(57)【要約】【課題】３−クロロ安息香酸を分解する能力を有する細菌を提供すること。【解決手段】本発明は、３−クロロ安息香酸を分解する能力を有するバークホルデリア属細菌を提供する。本発明の細菌は、土壌中の難分解性芳香族塩素化合物の分解除去に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−クロロ安息香酸を分解する能力を有するバークホルデリア属細菌。
【請求項２】
バークホルデリア属細菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８３８株。
【請求項３】
バークホルデリア属細菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８３９株。
【請求項４】
バークホルデリア属細菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９２株。
【請求項５】
バークホルデリア属細菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９３株。
【請求項６】
バークホルデリア属細菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９４株。
【請求項７】
土壌中の難分解性芳香族塩素化合物を分解除去する方法であって、請求項１から６のいずれかの項に記載の細菌を該土壌に添加する工程を含む、方法。
【請求項８】
前記難分解性芳香族塩素化合物が３−クロロ安息香酸である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−クロロ安息香酸を分解する能力を有する細菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
３−クロロ安息香酸（以下、「３ＣＢ」ともいう）は、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）の中間代謝物として生じ、細菌が有する安息香酸ジオキシゲナーゼによる水酸化反応を経て無機化される。したがって、３ＣＢは、種々の難分解性芳香族塩素化合物のモデル化合物として、その微生物分解がよく研究されている。これまでに多くの３ＣＢ分解細菌が土壌から分離されているが、土壌環境中で実際にどのような細菌群が分解菌として主要な役割を果たしているかは明らかではなかった。
【０００３】
活性汚泥、土壌などの種々の生物種が混合した環境サンプルにおける微生物群集を構成する微生物を同定するためには、培養を経ずに直接核酸を抽出し解析する分子生物学的手法が有効とされる。このような手法として、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（以下、「ＤＧＧＥ」ともいう）法が挙げられる。例えば、特許文献１では、生物性汚泥内に棲息する微生物の核酸の一部を鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」ともいう）によって取得したＤＮＡ断片をＤＧＧＥに適用し、フタル酸化合物の分解時に出現したバンドを決定して、フタル酸化合物を分解する微生物を同定することが記載されている。
【０００４】
本発明者らは、土壌中の３ＣＢ分解菌群を直接検出することを目指し、分解遺伝子を標的としたＰＣＲ−ＤＧＧＥ法の利用を試みた（非特許文献１および２）。安息香酸ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子（ｂｅｎＡ）に基づいて設計したプライマーを用いて、３ＣＢ添加土壌から抽出したＤＮＡを基にしたＰＣＲ−ＤＧＧＥによって、土壌中の微生物群を解析した。この結果、３ＣＢの添加によって新たに出現したバンドは、バークホルデリア（Burkholderia）属の細菌が有するｂｅｎＡに近縁な配列であると推定された（非特許文献１）。また、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に基づいて設計したプライマーを用いてＰＣＲ−ＤＧＧＥによって解析したところ、３ＣＢの添加によって新たに出現した複数のバンドは、いずれもバークホルデリア属の種の微生物に最も近縁であった（非特許文献２）。
【０００５】
しかし、土壌中の３ＣＢ分解に関与すると同定された菌株は、いまだ単離されていない。
【特許文献１】特開２００３−３１９７９８号公報
【非特許文献１】農業環境研究成果情報第２０集−８、「ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法による土壌中のクロロ安息香酸分解菌群の検出」（平成１６年３月発行）
【非特許文献２】Morimoto, S.ら、Microbes and Environments, 2005年, 20巻, 3号, 151-159頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、３−クロロ安息香酸を分解する能力を有する細菌を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、３−クロロ安息香酸を分解する能力を有するバークホルデリア属細菌を提供する。
【０００８】
本発明はまた、バークホルデリア属細菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８３８株を提供する。
【０００９】
本発明はまた、バークホルデリア属細菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８３９株を提供する。
【００１０】
本発明はまた、バークホルデリア属細菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９２株を提供する。
【００１１】
本発明はまた、バークホルデリア属細菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９３株を提供する。
【００１２】
本発明はまた、バークホルデリア属細菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９４株を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、土壌中の難分解性芳香族塩素化合物を分解除去する方法を提供し、該方法は、上記のいずれかの細菌を該土壌に添加する工程を含む。
【００１４】
１つの実施形態では、上記難分解性芳香族塩素化合物は３−クロロ安息香酸である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、３−クロロ安息香酸を分解する能力を有する細菌が提供される。この細菌は、土壌中の難分解性芳香族塩素化合物の分解除去に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、３−クロロ安息香酸を分解する能力を有するバークホルデリア属細菌を提供する（以下、「３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌」ともいう）。本発明の３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌は、３ＣＢを繰り返し添加することによって選択圧を高めた土壌から分離し、そして３ＣＢ汚染土壌におけるそれらの３ＣＢ分解能を検証したことによって、初めて単離同定された細菌である。
【００１７】
３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌としては、バークホルデリアｓｐ．ＡＳＳ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８３８）株、バークホルデリアｓｐ．ＡＳＳ７（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８３９）株、バークホルデリアｓｐ．ＡＳＳ８（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９２）株、バークホルデリアｓｐ．ＡＳＳ１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９３）株、およびバークホルデリアｓｐ．ＡＳＳ１４（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９４）株が挙げられる。
【００１８】
バークホルデリアｓｐ．ＡＳＳ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８３８）株の菌学的性質は以下の通りである。
【００１９】
（ａ）形態学的性質：
（１）細胞の形および大きさ：桿菌（0.8−1.0×1.5−2.0μm）
（２）胞子有無：−
（３）運動性：＋
（ｂ）培養的性質：ニュートリエント寒天（Nutrient Agar）培地で３０℃−４８hr培養後のコロニー形態
（１）形態：円形レンズ状
（２）色：不透明クリーム色
（３）表面形状：スムーズ
（４）直径：１．０ｍｍ
（５）粘稠度：バター様
（ｃ）生理学的性質：
（１）グラム染色性：−
（２）カタラーゼ反応：＋
（３）オキシダーゼ反応：＋(弱い）
（４）グルコースからの酸／ガス産生：−／−
（５）Ｏ／Ｆテスト：−／−
（６）チトクロームオキシダーゼ：＋
（７）硝酸塩還元：＋
（８）インドール産生：−
（９）アルギニンジヒドロラーゼ：−
（１０）ウレアーゼ：−
（１１）エスクリン加水分解：−
（１２）ゼラチン加水分解：−
（１３）β−ガラクトシダーゼ：＋
（１４）基質資化能
グルコース：＋
Ｌ−アラビノース：＋
Ｄ−マンニトール：＋
Ｄ−マンノース：＋
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：＋
マルトース：−
グルコン酸カリウム：＋
ｎ−カプリン酸：−
アジピン酸：−
ｄｌ−リンゴ酸：＋
クエン酸ナトリウム：−
酢酸フェニル：＋
（１５）３ＣＢ資化能：＋。
【００２０】
１６ＳリボソームＤＮＡの系統解析から、Burkholderia tuberum STM678が最近縁株であった（相同率９８．０％）。この系統解析は、ＢＬＡＳＴ相同性検索およびClustal W（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/clustalw-j.html）を使用した系統樹作成に基づく。
【００２１】
本菌株は、バークホルデリア属に属する新種の細菌（Burkholderia sp.）であると考えられ、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、平成１８年３月９日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８３８が付与された。
【００２２】
ＡＳＳ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８３８）株は、常温で生育可能であり、好ましくは２５〜３０℃である。ＡＳＳ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８３８）株は、生育可能な温度範囲であれば、３ＣＢ分解能を発揮できる。
【００２３】
ＡＳＳ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８３８）株は、ｐＨ７．２の液体培養条件で生育および３ＣＢ分解能の発現が確認されている。
【００２４】
培地としては、Tryptic Soy Broth、ニュートリエント寒天培地、ＳＣＤ寒天平板培地などの一般細菌用培地にて生育可能である。
【００２５】
バークホルデリアｓｐ．ＡＳＳ７（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８３９）株の菌学的性質は以下の通りである。
【００２６】
（ａ）形態学的性質：
（１）細胞の形および大きさ：桿菌（0.7−0.8×1.0−1.5μm）
（２）胞子有無：−
（３）運動性：−
（ｂ）培養的性質：ＳＣＤ寒天培地で３０℃−４８hr培養後のコロニー形態
（１）形態：円形レンズ状
（２）色：半透明クリーム色
（３）表面形状：スムーズ
（４）直径：１．０ｍｍ
（５）粘稠度：バター様
（ｃ）生理学的性質：
（１）グラム染色性：−
（２）カタラーゼ反応：＋
（３）オキシダーゼ反応：＋(弱い）
（４）グルコースからの酸／ガス産生：−／−
（５）Ｏ／Ｆテスト：−／−
（６）チトクロームオキシダーゼ：＋
（７）硝酸塩還元：＋
（８）インドール産生：−
（９）アルギニンジヒドロラーゼ：−
（１０）ウレアーゼ：−
（１１）エスクリン加水分解：−
（１２）ゼラチン加水分解：−
（１３）β−ガラクトシダーゼ：＋
（１４）基質資化能
グルコース：＋
Ｌ−アラビノース：＋
Ｄ−マンニトール：＋
Ｄ−マンノース：＋
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：＋
マルトース：−
グルコン酸カリウム：＋
ｎ−カプリン酸：−
アジピン酸：−
ｄｌ−リンゴ酸：＋
クエン酸ナトリウム：−
酢酸フェニル：＋
（１５）３ＣＢ資化能：＋。
【００２７】
１６ＳリボソームＤＮＡの系統解析から、本菌株は、Burkholderia tuberum STM678が最近縁株であった（相同率９７．１％）。系統解析は、上記の通りである。
【００２８】
本菌株は、バークホルデリア属に属する新種の細菌（Burkholderia sp.）であると考えられ、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、平成１８年３月９日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８３９が付与された。
【００２９】
ＡＳＳ７（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８３９）株は、常温で生育可能であり、好ましくは２５〜３０℃である。ＡＳＳ７（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８３９）株は、生育可能な温度範囲であれば、３ＣＢ分解能を発揮できる。
【００３０】
ＡＳＳ７（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８３９）株は、ｐＨ７．２の液体培養条件で生育および３ＣＢ分解能の発現が確認されている。
【００３１】
培地としては、Tryptic Soy Broth、ニュートリエント寒天培地、ＳＣＤ寒天平板培地などの一般細菌用培地にて生育可能である。
【００３２】
バークホルデリアｓｐ．ＡＳＳ８（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９２）株の菌学的性質は以下の通りである。
【００３３】
（ａ）形態学的性質：
（１）細胞の形および大きさ：桿菌（0.7−0.8×1.0−1.2μm）
（２）胞子有無：−
（３）運動性：＋
（ｂ）培養的性質：ニュートリエント寒天（Nutrient Agar）培地で３０℃−４８hr培養後のコロニー形態
（１）形態：円形レンズ状
（２）色：不透明クリーム色
（３）表面形状：スムーズ
（４）直径：１．０ｍｍ
（５）粘稠度：バター様
（ｃ）生理学的性質：
（１）グラム染色性：−
（２）カタラーゼ反応：＋
（３）オキシダーゼ反応：＋(弱い）
（４）グルコースからの酸／ガス産生：−／−
（５）Ｏ／Ｆテスト：−／−
（６）チトクロームオキシダーゼ：＋
（７）硝酸塩還元：＋
（８）インドール産生：−
（９）アルギニンジヒドロラーゼ：−
（１０）ウレアーゼ：−
（１１）エスクリン加水分解：−
（１２）ゼラチン加水分解：−
（１３）β−ガラクトシダーゼ：＋
（１４）基質資化能
グルコース：＋
Ｌ−アラビノース：＋
Ｄ−マンニトール：＋
Ｄ−マンノース：＋
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：＋
マルトース：−
グルコン酸カリウム：＋
ｎ−カプリン酸：−
アジピン酸：−
ｄｌ−リンゴ酸：＋
クエン酸ナトリウム：−
酢酸フェニル：＋
（１５）３ＣＢ資化能：＋。
【００３４】
１６ＳリボソームＤＮＡの系統解析から、Burkholderia caribensis MWAP64が最近縁株であった（相同率９８．５％）。系統解析は、上記の通りである。
【００３５】
本菌株は、バークホルデリア属に属する新種の細菌（Burkholderia sp.）であると考えられ、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、平成１８年２月１０日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９２が付与された。
【００３６】
ＡＳＳ８（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９２）株は、常温で生育可能であり、好ましくは２５〜３０℃である。ＡＳＳ８（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９２）株は、生育可能な温度範囲であれば、３ＣＢ分解能を発揮できる。
【００３７】
ＡＳＳ８（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９２）株は、ｐＨ７．２の液体培養条件で生育および３ＣＢ分解能の発現が確認されている。
【００３８】
培地としては、Tryptic Soy Broth、ニュートリエント寒天培地、ＳＣＤ寒天平板培地などの一般細菌用培地にて生育可能である。
【００３９】
バークホルデリアｓｐ．ＡＳＳ１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９３）株の菌学的性質は以下の通りである。
【００４０】
（ａ）形態学的性質：
（１）細胞の形および大きさ：桿菌（0.7−0.8×1.5−2.5μm）
（２）胞子有無：−
（３）運動性：＋
（ｂ）培養的性質：ニュートリエント寒天（Nutrient Agar）培地で３０℃−４８hr培養後のコロニー形態
（１）形態：円形レンズ状
（２）色：不透明クリーム色
（３）表面形状：スムーズ
（４）直径：１．０ｍｍ
（５）粘稠度：バター様
（ｃ）生理学的性質：
（１）グラム染色性：−
（２）カタラーゼ反応：＋
（３）オキシダーゼ反応：＋(弱い）
（４）グルコースからの酸／ガス産生：−／−
（５）Ｏ／Ｆテスト：−／−
（６）チトクロームオキシダーゼ：＋
（７）硝酸塩還元：＋
（８）インドール産生：−
（９）アルギニンジヒドロラーゼ：−
（１０）ウレアーゼ：−
（１１）エスクリン加水分解：−
（１２）ゼラチン加水分解：−
（１３）β−ガラクトシダーゼ：＋
（１４）基質資化能
グルコース：＋
Ｌ−アラビノース：＋
Ｄ−マンニトール：＋
Ｄ−マンノース：＋
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：＋
マルトース：−
グルコン酸カリウム：＋
ｎ−カプリン酸：−
アジピン酸：−
ｄｌ−リンゴ酸：＋
クエン酸ナトリウム：−
酢酸フェニル：＋
（１５）３ＣＢ資化能：＋。
【００４１】
１６ＳリボソームＤＮＡの系統解析から、Burkholderia tuberum STM678が最近縁株であった（相同率９７．４％）。系統解析は、上記の通りである。
【００４２】
本菌株は、バークホルデリア属に属する新種の細菌（Burkholderia sp.）であると考えられ、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、平成１８年２月１０日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９３が付与された。
【００４３】
ＡＳＳ１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９３）株は、常温で生育可能であり、好ましくは２５〜３０℃である。ＡＳＳ１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９３）株は、生育可能な温度範囲であれば、３ＣＢ分解能を発揮できる。
【００４４】
ＡＳＳ１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９３）株は、ｐＨ７．２の液体培養条件で生育および３ＣＢ分解能の発現が確認されている。
【００４５】
培地としては、Tryptic Soy Broth、ニュートリエント寒天培地、ＳＣＤ寒天平板培地などの一般細菌用培地にて生育可能である。
【００４６】
バークホルデリアｓｐ．ＡＳＳ１４（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９４）株の菌学的性質は以下の通りである。
【００４７】
（ａ）形態学的性質：
（１）細胞の形および大きさ：桿菌（0.6−0.7×0.8−0.9μm）
（２）胞子有無：−
（３）運動性：＋
（ｂ）培養的性質：ＳＣＤ寒天培地で３０℃−４８hr培養後のコロニー形態
（１）形態：円形レンズ状
（２）色：不透明クリーム色
（３）表面形状：スムーズ
（４）直径：１．０−２．０ｍｍ
（５）粘稠度：バター様
（ｃ）生理学的性質：
（１）グラム染色性：−
（２）カタラーゼ反応：＋
（３）オキシダーゼ反応：−
（４）グルコースからの酸／ガス産生：−／−
（５）Ｏ／Ｆテスト：−／−
（６）チトクロームオキシダーゼ：−
（７）硝酸塩還元：＋
（８）インドール産生：−
（９）アルギニンジヒドロラーゼ：−
（１０）ウレアーゼ：−
（１１）エスクリン加水分解：−
（１２）ゼラチン加水分解：−
（１３）β−ガラクトシダーゼ：＋
（１４）基質資化能
グルコース：＋
Ｌ−アラビノース：＋
Ｄ−マンニトール：＋
Ｄ−マンノース：＋
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：＋
マルトース：−
グルコン酸カリウム：＋
ｎ−カプリン酸：−
アジピン酸：−
ｄｌ−リンゴ酸：＋
クエン酸ナトリウム：−
酢酸フェニル：＋
（１５）３ＣＢ資化能：＋。
【００４８】
１６ＳリボソームＤＮＡの系統解析から、Burkholderia phymatum STM815が最近縁株であった（相同率９８．８％）。系統解析は、上記の通りである。
【００４９】
本菌株は、バークホルデリア属に属する新種の細菌（Burkholderia sp.）であると考えられ、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、平成１８年２月１０日に受託番号ＦＥＲＭ  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９４が付与された。
【００５０】
ＡＳＳ１４（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９４）株は、常温で生育可能であり、好ましくは２５〜３０℃である。ＡＳＳ１４（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９４）株は、生育可能な温度範囲であれば、３ＣＢ分解能を発揮できる。
【００５１】
ＡＳＳ１４（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９４）株は、ｐＨ７．２の液体培養条件で生育および３ＣＢ分解能の発現が確認されている。
【００５２】
培地としては、Tryptic Soy Broth、ニュートリエント寒天培地、ＳＣＤ寒天平板培地などの一般細菌用培地にて生育可能である。
【００５３】
上記３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌は、土壌中の難分解性芳香族化合物（例えば、３ＣＢ）の代謝分解に有用である。難分解性芳香族化合物を含む土壌に該細菌株を添加することにより、土壌中の難分解性芳香族化合物の分解除去が促進され得る。
【００５４】
上記３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌が難分解性芳香族化合物を分解除去するように該３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌を培養する条件は、上述したような培養条件が用いられ得る。例えば、培地としては、グルコース、デンプン、スクロースなどの炭素源、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、酵母エキス、ペプトンなどの窒素源を含有し、好ましくは、リン酸カリウム、硝酸マグネシウム、塩化カルシウムなどの無機塩類、微量金属類、アミノ酸類、ビタミン類などの微量成分を含有する培地が用いられ得る。静置培養、振盪培養、通気培養、通気撹拌培養などの各種培養条件を用いて培養を行い得る。ここで、培養の最適条件に関しては、用いる３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌株により異なるので、上記培地および培養方法は、用いる３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌株に適するものに適宜選択および調整され得る。培養を行うために、温度、ｐＨ、培養期間などの他の培養条件も適宜選択され得る。また、上記３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌は固体培養を行ってもよいし、液体培養を行ってもよい。
【００５５】
上記３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌は、その培養液のまま使用してもよいし、培養液を濾過、遠心分離、もしくは抽出などの精製処理を行って使用してもよいし、または培養液を水などで希釈して使用してもよい。
【００５６】
上記３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌は、汚染土壌の表面に散布する方法、注入管のような手段を通じて土壌中に注入する方法などにより汚染土壌に添加して作用させることができる。さらにまた、上記３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌を不織布などに接種したものを汚染土壌上に静置して作用させてもよい。また、上記３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌は、それぞれの菌株を単独で作用させてもよいし、または適切に組み合わせて作用させてもよい。
【００５７】
添加される上記３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌の量は、３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌の種類、汚染土壌の汚染の程度を考慮して、望ましい浄化の結果が得られるように決定し得る。さらに、汚染土壌の浄化をさらに効率的に行うために、上記３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌と共に他の追加成分を使用してもよく、そのような追加成分としては、３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌の増殖を促進する培養液、グルコース溶液、リノール酸またはリノレン酸などの不飽和脂肪酸、アミノ酸、硫酸マンガンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明の３ＣＢ分解バークホルデリア属細菌は、土壌中の難分解性芳香族化合物の分解除去のために、ＰＣＢから３ＣＢまで分解可能な微生物とさらに組み合わせて用いられ得る。
【実施例】
【００５９】
（実施例１．土壌細菌群のＰＣＲ−ＤＧＧＥ解析）
つくば市の自然林から採取した黒ボク土壌３００ｇに３−クロロ安息香酸（３ＣＢ）を５００ｍｇ／ｋｇの濃度で加え、人工汚染土壌（含水率４０％）を作製した。土壌を９００ｍＬ容量のガラスバイアル中で２８℃にて静置培養した。コントロールとして、上記人工汚染土壌をオートクレーブで滅菌したものを用いた。培養の間、土壌中の３ＣＢ濃度を１週間ごとに測定した。３ＣＢ濃度の測定は、土壌試料２ｇに１８ｍＬの０．０２５Ｍ  ＮａＯＨを加え１時間振盪抽出した溶液をＨＰＬＣ分析することによって行なった。
【００６０】
図１に、これらの土壌中の３ＣＢ濃度の経時変化を示す。生土壌（オートクレーブ滅菌していない）の結果を黒丸で表し、オートクレーブ滅菌した土壌の結果を白丸で表す。滅菌土中の３ＣＢ濃度が４００ｍｇ／ｋｇからあまり低下しないのに対し、生土壌では、培養開始から２１日後に３ＣＢがほぼ消失した。この時点で、同量の３ＣＢを生土壌に再添加したところ、培養開始から３５日後に３ＣＢがほぼ消失した。さらに３ＣＢを添加した後、３８日後には３ＣＢがほぼ消失した。
【００６１】
図１の結果から、供試した土壌には生物的要因による３ＣＢ分解活性があることが分かる。また、３ＣＢの反復添加によって、当初約３週間を要した分解時間が３日以下にまで短縮された。
【００６２】
一方、培養期間中に土壌中で優占化する細菌群を調べるために、１週間ごとに土壌ＤＮＡを抽出し、細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡを標的としたＰＣＲ−ＤＧＧＥ解析を行なった。以下にその詳細を示す。
【００６３】
土壌からのＤＮＡ抽出には、Q-BIOgene社製のFastDNA SPIN Kit for SoilおよびFastPrep FP120を使用し、上記のオートクレーブ滅菌していない土壌試料０．４ｇから８０μＬのＤＮＡ溶液を調製した。
【００６４】
得られたＤＮＡ溶液をZYMO RESEARCH社製のDNA Clean & Concentrator Kitを用いて精製し、１μＬの試料をＰＣＲに供した。ＰＣＲには、TOYOBO社製のＤＮＡポリメラーゼKOD-Plusと、真正細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡのＶ３−Ｖ５領域を増幅するプライマーGC-338f（配列番号１）および907r（配列番号２）とを用いた。使用したＰＣＲの反応条件は、以下の通りである：９４℃−２分、（９４℃−３０秒、５０℃−３０秒、６８℃−３０秒）×３５サイクル、６８℃−１分。
【００６５】
得られたＰＣＲ産物をMO BIO社製のUltraClean PCR Clean-up Kitで精製し、各６μＬ（ＤＮＡ約３００〜４００ｎｇに相当）をＤＧＧＥに供した。ＤＧＧＥには、BIO RAD社製のD-Codeを使用し、変性勾配４５％−６５％、ゲル濃度６％、電圧６５Ｖ、温度６０℃の条件で２１時間泳動した。ゲルをSYBR Green Iで染色し、BIO RAD社製のMolecular Imager FXを用いて泳動像を可視化した（図２）。図２は、３ＣＢ添加土壌（オートクレーブ滅菌していない）におけるＰＣＲ−ＤＧＧＥパターンの電気泳動写真である。各レーンの上方の数字は、３ＣＢ濃度測定の開始後の日数である。この電気泳動写真では、５本のバンドが、３ＣＢの添加に伴って強く現れた（優勢化）。
【００６６】
これらの５本のバンドについて、ＵＶイルミネーター上で視認しながらゲルから切り出した。切り出したゲル片を滅菌蒸留水で洗浄し、その小片（１ｍｍ３以下）を直接鋳型として再度上記のＰＣＲを行なった。得られた増幅産物を再びＤＧＧＥに供し、切り出したバンドと同じＤＮＡ断片が回収できていることを確認し、アプライドバイオシステムズ社製のBigDye Terminator ver.3およびABI PRISM 3100 Genetic Analyzerを使用したダイレクトシークエンシングにより塩基配列を決定した。
【００６７】
（実施例２．細菌の分離）
上記実施例１の３ＣＢ反復添加土壌から培養３８日目に５ｇの土壌試料を採取し、希釈平板法によって細菌の分離を行なった。
【００６８】
具体的には、上記土壌試料をｐＨ６．８の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で１０−６倍に段階希釈し、懸濁液を得た。この懸濁液１００μＬを土壌煎汁寒天培地（３ＣＢを５００ｐｐｍ含有）に塗布し、２８℃で１０日間培養し、生育したコロニーを単離および収集した。ここで用いた土壌煎汁培地の組成は、以下の通りである（単位は１Ｌ当たり）：土壌煎汁９９０ｍＬ；Ｋ２ＨＰＯ４  ０．２ｇ；Bacto Agar  ２０ｇ；および３ＣＢ溶液（５０ｇ／Ｌ）１０ｍＬ。これらを１２１℃にて２０分間オートクレーブして使用した。土壌煎汁は、自然林土壌に５倍量の蒸留水を加え１２１℃にて２０分間加熱した後、濾液をＫＯＨでｐＨ６．８に調整したものである。
【００６９】
収集した菌株からGentra社製のCell and Tissue Kitを使用して全ＤＮＡを抽出し、実施例１と同様にしてＰＣＲ−ＤＧＧＥ解析を行なった。この結果、ＡＳＳ３、ＡＳＳ７、ＡＳＳ８、ＡＳＳ１１、およびＡＳＳ１４の５菌株が、３ＣＢ反復添加土壌で優勢化したＤＧＧＥバンドと同じ位置にバンドを形成した（一致したバンドについては図２中に示す）。これらの単離株について、シークエンシングを行い、塩基配列を照合した。その結果、これらの単離株が、３ＣＢ反復添加土壌優勢化バンドと同じ１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有することが確かめられた。
【００７０】
（実施例３．土壌接種実験による３ＣＢ分解能評価）
上記実施例２で得られた５菌株（ＡＳＳ３、ＡＳＳ７、ＡＳＳ８、ＡＳＳ１１、およびＡＳＳ１４）を、５００ｐｐｍの３ＣＢを含む１／１０強度のTryptic Soy Broth（ベクトン・ディッキンソン社製）にそれぞれ植菌し、振盪培養（１８０ｒｐｍ−２８℃）した。対数増殖期後期に達した培養液から菌体を遠心分離し、リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ６．８）で１回洗浄し、同緩衝液に再懸濁し、ＯＤ６００＝０．４の菌体懸濁液を調製した。
【００７１】
続いて、上記実施例１と同様にして３ＣＢ人工汚染土壌を一菌株につき９５ｇ調製した。土壌をガラスバイアル（４５０ｍＬ容量）に詰め、菌体懸濁液５ｍＬを接種して十分混和した。これを２８℃で静置培養し、３ＣＢ濃度の変化を調べた。コントロールとして、リン酸緩衝液のみを加えた無接種土壌（「生土」）およびオートクレーブ滅菌（１２１℃−６０分）した無接種土壌（「滅菌土」）を用いた。一方、接種菌株が速やかに土壌中に定着するかどうかを調べるために、上記実施例１と同様にして、接種直後および３日後の各土壌からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ解析を行なった。これらの結果を図３に示す。
【００７２】
図３は、各株を接種した土壌中の３ＣＢ濃度変化およびＰＣＲ−ＤＧＧＥパターンを示す。なお、３ＣＢ濃度変化のグラフの縦軸は、土壌中の３ＣＢ濃度（ｍｇ／ｋｇ）を表す。いずれの菌株においても、菌株を接種した土壌では、無接種（滅菌土）および無接種（生土）に比べて土壌中の３ＣＢ濃度を顕著に低下させた。一方、接種３日後には、いずれの菌株においても、バンド（矢印で示す）が優勢化した。したがって、上記の５菌株は、土壌中で速やかに増殖し、３ＣＢ分解能を示したことが分かった。
【００７３】
（実施例４：菌株の性状の決定）
１．菌株の性状についての評価
上記実施例で得られた各菌株の性状を決定するために、菌体をＳＣＤ寒天平板培地（ベクトン・ディッキンソン社製：ＡＳＳ７、ＡＳＳ１４）またはニュートリエント寒天平板培地（オキソイド社製：ＡＳＳ３、ＡＳＳ８、ＡＳＳ１１）上で３０℃にて４８時間培養し、以下の分析に用いた。
【００７４】
１−１．１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列解析
菌体からのゲノムＤＮＡの抽出には、InstaGene Matrix（BIO RAD社製）を使用した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）の全塩基配列をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲには、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社製）とプライマー９Ｆ（配列番号３）および１５１０Ｒ（配列番号４）を使用した。得られたＰＣＲ産物を、アプライドバイオシステムズ社製のBigDye Terminator ver.3.1およびABI PRISM 3100 Genetic Analyzerを使用したダイレクトシークエンシングに供した。得られた１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列についてＢＬＡＳＴによる相同性検索を行い、データベースから最近縁株を検索した。
【００７５】
さらに、各株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に基づいて系統樹を作成した。系統樹作成のためのアライメントおよび計算には、Clustal W（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/clustalw-j.html）を使用した。
【００７６】
１−２．生理または生化学性状試験
上記培養後、培地上でのコロニー形態を観察した。光学顕微鏡下で、細胞形態、グラム染色性、胞子の有無、鞭毛による運動性の有無を調べた。また、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス産生、ブドウ糖の酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）について試験するとともに、ＡＰＩキット（bioMerieux社製，http://www.biomerieux.com）による生理または生化学的検定を行なった。
【００７７】
３ＣＢの資化能を確認するために、３ＣＢ（５００ｐｐｍ）を唯一の炭素源として含む基礎塩類寒天培地に植菌して２８℃で培養し、生育の可否を調べた。
【００７８】
３ＣＢ添加基礎塩類寒天培地の組成は、以下の通りである（単位は１Ｌ当たり）：精製寒天２０ｇ、蒸留水８７０ｍＬ、塩類ストック溶液Ｉ  １００ｍＬ、塩類ストック溶液II  １０ｍＬ、塩類ストック溶液III  １０ｍＬ、および３ＣＢ溶液（５０ｇ／Ｌ）１０ｍＬ。精製寒天および蒸留水をオートクレーブにかけた後５０〜６０℃に冷まし、塩類ストック溶液Ｉ、塩類ストック溶液II、塩類ストック溶液III、および３ＣＢ溶液を無菌的に添加した。塩類ストック溶液Ｉは、１０００ｍＬの蒸留水中に（ＮＨ４）２ＳＯ４  １１ｇ／Ｌ；Ｋ２ＨＰＯ４  ２２．９ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４  ９ｇ／Ｌを有し、塩類ストック溶液IIは、１０００ｍＬの蒸留水中にＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｇ／Ｌ；ＭｎＳＯ４・４−６Ｈ２Ｏ  ２．５ｇ／Ｌを有し、そして塩類ストック溶液IIIは、１０００ｍＬの蒸留水中にＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ／Ｌ；Ｌ−アスコルビン酸０．５ｇ／Ｌを有する。塩類ストック溶液Ｉおよび塩類ストック溶液IIはオートクレーブにかけ、そして塩類ストック溶液IIIは、濾過滅菌（０．２μｍ）により、それぞれ滅菌した。
【００７９】
２．各菌株の性状
上記１．の方法によって調べた５菌株の性状を表１から表５に示す。また、作成した系統樹を図４に示す。図４中の「０．０２」は、塩基配列の置換率を示す。
【００８０】
【表１】
2008048606.tif 000002
【００８１】
【表２】
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【００８２】
【表３】
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【００８３】
【表４】
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【００８４】
【表５】
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【００８５】
以上の結果より、これらの菌株はいずれも、バークホルデリア属に属する新種の細菌（Burkholderia sp.）であり、そして３ＣＢ資化能を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の細菌は、３−クロロ安息香酸で汚染された土壌中で３−クロロ安息香酸を効果的に分解除去し得る。さらに、本発明の細菌は、毒性のために社会的に問題となっているＰＣＢで汚染された土壌の浄化に有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】人工汚染した生土壌およびオートクレーブ滅菌土壌中の３ＣＢ濃度の経時変化を示すグラフである。
【図２】３ＣＢ添加生土壌におけるＰＣＲ−ＤＧＧＥパターンの電気泳動写真である。
【図３】ＡＳＳ３、ＡＳＳ７、ＡＳＳ８、ＡＳＳ１１、およびＡＳＳ１４の各菌株を接種した土壌中の３ＣＢ濃度の経時変化を示すグラフおよび該土壌におけるＰＣＲ−ＤＧＧＥパターンの電気泳動写真を並べた図である。
【図４】ＡＳＳ３、ＡＳＳ７、ＡＳＳ８、ＡＳＳ１１、およびＡＳＳ１４の分類位置を表す系統樹を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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