(57)【要約】【課題】互いに分離特性の異なる複数の分離分析を行う必要がある場合でも、必要な試料の量を少なくすることで省力化やコストの低減を図る。【解決手段】一端が共通のサンプルウエル１２に接続され、他端がそれぞれ分離した分離媒体充填口１３、１４となった２本の分離用の流路１５、１６を基板１１中に設ける。流路１５、１６内にはそれぞれ分離特性の異なる分離媒体を充填し、サンプルウエル１２に１回に注入した試料を両流路１５、１６中に導入して保持し、その後に並行して電気泳動させて分離分析する。これにより、１回の試料注入で分離特性の相違する複数の分離分析を同時に又は時間的にずらして行うことができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)一端が共通の試料導入口に接続された複数本の分離流路を有し、該複数本の分離流路中にそれぞれ分離特性の相違する分離媒体を充填して成る電気泳動部材と、
b)前記試料導入口と前記複数本の分離流路の他端との間にそれぞれ泳動電圧を印加する電圧印加手段と、
c)前記電圧印加手段による泳動電圧の印加により前記複数本の分離流路内でそれぞれ分離された試料成分を検出する検出手段と、
を備えたことを特徴とする電気泳動装置。
【請求項２】
前記複数本の分離流路の他端は共通の液溜め部に接続されていることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動装置。
【請求項３】
前記電気泳動部材はマイクロチップであることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の電気泳動装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の電気泳動装置を用いたＤＮＡ解析方法であって、前記導入口に導入された同一のＤＮＡ試料を分離特性が相違する複数本の分離流路中を電気泳動させてそれぞれ検出信号を収集し、該検出信号に基づいてそれぞれ異なる領域の塩基配列を解析し、その領域の重複部分を探索して該重複部分で結合した広い領域における塩基配列の決定を行うことを特徴とするＤＮＡ解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主として生化学、分子生物学、臨床医学、特にＤＮＡやタンパク質の解析分野等で利用されるに好適な電気泳動装置、及び該装置を用いたＤＮＡ解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キャピラリ電気泳動法（ＣＥ）は、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、糖類等の生体成分の分析のほか、光学分割、同位体の分離等、構造が類似している成分を分離するのに適した方法であり、臨床医学や医薬品、環境物質のモニタリング等の用途に広く利用されている。特に、フォトリソグラフィ技術等を利用して微小流路を形成したマイクロチップ型の装置（マイクロチップ電気泳動装置）は取扱いが非常に容易であり、近年、ＤＮＡの解析等に盛んに利用されるようになっている（例えば非特許文献１など参照）。
【０００３】
マイクロチップ電気泳動装置では、試料を成分分離するために、ガラス板、石英ガラス板などの基板に分離流路を形成した電気泳動チップが用いられる。従来の電気泳動チップでは、例えば特許文献１などに開示されているように、試料が供給されるサンプルウエル（サンプルリザーバ）に１本の分離流路が接続され、該分離流路を通過する際に分離された試料成分が検出器で検出される構成となっている。サンプルウエルに注入された試料は分離流路の両端に印加された泳動電圧により分離流路に導入され分析に供されるが、実際に分析に利用される試料の量は僅かであってもサンプルウエルには或る程度の量の試料を注入する必要がある。
【０００４】
例えば上記のような電気泳動装置を用いてＤＮＡの配列の解析を行う場合、分離流路に充填される分離媒体の特性の制約から或る程度の領域の解析しか行えない。従って、広い領域に亘る配列の解析を行いたい場合には、分離特性の相違する分離媒体を使用して複数回の分析を行う必要がある。ところが１回の分析毎にそれぞれ上述したような量の試料をサンプルウエルに注入する必要があるため、分析回数分だけの試料を用意しなければならず分析者にとって大きな負担であった。また、生体由来のタンパク質などの試料を分析する場合には試料の量が限られており、そのために複数回の分析が行えずに十分に正確な結果が得られないような場合もあり得る。
【０００５】
さらにまた複数回の分析を行うのに十分な量の試料を用意できる場合でも、１回の分析毎に分離流路中の分離媒体を入れ替えたり分離流路内を洗浄したりする必要があるために、分析に時間が掛かりスループットを向上するのが難しく、作業も繁雑であった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−３２３４７７号公報
【非特許文献１】荒井ほか６名、「マイクロチップ電気泳動装置MCE-2010の開発とその応用例」、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００２年３月、株式会社島津製作所、［平成１９年３月２０日検索］、インターネット＜http://www.shimadzu-biotech.jp/datahall/mce/sr58-101.pdf＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その主たる目的とするところは、分析に必要な試料の量を減らすことができるとともに、省力化、作業効率の向上を図ることができる電気泳動装置を提供することにある。また、本発明の他の目的は、そうした電気泳動装置を利用して効率的にＤＮＡの配列の解析を行うことができるＤＮＡ解析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために成された本発明に係る電気泳動装置は、
a)一端が共通の試料導入口に接続された複数本の分離流路を有し、該複数本の分離流路中にそれぞれ分離特性の相違する分離媒体を充填して成る電気泳動部材と、
b)前記試料導入口と前記複数本の分離流路の他端との間にそれぞれ泳動電圧を印加する電圧印加手段と、
c)前記電圧印加手段による泳動電圧の印加により前記複数本の分離流路内でそれぞれ分離された試料成分を検出する検出手段と、
を備えたことを特徴としている。
【０００９】
本発明に係る電気泳動装置では、電気泳動部材にあって試料導入口に分析対象の試料が注入されると、前記電圧印加手段により印加される泳動電圧により複数本の分離流路にそれぞれ適宜量の試料が導入される。複数本の分離流路における試料の導入は同時であってもなくてもよい。その後に、泳動電圧により試料を分離流路中で試料導入口側から反対方向に移動させ、その移動に伴って分離媒体の作用により試料成分を分離させる。複数本の分離流路において試料成分の分離は同時に行ってもよいし同時でなくてもよい。複数本の分離流路に充填されている分離媒体の分離特性はそれぞれ異なるため、同一の試料を成分分離してもその分離の態様は異なる。その結果、検出手段でそれぞれ検出される信号は異なるものとなる。
【００１０】
なお、検出手段としては、蛍光検出器や電気化学検出器などを用いることができる。
【発明の効果】
【００１１】
以上のように本発明に係る電気泳動装置によれば、試料導入口に１回だけ注入した試料を用いて複数の異なる検出結果を並行して得ることができる。具体的には、この検出結果を利用して、例えばＤＮＡの配列解析において、それぞれ異なる領域の解析を行うことができる。また、例えばタンパク質の同定において、異なる種類のタンパク質を同定することで同定可能なタンパク質の種類を増やすことができる。このように従来であれば複数回の分析を行う必要があったものを１回の試料注入に対する分析で済ますことができるため、用意する試料の量が少なくて済む。これにより、省力化を図ることができるとともに、そのための余分なコストを削減することができる。また、生体由来の試料のように、もともと量が限られている貴重な試料についても、より正確な結果を得ることができる。また、分離特性の相違する複数の分析を行う場合でも、分離媒体の入れ替えや洗浄などの作業を省くことができるので、スループットの向上を図ることができる。
【００１２】
本発明に係る電気泳動装置の一態様として、前記複数本の分離流路の他端が共通の液溜め部に接続されている構成とすることができる。この構成によれば、共通の液溜め部にバッファ液を貯留して電圧印加手段により液溜め部と試料導入口との間に所定の泳動電圧を印加することで、複数本の分離流路の両端間に同じ泳動電圧を印加して同時並行的に分離分析を行うことができる。
【００１３】
一方、複数本の分離流路の他端に接続される液溜め部をそれぞれ分離することにより、各分離流路の両端間に異なる泳動電圧を印加する、つまり、異なる電圧値の泳動電圧の印加、或いは異なるタイミングでの泳動電圧の印加を行うことができる。
【００１４】
また、本発明に係る電気泳動装置において、電気泳動部材はキャピラリとすることもできるが、特にマイクロチップ（電気泳動チップ）とすることで集積化を図ることができる。
【００１５】
さらにまた、本発明に係るＤＮＡ解析方法は、上記のような本発明に係る電気泳動装置を用いたＤＮＡ解析方法であって、前記導入口に導入された同一のＤＮＡ試料を分離特性が相違する複数本の分離流路中を電気泳動させてそれぞれ検出信号を収集し、該検出信号に基づいてそれぞれ異なる領域の塩基配列を解析し、その領域の重複部分を探索して該重複部分で結合した広い領域における塩基配列の決定を行うことを特徴としている。
【００１６】
このＤＮＡ解析方法によれば、従来のように複数回の分析を繰り返すことなく、１回の試料注入に応じた分析により短鎖から長鎖までの広い領域の塩基配列の解析を行うことができる。これにより、分析所要時間を短縮しながら分析対象を広げることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明に係る電気泳動装置の一実施例としてマイクロチップ電気泳動装置を説明する。まず、本実施例のマイクロチップ電気泳動装置に用いられる電気泳動チップについてその構造を図１により説明する。
【００１８】
図１（ａ）はこの電気泳動チップ（本発明における電気泳動部材）１０の上面平面図、図１（ｂ）は（ａ）中のＡ−Ａ’矢視線断面図である。電気泳動チップ１０は、ガラス板、石英ガラス板などから成る一対の透明平板１１ａ、１１ｂを貼り合わせた細長い扁平直方体形状の基板１１を有する。下側の透明平板１１ｂの上面には、平行に延伸する２本の溝が例えばエッチングにより形成されており、上側の透明平板１１ａには上記２本の溝の一方の端部に対応する位置に共通の略楕円形状の貫通孔が穿孔され、また２本の溝の他端に対応する位置にそれぞれ別の略円形状の貫通孔が穿孔されている。溝部分の幅は１０〜１００μｍ程度、深さは５〜５０μｍ程度である。
【００１９】
一対の透明平板１１ａ、１１ｂは溝を内側にして貼り合わされる。これによって、溝の上方開放面は上側の透明平板１１ａの下面で閉塞され、第１流路１５、第２流路１６なる２本の平行な分離流路が形成される。この第１流路１５、第２流路１６の一端が共通に接続される略楕円形状の貫通孔の下方開放面、及び、第１流路１５、第２流路１６の他端にそれぞれ接続される略円形状の貫通孔の下方開放面は、それぞれ透明平板１１ｂの上面で閉塞され、前者は試料導入口としてのサンプルウエル１２となり、後者は分離媒体充填口１３、１４となる。このサンプルウエル１２の上にはバッファ（泳動液）を貯留可能な第１バッファリザーバ１７が設けられ、分離媒体充填口１３、１４の上には同じくバッファを貯留可能な共通の第２バッファリザーバ（本発明における液溜め部）１８が設けられる。なお、図１中の符号２６ａ（２６ｂ）の位置には流路１５、１６内で分離された試料成分を検出するための後述する検出器が配設される。
【００２０】
図２は本実施例の電気泳動装置を含む分析システム全体の要部の構成図である。試料注入部２０は分析対象の試料を電気泳動チップ１０のサンプルウエル１２に注入するものであり、泳動電圧印加部（本発明における電圧印加手段）２１は第１流路１５、第２流路１６の両端間に所定の泳動電圧を印加するものであり、バッファ注入部２３はバッファ（泳動液）を第１、第２バッファリザーバ１７、１８に注入するものであり、分離媒体注入部２４は分離媒体を分離媒体充填口１３、１４から注入するものであり、洗浄部２５はサンプルウエル１２やバッファリザーバ１７、１８などを洗浄するものである。また、蛍光検出器（本発明における検出手段）２６は第１流路１５、第２流路１６に対してそれぞれ配設される励起光照射部２６ａと受光部２６ｂとを含み、第１流路１５、第２流路１６中で分離された試料成分を時間経過に伴って順次検出してそれぞれ検出信号を出力する。データ処理部２７はこの検出信号を受けて所定のデータ処理を実行する。制御部２８は上記各部を統括的に制御することで自動分析を可能とする。なお、データ処理部２７に含まれるデータ処理機能は、専用のソフトウエアを汎用のコンピュータ上で動作させることで実現することができる。
【００２１】
次に、本実施例による電気泳動装置による分析手順の一例を、図３のフローチャートに従って説明する。まず、分離媒体注入部２４により、電気泳動チップ１０の第１分離媒体充填口１３から分離媒体Ａを注入し、第１流路１５中に分離媒体Ａを充填する（ステップＳ１）。なお、必要に応じて洗浄部２５によりサンプルウエル１２を洗浄して第１流路１５から溢れ出た分離媒体Ａを除去するとよい。次に、分離媒体注入部２４により、電気泳動チップ１０の第２分離媒体充填口１４から分離媒体Ｂを注入し、第２流路１６中に分離媒体Ｂを充填する（ステップＳ２）。分離媒体Ａと分離媒体Ｂとは異なる分離特性を有する。その後、洗浄部２５により、サンプルウエル１２に溢れ出ている分離媒体Ａ、Ｂを除去してサンプルウエル１２内を洗浄する（ステップＳ３）。
【００２２】
分離媒体Ａ、Ｂが分析に不都合な不要成分を含有しているおそれがある場合には、それを除去するために、バッファ注入部２３により、第１、第２バッファリザーバ１７、１８にバッファを注入し、その状態で泳動電圧印加部２１により両リザーバ１７、１８に貯留されたバッファに浸漬させた一対の電極の間に所定の電圧を印加し、これにより流路１５、１６中に存在する不要成分を移動させるようにプレランを行う。そして、所定時間プレランを行った後に、洗浄部２５により両リザーバ１７、１８内のバッファを除去して洗浄を行う（ステップＳ４）。但し、分離媒体Ａ、Ｂに不要成分が混じっているおそれがなければ、このステップＳ４の処理は省略することができる。
【００２３】
次いでサンプルウエル１２に試料注入部２０より試料を注入する一方、第２バッファリザーバ１８にバッファ注入部２３よりバッファを注入する（ステップＳ５）。そして、泳動電圧印加部２１により、サンプルウエル１２中の試料に浸漬させた電極と第２バッファリザーバ１８中のバッファに浸漬させた電極との間に所定の泳動電圧を印加し、これにより試料を第１流路１５及び第２流路１６中にそれぞれ導入する（ステップＳ６）。つまり、１回の試料注入動作でサンプルウエル１２中に保持されている試料を所定量ずつ第１流路１５、第２流路１６の２経路に並行して移動させる。その後、必要に応じて、洗浄部２５により、サンプルウエル１２内に残っている試料を除去して洗浄する（ステップＳ７）。
【００２４】
それからバッファ注入部２３により第１バッファリザーバ１７にバッファを注入して貯留させる（ステップＳ８）。このとき第２バッファリザーバ１８にはステップＳ５で注入されたバッファが貯留された状態にある。そして、泳動電圧印加部２１により、第１バッファリザーバ１７中のバッファに浸漬させた電極と第２バッファリザーバ１８中のバッファに浸漬させた電極との間に所定の泳動電圧を印加する。この泳動電圧により形成される電場により先に流路１５、１６中に保持させた試料をサンプルウエル１２側から分離媒体充填口１３、１４に向かって移動させ、その移動の際に分離媒体Ａ、Ｂと試料中の各種成分との相互作用により該成分を流路１５、１６の長手方向に分離させる。但し、分離媒体Ａと分離媒体Ｂとでは分離特性が相違するから、例えば異なる種類の試料成分に対して良好に分離が行われる。
【００２５】
そうして分離した試料成分が蛍光検出器２６の励起光照射部２６ａと受光部２６ｂとによる測定位置を通過すると、その蛍光特性の相違が蛍光検出器２６により検出され、それが反映された検出信号が得られる（ステップＳ９）。試料成分の検出は第１流路１５、第２流路１６で並行して独立に行われるから、それぞれの流路１５、１６に対応する２系統の検出信号がデータ処理部２７に送られる。データ処理部２７では検出信号をデジタル値に変換して得たデータに基づいて、例えば横軸を泳動時間としたエレクトロフェログラムを作成する。
【００２６】
以上のようにして、本実施例によるマイクロチップ電気泳動装置によれば、従来であれば分離流路に充填される分離媒体を入れ替えて２回の分析を行う必要があったものを、１回の試料の注入の後の１回の同時並行的な分析により結果を得ることができる。これにより、１回の試料注入分の量の試料を用意すればよいので、試料の用意に時間や手間が掛かる場合に省力化、分析の効率化を図ることができる。また、試料が高価である場合でもコスト低減を図ることができる。さらにまた、もともと微量の試料しか用意できない場合でも、異なる分離特性を利用した良好な分析を行うことができる。
【００２７】
次に、上記マイクロチップ電気泳動装置を用いた分析システムによりＤＮＡシーケンスの鎖長解析を行う分析手法について説明する。上記のような電気泳動により鎖長毎にＤＮＡを分離する場合、一般に、高濃度の分離媒体では短鎖ＤＮＡは良好に分離されるものの長鎖ＤＮＡの分離は悪くなる。一方、低濃度の分離媒体では逆に長鎖ＤＮＡは良好に分離されるが、短鎖ＤＮＡの分離は悪くなる。そのため、或る１種の分離媒体だけで短鎖から長鎖までの広い領域の鎖長解析が可能なデータを取得するのは困難である。
【００２８】
そこで、上記マイクロチップ電気泳動装置において、電気泳動チップ１０の第１流路１５中に高濃度の分離媒体を充填し、第２流路１６中には低濃度の分離媒体を充填する。そして、上述のような手法でＤＮＡ試料を分離分析し、２つの流路１５、１６でそれぞれ分離された成分を蛍光検出器２６で検出し、データ処理部２７はそれらデータを収集する。
【００２９】
いま、図４に示すように解読の必要なＤＮＡの鎖長が非常に広い領域に広がっている場合、例えば、第１流路１５について収集したデータからは鎖長Ｌ１〜Ｌ３の領域の配列解析が行え、第２流路１６について収集したデータからは鎖長Ｌ２〜Ｌ４の領域の配列解析が行える。両者の解析結果では一部領域（Ｌ２〜Ｌ３の領域）で解析された配列がオーバーラップしているから、データ処理部２７ではこのオーバーラップ部分を探索し、オーバーラップ部が見い出されたならばこれを挟んで短鎖側領域と長鎖側領域とを結合し、鎖長Ｌ１〜Ｌ４に亘る広い領域の配列解析結果を得る。
【００３０】
１回の分析でこのように広い領域の配列解析結果を得ようとすると、分解能が低くなったり長鎖配列解析のために時間が掛かったりするが、上記実施例のマイクロチップ電気泳動装置では２本の流路１５、１６でそれぞれに割り当てられた領域のみ分離できればよいので、高い分解能を得易い。また、分離条件をそれぞれに最適化することにより、配列解析時間の短縮化を図ることもできる。
【００３１】
なお、上記実施例では、分離のための流路は２本であるが、３本以上であってもよい。また、第２バッファリザーバ１８を第１、第２流路１５、１６に対して共通にしているが、これを流路毎に分けるようにしてもよい。この第２バッファリザーバ１８を分離することにより、第１流路１５の両端と第２流路１６の両端とに異なる泳動電圧を印加することができる。即ち、同時に異なる電圧値の泳動電圧を印加することもできるし、或いは、両流路１５、１６に同時ではなく時分割で、例えば第１流路１５の両端に泳動電圧を印加して分離分析を行った後に、第２流路１６の両端に泳動電圧を印加して分離分析を行うといったタイミングをずらした分析も可能である。
【００３２】
また、上記実施例では、２本の流路１５、１６の流路長は同一であるが、異なる流路長にすることもできる。それにより、各流路で最短時間で泳動を行えるような時間の調整を行ったり、流路中の電界強度の調整を行うこともできる。また泳動時間の調整は、検出器２６による検出位置を流路毎に最適位置に調整することでも実現可能である。
【００３３】
また、上記実施例はマイクロチップ電気泳動装置に本発明を適用したものであるが、キャピラリ電気泳動装置にも本発明を適用することができる。さらに上記実施例は本発明の一例にすぎないから、上記記載の各種の変形のほかにも、本発明の趣旨の範囲で適宜変更、修正、追加などを行っても本願特許請求の範囲に包含されることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の一実施例の電気泳動装置に用いられる電気泳動チップの上面平面図（ａ）、及びＡ−Ａ’矢視線断面図（ｂ）。
【図２】本実施例の電気泳動装置を含む分析システム全体の要部の構成図。
【図３】本実施例による電気泳動装置による分析手順の一例を示すフローチャート。
【図４】本実施例による電気泳動装置を用いたＤＮＡの鎖長解析手法の説明図。
【符号の説明】
【００３５】
１０…電気泳動チップ
１１…基板
１１ａ、１１ｂ…透明平板
１２…サンプルウエル
１３…第１分離媒体充填口
１４…第２分離媒体充填口
１５…第１流路
１６…第２流路
１７…第１バッファリザーバ
１８…第２バッファリザーバ
２０…試料注入部
２１…泳動電圧印加部
２３…バッファ注入部
２４…分離媒体注入部
２５…洗浄部
２６…蛍光検出器
２６ａ…励起光照射部
２６ｂ…受光部
２７…データ処理部
２８…制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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