(57)【要約】      （修正有）【課題】シトリニン生合成系の複数の遺伝子の転写を包括的に制御することが出来る転写因子を提供する。【解決手段】紅麹菌に由来するシトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子をコードする特定の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む遺伝子。該遺伝子の発現を阻害する工程を含むシトリニンの生合成を阻害する方法。シトリニンの生合成を阻害された糸状菌においてシトリニン合成能を回復させる方法、および、シトリニンの生産を促進させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む遺伝子。
【請求項２】
配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子。
【請求項３】
紅麹菌由来である請求項１または２のいずれかの遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかの遺伝子または請求項４の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつシトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として作用するタンパク質。
【請求項７】
シトリニン生合成経路を有する糸状菌において、請求項１〜３のいずれかの遺伝子の発現を阻害する工程を含む、該糸状菌におけるシトリニン生合成を阻害する方法。
【請求項８】
遺伝子の発現の阻害を相同的組換えにより行う請求項７の方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかの遺伝子の発現を阻害することによってシトリニン生合成を阻害されたシトリニン生合成経路を有する糸状菌に、請求項１〜３のいずれかの遺伝子を導入する工程を含む、シトリニン生合成を阻害された該糸状菌においてシトリニン合成能を回復させる方法。
【請求項１０】
シトリニン生合成経路を有する糸状菌において、請求項１〜３のいずれかの遺伝子を導入する工程および該遺伝子を過剰発現させる工程を含む、該糸状菌におけるシトリニン生合成を促進する方法。
【請求項１１】
シトリニン生合成経路を有する糸状菌が紅麹菌である、請求項７〜１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
シトリニン生合成経路を有さない糸状菌に対して、請求項１〜３のいずれかの遺伝子、および、以下の（ｃ）または（ｄ）から選択されるポリヌクレオチド配列を有するシトリニン生合成遺伝子クラスターを導入することにより、該糸状菌においてシトリニンを産生させる方法；
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、請求項１〜３のいずれかの遺伝子と共にシトリニン生合成経路を有さない糸状菌に導入されると、該糸状菌におけるシトリニン生産を引き起こすことができるポリヌクレオチド。
【請求項１３】
シトリニン生合成経路を有さない糸状菌が、アスペルギルス・オリザエである、請求項１２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌由来のシトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子、それをコードする遺伝子およびそれを用いて糸状菌のシトリニン生合成能を正または負に調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌は多様な二次代謝能から、新規生理活性物質の有望な生物資源とみなされている。しかし、糸状菌の二次代謝は生育環境に依存するため、菌株、化合物ごとに生産最適条件を決定する必要があり、工業的利用には多大な労力を有する。
【０００３】
遺伝子工学的手法による糸状菌由来遺伝子の簡便な発現系の構築は、糸状菌における生理活性物質生合成機能の迅速な遺伝子解析、さらには有用物質の大量生産を可能とすると期待される。しかし糸状菌の二次代謝合成遺伝子はクラスターを形成して存在することが多いため、活性を有する物質の生産にはクラスター領域全体を宿主に導入する必要があり、開発が進んでいない。
【０００４】
紅麹菌の１種であるモナスカス・プルプレウス(Monascus purpureus)は、発酵食品の製造、天然着色料である色素の生産に利用されている有用な糸状菌である。しかし、紅麹菌はカビ毒であるシトリニンも生産するため、さらなる工業的有効利用には、これまで未解明のシトリニン生合成機構および生産制御機構を明らかにすることが必須であると考えられる。
【０００５】
シトリニンはグラム陽性細菌への抗菌活性を有する生理活性物質である。この生合成はポリケタイドシンターゼをはじめとする複数からなる生合成酵素群より行われると推測される。したがって、生合成遺伝子群の同定、操作ができれば意図的な生産調節を行うことが可能となると考えられる。
【０００６】
一方、シトリニンはポリケタイド化合物であり、動物実験により腎臓や肝臓に悪影響を与えることが知られており、モナスカス(Monascus)だけでなく、アスペルギルス(Aspergillus)やペニシリウム(Penicillium)においてもその生産が確認されている。シトリニンの毒性はカビ毒として有名なアフラトキシンと比較するとそれほど高くはないが、市場にでているこれらの菌を用いて生産された製品へのコンタミネーションが問題となっている。
【０００７】
モナスカスにおいて、シトリニンを含めた二次代謝産物における培養工学的研究は多数行われていたが、分子生物学的研究についてはあまり報告されていない。本発明者らは遺伝子工学的手法を用いてシトリニン生合成関連遺伝子の解析を行うために、まずシトリニンがポリケタイド化合物であることに注目し、モナスカスゲノムに対するポリケタイド生合成遺伝子のスクリーニングを行った結果、シトリニン生合成に必須のポリケタイドシンターゼの同定に成功している（特許文献１および非特許文献１参照）。しかしこの遺伝子は全長が約１０ｋｂｐからなり、遺伝子操作が困難であった。
【０００８】
現在のところ、上記ポリケタイドシンターゼ（以下、ｐｋｓＣＴと称する）の単離には成功しているが、上記のようにカビの二次代謝産物に関わる遺伝子群は、しばしばゲノムの一定領域に遺伝子クラスターを形成することが知られており、モナスカスにおけるシトリニン生合成遺伝子もｐｋｓＣＴ遺伝子の周辺領域に存在しているのではないかと推測されるが、その単離、同定は未だに成功していない。
【特許文献１】特開２００４−３２１１７６号公報
【非特許文献１】Applied and Environmental Microbiology, July 2005, p.3453-3457
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、シトリニン生合成系の複数の遺伝子の転写を包括的に制御することが出来る転写因子およびその利用方法を提供することを目的とする。
さらに本発明は、シトリニン生合成機構および生産制御機構の解明、および遺伝子クラスターを形成すると推測されるシトリニン生合成遺伝子群の同定を行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため、本発明者らは、ポリケタイドシンターゼｐｋｓＣＴの周辺領域を検索した結果、シトリニン生合成遺伝子クラスターを形成すると推定される、５つのＯＲＦ（ｏｒｆ１〜ｏｒｆ５）を見いだした。これらの推定アミノ酸配列に対して相同性検索を行った結果、それぞれ、デヒドロゲナーゼ、制御因子、オキシゲナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびトランスポーターと高い相同性を示し、これらのＯＲＦ群がポリケタイドシンターゼと共にシトリニン生産に関与していることを明らかにした。
【００１１】
特に上記制御因子は、２Ｃｙｓ６ジンクフィンガーモチーフを有しており、転写因子であることが推定された。そこで紅麹菌において該制御因子を破壊したところ、シトリニン生産が大幅に減少し、上記クラスターに属する４つの遺伝子（ｏｒｆ３〜５およびｐｋｓＣＴ）の転写量が減少していた。また破壊株において上記制御因子を発現させたところ、シトリニン生産および遺伝子転写が回復した。以上のことから、上記制御因子がシトリニン生合成遺伝子クラスターの活性化を介してシトリニン生産を正に調節している転写因子であることが判明した。以下、この制御因子をｃｔｎＲと称する。
【００１２】
さらに、ｃｔｎＲと紅麹菌由来のシトリニン生合成遺伝子クラスターを、シトリニン生合成能を有さないアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)に導入し、培養上清を解析したところ、シトリニンの生産が確認された。
【００１３】
すなわち、本発明は、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む遺伝子を提供する。配列番号１で表される配列は、ｃｔｎＲのコード領域からなるｃＤＮＡの配列である。また、本発明は、配列番号１で表される配列にイントロンを含めた配列番号３で表されるゲノムＤＮＡも提供する。なお、配列番号３の配列はイントロンを含むが、開始コドンで始まり、終止コドンで終わるものである。さらに、配列番号１または配列番号３に相当する領域を含む遺伝子も本発明の範囲に含まれる。
【００１４】
また、本発明には、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子も含まれる。なお、本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起こり、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、ＤＮＡを固定化したフィルターに対して、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件などをあげることができる。
【００１５】
また、本発明には、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基または塩基対が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつシトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子も含まれる。ここで、「１もしくは数個の塩基または塩基対が欠失、置換もしくは付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異導入法により置換、欠失、挿入、及び／または付加できる程度の数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／または付加されることを意味する。
【００１６】
本発明にはまた、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで６０％以上の相同性を示し、かつ、シトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子も含まれる。相同性は好ましくは６０％以上、さらに好ましくは、７０％以上、８０％以上、９０％以上である。配列の同一性は、FASTA検索 （Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444-2448）やBLASTN検索により決定することができる。
【００１７】
本発明はまた、以下の（ａ）または（ｅ）のタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつシトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として作用するタンパク質、
を提供する。
【００１８】
本発明において、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／または付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されることを意味する。また、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００１９】
本発明によって提供される上記遺伝子は、シトリニン生産能を有する糸状菌由来であるのが好ましく、紅麹菌由来であるのがさらに好ましい。
【００２０】
本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質を提供する：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつシトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として作用するタンパク質。
ここで、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加」とは上記と同意である。
【００２１】
さらに本発明は、以下の（ａ)または（ｆ）のタンパク質を提供する：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質とアミノ酸レベルで６０％以上の相同性を示し、かつシトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として作用するタンパク質。
ここで、相同性は好ましくは６０％以上、さらに好ましくは、７０％以上、８０％以上、９０％以上である。配列の同一性は上記のように、FASTA検索 （Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444-2448）やBLASTP検索により決定することができる。
【００２２】
本発明はまた、本発明によって提供される上記遺伝子によってコードされるタンパク質を提供する。
【００２３】
本発明はまた、所望により組換えベクターに含まれた、本発明の遺伝子を含む宿主細胞を提供する。該遺伝子または該組換えベクターにより形質転換される宿主細胞は好ましくは、シトリニン生合成経路を有する糸状菌の細胞である。本発明による遺伝子を担持するベクターとしては、ｐＡＧ（Biotechnology Letters 2006 28:115-120）などが挙げられる。また、本発明により形質転換される糸状菌の具体例としては、紅麹菌であるモナスカス・プルプレウスおよびモナスカス・ピロサス（ペニシリウム・シトリナム（Penicilliu citrinum）、ペニシリウム・ビリディカータム（Penicilliu viridicatum））などが挙げられ、好ましくは紅麹菌であり、なかでもモナスカス・プルプレウスが好ましい。
【００２４】
本発明は更に、シトリニン生合成経路を有する糸状菌において、上記いずれかの遺伝子の発現を阻害する工程を含む、該糸状菌におけるシトリニン生合成を阻害する方法を提供する。遺伝子の発現の阻害方法としては、ＲＮＡｉ、遺伝子破壊などが挙げられるが、好ましくは遺伝子発現の阻害は、当該技術分野で公知の相同的組換えにより行う。この方法において好ましい糸状菌としては、紅麹菌であるモナスカス・プルプレウスおよびモナスカス・ピロサス（ペニシリウム・シトリナム（Penicilliu citrinum）、ペニシリウム・ビリディカータム（Penicilliu viridicatum））などが挙げられ、好ましくは紅麹菌であり、なかでもモナスカス・プルプレウスが好ましい。
【００２５】
本発明は上記の、本発明の遺伝子の発現を阻害することによってシトリニン生合成を阻害されたシトリニン生合成経路を有する糸状菌に、本発明の上記いずれかの遺伝子を導入する工程を含む、シトリニン生合成を阻害された該糸状菌においてシトリニン合成能を回復させる方法を提供する。遺伝子の発現の阻害方法、好ましい糸状菌の例は上記と同様である。遺伝子の導入方法としては、プロトプラスト−ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法などが挙げられる。
【００２６】
さらに本発明は、シトリニン生合成経路を有する糸状菌において、上記のいずれかの遺伝子を導入する工程および該遺伝子を過剰発現させる工程を含む、該糸状菌におけるシトリニン生合成を促進する方法も提供する。好ましい糸状菌、遺伝子の導入方法は上記と同様であり、該遺伝子を過剰発現させる工程は、例えば、導入する上記遺伝子の上流に構成的プロモーターを連結することにより、あるいは誘導可能プロモーターに連結し、プロモーターに誘導をかけることにより達成される。
【００２７】
本発明はまた、シトリニン生合成経路を有さない糸状菌に対して、上記のいずれかの遺伝子（即ち、転写因子ｃｔｎＲをコードする遺伝子）、および、以下の（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）、および（ｈ）から選択されるポリヌクレオチド配列を有するシトリニン生合成遺伝子クラスターを導入することにより、該糸状菌においてシトリニンを産生させる方法を提供する；
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、本発明の上記ｃｔｎＲをコードする遺伝子と共にシトリニン生合成経路を有さない糸状菌に導入されると、該糸状菌におけるシトリニン生産を引き起こすことができるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基または塩基対が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、本発明の上記ｃｔｎＲをコードする遺伝子と共にシトリニン生合成経路を有さない糸状菌に導入されると、該糸状菌におけるシトリニン生産を引き起こすことができるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで６０％以上の相同性を示すポリヌクレオチドであり、かつ、本発明の上記ｃｔｎＲをコードする遺伝子と共にシトリニン生合成経路を有さない糸状菌に導入されると、該糸状菌におけるシトリニン生産を引き起こすことができるポリヌクレオチド。
【００２８】
ここで、好ましくはシトリニン生合成経路を有さない糸状菌としては、アスペルギルス・オリザエ、アスペルギルス・ニドュランスが挙げられ、好ましくは、アスペルギルス・オリザエである。
【００２９】
「シトリニン生合成遺伝子クラスター」とは、シトリニン生合成に関与する遺伝子の群を含む二本鎖ＤＮＡであり、その一方の鎖が、本発明によって同定された転写因子（ｃｔｎＲ）、オキシドレダクターゼ（Ｏｒｄ）、およびポリケタインドシンターゼ（ｐｋｓＣＴ）をコードし、その他方の鎖がオキシゲナーゼ（Ｏｘｇ）およびトランスポーター（Ｔｒａ）をコードする約２５ｋｂの遺伝子クラスターをいう（図７を参照されたい）。上記（ｄ）、（ｇ）および（ｈ）のポリヌクレオチドが、「上記ｃｔｎＲをコードする遺伝子と共にシトリニン生合成経路を有さない糸状菌に導入されると、該糸状菌におけるシトリニン生産を引き起こすことができるポリヌクレオチド」であるか否かは、実施例に記載のように、本発明の転写因子ｃｔｎＲをコードする遺伝子とともに、当該遺伝子クラスターであるかどうかを確かめるべきポリヌクレオチドを、シトリニン生産能を有さない糸状菌、例えば、アスペルギルス・オリザエに共導入することにより、該菌がシトリニン生産能を獲得し、菌体外にシトリニンを分泌するかどうかを確認することにより、判定することが出来る。
【発明の効果】
【００３０】
本発明において、シトリニンポリケタイドシンターゼをコードするｐｋｓＣＴの近傍の複数の遺伝子をクローニングし、シトリニン生合成に関与する複数の新規遺伝子を得た。本発明は、ｐｋｓＣＴの上流領域におけるシトリニン生合成の制御に必須な正の転写因子を提供するものであり、この正の転写因子の不活性化によりシトリニン生産能が非常に低い糸状菌株を作成できることが判明した。さらに、本発明は、複数の遺伝子がｐｋｓＣＴ遺伝子の周囲にシトリニン生合成遺伝子クラスターを形成していることを示す。シトリニン生合成遺伝子クラスターの存在はいままで報告されておらず、本発明はシトリニン生合成機構の解明に寄与するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下本発明をさらに詳細に説明する。
本発明に係る遺伝子について
本発明は、シトリニン生合成酵素発現を促す転写因子をコードする遺伝子を提供する。
配列番号３に示す塩基配列は、紅麹菌（Monascus purpureus）から得られたゲノムDNAとして、本願発明者らによって配列決定されたものである。具体的には紅麹菌から、シトリニンポリケタイドシンターゼをコードするｐｋｓＣＴの隣接領域をクローニングしたところ、ｐｋｓＣＴに近接する５'-隣接領域において４つのＯＲＦ(ｏｒｆ１、ｏｒｆ２（図１においてｃｔｎＲと称する）、ｏｒｆ３（図１においてｃｔｎＡと称する）、およびｏｒｆ４（図１においてｃｔｎＢと称する)）、３'-隣接領域において１つのＯＲＦ (ｏｒｆ５（図１においてｃｔｎＣと称する)）が同定された。ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、およびｏｒｆ５はそれぞれ、デヒドロゲナーゼ（Ｄｅｈｙ）、制御因子（ｃｔｎＲ）、オキシゲナーゼ（Ｏｘｇ）、オキシドレダクターゼ（Ｏｒｄ：これはＯｘｒと称される場合もある）、およびトランスポーター（Ｔｒａ）のホモログに対応するものであった（図１および図７を参照）。
【００３２】
RT-PCR分析により、デヒドロゲナーゼをコードするｏｒｆ１をのぞくこれらＯＲＦのすべてが、シトリニン生産条件下でｐｋｓＣＴ遺伝子とともに転写されていることが明らかとなり、これら４つの遺伝子（それぞれ制御因子、オキシゲナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびトランスポーターをコードするｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４およびｏｒｆ５）がシトリニン生合成に関与していることが示唆された。ｏｒｆ２（ｃｔｎＲ）を破壊した結果、ｐｋｓＣＴおよびｏｒｆ５の転写が劇的に低下しｏｒｆ３においても明確な低下が観察され、また、ｏｒｆ４も程度は低いが転写の低下が確認され（図２Ａ）、シトリニン生産は野生型株の0.0016%まで低下した。インタクトなｃｔｎＲを有するプラスミドをｃｔｎＲ-破壊株に導入したところ、転写およびシトリニン生産の両方が回復し、ｃｔｎＲがシトリニン生合成の主要な正の転写因子であることが判明した。
【００３３】
本発明に係るｃｔｎＲのコード領域は、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドであるが、この部分に相当する部分が含まれる遺伝子も本発明に含まれる。また、配列番号１に示すコード領域にイントロンの配列を加えたゲノムＤＮＡ配列を配列番号３に示す。配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドは、シトリニンを生産する紅麹菌から従来公知の方法によって調製したゲノムライブラリーから得ることが出来る。
【００３４】
上記配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドは、シトリニン生合成系遺伝子発現を正に制御する転写因子のコード領域であると確認された。該転写因子は、N-末端に典型的なZn(II)2Cys6 DNA 結合モチーフを含むタンパク質である。これまでにシトリニン生合成系を包括的に制御する転写因子は全く知られておらず、本発明の転写因子の利用によって、シトリニン生合成系の遺伝子の包括的誘導が期待できるものである。
【００３５】
本発明はまた、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する転写因子として作用するタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を包含する。ここで「転写因子として作用するタンパク質と機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の生物学的機能、即ちシトリニン生合成系遺伝子の発現を調節する機能を有することを指す。シトリニン生合成系遺伝子としては、シトリニンポリケタイドシンターゼ（ｐｋｓＣＴ）および、オキシゲナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびトランスポーターに対応する、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４およびｏｒｆ５が挙げられる。
【００３６】
本発明の遺伝子には、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。
【００３７】
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードする遺伝子を調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、部位特異的突然変異誘発（site-directed mutagenesis）法（Kramer, W.& Fritz,H.-J. Methods in Enzymology, 154: 350-367(1987)）が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型の本発明の転写因子（配列番号２）をコードするアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であっても、天然型（配列番号２）の転写因子と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。また、たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明の遺伝子に含まれる。対象となる遺伝子を構成するDNAの塩基の変異数は、アミノ酸レベルにおいて、典型的には、100アミノ酸以内、好ましくは50アミノ酸以内、さらに好ましくは20アミノ酸以内、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内）である。
【００３８】
上記遺伝子を獲得する方法は特に限定されるものではなく、一般的な方法が採用される。例えば、該遺伝子を、それを有する生物のゲノムDNA、cDNAライブラリーなどから適切な制限酵素で切り出し、精製すればよい。即ち、本発明の転写因子をコードする遺伝子には、ゲノムDNA、cDNA、および化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、対象生物からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる）を作成し、これを展開して、本発明のタンパク質をコードするゲノムDNA（配列番号３）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明の転写因子をコードするゲノムDNA（配列番号３）に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRを行うことによって調製することも可能である。
【００３９】
また、本発明の転写因子をコードするcDNAは、例えば、対象生物から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様に配列番号１に基づいて調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。
【００４０】
なお、上記遺伝子を有する生物としては、シトリニン産生能を有する糸状菌、例えば、紅麹菌であるモナスカス・プルプレウスおよびモナスカス・ピロサス、ならびに、ペニシリウム・シトリナムなどを挙げることができる。これらの中でも特に、シトリニン生産性の高い紅麹菌、特に好ましくはモナスカス・プルプレウスを用いれば、より確実に目的の遺伝子を単離することができる。
【００４１】
本発明の転写因子をコードするDNAは、例えば、シトリニン生合成系遺伝子の発現を活性化することにより、シトリニンの大量生産に利用することが考えられる。また、例えば、該転写因子の発現を阻害することにより、シトリニンを作らない糸状菌の分子育種も可能となる。
【００４２】
本発明の転写因子は、Zn(II)2Cys6 DNA 結合モチーフを有するため、Zn(II)2Cys6型の転写因子であると考えられる。実際、紅麹菌において、配列番号３に示す塩基配列を相同組換えにより破壊したところ、シトリニン生合成系遺伝子の転写が顕著に阻害された。したがって、本発明の転写因子は、シトリニン生合成系の遺伝子発現を活性化する転写因子である。
【００４３】
次に本発明の転写因子の獲得方法について説明する。
具体的には、ゲノムの少なくとも一部がデータベース化されている糸状菌から本発明の転写因子を獲得する場合には、上記ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて相同性のある塩基配列をデータベース中から検索すればよい。例えば、汎用されている相同性検索アルゴリズムであるBLASTNによる塩基配列の相同性検索を好適に用いることができる。
【００４４】
また、ゲノムがデータベース化されていない糸状菌の場合には、例えば、従来公知のDNAライブラリーを用いたハイブリダイゼーション法を用いることもできる。具体的には、適切なクローニングベクターを使用して対象となる糸状菌からゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーを調製する工程と、上記ポリヌクレオチドの少なくとも一部をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行い、ライブラリーから上記プローブにポジティブの断片を検出する工程とを含む方法を用いることができる。このように、本発明に係る遺伝子はプローブとしても有用である。プローブに用いる領域には、目的とする遺伝子に特異的な配列が含まれることが好ましい。また、プローブとして使用されるポリヌクレオチドの長さは、100bp以上が好ましい。
【００４５】
より具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する転写因子と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を調製するために、当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E.M. Journal of Molecular Biology, 98, 503(1975)）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K. et al. Science, 230, 1350-1354(1985)、Saiki, R. K. et al. Science, 239,487-491(1988)）を利用する方法が挙げられる。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうる本発明の転写因子と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子もまた本発明の遺伝子に含まれる。
【００４６】
このような遺伝子を単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起こり、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、ＤＮＡを固定化したフィルターに対して、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件などを指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、０．１倍濃度のＳＳＣ溶液の条件を用いれば、より相同性の高い遺伝子の効率的な単離を期待することができる。これにより単離された遺伝子は、それがコードするアミノ酸レベルにおいて、本発明のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、９０％以上）の配列の同一性を指す。配列の同一性は、FASTA検索 （Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444-2448）やBLASTP検索により決定することができる。
【００４７】
ある遺伝子が転写因子としての機能を有するタンパク質をコードするか否かは、例えば当業者により一般的に行われているゲルシフトアッセイによって調べることができる。具体的には、次のような方法で行うことができる。まず被検DNAを、その遺伝子産物が例えばこれに限定されないが、GSTとの融合タンパク質を生成するようにベクターへ組み込み、該ベクターからの融合タンパク質を発現させる。発現産物をGSTを指標に精製し、Zn(II)2Cys6 DNA 結合モチーフを含む標識したDNAプローブと混合する。この混合液を、非変性アクリルアミドゲルを用いた電気泳動により解析を行う。検出されたゲル上のバンドの位置から、結合活性を評価することができる。
【００４８】
また、ある遺伝子がシトリニン生合成系遺伝子の発現を活性化する機能を有するタンパク質をコードするか否かは、例えばレポーターアッセイにより調べることができる。具体的には、次のような方法で行うことができる。まず、シトリニン生合成系酵素の１つのプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結させたベクターを構築する。該ベクターと、被検DNAの遺伝子産物を発現するベクターとをレポーターアッセイ用の細胞へ導入し、レポーター遺伝子産物の活性を測定することにより、被検DNA遺伝子産物の転写活性の評価を行う。該レポーターアッセイに使用することができるプロモーターとしては、例えば上記のｏｒｆ５、ｐｋｓＣＴの上流のプロモーターを挙げることができる。レポーター遺伝子としては、その発現を検出し得るものであれば特に制限はなく、当業者が一般的に各種アッセイ系に使用するレポーター遺伝子を用いることができる。好適なレポーター遺伝子としては、例えば、β-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子を挙げることができる。
【００４９】
その他にも遺伝子が転写因子としての機能を有するタンパク質をコードするか否かは、当業者に周知のサウスウエスタン法、酵母ワンハイブリッド法などを用いて判定することが出来る。
【００５０】
本発明に係るタンパク質について
本発明に係るタンパク質は、上記遺伝子によってコードされる配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつシトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として作用するタンパク質、もしくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質とアミノ酸レベルで６０％以上の相同性を示し、かつシトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として作用するタンパク質である。
【００５１】
また、本発明に係るタンパク質は、タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、公知のHAやFlag等の付加配列を末端に含ませてもよいし、融合タンパク質であってもよい。また、N-グリコシル化などの各種修飾を受けていてもよい。
【００５２】
本発明による組換えベクターは、上記遺伝子が組み込まれたものである。上記ベクターは、公知の形質転換方法によって宿主に発現可能に導入されることによって、当該宿主において組み込まれた遺伝子あるいは遺伝子断片を発現させて本発明によるタンパク質を得ることが出来る。なお、本発明によるタンパク質は下記のように組換え産生により得られたものでもよいし、糸状菌から単離、精製したものでもよく、その起源は特に限定されない。
【００５３】
組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換宿主細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国New England BioLabs社発売のベクターpMALシリーズ）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として調製する方法（Amersham Pharmacia Biotech社発売のベクターpGEXシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Novagen社のpETシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例えば、酵母等の真菌細胞、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Mandel, M.& Higa, A. Journal of Molecular Biology, 53, 158-162(1970)、Hanahan, D. Journal of Molecular Biology, 166, 557-580(1983)）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。組み換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。
【００５４】
得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血ぺいを除去することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質若しくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗体が含まれる。
【００５５】
これらのタンパク質および遺伝子は、シトリニン生合成の制御に関与する転写因子として作用するものであり、それ自体非常に有用なものである。さらに、これらのタンパク質およびこれらタンパク質をコードする遺伝子を用いて、シトリニン生合成系の改変に利用することができる。
【００５６】
形質転換体
本発明の遺伝子を発現する形質転換体を作製する場合には、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を所望により適当なベクターに挿入して、これを対象の宿主細胞に導入する。
【００５７】
本発明に係る形質転換体は、上記遺伝子または上記遺伝子を含む組換えベクターが導入されたものである。より具体的に言えば、本発明に係る形質転換体は、本発明による転写因子をコードする遺伝子が導入されたものである。ここで、「遺伝子または組換えベクターが導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、宿主内に所望によりベクター内に組み込まれた遺伝子が例えばプロモーターの作用により、発現可能に導入されることを意味する。
【００５８】
本発明に係る形質転換体は、上記遺伝子を直接、あるいは上記遺伝子が組み込まれたベクターを宿主に導入することによって得られる。上記宿主は、特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌などの原核生物、糸状菌、酵母などの真菌、あるいは、植物、動物などを挙げることができる。しかしながら、上記ベクターに組み込まれた遺伝子が、糸状菌の一種である紅麹菌由来のものであることから、上記宿主としては、糸状菌が好ましく、そのなかでも紅麹菌、麹菌が特に好ましい。なお、形質転換は一過性でもよいが、好ましくは安定に上記遺伝子が組み込まれるものである。
【００５９】
本発明の遺伝子は、宿主細胞内で発現可能なプロモーター、例えば、アスペルギルス・ニドュランス由来ｔｒｐＣプロモーター、アスペルギルス・オリザエ由来、ａｍｙＢプロモーター等の下流域に連結して使用する。なお、シトリニン生合成遺伝子群（本発明において、発現の促進あるいは発現の抑制を図る対象となる遺伝子）の発現を促進するためには本発明の遺伝子をセンス方向にプロモーターに連結する。
【００６０】
上記形質転換宿主細胞を含む形質転換体を作製する方法としては、具体的には、例えば、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。例えば、形質転換体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、生物体を再生させる方法（Datta,S.K. (1995) In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、生物体を再生させる方法（Toki et al (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、生物体を再生させる方法（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9: 957-962.）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、生物体を再生させる方法（Hiei et al. (1994) Plant J. 6: 271-282.）などを挙げることができるが、特に限定されるものではない。また、上記形質転換方法は、宿主となる生物の種類に応じて適宜選択されることが好ましい。
【００６１】
本発明において使用することができるベクターとしては、従来から細菌、真菌などの形質転換に使用されているベクター、例えば、ｐＥＴ３ｄ、ｐＣＳＮ４４等を挙げることができる。そして、上記ベクターは、上記遺伝子またはその断片の他に、従来公知の遺伝子を発現させるための構成的プロモーター、例えば、アスペルギルス・ニドュランス由来ｔｒｐＣプロモーター、または発現誘導性プロモーター、例えば、アスペルギルス・オリザエ由来、ａｍｙＢプロモーター、そして形質転換体の選抜を容易にする薬剤耐性遺伝子、例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子などを含んでいるのが好ましい。
【００６２】
転写因子ｃｔｎＲの発現の阻害によるシトリニン生産の阻害、ｃｔｎＲの導入によるシトリニン生産の回復、ｃｔｎＲの導入によるシトリニン生産の促進
本発明の遺伝子の発現が抑制された形質転換体を作製する場合には、実施例に記載のように当業者に周知の相同的組換えを用いればよい。相同的組換えとは、欠損もしくはマーカー遺伝子等の挿入により機能必須部位を欠落もしくは分断された遺伝子の作成を目的とし、欠落もしくは分断部位の両側に存在する相同な領域による遺伝子組み換え反応を利用した遺伝子破壊法をいう。
【００６３】
遺伝子発現の抑制には、相同的組換えの他に、RNAi法を用いることができる。RNAiに用いる配列は、標的遺伝子（ｃｔｎＲ）の配列と完全に同一である必要はないが、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上（例えば、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、上記した検索を利用して決定することができる。
【００６４】
本発明の転写因子ｃｔｎＲを、例えば、シトリニン生産能を有する糸状菌において、例えば相同的組換えにより破壊することにより、シトリニン生産能が非常に阻害されているか、あるいはまったくシトリニンを生産しない糸状菌を得ることができる。
【００６５】
さらに、上記のようにｃｔｎＲが破壊された糸状菌に、本発明のｃｔｎＲをコードする遺伝子を導入することにより、ｃｔｎＲが破壊された糸状菌におけるシトリニン生産能が回復する。
【００６６】
さらに、ｃｔｎＲが過剰発現するようなプロモーター（例えば、アスペルギルス・オリザエ由来、ａｍｙＢプロモーターなど）を含むベクターに組み込んで、例えば糸状菌に導入することにより、ｃｔｎＲが過剰発現するとともに、ｃｔｎＲによって転写制御されるシトリニン生合成系の酵素（例えばｐｋｓＣＴ）を大量生産することができ、それゆえ該糸状菌におけるシトリニン生合成が促進される。
【００６７】
本発明のｃｔｎＲの破壊によるシトリニン生合成の阻害、ｃｔｎＲのさらなる導入によるシトリニン生合成の回復、およびｃｔｎＲの過剰発現によるシトリニン生合成の促進において、シトリニン生合成経路を有する糸状菌としては、紅麹菌であるモナスカス・プルプレウスおよびモナスカス・ピロサス、ならびにペニシリウム・シトリナムが挙げられ、好ましくは紅麹菌、特に好ましくはモナスカス・プルプレウスである。
【００６８】
シトリニン生合成経路を有さない異種糸状菌に対するシトリニン生産能の付与
本発明による転写因子、ｃｔｎＲをコードする遺伝子と、シトリニン生合成経路を構成する遺伝子クラスター（図７参照）をシトリニン生合成経路を有さない異種糸状菌に共導入することにより、該異種糸状菌はシトリニン生産能を獲得することが出来る。
【００６９】
シトリニン生合成経路を構成する「遺伝子クラスター」とは配列番号４からなる塩基配列からなるポリヌクレオチドであるか、あるいは、
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、本発明の上記ｃｔｎＲをコードする遺伝子と共にシトリニン生合成経路を有さない糸状菌に導入されると、該糸状菌におけるシトリニン生産を引き起こすことができるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基または塩基対が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、本発明の上記ｃｔｎＲをコードする遺伝子と共にシトリニン生合成経路を有さない糸状菌に導入されると、該糸状菌におけるシトリニン生産を引き起こすことができるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで６０％以上の相同性を示すポリヌクレオチドであり、かつ、本発明の上記ｃｔｎＲをコードする遺伝子と共にシトリニン生合成経路を有さない糸状菌に導入されると、該糸状菌におけるシトリニン生産を引き起こすことができるポリヌクレオチド；
のいずれかである。
【００７０】
ｃｔｎＲとかかる遺伝子クラスターを共に、シトリニン生合成経路を有さない異種糸状菌に導入することにより、該糸状菌はシトリニン生合成能力を獲得する。かかるシトリニン生合成経路を有さない異種糸状菌としては、アスペルギルス・ニドュランス、アスペルギルス・オリザエが挙げられ、好ましくは、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)である。
【００７１】
共遺伝子導入は、従来公知の方法、例えば、プロトプラストーＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、によって達成できる。
【００７２】
共遺伝子導入に用いるベクターは、例えば、ｃｔｎＲの導入にはｐＮＲ１０、シトリニン生合成遺伝子クラスターの導入にはｃｏｓＳＣが例示される。
【００７３】
共遺伝子導入に用いるプロモーターは、例えば、アスペルギルス・ニドュランス由来ｔｒｐＣプロモーターが例示される。
【００７４】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００７５】
［実施例の概略］
紅麹菌（Monascus purpureus）から、シトリニンポリケタイドシンターゼをコードするｐｋｓＣＴの隣接領域21-kbpをクローニングした。ｐｋｓＣＴに近接する5'-隣接領域において４つのＯＲＦ(ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、およびｏｒｆ４)、3'-隣接領域において１つのＯＲＦ (ｏｒｆ５)が同定された。ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、およびｏｒｆ５はそれぞれ、デヒドロゲナーゼ、制御因子、オキシゲナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびトランスポーターのホモログをコードするものであった。
【００７６】
RT-PCR分析により、デヒドロゲナーゼをコードするｏｒｆ１をのぞくこれらＯＲＦのすべてが、シトリニン生産条件下でｐｋｓＣＴ遺伝子とともに転写されていることが明らかとなり、これら４つの遺伝子（それぞれ制御因子（ｃｔｎＲ）、オキシゲナーゼ（Ｏｘｇ）、オキシドレダクターゼ（Ｏｒｄ）、およびトランスポーター（Ｔｒａ）に対応するｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４およびｏｒｆ５）がシトリニン生合成に関与していることが示唆された。ｏｒｆ２ (2,006 bpであり、4つのイントロンを有する（配列番号３）)はN-末端に典型的なZn(II)2Cys6 DNA 結合モチーフを含む576-アミノ酸のタンパク質をコードしており、ｃｔｎＲと称することとした。ｃｔｎＲを破壊した結果、ｐｋｓＣＴおよび推定シトリニン生合成遺伝子の１つ(ｏｒｆ５)の転写が劇的に低下し、ｏｒｆ３の転写も在る程度低下し、ｏｒｆ４の転写も程度は低いが低下した。シトリニン生産は野生型株の0.0016%まで低下した。インタクトなｃｔｎＲを有するプラスミドをｃｔｎＲ-破壊株に導入したところ、転写およびシトリニン生産の両方が回復し、ｃｔｎＲがシトリニン生合成の主要な正の転写因子であることが判明した。
【００７７】
Zn(II)2Cys6モチーフを有する制御因子は、糸状菌における転写因子のもっとも大きなクラスの一つを形成し、通常、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のＧＡＬ４によって例証されているように、正の転写因子として作用する(Todd, R. B., and A. Andrianopoulos. 1997. Evolution of a fungal regulatory gene family: the Zn(II)2Cys6 binuclear cluster DNA binding motif. Fungal Genet. Biol. 21: 388-405)。多数のZn(II)2Cys6 制御因子が真菌において同定されており、一次代謝、二次代謝、薬剤耐性、または減数分裂についての制御因子であるとして特徴づけられている。かかる制御因子はそのN末端のZn(II)2Cys6 DNA 結合モチーフ (CX2CX6CX6CX2CX6C、C; システイン残基、X; アミノ酸)により標的遺伝子のプロモーター領域における特異的結合部位(CGGN6-11CCG、N; ヌクレオチド)に結合する。糸状菌における二次代謝産物に関する以前の研究により、いくつかの遺伝子クラスターがこのタイプの制御因子遺伝子を含み、該制御因子が生合成クラスターにおける複数の遺伝子を同調発現させていることが明らかになっている(Walton, J. D. 2000. Horizontal gene transfer and the evolution of secondary metabolite gene clusters in fungi: An hypothesis. Fungal Genet. Biol. 30: 167171)。
【００７８】
本発明者らは、シトリニンポリケタイドシンターゼをコードするｐｋｓＣＴの近傍の複数の遺伝子をクローニングし、シトリニン生合成に関与する複数の新規遺伝子を得た。本発明者らはｐｋｓＣＴの上流領域におけるシトリニン生合成の制御に必須な正の転写因子の獲得に成功し、この正の転写因子の不活性化により非常にシトリニン生産能が低い株を作成できることを証明した。さらに、本発明は、複数の遺伝子がｐｋｓＣＴ遺伝子の周囲にシトリニン生合成遺伝子クラスターを形成している可能性を示す。シトリニン生合成遺伝子クラスターの存在はいままで報告されておらず、本発明はシトリニン生合成機構の解明に寄与するものである。
【００７９】
［材料および方法］
株、培養条件および形質転換
紅麹菌（Monascus purpureus）野生型株であるNBRC30873は、モナスカス培養(MC) 固体培地（グルコース(50 g/l)、ポリペプトン (7.5 g/l)、NH4H2PO4 (2.0 g/l)、MgSO47H2O (0.5 g/l)、CaCl22H2O (0.1 g/l)、KNO3 (2.0 g/l)、および寒天 (20.0 g/l)からなる）のプレート(2% 寒天)で28℃で7-10日間培養した。液体培養のために、菌糸体マット(寒天を伴う約1 cm2の四角片)を寒天プレートから取り出し、500-ml 三角フラスコ中の100 mlのMC 液体培地に接種し、120 rpmで往復振盪しながら28℃でインキュベートした。紅麹菌の形質転換は、Shimizu et al. (Shimizu T., H. Kinoshita, S. Ishihara, K. Sakai, S. Nagai, and T. Nihira. 2005. Polyketide synthase gene responsible for citrinin biosynthesis in Monascus purpureus. Appl. Environ. Microbiol. 71: 3453-3457およびShimizu T., H. Kinoshita, and T. Nihira. 2005. Development of transformation system in Monascus purpureus using an autonomous replication vector with aureobasidin A resistance gene. Biotechnol. Lett. in press)に記載のように行った。
大腸菌における遺伝子操作のために、大腸菌 XL10-Gold（登録商標） Ultracompetent Cells (Stratagene、La Jolla、CA USA)およびLibrary Efficiency（登録商標）DB3.1 Competent Cells (Invitrogen、Carlsbad、CA USA)をクローニング用宿主として用いた。
【００８０】
コロニーハイブリダイゼーション
サザンブロット分析により、４つの断片、即ち、5.0-kb XbaI (1)-XbaI (2)、4.1-kb SalI-HindIII (2)、2.6-kb EcoRI (1) -EcoRI (2)、および2.7-kb HindIII (1)-XbaI (1)が、プローブとしての750-bp EcoRI (3)-EcoRV、820-bp SalI -SacI (2)、960-bp XbaI (1)-EcoRI (2)、および1.6-kb EcoRI (1)-SacI (1) 断片、にそれぞれハイブリダイズすることが示された（図１参照）。モナスカスゲノムDNAを各制限酵素で消化し、1% アガロースゲルで電気泳動した。次いで、対応する領域を抽出し、pUC19のマルチクローニングサイトにサブクローニングし、個々の部分ゲノムライブラリーを構築した。各ライブラリーから、2000 コロニーを選択した。陽性クローンを各プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションにより同定した。
【００８１】
配列分析
クローニングしたDNA 断片をDNAの両鎖について配列決定し、DDBJ ホモロジーサーチシステムのBlastXプログラムにより分析した(http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html)。
【００８２】
RT-PCR
全RNAをRNeasy（登録商標）Mini Kit (Qiagen K. K.、Tokyo、Japan)を用いて抽出し、DNaseIで処理して混入しているゲノムDNAを除いた。cDNAをSuperScriptTM III RNase H- Reverse Transcriptase (Invitrogen)を用いて合成した。PCR 反応において、増幅条件は、25サイクルの、変性(95℃30秒)、アニーリング(55℃30秒)、および伸長 (72℃2分)、そして最後の１回の伸長(72℃4分)であった。用いたプライマーを表1に示す。
【００８３】
【表１】
2008048680.tif 000002
【００８４】
サザンおよびノザンブロット分析
サザンおよびノザンブロット分析は実質的にSambrook et al. (Sambrook J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.)の方法にしたがって行った。サザンブロット分析については、20μgのゲノムDNA (20 μg)を制限酵素で一晩消化し、1.0% アガロースゲル電気泳動によって分離し、Hybond N+ メンブレン(Amersham Biosciences Corp. 800 Centennial Ave、Piscataway、NJ 08855 USA)にトランスファーした。ノザンブロット分析については、全RNA (8 μg)を1 % アガロース-ホルムアルデヒドゲルで分離した。プローブはRandom Primer DNA Labeling Kit Ver. 2 (Takara Bio、Otsu、Japan)を用いて[α-32P] dCTPにより標識した。
【００８５】
pReg-disベクターの構築
2.0-kb SphI-XbaI断片および2.0-kb SalI-HindIII 断片 (図４参照)をT4 DNA ポリメラーゼで処理し、pCSN44 [Fungal Genetics Stock Center (http://www.fgsc.net/)] (Staben. C., B. Jensen, M. Singer, J. Pollock, M. Schechtman, J. Kinsey, and E. Selker. 1989. Use of a bacterial hygromycin B resistance gene as a dominant selectable marker in Neurospora crassa transformation. Fungal. Genet. Newsl. 36:79-81) の平滑末端 XhoIおよび EcoRV 部位にそれぞれ挿入した。該コンストラクトは、ハイグロマイシン-B-耐性遺伝子を選択マーカーとして含んでおり、その両側に2.0-kb SphI-XbaI 断片および2.0-kb SalI-HindIII 断片が位置しており、このベクターをpReg-disと称することとした。
【００８６】
pAG-regベクターの構築
ベクターpAG-regの構築の際、いくつかの制限酵素部位をT4 DNA ポリメラーゼで処理した;かかる部位を図６において星印(*)で示す。SalI 消化の前に、ベクター pCSN44をBamHIによる部分的消化に供し、次いでT4 DNA ポリメラーゼで処理した。pCSN44由来のtrpC プロモーター、ターミネーター、およびハイグロマイシン耐性遺伝子を含む、2.1-kb SalI-BamHI*断片を電気泳動後にアガロースゲルから抽出し、ベクター pUC19 (pTRPpt)のSalIおよびBamHI* 部位に挿入した。pTRPptをClaI*およびBamHI* での消化により直鎖化し、制御因子遺伝子を含む2.4-kb ApaLI*-NdeI* 断片にラーゲーションした (pTRPpregt) 。該ベクターは、pUC19におけるtrpC プロモーターおよびターミネーターを有する。trpC プロモーターおよびターミネーターの間に挟まれた制御因子遺伝子を含む3.4-kb HindIII*-SmaI* 断片をpTRPpregtから単離し、pENTR11 (Invitrogen) (pENTR-TRPpregt)中のEcoRI* 部位に挿入した。pENTR-TRPpregtおよびオーレオバシジンＡ耐性を紅麹菌に付与する選択マーカーとしてAurArを有するベクター pAG (Shimizu T., H. Kinoshita, and T. Nihira. 2005. Development of transformation system in Monascus purpureus using an autonomous replication vector with aureobasidin A resistance gene. Biotechnol. Lett. in press.)を用いて、Gateway system (Invitrogen)による組換え反応を介してベクター pAG-regを構築した（図６Ａ）。
【００８７】
色素およびシトリニン生産の分析
菌糸体および菌糸体非含有ろ液におけるシトリニンおよび色素の量をShimizu et al. (Shimizu T., H. Kinoshita, S. Ishihara, K. Sakai, S. Nagai, and T. Nihira. 2005. Polyketide synthase gene responsible for citrinin biosynthesis in Monascus purpureus. Appl. Environ. Microbiol. 71: 3453-3457.およびShimizu T., H. Kinoshita, and T. Nihira. 2005. Development of transformation system in Monascus purpureus using an autonomous replication vector with aureobasidin A resistance gene. Biotechnol. Lett. in press.)の記載にしたがって測定した。
【００８８】
［転写因子ｃｔｎＲおよびシトリニン生合成遺伝子クラスター同定］
紅麹菌におけるｐｋｓＣＴ-隣接領域のクローニングおよび配列分析
シトリニン生合成における制御機構を調べるために、ｐｋｓＣＴを含む21,917-bp 断片（配列番号４）を４ラウンドのゲノム歩行によってクローニングし、その配列を決定した(図１) (DDBJ登録番号AB243687)。配列分析およびデータベース検索により、この領域はｐｋｓＣＴに加えて、５つの推定ＯＲＦ(ｏｒｆ１、２、３、４および５)を含むことが明らかとなった。ｏｒｆ１、２、３、４および５はそれぞれ、デヒドロゲナーゼ、制御因子、オキシゲナーゼ、オキシドレダクターゼおよびトランスポーターとの類似性を示す産物をコードするものであった(表２)。表２および図１中、ｃｔｎＲはｏｒｆ２、ｃｔｎＡはｏｒｆ３、ｃｔｎＢはｏｒｆ４、ｃｔｎＣはｏｒｆ５にそれぞれ対応する。
【００８９】
【表２】
2008048680.tif 000003
【００９０】
５つのＯＲＦの転写パターンを、シトリニン生産条件下で2、4、または6日間培養された菌糸体から調製したRNAサンプルに対するRT-PCRにより調べた。以前に報告されたように、ｐｋｓＣＴ遺伝子は、野生型株においてシトリニン生産が開始される時期である、培養の２日目に転写されていた(図２−Ａ)。さらに、４つのその他の候補遺伝子(制御因子をコードするｏｒｆ２、オキシゲナーゼをコードするｏｒｆ３、オキシドレダクターゼをコードするｏｒｆ４およびトランスポーターをコードするｏｒｆ５)の転写産物は、ｐｋｓＣＴ遺伝子転写と同様のパターンで培養２日目から検出されたのに対し、ｏｒｆ１遺伝子の転写は検出されなかった。
【００９１】
推定制御因子ｃｔｎＲの特徴付け
ｐｋｓＣＴ遺伝子の上流に位置するｏｒｆ２ 遺伝子は、Zn(II)2Cys6 二核性クラスターDNA-結合タンパク質のメンバーと有意な類似性を示した(Todd, R. B., and A. Andrianopoulos. 1997. Evolution of a fungal regulatory gene family: the Zn(II)2Cys6 binuclear cluster DNA binding motif. Fungal Genet. Biol. 21: 388-405)。かかるZn(II)2Cys6 タンパク質は、それをコードする制御因子遺伝子が二次代謝産物のクラスター内に位置する場合、一般に生合成遺伝子クラスターのその他のメンバーに対する正の転写因子として作用する (Abe, Y., C. Ono, M. Hosobuchi, and H. Yoshikawa. 2002. Functional analysis of mlcR, a regulatory gene for ML-236B (compactin) biosynthesis in Penicillium citrinum. Mol. Genet. Genomics. 268: 352-361. ；Chang, P. K., K. C. Ehrlich, J. Yu, D. Bhatnagar, and T. E. Cleveland. 1995. Increased expression of Aspergillus parasiticus aflR, encoding a sequence-specific DNA-binding protein, relieves nitrate inhibition of aflatoxin biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol. 61: 2372-2377およびEhrlich, K. C., B. G. Montalbano, and J. W. Cary. 1999. Binding of the C6-zinc cluster protein, AFLR, to the promoters of aflatoxin pathway biosynthesis genes in Aspergillus parasiticus. Gene. 230: 249-257)。これにより、ｏｒｆ２が、モナスカスにおけるシトリニン生合成を制御していることが示唆される。ｃｔｎＲ転写産物の詳細な構造を推測するために、5'-および3'- RACEを６日間培養した菌糸体からのmRNAに対して行った。XbaI (1)- XbaI (2) 断片におけるXbaI (1) 部位の下流の残基12ヌクレオチド(nt)を転写開始部位(tss)であると同定した。開始コドン、終止コドン、およびポリアデニル化部位 (AATAAA)は、それぞれtssの下流の126 nt、2,005 nt、および2,048 ntに位置していた。４つのイントロンの存在は典型的なスプライシング部位 (5'- GT-AG-3')の存在から推定した。ｃｔｎＲ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列を配列番号１に、ｃｔｎＲタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に、イントロンを含めたゲノムｃｔｎＲ遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号３にそれぞれ示す。RT-PCR、次いで配列決定により、それらイントロンはtssから開始して、nt 238〜296、571〜622、1131〜1206、および1696〜1783にあることが確認された(図３) (DDBJ登録番号AB243687)。
【００９２】
ｏｒｆ２の遺伝子破壊
ｏｒｆ２のインビボでの機能を分析するために、ベクター pReg-dis (図４−Ａ)を用いる相同組換えによってｏｒｆ２-破壊株を作成した。それによってｏｒｆ２の、DNA結合Zn(II)2Cys6モチーフを含む主要な部分が欠損した。そのためｏｒｆ２-破壊株では標的遺伝子の発現を活性化することが出来なかった。ｏｒｆ２座位の組換えが正確であるかを、PCRおよびサザンブロット分析により確認した(図４−Ｂ)。
【００９３】
ｏｒｆ２-破壊株（即ちｃｔｎＲ破壊株）は成長 (図５−Ａ)または色素生産(図５−Ｂ)のいずれについても野生型株との有意差を示さなかった。しかし、培養期間中、ｏｒｆ２-破壊株のシトリニン生産(図５−Ｃ)は劇的に低下した(フラスコあたりのシトリニンは100 ng未満となった)。これとは対照的に、野生型株によるシトリニン生産は良好に進行した(培養１０日目にフラスコあたりのシトリニンは1930 μgであった)。即ち、ｃｔｎＲ遺伝子破壊により、モナスカスにおけるシトリニン生産を著しく抑制できることが明らかになった。これにより、ｏｒｆ２遺伝子産物はシトリニンの有効な生産に必須であることが示唆された。
【００９４】
転写分析を行ったところ、ｏｒｆ２ 遺伝子とシトリニン生産との相関関係が明らかになった。ｐｋｓＣＴ遺伝子についてのノザンブロット分析により、ｏｒｆ２-破壊株におけるｐｋｓＣＴ転写産物は劇的に低下していることが示され (図２−Ｂ)、この結果は、ｏｒｆ２遺伝子産物がシトリニン生合成に関与することを明確に示した。
【００９５】
さらに、ｐｋｓＣＴ遺伝子の周辺の遺伝子についてのｏｒｆ２-破壊株のRT-PCR 分析において、ｏｒｆ５遺伝子およびｏｒｆ３遺伝子の転写産物は、ｐｋｓＣＴとともに低下し、ｏｒｆ４の転写産物は程度は低いが低下した(図２−Ａ)。これらの結果は、アフラトキシン生合成クラスターにおけるAflRの場合と同様に(Ehrlich, K. C., B. G. Montalbano, and J. W. Cary. 1999. Binding of the C6-zinc cluster protein, AFLR, to the promoters of aflatoxin pathway biosynthesis genes in Aspergillus parasiticus. Gene. 230: 249-257)、ｏｒｆ２ 遺伝子産物（ｃｔｎＲ）は、ｐｋｓＣＴ、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４およびｏｒｆ５に対する正の転写因子として作用することを示し、ｐｋｓＣＴおよびｏｒｆ３〜５のプロモーター領域において保存された配列は見いだされていないが、これはおそらく、これら遺伝子のそれぞれの上流領域における特異的結合部位に対するｏｒｆ２ 遺伝子産物（ｃｔｎＲ）の結合による。
【００９６】
ｃｔｎＲ-破壊株におけるｃｔｎＲ遺伝子発現
ｃｔｎＲがシトリニン生合成における正の転写因子として作用することを証明するために、構成的trpC プロモーターの制御下にあるｃｔｎＲのインタクトな一つのコピーを、自己複製ベクターによってｃｔｎＲ-破壊株に導入した(図６-Ａ)。プラスミド上に単独のインタクトなｃｔｎＲを含む形質転換体(株：E3およびE4、図６−Ｂ) またはさらなるｃｔｎＲをゲノムに組み込まれた形態として含む形質転換体(株：E1およびE2)を得、前者をさらなる分析に用いた。前者、即ち、ｃｔｎＲ-破壊株に１コピーのｃｔｎＲを有する株を、ｃｔｎＲ-補完株と称する。
【００９７】
野生型株とｃｔｎＲ-破壊株との間で培養期間中成長における有意差は観察されなかったが、ｃｔｎＲ-補完株はわずかな成長の低下を示した。ｃｔｎＲ-破壊株とは全く対照的に、ｃｔｎＲ-補完株ではシトリニン生産能が回復していた。ただしシトリニン生産の程度は野生型株よりわずかに低かった (ｃｔｎＲ-補完株は培養１０日目で1649 μg/フラスコ、野生型株は培養１０日目で1930 μg/フラスコ)。
【００９８】
さらに、ｃｔｎＲ-補完株において、各遺伝子の転写産物をRT-PCRにより検出したところ、ｏｒｆ５、ｐｋｓＣＴ、およびｏｒｆ３遺伝子の転写レベルは野生型株に匹敵するものであった(図２)。また、ｃｔｎＲ−補完株においてｏｒｆ４の転写の増加が観測された。これら結果により、ｃｔｎＲが紅麹菌におけるシトリニン生合成の正の転写因子であることが結論される。
【００９９】
ｏｒｆ２（ｃｔｎＲ）以外のＯＲＦによりコードされるタンパク質は、オキシゲナーゼ (ｏｒｆ３)、オキシドレダクターゼ (ｏｒｆ４)、およびトランスポーター (ｏｒｆ５)である。オキシゲナーゼおよびオキシドレダクターゼの存在は、シトリニン生合成の提案されている経路に対応する(図７)。シトリニン生合成においては、シトリニンポリケタイド骨格の形成後のいくつかの工程において酸化および還元が必須である。推定されるトランスポーター(ｏｒｆ５)はカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)のFLU1 タンパク質のホモログである(Calabrese, D., J. Bille, and D. Sanglard. 2000. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole. Microbiology. 146: 2743-2754.)。したがって、ｏｒｆ５はシトリニンの細胞内蓄積を妨げるためのトランスポーターとして作用していることが示唆される。
【０１００】
転写分析もまた、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４およびｏｒｆ５が、シトリニン生合成経路に寄与していることを示唆した。というのはそれらの転写産物がシトリニン生産条件下で検出され、ｃｔｎＲ-破壊がｐｋｓＣＴ遺伝子と同様にこれらのｏｒｆの転写に影響していたからである（図２Ａ）。これらの結果は、ｐｋｓＣＴ、ｃｔｎＲ、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４およびｏｒｆ５がシトリニン生合成遺伝子クラスターを形成するという仮説を支持する。 
【０１０１】
本発明者らは、シトリニン産生菌における正の転写因子をコードする遺伝子を含むシトリニン生合成遺伝子クラスターの存在を初めて見いだした。
【０１０２】
以上のデータから、図７に示すように、モナスカスにおけるシトリニン生合成は、一般的なポリケタイド化合物と同様であり、初期段階においてポリケタイド骨格の形成のためにｐｋｓＣＴが働き、次いでオキシゲナーゼ（Ｏｘｇ）やオキシドレダクターゼ（Ｏｒｄ）といった酸化還元酵素が作用してシトリニンが合成され、産生したシトリニンはトランスポーター（Ｔｒａ）により菌体外へと排出されると結論される。そしてこれら生合成酵素群によるシトリニン生産をｃｔｎＲが正に調節していると考えられる。
【０１０３】
［アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）に対するｃｔｎＲおよびシトリニン生合成遺伝子クラスターの導入］
次に、本発明者らは生理活性物質の生産・遺伝子解析、有用物質の大量生産を可能とするため、糸状菌における異種遺伝子発現系の構築を試みた。この実施例において、宿主としてはアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）NS4株を用い、異種遺伝子群としては、紅麹菌（M.purpureus)由来のシトリニン生合成遺伝子群を用いた。
【０１０４】
M. purpureusゲノムＤＮＡをSau3AIで部分分解し、２０ｋｂ〜５０ｋｂの長さの断片をアガロースゲル電気泳動により分離、回収した。得られたＤＮＡ断片をSupercos1 コスミドベクター（Stratagene）のBamHIサイトにライゲーション後、Gigapack III XL パッケージングエクストラクト（Stratagene）を用いてパーケージングを行った。得られた４０００個のコロニーより、ＫＳ、ＬＣ５プライマーにより増幅した４３０ｂｐからなるpksCTの一部をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーションにより、ポジティブクローンを選択した。得られたポジティブクローンがシトリニン生合成遺伝子クラスター全てを含むかをpksCT、orf1〜orf5それぞれに特異的なプライマーを用いＰＣＲにより確認し、Supercos CT-1クローンがクラスター全てを含んでいることを確認した。表３において、Dehy-f および-rはデヒドロゲナーゼ遺伝子、Reg-fおよび-rはｃｔｎＲ遺伝子、Oxg-fおよび rはオキシゲナーゼ遺伝子、Oxd-fおよびrはオキシドレダクターゼ遺伝子、KSおよびLC5はｐｋｓＣＴ遺伝子、 Tra-fおよびrはトランスポーター遺伝子の存在をそれぞれ確認するためのオリゴヌクレオチドプライマーである。表において下線を付した配列はKpnI部位を示す。
【表３】
2008048680.tif 000004
【０１０５】
大腸菌-アスペルギルス・シャトルコスミドAn26(Fungal Genetics Stock Center, Kansas City, Missouri)をSmaI、XbaIで切断することによりハイグロマイシン耐性遺伝子を取り除き、そこにpUSCからPstI処理、T4 DNA polymerase処理を行った３．２５ｋｐのを硫酸塩資化性を付与するsC遺伝子を組込みCossCを構築した。Supercos CT-1をBamHIにより部分分解し、２０ｋｂ〜５０ｋｂの長さの断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、CossCのBamHIサイトにライゲーションし、Gigapack III XL パッケージングエクストラクト（Stratagene）を用いてパーケージングを行った。得られたコロニーより、上述した方法によりシトリニン生合成クラスター全長を含んでいることを確認した。得られたCossCをＫＳ、ＬＣ５プライマーにより増幅した４３０ｂｐからなるpksCTの一部をプローブとを用いて、図８に示すように、紅麹菌（M.purpureus)由来の、シトリニン生合成遺伝子クラスター、即ち、ｃｔｎＲ（ｏｒｆ２）、オキシゲナーゼ（ｏｒｆ３）、オキシドレダクターゼ（ｏｒｆ４）、ｐｋｓＣＴ（シトリニンポリケタイドシンターゼ）、トランスポーター（ｏｒｆ５）を含む、２１９１７ｂｐ（配列番号４）を含む領域である遺伝子クラスターを、シトリニン生合成経路を有さないアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）NS4株に導入した。シトリニン生合成遺伝子クラスターは、コスミドに挿入し、菌株への導入はタカラバイオ社のピリチアミン耐性を利用したプロトプラストーＰＥＧ形質転換法に基本的に従ったが選択培地にはsCもしくはsCD (CD + 0.8% NaCl)を用いた。
【０１０６】
図８の下パネルは、形質転換されたアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）NS4株における、遺伝子クラスターの存在を示すサザンブロットの結果を示す。サザンブロット分析は実質的にSambrook et al. (Sambrook J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.)の方法にしたがって行った。サザンブロット分析については、20μgのゲノムDNA (20 μg)を制限酵素Sac IIで一晩消化し、1.0% アガロースゲル電気泳動によって分離し、Hybond N+ メンブレン(Amersham Biosciences Corp. 800 Centennial Ave、Piscataway、NJ 08855 USA)にトランスファーした。プローブは、図８の遺伝子クラスターの模式図の上に実線（オキシドレダクターゼの上にある小さい実線）で示す。プローブはオキシドレダクターゼの一部をプライマーOxd-fおよびOxd-rにより増幅した断片をRandom Primer DNA Labeling Kit Ver. 2 (Takara Bio、Otsu、Japan)を用いて[α-32P] dCTPにより標識したものを用いた。
【０１０７】
図８において遺伝子クラスターを含んだコスミドからのサンプル（レーン１）では、約１５ｋｂの強いバンドが観察され、一方、アスペルギルス・オリザエ野生型株からのサンプル（レーン２）および、コントロールとして用いたインサートとして遺伝子クラスターを含まないコスミドを導入されたアスペルギルス・オリザエからのサンプル（レーン３）では、約１５ｋｂの対応するバンドは観察されなかった。遺伝子クラスターを含むコスミドを導入されたアスペルギルス・オリザエ形質転換候補株ＣＴ１〜３（それぞれレーン４〜６）においては、ＣＴ１およびＣＴ３において、遺伝子クラスターに対応するバンドが観察された。したがって、次の実験においては形質転換が成功したアスペルギルス・オリザエ形質転換株ＣＴ１およびＣＴ３を用いることとした。
【０１０８】
次いで、インサートを含まないコスミドのみを導入したコントロール株、およびシトリニン生合成遺伝子クラスター形質転換株ＣＴ１およびＣＴ３をＧＭＰ培地（2 %グルコース、2 % モルトエクストラクトおよび 0.1 % ポリペプトン）で３０℃、１６０ｒｐｍで、７日間培養し、培養液を0.20μmフィルター（DISMIC-13cp Cellulose Acetate, Advantec社）で濾過し、それぞれの500μlの培養液をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ条件は以下の通りであった。
Ｃ１８カラム（CAPCELL PAK C18 UG 資生堂）
ＨＰＬＣバッファー：55% CH3CN,45% 水(0.1% TFA)
発光波長：500nm、励起波長：330nm
流速：1ml/分
【０１０９】
結果を図９に示す。シトリニン生合成遺伝子クラスターを導入したＣＴ１およびＣＴ３によるシトリニン生産量は、遺伝子クラスターを含まないコスミドを導入したコントロール株と比較して、顕著な差を示さなかった。なお、以下の表に示すように、100mlの培養液中のシトリニン量を測定(n=3)したところ、コントロールと比較して、ＣＴ１およびＣＴ３によるシトリニン生産量は高くなっていることが判明した。
【表４】
2008048680.tif 000005
【０１１０】
先の実験により、シトリニン生合成遺伝子クラスターを導入したアスペルギルス・オリザエ形質転換株では、コントロールと比較して顕著なシトリニン生産量の上昇が達成されなかったため、シトリニン生合成遺伝子の正の転写因子であることが示唆されたｃｔｎＲを含むプラスミドpNR10+reg（ｔｒｐＣのプロモーターと、ｔｒｐＣのターミネーターの間にｃｔｎＲをコードする遺伝子を含むプラスミド：図１０参照）を、遺伝子クラスター導入株ＣＴ３にさらに導入した。
【０１１１】
ＣＴ３株におけるｃｔｎＲを含むプラスミドpNR10+regの導入を確認するために、ＣＴ３株（遺伝子クラスターのみを導入）およびＣＴ３＋ｃｔｎＲ株（遺伝子クラスターとｃｔｎＲの両方を導入）からのサンプルを、プローブとしてｃｔｎＲの一部を用いるサザンブロット分析に供した。図１０に示すように、ＣＴ３＋ｃｔｎＲ株（図中、形質転換体と示す）においては、ＣＴ３株では観察されない、pNR10+regに対応するバンドが検出された。また、ＣＴ３＋ｃｔｎＲ株では、ＣＴ３における強いバンド（遺伝子クラスターが検出されているバンド）に対応するバンドが検出された。このことから、ＣＴ３＋ｃｔｎＲ株においては、シトリニン生合成遺伝子クラスターと、ｃｔｎＲを含むプラスミドが導入されていることが確認された。
【０１１２】
次に、ＣＴ３＋ｃｔｎＲ株におけるシトリニン生産を上記と同様にＨＰＬＣにより測定した。図１１に示すように、ＣＴ３株ではほとんどシトリニン生産がみられないのに対し、ＣＴ３＋ｃｔｎＲ株においては、８株の内、２株（ＣＴ３＋ｃｔｎＲ４およびＣＴ３＋ｃｔｎＲ５）では、顕著なシトリニン生産量の増大が確認された。特に、ＣＴ３＋ｃｔｎＲ５株に注目すると、ＣＴ３株と比較して約５００倍のシトリニン生産の増大が確認された。
【０１１３】
ＣＴ３＋ｃｔｎＲ株におけるシトリニン生産の上昇の原因がｃｔｎＲの複数コピーの導入による転写活性化に起因するのかを確認するために、コントロール株（遺伝子クラスターを含まないコスミドを導入した株）、ｃｔｎＲ株（ｃｔｎＲのみを導入した株）、ＣＴ株（シトリニン生合成遺伝子クラスターのみを導入した株）およびＣＴ３＋ｃｔｎＲ株（シトリニン生合成遺伝子クラスターに加えてさらにｃｔｎＲを導入した株）における、シトリニン生合成遺伝子の転写活性をpksCT、orf1〜orf5それぞれに特異的なプライマーを用いＲＴ−ＰＣＲにより測定した。転写量を調べたシトリニン生合成遺伝子は、デヒドロゲナーゼ（Ｄｅｈｙ）、ｃｔｎＲ（Ｒｅｇ）、オキシゲナーゼ（Ｏｘｇ）、オキシドレダクターゼ（Ｏｘｒ：Ｏｒｄとも称される）、ｐｋｓＣＴおよびトランスポーター（Ｔｒａ）である。標準としてアクチンを用いた。
【０１１４】
結果を図１２に示す。レーン１は、コントロール株、レーン２および３は、ｃｔｎＲ株、レーン４は、ＣＴ株、レーン５および６は、ＣＴ３＋ｃｔｎＲ株からの転写産物の量をそれぞれ示す。コントロール株においては、シトリニン生合成に関与する遺伝子の転写産物はいずれも観察されなかったのに対し、ｃｔｎＲ株では、ｃｔｎＲの転写産物が観察された。ＣＴ株では、ｃｔｎＲよりも上流に位置するデヒドロゲナーゼを除く、すべてのシトリニン生合成遺伝子の転写がわずかに検出された。ＣＴ３＋ｃｔｎＲ株においては、すべてのシトリニン生合成遺伝子の転写が強く誘導されていた。これは、ｃｔｎＲが、シトリニン生合成遺伝子の転写を正に誘導する転写因子であることを強く示唆する。
【０１１５】
このことから、シトリニン生合成活性を有さないアスペルギルス・オリザエに、紅麹菌由来のシトリニン生合成遺伝子クラスターと、ｃｔｎＲ遺伝子をともに導入することにより、アスペルギルス・オリザエがシトリニン生産能を獲得すること、および、シトリニン生合成遺伝子クラスターを形成する各遺伝子が、転写因子ｃｔｎＲにより正の制御を受けることが判明した。
【０１１６】
上記のように、異種遺伝子群発現系のモデルとして紅麹菌（M.purpureus)由来のシトリニン合成遺伝子群をアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）に導入し、シトリニン生産を確認するとともに、転写因子であるｃｔｎＲをさらに導入することによりシトリニン生産が最大５００倍になることを見いだした。
【０１１７】
以上から、本発明者らは、シトリニン生産能を有さないアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）に、シトリニン生合成遺伝子クラスターと多重にｃｔｎＲ遺伝子を導入することにより、アスペルギルス・オリザエを用いたシトリニン生合成系の構築に成功するとともに、かかる系を利用することによりシトリニン生合成クラスター内の全ての遺伝子がｃｔｎＲにより発現調節されていることを明らかにした。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１は、クローニングされた断片の制限酵素地図である。5.0-kb XbaI (1)-XbaI (2)、4.1-kb SalI HindIII (2)、2.6-kb EcoRI (1)-EcoRI (2)、および2.7-kb HindIII-XbaI (1) 断片をコロニーハイブリダイゼーションにより得た。ｏｒｆ１、ｃｔｎＲ（ｏｒｆ２）、ｃｔｎＡ（ｏｒｆ３）、ｃｔｎＢ（ｏｒｆ４）、およびｃｔｎＣ（ｏｒｆ５）は、デヒドロゲナーゼ、制御因子、オキシゲナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびトランスポーターのホモログにそれぞれ対応する、同定された遺伝子を示す。ｐｋｓＣＴは、シトリニンポリケタイドシンターゼ遺伝子を示す。太い矢印は位置と方向を示す。
【図２】図２は、推定シトリニン生合成遺伝子の転写分析を示す。(A) RT-PCRを、示された培養期間後にMC 液体培地から回収した菌糸体から抽出したRNAサンプルに対して行った。(B) ｐｋｓＣＴ遺伝子のノザンブロット分析を示す。プライマー、ｐｋｓＣＴ−Ｆ（配列番号１９）およびｐｋｓＣＴ−Ｒ（配列番号２０）を用いたRT-PCRによる増幅断片をプローブとして用いた。  Wは野生型株、DはｃｔｎＲ-破壊株、 EはｃｔｎＲ-補完ｃｔｎＲ-破壊株を示す。ｏｒｆ１はデヒドロゲナーゼ、ｏｒｆ２は制御因子 (ｃｔｎＲ) 、ｏｒｆ３はオキシゲナーゼ、ｏｒｆ４はオキシドレダクターゼ、ｐｋｓＣＴはシトリニンポリケタイドシンターゼ、ｏｒｆ５はトランスポーターを示す。actはアクチンを示す。
【図３】図３は、ｃｔｎＲの遺伝子構造を示す。ｃｔｎＲの5'および3'末端の配列において、矢印は転写開始および終止部位を示す。下線で示す配列は推定ポリアデニル化部位である。太い矢印は、576-アミノ酸タンパク質（配列番号２）をコードする2,006 bpのｃｔｎＲゲノムDNA（配列番号３）を示す。各イントロンは白抜きで示し、その上部にイントロンの大きさを示す。左端の白い長方形は、Zn(II)2Cys6 DNA 結合モチーフを示す。N-末端のDNA結合モチーフの配列において大きい太字はZn(II)2Cys6 DNA 結合モチーフを構成するシステイン残基である。
【図４】図４は、(A)において相同組換えを介する二重乗換え（double crossover）によるｏｒｆ２-破壊を示し、(B)においてｏｒｆ２-破壊株のPCR (左側)およびサザンブロット(右側) 分析を示す。ｏｒｆ２ 遺伝子をpReg-disからのハイグロマイシン耐性遺伝子 (白抜き矢印、Hygr)の挿入によって破壊した。小さい矢印はPCR 分析に用いたPCR プライマー、dis F（配列番号２３）およびdis R（配列番号２４）を示す。ハイグロマイシン耐性遺伝子の一部をサザンブロット分析のためのプローブとして用いた(白抜き矢印の下の両側に向いた矢印)。Wは野生型株、DはｃｔｎＲ-破壊株を示す。
【図５】図５は、ｃｔｎＲ-破壊株およびｃｔｎＲ-補完-ｃｔｎＲ-破壊株の表現型分析である。(A)液体培地中での成長。成長は菌糸体の乾燥重量によって表す。野生型株は菱形、ｃｔｎＲ-破壊株は四角、およびｃｔｎＲ-補完-ｃｔｎＲ-破壊株は三角で表す。(B) 色素生産。色素は乾燥菌糸体から70% エタノールにより抽出し、500 nmにおける吸光度(OD)をエタノール抽出液について測定した。野生型株は菱形、 ｃｔｎＲ-破壊株は四角で示す。(C)野生型株 (菱形)、ｃｔｎＲ-破壊株 (四角)およびｃｔｎＲ-補完-ｃｔｎＲ-破壊株 (三角)の間のシトリニン生産の比較。菌糸体および菌糸体-非含有ろ液の両方におけるシトリニン含量をHPLCおよびELISAで測定し、その和を示す。かかる実験は少なくとも３回独立して行った。
【図６】図６は、インタクトなｃｔｎＲによるｃｔｎＲ-破壊株の補完を示す。(A)補完ベクター pAG-regの構築のためのスキーム。pTRPpregtにおいて、trpC プロモーターおよびターミネーターに挟まれているｃｔｎＲ遺伝子の発現カセットを、pCSN44におけるハイグロマイシン耐性遺伝子をｃｔｎＲと置換することにより構築した。Gateway systemによってカセットをpENTR-TRPpregtからpAGに移し、その結果、選択マーカーとしてAurArを有するベクター pAG-regを得た。 (B) ｃｔｎＲ-補完株のサザンブロット分析。ｃｔｎＲ遺伝子の一部をプローブとして用いた((A)の左上、ｃｔｎＲの上の両方に向いた矢印)。BglI-消化により、pAG-reg-由来のｃｔｎＲを含む株はいずれも1.3-kbのバンドを示す。SalI-消化により、pAG-reg-由来のｃｔｎＲを含む株はいずれも2.2-kbのバンドを示す。一方野生型株は3.0-kbのバンドを示す。株E1およびE2における2.2-kbpよりも小さいバンドは、自律的に存在するpAG-reg加えて、ゲノムに組み込まれたpAG-regが存在することを示す。E4が表現型分析について選択された。Pは陽性対照としてのpAG-regを示し、Wは野生型株を示し、E1〜E4は、ｃｔｎＲ-補完-ｃｔｎＲ-破壊株を示し、DはｃｔｎＲ-破壊株を示す。
【図７】図７は、シトリニン生合成遺伝子クラスターを示す図である。図中、ｃｔｎＲは、本発明による転写因子、Ｏｘｇはオキシゲナーゼ、Ｏｒｄはオキシドレダクターゼ、ｐｋｓＣＴはポリケタイドシンターゼ、Ｔｒａはトランスポーターを示す。ｃｔｎＲは、遺伝子クラスター内の遺伝子の転写を正に制御し、ｐｋｓＣＴはポリケタイド骨格の合成に関与し、オキシゲナーゼおよびオキシドレダクターゼは、該ポリケタイド骨格を酸化還元により修飾し、トランスポーターは生じたシトリニンの菌体外への排出に関与すると考えられる。
【図８】図８は、アスペルギルス・オリザエへの、紅麹菌由来のシトリニン生合成遺伝子クラスターの導入を確認するサザンブロット分析の結果を示す。遺伝子クラスターの導入が成功したアスペルギルス・オリザエ株においては、オキシドレダクターゼの上に実線で示す領域をプローブとして用いたサザンブロット分析により、当該位置に強いバンドが確認された（レーン４および６、それぞれＣＴ１およびＣＴ３と称される）。
【図９】図９は、紅麹菌由来のシトリニン生合成遺伝子クラスターが導入されたアスペルギルス・オリザエＣＴ１およびＣＴ３、およびコントロール株におけるシトリニンの生産を示すＨＰＬＣの結果を示す。ＣＴ１およびＣＴ３のいずれにおいても、コントロール株と比較して顕著なシトリニン生産の上昇はみられなかった。
【図１０】図１０は、紅麹菌由来のシトリニン生合成遺伝子クラスターが導入されたアスペルギルス・オリザエＣＴ３株に、さらに転写因子ｃｔｎＲ遺伝子を導入した形質転換体の作成を示す。
【図１１】図１１は、紅麹菌由来のシトリニン生合成遺伝子クラスターが導入されたアスペルギルス・オリザエＣＴ３に、さらに転写因子ｃｔｎＲ遺伝子を導入した形質転換体の一つであるＣＴ３＋ｃｔｎＲ５株は、ＣＴ３株と比較して約５００倍のシトリニンを生産することを示す図である。
【図１２】図１２は、アスペルギルス・オリザエの、コントロール株、ｃｔｎＲのみを導入したｃｔｎＲ株、シトリニン生合成遺伝子クラスターのみを導入したＣＴ株およびシトリニン生合成遺伝子クラスターとｃｔｎＲとの両方を導入したＣＴ＋ｃｔｎＲ株における、シトリニン生合成に関与する各遺伝子の転写活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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