(57)【要約】      （修正有）【課題】ＣＭＣ、キトサンに対して強い分解作用があるセルラーゼ、及びそのセルラーゼをコードするセルラーゼ遺伝子のクローニングを行い、当該酵素のアミノ酸配列、当該酵素をコードする塩基配列を決定し、それらを提供することを目的とする。【解決手段】特定な配列で表せるアミノ酸からなるタンパク質とし、そのアミノ酸をコードするセルラーゼ遺伝子及びその遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡ、それらを含む組み換え体の構成とした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列もしくはその一部、又はそれらのアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
配列番号４で表されるアミノ酸配列もしくはその一部、又はそれらのアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項３】
セルラーゼ活性の他、キトサナーゼ活性を有する請求項１、又は請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
配列番号１で表され、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項７】
配列番号３で表され、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項８】
セルラーゼ活性の他、キトサナーゼ活性を有する請求項４〜請求項７に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項９】
請求項４〜請求項８の遺伝子と８０％以上の相同性を有し、セルラーゼ活性、キトサナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１０】
請求項４〜請求項８の遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【請求項１１】
請求項２〜請求項６の遺伝子をベクターＤＮＡに組み込んだことを特徴とする組み換え体ＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項７に記載の組み換え体ＤＮＡを有することを特徴とする組み換え生物。
【請求項１３】
請求項２〜請求項６の遺伝子をゲノムに挿入されたことを特徴とする組み換え生物。
【請求項１４】
微生物であることを特徴とする請求項１１又は１２に記載の組み換え生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボキシルメチルセルロース（以下、「ＣＭＣ」という。）を分解する酵素であるセルラーゼ及びそのセルラーゼをコードするセルラーゼ遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明者等は、特許文献１、２に公開されているように、タンパク質及びペプチド中におけるリシン残基のカルボキシル基末端側のペプチド結合（−Ｌｙｓ−Ｘ−結合、Ｘ＝２０種類のアミノ酸残基）のみを特異的に切断するルシルエンドペプチダーゼ（以下、「ＬＥＰ」という。）を高生産するLysobacter sp. IB-9374株を土壌中から単離し、本菌とその酵素がコードされている遺伝子について発表している。
【特許文献１】特開２０００−８３６５２号公報
【特許文献２】特開２００１−２３１５７１号公報
【０００３】
なお、Lysobacter sp. IB-9374株は、凍結乾燥品として、ブダペスト条約の国際寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番１号）に、１９９８年８月３日付で受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１６９２８」として受託されている。
【０００４】
さらに、本菌は、前記ＬＥＰに加え、ＣＭＣを分解する酵素であるセルラーゼ（以下、「Ｃｅｌ８Ａ」という。）を分泌する。そこで、Ｃｅｌ８Ａについて、精製し、その基質特異性を検討した。
【０００５】
その結果は、非特許文献１に示すように、「Ｃｅｌ８Ａ」は、培養液から硫安分画、SP-Toyopearl 650M、Superdex 200などにより精製し、電気泳動的に均一な酵素標品を得た。精製酵素は分子量41kDaであり、CMCに対する至適pHは5.0、至適温度は40℃であった。また、本酵素はCMC活性に加えてキトサン活性を示し、CMC＞コロイドキトサン＞キトサン＞グリコールキトサンの順で加水分解した。N-末端アミノ酸配列はAPNYPFGSHRRA-であり、既知の両活性を示すB.subtilisおよびMyxobacter sp.由来のそれらと比較してN末端アミノ酸は同一であるが、それ以外は異なっていた。さらに、pH5.0でCMCに対して1/160量(w/w)の酵素を37℃で24時間反応させ主要分解生成物は、Cellobioseであった。
【非特許文献１】農芸化学会２００５年度、大会講演集ｐ２９                        「Lysobacter sp.由来セルラーゼの精製と諸性質」
【０００６】
セルラーゼはセルロースとその類似多糖をグルコース、又はセロビオース、或いはセロオリゴ糖まで分解する酵素反応を触媒する複雑な酵素系から成り、その作用機構により、Ｃ1酵素、Ｃx酵素とβ−グルコシダーゼ、或いはエキソ−β−グルカナーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、セロビアーゼなどの名称で呼ばれる酵素の総称と理解されている。
【０００７】
上記セルラーゼのうち、ＣＭＣに対する作用、すなわちエンド型水解作用が特に高いものをカルボキシメチルセルラーゼと称する。
【０００８】
従来のセルラーゼとして、特許文献３に、ＣＭＣ及びリケナンに対して強く作用し、作用pH範囲が広く、各種界面活性剤の存在下で安定で、特にアルカリ耐性に優れることを特徴とし、バチルス属に属するカルボキシメチルセルラーゼ５４３０が公開されている。
【特許文献３】特開平７−８７９７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献３に記載のセルラーゼは、ＣＭＣの他、「リケナン」を基質とするとされるが、「キトサン」を基質としない。
【００１０】
そこで、本発明は、ＣＭＣ、キトサンに対して強い分解採用があるセルラーゼ及びそのセルラーゼをコードするセルラーゼ遺伝子（以下、「ｃｅｌ８Ａ遺伝子」という。）のクローニングを行い、当該酵素のアミノ酸配列、当該酵素をコードする塩基配列を決定し、それらを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、上記の課題を解決するために、配列番号２で表されるアミノ酸配列もしくはその一部、又はそれらのアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有することを特徴とするタンパク質とし、配列番号４で表されるアミノ酸配列もしくはその一部、又はそれらのアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有することを特徴とするタンパク質とし、セルラーゼ活性の他、キトサナーゼ活性を有する請求項１、又は請求項２に記載のタンパク質とし、請求項１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子とし、請求項２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子とし、配列番号１で表され、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とし、配列番号３で表され、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とし、セルラーゼ活性の他、キトサナーゼ活性を有する請求項４〜請求項７に記載のタンパク質をコードする遺伝子とし、請求項４〜請求項８の遺伝子と８０％以上の相同性を有し、セルラーゼ活性、キトサナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とし、請求項４〜請求項８の遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子とし、請求項２〜請求項６の遺伝子をベクターＤＮＡに組み込んだことを特徴とする組み換え体ＤＮＡとし、請求項７に記載の組み換え体ＤＮＡを有することを特徴とする組み換え生物とし、請求項２〜請求項６の遺伝子をゲノムに挿入されたことを特徴とする組み換え生物とし、微生物であることを特徴とする請求項１１又は１２に記載の組み換え生物の構成とした。
【００１２】
ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、２つのＤＮＡ断片がSambrook
Jらによって記載されたような標準的なハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する（Expression
of cloned genes in E. coli(Molecular Cloning:A laboratory manual(1989))Cold
Spring harbor Laboratory Press, New York, USA, 9. 47-9. 62及び11.45-11.61）。
【００１３】
より具体的には、Ｔｍ値の±１０℃を基準としてハイブリダイゼーション及び洗浄（例えば約２．０×ＳＳＣ、５０℃）を行うことを意味する。また、前記相同性としては、例えば、８０％〜９０％以上であり、好ましくは９５％以上であり、より好ましくは、９７．５％以上である。
【００１４】
本発明の組み換え体ＤＮＡは、本発明のセルラーゼ活性、又はセルラーゼ活性及びキトサナーゼ活性をコードする遺伝子（ｃｅｌ８Ａ遺伝子）を挿入したベクターＤＮＡである。当該ベクターＤＮＡとしては、原核細胞及び／または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであれば特に制限されず、プラスミドベクター及びファージベクターが包含される。
【００１５】
本発明の組み換え体ＤＮＡは、簡便に当業界に於いて入手可能なベクター、好ましくはプラスミドベクターまたはバクテリオファージベクターに、本発明のセルラーゼ活性、又はセルラーゼ活性及びキトサナーゼ活性をコードする遺伝子（ｃｅｌ８Ａ遺伝子）を常法により組み込むことにより調製することもできる。
【００１６】
このようなベクターとして、具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして例えばpBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19など、酵母由来プラスミドとして例えばpSH19、pSH15など、枯草菌由来プラスミドとして例えばpUB110、pTP５、pC194などが挙げられる。また、ファージとしては、λファージなどのバクテリオファージが、更にレトロウィルス、ワクシニヤウィルス、核多角体ウィルスなどの動物や昆虫のウィルスが例示される。
【００１７】
本発明のｃｅｌ８Ａ遺伝子を発現させ、これらタンパク質を生産させる目的に於いては、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、原核細胞及び／または真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明のセルラーゼ遺伝子を発現し、これらタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に制限されない。
【００１８】
宿主細胞として細菌、特にE.coliを用いる場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−オペレーター領域、開始コドン、本発明のセルラーゼ遺伝子、終始コドン、ターミネーター領域及び複製可能単位から構成される。
【００１９】
宿主として酵母または動物細胞を用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、開始コドン、本発明のｃｅｌ８Ａ遺伝子、終止コドンを含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、本発明のセルラーゼ遺伝子の5’側及び3’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位なども発現ベクターに組み込むことが可能である。
【００２０】
細菌中で本発明のｃｅｌ８Ａ遺伝子を発現させるためのプロモーター−オペレーター領域は、プロモーター、オペレーター及びShine-Dalgarno(SD)配列（例えば、AAGGなど）を含むものである。例えば宿主がエシェリキア属菌の場合、好適にはTrpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーターなどを含むものが挙げられる。
【００２１】
酵母中で本発明のセルラーゼを発現させるためのプロモーターとしてはPH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合は、SL01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなどが挙げられる。
【００２２】
また、宿主が動物細胞等の真核細胞である場合、SV40由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、核多角体ウィルスの有するポリヘドリンプロモーターなどが挙げられる。しかし、特にこれらに限定されるものではない。また、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法である。
【００２３】
好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ATG）が例示される。終止コドンとしては常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡなど）が例示される。ターミネーター領域としては、天然または合成のターミネーターが挙げられる。複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる機能を持つＤＮＡをいい、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）及び合成プラスミド等が含まれる。
【００２４】
好適なプラスミドとしては、E.coliではpBR322，若しくはその人工的修飾物（pBR322を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母では酵母2μプラスミド、若しくは酵母染色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneoATCC37198、プラスミドpSV2dhfrATCC37145、プラスミドpdBPV-MMTneoATCC37224、プラスミドpSV2neoATCC37149等が挙げられる。
【００２５】
エンハンサー配列としては、SV40のエンハンサー配列（72bp）、ポリオーマ、アデノ、パピローマ等のＤＮＡ主要ウィルス、レトロウィルスLTR（LongTerminalRepeat）、免疫グロブリンＨ鎖、Ｌ鎖遺伝子などが例示される。
【００２６】
発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、本発明のｃｅｌ８Ａ遺伝子、終止コドン、及びターミネーター領域を連続的且つ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。
【００２７】
また、この際、所望により制限酵素での消化やT4ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他のレストリクションサイトなど）を用いることができる。
【００２８】
本発明の組み換え生物には、形質転換体、形質導入体がある。形質転換体は、上述の組み換えＤＮＡを宿主細胞に導入することにより調製することができる。宿主細胞としては、例えば微生物〔細菌（例えば、エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（例えばサッカロマイセス属など）、動物細胞及び昆虫細胞など〕が挙げられる。
【００２９】
具体的には、エシェリキア属菌では、エシェリキア・コリK12,DH1,M103,JA221,HB101,C600,XL-1Blue,JM109などが、バチルス属菌では、バチルス・サチリスMI114、207-21などが挙げられる。酵母としてはサッカロマイセス・セレビシエAH22,AH22R-,NA87-11A,DKD-5Dなどが挙げられる。動物細胞としては、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、マウスL細胞、ヒトFL細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはBmN4，Sf9などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００３０】
宿主細胞として、一般にＤＮＡ配列のクローニング及びベクターの組立のためには原核細胞が好ましい。組み立てられたベクターは、次に適当な宿主細胞に形質転換され、この場合原核細胞及び真核細胞を使用することができる。
【００３１】
発現ベクターの宿主細胞への導入（形質転換）は従来公知の方法を用いて行うことができる。細菌（例えば、E.coliやBacillus subtilis）の場合は、たとえばCohenらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1972)69,2110）プロトプラスト法(Mol.Gen.Genet.,(1979)168,111)またはコンピテント法（J.Mol.Biol.,(1971)56,209）等によって、Saccharomyces
cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1978)75,1927）やリチウム法(J.Bacteriol.,(1983)153,163)等によって、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法(Virology,(1973)52,456)等によってそれぞれ形質転換することができるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明のＣｅｌ８Ａは、上記の如く調製される発現ベクターを含む形質転換体を栄養培地で培養することによって製造することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源若しくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。
【００３３】
炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源若しくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。
【００３４】
また所望により他の栄養素〔例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム〕、ビタミン類、抗生物質を含んでいても良い。培養は当業界に於いて知られている方法により行われる。
【００３５】
培養条件、例えば温度、培地のpH及び発酵時間は本発明のＣｅｌ８Ａの最高力価が得られるように選択される。尚、下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地及び培養条件を例示するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。その際、pHが5〜8であることが望ましい。
【００３６】
宿主がE.colの場合、好ましい培地としてM9培地〔Miller.J.Exp.Mol.Genet.,(1972)p.431,Cold Spring Harbor Laboratory,New York〕が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、攪拌をしながら、通常14〜42℃、好ましくは28〜39℃、約3〜24時間行うことができる。宿主がBacillus属菌の場合、必要により通気、攪拌をしながら、通常14〜42℃、好ましくは28〜39℃、約3〜96時間行うことができる。
【００３７】
宿主が酵母である場合、培地としては、例えばBurkholder最小培地〔Bostian.K.L.et.al(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77,4505〕が挙げられ、pHは5〜8であることが望ましい。培養は通常14〜42℃、好ましくは20〜35℃、約12時間〜10日間行われ、必要により通気、攪拌を行うこともできる。
【００３８】
宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約5〜20％の胎児牛血清を含むMEM培地〔Science(1952)122,501〕、DMEM培地〔Virology,(1959)8,396〕、RPMI1640培地〔J.Am.Med.Assoc.,(1967)199,519〕、199培地〔proc.SSoc.Exp.Biol.Med.,(1950)73,1〕等を用いることができる。培地のpHは約6〜8であるのが好ましく、培養は通常約30〜40℃、好ましくは34〜38℃で約12〜72時間行われ、必要に応じて通気や攪拌を行うこともできる。
【００３９】
宿主が昆虫細胞の場合、培地としては、例えば胎児牛血清を含むGrace's培地〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1985)82,8404〕等が挙げられ、そのpHは5〜8であることが望ましい。培養は通常20〜40℃、好ましくは25〜30℃、約12時間〜10日間行われ、必要により通気、攪拌を行うこともできる。
【００４０】
本発明のＣｅｌ８Ａは、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得できる。即ち本発明のＣｅｌ８Ａが、培養物のうち培養液中に存在する場合は、得られた培養物を濾過または遠心分離等の方法で培養濾液または培養上清を得、該培養濾液または培養上清から、天然または合成タンパク質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法に従って本発明のＣｅｌ８Ａを精製、単離する。
【００４１】
単離、精製方法としては、例えば塩析、溶媒沈殿法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【００４２】
一方、本発明のＣｅｌ８Ａが培養された形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付して菌体或いは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波やリゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の細胞壁及び／または細胞膜を破壊した後、遠心分離や濾過などの方法で本発明のセルラーゼを含有する粗抽出液を得る。そして、当該粗抽出液を、先に例示したような常法を用いることにより、単離、精製することができる。以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【発明の効果】
【００４３】
セルラーゼは、植物、微生物など細胞の細胞壁を消化し、プロトプラストの調整に、また植物繊維の分解、可溶化に用いられ、人の健康維持、増強に使用されている。一方、キトサナーゼは、カビ類のプロトプラストの調整に、また有害微生物の成育阻害活性、抗腫瘍活性及び免疫増強作用活性を持つ低分子キトサンオリゴサッカライドの調整用酵素として利用されている。
【００４４】
従って、本発明であるセルラーゼをコードする遺伝子、セルラーゼ遺伝子を組み込んだ組み換え体ＤＮＡ、それらを含む組み換え生物によって、セルラーゼ活性、及びキトサナーゼ活性の両活性を有するＣｅｌ８Ａを安価に効率良く生産することができ、前記従来の利用形態における経費を低く抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
セルラーゼ及びその遺伝子を提供するという目的を、配列番号２、４のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１、３で表されるタンパク質をコードする遺伝子とすることで実現した。
【実施例１】
【００４６】
［Lysobacter
sp. IB-9374株産生セルラーゼ（Ｃｅｌ８Ａ）遺伝子（ｃｅｌ８Ａ遺伝子）の塩基配列の決定］
１．ゲノムＤＮＡの抽出
Lysobacter
sp. IB-9374株を0.5％ミルクカゼイン、1％スクロース、1%肉エキス、0.01％リン酸一カリウム、0.01％リン酸二カリウム及び0.01％硫酸マグネシウム（pH7.2）から構成される培地（100ml）に植菌し、30℃で16時間、振とう培養した後、菌体を遠心集菌した。
【００４７】
取得した菌体に10mlの50mMEDTAを含む50mMトリス‐塩酸緩衝液（pH8.0）を添加し、均一に懸濁した。懸濁液に1mlの10mg/mlリゾチームを含む250mMトリス‐塩酸緩衝液（pH8.0）を添加し、時々混合しながら氷上に45分間置いた後、0.5％SDS、0.4MEDTA、1mg/mlプロテイナーゼK、及び50mMトリス‐塩酸緩衝液（pH8.0）から構成されるSTEP緩衝液を2ml添加し、50℃で16時間インキュベーションした。
【００４８】
この操作で完全に溶菌した溶液に1mMEDTAを含む10mMトリス‐塩酸緩衝液（pH8.0、TE緩衝液）を11ml添加し、穏やかに混合した。水溶液に24mlのPCIを添加し、穏やかに混合した後、変性タンパク質を遠心することにより除去した。本操作を変性タンパク質が生じなくなるまで繰り返した後、上清にクロロホルム：イソアミルアルコール（24：1）を等量混合し、PCIを完全に除去した。
【００４９】
ＤＮＡ溶液に2.5倍量のエタノールを重層し、ガラス棒を用いて界面をゆっくりとかき回して、糸状に析出したＤＮＡをガラス棒で巻き取った。巻き取ったＤＮＡを70%エタノールでリンスし、風乾した後、5mlのTE緩衝液に溶解した。これらの操作で、リゾバクター属IB-9374のゲノムＤＮＡを6.5mg取得した。
【００５０】
２．ゲノムＤＮＡのBamHI処理
１．で取得した25μgのゲノムＤＮＡに10unitsのBamHI（ニッポンジーン）を添加し、37℃で3分間インキュベーションした。BamHIで部分消化したゲノムＤＮＡ溶液をPCI処理、クロロホルム処理し、エタノール沈殿を行った後、20μlのTEに溶解した。
【００５１】
３．コスミドベクターLorist6のBamHI処理及びゲノムＤＮＡ断片との結合
BamHI消化し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化したコスミドベクターLorist6（ニッポンジーン）60ng及び２で取得したBamHI部分消化ゲノムＤＮＡ溶液9μl（11μg-ＤＮＡ）を混合した後、ＤＮＡligation kit Ver.2（タカラバイオ）のライゲーションI液を等量添加し、16℃で6時間ライゲーションした。本溶液をエタノール沈殿処理した後、20μlのTE緩衝液に溶解した。
【００５２】
４．バクテリオファージλへのin vitroパッケージング
本操作には、Promega社のPackagene Lambda ＤＮＡ Packaging System（−80℃保存）を用いた。50μlのPackagene Extractを氷上で融解した後、３で取得したＤＮＡ溶液5μl（6μg-ＤＮＡ）を添加し、22℃で3時間インキュベーションした。本溶液に445μlのPhage bufferと25μlのクロロホルムを添加し、穏やかに混合後、4℃で保存した。
【００５３】
５．E.coliDH5αMCRへの感染
E.coliDH5αMCRを、0.2％マルトース及び10mM硫酸マグネシウムを含むLB培地（20ml）で37℃で16時間振とう培養した。滅菌したコルベンに10mlの培養液を移し、４で調製した0.2mlのパッケージング溶液を添加した。37℃で30分静置した後、予め37℃に温めておいた25mlのLB培地を添加し、1時間振とう培養した。培養液を室温、500ｘgで15分間遠心した後、上清を捨て、菌体を1.2mlのLB培地に懸濁した。
【００５４】
６．ネオマイシン耐性形質転換体の選択
25μl/mlネオマイシンを含むLB寒天培地に５で取得した菌体溶液を50μlずつ撒き、37℃で16時間培養した。ネオマイシン耐性の形質転換体が生えたLB寒天培地プレートに15％グリセロールを含むLB培地を1ml添加し、形質転換体をかき集めた後、滅菌した1.5ml容のプラスチックチューブに菌体溶液を移し、−80℃で保存した。
【００５５】
７．特異的プライマーの作製
電気泳動的に均一に精製したＣｅｌ８Ａのアミノ末端と内部のアミノ酸配列を解析し、アミノ末端配列中の配列-APNYPFG-から予想したprimerC12*1と内部アミノ酸配列中の配列-FFTAPFA-から予想したprimerC20*2をそれぞれ合成した。
【００５６】
2μM
primerC12、2μM primerC20、0.3μgの１で調製したリゾバクターのゲノムＤＮＡ、10μlの10ｘGC
BufferI、0.4mMdNTPミックス及び1unitのLA
Taq ＤＮＡpolymerase（タカラバイオ）から成る全容20μlの反応液を、以下のプログラム*3を用いてPCRを行った。
【００５７】
増幅された約1,000bpの断片を、ＤＮＡ ligation kit Ver.2（タカラバイオ）を用いてpGEMT-vector（プロメガ）にライゲーションした後、E.coliJM109を形質転換した。形質転換体からプラスミドを精製し、挿入断片の塩基配列を決定した結果、約1,000bpの断片の塩基配列から予想されるアミノ酸配列中に、精製したＣｅｌ８ＡのN−末端及び内部アミノ酸配列が含まれていた。
【００５８】
よって、本ＤＮＡ断片は、Ｃｅｌ８Ａをコードする遺伝子の一部であることが確認された。なお、塩基配列決定の際にはサンガー法を用いたBigDyeTerminator
Ver.3（ABI）とABI PRISM 3100 ＤＮＡシークエンサー（ABI）を使用した。そこで、本ＤＮＡ断片の推定アミノ酸配列から、cel8A遺伝子特異的プライマーprimerF*4及びprimerR*5を合成した。
【００５９】
*1 primerC12
5′-GC(A/C/G/T)CC(A/C/G/T)AA(C/T)TA(C/T)CC(A/C/G/T)TT(C/T)GG-3′（配列番号７）
*2 primerC20
5′-GC(A/G)AA(A/C/G/T)GG(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)GT(A/G)AA(A/G)AA-3′（配列番号８）
【００６０】
*3 PCRプログラム
ステップ１      94℃  4分  1サイクル
ステップ２      94℃  1分  30サイクル
45℃  1分
72℃  1分
ステップ３      72℃  5分  1サイクル
【００６１】
*4 primerF
5′-AGCCATCGCCAGGCCTACGTCAG-3′（配列番号９）
*5 primerR
5′-GCGTGACCAGCTTGGTGTTGGCG-3′（配列番号１０）
【００６２】
８．PCRを用いたcel8A遺伝子のスクリーニング
６．で取得した形質転換体を氷上で融解し、滅菌した生理食塩水で希釈した後、25μl/mlのネオマイシンを含むLB寒天培地に撒き、37℃で24時間培養した。約300コのシングルコロニーを25μl/mlのネオマイシンを含むLB寒天培地に鈞菌し、PCRスクリーニング用のプレートを作製した。
【００６３】
前記プレートからコロニーを25μl/mlのネオマイシンを含むLB液体培地に植菌し、37℃で16時間培養した後、コスミドベクターを精製した。これを鋳型とし、７で作製したprimerF及びprimerRを用いて以下の条件*6でPCRを行った。この操作で、約500bpの断片を増幅したものを陽性クローンとした。
【００６４】
*6 PCRプログラム
ステップ１：94℃、4分（1サイクル）
ステップ２：94℃、1分→60℃、1分→72℃、1分（30サイクル）
ステップ３：72℃、5分（1サイクル）
【００６５】
９．シーケンス
８．で８つの陽性クローン、pGH4-1-24、pGH4-1-41、pGH4-1-44、pGH4-1-54、pGH4-1-61、pGH4-1-65、pGH4-1-75、及びpGH4-1-93が得られた。本形質転換体からアルカリミニプレップ法でコスミドベクター、pGH4-1-24を取得し、これを、BigDyeTerminator Ver.3（ABI社）とABI PRISM 3100 ＤＮＡシークエンサー（ABI社）を使用してシークエンシングし、cel8A遺伝子の塩基配列を決定した。
【００６６】
その結果、Lysobacter
sp. IB-9374株由来のｃｅｌ８Ａ遺伝子は全長1,242塩基（配列番号１）で414アミノ酸残基からなるタンパック質をコードしていた。von Heijneの方法を用いたコンピューター解析（プログラム、PSORT；http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/）により、1から33番の領域はプレ配列（以下、「プレペプチド領域」）と推定された。
【００６７】
また、精製したＣｅｌ８ＡのN−末端アミノ酸配列は1-APNYPFGSHRQAYVS-15であり、これは推定アミノ酸配列の34から48番の領域に一致し、さらに、34から414番の領域の推定分子量（41,241Da）は、精製したＣｅｌ８Ａの分子量（41kDa）とほぼ一致した。
【００６８】
したがって、Ｃｅｌ８Ａは、33アミノ酸残基のプレペプチド領域（以下、「シグナルペプチド」という。）及び381アミノ酸残基の成熟Ｃｅｌ８Ａ領域から構成される前駆体として合成された後、翻訳後修飾を受けて酵素活性を持つ成熟Ｃｅｌ８Ａが生成すると推測された。
【００６９】
以下に添付図面に基づき、本発明であるｃｅｌ８Ａ遺伝子がコードするＣｅｌ８Ａについて詳細に説明する。
【００７０】
図１は、Lysobacter sp. IB-9374から精製したＣｅｌ８ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。レーン１は、分子サイズマーカー（単位は、ＫＤａ）である。レーン２が精製したＣｅｌ８Ａ（２．５μｇ／μｌ）である。  
【００７１】
「Ｃｅｌ８Ａの精製方法」
Ｃｅｌ８Ａは、本菌を上述したような培養液で、３０℃、１４４時間培養し、当該培養液からの硫安分画、続いてSP-Toyopearl 650M、Superdex 200などにより精製し、電気泳動的に均一な酵素標品を得た。
【００７２】
電気泳動の結果、Ｃｅｌ８Ａは、４１ｋＤａであると推定された（図中トライアングル）。ＣＭＣの分解活性における至適pHは5.0、至適温度は40℃であった。また、本酵素はＣＭＣ活性に加えてキトサン活性を示し、ＣＭＣ＞コロイドキトサン＞キトサン＞グリコールキトサンの順で加水分解活性を示した。その結果を図２に示す。
【００７３】
「Lysobacter sp. IB-9374株の培養方法」
なお、本菌の培養条件は、特許文献１に記載されているように、培地組成としては、通常この微生物が生育し得るものであれば天然培地及び合成培地の何れでもよく、培地は固体又は液体培地の何れでもよい。
【００７４】
これらの培地には、例えば、炭素源としての、グルコース、マルトース、マンノース等の糖類、クエン酸、リンゴ酸等の有機酸類、エタノール、グリセロール等のアルコール類など、窒素源としてのペプトン、肉エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物、アミノ酸などの一般天然窒素源の他に、各種無機、有機アンモニウム塩などが含まれ、その他、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、カルシウム塩などの無機塩類などが必要に応じて適宜添加される。
【００７５】
また、本菌の培養条件は慣用の方法で行うことができるが、培養温度は通常２０〜３５℃、好ましくは２５〜３５℃であり、培地のｐＨは通常は６〜８、好ましくはｐＨ６.５〜７.５である。また、振とう或いは通気攪拌などの手段により好気的条件下で行われる事が望ましく、培養時間は通常１５０〜２５０時間である。
【００７６】
図２は、Ｃｅｌ８Ａの基質特異性を示すテーブルである。上述のように精製したＣｅｌ８Ａを用い以下の条件で加水分解反応を行った。テーブル左が各種基質、テーブル中央が活性（Ｕ／ｍｇ）、テーブル右が相対活性（％）である。なお、活性（Ｕ／ｍｇ）は、標準物質（セルロース基質の場合はβ―Ｄ―グルコース、キトサン基質はβ―Ｄ―グルコサミン、キチン基質はＮ−アセチルグルコサミン、ｐＮＰ基質はｐ−ニトロフェノール）を用いて作成した標準曲線から１ｍｌ当たりの活性（Ｕ／ｍｌ）を算出し、その値を、用いたＣｅｌ８Ａ濃度で割ってのようにして求める。また、相対活性（％）は、Ｃｅｌ８Ａの単位時間当たりの分解活性を１００％としたときの、各基質に対する分解活性値である。
【００７７】
・基質
ｂ：８５％含有脱アセチルキトサン水物和
ｃ：９９％含有脱アセチルキトサン
ｄ：〜４０％含有脱アセチルキトサン
ｅ：４０〜５０％含有可溶性有脱アセチルキトサン
Ａｖｉｃｅｌ：セルロース粉末、旭化成（株）、規格生化学用
ｐＮＰ−Ｇｌｃ：p-Nitrophenyl-β-D-glucoside、生化学工業（株）
【００７８】
・反応条件
反応組成（０．７５ｍｌ）は、各基質０．４３％（ｗ／ｗ）と、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解した０．１４ＵのＣｅｌ８Ａからなる。反応温度は、３７℃とした。なお、Ｃｅｌ８Ａの１Ｕとは、１分間に１μｍｏｌの還元糖を遊離させる酵素量を示す。また、基質ｐＮＰ−Ｇｌｃの反応条件は、反応組成（１ｍｌ）が基質０．１％、４．５ＵのＣｅｌ８Ａ、および５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）からなり、反応温度は３７℃である。
【００７９】
図２の結果から、Ｃｅｌ８Ａはセルラーゼ活性の約４０％〜１５％のキトサン誘導体に対するキトサナーゼ活性を有することが認められた。このことからキトサナーゼ活性の約４０％以下のセルラーゼ活性を持つ既知の２機能性酵素とは異なり、逆の基質特異性を示す新規な２機能性酵素であと言える。このようなセルラーゼ活性とキトサナーゼ活性を持ち、セルラーゼを主要活性とする酵素は、今までに報告がない。
【００８０】
図３は、Ｃｅｌ８ＡによるＣＭＣの加水分解反応物の薄層クロマトグラムである。レーン０は未反応物、レーン２４はＣＭＣを基質とした反応液のスポット、レーンＳは標準品である。標準品は、Ｇｌｃ；グルコース、（Ｇｌｃ）２；セロビオース、（Ｇｌｃ）３；セロトリオース、（Ｇｌｃ）４；セロテトラオース、（Ｇｌｃ）５；セロペンタオース、（Ｇｌｃ）６；セロヘキサオースを使用した。
【００８１】
・反応条件、結果
pH5.0でＣＭＣに対して1/160量(w/w)の酵素を37℃で24時間反応させ、常法により展開したところ、Ｃｅｌ８ＡによってＣＭＣを分解したときの主要分解生成物は、セロビオースであった。
【００８２】
図４は、Ｃｅｌ８Ａによるコロイドキトサンの加水分解反応物の薄層クロマトグラムである。レーン０は未反応物、レーン０．５はコロイドキトサンを基質とし、下記の条件で、０．５時間反応させたときの反応液のスポット、レーン４は同様に４時間反応液のスポット、レーン２４は同様に反応液のスポット、レーンＳは標準品である。
【００８３】
標準品は、ＧｌｃＮ；グルコサミン、（ＧｌｃＮ）２；キトビオース、（ＧｌｃＮ）３；キトトリオース、（ＧｌｃＮ）４；キトテトラオース、（ＧｌｃＮ）５；キトペンタオース、（ＧｌｃＮ）６；キトヘキサオースを使用した。
【００８４】
・反応条件、結果
pH5.0でコロイドキトサンに対して1/160量(w/w)の酵素を37℃で24時間反応させ、常法により展開したところ、Ｃｅｌ８Ａによってコロイドキトサンを分解したときの分解生成物は、キトビオースが主要分解生成物であった。
【００８５】
図５は、Lysobacter sp. IB-9374由来のＣｅｌ８Ａをコードする塩基配列とそれから推定されるＣｅｌ８Ａのアミノ酸配列及びその遺伝子の近傍遺伝子配列である。
【００８６】
決定された塩基配列から推定されアミノ酸は、遺伝子配列の下に一文字表記で表した。アミノ酸配列は、最初のメチオニン残基から番号を付した。推定されるＳＤ配列には、アンダーラインを付した。精製したＣｅｌ８ＡのＮ末端、及び内部のアミノ酸配列と塩基配列から推定されるアミノ酸配列と一致した部分をそれぞれ、白黒反転、及びグレーで表示した。ストップコドンの下にアスタリスク（＊）を記載した。また、図中の実線「Ｃ１２」、「Ｃ２０」は、それぞれprimerC12、primerC20に対応する位置を、点線「Ｆ」、「Ｒ」は、それぞれprimerF、primerRに対応する位置を示している。
【００８７】
図６は、本発明である配列番号１の塩基配列から推定される構造タンパク質と、既知タンパク質との相同性を比較した結果である。既知タンパク質は、次の（１）、（２）である。
【００８８】
（１）β-1,3-1,4-glucanase from Bacillus
circulans WL-12（図中B.WL12）
（２）endo-1,4-β-glucanase from Bacillus
circulans KSM-N257（図中B.N257）
【００８９】
配列番号６の構造遺伝子は、矢印（Ａ）のメチオニンから翻訳され、全長４１４アミノ酸残基からなるタンパク質（以下、「ＣｅｌＡ８前駆体」という。）をコードしている。矢印（Ａ）から矢印（Ｃ）のシグナルペプチドが、翻訳後修飾を受け、矢印（Ｃ）以降の全長３８１残基からなる領域（以下、「成熟体セルラーゼ領域」という。）が形成される。即ち、成熟体セルラーゼ領域が、セルラーゼ活性、キトサナーゼ活性を有するLysobacter sp. IB-9374株が生産するＣｅｌ８Ａである。
【００９０】
本発明の遺伝子がコードするタンパク質と、既知タンパク質（１）、（２）との比較の結果、（１）とは４６％一致し、相同性は６３％と推定され、（２）とは４５％一致し、相同性は６３％と推定された。なお、比較する３配列の内、アミノ酸残基が２配列で一致した部分を線で囲んだ。
【００９１】
既知セルラーゼとのアミノ酸配列の相同性検索の結果、Ｃｅｌ８Ａはfamily8のmotif領域(ATDGDLDIAYALLLADLQW)を有している。他の既知の両活性を示すB.subtilisおよびMyxobacter sp.由来のそれらと比較してN末端アミノ酸３個は同一であるが、それ以外は異なっていた。Ｃｅｌ８Ａ前駆体の全アミノ酸配列はBacillus circulans WL-12由来glucanaseやBacillus circulans KSM-N257由来endoglucanase N257、Bacillus. sp.由来chitosanaseとそれぞれ４６%、４５%、４２%の同一性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】Lysobacter sp. IB-9374から精製したＣｅｌ８ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図２】Ｃｅｌ８Ａの基質特異性を示すテーブルである。
【図３】Ｃｅｌ８ＡによるＣＭＣの加水分解反応物の薄層クロマトグラム。
【図４】Ｃｅｌ８Ａによるコロイドキトサンの加水分解反応物の薄層クロマトグラム。
【図５】Lysobacter sp. IB-9374由来のＣｅｌ８Ａをコードする塩基配列とそれから推定されるＣｅｌ８Ａのアミノ酸配列及びその遺伝子の近傍遺伝子配列。
【図６】本発明である配列番号１の塩基配列から推定される構造タンパク質と、既知タンパク質との相同性を比較した結果である。
【配列表フリーテキスト】
【００９３】
配列番号７  ＰＣＲ用フォワードプライマーの基礎配列、ｎは、ａ、ｃ、ｇ、或いはｔ
配列番号８  ＰＣＲ用リバースプライマーの基礎配列、ｎは、ａ、ｃ、ｇ、或いはｔ
【図１】
2008048675.tif 000002
【図２】
2008048675.tif 000003
【図３】
2008048675.tif 000004
【図４】
2008048675.tif 000005
【図５】
2008048675.tif 000006
【図６】
2008048675.tif 000007
【配列表】
2008048675000001.app