(57)【要約】【課題】  ＲＵＮＸと相互作用してその作用を調節する蛋白質を見出し、ＲＵＮＸの作用を調節する手段を提供すること、およびＲＵＮＸの異常に起因する疾患の予防および／または治療に有用な手段を提供すること。【解決手段】  ＨＥＣＴ型Ｅ３リガーゼーであるＮＥＤＤ４がＲＵＮＸをユビキチン化し、それによりＲＵＮＸが分解されることを見出し、それに基づき、ＮＥＤＤ４を使用することを特徴とするＲＵＮＸのユビキチン化方法および分解方法、ＲＵＮＸのユビキチン化剤および分解剤、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化および分解の阻害方法、ＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤および分解阻害剤、ＲＵＮＸのユビキチン化を阻害または促進する化合物の同定方法、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合を阻害または促進する化合物の同定方法、試薬キット、ＲＵＮＸの異常に起因する疾患の予防および／または治療方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＵＮＸ（Ｒｕｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）とＮＥＤＤ４（Ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ４）とを共存させることを特徴とするＲＵＮＸのユビキチン化方法。
【請求項２】
ＲＵＮＸが、ヒトＲＵＮＸ１、ヒトＲＵＮＸ２およびヒトＲＵＮＸ３から選ばれるいずれか１である請求項１に記載のＲＵＮＸのユビキチン化方法。
【請求項３】
ＮＥＤＤ４を含んでなるＲＵＮＸのユビキチン化剤。
【請求項４】
ＲＵＮＸが、ヒトＲＵＮＸ１、ヒトＲＵＮＸ２およびヒトＲＵＮＸ３から選らばれるいずれか１である請求項３に記載のＲＵＮＸのユビキチン化剤。
【請求項５】
請求項１または２に記載のＲＵＮＸのユビキチン化方法を使用することを特徴とするＲＵＮＸの分解方法。
【請求項６】
請求項３または４に記載のＲＵＮＸのユビキチン化剤を用いてＲＵＮＸを処理することを特徴とするＲＵＮＸの分解方法。
【請求項７】
ＮＥＤＤ４を含んでなるＲＵＮＸの分解剤。
【請求項８】
ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合を阻害することを特徴とするＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法。
【請求項９】
配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質および／または配列番号１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を使用することを特徴とする請求項８に記載のＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法。
【請求項１０】
ＮＥＤＤ４の酵素活性を阻害することを特徴とするＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法。
【請求項１１】
ＮＥＤＤ４の発現を阻害することを特徴とするＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法。
【請求項１２】
ＲＵＮＸが、ヒトＲＵＮＸ１、ヒトＲＵＮＸ２およびヒトＲＵＮＸ３から選ばれるいずれか１である請求項８から１１のいずれか１項に記載のＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法。
【請求項１３】
配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質および／または配列番号１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を含んでなるＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤。
【請求項１４】
ＲＵＮＸが、ヒトＲＵＮＸ１、ヒトＲＵＮＸ２およびヒトＲＵＮＸ３から選らばれるいずれか１である請求項１３に記載のＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤。
【請求項１５】
請求項８から１２のいずれか１項に記載のＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法を使用することを特徴とするＲＵＮＸの分解阻害方法。
【請求項１６】
請求項１３または１４に記載のＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤を使用することを特徴とするＲＵＮＸの分解阻害方法。
【請求項１７】
配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質および／または配列番号１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を含んでなるＲＵＮＸの分解阻害剤。
【請求項１８】
ＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害することを特徴とする骨形成促進方法。
【請求項１９】
配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質および／または配列番号１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を使用することを特徴とする骨形成促進方法。
【請求項２０】
ＮＥＤＤ４の発現を阻害し得るｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を使用することを特徴とする骨形成促進方法。  
【請求項２１】
配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質および／または配列番号１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を含んでなる骨形成促進剤。
【請求項２２】
ＮＥＤＤ４の発現を阻害し得るｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を含んでなる骨形成促進剤。
【請求項２３】
ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法であって、ＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸとある化合物（被検化合物）とを接触させ、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害するか否かまたは促進するか否かを決定する工程を含む同定方法。
【請求項２４】
ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法であって、ＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸとある化合物とを接触させ、次いで、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物がＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害するか否かまたは促進するか否かを決定する工程を含む同定方法。
【請求項２５】
骨形成を促進させ得る化合物の同定方法であって、ある化合物（被検化合物）がＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害するか否かを測定する工程を含む方法。
【請求項２６】
ＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害することが明らかになった被検化合物が、骨形成を促進させ得るか否かを測定する工程をさらに含む、請求項２５に記載の化合物の同定方法。
【請求項２７】
骨形成を促進させ得る化合物の同定方法であって、ＮＥＤＤ４をコードするポリヌクレオチドとある化合物（被検化合物）とを接触させ、次いで、ＮＥＤＤ４を測定することにより、該被検化合物がＮＥＤＤ４の発現を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法。
【請求項２８】
ＮＥＤＤ４の発現を阻害することが明らかになった被検化合物が、骨形成を促進させ得るか否かを測定する工程をさらに含む、請求項２７に記載の化合物の同定方法。
【請求項２９】
骨形成を促進させ得る化合物の同定方法であって、ＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸとある化合物（被検化合物）とを接触させ、ＮＥＤＤ４によるＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸのユビキチン化を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該被検化合物がＮＥＤＤ４によるＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸのユビキチン化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法。
【請求項３０】
ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害することが明らかになった被検化合物が、骨形成を促進させ得るか否かを測定する工程をさらに含む、請求項２９に記載の化合物の同定方法。
【請求項３１】
骨形成を促進させ得る化合物の同定方法であって、ＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸとある化合物（被検化合物）とを接触させ、次いで、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該被検化合物がＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法。
【請求項３２】
ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害することが明らかになった被検化合物が、骨形成を促進させ得るか否かを測定する工程をさらに含む、請求項３１に記載の化合物の同定方法。
【請求項３３】
ＮＥＤＤ４、ＮＥＤＤ４をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つ、およびＲＵＮＸ、ＲＵＮＸをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つを含有してなる試薬キット。
【請求項３４】
請求項３に記載のＲＵＮＸのユビキチン化剤および／または請求項７に記載のＲＵＮＸの分解剤を有効量含んでなる、ＲＵＮＸの機能および／または発現の亢進に起因する疾患の予防および／または治療剤。
【請求項３５】
請求項１３または１４に記載のＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤および／または請求項１７に記載のＲＵＮＸの分解阻害剤を有効量含んでなる、ＲＵＮＸの機能および／または発現の低下に起因する疾患の予防および／または治療剤。
【請求項３６】
請求項１または２に記載のＲＵＮＸのユビキチン化方法、請求項３に記載のＲＵＮＸのユビキチン化剤、請求項５または６に記載のＲＵＮＸの分解方法、および請求項７に記載のＲＵＮＸの分解剤のうち少なくともいずれか１の方法または剤を使用することを特徴とするＲＵＮＸの機能および／または発現の亢進に起因する疾患の予防および／または治療方法。
【請求項３７】
請求項８から１２のいずれか１項に記載のＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法、請求項１３または１４に記載のＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤、請求項１５または１６に記載のＲＵＮＸの分解阻害方法、および請求項１７に記載のＲＵＮＸの分解阻害剤のうち少なくともいずれか１の方法または剤を使用することを特徴とするＲＵＮＸの機能および／または発現の低下に起因する疾患の予防および／または治療方法。
【請求項３８】
請求項２１および／または請求項２２に記載の骨形成促進剤を有効量含んでなる、骨損失を伴う疾患の予防および／または治療剤。
【請求項３９】
請求項２１および２２に記載の骨形成促進剤並びに請求項１８から２０に記載の骨形成促進方法のうち少なくともいずれか１の剤または方法を使用することを特徴とする骨損失を伴う疾患の予防および／または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＵＮＸ（Ｒｕｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）のユビキチン化方法および分解方法に関する。より詳しくは、本発明はＲＵＮＸとＮＥＤＤ４（Ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ４）とを共存させることを特徴とするＲＵＮＸのユビキチン化方法および分解方法に関する。
【０００２】
本発明はまた、ＲＵＮＸのユビキチン化剤および分解剤に関する。
【０００３】
本発明はさらにＲＵＮＸのユビキチン化および分解の阻害方法に関する。より詳しくは、本発明はＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合、ＮＥＤＤ４の酵素活性、およびＮＥＤＤ４の発現のうちの少なくとも１を阻害することを特徴とする、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化および分解の阻害方法に関する。
【０００４】
本発明はまた、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤および分解阻害剤に関する。
【０００５】
本発明はまた、骨形成促進方法および骨形成促進剤に関する。より詳しくは、本発明は、ＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害することを特徴とする骨形成促進方法および骨形成促進剤に関する。
【０００６】
本発明はさらに、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法、並びにＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法に関する。
【０００７】
本発明はまた、骨形成を促進させ得る化合物の同定方法に関する。
【０００８】
本発明はさらに、ＮＥＤＤ４、ＮＥＤＤ４をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つと、ＲＵＮＸ、ＲＵＮＸをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つとを含んでなる試薬キットに関する。
【０００９】
本発明はまた、ＲＵＮＸの異常に起因する疾患、例えばＲＵＮＸの機能および／または発現の亢進や低下に起因する疾患、具体的には癌疾患等の予防および／または治療剤、並びに予防および／または治療方法に関する。
【００１０】
本発明はさらに、骨損失を伴う疾患の予防および／または治療剤、並びに予防および／または治療方法に関する。
【背景技術】
【００１１】
ＲＵＮＸは、Ｒｕｎｔドメインを有することを特徴とする蛋白質であり、数々のファミリー蛋白質が知られている。Ｒｕｎｔドメインは、（１）ヒトの急性骨髄性白血病に関連するＡＭＬ１（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  １）、（２）レトロウイルスのエンハンサーに共通するコアに結合する転写因子として同定されたＣＢＦ（ｃｏｒｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、および（３）ポリオーマウイルスの遺伝子発現とＤＮＡ複製を制御するエンハンサーとして同定された転写因子ＰＥＢＰ２（ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）のαサブユニットが共有する約１３０アミノ酸残基からなる非常に相同性の高い配列である。
【００１２】
ＲＵＮＸは、ＰＥＢＰ２  ＣＢＦ  βサブユニット（ＰＥＢＰ２β／ＣＢＦβ）とヘテロ二量体を形成し、転写因子として作用することが知られている。Ｒｕｎｔドメインは、ＤＮＡ結合およびβサブユニットとのヘテロ二量体化を共に担い、ＲＵＮＸの転写因子としての作用に重要なドメインである。
【００１３】
ＲＵＮＸは、哺乳動物では３種類のファミリー蛋白質、すなわちＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２およびＲＵＮＸ３が知られている（非特許文献１および２）。ヒトＲＵＮＸ３とヒトＲＵＮＸ１およびヒトＲＵＮＸ２との相同性は、アミノ酸レベルでそれぞれ５７％および５４％である。
【００１４】
ＲＵＮＸファミリーは、転写因子として作用し、正常な分化や腫瘍形成に重要な役割を果たす。
【００１５】
ＲＵＮＸ１はヒト第２１染色体（２１ｑ２２）上に存在し、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）で染色体転座が最も高頻度にみられる遺伝子として同定された（非特許文献３）。一方、ＲＵＮＸ１が造血細胞の分化調節にも決定的な役割を果たしていることが報告されている（非特許文献４および５）。ＡＭＬでは第８染色体と第２１染色体の長腕が入れ替わる相互転座（ｔ（８；２１））が高頻度に見られ、該染色体転座によりＲＵＮＸ１に対してドミナントネガティブに作用するキメラ蛋白質が生じることが知られている。このキメラ蛋白質を発現している増殖細胞に、ＲＵＮＸ１を大量に発現させると細胞の増殖は抑制され分化が促進されたことが報告されている（非特許文献６）。一方、染色体転座のみられない白血病細胞でも、点突然変異によるＲＵＮＸ１転写活性化能の消失が報告されており、その機能消失が白血病の発症に重要な役割を果たしていると考えられる（非特許文献７）。
【００１６】
ＲＵＮＸ２は骨形成に関わる重要な転写因子であり、軟骨細胞の分化・成熟、骨芽細胞の分化、骨髄形成に必須である（非特許文献２６および２７）。ＲＵＮＸ２のノックアウトマウスでは膜性骨化および軟骨内骨化の両方が欠損しているため、骨格は軟骨のみから形成される（非特許文献８）。骨格は、骨芽細胞から直接形成される膜性骨化と、軟骨が形成された後に該軟骨が骨に置換される軟骨内骨化により構築される。骨芽細胞と軟骨細胞はいずれも間葉系幹細胞より分化する。これら細胞の間葉系幹細胞からの分化には、ＢＭＰ（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）等のサイトカインおよび各種の転写因子群が関与している。ＲＵＮＸ２は細胞内で、ＢＰＭ刺激による骨形成遺伝子の発現誘導に関与する転写因子Ｓｍａｄ１と結合することから、ＢＭＰ刺激を介した骨形成シグナルに関与していると考えられている（非特許文献２８）。また、ＲＵＮＸ２は骨細胞の分化に作用する他、骨基質遺伝子群（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、オステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）、オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、骨シアロプロテイン（ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）等）の発現を活性化させることが明らかにされている（非特許文献２９）。
【００１７】
一方、ＲＵＮＸ２の過剰発現がＴ細胞分化に異常をもたらし、ｃ−ｍｙｃとの相乗作用によりリンパ腫形成に関与することが報告されている（非特許文献９）。
【００１８】
ＲＵＮＸ３はＴＧＦ−β（ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β）の細胞内メディエーターであるＳｍａｄと結合することから、ＴＧＦ−βシグナル伝達への関与が考えられている（非特許文献１０）。ＴＧＦ−βレセプターやＳｍａｄの変異は、多くの癌で知られており（非特許文献１１）、ＲＵＮＸ３についても癌への関与が考えられている。ＲＵＮＸ３は正常の胃粘膜上皮で高発現しているが（非特許文献１２）、ＲＵＮＸ３をノックアウトすると胃粘膜上皮細胞の増殖亢進による粘膜肥厚がみられる。この細胞増殖亢進は、アポトーシスの抑制に起因することが明らかにされている。さらにＲＵＮＸ３ノックアウトマウスの胃粘膜上皮細胞は、ＴＧＦ−βの増殖抑制作用に対して抵抗性を示すことから、粘膜肥厚はＲＵＮＸ３欠損によるＴＧＦ−βシグナル伝達の異常が原因と考えられている（非特許文献１３）。これは、ＴＧＦ−βのノックアウトマウスにおいても、同様に胃粘膜上皮細胞の増殖による粘膜肥厚がみられることからも支持される（非特許文献１４）。また、ヒト食道癌細胞株のＳＥＧ−１細胞でもＲＵＮＸ３が欠損しており、ＴＧＦ−βの増殖抑制作用に対して抵抗性を示すが、ＲＵＮＸ３を発現させると反応性が回復する（非特許文献１５）。これらの事象は、ＲＵＮＸ３がＴＧＦ−βシグナルを介して癌に関与することを示唆する。
【００１９】
ヒトの癌とＲＵＮＸ３との関連性については既にいくつかの報告がある。ＲＵＮＸ３は多くの癌抑制遺伝子が存在する第１染色体（１ｐ３６）上にあり、ここは胃癌、大腸癌、胆管癌、膵臓癌等で頻繁に欠損がみられる領域である。胃癌細胞でのＲＵＮＸ３の発現は癌の進行と共に低下しており、ステージ４の胃癌では約９０％でＲＵＮＸ３の遺伝子発現が低下していた（非特許文献１３）。また、６０％以上の胆管癌、膵臓癌および大腸癌細胞株でＲＵＮＸ３の遺伝子発現が低下していたという報告もある（非特許文献１６および１７）。ＲＵＮＸ３発現低下の原因は、半接合体欠失（ｈｅｍｉｚｙｇｏｕｓ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）およびＲＵＮＸ３のプロモーター領域のメチル化が原因と考えられている。ＲＵＮＸ３の腫瘍形成抑制作用は、移植モデルを使用した動物実験で確認されており、ＲＵＮＸ３欠損ヒト胃癌細胞にＲＵＮＸ３遺伝子を発現させると、ヌードマウス移植後の腫瘍増殖が著しく抑制された（非特許文献１３）。
【００２０】
ＮＥＤＤ４は、蛋白質分解機構であるユビキチンプロテアソームシステムを構成するＨＥＣＴ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｅ６−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ）型ユビキチンリガーゼである。ＮＥＤＤ４は、Ｎ末端領域に膜脂質との結合に関与するＣ２ドメイン、中央部に基質との結合に関与する４つのＷＷドメイン、およびＣ末端領域にユビキチン化の触媒ドメインでありユビキチンリガーゼ活性を示すＨＥＣＴドメインを有する（非特許文献１８）。
【００２１】
ユビキチンプロテアソームシステムは、選択的かつ能動的な蛋白質分解機構であり、細胞周期やシグナル伝達等の様々な生理現象を調節し、それにより蛋白質や細胞の恒常性維持に関与している（非特許文献１９）。ユビキチンは真核生物に存在する進化的に保存された７６アミノ酸残基からなる蛋白質であり、これが標的蛋白質に鎖状に共有結合し、分解シグナルとして作用する。標的蛋白質へのユビキチンの結合はユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）およびユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の連続的な触媒作用で起こる。これら酵素の中で、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）が基質選択性を担う酵素として重要である。ユビキチン化された標的蛋白質は、該蛋白質に鎖状に結合したユビキチンを認識するプロテアソームにより分解される。ユビキチンプロテアソームシステムの異常は、標的蛋白質の過剰な分解による蛋白質の欠乏、あるいは標的蛋白質の分解阻害による蛋白質の蓄積を招き、それにより様々な疾患を引き起こす。具体的には、たとえば癌疾患におけるユビキチンプロテアソームシステムの関与が報告されている（非特許文献２０）。
【００２２】
ＮＥＤＤ４の組織分布は正常組織では筋肉で発現が高い。また、いくつかの癌細胞株においてＮＥＤＤ４の高い発現が確認されている（非特許文献２１）。また、ＮＥＤＤ４は神経細胞の分化とともに発現が減少することが知られている（非特許文献２２）。
【００２３】
ＮＥＤＤ４の基質として、ＮＦ−κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−κＢ）の制御因子であるＢｃｌ１０が報告されている（非特許文献２３）。ＮＥＤＤ４の基質にはその他、アミロイド感受性上皮ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）が知られている（非特許文献２４）。
【００２４】
ＲＵＮＸの安定性に対するユビキチンプロテアソームシステムの関与についていくつかの報告がある。例えば、ＲＵＮＸ２の細胞内での安定性は、ユビキチン化依存的に制御されている（非特許文献３０）。ＲＵＮＸ２のＥ３リガーゼとして既に、ＨＥＣＴ型Ｅ３リガーゼとして知られているＳｍｕｒｆ１（Ｓｍａｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  １）が報告されている（非特許文献３１）。プロテアソームインヒビター処理により、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での骨芽細胞の分化の誘導および個体での骨形成の促進が報告されている（非特許文献３１および３２）。しかしながら、Ｓｍｕｒｆ１のノックアウトマウスにおけるＲＵＮＸ２の発現量およびＳｍａｄシグナルは野生型マウスのものと差はなく、生体内でＲＵＮＸ２がＳｍｕｒｆ１依存的に分解されているかは不明である（非特許文献３３）。また、ＲＵＮＸ３が、Ｓｍｕｒｆ１およびＳｍｕｒｆ２によってユビキチン化され、分解することが報告されている（非特許文献２５）。
【００２５】
しかしながら、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸファミリーのユビキチン化は報告されていない。また、ＮＥＤＤ４とＳｍｕｒｆ１およびＳｍｕｒｆ２との相同性は低く、アミノ酸レベルでそれぞれ３９％および４３％である。
【００２６】
【非特許文献１】ランド（ＬｕｎｄＡ．Ｈ．）ら、「キャンサー  セル（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ）」、２００２年、第１巻、第３号、ｐ．２１３−２１５。
【非特許文献２】オットー（Ｏｔｔｏ  Ｆ．）ら、「ジャーナル  オブ  セルラー  バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００３年、第８９巻、第１号、ｐ．９−１８。
【非特許文献３】ミヨシ（Ｍｉｙｏｓｈｉ  Ｈ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９９１年、第８８巻、第２３号、ｐ．１０４３１−１０４３４。
【非特許文献４】オクダ（Ｏｋｕｄａ  Ｔ．）ら、「セル（Ｃｅｌｌ）」、１９９６年、第８４巻、第２号、ｐ。３２１−３３０。
【非特許文献５】ワン（Ｗａｎｇ  Ｑ．）ら、「セル（Ｃｅｌｌ）」、１９９６年、第８７巻、第４号、ｐ。６９７−７０８。
【非特許文献６】キタバヤシ（Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ  Ｉ．）ら、「エンボ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、１９９８年、第１７巻、第１１号、ｐ．２９９４−３００４。
【非特許文献７】オーサト（Ｏｓａｔｏ  Ｍ．）ら、「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、１９９９年、第９３巻、第６号、ｐ．１８１７−１８２４。
【非特許文献８】オットー（Ｏｔｔｏ  Ｆ．）ら、「セル（Ｃｅｌｌ）」、１９９７年、第８９巻、第５号、ｐ。７６５−７７１。
【非特許文献９】ヴァリアント（Ｖａｌｌｉａｎｔ  Ｆ．）ら、「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、１９９９年、第１８巻、第５０号、ｐ．７１２４−７１３４。
【非特許文献１０】イトー（Ｉｔｏ  Ｙ．）ら、「カレント  オピニオン  イン  ジェネティクス  アンド  ディベロプメント（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」，２００３年、第１３巻、第１号、ｐ．４３−４７。
【非特許文献１１】カワバタ（Ｋａｗａｂａｔａ  Ｍ．）ら、「ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９９年、第１２５巻、第１号、ｐ．９−１６。
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【非特許文献１９】ハーシコ（Ｈｅｒｓｈｋｏ  Ａ．）ら、「アニュアル  レビュー  オブ  バイオケミストリー（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９８年、第６７巻、ｐ．４２５−４７９。
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【非特許文献２６】コモリ（Ｋｏｍｏｒｉ，Ｔ．）「ジャーナル  オブ  セルラー バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００５年、第９５巻、ｐ．４４５−４５３。
【非特許文献２７】ヒメノ（Ｈｉｍｅｎｏ，Ｍ．）ら、「ジャーナル  オブ  ボーン  アンド  ミネラル  リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００２年、第１７巻、ｐ．１２９７−１３０５。
【非特許文献２８】ハナイ（Ｈａｎａｉ，Ｊ．Ｉ．）ら、「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９９年、第２７４巻、ｐ．３１５７７−３１５８２。
【非特許文献２９】コモリ（Ｋｏｍｏｒｉ，Ｔ．）、「ジャーナル  オブ  セルラー バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００２年、第８７巻、ｐ．１−８。
【非特許文献３０】チンタット（Ｔｉｎｔｕｔ，Ｙ．）ら、「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９９年、第２７４巻、ｐ．２８８７５−２８８７９。
【非特許文献３１】ザオ（Ｚｈａｏ  Ｍ．）ら、「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００３年、第２７８巻、ｐ．２７９３９−２７９４４。
【非特許文献３２】ガレット（Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｉ．Ｒ．）ら、「ザ  ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、２００３年、第１１１巻、ｐ．１７７１−１７８２。
【非特許文献３３】ヤマシタ（Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｍ．）ら、「セル（Ｃｅｌｌ）」、２００５年、第１２１巻、ｐ．１０１−１１３。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
ＲＵＮＸは、転写因子として作用し、正常な分化や腫瘍形成に重要な役割を果たす蛋白質である。ＲＵＮＸの異常により、例えば、分化の異常や腫瘍形成が引き起こされる。したがって、ＲＵＮＸの作用を調節することにより、ＲＵＮＸの異常に起因する疾患を予防および／または治療できる。
【００２８】
本発明の課題は、ＲＵＮＸと相互作用してその作用を調節する蛋白質を見出して提供することである。また、本発明の課題には、ＲＵＮＸの作用を調節する手段を提供することが含まれる。さらに、本発明の課題には、ＲＵＮＸの異常に起因する疾患、例えば癌疾患の予防および／または治療に有用な手段を提供することが含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、ＨＥＣＴ型Ｅ３リガーゼであるＮＥＤＤ４がＲＵＮＸ３と相互作用することをインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で予測した。
【００３０】
そして、ＮＥＤＤ４がＲＵＮＸをユビキチン化し、それによりＲＵＮＸの安定性を低下させることを実証した。具体的には、（１）ＮＥＤＤ４がＲＵＮＸ３と細胞内で結合すること、（２）ＮＥＤＤ４によりＲＵＮＸ３が細胞内でユビキチン化されること、および（３）ＮＥＤＤ４によりＲＵＮＸ３の安定性が低下することを実証した。さらに、（４）ＮＥＤＤ４がＲＵＮＸ１と細胞内で結合すること、（５）ＮＥＤＤ４によりＲＵＮＸ１がユビキチン化されること、および（６）ＮＥＤＤ４によりＲＵＮＸ１の安定性が低下することを実証した。また、（７）癌細胞では、Ｎ末端側のアミノ酸残基が欠失している短鎖型ＮＥＤＤ４が発現していることを見出し、（８）短鎖型ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２およびＲＵＮＸ３とがそれぞれ結合すること、および（９）短鎖型ＮＥＤＤ４によりＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２およびＲＵＮＸ３がユビキチン化されることを実証した。
【００３１】
本発明における実証結果から、ＮＥＤＤ４がＲＵＮＸと結合してＲＵＮＸのユビキチン化を触媒し、その結果ユビキチン化されたＲＵＮＸがユビキチンプロテアソームシステムにより分解されてその安定性が低下すると考える。ＲＵＮＸの分解が、ＮＥＤＤ４が関与するユビキチンプロテアソームシステムにより調節されることにより、ＲＵＮＸの機能、例えば転写因子としての機能が調節され、その結果、ＲＵＮＸが関与する様々な生理現象、例えば細胞周期やシグナル伝達等が調節される。
【００３２】
したがって、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を調節することにより、ＲＵＮＸの分解を調節でき、それによりＲＵＮＸの機能、例えば転写因子としての機能を調節できる。ＲＵＮＸの機能を調節することにより、ＲＵＮＸの異常に起因する疾患を予防および／または治療できる。
【００３３】
具体的には、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害することにより、ＲＵＮＸのユビキチンプロテアソームシステムによる分解を阻害できるため、ＲＵＮＸの低減を阻害できる。ＲＵＮＸの低減を阻害することにより、ＲＵＮＸが関与する生理現象を回復できるため、ＲＵＮＸの低減やその機能の低減に起因する疾患を予防および／または治療できる。また、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を促進することにより、ＲＵＮＸのユビキチンプロテアソームシステムによる分解を促進できるため、ＲＵＮＸを低減させることができる。ＲＵＮＸを低減させることにより、ＲＵＮＸが関与する生理現象を阻害できるため、ＲＵＮＸの増加やその機能の亢進に起因する疾患を予防および／または治療できる。
【００３４】
本発明においてはまた、ＮＥＤＤ４または短鎖型ＮＥＤＤ４がＲＵＮＸと結合してＲＵＮＸのユビキチン化を触媒するのに対し、ＲＵＮＸと結合するがＥ３リガーゼ活性を有さない不活性型ＮＥＤＤ４および不活性型短鎖ＮＥＤＤ４はＲＵＮＸをユビキチン化しないことを実証した。不活性型ＮＥＤＤ４および不活性型短鎖ＮＥＤＤ４は、いずれもＲＵＮＸと結合するがＥ３リガーゼ活性を有さないことから、ＮＥＤＤ４または短鎖型ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとの結合を拮抗的に阻害し、その結果、ＮＥＤＤ４または短鎖型ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害すると考える。
【００３５】
このように、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化には、ＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性が重要であること、またＲＵＮＸと結合するがＥ３リガーゼ活性を有さないＮＥＤＤ４不活性型変異体によりＲＵＮＸのユビキチン化を阻害できることが明らかになった。
【００３６】
また本発明において、ＲＵＮＸと結合するがＥ３リガーゼ活性を有さないＮＥＤＤ４不活性型変異体、および、ＮＥＤＤ４の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）が、骨形成のモデル細胞においてＢＭＰ刺激による骨分化を促進することを見出した。
【００３７】
このことから、ＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害することにより、骨分化を促進し、その結果、骨形成を促進できると考える。
【００３８】
本発明は、これら知見により完成した。
【００３９】
すなわち本発明は、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４とを共存させることを特徴とするＲＵＮＸのユビキチン化方法に関する。
【００４０】
また本発明は、ＲＵＮＸが、ヒトＲＵＮＸ１、ヒトＲＵＮＸ２およびヒトＲＵＮＸ３から選ばれるいずれか１である前記ＲＵＮＸのユビキチン化方法に関する。
【００４１】
さらに本発明は、ＮＥＤＤ４を含んでなるＲＵＮＸのユビキチン化剤に関する。
【００４２】
さらにまた本発明は、ＲＵＮＸが、ヒトＲＵＮＸ１、ヒトＲＵＮＸ２およびヒトＲＵＮＸ３から選らばれるいずれか１である前記ＲＵＮＸのユビキチン化剤に関する。
【００４３】
また本発明は、前記ＲＵＮＸのユビキチン化方法を使用することを特徴とするＲＵＮＸの分解方法に関する。
【００４４】
さらに本発明は、前記ＲＵＮＸのユビキチン化剤を使用してＲＵＮＸを処理することを特徴とするＲＵＮＸの分解方法に関する。
【００４５】
さらにまた本発明は、ＮＥＤＤ４を含んでなるＲＵＮＸの分解剤に関する。
【００４６】
また本発明は、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合を阻害することを特徴とするＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法に関する。
【００４７】
さらに本発明は、配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質および／または配列番号１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を使用することを特徴とする前記ＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法に関する。
【００４８】
さらにまた本発明は、ＮＥＤＤ４の酵素活性を阻害することを特徴とするＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法に関する。
【００４９】
また本発明は、ＮＥＤＤ４の発現を阻害することを特徴とするＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法に関する。
【００５０】
さらに本発明は、ＲＵＮＸが、ヒトＲＵＮＸ１、ヒトＲＵＮＸ２およびヒトＲＵＮＸ３から選ばれるいずれか１である前記いずれかのＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法に関する。
【００５１】
さらにまた本発明は、配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質および／または配列番号１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を含んでなるＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤に関する。
【００５２】
また本発明は、ＲＵＮＸが、ヒトＲＵＮＸ１、ヒトＲＵＮＸ２およびヒトＲＵＮＸ３から選らばれるいずれか１である前記ＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤に関する。
【００５３】
さらに本発明は、前記いずれかのＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法を使用することを特徴とするＲＵＮＸの分解阻害方法に関する。
【００５４】
さらにまた本発明は、前記ＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤を使用することを特徴とするＲＵＮＸの分解阻害方法に関する。
【００５５】
また本発明は、配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質および／または配列番号１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を含んでなるＲＵＮＸの分解阻害剤に関する。
【００５６】
さらに本発明は、ＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害することを特徴とする骨形成促進方法に関する。
【００５７】
さらにまた本発明は、配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質および／または配列番号１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を使用することを特徴とする骨形成促進方法に関する。
【００５８】
また本発明は、ＮＥＤＤ４の発現を阻害し得るｓｉＲＮＡを使用することを特徴とする骨形成促進方法に関する。
【００５９】
さらに本発明は、配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質および／または配列番号１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を含んでなる骨形成促進剤に関する。
【００６０】
さらにまた本発明は、ＮＥＤＤ４の発現を阻害し得るｓｉＲＮＡを含んでなる骨形成促進剤に関する。
【００６１】
また本発明は、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法であって、ＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸとある化合物（被検化合物）とを接触させ、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を使用し、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害するか否かまたは促進するか否かを決定する工程を含む同定方法に関する。
【００６２】
さらに本発明は、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法であって、ＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸとある化合物とを接触させ、次いで、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を使用して、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物がＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害するか否かまたは促進するか否かを決定する工程を含む同定方法に関する。
【００６３】
さらにまた本発明は、骨形成を促進させ得る化合物の同定方法であって、被検化合物がＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害するか否かを測定する工程を含む方法に関する。
【００６４】
また本発明は、ＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害することが明らかになった被検化合物が、骨形成を促進させ得るか否かを測定する工程をさらに含む、前記同定方法に関する。
【００６５】
さらに本発明は、骨形成を促進させ得る化合物の同定方法であって、ＮＥＤＤ４をコードするポリヌクレオチドと被検化合物とを接触させ、次いで、ＮＥＤＤ４を測定することにより、該被検化合物がＮＥＤＤ４の発現を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法に関する。
【００６６】
さらにまた本発明は、ＮＥＤＤ４の発現を阻害することが明らかになった被検化合物が、骨形成を促進させ得るか否かを測定する工程をさらに含む、前記同定方法に関する。
【００６７】
また本発明は、骨形成を促進させ得る化合物の同定方法であって、ＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸと被検化合物とを接触させ、ＮＥＤＤ４によるＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸのユビキチン化を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を使用して、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該被検化合物がＮＥＤＤ４によるＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸのユビキチン化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法に関する。
【００６８】
さらに本発明は、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害することが明らかになった被検化合物が、骨形成を促進させ得るか否かを測定する工程をさらに含む、前記同定方法に関する。
【００６９】
さらにまた本発明は、骨形成を促進させ得る化合物の同定方法であって、ＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸと被検化合物とを接触させ、次いで、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を使用して、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該被検化合物がＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法に関する。
【００７０】
また本発明は、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害することが明らかになった被検化合物が、骨形成を促進させ得るか否かを測定する工程をさらに含む、前記同定方法に関する。
【００７１】
さらに本発明は、ＮＥＤＤ４、ＮＥＤＤ４をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つ、およびＲＵＮＸ、ＲＵＮＸをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つを含有してなる試薬キットに関する。
【００７２】
さらにまた本発明は、前記ＲＵＮＸのユビキチン化剤および／または前記ＲＵＮＸの分解剤を有効量含んでなる、ＲＵＮＸの機能および／または発現の亢進に起因する疾患の予防および／または治療剤に関する。
【００７３】
また本発明は、前記ＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤および／または前記ＲＵＮＸの分解阻害剤を有効量含んでなる、ＲＵＮＸの機能および／または発現の低下に起因する疾患の予防および／または治療剤に関する。
【００７４】
さらに本発明は、前記ＲＵＮＸのユビキチン化方法、前記ＲＵＮＸのユビキチン化剤、前記ＲＵＮＸの分解方法、および前記ＲＵＮＸの分解剤のうち少なくともいずれか１の方法または剤を使用することを特徴とするＲＵＮＸの機能および／または発現の亢進に起因する疾患の予防および／または治療方法に関する。
【００７５】
さらにまた本発明は、前記いずれかのＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法、前記ＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤、前記ＲＵＮＸの分解阻害方法、および前記ＲＵＮＸの分解阻害剤のうち少なくともいずれか１の方法または剤を使用することを特徴とするＲＵＮＸの機能および／または発現の低下に起因する疾患の予防および／または治療方法に関する。
【００７６】
また本発明は、前記骨形成促進剤を有効量含んでなる、骨損失を伴う疾患の予防および／または治療剤に関する。
【００７７】
さらに本発明は、前記骨形成促進剤および前記骨形成促進方法のうち少なくともいずれか１の剤または方法を使用することを特徴とする骨損失を伴う疾患の予防および／または治療方法に関する。
【発明の効果】
【００７８】
本発明により、ＲＵＮＸのユビキチン化方法および分解方法を提供できる。例えば、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４とを共存させることを特徴とするＲＵＮＸのユビキチン化方法および分解方法を提供できる。また、ＲＵＮＸのユビキチン化剤および分解剤を提供できる。さらに本発明により、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化および分解、の阻害方法を提供できる。例えば、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合、ＮＥＤＤ４の酵素活性、およびＮＥＤＤ４の発現のうちの少なくとも１を阻害することを特徴とする、ＲＵＮＸのユビキチン化および分解、の阻害方法を提供できる。また、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化の阻害剤およびＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸの分解の阻害剤を提供できる。さらに、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法、並びにＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法を提供できる。また、ＮＥＤＤ４、ＮＥＤＤ４をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つと、ＲＵＮＸ、ＲＵＮＸをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つとを含んでなる試薬キットを提供できる。さらに、ＲＵＮＸの異常に起因する疾患、例えばＲＵＮＸの機能および／または発現の亢進や低下に起因する疾患、具体的には癌疾患等の予防および／または治療剤、並びに予防および／または治療方法を提供できる。
【００７９】
また本発明により、ＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害することを特徴とする骨形成促進方法および骨形成促進剤を提供できる。さらに本発明により、骨形成を促進させ得る化合物の同定方法を提供できる。また、骨損失を伴う疾患の予防および／または治療剤、並びに予防および／または治療方法を提供できる。
【００８０】
したがって、本発明により、ＲＵＮＸのユビキチン化を、例えばＮＥＤＤ４を使用して実施できる。また、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を促進する化合物の同定方法により取得された化合物を使用して促進できる。ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を促進することにより、ＲＵＮＸの分解を促進できるため、ＲＵＮＸの増加やその機能の亢進に起因する疾患の予防および／または治療が期待できる。
【００８１】
また、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を、例えばＲＵＮＸに結合するがＥ３リガーゼ活性を有さない不活性型ＮＥＤＤ４変異体を使用してＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとの結合を阻害することにより、阻害できる。また、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物の同定方法により取得された化合物を使用して阻害できる。ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害することにより、ＲＵＮＸの分解を阻害できるため、ＲＵＮＸの低減やその機能の低減に起因する疾患の予防および／または治療が期待できる。
【００８２】
さらに、骨形成、例えばＢＭＰ−２刺激による骨形成を、例えばＲＵＮＸに結合するがＥ３リガーゼ活性を有さない不活性型ＮＥＤＤ４変異体、または、ＮＥＤＤ４の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るｓｉＲＮＡを使用して促進できる。また、骨形成、例えばＢＭＰ−２刺激による骨形成を、本発明に係る骨形成を促進させ得る化合物の同定方法により取得された化合物を使用して促進できる。これら骨形成を促進させ得る化合物を使用することにより、骨損失を伴う疾患の予防および／または治療が期待できる。
【００８３】
このように、ＮＥＤＤ４または短鎖型ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を調節することにより、ＲＵＮＸの分解を調節でき、その結果、ＲＵＮＸの機能、例えば転写因子としての機能を調節できる。ＲＵＮＸの機能を調節することにより、ＲＵＮＸの異常に起因する疾患の予防および／または治療が期待できる。また、ＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害することにより、骨形成を促進でき、骨損失を伴う疾患の予防および／または治療が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８４】
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。
本明細書においては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。
【００８５】
本発明においては、ＲＵＮＸ３がＨＥＣＴ型Ｅ３リガーゼであるＮＥＤＤ４と相互作用する可能性をインシリコで予測し、さらにその可能性を実験的に検証した。その結果、（１）ＮＥＤＤ４がＲＵＮＸ３と細胞内で結合すること、（２）ＮＥＤＤ４によりＲＵＮＸ３が細胞内でユビキチン化されること、および（３）ＮＥＤＤ４によりＲＵＮＸ３の安定性が低下することを実証した。さらに、（４）ＮＥＤＤ４がＲＵＮＸ１と細胞内で結合すること、（５）ＮＥＤＤ４によりＲＵＮＸ１がユビキチン化されること、および（６）ＮＥＤＤ４によりＲＵＮＸ１の安定性が低下することを実証した。また、（７）癌細胞では、Ｎ末端側のアミノ酸残基が欠失している短鎖型ＮＥＤＤ４が発現していることを見出し、（８）短鎖型ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２およびＲＵＮＸ３とがそれぞれ結合すること、および（９）短鎖型ＮＥＤＤ４によりＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２およびＲＵＮＸ３がユビキチン化されることを実証した。
【００８６】
本実証結果から、ＮＥＤＤ４がＲＵＮＸと結合してＲＵＮＸのユビキチン化を触媒し、その結果ユビキチン化されたＲＵＮＸがユビキチンプロテアソームシステムにより分解されてその安定性が低下すると発明者らは考えている。
【００８７】
ＲＵＮＸの分解が、ＮＥＤＤ４が関与するユビキチンプロテアソームシステムにより調節されることにより、ＲＵＮＸの機能、例えば転写因子としての機能が調節され、その結果、ＲＵＮＸが関与する様々な生理現象、例えば細胞周期やシグナル伝達等が調節される。
【００８８】
したがって、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を調節することにより、ＲＵＮＸの分解を調節でき、それによりＲＵＮＸの機能、例えば転写因子としての機能を調節できる。ＲＵＮＸの機能を調節することにより、ＲＵＮＸの異常に起因する疾患を予防および／または治療できる。
【００８９】
「ユビキチン化」とは、１分子の蛋白質に１以上のユビキチンが共有結合することによる、ユビキチンによる該蛋白質の修飾を意味する。ユビキチンは、標的蛋白質内のリジン残基に共有結合する。蛋白質のユビキチン化と同様、標的蛋白質内のリジン残基に結合したユビキチン内のリジン残基に、別のユビキチンがさらに共有結合することにより、蛋白質には複数のユビキチンが鎖状に結合する。
【００９０】
「ユビキチン」は、真核生物に普遍的に存在するアミノ酸７６個からなる蛋白質であり、進化的に保存性が高い。ユビキチンは、蛋白質分解機構として知られているユビキチンプロテアソームシステムにおいて、標的蛋白質に鎖状に共有結合することにより、蛋白質分解の標識として働く。すなわち、蛋白質がユビキチン化されると、該蛋白質に鎖状に結合したユビキチンが該蛋白質の分解の標識となり、該標識を認識するプロテアソームにより該蛋白質が分解される。
【００９１】
標的蛋白質へのユビキチンの結合はユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）およびユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の連続的な触媒作用で起こる。これら酵素の中で、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）が基質選択性を担う酵素として重要である。ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）は、Ｅ３リガーゼとも称する。
【００９２】
ここで「標的蛋白質」とは、ユビキチン化される蛋白質を意味する。「基質」とは、酵素によって触媒作用を受ける分子を意味する。
【００９３】
「ユビキチンプロテアソームシステム」は、選択的かつ能動的な蛋白質分解機構であり、細胞周期やシグナル伝達等の様々な生理現象を調節し、それにより蛋白質や細胞の恒常性維持に関与している（非特許文献１９）。ユビキチン化された標的蛋白質は、該蛋白質に鎖状に結合したユビキチンを認識するプロテアソームにより分解される。ユビキチンプロテアソームシステムの異常は、標的蛋白質の過剰な分解による蛋白質の欠乏、あるいは標的蛋白質の分解阻害による蛋白質の蓄積を招き、それにより様々な疾患を引き起こす。具体的には例えば、癌疾患におけるユビキチンプロテアソームシステムの関与が報告されている（非特許文献２０）。
【００９４】
「ＮＥＤＤ４」は、蛋白質分解機構であるユビキチンプロテアソームシステムに関与するＨＥＣＴ型Ｅ３リガーゼである。ＮＥＤＤ４は、膜脂質との結合に関与するＣ２ドメイン、基質との結合に関与する４つのＷＷドメイン、およびユビキチン化の触媒ドメインでありＥ３リガーゼ活性を示すＨＥＣＴドメインを有する（非特許文献１８）。
【００９５】
ＮＥＤＤ４が関与する蛋白質ユビキチン化において、ＮＥＤＤ４の基質として、例えばＲＵＮＸを挙げることができる。また、Ｅ３リガーゼの多くが自己ユビキチン化作用を有することから、ＮＥＤＤ４の基質として、自己蛋白質を挙げることができる。
【００９６】
本明細書において、単にＮＥＤＤ４と称するときは、Ｅ３リガーゼ活性を有する野生型のＮＥＤＤ４を意味する。
【００９７】
「Ｅ３リガーゼ活性」とは、蛋白質のユビキチン化において、標的蛋白質を基質として認識し、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）により活性化されユビキチン結合酵素（Ｅ２）に結合したユビキチンを、標的蛋白質に結合させる作用を意味する。
【００９８】
ＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性は、具体的には例えば、ＲＵＮＸのユビキチン化において、ＲＵＮＸを基質として認識し、そして、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）により活性化されユビキチン結合酵素（Ｅ２）に結合したユビキチンをＲＵＮＸに結合させる、ＮＥＤＤ４の作用である。また、ＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性とは、具体的には例えば、自己蛋白質のユビキチン化において、自己蛋白質を基質として認識し、そして、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）により活性化されユビキチン結合酵素（Ｅ２）に結合したユビキチンを自己蛋白質に結合させる、ＮＥＤＤ４の作用である。
【００９９】
Ｅ３リガーゼ活性の測定は、Ｅ３リガーゼによる標的蛋白質へのユビキチンの結合を指標にして実施できる。標的蛋白質へのユビキチンの結合は、ユビキチン化された標的蛋白質の検出により測定できる。ユビキチン化された標的蛋白質の検出は、公知のウエスタンブロッティング等の方法により実施できる（実施例３、５、８および９参照）。
【０１００】
ＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性の測定は、具体的には例えば、基質としてＲＵＮＸを用い、ユビキチン化されたＲＵＮＸを検出することにより実施できる。または、基質として自己蛋白質を用い、ユビキチン化された自己蛋白質を検出することによっても実施できる。
【０１０１】
ＮＥＤＤ４は、好ましくは例えば、配列番号１に記載の塩基配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質である。配列番号１に記載の塩基配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、好ましくは配列番号２に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質である。配列番号２に記載のアミノ酸配列は、Ｓｗｉｓｓ  ｐｌｏｔデータベースにＰ４６９３４として登録されている。
【０１０２】
ＮＥＤＤ４は、上記蛋白質に制限されず、配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と配列相同性を有し、かつ該蛋白質と同様の構造的特徴および生物学的機能を有する蛋白質である限りにおいていずれの蛋白質も包含される。また、ＮＥＤＤ４をコードする遺伝子は、上記ポリヌクレオチドに制限されず、配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと配列相同性を有し、かつ該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同様の構造的特徴や生物学的機能を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限りにおいていずれのポリヌクレオチドも包含される。
【０１０３】
配列相同性は、通常、アミノ酸配列または塩基配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、またさらにより好ましくは９５％以上であることが適当である。
【０１０４】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と配列相同性を有する蛋白質には、該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列において、１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、付加または挿入といった変異が存するアミノ酸配列で表される蛋白質が含まれる。また、配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと配列相同性を有するポリヌクレオチドには、該塩基配列において、１個以上、例えば１〜３００個、好ましくは１〜９０個、より好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜３０個、特に好ましくは１〜数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列で表されるポリヌクレオチドが含まれる。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する蛋白質あるいは該変異を有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が、配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同様の構造的特徴および生物学的機能を有するものである限り特に制限されない。変異を有する蛋白質およびポリヌクレオチドは天然に存在するものであってよく、また人工的に変異を導入したものであってもよい。
【０１０５】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の構造的特徴は、例えば、膜脂質との結合に関与するＣ２ドメイン、基質との結合に関与するＷＷドメイン、およびユビキチン化の触媒ドメインでありＥ３リガーゼ活性を示すＨＥＣＴドメインである。配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同様の構造的特徴とは、該蛋白質に存在する上記ドメインと配列相同性を有しかつ同様の機能を有するドメインを意味する。ドメインの配列相同性は、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、またさらにより好ましくは９５％以上であることが適当である。
【０１０６】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の生物学的機能は、例えば、Ｅ３リガーゼ活性である。
【０１０７】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と配列相同性を有し、かつ該蛋白質と同様の構造的特徴および生物学的機能を有する蛋白質は、好ましくは例えば、配列番号３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質である。配列番号３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、好ましくは配列番号４に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質である。配列番号３に記載の塩基配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースにそれぞれアクセッションナンバーＮＭ＿００６１５４およびＮＰ＿００６１４５として登録されている。
【０１０８】
配列番号３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＮ末端側第１番目から第１００番目の１００個のアミノ酸残基が欠失した蛋白質である。言い換えれば、配列番号３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質のＮ末端側第１番目から第１００番目の１００個のアミノ酸残基が欠失した蛋白質である。
【０１０９】
配列番号３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を、「短鎖型ＮＥＤＤ４」と称することがある。それに対し、配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を「全長ＮＥＤＤ４」と称することがある。
【０１１０】
「短鎖型ＮＥＤＤ４」は、全長ＮＥＤＤ４においてそのＮ末端側のアミノ酸残基が欠失しているが、全長ＮＥＤＤ４と同様、Ｃ２ドメイン、ＷＷドメインおよびＨＥＣＴドメインを有し、ＨＥＣＴ型Ｅ３リガーゼとして機能する蛋白質である。
【０１１１】
本明細書において、単に短鎖型ＮＥＤＤ４と称するときは、Ｅ３リガーゼ活性を有する短鎖型ＮＥＤＤ４を意味する。
【０１１２】
「ＲＵＮＸ」は、Ｒｕｎｔドメインを有することを特徴とする蛋白質であり、ＰＥＢＰ２β／ＣＢＦβとヘテロ二量体を形成し、転写因子として作用する。ＲＵＮＸには数々のファミリー蛋白質が知られている。哺乳動物では３種類のファミリー蛋白質、すなわちＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２およびＲＵＮＸ３が知られている（非特許文献１および２）。ヒトＲＵＮＸ３とヒトＲＵＮＸ１およびヒトＲＵＮＸ２との相同性は、アミノ酸レベルでそれぞれ５７％および５４％である。
【０１１３】
本発明においてＲＵＮＸは、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２およびＲＵＮＸ３のいずれであってもよい。
【０１１４】
ＲＵＮＸ１は、好ましくは例えば、配列番号５に記載の塩基配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質である。配列番号５に記載の塩基配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、好ましくは配列番号６に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質である。配列番号５に記載の塩基配列および配列番号６に記載のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースにそれぞれアクセッションナンバーＮＭ＿００１７５４およびＮＰ＿００１７４５として登録されている。
【０１１５】
ＲＵＮＸ２は、好ましくは例えば、配列番号７に記載の塩基配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質である。配列番号７に記載の塩基配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、好ましくは配列番号８に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質である。配列番号７に記載の塩基配列および配列番号８に記載のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースにそれぞれアクセッションナンバーＮＭ＿００４３４８およびＮＰ＿００４３３９として登録されている。
【０１１６】
ＲＵＮＸ３は、好ましくは例えば、配列番号９に記載の塩基配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質である。配列番号９に記載の塩基配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、好ましくは配列番号１０に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質である。配列番号９に記載の塩基配列および配列番号１０に記載のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースにそれぞれアクセッションナンバーＮＭ＿００４３５０およびＮＰ＿００４３４１として登録されている。
【０１１７】
ＲＵＮＸは、上記蛋白質に制限されず、配列番号５、７および９のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と配列相同性を有し、かつ該蛋白質と同様の構造的特徴および生物学的機能を有する蛋白質である限りにおいていずれの蛋白質も包含される。また、ＲＵＮＸをコードする遺伝子は、上記ポリヌクレオチドに制限されず、配列番号５、７および９のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと配列相同性を有し、かつ該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同様の構造的特徴や生物学的機能を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限りにおいていずれのポリヌクレオチドも包含される。
【０１１８】
配列相同性は、通常、アミノ酸配列または塩基配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、またさらにより好ましくは９５％以上であることが適当である。
【０１１９】
配列番号５、７および９のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と配列相同性を有する蛋白質には、該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列において、１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、付加または挿入といった変異が存するアミノ酸配列で表される蛋白質が含まれる。また、配列番号５、７および９のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと配列相同性を有するポリヌクレオチドには、該塩基配列において、１個以上、例えば１〜３００個、好ましくは１〜９０個、より好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜３０個、特に好ましくは１〜数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列で表されるポリヌクレオチドが含まれる。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する蛋白質あるいは該変異を有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が、配列番号５、７および９のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同様の構造的特徴および生物学的機能を有するものである限り特に制限されない。変異を有する蛋白質およびポリヌクレオチドは天然に存在するものであってよく、また人工的に変異を導入したものであってもよい。
【０１２０】
配列番号５、７および９のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の構造的特徴は、例えばＲｕｎｔドメインである。配列番号５、７および９のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の構造的特徴とは、該蛋白質に存在するＲｕｎｔドメインと配列相同性を有しかつ同様の機能を有するＲｕｎｔドメインを意味する。Ｒｕｎｔドメインの配列相同性は、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、またさらにより好ましくは９５％以上であることが適当である。
【０１２１】
配列番号５、７および９のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の生物学的機能は、例えば転写因子活性である。
【０１２２】
「転写因子活性」とは、ＤＮＡからＲＮＡを合成する転写反応において、該ＤＮＡ内の特徴的な塩基配列を認識して結合し、直接または間接に転写装置（真核生物における基本転写因子群を含む）に作用して、転写を正または負に調節する作用を意味する。
【０１２３】
転写因子活性の測定は、公知の転写活性測定方法を使用して実施できる。ＲＵＮＸはＰＥＢＰ２β／ＣＢＦβと二量体を形成して転写因子として様々な遺伝子の発現に関与している（非特許文献２）。ＲＵＮＸの転写因子活性の測定は、例えば、この二量体が転写因子として作用する遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー部位の下流に、該遺伝子の代わりにレポーター遺伝子を連結したベクターを作成し、該ベクターをトランスフェクションした細胞、例えば真核細胞等とＲＵＮＸとを接触させ、レポーター遺伝子の発現の有無および変化を測定することにより実施できる。レポーター遺伝子として、レポーターアッセイで一般的に使用されている遺伝子を使用できる。例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子を使用できる。レポーター遺伝子の発現の測定は、その遺伝子産物自体または該遺伝子産物の活性を検出することにより実施できる。例えば、上記のようなレポーター遺伝子の発現は、その遺伝子産物自体または該遺伝子産物の酵素活性を検出することにより測定できる。
【０１２４】
（ＲＵＮＸのユビキチン化方法、分解方法、ユビキチン化剤および分解剤）
本発明の一態様は、ＮＥＤＤ４を使用することを特徴とするＲＵＮＸのユビキチン化方法、および該方法を使用することを特徴とするＲＵＮＸの分解方法に関する。
【０１２５】
また、本発明の一態様は、ＮＥＤＤ４を含んでなるＲＵＮＸのユビキチン化剤およびＲＵＮＸの分解剤に関する。
【０１２６】
さらに、本発明の一態様は、ＲＵＮＸのユビキチン化剤を使用してＲＵＮＸを処理することを特徴とするＲＵＮＸの分解方法に関する。
【０１２７】
ＮＥＤＤ４を使用することを特徴とするＲＵＮＸのユビキチン化方法および該方法を使用することを特徴とするＲＵＮＸの分解方法は、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとを共存させることにより実施できる。
【０１２８】
ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとの共存は、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）およびインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）のいずれの条件においても実施できる。
【０１２９】
ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとの共存は好ましくは細胞において実施できる。具体的には、ＲＵＮＸを発現していることが認められた真核細胞または培養細胞株を使用し、該細胞または細胞株にＮＥＤＤ４をコードするポリヌクレオチドを含むベクターをトランスフェクションしてＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとを共存させることにより、ＲＵＮＸのユビキチン化方法および該方法を使用することを特徴とするＲＵＮＸの分解方法を実施できる（実施例３、５、８および９参照）。また、ＲＵＮＸを発現していない真核細胞または培養細胞株を使用し、該細胞または細胞株にＮＥＤＤ４をコードするポリヌクレオチドを含むベクターおよびＲＵＮＸをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを共にトランスフェクションしてＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとを共存させることにより、ＲＵＮＸのユビキチン化方法および該方法を使用することを特徴とするＲＵＮＸの分解方法を実施できる。
【０１３０】
ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとを細胞において共存させてＲＵＮＸのユビキチン化方法および該方法を使用することを特徴とするＲＵＮＸの分解方法を実施するとき、上記のようにＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとを発現しているまたは発現させた細胞に、さらにユビキチンをコードするポリヌクレオチドを含むベクターをトランスフェクションすることができる。
【０１３１】
ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとの共存をインビトロで実施する場合、標的蛋白質のユビキチン化反応にはＮＥＤＤ４以外に、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）およびユビキチンが必要とされるため、これら酵素およびユビキチンをＮＥＤＤ４と共に使用することが適当である。また、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸの分解方法を実施する場合、ユビキチン化された標的蛋白質の分解にはプロテアソームが関与しているため、プロテアソームをこれら酵素やユビキチンと共に使用することが好ましい。プロテアソームは、プロテアソームを有する細胞から調製できる。好ましい細胞として、例えば、ヒト赤血球を使用できる。プロテアソームの調製は、エマーリッチらの方法（「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２０００年、第２７５巻、ｐ．２１１４０−２１１４８）に従って実施できる。あるいは、市販のプロテアソームを使用することもできる。例えば、アフィニティーリサーチプロダクツ社（ＡＦＦＩＮＩＴＩ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）からプロテアソームを購入できる。
【０１３２】
ユビキチン化の検出は、ユビキチン化された標的蛋白質の検出により測定できる。ユビキチン化された標的蛋白質の検出は、公知のウエスタンブロッティング等の方法により実施できる（実施例３、５、８および９参照）。標的蛋白質のユビキチン化反応を行なう前と比較して、ユビキチン化反応を行った後に、分子量が増加した標的蛋白質が検出された場合、該標的蛋白質はユビキチン化されたと判定できる。
【０１３３】
蛋白質の分解の検出は、公知のウエスタンブロッティング等の方法により実施できる（実施例４、６、８および９参照）。標的蛋白質のユビキチン化反応を行なう前と比較して、ユビキチン化反応を行った後に、標的蛋白質量が低減した場合、該標的蛋白質は分解されたと判定できる。
【０１３４】
ＲＵＮＸのユビキチン化剤およびＲＵＮＸの分解剤は、ＮＥＤＤ４を含んでなることを特徴とする。本発明に係るＲＵＮＸのユビキチン化剤を使用して、ＲＵＮＸのユビキチン化方法およびＲＵＮＸの分解方法を実施できる。
【０１３５】
（ＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法、分解阻害方法、ユビキチン化阻害剤および分解阻害剤）
本発明の一態様は、ＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法、および該阻害方法を使用することを特徴とするＲＵＮＸの分解阻害方法に関する。ＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法、および該阻害方法を使用することを特徴とするＲＵＮＸの分解阻害方法は、インビボおよびインビトロのいずれの条件においても実施できる。
【０１３６】
また、本発明の一態様は、ＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤、および分解阻害剤に関する。
【０１３７】
さらに、本発明の一態様は、ＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤を使用することを特徴とするＲＵＮＸの分解阻害方法に関する。
【０１３８】
ＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法は、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合、ＮＥＤＤ４の酵素活性、およびＮＥＤＤ４の発現のうちの少なくとも１を阻害することにより実施できる。ＲＵＮＸのユビキチン化が阻害されれば、ＲＵＮＸがプロテアソームにより認識されなくなるため、ＲＵＮＸのユビキチンプロテアソームシステムによる分解が阻害できる。
【０１３９】
具体的には、ＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法は、例えばＲＵＮＸとＮＥＤＤ４との結合を阻害する化合物、ＮＥＤＤ４の酵素活性を阻害する化合物、およびＮＥＤＤ４の発現を阻害する化合物のうちの少なくとも１を使用することにより実施できる。ここでは、このような阻害効果を有する化合物（例えば競合阻害効果を有するポリペプチド類、抗体および低分子化合物等を挙げられる）を阻害剤と称する。
【０１４０】
「ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合」とは、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４とが、複合体を形成するように、水素結合、疎水結合または静電的相互作用等の非共有結合により相互作用することを意味する。ここでの結合とは、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４がその一部分において結合すれば足りる。例えば、ＲＵＮＸまたはＮＥＤＤ４を構成するアミノ酸の中に、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４との結合に関与しないアミノ酸が含まれていてもよい。
【０１４１】
ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４との結合の測定は、ウエスタンブロッティング、免疫沈降法、プルダウン法、ツーハイブリッド法および蛍光共鳴エネルギー転移法等の自体公知の方法により実施できる。これらの方法は、組合わせて利用することができる。
【０１４２】
ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合を阻害する化合物は、好ましくは当該結合を特異的に阻害する化合物、より好ましくは当該結合を特異的に阻害する低分子量化合物である。ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合を特異的に阻害するとは、当該結合を強く阻害するが、他の蛋白質間結合は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。
【０１４３】
ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合を阻害する化合物は、例えば、ＮＥＤＤ４の不活性型変異体（以下、不活性型ＮＥＤＤ４と称することがある）であり得る。好ましい不活性型ＮＥＤＤ４として、ＲＵＮＸとの結合能を有するが、Ｅ３リガーゼ活性を有さない不活性型ＮＥＤＤ４を使用できる。このような不活性型ＮＥＤＤ４は、野生型のＮＥＤＤ４と拮抗してＲＵＮＸと結合することにより、ＲＵＮＸに対するＮＥＤＤ４の作用を阻害できる。したがって、このような不活性型ＮＥＤＤ４は、ＲＵＮＸのユビキチン化を阻害できる。不活性型ＮＥＤＤ４は、ＮＥＤＤ４のアミノ酸配列に基づいて所望の蛋白質を設計して公知の方法で製造し、取得した蛋白質の中からＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合を阻害するものを、後述の化合物の同定方法に記載の方法を使用して選別することにより取得できる。
【０１４４】
「ＮＥＤＤ４の不活性型変異体」とは、ＮＥＤＤ４に、アミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異が導入されたＮＥＤＤ４変異体であって、野生型のＮＥＤＤ４と比較してＥ３リガーゼ活性が減弱したまたは消失したＮＥＤＤ４変異体を意味する。不活性型ＮＥＤＤ４は、天然に存在するものであってもよく、人工的に変異を導入したものであってもよい。
【０１４５】
不活性型ＮＥＤＤ４における変異部位は、例えば、ＮＥＤＤ４のアミノ酸配列においてＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性に必要な部位である。具体的には本部位は、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列において第９６７番目のシステイン残基である。該システイン残基は、配列番号４に記載のアミノ酸配列においては第８６７番目のシステイン残基に相当する。該システイン残基は、ユビキチンが結合するＥ３リガーゼ活性の活性部位であり、ＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性に必須なアミノ酸残基である。
【０１４６】
不活性型ＮＥＤＤ４は、好ましくは例えば、配列番号１１または配列番号１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質である。配列番号１１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において第９６７番目のシステイン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列で表される蛋白質である。配列番号１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質は、配列番号４に記載のアミノ酸配列において第８６７番目のシステイン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列で表される蛋白質である（以下、不活性型短鎖ＮＥＤＤ４と称することがある）。
【０１４７】
上記不活性型ＮＥＤＤ４はいずれも、ＲＵＮＸと結合するがＥ３リガーゼ活性を有さず、ＲＵＮＸをユビキチン化しない（実施例３、４、５、６、８および９参照）。このことから、これら不活性型変異体はいずれも、ＮＥＤＤ４または短鎖型ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとの結合を拮抗的に阻害し、その結果、ＮＥＤＤ４または短鎖型ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害し得ると発明者らは考えている。
【０１４８】
また、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合を阻害する化合物は、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４とが結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり得る。このようなポリペプチドは、蛋白質間の結合を競合的に阻害できる。このようなポリペプチドは、ＲＵＮＸまたはＮＥＤＤ４のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものから、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合を阻害するものを選択することにより取得できる。このように特定されたポリペプチドに、１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したポリペプチドは、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合を阻害するものが好ましい。変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよく、また人工的に変異を導入したものであってもよい。これらポリペプチドは、後述する一般的な製造方法により取得できる。
【０１４９】
また、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合を阻害する化合物は、ＲＵＮＸまたはＮＥＤＤ４を認識する抗体であって、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合を阻害する抗体およびそのフラグメントであり得る。かかる抗体は、ＲＵＮＸまたはＮＥＤＤ４自体、またはこれらの断片、好ましくはＲＵＮＸとＮＥＤＤ４が結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により取得できる。
【０１５０】
ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合を阻害する化合物はさらにまた、ＲＵＮＸまたはＮＥＤＤ４を特異的に認識するアプタマーであって、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合を阻害するアプタマーであり得る。アプタマーは、核酸アプタマーあるいはペプチドアプタマーであることができ、かかるアプタマーは、公知の方法（例えば、ハーマン（Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｔ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２０００年、第２８７巻、第５４５４号、ｐ．８２０−８２５；バーグスタラー（Ｂｕｒｇｓｔａｌｌｅｒ  Ｐ．）ら、「カレント  オピニオン  イン  ドラッグ  ディスカバリー  アンド  ディベロプメント（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第５巻、第５号、ｐ．６９０−７００；およびホップ−セイラー（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  Ｆ．）ら、「カレント  モレキュラー  メディシン（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２００４年、第４巻、第５号、ｐ．５２９−５３８）に記載された方法）を使用して取得できる。
【０１５１】
「ＮＥＤＤ４の酵素活性」とは、ＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性を意味する。
【０１５２】
ＮＥＤＤ４の酵素活性を阻害する化合物は、後述する化合物の同定方法を使用して取得できる。ＮＥＤＤ４の酵素活性を阻害する化合物は、例えば、ＮＥＤＤ４の酵素活性を阻害する抗体またはそのフラグメントであってもよいし、ＮＥＤＤ４に特異的に結合しその活性を阻害する作用を有するアプタマーであることもできる。抗体あるいはアプタマーは上述の方法で取得でき、これらのＮＥＤＤ４の酵素活性の阻害作用を後述する化合物の同定方法に記載の方法で測定することにより、ＮＥＤＤ４の酵素活性を阻害する作用を有する抗体あるいはアプタマーを取得できる。
【０１５３】
「ＮＥＤＤ４の発現」とは、ＮＥＤＤ４をコードするＤＮＡの遺伝子情報がｍＲＮＡに転写されること、または、ｍＲＮＡに転写され、かつ蛋白質（ＮＥＤＤ４）のアミノ酸配列として翻訳されることをいう。
【０１５４】
ＮＥＤＤ４の発現を阻害する化合物は、後述する化合物の同定方法を使用して取得できる。ＮＥＤＤ４の発現を阻害する化合物は、例えば、ＮＥＤＤ４遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。また、ＮＥＤＤ４の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の発現を阻害する化合物として使用できる。
【０１５５】
ＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤およびＲＵＮＸの分解阻害剤は、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合を阻害する化合物、ＮＥＤＤ４の酵素活性の阻害する化合物、およびＮＥＤＤ４の発現を阻害する化合物のうちいずれか１を少なくとも含んでなる。好ましくは、本発明に係るＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤およびＲＵＮＸの分解阻害剤は、配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質および／または配列番号１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を有効量含んでなる。本発明に係るＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤を使用して、ＲＵＮＸのユビキチン化阻害方法およびＲＵＮＸの分解阻害方法を実施できる。
【０１５６】
（医薬組成物）
本発明の一態様は、本発明に係るＲＵＮＸのユビキチン化剤および／または本発明に係るＲＵＮＸの分解剤を有効成分としてその有効量含んでなる医薬組成物に関する。また、本発明の別の一態様は、本発明に係るＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤および／または本発明に係るＲＵＮＸの分解阻害剤を有効成分としてその有効量含んでなる医薬組成物に関する。
【０１５７】
本発明に係るＲＵＮＸのユビキチン化剤、本発明に係るＲＵＮＸの分解剤、並びに該ユビキチン化剤および／または該ＲＵＮＸの分解剤を有効量含んでなる医薬組成物は、ＲＵＮＸのユビキチン化および該ユビキチン化によるＲＵＮＸの分解の低減に起因する疾患の予防および／または治療剤として使用できる。これら薬剤および医薬組成物を使用して、このような疾患の予防および／または治療方法を実施できる。
【０１５８】
本発明に係るＲＵＮＸのユビキチン化阻害剤、本発明に係るＲＵＮＸの分解阻害剤、並びに該ユビキチン化阻害剤および／または該ＲＵＮＸの分解阻害剤を有効量含んでなる医薬組成物は、ＲＵＮＸのユビキチン化および該ユビキチン化によるＲＵＮＸの分解の亢進に起因する疾患の予防および／または治療剤として使用できる。これら薬剤および医薬組成物を使用して、このような疾患の予防および／または治療方法を実施できる。
【０１５９】
ＲＵＮＸ１は造血細胞の分化に関与しており、白血病の原因遺伝子である（非特許文献４および５）。具体的には、ＲＵＮＸ１機能の消失が白血病の発症に関与することを示す報告がある（非特許文献６および７）。このことから、ＲＵＮＸ１の低減が白血病等の癌疾患の発症や増悪に関与すると発明者らは考えている。
【０１６０】
ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸ１のユビキチン化および該ユビキチン化によるＲＵＮＸ１の分解を阻害することにより、ＲＵＮＸ１の低減を阻害でき、その結果、白血病等の癌疾患を予防および／または治療できると発明者らは考えている。
【０１６１】
ＲＵＮＸ２は骨形成に関わる重要な転写因子であり、軟骨細胞の分化・成熟、骨芽細胞の分化、骨髄形成に必須である（非特許文献２６および２７）。例えば、ＲＵＮＸ２のノックアウトマウスでは骨形成が認められないことから、その欠損は骨形成不全を引き起こすと考えられる（非特許文献８）。ＲＵＮＸ２は細胞内で、ＢＰＭ刺激による骨形成遺伝子の発現誘導に関与する転写因子Ｓｍａｄ１と結合することから、ＢＭＰ刺激を介した骨形成シグナルに関与していると考えられている（非特許文献２８）。また、ＲＵＮＸ２は骨細胞の分化に作用する他、骨基質遺伝子群（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、オステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）、オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、骨シアロプロテイン（ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）等）の発現を活性化させることが明らかにされている（非特許文献２９）。これらから、ＲＵＮＸ２の低減は骨形成の異常、例えば骨損失に関与すると発明者らは考えている。
【０１６２】
実際、ＢＰＭ−２で刺激した骨形成モデル細胞において、ＲＵＮＸと結合するがＥ３リガーゼ活性を有さない不活性型ＮＥＤＤ４、または、ＮＥＤＤ４の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るｓｉＲＮＡを使用して、ＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害することにより、骨形成の指標であるアルカリホスファターゼ活性が上昇することを本発明において見出した（実施例１０および１１参照）。骨芽細胞膜に存在する骨型アルカリホスファターゼは、早期の骨芽細胞の活性、例えば前骨芽細胞が骨芽細胞へ分化し、さらにその増殖期から基質合成期に移行するといった活性を反映している。すなわち、ＮＥＤＤ４の発現および／または機能の阻害は、ＢＰＭ−２刺激による骨芽細胞の骨分化を促進すると考えることができる。
【０１６３】
ＢＭＰは生体内で未分化間葉系幹細胞を軟骨細胞、骨芽細胞に分化、増殖させ骨組織を誘導するサイトカインである。ＢＭＰ−２は骨折治癒過程の初期に発現することが確認されており、骨修復における一連のカスケードの進行に関与している。また、ＢＭＰを筋肉内に作用させると異所性に骨を形成し、骨表面に作用させると仮骨様の骨新生を生じる。これらの事実から、骨折や骨欠損疾患、歯根手術等の骨組織の修復にＢＭＰ−２を使用することが考えられている（チェン（Ｃｈｅｎ，Ｄ．）ら、「グロース  ファクター（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）」、２００４年、第２２巻、第４号、ｐ．２３３−２４１）。また、骨粗しょう症は、骨芽細胞機能の低下と骨吸収の亢進により骨収支が不均衡となり、骨量が減少し骨折を来たしやすくなる疾患であるため、ＢＭＰ−２シグナルの増強は、本疾患に対し骨芽細胞機能の回復と骨折治癒の促進の両面を補強すると考えられる。
【０１６４】
したがって、ＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害することにより、骨芽細胞の分化および骨形成を促進することができ、さらに、骨形成の異常を伴う疾患、例えば骨損失疾患、より具体的には例えば骨粗しょう症を予防および／または治療できると発明者らは考えている。
【０１６５】
本知見に基づく本発明の一態様は、ＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害することを特徴とする骨形成促進剤に関する。本発明に係る骨形成促進剤は、ＮＥＤＤ４の酵素活性の阻害する化合物、およびＮＥＤＤ４の発現を阻害する化合物のうちいずれか１を少なくとも含んでなる。また、本発明に係る骨形成促進剤は、ＲＵＮＸとＮＥＤＤ４の結合を阻害する化合物含んでなる骨形成促進剤であり得る。好ましくは、本発明に係る骨形成促進剤は、ＲＵＮＸと結合するがＥ３リガーゼ活性を有さない不活性型ＮＥＤＤ４、例えば、配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質および／または配列番号１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を有効量含んでなる。また、本発明に係る骨形成促進剤は、ＮＥＤＤ４の発現を阻害し得るｓｉＲＮＡを含んでなる骨形成促進剤であり得る。本発明に係るＲＵＮＸの骨形成促進剤を使用して骨形成促進方法を実施できる。
【０１６６】
また本発明の一態様は、本発明に係る骨形成促進剤を有効成分としてその有効量含んでなる医薬組成物に関する。このような医薬組成物は、骨形成の異常、例えば骨損失疾患、より具体的には例えば骨粗しょう症の予防および／または治療剤として使用できる。これら薬剤および医薬組成物を使用して、このような疾患の予防および／または治療方法を実施できる。
【０１６７】
本発明においては、ＮＥＤＤ４の発現および／または機能の阻害により、ＢＰＭ−２で刺激した骨形成モデル細胞のアルカリホスファターゼ活性が上昇すること、および上述のように短鎖型ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸ２が結合することを見出した。これらの知見から、ＮＥＤＤ４の発現および／または機能の阻害は、ＢＰＭ−２刺激による骨形成シグナルに関与するＲＵＮＸ２のＮＥＤＤ４によるユビキチン化の阻害を引き起こし、その結果、ＲＵＮＸ２の安定化とそれによる該骨形成シグナルの促進を引き起こしたと考えることができる。そして、骨形成シグナルが促進された結果、骨形成モデル細胞の骨分化が促進され、そのアルカリホスファターゼ活性が上昇したと考えることができる。
【０１６８】
ＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害することにより、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸ２のユビキチン化および該ユビキチン化によるＲＵＮＸ２の分解を阻害でき、ＲＵＮＸ２を安定化することができる。その結果、ＲＵＮＸ２が関与する骨形成シグナルを促進でき、さらに骨芽細胞の分化および骨形成を促進することができる。このように骨芽細胞の分化および骨形成を促進することにより、骨形成の異常、例えば骨損失疾患、より具体的には例えば骨粗しょう症を予防および／または治療できると発明者らは考えている。
【０１６９】
ＲＵＮＸ２はまた、その過剰発現がＴ細胞分化に異常をもたらし、ｃ−ｍｙｃとの相乗作用によりリンパ腫形成に関与することが報告されている（非特許文献９）。このことから、ＲＵＮＸ２の増加がリンパ腫発症や増悪に関与すると発明者らは考えている。
【０１７０】
ＮＥＤＤ４によりＲＵＮＸ２をユビキチン化してＲＵＮＸ２を分解することにより、ＲＵＮＸ２を低減させることができ、その結果、リンパ腫を予防および／または治療できると発明者らは考えている。
【０１７１】
ＲＵＮＸ３はＴＧＦ−βの細胞内メディエーターであるＳｍａｄと結合することから、ＴＧＦ−βシグナル伝達への関与が考えられている（非特許文献１０）。ＴＧＦ−βレセプターやＳｍａｄの変異は、多くの癌で認められており（非特許文献１１）、ＲＵＮＸ３はＴＧＦ−βシグナルを介して癌に関与すると考えられている（非特許文献１２、１４および１５）。その他、ＲＵＮＸ３とヒト癌疾患、例えば胃癌、大腸癌、胆管癌、膵臓癌との関連性について既にいくつかの報告がある（非特許文献１３、１６および１７）。また、ＲＵＮＸ３の腫瘍形成抑制作用が、移植モデルを使用した動物実験で確認されている（非特許文献１３）。これらから、ＲＵＮＸ３の低減が胃癌、大腸癌、胆管癌、膵臓癌等の癌疾患の発症や増悪に関与すると発明者らは考えている。
【０１７２】
ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸ３のユビキチン化および該ユビキチン化によるＲＵＮＸ３の分解を阻害することにより、ＲＵＮＸ３の低減を阻害でき、その結果、胃癌、大腸癌、胆管癌、膵臓癌等の癌疾患を予防および／または治療できると発明者らは考えている。
【０１７３】
本発明に係る医薬組成物は、通常、有効成分に加えて１種または２種以上の医薬用担体を含む医薬組成物として製造することが好ましい。
【０１７４】
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常、約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【０１７５】
医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて一般的に使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤等が使用される。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。
【０１７６】
より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトールおよびラクトース等を医薬用単体として使用できる。これらは、本医薬組成物の剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合わせて使用される。
【０１７７】
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば、安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、およびｐＨ調整剤を適宜使用することもできる。
【０１７８】
安定化剤は、例えば、ヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を使用できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合わせて使用できる。特にこの組合わせによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えば、グリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトースおよび果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトールおよびキシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトースおよび乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸およびヒアルロン酸等の多糖類、並びにそれらの誘導体のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。
【０１７９】
界面活性剤も特に限定はなく、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えば、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系が包含される。
【０１８０】
緩衝剤は、例えば、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）を使用できる。
【０１８１】
等張化剤は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンを使用できる。
【０１８２】
キレート剤は、例えば、エデト酸ナトリウム、クエン酸を使用できる。
【０１８３】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。
【０１８４】
医薬および医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を使用してこれらの用量の変更を行い得る。上記投与量は１日１回〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
【０１８５】
本発明に係る医薬組成物を投与するときは、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは目的の疾患の予防および／または治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。例えば、抗腫瘍用医薬の有効成分等を配合してもよい。
【０１８６】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与を挙げることができる。あるいは経口経路で投与することもできる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。癌疾患に使用する場合は、腫瘍に注射等により直接投与することが好ましい。
【０１８７】
投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらはさらに投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製できる。
【０１８８】
（化合物の同定方法）
本発明の一態様は、ＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法に関する。
【０１８９】
ＲＵＮＸのユビキチン化は、ＮＥＤＤ４がＥ３リガーゼとして関与し、ＲＵＮＸと結合してＲＵＮＸのユビキチン化を触媒することにより行われると考えることができる。
【０１９０】
したがって、ＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法は、好ましくはＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法である。
【０１９１】
本発明に係る化合物の同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施できる。例えば、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法は、一般的にＥ３リガーゼの阻害剤のスクリーニングで用いられている方法を利用して実施できる。Ｅ３リガーゼの阻害剤のスクリーニングでは、Ｅ３リガーゼの基質として、生体内における基質またはＥ３リガーゼ自身が用いられている。本同定方法ではＮＥＤＤ４の基質として、ＲＵＮＸまたはＮＥＤＤ４自身を用いることができる。基質としてＲＵＮＸを用いた同定方法では、ＮＥＤＤ４の酵素活性を阻害する化合物の他に、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害する化合物を得ることができるので、基質としてＲＵＮＸを用いることがより好ましい。
【０１９２】
ＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法は、例えば、本発明に係るＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化方法を利用した実験系を使用して実施できる。本発明に係るＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化方法を利用した実験系とは、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとを共存させて、ＮＥＤＤ４によりＲＵＮＸをユビキチン化させる実験系をいう。このような実験系を使用した同定方法で同定される化合物は、ＮＥＤＤ４の酵素活性を阻害する化合物または促進する化合物、および、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害する化合物または促進する化合物を含む。
【０１９３】
具体的には、このような実験系において、ある化合物（以下、被検化合物と称する）とＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸとを接触させ、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を検出し得るシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を使用して、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物がＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害するか否かまたは促進するか否かを決定することにより、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物または促進する化合物を同定できる。
【０１９４】
被検化合物はＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化反応に共存させることもできるし、被検化合物を予めＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸと接触させ、その後にＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化反応を行うこともできる。ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化により生じるシグナルまたはユビキチン化のマーカーが、被検化合物をＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸと接触させたときに、被検化合物を接触させなかったときと比較して低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害すると判定できる。これに対して、該シグナルまたはマーカーが、被検化合物をＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸと接触させたときに、被検化合物を接触させなかったときと比較して増加するあるいは発生する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を促進すると判定できる。
【０１９５】
このような実験系は、インビボおよびインビトロのいずれの条件においても実施できる。
【０１９６】
インビトロの実験系においては、標的蛋白質のユビキチン化反応にＮＥＤＤ４の他、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、およびユビキチンが必要とされるため、これら酵素およびユビキチンを共に使用することが適当である。
【０１９７】
インビボの実験系は、好ましくは例えば、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとを共に発現している真核細胞または培養細胞株を使用した実験系であり得る。また、ＲＵＮＸやＮＥＤＤ４を発現させた真核細胞または培養細胞株を使用できる。さらに、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとを共に発現した真核細胞または培養細胞株、あるいはＮＥＤＤ４やＲＵＮＸを発現させた真核細胞または培養細胞株に、さらにユビキチン発現させた細胞を使用できる。細胞におけるこれら蛋白質の発現は、ＮＥＤＤ４をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクター、ＲＵＮＸをコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクター、および／または、ユビキチンをコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターを使用して慣用の遺伝子工学的手法でこれらベクターを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。
【０１９８】
ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとを共に発現した細胞を使用した実験系において、被検化合物により該細胞を処理し、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を検出し得るシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を使用して、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物がＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害するか否かまたは促進するか否かを決定することにより、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物または促進する化合物を同定できる。細胞を被検化合物により処理したときに、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化により生じるシグナルまたはユビキチン化のマーカーが、細胞を被検化合物により処理しないときと比較して低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害すると判定できる。これに対して、該シグナルまたはマーカーが、細胞を被検化合物により処理したときに、細胞を被検化合物により処理しないときと比較して増加するあるいは発生する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を促進すると判定できる。
【０１９９】
上記インビトロまたはインビボの実験系において、ＲＵＮＸを用いず、ＮＥＤＤ４による自己ユビキチン化を測定することによって、ＮＥＤＤ４の酵素活性を阻害する化合物を同定することができる。ＮＥＤＤ４の酵素活性を阻害する化合物は、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害し得る。したがって、上記実験系においてＲＵＮＸを用いず、ＮＥＤＤ４による自己ユビキチン化を測定することによっても、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害し得る化合物を同定できる。
【０２００】
ユビキチン化の検出は、ユビキチン化された標的蛋白質の検出により測定できる。ユビキチン化された標的蛋白質の検出は、公知のウエスタンブロッティング等の方法により実施できる（実施例３、５、８および９参照）。標的蛋白質のユビキチン化反応を行なう前と比較して、ユビキチン化反応を行った後に、分子量が増加した標的蛋白質が検出された場合、該標的蛋白質はユビキチン化されたと判定できる。また、適当な標識物質により標識したユビキチンを使用することにより、該標識物質を指標にしてユビキチン化された標識蛋白質を容易に検出できるため、このような標識化ユビキチンの使用は有用である。標識物質として、ＨＡ−ｔａｇやＦＬＡＧ−ｔａｇ等のタグペプチド類が好ましく使用できるが、これらに制限されず、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害しない物質である限りにおいていずれの物質も使用できる。標識物質の検出は、自体公知の検出方法を使用して実施できる。例えば、タグペプチド類は、抗タグペプチド抗体により検出できる。このとき、抗タグペプチド抗体として、ＨＲＰ（ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、放射性同位元素、蛍光物質またはビオチン等で標識した抗体を使用することにより検出がより容易に実施できる。あるいは、上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等で標識した二次抗体を使用してもよい。
【０２０１】
具体的には、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法は、例えば、ＲＵＮＸ遺伝子を含む適当なベクター、ＮＥＤＤ４を含む適当なベクターおよびＨＡ−ｔａｇがＮ末端に付加されたユビキチンをコードする遺伝子を含む適当なベクターをトランスフェクションした細胞（実施例３、５、８および９参照）を使用して実施できる。該細胞を、被検化合物で処理した後、細胞を回収し、適当な方法で細胞を溶解してセルライセートを調製し、該セルライセート中に含まれるユビキチン化ＲＵＮＸを測定し、被検化合物で処理しない細胞と比較して、ユビキチン化ＲＵＮＸが低減または消失したとき、該被検化合物は、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物と判定できる。これに対して、ユビキチン化ＲＵＮＸが増加したとき、該被検化合物は、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を促進する化合物と判定できる。セルライセート中に含まれるユビキチン化ＲＵＮＸの測定は、例えば、ＨＲＰ標識抗ＨＡ抗体によりＲＵＮＸに結合したユビキチンを検出することにより実施できる。
【０２０２】
その他、一般的にユビキチンＥ３リガーゼの阻害剤のスクリーニングで用いられている方法であれば制限無く、いずれの方法を使用することも可能であり、特に高速で多検体をスクリーニングする場合には、蛍光共鳴エネルギー転移アッセイ（ＦＲＥＴ  Ａｓｓａｙ）を応用した系、ディソシエーション−エンハンスド  ランタニド  フルオロイムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ  Ａｓｓａｙ）、電気化学発光（ＥＣＬ）を応用した系、シンチレーション  プロキミシティー  アッセイ（ＳＰＡ）を応用した系等を好適に使用できる（サン（Ｙｉ  Ｓｕｎ）、「メソッズ  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、２００５年、第３９９巻、ｐ．６５４−６６３）。この時、ユビキチン化の基質としては、ＲＵＮＸを使用することもできるし、ＮＥＤＤ４自身を基質とする自己ユビキチン化活性を検出することも可能であるが、ＲＵＮＸを基質として使用することが望ましい。
【０２０３】
本発明の一態様はまた、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法に関する。
【０２０４】
ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法は、一般的に結合阻害剤のスクリーニングで用いられているバインディングアッセイを利用して実施できる。
【０２０５】
ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法は、例えば、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとを共存させて、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸを結合させる実験系を使用して実施できる。
【０２０６】
このような実験系において、被検化合物とＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸとを接触させ、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を検出し得るシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を使用して、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物がＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害するか否かまたは促進するか否かを決定することにより、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害する化合物または促進する化合物を同定できる。
【０２０７】
被検化合物はＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合反応に共存させることもできるし、被検化合物を予めＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸと接触させ、その後にＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合反応を行うこともできる。ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合により生じるシグナルまたは結合のマーカーが、被検化合物をＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸと接触させたときに、被検化合物を接触させなかったときと比較して低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害すると判定できる。これに対して、該シグナルまたはマーカーが、被検化合物をＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸと接触させたときに、被検化合物を接触させなかったときと比較して増加するあるいは発生する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を促進すると判定できる。
【０２０８】
このような実験系は、インビボおよびインビトロのいずれの条件においても実施できる。
【０２０９】
インビトロの実験系は、蛋白質の結合阻害剤のスクリーニングにおいて一般的に使用されている同定方法を参考にして実施できる。インビトロの実験系は、例えば、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとをインビトロで反応させて、プルダウン法により両蛋白質の結合を検出する実験系であり得る。
【０２１０】
インビボの実験系は、好ましくは例えば、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸとを共に発現している真核細胞または培養細胞株を使用した実験系であり得る。ＲＵＮＸやＮＥＤＤ４を発現させた真核細胞または培養細胞株をこのような実験系に使用することもできる。細胞におけるこれら蛋白質の発現は、ＮＥＤＤ４をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターおよび／またはＲＵＮＸをコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターを使用して慣用の遺伝子工学的手法でこれらベクターを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。
【０２１１】
ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合の検出は、自体公知の蛋白質の検出方法、例えば免疫沈降法、プルダウン法、ツーハイブリッド法、ウエスタンブロッティングおよび蛍光共鳴エネルギー転移法等の方法またはこれらの方法を組合わせて、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸにより形成される複合体を検出することにより実施できる。ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの複合体の検出を容易にするために、ＮＥＤＤ４および／またはＲＵＮＸは、適当な標識物質により標識されたものを使用することが好ましい。標識物質として、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇおよびＨＡ−ｔａｇ等のタグペプチド類が好ましく使用できる。標識物質の検出は、自体公知の検出方法を使用して実施できる。例えば、タグペプチド類は、抗タグペプチド抗体により検出できる。このとき、抗タグペプチド抗体として、ＨＲＰ（ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、放射性同位元素、蛍光物質またはビオチン等で標識した抗体を使用することにより検出がより容易に実施できる。あるいは、上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等で標識した二次抗体を使用してもよい。
【０２１２】
具体的には、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法は、例えば、Ｎ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇが付加されたＲＵＮＸをコードする遺伝子を含む適当なベクターおよびＮ末端にＭｙｃ−ｔａｇが付加されたＮＥＤＤ４をコードする遺伝子を含む適当なベクターをトランスフェクションした細胞（実施例２参照）を使用して実施できる。該細胞を、被検化合物で処理した後、細胞を回収し、適当な方法で細胞を溶解してセルライセートを調製し、該セルライセート中に含まれるＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの複合体を検出する。セルライセート中に含まれる該複合体の測定は、抗ＦＬＡＧ抗体を使用した免疫沈降の後に、抗Ｍｙｃ抗体を使用してウエスタンブロッティングを行うことにより実施できる。細胞を被検化合物で処理したときに検出されるＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの複合体の量が、細胞を被検化合物で処理しないときに検出される複合体の量と比較して低減または消失する場合には、被検化合物はＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害すると判定できる。これに対して、細胞を被検化合物で処理したときに検出されるＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの複合体の量が、細胞を被検化合物で処理しないときに検出される複合体の量と比較して増加する場合には、被検化合物はＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を促進すると判定できる。
【０２１３】
ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害する化合物または促進する化合物の同定方法はまた、公知のツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を使用して実施できる。例えば、ＮＥＤＤ４とＤＮＡ結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、ＲＵＮＸと転写活性化蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続したｌａｃＺ等レポーター遺伝子を含有するプラスミドを酵母や真核細胞等の細胞にトランスフェクションし、該細胞を被検化合物で処理したときのレポーター遺伝子の発現量を、被検化合物で該細胞を処理しないときのレポーター遺伝子の発現量とを比較する。被検化合物で処理した該細胞のレポーター遺伝子の発現量が、被検化合物で処理しない該細胞のレポーター遺伝子の発現量と比較して低減または消失する場合、該被検化合物はＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害すると判定できる。これに対し、被検化合物で処理した該細胞のレポーター遺伝子の発現量が、被検化合物で処理しない該細胞のレポーター遺伝子の発現量と比較して増加する場合、該被検化合物はＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を促進すると判定できる。
【０２１４】
上記同定方法により同定される化合物は、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害する化合物または促進する化合物である。
【０２１５】
本発明においてはまた、ＮＥＤＤ４の発現を阻害するまたは促進する化合物の同定方法を実施できる。ＮＥＤＤ４の発現を阻害する化合物の同定方法は、ＮＥＤＤ４の発現を測定できる実験系を使用して実施できる。このような実験系において、ＮＥＤＤ４をコードする遺伝子と被検化合物とを共存させてその発現を測定し、ついで、被検化合物の非存在下での測定結果との比較における発現の変化（低減、消失または増加）を検出することにより、ＮＥＤＤ４の発現を阻害するまたは促進する化合物を同定できる。
【０２１６】
ＮＥＤＤ４の発現を測定できる実験系は、具体的には例えば、ＮＥＤＤ４をコードする遺伝子を含む発現ベクターをトランスフェクションした細胞を使用してＮＥＤＤ４を発現させる実験系であり得る。このような実験系において、該細胞を、被検化合物で処理した後、細胞を回収し、適当な方法で細胞を溶解してセルライセートを調製し、該セルライセート中に含まれるＮＥＤＤ４を検出する。細胞を被検化合物で処理したときに検出されるＮＥＤＤ４の量が、細胞を被検化合物で処理しないときに検出されるＮＥＤＤ４の量と比較して低減または消失する場合には、被検化合物はＮＥＤＤ４の発現を阻害すると判定できる。これに対して、細胞を被検化合物で処理したときに検出されるＮＥＤＤ４の量が、細胞を被検化合物で処理しないときに検出されるＮＥＤＤ４の量と比較して増加する場合には、被検化合物はＮＥＤＤ４の発現を促進すると判定できる。
【０２１７】
ＮＥＤＤ４の発現の測定は、自体公知の蛋白質の検出方法、例えばウエスタンブロッティング等の方法により、ＮＥＤＤ４を直接的に検出することにより実施できる。また、発現の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより、ＮＥＤＤ４の測定を容易に実施できる。発現の指標となるシグナルとして、例えば、標識物質を使用できる。標識物質でＮＥＤＤ４を標識し、該標識物質を測定することにより、ＮＥＤＤ４の測定を容易に実施できる。標識物質として、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇおよびＨＡ−ｔａｇ等のタグペプチド類を好ましく使用できる。標識物質の検出は、自体公知の検出方法を使用して実施できる。例えば、タグペプチド類は、抗タグペプチド抗体により検出できる。このとき、抗タグペプチド抗体として、ＨＲＰ（ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、放射性同位元素、蛍光物質またはビオチン等で標識した抗体を使用することにより検出がより容易に実施できる。あるいは、上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等で標識した二次抗体を使用してもよい。
【０２１８】
また、ＮＥＤＤ４の発現を測定できる実験系は、ＮＥＤＤ４をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流に、該遺伝子の代わりにレポーター遺伝子を連結したベクターを作成し、該ベクターをトランスフェクションした細胞、例えば真核細胞等を使用した実験系であり得る。このような実験系において、該細胞を被検化合物で処理したときのレポーター遺伝子の発現量を、被検化合物で該細胞を処理しないときのレポーター遺伝子の発現量とを比較する。被検化合物で処理した該細胞のレポーター遺伝子の発現量が、被検化合物で処理しない該細胞のレポーター遺伝子の発現量と比較して低減または消失する場合、該被検化合物はＮＥＤＤ４の発現を阻害すると判定できる。これに対し、被検化合物で処理した該細胞のレポーター遺伝子の発現量が、被検化合物で処理しない該細胞のレポーター遺伝子の発現量と比較して増加する場合、該被検化合物はＮＥＤＤ４の発現を促進すると判定できる。レポーター遺伝子として、レポーターアッセイで一般的に使用されている遺伝子を使用でき、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子を使用できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記レポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる。
【０２１９】
被検化合物として、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、またはＮＥＤＤ４およびＲＵＮＸの一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等を使用できる。あるいは、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被検化合物として好適である。
【０２２０】
また本発明の一態様は、骨形成を促進させ得る化合物の同定方法に関する。本発明に係る骨形成を促進させ得る化合物の同定方法は、被検化合物がＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害するか否かを測定することを特徴とする。
【０２２１】
本発明において、ＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害することにより、ＢＰＭ−２で刺激した骨形成モデル細胞において、骨形成の指標であるアルカリホスファターゼ活性（実施例１０および１１参照）が上昇することを見出した。上述のように短鎖型ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸ２が結合することから、ＮＥＤＤ４の発現および／または機能の阻害は、ＢＰＭ−２刺激による骨形成シグナルに関与するＲＵＮＸ２のＮＥＤＤ４によるユビキチン化の阻害を引き起こし、その結果、ＲＵＮＸ２の安定化とそれによる該骨形成シグナルの促進を引き起こしたと考えることができる。そして、骨形成シグナルが促進された結果、骨形成モデル細胞の骨分化が促進され、そのアルカリホスファターゼ活性が上昇したと考えることができる。
【０２２２】
すなわち、ＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害する化合物は、ＲＵＮＸ２のＮＥＤＤ４によるユビキチン化の阻害を引き起こし、その結果、ＲＵＮＸ２の安定化とそれによる該骨形成シグナルを促進すると考えることができる。そして、このような化合物は、骨形成シグナルを促進することにより、骨分化および骨形成を促進すると考えることができる。
【０２２３】
被検化合物がＮＥＤＤ４の発現を阻害するか否かを測定することを特徴とする、骨形成を促進させ得る化合物の同定方法は、上記のＮＥＤＤ４の発現を阻害する化合物の同定方法を利用して実施できる。被検化合物によりＮＥＤＤ４の発現が阻害された場合、該被検化合物は、骨形成を促進させ得ると判定できる。
【０２２４】
ＮＥＤＤ４の機能は、例えば、そのＥ３リガーゼ活性やＲＵＮＸとの結合能の測定により評価できる。ＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性は、例えば基質としてＲＵＮＸまたはＮＥＤＤ４を使用して、ＲＵＮＸのユビキチン化または自己ユビキチン化を検出することにより測定できる。好ましくは、ＲＵＮＸを基質としてそのユビキチン化活性を検出することが適当である。
【０２２５】
したがって、被検化合物がＮＥＤＤ４の機能を阻害するか否かを測定することを特徴とする、骨形成を促進させ得る化合物の同定方法は、例えば、上記のＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物の同定方法を利用して実施できる。また、ＲＵＮＸの代わりにＮＥＤＤ４自身を基質として用い、ＮＥＤＤ４による自己ユビキチン化を阻害する化合物を同定することにより実施できる。被検化合物により、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化または自己ユビキチン化が阻害された場合、該被検化合物は、骨形成を促進させ得ると判定できる。
【０２２６】
また、被検化合物がＮＥＤＤ４の機能を阻害するか否かを測定することを特徴とする、骨形成を促進させ得る化合物の同定方法は、例えば、上記のＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合を阻害する化合物の同定方法を利用して実施できる。被検化合物によりＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合が阻害された場合、該被検化合物は、骨形成を促進させ得ると判定できる。
【０２２７】
ＲＵＮＸファミリー蛋白質のうち、ＲＵＮＸ２が骨形成に重要な役割を果たすことが知られていることから、被検化合物がＮＥＤＤ４の機能を阻害するか否かを測定することを特徴とする、骨形成を促進させ得る化合物の同定方法では、ＲＵＮＸ２を使用することが好ましい。
【０２２８】
本発明に係る骨形成を促進させ得る化合物の同定方法は、さらに、上記同定方法によりＮＥＤＤ４の発現および／または機能を阻害することが明らかになった被検化合物が、骨形成を促進させ得るか否かを測定する工程をさらに含む同定方法であり得る。
【０２２９】
骨形成の促進を測定できる実験系として、例えば、骨形成モデル細胞を使用した実験系を使用できる。骨形成モデル細胞として、例えばマウスＣ２Ｃ１２細胞を使用できる。マウスＣ２Ｃ１２細胞は、筋芽細胞であり、骨芽細胞や軟骨細胞と同じ間葉系幹細胞に由来する。Ｃ２Ｃ１２細胞はＢＭＰ−２刺激により典型的な骨芽細胞のフェノタイプ、例えばアルカリホスファターゼ活性の上昇やオステオカルシンの産生等を示すことから、ＢＭＰ−２シグナルに依存した骨分化および骨形成のモデル細胞として利用されている（カタギリ（Ｋａｔａｇｉｒｉ  Ｔ．）ら、「ザ  ジャーナル  オブ  セル  バイオロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９４年、第１２７巻、ｐ．１７５５−１７６６）。
【０２３０】
具体的には、骨形成モデル細胞を使用した実験系において、骨形成を促進するサイトカイン存在下で該細胞を培養した後、該細胞の中の骨形成マーカーを測定することにより、該細胞の骨形成の促進を測定できる。サイトカイン存在下で細胞を培養したとき、サイトカイン非存在下で細胞を培養したときと比較して、骨形成マーカーが増加する場合、該細胞の骨分化および骨形成が促進されたと判定できる。
【０２３１】
骨形成を促進するサイトカインとして、例えば、ＢＭＰ−２が好ましく使用できる。また、骨形成マーカーとして、例えば、アルカリホスファターゼやオステオカルシンを使用できる。骨形成を促進するサイトカインや骨形成マーカーは、これらに限定されず、一般的に骨形成の評価に使用されるサイトカインやマーカーをいずれも使用できる。骨形成マーカーの測定は、一般的に使用されている骨形成マーカーの測定方法により実施できる。
【０２３２】
このような骨形成モデル細胞を使用した実験系において、該細胞を被検化合物で処理することにより、骨形成を促進させ得る被検化合物を同定できる。被検化合物で処理した細胞における骨形成マーカーが、被検化合物で処理していない細胞に該骨形成マーカーと比較して増加した場合、該細胞の骨分化および骨形成が促進されたと判定できる。
【０２３３】
（試薬キット）
本発明の一態様は、試薬キットに関する。本試薬キットは、ＮＥＤＤ４、ＮＥＤＤ４をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つと、ＲＵＮＸ、ＲＵＮＸをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つとを含んでなる試薬キットであり得る。本試薬キットはさらに、ユビキチン、ユビキチンをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットであり得る。本試薬キットは、例えば本発明に係る化合物の同定方法に使用できる。
【０２３４】
本発明に係る試薬キットは、上記同定方法において使用するシグナルおよび／またはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
【０２３５】
（ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンの取得）
【０２３６】
ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンはヒト由来の蛋白質であることが好ましいが、該ヒト由来の蛋白質と同質の機能を有し、かつ構造的相同性を有する哺乳動物由来の蛋白質、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはウサギ等の蛋白質であることができる。また、ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンをそれぞれコードする遺伝子は、ヒト由来の遺伝子であることが好ましいが、該ヒト由来の蛋白質と同質の機能を有しかつ構造的相同性を有する哺乳動物由来の蛋白質をコードする遺伝子であれば、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはウサギ等の遺伝子であることができる。ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンの性質や機能は、例えば、ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸの結合、ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸへのユビキチンの結合（ユビキチン化）、ＮＥＤＤ４のリガーゼ活性等である。
【０２３７】
ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンは、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンのうち少なくとも１を遺伝子工学的手法で発現させた細胞を使用することもできる。ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンは、その性質や機能に影響がない限りにおいて、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質やポリペプチドを、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を使用して付加してもよい。別の蛋白質やポリペプチドとして、例えば、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、あるいはＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類を使用できる。
【０２３８】
遺伝子工学的手法として、公知の方法がいずれも使用できる。例えば、成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社；ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス等を参照）を使用できる。
【０２３９】
ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンをそれぞれコードする遺伝子は、例えば、各遺伝子の発現が認められる適当な起源から、自体公知のクローニング方法等を使用して容易に取得できる。これら遺伝子の起源として、該遺伝子の発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞等を使用できる。ＮＥＤＤ４遺伝子の起源として、例えば、ヒトの筋肉由来の細胞や筋肉組織を使用できる。ＲＵＮＸ遺伝子の起源として、例えば、各種癌細胞株を使用できる。ユビキチンの起源として、例えば、ヒトの脳由来の細胞や脳組織を使用できる。
【０２４０】
起源からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施できる。また、市販されているｃＤＮＡライブラリーを使用することもできる。所望のクローンをｃＤＮＡライブラリーから選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を使用できる。例えば、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを使用したプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合せた方法等を使用できる。ここで使用するプローブとして、ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンをそれぞれコードする遺伝子の塩基配列に関する情報に基づいて化学合成されたＤＮＡ等が一般的に使用できる。また、該遺伝子の塩基配列情報に基づき設計したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをこのようなプローブとして使用できる。ｃＤＮＡライブラリーからの目的クローンの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して各クローンについて発現蛋白質の確認を行い、その生物学的機能を指標にして実施できる。
【０２４１】
遺伝子の取得にはその他、ＰＣＲ（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス；サイキ（Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８５年、第２３０巻、ｐ．１３５０−１３５４））によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。ｃＤＮＡライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法（「実験医学」、１９９４年、第１２巻、第６号、ｐ．３５−）、特に５´−ＲＡＣＥ法（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ  Ｍ．Ａ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９８８年、第８５巻、第２３号、ｐ．８９９８−９００２）等の採用が好適である。ＰＣＲに使用するプライマーは、ＤＮＡの塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により取得できる。増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、常法により実施できる。例えばゲル電気泳動法等によりＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製を実施できる。
【０２４２】
遺伝子は、その機能、例えばコードする蛋白質の発現や、発現された蛋白質の機能が阻害されない限りにおいて、５´末端側や３´末端側に、例えばＧＳＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、あるいはＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類等の遺伝子が、１つまたは２つ以上付加されたＤＮＡであることができる。これら遺伝子の付加は、慣用の遺伝子工学的手法により実施できる。
【０２４３】
ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンをそれぞれコードする遺伝子を含む組換えベクターを構築し、該組換えベクターを使用して適当な宿主細胞で該遺伝子を発現させることにより、ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンのうち少なくとも１を発現する細胞を取得できる。また、該細胞から、公知の方法でＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンを調製するとができる。
【０２４４】
ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。代表的なベクターＤＮＡは、例えば、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡである。プラスミドＤＮＡとして、例えば、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドを使用できる。バクテリオファージＤＮＡとして、例えば、λファージを使用できる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとして、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターを使用できる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡ等を使用できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクターＤＮＡ、例えば、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミド等）を使用できる。また、所望により、発現ベクターやクローニングベクターのいずれも使用できる。
【０２４５】
ベクターＤＮＡには、目的遺伝子の機能が発揮されるように遺伝子を組込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子配列とプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー等から選択した１つまたは複数の遺伝子配列を自体公知の方法により組合せてベクターＤＮＡに組込むことができる。選択マーカーとして、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子を使用できる。
【０２４６】
ベクターＤＮＡに目的遺伝子配列を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、目的遺伝子配列を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が使用される。あるいは、目的遺伝子配列に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。
【０２４７】
ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンをそれぞれコードする遺伝子を含む組換えベクターを宿主にトランスフェクションすることにより、形質転換体が得られる。ベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、これら遺伝子のうち少なくとも１を発現する細胞を取得でき、さらに該細胞使用して公知の方法によりＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸまたはユビキチンを製造できる。該形質転換体には、ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンをそれぞれコードする遺伝子以外の所望の遺伝子を組込んだベクターＤＮＡの１つまたは２つ以上をさらにトランスフェクションすることもできる。
【０２４８】
宿主として、原核生物および真核生物のいずれも使用できる。原核生物として、例えば、腸菌（エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））等のエシェリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌を使用できる。真核生物として、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母、Ｓｆ９やＳｆ２１等の昆虫細胞、あるいはサル腎由来細胞（ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞等の動物細胞を使用できる。好ましくは動物細胞を使用する。
【０２４９】
ベクターＤＮＡの宿主細胞へのトランスフェクションは、自体公知の手段が応用でき、例えば成書に記載されている標準的な方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法を使用できる。簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的な方法は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等である。
【０２５０】
ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンは、ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンをそれぞれコードする遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、本蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を含む細胞において発現しているものであり得る。該細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフェクションして得られた形質転換体であり得る。
【０２５１】
ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸおよびユビキチンはさらに、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない限りにおいて改変できる。また、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質等を、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を使用して付加することにより標識化したものであってもよい。好ましくは、本蛋白質の基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。付加する蛋白質等として、例えば、ＧＳＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）等の蛍光色素類、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンのＦｃ断片あるいはビオチンを使用できるが、これらに限定されない。また、放射性同位元素により標識することもできる。標識化に使用する物質は、１つまたは２つ以上を組合せて付加できる。これら標識化に使用した物質自体、またはその機能を測定することにより、本蛋白質を容易に検出または精製でき、また、例えば本蛋白質と他の蛋白質との相互作用を検出できる。
【０２５２】
具体的には例えば、ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸまたはユビキチンを含むベクターＤＮＡをトランスフェクションした形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とする蛋白質を回収することによりこれら蛋白質を製造できる。形質転換体の培養は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で実施できる。培養は、形質転換体により発現される本蛋白質自体またはその機能を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された本蛋白質自体またはその蛋白質量を指標にして培養してもよく、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。
【０２５３】
目的とする蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して目的とする蛋白質を抽出する。また、目的とする蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を使用する。
【０２５４】
ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸまたはユビキチンはまた、一般的な化学合成法により製造できる。例えば、成書（「ペプチド合成」、丸善株式会社、１９７５年および「ペプチド  シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９６年）に記載の方法が使用されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。蛋白質の化学合成方法として、固相合成方法や液相合成方法等が知られているがいずれを使用することもできる。このような蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含し、本蛋白質の合成は、そのいずれによっても実施できる。上記蛋白質合成において使用される縮合法も、常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等を使用できる。また、市販のアミノ酸合成装置を使用してこれら蛋白質を製造できる。
【０２５５】
ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸまたはユビキチンに、変異が導入されたものも本発明において使用できる。蛋白質、ポリペプチドおよびポリペプチドに変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（ウルマー（Ｋ．Ｍ．Ｕｌｍｅｒ）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１）を利用して実施できる。このような変異の導入において、当該の基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変できる。
【０２５６】
ＮＥＤＤ４、ＲＵＮＸまたはユビキチンは、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種分離操作方法により精製および／または分離できる。分離および／または精製は、本蛋白質の機能を指標にして実施できる。分離操作方法として、例えば硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を単独でまたは適宜組合せて使用できる。好ましくは、本蛋白質のアミノ酸配列情報に基づき、これらに対する特異的抗体を作成し、該抗体を使用して特異的に吸着する方法、例えば該抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーを使用することが推奨される。
【０２５７】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【実施例１】
【０２５８】
（ＲＵＮＸ３と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）
ＲＵＮＸ３と相互作用する機能を有する蛋白質の予測を、国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号パンフレットに記載のインシリコでの予測方法に従って次のように実施した：（ｉ）ＲＵＮＸ３のアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、（ｉｉ）各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、（ｉｉｉ）得られた蛋白質とＲＵＮＸ３との間でローカルアライメントを行い、（ｉｖ）ローカルアライメントのスコアの高いものをＲＵＮＸ３と相互作用する蛋白質であると予測する。
【０２５９】
解析の結果（図１）、ＲＵＮＸ３と相互作用する機能を有すると予測される蛋白質としてＮＥＤＤ４を見出した。ＲＵＮＸ３の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドＦＰＹＳＡＴ（配列番号１３）、ＡＥＬＲＮＡ（配列番号１５）およびＬＳＶＡＧＭ（配列番号１７）とそれぞれ相同なオリゴペプチドＦＥＹＳＡＴ（配列番号１４）、ＡＥＥＬＮＡ（配列番号１６）およびＧＲＶＡＧＭ（配列番号１８）がＮＥＤＤ４のアミノ酸配列中に認められた。
【実施例２】
【０２６０】
（ＲＵＮＸ３とＮＥＤＤ４の結合解析）
ヒトＲＵＮＫ３とヒトＮＥＤＤ４の結合を、ヒト培養細胞における一過性共発現系を使用して免疫沈降法により検討した。
【０２６１】
＜材料と方法＞
ヒトＲＵＮＸ３発現プラスミドを以下に述べるように構築した。ヒトＲＵＮＸ３  ｃＤＮＡはＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社より購入した（クローン番号  ＭＨＳ１０１１−７４９３６）。購入したヒトＲＵＮＸ３  ｃＤＮＡを鋳型とし、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩサイトを付加したプライマーを使用してＰＣＲによりＯＲＦを増幅し、シーケンスにより塩基配列を確認した。その後、獲得したＯＲＦ領域を、Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ結合蛋白質を発現させるための動物細胞用発現プラスミドｐＣＭＶ−Ｔａｇ２（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトで組み込み、ヒトＲＵＮＸ３発現プラスミドを構築した。本ヒトＲＵＮＸ３発現プラスミドにより、Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ結合ヒトＲＵＮＸ３（以下、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３と称する）が発現する。なお、クローニングしたヒトＲＵＮＸ３  ｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列はＮＣＢＩプロテインデータベースのアクセッションナンバーＮＰ＿００４３４１（登録遺伝子名はＲＵＮＸ３）に公開されたものと同一であった。
【０２６２】
ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドを以下に述べるように構築した。ヒトＮＥＤＤ４  ｃＤＮＡは、ＫＩＡＡ００９３クローンの塩基配列（ＮＣＢＩアクセッションナンバー  Ｄ４２０５５）に基づいて調製した。ＫＩＡＡ００９３クローンの塩基配列は、ゲノム配列と比較して５´末端側の２１８ｂｐが欠失していると考えられた。そこで、ゲノム配列を参考に、ＫＩＡＡ００９３クローンの塩基配列の５´末端側にさらに２１８ｂｐ延長したｃＤＮＡを調製した。延長部分の２１８ｂｐはヒト骨格筋由来ｃＤＮＡ（ＱＵＩＣＫ−ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）からＰＣＲによって獲得し、シーケンスにより塩基配列を確認した。獲得したヒトＮＥＤＤ４  ｃＤＮＡは、５´末端にＭｙｃ−ｔａｇコード配列を付加した後に、動物細胞用発現プラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に組み込み、ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドを構築した。本ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドにより、Ｎ末端Ｍｙｃ−ｔａｇ結合ヒトＮＥＤＤ４（以下、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４と称する）が発現する。なお、クローニングしたヒトＮＥＤＤ４  ｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列はＳｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータベースのアクセッションナンバーＰ４６９３４（登録遺伝子名はＮＥＤＤ４）に公開されたものと同一であった。
【０２６３】
免疫沈降実験は以下に述べるように実施した。細胞数１．０×１０６のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ｃｍ  ディッシュに播種し、１０％  牛胎仔血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて５％  ＣＯ２／９５％  エアの条件下で一晩培養後、ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミド  １．７５μｇをヒトＲＵＮＸ３発現プラスミド  ０．２５μｇと共にフュージーン６（ＦｕＧＥＮＥ６、Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用して細胞にトランスフェクションした。ヒトＲＵＮＸ３発現プラスミドの代わりに、ヒトＲＵＮＸ３遺伝子を組み込んでいないｐＣＭＶ−Ｔａｇ２ベクター（以下、空ベクターと称する）を、同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製してコントロールとして使用した。２日間培養後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと略称する）で洗浄し、セルスクレーパーを使用して回収した。回収した細胞に、プロテアーゼ阻害剤カクテル  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を含むリシスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／５ｍＭ  ＮａＦ／５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）を５００μＬ加え、ピペッティングにて細胞をけん濁し、氷上で２０分間静置して細胞を溶解させた。その後、１５，０００ｒｐｍで１５分間、４℃にて遠心処理して上清を回収し、セルライセートとして使用した。次いで、セルライセートにプロテインＧ  セファロース４  ファストフロー（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の５０％  スラリーを４０μＬ加え、４℃で１時間転倒混和した。その後、１０，０００ｒｐｍで１５秒間、４℃にて遠心処理し、回収した上清に抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製）０．５μＬを加え、４℃にて２時間転倒混和した後、新たにｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗ  ５０％スラリーを４０μＬ加え、再度４℃にて２時間転倒混和した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗを遠心処理により回収し、リシスバッファーで３回洗浄後、２０μＬの２×ＳＤＳ  サンプルバッファーを加え、１００℃で５分間加熱処理したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料として使用した。試料は５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ウエスタンブロッティングにより、ペルオキシダーゼ標識抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（ナカライテスク社製）でＭｙｃ−ＮＥＤＤ４を、ペルオキシダーゼ標識抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製）でＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３をそれぞれ検出した。検出はイーシーエル  ウエスタンブロッティング  ディテクション  キット（ＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して実施した。
【０２６４】
＜結果＞
図２のパネルＡに示すように、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３とを共発現させた細胞から調製した試料でのみ、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降（図中ＩＰと記載）によりＭｙｃ−ＮＥＤＤ４とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の共沈が認められた。これに対し、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３非発現細胞から調製した試料では、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降によるＭｙｃ−ＮＥＤＤ４の共沈が認められなかった。このことから、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降により認められたＭｙｃ−ＮＥＤＤ４の共沈降はＭｙｃ−ＮＥＤＤ４のアガロースビーズへの非特異的吸着によるものではなく、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の結合を示すものと判断した。両試料におけるＭｙｃ−ＮＥＤＤ４の発現は同程度であった（図２のパネルＡにおいてセルライセートと記載したレーン参照）。また、細胞で発現したＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３が抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体により回収されていることが確認された（図２のパネルＢ）。
【０２６５】
上記結果から、ヒトＮＥＤＤ４とヒトＲＵＮＸ３が細胞内で結合することが明らかになった。
【実施例３】
【０２６６】
（ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸ３のｉｎ  ｖｉｖｏユビキチン化）
ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸ３のｉｎ  ｖｉｖｏユビキチン化を、ヒトＲＵＮＸ３、ヒトＮＥＤＤ４およびヒトユビキチンを一過性共発現させたヒト培養細胞を使用して免疫沈降法により検討した。また、変異の導入によりそのＥ３リガーゼ活性が不活性化されたヒトＮＥＤＤ４変異体（以下、Ｅ３リガーゼ不活性型ヒトＮＥＤＤ４と称することがある）を使用して同様の検討を行った。
【０２６７】
＜材料と方法＞
ヒトＲＵＮＸ３発現プラスミドは、実施例２で作製した発現プラスミドを使用した。本ヒトＲＵＮＸ３発現プラスミドにより、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３が発現する。
【０２６８】
ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドは、実施例２で作製した発現プラスミドを使用した。本ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドにより、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４が発現する。
【０２６９】
ヒトＮＥＤＤ４変異体として、ＨＥＣＴドメインに変異が導入されたヒトＮＥＤＤ４変異体であるヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）を使用した。ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）は、ヒトＮＥＤＤ４のアミノ酸配列において第９６７番目のシステイン残基がアラニン残基に置換され、それによりＥ３リガーゼ活性が不活化されたヒトＮＥＤＤ４変異体である。
【０２７０】
ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドは、ヒト  ＮＥＤＤ４発現プラスミド（実施例２参照）を鋳型とし、ヒトＮＥＤＤ４の第９６７番目のシステイン残基のアラニン残基への置換を導入し得るプライマーを設計および合成して使用し、クイックチェンジサイトダイレクティッドミュータジェネシスキット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により構築した。構築した発現プラスミドのシーケンスを行い、該発現プラスミドに変異が導入されていることを確認した。本ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドにより、Ｎ末端Ｍｙｃ−ｔａｇ結合ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）（以下、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）と称する）が発現する。
【０２７１】
ヒトユビキチン（Ｕｂ）発現プラスミドを以下に述べるように構築した。ヒトＵｂ  ｃＤＮＡはヒト脳由来ｃＤＮＡ（ＱＵＩＣＫ−ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）からＰＣＲにより獲得し、シーケンスにより塩基配列を確認した。その後、ヒトＵｂ  ｃＤＮＡを、Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ結合蛋白質を発現させるための動物細胞用発現プラスミドｐＣＭＶ−ＨＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に組み込むことにより、Ｕｂ発現プラスミドを構築した。本Ｕｂ発現プラスミドにより、Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ結合Ｕｂ（以下、ＨＡ−Ｕｂと称する）が発現する。なお、クローニングしたＵｂ  ｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列はＮＣＢＩプロテインデータベースのアクセッションナンバーＮＰ＿０６６２８９（登録遺伝子名はＵＢＣ）に公開されたものと同一であった。
【０２７２】
Ｉｎ  ｖｉｖｏユビキチン化実験は以下に述べるように実施した。細胞数１．０×１０６のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ｃｍ  ディッシュに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて５％  ＣＯ２／９５％  エアの条件下で一晩培養後、ヒトＲＵＮＸ３発現プラスミド  ０．１μｇ、ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミド  ２．０μｇ、およびヒトＵｂ発現プラスミド  ０．２５μｇをＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用して細胞にトランスフェクションした。また、ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドの代わりに、ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドを同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製した。さらに、ヒトＲＵＮＸ３発現プラスミドのみをトランスフェクションした細胞、およびヒトＲＵＮＸ３発現プラスミドとヒトＵｂ発現プラスミドとをトランスフェクションした細胞を同様の方法で調製し、コントロールとして使用した。総ＤＮＡ導入量は空ベクターにより補正した。トランスフェクション後２日間培養した細胞を実施例２と同様の方法で処理してセルライセートを調製した。次いで、セルライセートにｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）５０％スラリーを４０μＬ加え、４℃にて１時間転倒混和した。その後、１０，０００ｒｐｍで１５秒間、４℃にて遠心処理し、回収した上清に抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製）０．５μＬを加え４℃にて２．５時間転倒混和した後、新たにｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗ  ５０％スラリーを４０μＬ加え、再度、４℃にて２時間転倒混和した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗを遠心処理により回収し、リシスバッファー（実施例２のものと同一組成）で３回洗浄後、２０μＬの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、１００℃で５分間加熱処理したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料として使用した。試料は５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ウエスタンブロッティングにより、ペルオキシダーゼ標識抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（ナカライテスク社製）でＭｙｃ−ＮＥＤＤ４およびＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）を、ペルオキシダーゼ標識抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製）でＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３を、ペルオキシダーゼ標識抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）でＨＡ−Ｕｂをそれぞれ検出した。検出はＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して実施した。
【０２７３】
＜結果＞
図３のパネルＡに示すように、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３より高い分子量を有する複数の蛋白質が抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降により検出された。一方、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４の代わりにＥ３リガーゼ活性が不活化されたＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）を共発現させた細胞から調製した試料においても、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３より高い分子量を有する蛋白質が検出されたがその量はＭｙｃ−ＮＥＤＤ４を発現させた細胞から調製した試料のものに比べ少なかった。ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞におけるＭｙｃ−ＮＥＤＤ４の発現、およびＭｙｃ−ＮＥＤＤ４の代わりにＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）を共発現させた細胞におけるＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）の発現は同程度であった（図３のパネルＣ）。
【０２７４】
図３のパネルＢに示すように、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料では、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降および抗ＨＡ抗体を使用したイムノブロットにより検出された蛋白質が、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４を発現させなかった細胞から調製した試料と比較して顕著に増加した。検出された蛋白質は、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３である。すなわち、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料では、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の増加が認められた。一方、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４の代わりにＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）を共発現させた細胞から調製した試料でも、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３が検出されたが、その量およびユビキチン化の程度はＭｙｃ−ＮＥＤＤ４を発現させた細胞から調製した試料のものと比べ、著しく低いものであった。
【０２７５】
これら結果から、ヒトＲＵＮＸ３がヒトＮＥＤＤ４により細胞内においてユビキチン化されること（図３のパネルＢ）、また、それによりヒトＲＵＮＸ３が高分子化することが明らかになった（図３のパネルＡ）。さらに、ヒトＮＥＤＤ４によるヒトＲＵＮＸ３のユビキチン化および高分子化には、ヒトＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性が重要であることが判明した。
【実施例４】
【０２７６】
（ＲＵＮＸ３の安定性に対するＮＥＤＤ４の影響）
ＲＵＮＸ３の安定性に対するＮＥＤＤ４の影響を、ヒトＲＵＮＸ３およびヒトＮＥＤＤ４を一過性性共発現させたヒト培養細胞を使用し、ウエスタンブロッティングにより検討した。
【０２７７】
＜材料と方法＞
ヒトＲＵＮＸ３発現プラスミドは、実施例２で作製した発現プラスミドを使用した。本ヒトＲＵＮＸ３発現プラスミドにより、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３が発現する。
【０２７８】
ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドおよびヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドは、実施例２および３で作製した発現プラスミドを使用した。本ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドにより、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４が発現する。また、本ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドにより、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）が発現する。
【０２７９】
細胞内安定性実験は以下に述べるように実施した。細胞数２．５×１０５のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウエルプレートの各ウエルに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて５％  ＣＯ２／９５％  エアの条件下で一晩培養後、ヒトＲＵＮＸ３発現プラスミド  ０．１μｇをヒトＮＥＤＤ４発現プラスミド  １．０〜２．０μｇと共にＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用して細胞にトランスフェクションした。また、ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドの代わりに、ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミド  ２．０μｇを同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製した。さらに、ヒトＲＵＮＸ３発現プラスミドのみをトランスフェクションした細胞を同様の方法で調製し、コントロールとして使用した。総ＤＮＡ導入量は空ベクターにより補正した。トランスフェクションの翌日に、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液を使用して回収した。回収した細胞は、リシスバッファー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）６０μＬを加えてピペッティングにてけん濁後、氷上で５分間静置することにより溶解させた。その後、１５，０００ｒｐｍで１０分間、４℃にて遠心処理して上清を回収し、セルライセートとして使用した。次いで、セルライセートに等量の２×ＳＤＳ  サンプルバッファーを加え、１００℃で５分間加熱処理したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料として使用した。同一蛋白質量の試料を、５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製）、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および抗アクチン（Ａｃｔｉｎ）抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を使用したウエスタンブロッティングを実施した。検出は蛍光標識された２次抗体を使用し、オディッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）イメージングシステム（Ａｌｏｋａ社製）により行なった。
【０２８０】
＜結果＞
図４のパネルＡに示すようにヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドの導入量に依存して、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の減少が認められた。一方、ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドをトランスフェクションした細胞から調製した試料では、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の減少は認められなかった。Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４がヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドの導入量に依存して発現されていること、またＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）がヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドにより発現されていることは、図４のパネルＢに示すように確認された。また、コントロールであるアクチンの発現量はいずれの試料においても同程度であった（図４のパネルＣ）。
【０２８１】
これら結果から、ヒトＮＥＤＤ４がヒトＲＵＮＸ３の細胞内での安定性を低下させることが明らかになった。また、ヒトＮＥＤＤ４によるヒトＲＵＮＸ３安定性の低下には、ヒトＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性が関与することが判明した。
【実施例５】
【０２８２】
（ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸ１の結合およびＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸ１のｉｎ  ｖｉｖｏユビキチン化）
ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸ１の結合およびＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸ１のｉｎ  ｖｉｖｏ  ユビキチン化を、ヒトＲＵＮＸ１、ヒトＮＥＤＤ４およびヒトユビキチンを一過性共発現させたヒト培養細胞を使用して免疫沈降法により検討した。また、Ｅ３リガーゼ不活性型ヒトＮＥＤＤ４を使用して同様の検討を行った。
【０２８３】
＜材料と方法＞
ヒトＲＵＮＸ１発現プラスミドは以下に述べるように構築した。ヒトＲＵＮＸ１  ｃＤＮＡはヒト腎臓由来ｃＤＮＡ（ＱＵＣＩＫ−ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）から、ＥｃｏＲＩサイトおよびＸｈｏＩサイトを付加したプライマーを使用してＰＣＲにより獲得し、シーケンスにより塩基配列を確認した。獲得したｃＤＮＡは、Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ結合蛋白質を発現させるための動物細胞用発現プラスミドｐＣＭＶ−Ｔａｇ２（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトで組み込み、ヒトＲＵＮＸ１発現プラスミドを構築した。本ヒトＲＵＮＸ１発現プラスミドにより、Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ結合ヒトＲＵＮＸ１（以下、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１と称する）が発現する。なお、クローニングしたヒトＲＵＮＸ１  ｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列はＮＣＢＩプロテインデータベースのアクセッションナンバーＮＰ＿００１７４５（登録遺伝子ＲＵＮＸ１）に公開されたものと同一であった。
【０２８４】
ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドおよびヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドは、それぞれ実施例２および３で作製した発現プラスミドを使用した。本ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドにより、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４が発現する。また、本ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドにより、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）が発現する。
【０２８５】
ヒトユビキチン（Ｕｂ）発現プラスミドは、実施例３で作製した発現プラスミドを使用した。本ヒトＵｂ発現プラスミドにより、ＨＡ−Ｕｂが発現する。
【０２８６】
Ｉｎ  ｖｉｖｏユビキチン化実験は以下に述べるように実施した。細胞数１．０×１０６のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ｃｍ  ディッシュに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて５％  ＣＯ２／９５％  エアの条件下で一晩培養後、ヒトＲＵＮＸ１発現プラスミド  ０．１μｇ、ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミド  ２．０μｇ、およびヒトＵｂ発現プラスミド  ０．２５μｇをＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用して細胞にトランスフェクションした。また、ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドの代わりに、ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドを同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製した。さらに、ヒトＲＵＮＸ１発現プラスミドとヒトＵｂ発現プラスミドとをトランスフェクションした細胞を同様の方法で調製し、コントロールとして使用した。総ＤＮＡ導入量は空ベクターにより補正した。トランスフェクション後２日間培養した細胞を実施例２と同様の方法で処理してセルライセートを調製した。次いで、セルライセートにｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）５０％スラリーを４０μＬ加え、４℃にて１時間転倒混和した。その後、１０，０００ｒｐｍで１５秒間、４℃にて遠心処理し、回収した上清に抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製）０．５μＬを加え４℃にて２．５時間転倒混和した後、新たにｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗ  ５０％スラリーを４０μＬ加え、再度、４℃にて２時間転倒混和した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗを遠心処理により回収し、リシスバッファー（実施例２のものと同一組成）で３回洗浄後、２０μＬの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、１００℃で５分間加熱処理したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料として使用した。試料は５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウエスタンブロッティングにより、ペルオキシダーゼ標識抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（ナカライテスク社製）でＭｙｃ−ＮＥＤＤ４およびＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）を、ペルオキシダーゼ標識抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製）でＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１を、ペルオキシダーゼ標識抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）でＨＡ−Ｕｂをそれぞれ検出した。検出はＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して実施した。
【０２８７】
＜結果＞
図５のパネルＡに示すように、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降によりＭｙｃ−ＮＥＤＤ４とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の共沈が認められた。また、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の共沈が認められた。
【０２８８】
図５のパネルＢに示すように、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１より高い分子量を有する複数の蛋白質が、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降により検出された。一方、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４の代わりにＥ３リガーゼ活性が不活化されたＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）を共発現させた細胞から調製した試料において、高分子量の蛋白質はほとんど検出されなかった。ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞におけるＭｙｃ−ＮＥＤＤ４の発現、およびＭｙｃ−ＮＥＤＤ４の代わりにＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）を共発現させた細胞におけるＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）の発現は同程度であった（図５のパネルＤ）。
【０２８９】
図５のパネルＣに示すように、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料では、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降および抗ＨＡ抗体を使用したイムノブロットにより検出された蛋白質が、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４を発現させなかった細胞から調製した試料と比較して顕著に増加した。検出された蛋白質は、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１である。すなわち、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料では、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の増加が認められた。一方、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４の代わりにＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）を共発現させた細胞から調製した試料でも、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１が検出されたが、その量およびユビキチン化の程度はＭｙｃ−ＮＥＤＤ４を発現させた細胞から調製した試料のものと比べ、低いものであった。
【０２９０】
これら結果から、ヒトＮＥＤＤ４およびヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）はいずれも、ヒトＲＵＮＸ１と細胞内で結合することが明らかになった（図５のパネルＡ）。また、ヒトＲＵＮＸ１がヒトＮＥＤＤ４により細胞内においてユビキチン化されること（図５のパネルＣ）、それによりヒトＲＵＮＸ１が高分子化することが明らかになった（図５のパネルＢ）。さらに、ヒトＮＥＤＤ４によるヒトＲＵＮＸ１のユビキチン化および高分子化には、ヒトＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性が重要であることが判明した。
【実施例６】
【０２９１】
（ＲＵＮＸ１の安定性に対するＮＥＤＤ４の影響）
ＲＵＮＸ１の安定性に対するＮＥＤＤ４の影響を、ヒトＲＵＮＸ１およびヒトＮＥＤＤ４を一過性性共発現させたヒト培養細胞を使用し、ウエスタンブロッティングにより検討した。
【０２９２】
＜材料と方法＞
ヒトＲＵＮＸ１発現プラスミドは、実施例５で作製した発現プラスミドを使用した。本ヒトＲＵＮＸ１発現プラスミドにより、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１が発現する。
【０２９３】
ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドおよびヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドは、それぞれ実施例２および３で作製した発現プラスミドを使用した。本ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドにより、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４が発現する。また、本ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドにより、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）が発現する。
【０２９４】
細胞内安定性実験は以下に述べるように実施した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ヒトＲＵＮＸ１発現プラスミド  ０．１μｇおよびヒトＮＥＤＤ４発現プラスミド  １．０〜２．０μｇを実施例４に記載の方法と同様の方法でトランスフェクションした。また、ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドの代わりに、ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミド  ２．０μｇを同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製した。さらに、ヒトＲＵＮＸ１発現プラスミドのみをトランスフェクションした細胞を同様の方法で調製し、コントロールとして使用した。総ＤＮＡ導入量は空ベクターにより補正した。トランスフェクションの翌日に、実施例４に記載の方法と同様の方法で細胞を回収してセルライセートを調製した。次いで、セルライセートに等量の２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、１００℃で５分間加熱処理したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料として使用した。同一蛋白量の試料を５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製）、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体／Ａ−１４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および抗ａｃｔｉｎ抗体／ｃ−１１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を使用したウエスタンブロッティングを実施した。検出は蛍光標識された２次抗体を使用し、Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステム（Ａｌｏｋａ社製）により行なった。
【０２９５】
＜結果＞
図６のパネルＡに示すように、ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドの導入量に依存して、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の減少が認められた。一方、ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドをトランスフェクションした細胞から調製した試料では、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の減少は認められなかった。Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４がヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドの導入量に依存して発現されていること、またＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）がヒトＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドにより発現されていることは、図６のパネルＢに示すように確認された。また、コントロールであるアクチンの発現量はいずれの試料においても同程度であった（図６のパネルＣ）。
【０２９６】
これら結果から、ヒトＮＥＤＤ４がヒトＲＵＮＸ１の細胞内での安定性を低下させることが明らかになった。また、ヒトＮＥＤＤ４によるヒトＲＵＮＸ１安定性の低下は、ヒトＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性が関与することが判明した。
【実施例７】
【０２９７】
（内因性ＮＥＤＤ４との比較）
ヒト癌細胞株で検出される内因性ＮＥＤＤ４の大きさを、ヒト培養細胞株で一過性発現させたヒトＮＥＤＤ４および短鎖型ヒトＮＥＤＤ４の大きさとウエスタンブロッティングにより比較した。
【０２９８】
＜材料と方法＞
ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドは、実施例２で作製した発現プラスミドを使用した。本ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドにより、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４が発現する。
【０２９９】
短鎖型ヒトＮＥＤＤ４として、ヒトＮＥＤＤ４（配列番号２）のＮ末端側第１番目から第１００番目の１００個のアミノ酸残基が欠失した蛋白質を使用した。
【０３００】
また、変異の導入によりそのＥ３リガーゼ活性が不活性化された短鎖型ヒトＮＥＤＤ４変異体を使用した。短鎖型ヒトＮＥＤＤ４変異体として、ＨＥＣＴドメインに変異が導入された短鎖型ヒトＮＥＤＤ４変異体である短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を作製した。短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）は、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４のアミノ酸配列において第８６７番目のシステイン残基がアラニン残基に置換され、それによりＥ３リガーゼ活性が不活化された短鎖型ヒトＮＥＤＤ４変異体である。短鎖型ヒトＮＥＤＤ４における第８６７番目のシステイン残基はヒトＮＥＤＤ４の第９６７番目のシステイン残基に相当する。
【０３０１】
短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドは以下に述べるように構築した。ヒトＮＥＤＤ４遺伝子のＯＲＦ領域のうち、ヒトＮＥＤＤ４の第１０１番目〜第１０００番目のアミノ酸配列をコードする領域（以下、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４  ｃＤＮＡと称する）をＰＣＲにより増幅し、シーケンスにより塩基配列を確認した。ＰＣＲは、実施例２で作製したヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドを鋳型とし、ＥｃｏＲＩサイトおよびＸｈｏＩサイトを付加したプライマーを使用して実施した。獲得した短鎖型ヒトＮＥＤＤ４  ｃＤＮＡは、動物細胞用発現プラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に組み込み、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドを構築した。なお、クローニングした短鎖型ヒトＮＥＤＤ４  ｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列はＮＣＢＩデータベースにアクセッションナンバーＮＰ＿００６１４５（ＫＩＡＡ００９３）に公開されたアミノ酸配列と同一であり、また、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータベースのアクセッションナンバーＰ４６９３４（登録遺伝子名はＮＥＤＤ４）に公開されたアミノ酸配列の第１０１番目〜第１０００番目のアミノ酸配列と一致した。
【０３０２】
短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミドは、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドを鋳型とし、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４の第８６７番目のシステイン残基のアラニン残基への置換を導入し得るプライマーを設計および合成して使用し、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により構築した。構築した発現プラスミドのシーケンスを行い、該発現プラスミドに変異が導入されていることを確認した。
【０３０３】
遺伝子発現およびイムノブロットは以下に述べるように実施した。細胞数１．０×１０６のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ｃｍ  ディッシュに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて５％  ＣＯ２／９５％  エアの条件下で一晩培養後、ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミド、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドおよび短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミドのうちいずれか１の発現プラスミド  １．０μｇをＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用して細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後２日間培養した細胞を使用して、実施例４に記載の方法と同様の方法で細胞を回収してセルライセートを調製した。
【０３０４】
ヒト癌細胞株で発現されている内因性ＮＥＤＤ４の検出は、乳癌由来細胞株（Ｔ−４７Ｄ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞およびＢＴ−２０細胞）、大腸癌細胞株（ＳＷ４８０細胞）、肺癌細胞株（Ａ５４９細胞）、骨髄性白血病細胞株（Ｋ５６２細胞およびＨＬ−６０細胞）、リンパ性白血病細胞（ＭＯＬＴ−４細胞）、胃癌細胞株（ＭＫＮ２８細胞およびＭＫＮ７４細胞）のセルライセートを使用して実施した。ＭＫＮ２８細胞およびＭＫＮ７４細胞以外の癌細胞株のセルライセートはＳａｎｔａＣｒｕｚ社より購入した。ＭＫＮ２８細胞およびＭＫＮ７４細胞は、プロテアーゼ阻害剤カクテルＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を含むＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／０．１％  ＳＤＳ／０．１％  ＤＯＣ）で溶解しセルライセートを調製した。
【０３０５】
上記セルライセートに等量の２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、１００℃で５分間加熱処理したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料として使用した。これら試料は５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗ＮＥＤＤ４抗体（Ｈ−１３５、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）を使用したウエスタンブロッティングにより、ＮＥＤＤ４を検出した。検出はＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して実施した。
【０３０６】
＜結果＞
短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞において、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４が検出された（図７のパネルＡ、レーン１）。また、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミドをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞において、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）が検出された（図７のパネルＡ、レーン２）。
【０３０７】
一方、ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を使用した解析では、ヒトＮＥＤＤ４のバンドの他に、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４および短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）の位置（図７のパネルＡ、レーン１および２参照）にバンドが認められた（図７のパネルＡ、レーン３）。このことから、ＨＥＫ２９３細胞においては、内因性と考えられる短鎖型ヒトＮＥＤＤ４が発現していると考える。
【０３０８】
Ｔ−４７Ｄ細胞を使用した解析では、ヒトＮＥＤＤ４のバンドは認められず、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４および短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）の位置（図７のパネルＡ、レーン１および２参照）にバンドが認められた（図７のパネルＡ、レーン４）。このことから、Ｔ−４７Ｄ細胞においては、ヒトＮＥＤＤ４はほとんど発現しておらず、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４が発現していると考える。
【０３０９】
Ｔ−４７Ｄ細胞以外の癌細胞株を使用した解析では、Ｔ−４７Ｄ細胞を使用した解析で認められたバンドの位置にバンドが認められた（図７のパネルＢ）。このことから、Ｔ−４７Ｄ細胞以外の癌細胞株において、Ｔ−４７Ｄ細胞と同様、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４が発現していると考える。
【０３１０】
これら結果から、癌細胞株で主に発現しているＮＥＤＤ４は短鎖型ＮＥＤＤ４であると考える。
【実施例８】
【０３１１】
（短鎖型ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸ１またはＲＵＮＸ３との結合、並びに短鎖型ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸ１またはＲＵＮＸ３のｉｎ  ｖｉｖｏユビキチン化）
短鎖型ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸ１またはＲＵＮＸ３との結合、並びに短鎖型ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸ１またはＲＵＮＸ３のｉｎ  ｖｉｖｏユビキチン化の検討を、ヒトＲＵＮＸ１またはヒトＲＵＮＸ３を、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４およびユビキチンと共に一過性共発現させたヒト培養細胞を使用して免疫沈降法により実施した。また、Ｅ３リガーゼが不活化された短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を使用して同様の検討を行った。
【０３１２】
＜材料と方法＞
ヒトＲＵＮＸ１発現プラスミドは、実施例５で作製した発現プラスミドを使用した。本ヒトＲＵＮＸ１発現プラスミドにより、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１が発現する。
【０３１３】
ヒトＲＵＮＸ３発現プラスミドは、実施例２で作製した発現プラスミドを使用した。本ヒトＲＵＮＸ３発現プラスミドにより、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３が発現する。
【０３１４】
Ｍｙｃ−ｔａｇ結合短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドは以下に述べるように構築した。短鎖型ヒトＮＥＤＤ４  ｃＤＮＡ（実施例７参照）を、その５´末端にＭｙｃ−ｔａｇコード配列を付加した後に、動物細胞用発現プラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に組み込み、Ｍｙｃ−ｔａｇ結合短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミド（以下、Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドと称する）を構築した。本Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドにより、Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（以下、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４と称する）が発現する。
【０３１５】
Ｍｙｃ−ｔａｇ結合短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミドは以下に述べるように構築した。短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）  ｃＤＮＡ（実施例７参照）を、その５´末端にＭｙｃ−ｔａｇコード配列を付加した後に、動物細胞用発現プラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に組み込み、Ｍｙｃ−ｔａｇ結合短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミド（以下、Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミドと称する）を構築した。本Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミドにより、Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）（以下、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）と称する）が発現する。
【０３１６】
ヒトユビキチン（Ｕｂ）発現プラスミドは、実施例３で作製した発現プラスミドを使用した。本ヒトＵｂ発現プラスミドにより、Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ結合ヒトＵｂ（以下、ＨＡ−Ｕｂと称する）が発現する。
【０３１７】
Ｉｎ  ｖｉｖｏユビキチン化実験は以下に述べるように実施した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ヒトＲＵＮＸ１発現プラスミドまたはヒトＲＵＮＸ３発現プラスミド  ０．１μｇを、Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミド  ２．０μｇおよびヒトＵｂ発現プラスミド  ０．２５μｇと共に実施例４に記載の方法と同様の方法でトランスフェクションした。また、Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドの代わりに、Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミド  ２．０μｇを同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製した。さらに、ヒトＲＵＮＸ１発現プラスミドまたはヒトＲＵＮＸ３発現プラスミドをヒトＵｂ発現プラスミドと共に同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製し、コントロールとして使用した。総ＤＮＡ導入量は空ベクターにより補正した。トランスフェクション後２日間培養した細胞を実施例２と同様の方法で処理してセルライセートを調製した。次いで、セルライセートにｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）５０％スラリーを４０μＬ加え、４℃にて１時間転倒混和した。その後、１０，０００ｒｐｍで１５秒間、４℃にて遠心処理し、回収した上清に抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製）０．５μＬを加えて４℃にて２．５時間転倒混和した後、新たにｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗ  ５０％スラリーを４０μＬ加え、再度、４℃にて２時間転倒混和した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗを遠心処理により回収し、リシスバッファー（実施例２に記載のものと同一組成）で３回洗浄後、２０μＬの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、１００℃で５分間加熱処理したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料として使用した。試料は５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウエスタンブロッティングにより、ペルオキシダーゼ標識抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（ナカライテスク社製）を使用してＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を、ペルオキシダーゼ標識抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を使用してＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１およびＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３を、ペルオキシダーゼ標識抗ＨＡ／３Ｆ１０抗体（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用してＨＡ−Ｕｂをそれぞれ検出した。検出はＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して実施した。
【０３１８】
＜結果＞
図８のパネルＡに示すように、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降によりＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の共沈が認められた。また、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の共沈が認められた。
【０３１９】
図８のパネルＢに示すように、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１より高い分子量を有する複数の蛋白質が、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降により検出された。一方、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の代わりにＥ３リガーゼ活性が不活化されたＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を共発現させた細胞から調製した試料において、このような高分子量の蛋白質はほとんど検出されなかった。ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞におけるＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の発現、およびＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の代わりにＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を共発現させた細胞におけるＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）の発現は同程度であった（図８のパネルＤ）。
【０３２０】
図８のパネルＣに示すように、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料では、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降および抗ＨＡ抗体を使用したイムノブロットにより検出された蛋白質が、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４を発現させなかった細胞から調製した試料と比較して顕著に増加した。検出された蛋白質は、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１である。すなわち、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料では、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の増加が認められた。一方、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の代わりにＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を共発現させた細胞から調製した試料でも、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１が検出されたが、その量およびユビキチン化の程度はＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４を発現させた細胞から調製した試料のものに比べ、著しく低いものであった。
【０３２１】
図９のパネルＡに示すように、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降によりＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の共沈が認められた。また、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の共沈が認められた。
【０３２２】
図９のパネルＢに示すように、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３より高い分子量を有する複数の蛋白質が、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降により検出された。一方、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の代わりにＥ３リガーゼ活性が不活化されたＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を共発現させた細胞から調製した試料において、このような高分子量の蛋白質はほとんど検出されなかった。ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞におけるＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の発現、およびＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の代わりにＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を共発現させた細胞におけるＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）の発現は、同程度であった（図９のパネルＤ）。
【０３２３】
図９のパネルＣに示すように、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料では、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降および抗ＨＡ抗体を使用したイムノブロットにより検出された蛋白質が、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４を発現させなかった細胞から調製した試料と比較して顕著に増加した。検出された蛋白質は、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３である。すなわち、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料では、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の増加が認められた。一方、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の代わりにＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を共発現させた細胞から調製した試料でも、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３が検出されたが、その量およびユビキチン化の程度はＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４を発現させた細胞から調製した試料のものに比べ、著しく低いものであった。
【０３２４】
これら結果から、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４および短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）はいずれも、ヒトＲＵＮＸ１と細胞内で結合することが明らかになった（図８のパネルＡ）。また、ヒトＲＵＮＸ１が短鎖型ヒトＮＥＤＤ４により細胞内においてユビキチン化されること（図８のパネルＣ）、それによりヒトＲＵＮＸ１が高分子化すること（図８のパネルＢ）が明らかになった。さらに、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４によるヒトＲＵＮＸ１のユビキチン化および高分子化には、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性が重要であることが判明した。
【０３２５】
また、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４および短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）はいずれも、ヒトＲＵＮＸ３と細胞内で結合することが明らかになった（図９のパネルＡ）。また、ヒトＲＵＮＸ３が短鎖型ヒトＮＥＤＤ４により細胞内においてユビキチン化されること（図９のパネルＣ）、それによりヒトＲＵＮＸ３が高分子化すること（図９のパネルＢ）が明らかになった。さらに、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４によるヒトＲＵＮＸ３のユビキチン化および高分子化には、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性が重要であることが判明した。
【実施例９】
【０３２６】
（短鎖型ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸ２の結合、および短鎖型ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸ２のｉｎ  ｖｉｖｏユビキチン化）
短鎖型ＮＥＤＤ４とＲＵＮＸ２の結合、および短鎖型ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸ２のｉｎ  ｖｉｖｏユビキチン化を、ヒトＲＵＮＸ２、ヒト短鎖型ヒトＮＥＤＤ４およびヒトユビキチンを一過性共発現させたヒト培養細胞を使用して免疫沈降法により検討した。また、Ｅ３リガーゼが不活化された短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を使用して同様の検討を行った。
【０３２７】
＜材料と方法＞
ヒトＲＵＮＸ２発現プラスミドは以下に述べるように構築した。ヒトＲＵＮＸ２のｃＤＮＡはヒト骨髄由来ｃＤＮＡ（ＱＵＣＩＫ−ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）から、ＥｃｏＲＶサイトおよびＸｈｏＩサイトを付加したプライマーを使用してＰＣＲにより獲得し、シーケンスにより塩基配列を確認した。獲得したｃＤＮＡは、Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ結合蛋白質を発現させるための動物細胞用発現プラスミドｐＣＭＶ−Ｔａｇ２（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩサイトで組み込み、ヒトＲＵＮＸ２発現プラスミドを構築した。本ヒトＲＵＮＸ２発現プラスミドにより、Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ結合ヒトＲＵＮＸ２（以下、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２と称する）が発現する。なお、クローニングしたヒトＲＵＮＸ２  ｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列はＮＣＢＩプロテインデータベースのアクセッションナンバーＮＰ＿００４３３９（登録遺伝子ＲＵＮＸ２）に開示されたものと同一であった。
【０３２８】
Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドおよびＭｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミドは、いずれも実施例８で作製した発現プラスミドを使用した。本Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドにより、Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４が発現する。本Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミドにより、Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）が発現する。
【０３２９】
ヒトユビキチン（Ｕｂ）発現プラスミドは、実施例３で作製した発現プラスミドを使用した。本ヒトＵｂ発現プラスミドにより、ＨＡ−Ｕｂが発現する。
【０３３０】
Ｉｎ  ｖｉｖｏユビキチン化実験は以下に述べるように実施した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ヒトＲＵＮＸ２発現プラスミド  ０．１μｇ、Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミド  ２．０μｇ、およびヒトＵｂ発現プラスミド  ０．２５μｇを実施例４に記載の方法と同様の方法でトランスフェクションした。また、Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドの代わりに、Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミド  ２．０μｇを同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製した。さらに、ヒトＲＵＮＸ２発現プラスミドとヒトＵｂ発現プラスミドを同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製し、コントロールとして使用した。総ＤＮＡ導入量は空ベクターにより補正した。トランスフェクション後２日間培養した細胞を実施例２と同様の方法で処理してセルライセートを調製した。次いで、セルライセートにｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）５０％スラリーを４０μＬ加え、４℃にて１時間転倒混和した。その後、１０，０００ｒｐｍで１５秒間、４℃にて遠心処理し、採取した上清に抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製）０．５μＬを加え４℃にて２．５時間転倒混和した後、新たにｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗ  ５０％スラリーを４０μＬ加え、再度、４℃にて２時間転倒混和した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗを遠心処理により回収し、リシスバッファー（実施例２に記載のものと同一組成）で３回洗浄後、２０μＬの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、１００℃で５分間加熱処理したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料として使用した。試料は５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウエスタンブロッティングにより、ペルオキシダーゼ標識抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（ナカライテスク社製）を使用してＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を、ペルオキシダーゼ標識抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を使用してＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２を、ペルオキシダーゼ標識抗ＨＡ／３Ｆ１０抗体（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用してＨＡ−Ｕｂをそれぞれ検出した。検出はＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して実施した
【０３３１】
＜結果＞
図１０のパネルＡに示すように、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降によりＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２の共沈が認められた。また、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２の共沈が認められた。
【０３３２】
図１０のパネルＢに示すように、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２より高い分子量を有する複数の蛋白質が、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降により検出された。一方、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の代わりにＥ３リガーゼ活性が不活化されたＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を共発現させた細胞から調製した試料では、このような高分子量の蛋白質はほとんど検出されなかった。ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞におけるＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の発現、およびＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の代わりにＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を共発現させた細胞におけるＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）の発現は、同程度であった（図１０のパネルＤ）。
【０３３３】
図１０のパネルＣに示すように、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料では、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降および抗ＨＡ抗体を使用したイムノブロットにより検出された蛋白質が、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４を発現させなかった細胞から調製した試料と比較して顕著に増加した。検出された蛋白質は、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２である。すなわち、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料では、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２の増加が認められた。一方、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の代わりにＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を共発現させた細胞から調製した試料では、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２を示すバンドは検出されなかった。
【０３３４】
これら結果から、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４および短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）はいずれも、ヒトＲＵＮＸ２と細胞内で結合することが明らかになった（図１０のパネルＡ）。また、ヒトＲＵＮＸ２が短鎖型ヒトＮＥＤＤ４により細胞内においてユビキチン化されること（図１０のパネルＣ）、それによりヒトＲＵＮＸ２が高分子化すること（図１０のパネルＢ）が明らかになった。さらに、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４によるヒトＲＵＮＸ２のユビキチン化および高分子化には、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性が重要であることが判明した。
【実施例１０】
【０３３５】
（ＢＭＰ−２の骨分化作用に対する不活性型ＮＥＤＤ４の影響）
ＢＭＰ−２の骨分化作用に対する、ＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性の影響を検討するため、マウス培養細胞にＥ３リガーゼ不活性型ヒトＮＥＤＤ４を一過性発現させ、骨形成マーカーであるアルカリフォスファターゼ（以下、ＡＬＰと略称する）活性を測定した。
【０３３６】
骨分化の検討は、マウス培養細胞Ｃ２Ｃ１２細胞を使用して行った。Ｃ２Ｃ１２細胞は、マウス筋芽細胞であり、骨芽細胞や軟骨細胞と同じ間葉系幹細胞に由来する。Ｃ２Ｃ１２細胞はＢＭＰ−２刺激により典型的な骨芽細胞のフェノタイプ、例えばＡＬＰ活性の上昇やオステオカルシンの産生等を示すことから、ＢＭＰ−２シグナルに依存した骨形成のモデル細胞として利用されている（カタギリ（Ｋａｔａｇｉｒｉ  Ｔ．）ら、「ザ  ジャーナル  オブ  セル  バイオロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９４年、第１２７巻、ｐ．１７５５−１７６６）。
【０３３７】
ＢＭＰは生体内で未分化間葉系幹細胞を軟骨細胞、骨芽細胞に分化、増殖させ骨組織を誘導するサイトカインである。ＢＭＰ−２は骨折治癒過程の初期に発現することが確認されており、骨修復における一連のカスケードの進行に関与している。
【０３３８】
＜材料と方法＞
Ｅ３リガーゼ不活性型ヒトＮＥＤＤ４として、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を使用した。Ｍｙｃ−ｔａｇ結合短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミドは、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４の第８６７番目のシステイン残基のアラニン残基への置換を導入し得るプライマーを設計および合成して使用し、クイックチェンジサイトダイレクティッドミュータジェネシスキット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により構築した。構築した発現プラスミドのシーケンスを行い、該発現プラスミドに変異が導入されていることを確認した。本Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミドにより、Ｎ末端Ｍｙｃ−ｔａｇ結合短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）（以下、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）と称する）が発現する。
【０３３９】
Ｍｙｃ−ｔａｇ結合短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドは実施例８で作製した発現プラスミドを使用した。本Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドにより、Ｎ末端Ｍｙｃ−ｔａｇ結合短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（以下、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４と称する）が発現する。
【０３４０】
ＢＭＰ−２の骨分化作用に対するＥ３リガーゼ不活性型ヒトＮＥＤＤ４の影響の検討は、以下に述べるように実施した。マウス筋芽細胞のＣ２Ｃ１２細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて５％  ＣＯ２／９５％  エアの条件下で２日間培養後、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡにて処理・回収し、ヌクレオフェクター（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、Ａｍａｘａ社製）を使用して、Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミド２μｇをエレクトロポレーションにより細胞にトランスフェクションした。また、Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミドの代わりに、Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドを同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製した。さらに、これら発現プラスミドの代わりに空ベクター（動物細胞用発現プラスミドｐＣＩ）を同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製し、コントロールとして使用した。次いで、細胞数１．６×１０５の細胞を６ウエルプレートの各ウエルに播種し一晩培養後、培養培地を、フェノールレッド無添加ＤＭＥＭ／５％チャコール−デキストラン処理ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）にＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を最終濃度３００ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地と交換した。ＢＭＰ−２存在下で３日間培養した後、細胞を回収し、リシスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）／０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）にて細胞溶解液を調製した。細胞溶解液の蛋白質濃度を測定後、各２０μｇの蛋白質中のＡＬＰ活性（Ａｂ５９５ｎｍ／ｍｉｎ／ｇ）の測定を、ＢｌｕＰｈｏｓ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ社製）を使用して実施した。
【０３４１】
ＢＭＰ−２無処理の空ベクター導入細胞から調製した細胞溶解液のＡＬＰ活性に対し、Ｍｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミドまたはＭｙｃ−短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドをトランスフェクションした細胞から調製した細胞溶解液のＡＬＰ活性の相対値を算出し、得られた相対値によりＢＭＰ−２の骨分化作用に対する短鎖型ヒトＮＥＤＤ４または短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）の影響を評価した。得られたデータについて統計処理を行った。各処理群のＡＬＰ活性データの分散についてはＦ検定を、平均値の差についてはスチューデントのｔ検定（ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）またはウエルチのｔ検定（Ｗｅｌｃｈ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）を行なった。
【０３４２】
＜結果＞
ＢＭＰ−２刺激下において、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現細胞のＡＬＰ活性と空ベクター導入細胞のＡＬＰ活性には有意な差はみられなかった。これに対し、ＢＭＰ−２で刺激した短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現細胞では、空ベクター導入細胞のＡＬＰ活性と比較して約１．４倍のＡＬＰ活性の増加が確認された（図１１）。短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）はＥ３リガーゼ不活性型短鎖型ヒトＮＥＤＤ４である。
【０３４３】
本結果より、ＮＥＤＤ４のＥ３リガーゼ活性が、ＢＭＰ−２誘発骨分化の亢進に寄与することが明らかになった。
【実施例１１】
【０３４４】
（ＢＭＰ−２の骨分化作用に対するＮＥＤＤ４ノックダウンの影響）
ＢＭＰ−２の骨分化作用に対する内因性ＮＥＤＤ４の影響を検討するため、マウス培養細胞においてｓｉＲＮＡによりマウスＮＥＤＤ４をノックダウンし、骨形成マーカーであるＡＬＰ活性を測定した。
【０３４５】
＜材料と方法＞
マウスＮＥＤＤ４（ＮＣＢＩデータベースにアクセッションナンバーＮＭ＿０１０８９０で公開されている）のｓｉＲＮＡはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入したＮＭ＿０１０８９０＿ｓｔｅａｌｔｈ＿３６０を使用した。また、コントロールｓｉＲＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ社のネガティブコントロール  ｓｉＲＮＡを使用した。
【０３４６】
マウスＮＥＤＤ４（以下、Ｎｅｄｄ４と称する）のｓｉＲＮＡを構成するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの塩基配列を以下に示す。
センスＲＮＡ：５´−ＧＧＡＧＵＵＧＡＡＵＣＣＧＡＡＵＵＣＣＣＵＧＧＡＡ−３´（配列番号１９）
アンチセンスＲＮＡ：５´−ＵＵＣＣＡＧＧＧＡＡＵＵＣＧＧＡＵＵＣＡＡＣＵＣＣ−３´（配列番号２０）
【０３４７】
細胞へのｓｉＲＮＡの導入は以下に述べるように行った。細胞数４×１０５のマウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞を６ｃｍ  ｄｉｓｈに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて５％  ＣＯ２／９５％  エアの条件下で一晩培養した。一方、５００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地に１０μｌのリポフェクトアミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｏｎｅ  ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加し、室温にて５分間インキュベーションした。その後、５００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地に２５０ｐｍｏｌのＮｅｄｄ４  ｓｉＲＮＡまたはネガティブコントロール  ｓｉＲＮＡを添加した溶液と混和し（計１ｍｌ）、さらに２０分間室温でインキュベーションし、ｓｉＲＮＡ／ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００混合液を調製した。上記細胞の培養培地を３ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭに交換し、ｓｉＲＮＡ／ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００混合液を添加した。
【０３４８】
ＢＭＰ−２の骨分化作用に対するＮｅｄｄ４  ｓｉＲＮＡ影響を、以下に述べるように検討した。ｓｉＲＮＡを細胞に導入して６時間培養後、培養培地を、フェノールレッド無添加ＤＭＥＭ／５％チャコール−デキストラン処理ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）にＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を最終濃度６００ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地と交換した。ＢＭＰ−２存在下で３日間培養した後、細胞を回収し、リシスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）／０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）にて細胞溶解液を調製した。細胞溶解液の蛋白質濃度を測定後、各２０μｇの蛋白質中のＡＬＰ活性（Ａｂ５９５ｎｍ／ｍｉｎ／ｇ）をＢｌｕＰｈｏｓ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ社）を使用して測定した。
【０３４９】
ＢＭＰ−２無添加条件下のネガティブコントロール  ｓｉＲＮＡを導入した細胞から調製した細胞溶解液のＡＬＰ活性に対し、Ｎｅｄｄ４  ｓｉＲＮＡを導入した細胞から調製した細胞溶解液のＡＬＰ活性の相対値を算出し、得られた相対値によりＢＭＰ−２の骨分化作用に対するＮｅｄｄ４  ｓｉＲＮＡの影響を評価した。得られたデータについて統計処理を行った。各処理群のＡＬＰ活性データの分散についてはＦ検定を、平均値の差についてはスチューデントのｔ検定またはウエルチのｔ検定を行なった。
【０３５０】
Ｎｅｄｄ４  ｓｉＲＮＡによる細胞内Ｎｅｄｄ４ノックダウンの確認をウエスタンブロッティングにより実施した。上記で作製した細胞溶解液の一部に５×ＳＤＳ  サンプルバッファーを添加し、１００℃で５分間加熱したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料として使用した。試料を５−２０％  ｇｅｌにより分離し、抗ＮＥＤＤ４抗体Ｈ−１３５（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および抗アクチン抗体Ｃ−１１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を使用したウエスタンブロッティングを実施した。蛋白質バンドの検出および定量は、蛍光標識した２次抗体を使用し、Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステム（Ａｌｏｋａ社製）により行なった。ＢＭＰ−２無処理のネガティブコントロール  ｓｉＲＮＡ導入細胞において検出されたＮｅｄｄ４のバンドの濃度に対する、各細胞において検出されたＮｅｄｄ４のバンドの濃度の相対値を算出した。相対値を算出するとき、各細胞において検出されたＮｅｄｄ４のバンドの濃度は、アクチン（Ａｃｔｉｎ）のバンドの濃度により補正した。
【０３５１】
＜結果＞
Ｎｅｄｄ４  ｓｉＲＮＡ処理細胞では、ネガティブコントロール  ｓｉＲＮＡ処理細胞と比較して、ＢＭＰ−２刺激によるＡＬＰ活性が約２倍増加した（図１２のパネルＡ）。
【０３５２】
Ｎｅｄｄ４  ｓｉＲＮＡ処理細胞では、Ｎｅｄｄ４の発現が著しく阻害された（図１２のパネルＢ）。Ｎｅｄｄ４  ｓｉＲＮＡによるＮｅｄｄ４のノックダウン率は５０％以上であった。
【０３５３】
以上の結果から、ＮＥＤＤ４の発現を阻害することでＢＭＰ−２刺激による骨分化作用は増強することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０３５４】
本発明によれば、ＮＥＤＤ４または短鎖型ＮＥＤＤ４を使用してＲＵＮＸをユビキチン化する方法を提供できる。本方法を利用して、ＮＥＤＤ４または短鎖型ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物または該ユビキチン化を促進する化合物の同定方法を提供できる。ＮＥＤＤ４、あるいはＮＥＤＤ４または短鎖型ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を促進する化合物を使用して、ＮＥＤＤ４または短鎖型ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を促進することができ、それにより、ＲＵＮＸの分解を促進できる。また、不活性型ＮＥＤＤ４、あるいはＮＥＤＤ４または短鎖型ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害する化合物を使用して、ＮＥＤＤ４または短鎖型ＮＥＤＤ４によるＲＵＮＸのユビキチン化を阻害することができ、それにより、ＲＵＮＸの分解を阻害できる。このように、ＲＵＮＸのユビキチン化およびそれによる分解を調節することにより、ＲＵＮＸの異常に起因する疾患の予防および／または治療が可能である。ＲＵＮＸが腫瘍形成および癌疾患の増悪に関与していると考えられることから、本発明により多様な癌疾患の予防および／または治療が可能である。
【０３５５】
また本発明によれば、ＮＥＤＤ４または短鎖型ＮＥＤＤ４の発現あるいは機能を阻害する化合物を同定することを特徴とする、骨形成を促進させ得る化合物の同定方法を提供できる。本同定方法により得られた化合物は、骨形成を促進させ得る化合物であるため、骨損失疾患等、例えば骨粗しょう症の予防および／または治療剤の有効成分として利用できる。
【０３５６】
本発明は、ＲＵＮＸの分解のメカニズム、ＲＵＮＸが関与する転写のメカニズムおよびＲＵＮＸの異常に起因する疾患等に関する基礎的研究や医薬品開発等に有用である。さらに本発明は、ＲＵＮＸの異常に起因する疾患、例えば癌疾患の予防および／または治療に利用できる。また、本発明は、骨損失疾患等、例えば骨粗しょう症の予防および／または治療剤の開発に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０３５７】
【図１】ＲＵＮＸ３とＮＥＤＤ４の相互作用をインシリコで予測した結果を示す図である。ＲＵＮＸ３とＮＥＤＤ４の間でローカルアライメントを行い、高いスコア（ｓｃｏｒｅ）を示した領域を図示した。アミノ酸配列は１文字表記した。図中の数字は、ＲＵＮＸ３またはＮＥＤＤ４の各アミノ酸配列における、図示した各領域のＮ末端アミノ酸の位置を意味する。（実施例１）
【図２】ヒトＲＵＮＸ３とヒトＮＥＤＤ４のｉｎ  ｖｉｖｏでの結合を、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３およびＭｙｃ−ＮＥＤＤ４を一過性共発現させたヒト培養細胞を使用して免疫沈降法により検出した結果を示す図である。パネルＡおよびパネルＢは、抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降物についてそれぞれ抗Ｍｙｃ抗体および抗ＦＬＡＧ抗体を使用してイムノブロットを行った結果を示す。図中、＋および−はそれぞれ各発現プラスミドの有無を、ＩＰは抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用して免疫沈降した試料を、セルライセートは免疫沈降していない細胞溶解液試料を示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３とを共発現させた細胞から調製した試料でのみ、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用した免疫沈降によりＭｙｃ−ＮＥＤＤ４とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の共沈が認められた（パネルＡ）。一方、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３非発現細胞から調製した試料ではＭｙｃ−ＮＥＤＤ４の共沈が認められなかった。両試料におけるＭｙｃ−ＮＥＤＤ４の発現は同程度であった（パネルＡ）。また、細胞で発現したＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３が抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体により回収されていることが確認された（パネルＢ）。（実施例２）
【図３】ヒトＮＥＤＤ４によるヒトＲＵＮＸ３のｉｎ  ｖｉｖｏでのユビキチン化を、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４およびＨＡ−ユビキチンを一過性共発現させたヒト培養細胞を使用して免疫沈降法により検討した結果を示す図である。パネルＡおよびパネルＢは、抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降物について、それぞれ抗ＦＬＡＧ抗体および抗ＨＡ抗体を使用したイムノブロットを行った結果を示す。また、パネルＣはセルライセートについて抗Ｍｙｃ抗体を使用したイムノブロットを行った結果を示す。図中、＋および−はそれぞれ各発現プラスミドの有無を示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３より高い分子量を有する複数の蛋白質が検出され（パネルＡ）、また、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の増加が認められた（パネルＢ）。一方、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４の代わりにＥ３リガーゼ活性が不活化されたＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）を共発現させた細胞から調製した試料においては、高分子量蛋白質の検出量は少なく（パネルＡ）、また、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の量およびそのユビキチン化の程度は著しく低かった（パネルＢ）。ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞におけるＭｙｃ−ＮＥＤＤ４の発現、およびＭｙｃ−ＮＥＤＤ４の代わりにＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）を共発現させた細胞におけるＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）の発現は同程度であった（パネルＣ）。（実施例３）
【図４】ヒトＲＵＮＸ３の安定性に対するヒトＮＥＤＤ４の影響を、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３およびＭｙｃ−ＮＥＤＤ４を一過性性共発現させたヒト培養細胞を使用し、ウエスタンブロッティングにより検討した結果を示す図である。パネルＡ、パネルＢおよびパネルＣは、それぞれ抗ＦＬＡＧ抗体、抗Ｍｙｃ抗体および抗アクチン抗体を使用したイムノブロットを行った結果を示す。図中、＋および−はそれぞれ各発現プラスミドの有無を示し、数字はＤＮＡ導入量を示す。図の右列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。ＮＥＤＤ４発現プラスミドの導入量に依存して、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の減少が認められた（パネルＡ）。一方、ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドをトランスフェクションした細胞から調製した試料では、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の減少は認められなかった（パネルＡ）。Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４がＮＥＤＤ４発現プラスミドの導入量に依存して発現されていること、またＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）がＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドにより発現されていることは確認された（パネルＢ）。また、コントロールであるアクチンの発現量はいずれの試料においても同程度であった（パネルＣ）。（実施例４）
【図５】ヒトＮＥＤＤ４とヒトＲＵＮＸ１の結合およびヒトＮＥＤＤ４によるヒトＲＵＮＸ１のｉｎ  ｖｉｖｏ  ユビキチン化を、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４およびＨＡ−ユビキチンを一過性共発現させたヒト培養細胞を使用して免疫沈降法により検討した結果を示す図である。パネルＡ、パネルＢおよびパネルＣは、抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降物について、それぞれ抗Ｍｙｃ抗体、抗ＦＬＡＧ抗体および抗ＨＡ抗体によるイムノブロットを行った結果を示す。パネルＤは、セルライセートについて、抗Ｍｙｃ抗体によるイムノブロットを行った結果を示す。図中、＋および−はそれぞれ各発現プラスミドの有無を示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の共沈が認められ（パネルＡ）、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１より高い分子量を有する複数の蛋白質が検出され（パネルＢ）、また、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の増加が認められた（パネルＣ）。一方、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料では、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の共沈が認められたが（パネルＡ）、高分子量の蛋白質はほとんど検出されず（パネルＢ）、また、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の量およびそのユビキチン化の程度は低かった（パネルＣ）。ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１、Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞におけるＭｙｃ−ＮＥＤＤ４の発現、およびＭｙｃ−ＮＥＤＤ４の代わりにＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）を共発現させた細胞におけるＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）の発現は同程度であった（パネルＤ）。（実施例５）
【図６】ヒトＲＵＮＸ１の安定性に対するヒトＮＥＤＤ４の影響を、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１およびＭｙｃ−ＮＥＤＤ４を一過性性共発現させたヒト培養細胞を使用し、ウエスタンブロッティングにより検討した結果を示す図である。パネルＡ、パネルＢおよびパネルＣは、それぞれ抗ＦＬＡＧ抗体、抗Ｍｙｃ抗体および抗アクチン抗体を使用したイムノブロットを行った結果を示す。図中、＋および−はそれぞれ各発現プラスミドの有無を示し、数字はＤＮＡ導入量を示す。図の右列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。ＮＥＤＤ４発現プラスミドの導入量に依存して、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の減少が認められた（パネルＡ）。一方、ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドをトランスフェクションした細胞から調製した試料では、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の減少は認められなかった（パネルＡ）。Ｍｙｃ−ＮＥＤＤ４がＮＥＤＤ４発現プラスミドの導入量に依存して発現されていること、またＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）がＮＥＤＤ４（Ｃ９６７Ａ）発現プラスミドにより発現されていることは確認された（パネルＢ）。また、コントロールであるアクチンの発現量はいずれの試料においても同程度であった（パネルＣ）。（実施例６）
【図７】ヒト癌細胞株で検出される内因性ＮＥＤＤ４の大きさを、ヒト培養細胞株で一過性発現させたヒトＮＥＤＤ４および短鎖型ヒトＮＥＤＤ４とウエスタンブロッティングにより比較した結果を示す図である。パネルＡは、短鎖型ＮＥＤＤ４（レーン１）、短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）（レーン２）またはＭｙｃ−ＮＥＤＤ４（レーン３）を発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のセルライセート、およびヒト乳癌細胞株Ｔ−４７Ｄのセルライセート（レーン４）について、抗ＮＥＤＤ４抗体を使用したイムノブロットを行った結果を示す。パネルＢは、様々なヒト癌細胞株のセルライセートについて、抗ＮＥＤＤ４抗体を使用したイムノブロットを行った結果を示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。（実施例７）
【図８】短鎖型ヒトＮＥＤＤ４とヒトＲＵＮＸ１の結合、および短鎖型ヒトＮＥＤＤ４によるヒトＲＵＮＸ１のｉｎ  ｖｉｖｏユビキチン化を、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−ユビキチンを一過性共発現させたヒト培養細胞を使用して免疫沈降法により検討した結果を示す図である。パネルＡ、パネルＢおよびパネルＣは、抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降物について、それぞれ抗Ｍｙｃ抗体、抗ＦＬＡＧ抗体および抗ＨＡ抗体によるイムノブロットを行った結果を示す。パネルＤは、セルライセートについて、抗Ｍｙｃ抗体によるイムノブロットを行った結果を示す。図中、＋および−はそれぞれ各発現プラスミドの有無を示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の共沈が認められ（パネルＡ）、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１より高い分子量を有する複数の蛋白質が検出され（パネルＢ）、また、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の増加が認められた（パネルＣ）。一方、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料では、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の共沈が認められたが（パネルＡ）、高分子量の蛋白質はほとんど検出されず（パネルＢ）、また、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１の量およびそのユビキチン化の程度は著しく低かった（パネルＣ）。ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ１、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞におけるＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の発現、およびＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の代わりにＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を共発現させた細胞におけるＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）の発現は同程度であった（パネルＤ）。（実施例８）
【図９】短鎖型ヒトＮＥＤＤ４とヒトＲＵＮＸ３の結合、および短鎖型ヒトＮＥＤＤ４によるヒトＲＵＮＸ３のｉｎ  ｖｉｖｏユビキチン化を、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−ユビキチンを一過性共発現させたヒト培養細胞を使用して免疫沈降法により検討した結果を示す図である。パネルＡ、パネルＢおよびパネルＣは、抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降物について、それぞれ抗Ｍｙｃ抗体、抗ＦＬＡＧ抗体および抗ＨＡ抗体によるイムノブロットを行った結果を示す。パネルＤは、セルライセートについて、抗Ｍｙｃ抗体によるイムノブロットを行った結果を示す。図中、＋および−はそれぞれ各発現プラスミドの有無を示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の共沈が認められ（パネルＡ）、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３より高い分子量を有する複数の蛋白質が検出され（パネルＢ）、また、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の増加が認められた（パネルＣ）。一方、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料では、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の共沈が認められたが（パネルＡ）、高分子量の蛋白質はほとんど検出されず（パネルＢ）、また、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３の量およびそのユビキチン化の程度は低かった（パネルＣ）。ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ３、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞におけるＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の発現、およびＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の代わりにＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を共発現させた細胞におけるＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）の発現は同程度であった（パネルＤ）。（実施例８）
【図１０】短鎖型ヒトＮＥＤＤ４とヒトＲＵＮＸ２の結合、および短鎖型ヒトＮＥＤＤ４によるヒトＲＵＮＸ２のｉｎ  ｖｉｖｏユビキチン化を、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−ユビキチンを一過性共発現させたヒト培養細胞を使用して免疫沈降法により検討した結果を示す図である。パネルＡ、パネルＢおよびパネルＣは、抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降物について、それぞれ抗Ｍｙｃ抗体、抗ＦＬＡＧ抗体および抗ＨＡ抗体によるイムノブロットを行った結果を示す。パネルＤは、セルライセートについて、抗Ｍｙｃ抗体によるイムノブロットを行った結果を示す。図中、＋および−はそれぞれ各発現プラスミドの有無を示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料において、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２の共沈が認められ（パネルＡ）、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２より高い分子量を有する複数の蛋白質が検出され（パネルＢ）、また、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２の増加が認められた（パネルＣ）。一方、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）、ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞から調製した試料では、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）とＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２の共沈が認められたが（パネルＡ）、高分子量の蛋白質は検出されず（パネルＢ）、また、ＨＡ−Ｕｂが付加されたＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２も検出されなかった（パネルＣ）。ＦＬＡＧ−ＲＵＮＸ２、Ｍｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４およびＨＡ−Ｕｂを共発現させた細胞におけるＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の発現、およびＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４の代わりにＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）を共発現させた細胞におけるＭｙｃ−短鎖型ＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）の発現は同程度であった（パネルＤ）。（実施例９）
【図１１】マウスＣ２Ｃ１２細胞において、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）がＢＭＰ−２刺激下でＡＬＰ活性を亢進させることを示す図面である。空ベクター（Ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ）、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４発現プラスミドまたは短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミドを細胞に導入し、３００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２刺激下で３日間培養後、細胞中のＡＬＰ活性を測定した。各データはＢＭＰ−２無処理の空ベクター導入細胞におけるＡＬＰ活性に対する相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ＡＬＰ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示す（平均値±ＳＤ、ｎ＝６）。図中、短鎖型ヒトＮＥＤＤ４および短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）はそれぞれ、単にＮＥＤＤ４およびＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）と表示する。ウエルチのｔ検定を使用して統計解析を行った結果、ＢＭＰ−２処理した短鎖型ヒトＮＥＤＤ４（Ｃ８６７Ａ）発現プラスミド導入細胞におけるＡＬＰ活性と、ＢＭＰ−２処理した空ベクター導入細胞のＡＬＰ活性との間に有意差が認められた（＊：ｐ＜０．０５）。（実施例１０）
【図１２】マウスＣ２Ｃ１２細胞において、マウスＮｅｄｄ４  ｓｉＲＮＡによるＮｅｄｄ４ノックダウンにより内因性Ｎｅｄｄ４の発現が阻害され（パネルＢ）、その結果、ＢＭＰ−２刺激下で該細胞のＡＬＰ活性が亢進した（パネルＡ）ことを示す図面である。ネガティブコントロール  ｓｉＲＮＡ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ）またはマウスＮｅｄｄ４  ｓｉＲＮＡを細胞に導入し、６００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２刺激下で３日間培養後、細胞中のＡＬＰ活性を測定した（パネルＡ）。各データはＢＭＰ−２無処理の空ベクター導入細胞におけるＡＬＰ活性に対する相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ＡＬＰ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示す（平均値±ＳＤ、ｎ＝６）。ウエルチのｔ検定を使用して統計解析を行った結果、ＢＭＰ−２処理したネガティブコントロール  ｓｉＲＮＡ導入細胞におけるＡＬＰ活性と、マウスＮｅｄｄ４  ｓｉＲＮＡ導入細胞のＡＬＰ活性との間に有意差が認められた（＊：ｐ＜０．０５）。マウスＮｅｄｄ４  ｓｉＲＮＡによるＮｅｄｄ４ノックダウン効果はウエスタンブロッティングにより評価した（パネルＢ）。図中、Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙは、ＢＭＰ−２無処理のネガティブコントロール  ｓｉＲＮＡ導入細胞において検出されたＮｅｄｄ４のバンドの濃度に対する、各細胞において検出されたＮｅｄｄ４のバンドの濃度の相対値を示す。相対値を算出するとき、各細胞において検出されたＮｅｄｄ４のバンドの濃度は、アクチン（Ａｃｔｉｎ）のバンドの濃度により補正した。（実施例１１）
【配列表フリーテキスト】
【０３５８】
配列番号１：ヒトＮＥＤＤ４（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド。
配列番号２：ヒトＮＥＤＤ４。
配列番号３：ヒトＮＥＤＤ４（配列番号２）のＮ末端側第１番目から第１００番目の１００個のアミノ酸残基が欠失した蛋白質（配列番号４）をコードするポリヌクレオチド。
配列番号４：ヒトＮＥＤＤ４（配列番号２）のＮ末端側第１番目から第１００番目の１００個のアミノ酸残基が欠失した蛋白質。
配列番号５：ヒトＲＵＮＸ１（配列番号６）をコードするポリヌクレオチド。
配列番号６：ヒトＲＵＮＸ１。
配列番号７：ヒトＲＵＮＸ２（配列番号８）をコードするポリヌクレオチド。
配列番号８：ヒトＲＵＮＸ２。
配列番号９：ヒトＲＵＮＸ３（配列番号１０）をコードするポリヌクレオチド。
配列番号１０：ヒトＲＵＮＸ３。
配列番号１１：ヒトＮＥＤＤ４（配列番号２）の不活性型変異体。
配列番号１２：ヒトＮＥＤＤ４（配列番号２）のＮ末端側第１番目から第１００番目の１００個のアミノ酸残基が欠失した蛋白質（配列番号４）の不活性型変異体。
配列番号１３：ヒトＮＥＤＤ４（配列番号２）の部分配列と高い相同性を有する、ヒトＲＵＮＸ３（配列番号１０）の部分配列。
配列番号１４：ヒトＲＵＮＸ３（配列番号１０）の部分配列と高い相同性を有する、ヒトＮＥＤＤ４（配列番号２）の部分配列。
配列番号１５：ヒトＮＥＤＤ４（配列番号２）の部分配列と高い相同性を有する、ヒトＲＵＮＸ３（配列番号１０）の部分配列。
配列番号１６：ヒトＲＵＮＸ３（配列番号１０）の部分配列と高い相同性を有する、ヒトＮＥＤＤ４（配列番号２）の部分配列。
配列番号１７：ヒトＮＥＤＤ４（配列番号２）の部分配列と高い相同性を有する、ヒトＲＵＮＸ３（配列番号１０）の部分配列。
配列番号１８：ヒトＲＵＮＸ３（配列番号１０）の部分配列と高い相同性を有する、ヒトＮＥＤＤ４（配列番号２）の部分配列。
配列番号１９：マウスＮｅｄｄ４に対するｓｉＲＮＡを構成するセンスＲＮＡ。
配列番号２０：マウスＮｅｄｄ４に対するｓｉＲＮＡを構成するアンチセンスＲＮＡ。
【図１】
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【図１１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【配列表】
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