(57)【要約】      （修正有）【課題】口腔内に存在する「連鎖球菌の菌数」に対する「ミュータンス連鎖球菌の菌数」の比率を短時間で算出することができるリアルタイムＰＣＲ法を提供する。【解決手段】それぞれ特定の塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせ、及び特定の塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むプローブからなる、口腔内連鎖球菌の菌数測定用プライマー及びプローブセットを使用する口腔内連鎖球菌数を測定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも１種のフォワードプライマーと、
配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも１種のリバースプライマーとの組み合わせ、からなる口腔内連鎖球菌の菌数測定用プライマーセット。
【請求項２】
前記フォワードプライマーが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、若しくは配列番号１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの２種以上のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、若しくは配列番号２６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの２種以上のオリゴヌクレオチドである請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のプライマーセットと、配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも１種のプローブとからなる口腔内連鎖球菌の菌数測定用プライマー及びプローブセット。
【請求項４】
前記プローブが、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、若しくは配列番号４５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの２種以上のオリゴヌクレオチドである請求項３に記載のプライマー及びプローブセット。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法により、口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法。
【請求項６】
請求項３又は４に記載のプライマー及びプローブセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法により、口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のプライマーセットを含む、口腔内連鎖球菌の菌数測定用リアルタイムＰＣＲキット。
【請求項８】
請求項３又は４に記載のプライマー及びプローブセットを含む、口腔内連鎖球菌の菌数測定用リアルタイムＰＣＲキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイムＰＣＲ法により口腔内に存在する口腔内連鎖球菌数を測定する方法及びそれに用いるＰＣＲプライマー及びプローブセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
う蝕の発生は、ヒトの口腔内のミュータンス連鎖球菌の存在と密接な関連があることが知られている。ヒトの口腔内に存在するミュータンス連鎖球菌の中では、主にストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）及びストレプトコッカス・ソブリヌス（Streptococcus sobrinus）がう蝕における原因菌であると考えられている。
【０００３】
しかしながら、最近、う蝕発生のリスクは、口腔内のミュータンス連鎖球菌の存在だけでなく、口腔内に存在する「総連鎖球菌の菌数」に対する「ミュータンス連鎖球菌の菌数」の比率が重要であることがわかってきた。すなわち、「総連鎖球菌の菌数」に対する「ミュータンス連鎖球菌の菌数」の比率が高いと、う蝕になり易いことが報告されている（非特許文献１、非特許文献２、及び非特許文献３）。この比率を算出するためには、ミュータンス連鎖球菌を含む「総連鎖球菌の菌数」と、「ミュータンス連鎖球菌の菌数」とを正確に把握することが重要である。従来、この「ミュータンス連鎖球菌の菌数」及びミュータンス連鎖球菌を含む「総連鎖球菌の菌数」を測定するためには、口腔内の菌を培養することによって測定していた。しかしながら、連鎖球菌の培養及び測定には時間が掛かるため、数日間が必要であった。
【０００４】
「ミュータンス連鎖球菌の菌数」及び「総連鎖球菌の菌数」のうち、ミュータンス連鎖球菌であるストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）及びストレプトコッカス・ソブリヌス（Streptococcus sobrinus）の測定に関しては、それぞれの菌に特異的なプライマー及びプローブを設計し、リアルタイムＰＣＲ法により、唾液や歯垢から短時間に菌数を測定する方法が開発されている（非特許文献４）。
【０００５】
一方、う蝕発症に関連しない連鎖球菌であるストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）、ストレプトコッカス・サンギウス（Streptococcus sanguis）、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、及びストレプトコッカス・ゴルドニス（Streptococcus gordonii）並びにミュータンス連鎖球菌を含む「総連鎖球菌の菌数」の測定に関しては、口腔内に存在するすべての連鎖球菌を測定することのできるリアルタイムＰＣＲ法は開発されていないため、時間の掛かる培養法が用いられている。そのため、口腔内に存在する「総連鎖球菌の菌数」に対する「ミュータンス連鎖球菌の菌数」の比率を算出するためには、数日間が必要であった。
【０００６】
従って、口腔内に存在する「総連鎖球菌の菌数」を培養法により測定し、これに対する「ミュータンス連鎖球菌の菌数」の比率を算出してう蝕リスクを検査する方法は、日数を要し効率が悪いため、臨床検査センター等で多数検体について、う蝕発生のリスクの検査を行う場合には適していなかった。
【０００７】
【非特許文献１】「初期う蝕のマネージメント」クインテッセンス出版株式会社、2004年8月10日、ｐ．２９−３１、及びｐ．１２４−１２５
【非特許文献２】「アーカイブス・オブ・オーラル・バイオロジー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（英国）１９９６年、第４１巻、ｐ．１６７−７３
【非特許文献３】「日本細菌学会誌」２００１年、第５６巻、ｐ．３３４
【非特許文献４】「ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」（米国）２００３年、第４１巻、ｐ．４４３８−４１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者等は、口腔内に存在する「総連鎖球菌の菌数」に対する「ミュータンス連鎖球菌の菌数」の比率を短時間で算出することができるように、口腔内連鎖球菌数を正確にリアルタイムＰＣＲ法で測定する方法について、鋭意研究した結果、原核生物リボソームの３０Ｓサブユニットに含まれるＲＮＡである１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列に着目し、連鎖球菌に共通して存在する配列を検討することにより、リアルタイムＰＣＲ法に使用可能なプライマー、並びにプライマー及びプローブを設計した。そのプライマー、並びにプライマー及びプローブを用いリアルタイムＰＣＲ法の検討を行い、培養法で測定した口腔内の連鎖球菌数を正確に反映することのできる特定のプライマー及びプローブを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明は、配列番号１で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも１種のフォワードプライマーと、配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも１種のリバースプライマーとの組み合わせ、からなる口腔内連鎖球菌の菌数測定用プライマーセットに関する。
本発明によるプライマーセットの好ましい態様においては、前記フォワードプライマーが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、若しくは配列番号１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの２種以上のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、若しくは配列番号２６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの２種以上のオリゴヌクレオチドである。
また本発明は、前記プライマーセットと、配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも１種のプローブとからなる口腔内連鎖球菌の菌数測定用プライマー及びプローブセットにも関する。
本発明によるプライマー及びプローブセットの好ましい態様においては、前記プローブが、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、若しくは配列番号４５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの２種以上のオリゴヌクレオチドである。
また、本発明は、前記プライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法により、口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法、又は前記プライマー及びプローブセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法により、口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法にも関する。
更に、本発明は、前記プライマーセットを含む、口腔内連鎖球菌の菌数測定用リアルタイムＰＣＲキット、又は前記プライマー及びプローブセットを含む、口腔内連鎖球菌の菌数測定用リアルタイムＰＣＲキットにも関する。
なお、本明細書において、「測定」は「定量」を意味するが、定量することにより検出を行っており、本発明のプライマー及びプローブセット、並びに口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法が、定性的な検出に使用することを排除するものではない。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数を正確に、且つ短時間に測定することが可能であり、本発明の方法により得られた口腔内連鎖球菌数から測定された総連鎖球菌の菌数からミュータンス連鎖球菌の菌数に対する比率を算出することにより、う蝕のリスクを効率良く検出することが可能である。また、本発明の方法により、培養法と比較して多数の検体を処理することができ、臨床検査センター等における効率的な測定が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のプライマーセット並びにプライマー及びプローブセットは、口腔内連鎖球菌数を測定するために使用することができる。これらのプライマーセット並びにプライマー及びプローブセットの塩基配列は、連鎖球菌のリボソームの３０Ｓサブユニットに含まれるＲＮＡである１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいたものである。
本明細書において、「口腔内連鎖球菌」とは、口腔内に存在するすべての種類の連鎖球菌を意味し、例えばストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）、ストレプトコッカス・サンギウス（Streptococcus sanguis）、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、及びストレプトコッカス・ゴルドニス（Streptococcus gordonii）並びにミュータンス連鎖球菌であるストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）及びストレプトコッカス・ソブリヌス（Streptococcus sobrinus）を含む。また、本明細書において、口腔内に存在する「総連鎖球菌の菌数」は、口腔内に存在するであろうすべての種類の連鎖球菌の菌数を意味するものである。本発明の方法によって測定される「口腔内連鎖球菌数」は、口腔内から採取した検体中のすべての種類の連鎖球菌の数を意味するものであり、本発明の方法によって得られた検体中の口腔内連鎖球菌数から口腔内の総連鎖球菌の菌の総数を推定することも可能である。
本発明者等は、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）、ストレプトコッカス・サンギウス（Streptococcus sanguis）、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、及びストレプトコッカス・ゴルドニス（Streptococcus gordonii）並びにミュータンス連鎖球菌であるストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）及びストレプトコッカス・ソブリヌス（Streptococcus sobrinus）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列において、同一の塩基配列からなるヌクレオチドの領域を選択し、プライマー及びプローブを作成した。しかしながら、単純にすべての連鎖球菌において同一の塩基配列のプライマー及びプローブを選択するのみでは、培養法と正確に相関する結果は得られなかった。そのため、本発明者等は、特定の塩基配列からなるヌクレオチドの領域を選択し、プライマー並びにプライマー及びプローブを設計することによって、培養法で測定した口腔内の連鎖球菌数を正確に把握することのできる測定方法を確立した。
【００１２】
本発明のプライマーセットにおけるプライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４の塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるプライマーオリゴヌクレオチド部分（以下、それぞれ、プライマーオリゴヌクレオチド部分１、プライマーオリゴヌクレオチド部分２、プライマーオリゴヌクレオチド部分３、及びプライマーオリゴヌクレオチド部分４と称する）を含むプライマーである。それぞれのプライマーオリゴヌクレオチド部分を含むプライマーを、領域１プライマー、領域２プライマー、領域３プライマー、及び領域４プライマーと称する。それぞれのプライマーオリゴヌクレオチド部分の長さは、好ましくは１５ｍｅｒ以上、より好ましくは１６ｍｅｒ以上、最も好ましくは１８ｍｅｒ以上である。また、本発明のプライマー及びプローブセットにおけるプローブは、配列番号３、及び配列番号４の塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるプローブオリゴヌクレオチド部分（以下、それぞれ、プローブオリゴヌクレオチド部分３、及びプローブオリゴヌクレオチド部分４と称する）を含むプローブである。それぞれのプローブオリゴヌクレオチド部分を含むプローブを領域３プローブ及び領域４プローブと称する。それぞれのプライマーオリゴヌクレオチド部分の長さは、好ましくは１０ｍｅｒ以上、より好ましくは１２ｍｅｒ以上、最も好ましくは１４ｍｅｒ以上である。以下に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４の塩基配列を示す。
領域１（配列番号１）：５‘−ＧＧＴＴＴＴＣＧＧＡＴＣＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＴＴＧＴＡＡＧ−３’
領域２（配列番号２）：５‘−ＡＡＴＣＣＧＧＡＣＡＡＣＧＣＴＣＧＧＧＡＣＣＴＡＣＧＴＡ−３’
領域３（配列番号３）：５‘−ＴＡＣＣＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡ−３’
領域４（配列番号４）：５‘−ＴＧＧＣＡＣＧＴＡＧＴＴＡＧＣＣＧＴＣＣＣＴＴＴＣＴＧＧＴＡ−３’
【００１３】
配列番号４６は、口腔内の存在する連鎖球菌の１つであるストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の二本鎖ＤＮＡのうち、一本鎖のＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０７７８３６）を示している。配列番号１で表される塩基配列は、配列番号４６で表される塩基配列の４１２〜４４０番領域に相当し、配列番号２で表される塩基配列は、配列番号４６で表される塩基配列５３０〜５５５番領域の相補鎖の塩基配列に相当する。また、配列番号３で表される塩基配列は、配列番号４６で表される塩基配列の４８７〜５１６番領域に相当し、配列番号４で表される塩基配列は、配列番号４６で表される塩基配列４８７〜５１６番領域の相補鎖の塩基配列に相当する。１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のヌクレオチドから、領域１プライマー、領域２プライマー、領域３プライマー、及び領域４プライマーを選択すること、及び領域３プローブ及び領域４プローブを選択することにより、口腔内の連鎖球菌数を正確に把握することのできる測定方法を確立することが可能である。
【００１４】
プライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４で表された塩基配列における連続する少なくとも１５塩基、及びそれ以上の塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドでもよく、好ましくは、配列番号１及び配列番号２で表された塩基配列における連続する少なくとも１５塩基、及びそれ以上の塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、最も好ましくは、配列番号１に示される塩基配列の２〜３０番、又は配列番号２に示される塩基配列の３〜２５番の塩基配列における連続する少なくとも１５塩基、又はそれ以上の塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。具体的には、配列番号５〜１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド又は配列番号１５〜２６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。表１及び表２に配列番号５〜２６のプライマーを示す。
【００１５】
【表１】
2008206516.tif 000002
【００１６】
【表２】
2008206516.tif 000003
【００１７】
しかしながら、口腔内連鎖球菌の菌数を正確に測定することが可能である限り、プライマーは前記のオリゴヌクレオチドに限定されるものではなく、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４で表された塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーでもよい。それらのオリゴヌクレオチドを含むプライマーの場合、前記配列番号１〜４で表された塩基配列以外に連鎖球菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチドを含んでもよく、その他の人工的な塩基配列からなるヌクレオチドを含んでもよい。例えば、オリゴヌクレオチドの５‘末端に１〜１０のヌクレオチドを付加することができる。また、１〜数個の塩基の置換を有するオリゴヌクレオチド、又は１０％以下程度のミスマッチがあるオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することもできる。
【００１８】
プライマーの長さは、特に限定する必要はないが、好ましくは、１５ｍｅｒ〜３５ｍｅｒであり、より好ましくは、２０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであり、最も好ましくは、２２ｍｅｒ〜２８ｍｅｒである。また、領域１プライマーの長さも、特に限定する必要はないが、好ましくは、１５ｍｅｒ〜３５ｍｅｒであり、より好ましくは、２０ｍｅｒ〜２９ｍｅｒであり、最も好ましくは、２２ｍｅｒ〜２５ｍｅｒである。領域２プライマーの長さも、特に限定する必要はないが、好ましくは、１５ｍｅｒ〜３５ｍｅｒであり、より好ましくは、１６ｍｅｒ〜２５ｍｅｒであり、最も好ましくは、１６ｍｅｒ〜２０ｍｅｒである。
【００１９】
本発明によるプライマーセットは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの組み合わせからなる。プライマーセットにおけるフォワードプライマーは１種でも、２種以上の組み合わせでも使用することができる。また、リバースプライマーも、１種でも、２種以上の組み合わせでも使用することができる。本明細書においてフォワードプライマーは、配列番号４６で表される塩基配列からなる１本鎖のヌクレオチドに対して、フォワード側のプライマーを意味し、リバースプライマーは、配列番号４６で表される塩基配列からなる１本鎖のヌクレオチドに対して、リバース側のプライマーを意味する。具体的にはフォワードプライマーは領域１プライマー又は領域３プライマーであり、リバースプライマーは、領域２プライマー又は領域４プライマーである。プライマーセットの組み合わせは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせであれば、特に限定されず、領域１プライマー及び領域２プライマー、領域１プライマー及び領域４プライマー、並びに領域３プライマー及び領域２プライマーの組み合わせを挙げることができるが、好ましくは領域１プライマー及び領域２プライマーの組み合わせである。
【００２０】
本発明のプライマー及びプローブセットは、前記プライマーセット及びプローブからなり、特にはフォワードプライマーである領域１プライマー及びリバースプライマーである領域２プライマー並びにプローブからなる。プライマー及びプローブセットにおけるプローブは、１種でも、２種以上の組み合わせでも使用することができる。また、プライマー及びプローブセットにおけるフォワードプライマーも１種でも、２種以上の組み合わせでも使用することができ、リバースプライマーも、１種でも、２種以上の組み合わせでも使用することができる。プローブは、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡ等をハイブリダイズの原理を用いた方法で検出するためのオリゴヌクレオチドであるが、好ましくは、リアルタイムＰＣＲ法であるＴａｑＭａｎ法において用いるプローブである。従って、プローブは、配列番号４６で表された塩基配列において、領域１プライマー及び領域２プライマーに挟まれた塩基配列の領域に設定することが可能であり、配列番号４６の塩基配列からなるヌクレオチドにハイブリダイズするものでも、その相補鎖のヌクレオチドにハイブリダイズするものでもよく、それらの混合物でもよい。配列番号４６の塩基配列からなるヌクレオチドにハイブリダイズするプローブとしては、好ましくは領域４プローブを挙げることができ、相補鎖のヌクレオチドにハイブリダイズするプローブとしては、好ましくは、領域３プローブを挙げることができる。
【００２１】
プローブは、配列番号３、又は配列番号４で表された塩基配列における連続する少なくとも１０塩基、及びそれ以上の塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプローブが好ましく、より好ましくは、配列番号２７〜４５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
【表３】
2008206516.tif 000004
【００２３】
しかしながら、口腔内連鎖球菌の菌数を正確に測定することが可能である限り、プライマーはそれらに限定されるものではなく、１〜数個の塩基の置換を有するオリゴヌクレオチド、又は１０％以下程度のミスマッチがあるオリゴヌクレオチドを使用することもできる。本明細書において「ハイブリダイズ」とは、通常のリアルタイムＰＣＲ条件下で用いる「ハイブリダイズする」と同じ意味である。
【００２４】
ＴａｑＭａｎ法に用いられるプローブは、レポーター色素及びクエンチャー色素で標識されており、オリゴヌクレオチドの一端、例えば５’−末端にレポーター色素を結合させ、他端、例えば３’−末端にクエンチャー色素を結合させて標識したプローブを使用する。色素としては、ＰＣＲ法において従来から使用されている色素を特に限定せずに用いることができ、レポーター色素としては、例えば、６−カルボキシ−フルオレッセイン（FAM）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（TET）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（JOE)、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（HEX）等を挙げることができる。また、クエンチャー色素の例としては、６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（TAMRA）、蛍光を発しないブラックホールクエンチャー（BHQ）等を挙げることができる。
【００２５】
プローブの長さは、特に限定する必要はないが、好ましくは、１２ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであり、より好ましくは、１３ｍｅｒ〜２９ｍｅｒであり、最も好ましくは、１４ｍｅｒ〜１８ｍｅｒである。
【００２６】
本発明の口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法には、ポリメレース重合反応（ＰＣＲ）を用いるが、特には、リアルタイムＰＣＲ法である。リアルタイムＰＣＲ法には、前記のプライマーセットを用い、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する化合物であるインターカレーター、例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩをＰＣＲの反応系に加えるインターカレーター法、並びにプライマーセットと５‘末端をレポーター色素で、３’末端をクエンチャー色素で修飾したプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）とをＰＣＲの反応系に加えるＴａｑＭａｎ法等がある。このようなリアルタイムＰＣＲ法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、前記プライマーセット、又は前記領域１プライマー、前記領域２プライマー及び前記プローブを合成すれば、市販のキット及び装置を用いて容易に実施することができる。
【００２７】
本発明の口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法をインターカレーター法で行う場合には、領域１プライマー及び領域２プライマー、領域１プライマー及び領域４プライマー、又は領域３プライマー及び領域２プライマーの組み合わせのプライマーセットを用いることができるが、領域１プライマー及び領域２プライマーの組み合わせのプライマーセットを用いることが好ましい。また、ＴａｑＭａｎ法で行う場合には、フォワードプライマーである領域１プライマー及びリバースプライマーである領域２プライマーからなるプライマーセット並びに領域４プローブ又は領域３プローブを用いることができる。いずれのリアルタイムＰＣＲ法も口腔内連鎖球菌の菌数を正確に測定することが可能であるが、ＴａｑＭａｎ法が好ましい。ＴａｑＭａｎ法は、２本のプライマーに加えて、プローブを用いるため、連鎖球菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対する特異性を上昇させることができるため、口腔内連鎖球菌の菌数をより正確に測定することが可能となるからである。
【００２８】
ＰＣＲ法は従来から広く行われている方法が使用可能であり、詳細には下記の３段階から成るＤＮＡ合成反応を繰り返して行う。
（１）まず、鋳型となるＤＮＡ２本鎖を加熱して変性し、１本鎖にする。
（２）次に、増幅したい特定部位のＤＮＡ鎖の両端に相補的な２種類のプライマーを反応系に過剰に加えた状態で温度を下げ、プライマーがＤＮＡ鎖の相補的な部位と２本鎖を形成する。
（３）この状態でＤＮＡ合成基質のデオキシヌクレオシド三リン酸とＤＮＡポリメラーゼを作用させると、ポリメラーゼはプライマー部位からＤＮＡ相補鎖を合成していく。
インターカレーター法は、この反応系にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等のインターカレーターを添加し、１サイクルごとに合成された二本鎖ＤＮＡに結合したインターカレーターの蛍光を測定する。ＴａｑＭａｎ法は、反応系にＴａｑＭａｎプローブを添加し、分解されたプライマーから分離したレポーター色素が蛍光を発するため、その蛍光を１サイクルごとに測定する。
【００２９】
ＴａｑＭａｎ法は、前記のようにオリゴヌクレオチドの一端、例えば５’−末端にレポーター色素を結合させ、他端、例えば３’−末端にクエンチャー色素を結合させて標識したプローブを使用するが、レポーター色素は、例えば励起光の照射によって蛍光を発する化合物である。同一のオリゴヌクレオチドにレポーターとクエンチャーとが一緒に結合している場合、その距離が近いために、レポーターの吸収したエネルギーはエネルギー転移によりクエンチャーに吸収されてしまい、レポーターは励起されない。この結果、本来ならば生じるはずの蛍光が発生しないことになる（このことを蛍光の消光、クエンチングと言う）。クエンチングを起こしているプローブをＰＣＲ反応系に添加すると、アニーリングのステップで一本鎖の鋳型ＤＮＡの内部に結合する、Ｔａｑポリメラーゼは、プライマーの３’末端から新生鎖を合成していくが、その途中でプローブを分解する。こうしてニックトランスレーションが起こり、隣接していたレポーターとクエンチャーとが分解し、クエンチングの抑制を受けていたレポーターが蛍光を発するようになる。この反応はＰＣＲの１サイクルにおいて１分子当たり１回起こるので、レポーターの蛍光強度の増加はＰＣＲ反応、すなわちＰＣＲ生成物量に概ね比例することになる。このようなレポーター及びクエンチャーを利用した測定法では、ＰＣＲ後に反応成生物を分離することなく測定が行えるため、リアルタイムに測定が可能である。
【００３０】
本発明の方法で使用される被検試料としては、口腔内から採取した唾液や歯垢等が用いられ、測定に適した粘度に適宜調整して使用する。唾液は、被験者にパラフィン等を噛ませた後に採取することも可能である。歯垢は、例えば、探針又は爪楊枝を用いて採取することができる。
【００３１】
具体的には、本発明の口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法は、下記の工程を含む。
（１）被検試料からＤＮＡを抽出する工程、
（２）抽出されたＤＮＡを鋳型としてプライマーセット又はプライマー及びプローブセットを用いてＤＮＡを増幅する工程、
（３）増幅されたＤＮＡを検出する工程
を含む。
【００３２】
前記工程（１）の口腔内から採取した唾液や歯垢に含まれるＤＮＡの抽出は、具体的には、市販のＤＮＡ抽出試薬キットを用い、添付のプロトコールに従って行うことができる。また、唾液や歯垢等を緩衝液又は界面活性剤等を含む溶菌液に混和し、８０℃〜１００℃で、１〜３０分保持し、連鎖球菌を溶菌させ、そのまま又は遠心分離した上清を、ＤＮＡ試料として用いることも可能である。
工程（２）におけるＤＮＡ増幅工程においては、ＴａｑＭａｎ法の場合は、具体的には以下の反応が起こる。
（ａ）検体中に、連鎖球菌が存在すると、連鎖球菌のＤＮＡを鋳型として指数関数的に増幅が起きる。
（ｂ）増幅が起きる過程で、プローブが鋳型ＤＮＡにハイブリダイズする。プライマーがハイブリダイズした鎖が鋳型となってその相補鎖がＤＮＡポリメラーゼにより形成される際、プローブは、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解される。
（ｃ）このためプローブに結合しているレポーター色素とクエンチャー色素が離れ離れになり、レポーター色素が検出されるようになる。すなわち、検体中に連鎖球菌が存在すればレポーター色素が検出され蛍光を発するようになる。
（ｄ）蛍光強度は、サイクル数に依存して指数関数的に増大する。
（ｅ）既知の菌濃度の標準試料を種々用意しておいて、各々の菌濃度について発光強度が急激に大きくなるサイクル数であるthreshold cycle値（以下、Ｃｔ値と称する）を調べて、菌濃度の対数を横軸、Ｃｔ値を縦軸に取ると、ほぼ直線状の検量線が描かれる。
（ｆ）未知の菌濃度の試料についてもＣｔ値を調べ、（ｅ）で作成した検量線に当てはめれば、未知の菌濃度の試料について菌濃度を知ることができる。
工程（３）の増幅されたＤＮＡを検出する工程では、蛍光強度をＰＣＲのサイクル毎に測定する。これによってＰＣＲ産物の増加をリアルタイムに測定することが可能である。
【００３３】
本発明のキットは、本発明の口腔内連鎖球菌の菌数を測定する方法に用いることのできるキットであり、少なくとも前記フォワードプライマー及びリバースプライマーを含むことを特徴とする。より好ましくは、領域１プライマー及び領域２プライマーからなるプライマーセット、並びに領域３プローブ又は領域４プローブを含む。
【００３４】
本発明のキットにおいてフォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブは、混合物として含まれてもよく、個別の試薬として含まれてもよい。また、本発明のキットは、プライマー及びプローブの他に、リアルタイムＰＣＲ法を行うのに必要な試薬又は酵素を更に含むこともできる。
【００３５】
口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数に対するミュータンス連鎖球菌の菌数の比率を算出することにより、う蝕発生の危険度を予測することができる。口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数及びミュータンス連鎖球菌の菌数は、口腔内から採取した被検試料を培養することにより、測定することができる。また、口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数及びミュータンス連鎖球菌の菌数は、リアルタイムＰＣＲ法を用いて推定することもできる。リアルタイムＰＣＲ法により得られる口腔内連鎖球菌の菌数及びミュータンス連鎖球菌の菌数は、培養方法により得られた結果と相関することが好ましい。
口腔内のミュータンス連鎖球菌の菌数は、例えば、後述の比較例４に記載のリアルタイムＰＣＲ法で測定することができる。また、口腔内連鎖球菌の菌数は、本発明のプライマー及びプローブセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法により測定することができる。リアルタイムＰＣＲ法により得られた口腔内連鎖球菌の菌数及びミュータンス連鎖球菌の菌数を用いて、比率を算出することが可能であり、う蝕発生の危険度を予測することができる。
すなわち、口腔内から採取した１つの試料中の口腔内連鎖球菌の菌数及びミュータンス連鎖球菌の菌数を測定し、口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数に対するミュータンス連鎖球菌の菌数の比率を算出する。
【００３６】
《作用》
本発明のプライマー及びプローブセット、並びに後述の比較例１〜３で用いたプライマー及びプローブセットは、いずれも口腔内に存在する連鎖球菌であるストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギウス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・オラリス、及びストレプトコッカス・ゴルドニス、ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に存在する共通の塩基配列を有する領域から選択したプライマー及びプローブセットである。本発明のプライマー及びプローブセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法によれば、培養法と相関する口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数の測定が可能である。しかしながら、比較例１〜３で用いたプライマー及びプローブセットによるリアルタイムＰＣＲ法では、測定値が培養法で得られた総連鎖球菌の菌数と相関しない場合や、検量線が得られない場合がある。これらの理由は、完全に解明されているわけではないが、以下のように推論することができる。また、本発明は以下の説明によって限定されるものではない。
【００３７】
口腔内には、連鎖球菌以外にもいくつかの常在菌が混在しており、連鎖球菌以外の菌の種類やその量は、個人によっても差があると考えられる。本発明のプライマー及びプローブセットは、１種類の連鎖球菌に特異的な塩基配列の領域にプライマー及びプローブを設計するのではなく、すべての連鎖球菌に共通する塩基配列の領域にプライマー及びプローブを設計する必要がある。従って、領域によっては連鎖球菌以外の常在菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を検出するものと考えられる。また、検量線が得られなかったプライマー及びプローブセットについては、ＰＣＲ反応が良好に起こっていないものと考えられる。例えば、後述する比較例３のような検量線の得られないプライマーではその領域の標的ＤＮＡが、ｄｅｎａｔｕｒｅされて一本鎖ＤＮＡとなったときに、ヘアピン構造等の２次構造を取りやすい領域の場合には、プライマーやプローブの結合が阻害される。またプライマー同士が結合してプライマーダイマーを形成したり、プライマーやプローブが２次構造を取るようなことも考えられる。従って、正確な口腔内総連鎖球菌数の測定を行うためにリアルタイムＰＣＲ法に適したプライマーやプローブを設計する領域は、単純にすべての連鎖球菌に共通する塩基配列の領域を選択すればよいわけでなく、リアルタイムＰＣＲ法に適しており、正確に口腔内総連鎖球菌数を測定することのできる領域である必要がある。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例に基づき、より具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３９】
《ＤＮＡの抽出例》
５人の被験者の口腔内から唾液０．２ｍＬを採取し、粘度を調整するため滅菌水１．６ｍＬに懸濁後に遠心して沈殿物を回収し、ＤＮＡ抽出試薬キット（商品名  QuickGene DNA tissue kit S；FUJIFILM社）を用い、キットマニュアルに従いＤＮＡを抽出し、０．２ｍＬのＤＮＡサンプルとした。
【００４０】
《実施例１》
TaqMan Fast Universal PCR Mater Mix（アプライド・バイオシステムズ株式会社）を用いて、１チューブあたり、ＤＮＡサンプル及び以下の量の試薬を混合して、全体の液量が２０μＬの反応液を調整した。
TaqMan Fast Universal PCR Mater Mix       ：１０μＬ
１０μＭのＦ６フォワードプライマー        ：０．４μＬ（終濃度２００ｎＭ）
１０μＭのＲ８リバースプライマー          ：０．４μＬ（終濃度２００ｎＭ）
５μＭのＰ８プローブ                      ：０．４μＬ（終濃度１００ｎＭ）
ＤＮＡサンプル                            ：１．０μＬ
滅菌水                                    ：７．８μＬ
反応液２０μＬの入ったチューブを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムにセットしＰＣＲ反応を行った。前処理として９５℃、２０秒でインキュベートを行った後、９５℃、３秒、６０℃、３０秒を４０サイクル繰り返し、増幅サイクル毎に蛍光強度を測定した。なお、プライマーはオリゴＤＮＡを化学合成により作製した。プローブはオリゴＤＮＡを化学合成し、５‘末端にＦＡＭを、３’末端にＢＨＱを結合させたものを用いた。
標準曲線を作成するために、Streptococcus mitis ATCC49456株を培養して種々の菌濃度の標準試料を用意し、各々の菌濃度について発光強度が急激に大きくなる閾値（Ｃｔ値）を予め調べて、菌濃度の対数を横軸にＣｔ値を縦軸に取って検量線を作成した。同時に検体についてもＣｔ値を調べ、検量線に当てはめることにより検体中の菌濃度を定量した。結果を表１に示す。
【００４１】
《実施例２》
フォワードプライマーとしてＦ１０フォワードプライマーを、リバースプライマーとしてＲ４リバースプライマーを、プローブとしてＰ１３プローブを用いたことを除いては、実施例１に記載の測定方法を繰り返した。結果を表４に示す。
【００４２】
《実施例３》
フォワードプライマーとしてＦ３フォワードプライマーを、リバースプライマーとしてＲ５リバースプライマーを、プローブとしてＰ１７プローブを用いたことを除いては、実施例１に記載の測定方法を繰り返した。結果を表４に示す。
【００４３】
《実施例４》
フォワードプライマーとしてＦ１フォワードプライマーを、リバースプライマーとしてＲ２リバースプライマーを、プローブとしてＰ１９プローブを用いたことを除いては、実施例１に記載の測定方法を繰り返した。結果を表４に示す。
【００４４】
《比較例１》
フォワードプライマーとしてＦ１１フォワードプライマー（配列番号４７）を、リバースプライマーとしてＲ１３リバースプライマー（配列番号４８）を、プローブとしてＰ２０プローブ（配列番号４９）を用いたことを除いては、実施例１に記載の測定方法を繰り返した。各プライマーは、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギウス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・オラリス（、及びストレプトコッカス・ゴルドニス、ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ソブリヌスのｓ１６ＲＮＡ遺伝子において、共通の配列を有する領域に設定した。Ｆ１１フォワードプライマー、Ｒ１３リバースプライマー、及びＰ２０プローブの塩基配列を以下に示す。括弧内は配列番号４６に示したストレプトコッカス・ミュータンスの塩基配列における相当するヌクレオチド番号を示す。
Ｆ１１：５‘−ＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡ−３’（６７８−６９９）
Ｒ１３：５‘−ＣＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴＣ−３’（９０２−９２３）
Ｐ２０：５‘−ＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧ−３’（７７８−７９８）
結果を表４に示す。
【００４５】
《比較例２》
フォワードプライマーとしてＦ１２フォワードプライマー（配列番号５０）を、リバースプライマーとしてＲ１４リバースプライマー（配列番号５１）を、プローブとしてＰ２１プローブ（配列番号５２）を用いたことを除いては、実施例１に記載の測定方法を繰り返した。各プライマーは、比較例１と同様に、各連鎖球菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子において、共通の配列を有する領域に設定した。Ｆ１２フォワードプライマー、Ｒ１４リバースプライマー、及びＰ２１プローブの塩基配列を以下に示す。括弧内は配列番号４６に示したストレプトコッカス・ミュータンスの塩基配列における相当するヌクレオチド番号を示す。
Ｆ１２：５‘−ＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧ−３’（１２１６−１２３７）
Ｒ１４：５‘−ＡＡＧＧＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣ−３’（１３６８−１３８６）Ｐ２１：５‘−ＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧ−３’（１３３６−１３５０）
結果を表４に示す。
なお、これらのプライマー及びプローブセットの組み合わせは、連鎖球菌だけでなく、Porphyromonas gingivalis、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus caseiも検出した。
【００４６】
《比較例３》
フォワードプライマーとしてＦ１３フォワードプライマー（配列番号５３）を、リバースプライマーとしてＲ１５リバースプライマー（配列番号５４）を、プローブとしてＰ２２プローブ（配列番号５５）を用いたことを除いては、実施例１に記載の測定方法を繰り返した。各プライマーは、比較例１と同様に、各連鎖球菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子において、共通の配列を有する領域に設定した。Ｆ１３フォワードプライマー、Ｒ１５リバースプライマー、及びＰ２２プローブの塩基配列を以下に示す。括弧内は配列番号４６に示したストレプトコッカス・ミュータンスの塩基配列における相当するヌクレオチド番号を示す。
Ｆ１３：５‘−ＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＣＧ−３’（１３３７−１３６０）
Ｒ１５：５‘−ＴＧＴＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡ−３’（１３８８−１４０５）
Ｐ２２：５‘−ＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣ−３’（１３６４−１３８３）
結果を表４に示す。
このプライマー及びプローブセットの組み合わせは、培養菌からのＤＮＡ抽出液の１０倍希釈系列を作製し、増幅して検量線を作成したが、検量線が直線にならず、正しく測定することができなかった。
【００４７】
《比較例４》
非特許文献４に記載のストレプトコッカス・ミュータンスを特異的に検出するプライマーを用いて、５人の被験者の口腔内のＤＮＡサンプルの測定を行った。すなわち、フォワードプライマーとしてＳｍｕｔ３３６８−Ｆプライマー（配列番号５６）を、リバースプライマーとしてＳｍｕｔ３４８１−Ｒプライマー（配列番号５７）を、プローブとしてＳｍｕｔ３４２３Ｔプローブ（配列番号５８）を用いたことを除いては、実施例１に記載の測定方法を繰り返した。各プライマー及びプローブは、ストレプトコッカス・ミュータンスのｇｔｆＢ遺伝子に設定されている。以下に、Ｓｍｕｔ３３６８−Ｆプライマー、Ｓｍｕｔ３４８１−Ｒプライマー（配列番号５７）、及びＳｍｕｔ３４２３Ｔプローブの塩基配列を示す。
Ｓｍｕｔ３３６８−Ｆ：５‘−ＧＣＣＴＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＡＴＧＣＴＡＴＴＣＴ−３’
Ｓｍｕｔ３４８１−Ｒ：５‘−ＧＣＣＡＴＡＣＡＣＣＡＣＴＣＡＴＧＡＡＴＴＧＡ−３’Ｓｍｕｔ３４２３Ｔ：５‘−ＴＧＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＡＴＧＡＡ−３’
結果を表４に示す。
被験者の口腔内から採取した唾液を適宜希釈し、ミティス・サリバリウス（Mitis Salivarius）寒天培地（以下、ＭＳ寒天培地と称す）にて培養した後、コロニー数をカウントすることにより口腔内総連鎖球菌数を測定した結果も表４に纏めて示す。
【００４８】
【表４】
2008206516.tif 000005
【００４９】
表４に示す結果より、本発明によるプライマー及びプローブセットを用いることによって、口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数を短時間で定量することができ、培養法と相関する結果を得ることができた。従って、本発明の方法及びキットを用いれば、口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数に対するう蝕発症に関連する連鎖球菌の比率を効率良く算出することができる。実際に、実施例１〜４によって得られた口腔内連鎖球菌数と比較例４によって得られたミュータンス連鎖球菌であるストレプトコッカス・ミュータンスの菌数とから、「総連鎖球菌の菌数」に対する「ミュータンス連鎖球菌の菌数」の比率を算出することが可能である。一方、比較例１〜３のプライマー及びプローブを用いた場合には、培養法とは異なる結果となり口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数の測定を行うことができなかった。
【００５０】
《実施例５》
実施例５では、口腔内の代表的な連鎖球菌を用い、本発明のプライマー及びプローブセットがいずれの菌種においても、有効な検量線を引くことができることを確認した。
用いた口腔内連鎖球菌株は以下のとおりであり、括弧内は入手先の菌株名を示している。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（ＡＴＣＣ２５１７５）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（ＪＣＭ５７０５）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（ＯＭＺ）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（ＪＣＭ５７０６）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（ＭＴ６２２９）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ（ＡＴＣＣ３３４７８）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ（ＯＭＺ６５）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ（６７１５）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ（ＭＴ８２４５）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ（ＡＴＣＣ９０３）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ（６２４９）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ（ＡＴＣＣ４９４５６）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（ＪＣＭ５７０７）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ（ＡＴＣＣ１０５５６）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ（ＡＴＣＣ１０５５７）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ（ＪＣＭ１２９９７）
【００５１】
ブレインハートインフージョン（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ：以下、ＢＨＩと称する）液体培地により各菌株を培養し、遠心（５，０００ｒｐｍ，５分間）により集菌した。菌をリン酸緩衝化生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：以下、ＰＢＳと称する）に懸濁し、培養菌懸濁液とした。ＤＮＡ抽出試薬キットQuickGene DNA tissue kit S（FUJIFILM社）を用いてキットマニュアルに従い、各培養菌懸濁液からＤＮＡを抽出した。同時にＭＳ寒天培地に適当に希釈した培養菌懸濁液を播種し、コロニー数をカウントすることにより懸濁液中の細菌数を測定した。
フォワードプライマーとしてＦ７フォワードプライマーを、リバースプライマーとしてＲ７リバースプライマーを、プローブとしてＰ７プローブを用いたこと、及びＤＮＡサンプルとして各培養懸濁液からのＤＮＡを用いたことを除いては、実施例１に記載の測定方法を繰り返した。
各々のＤＮＡサンプルについてシグナルが急激に大きくなるサイクル数（Ｃｔ値）を求め、菌数の対数を縦軸、閾値（Ｃｔ値）を横軸に取って検量線を作成した。
【００５２】
ＰＣＲ結果より得られたＣｔ値ともとの培養菌懸濁液の菌数をプロットしたものを図１に示す。
【００５３】
図１のＳ．ｍｕｔａｎｓはATCC25175株を、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓはATCC33478株を、Ｓ．ｍｉｔｉｓはATCC49456株を、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓは、ATCC10556株を示しており、Ｓ．ｍｕｔａｎｓやＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓは複数の株を用いて行ったが、株による増幅の違いはほとんどみられず、異なる連鎖球菌を正確に定量できることがわかった。
【００５４】
《実施例６》
各連鎖球菌の菌株について、培養により得られた菌数とリアルタイムＰＣＲ法により得られた菌数の相関を確認した。
実施例５で使用した培養菌株を用い、各株をＢＨＩ液体培地で培養し、増殖してきた培養液を集菌した。ＰＢＳで適当に懸濁し、この溶液からＤＮＡ抽出液を作製した。また、同時にＰＢＳ懸濁液をＭＳ寒天培地に播種し、培養法による菌数を算出した。
フォワードプライマーとしてＦ８フォワードプライマーを、リバースプライマーとしてＲ７及びＲ８リバースプライマーを、プローブとしてＰ８プローブを用いたこと、及びＤＮＡサンプルとして各培養懸濁液からのＤＮＡを用いたことを除いては、実施例１に記載の測定方法を繰り返した。
Streptococcus mitis ATCC49456から得られる検量線を用いて菌数を算出した。
【００５５】
リアルタイムＰＣＲ法による測定結果と培養法による測定結果を以下に示す。
【表５】
2008206516.tif 000006
リアルタイムＰＣＲ法により推定される菌数と培養法により得られる菌数は、よく相関していることがわかった。また、プライマーとして、複数のプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲ法による増幅を行っても、正確に定量できることがわかった。
【００５６】
《参考例１》
参考例１では、本発明のプライマー及びプローブセットが、連鎖球菌以外の菌は検出しないことを確認した。
用いた口腔内に存在する連鎖球菌以外の菌は、以下のとおりであり、括弧内は入手先の菌株名を示している。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（ＪＣＭ１２３１）
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ＪＣＭ１５６３）
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ（ＡＴＣＣ４６４６）
Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（ＡＴＣＣ２９５２４）
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＡＴＣＣ３３２７７）
Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ１０２３１）
Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ（ＪＣＭ１６０９）
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ（ＪＣＭ８３４９）
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１７９２９）
【００５７】
各菌株を以下に示す培地を用いて培養した。各培地の組成は、特に記載しない限り標準的なものを用いた。
Lactobacillus属：MRS培地
Actinobacillus actinomycetemcomitans：ＢＨＩ  ３７．５ｇ／Ｌからなる液体培地。オートクレーブ滅菌後にＮ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８：１：１の混合ガス中にて１晩放置したものを使用した。
Porphyromonas gingivalis培地組成：ＢＨＩ  ３７．５ｇ／Ｌにyeast extract  ５ｇ／Ｌ、tripticase peptone  ５ｇ／Ｌ、Ｌ−cysteine  ＨＣｌ  ０．５ｇ、ヘミン・メナジオン溶液*  １ｍＬからなる液体培地。オートクレーブ滅菌後にＮ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８：１：１の混合ガス中にて１晩放置したものを使用した。
ヘミン・メナジオン溶液*：ヘミン０．０５ｇを１Ｍ水酸化ナトリウム１ｍＬに溶解して１００ｍＬにメスアップした溶液をオートクレーブ滅菌する（溶液Ａ）。メナジオン０．２ｇをエタノール２０ｍＬに溶解してろ過滅菌する（溶液Ｂ）。溶液Ａ１００ｍＬと溶液Ｂ１ｍＬを混合することにより調製する。
Candida属、YM培地
Actinomyces属：アクチノミセス培地（ベクトン・ディッキンソン）
【００５８】
増殖した培養液を遠心（５，０００ｒｐｍ，５分間）により集菌した。ＰＢＳに懸濁し、培養菌懸濁液とした。ＤＮＡ抽出試薬キットQuickGene DNA tissue kit S（FUJIFILM社）を用いてキットマニュアルに従い、各培養菌懸濁液からＤＮＡを抽出した。同時に以下に示す寒天培地に適当に希釈した培養菌懸濁液を播種し、コロニー数をカウントすることにより懸濁液中の細菌数を測定した。
Lactobacillus属：ROGOSA寒天培地
Actinobacillus actinomycetemcomitans、Porphyromonas gingivalis：羊血液寒天培地（栄研化学）
Candida属：ポテトデキストロース培地
Actinomyces属：ＧＡＭ半流動培地
ＰＣＲ反応については実施例１と同じプライマー及びプローブセットを用い、実施例１に記載の測定方法を繰り返した。
どの培養菌株から得られたＤＮＡサンプルからも増幅がみられなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のプライマー及びプローブセットを用いた口腔内連鎖球菌数を測定する方法により、総連鎖球菌の菌数とミュータンス連鎖球菌の比率を算出することが可能である。この比率を求めることによって、う蝕のリスクを検出することが可能であり、う蝕の予防及び治療に役立てることができる。また、本発明の方法は、培養法と比較して多数の検体を処理することができるため、臨床検査センター等における多数検体の処理が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】口腔内に存在する異なる連鎖球菌をリアルタイムＰＣＲにより測定した場合のＣｔ値と含まれていた菌数をプロットした図である。
【図１】
2008206516.tif 000007
【配列表】
2008206516000001.app