(57)【要約】【課題】  リグノセルロース材料を酵素処理して得られる糖化物の残渣から酵素を回収する方法を提供する。【解決手段】  リグノセルロース材料を酵素処理して得られる糖化物の残渣に通電処理して酵素を回収する。酵素はセルラーゼ、ヘミセルラーゼの単独又は混合物であり、特に残渣中のリグノセルロースに吸着した酵素を効率よく回収することが出来る。リグノセルロース材料は林地残材、建築廃材、ソーダスト、剪定廃棄物などの工業廃棄物、ケナフ、稲藁、麦わら、バガスなどの農産廃棄物のいずれか、若しくは古紙、木材チップである。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース材料を酵素処理して得られる糖化物の残渣に通電処理することを特徴とする酵素回収方法。
【請求項２】
前記酵素がセルラーゼ、ヘミセルラーゼの単独又は混合物であることを特徴とする請求項１に記載の酵素回収方法。
【請求項３】
前記リグノセルロース材料が林地残材、建築廃材、ソーダスト、剪定廃棄物などの工業廃棄物、ケナフ、稲藁、麦わら、バガスなどの農産廃棄物のいずれか若しくは古紙あるいは木材チップであることを特徴とする請求項１または２に記載の酵素回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリグノセルロース材料を酵素処理して得られる糖化物の残渣から酵素を回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１８世紀の産業革命以降、人類は大量の化石燃料を消費してきた。これによって排出された二酸化炭素は温室効果ガスとなり、地球温暖化などの環境破壊の原因となっている。
一方、近年、ブラジル、ロシア、インド、中国などの急速な工業発展に伴う原油消費量の増大が世界的な原油価格の高騰を引き起こしている。その結果、従来、原油にエネルギーのほとんどを依存していた既存工業国では経済成長に深刻な影響が出始めている。これら環境保全やエネルギー保障の観点から、原油等の化石燃料に代わる環境に優しく、安価な代替エネルギーへの転換が試みられている。その中でバイオマスエネルギーに大きな関心が寄せられている。バイオマスエネルギーの原料は大気中の二酸化炭素を固定することにより成長した植物体であるため、消費時に新たな二酸化炭素を大気中に排出しない環境に優しい持続可能なエネルギーである。また、化石燃料の乏しい我が国にとって有望なエネルギー源と考えられている。
【０００３】
バイオマスから燃料用エネルギー又は化成品原料を得る方法として、リグノセルロース材料を酸加水分解または酵素糖化した後、得られた糖を発酵する方法がある。その中で酵素糖化法は古紙、木材チップ、林地残材、建築廃材、剪定廃棄物、ソーダスト、ケナフ、稲藁、麦わら、バガスなどの安価なリグノセルロース材料に含まれるセルロースにセルラーゼ、ヘミセルラーゼなどの酵素を作用させ、糖を得る方法である。さらに、糖化と並行して微生物のアルコール発酵により燃料用アルコール又はコハク酸、乳酸等の化成品原料の製造を行う糖化同時発酵法などがある。
【０００４】
酵素糖化において、爆砕処理、アルカリ抽出、化学パルプ製造法であるアルカリ蒸解法などによりリグニンを除去していないリグノセルロース材料は、リグニンを除去したリグノセルロース材料と比べ、酵素によって消化されにくく、糖化されずに樹脂、金属などの不純物と一緒に糖化液中に残渣として残る。一般に、この残渣はスクリーン、遠心分離等により分離し、廃棄される。しかし、この残渣には糖化におけるコストの中で大きな比重を占めている酵素が多量に含まれているため、残渣を廃棄してしまうと同時に高価な酵素も廃棄してしまうという問題があった。
【０００５】
残渣中に含まれる酵素の回収手段として、残渣の洗浄が考えられる。しかし、酵素は、その分子内に存在するセルロースと特異的に吸着するセルロースバインディングドメイン等によりセルロースと強固に結合している為、単なる水洗浄ではセルロースに吸着した酵素を十分に回収することは困難であった。回収率の改善を目的として界面活性剤の添加（特許文献１参照）などが提案されている。しかし、界面活性剤処理法でも酵素の回収率は十分でなく、薬品添加による酵素の失活、コストアップ及び後の発酵段階において微生物への悪影響などの問題があった。
また、糖液からの酵素の回収法としては限外濾過を用いた方法（特許文献２参照）、糖液に再度セルロースを添加し酵素を吸着回収する方法（特許文献３参照）などがある。しかし、限外濾過法は微少な不純物がろ過膜につまり十分な処理速度および酵素回収率が得られない問題があった。また、セルロース添加による回収法は十分な酵素回収が困難であった。
また、通電処理を特徴とするものには発酵によって得られた生成物を電気透析により発酵液から除去する方法、基質の前処理として通電を行う方法がある。（特許文献４及び５参照）しかし、これらは発酵効率を向上させることを目的としたもので、蛋白質の回収を目的としたものではない。蛋白質を回収する装置としてはバイオ・ラッドラボラトリーズ社などから生化学研究用の分取用蛋白質泳動装置が上市されている（非特許文献１参照）。しかし、これらの装置はアクリルアミドゲル及びアガロースゲル中の蛋白質の回収を目的としたものであり、リグノセルロース材料を糖化して得られた糖液およびその残渣、特にセルロースに吸着したセルラーゼを主成分とした酵素を回収するものではない。
【０００６】
【特許文献１】特許昭６３−８７９９４号公報
【特許文献２】特許昭６１−２３４７９０号公報
【特許文献３】特開昭５５−１４４８８５号公報
【特許文献４】特公平７−１０２２８号公報
【特許文献５】特開２００５−５８０５５号公報
【非特許文献１】2006/2007バイオ・ラッドラボラトリーズ社  ライフサイエンス事業本部総合カタログｐ166
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、リグノセルロース材料に酵素を作用させ得られた糖化物の残渣から酵素を効率よく回収する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは前記課題を解決する為、鋭意研究した結果、糖化物の残渣に通電することにより、酵素が回収できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は以下の構成を採用する。即ち、本発明の第１は、「リグノセルロース材料を酵素処理して得られる糖化物の残渣に通電処理することを特徴とする酵素回収方法」である。
【０００９】
本発明の第２は、前記第１発明において、前記酵素が、「セルラーゼ、ヘミセルラーゼの単独又は混合物であること」を特徴とする酵素回収方法である。
【００１０】
本発明の第３は、前記第１または第２の発明において、前記リグノセルロース材料が「林地残材、建築廃材、ソーダスト、剪定廃棄物などの工業廃棄物、ケナフ、稲藁、麦わら、バガスなどの農産廃棄物のいずれか若しくは古紙あるいは木材チップであること」を特徴とする酵素回収方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、リグノセルロース材料を酵素処理して得られる糖化物の残渣から酵素を回収する方法が提供される。特に残渣中のリグノセルロースに吸着したセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを効率よく回収することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明で原料とするリグノセルロース材料としては、林地残材、建築廃材、ソーダスト、剪定廃棄物などの工業廃棄物、ケナフ、稲藁、麦わら、バガスなどの農産廃棄物等が挙げられ、更には、古紙あるいは木材チップなども挙げられる。
また、本発明の効果は、リグニンを一定量含有するリグノセルロース材料に対して効果を発揮するものである。従って、古紙の中でも、製本断裁古紙などよりも、種々雑多な古紙が混ざっている、雑古紙、禁忌品古紙などが適している。更に、経済的理由や発生場所から考えて化学処理を行いにくい前記農産廃棄物、工業廃棄物などが適しており、いずれの場合でも全固形分中にリグニンが５質量％以上存在する場合、特に１０質量％以上存在する場合に有効である。
【００１３】
糖化に用いる酵素の種類についてはセルロース、ヘミセルロースを分解できるものであれば特にその起源は限定されるものではない。例えばトリコデルマ（Trichoderma）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、フミコーラ（Humicola）属、イルペックス（Irpex）属などに属する微生物およびこれらの酵素をコードする遺伝子を含む組換え体によって生産されるセルラーゼを主体とする酵素を、単独もしくは組み合わせて用いることができる。好ましくはプロテアーゼを含まないもの、酵素の安定性を高めるためのメイクアップがなされているものを使用する。また、必要に応じてヘミセルロースを分解する酵素、特に広葉樹のパルプに含まれるキシランを分解する酵素、キシラナーゼ、針葉樹に含まれるマンナンやガラクタンを分解する酵素を追加することができる。一般にバイオマスの糖化用に上市されている酵素は、これらの酵素も含むので好適である。
【００１４】
糖化反応槽でのリグノセルロース濃度は30％以下が好ましいが、糖化後、リグノセルロースが液化し、糖が回収されればよく、２０％以下が最適である。酵素の使用量は、基質となるリグノセルロースを所望の時間に１５％以上、好ましくは６０％以上分解できる量がよい。
【００１５】
糖化反応終了後、フィルターまたは遠心分離により上清と残渣を分離し、残渣を水に分散させて通電処理に供する。あるいは、残渣を洗浄し濾過して洗浄水中に溶解する酵素を回収した後の残渣を通電処理に供しても良い。また、必要に応じて、陽極と陰極の間に陽イオン交換膜及び陰イオン交換膜を配置して、酵素を濃縮することができる。陽イオン交換膜及び陰イオン交換膜は公知のものが何ら制限されず用い得る。
通電処理に供する液には必要に応じて電解質を添加しても良い。電解物質としては例えばトリス、グリシン、β-アラニンなどのアミノ酸、イミダゾール、ほう酸など有機酸、塩化ナトリウム等の塩、酢酸、硫酸、塩酸等の酸、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等のアルカリが挙げられるが、通電条件、回収する酵素の性質により適当なものを単独もしくは組み合わせて使用することができる。電解質の濃度は１Ｍ以下、好ましくは０．５Ｍ以下がよい。通電処理は定電圧、定電流、定電力のいずれの設定でもよく、ショートや発熱により酵素が失活しない範囲で自由に電圧値、電流値、電力値を設定することができる。両電極間の電位差は直流電圧で２００Ｖ/ｃｍ以下、好ましくは２０Ｖ/ｃｍ以下がよい。ｐＨ、温度は酵素の性質にもよるが、失活しない範囲であればよいが、好ましくはｐＨ３から９、温度６０℃以下がよい。通電処理の時間は、大体１〜２４時間程度である。
【００１６】
通電処理の装置としては、図１に模式図を示すような、１室型のもので、残渣のほぼ全てが電極間に位置するように配置する。電極の材質は、陽極には白金、炭素、銅、陰極には白金、鉄、ステンレスなどが使用できる。必要に応じて攪拌装置を設けて一定時間間隔で攪拌しても良い。
通電処理が終了したら遠心分離、濾過法等により、電極液と残渣に分離し、電極液をそのまま回収し、酵素液として使用してもよく、電極液から酵素を塩析、限外濾過、イオン交換樹脂などを用いて濃縮してから使用してもよい。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明について実施例により詳説する。本発明はこれにより限定されるものではない。
【００１８】
＜実施例１＞
リグンニンを除去していない機械パルプ５ｇにセルラーゼＧＣ２２０（Genencor製）1ｇおよびイオン交換水を加え、１００ｇとし、硫酸にてｐＨを４．５に調製した。本反応組成物を５０℃にて１２時間反応させた。反応終了後、上清と未糖化のパルプ繊維を回収した。
パルプ繊維をイオン交換水にて洗浄し、パルプ繊維に吸着していない酵素を分離し回収した。洗浄したパルプ繊維を電極液（２５ｍＭ  トリス、１９２ｍＭ  グリシン）に、パルプ濃度５質量％となるように懸濁後、図１の装置に移し通電処理に供した。電極は白金線を使用し、電極間距離は１２ｃｍとした。
同電極液中にて、電位差１０Ｖ／ｃｍで８時間通電処理した。通電処理後、上記上清および通電処理後の電解液中の酵素活性はＣＢＨ活性およびβ-glucosidase活性を測定することにより求めた。
ＣＢＨ活性の測定は1.25 mM  4-Methyl-umberiferyl-cellobiosideを含む125 mM  酢酸緩衝液(pH4.0)  16μlに、酵素液4 μlを加え、50℃、10min反応を行ったのち、500 mM glycine-NaOH緩衝液(pH10.0)100 μlを添加し、反応を停止後、350 nmの励起光での460 nmの蛍光強度を測定することによって行った。
β-glucosidase活性の測定は1.25 mM  4-Methyl-umberiferyl-glucosideを含む酢酸緩衝液(pH4.0)  16μlに、酵素液4 μlを加え、50℃、10 min反応を行ったのち、500 mM glycine-NaOH緩衝液  (pH10.0)  100 μlを添加し、反応を停止後、350 nmの励起光での460 nmの蛍光強度を測定することによって行った。
酵素回収率は下記式（１）により、β-glucosidase酵素回収率は下記式（２）により、それぞれ求め、ＣＢＨ酵素回収率を表１に、β-glucosidase酵素回収率を表２に示した。
（１）ＣＢＨ酵素回収率(%)＝１００×電極液中の全ＣＢＨ活性/（添加した全ＣＢＨ活性-上清中の全ＣＢＨ活性）
（２）β-glucosidase酵素回収率(%)＝１００×電極液中の全β-glucosidase活性/（添加したβ-glucosidase活性-上清中の全β-glucosidase活性）
【００１９】
＜比較例１＞
実施例１において電位差１０Ｖ／ｃｍで通電処理を行う代わりに、全く通電しないで実施例１と同様におこなった。その結果を表１におよび表２に示した。
【００２０】
実施例１及び比較例１より、通電処理によって未分解セルロースに吸着した酵素を電解液中に効率よく回収できることが示された。
【００２１】
＜実施例２＞
リグンニンを除去していない機械パルプの代わりに市販コピー用紙を用いた他は実施例１と同様におこなった。その結果を表１におよび表２に示した。
【００２２】
＜比較例２＞
実施例２において電位差１０Ｖ／ｃｍで通電処理を行う代わりに、全く通電しないで実施例２と同様におこなった。その結果を表１におよび表２に示した。
【００２３】
実施例２及び比較例２より、通電処理によって市販コピー用紙未分解繊維に吸着した酵素を電解液中に効率よく回収できることが示された。
【００２４】
ＣＢＨ酵素回収率
【表１】
2008206484.tif 000003
【００２５】
β-glucosidase酵素回収率
【表２】
2008206484.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の通電処理を行う装置の断面模式図
【符号の説明】
【００２７】
１  通電処理槽
２  懸濁液
３  電極
【図１】
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