(57)【要約】【課題】  体液中のＢＳＨを、高感度でかつ簡便に測定すること。【解決手段】  体液中のＢＳＨの測定方法であって、１）採取した体液を体液用希釈液にて希釈し、得られた希釈試料液をＢＳＨのハプテンと識別機能を有する物質との結合体の存在下において、抗ＢＳＨモノクローナル抗体またはそのフラグメントを担体に固定化してなる抗体固定部材に接触させる工程、および２）前記接触させることによって形成され得る体液中のＢＳＨと抗ＢＳＨモノクローナル抗体またはそのフラグメントとの免疫複合体量を検出する工程、を含む測定方法およびこの方法を実施する為のキットを提供する。【選択図】  図１
2008203195.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＢＳＨモノクローナル抗体またはそのフラグメントを担体に固定化してなる抗体固定部材、体液用希釈液、およびＢＳＨのハプテンと識別機能を有する物質との結合体とを含む、免疫測定用キット。
【請求項２】
さらに、既知量のＢＳＨ標準品を含む、請求項１記載の免疫測定用キット。
【請求項３】
前記担体が、ウェルプレートである、請求項１または２記載の免疫測定用キット。
【請求項４】
前記体液用希釈液が、血液用の1次希釈液と２次希釈液との組合せである、請求項１から３までのいずれかに記載の免疫測定用キット。
【請求項５】
体液中のＢＳＨの測定方法であって、
１）採取した体液を体液用希釈液にて希釈し、得られた希釈試料液をＢＳＨのハプテンと識別機能を有する物質との結合体の存在下において、抗ＢＳＨモノクローナル抗体またはそのフラグメントを担体に固定化してなる抗体固定部材に接触させる工程、
２）前記接触させることによって形成され得る体液中のＢＳＨと抗ＢＳＨモノクローナル抗体またはそのフラグメントとの免疫複合体量を検出する工程、
を含む、ＢＳＨの測定方法。
【請求項６】
前記担体が、ウェルプレートである、請求項５記載の体液中のＢＳＨの測定方法。
【請求項７】
前記体液が血液であり、前記体液用希釈液が血液用の1次希釈液と２次希釈液との組合せである、請求項５または６記載の体液中のＢＳＨの測定方法。
【請求項８】
前記免疫複合体量を検出する工程が、前記採取した体液から得られた希釈試料液における識別標識量と、既知量のＢＳＨ標準品における識別標識量とを比較する工程を含む、請求項５から７までのいずれかに記載の体液中のＢＳＨの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ；ボロカプテイト）のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを用いた、免疫測定方法および免疫測定用キットに関する。より詳細には、本発明は、特にホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）に用いられる中性子捕捉療法剤を血液などの体液から検出、定量するのに有用なＢＳＨの免疫測定用キットおよびＢＳＨの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、放射性アイソトープを利用した新しい癌の治療方法として、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）が注目を集めている。ホウ素中性子捕捉療法は、ホウ素１０同位体（１０Ｂ）を含むホウ素化合物をガン細胞に取り込ませ、低エネルギーの中性子線（たとえば熱中性子）を照射して、細胞内で起こる核反応により局所的にガン細胞を破壊する治療方法である。この治療方法では、１０Ｂを含むホウ素化合物をガン組織の細胞に選択的に蓄積させることが、治療効果を高める上で重要であるため、ガン細胞に選択的に取り込まれるホウ素化合物が開発されている。
【０００３】
これまでに、ＢＮＣＴに用いる薬剤として基本骨格にホウ素原子またはホウ素原子団を導入したホウ素含有化合物が合成されている。実際の臨床で用いられている薬剤としては、ｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）やメルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ）がある。このうち、ＢＳＨはナトリウム塩の形で主に脳腫瘍の治療に用いられ、その有用性が確認されている（たとえば、非特許文献１〜８参照）。
【０００４】
治療の有効性を高める為には、このようなＢＮＣＴに伴うＢＳＨの生体内挙動、特に細胞表層や細胞のミクロ分布について正確に把握し、患部へのＢＳＨの蓄積を確認して、タイミングよく中性子線を照射させることが望ましい。
【０００５】
【非特許文献１】Ｉ．Ｍ．Ｗｙｚｌｉｃら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９２，３３，７４８９−７４９０，
【非特許文献２】Ｗ．Ｔｊａｒｋ，Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．，２０００，６１４−６１５，３７−４７，
【非特許文献３】Ｋ．Ｉｍａｍｕｒａら、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９９７，７０．３１０３−３１１０．
【非特許文献４】Ａ．Ｓ．Ａｌ−Ｍａｄｈｏｒｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００２，４５，４０１８−４０２８，
【非特許文献５】Ｆ．Ｃｏｍｐｏｓｔｅｌｌａら、Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｎｅｕｔｒｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｔｈｅｒ．，２００２，８１−８４，
【非特許文献６】Ｓ．Ｂ  Ｋａｈｌら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｔｒｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９２，２２３，
【非特許文献７】Ｊ．Ｃａｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，４０，３８８７−３８９６，
【非特許文献８】Ｈ．Ｌｉｍら、Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｎｅｕｔｒｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｔｈｅｒ．，２００２，３７−４２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＢＮＣＴに伴うＢＳＨの生体内挙動、特に細胞表層や細胞のミクロ分布についての詳細は未だ明らかとはなっておらず、ＢＳＨの生体内挙動を簡便かつ迅速に定性、定量できる方法の開発が強く望まれている。治療用に併用されるＢＰＡと区別して検出することが困難という問題もある。ＢＳＨの検出、定量方法として、免疫学的測定方法が期待されているが、ＢＳＨのような低分子無機化合物は、分子量・体積が小さいことや、イオン化し易いといった理由のため抗原性が低く、ＢＳＨを高感度で検出しうるモノクローナル抗体を用いた測定方法や測定キットはこれまで得られていない。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、ＢＳＨを高感度かつ高選択的に認識するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを用いた高感度かつ定量性に優れたＢＳＨの測定用キットおよび免疫学的測定方法を提供することにある。
【０００８】
本発明の目的は、体液中に含まれるＢＳＨの簡易かつ迅速な測定において、特に競合的な免疫測定原理を利用した操作性に優れたＢＳＨの測定法及びそのキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、以下に示すＢＳＨの測定方法および測定キットにより上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１０】
すなわち、本発明は、抗ＢＳＨモノクローナル抗体またはそのフラグメントを担体に固定化してなる抗体固定部材、体液用希釈液、およびＢＳＨのハプテンと識別機能を有する物質との結合体とを含む、免疫測定用キットを提供する。
【００１１】
上記免疫測定用キットは、既知量のＢＳＨ標準品を含み得る。
【００１２】
上記担体は、ウェルプレートであり得る。
【００１３】
上記体液用希釈液は、血液用の1次希釈液と２次希釈液との組合せであってもよい。
【００１４】
本発明は、さらに、体液中のＢＳＨの測定方法を提供する。この方法は、１）採取した体液を、体液用希釈液にて希釈し、ＢＳＨのハプテンと識別機能を有する物質との結合体の存在下において、抗ＢＳＨモノクローナル抗体またはそのフラグメントを担体に固定化してなる抗体固定部材に接触させる工程、および２）前記接触させることによって形成され得る体液中のＢＳＨと抗ＢＳＨモノクローナル抗体との免疫複合体量を検出する工程、を含む。
【００１５】
上記担体は、ウェルプレートであり得る。
上記体液は、血液であり、上記体液用希釈液は、血液用の1次希釈液と２次希釈液との組合せであり得る。
【００１６】
上記免疫複合体量を検出する工程は、前記採取した体液から得られた液における識別標識量と、既知量のＢＳＨ標準品における識別標識量とを比較する工程を含み得る。
【発明の効果】
【００１７】
以上のように、本発明を適用することによって、血液などの体液中に含まれるＢＳＨに対して選択性が高く、ＢＰＡ（ボロノフェニルアラニン）と区別して検出することも可能で、複雑な工程を要さない操作性に優れた簡易なＢＳＨの測定キットまたは免疫測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１９】
抗原抗体反応を利用した免疫測定法は、一般に特定の物質に対して高い選択性を有し、高感度測定が可能であり、かつ操作が容易な測定法である。本発明は免疫測定法の特長を活かしながら、血液などの体液中に含まれるＢＳＨの測定においてキットの形状や反応に関与する抗体の固定化手段、試料液の調製手段、反応物質同士の接触手段および操作手段を選定し、試料および測定対象物に最適な操作が可能な簡便性を有する測定キットの構成または測定方法を可能にしたものである。
【００２０】
本発明においては、予め抗ＢＳＨモノクローナル抗体またはそのフラグメントを担体に固定化した抗体固定部材、体液用希釈液、および反応に寄与するＢＳＨのハプテンと識別機能を有する物質との結合体（以下、「識別結合体」ともいう）を安定な条件で準備することによって、操作性・安定性に優れた簡便な測定キットを構成することおよび測定方法を行うことが可能となった。具体的には、測定対象物である体液を体液用希釈液にて希釈後、調製したサンプルを、例えば、識別結合体と抗ＢＳＨモノクローナル抗体またはそのフラグメントを担体に固定化した抗体固定部材（以下単に「抗体固定部材」ともいう）を封入した反応容器に投入して反応させることができる。あるいは、抗体固定部材がウェルプレートあるいはシャーレなどである場合には、抗体固定部材内で、希釈試料液、および識別結合体を反応させることもできる。次に、このようにＢＳＨと識別結合体との間における競合的な抗原抗体反応を迅速かつ確実に行った結果得られた反応物を、抗体と結合した識別結合体に由来する発色反応として検出するように、試料中のＢＳＨ濃度に依存した変化を例えば光学的に検出することによって、ＢＳＨの濃度を求めることができる。以上のように、予め希釈液や識別結合体を入れた反応系中で、反応、測定など、全ての操作を行う特徴を有している。
【００２１】
ここで「光学的に検出する」とは、抗原抗体反応に伴う変化を、反応自体によって生じる発色や蛍光あるいは発色剤や蛍光剤を添加することによって生じる発色や蛍光、または濁度などの、光学的変化として取り出し、吸光光度計などによって検出することをいう。
【００２２】
免疫測定法において、識別結合体が測定対象となるＢＳＨと競合反応を形成するには、ＢＳＨに近い分子構造を有しかつ抗体のエピトープを有する物質を識別結合体とすることが好ましい。本発明においては、識別結合体をＢＳＨの誘導体と識別機能を有する物質の結合体とすることによって、この条件を満たすことができ選択性の高い測定が可能となる。また、抗体については、高感度および高選択性からモノクローナル抗体が好ましく用いられるが、モノクローナル抗体の可変部分であるＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントなどのように抗原結合性を有する抗体の一部も好ましく用いられ得る。本発明においては、これらを組み合わせることによって、非常に選択性が高く高感度な免疫測定法を用いたＢＳＨの測定キットを提供することが可能になった。ここで、「識別機能を有する物質」とは、抗原-抗体反応の結果を直接的あるいは間接的に識別可能にする物質あるいは担体物質をいい、具体的には酵素や蛍光タンパク質のような生体物質、低分子の蛍光物質、金コロイド、カラーラテックスビーズなどの担体が挙げられる。
【００２３】
本発明で、「体液」という時は、血液やリンパ液、血管の外の細胞間を満たす組織液、および漿膜腔液、胸水、腹水、心嚢液、脳脊髄液、関節液、眼房水などの体腔内の体腔液が含まれる。さらに、唾液や尿なども含まれる。本発明においては、特に血液が検査対象として好ましく用いられ得る。
【００２４】
本発明の「担体」は、限定はされないが、ウェルプレート、ビーズ、あるいは棒状加工体などを指す。ポリエチレン・ポリスチレンなどのたんぱく質が吸着しやすい樹脂を材質として使用しているものであれば、特に形態は限定されない。溶液との接触が容易で、かつ表面積の大きな担体が好ましい。
【００２５】
本発明で用いられる、体液用希釈液は、体液の種類に応じて選択することが可能である。限定はされないが、特に本発明において好ましく用いられる血液を検査対象とするときには、血液を希釈するのに好ましい、リン酸緩衝液（リン酸 ＋ リン酸ナトリウム）、やリン酸緩衝食塩水などを希釈用に用意する。その他、例えば酢酸緩衝液（酢酸 ＋ 酢酸ナトリウム）、クエン酸緩衝液（クエン酸 + クエン酸ナトリウム)、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液などが挙げられる。
【００２６】
本発明においては、体液用希釈液は、1次希釈液と２次希釈液との組合せであり得る。体液が血液の場合、溶血用の1次希釈液と混合用の2次希釈液との組合せが好ましく用いられる。溶血用の1次希釈液としては、リン酸緩衝液が好ましく用いられ、２次希釈液としては、リン酸緩衝生理食塩水が好ましく用いられる。希釈率として、全体として１０〜５００倍程度が好ましく、例えば、第１希釈液で体液をある程度の倍率で希釈し、使用直前にさらに第２希釈液で希釈することなどが可能である。このような組合せは、体液中に含まれるタンパク質の変性を防ぎながら、検査直前には、検出に耐え得るタンパク質濃度とするのに有用である。
【００２７】
本発明に係る測定キットまたは方法においては、抗原抗体反応後の結果を色量変化などとして例えば光学的変化として検出することから、試料液中のＢＳＨの濃度に対する基準を明確にすることが好ましい。そこで、血液などの体液中に含まれ得るＢＳＨの量はだいたい把握することができる為、既知量のＢＳＨ標準品を準備し、同じ実験条件で標準曲線を作成して、反応容器との色量変化を比較することによって、バックグランドや周囲温度などの影響を排除した測定を行うことが可能となる。つまり、測定条件を共通にした基準との比較を行うことによって、簡易かつ精度の高い免疫測定法を用いたＢＳＨの測定キットまたは方法を提供することが可能となる。
【００２８】
本発明においては、抗原抗体反応後の結果を色量変化などの目視的あるいは光学的変化で検出することは、抗体を固定化する担体の種類などに応じて、種々の態様で行い得る。例えば、抗体固定部材がウェルプレートである場合は、反応をウェルプレート内で行った後、反応結果をそのままウェルプレートに対する光学的分析で検知することが可能である。この目的の為にプレートリーダーなどが好ましく用いられ得る。あるいは、抗体を固定化する担体がビーズあるいは他の樹脂加工物などの場合は、反応容器中にて反応させた結果は、別の容器に移し替えて光学的分析で検知することも可能である。
【００２９】
＜本発明にかかる測定キットの基本構成および測定方法＞
本発明にかかる免疫測定法を用いたＢＳＨの測定キットは、（１）採取した体液を希釈する為の体液用希釈液、（２）識別結合体、および（３）抗ＢＳＨ抗体またはそのフラグメントを固定化した抗体固定部材を含み、かつ競合的な抗原抗体反応を行わせることを特徴とする。
【００３０】
上記測定キットの測定方法は、通常の免疫測定法の中でも、公知の例えば酵素免疫測定法、金コロイド法等(Meth. Enzymol., 92, 147-523 (1983), Antibodies Vol.II IRL Press Oxford (1989))を適用することができる。
【００３１】
以下、酵素免疫測定法の中でも抗体固相タイプのＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）を適用した場合を例に、測定キットの基本構成を説明するが、本発明はこれに限定されない。また、説明するそれぞれの材料等は、ＥＬＩＳＡを適用した測定キットに限らず、他の標識を使用した場合の測定キット、あるいはＥＬＩＳＡまたは他の標識を使用した場合の測定方法にも共通して使用可能である。ここで、測定対象としては、ヒトの血液を挙げることができる。
【００３２】
（１）体液用希釈液
体液用希釈液は、測定対象の血液などの体液の前処理に用いられ、例えば、溶血用の1次希釈液と混合用の2次希釈液との組合せであり、溶血用の1次希釈液としては、リン酸緩衝液が用いられ、２次希釈液としては、リン酸緩衝生理食塩水が用いられる。希釈率として、１０〜５００倍程度が好ましく、例えば、第１希釈液で体液を２０倍希釈し、使用直前にさらに第２希釈液で１０倍希釈することなどが可能である。
【００３３】
（２）識別結合体の調製
ＢＳＨと競合的な抗原抗体反応を行う識別結合体としては、ＢＳＨもしくはその誘導体に、酵素を結合したものを用いる為、誘導体としては、酵素との結合基を有するものを用いるとよい。使用可能な酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼ等が挙げられるが、公知のものであれば特に制限はない。誘導体と酵素の結合は、酵素が失活しない条件なら特に制限なくいかなる方法で行ってもよい。以下、ＢＳＨの誘導体の構造について具体的に説明する。
本発明のＢＳＨの誘導体は下記式（１）の構造を有する。
【化１】
2008203195.tif 000003
この化合物は、６−Ｓ−ウンデカハイドロドデカボリルヘキサン酸であり、ＢＳＨハプテンとして好適に使用される。前記式（１）において、カルボキシル基が後述する高分子化合物と共有結合することにより、複合体（結合体）を形成する。
【００３４】
前記ＢＳＨハプテンの製造は、公知の合成方法により行なうことができ、特に限定されるものではないが、たとえば下記反応式：
【化２】
2008203195.tif 000004
で示す方法は、各工程において高収率で化合物を得ることから好適に用いられる。前記反
応式において、式（２）、ＢＳＨ等の原料化合物はいずれも入手が容易な化合物である。
【００３５】
また、前記各工程における詳細な合成方法は、実施例１に記載している。
【００３６】
前記メルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ）は、ホウ素、水素およびイオウ原子から成る２０面体のホウ素クラスター構造をとる。ＢＳＨは無機低分子化合物であるにもかかわらず、体積はベンゼン環より大きく、３つのホウ素原子が２つの電子を共有するいわゆるスリーセンターボンド構造をとり、電子が局在化した特異な構造をしている。本発明において、ＢＳＨは下記式（４）、
【化３】
2008203195.tif 000005
または下記式（５）
【化４】
2008203195.tif 000006
で表される。
【００３７】
（３）抗体を担体に固定化した固定部材の作製
（３−１）抗体の調製
例えば式（１）で表されるＢＳＨのハプテン化合物を、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン等の高分子化合物（タンパク質）との複合体を形成させた後、抗原として用いる。
【００３８】
複合体の形成方法は、公知の方法により行うことができ、特に限定されるものではない。例えば、混合酸無水物法または活性エステル法等によって、ＢＳＨのハプテン化合物のカルボキシ基と前記高分子化合物の官能基とを反応させて、複合体を形成することができる。
【００３９】
本発明で用いられる抗体は、前記複合体を常法にしたがってウサギ、ヤギ、マウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを培養することにより得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４〜１１．１１）。
【００４０】
抗体の調製は、限外ろ過、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニテイークロマトグラフィーなどの濃縮・精製法を適宜組み合わせて行うことができる。
【００４１】
また、上記抗体として、より具体的には、たとえば、以下に示すような、本発明の実施例で得られたモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域におけるヌクレオチド配列から発現される抗体フラグメント、または、本発明の実施例で得られたモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を有する抗体フラグメントをあげることができる。また、これらのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は本発明の効果を奏する限り、配列の一部が欠損、付加、修飾、置換、変異している配列を有するものも含まれる。さらに、その場合、これらの配列の一部が欠損、付加、修飾、置換、変異している配列と上記配列との相同性が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることが特に好ましい。
【００４２】
重鎖の配列
【化５】
2008203195.tif 000007
【００４３】
軽鎖の配列
【化６】
2008203195.tif 000008
【００４４】
重鎖のアミノ酸配列
【化７】
2008203195.tif 000009
【００４５】
軽鎖のアミノ酸配列
【化８】
2008203195.tif 000010
（３−２）担体および抗体固定部材
担体は、溶液との接触が容易で、かつ表面積の大きな抗体固定化部分を有する、ウェルプレートやビーズが好ましく用いられる。ウェルプレートを用いた場合には、その後の分析までウェルプレート内で行うことができる為、特に好ましい。
【００４６】
（３−３）抗体の固定部材への固定化
抗体の固定化は、例えば抗体を含む緩衝液を封止部材上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗体の濃度は、通常０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬ程度である。緩衝液としては、特に制限無く公知のものを使用することができる。
【００４７】
（３−４）担体表面のブロッキング
試料中の夾雑物質が担体表面へ非特異的吸着し反応に影響することを防止するため、抗体が固定化されていない表面部分は抗体や識別結合体と反応性の無いタンパク質等によりブロッキングすることが好ましい。ブロッキング剤としては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）もしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース等を使用することができる。ブロッキングは、過剰濃度のブロッキング剤溶液へ抗体固定化担体を接触させ、例えば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液に制限はなく、例えば生理的塩濃度の塩化ナトリウムを含んだ緩衝液を使用することができる。
【００４８】
（３−５）ブロッキンッグした固定部材の安定化
抗体を固定化し、ブロッキングした固定部材は、乾燥によって安定化できる。乾燥は低温下で行うほうがよく、真空凍結乾燥、減圧乾燥、風乾などいずれの乾燥方法でもよい。
【００４９】
抗体固定部材は、具体的には、図１に例示するように、抗体またはそのフラグメントをプレート内に固定し（図１a）、ブロッキングした後（図１b）、乾燥させた構成（図１c）を挙げることができる。特に、乾燥後、シールなどで封をすることにより(図１ｄ) 、使用直前まで、抗体固定部材を安定な状態に保つことも可能である。
【００５０】
（４）抗原抗体反応
体液用希釈液で適度な濃度に調製した試料を、抗原抗体反応に供する。具体的には、図１に例示するようなウェルプレートに、識別結合体および希釈試料液を加えることによって抗原抗体反応を開始する。また、他に図１に例示するようなウェルプレートに、ＢＳＨ標準品と識別結合体をいれた反応系を用意することにより、正確に試料中のＢＳＨ濃度を調べることができる。抗原抗体反応は、反応温度４℃〜３７℃、また反応時間５分〜２時間程度で反応させるのがよい。
【００５１】
（５）検出
次に、反応の結果、測定対象物中のＢＳＨ濃度に依存した変化を目視あるいは光学的に検出する。これは、例えば担体がウェルプレートであれば、そのままプレートリーダーで分析することにより、より迅速で簡単に行うことができる。その他の場合でも、反応に用いた容器をそのまま光学的に分析することで、反応の結果を検出できる。
【００５２】
より具体的には、例えば、反応終了後は、精製水、緩衝液などでウェルプレートあるいは反応に用いた容器を洗浄後、固定化した抗体と結合した識別結合体の酵素によって発色する基質溶液を反応容器に加える。発色基質としては、公知の基質であれば特に制限はなく、酵素、例えば、ペルオキシダーゼの場合は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを用い、吸光度を測定するとよい。基質溶液を加えた後に生じる発色量の変化を検出することによって、ＢＳＨの濃度を判定する。ｏ−フェニレンジアミンなどの他の発色基質を使用することもできる。アルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を発色基質として測定する方法が挙げられる。いずれの発色方法においても、既知濃度のＢＳＨを添加した反応液の吸光度と濃度の関係により作成した検量線を用いて、試料液中のＢＳＨ濃度を定量することができる。
【００５３】
酵素免疫測定法以外にも、識別結合体の識別マーカーをカラーラテックスや金コロイドに置き換えた免疫測定法によって、ＢＳＨを測定することができる。これらの識別結合体は、ＢＳＨもしくはその誘導体にアルブミンなどのタンパク質を結合させ、このタンパク質との結合体をカラーラテックスや金コロイド表面へ公知の方法を用いて固相させることによって調製する。調製した識別結合体は、上記のＥＬＩＳＡで適用した例と同様に、抗体を固定化した固定部材との間で抗原抗体反応させることによってＢＳＨを測定することができる。これらの免疫測定法の場合は、その後の発色操作は必要なく、抗原抗体反応中に固定部材の表面上の固定化抗体にカラーラテックスや金コロイドが結合し呈色する。この呈色の度合いを目視判定することによって、ＢＳＨ濃度を測定することができる。
【００５４】
以下に、測定キット及び測定方法の具体例を実施例の態様で示すが、本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００５５】
抗原の調製
下記実施例において、化合物の分析および分離精製には以下の機種や試薬を用いて行った。
・ＮＭＲスペクトル：日本電子  ＪＭＴＣ−４００／５４／ＳＳ  ４００  ＭＨｚ（日本電子社製）。特に明記しない限り、内部標準としてＴＭＳを用いた。また、下記ケミカルシフトはδ値で示した。
・カラムクロマトグラフィー用シリカゲル：ＢＷ−２００（富士シリシア社製）。
【００５６】
（ａ）ＢＳＨ−ヘキサン酸エチルエステルの合成
ＢＳＨ（１０１ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解させた後、室温で撹拌しながらブロモヘキサン酸エチルエステル（０．２ｍＬ、１．１２ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、室温で２日間撹拌した。その後、減圧濃縮によりアセトニトリルを除去し、濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）により精製し、黄色の油状物（１０１ｍｇ、収率６７．４％）を得た。
・ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５８（クロロホルム：メタノール＝３：１）
・１H-NMR(DMSO)  δ（ｐｐｍ)：0.60-2.10 (m)、1.08 (t, 3H, J=7.08Hz)、1.34-1.42 (m, 2H)、1.52-1.59 (m, 2H)、1,63-1.70 (m, 2H)、2.19 (t, 2H, J=7.32Hz)、2.77 (m, 2H)、3.95 (q, 2H, J=7.08Hz)。
【００５７】
（ｂ）ＢＳＨ−ヘキサン酸の合成
上記（ａ）で得た化合物（１１３．７ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）をメタノール（２．０ｍＬ）に溶解させ、２Ｎ水酸化ナトリウム（０．６３ｍＬ）を滴下し室温で６時間撹拌した。反応液を酢酸エチルを用いて洗浄後、１Ｎ塩酸をｐＨ３になるまで加え、酢酸エチルで抽出した。その後、水および飽和食塩水で洗浄し硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮により酢酸エチルを除去し、濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝４：１）により精製し、黄色の油状物（６９．９ｍｇ、収率６７．４％）を得た。
・ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３０（クロロホルム：メタノール＝２：１）
・１H-NMR(DMSO)  δ（ｐｐｍ)：0.60-2.10 (m)、1.30-1.37 (m, 2H)、1.45-1.53 (m, 2H)、1,63-1.73 (m, 2H)、2.20 (t, 2H, J=7.32Hz)、2.85 (m, 2H)。
【００５８】
（ｃ）ＢＳＨ−ヘキサン酸−ＢＳＡ複合体（ＢＳＡを用いた免疫原）の合成
セントチューブにウシ血清アルブミン（１１ｍｇ、１６４ｎｍｏｌ）およびｐＨ９．４のホウ酸塩緩衝液（四ホウ素酸ナトリウム５０ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム１５．４ｍｍｏｌ、アジ化ナトリウム０．３ｍｍｏｌ／純水１００ｍＬ）を７６０μＬ加え、４℃で一晩撹拌した後、ＤＭＦ（４０μＬ）を加えた（Ｉ液）。
【００５９】
別のセントチューブに上記（ｂ）で得た化合物（６．０ｍｇ、１８μｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（１．５ｍｇ、１３．３μｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（２．５ｍｇ、１３．３μｍｏｌ）、ＤＭＦ（２００μＬ）を加え、室温で一晩撹拌した（ＩＩ液）。
【００６０】
Ｉ液にＩＩ液を室温で滴下（１０μＬ／５分）し、室温下で２．５時間撹拌後、４℃で一晩撹拌した。これを１０％イソプロパノール−リン酸緩衝液で約６０時間（緩衝液を６回換える）透析し、ＢＳＨ−ヘキサン酸−ＢＳＡ複合体（結合体）を得た。これをＩＣＰ分析によりホウ素濃度を測定した後、１．５ｍＬのエッペンチューブに移して、４℃で保存した。
【００６１】
（ｄ）ＢＳＨ−ヘキサン酸−ＫＬＨ複合体（ＫＬＨを用いた免疫原）の合成
免疫原として、ＫＬＨと本発明ＢＳＨハプテンとの結合体を、上記（ｃ）と同様にして作製した。
【実施例２】
【００６２】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
（ａ）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例１で合成したＢＳＨハプテン−ＫＬＨ結合体をリン酸緩衝液ｐＨ７．４（ＰＢＳ）（ＮａＣｌ  １３７ｍＭ、ＮａＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ８．１０ｍＭ、ＫＣｌ  ２．６８ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４  １．４７ｍＭ）で５００μｇ／ｍＬになるように希釈した。この抗原溶液２ｍＬを４０℃にて１０分間加温したＲＩＢＩアジュバントシステム（ＲＩＢＩ／ＭＰＬ（登録商標）＋ＴＤＭ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ，Ｒ−７００）と混合し、２〜３分間ボルテックスし、十分に混合した。
【００６３】
これを５匹のＢａｌｂ／ｃマウス（８週齢、オス）に皮下注射により免疫した（５０μｇ／ｄｏｓｅ）。これを２週間ごとに行い、２回目の免疫以降は各免疫から、１週間後に採血（眼窩採血）を行った。採血した血液は１．５ｍＬチューブに集め、３７℃で１時間インキュベートした後、４℃にて一晩静置した。
【００６４】
（ｂ）細胞融合
（ｂ−１）ＤＭＥＭ培地の調製
ダルベッコ改変イーグル培地（ＩＷＡＫＩ  ＤＭＥ／ＬＯＷ、Ｌｏｔ．９９５６２０１３）１パック、硫酸ゲンタマイシン（ゲンタマイシン６４２μｇ／ｍｇ、ＳＩＧＭＡ  Ｌｏｔ．１０５Ｈ０４５７）７８．４ｍｇ、炭酸水素ナトリウム（関東化学、Ｌｏｔ３０２Ｆ１３７８）２．２ｇにＭｉｌｌｉＱを加えて１Ｌにした後、０．２２μｍフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ＭＩＬＬＥＸ（登録商標）−ＧＶ、０．２２μｍ  フィルター  ＳＬＧＶ０１３５２）で滅菌して、ＤＭＥＭ培地を調製した。
【００６５】
（ｂ−２）ＨＡＴ培地およびＨＴ培地の調製
ＨＡＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＩＧＭＡ、Ｌｏｔ＃６１Ｋ８９３４）一瓶に１０ｍＬの滅菌したＭｉｌｌｉＱを加え、瓶内の試薬を完全に溶かした。この溶液をＤＭＥＭ培地（１５％ＦＣＳ）の１／５０量加えて混合し、ＨＡＴ培地とした。ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＩＧＭＡ、Ｌｏｔ＃３２Ｋ８９２８）一瓶に１０ｍＬの滅菌したＭｉｌｌｉＱを加え、瓶内の試薬を完全に溶かし、この溶液をＤＭＥＭ培地（１５％ＦＣＳ）の１／５０量加えて混合し、ＨＴ培地とした。
【００６６】
（ｂ−３）５０％ＰＥＧ培地の調製
２０ｇのＰＥＧ６０００（ＰＥＧ♯６０００（Ｍ．Ｗ．７３００−９０００）、ナカライテスク、Ｌｏｔ  Ｍ８Ｈ２９５０）を２０ｍＬのＤＭＥＭ培地に加え、ホットスターラーで２時間撹拌して完全に溶かした。その後、４０ｍＬにメスアップし、クリーンベンチで０．２０μｍフィルターを用いて滅菌した。その後、１．８ｍＬずつ分注して凍結し、使用直前に溶解し、２００μＬのＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ、Ｌｏｔ＃４２Ｋ２４０１）を加えて、５０％ＰＥＧ（１０％ＤＭＳＯ）溶液を作製した。
【００６７】
（ｂ−４）ＡＣＫ  ｌｙｓｉｓ緩衝液の調製
ＭｉｌｌｉＱ９０ｍＬに塩化アンモニウム８０２．３ｍｇ、炭酸水素カリウム１０．０１ｍｇ、ＥＤＴＡ３．７２ｍｇを加えｐＨ７．２〜７．４に調整し、１００ｍＬにメスアップした。これをメディウム瓶に入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブし、滅菌して、ＡＣＫ  ｌｙｓｉｓ緩衝液（０．１５Ｍ塩化アンモニウム、１．０ｍＭ炭酸水素カリウム、０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２〜７．４）とした。
【００６８】
（ｃ）脾臓細胞の調製
抗体価が飽和に達したマウスに最終免疫（尾静脈注射）を行い、３日後に脾臓を摘出した。摘出した脾臓を氷上のＤＭＥＭの入ったシャーレに入れ、クリーンベンチ内に入れた。摘出した脾臓の不要な部分を除き、新しいＤＭＥＭ培地の入った５ｍＬシャーレに入れた。２本のピンセットを用いて、脾臓細胞をこそぎだし、セルストレーナー（ＦＡＬＣＯ−Ｎ２３５０、７０μｍナイロン）でろ過して不要なものを取り除き、通過した細胞をガラス製の遠心管に集め、１０００ｒｐｍで１０分間遠心した。
【００６９】
上清を捨て、５ｍＬのＡＣＫ  ｌｙｓｉｓ緩衝液を加えピペッティングにより均一に混合し、室温で５分間静置し、脾臓細胞を洗浄除去した（赤血球の除去）。ここに２０ｍＬのＤＭＥＭ培地を加え、１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去した。さらに２０ｍＬのＤＭＥＭ培地を加え、ピペッティングにより細胞を洗浄し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を除去し、ＤＭＥＭ培地を１０ｍＬ加え、ピペッティングにより混合した後、血球計算盤（Ｅｒｍａ  Ｔｏｋｙｏ４０６２）を用いて、細胞数をカウントした。
【００７０】
（ｄ）ミエローマ細胞の調製
ミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１）を細胞融合を行う日程にあわせて培養し、使用直前に細胞をガラス製の遠心管に集め１０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を除去し、ＤＭＥＭ培地を１０ｍＬ加え、ピペッティングにより混合した後、血球計算盤（Ｅｒｍａ  Ｔｏｋｙｏ４０６２）を用いて、細胞数をカウントした。
【００７１】
（ｅ）細胞融合
脾臓細胞：ミエローマ細胞が１０：３になるようにミエローマ細胞懸濁液の量を調整し、脾臓細胞懸濁液の遠心管に入れ、ピペッティングによって混合した。これを１０００ｒｐｍで１０分間遠心し上清を除去した後、パスツールピペットを用いて完全に上清を除去した。
【００７２】
その後、遠心管をたたいて、細胞を遠心管の壁に広げた。遠心管を手で暖め、回しながら、１ｍＬの５０％ＰＥＧ（１０％ＤＭＳＯ）溶液を１分以上かけて、徐々に加えた。遠心管を１分間暖めながらまわし、同様の方法で、２ｍＬのＤＭＥＭ培地を２分以上かけて加え、さらに８ｍＬのＤＭＥＭ培地を５分以上かけて加えた。
【００７３】
その後、１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨て、さらに１０ｍＬのＤＭＥＭ培地を加えて細胞を洗浄し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を除去し、ＤＭＥＭ（１５％ＦＣＳ）培地を細胞密度が２×１０５個／ｍＬになるように調整し、９６穴プレートに１００μＬずつ分注し、３７℃で一晩静置した。
【００７４】
（ｆ）ＨＡＴ選択
９６穴プレートに分注した細胞に、２倍程度のＨＡＴ培地を１００μＬずつ分注し、３７℃で１週間放置した。その後、１００μＬのＨＡＴ培地を加えた。その後、陽性のウェルのハイブリドーマ細胞を２４穴プレートに移し変え、ＨＴ培地を用いて全量を１ｍＬにした。３日後、２次スクリーニングを行い、陽性であったウェルを限界希釈法によってクローニングした。
【００７５】
（ｇ）限界希釈法を用いたクローニング
２次スクリーニングで陽性であったウェルのハイブリドーマ細胞の細胞数を血球計算盤（Ｅｒｍａ  Ｔｏｋｙｏ４０６２）を用いてカウントして、濃度を求め、クローニング用の培地（ＤＭＥＭ（１５％ＦＣＳ）培地２０ｍＬ、Ｂｒｉｃｌｏｎｅ  １ｍＬ）を用いて、段階希釈することにより１０個／ｍＬ、５個／ｍＬに調整した。９６穴プレートに１００μＬずつ分注し、１ウェルあたり細胞が１個または０．５個とした。
【００７６】
これを３７℃で１週間静置し、その後各ウェルに１００μＬずつクローニング用の培地を加え、さらに３７℃で１週間静置した。陽性であったウェルの細胞を４８穴プレートに移し、同様に２回目のクローニングを行い、最終的に単一のハイブリドーマ細胞を得た。  本発明では、前記方法によりハイブリドーマを作製し、ＢＳＦ−２等の複数のハイブリドーマ株を樹立した。このうち、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＢＳＦ−２について、受領番号ＡＢＰ−１０６８９の下、２００６年１０月２日に独立行政法人  産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６、茨城県つくば市東１丁目１番１号）に国際寄託されている。また、ＢＳＦ−２について、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８０５の下、２００６年２月２２日に独立行政法人  産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６、茨城県つくば市東１丁目１番１号）に国内寄託されている。
【００７７】
（ｈ）無血清培地からの抗体の精製
無血清培地で培養したハイブリドーマ細胞ＢＳＦ−２培養液を１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、細胞上清に対し、６０％硫酸アンモニウム濃度になるように硫酸アンモニウムを加え、抗体タンパクを沈殿させた。これを４℃で２時間撹拌し、さらに一晩放置した。その後、４℃、１３５００ｒｐｍで２０分遠心し、結合バッファーに溶解させ、結合バッファーで透析した。
【００７８】
透析後、８０００ｒｐｍで１０分間遠心して、上清を０．４５μｍでフィルターろ過してサンプルとした。カラムに５ｍＬの超純水を流速１滴／秒（１〜２ｍＬ／分）で送液後、３〜５ｍＬの結合バッファーを流速１滴／秒（１〜２ｍＬ／分）で送液し、カラムの平衡化を行った。その後、調製したサンプルを１滴／２秒（１〜２ｍＬ／分）で送液し、抗体をカラムに吸着させた。
【００７９】
非吸着成分を３〜５ｍＬの結合バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．８Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．５）を流速１滴／秒で送液することにより除去した後、５ｍＬ溶出バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）を１滴／秒（１〜２ｍＬ／分）で送液して抗体を溶出させた。溶出液を０．５ｍＬずつ回収した。
【００８０】
全てのフラクションの吸光度（ＯＤ＝２８０ｎｍ）を測定し、抗体タンパクを含んでいるフラクションをブラッドフォード法により、抗体タンパク濃度を測定した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでモノクローナル抗体の純度を確認した。また、得られたモノクローナル抗体のヌクレオチド配列の一部およびアミノ酸配列の一部は上述したとおりである。得られたモノクローナル抗体のタイプはＩｇＧで、詳細には、ＩｇＧ１λであった。
【実施例３】
【００８１】
抗体を固定化したプレートの作成
ＰＢＳ溶液（リン酸緩衝液ｐＨ７．４）を用いて４μｇ／ｍＬに調製したモノクローナル抗体（ハイブリドーマ株（ＢＳＦ−２から調製）溶液を１００μＬずつ９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートに分注し、３７℃で１時間静置することでプレートに抗体を固定化した。反応後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液（リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、非特異的吸着を防ぐためにプレートに、1ウェルあたりブロッキング溶液（リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１％ＢＳＡ）を２００μｌ加え、シールで密閉して、３７℃にて２時間反応させ、ブロッキングを行った。
【００８２】
プレートの液を捨て、キムタオルにたたきつけて液をきり、３７℃にて２時間静置し、プレートを下向きにして、乾燥させた。シールを密閉して冷蔵した。こうして得られた乾燥プレートは、少なくとも４ヶ月間、冷蔵保存では劣化しないことが確認された。以下の実施例ではこうして得られた抗体固定ウェルプレートを用いた。
【実施例４】
【００８３】
ＥＬＩＳＡを応用したＢＳＨ測定キットは、具体的には、以下の表１に例示するような試薬構成からなる。この測定キットを用いて、まず、ＢＳＨの標準検量線を得た。
【表１】
2008203195.tif 000011
【００８４】
（１）標準液の調製
ＰＢＳ溶液（０．５μｇ／ｍＬ）にて、１００μｇ／ｍＬのＢＳＨ標準液を調製し、これを1次希釈液と２次希釈液とで段階的に希釈して、０、２、５、１０、２５、５０、１００、２００、４００、８００、１０００、２０００ｎｇ／ｍＬの標準希釈列を調製した。
【００８５】
（２）抗原抗体反応
抗体固定プレートのシールをはがし、プレートウォッシャー（ＢＩＯ−ＲＡＤイムノウォッシャー）で洗浄し、識別結合体と各標準液を混合し、室温で３０分間抗原抗体反応を行った。
【００８６】
（３）色量変化の検出
プレートをプレートウォッシャー（ＢＩＯ−ＲＡＤイムノウォッシャー）で洗浄し、固定化抗体と結合しなかった識別結合体を除去した。洗浄液の残液を充分に除去した後、発色試薬である、ＨＲＰ標識した競合剤（ＨＲＰ結合ＢＳＨ−ヘキサン酸）のＰＢＳ溶液（０．５μｇ／ｍＬ）をプレートに２００μｌずつ分注し、シールで密閉する。これを遮光して室温で１０分静置し、基質液（２０ｍＬのクエン酸リン酸緩衝液（１０ｍＭ  ｐＨ５．２）に８ｍｇのＯＤＰを加え、Ｈ２Ｏ２４μｌ添加して調製）反応停止液（１ＮのＨ２ＳＯ４）を５０μｌずつ加えて反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ／Ｍｏｄｅｌ５５０）を用いて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図２に示す。Ｘ軸はＢＳＨ濃度を、Ｙ軸は吸光度を表す。図２に示したように、ハイブリドーマ株ＢＳＦ−２から調製したモノクローナル抗体を用いてＢＳＨを特異的に５０ｎｇ／ｍＬから５００ｎｇ／ｍＬまでほぼ直線的な標準曲線で測定できることが判った。
【実施例５】
【００８７】
次に、血液中のＢＳＨを測定するための測定キット及び測定方法の具体例を挙げる。各ＢＳＨ測定キットは、表１に例示するような試薬構成からなる。この測定キットを用いて、血液中のＢＳＨの測定を行った。
【００８８】
（１）試料液の調製
まず、採取した血液をそのまま（全血）検査に供した。抗凝固剤として、ＥＤＴＡ・２Ｎａを２ｍｇ試験管に入れ、これに採血直後の血液を２ｍＬ加え、上下に転倒させて撹拌した。この血液にＢＳＨを加えて、１００μｇ／ｍＬのＢＳＨ溶液を調製した。１次希釈液を用いて、ピペットでこの希釈液をよく混合した後、別のチューブに一部を取り出すやり方で元の血液を２０倍希釈した。次に、第２希釈液を入れたチューブに先の１次希釈試料液を加え、１０倍に希釈することで、２００倍希釈の分析用試料を作成した。このサンプルをさらに血液を含む希釈液にて倍々希釈して様々なＢＳＨの濃度を様々に変えて試料を調製した。
【００８９】
（２）抗原抗体反応
試料液を、識別結合体の存在下において、抗体固定化ウェルプレートに１００μｌずつ分注し、室温にて３０分間抗原抗体反応を行った。
【００９０】
（３）色量変化の検出
プレートをプレートウォッシャーで洗浄し、固定化抗体と結合しなかった識別結合体を除去した。洗浄液の残液を充分に除去した後、発色試薬をプレートに加え、各１０分間発色反応させた後、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ／Ｍｏｄｅｌ５５０）を用いて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果、図３に示すように、血液試料について、希釈液に血液を加えた場合には、良好な直線が得られた(図３（１)）。一方、希釈液に緩衝液のみを使用した場合には、直線性に影響がでている（図３（２））。このことから、標準液調製の際には、血液を加えることが望ましいことがわかった。図３において、横軸は希釈率を縦軸はＢＳＨ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表している。
【実施例６】
【００９１】
次に、実施例４の表１に例示するような試薬構成の測定キットを用いて、血液中のＢＳＨの測定値と理論値との比較を行った。
【００９２】
（１）試料液の調製
実施例５と同様の方法で、ＢＳＨの測定の理論値が、５００、２５０、１００、５０ｎｇ／ｍＬになるように、血液の分析用試料を用意した。さらに、同じＢＳＨ濃度で、2次希釈液にＢＰＡを存在させることで調製したＢＰＡ混在試料を用意した。
【００９３】
（２）抗原抗体反応
試料液を、識別結合体の存在下において、抗体固定化ウェルプレートに１００μｌずつ分注し、室温にて３０分間抗原抗体反応を行った。
【００９４】
（３）色量変化の検出
プレートをプレートウォッシャーで洗浄し、固定化抗体と結合しなかった識別結合体を除去した。洗浄液の残液を充分に除去した後、発色試薬をプレートに加え、各１０分間発色反応させた後、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ／Ｍｏｄｅｌ５５０）を用いて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果、表２に示すように、高濃度のＢＳＨの場合ほど、良好な分析結果が得られた。
【表２】
2008203195.tif 000012
一方、表３に示すように、ＢＰＡの存在下においても、同様に良好な分析結果が得られた。
【表３】
2008203195.tif 000013
以上、ＥＬＩＳＡによるＢＳＨの体液濃度を検出する測定キットについて、具体的な構成例を基に説明を行ったが、本発明はこれらの例に限定されるものでないことはいうまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明に係る測定キットおよび測定方法に用いられる抗体固定部材の具体例を示す説明図。
【００９６】
【図２】本発明に係る測定キットでＢＳＨを測定した標準曲線。
【図３】本発明に係る測定キットでＢＳＨを測定した結果を示すグラフ。
【符号の説明】
【００９７】
１    抗ＢＳＨモノクローナル抗体
２    ウェルプレート
３    ブロッキング剤
４    シール
【図１】
2008203195.tif 000014
【図２】
2008203195.tif 000015
【図３】
2008203195.tif 000016
【配列表】
2008203195000001.app