(57)【要約】【課題】オートゲイン調整における検出感度の調整に要する時間を短縮する。【解決手段】光検出部８は、レーザ光を照射した試料１０からの反射光を検出して該反射光の光量に応じた大きさの信号を出力する。信号調整部５は、光検出部８から出力される信号の大きさを調整する。制御部２のシステム用計算機１４は、信号調整部５による調整後の信号の大きさを各画素の輝度値に対応付けて試料１０の画像を形成する。また、システム用計算機１４は、この画像を構成する画素を輝度値の順に並び替え、並び替えがされた画素における所定の順番の画素である基準画素が所定の輝度値になるように信号調整部５を調整するための調整量を算出し、算出された調整値での調整を信号調整部５に行わせる。光検出部８としてフォトマルチプライヤを用いる場合には、印加電圧をシステム用計算機１４が調整してフォトマルチプライヤからの出力信号の大きさを調整する。【選択図】      図１
2008112059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を照射した試料からの反射光を検出して該反射光の光量に応じた大きさの信号を出力する光検出手段と、
前記光検出手段から出力される信号の大きさを調整する調整手段と、
前記調整手段による調整後の信号の大きさを各画素の輝度値に対応付けて前記試料の画像を形成する画像形成手段と、
前記画像を構成する画素を輝度値の順に並べたときにおける所定の順番の画素である基準画素が所定の輝度値になるように前記調整手段を調整するための調整量を算出する調整量算出手段と、
を有することを特徴とする共焦点レーザ顕微鏡。
【請求項２】
前記調整量算出手段は、前記画像を構成する画素を輝度値の順に並べたときにおける所定の順番の範囲内の画素の輝度値の加算平均を前記基準画素の輝度値として、前記調整量を算出することを特徴とする請求項１に記載の共焦点レーザ顕微鏡。
【請求項３】
順番を示す入力を取得する順番入力手段を更に有し、
前記所定の順番は、前記順番入力手段が取得した順番である、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の共焦点レーザ顕微鏡。
【請求項４】
前記調整手段による調整後の信号をデジタルデータに変換するＡ／Ｄ変換器を更に有し、
前記画像形成手段は、前記Ａ／Ｄ変換器による変換後のデジタルデータを各画素の輝度値に対応付けて前記試料の画像を形成し、
前記Ａ／Ｄ変換器の入力のダイナミックレンジに対する割合を入力する割合入力手段を更に有し、
前記調整量算出手段は、前記基準画素の輝度値が、前記割合入力手段により取得される前記割合に相当する大きさの信号について前記画像形成手段が対応付ける輝度値になるように前記調整手段を調整するための調整量を算出する、
ことを特徴とする請求項１から３のうちのいずれか一項に記載の共焦点レーザ顕微鏡。
【請求項５】
前記調整量算出手段は、前記画像を構成する画素のうち輝度値が所定値以上であるものの数が所定数以上存在する場合には、前記光検出手段から出力される信号を小さくして該数を該所定数未満となるようにする調整を前記調整手段に行わせるための調整量を算出することを特徴とする請求項１から４のうちのいずれか一項に記載の共焦点レーザ顕微鏡。
【請求項６】
前記調整量算出手段は、該画像を構成する画素のうち輝度値が所定値以上であるものの数の計数を行い、該計数値が前記所定数に達した時点で、前記画像を構成する全ての画素についての信号の出力を前記光検出手段が完了する前であっても、該信号を小さくする調整を前記調整手段に行わせるための調整量を算出することを特徴とする請求項５に記載の共焦点レーザ顕微鏡。
【請求項７】
前記調整量算出手段は、前記画像の一部である注目領域を構成する画素を輝度値の順に並べたときにおける所定の順番の画素である基準画素が所定の輝度値になるように前記調整手段を調整するための調整量を算出することを特徴とする請求項１から６のうちのいずれか一項に記載の共焦点レーザ顕微鏡。
【請求項８】
共焦点レーザ顕微鏡の調整方法であって、
前記共焦点レーザ顕微鏡は、
レーザ光を照射した試料からの反射光を検出して該反射光の光量に応じた大きさの信号を出力する光検出手段と、
前記光検出手段から出力される信号の大きさを調整する調整手段と、
前記調整手段による調整後の信号の大きさを各画素の輝度値に対応付けて前記試料の画像を形成する画像形成手段と、
を有しており、
前記調整方法は、
前記画像形成手段によって形成される前記画像を構成する画素を輝度値の順に並び替え、
前記並び替えがされた画素における所定の順番の画素である基準画素が所定の輝度値になるように前記調整手段を調整するための調整量を算出し、
前記算出がされた調整値での前記調整を前記調整手段が行う、
ことを特徴とする共焦点レーザ顕微鏡の調整方法。
【請求項９】
共焦点レーザ顕微鏡の調整をコンピュータに行わせるためのプログラムであって、
前記共焦点レーザ顕微鏡は、
レーザ光を照射した試料からの反射光を検出して該反射光の光量に応じた大きさの信号を出力する光検出手段と、
前記光検出手段から出力される信号の大きさを調整する調整手段と、
前記調整手段による調整後の信号の大きさを各画素の輝度値に対応付けて前記試料の画像を形成する画像形成手段と、
を有しており、
前記プログラムは、
前記画像形成手段によって形成される前記画像を構成する画素を輝度値の順に並び替える手順と、
前記並び替えがされた画素における所定の順番の画素である基準画素が所定の輝度値になるように前記調整手段を調整するための調整量を算出する手順と、
前記算出がされた調整値での前記調整を前記調整手段に行わせる手順と、
をコンピュータに実行させるためのものである、
ことを特徴とするプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は顕微鏡技術に関し、特に、試料からの反射光から試料の表面情報を測定する共焦点レーザ顕微鏡の技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の共焦点レーザ顕微鏡では、検出器から得られる信号が観察・測定に最適な信号レベルになるように、可変利得増幅回路の利得（検出器としてフォトマルチプライヤが用いられている場合には印加電圧）を自動的に調整するオートゲイン調整が搭載されている。なお、以下の説明では、特に断らない限り、可変利得増幅回路の利得の調整と、フォトマルチプライヤへの印加電圧の調整とを総称して「検出感度調整」と称することとする。
【０００３】
図７Ａ、図７Ｂ、及び図７Ｃは、いずれも共焦点レーザ顕微鏡で得られた同一試料の画像例を示している。ここで、図７Ａの取得画像例は検出器からの信号レベルが低すぎる場合のものであり、画像全体が暗過ぎる状態を表している。図７Ｂの取得画像例は検出器からの信号レベルが高すぎる場合のものであり、画像全体が明る過ぎる状態を表している。一方、図７Ｃの取得画像例は、検出器からの信号レベルが適切な場合のものである。この画像例では画像が適切な明るさで表されているので、図７Ａ及び図７Ｂの取得画像例では識別することのできなかった試料の境界部分が明瞭に現れていることが分かる。
【０００４】
図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃは、それぞれ図７Ａ、図７Ｂ、及び図７Ｃの取得画像例についての輝度ヒストグラムを示している。なお、このヒストグラムにおいて、横軸は画像を構成している画素の輝度値（すなわち、検出器から得られる信号レベル）であり、縦軸は度数（横軸で示されている輝度値である画素の個数）である。
【０００５】
図８Ａのヒストグラムでは画像を構成している画素の度数が低輝度値に集中しており、このことからも図７Ａの画像例は画像全体が暗過ぎの状態にあることが分かる。また、図８Ｂのヒストグラムでは画像を構成している画素の度数が高輝度値に集中しており、このことからも図７Ｂの画像例は画像全体が明る過ぎすぎの状態にあることが分かる。これに対し、図８Ｃのヒストグラムでは構成している画素の度数が所定の輝度範囲内に集中し、且つその範囲内において広く分布しているので、図７Ｃの画像例は検出器からの信号レベルが適切であることが分かる。
【０００６】
前述したオートゲイン調整は、このように、共焦点レーザ顕微鏡の検出器で得られた信号レベルの画素毎のヒストグラムが、図８Ａや図８Ｂのように、所定の範囲から外れた位置に集中している場合に、検出感度調整を自動的に行って、そのヒストグラムを、図８Ｃに示すように、当該所定の範囲内に集中させ、且つその範囲内においてはなるべく広く分布するようにするものである。
【０００７】
このようなオートゲイン調整に関する各種の技術を紹介する。
例えば特許文献１には、以下のような技術が開示されている。
（１）演算により求めた検出感度調整値を適用した後の出力信号レベルが目標信号レベルより小さいときには、その検出感度調整値の１／２を増減幅とし、この増減幅を検出感度調整値に加算した新検出感度調整値を用いてゲイン増幅回路のゲインを変化させる。そして、このときの受光素子の出力をＡ／Ｄ変換してフレームメモリに格納し、格納された値の出力信号レベルと目標信号レベルと再び比較する。
【０００８】
（２）一方、演算により求めた検出感度調整値を適用した後の出力信号レベルが目標信号レベルより大きいときには、検出感度調整値の１／２を増減幅とし、この増減幅を検出感度調整値から減算した新検出感度調整値を用いてゲイン増幅回路のゲインを変化させる。そして、このときの受光素子の出力をＡ／Ｄ変換してフレームメモリに格納し、格納された値の出力信号レベルと目標信号レベルと再び比較する。
【０００９】
（３）上記（１）若しくは（２）での比較の結果、出力信号レベルが目標値より小さいときは上記（１）の手順を再度行い、出力信号レベルが目標値より大きいときは、上記（２）の手順を再度行う。但し、ここで、出力信号レベルが目標値と一致したとき若しくは検出感度調整値が所定の値を下回ったときには、検出感度調整を終了する。
【００１０】
また、この他にも、例えば特許文献２には、フォトマルチプライヤへの印加電圧を自動調整して、取得画像の構成画素における最高輝度と最低輝度とを予め設定された範囲内にする、若しくは、当該構成画素の輝度の平均値を予め設定された値にする技術が開示されている。
【００１１】
また、例えば特許文献３には、受光素子の出力信号を増幅する増幅器のゲインを調整して取得画像の構成画素における最高輝度を予め設定された値以下にすると共に、当該構成画素の輝度のダイナミックレンジを予め設定された範囲内にする技術が開示されている。
【特許文献１】特開２０００−３２１５０３号公報
【特許文献２】特開２００６−１２６３７５号公報
【特許文献３】特開２００１−５１２０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述した各技術では、いずれも、出力信号レベルと目標信号レベルとを比較して、両者が不一致の場合には、調整量を演算して求めた新たな調整量を検出器若しくは増幅器に設定して当該比較を再度行うといった一連の処理を、比較結果が一致するまで繰り返し行う。このため、検出感度調整の完了まで相当の時間を要していた。
【００１３】
また、共焦点レーザ顕微鏡での取得画像のうち、その一部である注目領域内の明るさが適切なものとなっていれば、その他の領域は適切でなくても（例えば輝度の飽和が生じていても）試料の観察・測定には支障がなく、寧ろ好ましい場合もある。しかし、前述した各技術では、このような要求に応えることはできなかった。
【００１４】
本発明は上述した問題に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、オートゲイン調整における検出感度の調整に要する時間を短縮することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の態様のひとつである共焦点レーザ顕微鏡は、レーザ光を照射した試料からの反射光を検出して該反射光の光量に応じた大きさの信号を出力する光検出手段と、光検出手段から出力される信号の大きさを調整する調整手段と、調整手段による調整後の信号の大きさを各画素の輝度値に対応付けて試料の画像を形成する画像形成手段と、画像を構成する画素を輝度値の順に並べたときにおける所定の順番の画素である基準画素が所定の輝度値になるように調整手段を調整するための調整量を算出する調整量算出手段と、を有することを特徴としており、この特徴によって前述した課題を解決する。
【００１６】
なお、上述した本発明に係る共焦点レーザ顕微鏡において、調整量算出手段は、画像を構成する画素を輝度値の順に並べたときにおける所定の順番の範囲内の画素の輝度値の加算平均を基準画素の輝度値として、調整量を算出するように構成することもできる。
【００１７】
また、前述した本発明に係る共焦点レーザ顕微鏡において、順番を示す入力を取得する順番入力手段を更に有し、所定の順番は、順番入力手段が取得した順番であるように構成することもできる。
【００１８】
また、前述した本発明に係る共焦点レーザ顕微鏡において、調整手段による調整後の信号をデジタルデータに変換するＡ／Ｄ変換器を更に有し、画像形成手段は、Ａ／Ｄ変換器による変換後のデジタルデータを各画素の輝度値に対応付けて試料の画像を形成し、Ａ／Ｄ変換器の入力のダイナミックレンジに対する割合を入力する割合入力手段を更に有し、調整量算出手段は、基準画素の輝度値が、割合入力手段により取得される割合に相当する大きさの信号について画像形成手段が対応付ける輝度値になるように調整手段を調整するための調整量を算出する、ように構成することもできる。
【００１９】
また、前述した本発明に係る共焦点レーザ顕微鏡において、調整量算出手段は、画像を構成する画素のうち輝度値が所定値以上であるものの数が所定数以上存在する場合には、光検出手段から出力される信号を小さくして該数を該所定数未満となるようにする調整を調整手段に行わせるための調整量を算出するように構成することもできる。
【００２０】
なお、このとき、調整量算出手段は、該画像を構成する画素のうち輝度値が所定値以上であるものの数の計数を行い、該計数値が所定数に達した時点で、画像を構成する全ての画素についての信号の出力を光検出手段が完了する前であっても、該信号を小さくする調整を調整手段に行わせるための調整量を算出するように構成することもできる。
【００２１】
また、前述した本発明に係る共焦点レーザ顕微鏡において、調整量算出手段は、画像の一部である注目領域を構成する画素を輝度値の順に並べたときにおける所定の順番の画素である基準画素が所定の輝度値になるように調整手段を調整するための調整量を算出するように構成することもできる。
【００２２】
また、本発明の別の態様のひとつである方法は、共焦点レーザ顕微鏡の調整方法であって、共焦点レーザ顕微鏡は、レーザ光を照射した試料からの反射光を検出して該反射光の光量に応じた大きさの信号を出力する光検出手段と、光検出手段から出力される信号の大きさを調整する調整手段と、調整手段による調整後の信号の大きさを各画素の輝度値に対応付けて試料の画像を形成する画像形成手段と、を有しており、調整方法は、画像形成手段によって形成される画像を構成する画素を輝度値の順に並び替え、並び替えがされた画素における所定の順番の画素である基準画素が所定の輝度値になるように調整手段を調整するための調整量を算出し、算出がされた調整値での調整を調整手段が行う、ことを特徴としており、この特徴によって前述した課題を解決する。
【００２３】
また、本発明の別の態様のひとつであるプログラムは、共焦点レーザ顕微鏡の調整をコンピュータに行わせるためのプログラムであって、共焦点レーザ顕微鏡は、レーザ光を照射した試料からの反射光を検出して該反射光の光量に応じた大きさの信号を出力する光検出手段と、光検出手段から出力される信号の大きさを調整する調整手段と、調整手段による調整後の信号の大きさを各画素の輝度値に対応付けて試料の画像を形成する画像形成手段と、を有しており、プログラムは、画像形成手段によって形成される画像を構成する画素を輝度値の順に並び替える手順と、並び替えがされた画素における所定の順番の画素である基準画素が所定の輝度値になるように調整手段を調整するための調整量を算出する手順と、算出がされた調整値での調整を調整手段に行わせる手順と、をコンピュータに実行させるためのものであることを特徴としており、この特徴によって前述した課題を解決する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、以上のようにすることにより、オートゲイン調整における検出感度の調整に要する時間が短縮されるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
まず図１について説明する。同図は本発明を実施する共焦点レーザ顕微鏡の構成を示している。
【００２６】
図１に示した共焦点レーザ顕微鏡は、顕微鏡部１、制御部２、表示部３、及び入力部４を備えている。
図１において、光源６はレーザ光等の点光源により構成されている。この光源６から発せられるスポット光は二次元走査用スキャナ７に導かれる。
【００２７】
二次元走査用スキャナ７は、光源６からのスポット光を試料１０上で二次元走査させるためのものである。二次元走査用スキャナ７は、Ｘ軸方向走査用のＸスキャナとして例えばレゾナントスキャナ若しくはガルバノミラーを、Ｙ軸方向走査用のＹスキャナとして例えばガルバノミラーを有している。これらのＸスキャナ及びＹスキャナをそれぞれＸ軸方向及びＹ軸方向に振ることで、スポット光を試料１０上でＸＹ方向に振らせることができる。
【００２８】
二次元走査されたスポット光は対物レンズ９を透過してステージ１１上の試料１０に照射される。この対物レンズ９は、サーボモータ等を備えている不図示の移動駆動部を駆動させることにより、スポット光の光軸方向、つまりＺ軸方向に連続的に移動可能な構成を有している。
【００２９】
試料１０からの反射光は、対物レンズ９を通して二次元走査用スキャナ７へと戻り、その後は光検出部８に導かれる。光検出部８には、不図示のピンホールが受光面の前面に設けられている。光検出部８は、このピンホールを介して得られる光を検出してその光量に応じた大きさのアナログ信号を出力する。
【００３０】
なお、光検出部８としては、フォトディテクタやフォトマルチプライヤ等を用いることができるが、本実施形態においては、フォトマルチプライヤを用いることとする。フォトマルチプライヤは、印加電圧を制御することで検出感度を変化させることができる。この制御電圧は制御部２によって制御される。
【００３１】
フォトマルチプライヤから出力されるアナログ信号は、信号調整部５に備えられているオフセット演算部１３と増幅部１２とにより、そのオフセット量と振幅（ゲイン）とが調整される。
【００３２】
なお、本実施形態においては、光検出部８であるフォトマルチプライヤへの印加電圧で検出感度を制御するので、増幅部１２の増幅倍率は所定の値に固定とする。ここで、光検出部８としてフォトディテクタを用いる場合には、増幅部１２の増幅倍率を制御部２が制御するように構成する。
【００３３】
光検出部８から出力されたアナログ信号は、その大きさが信号調整部５で調整されて顕微鏡部１の出力となる。その後、このアナログ信号は制御部２へと送られる。制御部２では、送られてきたアナログ信号をＡ／Ｄ変換器１５でデジタルデータへと変換した上で、システム制御用計算機１４へ入力する。
【００３４】
システム制御用計算機１４は、入力されたデジタルデータに基づき、Ａ／Ｄ変換前のアナログ信号の大きさを各画素の輝度値に対応付けて試料１０の画像を形成する。形成された画像は表示部３に表示する。また、システム制御用計算機１４は、入力部４から送られてくる、共焦点レーザ顕微鏡の使用者からの各種の指示に応じて、顕微鏡部１の各構成要素の動作を制御する。
【００３５】
システム制御用計算機１４としては、ごく標準的な構成のコンピュータシステム、すなわち、制御プログラムの実行によってコンピュータシステム全体の動作制御を司るＭＰＵ（演算処理装置）と、このＭＰＵが必要に応じてワークメモリとして使用するメインメモリと、各種のプログラムや制御データなどを記憶して保存しておく例えばハードディスク装置などの記憶装置と、本装置の各部との間で行われる各種のデータの授受を管理するインタフェース部とを有しているコンピュータシステム、を利用することができる。ここで、システム制御用計算機１４が前述した動作を行うには、記憶装置に予め記憶させておいた所定の制御プログラムをＭＰＵに読み出させて実行させればよい。
【００３６】
次に図２について説明する。同図は、図１に示した共焦点レーザ顕微鏡において行われるオートゲイン調整のための制御処理の第一の例の処理内容をフローチャートで示したものである。この制御処理は制御部２が行うものであり、制御部２のシステム制御用計算機１４が、前述した所定の制御プログラムをＭＰＵが実行することによって実現される。
【００３７】
図２の制御処理は、入力部４から送られてくる使用者からのオートゲイン調整の指示である、制御プログラムの実行によって表示部３に表示されているボタンアイコンに対するクリックの指示をシステム制御用計算機１４が取得すると開始される。なお、システム制御用計算機１４が実行している他の処理から呼び出されることで開始してもよい。
【００３８】
この制御処理が開始されると、まず、Ｓ１０１において、光源６からのスポット光の試料１０上での二次元走査を１回行い、このときに顕微鏡部１から出力される信号、すなわち試料１０の画像を構成している各画素の輝度値を示す信号を各画素の輝度値データとして取得する処理が行われる。
【００３９】
なお、ここで、二次元走査を試料１０全体に対して行い、得られた画像から当該画像を構成する画素の輝度値データを取得する代わりに、試料１０の画像の一部である注目領域のみに対して二次元走査を行い、得られた画像から当該画像を構成する画素の輝度値データを取得するようにしてもよい。このようにすることにより、注目領域外の領域は適切でなくても（例えば輝度の飽和が生じていても）、注目領域の観察・測定にとっては寧ろ好ましい、注目領域を対象とした検出感度調整を行うことができる。なお、注目領域は、使用者が任意に指定できるようにすることが好ましいが、図１の共焦点レーザ顕微鏡の観察視野内における予め設定されている固定位置とすることもできる。
【００４０】
Ｓ１０２では、Ｘ軸及びＹ軸の二次元座標の配置順に並べられている、Ｓ１０１の処理によって取得された各画素の輝度値データを、輝度値の降順に並び替える処理が行われる。
【００４１】
Ｓ１０３では、Ｓ１０１の処理によって取得された試料１０の画像を構成している画素のうち、輝度値が飽和している（顕微鏡部１から出力されるアナログ信号の大きさがＡ／Ｄ変換器１５の入力のダイナミックレンジ以上であるために、そのアナログ信号に対応する画素の輝度値が取り得る最大の値となっている）ものの数を計数し、この計数値が予め設定されている数（この値を「飽和判定基準度数」と称することとする。）に達したか否かを判定する処理が行われる。ここで、輝度値の飽和している画素数が飽和判定基準度数に達していると判定されたとき（判定結果かＹｅｓのとき）にはＳ１０６に処理を進め、輝度値の飽和している画素数が飽和判定基準度数に達していないと判定されたとき（判定結果かＮｏのとき）にはＳ１０４に処理を進める。
【００４２】
Ｓ１０４では、Ｓ１０２の処理によって並べ替えられた画素のうち輝度値が最大であるものから降順に数えて所定の順番のものを、調整値の決定のための基準の画素（調整基準画素）とし、この調整基準画素の輝度値を用いて調整値を算出する処理が行われる。ここで、調整基準画素の選択条件である当該所定の順番を幾つにするかは、予め設定されている固定値としてもよい。また、使用者によって任意に入力される順番を入力部４が取得し、この取得した順番を当該所定の順番とするようにしてもよい。
【００４３】
ここで、基準画素の輝度値を用いて調整値を算出する手法について説明する。
前述しように、本実施形態では、光検出部１としてフォトマルチプライヤを用いているので、検出感度調整の対象はフォトマルチプライヤへの印加電圧となる。
【００４４】
印加電圧ＨＶにおけるフォトマルチプライヤの検出感度Ｇは、下記の［１］式で表すことができる。
Ｇ＝ｋ×ＨＶa ………［１］
なお、上記［１］式における定数ａ及びｋは、フォトマルチプライヤ固体毎に決まる値である。
【００４５】
例えば、基準画素の輝度値をＡ／Ｄ変換器１５の入力のダイナミックレンジにおける９０％の値とすることが調整条件として予め要求されている場合を仮定する。
検出感度の調整前のフォトマルチプライヤによって検出された基準画素の輝度値Ｉ（１）は、この検出時におけるフォトマルチプライヤへの印加電圧ＨＶ（１）及びこの検出時におけるフォトマルチプライヤの検出感度をＧ（１）より、下記の［２］式で表される。
【００４６】
Ｉ（１）＝Ｇ（１）×ｒ×ｔ＝ｒ×ｔ×ｋ×ＨＶ（１）a ………［２］
なお、上記［１］式において、定数rは試料１０表面の反射率であり、定数ｔは、図１の共焦点レーザ顕微鏡における光学系の効率である。
【００４７】
一方、検出感度を調整した後のフォトマルチプライヤが検出する基準画素の輝度値の要求値Ｉ（９０％）（すなわち、Ａ／Ｄ変換器１５の入力のダイナミックレンジにおける９０％の値）は、この検出時におけるフォトマルチプライヤへの印加電圧ＨＶ（９０％）及びこの検出時におけるフォトマルチプライヤの検出感度をＧ（９０％）より、下記の［３］式で表される。
【００４８】
Ｉ（９０％）＝Ｇ（９０％）×ｒ×ｔ＝ｒ×ｔ×ｋ×ＨＶ（９０％）a ………［３］
よって、上記の［２］式及び［３］式より、下記の［４］式が成立する。
Ｉ（１）／Ｉ（９０％）＝｛ＨＶ（１）a ｝／｛ＨＶ（９０％）a ｝………［４］
従って、定数ａが判明していれば、基準画素の輝度値の検出結果をＩ（９０％）にするためのフォトマルチプライヤへの印加電圧ＨＶ（９０％）を算出することができる。ここで、定数ａは、例えば、フォトマルチプライヤの製造メーカによって提供される値を用いることができるが、装置毎に実験を行ってその値を厳密に求めておくようにしてもよい。
【００４９】
なお、光検出部１としてフォトディテクタを用いる場合には、検出感度調整の対象は増幅部１２の増幅倍率になる。増幅部１２には線形増幅器を用いることが一般的であるので、この場合における増幅倍率の調整値の算出は容易である。
【００５０】
図２の説明に戻る。Ｓ１０５では、上述したＳ１０４の処理によって算出された調整値を設定する処理が行われ、その後はこの制御処理を終了する。
ところで、前述したＳ１０３の判定処理の結果かＹｅｓであったときには、Ｓ１０６において、検出感度を低下させる調整のための調整値の算出が上述したＳ１０４とは異なる手法によって行われ、得られた調整値を設定する処理が行われる。そして、その後はＳ１０１へと処理を戻して上述した処理が繰り返される。
【００５１】
このＳ１０６の処理は、Ｓ１０１の処理によって取得された試料１０の画像が過度に飽和してしまい、Ｓ１０４の処理に基づく検出感度調整のみでは適切な画像が得られない場合の処理である。具体的には、例えば、Ｓ１０３の処理によって計数された輝度値の飽和している画素数に応じ、その数が大きいほど検出感度を大きく低下させるように調整値を求めて設定する。この画素数と検出感度との関係は、予め設定されている固定のものとしてもよいし、使用者が任意に設定できるようにしてもよい。また、この他にも、例えば、Ｓ１０２の処理における並べ替えにより取得画像についての輝度ヒストグラムを作成すると共に、増幅倍率が入力信号レベルに応じて変化する非線形増幅器を増幅器１２として採用し、輝度変化の単調性は維持しつつ、その輝度ヒストグラムにおける最大値と最小値との幅が所定の最大値及び最小値の範囲内に収まるように増幅器１２の増幅特性の調整を行うようにしてもよい。
【００５２】
以上の制御処理を制御部２が行うことにより、検出感度調整に要する時間の短いオートゲイン調整が図１の共焦点レーザ顕微鏡において実現される。
なお、上述した実施形態においては、試料１０の画像を取得した上で直ちに検出感度調整を行っていた。この代わりに、Ａ／Ｄ変換器１５を介して取得される試料１０の画像データをシステム制御用計算機１４で記憶しておくようにしておき、使用者からオートゲイン調整の指示を取得したときには、検出感度調整のための調整値の算出を、システム制御用計算機１４が保存していた画像データに基づいて行うようにすることもできる。なお、ここで、システム制御用計算機１４で保存されている試料１０の画像データは、スポット光の試料１０上での二次元走査を行う度に更新するようにする。このようにして行う検出感度調整について、図３を用いて説明する。
【００５３】
図３は、図１に示した共焦点レーザ顕微鏡において行われるオートゲイン調整のための制御処理の第二の例の処理内容をフローチャートで示したものである。この制御処理は制御部２が行うものであり、制御部２のシステム制御用計算機１４が、前述した所定の制御プログラムをＭＰＵが実行することによって実現される。
【００５４】
図３の制御処理は、入力部４から送られてくる使用者からのオートゲイン調整の指示である、制御プログラムの実行によって表示部３に表示されているボタンアイコンに対するクリックの指示をシステム制御用計算機１４が取得すると開始される。なお、システム制御用計算機１４が実行している他の処理から呼び出されることで開始してもよい。
【００５５】
Ｓ２０１では、システム制御用計算機１４が保存している画像データを読み出し、検出感度調整のための調整値を、得られた画像データに基づいて算出する処理が行われる。なお、具体的には、図２のＳ１０２及びＳ１０４の処理がＳ２０１の処理として実行される。
【００５６】
続くＳ２０２では、上述したＳ２０１の処理によって算出された調整値を設定する処理が行われ、その後はこの制御処理を終了する。
制御部２が以上の制御処理を実行することで、システム制御用計算機１４が保存していた画像データに基づく、検出感度調整のための調整値の算出が行われる。
【００５７】
また、前述した図２の制御処理におけるＳ１０３の処理において用いられる飽和判定基準度数や、Ｓ１０４の処理において用いられる調整条件（検出感度調整後の基準画素の輝度値）として、予め定められている値を用いる代わりに、使用者が任意に設定できるようにしてもよい。
【００５８】
図４について説明する。同図は、図１に示した共焦点レーザ顕微鏡において行われるオートゲイン調整のための制御処理の第三の例の処理内容をフローチャートで示したものである。この制御処理は制御部２が行うものであり、制御部２のシステム制御用計算機１４が、前述した所定の制御プログラムをＭＰＵが実行することによって実現される。
【００５９】
図４の制御処理は、入力部４から送られてくる使用者からのオートゲイン調整の指示である、制御プログラムの実行によって表示部３に表示されているボタンアイコンに対するクリックの指示をシステム制御用計算機１４が取得すると開始される。なお、システム制御用計算機１４が実行している他の処理から呼び出されることで開始してもよい。
【００６０】
図４において、まず、Ｓ３０１では、入力部４から送られてくる、使用者によって指定され、取得した上述した飽和判定基準度数及び調整条件を取得する処理が行われる。
以降のＳ３０２からＳ３０７にかけての処理は、図２に示した第一の例におけるＳ１０１からＳ１０６にかけての処理と同様であるので説明を省略する。但し、Ｓ３０４の処理では、Ｓ３０１の処理によって取得された飽和判定基準度数が用いられ、Ｓ３０５の処理では、Ｓ３０１の処理によって取得された調整条件が用いられる。
【００６１】
ここで図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃについて説明する。これらの画面は、図４のＳ３０１における調整条件の取得処理を制御部２が実行すると表示部３に表示される調整指示用画面の例である。
【００６２】
図５Ａ及び図５Ｂの画面例は、前もって行われたスポット光の試料１０上での二次元走査によって取得された試料１０の画像（若しくは注目領域の画像）についての輝度ヒストグラムを含んでいる。このヒストグラムにおいて、横軸は輝度値であり、縦軸は度数（輝度値に対応する画素の数）である。これらの画面例を表示した場合、使用者は、この輝度ヒストグラムを確認しながら、Ａ／Ｄ変換器１５を通過した後のデジタルデータを、Ａ／Ｄ変換器１５のダイナミックレンジに対してどの程度の大きさのものにするかを制御部２へ指示する。具体的には、検出感度調整を行った後の度数ヒストグラムにおいて最頻値となる輝度値を、Ａ／Ｄ変換器１５のダイナミックレンジに対してどの程度の大きさのものにするかを指示する。
【００６３】
図５Ａの画面例においては、使用者は、輝度ヒストグラムの下部に配置されているスライダを左右に移動させるための操作を入力部４に対して行うことで調整条件の指示を行う。また、図５Ｂの画面例においては、輝度ヒストグラム上に表示されている直線のマーカを左右に移動させるための操作を入力部４に対して行うことで調整条件の指示を行う。
【００６４】
また、図５Ｃの画面例が表示される場合には、使用者は、Ａ／Ｄ変換器１５を通過した後のデジタルデータを、Ａ／Ｄ変換器１５のダイナミックレンジに対してどの程度の大きさのものにするかを、相対数値で指示する。具体的には、使用者は、画面内の数値表示欄の右側に配置されている、数値の増減指示のためのアイコンボタンを押下するための操作を入力部４に対して行うことで調整条件の指示を行う。
【００６５】
次に図６について説明する。同図は、図１に示した共焦点レーザ顕微鏡において行われるオートゲイン調整のための制御処理の第四の例の処理内容をフローチャートで示したものである。この制御処理は制御部２が行うものであり、制御部２のシステム制御用計算機１４が、前述した所定の制御プログラムをＭＰＵが実行することによって実現される。
【００６６】
図２に示した制御処理の第一の例では、スポット光の試料１０上での二次元走査を１回完了させて試料１０の画像全体（若しくは注目領域の画像全体）を取得し終えてから、その画像を構成している画素の並び替えを行い、その後に検出感度調整のための調整値の算出を行っていた。これに対し、図６に示した制御処理の第四の例では、スポット光の二次元走査と並行して試料１０の画像（若しくは注目領域の画像）を構成している画素の並び替えを行うようにし、二次元走査の完了後直ちに検出感度調整のための調整値の算出を行うというものである。
【００６７】
このような第四の例の制御処理を行うようにすることにより、試料１０の画像（若しくは注目領域の画像）を構成する画素のうち、輝度値が飽和しているものの数が飽和判定基準度数に達していることの検出が二次元走査の完了までに可能となる。この結果、この場合に行われる二次元走査の再実行が早く開始できるようになるので、オートゲイン調整における検出感度調整に要する時間が、先述した第一の例よりも更に短縮される。
【００６８】
図６の制御処理は、入力部４から送られてくる使用者からのオートゲイン調整の指示である、制御プログラムの実行によって表示部３に表示されているボタンアイコンに対するクリックの指示をシステム制御用計算機１４が取得すると開始される。なお、システム制御用計算機１４が実行している他の処理から呼び出されることで開始してもよい。
【００６９】
図６の制御処理が開始されると、まず、Ｓ４０１において、光源６からのスポット光の試料１０上での二次元走査を開始する処理が行われる。
Ｓ４０２では、二次元走査の実行中に顕微鏡部１から出力される１画素分の信号、すなわち試料１０の画像（若しくは注目領域の画像）を構成している画素の輝度値を示す信号を当該画素の輝度値データとして取得する処理が行われる。
【００７０】
Ｓ４０３では、Ｓ４０２の処理によって取得された画素の輝度値が飽和しているものの数を計数し、この計数値が前述した飽和判定基準度数に達したか否かを判定する処理が行われる。ここで、輝度値の飽和している画素数が飽和判定基準度数に達していると判定されたとき（判定結果かＹｅｓのとき）にはＳ４０８に処理を進め、輝度値の飽和している画素数が飽和判定基準度数に達していないと判定されたとき（判定結果かＮｏのとき）にはＳ４０４に処理を進める。
【００７１】
Ｓ４０４では、Ｓ４０２の処理によって、Ｘ軸及びＹ軸の二次元座標の配置順に取得される画素の輝度値データを、輝度値の降順に並び替える処理が行われる。
Ｓ４０５では、Ｓ４０２の処理によって取得した輝度値データの個数を計数し、この係数値が、予め設定されている、検出感度調整のための調整値の算出に必要な個数に達したか否かを判定する処理が行われる。ここで、ここで、輝度値データの取得数が所定数に達していると判定されたとき（判定結果かＹｅｓのとき）にはＳ４０６に処理を進め、輝度値データの取得数が所定数に達していないと判定されたとき（判定結果かＮｏのとき）にはＳ４０２へと処理を戻し、輝度値データ取得のための処理を繰り返す。
【００７２】
Ｓ４０６では、Ｓ４０４の処理によって並べ替えられた画素のうち輝度値が最大であるものから降順に数えて所定の順番のものを、前述した調整基準画素とし、この調整基準画素の輝度値を用いて調整値を算出する処理が行われる。ここで、調整基準画素を選択条件である当該所定の順番を幾つにするかは、予め設定されている固定値としてもよい。また、使用者によって任意に入力される順番を入力部４が取得し、この取得した順番を当該所定の順番とするようにしてもよい。なお、この処理において調整値を算出する手法は、図２のＳ１０４において行われるものと同一のものとする。
【００７３】
Ｓ４０７では、上述したＳ４０６の処理によって算出された調整値を設定する処理が行われ、その後はこの制御処理を終了する。
ところで、前述したＳ４０３の判定処理の結果かＹｅｓであったときには、Ｓ４０８において、検出感度を低下させる調整のための調整値の算出が上述したＳ４０６とは異なる手法によって行われ、得られた調整値を設定する処理が行われる。そして、その後はＳ４０２へと処理を戻して上述した処理が繰り返される。なお、この処理において調整値を算出する手法は、図２のＳ１０６において行われるものと同一のものとする。
【００７４】
以上の制御処理を制御部２が行うことにより、検出感度調整に要する時間の短いオートゲイン調整が図１の共焦点レーザ顕微鏡において実現される。
以上のように、本発明のいずれの実施形態においても、出力信号レベルと目標信号レベルとを比較して両者が一致するまで調整量の設定を繰り返すような手順は実行しないので、オートゲイン調整における検出感度調整に要する時間が短縮される。
【００７５】
なお、上述した実施形態における図２のＳ１０２、図４のＳ３０３、及び図６のＳ４０４の各処理では、試料１０の画像を構成している画素を輝度値の降順に並び替えを行い、図２のＳ１０４、図４のＳ３０５、及び図６のＳ４０６の処理では、並び替えられた画素のうち輝度値の降順に数えて所定の順番のものを調整基準画素とし、この調整基準画素の輝度値を用いて調整値を算出していた。この代わりに、制御部２が、試料１０の画像を構成している画素を輝度値の昇順に並び替えを行い、並び替えられた画素のうち輝度値の昇順に数えて所定の順番のものを調整基準画素とし、この調整基準画素の輝度値を用いて調整値を算出するようにしてもよい。
【００７６】
また、この代わりに、制御部２が、試料１０の画像を構成している画素を輝度値の順（降順または昇順）に並び替えを行い、並び替えられた画素のうち輝度値の順に数えて所定の順番の範囲内のものの輝度値の加算平均を、調整基準画素の輝度値とし、この調整基準画素の輝度値を用いて調整値を算出するようにしてもよい。
【００７７】
また、上述した実施形態における図２のＳ１０３、図４のＳ３０４、及び図６のＳ４０３の各処理では、試料１０の画像を構成している画素のうち、輝度値が飽和しているものの数を計数し、この計数値が前述した飽和判定基準度数に達している場合には、図２のＳ１０６、図４のＳ３０７、若しくは図６のＳ４０８の各処理において、検出感度を低下させる調整のための調整値を算出して、得られた調整値を設定するようにしていた。この代わりに、制御部２が、試料１０の画像を構成している画素のうち、輝度値が所定の輝度値以上となっているものの数を計数し、この計数値が所定の数に達している場合には、検出感度を低下させる調整のための調整値を算出して、得られた調整値を設定する処理を実行するようにしてもよい。また、この代わりに、制御部２が、試料１０の画像を構成している画素のうち、輝度値が、Ａ／Ｄ変換器１５の入力のダイナミックレンジに対する所定の割合に相当する信号に対応付けられる輝度値以上となっているものの数を計数し、この計数値が所定の数に達している場合には、検出感度を低下させる調整のための調整値を算出して、得られた調整値を設定する処理を実行するようにしてもよい。
【００７８】
以上、本発明の実施形態を説明したが、本発明は、上述した各実施形態に限定されることなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の改良・変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明を実施する共焦点レーザ顕微鏡の構成を示す図である。
【図２】オートゲイン調整のための制御処理の第一の例の処理内容をフローチャートで示した図である。
【図３】オートゲイン調整のための制御処理の第二の例の処理内容をフローチャートで示した図である。
【図４】オートゲイン調整のための制御処理の第三の例の処理内容をフローチャートで示した図である。
【図５Ａ】調整指示用画面の例（その１）を示す図である。
【図５Ｂ】調整指示用画面の例（その２）を示す図である。
【図５Ｃ】調整指示用画面の例（その３）を示す図である。
【図６】オートゲイン調整のための制御処理の第四の例の処理内容をフローチャートで示した図である。
【図７Ａ】共焦点レーザ顕微鏡で得られた試料の画像例（その１）を示す図である。
【図７Ｂ】共焦点レーザ顕微鏡で得られた試料の画像例（その２）を示す図である。
【図７Ｃ】共焦点レーザ顕微鏡で得られた試料の画像例（その３）を示す図である。
【図８Ａ】図７Ａの取得画像例についての輝度ヒストグラムを示す図である。
【図８Ｂ】図７Ｂの取得画像例についての輝度ヒストグラムを示す図である。
【図８Ｃ】図７Ｃの取得画像例についての輝度ヒストグラムを示す図である。
【符号の説明】
【００８０】
１  顕微鏡部
２  制御部
３  表示部
４  入力部
５  信号調整部
６  光源
７  二次元走査用スキャナ
８  光検出部
９  対物レンズ
１０  試料
１１  ステージ
１２  増幅部
１３  オフセット演算部
１４  システム制御用計算機
１５  Ａ／Ｄ変換器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2008112059.tif 000009
【図８Ｂ】
2008112059.tif 000010
【図８Ｃ】
2008112059.tif 000011
【図５Ａ】
2008112059.tif 000012
【図５Ｂ】
2008112059.tif 000013
【図５Ｃ】
2008112059.tif 000014
【図７Ａ】
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【図７Ｃ】
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