(57)【要約】【課題】環境汚染物質、特に石油あるいは石油中の多環芳香族炭化水素を有効に分解無害化するための手段を提供して汚染環境を浄化する。また、汚染環境のモニタリング、評価等を簡便迅速に行うための手段を提供する。【解決手段】Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する新規微生物を単離し、該微生物を用いて上記環境汚染物質を分解、浄化する。また、該新種微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ／ＲＮＡから調製したプローブを用いて 環境汚染物質分解能を有する細菌の検出・定量を簡便迅速に行うとともに、汚染環境のモニタリング、評価を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１若しくは配列番号２の塩基配列の一部からなるか、または配列番号１若しくは配列番号２の塩基配列に対応するリボキシヌクレオチド配列の一部からなり、かつ、塩基長１０〜５０ｂｐのＲＮＡまたはＤＮＡプローブ。
【請求項２】
配列番号３、４または５に記載の塩基配列またはこれに対応するリボキシヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のＲＮＡまたはＤＮＡプローブ。
【請求項３】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する環境汚染物質分解細菌を検出または定量するために用いる、請求項１または２に記載のＲＮＡまたはＤＮＡプローブ。
【請求項４】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する環境汚染物質分解細菌が石油分解細菌である、請求項３に記載のＲＮＡまたはＤＮＡプローブ。
【請求項５】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＡＮＩ７Ａ菌株、またはＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＡＮＩ７Ｐ菌株を検出および／または定量するために用いる、請求項３または４に記載のＲＮＡまたはＤＮＡプローブ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のＲＮＡまたはＤＮＡプローブを用いて、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属 に属する細菌を検出および／または定量する方法。
【請求項７】
検出または定量される細菌が、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する環境汚染物質分解菌である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する環境汚染物質分解菌が石油分解菌である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載のＲＮＡまたはＤＮＡプローブを用いて、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する有用細菌をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
スクリーニングされる細菌がＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する環境汚染物質分解細菌である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する環境汚染物質分解細菌が石油分解細菌である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれかに記載のＲＮＡまたはＤＮＡプローブを用いたＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション、または該ＤＮＡプローブをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属細菌を同定する方法。
【請求項１３】
同定される細菌がＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する環境汚染物質分解細菌である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する環境汚染物質分解細菌が石油分解細菌である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項６〜８のいずれかに記載の方法を用いて、有害物質汚染環境のモニタリング、解析・評価および診断する方法
【請求項１６】
請求項６〜８のいずれかに記載の方法を用いて、有害物質汚染環境の浄化及乃至修復過程を解析し、評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は環境汚染物質を分解、除去することのできるＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する細菌を検出あるいはスクリーニングするためのＤＮＡまたはプローブ、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年，石油による海洋の汚染は海洋の生態系や水産生物などに悪影響を及ぼすことなどから世界的な環境問題となっている。
海洋に流出した石油はオイルフェンス，油回収機，油吸着材などによる物理的回収法と油ゲル化剤，乳化分散剤等の油処理剤による化学的処理方法がある（非特許文献１参照）。
物理的処理は海洋生態系に及ぼす影響は少ないと思われるが，化学的処理は油処理剤等の毒性や海洋生物など生態系への影響を十分考慮する必要がある。しかし，このような物理的・化学的な除去・処理を行っても完全ではなく，未回収の流出油は蒸発したり，光や酸素による物理・化学的な変化を受けるが，最終的には海水や海底堆積物中の微生物の生分解性に基づく自然生態系の自浄作用によって分解される（非特許文献２参照）。
近年、このような微生物を利用した環境調和型の生物学的油濁浄化技術（バイオレメディエーション）の開発が注目されている（非特許文献３、４参照）。このバイオレメディエーション技術は自然界で営まれている微生物による生分解プロセスを促進させて汚染物質を分解除去する技術である。
そこで、バイオレメディエーション技術を開発するためには、現場環境における石油等の有害環境汚染物質分解微生物の分布や種類，およびその分解能などを調べ、有害物質汚染環境に対する自然浄化能の見積もりやそのメカニズムを解明する必要がある。さらに、バイオレメディエーション技術を適用するためには、有害物質汚染環境中の微生物相や有害物質分解微生物のモニタリング、解析・評価やバイオレメディーエション技術による有害物質汚染環境の浄化・修復過程を的確に解析・評価する方法が求められている。
例えば、原油は複雑な数千にも及ぶ各種の炭化水素の混合物であり、石油中に存在する炭化水素は化学構造によって、飽和炭化水素と芳香族炭化水素に分けられるが、さらに前者はパラフィン（ｎ−パラフィン、分枝パラフィン）とシクロパラフィン（単環、多環）に、後者は単環と多環芳香族炭化水素に分類されている（非特許文献５参照） 。
また石油は炭化水素組成により，飽和分（ＳＡ），芳香族分（ＡＲ），レジン分（ＲＥ），アスファルテン分（ＡＳ）にも分けることができる（非特許文献６参照 ）。
微生物によるこれらの炭化水素の分解性はｎ−アルカン＞分枝アルカン＞低分子量芳香族炭化水素＞シクロアルカンの順に低下する（非特許文献７参照）。
現場環境に流出した石油の微生物分解は最初に易分解性の飽和分や低分子量芳香族炭化水素の分解が起こり，非常に分子量の大きい芳香族炭化水素，ＲＥ，ＡＳは分解され難く，その生分解速度はきわめて遅いといわれている（非特許文献８参照）。
また、発明者らの調査でも、日本海重油流出事故で汚染された現場海域海水中の微生物群集による重油の分解性は、重油中のＳＡは比較的よく分解されるが、難分解性の多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）等を含むＡＲの分解は少なく、縮合した芳香族環構造で分子量の大きいＲＥや ＡＳはほとんど分解されないことが認められた（非特許文献９ 、１０参照）。
重油など重質油に含まれるＰＡＨは発ガン性、変異原性を有し、難分解性であることから、これらを短期間で効率的に分解する微生物や安全な環境調和型の生物学的分解・除去技術の確立が求められている。海洋環境から分離された多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）分解細菌としては、これまでにＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＡＪ１（非特許文献１１）Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｐｕｇｅｔｉｉ、非特許文献１２参照）、Ｎｅｐｔｕｎｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｏｖｏｒａｎｓ（非特許文献１３）、Ｌｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｕｌｏｅｄｅｒａｎｓ（非特許文献１４）およびＶｉｂｒｉｏ ｃｙｃｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ（非特許文献１５参照）などいくつかのは報告がある。しかし、優れたＰＡＨ分解活性を有し、実用化できるようなものは得られていない。以上は石油汚染について主に説明したが、このほかにも化学薬品の流出事故あるいは工場排水、廃棄物の投棄に伴う有害物質による環境汚染等に対しても早急な対策を講じなくてはならず、この場合においても、上記したＰＡＨ乃至環境ホルモン等を有効に分解する技術の重要性はますます増大しており、そのための有用細菌の探索も盛んに行われている。
そして、これらの環境汚染浄化技術における有用微生物の探索には、該探索を迅速、簡便かつ正確に行えるような探索技術が望まれている。
【非特許文献１】海洋油流出対応，国際タンカー船主汚染防止連盟（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｍａｒｉｎｅ Ｏｉｌ Ｓｐｉｌｌｓ， Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｎｋｅｒ Ｏｗｎｅｒｓ Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ＦｅｄｅｒａｔｉｏｎＬｔｄ．１９９３石油連盟，ｐ．Ｉ３−Ｉ５， 東京， １９９７」
【非特許文献２】「月刊海洋」第３０巻１０号（１９９８）第６１３ − ６２１頁」
【非特許文献３】「Ｍａｒｉｎｅ Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ」第２６巻（１９９３）第４７６−４８１  頁」
【非特許文献４】「Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」第１９巻（１９９３）第２１７−２４２頁」
【非特許文献５】「石油と微生物」第 １号（１９６８）第２−２４頁」
【非特許文献６】「石油製品の品質と規格」（１９９７）第１４２−１５３頁」
【非特許文献７】「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． 」第５４巻（１９９０）第３０５−３１５頁」
【非特許文献８】「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ （ｅｄ． Ｋ．Ｃ． Ｍａｒｓｈａｌｌ）， ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ」第１２（１９９２）第２８７−３３８頁」
【非特許文献９】「平成１０年度環境保全研究成果集、環境庁企画調整局環境研究技術課編」（１９９９）第４８−ＩＩ， １−９，頁」
【非特許文献１０】第１４回日本微生物生態学会大会講演要旨集、Ｐ．４１、１９９８
【非特許文献１１】「Ｊ． Ｆｅｒ． Ｂｉｏｅｎｇ．」第８２巻（１９９６），第５７０−５７４頁」
【非特許文献１２】「Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，第４５巻（１９９５）第１１６−１２３頁」
【非特許文献１３】「Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第６５巻（１９９９）第２５１−２５９頁」
【非特許文献１４】「Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」第 ６７巻（２００１）第５５８５−５５９２頁」
【非特許文献１５】「Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｅｖｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第５１巻（２００１）第６１−６６頁」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、特に、流出石油あるいは廃棄物等に含まれるＰＡＨ等の環境汚染物質を分解する能力を有するＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する有用細菌の検出またはスクリーニングするために有用なプローブを提供することにあり、これを用いてＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する有用細菌を得て、環境汚染物質で汚染された水または土壌の浄化し、また、該プローブを用いて石油、廃棄物等による有害物質汚染環境のモニタリング、解析・評価、診断するとともに、バイオレメディーエション技術による有害物質汚染環境の浄化・修復過程を解析・評価するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記従来技術の問題点に鑑み、鋭意研究を行った結果、日本海流出重油汚染沿岸海域の海水からＰＡＨ分解能を有するＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する新種の細菌を見出し、さらに本細菌を特異的に検出、定量できる遺伝子プローブの作製に成功して本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００５】
（1）配列番号１若しくは配列番号２の塩基配列の一部からなるか、または配列番号１若しくは配列番号２の塩基配列に対応するリボキシヌクレオチド配列の一部からなり、かつ、塩基長１０〜５０ｂｐのＲＮＡまたはＤＮＡプローブ。
（２）配列番号３、４または５に記載の塩基配列またはこれに対応するリボキシヌクレオチド配列を有する、上記（１）に記載のＲＮＡまたはＤＮＡプローブ。
（３）Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する環境汚染物質分解細菌を検出または定量するために用いる、上記（１）または（２）に記載のＲＮＡまたはＤＮＡプローブ。
（４）Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する環境汚染物質分解細菌が石油分解細菌である、上記（３）に記載のＲＮＡまたはＤＮＡプローブ。
（５）Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＡＮＩ７Ａ菌株、またはＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＡＮＩ７Ｐ菌株を検出および／または定量するために用いる、上記（３）または（４）に記載のＲＮＡまたはＤＮＡプローブ。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のＲＮＡまたはＤＮＡプローブを用いて、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属 に属する細菌を検出および／または定量する方法。
（７）検出または定量される細菌が、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する環境汚染物質分解菌である上記（６）に記載の方法。
（８）Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する環境汚染物質分解菌が石油分解菌である上記（７）に記載の方法。
（９）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のＲＮＡまたはＤＮＡプローブを用いて、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する有用細菌をスクリーニングする方法。
（１０）スクリーニングされる細菌がＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する環境汚染物質分解細菌である上記（９）に記載の方法。
（１１）Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する環境汚染物質分解細菌が石油分解細菌である上記（１０）に記載の方法。
（１２）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のＲＮＡまたはＤＮＡプローブを用いたＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション、または該ＤＮＡプローブをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属細菌を同定する方法。
（１３）同定される細菌がＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する環境汚染物質分解細菌である上記（１２）に記載の方法。
（１４）Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する環境汚染物質分解細菌が石油分解細菌である上記（１３）に記載の方法。
（１５）上記（６）〜（８）のいずれかに記載の方法を用いて、有害物質汚染環境のモニタリング、解析・評価および診断する方法
（１６）上記（６）〜（８）のいずれかに記載の方法を用いて、有害物質汚染環境の浄化及乃至修復過程を解析し、評価する方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、環境汚染物質、特に石油、廃棄物あるいはこれらに含まれるＰＡＨ等有害環境汚染物質の分解能を有するＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する新規微生物を提供するものであり、本発明の新規微生物を利用して、上記環境汚染物質で汚染された海洋、湖沼、河川、廃液などを効率よく浄化することができる。また、本発明によれば、上記新規微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ／ＲＮＡ から調製したプローブにより、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する上記環境汚染物質分解能を有する細菌の検出・定量を簡便迅速に行うことが可能となり、この細菌の検出・定量方法により、世界的な環境問題になっているＰＡＨ等有害物質汚染環境のモニタリング、解析・評価、診断、ならびにバイオレメディーエション技術によるＰＡＨ等有害物質汚染環境の浄化・修復過程を解析・評価することができるきわめて有益な技術を提供できた。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下本発明を詳細に説明する。
〔微生物〕
本発明の微生物は、日本海流出重油汚染沿岸海域の一つである石川県沿岸の最も汚染された地点の海水試料から単離したことに基づくに基づく。これにより得られた菌株は具体的には、ＡＮＩ７Ａ 菌株（受託番号ＦＥＲＭＰ−１９０９５）とＡＮＩ７Ｐ菌株（受託番号ＦＥＲＭＰ−１９０９６）の２種である。これらの菌株は天然海水、好ましくは無菌的に採取した海水を微生物源として、例えばＰＡＨを唯一の炭素源・エネルギー源としてＮＳＷ培地（表２；Ｔ． Ｈｉｇａｓｈｉｈａｒａ， Ａ． Ｓａｔｏ ａｎｄ Ｕ． Ｓｈｉｍｉｚｕ： Ａｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｆｉｓｈｉｅｒｅｉｅｓ， ４４， １１２７−１１３４， １９７８）を用いた集積培養法により分離したものである。詳細な分離法を実施例１に示した。
【０００８】
ＡＮＩ７Ａ 菌株およびＡＮＩ７Ｐ菌株は、いずれもアントラセン（ＡＮ）、フェナントレン（ＰＨＥ）等のＰＡＨを分解することができる。以下これらの菌株の表現形質による分類・同定や１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列に基づく分子系統解析について説明する。
ＡＮＩ７Ａ菌株の菌学的性質を表１に示した。
【表１】
2008029350.tif 000002
これらの菌学的性質に基づき、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １（１９８４） （ Ｋｒｉｅｇ， Ｎ． Ｒ．， ａｎｄ Ｈｏｌｔ， Ｊ． Ｇ．： Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １． Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ， １９８４） およびＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９９４） （Ｈｏｌｔ， Ｇ．， Ｋｒｉｅｇ， Ｎ．Ｒ．， Ｓｎｅａｔｈ， Ｐ．Ｈ．Ａ．， Ｓｔａｌｅｙ， Ｊ．Ｔ．， ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｓ．Ｔ． （ｅｄｓ．）： Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （９ｔｈ ｅｄ．）． Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， １９９４）
を参考にして分類・同定を行った結果、ＡＮＩ７Ａ菌株はＳｐｈｉｎｇｍｏｎａｓ属に属する細菌と同定された。
【０００９】
次に、ＡＮＩ７Ａ菌株とＡＮＩ７Ｐ菌株について述べる。
Ａタイプコロニー（実施例１参照）から得られた純培養株、ＡＮＩ７Ａ菌株のコロニー形態（ＮＳＷ＋ＡＮ二層培地（表２）、２０℃、２６日培養）は、コロニー形状：円形（ｃｉｒｃｕｌａｒ）、大きさ：２．０ｍｍ、表面：平滑（ｓｍｏｏｔｈ）、隆起状態：半レンズ状（ｃｏｎｖｅｘ）、周縁：全縁（ｅｎｔｉｒｅ）、色調：ｌｉｇｈｔ ｂｒｏｗｎ（コロニー中心部の色調が縁部より濃い）であった。一方、Ｐタイプコロニーからの純培養株、ＡＮＩ７Ｐ菌株の上記培養条件下でのコロニー形態は、コロニー形状：円形（ｃｉｒｃｕｌａｒ）、大きさ：１．８ ｍｍ、表面：平滑（ｓｍｏｏｔｈ）、隆起状態：半レンズ状（ｃｏｎｖｅｘ）、周縁：全縁（ｅｎｔｉｒｅ）、色調：ｌｉｇｈｔ ｂｒｏｗｎ（コロニー色調は全体に均質で光沢がある）であった。このようにＡＮＩ７Ａ菌株とＡＮＩ７Ｐ菌株のコロニー形態は類似しているが、コロニーの色調、光沢が異なり、また培地の種類や培養期間によっては両菌株のコロニーの隆起状態が異なっていた。
【００１０】
上記のようにＡＮＩ７Ａ菌株とＡＮＩ７Ｐ 菌株のコロニー形態は若干違っていた。しかし、両菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列に基づく分子系統解析を行った結果、両菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列の相同性は９９．７％であつたことから、ＡＮＩ７Ａ菌株とＡＮＩ７Ｐ 菌株は同一種と推定された。ＡＮＩ７Ａ菌株およびＡＮＩ７Ｐ 菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１と２に示した。また、図１にＡＮＩ７Ａ菌株およびＡＮＩ７Ｐ 菌株の分子系統樹を示した。
なお、表現形質に基づく分類・同定は、本発明者らが開示している「重油分解方法」（特開２００１−３７４６６公報（公開日２００１．２．１３）およびＲ．Ｍ．Ｓｍｉｂｅｒｔ ａｎｄ Ｎ．Ｒ．Ｋｒｅｉｇ： Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｐ．Ｇｅｒｈａｒｄｔ， Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ， Ｗ．Ａ．Ｗｏｏｄ ａｎｄ Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ），ｐ．６０７−６５４， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）に述べている方法に準じて行った。また、１６Ｓ ｒＤＮＡの配列決定は本発明者らが開示している「新規低温細菌を検出するためのＤＮＡプローブ」（特開２０００−３３３６８０公報（公開日２０００．１２．５）に述べている方法に準じて行った。さらにＤＮＡデーターベースより入手したＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａ属および代表的な微生物種の塩基配列を並列させてアライメント処理を行い、比較不能なギャップを取り除いた後、ＮＪ法により分子系統解析を実施した。得られた系統樹の各分岐の確度は、１００回のブーストラップ解析により算出した（Ｍａｒｕｙａｍａ， Ａ．， Ｄ． Ｈｏｎｄａ， Ｈ． Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｋ． Ｋｉｔａｍｕｒａ ａｎｄ Ｔ． Ｈｉｇａｓｈｉｈａｒａ ： Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｊａｐａｎ Ｔｒｅｎｃｈ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｅｐ−ｓｅａ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ ｓｐ． ｎｏｖ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ５０， ８３５−８４６， ２０００）。
【００１１】
ＡＮＩ７Ａ菌株およびＡＮＩ７Ｐ 菌株の分子系統樹の位置は表現形質による分類位置と同様に、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓに属することを示した。さらにＡＮＩ７Ａ菌株と最も分子系統的に近縁なＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｕｂａｒｃｔｉａと本菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡの相同性は９５．８％であつた。
一方、「細菌の種は系統的にほぼ７０％またはそれ以上のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を示す菌株である」と定義されている（国際細菌分類命名委員会特別委員会報告、Ｌ． Ｇ． Ｗａｙｎｅ， Ｄ． Ｊ． Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｒ． Ｒ． Ｃｏｌｗｅｌｌ， Ｐ． Ａ． Ｄ． Ｇｒｉｍｏｎｔ， Ｏ． Ｋａｎｄｌｅｒ， Ｍ． Ｉ． Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ， Ｌ． Ｈ． Ｍｏｏｒｅ， Ｗ． Ｅ． Ｃ． Ｍｏｏｒ， Ｒ． Ｇ． Ｅ． Ｍｕｒｒａｙ， Ｅ． Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ， Ｍ． Ｐ． Ｓｔａｒｒ ａｎｄ Ｈ． Ｇ． Ｔｒｕｐｅｒ： Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｄ ｈｏｃ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｒｅｃｏｎｃｉｌｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ３７， ４６３−４６４， １９８７）が、Ｓｔａｃｋｅｒｂｒａｎｄｔらは、上記定義におけるＤＮＡ−ＤＮＡ相同性と１６Ｓ ｒＤＮＡの相同性との関係について、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性と１６Ｓ ｒＤＮＡの相同性の比較からＤＮＡ−ＤＮＡ相同性７０％以上のものと１６Ｓ ｒＤＮＡの相同性９７％以上のものは対応するとし、１６Ｓ ｒＤＮＡの相同性９７％以上のものを同一の種とみなされると述べている（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ， Ｅ． ａｎｄ Ｇｏｅｂｅｌ， Ｂ． Ｍ．： Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｎｏｔｅ： ａ ｐｌａｃｅ ｆｏｒ ＤＮＡ−ＤＮＡ ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ４４， ８４６−８４９， １９９４）。
【００１２】
以上のことから、ＡＮＩ７Ａ菌株およびＡＮＩ７Ｐ 菌株はＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ 属の新種として、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ 属ＡＮＩ７Ａ菌株およびＡＮＩ７Ｐ菌株と命名した。
これらの菌株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭＰ−１９０９５（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ 属ＡＮＩ７Ａ菌株）および受託番号ＦＥＲＭＰ−１９０９６（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ 属ＡＮＩ７Ｐ菌株）として寄託されている。
また、上記の１６Ｓ ｒＤＮＡの相同性と種の関係からみれば、ＡＮＩ７Ａ菌株または ＡＮＩ７Ｐ菌株と１６Ｓ ｒＤＮＡの相同性において９７％以上の菌株であれば、これら菌株と同一種とみなされ、本発明に包含される。
【００１３】
〔Ｓｐｈｉｎｇｍｏｎａｓ属微生物の機能〕
Ｓｐｈｉｎｇｍｏｎａｓ属はＹａｂｕｕｃｈｉらによつて１９９０年に提唱された新属で、細胞膜にスフィンゴ糖脂質を有し、キノン系はユビキノンＱ１０で、黄色のカロチノイド色素（Ｎｏｓｔｏｘａｎｔｈｉｎ）を生成すことが特徴としてあげられている（Ｙａｂｕｕｃｈｉ， Ｅ．， Ｙａｎｏ，Ｉ．， Ｏｙａｉｚｕ， Ｈ．， Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ， Ｙ．， Ｅｚａｋｉ， Ｔ．， ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｈ．： Ｐｒｏｐｏｓａｌｓ ｏｆ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ ｇｅｎ． ｎｏｖ． ａｎｄ ｃｏｍｂ． ｎｏｖ．， Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ ｓｐ．ｎｏｖ．， Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ ｓｐ． ｎｏｖ．， Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｄｈａｅｓｉｖａ ｓｐ． ｎｏｖ． ， Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｃａｐｓｕｌａｔａ ｃｏｍｂ． ｎｏｖ．， ａｎｄ ｔｗｏ ｇｅｎｏｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ３４， ９９−１１９， １９９０）。
最近、Ｓｐｈｉｎｇｍｏｎａｓ属細菌は、ビフェニール（ＢＰ）等環境ホルモン、クロロフェノール、ヘキサクロロシクロヘキサン等の有機塩素化合物、キシレン、ナフタレン、フェナントレン等の芳香族炭化水素、除草剤等の農薬、ポリエチレングリコール等の合成高分子化合物など非常に広範な種々の環境汚染物質に対する強力な分解能を有することが明らかにされるとともに、さらに新たな環境汚染物質分解能の発見が期待されることなどから世界的に注目されている（Ｓｐｈｉｎｇｍｏｎａｓ属細菌の最新の知見をまとめた特集号、「Ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２３（Ｎｏ．４／５）， ２３１−４４５， １９９９）。我が国においても、Ｓｐｈｉｎｇｍｏｎａｓ属細菌は、きわめて強力な有害環境汚染物質の分解能を有し、バイオレメディエーションの切り札として注目されている細菌群であることから、環境浄化にＳｐｈｉｎｇｍｏｎａｓ属細菌の能力を利用する研究を進展させるため、この細菌の生態（構造と機能）、分解能（酵素と遺伝子、分子育種）、使用法（汚染源への細菌導入または栄養源供給）、工学的側面（増殖制御、環境制御、複合微生物系制御）等の総合的研究（文部科学省、科学研究費補助金、特定領域研究）の提案に向けての調査研究が行われている（シンポジウム 科学研究費補助金基盤研究（Ｃ）（企画調査）「スフィンゴモナス属細菌を用いる環境浄化システム構築基盤−スフィンゴモナス属細菌とバイオレメディーエション」講演要旨集、２００１）。また、このシンポジウムを端緒に「環境微生物研究会（スフィンゴモナス研究会）」が設立された。
【００１４】
海洋環境から単離されたＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ 属のＰＡＨ分解細菌としては、ＰＨＥ分解細菌（Ｋｏｍｕｋａｉ−Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｓ．， Ｓｕｇｉｕｒａ， Ｋ．， Ｙａｍａｕｃｈｉ−Ｉｎｏｍａｔａ， Ｙ．， Ｔｏｋｉ， Ｈ．， Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒａｎ， Ｋ． ， Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｓ．， Ｔａｎａｋａ， Ｈ．， ａｎｄ Ｈａｒａｙａｍａ， Ｓ．： Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｎｓｏｒｔｉａ ｔｈａｔ ｄｅｇｒａｄｅ Ａｒａｂｉａｎ ｌｉｇｈｔ ｃｒｕｄｅ ｏｉｌ． Ｊ． Ｆｅｒ．Ｂｉｏｅｎｇ．， ８２， ５７０−５７４ ， １９９６、 Ｂｅｒａｒｄｅｓｃｏ， Ｇ．， Ｄｙｈｒｍａｎ， Ｓ．， Ｇａｌｌａｇｈｅｒ， Ｅ． ａｎｄ Ｓｈｉａｒｉｓ， Ｍ．Ｐ．： Ｓｐａｔｉａｌ ａｎｄ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ−ｄｅｇａｒｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｉｎｔｅｒｔｉｄａｌ ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６４， ２５６０−２５６５， １９９８）や２−ｍｅｔｈｙｐｈｅｎａｔｈｒｅｎｅ分解細菌が知られている（Ｇｉｌｅｗｉｃｚ， Ｍ．， Ｎｉｍａｔｕｚａｈｒｏｈ， Ｎａｄａｌｉｇ， Ｔ．， Ｂｕｄｚｉｎｓｋｉ， Ｈ．， Ｄｏｕｍｅｎｑ， Ｐ．， Ｍｉｃｈｏｔｅｙ， Ｖ．， ａｎｄ Ｂｅｒｔｒａｎｄ， Ｊ． Ｃ．： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ２−ｍｅｔｙｌｐｈｅａｎａｔｈｒｅｎｅ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４８， ５２８−５３３ １９９７）。また、海洋環境から得られたＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ 属細菌の中にはＰＡＨ以外にトルエン、キシレン等芳香族炭化水素など各種の炭化水素を分解する細菌が報告されている（Ｒ． Ｃａｚｉｃｃｈｉｏｌ， Ｆ． Ｆｅｇａｔｅｌｌａ， Ｍ． Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ， Ｍ． Ｅｇｕｃｈｉ， Ｊ． Ｇｏｔｔｓｃｈａｌ： Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄｓ ｆｒｏｍ ｍａｒｉｎｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２３， ２６８−２７２， １９９９）。さらに、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｒｏｍａｔｉｃｉｂｏｒａｎｓ Ｆ１９９菌株はトルエン、ｏ， ｍ， ｐ−キシレン、ｐ−クレゾール、ナフタレン、ビフェニール（ＢＰ）、ジベンゾチオフェン、フルオレン、サリチル酸、安息香酸などを分解し、一種一菌株で多様な有害物質分解能を有している（Ｊ．Ｋ． Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ， Ｆ． Ｊ． Ｂｒｏｃｋｍａｎ， Ｄ． Ｊ． Ｗｏｒｋｍａｎ， Ｓ． Ｗ． Ｌｉ ａｎｄ Ｔ． Ｏ． Ｓｔｅｖｅｎｓ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｕｂｓｕｒｆａｃｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｏｎ ｔｏｌｕｅｎｅ， ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ， ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５７， ７９６−８０３， １９９１； Ｊ．Ｋ． Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ， Ｄ． Ｌ． Ｂａｌｋｗｉｌｌ， Ｇ． Ｒ． Ｄｒａｋｅ， Ｍ． Ｆ． Ｒｏｍｉｎ���， Ｄ． Ｂ． Ｒｉｎｇｅｌｂｅｒｇ ａｎｄ Ｄ． Ｃ． Ｗｈｉｔｅ：Ａｒｏｍａｔｉｃ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｅｅｐ ｓｕｂｓｕｒｆａｃｅ， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６１， １９１７−１９２２， １９９５； Ｄ． Ｌ． Ｂａｌｋｗｉｌｌ， Ｇ． Ｒ． Ｄｒａｋｅ， Ｒ． Ｈ． Ｒｅｅｖｅｓ， Ｊ．Ｋ． Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ， Ｄ． Ｃ． Ｗｈｉｔｅ， Ｄ． Ｃ． Ｒｉｎｇｅｌｂｅｒｇ， Ｄ． Ｐ． Ｃｈａｎｄｌｅｒ， Ｍ． Ｆ． Ｒｏｍｉｎｅ， Ｄ． Ｗ． Ｋｅｎｎｅｄｙ ａｎｄ Ｃ． Ｍ． Ｓｐａｄｏｎｉ， Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ ｄｅｅｐ−ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ−ｓｕｂｓｕｒｆａｃｅ ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｒｏｍａｔｉｃｖｏｒａｎｓ ｓｐ． ｎｏｖ．， Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ ｓｐ． ｎｏｖ． ａｎｄ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｔｙｇｉａ ｓｐ． ｎｏｖ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ４７， １９１−２０１， １９９７）。
【００１５】
本発明のＡＮＩ７Ａ菌株およびＡＮＩ７Ｐ菌株は、日本海重油流出事故で汚染された沿岸海域の海水試料から分離された微生物で、いずれもアントラセン（ＡＮ）やフェナントレン（ＰＨＥ）の分解能を有していることから、現場油濁海域の浄化に働いているものと推察された。また、ＡＮＩ７Ａ菌株およびＡＮＩ７Ｐ菌株の近縁種Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｕｂａｒｃｔｉａはポリクロロフェノール分解細菌であることが報告されている（Ｎｏｈｙｎｅｋ， Ｌ． Ｊ．， Ｎｕｒｍｉａｈｏ−Ｌａｓｓｉｌａ， Ｅ． Ｌ．， Ｓｕｈｏｎｅｎ， Ｅ． Ｌ．， Ｂｕｓｓｅ， Ｈ． Ｊ．， Ｍｏｈａｍｍａｄｉ， Ｍ．， Ｈａｎｔｕｌａ， Ｊ．， Ｒａｉｎｅｙ， Ｆ． ａｎｄ Ｓａｌｋｉｎｏｊａ−Ｓａｌｏｎｅｎ， Ｍ．Ｓ： Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ｓｔｒａｉｎｓ ＫＦ１， ＫＦ３， ａｎｄ ＮＫＦ１ ａｓ ｎｅｗ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ， Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｕｂａｒｃｔｉｃａ ｓｐ． ｎｏｖ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ４６， １０４２−１０５５， １９９６）。
【００１６】
上記のことから、本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する新種の微生物は、ＰＡＨを含む石油や有害物質の分解能を有し、これらにより汚染された環境の浄化に利用できるきわめて有用な微生物である。また、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属細菌は上述のように非常に広範な環境汚染物質に対する強力な分解能を有することから、本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属の新種の微生物もＰＡＨ 分解能以外に環境ホルモン、有機塩素化合物、農薬、合成高分子化合物などの有害環境汚染物質分解能を有するものということができ、極めて有用な微生物であり、有害物質で汚染された環境浄化に利用することができる。
【００１７】
〔他の微生物〕
次ぎに、油濁環境や有害物質汚染環境の浄化に本微生物を利用する場合は、本発明の微生物を単独で使用してもよく、また本発明の微生物と例えば脂肪族炭化水素分解細菌Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ属細菌や公知の炭化水素分解微生物、また有害環境汚染物質分解能を有する微生物と混合して環境汚染物質分解微生物コンソーシアとして利用することもできる。さらに、石油等有害汚染物質の分解効率を促進するため、本発明の微生物を含む分解微生物コンソーシアに、有害汚染物質の中間分解物や代謝産物を分解する非有害汚染物質分解微生物を加えた複合微生物系を構築し、利用することもできる。
【００１８】
〔培地〕
本発明の微生物や本発明の微生物を含む環境汚染物質分解微生物コンソーシアの培養に用いる培地は、これらの微生物が良好に増殖し、かつＰＡＨ分解能や環境汚染物質分解能が発現できる培地であれば、いかなる組成の培地でもよい。炭素源としては、ＰＡＨを唯一の炭素源・エネルギー源として用いることができるが、ＰＡＨを含む原油、灯油、軽油、重油等の石油製品、船舶や工場からの流出油なども利用することができる。さらに、炭水化物、ピルビン酸のような有機酸、廃糖蜜なども用いることができる。これらはＰＡＨや石油類と混合して用いると効果的な場合もある。また、疎水性のＰＡＨや石油類を微生物によって分解され易くするため、これらにＴｗｅｅｎ ８０のよう界面活性剤を添加し、さらに超音波発生機にて乳化・分散させる場合もある。ＰＡＨを微量なエタノールやアセトンに溶解して添加することもできる。窒素源としては、微生物に利用される有機・無機化合物であればよい。有機窒素源としてはペプトン、肉エキス、コンステイプリカー、脱脂大豆、カゼンインなどが、無機窒素源としてはアンモニウム塩、硝酸塩、尿素などが利用できる。無機塩類としては、各種のリン酸塩、塩化ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、カルシウム、亜鉛、モリブデンなどを添加してもよい。また、増殖因子として、ビタミン類、アミノ酸類があり、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、コンステイプリカーなど前記栄養因子を含有する天然有機栄養物を添加してもよい。
なお、これらの微生物を効率よく大量に培養するときは、必ずしもＰＡＨ等環境汚染物質を含む培地で培養する必要はなく、Ｍａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ （Ｄｉｆｃｏ） やＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ （Ｄｉｆｃｏ） のような有機栄養培地でもよい。
【００１９】
〔培養方法〕
培養は好気的条件、例えば振とう培養法、通気撹拌培養法が好適であるが、
適宜液体静置培養を組み合わせてもよいし、また液体静置培養でもよい。培地のｐＨは５−９、好ましくは６−８であればよい。培養温度は１５−３７℃、好ましくは２０−３０℃であればよい。
【００２０】
〔本発明の微生物を用いた環境汚染物質の分解手段〕
本発明の微生物および本発明の微生物を含有する石油等環境汚染物質分解微生物コンソーシアを用いた浄化方法としては、ＰＡＨを含む石油等の環境汚染物質に汚染された海洋、湖沼、河川、廃液などに、これらの微生物の培養液、生菌体、凍結乾燥菌体を散布すればよい。この場合、有機または無機の窒素、リンなどの栄養源とこれらの微生物を混合した栄養・微生物製剤として、また本発明者らが開示したアルギン酸を用いた栄養源含有固定化担体（特開２００１−３７４６６、公開日：２００１．１２．１３）、ポリアクリルアミドゲル、ポリウレタンフォームなど公知の微生物固定化担体を用いて、これらの微生物を固定化した各種の微生物製剤を利用することができる。この場合栄養源とこれらの微生物を同時に固定化した方が好ましい。
【００２１】
〔環境汚染物質分解微生物の検出、定量、スクリーニング、同定及び環境評価方法〕
次ぎに、核酸プローブやそれを用いた石油等有害環境汚染物質分解微生物の検出・定量方法、スクリーニング方法、同定方法、およびこの検出・定量法を用いた有害汚染物質汚染のモニタリング、解析・評価方法などについて説明する。
先に述べた汚染物質分解微生物を用いた環境調和型の生物学的環境浄化技術、すなわちバイオレメディエーション技術には，一般に海等の汚染環境に欠乏している窒素（Ｎ），リン（Ｐ）などの栄養製剤を散布し，現場に生息している土着分解微生物の活性を高める方法（バイオスティミュレーション，Ｂｉｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）と分解微生物製剤等を散布する方法がある（バイオオーギュメンテーション，Ｂｉｏａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（Ｒ． Ｍ． Ａｔｌａｓ ａｎｄ Ｒ． Ｂａｒｔｈａ： Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｉｌ Ｓｐｉｌｌ Ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ （ｅｄ． Ｋ．Ｃ． Ｍａｒｓｈａｌｌ）， ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １２， ２８７−３３８，１９９２、Ｋ． Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．： Ｂｉｏａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ： ａ ｐａｒａｄｏｘ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｆｉｅｌｄ ｒｅｓｕｌｔｓ． Ｉｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １９９７ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｉｌ Ｓｐｉｌｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ， ｐ ６９７−７０５， ＡｍｅｒｉｃａｎＰｅｔｅｒｏｌｅｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．Ｄ．Ｃ．， １９９７ ）。この環境浄化技術を確立するためには、栄養源や微生物を散布した場合、現場環境における石油等有害物質分解微生物を定性的、定量的に把握し、汚染浄化に関与する微生物群集の挙動や機能を解明する必要がある。これまでに、石油で汚染された沿岸海域や航路海域に石油分解微生物が最も多く分布していることが報告されている（Ａｔｌａｓ， Ｒ． Ｍ．： Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ： ａｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｒｅｖ．， ４５， １８０−２０９， １９８１）。
例えば、一般に非汚染海域に分布する炭化水素分解微生物の割合は全微生物数の１％以下であるが、油濁海域ではその比率がしばしば１０％以上なるといわれている（Ｒ． Ｍ． Ａｔｌａｓ： Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｉｌ ｓｐｉｌｌ ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ， Ｍａｒｉｎｅ Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｔｅｔｉｎ， ３１， １７８−１８２， １９９５、Ｒ． Ｍ． Ａｔｌａｓ ａｎｄ Ｒ． Ｂａｒｔｈａ： Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｉｌ Ｓｐｉｌｌ Ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ． Ｉｎ： Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ， Ｅｄ． Ｋ． Ｃ． Ｍａｒｓｈａｌｌ， ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １２， ２８７−３３８， １９９２）。 一般に微生物群集全体に占める分解微生物の割合は石油等有害物質汚染の程度を反映し、その指標になるといわれている（Ａｔｌａｓ， Ｒ． Ｍ．： Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ： ａｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｒｅｖ．， ４５， １８０−２０９， １９８１）。
【００２２】
また、木材処理施設から排出されるクレオソート（約８５％の多環芳香族炭化水素 ［ＰＡＨｓ］ を含有する）で汚染された港湾の堆積物中のＰＡＨ分解菌数が調査されている（Ａ． Ｄ． Ｇｅｉｓｅｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ： Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ−Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｍａｉｒｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ Ｐｕｇｅｔ Ｓｏｕｎｄ Ｓｅｄｉｍｅｎｔ， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６２， ３３４４−３３４９， １９９６）。それによると、ＭＰＮ培養計数法により計数された、ＰＡＨ分解菌数は、汚染サイトで１０４〜１０７ ＭＰＮ／ｇ （乾燥重量）、非汚染サイトで１０３〜１０４ ＭＰＮ／ｇ （乾燥重量）であった。一方、堆積物中の全菌数は１０９ ／ｇ （乾燥重量）程度で、汚染サイトと非汚染サイト間でほとんど差がみられなかったという。すなわち、クレオソート汚染サイトでは、ＰＡＨ分解菌が非汚染サイトの１０−１０００倍多いというだけでなく、全微生物群集に占める割合も１％程度にまで増大していた。このように、環境が汚染されたことを反映して微生物群集に占める分解菌群の割合が増大していることが見出されており、分解菌の比率は汚染環境のよい指標になると考えられる。
【００２３】
しかし、従来の石油やＰＡＨ等の有害物質分解微生物の計数法は、上記報告のように平板培養法やＭＰＮ（最確数）法を用いた培養法によるものである。この培養法は、いずれも多大な労力と時間を要する。また、寒天平板培地を用いる計数法では， 炭化水素無添加の対照培地において，試料中の細菌が寒天中の不純物を利用して増殖し， コロニーを形成する。微量の増殖因子として酵母エキス（０．０１％）を添加した寒天平板培地を用いた計数では、炭化水素培地と炭化水素無添加培地の両培地において微小なコロニーが生成し，その数やコロニーの大きさで炭化水素分解細菌と非分解細菌の違いを明らかにすることができなかったといわれている（Ｔ． Ｈｉｇａｓｈｉｈａｒａ， Ａ． Ｓａｔｏ ａｎｄ Ｕ． Ｓｈｉｍｉｄｕ： Ａｎ ＭＰＮ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ， Ｂｕｌｌ． Ｊａｐａｎ． Ｓｏｃ． Ｓｃｉ． Ｆｉｓｈ．， ４４， １１２７−１１３４， １９７８）。以上のことから，炭化水素無添加の対照培地においても，寒天中の微量な有機物を利用してコロニーを形成する細菌が存在するため，寒天平板培地で特定の炭化水素分解細菌を選択的かつ正確に計数することは困難である。
加えて特定分解微生物を検出するには、寒天平板法にて目的微生物を分離し、分類・同定（属、種レベル）を行う必要があり、さらに長時間を要し多数の分離微生物を分類・同定することは困難である。さらに、自然界に生息する微生物の内、これら従来の分離・培養法で検出できる微生物の数は極めて少ない。すなわち、蛍光ＤＮＡ染色剤で染色し顕微鏡下で計数する直接顕微鏡計数法（たとえば、Ｊ． Ｅ． Ｈｏｂｂｉｅ， Ｒ．Ｊ． Ｄａｌｅｙ，ａｎｄ Ｓ． Ｊａｓｐｅｒ： Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３３：１２２５−１２２８， １９７７やＫ． Ｇ． Ｐｏｒｔｅｒ ａｎｄ Ｙ． Ｓ． Ｆｅｉｇ： Ｌｉｍｎｏｌ． Ｏｃｅａｎｏｇｒ． ２５： ９４３−９４８，１９８０）で得られた全菌数と比較して、分離・培養可能な微生物の割合は１％以下でしかないと考えられる（Ｒ． Ｉ． Ａｍａｎｎ， Ｗ． Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｋ−Ｈ． Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ： Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ， Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｒｅｖ．， ５９， １４３−１６９， １９９５）。したがって、従来の培養法では現場環境中に生息する微生物の１％程度を対象とした特定分解微生物や微生物相の調査しかできず、環境微生物群集中の分解微生物が十分に反映されていないという大きな欠点があった。
【００２４】
近年 、分子生物学的手法に基づく分子微生物生態学が発展し 、従来のように分離・培養法に依存せず 、分子・細胞レベルで 、環境中の微生物群集構造や多様性の解析が可能になってきている（Ｉ． Ｍ． Ｈｅａｄ， Ｊ．Ｒ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｒ． Ｗ． Ｐｉｃｋｕｐ： Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ， ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ａｎｄ ｅｃｏｌｏｇｙ： ａ ｄｅｃａｄｅ ｏｆ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｕｎｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， Ｍｉｃｒｏｂ． Ｅｃｏｌ．， ３５， １−２１， １９９８． 渡辺一哉， 二又裕之：環境中で働く微生物， 化学と生物， ３８，２３０−２３６， ２０００、丸山明彦：海洋微生物の分子・細胞レベルでの解析，海洋微生物，月刊海洋，号外Ｎｏ．２３， １６２−１７０， ２０００、浦川秀敏，大和田紘一：核酸を用いた培養に依存しない微生物群集解析手法，海洋微生物，月刊海洋，号外Ｎｏ．２３， １７６−１８２， ２０００）。この分子生物学的手法による微生物群集解析手法は 、石油等の有害物質汚染環境やバイオレメディエーション技術による環境修復過程の分解微生物群の挙動や微生物群集構造の変遷を把握するために必要不可欠であり、最近それらの技術が開発されつつある。
最近、全微生物や環境汚染物質分解微生物等の特定微生物を対象として、それらに特異的なＤＮＡプローブを用い、従来の分離・培養法に依存しない分子遺伝学的な検出および定量化が試みられている。 例えば、分離・培養法によらず細胞レベルで分解微生物等の特定微生物を検出する場合には、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ法：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が用いられている（Ｒ． Ｉ． Ａｍａｎｎ， Ｗ． Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｋ−Ｈ． Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ： Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ， Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｒｅｖ．， ５９， １４３−１６９， １９９５）。すなわち、ＤＮＡプローブを用いて、ＦＩＳＨを行うことにより 、微生物群集中の特定の分解微生物細胞のみを特異的に検出・計数することができる。直接顕微鏡計数法で求めた全菌数と比較することにより 、全微生物群集中の 特定微生物の定量的比率を算出することができる。さらに、水環境試料を対象とし、細胞レベルで全群集に占める分解微生物等の特定微生物の割合を解析する場合には、ＦＩＳＨ−ＤＣ法が有効である（Ａ． Ｍａｒｕｙａｍａａｎｄ Ｍ． Ｓｕｎａｍｕｒａ： Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｏｆ ｔｏｔａｌ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｅａｗａｔｅｒ， ｕｓｉｎｇ ａ ｄｅｅｐ−ｓｅａ ｍｉｃｒｏｂｅ ａｓ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ． Ａｐｐｌｉｅｄａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ６６： ２２１１−２２１５， ２０００）。また、ＤＮＡプローブを用いた分子レベルでの特定分解微生物の定量的解析手法としては 、核酸ハイブリダイゼーション法がある（Ｄ． Ａ． Ｓｔａｈｌ， Ｂ． Ｆｌｅｓｈｅｒ， Ｈ． Ｒ． Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｌ． Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ： Ｕｓｅ ｏｆ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｂａｓｅｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｒｕｍｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｃｏｌｏｇｙ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５４， １０７９−１０８４， １９８８）。この方法は環境試料や微生物試料から核酸を抽出し 、核酸試料をナイロン膜フィルター上に固定し 、次ぎに放射性同位体（ＲＩ）等で標識したＤＮＡプローブを加えて 、ハイブリダイゼーションを行い 、膜上に固定さている核酸と相補的に結合した標識プローブの放射能強度等を測定し 、プローブと特異的に結合した核酸濃度から特定微生物の定量化をはかる方法である。
【００２５】
最近 、丸山らはＲＩを用いない蛍光ドットブロットハイブリダイゼーション法による相対分子定量法を開発している（Ａ．Ｍａｒｕｙａｍａ， Ｋ， Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｈ． Ｉｓｈｉｗａｔａ， Ｍ． Ｍａｔｓｕｏ， Ｔ． Ｈｉｇａｓｈｉｈａｒａ， ａｎｄ Ｒ． Ｋｕｒａｎｅ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｉｎ ｏｉｌ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｓｅａｗａｔｅｒ． ９ｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）， Ａｂｓｔｒａｃｔ， ｐ．３７５， ２００１、丸山明彦：分離培養困難な環境微生物へのアプローチ，バイオサイエンスとインダストリー， ６０， ３１−３４， ２００２）。
以上のようなことから、本発明においては、本発明の上記新規微生物を特異的に検出・計数することが可能なＤＮＡプローブを新たに作製している。以下ＤＮＡプローブを作製する工程について説明する。
【００２６】
〔プローブ〕
ＡＮＩ７Ａ菌株または／およびＡＮＩ７Ｐ 菌株の各１６Ｓ ｒＤＮＡ（ＡＮＩ７Ａ菌株；配列番号１、ＡＮＩ７Ｐ 菌株；配列番号２）の塩基配列情報に基づいて、種々の用途に適したＲＮＡおよびＤＮＡプローブを設計することができる。プローブの塩基配列および長さは検出、定量、スクリーニング、あるいは同定の対象とするＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ 属微生物の範囲に応じて適宜選択すればよい。例えば、本発明の上記新種の微生物のみをスクリーニングしたい場合には、該微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡの特異的部分の塩基配列によりプローブを設計すればよく、さらに近縁種をも含めてスクリーニング範囲を広げたいときには、近縁種の１６Ｓ ｒＤＮＡと共通な塩基配列部分を含むよう例えば塩基配列の長さを短縮する等プローブを設計する、また、塩基配列部分の選択あるいはその長さを調節することによりさらに、プローブの菌株特異性を低下させれば、さらに広い範囲の有用細菌をスクリーニングすることができる。
本発明のプローブは 例えばＦＩＳＨ法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）により、試料（例えば、石油等有害物質で汚染された海、河川、湖沼、排水・廃液などの環境試料水）中、あるいは多数の微生物群の中から、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する、本発明の上記新種微生物、その近縁種、あるいは該近縁種の石油分解細菌を検出および／または定量したり、また、スクリーニングするためには、例えば、配列番号１の塩基配列の塩基番号 ５６５−６１５の領域（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列における５’末端からの位置（ナンバーリングシステム）では、６３０−６８０の領域）などから選択される領域に対応する塩基長１０−５０ｂｐ、好ましくは塩基長１５−２５ｂｐのプローブを設計するとよい。一例として以下のプローブを挙げることができる。
（１）５’−ＣＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＧＡＴＴＣＴＡＧＣＧＡＣＣＴ−３’（ＳＰＧ６４５＊， ２５ｍｅｒ）（配列番号３）
３’−ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＴＣＴＡＡＧＡＴＣＧＣＴＧＧＡ −５’
（２）５’−ＣＣＡＡＧＡＴＴＣＴＡＧＣＧＡＣＣ−３’（ＳＰＧ６４３＊， １７ｍｅｒ）（配列番号４）
３’−ＧＧＴＴＣＴＡＡＧＡＴＣＧＣＴＧＧ −５’
（３）５’−ＴＡＧＣＧＡＣＣＴＡＧＴＴＴＣＡＡＡＧＧ −３’（ＳＰＧ６３４＊， ２０ｍｅｒ）（配列番号５）
３’−ＡＴＣＧＣＴＧＧＡＴＣＡＡＡＧＴＴＴＣＣ −５’
（なお、＊（数字）はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列における５’末端からの位置（ナンバーリングシステム）を示す（Ｎｏｌｌｅｒ Ｈ． Ｆ． ａｎｄ Ｃ． Ｒ． Ｗｏｅｓｅ， １９８１． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２１２：４０３−４１１）。
プローブは、公知の方法、例えば、ホスホルアミド法またはトリエステル法により合成することができる。あるいは、ＤＮＡ自動合成機により合成してもよい。
【００２７】
また、プローブは、アイソトープ（３２Ｐ、３５Ｓなど）、蛍光色素（ビオチン／アビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン−ローダミン、
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ （ＦＩＴＣ）、ＬｕｃｉｆｅｒＹｅｌｌｏｗ ＣＨ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３、Ａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇｅ、Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ、ＢＯＢＯ−１、ＰＯＰＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＹＯＹＯ−１、Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ （ＣＦＤＡ）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ （ＦＤＡ）、Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ−ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ （ＣＦＤＡ−ＡＭ）、５−ｃｙａｎｏ−２，３０ｄｉｔｏｌｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ （ＣＴＣ）、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＴＲＩＴＣ）、Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ １０１ ａｃｉｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ （Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｎａｐｈｔｏｉｃ ａｃｉｄ−２’−ｐｈｅｎｙｌａｎｉｌｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ （ＨＮＰＰ）など）、化学発光などで標識するとよい。
【００２８】
〔Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属の有用細菌のスクリーニング及び検出、定量〕
本発明のＲＮＡまたはＤＮＡプローブを用い、種々のハイブリダイゼーション法（サザンブロット法、ノーザンブロット法、コロニーハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ法）などにより、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する、本発明の新種微生物、その近縁種、あるいは該近縁種の石油分解細菌種の石油分解細菌を検出及び／または定量したり、スクリーニングすることができる。
本発明のＤＮＡプローブを用いて、石油や環境汚染物質で汚染された現場の水や海水から石油等汚染物質分解微生物を検出・定量する方法の一例について以下に説明する。有害物質汚染現場から水や海水試料を採取し、この試料中に存在する微生物をフィルター（孔径０．２μｍ）に固定し、これを蛍光色素等で標識した配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、プローブを洗い落とした後、蛍光顕微鏡で観察して、ＤＮＡプローブとハイブリダイズし、標識した蛍光を呈している特定の分解微生物を選択的に検出または計数を行う。
上記したように、環境が汚染されれば、分解菌群の割合が増大してくるのでこれにより、環境汚染の指標とすることが可能となる。
【００２９】
また、本発明のＤＮＡプローブを用い、コロニーハイブリダイゼーション手法、ブロットハイブリダイゼーション手法、フローサイトメトリー法などにより、多数の微生物群の中からＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属の本発明の新種の微生物およびその近縁種、およびＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属の石油分解細菌、とくにＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属の本発明の新種の微生物およびその近縁種の石油分解細菌をスクリーニングすることができる。
【００３０】
〔Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属菌の同定〕
さらに、配列番号１または２の塩基配列情報や配列番号３、４または５を用いて、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属の本発明の新種の微生物およびその近縁種、およびＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属の本発明の新種の微生物およびその近縁種の石油等有害物質分解細菌を同定することができる。例えば、配列番号１または配列番号２の塩基配列との相同性、または請求項５〜７いずれかに記載のＲＮＡまたはＤＮＡプローブを用いたＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションにより同種の菌であることが同定できる。さらに、上記プローブの塩基配列（ＤＮＡ断片）をプライマーとして用いて、ＰＣＲを行うことによって菌種の同定を行うこともできる。すなわち、同定の対象となる菌体を溶菌して、上記プローブの塩基配列をもつＤＮＡ断片をプライマーとして添加した後、ＰＣＲ増幅する。そのＰＣＲ産物を電気泳動等により１６Ｓ ｒＤＮＡの増幅が確認されれば、対象とした菌には、用いたＤＮＡ断片に相補的な遺伝子部分を有していることになる。すなわち、同種の菌であることが特定できる。
【００３１】
〔有害物質汚染環境のモニタリング、解析・評価〕
石油等の有害物質汚染環境の指標となる特定の分解微生物の挙動、およびそれが全微生物群集に占める割合（優占度）を、簡単、迅速にモニタリングすることが可能になれば、汚染の程度、および汚染環境の修復、回復の程度などを、その汚染環境の診断が高精度かつ早期に可能になる。 例えば、環境中に石油分解菌やＰＣＢ分解菌がある時期に優占度が上昇していれば、その環境は石油やＰＣＢで汚染されている可能性が高いと判断できるし、その微生物群集全体として石油やＰＣＢ分解能が高まっていると判定できる。さらに、その優占度の変化を長期間にモニタリングし、その変遷の周期性や季節性を把握しておけば、その変化が突発的なものかどうか、その負荷が船舶事故や工場排水の流入など人為的なものかどうかを推定できる。 本発明のＤＮＡプローブを用いて、油濁環境中の全微生物群集中のＰＡＨ分解微生物の優占度を調べることにより、環境中の炭化水素成分、ＰＡＨの比率、濃度および消長など汚染の度合を把握でき、汚染物質の自然浄化過程やバイオ環境修復過程の解析・評価が可能になる。
【実施例１】
【００３２】
以下本発明を実施例によって具体的に説明する。
１）ＰＡＨ分解微生物の分離源試料
日本海重油流出事故で石川県沿岸域で最も汚染された地点、Ｓｔｎ．１９（珠洲西海海岸、長橋）で１９９８年６月１１日に採取された海水試料に無機栄養塩を加え系（ＳＷ＋Ｎ＋Ｐ）（表２−Ａ）に０．５％Ｃ重油を添加して、２０℃で６５日培養し、分解試験を行った。
この６５日の分解試験培養液中の分解細菌数のＭＰＮ計数培養（培地：表２−Ｃ）で、Ｃ重油で良好な増殖を示した希釈段階のもっとも高い試験管の培養液を、０．５％Ｃ重油を含む（ＳＷ＋Ｎ＋Ｐ）培地に接種し、２０℃にて培養期間１２−１７日で３回集積培養を繰り返した後、さらにＣ重油を加えたＮＳＷ培地（表２−Ｂ）を用いて、前記同様に、培養期間９−１７日で４回集積培養を繰り返した培養液を下記ＡＮ分解細菌の集積培養の種菌として用いた。
【表２】
2008029350.tif 000003
２） ＰＡＨ分解細菌の集積培養
前記Ｃ重油集積培養液０．１ｍｌを種菌として、０．１％ （ｗ／ｖ） ＡＮを添加したＮＳＷ培地（表２−Ｂ参照）１０ｍｌを含む大型試験管に接種し、２０℃で８日間振とう培養によりＡＮ分解細菌の集積培養を行った。
３） ＰＡＨ分解細菌の分離に用いた平板培地と培養法
ＡＮ 分解細菌およびＰＨＥ分解細菌の分離は、０．１％（ｗ／ｖ）ＡＮをＮＳＷ寒天培地に添加した（ＮＳＷ＋ＡＮ）平板培地（表２−Ｄ）、２％寒天ＮＳＷ下層培地にＡＮまたはＰＨＥのエタノール溶液を添加した１％アガロースＮＳＷ上層培地を被せた二層平板培地（表２：ＮＳＷ＋ＡＮ二層培地、ＮＳＷ＋ＰＨＥ二層培地）およびＭａｒｉｎｅ Ａｇａｒ ２２１６ （Ｄｉｆｃｏ製） （ＭＡ）平板培地を用いて、２０℃で平板培養により行った。なお、平板培地に形成されたコロニー形態は実体顕微鏡で観察した。
また、使用したＮＳＷ＋ＡＮ二層平板培地は、以下の２％寒天ＮＳＷ下層培地（１）に（シャーレ、直径９ｃｍ）、アントラセン（ＡＮ）を加えた１％アガロースＮＳＷ上層培地（２）５ｍｌ（約５０℃保温）をすばやく添加して、下層培地表面全体に上層培地を均一に広げて調製したものである。
（１）． ２％寒天ＮＳＷ下層培地
表２ＮＳＷ培地に２％濃度の寒天を添加した培地１５−２０ｍｌを直径９ｃｍのシャーレに加えて平板培地を調製する。
（２）． ＡＮ添加１％アガロースＮＳＷ上層培地
１％アガロースを添加したＮＳＷ培地５ｍｌを含む試験管をオートクレーブ滅菌後、約５０℃に保温し、その試験管にろ過滅菌した０．１％ＡＮエタノール（９９．５％、脱水エタノール）溶液０．２ｍｌを添加し、すばやく撹拌して均一に分散させる。
なお、本二層平板培地の調製法は下記文献に記載されている方法に準じて行った。
Ｂｏｇａｒｄｔ， Ａ． Ｈ． ａｎｄ Ｈｅｍｍｉｎｇｓｅｎ， Ｂ． Ｂ．： Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ ａｎ ｏｖｅｒｌａｙｅｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｓｉｔｅｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５８， ２５７９−２５８２（１９９２）．
ＮＳＷ培地：文献参照（Ｔ． Ｈｉｇａｓｈｉｈａｒａ， Ａ． Ｓａｔｏ ａｎｄ Ｕ． Ｓｈｉｍｉｚｕ： Ａｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒｔｈｅ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ， Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｆｉｓｈｉｅｒｅｉｅｓ， ４４， １１２７−１１３４， １９７８）
【００３３】
４）ＰＡＨ分解細菌の分離
前記２）項のＡＮ分解細菌の集積培養液を（ＮＳＷ＋ＡＮ）平板培地に塗抹し、２０℃、８日間培養した。この平板培養培地に形成されたコロニーを釣菌し、さらにその分離菌株を （ＮＳＷ＋ＡＮ）平板培地とＭＡ平板培地を用いて、平板分離培養を２回繰り返し、１６菌株を分離した。なお、平板培養は２０℃、１６日間行った。
さらに、これらの分離菌株を、０．１％ＡＮを添加したＮＳＷ培地５ｍｌを加えたキャップ付ねじ口試験管（直径１８ｍｍ）にて４０日振とう培養を行った結果、ＡＮの部分分解物と推定されるｐａｌｅ ｐｕｒｐｌｉｓｈ ｐｉｎｋ系の色素を生成し、ＡＮ分解性が示唆されるＡＮＩ７菌株を見出した。なお、本菌株はＮＳＷ＋ＡＮ平板培養培地からの分離菌株である。
【００３４】
５） ＡＮＩ７菌株の純粋分離
上記ＡＮＩ７菌株を０．１％ＡＮまたは０．１％ＰＨＥ を添加したＮＳＷ培地を用いて、約１ヶ月− １．５ヶ月間、振とう培養後、この培養液をＭＡ平板培地に塗抹し、培養した結果、いずれの培養液においてもＹｅｌｌｏｗ系の色調の濃いコロニー（Ａタイプ）と色調の薄いコロニー（Ｐ タイプ）の２種類のコロニーが混在していた。そこで、本菌株の純粋分離を行った。純粋分離は、ＭＡ平板培地、ＮＳＷ＋ＡＮ平板培地およびＮＳＷ＋ＡＮ二層培地を用いた平板培養と０．１％ＡＮまたは０．１％ＰＨＥ を添加したＮＳＷ培地を用いた液体培養を数回繰り返すことにより行った。なお、ＡタイプはＡＮ添加ＮＳＷ培地、Ｐ タイプはＰＨＥ添加ＮＳＷ培地を用いた液体培養系から、それぞれの純培養株としてＡＮＩ７Ａ菌株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９０９５）とＡＮＩ７Ｐ菌株（（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９０９６）の分離に成功した。なお、分離菌株の純粋性試験には上記の平板培地以外に、ＮＳＷ＋ＰＨＥ二層培地も用いた。
また、純粋分離したＡＮＩ７Ａ菌株とＡＮＩ７Ｐ菌株は、いずれもＡＮ添加ＮＳＷ培地を用いた液体培養でＡＮ の部分酸化物由来と推定されるＰａｌｅ ｐｉｎｋ−Ｐａｌｅ ｐｕｒｐｌｉｓｈ ｐｉｎｋ系の色素を、またＰＨＥ添加ＮＳＷ培地ではＤｕｌｌ ｙｅｌｌｏｗ−ｐａｌｅ ｙｅｌｌｏｗ ｏｒａｎｇｅ系の色素を生成した。さらに、両菌株のＰＡＨ分解性を調べた結果、いずれもＡＮやＰＨＥを分解することが確認された（実施例２参照）。また、ＡＮＩ７Ａ菌株については、ビフェニール（ＢＰ）を添加したＮＳＷ培地を用いた液体培養でＢＰの部分酸化物と推定されるＰａｌｅ ｙｅｌｌｏｗ ｇｒｅｅｎ−Ｐａｌｅ ｙｅｌｌｏｗ系の色素を生成した。
【実施例２】
【００３５】
ＡＮＩ７Ａ菌株およびＡＮＩ７Ｐ菌株のＰＡＨ分解試験には、炭素源として０．１％（ｗ／ｖ） ＡＮまたは０．１％（ｗ／ｖ） ＰＨＥを添加したＮＳＷ培地（表２−Ｂ）を用いた。このＡＮまたはＰＨＥを添加したＮＳＷ培地５ ｍｌをキャップ付ネジ口試験管（直径１８ｍｍ）に、または前記ＮＳＷ培地１０ｍｌをシリコセン付Ｌ字型試験管（直径１８ｍｍ）に加え、２０℃で振とう培養（４５ ｒｐｍ）を行った。
培養液中のＡＮおよびＰＨＥの定量は培養液と等量のジクロロメタンで２回抽出後、２５ｍｌ定容量とした。この抽出液の一定量を下記条件のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析した。なお、内部標準物質としてはｎ−ヘキサデカンを用いた。
ＧＣの分析条件（本体：島津ＧＣ−１７Ａ）
１． カラム
液相： ＴＣ−７０（ＧＬサイエンス製キャピラリーカラム）； 長さ：３０ｍｘ０．２５ｍｍ；
液相の膜厚：０．２５μｍ
２． キャリヤガス（Ｎ２）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
３． 測定条件
試料注入口温度：２５０ ℃
イニシャル温度：１２０ ℃
昇温速度：１０ ℃／ｍｉｎ （２６０ ℃まで）；２６０ ℃で８ｍｉｎ保持
検出器： ＦＩＤ
炭化水素の分解率は同一条件で振とう培養した菌無接種の対照培地中の残存炭化水素量を基準に求めた。なお、分解率は同一培養条件の試験管３本または４本の各分解率の平均値で示した。
【００３６】
シリコセン付Ｌ字型試験管（直径１８ｍｍ）にて２０℃で６０日振とう培養を行った場合、ＡＮＩ７Ａ菌株のＡＮおよびＰＨＥの分解率は８％と２１％であった。また、キャップ付ネジ口試験管（直径１８ｍｍ）を用いて、２０℃、３４日振とう培養を行った場合、ＡＮＩ７Ａ菌株のＰＨＥの分解率は ２２％であった。さらに、後者の培養条件下におけるＡＮＩ７Ｐ菌株のＰＨＥ分解率は１９％であり、ＡＮＩ７Ａ菌株とほぼ同程度であった。また、両菌株からなる微生物コンソーシアのＰＨＥ分解率は、後者の培養条件で２３％で、各単一菌株の分解率と大差はなく、両菌株を組み合わせたコンソーシアによるＰＨＥ分解の促進効果はみられなかった。ＡＮＩ７Ａ菌株とＡＮＩ７Ｐ菌株はコロニー色調は異なるが、分子系統解析からＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ 属の同一種とみなされたことから、ＰＨＥ分解能にも顕著な差はみられなかったものと推察された。
また、ＡＮＩ７Ａ菌株は、０．１％（ｗ／ｖ） ＢＰを添加したＮＳＷ培地を用いたシリコセン付Ｌ字型試験管による前者の培養条件で、培養１日目からＢＰの部分酸化物と推定されるＰａｌｅ ｙｅｌｌｏｗ ｇｒｅｅｎ −Ｐａｌｅ ｙｅｌｌｏｗの色素を生成した。、ＡＮＩ７Ｐ菌株についてはこのＢＰ分解試験を行わなかったが、上記したようにＡＮ１７Ａ菌株とＡＮ１７Ｐ菌株とは、同じ細菌種で、ともにＰＨＥを分解することから、ＡＮ１７Ｐ菌株もＢＰ分解能を有すると考えられる。
【実施例３】
【００３７】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＡＮＩ７Ａ菌株検出用ＤＮＡプローブの調製
石川県流出油汚染沿岸域より採取した試料から、集積培養を経て純粋分離に成功したＰＡＨ分解細菌Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＡＮＩ７Ａ菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９０９５）の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列情報（配列番号１）の中から、Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ａｍａｎｎ （Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ． Ｉｎ： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ． Ｅｄ．： Ｅ． Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ ａｎｄ Ｍ． Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ， ｐｐ． ２０５−２４８， １９９１）により示された高次構造による障害が見られないと考えられる領域から、この菌種に特異的な配列を選抜し、該配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、その５’末端をＴＲＩＴＣや Ｃｙ ５等の蛍光色素により標識化し、最終的に配列番号３示した配列を有する比放射性標識ＤＮＡプローブ（ＳＰＧ６４５）、配列番号４に示す比放射性標識ＤＮＡプローブ（ＳＰＧ６４３）及び配列番号５に示す比放射性標識ＤＮＡプローブ（ＳＰＧ６３４）を作製した。
【実施例４】
【００３８】
実施例３記載のＤＮＡプローブを用いたＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属微生物の検出、計数法
実施例３の上記各ＤＮＡプローブの使用にあたっては、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＡＮＩ７Ａ菌株を標的微生物、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ ＩＦＯ１６０８６（標準菌株）などを対象微生物とし、Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｓｕｎａｍｕｒａ（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｏｆ ｔｏｔａｌ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｅａｗａｔｅｒ， ｕｓｉｎｇ ａ ｄｅｅｐ−ｓｅａ ｍｉｃｒｏｂｅ ａｓｂｉｏｍａｒｋｅｒ． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ６６： ２２１１−２２１５， ２０００）に記載した装置及び手法を用い、ＦＩＳＨ法にて実際にその有効性を確認した。供試菌株の培養、固定及びハイブリダイゼーションの方法については、特開２０００−３３３６８０に準じた。ただしこの際のハイブリダイゼーションは、５０％ ホルムアミド存在下で４２℃で行い、洗浄処理は４２℃で行った。 試料の蛍光顕微鏡観察によるプローブの有効性を表３に示す。
【表３】
2008029350.tif 000004
【００３９】
今回デザインしたプローブＳＰＧ６４５、 ＳＰＧ６４３， およびＳＰＧ６３４の場合、ＵＶ励起では各細胞中 ＤＮＡにＤＡＰＩが普遍的に結合した結果として、ＤＡＰＩ由来の青色蛍光が ＡＮＩ７Ａ菌および対照菌株として供した２種類Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ （ＩＦＯ１６０８６） 、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ ＮＩＢＨ Ｐ２Ｋ１８）とも観察することができた。しかし、同視野をＧ励起で観察すると、ＡＮＩ７Ａ菌株のみがプローブＳＰＧ６４５、ＳＰＧ６４３、およびＳＰＧ６３４ と相補的な配列を持つため、プローブの５’末端をラベルしたＴＲＩＴＣ由来の赤色蛍光を発した。
一方、Ｂａｃｔｅｒｉａドメインに特異的なプローブＥＵＢ３３８の場合は、Ｂ励起での観察においても、ＡＮＩ ７Ａおよび２種類の対照菌株とも、それぞれＥＵＢ３３８の５’末端をラベルしたＦＩＴＣ由来の緑色蛍光を発した。
以上のことから、今回、油濁環境由来の微生物１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列からデザインした３つのプローブは、ＡＮＩ７Ａ菌株またはその近縁種を特異的に検出する上で、その高次構造に起因する結合上の妨害も見られず、実際に大変有効であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＡＮ１７Ａ株、及び同ＡＮ１７Ｐ株の各１６Ｓ ｒＤＮＡの分子系統解析に基づき作成された分子系統樹である。
【図１】
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【配列表】
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