(57)【要約】【課題】 活性型ＨＧＦＡを特異的に認識し、不活性型ＨＧＦＡは実質的に認識しない抗体、同抗体を用いて活性型ＨＧＦＡを測定する方法を提供する。【解決手段】 ＨＧＦＡ前駆体をコードするＨＧＦＡ ｃＤＮＡを使用して調製した組換え体不活性型ＨＧＦＡ、及び同ＨＧＦＡをプロテアーゼ処理して得られる活性型ＨＧＦＡを用いて、活性型ＨＧＦＡに対して反応性を示し、不活性型ＨＧＦＡに対して反応性を示さないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、得られたハイブリドーマの培養上清から目的とするモノクローナル抗体を調製する。【選択図】図１
2008048738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことを特徴とする、モノクローナル抗体の作製方法。
（１）不活性型肝細胞増殖因子アクティベーター（ＨＧＦＡ）の翻訳開始アミノ酸から数えて４０７番目のアルギニンと４０８番目のイソロイシン間で限定分解を受けることにより活性化している活性型ＨＧＦＡを抗原としてマウスを免疫する。
（２）マウスの脾臓から得た抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合し、ハイブリドーマを作製する。
（３）不活性型ＨＧＦＡをアルガトロバンを添加して調製する。
（４）上記（２）で得られたハイブリドーマの中から、前記活性型ＨＧＦＡと上記（３）で調製された不活性型ＨＧＦＡを用いて、該活性型ＨＧＦＡに対する解離定数が１×１０-8Ｍ以下であり、不活性型ＨＧＦＡに対する解離定数が１×１０-5Ｍ以上である抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
（５）得られたハイブリドーマの培養上清から前記モノクローナル抗体を調製する。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により作製された、不活性型ＨＧＦＡの翻訳開始アミノ酸から数えて４０７番目のアルギニンと４０８番目のイソロイシン間で限定分解を受けることにより活性化している活性型ＨＧＦＡに対する解離定数が１×１０-8Ｍ以下であり、不活性型ＨＧＦＡに対する解離定数が１×１０-5Ｍ以上であるモノクローナル抗体。
【請求項３】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７７７９であるハイブリドーマにより産生される請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項２または３に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系。
【請求項５】
請求項２または３に記載のモノクローナル抗体の１種又は複数種を用いて、活性型ＨＧＦＡを免疫学的方法により特異的に測定することを特徴とする、活性型ＨＧＦＡの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性型肝細胞増殖因子アクティベーター（ＨＧＦＡ）に対する特異的測定用抗体またはモノクローナル抗体、その使用方法および測定キットに関する。また活性型ＨＧＦＡを指標にした疾患状態の患者、特に臓器炎症、糸球体腎炎、癌、心筋梗塞、狭心症および血栓症に関する検出方法、さらにはこれらの方法の実施に最適な生体成分および血液の採取方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）は、タンパク質・ペプチド中のペプチド結合を加水分解する機能を有するタンパク質であり、生体機能と深く関連しつつ、その恒常性維持に重要な役割を果たしている。例えば、血液中に存在する種々のプロテアーゼ群は、それら自身が緻密なカスケードを形成し、血液の凝固・線溶を制御している。
【０００３】
肝細胞増殖因子アクティベーター（Hepatocyte Growth Factor Activator、以下「ＨＧＦＡ」と略す）は、その活性中心にセリン残基を有するセリンプロテアーゼの一種として知られている（宮澤ら、非特許文献１）。ＨＧＦＡは、一般的な血中プロテアーゼが血液凝固・線溶系カスケードに関与するのとは異なり、肝細胞増殖や臓器再生に関与するサイトカインとして知られている肝細胞増殖因子（Hepatocyte Growth Factor；以下「ＨＧＦ」と略す）（仲ら、非特許文献２）に作用して、これを特異的に限定分解して活性化するユニークな性質を有している（下村ら、非特許文献３）。しかしながらＨＧＦＡの作用は、ラットを用いた動物モデル実験や試験管内での実験によるＨＧＦの活性化作用しか知られておらず（宮澤ら、非特許文献４）、ヒトの病態における役割、機能および血中濃度と病態の関連に関しては全く判っていなかった。
【０００４】
ＨＧＦＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて分子量約96,000〜約98,000（以下「98kDaHGFA」と略す）を示すものと、その翻訳開始アミノ酸から数えて372番目のアルギニンと373番目のバリン間で限定分解をうけたＣ末端側のペプチドである分子量約34,000〜約38,000（以下「36kDa HGFA」と略す）を示すものが知られている。各分子量に幅があるのは、糖鎖結合量のヘテロジェナイティーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を還元下または非還元下で実施する分子量測定値の相違にもとづくものであり、本質的に単一のタンパク質である。さらに、各ＨＧＦＡは通常、不活性型として血中に存在しているが、翻訳開始アミノ酸から数えて407番目のアルギニンと408番目のイソロイシン間で限定分解を受けることにより活性化し、一本鎖状態のＨＧＦＡはジスルフィド結合でヘテロダイマー化した二本鎖状態のＨＧＦＡへと変換される。この活性化したＨＧＦＡは、基質であるＨＧＦを特異的に活性化すると考えられている（下村ら、非特許文献５）。
【０００５】
ＨＧＦＡの血中濃度と病態の関連を解析するには、ヒト組織、体液、または血液中などの生体成分中に存在する活性型ＨＧＦＡを特異的に測定する必要がある。そして、活性型ＨＧＦＡを特異的に検出または測定するためには、活性型ＨＧＦＡを極めて特異的に認識し、不活性型ＨＧＦＡは実質的に認識しない性質を持った抗体、特に望ましくはモノクローナル抗体の取得が不可欠である。しかしながらこの様な性質を有する抗体の存在は現在まで全く知られておらず、さらにはヒト血液などの生体成分中に存在する活性型ＨＧＦＡに特異的な測定方法やキットは存在しない。
【非特許文献１】J.Biol.Chem.,268:10024-10028(1993)
【非特許文献２】J.Biol.Chem.,267:20114-20119(1992)
【非特許文献３】Cytotechnology, 8:219-229(1992)
【非特許文献４】J.Biol.Chem.,271:3615-3618(1996)
【非特許文献５】J.Biol.Chem.,268:22927-22932(1993)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、活性型ＨＧＦＡを特異的に認識し、不活性型ＨＧＦＡは実質的に認識しない抗体、同抗体を用いて活性型ＨＧＦＡを測定する方法、並びに活性型ＨＧＦＡが関与する疾病の検出法及びキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ヒト病態におけるＨＧＦＡ血中濃度と各種ヒト疾患との関連を解析するため、ヒト血中におけるＨＧＦＡ定量系の構築を試みた。まず、ＨＧＦＡに対する既存のマウスモノクローナル抗体として知られている7E10, P1-4, A-1, A-6, A-23,A-32, A-51, A-75（宮澤ら、J.Biol.Chem.,271:3615-3618(1996)）を用い、２抗体サンドイッチ法を用いた酵素標識抗体測定系（enzyme-linkedimmunosorbent assay；以下「ＥＬＩＳＡ測定系」と略す）を構築した。さらに、健常人、臓器疾患をはじめとする種々の疾患患者の血液（血漿または血清）に対して、ＨＧＦＡモノクローナル抗体の反応性を解析していった。しかしながら、これらのモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ測定系では、健常人をはじめ、すべてのヒト血液に対して一様に強い反応性を示し、ヒト疾患に対する特異的な反応性、すなわち血中におけるＨＧＦＡ濃度の顕著な変化は全く検出することは出来なかった。そこで本発明者らは、ＨＧＦＡに対する既存のモノクローナル抗体が有するＨＧＦＡへの反応性を解析し、この原因の追求を試みた。
【０００８】
まず、ＨＧＦＡは活性型および不活性型の２形態が存在することから、それぞれのＨＧＦＡに対する各モノクローナル抗体の反応性を解析した。具体的には、活性型ＨＧＦＡおよび不活性型ＨＧＦＡのそれぞれを固相プレートに付着させ、固相に付着したＨＧＦＡと各モノクローナル抗体の反応性を解析した結果、これらのモノクローナル抗体は、活性型ＨＧＦＡおよび不活性型ＨＧＦＡの両方に反応する性質を有していることが判った。これらの結果は、既存のモノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡ法では、血中に恒常的かつ大量に存在していると考えられる不活性型ＨＧＦＡ（下村らJ.Biol.Chem.,268:22927-22932(1993)）、または微量の活性型ＨＧＦＡと不活性型ＨＧＦＡの両方を測定していることが考えられ、これら既存のモノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡ測定系では、ＨＧＦＡとヒト疾患との関連が全く判らないことが判明した。
【０００９】
そこで本発明者らは、ＨＧＦＡは活性型および不活性型の２形態が存在することに着目し、ヒト生体内に存在するＨＧＦＡの活性化状態を特異的に検出し、各種ヒト疾患とその血中に存在する活性型ＨＧＦＡ量との関連に関して検討を進めた。そして、鋭意研究を重ねた結果、活性型ＨＧＦＡを認識し、不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しないポリクローナル抗体やモノクローナル抗体の作製にはじめて成功した。さらに、これらの抗体を使用した免疫学的測定法を用いることにより、ヒト生体成分中に存在する活性型ＨＧＦＡと反応し不活性型ＨＧＦＡとは実質的に反応しない、すなわち活性型ＨＧＦＡを特異的に測定する方法およびそのキットを完成するに至った。
【００１０】
さらに、本発明の活性型ＨＧＦＡ特異的測定方法およびそのキットを使用した場合、健常人と比較し、糸球体腎炎をはじめとする臓器障害の患者や癌患者の血液中に存在する活性型ＨＧＦＡ量が著しく増加することをはじめて見いだした。また、血中の活性型ＨＧＦＡ量が増加することを指標に、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞などをはじめとする血栓症を感度良く予知することが可能であることを初めて見いだすに至った。
【００１１】
一方、ヒト血液をはじめとする生体成分中に存在する活性型ＨＧＦＡ量を測定する際、その中に存在する活性型ＨＧＦＡを安定かつ再現よく採取する方法が必要となる。本発明者
らはこの方法に関し、種々のプロテアーゼインヒビターの添加等を検討した結果、選択的トロンビン阻害剤であるアルガトロバンを添加することにより、極めて安定かつ再現良く活性型ＨＧＦＡを測定することが可能なことを見いだした。また、詳細に検討を重ねた結果、全血、血清、血漿などのヒト血液を採取する場合にでも、アルガトロバンの添加は有効であること、血液のなかではクエン酸血漿を用いることが極めて良好な結果が得られることを見いだした。
【００１２】
本発明は、上記知見からなされたものであり、その要旨は以下のとおりである。
（１）活性型肝細胞増殖因子アクティベーター（ＨＧＦＡ）を認識する抗体であって、不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しない抗体。
（２）活性型ＨＧＦＡに対する解離定数が１×１０-8Ｍ以下である（１）の抗体。
（３）モノクローナル抗体である（１）又は（２）の抗体。
（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で約34,000〜約98,000を示す活性型ＨＧＦＡを認識し、不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しない（３）の抗体。
（５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で約34,000〜約38,000を示す活性型ＨＧＦＡを認識する（４）の抗体。
（６）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７７７９であるハイブリドーマにより産生される（４）のモノクローナル抗体。
（７）活性型ＨＧＦＡの前駆体である不活性型ＨＧＦＡの翻訳開始アミノ酸から数えて407番目のアルギニンと408番目のイソロイシン間で限定分解を受けることにより活性化している活性型ＨＧＦＡを認識し、不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しないモノクローナル抗体。
（８）活性型ＨＧＦＡを認識し、不活性型ＨＧＦＡ、及び活性型ＨＧＦＡとプロテアーゼインヒビターの複合体を実質的に認識しないモノクローナル抗体。
（９）（３）〜（８）のいずれかのモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系。
（１０）（１）〜（８）のいずれかの抗体の１種又は複数種を用いて、活性型ＨＧＦＡを免疫学的方法により特異的に測定することを特徴とする、活性型ＨＧＦＡの測定法。
（１１）活性型ＨＧＦＡを測定する検体が、疾患の疑いのある被検者または被検動物から採取された生体成分である（１０）の方法。
（１２）前記疾患が、臓器炎症、糸球体腎炎、癌、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞または血栓症である（１１）の方法。
（１３）疾患の疑いのある被検者から採取された生体成分中の活性型ＨＧＦＡを検出または測定することを特徴とする疾患の検出方法。
（１４）前記疾患が、臓器炎症、糸球体腎炎、癌、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞または血栓症である（１３）の方法。
（１５）前記生体成分が血液又はその分画物もしくは処理物であることを特徴とする（１３）または（１４）の方法。
（１６）前記生体成分が血漿である（１５）の方法。
（１７）血漿がクエン酸血漿である（１６）の方法。
（１８）前記生体成分にアルガトロバンを添加することを特徴とする（１３）〜（１７）のいずれかの方法。
（１９）（１）〜（８）のいずれかの抗体の１種又は複数種を含み、活性型ＨＧＦＡを検出または測定するためのキット。
（２０）臓器炎症、糸球体腎炎、癌、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞または血栓症の診断に用いられる（１９）のキット。
（２１）疾患の疑いのある患者から採取された生体成分中の活性型ＨＧＦＡを測定することを特徴とする（１９）または（２０）のキット。
（２２）活性型ＨＧＦＡの検出または測定を、免疫染色によって行うことを特徴とする（１９）〜（２１）のいずれかのキット。
（２３）血清もしくは血漿または全血取得用採血管であって、アルガトロバンを添加した採血管。
（２４）活性型ＨＧＦＡ測定に用いる血清もしくは血漿または全血の採血に用いる（２３）の採血管。
【００１３】
本明細書において、活性型ＨＧＦＡを認識し不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しないモノクローナル抗体を、「活性型ＨＧＦＡ特異的モノクローナル抗体」、活性型ＨＧＦＡを認識し不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しないポリクローナル抗体を、「活性型ＨＧＦＡ特異的ポリクローナル抗体」ということがある。さらに、これらを総称して、「活性型ＨＧＦＡ特異的抗体」ということがある。また、「活性型ＨＧＦＡを認識する」とは、抗原抗体反応により活性型ＨＧＦＡに結合することをいい、好ましくは、活性型ＨＧＦＡに対する解離定数が１×１０-8Ｍ以下、より好ましくは１×１０-9Ｍ以下であることをいう。「不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しない」とは、抗原抗体反応により不活性型ＨＧＦＡに実質的に結合しないことをいう。より具体的には、「不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しない」とは、通常の免疫学的測定法によっては、不活性型ＨＧＦＡを検出することができないことを意味し、好ましくは、不活性型ＨＧＦＡに対する解離定数が１×１０-5Ｍ以上であることをいう。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、活性型ＨＧＦＡに特異的に結合し、不活性型ＨＧＦＡに結合しないモノクローナル及びポリクローナル抗体が提供される。本発明の抗体は、活性型ＨＧＦＡの特異的な測定、検出に用いることができる。
本発明の活性型ＨＧＦＡの測定法は、活性型ＨＧＦＡの血中濃度に反映される各種疾患の診断に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に本発明を詳細に説明する。
＜１＞活性型ＨＧＦＡに対する特異的抗体作製用の免疫抗原およびスクリーニング抗原本発明において用いられる「活性型ＨＧＦＡ」とは、その基質である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に作用し、その不活性型である一本鎖型ＨＧＦ（仲らJ.Biol.Chem.,267:20114-20119(1992)）から活性型である二本鎖型ＨＧＦに変換する能力を有するものを指す。ここで、一本鎖型とは、ＨＧＦ遺伝子より生成された一本の前駆体タンパク質よりシグナルペプチドが除去されたものを、二本鎖型とは、ＨＧＦの翻訳開始アミノ酸から数えて４９４番目のアルギニンと４９５番目のバリン間で限定分解を受け、生じた二本の鎖がジスルフィド結合によりヘテロダイマー化したものを指す。またＨＧＦＡの活性とは、不活性型である一本鎖型ＨＧＦを活性型である二本鎖型ＨＧＦに変換する活性を示す。
【００１６】
活性型ＨＧＦＡは、具体的には、例えば特開平6-153946に記載されているＨＧＦＡ前駆体タンパク質の翻訳開始アミノ酸から数えて407番目のアルギニンと408番目のイソロイシン間で限定分解を受けることにより活性化しているＨＧＦＡが含まれる。この活性型ＨＧＦＡは、通常ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分子量約34,000〜98,000であり、そのＮ末端が限定分解された種々の分子量を示す活性型ＨＧＦＡが知られている（Mitsubishi Kasei R & D Review, 8 (1), 26-35 (1994)）。その例として還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分子量約98,000を示すもの、またはその翻訳開始アミノ酸から数えて88番目のアルギニンと89番目のアラニン間で限定分解をうけたＣ末端側のペプチドである分子量約80,000を示すもの、または翻訳開始アミノ酸から数えて372番目のアルギニンと373番目のバリン間で限定分解をうけたＣ末端側のペプチドである分子量約36,000を示すものが存在する。糖鎖結合量のヘテロジェナイティー、分子量の測定法、又は精製法により、上記の分子量約98,000を示すものは、約96,000〜98,000の幅を示すことがあり、上記の分子量約36,000を示すものは、約34,000〜38,000の幅を示すことがある。従ってここで用いられる活性型ＨＧＦＡとは、そ
の分子量に限定されることなく、その基質であるＨＧＦを活性化する能力を有していればよい。
免疫抗原またはモノクローナル抗体のスクリーニング等に使用する活性型ＨＧＦＡまたは不活性型ＨＧＦＡは下村らの方法（J.Biol.Chem.,268:22927-22932(1993)に従い、ヒトなどの血液より精製したものを使用することが可能である。また特開平6-153966および特開平6-153946に記載されているＨＧＦＡ ｃＤＮＡを使用して大腸菌などの微生物、昆虫細胞、酵母、動物細胞および動物を使用した組換え蛋白質であるＨＧＦＡを使用したものも利用可能である。
【００１７】
特に、活性型ＨＧＦＡ特異的抗体を取得するためには、免疫用抗原、スクリーニング用抗原として、不活性型ＨＧＦＡが混入していない高純度の活性型ＨＧＦＡ、および活性型ＨＧＦＡが混入していない高純度の不活性型ＨＧＦＡを調製することが必要である。このような目的から、ここで使用する活性型ＨＧＦＡ、不活性型ＨＧＦＡとしては、ＨＧＦＡ ｃＤＮＡを使用した組換え蛋白質が望ましい。例えば、特開平6-153946に記載されているＨＧＦＡ前駆体をコードするＨＧＦＡ ｃＤＮＡを使用し、その全長または一部を適当な発現ベクターに挿入し、これを大腸菌などの微生物、昆虫細胞、酵母、動物細胞または動物に導入し、さらにＨＧＦＡを発現しているこれらの遺伝子導入細胞の培養上清または細胞内、組織、体液より精製操作を実施して、組換え蛋白質であるＨＧＦＡを得ることが可能である。また細胞系を使用することなく、Rapid Translation System RTS500（Roshe Diagnostics社）などを使用した試験管内での転写・翻訳システムを用いて、目的とするＨＧＦＡを作製することも可能である。
【００１８】
具体的な例としては、特開平6-153946に記載されている不活性型ＨＧＦＡ前駆体の全長であり、かつシグナル配列を有する６５５アミノ酸をコードするＨＧＦＡｃＤＮＡを動物細胞発現ベクターのプロモーター下流に挿入した発現ベクターを用いたり、特開平6-153966に記載された様に適当なシグナル配列とＨＧＦＡ前駆体の翻訳開始アミノ酸から数え373番目のバリン以降のＣ末端側をコードするｃＤＮＡを結合させた動物細胞発発現ベクター、または適当なシグナル配列とＨＧＦＡ活性を発揮する能力を有する領域のｃＤＮＡを結合させた動物細胞発発現ベクターを使用する方法が挙げられる。これらの発現ベクターを動物細胞に導入後、そのＨＧＦＡ ｃＤＮＡを発現している細胞を選択して、その培養上清から精製することにより組換え蛋白質であるＨＧＦＡを得ることが可能である。
【００１９】
このような方法で得られた組換え蛋白質であるＨＧＦＡは、一般的には不活性型である。従って、下村らの方法（J.Biol.Chem.,268:22927-22932(1993)）を参考に、この不活性型ＨＧＦＡに対して適量のトロンビンおよびデキストラン硫酸、またはカリクレインおよびトロンビンを添加することにより、この不活性型ＨＧＦＡを活性化させることが可能である。この処理により活性化されたＨＧＦＡは、ＨＰＬＣを使用したゲル濾過またはアフィニティークロマトグラフィーで精製することにより、純化することが可能である。
【００２０】
精製純度の高い活性型ＨＧＦＡおよび不活性型ＨＧＦＡは、免疫原として重要であるだけでなく、活性型ＨＧＦＡ特異的ポリクローナル抗体をアフィニテイー精製により選別したり、活性型ＨＧＦＡ特異的モノクローナル抗体をスクリーニングする際に、極めて重要な材料となる。
【００２１】
精製された不活性型ＨＧＦＡは極めて不安定であり、わずかな不純物の混入により活性化されてしまうことを、本発明者らは詳細な検討の結果見いだしている。このような活性型ＨＧＦＡが混入された不活性型ＨＧＦＡを用いたり、逆に不活性型ＨＧＦＡが混入された活性型ＨＧＦＡを用いては、活性型ＨＧＦＡ特異的ポリクローナル抗体や活性型ＨＧＦＡ特異的モノクローナル抗体を得ることは困難である。そこで本発明者らは、不活性型ＨＧＦＡを調製する際の人為的な活性化を防ぐ阻害物質として、種々のプロテアーゼインヒビ
ターを検討した結果、選択的トロンビン阻害剤であるアルガトロバン（三菱東京製薬（株））をＨＧＦＡに添加することが有用であることを見いだした。すなわち不活性型ＨＧＦＡの精製時や、モノクローナル抗体スクリーニングの際、不活性型ＨＧＦＡにアルガトロバンを添加しておけば、その人為的な活性化を防ぎ活性型ＨＧＦＡの混入を防ぐことが可能である。ここで調製された活性型ＨＧＦＡは、活性型ＨＧＦＡ特異的抗体を取得するための免疫用抗原としてふさわしいし、さらに活性型ＨＧＦＡを認識して不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しない抗体を選択、精製する材料としても使用することが出来る。
【００２２】
一方、不活性型ＨＧＦＡは、不活性型ＨＧＦＡを認識して活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しない抗体を取得するための免疫用抗原としてふさわしいし、活性型ＨＧＦＡを認識して不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しない抗体以外の抗体を選別、吸収または除去する材料として使用することが出来る。
【００２３】
活性型ＨＧＦＡ特異的抗体を取得するのに必要な免疫用抗原またはスクリーニング用抗原として、活性型ＨＧＦＡと不活性型ＨＧＦＡにおける一次構造配列（アミノ酸配列）の相違部位、または立体構造の相違部位に位置するペプチドを利用することが可能である。例えば活性型ＨＧＦＡの蛋白質表面だけに露出し、不活性型ＨＧＦＡの蛋白質表面には露出していない部位のペプチドを用いることができる。このような蛋白質の立体構造予測は、一般的に当業者にとっては入手可能であり、コンピュータープログラムにより活性型ＨＧＦＡおよび不活性型ＨＧＦＡのアミノ酸配列より三次元コンフォメーション構造を図式化して表現したものが入手可能である。この両者の比較により、活性型ＨＧＦＡに特異的な反応を示す抗体の結合部位（抗原部位）となる領域を探しだし、その部分アミノ酸配列を合成したペプチドを免疫抗原として使用することが可能である。
【００２４】
また、GENETYX（SOFTWARE DEVELOPMENT CO., LTD）などのタンパク質構造解析ソフトウェアを使用して、ＨＧＦＡのアミノ酸配列に関する情報から、活性型ＨＧＦＡおよび不活性型ＨＧＦＡに関する親水性・疎水性の相違部位、Cho-Fasman法やRobson法などによる二次構造解析結果の相違部位、抗原性の相違部位となる領域を探しだし、そのアミノ酸配列に基づいて合成したペプチドを免疫抗原やスクリーニング抗原として利用してもよい。例えば、活性型ＨＧＦＡは、ＨＧＦＡ前駆体タンパク質の翻訳開始アミノ酸から数えて407番目のアルギニンと408番目のイソロイシン間で限定分解を受けたアミノ酸配列を有している。一方、不活性型ＨＧＦＡは、この407番目のアルギニンと408番目のイソロイシン間が連続したアミノ酸配列を有している。従って、不活性型ＨＧＦＡには存在せず活性型ＨＧＦＡのみに存在するアミノ酸配列として、407番目のアルギニンをＣ末端として含み、そのＮ末端方向に存在する数アミノ酸配列を含むペプチドが利用可能である。その例として下記のものを選ぶことが可能である。配列２〜１２のアミノ酸配列は、配列１のアミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端側から１アミノ酸残基づつ欠失した配列である。
【００２５】
配列１：ＧＲＲＨＫＫＲＴＦＬＲＰＲ  配列２： ＲＲＨＫＫＲＴＦＬＲＰＲ  配列３： ＲＨＫＫＲＴＦＬＲＰＲ  配列４： ＨＫＫＲＴＦＬＲＰＲ  配列５： ＫＫＲＴＦＬＲＰＲ  配列６： ＫＲＴＦＬＲＰＲ  配列７： ＲＴＦＬＲＰＲ  配列８： ＴＦＬＲＰＲ  配列９： ＦＬＯＰＲ  配列１０： ＬＯＰＲ  配列１１： ＯＰＲ  配列１２： ＰＲ
【００２６】
また不活性型ＨＧＦＡには存在せず活性型ＨＧＦＡのみに存在するアミノ酸配列として、408番目のイソロイシンをＮ末端として含みそのＣ末端方向に存在する数アミノ酸配列を含むペプチドとして、下記のものを選ぶことが可能である。配列１４〜２４のアミノ酸配列は、配列１３のアミノ酸配列（配列番号２）のＣ末端側から１アミノ酸残基づつ欠失した配列である。
【００２７】
配列１３：ＩＩＧＧＳＳＳＬＰＧＳＨＰ  配列１４：ＩＩＧＧＳＳＳＬＰＧＳＨ  配列１
５：ＩＩＧＧＳＳＳＬＰＧＳ  配列１６：ＩＩＧＧＳＳＳＬＰＧ  配列１７：ＩＩＧＧＳＳＳＬＰ  配列１８：ＩＩＧＧＳＳＳＬ  配列１９：ＩＩＧＧＳＳＳ  配列２０：ＩＩＧＧＳＳ  配列２１：ＩＩＧＧＳ  配列２２：ＩＩＧＧ  配列２３：ＩＩＧ  配列２４：ＩＩ
【００２８】
また活性型ＨＧＦＡには存在せず不活性型ＨＧＦＡのみに存在するアミノ酸配列として、ＨＧＦＡ前駆体タンパク質の翻訳開始アミノ酸から数えて407番目のアルギニンと408番目のイソロイシン間（配列２５の１３位と１４位の間）が連続したアミノ酸配列を含む、例えば配列２５（配列番号３）のようなペプチドを選択することが出来る。
【００２９】
配列２５：ＧＲＲＨＫＫＲＴＦＬＲＰＲＩＩＧＧＳＳＳＬＰＧＳＨＰ
【００３０】
これらのペプチドを免疫用抗原として使用する場合、一般的にはキャリアーとしてＫＬＨ（キーホール・リンペット・ヘモシアニン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＯＶＡ（オバルブミン）などの蛋白質または高分子体に結合させたものを免疫用抗原として使用することが望ましい。例えば、配列１から配列１２に記載されたペプチドのＮ末端にさらにシステインを付加したもの、配列１３から配列２４に記載されたペプチドのＣ末端にさらにシステインを付加したもの、配列２５に記載されたペプチドのＮ末端またはＣ末端にシスティンを付加したペプチドを合成し、ＰＩＥＲＣＥ社Imject Maleimide Activated Carrier Proteinsに結合させたものを、免疫用抗原として用いることが可能である。
【００３１】
また配列１から配列２５に対応したｃＤＮＡとキャリアーとなる蛋白質のｃＤＮＡを結合させ、両者のコードするペプチドが融合した融合蛋白質を遺伝子工学的手法で各種細胞で発現させ、精製して得たものも使用可能である。配列１から配列２４のいずれかを含むものは、活性型ＨＧＦＡ特異的抗体を取得するための免疫用抗原としてふさわしいし、さらに活性型ＨＧＦＡ特異的抗体を選択、精製する材料としても使用することが出来る。一方、配列２５のようなペプチドは、不活性型ＨＧＦＡを認識して活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しない抗体を取得するための免疫用抗原としてふさわしいし、活性型ＨＧＦＡ特異的抗体以外の抗体を吸収または除去する材料として使用することが出来る。
【００３２】
＜２＞活性型ＨＧＦＡを認識し不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しないモノクローナル抗体の作製活性型ＨＧＦＡ特異的モノクローナル抗体を取得するには、免疫用抗原として、前述した活性型ＨＧＦＡを用い、通常行われる免疫学的方法を実施すればよい。例えば活性型98kDa HGFAもしくは活性型36kDa HGFAまたは両者を混合して使用することが出来る。
【００３３】
また、配列１から配列２４のいずれかを含むペプチドを前述した方法でキャリアーと融合させたものを調製し、これらを１種以上混合して免疫用抗原としても良い。さらには活性型ＨＧＦＡに特異的な抗原部位を含むペプチドを使用しても良い。
【００３４】
免疫に使用する動物は特に限定されないが、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ等はいずれも使用できる。免疫用抗原の動物への接種は、皮下、筋肉内、腹腔内に完全フロイントアジュバントや不完全フロイトアジュバントと免疫用抗原をよく混和して行う。接種は、２週間から５週間ごとに実施し、接種した抗原に対する免疫動物の抗体価が充分に上昇するまで続ける。この後、免疫動物に対して抗原のみの静脈注射を行い、その３日後に抗体産生細胞を含むと考えられる脾臓もしくはリンパ節を採取し、この脾臓細胞またはリンパ細胞を腫瘍細胞と細胞融合させる。この後、細胞融合して不死化した抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を単離する。ここで使用する腫瘍細胞は、一般的に免疫を行った動物から調製される脾臓細胞もしくはリンパ細胞と同一種であることが望ましいが、異種動物間のものでも可能である。
【００３５】
腫瘍細胞の例として、p3（p3/x63-Ag8）, P3U1, NS-1, MPC-11, SP2/0, FO, x63.6.5.3, S194, R210等の骨髄腫細胞が使用される。細胞融合は一般に行われている方法、例えば「単クローン抗体実験マニュアル」（講談社サイエンティフィック 1987年出版）に従って実施すればよい。細胞融合は、融合させる細胞を懸濁した融合培地に細胞融合促進剤を加えることに実施することができる。細胞融合促進剤としては、センダイウイルスや平均分子量1000-6000のポリエチレングリコールなどが挙げられる。この際、更に融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシド等の補助剤やＩＬ−６等のサイトカインを融合培地に添加することも出来る。免疫を行った脾臓細胞もしくはリンパ細胞に対する腫瘍細胞の混合比は、例えば腫瘍細胞に対し、脾臓細胞もしくはリンパ細胞を約１倍から１０倍程度用いればよい。
【００３６】
上記の融合培地としてはERDF培地、RPMI-1640培地、MEM培地等の通常の各種培地を使用することが出来、融合時は通常、牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清を培地から抜いておくのがよい。融合は、上記の免疫を行った脾臓細胞もしくはリンパ細胞と腫瘍細胞との所定量を上記の培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温しておいたポリエチレングリコール溶液を２０％から５０％程度加え、好ましくは３０℃から３７℃で１分から１０分程度反応させることによって実施する。以降、適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰り返す。
【００３７】
目的とするハイブリドーマは、通常の選択培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキチンサン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）で培養する。このＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分な時間、通常では数日から数週間行えばよい。活性型ＨＧＦＡ特異的モノクローナル抗体を取得する際、最も技術的に重要な点がそのスクリーニングである。活性型ＨＧＦＡ特異的モノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングは、前述した活性型ＨＧＦＡ、不活性型ＨＧＦＡなどの材料を用い、種々の免疫化学的方法で解析することにより可能となる。例えば活性型ＨＧＦＡまたは不活性型ＨＧＦＡをスクリーニング用抗原として用い、これらのスクリーニング用抗原とハイブリドーマ培養上清中に分泌されるモノクローナル抗体との結合を、ＥＬＩＳＡ法などの酵素免疫測法、またはウエスタンブロッティング法などで解析して、目的とするハイブリドーマを選択することが出来る。
【００３８】
具体的には、活性型ＨＧＦＡをスクリーニングプレートなどに付着させ、ＢＳＡ等でブロッキングしたものに対して、上記ハイブリドーマの培養上清を添加して、活性型ＨＧＦＡを認識する抗体を分泌しているハイブリドーマを選別する。さらに、選別されたハイブリドーマに対し、不活性型ＨＧＦＡをスクリーニングプレートなどに付着させ、ＢＳＡ等でブロッキングしたものを行い、この不活性型ＨＧＦＡを認識しない抗体を分泌しているハイブリドーマを選別する。例えば、選択するハイブリドーマの培養上清を活性型ＨＧＦＡもしくは不活性型ＨＧＦＡが付着したＥＬＩＳＡ法用のプレートに添加して反応させ、十分な洗浄操作後、標識抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を添加してさらに反応させる。洗浄操作後に標識の検出を行い、活性型ＨＧＦＡを付着したプレートに反応性を有し、不活性型ＨＧＦＡを付着させたプレートに対して反応性を示さない培養上清を有するハイブリドーマを選択する。標識としては、後述する各種酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープ、ビオチンまたはアビジン等が用いられる。
【００３９】
上記のスクリーニングにより、活性型ＨＧＦＡを認識するモノクローナル抗体であって、不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られる。一方、この様なハイブリドーマをスクリーニングする際、先に示した配列１から配列２４を含むペプチドのいずれかに反応し、配列２５などのペプチドに反応しないことを指標としても良い。この様な方法で選択されたハイブリドーマが産生する抗体に関しては、さらに活性型ＨＧＦＡに反応し不活性型ＨＧＦＡとは反応しないことを確認すると
良い。上記抗体の反応性は、活性型ＨＧＦＡ又は不活性型ＨＧＦＡに対する解離定数を測定することによって確認することができる。本発明の抗体の活性型ＨＧＦＡに対する解離定数は、好ましくは１×１０-8Ｍ以下、より好ましくは１×１０-9Ｍ以下である。また、不活性型ＨＧＦＡに対する解離定数は、好ましくは１×１０-5Ｍ以上である。
【００４０】
得られたハイブブリドーマは、限界希釈法によりクローニングすることにより、単一のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを得ることが出来る。このハイブリドーマクローンは、あらかじめＦＢＳ中に含まれるウシ抗体（ＩｇＧ）を除いたＦＢＳを１〜５％程度加えた培地または無血清用培地を用いて培養を行い、得られた培養上清を目的のモノクローナル抗体を精製する原料とする。一方、得られたハイブリドーマクローンをあらかじめプリステンを投与したBalb/CマウスまたはBalb/c(nu/nu)マウスの腹腔内に移植し、１０日から１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、目的のモノクローナル抗体を精製する原料としてもよい。モノクローナル抗体を精製する方法は、通常の免疫グロブリン精製法を用いれば良く、例えば、硫安分画法、ポリエチレン分画法、エタノール分画法、陰イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧが結合したアフィニティークロマトグラフィー等により実施することが出来る。
【００４１】
＜３＞活性型ＨＧＦＡを認識し不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しないポリクローナル抗体の作製活性型ＨＧＦＡ特異的ポリクローナル抗体は、活性型ＨＧＦＡまたは不活性型ＨＧＦＡを免疫用抗原として用い、得られた免疫動物由来のポリクローナル抗体に対し、活性型ＨＧＦＡを認識し不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しない抗体を精製する操作を実施すれば取得することが可能である。
【００４２】
また、ポリクローナル抗体を取得する免疫用抗原として、前述した活性型ＨＧＦＡに特異的な抗原部位を含むペプチドとキャリアーの融合体も使用可能である。例えば、前述した配列１から配列２５を含むいずれかのペプチドとキャリアー蛋白質または高分子体と融合させたものを１種以上混合して免疫用抗原して用いてもよい。免疫に使用する動物は特に限定されないが、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ等はいずれも使用できる。免疫用抗原の動物への接種は皮下、筋肉内、腹腔内に完全フロイントアジュバントや不完全フロイトアジュバントとよく混和して行う。接種は２週間から５週間ごとに実施し、接種した抗原に対する免疫動物の抗体価が充分に上昇するまで続ける。この後、免疫動物に対して抗原のみの静脈注射を行い、その３日後から５日後に抗血清を取得する。
【００４３】
取得した抗血清からポリクローナル抗体を精製する方法は、通常の免疫グロブリン精製法を用いれば良く、例えば、硫安分画法、ポリエチレン分画法、エタノール分画法、陰イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧが結合したアフィニティークロマトグラフィー等により実施することが出来る。
【００４４】
活性型ＨＧＦＡ特異的ポリクローナル抗体を取得するための精製操作とは、活性型ＨＧＦＡを認識し不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しないポリクローナル抗体を分画または精製可能な方法であればいずれでも良く、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気遊動法、免疫電気遊動法等が挙げられる。具体的な方法の一つとして、活性型ＨＧＦＡまたは不活性型ＨＧＦＡを固定化した樹脂を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーが挙げられる。例えば、前述の方法で得られたポリクローナル抗体を材料にして、不活性型ＨＧＦＡを固定化した樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーを実施する。この方法により、不活性型ＨＧＦＡに結合しない非吸着画分に存在するポリクローナル抗体を回収する。次に、この非吸着画分を材料にして、活性型ＨＧＦＡを固定化した樹脂を用いたアフ
ィニティークロマトグラフィーを実施し、活性型ＨＧＦＡに結合した吸着画分に存在するポリクローナル抗体を回収する。
【００４５】
これらの方法により、活性型ＨＧＦＡ特異的ポリクローナル抗体を得ることが出来る。また、このアフィニティークロマトグラフィーの方法として、活性型ＨＧＦＡ特異的な抗原部位と考えられるアミノ酸配列をもったペプチドを利用することも可能である。例えば、前述した配列１から配列２５のいずれか一種類以上を固定化した樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーが利用可能である。例えば配列１から配列２４を含むペプチドを固定化した樹脂は、活性型ＨＧＦＡ特異的ポリクローナル抗体を精製するアフィニティークロマトグラフィー用の固定化用担体として使用することが出来る。一方、配列２５のようなペプチドを固定化した樹脂は、活性型ＨＧＦＡ特異的抗体以外の抗体を吸収もしくは除去するアフィニティークロマトグラフィー用の固定化用担体として使用することが出来る。
【００４６】
＜４＞活性型ＨＧＦＡを特異的に測定する方法活性型ＨＧＦＡを特異的に測定する方法とは、活性型ＨＧＦＡ特異的抗体と、活性型ＨＧＦＡを反応させる操作を含む方法を意味する。従ってこの方法は、活性型ＨＧＦＡを測定し、不活性型ＨＧＦＡは実質的には測定しないことを特徴とする方法である。本方法は、本発明の活性型ＨＧＦＡ特異的抗体を使用して、生体試料中の活性型ＨＧＦＡを定性または定量する様々な診断方法、測定方法、アッセイ方法に用いることが可能である。その方法としては、活性型ＨＧＦＡを検出する目的であれば特に限定されない。例えば、活性型ＨＧＦＡを特異的に検出する組織染色法法や免疫沈降法、活性型ＨＧＦＡを特異的に測定する競合的結合アッセイ方法、または直接的または間接的サンドイッチアッセイ法、２抗体サンドイッチアッセイ法などが挙げられる。また検出方法としては、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、イムノブロッティング法、イムノクロマト法、ラテックス凝集法などが挙げられる。
【００４７】
イムノブロッティングの応用例としては、活性型ＨＧＦＡ特異的抗体をマイクロアレイやチップに添加もしくは固定したものも含まれる。また活性型ＨＧＦＡ特異的抗体を蛍光ラベル化し、蛍光偏向解消法、蛍光相関分散法を用いて活性型ＨＧＦＡとの相互作用を検出することも可能である。表面プラズモン共鳴装置を利用して活性型ＨＧＦＡ特異的抗体と、活性型ＨＧＦＡとの相互作用を測定することも可能である。例えば、この抗体をセンサーチップ上に結合させた後、このチップをとりつけた表面プラズモン共鳴装置に活性型ＨＧＦＡを含む生体試料を流し、応答シグナルの時間変化を追跡することにより、生体成分中の活性型ＨＧＦＡを定量することが可能である。
【００４８】
活性型ＨＧＦＡを特異的に測定する方法で使用される抗体、例えば活性型ＨＧＦＡ特異的抗体は、そのまま用いてもよいし、定法であるパパイン処理によって得られるＦａｂもしくはペプシン処理によって得られるＦ（ａｂ'）2またはＦ（ａｂ'）の形態を持った抗体を用いても良い。また活性型ＨＧＦＡを認識し不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しない性質を有する抗体の断片も、本発明に含まれる。例えば、活性型ＨＧＦＡ特異的抗体のＨ鎖とＬ鎖の両可変ドメイン内の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域などを含む断片がこれに含まれる。
【００４９】
生体成分中の活性型ＨＧＦＡを定量する２抗体サンドイッチアッセイ法とは、例えば、活性型ＨＧＦＡを特異的に測定する方法であって、（１）活性型ＨＧＦＡ特異的抗体の一種または複数を含むものからなる試薬を、検体中の活性型ＨＧＦＡと反応させ、免疫反応物を生成させる工程、（２）免疫反応物を分離した後、免疫反応物中のＨＧＦＡを認識する標識抗体と反応させる工程、及び（３）免疫反応物に結合した標識抗体を測定する工程を含む方法、または、
【００５０】
活性型ＨＧＦＡを特異的に測定する方法であって、（１）活性型ＨＧＦＡと活性型ＨＧＦＡ特異的抗体の一種または複数を第一次抗体として含むものからなる試薬、検体中の活性型ＨＧＦＡと反応させ、免疫反応物を生成させる工程、（２）免疫反応物を分離した後、免疫反応物中のＨＧＦＡを認識する第二次抗体と反応させ、免疫反応物を生成させる工程、（３）免疫反応物を分離した後、免疫反応物中の第二次抗体を認識する標識抗体を反応させる工程、及び（４）免疫反応物に結合した標識抗体を測定する工程を含む方法、が挙げられる。
【００５１】
具体的には、マイクロタイターウェルやマイクロ磁気ビーズなどの固相に対して活性型ＨＧＦＡ特異的ポリクローナル抗体又は活性型ＨＧＦＡ特異的モノクローナル抗体を、定法により一次抗体として固相化する。次に、この固相表面の過剰な蛋白質結合部位を、ウシ血清アルブミン、スキムミルクまたはゼラチン等でブロッキングする。この後、活性型ＨＧＦＡを含む生体成分を添加して固相上で免疫反応物を形成させた後に洗浄する。次にＨＧＦＡを認識する標識ポリクローナル抗体または標識モノクローナル抗体を二次抗体として添加して反応させる。この際、一次抗体としてモノクローナル抗体を用いた場合は、一次抗体とエピトープが異なる活性型ＨＧＦＡ特異的モノクローナル抗体を標識したものを二次抗体として使用しても良い。さらに洗浄後、標識抗体量を測定することにより、生体成分中の活性型ＨＧＦＡ量を測定することが出来る。
【００５２】
ここで使用するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の標識とは、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼなどの酵素でもよいし、フルオレッセイン誘導体やローダミン誘導体などの蛍光物質でもよい。またアクリジニウムエステル等の化学発光物質であってもよいし、125Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐなどのラジオアイソトープでもよい。すなわち、発色、蛍光、化学発光、電気化学発光、放射活性を測定する方法を用いて生体成分中の活性型ＨＧＦＡ量を定量することが本発明に含まれる。また、二次抗体をビオチン化標識し、アビジンと複合体を形成しているアルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシターゼ、β―ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、フルオレッセイン誘導体、ローダミン誘導体、アクリジニウムエステル等の化学発光物質、125Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐなどのラジオアイソトープを検出することも本発明に含まれる。
【００５３】
＜５＞活性型ＨＧＦＡを特異的に測定または染色するキット活性型ＨＧＦＡ特異的測定キットまたは活性型ＨＧＦＡ特異的染色キットとは、活性型ＨＧＦＡを測定または検出することを特徴とする、疾患の診断キットである。ここで述べる特異的とは、活性型ＨＧＦＡを測定または検出する際、不活性型ＨＧＦＡが活性型ＨＧＦＡの測定値もしくは検出値に影響を与えないことを意味する。活性型ＨＧＦＡを測定することにより、疾患状態にある患者、例えば糸球体腎炎、腎炎、肝炎、膵臓炎、肺炎、腸炎、胃炎をはじめとする臓器障害の患者、癌患者、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞などをはじめとする血栓症の患者の診断および予知が可能であることが本発明により初めて判明した。したがって、活性型ＨＧＦＡを測定または検出することにより、前記のような各種疾患を検出することができる。本発明においては、疾患を診断する目的の活性型ＨＧＦＡ特異的測定キットであるならば、そのキットを構成する材料、方法には限定されない。
【００５４】
具体的には、例えば、電気遊動法、ＨＰＬＣ法、各種カラムクロマトグラフィー法、各種アレー、チップ、表面プラズモン共鳴装置等を用い、活性型ＨＧＦＡを測定または検出することにより、疾患を診断するキットなどが挙げられる。より具体的には、抗体を用いた免疫学的方法により活性型ＨＧＦＡを測定または検出するキットが挙げられる。抗体としては、前記の活性型ＨＧＦＡを認識し不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識しない抗体の少なくとも一つ以上が用いられる。
【００５５】
例えば、本発明のキットが２抗体サンドイッチアッセイ法によるものである場合には、活性型ＨＧＦＡを特異的に測定するキットであって、（１）活性型ＨＧＦＡと活性型ＨＧＦＡ特異的抗体の一種または複数を含むものからなる試薬を検体中の活性型ＨＧＦＡと反応させ、免疫反応物を生成させる工程、（２）免疫反応物を分離した後、免疫反応物中のＨＧＦＡを認識する標識抗体と反応させる工程、及び（３）免疫反応物に結合した標識抗体を測定する工程を含んだキット、または、
【００５６】
活性型ＨＧＦＡを特異的に測定するキットであって、（１）活性型ＨＧＦＡ特異的抗体の一種または複数を第一次抗体として含むものからなる試薬を検体中の活性型ＨＧＦＡと反応させ、免疫反応物を生成させる工程、（２）免疫反応物を分離した後、免疫反応物中のＨＧＦＡを認識する第二次抗体と反応させ、免疫反応物を生成させる工程、（３）免疫反応物を分離した後、免疫反応物中の第二次抗体を認識する標識抗体を反応させる工程、及び（４）免疫反応物に結合した標識抗体を測定する工程を含んだキット、が挙げられる。
【００５７】
このキットは、少なくとも活性型ＨＧＦＡ特異的モノクローナル又は活性型ＨＧＦＡ特異的ポリクローナル抗体を含み、さらに、活性型ＨＧＦＡを検出または測定する操作に必要な構成要素が含まれていてもよい。その構成要素の例として、標準蛋白質としての活性型ＨＧＦＡ、不活性型ＨＧＦＡ、酵素および基質等が挙げられる。キットに含まれるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、酵素などの標識物質が結合した状態でもよいし、これらの抗体を認識する標識抗体が含まれていてもよい。また適切な各種緩衝液、抗原希釈液、反応希釈液、基質溶液、反応停止液等が含まれていてもよい。本キットにはラベルが付き、活性型ＨＧＦＡ検出および定量に必要な材料が封入された容器が含まれていてもよい。適した容器としては、例えばガラス、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ナイロン、テフロン（登録商標）などの各種プラスチックを材質とした容器が挙げられる。キットには、好ましくは、上述した活性型ＨＧＦＡを検出または測定するのに必要な材料、容器とともに、活性型ＨＧＦＡを検出または測定する方法が記載された説明書が含まれる。
【００５８】
＜６＞ヒト疾患に関する活性型ＨＧＦＡ特異的抗体とその使用法本発明による活性型ＨＧＦＡ特異的抗体を使用した方法、キットを用いることにより、疾患状態にある患者から採取された生体成分中の活性型ＨＧＦＡを検出することが出来、また定量することも可能である。活性型ＨＧＦＡを検出する生体材料は特に限定されず、組織、血清、血漿、尿、漿液、髄液、組織の抽出液等、いずれの生体材料も適切な前処理を行うことによって適応可能である。疾患状態にある患者の生体材料中に存在する活性型ＨＧＦＡを検出または定量することにより、その疾患の診断、予知、経過を判断することが可能である。疾患の例として、糸球体腎炎、腎炎、肝炎、膵臓炎、肺炎、腸炎、胃炎などをはじめとする臓器炎症、癌、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞などをはじめとする血栓症などが挙げられる。
【００５９】
特に腎炎の例としては、メサンギウム増殖性腎症、IgA腎症、膜性増殖性腎炎、膜性腎症、巣状糸球体硬化症、急性腎不全、溶連菌感染後急性糸球体腎炎、慢性・急性間質性腎炎、ネフローゼ症候群などが挙げられる。また狭心症、心筋梗塞の例としては安定労作時狭心症、不安定狭心症、急性心筋梗塞、陳旧性心筋梗塞、安定狭心症が挙げられ、冠動脈インターベンション施行患者、経食道心エコー施行患者、下肢動脈バイパス手術施行患者、大動脈バルーンパンピング施行患者、急性大動脈解離患者などの疾患状況、予後を知ることも可能である。
【００６０】
また活性型ＨＧＦＡ特異的抗体は、活性型ＨＧＦＡの活性を特異的に抑制する効果が期待できるため、活性型ＨＧＦＡにより引き起こされる疾患の治療薬として使用することが期待される。例えば、活性型ＨＧＦＡは不活性型ＨＧＦに作用してこれを活性化する性質を
有している。このため活性型ＨＧＦＡの活性を抑制する抗体は、生体中で出現する活性型ＨＧＦ量の増加を抑制し、活性型ＨＧＦにより引き起こされることが想定されている疾患（WO96/38557：ジェネンティックインコーポレーテッド、ＨＧＦの分子医学（１９９８年出版）メディカルレビュー社）、例えば胃癌、肺癌、結腸癌、脾癌、肝臓癌などの癌およびその転移、糸球体腎炎をはじめとする各種腎炎などの治療薬、予防薬として使用することが可能である。活性型ＨＧＦＡの活性を抑制するマウスモノクローナル抗体の存在（モノクローナル抗体Ｐ１−４）は宮澤ら（J. Biol. Chem., 271:3615-3618 (1996)）に記載されているが、このＰ１−４抗体は活性型ＨＧＦＡおよび不活性型ＨＧＦＡの両方に反応することが本発明者らの検討によって明らかとなっている。生体内には不活性型ＨＧＦＡが多量に存在することから、活性型ＨＧＦＡの活性抑制のために極めて多量のＰ１−４抗体が必要と考えられる。これに対し、本発明の活性型特異的抗体は、活性型ＨＧＦＡの活性を抑制する抗体であると推定されるので、少量で上記疾患の治療薬として極めて優れた効果を発揮すると思われる。この目的で使用する抗体は、遺伝子工学的手法を使用してヒト化しておくと良い。抗体のヒト化は、例えば特表平11-506327などに記載されている当業者によく知られた方法によって実施することができる。
【００６１】
＜７＞活性型ＨＧＦＡを測定するための採血方法および採血管活性型ＨＧＦＡを検出または測定するための生体成分は特に限定されないが、通常、血液又はその分画物もしくは処理物であり、望ましくは血液、血清、クエン酸血漿、ヘパリン血漿、ＥＤＴＡ血漿等の血漿など、血管より採取可能な生体成分又はその分画物もしくは処理物や、採取が容易な尿が望ましい。特に生体成分の採取時および保管時に、生体成分中に混在する不活性型ＨＧＦＡが活性型ＨＧＦＡへ人為的に変換されることを防ぐ操作が必要である。例えば採取した血清または血漿、尿等は採取後、ただちに氷冷等の低温下におくことが望ましい。
【００６２】
また、迅速に血管から血液、血清、クエン酸血漿、ヘパリン血漿、ＥＤＴＡ血漿を採取するために、採血管を使用することが望ましい。特に活性型ＨＧＦＡを検出または測定するための血液は、血漿、特にクエン酸血漿の状態が良い。また活性型ＨＧＦＡを検出または測定するための生体成分に対して種々のプロテアーゼインヒビターを添加する方法も良い。例えば生体成分の採取時および保管時に生体成分中に含まれる不活性型ＨＧＦＡが活性型ＨＧＦＡへ人為的に変換されることを防ぐため、例えば選択的なトロンビン阻害薬であるアルガトロバンを採取した生体試料に添加すると良好な結果が得られる。特にあらかじめアルガトロバンを添加した血液、血清、クエン酸血漿、ヘパリン血漿、ＥＤＴＡ血漿取得用採血管を使用すると良い。
【００６３】
＜８＞活性型ＨＧＦＡに対するプロテアーゼインヒビターのスクリーニング方法活性型ＨＧＦＡを認識する抗体であって、不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識せず、活性型ＨＧＦＡとプロテアーゼインヒビターの複合体を認識しない抗体を使用することにより、活性型ＨＧＦＡに対して作用するプロテアーゼインヒビターをスクリーニングすることが可能である。
【００６４】
上記の性質を有する抗体は、活性型ＨＧＦＡ特異的抗体から、さらに活性型ＨＧＦＡとプロテアーゼインヒビターの複合体を認識しない抗体を選択することによって、取得することができる。
【００６５】
上記スクリーニング法として具体的には、（１）活性型ＨＧＦＡとそのプロテアーゼインヒビターの候補となる化合物を混合して反応させる工程、（２）活性型ＨＧＦＡとプロテアーゼインヒビターの候補となる化合物を混合したものに対し、活性型ＨＧＦＡを認識する抗体であって、不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識せず、活性型ＨＧＦＡとプロテアーゼインヒビターの複合体を認識しないモノクローナル抗体を添加する工程、（３）免疫反応物を分離した後、活性型ＨＧＦＡとプロテアーゼインヒビターの候補となる化合物からな
る複合体と、前記抗体からなる免疫反応物量の低下を測定する工程が挙げられる。この免疫反応物量の低下を検出する方法としては、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、電気化学発光イムノアッセイ、イムノブロッティング法、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、イムノブロッティングの応用例であるマイクロアレイ法、蛍光偏向解消法、蛍光相関分散法、さらには表面プラズモン共鳴装置を利用したものが利用可能である。例えば活性型ＨＧＦＡを認識する抗体であって、不活性型ＨＧＦＡを実質的に認識せず、活性型ＨＧＦＡとプロテアーゼインヒビターの複合体を認識しない抗体をセンサーチップ上に結合させた後、このチップをとりつけた表面プラズモン共鳴装置に活性型ＨＧＦＡを含む生体試料を流し、応答シグナルの時間変化を追跡することによりプロテアーゼインヒビターをスクリーニングすることが可能である。
【００６６】
またここで使用する抗体は、そのまま用いてもよいし、定法であるパパイン処理によって得られるＦａｂまたはペプシン処理によって得られるＦ（ａｂ'）2もしくＦ（ａｂ'）の形態を持った抗体を用いても良い。またここで使用する抗体の性質を有する抗体の断片も使用可能である。
【００６７】
[実施例]
以下に実施例を挙げ本発明を具体的に説明するが, 本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６８】
不活性型ＨＧＦＡおよび活性型ＨＧＦＡの作製
不活性型ＨＧＦＡの調製は、特開平6-153946に記載されているＨＧＦＡ前駆体をコードするＨＧＦＡ ｃＤＮＡを使用し、特開平6-153966に記載された方法に準じ、組換え体不活性型ＨＧＦＡを作製することによって行った。すなわち不活性型ＨＧＦＡの前駆体の全長である６５５アミノ酸をコードするＨＧＦＡ ｃＤＮＡを、定法により動物細胞発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen社）のＣＭＶプロモーター下流に挿入した。
【００６９】
得られた発現ベクターを、チャイニーズハムスター卵巣細胞由来である動物細胞株、ＣＨＯ細胞へBIOSEPRA社TRANSFECTAMを使用し、添付の方法に従って導入した。この後、導入した発現ベクター上に存在するネオマイシン耐性遺伝子の性質を利用し、ＨＧＦＡ ｃＤＮＡを発現しているＣＨＯ細胞を選択した。すなわち400μg/mlのネオマイシンおよび５％牛胎児血清を含むＥＲＤＦ（極東製薬社製）培地中、５％ ＣＯ2下、３７℃にて生育可能な細胞を選択した。さらに選択したＨＧＦＡ ｃＤＮＡを発現しているＣＨＯ細胞を100μMナファモスタットメシレート，400μg/mlネオマイシンおよび５％牛胎児血清を含むＥＲＤＦ（極東製薬社製）培地にて約１０日間の培養を行い約５Ｌで培養上清を得た。
【００７０】
得られた培養上清をフィルター濾過後、10mM EDTA, 10mMベンズアミジン, 100μMナファモスタットメシレート, 大豆トリプシンインヒビター,1000KIU/mlアプロチニンを含むプロテアーゼインヒビターを添加し、さらに0.5M酢酸緩衝液（ｐＨ4.5）を添加することにより、培養上清のｐＨを約5.8に調整した。この培養上清を、100mM NaClを含む50mM酢酸緩衝液（pH5.5）で平衡化した硫酸化セルロファインカラム（生化学工業(株)）に添加し、100mM NaClを含む50mM酢酸緩衝液（pH5.5）で洗浄を行った。この後、500mM NaCl, 0.05% CHAPS（3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid）を含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）で溶出操作を行い、不活性型ＨＧＦＡ画分を得た。
【００７１】
得られた画分は、150mM NaClを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）に透析後、Ａ６モノクローナル抗体アフィニィティーカラム（下村ら、J. Biol. Chem., 268:22927-22932 (1993)）にかけた後に、50mMグリシン−HCl(pH3.0)緩衝液で溶出を行った。得られた
不活性型ＨＧＦＡ画分は100mM NaCl, 0.05% CHAPSを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.3）に置換した。この一部はプロテアーゼインヒビターであるアルガトロバンを終濃度40μＭになる様添加して、不活性型ＨＧＦＡとして-40℃下で保存した。一方、アルガトロバンを添加しなかった不活性型ＨＧＦＡに対し、その重量比で1/100量のプラズマカリクレインおよびトロンビンを添加し37℃下で充分反応させることにより活性型36kDa HGFAを得た。
【００７２】
またアルガトロバンを添加しなかった不活性型ＨＧＦＡに対し、ＨＧＦＡに対する重量比で1/100量のトロンビンおよび10μg/mlのデキストラン硫酸を添加し、37℃下で２０分反応させることにより、活性型98kDa HGFAを得た。各活性型ＨＧＦＡ画分はそれぞれ再度、Ａ６モノクローナル抗体アフィニィティーカラムにて精製後、100mM NaCl, 0.05% CHAPSを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.3）で平衡化したAsahipak ＧＳ５２０ＨＱカラム（昭和電工社製）を使用したHPLC操作を実施した後、活性型36kDa HGFAおよび活性型98kDa HGFAとして、-40℃下で保存した。
【実施例２】
【００７３】
活性型ＨＧＦＡ特異的モノクローナル抗体スクリーニング用ＥＬＩＳＡプレートの作製
実施例１で作製した活性型36kDa HGFAまたは活性型98KDa HGFをハイブリドーマスクリーニング用の抗原として、最終濃度１μg/ｍｌになる様に生理的リン酸水素緩衝液（PBS(-)）に希釈後、96wellプレートのウェルに100μｌずつ添加した。この後、４℃下にて２４時間保存して、各抗原を96ウェルプレートに吸着させた。この抗原付着プレートより溶液を除き、５%ウシ血清アルブミン（以下「BSA」と略す）を含むPBS(-)を250μlずつウェルに添加して、４℃にて一昼夜（12時間程度）または37℃にて２時間以上おくことによりブロッキング操作を行い、活性型ＨＧＦＡスクリーニング用ＥＬＩＳＡプレートとして、４℃下にて保存した。
【００７４】
一方、実施例１で作製した不活性型ＨＧＦＡをハイブリドーマスクリーニング用の抗原として、最終濃度１μg/ｍｌになる様にPBS(-)で希釈した。この後、96ウェルプレートのウェルに100μｌずつ添加し、４℃下にて２４時間保存して各抗原を96ウェルプレートに吸着させた。この抗原付着プレートより溶液を除き、５% BSAを含むPBS(-)を250μlずつウェルに添加して４℃にて一昼夜（12時間程度）、または37℃にて２時間以上おくことによりブロッキング操作を行い、不活性型ＨＧＦＡスクリーニング用ＥＬＩＳＡプレートとして、４℃下にて保存した。これらのＥＬＩＳＡプレートは、使用直前にプレート中のブロッキング溶液を除いて使用した。
【実施例３】
【００７５】
活性型ＨＧＦＡ特異的モノクローナル抗体の作製
実施例１で作製した活性型36kDa HGFA100μgまたは98KDa HGFA100μgを含む溶液を、同容量のフロイント完全アジュバントとともに、Balb/cマウスの皮下および腹腔内に２週間間隔で６回投与した。マウスの血清中に抗体が産生していることを確認後、100μgのＨＧＦＡを含む溶液を尾静脈内に投与した。３日後に脾臓を取り出し、「単クローン抗体実験マニュアル」（講談社サイエンティフィック1987年出版）に従い、ポリエチエングリコール1500を使用して、脾臓細胞をミエローマ細胞P3U1と細胞融合させ、96ウェルプレートに注入後ＨＡＴ培地を添加して１４日間の培養を行った。
【００７６】
この後、各活性型ＨＧＦＡに対して特異的なモノクローナル抗体を培地中に産生するハイブリドーマの選別を行った。すなわち実施例２で作製した36kDa HGFAまたは活性型98KDa HGFAスクリーニング用ＥＬＩＳＡプレートに対して、選択するハイブリドーマの培養上清を添加し、培養上清に存在するモノクローナル抗体の反応性を解析した。各活性型スクリーニング用ＥＬＩＳＡプレートに対し、選択するハイブリドーマの培養上清を100μl/ウ
ェルにて添加した後４℃下にて２時間以上反応させた。
【００７７】
この後、0.05% Tween20を含むPBS(-)液（以下「PBST液」と略す）を用いて十分な洗浄を行ない、HRP（西洋わさびペルオキシターゼ）標識ヒツジ抗マウスIgG・Fcポリクローナル抗体（DAKO社）１μg/mlおよび１％ BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。PBST液で充分に洗浄操作を行った後、0.4mg/mlオルトフェニレンジアミン（OPD、Sigma社 P-9029）および0.015〜0.03%過酸化水素溶液を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0）を添加して室温にて反応させ、発色を行なった。この後１Ｎ H2SO4溶液を添加して反応を止め、測定波長490nm、リファレンス波長650nmにて測定を行なった。
【００７８】
次に、ここで得られた活性型36kDa HGFAまたは活性型98KDa HGFAに対して反応性を有するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清を用い、実施例２で作製した不活性型ＨＧＦＡスクリーニング用ＥＬＩＳＡプレートにて同様にスクリーニングを行い、不活性型ＨＧＦＡに対して反応性を全く示さないハイブリドーマを選択した。このスクリーニングにより、活性型36kDa HGFAを認識するモノクローナル抗体であって、不活性型HGFAを実質的に認識しないモノクローナル抗体、または活性型98KDa HGFAを認識するモノクローナル抗体であって、不活性型ＨＧＦＡを認識しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（AHGA-A、AHGA-B、AHGA-C）が得られた。得られた各ハイブブリドーマは、限界希釈法による４回のクローニング操作後、培養上製を回収してプロテインＡが結合したアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシアバイオテク製）により、モノクローナル抗体の精製を行った。ハイブリドーマクローンAHGA-Aは、平成１３年１０月１９日より、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、ＦＥＲＭ ＢＰ−７７７９の受託番号で寄託されている。
【実施例４】
【００７９】
活性型ＨＧＦＡ特異的モノクローナル抗体の反応特異性解析
実施例３にて作製・精製された活性型ＨＧＦＡ特異的モノクローナル抗体のうち、ハイブリドーマクローンAHGA-A, AHGA-BおよびAHGA-C由来のモノクローナル抗体に関する反応性を解析した。このため、実施例２にて作製した活性型36kDaHGFAもしくは活性型98KDa HGFAスクリーニング用ＥＬＩＳＡプレートまたは不活性型ＨＧＦＡスクリーニング用ＥＬＩＳＡプレートに対して、ハイブリドーマクローンAHGA-A， AHGA-BおよびAHGA-C由来のモノクローナル抗体約１μg/mlおよび１％BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加して、４℃下にて２時間以上反応させた。
この後、0.05% Tween20を含むPBS(-)液（以下「PBST液」と略す）を用いて十分な洗浄を行ない、HRP標識ヒツジ抗マウスIgGポリクローナル抗体（DAKO社）１μg/mlおよび１％
BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。PBST液で充分に洗浄操作を行った後、0.4mg/mlオルトフェニレンジアミン（OPD、Sigma社 P-9029）および0.015〜0.03%過酸化水素溶液を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0）を添加して室温にて反応させ、発色を行なった。
【００８０】
この後、１Ｎ H2SO4溶液を添加して反応を止め、測定波長490nm、リファレンス波長650nmにて測定を行なった。測定結果を図１に示す。ハイブリドーマクローンAHGA-A、AHGA-B由来のモノクローナル抗体は、活性型36kDa HGFAと反応し、不活性型ＨＧＦＡとは反応しなかった。またハイブリドーマクローンAHGA-Cは、活性型98kDa HGFAと反応し、不活性型ＨＧＦＡとは反応しなかった（図１）。一方、ＨＧＦＡに対する既存のモノクローナル抗体（7E10, P1-4, A-1, A-6, A-23,A-32, A-51, A-75）に関して、活性型36kDa HGFAおよび不活性型ＨＧＦＡに対する反応性を解析した結果、活性型および不活性型ＨＧＦＡの両者に対して同等の反応性を示し、本発明で得られたモノクローナル抗体の様に活性型ＨＧＦ
Ａに対して特異的な反応性を有していなかった。
【実施例５】
【００８１】
活性型ＨＧＦＡ特異的モノクローナル抗体の解離定数測定
実施例３にて作製・精製された活性型ＨＧＦＡ特異的モノクローナル抗体のうち、ハイブリドーマクローンAHGA-A由来のモノクローナル抗体について解離定数を測定した。活性型HGFAを固相化し、ＢＳＡでブロッキングを行った活性型HGFA固相化プレートに対して抗体濃度を変えて添加し、平衡状態に達するまで十分に反応させた（２時間以上）。この後、0.05% Tween20を含むPBS(-)液（以下「PBST液」と略す）を用いて十分な洗浄を行ない、HRP（西洋わさびペルオキシターゼ）標識ヤギ抗マウスIgG・Fcポリクローナル抗体（ＩＣＮ社）１μg/mlおよび１％ BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。PBST液で充分に洗浄操作を行った後、0.4mg/mlオルトフェニレンジアミン（OPD、Sigma社 P-9029）および0.015〜0.03%過酸化水素溶液を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0）を添加して室温にて反応させ、発色を行なった。この後、１Ｎ H2SO4溶液を添加して反応を止め、測定波長490nm、リファレンス波長650nmにて測定を行なった。測定結果よりスキャチャードプロットを行い、解離定数を求めた。結果は４．０５×１０-10Ｍであった。この結果は、本発明の抗体の親和性が高いことを示している。
【実施例６】
【００８２】
活性型ＨＧＦＡを特異的に認識し、活性型ＨＧＦＡとプロテアーゼインヒビターの複合体を認識しないモノクローナル抗体の作製
実施例３にて選択された活性型ＨＧＦＡを特異的に認識し、不活性型ＨＧＦＡを認識しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに対し、さらに以下のスクリーニングを行った。実施例２で作製した活性型36kDa HGFAまたは活性型98KDa HGFAスクリーニング用ＥＬＩＳＡプレートのブロッキング溶液を除いた後、プロテアーゼインヒビターであるナファモスタットメシレート200μMを含むPBS(-)を20μlずつウェルに添加して室温で１時間反応させ、活性型ＨＧＦＡとナファモスタットメシレートとの複合体を形成させた。この後、選択するハイブリドーマの培養上清を100μl/ウェルにて添加した後４℃下にて２時間反応させた。
【００８３】
この後0.05% Tween20を含むPBS(-)液（以下PBST液と略す）を用いて十分な洗浄を行ない、HRP標識ヒツジ抗マウスIgGポリクローナル抗体（DAKO社）１μg/mlおよび１％ BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。PBST液で充分に洗浄操作を行った後、0.4mg/mlオルトフェニレンジアミン（OPD、Sigma社 P-9029）および0.015〜0.03%過酸化水素溶液を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0）を添加して室温にて反応させ、発色を行なった。
【００８４】
この後１Ｎ H2SO4溶液を添加して反応を止め、測定波長490nm、リファレンス波長650nmにて測定を行なった。このスクリーニングにより、活性型36kDa HGFAとナファモスタットメシレートの複合体を認識しないモノクローナル抗体を選択した。選択されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンをAHGA-Dとした。得られた各ハイブブリドーマは限界希釈法による４回のクローニング操作後、培養上製を回収してＰｒｏｔｅｉｎＡが結合したアフィニティークロマトグラフィーによりモノクローナル抗体の精製を行った。
【実施例７】
【００８５】
活性型ＨＧＦＡを特異的に認識し、活性型ＨＧＦＡとプロテアーゼインヒビターの複合体を認識しないモノクローナル抗体の反応特異性解析
実施例６にて選択されたハイブリドーマクローンAHGA-D由来のモノクローナル抗体の反応性を解析した。実施例２にて作製した活性型36kDa HGFAスクリーニング用ＥＬＩＳＡプレートに対して、0μM, 0.820μM, 7.40μM, 22.20μM, 2000μMの濃度のナファモスタット
メシレートを含むPBS(-)を20μlずつウェルに添加して室温で１時間反応させ、活性型ＨＧＦＡとナファモスタットメシレートとの複合体を形成させた。この後、ハイブリドーマクローンAHGA-D由来のモノクローナル抗体約１μg/ml, １％ BSAおよび種々の濃度のナファモスタットメシレート（0μM, 0.820μM, 7.40μM, 22.20μM, 2000μM）を含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加して、４℃下にて２時間以上反応させた。
【００８６】
この後、0.05% Tween20を含むPBS(-)液（以下「PBST液」と略す）を用いて十分な洗浄を行ない、HRP標識ヒツジ抗マウスIgGポリクローナル抗体（DAKO社）１μg/mlおよび１％ BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。PBST液で充分に洗浄操作を行った後、0.4mg/mlオルトフェニレンジアミン（OPD、Sigma社 P-9029）および0.015〜0.03%過酸化水素溶液を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0）を添加して室温にて反応させ、発色を行なった。
【００８７】
この後１Ｎ H2SO4溶液を添加して反応を止め、測定波長490nm、リファレンス波長650nmにて測定を行なった。測定結果を図２に示す。ハイブリドーマクローンAHGA-D由来のモノクローナル抗体は、プロテアーゼインヒビターであるナファモスタットメシレートと結合したＨＧＦＡに対して、著しく反応性が低下した。
【実施例８】
【００８８】
ＨＧＦＡに対するポリクローナル抗体およびその標識体の作製
ＨＧＦＡに対するポリクローナル抗体は、実施例１で調製した活性型36kDa HGFAおよび活性型98kDa HGFAならびに不活性型 HGFA各100μgずつ混合したものを抗原として、ウサギ皮下へ２週間間隔で７回投与した。血清中に抗体が産生していることを確認後、さらに10μgの各抗原を脈内に投与し、５日後に抗血清を取得た。さらに硫安沈殿操作後、プロテインＡカラムを使用した精製操作により、抗ＨＧＦＡポリクローナル抗体を取得した。この後、得られたＨＧＦＡポリクローナル抗体をビオチン標識することにより、ビオチン標識抗ＨＧＦＡポリクローナル抗体を調製した。
【実施例９】
【００８９】
活性型ＨＧＦＡ特異的測定系の構築
実施例４で使用したハイブリドーマクローンAHGA-A由来のモノクローナル抗体を一次抗体として使用した。このモノクローナル抗体を30μg/mlの濃度になるように0.05M炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ9.6）に溶解し、100μl/ウェルにて９６ウェルプレートへ添加し、４℃にて一昼夜（12時間程度以上）おいた。この一次抗体付着プレートより一次抗体溶液を除いた後、1% BSAを含むPBS(-)を250〜300μl/ウェルずつ添加し、４℃にて一昼夜（12時間程度）または37℃にて２時間以上おいた。このプレートからブロッキング溶液を除き、0.15M NaCl, 0.1% CHAPS,0.05% Tween20, 0.05% Az（アジ化ナトリウム）, 0.1% BSA, 20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5に溶解された種々の濃度（0, 0.69, 2.1, 6.2, 18.5, 55.6, 167, 500 ng/ml）の活性型36kDaＨＧＦＡまたは不活性型98kDa HGFAを100μｌずつ添加し、４℃下にて約２時間以上反応させた。
【００９０】
この後、500mM NaCl, 0.05% Tween 20, 20mM Tris-HCl pH7.5を組成とする洗浄液を使用して十分な洗浄を行なった後、実施例８で作製したビオチン標識抗ＨＧＦＡポリクローナル抗体１μg/mlおよび１％BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、３７℃インキュベーター中にて２時間反応させた。
【００９１】
次に上記の洗浄液を使用して十分な洗浄を行ない、HRP標識ストレプトアビジン（アマシャムファルマシアバイオテク、コードRPN1231）を２０００倍希釈した１％ BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。洗浄液液で充分に洗浄操作を行った後、0.4mg/mlオルトフェニレンジアミン（OPD、Sigma社 P-9029）および0
.015〜0.03%過酸化水素溶液を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0）を100μl/ウェルずつ添加して室温にて反応させ、発色を行なった。
【００９２】
この後１Ｎ H2SO4溶液を100μl/ウェルずつ添加して反応を止め、測定波長490nm、リファレンス波長650nmにて測定を行なった。この結果を図３に示す。図３ＡはＨＧＦＡの濃度、0〜500ng/mlの範囲で記載した。図３Ｂは図３Ａに記したＨＧＦＡの濃度のうち、0〜55.6ng/mlの範囲を拡大して示した。
【実施例１０】
【００９３】
健常人血液中おける活性型ＨＧＦＡ量の測定
実施例９で作製した活性型ＨＧＦＡ特異的測定系を用いて、健常人１４４人の血清を測定した。健常人血清は採取後に凍結して保存され、本実験の直前に解凍して使用した。まず実施例９で作製した一次抗体付着後にブロッキング操作を行った９６ウェルプレートに対し、あらかじめ0.15M NaCl, 0.1% CHAPS, 0.05% Tween20, 0.05% Az, 0.1% BSA, 20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5を50μlずつウェルに添加し、さらに健常人の血清または標準36kDa活性型ＨＧＦＡ（0, 0.69,2.1, 6.2, 18.5, 55.6, 167, 500 ng/ml）を50μlずつ添加した。この後、４℃下にて約２時間以上反応させ、500mM NaCl, 0.05% Tween 20, 20mM
Tris-HCl pH7.5を組成とする洗浄液を使用して十分な洗浄を行なった後、実施例８で作製したビオチン標識抗ＨＧＦＡポリクローナル抗体１μg/mlおよび１％BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、３７℃インキュベーター中にて２時間反応させた。次に上記の洗浄液を使用して十分な洗浄を行ない、HRP標識ストレプトアビジン（アマシャムファルマシアバイオテク、コードRPN1231）を２０００倍希釈した１％ BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。
【００９４】
洗浄液液で充分に洗浄操作を行った後、0.4mg/mlオルトフェニレンジアミン（OPD、Sigma社 P-9029）および0.015〜0.03%過酸化水素溶液を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0）を100μl/ウェルずつ添加して室温にて反応させ、発色を行なった。この後１Ｎ H2SO4溶液を100μl/ウェルずつ添加して反応を止め、測定波長490nm、リファレンス波長650nmにて測定を行なった。この後、標準36kDa活性型ＨＧＦＡ濃度とその発色量による検量線を作製し、健常人血清中の濃度を算出した。この結果を図４に示す。健常人血清においては、0ng/mlから58.5ng/mlまでの範囲を示し、平均は19ng/mlであった。
【実施例１１】
【００９５】
各種ヒト疾患患者血液中における活性型ＨＧＦＡ量の測定
実施例９で作製した活性型ＨＧＦＡ特異的測定系を用い、実施例１０の方法に従って各種ヒト疾患患者血清を測定した。患者数は、各疾患毎に５例とした。各血清は採取後に凍結して保存され、本実験の直前に解凍して使用した。その結果を表１に示す。糸球体腎炎、膵炎、癌、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞の患者血液中には、健常人（検体数９ 平均値19ng/ml）と比較して活性型ＨＧＦＡの濃度が高値であることが判った。
【００９６】
【表１】
2008048738.tif 000003
【実施例１２】
【００９７】
活性型ＨＧＦＡ測定用血液の採血方法と安定性の検討
健常人より血清、クエン酸血漿、ヘパリン血漿もしくはＥＤＴＡ血漿、またはアルガトロバンを終濃度40μＭ含む血清、クエン酸血漿、ヘパリン血漿もしくはＥＤＴＡ血漿を採取、調製し、それぞれを４℃または３７℃にて１２時間保管後、実施例１０に記載の方法にて活性型ＨＧＦＡ量を測定した。この結果を図５に示す。血清または血漿の保管による活性型ＨＧＦＡ量値の上昇は血清よりも血漿で少ないこと、この上昇はアルガトロバン添加により良く押さえられることが判った。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】活性型ＨＧＦＡ及び不活性型ＨＧＦＡに対するモノクローナル抗体の反応性を示す図。
【図２】活性型ＨＧＦＡとプロテアーゼインヒビターとの複合体と、モノクローナル抗体との反応性を示す図。
【図３】活性型ＨＧＦＡ測定系における活性型ＨＧＦＡおよび不活性型ＨＧＦＡとモノクローナル抗体との反応性を示した図である。図３ＡはＨＧＦＡの濃度、0〜500ng/mlの範囲で記載、図３Ｂは図３Ａに記したＨＧＦＡの濃度のうち、0-55.6ng/mlの範囲を拡大して示した。
【図４】健常人血清中における活性型ＨＧＦＡ量のヒストグラムを示した図である。
【図５】健常人の血清、クエン酸血漿、ヘパリン血漿、ＥＤＴＡ血漿における活性型ＨＧＦＡ値の保存安定性とアルガトロバン添加の効果を示した図である。
【図１】
2008048738.tif 000004
【図２】
2008048738.tif 000005
【図３】
2008048738.tif 000006
【図４】
2008048738.tif 000007
【図５】
2008048738.tif 000008
【配列表】
2008048738000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月23日(2007.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことを特徴とする、モノクローナル抗体の作製方法。
（１）不活性型肝細胞増殖因子アクティベーター（ＨＧＦＡ）の翻訳開始アミノ酸から数えて４０７番目のアルギニンと４０８番目のイソロイシン間で限定分解を受けることにより活性化している活性型ＨＧＦＡを抗原としてマウスを免疫する。
（２）マウスの脾臓から得た抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合し、ハイブリドーマを作製する。
（３）不活性型ＨＧＦＡをアルガトロバンを添加して調製する。
（４）上記（２）で得られたハイブリドーマの中から、前記活性型ＨＧＦＡと上記（３）で調製された不活性型ＨＧＦＡを用いて、該活性型ＨＧＦＡに対する解離定数が１×１０-8Ｍ以下であり、不活性型ＨＧＦＡに対する解離定数が１×１０-5Ｍ以上である抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
（５）得られたハイブリドーマの培養上清から前記モノクローナル抗体を調製する。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により作製された、不活性型ＨＧＦＡの翻訳開始アミノ酸から数えて４０７番目のアルギニンと４０８番目のイソロイシン間で限定分解を受けることにより活性化している活性型ＨＧＦＡに対する解離定数が１×１０-8Ｍ以下であり、不活性型ＨＧＦＡに対する解離定数が１×１０-5Ｍ以上であるモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項２に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系。
【請求項４】
請求項２に記載のモノクローナル抗体の１種又は複数種を用いて、活性型ＨＧＦＡを免疫学的方法により特異的に測定することを特徴とする、活性型ＨＧＦＡの測定方法。