(57)【要約】      （修正有）【課題】ホスホロアミダイト法によるオリゴＤＮＡ、ＲＮＡの合成において、縮合、酸化、キャピング、脱保護の全工程を無水条件下で行える製造方法の提供。【解決手段】亜リン酸エステルをリン酸エステルに酸化する工程において、酸化剤として１，１−ジヒドロペルオキシシクロアルカンを用いる。該方法は、従来法における脱水操作が不用になり、合成の最終収率を高めることが可能である。また、上記酸化剤は、有機溶媒への溶解性に優れ、爆発性、毒性がなく、安価であるという利点をもつ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
無水条件下，亜リン酸エステルをリン酸エステルに酸化する際，酸化剤として１，１−ジヒドロペルオキシシクロアルカンを用いることを特徴とする新規亜リン酸エステルの酸化方法。
【請求項２】
亜リン酸エステルが下記構造式
【化１】
2008100976.tif 000005
（式中，Ｒ１はジメトキシトリチル基，メトキシトリチル基，トリチル基，ｔ−ブチルジメチルシリル基，レブリノイル基，フルオレニルメトキシカルボニル基などのごとき水酸基の保護基から選択され，Ｒ２は２−シアノエトキシ基，アルコキシ基，ジアルキルアミノ基，ハロゲンなどから選択され，Ｒ３はリンカーを介した樹脂，あるいは水酸基の保護基から選択され，Ｒ４はｔ−ブチルジメチルシリルオキシ基，アシルオキシ基，アルコキシ基，トリアルキルシリルオキシ基，あるいは水素から選択され，Ｂ１，Ｂｍはそれぞれ塩基部位が保護された核酸塩基で同一であっても異なっていてもよく，ｎは以上の１以上の整数から選択される）で示され，１，１−ジヒドロペルオキシシクロアルカンが１，１−ジヒドロペルオキシシクロドデカンで，リン酸エステルが下記構造式
【化２】
2008100976.tif 000006
（式中，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｂ１，Ｂｍ，ｎは前記と同じ）で示される請求項１記載の亜リン酸エステルの酸化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は無水条件下，亜リン酸エステルをリン酸エステルに酸化する方法に関するもので，有機合成の属する分野，および他の分野において要求されている亜リン酸エステルからリン酸エステルへの酸化反応に供するものである。ことに，ＤＮＡおよびＲＮＡ化学合成において多用されているホスホロアミダイト法に供するものである。
【背景技術】
【０００２】  ２００３年，ヒトゲノム計画の達成が宣言され，遺伝子と疾病の関係解明，遺伝子情報発現の人為的な制御などが今後の重要な研究課題として挙げられている。これらの研究を進める上で，ＰＣＲのプライマー，ＤＮＡプローブ，アンチセンスＤＮＡなどとして用いることができる塩基配列が明確で，高純度のオリゴＤＮＡを効率よく入手することが極めて重要である。塩基配列が明確で，高純度のオリゴＤＮＡの入手法としては化学合成による手法が用いられている。ＤＮＡは塩基を有するデオキシリボースがリン酸ジエステル結合を介して高分子状に重合したもので，その合成にはインターヌクレオチド結合形成反応が必須であり，その形成方法によりリン酸トリエステル法，ホスホロアミダイト法，ホスホネート法などに分類される。近年，高い活性を有する３価のリン酸誘導体をインターヌクレオチド結合形成反応に利用するホスホロアミダイト法が広く用いられている。このホスホロアミダイト法は反応の確かさと迅速さを併せ持ち，固相合成へも応用されている。市販されているＤＮＡ自動合成機はホスホロアミダイト法を採用しており，この方法は，多方面で実用的な，そして確実な方法としてオリゴＤＮＡ合成に多用されている。一般的なホスホロアミダイト法による固相オリゴＤＮＡ合成は下記反応式に従って行われる。【０００３】
【化】
2008100976.tif 000002
2008100976.tif 000003
【０００４】（式中，Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３はそれぞれ保護された核酸塩基で，同一であっても異なっていても
2008100976.tif 000004
ビーズ，樹脂などの担体を表し，ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基を表す）オリゴＤＮＡの合成は上記反応式に示すように，まずテトラゾールの存在下，５′−位の水酸基がフリーで樹脂に担持させたヌクレオシド誘導体１と過剰量のホスホロアミダイト試薬２を縮合させ，縮合生成物３を得る。ホスホロアミダイト試薬２を過剰量使用することで，収率は１００％に近づくが，未反応のヌクレオシド誘導体１が残ることが避けられない。そのため，５′−位の水酸基をアセチル化し（キャッピング），未反応の１が後の縮合反応に影響を与えないようにする。縮合生成物３の亜リン酸トリエステル結合はヨウ素−ピリジン水溶液で酸化し，リン酸トリエステル誘導体４に酸化する。４の５′−位のジメトキシトリチル基を脱保護し，以後，縮合，酸化，キャッピング，脱保護を目的のＤＮＡ鎖長に達するまで繰り返し，樹脂から切り出し，すべての保護基を外してオリゴＤＮＡ７が得られる。【０００５】  以上のようにホスホロアミダイト法はインターヌクレオチド結合形成反応に３価の亜リン酸誘導体を利用するため，５価のリン酸エステルに酸化する必要がある。酸化剤としてヨウ素−ピリジン水溶液を用いる方法が広く用いられている。しかしながら，ヨウ素−ピリジン水溶液による酸化法ではアミノ基の保護基として多用されているジメチルアミノメチレン基をシアノ基に変換してしまうことが報告されている［Ｂ．Ｍｕｌｌａｈ，Ａ．Ａｎｄｒｕｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３６，４３７３（１９９５）］。また，縮合反応は水の存在により阻害される。次の縮合反応までに酸化反応の工程で使用した水を除く必要があるが，完全な除去は困難である。【０００６】  そのため，無水条件下で３価の亜リン酸エステルを５価のリン酸エステルへ酸化する方法が活発に研究され，数多くの優れた成功例が報告されている。例えば，Ｈａｙａｋａｗａらは２つヌクレオシドが結合した亜リン酸エステル誘導体をＴＭＳトリフラート，トリエチルアミンの存在下，ジクロロメタン溶媒中，ビス（トリメチルシリル）ペルオキシドで酸化し，高収率でリン酸エステル誘導体を得ている。また，ｔ−ブチルヒドロペルオキシドを酸化剤として用い，良好な結果を報告している［Ｙ．Ｈａｙａｋａｗａ，Ｍ．Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｒ．Ｎｏｙｏｒｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２７，４１９１（１９８６）］。さらに，Ｈａｙａｋａｗａらはビス（トリメチルシリル）ペルオキシドでの酸化法を固相ホスホロアミダイト法に応用し，６量体のＤＮＡオリゴマーを合成している［Ｙ．Ｈａｙａｋａｗａ，Ｍ．Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｒ．Ｎｏｙｏｒｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２７，４１９５（１９８６）］。Ｂａｊｗａらはジクロロメタン溶媒中，ヌクレオシドの環状亜リン酸エステルを四酸化二窒素で酸化し，ほぼ定量的に５価のリン酸エステルに変換している［Ｇ．Ｓ．Ｂａｊｗａ，Ｗ．Ｇ．Ｂｅｎｔｒｕｄｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ  Ｌｅｔｔ．，１９７８，４２１］。Ｍａｎｏｈａｒａｎらはアセトニトリル溶媒中，１０−（カンファースルホニル）オキサジリジンを酸化剤として用いる方法を報告している［Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ．Ｙ．Ｌｕ，Ｍ．Ｄ．Ｃａｓｐｅｒ，Ｇ．Ｊｕｓｔ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２，２４３（２０００）］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  しかしながら，Ｈａｙａｋａｗａらが酸化剤として用いたビス（トリメチルシリル）ペルオキシド，ｔ−ブチルヒドロペルオキシドは爆発性を有していることが知られている。その使用には細心の注意を払う必要があり，これらの酸化剤を用いる方法は満足の行く酸化法とは言い難い。Ｂａｊｗａらの用いた四酸化二窒素は強い毒性を有する気体であり，利用し難い酸化剤である。四酸化二窒素での酸化法は到底満足の行く酸化法ではない。Ｍａｎｏｈａｒａｎらが用いた１０−（カンファースルホニル）オキサジリジンは，爆発性，毒性に関する報告がなく，比較的安全な酸化剤であるが，極めて高価である。１０−（カンファースルホニル）オキサジリジンを酸化剤として用いる方法は経済性の面で到底満足の行くものではない。【０００８】  無水条件下，爆発性，毒性がなく，しかも安価である酸化剤を利用して３価の亜リン酸エステルを５価のリン酸エステルに酸化する方法が強く求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  そこで発明者らは鋭意研究を重ねた結果，本発明を完成するに至った。即ち，本発明は１，１−ジヒドロペルオキシシクロアルカンを酸化剤とし，無水条件下で３価の亜リン酸エステルを５価のリン酸エステルに酸化するものである。【０００１０】  本発明に用いる酸化剤は１，１−ジヒドロペルオキシシクロアルカンで，炭素数の違いにより，また置換基の有無により数多く存在するが，最も好ましい例としては１，１−ジヒドロペルオキシシクロドデカンである。代表例として１，１−ジヒドロペルオキシシクロドデカンを取り上げ，本発明の有用性を明らかにする。１，１−ジヒドロペルオキシシクロドデカンは，シクロドデカノンを過酸化水素で酸化することで極めて容易に得られる。非吸湿性の白色の結晶でエーテル−ヘキサンの混合溶媒から再結晶が可能で，高純度品が容易に得られる。出発物質であるシクロドデカノンは抗マラリヤ剤を合成するための原料として量産されており，入手の容易な安価な化合物である。また，１，１−ジヒドロペルオキシシクロドデカンの爆発性，毒性は報告されていない。したがって，１，１−ジヒドロペルオキシシクロドデカンは爆発性，毒性のない安価な酸化剤といえる。【００１１】  １，１−ジヒドロペルオキシシクロドデカンはＴＨＦに易溶，ＤＮＡ自動合成機で用いられているジクロロメタンにも可溶である。また，ジクロロメタン−酢酸エチル（９：１）には極めて高濃度で溶解し，酸化剤として機能する。
【発明の効果】
【００１２】  本発明を用いることで，ホスホロアミダイト法によるオリゴＤＮＡの合成において，縮合，酸化，キャピング，脱保護の全工程を無水条件下で行える。このことは極めて重要である。従来法のように酸化の工程で水を使用する場合，次回の縮合工程までに水分を除かなければならず，また極微量混在した場合は縮合反応の収率の低下を招く。オリゴＤＮＡの合成はオリゴマーの数マイナス１回の縮合反応を行う。そのため，１回の縮合反応の収率の低下が僅かであってもオリゴＤＮＡの最終収率に大きく影響する。オリゴＲＮＡの合成に関しても同様である。本発明の特有の効果として，ホスホロアミダイト法によるオリゴＤＮＡ，ＲＮＡ合成が効率よく行えることが挙げられる。また，本発明の特有の効果はホスホロアミダイト法によるオリゴＤＮＡ，ＲＮＡ合成のみならず，水に不安定な官能基を有する３価の亜リン酸エステルを５価のリン酸エステルに酸化する場合においても特有の効果を発揮する。【００１３】  以下に本発明の好ましい実施例を記載するが，これは例示であり，これに限定されるものでないことは当業者には明らかである。【００１４】実施例１オリゴＤＮＡ（ＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴ）の合成
ＡＢＩ社ＤＮＡ自動合成機ｍｏｄｅｌ３９２を用いて１２量体オリゴＤＮＡ（ＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴ）の合成を行った。ヨウ素−ピリンジン水溶液に代え，ジクロロメタン−酢酸エチル（９：１ｖ／ｖ）の混合溶媒に１，１−ジヒドロペルオキシシクロドデカンが０．１Ｍとなるように調製した溶液を用い，ポスホロアミダイト試薬は市販されているＰＡＣアミダイトを用いた。ＤＮＡ自動合成プログラムは自動合成機に組み込まれている１マイクロモルスケールを用いた。ただし，酸化時間のみを１５秒から９０秒へと延長し，鎖伸長反応を行った。縮合，酸化，キャッピング，脱保護のサイクルを１１回繰り返し，目的の１２量体を固相担体に担持した形で得た。この１２量体が担持している固相担体に２８％アンモニア水溶液を加え，固相担体からの切り出しとすべての保護基を除去し，１２量体オリゴＤＮＡ（ＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴ）を得た。得られた１２量体オリゴＤＮＡ（ＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴ）を精製した後，ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて質量分析を行った。その結果を以下に示す。
１２量体オリゴＤＮＡ（ＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴ）［Ｃ１１７Ｈ１４９Ｎ４５Ｏ７０Ｐ１１（Ｍ＋Ｈ＋）］の質量；理論値：３６４４．６６，実測値：３６４８．１９【００１５】実施例２オリゴＤＮＡ（ＴＣＴＣＣＡＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＴＡＴ）の合成
実施例１と同様にＡＢＩ社ＤＮＡ自動合成機ｍｏｄｅｌ３９２を用いて３０量体オリゴＤＮＡ（ＴＣＴＣＣＡＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＴＡＴ）の合成を行った。縮合，酸化，キャッピング，脱保護のサイクルを２９回繰り返し，目的の３０量体を固相担体に担持した形で得た。この３０量体が担持している固相担体に２８％アンモニア水溶液を加え，固相担体からの切り出しとすべての保護基を除去し，３０量体オリゴＤＮＡを得た。得られた３０量体オリゴＤＮＡを精製した後，ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて質量分析を行った。その結果を以下に示す。
３０量体オリゴＤＮＡ（ＴＣＴＣＣＡＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＴＡＴ）［Ｃ２９２Ｈ３６９Ｎ１１５Ｏ１７３Ｐ２９（Ｍ＋Ｈ＋）］の質量；理論値：９２０３．５７，実測値：９２０５．３２