(57)【要約】      （修正有）【課題】  デバイス上における大腸菌や酵母の形質転換方法や哺乳動物細胞の形質導入方法を提供し、遺伝子発現の時間的変化の評価、各遺伝子に由来する表現型の解析、そして遺伝子産物の細胞内局在など、ＤＮＡマイクロアレイでは困難あるいは不可能であった情報に関して細胞レベルで網羅的に解析すること。【解決手段】  予め固相基板上に固定化した複数種類のＤＮＡベクターを、微小流路を用いて流路の物理的障壁で隔絶された各々のマイクロウェル内にて細胞（微生物や哺乳動物細胞を含む。以下同じ）内部に効率的に取り込ませ、流路の物理的障壁により異なるＤＮＡベクターを取り込んだ細胞同士が混在することを防ぎ、引続き同一固相基板を選択培地に接触させながら選択培養し、各々のマイクロウェル内にて目的遺伝子発現誘導を促し、各々のマイクロウェル内にて細胞の形質転換または形質導入を行い、発現したレポータータンパク質の活性を検出する。【選択図】  図１
2008206397.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
あらかじめ固相基板上のマイクロウェルアレイに複数種類のＤＮＡベクターを固定化しておき、微小流路を用いて微生物細胞−コラーゲン懸濁液または哺乳動物細胞−コラーゲン懸濁液を基板上のマイクロウェルに導入し、微小流路の物理的障壁で隔絶された各々のマイクロウェル内にてＤＮＡベクターを細胞（微生物や哺乳動物細胞を含む。以下同じ）内部に効率的に取り込ませ、固相基板上の微小流路の物理的障壁により異なるＤＮＡベクターを取り込んだ細胞同士が各々のマイクロウェル内で混在することを防ぎ、引続き同一固相基板および固相基板上のマイクロウェルを選択培地に接触させながら細胞を選択培養することにより、各々のマイクロウェル内にて目的遺伝子発現誘導を促し、各々のマイクロウェル内にて細胞の形質転換（トランスフォーメーション）方法または形質導入（トランスフェクションまたはインフェクション）を行うことを特徴とする細胞の形質転換方法及び形質導入方法。
【請求項２】
同一基板上にて形質転換または形質導入により発現したレポータータンパク質の活性を、各々のマイクロウェルごとに検出する請求項１に記載の細胞の形質転換方法及び形質導入方法。
【請求項３】
取り込まれるＤＮＡベクターが、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡまたはウィルスである請求項１または２に記載の細胞の形質転換方法及び形質導入方法。
【請求項４】
取り込まれるＤＮＡベクターが、プラスミドＤＮＡで微生物細胞−コラーゲン懸濁液が大腸菌−コラーゲン懸濁液または酵母−コラーゲン懸濁液である請求項１または２に記載の細胞の形質転換方法及び形質導入方法。
【請求項５】
マイクロウェルの体積が、１〜５０nLである請求項１ないし４のいずれかに記載の細胞の形質転換方法及び形質導入方法。
【請求項６】
マイクロウェルの細孔サイズが、５〜１０００μｍである請求項１ないし５のいずれかに記載の細胞の形質転換方法及び形質導入方法。
【請求項７】
マイクロウェルの形態が、逆ピラミッド型である請求項１ないし６のいずれかに記載の細胞の形質転換方法及び形質導入方法。
【請求項８】
固相基板が、ガラス、シリコンまたは高分子樹脂である請求項１ないし７のいずれかに記載の細胞の形質転換方法及び形質導入方法。
【請求項９】
微小流路が、高分子膜に流路を成型し、該成型した高分子膜を固相基板上に被せることで作製される請求項１ないし８のいずれかに記載の細胞の形質転換方法及び形質導入方法。
【請求項１０】
高分子膜が、天然または合成ゴム、または高分子樹脂である請求項９に記載の細胞の形質転換方法及び形質導入方法。
【請求項１１】
高分子樹脂が、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）である請求項１０に記載の細胞の形質転換方法及び形質導入方法。
【請求項１２】
固相基板上でレポータータンパク質の発現が、電気化学的または呈色・発光・蛍光により検出される請求項１ないし１１のいずれかに記載の細胞の形質転換方法及び形質導入方法。
【請求項１３】
レポータータンパク質の発現が、電極集積型固相基板を使用して電気化学的に検出される請求項１２に記載の細胞の形質転換方法及び形質導入方法。
【請求項１４】
電極が細胞を固定化する固相基板片側面に配置された電極集積型固相基板を使用する請求項１２または１３に記載の細胞の形質転換方法及び形質導入方法。
【請求項１５】
電極がマイクロウェルの細孔部分の端に配置され、かつ電極幅５〜１００μmでデザインされている電極集積型固相基板を使用する請求項１２ないし１４のいずれかに記載の細胞の形質転換方法及び形質導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デバイス上における細胞の形質転換（トランスフォーメーション）方法または形質導入（トランスフェクションまたはインフェクション）方法に関する。
【０００２】
シリコン基板上に作製した貫通型微細孔アレイにあらかじめ種々のプラスミドＤＮＡを固定化しておき、これにＰＤＭＳ微小流路を用いて微生物細胞（大腸菌コンピテントセルや酵母細胞など）または哺乳動物細胞を作用することにより、微細孔内で形質転換または形質導入を誘起する。目的遺伝子を取り込んだ細胞（微生物および哺乳動物細胞）は、選択培地（抗生物質含培地など）を提供することにより選択的に増殖し、従って目的遺伝子を含むＤＮＡ配列が増幅される。即ち、本発明は、遺伝子クローニングをオンチップで実施する際の重要な方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子の転写レベルの細胞内変動をゲノム全体に渡って比較することで、各遺伝子が形成する細胞内ネットワークの網羅的解析を可能にした。そして近年盛んに開発されている細胞マイクロアレイは、生細胞の表現型や外部刺激応答を指標に遺伝子機能を網羅的に評価することを目的としている。遺伝子発現の時間的変化の評価、各遺伝子に由来する表現型の解析、そして遺伝子産物の細胞内局在など、ＤＮＡマイクロアレイでは困難あるいは不可能であった情報に関して細胞レベルで網羅的に解析することを可能とする。
【０００４】
２０００年にFujitaらは、チップ上での遺伝子導入を可能とする細胞マイクロアレイチップを設計した（非特許文献１）。彼らは、シリコン基板上のウエル内へ固定化した細胞に対し、ウエル底面に作製したノズルから遺伝子をインジェクトする方法を提案している。彼らの提案は細胞マイクロアレイのハイスループット化へ向けた画期的概念と言えるが、論文内では遺伝子導入に成功しておらず、固相基板上での遺伝子導入実現の難しさを例示している。
【０００５】
２００１年Sabatiniらは、Fujitaらと全く異なる手法でチップ上での細胞への遺伝子導入に成功した（例えば、非特許文献２）。ｃＤＮＡ発現ベクターをアレイ化した基板上へ細胞を播種、培養することで、ｃＤＮＡスポット上に接着した細胞のみがトランスフェクションされる。「リバーストランスフェクション法」と名付けられた手法により、彼らはチロシンキナーゼ情報伝達系やアポトーシス、細胞接着に関わるタンパク質を同定した。またｃＤＮＡだけでなく、多種類のＲＮＡｉなども細胞に同時に導入でき、特定遺伝子を過剰発現あるいは抑制した細胞の網羅的調整、およびスクリーニングが既に行われている（例えば、非特許文献３）。
【０００６】
特開２００５−９５０５８号公報（特許文献１）には、哺乳動物体内から微小量の細胞をコラーゲンゲルに包埋し、固相基板上の微小穴に固定化した状態で、培養・増殖する方法が記載されている。しかし、固相基板上での細胞への遺伝子導入可能性、固相基板上にＤＮＡを担持する方法については課題を残したままである。微生物や哺乳動物細胞をコラーゲンゲルに包埋固定化し、固相基板上にて培養・増殖を実施するとともに、電気化学測定法によりその活性を追跡した研究として、上述の特許文献１に加え、以下の非特許文献がある。大腸菌を対象に、細胞・微生物チップを用いて、菌の増殖過程を追跡した研究例が報告されている。大腸菌を対象に、細胞・微生物チップを用いて、誘導型酵素（ベータ・ガラクトシダーゼ）の発現過程を電気化学的に追跡した研究例がある。基板上に検出電極自体を集積化してある微生物チップの作製により、ベータ・ガラクトシダーゼ活性を電気化学的に追跡することは既に報告されている（非特許文献４）。形質転換により、あらかじめプラスミドpBR322-lacZを導入した大腸菌を基板上に包埋固定化し、抗生物質を含む培地中にて選抜・培養しながら、ベータ・ガラクトシダーゼの活性を電気化学的に追跡した研究例がある（非特許文献５）。
【０００７】
また、特開２００５−４６１２１号公報（特許文献２）にはアッセイに用いる微生物を安定に固定化する方法として、貫通孔をアレイ状に配置した単結晶シリコン基板とその表裏に二枚のＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）製チャンネルチップを張り合わせて三次元ネットワークを形成させる方法が記載されている。具体的には、格子状に配列した複数の微細孔が貫通された基板からなる微細孔チップの下面に、細胞導入用微小流体チップを固着して、微細孔チップと細胞導入用微小流体チップ間に複数の微細な流路を形成し、該流路を介して懸濁した細胞を微細孔に流し込み、次いで、微細孔チップの上面に、被検物質導入用微小流体チップを、その複数の微細な被検物質導入用流路が前記細胞導入用流路と直交するように固着して、微細孔チップと被検物質導入用微小流体チップ間に複数の微細な流路を形成し、該流路を介して被検物質を流し込み、微細孔チップの微細孔内の細胞と接触させ、所定時間後あるいは所定の時間間隔で、被検物質が細胞に及ぼす影響の程度をインサイチューに検出する方法を考案している。
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−９５０５８号公報
【特許文献２】特開２００５−４６１２１号公報
【非特許文献１】B. LePioufle et al., Mater. Sci. Eng. C, 12, 77-81 (2000)
【非特許文献２】I. Ziauddin & D. M. Sabatini, Nature, 411, 107-110 (2001)
【非特許文献３】D. B. Wheeler, et al., Nat. Methods, 1, 127-132 (2004)
【非特許文献４】T. Kaya, et al.,Chem. Comm., 2004, 248-249
【非特許文献５】K. Nagamine, T. Kaya, T. Yasukawa, H. Shiku, T. Matsue, Real-time electrochemical monitoring of gene expression in transformed bacteria using a microbial chip, in Meeting Abstracts of 2004 Joint International Meeting, 206th Meeting of the Electrochmical Sosiety, 2004 Fall Meeting of the Electrochemical Society of Japan  (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
細胞マイクロアレイ作製における問題点は、アレイ化する多種類の細胞の調製方法である。アレイ化する細胞は、レポーター遺伝子の導入や目的タンパク質に対する標識タグの付加など遺伝子機能解析を容易にするような遺伝子工学的処置を細胞に対しあらかじめ施さなければならず、ハイスループット化に際し多大な時間と労力を要する。固相基板上での遺伝子導入技術は、その開発の歴史が浅く、より効率的で簡便な方法を探索するべく、世界の研究者が競い合っている。しかし、微細加工技術の導入も遅れており、遺伝子導入の成功もごく一部の限られた哺乳動物細胞株を対象とした場合にのみ限られているのが現状である。固相基板上での微生物への遺伝子導入可能性については、報告はない。
【００１０】
Sabatiniらが開発した「リバーストランスフェクション法」であっても、効率よく遺伝子導入が可能な細胞はごく一部の限られた哺乳動物細胞株を対象とした場合にのみ限られているのが現状である。「リバーストランスフェクション法」の問題点は、導入遺伝子を含むＤＮＡとＤＮＡを取り込む細胞が作用可能な表面積が限定されている点にある。この問題を解決するための方策として、立体的なマイクロウェルをデザインすることにより、導入遺伝子を含むＤＮＡとＤＮＡを取り込むホスト細胞が作用可能な領域を大きくことが必要である。即ち、作用可能な表面積を確保するか立体的に確保する必要がある。
【００１１】
また、リバーストランスフェクション法の適用範囲は、固相基板上に接着性の細胞に対する遺伝子導入に限定されている点にある。リバーストランスフェクション法ではＤＮＡが基板上に固定化されており、細胞がそこへ接着することで初めて遺伝子導入が起こる。従って固相基板に対し非接着性の細胞に対して効率よく遺伝子を導入することが困難であった。そこで、細胞が固相基板に接着する性質に頼らず、コラーゲンなどのハイドロゲル材料を用いて細胞を包埋することができれば、非接着性の細胞を固相基板上に固定化することが可能となる。ところが、ゲル材料に細胞を包埋固定化する方法では、固相基板表面に位置するＤＮＡとゲル内部に位置するホスト細胞との距離が大きくなり、ゲル包埋細胞内に効率よく遺伝子を導入することが困難となる。
【００１２】
固相基板上にてゲル包埋非接着性細胞を固定化し、かつ細胞内に効率よく遺伝子導入を行うためには、体積の極めて小さいマイクロウェルを設計し、マイクロウェルの体積に対する表面積の比率を高める必要がある。既存の９６穴プレートやその他のマルチタイタープレートでは、明らかにウェルのサイズが大きすぎて使い物にならない。さらに、そのようにして設計されたゲル包埋非接着性細胞を固定化するための体積の極めて小さいマイクロウェル内の微小環境は、細胞が単に生存する状態であるに留まらず、細胞内の遺伝子転写-翻訳機能や、ＤＮＡ複製能や、細胞増殖能などが正常に保たれていなければならない。加えて、マイクロウェル内で形質転換または形質導入された細胞はレポーター遺伝子発現能を有するとともに、基板上の微小領域で発現してくるレポータータンパク質の活性を高感度に検出するシステムが基板上または基板近傍に配備されていることが望ましい。
【００１３】
このような細胞固定化基板を網羅的遺伝子発現解に応用するためには、正しい位置で目的のＤＮＡベクターのみが細胞に取り込まれる必要があり、従って固相基板上に高密度に配列固定化された種類の異なるＤＮＡベクターが目的のアドレス以外の領域に拡散することを防ぐ必要がある。 上述のように従来の技術では、基板上で細胞に遺伝子を導入する方法は効率や迅速性、汎用性に関して問題がある。基板上で細胞に遺伝子を導入する方法は、「リバーストランスフェクション法」およびそれと類似の方法に基づき、一部の動物細胞を対象とした場合においてのみ実現されているに過ぎない。異なる種類の遺伝子を導入する場合にも、ＤＮＡマイクロアレイの個々のスポットを物理的に隔絶するなどしてクロストークを遮断する方策は何らとられていない。ＤＮＡとホスト細胞の接触作用を増大させるために、３次元的マイクロウェルなどを適用し、表面積を確保し、遺伝子導入効率を高める工夫がなされていない。
【００１４】
特開２００５−９５０５８号公報は、固相基板上での細胞への遺伝子導入可能性について記述はない。固相基板上にＤＮＡを担持する方法について記述がない。 特開２００５−４６１２１号公報の方法では、用いられた菌体は、あらかじめ形質転換−選抜されたものを基板上に包埋固定化している。細胞マイクロアレイ作製において最大の問題点かつ時間と労力を要する工程は、アレイ化する多種類の細胞の調製方法である。特に種類の異なる遺伝子組換株細胞、形質転換細胞、形質導入株細胞の調製、維持は大変時間と労力を要する。
【００１５】
要するに、細胞マイクロアレイにより生細胞の表現型や外部刺激応答を指標に遺伝子機能を網羅的に評価する目的を達成する為には、固相基板上へのＤＮＡベクターの固定化、細胞の包埋固定化および配列化、所定のアドレスに於ける高効率かつコンタミネーションフリーの状態でＤＮＡベクターを細胞内へ取り込む工程、ＤＮＡベクターを取り込んだ細胞が所定の選択培地の作用により選択される工程、誘導剤の添加に対応するレポーター遺伝子の発現過程、レポータータンパク質の活性を感度よく検出する過程など、あらゆるプロセスを同一固層基板上にて連続的に実現するための手段を提供する必要がある。
【００１６】
本発明者は、マイクロウェルのサイズや形状のデザインの最適化やハイドロゲル材料の最適化が、固相基板上における遺伝子導入効率の向上に寄与していることに注目し、あらかじめ固相基板上のマイクロウェルにＤＮＡベクターを固定化しておき、微小流路を用いて大腸菌−コラーゲン懸濁液を基板上のマイクロウェルに導入し、ウェル内部でＤＮＡベクターが大腸菌内に効率的に取り込まれることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明では、微細孔、および流路で区切られた溶液空間内で遺伝子導入を行った後、その位置で形質転換大腸菌を固定化することでアレイを構築した。これにより基板底面への接着性を有さない浮遊細胞や、大腸菌などの遊走性細胞に対してもチップ上での遺伝子導入が可能となる。本発明者らは、体積が１〜５０nLであり、細孔サイズが５〜１０００μｍであり、形態が逆ピラミッド型であるマイクロウェルを設計しかつ微細加工技術により作製することにより、マイクロウェルの体積に対する表面積の比率を高めつつ、マイクロウェル内の微小環境に関して、細胞が単に生存する状態であるに留まらず、細胞内の遺伝子転写-翻訳機能や、ＤＮＡ複製能や、細胞増殖能などが正常に保たれること、マイクロウェル内で形質転換または形質導入された細胞はレポーター遺伝子発現能を有すること、基板上の微小領域で発現してくるレポータータンパク質の活性を高感度に検出するシステムが基板上または基板近傍に配備させることを可能にした。また、固相基板が、ガラス、シリコンまたは高分子樹脂であり、流路が高分子膜成型により作製され、該成型した高分子膜を固相基板上に被せることで作製される固相基板により形質転換または形質導入を可能とした。
【００１８】
すなわち本発明は、あらかじめ固相基板上のマイクロウェルアレイに複数種類のＤＮＡベクターを固定化しておき、微小流路を用いて微生物細胞−コラーゲン懸濁液または哺乳動物細胞−コラーゲン懸濁液を基板上のマイクロウェルに導入し、微小流路の物理的障壁で隔絶された各々のマイクロウェル内にてＤＮＡベクターを細胞（微生物や哺乳動物細胞を含む。以下同じ）内部に効率的に取り込ませ、固相基板上の微小流路の物理的障壁により異なるＤＮＡベクターを取り込んだ細胞同士が各々のマイクロウェル内で混在することを防ぎ、引続き同一固相基板および固相基板上のマイクロウェルを選択培地に接触させながら細胞を選択培養することにより、各々のマイクロウェル内にて目的遺伝子発現誘導を促し、各々のマイクロウェル内にて細胞の形質転換（トランスフォーメーション）または形質導入（トランスフェクションまたはインフェクション）を行う方法（請求項１）、請求項１記載の方法で同一基板上にて形質転換または形質導入により発現したレポータータンパク質の活性を各々のマイクロウェルごとに検出する方法（請求項２）に関する。
【００１９】
また本発明は、取り込まれるＤＮＡベクターがプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡまたはウィルスである請求項１〜２記載の形質転換方法または形質導入方法（請求項３）、取り込まれるＤＮＡベクターがプラスミドＤＮＡで微生物細胞-コラーゲン懸濁液が大腸菌-コラーゲン懸濁液または酵母−コラーゲン懸濁液である請求項１〜２記載の形質転換方法（請求項４）、マイクロウェルの体積が１〜５０nL（ナノリットル）である請求項１〜４記載の形質転換方法または形質導入方法（請求項５）、マイクロウェルの細孔サイズが５〜１０００μｍである請求項１〜５記載の形質転換方法または形質導入方法（請求項６）、マイクロウェルの形態が逆ピラミッド型である請求項１〜６記載の形質転換方法または形質導入方法（請求項７）、固相基板が、ガラス、シリコンまたは高分子樹脂である請求項１〜７記載の形質転換方法または形質導入方法（請求項８）、微小流路が、高分子膜に流路を成型し、該成型した高分子膜を固相基板上に被せることで作製される請求項１〜８記載の形質転換方法または形質導入方法（請求項９）、高分子膜が天然または合成ゴム、または高分子樹脂である請求項９記載の形質転換方法または形質導入方法（請求項１０）、高分子樹脂がポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）である請求項１０記載の形質転換方法または形質導入方法（請求項１１）に関する。
【００２０】
さらに本発明は、固相基板上でレポータータンパク質の発現を電気化学的または呈色・発光・蛍光により検出する請求項１〜１１記載の検出方法（請求項１２）、請求項１２記載の検出方法電気化学的検出方法が電極集積型固相基板を使用する検出方法（請求項１３）、電極が細胞を固定化する固相基板片側面に配置された請求項１２〜１３記載の電極集積型固相基板（請求項１４）、電極がマイクロウェルの細孔部分の端に配置され、かつ電極幅５〜１００μmでデザインされた請求項１２〜１４記載の電極集積型固相基板（請求項１５）に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、固相基板上での大腸菌をはじめとする微生物の形質転換方法（オンチップ・トランスフォーメーション法）を提供する。プラスミドを乾燥固定化した微細孔アレイチップを用い、流路を用いた大腸菌のプラスミドへの曝露、遺伝子導入、固定化を連続的に行うことで形質転換大腸菌のアレイを形成した。流路構造および三次元的マイクロウェル内で遺伝子導入を実現することにより、形質転換効率の向上が期待されると共に、物理的障壁により非目的ＤＮＡの混入、クロストークを防止することが可能となる。電気化学的計測、および蛍光計測による表現型評価から２種類の固定化プラスミドによる形質転換を確認した。本発明は大腸菌のみならず、浮遊性細胞、遊走性細胞、および接着性細胞など様々な細胞のオンチップ・遺伝子導入を可能にすると期待できる。本発明は、大腸菌全ゲノムスケールで遺伝子機能を解明するための基盤技術として期待できる。また大腸菌を宿主としたチップ上での多種組換えタンパク質発現系の構築、およびスクリーニングが可能になる。
【００２２】
本発明は、通常の大腸菌形質転換方法と較べ、本手法は操作に必要な細胞、培地、試薬、ＤＮＡは大幅に減ずることが期待できる。同一デバイス上で種類の異なる遺伝子の導入、形質転換が可能となる。酵母細胞や哺乳動物細胞の形質導入（トランスフェクション）やウィルス感染（インフェクション）も可能となる。チップ上で大腸菌が形質転換されていることを確認するために、比色法、蛍光観察、および電気化学的手法によりレポーター遺伝子の発現を検出する。また本発明は、遺伝子発現の時間的変化の評価、各遺伝子に由来する表現型の解析、そして遺伝子産物の細胞内局在など、ＤＮＡマイクロアレイでは困難あるいは不可能であった情報に関して細胞レベルで網羅的に解析することを可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
コンピテントセルとプラスミド調製について説明する。大腸菌JM109コンピテントセルはNIPPON GENEより購入した。プラスミドは、クローニングベクターpUC19(NIPPON GENE)、およびpUC19上のlacZ配列内に green fluorescent protein (GFP)をコードする遺伝子配列を組み込んだベクターpUC-GFPの2種類を用いた。pUC-GFPは、PCRによりGFP発現ベクターpQBI T7 GFP(NIPPON GENE)から増幅したgfp遺伝子断片を、pUC19上のEcoRI−HindIII制限酵素部位間に挿入することで作製した。gfp遺伝子はlacプロモーター下流に位置するためIPTGによる転写制御を受ける。
【００２５】
オンチップ・トランスフォーメーションの手順について説明する。図１にオンチップ・トランスフォーメーションの概略図を示す。基板には、異方性エッチングにより作製した貫通型微細孔アレイ(微細孔大：400×400μm2、微細孔小：100×100μm2、深さ230μm、微細孔間隔：800μm)を有する単結晶シリコン基板を用いた。微細孔小側に平板PDMSシートを貼り付け貫通型微細孔をマイクロウエル状にした後、0.2μlのプラスミド溶液（10 ng/μl  pUC19、30ng/μl  pUC-GFP）を微細孔大側から滴下し完全に乾燥させた。SU-8を鋳型として作製した微小流路を有するPDMSシートを、微細孔大側のアレイを通過するように貼り付けた。微小流路は平行した4つのレーン（幅500μm）から構成されている。各レーン両端にインレット、アウトレットを作製し、インレットに満たした溶液はアウトレットからシリンジで吸引することで流路内に導入される。コラーゲンタイプＩ溶液（新田ゼラチン）、10倍濃縮10.0 mM  Tris-HCl(pH7.0)、10倍濃縮85.0 mM  CaCl2水溶液、大腸菌JM109コンピテントセル（菌数）=８：１：１：２の混合溶液を流路内に導入するとこで乾燥固定されているプラスミドに大腸菌を曝露し、4℃で1hr静置した。4℃ではコラーゲンがゲル化せず溶液状態であるため、プラスミドの大腸菌への十分な拡散が促される。その後、42℃で90 secヒートショックを加えることで大腸菌によるプラスミドの取り込みを促進した。42℃ではコラーゲンのゲル化が進行し、プラスミドを取り込んだ大腸菌は、同時に微細孔内に固定化される。微細孔小側の平板PDMSシートを剥がしてSOC培地（2%  Tryptone、0.5% yeast  extract、10 mM  NaCl、2.5 mM  KCl、10mM  MgCl2、10mM  MgSO4、20mM  glucose、インビトロジェン）を滴下し、大腸菌を培地に接触させた状態で37 ℃で1時間インキュベートすることでアンピシリン耐性遺伝子の発現を促した。SOC培地を1.0  mM  Isopropyl−β−D−thiogalactopyranoside (IPTG、シグマ)、50μg/mlアンピシリンを含む液体培地（5.0g/L  肉エキス、15.0g/Lペプトン、5.0g/L  NaCl、5.0g/L  K2HPO4、pH7.0）に置換し、37℃で培養することでβ−Gal、およびGFPの発現を促した。以上の操作は一般的な塩化カルシウム法による形質転換手順とほぼ同様であるが、流路系と組み合わせることで一度に多数のサンプルを調製でき、また形質転換大腸菌はチップ上に固定化されているのでそのまま基板上でのアッセイが可能となる。
【実施例２】
【００２６】
形質転換体の検出方法について説明する。図２にオンチップ・トランスフォーメーションにより基板上にてpUC19を導入し形質転換した大腸菌の光学顕微鏡写真を示す。X−Gal（5−Bromo−4−chloro−3−indoyl β−D−galactopyronoside）を呈色基質として用いることにより、形質転換された大腸菌はβ−Gal活性を有し青色に呈色している。従って、基板上にてpUC19が大腸菌に取り込まれ、均一に形質転換している様子が確認できた。ここでは、基板をSOC培地にてインキュベートした後、1mg/ml  X−Gal、1.0%  dimethyl  sulfoxide、1.0 mM  IPTG、50μg/ml  Ampを含む培地中にて37℃16時間インキュベートした。
【００２７】
形質転換体の検出は、pUC19から発現するβ−Gal活性の電気化学計測、およびpUC−GFPから発現するGFPの蛍光計測によっても確認することができる。β−Gal活性は、基質p−aminophenyl β−D−galactopyranoside (PAPG、シグマ)の加水分解により生成する p−aminophenol (PAP)を電極上で酸化することで計測した。SECMプローブには電極半径10 μmのPtマイクロ電極を用いた。電極電位はPAPが十分酸化される0.3V vs.  Ag/AgClに設定し、電極を微生物アレイチップ上で（電極−基板間距離=150μm）二次元走査することでPAP濃度プロファイルのイメージングを行った。電極の走査速度は49.0μm/sに設定し、2000μm×600μmの範囲のイメージングを行った。所要時間は約30minであった。
【００２８】
図３にオンチップ・トランスフォーメーション後の微生物アレイチップの光学顕微鏡写真、および蛍光写真を示す。また図３にアレイチップ上の２スポットの拡大写真(Ａ)、蛍光イメージ(Ｂ)、およびβ-Gal活性のＳＥＣＭイメージを示す（Ｃ）。左スポットがpUC-GFP(lacZ欠損)、右スポットがpUC19 (lacZ未欠損)による形質転換体である。pUC19形質転換体ではGFPが発現しておらず、β-Galの応答が観測された。一方、pUC-GFP形質転換体ではGFP遺伝子の挿入によるβ-Gal活性の消失が確認できた。固定化したプラスミドが有する表現型を検出できたことから、チップ上に配列された大腸菌に異なるプラスミドを導入することが可能であることが示された。このように基板上にパターンされているプラスミドの種類が既知であるため、遺伝子とその表現型との関係を直結することができる。
【００２９】
チップ上に固定化した大腸菌に対する形質転換された大腸菌の割合を考察する。pUC19を用いた場合は再現性よく形質転換され、効率は約80%と非常に高かった。しかしpUC-GFPを用いた場合は非常に低く、10%未満の大腸菌のみからGFP由来の蛍光が観測された。形質転換手順は全く同様であるのに形質転換効率に大きな差異が生じたことから、形質転換効率はプラスミドに依存していると考えられる。pUC19とpUC-GFPは、塩基長（700 bp）、および構造（スーパーコイルかopen circular）に相違がある。
【実施例３】
【００３０】
電極集積型固相基板の作製換体の検出方法について説明する。実施例２では、電気化学的検出方法として走査型電気化学顕微鏡（SECM）を適用した。SECMでは、プローブであるマイクロ電極を走査する工程が必要となる。これにより電気化学応答がある領域とない領域を比較することが可能となり、応答を画像として得ることも可能となる。一方、基板のマイクロウェル近傍に微小電極を配置し、電極走査など煩雑な工程なしに、電気化学検出を実現することも可能である。細胞の固定化基板には厚さ400μmのシリコンウェハを用い、異方性エッチングにより逆ピラミッド型の微細溝(体積≒350nL)を作製した。逆ピラミッド型溝における細孔サイズの大きな側(1200μm)を細胞―コラーゲン混合液の注入口、小さい側(600μm)を検出口とし、検出口の周りにはPt電極をスパッタリングにより配列した。電極の絶縁はポリイミドを用いて行った。シリコン基板上への流路の作製にはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用い、CO2レーザーにより流路を作製、シリコン基板上に被せることで作製した。
【００３１】
図４に電極を集積化したデバイスの顕微鏡写真を示す。チップ上には4個の微細溝が配置されており、その周囲には50μm幅のPt電極が配列されている。この電極集積化デバイスを用いることにより、電極のうち１本を対照実験として用いることが可能となる。実際にこの電極を用いて4.0 mM K4Fe(CN)6のサイクリックボルタンメトリー(CV)を行った場合、マイクロ電極に特徴的なシグモイダルな形状が得られた。電極電位を0.3 V vs. Ag/AgClに設定し、細胞や微生物由来のβ-Gal活性を検出可能であることを確認した。電極集積化デバイスを用いることにより、形質転換と細胞活性リアルタイムモニタリングの両方を基板上にて行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】固相基板上における大腸菌の形質転換（オンチップ・トランスフォーメーション）方法の原理図。
【図２】形質転換後のチップの光学顕微鏡写真。大腸菌が形質転換していることを青色呈色により確認できる。
【図３】固相基板上における大腸菌の形質転換の結果（光学顕微鏡写真（A）、蛍光顕微鏡写真（B）、SECMイメージ（C））。オンチップ・トランスフォーメーションにより種類の異なるプラスミドベクターを同一基板上にて形質転換可能であることが確認できた。左側のマイクロウェルではpUC-GFPが、右側のマイクロウェルではpUC19が大腸菌に導入されている。
【図４】電極集積化型デバイスの概略図（a）と写真（b, c）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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