(57)【要約】【課題】アルギニン及びリジンから選択されたアミノ酸の同一又は異なる種の２以上の残基を有するペプチド又はタンパク質を、特異的に検出又は分離する方法を提供することを課題とする。【解決手段】アルギニン及びリジンから選択されたアミノ酸の同一又は異なる種の２以上の残基を有するペプチド又はタンパク質を含有する試料を、ポリフェノール化合物からなる検出又は分離用反応剤と接触させることを含む、ペプチド又はタンパク質の検出又は分離方法により、上記の課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニン及びリジンから選択されたアミノ酸の同一又は異なる種の２以上の残基を有するペプチド又はタンパク質を含有する試料を、
ポリフェノール化合物からなる検出又は分離用反応剤と接触させることを特徴とする、ペプチド又はタンパク質の検出又は分離方法。
【請求項２】
前記検出又は分離用反応剤が、標識物質により標識されている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標識物質が、酵素、放射性標識物質及び蛍光標識物質からなる群より選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出又は分離用反応剤が、担体に固定化されている請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリフェノール化合物が、１，２，３−トリヒドロキシベンゼン環を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド又はタンパク質を検出又は分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学や遺伝子工学などの分野において、タンパク質、例えば酵素が示す基質特異性や親和性を利用して、タンパク質を分離又は検出する方法が知られている。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とその基質であるグルタチオンとの結合特異性を利用して、グルタチオンが結合した担体を用いてＧＳＴを融合させたタンパク質を分離する方法や、ヒスチジンとＮｉ2+やＣｕ2+との親和性を利用して、Ｎｉ2+やＣｕ2+が結合した担体を用いてヒスチジンの繰り返し配列を付加したタンパク質を分離する方法（特許文献１）などが知られている。
【特許文献１】米国特許第４５５１２７１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、塩基性アミノ酸であるアルギニン及び／又はリジンと、ポリフェノール化合物、特に１，２，３−トリヒドロキシベンゼン環を有する化合物との親和性が高いことを見出した。そして、ポリフェノール化合物を用いてアルギニン及び／又はリジンを有する物質を検出又は分離できることを見出して、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、アルギニン及びリジンから選択されたアミノ酸の同一又は異なる種の２以上の残基を有するペプチド又はタンパク質を含有する試料を、ポリフェノール化合物からなる検出又は分離用反応剤と接触させることを含む、ペプチド又はタンパク質の検出又は分離方法である。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の検出方法又は分離方法により、ポリフェノール化合物を用いてペプチド又はタンパク質を特異的に検出又は分離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の検出又は分離方法は、アルギニン及びリジンから選択されたアミノ酸の同一又は異なる種の２以上の残基を有するペプチド又はタンパク質を含有する試料を、ポリフェノール化合物からなる検出又は分離用反応剤と接触させることからなる。
【０００７】
上記の方法において、検出又は分離しようとするペプチド又はタンパク質は、アルギニン及びリジンから選択されたアミノ酸の同一又は異なる種の２以上の残基を有する。このようなペプチド又はタンパク質は、天然のペプチド又はタンパク質であってもよいし、アルギニン及びリジンから選択されたアミノ酸の同一又は異なる種の２以上の残基を有するように改変又は合成したペプチド又はタンパク質であってもよい。
上記のペプチド又はタンパク質は、アルギニン及びリジンから選択されたアミノ酸の同一又は異なる種の２以上の残基を有し、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下の残基を有する。より具体的には、上記のペプチド又はタンパク質は、アルギニン及びリジンから選択されたアミノ酸の同一又は異なる種を２残基、３残基、４残基、５残基、６残基、７残基、８残基、９残基又は１０残基有するものが好ましい。該ペプチド又はタンパク質は、アルギニン及びリジンのいずれか１種のみを含んでもよく、アルギニン及びリジンをともに含んでもよい。アルギニン及びリジンは、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列において連続して存在することが好ましい。
【０００８】
上記のペプチド又はタンパク質は、検出又は分離することを目的とするペプチド又はタンパク質に、アルギニン及びリジンから選択されたアミノ酸の同一又は異なる種の２以上の残基を結合させることにより得ることができる。このようなペプチド又はタンパク質は、当該技術において公知の方法を用いて得ることができる。例えば、ある目的ペプチド又はタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端にアルギニン及びリジンから選択されたアミノ酸の同一又は異なる種の２以上の残基が付加したペプチド又はタンパク質に対応する核酸分子を作製し、それを適切なベクターに組み込み、得られたベクターで宿主細胞を形質転換することにより、Ｎ末端及び／又はＣ末端にアルギニン及びリジンから選択されたアミノ酸の同一又は異なる種の２以上の残基が付加したペプチド又はタンパク質を作製できる。
【０００９】
上記のペプチド又はタンパク質は、アルギニン及びリジンから選択されたアミノ酸の同一又は異なる種の２以上の残基と結合できるものであれば特に限定されない。上記のペプチド又はタンパク質は、作製の簡便性の点で、２００〜１００００、より好ましくは２００〜３０００の分子量を有するものが好ましい。
【００１０】
アルギニン及びリジンから選択されたアミノ酸の同一又は異なる種の２以上の残基を有する天然のペプチド又はタンパク質は、当該技術において公知のものであってよい。このようなペプチド又はタンパク質は、細胞膜を介するタンパク質の輸送に関連するシグナルペプチドであることが知られており、例えば次の文献に記載されている：Futaki S, et al., J. Biol. Chem., 276(8), 5836-5840, 2001；Jehangir S Wadia及びSteven F Dowdy, Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13:52-56；Matsui H, et al., Folia Pharmacol. Jpn. 121, 435-439, 2003；及びBrooks H, et al., Adv Drug Deliv Rev. 57(4), 559-77, 2005。
このような天然のペプチド又はタンパク質を含有する試料としては、例えば上記の文献に記載されるようなシグナルペプチドを有するタンパク質を発現する細胞の溶解物、又は植物若しくは動物の組織の切片、上記の文献に記載されるようなシグナルペプチドを有するタンパク質をコードする異種核酸配列を導入した宿主からの組織の切片、又は細胞の抽出物、可溶化物若しくは溶解物などが挙げられる。
【００１１】
本発明において、上記の検出又は分離用反応剤に用いられるポリフェノール化合物は、同一ベンゼン環上に複数の水酸基を有する化合物であれば特に限定されず、カテキン、エピカテキン、シアニジン、ルテオリン、コーヒー酸などの２つの水酸基を同一ベンゼン環上に有する二価フェノール、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、没食子酸、タンニン酸などの３つの水酸基を同一ベンゼン環上に有する三価フェノール、タンニンなどのポリフェノール縮合物及びこれらの塩、エステルなどの誘導体を含む。特に、三価フェノールが好ましく、１，２，３−トリヒドロキシベンゼン環を有する化合物がより好ましい。
【００１２】
本発明の方法のある実施形態において、上記の検出又は分離用反応剤は、例えば、上記のペプチドまたはタンパク質の検出又は分離を容易にするための所望の物質と結合していてもよい。上記の検出又は分離用反応剤は、標識物質で標識されているのが好ましい。該標識物質は、当該技術において通常用いられる標識物質であれば特に限定されず、酵素（例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼなど）、放射性標識（例えば35Ｓ−メチオニンや32Ｐなど）、蛍光標識（例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、フィコエリスリン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）など）、色素標識（例えばブロモフェノールブルー、コチニールなど）などが挙げられる。
【００１３】
上記の標識物質で標識された検出又は分離用反応剤は、当該技術において公知の方法により作製できる。ポリフェノール化合物を上記の標識物質で標識する方法は、用いるポリフェノール化合物及び標識物質の種類に応じて適宜選択できる。例えば、没食子酸のようなカルボキシル基を有するポリフェノール化合物を用いる場合、該ポリフェノール化合物を酸クロライドとしたのち、標識物質のアミノ基やヒドロキシル基と反応させて標識物質をポリフェノール化合物に結合させることができる。あるいはジシクロヘキシミドのような縮合剤を用いてもよい。
あるいは、標識物質の水酸基などにエピクロルヒドリンのようなエポキシ化試薬を作用させた後、ポリフェノール化合物の有する水酸基やアミノ基と反応させることにより、標識物質をポリフェノール化合物に結合させることもできる。
【００１４】
本発明の方法の別の実施形態において、上記の検出又は分離用反応剤は、適切な担体に固定化していることが好ましい。適切な担体は、通常のクロマトグラフィーで用いられる担体を含み、例えばアガロース、セファデックス（Sephadex（登録商標）、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）、セルロファイン（Cellulofine（登録商標）、チッソ株式会社製)、例えばトヨパール（登録商標）（東ソー株式会社製）のような合成クロマト担体、セライト、濾紙などを含む。
上記の検出又は分離用反応剤を固定化する方法としては、当該技術において公知の方法を用いることができる。例えば、ポリフェノール化合物を水に不溶性にして担体に固定化する方法が挙げられる。上記のポリフェノール化合物のうち、水に不溶性の没食子酸ドデシルなどを用いる場合、エタノールなどの溶媒に溶解させ、適切な担体に含浸させた後に水洗いすることにより固定化できる。例えば、没食子酸のようなカルボキシル基を有するポリフェノール化合物を用いる場合、該ポリフェノール化合物を酸クロライドとしたのち、アミノ基やヒドロキシル基と反応させて不溶性にし、エタノールなどの溶媒に溶解させ、適切な担体に含浸させた後に水洗いすることにより固定化できる。あるいはジシクロヘキシミドのような縮合剤により、不溶化させてもよい。
あるいは、担体の水酸基などにエピクロルヒドリンのようなエポキシ化試薬を作用させた後、ポリフェノール化合物の有する水酸基やアミノ基と反応させればよい。
【００１５】
本発明の方法において、上記の接触は、試料中のペプチド又はタンパク質とポリフェノール化合物との間に相互作用が働く条件下で行われる。該条件は、好ましくは、１〜５０ｍＭの塩濃度、２〜１０のｐＨ、０〜５０℃の温度である。また、上記の接触は、これらの条件下で、１〜６０分間行われることが好ましい。
【００１６】
本発明の方法のある実施形態、特に検出方法は、ペプチド又はタンパク質と検出又は分離用反応剤との間で形成された複合体を検出する工程をさらに含むことが好ましい。該複合体は、当該技術において公知の技術により検出できる。例えば、該複合体は、上記の標識を検出することにより検出できるか、或いはペプチド若しくはタンパク質又はポリフェノール化合物に対する抗体を用いて検出できるが、これらに限定されない。
【００１７】
上記の好ましい実施形態において、ペプチド又はタンパク質を検出した結果に基づいて、ポリフェノール化合物の定量を行うことができる。例えば、上記の検出工程において検出された標識の放射性、蛍光強度、発光強度などを、既知量の物質を用いて作成した標準曲線と比較することにより、ペプチド又はタンパク質の量を測定できる。
【００１８】
本発明の方法のある実施形態、特に分離方法は、ペプチド又はタンパク質と検出又は分離用反応剤との間で形成された複合体から、ペプチド又はタンパク質を回収する工程をさらに含むことが好ましい。回収は、ペプチド又はタンパク質と検出又は分離用反応剤との間の相互作用を切断する条件下で行われる。該回収は、例えば、塩、アルギニン、リジン、又は界面活性剤、特にＳＤＳの濃度を５０〜１０００ｍＭとすること、ｐＨを１０〜１２とすることなどにより行うことができる。
【００１９】
上記のポリフェノール化合物からなる検出又は分離用反応剤は、従来、ニッケルイオンなどの金属イオンとタンパク質のヒスチジン残基との間の相互作用により行われていた親和性に基づく検出又は分離とは異なる原理を用いて、目的とするペプチド又はタンパク質を検出又は分離することを可能にする。よって、このような検出又は分離用反応剤も、本発明の一つである。
【００２０】
上記の検出又は分離用反応剤のある実施形態、特に検出用反応剤は、上記の標識物質により標識されていることが好ましい。
上記の検出又は分離用反応剤のある実施形態、特に分離用反応剤は、上記の担体に固定化されていることが好ましい。
【実施例】
【００２１】
製造例１  アルギニン付加ＧＳＴタンパク質の作製
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末端部分に９つの連続したアルギニン残基を導入したタンパク質を作製する。
以下のオリゴヌクレオチドを作製した。
オリゴヌクレオチドFor-(E/N)5G9R：5’-AATTCCGGTGGTGGTGGTGGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTTGAGC-3’（配列番号1）；
オリゴヌクレオチドRev-(E/N)5G9R：5’-GGCCGCTCAACGACGACGACGACGACGACGACGACGACCACCACCACCACCGG-3’（配列番号２）。
【００２２】
これらのオリゴヌクレオチドを、９５℃で５分間の熱処理後、４℃に冷却することによって２本鎖ＤＮＡを合成した。得られた２本鎖ＤＮＡをEcoRIとNotIで消化し、同じ制限酵素で消化したＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターであるpGEX-4T3（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）のEcoRIとNotI制限酵素サイトに挿入し、プラスミドpGEX-5G9Rを得た。
【００２３】
得られたプラスミドを、大腸菌（Escherichia coli BL21株）に導入し、Ｃ末端部分に９つの連続したアルギニン残基を有するＧＳＴ（以下、（Ａｒｇ）9付加ＧＳＴタンパク質という）を発現させた。
菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）中でハンディーソニック（トミー精工社製、モデルUR-20P型）を用いて破砕し、２５℃で１５０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、上清を回収した。この上清は、（Ａｒｇ）9付加ＧＳＴタンパク質を、３５００μｇ／ｍＬ含有していた。なお、タンパク質の濃度は、牛血清アルブミンを標準物質としてローリーの方法により測定した。
【００２４】
製造例２  没食子酸ドデシルを固定化した担体の製造
没食子酸ドデシル（和光純薬工業株式会社製）を、５０μｍｏｌ／ｍＬの濃度でエタノール（特級、和光純薬工業株式会社製）に溶解した。エタノールで膨潤させたSephadex LH-20（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を、ほぼ等容量の没食子酸ドデシルエタノール溶液と混合し、ロータリーエバポレータ（東京理科機器株式会社製、ロータリーエバポレータＮ−２Ｎ型）を４０℃にて減圧下（５０ｈＰａ）で１０分間用いて乾固させた。これを純水になじませ、ＨＰＬＣ用カラム（長さ１００ｍｍ×内径６ｍｍ）に充填して、没食子酸ドデシル固定化担体カラムを作製した。
【００２５】
実施例１
製造例１で得られた（Ａｒｇ）9付加ＧＳＴタンパク質溶液を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）で２倍に希釈し、１００μｌをサンプルとして、製造例２で作製したカラムに注入した。
（Ａｒｇ）9付加ＧＳＴタンパク質溶液の注入から１０分毎にフラクションコレクターを用いて溶出液を回収し、分析した。
ＨＰＬＣの分析条件は、次のとおりである。
ＨＰＬＣポンプ：ＤＰ−８０２０（東ソー株式会社製）
分光光度計：ＵＶ−８０２０（東ソー株式会社製）
フラクションコレクター：ＤＣ−１５００（東京理科機器株式会社製）
溶離液：Ａ液＝５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）；
Ｂ液＝３００ｍＭ  ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）
流速：０．２ｍＬ／分
グラジエント条件
時間（分）        Ａ液（％）        Ｂ液（％）
０              １００                      ０
３０                  ０                  １００
６０                  ０                  １００
７０              １００                      ０
８０              １００                      ０
【００２６】
得られた溶出液２ｍＬを、Ultrafree-MCフィルタを用いるUltrafree-MC 5000 NMWL Filter Unit（ともにMILLIPORE社製）を用いて、約５０μｌまで濃縮して、エッペンドルフチューブに入れた。ここに、SDS-PAGE用サンプル処理液（水中に１５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０％  ２−メルカプトエタノール、３３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０、２５％グリセリン及び１％ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ））１０μｌを加えて沸騰水中で５分間加熱した。放冷後、４０μｌをe-PAGEL:E-T1020L（１０〜２０％アクリルアミドゲル、アトー株式会社製）にアプライし、AE-6531P型pageRun（アトー株式会社製）を用いて２０ｍＡで８０分間電気泳動を行った。なお、SDS-PAGEの泳動バッファーは、２５ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、０．１％ＳＤＳ、１９２ｍＭグリシンの水溶液を用いた。
コントロールとして、プレシジョンＰｌｕｓスタンダード（バイオラッド社製）５μＬを用いた。
ゲルを、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）０．１％溶液を用いて染色し、メタノール：酢酸：水＝３：１：６の混液を用いて脱色した。
【００２７】
得られたゲルの写真を、図１に示す。
図１の矢印部分は、（Ａｒｇ）9付加ＧＳＴタンパク質のバンドの位置を示し、コントロールではこの位置にバンドが見られるが、０〜１０分及び１０〜２０分の溶出フラクションにおいてはこのバンドが見られない。つまり、カラムにかける前に試料中に含有されていた（Ａｒｇ）9付加ＧＳＴタンパク質のバンドが、溶出フラクション中に存在せず、没食子酸ドデシル固定化担体に吸着され分離されたことがわかる。
【００２８】
実施例２
アルギニン塩酸塩（Ａｒｇ１）、Ａｒｇ−Ａｒｇ酢酸塩（Ａｒｇ２）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ酢酸塩（Ａｒｇ３）（いずれもBachem社製、H-1790）をそれぞれ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解して１％溶液を作製した。各溶液１５〜３０μｌを、製造例２で作製した没食子酸ドデシル固定化担体にアプライし、実施例１と同様のグラジエント条件で溶出した。
溶出液のＵＶ２８０ｎｍは、分光光度計ＵＶ−８０２０（東ソー株式会社製）を用いて測定した。
また、対照として、３０μLの上記のＡｒｇ１溶液、１５μLのＡｒｇ２溶液又は２０μLのＡｒｇ３溶液を、Sephadex LH-20（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にアプライして溶出したときの溶出液のＵＶ２８０ｎｍを測定した。
これらの結果を、図２に示す。
【００２９】
図２の結果から、没食子酸ドデシル固定化担体のカラムを用いると、アルギニンの重合度に応じて溶出時間が遅くなることがわかる。これに対して、没食子酸ドデシルを固定化していない担体のカラムでは、アルギニンの重合度が変化しても、溶出時間は変化しない。
没食子酸ドデシルを固定化していない担体のカラムを用いた場合の各アルギニン塩の溶出時間を１００とすると、没食子酸ドデシル固定化担体のカラムを用いた場合の各アルギニン塩の溶出時間は、Ａｒｇ１について１１９、Ａｒｇ２について１２３、Ａｒｇ３について１３６であった。アルギニンの重合度が高いほど、ポリフェノール化合物との親和性も高くなると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】没食子酸ドデシル固定化担体のカラムに（Ａｒｇ）9付加ＧＳＴタンパク質溶液を供した後の溶出フラクションのSDS-PAGEの結果を示すゲルの写真である。
【図２】種々の重合度のアルギニンの塩を没食子酸ドデシル固定化担体のカラムに通したときの溶出液のＵＶ２８０ｎｍを示すチャートである。
【図１】
2008241574.tif 000002
【図２】
2008241574.tif 000003
【配列表】
2008241574000001.app