(57)【要約】【課題】卵子活性化用培地の製造方法、当該方法により製造される卵子活性化用培地、当該培地を用いた卵子の活性化方法、および当該製造方法に使用する組成物を提供すること。【解決手段】カルシウム含有培養培地にキレート剤を添加するこうていを包含する卵子活性化用培地の製造方法、当該方法により製造される卵子活性化用培地、当該培地を用いた卵子の活性化方法、および当該製造方法に使用する組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム含有培養培地にキレート剤を添加する工程を包含する、卵子活性化用培地の製造方法であって、卵子活性化用培地がさらにストロンチウムを含有する、方法。
【請求項２】
キレート剤がエチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＥＧＴＡの終濃度範囲の下限が培地中のカルシウムイオン濃度に基づいて決定され、上限が培地中のカルシウムイオン濃度およびストロンチウムイオン濃度の合計に基づいて決定される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＥＧＴＡを終濃度１〜５ｍＭで添加する、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
卵子活性化用培地中のストロンチウムの終濃度が１〜２０ｍＭである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
カルシウム含有培養培地が０．５〜５ｍＭのカルシウムを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
製造された卵子活性化用培地を使用した場合の卵子の死滅率がカルシウム不含培地を使用した場合の卵子の死滅率より低い、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
活性化された卵子が最終発生する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の方法により製造される、卵子活性化用培地。
【請求項１０】
請求項９記載の卵子活性化用培地中で卵子を活性化する工程を包含する、卵子の活性化方法。
【請求項１１】
キレート剤を含有する、請求項１〜８のいずれか１項記載の卵子活性化用培地の製造方法に使用する、組成物。
【請求項１２】
カルシウム含有培養培地中で卵子を培養する工程、およびカルシウム含有培養培地にさらにカルシウムイオンに対する優先性を有するキレート剤およびストロンチウムを加えて卵子を培養する工程を包含する、卵子の活性化方法。
【請求項１３】
前記卵子が核移植後の卵子である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
カルシウム含有培養培地、カルシウムイオンに対する優先性を有するキレート剤、およびストロンチウムを含む、卵子活性化用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵子活性化用培地の製造方法、当該方法により製造される卵子活性化用培地、当該培地を用いた卵子の活性化方法、および当該製造方法に使用する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
排卵された哺乳動物の卵子は、受精に際しての一連のカルシウム振動（Ca2+ oscillation）により卵子減数分裂の再開が誘導されるまで第２分裂中期で停止している（非特許文献１）。この精子誘導性カルシウム振動はイノシトール三リン酸（Ｉｎｓｐ３）レセプターによって媒介される（非特許文献２、３）。この振動によって引き起こされる活性化事象は、表層粒放出、減数分裂の完了（第二極体の放出を伴う）および前核形成を含む。人工的活性化に関する研究によって、受精および細胞シグナリングの機構の理解が進んでいる。また、精子を使用しない人工的な卵子の活性化が、現在の補助繁殖技術、特に体細胞核移植および円形精子細胞注入（ＲＯＳＩ）のために必要である（非特許文献４、５）。
【０００３】
現在までに、エタノール、電気刺激およびカルシウムイオノフォアを含む多くの人工的活性化法が開発されている（非特許文献６）。しかし、大部分の単為生殖剤はカルシウムイオンの単調な増加を引き起こすのみである。一方、ストロンチウムイオンを含有する培地は、受精におけるような反復性の細胞内カルシウム振動を誘導する（非特許文献７、８）。従って、ストロンチウム誘導性卵子活性化は、精子によって誘導される活性化を完全には模倣していなものの、正常受精後の活性化に類似していると考えられている（非特許文献９、１０）。現在、特にマウスにおいてストロンチウム誘導性卵子活性化が、円形精子細胞注入（ＲＯＳＩ）（非特許文献１１および１２）および体細胞核移植（非特許文献４、１３）後の満期発生のために広く使用されている。最近の研究により、ストロンチウム誘導性卵子活性化がマウス以外の哺乳動物にも適用可能であることが実証されている（非特許文献１４〜１８）。
【０００４】
ストロンチウム誘導性卵子活性化は以前から知られていたが（非特許文献１９、２０）、ストロンチウムイオンによる卵子活性化の分子機構は十分には解明されていなかった。最近の研究により、ＶＩＩＩ型アデニル酸シクラーゼの刺激（非特許文献２１）、カルシウム依存性カルシウム放出（非特許文献１０）といったいくつかの方法によって、ストロンチウムイオンが細胞内の貯蔵カルシウムを放出させ得ることが示されている。効率的なストロンチウム誘導性卵子活性化にはカルシウム不含培地が必要とされる（非特許文献２０）が、カルシウムイオンによるストロンチウム誘導性卵子活性化の干渉が何に起因するかは本願以前には知られていなかった。
【０００５】
このように、ストロンチウム誘導性卵子活性化に及ぼすカルシウムの悪影響を簡便かつ効果的に排除するための方法が求められていた。
【０００６】
【非特許文献１】Cuthbertson KS, Cobbold PH. Phorbol ester and sperm activate mouse oocytes by inducing sustained oscillations in cell Ca2+. Nature 1985; 316: 541-542.
【非特許文献２】Miyazaki S, Yuzaki M, Nakada K, Shirakawa H, Nakanishi S, Nakade S, Mikoshiba K. Block of Ca2+ wave and Ca2+ oscillation by antibody to the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor in fertilized hamster eggs. Science 1992; 257: 251-255.
【非特許文献３】Miyazaki S, Shirakawa H, Nakada K, Honda Y. Essential role of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor/Ca2+ release channel in Ca2+ waves and Ca2+ oscillations at fertilization of mammalian eggs. Dev Biol 1993; 158: 62-78.
【非特許文献４】Wakayama T, Perry AC, Zuccotti M, Johnson KR, Yanagimachi R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 1998; 394: 369-374.
【非特許文献５】Yanagimachi R. Intracytoplasmic injection of spermatozoa and spermatogenic cells: its biology and applications in humans and animals. Reprod Biomed Online 2005; 10: 247-288.
【非特許文献６】Marcus GJ. Activation of cumulus-free mouse oocytes. Mol Reprod Dev 1990; 26: 159-162.
【非特許文献７】Bos-Mikich A, Swann K, Whittingham DG. Calcium oscillations and protein synthesis inhibition synergistically activate mouse oocytes. Mol Reprod Dev 1995; 41: 84-90.
【非特許文献８】Kline D, Kline JT. Repetitive calcium transients and the role of calcium in exocytosis and cell cycle activation in the mouse egg. Dev Biol 1992; 149: 80-89.
【非特許文献９】Kline D. Activation of the mouse egg. Theriogenology 1996; 45: 81-90.
【非特許文献１０】Jellerette T, He CL, Wu H, Parys JB, Fissore RA. Down-regulation of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor in mouse eggs following fertilization or parthenogenetic activation. Dev Biol 2000; 223: 238-250.
【非特許文献１１】Ogura A, Matsuda J, Yanagimachi R. Birth of normal young after electrofusion of mouse oocytes with round spermatids. Proc Natl Acad Sci U S A 1994; 91: 7460-7462.
【非特許文献１２】Kimura Y, Yanagimachi R. Mouse oocytes injected with testicular spermatozoa or round spermatids can develop into normal offspring. Development 1995; 121: 2397-2405.
【非特許文献１３】Kishikawa H, Wakayama T, Yanagimachi R. Comparison of oocyte-activating agents for mouse cloning. Cloning 1999; 1: 153-159.
【非特許文献１４】Okada K, Miyano T, Miyake M. Activation of pig oocytes by intracytoplasmic injection of strontium and barium. Zygote 2003; 11: 159-165.
【非特許文献１５】Kato M, Hirabayashi M, Aoto T, Ito K, Ueda M, Hochi S. Strontium-Induced Activation Regimen for Rat Oocytes in Somatic Cell Nuclear Transplantation J Reprod Dev 2001.
【非特許文献１６】Tomashov-Matar R, Tchetchik D, Eldar A, Kaplan-Kraicer R, Oron Y, Shalgi R. Strontium-induced rat egg activation. Reproduction 2005; 130: 467-474.
【非特許文献１７】Yamazaki W, Ferreira CR, Meo SC, Leal CL, Meirelles FV, Garcia JM. Use of strontium in the activation of bovine oocytes reconstructed by somatic cell nuclear transfer. Zygote 2005; 13: 295-302.
【非特許文献１８】Meo SC, Yamazaki W, Leal CL, de Oliveira JA, Garcia JM. Use of strontium for bovine oocyte activation. Theriogenology 2005; 63: 2089-2102.
【非特許文献１９】Whittingham DG, Siracusa G. The involvement of calcium in the activation of mammalian oocytes. Exp Cell Res 1978; 113: 311-317.
【非特許文献２０】Cuthbertson KS, Whittingham DG, Cobbold PH. Free Ca2+ increases in exponential phases during mouse oocyte activation. Nature 1981; 294: 754-757.
【非特許文献２１】Gu C, Cooper DM. Ca(2+), Sr(2+), and Ba(2+) identify distinct regulatory sites on adenylyl cyclase (AC) types VI and VIII and consolidate the apposition of capacitative cation entry channels and Ca(2+)-sensitive ACs. J Biol Chem 2000; 275: 6980-6986.
【非特許文献２２】Raz V, Fluhr R. Calcium Requirement for Ethylene-Dependent Responses. Plant Cell 1992; 4: 1123-1130.
【非特許文献２３】Chatot CL, Ziomek CA, Bavister BD, Lewis JL, Torres I. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil 1989; 86: 679-688.
【非特許文献２４】O'Neill GT, Rolfe LR, Kaufman MH. Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones. Mol Reprod Dev 1991; 30: 214-219.
【非特許文献２５】Kishigami S, Mizutani E, Ohta H, Hikichi T, Thuan NV, Wakayama S, Bui HT, Wakayama T. Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochem Biophys Res Commun 2006; 340: 183-189.
【非特許文献２６】Kishigami S, Wakayama S, Thuan NV, Ohta H, Mizutani E, Hikichi T, Bui HT, Balbach S, Ogura A, Boiani M, Wakayama T. Production of cloned mice by somatic cell nuclear transfer. Nat Protocols 2006; 1: 125-138.
【非特許文献２７】Kishigami S, Bui HT, Wakayama S, Tokunaga K, Thuan NV, Hikichi T, Mizutani E, Ohta H, Suetsugu R, Sata T, Wakayama T. Successful Mouse Cloning of an Outbred Strain by Trichostatin A Treatment after Somatic Nuclear Transfer. J Reprod Dev 2007; 53: 165-170.
【非特許文献２８】Cavaleri F, Gentile L, Scholer HR, Boiani M. Recombinant human albumin supports development of somatic cell nuclear transfer embryos in mice: toward the establishment of a chemically defined cloning protocol. Cloning Stem Cells 2006; 8: 24-40.
【非特許文献２９】Ma SF, Liu XY, Miao DQ, Han ZB, Zhang X, Miao YL, Yanagimachi R, Tan JH. Parthenogenetic activation of mouse oocytes by strontium chloride: a search for the best conditions. Theriogenology 2005; 64: 1142-1157.
【非特許文献３０】Abramczuk J, Solter D, Koprowski H. The beneficial effect EDTA on development of mouse one-cell embryos in chemically defined medium. Dev Biol 1977; 61: 378-383.
【非特許文献３１】Whittingham DG. Culture of mouse ova. J Reprod Fertil Suppl 1971; 14: 7-21.
【非特許文献３２】Lawitts JA, Biggers JD. Culture of preimplantation embryos. Methods Enzymol 1993; 225: 153-164.
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【非特許文献３４】Martell AE, Smith RM. Critical Stability Constants. New York: Plenum; 1974.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、卵子活性化用培地の製造方法、当該方法により製造される卵子活性化用培地、当該培地を用いた卵子の活性化方法、および当該製造方法に使用する組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
［１］カルシウム含有培養培地にキレート剤を添加する工程を包含する、卵子活性化用培地の製造方法であって、卵子活性化用培地がさらにストロンチウムを含有する、方法；
［２］キレート剤がエチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）である、［１］の方法；
［３］ＥＧＴＡの終濃度範囲の下限が培地中のカルシウムイオン濃度に基づいて決定され、上限が培地中のカルシウムイオン濃度およびストロンチウムイオン濃度の合計に基づいて決定される、［２］の方法；
［４］ＥＧＴＡを終濃度１〜５ｍＭで添加する、［２］または［３］の方法；
［５］卵子活性化用培地中のストロンチウムの終濃度が１〜２０ｍＭである、［４］の方法；
［６］カルシウム含有培養培地が０．５〜５ｍＭのカルシウムを含む、［１］〜［５］のいずれかの方法；
［７］製造された卵子活性化用培地を使用した場合の卵子の死滅率がカルシウム不含培地を使用した場合の卵子の死滅率より低い、［１］〜［６］のいずれかの方法；
［８］活性化された卵子が最終発生する、［１］〜［７］のいずれかの方法；
［９］［１］〜［８］のいずれかの方法により製造される、卵子活性化用培地；
［１０］［９］の卵子活性化用培地中で卵子を活性化する工程を包含する、卵子の活性化方法；
［１１］キレート剤を含有する、［１］〜［８］のいずれかの卵子活性化用培地の製造方法に使用する、組成物、
［１２］カルシウム含有培養培地中で卵子を培養する工程、およびカルシウム含有培養培地にさらにカルシウムイオンに対する優先性を有するキレート剤およびストロンチウムを加えて卵子を培養する工程を包含する、卵子の活性化方法；
［１３］前記卵子が核移植後の卵子である［１２］記載の方法；
［１４］カルシウム含有培養培地、カルシウムイオンに対する優先性を有するキレート剤、およびストロンチウムを含む、卵子活性化用キット、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、卵子活性化用培地の製造方法、当該方法により製造される卵子活性化用培地、当該培地を用いた卵子の活性化方法、および当該製造方法に使用する組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明により、カルシウム含有培養培地にキレート剤を添加する工程を包含する、卵子活性化用培地の製造方法であって、卵子活性化用培地がさらにストロンチウムを含有する、方法が提供される。さらに、当該製造方法により製造される卵子活性化用培地、および当該卵子活性化用培地中で卵子を活性化する工程を包含する卵子の活性化方法が提供される。
【００１１】
本明細書において「卵子活性化用培地」とは、卵子の活性化に使用される培地をいう。本明細書において「卵子の活性化」とは、精子を使用しないで人工的に卵子を活性化することをいう。従って、卵子活性化用培地は、精子を使用しない人工的な卵子の活性化のために使用される培地である。卵子の活性化は、例えば、体細胞核移植、円形精子細胞注入（ＲＯＳＩ）などにおいて用いられる。本発明の卵子活性化用培地は、ストロンチウムを含有する。ストロンチウムの存在下で行う卵子活性化を本明細書において「ストロンチウム誘導性卵子活性化」という。卵子活性化用培地中のストロンチウムの終濃度は、例えば、１〜２０ｍＭ、好ましくは２〜１０ｍＭ、より好ましくは３〜８ｍＭ、さらに好ましくは５ｍＭである。卵子活性化用培地に含まれるストロンチウムはストロンチウムイオンが生じるのであればその形態に限定はなく、例えば、塩化ストロンチウムが挙げられる。
【００１２】
なお、本発明の１つの実施態様において、本発明の卵子の活性化方法は、下記のようなカルシウム含有培養培地中で卵子を培養する工程、およびカルシウム含有培養培地にさらに下記のようなカルシウムイオンに対する優先性を有するキレート剤およびストロンチウムを加えて卵子を培養する工程を包含する。ここで、前記卵子は核移植後の卵子であってもよい。
【００１３】
本発明には、任意の哺乳動物由来の卵子が使用できる。哺乳動物の例としては、限定するものではないが、マウス、ラット、ブタ、ウシなどが挙げられる。
【００１４】
本明細書において「最終発生」とは、活性化された卵子を代理母に移植し、クローン化胚が得られ、正常に生育、離乳することをいう。
【００１５】
本明細書において「カルシウム含有培養培地」とは、カルシウムを含有する任意の細胞培養用培地をいう。カルシウム含有培養培地はカルシウムを含んでいればその成分に限定はなく、市販されているものを使用することができる。その例としては、限定するものではないが、ｍＣＺＢ培地、Ｍ１６培地、ＫＳＯＭおよびα−ＭＥＭ培地が挙げられる。カルシウム含有培養培地に含まれるカルシウムの濃度は、例えば、０．５〜５ｍＭ、好ましくは１〜２．５ｍＭ、より好ましくは１．５〜２．０ｍＭ、さらに好ましくは１．７ｍＭである。カルシウム含有培養培地に含まれるカルシウムはカルシウムイオンを生じるのであればその形態に限定はなく、例えば、塩化カルシウムが挙げられる。
【００１６】
本明細書において「カルシウム不含培地」とは、成分としてカルシウムイオンを含まない任意の細胞培養用培地をいう。このような培地は従来から卵子活性化用培地として使用されており、例としては、カルシウムイオン不含ｍＣＺＢ培地が挙げられる。
【００１７】
本明細書において「キレート剤」とは、金属イオンとキレートを形成する物質をいう。本発明の目的のためには、キレート剤は、カルシウムイオンに対する優先性を有することが好ましい。カルシウムイオンに対する優先性とは、他の金属イオンよりもカルシウムに対して高い安定度定数を示すことをいう。例えば、エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）またはＥＧＴＡの４ナトリウム塩が本発明において使用され得る。ＥＧＴＡは、金属イオンと、金属：試薬分子比１：１の安定なキレート錯体（金属キレート）を形成することが知られている。ＥＧＴＡは膜不透過性Ｃａ２＋キレート剤である（非特許文献２２）。このようなキレート剤を、培地中の終濃度よりも高い濃度で含有する組成物を調製し、本発明の活性化卵子用培地の製造方法に使用することができる。
【００１８】
例えば、カルシウムイオンに対する優先性を示し、金属イオンと、金属：試薬分子比１：１のキレート錯体を形成するＥＧＴＡをキレート剤として使用する場合、ＥＧＴＡの終濃度範囲の下限を培地中のカルシウムイオン濃度に基づいて（培地中のカルシウムイオンによる影響を排除できるように）決定し、上限を培地中のカルシウムイオン濃度およびストロンチウムイオン濃度の合計に基づいて（培地中のストロンチウムイオンによる効果を損なわないように）決定することができる。例えば、培地中に１．７ｍＭの塩化カルシウムおよび５ｍＭの塩化ストロンチウムが含まれる場合、ＥＧＴＡの終濃度範囲の下限を塩化カルシウムイオン濃度（１．７ｍＭ）と同程度の１ｍＭとすることができ、上限をカルシウムイオン濃度およびストロンチウムイオン濃度の合計（６．７ｍＭ）より低い５ｍＭとすることができる。すなわち、この場合、添加するＥＧＴＡの終濃度は例えば１〜５ｍＭであり、好ましくはＥＧＴＡの終濃度は２ｍＭである。
【００１９】
当業者はキレート剤を上記の例示および以下に記載するような本発明者らによる知見に基づいて適切に使用することができる。
【００２０】
本発明者らは、カルシウム不含培地を使用するかわりに、通常のカルシウム含有培養培地においてＥＧＴＡのようなキレート剤を用いてカルシウムイオンをキレート化することによって、ストロンチウムイオン誘導性卵子活性化を増強し得るか否かを検討した。そして、本研究者らは、ＥＧＴＡを添加することによって、３つの標準的な培養培地（ｍＣＺＢ（非特許文献２３）、Ｍ１６（非特許文献３１）、ＫＳＯＭ（非特許文献３２））におけるストロンチウム誘導性卵子活性化の効率が劇的に増加すること、そして一定の（例えば、１〜５ｍＭ）のＥＧＴＡ濃度範囲が効率的な卵子活性化に有効であることを見出した。より詳細には、例えば、２ｍＭのＥＧＴＡを用いて、上記３つの培地全てにおける最高の活性化率が得られ得る。
【００２１】
また、本発明者らは、活性化にＥＧＴＡのようなキレート剤を用いた結果、卵子の死滅がカルシウム不含培地を用いた従来の活性化より有意に少なくなることを見出した。卵子の死滅率は、活性化に供した卵子のうち、その後の培養において死滅した卵子の割合をいう。従来のカルシウム不含培地を用いた卵子活性化における卵子の死滅率に比較して、キレート剤を添加したカルシウム含有培養培地を用いた卵子活性化における卵子の死滅率が低い場合に、本発明の卵子活性化用培地を使用した場合の卵子の死滅率がカルシウム不含培地を使用した場合の卵子の死滅率より低いと判断される。本発明による卵子の死滅率の低下は、ＥＧＴＡが胚毒性効果を有することが知られていたことを考慮すると予想外である（非特許文献３３）。
【００２２】
さらに、本発明者らは、ＥＧＴＡのようなキレート剤を用いた活性化によって、体細胞核移植後に最終発生が達成され得ることを示した。このこともまた、上記のようなＥＧＴＡの有毒性を考慮すると予想外である（非特許文献３３）。
【００２３】
本発明に従ってＥＧＴＡのようなキレート剤を添加することによって通常の培養培地を卵子活性化培地に転換すれば、培養培地に加えて、卵子活性化のための別の培地（すなわち、カルシウム不含培地）を調製することが不要となる。すなわち、任意の市販の培地が容易に卵子活性化のために使用できる。
【００２４】
カルシウム不含培地は効率的なストロンチウム誘導性卵子活性化に重要であることが知られている（非特許文献２０）。本発明者らによる開示は、卵子活性化の増強に関して、カルシウムイオンをキレート化することによって得られる効果が、カルシウム不含培地を使用した場合の効果とほぼ同等であることを示す。キレート剤としてＥＧＴＡを用いる場合、一旦［Ｃａ（ＥＧＴＡ）］２−錯体が形成されれば、カルシウムイオンによってストロンチウム誘導性卵子活性化が干渉されることはないことが本発明者らによって示された。この増強は非常にＥＧＴＡ濃度（例えば、１〜５ｍＭ）依存性である。前記のような濃度は以前の報告において使用された濃度より少なくとも１０倍高い（非特許文献２９、３０）。また、上記のようにＥＧＴＡは胚毒性効果を有することが知られている（非特許文献３３）。それゆえ、活性化期間（例えば、６時間）中に胚を錯体へ曝露することが胚発生の進行に干渉するか否かを調べることが重要である。本発明者らは、ストロンチウム誘導性卵子活性化に１〜２ｍＭのＥＧＴＡを用いても、体細胞核移植によってマウスのクローン化に成功することを示した。このことは、卵子活性化の間のＥＧＴＡの存在が胚発生を妨害しないことを示す。
【００２５】
例えば、５ｍＭ  ＳｒＣｌ２に対して１〜５ｍＭの濃度範囲のＥＧＴＡを使用して、卵子を活性化できることが本発明者らによって示された。上記範囲より高いまたは低いＥＧＴＡ濃度では、卵子活性化の有意な促進が見られない可能性がある。このことは、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡを使用した以前の類似の試みが失敗したことを説明し得る（非特許文献２９）。より低濃度での活性化の場合は、不十分なキレート化によって上記失敗が説明され得る。すなわち、上記のような標準的な培養培地には１．７ｍＭのカルシウムが含まれており、１ｍＭ未満のＥＧＴＡを使用した場合、半分以上のカルシウムイオンがキレート化されないままであり、残存するカルシウムイオンによってストロンチウム誘導性卵子活性化が妨げられると考えられる。
【００２６】
一方、より高い濃度の場合は幾分複雑である。ＥＧＴＡは、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）よりもカルシウムイオンに結合するという強い優先性を示すことが知られている。マグネシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびカルシウムイオンについてのｌｏｇ（安定度定数）は、それぞれ５．２、８．５および１１．０である（非特許文献３４）。すなわち、ＥＧＴＡ４−は、ストロンチウムイオンおよびマグネシウムイオンよりも優先的にカルシウムイオンに結合し、［Ｓｒ（ＥＧＴＡ）］２−および［Ｍｇ（ＥＧＴＡ）］２−は、［Ｃａ（ＥＧＴＡ）］２−錯体よりそれぞれ約３桁および６桁低い安定度定数を示す。それゆえ、培養培地が同レベルの濃度のカルシウムイオン（約１．７ｍＭ）およびストロンチウムイオン（５ｍＭ）を含んでいても、ＥＧＴＡは選択的かつ優先的にカルシウムイオンに結合する。このＥＧＴＡのカルシウムに対する優先性により、効率的な卵子活性化の目的で、ＥＧＴＡを添加したカルシウム含有培養培地をカルシウム不含培地の代わりに使用することができる。しかし、より高濃度のＥＧＴＡ（例えば、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ）はカルシウムイオン（１．７ｍＭ）をキレート化した後にストロンチウムイオン（５ｍＭ）までもキレート化し得る。キレート化されたストロンチウムイオンはもはや卵子を活性化する能力を有しないと考えられる。このスキームは、１０ｍＭ  ＥＧＴＡの存在下でもより多くのストロンチウムイオン（１０ｍＭ）を添加することによって卵子活性化が回復することと一致する。すなわち、卵子活性化のためのＥＧＴＡ濃度は、ストロンチウムイオンのキレート化を回避するように培養培地中に含まれるカルシウムイオンの濃度付近に調整することが望ましい。
【００２７】
本発明者らの研究において、５ｍＭの塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）に対して２ｍＭのＥＧＴＡを添加することによって、試験した３つの標準的な培地（ｍＣＺＢ、Ｍ１６およびＫＳＯＭ）の全てにおいて最高の活性化率が得られた。この結果は、これらの培地が、他の化学成分のイオン濃度が異なるにもかかわらず、１．７ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を共通して含有することと一致する（表１）。それゆえ、任意の他の培地において、卵子活性化のために添加すべきＥＧＴＡの至適濃度は、各培地に含まれるカルシウム濃度とほぼ同じか若干高いことが望ましい。一方、本発明者らは、１０ｍＭの塩化ストロンチウムに対して１０ｍＭのＥＧＴＡを用いた結果、９０％より多くの卵子が活性化されることを見出した（図３Ａ）。このことは、１０ｍＭの塩化ストロンチウムとともに、より広範囲のＥＧＴＡを使用できることを示す。それゆえ、適正なＥＧＴＡ濃度を塩化ストロンチウムの濃度に依存して変化させることもできる。しかし、ＥＧＴＡの潜在的な毒性を考慮すれば、できるだけ高い胚発生率が得られように、できるだけＥＧＴＡ濃度を低くして、ストロンチウム誘導性卵子活性化の条件を至適化することが望ましい。
【００２８】
従来から、マウスのクローン化やＲＯＳＩのためにカルシウム不含培地が使用されている。しかし、多数の培地が市販されているにもかかわらず、カルシウム不含培地を得るためには手製または注文による培地調製が必要となる。これは、培地調製の手間、費用および品質管理の点から好ましくない。一方、本発明によれば、適正な濃度のキレート剤を使用してカルシウムイオンをキレート化することにより、簡便かつ低コストで、通常のカルシウム含有培養培地をカルシウム不含培地に転換することができる。それゆえ、本発明者らの方法は繁殖技術分野で有用である。
【００２９】
さらに、本発明は、カルシウム含有培養培地、カルシウムイオンに対する優先性を有するキレート剤、およびストロンチウムを含む、卵子活性化用キットを提供する。
【００３０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
材料および方法
動物
Ｂ６Ｄ２Ｆ１（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２）系統の雌マウスを、卵子および体細胞（卵丘細胞）ドナーの調製に使用した。精管切除した同系の雄マウスと交配させたＩＣＲ雌マウスを代理母とした。動物を日本エスエルシーから購入した。
【００３２】
採卵および胚培養
８〜１２週齢の雌マウスに５ＩＵの妊馬血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）を投与し、４８時間後に５ＩＵのヒト胎盤性性刺激ホルモン（ｈＣＧ）を投与して過排卵を誘発し、その卵管から成熟卵子を採集した。ｈＣＧ注射の約１６時間後に卵管から採卵し、ＨＥＰＥＳ緩衝化ＣＺＢ培地に入れ、卵丘細胞が分散するまで０．１％のヒアルロニダーゼで処理した。次いで、卵子を改変ＣＺＢ培地（ｍＣＺＢ、５．５６ｍＭ  Ｄ（＋）グルコースを補充したＣＺＢ培地（非特許文献２３））、ＫＳＯＭ培地（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ、ＭＲ−０２０Ｐ）またはＭ１６培地（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７２９２）に入れ、鉱油（Ｓｉｇｍａ、Ｍ８４１０）で覆い、３７℃（５％ＣＯ２／空気）で貯蔵した。
【００３３】
ＥＧＴＡを用いたストロンチウム誘導性卵子活性化
ＥＧＴＡ４ナトリウム塩（エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸４ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ、Ｅ８１４５）を蒸留水に溶解して、０．５Ｍストック溶液を作製した（４℃で貯蔵）。塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）を添加した際に、ＥＧＴＡストック溶液を培地（ｍＣＺＢ、Ｍ１６またはＫＳＯＭ）に添加して、所望の終濃度（０．２〜１０ｍＭ  ＥＧＴＡ）を得た。使用した培地の成分を表１に示す。
【００３４】
【表１】
2008263815.tif 000002
【００３５】
採卵後少なくとも２０分間、活性化に使用する培地と同じ培地中で卵子をインキュベートした。単為生殖活性化を、ＥＧＴＡを含有するカルシウム不含ｍＣＺＢ培地またはいずれかの培地中、５ｍＭの塩化ストロンチウムによって誘導し、６時間後に卵子活性化を、レリーフコントラスト装置を備えた倒立顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス）を使用して調べた。ストロンチウム誘導性卵子活性化の効率に対するＥＧＴＡの効果を評価するために、ストロンチウムイオンにより活性化した卵子を以下の４つのカテゴリーに分類した：１）１個の前核および第二極体を有する卵子を指標とした活性化卵子（１ＰＮ＋１ＰＢ）、２）異常卵子（２個の前核を有する卵子および断片化した卵子を含む）、３）死滅卵子、および４）ＭＩＩ卵子。各カテゴリーに属する卵子の数をストロンチウムイオンによる活性化に供した卵子の総数で割ることによって、比率を算出した。各ＥＧＴＡ濃度について、少なくとも２０個の卵子を使用し、３回反復した。
【００３６】
単為生殖二倍体胚の作製
二倍体単為生殖胚を作製するために、成熟卵子を、５ｍＭのストロンチウムイオンによって、２ｍＭのＥＧＴＡを含有するｍＣＺＢ培地またはカルシウム不含ｍＣＺＢ培地中、５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢの存在下で、６時間活性化し、３７℃、空気中５％ＣＯ２下、４日間（９６時間）までカルシウム含有ｍＣＺＢ培養培地中で培養した（非特許文献４、２４）。
【００３７】
クローン化胚の作製
トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）処理（非特許文献２５〜２７）した以外は、非特許文献４に記載のように核移植を実施した。すなわち、除核したＢ６Ｄ２Ｆ１マウスの卵子に、同じＢ６Ｄ２Ｆ１系マウス由来の卵丘細胞を個別に注入した。核移植後、再構築卵子を、６時間、５ｍＭ塩化ストロンチウムによって、５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢおよび５ｎＭ  ＴＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ８５５２）の存在下で活性化した。次いで、この活性化卵子を洗浄し、さらに４時間、５ｎＭ  ＴＳＡを含有するＫＳＯＭ培地中に静置した。次いで、卵子をＴＳＡ非存在下で胚移植に使用するまで培養した。
【００３８】
統計解析
イエーツ連続補正χ２検定を使用してデータを比較した。Ｐ＜０．０１の値を統計的に有意であるとした。
【００３９】
実施例１：mCZB培地を用いたストロンチウム誘導性卵子活性化のＥＧＴＡ濃度依存性
卵丘を含まないマウス卵子を、ｍＣＺＢ培地中、５ｍＭ塩化ストロンチウムで処理したところ、６時間の処理で約０〜２５％のみの卵子活性化が見られた。しかし、この活性化率は塩化ストロンチウムを用いないものと有意には異ならず（データは示さず）、このことは活性化がストロンチウムイオン非依存的に自然に起こったことを示唆する。残りの卵子はＭＩＩ期に留まった（図１Ａ）。
【００４０】
対照的に、カルシウム不含ｍＣＺＢ培地中での５ｍＭ塩化ストロンチウムでの処理によって、７２％の平均活性化率が得られた。この培地中では、他の卵子はＭＩＩ卵子としては残存せず、２８％といった高いストロンチウム誘導性卵子死滅率が示された（図１Ｆ）。従って、以前に報告されたように（非特許文献２０）、カルシウム不含培地が効率的なストロンチウムイオンでの卵子活性化に重要であった。
【００４１】
次に、ｍＣＺＢ培地中でのストロンチウムイオンでの処理を、カルシウムキレート剤であるＥＧＴＡの存在下で実施した。ＥＧＴＡの濃度を０から１０ｍＭまで増加させた。活性化率の上昇は１〜５ｍＭのＥＧＴＡを添加した場合のみで見られ（図１Ｂ〜ＥおよびＧ）、より高いまたはより低いＥＧＴＡ濃度では見られなかった。２ｍＭ  ＥＧＴＡを用いた場合、約９６％の卵子において１個の前核および極体を生じ、１％未満の卵子がＭＩＩ卵子として残存した。これらの結果は、適切な濃度のＥＧＴＡを使用すれば、カルシウム含有培養培地でさえも、効率的なストロンチウム誘導性卵子活性化のために使用することができることを示唆する。さらに驚くべきことに、２ｍＭ  ＥＧＴＡを用いたストロンチウムイオンでの処理の後に約１％のみの卵子が死滅した。生存卵子数に関しては、カルシウム不含培地におけるストロンチウムイオンでの処理、２ｍＭ  ＥＧＴＡを用いるストロンチウムイオンでの処理によってそれぞれ１００％、９７％の卵子活性化が見られたが、２ｍＭ  ＥＧＴＡを用いるストロンチウムイオンでの処理後の活性化卵子の正味の量は、カルシウム不含培地におけるストロンチウムイオンでの処理のものより、卵子死滅が少ないことから、有意に高いということができる。
【００４２】
実施例２：Ｍ１６培地およびＫＳＯＭ培地中での卵子活性化のＥＧＴＡ濃度依存性
多くのカルシウム不含培地（例えば、カルシウム不含Ｍ１６、α−ＭＥＭ、ＣＺＢ培地）を卵子活性化に使用できるので（非特許文献４、６、２８）、ＥＧＴＡの一般的な効果を確認することが重要である。そこで、Ｍ１６培地およびＫＳＯＭ培地へのＥＧＴＡの添加を、効率的ストロンチウム誘導性卵子活性化について検討した。
【００４３】
その結果、ＥＧＴＡの効果が確認され、２ｍＭ  ＥＧＴＡの添加により、Ｍ１６培地、ＫＳＯＭ培地において、それぞれ９９％、８２％の最も効率的な活性化率が得られた（図２ＡおよびＢ）。興味深いことに、ＥＧＴＡを含むＫＳＯＭ培地中での活性化によって、有意に多くのストロンチウム誘導性卵子死滅が示された。このことは、ストロンチウム誘導性卵子死滅がマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）やカリウムイオン（Ｋ＋）のような他のイオンによって増強され得ることを示唆する（表１）。それにもかかわらず、これらのＥＧＴＡを用いた卵子活性化率はカルシウム不含培地（ｍＣＺＢ）におけるものに匹敵するかそれより高かった。従って、ＥＧＴＡの添加がここで検討したいずれの培地においても、効率的なストロンチウム誘導性卵子活性化に有効に作用することが実証された。
【００４４】
実施例３：過剰ＥＧＴＡによる卵子活性化の妨害
上記で観察されたように、１〜５ｍＭのＥＧＴＡのみが有意な卵子活性化を導いた。例えば、１０ｍＭのＥＧＴＡとともに５ｍＭのストロンチウムイオンを用いた場合、１０％未満の卵子を活性化することができた（図１および２）。より高濃度のＥＧＴＡによって卵子活性化が妨げられる理由として、より高濃度のＥＧＴＡがカルシウムイオンに加えてストロンチウムイオンをキレート化し、活性化を妨げた可能性がある。この可能性を確認するために、本発明者らは、ストロンチウムイオンを増加することによって、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ存在下で、効率的な卵子活性化を回復させることができるか否かを検討した。
【００４５】
その結果、１０ｍＭ  ＥＧＴＡを用いても、１０ｍＭのストロンチウムイオンによって９３％の卵子が活性化された（図３Ａ）。従って、１０ｍＭ  ＥＧＴＡは１．７ｍＭのカルシウムイオンおよび５ｍＭのストロンチウムイオンの両方をキレート化するのに十分である。これと一致して、本発明者らは、１０ｍＭ  ＥＧＴＡによって培地のｐＨが０．２上昇することを見出した（図３Ｂ）。このことは、ＥＧＴＡが、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびマグネシウムイオンを含む全ての二価カチオンをキレート化した後に、水素イオンをキレート化して、Ｈ２Ｏの加水分解を促進することを示唆する。この上昇したｐＨ値は、ストロンチウムイオンを増加させることによって正常に戻った（図３Ｂ）。このように、ＥＧＴＡの濃度はカルシウムイオンおよびストロンチウムイオンの濃度に基づいて至適化すべきである。
【００４６】
実施例４：ＥＧＴＡを用いた卵子活性化後の胚発生
ＥＧＴＡを培養培地中で使用した報告は以前にもあるが、大部分の場合、その濃度は１ｍＭ未満であった（非特許文献２９、３０）。そこで、本発明者らは、ＥＧＴＡを用いた卵子活性化がその後の胚発生に影響を及ぼすか否かについて検討した。まず、単為生殖二倍体胚をサイトカラシンＢ（ＣＣＢ）の存在下で作製した。ＣＣＢは、第二極体の放出を妨げ、二倍体単為生殖胚を生じる。ＥＧＴＡを用いた単為生殖活性化後の移植前発生の結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】
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【００４８】
２ｍＭ  ＥＧＴＡおよびＣＣＢを用いた活性化の後、９０％より多くの卵子が活性化卵子として観察され、これはカルシウム不含培地中での活性化後のものより有意に高かった（表２）。これもまた、ＥＧＴＡを使用した場合に死滅卵子が少ないことによる（表２）。活性化後９６時間培養したところ、ＥＧＴＡを用いた実験群とカルシウム不含培地を用いた実験群との間で、生存活性化胚の胚盤胞形成に有意な差は見られなかった（図４Ａおよび表２）。しかし、ここでもまた最終的に得られた、ＥＧＴＡを用いた活性化により作製された胚盤胞の数は、カルシウム不含培地を用いてストロンチウム誘導性卵子活性化を行ったものより有意に高かった（表２）。
【００４９】
次に、本発明者らは、このＥＧＴＡを用いた活性化方法を卵丘細胞からのマウスのクローン化に適用した。近年のＴＳＡクローニング法（非特許文献２５）に従い、２細胞クローン化胚を代理母に移植した。ＥＧＴＡを用いた単為生殖活性化後の卵丘細胞クローン化の結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
その結果、クローン化胚が４％より高い成功率で得られ（図４Ｂ左および表３）、正常に離乳した（図４Ｂ右）。従って、活性化効率および胚発生に関して、ＥＧＴＡを用いたストロンチウム誘導性卵子活性化法がカルシウム不含培地を用いたストロンチウム誘導性卵子活性化方法と同等であることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明により、卵子活性化用培地の製造方法、当該方法により製造される卵子活性化用培地、当該培地を用いた卵子の活性化方法、および当該製造方法に使用する組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１−１】ｍＣＺＢ培地中、種々の濃度のＥＧＴＡを用いた５ｍＭ  ストロンチウムイオンによる卵子活性化率のプロフィールを示す図である。Ａ）成熟卵子をｍＣＺＢ培地中でＥＧＴＡの非存在下で５ｍＭのストロンチウムイオンに曝露したところ、活性化卵子はほとんど見出されなかった。終濃度１〜５ｍＭのＥＧＴＡを添加した後、卵子が１個の前核および第二極体を有することを指標に同定される活性化卵子の数が有意に増加した（Ｂ〜Ｄ）。特に、２ｍＭ  ＥＧＴＡによって最高の活性化率が得られた（Ｃ）。対照的に、５ｍＭまたはそれ以上（１０ｍＭ）のＥＧＴＡを用いて活性化した後は、活性化率が低下した（Ｄ、Ｅ）。１０ｍＭ  ＥＧＴＡで６時間活性化した後、前核を有しない膨潤した卵子がしばしば見出された（矢尻で示す）。対照としてのカルシウム不含培地（Ｃａ−ｆｒｅｅ）を用いたストロンチウム誘導性卵子活性化の場合、高い卵子活性化率が示されたが、有意な卵子の死滅（黒矢印で示す）が観察され、その結果、活性化卵子の正味の量が減少した（Ｆ）。各パネルにおいて、異常な卵子（２個の核を有する卵子および断片化した卵子を含む）を白矢印で示す。スケールバー＝１００μｍ。
【図１−２】（Ｇ）上記観察をまとめたグラフである。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）のデータを示す。
【図２】Ｍ１６培地またはＫＳＯＭ培地中、種々の濃度のＥＧＴＡを用いた５ｍＭのストロンチウムイオンによる卵子活性化率のプロフィールを示す図である。Ａ）Ｍ１６培地にＥＧＴＡを添加した場合、ｍＣＺＢ培地と同様のプロフィールが得られた。Ｂ）ＫＳＯＭ培地にＥＧＴＡを添加した場合、ｍＣＺＢ培地やＭ１６培地の場合と類似するが若干異なるプロフィールが示された。特徴的には、１ｍＭ  ＥＧＴＡの存在下でもより高い活性化率が観察され、そしてより多数の卵子の死滅が観察された。
【図３】ストロンチウムイオンの添加による過剰ＥＧＴＡの効果に対する優勢。Ａ）ｍＣＺＢ培地におけるストロンチウム誘導性卵子活性化は、１０ｍＭ  ＥＧＴＡによって強く妨げられた。ストロンチウムイオン濃度を５ｍＭから１０ｍＭに増加させることによってこの妨害が解消され、卵子活性化能が回復した（Ａ）。Ｂ）１〜５  ｍＭのＥＧＴＡはｍＣＺＢ、Ｍ１６およびＫＳＯＭ培地のｐＨに影響を及ぼさなかったが、１０ｍＭ  ＥＧＴＡによって培地のｐＨが上昇した。このことは、ＥＧＴＡが全ての２価カチオン（カルシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびマグネシウムイオン）をキレート化した後に水素イオンをキレート化したことを示唆する。１０ｍＭ  ＥＧＴＡによるこのｐＨ上昇は、ストロンチウム濃度を５ｍＭから１０ｍＭとし、より多くのストロンチウムイオンを供給することによって中和された（Ｂ）。
【図４】胚発生に対するＥＧＴＡの効果。Ａ）ＥＧＴＡを用いたストロンチウム誘導性卵子活性化単為生殖胚は、カルシウム不含培地（Ｃａ２＋−ｆｒｅｅ）を用いたストロンチウム誘導性卵子活性化の場合との差なしに胚盤胞に発生した。Ｂ）ＥＧＴＡを用いてストロンチウム誘導性卵子活性化した卵丘細胞由来クローン化胚は最終発生した。誕生後、ＴＳＡ処理したクローン化マウスは正常に生育し離乳した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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