(57)【要約】【課題】蛍光測定装置において、使い捨てられる程度安価で消耗品となり得るセンサ部を用い、しかも全血、血清や、尿など着色した試料や、または光を散乱させる試料中の微量成分も測定でき、測定の再現性を保持できる安価なものにする。【解決手段】蛍光測定装置１００は、励起光５０aを発する光源５０と、内部において励起光５０ａを伝搬させて他端からエバネッセント光を出射させ、他端が浸漬された試料液中の測定対象物質の存在を示す蛍光体を励起光５０ａにより励起するセンサ部５１と、前記励起により蛍光体から発せられた蛍光５９を検出する光検出器３７とを備える。センサ部５１は、柱状のセンサ部本体５２と、センサ部本体５２の少なくとも他端に隣接する外周面との間に空間Ａを介してセンサ部本体５２を囲む筒状のカバー部５３を備える。カバー部５３は、他端側の端部において空間Ａを閉塞する閉塞部５３ａを有する。【選択図】図１
2008185440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光を発する光源と、
一端から入射した前記励起光を内部において伝搬させて他端からエバネッセント光を出射させ、該他端が浸漬された試料液中の測定対象物質の存在を示す蛍光体を前記励起光により励起するセンサ部と、
前記励起により前記蛍光体から発せられた蛍光を検出する光検出器とを備えてなる蛍光測定装置において、
前記センサ部は、略柱状のセンサ部本体と、
該センサ部本体の少なくとも前記他端に隣接する外周面との間に空間を介して該センサ部本体を囲む筒状のカバー部とを備えてなり、
該カバー部は、前記他端側の端部において前記空間を閉塞する閉塞部を有するものであることを特徴とする蛍光測定装置。
【請求項２】
前記センサ部本体の前記励起光が反射しない部分に、該部分と前記カバー部とを架橋する補強用のリブが形成されていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光測定装置。
【請求項３】
前記カバー部が、前記励起光及び／又は前記蛍光を吸収する材料で成形又は塗装されているものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光測定装置。
【請求項４】
前記カバー部が、前記センサ部本体との一体成型により形成されたものであることを特徴とする請求項１又は３に記載の蛍光測定装置。
【請求項５】
前記カバー部が、前記センサ部を所定位置に保持する保持装置の保持部に係合する係合部を備えていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光測定装置。
【請求項６】
前記センサ部本体が励起光を導波モードで伝搬させるものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光測定装置。
【請求項７】
前記センサ部の前記他端の外表面に前記測定対象物質と特異的に結合するリガンドが固定されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光法により試料中の特定物質を検出する蛍光測定装置、特に詳細にはセンサ部を試料液中に浸漬するタイプの蛍光測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光法が広く用いられている。この蛍光法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する測定対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって測定対象物質の存在を確認する方法である。また、測定対象物質が蛍光体ではない場合、蛍光体で標識されて測定対象物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち測定対象物質の存在を確認することも広くなされている。
【０００３】
図１０は、上記の標識された物質を用いる蛍光法を実施するセンサの一例を概略図示するものである。本例の蛍光測定装置は一例として液体試料１に含まれる抗原２を検出するためのものであり、基板３には抗原２と特異的に結合する１次抗体４が塗布されている。そしてこの基板３上に設けられた試料保持部５の中において液体試料１が流され、次いで同様に蛍光体１０で標識されて抗原２と特異的に結合する２次抗体６が流される。その後、基板３の表面部分に向けて光源７から励起光８が照射され、また光検出器９により蛍光検出がなされる。このとき、光検出器９によって所定の蛍光が検出されたなら、上記２次抗体６と抗原２との結合、すなわち試料中における抗原２の存在を確認できることになる。
【０００４】
なお以上の例では、蛍光検出によって実際に存在が確認されるのは２次抗体６であるが、この２次抗体６は抗原２と結合しなければ流されてしまって基板３上に存在し得ないものであるから、この２次抗体６の存在を確認することにより、間接的に測定対象物質である抗原２の存在が確認されることとなる。
【０００５】
とりわけここ数年は、冷却ＣＣＤの発達など光検出器の高性能化が進んでいることもあって、以上述べた蛍光法はバイオ研究には欠かせない手段となっており、さらにバイオ以外の分野においても広範に利用されている。特に可視領域では、例えばＦＩＴＣ（蛍光波長：５２５ｎｍ、量子収率：０．６）や、Ｃｙ５（蛍光波長：６８０ｎｍ、量子収率：０．３）のように、実用の目安となる０．２を超える高い量子収率を持つ蛍光色素が開発されており、蛍光法の応用分野がさらに拡大することが期待されている。
【０００６】
また従来、エバネッセント光を用いる蛍光法も提案されている。この方法を実施する蛍光測定装置の一例を図１１に概略的に示す。なおこの図１１において、図１０中の要素と同等の要素には同番号を付し、それらについての説明は特に必要のない限り省略する（以下、同様）。
【０００７】
この蛍光測定装置においては、前述の基板３に代わるものとしてプリズム（誘電体ブロック）１３が用いられ、このプリズム１３に前記１次抗体４が塗布される。そして光源７からの励起光８が、このプリズム１３と液体試料１との界面で全反射する条件で、プリズム１３を通して照射される。この構成においては、励起光８が上記界面で全反射するとき該界面近傍に染み出すエバネッセント光１１により２次抗体６が励起される。そして蛍光検出は、液体試料１に対してプリズム１３と反対側（図中では上方）に配された光検出器９によってなされる。
【０００８】
この蛍光測定装置において、励起光８は図中の下方から全反射する角度で入射することで、上記界面から数百ｎｍの領域にしか到達しないエバネッセント光１１を発生させ２次抗体６を励起するため、液体試料１で反射・散乱した励起光８および、励起光８により励起された液体試料１、容器から発せられる蛍光（自家蛍光）が光検出器９に達して、検出したい蛍光信号に対するバック・グラウンドとなるといった問題を最小限に抑えることができる。そのため、このエバネッセント蛍光法は、従来の蛍光法と比べて（光）ノイズを大幅に低減でき、測定対象物質を１分子単位で蛍光測定できる方法として注目されている。
【０００９】
上述のような蛍光法を実施するための装置の一つとして、例えば特許文献１に記載が有るように、励起光を発する光源と、内部において励起光を伝搬させて外表面から出射させ、試料液中の測定対象物質の存在を示す蛍光体を励起光により励起するロッド状や板状のガラス等からなるセンサ部と、上記励起により蛍光体から発せられた蛍光を検出する光検出器とを備えてなるものが知られている。この種の装置によって測定を行う際には、通常センサ部が試料液中に浸漬され、そこから試料液中に出射した励起光により蛍光体が励起される。そして、それにより生じた蛍光が光検出器によって検出されるようになっている。
【００１０】
なお、特許文献２や特許文献３には、上述のようなセンサ部として光ファイバを適用することが示されている。特に特許文献２には、この光ファイバの表面から漏れ出すエバネッセント光で蛍光体を励起することも記載されている。
【００１１】
上述のように試料液中に浸漬されるセンサ部を用いる蛍光測定装置は、液槽の一部にセンサ部を組み込み、そこにポンプ等を用いて試料液を導入するタイプの蛍光測定装置と比べると構成が簡素化されて安価に形成可能であるという利点を有する。
【特許文献１】米国特許第４７０３１８２号公報
【特許文献２】特許１９１６９２４号公報
【特許文献３】特開２００６−０４７２５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、試料液中に浸漬されるセンサ部を用いる従来の蛍光測定装置では、例えば１ｐ・ｍｏｌ（ピコ・モル） ／ｌ（リットル）程度の極めて微量の測定対象物質を測定したい場合には、十分な測定精度が得られないという問題が認められている。この問題は、測定対象物以外の吸収・散乱成分が多く含まれる全血、血清や、尿など着色したものが測定対象物である場合、および、センサ部がクラッドや被覆のついた光ファイバではなく、より安価なガラスや一体成型した透明樹脂等からなるロッド状のものである場合に顕著に認められる。これは励起光・受光光が、光導波路となる上記ガラス等の中を伝播する間に、界面でそれらの測定対象物と接することで散乱し、または吸収されて減衰することによる。その影響を低減するために、一般にクラッドや被覆のついた光ファイバが用いられることがあるが、使い捨てが求められる上記の分野では消耗品が高価になってしまうためコスト面から採用できない。
【００１３】
また、洗浄し不要な成分を除去する工程を設ければ、安価なロッド状のセンサ部を採用できるが、洗浄するために分注器・ポンプなどの高価な送液機構が必要になり装置が高価になってしまう。
【００１４】
また試料液などの溶液に浸漬された状態で蛍光測定が行われるセンサ部は、溶液への挿入方法、溶液の液量及び液ゆれ等によって励起光・受光光の前記界面での反射率や光路等の全反射条件が変化してしまう虞があり、測定の再現性を保持することが困難である。
【００１５】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、使い捨てられる程度安価で消耗品となり得るセンサ部を用い、しかも全血、血清や、尿など着色した試料や、または光を散乱させる試料中の微量成分も測定でき、測定の再現性を保持できる安価な蛍光測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明による蛍光測定装置は、励起光を伝搬させるセンサ部を試料液中に浸漬するタイプの蛍光測定装置において、センサ部の外表面に付着した試料液等によって励起光や蛍光が吸収され、あるいは散乱するのを防止できるようにしたものであって、具体的には、
励起光を発する光源と、
一端から入射した励起光を内部において伝搬させて他端からエバネッセント光を出射させ、該他端が浸漬された試料液中の測定対象物質の存在を示す蛍光体を励起光により励起するセンサ部と、
励起により蛍光体から発せられた蛍光を検出する光検出器とを備えてなる蛍光測定装置において、
前記センサ部は、略柱状のセンサ部本体と、
センサ部本体の少なくとも前記他端に隣接する外周面との間に空間を介してセンサ部本体を囲む筒状のカバー部とを備えてなり、
カバー部は、前記他端側の端部において空間を閉塞する閉塞部を有するものであることを特徴とするものである。
【００１７】
なお「空間」は、空気層であっても、真空であってもよい。
【００１８】
本発明においては、センサ部本体の励起光が反射しない部分に、該部分とカバー部とを架橋する補強用のリブを形成してもよい。
【００１９】
また、カバー部が励起光及び／又は蛍光を吸収する材料で成形又は塗装されていることが好ましい。
【００２０】
このカバー部は、センサ部本体との一体成型により形成されたものであることが好ましい。また、このカバー部は、センサ部を所定位置に保持する保持装置の保持部に係合する係合部を備えてもよい。
【００２１】
また本発明においては、センサ部本体が励起光を導波モードで伝搬させるものであることが好ましい。
【００２２】
また、センサ部の前記他端の外表面に測定対象物質に結合するリガンドが固定されていることが好ましい。
【００２３】
また本発明の蛍光測定装置は、必要な試薬、センサ部、反応槽等がセットで供給、廃棄されるようにしてもよい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明者は、従来の蛍光測定装置に認められる前述の問題すなわち、安価なセンサ部を使い、安価な装置で微量の測定対象物質を測定したい場合に十分な測定精度が得られないという問題は、試料液中に浸漬されているセンサ部の周囲に試料液等が存在したとき、励起光や蛍光がその試料液によって吸収され、あるいは散乱する結果、光検出器に励起光が検出され難くなっていることから生じていることを見出した。
【００２５】
この新しい知見に基づいて本発明の蛍光測定装置は、センサ部が、略柱状のセンサ部本体と、センサ部本体の少なくともエバネッセント光が出射する他端に隣接する外周面との間に空間を介してセンサ部本体を囲む筒状のカバー部とを備えてなり、カバー部の前記他端側の端部において空間が閉塞されているので、カバー部の上端よりも下方に液面が位置するようにセンサ部を試料液中に浸漬すれば、カバー部が試料液と接触し、内部で励起光・受光光が伝搬するセンサ部本体はエバネッセント光が出射する他端側端面すなわちセンシング部分のみが直接試料液と接触するので、センサ部本体の外周面が直接試料液と接触するのを防止することができる。
【００２６】
従って上記吸収、散乱の影響を無くして、微量な測定対象物質も十分な精度で測定可能となる。またセンサ部本体の外周面が試料液等の溶液と接しないことにより、溶液に浸漬した状態で蛍光測定を行う場合に、センサ部の溶液への挿入方法、溶液の量、液ゆれによって全反射の条件が変化することがないので、測定の再現性を保持することできる。また、空間がクラッド層の役割をすることができるので、センサ部にクラッド層を有する高価な光ファイバを使用する必要がない。これによりセンサ部を安価にすることができる。
【００２７】
またセンサ部本体の励起光が反射しない部分に、該部分とカバー部とを架橋する補強用のリブが形成されている場合には、カバー部の強度を補強することができる。
【００２８】
またカバー部が励起光及び／又は蛍光を吸収する材料で成形又は塗装されている場合には、このカバー部が例えばセンサ部本体内の不純物等によって励起光や蛍光が散乱して生じる散光等を吸収できるので、光検出器による散光の検出を防止することができる。
【００２９】
またカバー部が、センサ部本体との一体成型により形成されたものである場合には、センサ部を安価に形成することができるので、使い捨ての要求が高い診断装置に採用するのに最適である。
【００３０】
またカバー部が、センサ部を所定位置に保持する保持装置の保持部に係合する係合部を備えている場合には、全反射の条件を変化させることなくセンサ部を容易に前記所定位置に配設することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。図１は本発明の一実施形態による蛍光測定装置１００の概略構成を示す概念図、図２は図１の蛍光測定装置１００のセンサ部５１の正面断面図（ａ）及び側面図（ｂ）である。なお図１及び図２においては、便宜上、光源５０が位置する側すなわち紙面上側を上方として説明する。
【００３２】
本実施形態の蛍光測定装置１００は、図１に示す如く、例えば波長６３５ｎｍ の励起光５０ａを発する半導体レーザ等の光源５０と、光源５０から発せられた励起光５０ａを光束調整するコリメータレンズ等の光学系２１と、内部において励起光５０ａや後述する蛍光５９を伝搬させる光導波路を有するセンサ部５１と、例えば波長６４５nm以下の光は透過し、波長６４５nm以上の光は直角に反射するダイクロイックミラー２２と、ダイクロイックミラー２２で反射した光を検出する例えばフォトダイオード等の光検出器３７とから概略構成されている。
【００３３】
センサ部５１は、例えば、屈折率ｎ１＝１．７の透明樹脂を用いて形成されたものであり、具体的にはフェノール樹脂（フェノール−ホルムアルデヒド）（「プラスチックＶｏｌ５２Ｎｏ．８」安田武夫著ｐ98-101プラスチック材料の各動特性の試験法と評価結果＜１９＞）、さらに具体的にはＨＯＹＡ製の「テスラリッド」（登録商標）、「アイリー」（登録商標）等を用いて形成する。
【００３４】
本発明において特徴的なのはセンサ部５１が、図２（ａ）、（ｂ）に示す如く、略円柱状のセンサ部本体５２と、センサ部本体５２の少なくとも下端に隣接する外周面５２ｃとの間に空間Ａを介してセンサ部本体５２を囲む筒状のカバー部５３とを備えてなり、カバー部５３が下端側の端部において空間Ａを閉塞する閉塞部５３ａを有していることである。なお本実施形態では、空間Ａは空気層Ａとし、以下空気層Ａとして説明する。
【００３５】
センサ部本体５２は、上記材料にて例えば直径Ｗ＝略１０ｍｍの略円柱状に形成され、上端側は、図２（ａ）に示す如く、正面からみて上端面５２ａとの間に例えばθ０＝略５３度の角度を有する傾斜面５２ｂが左右両側に形成されている。そしてセンサ部本体５２とカバー部５３とは、それらの下端面を略平坦にしてすなわちセンサ部５１の下端面５１ａを略平坦にして一体成型により形成される。このようにカバー部５３がセンサ部本体５２との一体成型により形成されたものである場合には、センサ部５１を安価に形成することができるので、使い捨ての要求が高い診断装置に採用するのに最適である。
【００３６】
そして上述のようにセンサ部５１は屈折率ｎ１＝１．７なので、センサ部５１の周囲が例えば屈折率ｎ２＝１の空気等であれば臨界角θ＝３６．０３度、屈折率ｎ３＝１．３３５の生理食塩水等であれば臨海角θ＝５１．７５度となり、図１に示す如く、センサ部５１の下端を、カバー部５３の上端面よりも液面が下方に位置するように生理食塩水に浸漬する場合、傾斜面５２ｂに垂直に励起光５０ａを入射すれば、センサ部本体５２の周面において水平面と光線とのなす角度はθ１＝３７度、センサ部５１の下端面５１ａにおいて垂直面と光線とのなす角度θ２は５３度となり、周囲に空気が存在するセンサ部本体５２の周面では角度θ１＝３７度は臨界角θ＝３６．０３度よりも大きく、周囲に生理食塩水が存在する下端面５１ａでは角度θ２＝５３度は臨界角θ＝５１．７５度よりも大きくなるので、励起光５０ａはセンサ部本体５２内部及びセンサ部５１の下端面５１ａで全反射することになる。
【００３７】
このとき例えばセンサ部本体５２の内部で４回全反射後にセンサ部５１の下端面５１ａにて後述の蛍光体を励起したい場合には、図２（ａ）に示す如く、下端面５１ａから傾斜面５２ｂの下端までの高さＨ２は、Ｈ２＝４×Ｗ×ｔａｎθ１＝３０．１４ｍｍとする。なおセンサ部本体５２の角度θ０、直径Ｗ、高さＨ２の値は、蛍光測定時にセンサ部本体５２の外周面及びセンサ部５１の下端面５１ａにおいて励起光や蛍光が全反射するように、空気やセンサ部５１が浸漬する溶液等の屈折率などによって適宜変更される。
【００３８】
本実施形態の蛍光測定装置１００が測定対象としているのは、一例としてCRP抗原（分子量11万 Da）であり、それと特異的に結合する１次抗体（モノクロナール抗体）が上記下端面５１ａの上に固定される。この１次抗体は、例えば末端をカルボキシル基化したPEGを介して、アミンカップリング法により、上記下端面５１ａに固定される。一方２次抗体としては、蛍光体（Cy5  Ge-healthcare社）で標識化したモノクロナール抗体（１次抗体とはエピトープ ＜epitope;抗原決定基＞が異なる）が用いられる。
【００３９】
上記アミンカップリング法は一例として下記（１）〜（３）のステップからなるものである。なおこれは、30μｌ（マイクロ・リットル）のキュベット／セルを用いた場合の例である。
【００４０】
（１）リンカー先端（末端）の-COOH基を活性化
０.１Ｍ（モル）のNHSと０.４ＭのEDCとを等体積混合した溶液を30μｌ加え、３０分間室温静置。なお、
NHS：N-hydrooxysuccinimide
EDC：1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
である。
【００４１】
（２）1次抗体の固定化
PBSバッファ（pH7.4）で5回洗浄後、1次抗体溶液（500μg/ｍｌ）を30μｌ加え、３０〜６０分間室温静置
（３）未反応の -COOH基をブロッキング
PBSバッフア（pH7.4）で5回洗浄後、１Ｍのエタノールアミン（pH8.5）を30μｌ加え、20分間室温静置。さらにPBSバッフア（pH7.4）で5回洗浄。
【００４２】
なお、光源５０としては上記半導体レーザに限らず、その他のLEDなどの公知の光源を適宜選択使用可能である。また光検出器３７も前述のものに限らず、CCD、光電子増倍管、c-MOS等の公知のものを適宜選択使用可能である。また励起波長を変えれば、Cy5以外の色素を標識として用いることもできる。
【００４３】
以下、上記構成の蛍光測定装置１００の作用について、図１を参照して詳細に説明する。先ずセンサ部５１を試料液としての血漿に浸漬する。このとき図１に示す如く、試料液の液面がカバー部５３の上端面よりも下方に位置するように浸漬させる。こうすることにより、センサ部本体５２の外周面は大気又は空気層Ａと接し、カバー部５３及びセンサ部５１の下端面５１ａのみが直接血漿と接するので、内部で励起光・受光光が伝搬するセンサ部本体５２の外周面に血漿が存在するのを防止することができる。そしてもし血漿の中にCRP抗原が含まれていれば、該CRP抗原と、センサ部５１の下端面５１ａに固定された一次抗体とが結合される。なおセンサ部５１を浸漬した状態で、センサ部５１を軽く上下に動かすことにより、この結合は促進される。
【００４４】
次に、センサ部５１を前述した蛍光体で標識された２次抗体を含む反応液に浸漬する。このときも上記と同様、反応液の液面がカバー部５３の上端面よりも下方に位置するように浸漬させ、軽く上下に動かす。こうすることで、センサ部５１の下端面５１ａ上の１次抗体にCRP抗原が結合していれば、該CRP抗原と２次抗体との結合が促進される。
【００４５】
そしてその後、センサ部５１をバッファ液に上記と同様に浸漬して上下動させて、センサ部５１の下端面５１ａを洗浄する。これにより上記CRP抗原と、蛍光体で標識された２次抗体とが結合していれば、それらを除いた余計なものが洗い流される。
【００４６】
次にセンサ部５１をバッファ液に、図１に示す如く、浸漬させた状態で蛍光測定を行う。測定に際しては、光源５０が駆動されて、そこからレーザ光等の励起光５０ａが発せられる。この励起光５０ａの大部分は、センサ部本体５２内を、その周囲面と大気又は空気層Ａとの界面にて全反射を繰り返しながら、導波モードで下方に進行する。こうしてセンサ部本体５２内を伝搬した励起光５０ａは、センサ部５１の下端面５１ａに到達してここで全反射する。なおセンサ部本体５２の角度θ0、直径Ｗ、高さＨ２の値は、センサ部本体５２の外周面及びセンサ部５１の下端面５１ａにおいて励起光や蛍光が全反射するようにバッファ液の屈折率ｎ３に応じて決定されている。
【００４７】
そしてこのとき、センサ部５１の下端面５１ａとバッファ液との界面でエバネッセント光が染み出すようになる。そこで、もし下端面５１ａ上の１次抗体にCRP抗原が結合していれば、さらに該抗原に反応液中の２次抗体が結合し、その２次抗体の標識である蛍光体がこのエバネッセント光によって励起される。励起された蛍光体は所定波長の蛍光５９    を発し、この発せられた蛍光５９の少なくとも一部がセンサ部本体５２内部を伝搬して、ダイクロイックミラー２２により直角に反射し、光検出器３７によって検出される。
【００４８】
こうして、光検出器３７が所定波長の蛍光５９を検出した場合は、それにより、CRP抗原に２次抗体が結合していること、すなわち試料液である血漿にCRP抗原が含まれていることを確認可能となる。また、上記のような蛍光５９を検出した信号の強度から、測定対象物質の濃度を検出することも可能である。蛍光測定装置１００は上記のようにして測定を行う。
【００４９】
上述のように本実施形態の蛍光測定装置１００は、センサ部５１が、略柱状のセンサ部本体５２とカバー部５３とを備えているので、カバー部５３の上端よりも下方に液面が位置するようにセンサ部５１を試料液中に浸漬すれば、カバー部５３が試料液と接触し、内部で励起光・受光光が伝搬するセンサ部本体５２はエバネッセント光が出射する下端面５１ａすなわちセンシング部分のみが直接試料液と接触するので、センサ部本体５２の外周面が直接試料液と接触するのを防止することができる。
【００５０】
従って試料液による励起光や蛍光の吸収、散乱の影響を無くして、微量な測定対象物質も十分な精度で測定可能となる。またセンサ部本体５２の外周面が試料液等の溶液と接しないことにより、溶液に浸漬した状態で蛍光測定を行う場合に、センサ部５１の溶液への挿入方法、溶液の量、液ゆれによって全反射の条件が変化することがないので、測定の再現性を保持することができる。また、空気層Ａがクラッド層の役割をすることができるので、センサ部５１にクラッド層を有する高価な光ファイバを使用する必要がない。これによりセンサ部５１を安価にすることができる。
【００５１】
なお本実施形態の蛍光測定装置１００のセンサ部５１は、センサ部本体５２の外周面５２ｃとカバー部５３との間の空間を空気層Ａとしたが、本発明はこれに限られるものではなく、例えば、上記測定を真空中にて行う場合等には、空間は真空であってもよいし、カバー部５３の上端側の端部を閉塞して空間を真空にしてもよいし、適宜変更可能である。
【００５２】
また本実施形態の蛍光測定装置１００においては、ダイクロイックミラー２２は波長６４５nm以下の光は透過し、波長６４５nm以上の光は直角に反射するものとしたが、本発明はこれに限られるものではなく、例えば波長６４５ｍｍ以上の光は透過し、波長６４５ｍｍ以下の光は直角に反射するものであってもよい。この場合、図１において光源５０及び光学系２１と光検出器３７との位置を逆にして、ダイクロイックミラー２２を透過した光を光検出器３７に検出させる。
【００５３】
また本実施形態の蛍光測定装置１００においては、蛍光の測定を行う手段として光検出器３７を上方に配設し、センサ部本体５２内部を伝搬した蛍光５９を検出するいわゆるダブルパス方式を採用しているが、本発明の蛍光測定装置はこれに限られるものではなく、例えば光検出器３７を下方に配設して、蛍光体から発せられた蛍光５９を直接検出するいわゆるシングルパス方式を採用してもよい。
【００５４】
また本実施形態の蛍光測定装置１００は、バッファ液に浸漬した状態で、上記蛍光測定を行うものとしたが、本発明の蛍光測定装置はこれに限られるものではなく、例えば空気、試料液や純水等の溶液に浸漬した状態で測定しても上記と同様の効果を得ることができる。この場合、センサ部５１及び前記溶液は、センサ部５１の下端面５１ａにて励起光５０ａが全反射する条件を備えるように構成する。
【００５５】
次に本発明にかかる第二の実施形態による蛍光測定装置１００−２について、以下図面を参照して詳細に説明する。図３は第二の実施形態による蛍光測定装置１００−２の側面形状を示すものであり、また図４は、そこに用いられているターレット３０の平面形状を示すものである。図示の通りこの蛍光測定装置１００−２は、上記ターレット３０と、このターレット３０を水平な状態にして回転自在に保持する架台３１と、この架台３１から垂直に立てられた縦部材３２と、この縦部材３２に保持されて図示外の駆動手段によって上下方向に移動自在とされた上下動台３３とを有している。この架台３１、縦部材３２、上下動台３３を合わせて保持装置という。
【００５６】
架台３１にはステッピングモータ３４が固定され、その駆動軸３５にターレット３０が固定されている。したがって、ステッピングモータ３４が駆動されると、ターレット３０が駆動軸３５の周りに、つまり水平面内で回転する。また架台３１の上面には、取付具３６を介して例えばフォトダイオード等の光検出器３７が取り付けられている。この光検出器３７は一例として、互いに間隔を置いて向き合う状態にした１対のものが用いられている。
【００５７】
図４に明示されるようにターレット３０の上面には、それぞれ一定深さの穴部として形成された試料槽４０、反応槽４１、バッファ液槽４２、センサ部保持穴４３が形成されている。さらにこのターレット３０には、貫通孔４４が形成されている。これらの槽４０〜４２、センサ部保持穴４３および貫通孔４４は、ターレット３０の回転軸周りの１つの共通円上に各中心が位置する状態にして、互いに所定の角度間隔を置いて配置されている。上下動台３３には、例えば波長６３５ｎｍ の励起光５０ａを発する半導体レーザ等の光源５０と、センサ部５１−２を解放自在に保持するチャック（保持部）４９とが搭載されている。
【００５８】
ここで図５に本実施形態のセンサ部５１−２の正面断面図を示す。本実施形態のセンサ部５１−２は、上記実施形態のセンサ部５１と略同様な構成であるため、同様の箇所は同符号で示して説明を省略し、異なる箇所についてのみ説明する。
【００５９】
本実施形態のセンサ部５１−２は、上記実施形態のセンサ部５１とはカバー部５３の形状が異なっている。本実施形態のカバー部５３−２は、図５に示す如く、上端側の外周面に外方に向かってピン状に突設された上記チャック部４９と係合する係合部５３ｂが所定間隔で複数設けられている。この係合部５３ｂを備えることにより、光路等を考慮することなく容易にチャック部４９すなわち上述の保持装置に着脱することが可能となり、センサ部５１−２を容易に所定位置に配設することが可能となる。なお本実施形態のカバー部５３−２は、上記形状の係合部５３ｂを備えているが本発明のカバー部はこれに限られるものではなく、光路に極力影響を与えない構成であれば、保持装置のチャック部４９の形状に応じて適宜変更可能である。カバー部５３−２は、センサ部５１−２を試料液に挿入したときに、試料液の液面がカバー部５３−２の上端面よりも下方に位置するように、上記ターレット３０の穴部の深さ等を考慮して形成する。
【００６０】
そして上記ステッピングモータ３４の駆動つまりターレット３０の回転動作は、図示外の制御回路により、上下動台３３、光源５０および光検出器３７の駆動と同期して制御される。また上記チャック４９は、一例として後述する機械的な把持機構を備えると共に円筒状の下端部を有し、その内部は図示外のブロワ等の空気吐出手段に連通されている。そこで、上記把持機構により係合部５３ｂを保持する一方、空気を吐出することにより試料液等を撹拌する機能を備えている。それらの機能については、後に詳しく説明する。
【００６１】
なお本実施形態の蛍光測定装置１００−２が測定対象としているのは、上記実施形態と同様であるため説明は省略し、以下、この蛍光測定装置１００−２の作用について、測定時の工程を順次示す図６を用いて説明する。なおこの図６では、図の煩雑化を回避するために、図３に示した各要素のうち、各工程（１）〜（１１）のそれぞれにおいて説明に必要な最小限のものだけに付番を与えてある。
【００６２】
まずこの測定に際しては予め、センサ部保持穴４３にセンサ部５１−２が収められる。そして同図（１）に示すように、試料槽４０に試料液としての全血５６が所定量注入され、ターレット３０が所定角度回転されることにより、この試料槽４０がチャック４９の真下位置に設定される。次に（２）に示すようにチャック４９が（つまり上下動台３３）が下降され、全血５６はこのチャック４９と試料槽４０との間の空気圧によって、試料槽４０にあるフィルター４８で濾され、（３）に示すように全血５６が重い血球５７と血漿５８とに分離する。
【００６３】
この状態になったところでチャック４９が引き上げられた後、ターレット３０がさらに所定角度回転され、（４）に示すように、センサ部保持穴４３に収められているセンサ部５１−２がチャック４９の真下位置に設定される。この状態でチャック４９が下降動され、一般的なボール盤がドリルを挟むような状態で係合部５３ｂを挟み込むことでセンサ部５１−２はチャック４９に保持される。そして（５）に示すようにチャック４９が引き上げられて、センサ部５１−２がセンサ部保持穴４３から上方に引き抜かれる。
【００６４】
（６）に示すようにセンサ部５１−２がターレット３０から完全に離れると、ターレット３０が所定角度回転され、（７）に示すように、試料槽４０が再度チャック４９の真下位置に設定される。そしてこの状態でチャック４９が所定長さ降ろされた上で上下動され、それにより、そこに保持されているセンサ部５１−２が血漿５８の中に浸漬した状態で、軽く上下に動かされる。このとき上記実施形態と同様に、血漿５８の液面がカバー部５３−２の上端面よりも下方に位置するように浸漬及び上下動させ、センサ部本体５２の外周面に血漿が付着するのを防止する。このように上下動することにより、もし血漿５８の中にCRP抗原が含まれていれば、該CRP抗原と、センサ部５１−２の下端面５１ａに固定されている１次抗体との結合が促進される。
【００６５】
その後センサ部５１−２が試料槽４０から上方に引き上げられ、次いでターレット３０が所定角度回転されることにより、（８）に示すように、反応槽４１がチャック４９の真下位置に設定される。この反応槽４１には、上述した蛍光体で標識された２次抗体を含む反応液４５が貯えられている。次にチャック４９が所定長さ降ろされた上で上下動され、それにより、センサ部５１−２が反応液４５の中に浸漬した状態で、軽く上下に動かされる。
【００６６】
このとき上記と同様に、反応液４５の液面がカバー部５３−２の上端面よりも下方に位置するように浸漬及び上下動させ、センサ部本体５２の外周面に反応液４５が付着するのを防止する。このように上下動することで、もしセンサ部５１−２の下端面５１ａ上の１次抗体にCRP抗原が結合していれば、該CRP抗原と２次抗体との結合が促進される。
【００６７】
その後センサ部５１−２が反応槽４１から上方に引き上げられ、次いでターレット３０が所定角度回転されることにより、（９）に示すように、バッファ液槽４２がチャック４９の真下位置に設定される。次にチャック４９が所定長さ降ろされた上で上下動され、それにより、センサ部５１−２がバッファ液槽４２内に貯えられているバッファ液４６によって洗浄される。つまり上記CRP抗原と、蛍光体で標識された２次抗体とが結合していれば、それらを除いた余計なものが洗い流される。
【００６８】
その後センサ部５１−２がバッファ液槽４２から上方に引き上げられ、次いでターレット３０が所定角度回転されることにより、（１０）に示すように、貫通孔４４がチャック４９の真下位置に設定される。次にチャック４９が下降され、それによりセンサ部５１−２が貫通孔４４内に位置する状態となる。この状態では、センサ部５１−２の周りに存在するのは空気だけとなるので、該センサ部５１−２は、以下に説明する蛍光測定を行う上で励起光および蛍光を実質的に吸収、散乱させることのない雰囲気中に配されることになる。
【００６９】
この状態になったところで行われる蛍光測定について、そのときの状態を示している図３を参照して詳しく説明する。測定に際しては、光源５０が駆動されて、そこからレーザ光等の励起光５０ａが発せられる。この励起光５０ａの大部分は、センサ部本体５２内を、その外周面と空気との界面で全反射を繰り返しながら、導波モードで下方に進行する。こうしてセンサ部本体５２内を伝搬した励起光５０ａの一部は、センサ部５１−２の下端面５１ａに到達しそこで全反射する。
【００７０】
このとき、センサ部５１の下端面５１ａと空気との界面からエバネッセント光が染み出すようになる。そこで、もし下端面５１ａ上の１次抗体にCRP抗原が結合していれば、さらに該抗原に反応液４５中の２次抗体が結合し、その２次抗体の標識である蛍光体が上記エバネッセント光によって励起される。励起された蛍光体は所定波長の蛍光５９を発し、その蛍光５９は光検出器３７によって検出される。こうして、光検出器３７が所定波長の蛍光５９を検出した場合は、それにより、CRP抗原に２次抗体が結合していること、すなわち試料液である血漿５８にCRP抗原が含まれていることを確認可能となる。また、上記のような蛍光５９を検出した信号の強度から、測定対象物質の濃度を検出することも可能である。
【００７１】
こうして蛍光測定が終了すると、センサ部５１−２が貫通孔４４内から上方に引き上げられ、次いでターレット３０が所定角度回転されることにより、図６の（１１）に示すように、センサ部保持穴４３がチャック４９の真下位置に設定される。次にチャック４９が下降され、それによりセンサ部５１−２がセンサ部保持穴４３内に挿入される。次いでチャック４９が開き、チャック４９が上昇動され、そこからセンサ部５１−２が離脱する。こうしてセンサ部５１−２が保持穴４３内に戻る。その後、使用済みのターレット３０は捨て、新たなターレット３０に交換することで、汚染を気にせずに測定を行うことができる。
【００７２】
ここで本実施形態においては、以上の説明から明らかな通り、回転部としてのターレット３０と、上下動台３３およびチャック４９からなる往復動手段とによってセンサ部駆動手段が構成されている。このようなターレット３０を用いると、測定を極めて能率良く行うことが可能となる。しかしながら、センサ部駆動手段はこのようなものに限らず、その他の公知の機構を用いて適宜構成することができる。
【００７３】
また、汚染をあまり気にする必要のない場合は、センサ部５１−２等を洗浄し、試薬を再度格納することで再利用も可能である。
【００７４】
なお、上記蛍光測定がなされるとき、前述したようにセンサ部本体５２の外周面に血漿５８や反応液４５が付着しないので、血漿５８や反応液４５による励起光５０ａや蛍光５９の吸収、散乱の影響を無くして、微量な測定対象物質も十分な精度で測定可能となる。さらにセンサ部５１−２は、励起光５０ａおよび蛍光５９を実質的に吸収、散乱させることのない雰囲気中に配されることになるので、蛍光５９が吸収されたり、散乱したりすることにより、検出される蛍光の強度が低下して、測定対象物質の測定精度が損なわれることを防止できる。また、センサ部５１−２から一部漏れ出したような励起光５０ａが散乱して光検出器３７に入射し、それにより測定精度が損なわれることも防止可能となる。
【００７５】
なお本実施形態の蛍光測定装置１００−２は、上述の如く、ターレット３０を備えるものとしたが、本発明はこれに限られるものではなく、例えば複数の容器を備えてもよいし、適宜変更可能である。
【００７６】
また本実施形態では、励起光５０ａおよび蛍光５９を実質的に吸収、散乱させることのない雰囲気を空気として、その中で蛍光体の励起および蛍光検出を行っているが、この空気の他に例えば、純水、PBSバッファ等の液体もそのような雰囲気として適しており、本発明の蛍光測定装置は、そのような液体の中で蛍光体の励起および蛍光検出を行うように構成されてもよい。
【００７７】
以上説明した実施形態の蛍光測定装置１００、１００−２は、蛍光測定することにより２次抗体を検出し、それにより、試料液中の測定対象物質を間接的に検出するものであるが、本発明の蛍光測定装置は、蛍光体である測定対象物質を直接的に検出するように構成することも勿論可能である。
【００７８】
また本発明の蛍光測定装置を構成するセンサ部としては、以上説明したセンサ部５１、５１−２に限られるものではなく、適宜変更可能である。ここで図７に第三の実施形態のセンサ部５１−３の正面断面図（ａ）及び側面図（ｂ）、図８に第四の実施形態のセンサ部５１−４の正面断面図、図９に第五の実施形態のセンサ部５１−５の正面断面図（ａ）及び上面図（ｂ）を示し、以下それぞれについて説明する。
【００７９】
第三の実施形態のセンサ部５１−３は、第一の実施形態のセンサ部５１と概略同様の構成であるがカバー部５３の形状が異なっている。本実施形態のカバー部５３−３は、図７（ａ）、（ｂ）に示す如く、下端から上端へ向かうにつれて直径が大きくされた筒状に形成されている。こうすることにより一体成型時に型から抜き易くすることができる。
【００８０】
第四の実施形態のセンサ部５１−４は、第二の実施形態のセンサ部５１−２と同様の形状であるが、図８に示す如く、カバー部５３−４が励起光５０ａ及び／又は蛍光５９を吸収する材料によって成形されている点が異なっている。この材料は、具体的には例えば、安中特殊硝子製作所製のプラスチックフィルターＰＩＲ７３０、ＰＩＲ８００に採用されている成型材料や、ＰＣ（ポリカーボネイト）、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）に一般的なアゾ色素や他の様々な染料を混ぜたもの等を使用することができる。またセンサ部５１−４は、センサ部本体５２とカバー部５３−４を２色成型によって一体的に成型されている。このようにカバー部５３−４を励起光５０ａ及び／又は蛍光５９を吸収する材料で成形することにより、このカバー部５３−４が例えばセンサ部本体５２内の不純物等によって励起光５０ａや蛍光５９が散乱して生じる散光等を吸収できるので、光検出器３７による前記散光の検出を防止することができる。なお本実施形態のカバー部５３−４は、上記材料にて形成するものとしたが本発明はこれに限られるものではなく、励起光５０ａや蛍光５９を吸収可能であれば塗装してもよい。
【００８１】
第五の実施形態のセンサ部５１−５は、第二の実施形態のセンサ部５１−２と概略同様の構成であるが、図９（ａ）、（ｂ）に示す如く、センサ部本体５２の励起光５０ａが全反射しない部分に、該部分とカバー部５３とを架橋する補強用のリブ５５が設けられている点が異なっている。このようにリブ５５を設けることによりカバー部５３の強度を補強することができる。本実施形態ではこのリブ５５は１つ設けられているが、本発明はこれに限られるものではなく、例えば周方向に所定間隔にて複数設けてもよいし、上下方向に複数設けてもよいし、励起光５０ａが全反射しない位置であればいずれに設けてもよい。
【００８２】
なお全反射する位置の高さＨは、図１の内部反射角度θ１、センサ部本体５２の直径Ｗから、Ｈ＝ｎ×（Ｗ／２）ｔａｎθ１の式にて求めることができる。ここでｎは奇数整数であり、この高さ位置にて励起光５０ａが全反射する。従って「全反射しない位置」は、上記式にて求められる全反射する位置の高さとは異なる高さの位置であり、例えば、全反射する位置は、Ｗ＝１０ｍｍ、θ１＝３７度、ｎ＝７の場合、高さＨ＝７×（１０／２）ｔａｎ３７°＝２６．３ｍｍであり、同様にｎ＝５の場合、高さＨ＝１８．８ｍｍであるため、高さＨ＝１８．８〜２６．３ｍｍの間が全反射しない位置の高さとなる。従って例えばその中間値である高さＨ＝２２．６ｍｍの位置にリブ５０を形成することができる。
【００８３】
以上により本発明にかかる実施形態の蛍光測定装置について説明したが、本発明の蛍光測定装置はこれに限られるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において適宜変更可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明の一実施形態による蛍光測定装置を示す概略構成を示す概念図
【図２】図１の蛍光測定装置のセンサ部の正面断面図及び側面図
【図３】本発明の第二の実施形態による蛍光測定装置を示す概略側面図
【図４】図３の蛍光測定装置の一部を示す平面図
【図５】図３の蛍光測定装置のセンサ部の正面断面図
【図６】図３の蛍光測定装置による測定工程を、順を追って示す概略図
【図７】センサ部の第三の実施形態を示す正面断面図及び側面図
【図８】センサ部の第四の実施形態を示す正面断面図
【図９】センサ部の第五の実施形態を示す正面断面図及び上面図
【図１０】従来の蛍光測定装置の一例を示す概略側面図
【図１１】従来の蛍光測定装置の別の例を示す概略側面図
【符号の説明】
【００８５】
１    試料
２    抗原
４    １次抗体
６    ２次抗体
７、５０    光源
８、５０ａ    励起光
９、３７    光検出器
１０    蛍光体
２１    光学系
２２    ダイクロイックミラー
３０    ターレット
３３    上下動台
３４    ステッピングモータ
４０    試料槽
４１    反応槽
４２    バッファ液槽
４３    センサ部保持穴
４４    貫通孔
４９    チャック部（保持部）
５１    センサ部
５２    センサ部本体
５３    カバー部
５３ａ  閉塞部
５９    蛍光
【図１】
2008185440.tif 000003
【図２】
2008185440.tif 000004
【図３】
2008185440.tif 000005
【図４】
2008185440.tif 000006
【図５】
2008185440.tif 000007
【図６】
2008185440.tif 000008
【図７】
2008185440.tif 000009
【図８】
2008185440.tif 000010
【図９】
2008185440.tif 000011
【図１０】
2008185440.tif 000012
【図１１】
2008185440.tif 000013