(57)【要約】      （修正有）【課題】生物体（例えば、植物）をグリホセートに対し抵抗性にするための方法および試薬の提供。【解決手段】単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、以下：（ａ）ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギャップイグジステンスペナルティー、および１のギャップエクステンションペナルティーを使用して、少なくとも４３０の類似性スコアを生み出すために、特定の配列からなる群から選択される配列と、最適に並べられ得るアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；または（ｂ）これらの相補鎖ヌクレオチド配列、を含む、ポリヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書等に記載されるような、遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、２０００年１０月３０日に出願された米国仮特許出願番号第６０／
２４４，３８５に対する優先権およびその利益を主張し、その開示は、すべての
目的のために、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
（３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．７１（Ｅ）に準拠する著作権通知）
本特許文献の開示の一部は、著作権保護を受ける材料を含む。この著作権の所
有者は、米国特許商標庁の特許ファイルまたは特許記録に掲載される、本特許文
献および特許公開情報の何人による複製に対しても拒絶をしないが、その他の場
合は、いかなるすべての著作権も保護される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
特異的な除草剤に対する農作物の選択性は、適当な除草剤代謝酵素をコードす
る遺伝子を農作物中の移入することによって賦与され得る。ある場合において、
これらの酵素、およびそれをコードする核酸は、植物に源を発する。他の場合に
おいて、これらの酵素、およびそれをコードする核酸は、他の生物体（例えば、
微生物）に由来する。例えば、Ｐａｄｇｅｔｔｅら、（１９９６）「Ｎｅｗ  ｗ
ｅｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｐｐｏｔｕｎｉｔｉｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｏｆ  ｓｏｙｂｅａｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｒｏｕｎｄ  ＵＰ  ＲｅａｄｙＴＭ
ｇｅｎｅ」、Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｃｒｏｐｓ（Ｄｕｋ
ｅ編）、５４−８４ページ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ；およ
びＶａｓｉｌ（１９９６）「Ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔ
ａｎｔ  ｃｒｏｐｓ」、Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｃｒｏｐｓ
（Ｄｕｋｅ編）、８５−９１ページを参照のこと。実際、トランスジェニック植
物は、種々の生物体に由来する、種々の除草剤耐性／除草剤代謝遺伝子を発現す
るように操作されてきた。例えば、アセトヒドロキシ酸（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏ
ｘｙ  ａｃｉｄ）シンターゼ（この酵素は、この酵素を発現する植物を複数の型
の除草剤耐性にすることが見出されてきた）は、種々の植物に導入されてきた（
例えば、Ｈａｔｔｏｒｉら、（１９９５）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２４６
：４１９、を参照のこと）。除草剤耐性を賦与する他の遺伝子として：ラットシ
トクロムＰ４５０７Ａ１および酵母ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０オキシドレ
ダクターゼのキメラタンパク質をコードする遺伝子（Ｓｈｉｏｔａら（１９９４
）Ｐｌａｎｔ  ＰｈｙｓｉｏｌＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０６：１７）、
グルタチオンレダクターゼおよびスーパーオキシドジスムターゼについての遺伝
子（Ａｏｎｏら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３６：１
６８７）、ならびに種々のホスホトランスフェラーゼについての遺伝子（Ｄａｔ
ｔａら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：６１９）が挙げられ
る。
【０００４】
この点に関して多くの研究の対象であるひとつの除草剤は、Ｎ−ホスホノメチ
ルグリシン（Ｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）（一般には
グリホセートといわれる）である。グリホセートは、２００３年までに売り上げ
が５０億ドルに達すると見積もられる、世界で一番売れている除草剤である。グ
リホセートは、広葉樹および芝生型植物の両方を殺す、広範なスペクトルの除草
剤である。トランスジェニック植物において商業レベルのグリホセート抵抗性の
成功した様式は、改変されたアグロバクテリウムＣＰ４  ５−エノールピルボイ
ルシキミ酸（ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ）−３−リン酸シンタ
ーゼ（以下ＥＰＳＰシンターゼまたはＥＰＳＰＳという）遺伝子の導入による。
導入遺伝子は、グリホセートの存在下においてホスホエノールピルビン酸（ＰＥ
Ｐ）およびシキミ酸−３−リン酸からＥＰＳＰ合成を継続し得る、葉緑体に向け
られる。対照的に、ネイティブＥＰＳＰシンターゼは、グリホセートによって阻
害される。導入遺伝子なしに、グリホセートを噴霧された植物は、芳香族アミノ
酸、ホルモン、およびビタミンの生合成に必要とされる下流の経路を止める、Ｅ
ＰＳＰシンターゼの阻害のため速やかに死ぬ。ＣＰ４グリホセート抵抗性ダイズ
トランスジェニック植物は、例えばＭｏｎｓａｎｔｏによって「Ｒｏｕｎｄ  Ｕ
Ｐ  ＲｅａｄｙＴＭ」という名で販売されている。
【０００５】
環境中において、グリホセートが分解される優勢な機構は、土壌微生物叢代謝
を介する。土壌においてグリホセートの主要な代謝産物は、最終的にアンモニア
、リン酸および二酸化炭素に変換される、アミノメチルリン酸（ＡＭＰＡ）と同
定された。ＡＭＰＡ経路を介する土壌でのグリホセートの分解を記述する提案さ
れた代謝体系を、図８に示す。ある土壌細菌のグリホセートによる機能停止のた
めの代替的代謝経路であるサルコシン経路は、図９に図示されるように、無機リ
ン酸およびサルコシンを生じるＣ−Ｐ結合の初めの切断を経て起こる。
【０００６】
別の首尾よい除草剤／トランスジェニック作物パッケージは、グルホシネート
（ホスフィノスリシン）およびＬｉｂｅｒｔｙＬｉｎｋＴＭ形質であり、これは
、例えばＡｖｅｎｔｉｓによって市販されている。グルホシネートもまた、広範
なスペクトルの除草剤である。グルホシネートの標的は、葉緑体のグルタミン酸
シンターゼ酵素である。抵抗性植物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏ
ｓｃｏｐｉｃｕｓ由来のｂａｒ遺伝子を保持し、そしてグルホシネートを修正お
よび解毒するｂａｒのＮ−アセチル化活性によって抵抗性を獲得する。
【０００７】
ＡＭＰＡの第１級アミンをアセチル化できる酵素が、ＰＣＴ出願番号第ＷＯ０
０／２９５９６に報告されている。この酵素が、第２級アミンを有する化合物（
例えばグリホセート）をアセチル化し得るとは記載されなかった。
【０００８】
上記のような種々の除草剤耐性戦略が、利用され得るとはいえ、さらなる取り
組みは、かなりの商業的価値を有する。本発明は、例えば除草剤耐性を賦与する
ための新規のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびに本開示の検討の間
に明らかになるような他の多数の利点を提供する。
【０００９】
本願発明によって以下が提供される：
（１）  単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド
であって、以下：
（ａ）ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギャップイグジステンスペナルテ
ィー、および１のギャップエクステンションペナルティーを使用して、少なくと
も４３０の類似性スコアを生み出すために、配列番号３００、配列番号４４５、
および配列番号４５７からなる群から選択される配列と、最適に並べられ得るア
ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；または
（ｂ）これらの相補鎖ヌクレオチド配列、
を含む、ポリヌクレオチド。
（２）  前記ポリペプチドがグリホセートＮ−アセチルトランスフェ
ラーゼ活性を有する、項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換
えポリヌクレオチド。
（３）  前記ポリペプチドが、グリホセートに対して、少なくとも１
０ｍＭ−１  ｍｉｎ−１のｋｃａｔ／Ｋｍでグリホセートのアセチル化を触媒す
る、項目２に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチ
ド。
（４）  前記ポリペプチドがアミノメチルホスホン酸のアセチル化を
触媒する、項目２に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌク
レオチド。
（５）  グリフォトセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有
するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレ
オチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが配列番号３０
０、配列番号４４５および配列番号４５７からなる群から選択されるアミノ酸配
列の、少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、ポリヌ
クレオチド。
（６）  前記ポリペプチドが、配列番号３００、配列番号４４５およ
び配列番号４５７からなる群から選択されるアミノ酸配列の、少なくとも５０個
の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、項目５に記載の単離されたポ
リヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（７）  前記ポリペプチドが、配列番号３００、配列番号４４５およ
び配列番号４５７からなる群から選択されるアミノ酸配列の、少なくとも１００
個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、項目５に記載の単離された
ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（８）  前記ポリヌクレオチドが、配列番号３００、配列番号４４５
および配列番号４５７からなる群から選択されるアミノ酸配列の、約１４０個の
連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、項目５に記載の単離されたポリ
ヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（９）  前記ポリペプチドが、配列番号３００、配列番号４４５およ
び配列番号４５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目５に記
載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（１０）  配列番号４８、配列番号１９３および配列番号２０５から
なる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、項目５に記載の単離されたポ
リヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（１１）  親コドンが、該親コドンに対して植物中で優先的に使用さ
れる同族コドンによって置換された、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（１２）  Ｎ末端葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列
さらにを含む、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（１３）  前記のコードされたポリペプチドの１つ以上のアミノ酸が
変異された、項目１に記載のポリヌクレオチドの非ネイティブ改変体。
（１４）  項目１に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
（１５）  項目１に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結され
たプロモーターを含む、項目１４に記載の核酸構築物であって、該プロモータ
ーが、前記ポリヌクレオチドに対して異種であり、そして、前記核酸構築物を用
いて形質転換された植物細胞のグリホセート耐性を強めるのに十分な前記のコー
ドされたポリペプチドの発現を引き起こすために効果的である、核酸構築物。
（１６）  項目１に記載のポリヌクレオチド配列が選択可能なマー
カーとして機能する、項目１４に記載の核酸構築物。
（１７）  前記構築物がベクターである、項目１４に記載の核酸構
築物。
（１８）第２のポリペプチドが効果的なレベルで発現する細胞または
組織に検出可能な表現型特性を付与する、該第２ポリペプチドをコードする第２
ポリヌクレオチド配列を含む、項目１７に記載のベクター。  
（１９）  前記検出可能な表現型特性が、選択可能なマーカーとして
機能する、項目１８に記載のベクター。
（２０）  前記検出可能な表現型特性が、除草剤耐性、害虫耐性、ま
たは可視マーカーからなる、項目１９に記載のベクター。
（２１）  前記ベクターが、Ｔ−ＤＮＡ配列を含む、項目１７に記
載のベクター。
（２２）  前記ポリヌクレオチドが調節配列に作動可能に連結される
、項目１７に記載のベクター。
（２３）  前記ベクターが植物形質転換ベクターである、項目１７
に記載のベクター。
（２４）  単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチ
ドであって、以下：
（ａ）ストリンジェントな条件下で、配列番号３００、配列番号４４５および配
列番号４５７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列の実質的に全長にわたりハイブリダイズするヌクレオチド。
（ｂ）これらの相補鎖ヌクレオチド配列；または
（ｃ）グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする（ａ）または（ｂ）のフラグメント、
を含む、ポリヌクレオチド。
（２５）  グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードす
るヌクレオチド配列を含む、項目２４に記載のポリヌクレオチド。
（２６）  項目１に記載の２つ以上のポリヌクレオチドを含む組成
物。
（２７）  項目１に記載のポリヌクレオチドを少なくとも１０個含
む、項目２６に記載の組成物。
（２８）  前記ポリヌクレオチドが細胞に対して異種である、項目
１に記載のポリヌクレオチドを少なくとも１つ含む細胞。
（２９）  前記ポリヌクレオチドが調節配列へ操作可能に連結される
、項目２８に記載の細胞。
（３０）  項目１７に記載のベクターによって形質導入される細胞
。
（３１）  前記細胞がトランスジェニック植物細胞である、項目２
８または項目３０に記載の細胞。
（３２）  前記植物細胞がグリホセートＮ−アセチルトランスフェラ
ーゼ活性を有する外来ポリペプチド発現する、項目３１に記載のトランスジェ
ニック植物細胞。
（３３）  項目３２に記載の細胞を含む、トランスジェニック植物
またはトランスジェニック植物エクスプラント。
（３４）  前記植物または前記植物エクスプラントがグリホセートＮ
−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、項目３
３に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物エクスプラン
ト。
（３５）  前記トランスジェニック植物または前記植物エクスプラン
トが、以下の属：Ｅｌｅｕｓｉｎｅ、Ｌｏｌｌｉｕｍ、Ｂａｍｂｕｓａ、Ｂｒａ
ｓｓｉｃａ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｚｅ
ａ、Ｏｒｙｚａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ａｖｅｎａ、Ｈｏｒｄｅｕ
ｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｃｏｉｘ、ＧｌｙｃｉｎｅおよびＧｏｓｓｙｐｉｕｍ
の中から選択される作物である、項目３４に記載のトランスジェニック植物ま
たはトランスジェニック植物エクスプラント。
（３６）  前記トランスジェニック植物または前記植物エクスプラン
トがＡｒａｂｉｄｏｓｉｓである、項目３４に記載のトランスジェニック植物
またはトランスジェニック植物エクスプラント。
（３７）  前記トランスジェニック植物または前記トランスジェニッ
ク植物エクスプラントがＧｏｓｓｙｐｉｕｍである、項目３４に記載のトラン
スジェニック植物またはトランスジェニック植物エクスプラント。
（３８）  前記植物または前記植物エクスプラントが、その同属、同
株または同品種の野生型植物と比較した場合、グリホセートへの増強された耐性
を示す、項目３４に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック
植物エクスプラント。
（３９）  項目３４に記載の植物によって生成される種子。
（４０）  グリホセートに対して少なくとも１０ｍＭ−１  ｍｉｎ−
１のｋｃａｔ/Ｋｍを有するグリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコ
ードする異種遺伝子を含むトランスジェニック植物であって、前記植物が、除草
剤の適用に起因する有意な収率の減少なしに、異種遺伝子が欠如した同植物の生
育を阻害するために効果的なレベルにて適用されたグリホセートに耐性を示す、
トランスジェニック植物。
（４１）  グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼがアミノメ
チルホスホン酸のアセチル化を触媒する、項目４０に記載のトランスジェニッ
ク植物。
（４２）  ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、１１のギャップイグジステ
ンスペナルティー、および１のギャップエクステンションペナルティーを使用し
て、少なくとも４３０の類似性スコアを生成するよう、配列番号３００、配列番
号４４５、配列番号４５７からなる群から選択される配列と、最適に整列され得
るアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであっ
て、該ポリペプチドがグリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有す
る、ポリペプチド。
（４３）  前記ポリペプチドが、グリホセートに対して少なくとも１
０ｍＭ−１  ｍｉｎ−１のｋｃａｔ／Ｋｍでグリホセートのアセチル化を触媒す
る、項目４２に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（４４）  前記ポリペプチドが、グリホセートに対して少なくとも１
００ｍＭ−１  ｍｉｎ−１のｋｃａｔ／Ｋｍでグリホセートのアセチル化を触媒
する、項目４３に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（４５）  前記ポリペプチドがアミノメチルホスホン酸のアセチル化
を触媒する、項目４４に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプ
チド。
（４６）  グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有す
る単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、配列番号４４５
および配列番号４５７からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも２０
個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
（４７）  前記ポリペプチドが配列番号３００、配列番号４４５およ
び配列番号４５７からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも５０個の
連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、項目４６に記載の単離されたポ
リペプチドまたは組換えポリペプチド。
（４８）  前記ポリペプチドが、配列番号３００、配列番号４４５お
よび配列番号４５７からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１００
個の連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、項目４６に記載の単離され
たポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（４９）  前記ポリペプチドが、配列番号３００、配列番号４４５お
よび配列番号４５７からなる群から選択されるアミノ酸配列の約１４０個の連続
したアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、項目４６に記載の単離されたポリペ
プチドまたは組換えポリペプチド。
（５０）  前記ポリペプチドが、配列番号３００、配列番号４４５お
よび配列番号４５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目４６
に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（５１）  Ｎ末端葉緑体輸送ペプチドをさらに含む、項目４２に記
載のポリヌクレオチド配列。
（５２）  前記ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸が変異された、請
求項４２に記載のポリペプチドの非ネイティブ改変体。
（５３）  前記ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸が、親ポリペプチ
ドに対して改変された、項目４２に記載のポリペプチドの非ネイティブ改変体
。
（５４）  前記ポリペプチドが、多様な生成手順によって生成される
、項目５３に記載のポリペプチド。
（５５）  前記多様な生成手順が、グリホセートＮ−アセチルトラン
スフェラーゼポリペプチドをコードする、少なくとも１つの親ポリヌクレオチド
の変異または組換えを含む、項目５４に記載のポリペプチド。
（５６）  前記親ポリヌクレオチドが項目１に記載のポリヌクレオ
チドである、項目５５に記載のポリペプチド。
（５７）  分泌配列または局在化配列を含む、項目４２に記載のポ
リペプチド。
（５８）  葉緑体輸送配列を含む、項目５７に記載のポリペプチド
。（５９）  １つ以上の抗原に対して惹起されたポリクローナル抗血
清によって特異的に結合されるポリペプチドであって、該抗原が配列番号３００
、配列番号４４５および配列番号４５７からなる群から選択されるアミノ酸配列
を含む、ポリペプチド。
（６０）  ＧＡＴ活性を有するポリペプチドであって、以下：
（ａ）少なくとも約２ｍＭまたはそれより少ない、グリホセートに対するｋｍ；
（ｂ）少なくとも約２００μＭまたはそれより少ない、アセチルＣｏＡに対する
ｋｍ；および
（ｃ）少なくとも約６／分と等しいｋｃａｔ、
によって特徴付けられる、ポリペプチド。
（６１）  グリホセート耐性トランスジェニック植物またはグリホセ
ート耐性植物細胞を生成する方法であって、以下：
（ａ）グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオ
チドを植物または植物細胞に形質転換する工程：および
（ｂ）該形質転換された植物細胞からトランスジェニック植物を必要に応じて再
生する工程、
を包含する、方法。
（６２）  前記ポリヌクレオチドが、項目１に記載のポリヌクレオ
チドである、項目６１に記載の方法。
（６３）  前記ポリヌクレオチドが細菌源由来である、項目６１に
記載の方法。
（６４）  同属の野生型植物の生育を阻害し、形質転換された植物の
生育を阻害しないグリホセート濃度において、形質転換された植物または形質転
換された植物細胞を生育する工程を包含する、項目６１に記載の方法。
（６５）  漸増濃度のグリホセートにおいて、前記形質転換された植
物もしくは前記形質転換された植物細胞、または該植物の子孫もしくは該植物細
胞の子孫を生育する工程を包含する、項目６４に記載の方法。
（６６）  前記同属の野生型植物または野生型植物細胞に致死である
グリホセート濃度において、前記形質転換された植物または前記形質転換された
植物細胞を生育する工程を包含する、項目６４に記載の方法。
（６７）  項目１に記載のポリヌクレオチドで形質転換した植物を
増殖する工程を包含する、項目６２に記載の方法。
（６８）  第１の植物が、該第１の植物と第２の植物との交配によっ
て増殖され、その結果、交配の子孫の少なくともいくつかがグリホセート耐性を
示す、項目６７に記載の方法。
（６９）  項目１に記載のポリヌクレオチドの改変体を生成する方
法であって、第２のポリヌクレオチドを用いて項目１に記載のポリヌクレオチ
ドを再帰的に組換え、それによって改変体ポリヌクレオチドのライブラリーを形
成する工程を含む、方法。
（７０）  グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を基礎
とする前記ライブラリーから改変体ポリヌクレオチドを選択する工程を包含する
、項目６９に記載の方法。
（７１）  前記再帰的な組換えがインビトロで実施される、項目７
０に記載の方法。
（７２）  前記再帰的な組換えがインビボで実施される、項目７０
に記載の方法。
（７３）  前記再帰的な組換えがでインシリコで実施される、項目
７０に記載の方法。
（７４）  前記再帰的な組換えがファミリーシャッフリングを包含す
る、項目７０に記載の方法。
（７５）  前記再帰的な組換えが合成シャッフリング法を包含する、
項目７０に記載の方法。
（７６）  ヌクレオチド配列中の少なくとも１つの親コドンを、該親
コドンに対して植物において優先的に使用される同族コドンに置換する工程を包
含する、項目７０に記載の方法。
（７７）  項目７０に記載される方法によって生成される、改変体
ポリヌクレオチドのライブラリー。
（７８）  項目７７に記載のライブラリーを含む、細胞集団。
（７９）  項目７０に記載の方法によって生成される、組換えポリ
ヌクレオチドであって、該組換えポリヌクレオチドがグリホセートＮ−アセチル
トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、ポリペプチド。
（８０）  項目７９に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
（８１）  前記細胞が植物細胞である、項目８０に記載の細胞。
（８２）  前記細胞がトランスジェニック植物細胞である、項目８
１に記載の細胞。
（８３）  項目８２に記載の植物によって生成される、種子。
（８４）  項目７９に記載のポリヌクレオチドによってコードされ
る、ポリペプチド。
（８５）  前記ポリヌクレオチドを変異する工程を包含する、項目
１に記載のポリヌクレオチドの改変体を生成する、方法。
（８６）  項目８５に記載の方法によって生成される、ポリヌクレ
オチド。
（８７）  核酸構築物を含む植物または細胞を、選択する方法であっ
て、以下：
（ａ）核酸構築物を含むトランスジェニック植物またはトランスジェニック細胞
を提供する工程であって、該核酸構築物がグリホセートＮ−アセチルトラスフェ
ラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、工程；
（ｂ）該グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼが効果的なレベルで発現
される条件下、グリホセートの存在下で前記植物または前記細胞を生育する工程
であって、それによって、該トランスジェニック植物または該トランスジェニッ
ク細胞が、該植物または該細胞が前記核酸構築物を含有していない場合に生育す
る速度よりも、明らかに速い速度にて生育する、工程、
を包含する、方法。
（８８）  前記核酸構築物が、第２のヌクレオチド配列に作動可能に
連結されるポリペプチドおよび調節配列をコードする、該第２のヌクレオチド配
列を含む、項目８７に記載の方法。
（８９）  農作物を有する領域において雑草を選択的に制御する方法
で、以下：
（ａ）グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子で形質
転換された結果として、グリホセート耐性である農作物の種子または作物を該領
域に植える工程；および
（ｂ）該農作物に有意な影響を与えることなしに、該領域中の該農作物および該
雑草に、該雑草を制御するために十分量のグリホセートを適用する工程、
を包含する、方法。
（９０）  グリホセートに対して耐性である、遺伝的に形質転換され
た植物を生成する方法で、以下：
（ａ）組換え、２本鎖ＤＮＡ分子を、植物細胞のゲノムへ挿入する工程であって
、該ＤＮＡ分子が以下：
（ｉ）ＲＮＡ配列の生成するよう、植物細胞中で機能するプロモーター
（ｉｉ）項目４２に記載のポリペプチドをコードするＲＮＡ配列を生成する
、構造ＤＮＡ配列
（ｉｉｉ）ＲＮＡ配列の３’末端にポリアデニルヌクレオチドストレッチを付
加するよう、植物細胞において機能する３’非翻訳領域を含み、前記プロモータ
ーが前記構造ＤＮＡ配列各々に対して異種であり、そして、該ＤＮＡ分子で形質
転換された植物細胞の該グリホセート耐性を強めるよう、該コードされたポリペ
プチドの十分な発現を引き起こすように適応されている工程、
（ｂ）形質転換された植物細胞を獲得する工程；および
（ｃ）該形質転換された植物細胞から、増加したグリホセート耐性を有する遺伝
的に形質転換された植物を再生する工程、
を包含する、方法。
（９１）  農作物を生成する方法であって、以下：
（ａ）農作物植物が農作物を生成する条件下で、グリホセートＮ−アセチルトラ
ンスフェラーゼをコードする遺伝子が形質転換された結果としてグリホセート耐
性である該農作物植物を生育する工程；および
（ｂ）該農作物植物から農作物を回収する工程
を包含する、方法。
（９２）  雑草を制御するために効果的な濃度で、前記作物にグリホ
セートを適用する工程を包含する、項目９１に記載の方法。
（９３）  前記農作物が綿、トウモロコシまたは大豆である、項目
９２に記載の方法。
（９４）  項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換
えポリヌクレオチドであって、以下の位置に対応するアミノ酸配列中のアミノ酸
残基が、少なくとも９０％、以下の制限に合致し：
（ａ）２、４、１５、１９、２６、２８、３１、４５、５１、５４、８６、９０
、９１、９７、１０３、１０５、１０６、１１４、１２３、１２９、１３９およ
び／または１４５位のアミノ酸残基がＢ１である；および
（ｂ）３、５、８、１０、１１、１４、１７、１８、２４、２７、３２、３７、
３８、４７、４８、４９、５２、５７、５８、６１、６２、６３、６８、６９、
７９、８０、８２、８３、８９、９２、１００、１０１、１０４、１１９、１２
０、１２４、１２５、１２６、１２８、１３１、１４３および／または１４４位
のアミノ酸残基がＢ２である；
ここで、Ｂ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択される
アミノ酸であり、そして、Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、
ＳおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸である、
ポリヌクレオチド。
（９５）  項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換
えポリヌクレオチドであって、以下の位置に対応する前記アミノ酸配列中のアミ
ノ酸残基が、少なくとも８０％、以下の制限に合致し：
（ａ）２、４、１５、１９、２６、２８、５１、５４、８６、９０、９１、９７
、１０３、１０５、１０６、１１４、１２９、１３９および／または１４５位の
アミノ酸残基がＺ１である；
（ｂ）３１および／または４５位のアミノ酸残基がＺ２である；
（ｃ）８および／または８９位のアミノ酸残基がＺ３である；
（ｄ）８２、９２、１０１および／または１２０位のアミノ酸残基がＺ４である
；
（ｅ）３、１１、２７および／または７９位のアミノ酸残基がＺ５である；
（ｆ）１２３位のアミノ酸残基がＺ１またはＺ２である；
（ｇ）１２、３３、３５、３９、５３、５９、１１２、１３２、１３５、１４０
および／または１４６位のアミノ酸残基がＺ１またはＺ３である；
（ｈ）３０位のアミノ酸残基がＺ１またはＺ４である；
（ｉ）６位のアミノ酸残基がＺ１またはＺ６である；
（ｊ）８１および／または１１３位のアミノ酸残基がＺ２またはＺ３である；
（ｋ）１３８および／または１４２位のアミノ酸残基がＺ２またはＺ４である；
（ｌ）５、１７、２４、５７、６１、１２４および／または１２６位のアミノ酸
残基がＺ３またはＺ４である；
（ｍ）１０４位のアミノ酸残基がＺ３またはＺ５である；
（ｏ）３８、５２、６２および／または６９位のアミノ酸残基がＺ３またはＺ６
である；
（ｐ）１４、１１９および／または１４４位のアミノ酸残基がＺ４またはＺ５で
ある；
（ｑ）１８位のアミノ酸残基がＺ４またはＺ６である；
（ｒ）１０、３２、４８、６３、８０および／または８３位のアミノ酸残基がＺ
５またはＺ６である；
（ｓ）４０位のアミノ酸残基がＺ１、Ｚ２またはＺ３である；
（ｔ）６５および／または９６位のアミノ酸残基がＺ１、Ｚ３またはＺ５である
；
（ｕ）８４および／または１１５位のアミノ酸残基がＺ１、Ｚ３またはＺ４であ
る；
（ｖ）９３位のアミノ酸残基がＺ２、Ｚ３またはＺ４である；
（ｗ）１３０位のアミノ酸残基がＺ２、Ｚ４またはＺ６である；
（ｘ）４７および／または５８位のアミノ酸残基がＺ３、Ｚ４およびＺ６である
；
（ｙ）４９、６８、１００および／または１４３位のアミノ酸残基がＺ３、Ｚ４
およびＺ５である；
（ｚ）１３１位のアミノ酸残基がＺ３、Ｚ５またはＺ６である；
（ａａ）１２５および／または１２８位のアミノ酸残基がＺ４、Ｚ５またはＺ６
である；
（ａｂ）６７位のアミノ酸残基がＺ１、Ｚ３、Ｚ４またはＺ５である；
（ａｃ）６０位のアミノ酸残基がＺ１、Ｚ４、Ｚ５またはＺ６である；ならびに
（ａｄ）３７位のアミノ酸残基がＺ３、Ｚ４、Ｚ５またはＺ６である；
ここで、Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸配列
であり；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ３
はＮ、Ｑ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ４はＲ、
ＨおよびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ５はＤおよびＥからな
る群から選択されるアミノ酸であり；そしてＺ６はＣ、ＧおよびＰからなる群か
ら選択されるアミノ酸である、
ポリヌクレオチド。
（９６）  項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換
えポリヌクレオチドであって、以下の位置に対応する前記アミノ酸配列中のアミ
ノ酸残基が、少なくとも９０％、以下の制限に合致し：
（ａ）１、７、９、１３、２０、３６、４２、４６、５０、５６、６４、７０、
７２、７５、７６、７８、９４、９８、１０７、１１０、１１７、１１８、１２
１および／または１４１位の前記アミノ酸残基がＢ１であり；ならびに
（ｂ）１６、２１、２２、２３、２５、２９、３４、４１、４３、４４、５５、
６６、７１、７３、７４、７７、８５、８７、８８、９５、９９、１０２、１０
８、１０９、１１１、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６および
／または１３７位のアミノ酸残基がＢ２であり；
ここで、Ｂ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択される
アミノ酸であり、そして、Ｂ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、Ｓ
およびＴからなる群から選択されるアミノ酸である、
ポリヌクレオチド。
（９７）  項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換
えポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸配列中の以下の位置に対応するアミ
ノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の限定に従う、ポリヌクレオチド：
（ａ）１位、７位、９位、２０位、３６位、４２位、５０位、６４位、７２位、
７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、１１０位、１２１位および／または
１４１位のアミノ酸残基が、Ｚ１である；
（ｂ）１３位、４６位、５６位、７０位、１０７位、１１７位および／または１
１８位のアミノ酸残基が、Ｚ２である；
（ｃ）２３位、５５位、７１位、７７位、８８位および／または１０９位のアミ
ノ酸残基が、Ｚ３である；
（ｄ）１６位、２１位、４１位、７３位、８５位、９９位および／または１１１
位のアミノ酸残基が、Ｚ４である；
（ｅ）３４位および／または９５位のアミノ酸残基が、Ｚ５である；
（ｆ）２２位、２５位、２９位、４３位、４４位、６６位、７４位、８７位、１
０２位、１０８位、１１６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３
６位および／または１３７位のアミノ酸残基が、Ｚ６である；
ここで、Ｚ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＶからなる群から選択される、アミ
ノ酸であり；Ｚ２は、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群から選択される、アミノ酸で
あり；Ｚ３は、Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴからなる群から選択される、アミノ酸であ
り；Ｚ４は、Ｒ、Ｈ、およびＫからなる群から選択される、アミノ酸であり；Ｚ
５は、ＤおよびＥからなる群から選択される、アミノ酸であり；そして、Ｚ６は
、Ｃ、Ｇ、およびＰからなる群から選択される、アミノ酸である。
（９８）  項目９４に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組
換えポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸配列中の以下の位置に対応するア
ミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の限定に従う、ポリヌクレオチド
：
（ａ）１位、７位、９位、１３位、２０位、３６位、４２位、４６位、５０位、
５６位、６４位、７０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、
１０７位、１１０位、１１７位、１１８位、１２１位および／または１４１位の
アミノ酸残基が、Ｂ１である；および
（ｂ）１６位、２１位、２２位、２３位、２５位、２９位、３４位、４１位、４３
位、４４位、５５位、６６位、７１位、７３位、７４位、７７位、８５位、８７
位、８８位、９５位、９９位、１０２位、１０８位、１０９位、１１１位、１１
６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位，１３６位および／または１３
７位のアミノ酸残基が、Ｂ２である；
ここで、Ｂ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択さ
れる、アミノ酸であり；そして、Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ
、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群から選択される、アミノ酸である。
（９９）  項目９４に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組
換えポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸配列中の以下の位置に対応するア
ミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の限定に従う、ポリヌクレオチド
：
（ａ）１位、７位、９位、１３位、２０位、３６位、４２位、４６位、５０位、
５６位、６４位、７０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、
１０７位、１１０位、１１７位、１１８位、１２１位および／または１４１位の
アミノ酸残基が、Ｂ１である；および
（ｂ）１６位、２１位、２２位、２３位、２５位、２９位、３４位、４１位、４３
位、４４位、５５位、６６位、７１位、７３位、７４位、７７位、８５位、８７
位、８８位、９５位、９９位、１０２位、１０８位、１０９位、１１１位、１１
６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位，１３６位および／または１３
７位のアミノ酸残基が、Ｂ２である；
ここで、Ｂ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択さ
れる、アミノ酸であり；そして、Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ
、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群から選択される、アミノ酸である。
（１００）  項目９４に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは
組換えポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸配列中の以下の位置に対応する
アミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の限定に従う、ポリヌクレオチ
ド：
（ａ）１位、７位、９位、１３位、２０位、３６位、４２位、４６位、５０位、
５６位、６４位、７０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、
１０７位、１１０位、１１７位、１１８位、１２１位および／または１４１位の
アミノ酸残基が、Ｂ１である；および
（ｂ）１６位、２１位、２２位、２３位、２５位、２９位、３４位、４１位、４３
位、４４位、５５位、６６位、７１位、７３位、７４位、７７位、８５位、８７
位、８８位、９５位、９９位、１０２位、１０８位、１０９位、１１１位、１１
６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３６位および／または１３
７位のアミノ酸残基が、Ｂ２である；
ここで、Ｂ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択さ
れる、アミノ酸であり；そして、Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ
、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群から選択される、アミノ酸である。
（１０１）  項目９５に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは
組換えポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸配列中の以下の位置に対応する
アミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の限定に従う、ポリヌクレオチ
ド：
（ａ）１位、７位、９位、１３位、２０位、３６位、４２位、４６位、５０位、
５６位、６４位、７０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、
１０７位、１１０位、１１７位、１１８位、１２１位および／または１４１位の
アミノ酸残基が、Ｂ１である；および
（ｂ）１６位、２１位、２２位、２３位、２５位、２９位、３４位、４１位、４３
位、４４位、５５位、６６位、７１位、７３位、７４位、７７位、８５位、８７
位、８８位、９５位、９９位、１０２位、１０８位、１０９位、１１１位、１１
６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位，１３６位および／または１３
７位のアミノ酸残基が、Ｂ２である；
ここで、Ｂ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択さ
れる、アミノ酸であり；そして、Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ
、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群から選択される、アミノ酸である。
（１０２）  項目に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換
えポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸配列中の以下の位置に対応するアミ
ノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、以下の限定に従う、ポリヌクレオチド：
（ａ）２位のアミノ酸残基が、ＩまたはＬである；
（ｂ）３位のアミノ酸残基が、ＥまたはＤである；
（ｃ）４位のアミノ酸残基が、Ｖ、ＡまたはＩである；
（ｄ）５位のアミノ酸残基が、Ｋ、ＲまたはＮである；
（ｅ）６位のアミノ酸残基が、ＰまたはＬである；
（ｆ）８位のアミノ酸残基が、Ｎ、ＳまたはＴである；
（ｇ）１０位のアミノ酸残基が、ＥまたはＧである；
（ｈ）１１位のアミノ酸残基が、ＤまたはＥである；
（ｉ）１２位のアミノ酸残基が、ＴまたはＡである；
（ｊ）１４位のアミノ酸残基が、ＥまたはＫである；
（ｋ）１５位のアミノ酸残基が、ＩまたはＬである；
（ｌ）１７位のアミノ酸残基が、ＨまたはＱである；
（ｍ）１８位のアミノ酸残基が、Ｒ、ＣまたはＫである；
（ｎ）１９位のアミノ酸残基が、ＩまたはＶである；
（ｏ）２４位のアミノ酸残基が、ＱまたはＲである；
（ｐ）２６位のアミノ酸残基が、ＬまたはＩである；
（ｑ）２７位のアミノ酸残基が、ＥまたはＤである；
（ｒ）２８位のアミノ酸残基が、ＡまたはＶである；
（ｓ）３０位のアミノ酸残基が、Ｋ、ＭまたはＲである；
（ｔ）３１位のアミノ酸残基が、ＹまたはＦである；
（ｕ）３２位のアミノ酸残基が、ＥまたはＧである；
（ｖ）３３位のアミノ酸残基が、Ｔ、ＡまたはＳである；
（ｗ）３５位のアミノ酸残基が、Ｌ、ＳまたはＭである；
（ｘ）３７位のアミノ酸残基が、Ｒ、Ｇ、ＥまたはＱである；
（ｙ）３８位のアミノ酸残基が、ＧまたはＳである；
（ｚ）３９位のアミノ酸残基が、Ｔ、ＡまたはＳである；
（ａａ）４０位のアミノ酸残基が、Ｆ、ＬまたはＳである；
（ａｂ）４５位のアミノ酸残基が、ＹまたはＦである；
（ａｃ）４７位のアミノ酸残基が、Ｒ、ＱまたはＧである；
（ａｄ）４８位のアミノ酸残基が、ＧまたはＤである；
（ａｅ）４９位のアミノ酸残基が、Ｋ、Ｒ、ＥまたはＱである；
（ａｆ）５１位のアミノ酸残基が、ＩまたはＶである；
（ａｇ）５２位のアミノ酸残基が、Ｓ、ＣまたはＧである；
（ａｈ）５３位のアミノ酸残基が、ＩまたはＴである；
（ａｉ）５４位のアミノ酸残基が、ＡまたはＶである；
（ａｊ）５７位のアミノ酸残基が、ＨまたはＮである；
（ａｋ）５８位のアミノ酸残基が、Ｑ、Ｋ、ＮまたはＰである；
（ａｌ）５９位のアミノ酸残基が、ＡまたはＳである；
（ａｍ）６０位のアミノ酸残基が、Ｅ、Ｋ、Ｇ、ＶまたはＤである；
（ａｎ）６１位のアミノ酸残基が、ＨまたはＱである；
（ａｏ）６２位のアミノ酸残基が、Ｐ、ＳまたはＴである；
（ａｐ）６３位のアミノ酸残基が、Ｅ、ＧまたはＤである；
（ａｑ）６５位のアミノ酸残基が、Ｅ、Ｄ、ＶまたはＱである；
（ａｒ）６７位のアミノ酸残基が、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｌ、ＨまたはＫである；
（ａｓ）６８位のアミノ酸残基が、Ｋ、Ｒ、ＥまたはＮである；
（ａｔ）６９位のアミノ酸残基が、ＱまたはＰである；
（ａｕ）７９位のアミノ酸残基が、ＥまたはＤである；
（ａｖ）８０位のアミノ酸残基が、ＧまたはＥである；
（ａｗ）８１位のアミノ酸残基が、Ｙ、ＮまたはＦである；
（ａｘ）８２位のアミノ酸残基が、ＲまたはＨである；
（ａｙ）８３位のアミノ酸残基が、Ｅ、ＧまたはＤである；
（ａｚ）８４位のアミノ酸残基が、Ｑ、ＲまたはＬである；
（ｂａ）８６位のアミノ酸残基が、ＡまたはＶである；
（ｂｂ）８９位のアミノ酸残基が、ＴまたはＳである；
（ｂｃ）９０位のアミノ酸残基が、ＬまたはＩである；
（ｂｄ）９１位のアミノ酸残基が、ＩまたはＶである；
（ｂｅ）９２位のアミノ酸残基が、ＲまたはＫである；
（ｂｆ）９３位のアミノ酸残基が、Ｈ、ＹまたはＱである；
（ｂｇ）９６位のアミノ酸残基が、Ｅ、ＡまたはＱである；
（ｂｈ）９７位のアミノ酸残基が、ＬまたはＩである；
（ｂｉ）１００位のアミノ酸残基が、Ｋ、Ｒ、ＮまたはＥである；
（ｂｊ）１０１位のアミノ酸残基が、ＫまたはＲである；
（ｂｋ）１０３位のアミノ酸残基が、ＡまたはＶである；
（ｂｌ）１０４位のアミノ酸残基が、ＤまたはＮである；
（ｂｍ）１０５位のアミノ酸残基が、ＬまたはＭである；
（ｂｎ）１０６位のアミノ酸残基が、ＬまたはＩである；
（ｂｏ）１１２位のアミノ酸残基が、ＴまたはＩである；
（ｂｐ）１１３位のアミノ酸残基が、Ｓ、ＴまたはＦである；
（ｂｑ）１１４位のアミノ酸残基が、ＡまたはＶである；
（ｂｒ）１１５位のアミノ酸残基が、Ｓ、ＲまたはＡである；
（ｂｓ）１１９位のアミノ酸残基が、Ｋ、ＥまたはＲである；
（ｂｔ）１２０位のアミノ酸残基が、ＫまたはＲである；
（ｂｕ）１２３位のアミノ酸残基が、ＦまたはＬである；
（ｂｖ）１２４位のアミノ酸残基が、ＳまたはＲである；
（ｂｗ）１２５位のアミノ酸残基が、Ｅ、Ｋ、ＧまたはＤである；
（ｂｘ）１２６位のアミノ酸残基が、ＱまたはＨである；
（ｂｙ）１２８位のアミノ酸残基が、Ｅ、ＧまたはＫである；
（ｂｚ）１２９位のアミノ酸残基が、Ｖ、ＩまたはＡである；
（ｃａ）１３０位のアミノ酸残基が、Ｙ、Ｈ、ＦまたはＣである；
（ｃｂ）１３１位のアミノ酸残基が、Ｄ、Ｇ、ＮまたはＥである；
（ｃｃ）１３２位のアミノ酸残基が、Ｉ、Ｔ、Ａ、Ｍ、ＶまたはＬである；
（ｃｄ）１３５位のアミノ酸残基が、Ｖ、Ｔ、ＡまたはＩである；
（ｃｅ）１３８位のアミノ酸残基が、ＨまたはＹである；
（ｃｆ）１３９位のアミノ酸残基が、ＩまたはＶである；
（ｃｇ）１４０位のアミノ酸残基が、ＬまたはＳである；
（ｃｈ）１４２位のアミノ酸残基が、ＹまたはＨである；
（ｃｉ）１４３位のアミノ酸残基が、Ｋ、ＴまたはＥである；
（ｃｊ）１４４位のアミノ酸残基が、Ｋ、ＥまたはＲである；
（ｃｋ）１４５位のアミノ酸残基が、ＬまたはＩである；および
（ｃｌ）１４６位のアミノ酸残基が、ＴまたはＡである。
（１０３）  項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組
換えポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸配列中の以下の位置に対応するア
ミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、以下の限定に従う、ポリヌクレオチド
：
（ａ）９位、７６位、９４位および１１０位のアミノ酸残基が、Ａである；
（ｂ）２９位および１０８位のアミノ酸残基が、Ｃである；
（ｃ）３４位のアミノ酸残基が、Ｄである；
（ｄ）９５位のアミノ酸残基が、Ｅである；
（ｅ）５６位のアミノ酸残基が、Ｆである；
（ｆ）４３位、４４位、６６位、７４位、８７位、１０２位、１１６位、１２２
位、１２７位および１３６位のアミノ酸残基が、Ｇである；
（ｇ）４１位のアミノ酸残基が、Ｈである；
（ｈ）７位のアミノ酸残基が、Ｉである；
（ｉ）８５位のアミノ酸残基が、Ｋである；
（ｊ）２０位、３６位、４２位、５０位、７２位、７８位、９８位および１２１
位のアミノ酸残基が、Ｌである；
（ｋ）１位、７５位および１４１位のアミノ酸残基が、Ｍである；
（ｌ）２３位、６４位および１０９位のアミノ酸残基が、Ｎである；
（ｍ）２２位、２５位、１３３位、１３４位および１３７位のアミノ酸残基が、
Ｐである；
（ｎ）７１位のアミノ酸残基が、Ｑである；
（ｏ）１６位、２１位、７３位、９９位および１１１位のアミノ酸残基が、Ｒで
ある；
（ｐ）５５位および８８位のアミノ酸残基が、Ｓである；
（ｑ）７７位のアミノ酸残基が、Ｔである；
（ｒ）１０７位のアミノ酸残基が、Ｗである；および
（ｓ）１３位、４６位、７０位、１１７位および１１８位のアミノ酸残基が、Ｙ
である。
（１０４）  項目１０２に記載の単離されたポリヌクレオチドまた
は組換えポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸配列中の以下の位置に対応す
るアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の限定に従う、ポリヌクレオ
チド：
（ａ）１位、７位、９位、１３位、２０位、３６位、４２位、４６位、５０位、
５６位、６４位、７０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、
１０７位、１１０位、１１７位、１１８位、１２１位および／または１４１位の
アミノ酸残基が、Ｂ１である；および
（ｂ）１６位、２１位、２２位、２３位、２５位、２９位、３４位、４１位、４３
位、４４位、５５位、６６位、７１位、７３位、７４位、７７位、８５位、８７
位、８８位、９５位、９９位、１０２位、１０８位、１０９位、１１１位、１１
６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３６位および／または１３
７位のアミノ酸残基が、Ｂ２である；
ここで、Ｂ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択さ
れる、アミノ酸であり；そして、Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ
、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群から選択される、アミノ酸である。
（１０５）  項目１０３に記載の単離されたポリヌクレオチドまた
は組換えポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸配列中の以下の位置に対応す
るアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の限定に従う、ポリヌクレオ
チド：
（ａ）２位、４位、１５位、１９位、２６位、２８位、３１位、４５位、５１位
、５４位、８６位、９０位、９１位、９７位、１０３位、１０５位、１０６位、
１１４位、１２３位、１２９位、１３９位および／または１４５位のアミノ酸残
基が、Ｂ１である；
（ｂ）３位、５位、８位、１０位、１１位、１４位、１７位、１８位、２４位、
２７位、３２位、３７位、３８位、４７位、４８位、４９位、５２位、５７位、
５８位、６１位、６２位、６３位、６８位、６９位、７９位、８０位、８２位、
８３位、８９位、９２位、１００位、１０１位、１０４位、１１９位、１２０位
、１２４位、１２５位、１２６位、１２８位、１３１位、１４３位および／また
は１４４位のアミノ酸残基が、Ｂ２である；
ここで、Ｂ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択さ
れる、アミノ酸であり；そして、Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ
、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群から選択される、アミノ酸である。
（１０６）  項目１０２に記載の単離されたポリヌクレオチドまた
は組換えポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸配列中の以下の位置に対応す
るアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の限定に従う、ポリヌクレオ
チド：
（ａ）１位、７位、９位、２０位、３６位、４２位、５０位、６４位、７２位、
７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、１１０位、１２１位および／または
１４１位のアミノ酸残基が、Ｚ１である；
（ｂ）１３位、４６位、５６位、７０位、１０７位、１１７位および／または１
１８位のアミノ酸残基が、Ｚ２である；
（ｃ）２３位、５５位、７１位、７７位、８８位および／または１０９位のアミ
ノ酸残基が、Ｚ３である；
（ｄ）１６位、２１位、４１位、７３位、８５位、９９位および／または１１１
位のアミノ酸残基が、Ｚ４である；
（ｅ）３４位および／または９５位のアミノ酸残基が、Ｚ５である；
（ｆ）２２位、２５位、２９位、４３位、４４位、６６位、７４位、８７位、１
０２位、１０８位、１１６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３
６位および／または１３７位のアミノ酸残基が、Ｚ６である；
ここで、Ｚ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＶからなる群から選択される、アミ
ノ酸であり；Ｚ２は、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群から選択される、アミノ酸で
あり；Ｚ３は、Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴからなる群から選択される、アミノ酸であ
り；Ｚ４は、Ｒ、Ｈ、およびＫからなる群から選択される、アミノ酸であり；Ｚ
５は、ＤおよびＥからなる群から選択される、アミノ酸であり；そして、Ｚ６は
、Ｃ、Ｇ、およびＰからなる群から選択される、アミノ酸である。
（１０７）  項目１０３に記載の単離されたポリヌクレオチドまた
は組換えポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸配列中の以下の位置に対応す
るアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、以下の限定に従う、ポリヌクレオ
チド：
（ａ）２位、４位、１５位、１９位、２６位、２８位、５１位，５４位、８６位
、９０位、９１位，９７位，１０３位，１０５位，１０６位，１１４位、１２９
位、１３９位および／または１４５位のアミノ酸残基が、Ｚ１である；
（ｂ）３１位および／または４５位のアミノ酸残基が、Ｚ２である；
（ｃ）８位および／または８９位のアミノ酸残基が、Ｚ３である；
（ｄ）８２位、９２位、１０１位および／または１２０位のアミノ酸残基が、Ｚ
４である；
（ｅ）３位、１１位、２７位および／または７９位のアミノ酸残基が、Ｚ５であ
る；
（ｆ）１２３位のアミノ酸残基が、Ｚ１またはＺ２である；
（ｇ）１２位、３３位、３５位、３９位、５３位、５９位、１１２位、１３２位
、１３５位、１４０位および／または１４６位のアミノ酸残基が、Ｚ１またはＺ
３である；
（ｈ）３０位のアミノ酸残基が、Ｚ１またはＺ４である；
（ｉ）６位のアミノ酸残基が、Ｚ１またはＺ６である；
（ｊ）８１位および／または１１３位のアミノ酸残基が、Ｚ２またはＺ３である
；
（ｋ）１３８位および／または１４２位のアミノ酸残基が、Ｚ２またはＺ４であ
る；
（ｌ）５位、１７位、２４位、５７位、６１位、１２４位および／または１２６
位のアミノ酸残基が、Ｚ３またはＺ４である；
（ｍ）１０４位のアミノ酸残基が、Ｚ３またはＺ５である；
（ｏ）３８位、５２位、６２位および／または６９位のアミノ酸残基が、Ｚ３ま
たはＺ６である；
（ｐ）１４位、１１９位および／または１４４位のアミノ酸残基が、Ｚ４または
Ｚ５である；
（ｑ）１８位のアミノ酸残基が、Ｚ４またはＺ６である；
（ｒ）１０位、３２位、４８位、６３位、８０位および／または８３位のアミノ
酸残基が、Ｚ５またはＺ６である；
（ｓ）４０位のアミノ酸残基が、Ｚ１、Ｚ２またはＺ３である；
（ｔ）６５位および／または９６位のアミノ酸残基が、Ｚ１、Ｚ３またはＺ５で
ある；
（ｕ）８４位および／または１１５位のアミノ酸残基が、Ｚ１、Ｚ３またはＺ４
である；
（ｖ）９３位のアミノ酸残基がＺ２、Ｚ３またはＺ４である；
（ｗ）１３０位のアミノ酸残基がＺ２、Ｚ４またはＺ６である；
（ｘ）４７位および／または５８位のアミノ酸残基が、Ｚ３、Ｚ４またはＺ６で
ある；
（ｙ）４９位、６８位、１００位および／または１４３位のアミノ酸残基が、Ｚ
３、Ｚ４またはＺ５である；
（ｚ）１３１位のアミノ酸残基が、Ｚ３、Ｚ５またはＺ６である；
（ａａ）１２５位および／または１２８位のアミノ酸残基が、Ｚ４、Ｚ５または
Ｚ６である；
（ａｂ）６７位のアミノ酸残基が、Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４またはＺ５である；
（ａｃ）６０位のアミノ酸残基が、Ｚ１、Ｚ４、Ｚ５またはＺ６である；および
（ａｄ）３７位のアミノ酸残基が、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５またはＺ６である；
ここで、Ｚ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＶからなる群から選択される、アミ
ノ酸であり；Ｚ２は、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群から選択される、アミノ酸で
あり；Ｚ３は、Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴからなる群から選択される、アミノ酸であ
り；Ｚ４は、Ｒ、Ｈ、およびＫからなる群から選択される、アミノ酸であり；Ｚ
５は、ＤおよびＥからなる群から選択される、アミノ酸であり；そして、Ｚ６は
、Ｃ、Ｇ、およびＰからなる群から選択される、アミノ酸である。
（１０８）  項目１０２に記載の単離されたポリヌクレオチドまた
は組換えポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸配列中の以下の位置に対応す
るアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、以下の限定に従う、ポリヌクレオ
チド：
（ａ）９位、７６位、９４位および１１０位のアミノ酸残基が、Ａである；
（ｂ）２９位および１０８位のアミノ酸残基が、Ｃである；
（ｃ）３４位のアミノ酸残基が、Ｄである；
（ｄ）９５位のアミノ酸残基が、Ｅである；
（ｅ）５６位のアミノ酸残基が、Ｆである；
（ｆ）４３位、４４位、６６位、７４位、８７位、１０２位、１１６位、１２２
位、１２７位および１３６位のアミノ酸残基が、Ｇである；
（ｇ）４１位のアミノ酸残基が、Ｈである；
（ｈ）７位のアミノ酸残基が、Ｉである；
（ｉ）８５位のアミノ酸残基が、Ｋである；
（ｊ）２０位、３６位、４２位、５０位、７２位、７８位、９８位および１２１
位のアミノ酸残基が、Ｌである；
（ｋ）１位、７５位および１４１位のアミノ酸残基が、Ｍである；
（ｌ）２３位、６４位および１０９位のアミノ酸残基が、Ｎである；
（ｍ）２２位、２５位、１３３位、１３４位および１３７位のアミノ酸残基が、
Ｐである；
（ｎ）７１位のアミノ酸残基が、Ｑである；
（ｏ）１６位、２１位、７３位、９９位および１１１位のアミノ酸残基が、Ｒで
ある；
（ｐ）５５位および８８位のアミノ酸残基が、Ｓである；
（ｑ）７７位のアミノ酸残基が、Ｔである；
（ｒ）１０７位のアミノ酸残基が、Ｗである；および
（ｓ）１３位、４６位、７０位、１１７位および１１８位のアミノ酸残基が、Ｙ
である。
（１０９）  項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組
換えポリヌクレオチドであって、ここで、前記アミノ酸配列中の２８位に対応す
るアミノ酸残基が、Ｖである、ポリヌクレオチド。
（１１０）  項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組
換えポリヌクレオチドであって、ここで、前記アミノ酸配列が、配列番号６〜１
０および２６３〜５１４からなる群から選択される、、ポリヌクレオチド。
（１１１）  項目４２に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは
組換えポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸配列中の以下の位置に対応する
アミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の限定に従う、ポリヌクレオチ
ド：
（ａ）２位、４位、１５位、１９位、２６位、２８位、３１位、４５位、５１位
、５４位、８６位、９０位、９１位、９７位、１０３位、１０５位、１０６位、
１１４位、１２３位、１２９位、１３９位および／または１４５位のアミノ酸残
基が、Ｂ１である；および
（ｂ）３位、５位、８位、１０位、１１位、１４位、１７位、１８位、２４位、
２７位、３２位、３７位、３８位、４７位、４８位、４９位、５２位、５７位、
５８位、６１位、６２位、６３位、６８位、６９位、７９位、８０位、８２位、
８３位、８９位、９２位、１００位、１０１位、１０４位、１１９位、１２０位
、１２４位、１２５位、１２６位、１２８位、１３１位、１４３位および／また
は１４４位のアミノ酸残基が、Ｂ２である；
ここで、Ｂ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択さ
れる、アミノ酸であり；そして、Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ
、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群から選択される、アミノ酸である。
（１１２）  項目４２に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは
組換えポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸配列中の以下の位置に対応する
アミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、以下の限定に従う、ポリヌクレオチ
ド：
（ａ）２位、４位、１５位、１９位、２６位、２８位、５１位、５４位、８６位
、９０位、９１位、９７位、１０３位、１０５位、１０６位、１１４位、１２９
位、１３９位および／または１４５位のアミノ酸残基が、Ｚ１である；
（ｂ）３１位および／または４５位のアミノ酸残基が、Ｚ２である；
（ｃ）８位および／または８９位のアミノ酸残基が、Ｚ３である；
（ｄ）８２位、９２位、１０１位および１２０位のアミノ酸残基が、Ｚ４である
；
（ｅ）３位、１１位、２７位および／または７９位のアミノ酸残基が、Ｚ５であ
る；
（ｆ）１２３位のアミノ酸残基が、Ｚ１またはＺ２である；
（ｇ）１２位、３３位、３５位、３９位、５３位、５９位、１１２位、１３２位
、１３５位、１４０位および／または１４６位のアミノ酸残基が、Ｚ１またはＺ
３である；
（ｈ）３０位のアミノ酸残基が、Ｚ１またはＺ４である；
（ｉ）６位のアミノ酸残基が、Ｚ１またはＺ６である；
（ｊ）８１位および／または１１３位のアミノ酸残基が、Ｚ２またはＺ３である
；
（ｋ）１３８位および／または１４２位のアミノ酸残基が、Ｚ２またはＺ４であ
る；
（ｌ）５位、１７位、２４位、５７位、６１位、１２４位および／または１２６
位のアミノ酸残基が、Ｚ３またはＺ４である；
（ｍ）１０４位のアミノ酸残基が、Ｚ３またはＺ５である；
（ｏ）３８位、５２位、６２位および／または６９位のアミノ酸残基が、Ｚ３ま
たはＺ６である；
（ｐ）１４位、１１９位および／または１４４位のアミノ酸残基が、Ｚ４または
Ｚ５である；
（ｑ）１８位のアミノ酸残基が、Ｚ４またはＺ６である；
（ｒ）１０位、３２位、４８位、６３位、８０位および／または８３位のアミノ
酸残基が、Ｚ５またはＺ６である；
（ｓ）４０位のアミノ酸残基が、Ｚ１、Ｚ２またはＺ３である；
（ｔ）６５位および／または９６位のアミノ酸残基が、Ｚ１、Ｚ３またはＺ５で
ある；
（ｕ）８４位および／または１１５位のアミノ酸残基が、Ｚ１、Ｚ３またはＺ４
である；
（ｖ）９３位のアミノ酸残基が、Ｚ２、Ｚ３またはＺ４である；
（ｗ）１３０位のアミノ酸残基が、Ｚ２、Ｚ４またはＺ６である；
（ｘ）４７位および／または５８位のアミノ酸残基が、Ｚ３、Ｚ４またはＺ６で
ある；
（ｙ）４９位、６８位、１００位および／または１４３位のアミノ酸残基が、Ｚ
３、Ｚ４またはＺ５である；
（ｚ）１３１位のアミノ酸残基が、Ｚ３、Ｚ５またはＺ６である；
（ａａ）１２５位および／または１２８位のアミノ酸残基が、Ｚ４、Ｚ５または
Ｚ６である；
（ａｂ）６７位のアミノ酸残基が、Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４またはＺ５である；
（ａｃ）６０位のアミノ酸残基が、Ｚ１、Ｚ４、Ｚ５またはＺ６である；および
（ａｄ）３７位のアミノ酸残基が、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５またはＺ６である；
ここで、Ｚ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＶからなる群から選択される、アミ
ノ酸であり；Ｚ２は、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群から選択される、アミノ酸で
あり；Ｚ３は、Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴからなる群から選択される、アミノ酸であ
り；Ｚ４は、Ｒ、Ｈ、およびＫからなる群から選択される、アミノ酸であり；Ｚ
５は、ＤおよびＥからなる群から選択される、アミノ酸であり；そして、Ｚ６は
、Ｃ、Ｇ、およびＰからなる群から選択される、アミノ酸である。
（１１３）  項目４２に記載の単離ポリペプチドまたは組換えポリ
ペプチドであって、以下の位置に対応するアミノ酸配列中のアミノ酸残基の、少
なくとも９０％が、以下の制限に合致し：
（ａ）１、７、９、１３、２０、３６、４２、４６、５０、５６、６４、７０
、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１０７、１１０、１１７、１１８、１
２１および／または１４１位のアミノ酸残基がＢ１である；および
（ｂ）１６、２１、２２、２３、２５、２９、３４、４１、４３、４４、５５
、６６、７１、７３、７４、７７、８５、８７、８８、９５、９９、１０２、１
０８、１０９、１１１、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６およ
び／または１３７位のアミノ酸残基がＢ２である；
ここでＢ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＶから成る群から選択される
アミノ酸である；そしてＢ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、Ｓお
よびＴから成る群から選択されるアミノ酸である、
ポリペプチド。
（１１４）  項目４２に記載の単離ポリペプチドまたは組換えポリ
ペプチドであって、以下の位置に対応するアミノ酸配列中のアミノ酸残基の、少
なくとも９０％が、以下の制限に合致し：
（ａ）１、７、９、２０、３６、４２、５０、６４、７２、７５、７６、７８
、９４、９８、１１０、１２１および／または１４１位のアミノ酸残基がＺ１で
ある；
（ｂ）１３、４６、５６、７０、１０７、１１７および／または１１８位のア
ミノ酸残基がＺ２である；
（ｃ）２３、５５、７１、７７、８８および／または１０９位のアミノ酸残基
がＺ３である；
（ｄ）１６、２１、４１、７３、８５、９９および／または１１１位のアミノ
酸残基がＺ４である；
（ｅ）３４および／または９５位のアミノ酸残基がＺ５である；
（ｆ）２２、２５、２９、４３、４４、６６、７４、８７、１０２、１０８、
１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６および／または１３７位のア
ミノ酸残基がＺ６である；
ここでＺ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから成る群から選択されるアミノ酸である
；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹから成る群から選択されるアミノ酸である；Ｚ３はＮ、
Ｑ、ＳおよびＴから成る群から選択されるアミノ酸である；Ｚ４はＲ、Ｈおよび
Ｋから成る群から選択されるアミノ酸である；Ｚ５はＤおよびＥから成る群から
選択されるアミノ酸である；そしてＺ６はＣ、ＧおよびＰから成る群から選択さ
れるアミノ酸である、
ポリペプチド。
（１１５）  項目１１１に記載の単離ポリペプチドまたは組換えポ
リペプチドであって、以下の位置に対応するアミノ酸配列中のアミノ酸残基の、
少なくとも９０％が、以下の制限に合致し：
（ａ）１、７、９、１３、２０、３６、４２、４６、５０、５６、６４、７０
、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１０７、１１０、１１７、１１８、１
２１および／または１４１位のアミノ酸残基がＢ１である；
（ｂ）１６、２１、２２、２３、２５、２９、３４、４１、４３、４４、５５
、６６、７１、７３、７４、７７、８５、８７、８８、９５、９９、１０２、１
０８、１０９、１１１、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６およ
び／または１３７位のアミノ酸残基がＢ２である；
ここでＢ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＶから成る群から選択される
アミノ酸である；そしてＢ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、Ｓお
よびＴから成る群から選択されるアミノ酸である、
ポリペプチド。
（１１６）  項目１１１に記載の単離ポリペプチドまたは組換えポ
リペプチドであって、以下の位置に対応するアミノ酸配列中のアミノ酸残基の、
少なくとも９０％が、以下の制限に合致し：
（ａ）１、７、９、１３、２０、３６、４２、４６、５０、５６、６４、７０
、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１０７、１１０、１１７、１１８、１
２１および／または１４１位のアミノ酸残基がＢ１である；
（ｂ）１６、２１、２２、２３、２５、２９、３４、４１、４３、４４、５５
、６６、７１、７３、７４、７７、８５、８７、８８、９５、９９、１０２、１
０８、１０９、１１１、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６およ
び／または１３７位のアミノ酸残基がＢ２である；
ここでＢ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＶから成る群から選択される
アミノ酸である；そしてＢ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、Ｓお
よびＴから成る群から選択されるアミノ酸である、
ポリペプチド。
（１１７）  項目１１１に記載の単離ポリペプチドまたは組換えポ
リペプチドであって、以下の位置に対応するアミノ酸配列中のアミノ酸残基の、
少なくとも９０％が、以下の制限に合致し：
（ａ）１、７、９、１３、２０、３６、４２、４６、５０、５６、６４、７０
、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１０７、１１０、１１７、１１８、１
２１および／または１４１位のアミノ酸残基がＢ１である；
（ｂ）１６、２１、２２、２３、２５、２９、３４、４１、４３、４４、５５
、６６、７１、７３、７４、７７、８５、８７、８８、９５、９９、１０２、１
０８、１０９、１１１、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６およ
びまたは１３７位のアミノ酸残基がＢ２である；
ここでＢ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＶから成る群から選択される
アミノ酸である；そしてＢ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、Ｓお
よびＴから成る群から選択されるアミノ酸である、
ポリペプチド。
（１１８）  項目１１２に記載の単離ポリペプチドまたは組換えポ
リペプチドであって、以下の位置に対応するアミノ酸配列中のアミノ酸残基の、
少なくとも９０％が、以下の制限に合致し：
（ａ）１、７、９、１３、２０、３６、４２、４６、５０、５６、６４、７０
、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１０７、１１０、１１７、１１８、１
２１および／または１４１位のアミノ酸残基がＢ１である；
（ｂ）１６、２１、２２、２３、２５、２９、３４、４１、４３、４４、５５
、６６、７１、７３、７４、７７、８５、８７、８８、９５、９９、１０２、１
０８、１０９、１１１、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６およ
び／または１３７位のアミノ酸残基がＢ２である；
ここでＢ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＶから成る群から選択される
アミノ酸である；そしてＢ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、Ｓお
よびＴから成る群から選択されるアミノ酸である、
ポリペプチド。
（１１９）  項目４２に記載の単離ポリペプチドまたは組換えポリ
ペプチドであって、以下の位置に対応するアミノ酸配列中のアミノ酸残基の、少
なくとも８０％が、以下の制限に合致し：
（ａ）２位のアミノ酸残基がＩまたはＬである；
（ｂ）３位のアミノ酸残基がＥまたはＤである；
（ｃ）４位のアミノ酸残基がＶ、ＡまたはＩである；
（ｄ）５位のアミノ酸残基がＫ、ＲまたはＮである；
（ｅ）６位のアミノ酸残基がＰまたはＬである；
（ｆ）８位のアミノ酸残基がＮ、ＳまたはＴである；
（ｇ）１０位のアミノ酸残基がＥまたはＧである；
（ｈ）１１位のアミノ酸残基がＤまたはＥである；
（ｉ）１２位のアミノ酸残基がＴまたはＡである；
（ｊ）１４位のアミノ酸残基がＥまたはＫである；
（ｋ）１５位のアミノ酸残基がＩまたはＬである；
（ｌ）１７位のアミノ酸残基がＨまたはＱである；
（ｍ）１８位のアミノ酸残基がＲ、ＣまたはＫである；
（ｎ）１９位のアミノ酸残基がＩまたはＶである；
（ｏ）２４位のアミノ酸残基がＱまたはＲである；
（ｐ）２６位のアミノ酸残基がＬまたはＩである；
（ｑ）２７位のアミノ酸残基がＥまたはＤである；
（ｒ）２８位のアミノ酸残基がＡまたはＶである；
（ｓ）３０位のアミノ酸残基がＫ、ＭまたはＲである；
（ｔ）３１位のアミノ酸残基がＹまたはＦである；
（ｕ）３２位のアミノ酸残基がＥまたはＧである；
（ｖ）３３位のアミノ酸残基がＴ、ＡまたはＳである；
（ｗ）３５位のアミノ酸残基がＬ、ＳまたはＭである；
（ｘ）３７位のアミノ酸残基がＲ、Ｇ、ＥまたはＱである；
（ｙ）３８位のアミノ酸残基がＧまたはＳである；
（ｚ）３９位のアミノ酸残基がＴ、ＡまたはＳである；
（ａａ）４０位のアミノ酸残基がＦ、ＬまたはＳである；
（ａｂ）４５位のアミノ酸残基がＹまたはＦである；
（ａｃ）４７位のアミノ酸残基がＲ、ＱまたはＧである；
（ａｄ）４８位のアミノ酸残基がＧまたはＤである；
（ａｅ）４９位のアミノ酸残基がＫ、Ｒ、ＥまたはＱである；
（ａｆ）５１位のアミノ酸残基がＩまたはＶである；
（ａｇ）５２位のアミノ酸残基がＳ、ＣまたはＧである；
（ａｈ）５３位のアミノ酸残基がＩまたはＴである；
（ａｉ）５４位のアミノ酸残基がＡまたはＶである；
（ａｊ）５７位のアミノ酸残基がＨまたはＮである；
（ａｋ）５８位のアミノ酸残基がＱ、Ｋ、ＮまたはＰである；
（ａｌ）５９位のアミノ酸残基がＡまたはＳである；
（ａｍ）６０位のアミノ酸残基がＥ、Ｋ、Ｇ、ＶまたはＤである；
（ａｎ）６１位のアミノ酸残基がＨまたはＱである；
（ａｏ）６２位のアミノ酸残基がＰ、ＳまたはＴである；
（ａｐ）６３位のアミノ酸残基がＥ、ＧまたはＤである；
（ａｑ）６５位のアミノ酸残基がＥ、Ｄ、ＶまたはＱである；
（ａｒ）６７位のアミノ酸残基がＱ、Ｅ、Ｒ、Ｌ、ＨまたはＫである；
（ａｓ）６８位のアミノ酸残基がＫ、Ｒ、ＥまたはＮである；
（ａｔ）６９位のアミノ酸残基がＱまたはＰである；
（ａｕ）７９位のアミノ酸残基がＥまたはＤである；
（ａｖ）８０位のアミノ酸残基がＧまたはＥである；
（ａｗ）８１位のアミノ酸残基がＹ、ＮまたはＦである；
（ａｘ）８２位のアミノ酸残基がＲまたはＨである；
（ａｙ）８３位のアミノ酸残基がＥ、ＧまたはＤである；
（ａｚ）８４位のアミノ酸残基がＱ、ＲまたはＬである；
（ｂａ）８６位のアミノ酸残基がＡまたはＶある；
（ｂｂ）８９位のアミノ酸残基がＴまたはＳである；
（ｂｃ）９０位のアミノ酸残基がＬまたはＩである；
（ｂｄ）９１位のアミノ酸残基がＩまたはＶである；
（ｂｅ）９２位のアミノ酸残基がＲまたはＫである；
（ｂｆ）９３位のアミノ酸残基がＨ、ＹまたはＱである；
（ｂｇ）９６位のアミノ酸残基がＥ、ＡまたはＱである；
（ｂｈ）９７位のアミノ酸残基がＬまたはＩである；
（ｂｉ）１００位のアミノ酸残基がＫ、Ｒ、ＮまたはＥである；
（ｂｊ）１０１位のアミノ酸残基がＫまたはＲである；
（ｂｋ）１０３位のアミノ酸残基がＡまたはＶである；
（ｂｌ）１０４位のアミノ酸残基がＤまたはＮである；
（ｂｍ）１０５位のアミノ酸残基がＬまたはＭである；
（ｂｎ）１０６位のアミノ酸残基がＬまたはＩである；
（ｂｏ）１１２位のアミノ酸残基がＴまたはＩである；
（ｂｐ）１１３位のアミノ酸残基がＳ、ＴまたはＦである；
（ｂｑ）１１４位のアミノ酸残基がＡまたはＶである；
（ｂｒ）１１５位のアミノ酸残基がＳ、ＲまたはＡである；
（ｂｓ）１１９位のアミノ酸残基がＫ、ＥまたはＲである；
（ｂｔ）１２０位のアミノ酸残基がＫまたはＲである；
（ｂｕ）１２３位のアミノ酸残基がＦまたはＬである；
（ｂｖ）１２４位のアミノ酸残基がＳまたはＲである；
（ｂｗ）１２５位のアミノ酸残基がＥ、Ｋ、ＧまたはＤである；
（ｂｘ）１２６位のアミノ酸残基がＱまたはＨである；
（ｂｙ）１２８位のアミノ酸残基がＥ、ＧまたはＫである；
（ｂｚ）１２９位のアミノ酸残基がＶ、ＩまたはＡである；
（ｃａ）１３０位のアミノ酸残基がＹ、Ｈ、ＦまたはＣである；
（ｃｂ）１３１位のアミノ酸残基がＤ、Ｇ、ＮまたはＥである；
（ｃｃ）１３２位のアミノ酸残基がＩ、Ｔ、Ａ、Ｍ、ＶまたはＬである；
（ｃｄ）１３５位のアミノ酸残基がＶ、Ｔ、ＡまたはＩである；
（ｃｅ）１３８位のアミノ酸残基がＨまたはＹである；
（ｃｆ）１３９位のアミノ酸残基がＩまたはＶである；
（ｃｇ）１４０位のアミノ酸残基がＬまたはＳである；
（ｃｈ）１４２位のアミノ酸残基がＹまたはＨである；
（ｃｉ）１４３位のアミノ酸残基がＫ、ＴまたはＥである；
（ｃｊ）１４４位のアミノ酸残基がＫ、ＥまたはＲである；
（ｃｋ）１４５位のアミノ酸残基がＬまたはＩである；および
（ｃｌ）１４６位のアミノ酸残基がＴまたはＡである、
ポリペプチド。
（１２０）  項目４２に記載の単離ポリペプチドまたは組換えポリ
ペプチドであって、以下の位置に対応するアミノ酸配列中のアミノ酸残基の、少
なくとも８０％が、以下の制限に合致し：
（ａ）９、７６、９４および１１０位のアミノ酸残基がＡである；
（ｂ）２９および１０８位のアミノ酸残基がＣである；
（ｃ）３４位のアミノ酸残基がＤである；
（ｄ）９５位のアミノ酸残基がＥである；
（ｅ）５６位のアミノ酸残基がＦである；
（ｆ）４３、４４、６６、７４、８７、１０２、１１６、１２２、１２７およ
び１３６位のアミノ酸残基がＧである；
（ｇ）４１位のアミノ酸残基がＨである；
（ｈ）７位のアミノ酸残基がＩである；
（ｉ）８５位のアミノ酸残基がＫである；
（ｊ）２０、３６、４２、５０、７２、７８、９８および１２１位のアミノ酸
残基がＬである；
（ｋ）１、７５および１４１位のアミノ酸残基がＭである；
（ｌ）２３、６４および１０９位のアミノ酸残基がＮである；
（ｍ）２２、２５、１３３、１３４および１３７位のアミノ酸残基がＰである
；
（ｎ）７１位のアミノ酸残基がＱである；
（ｏ）１６、２１、７３、９９および１１１位のアミノ酸残基がＲである；
（ｐ）５５および８８位のアミノ酸残基がＳである；
（ｑ）７７位のアミノ酸残基がＴである；
（ｒ）１０７位のアミノ酸残基がＷである；および
（ｓ）１３、４６、７０、１１７および１１８位のアミノ酸残基がＹである、
ポリペプチド。
（１２１）  項目１１９に記載の単離ポリペプチドまたは組換えポ
リペプチドであって、以下の位置に対応するアミノ酸配列中のアミノ酸残基の、
少なくとも９０％が、以下の制限に合致し：
（ａ）１、７、９、１３、２０、３６、４２、４６、５０、５６、６４、７０
、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１０７、１１０、１１７、１１８、１
２１および／または１４１位のアミノ酸残基がＢ１である；
（ｂ）１６、２１、２２、２３、２５、２９、３４、４１、４３、４４、５５
、６６、７１、７３、７４、７７、８５、８７、８８、９５、９９、１０２、１
０８、１０９、１１１、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６およ
び／または１３７位のアミノ酸残基がＢ２である；
ここでＢ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＶから成る群から選択される
アミノ酸である；そしてＢ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、Ｓお
よびＴから成る群から選択されるアミノ酸である、
ポリペプチド。
（１２２）  項目１２０に記載の単離ポリペプチドまたは組換えポ
リペプチドであって、以下の位置に対応するアミノ酸配列中のアミノ酸残基の、
少なくとも９０％が、以下の制限に合致し：
（ａ）２、４、１５、１９、２６、２８、３１、４５、５１、５４、８６、９
０、９１、９７、１０３、１０５、１０６、１１４、１２３、１２９、１３９お
よび／または１４５位のアミノ酸残基がＢ１である；
（ｂ）３、５、８、１０、１１、１４、１７、１８、２４、２７、３２、３７
、３８、４７、４８、４９、５２、５７、５８、６１、６２、６３、６８、６９
、７９、８０、８２、８３、８９、９２、１００、１０１、１０４、１１９、１
２０、１２４、１２５、１２６、１２８、１３１、１４３および／または１４４
位のアミノ酸残基がＢ２である；
ここでＢ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＶから成る群から選択される
アミノ酸である；そしてＢ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、Ｓお
よびＴから成る群から選択されるアミノ酸である、
ポリペプチド。
（１２３）  項目１１９に記載の単離ポリペプチドまたは組換えポ
リペプチドであって、以下の位置に対応するアミノ酸配列中のアミノ酸残基の、
少なくとも９０％が、以下の制限に合致し：
（ａ）１、７、９、２０、３６、４２、５０、６４、７２、７５、７６、７８
、９４、９８、１１０、１２１および／または１４１位のアミノ酸残基がＺ１で
ある；
（ｂ）１３、４６、５６、７０、１０７、１１７および／または１１８位のア
ミノ酸残基がＺ２である；
（ｃ）２３、５５、７１、７７、８８および／または１０９位のアミノ酸残基
がＺ３である；
（ｄ）１６、２１、４１、７３、８５、９９および／または１１１位のアミノ
酸残基がＺ４である；
（ｅ）３４および／または９５位のアミノ酸残基がＺ５である；
（ｆ）２２、２５、２９、４３、４４、６６、７４、８７、１０２、１０８、
１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６および／または１３７位のア
ミノ酸残基がＺ６である；
ここでＺ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから成る群から選択されるアミノ酸である
；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹから成る群から選択されるアミノ酸である；Ｚ３はＮ、
Ｑ、ＳおよびＴから成る群から選択されるアミノ酸である；Ｚ４はＲ、Ｈおよび
Ｋから成る群から選択されるアミノ酸である；Ｚ５はＤおよびＥから成る群から
選択されるアミノ酸である；そしてＺ６はＣ、ＧおよびＰから成る群から選択さ
れるアミノ酸である、
ポリペプチド。
（１２４）  項目１２０に記載の単離ポリペプチドまたは組換えポ
リペプチドであって、以下の位置に対応するアミノ酸配列中のアミノ酸残基の、
少なくとも８０％が、以下の制限に合致し：
（ａ）２、４、１５、１９、２６、２８、５１、５４、８６、９０、９１、９
７、１０３、１０５、１０６、１１４、１２９、１３９および／または１４５位
のアミノ酸残基がＺ１である；
（ｂ）３１および／または４５位のアミノ酸残基がＺ２である；
（ｃ）８および／または８９位のアミノ酸残基がＺ３である；
（ｄ）８２、９２、１０１および／または１２０位のアミノ酸残基がＺ４であ
る；
（ｅ）３、１１、２７および／または７９位のアミノ酸残基がＺ５である；
（ｆ）１２３位のアミノ酸残基がＺ１またはＺ２である；
（ｇ）１２、３３、３５、３９、５３、５９、１１２、１３２、１３５、１４
０および／または１４６位のアミノ酸残基がＺ１またはＺ３である；
（ｈ）３０位のアミノ酸残基がＺ１またはＺ４である；
（ｉ）６位のアミノ酸残基がＺ１またはＺ６である；
（ｊ）８１および／または１１３位のアミノ酸残基がＺ２またはＺ３である；
（ｋ）１３８および／または１４２位のアミノ酸残基がＺ２またはＺ４である
；
（ｌ）５、１７、２４、５７、６１、１２４および／または１２６位のアミノ
酸残基がＺ３またはＺ４である；
（ｍ）１０４位のアミノ酸残基がＺ３またはＺ５である；
（ｏ）３８、５２、６２および／または６９位のアミノ酸残基がＺ３またはＺ
６である；
（ｐ）１４、１１９および／または１４４位のアミノ酸残基がＺ４またはＺ５
である；
（ｑ）１８位のアミノ酸残基がＺ４またはＺ６である；
（ｒ）１０、３２、４８、６３、８０および／または８３位のアミノ酸残基が
Ｚ５またはＺ６である；
（ｓ）４０位のアミノ酸残基がＺ１、Ｚ２またはＺ３である；
（ｔ）６５および／または９６位のアミノ酸残基がＺ１、Ｚ３またはＺ５であ
る；
（ｕ）８４および／または１１５位のアミノ酸残基がＺ１、Ｚ３またはＺ４で
ある；
（ｖ）９３位のアミノ酸残基がＺ２、Ｚ３またはＺ４である；
（ｗ）１３０位のアミノ酸残基がＺ２、Ｚ４またはＺ６である；
（ｘ）４７および／または５８位のアミノ酸残基がＺ３、Ｚ４またはＺ６であ
る；
（ｙ）４９、６８、１００および／または１４３位のアミノ酸残基がＺ３、Ｚ
４またはＺ５である；
（ｚ）１３１位のアミノ酸残基がＺ３、Ｚ５またはＺ６である；
（ａａ）１２５および／または１２８位のアミノ酸残基がＺ４、Ｚ５またはＺ
６である；
（ａｂ）６７位のアミノ酸残基がＺ１、Ｚ３、Ｚ４またはＺ５である；
（ａｃ）６０位のアミノ酸残基がＺ１、Ｚ４、Ｚ５またはＺ６である；
（ａｄ）３７位のアミノ酸残基がＺ３、Ｚ４、Ｚ５またはＺ６である；
ここでＺ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから成る群から選択されるアミノ酸である
；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹから成る群から選択されるアミノ酸である；Ｚ３はＮ、
Ｑ、ＳおよびＴから成る群から選択されるアミノ酸である；Ｚ４はＲ、Ｈおよび
Ｋから成る群から選択されるアミノ酸である；Ｚ５はＤおよびＥから成る群から
選択されるアミノ酸である；そしてＺ６はＣ、ＧおよびＰから成る群から選択さ
れるアミノ酸である、
ポリペプチド。
（１２５）  項目１１９に記載の単離ポリペプチドまたは組換えポ
リペプチドであって、以下の位置に対応するアミノ酸配列中のアミノ酸残基の、
少なくとも８０％が、以下の制限に合致し：
（ａ）９、７６、９４および１１０位のアミノ酸残基がＡである；
（ｂ）２９および１０８位のアミノ酸残基がＣである；
（ｃ）３４位のアミノ酸残基がＤである；
（ｄ）９５位のアミノ酸残基がＥである；
（ｅ）５６位のアミノ酸残基がＦである；
（ｆ）４３、４４、６６、７４、８７、１０２、１１６、１２２、１２７およ
び１３６位のアミノ酸残基がＧである；
（ｇ）４１位のアミノ酸残基がＨである；
（ｈ）７位のアミノ酸残基がＩである；
（ｉ）８５位のアミノ酸残基がＫである；
（ｊ）２０、３６、４２、５０、７２、７８、９８および１２１位のアミノ酸
残基がＬである；
（ｋ）１、７５および１４１位のアミノ酸残基がＭである；
（ｌ）２３、６４および１０９位のアミノ酸残基がＮである；
（ｍ）２２、２５、１３３、１３４および１３７位のアミノ酸残基がＰである
；
（ｎ）７１位のアミノ酸残基がＱである；
（ｏ）１６、２１、７３、９９および１１１位のアミノ酸残基がＲである；
（ｐ）５５および８８位のアミノ酸残基がＳである；
（ｑ）７７位のアミノ酸残基がＴである；
（ｒ）１０７位のアミノ酸残基がＷである；および
（ｓ）１３、４６、７０、１１７および１１８位のアミノ酸残基がＹである、
ポリペプチド。
（１２６）  項目２４に記載の単離ポリペプチドまたは組換えポリ
ペプチドであって、ここで２８位に対応するアミノ酸配列中のアミノ酸残基が、
Ｖであるポリペプチド。
（１２７）  項目４２に記載の単離ポリペプチドまたは組換えポリ
ペプチドであって、ここでアミノ酸配列が、配列番号６〜１０および２６３〜５
１４から成る群から選択される、ポリペプチド。
（１２８）  増強されたグリホセート耐性を有するトランスジェニッ
ク植物またはトランスジェニック植物外植片であって、ここで植物または植物外
植片が、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチ
ドおよびさらなる機構によってグリホセート耐性を付与する少なくとも１つのポ
リペプチドを発現する、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物
外植片。
（１２９）  項目１２８に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここでグリホセートＮ−アセチルトラン
スフェラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号６〜１０および２６３〜５
１４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１３０）  項目１２９に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここでさらなる機構によってグリホセー
ト耐性を付与する少なくとも１つのポリペプチドが、グリホセート耐性５−エノ
ールピルビルシキメート−３−リン酸シンターゼおよびグリホセート耐性グリホ
セートキシドレダクターゼから成る群から選択される、
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１３１）  項目１３０に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここでさらなる機構によってグリホセー
ト耐性を付与する少なくとも１つのポリペプチドが、グリホセート耐性５−エノ
ールピルビルシキメート−３−リン酸シンターゼである、
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１３２）  項目１３０に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここでさらなる機構によってグリホセー
ト耐性を付与する少なくとも１つのポリペプチドが、グリホセート耐性グリホセ
ートキシドレダクターゼである、
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１３３）  トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物
外植片であり、ここで該植物または植物外植片が、グリホセートＮ−アセチルト
ランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドおよびさらなる除草剤に耐性を付与
する少なくとも１つのポリペプチドを発現する、
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１３４）  項目１３３に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここでグリホセートＮ−アセチルトラン
スフェラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号６〜１０および２６３〜５
１４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１３５）  項目１３４に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここでさらなる除草剤に耐性を付与する
少なくとも１つのポリペプチドが、変異されたヒドロキシフェニルピルベートジ
オキシゲナーゼ、スルホンアミド耐性アセトラクテートシンターゼ、スルホンア
ミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトラクテート
シンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、フォスフィノ
スリシンアセチル転移酵素および変異されたプロトポルフィリノゲンオキシダー
ゼから成る群から選択される、
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１３６）  項目１３５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここでさらなる除草剤に耐性を付与する
少なくとも１つのポリペプチドが、変異されたヒドロキシフェニルピルベートジ
オキシゲナーゼである、
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１３７）  項目１３５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここでさらなる除草剤に耐性を付与する
少なくとも１つのポリペプチドが、スルホンアミド耐性アセトラクテートシンタ
ーゼである、
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１３８）  項目１３５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここでさらなる除草剤に耐性を付与する
少なくとも１つのポリペプチドが、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シン
ターゼである、
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１３９）  項目１３５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここでさらなる除草剤に耐性を付与する
少なくとも１つのポリペプチドが、イミダゾリノン耐性アセトラクテートシンタ
ーゼである、
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１４０）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与える少なくとも１
つのポリペプチドが、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼである
、項目１３５に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物
外植片。
（１４１）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与える少なくとも１
つのポリペプチドが、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼである
、項目１３５に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物
外植片。
（１４２）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与える少なくとも１
つのポリペプチドが、変異型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼである、請
求項１３５に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植
片。
（１４３）  グリホサートに対する強化された耐性を有するトランス
ジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片であって、ここで該植物ま
たは植物外植片は、グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する
ポリペプチド、さらなる機構によりグリホサート耐性を与える少なくとも１つの
ポリペプチド、およびさらなる除草剤に対する耐性を与える少なくとも１つのポ
リペプチドを発現する、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物
外植片。
（１４４）  前記グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性
を有するポリペプチドが、配列番号６〜１０および２６３〜５１４からなる群よ
り選択されるアミノ酸配列を含む、項目１４３に記載のトランスジェニック植
物またはトランスジェニック植物外植片。
（１４５）  項目１４４に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここで、前記さらなる機構によりグリホ
サート耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性５−エ
ノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼおよびグリホサート耐
性グリホサートオキシドレダクターゼからなる群より選択され、そして前記さら
なる除草剤に対する耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、変異型ヒド
ロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ、スルホンアミド耐性アセトラクテ
ートシンターゼ、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、イミダゾ
リノン耐性アセトラクテートシンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ
酸シンターゼ、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、および変異
型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼからなる群より選択される、トランス
ジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１４６）  項目１４５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここで、前記さらなる機構によりグリホ
サート耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性５−エ
ノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼであり、そして前記さ
らなる除草剤に対する耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、変異型ヒ
ドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼである、トランスジェニック植物
またはトランスジェニック植物外植片。
（１４７）  項目１４５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここで、前記さらなる機構によりグリホ
サート耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性５−エ
ノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼであり、そして前記さ
らなる除草剤に対する耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、スルホン
アミド耐性アセトラクテートシンターゼである、トランスジェニック植物または
トランスジェニック植物外植片。
（１４８）  項目１４５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここで、前記さらなる機構によりグリホ
サート耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性５−エ
ノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼであり、そして前記さ
らなる除草剤に対する耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、スルホン
アミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼである、トランスジェニック植物また
はトランスジェニック植物外植片。
（１４９）  項目１４５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここで、前記さらなる機構によりグリホ
サート耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性５−エ
ノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼであり、そして前記さ
らなる除草剤に対する耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、イミダゾ
リノン耐性アセトラクテートシンターゼである、トランスジェニック植物または
トランスジェニック植物外植片。
（１５０）  項目１４５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここで、前記さらなる機構によりグリホ
サート耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性５−エ
ノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼであり、そして前記さ
らなる除草剤に対する耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、イミダゾ
リノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼである、トランスジェニック植物また
はトランスジェニック植物外植片。
（１５１）  項目１４５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここで、前記さらなる機構によりグリホ
サート耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性５−エ
ノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼであり、そして前記さ
らなる除草剤に対する耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、フォスフ
ィノスリシンアセチルトランスフェラーゼである、トランスジェニック植物また
はトランスジェニック植物外植片。
（１５２）  項目１４５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここで、前記さらなる機構によりグリホ
サート耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性５−エ
ノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼであり、そして前記さ
らなる除草剤に対する耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、変異型プ
ロトポルフィリノーゲンオキシダーゼである、トランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片。
（１５３）  項目１４５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここで、前記さらなる機構によりグリホ
サート耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性グリホ
サート酸化還元酵素であり、そして前記さらなる除草剤に対する耐性を与える少
なくとも１つのポリペプチドが、変異型ヒドロキシフェニルピルベートジオキシ
ゲナーゼである、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片
。
（１５４）  項目１４５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここで、前記さらなる機構によりグリホ
サート耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性グリホ
サート酸化還元酵素であり、そして前記さらなる除草剤に対する耐性を与える少
なくとも１つのポリペプチドが、スルホンアミド耐性アセトラクテートシンター
ゼである、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１５５）  項目１４５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここで、前記さらなる機構によりグリホ
サート耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性グリホ
サート酸化還元酵素であり、そして前記さらなる除草剤に対する耐性を与える少
なくとも１つのポリペプチドが、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンタ
ーゼである、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１５６）  項目１４５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここで、前記さらなる機構によりグリホ
サート耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性グリホ
サート酸化還元酵素であり、そして前記さらなる除草剤に対する耐性を与える少
なくとも１つのポリペプチドが、イミダゾリノン耐性アセトラクテートシンター
ゼである、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１５７）  項目１４５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここで、前記さらなる機構によりグリホ
サート耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性グリホ
サート酸化還元酵素であり、そして前記さらなる除草剤に対する耐性を与える少
なくとも１つのポリペプチドが、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンタ
ーゼある、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１５８）  項目１４５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここで、前記さらなる機構によりグリホ
サート耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性グリホ
サート酸化還元酵素であり、そして前記さらなる除草剤に対する耐性を与える少
なくとも１つのポリペプチドが、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラ
ーゼある、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１５９）  項目１４５に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここで、前記さらなる機構によりグリホ
サート耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性グリホ
サート酸化還元酵素であり、そして前記さらなる除草剤に対する耐性を与える少
なくとも１つのポリペプチドが、変異型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ
ある、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１６０）  グリホサートに対する強化された耐性を有するトランス
ジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片であって、ここで、該植物
または植物外植片は、グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有す
るポリペプチドを発現し、そして少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサー
ト耐性５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼおよびグ
リホサート耐性グリホサート酸化還元酵素からなる群より選択される、トランス
ジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１６１）  前記グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性
を有するポリペプチドが、配列番号６〜１０および２６３〜５１４からなる群よ
り選択されるアミノ酸配列を含む、項目１６０に記載のトランスジェニック植
物またはトランスジェニック植物外植片。
（１６２）  前記少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐
性５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼである、請求
項１６１に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片
。
（１６３）  前記少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐
性グリホサート酸化還元酵素である、項目１６１に記載のトランスジェニック
植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１６４）  トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物
外植片であって、ここで該植物または植物外植片は、グリホサートＮ−アセチル
トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し、そして、少なくとも１
つのポリペプチドが、変異型ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ、
スルホンアミド耐性アセトラクテートシンターゼ、スルホンアミド耐性アセトヒ
ドロキシ酸シンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトラクテートシンターゼ、イミ
ダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、フォスフィノスリシンアセチル
トランスフェラーゼ、および変異型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼから
なる群より選択される、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物
外植片。
（１６５）  前記グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性
を有するポリペプチドが、配列番号６〜１０および２６３〜５１４からなる群よ
り選択されるアミノ酸配列を含む、項目１６４に記載のトランスジェニック植
物またはトランスジェニック植物外植片。
（１６６）  前記少なくとも１つのポリペプチドが、変異型ヒドロキ
シフェニルピルベートジオキシゲナーゼである、項目１６５に記載のトランス
ジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１６７）  前記少なくとも１つのポリペプチドが、スルホンアミド
耐性アセトラクテートシンターゼである、項目１６５に記載のトランスジェニ
ック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１６８）  前記少なくとも１つのポリペプチドが、スルホンアミド
耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼである、項目１６５に記載のトランスジェ
ニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１６９）  前記少なくとも１つのポリペプチドが、イミダゾリノン
耐性アセトラクテートシンターゼである、項目１６５に記載のトランスジェニ
ック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１７０）  前記少なくとも１つのポリペプチドが、イミダゾリノン
耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼである、項目１６５に記載のトランスジェ
ニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１７１）  前記少なくとも１つのポリペプチドが、フォスフィノス
リシンアセチルトランスフェラーゼである、項目１６５に記載のトランスジェ
ニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１７２）  前記少なくとも１つのポリペプチドが、変異型プロトポ
ルフィリノーゲンオキシダーゼである、項目１６５に記載のトランスジェニッ
ク植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１７３）  グリホサートに対する強化された耐性を有するトランス
ジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片であって、ここで、該植物
または植物外植片は、グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有す
るポリペプチドを発現し、少なくとも１つの第１ポリペプチドが、グリホサート
耐性５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼおよびグリ
ホサート耐性グリホサート酸化還元酵素からなる群より選択され、そして、少な
くとも１つの第２ポリペプチドが、変異型ヒドロキシフェニルピルベートジオキ
シゲナーゼ、スルホンアミド耐性アセトラクテートシンターゼ、スルホンアミド
耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトラクテートシン
ターゼ、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、フォスフィノスリ
シンアセチルトランスフェラーゼおよび変異型プロトポルフィリノーゲンオキシ
ダーゼからなる群より選択される、トランスジェニック植物またはトランスジェ
ニック植物外植片。
（１７４）  前記グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性
を有するポリペプチドが、配列番号６〜１０および２６３〜５１４からなる群よ
り選択されるアミノ酸配列を含む、項目１７３に記載のトランスジェニック植
物またはトランスジェニック植物外植片。
（１７５）  前記第１ポリペプチドが、グリホサート耐性５−エノー
ルピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼであり、そして前記第２ポ
リペプチドが、変異型ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼである、
項目１７４に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外
植片。
（１７６）  前記第１ポリペプチドが、グリホサート耐性５−エノー
ルピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼであり、そして前記第２ポ
リペプチドが、スルホンアミド耐性アセトラクテートシンターゼである、項目
１７４に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１７７）  前記第１ポリペプチドが、グリホサート耐性５−エノー
ルピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼであり、そして前記第２ポ
リペプチドが、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼである、請求
項１７４に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片
。
（１７８）  前記第１ポリペプチドが、グリホサート耐性５−エノー
ルピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼであり、そして前記第２ポ
リペプチドが、イミダゾリノン耐性アセトラクテートシンターゼである、項目
１７４に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１７９）  前記第１ポリペプチドが、グリホサート耐性５−エノー
ルピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼであり、そして前記第２ポ
リペプチドが、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼである、請求
項１７４に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片
。
（１８０）  前記第１ポリペプチドが、グリホサート耐性５−エノー
ルピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼであり、そして前記第２ポ
リペプチドが、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼである、請求
項１７４に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片
。
（１８１）  前記第１ポリペプチドが、グリホサート耐性５−エノー
ルピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼであり、そして前記第２ポ
リペプチドが、変異型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼである、項目１
７４に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１８２）  前記第１ポリペプチドが、グリホサート耐性グリホサー
ト酸化還元酵素であり、そして前記第２ポリペプチドが、変異型ヒドロキシフェ
ニルピルベートジオキシゲナーゼである、項目１７４に記載のトランスジェニ
ック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１８３）  前記第１ポリペプチドが、グリホサート耐性グリホサー
ト酸化還元酵素であり、そして前記第２ポリペプチドが、スルホンアミド耐性ア
セトラクテートシンターゼである、項目１７４に記載のトランスジェニック植
物またはトランスジェニック植物外植片。
（１８４）  前記第１ポリペプチドが、グリホサート耐性グリホサー
ト酸化還元酵素であり、そして前記第２ポリペプチドがスルホンアミド耐性アセ
トヒドロキシ酸シンターゼである、項目１７４に記載のトランスジェニック植
物またはトランスジェニック植物外植片。
（１８５）  前記第１ポリペプチドが、グリホサート耐性グリホサー
ト酸化還元酵素であり、そして前記第２ポリペプチドがイミダゾリノン耐性アセ
トラクテートシンターゼである、項目１７４に記載のトランスジェニック植物
またはトランスジェニック植物外植片。
（１８６）  前記第１ポリペプチドが、グリホサート耐性グリホサー
ト酸化還元酵素であり、そして前記第２ポリペプチドがイミダゾリノン耐性アセ
トヒドロキシ酸シンターゼである、項目１７４に記載のトランスジェニック植
物またはトランスジェニック植物外植片。
（１８７）  前記第１ポリペプチドが、グリホサート耐性グリホサー
ト酸化還元酵素であり、そして前記第２ポリペプチドが、フォスフィノスリシン
アセチルトランスフェラーゼである、項目１７４に記載のトランスジェニック
植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１８８）  前記第１ポリペプチドが、グリホサート耐性グリホサー
ト酸化還元酵素であり、そして前記第２ポリペプチドが変異型プロトポルフィリ
ノーゲンオキシダーゼである、項目１７４に記載のトランスジェニック植物ま
たはトランスジェニック植物外植片。
（１８９）  グリホサートに対する強化された耐性を有するトランス
ジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片であって、ここで、該植物
または植物外植片は、グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有す
るポリペプチドを発現し、そして少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサー
ト耐性５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ、グリホ
サート耐性グリホサート酸化還元酵素、変異型ヒドロキシフェニルピルベートジ
オキシゲナーゼ、スルホンアミド耐性アセトラクテートシンターゼ、スルホンア
ミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトラクテート
シンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、フォスフィノ
スリシンアセチルトランスフェラーゼおよび変異型プロトポルフィリノーゲンオ
キシダーゼからなる群より選択される、トランスジェニック植物またはトランス
ジェニック植物外植片。
（１９０）  前記グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性
を有するポリペプチドが、配列番号６〜１０および２６３〜５１４からなる群よ
り選択されるアミノ酸配列を含む、項目１８９に記載のトランスジェニック植
物またはトランスジェニック植物外植片。
（１９１）  前記ポリペプチドが、グリホサート耐性５−エノールピ
ルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼである、項目１９０に記載の
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（１９２）  前記ポリペプチドが、グリホサート耐性グリホサート酸
化還元酵素である、項目１９０に記載のトランスジェニック植物またはトラン
スジェニック植物外植片。
（１９３）  前記ポリペプチドが、変異型ヒドロキシフェニルピルベ
ートジオキシゲナーゼである、項目１９０に記載のトランスジェニック植物ま
たはトランスジェニック植物外植片。
（１９４）  前記ポリペプチドが、スルホンアミド耐性アセトラクテ
ートシンターゼである、項目１９０に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片。
（１９５）  前記ポリペプチドが、スルホンアミド耐性アセトヒドロ
キシ酸シンターゼである、項目１９０に記載のトランスジェニック植物または
トランスジェニック植物外植片。
（１９６）  前記ポリペプチドが、イミダゾリノン耐性アセトラクテ
ートシンターゼである、項目１９０に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片。
（１９７）  前記ポリペプチドが、イミダゾリノン耐性アセトヒドロ
キシ酸シンターゼである、項目１９０に記載のトランスジェニック植物または
トランスジェニック植物外植片。
（１９８）  前記ポリペプチドが、フォスフィノスリシンアセチルト
ランスフェラーゼである、項目１９０に記載のトランスジェニック植物または
トランスジェニック植物外植片。
（１９９）  前記ポリペプチドが、変異型プロトポルフィリノーゲン
オキシダーゼである、項目１９０に記載のトランスジェニック植物またはトラ
ンスジェニック植物外植片。
（２００）  作物を含む畑において雑草を制御するための方法であっ
て、
（ａ）グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、お
よびさらなる機構によりグリホサート耐性を与えるポリペプチドをコードする少
なくとも１つの遺伝子を用いて形質転換されている、作物の種または植物を該畑
に植える工程；および、
（ｂ）該作物への有意な影響なしで該畑における該雑草の成長を阻害するのに
十分である、グリホサートの効果的な適用を、該畑における作物および雑草に適
用する工程、
を包含する、方法。
（２０１）  前記グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子が、配列番号１〜５および１１〜２６２からなる群より選択され
るポリヌクレオチド配列を含む、項目２００に記載の方法。
（２０２）  項目２０１に記載の方法であって、ここで、前記さら
なる機構によりグリホサート耐性を与えるポリペプチドが、グリホサート耐性５
−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼおよびグリホサー
ト耐性グリホサート酸化還元酵素からなる群より選択される、方法。
（２０３）  前記さらなる機構によりグリホサート耐性を与えるポリ
ペプチドが、グリホサート耐性５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェ
ートシンターゼである、項目２０２に記載の方法。
（２０４）  前記さらなる機構によりグリホサート耐性を与えるポリ
ペプチドが、グリホサート耐性グリホサート酸化還元酵素である、項目２０２
に記載の方法。
（２０５）  作物を含む畑においてグリホサート耐性雑草の発生を防
止するための方法であって、
（ａ）グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、お
よびさらなる機構によりグリホサート耐性を与えるポリペプチドをコードする少
なくとも１つの遺伝子を用いて形質転換されている、作物の種または植物を該畑
に植える工程；および、
（ｂ）グリホサートの効果的な適用を、該畑における作物および雑草に適用す
る工程、
を包含する、方法。
（２０６）  前記グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子が、配列番号１〜５および１１〜２６２からなる群より選択され
るポリヌクレオチド配列を含む、項目２０５に記載の方法。
（２０７）  項目２０６に記載の方法であって、ここで、前記さら
なる機構によりグリホサート耐性を与えるポリペプチドが、グリホサート耐性５
−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼおよびグリホサー
ト耐性グリホサート酸化還元酵素からなる群より選択される、方法。
（２０８）  前記さらなる機構によりグリホサート耐性を与えるポリ
ペプチドが、グリホサート耐性５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェ
ートシンターゼである、項目２０７に記載の方法。
（２０９）  前記さらなる機構によりグリホサート耐性を与えるポリ
ペプチドが、グリホサート耐性グリホサート酸化還元酵素である、項目２０７
に記載の方法。
（２１０）  作物を含む畑において選択的に雑草を制御するための方
法であって、以下：
（ａ）グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、お
よびさらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチドをコードする少なくとも
１つの遺伝子を用いて形質転換されている、作物の種または植物を該畑に植える
工程、および；
（ｂ）該作物への有意な影響なしで該畑における該雑草の成長を阻害するのに
十分である、グリホサートおよびさらなる該除草剤の、同時適用または経時的時
差適用を該畑における作物および雑草に適用する工程、
を包含する、工程。
（２１１）  前記グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子が、配列番号１〜５および１１〜２６２からなる群より選択され
るポリヌクレオチド配列を含む、項目２１０に記載の方法。
（２１２）  項目２１１に記載の方法であって、ここで、前記さら
なる除草剤に対する耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、変異型ヒド
ロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ、スルホンアミド耐性アセトラクテ
ートシンターゼ、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、イミダゾ
リノン耐性アセトラクテートシンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ
酸シンターゼ、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、および変異
型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼからなる群より選択される、方法。
（２１３）  項目２１１に記載の方法であって、ここで、前記さら
なる除草剤が、ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼインヒビター、
スルホンアミド、イミダゾリノン、ビアラホス、フォスフィノスリシン、アザフ
ェニジン、ブタフェナシル、スルフォセート、グルフォシネート、およびプロト
ックスインヒビターからなる群より選択される、方法。
（２１４）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、変異型ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼである、項目２１
２に記載の方法。
（２１５）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、スルホンアミド耐性アセトラクテートシンターゼである、項目２１２に記
載の方法。
（２１６）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼである、項目２１２に
記載の方法。
（２１７）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、イミダゾリノン耐性アセトラクテートシンターゼである、項目２１２に記
載の方法。
（２１８）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼである、項目２１２に
記載の方法。
（２１９）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼである、項目２１２に
記載の方法。
（２２０）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、変異型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼである、項目２１２に記載
の方法。
（２２１）  作物を含む畑における除草剤耐性雑草の発生を防止する
ための方法であって、以下：
（ａ）グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、お
よびさらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチドをコードする少なくとも
１つの遺伝子を用いて形質転換されている、作物の種または植物を該畑に植える
工程、および；
（ｂ）グリホサートおよびさらなる該除草剤の、同時適用または経時的時差適
用を、該畑における作物および雑草に適用する工程、
を包含する、方法。
（２２２）  前記グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子が、配列番号１〜５および１１〜２６２からなる群より選択され
るポリヌクレオチド配列を含む、項目２２１に記載の方法。
（２２３）  項目２２２に記載の方法であって、ここで、前記さら
なる除草剤に対する耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、変異型ヒド
ロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ、スルホンアミド耐性アセトラクテ
ートシンターゼ、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、イミダゾ
リノン耐性アセトラクテートシンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ
酸シンターゼ、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、および変異
型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼからなる群より選択される、方法。
（２２４）  項目２２１に記載の方法であって、ここで、前記さら
なる除草剤が、ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼインヒビター、
スルホンアミド、イミダゾリノン、ビアラホス、フォスフィノスリシン、アザフ
ェニジン、ブタフェナシル、スルフォセート、グルフォシネート、およびプロト
ックスインヒビターからなる群より選択される、方法。
（２２５）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、変異型ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼである、項目２２
３に記載の方法。
（２２６）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、スルホンアミド耐性アセトラクテートシンターゼである、項目２２３に記
載の方法。
（２２７）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼである、項目２２３に
記載の方法。
（２２８）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、イミダゾリノン耐性アセトラクテートシンターゼである、項目２２３に記
載の方法。
（２２９）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼである、項目２２３に
記載の方法。
（２３０）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼである、項目２２３に
記載の方法。
（２３１）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、変異型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼである、項目２２３に記載
の方法。
（２３２）  作物を含む畑において雑草を選択的に制御するための方
法であって、以下：
（ａ）グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、さ
らなる機構によりグリホサート耐性を与えるポリペプチドをコードする少なくと
も１つの遺伝子、およびさらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチドをコ
ードする少なくとも１つの遺伝子を用いて形質転換されている、作物の種または
植物を該畑に植える工程、および；
（ｂ）該作物への有意な影響なしで該畑における該雑草の成長を阻害するのに
十分である、グリホサートおよびさらなる該除草剤の、同時適用または経時的時
差適用を該畑における作物および雑草に適用する工程、
を包含する、方法。
（２３３）  前記グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子が、配列番号１〜５および１１〜２６２からなる群より選択され
るポリヌクレオチド配列を含む、項目２３２に記載の方法。
（２３４）  項目２３３に記載のトランスジェニック植物またはト
ランスジェニック植物外植片であって、ここで、前記さらなる機構によりグリホ
サート耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性５−エ
ノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼおよびグリホサート耐
性グリホサート酸化還元酵素からなる群より選択される、トランスジェニック植
物またはトランスジェニック植物外植片。
（２３５）  前記さらなる機構によりグリホサート耐性を与える少な
くとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性５−エノールピルビルシキメー
ト−３−ホスフェートシンターゼである、項目２３４に記載のトランスジェニ
ック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（２３６）  前記さらなる機構によりグリホサート耐性を与える少な
くとも１つのポリペプチドが、グリホサート耐性グリホサート酸化還元酵素であ
る、項目２３４に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植
物外植片。
（２３７）  項目２３３に記載の方法であって、ここで、前記さら
なる除草剤に対する耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、変異型ヒド
ロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ、スルホンアミド耐性アセトラクテ
ートシンターゼ、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、イミダゾ
リノン耐性アセトラクテートシンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ
酸シンターゼ、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、および変異
型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼからなる群より選択される、方法。
（２３８）  項目２３３に記載の方法であって、ここで、前記さら
なる除草剤が、ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼインヒビター、
スルホンアミド、イミダゾリノン、ビアラホス、フォスフィノスリシン、アザフ
ェニジン、ブタフェナシル、スルフォセート、グルフォシネート、およびプロト
ックスインヒビターからなる群より選択される、方法。
（２３９）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、変異型ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼである、項目２３
７に記載の方法。
（２４０）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、スルホンアミド耐性アセトラクテートシンターゼである、項目２３７に記
載の方法。
（２４１）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼである、項目２３７に
記載の方法。
（２４２）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、イミダゾリノン耐性アセトラクテートシンターゼである、項目２３７に記
載の方法。
（２４３）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼである、項目２３７に
記載の方法。
（２４４）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼである、項目２３７に
記載の方法。
（２４５）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、変異型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼである、項目２３７に記載
の方法。
（２４６）  作物を含む畑における除草剤耐性雑草の発生を制御する
ための方法であって、以下：
（ａ）グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、さ
らなる機構によりグリホサート耐性を与えるポリペプチドをコードする少なくと
も１つの遺伝子、およびさらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチドをコ
ードする少なくとも１つの遺伝子を用いて形質転換されている、作物の種または
植物を該畑に植える工程、および；
（ｂ）グリホサートおよびさらなる該除草剤の、同時適用または経時的時差適
用を、該畑における作物および雑草に適用する工程、
を包含する、方法。
（２４７）  前記グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子が、配列番号１〜５および１１〜２６２からなる群より選択され
るポリヌクレオチド配列を含む、項目２４６に記載の方法。
（２４８）  項目２４７に記載の方法であって、ここで、前記さら
なる除草剤に対する耐性を与える少なくとも１つのポリペプチドが、変異型ヒド
ロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ、スルホンアミド耐性アセトラクテ
ートシンターゼ、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、イミダゾ
リノン耐性アセトラクテートシンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ
酸シンターゼ、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、および変異
型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼからなる群より選択される、方法。
（２４９）  項目２４７に記載の方法であって、ここで、前記さら
なる除草剤が、ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼインヒビター、
スルホンアミド、イミダゾリノン、ビアラホス、フォスフィノスリシン、アザフ
ェニジン、ブタフェナシル、スルフォセート、グルフォシネート、およびプロト
ックスインヒビターからなる群より選択される、方法。
（２５０）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、変異型ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼである、項目２４
８に記載の方法。
（２５１）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、スルホンアミド耐性アセトラクテートシンターゼである、項目２４８に記
載の方法。
（２５２）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼである、項目２４８に
記載の方法。
（２５３）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、イミダゾリノン耐性アセトラクテートシンターゼである、項目２４８に記
載の方法。
（２５４）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼである、項目２４８に
記載の方法。
（２５５）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼである、項目２４８に
記載の方法。
（２５６）  前記さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチド
が、変異型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼである、項目２４８に記載
の方法。
（本発明の要旨）
生物体（例えば、植物）をグリホセートに対し抵抗性にするための方法および
試薬を提供することが、本発明の目的である。本発明のこの目的およびその他の
目的は、以下に記載される一つ以上の実施形態により提供される。
【００１０】
本発明の一つの実施形態は、本明細書中でＧＡＴポリペプチドといわれる新規
のポリペプチドを提供する。ＧＡＴポリペプチドは、その互いの構造の類似性（
例えば、ＧＡＴポリペプチドが、互いに整列させられた際の配列類似性に関して
）によって特性付けられる。いくつかのＧＡＴポリペプチドは、グリホセートＮ
−アセチルトランスフェラーゼ活性、すなわちグリホセートのアセチル化を触媒
する能力を有する。いくつかのＧＡＴポリペプチドはまた、グリホセート類似物
およびまたはグリホセート代謝産物（例えば、アミノメチルホスホン酸）のアセ
チル化を触媒し得る。
【００１１】
本明細書中においてＧＡＴポリヌクレオチドといわれる新規のポリヌクレオチ
ドもまた、提供される。ＧＡＴポリヌクレオチドは、それらがＧＡＴポリペプチ
ドをコードする能力によって特性付けられる。本発明のいくつかの実施形態にお
いて、ＧＡＴポリヌクレオチドは、よりよい植物の発現のため一つ以上の親コド
ンを、植物において親コドンと比較して優先的に使用される同義のコドンに置換
することにより操作される。他の実施形態において、ＧＡＴポリヌクレオチドは
、Ｎ末端葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入することによ
って修正される。
【００１２】
ＧＡＴポリペプチド、ＧＡＴポリヌクレオチドおよびグリホセートＮ−アセチ
ルトランスフェラーゼ活性は、以下により詳細に記載される。本発明はさらに、
本明細書中に記載されるＧＡＴポリペプチドおよびＧＡＴポリヌクレオチドのあ
る程度のフラグメントを含む。
【００１３】
本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチドおよびポリヌクレオチドの非
ネイティブ型改変体を含み、ここでコードされるポリペプチドの一つ以上のアミ
ノ酸が、変異される。
【００１４】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含有する核酸構築物を提供する
。本構成物は、植物形質転換ベクターのようなベクターであり得る。ある局面に
おいて、本発明に属するベクターは、Ｔ−ＤＮＡ配列を含有する。本構成物は、
ＧＡＴポリヌクレオチドと作動可能に連結される調節配列（例えば、プロモータ
ー）を必要に応じて含み得、ここで、本プロモーターは、ポリヌクレオチドに関
して異種であり、そして核酸構築物によって形質転換された植物細胞のグリホセ
ート耐性を強化するためにコードされたポリペプチドの、十分な発現を引き起こ
すために有効である。
【００１５】
本発明のいくつかの局面において、ＧＡＴポリヌクレオチドは、選択マーカー
（例えば、植物、細菌、放線菌類、酵母、藻類または他の真菌類における）とし
て機能する。例えば、ＧＡＴポリヌクレオチド選択マーカーを含むベクターによ
って形質転換された生物体は、グリホセート存在下でのその成長能力に基づいて
選択され得る。ＧＡＴマーカー遺伝子は、この遺伝子を発現する形質転換された
細胞の選択またはスクリーニングのために使用され得る。
【００１６】
本発明はさらに、形質が重ねられたベクター、すなわちＧＡＴをコードし、か
つまた第２のポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。この第２のポリ
ヌクレオチド配列は、有効なレベルの第２のポリペプチドを発現する細胞または
生物体において、検出可能な表現形の形質を賦与する、第２のポリペプチド配列
をコードする。この検出可能な表現形の形質は、選択マーカー（例えば、除草剤
抵抗性の賦与、害虫抵抗性の賦与、またはある種の可視性マーカーを提供するこ
とにより）として機能し得る。
【００１７】
一つの実施形態において、本発明は、本発明の２つ以上のポリヌクレオチドを
含有する組成物を供給する。
【００１８】
２つ以上のＧＡＴポリヌクレオチドまたはコードされたポリペプチドを含む組
成物は、本発明の特徴である。いくつかの場合において、これらの組成物は、例
えば、少なくとも３つ以上の上記の核酸を含む核酸のライブラリーである。デオ
キシリボヌクレオチド３リン酸および核酸ポリメラーゼ（例えば、熱安定性核酸
ポリメラーゼ）の存在下で、本発明の核酸のインキュベートにより生成される組
成物と同様に、制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅまたはＤＮＡｓｅによる本
発明の核酸の消化、またはその核酸のその他の断片化（例えば、機械的せん断、
化学的切断などによる）により生成される組成物もまた、本発明の特徴である。
【００１９】
本発明のベクター、またはその他の様式で本発明の核酸を組み入れるベクター
により形質導入された細胞は、本発明の一つの局面である。好ましい実施形態に
おいて、本細胞は、上記の核酸によってコードされるポリペプチドを発現する。
【００２０】
ある実施形態において、本発明の核酸を組み入れる細胞は、植物細胞である。
本発明の核酸を組み込んでいるトランスジェニック植物、トランスジェニック植
物細胞、およびトランスジェニック植物外植片もまた、本発明の特徴である。い
くつかの実施形態において、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物
細胞、またはトランスジェニック植物外植片は、本発明の核酸にコードされるグ
リホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する外因性のポリペプチド
を発現する。本発明はまた、本発明のトランスジェニック植物により産生された
トランスジェニック種子を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を持つポ
リペプチドおよび別の機構（例えば、グリホセート耐性５−エノールピルビルシ
キミ酸−３−リン酸シンターゼおよび／またはグリホセート耐性グリホセートキ
シドレダクターゼ）によってグリホセート耐性を与えるポリペプチドの発現のた
め、グリホセートに対する強化された耐性を持つトランスジェニック植物または
トランスジェニック植物外植片を提供する。さらなる実施形態において、本発明
は、ポリペプチドの発現によって、さらなる除草剤に対し耐性と同様に、グリホ
セートに対する強化された耐性を持つトランスジェニック植物またはトランスジ
ェニック植物外植片を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、グリホ
セートに対する強化された耐性ならびにグリホセートＮ−アセチルトランスフェ
ラーゼ活性を有するポリペプチド、別の機構（例えば、グリホセート耐性５−エ
ノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼおよび／またはグリホセート耐
性グリホセートキシドレダクターゼ）によってグリホセート耐性を与えるポリペ
プチド、およびさらなる除草剤に対し耐性を与えるポリペプチド（例えば、変異
されたヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、スルホンアミド耐性ア
セト乳酸シンターゼ、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、イミ
ダゾリノン（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ）耐性アセト乳酸シンターゼ、イミダ
ゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、ホスフィノスリシンアセチルトラ
ンスフェラーゼおよび変異されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ）の発
現に起因するさらなる除草剤に対する耐性を持つトランスジェニック植物または
トランスジェニック植物外植片を提供する。
【００２２】
本発明はまた、グリホセートに対する強化された耐性、ならびにグリホセート
Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドおよびさらなる除草
剤に対し耐性を与えるポリペプチド（例えば、変異されたヒドロキシフェニルピ
ルピン酸ジオキシゲナーゼ、スルホンアミド耐性アセト乳酸シンターゼ、スルホ
ンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、イミダゾリノン耐性アセト乳酸シ
ンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、ホスフィノスリ
シンアセチルトランスフェラーゼおよび変異されたプロトポルフィリノーゲンオ
キシダーゼ）の発現に起因するさらなる除草剤に対する耐性を持つトランスジェ
ニック植物またはトランスジェニック植物外植片を提供する。
【００２３】
本発明のポリペプチドをコードする核酸を細胞中に導入し、引き続いて発現さ
せ、そしてそれらを細胞または培地から回収することによる本発明のポリペプチ
ドを生成する方法は、本発明の特徴である。好ましい実施形態において、本発明
のポリペプチドを発現する細胞は、トランスジェニック植物細胞である。
【００２４】
配列番号：６〜１０および２６３〜５１４に由来する抗原に対して反応するが
、天然に存在する関連する配列には（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＡ７
０６６４の部分配列によって表わされるペプチド）反応しないポリクローナル抗
血清によって特異的に結合されるポリペプチド、ならびに配列番号：６〜１０お
よび２６３〜５１４の任意の一つ以上に由来する抗原の投与によって産生される
抗体および／または前記の抗体に特異的に結合し、そしてＧｅｎＢａｎｋ登録番
号ＣＡＡ７０６６４に対応する天然に存在するポリペプチドに対し特異的に結合
しない抗体は、すべて本発明の特徴である。
【００２５】
本発明の別の局面は、インビトロまたはインビボにおける本発明の核酸を組換
えることまたは変異させることにより新規のＧＡＴポリヌクレオチドおよびＧＡ
Ｔポリペプチドを生成するためのポリヌクレオチドの多様化の方法に関する。一
つの実施形態において、組換えは、少なくとも一つの組換えＧＡＴポリヌクレオ
チドのライブラリーを生成する。上記のように生成されるこのライブラリーは、
このライブラリーを構成する細胞と同様に、本発明の実施形態である。さらに、
本発明の核酸の変異による修正されたＧＡＴポリヌクレオチドを産生する方法は
、本発明の実施形態である。本発明の方法によって産生される組換えおよび変異
ＧＡＴポリヌクレオチドおよびポリペプチドもまた、本発明の実施形態である。
【００２６】
本発明のいくつかの局面において、多様化は、インビトロ、インビボ、インシ
リコ、またはこれらの組み合わせにおいて達成され得る、再帰的な組換えを使用
して成し遂げられる。以下により詳細に記載される多様化法のいくつかの実施例
は、ファミリーシャッフリング（ｆａｍｉｌｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）法および
合成シャッフリング（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）法である。
【００２７】
本発明は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードするポリヌ
クレオチドにより植物または植物細胞を形質転換すること、および形質転換され
た植物細胞からトランスジェニック植物を必要に応じて再生することを包含する
グリホセート抵抗性トランスジェニック植物または植物細胞を作製するための方
法を提供する。ある局面において、このポリヌクレオチドは、ＧＡＴポリヌクレ
オチドであり、必要に応じて細菌供給源に由来するＧＡＴポリヌクレオチドであ
る。本発明のある局面において、本方法は、形質転換された植物の成長を阻害す
ることなしに、同種の野生型植物の成長を阻害する濃度のグリホセートにより、
形質転換された植物または植物細胞を増殖させることを包含し得る。本方法は、
漸増する濃度のグリホセートにおいて、および／または同種の野生型植物または
植物細胞に対して致死的であるグリホセート濃度中において、形質転換された植
物または植物細胞あるいは植物または植物細胞の子孫を増殖させることを包含し
得る。
【００２８】
本方法によって作製されるグリホセート抵抗性トランスジェニック植物は、例
えば、その植物を第２の植物と交配することによって、繁殖させ得、その結果、
少なくともいくつかのこのような交配による子孫はグリホセート耐性を示す。
【００２９】
本発明はさらに、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする
遺伝子による形質転換の結果、グリホセート耐性である農作物の種子または作物
を農地に植付けること、および農作物に対する有意な影響なしに雑草を制御する
ために十分な量のグリホセートを農地において農作物および雑草に対して適用す
ることを包含する、農作物を有する農地において、選択的に雑草を制御するため
の方法を提供する。
【００３０】
本発明はさらに、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする
遺伝子および別の機構（例えば、グリホセート耐性５−エノールピルビルシキミ
酸−３−リン酸シンターゼおよび／またはグリホセート耐性グリホセートキシド
レダクターゼ）によってグリホセート耐性を与えるポリペプチドをコードする遺
伝子による形質転換の結果、グリホセート耐性である農作物の種子または作物を
農地に植付けること、ならびに農作物に対する有意な影響なしに雑草を制御する
ために十分な量のグリホセートを農地において農作物および雑草に対して適用す
ることを包含する、農地において雑草を制御し、そして農作物を含む農地におい
てグリホセート抵抗性の雑草の出現を予防する方法を提供する。
【００３１】
さらなる実施形態において、本発明は、グリホセートＮ−アセチルトランスフ
ェラーゼをコードする遺伝子、別の機構（例えば、グリホセート耐性５−エノー
ルピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼおよび／またはグリホセート耐性グ
リホセートキシドレダクターゼ）によってグリホセート耐性を与えるポリペプチ
ドをコードする遺伝子、およびさらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチ
ド（例えば、変異されたヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、スル
ホンアミド耐性アセト乳酸シンターゼ、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸
シンターゼ、イミダゾリノン耐性アセト乳酸シンターゼ、イミダゾリノン耐性ア
セトヒドロキシ酸シンターゼ、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ
および変異されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ）をコードする遺伝子
による形質転換の結果、グリホセート耐性である農作物の種子または作物を用い
た農地に植付けること、ならびに農作物に対する有意な影響なしに雑草を制御す
るための十分な量のグリホセートおよびさらなる除草剤（例えば、ヒドロキシフ
ェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼインヒビター、スルホンアミド、イミダゾリ
ノン、ビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）、フォスフォノスリシン、アザフェニ
ジン（ａｚａｆｅｎｉｄｉｎ）、ブタフェナシル（ｂｕｔａｆｅｎａｃｉｌ）、
スルフォセート（ｓｕｌｆｏｓａｔｅ）、グルホシネート、およびプロトポルフ
ィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）インヒビター）を農地における農作
物および雑草に適用することを包含する、農地において雑草を制御しそして農作
物を含む農地においてグリホセート抵抗性の雑草の出現を予防する方法を提供す
る。
【００３２】
本発明はさらに、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする
遺伝子およびさらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチドをコードする遺
伝子（例えば、変異されたヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、ス
ルホンアミド耐性アセト乳酸シンターゼ、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ
酸シンターゼ、イミダゾリノン耐性アセト乳酸シンターゼ、イミダゾリノン耐性
アセトヒドロキシ酸シンターゼ、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラー
ゼおよび変異されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ）による形質転換の
結果、グリホセート耐性である農作物の種子または植物を農地に植付けること、
ならびに農作物に対する有意な影響なしに雑草を制御するための十分な量のグリ
ホセートおよびさらなる除草剤（例えば、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキ
シゲナーゼインヒビター、スルホンアミド、イミダゾリノン、ビアラホス、フォ
スフォノスリシン、アザフェニジン、ブタフェナシル、スルフォセート、グルホ
シネート、および変異されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼインヒビタ
ー）を適用することを包含する、農作物を有する農地において雑草を制御するた
めの方法および除草剤抵抗性の雑草の出現を予防する方法を提供する。
【００３３】
本発明はさらに、グリホセートに対して耐性である、遺伝学的に形質転換され
た植物の作製のための方法を提供し、この方法は、組換え型二本鎖ＤＮＡ分子を
植物細胞ゲノムに挿入する工程であって、上記の組換え型二本鎖ＤＮＡ分子は、
（ｉ）植物細胞においてＲＮＡ配列の生成を引き起こすため機能するプロモータ
ー；（ｉｉ）ＧＡＴをコードするＲＮＡ配列の生成を引き起こす構造ＤＮＡ配列
；および（ｉｉｉ）植物細胞においてＲＮＡ配列の３’末端にポリアデニルヌク
レオチドのストレッチを付加するため、機能する３’非翻訳領域を含み；
ここで、プロモーターは、構造ＤＮＡ配列に関して異種であり、そしてＤＮＡ分
子により形質転換される植物細胞のグリホセート耐性を強化するためにコードさ
れたポリペプチドの十分な発現を引き起こすために適用される、工程；形質転換
された植物細胞を獲得する工程；およびグリホセートに対する耐性が増加した遺
伝学的に形質転換された植物を、形質転換された植物細胞から再生する工程を包
含する。
【００３４】
本発明はさらに、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする
遺伝子による形質転換の結果、グリホセート耐性である作物を、作物が農作物を
産出するような条件の元で生育させる工程；および作物から農作物を収穫する工
程を包含する、農作物の産生のための方法を提供する。これらの方法は、しばし
ば作物に対する雑草の制御に有効な濃度のグリホセートの適用を含む。例示的な
作物として、綿、トウモロコシ、およびダイズが挙げられる。
【００３５】
本発明はまた、配列番号１−５１４に対応する文字列を有する配列記録から構
成されるデータベースを含むコンピュータ、コンピュータで読み取り可能な媒体
、および集中型システムを提供する。上記の集中型システムは、互いにおよび／
または任意のさらなる核酸またはアミノ酸配列と共に、配列番号１−５１４に対
応する任意の一つ以上の文字列の選択、整列、翻訳、逆翻訳または閲覧のための
一つ以上の指示セットを必要に応じて含む。
【００３６】
（詳細な議論）
本発明は、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を示す新規のクラスの酵素に
関する。一つの局面において、本発明は、グリホセートおよびグリホセートアナ
ログをアセチル化できる新規のクラスの酵素（例えば、グリホセートＮ−トラン
スフェラーゼ（「ＧＡＴ」）活性を有する酵素）に関する。上記の酵素は、化合
物の２級アミンをアセチル化する能力によって特性付けされる。本発明のいくつ
かの局面において、化合物は図１に概略的に描かれるような除草剤（例えば、グ
リホセート）である。この化合物はまた、グリホセートアナログまたはグリホセ
ート分解による代謝産物（例えば、アミノメチルホスホン酸）であり得る。グリ
ホセートのアセチル化は、グリホセートの異化のための一つの代謝経路において
重要な触媒ステップであるが、天然に存在する酵素、単離された酵素、または組
換え型酵素によるグリホセートの酵素学的なアセチル化は、これまで記載されて
いない。従って、本発明の核酸およびポリペプチドは、除草剤抵抗性を移入する
ための新しい生化学的な経路を提供する。
【００３７】
一つの局面において、本発明は、ＧＡＴポリペプチドをコードする新規の遺伝
子を提供する。天然に存在するポリヌクレオチドに相当する単離されたＧＡＴポ
リヌクレオチドおよび組換え型ＧＡＴポリヌクレオチド、ならびに組換え型およ
び操作された（例えば、多様化された）ＧＡＴポリペプチドば、本発明の特徴で
ある。ＧＡＴポリヌクレオチドは、配列番号：１〜５および１１〜２６２によっ
て例示される。特異的ＧＡＴポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、本発
明の説明を助ける例示として提供され、そしてこれは、本明細書において記載さ
れるおよび／または特許請求されるＧＡＴポリヌクレオチドおよびポリペプチド
の種類の範囲を限定することを意図しない。
【００３８】
本発明はまた、改良されたおよび／または強化された特性（例えば、変更され
たグリホセートに対するＫｍ、増加された触媒作用速度、増加された安定性など
、本明細書に記載される新しいまたは改良された活性のためのライブラリーのポ
リヌクレオチド構成要素の選択に基づく）を有するＧＡＴポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを含むさらなるＧＡＴポリヌクレオチドを生成するための
多様化されるライブラリーを生成するおよび選択するための方法を提供する。上
記のポリヌクレオチドは、グリホセート抵抗性トランスジェニック植物の生成に
おいて特に都合よく使用される。
【００３９】
本発明のＧＡＴポリペプチドは、新規の酵素活性を示す。具体的には、合成除
草剤のグリホセートの酵素学的アセチル化は、本発明の以前には認められていな
かった。従って、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、配列番号：６〜
１０および２６３〜５１４によって例示される）は、インビボ（例えば、植物に
おいて）において機能するグリホセートの解毒のための新規の生化学的な経路を
規定する。
【００４０】
従って、本発明の核酸およびポリペプチドは、トランスジェニック植物におけ
る除草剤選択性の設計のための、新しい核酸、ポリペプチド、および生化学的経
路を提供することにより、グリホセート抵抗性植物の生成において意義深い重要
性を有する。
【００４１】
（定義）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の化合物または生物系に限定さ
れず、これらは当然、変動し得るということが理解されるべきである。本明細書
において使用される専門用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし
、そして限定することは意図しないこともまた理解されるべきである。本明細書
および添付の特許請求の範囲において使用される場合に、単数形の「ａ」、「ａ
ｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容がそうではないと明白に示さない限り、複
数の言及を含む。従って、例えば、「デバイス（ａ  ｄｅｖｉｃｅ）」との言及
は、２つ以上のこのようなデバイスの組み合わせを含み、「遺伝子融合構築物（
ａ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」、との言及は、構築物の
混合物を含む、などである。
【００４２】
他で定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用
語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されているのと同じ意味を
持つ。本明細書中において記載される類似または均等であるすべての方法および
材料は、本発明の試験のための業務において使用され得、適当な材料および方法
を使用する具体的な実施例が、本明細書中に記載される。
【００４３】
本発明の記載および特許請求において、下記のの専門用語は、以下に提示され
る定義に基づいて使用される。
【００４４】
本発明の目的のために、用語「グリホセート」は、任意の除草のため有効な形
態のＮ−ホスホノメチルグリシン（その任意の塩を含む）および植物（ｐｌａｎ
ｔａ）におけるグルホサートアニオン生成を生じるその他の形態を含むとみなさ
れるべきである。用語「グリホセートアナログ」は、グリホセートアナログが除
草のため有効であるレベルにＥＰＳＰＳを阻害するための能力を有する、グリホ
セート（ｇｌｙｐｈｏｓｔａｔｅ）の任意の構造上のアナログをいう。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「グリホセートＮ−アセチルトランスフェ
ラーゼ活性」または「ＧＡＴ活性」とは、例えば図１に図示されるように、グリ
ホセートの２級アミン基のアセチル化を触媒する能力をいう。「グリホセートＮ
−アセチルトランスフェラーゼ」または「ＧＡＴ」は、グリホセート、グリホセ
ートアナログ、および／またはグリホセートの主要な代謝産物（すなわち、ＡＭ
ＰＡまたはサルコシン）のアミン基のアセチル化を触媒する酵素である。本発明
のいくつかの好ましい実施形態において、ＧＡＴは、アセチル基をアセチルＣｏ
Ａからグリホセートの２級アミンおよびＡＭＰＡの１級アミンに転移し得る。本
明細書中に記載される例示的なＧＡＴは、ｐＨ５〜９において活性であり、ｐＨ
６．５〜８．０の範囲内で最適な活性を有する。活性は、当該分野で周知の種々
の速度論的パラメーター（例えば、ｋｃａｔ、ＫＭ、およびｋｃａｔ／ＫＭ）を
用いて定量化され得る。これらの速度論的パラメーターは、実施例７において以
下に記載されるように決定され得る。所定のポリヌクレオチドまたは相補的なポ
リヌクレオチドは、任意の特定されたヌクレオチド配列から決定され得る。
【００４６】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」および「核酸」は、ヌクレ
オチド（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、Ｇなど、または天然に存在するかもしくは人工的なヌ
クレオチドのアナログ）例えば関連する文脈に依存して、ＤＮＡまたはＲＮＡ、
あるいはそれらの表現（例えば、文字列など）のポリマーをいうために、使用さ
れる。
【００４７】
同様に、「アミノ酸配列」とは、アミノ酸のポリマー（タンパク質、ポリペプ
チドなど）または、アミノ酸ポリマーを意味する文字列であり、文脈に依存する
。用語「タンパク質」「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書中にお
いて交換可能に使用され得る。
【００４８】
ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは他の成分は、通常、それらが関連する
成分（他のタンパク質，核酸、細胞、合成試薬など）から部分的または完全に分
離される場合、「単離される」。核酸またはポリペプチドは、それが人工的もし
くは操作されたタンパク質または核酸である場合、または人工的または操作され
たタンパク質または核酸に由来する場合、「組換え」である。例えば、ベクター
または他のいずれかの異種位置に（例えば、組換え生物のゲノムに）挿入され、
その結果、天然に見い出されるような、そのポリヌクレオチドに通常隣接するヌ
クレオチド配列に関連しないポリヌクレオチドは、組換えポリヌクレオチドであ
る。インビトロまたはインビボにおいて組換えポリヌクレオチドから発現される
タンパク質は、組換えポリペプチドの例である。同様に、天然に見られないポリ
ヌクレオチド配列（例えば、天然に存在する遺伝子の改変体）は、組換えである
。
【００４９】
用語「グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼポリペプチド」および「
ＧＡＴポリペプチド」は、本明細書中に提供される新規のポリペプチドのファミ
リーのうちのいずれかをいうために互換的に用いられる。
【００５０】
用語「グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼポリヌクレオチド」およ
び「ＧＡＴポリヌクレオチド」は、ＧＡＴポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドをいうために互換的に用いられる。
【００５１】
「サブ配列」または「フラグメント」は、全配列の任意の部分である。
【００５２】
アミノ酸ポリマーまたはヌクレオチドポリマーの番号付けは、そのポリマーの
所定のモノマー成分（アミノ酸残基、組み込まれるヌクレオチドなど）の位置が
、選択される参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおいて同じ残基位置に
対応するとき、選択されるアミノ酸ポリマーまたは核酸の番号付けに対応する。
【００５３】
ベクターは、選択される核酸による細胞形質導入または細胞における核酸の発
現を促進するための組成物である。ベクターとしては、例えば、プラスミド、コ
スミド、ウイルス、ＹＡＣ、バクテリア、ポリ−リジン、染色体組込みベクター
、エピソームベクターなどが挙げられる。
【００５４】
「ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の実質的な全長」とは、配列の少
なくとも約７０％、一般的には配列の少なくとも約８０％、または代表的には配
列の約９０％以上をいう。
【００５５】
本明細書中に使用される場合、「抗体」とは、イムノグロブリン遺伝子または
イムノグロブリン遺伝子フラグメントによって実質的にまたは部分的にコードさ
れる１つ以上のポリペプチドを含むタンパク質をいう。認識されているイムノグ
ロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、な
らびに無数のイムノグロブリン可変領域遺伝子と同様にが挙げられる。軽鎖は、
κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεと
して分類され、これらは、それぞれ、順にイムノグロブリンクラス、ＩｇＧ、Ｉ
ｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。代表的なイムノグロブリン（抗
体）構造単位は、テトラマーを含む。それぞれのテトラマーは、ポリペプチド鎖
の２つの同一のペア（それぞのペアは１つの「軽鎖」（約２５ｋＤ）および１つ
の「重鎖」（約５０ｋＤ〜７０ｋＤ）を有する）より構成される。それぞれの鎖
のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００から１１０以上のアミノ酸の可変領域
を規定する。用語、可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）は、それぞれ、こ
れらの軽鎖および重鎖をいう。抗体は、インタクトなイムノグロブリンとして、
または様々なぺプチダーゼによる消化によって生成され十分特徴付けられた多々
のフラグメントとして存在する。それゆえ、例えば、ペプシンは、それ自体ジス
ルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合する軽鎖であるＦａｂのダイマー（Ｆ
（ａｂ）’２）を生成するために、ヒンジ領域におけるジスルフィド連結のもと
で抗体を消化する。Ｆ（ａｂ）’２は、温和な条件下においてヒンジ領域におけ
るジスルフィド連結を還元して壊し得、それによって（Ｆａｂ’）２ダイマーは
Ｆａｂ’モノマーに変換される。Ｆａｂ’モノマーは、事実上、ヒンジ領域の一
部を有するＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳細な説明に関しては、
Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ（
編），Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）を参照）。様々な抗体フ
ラグメントは、インタクトな抗体の消化によって定義されるが、当業者は、この
ようなＦａｂ’フラグメントが、化学的にまたは組換えＤＮＡ方法論のいずれか
を用いることによって新規に合成され得ることを理解する。それゆえ、用語抗体
はまた、本明細書中に使用される場合、全抗体の改変によって産生されるかまた
は組換えＤＮＡ方法論を用いて新規に合成されるかのいずれかである、抗体フラ
グメントを包含する。抗体としては、一本鎖抗体（可変重鎖および可変軽鎖が、
連続したポリペプチドを形成するように一緒に連結する（直接にまたはペプチド
リンカーを通して）一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）抗体を含む）が挙げられる。
【００５６】
「クロロプラスト移行ペプチド（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｉｔ  
ｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、タンパク質に結合して翻訳されるアミノ酸配列であり
、タンパク質が生成される細胞において存在するクロロプラストまたは他の色素
体型にタンパク質を方向付ける。「クロロプラスト移行配列」とは、クロロプラ
スト移行ペプチドをコードするヌクレオチド配列をいう。
【００５７】
「シグナルペプチド」とは、タンパク質に結合して翻訳されるアミノ酸配列で
あり、タンパク質を分泌系へ方向付ける（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ，Ｊ．Ｊ．，（
１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．４２：２１−５３）。タンパク質が液胞に方向付けられる場合、液胞標的
化シグナル（前出）がさらに付け加えられ得、あるいは、小胞体に方向付けられ
れる場合、小胞体保持シグナル（前出）が付け加えられ得る。タンパク質が核に
方向付けられる場合、存在するいかなるシグナルペプチドもが取り除かれ、代わ
りに核局在化シグナルが含まれるべきである（Ｒａｉｋｈｅｌ，Ｎ．（１９９２
）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．１００：１６２７−１６３２）。
【００５８】
ポリヌクレオチドに対して適用される用語「多様化」および「多様性」とは、
親のポリヌクレオチドの複数の改変形態の生成、または複数の親のポリヌクレオ
チドの複数の改変形態の生成をいう。ポリヌクレオチドがポリペプチドをコード
する場合、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列における多様性は、コードされ
る対応するポリペプチドに多様性（例えば、複数のポリペプチド改変体をコード
するポリヌクレオチドの多様なプール）を生み出し得る。本発明のいくつかの実
施形態において、この配列多様性は、望ましい機能的属性を有する改変体に対す
る多様化したポリヌクレオチド（例えば、増強した機能特性を有するＧＡＴポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド）のライブラリーをスクリーニング／選
択することによって得られる。
【００５９】
用語「コードする」とは、１つ以上のアミノ酸をコードするためのヌクレオチ
ド配列の能力をいう。この用語は、開始コドンまたは終止コドンを必要としない
。アミノ酸配列は、ポリヌクレオチド配列およびその相補鎖によって提供される
６つの異なるリーディングフレームのいずれか１つにおいてコードされ得る。
【００６０】
本明細書中に使用される場合、用語「人工的改変体」とは、改変されたＧＡＴ
ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１〜５および１１〜２６２、または生物か
ら単離された天然に存在するＧＡＴポリヌクレオチドのいずれか１つの改変され
た形態）によってコードされる、ＧＡＴ活性を有するポリペプチドをいう。改変
されたポリヌクレオチドは（これは、適切な宿主において発現される場合人工的
改変体がそこから産生される）、ＧＡＴポリヌクレオチドの改変による人為的介
入を通して得られる。
【００６１】
用語「核酸構築物」または「ポリヌクレオチド構築物」は、一本鎖または二本
鎖のいずれかの核酸分子を意味し、これは、天然に存在する遺伝子から単離され
るか、または他に天然に存在しない様式で核酸のセグメントを含むように改変さ
れている。用語核酸構築物は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に必要で
ある制御配列を含む場合、用語「発現カセット」と同義である。
【００６２】
用語「制御配列」は、本明細書中において、本発明のポリペプチドの発現に必
要または有利な全ての成分を含むように規定される。それぞれの制御配列は、ポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してネイティブであっても外来で
あってもよい。このような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、
プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネ
ーターが挙げられるが、これらに限定されない。制御配列は、最小でプロモータ
ーならびに転写終止シグナルおよび翻訳終止シグナルを包含する。制御配列は、
制御配列とポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域との連結を
促進する特異的制限部位を導入するためのリンカーを備え得る。
【００６３】
用語「作動可能に連結された」は、本明細書中において、制御配列がポリペプ
チドの発現を誘導するように、制御配列が、ＤＮＡ配列のコード配列に対応する
位置に適切に配置される立体配置として定義される。
【００６４】
本明細書中に使用される場合、用語「コード配列」は、そのタンパク質産物の
アミノ酸配列を直接特定するヌクレオチド配列をカバーすることを意図する。コ
ード配列の境界は、一般的に、通常ＡＴＧ開始コドンから始まるオープンリーデ
ィングフレームによって決定される。コード配列は、代表的に、ＤＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、および／または組換えヌクレオチド配列を包む。
【００６５】
本文脈において、用語「発現」は、ポリペプチドの産生に関与するいかなる工
程も包含し、この工程としては、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および
分泌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本文脈において、用語「発現ベクター」は、本発明のポリペプチドをコードす
るセグメントを含む、線状ＤＮＡ分子または環状ＤＮＡ分子をカバーし、これは
、その転写を提供するさらなるセグメントに作動可能に連結する。
【００６７】
本明細書中に使用される場合、用語「宿主細胞」は、核酸構築物での形質転換を受
けやすい任意の細胞型を含む。
【００６８】
用語「植物」は、全植物、苗状の栄養器官／構造（例えば、葉、茎、および塊
茎）、根、花および花器官／構造（例えば、包葉、萼片、花弁、おしべ、心皮、
やく、および胚珠）、種子（胚、内乳、および種皮を含む）および果実（成熟子
房）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）および細胞（例えば、孔
辺細胞、卵細胞、突起様構造など）、ならびにそれらの子孫を包含する。本発明
の方法において用いられ得る植物のクラスは、一般的に、被子植物（単子葉植物
および双子葉植物）、裸子植物、シダ、および多細胞性藻類を含む形質転換技術
の影響を受けやすい、高等植物および下等植物のクラスほど広く、異数体、倍数
体、二倍体、半数体および半接合体を含む様々な倍数性レベルの植物を包含する
。
【００６９】
本明細書中に使用される場合、用語「異種」は、一方のエレメントがもう一方
のエレメントに近接して天然においては通常見い出されないことを示す２つ以上
のエレメント間の関係を記載する。それゆえ、例えば、ポリヌクレオチド配列が
外来種に由来する場合、または同種に由来するポリヌクレオチド配列がその元の
形態から変更されている場合、そのポリヌクレオチ配列は生物または第二のポリ
ヌクレオチド配列に対して「異種」である。例えば、異種コード配列に作動可能
に連結しているプロモーターとは、プロモーターが由来する種とは異なる種に由
来するコード配列をいうか、または同種に由来するコード配列である場合、その
プロモーターに天然には関連しないコード配列（例えば、遺伝子操作されたコー
ド配列または異なる生態型もしくは変種に由来する対立遺伝子）をいう。異種の
ポリペプチドの例としては、トランスジェニック生物における組換えポリヌクレ
オチドから発現したポリペプチドが挙げられる。異種ポリヌクレオチドおよび異
種ポリペプチドは、組換え分子の形態をとる。
【００７０】
さらなる様々な用語が、本明細書中において定義されるか、そうでなければ特
徴付けられる。
（グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ）
１つの局面において、本発明は、単離された酵素または組換え酵素の新規ファ
ミリー（本明細書中において「グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ」
、「ＧＡＴ」、または「ＧＡＴ酵素」と称される）を提供する。ＧＡＴは、ＧＡ
Ｔ活性を有する酵素であり、好ましくは、ＧＡＴを発現するように操作されたト
ランスジェニック植物に対しある程度のグリホセート耐性を与えるための十分な
活性を有する酵素である。ＧＡＴのいくつかの例としては、以下により詳細に記
載されるＧＡＴポリペプチドが挙げられる。
【００７１】
当然、ＧＡＴを介するグリホセート耐性は、ＧＡＴ活性、トランスジェニック
植物におけるＧＡＴ発現レベル、特定の植物、除草剤適用の性質およびタイミン
グなどの複合した機能である。当業者は、特定の状況においてグリホセート耐性
をもたらすのに必要なＧＡＴ活性のレベルを過度の実験なしに決定し得る。
【００７２】
ＧＡＴ活性は、慣習的な動的パラメータである、ｋｃａｔ、ＫＭ、およびｋｃ
ａｔ／ＫＭを用いて特徴付けられ得る。ｋｃａｔは、特に高基質濃度における、
アセチル化の速度の基準として考えられ、ＫＭは、その基質（例えば、アセチル
ＣｏＡおよびグリホセート）に対するＧＡＴの親和性の基準であり、そしてｋｃ
ａｔ／ＫＭは、基質親和性および触媒速度の両方を考慮に入れる触媒効果の基準
である（このパラメータは、基質の濃度が少なくとも部分的に律速段階である状
況において特に重要である）。一般的に、より高いｋｃａｔまたはｋｃａｔ／Ｋ
Ｍを有するＧＡＴは、より低いｋｃａｔまたはｋｃａｔ／ＫＭを有する別のＧＡ
Ｔよりも効率の良い触媒である。より低いＫＭを有するＧＡＴは、より高いＫＭ
を有する別のＧＡＴよりも効率の良い触媒である。それゆえ、当業者は、一方の
ＧＡＴが別のＧＡＴより効率が良いかどうかを決定するために２つの酵素につい
ての動的パラメータを比較し得る。ｋｃａｔ、ｋｃａｔ／ＫＭおよびＫＭの相対
的重要性は、ＧＡＴが機能することが予想される状況（例えば、グリホセートに
関するＫＭに対し予想されるグリホセートの有効濃度）に依存して変化する。Ｇ
ＡＴ活性はまた、多くの機能特性（例えば、安定性、阻害に対する感受性、また
は他の分子による活性化など）のいずれかによって特徴づけられ得る。
【００７３】
（グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼポリペプチド）
１つの局面において、本発明は、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペ
プチドの新規ファミリー（本明細書中において「グリホセートＮ−アセチルトラ
ンスフェラーゼポリペプチド」または「ＧＡＴポリペプチド」と称される）を提
供する。ＧＡＴポリペプチドは、ＧＡＴの新規ファミリーに対するそれらの構造
的類似性によって特徴付けられる。全てではないが多くのＧＡＴポリペプチドは
、ＧＡＴである。その特質は、ＧＡＴポリペプチドが構造によって定義されるの
に対し、ＧＡＴは機能によって定義される。ＧＡＴポリペプチドの一部は、好ま
しくは、効果的なレベルでこのタンパク質を発現するトランスジェニック植物に
対してグリホセート耐性を与えるよう機能するレベルのＧＡＴ活性を有するＧＡ
Ｔポリペプチドを含む。グリホセート耐性を与える際に使用するためのいくつか
の好ましいＧＡＴポリペプチドは、少なくとも１ｍｉｎ−１のｋｃａｔ、または
より好ましくは少なくとも１０ｍｉｎ−１、１００ｍｉｎ−１、または１０００
ｍｉｎ−１のｋｃａｔを有する。グリホセート耐性を与える際に使用する他の好
ましいＧＡＴポリペプチドは、１００ｍＭ程度のＫＭ、またはより好ましくは１
０ｍＭ、１ｍＭもしくは０．１ｍＭ以下のＫＭ、を有する。グリホセート耐性を
与える際に使用するための、さらなる他の好ましいＧＡＴポリペプチドは、少な
くとも１ｍＭ−１ｍｉｎ−１以上のｋｃａｔ／ＫＭ、またはより好ましくは少な
くとも１０ｍＭ−１ｍｉｎ−１、１００ｍＭ−１ｍｉｎ−１、１０００ｍＭ−１
ｍｉｎ−１、または１０，０００ｍＭ−１ｍｉｎ−１のｋｃａｔ／ＫＭを有する
。
【００７４】
代表的なＧＡＴポリペプチドは、様々なバクテリア株から単離され、そして特
徴付けられてきた。単離され、そして特徴付けられたモノマーのＧＡＴポリペプ
チドの１つの例は、約１７ｋＤの分子ラジウス（ｒａｄｉｕｓ）を有する。Ｂ．
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓから単離された代表的なＧＡＴ酵素（配列番号７）
は、グリホセートに関し約２．９ｍＭのＫｍを示し、アセチルＣｏＡに関し約２
μＭのＫｍを示す（６ｍｉｎ−１のｋｃａｔを有す）。
【００７５】
用語「ＧＡＴポリペプチド」とは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギ
ャップ存在ペナルティ、および１つのギャップ伸長ペナルティを用い、配列番号
６〜１０および２６３〜５１４からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少な
くとも４３０の類似性スコアを生み出すように最適にアライメントされ得るアミ
ノ酸配列を含む、任意のポリペプチドをいう。本発明のいくつかの局面は、ＢＬ
ＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギャップ存在ペナルティ、１つのギャップ伸
長ペナルティを用い、配列番号６〜１０および２６３〜５１４からなる群より選
択されるアミノ酸配列と、少なくとも、４４０、４４５、４５０、４５５、４６
０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０
５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５
０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９
５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４
０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８
５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３
０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、または７６０の類似性スコアを
生み出すように最適にアライメントされ得るアミノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペ
プチドに関連する。
【００７６】
本発明の１つの局面は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギャップ存在
ペナルティ、および１つのギャップ伸長ペナルティを用い、配列番号４５７と、
少なくとも４３０の類似性スコアを生み出すように最適にアライメントされ得る
アミノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連する。本発明のいくつかの局面
は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギャップ存在ペナルティ、および１
つのギャップ伸長ペナルティを用い、配列番号４５７と、少なくとも、４４０、
４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、
４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、
５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、
５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、
６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、
６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、
７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、
または７６０の類似性スコアを生み出すように最適にアライメントされ得るアミ
ノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連する。
【００７７】
本発明の１つの局面は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギャップ存在
ペナルティ、および１つのギャップ伸長ペナルティを用い、配列番号４４５と、
少なくとも４３０の類似性スコアを生み出すように最適にアライメントされ得る
アミノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連する。本発明のいくつかの局面
は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギャップ存在ペナルティ、および１
つのギャップ伸長ペナルティを用い、配列番号４４５と、少なくとも、４４０、
４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、
４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、
５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、
５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、
６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、
６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、
７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、
または７６０の類似性スコアを生み出すように最適にアライメントされ得るアミ
ノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連する。
【００７８】
本発明の１つの局面は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギャップ存在
ペナルティ、および１つのギャップ伸長ペナルティを用い、配列番号３００と、
少なくとも４３０の類似性スコアを生み出すように最適にアライメントされ得る
アミノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連する。本発明のいくつかの局面
は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギャップ存在ペナルティ、および１
つのギャップ伸長ペナルティを用い、配列番号３００と、少なくとも、４４０、
４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、
４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、
５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、
５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、
６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、
６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、
７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、
または７６０の類似性スコアを生み出すように最適にアライメントされ得るアミ
ノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連する。
【００７９】
２つの配列は、規定されたアミノ酸置換マトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ
６２）、ギャップ存在ペナルティ、およびギャップ伸長ペナルティを用い、配列
のそのペアに関して可能な最も高いスコアに到達するように、類似性スコア付け
に関してそれらをアライメントする場合、「最適にアライメントされる」。２つ
の配列間の類似性を定量する際のアミノ酸置換マトリックスおよびそれらの使用
は、当該分野において周知であり、例えば、「Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」５巻、補遺３（Ｍ．Ｏ．
Ｄａｙｈｏｆｆ編）、３４５頁−３５２頁、Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．
Ｆｏｕｎｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣにおけるＤａｙｈｏｆｆら（１９７８
）「Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  
ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」、およびＨｅｎｉｋｏｆｆら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９に記載される
。ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（図１０）は、しばしば、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬ
ＡＳＴ  ２．０のような配列アライメントプロトコールにおけるデフォルトスコ
ア付け置換マトリックスとして使用される。ギャップ存在ペナルティは、アライ
メントされた配列の１つにおいて１つのアミノ酸ギャップの導入を課し、ギャッ
プ伸長ペナルティは、すでに開かれたギャップに挿入されたそれぞれの付加的な
空のアミノ酸位置を課す。アライメントは、アライメントの始まりから終わりま
でのそれぞれの配列のアミノ酸位置によって規定され、必要に応じて、最も高い
可能なスコアに到達するための１つまたは両方の配列における１つのギャップま
たは複数のギャップの挿入によって規定される。最適なアライメントおよびスコ
ア付けが手動で達成され得る一方、このプロセスは、コンピュータ実行アライメ
ントアルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載され、Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ  Ｗｅｂｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏ
ｖ）にて公に利用可能なｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ２．０）の使用によって促
進される。複数のアライメントを含む最適なアライメントは、例えばｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを通して利用可能であり、Ａｌ
ｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３
８９−３４０２に記載されているＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて整えられ得る。
【００８０】
参照配列と最適にアライメントされるアミノ酸配列に関して、アミノ酸残基は
、その残基がアライメントにおいてペアをなす参照配列の位置に「対応する」。
「位置」は、Ｎ末端に対する位置に基づいて、参照配列において連続的にそれぞ
れのアミノ酸を同定する数字によって示される。例えば、配列番号３００におい
て、位置１はＭ、位置２はＩ、位置３はＥなどである。あるテスト配列が配列番
号３００と最適にアライメントされる場合、位置３のＥとアライメントするテス
ト配列の残基は、配列番号３００の「位置３に対応する」といわれる。最適アラ
イメントを決定する際考慮に入れられるべき欠失、挿入、短縮、融合などのため
に、一般的に、単純にＮ末端から数えられることによって決定されるテスト配列
におけるアミノ酸残基番号が参照配列におけるその対応位置の番号と同じである
必要はない。例えば、アライメントされたテスト配列において欠失がある場合、
欠失部位において、参照配列中の位置に対応するアミノ酸は存在しない。アライ
メントされた参照配列において挿入がある場合、挿入は、参照配列におけるいか
なるアミノ酸位置にも対応しない。短縮または融合の場合には、対応配列におけ
るいかなるアミノ酸にも対応しない参照配列またはアライメントされた配列のど
ちらかにおけるアミノ酸のストレッチが存在し得る。
【００８１】
用語「ＧＡＴポリペプチド」とはさらに、配列番号６〜１０および２６３〜５
１４からなる群より選択されるアミノ酸配列に関して少なくとも４０％の配列同
一性を有するアミノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連する。本発明のい
くつかの局面は、配列番号６〜１０および２６３〜５１４からなる群より選択さ
れるアミノ酸に関して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９
５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配
列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連する。
【００８２】
本発明の１つの局面は、配列番号４５７に関して少なくとも４０％の配列同一
性を有するアミノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連する。本発明のいく
つかの局面は、配列番号４５７に関して少なくとも６０％、７０％、８０％、９
０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を
有するアミノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連する。
【００８３】
本発明の１つの局面は、配列番号４４５に関して少なくとも４０％の配列同一
性を有するアミノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連する。本発明のいく
つかの局面は、配列番号４４５に関して少なくとも６０％、７０％、８０％、９
０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を
有するアミノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連する。
【００８４】
本発明の１つの局面は、配列番号３００に関して少なくとも４０％の配列同一
性を有するアミノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連する。本発明のいく
つかの局面は、配列番号３００に関して少なくとも６０％、７０％、８０％、９
０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を
有するアミノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連する。
【００８５】
用語「ＧＡＴポリペプチド」とはさらに、配列番号６〜１０および２６３〜５
１４からなる群より選択されるアミノ酸の１〜９６残基に関して少なくとも４０
％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む任意ののポリペプチドをいう。本発
明のいくつかの局面は、配列番号６〜１０および２６３〜５１４からなる群より
選択されるアミノ酸の１〜９６残基に関して少なくとも６０％、７０％、８０％
、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一
性を有するアミノ酸配列を含むＧＡＴポリペプチドに関連する。
【００８６】
本発明の１つの局面は、配列番号４５７の１〜９６残基に関して少なくとも４
０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドに関連する。本発
明のいくつかの局面は、配列番号４５７の１〜９６残基に関して少なくとも６０
％，７０％，８０％，９０％，９２％，９５％，９６％，９７％，９８％，また
は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＡＴポリペプチドに関連す
る。
【００８７】
本発明の１つの局面は、配列番号４４５の１〜９６残基に関して少なくとも４
０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連する
。本発明のいくつかの局面は、配列番号４４５の１〜９６残基に関して少なくと
も６０％，７０％，８０％，９０％，９２％，９５％，９６％，９７％，９８％
，または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＡＴポリペプチドに
関連する。
【００８８】
本発明の１つの局面は、配列番号３００の１〜９６残基に関して少なくとも４
０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連する
。本発明のいくつかの局面は、配列番号３００の１〜９６残基に関して少なくと
も６０％，７０％，８０％，９０％，９２％，９５％，９６％，９７％，９８％
，または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＡＴポリペプチドに
関連する。
【００８９】
用語「ＧＡＴポリペプチド」とはさらに、配列番号６〜１０および２６３〜５
１４からなる群より選択されるアミノ酸の５１〜１４６残基に関して少なくとも
４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む任意のポリペプチドをいう。本
発明のいくつかの局面は、配列番号６〜１０および２６３〜５１４からなる群よ
り選択されるアミノ酸の５１〜１４６残基に関して少なくとも６０％、７０％、
８０％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配
列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに関連する。
【００９０】
本発明の１つの局面は、配列番号４５７の５１〜１４６残基に関して少なくと
も４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドに関連する。
本発明のいくつかの局面は、配列番号４５７の５１〜１４６残基に関して少なく
とも６０％，７０％，８０％，９０％，９２％，９５％，９６％，９７％，９８
％，または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＡＴポリペプチド
に関連する。
【００９１】
本発明の１つの局面は、配列番号４４５の５１〜１４６残基に関して少なくと
も４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連
する。本発明のいくつかの局面は、配列番号４４５の５１〜１４６残基に関して
少なくとも６０％，７０％，８０％，９０％，９２％，９５％，９６％，９７％
，９８％，または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＡＴポリペ
プチドに関連する。
【００９２】
本発明の１つの局面は、配列番号３００の５１〜１４６残基に関して少なくと
も４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＧＡＴポリペプチドに関連
する。本発明のいくつかの局面は、配列番号３００の５１〜１４６残基に関して
少なくとも６０％，７０％，８０％，９０％，９２％，９５％，９６％，９７％
，９８％，または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＡＴポリペ
プチドに関連する。
【００９３】
本明細書中に使用される場合、用語「同一性」または「同一性百分率」とは、
アライメントされたアミノ酸配列の特定ペアに関して用いられる場合、Ｅｕｒｏ
ｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ，ＵＫより利用可能なＣｌｕｓｔａｌＷ解析（バージョンＷ１．８）（ア
ライメントにおける同一な適合の数を数え、このような同一な適合の数を最大の
（ｉ）アライメントされた配列の長さ、および最大の（ｉｉ）９６の長さによっ
て除算し、スロウ／アキュレートペアワイズアライメントを達成するために以下
のデフォルトＣｌｕｓｔａｌＷパラメーター：ギャップオープンペナルティ：１
０；ギャップ伸長ペナルティー：０．１０；タンパク質重量マトリックス：Ｇｏ
ｎｎｅｔ  ｓｅｒｉｅｓ；ＤＮＡ重量マトリックス：ＩＵＢ；Ｔｏｇｇｌｅ  Ｓ
ｌｏｗ／Ｆａｓｔ  ペアワイズアライメント＝ＳＬＯＷ  ｏｒ  ＦＵＬＬ  Ａｌ
ｉｇｎｍｅｎｔを使用する）によって得られるアミノ酸配列同一性百分率をいう
。
【００９４】
別の局面において、本発明は、配列番号６〜１０および２６３〜５１４よりな
る群から選択されるアミノ酸配列の、少なくとも２０、あるいは５０、７５、１
００、１２５または１４０の連続したアミノ酸を含む、単離されたポリペプチド
または組換えポリペプチドを提供する。
【００９５】
別の局面において、本発明は、配列番号４５７の、少なくとも２０、あるいは
５０、１００、または１４０の連続したアミノ酸を含む、単離されたポリペプチ
ドまたは組換えポリペプチドを提供する。
【００９６】
別の局面において、本発明は、配列番号４４５の、少なくとも２０、あるいは
５０、１００、または１４０の連続したアミノ酸を含む、単離されたポリペプチ
ドまたは組換えポリペプチドを提供する。
【００９７】
別の局面において、本発明は、配列番号３００の、少なくとも２０、あるいは
５０、１００、または１４０の連続したアミノ酸を含む、単離されたポリペプチ
ドまたは組換えポリペプチドを提供する。
【００９８】
もう一つの局面において、本発明は配列番号６〜１０および配列番号２６３〜
５１４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００９９】
いくつかの好ましい本発明のＧＡＴポリペプチドは、以下のように特徴付けら
れる。必要に応じて、配列番号６〜１０および配列番号２６３〜５１４からなる
群から選択される参照アミノ酸配列とアライメントした場合、ポリペプチド中の
、以下の位置に対応するアミノ酸残基のうち少なくとも９０％は、以下の制約に
従う：（ａ）２位、４位、１５位、１９位、２６位、２８位、３１位、４５位、
５１位、５４位、８６位、９０位、９１位、９７位、１０３位、１０５位、１０
６位、１１４位、１２３位、１２９位、１３９位、および／または１４５位で、
アミノ酸残基はＢ１である；ならびに（ｂ）３位、５位、８位、１０位、１１位
、１４位、１７位、１８位、２４位、２７位、３２位、３７位、３８位、４７位
、４８位、４９位、５２位、５７位、５８位、６１位、６２位、６３位、６８位
、６９位、７９位、８０位、８２位、８３位、８９位、９２位、１００位、１０
１位、１０４位、１１９位、１２０位、１２４位、１２５位、１２６位、１２８
位、１３１位、１４３位、および／または１４４位で、アミノ酸残基はＢ２であ
る；ここで、Ｂ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択
されるアミノ酸であり；Ｂ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、Ｓ、
およびＴからなる群から選択されるアミノ酸である。アミノ酸またはアミノ酸残
基を特定するために使用するとき、一文字表記Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ
、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹは、当該技術分野中
で使用されるような、そして本明細書中の表２において提供されるような標準的
な意味を有する。
【０１００】
いくつかの好ましい本発明のＧＡＴポリペプチドは、以下のように特徴付けら
れる。必要に応じて、配列番号６〜１０および配列番号２６３〜５１４からなる
群から選択される参照アミノ酸配列とアライメントした場合、ポリペプチド中の
、以下の位置に対応するアミノ酸残基の少なくとも８０％は、以下の制約に従う
：（ａ）２位、４位、１５位、１９位、２６位、２８位、５１位、５４位、８６
位、９０位、９１位、９７位、１０３位、１０５位、１０６位、１１４位、１２
９位、１３９位、および／または１４５位で、アミノ酸残基はＺ１である；（ｂ
）３１位および／または４５位で、アミノ酸残基はＺ２である；（ｃ）８位およ
び／または８９位で、アミノ酸残基はＺ３である；（ｄ）８２位、９２位、１０
１位、および／または１２０位で、アミノ酸残基はＺ４である；（ｅ）３位、１
１位、２７位、および／または７９位で、アミノ酸残基はＺ５である；（ｆ）１
２３位で、アミノ酸残基はＺ１またはＺ２である；（ｇ）１２位、３３位、３５
位、３９位、５３位、５９位、１１２位、１３２位、１３５位、１４０位、およ
び／または１４６位で、アミノ酸残基はＺ１またはＺ３である；（ｈ）３０位で
、アミノ酸残基はＺ１またはＺ４である；（ｉ）６位で、アミノ酸残基はＺ１ま
たはＺ６である；（ｊ）８１位および／または１１３位で、アミノ酸残基はＺ２
またはＺ３である；（ｋ）１３８位および／または１４２位で、アミノ酸残基は
Ｚ２またはＺ４；（ｌ）５位、１７位、２４位、５７位、６１位、１２４位、お
よび／または１２６位で、アミノ酸残基はＺ３またはＺ４である；（ｍ）１０４
位で、アミノ酸残基はＺ３またはＺ５である；（ｏ）３８位、５２位、６２位、
および／または６９位で、アミノ酸残基はＺ３またはＺ６である；（ｐ）１４位
、１１９位および／または１４４位で、アミノ酸残基はＺ４またはＺ５である；
（ｑ）１８位で、アミノ酸残基はＺ４またはＺ６である；（ｒ）１０位、３２位
、４８位、６３位、８０位および／または８３位で、アミノ酸残基はＺ５または
Ｚ６である；（ｓ）４０位で、アミノ酸残基はＺ１、Ｚ２またはＺ３である；（
ｔ）６５位および／または９６位で、アミノ酸残基はＺ１、Ｚ３またはＺ５であ
る；（ｕ）８４位および／または１１５位で、アミノ酸残基はＺ１、Ｚ３または
Ｚ４である；（ｖ）９３位で、アミノ酸残基はＺ２、Ｚ３またはＺ４である；（
ｗ）１３０位で、アミノ酸残基はＺ２、Ｚ４またはＺ６である；（ｘ）４７位お
よび／または５８位で、アミノ酸残基はＺ３、Ｚ４またはＺ６である；（ｙ）４
９位、６８位、１００位および／または１４３位で、アミノ酸残基はＺ３、Ｚ４
またはＺ５である；（ｚ）１３１位で、アミノ酸残基はＺ３、Ｚ５またはＺ６で
ある；（ａａ）１２５位および／または１２８位で、アミノ酸残基はＺ４、Ｚ５
またはＺ６である；（ａｂ）６７位で、アミノ酸残基はＺ１、Ｚ３、Ｚ４または
Ｚ５；（ａｃ）６０位で、アミノ酸残基はＺ１、Ｚ４、Ｚ５またはＺ６である；
ならびに（ａｄ）３７位で、アミノ酸残基はＺ３、Ｚ４、Ｚ５またはＺ６である
；ここでＺ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸
であり；Ｚ２は、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｚ３は、Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ４
は、Ｒ、Ｈ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ５は、Ｄお
よびＥからなる群から選択されるアミノ酸であり；ならびにＺ６は、Ｃ、Ｇ、お
よびＰからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１０１】
いくつかの好ましい本発明のＧＡＴポリペプチドは、以下のように特徴付けら
れる。必要に応じて、配列番号６〜１０および配列番号２６３〜５１４からなる
群から選択される参照アミノ酸配列とアライメントした場合、ポリペプチド中の
、以下の位置に対応するアミノ酸残基の少なくとも９０％は、以下の制約に従う
：（ａ）１位、７位、９位、１３位、２０位、３６位、４２位、４６位、５０位
、５６位、６４位、７０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位
、１０７位、１１０位、１１７位、１１８位、１２１位、および／または１４１
位で、アミノ酸残基はＢ１である；ならびに（ｂ）１６位、２１位、２２位、２
３位、２５位、２９位、３４位、４１位、４３位、４４位、５５位、６６位、７
１位、７３位、７４位、７７位、８５位、８７位、８８位、９５位、９９位、１
０２位、１０８位、１０９位、１１１位、１１６位、１２２位、１２７位、１３
３位、１３４位、１３６位、および／または１３７位で、アミノ酸残基はＢ２で
ある；ここでＢ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選
択されるアミノ酸残基である；そしてＢ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ
、Ｋ、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸残基である。
【０１０２】
いくつかの好ましい本発明のＧＡＴポリペプチドは、以下のように特徴付けら
れる。必要に応じて、配列番号６〜１０および配列番号２６３〜５１４からなる
群から選択される参照アミノ酸配列とアライメントした場合、ポリペプチド中の
、以下の位置に対応するアミノ酸残基の少なくとも９０％は、以下の制約に従う
：（ａ）１位、７位、９位、２０位、３６位、４２位、５０位、６４位、７２位
、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、１１０位、１２１位、および／ま
たは１４１位で、アミノ酸残基はＺ１である；（ｂ）１３位、４６位、５６位、
７０位、１０７位、１１７位、および／または１１８位で、アミノ酸残基はＺ２
である；（ｃ）２３位、５５位、７１位、７７位、８８位、および／または１０
９位で、アミノ酸残基はＺ３である；（ｄ）１６位、２１位、４１位、７３位、
８５位、９９位、および／または１１１位で、アミノ酸残基はＺ４である；（ｅ
）３４位および／または９５位で、アミノ酸残基はＺ５である；（ｆ）２２位、
２５位、２９位、４３位、４４位、６６位、７４位、８７位、１０２位、１０８
位、１１６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３６位、および／
または１３７位で、アミノ酸残基はＺ６である；ここでＺ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ
、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である；Ｚ２はＦ、Ｗ、およびＹ
からなる群から選択されるアミノ酸である；Ｚ３はＮ、Ｑ、Ｓ、およびＴからな
る群から選択されるアミノ酸である；Ｚ４はＲ、Ｈ、およびＫからなる群から選
択されるアミノ酸である；Ｚ５はＤおよびＥからなる群から選択されるアミノ酸
である；そしてＺ６は、Ｃ、Ｇ、およびＰからなる群から選択されるアミノ酸で
ある。
【０１０３】
いくつかの好ましい本発明のＧＡＴポリペプチドは、以下のように特徴付けら
れる。必要に応じて、配列番号６〜１０および配列番号２６３〜５１４からなる
群から選択される参照アミノ酸配列とアライメントした場合、ポリペプチド中で
、以下の位置に対応するアミノ酸残基の少なくとも８０％が以下の制約に従う：
（ａ）２位で、アミノ酸残基はＩまたはＬである；（ｂ）３位で、アミノ酸残基
はＥまたはＤである；（ｃ）４位で、アミノ酸残基はＶ、ＡまたはＩである；（
ｄ）５位で、アミノ酸残基はＫ、ＲまたはＮである；（ｅ）６位で、アミノ酸残
基はＰまたはＬである；（ｆ）８位で、アミノ酸残基はＮ、ＳまたはＴである；
（ｇ）１０位で、アミノ酸残基はＥまたはＧである；（ｈ）１１位で、アミノ酸
残基はＤまたはＥである；（ｉ）１２位で、アミノ酸残基はＴまたはＡである；
（ｊ）１４位で、アミノ酸残基はＥまたはＫである；（ｋ）１５位で、アミノ酸
残基はＩまたはＬである；（ｌ）１７位で、アミノ酸残基はＨまたはＱである；
（ｍ）１８位で、アミノ酸残基はＲ、ＣまたはＫである；（ｎ）１９位で、アミ
ノ酸残基はＩまたはＶである；（ｏ）２４位で、アミノ酸残基はＱまたはＲであ
る；（ｐ）２６位で、アミノ酸残基はＬまたはＩである；（ｑ）２７位で、アミ
ノ酸残基はＥまたはＤである；（ｒ）２８位で、アミノ酸残基はＡまたはＶであ
る；（ｓ）３０位で、アミノ酸残基はＫ、ＭまたはＲである；（ｔ）３１位で、
アミノ酸残基はＹまたはＦである；（ｕ）３２位で、アミノ酸残基はＥまたはＧ
である；（ｖ）３３位で、アミノ酸残基はＴ、ＡまたはＳである；（ｗ）３５位
で、アミノ酸残基はＬ、ＳまたはＭである；（ｘ）３７位で、アミノ酸残基はＲ
、Ｇ、ＥまたはＱである；（ｙ）３８位で、アミノ酸残基はＧまたはＳである；
（ｚ）３９位で、アミノ酸残基はＴ、ＡまたはＳである；（ａａ）４０位で、ア
ミノ酸残基はＦ、ＬまたはＳである；（ａｂ）４５位で、アミノ酸残基はＹまた
はＦである；（ａｃ）４７位で、アミノ酸残基はＲ、ＱまたはＧである；（ａｄ
）４８位で、アミノ酸残基はＧまたはＤである；（ａｅ）４９位で、アミノ酸残
基はＫ、Ｒ、ＥまたはＱである；（ａｆ）５１位で、アミノ酸残基はＩまたはＶ
である；（ａｇ）５２位で、アミノ酸残基はＳ、ＣまたはＧである；（ａｈ）５
３位で、アミノ酸残基はＩまたはＴである；（ａｉ）５４位で、アミノ酸残基は
ＡまたはＶである；（ａｊ）５７位で、アミノ酸残基はＨまたはＮである；（ａ
ｋ）５８位で、アミノ酸残基はＱ、Ｋ、ＮまたはＰである；（ａｌ）５９位で、
アミノ酸残基はＡまたはＳである；（ａｍ）６０位で、アミノ酸残基はＥ、Ｋ、
Ｇ、ＶまたはＤである；（ａｎ）６１位で、アミノ酸残基はＨまたはＱである；
（ａｏ）６２位で、アミノ酸残基はＰ、ＳまたはＴである；（ａｐ）６３位で、
アミノ酸残基はＥ、ＧまたはＤである；（ａｑ）６５位で、アミノ酸残基はＥ、
Ｄ、ＶまたはＱである；（ａｒ）６７位で、アミノ酸残基はＱ、Ｅ、Ｒ、Ｌ、Ｈ
またはＫである；（ａｓ）６８位で、アミノ酸残基はＫ、Ｒ、ＥまたはＮである
；（ａｔ）６９位で、アミノ酸残基はＱまたはＰである；（ａｕ）７９位で、ア
ミノ酸残基はＥまたはＤである；（ａｖ）８０位で、アミノ酸残基はＧまたはＥ
である；（ａｗ）８１位で、アミノ酸残基はＹ、ＮまたはＦである；（ａｘ）８
２位で、アミノ酸残基はＲまたはＨである；（ａｙ）８３位で、アミノ酸残基は
Ｅ、ＧまたはＤである；（ａｚ）８４位で、アミノ酸残基はＱ、ＲまたはＬであ
る；（ｂａ）８６位で、アミノ酸残基はＡまたはＶである；（ｂｂ）８９位で、
アミノ酸残基はＴまたはＳである；（ｂｃ）９０位で、アミノ酸残基はＬまたは
Ｉである；（ｂｄ）９１位で、アミノ酸残基はＩまたはＶである；（ｂｅ）９２
位で、アミノ酸残基はＲまたはＫである；（ｂｆ）９３位で、アミノ酸残基はＨ
、ＹまたはＱである；（ｂｇ）９６位で、アミノ酸残基はＥ、ＡまたはＱである
；（ｂｈ）９７位で、アミノ酸残基はＬまたはＩである；（ｂｉ）１００位で、
アミノ酸残基はＫ、Ｒ、ＮまたはＥである；（ｂｊ）１０１位で、アミノ酸残基
はＫまたはＲである；（ｂｋ）１０３位で、アミノ酸残基はＡまたはＶである；
（ｂｌ）１０４位で、アミノ酸残基はＤまたはＮである；（ｂｍ）１０５位で、
アミノ酸残基はＬまたはＭである；（ｂｎ）１０６位で、アミノ酸残基はＬまた
はＩである；（ｂｏ）１１２位で、アミノ酸残基はＴまたはＩである；（ｂｐ）
１１３位でアミノ酸残基はＳ、ＴまたはＦである；（ｂｑ）１１４位で、アミノ
酸残基はＡまたはＶである；（ｂｒ）１１５位で、アミノ酸残基はＳ、Ｒまたは
Ａである；（ｂｓ）１１９位で、アミノ酸残基はＫ、ＥまたはＲである；（ｂｔ
）１２０位で、アミノ酸残基はＫまたはＲである；（ｂｕ）１２３位で、アミノ
酸残基はＦまたはＬである；（ｂｖ）１２４位で、アミノ酸残基はＳまたはＲで
ある；（ｂｗ）１２５位で、アミノ酸残基はＥ、Ｋ、ＧまたはＤである；（ｂｘ
）１２６位で、アミノ酸残基はＱまたはＨである；（ｂｙ）１２８位で、アミノ
酸残基はＥ、ＧまたはＫである；（ｂｚ）１２９位で、アミノ酸残基はＶ、Ｉま
たはＡである；（ｃａ）１３０位で、アミノ酸残基はＹ、Ｈ、ＦまたはＣである
；（ｃｂ）１３１位で、アミノ酸残基はＤ、Ｇ、ＮまたはＥである；（ｃｃ）１
３２位で、アミノ酸残基はＩ、Ｔ、Ａ、Ｍ、ＶまたはＬである；（ｃｄ）１３５
位で、アミノ酸残基はＶ、Ｔ、ＡまたはＩである；（ｃｅ）１３８位で、アミノ
酸残基はＨまたはＹである；（ｃｆ）１３９位で、アミノ酸残基はＩまたはＶで
ある；（ｃｇ）１４０位で、アミノ酸残基はＬまたはＳである（ｃｈ）１４２位
で、アミノ酸残基はＹまたはＨである；（ｃｉ）１４３位で、アミノ酸残基はＫ
、ＴまたはＥである；（ｃｊ）１４４位で、アミノ酸残基はＫ、ＥまたはＲであ
る；（ｃｋ）１４５位で、アミノ酸残基はＬまたはＩである；および、（ｃｌ）
１４６位で、アミノ酸残基はＴまたはＡである。
【０１０４】
いくつかの好ましい本発明のＧＡＴポリペプチドは、以下のように特徴付けら
れる。必要に応じて、配列番号６〜１０および配列番号２６３〜５１４からなる
群から選択される参照アミノ酸とアライメントされた場合、ポリペプチド中で、
以下の位置に対応するアミノ酸残基の少なくとも８０％は、以下の制約に従う：
（ａ）９位、７６位、９４位および１１０位で、アミノ酸残基はＡである；（ｂ
）２９位および１０８位で、アミノ酸残基はＣである；（ｃ）３４位で、アミノ
酸残基はＤである；（ｄ）９５位で、アミノ酸残基はＥである；（ｅ）５６位で
、アミノ酸残基はＦである；（ｆ）４３位、４４位、６６位、７４位、８７位、
１０２位、１１６位、１２２位、１２７位および１３６位で、アミノ酸残基はＧ
である；（ｇ）４１位でアミノ酸残基はＨである；（ｈ）７位で、アミノ酸残基
はＩである；（ｉ）８５位で、アミノ酸残基はＫである；（ｊ）２０位、３６位
、４２位、５０位、７２位、７８位、９８位および１２１位で、アミノ酸残基は
Ｌである；（ｋ）１位、７５位および１４１位で、アミノ酸残基はＭである；（
ｌ）２３位、６４位および１０９位でアミノ酸残基はＮである；（ｍ）２２位、
２５位、１３３位、１３４位および１３７位で、アミノ酸残基はＰである；（ｎ
）７１位で、アミノ酸残基はＱである；（ｏ）１６位、２１位、７３位、９９位
および１１１位で、アミノ酸残基はＲである；（ｐ）５５位および８８位で、ア
ミノ酸残基はＳである；（ｑ）７７位で、アミノ酸残基はＴである；（ｒ）１０
７位でアミノ酸残基はＷである；そして（ｓ）１３位、４６位、７０位、１１７
位および１１８位で、アミノ酸残基はＹである。
【０１０５】
いくつかの好ましい本発明のＧＡＴポリペプチドは、以下のように特徴付けら
れる。必要に応じて、配列番号６〜１０および配列番号２６３〜５１４からなる
群から選択される参照アミノ酸とアライメントした場合、２８位に対応するポリ
ペプチド中のアミノ酸残基はＶまたはＡである。２８位のバリンは、一般的に減
少したＫＭに関連し、一方、この位置のアラニンは、一般的に増加したｋｃａｔ
に関連する。他の好ましいＧＡＴポリペプチドは、Ｉ２７（すなわち、２７位が
Ｉ）、Ｍ３０、Ｓ３５、Ｒ３７、Ｓ３９、Ｇ４８、Ｋ４９、Ｎ５７、Ｑ５８、Ｐ
６２、Ｑ６５、Ｑ６７、Ｋ６８、Ｅ８３、Ｓ８９、Ａ９６、Ｅ９６、Ｒ１０１、
Ｔ１１２、Ａ１１４、Ｋ１１９、Ｋ１２０、Ｅ１２８、Ｖ１２９、Ｄ１３１、Ｔ
１３１、Ｖ１３４、Ｒ１４４、Ｉ１４５、もしくはＴ１４６、またはそれらの任
意の組合せを有することによって、特徴付けられる。
【０１０６】
いくつかの好ましい本発明のＧＡＴポリペプチドは、配列番号６〜１０および
配列番号２６３〜５１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０７】
本発明は、前述のアミノ酸残基位置の制約の組合せによって特徴付けられる好
ましいＧＡＴポリペプチドを、さらに提供する。
【０１０８】
加えて、本発明は、上記の好ましいＧＡＴポリペプチドをコードするＧＡＴポ
リヌクレオチド、およびその相補的ヌクレオチド配列を提供する。
【０１０９】
本発明のいくつかの局面は、本明細書中に記載されているようにＧＡＴ活性を
有するＧＡＴポリペプチドの任意の上記カテゴリーのサブセットに特に関係する
。これらＧＡＴポリペプチドは、例えば、植物に対してグリホセート耐性を付与
するための薬剤としての使用に好ましい。所望のレベルのＧＡＴ活性の例を、本
明細書中に記載する。
【０１１０】
一つの局面において、ＧＡＴポリペプチドは、組換体または天然源、例えば細
菌株、から単離された天然に存在する核酸の単離型によってコードされるアミノ
酸配列を含む。そのようなＧＡＴポリペプチドをコードする野生型ポリヌクレオ
チドは、当該技術分野で公知である標準技術によって特異的にスクリーニングさ
れ得る。例えば、配列番号６〜配列番号１０によって定義されるポリペプチドは
、以下により詳細にわたって記載される、ＧＡＴ活性を示すＢａｃｉｌｌｕｓ株
由来の配列を発現クローニングすることによって発見された。
【０１１１】
本発明は、配列番号１〜５および配列番号１１〜２６２、それらの相補体、な
らびに配列番号６〜１０および配列番号２６３〜５１４からなる群から選択され
るアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（これらの相補体を含む）からな
る群から選択されるヌクレオチド配列の実質的全長にわたって、ストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌク
レオチドまたは組換えポリヌクレオチドによってコードされる、単離されたポリ
ペプチドまたは組換えポリペプチドもまた含む。
【０１１２】
本発明は、ＧＡＴ活性を有し、本明細書中に記載されている任意のＧＡＴコー
ドポリヌクレオチドのフラグメントによってコードされる任意のポリペプチドを
さらに含む。
【０１１３】
本発明は、一緒にスプライシングされて機能性のＧＡＴポリペプチドを形成し
得るＧＡＴポリペプチドのフラグメントもまた提供する。スプライシングは、イ
ンビトロまたはインビボで達成され得、シススプライシングまたはトランススプ
ライシング（すなわち、分子内スプライシングまたは分子間スプライシング）を
含み得る。このフラグメントはそれ自身、ＧＡＴ活性を有し得るが、それは必要
ではない。例えば、ＧＡＴポリペプチドの二つ以上のセグメントはインテインに
よって分割され得、シススプライシングによるインテイン配列の除去によって、
機能性のＧＡＴポリペプチドという結果が得られる。もう一つの例において、暗
号化されたＧＡＴポリペプチドは、二つ以上の別々のフラグメントとして発現さ
れ得、これらフラグメントのトランススプラシングによって、機能性のＧＡＴポ
リペプチドの回復という結果が得られる。シススプライシングおよびトランスス
プライシングの様々な局面、遺伝子暗号化、ならびに介在配列の導入は、米国特
許出願第０９／５１７，９３３号および同第０９／７１０，６８６号において、
より詳細にわたって記述される。両者を、その全体を本明細書中に参考として援
用する。
【０１１４】
一般的に、本発明は、変異、反復配列（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ）組換え、および／または本明細書中に記載されたポリヌクレオチド配列の多
様性によって誘導された改変ＧＡＴポリヌクレオチドによってコードされる任意
のポリペプチドを含む。本発明のいくつかの局面において、ＧＡＴポリペプチド
は、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、挿入、もしくはこれらの改変型の一
つ以上の組合せによって改変される。置換は、保存的でも非保存的であってもよ
く、機能を改変しても改変しなくてもよく、そして新規機能を付加してもよい。
挿入および欠失は、例えば、配列の重要なフラグメントの短縮化の場合、あるい
は内部またはＮ末端もしくはＣ末端どちらかへのさらなる配列の融合において、
重要であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、ＧＡＴポリペプチドは
、例えば、分泌シグナル、葉緑体輸送ペプチド、精製タグ、または当業者に明ら
かな任意の多くの機能性官能基のような機能付加を含む融合タンパク質の一部で
ある。そして、そのことは本明細書中の他の箇所でより詳細に記述される。
【０１１５】
本発明のポリペプチドは、一つ以上の改変アミノ酸を含み得る。改変アミノ酸
の存在によって、例えば、（ａ）ポリペプチドのインビボでの半減期の増加、（
ｂ）ポリペプチドの抗原性の減少または増加、（ｃ）ポリペプチド保存安定性の
増加において有利であり得る。例えば、アミノ酸は組換え体産生中に、共翻訳修
飾または翻訳後修飾され（例えば、哺乳動物細胞中での発現時の、Ｎ−Ｘ−Ｓ／
ＴモチーフでのＮ−結合グリコシル化）、または合成的手段で改変される。
【０１１６】
改変アミノ酸の非限定的な例には、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、
プレニル化（例えば、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化）アミノ酸、アセチ
ル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、
カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、などが挙げられる。アミノ酸改変
の当業者を導くのに十分な参照は、文献全体にわたって充実している。例のプロ
トコールは、Ｗａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  
ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ中に見出さ
れる。
【０１１７】
本発明のＧＡＴポリペプチドを産生および単離する組換え方法を、本明細書中
に記載する。組換え産生に加えて、ポリペプチドは固相技術を使用した直接ペプ
チド合成によって産生され得る。（Ｓｔｅｗａｒｔら（１９６９）Ｓｏｌｉｄ−
Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃ
ｏ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｊ（１９６３）Ｊ．
Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）。ペプチド合成は手動の
技術の使用または自動制御によって実行され得る。例えば、自動化合成はＡｐｐ
ｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａペプチド合成器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅ
ｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて、製造業者によっ
て提供された説明書に従って達成され得る。例えば、部分配列は別々に化学合成
され、ＧＡＴポリペプチドの全長を提供する化学的方法を使用することによって
結合され得る。ペプチドはまた、様々な供給源から得られ得る。
【０１１８】
本発明のもう一つの局面において、本発明のＧＡＴポリペプチドは、例えば、
トランスジェニック植物の様々な組織中の、例えば、ＧＡＴポリペプチドの活性
、分布、および発現に関係する、例えば、診断的用途を有する抗体の産生に使用
される。
【０１１９】
抗体誘導のためのＧＡＴホモログポリペプチドは、生物学的活性を必要としな
いが、このポリペプチドまたはオリゴペプチドは抗原性でなければならない。特
異的な抗体を誘導するために使用されるペプチドは、少なくとも１０アミノ酸、
好ましくは少なくとも１５アミノ酸または２０アミノ酸からなるアミノ酸配列を
有し得る。短い一続きのＧＡＴポリペプチドは、キーホールリンペットヘモシア
ニンのような別のタンパク質と融合され得、キメラ分子に対する抗体が産生され
得る。
【０１２０】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は、当業者に公
知で、多くの抗体が入手可能である。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）  Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ
／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒ
ｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓｔｉｔｅｓら（ｅｄｓ．）Ｂａｓ
ｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ
Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡ、お
よびそれらの中で引用された文献；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃ
ｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ならび
にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４
９５−４９７を参照のこと。抗体の調製に適切な他の技術は、ファージまたは類
似したベクター中の組換え抗体のライブラリーの選別を含む。Ｈｕｓｅら（１９
８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；およびＷａｒｄら（１９
８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６を参照のこと。特異的なモノクロ
ーナル抗体およびポリクローナル抗体ならびに抗血清は、通常少なくとも約０．
１μＭのＫＤで、好ましくは少なくとも約０．０１μＭ以上のＫＤで、最も代表
的そして最も好ましくは、０．００１μＭ以上のＫＤで、結合する。
【０１２１】
抗体の産生技術および操作技術の追加的詳細は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（ｅｄ
）（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔ
ｉｏｎ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃ
ｋ）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  ａｔ  Ｏｘｆ
ｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）
，およびＰａｕｌ（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ（ｐａｕｌ
）に見出され得る。
【０１２２】
（配列のバリエーション）
本発明のＧＡＴポリペプチドは、本明細書中で配列番号６〜１０および配列番
号２６３〜５１４として開示される配列の保存的に改変されたバリエーションを
含む。そのような保存的に改変されたバリエーションは、置換、付加または欠失
を含み、それらは、配列番号６〜１０および配列番号２６３〜５１４中のいずれ
かの、単一のアミノ酸または小さな割合のアミノ酸（代表的には約５％未満、よ
り代表的には４％未満、２％未満、または１％未満）を改変し、付加し、または
欠失する。
【０１２３】
例えば、本明細書中で配列番号６として同定された１４６アミノ酸ポリペプチ
ドの保存的に改変されたバリエーション（例えば、欠失）は、少なくとも１４０
アミノ酸長、好ましくは少なくとも１４１アミノ酸、より好ましくは少なくとも
１４４アミノ酸、そしてさらにより好ましくは少なくとも１４６アミノ酸（これ
らはポリペプチド配列の約５％未満、約４％未満、約２％未満または約１％未満
の欠失に対応する）を有する。
【０１２４】
本明細書中で配列番号６として同定されたポリペプチドの保存的に改変された
バリエーションのもう一つの例（例えば「保存的に置換されたバリエーション」
）は、表２（下記）で説明された六つの置換群に従って、１４６アミノ酸ポリペ
プチドの約７残基まで（すなわち、約５％未満）において「保存的な置換」を含
む。
【０１２５】
保存的に置換された配列を含む、本発明のＧＡＴポリペプチド配列ホモログは
、ＧＡＴポリペプチド中、（例えば、葉緑体（ｃｈｌｏｒａｐｌａｓｔ）ターゲ
ティング配列）シグナル配列を有するＧＡＴ融合体中、またはタンパク質の精製
のための一つ以上のドメイン（例えば、ポリヒスチジンセグメント、ＦＬＡＧタ
グセグメント、など）の付加において生じるような、より大きなポリペプチド配
列の一部として存在し得る。後者の場合、付加的機能性ドメインは、タンパク質
のＧＡＴ部分の活性に対してほとんど影響を有しないか、または全く影響しない
、あるいはこの付加的ドメインは、プロテアーゼの処理によるような合成後プロ
セシング工程によって除去され得る。
【０１２６】
（免疫反応性によるポリペプチドの定義）
本発明のポリペプチドは、定義された活性、すなわちグリホセートのアセチル
化、を有する新規クラスの酵素を提供するので、このポリペプチドは例えば、免
疫学的アッセイにおいて認識され得る新規構造的特徴もまた提供する。本発明の
ポリペプチドを特異的に結合する抗血清の生成は、そのような抗血清によって結
合されるポリペプチドと同様に、本発明の一つの特徴である。
【０１２７】
本発明は、一つ以上の配列番号６〜配列番号１０から選択されるアミノ酸配列
を含む免疫原に対して生成された抗体または抗血清に、特異的に結合する、また
は特異的に免疫反応性であるＧＡＴポリペプチドを含む。他のＧＡＴホモログと
の交叉反応性を除去するために、この抗体または抗血清は、本願の出願日現在入
手可能なＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号に対応するタンパク質またはペプチ
ド（それらは、ＣＡＡ７０６６４，Ｚ９９１０９およびＹ０９４７６によって、
例示される）によって示されるタンパク質のような、入手可能な関連タンパク質
によって除去される。核酸に対応する登録番号の場合、核酸にコードされたポリ
ペプチドが生成され、抗体／抗血清除去の目的のために使用される。図３は、例
示のＧＡＴポリペプチドとＧｅｎｂａｎｋ中で入手可能な最もしっかりと関連し
た配列、ＹｉｔＩとの間の相対的同一性を表にする。ネイティブのＹｉｔＩの機
能は、未だに解明されていないが、この酵素は、検出可能なＧＡＴ活性を有する
ことが示される。
【０１２８】
一つの代表的なフォーマットにおいて、免疫アッセイは、配列番号６〜１０お
よび配列番号２６３〜５１４、またはそれらの実質的な部分配列（すなわち、提
供された全長配列の少なくとも約３０％）の一つ以上に対応する一つ以上の配列
を含む、一つ以上のポリペプチドに対して生成されたポリクローナル抗血清を使
用する。配列番号６〜１０および配列番号２６３〜５１４に由来する可能なポリ
ペプチド免疫原の全セットは、以下にひとまとめにして「免疫原性ポリペプチド
」という。結果として得られる抗血清は、必要に応じて他の関連配列に対する低
い交叉反応性を有するように選択され、そのようなどの交叉反応性も、免疫アッ
セイにおけるポリクローナル抗血清の使用前に、一つ以上の関連した配列を用い
た免疫吸着によって除去される。
【０１２９】
免疫アッセイの使用のための抗血清を産生するために、一つ以上の免疫原性ポ
リペプチドを、本明細書中で記載されるように、産生し、精製する。例えば、組
換えタンパク質を、細菌細胞株中で産生し得る。マウスの近交系（実質的なマウ
スの遺伝的同一性のために、結果により再現性があるのでこのアッセイにおいて
使用される）は、フロイントのアジュバンドのような標準的なアジュバンドと組
合わせた免疫原性タンパク質、および標準的なマウス免疫プロトコールを用いて
、免疫される（特異的な免疫反応性を決定するために使用され得る抗体産生、免
疫アッセイのフォーマットおよび免疫アッセイの条件の標準的な記述については
、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕ
ｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。あるいは、本明細書
中に開示された配列に由来する一つ以上の合成ポリペプチドまたは組換えポリペ
プチドを、キャリアータンパク質と結合し、免疫原として使用する。
【０１３０】
ポリクローナル血清が回収され、免疫アッセイ、例えば、固体支持体に固定し
た一つ以上の免疫原性タンパク質を用いた固相免疫アッセイ、で免疫原性ポリペ
プチドに対して力価測定が行われる。力価が１０６以上であるポリクローナル抗
血清が選択され、プールされ、関連ポリペプチド、例えば、示したようにＧＥＮ
ＢＡＮＫから同定されたポリペプチド、を用いて除去されて、除去されプールさ
れ力価測定されたポリクローナル抗血清を産生する。
【０１３１】
この除去されプールされ力価測定されたポリクローナル抗血清は、関連したポ
リペプチドに対する交叉反応性について、テストされる。好ましくは、免疫原性
タンパク質が特異的に結合する抗体を同定するために、少なくとも二つの免疫原
性ＧＡＴが、好ましくは、少なくとも二つの関連したポリペプチドとともにこの
測定に使用される。
【０１３２】
この比較アッセイにおいて、区別化するための結合条件は、関連するポリペプ
チドへの結合と比べて、力価測定されたポリクローナル抗血清の免疫原性ＧＡＴ
ポリペプチドへの結合に対して、少なくとも約５〜１０倍高いシグナルノイズ比
という結果が得られる、除去され力価測定されたポリクローナル抗血清に対して
決定される。すなわち、結合反応のストリンジェンシーは、アルブミンまたは脱
脂粉乳のような非特異的競合体の添加によって、もしくは塩条件、または温度な
どの調節によって調節される。これらの結合条件は、テストポリペプチドが、プ
ールされ除去されたポリクローナル抗血清によって特異的に結合されるかどうか
、を決定するための次のアッセイで使用される。特に、テストポリペプチドが、
区別化するための結合条件下でコントロールポリペプチドに比べて、少なくとも
２〜５倍高いシグナルノイズ比を示し、免疫原性ポリペプチドと比較して、少な
くとも約１／２のシグナルノイズ比を示すと、公知のＧＡＴと比較して免疫原性
ポリペプチドと実質的な構造類似性を共有し、従って、テストポリペプチドは本
発明のポリペプチドである。
【０１３３】
もう一つの例では、競合的結合フォーマットでの免疫アッセイを、テストポリ
ペプチドの検出に使用する。例えば、示したように、交叉反応抗体を、コントロ
ールＧＡＴポリペプチドとの免疫吸着により、プールされた抗血清混合物から除
去する。次いで、この免疫原性ポリペプチドは、固相支持体に固定され、その支
持体は、除去されプールされた抗血清にさらされる。テストタンパク質は、プー
ルされ除去された抗血清への結合と競合するアッセイに加えられる。固定された
タンパク質と比較した、このテストタンパク質がプールされ除去された抗血清へ
の結合について競合する能力は、このアッセイへ加えられた免疫原性ポリペプチ
ドが結合について競合する能力と比較される（免疫原性ポリペプチドは、プール
された抗血清への結合について、固定された免疫原性ポリペプチドと効果的に競
合する）。このテストタンパク質のパーセント交叉反応性を、標準の計算法を使
用して、計算する。
【０１３４】
平行アッセイにおいて、コントロールタンパク質がプールされ除去された抗血
清への結合について競合する能力は、必要に応じて、免疫原性ポリペプチドが抗
血清への結合について競合する能力と比べて決定される。再び、コントロールポ
リペプチドに対するパーセント交叉反応性を、標準の計算法を使用して、計算す
る。パーセント交叉反応性が、テストペプチドに対して少なくとも５〜１０倍高
い場合、このテストペプチドは、プールされ除去された抗血清へ特異的に結合す
るといわれる。
【０１３５】
一般的に、免疫吸着された抗血清およびプールされた抗血清を、本明細書中で
記載されているような競合的結合免疫アッセイにおいて使用して、任意の試験ポ
リペプチドを免疫原性ポリペプチドを比較し得る。この比較を行なうために、２
つのポリペプチドは、広範囲の濃度でそれぞれアッセイされ、そして固定化され
たタンパク質へのサブストラクトされた抗血清の結合を５０％阻害するために必
要とされるそれぞれのポリペプチドの量は、標準技術を使用して決定される。必
要とされる試験ポリペプチドの量が、必要とされる免疫原性ポリペプチドの量の
２倍より少ない場合、この試験ポリペプチドは，免疫原性タンパク質に対して産
生される抗体に特異的に結合するといわれ、供給された量は、コントロールのポ
リペプチドに対して少なくとも約５〜１０倍高い。
【０１３６】
特異性の最終決定として、免疫吸着で使用される免疫原性ポリペプチドに対す
る、得られた免疫原性ポリペプチドのサブストラクトされプールされた抗血清の
結合がほとんどまたは全く検出されなくなるまで、プールされた抗血清は、必要
に応じて、（コントロールポリペプチドではなく）免疫原性ポリペプチドに完全
に吸着される。この完全に免疫吸着された抗血清は、次に試験ポリペプチドとの
反応性を試験される。反応性がほとんどないかまたは反応性がないことが観察さ
れる場合（すなわち、免疫原性ポリペプチドへの、完全に免疫吸着された抗血清
の結合について観察されたノイズに対するシグナルの比が２倍しかない場合）、
試験ポリペプチドは、免疫原性タンパク質によって誘発された抗血清によって特
異的に結合される。
【０１３７】
（グリホセートＮ−アセチル基転移酵素ポリヌクレオチド）
ひとつの局面において、本発明は、「グリホセートＮ−アセチル基転移酵素ポ
リヌクレオチド」または「ＧＡＴポリヌクレオチド」のように本明細書中で参照
されている、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドの新規
ファミリーを提供する。ＧＡＴポリヌクレオチド配列は、ＧＡＴポリペプチドを
コードする能力によって特徴付けられている。一般的に本発明は、本明細書中で
記載されている新規ＧＡＴポリペプチドのいずれかをコードする任意の核酸配列
を含む。本発明のいくつかの局面においては、ＧＡＴ活性を有するＧＡＴポリペ
プチドをコードするＧＡＴポリヌクレオチドが好ましい。
【０１３８】
一つの局面において、ＧＡＴポリヌクレオチドは、生物体（例えば、細菌株）
から単離された天然に存在する核酸の組換え形態および単離形態を含む。例示的
なＧＡＴポリヌクレオチド（例えば、配列番号１〜配列番号５）は、ＧＡＴ活性
を示すＢａｃｉｌｌｕｓ株に由来する配列の発現クローニングによって発見され
た。簡潔には、約５００のＢａｃｉｌｌｕｓ株およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株
の収集物をグリホセートをＮアセチル化するネイティブな能力についてスクリー
ニングした。株を一晩ＬＢで増殖させ、遠心分離によって回収し、希トルエンで
透過化し、そして次に洗浄し、５ｍＭグリホセートおよび２００μＭアセチルＣ
ｏＡの緩衝液を含む反応混合液に再懸濁した。細胞を１〜４８時間の間反応混合
液中でインキュベートし、その時点で同等体積のメタノールをこの反応物に添加
した。細胞を、次に遠心分離によってペレット化し、そして上清を、親イオンモ
ードの質量分析法による分析前に濾過した。反応の生成物を、反応混合液の質量
分析プロフィールとＮ−アセチルグリホセートの標準とを図２で示すように比較
することによって、Ｎ−アセチルグリホセートとして明確に同定した。生成物検
出は、両方の基質（アセチルＣｏＡおよびグリホセート）の封入に依存しており
、細菌細胞を熱変性することによって消された。
【０１３９】
個々のＧＡＴポリヌクレオチドを、次に機能的スクリーニングによって同定さ
れた株からクローン化した。ゲノムＤＮＡを調製し、Ｓａｕ３Ａ１酵素を用いて
部分的に消化した。約４Ｋｂのフラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターにク
ローン化し、そして電気的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。ＧＡ
Ｔ活性を示す個々のクローンを、トルエン洗浄をＰＭＢＳを用いた透過化処理に
よって置換することを除いては、これまでに記載されたように、反応後の質量分
析方法によって同定した。ゲノムフラグメントを配列決定し、そしてオープンリ
ーディングフレームをコードする推定ＧＡＴポリペプチドを同定した。ＧＡＴ遺
伝子の同定を、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるオープンリーディングフレームの発現およ
び反応混合物から産生されたＮ−アセチルグリホセートの高レベルでの検出によ
って確認した。
【０１４０】
本発明の別の局面において、ＧＡＴポリヌクレオチドは、多様化することによ
って（例えば、一つ以上の天然に存在する単離されたＧＡＴポリヌクレオチドま
たは組換えＧＡＴポリヌクレオチドを組換えおよび／または変異することによっ
て）産生される。本明細書中の他で更に詳細に記載されているように、優れた機
能的性質（例えば、多様化プロセスにおいて基質または親として使用されるＧＡ
Ｔポリヌクレオチドよりも増加した触媒機能、増加した安定性、高い発現レベル
）を有するＧＡＴポリペプチドをコードする多様化されたＧＡＴポリヌクレオチ
ドを産生することがしばしば可能である。
【０１４１】
本発明のポリヌクレオチドは、以下の種々の用途を有する、例えば：本発明の
ＧＡＴポリペプチドの組換え産生（すなわち、発現）；導入遺伝子として（例え
ば、トランスジェニック植物に除草剤耐性を与えるための）；形質転換およびプ
ラスミド維持のための選択マーカーとして；免疫原として；相補的な核酸または
部分的に相補的な核酸の存在についての診断的なプローブとして（天然ＧＡＴコ
ード核酸の検出のために含まれる）；さらなる多様性生成（例えば、新しいＧＡ
Ｔホモログおよび／または改良されたＧＡＴホモログなどを産生するための組換
え反応または変異反応）のための基質として。
【０１４２】
ＧＡＴポリヌクレオチドのある特定の実質的かつ信頼できる有用性は、実質的
なＧＡＴ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを必要としな
いことに注目することは重要である。例えば、活性酵素をコードしないＧＡＴポ
リヌクレオチドは、望ましい機能的性質（例えば、高いｋｃａｔまたはｋｃａｔ
／Ｋｍ、低いＫｍ、熱または他の環境因子に対する高い安定性、高い転写または
翻訳速度、タンパク質溶解性の切断に対する抵抗性、抗原性を減らすこと、など
）を有する、ＧＡＴポリヌクレオチド改変体または非ＧＡＴポリヌクレオチドに
到達するための多様化手順での使用のための親ポリヌクレオチドの価値ある供給
源であり得る。例えば、ほとんどまたは全く検出されない活性を有するプロテア
ーゼ改変体をコードするヌクレオチド配列は、高活性プロテアーゼをコードする
子孫を産生するためにＤＮＡシャッフリング実験において親のポリヌクレオチド
として使用される（Ｎｅｓｓら、（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ  １７：８９３−９６）。
【０１４３】
多様性生成方法または再帰的配列組換え（「ＲＳＲ］）法（例えば、ＤＮＡシ
ャッフリング）によって産生されたポリヌクレオチド配列は、本発明の特徴であ
る。本明細書中で記載されている核酸を使用する変異方法および組換え方法は、
本発明の特徴である。例えば、本発明の１つの方法は、上記および以下に記載さ
れる１つ以上の本発明のヌクレオチド配列を、１以上のさらなる配列と再帰的に
組換える工程を包含する。この組換え工程は必要に応じて、インビボ、エキソビ
ボ、インシリコまたはインビトロで実行される。前記の多様性生成または再帰的
な配列組換えは、組換え改変ＧＡＴポリヌクレオチドの少なくとも一つのライブ
ラリーを生成する。このライブラリーのメンバーによってコードされるポリペプ
チドは、本発明に含まれる。
【０１４４】
オリゴヌクレオチドとしてもまた本明細書中で言及されるポリヌクレオチド（
代表的に少なくとも１２塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、さらに好ましく
は少なくとも２０、３０、もしくは５０またはそれ以上の塩基を有する）の使用
もまた企図され、これはストリンジェントまたは高ストリンジェントな条件下で
ＧＡＴポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ポリヌクレオチドは、本明
細書中に記述された方法に従って、プローブ、プライマー、センス、およびアン
チセンス因子などとして使用され得る。
【０１４５】
本発明に従って、ＧＡＴポリヌクレオチド（ＧＡＴポリペプチド、ＧＡＴポリ
ペプチドのフラグメント、関連する融合タンパク質、またはその機能的等価物を
コードするヌクレオチド配列を含む）は、細菌細胞または植物細胞のような適切
な宿主細胞でのＧＡＴポリペプチドの発現を指向する組換えＤＮＡ分子において
用いられる。遺伝暗号の固有の縮重に起因して、実質的に同じアミノ酸配列また
は機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他の核酸配列もまた、ＧＡＴポリヌ
クレオチドをクローン化および発現するために使用され得る。
【０１４６】
本発明は、続いて最終的に機能的なＧＡＴポリペプチドを産生するためにスプ
ライシングされる転写産物および／または翻訳産物をコードする、ＧＡＴポリヌ
クレオチドを提供する。スプライシングはインビトロまたはインビボで成し遂げ
られ得、そしてシススプライシングまたはトランススプライシングを含み得る。
スプライシングの基質は、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ転写物）またはポ
リペプチドであり得る。ポリヌクレオチドのシススプライシングの例は、コード
配列に挿入されたイントロンが除去され、２つの隣接したエキソン領域がスプラ
イシングされて、ＧＡＴポリペプチドコード配列を生成する場合である。トラン
ススプライシングの例は、ＧＡＴポリヌクレオチドが、別個に転写され、そして
次にスプライシングされ、全長ＧＡＴコード配列を形成し得る２つ以上のフラグ
メント内にコード配列を分けることによって暗号化される場合である。スプライ
シングエンハンサー配列（これは、本発明の構築物に導入され得る）の使用は、
シスまたはトランスのいずれかのスプライシングを容易にし得る。ポリペプチド
のシススプライシングおよびトランススプライシングは、本明細書中の他の箇所
でさらに詳細に記載されている。シススプライシングおよびトランススプライシ
ングのさらに詳細な説明は、米国特許出願第０９／５１７，９３３号および同第
０９／７１０，６８６号に見出され得る。
【０１４７】
したがって、いくつかのＧＡＴポリヌクレオチドは、全長ＧＡＴポリペプチド
を直接コードしないが、むしろＧＡＴポリペプチドのフラグメントをコードする
。これらのＧＡＴポリヌクレオチドは、スプライシングに関与する機構を通して
機能的なＧＡＴポリペプチドを発現するために使用され得る。ここで、スプライ
シングは、ポリヌクレオチド（例えば、イントロン／エキソン）および／または
ポリペプチド（例えば、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）／イクステイン（ｅｘｔｅ
ｉｎ））のレベルで生じ得る。スプライシングプロセスが機能的産物を産生する
ことを可能にする実験において、すべての必要とされるフラグメントが発現する
場合、機能的なＧＡＴポリペプチドが発現するだけなので、これは例えば、ＧＡ
Ｔ活性の発現制御に有用であり得る。別の例では、ＧＡＴポリヌクレオチドへの
一つ以上の挿入配列の導入は、低い相同性のポリヌクレオチドを用いる組換えを
容易にし得る；挿入配列に対するイントロンまたはインテインの使用は、介在配
列の除去を容易にし、それによってコードされた改変体の機能を回復する。
【０１４８】
当業者によって理解されるように、特定の宿主におけるその発現を増強するた
めのコード配列を改変する事は利点があり得る。その遺伝暗号には６４の可能な
コドンが縮重しているが、ほとんどの生物体は、優先的にこれらのコドンの一部
を使用する。一つの種で最もよく使用されているコドンは、最適コドンと呼ばれ
、それほどよく使用されないコドンは、まれなコドンまたは低使用コドンとして
分類される（例えば、Ｚｈａｎｇ  ＳＰら、（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０５：  
６１−７２を参照のこと）。コドンは、宿主の好ましいコドン使用を反応するよ
うに置換され、このプロセスは時々「コドン最適化」または「種のコドンの傾向
についての制御」と呼ばれる。
【０１４９】
特定の原核生物または真核生物の宿主（Ｍｕｒｒａｙ，Ｅ．ら、（１９８９）
Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−５０８も参照のこと）によって好
まれるコドンを含む最適化コード配列は、例えば、非最適化配列から産生された
転写物と比較して、翻訳速度を増加させることまたはより長い半減期のような所
望の性質を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するために調製され得る。翻訳終止
コドンはまた、宿主の優先度を反映するように改変され得る。例えば、Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物に対する好ましい終止コドンは、それぞれＵＡ
ＡおよびＵＧＡである。単子葉植物についての好ましい終止コドンは、ＵＧＡで
あり、これに対して昆虫およびＥ．ｃｏｌｉは、終止コドンとしてＵＡＡの使用
を好む（Ｄａｌｐｈｉｎ  ＭＥら、（１９９６）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．
２４：２１６−２１８）。植物での発現のためにヌクレオチド配列を最適化する
ための方法論は、例えば、米国特許第６，０１５，８９１号およびその中で引用
される参考文献において提供される。
【０１５０】
本発明の一つの実施形態は、関連する宿主（例えば、トランスジェニック植物
宿主）における発現のための最適コドンを有するＧＡＴポリヌクレオチドを含む
。
これは、細菌起源のＧＡＴポリヌクレオチドをトランスジェニック植物に導入す
る場合、例えば、植物にグリホセート耐性を与えるために、特に望ましい。
【０１５１】
本発明のポリヌクレオチド配列は、種々の理由のためにＧＡＴポリヌクレオチ
ドを変更するために設計され得、種々の理由には以下のものが挙げられるがこれ
らには限らない：遺伝子産物のクローニング、プロセシングおよび／または発現
を改変する変更。例えば、変更は、当業者に周知である技術（例えば、部位特異
的変異誘発、新しい制限部位を挿入すること、グリコシル化パターンを変更する
こと、コドンの優先度を変えること、スプライシング部位を導入することなど）
を使用して導入され得る。
【０１５２】
さらに詳細に本明細書中で記載されているように、本発明のポリヌクレオチド
は、新規なＧＡＴポリペプチドをコードする配列、およびこのコード配列に対す
る相補的配列、ならびにコード配列の新規なフラグメント、およびその相補体を
含む。これらのポリヌクレオチドは、ＲＮＡ形態またはＤＮＡ形態であり得、そ
してｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡおよび合成ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡならびに
ｃＤＮＡを含む。このポリヌクレオチドは、二本鎖または一本鎖であり得、そし
て一本鎖の場合、コード鎖または非コード（アンチセンス、相補）鎖であり得る
。このポリヌクレオチドは必要に応じて、ＧＡＴポリペプチドのコード配列を以
下のように含む（ｉ）単離して、（ｉｉ）例えば、融合タンパク質、プレタンパ
ク質、プレプロタンパク質などをコードするためのさらなるコード配列と組み合
わせて、（ｉｉｉ）イントロンもしくはインテインのような非コード配列、プロ
モーター、エンハンサー、ターミネーターエレメント、または適切な宿主におけ
るコード配列の発現のために有効な５’および／もしくは３’非翻訳領域のよう
な制御エレメントと組み合わせて、ならびに／あるいは（ｉｖ）ＧＡＴポリヌク
レオチドが異種遺伝子であるベクターまたは宿主環境。配列はまた、キャリア、
緩衝液、アジュバンド、賦形剤などの存在下を含む、核酸の代表的な組成物処方
と組み合わせて見出され得る。
【０１５３】
本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、公知の合成法に従っ
て、標準的な固相法によって調製され得る。代表的に、約１００塩基までのフラ
グメントは、個々に合成され、次に実質的に任意の望ましい連続配列を形成する
ために結合される（例えば、酵素的連結法または化学的結合法、あるいはポリメ
ラーゼ媒介法によって）。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９−６９によって記載される古典的なホスホ
ラミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓら、（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３：８
０１−０５によって記載された方法（例えば、代表的には自動合成方法で行なわ
れるような方法）を使用する、化学的合成によって調製され得る。ホスホラミダ
イト法に従って、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機で合成され
、精製され、アニールされ、連結され、そして適切なベクターにクローン化され
る。
【０１５４】
さらに、実質的に任意の核酸は、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅ
ｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｍｃｒｃ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、Ｔ
ｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（ｗｗｗ
．ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）および他多数のような任意の種々の商業的
供給源から特別注文され得る。同様に、ペプチドおよび抗体は、Ｐｅｐｔｉｄｏ
Ｇｅｎｉｃ（ｐｋｉｍ＠ｃｃｎｅｔ．ｃｏｍ）、ＨＴＩ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ，Ｉｎｃ．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｔｉｂｉｏ．ｃｏｍ）、ＢＭＡ  Ｂ
ｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ（Ｕ．Ｋ．）、Ｂｉｏ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉ
ｎｃ．および他多数のような任意の種々の供給源から特別注文され得る。
【０１５５】
ポリヌクレオチドはまた、技術文献に記載されているように周知の技術によっ
て合成され得る。例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  
Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８（１９
８２），およびＡｄａｍｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１（
１９８３）を参照のこと。次いで、二本鎖ＤＮＡフラグメントは、相補鎖を合成
し、そして適切な条件下でこれらの鎖を一緒にアニーリングすることによってか
、または適切なプライマー配列を用いてＤＮＡポリメラーゼを使用して、相補鎖
を付加することによってかのいずれかで得られ得る。
【０１５６】
変異誘発を含む本明細書中で有用な分子生物学的技術を記載する一般的なテキ
ストとしては、以下が挙げられる：ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄ
ｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（「Ｂｅｒｇｅｒ」）；Ｓａｍ
ｂｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（第２版），第１〜３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏ
ｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  
Ｙｏｒｋ，１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏ
ｒｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕ
ｂｅｌら、編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏ
ｎｓ，Ｉｎｃ．との間の合併（２０００年を通じて補完された）（「Ａｕｓｕｂ
ｅｌ」）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑ
βレプリカ−ゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、ＮＡＳＢ
Ａ）を含むインビトロでの増加方法を介する、当業者を指向させるに十分な技術
の例は、以下において見出される：Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，およびＡ
ｕｓｕｂｅｌならびにＭｕｌｌｉｓら、（１９８７）米国特許第４，６８３，２
０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ
ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら、編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  
Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ａｒｎｈｅｉｍ
＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  ３６−４７；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏ
ｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１−９４；Ｋｗｏｈら、（１
９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３；Ｇ
ｕａｔｅｌｌｉら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ  ８７：１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら、（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．
３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１
：１０７７−１０８０；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ  ８：２９１−２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，（１９８９）Ｇｅｎ
ｅ  ４：  ５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：１１
７，ならびにＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−５６４。インビトロで増幅された核酸をクローニ
ングする改良方法は、Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記
載されている。ＰＣＲによる大きな核酸の増幅の改良方法は、Ｃｈｅｎｇら、（
１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４−６８５およびその中の参考文献で要
約され、ここで、４０ｋｂまでのＰＣＲアンプリコンは生成される。当業者は、
実質的な任意のＲＮＡが、制限消化、ＰＣＲ伸長ならびに逆転写酵素およびポリ
メラーゼを使用する配列決定に適した二本鎖ＤＮＡに変換されることを認識する
。Ａｕｓｂｅｌ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒ（全て上出）を参照のこ
と。
【０１５７】
（配列バリエーション）
遺伝暗号の縮重に起因して、本発明のＧＡＴポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列の多数が生成され得、そのうちいくつかは、本明細書中で明白に開示
された核酸配列に対する実質的な同一性を有することは、当業者によって認識さ
れる。
【０１５８】
【表１】
2008206519.tif 000002
例えば、コドン表（表１）の検分は、コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ
、ＣＧＧおよびＣＧＵのすべてが、アミノ酸のアルギニンをコードしていること
を示す。したがって、アルギニンがコドンによって特定される本発明の核酸のす
べての位置で、コドンはコードされたポリペプチドを変えずに、上記の任意の対
応するコドンに変えられ得る。ＲＮＡ配列のＵは、ＤＮＡ配列のＴと対応してい
ることは理解されている。
【０１５９】
配列番号１（ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＡＡＡ）のヌクレオチド１〜
１５に対応する核酸配列を例として用いると、この配列のサイレントバリエーシ
ョンは、ＡＧＴ  ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧを含み、これらの配列は両方
とも、配列番号６のアミノ酸１〜５と対応するアミノ酸配列ＭＩＥＶＫをコード
する。
【０１６０】
このような「サイレントバリエーション」は、「保存的改変バリエーション」
の一種であり、下記で論じられている。当業者は、核酸のそれぞれのコドン（メ
チオニンに対する通常唯一のコドンであるＡＵＧは除く）が標準的な技術によっ
て改変されて、機能的に同一なポリペプチドをコードし得ることを認識する。し
たがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレントバリエーションのそれぞ
れは、任意の記載された配列中に潜在する。本発明は、可能なコドン選択に基づ
く組み合わせを選択することによって作られ得る、本発明のポリペプチドをコー
ドする核酸配列のそれぞれおよびすべての可能なバリエーションを提供する。こ
れらの組み合わせは、本発明のＧＡＴホモログポリペプチドをコードする核酸配
列に適用される場合、標準的なトリプレット遺伝暗号（例えば、表１で示すよう
な）に従ってなされる。本明細書中のすべての核酸のこのようなバリエーション
のすべては特異的に提供され、遺伝暗号と組み合わせて配列と考慮して、記載さ
れている。任意の改変体は、本明細書中で述べられたように生成され得る。
【０１６１】
すべて同じアミノ酸をコードする２つ以上異なるコドンのグループは、同じ前
後関係で翻訳される場合、「同義コドン」として本命書中で呼ばれる。本明細書
中に記載されたように、本発明のいくつかの局面において、ＧＡＴポリヌクレオ
チドは、例えば植物宿主のような望ましい宿主生物体内での最適化されたコドン
使用のために設計される。用語「最適化された」または「最適な」は、コドンの
可能な限り最良の組み合わせに限定されることを意味しないが、単純には、コー
ド配列が全体として、これが由来する前駆体ポリヌクレオチドと比較して、コド
ンの改良された使用をすることを示している。したがって、一つの局面において
、本発明は、親コドンと比較して、例えば、植物のような、望ましい宿主生物体
で優先的に使用される同義コドンによって、ヌクレオチド配列内の少なくとも一
つの親コドンを置換することによってＧＡＴポリヌクレオチド改変体を産生する
ための方法を提供する。
【０１６２】
特定の核酸配列の「保存的改変バリエーション」または、単純に「保存的バリ
エーション」とは、同一アミノ酸配列または実質的に同一なアミノ酸配列をコー
ドする核酸、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、実質的に同一な
配列をいう。当業者は、コードされた配列内で単一アミノ酸または低％のアミノ
酸（代表的に５％未満、さらに代表的には４％、２％または１％未満、あるいは
それより少ない）を変更、付加または欠失する個々の置換、欠損または付加が、
「保存的改変バリエーション」であり、この変更はアミノ酸の欠失、アミノ酸の
付加、または化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じるということ
を認識する。
【０１６３】
機能的な類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野で周知である。
表２は、お互いに「保存的置換」であるアミノ酸を含む６つのグループを示す。
【０１６４】
【表２】
2008206519.tif 000003
したがって、本発明の列挙されたポリペプチドの「保存的置換バリエーション
」は、同じ保存的置換グループの保存的に選択されたアミノ酸による、ポリペプ
チド配列のアミノ酸の低％（代表的には５％未満、さらに代表的には２％未満そ
してしばしば１％未満）の置換を含む。
【０１６５】
例えば、配列番号６として本明細書中で同定されているポリペプチドの保存的
置換バリエーションは、１４６アミノ酸のポリペプチド内で７残基（すなわち、
５％のアミノ酸）まで、上記に規定された６グループに従う「保存的置換」を含
む。
【０１６６】
さらなる例において、４つの保存的置換が配列番号６のアミノ酸２１〜３０と
に対応する領域に局在する場合、この領域の保存的置換バリエーションの例は、
ＲＰＮ  ＱＰＬ  ＥＡＣ  Ｍであり、以下：
ＫＰＱ  ＱＰＶ  ＥＳＣ  Ｍ  および
ＫＰＮ  ＮＰＬ  ＤＡＣ  Ｖ  などを含み、表２に記載された保存的置換に従
う（上記例では、保存的置換に下線がひかれてある）。本明細書中でのタンパク
質配列の一覧表は、上記の置換表と合わせて、すべての保存的置換タンパク質の
明確な表を提供する。
【０１６７】
最終的に、核酸分子のコードされた活性を変えない配列の付加（例えば、非機
能的配列または非コード配列の付加）は、基本核酸の保存的なバリエーションで
ある。
【０１６８】
当業者は、開示された核酸構築物の多数の保存的バリエーションが、機能的に
同一な構築物を生じることを認識する。例えば、上記で記載されたように、遺伝
暗号の縮重に起因して、「サイレント置換」（すなわち、コードされたポリペプ
チドでの変化を生じない核酸配列の置換）は、アミノ酸をコードするすべての核
酸配列の、意味される特徴である。同様に、アミノ酸配列内での１またはいくつ
かのアミノ酸の「保存的アミノ酸置換」は、非常に類似した特性を有する異なる
アミノ酸に置換され、また、開示された構築物に非常に類似するので容易に同定
される。このような開示されたそれぞれの配列の保存的バリエーションは、本発
明の特徴である。
【０１６９】
特定の核酸の非保存的な改変は、保存的置換として特徴付けられない任意のア
ミノ酸を置換する改変である。例えば、６つのグループの境界を越える任意の置
換は、表２に示されている。これらは、中性アミノ酸に対する塩基性または酸性
のアミノ酸の置換（例えば、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＭｅｔに対するＡｓ
ｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＧｌｎ）、塩基性または酸性のアミノ酸に対する芳香
族アミノ酸の置換（例えば、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＧｌｎに対するＰｈ
ｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐ）あるいはアミノ酸を類似のアミノ酸で置換しない任意
の他の置換、を含む。
【０１７０】
（核酸ハイブリダイゼーション）
核酸は、それらが（代表的には溶液中で）会合する場合に、「ハイブリダイズ
」する。核酸は、水素結合、溶媒排除、塩基スタッキングなどのような、よく特
徴付けられた物理化学的な種々の力に起因してハイブリダイズする。核酸のハイ
ブリダイゼーションへの広範な指針は、以下で見出される、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１
９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，第Ｉ部，
第２章，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉ
ｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏ
ｒｋ）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，上出、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１
９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ
およびＨｉｇｇｉｎｓ  １）ならびにＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９９
５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓおよ
びＨｉｇｇｉｎｓ  ２）はオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡおよびＲＮＡの合成
、標識、検出および定量に関する詳細を提供する。
【０１７１】
サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションのよう
な核酸のハイブリダイゼーションの実験の文脈において、「ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、そして異なる環境パ
ラメーターの下では異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針
は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），上出，ならびにＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉ
ｎｓ  １そしてＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ  ２，上出で見出される。
【０１７２】
本発明の目的のために、一般的に「高度にストリンジェント」なハイブリダイ
ゼーション条件および洗浄条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定配
列についての、融解点（Ｔｍ）よりおよそ５℃以下になるように選択される（以
下に記すように、高度にストリンジェントな条件とは比較の語句でも言及され得
る）。Ｔｍは、試験配列中の５０％が、完全に一致したプローブとハイブリダイ
ズする（規定されたイオン強度およびｐＨの下での）温度である。非常にストリ
ンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴｍと等しくなるように選択さ
れる。
【０１７３】
核酸二重鎖のＴｍは、所定の条件下で二重鎖が５０％変性される温度を示し、
そして核酸ハイブリッドの安定性の直接的な尺度を表す。従って、Ｔｍは、へリ
ックスからランダムコイルへの移行の中間点に対応する温度に対応する；Ｔｍは
、長さ、ヌクレオチド組成およびヌクレオチドの長いストレッチについてのイオ
ン強度に依存する。
【０１７４】
ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていない核酸物質は、一連の洗
浄により除去され得、洗浄のストリンジェンシーは所望される結果に依存して調
整され得る。低いストリンジェンシーの洗浄条件（例えば、より高い塩濃度およ
びより低い温度を用いた条件）は、感度を増加するが、非特異的なハイブリダイ
ゼーションのシグナルおよび高いバックグラウンドのシグナルを生じ得る。より
高度なストリンジェンシーの条件（例えば、より低い塩濃度および、ハイブリダ
イゼーションの温度に近い、より高い温度を用いた条件）は、バックグラウンド
シグナルを低下させ、代表的に特異的なシグナルのみが残存する。Ｒａｐｌｅｙ
，Ｒ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｍｅｔｈ
ｏｄｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）（
本明細書中でこれより以下、「ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ」）を参照のこ
と、この文献は本明細書中にて参考としてその全体があらゆる目的で援用される
。
【０１７５】
ＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、以下のような式１を用いて見積もられ得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−
０．７２（％ｆ）−５００／ｎ、
ここで、Ｍは１価陽イオン（普通はＮａ＋）のモル濃度、（％Ｇ＋Ｃ）はグアノ
シン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）ヌクレオチドのパーセント、（％ｆ）はホルム
アミドのパーセント、およびｎはハイブリッドのヌクレオチド塩基数（すなわち
、長さ）である。ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ、上記を参照のこと。
【０１７６】
ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、以下のような式２を用いることで見積もられ
得る：
Ｔｍ（℃）＝７９．８℃＋１８．５（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．５８（％Ｇ＋Ｃ）−
１１．８（％Ｇ＋Ｃ）２−０．５６（％ｆ）−８２０／ｎ、
ここで、Ｍは１価陽イオン（普通は、Ｎａ＋）のモル濃度、（％Ｇ＋Ｃ）はグア
ノシン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）ヌクレオチドのパーセント、（％ｆ）はホル
ムアミドのパーセント、およびｎはハイブリッドのヌクレオチド塩基数（すなわ
ち、長さ）である。同上。
【０１７７】
式１および式２は典型的に約１００〜２００ヌクレオチドより長いハイブリッ
ド二重鎖に対してのみ正確である。同上。
【０１７８】
５０ヌクレオチドより短い核酸配列のＴｍは、次のように計算され得る：
Ｔｍ（℃）＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）、
ここで、Ａ（アデニン）、Ｃ、Ｔ（チミン）、およびＧは対応するヌクレオチ
ドの数である。
【０１７９】
サザンブロットまたはノーザンブロットにおいてフィルター上の１００より多
いの相補的な残基を有する相補的な核酸のハイブリダイゼーションのためのスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃で１ｍｇのへパリン
を補充した５０％ホルマリンであり、ハイブリダイゼーションを一晩実施するこ
とである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で１５分間の０．２×Ｓ
ＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液に関する記述はＳａｍｂｒｏｏｋら、上記、を参
照のこと）。しばしば、バックグラウンドのプローブシグナルを除くために、高
度なストリンジェンシーの洗浄が、低いストリンジェンシーの洗浄に勝る。低い
ストリンジェンシーの洗浄の例は、４０℃で１５分間の２×ＳＳＣである。
【０１８０】
一般的に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係のプローブ
に見られるノイズ比シグナルよりも、２．５倍〜５倍（またはさらに高い）のノ
イズ比シグナルは、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。本発明の状
況下にある２つの配列間の少なくともストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ンの検出は、例えば、本明細書中の配列表にて提供される、本発明の核酸に対す
る比較的強い構造類似性または相同性を示す。
【０１８１】
記されるように、「高度にストリンジェント」な条件は、規定されたイオン強
度およびｐＨでの特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃以下となる
ように選択される。目的のヌクレオチド配列（例えば「プローブ」）に近い関係
か、または同一である標的配列は高度にストリンジェントな条件下で同定され得
る。低度にストリンジェントな条件は、より相補性の低い配列に対して適切であ
る。例えば、上記のＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒを参照のこと。
【０１８２】
比較ハイブリダイゼーションを、本発明の核酸を同定するために使用し得、そ
してこの比較ハイブリダイゼーションの方法は、本発明の核酸を区別する好まし
い方法である。本発明の状況下における２つのヌクレオチド配列間での高度にス
トリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、例えば本明細書中の配列表
に提供される核酸に対して、比較的強い構造類似性／構造相同性を示す。２つの
ヌクレオチド配列間の高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件により検出されるものよりも高い
程度の、構造の類似性または相同性、ヌクレオチド塩基組成の類似性または相同
性、配置または順序の類似性または相同性を示す。特に、本発明の状況下におけ
る高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、例えば、本明細
書中の配列表に提供される核酸に対する、強い構造類似性または構造相同性（例
えば、核酸構造、塩基組成、塩基配置または塩基順序）を示す。例えば、ストリ
ンジェントな条件下で本明細書中の例示的な核酸に対してハイブリダイズする試
験核酸を同定することが所望される。
【０１８３】
従って、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの１つの尺度は、列挙さ
れた核酸（例えば、配列番号１から配列番号５の核酸配列、および配列番号１１
から配列番号２６２の核酸配列、ならびにそれらの相補的なポリヌクレオチド配
列）の１つに対して高度にストリンジェントな条件（または非常にストリンジェ
ントな条件、または超高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条
件、または超超高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件）下
でハイブリダイズする能力である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション
（ならびに、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション、超高度にスト
リンジェントなハイブリダイゼーション、または超超高度にストリンジェントな
ハイブリダイゼーション）条件およびストリンジェントな洗浄条件は、任意の試
験核酸について経験的に容易に決定され得る。例えば、高度にストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件および高度にストリンジェントな洗浄条件を決定
する際に、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、選択された基準の組
み合わせを満たすまで、（例えば、ハイブリダイゼーションまたは洗浄における
温度の上昇、塩濃度の減少、界面活性剤濃度の増加および／または有機溶媒（例
えば、ホルマリン）の濃度の増加により）次第に強められる。例えば、ハイブリ
ダイゼーション条件および洗浄条件は、配列番号１〜配列番号５および配列番号
１１〜配列番号２６２より選択される１つ以上の核酸配列およびそれらの相補的
なポリヌクレオチド配列を含むプローブが、完全に一致する相補的な標的（再び
、配列番号１〜配列番号５および配列番号１１〜配列番号２６２より選択される
１つ以上の核酸配列およびそれらの相補的なポリヌクレオチド配列を含む、核酸
）に対して、非合致標的に対するプローブのハイブリダイゼーションにて観察さ
れるノイズ比シグナルの、少なくとも約２．５倍、場合によっては約５倍以上の
強さのノイズ比シグナルで結合するまで、次第に強められる。この場合、非合致
標的は、本願出願時点で公共データベース（例えばＧｅｎＢａｎｋＴＭ）に在る
核酸（添付の配列表中の核酸以外）に対応する核酸である。当業者はＧｅｎＢａ
ｎｋにおいてそのような配列を同定し得る。例としては、登録番号Ｚ９９１０９
およびＹ０９４７６が挙げられる。当業者はさらなるそのような配列を、例えば
ＧｅｎＢａｎｋにおいて、同定し得る。
【０１８４】
試験核酸は、完全に合致する相補的な標的に対する場合の少なくとも１／２の
割合でプローブとハイブリダイズする場合に、すなわち、完全に合致するプロー
ブが、登録番号Ｚ９９１０９および登録番号Ｙ０９４７６の任意の非合致のポリ
ヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションに観察されるノイズ比シグナルよ
り少なくとも約２倍〜１０倍、場合によっては２０倍、５０倍以上であるノイズ
比シグナルで、完全に合致する相補的標的と結合する条件下でのプローブの標的
に対するハイブリダイゼーションの少なくとも１／２の高さのノイズ比シグナル
で、プローブ核酸に対して特異的にハイブリダイズすると述べられる。
【０１８５】
超高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件と
は、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件のストリンジェンシーが、完全
に合致する相補的な標的核酸に対するプローブの結合についてのノイズ比シグナ
ルが、任意の非合致の標的核酸（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ９９１０９および登
録番号Ｙ０９４７６）に対するプローブのハイブリダイゼーションに観察される
ノイズ比シグナルの、少なくとも１０倍の高さになるまで強められる。完全に一
致する相補的な標的核酸に対するノイズ比シグナルの少なくとも１／２のノイズ
比シグナルを伴い、そのような条件下でプローブとハイブリダイズする標的核酸
は、超高度なストリンジェンシーの条件下でプローブに結合すると述べられる。
【０１８６】
同様に、ストリンジェンシーがより高度のレベルであっても、関連のハイブリ
ダイゼーションアッセイについてのハイブリダイゼーション条件および／または
洗浄条件を次第に強めることにより決定され得る。例えば、完全に一致する相補
的な標的核酸へのプローブの結合に対するノイズ比シグナルが、任意の非一致の
標的核酸Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ９９１０９および登録番号Ｙ０９４７６に対
するハイブリダイゼーションに観察されるノイズ比シグナルの少なくとも１０倍
、２０倍、５０倍、１００倍、または５００倍以上に高度になるまで、ハイブリ
ダイゼーション条件および洗浄条件のストリンジェンシーが強められる、ストリ
ンジェンシーのレベルである。完全に一致する相補的な標的核酸の少なくとも１
／２のノイズ比を伴う、そのような条件の下でプローブにハイブリダイズする標
的核酸は、超超高度なストリンジェンシーの条件の下でプローブに対して結合す
ると述べられる。
【０１８７】
高度、超高度、または超超高度なストリンジェンシーの条件の下で配列番号１
〜配列番号５および配列番号１１〜配列番号２６２に表される核酸にハイブリダ
イズする標的核酸は、本発明の１つの様相である。そのような核酸の例としては
、所定の核酸配列と比較して１つまたは数個のサイレントな核酸置換または保存
的な核酸の置換が挙げられる。
【０１８８】
ストリンジェントな条件下でお互いにハイブリダイズしない核酸は、それらの
コードするポリペプチドが実質的に同一である場合、なお実質的に同一である。
このことが起こるのは、例えば、既知のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録
番号ＣＡＡ７０６６４を含む）によりコードされるポリペプチドを使用して差し
引かれた、配列番号６〜配列番号１０および配列番号２６３〜配列番号５１４の
遺伝子コードによって許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーが生産
される場合、または、既知のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＡ
７０６６４を含む）によりコードされるポリペプチドを使用して差し引かれた、
配列番号６〜配列番号１０および配列番号２６３〜配列番号５１４のうちの１つ
以上に対して抗血清が作製される場合、である。本発明のポリペプチドの免疫学
的な同一性についてのさらなる詳細を以下に見出す。さらに、約１００ヌクレオ
チド未満の配列を有する二重鎖の間の識別のため、当該分野の当業者に公知のＴ
ＭＡＣ１ハイブリダイゼーション手順を使用し得る。例えば、Ｓｏｒｇ，Ｕ．ら
、１  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（Ｓｅｐｔ．１１，１９９１）１
９（１７）（本明細書中に参考としてその全体が全ての目的のために援用される
）を参照のこと。
【０１８９】
１つの局面として、本発明は配列番号１〜配列番号５および配列番号１１〜配
列番号２６２より選択される核酸における独特な部分配列を含む核酸を提供する
。独特な部分配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ９９１０９および登録番号Ｙ０
９４７６のうちのいずれかに対応する核酸と比較して独特である。そのような独
特な部分配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ９９１０９、登録番号Ｙ０９４７６
または本願の出願日の時点において公共データベース中で利用可能な他の関連配
列により表される、核酸の完全なセットに対して、配列番号１〜配列番号５およ
び配列番号１１〜配列番号２６２のうちの任意の配列を整列させることにより決
定され得る。デフォルトパラメーターにセットしたＢＬＡＳＴアルゴリズムを使
用して整列を実施し得る。任意の独特な部分配列は、例えば、本発明の核酸を同
定するためのプローブとして有用である。
【０１９０】
同様に、本発明は配列番号６〜配列番号１０および配列番号２６３〜配列番号
５１４から選択されるポリペプチド中の独特な部分配列を含むポリペプチドを包
含する。ここでは、独特の部分配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＡ７０６６
４に対応するポリペプチドと比較して独特である。再度ここでは、ポリペプチド
は登録番号ＣＡＡ７０６６４により表される配列に対して整列される。その配列
が偽遺伝子のような非翻訳配列に対応する場合、対応するポリペプチドは単に核
酸配列のアミノ酸配列へのインシリコでの翻訳により作製されることに注意する
べきであり、そこでは読み取り枠が相同なＧＡＴポリヌクレオチドの読み取り枠
に対応する様に選択される。
【０１９１】
本発明はまた、配列番号６〜配列番号１０および配列番号２６３〜配列番号５
１４から選択されるポリペプチド中の独特な部分配列をコードする、独特なコー
ドオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
る標的核酸を提供し、ここで独特の部分配列は任意のコントロールのポリペプチ
ドに対応するポリペプチドと比較して独特である。独特な配列は、上に記載した
ように決定される。
【０１９２】
１つの例において、ストリンジェントな条件は、コードするオリゴヌクレオチ
ドに対して完全に相補的なオリゴヌクレオチドが、任意のコントロールポリペプ
チドに対応するコントロール核酸に対する完全に相補的なオリゴヌクレオチドの
ハイブリダイゼーションよりも、少なくとも約２．５倍〜１０倍高い、好ましく
は少なくとも約５〜１０倍高いノイズ比シグナルで、コードするオリゴヌクレオ
チドにハイブリダイズするように、選択される。使用される特定のアッセイにお
いてより高い（例えば約１５倍、約２０倍、約３０倍、約５０倍またはそれ以上
）ノイズ比シグナルが見られるような条件を選択し得る。この例では、標的核酸
は、コードするオリゴヌクレオチドに対するコントロール核酸のハイブリダイゼ
ーションと比較して、少なくとも２倍高いノイズ比シグナルを有して独特なコー
ドオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズする。再び、より高いノイズ比シ
グナル（例えば約２．５倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約５０倍
またはそれ以上）を選択し得る。特定のシグナルは関連するアッセイにおいて使
用される標識（例えば、蛍光ラベル、比色ラベル、放射性ラベルなど）に依存す
る。
【０１９３】
（ベクター、プロモーターおよび発現系）
本発明はまた、上で広範に記載した１つ以上の核酸配列を含む組換え構築物を
包含する。その構築物は、本発明の核酸配列が順方向または逆方向にて組み込ま
れたベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、細菌人工
染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）など）を含む。この実施形態の好
ましい局面において、その構築物は、配列に作動可能に連結された調節配列（例
えば、プロモーターを含む）をさらに含む。多くの適切なベクターおよびプロモ
ーターは当該分野の当業者に公知であり、そして市販で利用可能である。
【０１９４】
ベクター、プロモーターおよび多くの他の関連題材の使用を含む、本明細書中
で有用な分子生物学技術を記載した、一般的なテキストとして、Ｂｅｒｇｅｒお
よびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２
巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（Ｂ
ｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐ
ｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈ
ａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）、およびＣ
ｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒ
ｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．の合弁事業（１９９９年まで追補された
）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が挙げられる。例えば、本発明の相同核酸を生産する
ための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ
レプリカーゼ増幅、および他のＲＮＡポリメラーゼに媒介される技術（例えば、
ＮＡＳＢＡ）を含む、インビトロ増幅方法を介して、当業者を指示するのに十分
なプロトコルの例は、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ
、ならびにＭｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣ
Ｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉ
ｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈｅｉｍ
＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ  ＆  ＥＮ  ３６−４７；
Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３，８
１−９４；（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ  ８６，１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ
．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ  ３５，１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ  ２４１，１０７７−１０８０；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，２９１−２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ
，（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４，５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅ
ｎｅ  ８９，１１７、ならびにＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（１９９５
）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−５６４において、見出される。
インビトロで増幅された核酸をクローニングするための改良された方法は、Ｗａ
ｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号中に記載される。ＰＣＲにより
大規模に核酸を増幅するために改良された方法は、Ｃｈｅｎｇら（１９９４）Ｎ
ａｔｕｒｅ  ３６９：６８４−６８５およびそこで引用される参考文献において
まとめられており、ここで、４０ｋｂにも及ぶＰＣＲアンプリコンが生成される
。当業者は、逆転写酵素およびポリメラーゼを使用して、制限消化、ＰＣＲ伸長
および配列決定に適した二本鎖ＤＮＡへと、実質的に任意のＲＮＡを変換し得る
ことを理解する。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＢｅｒｇ
ｅｒ（すべて同上）を参照のこと。
【０１９５】
本発明はまた、本発明のベクター（例えば、本発明のクローニングベクター、
または本発明の発現ベクター）を形質導入した（形質転換した、またはトランス
フェクトした）、操作された宿主細胞、ならびに組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの生産に関連する。そのベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒
子、ファージなどであり得る。プロモーター活性化、形質転換体の選択、または
ＧＡＴホモログ遺伝子の増幅に対して適切であるように改変された従来の栄養培
地中で、操作された宿主細胞を培養し得る。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど
）は、発現のために選択された宿主細胞で従来から用いられる条件であり、そし
て当業者に明らかであり、本明細書中に記載される参考文献（例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ、ＡｕｓｕｂｅｌおよびＢｅｒｇｅｒ、ならびに、例えば、Ｆｒｅｓｈ
ｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、ａ  Ｍ
ａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌ
ｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、およびそれらで引用される参考文献が挙げられる）
中にある。
【０１９６】
本発明のＧＡＴポリペプチドを、非動物細胞（例えば、植物、酵母、真菌、細
菌など）において生産し得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＢｅｒｇｅｒおよびＡｕｓｕ
ｂｅｌに加えて、非動物細胞培養に関する詳細を、Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐ
ｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕ
ｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、ＮＹ；ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）
Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；
Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎ
ｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒ
ｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ならびにＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ  
Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９
９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬに見出し得る。
【０１９７】
本発明のポリヌクレオチドを、ポリペプチドの発現に適した様々な発現ベクタ
ーのいずれかに組み込み得る。適切なベクターは、染色体、非染色体および合成
ＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０誘導体；細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキ
ュロウイルス、酵母プラスミド、ならびに、プラスミドとファージＤＮＡ、ウイ
ルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病
、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよび多くの他のウイ
ルス）の組み合わせに由来するベクター、が挙げられる。遺伝子物質を細胞へと
形質導入させる全てのベクター、および複製が所望される場合には、関連宿主に
おいて複製可能かつ生存可能な全てのベクターが、使用され得る。
【０１９８】
発現ベクターに組み込まれた場合、本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ合
成を指示する適切な転写制御配列（プロモーター）と作動可能に連結される。特
に、トランスジェニック植物における使用に適切なそのような転写制御配列の例
としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、ゴマノハグサ（ｆｉｇ
ｗｏｒｔ）モザイクウイルス（ＦＭＶ）、およびイチゴベインバンディングウイ
ルス（ＳＶＢＶ）プロモーターが挙げられ、米国仮特許出願番号６０／２４５，
３５４号に記載される。原核生物細胞、もしくは真核生物細胞、またはそれらの
ウイルスにおいて遺伝子発現を制御することが公知の他のプロモーター、および
本発明のいくつかの実施形態において使用され得るプロモーターとしては、ＳＶ
４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃプロモーターまたはｔｒｐプロモータ
ー、ファージλＰＬプロモーターが挙げられる。発現ベクターは、翻訳開始のた
めのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターを必要に応じて含む。その
ベクターはまた、発現を増幅させるための適切な配列（例えば、エンハンサー）
を必要に応じて含む。さらに、本発明の発現ベクターは、形質転換した宿主細胞
を選択するための表現形質を提供するために、１つ以上の選択可能なマーカー遺
伝子（例えば、真核生物細胞培養用のジヒドロ葉酸レダクターゼもしくはネオマ
イシン耐性、または、Ｅ．ｃｏｌｉ内でのテトラサイクリン耐性もしくはアンピ
シリン耐性など）を必要に応じて含む。
【０１９９】
本発明のベクターは、宿主に本発明のタンパク質またはポリペプチドを発現さ
せるために、適切な宿主を形質転換するために利用され得る。適切な発現宿主の
例としては：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）
；真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐ
ｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；
昆虫細胞（例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕ
ｇｉｐｅｒｄａ）；哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＨＥＫ  
２９３またはＢｏｗｅｓ黒色腫；または植物細胞もしくは外植体など、が挙げら
れる。細胞または細胞株の全てが完全に機能するＧＡＴポリペプチドを生産する
機能を有する必要はないことが理解される；例えば、ＧＡＴポリペプチドの抗原
性フラグメントが生産され得る。本発明は、使用される宿主細胞により制限され
ない。
【０２００】
細菌系において、多くの発現ベクターは、ＧＡＴポリペプチドに意図される使
用に依存して、選択され得る。例えば、ＧＡＴポリペプチドまたはそのフラグメ
ントの大部分が、商業的生産または抗体誘導に必要とされる場合、容易に精製さ
れる融合タンパク質の高レベル発現を指示するベクターが所望され得る。そのよ
うなベクターとしては、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のよう
な多機能のＥ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター（ここではＧ
ＡＴポリペプチドのコード配列が、ハイブリッドタンパク質を発現するように、
βガラクトシダーゼのアミノ末端のＭｅｔとそれに続く７残基の配列と、インフ
レームでベクターに連結され得る）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅおよ
びＳｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：５５０３−
５５０９）；ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）などが
挙げられるが、それらに限定されない。
【０２０１】
同様に、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、
α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨのような、構成的プロモーターま
たは誘導性プロモーターを含む多くのベクターが、本発明のＧＡＴポリペプチド
生成のために使用され得る。総説としては、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）およびＧ
ｒａｎｔら（１９８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３
：５１６−５４４）を参照のこと。
【０２０２】
哺乳動物宿主細胞において、ウイルスベースの系を含む様々な発現系が、使用
され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、（例えば、Ｇ
ＡＴポリペプチドの）コード配列は、後期プロモーターおよび三部分リーダー配
列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に中に必要に応じて連結され得る。
ウイルスゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域へのＧＡＴポリペプチドコード領
域の挿入は、感染宿主細胞においてＧＡＴを発現させ得る生存ウイルスを生じさ
せる（ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ
Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー（
例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）は、哺乳動物宿主細胞に
おいて発現を増加させるために使用され得る。
【０２０３】
同様に、植物細胞においては、発現は植物染色体に組み込まれた導入遺伝子よ
り、またはエピソーム核酸もしくはウイルス核酸より細胞質内で駆動され得る。
安定に組み込まれた導入遺伝子の場合では、例えば、ウイルス（例えば、ＣａＭ
Ｖ）または植物由来の制御配列を使用して、本発明のＧＡＴポリペプチドの構成
的または誘導性の発現を駆動し得る配列を提供することがしばしば所望される。
多くの植物由来の制御配列が記載されており、組織特異的な様式にて発現を指示
する配列（例えば、ＴｏｂＲＢ７、パタチンＢ３３、ＧＲＰ遺伝子プロモーター
、ｒｂｃＳ−３Ａプロモーターなど）を含む。あるいは、高レベル発現は、植物
ウイルスベクター（例えば、ＴＭＶ、ＢＭＶなど）の外来性配列を一過的に発現
させることにより達成され得る。典型的に、構成的に本発明のＧＡＴポリヌクレ
オチドを発現するトランスジェニック植物が好ましく、そしてＧＡＴポリペプチ
ドの構成的な安定な発現を確実とするように、制御配列が選択される。
【０２０４】
本発明のいくつかの実施形態において、植物細胞の形質転換に適切なＧＡＴポ
リヌクレオチド構築物が調製される。例えば、所望されるＧＡＴポリヌクレオチ
ドは、植物への遺伝子導入、およびその後のコードされるポリペプチドの発現を
容易にする組換え発現カセットに組み込まれ得る。発現カセットは、形質転換植
物の意図される組織（例えば、植物全体、葉、種子）においてこの配列の発現を
指示する、プロモーター配列ならびに他の転写および翻訳開始制御配列に作動可
能に連結された、ＧＡＴポリヌクレオチドまたはその機能的フラグメントを典型
的に含む。
【０２０５】
例えば、植物の全組織にてＧＡＴポリペプチドの発現を指示する、強いまたは
弱い構成的な植物プロモーターが使用され得る。そのようなプロモーターは、大
部分の環境条件の下、および発生または細胞分化の状態の下で活性である。構成
的なプロモーターの例としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡに由来する１’−または２’−プロモーター、および当業
者に公知の様々な植物遺伝子由来の他の転写開始領域が挙げられる。ＧＡＴポリ
ヌクレオチドの過剰発現が植物に有害であるか、さもなくば所望されない状況に
おいては、本開示を参照して、当業者は弱い構成的プロモーターが低レベルの発
現のために使用され得ることを理解する。高レベルの発現が植物に有害ではない
場合では、強力なプロモーター（例えば、ｔ−ＲＮＡまたは他のｐｏｌ  ＩＩＩ
プロモーター、もしくは強力なｐｏｌ  ＩＩプロモーター（例えば、カリフラワ
ーモザイクウイルスプロモーター））が使用され得る。
【０２０６】
あるいは、植物プロモーターは環境制御下であり得る。そのようなプロモータ
ーは、本明細書で「誘導性の」プロモーターと称する。誘導性プロモーターによ
り転写をもたらし得る環境条件の例としては、病原体の攻撃、嫌気的な条件また
は光の存在が挙げられる。
【０２０７】
本発明にて使用されるプロモーターは、「組織特異的」であり得、そして自体
、ポリヌクレオチドが特定の組織（例えば、葉および種子）でのみ発現される発
達制御下にあり得る。植物系に対して内在性の１つ以上の核酸配列が構築物に組
み込まれる実施形態において、これら遺伝子由来の内在性プロモーター（または
その改変体）はトランスフェクトされた植物において遺伝子発現を指示するため
に使用され得る。組織特異的なプロモーターはまた、異種ポリヌクレオチドの発
現を指示するために使用され得る。
【０２０８】
一般的に、植物において発現カセットに使用される特定のプロモーターは、意
図される用途に依存する。植物細胞において転写を指示する多くのプロモーター
はどれも適切である。プロモーターは構成的かまたは誘導的のどちらかであり得
る。上記のプロモーターに加え、植物において操作される微生物起源のプロモー
ターとして、オクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモー
ターおよびネイティブのＴｉプラスミドに由来する他のプロモーターが挙げられ
る（Ｈｅｒｒａｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：
２０９−２１３を参照のこと）。ウイルスプロモーターとして、カリフラワーモ
ザイクウイルスの３５Ｓおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Ｏｄｅｌｌら（１
９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）が挙げられる。他の植物プロ
モーターとしては、リブロース−１，３−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小
サブユニットプロモーター、およびファセオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）プロモ
ーターが挙げられる。Ｅ８遺伝子および他の遺伝子に由来するプロモーター配列
がまた使用され得る。Ｅ８プロモーターの単離および配列は、Ｄｅｉｋｍａｎお
よびＦｉｓｃｈｅｒ（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７：３３１５−３３２７に詳細
に記載されている。
【０２０９】
候補のプロモーターを同定するために、プロモーター配列に特徴的な配列につ
いて、ゲノムクローンの５’部分を解析する。例えば、プロモーター配列エレメ
ントとして、ＴＡＴＡボックスのコンセンサス配列（ＴＡＴＡＡＴ）が挙げられ
、これは通常は転写開始部位の２０塩基〜３０塩基上流である。植物では、ＴＡ
ＴＡボックスのさらに上流の−８０位〜−１００位に、３つのＧ（またはＴ）ヌ
クレオチドで囲まれた一連のアデニンを有する典型的なプロモーター要素があり
、これは、Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９８３）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｋｏｓａｇｅら（編）２２１−２２７頁に記載され
る。
【０２１０】
本発明のポリヌクレオチド構築物（例えば、ベクター）の調製にあたって、プ
ロモーター以外の配列および連結されるポリヌクレオチドが使用され得る。通常
のポリペプチド発現が所望される場合、ＧＡＴコード領域の３’末端にポリアデ
ニル化領域が含まれ得る。そのポリアデニル化領域は、例えば，様々な植物遺伝
子由来、またはＴ−ＤＮＡ由来であり得る。
【０２１１】
構築物はまた、植物細胞において選択可能な表現型を付与するマーカー遺伝子
を含み得る。例えば、マーカーは、殺生剤耐性をコードし得、特に抗生物質耐性
（例えば、カナマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ブレオマイシン耐性、ハイグロマ
イシン耐性）、または除草剤耐性（例えば、クロロスルフォロン（ｃｈｌｏｒｏ
ｓｌｕｆｏｒｏｎ）もしくはホスフィノトリシン（除草剤ビアラフォス（ｂｉａ
ｌａｐｈｏｓ）およびバスタ（Ｂａｓｔａ）の活性成分））をコードし得る。
【０２１２】
特定の開始シグナルは、本発明のＧＡＴポリヌクレオチドをコードする配列の
効率的な転写を補助し得る。これらのシグナルは、例えば、ＡＴＧ開始コドンお
よび隣接した配列を包含し得る。ＧＡＴポリヌクレオチドコード配列、その開始
コドンおよび上流配列が、適切な発現ベクターに挿入される場合、さらなる翻訳
の制御シグナルは必要とされ得ない。しかし、コード配列（例えば、成熟タンパ
ク質コード配列）、またはその一部のみが挿入される場合、開始コドンを含む外
因性転写制御シグナルが提供されなければならない。さらに、開始コドンは、挿
入物全体の転写を確実にするために正確なリーディングフレーム中に存在しなけ
ればならない。外因性の転写エレメントおよび開始コドンは、種々の起源のもの
であり得、天然および合成双方であり得る。発現の効率は、使用される細胞系に
適切なエンハンサーを封入することにより、増強され得る（Ｓｃｈａｒｆ  Ｄ  
ら（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ  ２０：
１２５−６２；Ｂｉｔｔｎｅｒら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ  １５３：５１６−５４４）。
【０２１３】
（分泌／局在化配列）
哺乳動物細胞の所望の細胞性区画、膜もしくは細胞小器官に対してポリペプチ
ド発現を標的化するためか、または、細胞質周辺腔もしくは細胞培養培地中にポ
リペプチドの分泌を指向するために、例えば、分泌／局在化配列をコードする核
酸に対して、本発明のポリヌクレオチドはまた、インフレームで融合され得る。
このような配列は、当業者に公知であり、そしてこれらとしては、分泌リーダー
ペプチド、細胞小器官標的配列（例えば、核局在化配列、ＥＲ保持シグナル、ミ
トコンドリア移行配列、クロロプラスト移行配列）、膜局在化／アンカー配列（
例えば、終止移行配列、ＧＰＩアンカー配列）などが挙げられる。
【０２１４】
好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、通常に葉緑体に標
的化されるポリペプチドをコードする遺伝子由来のＮ末端葉緑体輸送配列（もし
くは葉緑体輸送ペプチド配列）とインフレームで融合される。このような配列は
、代表的には、セリンおよびスレオニンにおいて豊富であり、アスパラギン酸、
グルタミン酸、およびチロシンにおいて欠失しており、一般的に正電荷のアミノ
酸において豊富な中央ドメインを有する。
【０２１５】
（発現宿主）
さらなる実施形態において、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する
。宿主細胞は真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、または植物細胞）で
あり得るか、あるいは、宿主細胞は原核生物（例えば、細菌細胞）であり得る。
構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、または
他の一般的な技術により行なわれ得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．
およびＢａｔｔｅｙ，Ｉ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
【０２１６】
宿主細胞株は、必要に応じて、挿入された配列の発現を調節するかまたは所望
の様式で発現されたタンパク質をプロセシングするそれらの能力について選択さ
れる。タンパク質のこのような改変は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシ
ル化、リン酸化、脂質化およびアシル化を含むがこれらに限定されない。タンパ
ク質の「プレ」または「プレプロ」形態を切断する翻訳後のプロセシングはまた
、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能のために重要であり得る。Ｅ.ｃｏ
ｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.、酵母などの異なる宿主細胞もしくは、ＣＨＯ
、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などの哺乳動物細胞は、例え
ば、翻訳後活性について特定の細胞性機構および特徴的な機構を有し、そして導
入された外来タンパク質の所望の改変およびプロセシングを確実にするように選
択され得る。
【０２１７】
組換えタンパク質の長期、高収率の生成のために、安定な発現系が使用され得
る。例えば、本発明のポリペプチドを安定に発現する植物細胞、移植片もしくは
組織（例えば苗条（ｓｈｏｏｔ）、リーフディスク）を、ウイルスの複製起点ま
たは内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを使用
して形質導入する。ベクターの誘導後、細胞を選択培地に切り換える前に、細胞
型によって適宜（例えば、細菌細胞には１時間以上、植物細胞には１〜４日間、
数種の植物移植片には２〜４週間）濃縮培地で増殖させ得る。選択マーカーの目
的は、選択に対して耐性を与えることであり、そして、その存在が、導入された
配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能にする。例えば、本発明の
ポリペプチドを発現するトランスジェニック植物は、除草剤であるグリホセート
に対する耐性について、直接選択され得る。安定して形質転換された移植片由来
の耐性胚は、例えば、その細胞型に適切な組織培養技術を使用して、増殖され得
る。
【０２１８】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換した宿主細胞は、必要
に応じて、細胞培養物からコードされたタンパク質を発現および回収するのに適
切な条件下で培養される。組換え細胞によって生成されたタンパク質またはその
フラグメントは、使用される配列および／またはベクターに依存して分泌される
か、膜結合されるか、または細胞内に含まれ得る。当業者によって理解されるよ
うに、本発明のＧＡＴポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核生物膜また
は真核生物膜を介して成熟ポリペプチドの分泌を指向するシグナル配列を使用し
て設計され得る。
【０２１９】
（付加的なポリペプチド配列）
本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば、コードされたポリペプチドの精製
を容易にするマーカー配列に対してインフレームで融合されたコード配列を含み
得る。このような精製を容易にするドメインとしては、固定された金属上での精
製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールのような金属キレートペ
プチド、グルタチオン（例えば、ＧＳＴ）に結合する配列、赤血球凝集素（ＨＡ
）タグ（インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する；
Ｗｉｌｓｏｎら（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）、マルトース結合タンパ
ク質配列、ＦＬＡＧＳ発現／アフィニティー精製系で利用されるＦＬＡＧエピト
ープ（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）などが挙げられるが
、これらに限定されない。精製ドメインとＧＡＴホモログ配列との間のプロテア
ーゼ切断可能なポリペプチドリンカー配列の包含は、精製を容易にするのに有用
である。本明細書中に記載される組成物および方法における使用に意図される１
つの発現ベクターは、エンテロキナーゼ切断部位によって分離されるポリヒスチ
ジン領域に融合される本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を提供
する。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣに対する精製を容易にするが（Ｐｏｒａｔ
ｈら（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ  ３：２６３−２８１に記載されるような、固定化された金属イ
オンアフィニティークロマトグラフィー）、エンテロキナーゼ切断部位は、融合
タンパク質からＧＡＴホモログポリペプチドを分離するための手段を提供する。
ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）はまた、グルタチ
オンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプ
チドを発現するために使用され得る。一般的に、このような融合タンパク質は可
溶性であり、リガンド−アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ−融合の場合におけ
るグルタチオン−アガロース）への吸着によって溶解細胞から簡単に精製され得
、その後、遊離リガンドの存在下で溶出され得る。
【０２２０】
（ポリペプチド生成および回収）
適切な宿主株の形質導入および適切な細胞密度に対する宿主株の増殖後、適切
な手段（例えば、温度変化または化学誘導）によって、選択されたプロモーター
は誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は、代表的には、遠心
分離によって収集され、物理的または化学的手段によって破壊され、そして得ら
れた粗抽出物をさらなる精製のために保持した。タンパク質の発現において使用
される微生物細胞は、任意の簡便な方法（凍結−解凍サイクル、超音波処理、機
械的破壊、もしくは細胞溶解剤の使用、または他の方法を含む）によって破壊さ
れ得、これらの方法は、当業者に周知である。
【０２２１】
記載されるように、多数の参考文献が、多数の細胞（細菌、植物、動物（特に
哺乳動物）および古細菌起源の細胞を含む）の培養および生成のために利用可能
である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＡｕｓｕｂｅｌおよびＢｅｒｇｅｒ（すべ
て前出）、ならびに、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａ
ｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅ、第３版、Ｗｉｅｌｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋおよびそこに引用さ
れた参考文献；Ｄｏｙｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９７）Ｍａｍｍ
ａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｈｕｍａｓｏｎ（１
９７９）Ａｎｉｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第４版、Ｗ．Ｈ
．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ；ならびにＲｉｃｃｉａｒｄｅｌｌ
ｉら（１９８９）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：１０
１６−１０２４を参照のこと。植物細胞培養および再分化については、Ｐａｙｎ
ｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，
Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（
編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  
Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈ
ｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｊｏｎｅｓ（編）（１９８４）Ｐｌ
ａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅ
ｙおよびＰｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９３）Ｒ．Ｒ
．Ｄ．Ｃｒｏｙ編、Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，
Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．ＩＳＢＮ０  １２  １９８３７０  ６。一般的な細胞培
養培地は、ＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬにおいて開示される。細胞培養についてのさら
なる情報は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ（ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ）か
らのＬｉｆｅ  Ｓｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  
Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（１９９８）（「Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣＣＣ」）のような市
販の文献において見出され、そして、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉ
ｎｃ（ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＴｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃ
ａｔａｌｏｇｕｅ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１９９７）（「Ｓｉｇｍａ
−ＰＣＣＳ」）においてもまた見出される。植物細胞形質転換およびトランスジ
ェニック植物産物に関するさらなる詳細は、以下において見出される。
【０２２２】
本発明のポリペプチドは、当該分野で周知の多数の方法のいずれかによって、
組換え細胞培養物から回収および精製され得、これらとしては、硫酸アンモニウ
ム沈殿またはエタノール沈殿、酸性抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマト
グラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、本明細書中で記載され
るタギングシステムのいずれかを使用する）、ヒドロキシルアパタイトクロマト
グラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。所望のように、
成熟タンパク質の立体配置を完成する際、タンパク質の再折り畳み工程が使用さ
れ得る。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終の精製工程
で使用され得る。前記の参考文献に加えて、種々の精製方法が、当該分野で周知
であり、Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒ
ｅｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；およびＢｏｌｌａｇ
ら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓ
ｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｅｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓおよ
びＡｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐ
ｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ
およびＡｎｇａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  
Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒ
ａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ
およびＲｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐ
ｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎ
ｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第２版、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；ならびに
Ｗａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−
ＲＯＭ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ．に開示される方法を含む。
【０２２３】
いくつかの場合においては、工業的および／もしくは商業的適用のために適切
な、本発明のＧＡＴポリペプチドを大規模に生成することが望ましい。このよう
な場合、バルク醗酵（ｂｕｌｋ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）手順が用いられる
。簡単には、ＧＡＴポリヌクレオチド（例えば、配列番号１〜５および１１〜２
６２のいずれか１つを含むポリヌクレオチド、または本発明のＧＡＴポリペプチ
ドをコードする他の核酸）は、発現ベクター中にクローン化され得る。例えば、
米国特許第５，９５５，３１０号；Ｗｉｄｎｅｒら「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  
ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  Ａ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥ  ＩＮ  Ａ  ＢＡＣＩＬＬＵ
Ｓ  ＣＥＬＬ」は、タンデムなプロモーターを有するベクターおよびポリペプチ
ドコード配列に作動可能に連結された安定化配列を記載している。目的のポリペ
プチドをベクターに挿入したのち、ベクターは細菌性の（例えば、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＰＬ１８０１ＩＩＥ株（ａｍｙＥ、ａｐｒ、ｎｐｒ、
ｓｐｏＩＩＥ：：Ｔｎ９１７）宿主に変換される。Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞への発
現ベクターの導入は、例えば、原形質形質転換により（例えば、Ｃｈａｎｇおよ
びＣｏｈｅｎ（１９７９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ  １６８：１１１を参照）またはコンピテント細胞を用いることにより（例
えば、ＹｏｕｎｇおよびＳｐｉｚｉｚｉｎ（１９６１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ８１：８２３もしくはＤｕｂｎａｕおよびＤａｖｉ
ｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ（１９７１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５６：２０９を参照）、またはエレクトロポレーション
により（例えば、ＳｈｉｇｅｋａｗａおよびＤｏｗｅｒ（１９８８）Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２を参照）、または接合により（例えば、Ｋｏｅｈ
ｌｅｒおよびＴｈｏｒｎｅ（１９８７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ  １６９：５２７１を参照）、また、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋおよびＢｅｒｇｅｒ（すべて前出）により達成される。
【０２２４】
形質転換された細胞は、当該分野での公知な方法を用いて、ポリペプチドの産
生に適した栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、振とうフラスコ培養（ｓ
ｈａｋｅ  ｆｌａｓｋ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）または小規模もしくは大規模
な醗酵（連続、バッチ、フェドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）、もしくは固形状
態醗酵を含む）によって、実験室または適切な培地中で、かつポリペプチドが発
現されおよび／もしくは単離されるのが可能な条件下で実施された工業的な醗酵
槽で培養され得る。培養は、炭素源および窒素源ならびに無機塩を含む適切な栄
養培地中で、当該分野で公知の手順を用いて行われる。適切な培地は、商業的な
供給者から利用が可能であり、もしくは、公開された組成物に従って調製され得
る（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎのカタログ中）。分泌されたポリペプチドは、培地から直接回収され得る。
【０２２５】
得られたポリペプチドは、当該分野で公知の方法により単離され得る。例えば
、このポリペプチドは、従来の手順（遠心、濾過、抽出、噴霧乾燥、エバポレー
ション、または沈殿などが挙げられるが、これらに限定されない）により栄養培
地から単離され得る。次いで、単離されたポリペプチドを当該分野で公知の種々
の方法のによって、さらに精製し得、これらの方法としては、クロマトグラフィ
ー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、等電点電気泳動、およびサ
イズ排除）、電気泳動の手順（例えば、分取用等電点電気泳動）、差次的溶解（
例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、または抽出（例えば、Ｂｏｌｌａｇら（１９
９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ
；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈ
ａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；Ｂｏｌｌａｇら（１９９６
）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗ
ａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ）が挙げられるが、これらに限定
されない。
【０２２６】
無細胞転写／翻訳系もまた、本発明のＤＮＡまたはＲＮＡを用いてポリペプチ
ドを産生するために使用され得る。いくつかこのような系が、市販されている。
インビトロ転写および翻訳プロトコルに対する一般的なガイドは、Ｔｙｍｍｓ（
１９９５）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎ
ｓｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３７巻、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎ
Ｙにおいて見出される。
【０２２７】
（配列組換えのための基質および形式）
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｂｅｒｇｅｒおよび
Ｓａｍｂｒｏｏｋが記載するような標準的なクローニング法におけるこれらの使
用、すなわち所望される特性を有するさらなるＧＡＴポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドを生成するためのそれらの使用に加えて、多様な生成手順（例えば、
変異、組換え、再帰的な組換え反応）のための基質として必要に応じて用いられ
る。多様な生成プロトコールは当該分野で利用可能であり、かつ記載されている
。これらの手順はポリヌクレオチもしくはポリヌクレオチドセットの１以上の改
変体、ならびにコードされるタンパク質改変体を生成するために、別々に、およ
び／もしくは組み合わせて用いられ得る。個々におよびまとめて、これらの手順
は、例えば、新規な特徴および／または改善された特徴を有する、ポリヌクレオ
チド、タンパク質、経路、細胞および／または生物の、技術または迅速な進化の
ために有用な、多様化したポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドのセット（
例えば、ポリヌクレオチドライブラリーを含む）の、確固とした広範に適用可能
な生成方法を提供する。配列を変更するプロセスは、例えば、一塩基変換、多重
塩基変換、および核酸配列領域の挿入もしくは欠損をもたらし得る。
【０２２８】
明確さのために、以下の議論の中で区別および分類がなされるが、この技術は
、しばしば、相互に相容れないわけではないことが認識される。実際、種々の方
法が、多様な配列改変体を得るために、単独でかまたは組み合わせて、並行して
かまたは連続して、使用され得る。
【０２２９】
本明細書中に記載される任意の多様性生成手順の結果は、１つ以上のポリヌク
レオチドの生成であり得、それらのポリヌクレオチドは、所望の特性を有するか
またはその特性を付与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドについて、
選択またはスクリーニングされ得る。本明細書中の方法または当業者が利用可能
な方法の１つ以上による多様化に続いて、生成される任意のポリヌクレオチドが
、所望される活性または特性（例えば、グリホセートの可変Ｋｍ、アセチルＣｏ
Ａの可変Ｋｍ、ｋｃａｔが増大した代替的な補因子（例えばプロピオニルＣｏＡ
）の使用などについて選択され得る。これは、例えば、自動化形式または自動化
可能な形式で、当該分野におけるアッセイのいずれかにより検出され得る任意の
活性を同定することを含み得る。例えば、増加した特異的な活性を有するＧＡＴ
ホモログは、グリホセートのＮ−アセチルグリホセートへの転換をアッセイする
ことにより（例えば、質量分析によって）検出され得る。あるいは、グリホセー
トに対する抵抗を与える改善された能力は、本発明の核酸で形質転換された細菌
を寒天（増加した濃度のグリホセートを含む）上で培養するか、もしくはグリホ
セートとともに本発明の核酸を組み込んだトランスジェニック植物をスプレーす
る（ｓｐｒａｙｉｎｇ）ことによりアッセイされ得る。種々の関連する特性が（
または関連しない特性さえ）、実務家の裁量にて、連続してまたは並行して、評
価され得る。除草剤の耐性のための組換えおよび選択に関するさらなる詳細は、
例えば、「ＤＮＡ  ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ  ＴＯ  ＰＲＯＤＵＣＥ  ＨＥＲＢＩＣ
ＩＤＥ  ＲＥＳＩＳＴＡＮＴ  ＣＲＯＰＳ」（１９９９年８月１２日出願）（Ｕ
ＳＳＮ０９／３７３，３３３）内において見出され得る。
【０２３０】
種々の多様性生成手順の詳細は、多重酵素領域をコードする改変された核酸配
列を生成するためのファミリーシャッフリングおよび方法を含み、以下の出版物
およびそこに引用される参考文献に見出される：Ｓｏｏｎｇ，Ｎ．ら（２０００
）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ」Ｎａｔ  
Ｇｅｎｅｔ  ２５（４）：４３６−３９；Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９９）「Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇ
ｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」
Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ４：１−４；Ｎｅｓｓら（１９９９）「ＤＮ
Ａ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  
ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １
７：８９３−８９６；Ｃｈａｎｇら（１９９９）「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  
ａ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎ
ｇ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：７９３−７９７；Ｍｉ
ｎｓｈｕｌｌおよびＳｔｅｍｍｅｒ（１９９９）「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕ
ｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ」Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏ
ｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：２８４−２９０
；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら（１９９９）「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏ
ｎ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ＡＺＴ  ｐｈｏｓｐｈ
ｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ
」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：２５９−２６４；Ｃｒａ
ｍｅｒｉら（１９９８）「ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌ
ｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅ
ｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ  ３９
１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９７）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅ
ｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｒｓｅｎａｔｅ  ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：４３６−４３８；Ｚｈａｎｇら（１９９７）
「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  
ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｂｙ  Ｄ
ＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４５０４−４５０９；Ｐａｔｔｅｎら（１
９９７）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｔ
ｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７２４−７３
３；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖ
ｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｈａｇｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  
ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：１
００−１０３；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇｒｅｅｎ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖ
ｏｌｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３１５−３１９；Ｇａｔｅｓら（１９９６）
「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇ
ａｎｄｓ  ｆｒｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  
ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｎ  ａ  ｌａｃ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ「ｈｅａｄｐｉｅｃｅ
ｄｉｍｅｒ」」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ
２５５：３７３−３８６；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９６）「Ｓｅｘｕａｌ  ＰＣ
Ｒ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲ」：Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ
ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ
，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．ｐｐ．４４７−４５７；ＣｒａｍｅｒｉおよびＳｔｅｍｍ
ｅｒ（１９９５）「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃａｓｓ
ｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｃｒｅａｔｅｓ  ａｌｌ  ｔｈｅ  ｐｅｒ
ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ａｎｄ  ｗｉｌｄｔｙｐｅ  ｃａｓ
ｓｅｔｔｅｓ」ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：１９４−１９５；Ｓｔｅｍ
ｍｅｒら（１９９５）「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ
ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｅｎｔｉｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｏｒｍ  ｌａｒｇｅ  
ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓ」Ｇｅｎｅ，１６４：４９−５３；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９５）「Ｔｈｅ  Ｅ
ｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ」Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ  ２７０：１５１０；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９５）「Ｓｅａｒｃｈｉ
ｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐａｃｅ」Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：
５４９−５５３；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）「Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏ
ｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆ
ｌｉｎｇ」  Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１；およびＳｔｅｍｍｅｒ（
１９９４）「ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅ
ｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏ
ｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．」Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１
。
【０２３１】
多様性を生成する変異誘発方法には、例えば、以下が挙げられる：部位特異的
変異誘発（Ｌｉｎｇら（１９９７）「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍ
ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
２５４（２）：１５７−１７８；Ｄａｌｅら（１９９６）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕ
ｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ」Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）
「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．
１９：４２３−４６２；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ＆  Ｓｈｏｒｔｌｅ（１９８５）「
Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉ
ｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０
１；Ｃａｒｔｅｒ（１９８６）「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７；およびＫｕｎｋｅｌ（１９８
７）「Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  
＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．およびＬｉ
ｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．編．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ
））；テンプレートを含むウラシルを用いた変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５
）「Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃ
ｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４
９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）「Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐ
ｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．１５４，３６７−３８２；およびＢａｓｓら（１９８８）「Ｍｕｔａｎｔ
Ｔｒｐ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２４０−２４５）；
オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．
１００：４６８−５００（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ
．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ（１９
８２）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ  ｅｆ
ｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈ
ｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ
ｎｙ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０
：６４８７−６５００；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ（１９８３）「Ｏｌｉｇ
ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  
ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｌｏｎｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒ
ｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００；および
Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ（１９８７）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏ
ｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ
ａｎｄ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌｅｔｅ」
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０）；ホスホロ
チオエート修飾ＤＮＡ変異誘発（Ｔａｙｌｏｒら（１９８５）「Ｔｈｅ  ｕｓｅ
ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ
ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｐｒｅ
ｐａｒｅ  ｎｉｃｋｅｄ  ＤＮＡ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７
４９−８７６４；Ｔａｙｌｏｒら（１９８５）「Ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅ
ｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍ
ｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏ
ｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ  Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７（１９８５）；Ｎａｋａｍａｙｅ  ＆  
Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９８６）「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃ
ｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｎｃｉ  Ｉ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  
ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９６７９−９
６９８；Ｓａｙｅｒｓら（１９８８）「Ｙ−Ｔ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉ
ｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２；およびＳａｙｅｒｓら（１９８８）「Ｓｔｒ
ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈ
ｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔ
ｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐ
ｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｔｈｉｄｉｕｒｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ」Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４）；ギャップ二重鎖ＤＮＡを用いた変異
誘発（Ｋｒａｍｅｒら（１９８４）「Ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  Ｄ
ＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃ
ｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ  ＆  Ｆｒｉｔｚ（１９８
７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  
ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ」１５４．３５０−３６７；Ｋｒ
ａｍｅｒら（１９８８）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉ
ｔｒｏ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  Ｄ
ＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃ
ｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」  Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７２０７；およびＦｒｉｔｚら（１９８８）「Ｏｌ
ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  
ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｐｒｏ
ｃｅｄｕｒｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉ
ｎ  ｖｉｔｒｏ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６．６９８７−６９９９）
。
【０２３２】
さらなる適切な方法としては、以下が挙げられる：点ミスマッチ修復（Ｋｒａ
ｍｅｒら、（１９８４）「Ｐｏｉｎｔ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ」Ｃｅ
ｌｌ  ３８：８７９−８８７）、修復欠陥宿主株を使用した変異誘発（Ｃａｒｔ
ｅｒら（１９８５）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓ
ｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖ
ｅｃｔｏｒｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３；お
よびＣａｒｔｅｒ（１９８７）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖ
ｅｃｔｏｒｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０
３）、欠失変異誘発（Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１
９８６）「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅ
ｒａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．
１４：５１１５）、制限−選択および制限−精製（Ｗｅｌｌｓら（１９８６）「
Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ  ｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔ
ｅ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ」Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎ
ｄ．Ａ  ３１７：４１５−４２３）、総遺伝子合成による変異誘発（Ｎａｍｂｉ
ａｒら（１９８４）「Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎ
ｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅ
ａｓｅ  Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９−１３０１；
ＳａｋａｍａｒおよびＫｈｏｒａｎａ（１９８８）「Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ
ａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｏｄ  ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅ
ｎｔ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉ
ｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ）」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６３６１
−６３７２；Ｗｅｌｌｓら（１９８５）「Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉ
ｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  
ｓｉｔｅｓ」Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３；およびＧｒｕｎｄｓｔｒｏｍら
（１９８５）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  ‘ｓｈｏｔ−ｇｕｎ’  ｇｅｎ
ｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３３０５−３
３１６）、２本鎖切断修復（Ｍａｎｄｅｃｋｉ（１９８６）；Ａｒｎｏｌｄ（１
９９３）「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｕｎｕｓｕａｌ
ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４５０−４５５。「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉ
ｒ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  
ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７１７７−７１８１
）。多くの上記方法におけるさらなる詳細は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ，第１５４巻に見出され得、これはまた、種々の変異誘発方法を用
いたトラブルシューティング問題についての有用なコントロールを記載する。
【０２３３】
種々の多様性生成方法に関するさらなる詳細は、以下の米国特許、ＰＣＴ公開
、およびＥＰ公開に見出され得る：Ｓｔｅｍｍｅｒに対する米国特許第５，６０
５，７９３号（１９９７年２月２５日），「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎ  ｖ
ｉｔｒｏ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；」Ｓｔｅｍｍｅｒらに対する米国特許
第５，８１１，２３８（１９９８年９月２２日）「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇ
ｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓ
ｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｂｙ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｓｅ
ｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；」Ｓｔｅｍｍｅｒらに
対する米国特許第５，８３０，７２１号（１９９８年１１月３日），「ＤＮＡ  
Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  
ａｎｄ  Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ」；Ｓｔｅｍｍｅｒに対する米国特許第５，８３
４，２５２号（１９９８年１１月１０日）「Ｅｎｄ−Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒ
ｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；」Ｍｉｎｓｈｕｌｌに対する米
国特許第５，８３７，４５８号（１９９８年１１月１７日），「Ｍｅｔｈｏｄｓ
ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍ
ｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；」ＷＯ  ９５／２２６２５，Ｓｔ
ｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒｉ，「Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｒａｎｄ
ｏｍ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ；」Ｓｔｅ
ｍｍｅｒおよびＬｉｐｓｃｈｕｔｚによるＷＯ  ９６／３３２０７，「Ｅｎｄ  
Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔ
ｉｏｎ；」ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒｉによるＷＯ  ９７／２００７８
，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  
ｂｙ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｔｉｏｎ；」ＭｉｎｓｈｕｌｌおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ  ９７／３５９
６６，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｃｅｌ
ｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；」Ｐｕｎ
ｎｏｎｅｎらによるＷＯ  ９９／４１４０２，「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓ；」Ｐｕｎｎｏｎｅｎらによる
ＷＯ  ９９／４１３８３，「Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｉｚ
ａｔｉｏｎ；」ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ  ９９／４１３６９，「Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；」Ｐｕｎｎ
ｏｎｅｎらによるＷＯ  ９９／４１３６８，「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ；」ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒｉによるＥＰ
７５２００８，「ＤＮＡ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｆ
ｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ；」Ｓｔｅｍｍｅｒ
によるＥＰ  ０９３２６７０，「Ｅｖｏｌｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ
Ｕｐｔａｋｅ  ｂｙ  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｔｉｏｎ；」ＳｔｅｍｍｅｒらによるＷＯ  ９９／２３１０７，「Ｍｏｄ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｒｏｐｉｓｍ  ａｎｄ  Ｈｏｓｔ  
Ｒａｎｇｅ  ｂｙ  Ｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ；」Ａｐｔ
らによるＷＯ  ９９／２１９７９，「Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕ
ｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ；」ｄｅｌ  ＣａｒｄａｙｒｅらによるＷＯ  ９８／３１８
３７，「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇ
ａｎｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉ
ｎａｔｉｏｎ；」ＰａｔｔｅｎおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ  ９８／２７２
３０，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌ
ｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；」ＳｔｅｍｍｅｒらによるＷＯ  
９８／１３４８７，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏ
ｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」ＷＯ  ００／００６３２
，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｄｉｖｅ
ｒｓｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，」ＷＯ００／０９６７９，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆ
ｏｒ  Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｐｏｌ
ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｎｋｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｕｌ
ｔｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，」ＡｒｎｏｌｄらによるＷＯ９８／４２８３２
，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｎｄｏｍ  ｏｒ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｐｒｉｍ
ｅｒｓ，」ＡｒｎｏｌｄらによるＷＯ  ９９／２９９０２，「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆ
ｏｒ  Ｃｒｅａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐ
ｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，」ＶｉｎｄによるＷＯ９８／４１６５３，
「Ａｎ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ  ａ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ，」ＢｏｒｃｈｅｒｔらによるＷＯ  ９８
／４１６２２，「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ａ  Ｌｉ
ｂｒａｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，」およびＰａｔｉおよ
びＺａｒｌｉｎｇによるＷＯ９８／４２７２７，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｔｅ
ｒａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉ
ｏｎ」ＰａｔｔｅｎらによるＷＯ００／１８９０６，「Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏ
ｆ  Ｃｏｄｏｎ−Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｇｅｎｅｓ；」ｄｅｌ  Ｃａｒｄａｙｒｅら
によるＷＯ  ００／０４１９０，「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃ
ｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｒｅｃｏ
ｍｂｉｎａｔｉｏｎ；」ＣｒａｍｅｒｉらによるＷＯ００／４２５６１，「Ｏｌ
ｉｇｏｎｕｃｕｃｌｅｃｔｉｄｅ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉ
ｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；」ＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒ
らによるＷＯ００／４２５５９，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｎ
ｇ  Ｄａｔａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏ
ｎａｒｙ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ；」ＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによるＷＯ  ００
／４２５６０，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒ
Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ；」
ＷｅｌｃｈらによるＷＯ０１／２３４０１，「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ−Ｖａ
ｒｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｓ
ｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ；」およびＡｆｆｈｏｌｔｅｒによるＰ
ＣＴ／ＵＳ０１／０６７７５，「Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ
ｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｉｓｏｌａｔ
ｉｏｎ」。
【０２３４】
特定の米国出願は、種々の多様性生成方法に関するさらなる詳細を提供し、こ
れには、以下が挙げられる：「ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ  ＯＦ  ＣＯＤＯＮ  ＡＬＴ
ＥＲＥＤ  ＧＥＮＥＳ」（Ｐａｔｔｅｎら、１９９９年９月２８日出願）（ＵＳ
ＳＮ０９／４０７，８００）；「ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ  ＯＦ  ＷＨＯＬＥ  ＣＥ
ＬＬＳ  ＡＮＤ  ＯＲＧＡＮＩＳＭＳ  ＢＹ  ＲＥＣＵＲＳＩＶＥ  ＳＥＱＵＥ
ＮＣＥ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」ｄｅｌ  （Ｃａｒｄａｙｒｅら、１９９
８年７月１５日出願）（ＵＳＳＮ０９／１６６，１８８），および１９９９年７
月１５日，（ＵＳＳＮ０９／３５４，９２２）；「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩ
ＤＥ  ＭＥＤＩＡＴＥＤ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩ
ＯＮ」（Ｃｒａｍｅｒｉら，１９９９年９月２８日出願）（ＵＳＳＮ０９／４０
８，３９２）；「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＭＥＤＩＡＴＥＤ  ＮＵＣ
ＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」（Ｃｒａｍｅｒｉら，２０
００年１月１８日出願）（ＰＣＴ／ＵＳ００／０１２０３）；「ＵＳＥ  ＯＦ  
ＣＯＤＯＮ−ＢＡＳＥＤ  ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩ
Ｓ  ＦＯＲ  ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ」（Ｗｅｌｃｈら，１９
９９年９月２８日出願）（ＵＳＳＮ０９／４０８，３９３）；「ＭＥＴＨＯＤＳ
ＦＯＲ  ＭＡＫＩＮＧ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ  ＳＴＲＩＮＧＳ，  ＰＯＬＹＮ
ＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＆  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＨＡＶＩＮＧ  ＤＥＳ
ＩＲＥＤ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」（Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖら，２００
０年１月１８日出願）（ＰＣＴ／ＵＳ００／０１２０２）；「ＭＥＴＨＯＤＳ  
ＦＯＲ  ＭＡＫＩＮＧ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ  ＳＴＲＩＮＧＳ，ＰＯＬＹＮＵＣ
ＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＆  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＨＡＶＩＮＧ  ＤＥＳＩＲ
ＥＤ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」（Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖら，２０００年
７月１８日出願）（ＵＳＳＮ／０９／６１８，５７９）ならびに「ＭＥＴＨＯＤ
Ｓ  ＯＦ  ＰＯＰＵＬＡＴＩＮＧ  ＤＡＴＡ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ  ＦＯＲ  
ＵＳＥ  ＩＮ  ＥＶＯＬＵＴＩＯＮＡＲＹ  ＳＩＭＵＬＡＴＩＯＮＳ」（Ｓｅｌ
ｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒら、２０００年１月１８日出願）（ＰＣＴ／
ＵＳ００／０１１３８）「ＳＩＮＧＬＥ−ＳＴＲＡＮＤＥＤ  ＮＵＣＬＥＩＣ  
ＡＣＩＤ  ＴＥＭＰＬＡＴＥ−ＭＥＤＩＡＴＥＤ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ
ＡＮＤ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＦＲＡＧＭＥＮＴ  ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ
」Ａｆｆｈｏｌｔｅｒ（ＵＳＳＮ  ６０／１８６，４８２、２０００年２月２日
出願）。
【０２３５】
要約すれば、変異、組換えなどのような、いくつかの異なる配列改変方法の一
般的なクラスは、本発明に適用可能であり、そして例えば上記参考文献に記載さ
れる。すなわち、成分核酸配列について、産生された改変遺伝子融合構築物への
改変は、配列の結合（ｃｏｊｏｉｎｉｎｇ）の前か、または結合工程の後のいず
れかで、記載される多数のプロトコルによって実施され得る。本発明の文脈にお
いて、多様性の作製のための好ましい形式の以下の例示的ないくつかの異なるタ
イプは、例えば、多様性作製の形式に基づいた特定の組換えを含む。
【０２３６】
核酸は、上記参考文献において考察された種々の技術のいずれかによってイン
ビトロで組換えられ得、例えば、組換えられる核酸のＤＮＡｓｅ消化に続く、ラ
イゲーションおよび／または核酸のＰＣＲ再構を含む。例えば、ＤＮＡ分子のラ
ンダム（または擬似ランダム、または非ランダムでさえも）なフラグメンテーシ
ョンに続く、インビトロで、異なるが関連するＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子間
の、配列類似性に基づく組換え、次いでポリメラーゼ連鎖反応における伸長によ
る交差の固定による、性に関するＰＣＲ変異誘発が使用され得る。このプロセス
および多くのプロセスの変形は、上記参考文献のいくつか（例えば、Ｓｔｅｍｍ
ｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０
７４７〜１０７５１）において記載される。
【０２３７】
同様に、核酸は、例えば、細胞内の核酸の間で組換えを生じさせることによっ
て、インビトロで再帰的に組換えられ得る。多くのこのようなインビトロでの組
換えの形式は、上記に記載された参考文献に記載される。このような形式は、必
要に応じて、目的の核酸の間の直接的な組換えを提供するか、または他の形式と
同様に、目的の核酸を含むベクター、ウイルス、プラスミドなどの間での組換え
を提供する。このような手順に関する詳細は、上記の参考文献中に見出される。
【０２３８】
必要に応じて所望のライブラリー成分（例えば、本発明の経路に対応する遺伝
子）を有するゲノムの組換え混合物のスパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）を含む、
細胞または他の生物のゲノム全体が組換えられる、ゲノム全体の組換え方法がま
た使用され得る。これらの方法は、標的遺伝子の同一性が知られていない用途を
含む、多くの用途を有する。このような方法に関する詳細は、例えば、ｄｅｌ  
ＣａｒｄａｙｒｅらによるＷＯ９８／３１８３７中の「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏ
ｆ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｒｅｃｕｒ
ｓｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；および例えば、
ｄｅｌ  ＣａｒｄａｙｒｅらによるＰＣＴ／ＵＳ９９／１５９７２、同様の題名
の「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ
ｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｔｉｏｎ」中に見出される。従って、組換え、再帰的組換え、およびゲノム全体
の組換えのためのこれらのプロセスおよび技術のいずれかは、単独または組合わ
せて、本発明の改変された核酸配列および／または改変された遺伝子融合構築物
を産生するために使用され得る。
【０２３９】
目的の標的に対応するオリゴヌクレオチドが、２以上の親核酸に対応するオリ
ゴヌクレオチドを含む、ＰＣＲまたはライゲーション反応において合成および再
構築され、これによって新しい組換え核酸を産生する、合成的な組換え方法もま
た使用され得る。オリゴヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド付加方法によっ
て作製され得るか、または、例えば、トリヌクレオチド合成アプローチによって
作製され得る。このようなアプローチに関する詳細は、上記参考文献中に見出さ
れ、例えば、ＣｒａｍｅｒｉらによるＷＯ００／４２５６１、「Ｏｌｉｇｏｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅ（Ｏｌｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＷｅｌｃｈらによるＷ
Ｏ０１／２３４０１、「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ−Ｖａｒｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓ
ｈｕｆｆｌｉｎｇ」；ＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによるＷＯ００／４２５６０、「Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒ  Ｓｔｒｉｎｇｓ，
Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｈａｖ
ｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」；ならびにＳｅｌ
ｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ００／４２５５９「Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ  ｏｆ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｄａｔａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  
Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」を含む。
【０２４０】
相同な（または、非相同でさえも）核酸に対応する配列のストリングを組換え
るために、遺伝的アルゴリズムがコンピュータ内で使用される、インシリコでの
組換えの方法が、達成され得る。その結果生じる組換えられた配列のストリング
は、必要に応じて、例えば、オリゴヌクレオチド合成／遺伝子再構技術と合わせ
て、組換えられた配列に対応する核酸の合成によって核酸に変換される。このア
プローチは、ランダム、部分的にランダムまたは設計された改変体を産生し得る
。インシリコでの組換えに関する多くの詳細は、対応する核酸（および／または
タンパク質）の産生、ならびに設計された核酸および／またはタンパク質（例え
ば、交差位置選択に基づく）の組合わせ、ならびに設計された、擬似ランダムな
またはランダムな組換え方法と組合わせたコンピュータシステムにおける遺伝的
アルゴリズム、遺伝的オペレータなどの使用を含み、Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖらによ
るＷＯ００／４２５６０、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｃｈａｒ
ａｃｔｅｒ  Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏ
ｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｓｔｉｃｓ」ならびにＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ００
／４２５５９「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｄａｔａ  Ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｓｉｍ
ｕｌａｔｉｏｎｓ」中に記載される。インシリコでの組換え方法に関する広範囲
にわたる詳細は、これらの出願において見出される。この方法論は、一般的に、
インシリコでの種々の代謝経路（例えば、カロチノイド生合成経路、エクトイン
（ｅｃｔｏｉｎｅ）生合成経路、ポリヒドロキシアルカノエート生合成経路、芳
香族ポリケチド生合成経路など）に関連するタンパク質をコードする、核酸配列
および／または遺伝子融合構築物の組換えならびに／あるいは対応する核酸もし
くはタンパク質の産生について提供することにおいて、本発明に適用可能である
。
【０２４１】
例えば、単鎖のテンプレートへの多種多様な核酸または核酸フラグメントのハ
イブリダイゼーションに続く、全長配列を再生させるための重合および／または
ライゲーション、必要に応じて、テンプレートの分解および生じた改変核酸の回
収によって、天然の多様性を利用する多くの方法は、同様に使用され得る。単鎖
のテンプレートを利用する１つの方法において、ゲノムライブラリーに由来する
フラグメントの集団は、反対側の鎖に対応するｓｓＤＮＡもしくはＲＮＡの一部
分、または、しばしばほぼ完全長を用いてアニールされる。次いで、この集団由
来の複雑なキメラの遺伝子のアセンブリは、非ハイブリダイジングフラグメント
の末端の核酸塩基の除去、このようなフラグメントとその結果生じる単鎖のライ
ゲーションとの間のギャップを満たすための重合によって媒介される。親のポリ
ヌクレオチド鎖は、消化（例えば、ＲＮＡまたはウラシル含有の場合）、変性条
件下での磁気分離（このような分離につながる方法において標識化された場合）
および他の使用可能な分離／精製方法によって除去され得る。あるいは、親鎖は
、必要に応じて、キメラ鎖と一緒に精製され、そして引き続くスクリーニング工
程およびプロセシング工程の間に除去される。このアプローチに関するさらなる
詳細は、例えば、Ａｆｆｈｏｌｔｅｒによる、ＰＣＴ／ＵＳ０１／０６７７５、
「Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｅｍｐｌａ
ｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ  Ａｃｉｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ」において見出される。
【０２４２】
別のアプローチにおいて、単鎖の分子は、二本鎖のＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変
換され、そしてこのｄｓＤＮＡ分子は、リガンドを媒介した結合によって固体支
持体に結合される。結合していないＤＮＡの分離の後、選択されたＤＮＡ分子は
、支持体から遊離され、そしてプローブにハイブリダイズするライブラリーが豊
富な配列を産生するために適切な宿主細胞の中へ導入される。この方法において
産生されたライブラリーは、本明細書中に記載された任意の手順を使用して、さ
らなる多様化のための所望の基質を提供する。
【０２４３】
任意の前述の一般的な組換えの形式は、より多様なセットの組換え核酸を産生
するために、反復様式（例えば、１以上のサイクルの変異／組換えまたは他の多
様性産生方法、必要に応じて、その後に１以上の選択方法が続く）において実施
され得る。
【０２４４】
ポリヌクレオチド連鎖停止法（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｈａｉｎ  
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ）を利用する変異誘発はまた、提案さ
れ（例えば、Ｓｈｏｒｔによる米国特許出願第５，９６５，４０８号、「Ｍｅｔ
ｈｏｄ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｎ
ｇ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、および上記の参考文献を参照のこと）、そして本発
明に適用され得る。このアプローチにおいて、配列類似性の領域を共有する１以
上の遺伝子に対応する二本鎖のＤＮＡは、その遺伝子について特異的なプライマ
ーの存在または非存在下において、結合および変性される。次いで、単鎖のポリ
ヌクレオチドは、ポリメラーゼおよび連鎖停止試薬（例えば、紫外線照射、γ線
照射もしくはＸ線照射；エチジウムブロマイドもしくは他のインターカレーター
；単鎖結合タンパク質、転写活性化因子、もしくはヒストンのようなＤＮＡ結合
タンパク質；多環式芳香族炭化水素；三価のクロムもしくは三価のクロム塩；ま
たは急速な熱循環によって媒介される簡略された重合；など）の存在下において
アニールおよびインキュベートされ、結果として部分的に二重鎖の分子の産生を
生じる。次いで、例えば、部分的に伸長された鎖を含む、部分的な二重鎖分子は
、種々の程度の配列類似性を共有し、そして最初のＤＮＡ分子の集団に対して多
様化されたポリヌクレオチドを生じる、複製または部分的な複製の引き続く繰り
返しにおいて、変性および再アニールされる。必要に応じて、産物、または産物
の部分的なプールは、このプロセスにおいて１以上の工程で増幅され得る。上記
記載のような、連鎖停止法により産生されたポリヌクレオチドは、任意の他に記
載された組換えの形式について適切な基質である。
【０２４５】
多様性はまた、Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）「Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔ
ｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎｄ
ｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ  １７：１２０５中に記載される「ハイブリッド酵素の作製のためのイン
クリメンタルトランケーション（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏ
ｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ
）」（「ＩＴＣＨＹ」）と称される組換えの手順を使用して、核酸または核酸の
集団において産生され得る。このアプローチは、必要に応じて、１以上のインビ
トロまたはインビボの組換え方法について基質として機能し得る改変体の初期ラ
イブラリーを産生するために使用され得る。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９
）「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  
ｂｙ  Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：３５６２〜６７；Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら
（１９９９）、「Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  
Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ
Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ」、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉ
ｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７：２１３９〜４４もまた参照のこと。
【０２４６】
個々のヌクレオチドまたは連続したヌクレオチドもしくは連続していないヌク
レオチドのグループの改変を生じる変異の方法は、本発明の核酸配列および／ま
たは遺伝子融合構築物の中へヌクレオチドの多様性を導入するために好んで使用
され得る。多くの変異誘発方法は、上記記載の参考文献において見出され；変異
誘発方法に関するさらなる詳細は、下記において見出され得、これらはまた、本
発明に適用され得る。
【０２４７】
例えば、誤りがちなＰＣＲは、核酸改変体を産生するために使用され得る。こ
の技術を使用することで、ＤＮＡポリメラーゼのコピーの正確さが低下される条
件下でＰＣＲは実施され、その結果、ＰＣＲ産物の全長に沿って高い率の点変異
が得られる。このような技術の例は、上記の参考文献中ならびに例えば、Ｌｅｕ
ｎｇら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１〜１５およびＣａｌｄｗｅｌ
ｌら（１９９２）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２：２８〜３３中に
見出される。同様に、小さなＤＮＡフラグメントの混合物由来のＰＣＲ産物のア
センブリに関連する工程において、アセンブリＰＣＲは、使用され得る。同じ反
応混合物中で同時に、多数の異なるＰＣＲ反応は生じ得、ここで１つの反応の産
物は、別の反応の産物をプライムする。
【０２４８】
オリゴヌクレオチド指向性変異誘発は、目的の核酸配列において部位特異的な
変異を誘導するために使用され得る。このような技術の例は、上記参考文献中お
よび例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
４１：５３〜５７中に見出される。同様に、ネイティブな配列と異なる合成オリ
ゴヌクレオチドのカセットを使用して、二本鎖のＤＮＡ分子の小さな領域を置換
する工程において、カセット式変異誘発は、使用され得る。オリゴヌクレオチド
は、例えば、完全および／または部分的にランダム化されたネイティブな配列を
含み得る。
【０２４９】
再帰的アンサンブル変異誘発は、タンパク質の変異誘発についてのアルゴリズ
ムが、表現型的に関連した変種の多種多様な集団（このメンバーはアミノ酸配列
が異なる）を産生するために使用される工程である。この方法は、コンビナトリ
アルなカセット式変異誘発の連続的な繰り返しをモニターするために、フィード
バック機構を使用する。このアプローチの例は、Ａｒｋｉｎ＆Ｙｏｕｖａｎ（１
９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１〜７
８１５中に見出される。
【０２５０】
指数的（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）アンサンブル変異誘発は、高い割合の独特
かつ機能的な変異体を有するコンビナトリアルライブラリーを作製するために使
用され得る。目的の配列における残基の小さなグループは、改変されたそれぞれ
の位置について、機能的なタンパク質をもたらすアミノ酸を同定するために並行
してランダム化される。このような手順の例は、Ｄｅｌｅｇｒａｖｅ＆Ｙｏｕｖ
ａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１５
４８〜１５５２中に見出される。
【０２５１】
インビボ変異誘発は、例えば、１以上のＤＮＡ修復経路内に変異を保有するＥ
．ｃｏｌｉの株において、ＤＮＡを増やすことによって目的の任意のクローンＤ
ＮＡ中に、ランダムな変異を産生するために使用され得る。これらの「ミューテ
ーター」株は、野生型の親の割合よりもより高いランダム変異の割合を有する。
これらの株の１つにおいてＤＮＡを増やすことは、最終的にＤＮＡ内にランダム
変異を産生する。このような手順は、上記記載の参考文献中に記載される。
【０２５２】
ゲノム（例えば、細菌ゲノム、真菌ゲノム、動物ゲノムまたは植物ゲノム）中
に多様性を導入するための他の手順は、上記記載の方法および／または参照とし
た方法と共に使用され得る。例えば、上記の方法に加えて、種々の種への形質転
換に適切な核酸のマルチマーを産生する技術が提案されている（例えば、Ｓｃｈ
ｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ、米国特許出願第５，７５６，３１６号および上記の参
考文献を参照のこと）。このようなマルチマーでの適切な宿主の形質転換は、互
いに対して相違であり（例えば、天然の多様性に由来するまたは部位特異的な変
異誘発、誤りがちなＰＣＲ、変異原性の細菌株にわたる継代、などの適用による
）、ＤＮＡの多様化について核酸の多様性の供給源を提供する（例えば、上記に
記載したようなインビボの組換え工程による）遺伝子から構築される。
【０２５３】
あるいは、部分的な配列類似性の領域を共有する単量体のポリヌクレオチドの
多重度は、宿主の種に形質転換され得、宿主細胞によってインビボで組換えされ
得る。引き続く細胞分化の繰り返しは、ライブラリーを産生するために使用され
得、ライブラリーのメンバーは、単一、相同な集団、または単量体ポリヌクレオ
チドのプールを含む。代替的に、単量体の核酸は、標準的な技術（例えば、ＰＣ
Ｒおよび／またはクローニング）によって回収され得、そして上記に記載された
再帰的組換えの形式を含む任意の組換えの形式において組換えられ得る。
【０２５４】
多種の発現ライブラリーを作製するための方法は記載されており（上記記載の
参考文献に加えて、例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎら（１９９８）米国特許出願第５
，７８３，４３１号「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ  ＡＮＤ
ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＮＯＶＥＬ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ  ＰＡＴＨＷＡＹＳ」
、およびＴｈｏｍｐｓｏｎら（１９９８）米国特許出願第５，８２４，４８５号
ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ  ＡＮＤ  ＳＣＲＥＥＮＩＮ
Ｇ  ＮＯＶＥＬ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ  ＰＡＴＨＷＡＹＳを参照のこと）、そし
て目的のタンパク質の活性を同定するためのそれらの使用が提案されてきた（上
記記載の参考文献に加えて、Ｓｈｏｒｔ（１９９９）米国特許出願第５，９５８
，６７２号「ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＯＦ  
ＣＬＯＮＥＳ  ＨＡＶＩＮＧ  ＤＮＡ  ＦＲＯＭ  ＵＮＣＵＬＴＩＶＡＴＥＤ  
ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ」を参照のこと）。多種発現ライブラリーは、一
般的に、発現カセット内で、適切な調節配列に作動可能に連結した、複数の種ま
たは株に由来するｃＤＮＡ配列またはゲノム配列を包含するライブラリーを含む
。ｃＤＮＡ配列および／またはゲノム配列は、必要に応じて、多様性をさらに強
化するために、ランダムに結合される。ベクターは、宿主生物（例えば、細菌種
、真核細胞）の１より多い種における形質転換および発現について適切なシャト
ルベクターであり得る。いくつかの場合において、ライブラリーは、目的のタン
パク質をコードするか、または目的の核酸にハイブリダイズする配列を、予め選
択することによって偏らせられる。任意のこのようなライブラリーは、本明細書
中に記載された任意の方法について基質として提供され得る。
【０２５５】
上記に記載された手順は、核酸の多様性および／またはコードされたタンパク
質の多様性を増大させることにほとんど向けられてきた。しかし、多くの場合に
おいて、全ての多様性が有用ではなく（例えば、機能上）、そしてわずかな好ま
しい改変体を同定するためにスクリーニングまたは選択されねばならない改変体
のバックグラウンドを単に増加することに寄与するだけである。いくつかの適用
において、ライブラリー（例えば、増幅されたライブラリー、ゲノムライブラリ
ー、ｃＤＮＡライブラリー、規格化されたライブラリーなど）もしくは多様化す
る（例えば、組換えに基づいた変異誘発手順による）前の他の核酸基質を、予め
選択もしくは予めスクリーニングするか、または、別の方法で機能的産物をコー
ドする核酸の方向へ基質を偏らせることが所望される。例えば、抗体設計の場合
において、記載された任意の方法による操作より前に、インビボでの組換え現象
を利用して、機能的な抗原結合部位を有する抗体の方向へ多様性を産生する工程
を偏らせることは可能である。例えば、Ｂ細胞ｃＤＮＡライブラリー由来の組換
えＣＤＲは、本明細書中に記載された任意の方法に従って多様化する前に、フレ
ームワーク領域内に増幅および構築され得る（例えば、Ｊｉｒｈｏｌｔら（１９
９８）「Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐａｃｅ：ｓｈｕｆｆｌ
ｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｏｒｍｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎｔｏ  ａ  ｍａｓｔｅｒ  ｆｒａ
ｍｅｗｏｒｋ」Ｇｅｎｅ  ２１５：４７１）。
【０２５６】
ライブラリーは、所望の酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸の方向
へ偏らせられ得る。例えば、特定の活性を示すライブラリー由来のクローンを同
定した後、このクローンは、ＤＮＡの変更を導入するための任意の公知の方法を
使用して変異誘発され得る。次いで、変異誘発された相同体を含むライブラリー
は、最初の特定の活性と同じかまたは異なり得る、所望の活性についてスクリー
ニングされる。このような手順の例は、Ｓｈｏｒｔ（１９９９）米国特許出願第
５，９３９，２５０号「ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＨＡＶ
ＩＮＧ  ＤＥＳＩＲＥＤ  ＡＣＴＩＶＩＴＩＥＳ  ＢＹ  ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩ
Ｓ」中に提案される。所望の活性は、当該分野において公知の任意の方法によっ
て同定され得る。例えば、ＷＯ９９／１０５３９は、遺伝子ライブラリーが、遺
伝子ライブラリー由来の抽出物を代謝的に豊富な細胞から入手された成分と混合
し、そして所望の活性を示す組み合わせを同定することによって、スクリーニン
グされ得ることを提案している。所望の活性を有するクローンが、ライブラリー
のサンプル中へ生物活性な基質を挿入し、そして蛍光分析器（例えば、フローサ
イトメトリーデバイス、ＣＣＤ、蛍光測定器、または分光光度計）を使用して、
所望される活性の産物に対応する生物活性な蛍光を検出することによって、同定
され得ることもまた提案されてきた（例えば、ＷＯ９８／５８０８５）。
【０２５７】
ライブラリーはまた、特定の特性（例えば、選択された核酸プローブに対する
ハイブリダイゼーション）を有する核酸の方向に偏らせられ得る。例えば、出願
ＷＯ９９／１０５３９は、所望の活性（例えば、酵素活性（例えば：リパーゼ、
エステラーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ
、ホスファターゼ、キナーゼ、オキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、ヒドロラー
ゼ、ヒドラターゼ、ニトリラーゼ、トランスアミナーゼ、アミダーゼ、またはア
シラーゼ））をコードするポリヌクレオチドが、以下の方法においてゲノムＤＮ
Ａ配列の中から同定され得ることを提案している。ゲノムＤＮＡの集団に由来す
る一本鎖のＤＮＡ分子は、リガンド結合プローブにハイブリダイズされる。この
ゲノムＤＮＡは、培養されたかもしくは培養されていない微生物、または環境中
のサンプルに由来し得る。あるいは、ゲノムＤＮＡは、多細胞生物、または多細
胞生物由来の組織に由来し得る。第２の鎖合成は、捕捉媒体から先に放出される
か、もしくは放出されないか、または当該分野において公知の多種多様な他の方
法によって、捕捉に使用されるハイブリダイゼーションプローブから直接的に実
施され得る。あるいは、単離された一本鎖のゲノムＤＮＡの集団は、さらなるク
ロニーングなしにフラグメント化され得、そして、上記記載のように、一本鎖の
テンプレートを使用して直接的に（例えば、組換えに基づいたアプローチ）使用
され得る。
【０２５８】
核酸およびポリペプチドを産生する「非確率的な」方法は、Ｓｈｏｒｔ「Ｎｏ
ｎ−Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖ
ａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＷＯ００／４６３４４中に主張され
る。非確率的ポリヌクレオチド再構法および部位飽和（ｓｉｔｅ−ｓａｔｕｒａ
ｔｉｏｎ）変異誘発法を含むこれらの方法は、本発明に同様に適用される。ドー
プまたは縮重したオリゴヌクレオチドを使用するランダムまたは半ランダムな変
異誘発はまた、例えば、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ（１９９２）「Ｏｐｔｉ
ｍｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｅｎｃｏｄｅ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ
ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ  １０：２９７〜３００；Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９９１）「
Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」
Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４〜８６；ＬｉｍおよびＳａｕ
ｅｒ（１９９１）「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐａｃｋｉｎ
ｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：３５９〜７６；ＢｒｅｙｅｒおよびＳａｕｅｒ（
１９８９）「Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｎ
ｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ５１Ｆ  ｔｏ  ｌａｍｂｄａ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ」
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３３５５〜６０；ならびに「Ｗａｌｋ−Ｔ
ｈｒｏｕｇｈ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」（Ｃｒｅａ，Ｒ；米国特許出願第５，
８３０，６５０号および米国特許出願第５，７９８，２０８号、ならびに欧州特
許出願第０５２７８０９  Ｂ１号）中に記載される。
【０２５９】
多様化よりも前にライブラリーを濃縮するために適切な、任意の上記に記載さ
れる技術がまた、多様性を産生する方法によって作製される、産物、または産物
のライブラリーをスクリーニングするために使用され得ることは、容易に理解さ
れる。任意の上記記載の方法は、核酸（例えば、ＧＡＴコードポリヌクレオチド
）を変更するために、再帰的または組合わせて実施され得る。
【０２６０】
変異誘発方法、ライブラリーの構築方法および他の多様性産生方法のためのキ
ットもまた市販されている。例えば、キットは、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
（例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  部位特異的突然変異誘発キット；およ
びＣｈａｍｅｌｅｏｎＴＭ  二本鎖部位特異的突然変異誘発キット）、Ｂｉｏ／
Ｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（例えば、上述されるＫｕｎｋ
ｅｌ法を使用する）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、
Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、５プライム
３プライムキット）；Ｇｅｎｐａｋ  Ｉｎｃ、Ｌｅｍａｒｇｏ  Ｉｎｃ、Ｌｉｆ
ｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎ
ｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ  
Ｃｏｒｐ．、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｌｃ（例えば、上記のＥｃｋｓｔｅｉｎ
法を使用する）、ならびにＡｎｇｌｉａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔ
ｄ（例えば、上記のＣａｒｔｅｒ／Ｗｉｎｔｅｒ法を使用する）から入手可能で
ある。
【０２６１】
上記の参考文献は、多くの変異の形式を提供し、変異の形式としては、以下が
挙げられる：組換え、再帰的組換え、再帰的変異および他の形態の変異誘発との
組み合わせまたは組換え、ならびにこれらの形式の多くの改良。使用される多様
性産生形式に関わらず、本発明の核酸は、組換え（相互に、または関連配列（ま
たは関連しない配列でさえも）とともに）し、本発明の遺伝子融合構築物および
改変された遺伝子融合構築物における使用のための組換え核酸の多様なセット（
例えば、相同な核酸のセット、および対応するポリペプチドを含む）を産生し得
る。
【０２６２】
改変されたポリヌクレオチドを産生するための上述された方法論の多くは、親
の配列の多数の多様な改変体を産生する。本発明のいくつかの好ましい実施形態
において、改変技術（例えば、いくつかの形態のシャッフリング）は、改変体の
ライブラリーを作製するために使用され、次いで、これは、いくつかの所望され
る機能的特性（例えば、改良されたＧＡＴ活性）をコードする改変されたポリヌ
クレオチドまたは改変されたポリヌクレオチドのプールについてスクリーニング
される。スクリーニングされ得る例示的な酵素活性は、触媒速度（ｋｃａｔおよ
びＫＭのような速度定数に関して慣習的に特性付けられる）、基質特異性、なら
びに基質、産物もしくは他の分子（例えば、インヒビターもしくはアクチベータ
ー）による活性化または阻害に対する感受性を含む。
【０２６３】
所望される酵素活性についての選択の１つの例は、目的の酵素活性（例えば、
ＧＡＴ活性）を十分には発現しない細胞の増殖および／または生存を阻害する条
件下で、宿主細胞を増殖することを伴う。このような選択工程を使用して、所望
される酵素活性をコードするポリヌクレオチド以外の、全ての改変されたポリヌ
クレオチドを考慮から除外し得る。例えば、本発明のいくつかの実施形態におい
て、宿主細胞は、十分なレベルのＧＡＴの非存在下で細胞の増殖または生存を阻
害する条件下（例えば、ＧＡＴポリヌクレオチドを欠き、これを発現しない同じ
品種の野生型の植物の成長に致命的または阻害するグリホセートの濃度）で保持
される。これらの条件下で、酵素活性または産物の十分なレベルの産生を触媒し
得る活性をコードする改変された核酸を有する、宿主細胞のみが、生存および増
殖する。本発明のいくつかの実施形態は、グリホセートまたはグリホセートアナ
ログの濃度を増加して、複数の繰り返しのスクリーニングを使用する。
【０２６４】
本発明のいくつかの実施形態において、質量分析法は、グリホセートまたはグ
リホセートアナログもしくは代謝産物のアセチル化を検出するために使用される
。質量分析法の使用は、以下の実施例においてより詳細に記載される。
【０２６５】
利便性および高処理量のために、しばしば、微生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの
ような細菌）における所望される改変核酸についてのスクリーニング／選択する
ことが所望される。他方では、植物細胞または植物におけるスクリーニングは、
いくつかの場合において好まれ得る。ここで、最終的な目的は、植物系における
発現のための改変核酸を産生することである。
【０２６６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、処理量は、単独かまたは遺伝
子融合構築物の一部としてのいずれかで、異なる改変核酸を発現する宿主細胞の
プールをスクリーニングすることによって増加される。有意な活性を示す任意の
プールは、所望の活性を発現する単一のクローンを同定するために逆重畳され得
る。
【０２６７】
当業者は、関連するアッセイ、スクリーニングまたは選択方法が所望される宿
主生物などに依存して変動することを認識する。ハイスループット形式において
実施され得るアッセイを使用することが、通常有利である。
【０２６８】
ハイスループットアッセイにおいて、１日に数千以下の異なる改変体をスクリ
ーニングすることが可能である。例えば、マイクロタイタープレートの各ウェル
を使用して別々のアッセイを実施し得るか、または、濃度もしくはインキュベー
ション時間の効果が観測される場合、５〜１０ウェル毎に単一の改変体を試験し
得る。
【０２６９】
流体アプローチに加え、上述のように、単に平板培地上で細胞を増殖し、所望
される酵素機能または代謝機能について選択することが可能である。このアプロ
ーチは、簡単なハイスループットスクリーニング方法を提供する。
【０２７０】
いくつかの周知の自動装置のシステムもまた、アッセイシステムにおいて有用
な溶相化学について開発されてきた。これらのシステムは、Ｔａｋｅｄａ  Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＬＴＤ．（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）に
よって開発された自動化合成装置および科学者により実施される手動の合成操作
を模倣するロボットアームを使用する多くの自動装置システム（Ｚｙｍａｔｅ  
ＩＩ、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ．；
Ｏｒｃａ、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）のよ
うな自動化されたワークステーションを含む。任意の上記の装置は、本発明への
適用について適切である。これらが、統合化されたシステムについての参考文献
とともに本明細書中に記載されるように操作し得るように、これらの装置への改
良の特徴および実施が（存在する場合）、当業者に理解される。
【０２７１】
ハイスループットスクリーニングシステムは、市販されている（例えば、Ｚｙ
ｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ；Ａｉｒ  Ｔｅｃｈｎｉｃａ
ｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｍｅｎｔｏｒ、ＯＨ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ、などを参照のこと）。これらのシ
ステムは、典型的に、全体の手順を自動化し、その工程としては、以下が挙げら
れる：全てのサンプルおよび試薬をピペッティングする工程、液体を分配する工
程、指定時刻に作動するインキュベーションの工程、およびアッセイに適切な検
出器におけるマイクロプレートの最終的な読み込みの工程。これらの構造化可能
なシステムは、高処理量および迅速な作動ならびに高い程度の自由度および特注
生産を提供する。
【０２７２】
このようなシステムの製造業者は、種々のハイスループット装置についての詳
細なプロトコルを提供する。従って、例えば、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．は、遺
伝子転写産物の調節の検出、リガンドの結合などのためのスクリーニングシステ
ムを記載する技術告示を提供する。試薬の操作に対する微量流体（ｍｉｃｒｏｆ
ｌｕｉｄｉｃ）のアプローチは、例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって開発されている。
【０２７３】
カメラまたは他の記録装置（例えば、フォトダイオードおよびデータ記憶装置
）によって観察される（および、必要に応じて、記録される）光学的な画像は、
必要に応じてさらに、本明細書中の任意の実施形態において（例えば、画像のデ
ジタル化ならびに／またはコンピュータ上での画像の保存および分析をすること
によって）処理される。種々の市販の周辺装置およびソフトウェアは、例えば、
ＰＣ（ＤＯＳＴＭ、ＯＳＴＭ  ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ（
登録商標）  ＮＴＴＭもしくはＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）  ９５ＴＭをベース
にしたマシンと互換性のあるインテル  ｘ８６もしくはペンティアム（登録商標
）チップ）、ＭＡＣＩＮＴＯＳＨＴＭ、またはＵＮＩＸ（登録商標）ベース（例
えば、ＳＵＮＴＭワークステーション）のコンピュータを使用して、デジタル化
し、デジタル化されたビデオまたはデジタル化された光学画像の保存および分析
をするために入手可能である。
【０２７４】
１つの従来のシステムは、アッセイ装置から冷却された電荷結合素子（ＣＣＤ
）カメラへの光を伝達し、当該分野において通常使用される。ＣＣＤカメラは、
画素（ピクセル）のアレイを含む。被験物からの光は、ＣＣＤ上で画像化される
。被験物の領域（例えば、生物学的ポリマーのアレイ上の個々のハイブリダイゼ
ーション部位）に対応する特定のピクセルは、各位置について光の強度の読みを
得るためにサンプリングされる。複数のピクセルは、速度の増加に応じて処理さ
れる。本発明の装置および方法は、例えば、蛍光技術または暗視野顕微鏡技術に
よって任意のサンプルを観測するために容易に使用される。
【０２７５】
（他のポリヌクレオチド組成物）
本発明はまた、本発明の２つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物（例えば、
組換えのための物質のような）を含む。この組成物は、組換え核酸のライブラリ
ーを含み得、ここでこのライブラリーは、少なくとも２、３、５、１０、２０、
または５０以上のポリヌクレオチドを含む。このポリヌクレオチドは、発現ライ
ブラリーを提供する発現ベクター中に必要に応じてクローン化される。
【０２７６】
本発明はまた、制限エンドヌクレアーゼであるＲＮＡｓｅ、またはＤＮＡｓｅ
を用いて、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを消化すること（例えば、上記
された特定の組換え様式において実施されるような）によって生成される組成物
；および、機械的手段（例えば、超音波処理、ボルテックスなど）により、本発
明の１つ以上のポリヌクレオチドをフラグメント化または剪断することによって
生成される組成物を含み、本発明はまた、上記の方法における組換えのための物
質を提供するために用いられ得る。同様に、本発明の１つより多い核酸に対応す
るオリゴヌクレオチドのセットを含む組成物は、組換え物質として有用であり、
そして本発明の特徴である。便宜上、これらのフラグメント化された混合物、剪
断された混合物、またはオリドヌクレオチド合成された混合物は、フラグメント
化核酸セットといわれる。
【０２７７】
リボヌクレオチド３リン酸またはデオキシリボヌクレオチド３リン酸および核
酸ポリメラーゼの存在中で、１つ以上のフラグメント化核酸セットをインキュベ
ートすることによって生成される組成物もまた、本発明に含まれる。この生じた
組成物は、上記の多くの組換え様式のための組換え混合物を形成する。この核酸
ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡ指向
性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、「逆転写酵素」）であり得；このポリメラーゼ
は、例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＶＥＮＴ、ＴＡＱなど）で
あり得る。
（統合システム）
本発明は、例えば、本明細書中に列挙されるこれらの配列、およびこれらの種
々のサイレント置換および保存的置換を含む、本明細書中のポリペプチドおよび
核酸に対する本明細書中での配列情報に対応する文字列を含むコンピュータ、コ
ンピュータ読み出し可能な媒体、および統合システムを提供する。
【０２７８】
例えば、当該分野において公知の種々の方法および遺伝子アルゴリズム（ＧＡ
）は、異なる文字列の間の相同性もしくは類似性を検出するために用いられ得る
か、または他の所望される機能（例えば、出力ファイルを制御すること）を実行
するために用いられ得、配列などを含む情報をの提示を作成するための基礎を提
供する。例としては、ＢＬＡＳＴ（前出で考察される）が挙げられる。
【０２７９】
従って、種々のストリンジェンシーおよび長さを有する異なる型の相同性なら
びに類似性は、本明細書中の統合システム中で検出および認識され得る。例えば
、多くの相同性決定方法が、生体高分子の配列の比較分析、ワードプロセッシン
グにおけるスペルチェック、および種々のデータベースからのデータ検索のため
に設計されてきた。天然のポリヌクレオチドにおける主要な４つの核酸塩基間の
二重らせん対形成の相補的相互作用の理解を用いて、相補的な相同ポリヌクレオ
チドの文字列のアニーリングをシミュレーションするモデルはまた、本明細書中
の配列に対応する文字列上で代表的に実行される配列整列もしくは他の操作（例
えば、ワードプロセッシング操作、配列もしくは部分配列の文字列を含む図の構
築、出力表など）の基礎として用いられ得る。配列類似性を計算するためのＧＡ
を用いたソフトウェアパッケージの一例としては、ＢＬＡＳＴがあり、これは、
本明細書中の配列に対応する文字列を入力することによって本発明に適応され得
る。
【０２８０】
同様に、ワードプロセッシングソフトウェアのような標準的なデスクトップア
プリケーション（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＷｏｒｄＴＭまたはＣｏｒｅｌ
ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔＴＭ）およびデータベースソフトウェア（例えば、表
計算ソフト（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌＴＭ、Ｃｏｒｅｌ  Ｑｕ
ａｔｔｒｏ  ＰｒｏＴＭ）またはデータベースプログラム（例えば、Ｍｉｃｒｏ
ｓｏｆｔ  ＡｃｃｅｓｓＴＭもしくはＰａｒａｄｏｘＴＭ）)が、本発明のＧＡ
Ｔホモログ（核酸もしくはタンパク質、または両方のいずれか）に対応する文字
列を入力することによって、本発明に適合され得る。例えば、この統合システム
は、例えば、文字の列を操作するためにユーザーインターフェース（例えば、Ｗ
ｉｎｄｏｗｓ（登録商標）システム、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈシステム、もしくはＬ
ＩＮＵＸシステムのような標準的な操作システムにおけるＧＵＩ）と共同して用
いられる、適切な文字列情報を有する前述のソフトウェアを含み得る。記載され
るように、ＢＬＡＳＴのような専門化された整列プログラムはまた、核酸もしく
はタンパク質（または対応する文字列）の整列のための本発明のシステムに組み
込まれ得る。
【０２８１】
本発明における分析のための統合システムは、代表的に、配列を整列するため
のＧＡソフトウェアを用いたデジタルコンピュータ、および本明細書中の任意の
配列を含むソフトウェアシステムに入力されるデータセットを含む。このコンピ
ュータは、例えば、ＰＣ（Ｉｎｔｅｌ  ｘ８６もしくはペンティアム（登録商標
）のチップに適合性のＤＯＳＴＭ、ＯＳ２ＴＭ、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）、
ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）ＮＴ、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）９５、ＷＩＮＤ
ＯＷＳ（登録商標）９８、ＬＩＮＵＸに基づく機械、ＭＡＣＩＮＴＯＳＨＴＭ、
Ｐｏｗｅｒ  ＰＣもしくはＵＮＩＸ（登録商標）（例えば、ＳＵＮＴＭワークス
テーション）に基づく機械、または、当業者に公知である他の商業的に一般的な
コンピュータであり得る。配列を整列するためのソフトウェア、さもなくば、配
列を操作するためのソフトウェアが、利用可能であるか、または標準的なプログ
ラミング言語（例えば、Ｖｉｓｕａｌｂａｓｉｃ、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｂａｓｉｃ
、Ｊａｖａ（登録商標）など）を用いて、当業者によって容易に構築され得る。
【０２８２】
任意のコントローラまたはコンピュータは、必要に応じて、モニターを含み、
このモニターは、しばしば、陰極線管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ、フラットパ
ネルディスプレイ（例えば、アクティブマトリックス液晶ディスプレイ、液晶デ
ィスプレイ）などである。コンピュータ回路は、しばしば、多数の集積回路チッ
プ（例えば、マイクロプロセッサ、メモリー、インターフェース回路など）を含
むボックス中に配置される。このボックスはまた、必要に応じて、ハードディス
クドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、高容量の取り外し可能
なドライブ（例えば、書き込み可能なＣＤ−ＲＯＭ）、および他の一般の周辺素
子を含む。入力デバイス（例えば、キーボードまたはマウス）は、必要に応じて
、ユーザーからの入力、および関連するコンピュータシステムにおいて比較され
るか、さもなくば操作される配列のユーザー選択を提供する。
【０２８３】
コンピュータは、代表的にセットパラメータ領域中に入力するユーザーの形態
のいずれかにおいて（例えば、ＧＵＩにおいてか、または予めプログラムされた
命令（例えば、種々の異なる特定の操作のために予めプログラムされた命令）の
形態において）ユーザーの命令を受けるために適切なソフトウェアを含む。次い
で、このソフトウェアは、所望の操作を実行するために、これらの命令を、流動
方向および輸送コントローラの操作を命令するための適切な言語に変換する。
【０２８４】
ソフトウェアはまた、（例えば、本明細書中の配列もしくは配列の整列に基づ
く）核酸合成を制御するための出力素子、または本明細書中の配列に対応する文
字列を用いて実行される整列もしくは他の操作の下流で生じる他の操作を含み得
る。従って、核酸合成装置は、本明細書中の１つ以上の統合システムにおける構
成要素であり得る。
【０２８５】
さらなる局面において、本発明は、本明細書中の方法、組成物、システムおよ
び装置を具体化するキットを提供する。本発明のキットは、必要に応じて次の１
つ以上を含む：（１）本明細書中に記載されるような装置、システム、システム
の構成要素、または装置の構成要素；（２）本明細書中に記載される方法を実行
するための命令、および／または本明細書中の装置もしくは装置の構成要素を操
作するための命令、および／または本明細書中の組成物を用いるための命令；（
３）１つ以上のＧＡＴ組成物または構成要素；（４）構成要素または組成物を保
持するための容器、ならびに（５）パッケージング物質。
【０２８６】
さらなる局面において、本発明は、本明細書中の任意の装置、装置の構成要素
、組成物、もしくはキットの使用、本明細書中の任意の方法もしくはアッセイの
実行、および／または本明細書中の任意のアッセイもしくは方法を実行するため
の任意の装置もしくはキットの使用を提供する。
【０２８７】
（宿主細胞および生物）
宿主細胞は、真核生物（例えば、真核細胞、植物細胞、動物細胞、プロトプラ
スト、または組織培養物）であり得る。宿主細胞は、必要に応じて複数（個）の
細胞（例えば、生物）を含む。あるいは、宿主細胞は、細菌（すなわち、グラム
陽性細菌、紅色細菌、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、シアノバクテリア、スピ
ロヘータ、テルモトーガ（ｔｈｅｒｍａｔｏｇａｌｅｓ）、フラボバクテリア、
およびバクテロイド）ならびに始原細菌（すなわち、コル古細菌、テルモプロテ
ウス、ピロディクティウム、テルモコックス、メタン細菌、アルカエグロブスお
よび高度好塩菌）を含むが、これらに限られない原核生物であり得る。
【０２８８】
本発明のＧＡＴ核酸を組込んでいるトランスジェニック植物もしくは植物細胞
、および／または本発明のＧＡＴポリペプチドを発現するトランスジェニック植
物もしくは植物細胞が、本発明の特徴である。植物細胞およびプロトプラストの
形質転換は、本明細書中に記載される方法を含むが、これらに限られない植物分
子生物学の当業者に公知である基本的に任意の種々の方法で実行され得る。一般
に、本明細書中で参考として援用されるＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、Ｖｏｌ．１５３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｐａｒｔ  Ｄ）  
ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ（編）１９８７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを
参照のこと。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」は、核酸配列（例
えば、「異種の」もしくは「外来の」核酸配列）の導入による宿主植物の遺伝子
型の変化を意味する。この異種の核酸配列は、必ずしも異なる供給源に由来する
必要はないが、いくつかの点で、異種核酸配列は、その導入される細胞に対して
外側にある。
【０２８９】
Ｂｅｒｇｅｒ、ＡｕｓｕｂｅｌおよびＳｈａｍｂｌｏｏｋに加えて、植物細胞
のクローニング、培養および再生について有用な一般の参考として、Ｊｏｎｅｓ
（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ  ４９  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｔｏ
ｗａｔａ  ＮＪ；Ｐａｙｎｅら、（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  
Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈ
ｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（Ｐａｙｎｅ）；
ならびにＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａ
ｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓ
ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）（Ｇａｍｂｏｒｇ）が挙げられる。種々の細胞培養培地が、Ａｔｌ
ａｓおよびＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ，Ｒ
ａｔｏｎ，ＦＬ（Ａｔｌａｓ）に記載される。植物細胞培養についてのさらなる
情報が、市販の文献（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ（Ｓｔ  Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｌ
ｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（１９９８）（Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣ
ＣＣ）ならびに、例えば、これもまたＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ（Ｓ
ｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＰｌａｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕ
ｅおよび補遺（１９９７）（Ｓｉｇｍａ−ＰＣＣＳ））に見出される。植物細胞
培養に関するさらなる詳細が、Ｃｒｏｙ（編）（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．）に見出される。
【０２９０】
本発明の１つの実施形態において、植物細胞の形質転換に適した１つ以上のＧ
ＡＴポリヌクレオチドを含む組換えベクターが、調製される。（例えば、配列番
号１〜５および１１〜２６２の中から選択される）所望のＧＡＴポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列は、所望の植物中に導入され得る組換え発現カセットを構
築するために都合よく使用される。本発明の文脈において、発現カセットは、代
表的に、形質転換された植物の意図される組織（例えば、植物全体、葉、根など
）においてＧＡＴ配列の転写を指示するために十分な、プロモーター配列ならび
に他の転写および翻訳の開始調節配列に作動可能に連結される、選択されたＧＡ
Ｔポリヌクレオチドを含む。
【０２９１】
例えば、植物の全ての組織においてＧＡＴ核酸の発現を指向する強い構成性植
物プロモーターまたは弱い構成性植物プロモーターが、都合よく利用され得る。
このようなプロモーターは、ほとんどの環境条件下および発育または細胞分化の
状態で活性である。構成性プロモーターの例としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの１’−プロモーターまたは２’−プロモーター
、および当業者に公知の種々の植物遺伝子由来の他の転写開始領域が挙げられる
。本発明のＧＡＴポリペプチドの過剰発現が植物に対して有害である場合、当業
者は、弱い構成性プロモーターが低レベルの発現のために用いられ得ることを認
識する。これらの場合において、高レベルの発現が植物に対して有害でない場合
、強いプロモーター（例えば、ｔ−ＲＮＡ、または他のｐｏｌ  ＩＩＩプロモー
ター、または強いｐｏｌ  ＩＩプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウ
ィルスプロモーター、ＣａＭＶ，３５Ｓプロモーター））が用いられ得る。
【０２９２】
あるいは、植物プロモーターは、環境制御下であり得る。このようなプロモー
ターは、「誘導性」プロモーターといわれる。誘導性プロモーターによって転写
を変化し得る環境条件の例としては、病原体の襲撃、嫌気的条件、または光の存
在が挙げられる。いくつかの場合において、「組織特異的」および／または発育
制御下であるプロモーターを用いることが所望され、その結果、このＧＡＴポリ
ヌクレオチドは、特定の組織もしくは発育の段階（例えば、葉、根、苗条など）
においてのみ発現される。除草剤耐性および関連する表現型に関する遺伝子の内
生プロモーターは、ＧＡＴ核酸（例えば、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ、グルタ
チオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ホモグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
、グリホセートキシダーゼ、および５−エノールピルビルシキミ酸−２−リン酸
シンターゼ）の発現の促進に対して特に有用である。
【０２９３】
組織特異的プロモーターはまた、本明細書中に記載されるＧＡＴポリヌクレオ
チドを含む異種の構造遺伝子の発現を指向するために用いられ得る。従って、こ
のプロモーターは、その発現が本発明のトランスジェニック植物において所望さ
れる任意の遺伝子（例えば、ＧＡＴおよび／または除草剤抵抗性もしくは除草剤
耐性を与える他の遺伝子、他の有用な特性（例えば、雑種強勢）に影響する遺伝
子）の発現を駆動する組換え発現カセットにおいて用いられ得る。同様に、（例
えば、５’調節配列、または異種の遺伝子のイントロンに由来する）エンハンサ
ーエレメントもまた、ＧＡＴポリヌクレオチドのような異種の構造遺伝子の発現
を向上するために用いられ得る。
【０２９４】
一般的に、植物の発現カセットにおいて用いられる特定のプロモーターは、意
図される適用に依存する。植物細胞における転写を指向する任意の多数のプロモ
ーターが、適し得る。このプロモーターは、構成性もしくは誘導性のいずれかで
あり得る。上記のプロモーターに加えて、植物において操作される細菌起源のプ
ロモーターとしては、オクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼ
プロモーター、およびＴｉプラスミドに由来する他のプロモーターが挙げられる
。Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：
２０９を参照のこと。ウィルスプロモーターとしては、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡ
プロモーターおよび１９ＳＲＮＡプロモーターが挙げられる。Ｏｄｅｌｌら、（
１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０を参照のこと。他の植物プロモーター
としては、リブロース−１，３−二リン酸カルボキシラーゼのスモールサブユニ
ットプロモーター、およびファゼオリンプロモーターが挙げられる。Ｅ８遺伝子
（ＤｅｉｋｍａｎおよびＦｉｓｃｈｅｒ（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ  ７：３３１
５）および他の遺伝子からのプロモーター配列がまた、都合よく用いられる。単
子葉植物種に対して特異的なプロモーターもまた、考察される（ＭｃＥｌｒｏｙ
Ｄ．，Ｂｒｅｔｔｅｌｌ  Ｒ．Ｉ．Ｓ．  １９９４．  Ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅ
ｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｃｅｒｅａｌｓ．
Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：６２−６８）。あるいは、有用な特
徴を有する新規なプロモーターが、配列分析、エンハンサートラッピングもしく
はプロモータートラッピングなどを含む当該分野で公知の方法によって、任意の
ウィルス源、細菌源、または植物源から同定され得る。
【０２９５】
本発明の発現ベクターの調製において、プロモーターおよびＧＡＴをコードす
る遺伝子以外の配列がまた、都合よく用いられる。適切なポリペプチド発現が所
望される場合、ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子、種々の他の植物遺伝子、
またはＴ−ＤＮＡに由来し得る。（例えば、内部の細胞器官（例えば、葉緑体）
への発現ポリペプチドの移動または細胞外分泌を促進する）シグナル／局在化ペ
プチドがまた、用いられ得る。
【０２９６】
ＧＡＴポリヌクレオチドを含むベクターはまた、植物細胞に選択可能な表現型
を与えるマーカー遺伝子を含み得る。例えば、このマーカーは、殺生剤耐性、特
に抗生物質耐性（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロ
マイシンに対する耐性）または除草剤耐性（例えば、クロロスルフロン、もしく
はホヒノトリシン（ｐｈｏｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対する耐性）をコード
し得る。可視化可能な反応産物（例えば、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を介して
か、または遺伝子産物自体（例えば、緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ；Ｓｈｅｅｎ
ら、（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８：７７７）の直接的
な可視化によって、遺伝子の発現およびタンパク質の局在化をモニターするため
に用いられるレポーター遺伝子は、例えば、植物細胞における一過性の遺伝子の
発現をモニタリングするために用いられ得る。一過性の発現系は、例えば、除草
剤耐性活性について植物細胞培養物をスクリーニングする際に、植物細胞で用い
られ得る。
【０２９７】
（植物の形質転換）
（プロトプラスト）
種々の植物型からの形質転換性プロトプラストの確立についての多数のプロト
コール、およびそれに続く培養されたプロトプラストの形質転換は、当該分野で
利用可能であり、そして本明細書中で参考として援用される。例えば、Ｈａｓｈ
ｉｍｏｔｏら、（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９３：８５７；Ｆｏ
ｗｋｅおよびＣｏｎｓｔａｂｅｌ(編）（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｐ
ｌａｓｔｓ；Ｓａｕｎｄｅｒｓら（１９９３）Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ
Ｐｌａｎｔ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
、ＵＰＭ  １６−１８；ならびにＬｙｚｎｉｋら（１９９１）ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ  １０：２９５を参照のこと、これらの各々は、本明細書中で参考と
して援用される。
【０２９８】
（葉緑体）
葉緑体は、いくつかの除草剤耐性活性の作用の部位であり、そしていくつかの
例において、このＧＡＴポリヌクレオチドは、葉緑体中への遺伝子産物の移動を
容易にするために葉緑体輸送配列ペプチドに融合される。これらの場合において
、ＧＡＴポリヌクレオチドを植物宿主細胞の葉緑体中へ形質転換することは、好
都合であり得る。葉緑体の形質転換および発現を達成するための多数の方法が、
当該分野において利用可能である（例えば、Ｄａｎｉｅｌｌら（１９９８）Ｎａ
ｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：３４６；Ｏ’Ｎｅｉｌｌら（１
９９３）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３：７２９；Ｍａｌｉｇａ（１
９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１）。この発現構築物は、ＧＡＴポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、植物において機能的な
転写調節配列を含む。葉緑体において機能するように設計された発現カセット（
例えば、ＧＡＴポリヌクレオチドを含む発現カセット）は、葉緑体における発現
を確実にするために必要な配列を含む。代表的に、葉緑体ゲノムを用いて相同組
換えをもたらすために、葉緑色素体ゲノムに相同的な２つの領域が、コード配列
に隣接し；しばしば、選択マーカー遺伝子もまた、生じる移植した（ｔｒａｎｓ
ｐｌａｓｔｏｎｉｃ）植物細胞における遺伝的に安定な形質転換葉緑体の選択を
容易にするために、近接する色素体ＤＮＡ配列内に存在する（例えば、Ｍａｌｉ
ｇａ（１９９３）およびＤａｎｉｅｌｌ（１９９８）、ならびにこれらに引用さ
れる参考文献を参照のこと）。
【０２９９】
（一般的な形質転換方法）
本発明のＤＮＡ構築物は、種々の従来の技術によって、所望される植物の宿主
のゲノムに導入され得る。広範な種々の高等植物種を形質転換するための技術が
、周知であり、そして技術文献および科学文献に記載される。例えば、Ｐａｙｎ
ｅ、Ｇａｍｂｏｒｇ、Ｃｒｏｙ、Ｊｏｎｅｓら、全て前出、および例えば、Ｗｅ
ｉｓｉｎｇら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１を参照の
こと。
【０３００】
例えば、ＤＮＡは、技術（例えば、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレ
ーションおよびマイクロインジェクション）を用いて植物細胞のゲノムＤＮＡに
直接導入され得るか、またはＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ粒子ボンバードメントのよ
うな弾道的な方法を用いて植物組織に直接導入され得る。あるいは、ＤＮＡ構築
物は、適切なＴ−ＤＮＡ近接領域と結合され得、そして従来のＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主ベクターに導入され得る。Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ宿主の毒性機能は、植物細胞が細菌によって感染される場合、
構築物および近接するマーカーの植物細胞ＤＮＡへの挿入を指向する。
【０３０１】
マイクロインジェクション技術は、当該分野において公知であり、科学文献お
よび特許文献に十分に記載される。ポリエチレングリコール沈殿を用いるＤＮＡ
構築物の導入は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ  ３：２７
１７に記載される。エレクトロポレーション技術は、Ｆｒｏｍｍら（１９８５）
Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８２４に記載され
る。弾道的な形質転換技術は、Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７
：７０；およびＷｅｅｋｓらＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０２：１０７７に
記載される。
【０３０２】
いくつかの実施形態において、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換技術
が、本発明のＧＡＴ配列をトランスジェニック植物へ移すために用いられる。Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換は、双子葉植物の形質転換のために広く
用いられるが、特定の単子葉植物もまた、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって
形質転換され得る。例えば、コメのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換が、Ｈ
ｉｅｉら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：２７１；米国特許第５，１８７，０
７３号；同第５，５９１，６１６号；Ｌｉら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｉｎ
Ｃｈｉｎａ  ３４：５４；およびＲａｉｎｅｒｉら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３３によって記載される。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
媒介形質転換によって形質転換されたトウモロコシ、大ムギ、ライムギおよびア
スパラガスもまた、記載されている（Ｘｕら（１９９０）Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊ  
Ｂｏｔ  ２：８１）。
【０３０３】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換技術は、植物細胞ゲノムに組み込み
、目的の核酸を植物細胞中に同時に移すＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫瘍誘導
（Ｔｉ）プラスミドの能力を利用する。代表的に、発現ベクターが生成され、こ
こで目的の核酸（例えば、本発明のＧＡＴポリヌクレオチド）は、Ｔ−ＤＮＡ配
列をまた含む自己複製プラスミドに結合される。Ｔ−ＤＮＡ配列は代表的に、目
的の発現カセット核酸に隣接し、そしてプラスミドの組込み配列を含む。発現カ
セットに加えて、Ｔ−ＤＮＡはまた代表的に、マーカー配列（例えば、抗生物質
耐性遺伝子）を含む。次いで、Ｔ−ＤＮＡおよび発現カセットを有するプラスミ
ドは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞中にトランスフェクトされる。代表的に
、植物細胞の効果的な形質転換のために、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細菌はま
た、プラスミド上またはその染色体に組み込まれた、必要なｖｉｒ領域を所有す
る。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の考察について、Ｆｉｒｏｏｚａ
ｂａｄｙおよびＫｕｅｈｎｌｅ（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕ
ｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）を参照のこと。
【０３０４】
（トランスジェニック植物の再生）
上記の技術を含む植物形質転換技術によって得られた形質転換された植物細胞
は、形質転換された遺伝子型（すなわち、ＧＡＴポリヌクレオチド）、従って所
望の表現型（グリホセートもしくはグリホセートのアナログに対して獲得した抵
抗性（すなわち、耐性））を有する植物全体を再生するために培養され得る。こ
のような再生技術は、組織培養増殖培地中の特定の植物ホルモンの操作に依存し
、代表的に、所望のヌクレオチド配列と一緒に導入されている殺生剤マーカーお
よび／または除草剤マーカーに依存する。あるいは、本発明のＧＡＴポリヌクレ
オチドによって与えられるグリホセート抵抗性に対する選択が、実行され得る。
培養されたプロトプラストからの植物再生は、Ｅｖａｎｓら（１９８３）Ｐｒｏ
ｔｏｐｌａｓｔｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、ｐｐ  １２４−１７６
、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏ
ｒｋ；およびＢｉｎｄｉｎｇ（１９８５）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐ
ｌａｎｔｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  ｐｐ  ２１−７３、ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎに記載される。再生物はまた、植物のカル
ス、植物の外植片、植物の器官、もしくはこれらの一部から得られ得る。このよ
うな再生技術は、一般的にＫｌｅｅら（１９８７）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  ｏｆ  Ｐｌ
ａｎｔ  Ｐｈｙｓ  ３８：４６７に記載される。例えば、ＰａｙｎｅおよびＧａ
ｍｂｏｒｇもまた参照のこと。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いる形質転換後
、この外植片は、典型的には、選択培地に移される。当業者は、選択培地が、外
植片に同時にトランスフェクトされる選択マーカーに依存することを理解する。
適切な長さの時間後、形質転換体は、芽を形成し始める。芽が約１〜２ｃｍの長
さになった後、この芽は、適切な根および芽の培地に移されるべきである。選択
圧は、根および芽の培地中で維持されるべきである。
【０３０５】
代表的に、この形質転換体は、約１〜２週間で根を発達させ、そして小植物を
形成する。この小植物が約３〜５ｃｍの高さになった後、これらは、ファイバー
・ポット中の面菌下土壌に移される。当業者は、異なる順応化手順が異なる種の
形質転換された植物を得るために用いられることを理解する。例えば、根および
芽が発達した後、切断、および形質転換された植物の体細胞胚は、小植物の確立
のための培地に移される。形質転換された植物の選択および再生の説明について
、例えば、ＤｏｄｄｓおよびＲｏｂｅｒｔｓ（１９９５）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、第３編、Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【０３０６】
真空浸潤（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ  Ｎ．、Ｅｌｌｉｓ  Ｊ．およびＰｅｌｌｅｔｉ
ｅｒ  Ｇ．、１９９３、Ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍ
ｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏ
ｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｐｌａｎ
ｔｓ．ＣＲ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｐａｒｉｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３１６：１１
９４−１１９９）および顕花植物の単純な液浸（Ｄｅｓｆｅｕｘ，Ｃ．、Ｃｌｏ
ｕｇｈ  Ｓ．Ｊ．、およびＢｅｎｔ  Ａ．Ｆ．、２０００、Ｆｅｍａｌｅ  ｒｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｒｅ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔ
ａｒｇｅｔ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎ
ｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｆｌｏｒａｌ
−ｄｉｐ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３：８９５−９０
４）を用いるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換の
ための方法がまた存在する。これらの方法を用いて、トランスジェニック種子が
、組織培養の必要なく生産される。
【０３０７】
効率的なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換プロトコルがなお開発さ
れている植物改変体がある。例えば、形質転換された組織の再生と共役してトラ
ンスジェニック植物を生産する、首尾よい組織の形質転換は、最も商業的に関連
するとともにワタの品種のいくつかについて、報告されていない。にも関わらず
、これらの植物とともに使用され得るアプローチは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ媒介性形質転換を介して関連する植物の品種にこのポリヌクレオチドを安定に
導入する工程、作動可能性を確認する工程、次いで、標準的な性交配技術もしく
は戻し交配技術を用いて、この導入遺伝子を所望の商業的な系統に移す工程、を
含む。例えば、ワタの場合において、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを使用して、
Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｕｓｔｕｍのＣｏｋｅｒ系（例えば、Ｃｏｋｅｒ系
３１０、３１２、５１００  Ｄｅｌｔａｐｉｎｅ６１またはＳｔｏｎｅｖｉｌｌ
ｅ２１３）を形質転換し得、次いで、この導入遺伝子は、戻し交配によって、別
のより商業的に関連するＧ．ｈｉｒｕｓｔｕｍ品種に導入され得る。
【０３０８】
本発明のトランスジェニック植物は、本発明のＧＡＴポリヌクレオチドの存在
を決定するために遺伝子型的にか、または表現型的にかのいずれかで特徴づけら
れ得る。遺伝子型の分析は、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅および特異的な標識プロ
ーブを用いたゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションを含む、多くの周知の技術
のいずれかによって実行され得る。表現型の分析としては、例えば、グリホセー
トのような選択された除草剤に曝露された植物もしくは植物組織の生存が挙げら
れる。
【０３０９】
本質的に、任意の植物が、本発明のＧＡＴポリヌクレオチドを用いて形質転換
され得る。本発明の新規なＧＡＴポリヌクレオチドの形質転換および発現のため
の適切な植物としては、農学的および園芸学的に重要な種が挙げられる。このよ
うな種としては、以下の科のメンバーが挙げられるが、これらに制限されない：
イネ科（トウモロコシ、ライムギ、ライコムギ、オオムギ、キビ、コメ、コムギ
、カラスムギなどを含む）；マメ科（エンドウマメ、マメ（ｂｅａｎ）、レンズ
マメ、ピーナッツ、クズイモ、ササゲ、ハッショウマメ、ダイズ、クローバー、
アルファルファ、ルビナス、ベッチ、ハス、スイートクローバー、フジ、および
スイートピーを含む）；キク科（少なくとも１，０００属を含む維管束植物の最
大の科で、ヒマワリのような重要な商業的作物を含む）およびバラ科（ラズベリ
ー、アンズ、アーモンド、モモ、バラなどを含む）ならびにナッツ植物（クルミ
、ペカン、ヘーゼルナッツなどを含む）および森の木（Ｐｉｎｕｓ、Ｑｕｅｒｃ
ｕｓ、Ｐｓｅｕｔｏｔｓｕｇａ、Ｓｅｑｕｏｉａ、Ｐｏｐｕｌｕｓなどを含む）
。
【０３１０】
本発明のＧＡＴポリヌクレオチドによる改変のためのさらなる標的、および上
記で特定された標的としては、以下の属由来の植物が挙げられる：Ａｇｒｏｓｔ
ｉｓ、Ａｌｌｉｕｍ、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、Ａｐｉｕｍ、Ａｒａｃｈｉｓ、
Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｔｒｏｐａ、Ａｖｅｎａ（例えば、カラスムギ）、Ｂａ
ｍｂｕｓａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ｂｒｏｗａａｌｉａ、Ｃａｍｅ
ｌｌｉａ、Ｃａｎｎａｂｉｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃｉｃｅｒ、Ｃｈｅｎｏｐｏ
ｄｉｕｍ、Ｃｈｉｃｈｏｒｉｕｍ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｃｏｆｆｅａ、Ｃｏｉｘ、Ｃ
ｕｃｕｍｉｓ、Ｃｕｒｃｕｂｉｔａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｄａ
ｔｕｒａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ、Ｅｌａｅ
ｉｓ、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｇｅｒａｎｉｕ
ｍ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｈｅｔｅｒ
ｏｃａｌｌｉｓ、Ｈｅｖｅａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ（例えば、オオムギ）、Ｈｙｏｓ
ｃｙａｍｕｓ、Ｉｐｏｍｏｅａ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｌｅｎｓ、Ｌｉｌｉｕｍ、Ｌ
ｉｎｕｍ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｌｏｔｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｍａｊｏｒ
ａｎａ、Ｍａｌｕｓ、Ｍａｎｇｉｆｅｒａ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ
、Ｎｅｍｅｓｉａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、Ｏｒｙｚａ（
例えば、コメ）、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔ
ｕｍ（例えば、キビ）、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｐｉｓｕｍ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐ
ｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｐｒｕｎｕｓ、Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ
、Ｒｉｂｅｓ、Ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｒｕｂｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｓａｌｐｉ
ｇｌｏｓｓｉｓ、Ｓｅｃａｌｅ（例えば、ライムギ）、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓｅｔ
ａｒｉａ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｓｔｅｎｏｔａ
ｐｈｒｕｍ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ
、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ（例えば、コムギ）、Ｖｉｃｉａ、Ｖｉｇｎａ、Ｖｉｔｉｓ
、Ｚｅａ（例えば、トウモロコシ）、ならびにＯｌｙｒｅａｅ、Ｐｈａｒｏｉｄ
ｅａｅおよび他の多くの属。記載されたように、Ｇｒａｍｉｎａｅ科の植物は、
特に本発明の方法のための標的植物である。
【０３１１】
本発明の標的である共通の作物植物としては、トウモロコシ、コメ、ライコム
ギ、ライムギ、ワタ、ダイズ、サトウキビ、小ムギ、カラスムギ、大ムギ、キビ
、ヒマワリ、アブラナ、エンドウマメ、マメ（ｂｅａｎ）、レンズマメ、ピーナ
ッツ、クズイモ、ササゲ、ベルベットマメ、クローバー、アルファルファ、ルビ
ナス、ベッチ、ハス、スイートクローバー、フジ、スイートピー、およびナッツ
植物（例えば、クルミ、ペカンなど）が挙げられる。
【０３１２】
１つの局面において、本発明は、作物植物が作物を産生し、そしてその作物を
収集するような条件下で、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコー
ドする遺伝子を用いて形質転換された結果としてグリホセート耐性である作物植
物を生育することによって作物を産生する方法を提供する。好ましくは、グリホ
セートは、そのトランスジェニック作物植物が作物の生育および産生を逸するこ
と無く、雑草を制御するのに効果的な濃度で、植物または植物の近縁に適用され
る。グリホセートの適用は、栽培前か、または収穫時までおよび収穫時を含む栽
培後の任意の時間であり得る。グリホセートは、一回または複数回適用され得る
。グリホセート適用のタイミング、適用される量、適用の様式、および他のパラ
メーターは、作物植物の特定の性質および生育環境に基づいて変化し、そして当
業者によって容易に決定され得る。本発明はさらに、本方法によって産生される
作物の増殖を提供する。
【０３１３】
本発明は、ＧＡＴポリヌクレオチド導入遺伝子を含む植物の増殖を提供する。
この植物は、例えば、単子葉植物または双子葉植物であり得る。１つの局面にお
いて、増殖は、ＧＡＴポリヌクレオチド導入遺伝子を含む植物と第２の植物との
交雑を必然的に伴い、その結果、交雑の少なくともいくつかの子孫が、グリホセ
ート耐性を示す。
【０３１４】
１つの局面において、本発明は、作物が生育されている畑における雑草を選択
的に制御するための方法を提供する。この方法は、ＧＡＴをコードする遺伝子（
例えば、ＧＡＴポリヌクレオチド）を用いて形質転換された結果としてグリホセ
ート耐性である作物の種または作物植物を栽培すること、および作物への有意の
有害な影響を有さずに雑草を制御するのに十分な量のグリホセートを、作物およ
び任意の雑草に適用することを含む。雑草阻害に由来する利点が、グリホセート
またはグリホセートアナログの、作物または作物植物上のいずれの負の影響より
も重要である限り、作物が、この除草剤に対して全く非感受性である必要は無い
ことに注意することが重要である。
【０３１５】
別の局面において、本発明は、選択マーカー遺伝子としてＧＡＴポリヌクレオ
チドの使用を提供する。本発明のこの実施形態において、細胞中または生物中の
ＧＡＴポリヌクレオチドの存在は、その細胞または生物に検出可能なグリホセー
ト耐性の表現型形質を与え、それにより、ＧＡＴポリヌクレオチドに連結された
目的の遺伝子で形質転換された細胞または生物について選択し得る。従って、例
えば、ＧＡＴポリヌクレオチドは、核酸構築物（例えば、ベクター）へと導入さ
れ得、それにより、グリホセートの存在下での宿主の増殖、ならびに核酸構築物
を欠損する宿主が、生存または増殖するよりも識別可能に速い速度で生存および
／または増殖する能力についての選択によって核酸構築物を含む宿主（例えば、
細胞またはトランスジェニック植物）の同定を可能にする。ＧＡＴポリヌクレオ
チドは、植物、ほとんどの細菌（Ｅ．ｃｏｌｉを含む）、放線菌、酵母、藻類、
および真菌類を含む、グリホセートに感受性である、広範な種々の種類の宿主に
おける選択マーカーとして用いられ得る。従来の抗生物質耐性株に対して、植物
においてマーカーとして除草剤耐性株を用いる１つの利点は、それが、抗生物質
耐性株が環境に逸出するという、本出願の何人かの構成員の心配を、回避するこ
とである。種々の宿主系における選択マーカーとしてのＧＡＴポリヌクレオチド
の使用を実証する実験からのいくつかの実験データが、本明細書の実施例の章に
記載される。
【０３１６】
（トランスジェニック植物における増強されたグリホセート耐性を与えるｇａ
ｔポリヌクレオチドの選択）
本明細書中に記載された方法に従い多様化されたＧＡＴコード核酸のライブラ
リーが、トランスジェニック植物中でグリホセートに対する耐性を与える能力に
ついて選択され得る。多様化および選択の１回以上のサイクルの後で、改変ＧＡ
Ｔ遺伝子が、トランスジェニック植物の産生および評価を容易にする選択マーカ
ー、ならびに実験植物または農学的植物に除草剤耐性を与える方法として用いら
れ得る。例えば、多様化されたＧＡＴポリヌクレオチドのライブラリーを産生す
るための、配列番号１〜配列番号５のうちの任意の１つ以上の多様化の後で、最
初の機能的評価が、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＧＡＴコード配列ライブラリーの発現
によって実施され得る。発現したＧＡＴポリペプチドが、上述のように精製され
得るか、または部分的に精製され得、そして質量分析法によって、改善された速
度についてスクリーニングされ得る。多様化および選択の１つ以上の第１ラウン
ド（ｒｏｕｎｄ）の後、改善されたＧＡＴポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドが、例えば、強力な構成的プロモーター（例えば、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロ
モーター）へと作動可能に連結された、植物発現ベクターへとクローニングされ
る。改変ＧＡＴ核酸を含むこの発現ベクターが、代表的には、アグロバクテリウ
ムが媒介する形質転換によって、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ宿
主植物へと形質転換される。例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ宿主は、アグロバ
クテリウムの溶液中に花序を浸漬することによって容易に形質転換され、そして
それらを成長させかつ種子をつけさせ得る。数千の種子が、約６週間の間に回復
する。これらの種子が、次いで、浸漬された植物から大量に収集され、そして土
壌中で発芽する。この様式において、高スループット（ＨＴＰ）植物形質転換形
式を構成する、数千の独立に形質転換された植物を、評価のために産生し得る。
大量の成長した苗木に、グリホセートを噴霧し、そしてグリホセート耐性を示す
生存する苗木は、選択プロセスで生存し、一方で、非トランスジェニック植物お
よびあまり好ましくなく改変されたＧＡＴ核酸を組み込んだ植物は、除草剤処理
によって損傷するか、または死滅する。必要に応じて、グリホセートに対する改
善された耐性を与えるＧＡＴコード核酸は、例えば、ライブラリー挿入部に隣接
するＴ−ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって回復され、そしてさらな
る多様化手順においてか、または同種もしくは異種のさらなるトランスジェニッ
ク植物を産生するために用いられる。所望の場合、さらなるラウンドの多様化お
よび選択が、各々の連続する区画においてグリホセートの濃度を増加させながら
用いることで実施され得る。この様式において、畑条件において有用な濃度のグ
リホセートに対する耐性を与えるＧＡＴポリヌクレオチドおよびポリペプチドが
得られる。
【０３１７】
（除草剤耐性）
本発明のグリホセート耐性の機構が、優れたグリホセート耐性を有する植物お
よび植物外植片を産生するための、他の当該分野において公知の様式のグリホセ
ート耐性と組み合わせられ得る。例えば、グリホセート耐性植物が、以下によっ
てより完全に記載されるように、高レベルの５−エノールピルビルシキメート−
３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰ）を産生する能力をその植物のゲノムへ
と挿入することによって産生され得る：米国特許第６，２４８，８７６  Ｂ１号
；同第５，６２７，０６１号；同第５，８０４，４２５号；同第５，６３３，４
３５号；同第５，１４５，７８３号；同第４，９７１，９０８号；同第５，３１
２，９１０号；同第５，１８８，６４２号；同第４，９４０，８３５号；同第５
，８６６，７７５号；同第６，２２５，１１４  Ｂ１号；同第６，１３０，３６
６号；同第５，３１０，６６７号；同第４，５３５，０６０号；同第４，７６９
，０６１号；同第５，６３３，４４８号；同第５，５１０，４７１号；米国特許
再発行第３６，４４９号；同第３７，２８７  Ｅ号；および米国特許第５，４９
１，２８８号；ならびに国際出願ＷＯ  ９７／０４１０３号；ＷＯ  ００／６６
７４６号；ＷＯ  ０１／６６７０４号；およびＷＯ  ００／６６７４７号（これ
らは、本発明中全体においてすべての目的のために参考として援用される。）。
グリホセート耐性はまた、米国特許第５，７７６，７６０号および同第５，４６
３，１７５号（これらは、すべての目的のために本明細書中全体に参考として援
用される）にさらに完全に記載されるようにグリホセートキシドレダクターゼ酵
素をコードする遺伝子を発現する植物にも伝達され得る。
【０３１８】
さらに、本発明のグリホセート耐性の機構が、グリホセートおよび１つ以上の
他の除草剤に対して耐性の植物および植物外植片を産生するために、他の様式の
除草剤耐性と組み合わせられ得る。例えば、ヒドロキシフェニルピルベートダイ
オキシゲナーゼは、パラ−ヒドロキシフェニルピルベート（ＨＰＰ）が、ホモゲ
ンチシン酸に変化する反応を触媒する酵素である。この酵素を阻害し、そしてＨ
ＰＰのホモゲンチシン酸への変化を阻害するためにこの酵素に結合する分子は、
除草剤として有用である。特定の除草剤に対してより耐性な植物が、米国特許第
６，２４５，９６８  Ｂ１号；同第６，２６８，５４９号；および６，０６９，
１１５号；ならびに国際出願ＷＯ９９／２３８８６号（これらは、全ての目的の
ために本明細書中全体に援用される）に記載される。
【０３１９】
スルホニル尿素およびイミダゾリノン（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ）除草剤
もまた、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）またはアセトヒドロキシ酸シンターゼ
（ＡＨＡＳ）をブロックすることによってより高い植物の成長を阻害する。スル
ホニル尿素およびイミダゾリノン耐性植物の産生は、米国特許第５，６０５，０
１１号；同第５，０１３，６５９号；同第５，１４１，８７０号；同第５，７６
７，３６１号；同第５，７３１，１８０号；同第５，３０４，７３２号；同第４
，７６１，３７３号；同第５，３３１，１０７号；同第５，９２８，９３７号；
および同第５，３７８，８７４号；ならびに国際出願ＷＯ  ９６／３３２７０号
（これらは、本明細書中全体において、全ての目的のために参考として援用され
る）より完全に記載される。
【０３２０】
グルタミンシンターゼ（ＧＳ）は、ほとんどの植物細胞の発生および生存に必
要な本質的酵素であることが明らかである。ＧＳのインヒビターは、植物細胞に
対して毒性である。グルフォシネート（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ）除草剤が、植
物中のＧＳの阻害に起因する毒性効果に基づき開発された。これらの除草剤は、
非選択性である。これらは、存在する植物の異なる種の全ての成長を阻害し、こ
れら全ての破壊を引き起こす。外因性ホスフィノスリシンアセチルトランスフェ
ラーゼを含む植物の開発が、米国特許第５，９６９，２１３号；同第５，４８９
，５２０号；同第５，５５０，３１８号；同第５，８７４，２６５号；同第５，
９１９，６７５号；同第５，５６１，２３６号；同第５，６４８，４７７号；同
第５，６４６，０２４号；同第６，１７７，６１６  Ｂ１号；および同第５，８
７９，９０３号（これらは、全ての目的のために本明細書中全体に参考として援
用される）に記載される。
【０３２１】
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）は、全ての植物の生
存に必要な、葉緑素の産生に必要である。このｐｒｏｔｏｘ酵素は、種々の除草
剤化合物の標的として作用する。これらの除草剤もまた、存在する植物の全ての
異なる種の成長を阻害し、これら全ての破壊を引き起こす。これらの除草剤に対
して耐性である変化されたｐｒｏｔｏｘ活性を含む植物の開発が、米国特許第６
，２８８，３０６  Ｂ１号；同第６，２８２，８３７  Ｂ１号；および同第５，
７６７，３７３号；ならびに国際出願ＷＯ０１／１２８２５号（これらは、全て
の目的のために本明細書中全体に参考として援用される）に記載される。
【０３２２】
（実施例）
以下の実施例は、例示的であって、限定をするものではない。当業者は、本質
的に類似する結果を達成するために変化され得る、種々の非限界パラメーターを
認識する。
【０３２３】
（実施例１：新規天然ＧＡＴポリヌクレオチドの単離）
５種の天然ＧＡＴポリヌクレオチド（すなわち、遺伝的に改変されていない生
物中に天然に存在するＧＡＴポリヌクレオチド）を、ＧＡＴ活性を示すＢａｃｉ
ｌｌｕｓ系統由来の配列の発現クローニングによって、見出した。これらのヌク
レオチド配列を、決定し、そして配列番号１〜配列番号５として本明細書中に提
供した。すなわち、約５００種のＢａｃｉｌｌｕｓ系統およびＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ系統の収集物を、Ｎ−アセチレートグリホセートに対する天然の能力につ
いてスクリーニングした。これらの系統を、ＬＢ中で一晩増殖し、遠心分離によ
って収集し、希トルエン中で透過性にし、ついで洗浄し、そして緩衝液、５ｍＭ
グリホセート、および２００μＭアセチルＣｏＡを含む反応混合物中に再懸濁し
た。この細胞を、１〜４８時間の間（この時間帯に、この反応物と等容量のメタ
ノールを添加した）反応混合物中でインキュベートした。次いでこの細胞を、遠
心分離によってペレットにし、そして上清を個体イオンモード質量分析法（ｐａ
ｒｅｎｔ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）による分
析の前に、ろ過した。この反応生成物を、反応混合物の質量分析法プロファイル
と、図２に示す標準Ｎ−アセチルグリホセートとを比較することによって、Ｎ−
アセチルグリホスサートとして陽性で同定した。生成物の検出は、両方の基質（
アセチルＣｏＡおよびグリホセート）含有物に依存し、そして細菌細胞の熱変性
によって破壊された。
【０３２４】
次いで、個々のＧＡＴポリヌクレオチドを、機能性スクリーニングによって同
定した系統からクローニングした。ゲノムＤＮＡを、調製し、そしてＳａｕ３Ａ
１酵素で部分的に消化した。約４Ｋｂのフラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベク
ターへとクローニングし、そして電子受容（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ
）Ｅ．ｃｏｌｉへと形質転換した。ＧＡＴ活性を示す個々のクローンを、トルエ
ン洗浄をＰＭＢＳでの浸透に置き換えたことを除き、前に記載したような反応後
の質量分析法によって同定した。ゲノムフラグメントを配列決定し、そして推定
のＧＡＴポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを同定した。
ＧＡＴ遺伝子の同定を、Ｅ．ｃｏｌｉ中のオープンリーディングフレームの発現
および反応混合物より産生された高レベルのＮ−アセチルグリホスフェートの検
出によって確認した。
【０３２５】
（実施例２：Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ系統Ｂ６から単離したＧＡＴポ
リペプチドの特徴づけ）
Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ系統Ｂ６からのゲノムＤＮＡを、精製し、Ｓ
ａｕ３Ａ１によって部分的に消化し、そして１〜１０Ｋｂのフラグメントを、Ｅ
．ｃｏｌｉ発現ベクターへとクローニングした。２．５ｋｂの挿入部を有するク
ローンによって、質量スペクトル分析を用いて決定したような、Ｅ．ｃｏｌｉ宿
主上のグリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）活性を与えた。
挿入部のの配列決定によって、４４１塩基対の単一の完全なオープンリーディン
グフレームを明らかにした。続くこのオープンリーディングフレームのクローニ
ングによって、それがＧＡＴ酵素をコードすることを確認した。Ｂ６のＧＡＴ酵
素をコードする遺伝子を有するプラスミド（ｐＭＡＸＹ２１２０、図４に示す）
を、Ｅ．ｃｏｌｉ系統ＸＬ１  Ｂｌｕｅへと形質転換した。１０％の移植片（ｉ
ｎｎｏｃｕｌｕｍ）の飽和培養物を、Ｌｕｒｉａ類（ｂｒｏｔｈ）へと添加し、
そして培養物を、３７℃で、１時間インキュベートした。ＧＡＴの発現を、１ｍ
Ｍの濃度でのＩＰＴＧの添加によって誘導した。この培養物を、さらに４時間イ
ンキュベートし、その後、細胞を、遠心分離によって収集し、細胞のペレットを
−８０℃で保存した。
【０３２６】
細胞の溶解を、１ｍｌの以下の緩衝液を、０．２ｇの細胞に添加することによ
ってもたらした：２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ
を添加した１００ｍＭのＫＣｌおよび１０％メタノール（ＨＫＭ）、１ｍＭのＤ
ＴＴ、１ｍｇ／ｍｌのニワトリ卵リソザイム、ならびにＳｉｇｍａより得、かつ
製造者の指示に従い用いたプロテーゼインヒビターカクテル。室温（例えば、２
２〜２５℃）での２０分のンキュベーションの後に、溶解は、簡単な超音波処理
を伴って達成された。この溶解産物を、遠心分離し、そして上清をＨＫＭを用い
て平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５を通して脱塩した。部分的精製物を、Ｃ
ｏＡアガロース（Ｓｉｇｍａ）上のアフィニティクロマトグラフィーによって得
た。このカラムを、ＨＫＭを用いて平衡化し、そして清澄化された抽出物を静水
圧下で通過させた。非結合タンパク質を、ＨＫＭを用いたカラムの洗浄によって
取り除き、そしてＧＡＴを、１ｍＭのＣｏエンザイムＡを含むＨＫＭを用いて溶
出した。この手順により４倍の精製物を提供した。この段階で、粗溶解産物で充
填したＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で観察された約６５％のタンパク質染色
は、ＧＡＴに起因し、別の２０％は、ベクターにコードされているクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼに起因した。
【０３２７】
均質性についての精製を、部分的精製されたタンパク質のＳｕｐｅｒｄｅｘ  
７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を介するゲルろ過によって得た。移動層は、ＨＫＭ
であり、ここでＧＡＴ活性が、１７ｋＤの分子半径に対応する容積で溶出された
。この物質は、１２％アクリルアミドゲル（厚さ１ｍｍ）上のＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供される、３μｇのＧＡＴ試料のクマシー染色物によっ
て判断されるほど、均一であった。精製により、特定の活性の６倍増加を達成し
た。
【０３２８】
グリホセートの見かけ上のＫＭを、５ｍＭのモルホリンを含み、酢酸でｐＨ７
．７に調製された緩衝液および２０％のエチレングリコールの中の、飽和（２０
０μＭ）アセチルＣｏＡ、種々の濃度のグリホセート、および１μＭ精製ＧＡＴ
を含む反応混合物上で決定した。反応初速度を、２３５ｎｍ（Ｅ＝３．４  ＯＤ
／ｍＭ／ｃｍ）でのアセチルＣｏＡのチオエステル結合の加水分解を連続的にモ
ニターすることによって決定した。飽和双曲線キネティックスを観察し（図５）
、ここから２．９±０．２（ＳＤ）ｍＭの見かけのＫＭを得た。
【０３２９】
ＡｃＣｏＡの見かけのＫＭを、５ｍＭのモルホリンを含み、酢酸でｐＨ７．７
に調製した緩衝液および５０％のメタノールの中の、５ｍＭグリホセート、種々
の濃度のアセチルＣｏＡ、および０．１９μＭ  ＧＡＴを含む反応混合物上で決
定した。反応初速度を、Ｎ−アセチルグリホセートの質量分析法検出を用いて決
定した。５μｌを、この機器に繰り返し注入し、反応速度を、反応時間対積算さ
れたピーク面積をプロットすることによって得た（図６）。飽和双曲線キネティ
ックスが、観察され（図７）、ここから２μＭの見かけのＫＭを導いた。既知濃
度の酵素から得られたＶｍａｘの値から、６／分のｋｃａｔを算出した。
【０３３０】
（実施例３：質量分析法（ＭＳ）スクリーニングプロセス）
試料（５μｌ）を、２６秒毎に１試料の速度で、９６ウェルのマイクロタイタ
ープレートから吸出し、いかなる分離もせずに、質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓ
ｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＬＣ、ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  
ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）へと注入した。この試料を、流速５００Ｕｌ／分の
水／メタノール（５０：５０）の移動層によって、質量分析計へと移動させた。
各々の注入された試料を、負のエレクトロスプレーイオン化プロセス（ニードル
ボルテージ（ｎｅｅｄｌｅ  ｖｏｌｔａｇｅ）、−３．５ＫＶ；コーンボルテー
ジ（ｃｏｎｅ  ｖｏｌｔａｇｅ）、２０Ｖ；供給源温度１２０Ｃ；非溶媒和（ｄ
ｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ）温度、２５０Ｃ；コーン気体流量、９０Ｌ／時間；およ
び非溶媒和気体流量、６００Ｌ／時間）によってイオン化した。このプロセスの
間に形成されたこの分子イオン（ｍ／ｚ  ２１０）を、第２の四重極（ここでの
圧力を、５×１０−４ｍＢａｒに設定し、そして衝突エネルギーを、２０  Ｅｖ
に調節した）における衝突誘導解離（ｃｏｌｌｉｓｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉ
ｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、ＣＩＤ）を実施するために、第１の四重極によって選択
した。第３の四重極を、親イオン（ｐａｒｅｎｔ  ｉｏｎ）（ｍ／ｚ  ２１０）
から産生された娘イオン（ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｉｏｎ）（ｍ／ｚ  １２４）の１
つが、シグナル記録のための検出器へと到達し得ることのみのために設置した。
第１の四重極および第３の四重極を、解像ユニットに設置した（ここで、光電子
増倍機を、６５０  Ｖで作動した）。純粋の標準Ｎ−アセチルグリホセートを、
比較のために用い、そして積算ピークを、濃度を見積もるため用いた。本方法に
より、２００Ｎｍ未満のＮ−アセチルグリホセートが、検出可能である。
【０３３１】
（実施例４：ＧＡＴ酵素の天然または低い活性の検出）
ＧＡＴ酵素の天然または低い活性は、代表的に、約１／分のＫｃａｔおよび１
．５〜１０ＭｍのグリホセートについてのＫＭを有する。アセチルＣｏＡについ
てのＫＭは、代表的に、２５μＭ未満である。
【０３３２】
細菌性培養物を、深い９６ウェルのプレート中の栄養豊富な培地中で増殖し、
そして０．５ｍｌの静止期の細胞を遠心分離によって収集し、５ｍＭのモルホリ
ンアセテート（ｐＨ  ８）を用いて洗浄し、そして２００μＭのアンモニウムア
セチルＣｏＡ、５ｍＭのアンモニウムグリホセート、および５μｇ／ｍｌ  ＰＭ
ＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を含む０．１ｍｌの反応混合物（５ｍＭのモルホリンアセテ
ート（ｐＨ  ８）中）中に懸濁した。このＰＭＢＳは、細胞膜を透過性にし、細
胞性内容物全てを放出することなく、基質および産生物を細胞から緩衝液へ移動
させ得る。反応を、２５〜３７℃で１〜４８時間実施した。この反応を、等容積
の１００％エタノールを用いて休止し、そして混合物全体を、０．４５μｍ  Ｍ
ＡＨＶ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上
でろ過した。試料を、上記のように質量分析計を用いて分析し、標準の合成Ｎ−
アセチルグリホセートと比較した。
【０３３３】
（実施例５：高活性ＧＡＴ酵素の検出）
高活性ＧＡＴ酵素は、代表的に、４００／分までのｋｃａｔおよび０．１ｍＭ
グリホセート以下のＫＭを有する。
【０３３４】
ＧＡＴ酵素をコードする遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクター（例えば、ｐＱ
Ｅ８０（Ｑｉａｇｅｎ））へとクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ系統（例え
ば、ＸＬ１  Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））へと導入した。培養物を、浅
いＵ底の９６ウェルポリスチレンプレート中の１５０μｌの栄養豊富な培地（例
えば、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｌｌｉｎ））を有す
るＬＢ）中で後期対数増殖期まで増殖し、そして１ｍＭのＩＰＴＧ（ＵＳＢ）を
含む新しい培地を用いて１：９に希釈した。４〜８時間の誘導の後で、細胞を収
集し、５ｍＭのモルホリンアセテートｐＨ  ６．８を用いて洗浄し、そして等容
積の同じモルホリン緩衝液中に再懸濁した。反応を、１０μｌまでの洗浄した細
胞を用いて実行した。より高い活性レベルでは、この細胞を、最初に１：２００
に希釈し、そして５μｌを１００μｌの反応混合物へと添加した。ＧＡＴ活性を
測定するために、低活性について記載したのと同じ反応混合物が、用いられ得る
。しかし、高活性ＧＡＴ酵素を検出するために、グリホセートの濃度を０．１５
〜０．５ｍＭまで下げ、ｐＨを６．８まで下げ、そして反応を、３７℃で１時間
実行した。反応のワークアップおよびＭＳ検出は、本明細書中に記載のようにし
た。
【０３３５】
（実施例６：ＧＡＴ酵素の精製）
酵素精製を、細胞溶解物のＣｏＡアガロース上でのアフィニティクロマトグラ
フィーおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５上でのゲルろ過によって達成した。１０ｍ
ｇまでの量の精製ＧＡＴ酵素を以下のように得た：５０μｇ／ｍｌのカルベニシ
リンを含むＬＢ中で一晩増殖した、ｐＱＥ８０ベクター上にＧＡＴポリヌクレオ
チドを保有するＥ．ｃｏｌｉの培養物１００ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのカルベニ
シリンを添加した１ＬのＬＢを接種するために用いた。その後１時間、ＩＰＴＧ
を１ｍＭまで添加し、そして培養物をさらに６時間増殖させた。細胞を、遠心分
離によって収集した。溶解を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１００ｍ
ＭのＫＣｌ、１０％  メタノール（ＨＫＭと称す）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１
ｍＭのＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによって供給されたプロテーゼイン
ヒビターカクテルおよび１ｍｇ／ｍｌのニワトリ卵リゾチーム中に細胞を懸濁す
ることによってもたらした。その後３０分、室温で、細胞を、暫時、超音波処理
した。粒状の物質を、遠心分離によって取り除き、そして溶解物を、コエンザイ
ムＡアガロースの層に通した。このカラムを、層容積の数倍のＨＫＭを用いて洗
浄し、そしてＧＡＴを、１ｍＭのアセチルコエンザイムＡを含む、層容積の１．
５倍のＨＫＭを用いて溶出した。溶出物中のＧＡＴを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｙ
Ｍ  ５０限外ろ過膜にわたるその保持によって、濃縮した。さらなる精製物を、
そのタンパク質を、一連の０．６ｍｌの注入を介してＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カ
ラムに通すことによって得た。ＧＡＴ活性溶出物のピークは、１７ｋＤの分子量
に対応する容積で、溶出した。この方法により、ＧＡＴ酵素の８５％の回復を超
えるまでの均一性精製を生じた。類似の手順を用いて、０．１〜０．４ｍｇの量
の、９６種までのシャッフルした改変体を同時に得た。誘導した培養物の容積を
、１〜１０ｍｌまで減らし、コエンザイムＡ−アガロースアフィニティクロマト
グラフィーを、ＭＡＨＶフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に充填し
た０．１５ｍｌカラムにおいて実施し、そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  クロマ
トグラフィを、省略した。
【０３３６】
（実施例７：ＫｃａｔおよびＫＭ決定のための標準プロトコール）
精製タンパク質のグリホセートについてのＫｃａｔおよびＫＭを、連続分光測
定アッセイ（ここでＡｃＣｏＡのスルホエステル結合の加水分解を、２３５ｎｍ
で、モニターした）を用いて決定した。反応を、９６ウェルアッセイプレートの
ウェル中で、周囲温度（約２３℃）で、０．３ｍｌの最終容積で存在する以下の
成分を用いて、実施した：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）、１０％エチレ
ングリコール、０．２ｍＭアセチルコエンザイムＡ、および種々の濃度のアンモ
ニウムグルホサート。２種のＧＡＴ酵素のキネティックスの比較において、両方
の酵素を、同じ条件下で（例えば、両方２３℃で）アッセイするべきである。Ｋ
ｃａｔを、ＶｍａｘおよびＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定した、酵素濃
度より算出した。ＫＭを、０．１２５〜１０ｍＭの範囲で変化するグリホセート
濃度から得た反応初速度から、ミカエリスメンテン式のラインウェーバーバーク
変換を用いて算出した。Ｋｃａｔ／ＫＭを、Ｋｃａｔについて決定した価を、Ｋ
Ｍについて決定した価で除することによって決定した。
【０３３７】
本方法論を用いて、本明細書中に例示した多くのＧＡＴポリペプチドについて
の速度パラメーターを、決定した。例えば、配列番号４４５に対応するＧＡＴポ
リペプチドについてのＫｃａｔ、ＫＭおよびＫｃａｔ／ＫＭを、上記のアッセイ
条件を用いて各々、３２２／分、０．５ｍＭ、および６６０／ｍＭ／分であると
決定した。配列番号４５７に対応するＧＡＴポリペプチドについてのＫｃａｔ、
ＫＭおよびＫｃａｔ／ＫＭを、上記のアッセイ条件を用いて各々、１１８／分、
０．１ｍＭ、および１１８４／ｍＭ／分であると決定した。配列番号３００に対
応するＧＡＴポリペプチドについてのＫｃａｔ、ＫＭおよびＫｃａｔ／ＫＭを、
上記のアッセイ条件を用いて各々、２９６／分、０．６５ｍＭ、および４５６／
ｍＭ／分であると決定した。当業者は、これらの数値を用いて、ＧＡＴ活性アッ
セイが、本明細書中で与えられる値との比較のために適した、ＧＡＴについての
速度パラメーターを産生することを確認し得る。例えば、ＧＡＴ活性を比較する
ために用いられる条件は、その条件が、試験ＧＡＴと本明細書中に例示されるＧ
ＡＴポリペプチドとを比較するために使用される場合、配列番号３００、４４５
、および４５７について、本明細書中に報告されるこれらの値と同じ速度定数（
通常の実験上の分散内で）を産み出すはずである。多くのＧＡＴポリペプチド改
変体についての速度パラメーターを、本方法論に従って決定し、表３、４、５に
提供した。
【０３３８】
（表３．ＧＡＴポリペプチドｋｃａｔ値）
【０３３９】
【表３】
2008206519.tif 000004
2008206519.tif 000005
2008206519.tif 000006
2008206519.tif 000007
2008206519.tif 000008
（表４．ＧＡＴポリペプチド（グリホセート）ＫＭ値）
【０３４０】
【表４】
2008206519.tif 000009
2008206519.tif 000010
2008206519.tif 000011
2008206519.tif 000012
2008206519.tif 000013
（表５．ＧＡＴポリペプチドｋｃａｔ／ＫＭ値）
【０３４１】
【表５】
2008206519.tif 000014
2008206519.tif 000015
2008206519.tif 000016
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2008206519.tif 000018
ＡｃＣｏＡについてのＫＭを、反応にわたる繰り返しのサンプリングを伴う質
量分析法を用いて測定した。アセチルコエンザイムＡおよびグリホセート（アン
ンモニウム塩）を、５０倍濃度ストック溶液として、質量分析計サンプルプレー
トのウェル中に配置した。反応を、モルホリンアセテートまたは炭酸アンモニウ
ムのような揮発性緩衝液（ｐＨ６．８または７．７）中に適切に希釈した酵素の
添加によって開始した。この試料を、この機器へと繰り返し注入し、そして初速
度を、保持時間およびピーク面積のプロットから算出した。ＫＭを、グリホセー
トについてと同様に算出した。
【０３４２】
（実施例８：形質転換Ｅ．ＣＯＬＩの選択）
進化したｇａｔ遺伝子（ＧＡＴコード配列の５’末端に直接的に結合された天
然Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓリボソーム結合部位（ＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡ
ＧＧＡＡＴＣＴＣ；配列番号５１５）とのキメラ）を、ＥｃｏＲＩ部位およびＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位の間の発現ベクターｐＱＥ８０（Ｑｉａｇｅｎ）にクローン化
し、プラスミドｐＭＡＸＹ２１９０（図１１）を得た。これは、このプラスミド
からＨｉｓタグドメインを排除し、そして抗生物質アンピシリンおよびカルベニ
シリンへの耐性を与えるＢ−ラクタマーゼ遺伝子を保持した。ｐＭＡＸＹ２１９
０を、ＸＬ１  Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞にエレクト
ロポレート（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）した。この細胞を、ＳＯ
Ｃリッチ培地に懸濁させ、そして１時間回復させた。次いで、この細胞を徐々に
ペレット化し、芳香族アミノ酸を欠くＭ９最小培地（１２．８ｇ／ＬのＮａ２Ｈ
ＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１
．０ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ，０．４％のグルコース、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１
ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍｌ／Ｌのチアミン、１０ｍｇ／Ｌのプロリン、３０ｍ
ｇ／Ｌのカルベニシリン）で１回洗浄し、２０ｍｌの同一のＭ９培地中に再懸濁
させた。３７℃での、２５０ｒｐｍでの終夜増殖の後、等体積の細胞を、Ｍ９培
地またはＭ９に１ｍＭのグリホセート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）を加えた培地の
どちらかにプレートした。ｇａｔ遺伝子を有さないｐＱＥ８０ベクターを、同様
にＥ．ｃｏｌｉ細胞に導入し、そして比較のための単一コロニーにプレートした
。結果を表６に要約する。そしてこの結果は、ＧＡＴ活性が、バックグラウンド
１％未満の形質転換Ｅ．ｃｏｌｉの選択および増殖を可能にすることを明確に示
す。ＩＰＴＧ誘導が、形質転換細胞の増殖を可能にするために十分なＧＡＴ活性
のために必須でないことに注目されたい。グリホセートの存在下で増殖されたＥ
．ｃｏｌｉ細胞に由来するｐＭＡＸＹ２１９０のの再単離によって、形質転換を
確認した。
【０３４３】
【表６】
2008206519.tif 000019
（実施例９：形質転換植物細胞の選択）
植物細胞のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換
は、低い有効性で生じる。非形質転換細胞の増殖を阻害しながら一方で、形質転
換細胞の増殖を可能にするために、選択可能なマーカーが必要とされる。カナマ
イシンおよびハイグロマイシンに対する抗生物質マーカー、ならびに、遺伝子ｂ
ａｒを改変する除草剤（これは、除草性化合物ホスフィノスリシン（ｐｈｏｓｐ
ｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）を解毒する）は、植物において用いられる選択可能な
マーカーの例である（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ，１９９５，４９：９〜１８）。ここで、本発明者らは、ＧＡＴ活性が植物
形質転換に対する有効な選択可能なマーカーとして役立つことを実証する。進化
したｇａｔ遺伝子（０＿５Ｂ８）を、植物プロモーター（強化イチゴ葉脈縞状ウ
イルス）とユビキノンターミネーターとの間でクローン化し、そして、図１２に
示されるように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨ
Ａ１０５を介して、植物細胞の形質転換に適する二成分ベクターｐＭＡＸＹ３７
９３のＴ−ＤＮＡ領域に導入した。スクリーニング可能なＧＵＳマーカーは、Ｔ
−ＤＮＡ中に存在し、形質転換の確認を可能にした。唯一の選択薬剤としてグリ
ホセートを用いて、トランスジェニックタバコ苗条を産生した。
【０３４４】
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．Ｘａｎｔｈｉの腋芽を、１６時間
の光（３５〜４２μＥｉｎｓｔｅｉｎｓ  ｍ−２ｓ−１、白色蛍光灯）の下で、
２４℃で２〜３週間毎に、スクロース（１．５％）およびゲルライト（Ｇｅｌｒ
ｉｔｅ）（０．３％）を含む、半強度（ｈａｌｆ−ｓｔｒｅｎｇｔｈ）ＭＳ培地
で継代培養した。２週間〜３週間の継代培養の後、若葉を植物から切除し、そし
て３×３ｍｍの断片に切り取った。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０５
を、ＬＢ培地に接種し、そしてＡ６００＝１．０の密度まで終夜増殖させた。４
，０００ｒｐｍで５分間かけて細胞をペレット化し、２ｍｇ／ＬのＮ６−ベンジ
ルアデニン（ＢＡ）を含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培
地（ｐＨ５．２）、１％のグルコースおよび４００ｕＭのアセチシリンゴン（ａ
ｃｅｔｙｓｙｒｉｎｇｏｎｅ）を含む、３容量の液体共同培養培地に再懸濁させ
た。次いで、葉片を、１００×２５ｍｍのペトリ皿中の２０ｍｌのＡ．ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ中に３０分間完全に浸し、オートクレーブ処理した濾紙を用いて
ブロットし、次いで固体共同培養培地（０．３％のゲルライト）に配置し、そし
て上記のようにインキュベートした。３日間の共同培養の後、２０〜３０個の断
片を、２ｍｇ／ＬのＢＡを含むＭＳ固体培地（ｐＨ５．７）、３％のスクロース
、０．３％のゲルライト、０〜２００ｕＭのグリホセート、および４００ｕｇ／
ｍｌのチメンチン（Ｔｉｍｅｎｔｉｎ）を含む基礎苗条誘導（ＢＳＩ）培地に移
した。
【０３４５】
３週間後、苗条は、ｇａｔ遺伝子の有無に関係なく、グリホセートを含まない
培地に配置された移植片上に明確に存在していた。両方の構築物からのＴ−ＤＮ
Ａ移入を、再生された苗条に由来する葉のＧＵＳ組織化学的染色によって確認し
た。２０ｕＭよりも大きなグリホセート濃度は、ｇａｔ遺伝子を欠く移植片に由
来する任意の苗条形成を完全に阻害した。ｇａｔ構築物を有するＡ．ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓに感染した移植片は、２００ｕＭ（試験された最高レベル）までの
グリホセート濃度において、苗条を再生した。ＧＵＳ組織化学的染色によって、
ならびに、プロモーターおよび３’領域にアニーリングするプライマーを用いる
ｇａｔ遺伝子のＰＣＲフラグメント増幅によって、形質転換を確認した。結果を
表７に要約する。
【０３４６】
【表７】
2008206519.tif 000020
（実施例１０：形質転換された酵母細胞のグリホセート選択）
酵母形質転換のための選択マーカーは、通常、特定のアミノ酸またはヌクレオ
チドを欠く培地での形質転換細胞の増殖を可能にする栄養要求性遺伝子である。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅがグリホセートに敏感であ
るので、ＧＡＴはまた、選択可能なマーカーとして用いられ得る。このことを示
すために、進化したｇａｔ遺伝子（０＿６Ｄ１０）を、コード領域全体を含むＰ
ｓｔＩ−ＣｌａＩフラグメントとして、（実施例９に示したように）Ｔ−ＤＮＡ
ベクターｐＭＡＸＹ３７９３からクローン化し、そして、図１３に示すようなＰ
ｓｔＩ−ＣｌａＩ消化ｐ４２４ＴＥＦ（Ｇｅｎｅ，１９９５，１５６：１１９〜
１２２）にライゲーションする。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点、
およびカルベニシリン耐性を与える遺伝子、ならびにＴＲＰ１（酵母形質転換の
ためのトリプトファン栄養要求体選択マーカー）を含む。
【０３４７】
ｇａｔ含有構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１  Ｂｌｕｅ（Ｓｔａｔａｇｅｎｅ
）へと形質転換し、そしてＬＢカルベニシリン（５０ｕｇ／ｍｌ）寒天培地にプ
レートする。プラスミドＤＮＡを調製し、形質転換キット（Ｂｉｏ１０１）を用
いて酵母菌株ＹＰＨ４９９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために用い
る。等量の形質転換された細胞を、全ての芳香族アミノ酸（トリプトファン、チ
ロシン、およびフェニルアラニン）を欠いており、グリホセートを添加された、
ＣＳＭ−ＹＮＢ−グルコース培地（Ｂｉｏ１０１）にプレートする。比較のため
に、ｇａｔ遺伝子を欠くｐ４２４ＴＥＦもまた、ＹＰＨ４９９に導入し、そして
上記のようにプレートする。この結果は、ＧＡＴ活性が有効な選択可能なマーカ
ーとして機能することを実証する。グリホセート選択コロニーにおけるｇａｔ含
有ベクターの存在は、プラスミドの再単離および制限消化分析によって確認され
得る。
【０３４８】
先述の本発明は、明確さおよび理解を目的として、いくらか詳細に記載されて
いるが、形態または詳細の種々の変更が、本発明の真の範囲から逸脱せずになさ
れ得ることは、当業者にとって、本開示を読めば明白である。例えば、上記の全
ての技術、方法、組成物、装置および系は、種々に組み合わせて用いられ得る。
本発明は、本明細書中に記載される全ての方法および試薬、ならびに全てのポリ
ヌクレオチド、ポリペプチド、細胞、生物体、植物、穀物（これらは、これらの
新規の方法および試薬の産物である）などを含むことを意図する。
【０３４９】
本出願に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、または他の文書は、各個
の刊行物、特許、特許出願、または他の文書が全ての目的のために参考として本
明細書中に援用されると個々に示されている場合と同じ程度まで、全ての目的の
ために参考としてその全体を本明細書中に援用される。
【０３５０】
【表８】
2008206519.tif 000021
2008206519.tif 000022
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【図面の簡単な説明】
【０３５１】
【図１】図１は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（「ＧＡＴ」）により触媒されるグリホセートのＮ−アセチル化を描く。
【図２】図２は、質量分析装置による、ネイティブＧＡＴ活性を発現する例示的なＢａｃｉｌｌｕｓ培養物によって生成されるＮ−アセチルグリホセートの検出を図示する。
【図３】図３は、異なる株の細菌から単離されるＧＡＴ配列とＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｙｉｔＩとの間の相対的同一性を表として示す。
【図４】図４は、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物からＧＡＴ酵素を発現および精製するためのプラスミドｐＭＡＸＹ２１２０のマップである。
【図５】図５は、典型的なＧＡＴ酵素反応混合物の時間に従い増加されるＮ−アセチルグリホセート産生を示す質量分析装置の出力である。
【図６】図６は、グリホセートのＫＭを２．９ｍＭとして計算された、ＧＡＴ酵素の速度論データのプロットである。
【図７】図７は、アセチルＣｏＡについてＫＭを２μＭとして計算された、図６のデータから引き出された速度論データのプロットである。
【図８】図８は、ＡＭＰＡ経路を経る、土壌におけるグリホセートの分解を記述する模式図である。
【図９】図９は、グリホセート分解のサルコシン経路を記述する模式図である。
【図１０】図１０は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＭＡＸＹ２１９０のマップである。
【図１２】図１２は、ｇａｔ選択マーカーを有するＴ−ＤＮＡ構成物を描く。
【図１３】図１３は、ｇａｔ選択マーカーを有する酵母発現ベクターを描く。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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