(57)【要約】【課題】本発明では、励起光波長を高速に切り換えることができるレーザー走査型顕微鏡を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の上記課題は、複数波長のレーザーを切り換えて試料に照射するレーザー走査型顕微鏡において、前記複数波長のレーザーを入射し、所望の波長のレーザーのみを選択的に前記試料に照射するための光路に射出する電気光学結晶と、前記所望の波長のレーザーによって励起された前記試料内の蛍光物質から放射された蛍光が前記電気光学結晶を通過した後の結像面に配置される、前記電気光学結晶の屈折率傾斜の方向に開口した共焦点スリットとを備え、前記電気光学結晶に印加する電圧を制御することによって、前記所望の波長のレーザーを動的に切り換えることによって解決される。【選択図】図６
2008203301.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数波長のレーザーを切り換えて試料に照射するレーザー走査型顕微鏡において、
前記複数波長のレーザーを入射し、所望の波長のレーザーのみを選択的に前記試料に照射するための光路に射出する、電圧の印加により内部に屈折率のグラディエーションが誘起される電気光学結晶と、
前記所望の波長のレーザーによって励起された前記試料内の蛍光物質から放射された蛍光が前記電気光学結晶を通過した後の結像面に配置される、前記電気光学結晶の屈折率傾斜の方向に開口した共焦点スリットと
を備え、前記電気光学結晶に印加する電圧を制御することによって、前記所望の波長のレーザーを動的に切り換えることを特徴とするレーザー走査型顕微鏡。
【請求項２】
複数波長のレーザーを切り換えて試料に照射するレーザー走査型顕微鏡において、
前記複数波長のレーザーを入射し、所望の波長のレーザーのみを選択的に前記試料に照射するための光路に射出する第一の電気光学結晶と、
前記所望の波長のレーザーによって励起された前記試料内の蛍光物質から放射された蛍光が前記第一の電気光学結晶を通過した後の光路に配置される、前記第一の電気光学結晶によって生じる光線分離を相殺させる第二の電気光学結晶と
を備え、前記第一と第二の電気光学結晶に印加する電圧を制御することによって、前記所望の波長のレーザーを動的に切り換えることを特徴とするレーザー走査型顕微鏡。
【請求項３】
複数波長のレーザーを切り換えて試料に照射するレーザー走査型顕微鏡において、
前記複数波長のレーザーを入射し、所望の波長のレーザーのみを選択的に前記試料に照射するための光路に射出する電気光学結晶と、
前記電気光学結晶と前記試料との間の前記試料と光学的に共役な位置に配置される共焦点ピンホールと、
前記共焦点ピンホールと前記電気光学結晶の間に配置された、入射光を前記電気光学結晶の有効方向の直線偏光に変換する偏光面変換手段と、
前記所望の波長のレーザーによって励起された前記試料内の蛍光物質から放射された蛍光が前記電気光学結晶を通過した後の結像面に配置される、前記電気光学結晶の屈折率傾斜の方向に直交した開口を持ち、所望の波長の蛍光を選択的に通過させるスリットと
を備え、前記電気光学結晶に印加する電圧を制御することによって、前記所望の波長のレーザーを動的に切り換えることを特徴とするレーザー走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記偏光面変換手段は偏光ビームスプリッターとλ／２位相板を組み合わせて構成されることを特徴とする請求項３に記載のレーザー走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記電気光学結晶がKTa1-xNbxO3である、請求項１から４のいずれかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
【請求項６】
請求項１から請求項５の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡を使ったレーザー走査方法において、
ピクセルごとに前記複数波長のレーザーを切り換えて試料に照射するレーザー走査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はレーザー走査型顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
共焦点レーザー走査顕微鏡は、通常の顕微鏡に比べて、分解能・コントラストが良く、試料の高さ方向にも分解能を持つことから、例えば生体試料や半導体試料の観察・測定等に広く使用されている。これを蛍光顕微鏡と組み合わせた共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡は、レーザーによって試料内の蛍光物質の蛍光を観察する顕微鏡である。近年では共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡において複数色（複数波長）のレーザーを試料に照射して、試料内の複数の蛍光物質を多色に染め分けて観測する手法が多く利用される。
【０００３】
このとき多くの場合は、ダイクロイックミラーなどを切り換えることによりレーザー切り換えを行い、各波長での観察結果を画像処理によって一つのフレームを合成する。
従来の走査方法による多波長励起観測では、１フレーム（あるいは１ライン）ごとに励起波長を切り換える方法を取っていた。その理由は励起波長を切り換えるための時間が試料面を走査する時間と比べて遅かったからである。つまり、従来の多波長励起観測では励起波長ごとに少なからず時間差が生じてしまっていて、観察結果の同時性精度が損なわれていた。このことは生体試料（とくに生きたまま細胞内の生体反応）などの時間変化をする観察対象に対しては大きな問題である。
【非特許文献１】Nakamura et al. Wide-angle, low-voltage electro-optic beam deflection based on space-charge-controlled mode of electrical conduction in , Applied Physics Letter 89, 131-115, 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記の技術的問題に鑑み、複数の励起光波長を高速に切り換えることができるレーザー走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の上記課題は、複数波長のレーザーを切り換えて試料に照射するレーザー走査型顕微鏡において、前記複数波長のレーザーを入射し、所望の波長のレーザーのみを選択的に前記試料に照射するための光路に射出する電気光学結晶と、前記所望の波長のレーザーによって励起された前記試料内の蛍光物質から放射された蛍光が前記電気光学結晶を通過した後の結像面に配置される、前記電気光学結晶の屈折率傾斜の方向に開口した共焦点スリットとを備え、前記電気光学結晶に印加する電圧を制御することによって、前記所望の波長のレーザーを動的に切り換えることによって解決される。
【０００６】
電気光学結晶による波長選択は物質的な駆動を伴わないので作動が高速であることに加えて、上記の構成によれば、電気光学結晶のもつ偏光特性による観察光分離の影響を抑えることができる。
【０００７】
また本発明の上記課題は、複数波長のレーザーを切り換えて試料に照射するレーザー走査型顕微鏡において、前記複数波長のレーザーを入射し、所望の波長のレーザーのみを選択的に前記試料に照射するための光路に射出する第一の電気光学結晶と、前記所望の波長のレーザーによって励起された前記試料内の蛍光物質から放射された蛍光が前記第一の電気光学結晶を通過した後の光路に配置される、前記第一の電気光学結晶によって生じる光線分離を相殺させる第二の電気光学結晶とを備え、前記電気光学結晶に印加する電圧を制御することによって、前記所望の波長のレーザーを動的に切り換えることによっても解決される。
【０００８】
電気光学結晶による波長選択は物質的な駆動を伴わないので作動が高速であることに加えて、上記の構成によれば、電気光学結晶のもつ偏光特性と分散を相殺することができる。
【０００９】
さらに、複数波長のレーザーを切り換えて試料に照射するレーザー走査型顕微鏡において、前記複数波長のレーザーを入射し、所望の波長のレーザーのみを選択的に前記試料に照射するための光路に射出する電気光学結晶と、前記電気光学結晶と前記試料との間の前記試料と光学的に共役な位置に配置される共焦点ピンホールと、前記共焦点ピンホールと前記電気光学結晶の間に配置された、入射光を前記電気光学結晶の有効方向の直線偏光に変換する偏光面変換手段と、前記所望の波長のレーザーによって励起された前記試料内の蛍光物質から放射された蛍光が前記電気光学結晶を通過した後の結像面に配置される、前記電気光学結晶の屈折率傾斜の方向に直交した開口を持ち、所望の波長の蛍光を選択的に通過させるスリットとを備え、前記電気光学結晶に印加する電圧を制御することによって、前記所望の波長のレーザーを動的に切り換えることによっても解決される。
【００１０】
電気光学結晶による波長選択は物質的な駆動を伴わないので作動が高速であることに加えて、上記の構成によれば、電気光学結晶のもつ分散を蛍光の分光に利用することができる。また、前記電気光学結晶としてKTa1-xNbxO3であることが望ましい。
【００１１】
なお、前記偏光面変換手段は偏光ビームスプリッターとλ／２位相板を組み合わせて構成されることが考えられる。
また、本発明によるレーザー走査型顕微鏡は、ピクセルごとに前記複数波長のレーザーを切り換えて試料に照射するレーザー走査型方法に適している。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ダイクロイックミラー等の光学部材を交換することなく、複数レーザー波長での励起と蛍光の取り込みが行えるレーザー走査型顕微鏡が提供される。
また、本発明によるレーザー走査型では、多波長蛍光の観察でも蛍光のクロストークが少なく、時間的に変化する標本を観察することに有効な高速検出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下では、図面を参照ながら本発明の実施形態について説明する。
図１は本発明の実施に利用される一般的な形のレーザー走査型顕微鏡の模式図である。同図における顕微鏡本体１は、ステージ２上の試料３を、対物レンズ４を使って観察する。そして顕微鏡本体１にはスキャンユニット５が接続され、スキャンユニット５にはレーザーユニット６からファイバーケーブル７を通してレーザーが導入され内部でレーザー走査が行われる。上記のような構成をする理由は一般的なレーザーユニットは大型の装置となるので顕微鏡本体に直接備え付けることができないからである。さらにコンピュータ端末８が備えられ、スキャンユニット５やレーザーユニット６の制御と得られた検出結果の可視化に利用される。
【００１４】
図２は従来のレーザー走査型顕微鏡の内部構成を説明する概略図である。通常のレーザー走査型顕微鏡ではレーザー光源として例えばアルゴンイオンレーザー（488nm）とＨｅ−Ｎｅグリーンレーザー(543nm)とＨｅ−Ｎｅレーザー(633nm)などの複数のレーザー光源９を搭載し、ダイクロイックミラー１０を組み合わせることによって同一光路に合成することによって一つのレーザーユニット６を構成する。一つの光路に合成されたレーザーはＡＯＴＦ（Acousto-optic tunable filters）１２によって光量調節などを行った後にファイバーカップリング機構１３を経由してファイバーケーブル７に導入される。
【００１５】
ファイバーケーブル７からスキャンユニット５に導入されたレーザーはダイクロイックミラー１５によって、対物レンズ４方向へ反射される。その光路の途中にはガルバノミラー１６、瞳投影レンズ１７、結像レンズ１８が配置され、レーザーを走査する機能が備えられている。ここで、多波長励起観察を行う場合にはダイクロイックミラー１５は励起波長に応じて選択して利用することが多かったので、この切り換え時間によって高速化が妨げられていた。
【００１６】
試料からの観察光は逆の光路を通り、ダイクロイックミラー１５を通過して検出光路に入る。検出光路内には結像レンズ２０が配置され、観察光は共焦点ピンホール２１に結像され、これを通過した観察光をダイクロイックミラー２２によって所望の波長ごとに分離する。分離したそれぞれの観察光を検出器（フォトマルチプライヤ）２４によって検出する。
【００１７】
なお、図中の符号１１、１４、１９、２３は光路を曲げるためのミラーである。
本発明は、ダイクロイックミラー１５の波長ごとの交換によって生じてしまう時間のロスを電気光学結晶に交換することによって大幅に短縮する。そこで先ず、図３を使って本発明で使われる電気光学結晶の働きについて説明する。本発明で使用する電気光学結晶は、電圧の印加により内部に屈折率のグラディエーションが誘起されるものであればよく、以下ではその一例としてＫＴＮ結晶を使って説明をする。このＫＴＮ結晶はKTa1-xNbxO3により構成され、カー定数が３×１０-16m2/V以上のものである。この結晶の詳細については、例えば非特許文献１を参照できる。
【００１８】
ＫＴＮ結晶２５は電圧の印加により屈折率の変化（光電効果）する光学素子である。その原理は以下の通りである。２つの電極２６によって電圧が印加されることによって電子２７が結晶内に注入され、電界傾斜２８が発生する。その結果、ＫＴＮ結晶２５内に屈折率のグラディエーションが生じる。そしてこの屈折率のグラディエーションによって入射光が偏向する仕組みである。
【００１９】
ただし、ＫＴＮ結晶２５のこの作用には偏光特性がある。つまり、有効な入射方向の直線偏光のみにしか上述の作用は起こらない。
図４はＫＴＮ結晶２５にランダム偏光が入射した場合の作用を説明する図である。同図において実線で示されるのは有効直線偏光であり、上述の通り電界方向に偏向される。一方、同図において点線で示されるのは有効入射方向と直交する成分を示しており、有効入射方向で入射した光線とは異なる振る舞いをする。この直交成分は直行する光線と有効直線偏光と反対に偏向される光線とに分かれる。つまり、ＫＴＮ結晶２５にランダム偏光が入射した場合は電界方向に光線が分離される。
【００２０】
次に、ＫＴＮ結晶２５を使って波長選択を行うための基本構成を、図５を使って説明する。一般的な光学素子と同様にＫＴＮ結晶２５も分散を持つ。すなわち、多波長光線を入射した場合は、波長ごとに分解されて射出される。そこで、射出光の一部をスリット２９や開口で抜き出すことにより、所望の波長の光線のみを選択することができる。また、電極２６に印加する電圧の制御によりＫＴＮ結晶２５の屈折率のグラディエーションは変えることができるので、スリット２９を動かすことなく選択波長を変更することができる。この操作は物質的な駆動を伴わないので、作動が高速である。
【００２１】
以下では、レーザー走査型顕微鏡においてＫＴＮ結晶２５を波長選択に利用した本発明の実施例について説明する。ここでは、スキャンユニット５の内部構成についてのみの説明をするが、それ以外の部位は従来と同様の構成としてよい。
【実施例１】
【００２２】
図６は本発明の実施の一形態によるスキャンユニット５の内部構成の概略図である。同図において、レーザーユニットからファイバーケーブルを通じて導入された多波長レーザー光は、ミラー１４などによってＫＴＮ結晶２５に入射される。そこで電圧印加により偏向角を制御し、後段のスリット２９を通過できる波長のレーザーを選択する。その後、レーザーはガルバノミラー１６と瞳投影レンズ１７などを経由し、試料内の蛍光試薬を励起する。
【００２３】
その結果として試料から放射される蛍光は、光路を励起光と逆に進む。つまり、瞳投影レンズ１７とガルバノミラー１６を経由して、スリット２９を通過し、ＫＴＮ結晶２５へ入射される。このとき、蛍光もＫＴＮ結晶２５によって偏向されるが、蛍光は励起光よりも波長が長い（ストークスシフト）ことによって、励起光路とは異なる方向に進む。つまり、励起光と蛍光がＫＴＮ結晶２５によって分離される。
【００２４】
また、一般にレーザー光は直線偏光であるが、観察光としての蛍光は直線偏光とは限らない。つまり、ＫＴＮ結晶２５に入射した蛍光は有効方向の直線偏光による偏向と、その直行成分の直線偏光による偏向によって、３つの異なる方向（一つは直行）に分離される。さらに、観察光である蛍光はある程度の波長帯域をもって射出されるので、このことによってもＫＴＮ結晶２５に入射した蛍光は分散してしまう。
【００２５】
この３種類の光線はすべて観察光であるので、これらすべてを検出する構成を後段に備える。
本構成例ではＫＴＮ結晶２５から射出された３つの光線を結像レンズ２０によって共焦点スリット３０に結像させる。この部分は本来、共焦点ピンホール２１であったものである。本構成例ではＫＴＮ結晶２５によって観察光が３つに分離してしまうために、その分離方向に開口したスリットを配置して共焦点効果を作り出す。
【００２６】
その後、共焦点スリット３０を通過した蛍光をリレーレンズ３１など使って検出器２４へ導く。このとき、ダイクロイックミラー２２や不図示のフィルタなどをつかって蛍光を光線分離し、複数の検出器２４によって検出する構成が好ましい。
【実施例２】
【００２７】
図７は本発明の実施の一形態によるスキャンユニット５の内部構成の概略図である。同図において、レーザーユニットからファイバーケーブルを通じて導入された多波長レーザー光は、ミラー１４などによってＫＴＮ結晶２５に入射される。そこで電圧印加により偏向角を制御し、後段のスリット２９を通過できる波長のレーザーを選択する。その後、レーザーはガルバノミラー１６と瞳投影レンズ１７などを経由し、試料内の蛍光試薬を励起する。
【００２８】
その結果として試料から放射される蛍光は、光路を励起光と逆に進む。つまり、瞳投影レンズ１７とガルバノミラー１６を経由して、スリット２９を通過し、ＫＴＮ結晶２５へ入射される。このとき、蛍光もＫＴＮ結晶２５によって偏向されるが、蛍光は励起光よりも波長が長い（ストークスシフト）ことによって、励起光路とは異なる方向に進む。つまり、励起光と蛍光がＫＴＮ結晶２５によって分離される。
【００２９】
このとき本構成例では、もう一つのＫＴＮ結晶３２を配置して、ＫＴＮ結晶２５によって発生した分散をＫＴＮ結晶３２によって相殺させる。その後、結像レンズ２０によって共焦点ピンホール２１に集光させる。
【００３０】
その後、共焦点ピンホール２１を通過した蛍光をリレーレンズなど使って検出器２４へ導く。このとき、ダイクロイックミラー２２や不図示のフィルタなどをつかって蛍光を光線分離し、複数の検出器２４によって検出する構成は好ましい。
【実施例３】
【００３１】
図８は本発明の実施の一形態によるスキャンユニット５の内部構成の概略図である。本構成では、共焦点ピンホールより検出器寄りにＫＴＮ結晶を配置する。同図において、レーザーユニットからファイバーケーブルを通じて導入された多波長レーザー光は、ミラー１４などによってＫＴＮ結晶２５に入射される。そこで電圧印加により偏向角を制御し、後段の共焦点ピンホール２１を通過できる波長のレーザーを選択する。このとき共焦点ピンホール２１を通過できるように結像レンズ２０をその前後に配置する。その後、レーザーはガルバノミラー１６と瞳投影レンズ１７などを経由し、試料内の蛍光試薬を励起する。
【００３２】
その結果として試料から放射される蛍光は、光路を励起光と逆に進む。つまり、瞳投影レンズ１７とガルバノミラー１６を経由して、共焦点ピンホール２１と結像レンズ２０を通過し、ＫＴＮ結晶２５へ入射される。
【００３３】
この構成ではＫＴＮ結晶２５の偏光特性による光線の分離を避けるために、ＫＴＮ結晶２５の前段に偏光面を揃える工夫を施す。単純に偏光板を挿入することが考えられるが、ここでは偏光ビームスプリッターを使った構成を用いる。
【００３４】
図８に示される構成例では、共焦点ピンホール２１とＫＴＮ結晶２５の間に偏光ビームスプリッター３３を挿入して、有効方向偏光とそれに直行する偏光に分解する。その後、有効方向偏光に直行する偏光をλ/２位相板３４を通過させて偏光面を９０度回転させる。その後、合成光学部材３５によって元の光路へ戻す。この結果、光量の損失を抑えながら観察光の偏光面を揃えることができる。なお、図中のミラー３６は光線を適切に導くために配置されている。
【００３５】
このように偏光面を揃えた場合には、ＫＴＮ結晶２５の偏光特性の影響を受けることがなく、蛍光と励起光を分離することができる。本構成ではＫＴＮ結晶２５によって、さらに分光を行う。
【００３６】
すでに説明したように、ＫＴＮ結晶２５は分散を持っている光学素子である。つまり、検出器２４との間に２枚のリレーレンズ３１によって結像面を作った場合には、その面上では波長ごとに分光された像が生成されている。本構成ではこの結像面にスリット３７を配置して、所望の波長を選択することができるようにする。このときスリット３７は可変にすることが望ましい。
【００３７】
以下では、本発明による上記のレーザー走査型顕微鏡によって実現される走査方法について説明する。
図９は従来の走査方法（ａ）と本発明の実施による走査方法（ｂ）の比較をするためのフローチャートである。
【００３８】
従来の走査方法（ａ）では、はじめのピクセルに対して励起光を照射する（Ｓ１）。それと同時に蛍光の測定を行う（Ｓ２）。その後、ガルバノミラーなどの走査手段によってピクセルを移動する（Ｓ３）。この走査を観察領域のすべてのピクセルに対して繰り返す。その後、励起光の切り替えを行う（Ｓ４）。そして利用するすべての励起光に対して上記の作業を行うことによってフレームを生成する。また、ラスタースキャンの1ライン毎に励起光波長を切り替えながら多波長蛍光画像のフレームを生成することも行われていた。
【００３９】
一方、本発明の実施による走査方法（ｂ）では、はじめのピクセルに対して励起光を照射、同時に蛍光の測定を行う（Ｓ５，Ｓ６）ことは同じである。その後、ＫＴＮ結晶の印加電圧を変更して励起光の切り替えを行う（Ｓ７）。これを利用するすべての励起光に対して上記の作業を行う。その後、ガルバノミラーなどの走査手段によってピクセルを移動する（Ｓ８）。この走査を観察領域のすべてのピクセルに対して繰り返すことによってフレームを生成する。つまり、ＫＴＮ結晶は作動時間が非常に短い（数MHz）ので、ピクセル毎に励起光を切り換えながらの走査を可能にするのである。
【００４０】
以上のように、本発明によれば励起光波長を高速に切り換えることができるレーザー走査型顕微鏡が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】一般的な形のレーザー走査型顕微鏡の模式図である。
【図２】従来のレーザー走査型顕微鏡の内部構成を説明する概略図である。
【図３】ＫＴＮ結晶の働きについて説明する図である。
【図４】ＫＴＮ結晶にランダム偏光が入射した場合の作用を説明する図である。
【図５】ＫＴＮ結晶を使って波長選択を行うための基本構成の図である。
【図６】本発明の実施例１によるスキャンユニットの内部構成の概略図である。
【図７】本発明の実施例２によるスキャンユニットの内部構成の概略図である。
【図８】本発明の実施例３によるスキャンユニットの内部構成の概略図である。
【図９】従来の走査方法と本発明の実施による走査方法の比較をするためのフローチャートである。
【符号の説明】
【００４２】
１・・・顕微鏡本体
２・・・ステージ
３・・・試料
４・・・対物レンズ
５・・・スキャンユニット
６・・・レーザーユニット
７・・・ファイバーケーブル
８・・・コンピュータ端末
９・・・レーザー光源
１０・・・ダイクロイックミラー
１１・・・ミラー
１２・・・ＡＯＴＦ
１３・・・ファイバーカップリング機構
１４・・・ミラー
１５・・・ダイクロイックミラー
１６・・・ガルバノミラー
１７・・・瞳投影レンズ
１８・・・結像レンズ
１９・・・ミラー
２０・・・結像レンズ
２１・・・共焦点ピンホール
２２・・・ダイクロイックミラー
２３・・・ミラー
２４・・・検出器
２５・・・ＫＴＮ結晶
２６・・・電極
２７・・・電子
２８・・・電界傾斜
２９・・・スリット
３０・・・共焦点スリット
３１・・・リレーレンズ
３２・・・ＫＴＮ結晶
３３・・・偏光ビームスプリッター
３４・・・λ／２位相板
３５・・・合成光学部材
３６・・・ミラー
３７・・・スリット
【図１】
2008203301.tif 000003
【図２】
2008203301.tif 000004
【図３】
2008203301.tif 000005
【図４】
2008203301.tif 000006
【図６】
2008203301.tif 000007
【図７】
2008203301.tif 000008
【図９】
2008203301.tif 000009
【図５】
2008203301.tif 000010
【図８】
2008203301.tif 000011