(57)【要約】      （修正有）【課題】環境ホルモンによる影響を検出すべく、エストロゲン類似活性を有する化学物質の影響を検出して評価する方法の提供。【解決手段】エストロゲン類似活性を有する化学物質により発現が影響される遺伝子及び／又はEST（Expressed Sequence Tag）の一部又は全部を含むDNA断片が基板上に固定化された、マイクロアレイ。該遺伝子及び／又はESTは、乳ガン由来のMCF-7細胞でエストロゲンの存在により発現量が変化するものから選ばれた、マイクロアレイ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エストロゲン類似活性を有する化学物質により、その発現が影響される遺伝子及び／又はESTの一部又は全部を含むDNA断片が基板上に固定化されたことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項２】
上記遺伝子及び／又はESTは、乳ガン由来のMCF-7細胞でエストロゲンの存在により発現量が変化するものから選ばれたことを特徴とする請求項１記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
上記遺伝子及び／又はESTは、下記（１）群、（２）群及び（３）群のいずれかに属することを特徴とする請求項１又は２記載のマイクロアレイ。
（１）エストロゲン類似活性を有する化学物質より発現量が上昇する遺伝子及び／又はEST。
（２）エストロゲン類似活性を有する化学物質より発現量が減少する遺伝子及び／又はEST。
（３）上記（１）及び（２）と比較して、発現量の変化が小であって発現量が大である遺伝子及び／又はEST。
【請求項４】
上記（１）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（２）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（３）群に属する遺伝子及び／又はESTとから選ばれる少なくとも１以上の遺伝子及び／又はESTを固定化することを特徴とする請求項３記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
上記DNA断片は、エストロゲン類似活性を有する化学物質の存否に拘わらず定常的に発現する遺伝子及び／又はESTの一部又は全部を含むことを特徴とする請求項１〜４いずれか一項記載のマイクロアレイ。
【請求項６】
上記遺伝子及び／又はESTは、下記（４）群、（５）群、（６）群、（７）群及び（８）群のいずれかに属することを特徴とする請求項１又は２記載のマイクロアレイ。
（４）癌に関連する遺伝子及び／又はEST。
（５）細胞増殖及び／又は分裂に関与する遺伝子及び／又はEST。
（６）レセプターとして機能するポリペプチドをコードする遺伝子及び／又はEST。
（７）転写反応に関与する遺伝子及び／又はEST。
（８）細胞構造に関与する遺伝子及び／又はEST。
【請求項７】
上記（４）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（５）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（６）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（７）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（８）群に属する遺伝子及び／又はESTとから選ばれる少なくとも１以上の遺伝子及び／又はESTを固定化することを特徴とする請求項６記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
上記遺伝子及び／又はESTは、下記（９）群、（１０）群及び（１１）群のいずれかに属することを特徴とする請求項１又は２記載のマイクロアレイ。
（９）エストロゲンが作用する組織において機能する遺伝子及び／又はEST。
（１０）上皮系細胞に特徴的な遺伝子及び／又はEST。
（１１）神経細胞において機能する遺伝子及び／又はEST。
【請求項９】
上記（９）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（１０）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（１１）群に属する遺伝子及び／又はESTとから選ばれる少なくとも１以上の遺伝子及び／又はESTを固定化することを特徴とする請求項８記載のマイクロアレイ。
【請求項１０】
上記遺伝子及び／又はESTは、下記（１２）群及び（１３）群のいずれかに属することを特徴とする請求項１又は２記載のマイクロアレイ。
（１２）エストロゲンのアンタゴニストに耐性の細胞においてエストロゲンにより発現量が上昇する遺伝子及び／又はEST。
（１３）エストロゲンのアンタゴニストに耐性の細胞においてエストロゲンにより発現量が減少する遺伝子及び／又はEST。
【請求項１１】
上記（１２）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（１２）群に属する遺伝子及び／又はESTとから選ばれる少なくとも１以上の遺伝子及び／又はESTを固定化することを特徴とする請求項１０記載のマイクロアレイ。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１いずれか一項記載のマイクロアレイ
を用いるエストロゲン類似活性化合物の活性評価方法。
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、エストロゲン類似活性化合物の活性評価方法。
（ａ）エストロゲン類似活性化合物の影響を評価したい所望の細胞から核酸試料を調製する工程。
（ｂ）該核酸試料を請求項１〜１１のいずれか一項記載のマイクロアレイに接触させる工程。
（ｃ）該マイクロアレイにハイブリダイズした核酸を検出する工程。
（ｄ）（ｃ）の検出の結果を、対照細胞から調製した核酸試料を用いて検出した結果と比較する工程。
【請求項１４】
対照細胞が、17β−エストラジオール処理したMCF-7細胞である、請求項１３に記載の活性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAプローブを基板上に固定化してなるマイクロアレイ及びこれを用いたエストロゲン類似活性化合物の活性評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、１７β−エストラジオール等のエストロゲンと類似の活性を有する化学物質として、いわゆる環境ホルモンが知られている。この環境ホルモンは、人体における内分泌系撹乱化学物質であって、人体における各組織に大きな悪影響を及ぼすものである。したがって、人体の各組織において、環境ホルモンを検出するとともに、環境ホルモンの活性を正確に評価することが求められている。しかしながら、人体の各組織等を採取して環境ホルモンを検出することは可能であったが、環境ホルモンの活性を各組織において検出することはできなかった。
【０００３】
ところで、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定及び変異解析等に利用されるマイクロアレイが知られている。マイクロアレイは、DNAチップとも呼ばれ、スライドガラスやシリコン等からなる基板と、この基板上に整列して固定化されたDNA断片とから構成されている。このマイクロアレイでは、試料中に含まれるDNAを、基板上に固定化されたDNA断片とハイブリダイズさせることによって検出することができる。このとき、試料中に含まれるDNAは、放射線標識或いは蛍光標識されているため、放射線イメージスキャナ或いは蛍光イメージスキャナ等により検出することができる。
【０００４】
このように、マイクロアレイによれば、試料中に含まれるDNAを定量的に検出することができ、遺伝子発現のモニタリング等が可能となる。しかしながら、上述したようなエストロゲンの検出及びその影響を、マイクロアレイを用いて評価するような手法は確立されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑みてなされたものであり、環境ホルモンによる影響を検出すべく、エストロゲン類似活性を有する化学物質の影響を検出して評価することのできるマイクロアレイ及びエストロゲン類似活性化合物の活性評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述した目的を達成した本発明に係るマイクロアレイは、エストロゲン類似活性を有する化学物質により発現が影響される遺伝子及び／又はEST（Expressed Sequence Tag）の一部又は全部を含むDNA断片が基板上に固定化されたことを特徴とするものである。
本発明において、遺伝子及び／又はESTは、乳ガン由来のMCF-7細胞でエストロゲンの存在により発現量が変化するものから選ばれることが好ましい。
【０００７】
また、上記遺伝子及び／又はESTは、下記（１）群、（２）群及び（３）群のいずれかに属することが好ましい。
（１）エストロゲン類似活性を有する化学物質より発現量が上昇する遺伝子及び／又はEST。
（２）エストロゲン類似活性を有する化学物質より発現量が減少する遺伝子及び／又はEST。
（３）上記（１）及び（２）と比較して、発現量の変化が小であって発現量が大である遺伝子及び／又はEST。
【０００８】
また、マイクロアレイにおいては、上記（１）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（２）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（３）群に属する遺伝子及び／又はESTとから選ばれる少なくとも１以上の遺伝子及び／又はESTを固定化することが好ましい。
さらに、本発明に係るマイクロアレイでは、エストロゲン類似活性を有する化学物質の存否に拘わらず定常的に発現する遺伝子及び／又はESTを基板上に固定化することが好ましい。
【０００９】
一方、本発明に係るマイクロアレイでは、上記遺伝子及び／又はESTは、下記（４）群、（５）群、（６）群、（７）群及び（８）群のいずれかに属することが好ましい。
（４）癌に関連する遺伝子及び／又はEST。
（５）細胞増殖及び／又は分裂に関与する遺伝子及び／又はEST。
（６）レセプターとして機能するポリペプチドをコードする遺伝子及び／又はEST。
（７）転写反応に関与する遺伝子及び／又はEST。
（８）細胞構造に関与する遺伝子及び／又はEST。
【００１０】
ここで、上記（４）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（５）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（６）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（７）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（８）群に属する遺伝子及び／又はESTとから選ばれる少なくとも１以上の遺伝子及び／又はESTを固定化することが好ましい。
【００１１】
また、本発明に係るマイクロアレイでは、上記遺伝子及び／又はESTは、下記（９）群、（１０）群及び（１１）群のいずれかに属することが好ましい。
（９）エストロゲンが作用する組織において機能する遺伝子及び／又はEST。
（１０）上皮系細胞に特徴的な遺伝子及び／又はEST。
（１１）神経細胞において機能する遺伝子及び／又はEST。
【００１２】
ここで、上記（９）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（１０）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（１１）群に属する遺伝子及び／又はESTとから選ばれる少なくとも１以上の遺伝子及び／又はESTを固定化することが好ましい。
【００１３】
さらに、本発明に係るマイクロアレイでは、上記遺伝子及び／又はESTは、下記（１２）群及び（１３）群のいずれかに属することが好ましい。
（１２）エストロゲンのアンタゴニストに耐性の細胞においてエストロゲンにより発現量が上昇する遺伝子及び／又はEST。
（１３）エストロゲンのアンタゴニストに耐性の細胞においてエストロゲンにより発現量が減少する遺伝子及び／又はEST。
【００１４】
ここで、上記（１２）群に属する遺伝子及び／又はESTと、上記（１３）群に属する遺伝子及び／又はESTとから選ばれる少なくとも１以上の遺伝子及び／又はESTを固定化することが好ましい。
一方、本発明に係るエストロゲン類似活性化合物の活性評価方法は、上記のマイクロアレイを用いるものである。
さらに、本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、エストロゲン類似活性化合物の活性評価方法に関する。
（ａ）エストロゲン類似活性化合物の影響を評価したい所望の細胞から核酸試料を調製する工程。
（ｂ）該核酸試料を上記のマイクロアレイに接触させる工程。
（ｃ）該マイクロアレイにハイブリダイズした核酸を検出する工程。
（ｄ）（ｃ）の検出の結果を、対照細胞から調製した核酸試料を用いて検出した結果と比較する工程。
ここで、対照細胞は、１７β−エストラジオール処理したMCF-7細胞であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、エストロゲン類似活性を有する化学物質の評価対象の細胞に対する影響を判定できるマイクロアレイを提供することができる。このマイクロアレイを用いることによって、評価対象の細胞に対する環境ホルモン等の影響を評価することができる。
【００１６】
また、本発明によれば、評価対象の細胞において遺伝子及び／又はESTの発現量を測定することによって、エストロゲン類似活性化合物の活性評価方法を提供することができる。このエストロゲン類似活性化合物の活性評価方法によれば、評価対象の細胞に対する環境ホルモン等の影響を評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明に係るマイクロアレイ及びエストロゲン類似活性化合物の活性評価方法について詳細に説明する。
本発明を適用したマイクロアレイは、複数のDNA断片を基板上に固定化している。ここで、DNA断片は、エストロゲン類似活性を有する化学物質により発現が影響される遺伝子及び／又はESTの一部又は全部を含むものである。具体的に、当該遺伝子及びESTとしては、乳ガン由来のMCF-7細胞株又はMCF-7細胞株由来の細胞株において、１７β−エストラジオールに対する応答性を示すものを挙げることができる。すなわち、乳ガン由来のMCF-7細胞株又はMCF-7細胞株由来の細胞株において、１７β−エストラジオールの存否に応じて発現量が変化するような遺伝子及びESTの一部又は全部を含むDNA断片を使用することができる。
【００１８】
ここで、１７β−エストラジオールの存否に応じて発現量が変化するとは、１７β−エストラジオールが存在した場合にmRNA量の増加が2倍以上であるか、或いは、１７β−エストラジオールが存在した場合にmRNA量の減少が1/2以下であるかを意味する。
【００１９】
乳ガン出来のMCF-7細胞株又はMCF-7細胞株由来の細胞株において、１７β−エストラジオールに対する応答性を示す遺伝子又はESTとしては、
（１）１７β−エストラジオールによって発現量が上昇するもの
（２）１７β−エストラジオールによって発現量が減少するもの
（３）上記（１）及び（２）と比較して、発現量の変化が小であって発現量が大であるもの
を例示することができる。
【００２０】
ここで、（１）群は、１７β−エストラジオールの存在により発現量が3倍以上に上昇するもの、（２）群は、１７β−エストラジオールの存在により発現量が1/3以下に減少するものを意味する。また、（３）群は、１７β−エストラジオールの存在により発現量が2倍を超えて3倍未満に増加するもの、或いは、1/3を超えて1/2未満に減少するものであって、且つ、対照としている遺伝子の一つであるkeratin 6Bの発現量と比較して同程度か、それ以上の発現量のものを意味する。
【００２１】
より具体的に、（１）群の遺伝子又はESTとしては、
activating transcription factor 3   ｛N39944｝；
aldo-keto reductase family 1, member C4  ｛T73188｝；
amphiregulin   ｛M30704｝；
asparagine synthetase  ｛L35946｝；
B-factor, properdin   ｛X72875｝；
cyclin A1   ｛U66838｝；
DKFZP566G223 protein   ｛AI261366｝；
early growth response 3   ｛X63741｝；
ESTs  ｛AA587912｝；
ESTs  ｛AI185199｝；
ESTs  ｛U82984｝；
ESTs  ｛X62585｝；
ESTs   ｛N35555｝；
ESTs   ｛AA975298｝；
ESTs   ｛AA682502｝；
ESTs  ｛AA629308｝；
exportin, tRNA  ｛AF039022｝；
FOS-like antigen 2  ｛AI088306｝；
FOS-like antigen 2  ｛X16706｝；
glutamic-oxaloacetic transaminase 1, soluble  ｛M37400｝；
glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 1  ｛M90516｝；
glycyl-tRNA synthetase   ｛D30658｝；
heat shock 70kD protein 5   ｛AI878886｝；
Homo sapiens ccr2b (ccr2), ccr2a (ccr2), ccr5 (ccr5) and ccr6 (ccr6) genes  ｛AF012281｝；
Homo sapiens integrin-linked kinase (ILK), 1  ｛XM_006424｝；
Homo sapiens integrin-linked kinase (ILK), 2  ｛XM-006424｝；
Homo sapiens methylene tetrahydrofolate dehydrogenase  ｛XM_002234｝；
Homo sapiens partial mRNA for A-type potassium channel modulatory protein 2  ｛AJ276317｝；
Homo sapiens similar to chemokine receptor 2  ｛XM_002923｝；
Homo sapiens solute carrier family 26, member 3  ｛L02785｝；
Homo sapiens transcription elongation factor A   ｛NM-006756｝；
hyaluronan-mediated motility receptor  ｛U29343｝；
insulin-like growth factor-binding protein 4   ｛M62403｝；
interferon stimulated gene  ｛X89773｝；
KIAA1051 protein  ｛AB028974｝；
matrix Gla protein  ｛AA484893｝；
methylene tetrahydrofolate dehydrogenase  ｛X16396｝；
microtubule-associated protein 1B   ｛L06237｝；
neuropeptide Y receptor Y1   ｛NM-00090｝；
nuclear receptor interacting protein 1   ｛X84373｝；
phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1   ｛D90070｝；
phosphoenolpyruvate carboxykinase 2  ｛X92720｝；
phosphoinositide-3-kinase, class 3   ｛Z46973｝；
prostate differentiation factor   ｛AA216685｝；
retinoblastoma-binding protein 8   ｛U72066｝；
ribosomal protein S6 kinase, 90kD, polypeptide 3  ｛U08316｝；
S100 calcium-binding protein P   ｛AI151190｝；
solute carrier family 7, member 5   ｛M80244｝；
stanniocalcin 2   ｛AB012664｝；
TGFB inducible early growth response   ｛AF050110｝；
transcobalamin I  ｛J05068｝；
trefoil factor 1  ｛X05030｝；
tumor protein D52-like 1   ｛U44427｝；
tumor rejection antigen (gp96) 1   ｛X15187｝；
unc-51-like kinase 1   ｛AB018265｝；
v-jun avian sarcoma virus 17 oncogene homolog   ｛AI598150｝；
を例示することができる。なお、括弧内はGenBank Accession No．示している。
【００２２】
（２）群の遺伝子又はESTとしては、
absent in melanoma 1   ｛U83115｝；
bassoon  ｛Y18448｝；
cadherin 18   ｛U59325｝；
catenin, delta 2  ｛XM-011351｝；
EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1   ｛U03877｝；
enolase 3  ｛X56832｝；
Estrogen receptor, alpha  ｛AY033393｝；
fucosyltransferase 8  ｛Y17977｝；
heat shock 70kD protein 1  ｛M59828｝；
Homo sapiens CDC14 homolog B  ｛XM-011585｝；
Homo sapiens paired basic amino acid cleaving system 4  ｛NM-002570｝；
Homo sapiens quiescin Q6  ｛NM-002826｝；
Homo sapinens mRNA;cDNA DKFZp434J065  ｛AL137638｝；
Human insulin-like growth factor binding protein 5  ｛L27560｝；
Human mRNA for KIAA0018 gene  ｛D13643｝；
insulin-like growth factor binding protein 5  ｛AA374325｝；
KIAA0307 gene product  ｛AB002305｝；
paired basic amino acid cleaving system 4  ｛D87993｝；
quiescin Q6   ｛U97276｝；
Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha   ｛X69550｝；
selenium binding protein 1   ｛U29091｝；
solute carrier family 12, member 2  ｛U30246｝；
を挙げることができる。
【００２３】
（３）群の遺伝子又はESTとしては、
aconitase 2, mitochondrial  ｛U87939｝；
alpha-1-antichymotrypsin   ｛X00947｝；
argininosuccinate synthetase  ｛AI660571｝；
calpain, small polypeptide  ｛AC002984｝；
carnitine palmitoyltransferase I  ｛L39211｝；
cathepsin D  ｛M63138｝；
CDC6 homolog   ｛AF022109｝；
CDP-diacylglycerol--inositol 3-phosphatidyltransferase  ｛AF014807｝；
chromobox homolog 1  ｛AL046741｝；
corneodesmosin  ｛L20815｝；
enolase 2  ｛X51956｝；
ESTs  ｛AI949781｝；
ESTs  ｛AI188401｝；
ESTs  ｛AI492976｝；
ESTs  ｛AI767533｝；
ESTs   ｛AI332415｝；
eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 9  ｛U78525｝；
ferritin, heavy polypeptide 1   ｛AA102267｝；
fructose-bisphosphatase 1  ｛M19922｝；
general transcription factor II, i, pseudogene 1  ｛AI700706｝；
H3 histone, family 3B  ｛Z48950｝；
histone deacetylase 6   ｛AJ011972｝；
Homo sapiens ,adipose specific 2  ｛BC004471｝；
Homo sapiens BAC clone CTB-163k11 from 7q31  ｛AC005192｝；
Homo sapiens cDNA FLJ12748fis  ｛AK022810｝；
Homo sapiens chromosome 17, Neurofibromatosis 1 locus  ｛AC004526｝；
Homo sapiens clone 23783 mRNA sequence   ｛AF054996｝；
Homo sapiens DNA from chromosome 19, cosmid F21856   ｛AC004030｝；
Homo sapiens interleukin 2 receptor, beta  ｛XM-009962｝；
Homo sapiens mRNA for KIAA0226 protein  ｛D86979｝；
Homo sapiens mRNA for NEFA protein  ｛X76732｝；
Homo sapiens ryanodine receptor 2  ｛XM-001778｝；
Homo sapiens vascular endothelial growth factor  ｛AF024710｝；
HS1 binding protein   ｛N28312｝；
Human breast cancer cytosolic NADP(+)-dependent malic enzyme  ｛U43944｝；
Human clone 23855 mRNA  ｛U79302｝；
Human low-Mr GTP-binding protein  ｛U59878｝；
Human meningioma-expressed antigen II  ｛U73682｝；
Human mRNA for KIAA0373 gene  ｛AB002371｝；
Human threonyl-tRNA synthetase  ｛M63180｝；
Human transcripton factor ERF-1  ｛U85658｝；
inhibitor of DNA binding 4, dominant negative helix-loop-helix protein   ｛AL022726｝；
isoleucine-tRNA synthetase   ｛NM-012096｝；
keratin 8   ｛X74929｝；
KIAA0058 gene product   ｛AL036958｝；
KIAA0123 protein   ｛D21064｝；
KIAA0196 gene product  ｛D83780｝；
KIAA0551 protein   ｛AB011123｝；
KIAA0587 gene product   ｛AB011159｝；
mal, T-cell differentiation protein  ｛X76220｝；
mannosidase, alpha, class 1A, member 1  ｛X74837｝；
membrane component, chromosome 1, surface marker 1  ｛X13425｝；
MYC promoter-binding protein 1   ｛AA482422｝；
poliovirus receptor   ｛X64116｝；
protein geranylgeranyltransferase type I, beta subunit   ｛AA481712｝；
protein kinase C substrate 80K-H   ｛J03075｝；
protein kinase C, delta   ｛D10495｝；
protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 18  ｛X79568｝；
ras homolog gene family, member C   ｛L25081｝；
reticulocalbin 1, EF-hand calcium binding domain  ｛D42073｝；
serine hydroxymethyltransferase 2  ｛U23143｝；
SH3-domain binding protein 5  ｛AB005047｝；
solute carrier family 1, member 5   ｛AF105826｝；
sorbitol dehydrogenase   ｛U07361｝；
stearoyl-CoA desaturase  ｛AA143530｝；
synaptogyrin 2   ｛AJ002308｝；
TATA box binding protein (TBP)-associated factor  ｛U21858｝；
tyrosyl-tRNA synthetase   ｛U89436｝；
U5 snRNP-specific protein  ｛D21163｝；
UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4- galactosyltransferase, polypeptide 1  ｛X13223｝；
を例示することができる。
【００２４】
なお、本発明は、基板上に固定化する遺伝子及び／又はESTとして上述した（１）群、（２）群及び（３）群に属するもに限定されず、エストロゲン類似活性を有する化学物質により発現が影響されるものであればいかなる遺伝子及び／又はESTを使用しても良い。ここで、エストロゲン類似活性を有する化学物質とは、ヒトの性ホルモンであるエストロゲン（ステロイド系の化学物質で卵巣濾胞や胎盤などから分泌され、卵胞や乳腺などの女性生殖器官あるいはその他の器官（脳など）の発育を促すホルモンの総称）と同様に、女性生殖器官などに影響を与える化学物質のことを意味する。エストロゲン自体の作用機構がまだ完全に解明されていないが、エストロゲンは、エストロゲン受容体に結合することにより、その他の遺伝子の発現に対して影響するものと考えられている。したがって、エストロゲン受容体遺伝子が発現している脳、肝臓、筋肉、骨細胞、胃などの組織に対してもエストロゲンは影響すると考えられる。
【００２５】
エストロゲン類似活性を有する化学物質としては、１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオール及びジエテルステルベストロール等の天然又は合成女性ホルモンを挙げることができる。また、エストロゲン類似活性を有する化学物質としては、クメストロール及びダイゼイン等の植物エストロゲンを挙げることができる。さらに、エストロゲン類似活性を有する化学物質としては、DDT、アルドリン、ヘプタクロル等の農薬を挙げることができる。さらにまた、エストロゲン類似活性を有する化学物質としては、ダイオキシン、PCB、ノニフェノール、ビスフェノールA、フタル酸エステル及びトリブチルスズ化合物等の工業原料、材料、製品及び副生成物を挙げることができる。
【００２６】
基板上に固定化するDNA断片としては、上述したような遺伝子及び／又はESTの全部を含むものであっても良いし、その一部を含むものであっても良い。ここで、遺伝子及び／又はESTの一部とは、上述した遺伝子及び／又はESTのの一部であって、少なくとも300〜500塩基対に相当する塩基配列を意味する。
【００２７】
また、マイクロアレイにおいては、エストロゲン類似活性を有する化学物質の存否に拘わらず定常的に発現する遺伝子及び／又はEST（以下、補正用遺伝子等という）を基板上に固定化することが好ましい。これら補正用遺伝子等としては、発現量に差がある複数のものを選定することが好ましい。エストロゲン類似活性を有する化学物質の存否に拘わらず定常的に発現し、発現量に差がある遺伝子としては、例えば、
actin, alpha 1｛BC003575｝；
actin, beta ｛X00351｝；
general transcription factor IIH｛AI239815｝；
glutamate-cysteine ligase｛L35546｝；
H. sapiens tunp mRNA for transformation｛X72727｝；
Homo sapiens cDNA FLJ12748fis, clone NT2RP2001137｛AK0022810｝；
Homo sapiens interleukin 6 signal transducer｛NM002184｝；
Homo sapiens protein kinase C delta  ｛XM003106｝；
Homo sapiens protein kinase related to S.cerevisiae STE20｛XM009395｝；
Homo sapiens putative transmembrane protein  ｛XM005791｝；
Homo sapiens STAT-induced STAT inhibitor-2｛AF037989｝；
Homo sapiens, short-chain deghydrogenase/reductase1｛BC002730｝；
Homo sapiens, TLS-associated serine-arginine protein2｛BC005039｝；
Human DNA sequence from PAC 204E5 on chromosome 12  ｛Z98941｝；
Human GOS2 gene｛M72855｝；
Human GT mitochondrial solute carrier protein｛M31659｝；
Human mRNA for glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD).｛X03673｝；
Human mRNA for KIAA0349 gene｛AB002347｝；
Human pre-B cell stimulating factor homologue (SDF1b)｛L36033｝；
keratin 6B ｛L42611｝；
Macaca fascicularis brain cDNA, clone: QnpA-21739｛AB050427｝；
mRNA from KIAA 1151 protein｛AB032977｝；
nucleophosmin  ｛AA173870｝；
ribosomal protein L35  ｛AI815757｝；
solute carrier family 29 (nucleoside transporters), member 2 ｛AI342303｝；
tumor necrosis factor receptor superfamily, member 7 ｛AA994925｝；
zinc finger protein 147｛D21205｝；
を挙げることができる。
【００２８】
補正用遺伝子等を基板上に固定化することによって、（１）群、（２）群及び（３）群の遺伝子及び／又はESTの発現量を補正することができる。すなわち、補正用遺伝子等の発現量が常に一定となるように、（１）群、（２）群及び（３）群の遺伝子及び／又はESTの発現量を補正することができる。これによって、（１）群、（２）群及び（３）群の遺伝子及び／又はESTの発現量の変化をより確実に検出することができる。
【００２９】
このとき、補正用遺伝子等として、発現量に差がある複数のものを選定することによって、（１）群、（２）群及び（３）群に示した遺伝子及び／又はESTの発現量を的確に補正することができる。すなわち、所定の遺伝子及び／又はESTの発現量を補正するときに、当該遺伝子及び／又はESTの発現量に近い発現量を示す補正用遺伝子等を用いることによって的確な補正を行うことができる。
また、マイクロアレイにおいては、１７β−エストラジオール処理したMCF-7細胞においては顕著な発現の上昇あるいは減少はみられないが、エストロゲンによる細胞影響においてエストロゲンとの関連性が公知あるいは類推される遺伝子及び／又はESTを正の対照（Positive Control）として用いることができる（以下、これらを対照用遺伝子等という）。すなわち、脳などの組織でエストロゲンの受容体として働くエストロゲン受容体ベータ遺伝子、エストロゲンあるいはエストロゲン類似活性を有する化合物により発現の上昇を示すアロマターゼ遺伝子や17beta-HSD遺伝子、あるいはダイオキシンのマーカーとして公知のCYP1A1遺伝子などを用いることにより、さらに精度の高い評価を行うことができる。
対照用遺伝子等としては、例えば、
17beta-HSD, type2  ｛AF411015｝；
A1B1  ｛AF012108｝；
AhR  ｛XM040803｝；
aromatase  ｛AF397171｝；
cyclinD  ｛AF318615｝；
CYP1A1  ｛AH007293｝；
erbB2  ｛M86910｝；
Estrogen receptor, beta  ｛NM001437｝；
Estrogen sulfatase  ｛L25275｝；
H.sapiens SCA1 mRNA for ataxin  ｛X79203｝；
Homo sapiens cDNA FLJ12048fis, clone HEMBB1001990  ｛AK022110｝；
Homo sapiens mRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE781354  ｛M60922｝；
Homo sapiens ribosormal protein L31  ｛NM000993｝；
Homo sapiens transforming growth factor,alpha  ｛XM002732｝；
Homo sapiens UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4-galactocyltransferase,polypeptide1  ｛NM001497｝；
Human 150kDa oxgen-regulated protein ORP150  ｛U65785｝；
Human autotaxin-t  ｛L46720｝；
Human chromosome 14 DNA sequence BAC R-406H23oq library   ｛AL118556｝；
Human inositol 1,3,4-trisphosphate 5/6-kinase  ｛U51335｝；
Human intercrine-alpha  ｛U19495｝；
Human mRNA amd promoter DNA for progesteron receptor  ｛X51730｝；
Human mRNA for KIAA0008  ｛D13633｝；
Human mRNA for KIAA0062 gene  ｛D31887｝；
Human mRNA for KIAA0101 gene  ｛D14656｝；
IGFR  ｛JQ1035｝；
KIAA0172  ｛D79994｝；
progesterone receptor  ｛XP006190｝；
SRC-1  ｛U40396｝；
を例示することができる。
【００３０】
基板上にDNA断片及び補正用遺伝子を固定化する際には、従来より公知の手法を用いることができる。例えば、ポリリジン等のポリ陽イオンで基板表面を処理してDNA断片の電荷により基板表面に静電結合させたり、DNA断片の5'末端と基板とを共有結合させる手法を用いることができる。また、表面にリンカーを有する基板を作製し、DNA断片の末端に当該リンカーと共有結合を形成できる官能基を導入し、当該官能基とリンカーとを共有結合させることによって、DNA断片等を固定化することもできる。
【００３１】
以上のように構成されたマイクロアレイを用いることによって、評価対象の細胞中における、エストロゲンに対して応答性を示す遺伝子及び／又はESTの発現量を測定することができる。評価対象の細胞において、当該遺伝子及び／又はESTの発現量を測定することによって、環境ホルモン等のエストロゲン類似活性を有する化学物質による影響を評価することができる。
【００３２】
本発明において、評価対象の細胞としては、特に限定されないが、乳腺、子宮、肝臓、脳及び胃等のヒトの組織から採取した細胞を使用することができる。評価対象の細胞における環境ホルモン等の影響を評価するには、先ず、当該細胞から全量mRNAを抽出する。mRNAを抽出する際には、従来より公知の手法を使用することができ、市販のmRNA精製キット（例えば、Miltenyi Biotec社、商品名MACS）を使用することができる。
【００３３】
次に、抽出したmRNAを鋳型として逆転写酵素（例えば、GibcoBRL社製、SuperScript Reverse Transcriptase）及び標識dNTP（例えば、アマシャムファルマシアバイオテク社製、Cy3-dUTP、Cy5-dUTP）を用いてcDNAを作製し、評価対象の細胞中に発現している遺伝子量を反映したcDNAサンプルを調製する。これによりcDNAサンプル中には、標識されたcDNAが含まれることとなる。ここで、標識には、蛍光標識又は放射線標識のいずれを用いても良い。
【００３４】
このように調製したcDNAサンプルを一本鎖に変性した状態で上述したマイクロアレイに作用させ、基板上に固定化された遺伝子及び／又はESTとcDNAサンプル中に含まれるcDNAとをハイブリダイズさせる。このとき、例えば、65℃で１０〜２０時間インキュベートすることによりcDNAとをハイブリダイズさせることができる。
【００３５】
その後、マイクロアレイのDNA断片とハイブリダイズしたcDNAを検出する。ハイブリダイズしたcDNAを蛍光標識した場合、例えば、蛍光レーザ顕微鏡とＣＣＤカメラとにより蛍光を検出し、コンピュータにより蛍光強度を解析する。なお、ハイブリダイズしたcDNAを放射線標識した場合も同様に、ＲＩイメージスキャナ等で検出し、コンピュータにより放射線強度を解析することができる。
【００３６】
評価対象の細胞において、上述した遺伝子及び／又はESTの発現量をマイクロアレイで検出することによって、評価対象の細胞に対するエストロゲン類似活性を有する化学物質の影響を判断することができる。言い換えると、上述したマイクロアレイを用いて当該細胞における遺伝子及びESTの発現を測定することによって、環境ホルモン等の影響を評価することができる。
【００３７】
この評価には、基板上に固定化したDNA断片に含まれる遺伝子及び／又はESTの発現量の合計を、10nMの１７β−エストラジオール存在下のＭＣＦ−7細胞における当該遺伝子及び／又はESTの発現量の合計に対する相対値として算出した評価値を用いる。すなわち、評価値は、10nMの１７β−エストラジオール存在下のMCF-7細胞における当該遺伝子及び／又はESTの発現量の合計を、検定を行う化学物質の存在化のMCF-7細胞における当該遺伝子及び／又はESTの発現量の総発現量の合計を等しいとしたときに、それぞれの遺伝子及びESTの発現量の比の絶対値を合計した値として算出される。
【００３８】
以下、評価値の算出手順を説明する。
n番目の遺伝子及びESTの発現量En（n=１〜203）は次のように定義できる。
En= (Cy3／C5補正値)
とする。ただし、
Cy3/C5補正値= （Cy3/C5値）／（補正用遺伝子等のCy3/C5値の平均値）
である。すなわち、Cy3/C5補正値はそれぞれの遺伝子のCy3/C5値を補正用遺伝子等の発現量で補正したものである。補正用遺伝子等は、発現量により合計27の遺伝子を選定しているが、発現状態などにより変更することができる。
【００３９】
次に、様々な化学物質処理において遺伝子及びESTの発現量を比較するために補正値tを用いて、
BDEn= t(En) 
と表すことができる。ただし、補正後の発現量をBDEn（n=1〜203）とする。t値は、１７β−エストラジオールを用いたときの発現量E(Estrogen)nを基準にする。すなわち、化学物質Aを用いたときの発現量をE(A)nとすると、
t=Σ［E(Estrogen)n］／Σ［E(A)n］
の計算により算出できる。ただし、１７β−エストラジオールの場合は、
t=1
であり、したがって、
BDEn= En、
となる。
【００４０】
エストロゲン類似活性の評価を行うとき、１７β−エストラジオールを用いたときの補正後の発現量BDE(Estrogen)nとし、化学物質Aを用いたときの遺伝子nの補正後の発現量をBDE(A)nとしたとき、BDE(A)nとBDE(Estrogen)nの差の絶対値を計算し、その和（n=1〜203）を評価値とする。
（評価値）= Σ［｜log｛BDE(A)n／BDE(Estrogen)n｝｜］
この結果、評価値が低いほど、エストロゲン類似活性が高いと評価できる。
このような評価を行うと、1例として同じエストロゲン処理の全く独立の試験の結果では、
（評価値）= 16.81
となるが、たとえば、10nMダイオキシン処理の場合は、
（評価値）= 46.19
と有意に高い直を示し、評価値が低いほど、エストロゲン（１７β−エストラジオール）処理と近似の影響を示すことがわかる。
【００４１】
また、このとき、基板上に固定化したDNA断片により発現量が測定される遺伝子及びESTの特徴などに基づいた重みを考慮して評価値を算出してもよい。すなわち、補正用及び対照用遺伝子等を含めた203種類の遺伝子及びESTそれぞれについて重みKn（n=1〜203）を予め設定し、
（評価値）= 〔Σ［Kn｜log｛BDE(A)n／BDE(Estrogen)n｝｜］〕／Σ(Kn)
（n=1〜203）に従って評価値を算出してもよい。
【００４２】
このように、遺伝子及びESTに重みを考慮して評価値を算出することによって、算出された評価値は、評価対象の細胞におけるエストロゲン類似活性を有する化学物質の影響をより顕著に反映することとなる。なお、補正用遺伝子等については、重みをゼロとして計算する。
【００４３】
ここで、重みKnは、遺伝子及び／又はESTに応じて限定的に設定されるものではなく、評価結果に鑑みて、より精度の高い評価結果を得るために変更することが好ましい。特に、重みKnの値は、評価対象の細胞が由来する組織や、エストロゲン類似活性を有する化合物に応じて、種々の値を設定することが好ましい。これにより、本評価方法によれば、目的に応じたより精度の高い評価を行うことができる。
【００４４】
また、この方法では、評価対象として乳腺、子宮、肝臓、脳及び胃等のヒトの組織から採取した細胞を用いることによって、これら各組織に対するエストロゲン類似活性を有する化学物質の影響を判別することができる。すなわち、このマイクロアレイによれば、エストロゲン類似活性を有する化学物質の組織に対する影響を評価することができる。
【００４５】
また、このマイクロアレイによれば、上述したようなエストロゲン類似活性を有する化学物質の組織に対する影響を評価できるだけでなく、未知あるいは既知の化学物質のエストロゲン活性を解明することもできる。すなわち、細胞に対する影響が知られていない化学物質に関して、このマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性を有するか否かを評価することができる。
さらに、このマイクロアレイによれば、エストロゲン類似活性を有する化学物質が他の化学物質と共存する場合に、その活性が促進されるのか又は抑制されるのかを判別することができる。
【００４６】
ところで、本発明のマイクロアレイは、上述したように評価対象の細胞に対するエストロゲン類似活性を有する化学物質の影響を評価するだけでなく、当該影響の詳細を示すこともできる。特に、上述したマイクロアレイでは、（１）群、（２）群及び（３）群に示した遺伝子及びEST及び対照用遺伝子等、合計176種類の遺伝子及びESTを、
（４）癌に関連する遺伝子及び／又はEST
（５）細胞増殖及び／又は分裂に関与する遺伝子及び／又はEST
（６）レセプターとして機能するポリペプチドをコードする遺伝子及び／又はEST
（７）転写反応に関与する遺伝子及び／又はEST
（８）細胞構造に関与する遺伝子及び／又はEST
に分類することもできる。具体的に、（４）群の癌に関連する遺伝子及び／又はEST（発現遺伝子又は癌抑制遺伝子）としては、
trefoil factor 1 {X05030};
tumor protein D52-like 1 {U44427};
phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1 {D90070};
down-regulated in adenoma {L02785};
retinoblastoma-binding protein 8 {U72066};
tumor rejection antigen (gp96) 1 {X15187};
v-jun avian sarcoma virus 17 oncogene homolog {AI598150};
pituitary tumor-transforming l {AA430241};
ras homolog gene family, member C {L25081};
MYC promoter-binding protein 1 {AA482422};
absent in melanoma 1 {U83115};
を挙げることができる。
【００４７】
（５）群の細胞増殖及び／又は分裂に関与する遺伝子及び／又はESTとしては、
early growth response 3 {X63741};
amphiregulin {M30704};
insulin-like growth factor-binding protein 4 {M62403};
cyclin A1 {U66838};
TGFB inducible early growth response {AF050110};
CDC6 homolog {AF022109};
catenin, delta 2 {U96136};
cadherin 18 {U59325};
EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 {U03877};
insulin-like growth factor binding protein 5 {AA374325};
Human insulin-like growth factor binding protein 5 (IGFBP5) {L27560};
cyclin A1 {U66838};
ribosomal protein S6 kinase, 90kD, polypeptide 3 {U08316};
を挙げることができる。
【００４８】
（６）群のレセプターとして機能するポリペプチドをコードする遺伝子及び／又はESTとしては、
hyaluronan-mediated motility receptor (RHAMM) {U29343};
neuropeptide Y receptor Y1 {M84755};
nuclear receptor interacting protein 1 {X84373};
poliovirus receptor {X64116};
estrogen receptor 1 {X03635};
を挙げることができる。
【００４９】
（７）群の転写反応に関与する遺伝子及び／又はESTとしては、
CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), beta {AA557306};
FOS-1ike antigen 2 {AI088306};
prostate differentiation factor {AA216685};
activating transcription factor 3 {N39944};
FOS-like antigen 2 {X16706};
H3 histone, family 3B (H3.3B) {Z48950};
TATA box binding protein (TBP)-associated factor, RNA polymerase II, G {U21858};
histone deacetylase 6 {AJ011972};
general transcription factor II, i, pseudogene 1 {AI700706};
heat shock 70kD protein 1 {AI700706};
を挙げることができる。
【００５０】
（８）群の細胞構造に関与する遺伝子及び／又はESTとしては、
H3 histone, family 3B {Z48950};
histone deacetylase 6 {AJ011972};
を挙げることができる。
【００５１】
このように、（４）群〜（８）群に分類された遺伝子及び／又はESTの発現量を個別に評価することによって、エストロゲン類似活性を有する化学物質が評価対象の細胞に対してどのように影響しているのかを判別することができる。言い換えると、マイクロアレイとしては、（４）群〜（８）群に属する遺伝子の一部又は全部を含むDNA断片を固定化することが好ましい。この場合、マイクロアレイを用いることによって、評価対象の細胞がエストロゲン類似活性を有する化学物質によってどのような影響を受けているのかを判別することができる。
【００５２】
また、（１）群、（２）群及び（３）群に示した遺伝子及びEST及び対照用遺伝子等を含めた合計176種類の遺伝子及びESTを、組織特異的な発現や機能が見られる遺伝子群に分類することもできる。すなわち、これら176種類の遺伝子及びESTは、
（９）エストロゲンが作用する組織において機能する遺伝子及び／又はEST
（１０）上皮系細胞に特徴的な遺伝子及び／又はEST
（１１）神経細胞において機能する遺伝子及び／又はEST
に分類することができる。具体的に、（９）群のエストロゲンが作用する組織において機能する遺伝子及び／又はESTとしては、
trefoil factor 1 {X05030};
estrogen receptor alpha {AY033393};
を挙げることができる。
【００５３】
（１０）群の上皮系細胞に特徴的な遺伝子及び／又はESTとしては、
tumor protein D52-like 1 {U44427};
solute carrier family 1, member 4  {L14595};
solute carrier family 12, member 2 {U30246};
EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 {U03877};
を挙げることができる。
【００５４】
（１１）群の神経細胞において機能する遺伝子及び／又はESTとしては、
amphiregulin {M30704};
neuropeptide Y receptor Y1 {M84755};
synaptogyrin 2 {AJ002308};
protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 18 {X79568};
を挙げることができる。
【００５５】
このように、（９）群〜（１１）群に分類された遺伝子の発現量を評価することによって、評価対象の細胞において、エストロゲン類似活性を有する化学物質が影響を与えている組織を判別することができる。
【００５６】
さらに、（１）群、（２）群及び（３）群に示した遺伝子及びEST及び対照用遺伝子等、合計176種類の遺伝子及びESTを、エストロゲンのアンタゴニストであるタモキシフェン（tanoxifen）に対する応答性によって分類することもできる。すなわち、これら176種類の遺伝子及びESTは、
（１２）タモキシフェン耐性の細胞においてエストロゲンにより発現量が上昇する遺伝子及び／又はEST
（１３）タモキシフェン耐性の細胞においてエストロゲンにより発現量が減少する遺伝子及び／又はEST
に分類することができる。具体的に、（１２）群のタモキシフェン耐性の細胞においてエストロゲンにより発現量が上昇する遺伝子及び／又はESTとしては、
down-regulated in adenoma (DRA) {AI700706};
v-jun avian sarcoma virus 17 oncogene homolog {AI598150};
を挙げることができる。
【００５７】
（１３）群のタモキシフェン耐性の細胞においてエストログンにより発現量が減少する遺伝子及び／又はESTとしては、
carnitine palmitoyltransferase I {L39211};
cadherin 18 {U59325};
insulin-like growth factor binding protein 5 {AA374325};
Human insulin-like growth factor binding protein 5 {L27560};
を挙げることができる。
【００５８】
このように、（１２）群〜（１３）群に分類された遺伝子の発現量を評価することによって、タモキシフェン耐性の細胞を評価対象として、エストロゲン類似活性を有する化学物質の影響を判別することができる。
なお、本明細書中に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明に係るマイクロアレイを用いて、MCF-7細胞由来タモキシフェン耐性株クローン9細胞におけるエストロゲン類似活性を有する化学物質を影響を評価した例を実施例として説明する。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６０】
[実施例１]  １７β−エストラジオールの影響
（１）cDNAサンプルの調製
本例では、MCF-7細胞由来タモキシフェン耐性株クローン9細胞からMACS mRNA分離・精製キット（Miltenyi Blotec社）を用いて抽出したmRNAを鋳型とし、標識cDNAサンプルを合成した。
【００６１】
標識反応は以下のようにして行った。まず、2μgのpoly(A) RNAと4.5μgのオリゴdTプライマーを混合した後、70℃で１０分間変性させ、急冷する。直ちに、6μlの5X Superscript buffer（GibcoBRL社）、3μlのDTT、0.6μlの50X dNTP（Promega社）、3μlのCy3-dUTPまたはCy5-dUTP（アマシャムファルマシアバイオテク社）、2μlのSuperscript（GibcoBRL社）を加え、42℃で１時間反応させる。再び、2μlのSuperscript（GibcoBRL社）を加え、さらに42℃で１時間反応させる。270μlのTEバッファーを加える。Cy3-dUTPとCy5-dUTPをそれぞれ加えた反応液をまとめ、１本のMicrocon−30（MILLIPORE社）に移す。Microcon-30の上のカップに残る液量が約10μlになるまで、10,000rpmで遠心する。カップを通過した溶液をべつのチューブに移し替える。Microcon-30の上のカップにTEバッファーを500μl、ヒトCot1DNA（GibcoBRL社）を15μg加える。Microcon-30の上のカップに残る液量が約10μlになるまで、10,000rpmで遠心する。Microcon-30の上のカップを取り出し、新しい遠心チューブに逆さにして挿入する。3,000rpmで3分間遠心し、遠心チューブに溶液を回収する。回収した溶液に10μgのyeast tRNA（Sigma社）、4μgのポリdA（Sigma社）、に蒸留水を加え全量を8μlとする。この溶液に1.7μlの20X SSCと0.3μlの10%SDSを加え、100℃で１分間変性させる。室温で３０分間放置してゆっくり冷却させることによって、標識cDNAを含むcDNAサンプルを調製した。
【００６２】
（２）マイクロアレイを用いた発現量の測定
（１）で調製したcDNAサンプルを、下記表１中「Gene Name」の行に記載した遺伝子及び／又はESTの一部又は全部を含むDNA断片をスライドガラス（日清紡社）上に固定化したマイクロアレイに滴下した。なお、表１中、「No.5、No.6、No.59、No.60、No.64、No.75、No.83、No.90、No.91、No.92、No.98、No.103、No.104、No.112、No.113、No.114、No.121、No.126、No.128、No.138、No.148、No.155、No.159、No.176、No.184、No.195、及びNo.203」の27種類の遺伝子は、エストロゲンの存否に拘わらず定常的に発現する遺伝子であり、当該遺伝子の一部又は全部を含むDNA断片を補正用遺伝子として基板上に固定化した。また、MCF-7細胞において10nMの１７β−エストラジオールを存在させた状態で、27種類の補正用遺伝子及び176種類の遺伝子及びESTの発現量の変化を表１中「BDE」の行に示した。ここで、負のBDE値は発現量の減少を示す。
【００６３】
cDNAサンプルをDNAマイクロアレイに滴下した後、カバーガラス（マツナミ社）を乗せた。スライドガラスの乾燥を防ぐために、ハイブリダイゼーションチャンバーに入れ、密閉した。ハイブリダイゼーションチャンバーを65℃で10〜20時間インキュベートした。ハイブリダイゼーションチャンバーからスライドガラスを取り出し、2x SSC／0.2x SDS溶液中に入れてカバーガラスを外した。スライドガラスをlX SSC中で軽く震盪して洗浄し、さらに0.2X SSC中で軽く震盪して洗浄する。スライドガラスを乾燥後、DNAマイクロアレイ用蛍光スキャナ（Virtek社、ChipReader）を用いて、DNAマイクロアレイ上の蛍光量を測定し、下記表1中「E（例）」の行に結果を示した。なお、補正用遺伝子を除く遺伝子及びESTについては、それぞれの特徴とに基づいて重み（表1中「K」の行）を設定した。27種類の補正用遺伝子についてはKをゼロとした。
【００６４】
【表１】
2008263947.tif 000002
2008263947.tif 000003
2008263947.tif 000004
2008263947.tif 000005
2008263947.tif 000006
2008263947.tif 000007
2008263947.tif 000008
2008263947.tif 000009
2008263947.tif 000010
2008263947.tif 000011
2008263947.tif 000012
2008263947.tif 000013
2008263947.tif 000014
【００６５】
表１に10 nMの１７β−エストラジオール存在化のMCF-7細胞における遺伝子及びESTの発現量の例としてそれぞれの遺伝子及びESTに対し発現量（BDE(Estrogen)）及び重み値（K）を示した。さらに、発現量変動の例として、全く独立に行った10 nMの１７β−エストラジオール処理の場合の発現量（E（例1））、及び、10 nMダイオキシン処理の場合の発現量（E（例2））を示した。このE（例）値から評価値を算出する場合、まず総発現量を補正するために、En、BDE(Estrogen)n（n = １〜２０３）を算出し、さらにその積算値を算出したとき、
ΣBDE(Estrogen)n =  303.41
Σ（E（例1）n） =  322.74
Σ（E（例2）n） =  207.49
となる。さらに、この比ΣBDE(Estrogen)n／Σ（En）を用いて発現量を補正した値（BDE値）を算出する。この値を用いて、それぞれBDE（例1）及びBDE（例2）を計算し、評価値を算出する。その結果、表１の場合、評価値は、
（評価値、例1） =  16.81
（評価値、例2） =  46.19
となった。
【００６６】
また、これに重み値（K）を勘案した計算を行うと、
（評価値、例1、+K） =  11.36
（評価値、例2、+K） =  32.90
となった。このように、10 nMの１７β−エストラジオール処理の場合に比べて、10 nMダイオキシン処理の場合は有意に高い直を示した。従って、この結果から、環境ホルモン等のエストロゲン類似活性を有する化学物質が細胞に対して与える影響を、上述したマイクロアレイにより評価できることを示すことができた。
【００６７】
[実施例２]  ダイオキシンの影響
MCF-7細胞またはRL95-2細胞を、10 nM,1 nM, 0.1 nMの濃度のダイオキシン（2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin、Cambridge Isotope Laboratory 社(Andover、MA、USA)）を用いて24時間培養し、mRNAを取得後、蛍光色素Cy3（処理後）を用いてラベルを行い、本発明のマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性の評価を行った。対照として、同じ細胞をダイオキシンで処理しないものから同様にmRNAを取得後、蛍光色素Cy5を用いてラベルを行い、本発明のマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性の評価を行った。細胞培養条件、mRNA取得、ラベル反応、マイクロアレイ操作などは、実施例１と同様である。その結果を図１から６に示す。
【００６８】
[実施例３]  エストロンの影響
MCF-7細胞を、10 nMの濃度のエストロン（Estrone、Sigma社カタログ番号E-9750）を用いて72時間培養し、mRNAを取得後、蛍光色素Cy3（処理後）を用いてラベルを行い、本発明のマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性の評価を行った。対照として、同じ細胞をエストロンで処理しないものから同様にmRNAを取得後、蛍光色素Cy5を用いてラベルを行い、本発明のマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性の評価を行った。細胞培養条件、mRNA取得、ラベル反応、マイクロアレイ操作などは、実施例１と同様である。その結果を図７に示す。
【００６９】
[実施例４]  エストリオールの影響
MCF-7細胞を、1 nMの濃度のエストリオール（Estriol、Sigma社カタログ番号E-1253）を用いて72時間培養し、mRNAを取得後、蛍光色素Cy3（処理後）を用いてラベルを行い、本発明のマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性の評価を行った。対照として、同じ細胞をエストリオールで処理しないものから同様にmRNAを取得後、蛍光色素Cy5を用いてラベルを行い、本発明のマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性の評価を行った。細胞培養条件、mRNA取得、ラベル反応、マイクロアレイ操作などは、実施例１と同様である。その結果を図８に示す。
【００７０】
[実施例５]  ゲニステインの影響
MCF-7細胞を、10 nMの濃度のゲニステイン（Genistein、Sigma社カタログ番号G-6649）を用いて72時間培養し、mRNAを取得後、蛍光色素Cy3（処理後）を用いてラベルを行い、本発明のマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性の評価を行った。対照として、同じ細胞をゲニステインで処理しないものから同様にmRNAを取得後、蛍光色素Cy5を用いてラベルを行い、本発明のマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性の評価を行った。細胞培養条件、mRNA取得、ラベル反応、マイクロアレイ操作などは、実施例１と同様である。その結果を図９に示す。
【００７１】
[実施例６]  ノニルフェノールの影響
MCF-7細胞を、10 nMの濃度のノニルフェノール（Nonylphenol、Aldrich社カタログ番号29085-8）を用いて72時間培養し、mRNAを取得後、蛍光色素Cy3（処理後）を用いてラベルを行い、本発明のマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性の評価を行った。対照として、同じ細胞をノニルフェノールで処理しないものから同様にmRNAを取得後、蛍光色素Cy5を用いてラベルを行い、本発明のマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性の評価を行った。細胞培養条件、mRNA取得、ラベル反応、マイクロアレイ操作などは、実施例１と同様である。その結果を図１０に示す。
【００７２】
[実施例７]  ビスフェノールAの影響
MCF-7細胞を、10 nMの濃度のビスフェノールA（Bisphenol A、Sigma社カタログ番号I-0635）を用いて72時間培養し、mRNAを取得後、蛍光色素Cy3（処理後）を用いてラベルを行い、本発明のマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性の評価を行った。対照として、同じ細胞をビスフェノールAで処理しないものから同様にmRNAを取得後、蛍光色素Cy5を用いてラベルを行い、本発明のマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性の評価を行った。細胞培養条件、mRNA取得、ラベル反応、マイクロアレイ操作などは、実施例１と同様である。その結果を図１１に示す。
【００７３】
[実施例８]  ジエチルスチルベストロールの影響
MCF-7細胞を、10 nMの濃度のジエチルスチルベストロール（DES、Sigma社カタログ番号D-4628）を用いて72時間培養し、mRNAを取得後、蛍光色素Cy3（処理後）を用いてラベルを行い、本発明のマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性の評価を行った。対照として、同じ細胞をジエチルスチルベストロールで処理しないものから同様にmRNAを取得後、蛍光色素Cy5を用いてラベルを行い、本発明のマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性の評価を行った。細胞培養条件、mRNA取得、ラベル反応、マイクロアレイ操作などは、実施例１と同様である。その結果を図１２に示す。
【００７４】
[実施例９]  対照実験
実施例２から８に対する対照データーとして、MCF-7細胞を、10 nMの濃度の17β-エストラジオールを用いて72時間培養し、mRNAを取得後、蛍光色素Cy3（処理後）を用いてラベルを行い、本発明のマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性の評価を行った。対照として、同じ細胞を17β-エストラジオールで処理しないものから同様にmRNAを取得後、蛍光色素Cy5を用いてラベルを行い、本発明のマイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性の評価を行った。細胞培養条件、mRNA取得、ラベル反応、マイクロアレイ操作などは、実施例１と同様である。その結果を図１３に示す。
なお、図１から図１３に対応する測定データーを表２に示す。
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】MCF-7細胞を、10 nMの濃度のダイオキシンで処理し、mRNAを取得後マイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性評価を行った結果を示す図である。  図１から図１３の実験においては、化学物質処理細胞由来のmRNAをCy3を用いてラベルし、対象として未処理の細胞より得たmRNAをCy5を用いてラベルした。また、縦軸、横軸ともにそれぞれのラベルの蛍光強度を便宜的な単位を用いて示した。MCF-7細胞、RL95-2細胞はそれぞれ乳癌細胞、子宮内膜癌細胞である。
【図２】MCF-7細胞を、1 nMの濃度のダイオキシンで処理し、mRNAを取得後マイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性評価を行った結果を示す図である。
【図３】MCF-7細胞を、0.1 nMの濃度のダイオキシンで処理し、mRNAを取得後マイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性評価を行った結果を示す図である。
【図４】RL95-2細胞を、10 nMの濃度のダイオキシンで処理し、mRNAを取得後マイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性評価を行った結果を示す図である。
【図５】RL95-2細胞を、1 nMの濃度のダイオキシンで処理し、mRNAを取得後マイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性評価を行った結果を示す図である。
【図６】RL95-2細胞を、0.1 nMの濃度のダイオキシンで処理し、mRNAを取得後マイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性評価を行った結果を示す図である。
【図７】MCF-7細胞を、10 nMの濃度のエストロンで処理し、mRNAを取得後マイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性評価を行った結果を示す図である。
【図８】MCF-7細胞を、1 nMの濃度のエストリオールで処理し、mRNAを取得後マイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性評価を行った結果を示す図である。
【図９】MCF-7細胞を、10 nMの濃度のゲニステインで処理し、mRNAを取得後マイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性評価を行った結果を示す図である。
【図１０】MCF-7細胞を、10 nMの濃度のノニルフェノールで処理し、mRNAを取得後マイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性評価を行った結果を示す図である。
【図１１】MCF-7細胞を、10 nMの濃度のビスフェノールAで処理し、mRNAを取得後マイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性評価を行った結果を示す図である。
【図１２】MCF-7細胞を、10 nMの濃度のジエチルスチルベストロールで処理し、mRNAを取得後マイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性評価を行った結果を示す図である。
【図１３】対照データーとして、MCF-7細胞を、10 nMの濃度の17β-エストラジオールで処理し、mRNAを取得後マイクロアレイを用いてエストロゲン類似活性評価を行った結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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