(57)【要約】【課題】肝臓の中に存在する多分化能を持った幹細胞を、神経細胞を含む種々の細胞や組織に分化誘導させて移植治療に提供する。【解決手段】患者自身の肝臓で再生肝を作らせ、そこから幹細胞を取り出して、神経系の細胞や、その他必要な組織の細胞に分化誘導させて患者本人の欠損した細胞や組織に移植する。自己の幹細胞を用いることによって、拒否反応の恐れがない多分化能を持った幹細胞を提供することができる。肝臓組織の一部をバイオプシーなどで取り出し、その中に含まれる多分化能を持った幹細胞を試験管内で目的の細胞や組織に分化誘導させて移植用の幹細胞を含む組織治療剤を得た。【選択図】図１ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓細胞中の多分化能を有する幹細胞を分化させて移植可能な組織細胞として得ることを特徴とする移植可能な幹細胞の調整方法。
【請求項２】
肝臓細胞中の多分化能を有する幹細胞を種々の細胞や組織に分化誘導させて移植可能な組織細胞として含有することを特徴とする組織治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は多分化能を有する幹細胞を得るための幹細胞の調整方法と幹細胞を分化誘導させた細胞を含む組織治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸素を運搬する赤血球、止血作用を有する血小板、感染を防御する白血球やリンパ球等ヒト血液、リンパ液中には多種類の細胞が存在する。これらの多様な細胞は骨髄中の造血幹細胞に由来している。生体内において樹状細胞もまた、骨髄の造血幹細胞から誘導される。樹状細胞の前駆細胞及び未成熟樹状細胞は、血液及びリンパ液中に存在し、完全に成熟した樹状細胞は脾臓及びリンパ節に存在する。特許文献１はこのような「樹状細胞の前駆細胞を含む細胞懸濁液分化誘導剤及びケモカインの存在下で培養することにより得られる抗原提示細胞能を有する樹状細胞を主成分とする細胞ワクチン。」が開示されている。特許文献２は、「ヒトノッチリガンド蛋白質を有効成分としヒト幹細胞を含む細胞を培養してヒト幹細胞の数若しくは頻度を維持もしくは増幅する活性を有する培養媒体。」及び「この培養媒体を用いるヒト幹細胞とヒトノッチリガンド蛋白質が接触する条件でヒト幹細胞を培養して、ヒト幹細胞の数若しくは頻度を維持もしくは増幅する培養方法。」が開示されている。
【０００３】
ヒトCNS神経幹細胞は、そのげっ歯類の相同物と同様に、有糸分裂促進因子（上皮細胞増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子等）を含有する。無血清培養培地中で維持される場合、懸濁培養物中で増殖し、「神経球（neurosphere)」として公知の細胞凝集物を形成する。ヒト神経幹細胞は、約３０日の倍加速度を有することが示されている。特許文献３においては、このヒト中枢神経系幹細胞の単離、ならびにこの細胞を増殖、分化および移植するための方法及び培地について開示されている。
【０００４】
肝臓は、生命維持のために重要な機能を果たしており、このような多くの機能を有するが故に障害も受けやすく、肝臓に障害を受けると健康に多大の影響を及ぼす。肝臓で最も豊富で代謝活性の高い細胞は、肝細胞である。肝細胞は分裂することは希であるが、肝臓を一部切除（肝切除術）するような刺激が加わると、この刺激に応答して再生する能力を発揮する。特許文献４においては、このような肝細胞に関し、「肝組織から単離された哺乳類の肝移植細胞の組成物であって、該組成物中の細胞の少なくとも８０％はR２であり、５E１２、Ep-Cam、CD４９ｆ、およびEーカドヘリンからなる群より選択されるマーカーについて陽性であり、かつHLA10Wであると特徴づけられ、成熟した肝細胞を生じる能力のある細胞を含む組成物。」が開示されている。
【０００５】
損傷された組織の修復治療は、拒絶反応のない自己組織を使用することが望ましく、自己組織の移植が簡単に行える方法の出現が望まれている。
【特許文献１】特開２０００−１４３５３４号公報
【特許文献２】WO  02/16556  A1  号公報
【特許文献３】特表２００３−５１２３３３号公報
【特許文献４】特表２００４−５３１２７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、自己の肝臓を用いて調整した幹細胞は移植をしても免疫反応の心配がなく、免疫抑制剤などの薬剤を投与する必要がない。このような多分化能を持った幹細胞を肝臓から大量に得るための方法を提供する。肝臓の中に存在する多分化能を持った幹細胞を、神経細胞を含む種々の細胞や組織に分化誘導させて組織の移植治療を容易にする組織治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
肝臓はその７０％程度を切除しても速やかに増殖して肝臓が再生される。このことは幹細胞（Stem cells）が肝臓には多数存在していることを示す。その肝細胞が肝臓以外の細胞にも分化する多分化能を持つことは、胎児の肝臓から神経細胞への分化もさせることができたことから明らかである。マウスの肝臓を３分の1程度切除すると３日目には再生肝が盛り上がるように増殖してくるがその組織を切除して幹細胞の指標としてネスチンに対する抗体で染色すると多数の陽性細胞が検出されることから、再生肝の増殖期には多分化能を持った細胞が多数存在することが確認できた。すなわち、再生肝に多分化能をもった細胞が存在することは、再生肝にはES細胞（Embrionic Stem-cell）に近い状態の幹細胞が存在することを示している。従って、患者自身の肝臓で再生肝を作らせ、そこから幹細胞を取り出して、神経系の細胞や、その他必要な組織の細胞に分化誘導させて患者本人の欠損した細胞や組織に移植する治療が可能である。この場合、自己の幹細胞を用いることから拒否反応の恐れがないことが特徴である。また、多分化能を持った幹細胞が肝臓に存在することから、再生肝を作成する代りに、肝臓組織の一部をバイオプシーなどで取り出し、その中に含まれる多分化能を持った幹細胞を試験管内で目的の細胞や組織に分化誘導させて移植用の細胞や組織として用いることもできる。このことは、蛍光を発する性質を持つGreen Fluorescent Protein (GFP)の遺伝子を導入して全ての細胞が蛍光を発するようにさせたマウスの肝臓から再生肝から幹細胞を取り出し、ヌードマウスやスキッドマウスに移植して種々の臓器に分化誘導されることを示すこともできる。
【発明の効果】
【０００８】
肝臓の中には多分化能を持った幹細胞が存在し、それを活用して神経細胞を含む種々の細胞や組織に分化誘導させて移植治療に用いることができる。また、患者自身の肝臓から作成した幹細胞を用いれば移植に対する免疫反応は起こらないので免疫抑制剤などの薬剤を投与する必要がない。さらに、多分化能を持った幹細胞を肝臓から大量に作成するには、患者の肝臓の一部を切除することにより速やかに増殖してくる再生肝の組織を用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で記載する「幹細胞」とは、胎児若しくは成人組織由来の細胞であって、複数の細胞系列に分化可能な細胞として定義され、このなかにはヒト神経幹細胞、ヒト間葉系幹細胞、ヒト造血幹細胞、ヒト肝臓系幹細胞などが含まれる。また、「ヒト造血幹細胞」とは胎児若しくは成人組織由来の細胞であり、血液を構成するあらゆる血液細胞に分化可能な細胞として規定される。
【００１０】
実施例１
胎生１３日の肝臓組織を採取し、DMEM/F12培養液（Invitrogen社製）中でほぐして単細胞浮遊液を調製した。ナイロンメッシュでろ過したあと２００ｇで５分間の遠心にかけて細胞を沈殿として集め、それをDMEM/F12培溶液に再浮遊させて同様に遠心する操作を更に２回繰り返し細胞を洗浄した。洗浄した細胞を20ng/mlEGF (epidermal growth factor：Sigma社製)、40 ng/ml bEGF (epidermal growth factor： 和光製、10 ul/ml N2 supplement (Invitrogen社製)、100U/mlペニシリンG、100 ug/ml ストレプトマイシン、100 ng/ml アンフォテリシンB (Invitrogen社製)を含むDMEM/F12培養液に浮遊させた。その細胞をpoly-HEMA (poly 2-hydroxyethyl methacrylate： Sigma社製) をコートした培養シャーレで１週間培養した。数日の内に多くの細胞は死滅していったが、一部の細胞は増殖を始めSphere（細胞塊）の形成を始めた。１週間に２回の割合で培養液を交換しながら更に培養を続けたところ、Sphere（細胞塊）は２週間目まで増大を続けた。図１ａににその細胞塊を示す。
【００１１】
神経系への分化を誘導する条件で培養を行ったので、確かに神経系の細胞に分化誘導されていることを確認するために、神経系に特有な抗原であるNestinで免疫染色を行った。７日目のSphereをアルブミンに対する抗体で免疫染色すると多くの細胞は肝細胞が産生するアルブミンを産生し、図１ｂに示すように染色された。Nestinでは11.4% +/- 3.3% の細胞が染色され１０％以上の細胞が神経系の細胞に分化を始めたことが、図１ｃに示すように確認された。
【００１２】
７日目のSphere（細胞塊）をpoly-D-lysine/laminin-coated slipsの上で10%FBS（牛胎児血清）およびEGF、ｂFGF、RA、BDNF、NGF、NT-3などの神経系への増殖因子を添加したDMEM/F12培養液中で培養して神経系細胞へ分化誘導させた。その結果、細胞はSphere（細胞塊）から遊出をはじめ、図２ａに示すように突起を伸ばした細胞になってきた。分化した細胞は、単突起（図２ｂ）、２突起（図２ｃ）、多突起（図２ｄ）などの神経細胞様の形態を示した。分化誘導培養の７日目で神経細胞の抗原発現を免疫染色法で観察したところ、６４．３％がベータチュブリン陽性であり（図３ａ）、７１．３％がMicrotubukin-associated proteins-2 (MAP-2)（図３ｂ） 、８９．５％がneurofilament-H (NF-H)（図３ｃ）が夫々陽性に染色され、成熟神経細胞の特徴を示していた。これに対し、グリア細胞の特徴抗原であるGFAPやO4抗原の発現は認められなかったので、神経細胞に特化しての分化誘導も可能であることが示された。
【００１３】
GABA反応性神経細胞のマーカーとして知られるGADは抹消神経には発現が認められないが、上記の分化誘導細胞では62.4％にGAD陽性細胞が認められ、中枢神経系の神経細胞に分化誘導できたことを図３ｄに示す。
【００１４】
実施例２
実施例１の方法で、胎児肝から神経細胞に分化誘導した細胞が神経細胞の特徴的な機能を持っていることを細胞生理学的手法で立証した。分化誘導１４日目の培養細胞の細胞膜の電荷ポテンシャルはマイナス26 +/- 9.7 mVであった。そこで、図４ａ及び図４ｂに示すようにパッチクランプ法でイオンカレントの測定を行った。電圧を上げてゆくと外向き電流が87％の細胞で認められた。その電流はK+channel blockers (TEA-Cl および4-amynopyridine)で阻害を受けたので、図４ｃ及び図４ｄに示すように、神経細胞の特徴である電圧依存性のK+-currentの機能を神経様細胞に分化誘導された細胞が保有していることが確認できた。そのイオン電流は１マイクロモルのTetrodotoxin（TTX）を外液に加えておいても阻害を受けず、TTXには非感受性であった。なお、アクションポテンシャルは10ｐAまで刺激を受けなかった。
【００１５】
さらに、神経伝達物質（Neurotransmitters）に対する反応性の解析も行った。図４ｆ、図４ｈ、図４ｊに示すように、内向電流（Innard-current）はGlutamateにより７５％祖細胞で、GABAにより６５％の細胞で、セロトニンによっては１００％の細胞で認められた。しかし、ドーパミンおよびアセチルコリンには反応性を示さなかった。図４ｅ、図４ｇ、図４ｉに示すように、神経系への分化誘導用因子を入れずに培養した胎児肝細胞ではGlutamate、GABA、セロトニンのどれとも全く反応性を示さなかった。しかし、約５０％の細胞は電圧依存性のK+-currentの機能を示していた。
【００１６】
以上の結果から、胎児肝の幹細胞は神経細胞へ分化誘導することができ、神経細胞の機能も保持していることが立証できた。
【００１７】
実施例３
胎生13日めのマウスの肝臓をアルブミンに対する抗体で赤色に蛍光染色すると、図５ａに示すように、殆どの細胞でアルブミンを産生している。この胎児肝をNestinに対する抗体でグリーンに蛍光染色すると、図５ｂに示すように、長い突起を伸ばしているような細胞がアルブミン陽性の幹細胞の間に散在して存在していた。しかし、正常の成体の肝臓組織にはNesutin陽性細胞は、図５ｃに示すように殆ど検出されなかった。これに対し、成体マウスの肝臓を３分の２ほど切除した後３日目に増殖して来た再生肝の組織をNestin抗体で蛍光染色すると胎児肝と同様に多数のNestin陽性細胞が検出され、再生肝では神経系への分可能も持つ幹細胞が胎児肝と同様に多数存在することが確認できた。したがって、再生肝を幹細胞のソースとして用いることにより、神経細胞に分化させ、これを患者自身に移植することが可能である。すなわち、自己の幹細胞由来の自己細胞移植や自己再生組織移植に活用すれば拒否反応の心配の無い再生医療が可能となることを示している。
【００１８】
実施例４
Green Fluorescent Protein (GFP)の遺伝子を導入したグリーンマウスは、常にGFPを発現しているので、その細胞の存在を追跡することができる。このグリーンマウスの肝臓を３分の２程度切除し、３日ごに増殖してくる再生肝組織を採取して、実施例１で用いたと同様な方法で細胞を分離した。この細胞をX線照射したC57BL/6マウスの尾静脈から注入した。４週間後に観察すると骨髄、胸腺、消化管粘膜下組織、皮下毛根組織などに蛍光を発するグリーンマウス由来の細胞の存在が観察された。
【００１９】
上記結果より、再生肝に含まれる幹細胞は多分化能を持ち、ES細胞に類似した性格を持っていると考えられる。従って、再生肝からの幹細胞をES細胞と同様に分化誘導することにより、患者自身への移植用細胞や移植用組織、移植用臓器、あるいは神経変性疾患患者への移植治療等の拒絶反応の恐れの無い再生医療に活用できる。
【００２０】
神経幹細胞培養物の成分濃度を以下に例示する。
【００２１】
成分                                      最終濃度
ＤＭＥＭ／Ｆ１２の５０／５０混合物      0.5~2.0倍、好ましくは１倍
グルコース                              0.2~1.0、好ましくは0.6％W/V
グルタミン                              0.1~10mM、好ましくは2mM
NaHCO3                                0.1~10mM、好ましくは3mM
HEPES                                  0.1~10mM、好ましくは5mM
アポトランスフェリン                    1~1000μg/ml、好ましくは100~1000μg/ml
ヒトインスリン                          1~100μg/ml、好ましくは25μg/ml
プトレッシン                            1~500μg/ml、好ましくは60μM
セレン                                  1~100μg/ml、好ましくは30μM
プロゲステロン                          1~100μg/ml、好ましくは20μM
EGF                                    0.2~200ng/ml、好ましくは20ng/ml
ｂFGF                                  0.2~200ng/ml、好ましくは20ng/ml
LIF                                     0.1~500ng/ml、好ましくは10ng/ml
ヘパリン                                0.1~50μg/ml、好ましくは2μg/ml
CO2                                    好ましくは５％
この他、必要に応じて血清成分が添加される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１ａ】胎生１３日目の胎児肝から作成した1週間目のSphere（細胞塊）を示す。
【図１ｂ】アルブミンに対する抗体で蛍光染色すると多数の細胞が染色された。
【図１ｃ】１０％程度の細胞はNestinで陽性に染色された。
【図２ａ】1週間で形成したSphereを神経細胞への分化誘導させると７日目にはSphereから細胞が遊出して広がってくることを示す。
【図２ｂ】遊出した細胞は単突起を示す。
【図２ｃ】２突起の形態を示す。
【図２ｄ】多突起を現し神経細胞様の形態を示す。
【図３ａ】神経細胞への分化誘導7日目の神経細胞様の形態を示している細胞をベータTubulinに対する蛍光標識抗体で染色する神経細胞に特徴的な特異染色が認められたことを示す。
【図３ｂ】MAP-2をに対する蛍光標識抗体で染色する神経細胞に特徴的な特異染色が認められたことを示す。
【図３ｃ】Neurofilament-Hに対する蛍光標識抗体で染色する神経細胞に特徴的な特異染色が認められたことを示す。
【図３ｄ】GADに対する蛍光標識抗体で染色する神経細胞に特徴的な特異染色が認められたことを示す。カウンター染色としてはHoechst33258でブルーに染めた状態で示している。
【図４ａ】胎児肝由来細胞を肝臓用培地で１４日間培養した細胞を示している。
【図４ｂ】および神経系細胞への分化誘導用培地で１４日間培養した細胞にパッチクランプの電極ガラスを当てたところの写真である。
【図４ｃ】神経細胞様に分化させた細胞について、Voltage gated potasium currentを示している。
【図４ｄ】図４ｃの反応がK+channel blockersで抑制されることを示している。
【図４ｅ】幹細胞用培地で培養した細胞はGlutamateに反応性を示さなかった。
【図４ｆ】はGlutamateｄｅ刺激を感受することを示している。
【図４ｇ】幹細胞用培地で培養した細胞はGABAに反応性を示さなかった。
【図４ｈ】GABAで刺激を感受することを示している。
【図４ｉ】幹細胞用培地で培養した細胞はセロトニンに反応性を示さなかった。
【図４ｊ】セロトニンでの刺激を感受することを示している。
【図５ａ】胎生１３日目の胎児肝組織切片をアルブミンに対する抗体で赤色に蛍光染色すると極めて多数の細胞が陽性を示している。
【図５ｂ】組織をNestinに対する抗体でグリーンに蛍光染色するとNesutin陽性の細胞が幹細胞の間に散在していることを示している。。
【図５ｃ】成体マウスの間組織切片では、Nestunに染色される細胞は殆ど検出されないことを示している。。
【図５ｄ】成体マウスの肝臓を3分の２ほど切除することにより増殖してくる再生肝の３日目の組織切片では胎児肝と同様にNestin陽性細胞が多数観察されることを示している。
【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図４ｈ】
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【図４ｉ】
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【図４ｊ】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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