(57)【要約】      （修正有）【課題】簡易な構成で、複数種類の細胞を効率的に分離することができる細胞分離装置および分離方法を提供する。【解決手段】細胞の種類に応じて誘電泳動特性が異なることから、その誘電泳動特性の差に基づいて複数種の細胞を分離する。誘電泳動特性の異なる複数種の細胞を含む細胞浮遊液を貯留する容器と、該容器内に配置される電極４と、該電極の周囲に電界強度の勾配を生じさせるように電圧を加える電界制御部とを備え、前記電極に、いずれかの細胞を捕集させる細胞分離装置および細胞分離方法。【選択図】図３
2008263847.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電泳動特性の異なる複数種の細胞を含む細胞浮遊液を貯留する容器と、
該容器内に配置される電極と、
該電極の周囲に電界強度の勾配を生じさせるように電圧を加える電界制御部とを備え、
前記電極に、いずれかの細胞を捕集させる細胞分離装置。
【請求項２】
前記電界制御部が、前記電極に加える電圧の周波数を調節する請求項１に記載の細胞分離装置。
【請求項３】
前記電界制御部が、前記細胞の種類毎に誘電泳動特性の符号を異ならせるような周波数を選択する請求項２に記載の細胞分離装置。
【請求項４】
前記電界制御部が、前記細胞の種類毎の誘電泳動特性の差が大きくなるような周波数を選択する請求項２に記載の細胞分離装置。
【請求項５】
前記容器内の電極の周囲に発生する電界強度の勾配方向に、前記電極と前記細胞浮遊液とを相対的に移動させる相対移動発生部を備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の細胞分離装置。
【請求項６】
前記相対移動発生部が、前記電界強度の勾配方向に前記細胞浮遊液を流動させる請求項５に記載の細胞分離装置。
【請求項７】
前記複数種の細胞が、少なくとも生細胞と死細胞とを含む請求項１から請求項６のいずれかに記載の細胞分離装置。
【請求項８】
誘電泳動特性の異なる複数種の細胞を含む細胞浮遊液内に配置した電極に電圧を加えて、電界強度の勾配を生じさせ、前記電極にいずれかの細胞を捕集させる細胞分離方法。
【請求項９】
前記電極に加える電圧の周波数を調節する請求項８に記載の細胞分離方法。
【請求項１０】
前記細胞の種類毎に誘電泳動特性の符号を異ならせるような周波数を選択する請求項９に記載の細胞分離方法。
【請求項１１】
前記細胞間の誘電泳動特性の差が大きくなるような周波数を選択する請求項９に記載の細胞分離方法。
【請求項１２】
前記電極の周囲に発生する電界強度の勾配方向に、前記電極と前記細胞浮遊液とを相対的に移動させる請求項８から請求項１１のいずれかに記載の細胞分離方法。
【請求項１３】
前記電界強度の勾配方向に前記細胞浮遊液を流動させる請求項１２に記載の細胞分離方法。
【請求項１４】
前記複数種の細胞が、少なくとも生細胞と死細胞とを含む請求項８から請求項１３のいずれかに記載の細胞分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離装置および細胞分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、電気泳動特性の差を利用して粒子を分離する技術が知られている（例えば、特許文献１〜４参照。）。
特許文献１に開示された技術は、平板電極からなる複数のトラップを流路中に配置して、ある細菌を特異的に吸着する抗体を被覆したビーズを電極に捕集させておき、そこに分析したい汚水を流通させて、誘電泳動特性により電極に近接する細菌をビーズに捕集させるものである
【０００３】
特許文献２に開示された技術は、波状の電極を複数並べた流路を形成し、その電極の配列方向に複数種の粒子を流動させることにより、誘電泳動特性の差を利用して、粒子を分離するものである。
特許文献３に開示された技術は、超音波により粒子を移動させた後に、電界を加えて誘電泳動により分離するものである。
特許文献４に開示された技術は、２種類以上の周波数の電界を加えることで、粒子に複数の誘電泳動力が作用するようにして粒子を分離するものである。
【０００４】
【特許文献１】国際公開第１９９７／３４６８９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００１／５５１２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００１／５５１３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００１／５５１４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１の技術は、流路の下流に分析用のチャンバを用意しておき、予め、細菌を捕集していない誘電泳動特性を測定しておき、ある細菌が捕集されたビーズを電極から遊離させ、分析用チャンバまで流し込み、測定および捕集していないビーズとの特性の差を見ることで、細菌を定量するものであり、工程が複雑であるという不都合がある。
【０００６】
また、特許文献２の技術は、電極の配列方向に流動する粒子を分離するために、波形の電極形状を採用する必要があり、装置が複雑で高価になるとともに、効率的に分離することができないという不都合がある。
【０００７】
また、特許文献３の技術は、超音波のような余分のエネルギを必要とするという不都合がある。
さらに、特許文献４の技術は、２種類の周波数の電界を加える点において、複雑であるという問題がある。
【０００８】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易な構成で、複数種類の細胞を効率的に分離することができる細胞分離装置および分離方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、誘電泳動特性の異なる複数種の細胞を含む細胞浮遊液を貯留する容器と、該容器内に配置される電極と、該電極の周囲に電界強度の勾配を生じさせるように電圧を加える電界制御部とを備え、前記電極に、いずれかの細胞を捕集させる細胞分離装置を提供する。
【００１０】
発明者らは、細胞の種類に応じて誘電泳動特性が異なることを見いだし、その誘電泳動特性の差に基づいて複数種の細胞を分離する技術を考案した。本発明によれば、電界制御部の作動により細胞浮遊液を貯留した容器内に配置した電極の周囲に電界強度の勾配を生じさせることにより、誘電泳動特性の差に基づく電極への捕集され易さの相違により、特定の種類の細胞を特異的に捕集することが可能となる。
【００１１】
上記発明においては、前記電界制御部が、前記電極に加える電圧の周波数を調節することとしてもよい。
このようにすることで、例えば、生細胞と死細胞では、電圧の周波数変化により、誘電泳動特性が変化する。そこで、電界制御部が電極に加える電圧の周波数を変化させることにより、細胞の誘電泳動特性の差を大きくすることができ、より確実に細胞毎に分離することが可能となる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記電界制御部が、前記細胞の種類毎に誘電泳動特性の符号を異ならせるような周波数を選択することとしてもよい。
発明者らは、細胞の種類に応じて異なる誘電泳動特性が、電界の周波数の変化に応じてその符号を異ならせるように変化させられることを見いだした。このように構成することで、誘電泳動特性の符号の相違により逆方向のクーロン力が発生するので、より容易に細胞毎に分離することが可能となる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記電界制御部が、前記細胞の種類毎の誘電泳動特性の差が大きくなるような周波数を選択することとしてもよい。
発明者らは、細胞の種類に応じて異なる誘電泳動特性が、電界の周波数の変化に応じてその差を大きくするように変化させられることを見いだした。このように構成することで、誘電泳動特性の差により電極に引きつけられるクーロン力が相違するので、その相違を利用して細胞毎に分離することが可能となる
【００１４】
また、上記発明においては、前記容器内の電極の周囲に発生する電界強度の勾配方向に、前記電極と前記細胞浮遊液とを相対的に移動させる相対移動発生部を備えることとしてもよい。
このようにすることで、相対移動発生部の作動により、クーロン力の大きな細胞は電極に吸着され、クーロン力の小さい細胞は、吸着することなく相対移動させられる。これにより、細胞を種類毎に容易に分離することができる。
【００１５】
また、上記発明においては、前記相対移動発生部が、前記電界強度の勾配方向に前記細胞浮遊液を流動させることとしてもよい。
このようにすることで、電極を固定し、細胞浮遊液を流動させることで、細胞浮遊液と電極とを相対的に移動させ、クーロン力の相違に基づき、細胞を種類毎に分離することができる。
また、上記発明においては、前記複数種の細胞が、少なくとも生細胞と死細胞とを含むこととしてもよい。
【００１６】
また、本発明は、誘電泳動特性の異なる複数種の細胞を含む細胞浮遊液内に配置した電極に電圧を加えて、電界強度の勾配を生じさせ、前記電極にいずれかの細胞を捕集させる細胞分離方法を提供する。
本発明によれば、細胞浮遊液内に配置した電極の周囲に電界強度の勾配を生じさせることにより、誘電泳動特性の差に基づいて、電極への捕集され易さの相違により、特定の種類の細胞を特異的に捕集することが可能となる。
【００１７】
上記発明においては、前記電極に加える電圧の周波数を調節することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記細胞の種類毎に誘電泳動特性の符号を異ならせるような周波数を選択することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記細胞間の誘電泳動特性の差が大きくなるような周波数を選択することとしてもよい。
【００１８】
また、上記発明においては、前記電極の周囲に発生する電界強度の勾配方向に、前記電極と前記細胞浮遊液とを相対的に移動させることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記電界強度の勾配方向に前記細胞浮遊液を流動させることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記複数種の細胞が、少なくとも生細胞と死細胞とを含むこととしてもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、簡易な構成で、複数種類の細胞を効率的に分離することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の一実施形態に係る細胞分離装置１および細胞分離方法について、図１〜図７を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１は、図１に示されるように、複数種の細胞、例えば、生細胞の中に死細胞が混在した細胞浮遊液を貯留する細胞浮遊液容器２と、該細胞浮遊液容器２に貯留された細胞浮遊液を流動させる処理槽（容器）３と、該処理槽３内に配置された電極４と、該処理槽３内において細胞浮遊液を流動させるポンプ（相対移動発生部）５と、分離された細胞を回収する２つの回収容器６，７と、細胞を含まない媒体物質を供給する媒体物質供給部８とを備えている。
【００２１】
前記電極４は、図２に示されるように、複数の直棒状電極部を平行に間隔をあけて配列してなる２つの櫛歯状電極４Ａ，４Ｂを、各櫛歯状電極の直棒状電極部４ａ，４ｂが交互に配置されるように配置することにより構成されている。２つの櫛歯状電極４Ａ，４Ｂ間には交流電源９が接続され、該交流電源９には、その周波数を調節する制御部１０が接続されている。
【００２２】
電極４は、細胞浮遊液の流動方向に直交する方向に直棒状電極部４ａ，４ｂを配列するように処理槽３内に配置されている。これにより、直棒状電極部４ａ，４ｂの周囲には図３に示されるような電界強度の勾配が形成されるようになっている。図３は電界強度を等高線により示しており、電界強度は、直棒状電極部４ａ，４ｂに近いほど強く、離れる程弱くなっている。。
【００２３】
前記ポンプ５は、細胞浮遊液容器２内に貯留された細胞浮遊液を処理槽３内に供給し、処理槽３内において流動させるようになっている。流動方向は、櫛歯状電極４Ａ，４Ｂを構成する各直棒状電極部４ａ，４ｂの配列方向に直交する方向（矢印Ａの方向）である。
【００２４】
一方の回収容器６は、前記櫛歯状電極４Ａ，４Ｂに対して、細胞浮遊液の流動方向の下流側において処理槽３に接続されている。また、他方の回収容器７は上流側に接続されている。
前記媒体物質供給部８は、図１に示されるように、処理槽３内に供給する媒体物質を貯留する媒体物質容器８ａと、媒体物質を供給するポンプ８ｂとを備え、処理槽３内において細胞浮遊液の流動方向Ａとは逆方向（矢印Ｂの方向）に流動させるようになっている。
【００２５】
このように構成された本実施形態に係る細胞分離装置１を用いた細胞分離方法について、以下に説明する。
ここで、生細胞と死細胞の誘電泳動特性について説明する。ここでは、マウスハイブリドーマ３−２Ｈ３細胞を例示して説明する。
【００２６】
図４は、生細胞と死細胞の誘電泳動特性の周波数変化を示している。この図４によれば、電極に加える交流電圧の周波数が１０５Ｈｚ以下の領域においては、生細胞と死細胞とはほぼ同等の誘電泳動特性を有している。
【００２７】
しかしながら、交流電圧の周波数が１０５Ｈｚを越えると、死細胞の誘電泳動特性は急激に低下し、交流電圧の周波数が１０７Ｈｚ近辺でほぼゼロとなるのに対し、生細胞の誘電泳動特性は、交流電圧の周波数が１０７Ｈｚ近辺までほぼ一定である。さらに、死細胞の誘電泳動特性は交流電圧の周波数が１０７Ｈｚを越えるとさらに低下して負の値となるのに対し、生細胞の誘電泳動特性は、交流電圧の周波数が１０７Ｈｚを越えると、低下するものの正の値に維持される。
【００２８】
本実施形態に係る細胞分離装置１を用いてマウスハイブイドーマ３−２Ｈ３細胞の生細胞と死細胞とを分離するには、生細胞と死細胞とを含む細胞浮遊液を細胞浮遊液容器２に貯留しておく、そして、制御部１０の作動により、電極４には、例えば、周波数１０７Ｈｚ程度の交流電圧を加える。
【００２９】
次いで、ポンプ５を作動させて、生細胞および死細胞を含む細胞浮遊液を貯留する細胞浮遊液容器２から、細胞浮遊液を処理槽３内に供給する。処理槽３内に供給された細胞浮遊液は、ポンプ５の駆動力により、電極４を構成する直棒状電極部４ａ，４ｂの配列方向に直交する方向Ａに流動させられる。
【００３０】
この場合において、電極４には周波数１０７Ｈｚ程度の交流電圧が加えられているので、各直棒状電極部４ａ，４ｂの周囲には、半径方向外方に向かって低くなる電界強度の勾配が形成されている。すなわち、直棒状電極部４ａ，４ｂの配列方向に直交する方向に流動する細胞浮遊液は、電界強度の勾配に沿う方向に流動させられることになる。
【００３１】
そして、生細胞Ｘはこの周波数１０７Ｈｚの交流電圧が加えられた状態では、正の誘電泳動特性を有しているので、電界強度が強くなる方向、すなわち、各直棒状電極部４ａ，４ｂに向かって吸引されるクーロン力を受ける。一方、死細胞Ｙの誘電泳動特性は、ほぼゼロであるので、電界強度の影響を受けることなく流動させられる。
【００３２】
その結果、死細胞Ｙは直棒状電極部４ａ，４ｂ間を通り抜けて流動し、生細胞Ｘは、各直棒状電極部４ａ，４ｂに吸着される。
したがって、死細胞Ｙは、直棒状電極部４ａ，４ｂに吸着されることなく、下流側に流れ、処理槽３の下流側に接続されている回収容器６に回収される。
【００３３】
一方、生細胞Ｘは直棒状電極部４ａ，４ｂに吸着されて残るので、死細胞Ｙを回収容器６に回収した後に、媒体物質供給部８を作動させて、媒体物質を処理槽３の下流側から供給するとともに、制御部１０が電極４に加えていた電圧を停止する。これにより、直棒状電極部４ａ，４ｂに吸着されていた生細胞が直棒状電極部４ａ，４ｂから剥離され、媒体物質の流れに従って、処理槽３の上流側に接続されている回収容器７に回収される。これにより、生細胞Ｘと死細胞Ｙとを容易に分離することができる。
【００３４】
なお、本実施形態においては、交流電圧の周波数を１０７Ｈｚに設定して、死細胞Ｙの誘電泳動特性をほぼゼロに設定したが、これに代えて、交流電圧の周波数を１０７Ｈｚより大きく設定してもよい。このようにすることで、死細胞Ｙの誘電泳動特性を負の値に設定することができる。
【００３５】
すなわち、交流電圧の周波数を１０７Ｈｚより大きく設定して、細胞浮遊液を流動させると、生細胞Ｘは、上記と同様にして直棒状電極部４ａ，４ｂに吸着されるが、死細胞Ｙについては、直棒状電極部４ａ，４ｂから離れる方向に反発するクーロン力が発生する。これにより、死細胞Ｙは、直棒状電極部４ａ，４ｂに吸着せずに上流側に浮遊状態に維持されるので、生細胞Ｘを吸着した後に、媒体物質供給部８から処理槽３の下流側に媒体物質を供給することによって、死細胞Ｙを上流側の回収容器７に回収することができる。死細胞Ｙの回収後に、制御部１０が直棒状電極部４ａ，４ｂに加えていた電圧を停止するとともに、媒体物質を処理槽３の上流側から供給することにより、死細胞Ｙから分離された生細胞Ｘを下流側の回収容器６に回収することができる。
【００３６】
また、交流電圧の周波数を１０６Ｈｚ程度に設定することにしてもよい。このように設定すると、生細胞Ｘも死細胞Ｙもいずれも正の誘電泳動特性を有するが、その誘電泳動特性の値に差が発生する。
生細胞Ｘおよび死細胞Ｙのいずれも正の誘電泳動特性を有しているので、直棒状電極部４ａ，４ｂに吸着するクーロン力が発生する。そして、誘電泳動特性の大きさに差があるので、発生するクーロン力にも差が生ずる。
【００３７】
この場合には、直棒状電極部４ａ，４ｂに対する細胞浮遊液の流速を調節することにより、クーロン力の小さい死細胞Ｙについては、直棒状電極部４ａ，４ｂから引きはがして下流に押し流し、クーロン力の大きい生細胞Ｘについては、直棒状電極部４ａ，４ｂに吸着状態に維持されるようにする。このようにすることで、生細胞Ｘを直棒状電極部４ａ，４ｂに吸着状態に捕集し、死細胞Ｙについては下流側の回収容器６により回収することができる。そして、死細胞Ｙの回収後に、媒体物質を処理槽３下流側から流入させ、直棒状電極部４ａ，４ｂに加えていた電圧を停止することにより、吸着していた生細胞Ｘを解放して、上流側の回収容器７に回収させることができる。
【００３８】
また、図４に示される生細胞Ｘと死細胞Ｙの誘電泳動特性では、両方の誘電泳動特性が負になるような交流電圧の周波数は存在しないが、仮にそのように調節できる細胞の分離を行う場合には、より誘電泳動特性の絶対値の大きな細胞には、より大きなクーロン力の反発力が発生する。したがって、細胞浮遊液の流速を調節して、より反発力の小さい細胞について直棒状電極部４ａ，４ｂ間を通過させて下流側で回収し、その後、直棒状電極部４ａ，４ｂを通過できずに残った細胞を上流側の回収容器７に回収することにすればよい。
【００３９】
また、本実施形態においては、マウスハイブリドーマ３−２Ｈ３細胞の生細胞と死細胞を分離する場合について説明したが、これに限定されるものではなく、他の任意の細胞の生細胞と死細胞との分離に適用することにしてもよい。また、図５に示されるように、複数種の細胞毎に、誘電泳動特性の周波数変化が相違することを利用して、分離することにしてもよい。
【００４０】
図６は、３−２Ｈ３細胞とＨｅＬａ細胞とを分離する場合であって、周波数３００〜１０００Ｈｚ、電圧１５Ｖｐｐ、細胞浮遊液の流量２ｍＬ／ｍｉｎ、媒体物質８．５重量％スクロース＋０．３重量％グルコース溶液、温度２５℃の場合の電極における生細胞保持率％を示している。生細胞保持率は電極を通過した細胞浮遊液の細胞濃度ＷＡ、電極を通過しなかった細胞浮遊液の細胞濃度ＷＢとして、
ＷＢ／（ＷＡ＋ＷＢ）
により算出した。
【００４１】
図７は、３−２Ｈ３細胞とＭＤＣＫ細胞とを分離する場合であって、周波数１〜１１０ｋＨｚ、電圧３０Ｖｐｐ、細胞浮遊液の流量２ｍＬ／ｍｉｎ、媒体物質８．５重量％スクロース＋０．３重量％グルコース溶液、温度２５℃の場合の電極における生細胞保持率％を示している。
【００４２】
これらの図によれば、電極に加える交流電圧の周波数変化によって、生細胞保持率が細胞毎に異なる態様で変化し、周波数によっては、生細胞保持率が大きく異なる場合があることがわかる。すなわち、そのような生細胞保持率の差の大きな周波数の交流電圧を加えることにより、細胞を種類毎に容易に分離することができる。
【００４３】
なお、本実施形態においては、電極４として櫛歯状電極４Ａ，４Ｂを組み合わせて構成したものを採用したがこれに限定されるものではない。
また、電極４に吸着されない負の強い誘電泳動特性を有する細胞について、処理槽３の下流側から供給した媒体物質によって上流側の回収容器７に回収することとしたが、これに代えて、電極４に通電したままで、処理槽３の上流側から媒体物質を供給し、上流側の回収容器７に回収することにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞分離装置を示す模式的な全体構成図である。
【図２】図１の細胞分離装置に用いられる電極の一例を示す図である。
【図３】図２の電極を構成する直棒状電極部の周囲に生ずる電界強度を等高線で示す図である。
【図４】図１の細胞分離装置により分離する３−２Ｈ３細胞の生細胞と死細胞の誘電泳動特性の周波数変化を示すグラフである。
【図５】細胞の種類による誘電泳動特性の相違を示す図である。
【図６】ＨｅＬａ細胞と３−２Ｈ３細胞の生細胞保持率の周波数変化を示すグラフである。
【図７】ＭＤＣＫ細胞と３−２Ｈ３細胞の生細胞保持率の周波数変化を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４５】
Ｘ  生細胞（細胞）
Ｙ  死細胞（細胞）
１  細胞分離装置
３  処理槽（容器）
４  電極
４ａ，４ｂ  直棒状電極部（電極）
５  ポンプ（相対移動発生部）
１０  制御部（電界制御部）
【図１】
2008263847.tif 000003
【図２】
2008263847.tif 000004
【図３】
2008263847.tif 000005
【図４】
2008263847.tif 000006
【図５】
2008263847.tif 000007
【図６】
2008263847.tif 000008
【図７】
2008263847.tif 000009