(57)【要約】      （修正有）【課題】低非特異吸着性を特徴とする蛋白質固定化磁性粒子およびその製造方法を提供する。【解決手段】２，３−ジヒドロキシプロピル基を有し、かつ、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に特異的に結合する蛋白質が固定化されている磁性粒子。または２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基を有し、かつ、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に特異的に結合する蛋白質が固定化されている磁性粒子であって、前記蛋白質がプロテインＡ，プロテインＧ，または少なくとも一方の誘導体である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２，３−ジヒドロキシプロピル基を有し、かつ、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に特異的に結合する蛋白質が固定化されている磁性粒子。
【請求項２】
２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基を有し、かつ、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に特異的に結合する蛋白質が固定化されている磁性粒子。
【請求項３】
前記蛋白質がプロテインＡ，プロテインＧ，または少なくとも一方の誘導体である、請求項１または２に記載の磁性粒子。
【請求項４】
２，３−ジヒドロキシプロピル基をトシル化して得られた活性基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に特異的に結合する蛋白質を固定化する工程を含み、
前記固定化する工程は、前記活性基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む、請求項１または２に記載の磁性粒子の製造方法。
【請求項５】
２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびカルボキシル基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に特異的に結合する蛋白質を固定化する工程を含み、
前記固定化する工程は、前記カルボキシル基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む、請求項１または２に記載の磁性粒子の製造方法。
【請求項６】
２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびエポキシ基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に特異的に結合する蛋白質を固定化する工程を含み、
前記固定化する工程は、前記エポキシ基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む、請求項１または２に記載の磁性粒子の製造方法。
【請求項７】
２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびアミノ基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に特異的に結合する蛋白質を固定化する工程を含み、
前記固定化する工程は、前記アミノ基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む、請求項１または２に記載の磁性粒子の製造方法。
【請求項８】
前記蛋白質がプロテインＡ、プロテインＧ、または少なくとも一方の誘導体である、請求項３ないし７のいずれかに記載の磁性粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低非特異吸着性を特徴とする蛋白質固定化磁性粒子およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインＡおよびプロテインＧは、それぞれ黄色ブドウ球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよび連鎖球菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの細胞壁由来の蛋白質である。これらの蛋白質は免疫グロブリンＧのＦｃ領域に特異的に結合する。その性質を利用して、これらの蛋白質を難溶性の担体に固定化したものをＩｇＧの分離・精製に用いることができる。また、難溶性担体に固定化されたプロテインＡ，プロテインＧに抗体を捕捉させることにより、抗体の活性を保ったまま抗体を難溶性担体に固定化することができるので、プロテインＡ，プロテインＧは、抗体をプローブとした診断や研究に用いることができる。
【０００３】
難溶性担体として磁性粒子を用いたものは、磁石に集まる性質を利用し特別な装置などを用いることなく簡便にＩｇＧの分離・精製や標的蛋白質の免疫沈降などを行うことができるという利点がある。しかし、磁性粒子を用いた場合、アガロースゲルなどを担体として用いた場合に比べ、非特異的吸着が多く十分な精製度や感度が得られない。よって、標的蛋白質以外の物質が磁性粒子表面に非特異的に吸着するのを低減することにより、高純度な精製や高感度な検出を行うことができる磁性粒子が求められている。
【０００４】
従来、このような非特異吸着の抑制法として、ブロッキングと言われる方法が行われてきた。ブロッキングは、一次プローブを粒子上に固定化した後に、二次プローブや夾雑物などの吸着の少ないアルブミン、カゼイン、スキムミルクなどのブロッキング剤で粒子表面を被覆する。しかし、ブロッキング剤の被覆効果が十分得られない場合、生体物質であるブロッキング剤の品質安定性が低い場合、ブロッキングが十分に行われた場合でもブロッキング剤の変質などによってその作用が経時的に変化し非特異吸着が発生する場合があり、十分な非特異吸着の抑制効果は得られていなかった。
【０００５】
非特異吸着の問題を解決するための方法として、９６ウェルプレートに代表される免疫測定用基材の表面に親水性ポリマーを導入する方法が提案されている（特許文献１〜３）。しかし、このような平面を利用した免疫測定用基材では、一次プローブを固相する面積が限られること、また、固液反応のため抗原抗体反応の効率が悪く検査時間が長くなることなどの欠点があった。
【０００６】
さらに非特異吸着の解決策として、スチレン−グリシジルメタクリレート共重合体などからなる有機ポリマー粒子にスペーサを介して生理活性物質を結合したミクロスフィア（特許文献４，５，６）、粒子表面に親水性のスペーサを導入した有機ポリマー粒子（特許文献７，８）などが提案されている。しかしながら、これらはいずれも非特異吸着の低減効果が充分ではなく、また、免疫検査用としては感度が不十分であった。
【０００７】
本発明者らは、親水性モノマーとして、ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、アルコキシアルキル（メタ）アクリレート、ポリオキシアルキレン（Ｃ２−Ｃ４）基含有（メタ）アクリレート、エポキシ基含有（メタ）アクリレート、ホスホリルコリン類似基含有単量体などを粒子表面に共重合した非特異吸着の少ない免疫検査用磁性粒子を提案した（特許文献９）が、現在、さらに高い感度を有する磁性粒子が求められている。
【特許文献１】特開平１１−１７４０５７号公報
【特許文献２】特開２０００−３０４７４９号公報
【特許文献３】特開２００１−２７２４０６号公報
【特許文献４】特開平１０−１９５０９９号公報
【特許文献５】特開２０００−３００２８３号公報
【特許文献６】ＷＯ２００４／０２５２９７  Ａ１号公報
【特許文献７】特開２００４−３３１９５３号公報
【特許文献８】ＷＯ２００４／０４０３０５  Ａ１号公報
【特許文献９】特開２００５−６９９２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、非特異吸着が少なく、ＩｇＧなどの免疫グロブリン類を高純度に精製でき、抗体をプローブとして固定化したときに標的物質を高感度で検出できる磁性粒子およびその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を重ね、特定の官能基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンＧ（以下、「ＩｇＧ」と称する。）のＦｃ領域に特異的に結合する蛋白質を固定化すると、蛋白質や核酸などの生体関連物質の非特異吸着が極めて少ないため、この蛋白質固定化磁性粒子を用いることにより、ＩｇＧなどの免疫グロブリン類を高純度に精製でき、かつ、抗体をプローブとして固定化させることにより、標的物質を高感度に検出できることを見出し、本発明を完成させた。本発明によれば、以下の態様の磁性粒子を提供することができる。
【００１０】
本発明の第１の態様の磁性粒子は、
２，３−ジヒドロキシプロピル基を有し、かつ、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に特異的に結合する蛋白質が固定化されている。
【００１１】
本発明の第２の態様の磁性粒子は、
２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基を有し、かつ、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に特異的に結合する蛋白質が固定化されている。
【００１２】
本発明において、「２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基」とは、２，３−ジヒドロキシプロピル基が有する２つの水酸基のいずれか一方または両方の水酸基をいう。
【００１３】
上記磁性粒子において、前記蛋白質がプロテインＡ，プロテインＧ，または少なくとも一方の誘導体であることができる。
【００１４】
本発明の第３の態様の磁性粒子の製造方法は、
２，３−ジヒドロキシプロピル基をトシル化して得られた活性基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に特異的に結合する蛋白質を固定化する工程を含み、
前記固定化する工程は、前記活性基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む、上記磁性粒子の製造方法である。
【００１５】
本発明の第４の態様の磁性粒子の製造方法は、
２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびカルボキシル基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に特異的に結合する蛋白質を固定化する工程を含み、
前記固定化する工程は、前記カルボキシル基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む、上記磁性粒子の製造方法である。
【００１６】
本発明の第５の態様の磁性粒子の製造方法は、
２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびエポキシ基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に特異的に結合する蛋白質を固定化する工程を含み、
前記固定化する工程は、前記エポキシ基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む、上記磁性粒子の製造方法である。
【００１７】
本発明の第６の態様の磁性粒子の製造方法は、
２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびアミノ基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に特異的に結合する蛋白質を固定化する工程を含み、
前記固定化する工程は、前記アミノ基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む、上記磁性粒子の製造方法である。
【００１８】
上記磁性粒子の製造方法において、前記蛋白質がプロテインＡ，プロテインＧ，または少なくとも一方の誘導体であることができる。
【発明の効果】
【００１９】
上記磁性粒子は、蛋白質や核酸などの生体関連物質の非特異吸着量が少ないため、ＩｇＧなどの免疫グロブリン類を高純度に精製することができる。また、抗体をプローブとして固定化した場合に標的物質を高感度で検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
１．蛋白質固定化磁性粒子およびその製造方法
１．１．蛋白質固定化磁性粒子の構成
本発明の一実施形態に係る磁性粒子（本明細書において「蛋白質固定化磁性粒子」ともいう。）は、２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基を有し、かつ、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に特異的に結合する蛋白質（本明細書において「ＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質」ともいう。）が固定化されている。すなわち、本実施形態に係る蛋白質固定化磁性粒子では、２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基を有する磁性粒子（Ｍ）に、ＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質が固定化されている。好ましくは、本実施形態に係る蛋白質固定化磁性粒子は、２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する。
【００２１】
ＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質は例えば、プロテインＡ，プロテインＧまたはいずれか一方の誘導体であることができる。プロテインＡおよびプロテインＧは、天然型および組換型（リコンビナント）のいずれであってもよい。プロテインＡおよびプロテインＧの誘導体としては例えば、プロテインＡおよびプロテインＧの融合蛋白質が挙げられる。
【００２２】
本実施形態に係る蛋白質固定化磁性粒子は、全体がポリマー部から構成されていてもよいし、あるいは、コア・シェル構造を有していて、ポリマー部がシェルであってもよい。
【００２３】
磁性粒子（Ｍ）としては、少なくとも表面に２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基を有し、水に分散し、かつ、磁石よって分離することができる粒子であれば特に制限はない。
【００２４】
磁性粒子（Ｍ）の好ましい粒径は、０．０１〜１０μｍ、さらに好ましい粒径は０．１〜８μｍ、最も好ましい粒径は０．８〜５μｍである。粒径は、レーザ回折・散乱法により求める。ここで、粒径が０．０１μｍ未満の場合、磁気分離に長時間を要し、水などの洗浄溶媒と粒子との分離が不十分になるため、目的外の分子（例えば、蛋白質や核酸などの生体関連物質）の除去が不十分になり、充分な精製ができない場合がある。一方、粒径が１０μｍを超えると、比表面積が小さくなり、生体関連物質の捕捉量が少なくなる結果、感度が低くなる場合がある。
【００２５】
磁性粒子（Ｍ）の内部組成は均質であってもよく、あるいは不均質であってもよい。内部組成が均質である構造としては、最表面のみを２，３−ジヒドロキシプロピル基を有するシランカップリング剤などで処理した無機磁性体のバルク粒子が挙げられる。しかしながら、上記の好ましい粒径範囲にある均質な無機磁性体のバルク粒子は、常磁性である場合が多く、磁力による分離精製を繰り返すと媒質への再分散が困難になる場合がある。このため、磁性粒子（Ｍ）は、残留磁化が少ない、超常磁性の磁性体微粒子を含む不均質な粒子であるのがより好ましい。また、磁性粒子（Ｍ）は、低比重にすることにより水中での沈降を遅らせ、水への分散が容易になるため、有機物が含まれていることが好ましい。
【００２６】
磁性粒子（Ｍ）の内部組成は、一次粒径５０ｎｍ以下の磁性体微粒子と、非磁性の有機物とからなることが好ましく、一次粒径３０ｎｍ以下の磁性体微粒子と、非磁性の有機物とからなることがより好ましく、一次粒径２０ｎｍ以下の磁性体微粒子と、非磁性の有機物とからなることが最も好ましい。磁性粒子（Ｍ）の内部組成に、一次粒径が５０ｎｍを超える磁性体微粒子が含まれると、磁気分離後の再分散性に劣る場合がある。
【００２７】
不均質な内部組成を有する磁性粒子（Ｍ）の内部構造としては、（Ｉ）有機ポリマーなどの非磁性の有機物からなる連続相中に磁性体微粒子が分散している粒子、（ＩＩ）磁性体微粒子の２次凝集体をコアとし、有機ポリマーなどの非磁性の有機物をシェルとする粒子、（ＩＩＩ）有機ポリマーなどの非磁性体からなる核粒子と、該核粒子の表面に設けられた超常磁性微粒子の２次凝集体層（磁性体層）と、さらに該磁性体層の外層に有機ポリマー層とを有する粒子などが挙げられる。これらの中では、（ＩＩＩ）前記磁性体微粒子の２次凝集体層を含む核粒子（以下、「磁性体微粒子の２次凝集体層を含む核粒子」を「母粒子」と表す）の外層に、有機ポリマー層を有する粒子が好ましい。有機ポリマー層は２層以上のポリマー層から構成されていてもよい。なお、各種粒子に用いられる有機ポリマーは、コア・シェル型粒子のコア部分を除いて、粒子最表面を形成するポリマーが２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基を有することが必要である。また、核粒子とその外層（磁性体層）との界面、ならびに磁性体層とその外層（有機ポリマー層）との界面は、両層の成分が混在した状態であっても構わない。
【００２８】
前記（Ｉ）の粒子の好ましい製造方法としては、例えば、特開平９−２０８７８８号公報で開示された方法が挙げられる。また、前記（ＩＩＩ）の粒子の好ましい製造方法としては、例えば、特開２００４−２０５４８１号公報で開示された方法が挙げられる。
【００２９】
一次粒径５０ｎｍ以下の磁性体微粒子の組成としては、特に制限はないが、酸化鉄系の物質が代表的であり、例えば、ＭＦｅ２Ｏ４（Ｍ＝Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ０．５Ｆｅ０．５など）で表現されるフェライト、Ｆｅ３Ｏ４で表現されるマグネタイト、あるいはγＦｅ２Ｏ３が挙げられる。特に、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ない磁気材料としてγＦｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４が好ましい。このような一次粒径５０ｎｍ以下の磁性体微粒子は、磁性流体として工業的に入手することができる。
【００３０】
非磁性体の有機物としては、有機低分子化合物および有機ポリマーが挙げられる。
【００３１】
有機低分子化合物としては、２，３−ジヒドロキシプロピル基を有するシランカップリング剤、２，３−ジヒドロキシプロピル基を有するキレート化剤、２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する界面活性剤などが挙げられる。
【００３２】
有機ポリマーとしては、２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する付加重合ポリマー、２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する縮重合ポリマーなどが挙げられる。
【００３３】
非磁性体の有機物としては、好ましくは２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する有機ポリマー、さらに好ましくは２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する付加重合ポリマー、最も好ましくは２，３−ジヒドロキシプロピル基を有するラジカル重合ポリマーである。
【００３４】
２，３−ジヒドロキシプロピル基を有するラジカル重合ポリマーの製造方法としては、例えば、２，３−ジヒドロキシプロピル基を有するモノマーを（共）重合する方法、加水分解により２，３−ジヒドロキシプロピル基を生成するモノマーを（共）重合し、加水分解する方法が挙げられる。２，３−ジヒドロキシプロピル基を有するモノマーとしては、具体的には、２，３−ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、アリルグリセロールエーテルなどが挙げられる。加水分解により２，３−ジヒドロキシプロピル基を生成するモノマーとしては、具体的には、グリシジル（メタ）アクリレート、アリルグリシジルエーテルなどの２，３−エポキシプロピル基を有するモノマー；１，３−ジオキソラン−２−オン−４−イルメチル（メタ）アクリレート、１，３−ジオキソラン−２，２−ジメチル−４−イルメチル（メタ）アクリレートなどの２，３−ジヒドロキシプロピル基をアセタール化したモノマー；２，３−ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリレートのジ（ｔ−ブチル）シリル化物、２，３−ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリレートのジ（トリメチルシリル）化物などの２，３−ジヒドロキシプロピル基をシリル化したモノマーを例示できる。加水分解の条件は、モノマーの種類によるが、通常、粒子を水に分散した状態で、酸、塩基、またはフッ化物塩を触媒として、加温条件下で数時間〜数十時間攪拌して加水分解する。モノマー由来の官能基の加水分解は、貯蔵安定性などに支障のない限り、必ずしもポリマー中の全ての官能基が加水分解されている必要はない。モノマー由来の官能基の加水分解は、通常、モノマー部の重合後に実施するが、重合中にその一部が加水分解されてもよい。
【００３５】
また、２，３−ジヒドロキシプロピル基を有するラジカル重合ポリマーを製造する場合、架橋性モノマーを共重合することが好ましい。ここで、「架橋性モノマー」とは、他のモノマーと共重合可能であり、１分子中に２個以上のラジカル重合性不飽和結合を有するモノマーである。架橋性モノマーとしては、具体的には、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレートなどの多官能性（メタ）アクリレート、ブタジエン、イソプレンなどの共役ジオレフィン、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートなどを例示することができる。さらに、架橋性モノマーとして、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ポリビニルアルコールのポリ（メタ）アクリルエステルなどの親水性のモノマーを例示することができる。
【００３６】
さらに、２，３−ジヒドロキシプロピル基を有するラジカル重合ポリマーを製造する場合、上記モノマーに加えて、その他のモノマーを共重合してもよい。その他のモノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、イタコン酸などのカルボキシル基を有するモノマー、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、メトキシエチルアクリレート、メトキシエチルメタクリレートなどの親水性官能基を有する（メタ）アクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、ダイアセトンアクリルアミドなどの親水性モノマー、および、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレンなどの芳香族ビニル単量体、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどのビニルエステル類、アクリロニトリルなどの不飽和ニトリル、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、イソボニルアクリレート、イソボニルメタクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルを例示することができる。カルボキシル基を導入する方法として、ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリレート、１−メチルシクロペンチル（メタ）アクリレート、１−エチルシクロペンチル（メタ）アクリレート、１−メチルシクロヘキシル（メタ）アクリレート、１−エチルシクロヘキシル（メタ）アクリレート、２−メチルアダマンタン−２−イル（メタ）アクリレート、２−エチルアダマンタン−２−イル（メタ）アクリレート、テトラヒドロフラニル（メタ）アクリレート、テトラヒドロピラニル（メタ）アクリレート等、カルボキシル基をアルコールで保護したエステルモノマー；α−アクリロイロキシ−γ−ブチロラクトン、α−メタクリロイロキシ−γ−ブチロラクトン、α−アクリロイロキシ−β，β−ジメチル−γ−ブチロラクトン、α−メタクリロイロキシ−β，β−ジメチル−γ−ブチロラクトン、α−アクリロイロキシ−α−メチル−γ−ブチロラクトン、α−メタクリロイロキシ−α−メチル−γ−ブチロラクトンなどの環状エステルモノマー；無水マレイン酸、無水イタコン酸などの酸無水物などを共重合し、その後、加水分解してもよい。２，３−ジヒドロキシプロピル基を有するラジカル重合ポリマーを製造する場合、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレンなどの芳香族ビニル単量体は、共重合しないことが望ましい。これらの芳香族ビニル単量体を共重合するとノイズが悪化する場合がある。
【００３７】
本実施形態に係る蛋白質固定化磁性粒子は、通常、適当な分散媒に分散させて用いられる。使用できる分散媒としては、磁性粒子（Ｍ）を溶解したり、あるいは、磁性粒子（Ｍ）を膨潤させたりしない分散媒が好ましい。好ましい分散媒としては、例えば、水系媒体が挙げられる。ここで、水系媒体とは、水、または水と水に混和する有機溶剤（例えば、アルコール類、アルキレングリコール誘導体等）との混合物をいう。
【００３８】
本実施形態に係る蛋白質固定化磁性粒子の好ましい粒径は、０．０３〜１０μｍ、さらに好ましい粒径は０．１〜８μｍ、最も好ましい粒径は０．８〜５μｍである。粒径は、レーザ回折・散乱法により求める。ここで、粒径が０．０３μｍ未満の場合、磁気分離に長時間を要し、水などの洗浄溶媒と粒子との分離が不十分になるため、目的外の分子（例えば、蛋白質や核酸などの生体関連物質）の除去が不十分になり、充分な精製ができない場合がある。一方、粒径が１０μｍを超えると、比表面積が小さくなり、生体関連物質の捕捉量が少なくなる結果、感度が低くなる場合がある。
【００３９】
１．２．蛋白質固定化磁性粒子の製造方法
本実施形態に係る蛋白質固定化磁性粒子は、例えば、以下の第１〜第４の製造方法によって、ＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質を磁性粒子（Ｍ）に化学結合することにより得ることができる。
【００４０】
１．２．１．カルボキシル基と結合する方法
第１の製造方法は、２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびカルボキシル基を有する磁性粒子（Ｍ）に、ＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質を固定化する工程を含み、この固定化する工程は、前記カルボキシル基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む。すなわち、第１の製造方法においては、２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびカルボキシル基の両方を有する磁性粒子（Ｍ）を用いることが必要である。
【００４１】
磁性粒子（Ｍ）がカルボキシル基を有する場合、水溶性カルボジイミドなどの脱水縮合剤の存在下で、ＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質中のアミノ基を前記カルボキシル基に反応させてアミド結合を形成することにより、ＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質を磁性粒子（Ｍ）の表面に固定化することができる。この方法においては、あらかじめ、磁性粒子（Ｍ）が有するカルボキシル基に脱水縮合剤を反応させ、その後、ＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質を加えて反応させることもできる。詳細は、特開２００１−１５８８００号公報などに記載された公知の方法を用いることができる。
【００４２】
１．２．２．トシル基を介する方法
第２の製造方法は、２，３−ジヒドロキシプロピル基をトシル化して得られた活性基を有する磁性粒子（Ｍ）に、ＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質を固定化する工程を含み、この固定化する工程は、前記活性基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む。
【００４３】
トシル化は、公知の方法により行うことができる。例えば、磁性粒子（Ｍ）が有する２，３−ジヒドロキシプロピル基とｐ−トルエンスルホン酸塩とをピリジンなどの有機溶媒中で反応させることにより、２，３−ジヒドロキシプロピル基を２−ヒドロキシ−３−（４’−メチルフェニル）スルホニルオキシプロピル基、３−ヒドロキシ−２−（４’−メチルフェニル）スルホニルオキシプロピル基または２，３−ジ（４’−メチルフェニル）スルホニルオキシプロピル基に変換することにより、トシル化を達成することができる。
【００４４】
ｐ−トルエンスルホン酸塩としては、特に限定されないが、ｐ−トルエンスルホン酸クロライド等を挙げることができる。この工程は、典型的には、磁性粒子（Ｍ）をピリジンなどの有機溶剤に分散した後、磁性粒子（Ｍ）１００重量部当たり１〜５０重量部のｐ−トルエンスルホン酸クロライドを添加し、室温で１〜６時間反応させることにより行う。あるいは、磁性粒子（Ｍ）が有する２，３−ジヒドロキシプロピル基とｐ−トルエンスルホン酸とを脱水縮合させることにより、２，３−ジヒドロキシプロピル基を２−ヒドロキシ−３−（４’−メチルフェニル）スルホニルオキシプロピル基に変換させて、前記トシル化を行ってもよい。２，３−ジヒドロキシプロピル基をトシル化した活性基は、例えば、２，３−ジヒドロキシプロピル基中の水酸基の一方または両方がトシル化された基であり、より具体的には、２−ヒドロキシ−３−（４’−メチルフェニル）スルホニルオキシプロピル基、３−ヒドロキシ−２−（４’−メチルフェニル）スルホニルオキシプロピル基、２，３−ジ（４’−メチルフェニル）スルホニルオキシプロピル基が挙げられる。
【００４５】
なお、本実施形態に係る蛋白質固定化磁性粒子は、トシル化されていない残余の２，３−ジヒドロキシプロピル基を有していても良い。すなわち、本実施形態に係る蛋白質固定化磁性粒子が第２の製造方法によって得られる場合、「２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基」とは、１つの２，３−ジヒドロキシプロピル基が有する２つの水酸基のいずれもトシル化されていない場合の当該２つの水酸基、あるいは、前記２つの水酸基の一方のみがトシル化された場合の残余の水酸基のことをいう。
【００４６】
ＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質を結合した後、過剰のＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質を洗浄し、未反応のトシル基を不活化した後の残余の２，３−ヒドロキシプロピル基により、特出した低非特異吸着性を発現することができる。このような効果は、例えば、モノヒドロキシプロピル基をトシル化したもの、例えば、３−（４’−メチルフェニル）スルホニルオキシプロピル基のみを有する粒子では発現し得ない。
【００４７】
１．２．３．エポキシ基と結合する方法
第３の製造方法は、２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびエポキシ基を有する磁性粒子（Ｍ）に、ＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質を固定化する工程を含み、この固定化する工程は、前記エポキシ基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む。
【００４８】
磁性粒子（Ｍ）がエポキシ基を有する場合、水系溶媒および有機溶媒中で、ＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質中のアミノ基を前記エポキシ基に反応させてアミド結合を形成することにより、磁性粒子（Ｍ）の表面にＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質を固定化することができる。この方法は、活性化剤などを特に必要せずに、ＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質を磁性粒子（Ｍ）に化学結合できる点で有用である。
【００４９】
１．２．４．アミノ基と結合する方法
第４の製造方法は、２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびアミノ基を有する磁性粒子（Ｍ）に、ＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質を固定化する工程を含み、この固定化する工程は、前記アミノ基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む。
【００５０】
磁性粒子（Ｍ）がアミノ基を有する場合、水系溶媒および有機溶媒中で、ＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質中のカルボキシル基を前記アミノ基に反応させてアミド結合を形成することにより、磁性粒子（Ｍ）の表面に、ＩｇＧ Ｆｃ領域特異的結合蛋白質を固定化することができる。
【００５１】
アミノ化は公知の方法で行うことができる。例えば、磁性粒子（Ｍ）が有するエポキシ基またはカルボキシル基とアミノ化剤を反応させることによりアミノ化を達成できる。
【００５２】
アミノ化剤としては、例えば、アンモニア、分子中に２個のアミノ基を有する有機化合物（ジアミン）、あるいは、分子中に３個以上のアミノ基を有する有機化合物（トリアミン）を挙げることができ、分子中に２個以上のアミノ基を有する有機化合物がより好ましい。
【００５３】
ここで、ジアミンとしては、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、ｏ−フェニレンジアミンなどの１級ジアミンなどが挙げられる。また、分子中に３個以上のアミノ基を有する有機化合物としては、１，２，３−トリアミノプロパン、テトラ（アミノメチル）メタン、１，３，５−トリアミノベンゼン、１，２，３，４−テトラアミノベンゼンなどが挙げられる。
【００５４】
アミノ基を導入する反応は、乾燥粒子をそのままアミノ化剤に分散させて実施してもよいし、あるいは、粒子を水系溶媒に分散させた状態で実施しても良い。水系溶媒とは、水溶性有機溶媒と水との混合溶媒、あるいは、水である。ここで、水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン、ジメチルホルムアミドなどを例示できる。アミノ基を導入する反応の好ましい温度および時間は、溶媒の有無および溶媒の種類などによって異なるが、通常、４℃〜１００℃、好ましくは、２０℃〜８０℃で、通常、１０分〜４８時間、好ましくは、１時間〜２４時間である。
【００５５】
２．用途
本実施形態に係る蛋白質固定化磁性粒子はＩｇＧなどの免疫グロブリン類を捕捉し、適当な条件で脱離させることができるので、免疫グロブリン類のアフィニティー精製における担体として利用できる。
【００５６】
また、本実施形態に係る蛋白質固定化磁性粒子によれば、活性を保持したまま免疫グロブリン類を固定化できるため、免疫グロブリン類をプローブとしたプローブ結合用粒子として好適に使用することができる。より具体的には、生化学分野での化合物担体用粒子および診断薬用の化学結合担体用粒子などのアフィニティー担体として利用でき、抗体などの一次プローブを結合させた免疫検査用およびプロテオーム用のプローブ結合用磁性粒子として、特出する高感度および低ノイズを発現することができる。
【００５７】
３．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、各実施例および比較例において、評価は以下の方法で行った。
【００５８】
３．１．評価方法
３．１．１．粒子径
レーザ回折式粒度分布測定装置（（株）島津製作所製）ＳＡＬＤ−２００Ｖにより、粒子の数平均粒子径を測定し、これを粒子の粒子径とした。
【００５９】
３．１．２．非特異吸着および感度
プロテインＧ固定化磁性粒子について、非特異吸着および感度の評価を下記に示す方法にしたがって行った。
【００６０】
プローブが固定化されたプロテインＧ固定化磁性粒子の１重量％分散液１００μＬをチューブに取り磁気分離して上澄みを除去した。これに、目的物質である蛋白質（２０Ｓプロテアソーム）を含むことが確認されているＪｕｒｋａｔ細胞破砕液２０μｌを注ぎ、さらにタッチミキサーで振動を与えて前記粒子を分散させた後、常温にて２時間回転倒混和させた。引き続きこのチューブを磁気分離した後、上澄みを除去し、０．０５％非イオン性界面活性剤ＮＰ４０を含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ１ｍｌを注いでタッチミキサーで前記粒子を分散させた。同様の処理をさらに２回繰り返した後、内容物を別の未使用のチューブに移し、磁気分離を行った後、上澄みを除去した。引き続きこのチューブに０．５％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液５０μｌを注いでタッチミキサーでごく軽く振動を与えて前記粒子を分散させた。１０分間放置した後、磁気分離を行ない、上澄みの２０μｌを採取した。バイオラッド社製プレミックスサンプルバッファー中での濃度が２ｗｔ％になるように２−メルカプトエタノールを溶解させ、このうち２０μｌをチューブに採取した。これに上記剥離工程で採取した上澄み２０μｌを混ぜ、チューブヒーターにて９５℃で５分間加熱した。バイオラッド社製縦型電気泳動システム「ミニプロティアン３」、バイオラッド社製プレキャストポリアクリルアミドゲル「レディーゲルＪ（１５％）」、およびバイオラッド社製プレミックス泳動バッファーを用いて、ゲル１レーンあたり２０μｌをアプライし、電気泳動を行った。染色はバイオラッド社製シルバーステインプラスキットを用いて標準的な手法で行った。染色されたゲルはバイオラッド社製デンシトメーター「ＧＳ−７００」でスキャンして画像化した。染色されたゲルの画像において、２０Ｓプロテアソームのサブユニットを構成する蛋白質に相当する分子量３１ｋ付近の数本のバンドが明瞭に確認された場合を感度「良好」、不明瞭であるが確認された場合を感度「やや良好」、それ以外を感度「不良」とした。また、染色されたゲルの画像で、分子量３１ｋ付近以外にバンドがほとんど確認されない場合を非特異吸着「良好」、それ以外を非特異吸着「不良」とした。
【００６１】
３．２．合成例１
７５％ジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド溶液（日本油脂製「パーロイル３５５−７５（Ｓ）」２質量部を１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液２０質量部に混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを粒径０．７７μｍのポリスチレン粒子１３質量部および水４１質量部の入ったリアクターに入れ、２５℃で１２時間攪拌した。別の容器にて、スチレン９６質量部およびジビニルベンゼン４質量部を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液４００質量部で乳化させた液を前記リアクターに入れ、４０℃で２時間攪拌した後、７５℃に昇温して８時間重合した。室温まで冷却した後、遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥および粉砕して核粒子を得た。核粒子の数平均粒径は１．５μｍであった。
【００６２】
次に、油性磁性流体（商品名：「ＥＸＰシリーズ」，（株）フェローテック製）にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の磁性体微粒子（平均一次粒子径：０．０１μｍ）を得た。
【００６３】
次いで、上記核粒子１５ｇおよび上記磁性体微粒子１５ｇをミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６２００ｒｐｍ）で５分間処理し、平均数粒子径が２．０μｍの磁性体微粒子からなる磁性体層を表面に有する母粒子を得た。
【００６４】
次に、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．２５重量％およびノニオン性乳化剤（商品名：「エマルゲン１５０」，花王（株）製）０．２５重量％を含む水溶液（以下、「分散剤水溶液」という）３７５ｇを１Ｌセパラブルフラスコに投入し、次いで、前記磁性体層を有する母粒子１５ｇを投入し、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱した。分散剤水溶液１５０ｇに、メチルメタクリレート２７ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（以下、「ＴＭＰ」という。）３ｇ、およびジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（日本油脂社製；パーロイル３５５）０．６ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした前記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。滴下終了後、６０℃に保持し１時間攪拌した後、分散剤水溶液７５ｇに、グリシジルメタクリレート（以下、「ＧＭＡ」という。）１３．５ｇ、ＴＭＰ１．５ｇ、およびジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（日本油脂社製；パーロイル３５５）０．３ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした上記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。その後、７５℃に昇温した後さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。続けて、この１Ｌセパラブルフラスコに１ｍｏｌ／Ｌ  硫酸６０ｍｌを入れ、６０℃で６時間撹拌した。次いで、前記セパラブルフラスコ中の粒子を、磁気を用いて分離した後、蒸留水を用いて繰り返し洗浄した。以上により、２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する磁性粒子を得た（以下、「Ａ−１粒子」とする。）。
【００６５】
次に、Ａ−１粒子を凍結乾燥して得られた乾燥粒子１．０ｇを９ｍｌのピリジンに分散させた後、無水コハク酸１ｇを加えて室温で２時間撹拌した。反応後、磁気を用いて粒子を分離し、アセトンで４回、続いて蒸留水で４回洗浄して、２，３−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびカルボキシル基を有する磁性粒子（以下、「Ｂ−１粒子」とする。）を得た。この磁性粒子（Ｂ−１粒子）の平均数粒子径は２．９μｍであった。
【００６６】
３．３．合成例２
合成例１のＡ−１粒子を凍結乾燥して得られた乾燥粒子１．０ｇを８ｍｌのピリジンに分散させた後、ｐ−トシルクロライド０．２ｇを加えて室温で２時間撹拌した。反応後、磁気を用いて粒子を分離し、アセトンで４回、続いて蒸留水で４回洗浄して、２，３−ジヒドロキシプロピル基をトシル化して得られた活性基を有する磁性粒子（以下、「Ｂ−２粒子」とする。）を得た。この磁性粒子（Ｂ−２粒子）の平均数粒子径は２．９μｍであった。
【００６７】
３．４．比較合成例１
合成例１で、ＧＭＡ１３．５ｇおよびＴＭＰ１．５ｇの代わりに、シクロヘキシルメタクリレート１３．５ｇおよびメタクリル酸１．５ｇを用いた以外は合成例１と同様の手順を行うことにより、２，３−ジヒドロキシプロピル基は有さず、カルボキシル基を有する磁性粒子（以下、「Ｂ−３粒子」とする。）を得た。この磁性粒子（Ｂ−３粒子）の平均数粒子径は２．９μｍであった。
【００６８】
３．５．実施例１
Ｂ−１粒子の１ｗｔ％水分散液５００μｌをチューブに取り、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ バッファー（ｐＨ５．０）にて３回洗浄後、５００μｌの１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ バッファー（ｐＨ５．０）に分散し、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）０．２５ｍｇを添加し、さらにｒプロテインＧ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）０．１５ｍｇを加え撹拌した後、室温下２時間撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次いで、ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）５００μｌを加え、室温で２時間撹拌を行った。さらに、ＰＢＳ（−）緩衝液にて５回洗浄した後、ＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌで前記粒子を分散させて、粒子の表面にｒプロテインＧを固定化した磁性粒子（プロテインＧ固定化磁性粒子）を調製した。次に、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去しＣｉｔｒａｔｅ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅバッファー（ｐＨ８．０）にて２回洗浄後、２００μｌのＣｉｔｒａｔｅ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅバッファー（ｐＨ８．０）に分散し、これに標的物質（標的蛋白質）である２０Ｓプロテアソームを特異的に捕捉するためのプローブとなる蛋白質（抗２０Ｓプロテアソームα６・マウスＩｇＧ抗体）０．１０ｍｇを添加し、室温下４０分撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。ついで、１００μｌの０．２Ｍトリエタノールアミンに分散し、ジメチルピメルイミデート二塩酸塩（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＭＰ））０．５４ｍｇを添加し、室温下３０分間攪拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次に、ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）５００μｌを加え、室温で１５分間撹拌を行った。さらに、ＰＢＳ（−）緩衝液にて５回洗浄した後、ＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌで前記粒子を分散させることにより、プローブ（抗体）結合磁性粒子の分散液を得た。
【００６９】
電気泳動の染色ゲルの画像を図１に示す。図１に示すように、本実施例で得られたプローブ結合磁性粒子においては、感度「良好」でかつ非特異吸着「良好」であった。
【００７０】
３．６．実施例２
Ｂ−１粒子１０ｍｇをｐＨ９．５のホウ酸バッファーに分散し、これにｒプロテインＧ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）０．３ｍｇを溶解させた溶液０．１ｍＬを添加し、３７℃で１６時間回転攪拌した後、トリスバッファーで３回洗浄して、粒子の表面にｒプロテインＧが固定化された磁性粒子（プロテインＧ固定化磁性粒子）を調製した。次に、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去し、Ｃｉｔｒａｔｅ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅバッファー（ｐＨ８．０）にて２回洗浄後、２００μｌのＣｉｔｒａｔｅ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅバッファー（ｐＨ８．０）に分散し、これに標的物質（標的蛋白質）である２０Ｓプロテアソームを特異的に捕捉するためのプローブとなる蛋白質（抗２０Ｓプロテアソームα６・マウスＩｇＧ抗体）０．１０ｍｇを添加し、室温下４０分撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。ついで、１００μｌの０．２Ｍトリエタノールアミンに分散し、ジメチルピメルイミデート二塩酸塩（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＭＰ））０．５４ｍｇを添加し、室温下３０分間攪拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次に、ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）５００μｌを加え、室温で１５分間撹拌を行った。さらに、ＰＢＳ（−）緩衝液にて５回洗浄した後、ＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌで前記粒子を分散させることにより、プローブ（抗体）結合磁性粒子の分散液を得た。
【００７１】
電気泳動の染色ゲルの画像を図１に示す。図１に示すように、本実施例で得られたプローブ結合磁性粒子においては、感度「やや良好」でかつ非特異吸着「良好」であった。
【００７２】
３．７．比較例１
Ｂ−３粒子を用いた以外は、実施例１と同様の手順を行うことにより、２，３−ヒドロキシプロピル基を有さない比較例１のプローブ（抗体）結合磁性粒子の分散液を得た。
【００７３】
３．８．非特異吸着および感度の評価結果
電気泳動の染色ゲルの画像を図１に示す。図１に示すように、本比較例で得られたプローブ結合磁性粒子においては、非特異吸着が「不良」であり、感度は非特異吸着が多いため判別できなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】実施例１，２および比較例１でそれぞれ得られたプローブ結合粒子の非特異吸着および感度を示す電気泳動パターンである。
【図１】
2008215817.tif 000002