(57)【要約】【課題】抗原特異的Ｔ細胞の免疫寛容を誘導するための有効な手段の提供。【解決手段】細胞表面に抗原を結合してなる細胞のアポトーシス誘導化物を有効成分として含有する免疫寛容の誘導剤、前記アポトーシス誘導化物を有効成分として含有する自己免疫疾患の予防剤、前記アポトーシス誘導化物を有効成分として含有するアレルギーの予防剤、ならびに細胞表面に抗原を結合してなる細胞を培養する工程、および前記培養した細胞にアポトーシスを誘導し、細胞のアポトーシス誘導化物を調製する工程を含む、免疫寛容の誘導剤、自己免疫疾患の予防剤またはアレルギーの予防剤の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面に抗原を結合してなる細胞のアポトーシス誘導化物を有効成分として含有する免疫寛容の誘導剤。
【請求項２】
前記細胞が抗原と膜結合タンパク質との融合タンパク質発現ベクターで形質転換された細胞である、請求項１記載の誘導剤。
【請求項３】
前記細胞がＦａｓ発現細胞またはさらにＦａｓ発現ベクターで形質転換された細胞である、請求項１または２に記載の誘導剤。
【請求項４】
前記アポトーシス誘導がＦａｓリガンドまたは紫外線照射により行われるものである、請求項１〜３いずれか１項に記載の誘導剤。
【請求項５】
前記細胞が投与対象に対して同種細胞である、請求項１〜４いずれか１項に記載の誘導剤。
【請求項６】
前記細胞がリンパ球である、請求項１〜５いずれか１項に記載の誘導剤。
【請求項７】
細胞表面に抗原を結合してなる細胞のアポトーシス誘導化物を有効成分として含有する自己免疫疾患の予防剤。
【請求項８】
前記細胞が抗原と膜結合タンパク質との融合タンパク質発現ベクターで形質転換された細胞である、請求項７記載の自己免疫疾患の予防剤。
【請求項９】
前記細胞がＦａｓ発現細胞またはさらにＦａｓ発現ベクターで形質転換された細胞である、請求項７または８に記載の自己免疫疾患の予防剤。
【請求項１０】
前記アポトーシス誘導がＦａｓリガンドまたは紫外線照射により行われるものである、請求項７〜９いずれか１項に記載の自己免疫疾患の予防剤。
【請求項１１】
前記細胞が投与対象に対して同種細胞である、請求項７〜１０いずれか１項に記載の自己免疫疾患の予防剤。
【請求項１２】
前記細胞がリンパ球である、請求項７〜１１いずれか１項に記載の自己免疫疾患の予防剤。
【請求項１３】
細胞表面に抗原を結合してなる細胞のアポトーシス誘導化物を有効成分として含有するアレルギーの予防剤。
【請求項１４】
前記細胞が抗原と膜結合タンパク質との融合タンパク質発現ベクターで形質転換された細胞である、請求項１３記載のアレルギーの予防剤。
【請求項１５】
前記細胞がＦａｓ発現細胞またはさらにＦａｓ発現ベクターで形質転換された細胞である、請求項１３または１４に記載のアレルギーの予防剤。
【請求項１６】
前記アポトーシス誘導がＦａｓリガンドまたは紫外線照射により行われるものである、請求項１３〜１５いずれか１項に記載のアレルギーの予防剤。
【請求項１７】
前記細胞が投与対象に対して同種細胞である、請求項１３〜１６いずれか１項に記載のアレルギーの予防剤。
【請求項１８】
前記細胞がリンパ球である、請求項１３〜１７いずれか１項に記載のアレルギーの予防剤。
【請求項１９】
細胞表面に抗原を結合してなる細胞を培養する工程、および
前記培養した細胞にアポトーシスを誘導し、細胞のアポトーシス誘導化物を調製する工程
を含む、免疫寛容の誘導剤の製造方法。
【請求項２０】
細胞表面に抗原を結合してなる細胞を培養する工程、および
前記培養した細胞にアポトーシスを誘導し、細胞のアポトーシス誘導化物を調製する工程
を含む、自己免疫疾患の予防剤の製造方法。
【請求項２１】
細胞表面に抗原を結合してなる細胞を培養する工程、および
前記培養した細胞にアポトーシスを誘導し、細胞のアポトーシス誘導化物を調製する工程
を含む、アレルギーの予防剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原結合アポトーシス細胞を用いる免疫反応の制御に関する。詳しくは、抗原結合細胞のアポトーシス誘導化物を有効成分とする免疫寛容誘導剤ならびに自己免疫疾患およびアレルギーの予防剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは、多細胞生物で不要または有害な細胞が除去されるための基本的なメカニズムである（非特許文献１）。細胞がアポトーシスを受けた後、アポトーシス細胞の死骸は、マクロファージおよび樹状細胞等のプロフェッショナル食細胞により速やかに認識され、食細胞内に取り込まれる（非特許文献２）。食作用によるアポトーシス細胞の迅速な除去は、死細胞からの潜在的な毒性物質または免疫原性物質の放出を阻止する。哺乳動物において、食細胞によるアポトーシス細胞の認識と貪食は、複雑な過程であり、食細胞上の多数の分子がこの現象に関与することがわかった（非特許文献３）。これらの分子のいくつかは、ノックアウト動物の解析によりインビボでアポトーシス細胞のクリアランスに関与すると定義付けられた。例えば、細胞質側テールが切断されたＭｅｒ受容体チロシンキナーゼを有するファンクショナルノックアウトマウスは、胸腺でデキサメタゾン誘導アポトーシス細胞のクリアランスが遅くなっていることを示した。このことは、胸腺マクロファージによる死細胞の死骸の食作用にＭｅｒが関与していることを示唆する（非特許文献４）。アポトーシス細胞と食細胞との架橋分子であるＭＦＧ−Ｅ８（非特許文献５）は、脾臓およびリンパ節の胚中心に局在する可染性マクロファージ（tingible body macrophages(ＴＢＭ)）で発現している。ＭＦＧ−Ｅ８欠損マウスでは、ＴＢＭは多数のアポトーシス細胞に結合しているが、ほとんどの死骸はマクロファージに貪食されない。このことは、ＭＦＧ−Ｅ８は胚中心でアポトーシス細胞のクリアランスに重要な役割を果たすことを意味する（非特許文献６）。両ノックアウトマウスでは、加齢とともに自己抗体の産生が見られた（非特許文献６、７）ことから、食細胞によるアポトーシス細胞の完全除去は自己寛容の維持に重要な役割を果たすことを示唆する。
【０００３】
これらの見解と一致して、細胞関連細胞外抗原の注入によりマウスにおいてこれらの抗原に対する免疫寛容の誘導が可能であったことが報告されている。Liuらは、アポトーシス細胞を外来性抗原のオブアルブミンで負荷し、マウスに注入した場合、当該タンパク質に対する免疫寛容を当該動物で誘導したことを報告した(非特許文献８)。Sunらは、ドナー系統由来のアポトーシス脾臓細胞の移植投与が心臓のアロ移植片の拒絶を抑制したことも報告している(非特許文献９)。両方の場合において、注入されたアポトーシス細胞が脾臓で抗原提示細胞により食作用を受け、抗原提示細胞がアポトーシス細胞由来の細胞関連タンパク質をＴ細胞に提示し、当該タンパク質に対する免疫寛容を誘導したことが予想される。しかしながら、細胞関連抗原に対する免疫寛容の誘導の詳細なメカニズムは、捕らえにくく、解明されていない。
【０００４】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、最初に尾部と後肢が冒される進行性の麻痺等の神経学的損傷により特徴付けられる。ＥＡＥはヒト多発性硬化症のモデルであり、ＣＮＳ組織ホモジネートまたはミエリン鞘の精製成分とアジュバントとを動物に注射することにより実験動物で引き起こされる。この免疫は、ミエリン抗原特異的自己反応性Ｔｈ１細胞の活性化を生じ、この活性化がＣＮＳで炎症と脱ミエリン化を誘導する。したがって、抗原特異的Ｔ細胞の免疫寛容の誘導は、ＥＡＥの発症と進行に対する治療上のアプローチとなりうる。
【非特許文献１】Nagata, S., Cell 88: 355-365, 1997
【非特許文献２】Henson, P.M. et al., Curr. Biol. 11: R795-805, 2001
【非特許文献３】Maderna, P. et al., Biochim. Biophys. Acta. 1639: 141-151, 2003
【非特許文献４】Scott, R.S. et al., Nature 411: 207-211, 2001
【非特許文献５】Hanayama, R., et al., Nature, 417: 182-187, 2002
【非特許文献６】Hanayama, R., et al., Science, 304: 1147-1150, 2004
【非特許文献７】Cohen, P.L., J. Exp. Med. 196: 135-140, 2002
【非特許文献８】Liu, K., et al., J. Exp. Med. 196: 1091-1097, 2002
【非特許文献９】Sun, E., et al., Cell Death differ. 11: 1258-1264, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、抗原特異的Ｔ細胞の免疫寛容を誘導するための有効な手段の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記問題点に鑑み、鋭意検討した結果、細胞膜表面に抗原を結合させた細胞にアポトーシスを誘導し、得られたアポトーシス細胞を静脈注射することにより、免疫寛容を誘導できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
【０００７】
〔１〕  細胞表面に抗原を結合してなる細胞のアポトーシス誘導化物を有効成分として含有する免疫寛容の誘導剤。
〔２〕  前記細胞が抗原と膜結合タンパク質との融合タンパク質発現ベクターで形質転換された細胞である、前記〔１〕記載の誘導剤。
〔３〕  前記細胞がＦａｓ発現細胞またはさらにＦａｓ発現ベクターで形質転換された細胞である、前記〔１〕または〔２〕に記載の誘導剤。
〔４〕  前記アポトーシス誘導がＦａｓリガンドまたは紫外線照射により行われるものである、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の誘導剤。
〔５〕  前記細胞が投与対象に対して同種細胞である、前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の誘導剤。
〔６〕  前記細胞がリンパ球である、前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載の誘導剤。
〔７〕  細胞表面に抗原を結合してなる細胞のアポトーシス誘導化物を有効成分として含有する自己免疫疾患の予防剤。
〔８〕  前記細胞が抗原と膜結合タンパク質との融合タンパク質発現ベクターで形質転換された細胞である、前記〔７〕記載の自己免疫疾患の予防剤。
〔９〕  前記細胞がＦａｓ発現細胞またはさらにＦａｓ発現ベクターで形質転換された細胞である、前記〔７〕または〔８〕に記載の自己免疫疾患の予防剤。
〔１０〕  前記アポトーシス誘導がＦａｓリガンドまたは紫外線照射により行われるものである、前記〔７〕〜〔９〕いずれか１項に記載の自己免疫疾患の予防剤。
〔１１〕  前記細胞が投与対象に対して同種細胞である、前記〔７〕〜〔１０〕いずれか１項に記載の自己免疫疾患の予防剤。
〔１２〕  前記細胞がリンパ球である、前記〔７〕〜〔１１〕いずれか１項に記載の自己免疫疾患の予防剤。
〔１３〕  細胞表面に抗原を結合してなる細胞のアポトーシス誘導化物を有効成分として含有するアレルギーの予防剤。
〔１４〕  前記細胞が抗原と膜結合タンパク質との融合タンパク質発現ベクターで形質転換された細胞である、前記〔１３〕記載のアレルギーの予防剤。
〔１５〕  前記細胞がＦａｓ発現細胞またはさらにＦａｓ発現ベクターで形質転換された細胞である、前記〔１３〕または〔１４〕に記載のアレルギーの予防剤。
〔１６〕  前記アポトーシス誘導がＦａｓリガンドまたは紫外線照射により行われるものである、前記〔１３〕〜〔１５〕いずれか１項に記載のアレルギーの予防剤。
〔１７〕  前記細胞が投与対象に対して同種細胞である、前記〔１３〕〜〔１６〕いずれか１項に記載のアレルギーの予防剤。
〔１８〕  前記細胞がリンパ球である、前記〔１３〕〜〔１７〕いずれか１項に記載のアレルギーの予防剤。
〔１９〕  細胞表面に抗原を結合してなる細胞を培養する工程、および
前記培養した細胞にアポトーシスを誘導し、細胞のアポトーシス誘導化物を調製する工程
を含む、免疫寛容の誘導剤の製造方法。
〔２０〕  細胞表面に抗原を結合してなる細胞を培養する工程、および
前記培養した細胞にアポトーシスを誘導し、細胞のアポトーシス誘導化物を調製する工程
を含む、自己免疫疾患の予防剤の製造方法。
〔２１〕  細胞表面に抗原を結合してなる細胞を培養する工程、および
前記培養した細胞にアポトーシスを誘導し、細胞のアポトーシス誘導化物を調製する工程
を含む、アレルギーの予防剤の製造方法。
〔２２〕  前記〔１〕〜〔６〕いずれか１項に記載の誘導剤をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における免疫寛容の誘導方法。
〔２３〕  前記〔７〕〜〔１２〕いずれか１項に記載の自己免疫疾患の予防剤をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における自己免疫疾患の予防方法。
〔２４〕  前記〔１３〕〜〔１８〕いずれか１項に記載のアレルギーの予防剤をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、対象におけるアレルギーの予防方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の免疫寛容誘導剤によると、少ない抗原量で抗原特異的免疫寛容を有効に誘導することができる。本発明の自己免疫疾患の予防剤によると、少ない抗原量で抗原特異的免疫寛容を有効に誘導し、当該抗原に伴う免疫異常に起因する自己免疫疾患を有効に予防することができる。本発明のアレルギーの予防剤によると、少ない抗原量で抗原特異的免疫寛容を有効に誘導し、当該抗原に対するアレルギーの発症を有効に予防することができる。また、本発明の製造方法によると、有効成分であるアポトーシス細胞を細胞工学的手法で用時調製し、それを必要とする対象に提供することができ、テーラーメイド医療に貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、細胞表面に抗原を結合してなる細胞のアポトーシス誘導化物を有効成分として含有する免疫寛容の誘導剤を提供する。
【００１０】
本発明において「免疫寛容」という用語は、当該技術分野において通常の意味で用いられ、抗原特異的な免疫学的無反応状態をいう。
【００１１】
前記有効成分である「細胞のアポトーシス誘導化物」（以下、本発明においては「アポトーシス細胞」とも称する）とは、下記本発明におけるアポトーシス誘導により得られた細胞をいう。
【００１２】
本発明において「アポトーシス誘導」とは、生存している細胞にＦａｓリガンド処理、紫外線照射、放射線照射またはデキサメタゾン処理などを施し、細胞内のカスパーゼを活性化して細胞を死に至らしめることをいう。本発明においては、生体への投与時から投与後所定の臓器（好ましくは、脾臓）に到達するまでに細胞の形態を維持するとともに生体内での安全性を確保する観点から、早期のアポトーシス誘導となることが好ましい。
【００１３】
早期のアポトーシス誘導は、本発明においては次のような指標により判断することができる。
１）アポトーシス誘導した細胞のカスパーゼ活性を測定し、カスパーゼ活性が上昇している。
アポトーシスはカスパーゼの活性化により引き起こされる細胞死であるので、アポトーシス誘導した細胞をカスパーゼ活性測定試薬を用いてカスパーゼの活性化の有無を調べ、アポトーシス誘導前の細胞におけるカスパーゼ活性と比較することにより、カスパーゼの活性化に基づく細胞死であるか否かを確認することができる。前記カスパーゼは、カスパーゼ活性化の経路の下流に存在する点から、カスパーゼ３もしくはカスパーゼ７、またはその両方であることが好ましい。カスパーゼ活性測定試薬は、市販品を好適に使用することができる。
２）標識したアネキシンＶを用いて、アポトーシス誘導した細胞を染色した場合に陽性である。
アネキシンＶは、細胞膜の脂質二重層の内側に存在しているホスファチジルセリン（ＰＳ）に対して、Ｃａ2+存在下で強い親和性を有している。アポトーシス細胞ではＰＳが細胞表層に露出しており、標識したアネキシンＶを用いてＰＳが細胞表層に露出したアポトーシス細胞を検出することができる。細胞表層のＰＳを検出するための標識したアネキシンＶは、市販品を好適に使用することができる。
３）プロピオニウムイオダイド（ＰＩ）を用いて、アポトーシス誘導した細胞を染色した場合に陰性である。
ＰＩは細胞膜を通過することはできないが、アポトーシス後期の細胞はその膜構造を保持できなくなり、ＰＩは細胞内に入り込むことができる。ＰＩは細胞内のＤＮＡと結合して発色するので、ＰＩ染色陽性の細胞は、アポトーシス後期細胞であると判断される。そこで、ＰＩ染色陰性を指標にして、早期のアポトーシス細胞を検出することができる。
【００１４】
前記１）〜３）の指標のうち、アポトーシスの誘導は、少なくとも１）の要件を満たしていることにより確認することができる。早期のアポトーシス誘導は、２）および３）の要件、または１）〜３）のすべての要件を満たしていることにより確認することができる。
【００１５】
アポトーシスを誘導させる細胞は、特に限定されるものではなく、生体から用時に採取した細胞であっても樹立した細胞株であってもよい。前記細胞は、任意の動物種由来の細胞であり得る。このような動物種としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等の哺乳動物が挙げられるが、臨床応用という観点からは、ヒト由来の細胞であることが好ましい。これら細胞は、投与対象に対して同種同系の細胞（好ましくは自己細胞）、投与対象に対して同種異系の細胞または投与対象に対して異種の細胞であってもよいが、安全性をさらに考慮すれば、同種細胞（同種同系の細胞および同種異系の細胞を含む）であることが好ましい。
【００１６】
前記細胞は、採取および培養の容易性ならびに生体内に投与した後の脾臓等の臓器への到達容易性を考慮すると、リンパ球が好ましい。前記リンパ球の好適な例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞などがあげられ、Ｔ細胞がより好ましい。
【００１７】
アポトーシスを誘導させる細胞は、より具体的には細胞表面に抗原が結合した細胞である。当該抗原としては、具体的には自己免疫疾患またはアレルギーなどとの関連が現在示唆されている抗原、あるいは将来示唆されうるあらゆる抗原があげられ、特に限定されるものではない。好ましくは、前記抗原はタンパク質であり、予防対象の自己免疫疾患またはアレルギーに応じて適する抗原（具体的には、好適なアミノ酸配列）を選択することができる。タンパク質抗原の場合、後述する膜タンパク質との融合タンパク質として細胞表面に強制的かつ有効量発現させることが容易であり、好ましい。
【００１８】
細胞表面と抗原との結合は、共有結合等の化学的結合または膜タンパク質との融合が好ましい。かかる強固な結合様式を選択することにより、前記抗原を結合したアポトーシス細胞は食細胞による貪食を経て効率的に抗原提示され、所期の目的を達成することができる。本発明の好適な具体例においては、抗原を膜タンパク質との融合タンパク質として細胞表面に局在させることにより細胞表面と抗原とが結合していることが好ましい。
【００１９】
したがって、アポトーシスを誘導させる細胞は、生来その細胞膜に目的抗原が結合している細胞であってもよく、目的抗原と膜結合タンパク質との融合タンパク質発現ベクターで形質転換された細胞であってもよいが、目的抗原のエピトープの選択と細胞膜における結合量を適宜選択しうる観点から、後者の形質転換細胞が好ましい。
【００２０】
前記融合タンパク質発現ベクターは、例えば、プロモーターおよびターミネーターが、所望によりシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、抗原をコードするＤＮＡ、膜結合タンパク質をコードするＤＮＡおよび所望により薬剤耐性遺伝子から構成されるユニットに作動可能に連結されているものがあげられる。このような融合タンパク質発現ベクターは、目的抗原をコードするＤＮＡと膜結合タンパク質をコードするＤＮＡとを自体公知の方法により連結させ、発現ベクターに組み込むことにより作製することができる。前記発現ベクターは、形質転換する細胞で機能しうるプロモーターを含むベクターを限定なく使用することができる。
【００２１】
プロモーターは、抗原遺伝子または膜結合タンパク質遺伝子のいずれか由来のプロモーターであってもよく、市販の発現ベクターに組み込まれているプロモーターであってもよい。使用可能なプロモーターとしては、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、ならびにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＥＦ１α遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成タンパク質遺伝子プロモーターなどがあげられる。また、ターミネーターは、抗原遺伝子または膜結合タンパク質遺伝子のいずれか由来のターミネーターであってもよく、市販の発現ベクターに組み込まれているターミネーターであってもよい。
【００２２】
目的抗原は、抗原特異的に免疫寛容を誘導するために適する抗原を限定なく使用することができる。例えば、オブアルブミンに対する免疫寛容を誘導するためには、オブアルブミンを選択する。目的抗原をコードするＤＮＡは、天然由来のＤＮＡであっても合成ＤＮＡであってもよい。
【００２３】
膜結合タンパク質としては、公知のものを使用することができ、特に限定されるものではないが、例えば、ＨＢ−ＥＧＦ、ＣＤ４、ＣＤ８などがあげられる。また、膜結合タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列も公知であり、Genbank等のデータバンクに開示されている。膜結合タンパク質をコードするＤＮＡは、自体公知の方法により単離することができる。
【００２４】
前記発現ベクターを用いて、自体公知の方法により、細胞を形質転換することができる。形質転換方法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション、リポフェクション、組み換えウイルスを用いた形質転換法などがあげられる。形質転換体の単離、目的抗原の細胞膜上での発現の確認は、自体公知の方法により行うことができる。
【００２５】
アポトーシスを誘導させる細胞は、アポトーシスのみを確実に誘導できるという観点から、Ｆａｓ発現細胞またはさらにＦａｓ発現ベクターで形質転換された細胞であることが好ましい。前者の細胞は、内在性のＦａｓが発現している細胞であり、後者の細胞は、外来性のＦａｓが発現している細胞である。Ｆａｓの発現は、抗Ｆａｓ抗体等を用いた通常の免疫学的手段によりＦａｓタンパク質が検出できる程度でよい。Ｆａｓ発現ベクターにより細胞に導入されるＦａｓ遺伝子は、形質転換される細胞と同種の生物由来の遺伝子であってもよく、異種遺伝子であってもよいが、同種の生物由来の遺伝子が好ましい。ヒト細胞を形質転換するためには、ヒトＦａｓ遺伝子を選択することが好ましい。Ｆａｓ遺伝子としては、NCBIに登録されたヒトHs.244139、マウスMm.1626などでその塩基配列が公表されており、自体公知の方法により単離することができる。発現ベクターは、目的の細胞でＦａｓを発現しうるものであれば公知のベクターを限定なく使用することができる。Ｆａｓ発現ベクターの構築は、自体公知の方法により行うことができる。細胞の形質転換、形質転換体の単離、Ｆａｓの発現の確認も、自体公知の方法により行うことができる。融合タンパク質発現ベクターとＦａｓ発現ベクターとの両方を細胞に導入する場合、両発現ベクターの導入の順序は同時であっても別々であってもよく、別々に導入する場合、その順序は特に限定されない。
【００２６】
このようにして得られた抗原結合細胞に、アポトーシスを誘導することによりアポトーシス細胞を得ることができる。アポトーシスの誘導方法は、Ｆａｓリガンド処理、紫外線照射、放射線照射などが挙げられ、確実にアポトーシスのみを誘導させる点から、Ｆａｓリガンド処理が好ましい。Ｆａｓリガンド処理および紫外線照射などは細胞によりその条件が異なりうるので、予備実験により前記した早期アポトーシスの基準に適合するように条件を設定することが好ましい。Ｆａｓリガンドとしては、Ｆａｓリガンド発現細胞の培養上清、可溶性Ｆａｓリガンド、抗Ｆａｓ抗体などを使用することができる。
【００２７】
本発明の免疫寛容剤に含まれるアポトーシス細胞は、通常、５×１０7〜１×１０8個／ｍＬの濃度に設定されうる。１回当りの投与量は、投与対象の年齢、体重その他様々なファクターを考慮して適宜設定することができるが、マウスの場合は通常１×１０7〜２×１０7個程度である。例えば、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）断片を細胞表面に結合したアポトーシス細胞を２×１０7個用いた場合、抗原として約2 pmolのＭＯＧを含有しており、ＭＯＧ抗原単独で免疫寛容を誘導する量の200分の１以下の量でよい。ヒトに適用する場合は、種差を考慮して好適な投与量を設定することが好ましい。
【００２８】
本発明の免疫寛容剤は、前記アポトーシス細胞に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含んでもよい。医薬上許容され得る担体としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、ショ糖水等の等張化剤などが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明は、細胞表面に抗原を結合してなる細胞のアポトーシス誘導化物を有効成分として含有する自己免疫疾患の予防剤を提供する。当該予防剤に含まれる有効成分のアポトーシス細胞は、前記した通りである。ここで用いられる抗原としては、対象とする自己免疫疾患に応じて適宜選択することができ、多発性硬化症の場合はＭＯＧ、Ｉ型糖尿病の場合はインスリン、バセドウ病の場合はＴＳＨレセプター、重症筋無力症の場合はアセチルコリンレセプター、Goodpasture症候群の場合は４型コラーゲンなどが例示される。
【００３０】
本発明は、細胞表面に抗原を結合してなる細胞のアポトーシス誘導化物を有効成分として含有するアレルギーの予防剤を提供する。当該予防剤に含まれる有効成分のアポトーシス細胞は、前記した通りである。ここで用いられる抗原としては、対象とするアレルギーに応じて適宜選択することができ、スギ花粉症の場合はスギ抗原、卵白アレルギーの場合はオブアルブミンなどが例示される。
【００３１】
また、本発明は、免疫寛容の誘導剤、より具体的には自己免疫疾患の予防剤またはアレルギーの予防剤の製造方法を提供する。本発明の製造方法においては、目的に応じて適する抗原結合細胞を準備し、下記共通の工程を実施することにより、各種細胞製剤を得ることができる。
【００３２】
（１）細胞表面に抗原を結合してなる細胞を培養する工程
本工程において、アポトーシスを誘導させる細胞を一定の数まで培養して増殖させる。前記したように、アポトーシスを誘導させる細胞は、生来その細胞膜に目的抗原が結合している細胞または目的抗原と膜結合タンパク質との融合タンパク質発現ベクターで形質転換された細胞であり、細胞に応じて適宜培地および培養条件を設定することができる。
【００３３】
培養培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Fischer’s培地、およびこれらの混合培地が挙げられる。培養培地は、例えば、血清（例えば、ＦＣＳ）、血清代替物（例えば、knockout Serum Replacement（ＫＳＲ））、脂肪酸または脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含むことができる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。培養における細胞数、各種因子の濃度等のその他の条件は、自体公知の方法により適宜設定できる。
【００３４】
（２）前記培養した細胞にアポトーシスを誘導し、細胞のアポトーシス誘導化物を調製する工程
本工程において、前記培養工程で得られた一定の数の細胞にアポトーシスを誘導する。
【００３５】
（2-1）Ｆａｓリガンド処理によるアポトーシス誘導
Ｆａｓリガンド処理は細胞によりその条件が異なりうるので、予備実験により前記した早期アポトーシスの基準に適合するように条件を設定する。Ｆａｓリガンド処理によるアポトーシス誘導が有効でない場合は、下記紫外線照射の条件を設定することが好ましい。ＦａｓリガンドとしてＦａｓリガンド発現細胞の培養上清を用いた場合、上記培養工程で一定の数に増殖した細胞の培地に当該培養上清を加え、さらに一定時間インキュベーションを続けてアポトーシスを誘導させる。前記培養上清は、馴らし培地（conditioned medium）として自体公知の方法により用時調製したものを好適に使用することができる。その後、前記細胞をＰＢＳ等の洗浄液で洗浄し、回収することによりアポトーシス誘導化物を得る。Ｆａｓリガンドとして可溶性Ｆａｓリガンドを用いた場合、上記培養工程で一定の数に増殖した細胞の培地に可溶性Ｆａｓリガンドを加え、さらに一定時間インキュベーションを続けてアポトーシスを誘導させる。可溶性Ｆａｓリガンドは、Ｆａｓリガンドの細胞外ドメインであり、自体公知の方法により製造することもでき、市販品を用いることもできる。その後、前記細胞をＰＢＳ等の洗浄液で洗浄し、回収することによりアポトーシス誘導化物を得る。Ｆａｓリガンドとして抗Ｆａｓ抗体を用いた場合、上記培養工程で一定の数に増殖した細胞の培地に抗Ｆａｓ抗体を加え、さらに一定時間インキュベーションを続けてアポトーシスを誘導させる。抗Ｆａｓ抗体は、自体公知の方法により製造することもでき、市販品を用いることもできる。その後、前記細胞をＰＢＳ等の洗浄液で洗浄し、回収することによりアポトーシス誘導化物を得る。
【００３６】
（2-2）紫外線照射によるアポトーシス誘導
紫外線照射は細胞によりその条件が異なりうるので、予備実験により前記した早期アポトーシスの基準に適合するように条件を設定することが好ましい。
【００３７】
また、本発明は、免疫寛容の誘導剤をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における免疫寛容の誘導方法を提供する。本発明の誘導方法においては、目的に応じて適する抗原結合細胞を準備し、前記製造方法によりアポトーシス誘導化物を調製し、続いて対象に投与する。ここで、対象としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等の哺乳動物が挙げられるが、臨床応用という観点からは、ヒトが好ましい。
【００３８】
ヒトを対象とする場合、好ましくは以下のような工程により免疫寛容を誘導することができる。まず、ヒトから血液を採取し、リンパ球等の所望の細胞を単離する。得られた細胞を培養し、目的抗原発現ベクターおよび所望によりＦａｓ発現ベクターで形質転換し、形質転換体を得る。形質転換体をさらに培養し、アポトーシスを誘導させる。得られたアポトーシス誘導化物を生理食塩水等に懸濁させ、静脈内注射により採取したヒトに戻す。したがって、投与工程は、好ましくは静脈内注射により行われる。皮下注射等の他の投与方法ではアポトーシス細胞が破壊される恐れがあるからである。
【００３９】
本発明の免疫寛容の誘導剤の投与量は、抗原が結合した細胞の種類、当該細胞における抗原の結合量、予想される免疫異常の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、所望の免疫寛容を達成するような細胞数が適宜投与され得る。
【００４０】
本発明の免疫寛容の誘導剤の投与時期は、原則、免疫異常が発現するより前である。投与回数は特に限定されず、１回であってもよく、誘導剤の用量と予想される免疫異常の発現の抑制とは用量依存性があることから複数回の投与であってもよい。この場合、投与間隔は特に限定されない。１回目の投与と２回目以降の投与時期は共に発現前が好ましいが、１回目の投与を発現の前に行えば、２回目以降の投与時期は免疫異常の発現が確認された後でもよい。
【００４１】
また、本発明は、自己免疫疾患の予防剤をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における自己免疫疾患の予防方法を提供する。本発明の予防方法においては、目的に応じて適する抗原結合細胞を準備し、前記製造方法によりアポトーシス誘導化物を調製し、続いて対象に投与する。ここで、対象としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等の哺乳動物が挙げられるが、臨床応用という観点からは、ヒトが好ましい。
【００４２】
自己免疫疾患としては、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、バセドウ病、重症筋無力症、Goodpasture症候群、皮膚筋炎、多発筋炎などが例示される。
【００４３】
ヒトを対象とする場合、好ましくは以下のような工程により自己免疫疾患を予防することができる。まず、ヒトから血液を採取し、リンパ球等の所望の細胞を単離する。得られた細胞を培養し、目的抗原発現ベクターおよび所望によりＦａｓ発現ベクターで形質転換し、形質転換体を得る。形質転換体をさらに培養し、アポトーシスを誘導させる。得られたアポトーシス誘導化物を生理食塩水等に懸濁させ、静脈内注射により採取したヒトに戻す。したがって、投与工程は、好ましくは静脈内注射により行われる。皮下注射等の他の投与方法ではアポトーシス細胞が破壊される恐れがあるからである。
【００４４】
本発明の自己免疫疾患の予防剤の投与量は、抗原が結合した細胞の種類、当該細胞における抗原の結合量、予想される自己免疫疾患の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、所望の免疫寛容を達成するような細胞数が適宜投与され得る。
【００４５】
本発明の自己免疫疾患の予防剤の投与時期は、原則、自己免疫疾患が発症するより前である。投与回数は特に限定されず、１回であってもよく、予防剤の用量と予想される自己免疫疾患の発症の抑制とは用量依存性があることから複数回の投与であってもよい。この場合、投与間隔は特に限定されない。１回目の投与と２回目以降の投与時期は共に発症前が好ましいが、１回目の投与を発症の前に行えば、２回目以降の投与時期は自己免疫疾患の発症が確認された後でもよい。
【００４６】
また、本発明は、アレルギーの予防剤をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、対象におけるアレルギーの予防方法を提供する。本発明の予防方法においては、目的に応じて適する抗原結合細胞を準備し、前記製造方法によりアポトーシス誘導化物を調製し、続いて対象に投与する。ここで、対象としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等の哺乳動物が挙げられるが、臨床応用という観点からは、ヒトが好ましい。
【００４７】
アレルギーとしては、スギ、ヒノキ、イネ科、ブタクサ等の花粉に対するアレルギー、卵白、牛乳、ダイズ、ソバ、落花生等の食物アレルギーなどが例示される。
【００４８】
ヒトを対象とする場合、好ましくは以下のような工程によりアレルギーを予防することができる。まず、ヒトから血液を採取し、リンパ球等の所望の細胞を単離する。得られた細胞を培養し、目的抗原発現ベクターおよび所望によりＦａｓ発現ベクターで形質転換し、形質転換体を得る。形質転換体をさらに培養し、アポトーシスを誘導させる。得られたアポトーシス誘導化物を生理食塩水等に懸濁させ、静脈内注射により採取したヒトに戻す。したがって、投与工程は、好ましくは静脈内注射により行われる。皮下注射等の他の投与方法ではアポトーシス細胞が破壊される恐れがあるからである。
【００４９】
本発明のアレルギーの予防剤の投与量は、抗原が結合した細胞の種類、当該細胞における抗原の結合量、予想される疾患の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、所望の免疫寛容を達成するような細胞数が適宜投与され得る。
【００５０】
本発明のアレルギーの予防剤の投与時期は、原則、アレルギーが発症するより前である。投与回数は特に限定されず、１回であってもよく、予防剤の用量と予想されるアレルギーの発症の抑制とは用量依存性があることから複数回の投与であってもよい。この場合、投与間隔は特に限定されない。１回目の投与と２回目以降の投与時期は共に発症前が好ましいが、１回目の投与を発症の前に行えば、２回目以降の投与時期はアレルギーの発症が確認された後でもよい。また、スギ花粉症のように発症の時期が比較的正確に予測可能なアレルギーに対しては、発症時期の数ヶ月前から本発明の予防剤を静脈注射するような投与スケジュールが推奨される。このようなスケジュールに合わせて、本発明の予防剤を用時投与できるようにアポトーシス細胞を準備することが好ましい。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００５２】
実験に使用したマウス
C57BL/6Jマウスは、チャールスリバー(神奈川、日本)から入手した。CD11c-DTRトランスジェニックマウス(C57BL/6Jバックグランド)は、D. Littman博士 (New York University School of Medicine)から供与された。すべてのマウスは、規定の病原菌フリーの施設で飼育した。実験は、理化学研究所ガイドラインに従って行った。 
【００５３】
実施例１.  発現ベクターの構築
ラットＭＯＧのｃＤＮＡを得るため、６週令の雌性Wistarラット(日本クレア)の側頭葉から全ＲＮＡを単離し、下記プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
センスプライマー(ラットMOG-S2):5'accataaagatggcc3'（配列番号１）、および
アンチセンスプライマー(ラットMOG-AS2):5'cactcaaaaggggtt3'（配列番号２）。
ヒトＨＢ−ＥＧＦとラットＭＯＧとのキメラ膜貫通タンパク質の発現プラスミドは、組換えポリメラーゼ連鎖反応により構築した。ＨＢ−ＥＧＦ1-192とＭＯＧ32-97のコーディング配列を保持するｐＨＢ−ＥＧＦ−ＭＯＧ−Ｓ/ＦＬＡＧを構築するため、
センスプライマー (hDTR-S1): 5'tgcgggaccatgaagct3'（配列番号３）、および
アンチセンスキメラプライマー (rMOG-hDTR-AS(32-97)): 5'ccatgcccgtggcataacctcctctcct3'（配列番号４）を用いて、ＨＢ−ＥＧＦｃＤＮＡの5'部分を増幅した。rMOG-hDTR-AS(32-97)に相補的なセンスプライマー (hDTR-rMOG-S(32-97))およびアンチセンスプライマー(rMOG-SpeI-AS12): 5'gactagtttcatccgagaacct3'（配列番号５）を用いて、ＭＯＧｃＤＮＡの3'部分を増幅した。一次ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により精製し、１：１に混合した後、hDTR-S1およびrMOG-SpeI-AS12プライマーを用いる二次ＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡ断片を、ＦＬＡＧペプチドをコードするｃＤＮＡに付け、pEF-BOSEXベクターに挿入した。HB-EGF1-192およびＭＯＧ1-120のコード配列を保持するｐＨＢ−ＥＧＦ−ＭＯＧ−Ｌ/ＦＬＡＧの構築は、下記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様の方法により行った:
HB-EGFcDNAの5'部分に対しては、センスプライマー(hDTR-S1): 5'tgcgggaccatgaagct3' （配列番号６）および
アンチセンスキメラプライマー (rMOG-hDTR-AS(1-120)): 5'cactctgaactgtccataacctcctctcct3'（配列番号７）、ならびに
ＭＯＧ ｃＤＮＡの3'部分に対しては、センスキメラプライマー(hDTR-rMOG-S (1-120)): 5'aggagaggaggttatggacagttcagagtg3'（配列番号８）(rMOG-hDTR-AS(1-120)に相補的)およびアンチセンスプライマー(rMOG-SpeI-AS11):5'gactagtgtagaagggatcttc3'（配列番号９）。
【００５４】
実施例２．  ＨＢ−ＥＧＦ−ＭＯＧを発現する細胞株の確立
マウスＷ３細胞（マウスＦａｓを発現するWR19L細胞、BALB/cマウス由来のＴ細胞[Ogasawara, J., Watanabe-Fukunaga, R., Adachi, M., Matsuzawa, A., Kasugai, T., Kitamura, Y., Itoh, N., Suda, T., and Nagata, S. (1993). Lethal effect of the anti-Fas antibody in mice. Nature 364, 806-809]）を、前記発現プラスミドと、ピューロマイシン耐性遺伝子を保持するpBS pacΔP[de la Luna, S., Soria, I., Pulido, D., Ortin, J., and Jimenez, A. (1988). Efficient transformation of mammalian cells with constructs containing a puromycin-resistance marker. Gene 62, 121-126]とをエレクトロポレーションにより共形質導入した。ピューロマイシン耐性形質転換体を650ng/mlピューロマイシンで選択し、ＨＢ−ＥＧＦ−ＭＯＧキメラタンパク質を発現する形質転換体クローンをAlexa Fluor 488結合ハムスター抗ヒトＨＢ-ＥＧＦモノクローナル抗体を用いたＦＡＣＳ解析により選択した。
形質転換体中のＨＢ−ＥＧＦ−ＭＯＧの発現は、ウエスタンブロッティングによっても検出した。細胞をＲＩＰＡ緩衝液 (50 mM Hepes Buffer, pH 7.6, 1% TritonX-100, 0.1% SDS, 0.5% Sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10% Glycerol, 1 mM APMSF, 1μg/ml leupeptin および1μg/ml pepstatin)で溶解し、溶解液を、10/20 % 勾配ゲルのSDS-PAGEにより分離した。タンパク質をPVDF膜に移し、抗ＨＢ−ＥＧＦポリクローナル抗体(R&D Systems, Minneapolis, MN)とHRP結合ウサギ抗ヤギIg(Dako Cytomation, Carpinteria, CA)によりキメラタンパク質を検出した。全長のＨＢ−ＥＧＦ−ＭＯＧ/ＦＬＡＧ融合タンパク質の発現を確認するために、ＲＩＰＡ溶解液をマウス抗ＦＬＡＧ（Sigma, St. Louis, MO）抗体とProteinG-Sepharose(Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden)で免疫沈降した。免疫沈降物をSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に移し、抗ＨＢ−ＥＧＦポリクローナル抗体または抗ＭＯＧ抗体(R&D systems)およびペルオキシダーゼ結合ロバ抗-ヤギIgG(Jackson ImmunoResearch, Baltimore, PA)により検出した。
【００５５】
実施例３.  細胞のアポトーシス処理
Ｗ３細胞またはその形質転換体を、RPMI1640/1% 同系マウス血清中の可溶性ヒトＦａｓリガンド[Shiraishi,T., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 322: 197-202, 2004]で4時間処理した。次いで、細胞を1mg/mlのマウス血清アルブミン(Sigma)含有ＰＢＳで２回洗浄し、ウシ血清の混入を避けた。前記細胞がアポトーシスを受けたことを確認するため、Annexin V-PE(BD Pharmingen, San Diego, CA)で当該細胞を染色し、フローサイトメトリーで解析した。200μlのPBS/2.5% 同系マウス血清中のアポトーシス細胞を所定数、尾静脈を介してマウスに静脈内に注射するか、またはマウスの尾底部に皮下に注射した。一部の実験において、既報[Asano,K., et al., J. Exp. Med. 200: 459-467, 2004]に従って調製した組換えMFG-E8変異タンパク質D89Eを、注射前にアポトーシス細胞に添加した。
【００５６】
実施例４．  ＥＡＥの誘導と臨床の疾患スコア
100μgのＭＯＧ35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK: 合成品 NeoMPS, San Diego, CA)（配列番号１０）を全量で200μlの完全フロイントアジュバント(ＣＦＡ, Difco, Detroit, MI)で乳化させたものを用いて、７ないし９週令雌性マウスの各マウスの尾底の２箇所の部位に０日目に皮下注射により免疫し、200ngの百日咳毒素(Seikagaku, Tokyo, Japan)の静脈内注射を補足した。さらに、２日目に、前記マウスに、200ngの百日咳毒素を腹腔内注射した。
前記マウスを、ＥＡＥの神経学的徴候の存在について、毎日または隔日に観察して、下記スコアをつけた：
0 = 徴候なし、 1 =弱った尾部、 2 =尾の調子の完全な損失、 3 =失調ゲート、 4 = 後肢麻痺、5 =後肢および前肢の麻痺、6 =死亡。データは各群に対して、平均臨床スコアで示す。
【００５７】
実施例５．  Ｔ細胞増殖アッセイ
アポトーシス細胞を前もって注射したマウスと注射しないマウスを、ＣＦＡで乳化した100μgのＭＯＧ35-55またはスカシガイヘモシアニン(ＫＬＨ)(Sigma)で両側の足蹠に免疫した。免疫５日後、マウスから両側の膝か部および鼠径部リンパ節を単離した。単離したリンパ節細胞をRPMI/10%FBS/50μM 2ME中に懸濁した。96-ウエルの平底培養プレート中の5x105細胞/ウエルを、ＭＯＧ35-55またはＫＬＨの段階的濃度で70時間、インビトロで再刺激した。増殖は、培養の最終２０時間での[3H]チミジン(0.5μCi/well)の取り込みに基づいて定量した。
【００５８】
実施例６．  サイトカインＥＬＩＳＡ
アポトーシス細胞を前もって注射したマウスと注射しないマウスを、０日目にＭＯＧ + ＣＦＡで免疫した。10日目に脾臓を切除し、スライドガラスの間に挟んで圧迫し、ピペッティングで懸濁した。この懸濁物をナイロンメッシュで濾過した。赤血球を塩化アンモニウムで溶解させた。細胞をRPMI/10% FCSで洗浄し、RPMI/10% FCS/50μM 2ME中に再懸濁した。5 x 105/wellの脾臓細胞を、RPMI/10% FCS/50μM 2ME中の段階的濃度のＭＯＧ35-55ペプチドで再刺激し、37℃で72時間培養した。培地中のIFN-γの濃度を、製造業者のプロトコールに従って、ELISA(Biosource)で測定した。
【００５９】
実験例１．脊髄の組織
脊髄を4％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンで包埋した。パラフィン切片(4μm)をキシレン中で脱パラフィンし、エタノールの段階系列で脱水した後、Hematoxylin-Eosin染色を行った。
【００６０】
実験例２．  ターゲティングベクターの構築およびCD169-DTRマウスの作出
CD169遺伝子を含むゲノムクローンを、129/SvマウスゲノムDNAのBACライブラリーから得た。ターゲティングベクターを作製するため、CD169遺伝子の転写開始点を基準に、-1.6から+8.2kbpの領域をpBluescript II SK(+)ベクター(Stratagene, La Jolla, CA)にサブクローニングした。次いで、エキソン1の28bp断片を、組換えPCR技術により、ポリアデニル化テールを有するヒトDTR(HB-EGF) cDNAに置換した。相同組換え体を選択するため、loxPに隣接するNeoカセットをヒトDTR遺伝子の下流にクローニングした。ランダムな組み込み体を排除するために、チミジンキナーゼ遺伝子を3’アームの下流に挿入した。最終のターゲティングベクターをPvuIで線状化し、トランスフェクションした。
CD169-DTRマウスを作出するため、R1 ES細胞をエレクトロポレーションによりターゲティングベクターでトランスフェクションした。G-418耐性およびガンシクロビル（gancyclovir）耐性クローンを、サザンブロット解析により相同組換についてスクリーニングした。生殖系列のキメラマウスは、凝集法により作出した。ES細胞寄与率の高いキメラマウスを、C57BL/6マウスと交配し、+/CD169DTR マウスを産生した。+/CD169DTR マウスをC57BL/6マウスと4回以上戻し交配し、野生型(+/+)とヘテロ接合型CD169-DTR(+/CD169DTR)同腹子を解析に用いた。
【００６１】
実験例３.  サザンブロット解析
マウス尾生検からゲノムＤＮＡを調製した。サザンハイブリダイゼーションのため、ゲノムＤＮＡをBglIIで消化し、0.8%アガロースゲルによる電気泳動で分離し、Biodyne Aメンブラン(PALL, East Hills, NY)に写した。ハイブルダイゼーションは、ターゲティングベクターの外側に位置する680-bp ＤＩＧ-標識ＤＮＡ断片を用いて行った。
【００６２】
実験例４．  免疫組織化学
脾臓をTissue-Tek OCT(SAKURA, Tokyo, Japan)に包埋し、凍結切片(4μm)をMAS-被覆スライド上にマウントした。切片を冷アセトンで固定し、1.5%正常ヤギ血清および2% Block Aceでブロックした。スライドを室温で１時間、抗CD169(3d6.112, Serotec, Oxford, UK)、ビオチン化抗CD11b(M1/70, BD Biosciences)またはビオチン化ER-TR9(BMA Biomedicals Augst, Switzerland)抗体でインキュベートした。次いで、前記切片を室温で１時間、CD169に対してはCy3-抗ラットIgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)抗体で、またはCD11bおよびER-TR9に対してはCy3-ストレプトアビジン(Jackson ImmunoResearch)でインキュベートした。染色した切片をFluorSave(Calbiochem, La Jolla, CA)でマウントし、蛍光顕微鏡(Olympus IX-71)で観察した。
樹状細胞を検出するため、前記切片をビオチン化抗CD11c抗体(HL3, BD Biosciences)、その後、Cy3-ストレプトアビジンおよびAlexa488-抗B220抗体(RA3-6B2, BD Biosciences)で染色した。
【００６３】
実験例５．  注射したアポトーシス細胞のインビボ分布
Ｗ３細胞を5μMのCMFDA(Cell Tracker Green, Molecular Probe, Leiden, Netherland)で標識した。標識した細胞を、さらにＦａｓリガンドで4時間処理し、アポトーシスを誘導した。ウシ血清の混入を避けるため、細胞をPBS/1mg/mlマウス血清アルブミンで２回洗浄した。200 μl PBS/2.5%マウス血清中2 x 107個のCMFDA-標識Ｗ３アポトーシス細胞を、DT処置-WTマウスおよびCD169-DTRマウスに静脈内注射した。注射後種々の時点で脾臓を採取した。注射したアポトーシス細胞の分布を、免疫組織化学およびフローサイトメトリーにより解析した。
免疫組織化学の評価に関して、4μm厚の凍結切片を上述のように調製し、抗F4/80、抗ER-TR9および抗CD169または抗MAdCAM-1抗体で染色した。蛍光顕微鏡(IX71, Olympus, Tokyo, Japan)下で、スライドを観察した。
フローサイトメトリー解析のために、脾臓を100U/ml コラゲナーゼD(Roche)でフラッシュし、細いピンセットでほぐし、37℃で45分間、400U/mlコラゲナーゼDで消化した。消化後、抗CD11cマイクロビーズ(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)を用いて、脾臓DCをMACSソーティングで濃縮した。次いで、CD11c+ DCを、CD11c-PE、CD8α-PE またはCD11b-PE(BD Pharmingen)で染色し、FACS Calibur(BD Biosciences)で解析した。PEおよびCMFDAの二重陽性細胞を、投与したアポトーシス細胞を貪食したものとみなした。
【００６４】
結果
ＭＯＧ-発現死細胞の静脈内注射はＥＡＥの進行を抑制する。
ＭＯＧ35-55ペプチドと完全フロイントアジュバント(ＣＦＡ)とを併用して免疫すると、C57BL/6マウスでＥＡＥを誘導する。アポトーシス細胞を介するＭＯＧエピトープの送達がＥＡＥを予防するか否かを調べるため、ＭＯＧ断片を発現する形質転換体を樹立した。 細胞の形質膜にＭＯＧ断片を係留させるため、まずＭＯＧ 断片を膜貫通タンパク質に付着させた。図１Ａに示すように、ＭＯＧ32-97(ＭＯＧ−Ｓ)またはＭＯＧ1-120(ＭＯＧ−Ｌ)をコードするcDNAを、ヒトHB-EGF cDNAの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインと融合させ、キメラタンパク質cDNAをヒト伸長因子α遺伝子のプロモーターの下流に置き、マウスＦａｓを発現するマウスWR19L細胞(Ｗ３細胞)に導入した。ＦＡＣＳ解析により、キメラタンパク質はＷ３/ＭＯＧ−Ｓ細胞およびＷ３/ＭＯＧ−Ｌ細胞の細胞表面上に発現していることが明らかとなった(図１Ｂ)。全細胞溶解液を、抗HB-EGF抗体を用いるウエスタンブロッティングに供したところ、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｓ細胞は２６および２８ｋＤａの主要バンド、ならびにＷ３/ＭＯＧ−Ｌ細胞は３３および３５ｋＤａの主要バンドを示した(図１Ｃ、レーン2および3)。前記細胞において全長のHBEGF-MOG/FLAG融合タンパク質の発現を確認するため、細胞溶解液をマウス抗FLAG 抗体を用いる免疫沈降にも供し、免疫沈降物を抗HBEGF抗体またはヤギ抗ＭＯＧ抗体を用いるウエスタンブロッティングにより解析した。図１Ｃ、レーン4-9に示されるように、前記抗体を用いるブロッティングにより、レーン2および3と同じサイズのバンドが検出された。このことは、全長のキメラタンパク質がＷ３/ＭＯＧ−Ｓ細胞およびＷ３/ＭＯＧ−Ｌ細胞で発現していることを示す。Ｗ３細胞およびその形質転換体をＦａｓリガンドで処理した場合、前記細胞はアポトーシスを起こし、９５％を越える細胞が４時間以内にAnnexin V陽性を示した(図１Ｄ)。
【００６５】
2x 107個の前記アポトーシス細胞を、BL/6マウスに静脈内注射した。８日後、マウスをＭＯＧペプチドおよびＣＦＡで免疫し、ＥＡＥを誘導した。図２Ａに示すように、未処理BL/6マウスでは平均臨床スコア約４を有するＥＡＥが誘導された。Ｗ３アポトーシス細胞をマウスに注射した場合、当該マウスはＭＯＧ免疫によりＥＡＥを発症し、当該マウスのＥＡＥの臨床スコアは、前処理しないマウスでのスコアと差がなかった。他方、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞またはＷ３/ＭＯＧ−Ｓアポトーシス細胞をマウスに前もって注射すると、ＥＡＥの誘導は抑制された。Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞の注射はＷ３/ＭＯＧ−Ｓ細胞の注射よりもＥＡＥの抑制に対してより強い効果を有するので、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌ細胞をさらなる実験に用いた。
【００６６】
次に、本発明者らは、ＥＡＥを予防するため、種々の数のＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞を投与した。図２Ｂに示すように、2x107または1.2x107個のＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞を−８日目にマウスに静脈内注射した場合、ＥＡＥはほとんど完全に抑制された。他方、6x106個の細胞を投与すると、ＥＡＥを部分的に抑制した。このことは、ＥＡＥの抑制において、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞注射の効果は用量依存的であることを示す。
【００６７】
また、本発明者らは、ＭＯＧでの免疫後にＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞を投与するとＥＡＥの進行に何か効果があるか否かを調べた。図２Ｃに示すように、−８日目または−３日目にＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞を注射すると、ＥＡＥの進行が抑制された。他方、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞をＭＯＧ免疫の８日後に注射した場合、ＥＡＥの疾患重症度は、アポトーシス細胞で処理しないマウスとは相違なかった。このことは、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞の前処理はＥＡＥの進行の抑制に必要であることを示唆する。
【００６８】
次に、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞の皮下注射もＥＡＥの進行に抑制効果を有するか否かについて調べた。2x107個のＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞をマウス尾底部に皮下注射した場合、当該マウスにおけるＥＡＥの疾患重症度は低下しなかった(図２Ｄ)。このことは、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞を静脈内注射することがＥＡＥの抑制に必要であることを示唆する。
【００６９】
一般に、大量の抗原またはペプチドの静脈内注射は、当該抗原に対して免疫寛容を誘導しうる[Gammon, G., et al., Nature 342: 183-185, 1989; Kaufman, D. L., et al., Nature 366: 69-72, 1993]。したがって、免疫寛容効果という観点から、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞注射とＭＯＧペプチドの静脈内注射とを比較した。抗FLAG抗体を用いるウエスタンブロット解析により、2x107個のＷ３/ＭＯＧ−Ｌ細胞は2pmolのＭＯＧ断片を含むことが見積もられた。400pmolのペプチドを静脈内注射した場合でさえも(モル比でＭＯＧ断片よりも200倍多い)、ＥＡＥの進行は抑制されなかった(図２Ｅ)。このことは、ＥＡＥの進行の十分な抑制のためには、ＭＯＧ断片をアポトーシス細胞の成分として取り込むことが必要であることを示唆する。
【００７０】
Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞を注射したマウスにおけるＭＯＧ特異的Ｔ細胞応答
次に、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞を前もって注射することがＭＯＧ特異的Ｔ細胞の活性化を低下させるか否かについて調べた。2x107個のＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞を、マウスに静脈内注射した。注射後４日目に、ＭＯＧ35-55とＣＦＡを足蹠に皮下注射した。次いで、前記マウスから鼠径部リンパ節を取り出し、インビトロでリンパ節細胞をＭＯＧペプチドで再刺激した。図３Ａに示すように、ＭＯＧ特異的Ｔ細胞応答は、前処理しないマウス由来のリンパ細胞に比べて、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞で前処理したマウス由来のリンパ細胞で大幅に減少した。また、無関係な抗原に対するＴ細胞応答におけるアポトーシス細胞注射の効果も調べた。Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞をマウスに静脈内注射した後、ＫＬＨとＣＦＡを足蹠に皮下注射した。図３Ｂに示すように、ＫＬＨ特異的Ｔ細胞応答は、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞で前処理したマウスでは低下しなかった。また、Ｗ３またはＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞をマウスに静脈内注射し、注射後４日目に、ＭＯＧ35-55とＣＦＡを免疫した。そして１０日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞をＭＯＧ35-55存在下で培養したところ、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞を投与したマウスの脾臓細胞ではIFNγの産生量が低下していた（図３Ｃ）。以上の結果から、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞の注射はＭＯＧに対するＴ細胞応答を特異的に減少させることを示す。
【００７１】
Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞のホスファチジルセリン依存性食作用は免疫寛容の誘導に必要である
前述の結果から、静脈内注射したＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞は食細胞により貪食され、ＭＯＧ断片を食細胞に送達することが予想される。アポトーシス細胞を貪食するためには、食細胞がアポトーシス細胞に見出されるが生細胞には存在しないリガンドを認識しなければならない。かかるリガンドの一例として、ホスファチジルセリン(ＰＳ)があげられる。ＰＳは、細胞がアポトーシスを受けたときに細胞膜の外葉に暴露される。乳脂肪球-EGF-因子8(MFG-E8)は、C末端側の第VIII因子に相同なドメインを介して、アポトーシス細胞上に暴露したＰＳに特異的に結合する。MFG-E8はアポトーシス細胞と遭遇した場合、食細胞に発現したαvβ3 インテグリンにN末端側のEGF様ドメインを介して結合し、アポトーシス細胞の貪食を促進する[Hanayama, R., Tanaka, M., Miwa, K., Shinohara, A., Iwamatsu, A., and Nagata, S. (2002). Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes. Nature 417, 182-187.]。MFG-E8変異タンパク質であってRGDモチーフ内に点突然変異を有するＤ８９Ｅタンパク質が死細胞上のＰＳをマスキングすることによって様々な食細胞によるアポトーシス細胞の貪食に抑制効果を有すること、およびＤ８９Ｅタンパク質の静脈内注射がアポトーシス細胞のクリアランスを抑制することによってマウスにおける自己抗体の産生を誘導することを以前に示した[Asano, K., et al., J. Exp. Med. 200: 459-467, 2004]。そこで、次に、アポトーシス細胞によるＥＡＥの抑制に対するＤ８９Ｅの効果を調べた。−３日目に、1x107個のＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞を10μg/mlのＤ８９Ｅタンパク質とともにマウスに注射した後、０日目に、当該マウスをＭＯＧペプチドとＣＦＡとで免疫した。細胞の死骸をＤ８９Ｅタンパク質とともに注射した場合には、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞投与によるＥＡＥ抑制効果は部分的に打ち消された。この結果は、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞のホスファチジルセリン依存性貪食は、少なくとも部分的に、ＥＡＥに対するＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞の抑制効果に必要であることを示唆する。
【００７２】
CD11c-DTRマウスでの解析
どの種類の食細胞がアポトーシス細胞が介在する抗原特異的免疫寛容に必要であるかを調べるため、まず、CD11c-DTRマウスを使用した。このマウスでは、ジフテリア毒素（DT）の単回投与によりCD11c+樹状細胞の枯渇が生じる。−１１日目に、DTを前記マウスに腹腔内投与した。DT注射24時間でCD11c+DCは完全に枯渇しており、DT注射24時間後、2x107個のＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞を前記マウスに静脈内注射した。次いで、DCが完全に回復した場合に、０日目に前記マウスをＭＯＧペプチドとＣＦＡで免疫した。Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞の注射は、DTで処理したCD11c-DTR マウスにおいてＥＡＥを抑制しなかったが、野生型マウスでのDT処理は、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌ細胞注射によるＭＯＧに対する免疫寛容誘導に何の影響も与えなかった(データ示さず)。これらの結果は、CD11c+DCはアポトーシス細胞が介在する抗原特異的免疫寛容に関与することを示す。しかしながら、最近、Probstらは以下のように報告している。すなわち、CD11c-DTRマウスに対するDTの単回注射はDCの有効かつ一過性の枯渇を生じさせるばかりでなく、脾臓の辺縁帯に通常に存在する辺縁帯マクロファージおよび金属親和性マクロファージの完全かつ長期化した枯渇を生じさせる[Probst, H.C., et al., Clin. Exp. Immunol. 141: 398-404, 2005]。これらのマクロファージの枯渇は、DCの枯渇の二次作用というよりはむしろ、これらの細胞によるトランスジーンの異所性発現に起因するように思われる。DT処理CD11c-DTRマウスにおける前記マクロファージの予想外の枯渇も、免疫組織化学により確認した(データ示さず)。したがって、CD11c-DTRマウスを用いる解析において、辺縁帯マクロファージがアポトーシス細胞が介在する抗原特異的免疫寛容に対して何らかの効果を奏したという可能性を排除することはできなかった。
【００７３】
CD169-DTRマウスの作出
アポトーシス細胞関連抗原に対する免疫寛容の誘導に関して、脾臓の辺縁帯におけるマクロファージの役割を決定するために、DT投与により一過性に前記マクロファージが枯渇するトランスジェニックマウスを確立した。図４Ａに示すように、ヒトDTR cDNAを内在性CD169遺伝子の第１エキソン内のATG開始部位に導入した。CD169遺伝子は、辺縁帯金属親和性マクロファージに特異的に発現している(Crocker, P. R., and Gordon, S. (1989). Mouse macrophage hemagglutinin (sheep erythrocyte receptor) with specificity for sialylated glycoconjugates characterized by a monoclonal antibody. J Exp Med 169, 1333-1346)。ヒトDTRノックイン対立遺伝子を保有するヘテロ接合性ES細胞を胚盤胞で凝集し、CD169-DTRキメラマウスを作出した。次いで、キメラマウスをC57BL/6野生型マウスと交配し、CD169-DTRヘテロ接合性動物を作出した。CD169-DTRマウスの相同組換えは、サザンブロット解析により確認した(図４Ｂ)。
第１に、脾臓のどの種類の細胞がCD169-DTRマウスでDT注射により枯渇するのかを調べた。CD169抗原は免疫組織化学により金属親和性マクロファージで専ら検出されるので、CD169-DTRマウスではDT投与により金属親和性マクロファージのみが枯渇するであろうと予測した。しかしながら、DT注射は、金属親和性マクロファージ(CD169陽性細胞)の枯渇のみならず、辺縁帯マクロファージ (ER-TR9陽性細胞)の枯渇をも生じさせた。CD169 mRNAが金属親和性マクロファージ以外に辺縁帯マクロファージにも発現しているかどうかを調べるため、マイクロレーザー切開システムを用いて各細胞から全RNAを調製し、CD169特異的プライマーセットを用いてRT-PCRを行った。
辺縁帯マクロファージでの発現レベルは金属親和性マクロファージのレベルに比べて低かったけれども、両方のタイプの細胞でCD169 mRNAの発現が検出された(データ示さず)。このことは、DTRが辺縁帯において両方のマクロファージで発現していることを示し、両方のタイプの細胞はDT投与により枯渇した。他方、CD11b陽性赤脾髄マクロファージ、CD11c陽性DCおよび胚中心に存在する染色性マクロファージ(ＴＢＭ)は、DT投与により影響を受けなかった(図４Ｃおよびデータ示さず)。また、CD169-DTRマウスにおいて、マクロファージの枯渇の時間経過を調べた。10μg/kgのDTをトランスジェニックマウスに注射した場合、辺縁帯の２種のタイプのマクロファージは、DT投与後４８時間後に完全に枯渇し、DT注射７日後まで枯渇が持続した（図４Ｄ）。
【００７４】
CD169-DTRマウスにおける免疫寛容誘導の失敗
−１０日目に、DTを野生型マウスとCD169-DTRマウスに腹腔内に投与した。DT注射４日後、Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞を前記マウスに静脈内注射した。次いで、０日目に、前記マウスをＭＯＧペプチドとＣＦＡで免疫した。ＤＴ処理した野生型同腹仔ではＷ３/ＭＯＧ−Ｌ細胞の注射によりＥＡＥの抑制が観察されたが、ＤＴ処理したCD169-DTRマウスではＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞の投与によりＥＡＥの抑制が起こらなかった（図５Ａ)。
【００７５】
CD169-DTRマウスにおける注射したアポトーシス細胞のクリアランスの遅延
次に、DT処理CD169-DTRマウスの脾臓において注射したアポトーシス細胞がどのようにクリアランスされるかを調べた。蛍光標識したアポトーシス細胞をマウスに静脈内注射し、種々の細胞マーカーを用いて脾臓を免疫組織化学により分析した。図６に示すように、注射した細胞の死骸は、野生型マウスでは注射後３０分という速さで脾臓の辺縁帯に蓄積した。前記死骸は、MAdCAM-1陽性洞裏打細胞に沿って、辺縁帯のマクロファージの両方の層に存在した。次いで、蛍光が迅速に消滅し、注射２時間後少数の死骸しか観察できなかった。ＤＴ処理CD169-DTRマウスでは、注射したアポトーシス細胞は、野生型同様、注射後３０分で辺縁帯に集積したが、死骸のクリアランスは、野生型マウスの場合と比べて遅延し、かなりの数の蛍光標識された死骸が注射後２時間辺縁帯に残存していた。これらの結果は、辺縁帯のマクロファージが静脈内注射された死骸のクリアランスに重要な役割を果たしていることを示唆する。
【００７６】
CD169-DTRマウスにおけるCD8-樹状細胞による死細胞の異常な貪食
野生型CD169-DTRマウスにおいて、注射したアポトーシス細胞の樹状細胞による貪食を調べた。まず、脾臓におけるDCの集団および分布に対するDT投与の効果を分析した。CD11c+ DCは、野生型マウスにおいて、辺縁帯および白色脾髄のＴ細胞領域に主として位置している。DTをCD169-DTRマウスに注射した場合、CD11c+ DCは野生型マウスと同じ領域に観察され、このことは、DCの分布がDT処理CD169 DTRマウスで変化しないことを示す。FACS解析により、DT処理CD169-DTRマウスのDC集団もチェックした。図７Ｂに示すように野生型およびCD169-DTRマウスの両方において、全CD11c+ DCの集団もDCサブセット(CD8a+、CD11b- リンパ系DC およびCD8a-、CD11b+ 骨髄系DC)の亜集団も、DT処理により影響を受けなかった。これらの結果は、DT投与がCD169-DTRマウスの脾臓において、DCの分布と集団に何の影響も与えないことを示す。
次いで、辺縁帯マクロファージ枯渇マウスにおいて、注射したアポトーシス細胞のDCによる食作用を調べた。野生型およびCD169-DTRマウスをDTで処理し、処理4日後、蛍光標識したアポトーシス細胞をマウスに注射した。図７Ｃに示すように、野生型マウスにおいては、アポトーシス細胞は主としてCD11c+、CD8+、CD11b-リンパ系DCにより貪食され、CD8-、CD11b+ DC 骨髄系DCの少数の集団のみが死細胞の死骸を貪食した。他方、CD169-DTRマウスにおける死細胞を貪食するリンパ系DCの集団は野生型マウスとは相違しなかったけれども、DT処理CD169-DTRマウスでは、注射した細胞の死骸は主としてCD11b+ 骨髄系DCにより貪食された。これらの結果は、マクロファージの枯渇がCD8α陰性樹状細胞による死骸の異常な貪食を生じさせたことを示す。
【００７７】
本発明者らは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）の断片を発現するアポトーシス細胞を静脈内に注射するとＭＯＧ特異的な免疫寛容を誘導し、ＭＯＧの免疫により生じるＥＡＥの発症を予防することを示した。注射したアポトーシス細胞表面のホスファチジルセリン（ＰＳ）をマスキングすると予防効果が取り消された。このことから、前記予防効果は死細胞の食細胞によるＰＳ依存的食作用を要することが示唆された。注射されたアポトーシス細胞は迅速に脾臓の辺縁帯に蓄積されたので、ジフテリアトキシン受容体トランスジェニックマウスを用いて、辺縁帯におけるマクロファージの役割を調べた。前記トランスジェニックマウスは、ＤＴの注入により辺縁帯におけるマクロファージが特異的に消失する。前記トランスジェニックマウスを用いた解析により、辺縁帯に存在するマクロファージは循環するアポトーシス細胞のクリアランスのみならず、ＣＤ８陽性ＤＣによる循環死細胞の選択的貪食をも制御すること、ならびに、これらのマクロファージの機能喪失が細胞関連抗原に対する免疫寛容誘導の異常を引き起こすことが明らかになった。
【００７８】
自己免疫寛容を維持するため、自己反応性Ｔ細胞は最初に胸腺から除去される。胸腺での主要な免疫寛容事象を補完するため、回避した自己反応性Ｔ細胞は末梢器官でさらに除去される。自己抗原に対する末梢での免疫寛容は、末梢組織に存在する樹状細胞を始めとする抗原提示細胞が介在すると思われる。常在するDCは、正常の組織のターンオーバー中に産生されるアポトーシス細胞を常に貪食しており、流入リンパ節に移動し、そこでは、DCが細胞の死骸から得られた細胞関連抗原の提示によりCD4およびCD8Ｔ細胞の免疫寛容を誘導する。リンパ節に常在するDCにより誘導される末梢の免疫寛容に加え、脾臓中の食細胞は、循環する死細胞から提供される自己抗原を提示し、自己免疫寛容を誘導する。ここで、ＭＯＧ断片を発現するアポトーシス細胞の静脈内注射がＭＯＧ特異的Ｔ細胞免疫寛容を誘導することおよびＥＡＥの進行を予防することを示した。免疫寛容の誘導は、可溶性抗原の注射により達成可能である。しかし抗原が死細胞の死骸に結合している場合は、免疫寛容の誘導には、可溶性抗原に比べて、より少ない量の抗原でよい。この効率は、アポトーシス細胞の死骸の貪食に関連した抗原の効率的なエンドサイトーシスに帰結する可能性がある。さらに、アポトーシス細胞の貪食は、TGFβおよびIL-10等の免疫抑制サイトカインの分泌を含む免疫制御作用を有する。これは、細胞結合抗原に対する免疫寛容を促進する可能性がある。したがって、死細胞の注射を介する抗原の送達は、免疫応答を制御する強力な候補となりうる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、Ｗ３−ＭＯＧ細胞におけるＨＢ−ＥＧＦ−ＭＯＧ融合タンパク質の発現を示す。(A) ＨＢ−ＥＧＦ−ＭＯＧ融合タンパク質構築物の概略図。ＭＯＧのアミノ酸32-97位（ＨＢ−ＥＧＦ−ＭＯＧ−Ｓ）または1-120位（ＨＢ−ＥＧＦ−ＭＯＧ−Ｌ）を、ヒトヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子(ＨＢ−ＥＧＦ)のシグナル(SIG)、細胞外(EC)および膜貫通(TM)ドメインのＣ末端に付加した。 (B) 形質転換体の細胞表面上でのＨＢ−ＥＧＦ−ＭＯＧ/ＦＬＡＧの発現。Ｗ３細胞、およびＨＢ−ＥＧＦ−ＭＯＧ−Ｓ(Ｗ３/ＭＯＧ−Ｓ)またはＨＢ−ＥＧＦ−ＭＯＧ−Ｌ(Ｗ３/ＭＯＧ−Ｌ)を発現するその形質転換体を、Alexa Fluor 488結合抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した。(C) 形質転換体におけるＨＢ−ＥＧＦ−ＭＯＧタンパク質の免疫学的検出。Ｗ３細胞(レーン1、4、7)、ＭＯＧ−Ｓ発現Ｗ３細胞(レーン2、5、8)またはＭＯＧ−Ｌ発現Ｗ３細胞(レーン3、6、9)をＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。ヤギ抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体(レーン1-3)を用いて、溶解液をウエスタンブロッティングで解析した。全長のＨＢ−ＥＧＦ−ＭＯＧ/ＦＬＡＧ融合タンパク質の発現を確認するため、細胞溶解液をマウス抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降した。免疫沈降物を、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体(レーン4- 6)またはヤギ抗ＭＯＧ抗体(レーン7-9)を用いてウエスタンブロッティングで解析した。(D) Ｗ３細胞およびその形質転換体におけるアポトーシスの誘導。Ｗ３細胞およびその形質転換体を、組換えＦａｓＬの存在下、または非存在下で4時間処理した。次いで、細胞をPE結合Annexin Vで染色し、フローサイトメーターで解析した。95％を越えるＷ３細胞およびＷ３/ＭＯＧ細胞がＦａｓリガンド処理によりアポトーシスを受けた。前記細胞の非アポトーシス細胞の解析を点線で示す。
【図２】図２は、Ｗ３/ＭＯＧアポトーシス細胞の静脈内投与はＥＡＥの進行を防止することを示すグラフである。(A) 2x107個のＷ３細胞またはその形質転換体Ｗ３/ＭＯＧ−Ｓ細胞もしくはＷ３/ＭＯＧ−Ｌ細胞を、組換えＦａｓＬで処理し、アポトーシスを誘導した。次いで、−８日目に、細胞の死骸をC57BL/6マウスに静脈内注射した。８日後、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化させたＭＯＧ35-55ペプチドでマウスを免疫した(０日目)。各マウスの疾患重症度を点数化し、示された時点の平均臨床スコアをプロットした。これらの結果は、３個の独立した実験の典型例である。(B) ＥＡＥにおけるアポトーシス細胞注射の用量依存的効果。示された数のＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞を−４日目にC57BL/6マウスに注射した後、０日目に、ＣＦＡで乳化させたＭＯＧ35-55ペプチドで免疫した。各マウスの疾患重症度を点数化し、示された時点の平均臨床スコアをプロットした。これらの結果は、３個の独立した実験の典型例である。(C) アポトーシス細胞での前処理はＥＡＥの抑制に必須である。マウスを、−８日目、−３日目または８日目に2x107個のＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞で処理した。ＭＯＧのＣＦＡ乳化液での免疫を０日目に行い、ＥＡＥを誘導した。各マウスの疾患重症度を点数化し、示された時点の平均臨床スコアをプロットした。これらの結果は、３個の独立した実験の典型例である。(D)アポトーシス細胞の皮下注射はＥＡＥを抑制しない。2x107個のＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞を、−６日目にC57BL/6マウスの尾底部に皮下注射した。６日後、ＭＯＧペプチドのＣＦＡ乳化液を、免疫した部位と同じ部位に免疫した。各マウスの疾患重症度を点数化し、示された時点の平均臨床スコアをプロットした。これらの結果は、３個の独立した実験の典型例である。(E) ＭＯＧ35-55ペプチドの皮下注射はＥＡＥに対する免疫寛容を誘導しない。１μｇのＭＯＧ35-55ペプチド（2x107個のＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞で発現しているＭＯＧ断片と比べてモル比で２００倍を超える量に相当する）を、−４日目にC57BL/6マウスに皮下注射した。４日後、ＭＯＧ35-55ペプチドのＣＦＡ乳化液を、前記マウスに免疫した。各マウスの疾患重症度を点数化し、示された時点の平均臨床スコアをプロットした。これらの結果は、２個の独立した実験の典型例である。
【図３】図３は、Ｗ３/ＭＯＧアポトーシス細胞の投与はマウスに抗原特異的Ｔ細胞の不応答を誘導することを示すグラフである。  2x107個のＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞をマウスに静脈内注射した。３日後、100μgのＭＯＧ35-55(A)またはＫＬＨ(B)のＣＦＡ乳化液を、両方の足蹠に皮下注射した。免疫後５日目に、マウスからひざ後面および鼠径部のリンパ節を採取した。5x105個のリンパ節細胞を、ＭＯＧ35-55(A)またはＫＬＨ(B)で７０時間、インビトロで再刺激した。培養の最終２０時間において、Ｔ細胞の増殖を[3H]チミジンの取り込みに基づいて定量した。アッセイを三連で行い、平均値をs.d.とともに示す。(C)アポトーシス細胞の注射は脾細胞でＩＦＮ−γの産生を低下させる。2x107個のＷ３アポトーシス細胞またはＷ３/ＭＯＧ−Ｌアポトーシス細胞をマウスに静脈内注射し（−４日目）、ＭＯＧ35-55で免疫した（０日目）。免疫後１０日目で脾細胞を取り出し、インビトロでＭＯＧ35-55を用いて７２時間再刺激した。ＩＦＮ−γの産生をＥＬＩＳＡで測定した。平均値をＳＥＭとともに示す。*ｐ＜０．０５。これらの結果は３個の独立した実験の典型例である。
【図４】図４は、CD169-DTRマウスの作出を示す。(A) CD169-DTRターゲティングコンストラクトの概略図。CD169遺伝子のエキソンを黒塗りのボックスで示す。ターゲティングコンストラクトにおいて、ヒトジフテリアトキシン受容体(hDTR)cDNA、loxPに隣接するネオマイシン耐性遺伝子(neo)、およびチミジンキナーゼ遺伝子(TK)を白抜きボックスで示す。サザンブロット解析に使用したプローブを、予想されるハイブリダイズ断片とともに実線で示す。(B) BglII消化物と、示されたプローブとを組合せて用いた、野生型(+/+)およびCD169-DTR(+/CD169DTR)マウスのゲノムサザンブロット解析。(C) CD169-DTRマウスにおけるDT投与後の辺縁帯マクロファージの枯渇。示された量のDTを、野生型(+/+)またはCD169-DTR(+/CD169DTR)マウスの腹腔内に注射した。DT投与４８時間後、前記マウスから脾臓を取り出した。脾臓切片を、CD11b、ER-TR9およびCD169をそれぞれ赤脾髄マクロファージ、辺縁帯マクロファージおよび辺縁金属親和性マクロファージの指標に用いて、免疫染色した。(D) 10μg/kgのDTを、野生型マウス(+/+)およびCD169-DTR(+/CD169DTR)マウスに腹腔内に注射した。DT投与後所定の日に、前記マウスから脾臓を取り出し、前記(C)と同様にER-TR9およびCD169について免疫染色した。
【図５】図５は、辺縁帯マクロファージ枯渇後、アポトーシス細胞が介在する免疫寛容誘導が起こらないことを示す。  10μg/kgのDTを、野生型(+/+)またはCD169-DTR(+/CD169DTR)マウスに−８日目に腹腔内注射した。−４日目に、2x107細胞のＷ３アポトーシス細胞またはＷ３/ＭＯＧ―Ｌアポトーシス細胞を前記マウスに静脈内注射した後、０日目にＭＯＧ35-55のＣＦＡ乳化液で免疫した。(A)各マウスの疾患重症度を計数し、所定の時点の平均臨床スコアをプロットした。(B)免疫後１８日に脊髄を取り出し、パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。パラフィン切片をヘマトキシリン−エオジン染色した。これらの結果は、３個の独立した実験の典型例である。
【図６】図６は、DT処理CD169-DTRマウスにおけるアポトーシス細胞クリアランスの遅延を示す。  10μg/kgのDTを、野生型(+/+)またはCD169-DTR(+/CD169DTR)マウスに腹腔内注射した。DT処理４日後、CMFDA-標識した（緑色）Ｗ３/ＭＯＧ―Ｌアポトーシス細胞(2x107細胞)を静脈内注射し、注射後所定の時点で脾臓を得た。脾臓の凍結切片を、F4/80(赤脾髄マクロファージ)、ER-TR9(辺縁帯マクロファージ)、CD169(辺縁金属親和性マクロファージ)およびMAdCAM-1(辺縁洞裏打細胞)で染色した（赤色）。これらの結果は、３個の独立した実験の典型例である。
【図７】図７は、辺縁帯マクロファージ枯渇マウスにおいてCD11b+樹状細胞によるアポトーシス細胞の異常な貪食を示す。  10μg/kgのDTを、野生型(+/+)またはCD169-DTR(+/CD169DTR)マウスに腹腔内注射した。(A、B)DT処理４日後、脾臓を取り出した。(A)脾臓の凍結切片を、CD11c(DC)およびB220(B細胞)で染色した。(B)脾臓細胞の単一細胞懸濁液を、CD11c単独(全DC)またはCD8α（リンパ系DC）またはCD11b(骨髄系DC)との組合せで染色し、フローサイトメトリーで解析した。(C、D)DT処理４日後、CMFDA-標識Ｗ３アポトーシス細胞(2x107細胞)を静脈内注射し、注射後所定の時点で脾臓を取り出した。脾臓のDCを、抗CD11cミクロビーズを用いてセルソーティングで濃縮し、CD11c-PEまたはCD8α-PEまたはCD11b-PEで染色した。PEおよびCMFDAの二重陽性細胞を、注射したアポトーシス細胞を貪食したものと見なした。(C)DC亜型によるアポトーシス細胞の貪食の動態(D)注射1時間後、DC亜型によるアポトーシス細胞の貪食。  (B)及び(D)において、結果は３個の独立した実験の典型例であり、平均値をs.d.とともに示す。*ｐ＜０．０１。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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