(57)【要約】      （修正有）【課題】ラクトバチラス属乳酸菌であるラクトバチラス・コリノイデス、ラクトバチラス・バッキラクトバチラス・リンドネリを正確に検出できるプライマー等の提供。【解決手段】特定の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドからなる群から選択されるプライマーを含んでなる、ラクトバチラス属乳酸菌の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットおよびＰＣＲ法プライマーセット。プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ラクトバチラス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）およびその近縁種検出用プローブまたはプライマー。
【請求項２】
請求項１に記載の二種以上のプライマーからなる、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項３】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項２に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項３に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項５】
配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ラクトバチラス・バッキ（Lactobacillus backi）およびその近縁種検出用プローブまたはプライマー。
【請求項６】
請求項５に記載の二種以上のプライマーからなる、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項７】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項６に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項８】
下記ポリヌクレオチドのいずれか一方あるいは両方を更に含んでなる、請求項７に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項５に記載の二種以上のプライマーからなる、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項１０】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項９に記載のＰＣＲ法プライマーセット：
配列番号２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号２４、２５、２６、または２７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、ラクトバチラス・リンドネリ（Lactobacillus lindneri）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１６の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号１〜１７および２４〜２８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項３、４、７、８、１０、および１１のいずれか一項に記載のプライマーセットまたは請求項１および５に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項１３】
配列番号１〜１７および２４〜２８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項３、４、７、８、１０、および１１のいずれか一項に記載のプライマーセットまたは請求項１および５に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項１４】
配列番号１〜１７および２４〜２８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列において、１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項３、４、７、８、１０、および１１のいずれか一項に記載のプライマーセットまたは請求項１および５に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項１５】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の検出方法。
【請求項１６】
請求項６〜８のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の検出方法。
【請求項１７】
請求項９または１０に記載のＰＣＲ法プライマーセットを用いてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の検出方法。
【請求項１８】
請求項１１に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、ラクトバチラス・リンドネリの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチラス属乳酸菌の検出用プライマーおよびプローブに関し、より詳細には、ラクトバチラス属乳酸菌の検出用のＬＡＭＰ法プライマーセットおよびＰＣＲ法プライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ビール業界においては、微生物によるビールの汚染は深刻な問題をもたらす。ホップ由来の苦味物質は、ビールに苦味とともに微生物安定性も付与する。しかし、いくつかの種類の乳酸菌は、このような抗菌活性に対抗してビールで増殖することが出来る。
【０００３】
製品となったビール中で増殖する菌種としてはラクトバチラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）等の報告例が多いが、近年の菌株同定技術の進歩により、それ以外の菌種のビールに対する有害菌種が報告されるようになった。
【０００４】
特許第３６７７０５６号公報（特許文献１）では、当時としては新規なビール混濁菌であり、検出法が無かったラクトバチラス・リンドネリ（Lactobacillus lindneri）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列を明らかにし、検出用プライマーが開示された。
【０００５】
特開平１０−２１０９８０号公報（特許文献２）では、ラクトバチラス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）と１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の相同性が高いビール混濁菌Ｌ．ｓｐ  ＡＢＢＣ７４株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子全体の塩基配列を明らかにし、検出用プライマーが開示された。
【０００６】
特開２００２−３４５７８号公報（特許文献３）では、ラクトバチラス・リンドネリ、およびＬ．ｓｐ  ＡＢＢＣ７４株の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子全体の塩基配列を明らかにし、検出用プローブ・プライマーが開示された。
【０００７】
特表２００３−５１００９１号公報（特許文献４）では、ラクトバチラス・リンドネリ、ラクトバシラス・コリニフォルミス 亜種コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis ssp. coryniformis）、ラクトバシラス・コリニフォルミス 亜種トルケンス（Lactobacillus coryniformis ssp. torquens）の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子および５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域の塩基配列から、ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ用のプローブを開発した。
【０００８】
特開２００５−６５５６号公報（特許文献５）では、ラクトバチラス・リンドネリについて、特許第３６７７０５６号公報（特許文献１）にて請求されているラクトバチラス・リンドネリの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、および検出用プライマーの塩基配列を使って、ネスティッドＰＣＲ法（入れ子ＰＣＲ法）用のプライマーを開発した。またラクトバチラス・コリニフォルミス、Ｌ．ｓｐ  ＡＢＢＣ７４株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を使ってネスティッドＰＣＲ法用のプライマーを開発した。
【０００９】
特開２００５−６５５７号公報（特許文献５）では、ラクトバチラス・リンドネリ、およびＬ．ｓｐ  ＡＢＢＣ７４株について１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子および２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域の遺伝子配列を使って、ネスティッドＰＣＲで特異的に検出するプライマーを開発した。
【００１０】
特開２００５−２２９８３９号公報（特許文献６）では、ビール工場から分離された乳酸菌である、ラクトバシラス・コリニフォルミスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列とある程度相同性があるラクトバチルス・ヘキソーサス（Lactobacillus hexosus）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子配列からＰＣＲ用プライマーセットを開発した。また、ビール工場から分離された乳酸菌であり、ラクトバチラス・コリノイデスと１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の相同性が高いラクトバチルス・シュードコリノイデス（Lactobacillus pseudocollinoides）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子配列からＰＣＲ用プライマーセットを開発した。
【００１１】
Bohakら（Monatsschrift fuer Brauwissenschaft, 2006, 78）は、新規なビール有害乳酸菌としてラクトバチラス・バッキ（Lactobacillus backi）という菌種を提唱し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を明らかにしたが、ラクトバシラス・コリニフォルミスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列とある程度の相同性があった。
【００１２】
しかし、ＰＣＲやＦＩＳＨは高度な温度制御や蛍光観察が必要なため、高価な機器を必要とする。またＰＣＲは反応後に電気泳動、染色、写真撮影等が必要であり、遺伝子増幅工程後の結果判定までに時間がかかる。このために、日々の微生物検査業務の中で行うことには問題があった。
【００１３】
土屋ら（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報（特許文献７））は、ラクトバチラス・リンドネリのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子、ラクトバチラス・シュードコリノイデスのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子、およびラクトバチラス・ヘキソーサスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するＬＡＭＰプライマーを開発したが、一部のプライマーは検出精度の点で更に改善の余地を残すものであった。またラクトバチラス・リンドネリとラクトバチラス・コリノイデスに近縁な菌種のｒＲＮＡ遺伝子配列を使ったＬＡＭＰプライマーは、まだ報告されていない。
【特許文献１】特許第３６７７０５６号公報
【特許文献２】特開平１０−２１０９８０号公報
【特許文献３】特開２００２−３４５７８号公報
【特許文献４】特表２００３−５１００９１号公報
【特許文献５】特開２００５−６５５７号公報
【特許文献６】特開２００５−２２９８３９号公報
【特許文献７】ＷＯ２００５／０９３０５９号公報
【発明の概要】
【００１４】
本発明者は、ラクトバチラス・コリノイデスと１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の同一性が高い菌株に共通のｒＲＮＡ遺伝子およびスペーサー領域の塩基配列を明らかにした。本発明者はまた、ラクトバチラス・バッキと１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の同一性が高い菌株に共通のｒＲＮＡ遺伝子およびスペーサー領域の塩基配列を明らかにした。本発明者は更に、その塩基配列情報に基づいて、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種を正確に検出できるＬＡＭＰ法プライマーセットと、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種を正確に検出できるＬＡＭＰ法プライマーセットおよびＰＣＲ法プライマーセットを開発することに成功した。本発明者は更に、ラクトバチラス・リンドネリの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を元に、ラクトバチラス・リンドネリを正確に検出できるＬＡＭＰ法プライマーセットを開発することに成功した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【００１５】
本発明は、ラクトバチラス属乳酸菌を正確に検出できるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットを提供することを目的とする。
【００１６】
以下、ラクトバチラス・コリノイデスとその近縁種の検出に関連する発明を第一の態様とし、ラクトバチラス・バッキとその近縁種の検出に関連する発明を第二の態様とし、ラクトバチラス・リンドネリの検出に関連する発明を第三の態様とする。
【００１７】
第一の態様
本発明者は、ラクトバチラス・コリノイデスに近縁であるラクトバチラス・パラコリノイデス（Lactobacillus paracollinoides）ＪＣＭ１１９６９株の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列（配列番号６）を明らかにし、この配列がラクトバチラス・コリノイデスとその近縁種に特異的な塩基配列であることを見いだした。本発明者は、このスペーサー領域の塩基配列に基づいて、ラクトバチラス・コリノイデスとその近縁種検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットを設計し、そのプライマーセットによってラクトバチラス・コリノイデスとその近縁種を正確に検出できることを見いだした。ラクトバチラス・コリノイデス近縁株の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
【００１８】
本発明は、ラクトバチラス・コリノイデスのみならずその近縁種を正確に検出できるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットを提供することを目的とする。
【００１９】
本発明の第一の態様によれば、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種検出用プローブまたはプライマーが提供される。
【００２０】
本発明の第一の態様によれば、好ましくは、配列番号６の塩基配列のうち、より識別性の高い部分にハイブリダイズするプローブまたはプライマーが提供される。具体的には、配列番号６の１４４〜２０８番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなるラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の検出用プローブまたはプライマーが提供される。
【００２１】
本発明の第一の態様によれば、また、二種以上の上記プライマーからなる、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される。
【００２２】
本発明の第一の態様によれば、また、二種以上の上記プライマーからなる、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種検出用ＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００２３】
本発明の第一の態様によれば、更に、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【００２４】
第二の態様
本発明者は、ラクトバチラス・バッキ近縁株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子全体、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列を明らかにし、これらの配列がラクトバチラス・バッキとその近縁種に特異的な塩基配列であることを見いだした。本発明者は、ラクトバチラス・バッキ近縁株であるビール工場分離株ＢＫ２株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子全体、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列（配列番号１３）に基づいて、ラクトバチラス・バッキとその近縁種検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットを設計し、そのプライマーセットによってラクトバチラス・バッキとその近縁種を正確に検出できることを見いだした。ラクトバチラス・バッキ近縁株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子全体、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
【００２５】
本発明は、ラクトバチラス・バッキのみならずその近縁種を正確に検出できるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットを提供することを目的とする。
【００２６】
本発明の第二の態様によれば、配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種検出用プローブまたはプライマーが提供される。
【００２７】
本発明の第二の態様によれば、好ましくは、配列番号１３の塩基配列のうち、より識別性の高い部分にハイブリダイズするプローブまたはプライマーが提供される。具体的には、配列番号１３の５４６〜５９８番目の塩基配列、７５１〜７８１番目の塩基配列、１６１７〜１６４８番目の塩基配列、１９２２〜１９８２番目の塩基配列、２３１３〜２３３０番目の塩基配列、または３３５０〜３４３３番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなるラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の検出用プローブまたはプライマーが提供される。
【００２８】
本発明の第二の態様によれば、また、二種以上の上記プライマーからなる、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される。
【００２９】
本発明の第二の態様によれば、また、二種以上の上記プライマーからなる、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種検出用ＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００３０】
本発明の第二の態様によれば、更に、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【００３１】
本発明の第二の態様によれば、更に、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセットが提供される：
配列番号２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号２４、２５、２６、または２７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【００３２】
第三の態様
本発明者は、特許第３６７７０５６号公報により明らかにされたラクトバチラス・リンドネリの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて、ラクトバチラス・リンドネリ検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットを設計し、そのプライマーセットによってラクトバチラス・リンドネリを正確に検出できることを見いだした。
【００３３】
本発明は、ラクトバチラス・リンドネリを正確に検出できるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットを提供することを目的とする。
【００３４】
本発明の第三の態様によれば、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、ラクトバチラス・リンドネリの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１６の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【００３５】
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットによれば、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種、並びにラクトバチラス・リンドネリを正確に検出することができる。特に、本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応に使用することができ、増幅産物の有無により対象菌種を検出することができる。従って、本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセット（特に、ＬＡＭＰ法プライマーセット）によれば、ラクトバチラス・コリノイデスとその近縁種、ラクトバチラス・バッキとその近縁種、ラクトバチラス・リンドネリを、正確、迅速、かつ簡便に識別することができる。
【００３６】
ラクトバチラス・コリノイデスとその近縁種、ラクトバチラス・バッキとその近縁種、並びにラクトバチラス・リンドネリは、ビール、および発泡酒などの各種飲料を混濁させる原因菌であり、これらの菌の存在・不存在は各種飲料の品質管理の指標となりうる。従って、本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットは、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビールおよび発泡酒）の品質管理や環境試料（例えば、原料用水）の検査に有用である。
【００３７】
特に、第一の態様のプローブおよびプライマー並びにプライマーセットは、ラクトバチラス・コリノイデスのみならず、その近縁種をも検出することができる。また、第二の態様のプローブおよびプライマー並びにプライマーセットは、ラクトバチラス・バッキのみならず、その近縁種をも検出することができる。従って、第一の態様の発明と第二の態様の発明は、各種飲料において混濁を生じさせる可能性がある乳酸菌を漏れなく検出できる点で有利である。
【発明の具体的説明】
【００３８】
定義
本発明において「近縁種」とは、ある菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または約１５００ヌクレオチドの領域を少なくとも含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部と、少なくとも９８％以上、好ましくは９９％以上の同一性を示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子またはその一部を有する菌種を意味する。遺伝子の塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴなどの周知の相同性検索ソフトウェアを用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターを設定して算出することができる。
【００３９】
ラクトバチラス・コリノイデスの近縁種としては、ラクトバチラス・パラコリノイデス（例えば、L. paracollinoides LA2T株（ＪＣＭ１１９６９））やラクトバチルス・シュードコリノイデスが挙げられ、菌種名未同定のLactobacillus sp. TG株のようなラクトバチラス・コリノイデス近縁株も含まれる。なお、Lactobacillus sp. TG株は、ラクトバチラス・コリノイデスＪＣＭ１１２３株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と９９％以上の同一性を示しており、少なくともラクトバチラス・コリノイデスの近縁種であることを確認している。
【００４０】
ラクトバチラス・バッキの近縁種としては、ラクトバチラス・ヘキソーサスが挙げられ、菌種名未同定のLactobacillus sp. BK2株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７９４）のようなラクトバチラス・バッキ近縁株も含まれる。なお、Lactobacillus sp. BK2株は、ラクトバチラス・バッキＢｏ２７９株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と９９％以上の同一性を示しており、少なくともラクトバチラス・バッキの近縁種であることを確認している。
【００４１】
微生物の寄託
ラクトバチラス・バッキ近縁株ＢＫ２株（Lactobacillus sp. BK2）は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター  中央第６）に平成１９年３月２日に寄託されており、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７９４である。
【００４２】
プライマーおよびプローブ並びにプライマーセット
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３の４種類のプライマーからなり、これらのプライマーは標的ヌクレオチド配列の６つの領域に対応している。具体的には、標的塩基配列について、３’末端側から５’末端側に向かって順番にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３という領域をそれぞれ規定し、この６領域に対し、４種類のプライマー、すなわちＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰおよびＢ３を作製する。ここで、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの各領域に相補的な領域はそれぞれＦ３、Ｆ２、Ｆ１であり、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の各領域に相補的な領域はそれぞれＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃである。
【００４３】
ＦＩＰは、標的配列のＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＦ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＦＩＰプライマーのＦ１ｃとＦ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００４４】
Ｆ３は、標的遺伝子のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００４５】
ＢＩＰは、標的配列のＢ２ｃ領域と相補的なＢ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＢ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＢＩＰプライマーのＢ１ｃとＢ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００４６】
Ｂ３は、標的遺伝子のＢ３ｃ領域と相補的なＢ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００４７】
ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーに制限酵素部位が含まれる場合、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に１つのバンドとして観察することができる。この場合、もし標的配列に制限酵素部位があれば、プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくてもよい。
【００４８】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットの実施に当たっては、核酸の増幅反応を加速するためにループプライマー（ＬＦプライマーまたはＬＢプライマー）を１種類あるいは２種類追加してもよい。ループプライマーをＦ１−Ｆ２間の領域、あるいはＢ１−Ｂ２間の領域にアニールするように設計し、ＬＡＭＰ法反応系に追加して使用すると、これらのプライマーが核酸増幅工程で利用されていないループ部分に結合することにより、全てのループ部分を起点として核酸反応が進み、核酸増幅反応が加速される（例えば、特開２００２−３４５４９９号公報参照）。
【００４９】
具体的には、第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットは、配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００５０】
第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットは、配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００５１】
第二の態様のプライマーセットはまた、配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００５２】
第二の態様のプライマーセットは、配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドの両方を、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００５３】
本発明では、配列番号１〜５、７〜１２、１４〜１７、および２４〜２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号１〜５、７〜１２、１４〜１７、および２４〜２８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある）も、プライマーやプローブとして用いることができる。なお、これらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドもプライマーやプローブとして用いることができることはいうまでもない。
【００５４】
本発明では、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドを、プライマーやプローブとして用いることができる。
【００５５】
本発明では、配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチド、および配列番号１３の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドを、プライマーやプローブとして用いることができる。
【００５６】
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドには、実質的にはハイブリダイズしないことを意味する。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プローブとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜約５℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム溶液中で、３７℃（約１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（約１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（約２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、６０℃（約２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）の洗浄条件が挙げられる。
【００５７】
相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１０塩基である。
【００５８】
ＬＡＭＰ法プライマーでは、ＦＩＰおよびＢＩＰの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも３０塩基（例えば、３０〜６０塩基）、より好ましくは少なくとも４２塩基（例えば、４２〜５７塩基）、特に好ましくは少なくとも４１塩基（例えば、４１〜５１塩基）とすることができる。
【００５９】
また、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１２塩基（例えば、１２〜２５塩基および１２〜３０塩基）、より好ましくは、少なくとも１８塩基（例えば、１８〜２５塩基および１８〜３０塩基）、特に好ましくは少なくとも１７塩基（例えば、１７〜２４塩基および１７〜３０塩基）とすることができる。
【００６０】
ＰＣＲ法プライマーでは、配列番号２４〜２８の相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１５塩基（例えば、１５〜２５塩基および１５〜３０塩基）、より好ましくは、少なくとも１８塩基（例えば、１８〜２４塩基、１８〜２５塩基、および１８〜３０塩基）、特に好ましくは、少なくとも２０塩基（例えば、２０〜２５塩基および２０〜３０塩基）とすることができる。
【００６１】
相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも１８個、特に好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００６２】
相同ポリヌクレオチドは、また、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【００６３】
相同ポリヌクレオチドは、更に、対応する塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【００６４】
ここで「変異」は、同一または異なっていてもよく、置換、欠失、挿入、および付加から選択でき、好ましくは、ある１個の塩基を他の１個の塩基に置換する「一塩基置換」、ある１個の塩基を欠失させる「一塩基欠失」、ある１個の塩基を挿入する「一塩基挿入」、およびある１個の塩基を付加する「一塩基付加」から選択できる。また、変異の個数は、１〜６個、１、２、３、または４個、１または２個、あるいは１個とすることができる。
【００６５】
配列番号１〜１７および２４〜２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドの例を示すと以下の通りである。
・配列番号１の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１の連続する少なくとも４１個（４１〜４７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（４３〜４７個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号２の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号２の連続する少なくとも１７個（１７〜２４個）、より好ましくは、少なくとも２１個（２１〜２４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号３の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号３の連続する少なくとも４１個（４１〜５１個）、より好ましくは、少なくとも４７個（４７〜５１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号４の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号４の連続する少なくとも１５個（１５〜１８個）、より好ましくは、少なくとも１７個（１７〜１８個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号５の塩基配列で表されるＬＦの相同ポリヌクレオチド：配列番号５の連続する少なくとも１７個（１７〜２１個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号７の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号７の連続する少なくとも３８個（３８〜４４個）、より好ましくは、少なくとも４１個（４１〜４４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号８の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号８の連続する少なくとも１７個（１７〜２１個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号９の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号９の連続する少なくとも３６個（３６〜４４個）、より好ましくは、少なくとも４１個（４１〜４４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号１０の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号１０の連続する少なくとも１７個（１７〜２２個）、より好ましくは、少なくとも２１個（２１〜２２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号１１の塩基配列で表されるＬＦの相同ポリヌクレオチド：配列番号１１の連続する少なくとも１７個（１７〜２１個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号１２の塩基配列で表されるＬＢの相同ポリヌクレオチド：配列番号１２の連続する少なくとも１８個（１８〜２２個）、より好ましくは、少なくとも２０個（２０〜２２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号１４の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１４の連続する少なくとも４１個（４１〜４７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（４３〜４７個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号１５の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号１５の連続する少なくとも１５個（１５〜１７個）、より好ましくは、少なくとも１６個（１６〜１７個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号１６の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１６の連続する少なくとも３３個（３３〜４１個）、より好ましくは、少なくとも３８個（３８〜４１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号１７の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号１７の連続する少なくとも１７個（１７〜２１個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号２４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号２４の連続する少なくとも１８個（１８〜２４個）、より好ましくは、少なくとも２０個（２０〜２４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
・配列番号２５の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号２５の連続する少なくとも１５個（１５〜１８個）、より好ましくは、少なくとも１７個（１７〜１８個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２３塩基とすることができる）。
・配列番号２６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号２６の連続する少なくとも１８個（１８〜２３個）、より好ましくは、少なくとも２０個（２０〜２３個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
・配列番号２７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号２７の連続する少なくとも１８個（１８〜２４個）、より好ましくは、少なくとも２０個（２０〜２４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
・配列番号２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号２８の連続する少なくとも１５個（１５〜１８個）、より好ましくは、少なくとも１７個（１７〜１８個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２３塩基とすることができる）。
【００６６】
本発明では、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号６の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドとすることができる。
【００６７】
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号６の塩基配列の相補配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【００６８】
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、更に、配列番号６の塩基配列の相補配列に１または数個の変異が導入された少なくとも１０塩基の改変塩基配列からなり、かつ配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列に１または数個の変異が導入された少なくとも１０塩基の改変塩基配列からなり、かつ配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【００６９】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）として用いる場合には、配列番号６の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも４１個（例えば、４１〜５１塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【００７０】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法プライマー（Ｆ３、Ｂ３、ＬＢ、およびＬＦ）として用いる場合には、配列番号６の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１７個（例えば、１７〜２４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【００７１】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、配列番号６の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜２４個および１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２４個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【００７２】
本発明においては、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種を検出するためのＰＣＲ法プライマーペアを選択することができる。ＰＣＲ法は周知であり、当業者であればＰＣＲ法プライマーペアを適宜選択することができる。具体的には、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号６の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号６の塩基配列の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号６の塩基配列またはその相補配列に対合し、他方のプライマーが配列番号６の塩基配列およびその相補配列以外の配列（配列番号６の配列の外側の領域）に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。ＰＣＲ法においては、好ましくは、二つのプライマーの一方あるいは両方を、配列番号６の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号６の１４４〜２０８番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。
【００７３】
本発明においては、また、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種を検出するためのＬＡＭＰ法プライマーセットを選択することができる。ＬＡＭＰ法は周知であり、当業者であればＬＡＭＰ法プライマーを適宜設計することができる。具体的には、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種類のプライマー、すなわち、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３を、前述のように設計し、必要に応じてループプライマー、すなわち、ＬＦおよびＬＢを使用することもできる。ＬＡＭＰ法においては、好ましくは、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種のプライマーのうち、少なくともＦＩＰおよびＢＩＰのいずれかまたは両方の一部または全部を、配列番号６の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号６の１４４〜２０８番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。この場合、ＬＡＭＰ法の実施に必要な他のプライマーは、配列番号６の塩基配列またはその相補配列に対合するように選択しても、配列番号６の塩基配列およびその相補配列以外の配列（配列番号６の配列の外側の領域）に対合するように選択してもよい。
【００７４】
なお、配列番号６の中で、「Ｗ」は「Ａ」と「Ｔ」、「Ｒ」は「Ａ」と「Ｇ」のミックス塩基であることを示す。塩基配列解析した際に、これらの塩基配列の位置で２種類の塩基のピークがそれぞれ近い高さのピークを示した。ｒＲＮＡ遺伝子は細胞内に複数コピーが存在することが知られているが、ゲノムＤＮＡの中にそれらの位置に限ってコピー間で複数の配列があるためにこのような現象が見られたと考えられる。このような配列に対してプライマーを設計する場合、例えば、「Ｒ」の位置に対しては、「Ｒ」、「Ａ」、あるいは「Ｇ」として合成させることが出来る。後述の実施例では、配列番号２の塩基配列中の「Ｒ」に相当する位置を「Ａ」としてプライマー合成した。
【００７５】
本発明では、配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号１３の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１３の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号１３の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドとすることができる。
【００７６】
配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号１３の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１３の塩基配列の相補配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号１３の塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【００７７】
配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号１３の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、更に、配列番号１３の塩基配列の相補配列に１または数個の変異が導入された少なくとも１０塩基の改変塩基配列からなり、かつ配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、および配列番号１３の塩基配列に１または数個の変異が導入された少なくとも１０塩基の改変塩基配列からなり、かつ配列番号１３の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【００７８】
配列番号１３の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）として用いる場合には、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも４１個（例えば、４１〜５１塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【００７９】
配列番号１３の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法プライマー（Ｆ３、Ｂ３、ＬＢ、およびＬＦ）として用いる場合には、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１７個（例えば、１７〜２４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【００８０】
配列番号１３の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜２４個および１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２４個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【００８１】
本発明においては、配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種を検出するためのＰＣＲ法プライマーペアを選択することができる。ＰＣＲ法は周知であり、当業者であればＰＣＲ法プライマーペアを適宜選択することができる。具体的には、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号１３の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号１３の塩基配列の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号１３の塩基配列またはその相補配列に対合し、他方のプライマーが配列番号１３の塩基配列およびその相補配列以外の配列（配列番号１３の配列の外側の領域）に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。ＰＣＲ法においては、好ましくは、二つのプライマーの一方あるいは両方を、配列番号１３の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号１３の５４６〜５９８番目の塩基配列、７５１〜７８１番目の塩基配列、１６１７〜１６４８番目の塩基配列、１９２２〜１９８２番目の塩基配列、２３１３〜２３３０番目の塩基配列、または３３５０〜３４３３番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。
【００８２】
本発明においては、また、配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種を検出するためのＬＡＭＰ法プライマーセットを選択することができる。ＬＡＭＰ法は周知であり、当業者であればＬＡＭＰ法プライマーを適宜設計することができる。具体的には、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種類のプライマー、すなわち、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３を、前述のように設計し、必要に応じてループプライマー、すなわち、ＬＦおよびＬＢを使用することもできる。ＬＡＭＰ法においては、好ましくは、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種のプライマーのうち、少なくともＦＩＰおよびＢＩＰのいずれかまたは両方の一部または全部を、配列番号１３の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号１３の５４６〜５９８番目の塩基配列、７５１〜７８１番目の塩基配列、１６１７〜１６４８番目の塩基配列、１９２２〜１９８２番目の塩基配列、２３１３〜２３３０番目の塩基配列、または３３５０〜３４３３番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。この場合、ＬＡＭＰ法の実施に必要な他のプライマーは、配列番号１３の塩基配列またはその相補配列に対合するように選択しても、配列番号１３の塩基配列およびその相補配列以外の配列（配列番号１３の配列の外側の領域）に対合するように選択してもよい。
【００８３】
なお、配列番号１３の中で、「Ｍ」は「Ａ」と「Ｃ」、「Ｒ」は「Ａ」と「Ｇ」、「Ｙ」は「Ｃ」と「Ｔ」のミックス塩基であることを示す。塩基配列解析した際に、これらの塩基配列の位置で２種類の塩基のピークがそれぞれ近い高さのピークを示した。ｒＲＮＡ遺伝子は細胞内に複数コピーが存在することが知られているが、ゲノムＤＮＡの中にそれらの位置に限ってコピー間で複数の配列があるためにこのような現象が見られたと考えられる。このような配列に対してプライマーを設計する場合、例えば、「Ｍ」の位置に対しては、「Ｍ」、「Ａ」、あるいは「Ｃ」として合成させることが出来る。
【００８４】
本発明において「ポリヌクレオチド」とはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。
【００８５】
本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセット等を構成するポリヌクレオチドは、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、検出対象の菌株の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で適宜取得してもよい。
【００８６】
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットは、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種、並びにラクトバチラス・リンドネリのようなラクトバチラス属乳酸菌の検出に用いることができる。ラクトバチラス属乳酸菌の多くは各種飲料（例えば、酒類、特に、ビールおよび発泡酒）を混濁させる原因菌である。従って、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットは、ラクトバチラス属乳酸菌の検出のみならず、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビールおよび発泡酒）の混濁可能性の判定に用いることができる。すなわち、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットにより検出対象菌種が検出された場合には、混濁菌が試料中に存在していると、あるいは試料が混濁する見込みがあると判定することができる。
【００８７】
本発明の別の態様によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、各種飲料中のラクトバチラス乳酸菌の検出方法が提供される。本発明の更に別の態様によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、各種飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。ここで、ハイブリダイゼーションの検出方法は周知であり、その検出のための装置、器具は市販のものを用いることができる。ハイブリダイゼーションの検出は、例えば、ＬＡＭＰ法やＰＣＲ法など周知の核酸増幅法を使用して増幅産物の有無等を検出することにより、あるいはサザンブロット法など周知の核酸検出法を使用してハイブリダイゼーション複合体の有無等を検出することにより、実施することができる。
【００８８】
本発明による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。より具体的には、以下の通りである。
【００８９】
本発明による第一の態様によれば、
（ａ）本発明による第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の存在を示す、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の検出方法が提供される。
【００９０】
本発明による第二の態様によれば、
（ｃ）本発明による第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｄ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の存在を示す、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の検出方法が提供される。
【００９１】
本発明による第三の態様によれば、
（ｅ）本発明による第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｆ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がラクトバチラス・リンドネリの存在を示す、ラクトバチラス・リンドネリの検出方法が提供される。
【００９２】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
【００９３】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応については後述する。
【００９４】
試料中に検出対象菌種が存在する場合には、標的とする特定の領域が増幅され、増幅産物が生成する。増幅産物が生成した場合には、核酸増幅反応が実施された試料溶液が白濁することから、試料溶液の濁度を測定することにより増幅産物の有無を決定することができる。ＬＡＭＰ法における濁度の測定は周知であり、市販のエンドポイント濁度測定装置（例えば、テラメックス社製ＬＡ−１００）やリアルタイム濁度測定装置（例えば、テラメックス社製ＬＡ−２００）を用いて濁度の測定をすることができる。
【００９５】
後記実施例で示すように、試料溶液がある一定の濁度に達するまでの時間を測定することにより、検定試料中の菌体数を決定することができる。すなわち、本発明による検出方法の別の面によれば、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施するとともに、核酸増幅反応の開始から試料がある一定の濁度に達するまでの時間を測定し、その時間から検体中の菌体数を求める工程を含む、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種、およびラクトバチラス・リンドネリの定量方法が提供される。具体的には、以下の通りである。
【００９６】
本発明による第一の態様によれば、
（ａ）本発明による第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；
（ｂ’）核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程；および
（ｂ”）測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の定量方法が提供される。
【００９７】
本発明による第二の態様によれば、
（ｃ）本発明による第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；
（ｄ’）核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程；および
（ｄ”）測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の定量方法が提供される。
【００９８】
本発明による第三の態様によれば、
（ｅ）本発明による第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；
（ｆ’）核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程；および
（ｆ”）測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、ラクトバチラス・リンドネリの定量方法が提供される。
【００９９】
本発明による定量方法においては、菌体数と一定の濁度に達するまでの時間との検量線を予め作成しておき、この検量線に基づいて、測定した時間から検体中の菌体数を求めることができる。検量線は、例えば、菌体を段階的に希釈した試料を準備し、それぞれについてＬＡＭＰ法による核酸増幅法を実施し、菌体のコロニー形成数の対数に対して、核酸増幅反応の開始から濁度が０．１になるまでの時間をプロットすることにより作成することができる。
【０１００】
本発明による検出方法および定量方法においては、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３からなるプライマーセットに、ループプライマー（ＬＦおよび／またはＬＢ）を追加して、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施してもよい。具体的には、本発明による第一の態様の検出方法および定量方法においては、配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、追加し、使用してもよい。本発明による第二の態様の検出方法および定量方法においては、配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドおよび配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドのいずれか一方あるいは両方を、ループプライマーとして、追加し、使用してもよい。
【０１０１】
本発明による検出方法のうちＰＣＲ法による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してＰＣＲ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【０１０２】
より具体的には、
（ｇ）本発明による第一の態様のＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｈ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の存在を示す、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の検出方法が提供される。
【０１０３】
また、
（ｉ）本発明による第二の態様のＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｊ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の存在を示す、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の検出方法が提供される。
【０１０４】
ＰＣＲ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
【０１０５】
ＰＣＲ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＰＣＲ法による核酸増幅反応は周知であり、当業者であればＰＣＲ法およびその改変方法の実施条件等を適宜設定し、ＰＣＲ法を実施することができる。
【０１０６】
本発明による検出方法のうちプローブによる検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対する本発明によるプローブのハイブリダイゼーションを実施した後、核酸複合体の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【０１０７】
より具体的には、
（ｋ）本発明による第一の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｌ）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の存在を示す、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の検出方法が提供される。
【０１０８】
より具体的には、
（ｍ）本発明による第二の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｎ）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の存在を示す、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の検出方法が提供される。
【０１０９】
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射性元素（例えば、３２Ｐおよび１４Ｃ）、蛍光化合物（例えば、ＦＩＴＣ）、酵素反応に関与する分子（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）が挙げられる。
【０１１０】
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション複合体の検出に先立って、未結合プローブやハイブリダイズしないその他の成分を除去してもよい。
【０１１１】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、それぞれ単独で使用しても、適宜組み合わせて使用してもよい。
【０１１２】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、また、単独で、あるいは組み合わせて、キットの形態で提供することができる。従って、本発明によれば、第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；およびこれらの一部または全部の組み合わせからなる群から選択されるプライマーセット含んでなる、ラクトバチラス属乳酸菌の検出キットが提供される。
【０１１３】
ＬＡＭＰ法プライマーセットを含む本発明によるキットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、反応用試薬混合液）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【０１１４】
ＰＣＲ法プライマーセットを含む本発明によるキットは、ＰＣＲ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、精製水）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【０１１５】
本発明によるプライマーセットを用いて核酸増幅反応を実施すると、酒類の品質低下の原因となるラクトバチラス属乳酸菌を正確に識別することができる。従って、本発明によるキットは、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビールおよび発泡酒）の品質管理や、環境試料（例えば、原料用水）の検査に用いることができる。
【０１１６】
ラクトバチラス・コリノイデスとその近縁種、ラクトバチラス・バッキとその近縁種、並びにラクトバチラス・リンドネリは、ビールおよび発泡酒の製造工程あるいは最終製品に、品質劣化の原因乳酸菌種として見いだされることがある。従って、第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；並びにこれらの一部または全部の組み合わせは、好ましくは、ビールおよび発泡酒の品質管理に用いることができる。
【０１１７】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応のプライマーとして用いることができる。本発明によるプライマーセットはまた、ＬＡＭＰ法のみならず、ＬＡＭＰ法を改良した核酸増幅反応のプライマーとしても用いることができる。
【０１１８】
ＬＡＭＰ法の原理およびそれを利用した核酸増幅方法は周知であり、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に当たっては、例えば、ＷＯ００／２８０８２号公報やNotomi T. et al., Nucleic Acids Research, 28(12),e63(2000)の開示を参照することができる。
【０１１９】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キットに従って実施することができるが、例えば、サンプルのＤＮＡ、プライマー溶液、および市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キット（例えば、栄研化学社製Loopamp ＤＮＡ増幅キット）で提供される試薬を、キットに添付されている説明書に従って混合して一定温度（６０〜６５℃）に保ち、一定時間（標準で１時間）反応させることにより実施できる。
【０１２０】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、以下のような工程を経て実施することができる。
（ｉ）鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、ＦＩＰのＦ２領域の３’末端を起点として鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
（ii）ＦＩＰの外側に、Ｆ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されているＦＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（iii）Ｆ３プライマーから合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが二本鎖となる。
（iv）ＦＩＰから先に合成されたＤＮＡ鎖は、Ｆ３プライマーからのＤＮＡ鎖によって剥がされて一本鎖ＤＮＡとなるが、このＤＮＡ鎖は、５’末端側に相補的な領域Ｆ１ｃ、Ｆ１をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
（ｖ）上記（iv）の過程でループを形成したＤＮＡ鎖に対し、ＢＩＰがアニールし、このＢＩＰの３’末端を起点として相補的なＤＮＡが合成される。この過程でループが剥がされて伸びる。さらに、ＢＩＰの外側にＢ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されたＢＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（vi）上記（ｖ）の過程で二本鎖ＤＮＡが形成される。
（vii）上記（ｖ）の過程で剥がされたＢＩＰから合成されたＤＮＡ鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
（viii）上記ダンベル構造のＤＮＡ鎖を起点として、ＦＩＰ次いでＢＩＰのアニ−リングを介して所望ＤＮＡの増幅サイクルが行われる。
【０１２１】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、上記の工程を適宜改変して実施できることは当業者に自明であろう。本発明によるプライマーセットはそのような改変された方法にも用いることができる。
【０１２２】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、約６０〜約６５℃（例えば６５℃）においてアニーリングと同時にＤＮＡ鎖の合成も起こす。アニ−リング反応およびＤＮＡ鎖合成により約１時間反応を行うことにより１０９〜１０１０倍に核酸を増幅させることができる。
【０１２３】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットをＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の条件の下で試料核酸と反応させると、検出対象の菌株のターゲット領域が増幅される。このような増幅反応が起こると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、この濁度に基づき増幅の有無が目視により判定できる。増幅の有無は、濁度測定装置を用いて濁度を光学的に測定してもよく、また、アガロースゲル電気泳動法などを利用してＤＮＡ断片の有無を確認し検出してもよい。
【０１２４】
核酸増幅が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【０１２５】
ＰＣＲ法による核酸増幅反応
本発明によるＰＣＲ法プライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ等の核酸増幅法を利用して、ラクトバチラス属乳酸菌の識別に用いることができる。
【０１２６】
核酸増幅物が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【０１２７】
ＰＣＲ法では、アガロースゲル電気泳動など周知の方法に従って核酸増幅物を検出することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法では、インターカレーターや蛍光標識プローブを使用し、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計とが一体化された装置において、核酸増幅物を経時的に検出することができる。
【０１２８】
検出対象試料とその調製
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類；ラムネ、炭酸水などの清涼飲料；原料用に採取された水等の環境試料；酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
【０１２９】
これらをＬＡＭＰ法やＰＣＲ法の試料として用いる場合には、試料中に存在する菌の濃縮、分離、および培養、菌体からの核酸分離、核酸の濃縮などの操作を前処理として実施してもよい。試料中に存在する菌の濃縮や分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが挙げられ、適宜選択できる。また試料から濃縮、分離した菌を、さらに培養して菌数を増やしてもよい。培養には、対象とする乳酸菌株の増殖に適切な寒天固体培地や液体培地を用いることができ、また対象とする乳酸菌株を選択するためにシクロヘキシミドなどの薬剤を添加してもよい。飲料試料や環境試料などに存在する菌体、あるいは培養した菌体から核酸を遊離させるためには、例えば、市販のキットを使用する方法や、アルカリ溶液などによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法を選択することができる。また、核酸を更に精製する必要があれば、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（European Brewery Convention:ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg、Rolfsら:PCR - Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin, 1992、大嶋泰治ら：蛋白  核酸  酵素， vol. 35, 2523-2541, 1990）。
【０１３０】
本発明によるプライマーセットおよびキットを用いたラクトバチラス属乳酸菌の検出は、例えば、以下のように実施することができる。
【０１３１】
まず、試料中に存在すると考えられるラクトバチラス属乳酸菌を適切な培地で増菌培養する。次いで、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して本発明によるプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法を実施し、ラクトバチラス属乳酸菌の特定遺伝子領域を増幅する。遺伝子増幅産物の存在は検出対象菌種の存在を示す。また、検出対象菌種の存在は、混濁菌が試料中に存在していること、あるいは試料が混濁する見込みを示す。
【実施例】
【０１３２】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１３３】
実施例１：ＬＡＭＰ法プライマーセットによるラクトバチラス属乳酸菌の検出
（ａ）ゲノムＤＮＡ抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この懸濁液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、上澄みを捨てた。沈殿した菌体に再度滅菌蒸留水を添加、懸濁し、遠心分離した。上澄みを捨て、得られた菌体にＰｒｅｐＭａｎ  Ｕｌｔｒａ（アプライドバイオシステムズ社製）の溶液１００μｌを添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１５０００ｒｐｍ、１分間遠心分離し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。あるいは洗浄した菌体に０．１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を１００μｌ添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて中和し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。
【０１３４】
（ｂ）ＬＡＭＰ用プライマー
以下のラクトバチラス属乳酸菌検出用プライマーを、富士通システムソリューションズ社のeGenome Order（http://genome.e-mp.jp/index.html）、あるいはそれと同等の方法で化学合成し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で１００μＭの濃度になるように溶解した。これらの溶液を、ＦＩＰ、ＢＩＰプライマー：１６μＭ、Ｆ３、Ｂ３プライマー：２μＭ、ＬＦ、ＬＢプライマー：８μＭとなるように混合し、希釈した。
【０１３５】
［ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種検出用プライマーセット（ＬＣＮ３ＬＦ１）］
FIP    CCGTTTTCTTACTTGGTTAAGTCCTCGGGAAGTCCAGTGATGGATGG（配列番号１）
F3     TGATCAGGTAGATAGGCTAGAAGT（配列番号２）
BIP    GGTAGGAAAACGATATTATCTAGTTTTGAGAGATCCTTCAGGCTATCGCCA（配列番号３）
B3     TTCGGCATGGGAACAGGT（配列番号４）
LF     ACCGATTAGTACTAGTCCGCT（配列番号５）
【０１３６】
［ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種検出用プライマーセット（ＨＭ６ＬＦ１ＬＢ１）］
FIP    ACGGCACTTCCACTTCCAACTTCCTTTATGGAAGTAAGACCCCT（配列番号７）
F3     CCCGCAAGATTAGATTTCCCA（配列番号８）
BIP    GTCGGAAACAATGTTTCCGCGTAGCTCTCAAAACTGGACCTTCT（配列番号９）
B3     CCACACCACTATCTGAGAACTT（配列番号１０）
LF     CTATCTACCTGATCATCTCTC（配列番号１１）
LB     GTGTTCAAAGGTCAAAGAAAAT（配列番号１２）
【０１３７】
［ラクトバチラス・リンドネリ検出用プライマーセット（ＬＬ１２）］
FIP    GGTCAGATCTATCGTCAAGCTGATGGCCTAAATAACATGCAAGTCGA（配列番号１４）
F3     TCAGGACGAACGTTGGC（配列番号１５）
BIP    AACCTGCCCAGAAGAAGGGGTGGTTCTCGTTGTTATACGGT（配列番号１６）
B3     GAAGCGATAGCATAAAAGCCA（配列番号１７）
【０１３８】
（ｃ）ＬＡＭＰ増幅反応溶液調製
ＬＡＭＰ法のための遺伝子増幅試薬キットとして、栄研化学社製Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅キットを使用した。反応用チューブに、ゲノムＤＮＡ溶液：２．５μｌ、プライマー溶液：２．５μｌ、２倍濃度反応用緩衝液：１２．５μｌ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ：１μｌ、滅菌水：６．５μｌを添加し、全量２５μｌの反応液を調製した。
【０１３９】
（ｄ）ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ反応には、テラメックス社製リアルタイム濁度計ＬＡ−２００、あるいは栄研化学社製ＬＡ−３２０Ｃを使用した。反応チューブをセットし、６５℃一定（ボンネットは７５℃）で反応させ、その間の濁度変化を６秒毎に計測した。濁度が上昇するものを陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。
【０１４０】
（ｅ）プライマーの評価
ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種、並びにラクトバチラス・リンドネリに対して作成したそれぞれの菌種特異的なプライマーについて乳酸菌の各種標準株を使ってＬＡＭＰ法で特異性を評価した。結果は表１〜３に示される通りであった。
【０１４１】
表１：各種乳酸菌標準株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表１】
2008263971.tif 000002
【０１４２】
表２：各種偏性嫌気性菌標準株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表２】
2008263971.tif 000003
【０１４３】
表３：ビール工場分離乳酸菌株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表３】
2008263971.tif 000004
【０１４４】
ＬＣＮ３ＬＦ１を用いた場合はラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種であるラクトバチラス・パラコリノイデス等の菌株に、反応開始６０分以内にＤＮＡ増幅に伴う濁度の上昇が見られた。ＨＭ６ＬＦ１ＬＢ１を用いた場合はラクトバチラス・バッキおよびその近縁種に、反応開始６０分以内にＤＮＡ増幅に伴う濁度の上昇が見られた。ＬＬ１２を用いた場合はラクトバチラス・リンドネリに、反応開始６０分以内にＤＮＡ増幅に伴う濁度の上昇が見られた。
【０１４５】
さらに、ＬＣＮ３ＬＦ１、ＨＭ６ＬＦ１ＬＢ１、ＬＬ１２について、検査対象以外の乳酸菌標準株、偏性嫌気性菌標準株、ビール工場分離乳酸菌を使用して各プライマーの特異性を評価したところ、各プライマーが検査対象にしている株以外からはほとんど増幅が見られなかった。
【０１４６】
以上により、本発明によるプライマーセットは、検査対象とするラクトバチラス属乳酸菌を菌種レベルで正確に検出できることが示された。本発明によるプライマーを用いれば、遺伝子増幅の有無を確認するだけでこれら３種のラクトバチラス属乳酸菌を同定・検出することができる。
【０１４７】
実施例２：特許文献にあるプライマーの評価
（ａ）特許文献のプライマー
土屋らの特許文献（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報）に記載されていた以下のラクトバチラス・ヘキソーサス検出用プライマーセット（ＳＬＨ１）について、実施例１（ｂ）と同様にＬＡＭＰ法用プライマー溶液を調製した。ラクトバチラス・ヘキソーサス検出用プライマーセット（ＳＬＨ１）は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的としており、ラクトバチラス・バッキの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と相同性が高いことから、ラクトバチラス・バッキ近縁種が検出されると考えられる。
【０１４８】
［ラクトバチラス・ヘキソーサス検出用プライマーセット（ＳＬＨ１）］
FIP    TGACCATGTGGTCACTTAAATTACACGTGGGTAACCTACCCAA（配列番号１８）
F3     TGGAGAGTTTGATCCTGGCTC（配列番号１９）
BIP    CACTTAATGAAAGATGYTTCGGCCGTTATCCCACCAACTAGC（配列番号２０）
B3     GCTGCTGGCACGTAGTTAGCC（配列番号２１）
LF     CTGTTTCCTTTTGTTATCCCCCA（配列番号２２）
LB     CTATCACTTTTGGATGGACCC（配列番号２３）
【０１４９】
実施例１（ｃ）および（ｄ）の記載に従って、上記プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により各種菌株の検出を行った。結果は図１に示される通りであった。
【０１５０】
（ｂ）プライマーの評価
その結果、ＳＬＨ１は試験した乳酸菌株のいくつかの菌種と反応し、特異性が低いと考えられた。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の設計に使用された配列の菌種特異性が低く、交差反応したと考えられた。
【０１５１】
実施例３：ＬＡＭＰ法の検出限界
ＬＡＭＰ法の増幅効率を検討するために、ｍ−ＮＢＢ液体培地で培養したラクトバチラス・リンドネリＤＳＭ２０６９２、ラクトバチラス・パラコリノイデスＪＣＭ１１９６９、ラクトバチラス・バッキ近縁種ＢＫ２株の菌体を遠心分離して集菌し、その菌体を滅菌水に懸濁し、段階的に希釈して上記した方法でＤＮＡ抽出し、これをＬＡＭＰ法に供した。その結果、ＬＡＭＰ法では１０２ｃｆｕレベルの少ない菌体量からも増幅が観察された。
【０１５２】
また、菌体の各段階の希釈液から抽出したゲノムＤＮＡを使ったときにＬＡＭＰ反応で濁度が０．１を越えた時間を検出時間として、各プライマーの検出時間とコロニー形成数の対数をグラフにしたところ、累乗近似によりある程度高い相関係数の近似曲線を描くことが出来た（Ｒ２＝０．９６−０．９９）。ＨＭ６ＬＢ１ＬＦ１について得られた近似曲線は図２に示される通りである。また、各プライマーの検出限界と検量線の相関係数との関係は下記に示される通りである。これを検量線とすることにより、１０２−１０７ｃｆｕの範囲で、サンプル中のラクトバチラス属乳酸菌の存在を定量的にある程度推測することが可能であることが示された。
【０１５３】
なお、ラクトバチラス・リンドネリ検出用プライマーセットＬＬ１２では、１０２ｃｆｕレベルの菌体の検出のために約７９分を要した。従って、プライマーセットＬＬ１２を用いて少ない菌体量のラクトバチラス・リンドネリを検出する場合には、判定時間を８０分程度に設定することが好ましい。ＨＭ６ＬＢ１ＬＦ１およびＬＣＮ３ＬＦ１を使用した場合は、１０２ｃｆｕレベルの菌体であっても６０分以内に検出できた。
【０１５４】
［各プライマーの検出限界と検量線の相関係数］
検出限界       検量線近似式    検量線相関係数（Ｒ２）
ＬＣＮ３ＬＦ１      3.4x102 cfu     y = 19792x-2.3525          0.956
ＬＬ１２            3.3x102 cfu     y = 97125x-2.4127          0.996
ＨＭ６ＬＢ１ＬＦ１  1.2x102 cfu     y = 1026.2x-1.5426         0.990
【０１５５】
実施例４：ビールからの検出
ビール製造工程中では、多くの場合、麦汁に下面発酵酵母を多量に添加して発酵させるが、外部から汚染する乳酸菌の菌数は製造用酵母に比べると非常に少ない。ビールに下面発酵酵母を懸濁させた液からの乳酸菌の検出限界について検討した。ｍ−ＮＢＢ固体培地で培養したラクトバチラス・バッキ近縁株ＢＫ２株の菌体を白金耳でかき取り、滅菌水に懸濁後、段階的に希釈して遠心分離し、その菌体にビールに多量の下面発酵酵母を懸濁させた液を添加して懸濁させた。その後、１回集菌洗浄し、実施例１（ａ）に記載した方法でまとめてＤＮＡ抽出し、ＨＭ６ＬＢ１ＬＦ１を使ったＬＡＭＰ法でラクトバチラス・バッキ近縁株ＢＫ２株が検出可能かどうか検討した。その結果、ビールによる反応阻害および下面発酵酵母の存在に関係なく、滅菌水に懸濁した場合とほとんど同じ検出限界（１０２ｃｆｕレベル）でラクトバチラス・バッキ近縁株ＢＫ２株が検出できることがわかった。なお、同様の実験で下面発酵酵母を懸濁していないビールからの検出も検討し、同じ検出限界で検出できることを確認した。
【０１５６】
ラクトバチラス・バッキ近縁株ＢＫ２株の検出限界
ビール＋下面発酵酵母（1 x 107 cells）                      2.1x 102 cfu
【０１５７】
実施例５：菌種特異的配列の特定
ラクトバチラス・バッキ近縁株であるビール工場分離株ＢＫ２株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子全体、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列（配列番号１３）からＰＣＲ法用のプライマーセットを設計し、各種乳酸菌で評価した。
【０１５８】
ＰＣＲ法にはタカラバイオ社製Ｅｘ  Ｔａｑを用いた。ＰＣＲに用いた各プライマーの塩基配列およびプライマーの組み合わせは次の通りである。これらのプライマーを常法により化学合成し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で５０μＭの濃度になるように溶解して使用した。
HMLS#1：CTAAGTTGTGAATACATAGCAGCT（配列番号２４）
HMLS#2：GCAGTTGGAACGCTGCGT（配列番号２５）
HMLS#3：CTGTGGATGATCACGTTAGTGAT（配列番号２６）
HMLS#4：TCTTAGTTTGAGTTAAAGGCTTGA（配列番号２７）
HMLSR#1：TCATTTCTGGGCTTCGCG（配列番号２８）
【０１５９】
セット１：ＨＭＬＳ＃１およびＨＭＬＳＲ＃１（約１７６０ｂｐ）
セット２：ＨＭＬＳ＃２およびＨＭＬＳＲ＃１（約１５７０ｂｐ）
セット３：ＨＭＬＳ＃３およびＨＭＬＳＲ＃１（約７１０ｂｐ）
セット４：ＨＭＬＳ＃４およびＨＭＬＳＲ＃１（約３９０ｂｐ）
（括弧内は予想されるバンドの分子量である。）
【０１６０】
これらの試薬をタカラバイオ社製Ｅｘ  Ｔａｑの説明書に従って混合し（全量５０μｌ）、サーマルサイクラー（アプライドバイシステムズ社製  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９６００）にセットして９４℃・３０秒、５０℃・３０秒、７２℃・２分の温度プログラムを２５回繰り返してＰＣＲ反応を実施した。結果は表４に示される通りであった。
【０１６１】
表４：各種乳酸菌標準株を使ったプライマーの評価（−：増幅なし、＋：予想される大きさのバンドの増幅あり、−＊：非特異的な増幅は見られるが、バンドの大きさで識別可能）
【表４】
2008263971.tif 000005
【０１６２】
その結果、セット１〜４については、ラクトバチラス・バッキ近縁株とラクトバチラス・バッキＤＳＭ１８０８０で予想された分子量のバンドが出現したが、それ以外の菌種の乳酸菌ではバンドは観察されなかった。すなわち、これらのプライマーセットはラクトバチラス・バッキとその近縁株を他の菌種から区別できるプライマーセットであることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】ラクトバチラス・ヘキソーサス検出用プライマーセット（ＳＬＨ１）の検出対象菌種への反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。ラクトコッカス・ラクチスＤＳＭ２０４８１、ペディオコッカス・イノピナタスＤＳＭ２０２８５、ラクトバチラス・フルクチボランスＤＳＭ２０２０３、ＮＢＲＣ１３９５４、ペディオコッカス・パルブルスＩＦＯ１２２３５、ペディオコッカス・ダムノサスＪＣＭ５８８６、ペディオコッカス・アシディラクチシＪＣＭ５８８５、ラクトバチラス・カゼイＪＣＭ１１３４、ラクトバチラス・パラカゼイＪＣＭ１１６３、ラクトバチラス・ラムノサスＮＢＲＣ３４２５、ラクトバチラス・ファーメンタムＤＳＭ２００５２、ラクトバチラス・ブフネリＪＣＭ１１１５、ラクトバチラス・プランタルムＪＣＭ１１４９、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加、ラクトバチラス・バッキ近縁株ＢＫ２。
【図２】ラクトバチラス・バッキ近縁株ＢＫ２株のコロニー形成数とＨＭ６ＬＢ１ＬＦ１によるＬＡＭＰ法検出時間の近似曲線を示した図である。時間（Threshold time:分）は、濁度が０．１を超えたときの反応時間である。
【図１】
2008263971.tif 000006
【図２】
2008263971.tif 000007
【配列表】
2008263971000001.app