(57)【要約】【課題】保存安定性に優れる生理活性物質を固定した基板を提供すること。【解決手段】生理活性物質を、親水性高分子から形成される親水性高分子層を介して固定した基板に、平均分子量が３５０より大きく５００万より小さく、且つ、水素結合を形成しうる残基を有する化合物（以下、化合物Ｓとする）を上記基板に含有させることより生理活性物質の安定性を向上させた基板を提供できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面に、親水性高分子から形成される親水性高分子層を介して固定した生理活性物質と、平均分子量が３５０より大きく５００万より小さく、且つ、水素結合を形成しうる残基を有する化合物（化合物Ｓ）とを有する基板。
【請求項２】
化合物Ｓの平均分子量が１２００以上７万以下である、請求項１に記載の基板。
【請求項３】
化合物Ｓがｎ糖類である請求項１又は請求項２に記載の基板。
【請求項４】
ｎ糖類のｎが２０以上６００以下である請求項１から請求項３の何れか１項に記載の基板。
【請求項５】
化合物Ｓがデキストラン骨格を有し、且つ、平均分子量が１万以上２００万以下である請求項１から請求項４の何れか１項に記載の基板。
【請求項６】
化合物Ｓがノニオン性化合物である請求項１又は２に記載の基板。
【請求項７】
化合物Ｓがポリエチレンオキシド骨格を有する請求項１に記載の基板。
【請求項８】
生理活性物質が蛋白質である請求項１に記載の基板。
【請求項９】
蛋白質がプロテインＡ、プロテインＧ、アビジン類、カルモデュリン、又は抗体である請求項８に記載の基板。
【請求項１０】
生理活性物質を含む層の上に前記化合物Ｓを含む層を有している請求項１から請求項９のいずれか1項に記載の基板。
【請求項１１】
親水性高分子層を形成する親水性高分子の骨格と、化合物Ｓの骨格が実質同一である請求項１から請求項１０の何れか1項に記載の基板。
【請求項１２】
親水性高分子層を形成する親水性高分子の平均分子量に対する、化合物Ｓの平均分子量の割合が０．００５以上０．２以下である請求項１から請求項１１の何れか１項に記載の基板。
【請求項１３】
生理活性物質が親水性高分子層に共有結合で固定されている請求項１から請求項１２の何れか１項に記載の基板。
【請求項１４】
親水性高分子層を形成する親水性高分子を活性化することにより生理活性物質を固定する、請求項１から請求項１３の何れか１項に記載の基板。
【請求項１５】
基材が金属膜を有し、下記一般式Ａ-１で表される自己組織化膜形成分子を介して親水性高分子層が金属膜に結合している、請求項１に記載の基板。
【化１】
2008185494.tif 000021
【請求項１６】
基材の屈折率が１．４以上１．７以下である請求項１５に記載の基板。
【請求項１７】
非電気化学的検出に使用される請求項１から請求項１６の何れか１項に記載の基板。
【請求項１８】
表面プラズモン共鳴分析に使用される請求項１から請求項１７の何れか１項に記載の基板。
【請求項１９】
請求項１から請求項１８の何れか１項に記載の基板を含むセンサーユニット。
【請求項２０】
請求項１９に記載のセンサーユニットを含むセンサー装置。
【請求項２１】
基板表面の親水性高分子層に、生理活性物質を含む溶液を接触、乾燥させることによって固定する工程と、生理活性物質を固定化した後、化合物Ｓの水溶液を接触させる工程を含む基板の製造方法。
【請求項２２】
生理活性物質を含む溶液の濃度が０.１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬである請求項２１に記載の基板の製造方法。
【請求項２３】
化合物Ｓを含む溶液の該化合物濃度が０.１重量％以上５重量％以下である請求項２１又は請求項２２に記載の基板の製造方法。
【請求項２４】
デキストラン骨格又はポリエチレンオキシド骨格を有し、且つ、平均分子量が１２００以上７万以下の化合物を含む、生理活性物質の失活抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、保存安定性に優れる生理活性物質を固定化した基板に関し、より詳細には、生理活性物質を固定化した基板に失活を抑制する効果のある化合物を添加することにより、生理活性物質の安定性を向上させた基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析するため、生理活性物質を固定化する表面が重要である。
【０００４】
生理活性物質は基板表面に、共有結合、リガンド結合、イオン結合、物理吸着、包括法などで固定されていたが、基板表面上の生理活性物質は、経過時間に伴って劣化し、特異的な結合反応が低下するという問題があった。このような経時的な劣化は種々の要因が複合的に絡んで生じると考えられるが、乾燥状態にある場合に特に顕著に現れる。よって、乾燥を防ぐため、生理活性物質の溶液に親水性ポリマー（例えば特許文献１）や単糖や二糖などの糖類（例えば特許文献２、３）を添加し、劣化を防ぐ試みがなされているが、それらにおいても十分な効果は得られなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１７０８３２号公報
【特許文献２】特開２００５−３００４０１号公報
【特許文献３】米国公開公報第２００３−０１７５８２７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は保存安定性に優れる生理活性物質を固定化した基板に関し、より詳細には、生理活性物質を固定化した基板に失活を抑制する効果のある化合物を添加することにより、生理活性物質の安定性を向上させた基板を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、生理活性物質を、親水性高分子から形成される親水性高分子層を介して固定した基板に、平均分子量が３５０より大きく５００万より小さく、且つ、水素結合を形成しうる残基を有する化合物（以下、化合物Ｓとする）を上記基板に含有させることより上記問題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明によれば、基板表面に、親水性高分子から形成される親水性高分子層を介して固定した生理活性物質と、平均分子量が３５０より大きく５００万より小さく、且つ、水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとを有する基板が提供される。
好ましくは、化合物Ｓの平均分子量が１２００以上７万以下である。
好ましくは、化合物Ｓがｎ糖類である。
好ましくは、ｎが２０以上６００以下のｎ糖類である。
好ましくは、化合物Ｓがデキストラン骨格を有し、且つ、平均分子量が１万以上２００万以下である。
好ましくは、化合物Ｓがノニオン性化合物である。
好ましくは、化合物Ｓがポリエチレンオキシド骨格を有する。
【０００９】
好ましくは、生理活性物質が蛋白質である。
好ましくは、蛋白質がプロテインＡ、プロテインＧ、アビジン類、カルモデュリン、抗体である。
【００１０】
好ましくは、生理活性物質を含む層の上に化合物Ｓを含む層を有している。
好ましくは、親水性高分子層を形成する親水性高分子の骨格と、化合物Ｓの骨格が実質同一である。
好ましくは、親水性高分子層を形成する親水性高分子の平均分子量に対する、化合物Ｓの平均分子量の割合が０．００５以上０．２以下である。
【００１１】
好ましくは、生理活性物質が親水性高分子層に共有結合で固定されている。
好ましくは、親水性高分子層を形成する親水性高分子を活性化することにより生理活性物質を固定する。
好ましくは、基板が金属膜を有し、下記一般式Ａ−１で表される自己組織化膜形成分子を介して親水性高分子層が金属膜に結合している。
【００１２】
【化１】
2008185494.tif 000002
【００１３】
好ましくは、基板の材料の屈折率が１．４以上１．７以下である。
好ましくは、非電気化学的検出に使用される基板である。
好ましくは、表面プラズモン共鳴分析に使用される基板である。
【００１４】
本発明の他の側面によれば、本発明による基板を含むセンサーユニット、また、該センサーユニットを含むセンサー装置を提供できる。
【００１５】
本発明の別の側面によれば、基板表面の親水性高分子層に、生理活性物質を含む溶液を接触、乾燥させることによって固定する工程と、生理活性物質を固定化した後、化合物Ｓの水溶液を接触させる工程を含む、基板表面上に固定化した生理活性物質の安定性を向上させた基板を製造する方法を提供できる。
好ましくは、上記生理活性物質を含む溶液の濃度が０.１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬである。
好ましくは、化合物Ｓを含む溶液の該化合物濃度が０.１重量％以上５重量％以下である。
【００１６】
本発明の別の側面によれば、デキストラン骨格又はポリエチレンオキシド骨格を有し、且つ、平均分子量が１２００以上７万以下の化合物を含む、生理活性物質の失活抑制剤を提供できる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、基板表面に固定化した生理活性物質の安定性を向上させた基板を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による、基板表面に固定化した生理活性物質の安定性を向上させた基板は、基板表面に、親水性高分子から形成される親水性高分子層を介して固定した生理活性物質と、平均分子量が３５０より大きく５００万より小さく、且つ、水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓを有することを特徴とする。また、化合物Ｓを有することにより、基板表面に固定化した生理活性物質の失活を抑制することができる。
【００１９】
本発明の基板は、例えば、バイオセンサーとして使用することができる。バイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００２０】
本発明の基板としては、好ましくは金属又は基材上に配置された金属膜を用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基材と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２１】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００２２】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２３】
本発明で使用することができる基材としては、例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィン高分子などのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基材は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。ここで、「基材上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明の基材の好ましい屈折率は１．４以上１．７以下である。特に表面プラズモン共鳴を用いて水溶液中における生理活性物質と化合物との親和性を計測する場合、基板の屈折率が低いと共鳴による暗線が反射光として得られない、屈折率が高いと基板に対する光源の入射角および反射角を小さくする必要があり装置を構成するのに障害となる場合が発生するといった問題を生じる。
【００２４】
上記の基板は、センサーユニットの誘電ブロックに固定され、一体化されて測定チップを構成しており、この測定チップが交換可能に形成されていてもよい。以下にその例を示す。
【００２５】
図１は、ＳＰＲを利用した測定に用いられるセンサーユニット１０の分解斜視図である。センサーユニット１０は、透明な誘電体である全反射プリズム（誘電ブロック）２０と、この全反射プリズム２０の上に取り付けられる流路部材３０とで構成される。流路部材３０は、図中奥側に位置する第１流路３１と、図中手前側に位置する第２流路３２との２種類の流路を有している。詳細は後述するが、センサーユニット１０を用いて測定を行う際には、これら２つの流路３１、３２を１組として、１つの試料の測定が行われる。流路部材３０には、各流路３１、３２が、それぞれ長手方向に６つずつ設けられており、１つのセンサーユニット１０で６つの試料を測定できるようにしている。なお、各流路３１、３２の数は、６つに限ることなく、５つ以下でもよいし７つ以上でもよい。
【００２６】
全反射プリズム２０は、長尺な台形柱状に形成されたプリズム本体２１と、このプリズム本体２１の一端に設けられた把持部２２と、プリズム本体２１の他端に設けられた突出部２３とからなる。この全反射プリズム２０は、例えば、押し出し法などによって型成形されるものであり、プリズム本体２１、把持部２２、突出部２３の各部は、一体に成形されている。
【００２７】
プリズム本体２１は、下底よりも上底の方が長い略台形の縦断面を有しており、底面側面から照射された光を上面２１ａに集光する。プリズム本体２１の上面２１ａには、ＳＰＲを励起するための金属膜（薄膜層）２５が設けられている。金属膜２５は、流路部材３０の各流路３１、３２と対面するように、長方形状をなしており、例えば、蒸着法などによって成形される。この金属膜２５としては、例えば、金や銀などが使用され、その膜厚は、例えば、５０ｎｍである。なお、金属膜２５の膜厚は、金属膜２５の素材や測定時に照射される光の波長などに応じて適宜選択される。
【００２８】
金属膜２５の上には、高分子膜２６が設けられている。高分子膜２６は、生理活性物質を固定させるための結合基を有するものであり、この高分子膜２６を介して金属膜２５上に生理活性物質が固定される。
【００２９】
本発明において金属膜は、自己組織化膜形成分子で被覆された後（以下、適宜、「自己組織化膜形成分子被覆工程」と称する。）、活性エステル化されたカルボキシル基を含有する親水性高分子（以下、「親水性高分子活性化工程」と称する。）を上記有機層と反応させることにより、生理活性物質を固定化し得る親水性高分子を基板に設けることができる（以下、適宜、「親水性高分子設置工程」と称する。）。また、本発明においては、このようにして得られた基板上の親水性高分子に生理活性物質を固定させ（以下、適宜、「生理活性物質固定工程」と称する。）、さらに水素結合を形成しうる残基を有する化合物を添加することにより（以下、適宜、「安定化剤添加工程」と称する。）、保存安定性に優れる、生理活性物質を固定した基板を得ることができる。
【００３０】
＜自己組織化膜形成分子被覆工程＞
本発明において自己組織化膜形成分子とは、金属膜と親水性高分子とをつなぐ役目を有している。以下、自己組織化膜形成分子を有してなる、自己組織化膜（SAMｓ）について説明する。
【００３１】
自己組織化膜（SAMs）を用いた金属膜の被覆法は、ハーバード大のWhitesides教授らにより精力的に展開されており、その詳細は例えばChemical Review, 105, 1103-1169 (2005)に報告されている。金属として金を用いた場合、自己組織化膜形成分子として一般式Ａ−１（一般式Ａ−１において、ｎは３から２０の整数を示し、Ｘは官能基を示す）に示すアルカンチオール誘導体を用いることにより、Au-S結合とアルキレン鎖同士のvan der Waals力に基づき、配向性を持つ単分子膜が自己組織的に形成される。自己組織化膜は、アルカンチオール誘導体の溶液中に金基板を浸漬するという極めて簡便な手法で作成される。本願においては、末端にアミノ基を有していることが好ましく、一般式Ａ−１においてX=NH2である分子を用いて自己組織化膜を形成させることで、アミノ基を有する自己組織化膜で金表面を被覆することが可能となる。
【００３２】
【化２】
2008185494.tif 000003
【００３３】
末端にアミノ基を有するアルカンチオールは、アルキレン鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している分子（一般式Ａ−２）（一般式Ａ−２において、ｎは３から２０の整数を示す）でもよく、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−３、Ａ−４）（一般式Ａ−３においてｎは３から２０の整数を示し、一般式４においてｎはそれぞれ独立に１から２０の整数を示す）と大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させた分子でもよい。末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールと大過剰のヒドラジドまたはジアミンとの反応は、溶液状態で行ってもよく、また、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールを基板表面に結合した後、大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させてもよい。
【００３４】
【化３】
2008185494.tif 000004
【００３５】
A-2〜A-4のアルキレン基の繰返し数は、3以上20以下が好ましく、さらに3以上16以下が好ましく、4以上8以下が最も好ましい。アルキレン鎖が短いと自己組織化膜を形成しにくく、アルキレン鎖が長いと水溶性が低下し、ハンドリングが困難になる。
【００３６】
本発明に用いるジアミンとしては、任意の化合物を用いることが可能であるが、例えば、バイオセンサー表面に用いる場合、水溶性ジアミンが好ましい。水溶性ジアミンとしては具体的に、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ピペラジン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ジヘキサメチレントリアミン、１．４−ジアミノシクロヘキサン等の脂肪族ジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、パラキシリレンジアミン、メタキシリレンジアミン、４，４’−ジアモノビフェニル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルケトン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン酸等の芳香族ジアミンが挙げられる。基板表面の親水性を向上させるという観点から、２つのアミノ基をエチレングリコールユニットで連結した化合物（一般式Ａ−５）を用いることも可能である。本発明に用いるジアミンとしては、好ましくはエチレンジアミンまたは一般式Ａ−５（一般式Ａ−５において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）で表される化合物であり、より好ましくは、エチレンジアミンまたは1,2-ビス(アミノエトキシ)エタン（一般式Ａ−５において、n=2,m=1）である。
【００３７】
【化４】
2008185494.tif 000005
【００３８】
アミノ基を有するアルカンチオールは、単独で自己組織化膜を形成することも可能であり、また、他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成することも可能である。基板表面に用いる場合、他のアルカンチオールとしては、生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な化合物を用いることが好ましい。生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な自己組織化膜に関しては、前述のWhitesides教授らにより詳細に検討されており、親水性基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化膜が非特異吸着抑制に有効であることが報告されている（Langmuir,17,2841-2850, 5605-5620, 6336-6343 (2001)）。本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールは、前記論文に記載された分子を好ましく用いることが可能である。非特異吸着抑制能に優れ、入手が容易であることから、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールとしては、水酸基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−６）あるいはエチレングルコールユニットを有するアルカンチオール（一般式Ａ−７）（一般式Ａ−６において、ｎは３から２０の整数を示し、一般式Ａ−７において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）を用いることが好ましい。
【００３９】
【化５】
2008185494.tif 000006
【００４０】
アミノ基を有するアルカンチオールを他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成する場合、A-2〜A-4のアルキレン基の繰返し数は、4以上20以下が好ましく、さらに4以上16以下が好ましく、4以上10以下が最も好ましい。また、A-6,A-7のアルキレン基の繰返し数は、3以上16以下が好ましく、さらに3以上12以下が好ましく、3以上8以下が最も好ましい。
【００４１】
本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールは、任意の割合で混合することが可能であるが、アミノ基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には活性エステル化されたカルボキシル基含有高分子の結合量が低下し、親水性基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には非特異吸着抑制能が減少する。それゆえ、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールの混合比は、１／１以上１／１００万以下の範囲であることが好ましく、１以上１／１０００以下の範囲であることがより好ましく、１以上１／１０以下の範囲であることがさらに好ましい。活性エステル化されたカルボキシル基を含有する高分子と反応する場合の立体障害低減の観点から、アミノ基を有するアルカンチオールの分子長は、親水性基を有するアルカンチオールの分子長よりも長いことが好ましい。
【００４２】
本発明で用いるアルカンチオールは、Northwestern大学のGrzybowski教授らによる総説（Curr. Org. Chem., 8, 1763-1797(2004). ）およびその引用文献に基づいて合成された化合物を用いても良く、また市販の化合物を用いてもよい。これらの化合物は、同仁化学（株）、Aldrich社、SensoPath Technologies社、Frontier Scientific Inc.社等から購入可能である。本発明においてアルカンチオールの酸化生成物であるジスルフィド化合物は、アルカンチオールと同様に用いることが可能である。
【００４３】
＜親水性高分子活性化工程＞
本発明で用いるカルボキシル基を含有する高分子としては、カルボキシル基含有合成高分子およびカルボキシル基含有多糖類を用いることが可能である。カルボキシル基含有合成高分子としては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、およびこれらの共重合体、例えば特開昭５９−５３８３６号明細書３頁２０行〜６頁４９行、特開昭５９−７１０４８号明細書３頁４１行〜７ページ５４行明細書に記載されているようなメタクリル酸共重合体、アクリル酸共重合体、イタコン酸共重合体、クロトン酸共重合体、マレイン酸共重合体、部分エステル化マレイン酸共重合、水酸基を有する高分子に酸無水物を付加させたものなどが挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、天然植物からの抽出物、微生物発酵の生産物、酵素による合成物、または化学合成物の何れであってもよく、具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、セロウロン酸、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン等が挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、市販の化合物を用いることが可能であり、具体的には、カルボキシメチルデキストランであるＣＭＤ、ＣＭＤ−Ｌ、ＣＭＤ−Ｄ４０（名糖産業社製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、等を挙げることができる。
【００４４】
カルボキシル基を含有する高分子は、好ましくはカルボキシル基を含有する多糖類であり、より好ましくはカルボキシメチルデキストランである。
【００４５】
本発明に用いるカルボキシル基を含有する高分子の分子量は特に制限されないが、平均分子量が１０００〜５００００００であることが好ましく、平均分子量が１００００〜２００００００であることがより好ましく、この範囲より平均分子量が小さい場合には生理活性物質の固定量が小さくなってしまい、この範囲より平均分子量が大きい場合には高い溶液粘度のため取り扱いが困難となる。
【００４６】
カルボキシル基を含有する高分子を活性化する方法としては、公知の手法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）単独、または、EDCとN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化する方法を好ましく用いることができる。この手法で活性化されたカルボキシル基を含有する高分子を、アミノ基を有する基板と反応させることで、本発明の基板を製造することが可能となる。
【００４７】
また、カルボキシル基を含有する高分子を活性化する方法として含窒素化合物を用いる方法があり、具体的には、下記一般式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）[式中、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立して置換基を有しても良いカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表し、Ｒ１及びＲ２は結合により５〜６員環を形成しても良く、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す]に示される含窒素化合物を用いることもできる。
【００４８】
【化６】
2008185494.tif 000007
【００４９】
ここで、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立して置換基を有しても良いカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表すが、好ましくはＲ１及びＲ２は結合により５〜６員環を形成する。特に好ましくは、ヒドロキシコハク酸、ヒドロキシフタル酸、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３、４−ジヒドロキシ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１、２、３−ベンゾトリアジン、及びその誘導体が提供される。
【００５０】
また、好ましくは下記化合物７で示される含窒素化合物を用いることもできる。
【００５１】
【化７】
2008185494.tif 000008
【００５２】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（ＩＩ）[式中、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表す]で表される化合物を用いることもできる。
【００５３】
【化８】
2008185494.tif 000009
【００５４】
具体的には、下記の化合物などを用いることができる。
【００５５】
【化９】
2008185494.tif 000010
【００５６】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記の化合物を用いることもできる。
【００５７】
【化１０】
2008185494.tif 000011
【００５８】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（ＩＩＩ）[式中、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す]を用いることもできる。
【００５９】
【化１１】
2008185494.tif 000012
【００６０】
ここで、Ａで表される炭素原子またはリン原子の置換基としては、置換基を有するアミノ基が好ましく、ジメチルアミノ基やピロリジノ基の様なジアルキルアミノ基が好ましい。Mで表される（n-1）価の元素は、リン原子、ホウ素原子、ヒ素原子などが挙げられるが、好ましくはリン原子があげられる。Xで表されるハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、好ましくはフッ素原子が挙げられる。
【００６１】
また一般式（ＩＩＩ）で表される含窒素化合物の具体例としては、下記の化合物などが挙げられる。
【００６２】
【化１２】
2008185494.tif 000013
【００６３】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（IV）[式中、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す]を用いることもできる。
【００６４】
【化１３】
2008185494.tif 000014
【００６５】
具体的には、下記の化合物などを用いることができる。
【００６６】
【化１４】
2008185494.tif 000015
【００６７】
また、カルボキシル基を含有する高分子を活性化する方法として、電子吸引性基を有するフェノール誘導体を使用することも好ましく、更に電子吸引性基のσ値が0.3以上であることが好ましい。具体的には、下記化合物１６などを用いることができる。
【００６８】
【化１５】
2008185494.tif 000016
【００６９】
更に、カルボキシル基を含有する高分子を活性化する方法では、別にカルボジイミド誘導体物を併用することができ、好ましくは、水溶性カルボジイミド誘導体を併用する事ができ、更に好ましくは下記の化合物、（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride）を併用することができる。
【００７０】
【化１６】
2008185494.tif 000017
【００７１】
上記のカルボジイミド誘導体及び、含窒素化合物、またはフェノール誘導体は併用して使用するだけではなく、所望により、夫々、単独で用いることもできる。好ましくはカルボジイミド誘導体と含窒素化合物との併用である。
【００７２】
また、カルボキシル基を含有する高分子を活性化する方法として、下記化合物を用いることもできる。該化合物は単独で用いることもできるが、カルボジイミド誘導体、含窒素化合物、フェノール誘導体と併用してもよい。
【００７３】
【化１７】
2008185494.tif 000018
【００７４】
＜親水性高分子設置工程＞
本発明において活性エステル化されたカルボキシル基を含有する高分子は、溶液として基板と反応させてもよく、また、スピンコート等の手法を用いて基板上の薄膜を形成させた状態で反応させてもよい。好ましくは、薄膜を形成させた状態での反応である。
【００７５】
上記の通り、本発明において活性エステル化されたカルボキシル基を含有する高分子は、薄膜状態で基板と反応させることが好ましい。基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。これらの薄膜形成法については、「コーティング技術の進歩」原崎勇次著、総合技術センター(1988)、「コーティング技術」技術情報協会(1999)、「水性コーティングの技術」シーエムシー(2001)、「進化する有機薄膜 成膜編」住べテクノリサーチ(2004)、「高分子表面加工学」岩森暁著、技報堂出版(2005)、等に説明されている。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。
【００７６】
スプレーコート法とは、微細化された高分子溶液を基板に吹きつけた状態で、基板を移動させることで、基板上に高分子溶液を均一塗布する方法である。スプレーガンの引き金を引くと空気バルブとニードルバルブが同時に開き、ノズルから高分子溶液が霧状に噴出し、ノズル先端にある空気キャップから噴出する空気で霧状の高分子溶液がさらに微細化される。微細化された高分子溶液による塗布膜を基板表面に形成させた後、溶媒を蒸発させることで、膜厚の制御された高分子フイルムが容易に作成される。高分子溶液濃度、基板の移動速度等により、高分子薄膜の膜厚制御が可能となる。
【００７７】
スピンコート法とは、水平に設置した基板上に高分子溶液を滴下した後に高速回転させ、遠心力によって基板全体に高分子溶液を均一塗布する方法である。遠心力による高分子溶液の飛散と溶媒の蒸発に伴い、膜厚の制御された高分子フイルムが容易に作成される。回転数、高分子溶液濃度、溶剤の蒸気圧等により、高分子薄膜の膜厚制御が可能となる。本発明においてスピンコート時の回転数は特に制限されないが、回転数が低すぎる場合には基板上に溶液が残存し、回転数が高すぎる場合には使用可能な装置が制限されてしまう。それゆえ本発明においてはスピンコート時の回転数は、500rpm〜10000rpmであることが好ましく、1000rpm〜7000rpmであることがさらに好ましい。
【００７８】
＜生理活性物質固定工程＞
上記の方法により基板に設置された、カルボキシル基を含有する高分子は、公知の方法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）単独、又は、EDCとN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化され、アミノ基を有する生理活性物質を固定化することが可能となる。カルボン酸を活性化する手法としては、特願２００４−２３８３９６号（特開２００６−５８０７１号公報）「００１１」〜「００２２」に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いて活性化することによりカルボン酸アミド基を形成する方法）、並びに特願２００４−２７５０１２号（特開２００６−９０７８１号公報）「００１１」〜「００１９」に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物でエステルとした後に、アミンと反応させることによりカルボン酸アミド基を形成する方法）を好ましく用いることもできる。
【００７９】
なお、上記した特願２００４−２３８３９６号（特開２００６−５８０７１号公報）における特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体とは、下記一般式１で表されるウロニウム塩、下記一般式２で表されるホスホニウム塩、又は下記一般式３で表されるトリアジン誘導体を示す。
【００８０】
【化１８】
2008185494.tif 000019
【００８１】
（一般式１において、Ｒ1とＲ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は互いに一緒になって炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ3は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ-はアニオンを示す。一般式２において、Ｒ4とＲ5はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は互いに一緒になって炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ6は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ-はアニオンを示す。一般式３において、Ｒ7はオニウム基を示し、Ｒ8及びＲ9はそれぞれ独立に電子供与基を示す。）
【００８２】
本発明の基板に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００８３】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００８４】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００８５】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
【００８６】
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
【００８７】
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００８８】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００８９】
本発明において基板に固定する生理活性物質として、タグ分子（特定のリガンドと特異的な親和力を形成する分子）と、Ｋｄ（解離定数）が１０-12Ｍ以下の結合を形成するリガンドであることが好ましく、具体的にはプロテインＡ、プロテインＧ、アビジン類、カルモデュリン、抗体が好ましい。タグ分子と、Ｋｄが１０-12Ｍ以下の結合を形成するリガンドを結合基として、タグ分子で修飾した特定の生理活性物質を活性の低下を抑えて基板上に固定することが可能となる。タグ分子／リガンドの組み合わせとしては、ビオチン／ビオチン結合蛋白質、ジゴキシゲニン／ジゴキシゲニン抗体、さらにはSCIENCE,280,708-711(1998)に記載のD-Ala-D-Ala誘導体／バンコマイシン3量体誘導体などを挙げることができる。ビオチン結合蛋白質の具体例としては、アビジン類（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン又はそれらの改変体など）を挙げることができ、基板上の安定性、低いＫｄ値の点で特に好ましい。
【００９０】
本発明では、生理活性物質固定層を有する金属基板の表面上に、該生理活性物質固定層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布し、乾燥させることによって基板表面上に均一な膜を形成する。この際、生理活性物質は、親水性高分子中の活性化されたカルボキシル基と共有結合することによって、金属基板の表面に固定化される。
【００９１】
生理活性物質を含む溶液（塗布液）の濃度は、基板表面に固定する生理活性物質の濃度が高い方が好ましい。生理活性物質により異なるが、０.１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬで使用することが好ましく、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬである。
【００９２】
生理活性物質を含む溶液の乾燥過程において、生理活性物質は塗布した溶液の外周部または、塗布液が乾固直前まで液が残った部分に析出する傾向がある。これにより基板表面に固定される生理活性物質の量に分布が発生し好ましくない。基板表面の生理活性物質固定量を均一にするため、塗布液の粘度は生理活性物質の基板表面への結合を阻害しない範囲で高くすることが好ましい。塗布液粘度を高くすることで、乾燥過程における塗布液中の生理活性物質の基板表面に対して水平方向の移動が抑えられ、結果として生理活性物質固定量のばらつきを抑えられる。乾燥過程における塗布液の粘度は０．９ｃＰ以上に保つことが好ましい。
【００９３】
生理活性物質を含む溶液（塗布液）の乾燥速度を上げることも生理活性物質固定量のばらつきを抑えることに効果がある。乾燥速度を上げ、生理活性物質の水平方向の移動に対して、十分早く乾燥を終了させることで、生理活性物質が実質的に移動する前に乾燥が終了し、ばらつきを抑えることが可能となる。塗布液が水を含む場合、乾球温度と湿球温度差の大きい環境で乾燥させることで乾燥速度は早くなる。乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の環境で乾燥させることが好ましく、さらに好ましくは１０℃以上である。また、製造工程上、乾燥時間としては１０分以内が好ましく、より好ましくは５分以内、特に好ましくは１分以内である。
【００９４】
生理活性物質を含む溶液を塗布する方法としては、塗布液を定量吐出するディスペンサーを使用する方法が挙げられる。ディスペンサーの吐出口を基板上で一定速度、一定間隔で動作させることで基板上の任意の場所に均一塗布することが可能である。ディスペンサーで塗布する場合、基板と吐出口の間隔を極力狭くし、塗布液厚みを薄くすることで生理活性物質の厚みを均一にすることができ、また乾燥速度を上げることができ、好ましい。また生理活性物質を含む溶液を塗布する好ましい方法として、スピンコートも挙げられる。この方法は、特に塗布膜厚を薄くする場合に好ましい。均一厚みの溶液を形成した後に乾燥させるため、スピンコーターは回転中の溶媒の蒸発を抑制することが好ましい。このため、回転時に基板を密閉容器に入れておくなどの方法で、基板周辺の溶媒濃度が高い環境に保つことで、回転中の薄膜形成と薄膜形成後の乾燥速度を制御できるため、特に好ましい。
【００９５】
生理活性物質と被検体物質との相互作用を検出する場合、センサー表面の生理活性物質の固定量の変動は相互作用の定量的、速度論的評価の誤差の原因となる。この誤差を最小限に抑える目的で、生理活性物質の固定量を均一にすることが好ましい。相互作用の検出に使用される基板表面の生理活性物質の固定量のばらつきはＣＶ値（標準偏差／平均値）で１５％以下が好ましく、さらに好ましくは１０％以下である。ＣＶ値は、基板表面の少なくとも２点以上、好ましくは１０点以上、更に好ましくは１００点以上の固定量から算出することができる。また、生理活性物質の固定量としては１ｎｇ/ｍｍ2以上５０ｎｇ/ｍｍ2以下であることが好ましい。
【００９６】
均一性は、生理活性物質を固定する前後のセンサー基板上の物質の量を定量することでも評価可能であるが、生理活性物質と結合することが知られている物質を蛍光標識して、この標識物質をセンサー基板に固定した後に蛍光顕微鏡などを用いて蛍光強度を測定することでも可能である。また、ＳＰＲイメージャー、エリプソメーター、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ、ＡＴＲ−ＩＲ装置などで生理活性物質の定量も可能である。
【００９７】
＜安定化剤添加工程＞
一般に蛋白質などの生理活性物質は水溶液中で水分子が配位することで三次元構造を維持しているが、乾燥されると三次元構造を保持できず失活する。また、基板表面の親水性高分子中に担持されている場合には、乾燥されることで生理活性物質同士が接近し凝集が発生する。本発明の水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水分子に代って生理活性物質の三次元構造を保持することで失活を抑制、または生理活性物質を被覆して立体効果で凝集を抑制する目的で使用することができる。
【００９８】
本発明において水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水溶液で基板上の生理活性物質を固定した層に添加することが好ましい。添加方法としては、生理活性物質との混合溶液として基板表面に塗布しても良く、生理活性物質を基板表面に固定した後オーバーコートなどによりして添加しても良い。化合物Ｓと生理活性物質との混合溶液として塗布した場合、生理活性物質の固定量ばらつきを抑えることもできる。化合物Ｓ水溶液は薄膜状態で基板に添加することが好ましい。基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。
【００９９】
化合物Ｓの塗布液濃度は塗布性、生理活性物質を含む層への浸透の問題がない範囲で特に限定されないが、０．１重量％以上５重量％以下であることが好ましい。また、塗布液は、塗布性、ｐＨ調整の観点で界面活性剤、緩衝剤、有機溶剤、塩などを添加してもよい。
【０１００】
水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、常温常圧で不揮発性のものが好ましく、平均分子量が３５０より大きく５００万より小さいものが好ましく、さらに好ましくは１２００以上２００万以下であり、最も好ましくは１２００以上７万以下である。分子内に水酸基を含む化合物Ｓは糖類が好ましく、糖類は、単糖、多糖類でも良い。ｎ糖類の場合ｎが４以上１２００以下であることが好ましく、さらに好ましくはｎが２０以上６００以下である。
【０１０１】
化合物Ｓの平均分子量が低いと基板表面で結晶化して、生理活性物質を固定した親水性高分子層の破壊および生理活性物質の三次元構造の破壊の原因となり、反対に平均分子量が高いと生理活性物質の基板への固定の障害となったり、生理活性物質を含む層に含浸できない、層分離を発生するなどの問題が発生する。
【０１０２】
基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、デキストラン骨格、又はポリエチレンオキシド骨格を有することが好ましく、本発明の目的を達成する範囲において、どの置換基を使用してもよい。また、基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、解離性基を有しないノニオン性化合物であることが好ましい。また、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは水分子との親和性の高い化合物が好ましく、水とｎ-オクタノールとの分配係数ＬｏｇＰ値が１以上であることが好ましい。ＬｏｇＰ値は、ＪＩＳ規格のＺ７２６０−１０７（２０００）「分配係数（1-オクタノール/水）の測定―振とう法」などに記載の方法で測定することができる。
【０１０３】
具体的な水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、ポリエチレングリコールなど多価アルコース類、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、デンプン、セルロース、アルギン酸、デキストランなど多糖類、ポリエチレンオキシド、プルロニックなどポリエチレンキシ-ポリプロピレンオキシド縮合物などのポリエーテル類、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０などの２種以上の残基から成る化合物、またはこれら化合物の誘導体および重合体などが挙げられる。特に、デキストラン、セルロース、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０が好ましい。また、これらの化合物Ｓは使用している親水性高分子の基本骨格と実質同一であることが好ましい。ここで、基本骨格とは、例えば、糖の環構造のことをいい、官能基や長さが異なっていても、環構造が同一であれば、実質同一であるという。
【０１０４】
基板上の、水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓの含有量としては、平均分子量の比で、親水性高分子の平均分子量に対する前記化合物Ｓの平均分子量の割合が０．００５以上０．２以下であることが好ましい。割合がこれよりも低い場合は化合物Ｓが結晶化しやすく、高い場合は親水性高分子層への浸透が困難であり、この範囲内に設定することでこれらの問題を解消し、生理活性物質の失活抑制効果、凝集抑制効果をより高く得ることができる。
【０１０５】
上記のようにして生理活性物質を固定化した基板は、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【０１０６】
本発明では、基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【０１０７】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の基板は、例えば、透明基材上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【０１０８】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【０１０９】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【０１１０】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【０１１１】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【０１１２】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【０１１３】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【０１１４】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【０１１５】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【０１１６】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【０１１７】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【０１１８】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【０１１９】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【０１２０】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【０１２１】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【０１２２】
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
【０１２３】
また、本発明により提供される基板は、例えば基板表面に導波路構造を保持した、屈折率変化を導波路を用いて検出するバイオセンサーにも用いることができる。屈折率変化を導波路を用いて検出する測定技術は、導波路に隣接する媒体の有効屈折率変化を光学変化で検出する技術である。この方式のバイオセンサーの構成については、例えば米国特許第 6,829,073号のcolumn6の31行目からcolumn7の47行目および第9図A,Bに記載されている。
【０１２４】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１２５】
実施例１：本発明の基板
ゼオネックス（日本ゼオン社製）のペレットを２４０℃で溶解し、この溶融物を射出成型器で縦８ｍｍ×横１２０ｍｍ×１．５ｍｍのプリズム基板を成型した。この基板に平行平板型６インチ用スパッタ装置（ＳＨ−５５０、アルバック（株）社製）の基板ホルダにプリズムを取付け、真空（ベースプレッシャー1×10-3Pa以下）に引いてからArガスを導入し（1Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、基板ホルダにRFパワー（0.5kW）を約9分間印加してプリズム表面をプラズマ処理（基板エする。次に、Arガスを止めて真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（10〜40rpm）させながら、8inchのCrターゲットにDCパワー（0.2kW）を約30秒間印加して2nmのCr薄膜を成膜する。次に。Arガスを止めて再び真空に引き、Arガスを再び導入し、（0.5Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、8inchのAuターゲットにDCパワー（1kW）を約50秒間印加して50nm程度のAu薄膜を成膜する。
【０１２６】
上記で得られたAu薄膜を成膜した基板を、6-Amino-1-octanethiol, hydrochloride（同仁化学社製）の1mM水溶液に40℃１時間浸漬し、超純水で5回洗浄した。
【０１２７】
（２）CMD(カルボキシメチルデキストラン)の活性エステル化
1重量%のCMD（名糖産業製：平均分子量100万、置換度0.59）溶液10g(カルボキシル基量：5×10-4mol)を溶解した後、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド２×１０-5Ｍ）を含む水溶液10mlを加え、室温で1時間攪拌した。
【０１２８】
（３）CMDの基板への結合反応
（１）で成された基板の上に、（２）で作成された活性エステル化されたCMD溶液を1ml滴下し、密閉式インナーカップを有するスピンコーター（Model408(特)、ナノテック社製）のインナーカップ上に回転中心から半径１３５ｍｍの位置に円弧の接線方向が基板の長軸方向となるように固定した。１０００ rpmで45 秒スピンコートすることで、アミノ基を有する基板上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で15分間反応させた後、1 N NaOH水溶液に30分浸漬し、超純水で5回洗浄することで、ＣＭＤ表面基板を作成した。
【０１２９】
（４）アビジン修飾基板の作成
（３）で作成したＣＭＤ表面基板表面に、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との１：１混合液を１ｍＬ滴下してＣＭＤ表面を被服し、室温で７分間静置してＣＭＤ基板表面を活性エステル化した。次いで、基板表面をほう酸バッファーで洗浄し、窒素ガンで除去した。
【０１３０】
活性エステル化されたＣＭＤ表面基板にストレプトアビジン（和光純薬製）５ｍｇ／ｍＬ溶液を１００μＬ滴下し基板表面を被覆した後、半径２０ｃｍの回転盤を有するスピンコーター（Model408(特)、ナノテック社製）の回転盤上に回転中心から半径１３５ｍｍの位置に円弧の接線方向が基板の長軸方向となるように固定した。２３℃１０％ＲＨの雰囲気中で５００ｒｐｍ４５秒間回転して乾燥させた後、同じ操作を３回繰返し、さらに３０分間静置した。
【０１３１】
このアビジン修飾基板表面を、ブロッキング溶液中に７分間室温で浸漬した。次いでほう酸バッファー中に３回浸漬、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間浸漬し、続いてｐＨ７．４のリン酸バッファーに３回浸漬することでブロッキング処理されたアビジン修飾基板を作成した。
【０１３２】
（５）安定化剤添加
（４）で作成したアビジン修飾基板上に５％デキストラン（名糖産業社製ＤＥＸ−１０、Ｍｗ１万）水溶液を１ｍＬ滴下し基板表面を被覆し、（４）で使用したスピンコーターで回転盤上に回転中心から半径１３５ｍｍの位置に円弧の接線方向が基板の長軸方向となるように固定した。２３℃１０％ＲＨの雰囲気中で１０００ｒｐｍ４５秒間回転して、安定化剤添加基板を作成した。
【０１３３】
（６）アビジン修飾基板の保存安定性評価
アビジン修飾基板はアビジン−ビオチン相互作用を使用して、ビオチン化ターゲット蛋白質を基板表面に変性を抑えて固定することができ、ターゲット蛋白質の固定方法として使用されている。（５）で作成した安定化剤添加基板のセンサー表面にポリプロピレン製の部材を被せることにより、幅（縦方向）１ｍｍ、長さ（横方法）７.５ｍｍ、深さ１ｍｍのセルを作成した。このようにして作成した安定化剤添加基板の１本は直後にパーオキシダーゼ、わさび由来、ビオチン−ＸＸコンジュゲート（モレキュラープローブ社製、以降ビオチン化ＨＲＰと略記）の結合性能を評価し、もう一本は窒素中に封入し４５℃７日間保存したその後、ビオチンＨＲＰ結合性能を評価した。
【０１３４】
結合性能評価のため、基板を表面プラズモン共鳴装置に設置し、酢酸バッファーをセルに添加し２０分間静置後、ビオチン化ＨＲＰ溶液（１００μｇ／ｍＬ、酢酸バッファー）をセル内に３０分間充填し、その後酢酸バッファーで置換した。ビオチンＨＲＰ溶液をセルに充填した前後の酢酸バッファー充填時の共鳴シグナル（RU値）の変化量をビオチンＨＲＰ固定量とし、窒素中４５℃７日間保管した後の保存安定性（固定性能残存率）を評価した。値が１．０に近いほど保存安定性に優れる。結果を表１に示した。
【０１３５】
実施例２：
Ｄｅｘ−１０に代り、Ｄｅｘ−７０（名糖産業社製、Ｍｗ７万）を使用したこと以外、実施例１と同じ方法で安定化剤添加基板を作成し、保存安定性を評価した。
【０１３６】
実施例３：
Ｄｅｘ−１０に代り、トゥイーン２０（シグマ社製、Ｍｗ約１２００）を使用したこと以外、実施例１と同じ方法で安定化剤添加基板を作成し、保存安定性を評価した。
【０１３７】
実施例４：
Ｄｅｘ−１０に代り、デキストラン（シグマ社製、Ｍｗ約２００万）を使用したこと以外、実施例１と同じ方法で安定化剤添加基板を作成し、保存安定性を評価した。
【０１３８】
比較例１：
Ｄｅｘ−１０に代り、デキストラン（シグマ社製、Ｍｗ５００万〜４０００万）を使用したこと以外、実施例１と同じ方法で安定化剤添加基板を作成し、保存安定性を評価した。
【０１３９】
比較例２：
Ｄｅｘ−１０に代り、ＣＭＤ（名糖産業社製、Ｍｗ約１００万）を使用したこと以外、実施例１と同じ方法で安定化剤添加基板を作成し、保存安定性を評価した。
【０１４０】
比較例３：
Ｄｅｘ−１０に代り、ショ糖（和光純薬社製、Ｍｗ３４２）を使用したこと以外、実施例１と同じ方法で安定化剤添加基板を作成し、保存安定性を評価した。
【０１４１】
比較例４：
安定化剤を添加をしないこと以外、実施例１と同じ方法で安定化剤添加基板を作成し、保存安定性を評価した。
【０１４２】
【表１】
2008185494.tif 000020
【０１４３】
表１の結果から、本発明の化合物Ｓを添加した基板は４５℃７日間保存の後も製膜直後同等の性能を示した。一方、高分子量のデキストラン（Mw500万〜4000万）を添加するとビオチン化蛋白の固定性能がほぼ消失した。低分子量のショ糖を添加した場合、４５℃７日後に表面にショ糖の結晶が析出し、局所的に固定性能の低下がみられた。ノニオン性でないＣＭＤを添加した基板は安定化効果がみられなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】センサーユニットの概略構成を示す分解斜視図である。
【符号の説明】
【０１４５】
１０ センサーユニット
２０ 全反射プリズム（光学ブロック）
２１ プリズム本体
２１ａ 上面
２２ 把持部
２２ａ 溝
２３ 突出部
２５ 金属膜（薄膜層）
２６ 高分子膜
２７ 系合爪
２８ 係合部
２８ａ 系合面
２９ａ 基準平面
３０ 流路部材
３１ 第１流路
３２ 第２流路
３３ 本体部
３４ 取付部
３５ 系合孔
３６ 開口
ＳＳ１ センサー面
ＳＳ２ センサー面
【図１】
2008185494.tif 000022