(57)【要約】【課題】本発明の目的は、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合し、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質からなることを特徴とするＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤や、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合し、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質を有効成分とする腎疾患予防・治療剤を提供することにある。【解決手段】アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合し、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合し、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質からなることを特徴とするＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤。
【請求項２】
３−メチルコランスレン（３−ＭＣ）、ベンツピレン、ベンズアントラセン、ポリ塩化ビフェニル、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン（ＴＣＤＦ）、ｂ−ナフトフラボン（ＢＮＦ）、６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール、オメプラゾール（ＯＭＥ）、クロトリマゾール（ＣＬＯ）、クロルプロマジン（ＣＰＺ）、フルタミド（ＦＬＵ）及びインドール−３−カルビノール（Ｉ３Ｃ）から選択される１種又は２種以上の物質、又はこれらの物質の誘導体であってヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質からなることを特徴とするＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤。
【請求項３】
アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合する物質が、３−メチルコランスレン（３−ＭＣ）、オメプラゾール（ＯＭＥ）及びフルタミド（ＦＬＵ）から選択される１種又は２種以上の物質、又はこれらの物質の誘導体であってヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質からなることを特徴とするＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤を用いて、ヒト腎臓細胞内のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する方法。
【請求項５】
アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合し、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質を有効成分とする腎疾患予防・治療剤。
【請求項６】
３−メチルコランスレン（３−ＭＣ）、ベンツピレン、ベンズアントラセン、ポリ塩化ビフェニル、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン（ＴＣＤＦ）、ｂ−ナフトフラボン（ＢＮＦ）、６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール、オメプラゾール（ＯＭＥ）、クロトリマゾール（ＣＬＯ）、クロルプロマジン（ＣＰＺ）、フルタミド（ＦＬＵ）及びインドール−３−カルビノール（Ｉ３Ｃ）から選択される１種又は２種以上の物質、又はこれらの物質の誘導体であってヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質を有効成分とする腎疾患予防・治療剤。
【請求項７】
アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合する物質が、３−メチルコランスレン（３−ＭＣ）、オメプラゾール（ＯＭＥ）及びフルタミド（ＦＬＵ）から選択される１種又は２種以上の物質、又はこれらの物質の誘導体であってヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質を有効成分とする腎疾患予防・治療剤。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載の腎疾患予防・治療剤を経口投与することを特徴とする腎疾患を予防・治療する方法。
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｅ）のステップを備えたことを特徴とするヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法。
（ａ）アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）が結合する繰り返し配列ＸＲＥを含むヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の５’上流転写領域の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子をプラスミドに組み込み組換えプラスミドを構築するステップ
（ｂ）構築した組換えプラスミドを、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）遺伝子を発現し得るヒト細胞株に導入して形質転換細胞株を調製するステップ
（ｃ）調製した形質転換細胞株に被検物質を接触させるステップ
（ｄ）レポーター遺伝子の発現の程度を測定するステップ
（ｅ）被検物質不存在下の対照と比較してレポーター遺伝子の発現の程度が大きい場合、被検物質をＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質と判定するステップ
【請求項１０】
被検物質として、多環芳香族炭化水素化合物又はハロゲン化芳香族炭化水素化合物を用いることを特徴とする請求項９に記載のヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
被検物質として、イミダゾール骨格又はインドール骨格を有する化合物を用いることを特徴とする請求項９に記載のヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法。
【請求項１２】
アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）遺伝子を発現し得る細胞として、腎癌細胞株を用いることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載のヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項９〜１２のいずれかに記載のヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法。
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｅ）のステップを備えたことを特徴とする腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法。
（ａ）アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）が結合する繰り返し配列ＸＲＥを含むヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の５’上流転写領域の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子をプラスミドに組み込み組換えプラスミドを構築するステップ
（ｂ）構築した組換えプラスミドを、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）遺伝子を発現し得るヒト細胞株に導入して形質転換細胞株を調製するステップ
（ｃ）調製した形質転換細胞株に被検物質を接触させるステップ
（ｄ）レポーター遺伝子の発現の程度を測定するステップ
（ｅ）被検物質不存在下の対照と比較してレポーター遺伝子の発現の程度が大きい場合、被検物質をヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する腎疾患予防・治療剤と判定するステップ
【請求項１５】
被検物質として、多環芳香族炭化水素化合物又はハロゲン化芳香族炭化水素化合物を用いることを特徴とする請求項１４に記載の腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１６】
被検物質として、イミダゾール骨格又はインドール骨格を有する化合物を用いることを特徴とする請求項１４に記載の腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）遺伝子を発現し得る細胞として、腎癌細胞株を用いることを特徴とする請求項１４〜１６のいずれかに記載の腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１８】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１４〜１７のいずれかに記載の腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ:Aryl Hydrocarbon receptor）に結合する物質であって、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質を有効成分とする腎疾患予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎不全と腎透析を受ける患者の数は年々増加の一途を辿っており、毎年３万人以上が新たに透析導入に至っている。また、高齢者では、腎機能の低下によって薬物の体内蓄積が起こり、投与された薬物の予期せぬ反応や副作用が現れ、問題となっている。特に、高血圧、糖尿病、膠原病など多剤併用療法を受けている患者では、薬剤に起因する腎障害と蓄積性が急増しており、腎不全などの重篤な合併症を起こすことが多いことから、早急な対策が望まれている。
【０００３】
生体内での薬物体内動態（吸収・分布・消失）には肝臓と腎臓が大きく関与しており、水溶性の物質や、体内での代謝により水溶性に化学変化を受けた物質は、腎臓から尿中に排泄される。肝臓で代謝された物質の場合、そのほとんどは胆管を通して腸管に排出されるが、残りの部分が腸管循環に移行して再吸収されてしまう。腎臓で代謝を受けた物質の場合、尿中への一方向で排泄されるため、生体にとっては非常に都合がよい。しかしながら、今のところ薬物などの蓄積性に関わる腎臓側の因子や増悪因子が解明されておらず、薬剤選択や投与計画を立てる上で適切な対応策がないことや、透析では除去できない尿毒症物質の体内への蓄積が大きな問題となっていた。
【０００４】
他方、有機アニオントランスポーターは、主に肝細胞、尿細管上皮細胞に存在することが知られており、有機アニオントランスポーターの種類によって臓器特異的に発現している。該有機アニオントランスポーターは、イオン性薬物を認識し能動的に細胞内に取り込む血管側底膜トランスポーターと、細胞内の薬物やそれらの代謝産物を胆汁又は尿中へ汲み出す胆管又は尿管側膜トランスポーターとに大別でき、現在、Ｎａ＋非依存性有機アニオントランスポーター（oatp1, organic anion transporting polypeptide）の他、ラットでは腎臓の近位尿細管血管側の有機アニオントランスポーターとして、ＯＡＴトランスポーターファミリー（ｏａｔｐ２、ｏａｔｐ３、ＯＡＴ−Ｋ１、ＯＡＴ−Ｋ２、ＯＡＴ１、ＯＡＴ２など）が同定されている。しかし、ヒトの有機アニオントランスポーターは、薬理的にこれらトランスポーターとは性質が異なり、未知であった。
【０００５】
前記有機アニオントランスポーターに関しては、腎臓からのアニオン性薬物の再吸収と排泄の役割に関与し、腎のみに存在する新規な有機アニオントランスポーター（ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１及びラットｏａｔｐ−Ｍ１）を提供するものであって、その動物細胞安定発現細胞株を使用してインビトロでの医薬品適正使用へ応用する方法や（例えば、特許文献１参照。）、有機アニオン輸送活性を有する新規タンパク質（ｏａｔｐ／ＬＳＴ）や、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該タンパク質の活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法、該スクリーニング方法で得られる化合物（例えば、特許文献２参照。）などが提案されている。しかしながら、既知のＯＡＴトランスポーターファミリーは、比較的水溶性で分子量の低い化合物しか輸送しないため、腎臓が本来持っている多様な有機化合物の排泄能を説明することはできなかった。
【０００６】
本発明者らは、腎臓が持っている多様な有機化合物の排泄能の仕組みを明らかにすべく研究を行った結果、腎臓からの薬物排泄において重要な役割を担う新規遺伝子ＯＡＴＰ−Ｒ（ＯＡＴＰ４Ｃ１）を発見し同定した（例えば、非特許文献１参照。）。ＯＡＴＰ−Ｒは、腎臓の近位尿細管の血管側のみに特異的に発現する１２回膜貫通型の膜タンパクであり、血液から腎臓にジゴキシン、甲状腺ホルモン、胆汁酸、ｃＡＭＰ等の薬物を送り込むトランスポーターであることが判明した。
【０００７】
また、従来、腎臓からのジゴキシンの排泄経路は、主に尿管側の多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）が司るものと考えられていたが、腎不全ラットモデルにおいては、多剤耐性遺伝子の発現に変化がないにもかかわらず、ＯＡＴＰ−Ｒの発現が著しく低下することを本発明者らは見い出した（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照。）。これらの事実は、ＭＤＲ１がジゴキシンを尿細管細胞から尿管へ取り込む前段階として、ＯＡＴＰ−Ｒがジゴキシンを血管から尿細管細胞に取り込む段階が、ジゴキシンの排泄やジゴキシンの血中濃度のコントロールに関して重要であることを示唆するものである。しかし、ＯＡＴＰ−Ｒの発現を促進する物質は知られていなかった。
【０００８】
一方、ダイオキシンは、強力な毒性を有する化合物として知られており、生体内に入ると、解毒酵素等の様々な酵素の発現が誘導されることが知られている。その誘導のメカニズムの中心的な役割は、受容体型転写因子アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）が果たしているといわれている。ダイオキシンの１種である２，３，７，８−テトラクロロジベンゾパラジオキシン（ＴＣＤＤ）が細胞内に取り込まれた場合における、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）を介した転写制御の模式図を図１に示す。図１に記載されているように、ＡＨＲにＴＣＤＤがリガンドとして結合すると、ＡＨＲはコンフォメーション変化を起こし、ＡＨＲ／ＡＲＮＴへテロ二量体を形成する。このＡＨＲ／ＡＲＮＴへテロ二量体は、xenobiotic responsive element（ＸＲＥ）というエンハンサー配列に結合してＣｙｐ１ａ１等の種々の遺伝子の転写を活性化する。一方、ＡＨＲＲ／ＡＲＮＴヘテロ二量体は構成的にＸＲＥに結合して転写を抑制することが知られていた。
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−６５０８６号公報
【特許文献２】特開２００４−８１１９６号公報
【非特許文献１】科学技術振興機構報  第３２号  平成１６年２月２７日  科学技術振興機構
【非特許文献２】PNAS March 9, 2004. Vol.101, no.10, 3569-3574
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合し、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質からなることを特徴とするＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤や、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合し、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質を有効成分とする腎疾患予防・治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明者らは、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子（ｓｌｃｏ４ｃ１遺伝子又はＯＡＴＰ４Ｃ１遺伝子とも呼ばれる）の５’上流転写領域を詳細に解析したところ、ダイオキシンの核内受容体（Aryl hydrocarbon receptor：ＡＨＲ）が結合する繰り返し配列（ＣＡＣＧＣＣＣＡＣＧＣ；配列番号５）として知られるxenobiotic responsive element（ＸＲＥ）が、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の５’上流転写領域に存在することを初めて見い出した。また、ラットとマウスのＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の５’上流領域についても同様に詳細に解析したところ、マウスには前述の繰り返し配列（ＸＲＥ）はなかったが、ラットには全く同じ繰り返し配列（ＸＲＥ）が存在した（図２参照）。本発明者らはこの知見に基づき、さらに鋭意研究を進めたところ、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合する物質が、ＯＡＴＰ−Ｒの発現を増強する活性を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、（１）アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合し、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質からなることを特徴とするＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤や、（２）３−メチルコランスレン（３−ＭＣ）、ベンツピレン、ベンズアントラセン、ポリ塩化ビフェニル、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン（ＴＣＤＦ）、ｂ−ナフトフラボン（ＢＮＦ）、６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール、オメプラゾール（ＯＭＥ）、クロトリマゾール（ＣＬＯ）、クロルプロマジン（ＣＰＺ）、フルタミド（ＦＬＵ）及びインドール−３−カルビノール（Ｉ３Ｃ）から選択される１種又は２種以上の物質、又はこれらの物質の誘導体であってヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質からなることを特徴とするＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤や、（３）アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合する物質が、３−メチルコランスレン（３−ＭＣ）、オメプラゾール（ＯＭＥ）及びフルタミド（ＦＬＵ）から選択される１種又は２種以上の物質、又はこれらの物質の誘導体であってヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質からなることを特徴とするＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤に関する。
【００１３】
また本発明は、（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤を用いて、ヒト腎臓細胞内のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する方法や、（５）アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合し、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質を有効成分とする腎疾患予防・治療剤や、（６）３−メチルコランスレン（３−ＭＣ）、ベンツピレン、ベンズアントラセン、ポリ塩化ビフェニル、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン（ＴＣＤＦ）、ｂ−ナフトフラボン（ＢＮＦ）、６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール、オメプラゾール（ＯＭＥ）、クロトリマゾール（ＣＬＯ）、クロルプロマジン（ＣＰＺ）、フルタミド（ＦＬＵ）及びインドール−３−カルビノール（Ｉ３Ｃ）から選択される１種又は２種以上の物質、又はこれらの物質の誘導体であってヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質を有効成分とする腎疾患予防・治療剤や、（７）アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合する物質が、３−メチルコランスレン（３−ＭＣ）、オメプラゾール（ＯＭＥ）及びフルタミド（ＦＬＵ）から選択される１種又は２種以上の物質、又はこれらの物質の誘導体であってヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質を有効成分とする腎疾患予防・治療剤や、（８）上記（５）〜（７）のいずれかに記載の腎疾患予防・治療剤を経口投与することを特徴とする腎疾患を予防・治療する方法に関する。
【００１４】
さらに本発明は、（９）以下の（ａ）〜（ｅ）のステップを備えたことを特徴とするヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法
（ａ）アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）が結合する繰り返し配列ＸＲＥを含むヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の５’上流転写領域の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子をプラスミドに組み込み組換えプラスミドを構築するステップ
（ｂ）構築した組換えプラスミドを、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）遺伝子を発現し得るヒト細胞株に導入して形質転換細胞株を調製するステップ
（ｃ）調製した形質転換細胞株に被検物質を接触させるステップ
（ｄ）レポーター遺伝子の発現の程度を測定するステップ
（ｅ）被検物質不存在下の対照と比較してレポーター遺伝子の発現の程度が大きい場合、被検物質をＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質と判定するステップ
や、（１０）被検物質として、多環芳香族炭化水素化合物又はハロゲン化芳香族炭化水素化合物を用いることを特徴とする上記（９）に記載のヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法や、（１１）被検物質として、イミダゾール骨格又はインドール骨格を有する化合物を用いることを特徴とする上記（９）に記載のヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法や、（１２）アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）遺伝子を発現し得る細胞として、腎癌細胞株を用いることを特徴とする上記（９）〜（１１）のいずれかに記載のヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法や、（１３）レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする上記（９）〜（１２）のいずれかに記載のヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法に関する。
【００１５】
本発明はまた、（１４）以下の（ａ）〜（ｅ）のステップを備えたことを特徴とする腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法
（ａ）アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）が結合する繰り返し配列ＸＲＥを含むヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の５’上流転写領域の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子をプラスミドに組み込み組換えプラスミドを構築するステップ
（ｂ）構築した組換えプラスミドを、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）遺伝子を発現し得るヒト細胞株に導入して形質転換細胞株を調製するステップ
（ｃ）調製した形質転換細胞株に被検物質を接触させるステップ
（ｄ）レポーター遺伝子の発現の程度を測定するステップ
（ｅ）被検物質不存在下の対照と比較してレポーター遺伝子の発現の程度が大きい場合、被検物質をヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する腎疾患予防・治療剤と判定するステップ
や、（１５）被検物質として、多環芳香族炭化水素化合物又はハロゲン化芳香族炭化水素化合物を用いることを特徴とする上記（１４）に記載の腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法や、（１６）被検物質として、イミダゾール骨格又はインドール骨格を有する化合物を用いることを特徴とする上記（１４）に記載の腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法や、（１７）アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）遺伝子を発現し得る細胞として、腎癌細胞株を用いることを特徴とする上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法や、（１８）レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする上記（１４）〜（１７）のいずれかに記載の腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤は、腎臓の近位尿細管の血管側のみに特異的に発現するＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強することができる。有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ輸送体系タンパクは、胆汁酸、ジゴキシンやウアバイン、ｃＡＭＰ等の腎不全物質を体外に排出する活性を有することが知られており、ＯＡＴＰ−Ｒトランスポーターの発現を増強することによって、腎不全物質の体外への排出機能が促進されて、腎疾患の予防効果や治療効果が得られると考えられる。
【００１７】
また、本発明の腎疾患予防・治療剤を用いることによって、透析では除去できない尿毒症物質を排泄することが可能となる。さらに、腎疾患患者に対して本発明の腎疾患予防・治療剤を投与した場合、腎疾患の進行を止めるか又は遅らせることができるため、透析等の煩雑な治療を行う必要がなくなったり、透析等の煩雑な治療を導入する時期を遅らせることができる。腎疾患の進行を少なくとも遅らせることができれば、その間にその腎疾患患者に効果的な治療剤や投与方法を選択する猶予が得られ、個々の腎疾患患者にとって最適な治療法を選択することが可能となる。
【００１８】
また、肝硬変、肝不全時には血中にビリルビンや胆汁酸が蓄積するが、そのような病態では肝臓の血管側にあるビリルビンや胆汁酸トランスポーターの発現が低下していることが知られる。本発明の腎疾患予防・治療剤によって発現が増強されるＯＡＴＰ−Ｒは、ビリルビン等を体外に排出する機能を有することが考えられており、本発明の腎疾患予防・治療剤を用いることによって、肝硬変や肝不全による黄疸や肝機能障害の軽減も期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤としては、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合し、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子のＯＡＴＰ−Ｒする活性を有する物質（以下、「ＯＡＴＰ−Ｒ発現増強物質」ということがある）であれば特に制限はされず、例えば、多環芳香族炭化水素又はハロゲン化芳香族炭化水素であって、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合し、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質や、イミダゾール骨格又はインドール骨格を有する化合物であって、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合し、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質を挙げることができ、より具体的には３−メチルコランスレン（３−ＭＣ）、ベンツピレン、ベンズアントラセン、ポリ塩化ビフェニル、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン（ＴＣＤＦ）、ｂ−ナフトフラボン（ＢＮＦ）、６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール、イミダゾール骨格を有するオメプラゾール（ＯＭＥ）、クロトリマゾール（ＣＬＯ）、クロルプロマジン（ＣＰＺ）、抗腫瘍薬であるフルタミド（ＦＬＵ）、ピオグリタゾン、フラボノイド類のケルセチン、胆汁酸であるタウロコール酸及びインドール骨格を有するインドール−３−カルビノール（Ｉ３Ｃ）から選択される１種又は２種以上の物質、又はこれらの物質の誘導体であってＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質を挙げることができ、中でも３−メチルコランスレン（３−ＭＣ）、オメプラゾール（ＯＭＥ）及びフルタミド（ＦＬＵ）から選択される１種又は２種以上の物質、又はこれらの物質の誘導体であってＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質を好ましく挙げることができる。なお、オメプラゾール（ＯＭＥ）及びフルタミド（ＦＬＵ）は、それぞれ、プロトンポンプ阻害薬、前立腺がん治療薬として既に実用化されているため、投与量設定や副作用の予想が容易である点で好ましい。
【００２０】
図３に、ＡＨＲの典型的なリガンドとして知られる２，３，７，８−テトラクロロジベンゾパラジオキシン（ＴＣＤＤ）、３−メチルコランスレン（３−ＭＣ）、ベンゾ［ａ］ピレン（Ｂ［ａ］Ｐ）、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン（ＴＣＤＦ）、ｂ−ナフトフラボン（ＢＮＦ）、６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾールの構造式を示す。また、図４には、ＡＨＲの非典型的なリガンドとして知られるフルタミド（ＦＬＵ）、オメプラゾール（ＯＭＥ）、クロトリマゾール（ＣＬＯ）、クロルプロマジン（ＣＰＺ）、及びインドール−３−カルビノール（Ｉ３Ｃ）の構造式を示す。
【００２１】
また、本発明のＯＡＴＰ−Ｒ発現増強物質には、便宜上、該物質の薬学上許容され得る塩も含まれる。「薬学上許容され得る塩」には、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩のような鉱酸塩；メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなスルホン酸塩；シュウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、マンデル酸塩、アスコルビン酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩、リンゴ酸塩のような有機酸塩等の酸付加塩、好適には塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩が含まれる。
【００２２】
本発明のＯＡＴＰ−Ｒ発現増強物質の誘導体とは、本発明の物質の置換基の位置を変更した物質や、本発明の物質のある分子を別の分子に置換した物質や、本発明の物質に特定の置換基を付加した物質や、本発明の物質から特定の置換基を取り除いた物質等を意味する。
【００２３】
上記の「アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）に結合する物質」としては、ヒトＡＨＲタンパクや、ラットＡＨＲタンパクに結合する物質である限り特に制限されないが、例えば、ヒトＡＨＲや、ラットＡＨＲのリガンドを挙げることができる。また、上記の「ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質」とは、ＡＨＲ遺伝子及びＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を発現し得るヒト細胞株と共培養したり、ヒトに投与した場合に、不存在又は非投与の場合と比較して、腎細胞等のＡＨＲ遺伝子及びＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を発現し得る細胞内におけるＯＡＴＰ−Ｒの発現がｍＲＮＡレベル及び／又はタンパクレベルで上昇する物質をいう。
【００２４】
ＯＡＴＰ−Ｒの発現の上昇の程度は、特に制限されないが、ＯＡＴＰ−Ｒ  ｍＲＮＡの発現の場合は、例えばＤＭＳＯをコントロール物質として用いたときを基準として１．３倍以上に上昇することが好ましく、１．５倍以上に上昇することがより好ましく、１．８倍以上に上昇することがさらに好ましく、３倍以上に上昇することがさらにより好ましい。
【００２５】
本発明のＯＡＴＰ−Ｒ発現増強物質としては、市販されている物質を用いてもよいし、適当な化学物質を原料として公知の反応を用いて合成してもよい。なお、ＡＨＲ遺伝子の配列は、Genbank accession NM 001621（ヒトＡＨＲ遺伝子）、Genbank accession NM 013149（ラットＡＨＲ遺伝子）やGenbank accession NM 013464（マウスＡＨＲ遺伝子）に記載されており、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の配列は、Genbank accession NM 180991（ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子：ヒトＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子）、Genbank accession NM 001002024（ラットＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子：ラットＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子）やGenbank accession NM 172658（マウスＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子：マウスＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子）に記載されている。これらの配列情報に基づいて、適当なプライマーを設計することによって、これらの遺伝子を単離することもできるし、単離したこれらの遺伝子の配列を適当なベクターに組み込んで該ベクターを適当な細胞に導入して発現させるなどして、ＡＨＲタンパクやＯＡＴＰ−Ｒタンパクを入手することもできる。
【００２６】
ＯＡＴＰ−Ｒは、腎臓において胆汁酸、ビリルビン、ジゴキシンやウアバイン、ｃＡＭＰ等の腎不全物質を体外に排出するトランスポーターであるため、本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤は、腎疾患予防・治療剤としても用いうることができる。本発明の腎疾患予防・治療剤は、ＯＡＴＰ−Ｒ発現増強物質や本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤を有効成分とする。本明細書において「腎疾患予防・治療剤」とは、腎疾患予防及び／又は治療剤を意味する。また、本発明の腎疾患予防・治療剤においては、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強によって、腎疾患の予防・治療効果が得られる限り、そのメカニズムは特に制限されない。
【００２７】
本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤や腎疾患予防・治療剤は、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性や腎疾患の予防・治療効果を阻害しない限り、他に任意の成分を含有してもよい。例えば本発明の腎疾患予防・治療剤の場合、本発明の物質以外に公知の腎疾患予防・治療剤を配合してもよいし、さらにこれら公知の腎疾患予防・治療剤との併用療法も可能である。また、本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤の場合、本発明の物質以外のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤を配合してもよいし、本発明の物質を用いること以外の、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強手段と併用してもよい。
【００２８】
本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤や腎疾患予防・治療剤の投与形態は特に制限は無く、経口的に投与してもよいし、血液中に注入する等、非経口的に投与してもよいが、投与の簡便性の観点から経口的に投与することが好ましい。本発明の腎疾患予防・治療剤の有効成分である本発明の物質は単独で配合されても良いが、これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。この場合、本発明の有効成分である本発明の物質の配合量は、腎疾患の予防効果や治療効果が得られる限り特に制限されず、製剤の投与量等の条件に応じて適切な配合量を選択することが可能である。
【００２９】
製薬学的に許容しうる担体あるいは添加剤としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、安定化剤等を用いることが出来る。
【００３０】
経口投与に適する製剤の例としては、例えば散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、液剤又はシロップ剤等を挙げることが出来る。経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシンのような種々の賦形剤を、澱粉、好適にはとうもろこし、じゃがいも又はタピオカの澱粉、及びアルギン酸やある種のケイ酸複塩のような種々の崩壊剤、及びポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムのような顆粒形成結合剤と共に使用することができる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤も錠剤形成に非常に有効であることが多い。同種の固体組成物をゼラチンカプセルに充填して使用することもできる。これに関連して好適な物質としてラクトース又は乳糖の他、高分子量のポリエチレングリコールを挙げることができる。経口投与用として水性懸濁液及び／又はエリキシルにしたい場合、活性成分を各種の甘味料又は香味料、着色料又は染料と併用する他、必要であれば乳化剤及び／又は懸濁化剤も併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、及びそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。
【００３１】
非経口投与に適する製剤としては、例えば注射剤、坐剤等を挙げることが出来る。非経口投与の場合、本発明の有効成分をゴマ油又は落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロピレングリコール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて適宜に緩衝し（好適にはｐＨ８以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このような水溶液は静脈内注射に適し、油性溶液は関節内注射、筋肉注射及び皮下注射に適する。これらすべての溶液を無菌状態で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成することができる。さらに、本発明の有効成分は皮膚など局所的に投与することも可能である。この場合は標準的な医薬慣行によりクリーム、ゼリー、ペースト、軟膏の形で局所投与するのが望ましい。
【００３２】
本発明の腎疾患予防・治療剤の投与量は特に限定されず、腎疾患の種類、患者の年齢や症状、投与経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。また、本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤の投与量についても、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現が増強し得る限り特に制限はされず、種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。
【００３３】
本発明の腎疾患予防・治療剤の対象となる腎疾患は、本発明の化合物を投与することにより、予防効果及び／又は治療効果を発揮する限り特に制限はなく、例えば、急性腎不全、急性尿細管壊死、慢性腎不全、尿細管間質障害、急性腎炎、慢性腎炎、ネフローゼ、腎機能障害、糖尿病性腎症、動脈硬化性腎症などが挙げられるが、糖尿病性腎症、動脈硬化性腎症などに対して特に優れた予防効果及び／又は治療効果を発揮する。
【００３４】
本発明の本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤や腎疾患予防・治療剤の投与対象としては、ＡＨＲ遺伝子及びＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を有する哺乳動物である限り特に制限はされず、例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、サル、ウシ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ及びハムスター、トリ等を好ましく挙げることができ、中でも、ヒト、ラットを特に好ましく挙げることができる。
【００３５】
また、本発明の物質の１つであるオメプラゾール（ＯＭＥ）は、肝臓の酵素であるＣＹＰ１ａ１の発現を誘導することが知られている。後述の実施例６に示されているように、オメプラゾールをラットに投与したところ、肝臓細胞において、ＣＹＰ１ａ１  ｍＲＮＡの発現が実際に上昇した。ＣＹＰ１ａ１（シトクロームＰ−４５０ １Ａ１）は、低分子有機化合物を酸化的に修飾し、その他の誘導される解毒酵素とともに働いて、いわゆる解毒反応を司る酵素である。したがって、本発明の物質は、腎疾患を予防・治療するだけでなく、肝臓の解毒作用をも向上すると考えられる。この点において、本発明の腎疾患予防・治療剤は、腎疾患と肝機能の低下を併発している患者に対して特に優れた効果を発揮することが期待される。
【００３６】
また、本発明における細胞内のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する方法は、本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤を用いる限り特に制限されず、具体的には、本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤を哺乳動物又は哺乳動物の腎細胞にインビボ又はインビトロで投与することによって、該哺乳動物の腎細胞内のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する方法を挙げることができる。ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現が増強しているかどうかは前述のルシフェラーゼアッセイ等により簡単に確認することができる。
【００３７】
本発明における腎疾患を予防・治療する方法としては、本発明の腎疾患予防・治療剤を用いる限り特に制限されず、具体的には、本発明の腎疾患予防・治療剤をヒトに経口投与することによって、ヒトの腎疾患を予防・治療する方法を挙げることができる。
【００３８】
本発明のヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法としては、（ａ）アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）が結合する繰り返し配列ＸＲＥを含むヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の５’上流転写領域の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子をプラスミドに組み込み組換えプラスミドを構築するステップ、（ｂ）構築した組換えプラスミドを、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）遺伝子を発現し得るヒト細胞株に導入して形質転換細胞株を調製するステップ、（ｃ）調製した形質転換細胞株に被検物質を接触させるステップ、（ｄ）レポーター遺伝子の発現の程度を測定するステップ、及び（ｅ）対照と比較してレポーター遺伝子の発現の程度が大きい場合、被検物質をＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する物質と判断するステップ、の各ステップを備えた方法であれば特に制限されず、また、本発明の腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法としては、（ａ）アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）が結合する繰り返し配列ＸＲＥを含むヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の５’上流転写領域の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子をプラスミドに組み込み組換えプラスミドを構築するステップ、（ｂ）構築した組換えプラスミドを、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）遺伝子を発現し得るヒト細胞株に導入して形質転換細胞株を調製するステップ、（ｃ）調製した形質転換細胞株に被検物質を接触させるステップ、（ｄ）レポーター遺伝子の発現の程度を測定するステップ、及び（ｅ）対照と比較してレポーター遺伝子の発現の程度が大きい場合、被検物質をヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する活性を有する腎疾患予防・治療剤と判断するステップ、の各ステップを備えた方法であれば特に制限されず、上記アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）遺伝子を発現し得るヒト細胞株としては、本来ＡＨＲを発現しているヒト細胞株の他、ＡＨＲ遺伝子を発現ベクターで導入し、転写制御領域と一緒に人工的にＡＨＲを発現し得るヒト細胞株を挙げることができ、より具体的には、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ２９３細胞）や本来ＡＨＲを発現しているヒトＡＣＨＮ細胞株等の腎癌由来のヒト細胞株や、ヒト子宮頸部癌細胞（ＨｅＬａ細胞）等のヒト由来の細胞株の他、ＡＨＲを発現し得るように形質転換されたヒト由来の細胞株を挙げることができるが、ヒトＡＣＨＮ細胞株、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ２９３細胞）等の腎癌由来のヒト細胞株をより好ましく挙げることができる。なお、ＡＨＲを発現し得るように形質転換する際に用いるヒト由来の細胞株は、本来ＡＨＲを発現していないヒト細胞株であってもよいし、本来ＡＨＲを発現しているヒト細胞株であってもよい。ＡＨＲ遺伝子が組み込まれた発現ベクターを、本来ＡＨＲを発現しているヒト細胞株に導入すると、ＡＨＲがより安定的に発現する点で好ましい。
【００３９】
上記ステップ（ａ）におけるアリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）が結合する繰り返し配列ＸＲＥを含むヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の５’上流転写領域としては、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の転写開始点より上流−１００塩基付近のＸＲＥ領域を含む領域、好適にはヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の転写開始点より上流−１１４塩基から下流＋１２５塩基までの配列などを例示することができる。また、上記レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、重金属耐性遺伝子由来のコーディング配列、より具体的には、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、細菌ルシフェラーゼ遺伝子、レニラ（Renilla）ルシフェラーゼ遺伝子、フォチヌス（Photinus）ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ジフテリアトキシン耐性遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子、ウレアーゼ遺伝子、カタラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子等を挙げることができる。ＸＲＥを含むヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の５’上流転写領域の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子は、哺乳動物細胞等で発現するプラスミドベクターにインテグレートされ、公知の方法で前記ＡＨＲ遺伝子を発現し得るヒト細胞株に導入され、形質転換細胞株を調製する。
【００４０】
被検物質としては特に制限されないが、ＡＨＲのリガンド物質として、多環芳香族炭化水素化合物、ハロゲン化芳香族炭化水素化合物や、イミダゾール骨格又はインドール骨格を有する化合物が多く知られているため、より効率良く所望の活性を有する化合物を得る観点から、多環芳香族炭化水素化合物、ハロゲン化芳香族炭化水素化合物や、イミダゾール骨格又はインドール骨格を有する化合物を用いることが好ましい。被検物質を形質転換細胞株に接触させる方法としては、被検物質の存在下で形質転換細胞株を培養する方法を好適に例示することができる。
【００４１】
被検物質を投与した場合の細胞内におけるレポーター遺伝子の発現の程度が、該被検物質を投与しなかった場合の細胞内におけるレポーター遺伝子の発現の程度よりも高い場合には、その被検物質はＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤、又は腎疾患予防・治療剤であると判定し、被検物質を投与した場合の細胞内におけるレポーター遺伝子の発現の程度が、該被検物質を投与しなかった場合の細胞内におけるレポーター遺伝子の発現の程度と同等、若しくは低い場合には、その被検物質はＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現増強剤、又は腎疾患予防・治療剤でないと判定する。
【００４２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
［プラスミドの構築］
ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の転写開始点より上流−２０４９塩基から下流＋１２５塩基までの配列（以下、「−２０４９／＋１２５の配列」という；配列番号１）を、ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲ法により増幅した。−２０４９／＋１２５の配列には、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子のコード領域はＮ末端側しか含まれていない。このＰＣＲにより得られた−２０４９／＋１２５の配列からなるポリヌクレオチドを、Photinus luciferase reporter vectorであるpGL3-basic vector（Promega社製）に組み込み、組換えプラスミドhOATP-R 5’UTR-pGL3（−２０４９／＋１２５）を構築した。また、ＰＣＲには配列番号６と配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるプライマーを用いた。
【００４４】
上述の−２０４９／＋１２５の配列に代えて、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の転写開始点より上流−１１４塩基から下流＋１２５塩基までの配列（以下、「−１１４／＋１２５の配列」という；配列番号２）、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の転写開始点より上流−９６塩基から下流＋１２５塩基までの配列（以下、「−９６／＋１２５の配列」という；配列番号３）、又は、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の転写開始点より上流−６７塩基から下流＋１２５塩基までの配列（以下、「−６７／＋１２５の配列」という；配列番号４）をpGL3-basic vector（Promega社製）に組み込み、組換えプラスミドhOATP-R 5’UTR-pGL3（−１１４／＋１２５）、組換えプラスミドhOATP-R 5’UTR-pGL3（−９６／＋１２５）、組換えプラスミドhOATP-R 5’UTR-pGL3（−６７／＋１２５）をそれぞれ構築した。また、ＰＣＲには、−１１４／＋１２５の配列用として配列番号８と配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるプライマーを、−９６／＋１２５の配列用として配列番号９と配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるプライマーを、−６７／＋１２５の配列用として配列番号１０と配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるプライマーをそれぞれ用いた。
【実施例２】
【００４５】
［培養細胞のトランスフェクション］
１）ＡＣＨＮ細胞のトランスフェクション
ＡＣＨＮ細胞株は東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより供与された。ＡＣＨＮ細胞株はヒト腎癌細胞株であり、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子及びＡＨＲ遺伝子を共に発現し得る。このＡＣＨＮ細胞を２４ウェルプレートに、１ウェル当たり２．４×１０５ｃｅｌｌずつ分注し、特定の培地（ＲＰＭＩ１６４０培地に、ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンを、それぞれ最終濃度がＦＢＳ１０％、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌとなるように添加した培地）中、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４８時間培養した。ＡＣＨＮ細胞が７０−８０％のコンフルエントになったのを確認してから、培地を無血清培地であるＯＰＴＩ−ＭＥＭＩに交換し、実施例１で構築した４種の組換えプラスミドのトランスフェクションを行った。トランスフェクションは１ウェルあたり、Lipofectamine 2000（Invitrogen社製）２μｌと、各組換えプラスミドhOATP-R 5’UTR-pGL3 １．２μｇと、pHRL-TK vector ５０ｎｇとを用いて行った。なお、pHRL-TK（Promega社製：Renilla luciferase reporter vector）は、後述のルシフェラーゼアッセイにおいて内部標準として利用するために用いた。また、コントロールとして、各組換えプラスミドhOATP-R 5’UTR-pGL3に代えて、pGL3-basic vectorを用いてトランスフェクションを行った。これらのトランスフェクションの結果、ＡＣＨＮ細胞／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−２０４９／＋１２５）、ＡＣＨＮ細胞／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−１１４／＋１２５）、ＡＣＨＮ細胞／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−９６／＋１２５）、ＡＣＨＮ細胞／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−６７／＋１２５）、ＡＣＨＮ細胞／pGL3-basic vectorを得た。
【００４６】
２）Ｈｅｌａ細胞のトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞株はＡＴＣＣより入手した（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）。ＨｅＬａ細胞株は、ヒト子宮頸部癌細胞であり、ＡＨＲ遺伝子を発現している。このＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに、１ウェル当たり１．２×１０５ｃｅｌｌずつ分注し、特定の培地［ダルベッコ改変イーグル培地（以下ＤＭＥＭ）に、ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンを、それぞれ最終濃度がＦＢＳ１０％、ペニシリン１０００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌとなるように添加した培地］中、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。ＨｅＬａ細胞が８０−９０％のコンフルエントになったのを確認してから、培地を無血清培地であるＯＰＴＩ−ＭＥＭＩに交換し、実施例１で構築した４種の組換えプラスミドのトランスフェクションを行った。トランスフェクションは１ウェルあたり、Lipofectamine 2000（Invitrogen社製）２μｌと、各組換えプラスミドhOATP-R 5’UTR-pGL3 ０．８μｇと、pHRL-TK vector ５０ｎｇとを用いて行った。また、コントロールとして、各組換えプラスミドhOATP-R 5’UTR-pGL3に代えて、pGL3-basic vectorを用いてトランスフェクションを行った。これらのトランスフェクションの結果、ＨｅＬａ細胞／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−２０４９／＋１２５）、ＨｅＬａ／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−１１４／＋１２５）、ＨｅＬａ／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−９６／＋１２５）、ＨｅＬａ／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−６７／＋１２５）、ＨｅＬａ細胞／pGL3-basic vectorを得た。
【実施例３】
【００４７】
［ルシフェラーゼアッセイ］
１）ルシフェラーゼアッセイ（ＨｅＬａ細胞）
ルシフェラーゼアッセイは、Promega社製のDual-Luciferase（登録商標）Reporter Assay Systemのマニュアルに基づいて行った。具体的には、ＨｅＬａ細胞／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−２０４９／＋１２５）、ＨｅＬａ／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−１１４／＋１２５）、ＨｅＬａ／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−９６／＋１２５）、ＨｅＬａ／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−６７／＋１２５）、及びＨｅＬａ細胞／pGL3-basic vectorをトランスフェクション後に無血清培地で４時間培養した後、２４ウェル内の無血清培地と等量の特定の培地を、それぞれのウェル内に添加した。この特定の培地としては、２０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地に、ＡＨＲの典型的なリガンドである３−メチルコランスレン（3-methylcholanthrene：３−ＭＣ）を最終濃度５μＭで添加した培地を用いた。また、対照培地として、２０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を最終濃度１重量％で添加した培地、及び、２０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【００４８】
これらの特定の培地を添加してから４８時間培養した後、培養細胞中のpGL3-basic vectorや、各組換えプラスミドhOATP-R 5’UTR-pGL3由来のPhotinus luciferase（ホタルルシフェラーゼ）の蛍光、及び、培養細胞中の内部標準用のpHRL-TK由来のRenilla luciferase（ウミシイタケルシフェラーゼ）の蛍光を測定した。これらの蛍光の測定には、Lumat LB 9507（BERTHOLD TECHNOLOGIES社製）を用いた。ホタルルシフェラーゼの蛍光の測定値をウミシイタケルシフェラーゼの蛍光の測定値で割ることにより、Photinus／Renilla activity ratioを算出した。ＨｅＬａ細胞／pGL3-basic vectorにおいて、ＤＭＳＯも３−ＭＣも添加しなかった場合のPhotinus／Renilla activity ratioを１としたときの、各場合のPhotinus／Renilla activity ratioを図５に示す。また、図５における同種の細胞の結果において、ＤＭＳＯ存在下での各Photinus／Renilla activity ratioを１とした場合の、３−ＭＣ存在下での各Photinus／Renilla activity ratioを図６に示す。図５及び図６の結果から、３−ＭＣ存在下では、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の転写が上昇する傾向があり、特に、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の転写開始点より上流−１００塩基付近のＸＲＥ領域が存在する場合において、この傾向が顕著であることが分かった。また、３−ＭＣを添加すると、ＨｅＬａ細胞／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−２０４９／＋１２５）、ＨｅＬａ細胞／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−１１４／＋１２５）、ＨｅＬａ細胞／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−６７／＋１２５）においては、コントロールであるＤＭＳＯを添加した場合と比較してヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の転写活性が有意に上昇した。これらの結果から、３−ＭＣ存在下におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の転写向上には、ＸＲＥ領域が関連している可能性が示唆された。
【００４９】
２）ルシフェラーゼアッセイ（ＡＣＨＮ細胞）
上記ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼアッセイで見られた、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の転写活性の上昇が、ＨｅＬａ細胞に代えてＡＣＨＮ細胞を用い、ＡＨＲのリガンドとして３−ＭＣに代えてオメプラゾール（ＯＭＥ）を用いた場合でも見られるかどうかを調べるために、実施例２で作製したＡＣＨＮ細胞／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−１１４／＋１２５）及びＡＣＨＮ細胞／pGL3-basic vectorを用いて、同様にルシフェラーゼアッセイを行った。ただし、３−ＭＣ５μＭに代えてオメプラゾール５０μＭを用い、コントロールとしてＤＭＳＯ１重量％を用いた。
【００５０】
また、オメプラゾール、ＤＭＳＯ下での細胞の培養時間は２０時間とした。ＡＣＨＮ細胞／pGL3-basic vectorにおいて、ＤＭＳＯもオメプラゾールも添加しなかった場合のPhotinus／Renilla activity ratioを１としたときの、各場合のPhotinus／Renilla activity ratioを図７に示す。また、図７の結果において、ＤＭＳＯ存在下でのＡＣＨＮ細胞／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−１１４／＋１２５）のPhotinus／Renilla activity ratioを１とした場合の、ＯＭＥ存在下でのＡＣＨＮ細胞／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−１１４／＋１２５）の各Photinus／Renilla activity ratioを図８に示す。図７及び図８の結果から分かるように、ＡＣＨＮ細胞／hOATP-R 5’UTR-pGL3（−１１４／＋１２５）とオメプラゾールを用いた場合は、対照物質（ＤＭＳＯ）を用いた場合と比較してヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の転写活性が有意に上昇した。
【実施例４】
【００５１】
［オメプラゾール投与ラットの腎臓におけるＯＡＴＰ−Ｒ ｍＲＮＡの発現］
オメプラゾール投与によるＯＡＴＰ−Ｒの発現の上昇が、インビボにおいても見られるかどうかを確認するために次の実験を行った。９匹のＳＤラット（雌、８週齢）をコーンオイル（コントロール）投与群（３匹）、フルタミド（ＦＬＵ）投与群（３匹）、オメプラゾール（ＯＭＥ）投与群（３匹）に分けた。ＦＬＵ投与群にはコーンオイルを溶媒としてＦＬＵを５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで３日間、フィーディングチューブを用いて経口投与した。また、ＯＭＥ投与群には、コーンオイルを溶媒としてＯＭＥを１２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで３日間、フィーディングチューブを用いて経口投与した。コントロール群には、ＦＬＵ投与群やＯＭＥ投与群に投与したのと同量のコーンオイルを投与した。
【００５２】
３日間の投与終了後、各ＳＤラットを解剖して、腎臓を摘出した。摘出した腎臓１ｇを１０ｍｌのＴＲＩＺＯＬ液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に加え、ポリトロン破砕機の最大速度（１００，０００ｒｐｍ）で１分間ホモジエナイズした。ホモジナイズした溶液に２倍量のクロロフォルム液を加えて攪拌後、遠心分離し、水相部分を別のチューブに移した。この水相に２倍量のイソプロピルアルコールを添加し、１５０００ｒｐｍで冷却遠心を行ってＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをテンプレートとし、SuperScriptIII RTS ファーストストランド cDNA 合成キット（インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。TaqMan Probe（アプライドバイオシステム社製）を用いて定量ＰＣＲを行い、ラット腎臓のＯＡＴＰ−Ｒの発現量を定量した。また、コントロールとしてＧＡＰＤＨの発現量も定量した。その結果を図９に示す。図９に示されているとおり、オメプラゾール投与群やＦＬＵ投与群のラットの腎臓においては、コントロール群のラットの腎臓に比べてＯＡＴＰ−Ｒ ｍＲＮＡの発現が有意に上昇していた。
【実施例５】
【００５３】
［オメプラゾール投与ラットにおけるジゴキシン排泄実験］
１０匹のＳＤラット（雌、８週齢）をコーンオイル（コントロール）投与群（５匹）、オメプラゾール（ＯＭＥ）投与群（５匹）に分けた。ＯＭＥ投与群にはコーンオイルを溶媒としてオメプラゾールを１２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで１２日間、フィーディングチューブを用いて経口投与した。コントロール群には、ＯＭＥ投与群に投与したのと同量のコーンオイルを投与した。投与開始から１１日目において、両投与群のラットに、体重１ｋｇ当たり５ｍｇの割合でデキサメタゾンを腹腔内投与し、その翌日（投与開始から１２日目）に以下のようなジゴキシン排泄実験を行った。
【００５４】
ラットをケタミン及びキシラジンで麻酔した後、大腿動脈と大腿静脈にそれぞれＰ５０チューブを挿入し、大腿動脈及び大腿静脈を確保した。その後、大腿静脈側から０．１ｍｇ／ｋｇのジゴキシンを静注した。一方、該ジゴキシンの静注前、静注後１分、３分、５分、１０分、３０分、６０分、１２０分のそれぞれの時点において、動脈側より採血を行った。各採血の間はヘパリン生理食塩水にてチューブ内を置換した。麻酔は適宜静脈側より追加した。採取した各血液サンプルを４℃に保存し、翌日、各血液サンプル中のジゴキシン濃度を測定した。その結果を図１０に示す。図１０に示されているとおり、ジゴキシンの静注直後においては両群の間にジゴキシン濃度の差はほとんど見られなかったが、ジゴキシンの静注後５分後以降では、ＯＭＥ投与群（Treat）は、コントロール群（Non-Treat）に比べてジゴキシンの血中濃度が低下していた。この結果は、ＯＭＥの投与によって、ジゴキシンの排出が促進されていることを示すものである。
【実施例６】
【００５５】
［オメプラゾール投与ラットの肝臓ＣＹＰ１ａ１  ｍＲＮＡの発現］
９匹のＳＤラット（雌、８週齢）をコーンオイル（コントロール）投与群（３匹）、フルタミド（ＦＬＵ）投与群（３匹）、オメプラゾール（ＯＭＥ）投与群（３匹）に分けた。ＦＬＵ投与群にはコーンオイルを溶媒としてＦＬＵを５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで３日間、フィーディングチューブを用いて経口投与した。また、ＯＭＥ投与群には、コーンオイルを溶媒としてＯＭＥを１２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで３日間、フィーディングチューブを用いて経口投与した。コントロール群には、ＦＬＵ投与群やＯＭＥ投与群に投与したのと同量のコーンオイルを投与した。
【００５６】
３日間の投与終了後、各ＳＤラットを解剖して、肝臓を摘出した。摘出した肝臓１ｇを１０ｍｌのＴＲＩＺＯＬ液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に加え、ポリトロン破砕機の最大速度（１００，０００ｒｐｍ）で１分間ホモジナイズした。ホモジナイズした溶液に２倍量のクロロフォルム液を加えて攪拌後、遠心分離し、水相部分を別のチューブに移した。この水相に２倍量のイソプロピルアルコールを添加し、１５０００ｒｐｍで冷却遠心を行ってＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをテンプレートとし、SuperScriptIII RTS ファーストストランド cDNA 合成キット（インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。TaqMan Probe（アプライドバイオシステム社製）を用いて定量ＰＣＲを行い、ラット肝臓のＣＹＰ１ａ１の発現量を定量した。また、コントロールとしてＧＡＰＤＨの発現量も定量した。その結果を図１１に示す。図１１に示されているとおり、コントロール投与群と比較して、オメプラゾール投与群やフルタミド投与群のラット肝臓ではＣＹＰ１ａ１  ｍＲＮＡの発現が有意に上昇していた。ＣＹＰ１ａ１は、低分子有機化合物を酸化的に修飾し、その他の誘導される解毒酵素とともに働いて、いわゆる解毒反応を司る酵素である。したがって、オメプラゾールやフルタミドは、腎疾患を予防・治療するだけでなく、肝臓の解毒作用をも向上すると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ダイオキシンが細胞内に取り込まれた場合における、アリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）を介した転写制御の模式図を示す図である。
【図２】ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子（ｓｌｃｏ４ｃ１遺伝子）と、マウスＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子（ｓｌｃｏ４ｃ１遺伝子）と、ラットＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子（ｓｌｃｏ４ｃ１遺伝子）における５’上流転写領域の比較解析結果を示す図である。
【図３】ＡＨＲの典型的なリガンドであるダイオキシンの各種異性体を示す図である。
【図４】ＡＨＲの非典型的なリガンドであるオメプラゾールやフルタミドなどを示す図である。
【図５】ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の種々の領域を組み込んだ各種プラスミドをトランスフェクションしたＨｅｌａ細胞において、ＡＨＲの典型的なリガンドである３−メチルコランスレンを添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図である。
【図６】図５において、３−メチルコランスレンとＤＭＳＯの結果を比較し易いようにした図である。
【図７】プラスミドhOATP-R 5’UTR-pGL3（−１１４／＋１２５）等をトランスフェクションしたＡＣＨＮ細胞における、ＡＨＲの非典型的なリガンドであるオメプラゾールを添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図である。
【図８】図７において、オメプラゾールとＤＭＳＯの結果を比較し易いようにした図である。
【図９】オメプラゾールを投与したラットの腎臓におけるＯＡＴＰ−Ｒ  ｍＲＮＡの発現を示す図である。
【図１０】オメプラゾールを投与したラットにおけるジゴキシン排泄実験の結果を示す図である。
【図１１】オメプラゾールを投与したラットの肝臓におけるＣＹＰ１ａ１  ｍＲＮＡの発現を示す図である。
【図１】
2008100927.tif 000002
【図２】
2008100927.tif 000003
【図３】
2008100927.tif 000004
【図４】
2008100927.tif 000005
【図５】
2008100927.tif 000006
【図６】
2008100927.tif 000007
【図７】
2008100927.tif 000008
【図８】
2008100927.tif 000009
【図９】
2008100927.tif 000010
【図１０】
2008100927.tif 000011
【図１１】
2008100927.tif 000012
【配列表】
2008100927000001.app