(57)【要約】【課題】ＬＡＭＰ法の反応原理を応用した新たな核酸増幅方法を提供する。【解決手段】５´末端側から３´末端側にかけて、核酸配列領域（ａ）、領域（ａ）の配列と相補的な核酸配列領域（ｂ）、および、標的核酸配列における領域（ｃ’）に相補的な核酸配列領域（ｃ）を含有するプライマー（Ａ）を、少なくとも２種含むことを特徴とする、標的核酸配列増幅用プライマーセット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５´末端側から３´末端側にかけて、核酸配列領域（ａ）、領域（ａ）の配列と相補的な核酸配列領域（ｂ）、および、標的核酸配列における領域（ｃ’）に相補的な核酸配列領域（ｃ）を含有するプライマー（Ａ）を、少なくとも２種含むことを特徴とする、標的核酸配列増幅用プライマーセット。
【請求項２】
プライマー（Ａ）に加え、標的核酸配列における領域（ｄ’）に相補的な核酸配列領域（ｄ）を有するプライマー（Ｂ）を、少なくとも２種含むことを特徴とする、請求項１に記載の標的核酸配列増幅用プライマーセット（ただし、標的核酸配列において、領域（ｄ’）は領域（ｃ’）より３´末端側に存在する。）。
【請求項３】
等温下における標的核酸配列の増幅に用いるための請求項１または２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
領域（ａ）および（ｂ）が各々５０塩基以下からなることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項５】
領域（ａ）と（ｂ）との間に存在する配列が１０塩基以下からなるか、あるいは領域（ａ）と（ｂ）とが隣接していることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項６】
領域（ａ）と（ｂ）がアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）のみで構成されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか1項に記載のプライマーセット。
【請求項７】
領域（ｃ）のＴｍ値が領域（ａ）のＴｍ値より高いことを特徴とする、請求項1〜６のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項８】
標的核酸配列を含む核酸試料と、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプライマーセットが存在する反応系で、核酸試料中の標的核酸配列の増幅反応を行う核酸増幅方法。
【請求項９】
下記工程を含む、請求項８に記載の核酸増幅方法。
（１）プライマー（Ａ）を標的核酸配列にハイブリダイズさせ、プライマー（Ａ）の３´末端を起点とする核酸合成反応を行う工程
（２）工程（１）で合成された核酸にプライマー（Ｂ）を標的核酸配列にハイブリダイズさせ、プライマー（Ｂ）の３´末端を起点として核酸合成反応を行う工程
（３）工程（２）で合成された核酸にプライマー（Ａ）をハイブリダイズさせ、プライマー（Ａ）の３´末端を起点として核酸合成反応を行う工程
（４）工程（３）で合成された核酸にプライマー（Ｂ）を標的核酸配列にハイブリダイズさせ、プライマー（Ｂ）の３´末端を起点として核酸合成反応を行う工程
（５）工程（４）で合成された核酸の３´末端を、同一鎖上の相補的な塩基配列からなる領域にハイブリダイズさせ、その３´末端を起点とする核酸合成反応を行う工程
（６）工程（５）で合成された核酸の３´末端を、同一鎖上の相補的な塩基配列からなる領域にハイブリダイズさせ、その３´末端を起点とする核酸合成反応を行う工程
【請求項１０】
反応系に、さらに変異認識タンパク質が存在することを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
変異認識タンパク質がＭｕｔＳ、ＭＳＨ２もしくはＭＳＨ６、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
反応系に、さらに融解温度調整剤が存在することを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれら２種以上の混合物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
核酸増幅反応が等温で行われることを特徴とする請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
以下の工程を含む、標的核酸配列における変異の有無を検出するための方法。
（１）標的核酸配列を含む核酸試料と、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプライマーセットが存在する反応系で、核酸試料中の標的核酸配列の増幅反応を行う工程
（２）核酸増幅反応の生成物の有無により、標的核酸配列における変異の有無を判定する工程
【請求項１６】
以下の工程を含む、標的核酸配列におけるメチル化の有無を検出するための方法。
（１）標的核酸配列を含む核酸試料中のメチル化されている塩基を別の塩基に置換する処理を行う工程
（２）被検メチル化部位を含むプライマーを含有する請求項１〜７のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて、標的核酸配列の増幅反応を行う工程
（３）核酸増幅反応の生成物の有無により、標的核酸配列におけるメチル化の有無を判定する工程
【請求項１７】
工程（２）のメチル化されている塩基を別の塩基に変換する処理が、亜硫酸水素塩による処理であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項８〜１４のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のプライマーセット、核酸合成酵素、基質、緩衝液を少なくとも含むことを特徴とする、核酸増幅用キット。
【請求項２０】
変異認識タンパク質を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の核酸増幅用キット
【請求項２１】
融解温度調整剤を含むことを特徴とする請求項１９または２０に記載の核酸増幅用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規遺伝子増幅法に用いられるプライマーセットおよびキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の変異は、翻訳アミノ酸の変化を伴うミスセンス変異、アミノ酸の変化を伴わないサイレント変異、更に塩基の欠失や挿入によって翻訳フレームがずれるフレームシフト変異などの原因となる可能性がある。また、遺伝子の変異は、スプライシングの異常等を通じて遺伝子の翻訳異常につながる可能性もあり、サイレント変異以外の変異は、タンパク質の構造的な、あるいは機能的な変化を伴うケースが多い。更に、タンパク質の発現調節領域における変異は、タンパク質の発現調節機構に影響を与える恐れがある。
【０００３】
核酸の塩基配列上の差異のうち、ある集団内で１％以上の頻度で存在する変異は、特に多型と呼ばれている。ここで集団とは、地理的な隔離や亜種によって区別される集団を意味する。多型の中でも、一塩基の挿入、欠失、置換による多型は、特に一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ；以下、ＳＮＰｓと省略する）と呼ばれている。ＳＮＰｓは、ヒトゲノムの中で最も出現頻度が高い多型であるため注目されている。多型は、一定の頻度で集団に広がっていることから、全く形質の変化を伴わないものか、特に生存あるいは生殖に不利な形質ではなく、いわば体質といえる形質を左右しているものと考えられる。
【０００４】
多型に対して、１％未満で見出される変異は、ヒトの場合は集団内で広がらない変異で、ほとんどが疾患に関わるものである可能性が高い。すなわち、遺伝病において見出される変異が相当する。また、個体内で見出される変異においても、癌等において見出される変異のように疾患にかかわるものがある。このような変異の検出は、対応する疾患の診断において決定的な情報を与える。
【０００５】
ある遺伝子について、その塩基配列が予測された塩基配列と比較して相違しているか否かは、相補的な塩基配列のハイブリダイズによって確認できる。具体的には、プライマーやプローブのハイブリダイズが利用される。例えば、核酸増幅用のプライマーは、標的塩基配列がプライマーに相補的な塩基配列を持つ場合にのみプライマーとして作用することができる。この原理に基づいて、核酸増幅産物を指標として、標的塩基配列がプライマーに相補的であるかどうかを知ることができる。
【０００６】
核酸増幅方法の一つとしてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が知られている（非特許文献１）。しかしＰＣＲに基づく塩基配列の確認方法には、いくつかの問題点がある。ＰＣＲにおいては、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合には、その生成物が以降の反応の鋳型として機能して誤った結果を与える原因となる。さらに、ＰＣＲ法においては、実施のために特別な温度調節装置が必要なこと、増幅反応が指数的に進むことから定量性に問題があること、試料や反応液が外部からの汚染を受け、誤って混入した核酸が鋳型として機能してしまうコンタミネーションの影響を受け易いこと等の問題点がある。
【０００７】
等温条件で実施することができ、しかもＰＣＲに比較して、反応特異性を高い水準に維持することができる核酸増幅方法として、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が用いられている（特許文献１、非特許文献２）。また、ＬＡＭＰ法を応用したＳＮＰｓの検出方法（非特許文献３）、ＬＡＭＰ法を改良した核酸増幅方法（特許文献２）についても報告されている。ＬＡＭＰ法には、鋳型の塩基配列が設計とは異なっていたときに核酸の増幅反応が著しく阻害されるという特徴がある。この特徴により、ＬＡＭＰ法に基づく変異の検出方法による、高い特異性が実現されている。
【０００８】
【特許文献１】国際公開公報００／２８０８２号パンフレット
【特許文献２】国際公開公報２００２／０９０５３８号パンフレット
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４，１９８５
【非特許文献２】Ｔ．Ｎｏｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２０００，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１２，ｅ６３
【非特許文献３】Ｔｈｅ ３ｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０００．１１．１３〜１４；Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ａ Ｎｏｖｅｌ ＳＮＰ Ｔｙｐｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ，ＬＡＭＰ ＫＡＮＤＡ，Ｈｉｄｅｔｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．
【非特許文献４】栄研化学株式会社、「ＬＡＭＰ法の原理」（プライマー設計）、２００５年、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｌｏｏｐａｍｐ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｌａｍｐ／ｐｒｉｍｅｒ．ｈｔｍｌ＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、ＬＡＭＰ法およびその改良法には、特殊なプライマー構造を必要としプライマー設計の自由度が制限されるという問題があった。例えば図１に示すように、ＬＡＭＰ法に使用するプライマーは、鋳型核酸と相補的な配列を二領域にわたって有する必要がある。さらにプライマー間距離、各プライマーの融解温度（以下、Ｔｍ値ともいう）、各プライマー領域の末端安定性、ＧＣ含量を最適化する必要があり、極端に二次構造をとらないようにするとともに３´末端が相補的にならないようにしなければならない等のプライマー設計上の制限がある（非特許文献４を参考のこと）。
【００１０】
本発明は、前記の問題を解決する、ＬＡＭＰ法の反応原理を応用した新たな核酸増幅方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するため研究を重ねた結果、特定の構造を有するプライマーセットをＬＡＭＰ法に応用することにより、新しい原理で核酸増幅を行うことができることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の構成よりなる。
【００１２】
＜１＞５´末端側から３´末端側にかけて、核酸配列領域（ａ）、領域（ａ）の配列と相補的な核酸配列領域（ｂ）、および、標的核酸配列における領域（ｃ’）に相補的な核酸配列領域（ｃ）を含有するプライマー（Ａ）を、少なくとも２種含むことを特徴とする、標的核酸配列増幅用プライマーセット。
＜２＞プライマー（Ａ）に加え、標的核酸配列における領域（ｄ’）に相補的な核酸配列領域（ｄ）を有するプライマー（Ｂ）を、少なくとも２種含むことを特徴とする、＜１＞に記載の標的核酸配列増幅用プライマーセット（ただし、標的核酸配列において、領域（ｄ’）は領域（ｃ’）より３´末端側に存在する。）。
＜３＞等温下における標的核酸配列の増幅に用いるための＜１＞または＜２＞に記載のプライマーセット。
＜４＞領域（ａ）および（ｂ）が各々５０塩基以下からなることを特徴とする、＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のプライマーセット。
＜５＞領域（ａ）と（ｂ）との間に存在する配列が１０塩基以下からなるか、あるいは領域（ａ）と（ｂ）とが隣接していることを特徴とする、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載のプライマーセット。
＜６＞領域（ａ）と（ｂ）がアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）のみで構成されていることを特徴とする、＜１＞〜＜５＞のいずれか1項に記載のプライマーセット。
＜７＞領域（ｃ）のＴｍ値が領域（ａ）のＴｍ値より高いことを特徴とする、＜1＞〜＜６＞のいずれか１項に記載のプライマーセット。
＜８＞標的核酸配列を含む核酸試料と、＜１＞〜＜７＞のいずれか１項に記載のプライマーセットが存在する反応系で、核酸試料中の標的核酸配列の増幅反応を行う核酸増幅方法。
＜９＞下記工程を含む、＜８＞に記載の核酸増幅方法。
（１）プライマー（Ａ）を標的核酸配列にハイブリダイズさせ、プライマー（Ａ）の３´末端を起点とする核酸合成反応を行う工程
（２）工程（１）で合成された核酸にプライマー（Ｂ）を標的核酸配列にハイブリダイズさせ、プライマー（Ｂ）の３´末端を起点として核酸合成反応を行う工程
（３）工程（２）で合成された核酸にプライマー（Ａ）をハイブリダイズさせ、プライマー（Ａ）の３´末端を起点として核酸合成反応を行う工程
（４）工程（３）で合成された核酸にプライマー（Ｂ）を標的核酸配列にハイブリダイズさせ、プライマー（Ｂ）の３´末端を起点として核酸合成反応を行う工程
（５）工程（４）で合成された核酸の３´末端を、同一鎖上の相補的な塩基配列からなる領域にハイブリダイズさせ、その３´末端を起点とする核酸合成反応を行う工程
（６）工程（５）で合成された核酸の３´末端を、同一鎖上の相補的な塩基配列からなる領域にハイブリダイズさせ、その３´末端を起点とする核酸合成反応を行う工程
＜１０＞反応系に、さらに変異認識タンパク質が存在することを特徴とする、＜８＞または＜９＞に記載の方法。
＜１１＞変異認識タンパク質がＭｕｔＳ、ＭＳＨ２もしくはＭＳＨ６、またはこれらの２種以上の混合物である、＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞反応系に、さらに融解温度調整剤が存在することを特徴とする、＜８＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１３＞融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれら２種以上の混合物である、＜１２＞に記載の方法。
＜１４＞核酸増幅反応が等温で行われることを特徴とする＜８＞〜＜１３＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１５＞以下の工程を含む、標的核酸配列における変異の有無を検出するための方法。
（１）標的核酸配列を含む核酸試料と、＜１＞〜＜７＞のいずれか１項に記載のプライマーセットが存在する反応系で、核酸試料中の標的核酸配列の増幅反応を行う工程
（２）核酸増幅反応の生成物の有無により、標的核酸配列における変異の有無を判定する工程
＜１６＞以下の工程を含む、標的核酸配列におけるメチル化の有無を検出するための方法。
（１）標的核酸配列を含む核酸試料中のメチル化されている塩基を別の塩基に置換する処理を行う工程
（２）被検メチル化部位を含むプライマーを含有する＜１＞〜＜７＞のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて、標的核酸配列の増幅反応を行う工程
（３）核酸増幅反応の生成物の有無により、標的核酸配列におけるメチル化の有無を判定する工程
＜１７＞工程（２）のメチル化されている塩基を別の塩基に変換する処理が、亜硫酸水素塩による処理であることを特徴とする＜１６＞に記載の方法。
＜１８＞＜８〜＜１４のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、＜１５＞〜＜１７＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１９＞＜１＞〜＜７＞のいずれか１項に記載のプライマーセット、核酸合成酵素、基質、緩衝液を少なくとも含むことを特徴とする、核酸増幅用キット。
＜２０＞変異認識タンパク質を含むことを特徴とする、＜１９＞に記載の核酸増幅用キット
＜２１＞融解温度調整剤を含むことを特徴とする＜１９＞または＜２０＞に記載の核酸増幅用キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明におけるプライマーは図２に示すように、鋳型核酸にハイブリダイズする領域は一領域を有していればよく、プライマー設計における自由度が高いという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明による核酸増幅反応の作用機序を、を図３および４（工程１〜５）、図５（工程６〜９）に基づいて説明する。
【００１５】
工程１：標的核酸配列を含む核酸試料と試薬を混合し、６０℃でインキュベートする。標的核酸は６０℃付近では動的平衡状態にあり、第一のプライマー（図３のＦＴＰ）および第二のプライマー（図４のＢＴＰ）のいずれかが標的核酸の相補的な部分にハイブリダイズし、そこから伸長することで、片側の鎖が剥がされて一本鎖状態となる。
【００１６】
工程２：鎖置換型核酸合成酵素の働きにより、図３のＦＴＰ（図４のＢＴＰ）の図３のＦ１（図４のＢ１）領域の３´末端を起点として鋳型核酸と相補的な核酸鎖が合成される。この核酸鎖は、５´末端側に自己相補的な領域ＦＴ、ＦＴｃを有するため、自己分子内でハイブリダイズして折り返し領域を形成している。
【００１７】
工程３：図３のＦＴＰ（図４のＢＴＰ）の外側に図３のＦ２（図４のＢ２）プライマーがハイブリダイズし、その３´末端を起点として、鎖置換型核酸合成酵素の働きにより、先に合成されている図３のＦＴＰ（図４のＢＴＰ）からの核酸鎖を剥がしながら核酸合成が伸長していく。
【００１８】
工程４：図３のＦ２（図４のＢ２）プライマーから合成された核酸鎖と鋳型核酸が二本鎖となる。工程３で剥がされて一本鎖となった図３のＦＴＰ（図４のＢＴＰ）から合成された核酸鎖に図３のＢＴＰ（図４のＦＴＰ）がハイブリダイズし、この図３のＢＴＰ（図４のＦＴＰ）の３´末端を起点として、相補的な核酸合成が行われる。
【００１９】
工程５：図３のＢＴＰ（図４のＦＴＰ）の外側に図３のＢ２（図４のＦ２）プライマーがハイブリダイズし、その３´末端を起点として、鎖置換型核酸合成酵素の働きによって、先に合成されている図３のＢＴＰ（図４のＦＴＰ）からの核酸鎖を剥がしながら核酸合成が伸長していく。この過程により二本鎖核酸ができる。また、工程５の過程で剥がされた図３のＢＴＰ（図４のＦＴＰ）から合成された核酸鎖は両端に自己相補的な配列を持つため、自己分子内でハイブリダイズし、折り返し領域を形成してダンベル型の構造（５）となる。この構造は工程６以降の増幅サイクルの起点構造となる。
【００２０】
工程６：図３のダンベル型構造以降の工程を図５に基づいて説明するが、図４のダンベル型構造以降の工程についても同様である。工程５（図３）で形成されたダンベル型の構造（５）は、３´末端のＦＴ領域を起点として自己を鋳型とした核酸合成が伸長し、この時、５´末端側のループは剥がされて延びる。さらに、３´末端側のループのＦ１ｃ領域は一本鎖であるためＦＴＰがハイブリダイズすることができ、そのＦ１領域の３´末端を起点として、ＦＴ領域から先に合成されている核酸鎖を剥がしながら核酸合成が伸長していく。
【００２１】
工程７：工程６において、ＦＴＰから伸長合成された核酸鎖によって剥がされて一本鎖となったＦＴ領域から伸長した核酸鎖は、その３´末端側に自己相補的な領域を持つためループを形成する。このループのＢＴ領域の３´末端から、一本鎖となった自己を鋳型として核酸合成を開始する。そして、この核酸鎖が二本鎖部分となっているＦＴＰからの核酸鎖を剥がしながら伸長し、構造（７）となる。
【００２２】
工程８：工程７の過程によってＦＴＰから合成された核酸鎖は一本鎖となり、その両端にそれぞれ自己相補的な領域ＦＴ、ＦＴｃ及びＢＴｃ、ＢＴを持っているため、自己分子内でハイブリダイズして折り返し領域を形成する。この構造（８）は工程５で形成された構造（５）と相補的な構造となる。この構造（８）では、構造（５）の場合と同様にＢＴ領域の３´末端を起点として自己を鋳型とした核酸合成が行われ、さらに一本鎖となっているＢ１ｃ領域にＢＴＰがハイブリダイズしてＢＴ領域からの核酸鎖を剥がしながら核酸合成を行う。それにより、工程５、６、８と同様の過程を経て再び構造（５）ができる。
【００２３】
工程９：構造（７）において、一本鎖となっているＢ１領域にＢＴＰがハイブリダイズし、二本鎖部分を剥がしながら核酸鎖が合成される。そしてこれらの過程の結果、同一鎖上に互いに相補的な配列を繰り返す構造の増幅産物がいろいろな鎖長で合成されることとなる。以上の反応を繰り返すことにより、鋳型核酸中の標的核酸配列に相補的な核酸を大量に合成することが可能となる。
【００２４】
本発明によるプライマーセットは、以上のような核酸増幅反応による標的核酸配列の増幅を可能とする少なくとも２種のプライマーを含んでなるものである。すなわち、本発明のプライマーセットに含まれるプライマー（Ａ）は、５´末端側から３´末端側にかけて、同一鎖上の配列領域（ｂ）（図２のＦＴｃおよびＢＴｃ）に対して相補的な配列領域（ａ）（図２のＦＴおよびＢＴ）、領域（ａ）に相補的な配列領域（ｂ）、標的核酸にハイブリダイズし増幅起点となりうる３´末端側の配列領域（ｃ）（図２のＦ１およびＢ１）を有するプライマーである。
【００２５】
本発明に用いるプライマーは、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドにより構成されており、与えられた条件下で必要な特異性を維持しながら標的核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を有するものである。本発明に用いるプライマーの鎖長は、プライマー（Ａ）の場合、標的核酸配列以外に自己相補的な領域（ａ）、（ｂ）を含むため、通常ＰＣＲ法で知られているプライマーより長い方が好ましい。好ましくは１５〜１００塩基、より好ましくは２５〜５０塩基である。また、プライマー（Ｂ）の場合、通常ＰＣＲ法で用いられているプライマーと同じく、好ましくは、１０〜５０塩基、より好ましくは、１５〜３０塩基である。
【００２６】
本発明のプライマーを構成する領域（ａ）、（ｂ）の各鎖長は、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは１０塩基以下とし、さらに好ましくは、５塩基である。また、必要に応じて、領域（ａ）と領域（ｂ）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。該介在配列の鎖長は好ましくは１０塩基以下、より好ましくは５塩基以下とする。標的核酸配列と相補的でない配列を有していることが好ましい。上記したように領域（ａ）と領域（ｂ）は相補的な塩基配列からなることが好ましい。例えば、領域（ａ）と（ｂ）がアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）のみで構成されていてもよい。
【００２７】
また、本発明に用いるプライマーを構成する領域（ｃ）は、核酸増幅反応において鋳型の相補鎖合成の起点となり得るものであればよい。領域（ｃ）の鎖長は、好ましくは、１０〜５０塩基、より好ましくは、１５〜３０塩基である。
【００２８】
本発明に用いるプライマーにおいては、領域（ｃ）のＴｍ値を領域（ａ）のＴｍ値より高く設定することが好ましい。領域（ｃ）と領域（ａ）のＴｍ値の差は好ましくは０〜２０℃、より好ましくは、５〜１０℃である。
【００２９】
本発明に用いるプライマーには、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、および未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドおよび未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー等も含まれる。
【００３０】
本発明によるプライマーセットは、少なくとも２種の前記プライマー（Ａ）に加えて、標的核酸配列領域（ｄ’）に相補的な配列領域（ｄ）を有するプライマー（Ｂ）を、少なくとも２種含むことが好ましい（ただし、鋳型核酸配列において、配列領域（ｄ’）は配列領域（ｃ’）より３´末端側に存在する。）。
【００３１】
本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、オリゴヌクレオチドの合成に用いることのできる任意の方法、例えば、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等により合成できる。前記第一および第二のプライマーは、例えば、ＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いてホスホアミダイト法により合成すれば、容易に取得することができる。
【００３２】
本発明に用いるプライマーは、公知の標識物質によって標識することができる。標識物質としては、ジゴキシンやビオチンのような結合性リガンド、酵素、蛍光物質や発光物質、あるいは放射性同位元素などを示すことができる。
【００３３】
本明細書において単に「５´末端側」、あるいは「３´末端側」と表現するときには、いずれも鋳型となっている方の鎖における方向を意味する。また３´末端側が相補鎖合成の起点となるというときには、その３´末端側の−ＯＨ基が相補鎖合成の起点となっていることを意味する。
【００３４】
本発明における「オリゴヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドの中でも特に構成塩基数が少ないものを示す。一般にオリゴヌクレオチドは、２〜１００、より一般的には、２〜５０程度の塩基数のポリヌクレオチドを指してオリゴヌクレオチドと呼ぶが、これらの数値には限定されない。
【００３５】
本発明において「標的核酸」または「標的核酸配列」とは、本発明において合成を目的とする核酸を構成する塩基配列を示す。また本発明の核酸増幅方法に基づいて、核酸の増幅を行う場合には、増幅すべき核酸を構成する塩基配列が標的核酸配列である。
【００３６】
一般に核酸の塩基配列は、５´末端側から３´末端側に向けてセンス鎖の塩基配列を記載する。本発明における標的塩基配列とは、センス鎖の塩基配列に加えて、その相補鎖、すなわちアンチセンス鎖の塩基配列も含む。すなわち、前記「標的核酸」または「標的核酸配列」とは、増幅すべき塩基配列、およびその相補鎖の少なくともいずれかを意味する用語として用いる。
【００３７】
本発明において、標的核酸配列は、鋳型として利用する核酸の塩基配列に限定されない。したがって、標的核酸配列は、鋳型と同じ塩基配列からなる場合もあるし、異なる塩基配列とすることもできる。鋳型の塩基配列に変異を導入してもよく、あるいは鋳型の塩基配列の一部をつなぎ合わせた塩基配列からなる標的塩基配列を合成することもできる。
【００３８】
本発明において「鋳型」とは、相補鎖合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を持つ相補鎖は、鋳型に対応する鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び鋳型として機能することができる。
【００３９】
本発明においては、鋳型核酸に含まれる塩基配列をそのまま標的核酸配列として合成する場合と、鋳型核酸とは異なる塩基配列を有する核酸の合成を目的とする場合とがある。鋳型核酸とは異なる塩基配列を有する核酸とは、例えば鋳型核酸に含まれる塩基配列に対して変異を導入したり、あるいは鋳型核酸上で離れて存在する領域を連続する塩基配列として合成する場合が挙げられる。更に本発明における標的核酸配列は、異なる核酸に由来する塩基配列を連結した塩基配列とすることもできる。
【００４０】
本発明において「核酸の合成」とは、合成起点となったオリゴヌクレオチドからの核酸の伸長を意味する。合成に加えて、更に他の核酸の生成と、この生成された核酸の伸長反応とが連続して起きるとき、一連の反応を総合して「核酸の増幅」という。
【００４１】
本発明において「ハイブリダイズ」とは、核酸がワトソン−クリックのモデルに基づく塩基対結合によって２重らせん構造を形成することを示す。したがって、塩基対結合を構成する核酸鎖が１本鎖であっても、分子内の相補的な塩基配列が塩基対結合を形成すれば、ハイブリダイズである。本発明において、「アニール」と「ハイブリダイズ」は、核酸が塩基対結合による２重らせん構造を構成する点で同義である。
【００４２】
本発明に用いるプライマーを構成する塩基配列の特徴付けのために用いられる「相補的」という用語には、完全に相補的でない塩基配列が含まれる。すなわち、ある配列と相補的とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、相補鎖合成の起点を提供することができる配列を意味する。
【００４３】
前記ストリンジェントな条件とは、本発明によるプライマーとその相補鎖との二重鎖のＴｍ値およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ, Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ， Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ(１９８９)等を参照することができる。
【００４４】
例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、プライマーを標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、市販のプライマー構築ソフト、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）などを用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーは、その標的核酸に相補的な核酸分子の全部または一部の配列を含んでなるものである。
【００４５】
本発明において「核酸」とは、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、あるいはそれらのキメラ分子を示す。「核酸」は、用語「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸は、天然のものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。また部分的に、あるいは全体が完全に人工的な構造からなるヌクレオチド誘導体であっても、それが塩基対結合を形成しうるものであるかぎり、本発明の核酸に含まれる。また、本発明における核酸の構成塩基数は、特に限定されない。
【００４６】
本発明の核酸増幅反応において用いられる標的核酸配列を含む核酸試料または鋳型核酸は、例えば、血液、組織、細胞、さらには動物、植物のような生体由来試料、または食品、土壌、排水等から分離された微生物由来試料から単離することができる。核酸試料の単離は任意の方法で行うことができ、例えば、界面活性剤による溶解処理、音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌およびフレンチプレス等を用いる方法が挙げられる。また、内在性ヌクレアーゼが存在する場合には、単離された核酸を精製することが好ましい。核酸の精製は、例えば、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動、密度に依存した遠心分離などにより実施することが可能である。
【００４７】
より具体的には、前記核酸試料または鋳型核酸としては、上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような二本鎖核酸、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖核酸のいずれも使用可能である。上記二本鎖核酸の場合は、変性工程（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）を行なって一本鎖とすることにより、より最適に利用することができる。
【００４８】
前記逆転写反応に用いられる酵素は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定されず、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能である。
【００４９】
核酸増幅反応では、鋳型核酸が二本鎖核酸の場合でも、これをそのまま反応に用いることができるが、必要に応じてそれらを変性して一本鎖にすることにより、鋳型核酸へのプライマーのアニーリングを効率よく行うこともできる。温度を約９５℃に上昇させることは、好ましい核酸変性法である。他の方法として、ｐＨを上昇させることにより変性させることも可能であるが、この場合には、プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせるためにｐＨを低下させる必要がある。
【００５０】
本発明の核酸増幅反応に用いるＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このＤＮＡポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５´→３´エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。
【００５１】
本発明の核酸増幅反応に使用するＤＮＡポリメラーゼとして、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、以下「Ｂ．ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、以下「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。
【００５２】
また、本発明の核酸増幅反応に使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）  ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、9°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｅｒ  ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。
【００５３】
さらに、本発明の核酸増幅反応においては、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等を使うことにより、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡからの逆転写反応とｃＤＮＡを鋳型にしたＤＮＡポリメラーゼ反応を１種類のポリメラーゼで行なうことが可能である。また、ＤＮＡポリメラーゼと、ＭＭＬＶ逆転写酵素などの逆転写酵素とを組み合わせて用いてもよい。
【００５４】
本発明の核酸増幅反応に使用するその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の塩、ｄＮＴＰ等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド(ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ)やベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。
【００５５】
本発明の核酸増幅反応系に変異認識タンパク質を添加してもよい。ここで「変異」とは、対照核酸と比較した場合における標的核酸中の異なる塩基（二本鎖核酸の場合には塩基対）を指す。また、「変異認識タンパク質」とは、二本鎖核酸中にミスマッチが含まれている場合に、そのミスマッチ部位に結合するタンパク質である。
【００５６】
本発明において「ミスマッチ」とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））から選択される一組の塩基対が正常な塩基対（ＡとＴの組み合わせ、またはＧとＣの組み合わせ）ではないことを意味する。ミスマッチには、一つのミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチ、一つまたは複数の塩基の挿入および／または欠失により生じるミスマッチ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
【００５７】
変異認識タンパク質（ミスマッチ結合タンパク質、ミスマッチ認識タンパク質ともいう）を反応系に添加することで、二本鎖核酸中の変異部分に変異認識タンパク質が結合し、核酸の増幅反応が阻害される。このことにより、二本鎖核酸に変異がある場合における非特異的な核酸増幅が抑えられる、という利点がある。
【００５８】
変異認識タンパク質として、例えばＭｕｔＳ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６が好適に挙げられるが、二本鎖核酸中の変異を認識しうる限りその由来に制限はない。
【００５９】
本発明に用いる変異認識タンパク質は、二本鎖核酸中の変異を認識しうる限り、これらタンパク質の部分ペプチドであってもよい。さらにまた、変異認識タンパク質はグルタチオン-S-トランスフェラーゼ等、他のタンパク質との融合タンパク質等であってもよい。
【００６０】
また、変異認識タンパク質は、二本鎖核酸中の変異を認識しうる限り、天然型のタンパク質のアミノ酸配列中、１つ若しくは複数のアミノ酸を置換、欠失、付加、および／または挿入したアミノ酸配列からなるタンパク質（変異体）であってもよい。このような変異体は、自然界において生じることもあるが、公知の方法を適宜利用して人為的に調製することも可能である。
【００６１】
変異認識タンパク質は、天然のタンパク質として、または組換えタンパク質として、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画等の公知の方法を適宜組み合わせて調製することが可能である。また、組換えタンパク質で発現量が多い場合には、陽イオン交換カラムおよびゲル濾過カラムを用いたクロマトグラフィーのみにより容易に調製することも可能である。
【００６２】
本発明の方法における二本鎖核酸と変異認識タンパク質との接触は、該タンパク質が該二本鎖核酸中の変異領域に結合しうる条件（例えば、適当なｐＨ、溶媒、イオン環境、温度）で行なわれる。反応温度や塩濃度、イオンの種類、バッファーのｐＨ等の詳細な条件は適宜調整することができる。
【００６３】
変異認識タンパク質は、一本鎖にも結合することがあり、このような変異認識タンパク質の一本鎖核酸への結合は一本鎖結合タンパク質により阻害されることが知られている。そのため、本発明の核酸増幅法において変異認識タンパク質を用いる場合には、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）を併用することが好ましい。該一本鎖結合タンパク質は、当技術分野において任意のＳＳＢとすることができる。
【００６４】
また、変異認識タンパク質は、ミスマッチを含まない二本鎖核酸に結合することがあり、このような誤った結合は、あらかじめ活性剤を用いて変異認識タンパク質を活性化しておくことにより防ぐことができることが知られている。したがって、本発明の核酸増幅方法において変異認識タンパク質を用いる場合には、活性剤によりあらかじめ活性化されたものを用いることが好ましい。
【００６５】
前記の変異認識タンパク質を活性化するための活性剤は当業者であれば適宜選択することができ、特に限定されないが、好ましくはＡＴＰ(アデノシン５´−三リン酸)、ＡＤＰ（アデノシン５´−二リン酸）、ＡＴＰ−γ−Ｓ（アデノシン５´−Ｏ−（３−チオ三リン酸））、ＡＭＰ−ＰＮＰ（アデノシン５´[β，γ−イミド]三リン酸）などの化合物とされ、あるいは変異認識タンパク質に結合できるヌクレオチドの一つとされる。変異認識タンパク質の活性化は、変異認識タンパク質と活性剤を、室温で数秒〜数分間インキュベートすることにより行うことができる。
【００６６】
本発明の核酸増幅反応において、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、この融解温度を変化させることができ、従って、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。一般的な融解温度調整剤は、融解温度を下げる効果を有する。
【００６７】
前記融解温度調整剤を添加することにより、二本の核酸の間の二本鎖形成部分の融解温度を下げることができ、換言すれば、その二本鎖形成の強度を下げることが可能となる。従って、前記核酸増幅反応においてこのような融解温度調整剤を反応溶液中に添加すると、強固な二本鎖を形成するＧＣの豊富な核酸領域や複雑な二次構造を形成する領域において効率的に二本鎖部分を一本鎖とすることが可能となり、これにより、プライマーによる伸長反応が終わった後に次のプライマーが目的領域にハイブリダイズしやすくなるため、核酸の増幅効率を上げることができる。
【００６８】
本発明において用いられる融解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適切に選択される。従って、融解温度調整剤は特に限定されるものではないが、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせとされる。
【００６９】
本発明の核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類などの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に限定されない。
【００７０】
また、本発明の核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素の耐熱性を増強するための試薬を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に限定されないが、トレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの二種以上の混合物とされる。
【００７１】
本発明は標的核酸配列を含む核酸試料と、本発明のプライマーセットが存在する反応系で、核酸試料中の標的核酸配列の増幅反応を行う核酸増幅方法を提供する。本発明によるプライマーセットを用いる核酸増幅反応は、等温で実施可能である。ここで「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。ほぼ一定の温度条件とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。例えば、０〜１０℃程度の温度変化であれば許容される。
【００７２】
一定の温度条件下での核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、当該核酸増幅反応において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーのＴｍ値付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーのＴｍ値を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。当該核酸増幅反応においては、酵素が失活するか、またはプライマーをはじめとする試薬のうちの一つが使い尽くされるかのいずれかまで増幅反応が繰り返される。
【００７３】
上記のように、本発明の核酸増幅反応は、等温で行うことが可能であるため、従来のＰＣＲ法と比較して核酸増幅酵素（ＤＮＡポリメラーゼ等）が失活する可能性が低い。したがって、本発明によるプライマーセットによる核酸増幅反応は、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅にも有効である。ここで、「非天然ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチドに含まれる塩基(アデニン、グアニンシトシン、およびチミン若しくはウラシル)以外の塩基を含むヌクレオチドであって、核酸配列空に取り込まれうるものを意味し、例えば、キサントシン類、ジアミノピリミジン類、ｉｓｏＧ、ｉｓｏＣ等が挙げられる。
【００７４】
非天然ヌクレオチドを含む核酸の増幅に用いられる酵素は、そのような標的核酸を増幅可能なものであれば特に限定されない。さらに、核酸増幅酵素の耐熱性を向上させる、例えばトレハロースなどの物質を反応液に添加することもでき、これにより効率的に非天然ヌクレオチドを含む標的核酸配列の増幅を行うことができる。
【００７５】
本発明の核酸増幅方法においては、標的核酸配列の各々について本発明によるプライマーセットを用意し、これら複数のプライマーセットを相互に識別可能な形で固相担体に固定化し、これらの固定化プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行ってもよい。これにより、複数の標的核酸を同時に増幅し、それぞれについての増幅産物を識別可能な形で検出することが可能となる。増幅産物の検出は、インターカレーターなどを用いて行うことができる。例えば、平面状の固相担体上において、複数のプライマーをそれぞれ特定の位置に固定化しておくことにより、核酸増幅反応および増幅産物の検出の後に増幅産物が検出された位置によって、増幅された標的核酸を特定することができる。
【００７６】
また、本発明の核酸増幅方法により得られる増幅産物の存在は、他のあらゆる方法により検出することができる。他の検出方法を実施する場合において、固相担体に固定化したプライマーセットを用いた場合、必要に応じて固相担体を増幅産物から分離してもよい。増幅産物からの固相担体の分離は、当技術分野で公知の方法により行うことができる。
【００７７】
他の検出方法として、一般的なアガロースゲル電気泳動による増幅産物の検出が挙げられる。この方法では、例えば、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン等の蛍光物質により検出できる。さらに別の検出方法としては、ビオチンのような標識を有する標識プローブを用い、これを増幅産物にハイブリダイズさせることにより検出することもできる。ビオチンは、蛍光標識されたアビジン、ペルオキシダーゼのような酵素に結合したアビジン等との結合により検出可能である。
【００７８】
本発明の核酸増幅反応によって合成された核酸は相補的な塩基配列から構成されるため、その大部分が塩基対結合を形成している。この特徴を利用して、核酸増幅反応の生成物の検出が可能である。エチジウムブロマイド、サイバーグリーンのような二本鎖特異インターカレーターである蛍光色素をあらかじめ反応系に添加しておき、本発明による核酸増幅反応を実施すれば、生成物の増加に伴って蛍光強度の増大が観察される。これをモニターすることで、リアルタイムに核酸増幅反応の追跡が可能となる。
【００７９】
本発明による核酸増幅反応によって得られた増幅断片は通常の塩基により構成されるため、増幅断片内部の制限酵素部位を用いて適当なベクターにサブクローニングすることも可能である。さらに、前記増幅断片は、ＲＦＬＰのように、制限酵素処理することも可能であり、遺伝子検査の分野においても広く利用することができる。また、前記増幅断片は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含むものとして生成させることができ、これにより増幅断片から直接ＲＮＡを合成することが可能となる。このようにして合成されたＲＮＡは、ＲＮＡプローブ、ｓｉＲＮＡ等として使用することができる。
【００８０】
また、本発明による核酸増幅法においては、通常のｄＮＴＰの代わりに、ビオチンや蛍光物質で標識された塩基を基質として使用することができ、これにより、ビオチンや蛍光物質で標識されたＤＮＡプローブを調製することも可能である。さらに、ビオチンや蛍光物質などの何らかの構造を介して増幅産物の有無を確認することも可能である。
【００８１】
本発明によるプライマーセットを用いた核酸増幅反応を利用して、核酸試料中の標的核酸配列における変異の有無を判定することが可能である。この目的のためには、被検変異部位がプライマー（好ましくはプライマーを構成する領域（ｃ）、より好ましくは領域（ｃ）の３´末端付近）に含まれるように本発明のプライマーセットを設計し、これにより増幅産物の有無を確認することにより、変異の有無を判定することが可能となる。
【００８２】
したがって、本発明は以下の工程を含む、標的核酸配列における変異の有無を検出するための方法を提供する。
（１）標的核酸配列を含む核酸試料と、本発明のプライマーセットが存在する反応系で、核酸試料中の標的核酸配列の増幅反応を行う工程
（２）核酸増幅反応の生成物の有無により、標的核酸配列における変異の有無を判定する工程
【００８３】
本発明による変異検出法では、目的とする変異の存在により鋳型核酸とミスマッチを生じるプライマーセットを用いる場合には、核酸増幅反応後における増幅産物の存在が該変異の不存在を示し、増幅産物の不存在または減少が該変異の存在を示す。一方、目的とする変異の不存在により鋳型核酸とミスマッチを生じるプライマーセットを用いて増幅産物が得られた場合、核酸試料中に該変異が存在するものと判定することができ、逆に増幅産物が得られなかった場合には前記変異が存在しないものと判定することができる。ここで、「増幅産物の減少」とは、得られた増幅産物の量が核酸試料中に標的核酸配列が存在する場合に得られる増幅産物の量に比較して減少していることを示す。
【００８４】
また、本発明によるプライマーセットを用いた核酸増幅反応を利用して、核酸試料中の標的核酸配列におけるメチル化の有無を判定することが可能である。この目的のためには、核酸増幅反応の前に核酸試料中のメチル化されている塩基を別の塩基に置換する処理をした後に、被検メチル化部位がプライマー（好ましくはプライマーを構成する領域（ｃ）、より好ましくは領域領域（ｃ）の３´末端付近）に含まれるように設計した本発明のプライマーセット使用して核酸増幅反応を行う。そして、増幅産物の有無を確認することで変異の有無を判定することが可能となる。
【００８５】
メチル化されている塩基を別の塩基に置換する処理としては、当該技術分野において周知の方法を適宜用いればよく、特に限定されない。標的試料核酸を亜硫酸水素塩で処理を行うと、メチル化されていないＣ（シトシン）は、Ｕ（ウラシル）に変換されるのに対して、メチル化されたＣは、変換されない。そこで、亜硫酸水素塩処理後、それぞれの塩基に対応したプライマーセットを用いて増幅反応を行うことにより、メチル化された試料とメチル化されていない試料を分けることが出来る。
【００８６】
したがって、本発明は以下の工程を含む、標的核酸配列におけるメチル化の有無を検出するための方法を提供する。
（１）標的核酸配列を含む核酸試料中のメチル化されている塩基を別の塩基に置換する処理を行う工程
（２）被検メチル化部位を含むプライマーを含有する本発明のプライマーセットを用いて、標的核酸配列の増幅反応を行う工程
（３）核酸増幅反応の生成物の有無により、標的核酸配列におけるメチル化の有無を判定する工程
【００８７】
本発明によるメチル化検出法では、被検メチル化部位における変異の存在により鋳型核酸とミスマッチを生じるプライマーセットを用いる場合には、核酸増幅反応後における増幅産物の存在がメチル化の不存在を示し、増幅産物の不存在または減少が該メチル化の存在を示す。一方、被検メチル化部位における変異の不存在により鋳型核酸とミスマッチを生じるプライマーセットを用いて増幅産物が得られた場合、核酸試料中に該メチル化が存在するものと判定することができ、逆に増幅産物が得られなかった場合には該メチル化が存在しないものと判定することができる。
【００８８】
本発明の変異検出法およびメチル化検出法は、変異認識タンパク質を利用することによりその特異性を向上させることができる。具体的には、核酸試料に含まれる被検核酸が、被検変異部位または被検メチル化部位において標的核酸配列と異なるヌクレオチドを有する場合には、本発明のプライマーにおける標的核酸にハイブリダイズし増幅起点となりうる領域（ｃ）の被検核酸へのハイブリダイゼーションが妨げられるため、増幅産物が得られないか、または増幅産物の量が減少することとなる。
【００８９】
しかしながら、前記ハイブリダイゼーションは完全には妨げられない場合があり、その場合には、これらの配列において少量のヘテロ二本鎖構造が生じる。ここで「ヘテロ二本鎖構造」とは、実質的には相補的な二本鎖構造であり、一つまたは複数のミスマッチを有することにより非相補的な領域を含む二本鎖構造を意味する。このようなヘテロ二本鎖構造により、誤った増幅産物が生成する。この場合、核酸増幅反応に用いる反応液中に変異認識タンパク質を添加しておくことにより、前記へテロ二本鎖構造にこの変異認識タンパク質が結合し、その後の増幅反応が妨げられる。したがって、変異認識タンパク質を利用することにより、誤った増幅産物の生成を防ぐことが可能になる。
【００９０】
本発明による核酸増幅法または核酸検出法を実施するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明によるプライマーセットを含んでなる。
【００９１】
さらに、本発明によるプライマーセットの少なくとも一方が固相担体と結合可能な部位を含む場合には、本発明によるキットは該固相担体をさらに含んでなることが好ましい。また、核酸増幅反応に用いられる基質が固相担体と結合可能な部位を含む場合にも、本発明によるキットは該固相担体をさらに含んでいることが好ましい。本発明によるキットはさらに、ＤＮＡポリメラーゼ等の核酸合成酵素、ｄＮＴＰ等の基質、緩衝液、変異認識タンパク質、融解温度調整剤などの上記した試薬類、反応容器、説明書を含んでいてもよい。このようなキットを用いることにより、前記反応容器に鋳型核酸または核酸試料を添加し、該反応容器を一定の温度に保つだけで核酸増幅反応を行うことが可能となる。
【実施例】
【００９２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００９３】
２本の自己相補配列を有するプライマーを含むプライマーセットを用いて、ヒトβ−アクチン遺伝子中の標的核酸配列の増幅を行った。
【００９４】
（１）標的核酸配列を含む核酸試料液の調製
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）１００ｎｇを９８℃にて３分間加熱し、１本鎖にした後、β−アクチン遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。ネガティブコントロールとして、水を上記同様の条件で加熱したサンプルも作成した。
【００９５】
＜プライマー＞
プライマーは、ヒトβアクチン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＣ００６４８３、標的核酸配列：５´末端から１７１１７０〜１７１２８２番目のヌクレオチド）を鋳型として設計を行った。フォワードプライマー〈１〉（配列番号１）、リバースプライマー〈２〉（配列番号２）ともに、鋳型と相補的な３´末端領域とそれ自身が折りたたみ構造をとるように設計されている５´末端領域からなる。また、フォワードプライマー〈１〉、リバースプライマー〈２〉のそれぞれ外側にアウタープライマー〈３〉および〈４〉（ＯＦ、ＯＲ）（配列番号３、４）を設計した。
【００９６】
以下にプライマーの配列を示す。フォワードプライマーおよびリバースプライマーにおける折り返し構造に下線を施す。
フォワードプライマー〈１〉：
５´−tttatatatatatataaaGGGCATGGGTCAGAAGGATT−３´（配列番号１）
リバースプライマー〈２〉:
５´−tttatatatatatataaaCATGTCGTCCCAGTTGGTGA−３´（配列番号２）
アウタープライマー〈３〉（ＯＦ）
５´−GGGCTTCTTGTCCTTTCCTTC−３´（配列番号３）                  
アウタープライマー〈４〉（ＯＲ）
５´−CCACACGCAGCTCATTGTAG−３´（配列番号４）
【００９７】
(２)核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃にて９０分間反応させることで増幅反応を実施した。
【００９８】
＜反応液の組成＞
１０×Ｂｓｔ  Ｂｕｆｆｅｒ(ＤＦ)            ２．５μｌ
１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４                      １．５μｌ
１０％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ２０                ０．２５μｌ
１００％ＤＭＳＯ                            １．２５μｌ
２５ｍＭ  ｄＮＴＰ                          各１．４μｌ
ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ                      ０．５μｌ
５０μＭプライマー〈１〉                    １．６μｌ
５０μＭプライマー〈２〉                    １．６μｌ
５０μＭプライマー〈３〉                    ０．２μｌ
５０μＭプライマー〈４〉                    ０．２μｌ
Ｂｓｔ．ポリメラーゼ                        １．０μｌ
ＴａｑＭｕｔＳ                              １．０μｌ
（１）で得た核酸断片試料液(１００ｎｇ／μｌ)１．０μｌ
精製水                                      １１．０μｌ
全量                                        ２５．０μｌ
【００９９】
（３）増幅産物の検出
前記（２）における増幅反応を行った後の反応液５μｌを２％アガロースゲル（１×ＴＡＥ）にアプライして電気泳動を行い、増幅産物を確認した。その結果を図６に示す。
【０１００】
核酸由来のサンプルからのみ、増幅産物が認められた。また、１２０ｂｐ付近に明瞭なピークが認められたが、これは、プライマーの設計情報から予測されるものであり、確かに狙った増幅産物が得られていることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】ＬＡＭＰ法に用いるプライマーの略図を示す。
【図２】本発明による核酸増幅方法に用いるプライマーの略図を示す。
【図３】本発明による核酸増幅方法の基本的な反応原理を示す。
【図４】本発明による核酸増幅方法の基本的な反応原理を示す。
【図５】本発明による核酸増幅方法の基本的な反応原理を示す。
【図６】増幅反応により得られた増幅産物を２％アガロースゲル（１×ＴＡＥ）による電気泳動で確認した。上段は核酸試料を、中段は水を、下段は１００ｂｐラダーを示す。（実施例１）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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