(57)【要約】【課題】タンパク質の立体構造予測において、構造予測対象となるタンパク質の、どの部分から最初に折り畳みを開始し、ついでどの部分が折り畳み、最終的にどの部分が折り畳むのかを、そのタンパク質のアミノ酸残基配列の特徴から特定する方法の開発が課題である。【解決手段】構造予測対象タンパク質のアミノ酸残基配列を、ながさn（n=５〜９）の断片に分け、各断片の配列断片がさまざまな立体構造をとった場合の多次元平均力場ポテンシャルに基づく配列断片のエントロピーを求め、このエントロピーの値が小さい順に立体構造の折り畳みが進行すると予測する。【選択図】図１
2008146529.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
与えられたタンパク質の折り畳み過程を推定する方法において折り畳みが進行していく過程での折り畳みの順序（配列上のどの部分から折り畳みが始まり、順次折り畳みが進行し、そして、最後に最終構造に到るように折り畳むまでの折り畳み順序）を推定する方法であって、与えられたタンパク質のアミノ酸残基配列Xのi番目のアミノ酸残基から連続する残基n個分の部分配列断片x(n,i)からの、その配列断片が様々な可能な構造とり、その際にとる各構造に対応したエネルギー値を考慮して得られる配列断片の構造エントロピーS(n,i)を計算するステップと、この配列断片エントロピーS(n,i)を配列Xで可能な全ての i について計算するステップとを有し、この配列断片エントロピーS(n,i)が最も小さいi=I である配列断片のある場所から折り畳みが開始され、順じS(n,i)が小さい順にそれに対応する部分配列の領域から折り畳みが進行すると推定することを特徴とする、タンパク質折り畳み順序予測法。
【請求項２】
請求項１において、配列断片エントロピーS(n,i)を計算する際に、エントロピーの統計力学的定義に基づき、部分配列断片x(n,i)をタンパク質立体構造データベースから選ばれたK個のテンプレートタンパク質構造の長さn残基の全ての可能な部分構造断片c(k,n,j)に当てはめ（ここでkはK個の中の一つをあらわし、n は断片長、jはこの構造断片が、j番目のアミノ酸残基かから始まることをあらわす）配列断片x(n,i)が、構造断片c(k,n,j)の構造をとったときの配列断片エネルギー値Ex(n,i,k,j)を計算するステップと、各構造断片c(k,n,j)それぞれの頻度から得られる構造頻度Pc(k,n,j)を計算するステップと、配列断片エネルギー値Ex(n,i,k,j)、およびPc(k,n,j)を可能な全てのk,j に対して計算して得られる配列断片エントロピーS(n,i)を計算するステップを有する配列断片エントロピー計算法。
【請求項３】
請求項１において各s(n,i)を、c(k,n,j)に当てはめてエネルギー値を計算し、これをすべてのk,j について行うステップにおいて、配列断片エネルギー値Ex(n,i,k,j)と構造頻度確率から推定される構造エネルギーEc(k,n,j)との和として得られる配列断片エネルギー総和 E(n,i,k,j)が最も小さくなったときのk,j   を記憶しておくステップを有し、後に、配列断片エントロピーS(n,i)がもっとも小さくなる  i=Iである断片については、このエネルギー値がもっとも小さくなった構造断片 c(k,n,j)  が、当該部分の部分配列 x(n,i=I)が最終的な立体構造において取る構造と非常に近いと予測することを特徴とする部分構造予測法。
【請求項４】
請求項１および請求項２における配列断片x(n,i)を構造断片c(k,n,j)に当てはめてエネルギーの計算をするステップにおいて、タンパク質の立体構造データベースから抽出され定義される平均力場ポテンシャルの総和として配列断片エネルギーEx(n,i,k,j)計算をすることを特徴とするタンパク質折り畳み順序予測法。
【請求項５】
請求項4において、平均力場ポテンシャルが、対を構成するアミノ酸残基種、配列上での相対配置（i番目のアミノ酸残基とj番目のアミノ酸残基との相対配置は i-j で与えられる、及び空間内のアミノ酸残基の相対配置に基づいて定義され、その中で、とくに空間内のアミノ酸残基の相対配置として、アミノ酸残基間距離だけでなく、一方のアミノ酸残基からみた他方の位置、姿勢をも考慮した多次元拡張された平均力場ポテンシャルを用いて構造断片エネルギーを計算することを特徴とするタンパク質折り畳み順序予測法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、立体構造未知のタンパク質の立体構造をアミノ酸配列から予測する立体構造予測法の一部となるタンパク質の折り畳みの順序を推定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、生体アミノ酸とされる２０種類が、数百程度ペプチド結合してできた鎖状の高分子が、折り畳みによって特定の三次元形状で安定状態を取っているものである。各タンパク質の特定の三次元形状は、立体構造と呼ばれ、これはタンパク質の機能に深く関連している。特に多くのタンパク質に共通する分子認識機能は、この立体構造中の特定の領域が特定の分子と特異的に結合することによって実現されている。
【０００３】
それぞれのタンパク質の立体構造は、X線結晶解析や、核磁気共鳴（NMR）によって求めることができる。X線結晶解析においては、まず一種類のタンパク質の単結晶を作る必要があり、この単結晶化がうまくできない場合、X線結晶解析ができない。またNMRでは結晶化の必要はなく、水溶液中の立体構造を求めることができるが、大きなタンパク質では立体構造に関する多くの情報が得られず、必ずしも立体構造が正確に求められるわけではない。現在までに判明しているタンパク質の立体構造を集めたデータベースPDB(Protein Data Bank)には、現在数万種類のタンパク質が登録されているが、この数が年々増えているとはいえ、すでに毎日のように判明しているDNAの配列データベースなどと比べた場合、登録されている数はかなり少ない。
【０００４】
それは、X線結晶解析やNMRによって一つのタンパク質の立体構造を決定するのに、数ヶ月から１年以上かかる場合があるからである。一方、立体構造は不明であってもアミノ酸残基配列は、遺伝子情報から、あるいはタンパク質直接であっても比較的簡単に求められる。よって、立体構造が判明していなくても、配列が判明しているタンパク質は、立体構造の判明しているものの１０倍以上存在する。そのことから、タンパク質の立体構造を、アミノ酸残基配列から予測する技術が必要とされているのである。
【０００５】
タンパク質は、前記のようにアミノ酸が数百結合した鎖状分子である。すなわち、鎖にそった主鎖から、それぞれのアミノ酸固有の側鎖が生えた分子構造である。主鎖には、水素結合を作る水素原子と酸素原子があり、配列上近傍、あるいは遠方の主鎖間に水素結合を作り、安定構造をとることが多い。もっとも典型的なのは、螺旋構造で、とくにi番目のアミノ酸残基主鎖の窒素原子に結合している水素が、i+4番目の主鎖の炭素原子に結合している酸素原子と水素結合するα螺旋構造がもっとも頻繁に現れる局所構造である。その他、配列上はなれたアミノ酸残基主鎖間で水素結合を作るβシート構造もかなり頻繁に現れる構造である。βシートは、その要素となる長く伸びたβストランド構造が配列上遠方の別のβストランドと主鎖間水素結合で結合することによって構成されている。α螺旋、βシートとも、半規則的な構造である。その他に、水素結合を伴って、特殊な部分構造を作ることもあり、これらをターン構造と呼ぶこともある。ターン構造には様々な種類がある。これらα螺旋、βシート、ターンなどの特徴的な部分構造とそのほかのランダム構造をあわせて二次構造と呼ぶ。タンパク質の立体構造は、配列上のそれぞれの部分が二次構造を形成し、この二次構造がさらに折れ畳んで形成されたものである。
【０００６】
アミノ酸残基配列からタンパク質の立体構造を予測しようとする試みは、１９６０年代にミオグロビンの立体構造がX線結晶解析で判明した直後から始まっている。１９７０年代にはタンパク質の配列の中で、どの部分がどの二次構造を取るのかを予測する二次構造予測の研究が、主に統計的な手法をもとに行われた。２０種類のアミノ酸残基それぞれがどの二次構造の中に発見されることが多いかを、立体構造既知のタンパク質から統計的にもとめ、それに基づいて、それぞれの残基がどの二次構造の中にあるかを予測するものである。しかし、２０種類のアミノ酸残基のそれぞれがそれぞれの二次構造となる傾向はそれほど強いものではなかったことと、当時、立体構造既知のタンパク質が大変少なかったことから（数十程度）、予測精度は大変悪かった。
【０００７】
１９８０年代には、主に物理学者が、タンパク質の折り畳み現象そのものを物理的に解析しようとする試みがなされ、実際のタンパク質を、モデル化した格子モデルなどで折り畳みがうまくいくにはどのような条件が必要となるか、などについて多くの研究がなされた（非特許文献１）。
【０００８】
しかし、これら当時の研究では実験的にもまた、シミュレーションなどでもタンパク質の折り畳みに関する知見が十分ではなかったため、この研究が実際のタンパク質の構造予測技術に繋がることはなかった。
【０００９】
１９９０年代になり、立体構造の判明しているタンパク質が千を超える状況になってくると、タンパク質の構造を予測するのではなく、与えられた配列が、構造既知のタンパク質の中でどのタンパク質の構造と似ている可能性があるか、について研究が始まった。
これを、「折り畳み認識（Fold  Recognition）」という。アミノ酸それぞれがどの二次構造にあることが多いか、あるいは、タンパク質表面に来るのか、あるいは内部に埋もれた状態になるのか、などに基づいて、構造を予測しようとするタンパク質のアミノ酸残基配列を構造既知のタンパク質の立体構造に当てはめて、配列と構造との適合度を計算し、適合度が高ければ、その配列は、その適合度の高い構造と似たものになると考えるのである。これを配列プロファイル法と呼ぶこともある(非特許文献２）。
【００１０】
こうした中で、Sippl（非特許文献３）は、構造既知タンパク質の立体構造中でのアミノ酸残基の分布から平均力場ポテンシャルを求め、これを配列と構造との適合度評価に用いる方法を提唱した（図５）。
【００１１】
２０種類のアミノ酸残基のAとBというアミノ酸残基が、構造既知のタンパク質立体構造中にどのような距離で分布しているかを統計処理し、その距離に対する頻度分布の対数をもってポテンシャルとするものである。
【００１２】
上記配列プロファイル法と平均力場ポテンシャルの導入、及び、１９９０年代に構造既知のタンパク質が１万個以上に達したことで、折り畳み認識法は、立体構造予測技術として、ある程度実用に耐える精度をもつようになった。これと並んで、配列の類似したタンパク質は構造も似ているという知見をもとに、配列比較から構造を予測する比較モデリング法も発展し、これらの方法を用いることで、構造未知のタンパク質のおよそ半分程度は、構造がかなりの確度で予測できるようになった。
【００１３】
１９９０年代末には、折り畳み認識や比較モデリング法では構造予測が不可能な、全く新しい立体構造のパターンをもつタンパク質に対しても対応できる方法として、断片結合法がD. JonesやD.Bakerらにより提案され、広く一般に使われるようになった。これは、構造予測しようとするタンパク質の配列を固定した長さ（たとえばアミノ酸１０残基分程度の長さ）の断片を切り出し、この断片が取りえる立体構造を、構造既知タンパク質の立体構造データから切り出し、これらをつなぎ合わせて、全体構造を作るというものである（図７  図８）。全体構造は全く新しくとも、１０残基程度の断片にしてしまえば、典型的な二次構造などは構造既知タンパク質の構造内に含まれているので、これらのつなぎ合わせで、全体構造が構築できるのではないか、という期待に基づく方法である。
【００１４】
配列断片の取りえる構造断片の候補を取り出す方法などに様々な細かな改良が行われ、結果として、断片結合法は、ときにかなり正確に立体構造を予測できるまでになった。
【００１５】
タンパク質の構造予測法は、折り畳み認識と、断片結合法により、ある程度実用的な段階を迎えたが、しかし、これでタンパク質の折り畳みメカニズムが判明したわけではない。断片結合法では、それぞれの配列断片に対して候補構造を１００程度与え、ランダムに作った立体構造中、それぞれの配列部分に候補を当てはめ、全体構造の適合度を計算し、その適合度が高くなるようにして、収束させる方法が用いられる。いわゆる組み合わせ最適化法の利用である。完全にランダムなモンテカルロ法などにくらべて収束時間は短く、また、得られる最終構造は、ときに正しい立体構造にかなり近いものになることもある。しかし、これでタンパク質の構造構築の、あるいは折り畳みのメカニズムが判明したわけではない。
【００１６】
９０年代の後半から、タンパク質の折り畳み過程を数値計算シミュレーションによって求める試みも始まり、小さなタンパク質（アミノ酸の数が数十程度）については、シミュレーションによってある程度正しい構造と近い安定構造が得られたとする計算結果も発表された。しかし、タンパク質は水溶液中で折り畳むものであり、水溶液の溶媒効果をシミュレーションに導入することが難しいなど、さまざまな課題があり、また計算時間も実用的なレベルではない。しかし、これらのシミュレーションによって、タンパク質の折り畳み過程が、実験以外の方法で、追いかけられるようになってきたことには十分価値がある。
【非特許文献１】Go N.,Abe H.,(1983) Randomness of the process of protein folding. In J. Pept Protein Res 22 622-632
【非特許文献２】Bowie J.U., Luthy R.L., Eisenberg D., (1991) "A Method to Identify Protein Sequence That Fold into a Known Three-Dimensional Structure." Science, 256,164-170)
【非特許文献３】Sippl M.J.,(1990) "Calculation of Conformational Ensembles form Potentials of Mean Force: An Approach to the Knowledge-based Prediction of Local Structure in Globular Proteins." J. Mol. Biol., 213,850-883
【非特許文献４】Onizuka K., Noguchi T., Akiyama Y., Matsuda H., (2002) "Using Data Compression for Multidimensional Distribution Analysis" IEEE Intelligent Systems 17(3),48-54
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従来技術のタンパク質立体構造予測における最大の問題は、折り畳みメカニズムが不明であることに起因する予測精度の不足と、予測にかかる時間の長さである。すなわち、タンパク質の構造予測は折り畳みメカニズムが不明であるために、まだ、十分な精度での予測ができず、また、仮にうまく予測できる場合にも、予測時間に多大な計算時間を必要とする。
【００１８】
折り畳みメカニズムが十分解明されていないことにより、タンパク質の立体構造予測における最終ステップである構造最適化においては、前記断片結合法などのように、ランダムに構造を変更するなどして、最適構造に近づけてゆくことが行われている。これが、最適化において無駄な探索を行うことになり、予測精度も不安定、かつ予測にかかる計算時間も大変長くなることに繋がっている。
【００１９】
この問題を解決するためには、タンパク質が折り畳みを始める前の主鎖が伸びきった状態から、どのような過程あるいは状態を経て、最終的な安定構造をもつ状態に到るかについての知見を得ることである。この知見は、折り畳みの順序を予測する手法を開発することで得られる。
【００２０】
本発明が解決しようとする課題は、したがって、タンパク質の折り畳みの順序をいかに推定するかである。すなわちタンパク質が、どの部分から最初に折り畳みを開始し、ついでどの部分が折り畳み、最終的にどの部分が折り畳むのかを、そのタンパク質のアミノ酸残基配列の特徴から特定する方法の開発である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
タンパク質の折り畳みにおいてタンパク質配列上の部分配列断片に統計力学の原理であるボルツマン分布が適用できると仮定し、タンパク質のアミノ酸残基配列全体の中の部分配列断片それぞれが可能な部分構造断片を取ったときのその状態での停滞時間が、その部分構造断片のエネルギー値と周囲の温度によってボルツマン分布にしたがって統計的に決定されると仮定する。
【００２２】
この前提のもとで、与えられたタンパク質のアミノ酸残基配列Xのi番目のアミノ酸残基から連続する残基n個分の部分配列断片x(n,i)をタンパク質立体構造データベースから選ばれたK個のテンプレートタンパク質構造の長さn残基の全ての可能な部分構造断片c(k,n,j)に当てはめ（ここでkはK個の中の一つをあらわし、n は断片長、jはこの構造断片が、j番目のアミノ酸残基かから始まることをあらわす）配列断片x(n,i)が、構造断片c(k,n,j)の構造をとったときの配列断片エネルギー値Ex(n,i,k,j)を計算するステップと、各構造断片c(k,n,j)それぞれの頻度から得られる構造頻度Pc(k,n,j)を計算するステップと、配列断片エネルギー値Ex(n,i,k,j)、およびPc(k,n,j)を可能な全てのk,j に対して計算して得られる配列断片エントロピーS(n,i)を計算するステップと、この配列断片S(n,i)を配列Xで可能な全ての i について計算するステップとを有し、このエントロピーS(n,i)が最も小さいi=I である配列断片のある場所から折り畳みが開始され、順じS(n,i)が小さい順にそれに対応する部分配列の領域から折り畳みが進行すると推定することにより、タンパク質の折り畳みの順序を推定する（請求項１、２）。
【００２３】
配列断片エントロピーの大小は、その部分の配列が構造をとる場合のとった構造の安定性と、その構造とっている停滞時間に影響する。ボルツマン分布を仮定すれば、エントロピーが大きいということは、その部分の構造の乱雑さが大きいことであり、さまざまな構造をとることができることを意味し、結論としては、不安定で、決まった特定の構造をとることがないことを示す。一方エントロピーが小さい場合は、特定のいくつかの構造をとることが非常に多く、よって、その特定の構造をとったときに、安定していることを表す。
【００２４】
配列全体の中で、この断片配列エントロピーが最も小さいところは、最初に構造がランダムから特定の良い構造断片へ向かって遷移すると考えられるので、この配列断片に対応する場所が、最初に折り畳みが開始する点であると考えられる。
【００２５】
ここで、各x(n,i)を、c(k,n,j)に当てはめてエネルギー値を計算し、これをすべてのk,j について行うステップにおいて、配列断片エネルギーと構造断片エネルギーの和が最も小さくなったときの、k,j   を記憶しておくステップを有し、後に、配列断片エントロピーS(n,i)がもっとも小さい  i=Iである断片については、このエネルギー和がもっとも小さくなった構造断片 c(k,n,j)  が、当該部分の部分配列 s(n,i=I)が最終的な立体構造において取る構造と非常に近いと予測することができる（請求項３）。
【００２６】
タンパク質の立体構造は、前記のように比較的規則的なα螺旋やβシートなどの二次構造が折り畳んだものである。よって、タンパク質の折り畳みが開始すると、ランダム構造の段階では空間的に遠くにあった部分構造が接近し、βシートを構成したり、α螺旋のバンドル構造を形成したりする。これらの二次構造の折り畳みにおいては、まず、最終的に接近してβシートやα螺旋バンドル構造を作るために、まず、互いに接近する複数の部分構造が、予め、それらの接近あるいは結合に適した形になっていることが必要である。たとえば、βシートを構成する二つの部分は、ともにβストランドを構成していなければならない。この場合、もしこの部分がα螺旋になっていると、いったんこれを巻き戻して伸ばさなければ、シートを形成できないからである。
【００２７】
また、二つの部分構造が接近する場合は、この二つ部分構造の間をつなぐ部分の主鎖構造が、この二つの部分構造の接近を許す、あるいは奨励する必要がある。いかに二つの構造がシートやバンドルを作ることで安定になるとしても、その二つの部分をつなぐ部分がそれを許さないような主鎖構造であったら、二つの構造が接近することはなく、よって安定化することもない。安定的な二次構造であるα螺旋や、βシート（あるいはこれを構成するβストランド）をとっていない部分は、ターン構造や、ランダムなコイルによるループ構造である。これらの部分は水素結合などによる安定化がそれほど顕著でないが、このような部分が最終的な全体構造構築において重要な意味がある場合は、配列の構成によって、このような部分の安定性が増し、特定のループやコイルの構造をとるようになっているはずであり、そういう場合にかぎっては、断片配列エントロピーは小さくなる。
【００２８】
また、βストランドもその部分単独ではエネルギー的に不安定であるから、その部分の配列断片が、はじめからβストランドになることが全体構造構築で重要である場合は、特別に低いエントロピーをもつ。
【００２９】
以上が、タンパク質の折り畳み開始位置、および折り畳み順序を予測するための、配列断片のエントロピー計算の概略と、その効果である。
【００３０】
この技術を実現するため重要なことは、配列断片が特定の構造をとったときのエネルギー値をいかに計算するかである。このエネルギー値が十分現実を反映していなければ、折り畳み開始位置の予測も折り畳み順序の予測も極めて不正確になる。
【００３１】
よって、配列断片s(n,i)を構造断片c(k,n,j)に当てはめてエネルギーの計算をするステップにおいて、タンパク質の立体構造データベースから抽出され定義される平均力場ポテンシャルの総和としてエネルギー計算をすることによって、上記の折り畳み順序予測が可能である（請求項４）。
【００３２】
また、平均力場ポテンシャルが、対を構成するアミノ酸残基種、配列上での相対配置（i番目のアミノ酸残基とj番目のアミノ酸残基との相対配置は i-j で与えられる、及び空間内のアミノ酸残基の相対配置に基づいて定義され、その中で、とくに空間内のアミノ酸残基の相対配置として、アミノ酸残基間距離だけでなく、一方のアミノ酸残基からみた他方の位置、姿勢をも考慮した多次元拡張された平均力場ポテンシャルを用いて構造断片のエネルギー計算することによって、折り畳み順序予測の高精度化が可能になる（請求項５）。
【００３３】
これで、いくつかのタンパク質について前記断片結合法に基づく折り畳みシミュレーションを行い、最終的に正しい立体構造が得られた場合の折り畳みの順序と、配列断片エントロピー値の解析から推定される折り畳み順序が概ね一致していることが確かめられた。
【００３４】
ここで発明の概要を説明する。
【００３５】
構造を予測する対象となるタンパク質のアミノ酸残基配列Xが与えられている。Xの長さは、Nであるとする。Xのi番目のアミノ酸残基からn残基分の長さの断片配列x(n,i)を取り出す。タンパク質立体構造データベースPDBから、できるだけ多様な構造をK個選び、これを構造のテンプレートとする。Kは統計処理の安定性を考慮して1000以上である必要がある。この選ばれた構造のk番目のものをC(k)とする。C(k)の中のj 番目のアミノ酸残基から n残基の長さの部分構造断片を、c(k,n,j)とする。
【００３６】
配列x(n,i)をc(k,n,j)に当てはめそのときの平均力場ポテンシャルによる配列断片エネルギー値Ex(n, i, k,j)を計算する。これを全てのk,j について行い、また、構造断片c(k,n,j)を、構造の類似度に応じて分類し、分類に基づき構造断片c(k,n,j)の頻度確率を計算する。これを、Pc(k,n,j)とする。すると、配列断片x(n,i)が、構造断片c(k,n,j)をとったときの、エネルギー値の総和E(n,i,k,j)は、E(n,i,k,j) = Ex(n,i,k,j)+ Ec(k,n,j)として与えられる。ここで、Ec(k,n,j)は、配列を考慮しないで、構造が形成されるエネルギーであり、これはその構造断片の頻度から、Ec(k,n,j)=-KbT log(Pc(k,n,j)) である。
【００３７】
配列が決まれば、各構造c(k,n,j)をとるときのエネルギー値 E(n,i,k,j)が決まるので、これを、統計力学的なエントロピーの定義式  S = -KbΣl Pl log(Pl) に当てはめ
ることができる。ここで、-KbT log (Pl) がエネルギー  E(n,i,k,j)  ということになる。正確なエントロピー計算においては、規格化のために、分配関数 Z=Σl Pl を用
いる必要がある。
【００３８】
このエントロピーS(n,i)を全ての可能な i について計算する。
【００３９】
断片長さn は二次構造の大きさや安定性、及び、データベース中の部分構造の多様性を考慮して、３から９であることが望ましい。結果得られたエントロピーS(n,i)中で、もっとも小さな値をとるとき、i=I であったとすると、構造を予測対象であるタンパク質のアミノ酸残基配列の、i=I番目のアミノ酸残基から連続して、i=I+n-1番目までのアミノ酸残基からなる部分配列が、もっとも早い段階で折り畳み、しかも、その折り畳み結果の構造は、最終的な立体構造において、E(n,i=I,k,j)が最も小さい値をとったときの構造断片 c(k,n,j)と非常に近い構造になっていることが予測される。エントロピーが二番目に小さな値をとるのが、i=I2であるとき、もとの配列S上で、配列断片x(n,i=I)が、配列断片x(n,i=I2)と重ならない限りにおいて、つまり、I2>I+n-1 あるいは、I>I2+n-1であるとき両者は独立しており、このi=I2である部分も、二番目に折り畳みを開始し、その断片配列が最終的な立体構造において、E(n,i=I,k,j)が最も小さな値をとったc(k,n,j)と非常に近い構造をとっていると考えられる。
【００４０】
こうして、配列X上のどの部分から折り畳みが始まるかが予測できる。ここで重要なことは、この方法で配列断片のエネルギー値からエントロピーを計算するときには、つねに、同じ立体構造テンプレートC(k)を用いるということである。断片ごとに異なる立体構造テンプレートを使うと、そのエントロピーを比べる基準が存在しなくなるからである。
【発明の効果】
【００４１】
タンパク質の折り畳みがどのような形で起こっているかを求めることで、タンパク質の構造予測と、与えられた立体構造をとるタンパク質の設計手法を高精度、かつ高速化することが見込まれる。すなわち、これまでの多くの構造予測法では、立体構造をエネルギー最適化する過程で、ランダム生成された立体構造を少しずつランダムに変形し、そのつどエネルギー値を計算するなどして、次第に最低エネルギーになるようにするシミュレーテッドアニーリング(SA）法などが用いられてきたが、本発明を用いると、ランダム構造を作らず、初期構造から、各断片のエントロピーS(n,i)によって示唆される、折り畳みの順序に従ってその部分を折り畳むことが可能になるため、ランダムに最適化するよりも、より高速に最適構造が得られ、またその際の予測結果の精度も大幅に向上することが見込まれる。ただし、本発明で得られた折り畳み順序が構造最適化において競合する場合の優先方法など構造最適化アルゴリズムそのものについては本発明に含まれない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明は、以下の部分からなる。
【００４３】
１）構造予測対象のタンパク質アミノ酸残基配列入力部（図１の１）
ここでで、構造予測対象のタンパク質のアミノ酸残基配列Sを計算システムのメモリー内の配列に格納する。
【００４４】
２）テンプレートとなるタンパク質構造読み込み部（図１の２）
タンパク質立体構造データベースPDBの中から選ばれた立体構造C(k)を一つ一つ読み込む。
【００４５】
３）  エントロピー計算部（図１の３）
前記C(k)が読み込まれるごとに、全ての配列断片s(n,i)を、C(k)の部分構造断片c(k,n,j)に当てはめ、次に述べる平均力場ポテンシャルによるエネルギー計算部において、E(n,i,k,j)を計算するところである。ここでは、後の構造最適化計算による立体構造予測に備えて、E(n,i,k,j)がそれ以前に計算されたどのE(n,i,k,j)よりも小さい値をとった場合は、その場合、k,j を記憶しておくようにする。
【００４６】
４）平均力場ポテンシャルによるエネルギー計算部（図１の４）
エントロピー計算部より送られた、配列断片x(n,i)と部分構造断片c(k,n,j)から、配列x(n,i)を部分構造断片c(k,n,j)に当てはめたときの平均力場ポテンシャルのエネルギー値を計算するところである。この中に含まれるn 個のアミノ酸残基の全ての対について平均力場ポテンシャルを計算し、その総和をもってこの部分構造断片c(k,n,j)が配列断片x(n,i)であるときのエネルギー値とし、このエネルギー値をエントロピー計算部へ結果として返す。図６、図７は、平均力場ポテンシャルの概念図であり、図７において多次元拡張した平均力場ポテンシャルを説明している。
【００４７】
計算の流れは、与えられた全体配列Sに対し、図１の２において、まず、kのループをまわし、選択された立体構造C(k)を一つ一つ読み込み、ついで、その中のループで j についてのループをまわし、もっとも内側のループで、i についてのループをまわすようにする。こうすることで、読み出したC(k,n,j)を全て記憶しておく必要がなくなり、また、平均力場ポテンシャルの計算を高速化することができる。
【００４８】
エネルギー計算部（図１の３）で用いる平均力場ポテンシャルは、Sipplの（非特許文献３）のものを（図６）、多次元拡張したものである（図７）。アミノ酸残基間の立体構造中での距離だけでなく、方位、姿勢についても分割し、ヒストグラムの形式で頻度分布を求めた。アミノ酸残基BのAに対する方位については、アミノ酸残基AのCα原子を原点とし、N原子がXZ平面上に、Cβ原子がZ軸上にくる局所座標を考えて、この局所座標におけるアミノ酸残基BのCα原子の位置座標を極座標表示したときの天頂角θ、経度φで分割する。姿勢については、アミノ酸残基BがAと同じ姿勢になるように回転させた場合のオイラー角（θ,φ,ψ）のθを用いた。これは、アミノ酸残基AのCα原子からCβ原子へのベクトルと、アミノ酸残基Bの同じベクトルの成す角度に対応している。他のオイラー角（φ,ψ）については無視している。ただし、ここでは（非特許文献４）にあるようなデータ圧縮はせず、単純なヒストグラムを用いている。分割数は、天頂角について３（ただし天頂部と反対側の天頂部は角度分割しておらず、その部分は、π/6の天頂角をもっている）、経度について６、オイラー角のθについて３である。また、距離については、１Åごとの分割で、０から１２Åまでの範囲について解析する。
【００４９】
候補構造断片選定に当たっては、Sipplの最初の方法と同様に、正味ポテンシャル（文献内では、net potentialsという用語を用いている）を用いる。
【００５０】
（実施例）
本発明をするにあたって、最初に行ったことは、独自に開発したタンパク質立体構造予測システムを用いてランダム構造から、最終的な立体構造になるまでの過程を観察することである（図２  図３）。
【００５１】
タンパク質立体構造予測システムとしては、断片結合法を用いた（図８  図９）。
【００５２】
断片結合法における候補構造断片選定には、多次元化された平均力場ポテンシャルを用いた。また、断片結合法での構造最適化においても、候補選定時と同じ多次元化された平均力場ポテンシャルを用いた（図５  図６）。
【００５３】
構造既知のタンパク質（PDBに登録されている1QKK、１STMを用いている）を構造予測対象として、それぞれのタンパク質が、PDBに登録されているX線構造と近い構造になるように、条件をいろいろと変えて、構造予測システムを動かし、その構造最適化の過程を観察した。
【００５４】
この観察を通じて、どちらのタンパク質も、最初のランダム構造からX線構造に近い形になる過程で、比較的一定の段階を経て折り畳みが進行することが判明した（図３）。断片結合法であるため、二次構造は比較的初期段階でほぼ正しい位置に正しい形に形成される。すなわち、α螺旋やβストランドの位置は断片結合による最適化過程でかなり早い段階でほぼ固定的になる。ついでこれらが折り畳まれて全体構造になる段階では、配列上の特定の領域で最終構造とほぼ同じ形状の折り畳み領域が生まれ、ついでこれが核となって、周囲の主鎖が巻き付くようにして、最終構造に到ることが観察された。
【００５５】
この観察を通じて、タンパク質の配列中では、比較的早い段階で折り畳みを開始する部分があり、その部分が核となって全体構造を導きだすことが分かる。
【００５６】
よって、タンパク質の配列中で、どの部分が最初に折り畳みを開始するかを予測できるようにすることが、折り畳みメカニズムの解明に繋がると考えた。
【００５７】
そこで、配列断片に対する候補構造断片をデータベース中から選定する段階で、全て、それぞれの配列断片ごとに、当てはめられた構造での平均力場ポテンシャルによるエネルギー値から配列断片のエントロピーを求めた（図４  図５）。その結果、ある配列断片は、さまざまな構造をとったときに、大きくエネルギー値が異なり、配列断片エントロピーが小さくなる。一方、別の配列断片は、さまざまな構造に対して、エネルギー値が大きく変化せず、配列断片エントロピーが小さくなる。そして、上記の折り畳みシミュレーションでの折り畳み過程の観察結果とあわせた結果、配列断片エントロピーが小さくなっている断片部分が、最初に折り畳みを開始する部分である可能性が出てきた。
【００５８】
以下に、それぞれの方法について詳しく解説する。
【００５９】
２）配列断片に対する候補構造断片の選定法（図  ８）
断片の長さをWとして、構造予測対象のタンパク質の配列から、長さWの全ての配列断片をN末端側から取り出し、それぞれの配列を、PDBから選ばれた２７００個のタンパク質立体構造のそれぞれの全ての位置に当てはめ、適合度の高い順に、候補となる構造断片を取り出す。それぞれの配列断片に対する候補構造の数は１６から３２程度に限定した。構造予測対象タンパク質１QKKと１STMも、この２７００個のタンパク質の中に含まれるので、適合度に精度の高いものを用いると、各断片では、必ず予測対象タンパク質そのものの構造が対応する部分で断片構造として選定される。
【００６０】
３）平均力場ポテンシャル（図６  図７）
平均力場ポテンシャルは、前記Sipplのもの（図  ６）を多次元拡張したものである（図  ７）。アミノ酸残基間の立体構造中での距離だけでなく、方位、姿勢についても分割し、ヒストグラムの形式で頻度分布を求めた。アミノ酸残基BのAに対する方位については、アミノ酸残基AのCα原子を原点とし、N原子がXZ平面上に、Cβ原子がZ軸上にくるような局所座標(r,θ,φ)を考えて、天頂角θ、経度φで分割する。姿勢については、アミノ酸残基BがAと同じになるように回転させた場合のオイラー角のθを用いた。これは、アミノ酸残基AのCα原子からCβ原子へのベクトルと、アミノ酸残基Bの同じベクトルの成す角度に対応している。他のオイラー角については無視している。
【００６１】
候補構造断片選定に当たっては、Sipplの最初の方法（前記Sipplの文献）と同様に、正味ポテンシャルを用い、折り畳み最適化においては、これに若干の凝集力を加えたものを用いた。凝集力としては、一定範囲内で距離の二乗に比例するごく弱いポテンシャルを用いた。
【００６２】
４）断片結合法のアルゴリズム（図９）
一般的な断片結合法は、SA法を用いるが、ここでは、これに遺伝アルゴリズム（以後GA法）の要素を加えたものを用いた。ランダム構造を１６から３２本つくり、次に、そのうちの一つの一つの場所について、その場所の候補構造断片の一つを選んで、その断片領域を交換していくことと（構造の微小変形、GA法でいえば突然変異）、最低１０回に一回は、ランダム構造間で全体配列の長さの半分未満２残基以上の領域について、一方からもう一方にコピーすること（GA法での構造のクロスオーバー）を繰り返し、SA法にそって、温度パラメータに沿った形で、変形を受け入れるかどうか決定するというものである。温度は、エネルギー値に対して、絶対温度で300°Kから1200°Kの範囲で変更した。
【００６３】
タンパク質の断片結合法による折り畳みシミュレーションで、折り畳みが進行する過程を観察した結果、ほとんどのシミュレーションで特定の配列領域において、まず折り畳みが進行し、ついで、その他の部分も折り畳みはじめ、これらがさらに互いに影響しあって全体構造が折り畳まれることが判明した。さらに、この折り畳みの過程は、折り畳みシミュレーションにおけるさまざまなパラメータや条件を変更しても、最終構造としてX線構造に近いものに到る場合は、つねにほとんど同じ過程を経て最終構造に到ることがわかった。そこで、折り畳みがどこの領域から開始されるのかを推定するために、断片配列を多数の構造に当てはめたときのエネルギー値から配列断片のエントロピーを計算した。その結果、折り畳みが始まる場所と、配列断片エントロピーの小さい配列断片の部分とは概ね一致していることがわかった。
【００６４】
実施例より判明したことは以下の点である。
【００６５】
タンパク質の折り畳みは、結局のところ、統計力学の原理にしたがっていると考えられる。それぞれの配列の部分は、最もエネルギーが低くなる構造へと向かって折り畳まる。それは、統計力学のボルツマン分布に従っているからであり、ある配列断片Aが、構造C1をとったときのエネルギーがE（A,C1）であり、構造C2をとったときにE（A,C2)であるとき、E(A,C2)が、E(A,C1)よりも小さい（安定）エネルギー値であるならば、構造C2に停滞する時間は構造C1に停滞する時間に比べてexp[(E(A,C1)-E(A,C2))/KbT]倍長いことになる。ある配列断片がさまざまな構造をとったときのエントロピーが小さいということは、その配列が構造の変化に対してエネルギーが非常に大きく変化するということであり、その配列部分のエネルギーが小さくなることによる安定化は、全体構造の安定化にも大きく貢献する。一方、エントロピーが大きい配列断片は、その部分の安定化が全体構造の安定化にあまり貢献しない。また、エントロピーの小さい配列断片は、上記のボルツマン分布にしたがっている場合各構造をとるときの停滞時間の関係で、短時間で低いエネルギーをもつ安定構造へと到る。一方エントロピーの大きい配列断片は、安定構造に到るまでの時間が長くかかる。よって、それら配列が多数繋がったタンパク質の全体構造で考えた場合、エントロピーが小さい部分配列のところから折り畳みが始まることになり、あとは競合でそれぞれの断片が安定化しようとする。
【００６６】
配列上遠い部分が近傍にきて安定化しシート構造や、あるいはヘリックスバンドル構造（二つのα螺旋が並行に接近する）を作ることについてはもう一つ別の視点を持ち込む必要がある。まず、そのような配列上遠い部分二つが接近して安定化するためには、接近を促すように、その二つの配列の間にはさまれた部分配列が特定の構造を取ることが奨励されていなければならない。また、その場合、それぞれ後に結合する部分は、両者ともに後に結合するときに互いに結合しやすい構造を予めとっておく必要がある。βシートが配列断片AとBからなるためには、A、Bが両方ともβストランドの形になっている必要がある。その部分がたとえ、最終的にシートになったときに安定化するとしても、両社が折り畳みの早い段階でα螺旋構造をとってしまったら、この二つの構造が接近しても、βシートを構成することは確率的にも統計力学的にもほとんどありえない。よって、βシートを構成する配列断片は、α螺旋になったときに、エネルギーが低くならないような配列パターンをもっていなければならない。このことは、α螺旋やβシートをつなぐランダム構造の部分についてもいえる。そういう部分はα螺旋やβストランドになってもあまりエネルギーが低くならないような配列である必要がある。結果として、ループ領域の配列断片は、さまざまな構造になった場合のエネルギー値から計算されるエントロピーが大きいことになり、折り畳みで比較的最後まで特定の構造をとらず、ランダム構造のままであり、それ以外の部分が十分に安定構造に至った段階で、初めて周囲に誘導されるように最終のループ構造をとるように折り畳む。
【００６７】
さらにもう一つ、折り畳みの初期段階で最初に折り畳んだ場所が核になって周囲の部分を誘い込み、核が成長する現象についてももう少し考察する必要がある。核になった構造は、それぞれの部分が核を作りやすくなっていて、その核となった構造は非常に安定である。そこで、その状態で停滞する時間が長い。だからこそ、周囲の不安定な構造はその核の部分と結合することによって安定化を図るわけである。
【００６８】
タンパク質の折り畳みはよく折り紙のようなもの、といわれる。むしろ、糊をべったりと塗った折り紙に近いだろう。間違った折り方をして、そこで糊でくっついてしまったら、はがしてもとにもどすことは難しい。すなわち、折り畳みには、従来から言われていたような、折り畳み順序が存在する。順序を間違うと折り畳みは最終的な安定構造まで至らない。そして、折り畳みの順序を決めているのは、全体配列の中のそれぞれの部分配列断片の特定の構造を目指して変化する速度にある。最初に折り畳む部分は、その構造になったときに、非常に低いエネルギーをとるような部分であり、その配列断片のエネルギーのエントロピーは小さい。もっとも最後に折り畳む部分は最後まで構造が決定しないのであるから、特定の構造への折り畳みの速度が遅いことになる。したがって、あとから折り畳みが行われる「折り畳み速度の遅い配列」は、必ずしももっとも低いエネルギーとなる最安定構造には至らないことになる。全体配列の中のそれぞれの部分が競合しつつもっともエネルギーの低い状態になるように競争しているのであれば、特定の構造に対してもっとも強い傾向をもつ部分が真っ先に折り畳みを開始し、他の部分はそれに影響されて最終構造を決めるというのは、きわめて自然な結果である。
【００６９】
ここに述べた折り畳みの順序と、配列断片エントロピーとの関係は、比較的短いタンパク質で、しかも折り畳み順序について実験的にある程度推定されている1YPAI, 1AB7#, 1ABQ# の三つのタンパク質について検討した結果でも、肯定的である（図１０）。
【００７０】
もちろん、ここで述べている折り畳みのメカニズムが全てのタンパク質で通用するとは限らない。タンパク質の折り畳みが進行する生物の細胞内は、非常に複雑な環境である。温度のみならず、PH値も異なる。それに、周囲には電解質や脂質などが浮遊しているし、また同種のあるいは別種のタンパク質も多数存在する。それらを避けつつ目的の構造をとるように「設計されている」とすれば、単体の折り畳みだけを考慮するのは間違いである。生物が進化し、かつタンパク質も進化してきたのだとすれば、タンパク質の配列はそれぞれのタンパク質が機能するように調整されていて、それぞれのタンパク質が折り畳みを行う環境に合わせて折り畳みが起こるようになっている。タンパク質によってはそれらの条件により、折り畳みが非常に短時間で進行しなければならないものもあれば、逆に、非常にゆっくりと折り畳む必要があるものもあるだろう。また、PHや温度などが特定の場合にかぎって折り畳みが進行する必要のあるタンパク質もある。これら全てを取り込んだ理論を構築することは大変難しい。したがって、タンパク質の構造予測において万能の方法を構築することは現状ではできない。
【００７１】
しかし、ここで述べた折り畳みの仕組みは理想的な環境で折り畳みを行う人工タンパク質を考える上で、有益である。この実施例で得られた折り畳みのメカニズムは、基盤として統計力学の原理を全体配列中の部分配列断片に適用し、配列断片同士の競合によって最終構造に到るとするものであるから、理論的にほとんど疑う余地がない。特定の目的構造をもつタンパク質の設計においては、まず目的構造に到る折り畳みの順序を考慮し、その順序に従って、部分配列断片がそれぞれの最終構造にむかって、順序に従った速度で折り畳みするようにすればよいのである。最適な配列設計アルゴリズムはかくして確定的なものとして提示できる。
【００７２】
本発明により、以下のようにタンパク質の折り畳みメカニズムと、タンパク質の構造予測に必要なアルゴリズムの基本方針、そして、人工タンパク質の配列設計の基本方針が得られる。
【００７３】
結論として、三点にまとめる。
【００７４】
１）タンパク質折り畳みメカニズム
タンパク質の折り畳みのメカニズムが判明した。タンパク質のアミノ酸残基配列中の部分配列断片は、さまざまな構造を取りえるが、それぞれの構造をとっている停滞時間は統計力学の原理に従い、その構造であるときのエネルギー値によって決まっている。タンパク質の折り畳みは、全体配列中の部分配列が互いに競合しつつそれぞれがもっとも低いエネルギー値となるような構造を目指して折り畳む。
【００７５】
２）タンパク質の構造予測
タンパク質構造予測は、次のようにして行われる。まず部分配列断片ごとに、それが様々な構造をとったときのエネルギー値から配列断片エントロピーを計算し、そのエントロピーの最も小さなところから順に、それぞれ許されるもっともエネルギーが低くなる最適構造へ向かって折り畳むようにする。途中段階で接近する部分構造があれば、その接近でエネルギーが低くなるようにそれぞれの部分構造、およびその二つの部分構造をつなぐ部分を調整し最適化を計る。ただし、野生型のタンパク質によっては、その折り畳みが特殊な環境で起こるものもあり、この方法で必ずしも正しい立体構造が予測できるとは限らない。しかし、一般的な環境で安定な水溶性タンパク質の多くは、この方法で予測できると考えられる。
【００７６】
３）人工タンパク質の配列設計
目的の構造をもつタンパク質の配列設計においては、その目的構造に到る折り畳み順序を設定し、その順序に応じて、部分の配列が適切な折り畳み速度をもつように設計する。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
タンパク質の立体構造予測が可能になることで、様々な構造未知タンパク質の構造が予測できるようになる。これによって、配列のみ知られているタンパク質に作用する医薬品などを作ることが可能になり、タンパク質とタンパク質の立体構造に基づく相互作用を見積もることができ、創薬分野、医療分野、さらに生物学全般に大きな貢献となる。本発明は、タンパク質立体構造予測法の一部をなすものである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】装置の構成図
【図２】折り畳みシミュレーションにつかった１QKKの立体構造と模式図
【図３】シミュレーションの観察結果の概念図
【図４】１ＱＫＫの場合における配列断片エントロピーのグラフ
【図５】タンパク質１STMの立体構造と、配列断片エントロピーのグラフ
【図６】平均力場ポテンシャルの概念図
【図７】平均力場ポテンシャルの多次元拡張の概念図
【図８】断片結合法における候補構造断片の選択法を説明する概念図
【図９】SA法、GA法を組み合わせた断片結合による構造最適化法を説明する概念図
【図１０】1YPAI, 1ABQ#, 1AB7# における構造とエントロピー解析の関係を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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