(57)【要約】【課題】  多量の野生型遺伝子を含むサンプル中の微量の変異型遺伝子を特異的に増幅しうる核酸増幅法の提供。【解決手段】  野生型遺伝子と変異型遺伝子の両方を含むサンプルからいずれか一方の遺伝子を特異的に増幅する方法であって、（ａ）増幅しようとする前記遺伝子上の２以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマーおよび同遺伝子上の１以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、変異にかかるヌクレオチド残基が前記領域のうちの１以上の領域に含まれる、プライマーセットを用意する工程、（ｂ）前記サンプルに含まれる核酸分子を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程、ならびに（ｃ）前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程を含んでなる方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型遺伝子と変異型遺伝子の両方を含むサンプルからいずれか一方の遺伝子を特異的に増幅する方法であって、
（ａ）増幅しようとする前記遺伝子上の２以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマーおよび同遺伝子上の１以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、変異にかかるヌクレオチド残基が前記領域のうちの１以上の領域に含まれる、プライマーセットを用意する工程、
（ｂ）前記サンプルに含まれる核酸分子を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程、ならびに
（ｃ）前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
工程（ｃ）が２回以上繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマーセットが等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするものであり、前記核酸増幅反応が等温下で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プライマーセットが、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも２種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）に相補的な配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）に相同な配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）に相補的な配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記プライマーセットが、配列（A）、配列（B）または配列（C）に前記変異にかかるヌクレオチド残基を含むように設計されたものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記プライマーセットが、配列（B）に前記変異にかかるヌクレオチド残基を含むように設計されたものである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記プライマーセットが、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする第三のプライマーであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しない第三のプライマーをさらに含んでなるものである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
第三のプライマーが、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
核酸増幅反応において鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
核酸増幅反応が、ミスマッチ結合タンパク質の存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ミスマッチ結合タンパク質が、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２もしくはＭＳＨ６、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
被験者に由来する検体から疾患に関連する細胞を検出する方法であって、
（ａ）前記疾患に関連する変異を有する変異型遺伝子上の２以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマーおよび同遺伝子上の１以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、変異型遺伝子中の変異にかかるヌクレオチド残基が前記領域のうちの１以上の領域に含まれる、プライマーセットを用意する工程、
（ｂ）前記検体に含まれる核酸分子を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程、
（ｃ）前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程、ならびに
（ｄ）増幅産物を検出する工程
を含んでなり、工程（ｄ）において増幅産物が検出された場合に、前記疾患に関連する細胞が検出されたことが示される、方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）が２回以上繰り返される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プライマーセットが等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするものであり、前記核酸増幅反応が等温下で行なわれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライマーセットが、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも２種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記プライマーセットが、配列（A）、配列（B）または配列（C）に前記変異にかかるヌクレオチド残基を含むように設計されたものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記プライマーセットが、配列（B）に前記変異にかかるヌクレオチド残基を含むように設計されたものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記プライマーセットが、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする第三のプライマーであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しない第三のプライマーをさらに含んでなるものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
第三のプライマーが、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
核酸増幅反応において鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
核酸増幅反応が、ミスマッチ結合タンパク質の存在下で行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
ミスマッチ結合タンパク質が、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２もしくはＭＳＨ６、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
被験者に由来する検体から病原体を特異的に検出する方法であって、
（ａ）検出しようとする目的の病原体に含まれる遺伝子上の２以上の特異的領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマー、および同遺伝子上の１以上の特異的領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマーを含んでなるプライマーセットを用意する工程、
（ｂ）前記検体に含まれる核酸分子を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程、
（ｃ）前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程、ならびに
（ｄ）増幅産物を検出する工程
を含んでなり、工程（ｄ）において増幅産物が検出された場合に、目的の病原体が検出されたことが示される、方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）が２回以上繰り返される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記プライマーセットが等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするものであり、前記核酸増幅反応が等温下で行なわれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記プライマーセットが、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも２種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記プライマーセットが、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする第三のプライマーであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しない第三のプライマーをさらに含んでなるものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
核酸増幅反応において鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
核酸増幅反応が、ミスマッチ結合タンパク質の存在下で行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
ミスマッチ結合タンパク質が、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２もしくはＭＳＨ６、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、サンプル中に含まれる微量な核酸分子を特異的に増幅し、これを検出する方法に関する。
【０００２】
背景技術
様々な疾患において、その疾患に特異的な性質を有する細胞が知られている。例えば、癌細胞としては、同じ組織の癌においても様々な性質のものが知られている。さらに、このような癌細胞の性質によって、治療用薬剤の効果、癌の進行、予後などが異なることが知られている。よって、様々な性質を有するこれら疾患関連細胞のそれぞれを特異的に検出することにより、その疾患を診断することができ、さらには、治療用薬剤の選択、治療法の選択、手術の際の術式の選択などに関連する重要な情報が提供される。
【０００３】
近年、癌などの疾病の分子生物学的な研究が進んでおり、癌細胞などの疾患関連細胞のそれぞれに特異的な遺伝子変異が数多く見出されている。このような変異を有する変異型遺伝子は、それぞれの疾患の診断において、疾患関連細胞の存在を示すマーカーとして用いることができる。
【０００４】
変異型遺伝子を検出するためには、その遺伝子の塩基配列を決定して変異の有無を調べればよい。しかしながら、塩基配列決定には前記変異型遺伝子の純度が高く、野生型などの他の型の遺伝子をほとんど含まない核酸試料が必要とされるため、多大な時間とコストがかかる。
【０００５】
最近、核酸増幅法を利用して疾患に特異的な変異型遺伝子のみを増幅し、増幅産物の有無によって疾患を検出する方法が開発の対象となっている。
【０００６】
一般に、核酸増幅法としてはＰＣＲ法（特許文献１：米国特許第４６８３１９５号明細書；特許文献２：米国特許第４６８３２０２号明細書；および特許文献３：米国特許第４８００１５９号明細書）が最もよく利用される。しかし、通常のＰＣＲ法では、プライマーが完全に相補的でない配列にアニーリングして誤った増幅反応が起こることがあるため、ＰＣＲ法は、変異の検出、特に一塩基変異の検出に必要な特異性を有する方法とはいえない。
【０００７】
また、疾患の診断における変異型遺伝子の検出では、サンプルとなる検体が野生型遺伝子と変異型遺伝子の両方を含んでいることが多く、さらには、他の変異を有する変異型遺伝子を含んでいることもある。さらに、サンプル中に含まれる変異型遺伝子の量が、野生型遺伝子または他の変異型遺伝子に比べて極端に少ないこともある。例えば、癌の診断では、正常組織中に含まれる微量の癌細胞を検出することが必要とされるため、大量の野生型遺伝子を含む検体から極微量の変異型遺伝子を検出する必要がある。
【０００８】
従って、疾患の診断を目的として核酸増幅法による変異型遺伝子の検出を行なう場合には、利用する核酸増幅法の特異性が特に重要となる。
【０００９】
一方で、核酸増幅方法としては、ＰＣＲ法以外にも様々な方法が開発されており、例えば、鎖置換増幅法（ＳＤＡ法；特許文献４：特公平７−１１４７１８号公報）、自己維持配列増幅法（３ＳＲ法）、Ｑβレプリカーゼ法（特許文献５：日本国特許第２７１０１５９号公報）、ＮＡＳＢＡ法（特許文献６：日本国特許第２６５０１５９号公報）、ＬＡＭＰ法（特許文献７：国際公開第００／２８０８２号パンフレット）、ＩＣＡＮ法（特許文献８：国際公開第０２／１６６３９号パンフレット）、ローリングサークル法、国際公開第２００４／０４００１９号パンフレット（特許文献９）に記載の方法などが知られている。
【００１０】
さらに、核酸増幅法を利用した遺伝子変異の検出法として、上記のＬＡＭＰ法を用いた変異検出法（特許文献１０：特開２００３−１５９１００号公報）、国際公開第０１／３４８３８号パンフレット（特許文献１１）に記載の方法などが知られている。
【００１１】
【特許文献１】米国特許第４６８３１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４６８３２０２号明細書
【特許文献３】米国特許第４８００１５９号明細書
【特許文献４】特公平７−１１４７１８号公報
【特許文献５】日本国特許第２７１０１５９号公報
【特許文献６】日本国特許第２６５０１５９号公報
【特許文献７】国際公開第００／２８０８２号パンフレット
【特許文献８】国際公開第０２／１６６３９号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２００４／０４００１９号パンフレット
【特許文献１０】特開２００３−１５９１００号公報
【特許文献１１】国際公開第０１／３４８３８号パンフレット
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは、核酸増幅反応において、標的核酸配列中の２以上の領域に特異的な配列を含むプライマーと、標的核酸配列中の１以上の領域に特異的な配列を含むプライマーとを使用し、前記領域の１以上の領域に変異にかかるヌクレオチド残基が含まれるようにこれらプライマーを設計しておくことにより、野生型遺伝子と変異型遺伝子のいずれか一方を特異的に増幅できることを見出した。さらに、本発明者らは、前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物を鋳型として含み、新たに前記プライマー等の試薬を加えた反応液による核酸増幅反応を繰り返すことにより、多量の野生型遺伝子を含むサンプル中の極微量の変異型遺伝子を特異的に増幅できることを見出した。本発明はこれら知見に基づくものである。
【００１３】
従って、本発明の目的は、多量の野生型遺伝子を含むサンプル中の微量の変異型遺伝子、または多量の変異型遺伝子を含むサンプル中の微量の野生型遺伝子を特異的に増幅しうる核酸増幅法を提供することにある。
【００１４】
そして、本発明による核酸増幅法は、野生型遺伝子と変異型遺伝子の両方を含むサンプルからいずれか一方の遺伝子を特異的に増幅する方法であって、（ａ）増幅しようとする前記遺伝子上の２以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマーおよび同遺伝子上の１以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、変異にかかるヌクレオチド残基が前記領域のうちの１以上の領域に含まれる、プライマーセットを用意する工程、（ｂ）前記サンプルに含まれる核酸分子を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程、ならびに（ｃ）前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程を含んでなるものである。
【００１５】
本発明によれば、野生型遺伝子と変異型遺伝子の両方を含むサンプルから、そのいずれか一方を特異的に増幅することができ、特に、その増幅対象となる遺伝子がサンプル中に極微量にしか存在しない場合でも、これを特異的に増幅することができる。これにより、野生型遺伝子を有する多量の正常細胞を含む検体から、変異型遺伝子を有する極微量の疾患関連細胞を検出することが可能となる。
【発明の具体的説明】
【００１６】
本発明による核酸増幅法は、野生型遺伝子と変異型遺伝子の両方を含むサンプルからいずれか一方の遺伝子を特異的に増幅する方法である。その特異性は極めて高度であり、野生型遺伝子と変異型遺伝子との配列の相違点が一塩基置換であっても、これらのいずれか一方のみを増幅することができる。さらに、いずれかの型の遺伝子がサンプル中に極微量にしか存在しない場合であっても、その遺伝子を特異的に増幅することができる。これらの効果は、プライマーのミスプライミングによる誤った増幅産物の生成を防止するためのプライマーの構造、および核酸増幅反応の繰り返しによって達成される。
【００１７】
本発明による核酸増幅法では、増幅しようとする遺伝子（野生型遺伝子または変異型遺伝子）上の２以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマーおよび同遺伝子上の１以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマーを含んでなるプライマーセットが用意される。このプライマーセットは、変異にかかるヌクレオチド残基が前記領域のうちの１以上の領域に含まれるように設計される。
【００１８】
前記プライマーセットに含まれる前記２種のプライマーは、典型的には、増幅しようとする標的核酸配列について設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーとすることができる。よって、一方のプライマーは標的核酸配列の５’末端領域に相同な配列を含むものとし、他方のプライマーは標的核酸配列の３’末端領域に相補的な配列を含むものとすることができる。さらに、これらプライマーの少なくとも一方は、標的核酸配列の５’末端領域および３’末端領域とは異なる領域に相同または相補的な配列を含むものとされる。このような配列は、例えば、一方のプライマーが標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズし、同プライマーの伸長反応が起こった後に、その伸長鎖上の領域にハイブリダイズしてループ構造を形成するように、同プライマーの５’末端側に組み込むことができる。このように、少なくとも１種のプライマーは、標的核酸配列（増幅しようとする遺伝子）上の２以上の領域の配列に基づいて設計され、その領域の数の上限は特に限定されないが、好ましくは２〜５領域、より好ましくは２〜３領域、さらに好ましくは２領域の配列に基づいて設計される。また、他の１種のプライマーは、標的核酸配列（増幅しようとする遺伝子）上の１以上の領域の配列に基づいて設計され、その領域の数の上限は特に限定されないが、好ましくは１〜５領域、より好ましくは１〜３領域、さらに好ましくは１〜２領域の配列に基づいて設計される。さらに、前記プライマーセットは、前記２種のプライマーに加え、核酸増幅反応に関与する他のプライマーをさらに含むものとしてもよい。
【００１９】
前記プライマーセットに含まれる前記２種のプライマーの設計に用いられる標的核酸配列（増幅しようとする遺伝子）上の領域は、そのうちの少なくとも１つが変異にかかるヌクレオチド残基を含むように選択される。このような変異にかかるヌクレオチド残基を含む複数の領域をプライマーの設計に用いることもでき、特に、変異型遺伝子中に複数の変異にかかるヌクレオチド残基が存在する場合には有利である。
【００２０】
前記プライマーセットの他の設計基準は、利用する核酸増幅反応の作用機序に従って決定される。このような核酸増幅反応としては、当業者に公知のいかなる方法であってもよいが、好ましくは等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするものとされる。よって、本発明の好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットは等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするものとされ、その場合には、核酸増幅反応は等温下で行なうことができる。このような等温核酸増幅法としては、例えば、ＬＡＭＰ法（国際公開第００／２８０８２号パンフレット）、国際公開第２００４／０４００１９号パンフレットに記載の方法等が挙げられる。
【００２１】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、等温核酸増幅法として、本発明者らによって開発された核酸増幅法が用いられる。この実施態様では、前記プライマーセットは、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも２種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）に相補的な配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）に相同な配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）に相補的な配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものとされる。
【００２２】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、プライマー中の領域がストリンジェントな条件下で標的領域にハイブリダイズし、標的領域以外の領域にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、プライマー中の領域とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用するプライマー領域の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、プライマー中の領域を標的領域に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、市販のプライマー構築ソフト、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（Whitehead Institute for Biomedical Research社製）などを用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的領域にハイブリダイズするプライマー中の領域は、その標的領域に相補的な配列を含んでなるものである。
【００２３】
前記第一のプライマーによる核酸合成の作用機序を図１に模式的に示す。まず、鋳型となる核酸中の標的核酸配列を決定し、その標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）、および配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）を決定する。第一のプライマーは、配列（Ac'）を含んでなり、さらにその５’側に配列（B'）を含んでなる。配列（Ac'）は配列（A）に相補的な配列であり、配列（B'）は配列（B）に相同な配列である。ここで、第一のプライマーは、前記配列（Ac'）と前記配列（B'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を含んでいてもよい。このようなプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせると、プライマー中の配列（Ac'）が標的核酸配列の配列（A）にハイブリダイズした状態となる（図１(a)）。この状態でプライマー伸長反応が起こると、標的核酸配列の相補配列を含む核酸が合成される。そして、合成された核酸の５’末端側に存在する配列（B'）が、同核酸中に存在する配列（Bc）にハイブリダイズし、これにより、合成された核酸の５’末端部分においてステム−ループ構造が形成される。その結果、鋳型核酸上の配列（A）が一本鎖となり、この部分に先の第一のプライマーと同一の配列を有する他のプライマーがハイブリダイズする（図１(b)）。その後、鎖置換反応により、新たにハイブリダイズした第一のプライマーからの伸長反応が起こると同時に、先に合成された核酸が鋳型核酸から分離される（図１(c)）。
【００２４】
上記の作用機序において、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズする現象は、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。上記第一のプライマーによる伸長反応で生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステム−ループ構造を形成することができる。このステムループ構造は安定的には存在しないが、その構造の形成により剥き出しとなった相補鎖部分（鋳型核酸上の配列（A））に同一の他のプライマーが結合し、すぐさまポリメラーゼが伸長反応を行うことにより、先に合成された鎖が置換されて遊離すると同時に、新たな二本鎖核酸を生成することができる。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様における第一のプライマーの設計基準は次のとおりである。まず、プライマーの伸長により鋳型核酸の相補鎖が合成された後に新たなプライマーが効率よく同鋳型核酸にアニーリングするためには、合成された相補鎖の５’末端におけるステム−ループ構造形成により、鋳型核酸上の前記配列（A）の部分を一本鎖とする必要がある。そのためには、配列（Ac'）の塩基数Ｘと標的核酸配列中における前記配列（A）と前記配列（B）に挟まれた領域の塩基数Ｙとの差（Ｘ−Ｙ）の、Ｘに対する割合（Ｘ−Ｙ）／Ｘが重要となる。ただし、鋳型核酸上において配列（A）よりも５’側に存在する、プライマーのハイブリダイズとは関係無い部分まで一本鎖とする必要はない。また、新たなプライマーが効率よく鋳型核酸にアニーリングするためには、上述のステム−ループ構造形成を効率よく行なうことも必要となる。そして、効率の良いステム−ループ構造形成、すなわち、効率の良い配列（B'）と配列（Bc）とのハイブリダイゼーションには、前記配列（B'）と前記配列（Bc）との間の距離（Ｘ＋Ｙ）が重要となる。一般に、プライマー伸長反応のための最適温度は最高でも７２℃付近であり、そのような低い温度では、伸長鎖が長い領域にわたって解離することは困難である。従って、配列（B'）が配列（Bc）に効率よくハイブリダイズするためには、両配列の間の塩基数は少ないほうが好ましいと考えられる。一方で、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズして鋳型核酸上の前記配列（A）の部分を一本鎖とするためには、配列（B'）と配列（Bc）との間の塩基数は多い方が好ましいと考えられる。
【００２６】
以上のような観点から、本発明の好ましい実施態様による前記第一のプライマーは、プライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の間に介在配列が存在しない場合において、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは５０以下、さらに好ましくは４８以下、さらに好ましくは４２以下とされる。
【００２７】
また、プライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の間に介在配列（塩基数はＹ’）が存在する場合には、本発明の好ましい実施態様による前記第一のプライマーは、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ＋Ｙ’）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは１００以下、さらに好ましくは７５以下、さらに好ましくは５０以下とされる。
【００２８】
前記第一のプライマーは、与えられた条件下で必要な特異性を維持しながら標的核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を有するものである。このプライマーの鎖長は、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは２０〜６０ヌクレオチドとする。また、前記第一のプライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の長さは、それぞれ、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは７〜３０ヌクレオチドである。また、必要に応じて、配列（Ac'）と配列（B'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
【００２９】
前記第二のプライマーは、上述のように、前記標的核酸配列の相補配列（第一のプライマーがハイブリダイズする鎖に対して反対側の鎖）の３’末端部分の配列（C）に相補的な配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである。このような第二のプライマーの構造は、例えば、図２に示すようなものであるが、図２に示される配列やヌクレオチド数に限定されるものではない。第二のプライマーを構成する配列（Cc'）の長さは、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。また、前記折返し配列（D-Dc'）の長さは、好ましくは２〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは２〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは４〜６０ヌクレオチド、さらに好ましくは６〜４０ヌクレオチドであり、折返し配列の内部におけるハイブリダイゼーションによって形成される塩基対のヌクレオチド数は、好ましくは２〜５００ｂｐ、より好ましくは２〜５０ｂｐ、さらに好ましくは２〜３０ｂｐ、さらに好ましくは３〜２０ｂｐである。折返し配列（D-Dc'）のヌクレオチド配列はいかなる配列であってもよく、特に限定されるものではないが、好ましくは標的核酸配列にハイブリダイズしない配列とされる。また、必要に応じて、配列（Cc'）と折返し配列（D-Dc'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
【００３０】
これら第一のプライマーおよび第二のプライマーによる核酸増幅反応について考えられる作用機序を、図３（図３ａおよび図３ｂ）を用いて説明する。まず、第一のプライマーが標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし、該プライマーの伸長反応が起きる（図３(a)）。次いで、伸長鎖（−）上においてステム−ループ構造が形成され、これにより一本鎖となった標的核酸センス鎖上の配列（A）に新たな第一のプライマーがハイブリダイズし（図３(b)）、該プライマーの伸長反応が起きて、先に合成された伸長鎖（−）が脱離する。次に、脱離した伸長鎖（−）上の配列（C）に第二のプライマーがハイブリダイズし（図３(c)）、該プライマーの伸長反応が起き、伸長鎖（＋）が合成される（図３(d)）。生成した伸長鎖（＋）の３’末端と伸長鎖（−）の５’末端ではステム−ループ構造が形成され（図３(e)）、遊離型の３’末端である伸長鎖（＋）のループ先端から伸長反応が起こると同時に、前記伸長鎖（−）が脱離する（図３(f)）。ループ先端からの前記伸長反応により、伸長鎖（＋）の３’側に配列（A）および配列（Bc）を介して伸長鎖（−）が結合したヘアピン型の二本鎖核酸が生成し、その配列（A）および配列（Bc）に第一のプライマーがハイブリダイズし（図３(g)）、その伸長反応により伸長鎖（−）が生成する（図３(h)および(i)）。また、前記ヘアピン型二本鎖核酸の３’末端に存在する折返し配列によって遊離型の３’末端が提供され（図３(h)）、そこからの伸長反応により（図３(i)）、両端に折返し配列を有し、第一および第二のプライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図３(j)）。この一本鎖核酸では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図３(k)）、同様の伸長反応が繰り返され、１回の伸長反応あたり２倍の鎖長となる（図３(l)および(m)）。また、図３(i)において脱離した第一のプライマーからの伸長鎖（−）では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図３(n)）、そこからの伸長反応により、両端にステム−ループ構造が形成され、プライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図３(o)）。この一本鎖核酸においても、３’末端におけるループ形成によって相補鎖合成起点が順次提供されるため、そこからの伸長反応が次々に起こる。このようにして自動的に延長される一本鎖核酸には、第一のプライマーおよび第二のプライマーに由来する配列が伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）との間に含まれているため、各プライマーがハイブリダイズして伸長反応を起こすことが可能であり、これにより標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖が顕著に増幅される。
【００３１】
前記プライマーセットは、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーに加えて、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする第三のプライマーをさらに含んでいてもよく、このような第三のプライマーは、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないものとされる。
【００３２】
本発明において「競合しない」とは、そのプライマーが標的核酸にハイブリダイズすることによって他のプライマーによる相補鎖合成起点の付与が妨げられないことを意味する。
【００３３】
第一のプライマーおよび第二のプライマーにより標的核酸が増幅された場合には、上述のように、増幅産物は標的核酸配列とその相補配列とを交互に有するものとなる。その増幅産物の３’末端には折返し配列またはループ構造が存在し、これにより提供される相補鎖合成起点から次々に伸長反応が起こっている。第三のプライマーは、このような増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的配列にアニ−リングすることができる。これにより、増幅産物中の標的核酸配列内に新たな相補鎖合成起点が提供され、そこからの伸長反応が起こるため、核酸増幅反応がより迅速に行われるようになる。
【００３４】
第三のプライマーは必ずしも１種類に限定されるわけではなく、核酸増幅反応の迅速性および特異性を向上させるためには２種類以上の第三のプライマーを同時に用いてもよい。これら第三のプライマーは、典型的には第一のプライマーおよび第二のプライマーとは異なる配列からなるが、これらのプライマーと競合しない限りにおいて、部分的に重なる領域にハイブリダイズするものとしてもよい。第三のプライマーの鎖長は、好ましくは２〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは７〜３０ヌクレオチドとされる。
【００３５】
第三のプライマーは、第一のプライマーおよび第二のプライマーによる核酸増幅反応をより迅速に進めるための補助的な働きをその主目的とするものである。従って、第三のプライマーは、第一のプライマーおよび第二のプライマーの各３’末端のＴｍよりも低いＴｍを有するものとすることが好ましい。また、第三のプライマーの増幅反応液への添加量は、第一のプライマーおよび第二のプライマーのそれぞれの添加量よりも少ない方が好ましい。
【００３６】
前記プライマーセットを利用して遺伝子変異の有無を判定するためには、変異にかかるヌクレオチド残基が前記配列（A）、前記配列（B）または前記配列（C）に含まれるようにプライマーセットを設計することができる。また、上記第三のプライマーが前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で１以上のミスマッチを生じるように、第三のプライマーを設計することもできる。これにより、増幅産物の有無を確認することによって前記変異の有無を判定することが可能となり、また、増幅産物を定量することにより前記変異を有する遺伝子の量を決定することが可能となる。
【００３７】
本発明の一つの実施態様によれば、前記プライマーセットは、変異にかかるヌクレオチド残基が前記配列（A）に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試料中の標的核酸配列が鋳型となる場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（A）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中の、変異部位において標的核酸配列とは異なる核酸配列が鋳型となる場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（A）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。変異にかかるヌクレオチド残基は、好ましくは前記配列（A）の５’末端（第一のプライマーにおける３’末端に対応する）に含まれるものとされる。
【００３８】
本発明の他の実施態様によれば、前記プライマーセットは、変異にかかるヌクレオチド残基が前記配列（C）に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試料中の標的核酸配列が鋳型となる場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（C）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中の、変異部位において標的核酸配列とは異なる核酸配列が鋳型となる場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（C）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。変異にかかるヌクレオチド残基は、好ましくは前記配列（C）の５’末端（第二のプライマーにおける３’末端に対応する）に含まれるものとされる。
【００３９】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットは、変異にかかるヌクレオチド残基が前記配列（B）に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試料中の標的核酸配列が鋳型となる場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上の配列（Bc）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中の、変異部位において標的核酸配列とは異なる核酸配列が鋳型となる場合には、核酸増幅反応における上記ステム−ループ構造の形成が困難となるため、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。
【００４０】
上述の配列（B）における変異の検出について、さらに詳細に説明する。図１に示す作用機序において、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズする現象は、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。第一のプライマーによる伸長反応によって生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステム−ループ構造を形成することができる。しかし、このステム−ループ構造は安定的には存在せず、特に、そのステムを形成する配列（B'）と配列（Bc）部分との間に相補的でないヌクレオチドが存在する場合には、非常に不安定となり、あるいは、ステムが全く形成されない。この場合には、鋳型上の配列（A）とプライマー中の配列（Ac'）とのハイブリダイゼーションの方が優位となり、配列（A）の部分が一本鎖とならないため、次の第一のプライマーがアニーリングできなくなる。そのため、図１に示される連続した反応を起こすことが極めて困難となる。
【００４１】
本発明による核酸増幅法では、前記サンプルに含まれる核酸分子を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応が行なわれる。その反応条件は、利用する核酸増幅反応に従って、当業者であれば適宜決定することができる。
【００４２】
前記プライマーセットが等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするものとされる場合には、核酸増幅反応は等温下で行なうことが好ましい。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。さらに、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。一定の温度条件下での核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、この核酸増幅反応において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。
【００４３】
核酸増幅反応に用いられるポリメラーゼは、鎖置換（strand displacement）活性（鎖置換能）を有するものであることが好ましく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus、以下「Ｂ．ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Bacillus caldotenax、以下「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。核酸増幅反応において使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、Vent DNAポリメラーゼ、Vent (Exo-) DNAポリメラーゼ、DeepVent DNAポリメラーゼ、DeepVent (Exo-) DNAポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Z-Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Pfu turbo DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、9°Nm DNAポリメラーゼ、Therminater DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
【００４４】
核酸増幅反応に用いられるその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド(dimethyl sulfoxide)やベタイン（N,N,N-trimethylglycine）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。
【００４５】
核酸増幅反応において、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度（Tm）は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、この融解温度を変化させることができ、従って、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。一般的な融解温度調整剤は、融解温度を下げる効果を有する。このような融解温度調整剤を添加することにより、２本の核酸の間の二本鎖形成部分の融解温度を下げることができ、換言すれば、その二本鎖形成の強度を下げることが可能となる。従って、前記核酸増幅反応においてこのような融解温度調整剤を反応溶液中に添加すると、強固な二本鎖を形成するＧＣの豊富な核酸領域や複雑な二次構造を形成する領域において効率的に二本鎖部分を一本鎖とすることが可能となり、これにより、プライマーによる伸長反応が終わった後に次のプライマーが目的領域にハイブリダイズしやすくなるため、核酸の増幅効率を上げることができる。本発明において用いられる融解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適切に選択される。従って、融解温度調整剤は特に制限されるものではないが、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせとされ、より好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とされる。
【００４６】
さらに、核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類などの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。
【００４７】
さらに、核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されないが、好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの２種以上の混合物とされる。
【００４８】
本発明の好ましい実施態様によれば、核酸増幅反応はミスマッチ認識タンパク質の存在下で行なわれ、これにより、より正確な変異型遺伝子または野生型遺伝子の特異的な増幅が可能となる。
【００４９】
細菌や酵母等には、ＤＮＡの２本鎖において部分的に対合できない（ミスマッチ）塩基対が生じたときに、これを修復するための機構があることが既に知られている。この修復は「ミスマッチ結合タンパク質」（「ミスマッチ認識タンパク質」とも称される）と呼ばれるタンパク質によって行なわれるものであり、ＭｕｔＳタンパク質（特表平９−５０４６９９号公報）、ＭｕｔＭタンパク質（特開２０００−３００２６５号公報）、ＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）に結合したＭｕｔＳタンパク質（国際公開第９９／０６５９１号パンフレット）などの様々なミスマッチ結合タンパクの使用が報告されている。さらに、近年、ミスマッチ結合タンパク質を利用してミスマッチを検出する遺伝子診断法が開発されている（M. Gotoh et al., Genet. Anal., 14, 47-50, 1997）。核酸中における特定のヌクレオチドにおける多型および突然変異の検出法としては、例えば、変異のない対照核酸と、変異が存在することが疑われる被検核酸とをハイブリダイズさせ、そこにミスマッチ認識タンパク質を導入することによりミスマッチを検出する方法が知られている。
【００５０】
本発明において「ミスマッチ」とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））から選択される一組の塩基対が正常な塩基対（ＡとＴの組み合わせ、またはＧとＣの組み合わせ）ではないことを意味する。ミスマッチには、１つのミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチ、１または複数の塩基の挿入および／または欠失により生じるミスマッチ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
【００５１】
変異型遺伝子または野生型遺伝子の特異的増幅のための核酸増幅反応においても、これらのミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、その特異性（正確さ）を向上させることができる。核酸増幅反応においては、相互に相補的でない２つのヌクレオチド配列の間で少量のヘテロ二本鎖構造が生ずることがある。本発明において「ヘテロ二本鎖構造」とは、実質的には相補的な二本鎖構造であるが、１または複数のミスマッチを有することにより非相補的な領域を含む二本鎖構造を意味する。このようなヘテロ二本鎖構造により、本来的には生成しないはずの誤った増幅産物がもたらされる。そこで、核酸増幅反応に用いられる反応液中にミスマッチ結合タンパク質を添加しておけば、上記のようなヘテロ二本鎖構造にこのミスマッチ結合タンパク質が結合し、その後の増幅反応が妨げられる。従って、ミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、誤った増幅産物の生成を防ぐことが可能となる。
【００５２】
本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸におけるミスマッチを認識し、そのミスマッチの部位に結合することが可能なタンパク質であればよく、例えば、当業者に公知のいずれのものであってもよい。また、本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸中のミスマッチを認識しうる限り、野生型タンパク質のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質（変異体）であってもよい。このような変異体は、自然界において生じることもあるが、人為的に作製することも可能である。タンパク質にアミノ酸変異を導入する方法としては、多くの方法が知られている。例えば、部位特異的変異導入法としては、 W.P. DengとJ.A. Nickoloffの方法（Anal. Biochem., 200, 81, 1992）、K.L. MakamayeとF. Ecksteinの方法（Nucleic Acids Res., 14, 9679-9698, 1986）などが知られており、ランダム変異導入法としては、基本的な修復系を欠損した大腸菌 XL1-Red 株（Stratagene社）を用いる方法、亜硝酸ナトリウム等を用いて化学的に塩基を修飾する方法（J.-J. Diaz et al., BioTechnique, 11, 204-211, 1991）などが知られている。このようなミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＭ、ＭｕｔＳおよびそれらの類似体など、多くのものが知られている（Radman,M.et al.,Annu.Rev.Genet.20:523-538(1986);Radaman,M.etal.,Sci.Amer.,August 1988,pp40-46;Modrich,P.,J.Biol.Chem.264:6597-6600(1989)； Lahue,R.S. et al.,Science 245:160-164(1988);Jiricny,J.et al,.Nucl.Acids Res.16:7843-7853(1988);Su,S.S.et al.,J.Biol.Chem.263;6829-6835(1988);Lahue,R.S.et al.,Mutat.Res.198:37-43(1988);Dohet,C.et al.,Mol.Gen.Gent.206:181-184(1987); Jones,M.et al.,Gentics 115:605-610(1987)； Salmonella typhimuriumのＭｕｔｓ（Lu,A.L.,Genetics 118:593-600(1988);HaberL.T. et al.,J.Bacteriol.170:197-202(1988);Pang,P.P.et al.,J.Bacteriol.163:1007-1015(1985)）；およびPriebe S.D.et al.,J.Bacterilo.170:190-196(1988)）。本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、好ましくはＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、または酵母に由来するものとされ、より好ましくはＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、またはＭｕｔＬとされる。
【００５３】
ミスマッチ結合タンパク質は、一本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマッチ結合タンパク質の一本鎖核酸への結合は、一本鎖結合タンパク質により阻害されることが知られている。従って、核酸増幅反応においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、一本鎖結合タンパク質を併用することが好ましい。また、ミスマッチ結合タンパク質は、ミスマッチを含まない二本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマッチ結合タンパク質の誤った結合は、あらかじめ活性剤を用いてミスマッチ結合タンパク質を活性化しておくことにより阻害されることが知られている。従って、核酸増幅反応においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、活性剤によりあらかじめ活性化されたものを用いることが好ましい。
【００５４】
一本鎖核酸にミスマッチ結合タンパク質が結合するのを阻害するために使用する一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）は、当技術分野において公知の任意のＳＳＢとすることができる。好ましいＳＳＢとしては、エシェリキア・コリ、ショウジョウバエ、およびアフリカツメガエルに由来する一本鎖結合タンパク質、およびＴ４バクテリオファージ由来の遺伝子３２タンパク質、ならびに他の種に由来するこれらの相当物が挙げられる。この場合に使用されるミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、ＨｅｘＡ、ＭＳＨ１〜６、Ｒｅｐ３、ＲＮａｓｅＡ、ウラシル−ＤＮＡグリコシダーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼVII、レゾルバーゼなどが挙げられ、好ましくはＭｕｔＳ、ＭＳＨ２もしくはＭＳＨ６、またはこれらの２種以上の混合物とされ、より好ましくはＭｕｔＳとされる。
【００５５】
ミスマッチ結合タンパク質を活性化するための活性剤は、当業者であれば適宜選択することができるため、特に限定されないが、好ましくは、ＡＴＰ(アデノシン５'−三リン酸)、ＡＤＰ(アデノシン５'−二リン酸)、ＡＴＰ−γ−Ｓ(アデノシン５'−Ｏ−(３−チオ三リン酸))、ＡＭＰ−ＰＮＰ(アデノシン５'−[β,γ−イミド]三リン酸)などの化合物とされ、あるいは、ミスマッチ結合タンパク質に結合できるヌクレオチドの一つとされる。ミスマッチ結合タンパク質の活性化は、ミスマッチ結合タンパク質と活性剤とを、室温で数秒間から数分間インキュベートすることにより行うことができる。
【００５６】
本発明による核酸増幅法では、前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応が行なわれる。この核酸増幅反応は、上記の核酸増幅反応によって得られる反応液の全部または一部をサンプルとして、上記と同様の条件下で実施することができる。より具体的には、核酸増幅反応によって得られる反応液に、必要に応じてプライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰミックス、緩衝液等の試薬を添加して新たな反応液を調製し、これを用いて核酸増幅反応を行なうことができる。本発明の好ましい実施態様によれば、このような増幅産物を鋳型とする核酸増幅反応は２回以上繰り返される。
【００５７】
核酸増幅法によって得られた増幅産物の存在は、多くのあらゆる方法により検出することができる。一つの方法は、一般的なゲル電気泳動による特定のサイズの増幅産物の検出である。この方法では、例えば、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン等の蛍光物質により検出できる。他の方法としては、ビオチンのような標識を有する標識プローブを用い、これを増幅産物にハイブリダイズさせることにより検出することもできる。ビオチンは、蛍光標識されたアビジン、ペルオキシダーゼのような酵素に結合したアビジン等との結合により検出可能である。さらに別の方法としては、免疫クロマトグラフを用いる方法がある。この方法では、肉眼で検出可能な標識を利用したクロマトグラフ媒体を用いることが考案されている（イムノクロマトグラフィー法）。上記増幅断片と標識プローブとをハイブリダイズさせ、該増幅断片のさらに異なる配列とハイブリダイズ可能な捕捉用プローブをクロマト媒体に固定しておけば、その固定した部分でトラップすることができ、クロマト媒体での検出が可能となる。その結果、肉眼的にシンプルな検出が可能となる。さらに、本発明者らによる核酸増幅法では、核酸増幅反応における増幅効率が非常に高いため、増幅の副産物としてピロリン酸が生じることを利用して、増幅産物を間接的に検出することもできる。このような方法としては、例えば、ピロリン酸が反応溶液中のマグネシウムと結合することによりピロリン酸マグネシウムの白色沈澱が生じることを利用して、反応溶液の白濁を目視で観察する方法がある。また、他の方法としては、ピロリン酸がマグネシウムなどの金属イオンと強く結合して不溶性塩を形成することにより、反応溶液中のマグネシウムイオン濃度が著しく減少することを利用する方法がある。この方法では、マグネシウムイオン濃度に応じて色調が変化する金属指示薬（例えば、Eriochrome Black T、Hydroxy Naphthol Blue等）を反応溶液に添加しておくことにより、反応溶液の色の変化を目視で観察することにより、増幅の有無を検出することが可能となる。さらに、Calceinなどを利用することにより、増幅反応に伴う蛍光の増大を目視で観察することができるため、リアルタイムでの増幅産物の検出が可能となる。
【００５８】
本発明による核酸増幅法によって得られた増幅産物の存在は、増幅産物の生成に起因する固相担体の凝集を観察することによって検出することもできる。このような検出を行なう場合には、核酸増幅反応に用いられるプライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーを、固相担体または固相担体と結合可能な部位（基）を含んでなるものとされる。固相担体または固相担体と結合可能な部位は、プライマーの３’末端部、５’末端部、中央領域など、いかなる部分に導入されたものであってもよいが、好ましくは５’末端部に導入されたものとされる。あるいは、核酸増幅反応において用いられる基質を、固相担体または固相担体と結合可能な部位を含んでなるものとしてもよい。
【００５９】
本発明に用いられる固相担体としては、核酸増幅反応に用いられる反応溶液に不溶性の担体、または増幅の前後において液相から固相（ゲル相）もしくは固相（ゲル相）から液相に性状が変化する相転移性担体であれば、いずれも使用することが可能である。好ましい固相担体としては、水不溶性有機高分子担体、水不溶性無機高分子担体、合成高分子担体、相転移性担体、金属コロイド、磁性粒子等が挙げられ、さらには、溶媒不溶性有機高分子担体、溶媒不溶性無機高分子担体、溶媒可溶性高分子担体、ゲル高分子担体等が挙げられる。さらに、水不溶性有機高分子としては、例えば、多孔質シリカ、多孔質ガラス、珪藻土、セライトなどの珪素含有物質、ニトロセルロース、ヒドロキシアパタイト、アガロース、デキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの多糖類の架橋体、メチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼインなどのタンパク質の架橋体、ゲル状粒子、染料ゾル等が挙げられる。水不溶性無機高分子としては、例えば、酸化アルミニウム、酸化チタン、セラミック粒子等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアクリロニトリルまたはこれらの共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。金属コロイドとしては、金コロイド等が挙げられる。磁性粒子としては、磁性酸化鉄のビーズ、磁性酸化鉄の微粉砕粒子を表面に有する単分散、超常磁性粒子（特表平４−５０１９５９号公報）、重合性シラン被膜によって覆われた超常磁性酸化鉄を有する磁気応答粒子（特公平７−６９８６号公報）、有機ポリマー中に封入された微粉末状の磁化可能な粒子等が挙げられる。磁性化された固相担体は、固体と液体との分離を磁力を利用して簡単に行うことができる。固相担体の形状としては、粒子、膜、繊維状、フィルター等が挙げられる。固相担体の形状としては粒子が特に好ましく、その表面は多孔質または非多孔質のいずれであってもよい。特に好ましい固相担体としては、合成高分子担体が水などに均一に分散されたラテックス、金コロイドなどの金属コロイド粒子、マグネットビーズなどの磁性粒子等が挙げられる。
【００６０】
プライマーまたは基質の固相担体への固定化は当業者に公知の方法によって行なうことができ、物理的な結合または化学的な結合のいずれによる方法であってもよい。プライマーまたは基質の固相担体への固定化は、例えば、一般的にプライマーやプローブなどのオリゴヌクレオチドを標識化しうる物質と、これに結合可能な物質を結合させた固相担体とを組み合わせて行なうことができる。このような目的で用いられる物質の組み合わせは、当技術分野において周知のものを用いることができ、例えば、ビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジンとの組み合わせ、抗原とこれに結合しうる抗体との組み合わせ、リガンドとこれに結合しうるレセプターとの組み合わせ、相互にハイブリダイズする２つの核酸の組み合わせ等が挙げられる。具体的には、例えば、ビオチンで標識したプライマーまたは基質を、アビジンもしくはストレプトアビジンで表面をコートした固相担体に結合させることにより、プライマーまたは基質を固相担体に固定化することができる。前記抗原としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ＤＮＰ等のハプテンが挙げられ、これらと結合しうる抗体としては、抗ＦＩＴＣ抗体、抗ＤＩＧ抗体、抗ＤＮＰ抗体等の抗体が挙げられる。また、これらの抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよい。特に、ビオチンとストレプトアビジンとの結合は特異性が高く、結合効率も良好であるため、これらの組み合わせは特に好ましい。ビオチン、ハプテン、リガンド等の標識物質は、いずれも単独で、あるいは必要であれば複数の組み合わせで、公知の手段（特開昭５９−９３０９９号公報、特開昭５９−１４８７９８号公報、および特開昭５９−２０４２００号公報を参照のこと）により、プライマーの５’末端部に導入することができる。
【００６１】
本発明に用いられる固相担体と結合可能な部位（または基）は、プライマーまたは基質の固相担体への固定化のために用いられる上述の方法に従って選択することができ、従って、固相担体との物理的な結合を可能とするものまたは化学的な結合を可能とするもののいずれであってもよいが、好ましくは特異的結合を可能とするものとされる。このような固相担体と結合可能な部位としては、上述のような、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗原、抗体、リガンド、レセプター、核酸、タンパク質などが挙げられ、好ましくはビオチンまたはストレプトアビジンとされ、より好ましくはビオチンとされる。このような部位を含むプライマーまたは基質を用いることにより、核酸増幅反応を行なった後に、増幅産物に上記固相担体を結合させることが可能となる。この場合において用いられる固相担体は、必要に応じて、プライマーまたは基質に含まれる前記部位の結合相手を含むものとすることができる。このような結合相手は、プライマーまたは基質に含まれる前記部位との結合が可能な形で存在するものであり、好ましくは固相担体の表面上に存在するものとされ、より好ましくは固相担体の表面上に塗布されたものとされる。
【００６２】
本発明による核酸増幅法は高い特異性と検出感度を有するため、サンプルを被験者に由来する検体とし、増幅の対象を疾患に関連する変異を有する変異型遺伝子または病原体に含まれる遺伝子とすることによって、前記検体中に含まれる微量の疾患関連細胞または病原体を検出することが可能となる。
【００６３】
従って、本発明によれば、被験者に由来する検体から疾患に関連する細胞を検出する方法が提供され、該方法は、（ａ）前記疾患に関連する変異を有する変異型遺伝子上の２以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマーおよび同遺伝子上の１以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、変異型遺伝子中の変異にかかるヌクレオチド残基が前記領域のうちの１以上の領域に含まれる、プライマーセットを用意する工程、（ｂ）前記検体に含まれる核酸分子を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程、（ｃ）前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程、ならびに（ｄ）増幅産物を検出する工程を含んでなる。この方法では、工程（ｄ）において増幅産物が検出された場合に、前記疾患に関連する細胞が検出されたことが示される。
【００６４】
疾患に関連する細胞は、その疾患に関連する遺伝子変異、好ましくはその疾患に特異的な遺伝子変異を有するものであり、目的とする疾患に応じて当業者により適宜選択される。様々な疾患についてこれに関連する遺伝子変異が知られており、当業者であればこれらの疾患と遺伝子変異との組み合わせを適宜利用することが可能である。このような遺伝子変異としては、例えば、鎌状赤血球症に特異的なβグロビン遺伝子における変異、癌に特異的なｐ５３遺伝子における変異などが挙げられる。
【００６５】
遺伝病として知られる鎌状赤血球症に特異的なβグロビン遺伝子の変異としては、第７コドンにおけるGAGからGTGへの変異が挙げられ、この一塩基変異により、発現されるβ−グロビンの６番目のアミノ酸がグルタミン酸からバリンへ置換される。よって、この変異を有する変異型βグロビン遺伝子を特異的に増幅することにより、鎌状赤血球症に関連する細胞を検出することができる。
【００６６】
癌細胞に特異的な遺伝子変異は数多く知られているが、中でも最も多いのがｐ５３遺伝子の変異である。この遺伝子から発現するｐ５３タンパク質は転写因子の一つであり、細胞周期、アポトーシス、およびＤＮＡ修復の制御を行ない、個体レベルでの変異の蓄積（癌化など）を防ぐ役割を果たしている。ヒトの癌では、その５０％以上の症例においてｐ５３遺伝子の変異が見られ、その中の８０％がアミノ酸置換を伴う点突然変異である。この変異率は他に知られている癌遺伝子と比較してかなり高くなっている。ｐ５３タンパク質はＤＮＡ結合タンパク質であり、癌で見られる変異の多くはＤＮＡ結合ドメインに集中している。さらに、ｐ５３遺伝子の中でも際だって変異の集中するホットスポットが報告されている（Lopez M et al., Use of cytological specimens for p53 gene alteration detection in oral squamous cell carcinoma risk patients. Clin. Oncol. (R Coll Radiol). 2004 Aug; 16(5): 366-70；Soussi T et al., Reassessment of the TP53 mutation database in human disease by data mining with a library of TP53 missense mutations, Hum. Mutat. 25(1): 6-17, 2004；Sudhir Srivastava, et al., Biomarkers for Early Detection of Colon Cancer, Clinical Cancer Research vol. 7, 1118, 2001；Thierry Soussi, et al., Significance of TP53 Mutation in Human Cancer: A Critical Analysis of Mutations at CpG Dinucleotides, Human. Mutation Vol.21, 192, 2003）。また、臓器によって変異の頻度や変異のおこりやすい位置は異なる。ヒトの癌の中で、ｐ５３遺伝子の変異の頻度が高いものは、肺癌、大腸癌、膵臓癌などであり、これらの癌の７０％近くに変異が見られる。例えば、大腸癌に多く見られるｐ５３遺伝子中の変異は、第１７５コドン、第２４８コドン、および第２７３コドンに見られるＣＧでの変異であり、次いで第１９６コドン、第２１３コドン、第２４５コドン、第２８２コドンなどに変異が集中する傾向がある。点突然変異の種類にも明確な傾向があり、圧倒的にＧＣからＡＴへのトランスバージョンが多い。本発明による疾患関連細胞の検出法においては、このような変異のいずれか１つまたは２以上の組み合わせを有する変異型遺伝子を特異的に増幅することにより、癌細胞を検出することができる。
【００６７】
さらに、本発明によれば、被験者に由来する検体から病原体を特異的に検出する方法が提供され、該方法は、（ａ）検出しようとする目的の病原体に含まれる遺伝子上の２以上の特異的領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマー、および同遺伝子上の１以上の特異的領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマーを含んでなるプライマーセットを用意する工程、（ｂ）前記検体に含まれる核酸分子を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程、（ｃ）前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程、ならびに（ｄ）増幅産物を検出する工程を含んでなる。この方法では、工程（ｄ）において増幅産物が検出された場合に、目的の病原体株が検出されたことが示される。
【００６８】
病原体としては、病原性を有する細菌、真菌、ウイルスなどを挙げることができる。目的の病原体に含まれる遺伝子上の特異的領域は、該遺伝子の配列と検体中に含まれる核酸の配列とを比較することにより容易に選択することができる。また、病原体には、野生型遺伝子を有する野生株だけでなく、変異型遺伝子を有する変異株が存在することがある。このような変異株としては、野生株との間における遺伝子配列の相違点とともに様々なものが知られている。本発明による方法によれば、このような野生株および変異株の全部または一部を同時に検出することができ、あるいはそれらの１種のみを特異的に検出することもできる。例えば、病原体の複数の株を同時に検出する場合には、これらの株に共通し、かつ他の株または検体中に含まれる核酸には見られない配列を有する領域を上記特異的領域として用いることができる。また、病原体の単一の株のみを特異的に検出する場合には、他の株または検体中に含まれる核酸には見られず、かつ目的の病原体株のみに見られる配列を有する領域を上記特異的領域として用いることができる。
【００６９】
特に、病原体の野生株および変異株のうちの１種のみを特異的に検出するためには、変異にかかるヌクレオチド残基が前記特異的領域のうちの１以上の領域に含まれるようにプライマーセットを設計することができる。例えば、本発明者らによって開発された核酸増幅法を用いる場合には、変異にかかるヌクレオチド残基が前記配列（A）、前記配列（B）または前記配列（C）に含まれるようにプライマーセットを設計することができる。また、上記第三のプライマーが前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で１以上のミスマッチを生じるように、第三のプライマーを設計することもできる。これにより、増幅産物の有無を確認することによって目的の病原体株の有無を判定することが可能となり、また、増幅産物を定量することにより該病原体株の量を決定することが可能となる。
【００７０】
本発明による疾患関連細胞または病原体の検出法の各工程は、本発明による核酸増幅法について上述したように実施することができる。
【００７１】
本発明による疾患関連細胞または病原体の検出法において前記疾患関連細胞または病原体が検出された場合には、被験者がその疾患またはその病原体株による感染症に罹患しているものと判断することができる。従って、本発明によれば、被験者における疾患を診断する方法が提供され、該方法は、本発明による疾患関連細胞または病原体の検出法の全工程を含んでなる。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７３】
実施例１：野生型および変異型のβグロビン遺伝子が混在するサンプルからの前記変異型遺伝子の検出
本実施例では、野生型ヒトβグロビン遺伝子と一塩基置換を含む変異型ヒトβグロビン遺伝子とを含むサンプルから、前記変異型遺伝子を特異的に増幅し、これを検出した。
【００７４】
一塩基変異のモデルを作製するため、ヒトβグロビン遺伝子中の特定の領域において一塩基変異を含むような長鎖合成オリゴヌクレオチドと、一塩基変異を含まない長鎖合成オリゴヌクレオチドとを合成した。さらに、これら長鎖合成オリゴヌクレオチドをＰＣＲ法でそれぞれ増幅し、一塩基変異を含まない野生型ＤＮＡと一塩基変異を含む変異型ＤＮＡの増幅産物を得た。配列決定して変異部分のヌクレオチド残基を確認した後、これら増幅産物をテンプレートとして以下の実験に使用した。
【００７５】
野生型の増幅産物のヌクレオチド配列（配列番号１）を図４に示す。図４において、囲み枠を付した残基が変異にかかる残基であり、この残基は変異型の増幅産物では「ｔ」である。
【００７６】
プライマーとしては、下記の配列を有する野生型ＤＮＡ検出用プライマーペアおよび変異型ＤＮＡ検出用プライマーペアを用いた。これらのプライマーの設計に用いられたテンプレート上の領域は、図４に下線部分として示されている。
【００７７】
野生型ＤＮＡ検出プライマー：
F1-W：5'-gatgctccatacaactgtgttcactagcaa-3'（配列番号２）；
R1：5'-ggatatatatatatcccttcaccacgttcaccttg-3'（配列番号４）。
【００７８】
変異型ＤＮＡ検出プライマー：
F1-M：5'-gatgcaccatacaactgtgttcactagcaa-3'（配列番号３）；
R1：5'-ggatatatatatatcccttcaccacgttcaccttg-3'（配列番号４）。
【００７９】
フォワードプライマーF1-Wは、その３’末端側にある配列（２０ｍｅｒ：下線部）が鋳型にアニーリングし、５’末端側にある配列（１０ｍｅｒ：下線部以外）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、該プライマーの３’末端残基の１６塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするように設計されている。フォワードプライマーF1-Mは、５’末端から６番目に変異にかかるＴ残基を有することを除いて、プライマーF1-Wと同一のヌクレオチド配列を有するものである。リバースプライマーR1は、その３’末端側にある配列（１９ｍｅｒ：下線部）が鋳型にアニーリングし、５’末端側にある配列（１６ｍｅｒ：下線部以外）がその領域内で折り畳まれる構造をとるように設計されている。
【００８０】
上記の野生型ＤＮＡ、変異型ＤＮＡ、またはその混合物を鋳型とし、それぞれの鋳型について、野生型ＤＮＡ検出用プライマーペアまたは変異型ＤＮＡ検出用プライマーペアを用いた核酸増幅反応を行なった。具体的には、次の組成を有する反応液（２５μＬ）：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ，ｐＨ８．８）、ＫＣｌ（１０ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（８ｍＭ）、ＤＭＳＯ（３％）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（１％）、ｄＮＴＰ（１．４ｍＭ）、ＭｕｔＳ（１μｇ）、それぞれ２０００ｎＭの上記のプライマー対、上記の鋳型（１０−１９ｍｏｌ／ｔｕｂｅ（約６００００分子））、サイバーグリーン（０．０１μｌ／ｍｌ）、および１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）を含有；を調製し、これを６０℃で２０分間インキュベートした。その後、反応液から１μｌをとり、これを鋳型溶液として用いて上記と同様の組成を有する反応液２５μｌに調製し（希釈工程）、再度６０℃で２０分間インキュベートした。その後、さらにもう一度同様の希釈工程およびインキュベート工程を行った。鋳型は二本鎖のまま反応させた。これらの反応は、リアルタイムＰＣＲ装置（ストラタジーン社製）を用いて行った。
【００８１】
３回目の核酸増幅反応における増幅量の経時変化を図５に示す。表１は、核酸増幅を行った結果をまとめたものである。この表において、増幅反応の結果は、増幅産物の増加速度が速いもの（グラフにおいて曲線の立ち上がりが速いもの）から順に、＋＋＋，＋＋，＋，および±とし、全く増幅が見られなかったものを−とした。なお、図５に記載されているサンプル番号は、表１に記載のサンプル番号に対応している。
【００８２】
【表１】
2008048603.tif 000002
【００８３】
図５および表１によれば、野生型ＤＮＡ検出用プライマーペアは野生型ＤＮＡのみを特異的に検出し、変異型ＤＮＡ検出用プライマーペアは変異型ＤＮＡのみを特異的に検出することが確認された。また、変異型ＤＮＡが野生型ＤＮＡの５０００分の１しか存在しないサンプルについても、変異型ＤＮＡを検出できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、第一のプライマーを用いた核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図である。
【図２】図２は、第二のプライマーの構造を例示した図である。
【図３ａ】図３ａは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを用いた核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図である。
【図３ｂ】図３ｂは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを用いた核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図である。
【図４】図４は、ヒトβグロビン遺伝子に含まれるヌクレオチド配列（配列番号１）、ならびに実施例１において用いられた変異の部位およびプライマーの設計に用いられた領域を示す図である。
【図５】図５は、実施例１における３回目の核酸増幅反応の経時変化を示すグラフである。
【図１】
2008048603.tif 000003
【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2008048603000001.app