(57)【要約】【課題】本発明は、ヒト肺がんの４病態について共通して用いることができ、当該４病態を自動的に識別してこれを特定することができる、ヒト肺がん用分子診断システムを提供することを目的とする。【解決手段】配列番号１〜８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイから検体細胞の蛍光値と正常肺由来細胞の蛍光値を取得し、各スポットについて、蛍光値に関する４通りの評価を出力する。各スポットの上記評価結果と、予め用意された各病態の評価テーブルとを照合し、自動的に肺がんの診断結果を判定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたＤＮＡマイクロアレイの蛍光分析によってヒト肺がんの４病態を特定するヒト肺がん用分子診断システムであって、
前記ＤＮＡマイクロアレイの配列番号３、配列番号７、配列番号９、配列番号２９、配列番号１３、配列番号５０、配列番号５６、および配列番号７４で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載された８つのスポットについて、検体細胞の蛍光値である第１蛍光値と正常肺由来細胞の蛍光値である第２蛍光値とを取得する手段と、
前記８つのスポットのそれぞれについて取得された前記第１蛍光値および前記第２蛍光値の少なくともいずれか一方が閾値より大きいか否かを判断し、
前記第１蛍光値および前記第２蛍光値のいずれもが閾値以下の場合に、評価結果Ｗを出力し、
前記第１蛍光値および前記第２蛍光値の少なくともいずれか一方が閾値より大きい場合に、前記第１蛍光値と前記第２蛍光値の比（第１蛍光値／第２蛍光値）を算出して、前記比が３より大きい場合に評価結果Ｘを出力し、前記比が１／３より小さい場合に評価結果Ｙを出力し、前記比が１／３以上３以下の場合に評価結果Ｚを出力する、蛍光値評価手段とを含み、
前記８つのスポットのそれぞれについて、前記蛍光値評価手段によって出力された評価結果を予め記憶手段に記憶された参照テーブルと照合し、前記参照テーブルが示す評価と合致するスポットの数が所定数以上の場合に、前記検体細胞が腺がんであることを判定する判定手段と、
を含むヒト肺がん用分子診断システム。
【請求項２】
前記参照テーブルは、下記表に示す対応表を備える、請求項１に記載のヒト肺がん用分子診断システム。
【表１】
2008263957.tif 000013
【請求項３】
前記所定数が５である、請求項１に記載のヒト肺がん用分子診断システム。
【請求項４】
配列番号１〜８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたＤＮＡマイクロアレイの蛍光分析によってヒト肺がんの４病態を特定するヒト肺がん用分子診断システムであって、
前記ＤＮＡマイクロアレイの配列番号３６、配列番号５３、配列番号５６、配列番号６９、および配列番号７４で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載された５つのスポットについて、検体細胞の蛍光値である第１蛍光値と正常肺由来細胞の蛍光値である第２蛍光値とを取得する手段と、
前記５つのスポットのそれぞれについて取得された前記第１蛍光値および前記第２蛍光値の少なくともいずれか一方が閾値より大きいか否かを判断し、
前記第１蛍光値および前記第２蛍光値のいずれもが閾値以下の場合に評価結果Ｗを出力し、
前記第１蛍光値および前記第２蛍光値の少なくともいずれか一方が閾値より大きい場合に、前記第１蛍光値と前記第２蛍光値の比（第１蛍光値／第２蛍光値）を算出して、前記比が３より大きい場合に判定結果Ｘを出力し、前記比が１／３より小さい場合に評価結果Ｙを出力し、前記比が１／３以上３以下の場合に評価結果Ｚを出力する蛍光値評価手段とを含み、
前記５つのスポットのそれぞれについて、前記蛍光値評価手段によって出力された評価結果を予め記憶手段に記憶された参照テーブルと照合し、前記参照テーブルが示す評価と合致するスポットの数が所定数以上の場合に、前記検体細胞が扁平上皮がんであることを判定する判定手段と、
を含むヒト肺がん用分子診断システム。
【請求項５】
前記参照テーブルは、下記表に示す対応表を備える、請求項４に記載のヒト肺がん用分子診断システム。
【表２】
2008263957.tif 000014
【請求項６】
前記所定数が４である、請求項４に記載のヒト肺がん用分子診断システム。
【請求項７】
配列番号１〜８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたＤＮＡマイクロアレイの蛍光分析によってヒト肺がんの４病態を特定するヒト肺がん用分子診断システムであって、
前記ＤＮＡマイクロアレイの配列番号１９、配列番号３０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４６、配列番号５３、および配列番号５６で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載された７つのスポットについて、検体細胞の蛍光値である第１蛍光値と正常肺由来細胞の蛍光値である第２蛍光値とを取得する手段と、
前記７つのスポットのそれぞれについて取得された前記第１蛍光値および前記第２蛍光値の少なくともいずれか一方が閾値より大きいか否かを判断し、
前記第１蛍光値および前記第２蛍光値のいずれもが閾値以下の場合に評価結果Ｗを出力し、前記第１蛍光値および前記第２蛍光値の少なくともいずれか一方が閾値より大きい場合に、前記第１蛍光値と前記第２蛍光値の比（第１蛍光値／第２蛍光値）を算出して、前記比が３より大きい場合に評価結果Ｘを出力し、前記比が１／３より小さい場合に評価結果Ｙを出力し、前記比が１／３以上３以下の場合に評価結果Ｚを出力する蛍光値評価手段とを含み、
前記７つのスポットのそれぞれについて、前記蛍光値評価手段によって出力された評価結果を予め記憶手段に記憶された参照テーブルと照合し、前記参照テーブルが示す評価と合致するスポットの数が所定数以上の場合に、前記検体細胞が大細胞がんであることを判定する判定手段と、
を含むヒト肺がん用分子診断システム。
【請求項８】
前記参照テーブルは、下記表に示す対応表を備える、請求項７に記載のヒト肺がん用分子診断システム。
【表３】
2008263957.tif 000015
【請求項９】
前記所定数が６である、請求項７に記載のヒト肺がん用分子診断システム。
【請求項１０】
配列番号１〜８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたＤＮＡマイクロアレイの蛍光分析によってヒト肺がんの４病態を特定するヒト肺がん用分子診断システムであって、
前記ＤＮＡマイクロアレイの配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号７１、配列番号８０、および配列番号１７で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載された６つのスポットについて、検体細胞の蛍光値である第１蛍光値と正常肺由来細胞の蛍光値である第２蛍光値とを取得する手段と、
前記６つのスポットのそれぞれについて取得された前記第１蛍光値および前記第２蛍光値の少なくともいずれか一方が閾値より大きいか否かを判断し、
前記第１蛍光値および前記第２蛍光値のいずれもが閾値以下の場合に評価結果Ｗを出力し、前記第１蛍光値および前記第２蛍光値の少なくともいずれか一方が閾値より大きい場合に、前記第１蛍光値と前記第２蛍光値の比（第１蛍光値／第２蛍光値）を算出して、前記比が３より大きい場合に判定結果Ｘを出力し、前記比が１／３より小さい場合に評価結果Ｙを出力し、前記比が１／３以上３以下の場合に評価結果Ｚを出力する蛍光値評価手段とを含み、
前記６つのスポットのそれぞれについて、前記蛍光値評価手段によって出力された評価結果を予め記憶手段に記憶された参照テーブルと照合し、前記参照テーブルが示す評価と合致するスポットの数が所定数以上の場合に、前記検体細胞が小細胞がんであることを判定する判定手段と、
を含むヒト肺がん用分子診断システム。
【請求項１１】
前記参照テーブルは、下記表に示す対応表を備える、請求項１０に記載のヒト肺がん用分子診断システム。
【表４】
2008263957.tif 000016
【請求項１２】
前記所定数が４である、請求項１０に記載のヒト肺がん用分子診断システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイを用いる蛍光分析システムに関し、より詳細には、ヒト肺がんの４病態を自動的に識別してこれを特定することができるヒト肺がん用分子診断システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、肺がんは、その腫瘍細胞の大きさという病理形態学的診断基準から、小細胞がんまたは非小細胞がんの主な２つの型に分類され、非小細胞がんは、さらに、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がんに分類される。従来、肺がんの型を特定する診断においては、手術で摘出した臓器や組織を固定液などで固定して包埋し、適宜の大きさに切り出して作製した顕微鏡標本を病理医が細胞病理組織診断することによって行われていた。
【０００３】
しかしながら、このような細胞病理組織診断には一般に時間がかかり、またそれを正確に行うには経験を要することに加え、その判断に診断を行う病理医の主観が入るという問題があった。そこで、診断者を選ばず、且つ、精度の高い客観的な診断を実現すべく、ヒト肺がんの型の特定診断においてゲノム研究の成果を取り入れた分子診断法の適用が求められていた。ここで、がんの分子診断法とは、がん細胞で特異的に変化する遺伝子発現をマーカーとして、その分子マーカーの変化を定量的に計測することでがん細胞の存在を特定する方法をいう。がんの分子診断法を実現するシステムとして、たとえば、Affymetrix社から１６００遺伝子を搭載したがん関連のカスタム・ＤＮＡマイクロアレイと自動測定システムが提供されているが、この製品は、大集積のＤＮＡマイクロアレイであって非常に高価であり、また、肺がんに特化されたものではなかった。なお、非特許文献１〜７は、ヒト肺がん培養細胞における遺伝子発現解析に関する知見を開示する。
【非特許文献１】Bhattacharjee A et al ,Proc Natl Acad Sci [2001]98(24):13790-13795
【非特許文献２】Garber ME et al ,Proc Natl Acad Sci [2001]98(24):13784-13789
【非特許文献３】Beer DG et al ,Nat Med. [2002] 8(8):816-824、GiordanoTJ et al ,Am J Pathol. [2001] 159(4):1231-1238
【非特許文献４】Giordano TJ et al ,Am J Pathol. [2001]159(4):1231-1238
【非特許文献５】Nacht M et al ,Proc Natl Acad Sci [2001] 98(26):15203-15208
【非特許文献６】McDoniels-Silvers AL et al ,Clin Cancer Res. [2002]8(4):1127-1138
【非特許文献７】Virtanen C et al ,Proc Natl Acad Sci [2002] 99(19):12357-12362
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記従来技術における課題に鑑みてなされたものであり、本発明は、ヒト肺がんの４病態について共通して用いることができ、当該４病態を自動的に識別してこれを特定することができる、ヒト肺がん用分子診断システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ヒト肺がんの型の特定診断に対し分子診断法の適用を試みるうえで、ヒト肺がんの４病態について共通して用いることができ、当該４病態を自動的に識別してこれを特定することができるヒト肺がん用分子診断システムにつき鋭意検討した。その結果、精選された８０のマーカー遺伝子由来のＤＮＡプローブからなるセットであって、特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド群が搭載されたＤＮＡマイクロアレイの蛍光値を自動解析することよって、ヒト肺がんを特定することはもちろんのこと、その４病態を自動的に識別してこれを特定することができるヒト肺がん用分子診断システムを構築し、本発明に至ったのである。
【０００６】
すなわち、本発明によれば、配列番号１〜８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたＤＮＡマイクロアレイの蛍光分析によってヒト肺がんの４病態を特定するヒト肺がん用分子診断システムであって、前記ＤＮＡマイクロアレイの所定のスポット群について、検体細胞の蛍光値である第１蛍光値と正常肺由来細胞の蛍光値である第２蛍光値とを取得する手段と、前記所定のスポット群のそれぞれについて取得された前記第１蛍光値および前記第２蛍光値の少なくともいずれか一方が閾値より大きいか否かを判断し、前記第１蛍光値および前記第２蛍光値のいずれもが閾値以下の場合に、評価結果Ｗを出力し、前記第１蛍光値および前記第２蛍光値の少なくともいずれか一方が閾値より大きい場合に、前記第１蛍光値と前記第２蛍光値の比（第１蛍光値／第２蛍光値）を算出して、前記比が３より大きい場合に評価結果Ｘを出力し、前記比が１／３より小さい場合に評価結果Ｙを出力し、前記比が１／３以上３以下の場合に評価結果Ｚを出力する、蛍光値評価手段とを含み、前記所定のスポット群のそれぞれについて、前記蛍光値評価手段によって出力された評価結果を予め記憶手段に記憶された参照テーブルと照合し、該参照テーブルが示す評価と合致するスポットの数が所定数以上の場合に、前記検体細胞がヒト肺がんの４病態を判定する判定手段と、を含むヒト肺がん用分子診断システムが提供される。
【発明の効果】
【０００７】
上述したように、本発明によれば、ヒト肺がんの４病態について共通して用いることができ、当該４病態を自動的に識別してこれを特定することができる、ヒト肺がん用分子診断システムが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を実施の形態をもって説明するが、本発明は、以下に示す実施の形態に限定されるものではない。
【０００９】
本発明のヒト肺がん用分子診断システムについて説明するにあたり、まず、本発明のヒト肺がん用分子診断システムの特徴的構成であるＤＮＡマイクロアレイの構成について説明する。本発明者らは、ヒト肺がんの４病態を分類するためのＤＮＡプローブ・セットの設計に際し、ヒト肺がん培養細胞における遺伝子発現解析に関する先に挙げた論文７報（非特許文献１〜７）に掲載されたマーカー遺伝子について、ヒト肺がんの４病態に対する発現の特異性とその発現量などに鑑みて精査した結果、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、および小細胞がんのそれぞれについて２０ずつ、合計８０のマーカー遺伝子を抽出した。
【００１０】
次に、National Center for Biotechnology Information（NCBI）とEnsembl に登録されているＤＮＡデータベースを参照して、上述した８０のマーカー遺伝子のそれぞれについて、45
±2 merのオリゴヌクレオチド・シーケンスを抽出した。オリゴヌクレオチド・シーケンスの抽出は、（１）5′末端および3′末端が、ＧまたはＣであること、（２）ＧＣ含有率が４５〜６０％であること、（３）融解温度（Ｔｍ）が６３〜７４°であること、（４）Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）の各塩基が偏在しないこと、（５）NCBIの検索ソフトウェアであるBLASTを用いた検索で、他の遺伝子において部分配列として含まれていないこと、の５つの条件を満たすものについてこれを選択して行った。
【００１１】
下記表５〜８に、上述した手順で抽出した、本発明のヒト肺がん用分子診断システムに用いられるＤＮＡマイクロアレイに搭載するＤＮＡプローブ・セットである、８０のオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。表５には、腺がんのマーカー遺伝子由来の一群を、表６には、扁平上皮がんのマーカー遺伝子由来の一群を、表７には、大細胞がんのマーカー遺伝子由来の一群を、表８には、小細胞がんのマーカー遺伝子由来の一群をそれぞれ示す。なお、表５〜８には、ＤＮＡプローブの塩基配列とともに、由来マーカー遺伝子のAccession No.（GenBank）およびSymbol、ならびに、その塩基数、ＧＣ含有率（％）、および融解温度（Ｔｍ）を併せて示す。
【００１２】
【表５】
2008263957.tif 000002
【００１３】
【表６】
2008263957.tif 000003
【００１４】
【表７】
2008263957.tif 000004
【００１５】
【表８】
2008263957.tif 000005
【００１６】
本発明のヒト肺がん用分子診断システムは、上述した、わずか８０のＤＮＡプローブを用いた遺伝子発現解析結果から、ヒト肺がんの４病態を絞り込むための情報を必要十分に抽出し、ヒト肺がんの４病態を正確に特定することを特徴とするものであり、上記ＤＮＡプローブ・セットを構成する特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド群の構成は、本発明者らによって初めて開示されるものである。以上、本発明のヒト肺がん用分子診断システムに用いられるＤＮＡマイクロアレイに搭載するＤＮＡプローブ・セットについて説明してきたが、次に、本発明のヒト肺がん用分子診断システムについて、以下説明する。
【００１７】
図１は、本実施形態のヒト肺がん用分子診断システム１０(以下、分子診断システム１０として参照する）。分子診断システム１０は、ＤＮＡマイクロアレイ１２に励起光を照射するための励起光照射系１４と、ＤＮＡマイクロアレイ１２に搭載されたＤＮＡプローブのスポットから発せられる蛍光を受光して光電変換し、電気信号として出力するための蛍光検出系１６と、励起光照射系１４および蛍光検出系１６を制御してＤＮＡマイクロアレイ１２の蛍光分析を行なうとともに、その分析結果からヒト肺がんの４病態を特定するための情報処理を行なうコンピュータ１８（ＰＣ１８）を含んで構成されている。
【００１８】
ＤＮＡマイクロアレイ１２には、上述したように、表５〜８に示される配列番号１〜８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプローブ・セットが搭載されている。ヒト肺がんの診断にあたっては、診断対象である検体細胞および正常肺由来細胞のそれぞれから抽出されたｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、これらを蛍光標識したものをＤＮＡマイクロアレイ１２上でハイブリダイゼーションさせたものを調製し、これに対し励起光照射系１４によって励起光を走査する。その結果、各プローブからの蛍光が蛍光検出系１６によって検出・光電変換され、蛍光強度に対応した電気信号がＰＣ１８に出力される。
【００１９】
本実施形態におけるＤＮＡマイクロアレイ１２は、搭載されるＤＮＡプローブ・セットのプローブ数が８０に精選されているため、その他コントロールを含めても、そのスポットエリアを２×２ｍｍ〜４×４ｍｍ程度に設計することができる。その結果、励起光照射系１４あるいは蛍光検出系１６の光学系を小型化することができ、また、解析対象であるスポット数が従来のものに比べて格段に少ないため、その解析時間を大幅に短縮することができる。
【００２０】
さらに、分子診断システム１０は、100〜100,000(３桁）の範囲の蛍光強度を示すスポットの蛍光値からヒト肺がんの４病態を識別する解析アルゴリズムを採用するため、蛍光スキャナーとして、蛍光強度の直線的測定レンジが100〜100,000(３桁）の範囲の比較的廉価なスキャナーを採用することができ、その結果、分子診断システム１０を低いコストで構築することができる。以上、本実施形態の分子診断システム１０の物理的構成について説明してきたが、以下、実施形態の分子診断システム１０における、ヒト肺がんの４病態を特定するための情報処理について、図２〜４を参照して説明する。
【００２１】
図２は、図１に示したＰＣ１８の機能ブロック図を示す。ＰＣ１８は、励起光照射系１４および蛍光検出系１６の制御処理を行なうが、これについては、従来の蛍光分析装置と同様であるので説明を省略するものとし、ここでは、ＰＣ１８におけるヒト肺がんの４病態を特定するための情報処理について説明する。
【００２２】
ＰＣ１８は、システム・コントローラとして機能するＣＰＵと、アプリケーション・ソフトウェアの実行空間を与えるためのＲＡＭと、ハードディスクなどの記憶手段とを含んで構成されており、記憶手段には、ヒト肺がんの４病態に関する参照テーブルが記憶されている。ＰＣ１８は、ＭａｃＯＳ（商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＵＮＩＸ（登録商標）、ＬＩＮＵＸ（登録商標）またはそれ以外の適切なオペレーティング・システム（ＯＳ）上で動作する、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｖｉｓｕａｌ  Ｃ＋＋、ＶｉｓｕａｌＢａｓｉｃ、Ｊａｖａ（登録商標）などのオブジェクト指向のプログラミング言語により記述されたアプリケーション・プログラムを格納し、実行することによって、図２に示す、蛍光値取得部２０、蛍光値評価部２２、およびヒト肺がん判定部２４という機能手段が実現される。
【００２３】
蛍光値取得部２０には、蛍光検出系１６から、ＤＮＡマイクロアレイ１２上のスポットが発する蛍光に対応する電気信号が入力され、蛍光値取得部２０は、該入力信号を解析処理することによって、検体細胞および正常肺由来細胞のそれぞれについて、各スポットの蛍光値を取得する。次に、蛍光値評価部２２は、蛍光値取得部２０によって取得された検体細胞の蛍光値と正常肺由来細胞の蛍光値から、各スポットについて、蛍光値に関する４通りの評価を出力する。ヒト肺がん判定部２４は、蛍光値評価部２２が出力した各スポットの評価結果と、予めＰＣ１８の記憶手段に用意された各病態の評価テーブルとを照合し、肺がんの診断結果を判定する。以下、本実施形態におけるヒト肺がんの４病態を識別するための解析アルゴリズムについて、図３および図４に示すフローチャートを参照して、さらに具体的に説明する。
【００２４】
図３は、本実施形態の分子診断システム１０における、蛍光値取得処理および蛍光値評価処理のフローチャートを示す。まず、ステップ１００において、配列番号１〜８０のＤＮＡプローブが搭載されたＤＮＡマイクロアレイ１２が、検体細胞および正常肺由来細胞のそれぞれについて調製され、分子診断システム１０にセットされる。次に、ステップ１０２において、蛍光値取得部２０によって、スポットごとに検体細胞の蛍光値（第１の蛍光値）および正常肺由来細胞の蛍光値（第２の蛍光値）が取得される。その後、各スポットについて取得された第１および第２の蛍光値を用いて、蛍光値評価部２２がステップ１０４〜ステップ１１８に示す蛍光値評価処理を行なう。
【００２５】
まず、ステップ１０４においては、各スポットの第１の蛍光値および第２の蛍光値の少なくとも一方が「１００」より大きいか否かが判断され、第１の蛍光値および第２の蛍光値のいずれもが１００以下の場合（N）には、ステップ１０６に進んで評価結果Ｗを出力する。一方、ステップ１０４において、第１の蛍光値および第２の蛍光値の少なくとも一方が「１００」より大きい場合（Y）には、ステップ１０８に進み、第１の蛍光値と第２の蛍光値の比（第１の蛍光値／第２の蛍光値）を算出する。本実施形態においては、蛍光光度計で出力１０００Ｖのフォトマルを９８％出力で使用した時の蛍光値１００を閾値として用いたが、本発明は、閾値をこれに限定するものではなく、適宜設定することができる。
次に、ステップ１１０において、算出された第１の蛍光値と第２の蛍光値の比（以下、Ratioとして参照する）が３より大きいか否かが判断され、Ratioが３より大きい場合（Y）には、ステップ１１２に進んで評価結果Ｘが出力され、Ratioが３以下の場合（N）には、ステップ１１４に進む。ステップ１１４では、Ratioが１／３より小さい否かが判断され、Ratioが１／３より小さい場合（Y）には、ステップ１１６に進んで評価結果Ｙが出力され、Ratioが１／３以上の場合（N）には、ステップ１１８に進んで評価結果Ｚが出力される。
【００２６】
その後、ステップ１２０において、蛍光値を取得した全てのスポットについての評価結果が出力されたか否かについて判断され、全てのスポットについての評価結果が出力された場合（Y）には、ステップ２００に示す、ヒト肺がん判定部２４による判定処理２００に移行し、そうでない場合（N）には、ステップ１０４〜ステップ１１８の蛍光値評価処理を戻る。
【００２７】
図４は、本実施形態の分子診断システム１０における、ヒト肺がんの４病態を判定するための判定処理２００のフローチャートを示す。まず、ステップ２０２において、ヒト肺がん判定部２４は、蛍光値評価部２２が出力した、配列番号３、７、９、２９、１３、５０、５６、７４で表される塩基配列のＤＮＡプローブが搭載された各スポットについての評価結果と、下記表９に示す「腺がんの評価テーブル」とを照合し、両者が合致するスポットの数を導出する。
【００２８】
【表９】
2008263957.tif 000006
【００２９】
次に、ステップ２０４において、両者が合致するスポットの数が閾値Ｔ１以上であるか否かが判断され、閾値Ｔ１以上である場合（Y）は、ステップ２０６に進んで検体細胞を「腺がん」と判定し、そうでない場合（N）には、ステップ２０８に進む。
【００３０】
ステップ２０８において、ヒト肺がん判定部２４は、蛍光値評価部２２が出力した、配列番号３６、５３、５６、６９、７４で表される塩基配列のＤＮＡプローブが搭載された各スポットについての評価結果と、下記表１０に示す「扁平上皮がんの評価テーブル」とを照合し、両者が合致するスポットの数を導出する。
【００３１】
【表１０】
2008263957.tif 000007
【００３２】
次に、ステップ２１０において、両者が合致するスポットの数が閾値Ｔ２以上であるか否かが判断され、閾値Ｔ２以上である場合（Y）は、ステップ２１２に進んで検体細胞を「扁平上皮がん」と判定し、そうでない場合（N）には、ステップ２１４に進む。
【００３３】
ステップ２１４において、ヒト肺がん判定部２４は、蛍光値評価部２２が出力した、配列番号１９、３０、４１、４２、４６、５３、５６で表される塩基配列のＤＮＡプローブが搭載された各スポットについての評価結果と、下記表１１に示す「大細胞がんの評価テーブル」とを照合し、両者が合致するスポットの数を導出する。
【００３４】
【表１１】
2008263957.tif 000008
【００３５】
次に、ステップ２１６において、両者が合致するスポットの数が閾値Ｔ３以上であるか否かが判断され、閾値Ｔ３以上である場合（Y）は、ステップ２１８に進んで検体細胞を「大細胞がん」と判定し、そうでない場合（N）には、ステップ２２０に進む。
【００３６】
ステップ２２０において、ヒト肺がん判定部２４は、蛍光値評価部２２が出力した、配列番号６４、６６、６７、７１、８０、１７で表される塩基配列のＤＮＡプローブが搭載された各スポットについての評価結果と、下記表１２に示す「小細胞がんの評価テーブル」とを照合し、両者が合致するスポットの数を導出する。
【００３７】
【表１２】
2008263957.tif 000009
【００３８】
次に、ステップ２２２において、両者が合致するスポットの数が閾値Ｔ４以上であるか否かが判断され、閾値Ｔ４以上である場合（Y）は、ステップ２２４に進み、検体細胞を「小細胞がん」と判定し、そうでない場合（N）には、ステップ２２６に進んで、検体細胞がヒト肺がんのいずれの病態にも該当しないことを判定した後、ステップ２２８に進んで判定処理２００を終了する。
【００３９】
なお、上述した閾値Ｔ１〜Ｔ４は、その診断に求められる精度に鑑みて適宜設定しうることはいうまでもない。本実施形態においては、Ｔ１を「５」に、Ｔ２を「４」に、Ｔ３を「６」に、Ｔ４を「４」にそれぞれ設定することができる。
【００４０】
以上、本実施形態の分子診断システム１０のヒト肺がんの４病態を識別するための解析アルゴリズムについて説明してきたが、本発明のヒト肺がん用分子診断システムにおける解析アルゴリズムは、上述したフローチャートに限定されるものではなく、その実装において種々の設計変更が可能であろう。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明のヒト肺がん用分子診断システムについて、実施例を用いてより具体的に説明を行なうが、本発明は、後述する実施例に限定されるものではない。
【００４２】
（ＤＮＡマイクロアレイの作製）
上述した手順に従って決定した塩基配列を有する45 ±2 mer のオリゴヌクレオチドを、Invitrogen社（Invitrogen Japan KK.,Tokyo,Japan)から入手した。上記表５〜８に示す末端未修飾の８０のオリゴヌクレオチドを、３×３ｍｍ基板に対してスポッティングすることによって独自のＤＮＡマイクロアレイを作製した。なお、本実施例におけるＤＮＡマイクロアレイには、上記表５〜８に示す８０のオリゴヌクレオチドの他に、正常細胞のマーカーとしてhouse-keeping遺伝子由来のＤＮＡプローブである２０種のオリゴヌクレオチドと、陰性対照として植物遺伝子由来のＤＮＡプローブである３種のオリゴヌクレオチドを加え、合計１０３のスポットを搭載した。下記表１３に、house-keeping遺伝子由来の２０種のオリゴヌクレオチドの塩基配列を、下記表１４に、植物遺伝子由来の３種のオリゴヌクレオチドの塩基配列をそれぞれ示す。
【００４３】
【表１３】
2008263957.tif 000010
【００４４】
【表１４】
2008263957.tif 000011
【００４５】
（ヒト肺がん培養細胞系への適用）
上述した手順で作製したＤＮＡマイクロアレイをヒト肺がん培養細胞系へ適用し遺伝子発現量の測定を行った。本実施例においては、ヒト肺がんの４種の病態のそれぞれに対し２種類のヒト肺がん由来培養細胞を用い、対照群として正常肺由来培養細胞を用いた。下記表１５に、各病態と用いた培養細胞株の対応関係をまとめて示す。
【００４６】
【表１５】
2008263957.tif 000012
【００４７】
表１５に示した細胞株を培養してtotal RNAを抽出し、当該total RNAから逆転写酵素によってcDNAを調製した。肺がん細胞群はAlexa555で、対照群はAlexa647でそれぞれ蛍光標識した。ほぼ等量の蛍光標識DNAを本実施例のＤＮＡマイクロアレイへ競合ハイブリダイズさせて、スキャナーで測定して蛍光強度を解析した。なお、測定した蛍光強度は、SLC16A4(配列番号8)の蛍光強度で補正して蛍光値データを得た。本実施例においては、上述した測定を各々の培養細胞について最低３回以上行い、その平均値を蛍光値データとした。得られた蛍光値データについて、（１）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が３以上、（２）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が１／３以下、（３）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が１／３以上３以下、（４）肺がん細胞および正常細胞の蛍光値がいずれも１００以下である、という４段階で評価し、各病態の培養細胞２株に対して共通した評価を得たスポットを抽出した。
【００４８】
図５は、腺がんの培養細胞２株に対して共通した結果を得たスポットに搭載されたオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子（Symbol）とともにまとめて示す。以下同様に、扁平上皮がんについては図６に、大細胞がんについては図７に、小細胞がんについては図８にそれぞれ示す。なお、図５〜８においては、対比のために他の病態の培養細胞２株についての結果を紙面右側に併せて示す。
【００４９】
図５に示されるように、本実施例のＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイにおいて、配列番号３（BENE）、配列番号７（DUSP4）、配列番号９（S100P）、配列番号２９（CSTA）、配列番号１３（PLAU）、配列番号５０（IGSF3）、配列番号５６（CDH1）、配列番号７４（INADL）で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された８つのスポットのそれぞれが、腺がんの培養細胞２株（A549,ABC-1）について同じ結果を示す一方、上記８つのスポットは、他の３病態の培養細胞株群については、一貫性のない結果を示すことがわかった。ここで同じ結果を示すとは、各病態の２つの培養細胞のいずれもが、（１）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が３より大きい、（２）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が１／３より小さい、（３）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が１／３以上３以下である、（４）肺がん細胞および正常細胞の蛍光値がいずれも１００以下である、のいずれか１つの結果を示すことをいう（以下、図６〜８についても同様）。
【００５０】
同じく、図６に示されるように、配列番号３６（RAB38）、配列番号５３（RAB25）、配列番号５６（CDH1）、配列番号６９（BEX1）、配列番号７４（INADL）で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された５つのスポットのそれぞれが、扁平上皮がんの培養細胞２株（EBC-1,
LK-2）ついて同じ結果を示す一方、上記５つのスポットは、他の３病態の培養細胞株群については、一貫性のない結果を示すことがわかった。
【００５１】
同じく、図７に示されるように、配列番号１９（SLCO4A1）、配列番号３０（S100A2）、配列番号４１（HMGA1）、配列番号４２（FOSL1）、配列番号４６（AMY2A）、配列番号５３（RAB25）、配列番号５６（CDH1）で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された７つのスポットのそれぞれが、大細胞がんの培養細胞２株（LU65,
LU99）ついて同じ結果を示す一方、他の３病態の培養細胞株については、一貫性のない結果を示すことがわかった。
【００５２】
また、図８に示されるように、配列番号６４（APLP1）、配列番号６６（ISL1）、配列番号６７（FOXG1B）、配列番号７１（INA）、配列番号８０（STMN1）、配列番号１７（TGM2）で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された６つスポットのそれぞれは、図５〜７について上述したように、小細胞がんの培養細胞２株（RERF-LC-MA,
STC-1）ついて同じ結果を示すものではないが、上記６つのスポットは、他の３病態の培養細胞株については、３以上のRatio（肺がん細胞/正常細胞)を一切示さないため、小細胞がんの結果と他の病態の結果は容易に判別しうることが示された。以上、説明してきた本実施例によって、本発明のヒト肺がん用分子診断システムにおける配列番号１〜８０で表されるＤＮＡ配列からなるＤＮＡプローブが搭載されたＤＮＡマイクロアレイを用いた蛍光分析によって、ヒト肺がんの４病態を絞り込むために必要十分な情報が導出されることが示された。
【００５３】
上述したＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイに対して、蛍光標識したサンプルを競合ハイブリダイズさせ、その蛍光データを元に解析する際、図５〜８にそれぞれ示した配列番号に表されるＤＮＡプローブが搭載されたスポットに着目することによって４病態を識別しうることは容易に理解されるところである。すなわち、図５〜８に示した配列番号のＤＮＡプローブが搭載されたスポットについて、肺がん細胞と正常細胞の蛍光値に関する評価結果（（１）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が３より大きい、（２）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が１／３より小さい、（３）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が１／３以上３以下である、（４）肺がん細胞および正常細胞の蛍光値がいずれも１００以下である）と、図５〜８に表示した結果を予め記録した参照テーブルとを照合し、その合致率を割り出すことによって４病態を絞り込むことが可能となる。例えば、図５に示した配列番号３（BENE）、配列番号７（DUSP4）、配列番号９（S100P）、配列番号２９（CSTA）、配列番号１３（PLAU）、配列番号５０（IGSF3）、配列番号５６（CDH1）、配列番号７４（INADL）の８つのオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの結果に着目し、その内の５つ以上のスポットで図５に表示された結果と同じの結果を得た場合、すなわち５／８の合致率を得た場合に、当該サンプルを「腺がん」と判定することは十分な妥当性をもつ。なお、上述した合致率は、その診断に求められる精度に鑑みて適宜設定しうることはいうまでもない。
【００５４】
（本発明のヒト肺がん用分子診断システムの測定レンジの検証）
図９は、上述したＤＮＡプローブ・セットを搭載して独自に作製したＤＮＡマイクロアレイの、ヒト肺腺がん培養細胞とヒト正常培養細胞によるscattering pattern を示す。図９において「×」はプローブが搭載された各スポットを示し、線分ａはRatio（肺がん細胞/正常細胞)が「１」を示している。また、線分ｂと線分ｃの２本の線によって画定される範囲は、Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が「0.5< <2.0」であり、両細胞において有意な差異が認められない範囲を示している。一方、線分ｂの上側にある「×」はヒト肺腺がんで2.0倍以上に発現が増加している遺伝子を示しており、線分ｃの下側にある「×」はヒト肺腺がんで0.5倍以下に発現が減少している遺伝子を示している。
【００５５】
図９に示されるように、「×」で示される各スポットは、蛍光強度101〜105の範囲にほぼ納まっている。一方、蛍光強度101〜102の範囲は、すでに説明したように、本発明の解析方法においては「蛍光値が低い」と評価される範囲であって、その定量化を必要としない。すなわち、本発明の解析方法においては、蛍光強度101〜102の範囲に定量性は要求されず、蛍光強度102〜105の範囲についてのみ定量性をもって測定できれば必要十分なのであり、図９は、蛍光強度102〜105の３桁の範囲についてのみ直線的測定レンジを備える測定装置であっても妥当性をもった診断結果が得られることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
以上、説明したように、本発明によれば、ヒト肺がんの４病態について共通して用いることができ、当該４病態を自動的に識別してこれを特定することができる、ヒト肺がん用分子診断システムが提供される。本発明は、安価で高性能なヒト肺がんの分子診断システムの構築を実現し、臨床医療の分野への貢献が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本実施形態のヒト肺がん用分子診断システムを示す図。
【図２】本実施形態のヒト肺がん用分子診断システムの機能ブロック図。
【図３】本実施形態のヒト肺がん用分子診断システムにおける、蛍光値取得処理および蛍光値評価処理のフローチャート。
【図４】本実施形態のヒト肺がん用分子診断システムにおける、ヒト肺がんの４病態を判定するための判定処理フローチャート。
【図５】腺がんの培養細胞２株に対して共通した結果を得たスポットに搭載されたオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子とともに示した図。
【図６】扁平上皮がんの培養細胞２株に対して共通した結果を得たスポットに搭載されたオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子とともに示した図。
【図７】大細胞がんの培養細胞２株に対して共通した結果を得たスポットに搭載されたオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子とともに示した図。
【図８】小細胞がんの培養細胞２株に対して共通した結果を得たスポットに搭載されたオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子とともに示した図。
【図９】本実施例のヒト肺がん用分子診断システムにおける、ヒト肺腺がん培養細胞とヒト正常培養細胞によるscattering pattern を示す図。
【符号の説明】
【００５８】
１０…ヒト肺がん用分子診断システム、１２…ＤＮＡマイクロアレイ、１４…励起光照射系、１６…蛍光検出系、１８…コンピュータ、２０…蛍光値取得部、２２…蛍光値評価部、２４…ヒト肺がん判定部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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