(57)【要約】【課題】光軸ずれを発生させることなく光刺激用のレーザ光の合焦位置またはスポット径の変更を可能にし、標本における所望の位置または範囲に精度よく光刺激を与える。【解決手段】観察用のレーザ光Ｌ１を導く観察用光路と、光刺激用のレーザ光Ｌ２を導く光刺激用光路と、これらの光路を合成する光路合成部４とを備えるとともに、少なくとも光刺激用光路に、レーザ光Ｌ１，Ｌ２の合焦位置を変更する合焦位置変更部１３，２３と、該合焦位置変更部１３，２３と光路合成部４との間における光軸のずれ量を検出する光軸ずれ検出部１５，２５と、該光軸ずれ検出部１５，２５により検出された光軸のずれ量に基づいて光軸位置を調節するアライメント部１４，２４とを備えるレーザ顕微鏡１を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察用のレーザ光を導く観察用光路と、
光刺激用のレーザ光を導く光刺激用光路と、
これらの光路を合成する光路合成部とを備えるとともに、
少なくとも前記光刺激用光路に、前記レーザ光の合焦位置を変更する合焦位置変更部と、該合焦位置変更部と光路合成部との間における光軸のずれ量を検出する光軸ずれ検出部と、該光軸ずれ検出部により検出された光軸のずれ量に基づいて光軸位置を調節するアライメント部とを備えるレーザ顕微鏡。
【請求項２】
観察用のレーザ光を導く観察用光路と、
光刺激用のレーザ光を導く光刺激用光路と、
これらの光路を合成する光路合成部とを備えるとともに、
少なくとも前記光刺激用光路に、前記レーザ光のスポット径を変更するスポット径変更部と、該スポット径変更部と光路合成部との間における光軸のずれ量を検出する光軸ずれ検出部と、該光軸ずれ検出部により検出された光軸のずれ量に基づいて光軸位置を調節するアライメント部とを備えるレーザ顕微鏡。
【請求項３】
観察用のレーザ光を導く観察用光路と、
光刺激用のレーザ光を導く光刺激用光路と、
これらの光路を合成する光路合成部とを備えるとともに、
少なくとも前記光刺激用光路に、前記レーザ光の合焦位置を変更する合焦位置変更部と、前記レーザ光のスポット径を変更するスポット径変更部と、これら合焦位置変更部およびスポット径変更部と光路合成部との間における光軸のずれ量を検出する光軸ずれ検出部と、該光軸ずれ検出部により検出された光軸のずれ量に基づいて光軸を調節するアライメント部とを備えるレーザ顕微鏡。
【請求項４】
前記アライメント部が、前記光軸ずれ検出部の前段に配置され、レーザ光の光軸のシフト量および傾き量を調節する請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
【請求項５】
前記観察用光路および光刺激用光路に、レーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源から出射されたレーザ光を２次元的に走査するスキャナとがそれぞれ設けられている請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
【請求項６】
前記レーザ光源が、波長を変更可能な超短パルスレーザ光源である請求項５に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項７】
前記合焦位置変更部が、波面変換素子からなる請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【請求項８】
前記アライメント部が、前記スキャナによる走査範囲を変更する請求項５に記載のレーザ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、観察用のレーザ光を導く観察用光路とは別に、光刺激用のレーザ光を導く光刺激用光路とを備えるレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
このレーザ顕微鏡においては、標本における観察断面とは異なる断面を光刺激するために、光刺激用のレーザ光の標本上における集光位置を可変にすることができる。
【０００３】
【特許文献１】特開平１０−２０６７４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、光刺激用のレーザ光の集光位置の変更を光路中に配置されているレンズの移動により行う場合に、駆動系の誤差により、レンズの中心位置がずれたりレンズが傾いたりすることがある。このような場合には、レーザ光の光軸がずれて所望の位置に精度よく光刺激を与えることができず、所望の観察結果を得ることができないという不都合がある。
また、光刺激を行うスポット径の大きさを調整しようとする場合にも、光刺激用レーザ光の光路に配置したレンズを移動させることがあり、この場合にも同様の不都合が発生する。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、光軸ずれを発生させることなく光刺激用のレーザ光の合焦位置またはスポット径の変更を可能にし、標本における所望の位置または範囲に精度よく光刺激を与えることができるレーザ顕微鏡を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、観察用のレーザ光を導く観察用光路と、光刺激用のレーザ光を導く光刺激用光路と、これらの光路を合成する光路合成部とを備えるとともに、少なくとも前記光刺激用光路に、前記レーザ光の合焦位置を変更する合焦位置変更部と、該合焦位置変更部と光路合成部との間における光軸のずれ量を検出する光軸ずれ検出部と、該光軸ずれ検出部により検出された光軸のずれ量に基づいて光軸位置を調節するアライメント部とを備えるレーザ顕微鏡を提供する。
【０００７】
本発明によれば、観察用光路を介して導かれた観察用のレーザ光と、光刺激用の光路を介して導かれた光刺激用のレーザ光とが光路合成部により合成され、標本に照射される。光刺激用光路に設けられた合焦位置変更部の作動により光刺激用のレーザ光の合焦位置を変更し、その変更に伴って合焦位置変更部と光路合成部との間における光軸ずれが発生した場合に、光軸ずれ検出部の作動によりそのずれ量が検出される。この場合には、アライメント部の作動により検出されたずれ量に基づいて光軸位置が調節されてずれ量が修復されるので、光刺激用のレーザ光に光軸ずれを生じさせることなく、合焦位置を変更することができる。すなわち、光刺激用のレーザ光の合焦位置を光軸方向に移動させても、それによって合焦位置が光軸に交差する方向に変動しないので、標本の所望の位置に光刺激を与えつつ、観察用のレーザ光による観察を行うことができる。
【０００８】
また、本発明は、観察用のレーザ光を導く観察用光路と、光刺激用のレーザ光を導く光刺激用光路と、これらの光路を合成する光路合成部とを備えるとともに、少なくとも前記光刺激用光路に、前記レーザ光のスポット径を変更するスポット径変更部と、該スポット径変更部と光路合成部との間における光軸のずれ量を検出する光軸ずれ検出部と、該光軸ずれ検出部により検出された光軸のずれ量に基づいて光軸位置を調節するアライメント部とを備えるレーザ顕微鏡を提供する。
【０００９】
本発明によれば、光刺激用光路に設けられたスポット径変更部の作動により光刺激用のレーザ光のスポット径を変更し、その変更に伴ってスポット径変更部と光路合成部との間における光軸ずれが発生した場合に、光軸ずれ検出部の作動によりそのずれ量が検出される。この場合には、アライメント部の作動により検出されたずれ量に基づいて光軸位置が調節されてずれ量が修復されるので、光刺激用のレーザ光に光軸ずれを生じさせることなく、スポット径を変更することができる。すなわち、光刺激用のレーザ光のスポット径を縮小または拡大させても、それによってレーザ光の照射範囲が光軸に交差する方向にシフトしないので、標本の所望の範囲に光刺激を与えつつ、観察用のレーザ光による観察を行うことができる。
【００１０】
また、本発明は、観察用のレーザ光を導く観察用光路と、光刺激用のレーザ光を導く光刺激用光路と、これらの光路を合成する光路合成部とを備えるとともに、少なくとも前記光刺激用光路に、前記レーザ光の合焦位置を変更する合焦位置変更部と、前記レーザ光のスポット径を変更するスポット径変更部と、これら合焦位置変更部およびスポット径変更部と光路合成部との間における光軸のずれ量を検出する光軸ずれ検出部と、該光軸ずれ検出部により検出された光軸のずれ量に基づいて光軸を調節するアライメント部とを備えるレーザ顕微鏡を提供する。
【００１１】
本発明によれば、アライメント部の作動により検出されたずれ量に基づいて光軸位置が調節されてずれ量が修復されるので、光刺激用のレーザ光に光軸ずれを生じさせることなく、合焦位置およびスポット径を変更することができる。すなわち、光刺激用のレーザ光のスポット径を縮小または拡大させ、かつ、合焦位置を光軸方向に移動させても、それによってレーザ光の照射範囲が光軸に交差する方向にシフトしないので、標本の所望の位置および範囲に光刺激を与えつつ、観察用のレーザ光による観察を行うことができる。
【００１２】
上記発明においては、前記アライメント部が、前記光軸ずれ検出部の前段に配置され、レーザ光の光軸のシフト量および傾き量を調節することとしてもよい。
このようにすることで、合焦位置調節およびスポット径調節に伴う光軸のシフトおよび傾きをアライメント部により補正し、標本の所望の位置に精度よく光刺激を与えることができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記観察用光路および光刺激用光路に、レーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源から出射されたレーザ光を２次元的に走査するスキャナとがそれぞれ設けられていることとしてもよい。
このようにすることで、各光路に設けられたレーザ光から異なる種類のレーザ光を出射させ、別個のスキャナにより走査範囲および照射位置をそれぞれ独立して調節することができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記レーザ光源が、波長を変更可能な超短パルスレーザ光源であることとしてもよい。
このようにすることで、超短パルスレーザ光源から出射されるレーザ光の波長の変更に伴って発生する光軸の変動も光軸ずれ検出部により検出し、アライメント部により補正することができる。
【００１５】
また、上記発明においては、前記合焦位置変更部が、波面変換素子からなることとしてもよい。
このようにすることで、波面変換素子の作動によりレーザ光の波面が変換され、刺激用のレーザ光の合焦位置を光軸方向に移動させることができる。
【００１６】
また、上記発明においては、前記アライメント部が、前記スキャナによる走査範囲を変更することとしてもよい。
このようにすることで、レーザ光を標本に対して２次元的に走査するスキャナを利用して、光軸ずれを簡易に補正することが可能となる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、光軸ずれを発生させることなく光刺激用のレーザ光の合焦位置またはスポット径の変更を可能にし、標本における所望の位置または範囲に精度よく光刺激を与えることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡１について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１は、図１に示されるように、標本Ａを観察するためのレーザ光を出射する観察用光学系２と、標本Ａに光刺激を与えるためのレーザ光を出射する光刺激用光学系３と、これら光学系２，３からのレーザ光を合波するダイクロイックミラー（光路合成部）４と、該ダイクロイックミラー４により合波されたレーザ光を標本Ａに照射する一方、標本Ａから戻る光を集光する対物レンズ５と、該対物レンズ５により集光された光を検出する光検出器６と、これらを制御する制御部７と、検出された光を表示する表示部８と、操作者が操作を入力する入力部９とを備えている。
【００１９】
観察用光学系２は、超短パルスレーザ光のようなレーザ光Ｌ１を出射するレーザ光源１０と、該レーザ光源１０から出射されたレーザ光Ｌ１を２次元的に走査するスキャナ１１とを備えている。また、観察用光学系２には、レーザ光源１０とスキャナ１１との間に配置され、レーザ光源１０から出射されたレーザ光Ｌ１のスポット径を調節するスポット径変更部１２と、対物レンズ５の前方における焦点位置を調節する集光位置変更部（合焦位置変更部）１３と、レーザ光Ｌ１の光軸のシフトおよび傾きを調節する光軸調整部（アライメント部）１４と、レーザ光Ｌ１の光軸ずれを検出する光軸ずれ検出部１５とが設けられている。
【００２０】
前記スポット径変更部１２は、例えば、ビームエキスパンダにより構成されている。
ビームエキスパンダは、対物レンズ５の瞳に入射するレーザ光のビーム径を変化させることで標本Ａに照射されるレーザ光のスポット径を調節するようになっている。
また、前記集光位置変更部１３は、光軸に沿う方向に移動可能な１以上のレンズにより構成されている。なお、集光位置変更部１３は波面変換素子により構成されていてもよい。
また、前記光軸調整部１４は、それぞれ２軸回りに揺動可能な２枚の平面ミラーを備えるビームシフタにより構成されている。
【００２１】
光軸ずれ検出部１５は、観察用光学系２の観察用光路に配置され、レーザ光Ｌ１の一部を分岐する第１のビームスプリッタ１６と、該第１のビームスプリッタ１６により分岐されたレーザ光Ｌ１を、さらに２つに分岐する第２のビームスプリッタ１７と、該第２のビームスプリッタ１７により分岐されたレーザ光Ｌ１をそれぞれ検出する２つのフォトディテクタ１８，１９とを備えている。
【００２２】
２つのフォトディテクタ１８，１９は、それぞれ、入射されるレーザ光Ｌ１のスポット位置を検出するようになっている。また、２つのフォトディテクタ１８，１９は、第２のビームスプリッタ１７からの距離を異ならせて配置されている。これにより、２つのフォトディテクタ１８，１９によるレーザ光Ｌ１のスポット位置の差に基づいて、観察用のレーザ光Ｌ１の傾きを検出することができるようになっている。
【００２３】
前記光刺激用光学系３も、超短パルスレーザ光のようなレーザ光Ｌ２を出射するレーザ光源２０と、該レーザ光源２０から出射されたレーザ光Ｌ２のスポットの位置を２次元的に移動させるスキャナ２１とを備えている。また、光刺激用光学系３にも、レーザ光源２０とスキャナ２１との間に配置され、レーザ光源２０から出射されたレーザ光Ｌ２のスポット径を調節するスポット径変更部２２と、対物レンズ５の前方における焦点位置を調節する集光位置変更部（合焦位置変更部）２３と、レーザ光Ｌ２の光軸のシフトおよび傾きを調節する光軸調整部２４と、レーザ光Ｌ２の光軸ずれを検出する光軸ずれ検出部２５とが設けられている。
【００２４】
光刺激用光学系におけるスポット径変更部、合焦位置変更部および光軸調整部は、観察用光学系におけるそれと同様のものである。また、光軸ずれ検出部２５は、光刺激用光学系３の光刺激用光路に配置され、レーザ光Ｌ２の一部を分岐する第１のビームスプリッタ２６と、該第１のビームスプリッタ２６により分岐されたレーザ光Ｌ２を、さらに２つに分岐する第２のビームスプリッタ２７と、該第２のビームスプリッタ２７により分岐されたレーザ光Ｌ２の位置をそれぞれ検出する２つのフォトディテクタ２８，２９とを備えている。
【００２５】
前記制御部７は、入力部９から入力された操作者の操作、例えば、スポット径の変更の操作入力、あるいは集光位置の変更の操作入力を受けて、スポット径変更部１２，２２または集光位置変更部１３，２３に対し、変更指令を出力するようになっている。また、制御部７は、光軸ずれ検出部１５，２５の作動により検出された光軸のシフトおよび傾きに基づいて、光軸調整部１４，２４を調節するようになっている。図中、符号３０はダイクロイックミラーである。
【００２６】
このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１を用いて標本Ａを観察するには、観察用光学系２の作動により、レーザ光源１０から出射されたレーザ光Ｌ１が、スキャナ１１の作動により２次元的に走査され、対物レンズ５を介して、標本Ａに照射される。レーザ光Ｌ１が照射されると、その集光位置において標本Ａ内に存在している蛍光物質が励起されて多光子蛍光が発生する。発生した多光子蛍光は、対物レンズ５により集光され光検出器６により検出される。
【００２７】
検出された多光子蛍光は、その強度がスキャナ１１による走査位置と対応づけた形態で記憶されていくことにより、制御部７により多光子蛍光画像が作成される。そして、得られた多光子蛍光画像が表示部８により表示され、これによって操作者が標本Ａの多光子蛍光観察を行うことができる。
【００２８】
また、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、光刺激用光学系３の作動により、レーザ光源２０から出射されたレーザ光Ｌ２が、スキャナ２１によってそのスポット位置を２次元的に調節され、対物レンズ５を介して標本Ａに照射される。これにより、標本Ａにおける特定位置に光刺激を与えつつ、同時に観察用光学系２を用いて標本Ａの蛍光観察を行うことができる。
【００２９】
操作者が、観察用あるいは光刺激用のレーザ光Ｌ１，Ｌ２のスポット径を変更し、あるいは、対物レンズ５の先端側における集光位置を変更したい場合には、入力部９を介してその操作を入力する。
スポット径の変更操作が入力されたときには、制御部７は、その入力に応じてスポット径変更部１２，２２に対し指令信号を出力する。また、集光位置の変更操作が入力されたときには、制御部７は、その入力に応じて集光位置変更部１３，２３に対し指令信号を出力する。
【００３０】
スポット径変更部１２，２２は、例えば、ビームエキスパンダにより構成されているので、ビームエキスパンダを構成しているレンズの形状誤差やレンズ移動機構の機械的誤差等により、スポット径の変化に応じて、レーザ光Ｌ１，Ｌ２の光軸が、該光軸に交差する方向にシフトし、あるいは、その傾きが変動することが考えられる。また、集光位置変更部１３，２３も、光軸方向に移動する１枚以上のレンズにより構成されているので、レンズの形状誤差やレンズ移動機構の機械的誤差等により、集光位置の変化に応じて、レーザ光Ｌ１，Ｌ２の光軸がシフトあるいは傾斜する。
【００３１】
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、光軸ずれ検出部１５，２５が設けられているので、レーザ光源１０，２０から出射されたレーザ光Ｌ１，Ｌ２の一部が第１のビームスプリッタ１６，２６により分岐され、さらに第２のビームスプリッタ１７，２７により２つに分岐されて、それぞれフォトディテクタ１８，１９；２８，２９により検出される。２つのフォトディテクタ１８，１９；２８，２９のいずれかにおけるレーザ光Ｌ１，Ｌ２のスポットの検出位置に基づいて、レーザ光Ｌ１，Ｌ２のシフト量が検出される。また、第２のビームスプリッタ１７，２７から２つのフォトディテクタ１８，１９；２８，２９までの距離が異ならされているので、２つのフォトディテクタ１８，１９；２８，２９のスポットの検出位置の相違に基づいてレーザ光Ｌ１，Ｌ２の傾きが検出される。
【００３２】
これら２つのフォトディテクタ１８，１９；２８，２９によりレーザ光Ｌ１，Ｌ２の光軸におけるシフトが検出された場合には、制御部７は、光軸調整部１４，２４に対して、検出されたシフトの方向とは逆方向に光軸をシフトさせる指令信号を出力し、光軸調整部１４，２４の作動により、シフトが補正される。また、レーザ光Ｌ１．Ｌ２の光軸における傾きが検出された場合には、制御部７は、光軸調整部１４，２４に対して、検出された傾きとは逆方向に光軸を傾ける指令信号を出力し、光軸調整部１４，２４の作動により、傾きが補正される。
【００３３】
このように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、観察用光学系２から出射された観察用のレーザ光Ｌ１を標本Ａ上で２次元的に走査して、標本Ａの多光子蛍光観察を行いながら、光刺激用光学系３から出射された光刺激用のレーザ光Ｌ２で光刺激を行う光軸方向の位置あるいはスポット径を変更する場合に、集光位置やスポット径を変更しても光軸ずれが発生しないように補正できる。したがって、複数の光刺激観察範囲に対して精度よく設定された所望の位置に正確に光刺激を与えて、標本Ａの多光子蛍光観察を行うことができる。
【００３４】
また、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、観察用のレーザ光Ｌ１の照射により取得した標本画像に基づいて光刺激位置を指定する場合に、常に画像上で指定した位置に正しく光刺激を行うことができる。
【００３５】
なお、本実施形態においては、観察用光学系２および光刺激用光学系３のいずれにも光軸ずれ検出部１５，２５および光軸調整部１４，２４を設けることとしたが、光軸調整部１４，２４は、いずれかの光学系、例えば、光刺激用光学系３のみに設けることとしてもよい。
この場合、制御部７は両光学系の光軸ずれ検出部１５，２５で検出された光軸ずれ量に基づいて、光刺激用のレーザ光Ｌ２の照射位置が観察用のレーザ光Ｌ１の照射位置に合致するように光軸調整部２４を制御する。このようにしても、観察用のレーザ光Ｌ１の照射により取得した画像に基づいて光刺激位置を指定する場合には、常に画像上で指定した位置に正しく光刺激を行うことができる。
【００３６】
また、本実施形態においては、観察用光学系２および光刺激用光学系３のいずれにもスキャナ１１，２１を設け、標本Ａの所定の位置に光刺激を与えながら、同時に多光子蛍光画像を取得することを独立して行えることとしたが、これに代えて、図２に示されるように、観察用光学系２と光刺激用光学系３とで、スキャナ３１を共通に使用することとしてもよい。図中、符号３２はミラー、符号３３はダイクロイックミラーである。
この場合には、両者を独立して行うことができないので、時分割で多光子蛍光観察と光刺激とを行うことにすればよい。
【００３７】
また、本実施形態においては、スキャナ１１，２１とは別に光軸調整部１４，２４を設けることとしたが、これに代えて、光軸ずれ検出部１５，２５による検出結果に応じて、スキャナ１１，２１により光軸のシフトあるいは傾きの補正を行うことにしてもよい。このようにすることで、光軸ずれの補正をより高速に行うことができる。
【００３８】
また、レーザ光原１０，２０として、超短パルスレーザ光Ｌ１．Ｌ２を出射するものを採用したが、これに代えて、通常の連続レーザ光を出射するものを採用してもよい。その場合、蛍光は、スキャナ１１とビームスプリッタ１６との間にダイクロイックミラー（図示略）を配置して分岐し、共焦点ピンホール（図示略）を介して光検出器６により検出することとすればよい。
また、本実施形態において、レーザ光源１０，２０から出射する超短パルスレーザ光の波長を変更することによっても光軸ずれが発生するので、制御部７は、波長変更時の光軸ずれの補正を行うこともできる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡の全体構成を示すブロック図である。
【図２】図１のレーザ顕微鏡の変形例を示す図である。
【符号の説明】
【００４０】
Ａ  標本
Ｌ１，Ｌ２  レーザ光
１  レーザ顕微鏡
４  ダイクロイックミラー（光路合成部）
１０，２０  レーザ光源
１１，２１  スキャナ
１２，２２  スポット径変更部
１３，２３  集光位置変更部（合焦位置変更部）
１４，２４  光軸調整部（アライメント部）
１５，２５  光軸ずれ検出部
【図１】
2008203417.tif 000003
【図２】
2008203417.tif 000004