(57)【要約】      （修正有）【課題】被検物質の生物学的影響を評価する技術の提供。【解決手段】被検物質に曝露されたホヤにおいて発現量が変化した遺伝子を検出し、独自に作成した分類表および評価表に従って、被検物質の生物学的影響を評価する方法。検出工程が、ホヤの全遺伝子の５０％以上の遺伝子を検出し得るマイクロアレイを用いる、被検物質の生物学的影響を評価する方法。特定の分類表、および特定の評価表を備えている、被検物質の生物学的影響を評価するための評価キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質の生物学的影響を評価する評価方法であって、
被検物質をホヤに曝露させる第１曝露工程；
第１曝露工程により該ホヤにおいて発現量が変化した遺伝子を検出する検出工程；
検出された該遺伝子が、図８〜３１に示される分類表に記載の遺伝子クラスターのうち、どのクラスターに属しているのかを特定する特定工程；および
表１〜５に示される評価表に従って、該被検物質の該ホヤに対する影響を評価する評価工程
を包含していることを特徴とする評価方法。
【請求項２】
上記検出工程が、ホヤの全遺伝子の５０％以上の遺伝子を検出し得るマイクロアレイを用いることを特徴とする請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
上記被検物質を、ホヤの発生胚または幼生に曝露させる第２曝露工程；ならびに
第２曝露工程において上記発生胚に上記被検物質を曝露させたとき、該被検物質が曝露された発生胚からの幼生の発生率、および該被検物質が曝露された発生胚から発生した幼生の変態率のうちの何れかを測定し、上記第２曝露工程において上記幼生に上記被検物質を曝露させたとき幼生の変態率を測定して、評価工程において評価された影響を検証する検証工程
をさらに包含していることを特徴とする請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項４】
被検物質の生物学的影響を評価するための評価キットであって、図８〜３１に示される分類表、および表１〜５に示される評価表を備えていることを特徴とする評価キット。
【請求項５】
ホヤの全遺伝子の５０％以上の遺伝子を検出し得るマイクロアレイをさらに備えていることを特徴とする請求項４に記載の評価キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質の生物学的影響を評価する技術に関するものであり、特に、ホヤの遺伝子発現を指標として被検物質の生物学的影響を評価する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人類は様々な物質を大量に使用している。これらの物質の使用は、地球上の生態系に様々な影響を与えている。特に、海洋に排出された難分解性の化学物質は、海洋における生態系の中で、食物連鎖により上位の生物に濃縮され、その結果として海洋動物において生殖異常、免疫低下、奇形等の深刻な問題が生じることが報告されている。
【０００３】
上記のような地球上の生態系に対する悪影響を軽減させるためには、生物に悪影響を与える物質の使用を抑えることが重要である。そのため、被検物質の生物学的影響を正しく評価する技術が求められている。
【０００４】
従来、農薬および薬物を含む被検物質の生物に対する影響を評価するために、昆虫、植物、哺乳動物等の成体、発生胚、培養細胞等に該被検物質を直接曝露させて、致死性または異常性の有無を調べ、毒性の有無を判断することが一般的に行われていた。
【０００５】
また近年では、いわゆるポストゲノムの解析手法を利用した毒性の研究も行われている。例えば、化学物質を曝露させたマウス等の肝臓において生じる遺伝子発現の変動を、マイクロアレイを用いて解析することがなされている。このような、遺伝子発現の変動に基づく被検物質の生物学的影響の評価法は、評価に要する時間が比較的短時間で済み、表現形として観察することが困難な影響についても評価し得るので好ましい。
【０００６】
ところで、本発明者らは、ホヤの遺伝子を解析するためのマイクロアレイを作製し、生命科学の基礎研究のために用いている。ホヤは、世界各海域において、岩または岸壁等に固着して生息している。また、ホヤは、幼生期に形成された脊索が、変態して成体になると消失することから原索動物に分類され、脊椎動物と無脊椎動物の境界領域の動物として位置づけられている。ホヤと脊椎動物とでは胚発生がよく似ており、ホヤは発生学のモデル生物として研究され、近年ゲノムが解析された（非特許文献１）。
【０００７】
本発明者らの考えによれば、ホヤは、被検物質の生物学的影響の評価のために好適に用いることができる。なぜなら、上述したように、ホヤは脊椎動物と無脊椎動物の境界領域の動物であるため、ホヤを用いることにより、無脊椎動物および脊椎動物に共通した影響についても評価し得ると考えられるからである。したがって、ホヤを用いて被検物質の生物学的影響を解析することにより、動物全般に対する被検物質の生物学的影響を評価し得る。また、上述したように、ホヤは全世界中に生息しているので、世界中で用い得る。さらに、一箇所に固着して生育するので、局所的な汚染等を好適に評価し得る。
【０００８】
本発明者らは、ホヤに有機スズを曝露させ、該ホヤにおける遺伝子の発現量の変化を観察したことを報告している（非特許文献２）。
【非特許文献１】Dehal et al., The draft genome of Ciona intestinalis:Insights into chordate and vertebrate origins, Science, 2002, 270:pp467-470
【非特許文献２】Azumi et al., A cDNA microarray technique applied for analysis of global gene expression profiles in tributyltin-exposed ascidians, Mar Environ Res., 2004 Aug-Dec, 58(2-5):pp543-6
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、非特許文献２に記載の方法では、被検物質の生物学的影響を評価し得なかった。詳しく述べれば、上記方法では、有機スズを曝露されたホヤにおいて発現量が変化した遺伝子を検出し得たが、それらの変動が何を意味しているかは十分には評価し得なかった。なぜならば、ホヤの遺伝子は大半が特徴づけされておらず、特に、成体において機能する遺伝子はほとんど解析されていないため、大多数の遺伝子について、発現量の変化が何を意味しているか評価し得なかったからである。
【００１０】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、ホヤの遺伝子発現を指標として被検物質の生物学的影響を評価するための技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、独自に作成した分類表および評価表を用いることによって、ホヤの遺伝子の発現量の変化に基づいて被検物質の生物学的影響を評価し得ることを見出し、発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明に係る方法は、被検物質の生物学的影響を評価する評価方法であって、被検物質をホヤに曝露させる第１曝露工程；第１曝露工程により該ホヤにおいて発現量が変化した遺伝子を検出する検出工程；検出された該遺伝子が、図８〜３１に示される分類表に記載の遺伝子クラスターのうち、どのクラスターに属しているのかを特定する特定工程；および表１〜５に示される評価表に従って、該被検物質の該ホヤに対する影響を評価する評価工程を包含していることを特徴としている。
【００１３】
上記評価方法では、上記検出工程が、ホヤの全遺伝子の５０％以上の遺伝子を検出し得るマイクロアレイを用いることが好ましい。
【００１４】
上記評価方法では、上記被検物質を、ホヤの発生胚または幼生に曝露させる第２曝露工程；ならびに第２曝露工程において上記発生胚に上記被検物質を曝露させたとき、該被検物質が曝露された発生胚からの幼生の発生率、および該被検物質が曝露された発生胚から発生した幼生の変態率のうちの何れかを測定し、上記第２曝露工程において上記幼生に上記被検物質を曝露させたとき幼生の変態率を測定して、評価工程において評価された影響を検証する検証工程をさらに包含していてもよい。
【００１５】
本発明に係る評価キットは、被検物質の生物学的影響を評価するための評価キットであって、図８〜３１に示される分類表、および表１〜５に示される評価表を備えていることを特徴としている。
【００１６】
上記評価キットでは、ホヤの全遺伝子の５０％以上の遺伝子を検出し得るマイクロアレイをさらに備えていることが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明を用いれば、被検物質に曝露されたホヤの遺伝子発現の変化に基づいて該ホヤに対する被検物質の生物学的影響を評価し得るので、被検物質の生物学的影響を好適に評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
〔１：評価方法〕
本発明は、被検物質の生物学的影響を評価するための評価方法を提供する。本明細書において用いられる場合、用語「生物学的影響」は、特定の事象に起因して生じる生体内の生理学的変化が意図される。したがって「被検物質の生物学的影響」とは、被検物質に起因して生じる生体内の生理学的変化が意図される。用語「生理学的変化」は、生体またはその器官あるいは細胞などの機能の変化が意図され、具体例としては、生殖異常、免疫低下、奇形、各器官の機能低下等があるがこれらに限られない。
【００１９】
また、上述したように、ホヤは無脊椎動物および脊椎動物の性質を有しているので、本発明に係る評価方法を用いて得られる結果は、ホヤだけでなくすべての動物に適用し得る。特に、ホヤと生息環境が類似している海洋無脊椎動物および海洋脊椎動物を含む海洋動物に対しては、上記結果を好適に適用し得る。
【００２０】
本発明に係る評価方法は、被検物質をホヤに曝露させる曝露工程（第１曝露工程）、曝露工程により該ホヤにおいて発現量が変化した遺伝子を検出する検出工程、検出された該遺伝子が、図８〜３１に示される分類表に記載の遺伝子クラスターのどのクラスターに属しているのかを特定する特定工程、および表１〜５に示される評価表に従って、該被検物質の該ホヤに対する影響を評価する評価工程を包含している。
【００２１】
（１−１：第１曝露工程）
被検物質は、生物学的影響を評価すべき物質であれば、単体であっても、化合物であっても、それらの混合物であってもよい。また、化合物は、天然の化合物であっても人工の化合物であってもよい。
【００２２】
ホヤは、カタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）等の全世界に生息しているホヤを用いることが好ましいが、これに限られない。脊索動物門尾索動物亜門ホヤ綱に属する動物であって入手可能なものを用いればよい。具体的な入手方法としては、例えば、京都大学舞鶴水産実験所（舞鶴、京都）等の水産実験所から入手してもよいし、海中に生息している個体を採取してもよい。ホヤは、海中において飼育してもよいし、飼育槽中において飼育してもよい。当業者であればホヤを容易に入手し、飼育し得る。被検物質をホヤに曝露するとき、該ホヤは成体であることが好ましく、受精後１ヵ月から５ヵ月の成体であることがより好ましく、受精後２ヶ月から４ヶ月の成体であることがさらに好ましいがこれに限られない。卵、胚、幼生または幼若体を用いてもよい。
【００２３】
本明細書において用いられる場合、用語「曝露」は、特定物質を別物質と接触させることが意図され、「被検物質をホヤに曝露させる」とは、被検物質をホヤに接触させることが意図される。第１曝露工程では、被検物質をホヤに曝露するために様々な手法を用い得る。例えば、被検物質の水溶液または分散液の中でホヤを飼育してもよい。この手法は、海水中に溶解した汚染物質がホヤに影響を与える場合に状況が類似していると考えられるので好ましい。このように「曝露」は、ホヤの体表面に被検物質を接触させる態様が好ましいが、ホヤの体腔内に注射針を用いて直接被検物質を投与する態様であってもよい。さらに、その他の手法であっても、被検物質をホヤに接触させ、ホヤが影響を受け得る状態にする手法であれば曝露に用いることができる。
【００２４】
また、第１曝露工程において用いる被検物質の水溶液の濃度等を適宜調整することにより、被検物質の生物学的影響を定量的に評価することも可能である。
【００２５】
（１−２：検出工程）
本明細書において用いられる場合、用語「遺伝子の発現量」は、遺伝子がコードするタンパク質の合成量が意図される。また、遺伝子がコードするタンパク質の合成量は、該遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写量と相関することから、ｍＲＮＡ量を測定することによって遺伝子の発現量を測定し得ることを当業者は容易に理解する。
【００２６】
一実施形態において、検出工程では、被検物質を曝露させたホヤの各遺伝子の第１の発現量と、被検物質を曝露させていないホヤの各遺伝子の第２の発現量とを比較する。第１の発現量と第２の発現量とが異なる遺伝子を検出することによって、第１曝露工程によりホヤにおいて発現量が変化した遺伝子を検出することができる。
【００２７】
例えば、ＡＧＰＣ法等の周知慣用技術を用いて、被検物質を曝露させたホヤから第１の総ＲＮＡを調製し、被検物質を曝露させていないホヤから第２の総ＲＮＡを調製する。総ＲＮＡの調製は、被検物質のホヤに対する影響が十分に現れた時点において行われることが好ましく、該被検物質をホヤに曝露させてから数時間から数日を経てから総ＲＮＡを調製することが好ましい。次に、第１の総ＲＮＡから、赤色蛍光色素（Ｃｙ５）により標識されたｃＲＮＡプローブ（ｃＤＮＡプローブであってもよい）を調製し、第２の総ＲＮＡから緑色蛍光色素（Ｃｙ３）により標識されたｃＲＮＡプローブ（ｃＤＮＡプローブであってもよい）を調製する。その後、各プローブを、後述するようなホヤの遺伝子を検出するためのマイクロアレイに共にアプライする。一晩ハイブリダイゼーションを行ったのちマイクロアレイを洗浄して未反応のプローブを除去し、乾燥させる。専用の蛍光スキャナーを用いて上記マイクロアレイの各スポットに結合している赤色および緑色の蛍光色素量を測定し、数値化する。このとき、被検物質を曝露しても発現量が変動しない遺伝子のスポットは、赤色および緑色の蛍光色素量がほぼ同量となる（スポットは黄色）。また、被検物質の暴露によって発現量が亢進した遺伝子のスポットは、赤色の蛍光色素量が緑色に比べて多くなる（スポットは赤色）。さらに、被検物質の曝露によって発現量が低減した遺伝子のスポットは、緑色の蛍光色素量が赤色に比べて多くなる（スポットは緑色）。以上にように、被検物質が曝露されたことにより、発現量が変化した遺伝子を検出することができる。なお、上記ｃＲＮＡプローブまたはｃＤＮＡプローブの標識に用いる標識は赤色蛍光色素および緑色蛍光色素に限られず、スキャナーを用いて量を測定し得る標識であればよい。
【００２８】
ホヤの遺伝子を検出するためのマイクロアレイは、ホヤに対する被検物質の生物学的影響を網羅的に評価するため、ホヤの全遺伝子の５０％以上の遺伝子を検出し得ればよく、５５％以上の遺伝子を検出し得ることが好ましく、６０％以上の遺伝子を検出し得ることがより好ましく、６５％以上の遺伝子を検出し得ることがさらに好ましい。
【００２９】
上記のようなマイクロアレイは、図８〜３１に記載のホヤの遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を参照すれば容易に設計し得ることを当業者は容易に理解する。また、本発明者らは、図８〜３１に記載のホヤの遺伝子を搭載したカスタムメイドオリゴＤＮＡマイクロアレイ（Ｃ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ  Ｏｌｉｇｏａｒｒａｙ  ｖｅｒ．１，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を作製しており、当業者は本発明者らから上記マイクロアレイを取得することができる。上記カスタムメイドオリゴＤＮＡマイクロアレイは、ホヤの全遺伝子の６７％の遺伝子を検出し得る。
【００３０】
（１−３：特定工程）
本明細書において用いられる場合において、用語「遺伝子クラスター」は、特定の基準に基づいて分類された遺伝子の集合が意図される。用語「分類表」は、特定の基準に基づいて分類された事項が示されている表が意図される。
【００３１】
図８〜３１に示される分類表には、実施例において後述する基準に基づいて４９の遺伝子クラスター（クラスターａ１〜ａ１０、クラスターｂ１〜ｂ１６、クラスターｃ１〜ｃ１２、クラスターｄおよびクラスターｅ１〜ｅ１２）に分類された遺伝子の、ＥＳＴクローンのアクセッション番号が示されている。上記アクセッション番号を参照すれば、上記各遺伝子クラスターに属する遺伝子を当業者は容易に認識し得る。上記分類表では、遺伝子が遺伝子クラスターごとに分類されて示されているので、該分類表を参照することにより、検出工程において検出された遺伝子が属する遺伝子クラスターを容易に特定することができる。
【００３２】
なお、特定工程および検出工程は同時に行い得る。例えば、検出工程においてマイクロアレイを用いる場合、上記分類表に従って、該マイクロアレイの各スポットに対し遺伝子クラスターを予め対応付けする。これにより、検出工程において、上記マイクロアレイ上に、発現が亢進または低減したことを示すスポットを検出したとき、該スポットに対応付けられたクラスターを、検出工程において検出された遺伝子が属するクラスターとして特定することができる。
【００３３】
（１−４：評価工程）
本明細書において用いられる場合において、用語「評価表」は、特定の事項を評価するために用い得る表が意図される。表１〜５に示される評価表には、上記各遺伝子クラスターそれぞれの（Ａ）発現パターンの特徴、（Ｂ）クラスターに含まれる遺伝子の特徴、および（Ｃ）クラスターに含まれる重要な遺伝子が示されており、被検物質の生物学的影響を評価するために用い得る。
【００３４】
【表１】
2008263965.tif 000002
【００３５】
【表２】
2008263965.tif 000003
【００３６】
【表３】
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【００３７】
【表４】
2008263965.tif 000005
【００３８】
【表５】
2008263965.tif 000006
【００３９】
評価工程では、上記評価表を参照することによって、特定工程において特定された遺伝子クラスターについての情報を得、該情報に基づいて被検物質のホヤに対する影響を評価する。例えば、上記遺伝子クラスターが、特定の機能に関与する遺伝子を多く含むクラスターであった場合、被検物質はホヤの該機能を阻害し得ると評価し得る。また、上記遺伝子クラスターが、ホヤの発生における特定の段階において発現される遺伝子からなるクラスターであった場合、被検物質は、ホヤの該段階での発生を阻害し得ると評価し得る。さらに、上記遺伝子クラスターが、ホヤの特定の器官において発現される遺伝子を多く含むクラスターであった場合、被検物質は、ホヤの該器官の機能を阻害し得ると評価し得る。以上のように、特定工程において特定された遺伝子クラスターが、特定の機能等に関与する遺伝子を多く含む場合、被検物質について、ホヤにおいて該機能等を阻害する可能性があると評価し得る。これは、以下に示す本発明者らの知見に基づく。
【００４０】
検出工程において検出された遺伝子は、第１曝露工程によって発現量が変動した遺伝子である。上記遺伝子の発現が亢進したにせよ、低減したにせよ、恒常性の観点からすれば、被検物質は、ホヤにおいて該遺伝子の関与する機能を阻害する可能性があると考えられる。特に、上記遺伝子の発現が亢進した場合、癌化により上記機能が異常となっている可能性があると考えられる。
【００４１】
また、上記遺伝子クラスターは、実施例において後述するように、発現パターンが類似している遺伝子の集合である（図１参照）。なお、本明細書において用いられる場合において、用語「発現パターン」とは、遺伝子の発現量の一生を通じた推移の態様が意図される。すなわち、「発現パターン」とは、卵、胚、幼生、幼若体、および成体の各段階において、遺伝子の発現量がどのように変化しているのかが意図される。発現パターンが類似している遺伝子群は、何らかの相互作用を行っていると考えられる。したがって、上記遺伝子クラスターに含まれる遺伝子は、同一の機能に関与している可能性が高い。特に、上記遺伝子クラスターに同一の機能に関与する遺伝子が多く含まれている場合、該クラスターに属する他の遺伝子も同じ機能に関与している可能性が非常に高いと考えられる。
【００４２】
ここで、上記クラスターには、検出工程において検出された遺伝子が含まれる。上記遺伝子クラスターが特定の機能に関与する遺伝子を多く含んでいる場合、上記検出された遺伝子も該機能に関与していると推定される。これにより、被検物質について、ホヤにおいて上記機能を阻害する可能性があると評価することができる。
【００４３】
評価工程ではまた、特定工程において特定された遺伝子クラスターのうち、検出工程において検出された遺伝子が多数含まれているクラスターについての情報を重視して、被検物質の生物学的影響の評価を行うことが好ましい。すなわち、同一遺伝子クラスターに含まれ、同じ機能に関与すると推定される複数の遺伝子の発現量が変化した場合、該機能は大きく阻害され得ると評価することができる。
【００４４】
（１−５）第２曝露工程および検証工程
本発明に係る評価方法は、上記評価工程において得られた、被検物質の生物学的影響の評価を、検証するための工程をさらに包含していてもよい。
【００４５】
すなわち、一実施形態において、本発明に係る評価方法は、上記被検物質をホヤの発生胚または幼生に曝露させる第２曝露工程；ならびに第２曝露工程において上記発生胚に上記被検物質を曝露させたとき、該被検物質が曝露された発生胚からの幼生の発生率、および該被検物質が曝露された発生胚から発生した幼生の変態率のうちの何れかを測定し、上記第２曝露工程において上記幼生に上記被検物質を曝露させたとき幼生の変態率を測定して、評価工程において評価された影響を検証する検証工程を包含している。
【００４６】
上記の構成によれば、本発明に係る評価工程において得られた、被検物質の生物学的影響のうち、特に重要である発生および変態に関する影響について、実際に影響評価を検証することができる。したがって、より信頼性の高い、被検物質の生物学的影響の評価を得ることができる。
【００４７】
第２曝露工程において用いるホヤは、第１曝露工程において用いるホヤと同様の手段によって取得することができる。ホヤの発生胚および幼生は、ホヤを取得した後、周知慣用技術に基づいて適宜飼育することにより容易に取得することができる。上記被検物質をホヤに曝露させる方法は、第１曝露工程と同様に行うことができる。
【００４８】
第２曝露工程において上記被検物質が曝露された発生胚からの幼生の発生率の測定は、第２曝露工程の後、該発生胚を定法を用いて飼育して、発生した幼生の数を目視等により測定することにより行うことができる。飼育期間は、受精後２０〜２４時間であることが好ましく、２１時間程度であることがより好ましいが、特に限定されない。コントロールとしては、例えば、上記被検物質を曝露していない発生胚を用いればよい。以上により、上記被検物質の発生に対する影響を検証することができる。
【００４９】
また、第２曝露工程において上記被検物質が曝露された発生胚から発生した幼生の変態率の測定は、第２曝露工程の後、該発生胚を定法を用いて飼育して、発生し、変態した幼生の数を目視等により測定することにより行うことができる。飼育期間は、受精後２〜４日間（ふ化後１〜３日間）であることが好ましく、受精後３日間（ふ化後２日間）程度であることがより好ましいが、特に限定されない。コントロールとしては、例えば、上記被検物質を曝露していない発生胚を用いればよい。以上により、上記被検物質の変態に対する影響を検証することができる。
【００５０】
さらに、第２曝露工程において上記被検物質が曝露された幼生の発生率の測定は、第２曝露工程の後、該幼生を定法を用いて飼育して、変態した幼生の数を目視等により測定することにより行うことができる。飼育期間は、ふ化後１〜３日間であることが好ましく、２日間程度であることがより好ましいが、特に限定されない。コントロールとしては、例えば、上記被検物質を曝露していない幼生を用いればよい。以上により、上記被検物質の変態に対する影響を検証することができる。
【００５１】
検証工程ではまた、得られた発生率または変態率と、評価工程において得られた生物学的影響の評価とを比較してもよい。上記比較を行うことにより、上記評価の信頼性を確かめることができる。
【００５２】
〔２：評価キット〕
本発明は、被検物質の生物学的影響を評価するための評価キットを提供する。本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは該材料を使用するための指示書を備える。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明に係るキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得、ここで、組成物の形態は上述したような形態であり得、溶液形態の場合は容器中に内包されていてもよい。本発明に係るキットは、物質Ａおよび物質Ｂを同一の容器に混合して備えても別々の容器に備えてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明に係るキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。また、用語「評価キット」は、特定の事項の評価のために用い得るキットが意図される。
【００５３】
本発明に係る評価キットは、本発明に係る評価方法の特定工程に用いるための分類表、および該評価方法の評価工程に用いるための評価表を備えている。
【００５４】
上記分類表は、実施例において後述する基準に基づいて４９の遺伝子クラスター（クラスターａ１〜ａ１０、クラスターｂ１〜ｂ１６、クラスターｃ１〜ｃ１２、クラスターｄおよびクラスターｅ１〜ｅ１２）に分類されたホヤの遺伝子が示されているものであればよい。ホヤの遺伝子を示す方式は特に限定されない。遺伝子またはＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す等の、当業者が該遺伝子を識別可能な方式を用いればよい。具体的には、上記分類表として、図８〜３１に示される分類表を用いることができる。また、上記分類表は、特定の遺伝子クラスターを入力すると、該遺伝子クラスターに属する遺伝子を出力する装置の構成要素として備えられていてもよく、特定の遺伝子を入力すると、該遺伝子が属する遺伝子クラスターを出力する装置の構成要素として備えられていてもよい。
【００５５】
上記評価表には、本発明に係る評価方法において用い得る、上記各遺伝子クラスターに関する情報を示すものであればよい。（Ａ）発現パターンの特徴、（Ｂ）クラスターに含まれる遺伝子の特徴、および（Ｃ）クラスターに含まれる重要な遺伝子を示すものであることが好ましいが、これらに限られない。それぞれの遺伝子クラスターに含まれる遺伝子の発現量が変化したときに、どのような生理学的変化が生じ得るかを評価するために用い得る情報であればよい。具体的には、上記評価表として、表１〜５に示される評価表を用いることができる。上記評価表は、特定の遺伝子クラスターを入力すると、該遺伝子クラスターに関する情報を出力する装置の構成要素として備えられていてもよい。
【００５６】
上記分類表および上記評価表は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。また、上記分類表または上記評価表がウェブサイトにおいて公表されている場合、該ウェブサイトへのアクセス方法が記載された指示書が備えられていてもよい。
【００５７】
本発明に係る評価キットは、ホヤの全遺伝子の５０％以上、好ましくは５５％、６０％、または６５％以上の遺伝子を検出し得るマイクロアレイをさらに備えていてもよい。上記マイクロアレイは、本発明に係る評価方法の検出工程に好適に用いることができる。図８〜３１に記載のホヤの遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を参照すれば、上記マイクロアレイを容易に設計し得る。また、上述の、本発明者らが作製したカスタムメイドオリゴＤＮＡマイクロアレイを、本発明者らから取得してもよい。
【００５８】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００５９】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００６０】
〔実施例１：ホヤ遺伝子の発現パターンの解析〕
以下の手順により、ホヤ遺伝子の発現パターンを解析した。ホヤは、京都大学舞鶴水産実験所（舞鶴、京都）において飼育されたカタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）を用いた。まず、ホヤ成体を定常光の下で飼育することにより、卵成熟を導入した。次に、卵および精子を生殖輸管から外科的に取得し、人工的に受精させた。受精後、卵を洗浄し、室温（１８−２０℃）の海水中に維持した。約１７時間の発生段階を経て、ホヤ幼生が孵化した。ホヤ幼生の変態後、トレイに付着している幼若体を海生珪藻（ｄｉａｔｏｍ  ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｇｒａｃｉｌｌｉｓ）を餌として飼育した。変態の２週間後、トレイに付着しているホヤ幼若体を舞鶴港の海中に移送した。ホヤ幼若体はトレイ上でホヤ成体に成長し、数ヶ月生存した。
【００６１】
以下の時期におけるホヤからそれぞれ総ＲＮＡを調製した：発生段階において、受精卵（ＦＥ）、２細胞期胚（２−ｃｅｌｌ）、４細胞期胚（４−ｃｅｌｌ）、８細胞期胚（８−ｃｅｌｌ）、１６細胞期胚（１６−ｃｅｌｌ）、３２細胞期胚（３２−ｃｅｌｌ）、６４細胞期胚（６４−ｃｅｌｌ）、初期原腸胚（ＥＧ）、後期原腸胚（ＬＧ）、初期神経胚（ＥＮ）、最初期尾芽胚（ＩＴＢ：ｉｎｉｔｉａｌ  ｔａｉｌｂｕｄ）、初期尾芽胚（ＥＴＢ）、中期尾芽胚（ＭＴＢ）、後期尾芽胚（ＬＴＢ）、および幼生（ＬＶ）；成体において、幼若体（ＪＮ）、１．５ヶ月齢成体（１．５Ｍ）、２．５ヶ月齢成体（２．５Ｍ）、および４ヶ月齢成体（４Ｍ）。ホヤ幼若体は、変態の２週間後のものを用いた。変態の２週間後において、ホヤ幼若体は体のサイズは小さいが、卵巣および睾丸以外のほとんどの成体の器官を備えている。１．５ヶ月齢のホヤ成体は、成熟前の段階にあり、成熟した性腺を有さない。２．５ヶ月齢のホヤ成体は、繁殖時期にあり、成熟した性腺、卵子、及び精子を有する。４ヶ月齢のホヤ成体は、性腺を有するが、既に繁殖能力は失われている。
【００６２】
チオシアン酸グアニジン−フェノール／クロロホルム（ＡＧＰＣ）法により、ホヤの卵、胚、および幼若体から総ＲＮＡを調製した。また、ホヤの成体に対しては、被嚢を取り除いた内部の体を各時期に付き３体ずつホモジェナイズした後、超遠心分離することにより総ＲＮＡを調製した（安住ら、２００５年、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５７，４４４−４５２を参照）。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｐｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を用いて精製した。上記ＲＮＡの精製度は、全自動電気泳動システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）を用いた電気泳動法により検証した。
【００６３】
上記各時期のホヤから調製した解析用の総ＲＮＡを、それぞれマイクロアレイにより解析した。上記解析では、解析用の総ＲＮＡを、参照用の総ＲＮＡとともに解析することにより、解析用の総ＲＮＡに含まれる各遺伝子のｍＲＮＡ量を、参照に対する相対値として求めた。これを各時期のホヤから調製した総ＲＮＡについて行い、結果をまとめることによって、ホヤの一生を通じた遺伝子の発現量の変化を解析した。
【００６４】
ここで一般に、マイクロアレイを用いてホヤの総ＲＮＡを解析するとき、参照としてホヤ受精卵が用いられる。しかしながら、本発明者らは、ホヤ受精卵を参照として用いた場合、ホヤ成体における遺伝子の発現量の変化を精度高く解析し得ないことを見出した。これは、ホヤ成体における遺伝子の発現量が、ホヤ受精卵における遺伝子の発現量と大きく異なっており、ホヤ成体間における遺伝子の発現量の差異よりも、ホヤ成体とホヤ受精卵との間における遺伝子の発現量の差異の方が大きいことが原因であった。
【００６５】
そこで、本発明者らは、独自の発想に基づいて、各時期におけるホヤ成体について、隣接する時期におけるホヤ成体の総ＲＮＡを参照用として用いた。具体的には、幼若体に対しては幼生の、１．５ヶ月齢成体に対しては幼若体の、２．５ヶ月齢成体に対しては１．５ヶ月齢成体の、および４ヶ月齢成体に対しては２．５ヶ月齢成体のそれぞれの総ＲＮＡを参照用として用いた。
【００６６】
具体的には、以下の手順によりマイクロアレイによる解析を行った。各２μｇの測定用および参照用のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを蛍光標識キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてそれぞれＣｙ３またはＣｙ５で標識し、前述したカスタムメイドオリゴＤＮＡマイクロアレイ（Ｃ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ  Ｏｌｉｇｏａｒｒａｙ  ｖｅｒ．１，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は製造者の説明書に従って行った。すべての測定用および参照用のポリ（Ａ）＋ＲＮＡの組み合わせについて、蛍光色素を交換して２回実施した。マイクロアレイは、スキャナー（ＧｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ，  Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて読み取りを行った。読み取った各スポットの蛍光強度は、マイクロアレイ解析ソフト（ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ４．０  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて量子化した。すべての発現量を、受精卵における発現量を１として算出した。
【００６７】
〔実施例２：発現パターンに基づいたホヤ遺伝子のクラスタリング〕
実施例１において得られた発現パターンに対して、解析ソフト（ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて階層的クラスタリングおよびＫ平均クラスタリングを行った。その結果、ホヤ遺伝子を発現量の変化パターンに基づいて、５つの大クラスターおよび４９の小クラスターに分類した（図１）。この分類の方式を以後「安住式ホヤ遺伝子分類法」と称する。以下にそれぞれのクラスターについて詳細に説明する。
【００６８】
図１（ａ）に示すように、クラスターＡ（胚性遺伝子クラスター）は、胚の段階において発現量が多く、成体において発現量が少ない遺伝子のクラスターであり、ａ１〜１０の小クラスターを含む。小クラスターａ１は、８または１６細胞期胚において急峻に発現量が増加し、胚発生の中期において発現量が維持され、胚発生の後期に発現量が減少し、幼若体および成体において発現量が変化しない遺伝子のクラスターである。小クラスターａ２〜６は、それぞれ３２細胞期胚、初期原腸胚、初期尾芽胚、または中期尾芽胚において発現量が増加し、その後胚発生の後期において減少し、幼若体において発現量が少ない遺伝子のクラスターである。小クラスターａ７〜１０は、ａ１〜６に比べて緩やかに増加し、発現量があまり多くならない遺伝子のクラスターである。
【００６９】
図１（ｂ）に示すように、クラスターＢ（胚性および成体遺伝子クラスター）は、胚発生の中期において発現量が多い遺伝子のクラスターであり、ｂ１〜１６の小クラスターを含む。クラスターＢは、大きく２つに分けられる。小クラスターｂ１〜７は、胚発生の中期または後期から幼若体まで発現量が多く、成体において少なくなる遺伝子のクラスターである。小クラスターｂ８〜１６は、胚発生の中期または後期から発現が始まり、成体の間中発現量が維持される遺伝子のクラスターである。
【００７０】
図１（ｃ）に示すように、クラスターＣ（成体遺伝子クラスター）は、受精卵および胚発生の段階では発現量が少なく、成体において発現量が多い遺伝子のクラスターであり、ｃ１〜１２の小クラスターを含む。小クラスターｃ６〜８は、１．５ヶ月齢成体から２．５ヶ月齢成体において発現量が最大となる遺伝子のクラスターである。小クラスターｃ９は、２．５ヶ月齢成体のみにおいて発現量が最大となる遺伝子のクラスターである。小クラスターｃ３およびｃ４は、主に幼若体において発現量が最大となる遺伝子のクラスターである。さらに、小クラスターｃ１０およびｃ１２は、一生のうちの最後の時期、すなわち４ヶ月齢成体のみで発現量が増加している遺伝子のクラスターである。
【００７１】
図１（ｄ）に示すように、クラスターＤ（定常発現遺伝子クラスター）は、ホヤの一生において定常的に発現されている遺伝子のクラスターである。
【００７２】
図１（ｅ）に示すように、クラスターＥ（母性遺伝子クラスター）は、受精卵および胚発生の初期において発現量が多く、その後発現量が減少した後、成体において発現量が受精卵における発現量にまで戻る遺伝子のクラスターであり、小クラスターｅ１〜１０を含む。
【００７３】
以上のように分類された各クラスターに属するホヤ遺伝子のＥＳＴクローンのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を図８〜３１に示す。当業者は、各アクセッション番号を参照すれば、対応するＥＳＴクローンの塩基配列を取得し得、これに基づいて本発明に係るマイクロアレイを設計し得ることを容易に理解する。また、当業者は、各アクセッション番号を参照すれば、対応するＥＳＴクローンに係るホヤ遺伝子を取得し得ることを容易に理解する。
【００７４】
〔実施例３：各クラスターの特徴づけ〕
実施例２における各クラスターについて、（ｉ）各クラスターに含まれる遺伝子についてのヒト遺伝子との相同性からの機能推定、（ｉｉ）ホヤ成体の各器官におけるＥＳＴカウント実験の結果から得られた、各クラスターに含まれる遺伝子の器官特異的な発現の情報、および（ｉｉｉ）各クラスターに既に知られているホヤの胚発生、変態、または免疫に関連する遺伝子群が含まれているか否かから各クラスターの特徴づけを行った。表１〜５に結果を示す。
【００７５】
次に、幾つかの被検物質について表１〜５のデータを用いて実際に評価を行った。
【００７６】
〔実施例４：有機スズ曝露〕
ホヤ成体を飼育している水槽に、１００ｎＭの有機スズを添加した。２４時間後に上記ホヤ成体の全組織を採取した。また、コントロールとして、有機スズを加えていない水槽のホヤ成体の全組織を採取した。両サンプルから総ＲＮＡを調製し、上記カスタムメイドオリゴＤＮＡマイクロアレイを用いて解析を行った。
【００７７】
有機スズ曝露で発現が亢進した遺伝子群（１５２遺伝子）および有機スズ曝露で発現が低下した遺伝子群（１９９遺伝子）について、「安住式ホヤ遺伝子分類法」を用いて分類を行った。結果を図２および表６に示す。
【００７８】
【表６】
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【００７９】
示すように、有機スズはホヤの幼若体形成（変態）、および成体の組織形成や機能に異常を引き起こす可能性が示された。また、血球（免疫組織）の機能低下は免疫機能の低下を引き起こす可能性が示唆されている。
【００８０】
ホヤの幼若体形成では、岩または岸壁等への固着が行われる。すなわち、有機スズはホヤの岸壁等への固着を阻害し得る可能性が示されている。これは、有機スズが水生動物の船底への付着防止剤として知られていることに一致する。
【００８１】
〔実施例５：ダイオキシン曝露〕
ホヤ成体を飼育している水槽に１００ｎＭのダイオキシンを添加した。３日後に上記ホヤ成体の全組織を採集した。また、コントロールとして、ダイオキシンを加えてない水槽のホヤ成体の全組織を採取した。両サンプルから総ＲＮＡを調製し、上記カスタムメイドオリゴＤＮＡマイクロアレイを用いて解析を行った。
【００８２】
ダイオキシン曝露で発現が亢進した遺伝子群（３２２遺伝子）およびダイオキシン曝露で発現が低下した遺伝子群（１６６遺伝子）について、「安住式ホヤ遺伝子分類法」を用いて分類を行った。結果を図３および表７に示す。
【００８３】
【表７】
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【００８４】
示すように、ダイオキシンはホヤの胚発生および成体の組織形成（特に精巣）に異常を引き起こす可能性が示された。この結果は、ダイオキシンが魚類の発生に異常を引き起こすという報告と一致する。
【００８５】
〔実施例６：β-ナフトフラボン注射〕
１匹あたり３０μｇのβ-ナフトフラボンをホヤ成体体腔内に注射した。２４時間後に上記ホヤ成体の全組織を採取した。コントロールとしてβ−ナフトフラボンを注射していないホヤ成体の全組織を採取した。両サンプルから総ＲＮＡを調製し、上記カスタムメイドオリゴＤＮＡマイクロアレイを用いて解析を行った。
【００８６】
β-ナフトフラボン注射で発現が亢進した遺伝子群（６４遺伝子）およびダイオキシン曝露で発現が低下した遺伝子群（１１３遺伝子）について、「安住式ホヤ遺伝子分類法」を用いて分類を行った。結果を図４および表８に示す。
【００８７】
【表８】
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【００８８】
示すように、β-ナフトフラボンはホヤの成体の組織形成（特に精巣）および変態プロセスに異常を引き起こす可能性が示された。この結果は、魚類において、β-ナフトフラボンを精巣組織に曝露させると内分泌が撹乱される（具体的には、テストステロンが顕著に合成促進される）という報告と一致する。
【００８９】
〔実施例７：銅イオン曝露〕
ホヤ成体を飼育している水槽に５００ｐｐｂのＣｕＣｌ２を添加した。３日後に上記ホヤ成体の全組織を採集した。また、コントロールとして、塩化銅を加えてない水槽のホヤ成体の全組織を採取した。両サンプルから総ＲＮＡを調製し、上記カスタムメイドオリゴＤＮＡマイクロアレイを用いて解析を行った。
【００９０】
塩化銅曝露で発現が亢進した遺伝子群（３７６個の遺伝子）および塩化銅曝露で発現が低下した遺伝子群（７０２個の遺伝子）について、「安住式ホヤ遺伝子分類法」を用いて分類を行った。結果を図５および表９に示す。
【００９１】
【表９】
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【００９２】
示すように、銅イオンによってハウスキーピング遺伝子群の発現が変動するので、卵、幼生、成体いずれのステージでも恒常性に異常が出る可能性が示された。また、クラスターＥ（母性遺伝子クラスター）の遺伝子の発現変動が多いので、発生が阻害される可能性が示された。さらに、クラスターｃ７は幼若体特異的遺伝子を多く含むので、変態が阻害される可能性が示された。なお、これらの評価の結果は、後述する実施例９によって検証された。
【００９３】
〔実施例８：有機スズ曝露の影響評価の検証（バイオアッセイ）〕
ホヤの発生胚および幼生に、被検物質を曝露させ、該ホヤの発生および変態に関する阻害の有無を検出した。これにより、上記実施例において得られた評価結果のうち、特に重要である発生および変態の阻害に関する評価を検証した。
【００９４】
評価は次のように行った。まず、実施例１と同様にホヤを受精させた後、卵を洗浄し、室温（１８−２０℃）の海水中に維持した。そして、受精直後、または幼生となった時点で被検物質を添加した。受精直後に被検物質を添加したホヤについては、２１時間後に幼生数を計測し（発生率）、そのさらに２日後に、水槽に固着した幼生の数を計測した（変態率１）。また、幼生となった時点で被検物質を添加したホヤについては、２日後に、水槽に固着した幼生の数を計測した（変態率２）。コントロールとしては、０．０１％エタノールを添加した発生胚および幼生を用いた。
【００９５】
本実施例では、被検物質として、ＴＢＴ（トリブチルスズ）またはＴＰＴ（トリフェニルスズ）を用いた。それぞれ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１０ｎＭ、または２ｎＭとなるように、上記海水中に添加した。結果を図６に示す。
【００９６】
図６に示すように、ＴＢＴは２５ｎＭ以上の濃度において、ＴＰＴは１０ｎＭ以上の濃度においてホヤの発生および変態を阻害した。このことは、実施例４において得られた、有機スズがホヤの変態に影響を与えるという評価と一致する。
【００９７】
〔実施例９：銅イオン曝露の影響評価の検証（バイオアッセイ）〕
実施例８に従って、銅イオン曝露の影響評価の検証を行った。本実施例では、被検物質として、ＣｕＣｌ２またはＣｕＳＯ４を用いた。それぞれ、５００ｐｐｂ（パーツパービリオン）、１００ｐｐｂ、または２０ｐｐｂとなるように、上記海水中に添加した。結果を図７に示す。
【００９８】
図７に示すように、銅イオンは、５００ｐｐｂ以上の濃度においてホヤの発生および変態を阻害した。このことは、実施例７において得られた、銅イオンがホヤの発生および変態に影響を与えるという評価と一致する。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明を使用すれば、例えば、有機スズ、ダイオキシン、内分泌撹乱物質、金属イオン等の幅広い化学物質および金属等の被検物質の生物学的影響を評価し得るので、ヒトおよびその他の動物に対する食品、薬品、衣料、建材、日用品、産業廃棄物等の安全性を評価することができる。
【０１００】
特に、本発明は海洋動物に対する物質の生物学的影響を好適に評価し得るので、船舶および漁業網の塗料、ならびに魚介類の養殖場で使用する薬物等の開発にあたり、原材料の化学物質が海洋動物に与える影響を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】（ａ）は胚性遺伝子クラスターに属する遺伝子の発現パターンを示すグラフであり、（ｂ）は胚性および成体遺伝子クラスターに属する遺伝子の発現パターンを示すグラフであり、（ｃ）は成体遺伝子クラスターに属する遺伝子の発現パターンを示すグラフであり、（ｄ）は定常発現遺伝子クラスターに属する遺伝子の発現パターンを示すグラフであり、（ｅ）は母性遺伝子クラスターに属する遺伝子の発現パターンを示すグラフである。
【図２】有機スズ曝露によって発現量が変化した遺伝子の属するクラスターを示すグラフである。
【図３】ダイオキシン曝露によって発現量が変化した遺伝子の属するクラスターを示すグラフである。
【図４】β−ナフトフラボン注射によって発現量が変化した遺伝子の属するクラスターを示すグラフである。
【図５】銅イオン曝露によって発現量が変化した遺伝子の属するクラスターを示すグラフである。
【図６】有機スズ曝露の発生および変態に与える影響を示すグラフである。
【図７】銅イオン曝露の発生および変態に与える影響を示すグラフである。
【図８】クラスターａ１〜ａ４のいずれかに属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図９】クラスターａ５〜ａ７のいずれかに属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図１０】クラスターａ８〜ａ１０のいずれかに属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図１１】クラスターｂ１〜ｂ３のいずれかに属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図１２】クラスターｂ４〜ｂ６のいずれかに属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図１３】クラスターｂ７〜ｂ９のいずれかに属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図１４】クラスターｂ１０〜ｂ１２のいずれかに属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図１５】クラスターｂ１３〜ｂ１６のいずれかに属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図１６】クラスターｃ１〜ｃ３のいずれかに属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図１７】クラスターｃ４〜ｃ６のいずれかに属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図１８】クラスターｃ７〜ｃ１０のいずれかに属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図１９】クラスターｃ１１またはｃ１２に属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図２０】クラスターｄに属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図２１】クラスターｄに属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図２２】クラスターｅ１に属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図２３】クラスターｅ２に属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図２４】クラスターｅ３のいずれかに属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図２５】クラスターｅ４またはｅ５に属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図２６】クラスターｅ６に属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図２７】クラスターｅ７に属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図２８】クラスターｅ７に属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図２９】クラスターｅ８に属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図３０】クラスターｅ９に属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図３１】クラスターｅ１０に属する遺伝子のＥＳＴクローンのアクセッション番号を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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