(57)【要約】【課題】心筋梗塞と関連性のある遺伝子多型を同定し、その遺伝子多型を利用して心筋梗塞をはじめとする炎症性疾患を判定する方法、該方法に用いることのできるオリゴヌクレオチド、炎症性疾患診断用キット、並びに炎症性疾患の治療薬などを提供すること。【解決手段】インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子又はインターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子又はインターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。
【請求項２】
インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子又はインターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子に存在する少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。
【請求項３】
下記の（１）から（３）よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。
（１）インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、
（２）インターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子のイントロン１０の５３６番目の塩基におけるＡ／Ｃの多型、及び
（３）上記（１）又は（２）に記載の多型と連鎖不平衡係数D’が０.８以上の連鎖不平衡状態にある多型。
【請求項４】
炎症性疾患が心筋梗塞である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
下記の（１）から（３）よりなる群から選ばれる少なくとも１つの部位を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、又はその相補配列にハイブリダイズすることができ、請求項１から４のいずれかに記載の方法においてプローブとして用いるオリゴヌクレオチド。
（１）インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、
（２）インターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子のイントロン１０の５３６番目の塩基におけるＡ／Ｃの多型、及び
（３）上記（１）又は（２）に記載の多型と連鎖不平衡係数D’が０.８以上の連鎖不平衡状態にある多型。
【請求項６】
下記の（１）から（３）よりなる群から選ばれる少なくとも１つの部位を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、及び／又はその相補配列を増幅することができ、請求項１から４のいずれかに記載の方法においてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチド。
（１）インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、
（２）インターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子のイントロン１０の５３６番目の塩基におけるＡ／Ｃの多型、及び
（３）上記（１）又は（２）に記載の多型と連鎖不平衡係数D’が０.８以上の連鎖不平衡状態にある多型。
【請求項７】
プライマーがフォワードプライマー及び／又はリバースプライマーである請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項５から７のいずれかに記載のオリゴヌクレチドの1種以上を含む、炎症性疾患診断用キット。
【請求項９】
炎症性疾患が心筋梗塞である請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの一塩基多型を検出することを含む、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現状態の分析方法。
【請求項１１】
インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの一塩基多型を含むインターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子断片を細胞に導入し、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写活性を阻害する候補物質の存在下で該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写活性阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現又は活性を抑制する物質を有効成分として含む、炎症性疾患の治療薬。
【請求項１３】
インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現又は活性を抑制する物質が、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3に対する抗体又はｓｉＲＮＡである、請求項１２に記載の治療薬。
【請求項１４】
細胞と候補物質とを接触させる工程、細胞内におけるインターアルファ（グロブリン）インヒビター3をコードする遺伝子の発現量を分析する工程、及び候補物質の非存在下の条件と比較して当該遺伝子の発現量を低下させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１５】
インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現状態を、炎症性疾患治療薬の存在下及び非存在下で比較観察する工程を含む、炎症性疾患治療薬の作用機序の確認方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子に存在する遺伝子多型を検出することを含む炎症性疾患の判定方法、該方法に使用されるオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを含む炎症性疾患診断用キット、並びにそれらの利用に関する。本発明はさらに、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子を利用した炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞を含む冠状動脈疾患は、先進国において主な死亡原因である (非特許文献１)。アテローム性動脈硬化症発症の一因となる冠状動脈リスク因子が明らかになっている (非特許文献２)。個々の因子は部分的に遺伝的制御を受けるが、家族歴陽性は独立した予測因子であり (非特許文献３)、心筋梗塞の遺伝的寄与因子の存在が示唆される。家族研究又は双生児研究などの多数の研究により心筋梗塞の病因における遺伝的要素の証拠が提供されている (非特許文献４)。最近では、連鎖解析および／または一塩基多型（SNP）を用いた患者・対照相関解析によって、心筋梗塞感受性遺伝子の候補が幾つかの染色体遺伝子座に同定されている (非特許文献５から９)。
【０００３】
炎症は、アテローム性動脈硬化症の一因となり心筋梗塞のリスクを増大させる可能性があることが示された (非特許文献２)。それは、修飾リポ蛋白質、単球由来マクロファージ、Tリンパ球および血管壁由来の血管平滑筋細胞の間の複雑な相互作用の結果である。最近の研究では、接着分子、ケモカイン、成長因子、蛋白質分解酵素およびその阻害剤などの、アテローム性動脈硬化性プラークの形成及び破壊における化学誘引物質の重要性が明らかにされている (非特許文献１０から１３)。
【０００４】
インターアルファ（グロブリン）インヒビター3（ITIH3）は、血漿セリンプロテアーゼインヒビターの１成分であり、多数の研究により、炎症誘発プロセスとの関係が示唆されている (非特許文献１４)。この蛋白質は、軽鎖（ビクニン）のコンドロイチン硫酸鎖への独特な共有結合に特徴がある。プレアルファトリプシンインヒビター（PαI）と呼ばれる複合体が肝細胞から合成されて、血漿中へ放出される。炎症反応中に血液漏出とともに、血清中PαIが血管外組織内のヒアルロナン（HA）と遭遇すると、コンドロイチン硫酸はトランスエステル化反応によってHAに鎖状につながり、マトリックス構造を構成する。この複合体は、慢性関節リウマチや炎症性腸疾患などの炎症性疾患に関連することが明らかにされている (非特許文献１５)。
【０００５】
【非特許文献１】Ross, R. N.Engl.J.Med. 340, 115-126 (1999)
【非特許文献２】Libby, P. Nature. 420, 868-974 (2002)
【非特許文献３】Shea S. J. Am. Coll. Cardiol. 4, 793-801 (1984)
【非特許文献４】Marjorie, E. N. Engl. J. Med. 330, 1041-1046 (1996)
【非特許文献５】Wang,Q. Am.J.Hum.Genet. 74(2), 262-271 (2004)
【非特許文献６】Ozaki,K. Nat. Genet. 32, 650-654 (2002)
【非特許文献７】Yamada,Y.  N. Engl. J. Med. 347, 1916-1923 (2002)
【非特許文献８】Wang, L. Science. 302, 1578-1581 (2003)
【非特許文献９】Helgadottir, A. Nat. Genet. 36, 233-239 (2004)
【非特許文献１０】Cybulsky,M.I. Science, 251, 788-791 (1991)
【非特許文献１１】Boring,L. Nature, 394, 894-897 (1998)
【非特許文献１２】Brogi,E. J.Clin.Invest. 92, 2408-2418 (1993)
【非特許文献１３】Galis,Z.S. J.Clin.Invest. 94, 2493-2503 (1994)
【非特許文献１４】Fries, E. Acta Biochimica Polonica. 50, 735-742 (2003)
【非特許文献１５】Zhuo, L.  J Bio. Chem. 279, 38079-38082 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、心筋梗塞と関連性のある遺伝子多型を同定し、その遺伝子多型を利用して心筋梗塞をはじめとする炎症性疾患を判定する方法、該方法に用いることのできるオリゴヌクレオチド、炎症性疾患診断用キット、並びに炎症性疾患の治療薬などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、大規模な患者・対照相関解析において、心筋梗塞感受性の1個のSNPを全ゲノムから抽出した。本発明者らは、このSNPが、遺伝子座近傍の他のSNPとの連鎖不平衡から孤立していること、そしてこのSNPが単独でITIH3の転写レベルに影響を及ぼすことを実証した。即ち、このゲノム領域には他のITIHファミリー遺伝子、すなわちITIH1とITIH4を含まれるが (Diarra-Mehrpour, M.  Eur. J. Biochem. 179(1), 147-154 (1989))、連鎖不平衡解析により、エクソン2の15A/GのSNPは、他の全てのSNPと連鎖不平衡ではないことを明らかにした。さらに、HapMapデータからも同様の結果が得られることを確認した（The International HapMap Consortium. The International HapMap Project. Nature. 426, 789-796 (2003)、http://www.hapmap.org/にて参照可能）。上記の結果から、ITIH3のエクソン２の15A/G のSNPが心筋梗塞のリスクを与えることが分かった。さらに本発明者らは、このSNPがITIH3の転写レベルに影響するのではないかという仮説を立てた。図３ａに示す通り、エクソン2の15G対立遺伝子を含むルシフェラーゼベクターはA対立遺伝子を含むクローンの2〜3倍高い転写活性を示し、エクソン２における置換がITIH3の転写レベルに影響を及ぼすことが示された。さらに、ゲルシフトアッセイにより、未同定の転写因子との結合についての蛋白質の親和性に対立遺伝子による差異があることを見出した（図３ｂ）。これらの結果は、このSNPがITIH3発現のレベルに影響を及ぼすことを示している。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子又はインターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。
【０００９】
本発明によればまた、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子又はインターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子に存在する少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。
【００１０】
本発明によればまた、下記の（１）から（３）よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。
（１）インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、
（２）インターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子のイントロン１０の５３６番目の塩基におけるＡ／Ｃの多型、及び
（３）上記（１）又は（２）に記載の多型と連鎖不平衡係数D’が０.８以上の連鎖不平衡状態にある多型。
【００１１】
好ましくは、炎症性疾患は心筋梗塞である。
【００１２】
本発明によればまた、下記の（１）から（３）よりなる群から選ばれる少なくとも１つの部位を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、又はその相補配列にハイブリダイズすることができ、上記のいずれかに記載の方法においてプローブとして用いるオリゴヌクレオチドが提供される。
（１）インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、
（２）インターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子のイントロン１０の５３６番目の塩基におけるＡ／Ｃの多型、及び
（３）上記（１）又は（２）に記載の多型と連鎖不平衡係数D’が０.８以上の連鎖不平衡状態にある多型。
【００１３】
本発明によればまた、下記の（１）から（３）よりなる群から選ばれる少なくとも１つの部位を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、及び／又はその相補配列を増幅することができ、上記のいずれかに記載の方法においてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドが提供される。
（１）インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、
（２）インターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子のイントロン１０の５３６番目の塩基におけるＡ／Ｃの多型、及び
（３）上記（１）又は（２）に記載の多型と連鎖不平衡係数D’が０.８以上の連鎖不平衡状態にある多型。
【００１４】
好ましくは、プライマーはフォワードプライマー及び／又はリバースプライマーである。
【００１５】
本発明によればまた、上記のいずれかに記載のオリゴヌクレチドの1種以上を含む、炎症性疾患診断用キットが提供される。
好ましくは、炎症性疾患は心筋梗塞である。
【００１６】
本発明によればまた、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの一塩基多型を検出することを含む、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現状態の分析方法が提供される。
【００１７】
本発明によればまた、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの一塩基多型を含むインターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子断片を細胞に導入し、該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写活性の測定方法が提供される。
【００１８】
本発明によればまた、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの一塩基多型を含むインターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子断片を細胞に導入し、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写活性を阻害する候補物質の存在下で該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写活性阻害物質のスクリーニング方法が提供される。
【００１９】
本発明によればまた、上記したスクリーニング方法により得られるインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写活性阻害物質が提供される。
【００２０】
好ましくは、前記インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。
【００２１】
好ましくは、前記リポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である。
【００２２】
本発明によればまた、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの一塩基多型を含む遺伝子断片とインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写制御因子の存在が予想される試料を接触させ、上記断片と転写制御因子との結合を検出することを含む、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写制御因子のスクリーニング方法が提供される。
好ましくは、検出はゲルシフトアッセイにより行われる。
【００２３】
本発明によればまた、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現又は活性を抑制する物質を有効成分として含む、炎症性疾患の治療薬が提供される。
好ましくは、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現又は活性を抑制する物質は、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3に対する抗体又はｓｉＲＮＡである。
【００２４】
本発明によればまた、細胞と候補物質とを接触させる工程、細胞内におけるインターアルファ（グロブリン）インヒビター3をコードする遺伝子の発現量を分析する工程、及び候補物質の非存在下の条件と比較して当該遺伝子の発現量を低下させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法が提供される。
本発明によればまた、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現状態を、炎症性疾患治療薬の存在下及び非存在下で比較観察する工程を含む、炎症性疾患治療薬の作用機序の確認方法が提供される。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の方法によれば、心筋梗塞を初めとする炎症性疾患の発症の有無の判断、疾患発症の可能性の判断を正確にかつ迅速に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
[１]  炎症性疾患の判定方法
本発明の方法は、炎症性疾患と関連性を示す特定遺伝子に存在する遺伝子多型、特には一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出することによって、炎症性疾患の発症の有無、あるいは炎症性疾患の発症の可能性を判定する方法である。
上記の特定遺伝子とは、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子又はインターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子であって、遺伝子多型は、この遺伝子を含むゲノムＤＮＡのエクソン又はイントロンに存在する。
【００２７】
本発明において「インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子（又は又はインターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子）に存在する少なくとも一種の遺伝子多型（一塩基多型など）を検出する」とは、(i)当該遺伝子多型（遺伝子側多型と称する）を直接検出すること、及び(ii)前記遺伝子の相補配列側に存在する遺伝子多型（相補側多型と称する）を検出し、その検出結果から遺伝子側多型を推定することの双方を指すものとする。ただし、遺伝子側の塩基と相補配列側の塩基とが完全に相補的な関係にあるとは限らないという理由から、遺伝子側多型を直接検出することがより好ましい。
【００２８】
なお、本発明において検出対象となる一塩基多型としては、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子又はインターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子に存在する遺伝子多型が挙げられ、より具体的には、下記の（１）から（３）よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型が挙げられる。
（１）インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、
（２）インターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子のイントロン１０の５３６番目の塩基におけるＡ／Ｃの多型、及び
（３）上記（１）又は（２）に記載の多型と連鎖不平衡係数D’が０.８以上の連鎖不平衡状態にある多型。
【００２９】
本明細書において、エクソン又はイントロンにおけるＸ番目の塩基を、その位置を示す数字Ｘと、塩基を表す記号との組み合わせで示す場合がある。例えば、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の「１５Ａ／Ｇ」とは、エクソン２の１５番目の位置にあるＡ又はＧを示す。配列表の配列番号１に、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のゲノムの塩基配列を示す。エクソン２の１５番目の位置にあるＡ又はＧは、配列番号１の８２０番目の塩基（配列番号１の８２０番目の塩基であるｒは、Ａ又はＧを示す）に相当する。
【００３０】
また、インターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子のイントロン１０の「５３６Ａ／Ｃ」とは、イントロン１０の５３６番目の位置にあるＡ又はＣを示す。配列表の配列番号２に、インターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子のゲノムの塩基配列を示す。イントロン１０の５３６番目の位置にあるＡ又はＣは、配列番号２の６２８４番目の塩基（配列番号２の６２８４番目の塩基であるｍは、Ａ又はＣを示す）に相当する。
【００３１】
本発明においては、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基がＧである場合は、炎症性疾患が発症している、あるいは発症の可能性が高いと判定できる。これに対し、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基がＡである場合は、炎症性疾患が発症していない、あるいは発症の可能性が低いと判定できる。
【００３２】
本発明においては、インターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子のイントロン１０の５３６番目の塩基がＡである場合は、炎症性疾患が発症している、あるいは発症の可能性が高いと判定できる。これに対し、インターアルファ（グロブリン）インヒビター1遺伝子のイントロン１０の５３６番目の塩基がＣである場合は、炎症性疾患が発症していない、あるいは発症の可能性が低いと判定できる。
【００３３】
さらに本発明においては、上記（１）及び（２）に記載の多型と連鎖不平衡係数D’が０.８以上の連鎖不平衡状態にある多型を用いることもできる。連鎖不平衡とは、２つの対立遺伝子がそれぞれ独立に遺伝する場合よりも大きな頻度で互いに連鎖して遺伝することをいう。ＳＮＰｓマーカーは、日本人を含むアジア人とヨーロッパ人では平均２２ｋｂ以内で連鎖不平衡が保たれている。また、アフリカ人では平均１１ｋｂ以内で連鎖不平衡が保たれていることが報告されている。さらに、このような連鎖不平衡を示す一群の対立遺伝子のことをハプロタイプと称する。インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子座において複数のＳＮＰｓがある場合、その多型の組み合わせは個人によって異なる。この組み合わせがいわゆるハプロタイプマーカーであり、個人の多様性を表している。このようなハプロタイプマーカーを利用して被験者の遺伝情報と炎症性疾患に対する素因を関連付けることができる。連鎖不平衡係数D'は、２つのSNPについて第一のSNPの各アレルを（A，a）、第二のSNPの各アレルを（B，b）とし、４つのハプロタイプ（AB，Ab，aB，ab）の各頻度をPAB，PAb，PaB，Pabとすると、下記式により得られる。
【００３４】
D'＝（PABPab-PAbPaB）/Min[（PAB+PaB）（PaB+Pab），（PAB+PAb）（PAb+Pab）]
[式中、Min[（PAB+PaB）（PaB+Pab），（PAB+PAb）（PAb+Pab）]は、（PAB+PaB）（PaB+Pab）と（PAB+PAb）（PAb+Pab）とのうち、値の小さい方をとることを意味する。]
【００３５】
本発明では、好ましくは、連鎖不平衡係数D'が0.8以上、より好ましくは0.95以上、さらに好ましくは0.99以上、最も好ましくは１である多型を用いることができる。
【００３６】
本明細書において、疾患の「判定」とは疾患発症の有無の判断、疾患発症の可能性の判断（罹患危険性の予想）、疾患の遺伝的要因の解明などをいう。
【００３７】
また、疾患の「判定」は、上記の一塩基多型の検出法による結果と、所望により他の多型分析(ＶＮＴＲやＲＦＬＰ）及び／又は他の検査結果と合わせて行うこともできる。
【００３８】
また、本明細書において、「炎症性疾患」とは、炎症性病態との相関が知られている細胞接着因子やサイトカインの誘導が認められる疾患であれば特に限定はされないが、例えば慢性関節リウマチ、全身性エリマトーデス、炎症性腸炎、種々のアレルギー反応、細菌性ショック、心筋梗塞や脳卒中などの動脈硬化性疾患などが挙げられ、特には心筋梗塞が挙げられる。
【００３９】
（検出対象）
遺伝子多型の検出の対象は、ゲノムＤＮＡが好ましいが、場合によっては（つまり多型部位及びその隣接領域の配列がゲノムと同一または完全相補的になっている場合）ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡを使用することもできる。また、上記対象を採取する試料としては、任意の生物学的試料、例えば血液、骨髄液、精液、腹腔液、尿等の体液；肝臓等の組織細胞；毛髪等の体毛等が挙げられる。ゲノムＤＮＡ等は、これらの試料より常法に従い抽出、精製し、調製することができる。
【００４０】
(増幅）
遺伝子多型を検出するにあたっては、まず遺伝子多型を含む部分を増幅する。増幅は、例えばＰＣＲ法によって行われるが、他の公知の増幅方法、例えばＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等で行ってもよい。
【００４１】
プライマーの選択は、例えば、配列番号１又は２で示す塩基配列における、前記の一塩基多型部位を含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基、より好ましくは１０〜５０塩基の配列、及び／又はその相補配列を増幅するように行う。
【００４２】
プライマーは、前記の一塩基多型部位を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
【００４３】
増幅のために用いるプライマーは、試料が一の対立遺伝子型の場合にのみ増幅されるようにフォワードプライマー又はリバースプライマーの一方が一塩基多型部位にハイブリダイズするように選択してもよい。プライマーは必要に応じて蛍光物質や放射性物質等により標識することができる。
【００４４】
（遺伝子多型の検出）
遺伝子多型の検出は、一の対立遺伝子型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識してもよい。プローブは、前記の一塩基多型部位を含み、被検試料とハイブリダイズし、採用する検出条件下に検出可能な程度の特異性を与えるものである限り何等限定はない。プローブとしては、例えば配列番号１又は２に示す配列における、前記の一塩基多型部位を含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基の配列、より好ましくは１０〜５０塩基の配列、又はそれらの相補配列にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを用いることができる。また、一塩基多型部位がプローブのほぼ中心部に存在するようにオリゴヌクレオチドを選択するのが好ましい。該オリゴヌクレオチドは、プローブとして機能し得る限り、即ち、目的の対立遺伝子型の配列とハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の配列とはハイブリダイズしない条件下でハイブリダイズする限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。また、プローブには、ＲＣＡ（rolling circle amplification)法による増幅に用いられる一本鎖プローブ（パドロックプローブ）のように、ゲノムＤＮＡとアニールし、環状になることによって上記のブロープの条件を満たすプローブが含まれる。
【００４５】
本発明に用いるハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子型を区別するのに十分な条件である。例えば、試料が一の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件である。ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Sambrook et al., 1989)に記載の条件等が挙げられる。具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中プローブとともに６５℃で一晩保温するという条件等が挙げられる。
【００４６】
プローブは、一端を基板に固定してＤＮＡチップとして用いることもできる。この場合、ＤＮＡチップには、一の対立遺伝子型に対応するプローブのみが固定されていても、両方の対立遺伝子型に対応するプローブが固定されていてもよい。
【００４７】
遺伝子多型の検出は、制限酵素断片長多型分析法（ＲＦＬＰ：Restriction fragment length polymorphism）により行うこともできる。この方法では、一塩基多型部位がいずれの遺伝子型をとるかによって制限酵素により切断されるか否かが異なってくる制限酵素で試料核酸を消化し、消化物の断片の大きさを調べることにより、該制限酵素で試料核酸が切断されたか否かを調べ、それによって試料の多型を分析する。
【００４８】
遺伝子多型の検出は、増幅産物を直接配列決定することによって行ってもよい（ダイレクトシークエンシング法）。配列決定は、例えばジデオキシ法、Maxam-Gilbert法等の公知の方法により行うことができる。
【００４９】
遺伝子多型の検出は、インベーダーアッセイにより行ってもよい。この方法では、SNPがあるかどうかテストするDNAターゲットフラグメントに対して相補的配列を持つインベーダーオリゴと５’のフラップ構造を持ち、SNPを検出するための相補的オリゴ（シグナルプローブ）を使用する。まずターゲットDNAに対してインベーダーオリゴとシグナルプローブをハイブリダイズさせる。この時、インベーダーオリゴとプローブは１塩基がオーバーラップする構造(invasive structure)を持つ。この部分にCleavase（Archaeoglobus fulgidusから分離されたフラップ・エンドヌクレアーゼ）が作用し、SNP部位のシグナルプローブの塩基とターゲットの塩基が相補的（SNPなし）の場合にはシグナルプローブの５'フリップが切断される。切断された５’フリップはFRET Probe (Fluorescence resonance energy transfer probe)にハイブリダイズする。FRET プローブ上には蛍光色素とクエンチャー(Quencher)が近接しており、蛍光が抑制されるが、５’フリップDNAが結合することによりCleavaseによって蛍光色素の部分が切断され、蛍光シグナルが検出できる。
【００５０】
遺伝子多型の検出はまた、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ：denaturing gradient gel electrophoresis）、一本鎖コンフォメーション多型解析(ＳＳＣＰ：single strand conformation polymorphism）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ(allele- specific PCR）、ＡＳＯ（allele-specific oligonucleotide）によるハイブリダイーゼーション法、ミスマッチ部位の化学的切断（ＣＣＭ：chemical cleavage of mismatches）、ＨＥＴ（heteroduplex method)法、ＰＥＸ(primer extension)法、ＲＣＡ（rolling circle amplification)法等を用いることができる。
【００５１】
[２]  炎症性疾患診断用キット
前記のプライマー又はプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、これを含む炎症疾患診断用キットとして提供できる、キットは、上記遺伝子多型の分析法に使用される制限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、標識、緩衝液等を含んでいてもよい。
【００５２】
[３]   インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現状態の分析方法
本発明によればまた、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの一塩基多型を検出することによって、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現状態を分析することができる。即ち、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基がＧである場合は、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現量が多いと判断でき、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基がＡである場合は、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現量が少ないと判断できる。
【００５３】
[４]   インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写活性の測定方法
本発明によればまた、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの一塩基多型を含むインターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子断片を細胞に導入し、該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することによってインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写活性を測定することができる。
【００５４】
本発明の好ましい態様によれば、前記インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。
【００５５】
一塩基多型がプロモーター部位に存在する場合は、その一塩基多型を含む遺伝子の下流にレポーター遺伝子を挿入した系を導入した細胞を培養し、レポーター活性を測定すれば、一塩基多型による転写効率に違いを測定することができる。
【００５６】
ここでリポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼなどの遺伝子が用いられる。
【００５７】
[５]   インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子の転写活性阻害物質のスクリーニング方法
本発明においては、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの一塩基多型を含むインターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子断片を細胞に導入し、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写活性を阻害する候補物質の存在下で該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することによってインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写活性阻害物質をスクリーニングすることできる。
【００５８】
本発明の好ましい態様によれば、前記インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。
例えば、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子の発現量が有意に高いことが認められる一塩基多型（例えば、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基がＧである場合）を有する遺伝子の下流にレポーター遺伝子を挿入した系を導入した細胞を候補物質の存在下又は非存在下の両方の場合について培養し、候補物質の存在下で培養を行った場合にレポーター活性が下がれば、その候補物質は、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写活性阻害物質として選択することができる。
【００５９】
ここでリポーター遺伝子としては、上記に挙げた遺伝子が用いられる。
候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。候補物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
【００６０】
上記のスクリーニング法により得られるインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写活性阻害物質もまた本発明の範囲内である。このようなインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写活性阻害物質は、心筋梗塞治療剤、抗炎症剤、免疫抑制剤などの各種薬剤の候補物質として有用である。
【００６１】
[６]   インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写制御因子のスクリーニング方法
本発明においてはまた、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるＡ／Ｇの一塩基多型を含む遺伝子断片と、プインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写制御因子の存在が予想される試料を接触させ、上記断片と転写制御因子との結合を検出することによって、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写制御因子をスクリーニングすることができる。前記の一塩基多型を含む遺伝子断片とインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の転写制御因子の存在が予想される物質との結合の検出は、ゲルシフト法（電気泳動移動度シフト解析： electrophoretic mobility shift assay, EMSA）、DNase I フットプリント法等によって行うことがきるが、ゲルシフト法が好ましい。ゲルシフト法では、タンパク質（転写制御因子）が結合すると、分子サイズが大きくなり電気泳動におけるDNAの移動度が低下するので、32Pで標識した遺伝子断片と転写制御因子を混ぜ、ゲル電気泳動にかける。オートラジオグラフィーでDNAの位置を見ると、因子の結合したDNAはゆっくり動くので、通常のバンドよりも遅れて移動するバンドとして検出される。
【００６２】
[７]  炎症性疾患の炎症性疾患の治療薬
本発明においては、以下の実施例で示す通り、心筋梗塞患者では、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基がＧとなる確率が高く、これによりインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現が亢進されていることが示された。この結果は、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3が、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症、進展に関与していることを示していると共に、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現や活性を抑制することによる心筋梗塞等の炎症性疾患の治療が期待できる。また、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の活性を抑制するための手段としては、例えば、RNAiによりインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現を阻害する物質、又はインターアルファ（グロブリン）インヒビター3に対する抗体を用いることができる。
【００６３】
また、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現又は活性を抑制する物質を有効成分として含む、炎症性疾患の治療薬も本発明の範囲内に含まれる。ここで用いるインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現又は活性を抑制する物質としては、低分子化合物でもよいし、RNAiによりインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現を阻害する物質でもよいし、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3に対する抗体でもよい。
【００６４】
RNAi（RNA interference）は、細胞に導入された2本鎖RNAが、同じ配列を持つ遺伝子の発現を抑制する現象を言う。RNAiによりインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現を阻害する物質の具体例としては、下記に説明するようなsiRNA又はshRNA等が挙げられる。
【００６５】
siRNA とはshort interfering RNAの略称であり、約２１〜２３塩基程度の長さの二本鎖RNAをいう。siRNAはRNAiを引き起こすことができる限り、どのような形態のものでもよく、例えば、化学合成もしくは生化学的合成、又は生物体内の合成で得られたsiRNA、あるいは約４０塩基以上の二本鎖RNAが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖RNA等であればよい。siRNA の配列と、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3のmRNAの部分配列とは１００％一致することが好ましいが、必ずしも１００％一致していなくてもよい。
【００６６】
siRNAの塩基配列と、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子の塩基配列との間で相同性のある領域は、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子の翻訳開始領域を含まないことが好ましい。相同性を有する配列は、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子の翻訳開始領域から２０塩基離れていることが好ましく、７０塩基離れていることがより好ましい。相同性を有する配列としては、例えば、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子の３'末端付近の配列でもよい。
【００６７】
RNAiによりインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現を阻害する物質としては、siRNA を生成する約４０塩基以上のdsRNA等を用いてもよい。例えば、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3遺伝子の核酸配列の一部に対して約７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する配列を含む、二本鎖部分を含むRNA又はその改変体を使用することができる。相同性を有する配列部分は、通常は、少なくとも１５ヌクレオチド以上であり、好ましくは約１９ヌクレオチド以上であり、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド以上であり、さらに好ましくは２１ヌクレオチド以上である。
【００６８】
RNAiによりインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現を阻害する物質としては、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造から成るshRNA（short hairpin RNA）を使用することもできる。shRNAとは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことである。また、shRNAとしては３'突出末端を有するのが好ましい。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは２０ヌクレオチド以上である。ここで、３'突出末端は、好ましくはDNAであり、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド以上のDNAであり、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチドのDNAである。
【００６９】
RNAiによりインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現を阻害する物質は、人工的に化学合成してもよいし、センス鎖及びアンチセンス鎖のDNA配列を逆向きに連結したヘアピン構造のDNAをT7 RNAポリメラーゼによってインビトロでRNAを合成することによって作製してもよい。インビトロで合成する場合は、T7 RNAポリメラーゼ及びＴ７プロモーターを用いて、鋳型DNAからアンチセンス及びセンスのRNAを合成することができる。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、RNAiが引き起こされ、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現が抑制される。細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法、又は各種のトランスフェクション試薬（例えば、oligofectamine、Lipofectamine及びlipofection等）を用いた方法等により行うことができる。
【００７０】
RNAiによりインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現を阻害する物質としては上述のsiRNA又はshRNAをコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いてもよい。さらに該発現ベクターを含む細胞を用いてもよい。上記した発現ベクターや細胞の種類は特に限定されないが、既に医薬として用いられている発現ベクターや細胞が好ましい。
【００７１】
インターアルファ（グロブリン）インヒビター3に対する抗体は、定法により作製することができる。例えば、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3に対するポリクローナル抗体は、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3を抗原として哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等）を当業者に公知の方法で免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。抗原を投与する際には、適当なアジュバントを使用することもできる。血液からの抗体の分離・精製は、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって行うことができる。また、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを用いて常法により作製することができる。
【００７２】
［８］炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法
本発明では、炎症性疾患では、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現又は活性の亢進が関与していることが示されたことにより、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現又は活性を低下させる物質は、炎症性疾患の治療薬として有用であることが判明した。本発明によればさらに、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の発現又は活性を低下させる物質をスクリーニングする方法が提供される。上記スクリーニングの一例としては、細胞と候補物質とを接触させる工程、細胞内におけるインターアルファ（グロブリン）インヒビター3をコードする遺伝子の発現量を分析する工程、及び候補物質の非存在下の条件と比較して当該遺伝子の発現量を低下させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程により行うことができる。また、上記スクリーニングの別の例としては、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3と候補物質とを接触させる工程、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3の活性を測定する工程、及び候補物質の非存在下の条件と比較してインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の活性を低下させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程により行うことができる。ここで言うインターアルファ（グロブリン）インヒビター3の活性とは、例えば、血漿セリンプロテアーゼを阻害する活性を挙げることができる。
【００７３】
候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されず、例えば、本明細書中上記［５］に記載した各種のライブラリー等を使用することができる。
【００７４】
［９］炎症性疾患治療薬の作用機序の確認方法
炎症性疾患治療薬にはその作用機序が完全には明らかになっていないものも多い。本発明は、インターアルファ（グロブリン）インヒビター3が炎症性疾患の原因遺伝子の一つである可能性を示唆するが、現在市販されている炎症性疾患治療薬の中にはインターアルファ（グロブリン）インヒビター3（以下「当該遺伝子」）に直接あるいは間接的に作用するものも、全く作用しないものも含まれていると考えられる。
【００７５】
従って、炎症性疾患治療薬の存在下及び非存在下で当該遺伝子の発現量を比較観察し、当該遺伝子の発現を抑制するもの／変化が見られないもの／（場合によっては）発現を上昇させるもの、を分類することは、炎症性疾患の患者個々人に最適な治療薬を選択する一助になるという観点からも非常に有効である。
【００７６】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００７７】
実施例１：相関研究
（方法）
（被験者）
本実施例では、大阪急性冠状動脈不全研究会で調査された日本人の心筋梗塞患者を対象とした。対照被験者は、日本のいくつかの医療機関を通じて募集された一般母集団で構成された。全対象者は日本人で、本研究へ参加するに当たって書面によるインフォームドコンセントがなされた。さらに、20歳未満の被験者については、横浜の理化学研究所の遺伝子多型研究センター倫理委員会が承認した手続きに従い保護者の承諾を得た。
【００７８】
（遺伝子型同定）
PCRプライマーの設計、PCR実験、DNA抽出、DNAシークエンシング、SNP発見、SNPの遺伝子型の同定および統計分析については既報の通り行った (Ozaki,K. Nat. Genet. 32, 650-654 (2002))。
【００７９】
（ハプロタイプブロック）
ハプロタイプの同定には、Haploviewソフトウエアを使用した。ブロック構築のための連鎖不平衡の尺度として連鎖不平衡係数Ｄ’を使用し、Ｄ’が０．９を超えるＳＮＰ間においてＤ’の片側９５％信頼値の上限が０．９８を超え、かつ下限が０．８を超えるＳＮＰ間同士を真の連鎖不平衡の関係にあるとした。また、Ｄ’の９５％信頼値の上限が０．９以下のＳＮＰ間では組み替えがおこったものと定義した。
【００８０】
（統計分析）
相関解析、ハプロタイプ頻度、およびハーディワインバーグ（Hardy-Weinberg）平衡およびγ2の計算をするために統計分析を実施した。本実施例における独立したSNPの総数を計算したところ41,362であった（LD γ2＞0.80のものを1つのSPNとして数えた）。得られたP値をボンフェローニ（Bonferroni）の補正によって修正した（Pｃ）。ルシフェラーゼアッセイの結果は、スタティスチカ（Statistica）ソフトウェア（StatSoft）でフィッシャーの直接確率検定によりテストした。
【００８１】
（結果）
188人の心筋梗塞患者と752人の日本人母集団の遺伝子型をハイスループットマルチプレックス PCRインベーダーアッセイ法を用いて調べ (Ohnishi, Y. Hum. Genet. 46, 471-477 (2001))、さらに以前に評価したハプロタイプブロック構成に基づくJSNPデータベースから選択した52,608のSNPgene-based SNPの遺伝子型を調べた (Haga, H. J.Hum. Genet. 47, 605-610 (2002)、及びTsunoda, T. Hum. Mol. Genet. 13, 1623-1632 (2004))。この遺伝子型同定の成功率は93.5パーセント（49,167のSNP）で、P値分布を表１に示す。
【００８２】
【表１】
2008048627.tif 000002
【００８３】
心筋梗塞患者と対照のさらに大きなパネルにおいて、劣性モデルでも優性モデルでも、相関を表す0.01未満のP値を示すSNPの遺伝子型をさらに調べた。この二次スクリーニングの遺伝子型の同定により、この遺伝子座の大部分が最終的に0.01を超えるP値を示した。しかし、最初のスクリーニングで心筋梗塞と相関（P=0.0071）していた染色体3p21.2-p21.1上のITIH3遺伝子の１つのSNP（エクソン2の15A/G Pro 36 Pro; rs2286797）が、3,353人の罹患者対3,894人の対照で立証されると、相関は非常に有意になり、24.88のχ2値（P=0.00000061: 対立遺伝子頻度の比較）を示した（表２）。ボンフェローニ（Bonferroni）の補正後もなお、この結果は統計的に有意であった（Pc<0.05）。
【００８４】
【表２】
2008048627.tif 000003
【００８５】
この遺伝子座における他のSNPが心筋梗塞のリスクに寄与する可能性を調べるために、HapMapデータベース（http://www.hapmap.org）(The International HapMap Consortium (2003) The International HapMap Project. Nature. 426, 789-796)を検索し、ITIH3とITIH1(ITIH遺伝子ファミリーの他の一員)が同じハプロタイプブロックに含まれることを見出した。次に、24名の日本人由来のゲノムDNAの配列を再度決定することによって、ITIH1及びITIH3領域(反復配列を除く)のSNPを調査した。ITIH1遺伝子座には全部で31個のSNPと2個の欠失・挿入多型（DIP: deletion-insertion polymorphism）を同定し、ITIH3遺伝子座には19個のSNPを同定した（表３）。
【００８６】
【表３】
2008048627.tif 000004
【００８７】
次に、この領域内のより正確なハプロタイプ構造を調べるために、１０％より高いマイナー対立遺伝子頻度を有することに基づいて選択したこれらの多型のうちの38個について、94名の心筋梗塞患者と94名の健常者について遺伝子型を決定した。Haploviewソフトウエア（http://hapmap.org）を用いて、集団の９０％以上をカバーする４つの共通ハプロタイプを有する1個のハプロタイプブロックを同定した。３つのSNP（rs2710322、rs2239699、及びrs2286797）を、この遺伝子座（図１Ｂの矢印）を表すtagSNPとして選択した。次いで、ブロック中の２つの選択したtagSNP（rs2710322、及びrs2239699）の各々と心筋梗塞との相関を調べた。727名の心筋梗塞患者と550名の対照者の遺伝子型をこれらのSNP部位で比較し、tagSNPは何れも心筋梗塞と相関を示さないことが判明した（表４）。
【００８８】
【表４】
2008048627.tif 000005
【００８９】
4個の共通ハプロタイプの各々と心筋梗塞との相関を調べたが、心筋梗塞と統計的に有意な相関を示すハプロタイプはなかった（P＞0.01）(表５)。
【００９０】
【表５】
2008048627.tif 000006
【００９１】
ITIH1における1個のSNP（イントロン10  ５３６Ａ＞Ｃ；rs3774356）は、rs2286797 SNPと強い連鎖不平衡（ＬＤ）にあった（γ2＝０．９３）。
【００９２】
実施例２：ルシフェラーゼアッセイ
（方法）
ITIH3のイントロン1の642番目の塩基からイントロン3の 54番目の塩基までに相当するDNA断片を、ゲノムDNAをテンプレートとして用いるPCRによって増幅させ、pGL3プロモーターベクター (Promega社製)に5’−3’'方向にクローニングした。ジャーカット細胞とHepG2細胞（理研Cell Bankから入手、それぞれRCB0806およびRCB1681）を、それぞれRPMI1640培地およびダルベッコ（Dulbecco）改変イーグル培地（DMEM）にて10%ウシ胎児血清を補充して培養した。次いで、FuGeneトランスフェクション試薬（Roche社製）を使って、1μgの1種の構築物、およびトランスフェクション効率の内部標準として0.1μgのpRL-TKベクターで細胞（HeLa細胞とジャーカット細胞をそれぞれおよそ1 ( 105および3 ( 106細胞）をトランスフェクトした。24時間後に細胞を回収して、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ システム（Promega社製）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した (Ozaki,K. Nat. Genet. 32, 650-654 (2002))。
【００９３】
（結果）
実施例1で同定したSNPが転写活性に与える影響について調べた。ルシフェラーゼ遺伝子の下流にSNPを含むゲノム断片を使ってレポータープラスミドを構築し、ジャーカット細胞とHepG2細胞をそれぞれ用いてルシフェラーゼアッセイを行った。15Gを含むクローンは、15Aを含むクローンの場合と比較して、ジャーカット細胞において約１．６倍高い転写を活性を示し、HepG2細胞において約３．３倍高い転写活性を示した（図２Ａおよび図２Ｂ）。この結果は、このSNPがITIH3の転写レベルに影響を及ぼすことを示す。
【００９４】
実施例３：電気泳動移動度シフトアッセイ
（方法）
ジャーカット細胞由来の核抽出物を調製して、ジゴキシゲニンゲルシフトキット（Roche社製）を使ってジゴキシゲニン-11-ddUTPで標識した16オリゴヌクレオチド（ITIH3のエクソン２の８からイントロン３の２）の3タンデムコピーと一緒にこの抽出物をインキュベートした。比較研究のために、ジゴキシゲニン標識したオリゴヌクレオチドを添加する前に、核抽出物を未標識オリゴヌクレオチド（100倍過剰に）で予めインキュベートした。0.5 x Tris-Borate-EDTA buffer中の未変性7%ポリアクリルアミドゲル上で蛋白質DNA複合体を分離した。さらに、ゲルをニトロセルロース膜に移し、化学発光検出システム(chemiluminescent detection system)(Roche社製)を用いて使用説明書に従ってシグナルを検出した (Ozaki,K. Nat. Genet. 32, 650-654 (2002))。
【００９５】
（結果）
ITIH3遺伝子のエクソン２の１５番目の塩基におけるG/Aの遺伝子多型のゲノム配列に相当するオリゴヌクレオチドに結合する可能性がある核因子の存在を調べた。図２ｃに示す通り、それぞれG対立遺伝子またはA対立遺伝子に対応するレーンに特異的な２つのバンドが検出された。この結果により、異なる核因子が各対立遺伝子に結合し、この結果、２つの対立遺伝子において転写活性が異なることが示唆された。
【００９６】
実施例４：アテローム動脈硬化病変領域の免疫病理学的染色
（方法）
組織試料は選択的方向性冠動脈粥腫切除術によって心筋梗塞患者から取得した。免疫組織化学のプロトコルは、ヤギのポリクローナル抗ヒトITIH3 IgG（Santacruz社製）を用いて既報の通り実施した (Ozaki, K.  Nature. 429, 72-75. (2004);及びMinami, M. Artrioscler. Thromb.Vasc. Biol. 21, 1796-1800 (2001))。
【００９７】
（結果）
動脈硬化性プラークでITIH3が発現しているかどうかを調べるために、ヒト冠状動脈アテローム切除標本に対しITIH3抗体を用いて免疫病理学的染色を行った。図３に示す通り、ITIH3がマクロファージ、泡沫細胞および平滑筋細胞（SMC）で検出された。ほぼ全てのマクロファージと泡沫細胞が染色され、その中には脈管内膜でコレステロール結晶の周囲に凝集しているものもあった。血管壁深層の平滑筋細胞では、より強く染色された。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、ITIH1及びITIH3遺伝子座の多型マップ及びハプロタイプ構造を示す。Ａは、ITIH1及びITIH3におけるSNPとDIPのマップ、及び対LD係数（γ2）を示す。数値はMAFを示す。ヌクレオチド番号は、変異命名による（den Dunnen, J.T. Hum.Mutat. 15, 7-12 (2000)）。GenBank detabaseに登録された塩基対の番号はゲノム配列（NC_000003.10）に基づく。Ｂは、この領域のハプロタイプ及びtagSNPを示す。
【図２】図２は、ITIH3のSNP（エクソン2の15 G→A）の機能解析を示す。細胞（Ａはジャーカット細胞を示す。ＢはHepG2細胞を示す）を用いて、SNPによって影響を受ける転写調節活性を示す。＊は、スチューデントT検定でP<0.01を示す。実験は3重に行い、独立して4回繰り返した。Ｃは、ジャーカット細胞内における未知の核内因子のITIH3のエクソン2への結合を示す。実験は３回反復し、同じ結果を得た。
【図３】図３は、冠状動脈アテローム切除標本におけるITIH3タンパク質の発現を示す。Ａでは、血管内膜層の大半の血管平滑筋細胞および深層のマクロファージが染色されている（倍率：３７倍）。Ｂでは、活性化された平滑筋細胞が血管の表層（sorrow layer）で遊走し増殖している（倍率：７０倍）。Ｃでは、泡沫細胞がコレステロール結晶の周囲で凝集している（倍率：７０倍）。Ｄでは、中間層から内膜層へ遊走する平滑筋細胞は染色されているが、中間層の平滑筋細胞は染色されていない（倍率：５０倍）。
【配列表フリーテキスト】
【００９９】
[配列表]
SEQUENCE LISTING
<110> RIKEN
<120> Method for judging inflammatory diseases
<130> A61419A
<160>  2
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  14002
<212>  DNA
<213>  human
<400>  1
tcagcgatgg catttgcatg gtggccctgt ctcatcttgg ctctgctctc cagcttggca     60
gcctctggct tcccgagaag cccctttcgg ctgcttgggg tgagtctgcc ccctctttgc    120
catctgggtc ttggtgtgga atgggcagaa ggcatcatgc tgggcaaggc ctctgagtgg    180
agtgaagagg aggcagaggg ctgggcactg agctgctggg agtagtgtgg acactgggag    240
aaccgggctc cagctgaggc ctatgctaac ctgttgtcta accctgggaa ggctcttaaa    300
actccctggg cctcagcttc cccacctgtc aaaagagcaa tgcaccagga actgctcact    360
tcactgaggg gcaatgaagg ttcaagtctc aaacgagtgt gacctctaca aaatgctcag    420
ttgagccctg cggggtgtgg cgggggcagg ggtgctctgg aaggaggcct aaaggggcct    480
gggggccagg gaaaggcaga atgggagata gaatgaggtg gggcatgtag ggtgtgaaga    540
gagctctggg ttcagttccc cctgccctgc tctcctggta acctggatac ctgcccctct    600
ctggacctca gtttccccat ctattcagag tttttcctac tctgacatgt ggctctggag    660
ggtcctatgt ctgggggcca ctcaggtgtg tggggggcag ggcaccactg aacccctggt    720
ctcagcccag agcctcccag gccatgcggc cttggtgttg gccttggcct gattcctgtg    780
tttgtgtttg tttttgtttt ttcagaaacg gagcctcccr gaaggggtaa gaactttcac    840
cagggggtgg gaccgagtgg ggcagggcag gatggagctg gttccccaac tgctgaaggt    900
gtaggctata acagctgact cctcacagct ggcaaacagc ttacggccct ctgccctggc    960
agcctccaac agcgcaggac tcctgggaaa gagcaccaca gagtgacgac ccctccaacc   1020
tcgcaggatg tagcccaaga gggcccctca caggcatccc ttccttccgc agacacttcc   1080
ttagcacttg ctggtacctg gctctgtgaa gcggtccctg ccacaccctc acgaagcatc   1140
tttatatccc tagggggagg gggctggaac acctccctag agcctctcaa aattcaacac   1200
ccctattgga aagagggtgt ttggagactt cccttggcac aggaaatcag ttcctctttg   1260
ggagacagaa tgaggcaatt acctaaagac ccaggaggtg ggctgggctg tgtgcttgag   1320
ggagtgtgag gtgtggagga tgagcaggaa gagccagggg cagatgctcc agagccagtg   1380
tcccacgcat agctggagct cagggtgact ggacgggaaa gggcaagctc tcactggctg   1440
cagtggtgtg taaacggatc gcagaattaa ggaggcagga caagcatctg aataatggtg   1500
gccaccagaa catggagact ggagacgcca ccaagtcttc cagtgtagaa gacctggagg   1560
atgagggttg cgtgccgggc aggggcctca gagcctccaa gggtttgcaa gggaggtggc   1620
tgggttgcaa acctgcttct ccagtgtccc agtctggctg attctccacc cacctcccca   1680
aaggtggcca atggcatcga ggtctacagt accaaaatca actccaaggt gacctcccgt   1740
tttgctcaca atgttgtcac catgagagcc gtcaaccgtg cagacacggc caaggaggtt   1800
tcctttgatg tggagctgcc caagacggcc ttcatcacca acttcacctt gtgggtacca   1860
ccatggctgc tggctctggg ctcgggaaca gggggtctgg cccagtgtga tctccctacc   1920
cccaactctc tttccctgca ggaccatcga cggtgttacc taccctggga atgtcaagga   1980
gaaggaagtt gccaagaagc agtatgaaaa ggctgtgtcc cagggcaaga cggccggctt   2040
ggtcaagtaa gtatggactc ccaggccttg gggagaatgt ctgggatcca agggccttca   2100
gggctacaaa caacaacaac agctattatt attggtatag caaaatgtgc ccataatttt   2160
gccattatcc cacgttgagg ctgaggcaag tgaggctcag aatggttagg gatctccctc   2220
gccaaagggc tgggcctggg gccgagggcc gaggaagggt gggctcctgc agtctttgag   2280
ggagtcacca tctcgcaccc tggtcagggc ctctgggagg aagttggaga agttcacagt   2340
ctcggtcaac gtggctgcag gcagcaaagt caccttcgag ctaacctacg aggagctgct   2400
gaagaggcac aagggcaagt acgagatgta cctcaaggtc cagcctaagc aactggtcaa   2460
acactttgag gtaatcaacc gcccctgcag acctgggggg acggcagcgg ggtgcaggaa   2520
cccgcccatg gggcagtctc agacaggggt caaaaacaaa agttctgcct cacggcatcc   2580
cccatccttg gctgggaagg ctggaggaat tcaatggttc tggccaaaag catctggggc   2640
caaggggaag aggctgggat ggactccaca gatgcagatt cggtgctggg ccctcaagag   2700
caacaccagc aagtgcctct gtaaggcttc tcactgggca catgggcatt tttcctacct   2760
caaagctgaa agccaaagga aaagcatcag tggtggaatt tcgggcgcat atggcaggcg   2820
gtggtaacac ctcccgatca gcatactctc ctccaagccc ctgtggtcac tttcgcagtg   2880
ggagacacca ggcttggccc tcagcactgt cctagagggt ccctgcatca ccacagaccc   2940
atctcattcc cattggcctt gttctgggaa ctggcctctg aggtcactga gtgacatttc   3000
cttactttgg ccatttcaga tcgaggtaga catcttcgag cctcagggaa tcagcatgct   3060
ggatgctgag gcctctttca tcaccaacga cctcctggga agcgccctca ccaagtcctt   3120
ctcagggaaa aaggtgatgt agatgcctct cagacctggt ggggcagggg acaggaatac   3180
tgactccagc agaacaagcc tgcagcctag ggcttagctg ctgcaagcat gcatgtgttg   3240
gggtggggct ggggatcaat ctgcaactat caccttcctc cttgcccact ggggttggga   3300
gtgaggatgc tgagggcagg ggctgctgac aatgacctgc cagaggagcc atttacaaag   3360
cctggtcccg ttcccccttg ggaaatggac agggcagggc ttatcttccc tgttttacag   3420
gtcccgaggc tgaagcccaa gggagtcatt tagatctact gactccacaa tgagaggtga   3480
aagactaaag agaacttcat tcttggtgct aggtggttga ctccagtccc caaggctccc   3540
agctgttcca ggggccttaa tggcagtgga cagtgggtga ataaatgttt gtataaacaa   3600
caaaccaatc atccaggact tccagggcga ggcccgagga gcacacactc agaggactgc   3660
tggcttctgc agggccacat cctgccccgg gaccctcctc ctcccctttc tcctcctttc   3720
tccctcccct cctcttggca cccacacacc aacattccaa acctacaaga aattcctttt   3780
aatgggaagc taccccttcc ctaagtagct tctcagtgct gagctccaag gtagcctggg   3840
ctaatgggtg tgtgaggcca agaaaaaggg agctggaagc tgaatcagcc aaggcctgtg   3900
cccagccagg agccctgatc tccaagggga aaagcggtgc tcagaaaggc cggagcgtgg   3960
taaacagtgc cttccagtga gtcctgggag ctgcagagca cgccaccggc gggcagggct   4020
gcccaggcct ccagctcttg ctagcctctg ccctgccaag ggctcctccc tgtgaggctg   4080
cacctctgct ccctcagcta agggctgagg tctcccagtg ggcaggccct ggccgagctg   4140
agcaaggtct ttcatctcca tcccttaggg ccatgtgtcc ttcaagccca gcttagacca   4200
acagcgttca tgcccaacct gtacagactc cctcctcaat ggagatttca ctatcaccta   4260
tgacgtgaac agagaatctc ctggcaacgt gcaggtaccc gggctggctg attcatcatc   4320
agggtggggc gagggctggt cgggcggggg ctgcagctgg atctagtgcc atcaccctgg   4380
gtcctcagcc caaggctgtt ttcctgcagg atgtgggaca gctgatggcc tagagcctgg   4440
tgcagcaccc cctagagggt gggataggaa cgtctttttc ttgggctggt aaatgtctgg   4500
cttctacctg caagaatagt caatgtggtg ttgctaaaag gacaccggcc tccgtccctc   4560
tccccacttt ccagatagtc aatggctact tcgtgcactt ctttgcacct caaggccttc   4620
cagtggtgcc taagaacgtg gcctttgtga ttgacatcag cggctccatg gctggtcgga   4680
aattagagca ggtaatcagc accagtggca cagccagggc tcggggtagt agggggtgga   4740
agagattttt ttttttaact ggaaaaagct gatctttgtg gtgaatgagg agaaagggga   4800
caggataaga gaaggctcac ggcctctgcc cgcttctgtg gcaagcctca ggcagggctc   4860
gctggtgcag atggcgtggg ctgcaccgcc tgctgagctg agaagggacc tcactctctg   4920
ctgcggcttc tcccagctct ttgtctctcc tccagacaaa ggaggccctt ctcagaatcc   4980
tggaagatat gcaagaggaa gactatctga atttcatcct gttcagtgga gatgtgtcca   5040
catggaaaga gcacttagtc caggccacgc ccgagaacct ccaggaggcc aggacgtttg   5100
tgaagagcat ggaggataaa ggaagtaaga gcggagctgg agcccacaca cctcctagcg   5160
gtgcctccct ctgtccctga gcagcctgca acccccctct tagggactct gctggtctca   5220
ggccctcttc agatctgagc tggggtagag gtgggagtgg atggtcctca ggcttgaaga   5280
cagaatatcg gctgtcttct ccgtggtcca gggaaaccca ttctttctgt ttctaatcca   5340
tgatcctggt atctcacaag tcccagcaag ataaggccac agagaaccct tcttcttggc   5400
cctgtttcat atggaaaatg gcacgatgtc tacactgctc ccctctcctc ccagcaagag   5460
gtactgggag tccatccaac tctgccaaag ggctttcaca atcaccatgt gcttttcgtc   5520
ttcaccatgt gcctttcatc cccatttgaa agtggaagtt gtttgtttgt ttgttcatgt   5580
ggtggttcat tcattgtttg ctgagtacca ccatgggctg gcagataggg tccttgggca   5640
catgagtggg gccggctgtc ccggcctcct ccgctccagc ctgtctgcac actggcaccc   5700
tgaggacacc ctcccacggt gctgtctgtc tgtgtcccag tgaccaacat caatgacggg   5760
ctgctgaggg gcatcagtat gctgaacaag gcccgagagg agcacagaat cccagagagg   5820
agcacctcca ttgtcatcat gctgactgat ggggatgcca atgttggtga ggagcacggg   5880
catggttttg agctagggct ggagtgcttg gctgctgctc ctggctctgt agctggctca   5940
ttggaaaacc tggggcagct cttccctggg ttccctgtgg tctgggagcc cctcaagggc   6000
agggtcctgc ctccctctgc cagggctctc caccacctgc cccacaaggg ctcatggtcg   6060
tgactccagc aactctgcat gtgcaggagt ccggtctccc cagacagagc tggtctagac   6120
catccccagg gctggggctg gactgtgaac acccccttct ccaacaggtg agagcagacc   6180
cgaaaaaatc caagagaatg tgcggaatgc catcgggggc aagttcccct tgtataacct   6240
gggctttggc aacaatctga attataactt cctggagaac atggccctgg agaaccatgg   6300
gtttgcccgg cgcatttatg aggactctga tgccgatttg cagttgcagg tatgccttgt   6360
cttgcacact tccgggcata aggagctcac tacttcctca gacagctgct ccataaggtg   6420
acagttctag ttattaggaa gagcttcgtc ttgggtcaaa atccacctct gactatctct   6480
tacccatcag taaagattct gattttgtcc ttgggctaca caacaggccc gtttcttcaa   6540
caggattatc agagcaaaca caggacatct ggttcaatat gaatttctga taaataatga   6600
atttttgtag tgtaagtatg ccccaaatat tgcacaggac attgtattag tgtatggcgg   6660
ctgccatacc aaagtaccaa gtggcttcaa tgagagaaac gtattgtctc ccagttccag   6720
agcccggaca tcccagatcc atgtggcggt gggttggttc cttctgaggg ctatgagggc   6780
agatctttct aggcctcttt ccttttctcc atggcttatc aatggctgtc ttctccctgt   6840
gtctgcacat gtcttccctc tggatgtctg tgtccaactc cccttttaat aaggacatca   6900
atcatattgg attagggccc atactcatga ccttattttg tagaccctat caccaaataa   6960
ggttgaactt taggagtacg ctattcaacc cataacagac atacctacac taaaaaatta   7020
ttcattgttt atttgacctt caatgtagct gcacgtcctg tctttgcatt tgctgaatct   7080
agcaattttg ttccttctct aggcaggtaa tggcatctcc acctctgcag ggcgaccacc   7140
ccattccctc cctcctctgt ctccagatct ctgcactcct gtccacatca ctttatcatc   7200
tgcctctctt acttcctttt ctccttcttg ctttcattcc aacagacatt ccttaaatac   7260
tttctttgtg ctaagaactc tgtcctttca tatttctttt tttttttaat aggaaatact   7320
tctgaaactg tcctttctag tcttcctcgt gtctatctgg gagcagggag ttgccggggg   7380
gaggccccca cagactgaag gacgcagtca gggacaggca gagtgaacat taggagccat   7440
taggacgggc ccagccctgg ggcatggatg cccagctgca gcatcagtgg gagcctgacc   7500
tggggcttga gatgactggc cccgtgcgaa cttcagggct tctatgagga ggtggccaac   7560
ccactgctga cgggtgtgga gatggagtac cccgagaacg ctatcctgga cctcacccag   7620
aacacttacc agcacttcta cgatggctct gagatcgtgg tggccgggcg cctggtggac   7680
gaggacatga acagctttaa ggcagatgtg aagggccatg gggtgagtgg ggacagggcc   7740
tggaagtgtg ctggggatgg ggtatcagca gtggtagggc tctggcctca tgagggtcca   7800
ggagtggtgg cccctgaacc tgatccaccc aagcctccag ccccttgcct ccttctaccc   7860
ccaccctagg ccaccaacga cctgaccttc acagaggagg tggacatgaa ggagatggag   7920
aaggccctgc aggagcggga ctacatcttc gggaattaca ttgagcggct ctgggcctac   7980
ctcaccattg agcagctgct ggagaagcgg tgagcagagt cccagccccc acctgtgcct   8040
acccctggct gggctccaat gcaagggcac ccccatacgc agtcccagcg gtcctgccct   8100
cttcttgggc cagcccagga agtgtctgta gagcagtctg taaggaaccc caggccgcca   8160
ctccccatcc tgtcagcccc aaggctcaag ctggcaagtc ccctggccag cagcctggga   8220
gtgccccggg gtagggggga cttcagcacc ctgctgccca cactgggcat ggcccagggg   8280
tggtgaggct gagtggaact gaaggccggg atcccagccc tcagtgccca gagggcagag   8340
ctgagcccac tgagagggtc agtgttggtg tgggtgggat tagactgtga agccgttagt   8400
acacaatcta gcacatgctg agtgctctgc acatggacac cattgcgagt ggctgttgta   8460
gccccttatt ttatttattt atttatttat ttatttattt atttatttat tttattttat   8520
tattattatt tttttttttg agacggagtc tcgctctgtc gcccaggctg gagtgcagtg   8580
gcgggatctc ggctcactgc aagctccgcc tcccgggttc acgccattct cctgcctcag   8640
cctcccaagt agctggaatt acaggcatgc accaccatgc ctggctaatt tttgtatttt   8700
tagtagagat ggggtttcac catgttggcc aggctgatct cgaactcctg acctcaggtg   8760
attcacccgc cttggcctcc caaagtgctg ggattacagg cgtgagccac catgcccggc   8820
cggtccttac gttttatagg tggggaaacc aaggtccagc aaggaaacag ggcttgttca   8880
catgccccag ggagttgtga gccagtcttc tctgagccca actgggctgt accctggggg   8940
accccacaat ggggaaggtg gagtggggat ccccagctgt gtccactgct ccagtgcagg   9000
ggaagtgggc agggtgctgc tctccaggct gtcctcctga ctggcccctc ctcacagcaa   9060
gaacgcccat ggcgaggaga aggagaacct cacggcccgg gccctggacc tgtccctcaa   9120
gtatcacttt gtgactccac tgacctcaat ggtggtgacc aagcctgagg acaacgagga   9180
tgagagggcc attgccgaca agcctgggga aggtggggat agggatggag gccggaaccc   9240
ggaggcctcc tgtgctgggc accctacctg ggtgtccagt ggaggagtgg gccaggctgg   9300
ggagacccag acctgctgaa gtagggcatc tgaaggaaaa ctggccacgg gatggggaaa   9360
gtggggtgga gcgtgaagca gtcagcatgg acagtggggt gtggggtgaa taggagcctc   9420
tgcacctcta aagggaagtg agtaaagggg gcacactgcc catggggcat ttcaaggaaa   9480
aggactgagg ctgcagcatg gaagggctta gttagacaag aagaagcact tccaacatga   9540
aaggcctgga gcaggctatc aggcacctgg agattgttag gggaagagtc cctgagagct   9600
ggaggctggg accccctcaa ccagacccca gattgcccta ctcaacaggg ggtcccaaat   9660
gcccactgca actaggtaca gggtctgtgt gtggtggtgg aggattggca ttgggagaca   9720
tgggaggcaa agagctgggc ctggccaggc caggcctctg gcttccaaga actcctagtt   9780
ccaggggaca cccagtgggg gaagagctgg ctgctgggag gcccacagcc tagggctggt   9840
cggccaagca gccagctctg gtccctgctc acaagtgccc tatggcttct aatgcatttc   9900
tcttcttcct cccttgctgc acctgcagat gcagaaggta agcctttagc cagccaccgg   9960
gttgggcatt atggaaggga gacaagagag aactgaggag gcctttccaa gcaagatagg  10020
acccccagcc atgggggcac acttgggaca cctgggctca ggcccagccc tattgccaaa  10080
tcatgaacgt gcccctctct gagcctgagg atccctgtga gttaattggg ggtggcttcc  10140
cttgcccagg gagacacaat cagtatgaca gtatctatga cctgcaaaaa tgagcaattt  10200
agcatgtcag tcatttatac ttcattagtc ccatagcaac cctccaagag ggccctttta  10260
tgatccccat tttacaatgg ggaaattgag gcacgggggg ttaatttgct cagtctgttt  10320
gctcacagac tcagcagatg gccaagctgg tacttaggcc aaggcagtct ggccccaatg  10380
cccatgctgg gaattgctgg ggatcacagt cctctgtgcc tctctcacca caaaactgga  10440
acctcacaaa ctccctgcca ctaggcaggg cctccccagc ccctactggc ctgccccacc  10500
tccatttgga ctggcacatt tggactgggc catcacattc ccctcagaac agccctgata  10560
aatgtaccgg tgcatgtgag tacatatatg catgtgcacg catatgtgtg cgcctgtgtg  10620
cacgtgtggg tgggtgttta ctatcaagaa gcaacagaca gccgtgagcc tcactcaccc  10680
caactagggg gtgggaagcc caggggtggg gcagatgttt gctgtgagca ttactcaaga  10740
gagagaagat gacttaatgg cttgcatttc agccacatca aaaagccctg cgccaacgtt  10800
aaaatcacat cccattgcca ccagccccat aaagggcttc cctggacgtg cccgatttcc  10860
aaagcctaat ctttgtagtc acatctccac ctctatctgc cagtgttggg gcccctctgg  10920
ggcccagcag cgctaagaca ggaggaaggc acggggctgg gggagaagga acccctagac  10980
cctgctcacc actgcccttc ggcttttcag ccacaccggt gagccccgcc atgtcctacc  11040
tgagtgagta catgctggca gctgccactc ctcccactgc ttagagcctg cccctgccac  11100
atgtccctcc accgtggcta ctcactcagc tctccgggat gggcagatgg acaatgtgcc  11160
ctgaggagat tgcggggtgg gagggcaatg gcattagcga gcgggaaggg gaggggaggg  11220
gcataagctg aactcctatg ggggtcgtcg ggcgcctccc agggccactt gcttagctca  11280
gccctctctc cctttgtatc tgcagccagc taccagcctc ctcaaaaccc ctactactat  11340
ggtgagtccc tggctgctcc tcgggaaggc tcaggggcct gggcacgtgc tcctgcctgt  11400
ctcggagtcg agcccatgga ggccagaagg ctgggggagg ccccaggtat gatgagaggc  11460
cccgggagtc agctccttct ctaatgtgtc accagtggac ggggatcccc acttcatcat  11520
ccaaattccg gagaaagacg atgccctctg cttcaacatc gatgaagccc caggcacagt  11580
gctgcgcctt attcaggatg cagtcacagg tgaggcttgt gggctagggc cggggccagg  11640
gggctcttcc tgggagggct tgggtccccc gaggtaggca cagggaacag gttctcactc  11700
tgcccagtaa ggcatcatct tcacatgcaa agaaacccct gggggtgggg agtgcccagg  11760
gccacaggct tgctcagccc cacatgccag tgctattggg agatgattag cgtgaatgga  11820
ccacctgggc ctagggtagg acccagcctg tgtctgggga atagcttttc tctgaacaac  11880
actccctggc ccaggcaagt ggcagaccca taaggtccca gcatgaccca aacctagagt  11940
gtctaggaac caacaggctt gggctctgaa gtcctggtct ctcttgtggc ccccgctctg  12000
ctgcccctca gccagtctgg ttgaagagga aggcacaccc ctaaaggcaa tctggactca  12060
gaagttctcg ctggtctctc tccctgcccc atccctctgg caggcctcac agttaatggg  12120
cagatcactg gcgacaagag aggcagccct gactccaaga ccagaaagac ttactttgga  12180
aaactgggca tcgccaatgc tcagatggac ttccaggtgg aggtgacaac ggagaagatc  12240
accctgtgga acagggccgt gccgagcact ttcagctggc tggacacagt cacagtcacg  12300
caggatgggt aagctcccct acaaggtctc caaggtggac tacagggtga gagtctaagg  12360
aggctcttga gggatttaga aaaatcccag gacaggagat ccatgggggt cacaggaaag  12420
atcagagacc ccagaatcca gtctcctgtc acaggggagg gtgaccatag tggcccccaa  12480
ccaaaccctg gggccctatc agagccagaa ttggtagctg cacagttcag ctggttgggt  12540
gaaggcatta ggtgataatg gcccccattt gcctcttctg tggctgctct tgtcttctta  12600
gctctcctgt cttcagatcc cccagagcct cccactgagg ctcagagaag gtgtggagcc  12660
tgcccaatgt cactcaggaa gtcagtggct tagctgaggc tggaccacag gcctccagat  12720
tcataggcca gccctctctt tcccacttat agacactcaa ggatccactc acgggagggg  12780
agacagtgtg catgaggcat cctctttcca acgcccctga gatagtttct ggagtctgtg  12840
ggccctcggg tgccatgtac aggggaggcc ccaccaaaac gcccttgagt cagatgccca  12900
gtgtcacggc cactgggccc cacagccact ttctggcttc ctctcgtagg ctgtccatga  12960
tgatcaacag gaagaacatg gtggtctcct ttggagatgg ggttaccttc gtggtcgtcc  13020
tacaccaggt gtggaagaaa catcctgtcc accgtgactt tctaggcttc tacgtggtgg  13080
acagtcaccg gatgtcagca cagacgcatg ggctgctggg tacgaagtgt tcagactgca  13140
ggctgttcag gcctgagagc agcatgggaa agacatacac aaggccttcc taggcaccct  13200
gtacccagct cacaacaccc cattcagcct ttgcatcaac cctgaaaggc cagtggccac  13260
gttacccgtg gcaatggcca ggggctgaca gcatgaatat ttttcttccc agggcaattc  13320
ttccaaccct ttgactttaa agtgtctgac atccggccag gctctgaccc cacaaagcca  13380
gatgccacat tggtggtgaa gaaccatcag ctgattgtca ccaggtgagg agacttctcc  13440
cacaccctca cctgctcagc aacgagagga ggaaagagca cctgcagccc aggcacatta  13500
gtctggtggg cttttgtctt ctgtggggta cccttgtttc cctttgaggt cttggcccct  13560
cccaggctct tgctaatcaa gaaaaagccc aaacttggct tcctcgaaag agtaatcatg  13620
taacttcatt cttgaccaaa gaattctggg ctgttagaat tgccaacttc ccaccctttt  13680
tcaatctcag gtccgctagc ctagcagcca tcttacccac cccgtgtatt gcagcatctc  13740
tcttctttcc ccaggggctc ccagaaagac tacagaaagg atgccagcat cggcacgaag  13800
gttgtctgct ggttcgtcca caacaacgga gaagggctga ttgatggtgt ccacactgac  13860
tacattgtcc ccaacctgtt ttgagtagac acaccagctc ctgttgggat ggatggcccg  13920
gattttatgg catctggaac atgggcacag agaggggcct gtgggagggg ctgggaaaat  13980
aaagtccaag gtcgagacca ga                                           14002
<210>  2
<211>  14471
<212>  DNA
<213>  human
<400>  2
acagggcagc aggagcctta gagcatggac ggtgccatgg ggcctcgggg gctgctgttg     60
tgcatgtacc tggtatctct cctcatcctg caggccatgc ctgccctggg ctcggctaca    120
ggcaggtcca agagcagcga ggtatatggc taagcccaca gggcagaaat aggcagctga    180
acctggatga ggccccgggc gggacacaag acccccattc aaggggccag ggtcaccccc    240
accacctcca ccacttctga gtggagaggt gacctcccag caccaccaag gaggtgaagc    300
taaggggcag aggacacagg ctgtgttcca ctcccatccc tgaactggca ggccggtggt    360
cccctgagtt ttcctctcac acttgaccct gattttgttt tgcagaagcg acaggctgtg    420
gacaccgtga gtaagagtcc tggcaaaggg gtctgtgaca gagccctttt tacaggcttg    480
ctttccccaa cctgtcaggg gtggacccct ctatcagggc cataggcatg gggtactctc    540
cagggtccta gaaatgggga cttgttccca tctcacctca tatcccacag cacggtctca    600
gccagagagc aggggtcttc ctgcggtctg ttcttcctgc atctgggcac catgcactgg    660
ggctaagtgc caagtccccg taccacagga agtccctcgc tgacagaggc cctgtctcag    720
gccacagctc cttcatgtct cactttaggc tgtcgatggc gtgttcatcc ggagtttgaa    780
agtcaactgc aaagtcacct ctcgcttcgc ccactatgtt gtcaccagcc aagtggtcaa    840
cactgccaat gaagccaggg aagtggcctt cgacctggaa atccccaaga cagcattcat    900
cagtgacttt gccgtgtgcg tgcctgccca actcccatgc cttctcccag gggtgccgct    960
tactagtccc agcttaagaa caaggatcgg agtggccaga taacgcagag catctcctca   1020
ttctagaagg gccacagacc agccctggct ttgaggggag gaagaagccc tttaggtctg   1080
tgcttggctc ccatcttgga ggcaaactgg gacccatcac agcatgtttc aggctagaac   1140
ccaaggagcc aaggccagag tctgaggctt cttgctggcc tctgacctgg gctgctcacc   1200
tcattgccca tggacccctg agttccacca tgggcagtgg aaggctcgtc aggagacgtc   1260
cttatccaag ggctcacatg gacaggccct ctcaggacct gtgtggtcag gaggctcatc   1320
tttcctgagg gtgtccttcc ctccctgcag tacagcagat ggaaacgcat ttatcggaga   1380
cataaaggac aaggtgactg catggaagca gtaccggaaa gcagctatct caggagagaa   1440
tgccggcctt gtcaggtgag ttctgggcct gctggtctca tctctagggc tgccctcccc   1500
agccaggaca ggtctgatgg ctgcaaggtg gctttagtgg agaacagccc aggatgatgg   1560
aagggtaagc aaactgccca aacccagatg ccagcacggt gcactgaaca ggctgccgtg   1620
cagttgccct tttcccagat atgccactgg gagaagtggg cccccgccat cttgggccct   1680
gaccctgacc agccagctaa cacatttgtg aggtccaggg aaacctggga gcaacactca   1740
tctaagagaa ataaattctg tgggccacat gttaggtgac aaggacccaa atgtcattta   1800
ccctctgtct gtctgctgtt gcctctggtg gcacatccag ggcctcgggg agaactatgg   1860
agcaattcac catccacctc accgtcaatc cccagagcaa ggtcacgttt cagctgactt   1920
atgaggaagt gctgaagaga aaccatatgc agtatgaaat tgtcatcaaa gtcaagccca   1980
agcagctggt gcatcatttt gaggtagatc acaggtcccg gggcaggggt cctgcccctc   2040
tctccgtcac catggctccc aacactggtt gagcacccac catgtgtcac cacccaggcc   2100
tgagaacaca gggatgggga ctaacccctc agggtgagct ctgatgtgct cttcttgggc   2160
agggaactcc ctgaattctc taacttcctc tttatctctg agcttcggtt tgctcatctg   2220
ctagacgggg ggtttctgtg agtcccagga ccgccacagg gatcacgaga agtactgaat   2280
gtccaggtaa ttttgtaaac tagaaagtcc cgcgcagcct gagggcctgg aattattgct   2340
ggcacctaag tggtggctga gttgagggat gcaggcatgt acaccttcat ttggtcagta   2400
tttttggagt gcctactgag taccaggccc tgtgatcagg gctgggtggg tgctgcacac   2460
agtaggtggc caggacacat gctggctctt ggctgagact tggtgagtgg gagccctggt   2520
agagaatttg cttcagtgtg gtgtgagcct ataatcccag ctacgtggga ggctgaggca   2580
ggaggacggc ttgagcccag gagtttgagg ccagcctggg caacaaagca agatcccatc   2640
ttttttttta aaaaaataat ttgcttcaat gttgcagatt gatgtggaca tcttcgagcc   2700
ccaggggatc agcaagctgg atgcccaggc ctctttcctg ccgaaggaac tggcagccca   2760
aactatcaag aagtccttct caggaaaaaa ggtacatggg atagcaaggg ggtggtggtg   2820
ggccctttgg agacttctca gcctgcccac cccttatgga atgtccagcc ttagcccaga   2880
aaccaggcag gggctgtggt ctgccctcag gatgagagaa gctggtgtca tgtgattggt   2940
gcctaggaga actcagctat cctggttctc agagcaattt agcaaaagcc tgcatgctga   3000
ggtggggaag gagccagctc cagctccacc acacacgggc tgcatggtcc agggtgagtt   3060
gctggcttgc ttgagcctca gtgccctctt tgcccgcctc acgcccatgg gagagcattc   3120
agggaaatat ccagcacata agtaaacctc atatgctggt gtggttagga ctccaagctt   3180
caggtttctt ggaaacataa gtttggaaag acctttggcc tacccaacga cttgtcgctt   3240
gccactattt gcaggaatcc cagaagcccc tggctcaccc ccaccccagg ttcctggagg   3300
agtgtggtgt atggatgggc aatgccctgc ttcctgactt gcccccaacc cgagccagga   3360
acaaatcctt tagttcccac ttatgtagag cctgcaccac aattcattta aaagaagtgc   3420
ttcttacagt ttagaggggt ttccttttaa actaaatatg acacctcaag agtgttagca   3480
aacatgcttg ctttctgtgg gggaacaaag ggatgggtcc ttgtcttccc aagacttttt   3540
caaggttcta ttttatcctc catcctttct ctcctcttcc tcctcctcct tcacctcctc   3600
ctcttctttt tttttttttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct   3660
tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcctctt cttcttcttc tgcttcttct   3720
tctccttctc cttcttcttc ttctatcttc tcttcttctt cctcttcttt tctgctgctt   3780
cttcttcctt ttgcttctgc ttctttttga tgagcctacc ttacttttat aacaaacaaa   3840
aatttcttta tagaaaaata tatgaagtcc aggaatatag aaagtattga ataaaaacca   3900
tcactagctt ccccaagcac atcaccaact ccaaccagac ctcagcttcc attctgcacc   3960
cttccttcca gtctttgttc tttgtcaacc tgggcagctt ttatttctca ccacagtatt   4020
gtagtgctgc tttttcactc aacagtttga gttgtcagat gtatcacatt gctattattt   4080
tgttattatt tatataccca aagtgatgat gttcattgta gaaaatccca atgattcaga   4140
agcatataag caagggaatg ggtcatctct cccaccacct acaggtgtgt gctctcagca   4200
gctaggtgag tgagtggccc accgaactcg tttctctgtc cgtgcaaaca cacacacaca   4260
cacacgcatg ccttcttatg ttgtctttgc aaacatcttg tttgtggtta cacagaccag   4320
taatggctca cactctcgac ggttccaggg tcatgtgctg ttccgtccca ccgtgagcca   4380
gcagcagtcc tgccccacat gctctacatc cttactgaac gggcacttca aggtgaccta   4440
cgatgtcagt cgagacaaga tctgcgacct cctggtgagc cctgagcttc tggctcagca   4500
cccagaggat gggcaagggg tgctgtgaga gtggcctcac tcgttctcct ctatttcagg   4560
tggccaataa ccactttgcc cacttctttg ccccccaaaa cctgacaaac atgaacaaga   4620
acgtggtttt tgtgattgac atcagtggct ccatgagagg ccagaaagtg aagcaggtag   4680
gctgcagctt gaaacagctc acccagcaga agcttccaca gccccatcac tcaccacatg   4740
ccagttttgc tgccagagtc tggtttggga tttatcctcc tggtcagagg cagagtgatt   4800
taacaggaaa tcccagtggt tagcatctct ggaatcagca tcgcttcctc actgtgcagt   4860
cgtgaggaag tgcattcacc tctcctcaat ggcaaaaaat gggaatgaca atggtgtctg   4920
cagggtcatg gagttacccc ctgggggaag tgcttagaag aggaaacctg tgcactacaa   4980
ttacggtggt ccgtggggag gcatcttata gcagggaata gctctccgcc cacagggttt   5040
ggagtgccct gtccatggtg cagtgtagac atggctggac aaggagtatt ctagaagcac   5100
agctcctggg gtcctttctc ttaatcctgc ccctcccgaa ctcctgatta tttcttttcc   5160
ccatggtggg ttcctttgcc ttctccacct ccctcatcca ccccaaggcc cggcaggatg   5220
ctcctgtctc ggggccacct ggttgtccta tctcctcctg cttgtccacc ctgtggatct   5280
ctgaaatggg tatttggagt tggaaggtgc tgtcctgggg ccaccctggg gccctgtctg   5340
tctactgact gttctgtcct tgcagaccaa ggaggcactc cttaaaattc tgggggacat   5400
gcagccaggg gactactttg acctggttct ttttgggact cgagtacaat cgtggaaggg   5460
ctcgctggtg caagcatctg aggccaacct acaagcagct caagactttg tgcggggctt   5520
ttccctggat gagggtaagg gtgggggtct caggcaacct tgatgtcacc tctgtcccct   5580
cagaatgagg gcatacactg gtctgctttc tcttccttgc agccacaaac ctgaatggag   5640
gtttgctccg gggaattgag atcttgaacc aagttcagga aagcctccca gaactcagca   5700
accatgcctc aatactcatc atgttgacag atggcgatcc cacagagggt aagcaccttg   5760
ggggctgcct tgggaggtag tgatctcctt gtcacccgag acatgcaagc tgaagttgga   5820
aacccaacca ttggagatgc catcaggggg cagaaaagct cagggcaaaa tcaagcactg   5880
gtctaaaaac acagctcaga ccacaaagtc tgagggagct ctatggtgta cctctgtcct   5940
gtgagttgag aaattggaga tgtttctaaa tgacacaggt ctgtatgagt ccctggaaga   6000
tgggcaagat tccatgcttc tgttcacagt ttaatgaact atttatttat cacctactgt   6060
atgctaagca aggggctagg gactgaaata ccaagggaac aagacatatt tctgccctca   6120
aagagcccgg gacctactgg gggaagcaga tccaggagta gatactgagg gccctgaaag   6180
aacagggtgc ttgaggctgt ggaaccatag acaaaggaca cctgacccag ggggatgtcc   6240
gggaaggcct cctggaggag gtgactcctg agctcagtct agamagaggg gagagtggca   6300
ggaagggatc ccaggcagaa gaggcagctt aagtcataaa aagggtgtgt gcactggcag   6360
ggcctgcccg ggaactgtgg gcatgtgcag aatggggtaa aacaagcgtg ggaaggtcag   6420
cagggtctcg cagtccatgg caaaggagcc atggcaggat ttcgagcaga atcagacctg   6480
ctggtgatgg acccacctag atgggcgggg tctgtgagga gctgttgata gctgctgcag   6540
tctcccagga gagccaggag gacgcgatgc ctcaggatgc ccaggagcct ggagatgctc   6600
tgagatggaa ggcttgagcc ccagggagtg ttccccagag ccccctcgtg ccccacatgc   6660
ctgtgggcca gcatcccgtc actacccagg tgtgtggctt gcaggggtga cggaccgttc   6720
ccaaatcctc aagaacgtcc gcaacgccat ccggggcagg ttcccgctct acaacctggg   6780
tttcggccac aatgtggact ttaactttct ggaggtcatg tccatggaga acaacggacg   6840
ggcccagaga atctacgagg accatgatgc cacccagcag ctgcaggtct cccctcacaa   6900
ccccctgtac ctccaatggc atgccatagg gagccctgcc ttggtggccg tttgcccatc   6960
agcctagagg agcagataaa gctctggcat agagttcaaa tcagctgcat gggccaggca   7020
tggtggctca agcctgtaat cccagcactt tgggaggcca aggtgggtgg atcgggagtt   7080
cgagaccagc ctggccaaca tggtgaaacc ccgtctctac tgaagataca aaaattagcc   7140
aggtgtggtg gtggatgcct gtaatctcag ctacctggga ggctgaggca ggagaatcac   7200
ttgagcccag gaggtggagg ttgcaatgag ctgagattgt gccactgcac tccagcctgg   7260
gcaacacagt gagactctgt ctcagaaaaa aaaaaaaaaa tcagcagcat gacctcgagc   7320
cagctacttg acctctcgga ccctcaaatt ccttctctaa cttgggaatt cccaacactc   7380
cactttgtgg gcaggcttcc cattaggagc ccagggtgct cagctctaag gctgcaacct   7440
ctatccctgc agggtttcta cagccaggta gccaaacccc tgctggtgga tgtggatttg   7500
cagtaccccc aggatgctgt cttggccctg acccagaacc accataaaca gtactacgaa   7560
ggctcagaga ttgtggtggc cgggcgcatt gctgacaaca aacagagcag cttcaaggct   7620
gatgtgcagg cccatggggt aaatggtggg ccatggaggg tggagaggcc aggcagcacc   7680
ctagaggctc caaacccaca ctgttcccca ttcctgccat cccccagagg cctctctttc   7740
cccagagtag taccctcatc cccaccatgc cacatacacc ccaggcctga acatccctcc   7800
acacaggcat cctgggggct ggattggctg gaatggggcc aatatggcct ttatcagttg   7860
cagtccctcg gcccccagtg accaattgtt atttttcgca tcattcatcc caaggtgcaa   7920
gagagcaaga gaccaacctc tcccttctca tttgataacc atttcctgaa cacctactgt   7980
gtgccaggct ttgtgccatg gtgcagtgca tgcatgtatg tgcacctgtg tgtggtgggg   8040
acaggcatgt gagacctgga tcctgccctc caggacacag acaacgccct aagtgtggtc   8100
gaaggttcag aactcaggct ttgagtaagg agagttgagc tggaccttgg ctccatcctg   8160
accagctggg catccttggg caaggggtcc agttccctag gcctcagttt ccttttctgt   8220
accatactgc atcagagcat tgtgtggagt aaatggaata atccatataa tacccttagg   8280
cagcagctgg tgcataggat gcccttggga agtggtgccc cggttaatgt agctggatgg   8340
aggaggcaca tttgtgtgcc gtggcaagtt gaatggtgca gcccacctag aatttggtgg   8400
gcatttggag tgggtcatag tggaaacagc cgggtgctta ttggcctccc ctagagaaac   8460
tccacaaggc agggcctggt tctcccattc catgggatcc ctagggtcca ggccaagcct   8520
ggcttgcaga gggtgcttgg caagaatcaa cgaataggat gaggcgaaca ggctcaggga   8580
agcaggtgat gctgaggacg aagctgcaga taccagacga aatgggcccc tcagagcccc   8640
tagcaccagc caggggccgt gcttatcatg gtgcaccacc cctctctgta cctcaactct   8700
caggagggac aagaattcag tataacctgc ctagtggatg aggaggagat gaagaaactg   8760
ctccgagagc gtggccacat gctggagaac cacgtcgagc gcctctgggc ctacctcacc   8820
atccaggagc tgctggccaa gcggtagggc acctgcagct gccccaggtg ggcactgccc   8880
accccagagt ccccccaccc cttggaggtg agcagaggag gggtggttct ggggcaagta   8940
ggtcagattt actttcctct tctgctttgc tcactgagtt aatatcaacc agtcagtcaa   9000
cagtccgggc aggcccacca gggcacaagg cagcctgcta tttacccaca ctcagcacac   9060
agaggctcag cgaggttaga cctcttgacc cagatctcac agctgttaac gtctctgcgt   9120
atctctgagg catgcccctc aaccccaccg aatctccaag tgatctctgt aagagatcat   9180
taaacctgga ggcccctgag gatgtagcca ctgcatagga caccatgggg gcttaatact   9240
tatgtgtcga atgaatgaat gaatgaatga atgaatgaat aagtgaatgg ataggtgaaa   9300
ggatgagggc cgtgcaagtc ggggcttgga gccagcctct gtcttgaatg caggatgaag   9360
gtggacaggg aggagagggc caacctgtca tcccaggccc tgcagatgtc gctggactat   9420
gggtttgtga ccccactgac ctccatgagc atcaggggca tggcggacca ggacggcctg   9480
aagcccacca tcgacaagcc ctcagagggt ataggctgca ggggtctaca gaagggagag   9540
gccatgggcc aaaaacctct ggggctctaa ttattttctc tttctctccc ttccagattc   9600
tccgcctttg ggtgagtttt aaattgcatt agtttcagtt ctgggcttcg gtagctgggc   9660
aggtggcagg tgctccagcc ccaggctcgc agctccccat ccccattctt ccctgactcc   9720
actccttccc gttcttccgt cccctgagcc gcccttctcc acatcaccgc gaactccctg   9780
ctgcgctttg tgagcttttg tgcaggctga acccccagca gcctccactg gtcccctctt   9840
ggtgtgagtg tatgtctgtg aggaggcagg accccagggg agggctgaga cccccagagg   9900
gacggctggg cccaggcctg ttgtggacag agctgcatgc ctttcgtgtg gggcaccgtg   9960
ggtgacactg tcttcgataa tatgtccttg tcttctacag agatgctggg acccagaagg  10020
agtaagtggc agccatcctg gccattcaca tctctacccc tccttgatga tcaccccgtt  10080
ggctttcttc ctccgttcta gctgtcttca ctgcttgtca ctgggaatct ttagaacaga  10140
cctctgaaca gcctggcctc cccagcctga ggtccctggg ggaggagaca gagagggggc  10200
cagctaaaca tgccaggcca agcttctgtc cccgtgtccc gggagccaat caagggcatg  10260
tgatgttgag tggacatccc tgcttggtgg cctcaggcca gccccaccag tgaggaaaga  10320
gtcatcagag ggatcagcag ctccagggaa ggcctggctg ccccgcttct aaatgccact  10380
ccccctccca tcagcgttcg tgctgtcagc cttgcagcct tctcctactc attccagctc  10440
caatacccag cggctgccag accgagtgac cggcggtgag tccttggaag ggtctgaggg  10500
acacccctgt ttgggaccca ccctatctgg ctgtctctct ctctctgtct ctctctggga  10560
cctgcctagc tgaaccccaa cccctggcca gccccatctg cccgatgtcc aatctaacga  10620
attccatgct gtgcccccag tggacacaga ccctcacttc atcatccacg tgccccagaa  10680
agaggacacc ctgtgcttca acatcaatga ggagcctggt gttatcctga gcctggtaca  10740
ggaccccaac acaggtatgg cgggcatcac acctctgcca gacagggcca gggctcctct  10800
gccctcaaca ttcagccagg aacaggacta tggccaaggc cctcactgcc ctctgcctgg  10860
gcaccatcca cctggctggg ctctgcccgc tgccttccca cgccatcctc ctggctgcac  10920
ctacacaggg ccagctttat cagcatgtga ctggggtagg cacacagggg cttttttttt  10980
tttttctgag acagagtctt gctctgttgc ccaggctgga gtacagtggc gttatctcag  11040
ctcactgcaa cctctgcctc ctgggttcaa gtgattctcc tgcctcagcc tcccaagtag  11100
ctgggactac aggcgcatgc caccatgact ggtttatttt tgtattttta gtagagatgg  11160
ggtttcacca tgttggcctg gttggtctca aactcctgac ctcaggtgat ccgtccacct  11220
cggcctccca aagtgctggg attacaggtg tgagccaccg tgcccagcca gtttaatgct  11280
cttccgttgc cgccttgaaa cccttaacac tttctaaaca aggggccctt cctttttatt  11340
tcatactagg tcctgcaaat atgtcacagt cctgccccac cttccccatg aagcatggct  11400
gagcagagca cctctctccc agcagtgcct tggttatggg gaacagctcc ctctccttct  11460
ctcacccctg ctccctcctg tctccttccc tccctgtcca gttagtccat ctgcaagtgt  11520
ttgttgtgca ccaacgaggg gctgggaatg cagtgggagc caagatagtc ccgctttcat  11580
agagtttagg gaaggggaag acaaacaggt gaacattctg agatgatcat ttcagagcat  11640
gagacgtgct gggttggcag cgtgagggtg ggaagggggc tttgtggctg cccaggtcag  11700
cggagacctc tgtgaagagg tcccacaatg catttccagc acaatgggag cctgtccctg  11760
tgtgaggggc tggggccaca gagaaggagc aggctaggtc ctgttctcgg ggaggcacga  11820
cctccgttag gacccagaac tgagagctga gtatgggata tttggcatgg caggaggggt  11880
ggagaggaag gagaggtggt gctgtgtgcg ggaccagacc tggagaccct gaggcaggag  11940
actctcaaag acagagtggc acaggcaggg cgtagaggcc tcttaggaag gaggcatgat  12000
cctgctaagc aaaggcaggc aggccccttc ccaacccgga tgccctcttg ctccattgca  12060
ggcttctcag tgaatggaca gctcattggc aacaaggcca ggagccctgg gcagcatgac  12120
ggcacgtact tcgggcggct gggaatcgca aaccctgcca cggactttca gttggaagtg  12180
actcctcaga acattacgct gaaccccggc tttggtgggc ctgtgttttc ctggagggac  12240
caagctgtgc tgcggcagga cgggtaacct gccagggcct gggcaagatg cagggggagg  12300
tgtggcctgg gcccaggact ctgctgagtc tgcagggccc tcgtccctga gccatgtctg  12360
tgggtgacac ccatgtggcc tgtgcagaca tgtcagactc catggcccac ccagccctcc  12420
atttcccttg gttactggat atgtcctctg ggcccagctg catggcaact gtgctcccac  12480
cgcaccttag ctctgaatgc cacccctgtc tctaccaaac aaagccagct catcctccca  12540
ggcccagcaa agaggccacc tcttcccctc agccctcctg ctctcttcct ctgctgaact  12600
ccagatttct ctgggcttct catttggcat gtcttagtct gcattgtctc atgacttttc  12660
cttcctttac taattcgttc attcattcat tcattcattc aacaaactgt gccaagcacc  12720
agagcaatgc tgggcagcag agctatagga agaggtgggg agagtctgct gtggaggtca  12780
caggtgatga gtgggagtca cagaacacgg actctgatat tagacagcct gaagtccaag  12840
tcctggctcc actgcttacc agctgtgcta ccttgggcaa gttacttaac ctctctgagc  12900
ctgggacttc acaggctcgg agtgaggatt gaatgatgca gtttgcacag agggcttagc  12960
acaggacctg gcacattgca agggccccaa gcaacatgtg gggaggggcg tggaacaggt  13020
aacagccggc catctgggga tgaaggccat ggggtggggg cgtggtcata agggttgggt  13080
cccagatgac aagggcagct gaatggagag ggatgcagtg cagccgcacc tgccctctcg  13140
gccacctggc tctgcagggt ggtggtgacc atcaacaaga agaggaacct ggtggtgtct  13200
gtggacgacg gtggcacctt tgaggttgtt ttgcaccgag tgtggaaggg gagctcggtc  13260
caccaggact tcctgggctt ctatgtgctg gacagtcatc ggatgtcagc ccggacgcac  13320
gggctgctgg gtacggctgg ccaggctggc agggctgtgg ggaagggtgt tgaagccaga  13380
ggacatgtgg gacctggggc caccggtcag ttctatagct gggcaccagg acaggcccac  13440
ctccagtgtg gcctccaagg agcagagccg tctgaggggc tgtgttggtg aggctgtgag  13500
caaacacaca gtgaaacaaa cgcttaagcg agcctgggag caagtgaggg gcagaggtct  13560
gatcgcaaaa agaaaggccc agagggttcc caggaacctt gtgagtaggg tgggtcactg  13620
accacactgc tcctgtgtgg cctttctaca gacactgctc tctatgggca cctgccctca  13680
aacctctctc cccagacaga tcccgtttta aaagacagga ggtaggacca cctagaaatg  13740
tatctacttc tctatagcaa gtgaaccaaa ggtagctttt catgctggga ctgttagcag  13800
aaacagtcaa gccctggaaa aaaagcggtc cagcaatgct ctaaccccgc agtgagcacc  13860
tgctgagtgc agggcaggag caagtccccg agatggtaac cgctgtctcc aatgtgcctt  13920
tctagggcaa tttttccacc ccatcggttt tgaagtgtct gacatccacc caggctctga  13980
ccccacaaag ccagatgcca cgatggtggt gaggaaccgc cggctcacgg tcaccaggtg  14040
ggtgggctgc ttgcccagca cgtctgccct cggccacttt gtagttcttc caggtcttcc  14100
tccaggtgtc acatgggtgg ggtgagcttc ctggggaggt gctgccctac tggtccgaag  14160
ggtgacccca gctgacttgt ctctgcacag gggtttgcaa aaagactaca gcaaggaccc  14220
gtggcatggg gccgaggtgt cctgctggtt cattcacaac aatggggctg gactcatcga  14280
tggtgcctac actgattata tcgtccccga catcttctga gccctctggc cagcacgcct  14340
gtcctccccc ggggccaagg cagaggagga ggacgacatc ctgacctgct gctgaggctg  14400
tacctccttg actaagctgg ttccttgtgt caaagcacct catgccttcc attaaagaga  14460
ggccgtgtcc a                                                       14471
【図１】
2008048627.tif 000007
【図２】
2008048627.tif 000008
【図３】
2008048627.tif 000009