(57)【要約】      （修正有）【課題】ＭＰＣなどのリン脂質極性基を有する（メタ）アクリル酸誘導体モノマーを含む新規共重合体及びその新規用途を提供すること。【解決手段】（メタ）アクリルアミド系化合物、（メタ）アクリル酸エステル、及び次式［Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４は互いに独立して、水素原子又はメチル基、Ｒ３は炭素数８〜２４の直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和の１価の炭化水素基、Ｒ５は炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、Ｒ６は炭素数１〜４の２価の炭化水素基、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基、Ａはエステル結合、アミド結合、ウレタン結合、エーテル結合からなる群から選択される２価の結合、Ｌは単結合又は連結基、Ｘは送達されるべき物質の残基。］：2008297488.tif 000028【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2008297488.tif 000021
で示される繰り返し単位、
式（II）：
【化２】
2008297488.tif 000022
で示される繰り返し単位、及び
式（III）：
【化３】
2008297488.tif 000023
で示される繰り返し単位
を含有する共重合体
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４は、互いに独立して、水素原子又はメチル基であり；
Ｒ３は、炭素数８〜２４の直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和の１価の炭化水素基（この炭化水素基は、非置換であるか、又はハロゲン若しくはアジド基で置換されている）であり；
Ｒ５は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり；
Ｒ６は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり；
Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、互いに独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり；
Ａは、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり；
Ｌは、単結合であるか又は連結基であり；
Ｘは、送達されるべき物質の残基である］。
【請求項２】
式（III）で示される繰り返し単位が
【化４】
2008297488.tif 000024
である、請求項１記載の共重合体。
【請求項３】
式（IV）：
【化５】
2008297488.tif 000025
で示される化合物、
式（Ｖ）：
【化６】
2008297488.tif 000026
で示される化合物、及び
式（VI）：
【化７】
2008297488.tif 000027
で示される化合物
を重合させて得られる共重合体
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ａ、Ｌ、及びＸは、請求項１に定義されたとおりである］。
【請求項４】
式（VI）で示される化合物が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである、請求項３記載の共重合体。
【請求項５】
Ｒ３が炭素数１２〜２４の炭化水素基である、請求項１〜４のいずれか１項記載の共重合体。
【請求項６】
Ｌが炭素数１〜１２の炭化水素基（この炭化水素基は、中断されていないか、あるいは互いに隣接しない酸素原子若しくは硫黄原子又はその両方により１箇所以上で中断されている）である、請求項１〜５のいずれか１項記載の共重合体。
【請求項７】
式（Ｉ）で示される単位と式（II）で示される単位と式（III）で示される単位との含有比が、モル比で０．１〜２：０．１〜２：１である、請求項１〜６のいずれか１項記載の共重合体。
【請求項８】
数平均分子量が１×１０３〜１×１０５である、請求項１〜７のいずれか１項記載の共重合体。
【請求項９】
送達されるべき物質が標識である、請求項１〜８のいずれか１項記載の共重合体。
【請求項１０】
請求項９記載の共重合体を含む、小胞体及びゴルジ体の標識用試薬。
【請求項１１】
所望の物質を小胞体及びゴルジ体に送達するための、請求項１〜８のいずれか１項記載の共重合体の使用。
【請求項１２】
所望の物質が標識である、請求項１１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ポリ（メタ）アクリレート共重合体、ならびにそれを用いて所望の物質を小胞体及びゴルジ体に送達する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質は、その他の膜構成成分とともに細胞膜とこれらの細胞小器官の間を循環している。ゴルジ体では、糖鎖がひとつずつ付加されて新たな糖脂質が合成され、リソソームでは、糖脂質が一つずつ糖鎖を除かれて分解される。エンドソームではエンドサイトーシスによって細胞膜から細胞内へ取り込まれた糖脂質がゴルジ体若しくはリソソームへと振り分けられる。また、ゴルジ体で合成された糖脂質やエンドサイトーシスで取り込まれた糖脂質の一部はここを通って細胞膜へと戻っていく。細胞の種類にもよるが、細胞膜の糖脂質は、30〜40分で半数が循環し、糖脂質組成の恒常性を維持している。膜間の移動は、ほとんどの場合、二層膜構造を維持した小胞を形成して行われる。
このような、糖脂質などの生合成、修飾に重要なゴルジ体や小胞体に所望の物質を選択的に送達する手法は知られてない。
【０００３】
ところで、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下「ＭＰＣ」ともいう）と（メタ）アクリレートとを重合させて得られる共重合体は、薬物放出システム（非特許文献１）、血液適合性材料（非特許文献２）、化粧料用粉体のコーティング剤（特許文献１）、糖鎖化合物吸着制御実験器具用のコーティング材料（特許文献２及び３）として、研究開発されている。
【特許文献１】特開２００４−１８９６５２号公報
【特許文献２】特開２００４−２７５８６２号公報
【特許文献３】特開２００４−２９０１１１号公報
【非特許文献１】石原一彦、上田智子、中林宣男、「リン脂質類似構造を有するハイドロゲル膜からの薬物放出特性」、高分子論文集、１９８９年、第４６巻、第１０号、ｐ.５９１−５９５
【非特許文献２】上田智子、石原一彦、中林宣男、「ハイドロゲルの血液適合性に及ぼす親水性基構造の影響」、生体材料、１９９１年、第９巻、第６号、ｐ.２８８−２９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、ＭＰＣなどのリン脂質極性基を有する（メタ）アクリル酸誘導体モノマーを含む新規共重合体及びその新規用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意研究の結果、所望の物質を担持した（メタ）アクリルアミド誘導体モノマーと、特定の（メタ）アクリル酸誘導体モノマーと、ＭＰＣなどのリン脂質極性基を有する（メタ）アクリル酸誘導体との新規共重合体を用いることによって、所望の物質を小胞体及びゴルジ体に選択的に送達できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は、
式（Ｉ）：
【化８】
2008297488.tif 000002
で示される繰り返し単位（以下「単位Ｉ」ともいう）、
式（II）：
【化９】
2008297488.tif 000003
で示される繰り返し単位（以下「単位II」ともいう）、及び
式（III）：
【化１０】
2008297488.tif 000004
で示される繰り返し単位（以下「単位III」ともいう）
を含有する共重合体
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４は、互いに独立して、水素原子又はメチル基であり；
Ｒ３は、炭素数８〜２４の直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和の１価の炭化水素基（この炭化水素基は、非置換であるか、又はハロゲン若しくはアジド基で置換されている）であり；
Ｒ５は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり；
Ｒ６は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり；
Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、互いに独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり；
Ａは、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり；
Ｌは、単結合であるか又は連結基であり；
Ｘは、送達されるべき物質の残基である］、ならびにその共重合体を用いる所望の物質の小胞体及びゴルジ体への送達方法に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の共重合体は、生体適合性に優れ、所望の物質を小胞体及びゴルジ体に選択的に送達することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
前記式（Ｉ）〜（III）中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４は、互いに独立して、水素原子又はメチル基である。Ｒ１は重合反応性の点から好ましくは水素原子である。Ｒ２及びＲ４は得られる共重合体の安定性の点から好ましくはメチル基である。
【０００９】
前記式（II）中、Ｒ３は、炭素数８〜２４の直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和の１価の炭化水素基である。この炭化水素基は、非置換であるか、又はハロゲン若しくはアジド基で置換されていてもよいが、好ましくは非置換である。ハロゲン若しくはアジド基で置換された炭化水素基として、１２−ブロモドデシル基や１２−アジドドデシル基が例示される。
上記の炭化水素基の炭素数は、通常８〜２４であるが、所望の物質を好適に送達できる点から、１２〜２４が好ましく、その点に加えて、送達された物質が送達された小胞体やゴルジ体から漏れにくくなることも加味できる点から、１８〜２４が好ましい。
上記の不飽和の炭化水素基は、炭素−炭素単結合の他に、炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合あるいはその両方を、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個含んでいてもよい。上記炭化水素基は、得られる共重合体に良好な細胞膜透過性を付与できる点から、飽和しているものが好ましい。
上記炭化水素基として、ラウリル基、トリデシル基、ミリスチル基、ペンタデシル基、パルミチル基、マルガリル基、ステアリル基、ノナデシル基、アラキジル基、ベヘニル基などの直鎖の高級アルキル基；イソステアリル基などの分岐鎖の高級アルキル基；ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノール基、リノレル基、アラキドル基、１２−ドコセル基などの不飽和の高級炭化水素基が例示される。また、これらの中でも、得られる共重合体に細胞膜との良好な親和性を付与できることから、ミリスチル基、パルミチル基、ステアリル基、特にパルミチル基が好ましい。
【００１０】
前記式（III）中、Ｒ５は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基：−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは、本発明の共重合体に適切な水溶性と生体適合性を付与する単位IIIの機能を損なわない限り特に制限されず、例えば、１〜１０である。なお、該ポリオキシエチレン基は−Ｏ−を介して基Ａと結合する）であり、好ましくは炭素数１〜６の２価の炭化水素基、特にアルキレンである。このようなアルキレンとして、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレンなどが例示され、好ましくは、エチレン、プロピレン、ブチレン、ヘキシレン、特にエチレンである。
Ｒ６は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基、好ましくは炭素数１〜４のアルキレン、例えばメチレン、エチレン、プロピレン、ブチレンなどが例示され、エチレンが特に好ましい。
Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、互いに独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基、例えばメチル又はエチルであり、特にＲ７、Ｒ８、及びＲ９が、同時に、水素原子又はメチル、特にメチルであることが好ましい。
Ａは、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、エステル結合、アミド結合、特にエステル結合が好ましい。
【００１１】
前記式（Ｉ）中、Ｌは単結合であるか又は連結基であり、連結基として、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和炭化水素基が例示される。この炭化水素基の炭素数は、得られる共重合体に高い水溶性を付与できる点から、好ましくは１〜１２、より好ましくは２〜１２、最も好ましくは２〜６である。この炭化水素基は、互いに隣接しない酸素原子若しくは硫黄原子又はその両方により、１箇所以上、好ましくは１箇所で中断されていてもよい。また、上記不飽和炭化水素基は二重結合若しくは三重結合又はその両方を１個以上含んでもよい。
【００１２】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、送達されるべき物質の残基である。送達されるべき物質は、上記Ｌ基に直接結合していてもよいし、あるいはエステル結合、アミド結合、ウレタン結合、エーテル結合、ジスルフィド結合、ジアゾ結合、チオカルバミド結合、アセタール結合、及びケタール結合などからなる群から選択される一つ以上の結合を介して結合していてもよい。上記結合は、例えば、送達されるべき物質に存在する官能基Ｚ１又は該物質に新たに導入された官能基Ｚ２と、上記Ｌ基に導入された官能基Ｚ３とを反応させて形成してもよい。これら官能基Ｚ１〜Ｚ３として、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキサミド基、イミデート基、イソチオシアナト基、及びイソシアナト基が例示される。
上記結合が小胞体及びゴルジ体において生理学的に切断、例えば加水分解又は酵素によって切断されると、送達されるべき物質が、本発明の共重合体から遊離し、小胞体及びゴルジ体中でその活性や機能を発揮し得ることもある。このような遊離を可能にして送達されべき物質の活性を発現させる点から、上記結合はエステル結合やアミド結合が好ましい。逆に送達されるべき物質の遊離を抑えることで細胞内の糖鎖合成を抑制することができる場合もある。このような遊離を抑える点から、上記結合はエーテル結合が好ましい。
【００１３】
上記の送達されるべき物質は、特に制限されず、ヌクレオチド；ペプチド、タンパク質、抗体、酵素；脂質；単糖（グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノースなど）、二糖（マルトース、イソマルトース、ラクトース、スクロースなど）、三糖（マルトトリオースなど）などのオリゴ糖、及び多糖；放射能標識、磁性標識、スピン標識、蛍光標識などの標識；糖鎖生合成の阻害剤；グリコシダーゼ阻害剤（デオキシノジリマイシンなど）などが例示される。特にグリコシダーゼ阻害剤（デオキシノジリマイシンなど）が有用である。
【００１４】
本願発明の共重合体は、互いに異なる２種以上の送達されるべき物質の残基をそれぞれ担持した２種以上の単位Ｉを含有することで、送達されるべき物質を２種以上担持することができる。例えば、所望の送達されるべき物質の他に、標識も送達されるべき物質として担持させることで、送達された箇所を標識することができるので便利である。
【００１５】
前記単位IIIは、本発明の共重合体に良好な水溶性と生体適合性が付与される点から、好ましくは
【化１１】
2008297488.tif 000005
である。
【００１６】
本発明の共重合体は、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互性の高い共重合体のいずれでもよく、前記単位Ｉ、II、及びIIIが共重合体分子全体に平均的に分布するランダム共重合体が、ゴルジ体や小胞体で基Ｘに対する生体反応が起こる際、反応場の均一性が保たれることから、好ましい。
【００１７】
本発明の共重合体において、単位Ｉは、送達されるべき物質を担持する役割を有する。単位IIは、本発明の共重合体に細胞膜貫通性と小胞体及びゴルジ体への標的指向性とを付与する役割を有する。単位IIIは、本発明の共重合体に水溶性と生体適合性を付与する役割を有する。このような各単位の役割によって、本発明の共重合体は、水溶性及び生体適合性を確保しつつ、細胞膜に貫通することもでき、その結果、送達されるべき物質を小胞体及びゴルジ体に選択的に送達せしめる。これら単位の比率を変化させることで、本発明の共重合体の細胞膜貫通性、標的指向性、水溶性、生体適合性を適宜制御することができる。
本発明の共重合体において単位Ｉと単位IIと単位IIIとの含有比は、本発明の共重合体に適切な細胞膜貫通性、水溶性、生体適合性などを付与する点から、モル比で０．１〜２：０．１〜２：１、特に０．１〜１：０．１〜１：１、とりわけ０．１〜１：０．２〜１：１であるのが好ましい。
上記の単位の比率を変化させる手法は、特に制限されず、原料となる単量体の混合比を調整する方法が例示される。
【００１８】
さらに、本発明の共重合体の数平均分子量は、本発明の共重合体に適切な細胞膜貫通性、水溶性、生体適合性などを付与する点から、１×１０３〜１×１０５、特に１×１０３〜１×１０４、とりわけ１×１０３〜５×１０３であるのが好ましい。なお、数平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定する。
【００１９】
本発明により所望の物質を小胞体及びゴルジ体に送達する方法としては、特に制限されるわけではないが、例えば、培養細胞に所望の物質を送達したい場合は、当該細胞の培養液に、送達したい所望の物質を担持する本発明の共重合体を添加して、適切な時間、例えば５〜１２０分間培養を続けることで、所望の物質を小胞体及びゴルジ体に送達することができる。
上記の培養条件は、培養される細胞の種類に応じて当業者が適宜選択してもよいが、血清を培地中に含むことが、所望の物質の小胞体及びゴルジ体への選択的送達が高まる点から好ましい。この点から、血清は上記培養液中に５〜１０％含有されるのが好ましい。血清は、細胞培養に通常用いられているものであれば特に制限されず、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、新生ウシ血清、仔ウシ血清、ウマ血清が例示される。
【００２０】
本発明の共重合体を適用する対象として、ゴルジ体や小胞体を有している真核細胞が例示される。ガン細胞、例えば子宮頸ガン由来細胞(Ｈｅｌａ)、メラノーマ細胞、腎臓細胞、脳細胞などが例示される。
【００２１】
本発明の共重合体は、単位IIが疎水性を示し、単位IIIが親水性を示すことから、溶液中である濃度以上になると、自己会合することが予想される。本発明の共重合体を培養細胞に投与する場合、小胞体及びゴルジ体に所望の物質を良好に送達する上で、ミセルを形成しない濃度（境界ミセル濃度）、例えば１〜１０００μg/ml、特に１〜２００μg/ml、とりわけ１〜１００μg/mlで、該細胞を培養又は分散させた液に添加することが好ましい。
このような共重合体の境界ミセル濃度（ｃｍｃ）は慣用の方法で測定できる。
例えば、ピレンを蛍光プローブとして用いて本発明の共重合体の凝集濃度を求めてもよい。ピレンは親水場では334.5nmに発光ピークを示し、疎水場では高波長側にシフトし、336.5nmに発光ピークを示す。共重合体が凝集しピレンが取り込まれると、発光ピークがシフトすることを利用して凝集濃度を求めることができる。溶液中での共重合体の濃度をさまざまに変化させ、それに伴うピレンの励起スペクトルを観察し、その蛍光強度比（334.5nm／336.5nm）を求め、この蛍光強度比を共重合体濃度のLog値に対してプロットする。その変極点を計算することで凝集濃度が求まる。
【００２２】
本発明の共重合体の製法を以下に説明するが、本発明の共重合体は必ずしも下記の製法によって得られるものに限定されるわけではない。
【００２３】
式（IV）：
【化１２】
2008297488.tif 000006
で示される化合物（以下「単量体Ｉ」ともいう）、
式（Ｖ）：
【化１３】
2008297488.tif 000007
で示される化合物（以下「単量体II」ともいう）、及び
式（VI）：
【化１４】
2008297488.tif 000008
で示される化合物（以下「単量体III」ともいう）
を重合させて、本発明の共重合体を得ることができる［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ａ、Ｌ、及びＸは、前記で定義されたとおりである］。
すなわち、本発明はこの方法で得られる共重合体にも関する。
【００２４】
単量体Ｉ、II、及びIIIを重合させて本発明の共重合体を得るのは、公知の方法、例えば、溶液重合、塊状重合、乳化重合、懸濁重合などの方法を用いて、必要に応じて不活性ガス、例えば、窒素、二酸化炭素、ヘリウムで置換して、ラジカル重合させる方法などで製造することもできる。この場合、溶媒中で、開始剤存在下で、０〜１００℃、好ましくは６０〜６５℃で、１０分〜４８時間、好ましくは４〜２０時間、より好ましくは４〜８時間、上記単量体を反応させることで本発明の共重合体を得ることができる。このとき、溶媒として用いることができるものは、上記単量体を溶解できるものであればよく、具体的には水、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ−ブタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ならびにこれらの混合溶媒、例えば、ＤＭＳＯと水との、エタノールとテトラヒドロフランとの混合溶媒が例示される。
開始剤としては、通常のラジカル開始剤であればいずれも用いることができ、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２’−アゾビス（２−（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）二塩酸塩、２，２’−アゾビス（２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）二塩酸塩、２，２’−アゾビスイソブチルアミド二水和物、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、過硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート、ｔ−ブチルペルオキシジイソブチレート、過酸化ラウロイル、２，２′−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、アゾビスマレノニトリルなどの脂肪酸アゾ化合物、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート（商品名「パーブチルＮＤ」、日本油脂（株）製、以下Ｐ−ＮＤと略記する）、又はこれらの混合物などが例示される。上記重合開始剤には各種レドックス系の促進剤を用いてもよい。重合開始剤の使用量は、単量体Ｉ、II、及びIIIの合計１００重量部に対して０．０１〜５．０重量部が好ましい。
このようにして得られた共重合体の精製は、再沈澱法、透析法、限外濾過法など一般的な精製法により行うことができる。
【００２５】
単量体Ｉは、特に制限されず、公知の方法を用いて製造できるが、以下の方法が例示される。先ず、連結基及びアミノ基を有する化合物：Ｈ２Ｎ−Ｌ−Ｚ３（式中、Ｌは連結基であり、Ｚ３基はヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基などの前記官能基である。Ｚ３基はＦmoc基などの保護基で保護されていてもよい）を公知の方法を用いて合成する。次いで、これにアクリル酸（又はメタクリル酸）：ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯＯＨを市販の縮合剤を用いて縮合させ、ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＨＮ−Ｌ−Ｚ３を得る。Ｚ３基が保護されている場合は脱保護してから、この得られた化合物のＺ３基と所望の送達させるべき物質に存在する前記官能基Ｚ１又はＺ２とを反応させて前記結合を形成させて、単量体Ｉ：ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＨＮ−Ｌ−Ｘを得ることができる。また、Ｌが単結合のときは、上記アクリル酸（又はメタクリル酸）のカルボキシル基と送達されるべき物質：Ｈ２Ｎ−Ｘに存在するアミノ基とをアミド結合させることで、単量体Ｉ：ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＨＮ−Ｘを得ることができる。
【００２６】
単量体IIは、公知の方法で製造することができる。
【００２７】
単量体IIIは、特開２００５−２３９９８８号公報に記載された方法などの公知の方法で製造することができる。単量体IIIとしては、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、４−（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルコリン、ω−（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２−アクリルアミドエチルホスホリルコリン、３−アクリルアミドプロピルホスホリルコリン、４−アクリルアミドブチルホスホリルコリン、６−アクリルアミドヘキシルホスホリルコリン、１０−アクリルアミドデシルホスホリルコリン、ω−（メタ）アクリルアミド（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルエタノールアミン、２−アクリロイルオキシエチルホスホリルエタノールアミン、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルエタノールアミン、４−（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルエタノールアミン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルエタノールアミン、１０−（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルエタノールアミン、ω−（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルエタノールアミンが例示される。
上記単量体中の（ポリ）オキシエチレン部分のオキシエチレン単位の繰り返し数は、本発明の共重合体に適切な水溶性と生体適合性を付与する単位IIIの機能を損なわない限り特に制限されず、例えば、１〜１０である。
【００２８】
特に好ましくは、本発明の共重合体に良好な水溶性と生体適合性を付与する点から、下式：
【化１５】
2008297488.tif 000009
で示される２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、これにより本発明が限定されるものではない。
なお、NMR測定には日本電子製のECP-600核磁気共鳴分光計(1H  600MHz；13C  150MHz)を使用して行った。共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）及び重量平均分子量（Ｍｗ）は、島津製作所製（ＬＣ−９Ａ、ＲＩＤ−６Ａ、ＳＰＤ−１０Ａ）を利用し、測定には東ソー製のカラム、TSK-gel G4000PWXL、G3000PWXL、G2000PWXL、G-Oligo PWXLを使用して、ＧＰＣ法で測定した。標準にはプルランを用いた。試薬は、和光純薬工業株式会社及び東京化成工業より購入し精製せずに用いた。カラムクロマトグラフィー用シリカゲルは、MERCK silica gel(70-230 mesh)を用いた。薄層クラマトグラフィーは、MERCK TLC plate silica gel(60 F2540.25mm)を用いた。
【００３０】
ラクトース担持単量体１の合成
【化１６】
2008297488.tif 000010
５−アミノ−１−ペンタノールをアクリル化してからグリコシレーションさせた。イミデート基を導入したアセチルラクトース(3)と、５−アミノ−１−ペンタノールをアクリル化して得たＮ−アクリルペンタノール(10)とをグリコシレーションさせたところ、約10％の収率で化合物７を得た。次いで、脱アセチル化を行ってラクトース担持単量体１を得た。
【００３１】
４−Ｏ−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド−α−トリクロロアセトイミデート(3)の合成
【化１７】
2008297488.tif 000011
アルゴン雰囲気下、アセチルラクトース(30ｇ、29.5mol)を80mlのDMFに溶解し、氷浴下でヒドラジン一水和物（1.43ml、1.0eq）を加えた。複数のアセチル基が外れるのを防ぐため、未反応物が残っている状態で濃縮した。続いて、アルゴン雰囲気下、1,2-ジクロロエタン(15ml)に溶解し、トリクロロアセトニトリル(15ml、5.1eq)を加え、室温で撹拌した。氷冷下でDBU(1.8ml、0.4eq)を滴下し、室温で一晩撹拌した。反応終了後、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：1）で精製し、ベンゼンによる凍結乾燥の後、白黄色固体の標記化合物３(12.8g、2工程、収率55.8％)を得た。
【００３２】
５−アクリルアミド−１−ペンタノール(10)の合成
【化１８】
2008297488.tif 000012
５−アミノ−１−ペンタノール（5ml、46.0mmol）、炭酸ナトリウム（5.85g、1.2eq）をメタノール（50ml）に溶解させ、氷浴下でアクリル酸クロリド（4.5ml、1.2eq）を滴下し、室温で１時間攪拌した。反応終了後、濃縮し、オープンカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝４：1）により精製し、化合物10（4.79g、62.8％）を得た。
【００３３】
１−（５−Ｎ−アクリルアミド−１−ペンタニル）−４−Ｏ−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド(7)の合成
【化１９】
2008297488.tif 000013
アルゴン雰囲気下、化合物３(3g、3.84mmol)をジクロロメタン(90ml)に溶解し、化合物１０(0.91mg、1.5eq)とモレキュラーシーブス(9g)を加え、-30℃まで冷却し、30分撹拌した。三フッ化ホウ素・エーテル錯体(420μl、0.4eq)を0.1Mになるようにジクロロメタンにより希釈し、数回に分けて滴下し-30℃で3時間撹拌した。反応終了後、クロロホルムで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮しオープンカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：4）で精製し、標記化合物７（0.315g、10.6％）を得た。
【００３４】
１−（５−Ｎ−アクリルアミド−１−ペンタニル）−４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド(1)の合成
【化２０】
2008297488.tif 000014
化合物７(995mg、1.5mmol)をメタノール(30ml)に溶解させ、ナトリウムメトキシド(4.0mg、0.75eq)を加え、室温で一晩撹拌した。反応終了後、陽イオン交換樹脂を加え、反応液を中和し、ろ過により樹脂を取り除いた後濃縮し、ラクトース担持単量体１として標記化合物１(720mg)を得た。
【００３５】
蛍光標識担持単量体１３の合成
片側がFmoc基で保護された１，５−ジアミノペンタンと蛍光物質フルオレセインイソチオシアネート（FITC）を用い、蛍光標識担持単量体１３を合成した（スキーム２）。
【００３６】
【化２１】
2008297488.tif 000015
【００３７】
（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル ５−（アクリルアミド）ペンチルカルバメート(15)の合成
【化２２】
2008297488.tif 000016
（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル ５−（アンモニウムクロリド）ペンチルカルバメート（200 mg、0.55 mmol）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（DIEA、193μl、2.0eq）をDMF（4 ml）に溶解させ、氷浴下でアクリル酸クロリド（50 μl、1.1eq）を滴下し、室温で１時間攪拌した。反応終了後、反応液を水に滴下することで再沈殿を行った。遠心により沈殿物を集め、10％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液により洗浄を行った後、凍結乾燥させ白色の標記化合物１５を得た。
【００３８】
Ｎ−（５−アミノペンチル）アクリルアミド(16)の合成
【化２３】
2008297488.tif 000017
化合物１５（200.1mg、529μmol）をジエチルアミン(10ml)に溶解させ、終夜で攪拌した。反応終了後、濃縮し、クロロホルムにより抽出を行い、水相を集め、凍結乾燥させ白色の標記化合物１６（119.2mg、144％）を得た。NMRにより化合物１６とジエチルアミンが約1：1で混じっていることが確認できた。
【００３９】
５−（３−（５−（アクリルアミド）ペンチル）チオウレイド）−２−（３−ヒドロキシ−６−オキソ−６Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸(13)の合成
【化２４】
2008297488.tif 000018
化合物16（19.6mg、2.0eq）、トリエチルアミン（9.9μｌ、1.1eq）をDMF（250μｌ）、メタノール（50μｌ）に溶解させ、遮光下で、FITC（25.6mg、64.2μmol）を加え終夜で攪拌した。反応終了後、分取TLC（クロロホルム：メタノール＝2：1）により精製し、蛍光標識担持単量体１３として標記化合物１３（7.2mg、20.5％）を得た。
【００４０】
共重合体の合成（例１〜６）
【化２５】
2008297488.tif 000019
ステアリルメタクリレート(11)は東京化成から購入（M0593）し、MPC(12)は文献（特許2870727 または Polymer Journal, 22(5), 355-360 (1990)）に従って合成した。
アルゴン雰囲気下、前記で合成したラクトース担持単量体1と、ステアリルメタクリレート(11)と、MPC(12)と、得られる共重合体の細胞内における存在位置を示す前記で合成した蛍光標識担持単量体13とを、これら単量体を併せた全濃度が0.5Mとなるように、表１に示したモル比でDMSO：水＝１：１溶媒に溶解させた。これに開始剤としてAPSを2.5×10-2Mとなるように加え、60℃で20時間攪拌した。アセトンを用いた再沈殿法により精製してから、3500cut offの透析膜を用いて３日間透析した後、凍結乾燥させて、例１〜６の共重合体を得た。得られた共重合体の分子量、共重合体中の各単位の組成を表１に示す。
【００４１】
【表１】
2008297488.tif 000020
【００４２】
細胞への投与
前記で合成した共重合体を細胞に投与し、その結果を顕微鏡により観察することで、該共重合体の細胞内における挙動を観察した。従来の合成修飾剤は細胞に投与すると細胞膜表面を修飾している。そこで、今回合成した共重合体が、細胞に取り込まれないのか、細胞膜に局在するのか、それとも細胞中に取り込まれるのかを確認した。
【００４３】
培地・試薬・実験用具
DMEM（Gibco製）、DMEM/F12（Gibco製）、ウシ胎児血清（FBS)、グルタミン（商品名「ニッスイ」、日水製薬製）、トリプシン-EDTA液（0.25％トリプシン、1mM EDTA-4Na含有）、ダルベッコPBS（−）粉末（商品名「ニッスイ」、日水製薬製）、HBSS（Gibco製）
【００４４】
Hela細胞の前培養
ヒト子宮頸癌由来細胞（Hela）を用いた。DMEM/F1培地（2mMグルタミン、10％FBS含有）を用い、37℃、5％ＣＯ２下で培養し、２〜３日ごとに継代を行った。継代の際には、培地を除去した後、トリプシン-EDTA液を2ml加え、細胞表層を洗浄し、除去した後再度トリプシン-EDTA液を２ml加え、37℃、5％ＣＯ２下で５分ほどインキュベートした。このトリプシン-EDTA液を、あらかじめ10ml程度のDMEM/F12培地を加えてあった15ml遠沈管に加え、遠心分離（1000rpm、５分、室温）することで細胞を沈殿させ、上清を除去して、細胞を回収した。その後、再度10mlのDMEM/F12培地を加え、懸濁させ、血球計算板で細胞数を数え1.0×106cells/7ml/dishとなるように播種した。
【００４５】
実験手順
実験は以下の手順により行った。また、共重合体が取り込まれている細胞内の位置は、共重合体に含まれる蛍光標識からの蛍光を検出することで特定した。核の位置はpropidium iodide（PI）で染色することで特定し、ゴルジ体及び小胞体の位置はWGAレクチン−Alexa647で染色することで特定した。
1)  消毒したカバーガラスを6wellプレートに入れ、24時間前培養した（37℃、5％ＣＯ２、3.0×105cells/well）。
2)  培地を除去し、50μg/mlに調整した前記合成した共重合体の溶液を添加し（2ml/well）、1時間インキュベートした（37℃、5％ＣＯ２）。
3)  HBSSで洗浄した（2ml/well×2回）。
4)  メタノールを添加し（0.5ml/well）、5分間インキュベート(室温)して固定した。
5)  HBSSで洗浄した（2ml/well×2回）。
6)  HBSSを用いて5μg/mlに希釈したWGAレクチン−Alexa647を添加（2ml/well）し、10分間インキュベートした(室温)。
7)  HBSSで洗浄した（2ml/well×2回）。
8)  HBSSを用いて0.5μg/mlに希釈したPIを添加（1ml/well）し、5分間インキュベートした（37℃、5％ＣＯ２）。
9)  HBSSで洗浄した（2ml/well×2回）。
10)  プレパラート上に退色防止剤をカバーガラス1枚につき1滴滴下した。
11)  ピンセットを用いて、カバーガラスを取り出し、退色防止剤を滴下した上に、観察面が下になるようにのせた。
12)  カバーガラスの周囲をマニュキュアで覆った。
13)  細胞を観察した。
【００４６】
結果
共重合体中の脂質の有無による違い
ステアリル基を有する共重合体（例４）及びそれを有さない共重合体（例５）をそれぞれ細胞に投与することで、脂質の有無による違いを調べた。その結果を図１に示した。図１より、例４の共重合体をHela細胞に投与したAの写真に注目すると、細胞のいずれかの部位に共重合体が取り込まれていることが確認できた。そこで、核及びゴルジ体・小胞体をそれぞれ染色した写真B及び写真Cと比較したところ、多くの共重合体がゴルジ体・小胞体の染色部位の局在と一致することがわかった。このことより、取り込まれた共重合体はゴルジ体及び小胞体に局在し、核にまでは運搬されないということがわかった。次に、例５の共重合体を細胞に投与した写真Eと比較すると、例５の共重合体はほとんど細胞に取り込まれないことがわかった。
【００４７】
糖質を有する共重合体の投与
ラクトース及びステアリル基を有する例１〜３の共重合体をそれぞれ細胞に投与した。その結果を図２に示した。図２より、例１〜３の共重合体をHela細胞に投与したA、E、Iの写真に注目すると、ラクトースを多く含む共重合体は細胞に導入されず、ラクトースの含有率を減少させると、細胞により取り込まれやすくなっていることがわかった。また、核及びゴルジ体・小胞体を染色した写真と比較すると、細胞内に取り込まれた多くのポリマーはゴルジ体・小胞体のマーカーの局在と一致することがわかった。ラクトースの含有率が大きくなると、ポリマーの親水性が大きくなるため細胞に取り込まれにくくなるのではないかと考えられる。
【００４８】
インキュベート時間と細胞への取り込み
例３の共重合体を用いて、インキュベート時間と共重合体の局在を確認した。その結果を図３に示した。図３より、5分間インキュベートした時点ですでに細胞に取り込まれ、かつゴルジ体・小胞体に局在していることがわかった。インキュベート時間が1時間の場合までは、ゴルジ体や小胞体に共重合体が局在していたが、3及び6時間のインキュベート後ではポリマーが細胞全体に広がっていった。
【００４９】
血清の影響
10%FBSを含む培地ではなくITS-X（GIBCO社製）を含む培地を用いて例３の共重合体溶液を調整することで、共重合体の取り込みに対する血清の影響を検討した。その結果を図4に示した。ITS-Xを含む培地と比較して、10%FBSを含む培地の方が、共重合体の細胞内への取り込みが大きいことがわかった。単純な濃度拡散によって細胞内に共重合体が取り込まれるのではなく、キャリアー及びエンドサイトーシス経由で細胞内に取り込まれている可能性が考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明によれば、所望の物質を小胞体やゴルジ体に送達することができる。これによって、例えば、標識を含む本発明の共重合体をこれら小胞体及びゴルジ体の標識として利用することができる。また、例えば、糖転移酵素阻害剤又は原料となる糖を小胞体及びゴルジ体に送達することで、そこで行われる特定の糖鎖生合成を抑制したりあるいは促進させたり制御することができる。また、所望のペプチドを小胞体及びゴルジ体に送達して、そこで所望の糖ペプチドを合成させることができる。
このように細胞内の糖やタンパク質の生合成を制御できるので、糖鎖異常の糖タンパク質や糖脂質などの産生を抑え、正常な糖タンパク質や糖脂質などの生合成を促し、糖鎖異常の糖タンパク質や糖脂質などによる疾患、例えばガンや脳疾患を治療又は予防することができる。
また、ペプチドやタンパク質などへ糖鎖を付与して、糖ペプチド薬剤の生産、あるいは多糖の生産において利用することもできる。特に、本発明の共重合体は、Ｈｅｌａに投与した場合、小胞体やゴルジ体により選択的に送達されることから、このような物質生産ではHela細胞を使用するのが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の共重合体の細胞内局在を示す図である。Ａ〜Ｄは例４を、Ｅ〜Ｈは例５を、それぞれ投与した細胞を示す。ＡとＥは投与された共重合体のＦＩＴＣ蛍光を、ＢとＦはＰＩで染色された核を、ＣとＧはWGAレクチン−Alexa647で染色されたゴルジ体及び小胞体を、それぞれ示す。ＤはＡ〜Ｃを、ＨはＥ〜Ｇを、それぞれ重ね合わせた図である。
【図２】本発明の共重合体の細胞内局在を示す図である。Ａ〜Ｄは例１を、Ｅ〜Ｈは例２を、Ｉ〜Ｌは例３を、それぞれ投与した細胞を示す。ＡとＥとＩは投与された共重合体のＦＩＴＣ蛍光を、ＢとＦとＪはＰＩで染色された核を、ＣとＧとＫはWGAレクチン−Alexa647で染色されたゴルジ体及び小胞体を、それぞれ示す。ＤはＡ〜Ｃを、ＨはＥ〜Ｇを、ＬはＩ〜Ｋを、それぞれ重ね合わせた図である。Sugarはラクトース担持単量体１の共重合体組成（mol%）を示す。
【図３】例３の共重合体のインキュベート時間による細胞内局在の変化を示す図である。例３を投与する前（Ａ〜Ｄ）、例３を投与しインキュベートを開始してから５分後（Ｅ〜Ｈ）、６０分後（Ｉ〜Ｌ）、１８０分後（Ｍ〜Ｐ）、３６０分後（Ｑ〜Ｔ）の細胞を示す。Ａ、Ｅ、Ｉ、Ｍ、及びＱは投与された共重合体のＦＩＴＣ蛍光を、Ｂ、Ｆ、Ｊ、Ｎ、及びＲはＰＩで染色された核を、Ｃ、Ｇ、Ｋ、Ｏ、及びＳはWGAレクチン−Alexa647で染色されたゴルジ体及び小胞体を、それぞれ示す。ＤはＡ〜Ｃを、ＨはＥ〜Ｇを、ＬはＩ〜Ｋを、ＰはＭ〜Ｏを、ＴはＱ〜Ｓを、それぞれ重ね合わせた図である。
【図４】血清の有無による例３の共重合体の細胞内局在の変化を示す図である。Ａ〜Ｄは10%FBSを含む培地で、Ｅ〜ＨはITS-Xを含む培地で、それぞれ調製された例３を投与した細胞を示す。ＡとＥは投与された共重合体のＦＩＴＣ蛍光を、ＢとＦはＰＩで染色された核を、ＣとＧはWGAレクチン−Alexa647で染色されたゴルジ体及び小胞体を、それぞれ示す。ＤはＡ〜Ｃを、ＨはＥ〜Ｇを、それぞれ重ね合わせた図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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