(57)【要約】【課題】  EAAC1グルタミン酸輸送体結合因子アディクシン(addicsin)のEAAC1グルタミン酸輸送能抑制機能を欠損させ、同時にArl6ip-1タンパク質とのタンパク質間相互作用を著しく抑制させた新規のドミナントネガティブ変異体タンパク質を提供するとともに、その分子特性を利用した新規EAAC1グルタミン酸輸送体機能制御手段ならびに新規EAAC1グルタミン酸輸送体機能制御薬の探索方法を提供する。【解決手段】  アディクシン(addicsin)タンパク質の１１０番目のアミノ酸残基（チロシン）を疎水性アミノ酸残基に、及び１１２番目のアミノ酸残基（ロイシン）を他の疎水性アミノ酸残基に置換した変異体を得るとともに、該変異体あるいは該変異体の発現細胞を用いてEAAC1グルタミン酸輸送体機能制御及びEAAC1グルタミン酸輸送体機能制御薬の探索を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のａ）またはｂ）のアディクシン(addicsin)変異体タンパク質であって、アディクシン(addicsin)タンパク質が保有する、EAAC1グルタミン酸輸送体依存的細胞外グルタミン酸取り込み能抑制機能が消失するとともに、ADP ribosylation like 6 interacting protein-1 (Arl6ip-1)タンパク質に対する結合能が抑制されていることを特徴とする、上記変異体タンパク質。
ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１１０番目のチロシン残基が疎水性アミノ酸残基に、ならびに１１２番目のロイシン残基がロイシン以外の疎水性アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異体タンパク質。
ｂ）上記ａ）の変異体タンパク質のアミノ酸配列において、１１０番目及び１１２番目のアミノ酸残基を除き、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有する変異体タンパク質。
【請求項２】
上記１１０番目のアミノ酸残基が、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、グリシン及びプロリン残基から選ばれたものであり、上記１１２番目のアミノ酸残基がバリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、グリシン及びプロリンから選ばれたものであることを特徴とする、請求項１に記載のアディクシン(addicsin)変異体タンパク質。
【請求項３】
上記１１０番目及び１１２番目の疎水性アミノ酸残基が、ともにアラニンであることを特徴とする、請求項１または２に記載のアディクシン(addicsin)変異体タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のアディクシン(addicsin)変異体タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号７に示す塩基配列を有することを特徴とする、請求項４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号４に示す塩基配列を有することを特徴とする、請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５から６のいずれかに記載のＤＮＡが挿入されていることを特徴とする、発現ベクター。
【請求項８】
請求項７の発現ベクターが導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項９】
形質転換体が、EAAC1グルタミン酸輸送体発現能を有する動物細胞株であることを特徴とする、請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
上記請求項９に記載の形質転換体からなることを特徴とする、EAAC1グルタミン酸輸送機能異常の病態モデル。
【請求項１１】
上記請求項９に記載の形質転換体からなることを特徴とする、EAAC1グルタミン酸輸送体機能の促進剤または阻害剤のスクリーニング試薬。
【請求項１２】
請求項９に記載の形質転換体に、EAAC1グルタミン酸輸送体機能の促進剤または阻害剤の候補物質を接触させ、細胞外グルタミン酸の取り込み能ならびに細胞障害の程度を評価することにより、EAAC1グルタミン酸輸送体機能の促進剤または阻害剤をスクリーニングすることを特徴とする、EAAC1グルタミン酸輸送体制御薬剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規アディクシン(addicsin)変異体タンパク質、その遺伝子及び該遺伝子により組換えられた組み換えベクター、該組換えベクターが導入された形質転換体、並びに該形質転換体を使用したEAAC1グルタミン輸送体制御薬剤のスクリーン方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
＜グルタミン酸輸送体＞
グルタミン酸は、中枢系では興奮性神経伝達物質として記憶・学習などの高次神経機能に密接に関与している。その一方で、高濃度の細胞外グルタミン酸は、神経細胞毒性を示すため、神経細胞の細胞膜に存在するグルタミン酸輸送体によって常に低濃度に維持されている。細胞膜に存在するグルタミン酸輸送体は、GLAST、GLT-1、EAAC1、EAAT4、EAAT5の５種類が存在し、Na+依存的にL-グルタミン酸、D/L-アスパラギン酸等を基質として細胞内へ輸送する。（図１、非特許文献１）。これらグルタミン酸輸送体は、各々特徴的な分布と機能を有しており、その神経シナプスにおける作用機構ならびに特徴の概略を、表１（非特許文献２）ならびに図１にそれぞれ示す。
【０００３】
【表１】
2008061612.tif 000002
【０００４】
例えば、GLAST、GLT-1は、中枢系では小脳と終脳のアストログリア細胞に発現し、シナプス間隙の細胞外グルタミン酸の素早い除去に関与する。また、EAAT4は小脳プルキンエ神経細胞に、EAAT5は網膜に特異的な発現を示す（表１）。一方、EAAC1は、末梢では腎臓、心臓、肝臓などの臓器に、中枢では遍在的に神経細胞に発現している（表１）。興味深いことに、中枢で発現するEAAC1は、神経シナプスに存在せず、シナプス間隙からの細胞外グルタミン酸除去能力もGLAST、GLT-1と比較すると極めて低く、その生理機能に関しては依然不明な点も多い。しかし、近年、EAAC1が運動神経再生（非特許文献３）、腎臓の近位尿細管におけるグルタミン酸の再吸収（非特許文献４）、てんかんと抑制性神経伝達物質GABAの生合成（非特許文献５）、神経保護作用ならびにグルタチオン恒常性維持機構（非特許文献６）に関与することが報告され、生体の恒常性維持に重要な役割を果たす可能性が強く示唆されている。
【０００５】
＜EAAC1グルタミン酸輸送体機能制御因子＞
EAAC1グルタミン酸輸送体の細胞外グルタミン酸取り込み能抑制因子は、EAAC1グルタミン酸輸送体結合タンパク質として同定されたGTRAP3-18タンパク質 (非特許文献７) ならびにモルヒネ依存形成時に扁桃体におけるmRNA発現量が増加する因子として同定されたアディクシン(addicsin)タンパク質が知られている（非特許文献８、特許文献１）。
なお、上記GTRAP3-18タンパク質、アディクシン(addicsin)タンパク質はそれぞれラット及びマウスから得られているが、同じ生物種では両者のアミノ酸配列は全く同じで（配列番号２）、同一タンパク質である。
【０００６】
また、アディクシン(addicsin)タンパク質のPKCリン酸化モチーフ内に存在する１８番目のセリン残基をアラニン残基に置換したアディクシン(addicsin)S18A点変異体タンパク質は、100 nM PMA刺激（PKC活性化）条件化では細胞外グルタミン酸取り込み能の抑制効果が消失し、無刺激条件化では細胞外グルタミン酸取り込み能が促進する（特許文献１）。さらに、アディクシン(addicsin)結合タンパク質として単離したADP ribosylation like 6 interacting protein (Arl6ip-1) タンパク質は、EAAC1グルタミン酸輸送体の細胞外グルタミン酸取り込み能促進因子として機能する（特許文献１)。なお、ビオチン化アッセイ法による解析により、アディクシン(addicsin)S18A点変異体タンパク質は、アディクシン(addicsin)タンパク質と同様に、細胞膜に局在するタンパク質（EAAC1グルタミン酸輸送体と推定）と直接結合するが、Arl6ip-1タンパク質は結合しないことが明らかとなっている (非特許文献９)。
【０００７】
＜EAAC1グルタミン酸輸送体機能制御薬＞
従来のEAAC1グルタミン酸輸送体機能制御薬は、EAAC1グルタミン酸輸送体自身に直接作用することによってEAAC1グルタミン酸輸送体機能を調節する。EAAC1グルタミン酸輸送体に選択特異的なグルタミン酸取り込み促進薬は現在のところ知られていない。また、グルタミン酸輸送体の阻害薬は、自身が取り込まれることでグルタミン酸の取り込みを阻害する基質型阻害薬と、自身は取り込まれずにグルタミン酸輸送体に親和性を示して効果を発揮するブロッカー型阻害薬に大別される。従来の阻害薬の大半は、基質型阻害薬であり、細胞内へグルタミン酸が取り込まれる際にNa+流入（取り込み電流）が発生する場合や、基質が取り込まれた際に細胞内グルタミン酸を代わりに細胞外へ汲み出してしまうために阻害薬濃度依存的に細胞外グルタミン酸濃度の上昇が引き起こされる場合があり、生理現象の解析に不向きである。
【０００８】
EAAC1グルタミン酸輸送体の基質型阻害薬としては、L-trans-2,4-PDC、L-(-)-threo-3-Hydroxyaspartic acidなどが代表的であるが、いずれの阻害薬もEAAC1グルタミン酸輸送体のみに対する選択特異性は無く、上述した問題点を内包する。また、近年盛んに開発がすすめられているブロッカー型阻害薬は、これら欠点を補うものとして注目されているが、まだその数は限られている。EAAC1グルタミン酸輸送体のブロッカー型阻害薬としてはDL-TBOAが代表的であるが、やはりEAAC1グルタミン酸輸送体のみに対する選択特異性は無い。また、EAAC1グルタミン酸輸送体機能制御因子を作用点とした薬物は皆無である。従って、EAAC1を介した細胞外グルタミン酸取り込み機構や、その異常に関連して発症する各種疾患の分子機構の解明は依然困難な状況下にある。
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−１１５７８６号公報
【非特許文献１】茂里＆島本Folia Pharmacol. Jpn.122,p.253-264,(2003)
【非特許文献２】kanai Y．&hediger MA  Pflugers Arch Eur JPhysiology 447, 469-479, (2004)
【非特許文献３】KiryuS. et. al., J. Neurosci. 15 (12), 7872-7878, (1995)
【非特許文献４】Peghini,P. et. al. EMBO J. 16 (13), 3822-3832, (1997）
【非特許文献５】Sepkuty,J. P. et. al., J. Neurosci. 22 (15), 6372-6379, (2002)
【非特許文献６】AoyamaK. et. al., Nat. Neurosci. 9, 119-126, (2006)
【非特許文献７】CG, Linet. al., Nature, 410, 84-88, (2001)
【非特許文献８】M.J.Ikemoto et. al., NeuroReport, 16, 2079-2084, (2002)
【非特許文献９】M.J.Ikemoto et. al., Neuroscience Research, 55, Supplement 1, S82, (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
最近、EAAC1グルタミン酸輸送体の機能ならびに発現量変化が、てんかん（減少)、アミノ酸尿症（欠損）、運動神経再生（増加）、モルヒネ耐性依存（増加）、加齢依存的神経変性（欠損）などに代表される各種病態の発症に深く関与する可能性が指摘されている。しかし、EAAC1グルタミン酸輸送体機能変化が、どのようにこれら各種病態の発症に繋がるかに関する分子機序については殆ど不明であり、今後に向けた大きな課題である。特に、アディクシン(addicsin)タンパク質をはじめとするEAAC1グルタミン酸輸送体制御因子群の解析は、近年開始されたばかりであり、抑制因子としてアディクシン(addicsin)/GTRAP3-18タンパク質が、促進因子としてAri6ip-1タンパク質等のごくわずかの因子が同定されたにすぎない。一方、EAAC1グルタミン酸輸送体のみに選択特異性を有し、かつ生理条件下の使用に十分耐えうるEAAC1グルタミン酸輸送体機能制御薬（促進薬ならびに阻害薬）は皆無であり、それらの開発も必要である。また、EAAC1グルタミン酸輸送体を標的とした従来の作用機序とは異なる新規EAAC1グルタミン酸輸送体機能制御薬の開発も必要である。従って、そのような目的を達成するためには、EAAC1グルタミン酸輸送体機能制御因子群を標的とした創薬、すなわち、EAAC1グルタミン酸輸送体機能制御因子によるEAAC1グルタミン酸輸送体機能制御機構の解明と、その分子機構に立脚した創薬が必要である。
【００１１】
そこで本発明の課題は、EAAC1グルタミン酸輸送体結合因子アディクシン(addicsin)/GTRAP3-18のEAAC1グルタミン酸輸送能抑制機能を欠損させ、同時にArl6ip-1タンパク質とのタンパク質間相互作用を著しく抑制させた新規のドミナントネガティブ変異体タンパク質群を提供するとともに、その分子特性を利用した新規EAAC1グルタミン酸輸送体機能制御手段ならびに新規EAAC1グルタミン酸輸送体機能制御薬の探索方法を提供しようとするものである。また、本発明は、EAAC1グルタミン酸輸送体機変化と関連する疾患の発症機序の解明に貢献し、同時に新規分子機構に立脚した新規創薬の可能性を拓こうとするものでもある。なお、上記特許文献１のアディクシン(addicsin)S18A点変異体タンパク質は、EAAC1タンパク質と結合し、無刺激条件化では細胞外グルタミン酸取り込み能が促進する特徴を有するのに対し、本発明において目的とするドミナントネガティブ変異体タンパク質群は、EAAC1タンパク質と結合せず、無刺激条件化では細胞外グルタミン酸取り込み能を変化させないことを特徴とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は鋭意研究の結果、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するアディクシン(addicsin)タンパク質の１１０番目のアミノ酸残基（チロシン）を疎水性アミノ酸残基に、また１１２番目のアミノ酸残基（ロイシン）をそれぞれロイシン以外の疎水性アミノ酸残基に置換した変異体を作成し、該変異体が、Arl6ip-1タンパク質とアディクシン(addicsin)タンパク質とのタンパク質間相互作用を著しく抑制し、アディクシン(addicsin)タンパク質によるEAAC1グルタミン酸輸送能抑制機能を完全に抑制しうることを見いだした。しかも、このアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質は、EAAC1タンパク質と結合せず、無刺激条件化では細胞外グルタミン酸取り込み能を変化させない点で従来のアディクシン(addicsin)S18A点変異体タンパク質には見られない機能を有することも確認した。
【００１３】
さらに、このようなアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質の過剰発現細胞は、EAAC1グルタミン酸輸送異常の病態モデルとしても有用であり、EAAC1グルタミン酸輸送体制御薬剤の探索手段として使用できると確信し、これらの知見に基づき本発明を完成するに至ったものである。すなわち、本発明は以下の（１）〜（１２）に示されるとおりのものである。
【００１４】
（１）以下のａ）またはｂ）のアディクシン(addicsin)変異体タンパク質であって、アディクシン(addicsin)タンパク質が保有する、EAAC1グルタミン酸輸送体依存的細胞外グルタミン酸取り込み能抑制機能が消失するとともに、ADP ribosylation like 6 interacting protein-1 (Arl6ip-1)タンパク質に対する結合能が抑制されていることを特徴とする、上記変異体タンパク質。
ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１１０番目のチロシン残基が疎水性アミノ酸残基に、ならびに１１２番目のロイシン残基がロイシン以外の疎水性アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異体タンパク質。
ｂ）上記ａ）の変異体タンパク質のアミノ酸配列において、１１０番目及び１１２番目のアミノ酸残基を除き、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有する変異体タンパク質。
（２）上記１１０番目のアミノ酸残基が、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、グリシン及びプロリン残基から選ばれたものであり、上記１１２番目のアミノ酸残基がバリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、グリシン及びプロリンから選ばれたものであることを特徴とする、上記（１）に記載のアディクシン(addicsin)変異体タンパク質。
（３）上記１１０番目及び１１２番目の疎水性アミノ酸残基が、ともにアラニンであることを特徴とする、上記（１）または（２）に記載のアディクシン(addicsin)変異体タンパク質。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のアディクシン(addicsin)変異体タンパク質をコードするＤＮＡ。
（５）配列番号７に示す塩基配列を有することを特徴とする、上記（４）に記載のＤＮＡ。
（６）配列番号４に示す塩基配列を有することを特徴とする、上記（５）に記載のＤＮＡ。
（７）上記（４）または（５）に記載のＤＮＡが挿入されていることを特徴とする、発現ベクター。
（８）上記（７）の発現ベクターが導入されていることを特徴とする形質転換体。
（９）形質転換体が、EAAC1グルタミン酸輸送体発現能を有する動物細胞株であることを特徴とする、上記（８）に記載の形質転換体。
（１０）上記（９）に記載の形質転換体からなることを特徴とする、EAAC1グルタミン酸輸送機能異常の病態モデル。
（１１）上記（９）に記載の形質転換体からなることを特徴とする、EAAC1グルタミン酸輸送体機能の促進剤または阻害剤のスクリーニング試薬。
（１２）上記（９）に記載の形質転換体に、EAAC1グルタミン酸輸送体機能の促進剤または阻害剤の候補物質を接触させ、細胞外グルタミン酸の取り込み能ならびに細胞障害の程度を評価することにより、EAAC1グルタミン酸輸送体機能の促進剤または阻害剤をスクリーニングすることを特徴とする、EAAC1グルタミン酸輸送体制御薬剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、アディクシン(addicsin)タンパク質によるEAAC1グルタミン酸輸送体グルタミン酸取り込み能抑制機能を完全に阻害するアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体を見出したことによるものである。この機能阻害効果は、アディクシン(addicsin)タンパク質（抑制因子）とArl6ip-1タンパク質（促進因子）間のタンパク質間相互作用が抑制することより惹起されること、さらにはC6BU-1細胞では細胞障害が進行するという知見を得ている。これにより、上記アディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体を過剰発現させることにより、アディクシン(addicsin)タンパク質によるEAAC1グルタミン酸輸送体グルタミン酸取り込み抑制機能を阻害（中和）させることが可能となる。さらに、本発明者等によるアディクシン(addicsin)タンパク質（抑制因子）、Arl6ip-1タンパク質（促進因子）によるEAAC1グルタミン酸輸送体グルタミン酸取り込み機能制御手段（上記特許文献１）と併せると、本発明は、EAAC1グルタミン酸輸送体のグルタミン酸取り込み能を厳格に制御することを可能にする。
【００１６】
また、本発明は、EAAC1グルタミン酸輸送発現能を有し、かつ本発明のアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質をコードする遺伝子を導入し、該変異体タンパク質を発現しうる形質転換細胞に、EAAC1グルタミン酸輸送体制御薬剤の候補物質を接触させ、細胞外グルタミン酸の取り込み能ならびに細胞障害の程度を評価することによりEAAC1グルタミン酸輸送体制御薬剤の探索を可能にする。従って、本発明における上記アディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質は、例えば、EAAC1グルタミン酸輸送体機能解析研究用試薬として有用であるだけでなく、 EAAC1グルタミン酸輸送体機能制御薬、神経損傷ならびに各種疾患（アミノ酸尿症、てんかん、加齢依存的神経変性、モルヒネ耐性依存形成等）の治療法ならびに予防法の開発等に大いに資すると共に、EAAC1グルタミン酸輸送体機能異常に起因して発生する疾患（例えば、アミノ酸尿症、てんかん、モルヒネ耐性依存形成等）の発症機構の解明や神経再生機構の解明を行う上での基盤技術としても極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
１）本発明のアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質
本明細書にいうEAAC1グルタミン酸輸送体機能制御因子とは、EAAC1グルタミン酸輸送体を介したL-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、D-アスパラギン酸のNa+依存的な細胞内への取り込む機能を促進もしくは阻害し、EAAC1グルタミン酸輸送体あるいはEAAC1グルタミン酸輸送体結合因子アディクシン(addicsin)/GTRAP3-18と直接的なタンパク質間相互作用を示すか、あるいは阻害するタンパク質もしくはペプチド因子群全般を指す。マウスのEAAC1グルタミン酸輸送体タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１１に示され、その完全長遺伝子及びＯＲＦの塩基配列はそれぞれ配列番号１０及び１２に示される。
本発明のアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質は、アディクシン(addicsin)タンパク質のEAAC1グルタミン酸輸送体機能抑制効果を消失させ、同時にArl6ip-1タンパク質とのタンパク質間相互作用を著しく抑制させたアディクシン(addicsin)変異体タンパク質であり、EAAC1グルタミン酸輸送体機能阻害因子としての役割を果たす。マウスアディクシン(addicsin)タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示され、マウスアディクシン(addicsin)の完全長遺伝子及びそのＯＲＦの塩基配列はそれぞれ配列番号１及び３に示される。
【００１８】
すなわち、本発明のアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質は、EAAC1グルタミン酸輸送体機能制御因子アディクシン(addicsin)タンパク質（配列番号２）の１１０番目のチロシン残基を疎水性アミノ酸残基に、ならびに１１２番目のロイシン残基を、ロイシン以外の疎水性アミノ酸残基に置換したものである。
疎水性アミノ酸残基としては、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、グリシン、プロリンが挙げられ、アディクシン(addicsin)タンパク質の１１０番目のアミノ酸残基を置換する疎水性アミノ酸残基は、上記疎水性アミノ酸残基のいずれであってもよく、同１１２番目のアミノ酸残基を置換する疎水性アミノ酸残基は、上記疎水性アミノ酸残基のうちロイシンを除くアミノ酸残基であり、１１０番目と１１２番目のアミノ酸残基を置換する疎水性アミノ酸残基は、同一でも異なっていてもよい。この変異体タンパク質のアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列は、それぞれ配列番号９及び８に示される。また、この変異体タンパク質の完全長遺伝子の塩基配列は配列番号７に示される。
【００１９】
本発明のアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質として特に好ましいものは、アディクシン(addicsin)タンパク質の１１０番目及び１１２番目のアミノ酸残基が共にアラニンに置換された変異体である。この変異体タンパク質のアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列はそれぞれ配列番号６及び５に示され、またその完全長遺伝子の塩基配列は配列番号４に示される。なお、以下、この変異体をアディクシン(addicsin)Y110A/L112Aという場合がある。この変異体タンパク質はアディクシン(addicsin)タンパク質によるEAAC1グルタミン酸輸送体依存的細胞外グルタミン酸取り込み能抑制機能及びADP ribosylation like 6 interacting protein-1 (Arl6ip-1)タンパク質とのタンパク質間相互作用の抑制能が極めて高い。
【００２０】
また、本発明においては、上記した変異体タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９あるいは６）において、１１０番目及び１１２番目のアミノ酸残基を変更しないかぎり、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換された、または付加されたアミノ酸配列を有するものであっても、EAAC1グルタミン酸輸送体依存的細胞外グルタミン酸取り込み能抑制機能びADP ribosylation like 6 interacting protein-1 (Arl6ip-1)タンパク質とのタンパク質間相互作用の抑制機能を抑制するものであれば、これらの変異体タンパク質も包含する。
さらに、本請求項で記載するアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質は、上記した変異体タンパク質のみならず、これら変異体タンパク質に、エピトープタグ配列やシグナル配列などをコードするアミノ酸配列を人工的に付加させたキメラタンパク質も含む。
【００２１】
２）本発明のアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質の発現
本発明においては、上記アディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質をコードするDNAを発現ベクターに挿入し、得られた組換えベクターを、宿主細胞に導入し形質転換体を得ることができる。該形質転換体は、アディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質を発現し、該形質転換体を培養することによりアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質を得ることができる。本発明の上記アディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質をコードするDNAの作成は常法による。すなわち、（１）Kunkel法などに代表されるような一般的な点変異導入法を活用し、野生型アディクシン(addicsin) cDNA塩基配列を含むベクターを鋳型として１１０番目のタイロシン残基と１１２番目のロイシン残基をそれぞれ置換したいアミノ酸残基、例えば、アラニン残基をコードするように設計した合成DNAプライマーを使用して点変異導入を行う方法（２）野生型アディクシン(addicsin) cDNA塩基配列を含むベクターあるいは全長アディクシン(addicsin) cDNA断片を鋳型とし、１１０番目のタイロシン残基と１１２番目のロイシン残基をそれぞれ置換したいアミノ酸残基をコードするように設計した合成プライマーを使用してPCRを実施し、増幅されたPCR断片を野生型アディクシン(addicsin) cDNAを含むベクターにサブクローニングする方法などがある。
【００２２】
本発明において宿主細胞として好適なものとしては、初代培養細胞、神経細胞やグリア細胞等を由来として株化された各種培養細胞（NG108-15, N18TG-2、C6BU-1、PC12等）、幹細胞等の細胞群が挙げられる。また、動物細胞以外にも、昆虫細胞、植物細胞、大腸菌等の細胞が含まれる。また、これら細胞に本発明のアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質（アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質など）を過剰発現させるためには、ウイルスベクター法、リポフェクション法、電気穿孔法、直接注射法等の周知の方法を適用して、本発明のアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質（アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質など）をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入すれば良い。アディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号７、より具体的には配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡあるいは該ＤＮＡの塩基配列を少なくとも含むＤＮＡを使用する。これらＤＮＡは３’末端にさらに停止コドン（ｔａａ，ｔｇａ、ｔａｇ）を含みうる。
【００２３】
ウイルスベクター法では、ウイルスベクター中に存在するマルチクローニング部位に、アディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質（アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質など）をコードするcDNAをin vitroで挿入し、組み換えウイルスDNAを作製する。この組み換えDNA （あるいは組み換えウイルスDNAより逆転写して作製した組み換えウイルスRNA）を宿主細胞（BHK細胞、HEK293細胞等）へトランスフェクションし、宿主細胞中で増殖して培地中に放出された組み換えウイルスを回収・精製することにより高力価アディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質（アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質など）遺伝子挿入組み換えウイルスを調製する。これら調製ウイルスを細胞培養液中に添加することにより遺伝子導入を行う。使用するウイルスとしては、例えば、シンドビスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス等を挙げることができる。また、該遺伝子を組み込む代表的なウイルスベクターとしては、各々pSinrep5 (Invitorogen社)、HSV-PrpUC、pAxCAwt (TAKARA社)、pLenti6/V5 (Invitorogen社)等が存在する。
【００２４】
本発明において特に有用な形質転換体は、EAAC1グルタミン酸輸送体を内在的に発現する動物細胞あるいは人為的に発現させた動物細胞に、アディクシン(addicsin) Y110A/L112Aタンパク質等のアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質をコードするＤＮＡを染色体に組み込んだ安定形質発現細胞株である。
上記安定形質発現細胞株の代表例としては、GeneSwitch System (Invitrogen社)を利用して作製したC6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A#34（FERM P-20962）細胞株が挙げられる。
この細胞株系は、下記に記載する利点を併せ持っている。
【００２５】
ａ）各種グルタミン酸輸送体の内、EAAC1のみを内在的に発現するラット神経グリオーマ細胞C6BU-1細胞を用いており、EAAC1グルタミン酸輸送体の細胞外グルタミン酸輸送等の分子制御機構の解析モデルならびに変異体株として有用である。
ｂ）クローン化した安定形質発現細胞株であるために、すべての細胞形質が同一である長所を併せ持つ。
ｃ） 低濃度（100 pM以上）のミフェプリストンの24時間曝露によって、アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質等のアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質の顕著なコンディショナル発現誘導が可能であるため、各種実験における対照群を厳密に設定できる。
ｄ）アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質等の上記アディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質の顕著なコンディショナル発現誘導により細胞障害を示す特徴を有する。
【００２６】
したがって、本細胞株系を用いれば、アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質等のアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体の発現がEAAC1グルタミン酸輸送体機能等に及ぼす効果を厳密に比較解析すること、EAAC1グルタミン酸輸送体機能の分子機序の解析、さらにEAAC1グルタミン酸輸送体機能制御因子を作用点とするEAAC1グルタミン酸輸送体機能制御薬の探索に活用することが可能となる。
【００２７】
３）本発明のアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質によるEAAC1グルタミン酸輸送体機能の制御
本発明によれば、アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質等のアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質の分子機能特性を利用してEAAC1グルタミン酸輸送体機能を制御することが可能となる。すなわち、EAAC1グルタミン酸輸送体を内在的に発現するもしくは人為的に発現させた細胞（in vitro系）において、導入したアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質の遺伝子DNAの発現量を人為的に制御することにより、アディクシン(addicsin)タンパク質によるEAAC1グルタミン酸輸送体機能（細胞外グルタミン酸取り込み能）抑制効果を調節（中和）することが可能となり、このようなアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質の遺伝子ＤＮＡの発現によりEAAC1グルタミン酸輸送体機能（細胞外グルタミン酸取り込み能）に異常を生じた細胞は、EAAC1グルタミン酸輸送体機能の促進剤あるいは阻害剤のスクリーニング試薬、あるいは神経系異常の病態モデルとなり得るものであり、神経系の各種疾患の発症機構の解明あるいはその治療等の研究において有用である。
【００２８】
上記EAAC1グルタミン酸輸送体を内在的に発現する細胞としては、上記２）で挙げた細胞のうち、神経細胞、C6BU-1細胞が挙げられるが、また、これ以外の上記２）で例示した細胞であっても、EAAC1グルタミン酸輸送体遺伝子を導入し、EAAC1グルタミン酸輸送体を発現可能にした細胞も使用できる。
例えば、ラットグリオーマC6BU-1細胞に、アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質等のアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質を過剰発現させて（例えば、上記 C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A 株使用）PKC活性化処理を施した場合、アディクシン(addicsin)タンパク質による細胞外グルタミン酸取り込み能抑制効果を完全に阻害することが可能である。このように、本発明のアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質はアディクシン(addicsin)タンパク質の生理機能を中和する働きを有する。
【００２９】
一方、このようなアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞を用いる以外にも、アディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質（アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質など）あるいはその変異を含む部分配列ペプチド自身を、タンパク質導入法や直接注射法等の周知の方法を適用して直接細胞に導入することにより、EAAC1グルタミン酸輸送体機能が制御された細胞を得ることも可能である。この手法に使用するタンパク質導入法は、Protein
Transduction Domain (PTD)と呼ばれる膜透過機能を有するペプチド配列を目的タンパク質（ペプチド）に付加したキメラタンパク質（ペプチド）を作製し、細胞外から該キメラタンパク質（ペプチド）を細胞内へ取り込ませる手法であり、それ自体周知である。PTDのアミノ酸配列としては、HIV/TAT (YGRKKRRQRR；配列番号１３)、HSV/VP-22 (DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE；配列番号１４)、AntP (RQIKIKWPQNRRMKWKK；配列番号１５)、11 Arginine (RRRRRRRRRRR；配列番号１６)等が適用可能である。
【００３０】
また、アディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質によるEAAC1グルタミン酸輸送体機能の制御手段は、in vivo系すなわちEAAC1グルタミン酸輸送体を内在的に発現するもしくは人為的に発現させた脳をはじめとする種々の組織、例えば、脳内では、海馬、扁桃体、大脳皮質、線条体等に適用しても良い。この場合、アディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質（アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質など）を発現させる手段としては、上記２）において記載したin vitro系手段をすべて適用することが可能である。これらに加え、脳内投与法等のin vivo系に特有な周知の導入方法を適用すれば良い。 
【００３１】
４）EAAC1グルタミン酸輸送体機能制御薬の探索
上記３）で述べたように、本発明のアディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質（アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質など）、あるいはその発現細胞は、上記変異体タンパク質の分子機能の特徴を利用してEAAC1グルタミン酸輸送体制御因子を標的としたEAAC1グルタミン酸輸送体機能制御薬の探索にも有効に利用できる。本探索法は、アディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質を過剰発現させた場合に、アディクシン(addicsin)タンパク質によるEAAC1グルタミン酸輸送体の細胞外グルタミン酸取り込み能抑制機能が完全に阻害されること、さらには細胞障害が惹起されることを利用する。例えば、アディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質を過剰発現させた細胞をEAAC1グルタミン酸輸送体機能異常病態モデル細胞と見なし、このような異常をレスキューする種々の候補物質（無機物質、有機物質、タンパク質、ペプチド等）をEAAC1グルタミン酸輸送体の細胞外グルタミン酸取り込み能変化（促進あるい抑制）ならびに/あるいは細胞障害の進行度を評価指標として探索する方法である。
【００３２】
本探索法で使用可能な細胞は、ａ） EAAC1グルタミン酸輸送体を内在的に発現もしくは人為的に発現するように構築され、ｂ） 同時に、アディクシン(addicsin)ドミナントネガティブ変異体タンパク質（アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質など）をコンディショナルに過剰発現させ得ることが必要である。細胞の種類としては、上記したように初代培養細胞、神経細胞やグリア細胞等を由来として株化された各種培養細胞（NG108-15, N18TG-2、C6BU-1、PC12等）、幹細胞等の細胞群、ウイルス発現系や遺伝子改変動物等を利用してEAAC1グルタミン酸輸送体機能制御因子を過剰発現させるように人為的に構築された細胞群、また、昆虫細胞、植物細胞、大腸菌等の動物細胞以外の細胞群が挙げられるが、いずれの場合にも上記２つの条件を満たすことが必須である。
【００３３】
また、本探索法に適した代表的細胞例としては、上記C6Bu-1/pSw-adicsinY110A/L112A細胞が挙げられる。本細胞系では、アディクシン(addicsin)タンパク質による特徴的な細胞外グルタミン酸取り込み能パターンが、アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質の過剰発現により完全に阻害されること、その効果がArl6ip-1タンパク質とのタンパク質間相互作用の抑制に由来することが明らかとなっている。また、本細胞は、C6Bu-1/pSw-adicsin細胞と異なり、アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質の過剰発現により細胞障害が惹起される。これらの実験結果は、本細胞系で観察される細胞外グルタミン酸取り込み能の阻害ならびに細胞障害を解除する未知物質は、EAAC1グルタミン酸輸送体機能制御因子アディクシン(addicsin)ならびにArl6ip-1を作用点とする可能性が高いことを示唆している。従って、本細胞系の利用により、EAAC1グルタミン酸輸送体機能制御因子アディクシン(addicsin)ならびにArl6ip-1に作用点を有する新規EAAC1グルタミン酸輸送体機能促進薬あるいは阻害薬が効率よく発見・開発することが可能となる。
【００３４】
これには、まず、24時間の100 pMミフェプリストン前処理によってアディクシン(addicsin)Y110A/L112Aドミナントネガティブ変異体タンパク質を過剰発現させたC6BU-1/pSw-addicsinY110A/ L112A細胞に対し、DMSOや蒸留水などの細胞毒性の無い溶媒に溶解させた種々の候補物質（天然抽出物、タンパク質、ペプチド、核酸、その他の無機および有機化合物を含む）を種々の濃度で前処置し、PKC活性薬等の細胞外刺激を与えた時のEAAC1グルタミン酸輸送体細胞外グルタミン酸取り込み能パターンの変化ならびに/あるいはLDHアッセイ法などによる細胞障害の進行度を検出することにより候補物質を探索・同定を行うことが可能となる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
アディクシン(addicsin)遺伝子
a．サブトラクションクローニングによる同定
ddY系マウス (雄、6週令) に塩酸モルヒネを10, 20, 40, 80, 100, 100, 100 mg/kgの用量で７日間にわたり1日に2回ずつ皮下に反復投与を行い、モルヒネ依存モデルマウスを作成した。一方、ddY系マウス (雄、6週令)に同様の方法にて生理食塩水を皮下投与したマウスを対照群とした。最終投与から16時間後にモルヒネならびに生理食塩水反復投与マウス群の扁桃体をそれぞれ摘出し、Quick prep micro mRNA purification Kit (Amersham Bioscience社) を用いてpoly(A) RNA (5 μg)を調製した。Zap-cDNA synthesis kit (STRATAGENE社) を使用して本mRNAよりλZap II cDNA ライブラリーを構築した。さらに、photobiotin-avidin法 (Nucleic Acids Res. 16, 10937, 1988) によるmRNAの差し引きを行ってsubtracted cDNAライブラリーを構築後、ディファレンシャルハイブリダイゼーションによりアディクシン(addicsin)遺伝子を含む薬物耐性依存関連候補遺伝子群を単離した。単離したλZapファージプラークは、in vivo excison によりpBluescript SK(-) 型ベクターに変換後、挿入断片の部分cDNA塩基配列を決定した。さらに、アディクシン(addicsin)タンパク質の生理機能を明らかにするために、昆虫からヒトに至る各種生物のアディクシン(addicsin)タンパク質の全アミノ酸配列を決定し、相同性解析を実施した。その結果、マウスアディクシン(addicsin)タンパク質の１０２番目〜１１８番目に相当するアミノ酸配列が解析したすべての生物種において極めて相同性が高いことが明らかとなった（図２）。さらに、マウスアディクシン(addicsin)タンパク質の１１０番目のチロシン残基ならびに１１２番目のロイシン残基に相当するアミノ酸残基は、解析したすべての生物種において完全に保存されていた（図２）。したがって、１１０番目のチロシン残基ならびに１１２番目のロイシン残基は、アディクシン(addicsin)タンパク質の分子生理機能の発現に深く関与する重要なアミノ酸残基であると考えられる。
【００３６】
b．アディクシン(addicsin) cDNAのクローニング
プラークハイブリダイゼーション法を用いて完全長アディクシン(addicsin) cDNAの単離を試みた。まず、反復モルヒネ投与を施したマウス扁桃体より構築したλZap II cDNA ライブラリーファージ溶液 (1x107 pfu/ml) 5 μlをOD660 = 0.5 になるように10 mM MgSO4 溶液に懸濁後、要時調製した大腸菌XL1-Blue MRF'溶液600 μlに添加し、ファージを大腸菌に感染させた。この感染済みの大腸菌をNZYプレート(13 cm x 9 cm) 12枚に5 x 104 プラーク/プレートとなるように蒔き、37℃で一晩培養してプラークを形成させた。ニトロセルロースフィルター (S&S社) をプレート上に約3分間静置してプラークをフィルター側に移し、さらにこのフィルターを変性溶液 (0.5 M NaOH、1.5 M NaCl) に2分間、中和溶液 (0.5 M Tris-HCl pH 7.6, 1.5 M NaCl) に5分間、2xSSC溶液に5分間それぞれ浸漬した。風乾後、UV照射を行い、42℃のプレハイブリダイゼーション溶液 (50% ホルムアミド、3xSSPE、1x Denhardt's、1% SDS、0.5 mg/ml サケ精子DNA) 中で約3時間浸漬振盪した。次に、Random Primer DNA Labeling Kit (宝酒造社)を使用してアディクシン(addicsin)挿入断片 (nt 1207- nt 1394) 100 ngより調製した放射性DNAプローブ (2×106 cpm/ml) 15 μlを添加後、42℃で一昼夜浸漬振盪してハイブリダイゼーションを行った。フィルターは、2xSSC溶液 (2xSSC、0.1% SDS) および0.2xSSC溶液 (0.2xSSC、0.1% SDS) の順に60℃で1時間ずつ洗浄し、風乾後に-80℃でオートラジオグラフィーを行った。陽性プラークは、SM溶液に懸濁後、2次ならびに3次スクリーニングに使用した。最終的に陽性であったプラークは、in vivo excision によってpBluescript SK(-) 型プラスミドに変換し、定法に従って増殖後、QIAGEN Midi Kit (QIAGEN社)を用いて精製プラスミドDNAを調製した。
【００３７】
また、このプラスミドのcDNA塩基配列は、中山等のSize-fractionated Uni-directional Deletion (SUD) 法 (実験医学 6, 849-857, 1988) に準拠し、各種デレーションミュータントを作成することで決定した。その結果、このプラスミドは、アディクシン(addicsin) cDNA (nt 75 - nt 1394)を含むものの、開始コドンおよび5'非翻訳領域が欠損していることが判明した。以後、本プラスミドをpBluescript SK(-)-アディクシン(addicsin)（partial）と記載する。そこでアディクシン(addicsin) (nt 1- nt 74)に相当するcDNA領域をクローニングするために、Nested PCR法によるアディクシン(addicsin) の5'非翻訳領域のクローニングを実施した。λgt10 BALB/c3T3マウス線維芽細胞 cDNAライブラリー(4×10５ pfu/μl) 溶液1.0 μl に10x PCR緩衝溶液 (PEアプライドシステムズ社) 2.5 μl、Ampli Taq DNA polymerase (5 U/μl ) (PEアプライドシステムズ社) 0.25 μl、1.25mM dNTP (TAKARA社) 8.0 μl、 プライマー1 (60 ng/μl) (配列番号１７) およびプライマー2 (60 ng/μl) (配列番号１８) を 各々2.5 μl、滅菌水4.25 μlを加えて最終容量を25 μlに調製した。
【００３８】
次に、DNA Thermal cycler PJ2000 Model 480 (PEアプライドシステムズ社) を用いてPCR反応（変性反応：96℃、30秒、アニーリング反応：52℃、45秒、合成反応：72℃、90秒、30サイクル）を行い、続いて72℃で10分間の伸長反応を行うことによって約455 bpのPCR産物を得た。このPCR産物を２回目の鋳型DNA溶液として使用した。次に、この鋳型DNA溶液 0.5 μlとプライマー３ (60 ng/μl) (配列番号１９) およびプライマー４(60 ng/μl) (配列番号２０) を各々2.5 μlを使用して1回目と同一組成のPCR試料を調製し、同一反応条件で2回目のPCRを行うことで約435 bp のPCR産物を得た。このPCR産物を1％アガロースゲルによって分離精製後、TAKARA Ligation kit (Ver.2) (TAKARA社)を用いてD. Marchukらの方法（Nucleic Acids Research 19, 1154, 1990）に準じて作製したpBluescript SK(-)-Tベクターにサブクローニング後、Eco RI - Nhe I挿入断片 (nt 1 - nt 452) を調製した。この調製挿入断片をプラークハイブリダイゼション法により単離したpBluescript SK(-)-アディクシン(addicsin)（partial）ベクターのEco RI - Nhe I部位に組み込むことによって完全長アディクシン(addicsin) cDNAを得た。以下、このベクターをpBluescript SK(-)-Ｔ-addicsinと記載する。
【実施例２】
【００３９】
動物細胞用発現ベクターの構築
動物細胞用発現ベクターを以下に示す手順で構築した。なお、構築したベクター類はすべて、cDNA塩基配列解析を実施して各種タグが付加した目的タンパク質をコードしていることを確認した。
a ．pcDNA3.1-addicsin発現ベクターの構築
pBluescript SK(-)-T-addicsinベクターを鋳型として、Ampli Taq DNA polymerase (5 U/μl) (PEアプライドシステムズ社) を使用してPCR反応を行った。プライマーは、５’ 末端側にKpn I部位を含むプライマー5（配列番号２１）ならびに5’末端側にApa I部位を含むプライマー6（配列番号２２）を使用した。PCR反応は、Gene Amp PCR System 9600 (PEアプライドシステムズ社) を使用して行い、変性反応；94℃、30秒、アニーリング反応；55℃、30秒、合成反応 ; 72℃、60秒を１サイクルとした35サイクルのPCR反応を実施した。なお、PCR前の酵素活性化反応は、95℃、9分、1サイクル、PCR終了後の伸長反応は72℃、1分、1サイクルで実施した。得られたPCR産物をKpn IとApa Iで二重消化後、 pcDNA3.1/Myc-His (+) A (Invitrogen社) 発現ベクターのKpn I - Apa I二重切断部位へ組み込んでpcDNA3.1-addicsin-myc 発現ベクターを得た。
【００４０】
b．pcDNA3.1-addicsinY110A/L112A発現ベクターの構築
pcDNA3.1-addicsin-mycベクターを鋳型としてAmpli Taq DNA polymerase (5 U/μl ) (PEアプライドシステムズ社)を使用してPCR反応を行った。プライマーは、１１０番目のチロシン残基ならびに１１２番目のロイシン残基を各々アラニン残基に置換されるように設計したプライマー7 (内在配列中にNhe I部位を含む) (配列番号２３) ならびに５’ 末端側にApa I部位を含むプライマー6（配列番号２２）を使用した。PCR反応は、Gene Amp PCR System 9600 (PEアプライドシステムズ社)を使用して行い、変性反応；94℃、30秒、アニーリング反応；50℃、30秒、合成反応 ; 72℃、60秒を１サイクルとして35サイクルの条件下で実施した。なお、PCR前の酵素活性化反応は、95℃、12分、1サイクルで実施し、PCR終了後の伸長反応は72℃、1分、1サイクルにて実施した。次に、Apa IおよびNhe Iで二重切断したpcDNA3.1-addicsin-myc ベクターと、Apa IとNhe Iで二重消化したPCR 産物をLigation Kit Ver.2 (TAKARA社)を用いて連結させることによりpcDNA3.1-addicsinY110A/L112A-myc 発現ベクターを構築した。さらに、この発現ベクターをKpn IとApa Iで二重消化することによって得られたKpn I - Apa I挿入断片を、pcDNA3.1/FLAG-His (+) A (Invitrogen社製品を独自に一部改変) 発現ベクターのKpn I - Apa I切断部位に組み込み、pcDNA3.1-addicsinY110A/L112A-FLAGベクターを構築した。
【００４１】
c．プライマー配列表
プライマー1 (配列番号１７）    5'-AGCAAGTTCAGCCTGGTTAAGT-3'
プライマー2 (配列番号１８）    5'-AACAGCAAAGGAAGAGTGATGC-3'
プライマー3 (配列番号１９）    5'-TTCAGCCTGGTTAAGTCCAAGC-3'
プライマー4 (配列番号２０）    5'-AGTGATGCCGAACACAAAGACC-3'
プライマー5 (配列番号２１）    5'- GCGGTACCCTCGCGAAGCAGAGGAACAT-3'
プライマー6 (配列番号２２）    5'- AAGGGCCCCTCCCTCGCTTTGCTGATGT-3'
プライマー7 (配列番号２３)     5'- CATGCTAGCCAGCGCCTTCGCCATATCC-3'
【実施例３】
【００４２】
C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A細胞の作製
ａ．導入ベクターの作製
本実験では、コンディショナル発現誘導システムとしてGeneSwitchTM System （Invitrogen社）を使用した。本システムのコンディショナル発現誘導原理は下記のとおりである。(i) pSwitchベクターならびにpGene/V5-His/addicsinY110A/L112A ベクターを哺乳類動物細胞（例えば、C6BU-1ラットグリオーマ細胞など）にコトランスフェクションすると、動物細胞内に導入されたpSwitchベクターからGAL4-DNA binding domain/human progesterone receptor (hPR)/p65 activation domainから構成されるGeneSwitch キメラ調節タンパク質が発現される。(ii)ヒトプロゲステロン受容体の人工リガンドであるミフェプリストンがGeneSwitchキメラ調節タンパク質内のhPRドメインに結合すると、GeneSwitchキメラ調節タンパク質の立体構造が変化して2量体形成が促進されると同時に、pGene/V5-His/addicsinY110A/L112A のプロモーター領域に存在するGAL4 UAS (Upstream Activating Sequence) への結合も促進され、アディクシン(addicsin) Y110A/L112Aタンパク質の転写反応が急速に誘導される。(iii) pSwitchベクター内にもGAL4 UASが存在するため、GeneSwitchキメラ調節タンパク質自身の発現に関してもポジティブフィードバックがかかる結果となり、加速度的にアディクシン(addicsin) Y110A/L112Aタンパク質の転写が促進される。従って、C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A安定株を作製するためには、pSwitchベクターならびにpGene/V5-His/addicsinY110A/L112Aベクターの双方を染色体に安定的に組み込んだ細胞を選別する必要がある。以下に、選別作業の概略を記す。
【００４３】
（１）pGene/V5-His/addicsinY110A/L112Aベクターの調製
pGene/V5-His/A ベクター (0.65 μg/μl)（Invitrogen社）5 μl に10×緩衝液L（TAKARA社）3 μl、Kpn I (10 U/μl) 1 μl、Apa I (15 U/μl) 1 μl、滅菌水20 μl を加えて総量を30μlにし、37℃で1時間反応させた。Kpn I - Apa I消化断片 (約4.6 kbp)を1％アガロースゲル電気泳動により分離精製後、Ultrafree-MC 0.65 μm フィルターカラム（ミリポア社）を用いてアガロースゲルより回収した（以下、pGene回収溶液と記載）。次に、pcDNA3.1-addicsinY110A/L112Aベクター3 μgに相当する溶液に10×緩衝液L（TAKARA社）3 μl、Kpn I (10 U/μl) 1 μl、Apa I (12 U/μl) 1 μl、至適量の滅菌水を各々加え、最終的に総量が30 μlになるようにし、37℃で1時間反応させた。各々の反応生成物は1％アガロースゲル電気泳動により分離精製後、各々のKpn I - Apa I挿入断片（約600 bp前後）をUltrafree-MC 0.65 μm フィルターカラム（ミリポア社）を用いてアガロースゲルより回収した（以下、断片回収溶液と記載）。1/10量のpGene回収溶液と断片回収溶液全量を混合後、フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿による精製濃縮を行った。さらに、滅菌蒸留水5 μl を加えてよく撹拌後、DNA Ligation Kit Ver.2（TAKARA社）を用いて、pGene/V5-His/AベクターのKpn IおよびApa I部位に、addicsinY110A/L112A cDMAのKpn I - Apa I挿入断片を連結することによりpGene/V5-His/addicsinY110A/L112Aベクターを得た。最終的に得られたpGene/V5-His/addicsinY110A/L112Aベクターは、アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質のＣ末側にV5-Hisタグが付加したキメラタンパク質をコードすることをcDNA塩基配列解析により確認した。
【００４４】
（２）直鎖状pSwitchならびにpGene/V5-His/addicsinY110A/L112Aベクターの作製
pSwitchベクター（Invitrogen社）およびpGene/V5-His/addicsinY110A/L112Aベクター (Invitrogen社）それぞれ30 μg分に相当する溶液に、10×緩衝液K (TAKARA社) 5 μl、BST1107I (10 U/μl) (TAKARA社) 3 μl、至適量の滅菌水を加えて最終的に総量が50 μlになるようにし、37℃で11時間反応させた。BST1107Iで消化した断片は、1％アガロースゲル電気泳動により分離精製後、Ultrafree-MC 0.65 μm フィルターカラム（ミリポア社）を用いて回収した。フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿による精製濃縮後、20 μl の滅菌蒸留水に溶解させ、直鎖状のpSwitchならびpGene/V5-His/addicsinY110A/L112Aベクター溶液を得た。
【００４５】
ｂ．C6BU-1/pSw安定株の作製
最初に、GeneSwitchキメラ調節タンパク質をコードするpSwitchベクターを染色体に組み込んだC6BU-1安定細胞株（以下、C6BU-1/pSwと記載）を作製した。ラットC6BU-1グリオーマ細胞を25cm2フラスコ（グライナー社）に播種し、10％ 牛胎児血清 (Hyclone社)を含むDulbeco’s Modified Eagle’s Medium (Sigma社) (以下、10％ FCS DMEM) 中、37℃、湿度100％、5％ CO2を含む空気下のCO2インキュベーター内で90% 細胞密度に達するまで培養を行った。次に、培地を5 mlの新鮮な10％ FCS DMEMに交換後、 実施例３ a（２）で得られた直鎖状pSwitchベクター (Invitrogen社) 12 μgをリポフェクトアミン2000試薬（Invitrogen社）を用いてトランスフェクションした。なお、トランスフェクション操作は、リポフェクトアミン2000試薬に添付されていた取扱説明書に準拠した。48時間後に培地を200 μg/ml ハイグロマイシンＢ(Invitrogen社)を含む10％ FCS DMEMに交換し、さらに19日間にわたって培養を続け、ハイグロマイシンＢ抵抗性C6BU-1細胞株（pSwitchベクターが染色体に組み込まれたC6BU-1細胞株）を得た。これらハイグロマイシンＢ抵抗性C6BU-1細胞株を、１穴あたり１個以下の細胞数となるように200 μg/mlハイグロマイシンＢを含む10％ FCS DMEMで無限希釈し、96穴プレート（ファルコン社）に継代した。その後25日間にわたって培養を続け、増殖性を示すハイグロマイシンＢ抵抗性C6BU-1細胞株を42個得た。次に、これら細胞株のミフェプリストン依存的コンディショナル発現誘導応答性をレポーター遺伝子lacZの転写産物であるβ-ガラクトシダーゼ（β-Gal）酵素活性を指標に評価（β-Galアッセイ法）して至適安定細胞株の選別を行った。
【００４６】
β-Galアッセイ法の概略は下記に記すとおりである。まず、これら候補細胞株を24穴プレート（ファルコン社）に個別に継代し、90% 細胞密度に達するまで培養した。次に、リポフェクトアミン2000試薬（Invitorgen社）を用いてpGene/V5-His/lacZベクター（Invitrogen社）1 μgを各候補安定細胞株にトランスフェクションし、24時間後に最終濃度が10 nMとなるようにミフェプリストンを添加した。48時間後にβ-Galアッセイキット（Invitrogen社）を用い、ミフェプリストンの曝露によって一過性に発現が誘導されたβ-Galの酵素活性を定量した。なお、β-Galアッセイの操作は、キットに添付された取扱説明書に準拠した。また、β-Galの基質にはortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (以下、ONPG)（Invitrogen社）を使用し、β-GalがONPGを加水分解することにより産生する反応生成物量を420 nmにおける吸光度を指標にして定量化し、ミフェプリストン依存的コンディショナル発現誘導能を評価した。
最終的に、クローン＃39の１株のみが極めて厳格なミフェプリストン依存的コンディショナル発現誘導応答性を示したので、この株をC6BU-1/pSwと命名し、以後の実験に使用した。
【００４７】
ｃ．C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A安定株の作製
アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質をコードするcDNAを染色体に安定的に組み込んだC6BU-1/pSw細胞株（以下、C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112Aと記載）を作製した。その概略は下記のとおりである。まず、C6BU-1/pSw細胞を直径9cmプラスチックシャーレ（グライナー社）に播き、200 μg/ml ハイグロマイシンＢを含む10％ FCS DMEM中、37℃、湿度100％、5％ CO2を含む空気下のCO2インキュベーター内で90% 細胞密度に達するまで培養を行った。次に、培地を10 mlの新しい200 μg/ml ハイグロマイシンＢを含む10％ FCS DMEMに交換後、リポフェクトアミン2000試薬（Invitrogen社）を用い、上述した直鎖状pGene/V5-His/addicsinY110A/L112Aベクター5 μgをトランスフェクションした。なお、トランスフェクション操作は、リポフェクトアミン2000試薬に添付されている取扱説明書に準拠した。48時間後に培地を200 μg/mlハイグロマイシンＢ(Invitrogen社)ならびに250 μg/mlゼオシン(Invitrogen社)を含む10％ FCS DMEMに交換し、さらに13日間にわたって培養を続け、ゼオシン抵抗性C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A細胞株（C6BU-1/pSw細胞株の染色体にpGene-addicsinY110A/L112Aベクターが組み込まれた細胞株）を作製した。次に、これらゼオシン抵抗性C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A細胞株を、１穴あたり１個以下の細胞数となるように、200 μg/mlハイグロマイシンＢならびに250 μg/mlゼオシンを含む10％ FCS DMEMで無限希釈し、96穴プレート（ファルコン社）に継代した。その後さらに約2ヶ月間にわたって培養を続け、増殖性を示すゼオシン抵抗性C6BU-1/pSｗ-addicsinY110A/L112A安定細胞を18株得た。
【００４８】
次に、これら安定細胞株におけるアディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5タンパク質のミフェプリストン依存的コンディショナル発現誘導性を抗V5-HRPモノクローナル抗体（Invitrogen社）を用いたウエスタンブロット解析により評価し、至適細胞株を選別した。なお、選別作業は下記のとおり行った。まず、24穴プレート（ファルコン社）に、これら安定細胞株を200 μg/ml ハイグロマイシンＢおよび250 μg/mlゼオシンを含む10％ FCS DMEM中で継代し、90% 細胞密度に達するまで培養後、最終濃度が100 pMとなるようにミフェプリストンを添加した。24時間後に培地を完全に除去し、１穴あたり500 μlのPBS溶液で3回の洗浄を行った。次に、１穴あたり50 μlの2xSDS試料溶液 （125 mM Tris HCl, 20% Glycerol, 4% SDS, pH 6.8）を加えて細胞を完全に溶解させ、16Ｇ注射針を装着したシリンジで5回以上のポンピング操作を実施してゲノムDNAを物理的に断片化させることで試料粘度を低下させた細胞溶解溶液を調製した。この試料を100℃で5分間の加熱処理後、ウエスタンブロット解析に供し、アディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5タンパク質の発現誘導の有無を解析することによって至適細胞株の選別評価を行った。
【００４９】
本ウエスタンブロット解析ではマウス抗V5-HRP モノクローナル抗体（Invitrogen社）を500倍希釈して使用した。また、アディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5タンパク質由来のシグナルは、ECL system (Amersham Bioscience 社)を使用した化学発光法によってX線フィルム（コダック社）上にて検出した。アディクシン(addicsin)Y110A/L112A変異タンパク質は、ミフェプリストン非存在下では、検出不能な発現レベルであるが、100 pMのミフェプリストン存在下では顕著な発現が観察される（図３）。したがって、このミフェプリストンによる発現誘導の有無で、目的とする細胞株を選別することができる。
最終的に、ミフェプリストンによる発現誘導を示したC6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A安定細胞18株中、クローン＃34の１株が極めて厳格なミフェプリストン依存的コンディショナル発現誘導応答性を示したので、この安定細胞株をC6BU-1/pSｗ-addicsinY110A/L112A#34と命名し、各種生化学的解析に使用した。本細胞株は寄託番号FERM P-20962として独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。
【実施例４】
【００５０】
C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A#34（FERM P-20962）細胞株の生化学的特性の解析
ａ．内在性アクチンタンパク質発現量の解析
C6BU-1/pSｗ-addicsinY110A/L112A #34（FERM P-20962）細胞のミフェプリストン依存的コンディショナル発現誘導時における内在性アクチンタンパク質発現量の変動の有無をウエスタンブロット解析により検討した。ウエスタンブロット解析に使用した試料は、実施例３ cと同様にして調製した。アディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5タンパク質の発現誘導の解析目的には、１次抗体として500倍希釈のマウスV5-HRPモノクローナル抗体（Invitorogen社）を使用した。また、アクチン動態の解析目的には、１次抗体として250倍希釈のマウス抗アクチンモノクローナル抗体（CENMICON社）を、2次抗体として2,000倍希釈のウサギ抗マウスIgG-HRP抗体（CENMICON社）を使用した。さらに、アクチンタンパク質由来のシグナルは、ECL system (Amersham Bioscience 社)を使用した化学発光法によってX線フィルム（コダック社）上にて検出した。まず、アディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5タンパク質の発現誘導がミフェプリストン依存的であるかを検討したところ、24時間曝露下条件では、ミフェプリストン添加時のみにアディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5タンパク質の発現誘導が確認された（図３）。また、ハウスキーピング因子であるactinタンパク質の内在性発現量を検討したところ、ミフェプリストンの添加、無添加にかかわらずその発現が検出され、しかも発現量に変動はなかった（図３）。したがって、C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A#34（FERM P-20962）細胞株は、アディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5変異体タンパク質の発現能を有するとともに、安定的な内在性アクチンの発現能も保持していることが明らかである。
【００５１】
ｂ．ミフェプリストン曝露時における細胞形態変化に関する解析
C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A#34（FERM P-20962）細胞を1ｘ10５ 個/mlの濃度になるように200 μg/ml ハイグロマイシンＢおよび250 μg/mlゼオシンを含む10％ FCS DMEMにて希釈調製した。この希釈培地を24穴 PRIMARIAプレート（ファルコン社）に1穴当たり500 μlずつ播種し、37℃、湿度100％、5％ CO2を含む空気下のCO2インキュベーター内で70% 細胞密度に達するまで培養後、最終濃度が1 pM 〜 1 μM（10倍希釈系列）の濃度となるようにミフェプリストンを添加した。なお、対照群（非曝露群）には、添加したミフェプリストンと等容量の99%エタノール溶液を添加した。なお24時間曝露下条件では、ミフェプリストン添加時のみ、アディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5タンパク質の発現誘導が確認された（図３）。
また、添加24時間後に位相差顕微鏡DTPHOT-TND（ニコン社）を用いて、各種濃度のミフェプリストン曝露時におけるC6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A#34（FERM P-20962）細胞の形態観察ならびに写真撮影を行い、細胞形態変化に関する解析を実施した。結果を図４に示す。これによれば、100 pMのミフェプリストン存在下では、一部の細胞が球形化するのが観察されたが、核の凝集などのアポトーシス様の反応は形態学的には見出されなかった。
【００５２】
ｃ．ミフェプリストン曝露時における細胞毒性評価
C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A#34（FERM P-20962）細胞を1ｘ10５ 個/mlの濃度になるように200 μg/ml ハイグロマイシンＢおよび250 μg/mlゼオシンを含む10％ FCS DMEMにて希釈調製した。この希釈培地を24穴 PRIMARIAプレート（ファルコン社）1穴当たり500 μlずつ播種し、37℃、湿度100％、5% CO2を含む空気下のCO2インキュベーター内で70% 細胞密度に達するまで培養後、最終濃度が1 pM 〜 1 μM（10倍希釈系列）の濃度となるようにミフェプリストンを添加した。なお、対照群（非曝露群）には、添加したミフェプリストンと等容量の99%エタノール溶液を添加した。C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A#34（FERM P-20962）細胞の細胞毒性は、ミフェプリストン添加24時間後における細胞培養液中に遊離したLDH活性をLDH-Cytotoxic Test (和光純薬)を用いて測定することにより定量した。なお、実験操作は、キット添付の取扱説明書に準拠して実施した。その概要は下記の通りである。まず、細胞培養液（50 μl/穴）を検体として採取後、キット添付の反応試薬 (50 μl/穴)を添加して適当な検出感度に達する間まで室温で放置した。次に、反応停止液 (100 μl/穴)を加えて反応を完全に停止後、分光光度計にて563 nmの吸光度を測定し定量化した。結果を図５に示す。これによれば、なお、24時間曝露下条件では、100 pM以上のミフェプリストン添加時のみ、アディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5タンパク質の発現誘導が確認された（図３）。この時、100 pMのミフェプリストン存在下（アディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5タンパク質の過剰発現状態）では、細胞障害反応が進行していることが判明した（図５）。
【００５３】
d．ビオチン化アッセイ法を用いたアディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5タンパク質と細胞膜表面局在タンパク質との結合動態の解析
アディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5タンパク質と細胞膜表面局在タンパク質との結合動態を明らかにする目的で、ビオチン化アッセイを既報に準拠して実施した (K.E. Davis et. al., J. Neuroscience, 18 (7), 2475-2485, 1998)。その概略は下記の通りである。まず、C6BU-1/pSｗ-addicsinY110A/L112A#34（FERM P-20962）細胞を直径3.5 cmプラスチックシャーレ（グライナー社）に播種し、200 μg/ml ハイグロマイシンＢならびに250 μg/mlゼオシンを含む10％ FCS DMEM中、37℃、湿度100％、5％ CO2を含む空気下のCO2インキュベーター内で約80％ 細胞密度に達するまで培養を行った。次に、アディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5タンパク質をコンディショナルに発現誘導させる目的で、最終濃度が100 pMになるようにミフェプリストンを添加し、さらに24時間の培養を行った。なお、対照群（非誘導群）には、添加したミフェプリストンと同容量の99％エタノール溶液を培地に添加した。ミフェプリストン添加24時間後、培地を10 mlの新しいを含む10％ FCS DMEMに交換し、100 nM PMAを含む培養液中に37℃で30分間曝露すさせ、PKCの活性化によるEAAC1グルタミン酸輸送体の細胞膜表面上への発現量が増加させた。一方、対照群（100 nM PMA未処理群）はDMSO処理した。C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A細胞を、37℃で保温した0.1 mM Ca2+ならびに1.0 mM Mg2+を含むPBS溶液（以下、PBS/Ca-Mg溶液と記載）で3回洗浄後、ビオチン化溶液（Sulfosuccinimido-NHS-biotin（PIERCE社）を最終濃度で0.5 mg/mlになるようにPBS/Ca-Mg溶液に溶解した溶液）を500 μl添加し、4℃下で2時間反応させて細胞膜外表面に局在するタンパク質をビオチン化した。次に、細胞膜外表面のタンパク質と結合しなかったSulfosuccinimido-NHS-biotinを非活化ならびに除去させる目的で、グリシン溶液（グリシン（和光社）を最終濃度で100 mMになるようにPBS/Ca-Mg溶液に溶解した溶液）で細胞を2回洗浄後 (2 ml/回)、さらに細胞をグリシン溶液2 mlと4℃下で20分間反応させた。グリシン溶液を完全に除去後、250 μlのRIPA溶液 (10 mM Tris HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% DOC, 1% TritonX-100, 0.1%SDS, pH 7.4, 0.1% Protease Inhibitor Cocktail (P-8340) (Sigma社))を細胞に添加し、4℃下で60分間穏やかに振とうすることで細胞を完全に溶解させて細胞溶解液を調製した。遠心分離後（16,500 x g , 30分, 4℃）、上清1を回収してTotal lysates fractionとした。
【００５４】
次に、Total lysates fraction  125 μlと実施例５ b (1) に記載した方法と同様にしてAvidin Agarose Gel（Sigma社）より調製したAvidin Agarose Gel 50％懸濁液（以下avidinビーズと記載）125 μlを混合し60分間、室温で反応させた。遠心分離後（16,500 x g , 10分, 4℃）、上清2を回収してintracellural lysates fractionとした。Total lysates fraction  と反応させたavidinビーズは、RIPA溶液で6回洗浄後（250 μl/回）、2xSDS試料溶液（125 mM Tris HCl, 20% Glycerol, 4% SDS, pH 6.8）65 μlを添加して撹拌し、avidinビーズに結合したビオチン化細胞膜局在タンパク質群を溶出後、遠心分離（16,500 x g , 10分）により上清３を回収し、Biotinylated lysates fractionとした。各lysates fractionは、加熱変性処後、各々ウエスタンブロット解析に供した。また、ECL system (Amersham Bioscience 社)を使用した化学発光法によってアディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5タンパク質ならびにアクチンタンパク質由来のシグナルをX線フィルム（コダック社）上において検出した。なお、ウエスタンブロット解析に使用した抗体とその反応条件は次の通りである。
【００５５】
<１次抗体>
・マウス抗V5-HRPモノクローナル抗体（Invitrogen社）；5,000倍希釈
・マウス抗アクチンモノクローナル抗体（CENMICON社）；250倍希釈
<2次抗体>
・ウサギ抗マウスIgG-HRP抗体（CENMICON社）；2,000倍希釈
尚、C6BU-1/pSw-addicsin#4細胞についても全く同様の実験を実施した。但し、コンディショナルな発現誘導をミフェプリストン10 nMの条件で実施した。
結果を図６に示す。すなわち、アディクシン(addicsin)-V5タンパク質ならびにアディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5タンパク質とも、本実験系では100 nM PMA刺激による細胞内局在変化は観察されなかった。しかし、アディクシン(addicsin)-V5タンパク質は細胞膜表面に局在するタンパク質群（恐らくEAAC1タンパク質と思われる）に対してタンパク質間相互作用を示したが、アディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5タンパク質は細胞膜表面に局在するタンパク質群とはタンパク質間相互作用をほとんど示さなかった。
【実施例５】
【００５６】
Arl6ip-1タンパク質とアディクシン(addicsin)L110A/L112Aタンパク質のタンパク質間相互作用の解析
ａ．解析試料の作製
COS-7細胞を直径3 cmシャーレ（グライナー社）に播き、10％ 牛胎児血清 (Hyclone社)を含むDulbeco’s Modified Eagle’s Medium (Sigma社) (以下、10％ FCS DMEMと記載) 中、37℃、湿度100％、5％ CO2を含む空気下のCO2インキュベーター内で80% ~ 90% 細胞密度に達するまで培養を行った。次に、培地を新鮮な10％ FCS DMEMに交換後、リポフェクトアミン2000試薬（Invitrogen社）を用い、pcDNA3.1-addicsin-mycベクターならびにpcDNA3.1-Arl6ip-1-FLAGベクター 各5 μg（合計10 μg）、あるいはpcDNA3.1-addicsinY110A/L112A-myc ベクターならびにpcDNA3.1-Arl6ip-1-FLAGベクター 各5 μg（合計10 μg）を同時にトランスフェクションした。なお、トランスフェクション操作は、リポフェクトアミン2000試薬に添付された取扱説明書に準拠した。トランスフェクション操作から6時間経過後に新鮮な10％ FCS DMEM培地に交換し、さらに42時間（合計48時間）の培養を行った。培養後、PBS溶液で3回洗浄後、細胞を1 mlのRIPA溶液 (10 mM Tris HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% DOC, 1% TritonX-100, 0.1%SDS, pH 7.4, 0.1% Protease Inhibitor Cocktail (P-8340) (Sigma社))に溶解させ、以下の実験に供した。
【００５７】
b．免疫沈降法による解析
（１）Anti-FLAG-M2 Agarose Affinity Gel 50％懸濁液の調製
Anti-FLAG-M2 Agarose Affinity Gel溶液（Sigma社）１mlを1.5mlチューブに分注して遠心分離後（500 ｘｇ, 30秒）、デカントによりAnti-FLAG-M2 Agarose Affinity Gel （以下FLAGビーズと記載）を回収した。
FLAGビーズへの非特異的吸着を防ぐために、FLAGビーズを5% BSA-TBS溶液（50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 5% BSA）にて4回、さらにTBS溶液（50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl）にて4回洗浄した。洗浄済みのFLAGビーズと等容量のTBS溶液を混合し、Anti-FLAG-M2 Agarose Affinity Gel 50％懸濁液とした。
【００５８】
（２）免疫沈降実験
まず、実施例５ a 項で記載したRIPA溶解溶液を遠心分離（15,000 ｘｇ、20分）して上清１を回収した。上清１にAnti-FLAG-M2 Agarose Affinity Gel 50％懸濁液50 μlを混合し、4℃で一晩、ゆっくりと回転撹拌することによってFLAGビーズとArl6ip-1-FLAGタンパク質複合体（Arl6ip-1-FLAG/アディクシン(addicsin)-mycあるいはArl6ip-1-FLAG/アディクシン(addicsin)Y110A/L112A-myc）との抗原抗体反応を実施した。この混合溶液を遠心分離後（500 ｘｇ、30秒）、デカントによりFLAGビーズを回収し、TBS溶液にてさらに5回の洗浄を行った。洗浄を終えたFLAGビーズは、2xSDS試料溶液（125 mM Tris HCl, 20% Glycerol, 4% SDS, pH 6.8）40 μlを添加後に加熱変性処理を施し、ウエスタンブロット解析に供することで、Arl6ip-1-FLAGタンパク質に結合するアディクシン(addicsin)-mycタンパク質、アディクシン(addicsin)Y110A/L112A-mycタンパク質の発現量を解析した。また、上清１をウエスタンブロット解析に供することで、COS-7細胞内に発現するアクチンタンパク質、Arl6ip-1-FLAGタンパク質、アディクシン(addicsin)-mycタンパク質、アディクシン(addicsin)Y110A/L112A-mycタンパク質の発現量を解析した。各タンパク質の発現量は、ECL system (Amersham Bioscience 社)を使用した化学発光法によって各タンパク質由来のシグナルをX線フィルム（コダック社）上にて検出し、NIH Image 1.62解析ソフトを用いて検出シグナルの強度を定量化することで算出した。この時、各タンパク質の発現量は、ハウスキーピングタンパク質であるアクチンタンパク質の発現量に対して標準化し、アクチンタンパク質の発現量に対する相対比として算出した。なお、ウエスタンブロット解析に使用した抗体とその反応条件は次の通りである。
【００５９】
<１次抗体>
・マウス抗FLAG-M2モノクローナル抗体（Sigma社）；2,000倍希釈
・マウス抗c-mycモノクローナル抗体（Invitrogen社）；500倍希釈
・マウス抗アクチンモノクローナル抗体（CENMICON社）；250倍希釈
<2次抗体>
・ウサギ抗マウスIgG-HRP抗体（CENMICON社）；2,000倍希釈
結果を図７，８に示す。これによれば、アディクシン(addicsin)Y110A/L112A-mycタンパク質のArl6ip-1-FLAGタンパク質とのタンパク質間相互作用能力は、アディクシン(addicsin)-mycタンパク質のそれと比較した場合、約40％程度のタンパク質間相互作用能力しか持たないことが明らかである。
【実施例６】
【００６０】
C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A#34（FERM P-20962）細胞の細胞外グルタミン酸取り込み能の解析
C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A#34（FERM P-20962）細胞を1ｘ10５ 個/mlの濃度になるよう200 μg/ml ハイグロマイシンＢおよび250 μg/mlゼオシンを含む10％ FCS DMEMにて希釈調製した。この希釈培地を24穴 PRIMARIAプレート（ファルコン社）に1穴当たり500 μlずつ播き、37℃、湿度100％、5％ CO2を含む空気下のCO2インキュベーター内で70% 細胞密度に達するまで培養後、最終濃度が100 pMとなるようにミフェプリストンを添加した。24時間後に培地を完全に除去し、10% FCS DMEM 、100 nM PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate; PKC活性化剤)、あるいは100 nM 4α (4αPhorbol ; PKC非活性化剤)を含む10% FCS DMEMを１穴あたり1000 μlずつ分注し、前処置を施した。37℃で30分間の前処置培養後、グルタミン酸取り込み能の測定実験に供した。なお、グルタミン酸取り込み実験に関する操作は、既報 (Lisa A. Dowd et.al., J. Neurochem., 67, 508-516, 1996)の内容を一部改変して実施した。まず実験に先立ち、(i) Na+ 溶液 (5 mM Tris-HCl (pH 7.2), 10 mM HEPES (pH 7.2), 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 1.2 mM K2HPO4, 10 mＭ D-(+)-Glucose, pH 7.2)、(ii) Choline+ 溶液 (5 mM Tris-HCl (pH 7.2), 10 mM HEPES (pH 7.2), 140 mM Choline Cl, 2.5 mM KCl, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 1.2 mM K2HPO4, 10 mＭ D-(+)-Glucose, pH 7.2)、(iii)細胞溶解液 (100 mM NaOH)、(iv) 2.5 mCi 放射性グルタミン酸溶液 (L-［G-3H］放射性グルタミン酸（37 MBq, 1 mCi/ml）(Amersham Bioscience社)ならびに30 μM 非放射性L-グルタミン酸を含むNa+ 溶液 もしくはCholine+ 溶液)をそれぞれ要時調製した。次に、Na+依存的なグルタミン酸取り込み能を測定する目的で、37℃に保温したNa+溶液を、１穴あたり500 μlずつ上記プレートに分注し、合計3回の洗浄を行った。洗浄終了後、ただちに、放射性グルタミン酸溶液を１穴当たり400 μlずつ分注し、37℃で5分間にわたって放射性グルタミン酸を細胞内へ取り込ませた。取り込み反応終了後、ただちに放射性グルタミン酸溶液を完全に除去し、あらかじめ4℃に冷却しておいたCholine+ 溶液を１穴あたり500 μlずつ分注し、合計3回の洗浄を行った。Choline+ 溶液を完全に除去後、細胞溶解液を１穴あたり正確に400 μlずつ分注し、十分に振とう後、細胞を完全に溶解させ、細胞溶解溶液とした。この細胞溶解液360 μlをHionic-Flour液体シンチレーションカクテル(Perkin Elmer社) 1 mlに加えて均一になるまで混合後、液体シンチレーションカウンター (Beckman社)を用いて3Hの絶対放射活性（dpm）を測定した。また、この細胞溶解溶液のタンパク質濃度は、DC Protein Assayキット（PIERCE社）を用いて測定した。具体的には、上記の細胞溶解溶液5 μl 、キット添付試薬Ａ 25 μl ならびにキット添付試薬Ｂ 200 μl をそれぞれ混合し、室温で30分間反応後、分光光度計にて655 nmの吸光度を測定した。また、同様の条件下、各種濃度の牛血清アルブミン（BSA）の655 nmの吸光度を測定して標準濃度曲線を作製し、これに基づいて１穴毎のタンパク質濃度を算出した。
【００６１】
一方、Na+に依存しない非特異的グルタミン酸取り込み量（バックグランド）は、Na+溶液の代わりにCholine+溶液を使用し、上記記載内容と全く同一の操作を行うことによって測定した。また、この実験時におけるタンパク質濃度も上記記載内容と全く同一の操作を行うことによって決定した。なお、細胞内へのグルタミン酸取り込み量は、グルタミン酸取り込み量 = （Na+に依存的なタンパク質重量当たりの絶対放射活性値） - (Na+に非依存的なタンパク質重量当たりの絶対放射活性値) により算出した。
C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A#34（FERM P-20962）細胞の細胞外グルタミン酸取り込み能の解析結果を図９、１０に示す。当該細胞の細胞外グルタミン酸取り込み能は、対照群（100 nM PMA未処理群）と比べて２倍以上に増加した（図９）。また、この効果は、PMAの非活性化アナログである 100 nM の4 alphaでは全く観察されなかった（図１０）。C6BU-1細胞では、37℃で30分間の100 nM PMA処理により、PKCの活性化に伴うEAAC1グルタミン酸輸送体の細胞膜表面上の発現量が増加し、細胞外グルタミン酸取り込み能が２〜３倍に増加することが既に知られている。従って、C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A細胞は、野生型C6BU-1細胞と同様な形質を保持していることが明らかとなった。次に、100 pMミフェプリストン前処置したC6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A細胞を、37℃で30分間の100 nM PMA処理を施し、アディクシン(addicsin)Y110A/L112A-V5タンパク質の過剰発現が細胞外グルタミン酸取り込み能に及ぼす影響を検討した。C6BU-1/pSw-addicsin細胞では、アディクシン(addicsin)タンパク質の発現量の増加によって統計的に有為な細胞外グルタミン酸取り込み能の減少が観察されることが明らかとなっている（特許文献１）。しかしながら、C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A細胞では、100 nM PMA処理の有無にかかわらず、細胞外グルタミン酸取り込み能は全く変化しなかった（図９）。したがって、上記、図７、８、９、１０に示した結果は、１）EAAC1グルタミン酸輸送体の細胞膜表面上への輸送に伴って生じる細胞外グルタミン酸取り込み動態は、アディクシン(addicsin)タンパク質とArl6ip-1タンパク質とのタンパク質間相互作用によって制御され得ること、さらには、アディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質がアディクシン(addicsin)タンパク質のドミナントネガティブ変異体として機能し得ることを強く示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】神経シナプス近傍におけるグルタミン酸輸送体の作用機構の概略を示す図である。
【図２】アディクシン(addicsin)タンパク質の１１０番目のタイロシン残基と１１２番目のロイシン残基が生物種間を越えて高度に保存されていることを示すアミノ酸配列比較図である。
【図３】C6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A#34（FERMP-20962）細胞におけるアディクシン(addicsin)Y110A/ L112A-V5タンパク質のミフェプリストン曝露時に特異的な発現誘導をウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。
【図４】ミフェプリストン曝露によるC6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A#34（FERMP-20962）細胞の細胞形態変化を示す図である。
【図５】ミフェプリストン曝露によるC6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A#34（FERMP-20962）細胞の細胞障害試験（LDH試験）結果を示す図である。
【図６】細胞膜表面をビオチン化標識したC6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A#34（FERMP-20962）細胞におけるアディクシン(addicsin)Y110A/L112Aタンパク質と細胞膜表面局在タンパク質との結合動態をウエスタンブロットを用いて解析した結果を示す図である。
【図７】COS-7細胞におけるArl6ip-1/アディクシン(addicsin)タンパク質複合体及びArl6ip-1/アディクシン(addicsin)L110A/L112Aタンパク質複合体におけるタンパク質間相互作用を免疫沈降法により解析した結果を示す図である。
【図８】図７における免疫沈降結果を定量化した図である。
【図９】100 nM PMA前処置後におけるC6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A#34（FERMP-20962）細胞の細胞外グルタミン酸取り込み能変化の解析結果を示す図である。
【図１０】100 nM 4α前処置後におけるC6BU-1/pSw-addicsinY110A/L112A#34（FERMP-20962）細胞の細胞外グルタミン酸取り込み能変化の解析結果を示す図である。
【図１】
2008061612.tif 000003
【図２】
2008061612.tif 000004
【図３】
2008061612.tif 000005
【図４】
2008061612.tif 000006
【図５】
2008061612.tif 000007
【図６】
2008061612.tif 000008
【図７】
2008061612.tif 000009
【図８】
2008061612.tif 000010
【図９】
2008061612.tif 000011
【図１０】
2008061612.tif 000012
【配列表】
2008061612000001.app