(57)【要約】【課題】透明な結晶状の物質だけでなく、生きた生物試料を高い空間的弁別能で、かつ、時間分解能を上げてそのような試料の動的な変化を無染色の状態で観察可能にする。【解決手段】試料照明光路中に偏光子６を配置し、対物レンズ２から撮像面３に至る光路中にクロスニコルの状態で検光子７を配置してなる偏光顕微鏡を使用した観察法であって、偏光子６と試料Ｓの間又は試料Ｓと検光子７の間に可変位相子９を配置して、可変位相子９が与える位相差を経時的に相互に異なる３つの位相差とし、各々の位相差付与時に各１枚の偏光顕微鏡画像を撮像し、取得された３つの画像から試料Ｓの位相差分布画像を算出する偏光顕微鏡観察法。【選択図】図１
2008242022.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単波長の試料照明光路中に偏光子を配置し、対物レンズから撮像面に至る光路中にクロスニコルの状態で検光子を配置してなる偏光顕微鏡を使用した観察法において、
偏光子と試料の間又は試料と検光子の間に可変位相子を配置して、前記可変位相子が与える位相差を経時的に相互に異なる３つの位相差とし、各々の位相差付与時に各１枚の偏光顕微鏡画像を撮像し、取得された３つの画像から試料の位相差分布画像を算出することを特徴とする偏光顕微鏡観察法。
【請求項２】
前記可変位相子で与える位相差をそれぞれθ1 ，θ2 ，θ3 とし、それぞれの位相差θ1 ，θ2 ，θ3 付与時の撮像面での光強度をＩ（ｘ）1 、Ｉ（ｘ）2 、Ｉ（ｘ）3 とするとき（ｘは撮像面での座標）、式（２９）の演算をすることで位相差分布画像Ｒ（ｘ）を算出することを特徴とする請求項１記載の偏光顕微鏡観察法。
Ｒ（ｘ）＝１／２×
｜｛（θ2 2 −θ1 2 ）−ｐ（θ3 2 −θ1 2 ）｝
÷｛（θ2 −θ1 ）−ｐ（θ3 −θ1 ）｝｜    ・・・（２９）
ただし、
ｐ＝（Ｉ（ｘ）2 −Ｉ（ｘ）1 ）／（Ｉ（ｘ）3 −Ｉ（ｘ）1 ）  ・・・（２４）
である。
【請求項３】
前記可変位相子がポッケルスセルからなることを特徴とする請求項１又は２記載の記載の偏光顕微鏡観察法。
【請求項４】
前記可変位相子が液晶素子からなることを特徴とする請求項１又は２記載の記載の偏光顕微鏡観察法。
【請求項５】
前記可変位相子が与える位相差が波長の１／３６以下であることを特徴とする請求項１から４の何れか１項記載の偏光顕微鏡観察法。
【請求項６】
前記可変位相子が与える位相差がθ1 ＝０，θ2 ＝ａ，θ3 ＝−ａであることを特徴とする請求項２記載の偏光顕微鏡観察法。
【請求項７】
前記異なる３つの位相差を周期的に与え、それぞれの位相差のときに撮像された連続する画像を撮影時間間隔ずつずらして得られる連続する３つの画像から各々演算して位相差分布画像を撮影時間間隔毎に連続的に算出することを特徴とする請求項１から６の何れか１項記載の偏光顕微鏡観察法。
【請求項８】
単波長の試料照明光路中に偏光子を配置し、対物レンズから撮像面に至る光路中にクロスニコルの状態で検光子を配置してなる偏光顕微鏡を使用した偏光顕微鏡システムにおいて、
偏光子と試料の間又は試料と検光子の間に可変位相子が配置され、
前記可変位相子が経時的に相互に異なる３つの位相差を発生させるための制御手段と、前記可変位相子が各位相差付与時に同期して各々１枚の偏光顕微鏡画像を撮像する撮像手段と、撮像された３つの偏光顕微鏡画像から試料の位相差分布画像を算出する演算手段と、算出された試料の位相差分布画像を表示する表示手段とを備えていることを特徴とする偏光顕微鏡システム。
【請求項９】
前記制御手段で前記可変位相子によって相互に異なる３つの位相差が周期的に変化するように制御し、前記撮像手段で前記可変位相子の各位相差に同期して各々１枚の偏光顕微鏡画像を撮像し、前記演算手段で前記制御手段によって位相差を変える時間間隔ずつずらしながら連続する３枚の偏光顕微鏡画像から試料の位相差分布画像１枚を算出することで、前記撮像手段での撮影と同じ時間間隔で順に連続して位相差分布画像を得るようにしたことを特徴とする請求項８記載の偏光顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、偏光顕微鏡観察法及び偏光顕微鏡システムに関し、特に、照射光として直線偏光を用いた光学顕微鏡において、可変位相子に経時的に電圧を加え、その電圧印加と同期して偏光顕微鏡画像を取得し、取得画像情報を処理することで、試料の位相差分布画像を得る方法とシステムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来の透過型の通常の光学顕微鏡では、透明な生物試料や透明な結晶・非晶質等の物質は、コントラストが低く識別が不可能であった。生物の場合には、色素で染色して観察する方法がとられてきた。
【０００３】
また、高感度で知られる蛍光顕微鏡でも、固有蛍光を発することのない生物試料の場合には、蛍光色素で染色をして用いる必要があるために、上記と同様に染色による生体への影響を無視することは困難である。
【０００４】
また、従来から用いられている偏光顕微鏡は、透明な繊維状物質、生物試料や岩石、結晶の超薄切片でも、直線偏光を用いて複屈折性の違いを利用することにより観察が可能である。しかし、遅相量（位相差）を定量することに欠けたり、また、観察に時間がかかると共に、偏光顕微鏡の取り扱いに熟練・経験を要するという欠点がある。また、動的に構造が変化する環境条件を与えた場合や、生物のように変化する対象物の場合にも、不都合である。
【０００５】
これを改善する方式として、米国のOldenburg (1996)による液晶制御を用いた偏光顕微鏡が発明され（特許文献１）、これらの欠点を克服するものとして作られた。
【０００６】
しかし、後記する本発明の方法と異なり、２枚の液晶板に各々電圧を加える方式であるために、システムとして複雑となる。また、電圧に対する液晶高分子の変化が数十ミリ秒もかかるために、本質的に高速な画像取得が不可能である。また、１画面を構成するのに４画面を画像処理する必要があると共に、動画像を作製するときには４画面で１画面を合成するために、時間分解能が低いという欠点があった。
【特許文献１】米国特許第５，５２１，７０５号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は従来技術のこのような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、透明な結晶状の物質だけでなく、生きた生物試料を高い空間的弁別能で、かつ、時間分解能を上げてそのような試料の動的な変化を無染色の状態で観察可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の偏光顕微鏡観察法は、単波長の試料照明光路中に偏光子を配置し、対物レンズから撮像面に至る光路中にクロスニコルの状態で検光子を配置してなる偏光顕微鏡を使用した観察法において、
偏光子と試料の間又は試料と検光子の間に可変位相子を配置して、前記可変位相子が与える位相差を経時的に相互に異なる３つの位相差とし、各々の位相差付与時に各１枚の偏光顕微鏡画像を撮像し、取得された３つの画像から試料の位相差分布画像を算出することを特徴とする方法である。
【０００９】
この場合に、前記可変位相子で与える位相差をそれぞれθ1 ，θ2 ，θ3 とし、それぞれの位相差θ1 ，θ2 ，θ3 付与時の撮像面での光強度をＩ（ｘ）1 、Ｉ（ｘ）2 、Ｉ（ｘ）3 とするとき（ｘは撮像面での座標）、式（２９）の演算をすることで位相差分布画像Ｒ（ｘ）を算出することが望ましい。
【００１０】
Ｒ（ｘ）＝１／２×
｜｛（θ2 2 −θ1 2 ）−ｐ（θ3 2 −θ1 2 ）｝
÷｛（θ2 −θ1 ）−ｐ（θ3 −θ1 ）｝｜    ・・・（２９）
ただし、
ｐ＝（Ｉ（ｘ）2 −Ｉ（ｘ）1 ）／（Ｉ（ｘ）3 −Ｉ（ｘ）1 ）  ・・・（２４）
である。
【００１１】
また、前記可変位相子がポッケルスセルから、あるいは、液晶素子からなることが望ましい。
【００１２】
また、前記可変位相子が与える位相差が波長の１／３６以下であることが望ましい。
【００１３】
また、前記可変位相子が与える位相差がθ1 ＝０，θ2 ＝ａ，θ3 ＝−ａであることが望ましい。
【００１４】
また、前記異なる３つの位相差を周期的に与え、それぞれの位相差のときに撮像された連続する画像を撮影時間間隔ずつずらして得られる連続する３つの画像から各々演算して位相差分布画像を撮影時間間隔毎に連続的に算出することもできる。
【００１５】
本発明の偏光顕微鏡システムは、単波長の試料照明光路中に偏光子を配置し、対物レンズから撮像面に至る光路中にクロスニコルの状態で検光子を配置してなる偏光顕微鏡を使用した偏光顕微鏡システムにおいて、
偏光子と試料の間又は試料と検光子の間に可変位相子が配置され、
前記可変位相子が経時的に相互に異なる３つの位相差を発生させるための制御手段と、前記可変位相子が各位相差付与時に同期して各々１枚の偏光顕微鏡画像を撮像する撮像手段と、撮像された３つの偏光顕微鏡画像から試料の位相差分布画像を算出する演算手段と、算出された試料の位相差分布画像を表示する表示手段とを備えていることを特徴とするものである。
【００１６】
この場合に、前記制御手段で前記可変位相子によって相互に異なる３つの位相差が周期的に変化するように制御し、前記撮像手段で前記可変位相子の各位相差に同期して各々１枚の偏光顕微鏡画像を撮像し、前記演算手段で前記制御手段によって位相差を変える時間間隔ずつずらしながら連続する３枚の偏光顕微鏡画像から試料の位相差分布画像１枚を算出することで、前記撮像手段での撮影と同じ時間間隔で順に連続して位相差分布画像を得るようにすることもできる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の偏光顕微鏡観察法及び偏光顕微鏡システムによると、暗黒の画面の中に、複屈折性の分子・物質等の構造物があると、それによる位相差の大きさが光強度として検出できるために、定量的な物質量の測定が可能である。
【００１８】
また、暗黒の中に光る像として数十ｎｍの大きさの分子が観察されるという、非常に高い空間弁別能で識別が可能である。
【００１９】
また、透明な物質に対して無染色で非常に高感度の画像データの収集が可能であり、生物等で染色による影響が出るような場合にも観察が可能である。
【００２０】
また、高倍率の対物レンズを用いて焦点深度を浅くして深さ方向の情報を集めることによって、細胞等の３次元立体構築が可能である。
【００２１】
そして、無染色で生きた状態での生物組織中の細胞や細胞の内部構造に関して、動的に、かつ、高空間弁別能で観察可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、図面の参照にして本発明の偏光顕微鏡観察法及び偏光顕微鏡システムの原理と実施例を説明する。
【００２３】
図１は、本発明の偏光顕微鏡システムの１実施例の構成を示す図であり、偏光顕微鏡は、試料Ｓを載置するステージ１と、対物レンズ２と、対物レンズ２で拡大された試料Ｓの像を撮像するＣＣＤカメラ３と、光源４と、コンデンサー５と、光源４とコンデンサー５の間に配置される直線偏光子（ポーラライザー、偏光子）６と、対物レンズ２とＣＣＤカメラ３の間に配置される直線偏光子（アナライザー、検光子）７と、光源４と直線偏光子（ポーラライザー）６の間に配置され単波長の照明光を透過させる干渉フィルター８と、対物レンズ２と直線偏光子（アナライザー）７の間に配置され所定の位相差を発生させるポッケルスセル９とからなり、ＣＣＤカメラ３で撮影された画像はコンピュータ１０に取り込まれ、また、ポッケルスセル９の位相差はコンピュータ１０からの信号がパラレルポート１１を経てポッケルスセルコントローラ１２によりポッケルスセル９に入力されることで制御される。さらに、コンピュータ１０で演算された位相差分布像はモニター１３上に表示される。
【００２４】
本発明による偏光顕微鏡システムにおいては、位相を重要な情報とするので、単波長の光を照射光源として用いることから、光源４としては、単波長を持ったレーザー光源か、あるいは広い波長の光源である水銀ランプ、キセノンランプ、メタルハライドランプ、ハロゲンランプ等の場合には、干渉フィルター８を通過した単一の波長の光を用いる。光源４としてはレーザー光源を用いる場合は、干渉フィルター８は省いてもよい。
【００２５】
直線偏光子（ポーラライザー）６と直線偏光子（アナライザー）７は、透過軸が相互に直交するクロスニコルの状態に配置され、ポッケルスセル９の光学軸はポーラライザー６の透過軸とアナライザー７の透過軸それぞれに対して４５°の角度をなすように配置される。
【００２６】
なお、ポッケルスセル９は、直線偏光子（ポーラライザー）６と試料Ｓの間に配置しても同じ効果が得られる。
【００２７】
このような光学系では、試料Ｓがない状態では、ＣＣＤカメラ３で撮像される画面が暗黒となるように配置した光学顕微鏡であり、消光比（消光係数＝入射光輝度／出射光輝度、extinction factor ）が大きければ大きい程、顕微鏡の視野全体が暗くなるので、観察対象である試料Ｓの複屈折性の物質に基づき、位相の変化量（位相差）に応じてアナライザー７を通過可能となり、位相の変化量の大きさに応じて、試料Ｓが視野の中で強く光って観察されることから、大きな検出感度が得られる。
【００２８】
ポッケルスセル９、あるいはその代わりに用いる液晶素子で構成された液晶板、他の電気光学効果に基づく可変位相子（コンペンセータ）に電圧を加えることにより、振動面が直交する２つの直線偏光に位相差を生じさせる。この位相差は、コンピュータ１０からパラレルポート１１とポッケルスセルコントローラ１２を経てポッケルスセル９に電圧を加えることで制御する。このときに加える電圧は、直線偏光において波長の１／３６程度（用いる波長が緑色光の５４０ｎｍのときには、約１５ｎｍ）の位相差を生ずる電圧又はそれ以下の電圧で行う。
【００２９】
この制御用の電圧と同期して得られる画像を、コンピュータ１０の制御でＣＣＤカメラ３から取得して、各画素毎に次の演算処理をして、モニター１３上に画像表示する。
【００３０】
なお、手動で可変位相子（コンペンセータ）を使用することも可能である。可変位相子の例としては、剥離した雲母板を用いることができる。
【００３１】
以下、画像処理の演算アルゴリズムを説明する。
【００３２】
アナライザー７を透過後のＣＣＤカメラ３のｎ枚目の画像のアドレスｘ番地の画素における輝度をＩn （ｘ）とする。また、ポッケルスセル９で与える位相差をθn とする。画素ｘ番地において試料Ｓの複屈折による位相差（レタデーション）をθ0 （ｘ）とする。最終の光学素子であるアナライザー７に入射する光強度Ｉ0 （ｘ）とし、Ｉn （ｘ）の最小値（クロスニコルの状態での光強度）をＩm （ｘ）とする。Ｉn （ｘ）は、実際の観察で求まる値であり、θn は観測者が与える値である。いま、ＣＣＤカメラ３において、ｎ枚目の画像のｘ番地に着目して、輝度に関する式からレタデーションθ0 （ｘ）を求める。以下の説明においては、ｘは省略する。
【００３３】
Ｉn ＝Ｉ0 ・ｓｉｎ2 （θn −θ0 ）＋Ｉm                       ・・・（１）
この式（１）の第１項目は、クロスニコルの状態の位相差（レタデーション）θ0 からのずれ（θn −θ0 ）に基づいてアナライザー７を通過する光量である。
【００３４】
θ0 とθn も微小な角度とすると、式（１）は、近似的には、
Ｉn ＝Ｉ0 ・（θn −θ0 ）2 ＋Ｉm                             ・・・（２）
となる。
【００３５】
ここで、ポッケルスセル９に加える３種類の電圧によって生じる位相差θ1 、θ2 、θ3 を与えたときに得られる光強度Ｉ1 、Ｉ2 、Ｉ3 に関する３つの方程式から、この３元連立方程式を解くことにより、未知数Ｉ0 、Ｉm 、θ0 が一般に求められる。位相差（レタデーション）θ0 分布画像は、各画素毎の場所におけるθ0 を表示することで得られる。時々刻々に変化するθ0 を表示することで、試料Ｓのレタデーション分布変化動画が得られる。
【００３６】
１例として、いま、ポッケルスセル９に加える３種類の電圧により、θ1 ＝０，θ2 ＝ａ，θ3 ＝−ａの位相差を与えたときのＣＣＤカメラ３で記録される光強度をＩ1 、Ｉ2 、Ｉ3 （３枚の画像における同一アドレスの１画素の輝度）とすると、試料Ｓの複屈折による位相差（レタデーション）θ0 は、３元連立方程式の解として次の式で求まる。
【００３７】
θ1 ＝０，θ2 ＝ａ，θ3 ＝−ａを式（２）のに代入し連立方程式を解く。
【００３８】
Ｉ1 ＝Ｉ0 ・θ0 2 ＋Ｉm                                       ・・・（３）
Ｉ2 ＝Ｉ0 ・（ａ2 −２ａθ0 ＋θ0 2 ）＋Ｉm                   ・・・（４）
Ｉ3 ＝Ｉ0 ・（ａ2 ＋２ａθ0 ＋θ0 2 ）＋Ｉm                   ・・・（５）
式（３）から、
Ｉm ＝Ｉ1 −Ｉ0 ・θ0 2                                       ・・・（６）
式（６）を式（４）、（５）に代入すると、
Ｉ2 ＝Ｉ0 ａ2 −２Ｉ0 ａθ0 ＋Ｉ1                             ・・・（７）
Ｉ3 ＝Ｉ0 ａ2 ＋２Ｉ0 ａθ0 ＋Ｉ1                             ・・・（８）
式（７）、（８）より、
Ｉ0 ａ2 ＋Ｉ1 ＝Ｉ2 ＋２Ｉ0 ａθ0                             ・・・（９）
Ｉ0 ａ2 ＋Ｉ1 ＝Ｉ3 −２Ｉ0 ａθ0                           ・・・（１０）
式（９）＝式（１０）より、
Ｉ2 ＋２Ｉ0 ａθ0 ＝Ｉ3 −２Ｉ0 ａθ0                       ・・・（１１）
式（１１）より、
４Ｉ0 ａθ0 ＝Ｉ3 −Ｉ2                                     ・・・（１２）
Ｉ0 ＝（Ｉ3 −Ｉ2 ）／４ａθ0                               ・・・（１３）
式（１３）を式（６）に代入して、
Ｉm ＝Ｉ1 −（Ｉ3 −Ｉ2 ）θ0 ／４ａ                        ・・・（１４）
式（１３）、（１４）を式（５）に代入して、
Ｉ3 ＝｛（Ｉ3 −Ｉ2 ）／４ａθ0 ｝（ａ2 ＋２ａθ0 ＋θ0 2 ）
＋Ｉ1 −（Ｉ3 −Ｉ2 ）θ0 ／４ａ・・・（１５）
４ａθ0 Ｉ3 ＝（Ｉ3 −Ｉ2 ）（ａ2 ＋θ0 ）2 
＋４ａθ0 Ｉ1 −（Ｉ3 −Ｉ2 ）θ0 2 
４ａθ0 Ｉ3 ＝（Ｉ3 −Ｉ2 ）（ａ＋２θ0 ）ａ＋４ａθ0 Ｉ1 
４θ0 Ｉ3 ＝（Ｉ3 −Ｉ2 ）（ａ＋２θ0 ）＋４θ0 Ｉ1 
θ0 （４Ｉ3 −２Ｉ3 ＋２Ｉ2 −４Ｉ1 ）＝（Ｉ3 −Ｉ2 ）ａ
θ0 ＝（Ｉ3 −Ｉ2 ）ａ／（４Ｉ3 −２Ｉ3 ＋２Ｉ2 −４Ｉ1 ）
＝（Ｉ3 −Ｉ2 ）ａ／（２Ｉ3 ＋２Ｉ2 −４Ｉ1 ）          ・・・（１６）
ただし、Ｉ1 、Ｉ2 、Ｉ3 は、取得した３枚の画像における同一アドレスの１画素の輝度を表す。ａは観測者が与える定数である。
【００３９】
したがって、試料Ｓのレタデーションの値Ｒ（ｘ）は、
Ｒ（ｘ）＝｜θ0 （ｘ）｜
＝｜（Ｉ3 （ｘ）−Ｉ2 （ｘ））ａ
÷｛２Ｉ3 （ｘ）＋２Ｉ2 （ｘ）−４Ｉ1 （ｘ）｝｜・・・（１７）
となる。
【００４０】
以上は、式（２）のθn （ポッケルスセル９で与える位相差）を特定の３つの値：０，ａ，−ａとする場合であったが、上記したように、未知数がＩ0 、Ｉm 、θ0 の３つであるので、原理的には、式（２）のθn に異なる３つの値を与えてそれに同期してＣＣＤカメラ３で得られる画像をコンピュータ１０に取り込み、各画素毎に上記と同様な演算処理を施して、モニター１３上に画像表示することで、試料Ｓのレタデーション分布像Ｒ（ｘ）を求めることができる。
【００４１】
このようにポッケルスセル９で与える位相差の任意の位相差θ1 ，θ2 ，θ3 にした場合に関する一般解を以下に示す。
【００４２】
式（２）のθn にθ1 ，θ2 ，θ3 を代入して連立方程式を解く。
【００４３】
Ｉ1 ＝Ｉ0 ・（θ1 −θ0 ）2 ＋Ｉm                           ・・・（１８）
Ｉ2 ＝Ｉ0 ・（θ2 −θ0 ）2 ＋Ｉm                           ・・・（１９）
Ｉ3 ＝Ｉ0 ・（θ3 −θ0 ）2 ＋Ｉm                           ・・・（２０）
式（１９）、（２０）からそれぞれ式（１８）を引くと、
Ｉ2 −Ｉ1 ＝Ｉ0 ｛（θ2 −θ0 ）2 −（θ1 −θ0 ）2 ｝
＝Ｉ0 （θ2 −θ1 ）（θ2 ＋θ1 −２θ0 ）        ・・・（２１）
Ｉ3 −Ｉ1 ＝Ｉ0 ｛（θ3 −θ0 ）2 −（θ1 −θ0 ）2 ｝
＝Ｉ0 （θ3 −θ1 ）（θ3 ＋θ1 −２θ0 ）        ・・・（２２）
上記式（２１）と式（２２）から、
（Ｉ2 −Ｉ1 ）／（Ｉ3 −Ｉ1 ）
＝｛（θ2 −θ1 ）（θ2 ＋θ1 −２θ0 ）｝
÷｛（θ3 −θ1 ）（θ3 ＋θ1 −２θ0 ）｝・・・（２３）
いま、
ｐ＝（Ｉ2 −Ｉ1 ）／（Ｉ3 −Ｉ1 ）                          ・・・（２４）
と置くと、
ｐ（θ3 −θ1 ）（θ3 ＋θ1 −２θ0 ）
＝（θ2 −θ1 ）（θ2 ＋θ1 −２θ0 ）  ・・・（２５）
ｐ＝（Ｉ2 −Ｉ1 ）／（Ｉ3 −Ｉ1 ）≠（θ2 −θ1 ）／（θ3 −θ1 ）
・・・（２６）
のときに、
θ0 ＝１／２×｛（θ22−θ12）−ｐ（θ32−θ12）｝
÷｛（θ2 −θ1 ）−ｐ（θ3 −θ1 ）｝    ・・・（２７）
と解ける。したがって、ポッケルスセル９で任意の位相差θ1 ，θ2 ，θ3 を与えたときの試料Ｓのレタデーションの値Ｒ（ｘ）は、
Ｒ（ｘ）＝｜θ0 （ｘ）｜＝１／２×                                                  ｜｛（θ2 2 −θ1 2 ）−ｐ（θ3 2 −θ1 2 ）｝
÷｛（θ2 −θ1 ）−ｐ（θ3 −θ1 ）｝｜    ・・・（２９）
となる。ただし、ｐは式（２４）：
ｐ＝（Ｉ（ｘ）2 −Ｉ（ｘ）1 ）／（Ｉ（ｘ）3 −Ｉ（ｘ）1 ）  ・・・（２４）
で与えられる。
【００４４】
以上のように本発明の偏光顕微鏡システムにおいては、特許文献１による偏光顕微鏡で用いた２枚の液晶板の代わりに、１枚の液晶板で可能である。あるいはポッケルス素子に電圧を加えることにより複屈折の位相差（レタデーション）を変化させるというポッケルス効果を利用したポッケルスセル９を位相子として使用する場合には、駆動速度が十マイクロ秒以下であり、液晶と比べて千倍以上高速でレタデーション分布像を観察することができる。
【００４５】
また、本発明の偏光顕微鏡システムでは、１枚の液晶板あるいは１つのポッケルスセルのみで可能なために、駆動用電気回路とコンピュータ制御が単純化される。
【００４６】
さらに、１画像の構成に必要な画面は、３つですむために、特許文献１による偏光顕微鏡では４画面必要なのと比べても、３画面ですむこと、また、より短時間での画像表示が可能となる。本発明では、以上のような根本的な改善がなされている。
【００４７】
また、一定時間間隔毎に３枚の位相量を変えた画像（ポッケルスセル９で位相差を順にθ1 →θ2 →θ3 と変えた画像）の撮影をタイムラプス撮影によって実現できる。以下、連続的かつ周期的にポッケルスセル９によって与える位相差を３段階、例えば＋ａ，０，−ａと変えてＣＣＤカメラ３で得られる画像から式（１７）に基づいて時間的に変化するレタデーション分布画像を順に得る過程を図２に模式的に示す。図２において右方向に時間軸をとる。図２（ａ）にポッケルスセル９に印加える電圧波形を示す。図２（ａ）に示すように、時間間隔Δｔで＋Ｖ→０→−Ｖと階段状に変化する電圧をポッケルスセル９に周期Ｔで印加する。すると、ポッケルスセル９で生じる位相差は、図２（ｂ）に示すように、時間間隔Δｔで＋ａ→０→−ａと周期Ｔで変化する位相差となる。そして、それぞれの位相差のときのＣＣＤカメラ３で撮影された画像は、図２（ｃ）に示すように、上記の位相差＋ａ，０，−ａ，＋ａ，０，−ａ，＋ａ，０，−ａ，・・・・の変化に対応して、符号を順に＋，０，−，＋，０，−，＋，０，−，・・・・と付した画像が時間間隔Δｔで順に得られる。そして、上記の原理から、時間間隔Δｔずつずらして得られる連続する３枚の画像から、図２（ｄ）に示すように、各々１枚のレタデーション分布画像（１）→（２）→（３）→（４）→（５）→（６）→（７）→（８）→（９）・・・が時間間隔Δｔで順に得られる。そのため、レタデーション分布画像は、ＣＣＤカメラ３での撮影と同じ時間間隔で順に連続して得ることができ、動画を作成することができる。
【００４８】
この点に関して、特許文献１の方式では、図２（ｅ）に類似的に示すように、４枚１組（図２（ｅ）では３枚１組）で撮影し、それを元に１枚の画像を作る方式であり、この図からも明らかなように、特許文献１の方式に比較して４倍の時間分解能が得られることになる。
【００４９】
以上の説明から明らかなように、本発明の偏光顕微鏡システムは、暗黒の画面の中に、複屈折性の分子・物質等の構造物があると、それによる位相差の大きさが光強度として検出できるために、定量的な物質量の測定が可能である。これは従来の顕微鏡では確認できない透明な物質も、複屈折性が周りの物質と異なれば観察可能であるということであり、大きな特徴である。
【００５０】
また、暗黒の中に光る像として数十ｎｍの大きさの分子が観察されるという、非常に高い空間弁別能で識別が可能である。これは光学顕微鏡として二百数十ｎｍの離れた点の分離が理論的に可能であるという空間分解能と比べて、非常に高い空間弁別能である。
【００５１】
また、透明な物質に対して無染色で非常に高感度の画像データの収集が可能であり、生物等で染色による影響が出るような場合にも観察が可能という点で重要である。
【００５２】
また、高倍率の対物レンズを用いて焦点深度を浅くして深さ方向の情報を集めることによって、細胞等の３次元立体構築が可能である。
【００５３】
以上のことから、無染色で生きた状態での生物組織中の細胞や細胞の内部構造に関して、動的に観察が可能であるという特徴を有している。すなわち、細胞内の染色体、ミトコンドリア、微小管、アクチン束等の数十ｎｍ以上の繊維状あるいは顆粒状の微小構造物、微小器官が生きて動く状態を高空間弁別能で識別が可能である。
【００５４】
また、生物以外でも、透明な結晶あるいはガラス、プラスチック等の非晶質の物質の観察にも適している。
【００５５】
なお、実施例としては、光源の位置が下であるか上であるかによって、偏光顕微鏡には正立型顕微鏡と倒立型顕微鏡の方式がある。また、光源としては、レーザー光源、水銀ランプ、キセノンランプ、メタルハライドランプ、ハロゲンランプ等がある。可変位相子として、液晶板やポッケルスセルとしてＫＤＰ等の結晶が使用できる。
【００５６】
本発明による偏光顕微鏡観察法及び偏光顕微鏡システムは様々な産業分野に利用が可能である。
【００５７】
第１に、上記のように、生物試料において、無染色で生きた状態での生物組織中の細胞、あるいは細胞の内部構造を含めて動的に観察が可能である。その細胞内の染色体、ミトコンドリア、微小管、アクチン束等の数十ｎｍ以上の繊維状あるいは顆粒状の微小構造物、微小器官の動く状態を高空間弁別能で識別が可能であり、かつ高感度の画像データの収集が可能である。また、焦点深度を浅くでき深さ方向の情報を集めることによって、細胞等の３次元立体構築が可能である。
【００５８】
第２に、畜産業や産婦人科等の医療現場において、受精卵・核分裂の検証・判定・判別や、核移植等のバイオテクノロジーに必要な細胞操作・遺伝子操作で、染色ができない状態の観察・微小作業において鮮明な画像を見ることが可能であることから、大きな貢献をすると考えられる。
【００５９】
第３に、製薬業において、無色の薬品化合物の結晶や薄膜状の状態での薬物の微細な静的又は動的観察に有用である。
【００６０】
第４に、透明な結晶や薄膜状結晶等に対する物理的、化学的あるいは生物処理等による結晶等の動的な変化の観察に有用である。電流、電圧、圧力、応力を加えた場合、あるいは溶解・溶融等による動的な変化における結晶等の変化を観察できる。
【００６１】
第５に、プラスチック、ガラス等の非晶質の物質に対して、上記の第４で与えると同様の環境条件に対する静的又は動的変化の観察に有用である。
【００６２】
以上、本発明の偏光顕微鏡観察法及び偏光顕微鏡システムをその原理と実施例に基づいて説明してきたが、本発明はこれらに限定されず種々の変形が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の偏光顕微鏡システムの１実施例の構成を示す図である。
【図２】連続的かつ周期的にポッケルスセルによって与える位相差を変えてＣＣＤカメラで得られる画像から時間的に変化するレタデーション分布画像を順に得る過程を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【００６４】
Ｓ…試料
１…ステージ
２…対物レンズ
３…ＣＣＤカメラ
４…光源
５…コンデンサー
６…直線偏光子（ポーラライザー、偏光子）
７…直線偏光子（アナライザー、検光子）
８…干渉フィルター
９…ポッケルスセル
１０…コンピュータ
１１…パラレルポート
１２…ポッケルスセルコントローラ
１３…モニター
【図１】
2008242022.tif 000003
【図２】
2008242022.tif 000004