(57)【要約】【課題】遺伝子工学的に取り扱いが容易な細胞表層固定化アンカータンパク質及び当該アンカータンパク質を利用したタンパク質の細胞表層固定化技術を提供する。【解決手段】細胞表層結合性タンパク質を、セリンリッチドメインを有する細胞表層タンパク質の前記セリンリッチドメインを含む第１のポリペプチド鎖と、他のタンパク質を含む第２のポリペプチド鎖と、を備えるように構成する。セリンリッチドメインを有する第１のポリぺプチド鎖は、前記第２にポリぺプチド鎖を細胞表層に提示するためのアンカー作用を奏することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表層結合性タンパク質であって、
セリンリッチドメインを有する細胞表層タンパク質の前記セリンリッチドメインを含む第１のポリペプチド鎖と、
他のタンパク質を含む第２のポリペプチド鎖と、
を備える、タンパク質。
【請求項２】
前記細胞表層タンパク質は、ＧＰＩアンカーを備えておらず、かつ、ＧＨ（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ Ｈｙｄｏｌａｓｅ）ファミリー１７のグルカナーゼ並びに細胞壁及び真菌の細胞壁においてアルカリ感受性結合によって結合されている細胞表層タンパク質から選択される、請求項１に記載の細胞表層結合性タンパク質。
【請求項３】
前記細胞表層タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＳＣＷ４遺伝子及びＳＣＷ１０遺伝子がコードするタンパク質又は当該タンパク質と実質的に同一であるタンパク質である、請求項２に記載の細胞表層結合性タンパク質。
【請求項４】
前記第２のポリペプチド鎖は、前記第１のポリペプチド鎖のＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合されている、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞表層結合性タンパク質。
【請求項５】
前記第２のポリペプチド鎖は、前記第１のポリペプチド鎖の前記セリンリッチドメインのＮ末端側に結合されている、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項６】
前記第２のポリぺプチド鎖は、前記第１のポリペプチド鎖の前記セリンリッチドメインのＣ末端側に直接結合されている、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の細胞表層結合性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の細胞表層結合性タンパク質を細胞表層に備える、細胞。
【請求項９】
前記細胞は酵母である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記他のタンパク質が酵素である、請求項８又は９に記載の細胞。
【請求項１１】
細胞の使用方法であって、
請求項８〜１０のいずれかに記載の細胞を使用して、前記他のタンパク質と他の物質と相互作用させる相互作用工程を備える、方法。
【請求項１２】
前記相互作用工程は、前記他のタンパク質と前記他の物質との相互作用により、さらに他の物質を生産する物質生産工程である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、所望のタンパク質を細胞表面に提示することができる細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母の細胞表層タンパク質としてはglycosylphosphatidylinositol（ＧＰＩ）アンカーを介して細胞壁に固定化されているタンパク質が良く知られている。そこで、α−アグルチニン（SAG1）、SED1、FLO1、CWP1、CWP2、TIP1などの細胞表層タンパク質のC末端に存在するＧＰＩアンカーを利用して、他のタンパク質を細胞表層に固定化する方法が検討され、開示されている（特許文献１、非特許文献１）。また、同様に、ＧＰＩアンカーを備えるタンパク質のＧＰＩアンカーを含まない糖鎖結合タンパク質ドメインをアンカーとして用いることも開示されている（特許文献２）。
【０００３】
別のグループの細胞表層タンパク質として、細胞壁グルカンに付着しており、アルカリ溶液により細胞表層から抽出されるグループがあり、ＰＩＲ１が代表的なものとして知られている。これらのグループは、細胞内にアミノ酸の繰り返し配列が多数存在することが特徴であり、この繰り返し配列が細胞壁への固定に必要であると考えられている。ＰＩＲ１を利用して他のタンパク質を細胞表層に固定化する方法についても検討されている（非特許文献２）。
【０００４】
ＰＩＲ１と同様に細胞壁グルカンに付着しているが、繰り返し配列を持たないグループも報告されている（非特許文献３）。このグループとしてはＳＣＷ４，ＳＣＷ１０およびＴＯＳ１などの遺伝子がある。これらのタンパク質は、配列内部にセリン・リッチなドメイン配列を持っている。ＳＣＷ４とＳＣＷ１０はGlycosyl hydrolase（GH）ファミリー１７のグルカナーゼとの相同性が高く、ＴＯＳ１については機能未知である。これらのグループの細胞壁への付着の機構は不明であるが、上記ＧＰＩアンカータンパク質やＰＩＲタンパク質とは異なる機構で細胞壁に付着すると考えられる。
【特許文献１】国際公開ＷＯ１９９４／００１５６７号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００２／０８５９３５号パンフレット
【非特許文献１】シュレーダーら、イースト、第9、ｐ399-409（Schreuder, M. P., et al. Yeast 9:399-409(1993）
【非特許文献２】アベら、ＦＥＭＳ イースト リサーチ、第４、ｐ417-425、（Abe, H., et al. FEMS Yeast Res 4:417-425（2005））
【非特許文献３】インら、ジャーナル オブ バイオケミストリー、第280号、ｐ．20894-20901（米国）（Yin, Q. Y.,et al., J Biol Chem 280:20894-20901(2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＧＰＩアンカーは小胞体で合成され糖鎖修飾を受ける。これらの合成・修飾には１０種類以上の遺伝子が関与する複雑な生合成経路であることが知られており、生合成の律速となることが予想される。また、ＧＰＩアンカータンパク質の中で凝集機能ドメインもつＦＬＯファミリーやＰＩＲ１ファミリーは多数の繰り返し配列を有しており、遺伝子工学上取り扱いが困難である。
【０００６】
さらに、酵母等を用いた物質生産を考えた場合、一つの酵母の細胞表層に大量の酵素を提示させる必要がある場合や、複数の酵素を提示する必要がある場合がある。このような場合は、従来用いられているＧＰＩアンカーやＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメイン以外の新規なアンカー作用によって細胞表層提示させることで確実に大量又は多種類の酵母を提示できると考えられる。
【０００７】
一方、ＳＣＷ４などについては、細胞表層固定化アンカーとして用いる検討は現在まで行われておらず、アンカーとして用いることが可能であるかどうかは不明である。
【０００８】
そこで、本発明は、遺伝子工学的に取り扱いが容易な細胞表層固定化アンカータンパク質及び当該アンカータンパク質を利用したタンパク質の細胞表層固定化技術を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、新たなアンカー作用でアンカーとして機能する細胞表層固定化アンカータンパク質及び当該アンカータンパク質を利用したタンパク質の細胞表層固定化技術を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、セリン・リッチなドメイン配列を持つ細胞表層タンパク質を、他のタンパク質を細胞表層に固定化するアンカーとして用いることについて検討したところ、こうしたタンパク質を固定化アンカーとして用いることができることを新たに見出し、本発明を完成した。本発明によれば、以下の手段が提供される。
【００１０】
本発明によれば、細胞表層結合性タンパク質であって、セリンリッチドメインを有する細胞表層タンパク質の前記セリンリッチドメインを含む第１のポリペプチド鎖と、他のタンパク質を含む第２のポリペプチド鎖と、を備える、タンパク質が提供される。
【００１１】
本発明の細胞表層結合性タンパク質にあっては，前記細胞表層タンパク質は、ＧＰＩアンカーを備えておらず、かつ、ＧＨ（ＧｌｙｃｏｓｉｄｅＨｙｄｏｌａｓｅ）ファミリー１７のグルカナーゼ並びに細胞壁及び真菌の細胞壁においてアルカリ感受性結合によって結合されている細胞表層タンパク質から選択されることが好ましく、また、前記細胞表層タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＳＣＷ４遺伝子及びＳＣＷ１０遺伝子がコードするタンパク質又は当該タンパク質と実質的に同一であるタンパク質であることが好ましい。
【００１２】
前記第２のポリペプチド鎖は、前記第１のポリペプチド鎖のＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合されていてもよく、前記第２のポリペプチド鎖は、前記第１のポリペプチド鎖の前記セリンリッチドメインのＣ末端側に結合されていてもよく、好ましくは、前記第２のポリペプチド鎖は、前記第１のポリペプチド鎖の前記セリンリッチドメインＣ末端側に直接結合されている。
【００１３】
本発明によれば、上記いずれかに記載の細胞表層結合性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物が提供される。また、本発明によれば、上記いずれかに記載の細胞表層結合性タンパク質を細胞表層に備える、細胞が提供される。この細胞は酵母であることが好ましく、また、前記他のタンパク質が酵素であることが好ましい。
【００１４】
本発明によれば、細胞の使用方法であって、上記いずれかの細胞を使用して、前記他のタンと他の物質とを相互作用させる相互作用工程を備える、方法が提供される。前記相互作用工程は、前記他のタンパク質と前記他の物質との相互作用により、さらに他の物質を生産する物質生産工程とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の細胞表層結合性タンパク質は、セリンリッチドメインを有する細胞表層タンパク質の前記セリンリッチドメインを含む第１のポリペプチド鎖と、他のタンパク質である第２のポリペプチド鎖と、を備えることができる。本発明の細胞表層タンパク質によれば、第１のポリペプチド鎖は、繰り返し配列を有しないため、遺伝子工学的な取り扱いが容易である。また、第１のポリペプチド鎖のセリンリッチドメインは、ＧＰＩアンカーやＧＰＩアンカーの凝集性作用とは異なる作用によって細胞表層にタンパク質を固定化するため、ＧＰＩアンカー等により既に細胞表層に他のタンパク質が発現されていてもなおタンパク質を細胞表層に発現させることができる。
【００１６】
以下、本発明の細胞表層結合性タンパク質、当該タンパク質を発現する細胞及びこれらの利用について説明する。
【００１７】
（細胞表層結合性タンパク質）
細胞表層結合性タンパク質は、セリンリッチドメインを有する細胞表層タンパク質のセリンリッチドメインを含む第１のポリペプチド鎖と、他のタンパク質である第２のポリペプチド鎖とを備えることができる。
【００１８】
（第１のポリペプチド鎖）
セリンリッチドメインを有する細胞表層タンパク質としては、ＧＰＩアンカータンパク質でないことが好ましい。すなわち、ＧＰＩアンカータンパクを備えていない細胞表層タンパク質であることが好ましい。このような細胞表層タンパク質としては、ＧＨ（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ Ｈｙｄｏｌａｓｅ）ファミリー１７のグルカナーゼが挙げられる。具体的には、以下の表に記載のタンパク質が挙げられる。なお、以下の表においては、ＳＣＷ４遺伝子の配列を基準に相同性を記載している。
【００１９】
【表１】
2008263975.tif 000002
【００２０】
こうしたタンパク質のなかでは、Ｓｃｗ４タンパク質（配列番号１）及びＳｃｗ１０タンパク質が好ましい。これらは、いずれもサッカロマイセス・セレビシエの細胞表層タンパク質である。
【００２１】
また、このような細胞表層タンパク質としては、酵母や真菌の細胞壁から抽出される、これらの細胞壁においてアルカリ感受性結合によって結合されている細胞表層タンパク質が挙げられる。こうした細胞表層タンパク質は、例えば、細胞壁を３０ｍＭのＮａＯＨにより、４℃、１７時間処理することにより抽出できる。抽出したタンパク質は、アニオン交換カラムによって精製することができる。具体的には、こうしたタンパク質は、デ・グロートらの方法（Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｃｅｌｌ３、９５５−９６５（２００４）に記載の方法によってＭｏｎＱＨＲ５／５カラムによって分離され、水に対して透析し電気泳動等して精製される。これらのタンパク質としては、すでに説明したＳｃｗ４タンパク質、Ｓｃｗ１０タンパク質が挙げられるほか、Ｔｏｓ１タンパク質（配列番号２）が挙げられる。Ｔｏｓ1タンパク質もサッカロマイセス・セレビシエの細胞表層タンパク質である。
【００２２】
セリンリッチドメインのアミノ酸残基数やセリン残基数の比率は特に限定しない。セリンリッチドメインの例としては、ＳＣＷ４及びＴＯＳ１のセリンリッチドメインが挙げられる。これらのタンパク質及びセリンリッチドメインのアミノ酸配列を配列番号１及び２に示す。
【００２３】
なお、細胞表層タンパク質及びセリンリッチドメインは、上記した各種の特定の細胞表層タンパク質及びそのセリンリッチドメインと実質的に同一である細胞表層タンパク質やセリンリッチドメインであってもよい。なお、ここで、実質的に同一とは、細胞表層へのアンカー作用を発現することができるという意味で同一であることを意味している。実質的に同一であるタンパク質は、もとのタンパク質やドメインにおけるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の１又は２以上の置換、挿入、欠失及び付加のいずれかあるいは２種類以上による公知の改変や、あるいはこれらタンパク質等をコードするＤＮＡ若しくはその一部又はこれに相補的なプローブを用いてハイブリダイゼーション技術によって取得することもできる。
【００２４】
第１のポリペプチド鎖はこのような細胞表層タンパク質のセリンリッチドメインを有していればよい。したがって、セリンリッチドメインのみを有していてもよいし、セリンリッチドメイン以外の細胞表層タンパク質の部分を有していてもよい。また、細胞表層タンパク質の全アミノ酸配列を備えていてもよい。ただし、これらの細胞表層タンパク質の機能するドメイン（活性ドメイン）を含まないことが好ましい。細胞表層タンパク質が酵素等の機能を有している場合、こうした機能が本発明の細胞表層結合性タンパク質における他のタンパク質の機能発現を妨げる可能性があるからである。なお、実質的に機能することができない機能ドメインの一部を含んでいてもよい場合がある。
【００２５】
例えば、Ｓｃｗタンパク質は、グルカナーゼであると考えられ、このタンパク質のＣ末端側には機能性ドメインが含まれていると推定されるため、この機能ドメインの全てを含んでいないことが好ましい。
【００２６】
本発明の第１のポリペプチド鎖による細胞表層アンカー効果については今のところ解明されていない。
【００２７】
（第２のポリペプチド鎖）
第２のポリペプチド鎖は、セリンリッチドメインを有する細胞表層タンパク質とは他のタンパク質を含んでいる。本発明の細胞表層結合性タンパク質における第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖との結合態様は、第１のポリペプチド鎖におけるセリンリッチドメインの存在形態と、第２のポリペプチド鎖における他のタンパク質の活性部位等により種々の形態を採ることができる。セリンリッチドメインを介した細胞表層結合作用を呈する限り、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とはどのような結合形態であってもよい。
【００２８】
典型的には、第１のポリペプチド鎖のＮ末端側に第２のポリペプチド鎖が結合されている態様、第１のポリペプチド鎖のＣ末端側に第２のポリペプチド鎖が結合されている態様及び第１のポリペプチド鎖のＮ末端側及びＣ末端側に第２のポリぺプチド鎖が結合されている態様が挙げられる。また、セリンリッチドメインと他のタンパク質との関係においては、セリンリッチドメインのＮ末端側及び／又はＣ末端側に直接結合されていてもよいし、リンカーを介して結合されていてもよい。また、他のタンパク質が、第１のポリぺプチド鎖又はセリンリッチドメインのＮ末端側に結合されるかＣ末端側に結合されるかは、他のタンパク質における活性ドメインの位置によって決定することができる。例えば、Ｃ末端側に活性ドメインを有する他のタンパク質の場合、当該他のタンパク質は、第１のポリぺプチド鎖、より好ましくはセリンリッチドメインのＮ末端側に直接結合されることが好ましい。
【００２９】
第２のポリぺプチド鎖に含まれるタンパク質は、特に限定しない。好ましくは、細胞表層における発現を利用できるタンパク質である。こうしたタンパク質としては、例えば、物質生産等に関わる酵素、センサー機能を有する酵素や抗体などの各種タンパク質、受容体タンパク質や抗体など特異的結合作用を有するタンパク質、抗原などとなりうる糖タンパク質、ＧＦＰなど細胞の可視化が可能なタンパク質、スクリーニング等の対象となる機能未知又は機能既知のタンパク質が挙げられる。物質生産にかかわる酵素としては、例えば、リパーゼ類、炭水化物分解酵素類が挙げられる。リパーゼとしては、グリセロールに脂肪酸が結合した油脂から脂肪酸を遊離させる活性を有するタンパク質である。炭水化物分解酵素類としては、多糖類およびオリゴ糖類を分解して単糖類を生成させる糖類分解酵素が挙げられる。
【００３０】
本発明の細胞表層結合性タンパク質は、こうした糖類分解酵素活性を有するタンパク質を他のタンパク質として備えることが好ましい。こうした分解酵素が分解対象とする糖類は、多糖類であってもオリゴ糖類であってもよく、動物由来であっても植物由来であってもよいが、好ましくは植物由来である。これらの糖類は、好ましくは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、キシロースおよびアラビノースならびにこれらの誘導体から選択される１種あるいは２種以上を構成単糖類として含有する。これらは植物系バイオマス資源の糖質材料の構成単糖類である。また、キシロース、マンノース、ガラクトースおよびアラビノースならびにこれらの誘導体から選択される１種あるいは２種以上を構成単糖類として有していることも好ましい。これらは、植物系バイオマス資源中、特にリグノセルロース系材料に含まれるヘミセルロースの主たる構成単糖類である。なお、糖類の誘導体としては、ガラクツロン酸、グルクロン酸などのウロン酸や、水酸基がエステル化されたエステル誘導体、水酸基がメチル化等されたアルキル誘導体が挙げられる。
【００３１】
炭素源としては、セルロース、ヘミセルロースおよびデンプンから選択される多糖類あるいはその一部であるオリゴ糖類であることが好ましい。なお、本明細書においては、ヘミセルロースは、植物細胞壁をセルロースとともに構成する多糖類あるいは植物細胞壁を構成するセルロース以外の多糖類であって、ホモ多糖類あるいはヘテロ多糖類を総称するものとする。ヘミセルロースとしては、例えば、マンナン、グルコマンナン、グルコキシラン、ガラクタン、キシラン、アラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、ペクチン、キチン等が挙げられる。
【００３２】
より好ましくは、セルロースおよびヘミセルロースである。これらは植物系バイオマス資源の廃棄物や未利用資源に多く含まれているからである。より好ましくはセルロースである。また、セルロースの一部であるオリゴ糖類としては、セロビオースが挙げられる。なお、炭素源としての多糖類およびオリゴ糖類は上記した多糖類および糖類のうち１種あるいは２種以上が組み合わされていてもよい。
【００３３】
糖類分解酵素としては、グルコースのβ１，４−結合による重合構造を有する（セルロース）場合には、β１，４−グルコシド結合を切断できる酵素であれば特に制限なく使用できるが、好ましくは、エンドβ１，４−グルカナーゼ、セロビオヒドラーゼ（エキソβ１，４−グルカナーゼ）、β−グルコシダーゼ、カルボキシメチルセルラーゼなどが挙げられる。なかでも、エンドβ１，４−グルカナーゼ、セロビオヒドラーゼ、およびβ−グルコシダーゼのいずれかあるいは２種以上を好ましく用いることができ、エンドβ１，４−グルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼの組み合わせやこれら３種の酵素の組み合わせが用いられる。これら３種の組み合わせによれば、これらの相乗効果によってセルロースからの高効率な有機酸生産が可能となる。
【００３４】
また、多糖類およびオリゴ糖が、グルコースのα１，６−結合および／またはα１，４−結合による重合構造を有する（デンプン、アミロースおよびアミロペクチン）場合には、分解酵素としては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼが挙げられる。また、多糖類およびオリゴ糖類が、キシロース、アラビノース、マンノースおよびガラクトースならびにこれらの誘導体から選択される単糖類を構成単糖として有する（各種ヘミセルロース）場合の分解酵素としては、β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、マンノシダーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼが挙げられる。これらの酵素は、炭素源として利用する１種あるいは２種以上の多糖類あるいはオリゴ糖類の種類に応じて選択されるが、１種あるいは２種以上の分解酵素が組み合わされていてもよい。
【００３５】
なお、各種の糖類分解酵素としては、分解酵素のアミノ酸配列において１あるいは２以上のアミノ酸残基を、置換、欠失、挿入および／または付加することによって変異させて改変されたものを同様に用いることができる。
【００３６】
本発明の細胞表層結合性タンパク質は、Ｎ末端に分泌シグナル配列を有することができる。分泌シグナル配列は、一般に、細胞外に分泌される分泌性タンパク質のＮ末端に結合している。通常、分泌性タンパク質を細胞膜を通じて細胞外分泌される際に除去される。こうした分泌シグナル配列としては、特に限定されない。分泌シグナル配列としては、例えば、Rhizopus oryzaeのグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列などが挙げられる。なお、分泌シグナル配列は、本発明の細胞表層結合性を妨げない限り、細胞表層に発現される際にＮ末端に全部又はその一部が結合されたままであってもよい。
【００３７】
（ＤＮＡ構築物）
本発明のＤＮＡ構築物は、本発明の細胞表層結合性タンパク質をコードしている。ＤＮＡ構築物の形態は、細胞表層結合性タンパク質をコードするＤＮＡを有していればよく、特に限定されないが、好ましくは、細胞表層結合性タンパク質を発現可能に、プロモーター領域、ターミネーター領域及びエンハンサー領域等の調節領域を備えていることが好ましく、より好ましくは選択マーカー遺伝子等を備える。
【００３８】
プロモーターは、細胞の種類や発現レベルに応じて選択することができる。例えば、酵母等において細胞表層結合性タンパク質を発現させるには、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子１プロモーター（ＰＤＣ１プロモーター）、アルコール脱水素酵素遺伝子プロモーター（ＡＤＨプロモーター）、高浸透圧応答７遺伝子プロモーター（ＨＯＲ７プロモーター）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素３遺伝子プロモーター（ＴＤＨ３プロモーター）、ヘキソース輸送タンパク質７遺伝子プロモーター（ＨＸＴ７プロモーター）が挙げられる。
【００３９】
また、他の調節領域としては、ＣＹＣ１ターミネーターやＴＤＨ３ターミネーターなどのターミネーター他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナルを備えることができる。選択マーカーとしては、特に限定しないで、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めとする公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。
【００４０】
ＤＮＡ構築物は、線状等のＤＮＡ断片、プラスミド（ＤＮＡ）、ウイルス（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ）を、外来遺伝子の導入形態（染色体外あるいは染色体内）等に応じて選択してベクターとしての形態をとることができる。好ましくは、プラスミドなどのベクターの形態を備える。
【００４１】
以上説明したような本発明のＤＮＡ構築物は、周知の遺伝子工学的手法により取得することができる。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (T. Maniatis, et al., Cold Spring Harbor Laboratory) に従い実施できる。
【００４２】
（細胞表層結合性タンパク質を備える細胞）
本発明の細胞は、細胞表層に細胞表層結合性タンパク質を備えている。本発明の細胞によれば、細胞表層において有用タンパク質を発現させることができるので細胞自体を有用タンパク質の固定化体又は集約体として用いて、発現させるタンパク質により、物質生産、センシング、イメージング、スクリーニング等の各種の用途に用いることができる。
【００４３】
こうした細胞は、通常、本発明のＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入することによって得ることができる。ＤＮＡ構築物の遺伝子導入の宿主となる微生物は特に限定しない。大腸菌、乳酸菌のほか、酵母、カビ等の真核微生物とすることができる。他のタンパク質として糖類の分解酵素等を発現させる場合には、多糖類等の資化能を有する微生物、有機酸発酵能を有する微生物の他、アルコール発酵能を有する微生物を用いることが好ましい。こうすることで、ＤＮＡ構築物により細胞表層に提示させた酵素と宿主本来の代謝能とを組み合わせることで所望の細胞育種を容易に行うことができる。
【００４４】
糖類の資化能を有する微生物として、キシロースなどを資化できるペントース資化性微生物としては、例えば、Breltanomyces clansenii, Pichia stipitis、Candida shehatae、Esherichia coliが挙げられる。また、デンプンを資化できるデンプン資化性微生物としては、例えば、Saccharomyces diastaticusが挙げられる。また、アルコール発酵性微生物としては、Zymomonas mobilisなどのZymomonas属菌やZymobacter属菌のほか、酵母を用いることが好ましい。工業的な発酵生産を考慮すると酵母を用いることが好ましい。酵母としては、清酒酵母やワイン酵母などが挙げられ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Scizosaccharomyces pombe）などのサッカロマイセス属酵母、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などのピキア属酵母を挙げることができる。より好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などのサッカロマイセス属を始めとする酵母である。
【００４５】
ＤＮＡ構築物を、宿主微生物に導入した形質転換細胞は、周知の遺伝子工学的手法により取得することができる。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (T. Maniatis, et al., Cold Spring Harbor Laboratory) に従い実施できる。
【００４６】
（細胞の使用方法）
本発明の細胞の使用方法は、本発明の細胞表層結合性タンパク質を表層に発現する細胞を使用して、前記他のタンパク質と他の物質と相互作用させる工程を備えることができる。本発明の細胞は、すでに説明したように、物質生産、センシング、細胞イメージング（可視化）、スクリーニング等の各種の用途に用いることができる。したがって、本発明の使用方法は、本発明の細胞の細胞表層発現させたタンパク質と他の物質の相互作用に基づくセンシングを行うことでセンシング方法（検出方法）を実施できる。また、細胞表層結合性タンパク質と他の物質との相互作用により目的の物質をスクリーニングするスクリーニング方法としても実施できる。さらに、細胞表層結合性タンパク質が他の物質との相互作用により細胞を含むマトリックス中のどこに存在するかを細胞自体が発揮する蛍光等によってイメージングし検出する方法として実施できる。
【００４７】
本発明の使用方法は、さらに、細胞表層結合性タンパク質と他の物質との相互作用により、当該他の物質をさらに他の物質に変換したりするなどして、物質生産方法として実施できる。物質生産方法としては、好ましくは、セルロースやキシロースなどの糖類を含む植物バイオマス資源を炭素源としてこれを資化して有機酸、アルコール等を生産する方法が挙げられる。
【００４８】
植物バイオマス資源とは、植物に由来する有機性資源であって化石資源を除いたものを意味している。また、こうした有機資源から分離あるいは抽出されたフラクションも植物バイオマス資源に含むことができる。本発明の物質生産方法によれば、容易に細胞表層タンパク質の提示種類又は提示量を増大させることができるため、複数種類の酵素の提示や大量なタンパク質の提示が必要なセルロース、キシロースからの有機酸やエタノールの生産に有用である。
【００４９】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下に述べる遺伝子組換え操作はMolecular Cloning： A Laboratory Manual (T. Maniatis, et al., Cold Spring Harbor Laboratory) に従い行った。PCRによる遺伝子増幅は、特に述べない限り、KOD plus DNA polymerase（TOYOBO）を用い、添付のプロトコルに従って行った。PCR増幅反応は94℃で２分間の熱処理を行った後、94℃で15秒と53℃で30秒と68℃でX分（X：増幅遺伝子の大きさが1kbにつき1分とした）との３つの温度変化を1サイクルとし、これを25サイクル繰り返し、最後に4℃とした。PCR増幅装置はGene Amp PCR system 9700（PApplied Biosystems）を使用した。DNA断片のライゲーション反応にはIn-Fusion PCRクローニングキット（Clontech）またはLigaFast Rapid DNA Ligation System（Promega）を用いた。大腸菌の形質転換は、DH５α株のコンピテント細胞（TOYOBO）を用い、添付のプロトコルに従って行った。大腸菌の形質転換体の選抜はアンピシリン１００μg/mlまたはカナマイシン５０μg/mlを含むLBプレートを用いて行った。大腸菌からのプラスミドの抽出にはQIA Prep Spin Miniprepkit (QIAGEN)を用いた。酵母のゲノムDNAの調製はGenとるくん（TaKaRa）を用いた。酵母の形質転換はFrozen-EZ Yeast Transformation II（ZYMO RESEARCH）を用い、添付のプロトコルに従って行った。
【実施例１】
【００５０】
（染色体組込型ベクターの構築）
サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の細胞表層タンパク質であるＳＣＷ４およびＴＯＳ１に、レポーター酵素としてPhanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼｃｅｌ１２Ａ（以下Ｐｃｃｅｌ１２Ａと表記）を融合した。ＳＣＷ４およびＴＯＳ１は全長およびN末端半分部分を用いて細胞表層への提示能力を比較した。これらの構造を図１に示す。これらの融合タンパク質を酵母菌体で発現するために、染色体組込型ベクターを作製した。これらのベクターの構造を図２に示す。
【００５１】
これらのベクターは以下の方法で作製した。まず、ＰＣＲ反応により所定長のＤＮＡを増幅して、以下の各種断片を作製した。酵母由来の遺伝子についてはS. cerevisiae OC２株の酵母ゲノムDNAをテンプレートとした。
【００５２】
（HOR7プロモーター断片及びTDH3ターミネーター断片）
酵母のHOR7遺伝子のプロモーター領域（開始コドン上流-810 bpから-1 bpまでの領域）をＨＯＲ７プロモーター断片とし、酵母の TDH3遺伝子のターミネーター域（終始コドンの下流580 bpの領域）をＴＤＨ３ターミネーター断片とした。
【００５３】
（分泌シグナル断片（s.s.））
Rhizopus oryzae のグルコアミラーゼ遺伝子（GenBank accession  number D00049）の分泌シグナルを用いた。
【００５４】
（各種細胞表層タンパク質遺伝子断片）
これらの遺伝子断片はそれぞれ以下のとおりとした。
遺伝子断片の種類                            由来                          
ＳＣＷ４C１断片           酵母のＳＣＷ４遺伝子の全長
（開始コドンを+1として、+1〜+1,161 bpの領域）
ＳＣＷ４C２断片           酵母のＳＣＷ４遺伝子の5'末端半分の部分
（+1〜+465 bp）。
ＴＯＳ１C１断片           酵母のＴＯＳ１遺伝子の全長（+1〜+1,368 bp）
ＴＯＳ１C２断片           酵母のＴＯＳ１遺伝子の5'末端半分の部分
（+1〜+819 bpの領域）
【００５５】
（Pccel12A遺伝子断片）
Pccel12A遺伝子断片としては、セルロースを唯一炭素源とする培地で培養した白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium（ATCC64314）の菌体からcDNAを調整し、得られたcDNAを鋳型としてエンドグルカナーゼPccel12A（GenBank accession No. AY682744）遺伝子をPCR法により増幅した。Pccel12A遺伝子を上記アンカー遺伝子と融合する場合には、アミノ酸の読み枠がずれないように設計した。
【００５６】
（G418マーカー断片）
特開2006-42719号公報に記載のpBG418-PDC1p-AaBGLベクターを鋳型として、G418耐性マーカーカセットを増幅した。
（上流相同遺伝子断片）
宿主細胞として、ウシ由来LDH遺伝子が８コピー導入された乳酸生産酵母Ｔ１６７−１０Ｂ株（特開2006-20602号公報に記載）を用いた。Ｔ１６７−１０Ｂ株では、導入された８コピーのLDH遺伝子の内2コピーはフレオマイシン耐性遺伝子を用いて導入されている。そこで作製する染色体組込型ベクターは、宿主細胞染色体上のフレオマイシン耐性遺伝子（ble）を標的として遺伝子導入できるように設計した。pBBLE-LDHKCBベクター（Saitoh, S., et al. 2005. Appl Environ Microbiol 71:2789-92.）を鋳型として、フレオマイシン耐性遺伝子（ble）の一部を増幅し、上流相同遺伝子断片（ble-U）とした。
【００５７】
（下流相同遺伝子断片）
pBBLE-LDHKCBベクターで使用した相同組換え配列SLX4断片を用いた。
【００５８】
上記操作で得られた各断片を、順次pBluescriptII SK+ベクター（TOYOBO）のマルチクローニングサイトに連結して、図１で示した遺伝子構造を有し、図２に示した染色体導入型ベクターを構築した。アンカーとしてＳＣＷ４Ｃ１を用いたベクターをpXbG-SCW4C1-12Aと称した。同様に、ＳＣＷ４Ｃ２、ＴＯＳ１Ｃ１、ＴＯＳ１Ｃ２をアンカーとした場合をそれぞれpXbG-SCW4C2-12A、pXbG-TOS1C1-12A、pXbG-TOS1C2-12Aと称した。また、ネガティブコントロールとしてPccel12Aにアンカーをつけずに分泌するためのベクター（pXbG-Pccel12A）を作製した。各遺伝子断片と構築したベクターは、シークエンス解析を行って、変異等がないことを確認した。なお、これらの遺伝子工学的操作にあたり、細胞表層タンパク質断片は繰り返し配列を有するものではないため、特別な操作を要することなく通常の操作によりクローニング等することができた。
【実施例２】
【００５９】
（組換え酵母の作製）
上記操作で得られたベクター各４０μｇを制限酵素Sse8387Iで消化して線状化し、Ｔ１６７−１０Ｂ株にそれぞれ導入した。形質転換体はＹＰＤ培地（２％グルコース、１％酵母エキス、２％ペプトン、１．５％寒天）に０．２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を添加したＧ４１８選択培地プレートで生育したコロニーについて更にＧ４１８選択培地プレートでコロニーを純化した。目的遺伝子が挿入されたことはコロニーダイレクトＰＣＲにより確認した。
【実施例３】
【００６０】
（エンドグルカナーゼ活性の測定）
作製した形質転換体の菌体と、培地上清のエンドグルカナーゼ活性を以下の方法で測定した。形質転換体を試験管に入れた５ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、２日間振とう培養（３０℃、１２０ｒｐｍ）したのち、培養液を遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）して菌体画分と上清画分に分離した。菌体画分については滅菌水にて３回洗浄したのち酢酸バッファー（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）に懸濁し、ＯＤ６００＝２０となるように調製して菌体液とした。基質溶液はＣＭＣ（carboxymethyl cellulose sodium salt（Aldrich））を１％（ｗ／ｖ）となるように酢酸バッファーに溶解して調製した。０．５ｍｌの培地上清または菌体液に０．５ｍｌのＣＭＣ基質溶液を加え、３０℃で１６時間、緩やかに攪拌しながら反応した。反応終了後、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により反応液上清をとり、還元糖濃度をソモギー・ネルソン法により定量した。結果を図３に示す。図３においては、還元糖濃度はグルコース当量（Glc. eq.）で示し、培地上清については、培地当たりの遊離還元濃度（mg Glc. eq. /l）で示し、菌体画分については、菌体乾燥重量当たりの遊離還元糖濃度（mg Glc. eq. /mg dry cell）で示した。
【００６１】
図３に示すように、アンカータンパク質を融合した各種融合タンパク質の培地上清画分のエンドグルカナーゼ活性は、アンカーなしの場合と同等であったことから、Pccel12Aはアンカータンパク質を融合しても活性を発現することがわかった。一方、菌体画分では、SCW4C2の場合のみ活性が認められた。このことから、Ｓｃｗ４タンパク質のセリンリッチドメインをＣ末端近傍に備えるようなＮ末端側部分を細胞表層アンカーとして用い、そのＣ末端側を目的タンパク質のＮ末端側に結合させることにより、効率的に菌体の細胞表層に目的タンパク質を提示することができることがわかった。
【００６２】
以上の結果から、セリンリッチドメインを有するぺプチド鎖と他のタンパク質を含むぺプチド鎖とを備える融合タンパク質は、当該他のタンパク質を細胞表層で発現させることができることがわかった。
【実施例４】
【００６３】
（アンカータンパク質Ｎ末端へのレポーター遺伝子の融合）
次に、アンカータンパク質ＳＣＷ４のＮ末端側にPccel12Aを融合して細胞表層に提示を行うためのベクターを製した。すなわちＳＣＷ４遺伝子の分泌シグナルおよびプロ配列を除いた成熟タンパク質をコードする部分から終始コドン下流のターミネーター領域を含む断片の5'末端（以下ＳＣＷ４Ｎ）にPccel12A遺伝子を融合して発現するベクターを実施例１と同様にして構築した。分泌シグナルとしてはRhizopus oryzae のグルコアミラーゼ遺伝子（GenBank accession number D00049）の分泌シグナルを用いた。対照として、特許文献１および非特許文献２に開示されているＧＰＩアンカータイプのαーアグルチニン（ＳＡＧ１遺伝子にコード）の3'部分（以下ＳＡＧ１Ｎ）をアンカーとして用いたベクターを、非特許文献２を参考にして構築した。アンカーとしてＳＣＷ４ＮとＳＡＧ１Ｎを用いた発現ベクターをそれぞれpXbG-SCW4N-12A、pXbG-SAG1N-12Aと称した(図４)。
【００６４】
これらの遺伝子断片はそれぞれ以下の通りとした。
遺伝子断片の種類                由来                                                  
ＳＣＷ４Ｎ    酵母のＳＣＷ４遺伝子の成熟タンパク質部分＋ターミネーター配列
（＋91〜+1,703 bp）
ＳＡＧ１Ｎ    酵母のＳＡＧ１遺伝子の3'半分の領域＋ターミネーター配列
（＋991〜＋1,953 bp）
【００６５】
上記操作で得られたベクターを実施例２と同様にしてＴ１６７−１０Ｂ株に導入した。作製した形質転換体の菌体と培地上清のエンドグルカナーゼ活性を実施例３と同様にして測定した。また、実施例２で作製したＳＣＷ4Ｃ2アンカーと、アンカー無しでPccel12Aを分泌発現する菌株も同時に活性を測定した。反応開始３時間後に反応液上清の還元糖濃度をソモギー・ネルソン法により定量した。結果を図５に示す。なお、図５においても、菌体画分及び培地上清のそれぞれにつき、図３と同様の還元糖濃度の指標を用いた。
【００６６】
図５に示すように、アンカータンパク質を融合した各種融合タンパク質の培地上清画分のエンドグルカナーゼ活性は、アンカー無しの場合と同等であったことから、Pccel12AのＣ末端にＳＣＷ４ＮまたはＳＡＧ１Ｎアンカータンパク質を融合しても活性を発現することがわかった。一方、菌体画分ではＳＣＷ4Ｎの活性が最も高く、既知のＳＡＧ１Ｎアンカーに比べて約２倍の比活性を示した。この結果からＳＣＷ４遺伝子の分泌シグナルおよびプロ配列を除いた成熟タンパク質をコードする部分のＮ末端側を目的タンパク質のＣ末端に融合することにより、既存の方法より高い効率で菌体の細胞表層に目的タンパク質を提示することができることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本実施例で作製した細胞表層結合タンパクのための融合遺伝子の構造を示す図である。
【図２】図１に示す融合遺伝子を染色体に組み込むために染色体組み込み型ベクターの構造を示す図である。
【図３】エンドグルカナーゼ活性の測定結果を示す図である。左側のグラフは、菌体画分での活性を示す図であり、右側のグラフは培地上清での活性を示す図である。
【図４】実施例４で作製した染色体組み込み型ベクターの構造を示す図である。
【図５】エンドグルカナーゼ活性の測定結果を示す図である。左側のグラフは、菌体画分での活性を示す図であり、右側のグラフは培地上清での活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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