(57)【要約】【課題】血液のような試料をフィルタリング処理することなく、極めて高い感度で蛍光検出する。【解決手段】励起光を透過させる材料からなる誘電体ブロック１３の表面に形成された、表面に疎水性材料からなる不撓性膜３１が形成され金属膜２０で試料１を保持し、誘電体ブロック１側から７００〜２０００ｎｍの波長を有する近赤外光の励起光８を入射させて、試料１中に含まれる物質を、表面プラズモンによって増強された金属膜２０表面に染み出すエバネッセント波１１によって励起し、この励起により物質が発した蛍光を光検出器９によって検出する。【選択図】図１
2008203172.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光を透過させる材料からなる誘電体ブロックの表面に形成された金属膜で試料を保持し、前記誘電体ブロック側から励起光を入射させて、前記試料中に含まれる物質を、表面プラズモンによって増強された前記金属膜表面に染み出すエバネッセント波によって励起し、該励起により前記物質が発した蛍光を検出する表面プラズモン増強蛍光検出方法において、
前記金属膜表面には疎水性材料からなる不撓性膜が形成され、前記励起光が７００〜２０００ｎｍの波長を有する近赤外光であることを特徴とする表面プラズモン増強蛍光検出方法。
【請求項２】
前記不撓性膜の膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲であることを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン増強蛍光検出方法。
【請求項３】
前記不撓性膜がポリマーからなるものであることを特徴とする請求項１または２記載の表面プラズモン増強蛍光検出方法。
【請求項４】
前記ポリマーからなる不撓性膜の上に、特定物質と結合する親水性リンカーが形成されていることを特徴とする請求項３記載の表面プラズモン増強蛍光検出方法。
【請求項５】
前記試料が血液であることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の表面プラズモン増強蛍光検出方法。
【請求項６】
前記不撓性膜の上に、特定物質と結合するキャプチャ分子が固定化されている誘電体ブロックを用いることを特徴とする請求項１から５いずれか１項記載の表面プラズモン増強蛍光検出方法。
【請求項７】
前記キャプチャ分子が、生体内のセカンドメッセンジャーと結合するものであることを特徴とする請求項６記載の表面プラズモン増強蛍光検出方法。
【請求項８】
前記キャプチャ分子と直接結合する物質と、前記エバネッセント波によって励起され得る蛍光成分とが一体化されてなる標識化特定物質を試料中に含ませた上で、前記蛍光の検出を行うことを特徴とする請求項６または７記載の表面プラズモン増強蛍光検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光法により試料中の特定物質を検出する蛍光センサ、特に詳細には表面プラズモン増強による蛍光検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、バイオ測定等において、高感度かつ簡易な測定法として蛍光法が広く用いられている。この蛍光法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する検出対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのときの蛍光を検出することによって検出対象物質の存在を確認する方法である。検出対象物質が蛍光体でない場合には、蛍光体で標識されて検出対象物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち検出対象物質の存在を確認することも広く行われている。
【０００３】
図３は、上記の標識された物質を用いる蛍光法を実施するセンサの一例を概略表示するものである。この蛍光センサは一例として試料１に含まれる抗原２を検出するためのものであり、基板３には抗原２と特異的に結合する一次抗体４が塗布されている。そしてこの基板３上に設けられた試料保持部５の中において試料１が流され、次いで同様に蛍光体１０で標識されて抗原２と特異的に結合する二次抗体６が流される。その後、基板３の表面部分に向けて光源７から励起光８が照射され、光検出器９により蛍光検出がなされる。このとき、光検出器９によって所定の蛍光が検出されれば、上記二次抗体６と抗原２との結合、すなわち試料１中における抗原２の存在を確認できることになる。
【０００４】
なお以上の例では、蛍光検出によって実際に存在が確認されるのは二次抗体６であるが、この二次抗体６は抗原２と結合しなければ流されてしまって基板３上に存在し得ないものであるから、この二次抗体６の存在を確認することにより、間接的に検出対象物質である抗原２の存在が確認されることとなる。
【０００５】
しかしながら、図３に示したような従来の蛍光センサでは、基板と試料との界面における励起光の反射光／散乱光や、検出対象物質以外の不純物／浮遊物Ｍ等による散乱光がノイズとなるため、せっかく光検出器を高性能化しても蛍光検出におけるＳ／Ｎは向上しないのが実情であった。
【０００６】
これに対する解決法として、例えば非特許文献１に示されるようなエバネッセント蛍光法、つまりエバネッセント波を用いる蛍光法が提案されている。この蛍光法を実施する蛍光センサの一例を図４に概略的に示す。なおこの図４において、図３中の構成要素と同等の構成要素には同番号を付し、それらについての説明は特に必要のない限り省略する（以下、同様）。
【０００７】
この蛍光センサにおいては、前述の基板３に代わるものとしてプリズム（誘電体ブロック）１３が用いられ、そして光源７からの励起光８は、このプリズム１３と試料１との界面で全反射する条件で、プリズム１３を通して照射される。この構成においては、励起光８が上記界面で全反射するとき該界面近傍に染み出すエバネッセント波１１により二次抗体６が励起される。そして蛍光検出は、試料１に対してプリズム１３と反対側（図中では上方）に配された光検出器９によってなされる。
【０００８】
この蛍光センサにおいては、励起光８は図中の下方に全反射するので、上方からの蛍光検出において、励起光検出成分が蛍光検出信号に対するバック・グラウンドとなってしまうことがない。またエバネッセント波１１は上記界面から数百ｎｍの領域にしか到達しないので、試料中の不純物／浮遊物Ｍからの散乱を殆ど無くすことができる。そのため、このエバネッセント蛍光法は、従来の蛍光法と比べて（光）ノイズを大幅に低減でき、検出対象物質を１分子単位で蛍光測定できる方法として注目されている。
【０００９】
また、さらに高感度で蛍光測定できるセンサとして、図５に示すような表面プラズモン増強蛍光センサも知られている。この表面プラズモン増強蛍光センサは、例えば特許文献１に記載があるもので、図４の蛍光センサと比べると基本的に、プリズム１３の上に金属膜２０が形成されている点が異なる。すなわち、このような金属膜２０が形成されていることにより、励起光８が照射されたときこの金属膜２０中に表面プラズモンが生じ、その電場増幅作用によって蛍光が増幅されるようになる。あるシミュレーションによると、その場合の蛍光強度は１０００倍程度まで増幅されることも判っている。
【００１０】
しかし、上述のような表面プラズモン増強蛍光センサにおいては、非特許文献２に示されているように、試料中の蛍光体と金属膜とが接近し過ぎていると、蛍光体内で励起されたエネルギーが蛍光を発生させる前に金属膜へ遷移してしまい、蛍光が生じないという現象（いわゆる金属消光）が起こり得る。
【００１１】
この金属消光に対処するために非特許文献２には、金属膜の上にＳＡＭ（自己組織化膜）を形成し、それにより試料中の蛍光体と金属膜とをこのＳＡＭの厚さ以上離間させることが提案されている。なお図５でも、このＳＡＭに番号２１を付けて示してある。また非特許文献３では、この金属消光に関連して、表面プラズモンにより増強された蛍光強度の、金属膜からの距離に対する依存性が検討されている。
【００１２】
ここ数年は、冷却ＣＣＤの発達など光検出器の高性能化が進んでいること、また、特に可視領域では、効率（量子収率）の高い色素、例えば  ＦＩＴＣ（蛍光５２５ｎｍ、量子収率０．６）や Ｃｙ５（蛍光６８０ｎｍ、量子収率０．３）のような、実用の目安となる量子効率０．２を超える色素が開発され、以上述べた蛍光法はバイオ研究には欠かせない道具となっている。
【００１３】
ところで、病院などで精密診断を行なう場合、ウィルス等の血液中のアナライトを蛍光検出することが広く行なわれている。しかしながら、血液は一般に赤もしくは赤褐色の色を持つため可視光による励起が難しく、また蛍光信号も血液に吸収されてしまうため、高感度での検出は困難である。また可視光を照射した場合、血液中にはアルブミンのような自家蛍光を発する生体物質が大量に存在するため、これが光ノイズとなり検出限界を大きく低下させる。
【００１４】
このため、血液中のアナライトを高感度検出する場合は、網目状の膜を通すなどのフィルタリング処理を行なうことが広く行なわれている。これは、一般的には血球分離と呼ばれ、主に赤血球を除去している。これによりサンプル（血液成分）はほぼ透明となり、可視光を用いた蛍光測定が可能となる。しかしながら、膜を通すことによりアナライトの立体構造が破壊あるいは変性してしまい、本来持つ生体機能が損なわれる場合がある。また、場合によってはアナライト自体も膜中に残ってしまうため血液中の濃度が落ちてしまい、検出が難しくなることもある。さらに、余分な作業が一つ増えるため、手間と時間がかかるという問題がある。
【特許文献１】特許第３５６２９１２号公報
【非特許文献１】「バイオイメージングでここまで理解る」p.104-113  楠見明弘他著  羊土社
【非特許文献２】W.Knoll他、Analytical Chemistry（Anal.Chem.）75(2003)  p.2610
【非特許文献３】W.Knoll他、Colloids and Surfaces. A.（Colloids Surf.A）,171(2000) p.115
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
血液中の大半を占める赤血球のヘモグロビンは、図６に示すように酸化型ヘモグロビン（実線）であっても還元型ヘモグロビン（点線）であっても、７００ｎｍより長い近赤外領域では吸収が可視領域に較べて２桁以上も小さいため、近赤外光を用いれば蛍光検出が可能になると考えられる。
【００１６】
しかしながら、現在実用化されている近赤外領域の色素は、量子収率が低いため蛍光信号が微弱となり、高感度検出に不向きである。実際、血液量測定や心機能検査・肝機能検査の他、蛍光眼底造影等に汎用されている近赤外蛍光色素ＩＣＧ（蛍光８２０ｎｍ）の量子収率は 〜０．１程度であり、信号が弱すぎるため検出ができない。
【００１７】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、血液のような試料をフィルタリング処理することなく、極めて高い感度で蛍光検出することができる表面プラズモン増強蛍光検出方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の表面プラズモン増強蛍光検出方法は、励起光を透過させる材料からなる誘電体ブロックの表面に形成された金属膜で試料を保持し、前記誘電体ブロック側から励起光を入射させて、前記試料中に含まれる物質を、表面プラズモンによって増強された前記金属膜表面に染み出すエバネッセント波によって励起し、該励起により前記物質が発した蛍光を検出する表面プラズモン増強蛍光検出方法において、前記金属膜表面には疎水性材料からなる不撓性膜が形成され、前記励起光が７００〜２０００ｎｍの波長を有する近赤外光であることを特徴とするものである。
【００１９】
ここで、上記の「不撓性」とは、表面プラズモン増強蛍光検出を普通に行っているうちに膜厚が変わってしまうほどに変形することが無い程度の剛性を備えていることを意味する。
【００２０】
前記不撓性膜の膜厚は、１０〜１００ｎｍの範囲であることが好ましい。また、前記不撓性膜としては、ポリマーからなるものが好適に用いられる。また、このポリマーからなる不撓性膜が適用される場合は、その不撓性膜の上に、特定物質と結合する親水性リンカーが形成されることが望ましい。とりわけ、本発明の表面プラズモン増強蛍光検出方法は、前記試料が血液である場合に好適である。
【００２１】
また本発明の表面プラズモン増強蛍光検出方法においては、前記不撓性膜の上に、特定物質と結合するキャプチャ分子が固定化されている誘電体ブロックを用いることが望ましい。その場合、上記キャプチャ分子は、生体内のセカンドメッセンジャーと結合するものであることが望ましい。
【００２２】
そして、そのような誘電体ブロックを用いる場合は、前記キャプチャ分子と直接結合する物質と、エバネッセント波によって励起され得る蛍光成分とが一体化されてなる標識化特定物質を試料中に含ませた上で、前記蛍光の検出を行うことが望ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の表面プラズモン増強蛍光検出方法は、励起光を透過させる材料からなる誘電体ブロックの表面に形成された金属膜で試料を保持し、前記誘電体ブロック側から励起光を入射させて、前記試料中に含まれる物質を、表面プラズモンによって増強された金属膜表面に染み出すエバネッセント波によって励起し、この励起により物質が発した蛍光を検出する表面プラズモン増強蛍光検出方法において、金属膜表面に疎水性材料からなる不撓性膜を形成し、励起光を７００〜２０００ｎｍの波長を有する近赤外光としたので、量子収率が低いため蛍光信号が微弱となってしまう近赤外領域の色素であっても、高感度検出を実現することが可能である。
【００２４】
すなわち、血液等の試料は近赤外光を用いれば蛍光検出が可能になるものの、近赤外光の励起によって検出される蛍光は微弱であるために、従来は血液中のアナライト等を高感度検出する場合は、励起光として可視光を使用せざるを得ず、このためアナライト等の血中濃度を低下させる可能性のあるフィルタリング処理を行うことを余儀なくされていたが、本発明の表面プラズモン増強蛍光検出方法によれば、表面プラズモンによって増強された金属膜表面に染み出すエバネッセント波によって励起し、この励起により物質が発した蛍光を検出するので、近赤外光を使用して高感度検出を行うことが可能であるとともに、フィルタリング等の前処理が不要となるため、測定を格段に簡易化することができる。
【００２５】
なお、波長の長い近赤外光を励起光として用いることにより、基板中でのレイリー散乱による散乱光を大きく抑制できるので、光ノイズを低減させ、Ｓ／Ｎ比を向上させることもできる。基板には通常散乱の少ないガラス基板が用いられるが、コストの面を考慮して樹脂基板（ＰＭＭＡなど）を使用したい向きもあり、本発明の表面プラズモン増強蛍光検出方法によれば、散乱が多い樹脂基板であっても高感度検出が可能となりコストを大幅に低減することができる。
【００２６】
また、本発明者の研究によると、前述のＳＡＭを設けた従来の表面プラズモン増強蛍光センサにおいて、蛍光検出の感度がさほど改善されないのは、このＳＡＭがいわゆる「ふわふわ」したものであることからその厚さが容易に変動し、そこで試料液中の蛍光体が金属膜に対して、金属消光が起きる程度まで近接してしまうことがあるためであることが判明した。
【００２７】
さらに、このＳＡＭを設けた従来の表面プラズモン増強蛍光センサにおいて、蛍光検出の感度がさほど改善されないのは、このＳＡＭがいわゆる「すかすか」したものであることから、試料液中に存在する金属イオンや溶存酸素のような消光の原因となる分子がこのＳＡＭの内部にまで入り込み、それらの分子が励起光の励起エネルギーを奪ってしまうことが有るためであることも判明した。
【００２８】
本発明による表面プラズモン増強蛍光検出方法では、上記の新しい知見に鑑みて、金属膜の上に不撓性膜が設けられているので、試料液中の蛍光体が金属膜に対して、金属消光が起きる程度まで近接してしまうことが防止されるので、上述のような金属消光を招くことがなくなり、表面プラズモンによる電場増幅作用を確実に得て、極めて高い感度で蛍光を検出可能となる。
【００２９】
また本発明による表面プラズモン増強蛍光検出方法では、上記の新しい知見に鑑みて、不撓性膜が疎水性材料から形成されているので、試料液中に存在する金属イオンや溶存酸素のような消光の原因となる分子がこの不撓性膜の内部にまで入り込むことが無く、よってそれらの分子が励起光の励起エネルギーを奪ってしまうことが防止される。そこで本発明による表面プラズモン増強蛍光センサによれば、極めて高い励起エネルギーが確保され、極めて高い感度で蛍光を検出可能となる。
【００３０】
なお、不撓性膜の好ましい材料としてはポリマーが挙げられるが、ポリマーには、多くの場合試料液中に含まれるタンパク等が容易に非特異吸着しやすくなっている。そうであると、例えばこの不撓性膜の表面に塗布した抗体に特異吸着する抗原を蛍光法によって検出するような場合、この非特異吸着が特異吸着を生じたのと同様の状態となるので、それが誤検出を招くことになる。
【００３１】
そこで、本発明の表面プラズモン増強蛍光検出方法において特にポリマーからなる不撓性膜が適用される場合、その不撓性膜の上に親水性リンカーが形成されていれば、そのリンカーが上記タンパク等を遮断するので、タンパク等が不撓性膜に非特異吸着することがなくなり、上述のような誤検出が防止される。他方、本来不撓性膜の表面部分に配置すべき抗体等は、そのリンカーと特異的に結合させて、不撓性膜の表面部分に捉えることができる。
【００３２】
本発明における不撓性膜としては、疎水性高分子、無機酸化物を含む膜を好ましく挙げることができる。
【００３３】
本発明に使用可能な疎水性高分子としては、水に対する溶解度が２０重量％以下であるモノマーを５０重量％以上含むことが好ましい。
【００３４】
疎水性高分子を形成するモノマーの２５℃の水に対する溶解度は、新実験化学講座基本操作１（丸善化学、１９７５）に記載されている方法で測定することができる。この方法で測定すると上記本発明におけるモノマーの２０℃の水に対する溶解度は、例えば２−エチルヘキシルメタクリレートで０．００重量％、スチレンで０．０３重量％、メチルメタクリレートで１．３５重量％、ブチルアクリレートで０．３２重量％、ブチルメタクリレートで０．０３重量％である。本発明における疎水性高分子膜としての水に対する溶解度の指標としては、１０重量％以下であることがより好ましく、１重量％以下であることが更に好ましい。
【００３５】
本発明で用いられる水に対する溶解度が２０重量％以下であるモノマーの具体例としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができ、スチレン、メタクリル酸メチル、メタクリル酸ヘキサフルオロプロパン、酢酸ビニル、アクリロニトリルなどが好ましく用いられる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００３６】
本発明では、前述の水に対する溶解度が２０重量％以下であるモノマーと共に、水に対する溶解度が２０重量％以上であるモノマーを共重合した高分子化合物を併用してもよい。水に対する溶解度が２０重量％以上であるモノマーの具体例としては、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸、アクリル酸、アリルアルコール等が挙げられる。
【００３７】
本発明に使用可能な無機酸化物としては、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、フェライト及びその複合材料や誘導体を選択することができる。成膜方法としては常法によって行うことができ、例えばゾルゲル法、スパッタ法、蒸着法、めっき法などの手法を採用することができる。
【００３８】
本発明において水非膨潤性膜を形成する化合物としては、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリエステル、ポリスチレンが好ましい。そうすることによって、膜形成が容易になりかつ表面に生理活性物質を固定化するための官能基を露出することも容易になる。例えばポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリエステルで形成された膜は表面を酸や塩基で加水分解することによって表面にカルボキシル基とヒドロキシル基を露出させることが容易であり、またポリスチレンで形成された膜はUV／オゾン処理などの酸化処理を施すことによってカルボン酸を露出させることが容易である。
【００３９】
他方、本発明による表面プラズモン増強蛍光検出方法において、不撓性膜の上に、生体内のセカンドメッセンジャー等の特定物質と結合するキャプチャ分子が固定化されている誘電体ブロックを用いる場合は、いわゆる「競合形式」の蛍光検出を好適に採用可能となる。すなわち、より具体的には、キャプチャ分子と直接結合する前記セカンドメッセンジャー等の物質と、エバネッセント波によって励起され得る蛍光成分とが一体化されてなる標識化特定物質を試料中に含ませた上で蛍光検出を行うことにより、検出対象の物質と標識化特定物質を競合的にキャプチャ分子と結合させてその標識化特定物質を検出する、競合形式の検出方法を実施可能となる。
【００４０】
この競合形式の蛍光検出方法を採用すれば、表面プラズモン増強により高感度で蛍光検出可能であることから、二種のキャプチャ分子を用いる「サンドイッチ形式」の蛍光検出では困難とされていたＢ／Ｆ分離（バウンド／フリー分離)の不要化と高感度化の両立を実現できるようになる。Ｂ／Ｆ分離を不要にできれば、競合形式の蛍光検出方法においてしばしば生じる洗浄ムラによる感度の低下を防止可能となる。
【００４１】
また、その場合も表面プラズモン増強効果が得られるから、サンドイッチ形式の検出方法では通常行うことが非常に困難である低分子化合物の検出および/または定量も、容易に実施可能となる。
【００４２】
上述のような標識化特定物質は予め試料中に存在させてもよく、あるいは試料をキャプチャ分子と接触させて所定時間経過してから試料中に混合させてもよく、さらには、標識化特定物質をキャプチャ分子と接触させて所定時間経過してからそれらと試料とを混合するようにしてもよい。
【００４３】
なお上記キャプチャ分子は、特定の物質に対して結合する分子であれば、特に限定されるものではない。例えば抗体やその断片、核酸からなるアダプター、包摂化合物やモリキュラーインプリンティングで構築される鋳型分子などを挙げることができる。キャプチャ分子の特定物質との結合性を示す指標として解離平衡定数（Ｋｄ）があるが、本発明においては、Ｋｄが好ましくは１０-5以下、さらに好ましくは１０-6以下、さらに好ましくは１０-7以下、さらに好ましくは１０-8以下のキャプチャ分子が選択される。また、特定分子には結合性を示すが他の物質に対しては結合性を示さない、特異性を有するキャプチャ分子を選択使用することが望ましい。
【００４４】
特にこのキャプチャ分子が、生体内のセカンドメッセンジャーと結合するものである場合には、セカンドメッセンジャー量を測定することでリガンドによるレセプターの活性化、または阻害を検出および/または定量することができる。この場合も、表面プラズモン増強により、セカンドメッセンジャーを高感度に検出および／または定量することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００４６】
図１は、本発明の表面プラズモン増強蛍光検出方法の実施に利用される表面プラズモン増強蛍光センサ（以下、単に蛍光センサという）を示す概略側面図である。図示の通りこの蛍光センサは、近赤外光の励起光８を発する半導体レーザ等の光源７と、上記励起光８を透過させる材料からなり、この励起光８が一端面から入射する位置に配されたプリズム（誘電体ブロック）１３と、このプリズム１３の一表面１３ａに形成された金属膜２０と、この金属膜２０の上に形成されたポリマーからなる不撓性膜３１と、プリズム１３と反対側から不撓性膜３１に液体状試料１が接するように該試料１を保持する試料保持部５と、この試料保持部５の上方に配された光検出器（蛍光検出手段）９とを備えてなるものである。
【００４７】
なお図１では、光源７が、励起光８を、プリズム１３と金属膜２０との界面に向けて、全反射条件を満たすようにプリズム１３を通して入射させるように配置されている。つまりこの光源７自体が、プリズム１３に対して励起光８を上述のように入射させる入射光学系を構成している。しかしこのような構成に限らず、励起光８を上述のように入射させるレンズやミラーなどからなる入射光学系を、光源７とは別途設けるようにしても何ら支障はない。
【００４８】
上記プリズム１３は一例として、日本ゼオン株式会社製ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）３３０Ｒ（屈折率１．５０）からなるものである。一方、金属膜２０は、プリズム１３の一表面１３ａ上に金をスパッタして形成されたものであり、膜厚は５０ｎｍとしている。
【００４９】
不撓性膜３１は、金属膜２０の上に屈折率１．５９のポリスチレン系ポリマーをスピンコートして形成されたものであり、ここでは、膜厚は２０ｎｍである。なお、不撓性膜３１はポリマーのような有機物に限定されるものではなく、無機物であってもよい。またプリズムの材料もＺＥＯＮＥＸ（登録商標）３３０Ｒに限るものでなく、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネイト（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を公知の樹脂や光学ガラスを用いて適宜形成することができるし、光学ガラスのような無機物でも構わない。
【００５０】
なお、金属の近傍に存在する蛍光体分子は、金属へのエネルギー移動により消光を起こす。エネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。そして前述した非特許文献３にも述べられているように、金属膜の場合は、金属と蛍光分子との間の距離は少なくとも 数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。従って不撓性膜３１の膜厚の下限値は１０ｎｍとすることが好ましい。
【００５１】
一方、蛍光体分子は、表面プラズモンによって増強された、金属膜表面に染み出したエバネッセント波によって励起される。エバネッセント波の到達範囲（金属膜表面からの距離）は高々波長程度であり、その電界強度は金属膜表面からの距離に応じて指数関数的に急激に減衰することが知られている。実際、波長８０８ｎｍの近赤外光では、エバネッセント波の染み出しが生じているのは、波長（８０８ｎｍ）程度であり、１００ｎｍを超えるとその電界強度が急激に減衰する。蛍光体分子を励起する電界強度は大きいほど望ましいので、効果的な励起を行なうためには、金属膜表面と蛍光体分子との距離を１００ｎｍより小さくすることが望ましい。従って、不撓性膜３１の膜厚の上限値は１００ｎｍとすることが好ましい。
【００５２】
なお、プリズム１３は上記材料の他、公知の樹脂や光学ガラスを用いて適宜形成することができる。コストの点からは、光学ガラスよりも樹脂の方がより好ましいと言える。樹脂から形成する場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネイト（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を好適に用いることができる。
【００５３】
光検出器９としては、例えば富士フイルム株式会社製  ＬＡＳ−１０００（商品名）が用いられている。
【００５４】
この蛍光センサが検出対象としているのは、一例としてＣＲＰ抗原２（分子量１１万  Ｄａ）であり、これと特異的に結合する一次抗体（モノクロナール抗体）４が上記不撓性膜３１の上に固定されている。この一次抗体４は、例えば末端をカルボキシル基化したＰＥＧを介して、アミンカップリング法により、上記ポリマーからなる不撓性膜３１に固定される。一方、二次抗体６としては、下記化学式で表される蛍光体（ＩＣＧ）１０で標識化したモノクロナール抗体（一次抗体４とはエピトープ  ＜ｅｐｉｔｏｐｅ；抗原決定基＞が異なる）が用いられる。
【化１】
2008203172.tif 000003
【００５５】
上記アミンカップリング法は一例として下記（１）〜（３）のステップからなるものである。なおこれは、３０μｌ（マイクロ・リットル）のキュベット／セルを用いた場合の例である。
【００５６】
（１）リンカー先端（末端）の−ＣＯＯＨ基を活性化
０．１Ｍ（モル）のＮＨＳ（N-hydrooxysuccinimide）と０．４ＭのＥＤＣ（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide）とを等体積混合した溶液を３０μｌ加え、３０分間室温静置
（２）一次抗体４の固定化
ＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、一次抗体溶液（５００μｇ／ｍｌ）を３０μｌ加え、３０〜６０分間室温静置
（３）未反応の−ＣＯＯＨ基をブロッキング
ＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）を３０μｌ加え、２０分間室温静置。さらにＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄。
【００５７】
一方、光源７としては上記半導体レーザに限らず、その他の公知の光源を適宜選択使用可能である。また光検出器９も上述のものに限らず、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等の公知のものを適宜選択使用可能である。色素としては、上記ＩＣＧの他、励起波長により、IRDyeTM700DX (励起波長/蛍光波長 689/700) 、IRDyeTM800DX (778/806)、HiLyte Fluor750 (750/780)、Cy7 (750/780)、Alexa Fluor（登録商標） 700 (700/720)、Alexa Fluor（登録商標）750 (750/780)、DiR（DilC18（7 ））(750/780)、TO- PRO- 5 (750/770)なども用いることもできる。
【００５８】
以下、この蛍光センサを使用して本発明の表面プラズモン増強蛍光検出方法について、試料１として血液（以下、血液１とする）に含まれるＣＲＰ抗原２を検出する場合を例にとって説明する。まず、試料保持部５の中において血液１が流され、次いで同様に蛍光体１０で標識されてＣＲＰ抗原２と特異的に結合する二次抗体６が流される。なお上記ＩＣＧは、波長７６８ｎｍの励起光８により励起されて、８０７ｎｍの蛍光を発するものである。
【００５９】
その後、プリズム１３に向けて光源７から励起光８が照射され、そして光検出器９により蛍光検出がなされる。このとき、プリズム１３と金属膜２０との界面からエバネッセント波１１が染み出すようになる。そこで、もし一次抗体４にＣＲＰ抗原２が結合していれば、さらにこのＣＲＰ抗原２に二次抗体６が結合し、その二次抗体６の標識である蛍光体１０がエバネッセント波１１によって励起されることとなる。励起された蛍光体１０は所定波長の蛍光を発し、その蛍光は光検出器９によって検出される。こうして、光検出器９が所定波長の蛍光を検出した場合は、それにより、ＣＲＰ抗原２に二次抗体６が結合していること、すなわち血液１にＣＲＰ抗原２が含まれていることを確認可能となる。
【００６０】
このように、本発明の表面プラズモン増強蛍光検出方法においては、近赤外光を使用することができるので、血球分離等のフィルタリング処理を行なわず、直接血液中の物質を高感度に検出することが可能である。
【００６１】
なお上記エバネッセント波１１は、プリズム１３と金属膜２０との界面から数百ｎｍ程度の領域にしか到達しない。このため、血液１中の不純物／浮遊物からの散乱を略皆無とすることができる。それに加えてこの蛍光センサにおいて、プリズム１３中の不純物Ｎ等で散乱した光（これは通常の伝搬光である）は金属膜２０で遮断され、光検出器９に到達することがない。このため、本発明の表面プラズモン増強蛍光検出方法においては、光ノイズを殆ど皆無までに低減することができ、極めて高Ｓ／Ｎの蛍光検出が可能となる。
【００６２】
また、本発明の表面プラズモン増強蛍光検出方法においては、プリズム１３の一表面１３ａに金属膜２０により表面プラズモンが励起され、この表面プラズモンの電場増幅作用によって上記蛍光が増幅されるので、従来の蛍光法、例えば、Ｌ.Ａ.Tempelman他、Analytical Biochemistry, 233(1996) p.50-57のTABLE１（p.55）に示された「Serum（血漿）」中の検出限界５ng/ml（約180ｐＭ）に比べて、２−３桁検出感度を改善することが可能である。
【００６３】
加えて、本発明の表面プラズモン増強蛍光検出方法においては、金属膜２０の上に不撓性膜３１が設けられているので、血液１中の蛍光体１０が金属膜２０に対して、金属消光が起きる程度まで近接してしまうことが防止される。そこでこの蛍光センサによれば、上述のような金属消光を招くことがなくなり、表面プラズモンによる電場増幅作用を確実に得て、極めて高い感度で蛍光を検出可能となる。
【００６４】
そして上記不撓性膜３１は疎水性材料であるポリスチレン系ポリマーから形成されているので、血液１中に存在する金属イオンや溶存酸素のような消光の原因となる分子が該不撓性膜３１の内部に入り込むことが無く、よってそれらの分子が励起光８の励起エネルギーを奪ってしまうことが防止される。そこでこの蛍光センサによれば、極めて高い励起エネルギーが確保され、極めて高い感度で蛍光を検出可能となる。
【００６５】
なお、この蛍光センサにおいて、ＣＲＰ抗原２と結合しないで不撓性膜３１の表面から離れている二次抗体６は、そこまでエバネッセント波１１が届かないので蛍光を発することがない。そこで、血液１中でそのような二次抗体６が浮遊していても測定上問題が無いので、測定毎に洗浄つまりＢ／Ｆ分離（バウンド／フリー分離）を行う必要もない。
【００６６】
前述のように作用するポリスチレン系ポリマーからなる不撓性膜３１には、二次抗体６や抗原２が容易に非特異吸着しやすくなっている。そうであると、抗体４および６と抗原２との間の特異吸着が生じたのと同様の状態となるので、それが抗原２の誤検出を招くことになる。このため、図２に示すような不撓性膜３１の上に親水性リンカー３２が結合されている蛍光センサを用いてもよい。
【００６７】
図２に示す蛍光センサにおいては、不撓性膜３１の上に、一次抗体４と結合する親水性リンカー３２が形成されて、そのリンカー３２が二次抗体６や抗原２を遮断するので、それらが不撓性膜３１に非特異吸着することがなくなり、上述のような誤検出が防止される。他方、本来不撓性膜３１の表面部分に配置すべき一次抗体４は、リンカー３２と特異吸着させて、不撓性膜３１の表面部分に捉えることができる。
【００６８】
以上のように、本発明の表面プラズモン増強蛍光検出方法によれば、表面プラズモンによって増強された金属膜表面に染み出すエバネッセント波によって励起し、この励起により物質が発した蛍光を検出するので、近赤外光を使用して高感度検出を行うことが可能であるとともに、フィルタリング等の前処理が不要となるため、測定を格段に簡易化することができる。
【００６９】
次に図７を参照して、本発明による表面プラズモン増強蛍光検出方法の別の実施形態について説明する。ここで用いる蛍光センサは、図１に示したものと比較すると基本的に、不撓性膜３１の上にキャプチャ分子４０が固定化されている点が異なるものである。
【００７０】
本実施形態の方法は、試料１に含まれる物質の検出および／または定量を行うに当たり、いわゆる競合形式の蛍光検出を行うものである。以下、その蛍光検出について説明する。本実施形態では一例として、生体内に存在するセカンドメッセンジャー４１が検出対象とされ、キャプチャ分子４０はそのセカンドメッセンジャー４１と直接結合するものが適用されている。
【００７１】
また蛍光検出に先行して試料１の中には、前述したような蛍光体１０とセカンドメッセンジャー４１とが一体化されてなる標識化特定物質が含ませられる。なお、このような標識化特定物質は予め試料１中に存在させてもよく、あるいは試料１をキャプチャ分子４０と接触させて所定時間経過してから試料１中に混合させてもよく、さらには、標識化特定物質をキャプチャ分子４０と接触させて所定時間経過してからそれらと試料１とを混合するようにしてもよい。また、そのような標識化特定物質は、蛍光センサと共に、あるいは蛍光センサ専用のキットとして販売されれば、センサユーザが容易に入手可能となって競合形式の蛍光検出を簡便に実施できるので好ましい。
【００７２】
この競合形式の蛍光検出においては、検出対象のセカンドメッセンジャー４１が試料１の中に多く存在するほど、キャプチャ分子４０と結合する標識化特定物質が（つまり蛍光体１０が）少なくなる。つまり、試料１中のセカンドメッセンジャー４１の量が多いほど、表面プラズモン増強検出される蛍光の強度が低くなるので、この原理に基づいてセカンドメッセンジャー４１の検出および／または定量を行うことができる。
【００７３】
この場合も、前述した表面プラズモン増強効果が同様に得られるから、セカンドメッセンジャー４１を高感度で検出可能となり、そこで、サンドイッチ形式の検出方法では通常行うことが非常に困難である低分子化合物の検出および/または定量も容易に実施可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明の蛍光検出方法を実施可能な表面プラズモン増強蛍光センサを示す概略側面図
【図２】本発明の蛍光検出方法を実施可能な別の態様の表面プラズモン増強蛍光センサを示す概略側面図
【図３】従来の蛍光センサの一例を示す概略側面図
【図４】従来の蛍光センサの別の例を示す概略側面図
【図５】従来の蛍光センサのさらに別の例を示す概略側面図
【図６】ヘモグロビン吸収波長スペクトルを示すグラフ
【図７】本発明の蛍光検出方法を実施可能な表面プラズモン増強蛍光センサの別の例を示す概略側面図
【符号の説明】
【００７５】
１    試料
２    抗原
４    一次抗体
６    二次抗体
７    光源
８    励起光
９    光検出器
１０    蛍光体
１３    プリズム（誘電体ブロック）
２０    金属膜
３１    不撓性膜
３２    親水性リンカー
４０    キャプチャ分子
４１    セカンドメッセンジャー
【図１】
2008203172.tif 000004
【図２】
2008203172.tif 000005
【図３】
2008203172.tif 000006
【図４】
2008203172.tif 000007
【図５】
2008203172.tif 000008
【図６】
2008203172.tif 000009
【図７】
2008203172.tif 000010