(57)【要約】【課題】切断された神経末端間の架橋。【解決手段】気体プラズマを含む方法で製造される、ラミニン修飾ポリマー中空導管を提供する。該導管はラミニン修飾の効果により、脊髄切断を伴う哺乳類で機能回復が達成される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被切断神経末端間の間隙を架橋して、切断された哺乳類神経の生体内再生を促進する中空の導管であって、生分解性ポリマー材料で構成される壁を含み、その壁の内腔表面と、その壁の内腔表面に共有結合で結合するラミニンで定義される内腔を形成し、ラミニンと内腔表面の結合が気体プラズマ処理で達成される導管。
【請求項２】
生分解性ポリマー材料が、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリ（カプロラクトン−乳酸）、キトサン、アルギン酸、ヒアルロン酸、ゼラチンおよびフィブリンよりなる群から選択される、請求項１の中空の導管。
【請求項３】
生分解性ポリマー材料がポリ（乳酸−グリコール酸）を含む、請求項２の中空の導管。
【請求項４】
生分解性ポリマー材料がキトサンを含む、請求項２の中空の導管。
【請求項５】
気体プラズマがＯ２プラズマ若しくはＯ２を含む気体プラズマである、請求項１の中空の導管。
【請求項６】
被切断神経末端間の間隙を架橋して、切断された哺乳類神経の生体内再生を促進するラミニン修飾導管を製造する方法であって、
(a)生分解性ポリマー材料で構成される中空の導管を、そのポリマー材料の内腔表面を活性化してラミニンと結合させるのに十分な電力密度、圧および時間で、気体プラズマによる処理を行い；そして
(b)活性化内腔表面とラミニンとの間に共有結合を形成させるために十分な時間、その活性化した内腔表面をラミニンと接触させる工程を含む、方法。
【請求項７】
気体プラズマがＯ２プラズマ若しくはＯ２を含む気体プラズマである、請求項６の方法。
【請求項８】
電力密度が約2 W/cm２から約100 W/cm２の範囲で(a)工程を行う、請求項６の方法。
【請求項９】
電力密度が約50 W/cm２で(a)工程を行う、請求項８の方法。
【請求項１０】
圧が約0 mTorrから約80 mTorrの範囲で(a)工程を行う、請求項６の方法。
【請求項１１】
圧が約36 mTorrで(a)工程を行う、請求項１０の方法。
【請求項１２】
(a)工程の処理時間が約5分間から10分間の範囲である、請求項６の方法。
【請求項１３】
(a)工程の処理時間が約5分間である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
(b)工程が、活性化された内腔表面とラミニンとの直接の接触を提供するようなラミニン濃度を含む溶液を導管に加えることを含む、請求項６の方法。
【請求項１５】
ラミニン溶液が約100μg/mlの濃度である、請求項１４の方法。
【請求項１６】
導管をラミニン溶液中約４℃で約３時間インキュベートする、請求項１５の方法。
【請求項１７】
生分解性ポリマー材料がポリ（乳酸−グリコール酸）およびキトサンから選択される、請求項６の方法。
【請求項１８】
該導管が請求項６の方法で製造される、被切断神経末端間の間隙を架橋して切断された哺乳類神経の生体内再生を促進する中空の導管。
【請求項１９】
被切断神経末端間の間隙を架橋して、切断された哺乳類神経の生体内再生を促進する方法で、被切断神経末端を請求項１の中空導管の各末端と接触させることを含む方法。
【請求項２０】
被切断神経末端間の間隙を架橋して、切断された哺乳類神経の生体内再生を促進する方法で、被切断神経末端を請求項１８の中空導管の各末端と接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は哺乳類の神経再生分野に関する。より具体的には、本発明は切断された神経末端間の間隙を繋ぐ、神経再生を促進する中空の導管に関する。本発明はまた該導管の製造および使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
神経の再生は複雑な生物学的現象である。成熟した神経は再生しない；言い換えると細胞分裂しない。神経系が一旦損なわれると、回復させることは困難で別の体組織の障害が生じ得る。末梢神経系（ＰＮＳ）では、損傷が小さければ神経は自ら再生することができる。成人のＰＮＳが傷害を受けた後はたとえ再生した場合でも、常に機能が回復するとは限らない。これは主として、再生の軸索が不適切な標的に対し誤って誘導されたことによる。神経が長さ１cmよりも大きな間隙で分離された場合、特異的なガイドがないと軸索が近接した神経幹の方向に向いてしまい、不適切な神経内膜に進入するかまたは神経塊を形成する。これらのすべての条件下では障害を受けた軸索が再生するのには数ヶ月を要する。軸索の再生と機能回復の可能性を増大させるため多くの戦略が用いられる。これには、自家移植片、同種移植片、異種移植片、およびシュワン細胞（ＳＣ）充填管の埋め込みが含まれる。自家移植には多くの問題が生じ得る；ドナー部位の罹患率、ドナー部位より末梢側の脱神経、神経腫の形成、神経採取の可能な適切な部位の数が限られていること等である。これらの不利益から人工的な神経移植片が発達して来た。
【０００３】
研究者等は中枢神経系（ＣＮＳ）とＰＮＳの双方を横断して間隙を架橋するチューブ管または神経ガイドの創造に焦点を当てた。これまでに報告されたチューブ管を作る多くの研究の中、ＰＮＳにおいて最良の結果が達成された〔S. E. Mackinnon and A. L. Dellon, Plastic Reconstructive Surg, 85: 419-24 (1990); M. F. Meek et al., Microsurgery,19: 247-53 (1999); S. T. Li et al., Clin Mater, 9: 195-200 (1992)〕。生体分解可能性や生体適合可能性の項目に加えて、導管について種々の物理的パラメータ、例えば、導管の直径と長さ、内腔表面微小形状、壁面の多孔性、浸透性等の影響が確定された。
【０００４】
合成された神経移植片の内腔に培養ＳＣを導入すると末梢神経の再生が促進される〔V. Guenard et al., J Neurosci, 12: 3310-20(1992)〕。接着はＳＣの生存と増殖に必須の要件であるから、ＳＣが移植片中で生存するためには接着は絶対必要である。細胞外マトリクスタンパクのラミニンは、神経再生に用いられるＳＣの接着について寛容なタンパク質である。ラミニンはＳＣ表面上のインテグリンと相互作用してＳＣの接着と増殖を支援する。マディソン等(Madison et al.)はマウスにおいて軸索の再生を促進する、生体再吸収可能な神経ガイドの使用を開示した〔Madison et al., Experimental Neurology, 88: 767-772(1985)〕。けれども、そのような促進剤が充填されたチューブ管の製造は費用がかかり工程が面倒である。ランガッパ等(Rangappa et al.)は、頑強な軸索突起の成長を誘導し成長の方向付けをする、整列したラミニン被覆ポリ(1-ラクチド)フィラメントで充填された神経ガイドの使用を開示した〔N. Rangappa et al., J Biomed Mater Res, 51: 625-34(2000)〕。しかしながら、誘導路内のフィラメントの配列が不規則で再生が困難である。米国特許第4,963,146号および第5,019,087号はＩ型コラーゲンとラミニン含有物質を含む壁面を有する、中空の導管およびその導管の製造方法を開示した；これらは切断された哺乳類神経のin vivo再生を促進する。その方法は、Ｉ型コラーゲンとラミニン含有物質を含む分散液を調製する工程、その分散液に沈殿化剤を加える工程およびその沈殿物を回転する心棒と接触させチューブ状コラーゲン膜を製造する工程を含む。
【０００５】
多くの研究により、生物学的環境と人工的材料との相互作用はその材料の「表面上の性質」で多くの場合支配されることが示唆された。そこで、物質の生体適合可能性の改善のため、既存の生体物質の表面修飾が近年生体物質研究の主たる焦点となった。例えば長鎖アルキル基や生体活性分子の移植等の合成的アプローチが異なる研究機関で試みられた。これら合成的方法はしばしばもとの物質の物理的性質の改変を導いた。対照的に、プラズマ表面の修飾工程は、全体の物理的性質を変更することなく生体物質表面の性質を修飾し得ることが示された。加えて、基質中に特異的な官能基を導入するために、慣用的合成法では重合させることのできないものを含む広範な化学物質を用いることができる。
【０００６】
気体プラズマ処理は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）またはポリ（乳酸−グリコール酸）（乳酸−グリコール酸共重合体；ＰＬＧＡ）の化学修飾に広く用いられる。非重合性気体プラズマはポリマー表面上にパーオキシド基やスルホン酸基のような反応部位を創り出す。プラズマ処理はＰＬＡの親水性を増加させその細胞接着を改善するのに用いられる〔J. Yang et al., Polym Adv Technol, 13: 220-6(2002)〕。別法として、プラズマ処理とコラーゲン固定の組み合わせもまたＰＬＡの細胞親和性を有意に改良できた〔J. Yang et al., Biomaterials, 23: 2607-14 (2002)〕。これらの結果は表面の組成とプラズマ処理後のポリマー表面の官能基が、当該ポリマーの細胞親和性に大きく影響することを示している。
【０００７】
ラミニンのような細胞接着分子を含む神経ガイド／導管の使用により神経再生における改善結果が得られたが、さらに改善すべき余地が依然残っている。その上、それにより、より多くの有髄軸索が再生し、神経成長の速望ましい。そのような要求を満たし、例えば血管再生、過剰な線維化、神経線維の再配向、そして末端器官機能の乏しい回復等先行技術である神経修復の試みが遭遇した問題を除去し若しくは軽減する必要性が依然として存在する。
【発明の開示】
【０００８】
本発明により、神経再生のための新しい導管が見出され、これは神経再生についての先行技術が関係した問題や不利益の多くを除外しまたは実質的に軽減する。
従って第一の側面では、本発明は切断された末端間の間隙を架橋して切断された哺乳類神経の生体内再生を促進するための中空の導管を提供し、該導管はラミニンにより壁面の内腔表面に共有結合した生分解性高分子物質よりなる壁を含み、ここでラミニンの結合は気体プラズマ処理により達成される。
【０００９】
別の側面では、本発明は切断された末端間の間隙を架橋して切断された哺乳類神経の生体内再生を促進するためのラミニン修飾導管を製造する方法を提供する；該方法は、
ａ）生分解性高分子物質よりなる中空の導管を高分子表面が活性化されてラミニンと結合するために十分な時間、適切な出力密度と適切な圧の下で気体プラズマによる処理を行う工程、そして
ｂ）該高分子表面とラミニン間で共有結合を形成するのに十分な時間、導管の内腔表面をラミニンと接触させる工程、を含む。
【００１０】
さらなる側面では、本発明は切断された神経末端間の間隙を架橋するための切断された哺乳類神経の生体内再生を促進する方法を提供する；該方法は、それぞれの被切断神経末端と中空導管の各末端との接触を含み、その導管は生分解性高分子物質よりなる壁面を含み、ラミニンがその壁面の内腔表面と共有結合していて、そのラミニンの結合は気体プラズマ処理により達成される。
前述の要約と下記の発明の詳細な説明は、添付した図面とあわせて読むことによって、よりよく理解されるであろう。発明の説明する目的のため図面中には目下の好ましい態様が記載されている。しかしながら、本発明はその示された装置や手段に厳格に限定されるものでないことを理解すべきである。
【００１１】
本発明は切断された神経末端間の間隙を架橋するための被切断哺乳類神経の生体内再生を促進する中空の導管を提供する；該導管はラミニンが壁面の内腔表面に共有結合した生分解性高分子物質よりなる壁を含み、ここでラミニンの結合は気体プラズマ処理により達成される。
本発明に従うと、その生分解性高分子物質は神経導管を作るために慣用的に用いられるものをいい、コラーゲン、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸-グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン、ポリ（カプロラクトン-乳酸）（ＰＣＬＡ）、キトサン、アルギン酸、ヒアルロン酸、ゼラチン、およびフィブリンが含まれるがこれらに限定はされない。本発明の好ましい態様では、生分解性高分子物質はＰＬＧＡまたはキトサンである。
【００１２】
ラミニンはすべての基底膜における豊富な構成成分である。基底膜は上皮組織と間質、周辺神経、筋肉組織、平滑筋細胞および肥満細胞を分離する薄くて連続的なシートである。基底膜はとりわけ、IV型コラーゲン、ラミニン、ナイドジェン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、およびその他のグリコプロテインとプロテオグリカンを含む。ヒト胎盤は大量のラミニンを含み、よいラミニン源である。
ラミニンは基底膜や、ヒト胎盤のような物質から当業者によく知られた手段で抽出することができる。そのようなラミニンの抽出技術およびより詳細な議論は、ラパート・ティンプル等(Rupert Timple, et al.)「ラミニン；酵素学的方法−構造および収縮性タンパク質、パートＡ、細胞外マトリクス」82巻、47章、831-838頁, Academic Press,(1982)；ヒンダ・クレイマン等(Hynda K. Kleinman, et al.)、「ラミニンの生物学的活性」、Journal of Cellular Biochemistry, Vol. 27, pp. 317-325 (1985)に説明があり、参考のため両者の内容をすべてここに並べた如く援用する。
【００１３】
一般に、本発明の導管はその内径が約100μｍから約2000μｍの範囲である。好ましくは本発明の導管の内径は約570μｍである。導管の壁面の厚さは望ましい浸透性と崩壊を防ぐための十分な圧縮強度との均衡を表している。生体内(in vivo)での使用の際縫合と崩壊に耐え得る一方、できる限り薄く作られた導管が好ましい。好適には、導管の壁面の厚さは約0.5 mmから約1.5 mmの範囲である。好ましくは、本発明の導管の壁面の厚さは約1 mmから約1.2 mmの範囲である。導管の長さは、架橋すべき神経間隙の長さにより変化する。
【００１４】
本発明はまた、切断された末端間の間隙を架橋して、被切断哺乳類神経の生体内(in vivo)再生を促進するためのラミニン修飾導管を製造する方法を提供する；該方法は、
ａ）生分解性高分子物質よりなる中空の導管を高分子表面が活性化されてラミニンと結合するために十分な時間、適切な出力密度と適切な圧の下で気体プラズマによる処理を行う工程、そして
ｂ）該高分子表面とラミニン間で共有結合を形成するのに十分な時間、導管の内腔表面をラミニンと接触させる工程、を含む。
【００１５】
本発明に従うと、本発明のラミニン修飾導管を作るための中空の導管は、生分解性高分子物質よりなる市販の任意の導管でよい。或いは、その中空の導管は任意の公知方法により必要に従って調製され、これらは例えば、Biomaterials 24: 4265-4272 (2003)に示されたフリン等(Flynn et al.)の線維鋳型方法やBiomaterials 24: 819-830 (2003)に示されたサンドバック等(Sundback et al.)の低圧注入成型方法であって、参考のため両者の内容をすべてここに並べた如く援用する。
【００１６】
本発明のより好ましい態様では、中空の導管はハング等(Huang et al.)のJ. Biomed Mater Res Part B: Applied Materials 74: 659-664に開示された凍結乾燥およびワイヤ加熱法に従って調製され、参考のためその内容をすべてここに並べた如く援用する。要約すると、マトリクス（例えばキトサン等）溶液を心棒として金属（例えばNi-Cr等）ワイヤを含む鋳型に注入し；そのマトリクス溶液を含む鋳型を液体窒素トラップ中に入れて；凍結後、液体窒素からその鋳型を取り出して加熱のため金属ワイヤに電圧をかける；ワイヤを囲むマトリクスがわずかに溶けたら、縦方向に向いたチャネルをマトリクス内に作るためワイヤをマトリクスから抜き取り；凍結乾燥法により溶媒を除去して縦方向に向いたチャネルを有する導管を形成する。好ましくは、本発明のラミニン修飾導管を作るために用いられる中空の導管はキトサンまたはＰＬＧＡより作られる。
【００１７】
プラズマは電荷若しくは中性の種を含む気体として大まかに定義され、以下のものを含む；電子、陽性イオン、陰性イオン、ラジカル、原子および分子。プラズマ処理はポリマー表面を修飾するためのよく知られた方法である。そのような表面修飾は、例えば、他の官能基と特別な相互作用をする特別な官能基を表面上に作成するなど種々の目的達成のために用いることができる。プラズマ技術の複雑な議論がチャン等(C.-M. Chan et al.)のSurface Science Reports 24: 1-54 (1996)に提供されていて、参考のためその内容をすべてここに並べた如く援用する。
本発明に従うと、ポリマー部品のプラズマ処理は、その部品を処理に用いるガスと接触させて高周波、好ましくは気体をイオン化してプラズマ状態とするのに十分なおよそ13.56 MHzの高エネルギー放射線をかける。いずれの特別な理論または作用メカニズムに束縛される意図はないが、ポリマー鎖中の共有結合が解離することによりプラズマに接触しているポリマー鎖がプラズマで活性化され、相互にまたはプラズマガス自身のラジカルと反応性のあるフリーラジカルを生じると信じられる。
【００１８】
アルゴン、酸素、窒素、フッ素、二酸化炭素、および水のような異なるタイプの気体が種々の適用に必要な表面上の独特の性質を作り出すことができる。本発明に従うと、中空の導管処理に用いられるが気体プラズマは好ましくは酸素または酸素含有気体プラズマである。酸素プラズマが広範なポリマーと反応して表面上で種々の酸素官能基、例えばＣ−Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ−Ｃ＝ＯおよびＣＯ３等を産生し得ることはよく知られている。酸素プラズマによりポリマー表面上で産生された酸素官能基はラミニンの-ＮＨ２基と反応して導管の内腔表面へのラミニン結合をもたらすと信じられている。
【００１９】
本発明によるプラズマ処理の効果は、プラズマを生じさせる気体のタイプのみならず、電力密度、晒し時間、作業圧、気体流速、温度、電極間隔、チェンバー寸法、基質バイアス電圧-およびこれらの組み合わせに依存する。本発明に従うと、処理すべき表面上の単位面積あたりのワット量で表して電力密度を約２から約100 W/cm２の範囲で使用した場合に最良の結果が得られる。本発明の好ましい態様では、使用する電力密度は約50 W/cm２である。本発明で使用されるプラズマは低圧プラズマ、即ち気圧が、数mTorrから数百Torrの範囲が好ましい。本発明に従うと、約0 mTorrから約80 mTorrの圧を使用した場合に最良の結果が得られる。本発明のより好ましい態様によれば、使用される圧は約36 mTorrである。プラズマ処理がポリマー表面の活性化に十分であって、ポリマー材の微小構造が損なわれない限り、晒し時間は約５分から約10分の間である。本発明の好ましい態様では晒し時間は約５分である。例えば温度や気体流速等の他の処理条件は一定でなく本発明の新規性や有用性には重要でない。
【００２０】
本発明ではプラズマ処理導管の内腔表面とラミニンとの接触は任意の方法により達成される。例えば、適切な濃度のラミニンを含む溶液を導管に加えてもよい。ラミニン溶液の量は導管を沈めるために十分でなければならない。時間、温度等、ラミニンとポリマー表面との間の共有結合形成のためのの反応条件はポリマー種に依存するが、当業者は過度の実験をすることなく本願の開示をもとに決定することができる。本発明の態様では、100μg/mlのラミニン溶液200μlに導管を４℃で３時間インキュベートする。
【００２１】
本発明はさらに、神経の被切断末端とそれぞれの中空導管末端との接触を含む、被切断神経末端の間隙を架橋する哺乳類被切断神経のin vivo再生を促進させる方法を提供する；ここで、その導管はラミニンが壁の内腔表面と共有結合により結合した生分解性ポリマー物質よりなる壁で構成され、ラミニンの結合は気体プラズマ処理により達成される。
本発明のラミニン修飾導管は、ＰＮＳおよびＣＮＳの両方において、切断された神経の架橋および神経再生と機能回復の促進に適している。使用の際、切断された神経末端は本発明導管のそれぞれの末端と接触させ、その導管は架橋すべき間隙よりもわずかに長く被切断神経上に負荷はない。末端の近接した神経幹の双方を一部導管内に挿入する。導管は柔軟性に富むので、縫合することなく間隙に留まることができる。しかしながら、必要なら被切断末端を神経周膜上から導管に縫合してもよい。
【実施例】
【００２２】
実施例１  ラミニン修飾ポリマーフィルムの調製と特徴づけ
１．１  ポリマーフィルムの調製
二種類のポリマーフィルムを調製した。ＰＬＧＡ（ポリ(d,l)乳酸-グリコール酸）の場合、シグマ・ケミカル社(Sigma Chemcial Co.,USA)より購入したＰＬＧＡ(50:50、Mw：40,000-75,000)をゆっくりと攪拌しながらジオキサン中に溶解し５％(w/v)溶液を調製した。それから、この溶液250μlを９６ウェルマイクロプレートに加えて底周辺を浸した。室温で溶媒を空気中に蒸発させ乾燥したＰＬＧＡフィルムが得られた。
キトサンフィルムの場合、キトサン／酢酸の２%(w/v)溶液を代わりに用いた。脱アセチル化度（＞85％）のキトサン(Mw: 645,000)をシグマ・ケミカル社より購入した。酢酸(98%)は和光純薬工業より購入した。以下の製法はＰＬＧＡフィルムの場合と同様にした。水は蒸留しミリポア・システム(Millipore Milli-RO 10 Plus ろ過システム)を用いて脱イオン化した（抵抗18MΩ）。
【００２３】
１．２  ポリマーフィルムのラミニン修飾
ＰＬＧＡフィルムを親水性かつ化学的に活性とするため、最初にＰＬＧＡフィルムをアルゴン・プラズマで処理した。アナテック社(Anatech Co. Ltd., USA)製造のグロウ放電クォーツ反応器(モデルSP100 プラズマシステム)を用いて二つの平行なプレート電極の間でプラズマ処理を実施した。プラズマ電力供給は50W、13.56 MHzで行った。接地電極上に基質を上向きに置いて、アルゴン圧36 mTorrで10分間グロウ放電に晒し、続いてラミニン（L-2020、シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）縮合反応に供した。ラミニン(100μg/ml)溶液200μlを９６ウェルマイクロプレート中のプラズマで前処理したＰＬＧＡフィルム上に加え、4℃で３時間置いた。縮合反応の後、ラミニン-ＰＬＧＡフィルムをＰＢＳバファーで数回洗浄した。ＰＬＧＡ表面上に固定化されたラミニン量の計測にはＢＣＡプロテインアッセイキット（ピエース、ロックフォード、イリノイ州）を使用した。
キトサンフィルムを最初に0.1Ｍ ＮａＯＨ-ＭｅＯＨ（１：１）およびＭｅＯＨ-水（１：１）で洗浄して酸を中和し、空気中で乾燥させた。続く製法はＰＬＧＡフィルムの場合と同様にした。これら実験ではアルゴンプラズマのほか、酸素プラズマもまた使用した。
【００２４】
比較のため、以下の化学的方法によってもラミニン修飾を行った。最初に、ＰＬＧＡフィルムに対して100 mMの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ、39391、シグマ）を１時間加えそのカルボキシル基を活性化した。ＰＢＳで洗浄後、該フィルムをラミニン(100μg/ml)溶液200μlと３時間、4℃で反応させ続いてＰＢＳバファーで数回洗浄した。ＰＢＳ洗浄の後、ＢＣＡプロテインアッセイキットを用いてラミニン量を計測した。
化学的にラミニン修飾したキトサンフィルムを調製するためには、最初にカルボキシル基をキトサンに導入しなければならない。室温で２０重量％ＮａＯＨ（約50μl）と１０重量％モノクロロ酢酸溶液（約200μl）をpHが7.4 ± 0.2となるまで順番に加えた。その後、ＰＢＳでフィルムを数回洗浄した。続く製法はラミニン-ＰＬＧＡフィルムの場合と同様にした。
【００２５】
ラミニン修飾ポリマーフィルムを四群に分けた；(1) 100μg/mlのラミニンに4℃で3時間浸してからＰＢＳで3回洗浄したフィルム（フィルムに物理的に吸着させたラミニン、Lphys）；(2)ＷＳＣを加えてカルボキシル基を活性化してから100μg/mlのラミニンに4℃で3時間浸し、それからＰＢＳで3回洗浄したフィルム（物理的に吸着および化学的結合の両方によりフィルムに固定化したラミニン、Ltot）；(3)Ｏ２プラズマまたはＡｒプラズマ処理の後100μg/mlのラミニンに浸したフィルム（(LO２およびLAr）；(4)ブランクのフィルム；および(5)対照群としてのペトリ皿である。
フィルム上に固定化されたラミニンの百分率は次式
【００２６】
【数１】
2008100038.tif 000002
（式中、ＡＬａｍｉｎｉｎはラミニン固定化フィルムの吸収、Ａ０は100μg/mlのラミニンの吸収である。）
を用いて計算した。
【００２７】
ＰＬＧＡおよびキトサン表面上にラミニンがうまく移植されたかどうか確かめるため、ＢＣＡプロテインアッセイ用いてラミニン量を計測した。Table１によると、ＰＬＧＡに固定化されたラミニンの百分率はキトサンのそれよりも高い。さらに、その結果はまたほとんどのラミニンが物理的吸着によりフィルムに固定化されていることを示している。プラズマ処理については、両方の素材においてＯ２プラズマの効率のほうがＡｒプラズマよりも有意に高い。化学的方法でＰＬＧＡフィルム上に固定化されたラミニンの百分率はＯ２プラズマ処理を用いた場合とほとんど同じである。ＰＬＧＡフィルム上のラミニン量は41.3μg/cm２であるが、ラミニン-キトサンフィルムではＯ２プラズマ処理の効率がより高い。キトサンフィルム上のラミニン量は30.6μg/cm２である。キトサンフィルムはその機械的強度が低いため水溶液中で膨潤し、そのため化学的方法によるラミニン修飾は制御が困難である。上記の結論としては、伝統的に用いられる化学的方法と比較してＯ２プラズマはよりよい表面修飾方法である。
【００２８】
【表１】
2008100038.tif 000003
【００２９】
１．３  修飾した表面の特徴づけ
すべてのフィルムの表面修飾の更なる特徴づけのためフーリエ変換ＩＲ分光計（ＦＴＩＲ）を用いた。スペクトルはすべて4/cm、16スキャンの解像度で測定し標準的なソフトウェア・パッケージで解析した（パーキン・エルマー・スペクトラム・ワン、パーキン・エルマー社、ノーウォーク、コネチカット州、米国）。
【００３０】
Fig１はフィルムのＦＴＩＲ吸収スペクトルを示す。ラミニン-ＰＬＧＡフィルムでは、アミド基（−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ）のため1458cm−１の吸収スペクトルピークが明らかに増加した。1134cm−１の他のピークはアミド基（ＣＯ−ＮＨ２）とアミノ基（−ＣＨ２ＮＨ２）による。ＰＬＧＡフィルムにはアルカンのため、その吸収がある。キトサンおよびラミニン-キトサンフィルムでは、1649cm−１に対する1564cm−１のピークの比が有意な増加を示している。1649cm−１の吸収ピークはアミド基とアミノ基の両方の存在を示すが、アミド基のみが1564cm−１で吸収する。二つのピーク比率の変化はアミド基の生成とアミノ基の消滅を示している。換言すると、ラミニンがＰＬＧＡとキトサンの両方のフィルムにうまく固定化されている。
【００３１】
さらには、ＰＬＧＡおよびキトサンフィルムの表面の化学組成が高分解能Ｘ線光電子分光器(XPS, VGマイクロテック, MT-500, 英国)により研究された。スペクトルはVG Escalab 220i-xl分光器を用い、単色Mg-Ka放射源(1253.6 eV)、電力400Ｗの条件下で得た。９チャンネル検出器を備えたCLAM4 MCD電子分析器を用いた。C1sピーク領域(275295 eV)およびN1sピーク領域(390-415 eV)につき高分解能の詳細な走査をパスエネルギー20 eVで記録した。種々のC1sおよびN1sピーク濃度を相対ピーク面積から計算した。
【００３２】
ラミニン修飾前後におけるフィルム表面の化学的変化を研究するため高分解能ＸＰＳ測定を用いた。ラミニンの有無とは無関係にＰＬＧＡフィルムのC1s領域は三つのピークを示す〔Fig 2(a)〕。最初のピーク(284.5 eV)は脂肪族炭素結合または炭素-水素結合（-ＣＨ、-Ｃ-Ｃ-）のC1sに帰属された。第二のピークはエーテル結合(-Ｃ-Ｏ-)および-Ｃ-Ｎ結合のC1sに帰属され、第三のピークはカルボニル様種、例えば、-ＣＯＯ-、＞Ｃ=Ｏまたは-ＣＯＯＨのC1sに帰された。しかしながら、Table２に示すとおり、ラミニン結合後、C1sの三つのタイプの相対的組成は変化した。二つの異なる特徴が認められる。第一に-ＣＯおよび-ＣＮ結合の割合が13.7％に増加した。第二に脂肪族炭素結合または炭素-水素結合の割合が80.3％に増加した。第三にエステル結合の割合が減少した。
【００３３】
-ＣＯＯ-および-ＣＯＯＨ結合における減少と、-ＣＮ結合における増加はエステル結合の切断とアミド若しくはアミン結合の増加により引き起こされたのかもしれない。N1s XPSスペクトルにおける-Ｎ-Ｈおよび-Ｎ-Ｃ結合の増加はまたこの推測を支持する〔Table２およびFig 2(b)〕。これはラミニンおよびＰＬＧＡフィルム間に共有結合が生成したことを示す。ラミニン結合およびラミニンなしのキトサン・フィルムのC1s XPSスペクトルをFig 2(c)に示した。-ＣＨおよび-Ｃ-Ｃ-結合が減少し-Ｃ-Ｎ-およびカルボニル結合が有意に増加した。これら結果は脂肪族炭素または炭素-水素結合の切断とアミド結合の生成から生じているのかもしれない。XPSスペクトルによればラミニンはキトサン・フィルム上に共有結合的に結合していて、これはFTIR吸収スペクトルにおいても同様であった。-Ｎ-Ｈおよび-Ｎ-Ｃ-結合はキトサンおよびラミニン・キトサンフィルムの両方に存在するのでN1s XPSスペクトルは示さなかった。
【００３４】
【表２】
2008100038.tif 000004
【００３５】
１．４  修飾表面上におけるシュワン細胞の増殖と接着
ラミニン修飾フィルムの細胞親和性をシュワン細胞培養で確かめた。成熟雌性ウィスターラットのシュワン細胞を単離してブロックス等の方法〔J. P. Brockes et al., Brain Research. 165:105-118(1979)〕により培地中で培養した。要約すると、成熟雌性ウィスターラットを過剰の麻酔で犠牲死させた。左右の坐骨神経を切除してリン酸バファー生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１mmの長さに断片化した。この断片をダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）３ml中0.03％コラゲナーゼ／0.25％トリプシンで酵素消化し、5％CO２、37℃で30分間インキュベートした。その後、これら断片を2000 rpmで遠心分離して上澄を除いた。針を用いて機械的に神経上膜を剥がした。ペトリ皿中で10％加熱非活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と１％抗生剤（ペニシリン-ストレプトマイシン溶液とアムホテリシンＢ）を含むＤＭＥＭに一次細胞懸濁液をプレート化した。細胞濃度をより高めるため、培養の培地を週に二度交換し、個々の神経断片を週に一度新しい皿に移した。それから、シュワン細胞の成長に及ぼす種々のＰＬＧＡフィルムおよびキトサン・フィルムの影響を試験するため、懸濁の後、９６ウェルの組織培養プレート中の個々のウェルに２ｘ１０４cells/mlのシュワン細胞を10％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ２mlとともに播種した。
【００３６】
シュワン細胞の形態学的評価のため走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）と光学顕微鏡（オリンパスIX70）を用いた。ＳＥＭの観測のため、標本はすべて以下の手順で固定して脱水する必要があった。最初に、ＰＬＧＡおよびキトサンフィルムを2％グルタルアルデヒド／ＰＢＳに１時間浸して固定化した。それから、50％から開始して一連の上行性アルコール溶液を用いてフィルムを脱水した。そして臨界点乾燥器（ＣＰＤ）を用いて標本を乾燥した。標本はすべて金でコートしてからＳＥＭで調べた。ＳＥＭで得られた結果はここでは示さなかった。
連続的解明法を用いた精製で高度に精製されたＳＣ培養物が得られた。部分的に折り畳まれたと思われる細胞が相当数ありこれら細胞はいまだ完全には接着していないことを示していたが、多くの細胞が広がって紡錘型に変換されていた。
【００３７】
播種して１日後、修飾フィルムに接着したＳＣの多くは小さなラメリポディア伸張を示した〔Fig 3(b)および(c)、左〕。３日目、Ｏ２プラズマ処理ラミニン・キトサンフィルム上の多くの細胞が伸張しまたは紡錘型に変形した〔Fig 3(b)および(c)、右〕。プラズマ処理をしないラミニン・キトサンフィルム上では、長時間の後もまだ多くの細胞が十分に伸張しなかった。歴史的には、ＳＣは紡錘型と記述されてきた。しかしながら後年、多くの培養ＳＣはこの紡錘型の形態学的特徴を有するけれども、あるものは扁平な形態（線維芽細胞様）であることが示された。
【００３８】
細胞活性はＭＴＳアッセイ〔CellTiter 96(商標)、アクオウス、プロメガ〕を用いて定量化した。各時点でＭＴＳ試薬40μlと培養培地600μlをそれぞれのウェルに入れた。プレートは37℃、５％CO２で４時間培養した。波長490nmの吸収をUV/VIS分光器（Lambda 20、パーキン・エルマー）で測定して、値の平均を採用した。値から培養培地の吸収値を控除して測定値の背景を補正した。
修飾したフィルム間で接着した細胞の数量は異なった（Fig 4）。播種１０日目、Ｏ２プラズマ処理ラミニン・キトサンフィルムに接着した細胞数は他のフィルムと比較して有意に多かった。さらに、修飾フィルム上の細胞生存率を計算した図表からも同じ結果が得られた。
【００３９】
１．５  結論
この試験の結果、酸素プラズマを用いる表面修飾は、制御が容易でより直接的、そしてより有効であることが示された。慣用的な化学的方法と比較すると、プラズマ処理によりキトサンフィルム上に導入されたラミニンの比率は有意に高い。多くのラミニンは物理的吸着によりフィルム上に吸収された。FTIRおよびXPSを用いて、ラミニンが両方のフィルム表面上に固定化されることが示された。XPSスペクトルの結果はラミニンと表面との間に共有結合が形成されたことを示す。キトサンおよび／またはＰＬＧＡフィルム表面上のラミニンはシュワン細胞の接着および親和性に大きく影響した。これらの成功の結果は末梢神経再生に向けて重要と考えられる。
【００４０】
実施例２  ラミニン修飾神経導管による外傷性脊髄損傷後の機能回復
２．１  材料
平均分子量約645,000のキトサンはシグマ・ケミカル社より供給を受けた。脱アセチル化度は１Ｈ-ＮＭＲ測定により82.5 ± 1.15％と決定された。重水(D２O、L-4501)および塩化ジュウテリウム(DCl、D２O中35重量％)はシグマ・アルドリッチ社(USA)より購入した。酢酸（98％、和光純薬工業）およびNi-Crワイヤ（570μm）は受け取ったまま使用した。他のすべての化学品および溶媒はシグマ-アルドリッチ社（オークヴィル、カナダ）より購入し、特に言及しない限りそのまま使用した。水は蒸留しミリポア・システム(Millipore Milli-RO 10 Plus ろ過システム)を用いて脱イオン化した（抵抗18MΩ）。
【００４１】
２．２  脱アセチル化度（ＤＤＡ）の分析
市販品として入手できる脱アセチル化82.5 ± 1.15％のキトサン・フレークを110℃の40％水酸化ナトリウム水溶液に２時間浸し、ＤＤＡが96.4 ± 0.72％のキトサンを合成した。キトサン試料のＤＤＡはバショー等の変法〔L.Vachoud et al., Carbohydr Res 1997; 302:169-177；およびM.Lavertu et al., J Pharm Biomed Anal 2003;32:1149-1158参照〕１Ｈ-ＮＭＲ測定(ブルカー AV400MHz)により決定した。要約すると、キトサン10mgを1.96mlのD２Oと0.04mlのDCl中、室温で撹拌し30分間待って高分子を完全に溶解させて試料を調製した。溶液中の高分子の濃度はすべての場合約0.5％(w/v)であった。前述したメチル基のシグナルと、H1またはH2H6のシグナルの積分面積を比較してＤＤＡを計算した。
【００４２】
Fig５はＤＤＡの異なるキトサンの70℃における400MHz １Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す。アルカリ加水分解によりキトサンのＤＤＡは首尾よく調整できた。長い神経欠陥を修繕するためには骨格の再吸収速度がまた臨界的である。キトサンの脱アセチル化程度を制御すれば再吸収速度と機械的強度を規制することができる。フライエル等(Freier T. et al.)は脱アセチル化度の高いキトサンは分解速度が遅く、機械的強度が強くて細胞生存率が高いことを示した〔Freier T. et al., Biomaterials 26:4624-4632(2005)；およびFreier T. et al., Biomaterials 26:5872-5878(2006)〕。
【００４３】
２．３  ラミニン修飾神経導管の調製と特徴づけ
神経導管は凍結乾燥とワイア加熱の方法により調製した〔ハング等(Y. C. Huang et al.), 2005, 上記〕。要約すると、Ni-Crワイア(570μm)を心棒として用いた。キトサン／酢酸溶液(2％w/v)をワイヤを含む鋳型に注入した。ワイアの骨組みを含む鋳型を液体窒素トラップ中に入れた。凍結したら、電源(Tai Yee Shing、台湾)から電圧を上げながらNi-Crワイアを加熱した。電源を入れたなら、当該ワイアを、通常は１分間よりも短い時間で凍結した骨組みからワイアをできる限り速やかに引き抜いた。ワイアはペンチでまっすぐ引き抜けば容易に個別に除去できるであろう。それから温度制御凍結乾燥器(VirTis、ニューヨーク、米国)を用いて酢酸を昇華させた。凍結乾燥の後、神経導管を0.1Ｍ ＮａＯＨ-ＭｅＯＨ（１：１）およびＭｅＯＨ-水（１：１）で洗浄して酸を中和し再度凍結乾燥器で乾燥した。最後に、神経導管は使用するまで乾燥した環境下で保存した。鋭い外科用メスで導管を切断して所望の長さとした。
【００４４】
神経導管を親水性にそして化学的に活性化するため、最初酸素プラズマで処理した。プラズマ処理はアナテック社(Anatech Co. Ltd., USA)製造のグロウ放電クォーツ反応器(モデルSP100 プラズマシステム)を用いて二つの平行なプレート電極の間で実施した。プラズマ電力供給は50W、13.56 MHzで行った。接地電極上に基質を上向きに置いて、酸素圧36 mTorrで10分間グロウ放電に晒し、続いてラミニン（L-2020、シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）縮合反応に10分間晒した。ラミニン(100μg/ml)溶液200μlをプラズマで前処理した導管上に加えて、4℃で３時間置いた。縮合反応の後、ラミニン修飾神経導管をＰＢＳバファーで数回洗浄した。
【００４５】
ラミニン修飾神経導管の形態は光学顕微鏡(オリンパスIX70、日本)を用いて特徴づけした。我々はヘマトキシリン／エオシン(H&E)染色法を用いて骨格をより明確に撮影した。プラズマ技術で調製した神経導管におけるタンパク質分配を視覚化するため、上記方法に従って導管の代表的なサンプルを調製したが、ラミニンの代わりにローダミン-ＢＳＡ（赤色の蛍光）を用いた。調製の後、チャンネルをＰＢＳバファーで洗浄し、蛍光モードの共焦点顕微鏡(TCS SP2、レイカ、メジャー・インスツルメント社)を用いて視覚化した(Fig.６Ａ)。
【００４６】
Fig.６Ａに示すとおり、タンパク質は神経導管内に主として局在していた。その上、重要な写真によると、タンパク質がチャネルの壁面全体に分布していると思われた（データは示さず）。ラミニンはシュワン細胞の接着を助けて神経突起の成長を導くので、チャネルの壁面内部のラミニン局在化は神経再生を促進するはずである。このことはチャネル内での軸策の再生を促し再生能力増強につながり得る。
酸素プラズマ処理後の神経導管の微小構造変化を観察するため、蛍光および位相差画像をFig.６Ｂに示す。プラズマ処理が長いほど、構造破壊の程度は大きくなる。その上、10分間のプラズマ処理で、タンパク質は全体の骨格を貫通した。この結果は、処理時間の不適切な延長は骨格の微小構造損傷をもたらすことを示した。これは方向付けのない軸策再生を導くかもしれない。
【００４７】
２．４  外科的処置と動物ケア
以下の試験では成熟した250gの雌性スプラーグ・ドーリイ(Sprague-Dawley)ラットを使用した。動物を含むすべての手順はTaipei Veterans General Hospitalの動物委員会の承認を得た。T8でラット脊髄を完全に切断して、脊髄組織5 mmを切り取った。切断した脊髄中の5mmの間隙にキトサン導管を移植した。特定の期間、１または２カ月の経過後、ラットにペントバツビタールナトリウムの過剰量を与えた。組織切片染色のため、外傷部位嘴骨側の脊髄断片１-cm長のサンプルを採取した。ラットを生理食塩水、次いで4％緩衝パラホルムアルデヒドで灌流し、脊髄を後固定（ＰＦＡ中１時間）してスクロースのグラディエントを行った。脊髄をOCT Tissue Tekマウントメディアに埋め込んでクリオスタット中で切断した。連続する冠状の10 mmクリオ切片を作成して-20℃で保存した。
【００４８】
２．５  行動分析
すべての実験動物が同程度の外傷を受けたことを保証し、回復速度を監視するために、バッソ等の試験〔Basso、BeattieおよびBresnehanの移動試験(ＢＢＢ)〕および外傷後の組み合わせ行動スコア〔Combined Behavior Score (ＣＢＳ)；バッソ等(D.M.Basso et al.), J. Neurotrauma 12:121(1995)〕に従って動物の機能障害を試験した。ＢＢＢはオープンフィールド移動の間の姿勢、体重支え、協調を試験する。ＣＢＳは一連の反射試験を含み、つま先広げ、踏み直り、伸長・圧・痛みに応答しての引っ込め、立ち直り、水泳、そして熱い表面上に置かれた場合の前足を舐める反射が含まれ、オープンフィールドでの運動性、水泳、傾斜面での位置保持能力等を含む運動機能と協調している。
【００４９】
Fig.７Ａは二つの実験群におけるオープンフィールド・ウォーキングのＢＢＢおよびＣＢＳスコア平均を示す。代表的な動物のオープンフィールド移動を記録した映画によれば、ラミニン修飾神経導管および非修飾導管の両方の介入により障害の後肢は回復の可能性がある。両群のＢＢＢスコアは有意な機能回復を示さなかったが、ＣＢＳスコアはおよそ80の安定的な平均値を達成し、行動改善の発現を示している。非修飾神経導管を用いた群と比較して、ラミニン修飾神経導管を用いた実験群はより良好な結果を得た。
【００５０】
トレッドミル分析によりラットの機能回復をさらに試験した。ロボメディカ社（Robomedica,Inc.）(げっ歯類ロボット）より市販のロボッティックラット・ステッパーをこの試験で用いた。体重支持（ＢＷＳ）レベル、ラットの下部脛骨の位置をサンプリングして100Hzのデジタル形式でロボットを制御するコンピュータの保存ドライヴに蓄えた。ラットの下部脛骨の位置は精密光学旋光度エンコーダーでなされたロボットの関節角度測定から計算し、1.0mm未満に至るまで正確であった。ラットの踏み出し能力の詳しい評価はＳＣＩラットに導管移植してから１４、２８、３５および７０日後に行った。記録の際、ロボットを装着せずに３０秒間、75％ＢＷＳでラットをトレッドミル上に置いて歩行させた。それから、後肢にロボットを装着し四段階の固定ＢＷＳレベル（７５、５０、２５および０％）で３０秒間歩行させた。訓練および試験のすべての時間中、後肢の動きを矢上面においてビデオ撮影した。
【００５１】
試験日のラットの歩行能力を評価するために二種の結果判定法を用いた。第一に歩行検出アルゴリズムを用いて、各ＢＷＳレベルにおけるラットのそれぞれのステップ数を計測した。このアルゴリズムによりつま先離れ(toe-off)とつま先下ろし(toe-down)の事象を示す水平速度方向の変化が同定された。ステップ長、ステップ期間、速度の最大及び最小の限界が設定された。少なくとも一つのパタメータが限界の外にあるステップは短い屈曲若しくは大きな引き込みを表していてステップではないと推定され、分析から除外した。歩行能力評価のための第二の判定は、テスト期間中に記録されたビデオデータからの歩行の定性的評価である。それぞれの分析でＳＣＩラットは肢置き、体重負荷、および運動能力が評価された。評価者にはラットのトレーニング群は知らせなかった（即ち、固定ＢＷＳ、後足立ＢＷＳまたは非トレーニング）。歩行能力評価に加えて、ＢＷＳ減少に特異的な空間の一時的ステップ応答も調べた。ロボットの軌跡をステップ検出アルゴリズムにより個々のステップに分割し、ＢＷＳの機能としてステップの周期、揺れ、姿勢持続期間の他、ステップ長、ステップ高、およびつま先離れ位置を決定した〔ネスラー等(J.A.Nessler et al.), IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng 13(4):497-506(2005)〕。
【００５２】
Fig.７Ｂに示すとおり、傷害２ヶ月後のトレッドミル分析は足底歩行の改善を暗示し得る。そこで我々は、両方の導管で動物の機能が回復すると推測した。しかしながら、トレッドミル分析による歩行改善は筋若しくは神経機能によるものかも知れず、これを区別することは困難である。従って、行動改善の傾向はＢＢＢ、ＣＢＳおよびトレッドミル分析により得られた結果により示すことが可能である。これが以下の実験において免疫組織化学的および組織学的分析を行った理由である。
【００５３】
２．６  免疫組織化学
機能回復の説明を助けるためにすべての脊髄について組織および免疫細胞化学を検討した。動物を４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液でかん流した。脊髄を採取して終夜４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液中に浸し、それから30％スクロース溶液に移した。免疫染色のため、脊髄の水平または横断的低温切開片（厚さ20μm）をポリリジン皮膜スライド上においた。切片を関心のある抗体でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄してから、蛍光プローブと結合した二次抗体、またはビオチンと結合した二次抗体、次いでその後蛍光プローブと結合したストレプトアビジンとインキュベートし感度を増大させた。或いは、一次抗体とインキュベートした後、該切片をＡＢＣ混合物〔ベクトール・ラボ(Vector lab）〕中でインキュベートし、続いてＤＡＢ溶液中でインキュベートしてパオキシダーゼを発現させ、パオキシダーゼ・ラベルを視覚化するか、またはベクトール・ラボのキットで所望の発色現象を利用することもできる。
【００５４】
Fig.８Ａに示したＴ５からＴ１０の脊髄画像は、傷害後３０日のラミニン修飾群の代表例であり、そのＣＢＳスコアが個別の群の平均値に近い動物から得たものである。傷害域の多数のチューブリンβIII陽性細胞は多くの細胞が見出されたことを示した。さらに、ＥＤ−１陽性染色はマクロファージが傷害域に浸潤して抑制性の残がいを除去することを示した。
【００５５】
マクロファージはまた、サイトカインを産生し軸索の再成長を促し得る。軸索再生の直接の証拠を得るため再生軸索の成長円錐中で上方制御されているタンパク質の、ＧＡＰ−４３を使用した。ＧＡＰ−４３の存在は、一次抗体として抗ＧＡＰ−４３抗体を使用し、ウェスターンブロット分析により確かめた。ウェスターンブロット分析のため、一匹のラット脊髄から１０の切片を採取した。この切片を１mLの50mM NH４Cl中、室温で10分間インキュベートして、１ｘＰＢＳで洗浄し、さらに１mLの50mM Tris-HCl、pH 7.4中、室温で10分間インキュベートして、１ｘＰＢＳで洗浄した。1% NP-40 溶解バファー中の脊髄切片からタンパク質試料を抽出し、ブラッドフォードのタンパク質アッセイを用いて検出した。等量のタンパク質を3.5-12.5%のグラディエントSDS-PAGEゲル上にロードした。標準的方法により電気泳動を実施しタンパク質をPVDF膜に移してこれを一次抗体としての抗ＧＡＰ−４３抗体とインキュベートした。それからこの膜をＨＲＰ結合二次抗体とインキュベートし、スーパーシグナル・化学蛍光基質（ピエース、ロックフォード、イリノイ州）と反応させ、最終的にシグナルをフィルムに捕捉した。関係するＧＡＰ−４３陽性バンドの光学密度をイメージＪ（NIH）を用いて定量化した。
【００５６】
Fig.８Ｂに示した関係するＧＡＰ−４３陽性バンドの光学密度は再生が起こるプロフィールの成分が存在するかも知れないことを示唆した。非修飾群に比して、ラミニン修飾群ではより多くのＧＡＰ−４３が検出された。これは、神経の再生においてラミニン修飾神経導管がより効率的であることを意味する。
【００５７】
神経導管により媒介されて外傷性ＳＣＩに続き神経が再生するが可能な再生の経路については議論があるかも知れない。Ｔ５からＴ１０の横断的切片を入手し、外傷中心を通り脊髄中央線に沿って縦切片を切断した（Fig.８Ｃ）。Fig.８Ｃ(a)の赤い枠中の二つの画像は傷害域を示す。チャネルおよび骨格中の多数のチューブリン陽性要素はさらに細胞成長のメカニズム可能性を示唆する。導管のチャネルに加えて、キトサンの多孔性の骨格もまた細胞接着に良好な親和性を有する。Fig.８ＤにおけるＧＡＰ−４３の免疫染色の画像はFig.８Ｃと同じ脊髄領域から得られた。ＧＡＰ−４３陽性の結果は、傷害６０日後で多くのＧＡＰ−４３がチャネルの周囲に広がっていることを示した。神経導管の内部表面は軸索再生のための最適の領域なのかも知れない。
【００５８】
非修飾神経導管はＣＯＸ−２およびカスパーゼ−３に対する抗体のいずれについても免疫染色陰性であった〔それぞれ、Fig.８Ｅ(a)および(b)〕。Fig.８Ｅは免疫染色陰性領域は一次傷害領域内にあり、新しく生成された組織は炎症反応を生じていないことを示唆している。Fig.８Ｅ(b)の横断切片は脊髄のＴ５からＴ１０より採取し、神経導管はＴ８であった。アポトーシスを同定するためカスパーゼ−３抗体を用いた免疫組織診断を行った。陰性の結果は神経再生中にアポトーシスが生じていないことを示し勇気づけられた。
【００５９】
２．７  結論
酸素プラズマの使用により、我々は神経導管の内部表面上にラミニンを導入することに成功した。不適切に長時間のプラズマ処理は多孔性のキトサン骨格の微小構造を破壊するであろう。動物実験で、神経導管の移植を受けた後のＢＢＢ、ＣＢＳおよびトレッドミル分析から得た結果は行動改善の傾向が示された。ＥＤ−１、チューブリンβIIIおよびＧＡＰ−４３の免疫陽性染色は、神経導管により、損傷した軸索が外傷領域を通って伸び得ることを示した。ＣＯＸ−３およびカスパーゼ−３の免疫陰性染色は神経導管が不要な炎症や手術後のアポトーシスを引き起こさないらしいことを示した。ウェスターンブロット分析により、ラミニン修飾群のＧＡＰ−４３の光学密度は非修飾群と比較して良好であった。ラミニンは実際、軸索の成長効率を増加させる。
その広い発明概念から逸脱することなく上記の態様に変化を加え得ることが当業者であれば理解できるであろう。従って、この発明が開示された個々の態様に限定されないことを理解すべきであり、添付した特許請求の範囲の定義のとおり、本発明の精神と範囲内にある変法をカバーすることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】Fig.１は酸素プラズマ処理により調製したラミニン修飾フィルムのＦＴＩＲスペクトルを示す。（ａ）非処理ＰＬＧＡフィルム：（ｂ）ラミニンＰＬＧＡフィルム：（ｃ）非処理キトサンフィルム：（ｄ）ラミニンキトサンフィルム。
【００６１】
【図２】Fig.２は化学的方法または酸素プラズマ処理により調製したラミニン修飾フィルムのＸＰＳスペクトルを示す。（ａ）化学的方法により調製したラミニンＰＬＧＡフィルムのＸＰＳ Ｃ１ｓ核レベルスペクトルで、左側は非処理ＰＬＧＡフィルム、右側はラミニンＰＬＧＡフィルム：（ｂ）化学的方法により調製したラミニンＰＬＧＡフィルムのＸＰＳ Ｎ１ｓ核レベルスペクトルで、左側は非処理ＰＬＧＡフィルム、右側はラミニンＰＬＧＡフィルム：（ｃ）酸素プラズマ処理により調製したラミニンキトサンフィルムのＸＰＳ Ｃ１ｓ核レベルスペクトルで、左側は非処理キトサンフィルム、右側はラミニンキトサンフィルム。
【００６２】
【図３】Fig.３はシュワン細胞（ＳＣ）の顕微鏡写真を示す。（ａ）ペトリ皿で培養したＳＣの形態的外観：（ｂ）および（ｃ）は修飾フィルムに付着させたＳＣで、（ｂ）は酸素プラズマ処理したラミニンキトサンフィルム上のＳＣの形態的外観、（ｃ）は酸素プラズマ処理をしないラミニンキトサンフィルム上のＳＣの形態的外観、播種の１日後および３日後。
【００６３】
【図４】Fig.４はFig.４Ａおよび４Ｂを含み、修飾フィルムに付着させたＳＣの定量結果を示す。Fig.４Ａは異なるフィルムに接着させ播種から１０日後を経たＳＣのＭＴＳ試験の結果である。播種した細胞の数はおよそ1x10５細胞/ウェルで、三つの異なるフィルムを互いに比較した。Fig.４Ｂは三種のフィルムの細胞生存率相対比率を示す。吸収波長は４９０nmである。「キトサン＋プラズマ＋ラミニン」：酸素プラズマ処理したラミニンキトサンフィルム「キトサン＋プラズマ」：酸素プラズマ処理をしないラミニンキトサンフィルム「キトサン」：キトサンフィルムのみ。
【００６４】
【図５】Fig.５は70℃、異なるＤＤＡにおけるキトサンの400ＭＨz １Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す。（ａ）アルカリ加水分解したキトサン（ＤＤＡ= 96.4 ± 0.72％)：（ｂ）市販のキトサン（ＤＤＡ= 82.5 ± 1.15％）。
【００６５】
【図６】Fig.６はFig.６Ａおよび６Ｂを含む。Fig.６Ａは蛍光顕微鏡法を用いて、ローダミン-ＢＳＡを組み込んだ神経導管を示す。Fig.６Ｂはローダミン組み込み導管の横断面を示す；（ａ）と（ｂ）は蛍光画像、（ｃ）と（ｄ）は位相差画像である。該導管は５分間（ａおよびｃ）または１０分間（ｂおよびｄ）酸素プラズマ処理をした。
【００６６】
【図７】Fig.７はFig.７Ａおよび７Ｂを含み、行動分析の結果を示す。Fig.７Ａは、二つの実験群についての（ａ）ＢＢＢおよび（ｂ）ＧＢＳスコアを示し、赤い線はラミニン修飾神経導管、青い線は非修飾導管を用いた群を示す（データは平均±標準偏差で示す、ｎ＝３）。Fig.７Ｂは、非修飾神経導管を適用した動物のトレッドミル分析結果で（ａ）は脊髄損傷（ＳＣＩ）が生じた時、（ｂ）は損傷の２ヶ月後である。
【００６７】
【図８】Fig.８はFig.８Ａから８Ｅを含み、免疫組織学的分析結果を示す。Fig.８Ａは損傷中心のラミニン修飾神経導管断面であって、（ａ）から（ｃ）は細胞骨格マーカーのチューブリンβIII、（ｄ）から（ｆ）はマクロファージマーカーのＥＤ−１について免疫染色した。（ａ）と（ｄ）の断面はＴ５およびＴ６、（ｂ）と（ｅ）は損傷領域、（ｃ）と（ｆ）はＴ１０である。Fig.８Ｂは、ＧＡＰ-４３のウェスターンブロット抗体反応性を示し、ラミニン修飾群で関連する視覚密度は有意に高くアステリスクで示した（ステューデントのｔ-テスト）。Fig.８Ｃは、損傷から６０日後の非修飾群のチューブリン染色を示し、（ａ）は横断面、（ｂ）は縦断面である。Fig.８Ｄは、損傷から６０日後の非修飾群のＧＡＰ-４３染色を示し、（ａ）は横断面、（ｂ）は縦断面である。Fig.８Ｅは、損傷から６０日後の非修飾群で他の二つのマーカーについての免疫染色を示し、（ａ）はＣＯＸ-２染色の縦断面、（ｂ）はカスパーゼ-３染色の横断面である。
【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
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【図１（ｃ）】
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【図１（ｄ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月10日(2007.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被切断神経末端間の間隙を架橋して、切断された哺乳類神経の生体内再生を促進する中空の導管であって、生分解性ポリマー材料で構成される壁を含み、その壁の内腔表面と、その壁の内腔表面に共有結合で結合するラミニンで定義される内腔を形成し、ラミニンと内腔表面の結合が気体プラズマ処理で達成される導管。
【請求項２】
生分解性ポリマー材料が、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリ（カプロラクトン−乳酸）、キトサン、アルギン酸、ヒアルロン酸、ゼラチンおよびフィブリンよりなる群から選択される、請求項１の中空の導管。
【請求項３】
生分解性ポリマー材料がポリ（乳酸−グリコール酸）を含む、請求項２の中空の導管。
【請求項４】
生分解性ポリマー材料がキトサンを含む、請求項２の中空の導管。
【請求項５】
気体プラズマがＯ２プラズマ若しくはＯ２を含む気体プラズマである、請求項１の中空の導管。
【請求項６】
被切断神経末端間の間隙を架橋して、切断された哺乳類神経の生体内再生を促進するラミニン修飾導管を製造する方法であって、
(a)生分解性ポリマー材料で構成される中空の導管を、そのポリマー材料の内腔表面を活性化してラミニンと結合させるのに十分な電力密度、圧および時間で、気体プラズマによる処理を行い；そして
(b)活性化内腔表面とラミニンとの間に共有結合を形成させるために十分な時間、その活性化した内腔表面をラミニンと接触させる工程を含む、方法。
【請求項７】
気体プラズマがＯ２プラズマ若しくはＯ２を含む気体プラズマである、請求項６の方法。
【請求項８】
電力密度が約2 W/cm２から約100 W/cm２の範囲で(a)工程を行う、請求項６の方法。
【請求項９】
電力密度が約50 W/cm２で(a)工程を行う、請求項８の方法。
【請求項１０】
圧が約0 mTorrから約80 mTorrの範囲で(a)工程を行う、請求項６の方法。
【請求項１１】
圧が約36 mTorrで(a)工程を行う、請求項１０の方法。
【請求項１２】
(a)工程の処理時間が約5分間から10分間の範囲である、請求項６の方法。
【請求項１３】
(a)工程の処理時間が約5分間である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
(b)工程が、活性化された内腔表面とラミニンとの直接の接触を提供するようなラミニン濃度を含む溶液を導管に加えることを含む、請求項６の方法。
【請求項１５】
ラミニン溶液が約100μg/mlの濃度である、請求項１４の方法。
【請求項１６】
導管をラミニン溶液中約４℃で約３時間インキュベートする、請求項１５の方法。
【請求項１７】
生分解性ポリマー材料がポリ（乳酸−グリコール酸）およびキトサンから選択される、請求項６の方法。
【請求項１８】
該導管が請求項６の方法で製造される、被切断神経末端間の間隙を架橋して切断された哺乳類神経の生体内再生を促進する中空の導管。