(57)【要約】      （修正有）【課題】優れた治療効果を有するガン治療用組成物の提供。【解決手段】超音波感受性リポソームであるナノバブルとシスプラチンなどの抗ガン剤を含有するＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションとからなるガン治療用組成物。該組成物を投与し、ガン細胞が存在する場所に超音波を照射するよって、ナノバブルを崩壊させ、ガン細胞の膜構造を破壊するとともにＷ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから抗ガン剤を放出させて、膜構造が破壊されたガン細胞に抗ガン剤を作用させるガンの治療方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノバブルと抗がん剤含有Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションとからなるがん治療用組成物。
【請求項２】
ナノバブルが超音波感受性リポソームである、請求項１に記載のがん治療用組成物。
【請求項３】
がんの超音波療法に用いるための、請求項１又は２に記載のがん治療用組成物。
【請求項４】
がんの治療において、異なる２種の有効成分を別々に投与するためのキットであって、（ａ）第一成分がナノバブルを有効成分として含有する医薬組成物であり、（ｂ）第二成分が抗がん剤含有Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションを有効成分として含有する医薬組成物であるキット。
【請求項５】
ナノバブルが超音波感受性リポソームである、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
下記工程：
ナノバブルと抗がん剤含有Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションとからなるがん治療用組成物を投与する工程、及び
がんを超音波処理する工程
からなる、がんの治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん細胞の近傍に存在する新生血管などの血管には、孔径が２００−４００ｎｍの大きさの穴が開いていることが知られている。この穴は、がん細胞の近傍の血管に特異的なものであり、正常細胞の近傍の血管にはそのような穴は存在しない。したがって、抗がん剤を投与すると、がん細胞が存在する場所において特異的に抗がん剤が血管内からこの穴を通って血管外に漏れ出すことになる。
【０００３】
特許文献１には、シスプラチン(ＣＤＤＰ)含有ガス封入リポソームを投与し、０．５−２ＭＨｚの共振周波数を含む低周波超音波を照射することにより、リポソームの崩壊とガスの微小気泡によるキャビテーションによるがんの治療方法が記載されている（００１５、００２２）。また、特許文献２には、抗がん剤含有Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションを用いるがん治療用組成物が記載されている。しかし、ナノバブルと抗がん剤含有Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションとを組み合わせたがん治療用組成物は未だ開発されていない。
【０００４】
本発明者らは、上記知見に基づき鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことに、ナノバブルと抗がん剤含有Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションとからなる抗がん剤を投与し、がん細胞が存在する場所に超音波を照射することによって、ナノバブルを崩壊させ、その際の崩壊エネルギーやキャビテーション現象によりがん細胞の膜構造を破壊するとともにＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションから抗がん剤を放出させ、膜構造の破壊されたがん細胞に抗がん剤が作用し、がんの治療が可能になることを見出し、本発明を完成させた。
【特許文献１】特開２００５−１５４２８２
【特許文献２】特開平１０−１５８１５２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、優れた治療効果を有するがん治療用組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、下記：
１．ナノバブルと抗がん剤含有Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションとからなるがん治療用組成物、
２．ナノバブルが超音波感受性リポソームである、上記１に記載のがん治療用組成物、
３．がんの超音波療法に用いるための、上記１又は２に記載のがん治療用組成物、
４．がんの治療において、異なる２種の有効成分を別々に投与するためのキットであって、（ａ）第一成分がナノバブルを有効成分として含有する医薬組成物であり、（ｂ）第二成分が抗がん剤含有Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションを有効成分として含有する医薬組成物であるキット、
５．ナノバブルが超音波感受性リポソームである、上記４に記載のキット、
６．下記工程：
ナノバブルと抗がん剤含有Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションとからなるがん治療用組成物を投与する工程、及び
がんを超音波処理する工程
からなる、がんの治療方法、
に関する。
【０００７】
本発明でナノバブルとは、気泡を包み込んだ微粒子のことをいい、たとえば、超音波感受性のリポソーム（音響性リポソームともいう。）を挙げることができる。より具体的には、ナノバブルは、パーフルオロプロパン（Ｃ３Ｆ８）封入リポソームである。本発明のナノバブルの製造方法は、たとえば、特開２００５−１５４２８２に具体的に記載されている。要約すると、内容積の２０−８０％リポソーム懸濁液を含有する密封容器の空隙物にフッ化物ガス又は窒素ガスを充填し、超音波処理することによって、本発明のナノバブルを得ることができる。
【０００８】
本発明のナノバブルは、０．５〜２Ｍｈｚの共振周波数を含む低周波超音波を照射すると、リポソームの崩壊とガスの微小気泡によるキャビテーションを生じる。このキャビテーションによって、がん細胞の膜構造を破壊し、そしてＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを破壊し内包する制がん剤を放出させることができる。
【０００９】
本発明のナノバブルのメカニカルインデックスは、好ましくは１未満であり、より好ましくは、０．７未満である。
ここで、メカニカルインデックス（ＭＩ）は、下記：
【数１】
2008100956.tif 000002
（式中、Ｐ−は、負圧の最大値で単位ＭＰａで無次元化しており絶対値であり、ｆは、超音波の周波数でＭＰａで無次元化している値であり（Abbott JG. Rationale and derivation of MI and TI-a review. Ultrasound Med Biol 1999; 25:431-441.）。
【００１０】
本発明のナノバブルの粒子径は、好ましくは１０−１０００ｎｍであり、より好ましくは５０−８００ｎｍであり、最も好ましくは１００−６００ｎｍである。
【００１１】
本発明の抗がん剤含有Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション（以下、ＷＯＷともいう。）の製造方法は、たとえば、特開平１０−１５８１５２に具体的に開示されている。粒径が均一な単分散エマルションを得る方法としては、多孔質ガラス膜を用いる乳化方法（膜乳化法という。）が知られている（特開平２−９５４３３）。この膜乳化法によれば、細孔径が異なる多孔質ガラス膜を利用することによって、０．３−４０μｍの範囲において単分散Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションを製造することができる。より具体的には、浸透圧０．０１−７．０ＭＰａの範囲に調整された抗がん剤含有水溶液からなる水相を、油性界面活性剤０．１−１０重量％を含む油相に分散させることによりＷ／Ｏ型エマルションを得、得られたＷ／Ｏ型エマルションを、多孔質ガラス膜を介して、浸透圧０．１−０．７ＭＰａの外水相となる水相に圧入分散させることにより、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションを得ることができる。
【００１２】
本発明の抗がん剤含有Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションの粒径は、好ましくは、７μｍ以下であり、より好ましくは５μｍ以下であり、最も好ましくは１μｍ以下である。
【００１３】
本発明の抗がん剤含有Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションに用いる抗がん剤は、水溶性抗腫瘍剤であれば任意のものを用いることができ、好ましくは、シスプラチン（ＣＤＤＰ）である。
【００１４】
本発明のがん治療用組成物におけるナノバブルと抗がん剤含有Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションの体積比は、通常１０％（ｖ／ｖ）：９０（ｖ／ｖ）〜９０％（ｖ／ｖ）：１０（ｖ／ｖ）の範囲内であり、好ましくは２０％（ｖ／ｖ）：８０（ｖ／ｖ）〜８０％（ｖ／ｖ）：２０（ｖ／ｖ）の範囲内であり、より好ましくは２０％（ｖ／ｖ）：８０（ｖ／ｖ）〜４０％（ｖ／ｖ）：６０（ｖ／ｖ）の範囲内である。
【００１５】
本発明のがん治療用組成物の製剤形態を図１に示す。図１（Ａ)は光学顕微鏡で観察したＷＯＷの画像であり、下図に向かって同一物の倍率を変えたもであり、ほぼ球形になっている。図１（Ｂ）はレーザ回折式粒度分布測定装置で測定した粒度分布であり、平均直径は約７０μmである。
【００１６】
本発明のがん治療用組成物は、超音波処理をすることができる任意のがんの治療に用いることができる。たとえば、肺には超音波が届かないことから肺がんは除外される。
【００１７】
本発明のがん治療用組成物は、静脈注射あるいは動脈注射により、血液を介してがん腫瘍部位に到達する。あるいは本発明のがん治療用組成物は、腫瘍部位に直接注射することができる。本発明のがん治療用組成物の投与量は、ＷＯＷに含まれる抗がん剤、たとえばＣＤＤＰの濃度が１回の投与あたり０．１−１００mg/m2とする。連続投与の場合には、４日間の総量を０．１−１００mg/m2とする。ＷＯＷが特定部位に到達した段階で超音波を照射する。治療期間は４週間程度とし、２週間程度の中断期間を設けて再度、治療を開始することができる。
【００１８】
また、本発明は、がんの治療において、異なる２種の有効成分を別々に投与するためのキットにも関する。当該キットは、（ａ）ナノバブルを有効成分として含有する医薬組成物、及び（ｂ）抗がん剤含有Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションを有効成分として含有する医薬組成物から構成される。このキットは、上記がん治療方法において、異なる２種の有効成分を別々に投与するために用いることができる。
【００１９】
本発明のがん治療用組成物は、局部的に集中して発生したがん組織に抗がん剤を確実に到達させることができることから、抗がん剤の薬効を飛躍的に高め、無用な副作用の軽減を図ることができるという効果を有する。
【実施例１】
【００２０】
実験・手法
細胞培養
ヒト胎児性腎細胞（２９３Ｔ）は小野栄夫教授(東北大学)から、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を構成的に発現する大腸癌細胞（ＨＴ２９−ｌｕｃ）は 米国Xenogen社から入手した。両細胞は５％  ＣＯ２存在下、３７℃で細胞培養器(ＳＣＩ−３２５Ｄ、アステック社)において２５０mL培養フラスコ中で１０％胎児ウシ血清と１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥ培地において培養した。生細胞はトリパンブルー色素排除法を使用してヘモサイトメーターにおいて決定した。対数増殖期において生存率が９９％以上の細胞のみを使用した。
【００２１】
エマルション（ＷＯＷ）作成
ＷＯＷは、３つの生成：Ｗ１、Ｏ１、Ｗ２から構成された。Ｗ１はシスプラチン３mL （０．５mg/mL、日本化薬（株））、Ｏ１は５mLリピオドール（ゲルベ・ジャパン）と０．５mLポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル（ＰＧＣＲ）（１０％  ｗｔ％）（阪本薬品工業（株）ＣＲ−３１０）との混合液５．５mLであり、Ｗ２は７．５mL乳化剤水溶液［０．４％ＮａＣｌ＋０．７％ＨＣＯ６０（日光ケミカルズ（株））］であった。まず、ＳＰＧ小型膜乳化装置（SPGテクノ（株））を用いて、ＳＰＧフィルターキット（ＷＯ系調製用）で内水Ｗ１を分散相とし油相Ｏ１中に乳化分散しＷＯエマルションを調製した。次に、ＳＰＧフィルターキット（ＯＷ系調製用）でこのＷＯエマルションを分散相とし、外水相Ｗ２中に乳化分散させＷＯＷエマルションを調製した。ＷＯＷ内に含まれるＣＤＤＰの最終的な濃度は０．０９mg/mLであった。
【００２２】
ナノバブル
音響性リポソームは、平均分子質量２０００DaのＰＥＧ存在下で、９４mol%１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）と６mol%１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）を含む溶液をエバポレーションして調製し、クロロホルムに溶解した。気泡のゼータ電位はＭｇ2+およびＣａ2+を含まないＰＢＳ（室温下pH７．２、シグマ社）中でポテンシャル計（粒度分布０．６ｎｍ−６μm；英国Malvern Instruments社）で測定した。気泡サイズの分布はレーザー回析粒度分布測定装置（粒度分布０．０３−１０００μm，ＳＡＬＤ−２０００，島津製作所）で測定した。その結果、平均の粒子直径は７０μmであった。
【００２３】
超音波照射
マルチファンクションシンセサイザ（ＷＦ１９４６Ａ、エヌ・エフ回路株式会社）で発生させた信号を高速度バイポーラ電源（ＨＳＡ４１０１、エヌ・エフ回路株式会社）を介してピエゾ素子超音波プローブ（富士セラミックス社）を駆動させて、１MHz超音波（duty比２０%、パルス数 200波）を発生させた。プローブは水道水で満たされた容器（３００mm×４５０mm×３００mm）に、発生面を上に向けて垂直に配置した。水面と発生面との距離は１５mmとした。超音波の圧力はハイドロフォン（ＰＶＤＦ−Ｚ４４−１０００、米国OND社）で感知して、オシロスコープ（Wave Surfer 454、５００MHz、１MΩ（１６pF）、米国LeCroy社)で計測した。ハイドロフォンの位置は３軸の自動移動装置（シグマ光機社）で可変できた。実験で使用した超音波の強さは、超音波発生面から１mmの距離で３W/cm2であった。
【００２４】
腫瘍モデルと分子導入
ＳＣＩＤマウス（９週）の両足の前脛骨筋に、ＨＴ２９−ｌｕｃ細胞（１×１０６細胞／部位）を注入した（この実験日をゼロ日目とした）。３日目、７日目に以下の３条件で実験をおこなった。
条件１：［生理食塩水６５μL＋音響性リポソーム１５μL＝合計８０μL］を前脛骨筋注入後、超音波を照射した。
条件２：［ＣＤＤＰ（０．５μg/μL）１２．５μL＋生理食塩水５２．５μL＋音響性リポソーム１５mL＝合計８０μL］を各前脛骨筋に注入後、超音波を照射した。
条件３：［ＷＯＷ６５μL＋音響性リポソーム１５μL＝合計８０μL］を各前脛骨筋注入後、超音波を照射した。
各前脛骨筋に注入されたＣＤＤＰの最終濃度は、０．０８μg／μLであった。
【００２５】
抗腫瘍効果の検証
抗腫瘍効果を４日目、７日目、９日目にリアルタイムインビトロイメージング装置（ＩＶＩＳ１００、米国Xenogen社）を用いて測定した。マウス１匹あたり１５mg/mL濃度のルシフェリンを１００μL（米国Promega社）注射し、このマウスをイソフルランで麻酔し、１０分後、ＩＶＩＳ１００のチャンバー内に置き、発光量を測定した。
【００２６】
統計処理
正規性を多重間比較検定で検定後、母分散が等しいことをパレット検定で判断した。つぎに、一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）で平均値に差があることを判断して、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法により各群間の有意差を判定した。５％以下を有意差があると判断した。
【００２７】
実験結果
図１（Ａ）はＡＬ(音響性リポソーム）＋ＵＳ（超音波）、ＡＬ＋ＵＳ＋ＣＤＤＰ（シスプラチン）およびＡＬ＋ＵＳ＋ＷＯＷとの抗腫瘍効果を示す。横軸はＨＴ２９−ｌｕｃ細胞の前脛骨筋への移植からの経過時間であり、移植日をゼロ日目とした。縦軸はルシフェラーゼ活性値（フォトン／秒）である。３日目および７日目に超音波による分子導入を行い、４日目、７日目、９日目に蛍光量を測定した。４日目では、３群間で有意な差が見られなかったが、７日目には、ＷＯＷによる抗腫瘍効果が観察された。９日目で有意差検定をおこなった場合には、ＡＬ＋ＵＳ＋ＷＯＷとＡＬ＋ＵＳでは１％以下で有意差があり、ＡＬ＋ＵＳ＋ＷＯＷとＡＬ＋ＵＳ＋ＣＤＤＰでは5％以下で有意差があると判定できた。一方、ＡＬ＋ＵＳとＡＬ＋ＵＳ＋ＣＤＤＰでは有意差は認められなかった。したがって、ＷＯＷとＡＬ＋ＵＳを組み合わせることで初めて抗腫瘍効果が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明のがん治療用組成物は、がんの治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ＷＯＷの光学顕微鏡撮影画像である。スケールバーは上から１００μm（倍率×１００）、５０μm（倍率×４００）、２０μm（倍率×１０００）である。
【図２】図２は、経時的な抗腫瘍効である。横軸はＨＴ２９−ｌｕｃ細胞の前脛骨筋への移植からの経過時間であり、移植日をゼロ日目とした。縦軸はルシフェラーゼ活性値（フォトン／秒）である。超音波による分子導入は３日目および７日目とし、蛍光量の測定は４日目、７日目、９日目におこなった。ＡＬ：音響性リポソーム、ＵＳ：超音波、ＣＤＤＰ：シスプラチンである。
【図３】図３は、９日目でのリアルタイムインビボイメージングの画像である。ＡＬ＋ＵＳ＋ＷＯＷは他のコントロール群（ＡＬ＋ＵＳ、ＡＬ＋ＵＳ＋ＣＤＤＰ）に比較してルシフェラーゼ活性が顕著に抑制されており、抑制効果が高いことが示されている。ＡＬ：音響性リポソーム、ＵＳ：超音波、ＣＤＤＰ：シスプラチン、ＷＯＷ：エマルションである。
【図２】
2008100956.tif 000003
【図１】
2008100956.tif 000004
【図３】
2008100956.tif 000005