(57)【要約】【課題】Ｃ１ｑタンパク質の定量に用いることができる抗Ｃ１ｑ抗体、Ｃ１ｑタンパク質の定量方法およびそのためのキット、関節リウマチの治療または予防用医薬組成物、関節リウマチの治療または予防用物質をスクリーニングする方法およびキット、ならびに関節リウマチの予後診断用組成物、方法およびキットを提供する。【解決手段】Ｃ１ｑタンパク質を特異的に認識することができる、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体およびその製造方法、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いた試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定する方法およびそのためのキット、Ｃ１ｑ結合活性を有する物質を含む、関節リウマチの治療または予防用医薬組成物、関節リウマチの治療または予防用物質のスクリーニング方法およびそのためのキット、ならびにＣ１ｑ結合活性を有する物質を含む、関節リウマチの予後診断用組成物、予後診断方法およびそのためのキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ１ｑタンパク質を特異的に認識することができる、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体。
【請求項２】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４９を有するハイブリドーマにより産生される、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５０を有するハイブリドーマにより産生される、請求項１記載の抗体。
【請求項４】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５１を有するハイブリドーマにより産生される、請求項１記載の抗体。
【請求項５】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５２を有するハイブリドーマにより産生される、請求項１記載の抗体。
【請求項６】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５３を有するハイブリドーマにより産生される、請求項１記載の抗体。
【請求項７】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５４を有するハイブリドーマにより産生される、請求項１記載の抗体。
【請求項８】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５３、またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５４を有する、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項９】
請求項８記載のハイブリドーマを培養することを特徴とする、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１０】
請求項１記載の抗体を用いることを特徴とする、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定する方法。
【請求項１１】
ＥＬＩＳＡ法によるものである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項１記載の抗体を２種以上用いるものである、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項３記載の抗体と請求項６記載の抗体、請求項３記載の抗体と請求項７記載の抗体、請求項５記載の抗体と請求項６記載の抗体、または請求項５記載の抗体と請求項７記載の抗体を用いるものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
関節リウマチの予後診断のための、請求項１０から１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
請求項１記載の抗体を必須構成成分として含む、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定するためのキット。
【請求項１６】
ＥＬＩＳＡ法によるものである、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
請求項１記載の抗体を２種以上含むものである、請求項１５または１６記載のキット。
【請求項１８】
請求項３記載の抗体と請求項６記載の抗体、請求項３記載の抗体と請求項７記載の抗体、請求項５記載の抗体と請求項６記載の抗体、または請求項５記載の抗体と請求項７記載の抗体を含むものである、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
関節リウマチの予後診断のための、請求項１５から１８のいずれか１項記載のキット。
【請求項２０】
Ｃ１ｑ結合活性を有する物質を含む、関節リウマチの治療または予防用医薬組成物。
【請求項２１】
Ｃ１ｑ結合活性を有する物質が請求項１記載の抗体である、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
Ｃ１ｑ結合活性を有する物質が請求項３記載の抗体である、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２３】
Ｃ１ｑ結合活性を有する物質を含む、関節リウマチの予後診断用組成物。
【請求項２４】
Ｃ１ｑ結合活性を有する物質が請求項１記載の抗体である、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
Ｃ１ｑ結合活性を有する物質が請求項３記載の抗体である、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
関節リウマチの治療または予防用、あるいは予後診断用物質のスクリーニング方法であって、下記工程：
（ａ）ナース細胞をＣ１ｑおよび候補物質の存在下で単球と共にインキュベーションし、次いで、
（ｂ）ナース細胞による単球の抱き込みを調べる；あるいは
（ｃ）単球の破骨細胞への分化を調べる
を特徴とし、
該抱き込みまたは分化が、候補物質不存下にてナース細胞をインキュベーションした場合の抱き込みまたは分化と比較して抑制されている場合に、該候補物質が関節リウマチの治療または予防用、あるいは予後診断用物質である、方法。
【請求項２７】
請求項２６記載の方法に用いられる、関節リウマチの治療または予防用、あるいは予後診断用物質をスクリーニングするためのキット。
【請求項２８】
関節リウマチの予後診断方法であって、下記工程：
（ａ）ナース細胞および単球をＣ１ｑ結合活性を有する物質の存在下でインキュベーションし、次いで、
（ｂ）ナース細胞による単球の抱き込みを調べる；あるいは
（ｃ）単球の破骨細胞への分化を調べる
を特徴とする、方法。
【請求項２９】
Ｃ１ｑ結合活性を有する物質を含む、関節リウマチの予後診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体、かかる抗体を用いたＣ１ｑの存在または量を決定する方法およびそのためのキット、Ｃ１ｑ結合活性を有する物質を含む、関節リウマチの治療または予防用医薬組成物、関節リウマチの治療または予防用物質のスクリーニング方法およびそのためのキット、ならびにＣ１ｑ結合活性を有する物質を含む、関節リウマチの予後診断用組成物、予後診断方法およびそのためのキットなどに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ＲＡ）患者は、将来重篤な関節破壊に陥る群と、そうでない群とに二分される。ＲＡ患者がいずれの群に属するかで必要な治療方法は異なるが、かかる予後を有効に診断する検査試薬はない。
【０００３】
ＲＡ患者の血中Ｃ１ｑタンパク質の量によって、関節破壊に陥るか否かの予後診断が可能であることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、臨床において、患者試料中のＣ１ｑタンパク質の定量に用いることができる抗Ｃ１ｑ抗体は確立されておらず、その開発が望まれていた。
【０００４】
本発明者はこれまでに、ＲＡ患者の関節及び骨髄中には、マウスおよびラットで見出された胸腺のナース細胞と同様の機能を持つ細胞が存在し、かかる細胞が単球を抱き込み分化させ、本発明者のグループが新たに見出したＲＡ特異的破骨細胞が形成されることを明らかにしてきた（非特許文献２）。しかしながら、Ｃ１ｑがかかる過程に関与することは分かっていなかった。
【非特許文献１】Ochi T et al., Arthritis Rheum. 1988 Jan; 31(1): 37-43
【非特許文献２】Ochi T et al,, J Clin Invest. 1998 Aug 1; 102(3): 606-18
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の解決課題は、Ｃ１ｑタンパク質の定量に用いることができる抗Ｃ１ｑ抗体を得ること、かかる抗体の製造方法、特異的かつ再現性のあるＣ１ｑタンパク質の定量方法およびそのためのキット、ならびに関節リウマチの治療または予防用医薬組成物を得ること、関節リウマチの治療または予防用物質のスクリーニング方法およびそのためのキットを開発すること、関節リウマチの予後診断用組成物および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、Ｃ１ｑタンパク質量に依存して抗原と抗体の結合体量が増大する抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製に成功した。さらに、本発明者は、ナース細胞がＣ１ｑを発現し、かかるＣ１ｑが単球の抱き込み、さらには単球の破骨細胞への分化に関与することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）Ｃ１ｑタンパク質を特異的に認識することができる、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体、
（２）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４９を有するハイブリドーマにより産生される、（１）記載の抗体、
（３）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５０を有するハイブリドーマにより産生される、（１）記載の抗体、
（４）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５１を有するハイブリドーマにより産生される、（１）記載の抗体、
（５）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５２を有するハイブリドーマにより産生される、（１）記載の抗体、
（６）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５３を有するハイブリドーマにより産生される、（１）記載の抗体、
（７）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５４を有するハイブリドーマにより産生される、（１）記載の抗体、
（８）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５３、またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５４を有する、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、
（９）（８）記載のハイブリドーマを培養することを特徴とする、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の製造方法、
（１０）（１）記載の抗体を用いることを特徴とする、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定する方法、
（１１）ＥＬＩＳＡ法によるものである、（１０）記載の方法、
（１２）（１）記載の抗体を２種以上用いるものである、（１０）または（１１）記載の方法、
（１３）（３）記載の抗体と（６）記載の抗体、（３）記載の抗体と（７）記載の抗体、（５）記載の抗体と（６）記載の抗体、または（５）記載の抗体と（７）記載の抗体を用いるものである、（１２）記載の方法、
（１４）関節リウマチの予後診断のための、（１０）から（１３）のいずれか記載の方法、
（１５）（１）記載の抗体を必須構成成分として含む、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定するためのキット、
（１６）ＥＬＩＳＡ法によるものである、（１５）記載のキット、
（１７）（１）記載の抗体を２種以上含むものである、（１５）または（１６）記載のキット、
（１８）（３）記載の抗体と（６）記載の抗体、（３）記載の抗体と（７）記載の抗体、（５）記載の抗体と（６）記載の抗体、または（５）記載の抗体と（７）記載の抗体を含むものである、（１７）記載のキット、
（１９）関節リウマチの予後診断のための、（１５）から（１８）のいずれか記載のキット、
（２０）Ｃ１ｑ結合活性を有する物質を含む、関節リウマチの治療または予防用医薬組成物、
（２１）Ｃ１ｑ結合活性を有する物質が請求項１記載の抗体である、（２０）記載の医薬組成物、
（２２）Ｃ１ｑ結合活性を有する物質が請求項３記載の抗体である、（２１）記載の医薬組成物、
（２３）Ｃ１ｑ結合活性を有する物質を含む、関節リウマチの予後診断用組成物、
（２４）Ｃ１ｑ結合活性を有する物質が請求項１記載の抗体である、（２３）記載の組成物、
（２５）Ｃ１ｑ結合活性を有する物質が（３）記載の抗体である、（２４）記載の組成物、
（２６）関節リウマチの治療または予防用、あるいは予後診断用物質のスクリーニング方法であって、下記工程：
（ａ）ナース細胞をＣ１ｑおよび候補物質の存在下で単球と共にインキュベーションし、次いで、
（ｂ）ナース細胞による単球の抱き込みを調べる；あるいは
（ｃ）単球の破骨細胞への分化を調べる
を特徴とし、
該抱き込みまたは分化が、候補物質不存下にてナース細胞をインキュベーションした場合の抱き込みまたは分化と比較して抑制されている場合に、該候補物質が関節リウマチの治療または予防用、あるいは予後診断用物質である、方法、
（２７）（２６）記載の方法に用いられる、関節リウマチの治療または予防用、あるいは予後診断用物質をスクリーニングするためのキット、
（２８）関節リウマチの予後診断方法であって、下記工程：
（ａ）ナース細胞および単球をＣ１ｑ結合活性を有する物質の存在下でインキュベーションし、次いで、
（ｂ）ナース細胞による単球の抱き込みを調べる；あるいは
（ｃ）単球の破骨細胞への分化を調べる
を特徴とする、方法、
（２９）Ｃ１ｑ結合活性を有する物質を含む、関節リウマチの予後診断用キット、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、Ｃ１ｑタンパク質の定量に用いることができる、Ｃ１ｑタンパク質を特異的に認識する抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体およびその製造方法、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いた試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定する方法、およびそのためのキット、Ｃ１ｑ結合活性を有する物質を含む、関節リウマチの治療または予防用医薬組成物、関節リウマチの治療または予防用物質のスクリーニング方法およびそのためのキット、ならびにＣ１ｑ結合活性を有する物質を含む、関節リウマチの予後診断用組成物、予後診断方法およびそのためのキットなどが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、１の態様において、Ｃ１ｑタンパク質を特異的に認識することができる、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体に関するものである。本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は、Ｃ１ｑタンパク質と特異的に結合できるだけでなく、かかるタンパク質量に依存して、形成される抗原と抗体の結合体量が増大する点、すなわち、Ｃ１ｑタンパク質の定量に用いることができる点で非常に優れている。本発明の抗体は、例えば、マウスのような哺乳動物をＣ１ｑタンパク質で免疫し、免疫動物のリンパ球と骨髄腫細胞株を融合させてハイブリドーマを作製し、これを培養することにより、得ることができる。他の既知の方法、例えば、遺伝子組換え法、化学合成法などを用いてかかる抗体を製造してもよい。
【００１０】
本発明の抗体の１の具体例は、マウス骨髄腫細胞株とマウスリンパ球との融合細胞であるハイブリドーマＫＳ−０１３１  ＃８、ＫＳ−０１３１  ＃３３、ＫＳ−０１３１  ＃３５、ＫＳ−０１３１  ＃４０、ＫＳ−０１３１  ＃５４、またはＫＳ−０１３１  ＃７６により産生される抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体である。当該ハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され、平成１８年８月２日付で受領され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５３、およびＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５４を付与された。かかるハイブリドーマを、公知の培養条件、例えば、組成：ＲＰＭＩ  １６４０（Kohjin  16005005）  ４２５ｍＬ、L-Glutamine（SIGMA  G7513）  ５ｍＬ、ピルビン酸ナトリウム（SIGMA  S8636）  ５ｍＬ、ＨＡＴサプリメント（GIBCO 21060-017）  １０ｍＬ、ペニシリン・ストレプトマイシン（SIGMA  P4333）  ２．５ｍＬ、ＦＢＳ  ７５ｍＬの培地中、３７±０．１℃、５±０．１５％  ＣＯ２にて培養し、産生された抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を公知の手段・方法にて回収・精製することにより、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を製造することができる。本明細書において、ハイブリドーマＫＳ−０１３１  ＃８、ＫＳ−０１３１  ＃３３、ＫＳ−０１３１  ＃３５、ＫＳ−０１３１  ＃４０、ＫＳ−０１３１  ＃５４、およびＫＳ−０１３１  ＃７６により産生される抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体をそれぞれ、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃８、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３３、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃４０、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４、および抗Ｃ１ｑ抗体  ＃７６と表す。
【００１１】
本発明の抗体はまた、上記ハイブリドーマにより産生される抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体と結合するＣ１ｑタンパク質のエピトープを認識する抗体を含む。エピトープは、上記ハイブリドーマにより産生される抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いて、公知の手段・方法により決定される。決定されたエピトープまたはそれを含むタンパク質などでマウスなどの動物を免疫し、かかる免疫マウスのリンパ球と骨髄腫細胞株を融合させてハイブリドーマを作製し、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を得てもよい。
【００１２】
本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は、そのフラグメント、およびそのキメラ抗体およびヒト化抗体などの改変抗体ならびに変異抗体を含む。これらのフラグメント、改変抗体または変異抗体もまた、元の抗体と同様のＣ１ｑタンパク質に対する特異性を有するものである。これらは、当業者に既知の手段・方法により製造され得る。
【００１３】
本発明は、別の態様において、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５３、またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５４を有する、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関するものである。本発明のハイブリドーマは、Ｃ１ｑタンパク質で免疫されたマウス由来のリンパ球とマウス骨髄腫細胞株を融合させて得られた細胞である。
【００１４】
本発明は、さらに別の態様において、本発明のハイブリドーマを培養することを特徴とする、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の製造方法に関するものでる。ハイブリドーマの培養は、インビトロ培養、およびインビボ培養の両方を含む。インビトロ培養は、例えば、組成：ＲＰＭＩ  １６４０（Kohjin  16005005）  ４２５ｍＬ、L-Glutamine（SIGMA  G7513）  ５ｍＬ、ピルビン酸ナトリウム（SIGMA  S8636）  ５ｍＬ、ＨＡＴサプリメント（GIBCO 21060-017）  １０ｍＬ、ペニシリン・ストレプトマイシン（SIGMA  P4333）  ２．５ｍＬ、ＦＢＳ  ７５ｍＬの培地中、３７±０．１℃、５±０．１５％  ＣＯ２にて行うことができる。インビボ培養は、例えば、マウスの腹腔に移植することで、達成される。本発明の製造方法は、得られた抗体を精製する工程をさらに含んでいてもよい。精製方法を当業者は適宜選択して用いることができる。
【００１５】
本発明は、さらなる態様において、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定する方法に関するものである。本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は、Ｃ１ｑタンパク質の量に依存して、抗原と抗体の結合体量が増大するという特性を有するので、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在ばかりでなく、量を決定することができる。本発明の決定方法において用いられる抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は２種以上であってもよい。２種以上の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いることで、決定感度および特異性が増大し、精度が向上する。好ましくは、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３３と抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３３と抗Ｃ１ｑ抗体  ＃７６、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃４０と抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃４０と抗Ｃ１ｑ抗体７６とが本発明の決定方法において用いられる。本発明の決定方法において用いられる抗体は、標識されたものであってもよい。様々な標識が公知であり、当業者は適宜選択して用いることができる。例えば、horseradish peroxidase（HRP）、ALP、Glucose oxidase、β-galactosidaseなどの酵素、FITC、Rhodamine、Cy3、Cy5、Texas Red、Alexa Fluor類、BODIPY類、IRDye類、MFP類、Quantum Dot類、AMCA、Allophycocyanin、BMP、Cy2、Cy3.5、Cy5.5、DTAF、DyLight 547、DyLight 647、FluoroNanogold、Phycoerythrin、Phycocyanin、R-PE、Saporin、TRITCなどの蛍光標識、Biotin、Digoxigenin（DIG）、Acridium Ester、Flashlightなどの化学物質、60mm Microbeadなどのビーズ、MagCellect Ferrofluid［登録商標］などの磁気ビーズ、125Iなどの放射標識、金粒子、Agaroseなどの標識が用いられる。かかる標識を付すことで、本発明の決定方法を効率よく行うことができる。
【００１６】
試料は、Ｃ１ｑタンパク質が含まれる可能性があればいずれのものであってもよく、例えば、血清、関節液、軟骨や骨及び各組織などが挙げられる。本発明の決定方法を用いることで、かかる試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を迅速かつ容易に決定することができる。
【００１７】
本発明の決定方法は、例えば、上記試料を本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体とインキュベーションし、該抗Ｃ１ｑ抗体と試料中のＣ１ｑタンパク質との結合体を形成させ、次に該結合体を測定することにより、行われてもよい。例えば、サンドイッチELISA法などのELISA法、イムノブロット法、Radioimmunoassay（RIA）法、免疫沈降法、プロテインアレイを用いる方法、フローサイトメーターを用いる方法、化学発光酵素免疫測定法（CLEIA）、生物発光酵素免疫測定法（BLEIA）、毛細管現象によって輸液可能な展開器材（免疫測定用試験片）を用いる測定法、イミュノクロマト法、免疫染色法、凝集法などを用いて本発明の決定方法を実施することができる。ＥＬＩＳＡ法は、特殊な設備等を必要とせず、実際の医療現場においてＣ１ｑタンパク質の存在または量の決定を迅速かつ容易に行うことが可能であるので、好ましく用いられる。
【００１８】
本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いて、Ｃ１ｑタンパク質の存在または量を迅速かつ容易に決定することができるので、本発明の決定方法をＲＡの予後診断に用いることもできる。
【００１９】
本発明は、なおさらなる態様において、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いて試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定することを特徴とする、患者におけるＲＡの予後の診断方法に関するものである。Ｃ１ｑタンパク質の存在または量は上述の方法にて決定されてもよい。
【００２０】
本発明は、もう１つの態様において、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を投与することを特徴とする、患者におけるＲＡの治療方法に関するものである。
【００２１】
本発明は、さらなる態様において、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を必須構成成分として含む、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定するためのキットに関するものである。本発明のキットに含まれる抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は２種以上であってもよい。２種以上の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を含むことで、本発明のキットを用いて行われるＣ１ｑタンパク質の存在または量の決定の感度、特異性、精度を向上させることができる。本発明のキットは、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の他に、例えば、試料採取手段、標識、反応容器、決定用試薬等を含んでいてもよい。一般的に、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットにおいて、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は標識されたものであってもよい。
【００２２】
本発明のキットにおいて、例えば、サンドイッチELISA法などのELISA法、イムノブロット法、Radioimmunoassay（RIA）法、免疫沈降法、プロテインアレイを用いる方法、フローサイトメーターを用いる方法、化学発光酵素免疫測定法（CLEIA）、生物発光酵素免疫測定法（BLEIA）、毛細管現象によって輸液可能な展開器材（免疫測定用試験片）を用いる測定法、イミュノクロマト法、免疫染色法、凝集法などを用いてもよい。本発明のキットを用いて、Ｃ１ｑタンパク質の存在または量を迅速かつ容易に決定することができるので、臨床現場においてＲＡ患者の予後診断が可能になる。また、本発明のキットを用いてＲＡの研究等を行うこともできる。
【００２３】
関節リウマチにおいて、Ｃ１ｑタンパク質は、ナース細胞による単球の抱き込み、および抱き込まれた単球の破骨細胞への分化に関与する。そこで、Ｃ１ｑタンパク質の作用・機能を阻害または遮断する物質を用いて、破骨細胞（特に、関節リウマチ特異的破骨細胞）による骨破壊を防止あるいは抑制することにより、関節リウマチを治療および／または予防することができる。かかる物質の一例として、Ｃ１ｑタンパク質と結合することにより、その作用・機能を阻害または遮断することができる物質が挙げられる。
【００２４】
したがって、本発明は、別の態様において、Ｃ１ｑ結合活性を有する物質を含む、関節リウマチの治療または予防用医薬組成物に関するものである。本発明の医薬組成物は、含まれるＣ１ｑ結合活性を有する物質がナース細胞による単球の抱き込み、および抱き込まれた単球の破骨細胞への分化、増殖を抑制することにより、関節リウマチを治療または予防することができる。Ｃ１ｑ結合活性を有する物質とは、Ｃ１ｑと結合することで、Ｃ１ｑの作用・機能を阻害または遮断することができる物質を意味する。例えば、Ｃ１ｑの他の物質との結合を阻害するＣ１ｑアンタゴニスト、抗Ｃ１ｑ抗体などを含むが、これらに限定されない。Ｃ１ｑ結合活性を有する好ましい物質は、本明細書に記載の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体であり、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５０を有するハイブリドーマにより産生される、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体が特に好ましい。
【００２５】
本発明の組成物は、Ｃ１ｑ結合活性を有する物質の他、例えば、賦形剤、添加剤、および担体などの種々の物質を含んでいてもよい。かかる物質は、例えば、剤形、投与経路等の種々の因子に応じて適宜選択され得る。本発明の組成物は、さらに別の関節リウマチ治療または予防薬を含んでいてもよいし、あるいは別の関節リウマチの治療または予防用医薬組成物と併用されててもよく、例えば、同時または逐次投与されてもよい。本発明の組成物の投与量、投与経路、および投与方法等も、対象の状態等の種々の因子に応じて適宜選択され得る。好ましい投与経路としては、例えば、局所投与、点滴による血管内投与などが挙げられる。
【００２６】
本発明は、さらに別の態様において、Ｃ１ｑ結合活性を有する物質、好ましくは、Ｃ１ｑ結合活性を有する物質を含む医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、対象の関節リウマチを治療または予防する方法に関するものである。対象は、いずれのものであってもよいが、好ましくは、関節リウマチに罹患したヒト対象もしくは罹患の疑われるヒト対象、または関節リウマチの素因を有するヒト対象もしくは素因の疑われるヒト対象である。Ｃ１ｑ結合活性を有する物質の投与量、投与経路、投与方法等は、種々の因子に応じて適宜選択され得る。本発明の治療または予防方法において、上記Ｃ１ｑ結合活性を有する物質以外に関節リウマチの治療または予防用薬物または組成物を併用してもよい。
【００２７】
本発明は、別の態様において、Ｃ１ｑ結合活性を有する物質を含む、関節リウマチの予後診断用組成物に関するものである。本発明の組成物に含まれるＣ１ｑ結合活性を有する物質による、ナース細胞による単球の抱き込み、および破骨細胞への分化の阻害を調べることにより予後診断することができる。Ｃ１ｑ結合活性を有する物質については、上述の通りである。本発明の組成物は、Ｃ１ｑ結合活性を有する物質の他、例えば、バッファー、培地成分などを含んでいてもよい。
【００２８】
本発明は、さらに別の態様において、関節リウマチの治療または予防用、あるいは予後診断用物質のスクリーニング方法であって、下記工程：
（ａ）ナース細胞をＣ１ｑおよび候補物質の存在下で単球と共にインキュベーションし、次いで、
（ｂ）ナース細胞による単球の抱き込みを調べる；あるいは
（ｃ）単球の破骨細胞への分化を調べる
を特徴とし、
該抱き込みまたは分化が、候補物質不存下にてナース細胞をインキュベーションした場合の抱き込みまたは分化と比較して抑制されている場合に、該候補物質が関節リウマチの治療または予防用、あるいは予後診断用物質である、方法に関するものである。ナース細胞とは、胸腺のナース細胞およびこれに類似する機能・形態を有する細胞をいい、例えば、ＲＡ関節の骨髄及び関節滑膜に存在する。ナース細胞は、当業者に公知の手段・方法により、胸腺、関節、骨髄等から得られる。ナース細胞が由来する動物種は、特に限定されず、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、サルなどを含む哺乳類、より好ましくは、ヒトである。治療または予防すべき対象と同一の動物種由来のナース細胞を用いることが好ましい。
【００２９】
単球は、当業者に公知の手段・方法により得られる。単球が由来する動物種は、特に限定されず、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、ヒトである。また、ナース細胞が由来する動物種と同一の動物種由来のもの、および治療または予防すべき対象と同一の動物種由来のものが好ましい。Ｃ１ｑは市販品を用いてもよい。
【００３０】
候補物質は、いずれのものであってもよいが、例えば、Ｃ１ｑと結合することが期待されるものなどである。候補物質として、例えば、Ｃ１ｑ阻害物質などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、物質のＣ１ｑ結合活性をインビトロ等で調べ、結合活性を有する物質を候補物質として用いてもよい。候補物質の添加は、１回または複数回行われてもよい。また、Ｃ１ｑは、反応系外から添加されてもよいし、あるいはナース細胞により供給されてもよい。
【００３１】
ナース細胞による単球の抱き込みとは、ナース細胞が単球全体または一部を取り込むこと、あるいはナース細胞が単球と融合することなどをいう。ナース細胞による単球の抱き込みは、例えば、顕微鏡観察によりナース細胞中に抱き込まれた単球の核数を計測することなどにより、調べることができる。
【００３２】
破骨細胞は、ＲＡ特異的破骨細胞などのあらゆる破骨細胞を包含する。ここで、ＲＡ特異的破骨細胞とは、ＭＭＰ１２およびＣＤ１４陽性かつＭＭＰ９陰性の破骨細胞をいう。ＲＡ特異的破骨細胞は、異常活性化した単球が、ナース細胞機能を持つ繊維芽細胞様細胞で構成される病巣によって維持、活性化された、骨破壊を導くことができる細胞である。単球の破骨細胞への分化は、例えば、顕微鏡観察により可能である。また、ＭＭＰに反応する破骨細胞を計測することにより、調べることができる。
【００３３】
本発明は、さらなる態様において、上記スクリーニング方法により得ることのできる、関節リウマチの治療または予防用、あるいは予後診断用物質に関するものである。
【００３４】
本発明は、もう１つの態様において、上記スクリーニング方法に用いられる、関節リウマチの治療または予防用、あるいは予後診断用物質をスクリーニングするためのキットに関するものである。本発明のキットは、ナース細胞および／または単球取得手段、培地、培養容器、ナース細胞による単球の抱き込みまたは単球の破骨細胞への分化を調べる手段等を含んでいてもよい。本発明のキットには、通常、取扱説明書を添付する。かかるキットを用いて、上記スクリーニング方法を迅速かつ容易に行うことができる。
【００３５】
本発明は、別の態様において、関節リウマチの予後診断方法であって、下記工程：
（ａ）ナース細胞および単球をＣ１ｑ結合活性を有する物質の存在下でインキュベーションし、次いで、
（ｂ）ナース細胞による単球の抱き込みを調べる；あるいは
（ｃ）単球の破骨細胞への分化を調べる
を含む、方法に関するものである。
【００３６】
本発明は、さらに別の態様において、Ｃ１ｑ結合活性を有する物質を含む、関節リウマチの予後診断用キットに関するものである。本発明のキットは、好ましくは、上記予後診断方法において用いられる。本発明のキットは、ナース細胞および／または単球取得手段、培地、培養容器、ナース細胞による単球の抱き込みまたは単球の破骨細胞への分化を調べる手段等を含んでいてもよい。本発明のキットには、通常、取扱説明書を添付する。かかるキットを用いて、上記予後診断方法を迅速かつ容易に行うことができる。
【００３７】
以下に実施例を示して本発明を詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３８】
抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
雌のＢＡＬＢ／Ｃマウス４匹にＣ１ｑ精製タンパク質（純度９９％以上、Calbiochem  204876）０．１ｍｇをアジュバント（タイターマックス、SIGMA）と共に２週間おきに２〜３回、フットパットおよび背中皮下に投与し、免疫した。マウスの脾臓からリンパ球を回収し、抗原３０μｇを含む培地にて３日間培養した。培養後、リンパ球とマウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｕ１細胞を、ＰＥＧ１５００を用いて常法に従い融合させた。融合後、細胞を組成：ＲＰＭＩ  １６４０（Kohjin  16005005）  ４２５ｍＬ、L-Glutamine（SIGMA  G7513）  ５ｍＬ、ピルビン酸ナトリウム（SIGMA  S8636）  ５ｍＬ、ＨＡＴサプリメント（GIBCO 21060-017）  １０ｍＬ、ペニシリン・ストレプトマイシン（SIGMA  P4333）  ２．５ｍＬ、ＦＢＳ  ７５ｍＬの培地に懸濁し、あらかじめマウス胸腺細胞を播種した９６ウェルプレートに分注した。８日後、上清中の抗体の有無をＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングした。ＥＬＩＳＡ法の手順は以下の通りである。１μｇ／ｍｌ  Ｃ１ｑのＰＢＳ中溶液を調製し、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（３９１２  ファルコン）に添加し、室温にて２時間インキュベーションすることで結合させた。次に、１％  スキムミルク／ＰＢＳを用いてブロッキングを行い、抗原プレートとした。抗原プレートに培養上清を添加して反応させ、洗浄後、ＡＬＰ標識ヤギ抗ＩｇＧ（ザイメット）を結合させた。ＡＬＰ基質を添加して、酵素反応させ、４９２ｎｍにおける吸光度を測定し、抗体陽性ウェルを選択した。対照として、同様に免疫したウサギの血清から分離したポリクローナル抗体を用いた。結果を図１に示す。抗原を結合させていないＥＬＩＳＡ用マイクロプレートを用い、非特異的反応を除去し、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＫＳ−０１３１  ＃８、ＫＳ−０１３１  ＃２５、ＫＳ−０１３１  ＃３３、ＫＳ−０１３１  ＃３５、ＫＳ−０１３１  ＃４０、ＫＳ−０１３１  ＃５４、ＫＳ−０１３１  ＃７６、ＫＳ−０１３１  ＃１００、ＫＳ−０１３１  ＃１０２、ＫＳ−０１３１  ＃１０７、ＫＳ−０１３１  ＃１１２、およびＫＳ−０１３１  ＃１１９などを得た。
【００３９】
サンドイッチＥＬＩＳＡによるＣ１ｑタンパク質の定量
５μｇ／ｍＬ  抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体（固相抗体）溶液１００μｌをＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに結合させた。１％  スキムミルク／ＰＢＳ  １００μｌを添加し、室温にて３０〜６０分間インキュベーションした。次に、１０μｇ／ｍＬ  Ｃ１ｑタンパク質抗原２倍連続希釈溶液  １００μｌを添加して、３７℃で１〜２時間反応させた。純水で２回洗浄後、５μｇ／ｍＬ  Ｃ１ｑモノクローナル抗体（感作抗体）溶液１００μｌを添加し、４℃にて一晩反応させた。次に、２次抗体（アビジン化ＡＬＰ抗体）を１００μｌ／ウェルにて添加し、４℃〜室温で１〜２時間反応させた。純水で４回洗浄後、ＡＬＰ基質発色液を添加して発色させた。マイクロプレートリーダにて４９２ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した（参照波長：６６０ｎｍ）。結果を図２〜１０に示す。Ｃ１ｑタンパク質濃度と吸光度との間に正の相関関係が認められ、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、試料中のＣ１ｑタンパク質を定量できることが分かった。図示してはいないが、濃度〜４００μｇ／ｍＬのＣ１ｑタンパク質について定量可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明により、Ｃ１ｑタンパク質の定量に用いることができる、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体、かかる抗体を用いたＣ１ｑタンパク質の検出および／または定量方法、およびそのためのキットなどが得られるので、ＲＡ患者の予後診断、研究等の分野において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、ハイブリドーマの培養上清を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２】図２は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃８を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５（四角）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３３を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５（四角）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４（丸）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃７６（菱形）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５（四角）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４（丸）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃７６（菱形）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃４０を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４（丸）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃７６（菱形）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５（四角）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４（丸）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃７６を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５（四角）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃１０７を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３３（三角）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５（四角）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃１１２を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５（四角）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４（丸）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃７６（菱形）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃１１９を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３３（三角）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図１】
2008100986.tif 000002
【図２】
2008100986.tif 000003
【図３】
2008100986.tif 000004
【図４】
2008100986.tif 000005
【図５】
2008100986.tif 000006
【図６】
2008100986.tif 000007
【図７】
2008100986.tif 000008
【図８】
2008100986.tif 000009
【図９】
2008100986.tif 000010
【図１０】
2008100986.tif 000011