(57)【要約】【課題】安定化剤の選定によりp-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の保存安定性を向上させ酵素製品の長期安定性を可能にする。  【解決手段】α−シクロデキストリン、イノシトール、スクロース、ソルビトース、クエン酸、グルコン酸ナトリウム、ＢＳＡ、アラビトール、ＥＤＴＡ・３ナトリウムのうち少なくとも１種を安定化剤として添加する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）に記載された少なくとも１種を安定化剤として添加することを特徴とするp-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の安定化方法。
（Ａ）α−シクロデキストリン、イノシトール、スクロース、ソルビトース、クエン酸、グルコン酸ナトリウム、ＢＳＡ、アラビトール、ＥＤＴＡ・３ナトリウム
【請求項２】
以下の（Ａ）およびマンニトールおよび/またはフラビンアデニンジヌクレオチドを添加することを特徴とする請求項１記載の方法。
（Ａ）α−シクロデキストリン、イノシトール、スクロース、ソルビトース、クエン酸、グルコン酸ナトリウム、ＢＳＡ、アラビトール、ＥＤＴＡ・３ナトリウム
【請求項３】
以下の（Ａ）に記載された少なくとも１種を含むp-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素水溶液を凍結乾燥することを特徴とする安定化されたp-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素凍結乾燥品の製造方法。
（Ａ）α−シクロデキストリン、イノシトール、スクロース、ソルビトース、クエン酸、グルコン酸ナトリウム、ＢＳＡ、アラビトール、ＥＤＴＡ・３ナトリウム
【請求項４】
以下の（Ａ）およびマンニトールおよび/またはフラビンアデニンジヌクレオチドを添加することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
以下の（Ａ）に記載された少なくとも１種を含むp-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素水溶液を凍結乾燥されたことを特徴とする安定化されたp-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素凍結乾燥組成物。
【請求項６】
以下の（Ａ）およびマンニトールおよび/またはフラビンアデニンジヌクレオチドを添加することを特徴とする請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、p-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の安定化に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内のコリンエステラーゼは農薬・殺虫剤などの薬物に暴露した場合、活性が阻害されることが知られており、薬物中毒症の診断に有用なマーカーである。
コリンエステラーゼを測定する方法は数種類知られているが、正確性、迅速性、経済性などの点で酵素法が優れており、特にp-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素とプロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼを使用した測定法が優れており、これらの酵素の製造方法および酵素を用いた分析方法に関して多くの報告がある。
【特許文献１】特開昭５８−１２９９９９
【特許文献２】特許登録番号２７５６８００
【特許文献３】特開２００４−３３０２９
【０００３】
p-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の安定化剤は従来より検討されてきたが、臨床診断薬用途に必要なレベルには至っておらず、さらに安定性を向上させる方法が望まれていた。
【特許文献４】特開昭５９−２５６８４
【０００４】
酵素製品の安定性が不良であることは、派生する管理業務、分析業務が増えることを意味する。
【０００５】
さらに、酵素法で測定試薬を調整する際、添加すべき活性量は正確に秤量されなければならないが、活性変動が大きな酵素粉末を取り扱う場合、調合の都度、その時点の活性を測定し添加量を計算し直さなければならない。酵素粉末の力価を正確に評価するためには、粉末の秤量・溶解、測定用試薬の調整を含め熟練した分析作業員でも半日が必要であり、作業負担が大きい。
【０００６】
酵素の活性が低下していくことは、活性で評価される酵素製品の価値が低下するだけでなく、失活した酵素タンパク質の析出により濁りの生成を招き、これらを原料とした分析試薬の性能に致命的な欠陥を与える。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、安定化剤の選定によりp-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の保存安定性を向上させ酵素製品の長期安定性を可能にするとともに、活性変動により派生する管理業務・分析業務を低減させ、失活した酵素タンパク質がコリンエステラーゼ測定試薬中で析出することによって生じる不具合を回避することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者はp-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の安定性を向上させるために当該酵素の安定化剤となり得る物質を種々検討し、p-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の安定化効果を有するものを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［項１］
以下の（Ａ）に記載された少なくとも１種を安定化剤として添加することを特徴とするp-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の安定化方法。
（Ａ）α−シクロデキストリン、イノシトール、スクロース、ソルビトース、クエン酸、グルコン酸ナトリウム、ＢＳＡ、アラビトール、ＥＤＴＡ・３ナトリウム
［項２］
以下の（Ａ）およびマンニトールおよび/またはフラビンアデニンジヌクレオチドを添加することを特徴とする項１記載の方法。
（Ａ）α−シクロデキストリン、イノシトール、スクロース、ソルビトース、クエン酸、グルコン酸ナトリウム、ＢＳＡ、アラビトール、ＥＤＴＡ・３ナトリウム
［項３］
以下の（Ａ）に記載された少なくとも１種を含むp-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素水溶液を凍結乾燥することを特徴とする安定化されたp-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素凍結乾燥品の製造方法。
（Ａ）α−シクロデキストリン、イノシトール、スクロース、ソルビトース、クエン酸、グルコン酸ナトリウム、ＢＳＡ、アラビトール、ＥＤＴＡ・３ナトリウム
［項４］
以下の（Ａ）およびマンニトールおよび/またはフラビンアデニンジヌクレオチドを添加することを特徴とする項３記載の方法。
［項５］
以下の（Ａ）に記載された少なくとも１種を含むp-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素水溶液を凍結乾燥されたことを特徴とする安定化されたp-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素凍結乾燥組成物。
［項６］
以下の（Ａ）およびマンニトールおよび/またはフラビンアデニンジヌクレオチドを添加することを特徴とする項５記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によりp-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の安定性が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
P-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素は、ＥＣ１．１４．１３．２に分類される酵素である。
【００１３】
本発明において安定化の対象となるP-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の由来は特に限定されない。例えば、シュードモナス・デスモテリカ、シュードモナス・ダキューネ、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレッセンス等から生産される。
【００１４】
本発明は、P-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の安定化剤に、α−シクロデキストリン、イノシトール、スクロース、ソルビトース、クエン酸、グルコン酸ナトリウム、ＢＳＡ、アラビトール、ＥＤＴＡ・３ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも１種を使用し、さらにマンニトールおよび/またはフラビンアデニンジヌクレオチド（以下ＦＡＤと略す）を含んでもよい。
【００１５】
本発明で言うP-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素組成物の形態は、乾燥粉末品、凍結乾燥品、懸濁液、溶液など形状を問わない。一般に、安定性の面からは乾燥品（とくに凍結乾燥品）が優れる。また、取扱いの面からは液状品（とくに溶液）が優れる。
また、別の面では、本発明の組成物は、例えば体外診断用医薬品向け酵素製剤や、コリンエステラーゼを測定するための体外診断用医薬品として製品化されうる。これらの製品形態としては、さらに必要なものを組み合わせてキット化したものであっても良い。
【００１６】
本発明のP-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素組成物には、さらに必要によりその他の成分を含む場合がある。あるいは、必要によりその他の成分の含有量を制限する方が好ましい場合がある。
【００１７】
本酵素を製品化する場合、種々の緩衝液を添加することができる。緩衝液の種類は特に限定されず、生化学の分野で一般的なものを使用する事が出来るが、酵素の安定ｐＨ域に緩衝能のある物が好ましい。例えば、リン酸カリウム塩（Ｋ−リン酸）、リン酸ナトリウム塩、トリス塩、酢酸、りんご酸、マレイン酸などの有機酸塩、ＰＩＰＥＳ，ＴＥＳ，ＭＯＰＳ，ＨＥＰＥＳ、ＢｉｓＴｒｉｓ，Ｂｉｃｉｎｅ等の各種Ｇｏｏｄ ｂｕｆｆｅｒを使用出来る。本発明者らの検討によれば、例えば、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ由来のP-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の場合、この酵素のｐＨ安定域から製品化時の下限は好ましくは５．０、さらに好ましくは５．５、最も好ましくは６．０である。ｐＨ上限は好ましくは７．５、さらに好ましくは７．０、更に好ましくは６．５である。
【００１８】
緩衝液濃度は希薄過ぎると緩衝能が弱いため、酵素溶液のｐＨが変動し易く好ましくない。逆に高濃度緩衝液を用いて凍結乾燥する場合、酵素液を凍結する過程でその一部が不凍液となり、製品中酵素の失活や、粉末形状および溶解性の不良を招くため、過度に高濃度な緩衝液の使用は避けるべきである。これらのことより緩衝液濃度の下限は５ｍＭ以上、好ましくは１０ｍＭ以上である。緩衝液濃度の上限は１０００ｍＭ以下、好ましくは８００ｍＭ以下、更に好ましくは６００ｍＭ以下である。
【００１９】
本発明で用いる安定化剤の添加量は酵素に対して少なすぎると効果が無く、逆に多すぎても製品中の酵素蛋白が希釈されてしまい失活を招くことがある。安定化剤の添加量と酵素の添加量の比率が同じであっても、安定化効果は、さらに酵素蛋白質の濃度によっても変動する。一般的に、酵素濃度が高いと、必要な安定化剤の添加濃度の範囲は低下する傾向にあると考えられる。
【００２０】
P-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素を凍結乾燥品にする場合、酵素溶液の蛋白濃度は、希薄過ぎると凍結乾燥投入時の液量が大きくなり乾燥に長時間を要し、精製する氷の結晶も大きくなるため乾燥中の活性低下の原因になり得る。逆に蛋白濃度が高すぎると乾燥品化した場合に溶解に長時間要するようになるとともに、蛋白質が析出して濁質を生成し易くなる。濁質生成量が大きい場合活性回収率の低下を招く。
【００２１】
本発明において、凍結乾燥品を製造する場合、乾燥酵素タンパク質の乾燥重量１に対して安定化剤の添加重量の下限は０．０２、好ましくは０．０５、更に好ましくは０．１である。添加重量の上限は５０、好ましくは３０、更に好ましくは１０である。
ただし、発明の効果を引き出すには、酵素タンパクと安定化剤の濃度比が全てではない。凍結乾燥に供する溶液の酵素タンパク、安定化剤、緩衝液成分を含めた固形分濃度も考慮の対象とすべきで、固形分が凍結乾燥に適した濃度に設定されることが重要である。固形分濃度の下限は３ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは１０ｍｇ／ｍｌである。固形物濃度の上限は、３５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２５０ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは１５０ｍｇ／ｍｌである。
酵素タンパク質の濃度と添加すべき安定化剤の濃度、選定した安定化剤の溶解性等から、最適な濃度条件を設定することは酵素を製品化するにあたって当然である。
【００２２】
液状品では、安定化剤の添加量下限は溶液の重量に対して好ましくは０．０５％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは０．１％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは１％（ｗ／ｗ）である。添加量上限は酵素蛋白重量に対して好ましくは２０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは１０％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは５％（ｗ／ｗ）である。
もちろん、物質によって水に対する溶解度が異なっているため、安定化剤として選定した物質の溶解度を考慮し、酵素の安定化効果の高い、適切なタンパク濃度と安定化剤濃度の組み合わせを選ぶ事が重要である。
【００２３】
酵素は蛋白質であるため本質的に保存中に徐々に劣化変性し活性が低下していくものであり、製品の安定化は、初期活性の完全保持を意味しない。本発明で言う安定化は製品保存後の活性残存率が高いことを言い、具体的には、３７℃で１週間保管した場合の活性残存率が７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上保持する事を言う。乾燥品の場合は、好ましくは、乾燥品中の酵素蛋白含量が２５％（ｗ／ｗ）から７５％（ｗ／ｗ）である製品を、乾燥条件下で保管した場合である。また、液状品の場合は、好ましくは、液中のP-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の酵素蛋白含濃度が０．１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌである製品を保管した場合である。
【００２４】
本発明で用いる安定化剤としての上記の試薬類、あるいは、本発明に必要により添加される上記の試薬類は、いずれも市販されているものを使用することができる。
【００２５】
酵素の安定化剤として使用するためには、一般に市販され容易に入手可能である事が望ましいが、やむを得ず市販品が得られない場合や、コスト削減などの事情により、種々の公知の手段により合成しても良い。
【実施例】
【００２６】
以下実施例を挙げて発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２７】
P-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素は東洋紡績製：製品コードＨＢＨ−３０１を使用した。
【００２８】
P-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の酵素活性は、P-ヒドロキシ安息香酸を基質とし、補酵素であるＮＡＤＰＨの消失量を３４０ｎｍの吸光度の変化で測定することにより測定した。具体的方法を以下に示す。
５．０ｍＭ P-ヒドロキシ安息香酸溶液（用事調整）、０．２ｍＭ ＦＡＤ溶液（用事調整）、３ｍＭ ＮＡＤＰＨ溶液（用事調整）、５０ｍＭ トリスマレイン酸緩衝液（ｐＨ８．２（２５℃））を調製する。
次に、これらを用いて以下のように反応混液を調整する。
２１ｍｌトリスマレイン酸緩衝液
３ｍｌP-ヒドロキシ安息香酸溶液
３ｍl ＦＡＤ溶液
３ｍｌＮＡＤＰＨ溶液
また、測定試料（酵素溶液）は、予め氷冷した０．２％ＢＳＡを含む５０ｍＭＫ−リン酸
緩衝液（ｐＨ６．０（２５℃））で１．０ｍｇ／ｍｌ以上溶解し、分析直前に同緩衝液で０．２〜０．６Ｕ／ｍｌに希釈した。
各反応は、反応混液を３．０ｍｌ取り、３７℃で約５分間予備加温した後、測定試料（酵素溶液）０．０５ｍｌを添加し、混和後、３７℃に制御された分光光度計で３４０ｎｍの吸光度を３〜４分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化を求めた（ΔＯＤｔｅｓｔ）。盲検（ｂｌａｎｋ）は酵素溶液の代わりに水を０．０５ｍｌ加え上記同様に操作を行って１分間当りの吸光度変化量を求めた（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。
得られた吸光度変化量より下記計算式に基づきP-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の酵素活性を算出した。なお上記条件下で１分間に１マイクロモルのＮＡＤＰＨを酸化する酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
計算式
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×３．０５（ｍｌ）×希釈倍率｝／｛６．２２×１．０（ｃｍ）×０．０５（ｍｌ）｝
３．０５ｍｌ＝反応混液液量
３．８＝ＮＡＤＰＨの上記測定条件下でのミリモル分子吸光係数
１．０ｃｍ＝セルの光路長
０．０５ｍｌ＝酵素サンプル液量
【００２９】
［実施例−１］
P-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素を５０ｍＭのＫ−リン酸緩衝液 ｐＨ６．０で３０ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌの濃度に調製し、添加剤をそれぞれ２０ｍｇ／ｍｌになるように添加溶解し、これを凍結乾燥により粉末化した。
得られた凍結乾燥粉末を乾燥条件下３７℃で１週間保存し、初期活性を１００％として活性残存率を求めた。結果を（表１）に示す。
【００３０】
【表１】
2008206491.tif 000002
【００３１】
この結果から解るように、上記添加剤と共に凍結乾燥した場合、P-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の安定化効果がみられる。 
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、p-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素とプロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼを使用したコリンエステラーゼ測定法に利用することができる。コリンエステラーゼは農薬・殺虫剤などの薬物に暴露した場合、活性が阻害されることが知られており、薬物中毒症の診断に有用なマーカーである。