(57)【要約】【課題】早期かつ最小の切除で、転移および／または浸潤のリスクを指標として口腔癌の悪性度を診断する方法を提供することが、課題である。さらに、口腔癌における浸潤および／または転移を抑制する核酸、抗体および組成物を提供することが、課題である。【解決手段】浸潤能の高い細胞において高い発現を示す新規マーカー遺伝子が開示される。この遺伝子は、５ｍｍ程度の最小の切除物からでも早期に口腔癌の浸潤および／または転移のリスクを決定することを可能にするマーカーである。本発明は、少なくとも２つの浸潤／転移マーカーを組み合わせて解析することが可能であることから、総合的に浸潤／転移を予測することで精度が増すという効果も奏する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の転移および／または浸潤の可能性を評価するための診断マーカーであって、以下：
配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号１に記載の核酸配列のフラグメントを含む核酸、
配列番号１に記載の核酸配列のフラグメントを含む核酸の対であって、少なくとも１０塩基の長さであって、ＰＣＲプライマーとして配列番号１に記載の核酸配列の少なくとも一部を増幅できる核酸の対、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに反応する抗体、
配列番号３に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号３に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号３に記載の核酸配列のフラグメントを含む核酸、
配列番号３に記載の核酸配列のフラグメントを含む核酸の対であって、少なくとも１０塩基の長さであって、ＰＣＲプライマーとして配列番号１に記載の核酸配列の少なくとも一部を増幅できる核酸の対、
配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに反応する抗体、
からなる群より選択される核酸または抗体を含む、癌の転移および／または浸潤診断マーカー。
【請求項２】
前記癌が、頭頸部に生じた扁平上皮癌である、請求項１に記載の診断マーカー。
【請求項３】
前記癌が、口腔癌である、請求項２に記載の診断マーカー。
【請求項４】
請求項１に記載の診断マーカーであって、以下、
配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸、および
配列番号３に記載の核酸配列を含む核酸、
からなる群より選択される核酸を含む、診断マーカー。
【請求項５】
請求項１に記載の診断マーカーであって、以下、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに反応する抗体、および
配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに反応する抗体、
からなる群より選択される抗体を含む、診断マーカー。
【請求項６】
被験体において癌の転移および／または浸潤の可能性を評価するための方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号１および配列番号３からなる群より選択される核酸配列を含む核酸、または
（ｉｉ）（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
の発現量を、該被験体由来の生物学的サンプルにおいて測定する工程、ならびに
（ｂ）該発現量を指標として、該被験体における該転移および／または浸潤の可能性を評価する工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
被験体において癌の転移および／または浸潤の可能性を評価するための方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
（ｉｉ）配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつ癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチド、
の発現量を、該被験体由来の生物学的サンプルにおいて測定する工程、ならびに
（ｂ）該発現量を指標として、該被験体における該転移および／または浸潤の可能性を評価する工程、
を包含する、方法。
【請求項８】
癌細胞の転移および／または浸潤を阻害および／または抑制する抗体であって、該抗体は、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに反応する抗体、および
配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに反応する抗体、
からなる群より選択される、抗体。
【請求項９】
前記癌が、頭頸部に生じた扁平上皮癌である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記癌が、口腔癌である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
癌細胞の転移および／または浸潤を阻害および／または抑制する組成物であって、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の抗体を含む、組成物。
【請求項１２】
さらに抗癌剤を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗癌剤が、シスプラチンまたは５−ＦＵである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
癌細胞の転移および／または浸潤を阻害および／または抑制する核酸であって、該核酸は、
（ｉ）配列番号１および配列番号３からなる群より選択される核酸配列を含む核酸、または
（ｉｉ）（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群より選択される核酸の発現量を低下させる、
核酸。
【請求項１５】
前記核酸が、
配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であり、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸のフラグメントである、核酸
配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であり、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸のフラグメントである、核酸
配列番号３に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であり、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸のフラグメントである、核酸、および
配列番号３に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であり、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸のフラグメントである、核酸
からなる群より選択される、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
前記癌が、頭頸部に生じた扁平上皮癌である、請求項１４または１５に記載の核酸。
【請求項１７】
前記癌が、口腔癌である、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
癌細胞の転移および／または浸潤を阻害および／または抑制する組成物であって、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の核酸を含む、組成物。
【請求項１９】
さらに抗癌剤を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記抗癌剤が、シスプラチンまたは５−ＦＵである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項２２】
癌細胞の転移および／または浸潤を阻害および／または抑制する組成物であって、請求項２１に記載のベクターを含む、組成物。
【請求項２３】
さらに抗癌剤を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗癌剤が、シスプラチンまたは５−ＦＵである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
抗浸潤薬のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）（ｉ）配列番号１および配列番号３からなる群より選択される核酸配列を含む核酸、または
（ｉｉ）（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
を発現する細胞と、候補化合物とを接触させる工程；
（ｂ）該細胞における該核酸の発現量を測定する工程；および
（ｃ）該測定された発現量を指標として、該候補化合物から抗浸潤活性を有する化合物を選択する、工程；
を包含する、方法。
【請求項２６】
抗浸潤薬のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）（ｉ）配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
（ｉｉ）配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつ癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチド、
を発現する細胞と、候補化合物とを接触させる工程；
（ｂ）該細胞における該ポリペプチドの発現量を測定する工程；および
（ｃ）該測定された発現量を指標として、該候補化合物から抗浸潤活性を有する化合物を選択する、工程；
を包含する、方法。
【請求項２７】
癌の転移および／または浸潤の可能性を測定するためのキットであって、該キットは、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物、および
該癌の転移および／または浸潤の可能性を評価するための指示書、
を備える、キット。
【請求項２８】
前記癌が、頭頸部に生じた扁平上皮癌である、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記癌が、口腔癌である、請求項２８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の浸潤および／または転移のリスクの予測による悪性度診断方法に関する。本発明はまた、癌の浸潤および／または転移を阻害および／または抑制する核酸、抗体および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、口腔癌は、増加傾向にある。口腔癌とは、歯肉、舌、頬部、口蓋、口底等の口腔を構成する部位の粘膜より発生する癌のことで、その発生頻度は全体の癌の約４％であり、日本では毎年１万５千人の新しい患者がでており、約７千人の人が口腔癌で死亡していると推定される。なお、東南アジア諸国では発癌因子を含む檳榔子の実を噛む習慣があるため、口腔癌の発生率が非常に高く、世界では年間５０万人の患者が発生し、全体の癌で５番目に発生率の高い癌である（非特許文献１）。
【０００３】
通常、粘膜表層に生じた癌は、深部へと浸潤・増殖し、頚部リンパ節や他臓器に転移する。口腔癌の悪性度には、深部への浸潤および／または転移が重要な因子であると考えられている。
【０００４】
現在、口腔癌の治療方針は、主に病理診断（生検）によって決定されている。生検においては、生体組織の一部を切除または摘出し、その形態から悪性度等を診断し、治療方針を決定する。しかし、形態からの判断では浸潤および／または転移の予測は不可能であるため、浸潤および／または転移を予測し、それによって早期に治療方針を決定する方法は現在のところ存在しない。
【０００５】
また、患者のクオリティ・オブ・ライフ（ＱＯＬ）の観点から、口腔癌が存在する部位である顔または舌を大規模に切除するのは望ましくない。５ｍｍ程度の最小の切除によりその癌の悪性度が判定され、治療方針を決定できることが望ましい。この点からも、現在の生検とは異なる、口腔癌の悪性度診断法が必要とされている。
【０００６】
近年の分子生物学の進歩に伴って、疾患の存在、リスクまたは悪性度診断のための特定の核酸またはポリペプチドのマーカーの同定がさかんに試みられている。しかし、口腔癌の浸潤および／または転移を予測し、早期に治療方針を決定することを可能にするような優れたマーカーは存在しない。
【非特許文献１】Ｍａｏ  Ｌ，Ｈｏｎｇ  ＷＫ，Ｐａｒａｄｉｍｉｔｒａｋｏｐｏｕｌｏｕ  ＶＡ．Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００４年；５：ｐ．３１１〜６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の問題点を考慮し、本発明は、早期かつ最小の切除で、転移および／または浸潤のリスクを指標として口腔癌の悪性度を診断する方法を提供することを課題とする。本発明はさらに、口腔癌における浸潤および／または転移を抑制する核酸、抗体および組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、浸潤能の高い細胞において高い発現を示す遺伝子を新規に同定することによって、本発明を完成させた。この遺伝子は、５ｍｍ程度の最小の切除物からでも早期に口腔癌の浸潤および／または転移のリスクを決定することを可能にするマーカーである。本発明におけるこれらのマーカーの同定は、浸潤および／または転移を予測する悪性度診断法は存在しないという従来の課題を解決するという顕著な効果を奏する。本発明は、少なくとも２つの浸潤／転移マーカーを組み合わせて解析することが可能であることから、総合的に浸潤／転移を予測することで精度が増すという効果も奏する。
【０００９】
従って、本発明は、以下を提供する。
（書類名）特許請求の範囲
（項目１）
癌の転移および／または浸潤の可能性を評価するための診断マーカーであって、以下：
配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号１に記載の核酸配列のフラグメントを含む核酸、
配列番号１に記載の核酸配列のフラグメントを含む核酸の対であって、少なくとも１０塩基の長さであって、ＰＣＲプライマーとして配列番号１に記載の核酸配列の少なくとも一部を増幅できる核酸の対、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに反応する抗体、
配列番号３に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号３に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号３に記載の核酸配列のフラグメントを含む核酸、
配列番号３に記載の核酸配列のフラグメントを含む核酸の対であって、少なくとも１０塩基の長さであって、ＰＣＲプライマーとして配列番号１に記載の核酸配列の少なくとも一部を増幅できる核酸の対、
配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに反応する抗体、
からなる群より選択される核酸または抗体を含む、癌の転移および／または浸潤診断マーカー。
（項目２）
上記癌が、頭頸部に生じた扁平上皮癌である、項目１に記載の診断マーカー。
（項目３）
上記癌が、口腔癌である、項目２に記載の診断マーカー。
（項目４）
項目１に記載の診断マーカーであって、以下、
配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸、および
配列番号３に記載の核酸配列を含む核酸、
からなる群より選択される核酸を含む、診断マーカー。
（項目５）
項目１に記載の診断マーカーであって、以下、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに反応する抗体、および
配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに反応する抗体、
からなる群より選択される抗体を含む、診断マーカー。
（項目６）
被験体において癌の転移および／または浸潤の可能性を評価するための方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号１および配列番号３からなる群より選択される核酸配列を含む核酸、または
（ｉｉ）（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
の発現量を、その被験体由来の生物学的サンプルにおいて測定する工程、ならびに
（ｂ）その発現量を指標として、その被験体におけるその転移および／または浸潤の可能性を評価する工程、
を包含する、方法。
（項目７）
被験体において癌の転移および／または浸潤の可能性を評価するための方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
（ｉｉ）配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつ癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチド、
の発現量を、その被験体由来の生物学的サンプルにおいて測定する工程、ならびに
（ｂ）その発現量を指標として、その被験体におけるその転移および／または浸潤の可能性を評価する工程、
を包含する、方法。
（項目８）
癌細胞の転移および／または浸潤を阻害および／または抑制する抗体であって、その抗体は、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに反応する抗体、および
配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに反応する抗体、
からなる群より選択される、抗体。
（項目９）
上記癌が、頭頸部に生じた扁平上皮癌である、項目８に記載の抗体。
（項目１０）
上記癌が、口腔癌である、項目９に記載の抗体。
（項目１１）
癌細胞の転移および／または浸潤を阻害および／または抑制する組成物であって、項目８〜１０のいずれか１項に記載の抗体を含む、組成物。
（項目１２）
さらに抗癌剤を含む、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
上記抗癌剤が、シスプラチンまたは５−ＦＵである、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
癌細胞の転移および／または浸潤を阻害および／または抑制する核酸であって、その核酸は、
（ｉ）配列番号１および配列番号３からなる群より選択される核酸配列を含む核酸、または
（ｉｉ）（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群より選択される核酸の発現量を低下させる、
核酸。
（項目１５）
上記核酸が、
配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であり、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸のフラグメントである、核酸
配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であり、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸のフラグメントである、核酸
配列番号３に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であり、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸のフラグメントである、核酸、および
配列番号３に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であり、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸のフラグメントである、核酸
からなる群より選択される、項目１４に記載の核酸。
（項目１６）
上記癌が、頭頸部に生じた扁平上皮癌である、項目１４または１５に記載の核酸。
（項目１７）
上記癌が、口腔癌である、項目１６に記載の核酸。
（項目１８）
癌細胞の転移および／または浸潤を阻害および／または抑制する組成物であって、項目１４〜１７のいずれか１項に記載の核酸を含む、組成物。
（項目１９）
さらに抗癌剤を含む、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
上記抗癌剤が、シスプラチンまたは５−ＦＵである、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
項目１４〜１７のいずれか１項に記載の核酸を含む、ベクター。
（項目２２）
癌細胞の転移および／または浸潤を阻害および／または抑制する組成物であって、項目２１に記載のベクターを含む、組成物。
（項目２３）
さらに抗癌剤を含む、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
上記抗癌剤が、シスプラチンまたは５−ＦＵである、項目２３に記載の組成物。
（項目２５）
抗浸潤薬のスクリーニング方法であって、その方法は、
（ａ）（ｉ）配列番号１および配列番号３からなる群より選択される核酸配列を含む核酸、または
（ｉｉ）（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
を発現する細胞と、候補化合物とを接触させる工程；
（ｂ）その細胞におけるその核酸の発現量を測定する工程；および
（ｃ）その測定された発現量を指標として、その候補化合物から抗浸潤活性を有する化合物を選択する、工程；
を包含する、方法。
（項目２６）
抗浸潤薬のスクリーニング方法であって、その方法は、
（ａ）（ｉ）配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
（ｉｉ）配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつ癌細胞の浸潤を増強させる活性を有するポリペプチド、
を発現する細胞と、候補化合物とを接触させる工程；
（ｂ）その細胞におけるそのポリペプチドの発現量を測定する工程；および
（ｃ）その測定された発現量を指標として、その候補化合物から抗浸潤活性を有する化合物を選択する、工程；
を包含する、方法。
（項目２７）
癌の転移および／または浸潤の可能性を測定するためのキットであって、そのキットは、
項目１〜５のいずれか１項に記載の組成物、および
その癌の転移および／または浸潤の可能性を評価するための指示書、
を備える、キット。
（項目２８）
上記癌が、頭頸部に生じた扁平上皮癌である、項目２７に記載のキット。
（項目２９）
上記癌が、口腔癌である、項目２８に記載のキット。
【００１０】
本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、早期かつ最小の切除で、転移および／または浸潤のリスクを指標として口腔癌の悪性度を診断する方法が提供される。さらに本発明によって、口腔癌における浸潤および／または転移を抑制する核酸、抗体および組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に本発明を、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により記載する。本発明を以下に説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１３】
以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきではない。本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは、当業者に明らかである。
【００１４】
本発明者らは、口腔癌患者より培養細胞株を樹立し、その細胞よりｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ（具体的な方法については、実施例の一般的手法の項を参照のこと）を応用して浸潤能の高い細胞を分離した。浸潤能の高い細胞において高い発現を示す遺伝子であるＩＦＩＴＭ１（核酸配列は配列番号１に、アミノ酸配列は配列番号２にそれぞれ示す）およびＷＮＴ５Ｂ（核酸配列は配列番号３に、アミノ酸配列は配列番号４にそれぞれ示す）を新規に同定することによって、本発明を完成させた。この遺伝子は、５ｍｍ程度の最小の切除物からでも早期に口腔癌の浸潤および／または転移のリスクを決定することを可能にするマーカーである。本発明におけるこれらのマーカーの同定は、浸潤および／または転移を予測する悪性度診断法は存在しないという従来の課題を解決するという顕著な効果を奏する。
【００１５】
本発明はさらに、少なくとも２つ（ＩＦＩＴＭ１遺伝子およびＷＮＴ５Ｂ遺伝子）の浸潤／転移マーカーを組み合わせて解析することが可能であることから、総合的に浸潤／転移を予測することで精度が増すという効果も奏する。また、本発明の方法では、約２日という短期間で悪性度診断が完了する。
【００１６】
ＩＦＩＴＭ１／９−２７は、インターフェロンにより誘導される約１７ＫＤの膜タンパクとして同定された。ＩＦＩＴＭ１は、細胞増殖を抑制することが知られているが、その他の機能に関してはよくわかっていない。癌でのＩＦＩＴＭ１の報告は、これまでにほとんどなく、癌におけるＩＦＩＴＭ１の詳細な機能についてはまだ明らかにされていない。
【００１７】
Ｗｎｔ５Ｂは、発生や癌化に深く関わるＷｎｔファミリーのメンバーで、Ｗｎｔ５Ａと高い相同性を有している。機能については、ほとんど明らかにされていないが、脂肪細胞の機能を介して、糖尿病に関わることやＷｎｔ５Ａとともに癌細胞株で高い発現を示すことが知られている。
【００１８】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００１９】
「転移」とは、癌細胞が体のある場所から他の離れた場所に運ばれ、そこで増殖を続ける現象をいう。
【００２０】
「浸潤」とは、一般的に、癌細胞、白血球、リンパ球などの遊走細胞が組織内に侵入する病理的現象をいう。本明細書中における「浸潤」とは、特に、癌細胞の組織内への侵入をいう。
【００２１】
「転移の可能性」とは、癌の転移の起こりやすさまたはリスクをいう。本明細書中における「転移」は、例えば以下の実施例５に記載されるように、マウスなどの実験動物のある部位（例えば、実施例５においては舌）に癌細胞を注射し、ある一定期間の経過後にその動物のいくつかの組織（例えば、実施例５においては頚部リンパ節および肺）を採取して、注射した部位以外の組織における癌の存在を試験することによって、決定される。マウスなどの実験動物の尾静脈に癌細胞を注射し、様々な臓器への転移の有無を決定するアッセイ法によってもまた、「転移」は決定され得る。
【００２２】
「浸潤の可能性」とは、癌の浸潤の起こりやすさまたはリスクをいう。本明細書中における「浸潤」は、例えば実施例の一般的手法に記載されるようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙによって決定される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙでは、マトリゲルを移動（浸潤）してフィルターを貫通する細胞の数を指標にして、細胞株の浸潤能を決定する。一般的に、貫通した細胞数が多いほど、その細胞株の浸潤能は高く、貫通した細胞数が少ないほど、その細胞株の浸潤能は低い。
【００２３】
本明細書中で「癌の転移および／または浸潤の可能性を評価する」とは、癌の転移および／または浸潤の起こりやすさまたはリスクを決定することをいう。本発明では一般的に、被験体由来の生物学的サンプルにおいてＩＦＩＴＭ１遺伝子およびＷＮＴ５Ｂ遺伝子の発現が正常組織と比較して高い（例えば、コントロールの発現量の１．５倍以上）場合に、その被験体は「癌の転移および／または浸潤の可能性が高い」と評価され、正常組織と比較して同程度（例えば、コントロールの発現量の１〜１．２倍）の場合に、その被験体は「癌の転移および／または浸潤の可能性が高くない」と評価され、そして正常組織と比較して低い（例えば、コントロールの発現量の１倍未満）場合に、その被験体は「癌の転移および／または浸潤の可能性が低い」と評価される。本発明において使用するコントロールとしては、代表的には、口腔粘膜上皮（歯肉または舌の表面を覆う上皮組織）を使用するが、これに限定されない。
【００２４】
「浸潤を増強させる」とは、浸潤能を高くすることをいう。上述のように、浸潤能は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙでは、移動してフィルターを貫通する細胞の数を指標にして決定される。浸潤が増強された細胞株は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙにおいて移動してフィルターを貫通する細胞の数が増加する。
【００２５】
転移および／または浸潤を「阻害および／または抑制する」とは、癌の転移および／または浸潤を起こりにくくすること、転移および／または浸潤の可能性を低下させること、あるいは転移および／または浸潤が起こらないようにすることをいう。
【００２６】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖形態、二本鎖形態、または他の形態である、リン酸エステルポリマー形態のリボヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオチド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン（ＤＮＡ分子」）、またはそれらの任意のホスホエステルアナログ（例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル）を指し得る。
【００２７】
「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオシド」とも呼ばれる）であり、２つの以上のヌクレオチドの任意の鎖またはその相補鎖を意味する。本発明の好ましい核酸は、配列番号１もしくは３のいずれかに示される核酸、ならびにその相補鎖、改変体およびフラグメントを包含する。
【００２８】
「相補鎖」とは、ある核酸配列に対して塩基対を形成し得るようなヌクレオチドの鎖を意味する。例えば、二本鎖ＤＮＡの各々の鎖は互いに相補的な塩基配列を有し、一方の鎖から見て他方の鎖は相補鎖である。
【００２９】
「コード配列」または発現生成物（例えば、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、もしくは酵素）を「コードする」配列は、発現された場合にその生成物の生成をもたらすヌクレオチド配列である。
【００３０】
「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の連続列を含む。本発明の好ましいペプチドは、配列番号２もしくは４のいずれかに示されるペプチド、ならびにその改変体およびフラグメントを包含する。
【００３１】
「タンパク質配列」、「ペプチド配列」、または「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中にある一連の２つ以上のアミノ酸を指す。
【００３２】
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。
【００３３】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。
【００３４】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
【００３５】
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【００３６】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００３７】
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。
【００３８】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００３９】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ
、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【００４０】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【００４１】
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５
Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
【００４２】
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
【００４３】
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１ＭＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
【００４４】
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１の核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
【００４５】
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列（他
の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする）と比較したときに、付加または欠失（すなわちギャップ）が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（８）：２４４４−２４４８、  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。
【００４６】
（１）  ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２）  ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３）  ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４）  ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５）  ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
【００４７】
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。
【００４８】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【００４９】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プライマーとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、最も好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【００５０】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００５１】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ  ＥＳ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００５２】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００５３】
本明細書において核酸の存在を確認するには、放射能法、蛍光法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価され得る。
【００５４】
本明細書中で、「生物学的サンプル」とは、例えば、血液、血清、尿、および／または腫瘍生検をいうが、これらに限定されない。
【００５５】
「マーカー」とは、生物学的因子を明確に同定する、生物学的因子の高分子的、微視的、または分子的特徴をいう。
【００５６】
「抗体」は、抗体およびそのフラグメント（好ましくは、抗原結合フラグメント）を包含するが、これらに限定されない。この用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、単鎖Ｆｖ抗体フラグメント、およびｄｓＦｖ抗体フラグメントを包含する。さらに、本発明の抗体分子は、完全ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ニワトリ抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。本発明の抗体は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに、特異的に反応する。
【００５７】
「中和」は、生物学的活性を有する物質が、それに対する抗体に結合することにより、活性を失う現象をいう。本明細書中では、この生物学的活性は特に、転移および／または浸潤活性である。
【００５８】
「中和抗体」は、生物学的活性を中和する抗体をいう。本明細書中における「中和抗体」は、特に、癌細胞の転移および／または浸潤活性を中和する抗体をいう。
【００５９】
本発明が適用され得る癌は、頭頸部に生じた扁平上皮癌である。本発明が適用され得る癌は、特に、口腔癌である。本発明の別の実施形態においては、本発明が適用され得る癌は、大腸癌、胃癌または悪性黒色腫であり得るが、これらに限定されない。
【００６０】
本発明の核酸または抗体は、抗癌剤と組み合わせて使用され得る。この抗癌剤としては、当該分野で公知の任意の抗癌剤（抗悪性腫瘍薬剤、細胞毒性薬剤（例えば、ＤＮＡ相互作用剤（例えば、シスプラチンまたはドキソルビシン）等）；タキサン（例えば、タキソテール、タキソール）；トポイソメラーゼＩＩインヒビター（例えば、エトポシド）；トポイソメラーゼＩインヒビター（例えば、イリノテカン（すなわちＣＰＴ−１１）、カンプトスターまたはトポテカン）；微小管相互作用剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセルまたはエポシロン）；ホルモン剤（例えば、タモキシフェン）；チミジル酸合成インヒビター（例えば、５−フルオロウラシル）；代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート）；アルキル化剤（例えば、テモゾロミド（ＴＥＭＯＤＡＲＴＭ）、シクロホスファミド）；ファネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター（例えば、ＳＡＲＡＳＡＲＴＭ（４−［２−［４−［（１１Ｒ）−３，１０−ジブロモ−８−クロロ−６，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［５，６］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−１１−イル−］−１−ピペリジニル］−２−オキソエチル］−１−ピペリジンカルボキサミド、またはＳＣＨ  ６６３３６）、チピファルニブ（ＺａｒｎｅｓｔｒａｓまたはＲ１１５７７７）、Ｌ７７８，１２３（ファネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター）、ＢＭＳ  ２１４６６２（ファネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター）；シグナル伝達系インヒビター（例えば、Ｉｒｅｓｓａ、Ｔａｒｃｅｖａ（ＥＧＦＲキナーゼインヒビター）、ＥＧＦＲに対する抗体（例えば、Ｃ２２５）、ＧＬＥＥＶＥＣＴＭＣ−ａｂｌキナーゼインヒビター）；インターフェロン（例えば、イントロン、Ｐｅｇ−イントロン）；ａｒａ−Ｃ、アドリアマイシン、シトキサンおよびゲムシタビン）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物と組み合わされて使用される、特に有用な抗癌剤は、シスプラチンまたは５−ＦＵである。
【００６１】
本明細書中において、「抗浸潤剤」とは、癌の浸潤を阻害および／または抑制することができる任意の因子をいう。
【００６２】
「抗浸潤活性」とは、浸潤を阻害および／または抑制し、浸潤が起こる可能性を低下させる活性をいう。
【００６３】
本発明の遺伝子は、ｓｉＲＮＡを用いてその発現をノックダウンすることが可能である。所定の遺伝子からｓｉＲＮＡを調製する方法は周知であり、例えば、実施例に示すような方法によって調製できる。さらに、（１）ＧまたはＣが連続して４つ以上存在しない、（２）ＡまたはＴが連続して４つ以上存在しない、（３）ＧあるいはＣが９塩基以上存在しない、などの条件を加えてもよい。本発明のｓｉＲＮＡは、１９塩基長、２０塩基長、２１塩基長、２２塩基長、２３塩基長、２４塩基長、２５塩基長、２６塩基長、２７塩基長、２８塩基長、２９塩基長、または３０塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、１９塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２０塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２１塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２２塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２３塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２４塩基長である。ｓｉＲＮＡの調製法については、実施例の一般的手法の項を参照のこと。
【００６４】
用語「発現する」および「発現」は、遺伝子、ＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列中の情報が明らかになるのを可能にすることまたはそれを引き起こすこと（例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによって、タンパク質を生成すること）を意味する。ＤＮＡ配列は、細胞中でかまたは細胞によって、「発現生成物」（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質）を形成するように発現される。その発現生成物自体はまた、その細胞によって「発現される」と言われ得る。
【００６５】
用語「形質転換」とは、核酸を細胞中に導入することを意味する。導入される遺伝子または配列は、「クローン」と呼ばれ得る。その導入されるＤＮＡまたはＲＮＡを受ける宿主細胞は、「形質転換」されており、これは、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、任意の供給源由来であり得、宿主細胞と同じ属または種の細胞由来であっても、異なる属または種の細胞由来であってもよい。
【００６６】
用語「ベクター」は、宿主を形質転換し、必要に応じて導入された配列の発現および／または複製を促進するように、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が宿主細胞中に導入され得る媒体（例えば、プラスミド）を包含する。
【００６７】
本発明において使用され得るベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡフラグメント、および宿主ゲノム中への核酸の導入を促進し得る他の媒体が挙げられる。プラスミドは、最も一般的に使用される形態のベクターであるが、同様の機能を提供しかつ当該分野で公知であるかまたは公知となる他のすべての形態のベクターが、本明細書中で野使用のために適切である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８５  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら、（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ  １９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。
【００６８】
用語「発現系」とは、適切な条件下で、そのベクターにより保有されて宿主細胞中に導入されるタンパク質または核酸を発現し得る、宿主細胞および適合性ベクターを意味する。一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。
【００６９】
本発明の配列番号２または４に記載のポリペプチドをコードする核酸の発現は、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかにおいて従来の方法によって実行され得る。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、原核生物系において最も頻繁に使用されるが、他の多くの細菌（例えば、種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓの株）が、当該分野で公知であり、そしてコレラも同様に、使用され得る。配列番号２または４に記載のポリペプチドをコードする核酸を発現するために適切な宿主細胞としては、原核生物および高等真核生物が挙げられる。原核生物は、グラム陰性生物およびグラム陽性生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の両方を包含する。高等真核生物は、動物細胞（非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞）および哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類、および齧歯類）の両方の動物細胞）由来の樹立された組織培養細胞株を包含する。
【００７０】
原核生物宿主−ベクター系は、多くの異なる種のための広範な種類のベクターを包含する。ＤＮＡを増幅するための代表的なベクターは、ｐＢＲ３２２またはその誘導体の多く（例えば、ｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９）である。配列番号２または４に記載のポリペプチドを発現するために使用され得るベクターとしては、ｌａｃプロモーターを含むベクター（ｐＵＣシリーズ）；ｔｒｐプロモーターを含むベクター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；Ｉｐｐプロモーターを含むベクター（ｐＩＮシリーズ）；λ−ｐＰプロモーターもしくはλ−ｐＲプロモーターを含むベクター（ｐＯＴＳ）；またはハイブリッドプロモーター（例えば、ｐｔａｃ）を含むベクター（ｐＤＲ５４０）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｒｏｓｉｕｓら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ｌａｍｂｄａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎｄ  Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ（編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．２０５〜２３６を参照のこと。多くのポリペプチドは、米国特許第４，９５２，４９６号、同第５，６９３，４８９号および同第５，８６９，３２０号、ならびにＤａｖａｎｌｏｏ，Ｐ．ら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：２０３５〜２０３９；Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．ら、（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ら、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５６：１２５−１３５；およびＤｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．ら、（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６８：２５９に開示されるような、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｔ７発現系において、高レベルで発現され得る。
【００７１】
高等真核生物組織培養細胞もまた、本発明の配列番号２または４に記載のポリペプチドの組換え生成のために使用され得る。任意の高等真核生物組織培養細胞株（昆虫バキュロウイルス発現系が挙げられる）が使用され得るが、哺乳動物細胞が、好ましい。このような細胞の形質転換、トランスフェクションおよび増殖は、慣用的手順となっている。有用な細胞株の例としては、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、Ｊ７７４細胞、Ｃａｃｏ２細胞、ラット乳児腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞株、およびサル（ＣＯＳ）細胞株が挙げられる。そのような細胞株のための発現ベクターは、通常は、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、通常は、選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスのような供給源に由来するプロモーターを保有する、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。発現ベクターの例としては、ｐＣＲ（登録商標）３．１、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１１３６）、ｐＭＣ１ｎｅｏ  Ｐｏｌｙ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら、（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３）、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴおよびそれらの誘導体、ならびにバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０）が挙げられる。
【００７２】
本発明はまた、本発明の配列番号２または４に記載のポリペプチドおよび配列番号１または３に記載のポリヌクレオチドと、第２ポリペプチド部分もしくは第２ポリヌクレオチド部分（「タグ」と呼ばれ得る）とを含む、融合物を包含する。本発明の融合ポリペプチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを、発現ベクター中に挿入することによって、簡便に構築され得る。本発明の融合物は、精製または検出を容易するタグを含み得る。そのようなタグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、セルロース結合タンパク質（ＣＢＰ）タグ、およびｍｙｃタグが挙げられる。検出可能なタグ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、６８Ｇａ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１３ｍＩｎ、７６Ｂｒ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎおよび６８Ｇａ）もまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを標識するために使用され得る。このような融合物を構築および使用するための方法は、当該分野で周知である。
【００７３】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００７４】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【００７５】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
【００７６】
本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬のような農薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤および／または薬学的アジュバント。
【００７７】
本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、本発明の方法によって得られた情報（例えば、疾患に関する情報）を元に、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、投与される被検体の部位の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明のモニタリング方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。疾患状態をモニタリングする頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）のモニタリングが挙げられる。１週間−１ヶ月に１回のモニタリングを、経過を見ながら施すことが好ましい。
【００７８】
必要に応じて、本発明の治療では、２種類以上の薬剤が使用され得る。２種類以上の薬剤を使用する場合、類似の性質または由来の物質を使用してもよく、異なる性質または由来の薬剤を使用してもよい。このような２種類以上の薬剤を投与する方法のための疾患レベルに関する情報も、本発明の方法によって入手することができる。
【００７９】
「被験体」または「患者」は、ヒト、またはイヌ、ネコ、マーモセット、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ゾウ、キリン、ニワトリ、ライオン、サル、フクロウ、ラット、リス、ホソロリス、およびマウスなどを含む脊椎動物を意味する。本明細書中では、「被験体」または「患者」は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００８０】
（薬学的組成物）
本発明のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、癌の転移／浸潤の阻害および／または抑制のため薬学的組成物の成分として使用することが可能である。
【００８１】
本明細書において薬剤の「有効量」とは、その薬剤が目的とする薬効が発揮することができる量をいう。本明細書において、そのような有効量のうち、最小の濃度を最小有効量ということがある。そのような最小有効量は、当該分野において周知であり、通常、薬剤の最小有効量は当業者によって決定されているか、または当業者は適宜決定することができる。そのような有効量の決定には、実際の投与のほか、動物モデルなどを用いることも可能である。本発明はまた、このような有効量を決定する際に有用である。
【００８２】
本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬のような農薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤および／または農学的もしくは薬学的アジュバント。
【００８３】
本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、本発明の方法によって得られた情報（例えば、疾患に関する情報）を元に、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、投与される被検体の部位の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明のモニタリング方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。疾患状態をモニタリングする頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）のモニタリングが挙げられる。１週間−１ヶ月に１回のモニタリングを、経過を見ながら施すことが好ましい。
【００８４】
必要に応じて、本発明の治療では、２種類以上の薬剤が使用され得る。２種類以上の薬剤を使用する場合、類似の性質または由来の物質を使用してもよく、異なる性質または由来の薬剤を使用してもよい。このような２種類以上の薬剤を投与する方法のための疾患レベルに関する情報も、本発明の方法によって入手することができる。
【００８５】
本発明では、いったん類似の種類（例えば、ヒトに対するマウスなど）の生物、培養細胞、組織などに関し、ある特定の糖鎖構造の分析結果と、疾患レベルとが相関付けられた場合、対応する糖鎖構造の分析結果と、疾患レベルとが相関付けることができることは、当業者は容易に理解する。そのような事項は、例えば、動物培養細胞マニュアル、瀬野ら編著、共立出版、１９９３年などに記載され支持されており、本明細書においてこのすべての記載を援用する。
【００８６】
本明細書において使用される場合、「キット」とは、複数の容器、および製造業者の指示書を含み、そして各々の容器が、本発明の薬学的組成物、その他の薬剤、およびキャリアを含む製品をいう。
【００８７】
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００８８】
（一般的手法）
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙは、Ｋｕｄｏ  Ｙ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；１０：５４５５−６３に記載されるように行った。簡単に述べると、浸潤は、８ｍｍの孔を有する２４ウェル用細胞培養インサート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して測定した。フィルターを、再構成された基底膜物質であるＥＨＳ抽出物（Ｉｗａｋｉ  Ｇａｒａｓｕ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）２０μｇでコーティングした。下側の区画は、０．５ｍＬの血清を含まない培地を含んだ。トリプシン処理した後、１．５×１０５個の細胞を１００μＬの血清を含まない培地に再懸濁し、その細胞培養インサートの上側の区画に６〜２４時間置いた。インキュベーション後、Ｋａｌｅｂｉｃらの方法（Ｋａｌｅｂｉｃ  Ｔ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １９９８；６：３０１−１８）をわずかに改変した方法により、浸潤能が高いクローンを単離するためにフィルターの下側に貫通している細胞を収集した。浸潤能を試験するために、細胞をホルマリン固定し、Ｈ＆Ｅで染色した。細胞の浸潤能は、孔を通ってフィルターの下側へ貫通した細胞を、倍率１００×で顕微鏡下で計数することによって決定した。アッセイは三回行い、３つの視野をランダムに選択し、そして各アッセイについて計数した。
【００８９】
（遺伝子アレイ分析）
１０，４５８遺伝子プローブを含んでいる、ＵｎｉＳｅｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｉ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｂｉｏａｒｒａｙを使用するＡｍｅｒｓｈａｍ  ＣｏｄｅＬｉｎｋ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を、転写プロファイルの比較のために使用した。このアレイは、公共に入手可能な、十分に注釈のついたｍＲＮＡ配列から広範な遺伝子を含んでいる。総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱｉａｇｅｎｍＣｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を製造者の指示に基づいて使用して、コンフルエントな細胞から単離した。調製物を定量し、その純度を標準的な分光光度法によって決定した。データは、対象遺伝子（ＩＦＩＴＭ１およびＷＮＴ５Ｂ）について、パーフェクトマッチプローブとミスマッチプローブとの間の平均差異として表される。
【００９０】
（逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱｉａｇｅｎｍＣｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して、コンフルエントな細胞から単離した。調製物を定量し、その純度を標準的な分光光度法によって決定した。ｃＤＮＡを、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ｄａｓｈ（Ｔｏｙｏｂｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって、１μｇの総ＲＮＡから合成した。プライマー配列は以下の通りであった：
ＩＦＩＴＭ１フォワードプライマー；
５’−ａｔｇｔｃｇｔｃｔｇｇｔｃｃｃｔｇｔｔｃ−３’（配列番号５）
ＩＦＩＴＭ１リバースプライマー；
５’−ｇｔｃａｔｇａｇｇａｔｇｃｃｃａｇａａｔ−３’（配列番号６）
Ｗｎｔ５Ｂフォワードプライマー；
５’−ｃｇｇｇａｇｃｇａｇａｇａａｇａａｃｔ−３’（配列番号７）
Ｗｎｔ５Ｂリバースプライマー；
５’−ｔａｃａｃｃｔｇａｃｇａａｇｃａｇｃａｃ−３’（配列番号８）
総ｃＤＮＡのアリコートを、１．２５ユニットのｒＴａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）で増幅した。この増幅は、ＰＣ７０１サーマルサイクラー（Ａｓｔｅｃ，Ｆｕｋｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）において、全てのプライマーについて以下の工程を３０〜３５サイクル繰り返すことによって行った：９４℃で３０秒間の変性工程；６０℃で３０秒間のアニーリング工程；および７２℃で１分間の伸長工程。増幅反応の産物は、１．５％アガロース／ＴＡＥゲル（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）に溶解し、１００ｍＶで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色して可視化した。
【００９１】
（ウェスタンブロッティング分析）
ウェスタンブロッティング分析は、Ｋｉｔａｊｉｍａ  Ｓ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００４；１６５：２１４７−５５に記載されるように行った。ポリクローナルＩＦＩＴＭ１抗体およびＷＮＴ５Ｂ抗体は、ＩＦＩＴＭ１およびＷＮＴ５Ｂについて特異的な配列（ＩＦＩＴＭ１抗体は、Ｂｏｓｔｅｒ社より購入し（ＣＡＴ  ＮＯ．ＢＡ１７８１）、ＷＮＴ５Ｂ抗体は、広島大学大学院医歯薬学総合研究科  菊池  章教授より供与していただいた）で、ウサギを免疫化することによってそれぞれ生成し、アフィニティカラムによって精製する。抗Ｈｉｓポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｘｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびβ−アクチンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）もまた使用する。３０μｇのタンパク質を１０％ＰＡＧＥに供し、次いでニトロセルロースフィルターに電気ブロットする。免疫複合体の検出のためには、ケミルミネッセンスウェスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用する。
【００９２】
（組み換えＩＦＩＴＭ１および組み換えＷＮＴ５Ｂの生成）
全長のヒトＩＦＩＴＭ１およびＷＮＴ５ＢのｃＤＮＡを、ｐＩＺ／Ｖ５−Ｈｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。ＩＦＩＴＭ１およびＷＮＴ５Ｂを含むｐＩＺ／Ｖ５−Ｈｉｓベクターを、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ昆虫細胞にトランスフェクションした。安定なクローンを、培地中でのゼオシン選択によって得た。Ｎｉ−ニトリロ三酢酸カラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造者の指示に従って組み換えＩＦＩＴＭ１および組み換えＷＮＴ５Ｂを精製した。
【００９３】
（ｓｉＲＮＡの調製）
当該分野で公知のｓｉＲＮＡ提供業者（株式会社  ニッポンイージーティー、富山、日本）により、アニーリングしている２本鎖の合成ｓｉＲＮＡを入手した。その合成ｓｉＲＮＡをＲＮＡｓｅフリーの溶液に溶解し、最終濃度が２０μＭになるように調整し、その後細胞へ導入した。
【００９４】
（組織サンプル）
ＨＮＳＣＣの組織サンプルは、広島大学倫理委員会の承認後に、広島大学病院の１９９８年〜２００４年の病理組織標本ファイルから取り出した。緩衝化ホルマリン固定してパラフィン包埋した組織（１０％）を、免疫組織化学試験のために使用する。腫瘍の組織学的悪性度分類およびステージは、日本頭頸部癌学会の基準に従って分類する。新鮮なサンプルをＲＴ−ＰＣＲ分析のために腫瘍性組織および非腫瘍性組織から採取する。
【００９５】
（免疫組織化学染色）
ＮＨＳＣＣにおけるＩＦＩＴＭ１およびＷＮＴ５Ｂの免疫組織化学検出は、シリコンコーティングされたガラススライド上に載せた４．５μｍ切片において、Ｋｉｔａｊｉｍａ  Ｓ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００４；１６５：２１４７−５５に記載されたようなストレプトアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ技術を使用して行う。ＩＦＩＴＭ１およびＷＮＴ５Ｂの発現を、＋＋（３０％を超える腫瘍細胞が、強いかまたは散在性の免疫陽性を示す）、＋（１０〜３０％の腫瘍細胞が、中程度または寄せ集めの免疫陽性を示す）および−（１０％未満の腫瘍細胞が、弱いかまたは限局的な免疫陽性を示すか、あるいは染色しない）に分類する。３人の病理学者が全ての評価を行う。分析した腫瘍サンプルの変量間の相関は、Ｆｉｓｈｅｒの正確検定によって試験する。ｐ＜０．０５が有意性のためには必要とされる。
【００９６】
（実施例１  浸潤能が高い頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）細胞株において過剰発現している遺伝子としての、ＩＦＩＴＭ１およびＷＮＴ５Ｂの同定）
本発明者らは、以前の研究で、リンパ節転移からＨＮＳＣＣ細胞株であるＭＳＣＣ−１を樹立した（Ｋｕｄｏ  Ｙ．ら、Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２００３；３９：５１５−２０を参照のこと）。さらに本発明者らは、上述のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙを使用して、ＭＳＣＣ−１細胞から、浸潤能が高いクローンであるＭＳＣＣ−Ｉｎｖ１を単離した。次いで、親細胞であるＭＳＣＣ−１と浸潤能が高いＭＳＣＣ−Ｉｎｖ１との間で発現が異なっている遺伝子を同定するために、ＭＳＣＣ−１の転写プロファイルとＭＳＣＣ−Ｉｎｖ１の転写プロファイルとを、上述のように遺伝子アレイ分析によって比較した。ＩＦＩＴＭ１遺伝子およびＷＮＴ５Ｂ遺伝子の発現量が、浸潤能が高いＭＳＣＣ−Ｉｎｖ１細胞株において上昇していることを見出した。これらの中でとりわけ、親株と比較して約１８倍過剰に発現している遺伝子として、本願発明に係るＩＦＩＴＭ１およびＷＮＴ５Ｂを同定した。これらの遺伝子がＭＳＣＣ−１細胞よりもＭＳＣＣ−Ｉｎｖ１細胞において過剰発現していることを、ＲＴ−ＰＣＲによってさらに確認した。この結果を、図１に示す。これらの結果により、ＩＦＩＴＭ１遺伝子およびＷＮＴ５Ｂ遺伝子を、浸潤能増強のマーカーと同定した。
【００９７】
（実施例２  ＩＦＩＴＭ１およびＷＮＴ５Ｂ過剰発現による、浸潤能の増強）
（ＩＦＩＴＭ１）
６ヒスチジンタグ−ＩＦＩＴＭ１  ｃＤＮＡをコードする、ＩＦＩＴＭ１発現プラスミドｐＢＩＣＥＰ−ＣＭＶ−２−ＩＦＩＴＭ１を、φ６ｃｍの培養皿に播種した細胞に３μｇのｐｌａｓｍｉｄを導入した。ｐＢＩＣＥＰ−ＣＭＶ−２−ＩＦＩＴＭ１またはベクターのみを、頭頸部扁平上皮癌細胞株のＨＳＣ２およびＨＳＣ３細胞に導入し、培地中においてＧ４１８（５００μｇ／ｍｌ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって選択して、安定なクローンを得た。細胞トランスフェクションは、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して製造者の指示に従って行った。各細胞について４個のＩＦＩＴＭ１過剰発現クローンおよび１個のコントロールクローンを、次の実験のために選択した。
【００９８】
ＩＦＩＴＭ１の過剰発現を、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔによって確認した（図２Ａ）。その細胞を用いて、ＩＦＩＴＭ１過剰発現細胞では浸潤能が増強されていることを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙによって確認した（図２Ｂ）。
【００９９】
（ＷＮＴ５Ｂ）
６ヒスチジンタグ−ＷＮＴ５Ｂ  ｃＤＮＡをコードする、ＩＦＩＴＭ１発現プラスミドｐＰＧＫ２−Ｗｎｔ５Ｂ（広島大学大学院医歯薬学総合研究科  菊池  章教授より供与された）を、φ６ｃｍの培養皿に播種した細胞に３μｇのｐｌａｓｍｉｄを導入した。ｐＰＧＫ２−Ｗｎｔ５Ｂまたはベクターのみを、頭頸部扁平上皮癌細胞株のＨＳＣ２およびＨＳＣ３細胞に導入し、培地中においてＧ４１８（５００μｇ／ｍｌ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって選択して、安定なクローンを得た。細胞トランスフェクションは、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して製造者の指示に従って行った。各細胞について４個のＷＮＴ５Ｂ過剰発現クローンおよび１個のコントロールクローンを、次の実験のために選択した。
【０１００】
ＷＮＴ５Ｂの過剰発現を、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔによって確認した（図３Ａ）。その細胞を用いて、ＷＮＴ５Ｂ過剰発現細胞では浸潤能が増強されていることを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙによって確認した（図３Ｂ）。
（実施例３  ｓｉＲＮＡによるＩＦＩＴＭ１およびＷＮＴ５Ｂ発現抑制）
上述のように調製したｓｉＲＮＡを用いて、ＩＦＩＴＭ１およびＷＮＴ５Ｂ発現抑制アッセイを行った。ＭＳＣＣ−Ｉｎｖ１細胞（Ｋｕｄｏ  Ｙ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；１０：５４５５−６３およびＫｕｄｏ  Ｙ．ら、Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２００３；３９：５１５−２０を参照のこと）に、１ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中の１５０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを、製造者の指示に従ってトランスフェクションした。４８時間のｓｉＲＮＡ処理後、ＭＳＣＣ−Ｉｎｖ１細胞を、上述のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙにおいて使用した。ラット、マウスまたはヒトの遺伝子配列に対して有意な相同性を示さないスクランブル配列を、コントロールとして使用した。
【０１０１】
ＷＮＴ５Ｂの発現抑制のために使用したｓｉＲＮＡの配列を以下に示す。
１−センス：ＧＡＡＣＵＵＵＧＣＣＡＡＡＧＧＡＵＣＡＴＴ
アンチセンス：ｕｇａｕｃｃｕｕｕｇｇｃａａａｇｕｕｃＴＴ
２−センス：ＧＧＡＧＣＡＣＡＵＧＧＣＣＵＡＣＡＵＡＴＴ
アンチセンス：ｕａｕｇｕａｇｇｃｃａｕｇｕｇｃｕｃｃＴＴ
いずれのセットを使用しても、ｓｉＲＮＡの発現を抑制することができる。ＷＮＴ５ＢのｓｉＲＮＡによる発現抑制の結果を図４に示す。ＲＴ−ＰＣＲ法により、実際にｓｉＲＮＡによるＷＮＴ５Ｂの発現の低下を確認した（図４Ａ）。このＷＮＴ５Ｂ発現抑制細胞において、浸潤能が抑制されていることを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙによって確認した（図４Ｂ）。ＩＦＩＴＭ１についても、同様に発現抑制によって浸潤能が抑制される。
【０１０２】
（実施例４  Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙによる、細胞の走化能の評価）
癌の転移は、細胞の走化能の増強によって促進される。そこで、細胞の走化能（運動能）を調べる実験として、Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙを行なった。まず、６ウェルプレートに細胞を播種し、コンフルエントに達した細胞(monolayer)にチップの先を用いて、横線を引くような意識で傷をつけた。数時間後、動いてきた細胞を位相差顕微鏡下で観察した（図５Ａを参照のこと）。
【０１０３】
図５Ｂに、ＩＦＩＴＭ１過剰発現細胞のＷｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙの結果を示す。図５Ｂから分かるように、コントロール細胞と比較して、ＩＦＩＴＭ１過剰発現細胞では、中心に向かって動いている細胞が有意に多いことを示す像を観察した。図５Ｃには、Ｗｎｔ５Ｂ過剰発現細胞のＷｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙの結果を示す。図５Ｃから分かるように、コントロール細胞と比較して、Ｗｎｔ５Ｂ過剰発現細胞でも、中心に向かって動いている細胞が有意に多いことを示す像を観察した。以上の結果から、ＩＦＩＴＭ１およびＷｎｔ５Ｂともに、細胞の走化能（運動能）を増強させることが明らかになった。
【０１０４】
（実施例５  ヌードマウスにおける異種移植片アッセイ）
ＭＳＣＣ細胞におけるＩＦＩＴＭ１およびＷＮＴ５Ｂ発現がインビボでの足場非依存性増殖に影響するか否かを試験するために、ＩＦＩＴＭ１過剰発現ＨＳＣ２細胞（５００μＬのＨＢＳＳ中１×１０７個）およびＷＮＴ５Ｂ過剰発現ＨＳＣ２細胞（５００μＬのＨＢＳＳ中１×１０７個）を、胸腺欠損（ヌード）マウスの多数の部位に皮下注射する。コントロール群には、ベクターをトランスフェクションしたＨＳＣ２細胞（５００μＬのＨＢＳＳ中１×１０７個）を注射する。実験プロトコールは、広島大学の動物実験委員会によって承認されたものである。これらの動物を腫瘍形成について毎週モニタリングし、１ヶ月後に屠殺する。腫瘍の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）を実験の最後に測定し、腫瘍の体積を式：（Ｌ×Ｗ２）／２によって計算する。ＩＦＩＴＭ１過剰発現ＨＳＣ２細胞およびＷＮＴ５Ｂ過剰発現ＨＳＣ２細胞は、コントロール細胞と比較して、有意に大きい腫瘍体積を示す。
【０１０５】
（実施例６  同所移植アッセイ）
ＩＦＩＴＭ１過剰発現ＨＳＣ２細胞（５００μＬのＨＢＳＳ中１×１０７個）、ＷＮＴ５Ｂ過剰発現ＨＳＣ２細胞（５００μＬのＨＢＳＳ中１×１０７個）およびコントロールのＨＳＣ２細胞（５００μＬのＨＢＳＳ中１×１０７個）を、雄性の胸腺欠損（ヌード）マウスの舌に注射する。これらの動物を腫瘍形成について３日ごとにモニタリングし、２週間後に屠殺する。舌の腫瘍、頸部リンパ節および肺を採取し、４％ホルマリンで固定する。標本をパラフィンに包埋し、４μｍ厚の切片に切り、Ｈ＆Ｅで染色する。これらを、診断、リンパ節転移および肺転移について、組織学的に評価する。ＩＦＩＴＭ１過剰発現ＨＳＣ２細胞およびＷＮＴ５Ｂ過剰発現ＨＳＣ２細胞移植マウスにおける腫瘍は、コントロールのＨＳＣ２細胞を移植されたマウスの腫瘍と比較して有意に大きいことが観察できる。さらに、ＩＦＩＴＭ１過剰発現ＨＳＣ２細胞およびＷＮＴ５Ｂ過剰発現ＨＳＣ２細胞は、著しい浸潤性を示し、場合によっては、下顎骨の破壊およびリンパ性浸潤も観察される。興味深いことに、ＩＦＩＴＭ１過剰発現ＨＳＣ２細胞およびＷＮＴ５Ｂ過剰発現ＨＳＣ２細胞は、頚部リンパ節および肺に、自発的に転移し得る。また、コントロールのＨＳＣ２細胞移植マウスでは転移は観察されないが、ＩＦＩＴＭ１過剰発現ＨＳＣ２細胞およびＷＮＴ５Ｂ過剰発現ＨＳＣ２細胞移植マウスでは、局地的なリンパ節および／または肺への転移が観察され得る。これらの結果から、ＩＦＩＴＭ１過剰発現およびＷＮＴ５Ｂ過剰発現は、積極的な浸潤によって転移に関与していることが示される。
【０１０６】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、ＩＦＩＴＭ１およびＷＮＴ５Ｂ遺伝子が、ＭＳＣＣ−１細胞よりもＭＳＣＣ−Ｉｎｖ１細胞において過剰発現していることを示す。ＧＡＰＤＨはコントロールである。
【図２】図２Ａは、ＩＦＩＴＭ１過剰発現細胞のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔの結果を示す。図２Ｂは、そのＩＦＩＴＭ１過剰発現細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙの結果を示す。
【図３】図３Ａは、ＷＮＴ５Ｂ過剰発現細胞のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔの結果を示す。図３Ｂは、そのＷＮＴ５Ｂ過剰発現細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙの結果を示す。
【図４】図４は、ＷＮＴ５ＢのｓｉＲＮＡによる発現抑制の結果を示す。図４Ａは、ＷＮＴ５Ｂ発現抑制細胞におけるＲＴ−ＰＣＲ法の結果を示す。図４Ｂは、ＷＮＴ５Ｂ発現抑制細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙの結果を示す。
【図５】図５は、ＩＦＩＴＭ１およびＷｎｔ５Ｂ過剰発現細胞を使用したＷｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙの結果を示す。図５Ａは、Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙのプロトコールである。図５Ｂは、ＩＦＩＴＭ１過剰発現細胞のＷｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙの結果を示す。図５Ｃは、Ｗｎｔ５Ｂ過剰発現細胞のＷｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙの結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１０８】
配列番号１＝ＩＦＩＴＭ１の核酸配列
配列番号２＝ＩＦＩＴＭ１のアミノ酸配列
配列番号３＝ＷＮＴ５Ｂの核酸配列
配列番号４＝ＷＮＴ５Ｂのアミノ酸配列
配列番号５＝ＩＦＩＴＭ１フォワードプライマー
配列番号６＝ＩＦＩＴＭ１リバースプライマー
配列番号７＝ＷＮＴ５Ｂフォワードプライマー
配列番号８＝ＷＮＴ５Ｂリバースプライマー
配列番号９＝ＷＮＴ５Ｂ用ｓｉＲＮＡセンスプライマー
配列番号１０＝ＷＮＴ５Ｂ用ｓｉＲＮＡアンチセンスプライマー
配列番号１１＝ＷＮＴ５Ｂ用ｓｉＲＮＡセンスプライマー
配列番号１２＝ＷＮＴ５Ｂ用ｓｉＲＮＡアンチセンスプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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