(57)【要約】【課題】嫌気性超好熱菌１２を効率良く、かつ、高速に高密度化できる嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置を提供する。また、水素の生産速度及び生産性が向上した水素の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置は、ろ過膜１１を備える培養槽１０と、前記培養槽１０を加熱する加熱手段１３と、前記培養槽１０に培養液を供給する培養液供給手段２０と、前記培養槽１０から廃液を回収する廃液回収手段３０と、前記培養槽１０内のガスを回収分離するガス回収分離手段４０と、前記培養槽１０に不活性ガスを供給する不活性ガス供給手段５０とを備え、前記ろ過膜１１と前記廃液回収手段３０が接続されている。本発明の水素の製造方法は、水素発生嫌気性超好熱菌をろ過培養することにより、水素を製造する。【選択図】図１
2008061522.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ろ過膜を備える培養槽と、
前記培養槽を加熱する加熱手段と、
前記培養槽に培養液を供給する培養液供給手段と、
前記培養槽から廃液を回収する廃液回収手段と、
前記培養槽内のガスを回収分離するガス回収分離手段と、
前記培養槽に不活性ガスを供給する不活性ガス供給手段とを備え、
前記ろ過膜と前記廃液回収手段が接続されている嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置。
【請求項２】
前記ろ過膜の細孔径が０．０１〜０．１μｍである請求項１に記載の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置。
【請求項３】
前記ろ過膜が金属膜である請求項１又は２に記載の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置。
【請求項４】
前記ろ過膜と前記不活性ガス供給手段が接続されている請求項１ないし５のいずれかに記載の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置。
【請求項５】
前記ろ過膜と前記培養液供給手段が接続されている請求項１ないし６のいずれかに記載の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置。
【請求項６】
前記培養槽に酸溶液及びアルカリ溶液を供給する酸溶液／アルカリ溶液供給手段をさらに備える請求項１ないし７のいずれかに記載の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置。
【請求項７】
前記ろ過膜が２つであり、
各ろ過膜が前記培養液供給手段及び前記廃液回収手段にそれぞれ１つずつ接続し、
前記各ろ過膜と、前記培養液供給手段及び前記廃液回収手段との接続を切り替える切り替え手段をさらに備える請求項１ないし８のいずれかに記載の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置。
【請求項８】
水素発生嫌気性超好熱菌をろ過培養することにより、水素を製造する水素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置及び水素の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
嫌気性超好熱菌の中には、細胞分裂の過程で水素を産生する性質を有する水素発生嫌気性超好熱菌がある。このような水素発生嫌気性超好熱菌の例として、サーモコッカス  コダカラエンシス（Thermococcus kodakaraensis；以下、「Ｔｋ」と略記することがある。）が挙げられる。このＴｋを培養して水素を生物学的に製造する技術が、従来から提案されている（例えば、特許文献１参照）。
なお、微生物名はイタリック体で表すべきであるが、本明細書においては通常の字体で表示する。また、本発明においては、「水素発生嫌気性超好熱菌」を、細胞分裂の過程で水素を産生する性質を有する嫌気性超好熱菌と定義する。
【０００３】
また、Ｔｋ以外の水素発生嫌気性超好熱菌を用いた水素供給設備が提案されている（例えば、特許文献２参照）。この特許文献２には、常温より高い温度の嫌気性雰囲気内で有機物を栄養源として水素発生嫌気性超好熱菌を培養する培養装置と、排熱源から排出させる８０℃以上の排熱保有媒体から給熱されて前記培養装置を前記水素発生嫌気性超好熱菌の増殖に適した温度に維持する培養温度維持機構と、前記水素発生嫌気性超好熱菌の増殖に必要な前記有機物を前記培養装置内に供給する有機物供給機構と、前記水素発生嫌気性超熱菌の増殖により前記培養装置内で発生する水素を、前記培養装置から取り出して貯蔵する水素貯蔵器とを備え、前記水素貯蔵器から水素を取り出し可能に構成した水素供給設備が記載されている。また、前記水素発生嫌気性超好熱菌がピロコッカス  フリオサス（Pyrococcus furiosus）またはサーモトガ  マリティマ（Thermotoga maritima）であり、前記増殖に適した温度が８０ 〜 １０３℃であることが記載されている。
【特許文献１】特開２００３−１１６５８９号公報
【特許文献２】特開平８−３０８５８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に記載の水素の製造法及び製造装置は、回分培養法を行うものである。この回分培養法とはバッチ式の培養法であるため連続的に水素を製造できず、水素生産速度が遅く、水素の生産性が低いという問題があった。
特許文献２に記載の水素供給設備は連続培養法を行うものである。この連続培養法には、培養装置内の廃液を回収する際、菌体も同時に回収してしまうため、培養装置内の菌体を高密度化することが困難であるという問題があった。
【０００５】
本発明は、上記従来技術の問題点に鑑み、嫌気性超好熱菌を効率良く、かつ、高速に高密度化できる嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置を提供することを目的とする。また、水素の生産速度及び生産性が向上した水素の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる課題を解決するため、
本発明の第１の態様は、ろ過膜を備える培養槽と、前記培養槽を加熱する加熱手段と、前記培養槽に培養液を供給する培養液供給手段と、前記培養槽から廃液を回収する廃液回収手段と、前記培養槽内のガスを回収分離するガス回収分離手段と、前記培養槽に不活性ガスを供給する不活性ガス供給手段とを備え、前記ろ過膜と前記廃液回収手段が接続されている嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置である。
【０００７】
本発明の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置においては、前記ろ過膜の細孔径が０．０１〜０．１μｍであることが好ましい。また、前記ろ過膜が金属膜であることが好ましい。また、前記ろ過膜と前記不活性ガス供給手段が接続されていることが好ましい。また、前記ろ過膜と前記培養液供給手段が接続されていることが好ましい。また、前記培養槽に酸溶液及びアルカリ溶液を供給する酸溶液／アルカリ溶液供給手段をさらに備えることが好ましい。また、前記ろ過膜が２つであり、各ろ過膜が前記培養液供給手段及び前記廃液回収手段にそれぞれ１つずつ接続し、前記各ろ過膜と、前記培養液供給手段及び前記廃液回収手段との接続を切り替える切り替え手段をさらに備えることが好ましい。
【０００８】
本発明の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置は、嫌気性超好熱菌の１種である水素発生超好熱菌に好適であり、水素発生嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置として使用可能である。水素発生嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置においては、前記ガス回収分離手段によって回収分離した水素ガスを前記加熱手段のエネルギー源として利用することが好ましい。
【０００９】
本発明の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置は、嫌気性超好熱菌の１種であるサーモコッカス  コダカラエンシスに好適であり、サーモコッカス  コダカラエンシス用ろ過培養装置として使用可能である。サーモコッカス  コダカラエンシス用ろ過培養装置においては、前記ガス回収分離手段によって回収分離した二酸化炭素ガスを前記培養槽に供給することが好ましい。また、前記培養液供給手段がアミノ酸源及び炭素源を含む培養液を供給することが好ましい。また、前記炭素源が、ピルビン酸、ビルビン酸塩、及びでんぷん系多糖類からなる群から選ばれる１種又は２種以上であることが好ましい。また、前記サーモコッカス  コダカラエンシスが、サーモコッカス  コダカラエンシス  ＫＯＤ１（寄託機関：独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室、受託番号：ＪＣＭ  １２３８０号、又は、寄託機関：American Type Culture Collection (ATCC)、受託番号：ATCC BAA-918）であることが好ましい。
【００１０】
本発明の第２の態様は、水素発生嫌気性超好熱菌をろ過培養することにより、水素を製造する水素の製造方法である。具体的には、嫌気性超好熱菌及び培養液をろ過培養装置の培養槽内に供給する工程と、該培養液中で嫌気性超好熱菌をろ過培養することにより水素を製造する工程とを含む水素の製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、嫌気性超好熱菌のろ過培養を行うため、廃液の回収時に嫌気性超好熱菌を失うことなく、培養槽内の増殖阻害物質濃度を減少させると同時に、培養槽内の嫌気性超好熱菌を濃縮することができる。結果、嫌気性超好熱菌を効率良く高密度化することができる。また、嫌気性超好熱菌として水素発生嫌気性超好熱菌を用い、これをろ過培養することによって、水素の生産速度及び生産性を向上することができる。
また、ろ過膜の細孔径を０．０１〜０．１μｍにすることにより、嫌気性超好熱菌の透過を効果的に阻止するとともに、培養液及び増殖阻害物質の透過を確保することができる。嫌気性超好熱菌の成熟時の一般的な大きさは約１μｍ以上であるので、ろ過膜の細孔径を嫌気性超好熱菌の大きさの１０分の１以下にすることにより、嫌気性超好熱菌の透過を効果的に阻止することができる。また、ろ過膜の細孔径を０．０１μｍ以上にすることにより、培養液及び増殖阻害物質がろ過膜を自由に透過することができる。
【００１２】
また、高密度に培養された嫌気性超好熱菌から、ＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ又はヒドロゲナーゼ等の有用な生体物質を多量に得ることができる。
また、ろ過膜として金属膜を用いた場合、加工及び機械的洗浄によるメンテナンスが容易で、滅菌処理並びに高温、酸性、又はアルカリ性環境下における長期培養に高い耐久性を有するろ過培養装置を構成することができる。
【００１３】
なお、本発明において、「酸溶液／アルカリ溶液」とは、酸溶液とアルカリ溶液の両方又はいずれか一方を意味する。また、「ＤＮＡ／ＲＮＡ」とは、ＤＮＡとＲＮＡの両方又はいずれか一方を意味する。また、「水素発生嫌気性超好熱菌」とは、細胞分裂の過程で水素を産生する性質を有する嫌気性超好熱菌をいう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について、詳しく説明する。
本発明は、嫌気性超好熱菌（以下、単に「本菌体」ということがある。）を対象とする。この嫌気性超好熱菌の具体例としては、サーモコッカス  コダカラエンシス（Ｔｋ）、ピロコッカス  フリオサス、又はサーモトガ  マリティマ等が挙げられる。
【００１５】
嫌気性超好熱菌の１種であるＴｋは、以下の特徴１）〜４）を有する。
１）培養温度が６０〜１０５℃（最適生育温度：約８５℃）であるため、他の菌の繁殖による汚染を回避できる。
２）水素産生量を温度変化により制御できる。
３）栄養源として有機性廃棄物を利用した場合、有機性廃棄物(特にデンプン系多糖類）の可溶化と水素生産反応を同時に進行させることができる。
４）産生された水素を燃料電池の水素源とする場合、高温の水素が得られるため、発電起電力が高くなる。
【００１６】
Ｔｋとしては、サーモコッカス  コダカラエンシス  ＫＯＤ１（以下、「ＫＯＤ１株」と略記する。）、並びにＫＯＤ１株の遺伝子組換え体及び変異体が挙げられ、いずれも本発明の好適な対象である。その中でもＫＯＤ１株が特に好適である。その理由を以下に記載する。
【００１７】
ＫＯＤ１株は、寄託機関：独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（受託番号：ＪＣＭ  １２３８０号）、又は、寄託機関：American Type Culture Collection (ATCC)（受託番号：ATCC BAA-918）に寄託されているため、入手が容易である。また、ＫＯＤ１株の全塩基配列は決定されているため、遺伝子組換え操作を行い易い。また、ＫＯＤ１株の細胞抽出液には、ヒドロゲナーゼ（水素生産に関与する生体触媒）及びＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ等の有用な生体物質が存在することが判明している。また、ＫＯＤ１株は、炭素源としてペプチド類やデンプンを利用できるため、有機性廃棄物を培養液に使用することができる。また、ＫＯＤ１株の培養条件及び水素生産条件が既に判明している。また、ＫＯＤ１株は野生株であるため、増殖能力が安定している。
【００１８】
（嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置の第１の例）
図１に、本発明の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置の第１の例を示す。
培養槽１０は本菌体１２が培養されるところである。この培養槽１０は、ろ過膜１１、本菌体１２、及び培養液を有する。ろ過膜１１は培養液内に存在している。また、培養液の液面上には、不活性ガス等のガスが存在している。培養槽１０の周囲（例えば側面及び底面）には、加熱手段１３が設けられており、培養槽１０内の温度を６０〜１０５℃に制御可能になっている。加熱手段１３の具体例としては、シリコンラバーヒーターやマントルヒーターが挙げられる。
【００１９】
培養槽１０は、嫌気性超好熱菌１２を培養することから、約１００℃の温度に耐えられるものである必要がある。また、酸素が培養槽１０内に侵入することを防ぐため、酸素透過率が小さいものである必要がある。また、培養槽１０内に供給される培養液には高濃度の塩が使用されることがあり、かつ、嫌気性超好熱菌１２の培養時に硫化水素が発生することがあるため、培養槽１０は耐腐食性が高いものである必要がある。従って、培養槽１０の材質としては、上記特性を有する、アルミニウム、ステンレス鋼、ハステロイなどの耐酸性金属が用いられる。前記ステンレス鋼の中では、安価であり、かつ、入手が容易であることから、オーステナイト系ステンレス鋼が好ましく、ＳＵＳ３１６Ｌ、ＳＵＳ３０４等が特に好ましい。
【００２０】
先に例示された材質には、樹脂をコーティング又はライニングしたものが好ましい。これにより、耐腐食性をさらに向上することができる。この樹脂としては、炭素と水素のみからなる樹脂（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン）が挙げられるが、耐熱性が高いことから、フッ素樹脂が好ましい。このフッ素樹脂の中でも、特にポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン−パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、テトラフルオロエチレン−ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）などが特に好ましい。
なお、培養槽１０の形状は、培養に適したものであればよく、例えば円筒形が挙げられる。
【００２１】
ろ過膜１１は本菌体１２を透過させず、培養液及び本菌体１２が排泄する酢酸等の増殖阻害物質を透過させるものである。本菌体１２の成熟時の一般的な大きさは約１μｍである。よって、ろ過膜１１の細孔径は、０．１μｍ以下であることが好ましい。このように、ろ過膜１１の細孔径を本菌体の大きさの１０分の１以下にすることにより、本菌体１２の透過を効果的に阻止することができる。
また、ろ過膜１１の細孔径は、０．０１μｍ以上であることが好ましい。これにより、培養液及び増殖阻害物質がろ過膜１１を自由に透過することができる。
【００２２】
ろ過膜１１の材質としては、金属、樹脂、又はガラス等が挙げられる。これらの材質は、滅菌処理並びに６０℃以上の高温、酸性、又はアルカリ性環境下における長期培養に高い耐久性を有する。中でも、曲げ加工が可能であり、かつ機械的洗浄を行うのに十分な強度を有することから、金属膜が好ましい。
金属膜の材質としては、上述した培養槽１０と同様の材質が好ましい。これにより、ろ過膜１１は培養槽１０と同様の性質を有することができる。また、この材質には、上記樹脂をコーティング又はライニングすることが好ましい。これにより、耐腐食性をさらに向上することができる。
ろ過膜１１の形状は、培養に適したものであればよく、例えば円筒形が挙げられる。
【００２３】
培養槽１０内には、攪拌翼１４が設けられていることが好ましい。この攪拌翼１４を用いて培養液を攪拌して均一化することにより、培養液内の本菌体１２を均一に培養することができる。また、攪拌翼１４は、防御網を装着することが好ましい。これにより、攪拌翼１４による本菌体１２への物理的影響（例えば、せん断応力）を防止することができる。攪拌翼１４は本菌体１２の培養条件においても安定なものである必要があるため、その材質は培養槽１０と同じものであることが好ましい。
【００２４】
培養槽１０には、培養液貯槽２１と、該培養液貯槽２１内の培養液を培養槽１０に供給する第１及び第２の培養液供給管２２，２２ａと、該第１及び第２の培養液供給管２２，２２ａに設けられた第１及び第２の培養液供給用ポンプ２３，２３ａとから構成される培養液供給手段２０が設けられている。培養槽１０と培養液貯槽２１は第１及び第２の培養液供給管２２，２２ａを介して接続されている。また、第１の培養液供給管２２は培養槽１０内の培養液に直接通じており、第２の培養液供給管２２ａは後述する廃液回収管３２と接続してろ過膜１１に通じている。これにより、培養液貯槽２１内の培養液は、培養槽１０内に直接又はろ過膜１１を介して供給される。培養液の流量は、第１及び第２の培養液供給用ポンプ２３，２３ａにより制御される。
なお、培養液を培養槽１０内に供給する際には、予め培養液内の溶存酸素を窒素、アルゴン等の不活性ガスで置換させる。これにより、酸素によって培養が阻害されることを防止することができる。
【００２５】
本発明で用いられる培養液は、本菌体１２の培養に一般に用いられるものであればよいが、アミノ酸源及び炭素源を含有することが好ましい。これにより、本菌体１２に属するＴｋやピロコッカス  フリオサス等を効率良く培養することができる。
アミノ酸源は、本菌体１２の培養に一般に用いられるものであればよい。炭素源としては、ピルビン酸、ピルビン酸塩、及びデンプン系多糖類等が挙げられる。これらの炭素源は、単独で又は複数を組み合わせて用いられる。
【００２６】
ピルビン酸は酸性であるため、このピルビン酸を高濃度で用いると、培養液のｐＨが低下する。よって、炭素源としてピルビン酸を高濃度で用いる場合には、ｐＨ調整剤を用いて培養液のｐＨを５〜９に調整することが好ましい。これにより、本菌体１２を良好に培養することができる。
なお、ピルビン酸の代わりにピルビン酸塩を用いると、培養液のｐＨが低下しないので、ｐＨ調整剤を用いる必要がなくなる。このピルビン酸塩としては、ピルビン酸ナトリウム等が挙げられる。このピルビン酸ナトリウムは、グルコースを原料として用いる発酵法により製造できる。また、化学合成によっても製造できる。
【００２７】
デンプン系多糖類としては、とうもろこしデンプン、馬鈴薯デンプン、甘藷デンプン、小麦デンプン、キャッサバデンプン、サゴデンプン、タピオカデンプン、米デンプン、豆デンプン、くずデンプン、わらびデンプン、はすデンプン、ひしデンプン等の生デンプン；α−デンプン、分別アミロース、湿熱処理デンプン等の物理的変性デンプン；加水分解デキストリン、酵素分解デキストリン、アミロース等の酵素変性デンプン；化学分解変性デンプン；化学変性デンプンなどが挙げられる。
【００２８】
デンプン系多糖類は、培養液に添加する際に可溶性であることが好ましいが、水と加熱することにより容易に可溶化するので、特に限定しなくてもよい。超好熱菌を用いて培養を行う場合には、約８５℃の高温で培養することが多いので、常温で不溶性のデンプンであっても容易に可溶化できるという利点がある。デンプンは、周知のように、貯蔵用炭水化物として高等植物の種子、根茎等に多量に含まれる。
【００２９】
培養液におけるピルビン酸、ピルビン酸塩、及びデンプン系多糖類の濃度は、本菌体１２の培養に適した値であればよく、例えば、０．０１〜２０重量％の範囲が挙げられる。なお、ピルビン酸塩の濃度に関しては、塩基の重量を無視して計算するものとする。
【００３０】
本発明で用いられる培養液は、上述したアミノ酸源及び炭素源の他に、必要に応じて、培養槽１０内における培養液の液面を安定させる消泡剤や、ビタミン源である乾燥酵母エキス等の添加物を含有することが好ましい。なお、培養液を培養槽１０内に供給する際には、予め培養液内の溶存酸素を窒素、アルゴン等の不活性ガスで置換させる。これにより、酸素によって培養が阻害されることを防止することができる。
なお、上述した培養液は、上記成分を人工的に調製してもよいが、アミノ酸源及び炭素源が豊富な、工場排水又は生活排水を、培養液の原料として利用してもよい。これにより、培養液の作製とともに廃棄物処理を同時に達成することができる。
【００３１】
培養槽１０には、培養槽１０内の培養液を廃液として回収可能な廃液回収管３２と、該廃液回収管３２に接続する廃液回収槽３１と、廃液回収管３２に設けられた廃液回収用ポンプ３３とから構成される廃液回収手段３０が設けられている。培養槽１０内のろ過膜１１と廃液回収槽３１は廃液回収管３２を介して接続されている。この廃液回収手段３０により、培養槽１０内において発生する廃液が回収される。また、培養槽１０内の培養液はろ過膜１１を透過し、その一部が廃液として回収される。このため、ろ過膜１１を透過しない本菌体１２が廃液とともに廃液回収手段３０に回収されることが防止される。
なお、本発明において、「廃液」とは、アミノ酸源及び炭素源が本菌体１２によって消費され、かつ本菌体１２の排泄物を含む培養液をいう。
【００３２】
廃液回収管３２には、ｐＨ電極３４が取り付けられており、このｐＨ電極３４は、制御装置３５と通信可能に接続されている。本菌体１２は炭素源を代謝して酢酸等の酸を排泄するため、培養液のｐＨは通常低下している（酸性の度合いが強くなっている。）。そこで、ｐＨ電極３４及び制御装置３５を用いて廃液のｐＨを測定することにより、培養液の利用状況を評価することができる。
なお、回収した廃液はそのまま廃棄してもよい。また、ｐＨの測定及び調整を行った後、培養槽１０に再供給してもよい。このように廃液を再利用することにより、培養液の利用効率を向上することができる。
【００３３】
培養槽１０には、培養槽１０内のガスを回収可能なガス回収管４２と、該ガス回収管４２に接続するガス分離器４１とから構成されるガス回収分離手段４０が設けられている。培養槽１０とガス分離器４１はガス回収管４２を介して接続されている。このガス回収分離手段４０により、不活性ガス及び本菌体１２の内の水素発生嫌気性超好熱菌が産生する水素ガス及び二酸化炭素ガス等の培養槽１０内におけるガスが回収され、次いで各成分に分離される。ガス分離器の具体例としては、ガスを液化し、次いで蒸留することによって各成分に分離するガス液化分離装置、又は分離膜と吸収剤を組み合わせたハイブリット型分離回収装置が挙げられる。
なお、ガス回収分離手段４０には、ガスクロマトグラフ分析計を取り付けてもよい。これにより、回収したガスの成分を測定することができる。
【００３４】
培養槽１０には、不活性ガスタンク５１と、該不活性ガスタンク５１内の不活性ガスを培養槽１０に供給する第１及び第２の不活性ガス供給管５２，５２ａと、該第１及び第２の不活性ガス供給管５２，５２ａに設けられた第１及び第２のマスフローコントローラー５３，５３ａとから構成される不活性ガス供給手段５０が設けられている。培養槽１０と不活性ガスタンク５１は第１及び第２の不活性ガス供給管５２，５２ａを介して接続されている。また、第１の不活性ガス供給管５２は培養槽１０内の培養液に直接通じており、第２の不活性ガス供給管５２ａは上記廃液回収管３２と接続してろ過膜１１に通じている。これにより、不活性ガスタンク５１内の不活性ガスは、培養槽１０内に直接又はろ過膜１１を介して供給される。不活性ガスの流量は、第１及び第２のマスフローコントローラー５３，５３ａにより制御される。
【００３５】
この不活性ガス供給手段５０を用いて不活性ガスを培養槽１０に供給することにより、培養槽１０内を嫌気性雰囲気下に保持することができる。また、不活性ガスの圧力により、本菌体１２の内の水素発生嫌気性超好熱菌が増殖の過程で産生した水素をガス回収分離手段４０に効率良く回収させることができる。不活性ガスとしては、窒素又はアルゴン等が挙げられる。中でも半導体用材料窒素等の工業用窒素が、入手が容易であるため好ましい。
【００３６】
培養槽１０には、酸溶液／アルカリ溶液貯槽６１と、該酸溶液／アルカリ溶液貯槽６１内の酸溶液／アルカリ溶液を培養槽１０に供給する酸溶液／アルカリ溶液供給管６２と、該酸溶液／アルカリ溶液供給管６２に設けられた酸溶液／アルカリ溶液供給用ポンプ６３とから構成される酸溶液／アルカリ溶液供給手段６０が設けられている。培養槽１０と酸溶液／アルカリ溶液貯槽６１は酸溶液／アルカリ溶液供給管６２を介して接続されている。酸溶液／アルカリ溶液供給手段６０は、酸溶液／アルカリ溶液を培養槽１０に供給するものである。酸溶液は特に限定されず、例えば塩酸が挙げられる。アルカリ溶液は特に限定されず、例えば水酸化ナトリウム水溶液が挙げられる。
【００３７】
上述のように、本菌体１２の代謝により培養液のｐＨが低下するので、培養液供給手段２０からの培養液の供給及び廃液回収手段３０への廃液の排出により、培養液のｐＨを高めて本菌体１２の代謝を維持する必要がある。新規の培養液供給でもｐＨが好適な範囲を下回る場合には、酸溶液／アルカリ溶液供給手段６０から酸溶液／アルカリ溶液を培養槽１０に供給して、培養液のｐＨを調整する。 
なお、酸溶液／アルカリ溶液を培養槽１０内に供給する際には、予め各溶液内の溶存酸素を窒素、アルゴン等の不活性ガスで置換させる。これにより、酸素によって培養が阻害されることを防止することができる。
【００３８】
培養槽１０には、培養槽１０内の培養液を排出液として回収可能な液面制御用排出管７２と、該液面制御用排出管に接続する排出液貯槽７１と、液面制御用排出管７２に設けられた液面制御用ポンプ７３とから構成される液面制御手段７０が設けられていることが好ましい。培養槽１０と排出液貯槽７１は液面制御用排出管７２を介して接続されている。この液面制御手段７０を用いて過剰な培養液を排出し、培養液の液面を制御することにより、培養液の量を一定に保持することができる。
なお、本発明において、「排出液」とは、液面制御のために排出される培養液をいう。また、液面制御用排出管７２の培養槽１０側の一端には、排出液用ろ過膜が設けられていることが好ましい。これにより、本菌体１２が排出液とともに培養槽１０から排出されることを防止することができる。
【００３９】
以下、本発明の嫌気性好熱菌用ろ過培養装置を用いた培養方法の一例を説明する。
先ず、本菌体１２及び培養液を培養槽１０内に導入する。導入方法としては、公知のものを用いることができる。例えば、予め滅菌処理を施した培養液を培養槽１０内に供給し、次いで培養槽１０内に本菌体１２を添加してもよい。また、本菌体１２を培養液に植菌して前培養し、この前培養した培養液を予め滅菌処理を施した培養液を有する培養槽１０内に添加することにより、本培養を開始してもよい。
なお、本菌体１２を培養槽１０内に導入する際には、予め培養槽１０内の空気を不活性ガスで置換させることが好ましい。この不活性ガスは、上述の不活性ガス供給手段５０で用いられものと同様である。これにより、酸素によって培養が阻害されることを防止することができる。
【００４０】
次に、本菌体１２をろ過培養する。具体的には、培養液供給手段２０を用いて培養槽１０に培養液を供給しながら、廃液回収手段３０を用いて培養槽１０から廃液をろ過膜１１を介して回収する。本菌体１２の培養中、廃液はろ過されながら回収されるため、廃液とともに本菌体１２が廃液回収手段３０に回収されることが防止される。
【００４１】
培養液の供給速度は特に限定されず、培養する本菌体１２の量に応じて適宜設定すればよい。また、廃液の回収速度は、培養槽１０内の培養液の量を一定に保持するため、培養液の供給速度と同じ速度に設定することが好ましい。なお、上記速度設定によっても、本菌体１２の増殖による体積の増加、酸溶液／アルカリ溶液の供給等の理由により、培養槽１０内の培養液の量が一定に保持されないときには、液面制御手段７０を用いて、余分な培養液を排出する。
【００４２】
培養液内の本菌体１２を均一に培養するため、攪拌翼１４を用いて培養槽１０内の培養液を攪拌してもよい。ただし、本菌体１２の１種であるＴｋは細胞膜が弱いため、せん断応力に弱いという性質を有する。よって、攪拌翼１４の攪拌速度は、攪拌のせん断応力による増殖阻害が発生しない程度である必要がある。具体的には、攪拌翼１４の攪拌速度を５０〜１００ｒｐｍに設定することが好ましい。これにより、Ｔｋを破壊せずに攪拌することができる。
【００４３】
培養温度は、本菌体１２の培養に適した値であればよく、例えば、６０〜１０５℃が挙げられる。Ｔｋの最適生育温度は約８５℃である。また、培養液のｐＨも、本菌体１２の培養に適した値であればよく、例えば、６．０〜７．０が挙げられる。Ｔｋの最適生育ｐＨは６．４付近である。
新規の培養液供給でも、本菌体１２の代謝によりｐＨが好適な範囲を逸脱する場合には、酸溶液／アルカリ溶液供給手段６０から酸溶液／アルカリ溶液を培養槽１０に供給して、培養液のｐＨを調整する。
【００４４】
ろ過培養が進行すると、培養槽１０内の菌体濃度が増加し、栄養源の需要も増加する。そこで、培養槽１０内の培養液の量、培養液の供給速度、及び供給する培養液の培地組成濃度を菌体濃度に応じて調整することが好ましい。これにより、本菌体１２の増殖速度を最適に保持することができる。
なお、後述する実施例に記載の通り、炭素源及びアミノ酸源の濃度と、Ｔｋの菌体濃度には比例関係がある。よって、本菌体１２としてＴｋを使用する場合には、培地組成の成分のうち炭素源とアミノ酸源を、Ｔｋの菌体濃度に応じて調整することが好ましい。
【００４５】
ろ過培養の進行中、本菌体１２の内の水素発生嫌気性超好熱菌は水素ガス及び二酸化炭素ガスを産生する。水素ガスは燃料ガスとして産業上有用であるが、本菌体１２の増殖を阻害する作用を有する。そこで、不活性ガス供給手段５０により不活性ガスを培養槽１０内に供給し、この不活性ガスの圧力を利用して、水素ガスを不活性ガスとともにガス回収分離手段４０により回収することが好ましい。
不活性ガスの供給速度は、ガス供給のせん断応力による本菌体１２の増殖阻害が発生しない程度である必要がある。例えば、培養槽１０の単位体積当りの不活性ガス供給速度が以下の値になることが好ましい。
不活性ガス供給速度［ｌ／ｈｒ］／培養槽体積［ｌ］＝３〜１５［１／ｈｒ］
これにより、培養槽１０内の水素濃度を低下し、本菌体１２を効率良く培養することができる。
【００４６】
また、不活性ガス、水素ガス、又は二酸化炭素ガス等が充満することにより培養槽１０内の圧力が高まると、本菌体１２の増殖が阻害されることがある。よって、ガス回収分離手段４０を用いて、培養槽１０内の圧力を調節し、本菌体１２の増殖を最適に維持することが好ましい。Ｔｋの場合には、培養槽１０内の圧力が０．２Ｋｇ／ｆｃｍ２以上になると、増殖が阻害される。よって、培養槽１０内の圧力を０．２Ｋｇ／ｆｃｍ２以下に調節することが好ましく、これにより、Ｔｋが効率的に増殖する。なお、培養槽１０内の圧力の下限値は、本菌体１２の培養に用いられる値であればよく、例えば大気圧が挙げられる。培養槽１０内の圧力を大気圧以上にすることにより、培養槽１０内に外気が進入することを防止することができる。
【００４７】
ガス回収分離手段４０によって回収分離した水素ガスは、加熱手段１３のエネルギー源として利用されることが好ましい。例えば、回収分離した水素ガスを燃料電池に燃料ガスとして供給することにより電力を得、この電力を用いて加熱手段１３を作動する方法が挙げられる。また、水素ガスから得られた電力は、加熱手段１３に限らず、本発明の嫌気性好熱菌用ろ過培養装置が備える各手段の作動に用いられてもよい。
【００４８】
本菌体１２がＴｋ又はピロコッカス  フリオサスである場合、ガス回収分離手段４０によって回収分離した二酸化炭素ガスは、培養槽１０の培養液内に供給されることが好ましい。ピロコッカス  フリオサスは、不活性ガス及び二酸化炭素ガスの雰囲気下で培養されると、増殖能力が向上することが報告されている（例えば、以下の文献を参照。"Effect of glucose,maltose,soluble starch ,and CO2 on  the  growth of the hyperthermophilic  archaeon Pyrococcus furiosus", K. Biller, I.Kato, H.Markl, Extremophiles.,6:161-166 (2002) "）。また、Ｔｋも、不活性ガス及び二酸化炭素ガスの雰囲気下で培養されると、増殖能力が向上することが、後述する実施例において明らかとなった（実施例１における（２−１）培地組成Ａを参照。）。
この理由は完全には解明されていないが、Ｔｋに属するＫＯＤ１株は、生体触媒であるリブロース−１，５−ビスホセフェート  カルボキシラーゼを有し、二酸化炭素の固定化能力を有することが知られている。このような能力が、二酸化炭素ガスによる増殖能力の向上に関係しているものと推測される。
【００４９】
培養槽１０内における二酸化炭素の濃度は１〜２０％であることが好ましい。下限値以上にすることにより、Ｔｋ又はピロコッカス  フリオサスの増殖能力を効果的に向上することができる。また、上限値以下にすることにより、培養液内が酸性化して本菌体１２の培養に好適なｐＨ範囲を逸脱することを防止することができる。好適なｐＨ範囲を逸脱すると、多量の酸溶液／アルカリ溶液を供給することになり、培養液内の栄養源が希釈される問題が発生する。また、運転コストが増大する問題も発生する。
なお、Ｔｋの最適生育二酸化炭素濃度は１０％であるので、培養槽１０内における二酸化炭素の濃度は５〜１５％であることがより好ましい。
【００５０】
このように、ガス回収分離手段４０によって回収分離した二酸化炭素ガスを培養槽１０内に供給して、Ｔｋ又はピロコッカス  フリオサスの増殖因子として利用することにより、ろ過培養装置全体における二酸化炭素の排出量を削減することができる。
【００５１】
ろ過膜１１は、培養槽１０内の菌体濃度の増加に従って、本菌体１２によって付着される。結果、ろ過膜１１が目詰まりを起こし、ろ過膜１１における廃液の透過流速が低下する。この状態を放置すると、本菌体１２が排泄した増殖阻害物質が培養槽１０内の培養液に溜まり、本菌体１２の増殖が阻害される。これを防止するため、ろ過膜１１を逆洗浄する必要がある。
【００５２】
逆洗浄とは、培養液又は不活性ガスをろ過膜１１の内側から供給することにより、ろ過膜１１の外側に付着した本菌体１２や多糖類等の副生産物を取り除くことをいう。具体的には、培養液供給弁２４又は不活性ガス供給弁５４を開き、廃液回収管３２に設けられた弁を閉め、廃液回収用ポンプ３３を停止することにより、培養液又は不活性ガスを廃液回収管３２及びろ過膜１１を介して培養槽１０内に供給する。結果、ろ過膜１１における付着物が、培養液又は不活性ガスの圧力により取り除かれる。逆洗浄に用いられる培養液の流量は、第２の培養液供給用ポンプ２３ａにより制御される。また、逆洗浄に用いられる不活性ガスの流量は、第２のマスフローコントローラー５３ａにより制御される。
なお、逆洗浄においては、培養液と不活性ガスの両方を使用することが好ましく、これにより、洗浄効果がより一層高まる。
【００５３】
液面制御用排出管７２の培養槽１０側の一端に排出液用ろ過膜を設けた場合には、この排出液用ろ過膜についても逆洗浄を行うことが、目詰まり防止のため好ましい。具体的には、第２の培養液供給管２２ａ又は第２の不活性ガス供給管５２ａが液面制御用排出管７２に接続するように本発明の嫌気性好熱菌用ろ過培養装置を構成し、培養液又は不活性ガスを液面制御用排出管７２及び排出液用ろ過膜を介して培養槽１０内に供給する。
【００５４】
逆洗浄の頻度は、ろ過膜１１における廃液の透過流速に応じて設定すればよく、逆洗浄における培養液の供給速度及び供給時間も透過流速が初期値に回復するように設定すればよい。例えば、逆洗浄の頻度は０．５〜２．０時間に１回に設定される。培養液の供給速度及び供給時間は、使用するろ過膜１１の細孔径及び形状（特に、ろ過膜１１の内側における容積）により、設定される。
【００５５】
このように、本発明の嫌気性好熱菌用ろ過培養装置を用いてろ過培養を行うことにより、廃液の回収時に本菌体１２を失うことなく、培養槽１０内の増殖阻害物質濃度を減少させると同時に、培養槽１０内の本菌体１２を濃縮することができる。結果、本菌体１２を効率良く高密度化することができる。また、本菌体１２が有するＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ又はヒドロゲナーゼ等の有用な生体物質の生産性を向上することができる。
【００５６】
本発明の嫌気性好熱菌用ろ過培養装置は、本菌体１２の１種である水素発生超好熱菌に好適であり、水素発生嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置として使用可能である。水素発生嫌気性超好熱菌をろ過培養することによって、水素を製造することができる。また、連続培養法及び回分培養法を用いた水素の製造と比較して、水素の生産速度及び生産性を向上することができる。また、産生された水素ガス及び二酸化炭素ガスをガス回収分離手段により回収分離し、得られた水素ガスをろ過培養装置の運転に必要なエネルギー源として利用することにより、エネルギー自給型ろ過培養装置を構築することができる。
【００５７】
本発明の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置は、本菌体１２の１種であるＴｋに好適であり、Ｔｋ用ろ過培養装置として使用可能である。Ｔｋが産生する二酸化炭素ガスを、ガス回収分離手段によって回収して培養槽に供給することにより、Ｔｋの増殖能力を効果的に向上することができる。
【００５８】
（嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置の第２の例）
図２（Ａ）、（Ｂ）に、本発明の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置の第２の例を示す。第２の例において第１の例と異なるところは、２つのろ過膜１１ａ、１１ｂを備える点と、これらろ過膜１１ａ、１１ｂと培養液供給手段２０又は前記廃液回収手段３０との接続を切り替える切り替え手段８０を備える点である。
なお、図１に示されている上記以外の構成要素は、第２の例の特徴とは直接関係がないため、図２（Ａ）、（Ｂ）においては省略されている。
【００５９】
切り替え手段８０は、複数の切り替え弁８２ａ、８２ｂ、８２ｃ、８２ｄと切り替え管８１を備えるものである。具体的には、第１の培養液供給管２２が切り替え手段８０内の切り替え管８１と接続し、この切り替え管８１が分岐してろ過膜１１ａ、１１ｂにそれぞれ接続している。また、切り替え管８１における分岐点から各ろ過膜１１ａ、１１ｂに至る部分には、切り替え弁８２ａ、８２ｂがそれぞれ設けられており、この切り替え弁８２ａ、８２ｂの開閉を制御することにより、培養液をろ過膜１１ａ、１１ｂのいずれかに供給することができる。一方、廃液回収管３２も切り替え手段８０内の切り替え管８１と接続し、この切り替え管８１が分岐してろ過膜１１ａ、１１ｂにそれぞれ接続している。また、切り替え管８１における分岐点から各ろ過膜１１ａ、１１ｂに至る部分には、切り替え弁８２ｃ、８２ｄがそれぞれ設けられており、この切り替え弁８２ｃ、８２ｄの開閉を制御することにより、廃液をろ過膜１１ａ、１１ｂのいずれかから回収することができる。
【００６０】
２つのろ過膜１１ａ、１１ｂ及び切り替え手段８０を備えることにより、第２の例の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置は、ろ過培養と逆洗浄を同時に行うことができる。例えば、図２（Ａ）に示された第２の例においては、ろ過膜１１ａを介して廃液が回収されるとともに、ろ過膜１１ｂを介して培養液が供給される。結果、ろ過膜１１ａを用いたろ過培養と、ろ過膜１１ｂの逆洗浄が同時に行われる。
【００６１】
ろ過培養の進行により、ろ過膜１１ａにおける廃液の透過流速が低下した場合には、切り替え手段８０を用いてろ過膜１１ａ、１１ｂと培養液供給手段２０及び前記廃液回収手段３０の接続を切り替える。これにより、図２（Ｂ）に示されるように、ろ過膜１１ｂを介して廃液が回収されるとともに、ろ過膜１１ａを介して培養液が供給される。結果、ろ過膜１１ｂを用いたろ過培養と、ろ過膜１１ａの逆洗浄が同時に行われる。
【００６２】
このように、ろ過膜１１ａ、１１ｂと培養液供給手段２０及び前記廃液回収手段３０の接続を定期的に切り替えることにより、ろ過培養を連続的に行うことができる。
なお、図２（Ａ）、（Ｂ）に示された切り替え手段８０における矢印線は、培養液又は廃液の流れの方向を示す。また、図２（Ａ）、（Ｂ）には切り替え手段８０の構成の一例を示したが、これ以外の構成であっても上述の機能を有していれば、切り替え手段８０として採用できる。
【００６３】
（水素の製造方法）
以下、本発明の水素の製造方法について説明する。
本発明の水素の製造方法は、水素発生嫌気性超好熱菌及び培養液をろ過培養装置の培養槽内に供給する工程と、該培養液中で嫌気性超好熱菌をろ過培養することにより水素を製造する工程とを含む。上述のように、ろ過培養を行うことによって水素発生嫌気性超好熱菌を高密度化することができる。この高密度化された水素発生嫌気性超好熱菌をさらに培養すると、水素発生嫌気性超好熱菌は、高密度化される前と比較して多量の水素を産生する。よって、水素発生嫌気性超好熱菌による水素の生産性を向上することができる。
【００６４】
本発明の水素の製造方法における水素発生嫌気性超好熱菌の培養条件は、上述した本発明の嫌気性好熱菌用ろ過培養装置を用いた培養方法の一例に記載の条件と同様である。また、水素発生嫌気性超好熱菌のろ過培養を行う場合には、本発明の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置を好適に用いることができる。なお、得られた水素は、使用したろ過培養装置のエネルギー源として利用してもよく、燃料ガスとして別の用途に使用してもよい。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。本発明は、下記実施例に何ら制限されるものではない。
【００６６】
（実施例１）
実施例１では、本発明の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置の第１の例を用いて本菌体１２のろ過培養を行った。
【００６７】
（１）嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置の構造及び使用
（１−１）ろ過培養装置
ろ過培養装置として、大陽日酸株式会社製嫌気性好熱菌ろ過培養装置（型式：ＴＳＦ−ＭＦ１）を使用した。このろ過培養装置は図１に示されたものと同様の構成を有する。また、このろ過培養装置に、大陽日酸株式会社製嫌気性好熱菌培養装置（型式：ＴＳＦ１００−１０）の制御系を設けた。
【００６８】
（１−２）ろ過膜１１
ろ過膜１１として、日本精線株式会社製金属膜（品名：NASclean VENT TEL-1S、１／４インチ継手（ＳＷ）取付タイプ）を使用した。この金属膜は、以下の特徴を有する。
細孔径：０．０３μｍ、ろ過有効面積：１２２ｃｍ２程度、円筒直径：３２ｍｍ、長さ１５４ｍｍ、材質：ＳＵＳ３１６。
【００６９】
（１−３）培養槽１０
上記ろ過培養装置が備える培養槽１０は、以下の特徴を有する。
容量：２ｌ（金属膜を取り外した状態）材質：ステンレス鋼（ＳＵＳ３１６）製、形状：円筒形状（底板直径１５５ｍｍ、高さ４８８ｍｍ）。
培養槽１０の概略上面図を図３（Ａ）に、概略側面図を図３（Ｂ）に示す。図３（Ａ）、（Ｂ）に示すように、培養槽１０の上蓋には、以下の９つの口が設けられている。
【００７０】
廃液出口（逆洗浄口）１０１・・・ＳＵＳパイプ方式（材質：ＳＵＳ３０４、外径：１／４インチ）、金属膜が取り付けられている。
培養液供給口１０２・・・ＳＵＳパイプ方式（材質：ＳＵＳ３０４、外径：１／８インチ）
不活性ガス供給口１０３・・・ＳＵＳパイプ方式（材質：ＳＵＳ３０４、外径：１／８インチ）
ガス出口１０４・・・ＳＵＳパイプ方式（材質：ＳＵＳ３０４、外径：１／４インチ）
液面センサー（レベル電極）差込口１０５・・・袋ナット方式（外径：１／４インチ）
温度センサー（測温抵抗体）差込口１０６・・・袋ナット方式（外径：１／４インチ）
サンプリング口（植菌口及び菌体採取口）１０７・・・ＳＵＳパイプ方式（材質：ＳＵＳ３０４、外径：１／８インチ）
培養液排出口１０８・・・ＳＵＳパイプ方式（材質：ＳＵＳ３０４、外径：１／８インチ）、液面制御にて培養槽１０内の培養液の量を一定にする。
酸溶液／アルカリ溶液供給口１０９・・・ＳＵＳパイプ方式（材質：ＳＵＳ３０４、外径：１／８インチ）
【００７１】
なお、廃液出口（逆洗浄口）１０１には廃液回収管３２が、培養液供給口１０２には第１の培養液供給管２２が、不活性ガス供給口１０３には第１の不活性ガス供給管５２が、ガス出口１０４にはガス回収管４２が、液面センサー（レベル電極）差込口１０５には液面センサー９１が、温度センサー（測温抵抗体）差込口１０６には温度センサー９２が、サンプリング口（植菌口及び菌体採取口）１０７にはサンプリング管９３が、培養液排出口１０８には液面制御用排出管７２が、酸溶液／アルカリ溶液供給口１０９には、酸溶液／アルカリ溶液供給管６２が差し込み可能となっている。
【００７２】
（１−４）ろ過培養装置の制御
培養槽１０内の温度、ｐＨ、及び攪拌速度を、大陽日酸株式会社製嫌気性好熱菌培養装置（型式：ＴＳＦ１００−１０）の制御系であるラボコントローラーＭＤＬ−６Ｃを用いて一括制御した。また、温度、ｐＨ、及び攪拌速度の各値を、上記制御系に表示した。培養槽１０の液面レベルも同様に制御したが、表示はされなかった。各制御の説明を、以下に示す。
【００７３】
温度制御・・・培養槽１０の底部のコントロールと側面ヒーター（補助）のＯＮ／ＯＦＦ制御。温度は８５℃に設定した。
攪拌制御・・・マグネット式攪拌機による制御。回転速度は３０〜１００ｒｐｍ（安定攪拌領域）に設定した。
ｐＨ制御・・・酸／アルカリ用チュービングポンプ（ＳＭＰ−１Ｃ型、酸溶液／アルカリ溶液供給用ポンプ６３に相当）のＯＮ／ＯＦＦ制御。調節範囲はｐＨ２〜１２である。ｐＨ電極３４として、株式会社丸菱バイオエンジ製のｐＨ電極（ＧＳＴ−５４７２Ｃ型、リード線付）を使用した。
液面制御・・・培養槽１０に一定量の培養液をマスターフレックスデジタル送液ポンプ（７５２４−４０型、ヤマト科学株式会社製、第１及び第２の培養液供給用ポンプ２３，２３ａに相当）により連続的に供給し、液面センサー９１が液面上限を検知することにより培養液排出用定量送液ポンプ（ＲＰ−１０００型、東京理科化器械株式会社製、液面制御用ポンプ７３に相当）が作動する。液面センサー９１が液面から離れたら、培養液排出用定量送液ポンプが停止する。
【００７４】
（２）ろ過培養
（２−１）培地組成
培地組成Ａは、マリンアートＳＦ−１試験研究用人工海水（富田製薬株式会社製）３０．４ｇ／ｌ（規定量の０．８倍希釈）、微生物培地用特製乾燥酵母エキス５ｇ／ｌ（ナカライテスク株式会社製）、微生物培地用特製トリプトン５ｇ／ｌ（ナカライテスク株式会社製）、ピルビン酸ナトリウム５ｇ／ｌ（ナカライテスク株式会社製）、１％アデカノール水溶液０．５ｍｌ／ｌ−培養液、（原液はアデカノールＬＧ−１０９、旭電化工業株式会社製）、及び水を有する。なお、１％アデカノール水溶液は消泡剤であり、培養時に培養液が泡立つことにより、液面制御手段７０が誤作動することを防止する効果を有する。
【００７５】
なお、培地組成Ａにおける炭素源（ピルビン酸ナトリウム）及びアミノ酸源（トリプトン）の濃度を２倍にした培養液を用いてＫＯＤ１株を従来の方法で連続培養したところ、培地組成Ａの培養液と比較して、菌体濃度が２８％、水素発生速度が５６％向上した。また、培地組成Ａにおける炭素源をマルトデキストリン５ｇ／ｌ（商品名：アミコールＮｏ．３−Ｌ、日澱化学株式会社製）に変更した培地組成Ｂにおいて、炭素源（マルトデキストリン）及びアミノ酸源（トリプトン）の濃度を２倍にした培養液を用いてＫＯＤ１株を従来の方法で連続培養したところ、培地組成Ｂの培養液と比較して、菌体濃度が２７％、水素発生速度が５２％向上した。また、炭素源（マルトデキストリン）及びアミノ酸源（トリプトン）の濃度を３倍にした培養液を用いた場合には、培地組成Ａの培養液と比較して、菌体濃度が４０％、水素発生速度が８３％向上した。この結果から、水素生産に関与するＴｋの必須成分は炭素源及びアミノ酸源であることが判明した。
一方、培地組成Ｂを用い、かつ、培養槽１０内に二酸化炭素の濃度が１０％、窒素の濃度が９０％の混合ガスを供給してＫＯＤ１株を連続培養したところ、窒素ガスのみを供給した場合と比較して、菌体濃度が３３％、水素発生速度が４６％向上した。
【００７６】
（２−２）培養準備
培地組成Ａの培養液１０００ｍｌをろ過培養装置の培養槽１０に充填した。この培養槽１０を高圧蒸気滅菌処理（１２１℃、２０分)した。培養液中の溶存酸素を低減し、培養槽１０内を嫌気性雰囲気下に保持するため、不活性ガス供給手段５０の第１のマスフローコントローラー５３（デジタルマスフローコントローラー、型式ＣＭＱ０００２、株式会社山武製、図１ではＭＦＣと記載）から培養液中に窒素を供給流量１００ｍｌ／ｍｉｎにて通気した。窒素としては、工業用窒素（大陽日酸株式会社製）を使用した。培養液を均一化するためにろ過培養装置付属の攪拌翼１４を用いて攪拌速度１００ｒｐｍで攪拌した。植菌し易い環境にするために、ろ過培養装置付属の底面ヒーター、側面ヒーター(大科電器株式会社製、ＣＬ型ニッ割布製マントルヒーターを使用、加熱手段１３に相当)、温度センサー９２(側温抵抗体)を用いて培養槽１０内の温度を８５℃に制御した。
【００７７】
（２−３）前培養操作
前培養は、内容積約３００ｍｌの密閉ガラス容器内に培地組成Ａの培養液１００ｍｌを充填し、高圧蒸気滅菌処理（１２１℃、２０分）した。その後、嫌気性培養装置（型式：ＥＡＮ−１４０、タバイエスペック社製)を用いた嫌気性雰囲気下で植菌量が１体積％になるようにＫＯＤ１株（種菌溶液を１．０ｍｌ）を添加し、次いで、乾燥機（プログラムオーブン、型式：ＭＯＶ−２１２Ｐ、三洋電機株式会社製）で、８５℃、２０時間、回分培養を行った。
【００７８】
（２−４）回分培養操作
（２−３）の前培養した培養液１００ｍｌを（２−２）で準備した培地組成Ａの培養液１０００ｍｌが充填した培養槽１０中に植菌した（１０体積％植菌を実施）。植菌後も（２−２）と同様の温度８５℃、攪拌速度１００ｒｐｍ、窒素ガス流量１００ｍｌ／ｍｉｎの培養条件下で回分培養を１５時間行った。
回分培養の間、定期的にろ過培養装置付属のポンプを用いて培養槽１０内の培養液を約５〜２０ｍｌサンプリングし、デジタル比色計簡易ＯＤモニター（型式：ｍｉｎｉ ｐｈｏｔｏ ５１８Ｒ、タイテック株式会社製)を用いて、波長６６０ｎｍの吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を測定した。これにより、培養液の菌体濃度を測定した。
【００７９】
菌体濃度は次式で求めた。
菌体濃度［ｇ／ｌ］＝波長６６０ｎｍの吸光度値［−］×０．３５［ｇ／ｌ］（培地組成Ａの場合）
回分培養の間、定期的に培養槽１０内を通過したガスの一部をガスクロマトグラフ分析計（ＧＣ−ＴＣＤ熱伝導式検出器：ＧＣ−８Ａ型、株式会社島津製作所製）に送り、その成分を測定した。
【００８０】
（２−５）ろ過培養操作
回分培養１５時間後（菌体濃度が０．３５ｇ／ｌ以上になった後）、連続培養を開始した。第１の培養液供給用ポンプ２３を用いて高圧蒸気滅菌処理（１２１℃、２０分）後の培地組成Ａの培養液を培養槽１０内に連続的に供給した。液面センサー９１と液面制御用ポンプ７３を用いて培養槽１０内の培養液を１０００ｍｌに液面制御した。
連続培養開始と同時に、ｐＨ電極３４及び酸溶液／アルカリ溶液供給手段６０を用いて、酸溶液（０．２〜０．４Ｎ ＨＣｌ水溶液を使用）供給、アルカリ溶液（０．２〜０．４ｍｏｌ／ｌ ＮａＯＨ水溶液を使用）供給を行い、ｐＨ６．４〜７．０に制御した。なお、ＨＣｌ水溶液、ＮａＯＨ水溶液は窒素ガスで脱気した。窒素としては、工業用窒素（大陽日酸株式会社製）を使用した。窒素ガスの供給流量は約５０ｍｌ／ｍｉｎであった。
【００８１】
連続培養３時間後、ろ過培養を１５時間行った。その後、再度、連続培養を４時間行った。これにより、連続培養に対するろ過培養の評価を行った。
従来の連続培養は、連続的に培養液供給を行い、液面制御にて培養液量を一定にし、系外に廃液を排出するといった液の出入り以外の負荷を本菌体１２に与えないものである。ろ過膜１１は使用されない。
【００８２】
連続培養及びろ過培養の間も、（２−４）の回分培養操作と同様に、定期的に菌体濃度とガス分析を行った。
【００８３】
培地組成Ａの培養液は、デジタルマスフローコントローラー（型式ＣＭＱ０００２、株式会社山武製）を用いて窒素ガスで脱気した。窒素ガスの供給流量は１００ｍｌ／ｍｉｎであった。また、脱気と同時に培養液を混合した。
ろ過培養条件（連続培養条件も含む）としては、温度８５℃、攪拌速度１００ｒｐｍ、ｐＨ６．４〜７．０、培養槽供給用窒素ガス流量１００ｍｌ／ｍｉｎを選択した。
【００８４】
第１の培養液供給用ポンプ２３及び廃液回収用ポンプ３３としてはマスターフレックスデジタル送液ポンプ（７５２４−４０型、ヤマト科学株式会社製）を用い、培養液供給速度及び廃液回収速度を同じに設定した。
ろ過培養の開始時においては、培地組成Ａの培養液供給速度を３．７ｍｌ／ｍｉｎに設定した。この速度で２．０時間ろ過培養した後、本菌体１２の増殖速度（菌体濃度）を高めると同時に水素発生速度を高めるために、培養液供給速度を７．５ｍｌ／ｍｉｎに変更し、ろ過培養を行った。
【００８５】
ろ過培養期間においては、１．５時間に１回、１５分間、ろ過膜１１の内側から培地組成Ａの培養液（培養液供給速度７．５ｍｌ／ｍｉｎ）を供給し、逆洗浄を行った。これにより、ろ過膜１１に付着した本菌体１２や副生産物（多糖類）等を取り除き、廃液の透過流速を回復させた。
【００８６】
（２−６）結果
実施例１におけるろ過膜１１のろ過効率を評価するため、阻止率Ｒを計測した。阻止率Ｒは以下の式により得られる。
【００８７】
【数１】
2008061522.tif 000003
【００８８】
式中、Ｒはろ過膜１１における本菌体１２の阻止率［−］（０＜Ｒ＜１）を表し、ＣＲは培養槽１０内の菌体濃度［ｇ／ｌ］を表し、ＣＰは廃液中の菌体濃度［ｇ／ｌ］を表す。
【００８９】
上記ろ過培養の結果、日本精線株式会社製の金属膜（細孔径０．０３μｍ）の阻止率は、ろ過培養開始から０．５時間後には０．９７［−］以上であることがわかった。この値はろ過培養において好適である。
【００９０】
図４に、実施例１のろ過培養における培養時間に対する培養槽１０内の菌体濃度及びガス発生速度を示す。図４に示すように、ろ過膜１１を利用したろ過培養では連続培養と比較して菌体濃度が約２倍に上昇した。また、菌体濃度が上昇するとともに、水素発生速度も３３％向上した（連続培養時：３．０ｍｌ−Ｈ２／ｍｉｎ・Ｌ−培養液→ろ過培養時：４．０ｍｌ−Ｈ２／ｍｉｎ・Ｌ−培養液）。
【００９１】
図５に、従来の連続培養における培養時間に対する培養槽１０内の菌体濃度及びガス発生速度を示す。従来の連続培養では、回分培養により菌体濃度を高め、その後、連続培養に切り替える。図５に示すように、連続培養開始後、菌体濃度は供給された培養液により希釈され、菌体濃度は一次的に低下するが、培養液の供給による希釈に本菌体１２の増殖が追いつき、最終的には菌体濃度は安定し、水素発生速度も安定する。
これに対し、図４に示すように、ろ過培養においてはろ過膜１１により廃液回収時の本菌体１２の損失が阻止されているため、培養槽１０内の本菌体１２が希釈されなかった。そのため、ろ過膜１１を利用するろ過培養では、連続培養と比較して、水素発生速度の向上や安定化への所要時間が短いことが判明した。
【００９２】
（比較例１）
ろ過膜１１として、株式会社安来製作所日立メタルプレシジョン製の金属膜（細孔径０．３μｍ）を用いたことを除いては、実施例１と同様の条件でろ過培養を行った。結果、このろ過膜１１の阻止率は０．４［−］付近であり、実施例１と比較して低いことがわかった。
【００９３】
（実施例２）
上述の通り、１つのろ過膜１１を利用するろ過培養においては、ろ過膜１１における透過流速を好適に維持するため、ろ過培養の間、定期的に逆洗浄を行う必要がある。この逆洗浄の頻度を確認するため、実施例２ではろ過時間と廃液の透過流速の関係を調べた。具体的には、逆洗浄を行わないことを除いては（２）のろ過培養と同様の条件でろ過培養を行った。その結果を図６に示す。図６から、ろ過時間が３０分を超えると、廃液の透過流速が顕著に下がることがわかった。よって、本発明の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置の第１の例の運転においては、ろ過と逆洗浄の切り替え時間は３０分付近であることが好ましいことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】本発明の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置の第１の例を示す概略図である。
【図２】本発明の嫌気性超好熱菌用ろ過培養装置の第２の例を示す概略図である。
【図３】（Ａ）実施例１における培養槽の上面図である。（Ｂ）実施例１における培養槽の側面図である。
【図４】実施例１のろ過培養における培養時間に対する培養槽内の菌体濃度及びガス発生速度を示すグラフである。
【図５】従来の連続培養における培養時間に対する培養槽内の菌体濃度及びガス発生速度を示すグラフである。
【図６】実施例２のろ過培養におけるろ過時間に対する廃液の透過流速を示すグラフである。
【符号の説明】
【００９５】
１０・・・培養槽、１１、１１ａ、１１ｂ・・・ろ過膜、１２・・・嫌気性超好熱菌（本菌体）、１３・・・加熱手段、２０・・・培養液供給手段、３０・・・廃液回収手段、４０・・・ガス回収分離手段、５０・・・不活性ガス供給手段、６０・・・酸溶液／アルカリ溶液供給手段、８０・・・切り替え手段
【図１】
2008061522.tif 000004
【図２】
2008061522.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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