を透過する光またはプラスティックファイバを配置する。この他の構成としては透明の樹脂材料（たとえばポリカーボネート）を凹部78にあわせて整形し、接着してもよい。
【００７３】
最後に(iii)の場合のピコタイタープレート80の断面を示す（図１３(c)参照）。図１３(c)において、81は照明用光源である。光源には化学発光波長と同程度の緑色発光ダイオードが用いられる。ただし、各種ランプを用いてもよい。ここではフォーカス位置あわせ精度を向上するために光源81は波長で発光する緑色発光ダイオードを用いた。撮像素子はプレート80に対してランプ81と同じ側に配置されている。４つの発光点に対応する位置に10μｍのシリカビーズ82を散乱体としてプレート表面よりも数μｍ上に突き出るように配置した。実際には、発光点の位置の微小反応槽83を5μｍとしてビーズを配置し、透明の接着剤にて固定した。
【００７４】
なお、反射体材料は、ガラス材料、金属、樹脂材料で作製しても良いし、形状も球形でなく、円柱でも直方体でもよい。発光点とされ以外のコントラストを向上するためにプレートは発光点以外のプレート表面で光の反射が抑圧されるように、黒色の色素を含む樹脂材料でプレート88を作製した。同じ目的のために反射防止処理を行ってもよい。また、同じくコントラストを向上するために、微小な半導体微粒子（Quantum Dotとよばれる、数nmから数十nmのZnSeなどの半導体微粒子）を混ぜて、光源にレーザを用いてビーズからの蛍光を発光点として用いてもよい。半導体微粒子は退色がなく、レーザ光を長時間照射して調整するのに適している。このときにはレーザ励起波長は発光波長よりも短い波長の光源を用いるとともに、撮像素子とプレート80の間にはこの波長を遮断するバンドストップフィルタを用いる。
【００７５】
次に上記３種類の発光方式それぞれについてのシステムの中での配置を説明する。本実施形態例の装置構成は図７に示されるが、これは(ii)の透過方式に対応する。87はバックライトの光を透過する、画素サイズより直径が小さい窓であり、図１３では接着剤84で封止した貫通孔74に対応する。87は光ファイバを用いてもよい。(i)の発光方式の場合も、撮像素子とは反対側に発光ダイオードを配置すればよい。構成は図７と同様なので図示は省略する。
【００７６】
また、図１４は、上記(iii)の発光方式を用いる場合のシステム構成を示している。プレート202上に反射体82を配置し、レンズ104の周囲に発光ダイオード81が配置されている。照明は生物発光を遮蔽しないようにするとともに反射体に対して均一な光強度で照射しなければならない。そのため、反射体の配置と照明用の発光ダイオードの配置の間には一定の関係が成り立っていなければならない。
【００７７】
図９に示したように、反射体が正方形の形に配置する場合には、ダイオードも反射体の配置の対象性に合わせて4n回対象（nは自然数）に配置しなければならない。n=1の場合のダイオードの配置の例が図１５及び１６に示されている。図中、1001が照明用発光ダイオードである。ダイオード1001はレンズ104の外枠1004に固定される。なお、各図は撮像素子103の中心とレンズ104の中心を結ぶ軸1002の延長線上から見たものである。
【００７８】
また、図１５において、Qiは反射点の像であり、正しく、位置あわせとフォーカス調整が終了している状態が示されている。発光ダイオードは、4回対称（対称軸1005）になるように配置される。さらに、図１６には同じ4回対称であるがダイオード数が８個の場合が示されている。同様に図１７は８回対称の場合であり、図１９はリング状の照明機1006を用いてn=∞の場合を実現している。
【００７９】
上記対称性の条件を満たせばさまざまな照明方法が可能である。もし、この対称性の条件を満たしていない発光ダイオードを配置すると反射点からの発光は同じ強度の発光が得られなくなり、Qiに対応するコントラストに大きな差が生じ、ηやθの調整精度が劣化する。精度の劣化はコントラストの最大化プロセスにおいて極大値にとどまることによっても生じ、動作条件によっては大幅な位置あわせ精度劣化を招く場合もある。
【００８０】
（７）光学系の特徴
本実施形態における光学系に必要な条件は、微小反応槽201で発光した光を効率よく特定の画素のみに導き、それ以外の画素に導かないようにすることである。これを実現する最も一般的な方法は、図７に示したように、Ｆ値の小さいレンズ系104を用いて効率的に撮像素子103上に微小反応槽からの発光の像を結像させることが望ましい。Ｆ値の小さいレンズを用いるのは、発光が暗くても効率よく計測できるようにするためである。
【００８１】
しかし、光学系104にカメラレンズなどの組み合わせレンズを使うと像のゆがみが生じ、プレート上の全ての微小反応槽と撮像素子上のすべての画素の位置を一致させることが簡易な構成ではできない。
【００８２】
それゆえ、第３の実施形態でも、第１及び第２の実施形態と同様に、セルフォックレンズアレイまたはマイクロレンズアレイおよびファイババンドルを用いても良い。
【００８３】
この場合にはフォーカスの調整と角度φ、ηの調整は不要となる。ただし、面内のX、Yおよびθの調整は上記プロセスを用いて実行する。また、これらの光ファイババンドルを複数用いるか分岐のあるファイババンドルを用いて、１つのフローセルを複数の撮像素子で測定できるようにしてもよい。
【００８４】
（８）その他
変形例として、ピコタイタープレート202に光ファイバプレートを用いて微小反応槽201からの光をプレート202の裏面から計測してもよい。非特許文献２でもプレートの裏面から光を計測しているが、微小反応槽と撮像素子の画素は１対１には対応していない。
【００８５】
しかし、プレート202の裏面から光を計測する場合でも、本実施形態の構成（位置調整機構105と位置調整動作（図１１））を備えれば、撮像素子103に対してピコタイタープレート202を面内の移動とθ回転のみで画素と反応槽201を１対１にすることができる。
【００８６】
図１９は、変形例において１対１の位置調整を実現するための構成を示す断面図である。この場合にはファイバプレート85が光透過性であるためバックライト86（図１３(b)の76に相当）を使う場合にはプレート85の一部に光が当たるようにしなければならない。すなわち、発光点に対応する特定の位置に対応する場所1202（光透過窓87に相当）でのみフローセル1201の上板が光透過性でその他の領域（1201の黒く塗りつぶした領域）では光は反射するか吸収し、光を透過させないようにする。全ての微小反応槽201の直下には光ファイババンドル1102の光ファイバ（コア）があり、化学発光と同様にバックライト86からの光も撮像素子103に伝達する。もちろん発光ダイオードを用いてもよい。
【００８７】
また、レンズ系104の内部にグレーティングまたはプリズムを挿入することによって発光波長によって検出する画素を変えてもよい。この場合、本実施形態ではdATP、dTTP、dCTP、dTTPの発光波長が異なる場合にどの塩基で発光したかを、発光を検出した画素の位置で識別することができるようにする。つまり、４種類のdNTPに対して異なる波長の蛍光体を導入し、試薬を一度に入れて、どの塩基が伸長したかを波長で識別する。波長ごとに異なるピクセルに対応させてdNTPの種類を識別する。ただし、波長分解しない場合は1つの反応槽が1つの画素に対応するようにするのと同様に、この変形例の場合には同じ反応槽であっても別の波長なら別の画素で計測されるようにして、クロストークがないようにしなければならない。これによって、高スループットで高精度な塩基配列決定が可能となる。より詳しく述べると、dNTPを１種類ずつ入れて伸長反応させる場合には伸長反応が起きるか起きないかによって塩基の種類を判定する一方、この変形例では必ず１塩基だけ伸長させるようにし、その種類が何かを波長によって判別できるようにする。すると、試薬を入れたのに伸長しないというステップがないので解析時間が半分になる（１種類ずつ投入する場合は、配列がランダムであれば、約50％の確率で伸長反応が起きる）。このように、試薬投入回数が半分になって解析時間が半分となりスループットが倍に向上する。
【００８８】
＜第４の実施形態＞
第３の実施形態では、１つの発光点90を１つの画素に対応させるようにして位置合わせを行う例を示した。本実施形態では、１つの発光点を４つの画素に対応させて位置あわせを行う例を示す。
【００８９】
図２０は、微小反応槽201と発光点の配置および撮像素子の画素の配置の関係を示している。位置あわせ用発光点Siを４つの微小反応槽201の中央に配置し、発光点の像Qiの中心を正しく調整（４つの画素の光強度を等しくする）すれば、４つの画素の境界点Piに一致する。このように発光点を微小反応槽がある位置とはずらせては位置することによって、次ぎのようなコントラスト関数を定義することができる。
【００９０】
【数２】
2008268069.tif 000004
【００９１】
ここで、このコントラスト関数は、正しく調整されたときには値が発散するので、逆数をとって、逆数を最小化（即ち０）に近づけるように調整する。それゆえ図１１のフローチャートで示された処理を実行するときには、コントラスト関数を最大化するところをコントラスト関数の逆数を最小化すると読み替えて実行する。また、この式２で、Piは[k-1/2,l-1/2](k=3, M-1, l=3, N-1)であり、それぞれ４つの画素の境界点に対応する。
【００９２】
このように発光点を境界点に配置することによって定義できるコントラスト関数は、次に説明するように優れた特性を示す。比較のため、図２１に式（１）の値をQiのPiに対する面内のずれ（角度が調整済の場合のXまたはY方向のずれ）量と解像度（フォーカスがずれたり、発光点が大きくなると０に近づき、フォーカスがあって発光点の像の中心が画素の中心に一致していて、画素の縁での光強度が1/eになるようになるとき、解像度が１と定義された、フォーカスに対応するパラメータ）の関数としてプロットした。図２１には極大値が複数あり、図から明らかなように位置あわせやフォーカスあわせを行うとき、局所的な最大値で最適化が終了してしまう可能性があることを示している。
【００９３】
同様に、図２２に式（２）の値をプロットした。この場合は最大化ではなく最小化であるが、極小値は１点しかなく、途中で最適化が終了する可能性はない。それゆえ、このような発光点の配置の方が精度の高い位置あわせが可能であることが分かる。
【００９４】
＜第５の実施形態＞
第５の実施形態では、発光点の数は４点ではなく、もっと増やした場合の例が示されている。図２３および図２４は、微小反応槽201と発光点の配置関係をそれぞれ示している。図２３では、発光点S1〜S10が配置されている。また、図２４では、発光点S1〜S20が配置されている。
【００９５】
また、これらの例では、発光点の周囲の一部の微小反応槽201の位置に発光を周囲よりさらに低減した点（黒く塗りつぶした丸）を配置することによって、コントラスト関数値の精度を向上し、位置あわせ精度を向上させる。図２３、２４中の黒い塗りつぶし部分が光の発光、反射、透過が意図的に抑圧した点に対応する。
【００９６】
さらに、コントラスト関数は、各発光点個別に定義するよりは次のようにグループ化してコントラスト関数を定義した方が位置合わせのためには効果的である。
【００９７】
【数３】
2008268069.tif 000005
【００９８】
＜まとめ＞
各実施形態の化学発光検出装置において、核酸分析、特に段階的相補鎖合成を用い、反応槽からの化学発光が検出される。その検出結果を用いて遺伝子配列解析が実行される。
【００９９】
そして、各実施形態による化学発光検出装置によれば、複数の反応槽と撮像素子の画素が１対１に対応しており、かつ、検出される像にゆがみが無い。このため、解析スループットを、規定する反応槽の個数を極限まで高めることができると共に、精度よく解析することができるようになる。また、一度に解析できるDNAサンプル数を検出素子の画素数にまで向上させることができるので、装置を安価に作製することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】第１の実施形態による化学発光検出装置の概略構成を示す図である。
【図２】フローセルの概略構成図である。
【図３】フローセルの断面図である。
【図４】倍率と一画素あたりの受光効率の間の関係を示すグラフである。
【図５】第２の実施形態による化学発光検出装置の概略構成を示す図である。
【図６】ピコタイタープレートの概略構成図である。
【図７】第３の実施形態による化学発光検出装置の概略構成を示す図である。
【図８】フローセルの断面図である。
【図９】第３の実施形態で用いられるピコタイタープレート例を示す図である。
【図１０】ピコタイタープレート上の反応槽と画素との位置関係を説明するための図である。
【図１１】位置およびフォーカス調整の手順を説明するためのフローチャートである。
【図１２】プレートの角度を定義する図である。
【図１３】発光点を有するピコタイタープレート例の断面図である。
【図１４】第３の実施形態に係る、発光点として反射体を有する化学発光検出装置の概略構成を示す図である。
【図１５】照明位置を説明する図（１）である。
【図１６】照明位置を説明する図（２）である。
【図１７】照明位置を説明する図（３）である。
【図１８】照明位置を説明する図（４）である。
【図１９】光ファイバプレートを用いる場合の断面図である。
【図２０】発光点の位置が微小反応槽の間である場合（第４の実施形態）のプレート概略図である。
【図２１】コントラスト関数の位置ズレと解像度に対するプロット（１）である。
【図２２】コントラスト関数の位置ズレと解像度に対するプロット（２）である。
【図２３】微小反応槽と発光点の配置関係（１）を示す図である。
【図２４】微小反応槽と発光点の配置関係（２）を示す図である。
【符号の説明】
【０１０１】
87       光透過窓
90       発光点
101      フローセル
103      撮像素子
104      光学系
124      凹部
125      凸（嵌合）部  
123      ファイババンドル
127      セルフォックレンズアレイ
201      微小反応槽
202      プレート
1501     マイクロレンズアレイ
【図１】
2008268069.tif 000006
【図２】
2008268069.tif 000007
【図３】
2008268069.tif 000008
【図４】
2008268069.tif 000009
【図５】
2008268069.tif 000010
【図６】
2008268069.tif 000011
【図７】
2008268069.tif 000012
【図８】
2008268069.tif 000013
【図９】
2008268069.tif 000014
【図１０】
2008268069.tif 000015
【図１１】
2008268069.tif 000016
【図１２】
2008268069.tif 000017
【図１３】
2008268069.tif 000018
【図１４】
2008268069.tif 000019
【図１５】
2008268069.tif 000020
【図１６】
2008268069.tif 000021
【図１７】
2008268069.tif 000022
【図１８】
2008268069.tif 000023
【図１９】
2008268069.tif 000024
【図２０】
2008268069.tif 000025
【図２１】
2008268069.tif 000026
【図２２】
2008268069.tif 000027
【図２３】
2008268069.tif 000028
【図２４】
2008268069.tif 000029