(57)【要約】【課題】骨髄細胞から骨芽細胞への分化をさらに促進させ、迅速に患者の骨欠損部を修復する。【解決手段】骨補填材１０１上に播種された骨髄細胞に骨分化誘導剤を添加するとともに、周波数１．３〜２ＭＨｚ、繰り返し周期１００〜１．０ｋＨｚ、バースト幅１０〜２０００μｓ、空間時間平均出力１００ｍＷ／ｃｍ２以下の超音波パルスＵを照射しつつ培養する培養骨の製造方法を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨補填材上に播種された骨髄細胞に骨分化誘導剤を添加するとともに、周波数１．３〜２ＭＨｚ、繰り返し周期１００〜１．０ｋＨｚ、バースト幅１０μｓ〜２０００μｓ、空間時間平均出力１００ｍＷ／ｃｍ２以下の超音波パルスを照射しつつ培養する培養骨の製造方法。
【請求項２】
前記超音波パルスが周波数１．５ＭＨｚ、繰り返し周期１．０ｋＨｚ、バースト幅２００μｓ、空間時間平均出力３０ｍＷ／ｃｍ２である請求項１に記載の培養骨の製造方法。
【請求項３】
前記骨補填材が、βリン酸三カルシウム多孔体からなる成形体である請求項１または請求項２に記載の培養骨の製造方法。
【請求項４】
前記骨分化誘導剤が、デキサメタゾンおよびβグリセロフォスフェートである請求項１から請求項３のいずれかに記載の培養骨の製造方法。
【請求項５】
骨補填材上に播種した骨髄細胞を、骨分化誘導剤を含有する培地内に投入して培養する培養槽と、
該培養槽に隣接して配置され、培養槽内の骨髄細胞に超音波を照射する超音波照射装置とを備え、
該超音波照射装置が、周波数１．３〜２ＭＨｚ、繰り返し周期１００〜１．０ｋＨｚ、バースト幅１０μｓ〜２０００μｓ、空間時間平均出力１００ｍＷ／ｃｍ２以下の超音波パルスを照射する培養骨の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、培養骨の製造方法および装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、骨腫瘍掻爬、外傷などによる骨折や人工関節再置換術の際に、骨欠損がある場合には、その外科的治療法として自家骨移植や同種骨移植等が行われているが、種々の問題が残されている。例えば、骨欠損部に骨補填材を補填して骨を修復することが治療方法として実施されているが、骨欠損部が広域に及ぶ場合には、この手法による治療は困難となる。
【０００３】
近年、骨欠損部に対する再生医療の試みがなされている。すなわち、患者から骨髄を採取し、採取された骨髄中に含まれている間葉系幹細胞を基にして、人為的に骨芽細胞を十分に増殖させた後、再度患者の体内に戻す手法が行われている。この場合に、患者自身から採取した骨髄から骨芽細胞への分化を促進させ、十分に増殖させた後に患者の体内に戻すため、拒絶反応等の免疫反応を生じることなく骨形成を促進することが期待されている。
【０００４】
また、このような細胞を培養するシステムの開発も試みられている（例えば、特許文献１，２参照。）。骨髄細胞から骨芽細胞への分化を促進することが可能であれば、患者からより少ない骨髄細胞を採取し、採取後短時間で患者に戻すことができるため、治療期間を短縮することが可能となる。
【０００５】
一方、低出力超音波（Low-Intensity
Pulsed Ultrasound：以下、ＬＩＰＵＳと略す。）パルス刺激が骨折修復促進機能を有することが知られている（例えば、特許文献３参照。）。このような作用をもたらすＬＩＰＵＳ条件（周波数１．５ＭＨｚ、繰り返し周波数１ｋＨｚ，パルス幅２００μｓ、出力値３０ｍＷ／ｃｍ２）を備えた治療装置が米国Exogen社により超音波骨折治療器として開発されている。
【０００６】
この超音波骨折治療器は、臨床試験において、頸骨骨幹部骨折（例えば、非特許文献１参照。）、橈骨遠位端骨折（例えば、非特許文献２参照。）等の治癒促進効果並びに動物モデルでの有効性（例えば、非特許文献３参照。）が照明されている。これらの超音波治療は非侵襲、非温熱効果を用いたものであり、超音波の音圧により骨表面で発生する微小な機械的刺激が骨折部位並びに周囲の細胞群に影響を与えていると考えられている。
【０００７】
これらのメカニズム解明のための研究として、ＬＩＰＵＳにより早期の骨芽細胞内の骨形成作用増強に関連したＣＯＸ−２などの因子の発現が増強されている報告や、コラーゲン分子の架橋結合が増強していることが骨強度の増加につながっているという報告がある（例えば、非特許文献４，５参照。）。また、様々な研究者が多数の超音波条件で骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞などへの超音波刺激の影響を検討しているが、そのメカニズムの詳細は未だに明らかとはなっていない。さらに、三次元軟骨細胞培養モデルにおいて、超音波刺激が軟骨細胞の分化を促進するという報告（例えば、非特許文献６参照。）があるが、その詳細についても不明である。
【０００８】
患者の骨髄液から採取した間葉系幹細胞を培養後、骨補填材料上で骨細胞に分化させ、培養骨として提供する再生医療事業が実施に移されている。かかる骨補填材料として、βリン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）が市販され、整形外科分野で生体に吸収されながら自ら骨様に置換する特性を利用して再生医療技術に応用されている。
【特許文献１】特開２００４−１１９号公報
【特許文献２】特開２００４−１６０４５号公報
【特許文献３】米国特許第４５３０３６０号明細書
【非特許文献１】JBone and Joint Surg, 76A, p26-34, 1994
【非特許文献２】JBone and Joint Surg, 7９A, p961-973, 1997
【非特許文献３】JBone Mineral Res, vol.16, p671-680, 2001
【非特許文献４】NaruseK他、J Bone Mineral Res, vol.18, p360-369, 2003
【非特許文献５】SaitoM他, Bone, vol.35, p644-655, 2004
【非特許文献６】NishikoriT他, John Wiley &Sons Inc.,p201-206, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、患者から採取した骨髄細胞を骨補填材料に播種し、骨分化誘導剤を添加して骨芽細胞に分化させ、充分な量に達した段階で患者に戻す方法は、培養に時間を要することから、治療時期の遅れや骨再生の遅延などの不都合がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、骨髄細胞から骨芽細胞への分化をさらに促進させ、迅速に患者の骨欠損部を修復することができる培養骨の製造方法および装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明者らは、骨髄細胞の骨芽細胞への分化を促進する方法について鋭意検討を行った結果、骨補填材内において培養されている骨髄細胞に対し超音波を照射することで骨芽細胞への分化を促進する手法を見いだし、以下の手段を提供する。
【００１１】
本発明は、骨補填材上に播種された骨髄細胞に骨分化誘導剤を添加するとともに、周波数１．３〜２ＭＨｚ、繰り返し周期１００〜１ｋＨｚ、バースト幅１０〜２０００μｓ、空間時間平均出力１００ｍＷ／ｃｍ２以下の超音波パルスを照射しつつ培養する培養骨の製造方法を提供する。
【００１２】
上記発明においては、前記超音波パルスが周波数１．５ＭＨｚ、繰り返し周期１ｋＨｚ、バースト幅２００μｓ、空間時間平均出力３０ｍＷ／ｃｍ２であることが好ましい。
また、上記発明においては、前記骨補填材が、βリン酸三カルシウム多孔体からなる成形体であることが好ましい。
さらに、上記発明においては、前記骨分化誘導剤が、デキサメタゾンおよびβグリセロフォスフェートであることが好ましい。
【００１３】
また、本発明は、骨補填材上に播種した骨髄細胞を、骨分化誘導剤を含有する培地内に投入して培養する培養槽と、該培養槽に隣接して配置され、培養槽内の骨髄細胞に超音波を照射する超音波照射装置とを備え、該超音波照射装置が、周波数１．３〜２ＭＨｚ、繰り返し周期１００〜１ｋＨｚ、バースト幅１０〜２０００μｓ、空間時間平均出力１００ｍＷ／ｃｍ２以下の超音波パルスを照射する培養骨の製造装置を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、骨補填材上に播種された骨髄細胞を早期に骨芽細胞に分化させて、短期間で患者の骨欠損部に補填可能な成熟した培養骨を早期に製造することができ、治療期間を短縮し、患者にかかる負担を軽減できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の一実施形態に係る培養骨製造装置１００および製造方法について、図１および図２を参照して説明する。
本実施形態に係る培養骨製造装置１００は、骨髄細胞を播種した骨補填材１０１および骨分化誘導剤を添加した培地１０２を収容する培養槽１０３と、培養槽１０３の下方に配置され培養槽１０３内の骨髄細胞に対し超音波Ｕを照射する超音波照射装置１０４とを備えている。
【００１６】
前記培養槽１０３は、培地１０２を収容する容器部１０５と、該容器部１０５の上部開口を塞ぐように配置される蓋部１０６とを備えている。これら容器部１０５および蓋部１０６は、生体に対して毒性を有しない材質で構成されている。特に、容器部１０５は、ポリエチレンやポリスチレン等の透明材料または半透明材料により構成されている。容器部１０５の底面は、厚さ１ｍｍ程度に形成されている。
【００１７】
蓋部１０６は、容器部１０５の上部開口外周を全周にわたって覆う一方、スペーサ１０７によって容器部１０５との間に隙間をあけて配される鍔部１０８と、該鍔部１０８の内側に一体的に設けられ、容器部１０５内に挿入されて、容器部１０５内に貯留されている培地１０２の液面に接触させられる凸部１０９とを備えている。蓋部１０６は、その少なくとも凸部１０９が、超音波吸収材、例えば、シリコーンゴムにより構成されている。
【００１８】
前記超音波照射装置１０４は、滅菌水１１０を貯留し、その水面近傍に前記培養槽１０３を収容し、例えば、３７℃の培養温度に水温を維持する恒温水槽１１１と、該恒温水槽１１１内に配置され、培養槽１０３の底面に向けて超音波パルスＵを照射する超音波発振器１１２とを備えている。超音波発振器１１２を作動させて超音波パルスＵを出射させると、超音波パルスＵが滅菌水１１０内を伝播して、培養槽１０３の容器部１０５底面から培養槽１０３内に入射され、培養槽１０３内に収容されている骨補填材１０１上の骨髄細胞に超音波振動が加えられるようになっている。
【００１９】
超音波発振器１１２は、周波数１．３〜２ＭＨｚ、繰り返し周期１００〜１ｋＨｚ、バースト幅１０〜２０００μｓ、空間時間平均出力１００ｍＷ／ｃｍ２以下の超音波パルスＵを出射するようになっている。
【００２０】
骨補填材１０１としては、それに担持させた骨髄細胞が骨芽細胞へと分化誘導されることにより培養骨を構成するものであり、例えば、高純度のβリン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）多孔体を、例えば、立方体ブロック状に成形したものが使用される。
また、培地１０２としては、デキサメタゾンあるいはβグリセロフォスフェート（β−ＧＰ）を骨分化誘導材として含有する骨形成培地である。
【００２１】
このように構成された本実施形態に係る培養骨製造装置１００を用いて培養骨を製造するには、培養槽１０３の容器部１０５内に骨形成培地１０２を貯留し、骨補填材１０１に骨髄細胞を播種したものを培養槽１０の容器部１０５内に投入して、蓋部１０６により上部開口を覆う。そして、この培養槽１０３を、滅菌水１１０を貯留した恒温水槽１１１内に収容し、超音波発振器１１２を作動させる。
【００２２】
超音波発振器１１２から出射された超音波パルスＵは、滅菌水１１０内を伝播して培養槽１０３内に入射される。本実施形態においては、培養槽１０３を構成する容器部１０５の底面が１ｍｍ程度と薄く形成されているので、滅菌水１１０と容器部１０５との界面における反射があまり発生せず、超音波パルスＵは培養槽１０３内にスムーズに入射され、骨補填材１０１に播種されている骨髄細胞に照射される。
【００２３】
培養槽１０３は恒温水槽１１１内に収容されているので、３７℃の適正な培養温度に維持され、超音波発振器１１２から照射される超音波パルスＵの作用によって骨髄細胞の骨芽細胞への分化が効率的に促進される。その結果、従来と比較して大幅に骨芽細胞への分化誘導を促進することができ、早期に培養骨を得ることができるという効果がある。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）
次に、上述した本実施形態に係る培養骨製造方法の実施例について説明する。
本実施例においては、培養槽１０３の容器部１０５として６穴の培養皿（以下、培養皿１０５とも言う。）を用い、該培養皿１０５の上部を覆う蓋部１０６として、シリコーンゴムを成形してなる超音波吸収板を使用した。恒温水槽１１１内にフレーム１１３を配置し、フレーム１１３によって恒温水槽１１１を滅菌水１１０の水面近傍に支持した。また、フレーム１１３には、培養皿１０５の下方に該培養皿１０５の６個の各ウェル１０５ａに対応する位置に超音波発振器１１２を配置した。超音波の出力条件は、周波数１．５ＭＨｚ、繰り返し周期１．０ｋＨｚ、バースト幅２００μｓ、空間時間平均出力３０ｍＷ／ｃｍ２とした。符号１１４は超音波発振器１１２への電力を供給するケーブルである。
【００２５】
骨髄細胞として、ラット大腿骨由来の骨髄細胞を使用した。具体的には、Fischer334(ラット)の６週齢の大腿骨から骨髄細胞を採取し、７５ｍｍ２の培養皿で初代培養を実施した。この際の培地は、α−ＭＥＭ、１５％ＦＣＳを使用し、分化誘導剤を含んでいない。トリプシン処理により得られた骨髄細胞を、１０６cell/mLの濃度に調製し、この細胞懸濁液に５ｍｍ角（１２５ｍｍ３）、気孔率７５％のβ−ＴＣＰブロック（オスフェリオン／オリンパスバイオマテリアル株式会社製）１０１を２時間浸漬した。
【００２６】
その後、骨髄細胞およびβ−ＴＣＰの複合体（以下、複合体１０１という。）を培地内から取り出し、６穴培養皿１０５に載せて、骨形成培地（α−ＭＥＭ、１５％ＦＣＳ、１０８ｍＭデキサメタゾン（以下、ＤＥＸという。）、１０ｍＭβグリセロフォスフェート（以下、β−ＧＰという。））１０２中で培養した、以下の２群を設定した。
（１）超音波照射群：複合体＋ＤＥＸ＋β−ＧＰに対して、３７℃のインキュベータ内で超音波パルスＵ刺激を実施した群。
（２）対照群：複合体＋ＤＥＸ＋β−ＧＰに対して、３７℃のインキュベータ内で静置し、超音波刺激は実施しない群。
超音波照射群に関しては、培養１日後から超音波発振器１１２の作動により超音波パルスＵ刺激（２０分／日）を実施した。
【００２７】
本実施例における検討項目を以下に列挙する。
（１）ＤＮＡ量
採取したβＴＣＰブロック１０１を液体窒素で破砕し、ＰＢＳ／ＮＰ−４０液でホモジネートしてHoechist33258を用いてｄｓＤＮＡ量を定量し、細胞数を算出した。
（２）アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）量
上記によるホモジネート後の溶液を用いて、Ｋｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法でＡＬＰ活性を測定した。
（３）オステオカルシン（ＯＣ）量（ｍＲＮＡレベル並びに蛋白量）
特定器プライマを用いてＰＴ−ＰＣＲ法でｍＲＮＡ発現量を解析した。また、ＯＣ蛋白量は回収したβＴＣＰブロック１０１を２０％蟻酸で脱灰し、その抽出液を脱塩凍結乾燥したものを用いてＥＩＡ法で定量した。
（４）コラーゲン量（ｍＲＮＡレベル並びに蛋白量）
特異的プライマを用いてＰＴ−ＰＣＲ法でｍＲＮＡ発現量を解析した。コラーゲン蛋白量は、βＴＣＰブロック１０１を６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間加水分解した後、ＨＰＬＣ法でhyroxyroline量を求め、コラーゲン量に換算した。
（５）コラーゲン架橋形成量（未熟型架橋：DHLNL,HLNL,LNL、成熟架橋：Pyridinoline，Deoxypyridinoline）
βＴＣＰブロック１０１を６Ｎ塩酸で１１０℃２４時間加水分解した後、ＨＰＬＣ法で未熟型架橋、成熟架橋を分離定量し、単位コラーゲン量当たりとして算出した。
【００２８】
これらの検討項目に対して、超音波パルスＵの刺激回数との関係を、対照群に対する超音波刺激群の比率（％）により表１に示した。
解析サンプルとしては、超音波刺激１回の２４時間後、刺激３回（３日間）してから２４時間後、刺激７回（７日間）してから２４時間後、刺激１４回（２週間）してから２４時間後、および刺激２１回（３週間）してから２４時間後のサンプルを使用した。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
本試験実施前に、ＤＥＸ等の分化誘導剤を添加しないで超音波刺激により骨髄細胞から骨芽細胞への分化状態を検討したが、オステオカルシンの誘導およびコラーゲン架橋パターンの骨型への誘導は認められなかった。
【００３１】
対照群では、培養約２週間で骨芽細胞への分化傾向が認められた。この結果から、超音波刺激により、対照群に比較して約１週間早く、石灰化基質の成熟等が認められた。分化誘導剤であるＤＥＸは、骨髄細胞の骨芽細胞への分化誘導に効果があるが、培養期間が長いほど、効果を発揮することがわかっている。
【００３２】
したがって、この結果においても、培養２週目以降は超音波刺激による顕著な差は認められなかったが、その時期に至るまでのオステオカルシン量並びにコラーゲン量は、超音波刺激群で有意に複合体１０１内に蓄積されている。このことから、成熟度の高い基質、すなわち、基質量は同様であっても、非常に骨質が高い基質が得られる可能性が示唆された。以上のように、超音波刺激により分化誘導剤存在下における骨補填材１０１中の骨髄細胞の骨芽細胞への分化が促進されることが明らかとなった。
【００３３】
（実施例２）
実施例１と同一の試験を実施し、２１日間培養し経時的に回収して分析した。また、検討項目として、コラーゲン架橋パターン（未熟型架橋：(DHLNL+HLNL)/LNL、成熟架橋：DPD/PYD）を加えた。
培養１４日目の顕微鏡写真を図４に示す。図４（ａ）は超音波照射群、（ｂ）は対照群である。これによれば、超音波照射群は、ＴＣＰの周囲に骨マトリクスが形成されていることがわかる。
【００３４】
図５に細胞数、図６にコラーゲン量、図７にＡＬＰ活性、図８にオステオカルシン量、図９に未熟架橋「量」、図１０に成熟架橋「量」、図１１に未熟架橋「骨型パターン」、図１２に成熟架橋「骨型パターン」をそれぞれ示す。
細胞数においては、超音波照射群と対照群との間に顕著な差は見られないが、他の分析結果においては、両者の差は顕著である。未熟架橋「量」はDHLNLとHLNLとLNLとの総和、成熟架橋「量」はPYDとDPDとの和により求めた。
【００３５】
また、未熟架橋「骨型パターン」では、(DHLNL+HLNL)/LNLが９以上になると骨のパターンと言うことができ、成熟架橋「骨型パターン」では、(DPD/PYD）が０．２以上になると骨のパターンと言える。図１１，１２によれば、対照群が骨のパターンに移行するのに２１日を要しているのに対し、超音波照射により、７日目と極めて早期に骨のパターンになっていることがわかる。
これにより、超音波照射によって、早期にコラーゲンの「量」と「質」を高め、骨型のコラーゲン基質を誘導することができることがわかった。
【００３６】
ここで、骨補填材１０１としての多孔質体について説明する。
細胞を用いた骨組織再生用の足場材料には、リン酸カルシウム、コラーゲン等の多くの材料が応用されている。その中でも、β−ＴＣＰはそれ自体が吸収性を有するとともに、骨形成の足場となり、完全に骨に置換する特徴を有するため、極めて有用である。さらに、細胞がその内部に進入することを可能とするために、足場材料に効果的に付着、増殖、分化しなければならない。そのため、本発明では、骨補填材１０１として、β−ＴＣＰからなる多孔質体を使用することが望ましい。さらに、その気孔率は、６０〜８０％であることが望ましく、７５％が最も好ましい。７５％の気孔率が最も超音波刺激の付与に適した気孔性状である。
【００３７】
また、本実施形態に係る培養骨製造装置１００を適用した培養装置１について説明する。
この培養装置１は、患者から採取した骨髄液２と、該骨髄液２に含有されている細胞を付着させる骨補填材１０１と、培地４，１０２とを供給することにより、培養細胞を付着させた培養骨５と各工程における感染検査の結果を示すデータとを出力するものである。
【００３８】
さらに具体的には、この培養装置１は、貯蔵部６と、細胞抽出部７と、細胞培養部８ａ，８ｂと、密封部９と、検査部１０とを無菌室１１内に備えている。
貯蔵部６は、骨補填材１０１，培地４，１０２をそれぞれ別々に収容する複数の容器を備えている。培地４は、例えば、図に示されるように、ＭＥＭ（Minimal Essential
Medium：最小必須培地）、ＦＢＳ（Fatal Bovine Serum：ウシ胎子血清）および抗生剤から構成されており、これらが混合された状態で、あるいは別々の容器１２，１３，１４内に収容されている。また、培地４を貯蔵する容器は、図示しない冷蔵装置内に収容されており、例えば、４℃で保存されている。抗生剤は、例えば、ペニシリン系抗生物質である。骨髄液２は細胞抽出部７に供給される。
【００３９】
該細胞抽出部７は、例えば、遠心分離機であり、骨髄液２を収容している容器から骨髄液２を受け取って、旋回させることにより、骨髄液２中から比重の重い骨髄細胞を採集することができるようになっている。
【００４０】
骨髄培養部は、一次培養部８ａと二次培養部８ｂとから構成されている。一次培養部８ａは、図に示すように、前記細胞抽出部７および培地４を収容している容器のそれぞれに接続されている。この一次培養部８ａは細胞抽出部７において抽出された骨髄細胞と、容器に貯蔵されている培地４とを受け入れる培養容器１５と、培養容器１５内においてこれら骨髄細胞および培地４を攪拌する攪拌手段（図示略）と、攪拌されて混合された骨髄細胞および培地４を所定の温度（例えば、３７±０．５℃）およびＣＯ２濃度（例えば、５％）等の培養条件に維持する手段１６とを備え、所定時間にわたって、一定培養条件下で骨髄細胞を培養することができるようになっている。また、一次培養部８ａにはトリプシン等の蛋白質分解酵素を貯蔵する容器１７が接続されている。
【００４１】
これにより、一次培養部８ａにおける培養工程において、培養容器１５内にトリプシンを供給することで、培養容器１５の底面に付着した骨髄細胞を培養容器１５から剥離させることができるようになっている。図中、符号１８はトリプシン内に混合している骨髄細胞を抽出するための遠心分離機である。
【００４２】
二次培養部８ｂには、上述した本実施形態に係る培養骨製造装置１００が用いられる。
二次培養部８ｂは一次培養部８ａに接続されているとともに、骨補填材１０１を収容する容器（図示略）にも接続されている。この二次培養部８ｂも前記一次培養部８ａと同様に、培養容器１０３および図示しない攪拌手段、培養条件維持手段２０を備えている。
【００４３】
また、これら、一次培養部８ａおよび二次培養部８ｂには、培養容器１５，１９内の培地を定期的に交換する培地交換手段２７，２８が備えられている。培地交換手段２７，２８は、例えば、培養容器１５，１０３を水平軸回りに回転させる容器回転手段（図示略）を備えている。すなわち、容器回転手段を作動させて培養容器１５，１０３を水平軸回りに回転させることにより傾斜させ、あるいは反転させて、内部の培地１０２を培養容器１５，１０３から排出することができるようになっている。
また、培地交換手段２７，２８には排出された培地１０２’を収容する廃培地容器２９が備えられている。
【００４４】
密封部９は、二次培養部８ｂに接続され、該二次培養部８ｂにおいて製造された培養骨を密封容器３０内に密封して出力するように構成されている。図中、符号３１は最終製品である培養骨から検査用の検体を取り出す検体抽出部である。
また、検査部は前記骨髄液２の容器、一次培養部８ａの廃培地容器２９、二次培養部８ｂの廃培地容器２９および検体抽出部３１に接続された全自動リアルタイムＰＣＲ（Polymerase Chain
Reaction）装置である。この全自動リアルタイムＰＣＲ装置においては、真菌、細菌、エンドトキシン、ウィルス、マイコプラズマ等を全て検出できるようなプライマが使用される。
【００４５】
この培養装置１においては、貯蔵部６、細胞抽出部７、細胞培養部８ａ，８ｂ、密封部９および検査部１０が無菌室１１内に配置されており、無菌室１１は、例えば、クリーンルームと同様に、内部を一定の陽圧に設定され、パーティクルカウンタ等によって単位容積当たりの塵埃数を制限されている。
【００４６】
このように、この培養装置１によれば、骨髄液から採取した骨髄細胞を使用し、β−ＴＣＰなどの骨補填材１０１上で骨分化誘導剤を添加して培養する二次培養部８ｂにおいて、特定周波数の低出力超音波パルスＵを照射することにより、骨芽細胞への分化を促進し、骨折等の骨欠損部の修復用として自家骨細胞を含む培養骨を早期に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の一実施形態に係る培養骨製造装置を示す縦断面図である。
【図２】図１の培養骨製造装置の実施例に使用される装置の外観を示す斜視図である。
【図３】本実施形態に係る培養骨製造装置を用いた培養装置を示す全体構成図である。
【図４】本発明の培養骨の製造方法の実施例であって、培養１４日目の顕微鏡写真、（ａ）超音波照射群、（ｂ）対照群をそれぞれ示す図である。
【図５】本発明の培養骨の製造方法の実施例における細胞数の変化を示すグラフである。
【図６】本発明の培養骨の製造方法の実施例におけるコラーゲン量の変化を示すグラフである。
【図７】本発明の培養骨の製造方法の実施例におけるＡＬＰ活性の変化を示すグラフである。
【図８】、本発明の培養骨の製造方法の実施例におけるオステオカルシン量の変化を示すグラフである。
【図９】本発明の培養骨の製造方法の実施例における未熟架橋「量」の変化を示すグラフである。
【図１０】本発明の培養骨の製造方法の実施例における成熟架橋「量」の変化を示すグラフである。
【図１１】本発明の培養骨の製造方法の実施例における未熟架橋「骨型パターン」の変化を示すグラフである。
【図１２】本発明の培養骨の製造方法の実施例における成熟架橋「骨型パターン」の変化を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４８】
Ｕ  超音波パルス
１００  培養骨製造装置
１０１  骨補填材
１０２  培地
１０３  培養槽
１０４  超音波照射装置
【図１】
2008029317.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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