(57)【要約】【課題】イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーター（以下、「イオンチャネル等」という）の調節剤を同定する新規なタリウム感受性アッセイを提供する。【解決手段】以下の工程：(ａ)イオンチャネル等を発現する細胞を信号発生タリウム感受性試薬と接触させ；(ｂ)該細胞をイオンチャネル等の調節剤候補と接触させ；(ｃ)タリウム塩溶液を含有するアッセイ緩衝液と該細胞を接触させ；および(ｄ)信号発生タリウム感受性試薬により生じた信号を検出および測定し、イオンチャネル等の調節剤候補の、該イオンチャネル等の活性に対する効果を決定する；からなる、細胞内に発現されたイオンチャネル等の活性を検出及び測定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程からなる、細胞内に発現されたイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性を検出及び測定する方法：
(ａ)イオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを発現する細胞を、信号発生タリウム感受性試薬と接触させ；
(ｂ)該細胞をイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤候補と接触させ；
(ｃ)タリウム塩溶液を含有するアッセイ緩衝液と該細胞を接触させ；および
(ｄ)信号発生タリウム感受性試薬により生じた信号を検出および測定し、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤候補の、該イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性に対する効果を決定する。
【請求項２】
該イオンチャネルがタリウムイオンに透過性であるカチオンチャネルからなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該カチオンチャネルが、カリウムイオンチャネル、ナトリウムイオンチャネルおよびカルシウムイオンチャネルからなる群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該カチオンチャネルがカリウムイオンチャネルである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
該カリウムイオンチャネルがカルシウム賦活電位依存性チャネルである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
該カリウムイオンチャネルがＳＫチャネル、Ｍａｘｉ−Ｋ、ＨＥＲＧおよびＫＣＮＱチャネルからなる群から選択される、請求項４記載の方法。
【請求項７】
該カチオンチャネルがリガンド依存性ＶＲ１チャネルである、請求項２記載の方法。
【請求項８】
該カチオンチャネルが非選択的イオンチャネルである、請求項２記載の方法。
【請求項９】
該非選択的イオンチャネルが、アセチルコリン受容体、ＡＭＰＡ、カイニン酸およびＮＭＤＡ受容体などのグルタミン酸受容体、５−ヒドロキシトリプタミン依存性受容体チャネル、ＡＴＰ依存性(Ｐ２Ｘ)受容体チャネル、ニコチン酸アセチルコリン依存性受容体チャネル、バニロイド受容体、リアノジン受容体チャネル、ＩＰ３受容体チャネル、細胞内ｃＡＭＰにより原位置(in situ)活性化されたカチオンチャネル、および細胞内ｃＧＭＰで原位置(in situ)活性化されたカチオンチャネルからなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該タリウム塩溶液が水溶性タリウム塩からなる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
該タリウム塩が、Ｔｌ２ＳＯ４、Ｔｌ２ＣＯ３、ＴｌＣｌ、ＴｌＯＨ、ＴｌＮＯ３およびＴｌＯＡｃからなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該タリウム塩がＴｌ２ＳＯ４である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該アッセイ緩衝液がＣｌ−−フリーである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
該アッセイ緩衝液がグルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸マグネシウム、ＨＥＰＥＳおよびグルコースをさらに含有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該細胞を、Ｃｌ−を２ｍＭ以下の濃度で含有する低Ｃｌ−細胞培養培地で培養することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
低Ｃｌ−細胞培養培地がグルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣ０３、グルコン酸カルシウム、ＮａＨ２ＰＯ４、ＨＥＰＥＳ、グルコース、１００Ｘビタミン、５０Ｘアミノ酸およびグルタミンを含有する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該タリウム感受性試薬がタリウム感受性蛍光試薬またはタリウム感受性非蛍光試薬である、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
該タリウム感受性蛍光試薬が、ＡＮＴＳ、Ｆｌｕｏ−４、Ｆｌｕｏ−３、ＰＢＦＩ、フェン・グリーン、マグネシウム・グリーン、ＡＰＴＲＡ−ＢＴＣ、Ｆｌｕｏ−４ＦＦ、ＦｌｕｏＺｉｎ−１、ＦｌｕｏＺｉｎ−２、Ｍａｇ−ＦｕｒａレッドおよびＢＴＣからなる群から選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
該タリウム感受性試薬がタリウム感受性非蛍光試薬である、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
該タリウム感受性非蛍光試薬が塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該イオンチャネル連結型受容体がＧＰＣＲ、代謝調節型グルタミン酸受容体、ムスカリン様アセチルコリン受容体、ドパミン受容体およびセロトニン受容体からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
該イオントランスポーターがドパミンイオントランスポーター、グルタミン酸イオントランスポーター、セロトニンイオントランスポーター、ナトリウム−カリウム ＡＴＰase、プロトン−カリウム ＡＴＰase、ナトリウム／カルシウムイオン交換体、およびカリウム−塩素イオン共トランスポーターからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
細胞を信号発生タリウム感受性蛍光試薬と接触させる工程後、該細胞をさらに細胞外蛍光消光化合物と接触させることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
該調節化合物候補が、該イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを活性化または阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
タリウム塩溶液に刺激剤溶液をさらに加えることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
刺激剤溶液がイオノフォア、ＫＣｌ、ニコチン、アセチルコリン、ムスカリンおよびカルバミルコリンからなる群から選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
以下の工程からなる、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤を同定する方法：
(ａ)イオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを発現する細胞を信号発生タリウム感受性試薬と接触させ；
(ｂ)該細胞を調節剤候補と接触させ；
(ｃ)タリウム塩溶液を含有するアッセイ緩衝液と細胞を接触させ；および
(ｄ)該イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性に対する調節剤の効果を示す、信号発生タリウム感受性試薬により発生した信号を検出、測定する。
【請求項２８】
工程(ｂ)の後、信号発生タリウム感受性試薬により発生した信号を測定する工程をさらに包含することを特徴とする、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
該調節剤が、該イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを活性化または阻害する、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
タリウム感受性アッセイに用いる新規なＣｌ−−フリーアッセイ緩衝液。
【請求項３１】
該アッセイ緩衝液がグルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸マグネシウム、ＨＥＰＥＳおよび グルコースをさらに含有することを特徴とする、請求項２９の組成物。
【請求項３２】
Ｃｌ−イオン濃度が２ｍＭ以下である、低Ｃｌ−細胞培養培地。
【請求項３３】
低Ｃｌ−細胞培養培地がグルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３、グルコン酸カルシウム、ＮａＨ２ＰＯ４、ＨＥＰＥＳ、グルコース、１００Ｘビタミン、５０Ｘアミノ酸およびグルタミンを含有する、請求項３１記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タリウム(Ｉ)(Ｔｌ＋)感受性蛍光アッセイを用いて、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオンチャネルは、細胞膜を越えるイオン輸送を介在する膜貫通型タンパク質である。これらのチャネルは殆どの細胞型にあり、細胞の興奮性と恒常性の調節に重要である。イオンチャネルは、多くの細胞過程、例えば活動電位、シナプス伝達、ホルモン分泌、筋収縮等に関与している。生体細胞における多くの重要な生物学的過程はカルシウム(Ｃａ２＋)、カリウム(Ｋ＋)およびナトリウム(Ｎａ＋)イオンなどのカチオンの、イオンチャネルを介する転座を包含する。カチオンチャネルは、重要な薬剤標的として認められるイオンチャネルの大きく多様なファミリーを意味する。
【０００３】
多様な命名法がイオンチャネルに用いられている。イオンチャネルは、リガンド依存性または電位依存性、選択的または非選択的イオンチャネルとして定義される(ノース、R. A., 1995, Ligand and Voltage-Gated Ion Channels、ＣＲＣプレス・インク；ボーカラートン、フロリダ州、1-58)。例えば、古典的な電位依存性カリウムチャネル、ナトリウムチャネル、およびカルシウムイオンチャネルは、生理学的条件下においてそれらの個々のイオンに対して強い選択性または優先性を発揮するために、一般的には選択的イオンチャネルであると考えられている。しかしながら、選択性は絶対ではなく、例えばナトリウムチャネルはリチウム等の他のイオンを通すことができる。反対に、非選択的カチオンチャネルは、僅かなあるいは全く優先性を示さずに多くのカチオンを輸送する。例えば、アルファ−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロプリオネート(ＡＭＰＡ)型グルタミン酸受容体イオンチャネルは、リガンド依存性非選択的イオンチャネルであり、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、およびカルシウムイオン等のイオンを容易に貫通させる。リガンド依存性イオンチャネルは、イオンチャネルにリガンドを結合させることにより調節される。リガンド依存性イオンチャネルの例としては、グルタミン酸、ニコチン酸アセチルコリン受容体、ＡＭＰＡ、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸(ＮＭＤＡ)およびバニロイド受容体が挙げられる。
【０００４】
電位依存性イオンチャネルは、チャネルを開閉して細胞膜電位変化に応答し、よってイオン輸送を介在する。これらのチャネルは興奮性(例えば、神経細胞、筋肉)および非興奮性(例えば、外分泌腺／内分泌線分泌、および血液)細胞中に存在し、細胞性信号伝達および相互作用に重要な役割を果たし(コンリー、 E. C.; ブラマ−、W. J.、The Ion Channel FactsBook IV：Voltage-Gated Channels, 1999, アカデミック・プレス、ロンドン、英国)、それ故創薬の重要な標的である。これらのイオンチャネルは好適な薬剤標的の多くの特徴的特質を持ち、例えば、(１)これらは既知の生物学的機能を持ち；(２)それらはインビボで小分子量化合物により修飾され、また接近し易く；および(３)それらはインビトロでの特性決定とハイスループットスクリーニングのためのアッセイシステムを持っている(クラン、M；Current Opin. Biotech., 1998, 9, 565-572)。
【０００５】
カリウム(Ｋ＋)チャネルはカチオンチャネルの大きな、多様な遺伝子ファミリーによりコードされ、その開閉特性を基にして電位依存性およびリガンド依存性サブタイプに分けられる。これらのチャネルは、殆どすべての細胞型、組織および器官で調節機能を兼ね備えた高分子(macromelecule)に結合した膜である(ノース, R. A.、1995, Ligand and Voltage-Gated Ion Channels, ＣＲＣプレス・インク, ボーカラトーン、フロリダ州、1-58)。Ｋ＋チャネルは電気的興奮性細胞(例えば、神経や筋肉)および非興奮性細胞(例えば、リンパ球)の膜電位、情報伝達、インスリン分泌、ホルモン放出、および血管トーン(vascular tone)、細胞内容量および免疫応答を調節する(ヒル, B., Ionic channels of Excitable Membranes, 1992, Ed. 2,サンダーランド、マサチューセッツ州; Sinauer)。近年、Ｋ＋チャネルは重要な生理学的過程において同定され、心血管病、血圧／血管抵抗、癲癇、鎌形赤血球貧血、骨格筋疾患、島細胞代謝、免疫抑制、炎症、および癌を含むヒト疾病に伴うことが発見された(バルマン、D. E., Hum. Mol. Genet.1997, 6, 1679-1685；アッカーマン M. J.; オラファム、D. E., N. Engl.J. Med. 1997, 336, 1575-1586；クラン、M., 同上)。
【０００６】
電位依存性Ｋ＋チャネルは膜電位の変化を検出し、Ｋ＋イオンを輸送することにより応答する。リガンド依存性Ｋ＋チャネルは小分子量作働体(effector)、例えばカルシウム、ナトリウム、ＡＴＰ、または脂肪酸などにより調節される(ラズダンスキ、Cardiovascular Drugs and Therapy, 1992, 6, 313-319)。電位依存性およびリガンド依存性Ｋ＋チャネルの両者がカリウムイオンを輸送するけれども、それらは生理学的、生化学的および薬理学的性質において異なる。カリウムイオンチャネルを分類するにあたり、ドウプニクらはＫ＋チャネルタンパク質の内向き整流(inward rectifying)ファミリーの体系的命名法を提唱している(ドウプニクら、Curr. Opin. Neuro. 1995, 8, 268-277)。このファミリーは、その三次構造と、一価のカチオン電位依存性チャネルとホモロガス(homologous)なポア(pore)領域が特徴的である。
【０００７】
Ｋｉｒ−３チャネルは、Ｇタンパク質で調節されるＫ＋電位依存性チャネルファミリーのサブファミリーである(ドウプニクら、同上)。Ｇタンパク質介在情報伝達経路はイオンチャネル、つまりイオンチャネル連結型受容体に直接結合していると示唆されている。Ｇタンパク質調節Ｋ＋チャネル、例えばＧタンパク質賦活内向き整流Ｋ＋チャネル(ＧＩＲＫ)は心臓および神経機能の調節に重要であると示されている(クラチら、Prog. Neurobiol., 39, 229-246; グロウンおよびバーンバウマー, Ann. Rev. Physiol. 1990, 52, 297-213; マーク, M. D. およびヘルリッズ, S., Eur. J. Biochem., 2000, 267, 5830-5836; リーニー, J. L.およびティンカー, A.; Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 5651-5656)。
【０００８】
ニューロン受容体の心房性Ｋ＋チャネルへの結合はカルチンらにより示された(カルチンら、 Proc. Nat. Acad. Sci., 1991, 88, 5694-5698)。これらのイオンチャネルの活性、特に、タンパク質のＧタンパク質結合受容体(ＧＰＣＲ)ファミリーに連結したイオンチャネルの活性をモニターすることにより、ＧＰＣＲの活性に及ぼす潜在的な調節化合物の効果を観察する、間接的方法が提供される。よって、ＧＰＣＲは創薬の優れた標的である。現在のところ、ＧＰＣＲ活性を調節する化合物を検出する、簡単で有効なハイスループットスクリーニングアッセイが求められている。
【０００９】
生理学的に関連する基質のイオンチャネルを介しての移動は、多様な物理的、光学的または化学的手法で辿ることが出来る(ステイン、W.D., Transport and Diffusion Across Cell Membranes, 1986, アカデミック・プレス、オーランド、フロリダ州)。イオンチャネルの調節剤のアッセイとしては、電気生理学的アッセイ、微小電極を用いるセルバイセル アッセイ(ウ, C.-F., スズキ, N., およびプー, M.M., J. Neurosci, 1983, 3 1888)、つまり、細胞内およびパッチクランプ法(ネエール, E.; サッカマン, B., 1992, Sci., Amer., 266, 44-51)、および放射活性トレイサーイオン法が挙げられる。パッチクランプ法および細胞全膜電位クランプ、電流クランプ、および二電極電位クランプ法は、電極を置く際に高程度の空間的精密さを要求する。機能的アッセイは、パッチクランプ法を用いて細胞全膜電流を測定することにより行うことができるが、しかしながら、処理能力は１日に行うアッセイ数で非常に限定されている。
【００１０】
ラジオトレーサーイオンは、細胞試料内におけるチャネル制御イオン転座の生化学的および薬理学的研究に用いられている(ホスフォード、D,A.ら、Brain Res., 1990, 516, 192-200)。この方法において、放射活性トレーサーイオンと活性リガンドに一定の期間細胞を曝露し、ついで細胞を洗浄し、放射能含量を測定する。放射活性アイソトープはよく知られており(エバンス、E.A.；ムラマツ、M, Radiotracer techniques and applications, M. デッカー；ニューヨーク、1977)、およびそれらの使用は高感度での標的基質の検出を可能としている。しかしながら、放射活性アイソトープは多くの安全対策を必要とする。別法のさらに安全な非放射活性標識試薬の使用が近年増加している。
【００１１】
蛍光検出を用いる光学方法は、パッチクランプおよび放射活性トレーサー法に対する好適な別法である。光学方法は、細胞群の場合と同様に単一細胞におけるイオン流動の全工程の測定を可能とする。蛍光法による輸送をモニターすることの利点は、これらの方法の高感度、一時的分解能、生体物質の控えめな要求、放射活性の欠如、およびイオン輸送を継続的にモニターして動的情報を得る能力が挙げられる(アイデルマン, O. カバンチック, Z.I., Biochim. Biophys. Acta, 1989, 988, 319−334)。蛍光により輸送をモニターする一般的原理は、化合物の転座に伴う蛍光特性においてコンパートメント依存性変異を持つことに基づいている。
【００１２】
光学法は当初Ｃａ２＋イオン流動の測定のために開発され(スカルパ, A. Methods of Enzymology, 1979, 56,301, アカデミック・プレス、オーランド、フロリダ州；チェン, R.Y., Biochemistry, 1980, 19, 2396；グリンキービッツ, G., ポエニック, M., チェン, R.Y., J. Biol Chem., 260, 3440)、ハイスループットアッセイ用に一部変更された(米国特許第６,０５７,１１４号)。Ｃａ２＋イオンの流動はカルシウム感受性蛍光色素、例えばＦｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、カルシウム・グリーン他等を用いて一般的に行なわれる(Molecular Probes Inc., Handbook of Fluorescent probes and research chemicals, 7th edition, chapter 1, ユージーン、オレゴン州)。神経細胞における電気的活性の光学検出は電位感受性膜色素と光検知器設備を用いて行われる(グリンバルド, A, 1985, Annu. Rev. Neurosci. 8, 263；ロー, L.M.およびシンプソン, L.L., 1981, Biophys. J. 34, 353；グリンバルド, A.ら、1983, Biophys. J. 39, 301; グリンバルド, A.ら, Biophys. J. 42, 195)。
【００１３】
カーペンらは生体細胞における１価のカチオン流動を検出する光学方法を開発した。この方法は細胞全膜内のセシウムイオン(Ｃｓ＋)による、包埋色素、アントラセン−１,５−ジカルボン酸(ＡＤＣ)の蛍光消光に基づくイオン流動を測定した(カーペン, J.W., サッチス, A.B.、パスキール, E. B., ヘス、G. P., Anal. Biochem. 1986, 157, 353-359)。本方法は特殊な神経伝達物質に対して応答する細胞をスクリーニングするために用いられた。カーペンらの方法は、Ｃｓ＋がＮａ＋やＫ＋に置き換わることができるすべてのシステムで応用でき、トレーサーイオン法に匹敵することが証明されている。しかしながら、最も古典的Ｋ＋およびナトリウムチャネルはＣｓ＋に対して最も選択的であり、それ故にこの方法は非選択的カチオンチャネルにのみ有用である。
【００１４】
タリウムイオンは多くのＫ＋チャネルを通過して輸送されることが、以前に報告されている(ヒル, B., J Gen. Physiol., 1972, 59, 637-58)。１価のカチオン流動を測定するためのタリウム蛍光消光法は再構築された膜小胞体で最初に開発された(モーア, H-P. H., ラフテリー, M. A., Proc. Natl, Acad. Sci, 1980, 77, 4509-4513)。タリウムはポリアニオン蛍光色素、８−アミノナフタレン−１,３,６−トリスルホネート(ＡＮＴＳ)の蛍光に影響を及ぼすと報告された(モ−ア, H-P. H., ラフテリー、同上)。この方法は、精製されたアセチルコリン受容体を含有する膜小胞体を通過するイオン輸送反応速度論を解明するために用いられた(ウ, W. C.-S.；モーア, H-P. H.；ラフテリー, M. A., Proc. Natl, Acad. Sci,, 1984, 78, 775-779)。タリウムイオンの小胞体への流入は、包埋蛍光試薬、ＡＮＴＳの蛍光に及ぼすタリウムイオンの効果により測定された(ウ, W, C-S. モーア, H-P. H, ラフテリー, M. A.、同上)。しかしながら、この方法は小胞体を使用することに限定され、生理学的条件下での塩化タリウムの不溶性のため、細胞全膜には適用できないことが報告された。
【００１５】
ここで述べる光学またはラジオトレーサー法の適用は、ハイスループットスクリーニング法へのそれらの順応性に限定される。例えば、Ｃａ２＋透過カチオンチャネルのハイスループットスクリーニング法は、一般的には、カルシウム感受性蛍光色素、例えばＦｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、カルシウム・グリーン等を用いて行う(米国特許第６,０５７,１１４および５,９８５,２１４)。これらのスクリーニング法は、カルシウムまたは他の関連する２価イオンを通過させるチャネルに主に適用でき、よってＫ＋チャネルにはおおむね無用である。殆どの他のカチオンチャネルのハイスループットスクリーンは電位感受性色素、例えばＤｉＢＡＣを用いて行う(米国特許第５,８８２,８７３)。これらの色素はイオン流動の結果としておこる膜貫通型電位の変化を示す。しかしながら、このような方法は、膜電位を変える電荷を持つチャネルの型を直接的には分別せず、よって他の課題のなかで、細胞に存在するイオンチャネルの多様性のため、再現性に影響する人工物に対してはもっと困難である。
【００１６】
カチオンチャネル活性を調節する化合物をスクリーニングする現行方法の限界により、カチオンチャネルの新規な調節剤の検索を妨げていた。さらに、チャネル活性の現行のアッセイは、潜在的調節剤の大きなライブラリーまたはグループをスクリーニングするために必要なハイスループットスクリーニング法には適当ではない。よって、カチオンチャネル活性を調節する多数の化合物候補をスクリーニングし同定する新規なアッセイ方法が依然としてこの分野で望まれている。本発明はこれらのまたは他の要望を満足させるものである。
【００１７】
発明の概要
よって、本発明は、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤を検出する新規なタリウム感受性光学アッセイ方法を提供するものである。本方法は、生体細胞内のイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの機能活性を測定するタリウム感受性アッセイを用いる。
【００１８】
本発明方法はさらに、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤を同定する、ハイスループットスクリーニングアッセイを提供する。これは、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性を阻害または活性化する能力で、調節剤候補をスクリーニングするアッセイを提供するものである。本発明のハイスループットスクリーニングアッセイを用いることにより、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性を調節する新規化合物が、新規治療薬または診断薬の開発に用いるために同定される。
【００１９】
本発明方法はまた、対象となるイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを発現する細胞を培養するための新規な低Ｃｌ−細胞培養培地と、本発明のタリウム感受性アッセイを行うための新規なＣｌ−−フリーアッセイ緩衝液を提供する。これらの溶液において、２００ｍＭより大きいタリウムイオン濃度が得られる。一つの態様において、細胞培養培地は２ｍＭ以下のＣｌ−を含有し、塩素アニオンは有機グルコン酸アニオンで置換される。これらすべてのアッセイを既知の生理学的Ｃｌ−含有緩衝液中で行うことは可能だが、新規Ｃｌ−−フリー緩衝条件と低Ｃｌ−細胞培養培地は、さらに堅調で一貫性のある結果を出す。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性を調節する対象化合物を検出および同定するための、細胞全膜を用いる新規なタリウム感受性アッセイ法を提供する。対象化合物はイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性を活性化あるいは阻害する。そのような調節剤は、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの原核細胞および真核細胞系における生化学、生理学および薬理学を解明するために用いることができる、貴重なリサーチ・ツールである。
【００２１】
さらに、そのような調節剤は、カチオンチャネル関連疾患、イオンチャネル連結型受容体を伴う疾患、抗生物質、抗カビ剤、炎症緩和剤、免疫学的疾患等の多くの疾病に有用な薬剤の開発を含む、多様な病態を治療するための診断薬または治療薬開発の為のリード化合物を提供する。
【００２２】
よって、本発明アッセイは、カチオンチャネル関連疾患および／またはイオンチャネル連結型受容体を伴う疾患の治療に用いることができる薬剤の製薬学的開発のリード化合物を同定する方法を提供する。イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーター活性の潜在的調節剤のスクリーニングのためのハイスループット法もまた提供される。
【００２３】
さらに、本発明方法を実施するための新規な低Ｃｌ−細胞培養培地およびＣｌ−−フリーアッセイ緩衝液も、本発明方法は包含するものである。
【００２４】
定義
本出願に用いられる以下の用語および表現は特定の意味を持つ。
【００２５】
「イオンチャネル」とは、開口またはポアを細胞膜内に形成するタンパク質で、ポアまたは開口はそれを通してイオンを流動させることができる。
【００２６】
「イオンチャネル連結型受容体」とは、イオンチャネルに連結しているタンパク質であり、該タンパク質活性はイオンチャネルの活性に影響を与える。
【００２７】
「イオントランスポーター」とは、細胞膜を通過してイオンを輸送するタンパク質である。
【００２８】
「調節剤」とは、イオンチャネルの活性を変化することの出来る、つまり、イオンチャネルを介してイオンの移動または輸送を変えることができる、化合物または薬剤である。調節剤は有機分子または化学物質(天然のものまたは非天然のもの)であり、例えば生物学的高分子(例えば、核酸、タンパク質、非ペプチド、または有機分子)、または生体物質(例えば細菌、植物、菌類、または動物(特に哺乳動物)細胞または組織、タンパク質またはタンパク質フラグメント)から作られた抽出物である。調節剤は生物学的過程の阻害剤または活性化剤として作用する、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、部分的アンタゴニスト、抗腫瘍剤、細胞毒剤、腫瘍形成または細胞増殖阻害剤、および細胞増殖促進剤として作用するその能力で評価する。調節材の活性は既知、未知または部分的に既知である。
【００２９】
チャネル遮断薬は、イオンチャネルを介するイオンの移動を直接的または間接的に阻害する化合物である。化合物は直接ポアを閉塞したり、ポアの開口を結合して阻害したり、またはイオンチャネルの開口時間およびその頻度に影響して、その効果を発揮する。
【００３０】
チャネル開口剤はイオンチャネルを介するイオンの移動を活性化する化合物である。化合物は、イオンチャネルの開口期間および／またはその頻度に影響を及ぼして、または電位依存性イオンチャネルの電位依存度を変えてイオンチャネルが開口して、イオンチャネルを調節する。
【００３１】
アゴニストはイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを活性化することができる分子である。
【００３２】
アンタゴニストは、アゴニスト作用に影響を与える分子、またはイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性を阻害する分子である。
【００３３】
本発明方法
本発明は、生体細胞のカチオンチャネルの機能活性を測定するためのタリウム感受性アッセイを用いる、カチオンチャネル調節剤を検出する新規方法を提供する。本発明は、カチオン流動(流入または流出)、特にタリウムイオンの流動を検出する、簡単で便利な光学方法を提供する。タリウムイオンの流動を検出することにより、直接的または間接的にイオンチャネルの活性を測定および観察することができる。
【００３４】
本発明の一態様において、イオンチャネルに連結しているイオンチャネル連結型受容体の調節剤を間接的に検出するために本方法は用いることが出来る。ここに記載のタリウム感受性アッセイを用いて、受容体に連結している(調節剤の存在下または非存在下)イオンチャネルの機能活性を測定または観察することにより、イオンチャネル連結型受容体の調節剤の効果を観察することができる。
【００３５】
本発明の他の態様において、イオントランスポーターの調節剤を検出するために、本方法は用いることが出来る。ここに述べるように、タリウム感受性アッセイを用いてイオントランスポーターの機能活性を測定および観察することにより、イオントランスポーターの調節剤の効果を観察することができる。
【００３６】
一般的流入方法：
本発明方法は、本発明のタリウム感受性アッセイを用いて、標的イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの潜在的調節剤である化合物を検出および同定する方法も包含するものである。これらのアッセイは、標的イオンチャネル(例えばカリウムイオンチャネル)、受容体に連結するイオンチャネル(例えばＧＩＲＫ)、イオンチャネル連結型受容体(例えばＧＰＣＲ)、またはイオントランスポーター(例えばグルタミン酸トランスポーター)を発現する細胞、検出可能(信号発生)タリウム感受性試薬(例えばＢＴＣ)、タリウムイオンおよびイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーター活性の調節剤候補を含有する試験混合物をインキュベーションすることを包含する。タリウム感受性試薬の光学信号は調節剤を加える前に測定する。アッセイは、発生するイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーター活性に好適な条件下で行う。タリウム感受性試薬の光学信号の変化を測定する。信号の増加または減少はイオンチャネルまたはイオントランスポーターを通過するタリウムイオンの移動を示す。
【００３７】
本発明方法は、イオンチャネルを発現する細胞全膜を用いて実施し、次の工程からなる。１)イオンチャネルを発現する細胞を好適な条件下で培養し；２)信号発生タリウム感受性試薬(例えば、細胞透過性タリウム感受性試薬)と該細胞を接触または負荷し；３)好適な条件下で細胞を処理(例えば、洗浄または細胞外消光剤の添加)して過剰のタリウム感受性試薬の寄与を細胞外に除き；４)ベースライン測定のために検知可能な信号を測定し；５)細胞を、タリウムイオンとイオンチャンネルのための好適な刺激剤溶液(イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを活性化する溶液)を含有する溶液と接触させ、イオンチャネル調節化合物候補と細胞を接触せしめ；６)信号を検出する。
【００３８】
本発明の他の態様において、本発明方法はイオンチャネルおよびイオンチャネル連結受容体を発現する細胞全膜を用いて行い、次の工程を包含する：１)対象のイオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体を発現する細胞を好適な条件下で培養し；２)信号発生タリウム感受性試薬(例えば、細胞透過性タリウム感受性試薬)と細胞を接触または負荷し；３)好適な条件下で細胞を処理(例えば、洗浄または細胞外消光剤の添加)して過剰のタリウム感受性試薬を除き；４)ベースライン測定のために検出可能な信号を測定し；５)細胞をイオンチャネル連結型受容体の調節化合物候補と接触させ；６)検出可能な信号を測定し；７)細胞を、タリウムイオンとイオンチャネル連結型受容体のための好適な刺激剤溶液を含む溶液と接触させ；および８)検出可能な信号を測定する。
【００３９】
本発明のさらなる態様において、本発明方法はイオントランスポーターを発現する細胞全膜を用いて行い、次の工程を包含する：１)対象のイオントランスポーターを発現する細胞を好適な条件下で培養し；２)信号発生タリウム感受性試薬(例えば、細胞透過性タリウム感受性試薬)と細胞を接触または負荷し；３)好適な条件下で細胞を処理(例えば、洗浄または細胞外消光剤の添加)して過剰のタリウム感受性試薬を除き；４)ベースライン測定のために検出可能な信号を測定し；５)細胞をイオントランスポーター調節剤候補と接触させ；６)検出可能な信号を測定し；７)細胞を、タリウムイオンとイオントランスポーターのための好適な刺激剤溶液を含む溶液と接触させ；および８)検出可能な信号を測定する。
【００４０】
タリウム感受性試薬により発生した信号の変化は、調節剤の添加前に、つまりタリウム塩または調節剤の添加前または後に、試験混合物中のベースライン信号を測定することにより、決定できる。
【００４１】
調節剤候補の効果の分析を容易にするために対照実験を行うことは、本分野の通常の技術者は理解するであろう。対照実験は、(１)本発明方法と同一条件下で、天然のトランスフェクトされていない細胞；(２)刺激剤溶液非存在下の試験混合物にタリウムイオンを添加；(３)イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤候補を試験混合物に添加せず、本発明方法と同条件下の細胞；および／または(４)イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの既知の調節剤を用いて、本発明方法と同条件下の細胞、を用いて行う。
【００４２】
一般的流出方法：
本発明はさらにイオン流出を測定する方法を提供する。タリウム流入を測定する方法は前述したとおりであり、また後記実施例の項で説明する。流出アッセイは流入アッセイで用いた同じ細胞を用い、ＢＴＣなどの上記信号発生タリウム感受性蛍光試薬で負荷する。細胞をタリウムと接触させて細胞を負荷する。一態様として、約１５分間タリウムイオンと細胞を接触させる。細胞を洗浄して過剰のタリウムイオンを除き、流入アッセイで用いたように信号の変化を検出する同じ機器を用いて分析する(例えば、フルオロメトリック・イメージ・プレート・リーダー(ＦＬＩＰＲ)(モレキュラー・デバイシス・コープ、サニーベール、カルフォルニア))。アッセイチャネルは、多くのリガンドのなかから一つを添加することにより、またはカリウム濃度を変えたりして細胞の膜電位を変えることによって刺激され開口し、イオンチャネルを介してイオンを流出させる。ＢＴＣでは、流出は蛍光減少を起こす。他の化合物、例えば対照化合物は流入アッセイと同じでよい。細胞を前述のとおりタリウムイオンで先に負荷しておき、洗浄して過剰のタリウムイオンを除く以外は、本発明方法の流入アッセイと同条件が適用できる。
【００４３】
刺激剤溶液：
刺激剤溶液とは、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーター(例えばアゴニスト)を活性化する溶液である。ある種のイオンチャネル／トランスポーターは常時活性であり、その場合はタリウムイオントレーサーの他に「刺激剤」を添加する必要はない。刺激剤を要するチャネルにとって、刺激剤はリガンド、チャネルまたはイオンチャネル連結型受容体に結合してそれを作動させる分子、アゴニストである。刺激剤は電位依存性チャネルにとっては膜電位の変化でもある。典型的な電位依存性チャネルは電極による直接的電気的刺激により、または脱分極を起こすイオン組成物を含有する刺激剤溶液(例えば、高い対外カリウム)を用いることにより活性化される。さらに、タリウムイオンは電位依存性チャネルの刺激剤としても作用することができる。そのようなケースでは、タリウムイオンは「トレーサー」としてもまた「脱分極刺激剤」としても作用できる。流入アッセイでは、タリウムイオンは刺激剤の添加の直前、添加中、またはその後で加えることができる。
【００４４】
本発明方法は、本方法で用いるイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターのタイプに基づいて選択される刺激剤溶液を包含する。好適な刺激剤溶液と、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターを選択することは、本分野の技術範囲である。一態様では、刺激剤溶液はイオンチャネルを活性化する試薬を含まない緩衝液が挙げられ、よってイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターは実質的に静止したままである。この態様において、刺激剤溶液は、対象のイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターを活性化しないが、調節試薬を細胞に添加しアッセイを開始させたときに、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターの活性化を促進する試薬が挙げられる。
【００４５】
電位依存性チャネル(例えば、Ｎ型カルシウムチャネルまたはＫＣＮＱ２チャネル)との使用に選択された刺激剤溶液は、細胞膜の静止電位に対するイオンチャネルの感受性に依存する。これらの電位依存性イオンチャネルを用いる方法では、刺激剤溶液は膜を脱分極する働きをする活性化試薬が挙げられる(例えば、イオノフォア、バリノマイシン等)。
【００４６】
細胞膜の脱分極による活性化のための、いくつかの電位依存性イオンチャネルとの使用に選択された刺激剤溶液は、細胞含有ウェルのカリウムイオンの最終濃度が約１０〜１５０ｍＭ(例えば５０ｍＭ ＫＣｌ)の範囲になるような濃度のカリウム塩が挙げられる。さらに、電位依存性イオンチャネルはまた電気的刺激によっても刺激される。
【００４７】
イオンチャネル連結型受容体およびリガンド依存性イオンチャネルとの使用に選択された刺激剤溶液は、そのような受容体を活性化することが知られているリガンドに依存する。例えば、ニコチン酸アセチルコリン受容体はニコチンまたはアセチルコリンにより活性化されることが知られており、同様に、ムスカリン性アセチルコリン受容体はムスカリンまたはカルバミルコリンの添加により活性化される。これらの系と使用される刺激剤溶液はニコチン、アセチルコリン、ムスカリンまたはカルバミルコリンが挙げられる。
【００４８】
細胞：
本発明方法は、１)タリウムに透過性のイオンチャネル：２)タリウムイオンに透過性のイオンチャネルまたはイオンチャネル連結型受容体；または３)タリウムイオンに透過性のイオントランスポーター、を持つ細胞を用いる。本発明方法に用いる細胞は、１)イオンチャネル；２)イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体；または３)イオントランスポーターをコードするＤＮＡで宿主細胞をトランスフェクトすることにより作成することができる。
【００４９】
基本的には内因性イオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターを発現するいかなる細胞も用いることができるが、単一型のイオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターを優先的に発現するように、そのようなイオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターをコードする異種核酸で形質転換された、またはトランスフェクトされた細胞を用いることが好ましい。
【００５０】
異種細胞表面タンパク質発現のための好ましい細胞は、容易におよび効率良くトランスフェクトされて、イオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターを発現するものである。イオンチャネルを発現する天然の細胞、およびイオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターを発現するようにトランスフェクトされた細胞は本分野の技術者には良く知られているか、あるいは本分野の技術者に同定され得る。異種細胞表面タンパク質を発現するように遺伝学的に設計された多くの細胞が知られている。イオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターを発現するために使用できる細胞型は、これらに限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。そのような細胞の例としては、これらに限定されないが、ヒト胎児腎臓(ＨＥＫ)細胞、ＨＥＫ２９３細胞(米国特許第５,０２４,９３９号：スチルマンら、1985, Mol. Cell Biol., 5, 2051-2060)、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(ATCC Nos. CRL9618, CCL61, CRL9096)、ゼノパス絨毛卵母、(ＸＬＯ)細胞、ベビーハムスター腎臓(ＢＨＫ)細胞(ATCC No. CCL10)、マウスＬ細胞(ATCC No. CCLI.3)、ジャルカット(ATCC No. TIB 152)および１５３ ＤＧ４４細胞(Chasin (1986) Cell. Molec. Genet. 12: 555)、ヒト胎児腎臓(ＨＥＫ)細胞(ATCC No. CRL1573)、ＰＣ１２細胞(ATCC No. CRL17.21)およびＣＯＳ−７細胞(ATCC No, CRL1651)が挙げられる。
【００５１】
細胞は溶液中でまたは固体支持体上で培養できる。細胞は付着性または非付着性である。固体支持体は、これらに限定されないが、ガラスまたはプラスチック培養皿、またはマルチウェルプレートである。
【００５２】
アッセイにおいて検出可能な蛍光信号を誘い出すことのできる細胞はいずれもマルチウェル・プレートに用いることができるが、各ウェルに植種される細胞数は、アッセイ時に細胞がコンフルエンスあるいは殆どコンフルエルスにあるが過剰増殖はしないように選択されるべきであり、それにより信号のシグナル対バックグランド(Ｓ／Ｂ)比が増加する。
【００５３】
別法として、本発明方法は全細胞よりむしろ、イオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターを持つ膜(例えば膜小胞体)を用いて行うことができる。膜小胞体の使用は本分野の技術者に知られている。
【００５４】
本発明方法は、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体、例えば、ＧＰＣＲなどの受容体、イオンチャネルと連結し、またはイオンチャネルの活性を調節できる信号伝達経路、およびイオンチャネル、細菌ポリンまたはイオントランスポーターに連結したタンパク質に適用できる。
【００５５】
イオンチャネル：
本発明方法に用いることが出来るイオンチャネルのタイプとしては、これらに限定されないが、リガンドまたは電位依存性、伸展活性化カチオンチャネル、選択的または非選択的カチオンチャネルが挙げられる。
【００５６】
リガンド依存性非選択的カチオンチャネルのタイプとしては、これらに限定されないが、アセチルコリン受容体、ＡＭＰＡ、カイニン酸およびＮＭＤＡ受容体などのグルタミン酸受容体、５−ヒドロキシトリプタミン依存性受容体チャネル、ＡＰＴ依存性(Ｐ２Ｘ)受容体チャネル、ニコチン酸アセチルコリン依存性受容体チャネル、バニロイド受容体、リアノジン受容体チャネル、ＩＰ３受容体チャネル、細胞内ｃＡＭＰで原位置(in situ)活性化されたカチオンチャネル、および細胞内ｃＧＭＰで原位置(in situ)活性化されたカチオンチャネルが挙げられる。
【００５７】
電位依存性イオンチャネルのタイプとしては、Ｃａ２＋、Ｋ＋およびＮａ＋が挙げられる。チャネルは外生的または内生的に発現される。チャネルは安定的にまたは一時的に、天然のまたは組換えセルラインの両者で発現される。
【００５８】
Ｋ＋チャネルのタイプとしては、これらに限定されないが、ＫＣＮＱＩ(ＫｖＬＯＴ１)、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＫＣＮＱ４、ＫＣＮＱ５、ＨＥＲＧ、ＫＣＮＥ１(ＩｅＫ、ＭｉｎＫ)、Ｋｖ１.５、Ｋｉｒ ３.１、Ｋｉｒ ３.２、Ｋｉｒ ３.３、Ｋｉｒ ３.４、Ｋｉｒ ６.２、ＳＵＲ２Ａ、ＲＯＭＫ１、Ｋｖ２.１、Ｋｖｌ.４、Ｋｖ９.９、Ｋｉｒ６、ＳＵＲ２Ｂ、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＧＩＲＫ１、ＧＩＲＫ２、ＧＩＲＫ３、ＧＩＲＫ４、ｈｌＫ１、ＫＣＮＡ１、ＳＵＲ１、Ｋｖｌ.３、ＨＥＲＧ(コンレイ，Ｅ.C.およびブラマー，W.J.；1999, The Ion Channel, Factsbook IV: Voltage-Gated Channels, アカデミック・プレス、ロンドン、英国)、細胞内カルシウム賦活Ｋ＋チャネル、ラット脳(ＢＫ２)(マッキンノン，D., (1989) J. Biol Chem. 264, pp. 9230-8236)；マウス脳(ＢＫ１)(テンペルら、(1988) Nature 332, pp. 837-839)等が挙げられる。
【００５９】
Ｎａ＋チャネルのタイプとしては、これらに限定されないが、ラット脳ＩおよびＩＩ(ノダら、 1986, Nature 320, pp. 188-192)；ラット脳ＩＩＩ(カヤノら、1988, FEBS Lett. 228, pp. 187-194)；ヒトＩＩ(ATCC No. 59742, 59743およびGenomics 1989, 5: 204-208)等が挙げられる。
【００６０】
Ｃａ２＋チャネルのタイプとしては、これらに限定されないが、ヒトカルシウムチャネルα１、α２、βおよび／またはγサブユニット(米国出願第０７／７４５,２０６および０７／８６８,３５４)、リアノジン受容体(ＲｙＲ)およびイノシトール １,４,５−トリホスフェート受容体(ＩＰ３Ｒ)(T. ジャヤラマンら、J. Biol. Chem., 267, pp. 9474-77 (1992)； A. M. カメロンら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, pp. 1784-44 (1995))；ラビット骨格筋α１サブユニット(タナベら、(1987) Nature 328, pp. 313-E318)；ラビット骨格筋α２サブユニット (エリスら、(1988) Science 241, pp. 1661-1664)；ラビット骨格筋ｐサブユニット(ルースら、(1989) Science 245, pp. 1115-1118)；ラビット骨格筋ガンマ・サブユニット(ジェイら、(1990) Science 248, pp. 490−492)等が挙げられる。
【００６１】
イオンチャネル連結型受容体：
本発明方法はイオンチャネル連結型受容体活性および情報伝達システムを間接的に測定するために用いることもできる。本発明方法の一態様において、受容体の活性化によりイオンチャネルの活性の調節へと導かれる、後続の細胞内事象を起こす場合に、イオンチャネル連結型受容体の活性は測定される。この調節は受容体サブユニットとイオンチャネルとの相互作用(例えば、ＧＰＣＲβγサブユニットとＧＰＣＲ連結型Ｋ＋チャネル(例えばＧＩＲＫ))の結果であり、あるいはイオンチャネル活性を調節するカルシウム、脂質代謝物、サイクリックヌクレオチドなどのメッセンジャー分子濃度の変化によるものである。
【００６２】
Ｇタンパク質結合受容体のなかで、ムスカリン様アセチルコリン受容体(ｍＡＣｈＲ)、アドレナリン受容体、セロトニン受容体、ドパミン受容体、アンギオテンシン受容体、アデノシン受容体、ブラジキニン受容体、代謝調節型興奮性アミノ酸受容体等を用いることが出来る。
【００６３】
本発明の間接的測定法のもう一つのタイプは、活性化されると細胞内サイクリックヌクレオチド(ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ)のレベルに変化を起こす受容体の活性を測定することを包含する。例えば、ある種のドパミン、セロトニン、代謝活性型グルタミン酸受容体およびムスカリン様アセチルコリン受容体の活性化により、細胞質のｃＡＭＰ、ｃＧＭＰレベルの増加または減少を起こす。さらに、サイクリックヌクレオチド依存性イオンチャネル、例えば、桿体視細胞(rod photoreceptor cell)チャネルや嗅覚ニューロンチャネルが存在し(アルテンホッフェン、W. ら、(1991) Proc. Natl. Acad, Sci U. S. A. 88: 9868-9872 およびダーランら、 (1990) Nature 347: 184-187)、それらはｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの結合により活性化されカチオンに透過性である。よって、本発明方法によれば、視細胞または嗅覚受容体チャネルのサイクリックヌクレオチド活性化量の変化により生じた細胞質イオンレベルの変化は、活性化された場合にｃＡＭＰまたはｃＧＭＰレベルの変化を起こす受容体の機能測定に用いられる。受容体の活性化がサイクリックヌクレオチドレベルの減少を起こす場合には、このアッセイにおいて細胞に受容体活性化化合物を加える前に、該細胞を細胞内サイクリックヌクレオチドレベルを増加させる試薬、例えばホルスコリンに曝露しておくことが好ましい。
【００６４】
このタイプのアッセイに用いられる細胞はイオンチャネル(ＧＩＲＫなど)をコードするＤＮＡと、活性化された場合に細胞質内のサイクリックヌクレオチドレベルに変化を起こすイオンチャネル連結型受容体(ある種の代謝型グルタミン酸受容体、ムスカリンアセチルコリン受容体、ドパミン受容体、セロトニン受容体等)をコードするＤＮＡとで、宿主細胞を共トランスフェクトすることにより得ることができる。
【００６５】
受容体を活性化した際に、細胞内に発現したイオンチャネルの活性に変化を起こすことができる受容体タンパク質を発現する細胞であれば本発明方法に用いることが出来る。例えば、カルシウムチャネルを開口することによって、あるいはＣａ２＋をセカンドメッセンジャーとして利用する反応の開始を起こすことによって細胞内カルシウム濃度を間接的に影響することによって、活性化の際にカルシウムの細胞内濃度を直接的に増加することができる受容体タンパク質(Ｇタンパク質結合受容体)を発現する細胞が本発明方法に用いることが出来る。そのようなイオンチャネル連結型受容体またはイオンチャネルを内生的に発現する細胞、およびそのような細胞表面タンパク質の１つまたはそれ以上をコードする好適なベクターでトランスフェクトすることができる細胞は本分野の技術者には知られており、または本分野の技術者により同定されることができる。
【００６６】
本発明に使用する受容体は、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる。ムスカリン性受容体、例えばヒトＭ２(ジェンバンク・アセッション番号 M16404)；ラットＭ３(ジェンバンク・アセッション番号 M16407)；ヒトＭ４(ジェンバンク・アセッション番号 M16405)；ヒトＭ５(ボーナーら、(1988) Neuron 1, pp. 403-410)等；ニューロンニコチン酸アセチルコリン受容体、例えばヒトα２、ヒトα３、およびヒトβ２、米国特許第５０４,４５５(１９９０年４月３日出願；その全体がここに参照として組み入れられている)に開示のサブタイプ；ヒトα５、サブタイプ(チニら、(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 1572-1576)、ラットα２サブユニット(ワダら、(1988) Science 240, pp. 330-334)；ラットα３サブユニット(ボールターら、(1986) Nature 319, pp. 368-374)；ラットα４サブユニット(ゴールドマンら、(1987) Cell 48, pp. 965-973)；ラットα５サブユニット(ボールターら、(1990) J. Biol. Chem. 265, pp. 4472- 4482)；ニワトリα７サブユニット(クーツリアーら、(1990) Neuron 5: 847-856)；ラットβ２サブユニット(デネリスら、(1988) Neuron 1, pp. 45-54)；ラットβ３サブユニット(デネリスら、(1989) J. Biol. Chem. 264, pp. 6268-6272);ラットβ４サブユニット(デュボイシンら、(1989) Neuron 3, pp. 487-496)；ラットαサブユニットのコンビネーション、ラットＮＭＤＡＲ１受容体(モリヨシら、(1991) Nature 354: 31-37 および スギハラら(1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 185: 826-832); マウスＮＭＤＡ el 受容体 (メグロら、(1992) Nature 357: 70-74); ラットＮＭＤＡＲ２Ａ、ＮＭＤＡＲ２ＢおよびＮＭＤＡＲ２Ｃ受容体(モンヤーら、(1992) Science 256: 1217-1221)；ラット代謝調節型 ｍＧｌｕＲ１受容体(ホウムドら、(1991) Science 252: 1318-1321)；ラット代謝調節型ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３およびｍＧｌｕＲ４受容体(タナベら、(1992) Neuron 8: 169-179)；ラット代謝調節型 ｍＧｌｕＲ５ 受容体(アベら. (1992) J. Biol. Chem. 267: 13361-13368)等；アドレナリン受容体、例えばヒトベータ１(フリーレら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84, pp. 7920-7924)；ヒト アルファ２(コビルカら、(1987) Science 238, pp. 650-656)；ハムスター ベータ２(ディクソンら、(1986) Nature 321, pp. 75-79)等；ドパミン受容体、例えばヒトＤ２(ストーマンら、(1990) Molec. Pharm. 37, pp. 1-6)；哺乳類ドパミンＤ２受容体(米国特許第５,１２８,２５４); ラット(ブンゾウら、(1988) Nature 336, pp. 783-787)等；セロトニン受容体、例えばヒト５ＨＴ１ａ(コビルカら、(1987) Nature 329, pp. 7579)；セロトニン５ＨＴ１Ｃ受容体(米国特許第４,９８５,３５２)；ヒト５ＨＴ.sub.１Ｄ(米国特許第５,１５５,２１８)；ラット５ＨＴ２(ジュリウスら、(1990) PNAS 87, pp. 928-932)；ラット５ＨＴ１ｃ(ジュリウスら、(1988) Science 241, pp. 558-564) 等。
【００６７】
イオントランスポーター：
本発明方法はまたイオントランスポーターの活性測定にも適用できる。
本発明方法に用いるイオントランスポーターは、これらに限定されないが、神経伝達物質イオントランスポーター(ドパミンイオントランスポーター、グルタミン酸イオントランスポーターまたはセロトニンイオントランスポーター)(ガデア、A. および ロペス−コロム, A. M., J. Neurosci. Res., 2001, 63, 453-460)、ナトリウム−カリウム ＡＴＰase、プロトン−カリウムＡＴＰase(シルバー、R. B. およびソレイマニ, M., Am.J. Physiol, 1999, 276, F799-F811)、ナトリウム／カルシウムイオン交換体、および塩化カリウムイオン共トランスポーター(ギレン, C. M,ら、J. Biol. Chem., 1996, 271, 16237-16244)。
【００６８】
緩衝液：
本発明方法に用いる緩衝液のタイプとしては、約ｐＨ５.５〜ｐＨ９.０に緩衝能力のものであればよく、例えばＨＥＰＥＳやＰＢＳが挙げられる。緩衝液は本分野でよく知られており、Molecular Cloning; A Laboratory Manual (2nd edition, サムブロック、フリッチおよびマニアティス、1989, コールド・スプリング・ハーバー・プレス)、またはShort Protocols in Molecular Biology(オースベル, F. M., ら、1989, ジョン・ウェリー・アンド・サンズ)により容易に得ることができる。
【００６９】
既知の生理学的Ｃｌ−含有緩衝液ですべてのアッセイを実行することはできるが、新規なＣｌ−−フリー緩衝条件および低Ｃｌ−細胞培養培地ではさらに堅調で一貫性のある結果が得られる。
【００７０】
新規細胞培養培地：
本発明の一態様において、さらに一貫性のあるアッセイ結果を得るために溶液中のタリウムイオンのさらに高い濃度を用いる為に、新規な細胞培養培地およびアッセイ緩衝溶液が提供される。これらの両溶液において、２００ｍＭまでのタリウムイオン濃度を用いることができる。
【００７１】
新規な細胞培養培地は、殆ど完全にＣｌ−を含まない位の非常に低レベルのＣｌ−を含有する。細胞培養培地はこの分野で知られた細胞培養に適したすべての成分(カチオン、アニオン、ビタミンおよびアミノ酸)を含むが、但し、Ｃｌ−濃度は約２ｍＭより多くないように限定されている。残留するＣｌ−は有機アニオングルコン酸塩で置き換えることができる。約ｐＨ５.５〜９.０の間を緩衝する処理能力の緩衝液であればどれども、例えばＨＥＰＥＳが使用できる。
【００７２】
細胞培養培地は以下の一つまたは複数を含有する：グルコン酸ナトリウム；グルコン酸カリウム；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＮａＨＣＯ３；グルコン酸カルシウム；ＮａＨ２ＰＯ４；グルコース；ビタミン；アミノ酸；グルタミンおよび緩衝液(例えばＨＥＰＥＳ)。
【００７３】
新規細胞培養培地組成物の好ましい態様は、グルコン酸ナトリウム(１０９ｍＭ)；グルコン酸カリウム(５.４ｍＭ)；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ(０.８ｍＭ)；ＮａＨＣＯ３(２６.２ｍＭ);グルコン酸カルシウム(３.６ｍＭ)；ＮａＨ２ＰＯ４(１.２ｍＭ);ＨＥＰＥＳ, ｐＨ７.３ w/ＮａＯＨ(２５ｍＭ);グルコース(５.６ｍＭ)；１００Ｘビタミン(１０ｍｌ／Ｌ)；５０Ｘ アミノ酸(２０ｍｌ／Ｌ)；およびグルタミン(２ｍＭ)を含有する。
【００７４】
新規Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液：
本発明は新規Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液組成物および使用方法を提供する。Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液は、Ｃｌ−イオン濃度が約２ｍＭ以下に限定されたどの緩衝液でもよい。残留Ｃｌ−イオンは有機アニオングルコン酸塩で置き換えることができる。新規Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝組成物は２５０から３６０ ｍＯｓＭの浸透圧範囲であり、緩衝能力はｐＨ５.５からｐＨ９.０の間である。Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液の浸透圧は本発明方法に用いる細胞型に依る。例えば、ゼノパス卵母細胞などの細胞は２００ ｍＯｓＭ以下の条件下で生存できるが、一方他の細胞型では、１０００ｍＯｓＭまでの高い浸透圧の細胞培養培地とアッセイ緩衝液の、高い浸透圧条件下で生存する。
【００７５】
新規Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液はグルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸マグネシウム、グルコースおよび緩衝液(例えば ＨＥＰＥＳ)を含有する。好ましい新規Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝組成液はグルコン酸ナトリウム(１４０ｍＭ)、グルコン酸カリウム(２.５ｍＭ)、グルコン酸カルシウム(６ｍＭ)、グルコン酸マグネシウム(１ｍＭ)、グルコース(５.６ｍＭ)およびＨＥＰＥＳ(１０ｍＭ)を含有する。
【００７６】
タリウム塩：
本発明方法において、細胞膜を通過するタリウムイオン(つまり、トレーサー)流動はタリウム感受性試薬を用いて測定する。タリウム塩溶液はタリウムイオンを提供する。
【００７７】
本発明方法に用いるタリウム溶液に用いるタリウム塩は水溶性であり、例えばＴｌ２ＳＯ４、Ｔｌ２ＣＯ３、ＴｌＣｌ、ＴｌＯＨ、ＴｌＯＡｃ、ＴｌＮＯ３塩等が挙げられる。
【００７８】
タリウム感受性試薬：
本発明方法は信号発生タリウム感受性試薬を提供する。タリウム感受性試薬は細胞膜を通過するタリウム流動の指示薬として用いられ、十分に感受性であり細胞質のタリウムイオン濃度の変化に応答して蛍光または光学強度の検出可能な変化を起こすものである。検出可能な信号を起こすタリウム感受性試薬としては、これらに限定されないが、蛍光化合物および非蛍光化合物が挙げられる。
【００７９】
タリウム感受性蛍光試薬：
タリウム感受性試薬の本発明の一態様としては、蛍光化合物が挙げられる。本質的に、細胞内に負荷できるいかなるタリウム感受性蛍光化合物も用いることが出来る。好ましくは、化合物はタリウムイオンの低濃度を検出できるように選択される。これらの蛍光化合物はタリウムイオンの存在下で蛍光減少又は増加を示すことが出来る。
【００８０】
好ましいタリウム感受性蛍光試薬としては、これらに限定されないが、ＡＮＴＳ、Ｆｌｕｏ−４、Ｆｌｕｏ−３、ＰＢＦＩ、フェン・グリーン(Phen Green)、マグネシウム・グリーン、ＢＴＣ、ＡＰＴＲＡ−ＢＴＣ、Ｍａｇ−Ｆｕｒａレッド、Ｆｌｕｏ−４ＦＦ、ＦｌｕｏＺｉｎ−１およびＦｌｕｏＺｉｎ−２が好ましい色素である(Molecular Probes Inc.、ージーン、オレゴン州)。ＡＮＴＳ、Ｆｌｕｏ−４、Ｆｌｕｏ−３、ＰＢＦＩ、フェン・グリーン、ＡＰＴＲＡ−ＢＴＣおよびＭａｇ−Ｆｕｒａレッドはタリウムイオンの存在下で蛍光減少を示す。マグネシウム・グリーン、ＢＴＣ、Ｆｌｕｏ−４ＦＦ、ＦｌｕｏＺｉｎ−ｌおよびＦｌｕｏＺｉｎ−２はタリウムイオンで増加する蛍光を示す。タリウム感受性蛍光試薬は親水性でも疎水性であってもよい。
【００８１】
タリウム感受性蛍光試薬は、細胞を色素の膜透過性誘導体を含む溶液に接触させて細胞質内に負荷できるが、しかしながら、もっと疎水性の指示薬を用いることにより、負荷過程は促進される。よって、蛍光指示薬は、非修飾された色素に比べさらに容易に細胞膜に透過できるさらに疎水性のアセトキシメチルエステル(Ａｍ)が良く知られており、入手可能である。色素のアセトキシメチルエステル形が細胞に入った後、エステル基は、細胞質エステラーゼにより除かれ、それにより細胞質に色素は捕獲される。
【００８２】
タリウム感受性試薬の蛍光は蛍光信号を検知できる装置で測定する。装置の一つとしてＦＬＩＰＲ(Molecular Devices Corp.、サニーベール、カルフォルニア)があり、蛍光はタリウムイオンとイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーター調節剤の添加前、添加中、および添加後に、１Ｈｚまでの速度で記録される。非接着細胞に用いる装置としてはＦＬＩＰＲおよびフロー・サイトメーター(flow cytometer)(Becton-Dickenson)が例示できる。
【００８３】
イオンチャネル活性の調節剤を検出する本発明の一態様において、ＢＴＣはタリウム感受性蛍光試薬である。タリウムイオンの存在下、ＢＴＣは４８８ｎｍで励起した場合、蛍光の強い増加を示す。
【００８４】
タリウム感受性試薬およびタリウムイオンの細胞内への輸送は信号の増加または減少を起す。タリウムイオンはその濃度勾配に従って開口したチャネルを通過して移動し、細胞内の色素蛍光強度を変え、よって、記録できる信号を起こす。カチオンチャネルの活性化はタリウムイオンの流入速度を促進し(タリウム感受性蛍光化合物の蛍光変化を起こし)およびその阻害によりタリウムイオンの流入速度を減少させる(タリウム感受性蛍光試薬の蛍光に全くまたは殆ど変化をもたらさない)。一般的に、タリウムイオンがそれに結合していなければ、蛍光はそのまま変化しない。よって、イオンチャネルがチャネル調節剤候補により遮断され、タリウム流入が阻害されていれば、蛍光変化は殆どまたは全く検出されない。
【００８５】
細胞外消光剤：
蛍光タリウム感受性試薬を用いる一態様において、過剰の蛍光化合物は細胞外消光剤の充分量を用いて除かれる。細胞外消光剤の使用により細胞から非負荷されたタリウム感受性蛍光試薬を洗浄する必要を未然に防ぐ。細胞外消光剤は細胞透過性ではなく、タリウム感受性蛍光試薬の蛍光から容易に分離できる蛍光を持つ、光吸収型蛍光化合物である。細胞外消光剤の吸光スペクトルはタリウム感受性蛍光試薬の発光を有意に吸収する。細胞外消光剤は、細胞内へのその経路を阻害する化学組成物でなくてはならず、一般的に消光剤は電荷されるかまたは非常に大きな化合物であるべきである。細胞外消光剤の濃度範囲はマイクロモルからミリモルの範囲であり、その光吸収能に依る。使用できる細胞外消光剤としては、それらに限定されないが、タートラジンおよびアマランス、あるいはそのような消光剤の混合物が挙げられる。消光剤は「色素、染料および指示薬のシグマ・アルドリッチ・ハンドブック」(フロイド、G. グリーン, 1990, セントルイス、ミズーリ州)に記載されている。
【００８６】
タリウム感受性非蛍光試薬：
本発明方法はさらにタリウム感受性非蛍光試薬を提供する。
本発明の一態様において、タイウムイオンと反応して、沈殿物や着色生成物を形成し、よって試験混合物の光学濃度の検出可能な変化を起こす非蛍光化合物であるタリウム感受性試薬の使用を提供する。これらの化合物としては、これらに限定されないが、ヨウ化物、臭化物、およびクロム酸塩が挙げられる。
【００８７】
本発明の一態様において、タリウム感受性試薬が非蛍光化合物である場合、タリウムイオンおよびチャネル調節剤の添加の前、添加中および添加後に吸光度を分光光度計で記録できる。イオンチャネルおよび／または受容体を発現する細胞はヨウ化物、臭化物またはクロム酸塩で負荷される。細胞を、例えば、緩衝生理食塩水で洗浄する。タリウムイオンの細胞内への輸送は光学濃度信号の増加または減少を起こす。タリウムイオンは、その濃度勾配に従って開口したチャネルを通過し、細胞内の光学濃度を変え、記録できる信号を起こす。カチオンチャネルの活性化はタリウムイオンの流入速度を促進し(沈殿物または着色生成物の形成を増加する)およびその阻害によりタリウムイオンの流入速度を減少させる(沈殿物または着色生成物の生成に全くまたは殆ど変化をもたらさない)。一般的に、タリウムイオンが非蛍光化合物と反応しなければ、光学濃度はそのままで変化しない。よって、イオンチャネルが遮断され、タリウムイオン流入が阻害されると、光学濃度変化は殆どまたは全く検出されない。
【００８８】
調節剤候補：
本発明はイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーター活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。基本的には、本発明のアッセイには潜在的な調節剤としていかなる化学物質も使用することができるが、水溶液または有機(特にＤＭＳＯを基礎とした)溶液に溶解できる化合物が好ましい。シグマ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Co.、セントルイス、ミズーリ州)、アルドリッチ・ケミカル・カンパニー(Aldrich Chemical Co.、セントルイス、ミズーリ州)、シグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)、フルカ・ケミカ・バイオケミカ・アナラチカ(Fluka Chemika-Biochemica Analytika、バッチス、スイス)などの多くの化学物質の商業的供給者が存在することは、この分野の技術者に認識されるであろう。
【００８９】
イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体およびイオントランスポーターの例は上記で例示した。
【００９０】
ハイスループットスクリーニング(High-Throushput Screening)法：
本発明方法はハイスループットスクリーニング用に適合できる。ハイスループットスクリーニング法は既知であり、マイクロタイタープレートまたはピコ、ナノまたはマイクロリッターアレイの使用を採用する。
【００９１】
本発明のハイスループット法は、対象のイオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを発現する細胞全膜を用いて行い、以下の工程を含む。１)好適な条件下で細胞を培養し；２)要すれば、細胞を固体支持体上に接着させ；３)細胞を検出可能な信号を生成する細胞透過性タリウム感受性試薬で負荷し；４)好適な条件下で細胞を処理(洗浄または細胞外消光剤の添加)して過剰のタリウム感受性試薬を除き;５)検出可能な信号を測定し；６)タリウムイオンと適した刺激剤溶液を含む溶液を加え；７)調節化合物候補を加え；８)検出可能な信号を測定し：および９)検出可能な信号の変化を記録する(つまり、タリウムイオン、刺激剤溶液および調節化合物の添加の前後)。検出可能な信号の変化はチャネル調節剤の効果を示す。
【００９２】
本発明のアッセイは、大きなケミカル・ライブラリーのハイスループットスクリーニングを可能とするよう、例えばアッセイ工程を自動化し、いかなる通常の供給源からの調節化合物候補をアッセイに提供するように設計されている。固体支持体上で並行して行われるアッセイ(例えば、ロボット利用アッセイにおいてマイクロタイタープレート上のマイクロタイターフォーマット)は良く知られている。自動化システムおよび光学検出(または信号)の変化を検出および測定する方法は良く知られている(米国特許第６,１７１,７８０；５,９８５,２１４；６,０５７,１１４)。
【００９３】
本発明のハイスループットスクリーニング法は多数の潜在的な治療用調節化合物を包含するコンビナトリアル・ライブラリーを提供することを含む(ボーマン、S, C. & E News, 1999, 70 (10), 33-48)。コンビナトリアル・ケミカル・ライブラリーの調製およびスクリーニングは本分野の技術者によく知られている。
【００９４】
コンビナトリアル・ケミカル・ライブラリーは、化学合成や生物学的合成を用いて得られる、多様な化学基礎的要素、例えば試薬等を集めた、多種多様の化学物質のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの一次コンビナトリアル・ケミカル・ライブラリーは、与えられた化合物長(ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数)にする為のすべての可能な方法で、一連の化学基礎的要素(アミノ酸)の結合して形成される。数百万の化学物質が、このような化学基礎的要素をコンビナトリアル的に混合することにより合成される。
【００９５】
そのようなコンビナトリアル・ケミカル・ライブラリーとしては、これらに限定されないが、ペプチドライブラリーがある(米国特許第５,０１０,１７５、Furka, Int. J. Pept. Prot. Res., 1991, 37: 487-493およびホートンら、Nature, 1991, 354, 84-88)。化学的多様なライブラリーを作り出す為の他のケミストリーも用いることも出来る。そのようなケミストリーとしては、これらに限定されないが、ペプトイド(ＰＣＴ公開公報ＷＯ ９１／１９７３５); コードされたペプチド(ＰＣＴ公開公報ＷＯ ９３／２０２４２)；ランダム・バイオオリゴマー(ＰＣＴ公開公報ＷＯ ９２／０００９１)；ベンゾジアゼピン(米国特許第５,２８８,５１４)；ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー(diversomers)(ホブスら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 6909-6913)；ビニル性ポリペプチド(ハギハラら、J. Amer. Chem. Soc. 1992, 114, 6568)；ベータ−Ｄ−グルコース・スカフォルディングとの非ペプチド性ペプチド模倣(peptidomimetics)(ハーシュマンら、J. Amer. Chem. Soc., 1992, 114, 9217-9218)；小化合物ライブラリーの類似体有機合成(チェンら、J, Amer. Chem. Soc., 1994, 116, 2661；アームストロングら、Acc. Chem. Res., 1996, 29, 123-131)；あるいは小有機分子ライブラリー(例えば、ベンゾジアゼピン、バーム C & E News, 1993, Jan. 18, page 33)；オリゴカルバメート(チョら、Science, 1993, 261, 1303)；および／またはホスホン酸塩ペプチジル(キャンベルら、J. Org. Chem. 1994, 59, 658)；核酸ライブラリー(セリガー, Ｈら、Nucleotides & Nucleotides, 1997, 16, 703-710)；ペプチド核酸ライブラリー(米国特許第５,５３９,０８３参照)；抗体ライブラリー(バーンら、Nature Biotechnology, 1996, 14(3), 309-314およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７参照)；炭水化物ライブラリー(リャンら、Science, 1996, 274, 1520-1522および米国特許第５,５９３,８５３、ニルソン, UJら、Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 1999 2, 335-352；シュワイザー, F; ヒンドガール, O., Current Opinion In Chemical Biology, 1999 3, 291-298)；イソプレノイド(米国特許第５,５６９,５８８)；チアゾリジノンおよびメタチアザノン(米国特許第５,５４９,９７４)；ピロリジン(米国特許第５,５２５,７３５および５,５１９,１３４)；モルホリノ化合物(米国特許第５,５０６,３３７)；ベンゾジアゼピン(米国特許第５,２８８,５１４)および他の同様の技術。
【００９６】
コンビナトリアル・ライブラリーの調製の為の装置は市販されている(例えば、３５７ ＭＰＳ、３９０ ＭＰＳ、Advanced Chem. Tech.,ルイビル、ケンタッキー州、Symphony, Rainin, ウォバーン、マサチューセッツ州、433A Applied Biosystems, ホスターシティー、カルフォルニア州、9050 Plus, Millipore,ベッドフォード、マサチューセッツ州)。さらに、多くのコンビナトリアル・ライブラリーそのものが市販されている(例えば、ComGenex、プリンストン、ニュージャージー州、Asinex, モスクワ、ロシア、Tripos, Inc., セントルイス、ミズーリ州、ChemStar, Ltd., モスクワ、ロシア、3D Pharmaceuticals、エクストン、ペンシルベニア州、Martek Bio sciences、コロンビア、メリーランド州等参照)。
【００９７】
コンビナトリアル・ケミカル・ライブラリーはここで開示の１つまたは複数のアッセイでスクリーニングされて、標的イオンチャネル活性(ボーマン, S., 上記；ダガミ, R., C. & E. News, 1999, 70 (10), 51-60)、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性の調節能を発揮するライブラリー構成化合物(特に、化学スペシーズまたはサブクラス)を同定する。このように同定された調節化合物は、通常のリード化合物としての役目をし、または潜在的または実際的な治療剤としてそのものを使用することができる。
【００９８】
ハイスループットアッセイにおいて、アッセイの成分が適宜に機能していることを確認するためポジティブ対照を用いることが望ましい。ポジティブ対照の例において、既知のカチオンチャネル開口剤化合物をアッセイの試験混合物と接触させ、得られたカチオンチャネル活性の増加をここに開示の方法に従って測定する。ポジティブ対照の他の例において、カチオンチャネルを発現する細胞には、既知のカチオンチャネル遮断薬化合物を加えることができ、得られたカチオンチャネル活性の減少を同様にして検出する。イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターに既知の効果を持つ化合物と調節剤候補が結合できることは、当然認識されるであろう。例えば、既知のカチオンチャネル開口剤または遮断薬は、そうでなければ既知のイオンチャネル調節剤の存在により引き起こされであろう、カチオンチャネル活性化または抑制に影響を与える調節剤を発見するために用いることが出来る。
【００９９】
本発明のハイスループットアッセイにおいては、数千個までの異なる調節剤候補を１日でスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタッタープレートの各ウェルを、選択した潜在的調節剤に対する分離したアッセイを行うことに用いることができ、または濃度またはインキュベーション時間効果が観察されるなら、各５〜１０個ずつのウェルで単一調節剤を試験することができる。よって、１枚の標準マイクロタッタープレートで約１００(９６)個の調節剤を試験することができる。１５３６穴プレートを用いるならば、１枚のプレートで約１００〜約１５００個の異なる化合物を容易に試験することが出来る。１日あたり多くの異なるプレートを試験することも可能である。約６,０００〜２０,０００の、さらには約１００,０００〜１,０００,０００個の異なる調節剤化合物候補をアッセイスクリーニングすることが本発明方法を用いることにより可能である。
【発明の開示】
【発明の効果】
【０１００】
本発明は、多様な方法でイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤を検出し特性決定できる現行の技術の改良を示す。例えば、(ａ)放射活性試薬の必要がない；(ｂ)方法はタリウムイオンの透過性を利用している；(ｃ)イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性をタリウムイオン流動のみでモニターし、生理学的関連イオンの存在により混乱されない；(ｄ)イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの化学的または生化学的修飾の必要がない；(ｅ)アッセイは細胞全膜で実施でき、特に新規な低Ｃｌ−細胞培養培地と新規なＣｌ−−フリーアッセイ緩衝液を用いて行うことができる；(ｆ)アッセイにより発生した信号または発光は、従来既知の光学手法を用いて一般的に得られるものより、有意に大きく、さらの強固である；(ｇ)信号変化は調節剤候補の存在によりで発生し、よって特異な調節試薬の同定が容易にできる；(ｈ)現在入手可能な多様なタリウム感受性試薬がある；(ｉ)アッセイ過程において、アッセイフォーマットはイオンチャネルおよび／または受容体を固体支持体上に固定することを要しない；および(ｊ)記載の各フォーマットは容易に自動化およびハイスループットスクリーニング用に変更可能である。
【０１０１】
下記の実施例は本発明方法および化合物を例示するために、また通常の技術者がこれを合成したり使用したりするのを助けるために提示する。実施例はここに特許される特許証により許される保護の開示範囲を制限するためのものではない。
【実施例１】
【０１０２】
本実施例は哺乳動物細胞での対象のイオンチャネルの発現を説明する。
【表１】
2008264004.tif 000002
【０１０３】
表１は実施例中のタリウム感受性アッセイで用いるＤＮＡ構築物を示す。各クローン物の制限サイトは、対象のイオンチャネルｃＤＮＡが如何にして哺乳動物細胞発現に必要なＤＮＡベクターにサブクローンされるかを例示する(ｐＣＤＮＡ３(インビトロゲン、カールスバッド、カルフォルニア)およびｐｌＲＥＳｎｅｏ(クローンテック、パロ・アルト、カルフォルニア))。安定なセルラインの選択および調製に用いる細胞型(ＨＥＫ；ヒト胎児腎臓細胞)および抗生物質の濃度を示す。標準的分子生物学的手法が表１に列記したイオンチャネル遺伝子のクローニングで用いた。詳細なクローニング技術もまた文献に記載されている(ＨＳｌｏ／ＢＫ(ドウオレツキ, SI.ら、Mol. Brain Res.. 27: 189-193)；ＫＣＮＱ２(特許ＷＯ ９９／０７８３２)；ＳＫチャネル(ケーラー,Mら、Science 1996, 273: 1709-1714)；およびＶＲ１(M J カテリナら、Nature 1997, 389: 816-824))。
【０１０４】
ＶＲ１−ｐＩＲＥＳｎｅｏをリポフェクタミン プラス(Lipofectamine PLUS、Life Technologies)トランスフェクション・キット・プロトコールを用いて、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。ｈＳＫ−ｐＣＤＮＡ３、ｈｓｌｏ(ＢＫ)-ｐＣＤＮＡ３およびｍＫＣＮＱ２−ｐＣＤＮＡ３を、リポフェクタミン プラス(Life Technologies)トランスフェクション・キット・プロトコールを用いて別々にＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトした。細胞はＣＨＯ細胞には５００μｇ／ｍｌの濃度で、ＨＥＫ２９３細胞には８００μｇ／ｍｌの濃度で、Ｇ４１８(Life Technologies)を用いて選択した。薬剤選択の１２日後、各セルラインのタリウム流入アッセイを用いて、ここに記載(実施例２)のとおりにチャネル発現を分析した。ＦＬＩＰＲマニュアルに記載の、ＣＨＯ細胞でのカルシウム応答の測定指示に従い、カルシウム感受性色素Ｆｌｕｏ−３を用いて、ｈＶＲ１発現ＣＨＯ細胞をチャネルの細胞内カルシウム増加能で評価した(Molecular Devices,サニーベール、カリフォルニア州)。
【実施例２】
【０１０５】
本実施例は、ペプチド阻害剤アパミン(Sigma Chemical Co., セントルイス、ミズーリ州；ハチ毒より)の、スモールコンダクタンスカルシウム賦活Ｋ＋チャネル(ＳＫ２)(ケーラー, M.ら、Science 1996, 273:1709-14)に対する効果を測定する、タリウム流入の尺度としてＢＴＣ蛍光変化を用いる本発明のタリウム流入アッセイの能力を例示する。
【０１０６】
スモールコンダクタンスカルシウム賦活Ｋ＋チャネル(ＳＫ２)を安定的に発現するＨＥＫ−２９３セルライン(ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州から入手)を、ポリ−Ｄ−リジンプレートで被膜し、低Ｃｌ−細胞培養培地を２０μｌ／ウェルで含有した３８４穴マイクロタイタープレートに約８０％コンフルエンスで植種した。細胞は３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター内で終夜静置培養した。
【０１０７】
細胞含有プレートをインキュベーターから取り除き、アマランスとタルトラジン(本アッセイでの最終濃度はアマランスは２ｍＭで、タルトラジンは１ｍＭ)含有Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液２０μＬ／ウェルに溶解した、２μＭ ＢＴＣ−ＡＭ(Molecular Probes、ユージーン、オレゴン州)で約１５分間負荷した。ＢＴＣのＡＭエステル(ＢＴＣ−ＡＭ)は膜透過性である。これは膜を越えて拡散するので、細胞性エステラーゼにより切断されて、荷電された膜非透過性色素ＢＴＣを生成する。これらのタイプの色素および負荷メカニズムは本技術に精通した技術者には良く知られている。
【０１０８】
一旦負荷されると、アパミン(表ＩＩのＣｌ−−フリーアッセイ緩衝液に溶解した５００ｎＭ保存液を５μｌ／ウェル、あるいはＣｌ−−フリーアッセイ緩衝液の同容量)を加えた。ついでマイクロタイタープレートをプレートリーダー、ＦＬＩＰＲに移す。アパミンまたはＣｌ−−フリーアッセイ緩衝液単独に曝露した後あるいは同時に、２ｍＭアマランスと１ｍＭタルトラジン含有Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液に溶解した、５μＭのイノマイシン(Calbiochem)と７.５ｍＭのＴｌ２ＳＯ４を含有する刺激剤緩衝液５μｌ／ウェルに、細胞を曝露した。
【０１０９】
示されるすべてのデータはＦＬＩＰＲ(Molecular Devices、サニーベール、カリフォルニア州)を用いて集めた。好適な標準プロトコールでは、刺激剤緩衝液の添加前ベースラインとして１Ｈｚにて１分１０秒間データを取得する。
【０１１０】
ＳＫ２、スモールコンダクタンスカルシウム賦活Ｋ＋チャネルの活性化および遮断を測定するタリウム流入技術の能力は図１に示された。
【０１１１】
安定なベースライン蛍光が、カルシウムイオノフォア、イノマイシンおよびタリウムイオンの添加前に、ＳＫ２チャネル遮断薬アパミンの存在下または非存在下で培養した細胞で観察された。タリウムイオンとイノマイシン(細胞内カルシウムの増加とそれに続くＳＫ２の活性化を起こす)の添加により、ＢＴＣ蛍光の実質的増加が観察された。蛍光のこの増加はＳＫ２遮断薬アパミンの添加により完全に消失した。ＢＴＣ蛍光のアパミン感受性増加は、同様の条件下の天然のトランスフェクトされていないＨＥＫ細胞では観察されず、またはイノマイシンの非存在下でタリウムの添加では観察されないことから、これらの結果はＳＫ２チャネルの活性化を測定するタリウム流入アッセイ能を明確に例示する。これらのデータはまたカルシウム賦活ＳＫ２チャネルの遮断薬を同定するこのアッセイの能力を例示する。
【０１１２】
細胞培養培地とアッセイ緩衝液に用いるすべての試薬はシグマ・アルドリッチ(セントルイス、ミズーリ州)から入手したが、１００Ｘ ビタミンと５０Ｘ アミノ酸溶液はライフ・テクノロジー(ロックビル、メリーランド州)から入手した。試薬に用いた記号表示は供給者から提供されたものあった。
【０１１３】
【表２】
2008264004.tif 000003
【０１１４】
【表３】
2008264004.tif 000004
【実施例３】
【０１１５】
本実施例は、タリウム流入の尺度としてＢＴＣ蛍光の変化を利用するＣａ２＋感受性電位依存性Ｍａｘｉ−Ｋチャネルを遮断または開口する化合物を検出するための、本発明のタリウム流入アッセイの使用を例示する。
【０１１６】
この実施例のすべての実験条件は以下の点を除いて実施例２と同じであった。
１.ＨＥＫ−２９３細胞をＭａｘｉ−Ｋチャネルで安定的にトランスフェクトした。ラージコンダクタンスカルシウム賦活Ｋ＋チャネル、Ｍａｘｉ−Ｋチャネルを発現する細胞を用いた(ドオレツキ SI, トロジナッキ JT, グリブロフ VK、Brain Res Mol Brain Res. 1994, 1: 189-93) (aka BK, slo)；および
２.用いたチャネル開口剤はＮＳ−１６１９(シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州)を１５μＭの最終濃度で用いた。用いたチャネル遮断薬はイベリオトキシン(Iberiotoxin、シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州)を１００ｎＭの最終濃度で用いた。
【０１１７】
チャネル遮断薬を検出するために、アッセイは１１μｌの刺激剤緩衝液(２ｍＭのアマランスと１ｍＭのタートラジン含有Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液(表ＩＩ)に溶解した、１５μＭイノマイシン、１２.５ Ｔｌ２ＳＯ４および５０ｍＭ Ｋ２ＳＯ４含有)を添加して開始した。
【０１１８】
チャネル開口剤を検出するために、刺激剤緩衝液は、１５μＭ イノマイシンの替わりに５μＭイノマイシンを用いる以外は、チャネル遮断薬のアッセイ条件と同一であった。これらの条件下、チャネルは亜最大的に開口し、チャネル開口剤を観察できた。
【０１１９】
Ｍａｘｉ−Ｋ、ラージコンダクタンスカルシウムおよび電位依存性Ｋ＋チャネルの活性化および阻害の測定を可能にするタリウム流入技術の能力は図２に例示する。
【０１２０】
安定なベースライン蛍光は、イノマイシンおよび超生理学的カリウムの添加前に、ＨＥＫ細胞脱分極およびタリウム流入を起こす、Ｍａｘｉ−Ｋチャネル遮断薬イベリオトキシンまたはＭａｘｉ−Ｋチャネル開口剤 ＮＳ−１６１９の存在下または非存在下で培養した細胞で観察される。タリウム、イノマイシンおよびカリウムイオンの添加により、ＢＴＣ蛍光の相当な増加が観察される。蛍光のこの増加はイベリオトキシンの添加により完全に消失した(図２Ａ)。Ｍａｘｉ−Ｋチャネルの小幅な開口を起こすわずかに異なる条件下では、ＮＳ−１６１９の添加により、ＮＳ−１６１９非存在下で観察されるものと比べ、ＢＴＣ蛍光のタリウム誘発増加を著しく増加した。イベロトキシンやＮＳ−１６１９は両者とも、天然のトランスフェクトされていないＨＥＫ細胞に負荷されたＢＴＣの蛍光に影響を与えなかった。これらの結果から、カルシウムおよび電位依存性Ｍａｘｉ−Ｋチャネルの遮断薬および開口剤の両方を同定する、またはこれらの調節剤の活性を測定する、タリウム流入技術の能力を明確に示す。
【実施例４】
【０１２１】
本実施例は、タリウム流入の尺度としてＢＴＣ蛍光変化を用いて、電位依存性Ｋ＋チャネル ＫＣＮＱ２(欧州特許第ＷＯ ９９／０７８３２)を遮断する、または開口する化合物を検出する、タリウム流入アッセイの能力を例示する。
【０１２２】
この実施例のすべての実験条件は以下の例外を除いて、実施例２と同じであった。
１.電位依存性Ｋ＋チャネルＫＣＮＱ２で安定にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３セルラインを用いた；
２.用いたチャネル開口剤は最終濃度１５μＭのレチガビン(retigabine)であった(メイン, M. J.ら、Mol. Pharmacol., 2000, 58, 253-62)；および
３.用いたチャネル遮断薬ＤＭＰ-５４３(ザックゼック、Ｒら、J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998, 285, 724-30)は最終濃度１５μＭであった。
【０１２３】
チャネル遮断薬を検出するために、ＫＣＮＱ２チャネルをタリウムイオン(５ｍＭ)とＫ＋(２０ｍＭ)の組み合わせで開口した。開口剤を検出するために、アッセイはタリウムイオン(３ｍＭ)で開始した。
【０１２４】
チャネル遮断薬を検出するために、刺激剤緩衝液(２ｍＭアマランスおよび１ｍＭタートラジン含有Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液(表ＩＩ)に溶解した１２.５ｍＭ Ｔｌ２ＳＯ４、５０ｍＭ Ｋ２ＳＯ４含有)１１μｌを加えて、アッセイを開始した。
【０１２５】
開口剤を検出するために、刺激剤緩衝液(２ｍＭアマランスおよび１ｍＭタートラジン含有Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液に溶解した７.５ｍＭ Ｔｌ２ＳＯ４含有)１１μｌを加えて、アッセイを開始した。
【０１２６】
ＫＣＮＱ２電位依存性Ｋ＋チャネルの活性化および遮断を測定可能にするタリウム流入技術の能力は図３に示す。安定なベースライン蛍光はタリウムおよび超生理学的カリウムの添加(ＨＥＫ細胞の脱分極化を起こす)前に、ＫＣＮＱ２チャネル遮断薬ＤＭＰ−５４３またはＫＣＮＱ２チャネル開口剤レチガビンの存在下または非存在下で培養した細胞で観察される。タリウムおよびカリウムの添加により、ＢＴＣ蛍光の大きな増加が観察された。蛍光のこの増加はＤＭＰ−５４３の添加により完全に消失した(図３Ａ)。ＫＣＮＱ２チャネルの小幅な開口に有利なわずかに異なる条件下では、ＫＣＮＱ２開口剤レチガビンの添加により、レチガビン非存在下で観察されるものと比べ、ＢＴＣ蛍光のタリウム誘発増加を著しく増加した(図３Ｂ)。ＤＭＰ−５４３やレチガビンは両者とも、天然のトランスフェクトされていないＨＥＫ細胞に負荷されたＢＴＣの蛍光に影響を与えなかった。これらの結果から、電位依存性ＫＣＮＱ２チャネルの遮断薬および開口剤の両方を同定し、またこれらの調節剤の活性を測定する、タリウム流入技術の能力が明確に示される。
【実施例５】
【０１２７】
本発明は、タリウム流入の尺度としてＢＴＣ蛍光の変動を用いる、リガンド依存性、非選択的カチオンチャネル、ＶＲ１(カプサイシン受容体)(カテリナＭＪら、Nature 1997, 389, 816-824)の調節剤を検出するタリウム流入技術の能力を例示する。
この実施例のすべての実験条件は以下の例外を除いて、実施例２と同じであった。
１７.非選択的カチオンチャネル バニロイド受容体(ＶＲ１)を安定に発現するセルラインＣＨＯを用いた； 
１８.チャネルアンタゴニスト、カプサゼピン(capsazepine、シグマ・アルドリッチ、ＲＢＩ、セントルイス、ミズーリ州)を１０μＭの最終濃度で用いた；および
１９.刺激剤緩衝液(２ｍＭアマランスおよび１ｍＭタートラジン含有Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液に溶解した、１ｍＭカプサイシンおよび７.５ｍＭ Ｔｌ２ＳＯ４含有)５μｌを加えて、アッセイを開始した。
【０１２８】
ＶＲ１リガンド依存性、非選択的カチオンチャネルの活性化および阻害を測定可能にするタリウム流入アッセイの能力を図４の通り例示した。
【０１２９】
安定なベースライン蛍光は、タリウムおよびＶＲ１アゴニスト、カプサイシンの添加前に、ＶＲ１アンタゴニスト、カプサゼピンの存在下または非存在下で培養した細胞で観察された。タリウムおよびカプサイシンの添加により、ＢＴＣ蛍光の実質的な増加が観察された。蛍光のこの増加はカプサゼピンの添加により完全に消失した。ＢＴＣのカルシウム感受性により、ＶＲ１発現ＣＨＯ細胞のＢＴＣ蛍光は、カプサイシン単独では減少は僅かでが、増加は示さなかった。カプサゼピン単独ではＶＲ１発現ＣＨＯ細胞に負荷したＢＴＣ蛍光に影響を与えない。これらのデータより、リガンド依存性、非選択的カチオンチャネルＶＲ１のアゴニストおよびアンタゴニスト両者を同定し、これらの調節剤の活性を測定する、タリウム流入技術の能力が明確に例示される。
【実施例６】
【０１３０】
本発明は、スモールコンダクタンスカルシウム賦活Ｋ＋チャネル(ＳＫ２)の阻害剤検出のための、タリウム流出技術の能力を例示する。
この実施例のすべての実験条件は以下の例外を除いて、実施例２と同じであった。
細胞を２μＭ ＢＴＣ−ＡＭで負荷する代わりに、２μＭのＦｌｕｏＺｉｎ−１(Molecular Probes、ユージーン、オレゴン州)で負荷した。
ＦｌｕｏＺｉｎ−１で細胞を負荷後、細胞を７.５ｍＭのＴｌ２ＳＯ４含有Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液 １０μｌ／ウェルに、１０分間室温下で曝露した。この工程ではタリウムイオン感受性蛍光色素ＦｌｕｏＺｉｎ−１と相互反応し、その蛍光を増加させるタリウムで細胞を負荷した。
【０１３１】
タリウムイオンで細胞を負荷後、細胞を洗浄する溶液を吸引除去し、Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液 ８０μｌ／ウェルで置換した。８０μｌ／ウェルのＣｌ−−フリーアッセイ緩衝液を直ちに吸引除去し、２ｍＭアマランスおよび１ｍＭタートラジン含有Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液４０μｌ／ウェルで置換した。
【０１３２】
要すれば、タリウムイオンとＦｌｕｏＺｉｎ−１負荷細胞を測定の為にＦＬＩＰＲに移す前に、アパミン(Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液に溶解した５μＭ保存溶液を１０μｌ／ウェル)または等量のアパミン非含有のＣｌ−−フリーアッセイ緩衝液を加えた。
【０１３３】
ＳＫ２およびＳＫ２遮断薬アパミンの活性を検出するために、刺激剤緩衝液(Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液に溶解した５μＭのイノマイシン含有)１３μｌ／ウェルを加えて、アッセイを開始した。対照として、いくつかのウェルはＣｌ−−フリーアッセイ緩衝液単独で処理し、イノマイシンは加えなかった。
【０１３４】
ＳＫ２の活性およびアパミンによるその阻害を、タリウム流出技術を利用して測定する能力を図５に示す。ＳＫ２遮断薬アパミンの存在下または非存在下で、同様のベースライン蛍光が細胞内で観察された。イノマイシンの添加により、ＦｌｕｏＺｉｎ−１から離れ、活性化ＳＫチャネルの介して細胞を出て行くタリウムイオンにより、蛍光の減少が観察された。蛍光のこの減少はイノマイシンの添加なしでは存在せず、ＳＫ２遮断薬アパミンの存在により殆ど消失した。これらのデータより、ＳＫ２の活性およびアパミンによるその阻害を検出するためのタリウム流出技術の能力が明快に例示される。
【実施例７】
【０１３５】
本発明は、スモールコンダクタンスカルシウム賦活Ｋ＋チャネル、ＳＫ２の活性化を通じて、Ｇタンパク質連結型受容体、ムスカリン様アセチルコリン受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを検出するタリウム流入技術の能力を例示する。
この実施例のすべての実験条件は以下の例外を除いて、実施例２と同じであった。
同じＳＫ２発現ＨＥＫ−２９３細胞を用いた。ＨＥＫ−２９３細胞は本来的にムスカリン様アセチルコリン受容体を発現する。
選択された細胞をＳＫ２遮断薬アパミンでプレインキュベーションする代わりに、いくつかのウェルをアセチルコリン受容体アンタゴニスト、アントロピン１０μＭでプレインキュベーションした。
ムスカリン性受容体のアゴニストの活性を検出するために、Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液に溶解した、ムスカリン性受容体アゴニスト、オキソトレモリン−Ｍ(オキソ−Ｍ)を１０μＭ含有のタリウム含有刺激剤緩衝液１３μｌ／ウェルを添加して、アッセイを開始した。対照として、オキソ−Ｍを添加せず、Ｃｌ−−フリーアッセイ緩衝液単独でいくつかのウェルを処理した。
【０１３６】
タリウム流入技術を利用して、ＳＫ２Ｋ＋チャネルの活性化を介して、ムスカリン様アセチルコリン受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを検出する能力は図６に示す。安定なベースライン蛍光は、アセチルコリン受容体アンタゴニスト、アトロピンの存在下または非存在下の細胞で観察された。オキソ−Ｍの添加により、ＢＴＣ蛍光の増加が見られた。蛍光のこの増加はオキソ−Ｍの添加が無ければ存在しなかった。さらに、ＢＴＣ蛍光のオキソ−Ｍ刺激による増加はアトロピンの存在により完全に妨害された。これらのデータにより、ＳＫ２Ｋ＋チャネルの活性化を介して、Ｇタンパク質連結型ムスカリン様アセチルコリン受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを検出する、タリウム流出技術の能力が明快に例示された。
【実施例８】
【０１３７】
本実施例はハイスループットスクリーニングへのタリウム流入アッセイの適用性を例示する。
イオンチャネルヘの選択性を示す調節剤を素早くスクリーニングし、試験するために、３８４穴ＦＬＩＰＲを用いた。この装置は同時に光学的に、３８４穴マイクロテスト・プレートの各ウェルにある細胞の蛍光変化を測定する(図５)。
【０１３８】
電位依存性Ｋ＋チャネルを、実施例４のＫＣＮＱ２で前述したものと同様の条件を用いて、開口剤化合物および遮断薬化合物の両方でスクリーニングした。スクリーニングは、約４８,０００試料／８時間の速度でスタッカーを備えたモレチュラー・デバイシスＦＬＩＰＲ３８４を用いて、一人で行った。
【０１３９】
タリウム流動アッセイで同定される遮断薬および開口剤化合物は、ゼノパス卵母細胞に発現される同じ電位依存性チャネルを用い、２極電位クランプにより検証した(バーナード, E. A.ら、Proc. R, Soc. Lond., 1982, B215, 241-246；クラフテ, D., レスター, H. A., 1989, J. Neurosci. Meth., 26, 211-215)。検証率は開口剤で８０％以上、遮断薬で８０％以上であった。スクリーニングされた電位依存性Ｋ＋チャネルの正真正銘の開口剤および遮断薬の同定における、タリウム流動アッセイの、１人あたりの試験検体の高い比率と忠実さは、カチオンチャネルの活性を調節できる分子を効率的に発見するためのこのアッセイの有用性を明確にする。
【０１４０】
総合して、本発明方法はリガンドおよび電位依存性チャネル両者、および非選択的カチオンチャネルの調節剤を、ハイスループットスクリーニングに有用なマイクロタイター・プレート・フォーマットで検出できることを、これらの実施例は明瞭に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】実施例２に記載の、Ｃａ２＋賦活スモールコンダクタンスＫ＋チャネル、ＳＫ２のためのタリウム流入アッセイを示す。矢印はイオノマイシン(ionomycin)とタリウムイオンを添加した時点を示す。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、実施例３に記載の、Ｃ２＋賦活ラージコンダクタンスＫ＋チャネル、Ｍａｘｉ−Ｋのためのタリウム流入アッセイを示す。Ａ)：１００ｎＭ ＩＢＴＸ、またはＢ)：１５μＭ ＮＳ―１６１９。矢印はイオノマイシン、タリウムイオンおよびＫ＋を添加した時点を示す。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、実施例４に記載の、電位依存性Ｋ＋チャネル、ＫＣＮＱ２のためのタリウム流入アッセイを示す。Ａ)：１５μＭ ＤＭＰ−５４６またはＢ)：１５μＭ レチガビン(retigabine)。矢印はタリウムイオンまたは(タリウムイオンとＫ＋)を添加した時点を示す。
【図４】実施例５に記載の、リガンド依存性非選択的カチオンチャネル、ＶＲ１(カプサイシン受容体)のためのタリウム流入アッセイを示す。矢印はカプサイシンとタリウムイオンを添加した時点を示す。
【図５】実施例６に記載の、Ｃａ２＋賦活スモールコンダクタンスＫ＋チャネル、ＳＫ２のためのタリウム流出アッセイを示す。矢印はイオノマイシンを添加した時点を示す。
【図６】実施例７に記載の、Ｃａ２＋賦活スモールコンダクタンスＫ＋チャネル、ＳＫ２を介するタリウムイオン流入の検出を通じて連結したムスカリン性アセチルコリン受容体アッセイを示す。矢印はムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト、オキソテレモリン−Ｍ(oxoteremorine-M (oxo-M))を添加した時点を示す。
【図７】実施例９に記載の、標準的タリウム流入アッセイのための典型的実験プロトコールを示す。
【図１】
2008264004.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008264004.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月4日(2008.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程からなる、細胞内に発現されたイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性を検出及び測定する方法：
(ａ)イオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを発現する細胞を、信号発生タリウム感受性試薬と接触させ；
(ｂ)該細胞をイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤候補と接触させ；
(ｃ)タリウム塩溶液を含有するアッセイ緩衝液と該細胞を接触させ；および
(ｄ)信号発生タリウム感受性試薬により生じた信号を検出および測定し、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤候補の、該イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性に対する効果を決定する。
【請求項２】
該イオンチャネルがタリウムイオンに透過性であるカチオンチャネルからなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該カチオンチャネルが、カリウムイオンチャネル、ナトリウムイオンチャネルおよびカルシウムイオンチャネルからなる群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該カチオンチャネルがカリウムイオンチャネルである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
該カリウムイオンチャネルがカルシウム賦活電位依存性チャネルである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
該カリウムイオンチャネルがＳＫチャネル、Ｍａｘｉ−Ｋ、ＨＥＲＧおよびＫＣＮＱチャネルからなる群から選択される、請求項４記載の方法。
【請求項７】
該カチオンチャネルがリガンド依存性ＶＲ１チャネルである、請求項２記載の方法。
【請求項８】
該カチオンチャネルが非選択的イオンチャネルである、請求項２記載の方法。
【請求項９】
該非選択的イオンチャネルが、アセチルコリン受容体、ＡＭＰＡ、カイニン酸およびＮＭＤＡ受容体などのグルタミン酸受容体、５−ヒドロキシトリプタミン依存性受容体チャネル、ＡＴＰ依存性(Ｐ２Ｘ)受容体チャネル、ニコチン酸アセチルコリン依存性受容体チャネル、バニロイド受容体、リアノジン受容体チャネル、ＩＰ３受容体チャネル、細胞内ｃＡＭＰにより原位置(in situ)活性化されたカチオンチャネル、および細胞内ｃＧＭＰで原位置(in situ)活性化されたカチオンチャネルからなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該タリウム塩溶液が水溶性タリウム塩からなる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
該タリウム塩が、Ｔｌ２ＳＯ４、Ｔｌ２ＣＯ３、ＴｌＣｌ、ＴｌＯＨ、ＴｌＮＯ３およびＴｌＯＡｃからなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該タリウム塩がＴｌ２ＳＯ４である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該アッセイ緩衝液がＣｌ−−フリーである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
該アッセイ緩衝液がグルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸マグネシウム、ＨＥＰＥＳおよびグルコースをさらに含有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該細胞を、Ｃｌ−を２ｍＭ以下の濃度で含有する低Ｃｌ−細胞培養培地で培養することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
低Ｃｌ−細胞培養培地がグルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣ０３、グルコン酸カルシウム、ＮａＨ２ＰＯ４、ＨＥＰＥＳ、グルコース、１００Ｘビタミン、５０Ｘアミノ酸およびグルタミンを含有する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該タリウム感受性試薬がタリウム感受性蛍光試薬またはタリウム感受性非蛍光試薬である、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
該タリウム感受性蛍光試薬が、ＡＮＴＳ、Ｆｌｕｏ−４、Ｆｌｕｏ−３、ＰＢＦＩ、フェン・グリーン、マグネシウム・グリーン、ＡＰＴＲＡ−ＢＴＣ、Ｆｌｕｏ−４ＦＦ、ＦｌｕｏＺｉｎ−１、ＦｌｕｏＺｉｎ−２、Ｍａｇ−ＦｕｒａレッドおよびＢＴＣからなる群から選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
該タリウム感受性試薬がタリウム感受性非蛍光試薬である、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
該タリウム感受性非蛍光試薬が塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該イオンチャネル連結型受容体がＧＰＣＲ、代謝調節型グルタミン酸受容体、ムスカリン様アセチルコリン受容体、ドパミン受容体およびセロトニン受容体からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
該イオントランスポーターがドパミンイオントランスポーター、グルタミン酸イオントランスポーター、セロトニンイオントランスポーター、ナトリウム−カリウム ＡＴＰase、プロトン−カリウム ＡＴＰase、ナトリウム／カルシウムイオン交換体、およびカリウム−塩素イオン共トランスポーターからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
細胞を信号発生タリウム感受性蛍光試薬と接触させる工程後、該細胞をさらに細胞外蛍光消光化合物と接触させることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
該調節化合物候補が、該イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを活性化または阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
タリウム塩溶液に刺激剤溶液をさらに加えることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
刺激剤溶液がイオノフォア、ＫＣｌ、ニコチン、アセチルコリン、ムスカリンおよびカルバミルコリンからなる群から選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
以下の工程からなる、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤を同定する方法：
(ａ)イオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを発現する細胞を信号発生タリウム感受性試薬と接触させ；
(ｂ)該細胞を調節剤候補と接触させ；
(ｃ)タリウム塩溶液を含有するアッセイ緩衝液と細胞を接触させ；および
(ｄ)該イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性に対する調節剤の効果を示す、信号発生タリウム感受性試薬により発生した信号を検出、測定する。
【請求項２８】
工程(ｂ)の後、信号発生タリウム感受性試薬により発生した信号を測定する工程をさらに包含することを特徴とする、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
該調節剤が、該イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを活性化または阻害する、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
タリウム感受性アッセイに用いる新規なＣｌ−−フリーアッセイ緩衝液。
【請求項３１】
該アッセイ緩衝液がグルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸マグネシウム、ＨＥＰＥＳおよび グルコースをさらに含有することを特徴とする、請求項２９の組成物。
【請求項３２】
Ｃｌ−イオン濃度が２ｍＭ以下である、低Ｃｌ−細胞培養培地。
【請求項３３】
低Ｃｌ−細胞培養培地がグルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３、グルコン酸カルシウム、ＮａＨ２ＰＯ４、ＨＥＰＥＳ、グルコース、１００Ｘビタミン、５０Ｘアミノ酸およびグルタミンを含有する、請求項３１記載の組成物。
【請求項３４】
細胞内に発現されたイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性を検出及び測定するためのハイスループット方法であって、以下の工程：
(ａ)イオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを発現する細胞からなる複数の試料の各々を、信号発生タリウム感受性試薬と接触させ、ここで該信号が蛍光および光学信号の変化からなる群から選ばれ、また各試料は複数ウェルアッセイプレートに設置され；
(ｂ)試料を細胞外蛍光消光化合物と接触させ；
(ｃ)該各試料をイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤候補と接触させ；
(ｄ)タリウム塩溶液およびグルコン酸塩を含むアッセイ緩衝液と該各試料を接触させ；ついで
(ｅ)信号発生タリウム感受性試薬により生じた信号を検出および測定し、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤候補の、該イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性に対する効果を決定する、
からなり、その際、信号発生タリウム感受性試薬により生じた信号をイオンチャネル活性の指標とすることを特徴とする方法。
【請求項３５】
該タリウム塩溶液が水溶性タリウム塩の溶液である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
該水溶性タリウム塩が、Ｔｌ2ＳＯ4、Ｔｌ2ＣＯ3、ＴｌＣｌ、ＴｌＯＨ、ＴｌＮＯ3およびＴｌＯＡｃからなる群から選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
該イオンチャネルがタリウムイオンに透過性であるカチオンチャネルからなる、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
該カチオンチャネルが、カリウムイオンチャネル、ナトリウムイオンチャネルおよびカルシウムイオンチャネルからなる群から選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
該カチオンチャネルがカリウムイオンチャネルである、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
該カリウムイオンチャネルがカルシウム賦活電位依存性チャネルである、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
該カリウムイオンチャネルがＳＫチャネル、Ｍａｘｉ−Ｋ、ＨＥＲＧおよびＫＣＮＱチャネルからなる群から選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
該アッセイ緩衝液がＣｌ―−フリーである、請求項３４記載の方法。
【請求項４３】
該アッセイ緩衝液がグルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸マグネシウム、ＨＥＰＥＳおよびグルコースをさらに含有する、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
該タリウム感受性試薬がタリウム感受性蛍光試薬またはタリウム非感受性蛍光試薬である、請求項３４記載の方法。
【請求項４５】
該タリウム感受性蛍光試薬が、ＡＮＴＳ〔８−アミノナフタレン−１,３,６−トリスルホン酸ジナトリウム塩〕、Ｆｌｕｏ−４〔４−（６−アセトキシメトキシ−２，７−ジフルオロ−３−オキソ−９−キサンテニル）−４’−メチル−２，２’−（エチレンジオキシ）ジアニリン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸・テトラキス（アセトキシメチル）エステル〕、Ｆｌｕｏ−３〔４−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−９−キサンテニル）−４’−メチル−２，２’−（エチレンジオキシ）ジアニリン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸〕、ＰＢＦＩ〔ビス（アセチルオキシメチル）・４−〔６−〔１６−〔２−〔２，４−ビス（アセチルオキシメトキシカルボニル）フェニル〕−５−メトキシ−１−ベンゾフラン−６−イル〕−１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシクロオクタデク−７−イル〕−５−メトキシ−１−ベンゾフラン−２−イル〕ベンゼン−１，３−ジカルボキシレート〕、フエン・グリーン〔下記式：
2008264004.tif 000012
で示される化合物〕、マグネシウム・グリーン〔グリシン、Ｎ−〔２−（カルボキシメトキシ）−４−〔〔２’７’−ジクロロ−３’６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９’Ｈ〕キサンテン〕−５−イル）カルボニル〕アミノ〕フェニル〕−Ｎ−（カルボキシメチル）−・ペンタカリウム塩〕、ＡＰＴＲＡ−ＢＴＣ〔ウェブサイトwww.invitrogen.comから入手可能〕、Ｆｌｕｏ−４ＦＦ〔下記式：
2008264004.tif 000013
で示される化合物〕、ＦｌｕｏＺｉｎ−１〔下記式：
2008264004.tif 000014
で示される化合物〕、ＦｌｕｏＺｉｎ−２〔下記式：
2008264004.tif 000015
で示される化合物〕、Ｍａｇ−Ｆｕｒａ〔５−オキサゾールカルボン酸・２−〔５−〔２−〔（アセチルオキシ）メトキシ〕−２−オキソエトキシ〕−６−〔ビス〔２−〔（アセチルオキシ）メトキシ〕−２−オキソエチル〕アミノ〕−２−ベンゾフラニル〕−（アセチルオキシ）メチルエステル〕およびＢＴＣ〔Ｎ−〔２−〔（アセチルオキシ）メトキシ〕−２−オキソエチル〕−Ｎ−〔３−（２−ベンゾチアゾイル）−６−〔２−〔２−〔ビス〔２−〔（アセチルオキシ）メトキシ〕−２−オキソエチル〕アミノ〕−５−メチルフェノキシ〕エトキシ〕−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−７−イル〕グリシン・（アセチルオキシ）メチルエステル〕からなる群から選ばれる、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
該調節化合物候補が、該イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを活性化または阻害する、請求項３４記載の方法。
【請求項４７】
タリウム塩溶液に刺激剤溶液をさらに加えることを特徴とする、請求項３４記載の方法。
【請求項４８】
刺激剤溶液がイオノフォア、ニコチン、アセチルコリン、ムスカリンおよびカルバミルコリンからなる群から選択される、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
該消光剤が細胞非透過性である請求項３４に記載の方法。
【請求項５０】
タリウム感受性蛍光試薬がＢＴＣ、ＦｌｕｏＺｉｎ−１またはＦｌｕｏＺｉｎ−２である請求項１８に記載の方法。
【請求項５１】
該タリウム感受性試薬で発生される信号が、タリウムの不存在下に発生される信号に比べてタリウム存在下に発生する信号がより大である請求項３４に記載の方法。
【請求項５２】
神経生理学的活性の検出および測定のためのハイスループット方法であって、以下の工程：
(ａ)イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体およびイオントランスポーターからなる群から選ばれるメンバーを発現する複数の細胞を、支持体上で増殖に好適な条件下に増殖させ；
(ｂ)該細胞を、蛍光および光学密度の変化からなる群から選ばれる検出しうる信号を発生する細胞透過性のタリウム感受性試薬で負荷させ；
(ｃ)該細胞を過剰のタリウム感受性試薬を除去する処理を行ない；
(ｄ)該細胞透過性タリウム感受性試薬に結合した検出しうる信号を測定し；
(ｅ)刺激溶液およびタリウムイオンを含む溶液を加え；
(ｆ)調節候補化合物の溶液を加え；
(ｇ)該細胞透過性タリウム感受性試薬に結合した検出しうる信号を測定し；ついで
(ｈ)工程(ｄ)と工程(ｇ)の該細胞透過性タリウム感受性試薬に結合した該信号の変化（該信号の変化は調節候補化合物の効果に反映する）を記録して比較する、
からなることを特徴とする神経生理学的活性の検出および測定方法。