(57)【要約】      （修正有）【課題】ＤＮＡ組換え技術により、効率的にフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法の提供。【解決手段】複数の特定の塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、大腸菌Ｋ１２株での翻訳に合わせて設計されたＤＮＡ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１０記載の塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡにおいて１若しくは数個の塩基が置換されたＤＮＡで、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも記載）活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする、請求項１記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１つのアミノ酸置換及び１以上１０以下のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードする、請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号１１〜１５記載の塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡにおいて１若しくは数個の塩基が置換されたＤＮＡで、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも記載）活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする、請求項４記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質
【請求項６】
配列番号１１に記載のアミノ酸配列において、１つのアミノ酸置換及び１以上１０以下のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードする、請求項４記載のＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号１６〜２０記載の塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡにおいて１若しくは数個の塩基が置換されたＤＮＡで、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも記載）活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする、請求項７記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質
【請求項９】
配列番号１６に記載のアミノ酸配列において、１つのアミノ酸置換及び１以上１０以下のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードする、請求項７記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかのＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えベクターにより形質転換された大腸菌Ｋ１２株形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の大腸菌Ｋ１２株形質転換体を栄養培地にて培養し、ＧＤＨ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするＧＤＨ活性を有するタンパク質を製造する方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の製造方法により得られた、ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては、例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００３】
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４７）あるいはピロロピノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．５．２）が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼは安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のピロロピノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼは、基質特異性に乏しくマルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため、測定値の正確性を損ねる可能性があるという欠点がある。
【０００４】
一方、別のタイプのグルコースデヒドロゲナーゼとして、非特許文献１〜４や特許文献１にはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼについて報告されている。本酵素は基質特異性に優れかつ溶存酸素の影響を受けない点で優位である。熱安定性については５０℃１５分処理で８９％程度の活性残存率であり安定性についても優れているとされている。特許文献２には、そのＤＮＡ配列、アミノ酸配列が報告されている。
【０００５】
しかしながら、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの製造は、組換えＤＮＡ技術を用いても困難を極めている。実際、特許文献２において開示されているＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの組換え大腸菌Ｋ１２株において０．０９Ｕ／ｍｌと、極めて低いレベルであった。大腸菌Ｋ１２株は、組換え生産において最も汎用され、組換え操作が簡便で、培養のし易さ、安全性の面などから工業的に多用されている宿主である。したがって、大腸菌Ｋ１２株を宿主とした組換え体により、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産する方法が望まれていた。
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９６７  Ｊｕｌ  １１；１３９（２）：２６５−７６
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９６７  Ｊｕｌ  １１；１３９（２）：２７７−９３
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１４６（２）：３１７−２７
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１４６（２）：３２８−３５
【特許文献１】ＷＯ ２００４／０５８９５８
【特許文献２】ＷＯ ２００６／１０１２３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＤＮＡ組換え技術により、血糖センサー用酵素として実用面において有利なＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に製造する方法を提供することである。より具体的には、大腸菌Ｋ１２株において効率的に発現するＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を作成し、利用することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するために、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得し、該遺伝子を用い、大腸菌Ｋ１２株のコドン使用頻度およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の二次構造の両面のバランスを考慮してＤＮＡ配列を改変することにより、大腸菌Ｋ１２株において効率的に発現するＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子が作成できることを見出し、本出願に到った。
【０００８】
本発明によれば、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを、大腸菌Ｋ１２株での翻訳に合わせて設計することにより、大腸菌Ｋ１２株においてＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に製造することが可能になる。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のようなものである。
［項１］配列番号１〜１０記載の塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡにおいて１若しくは数個の塩基が置換されたＤＮＡで、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも記載）活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［項２］以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする、項１記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質
［項３］配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１つのアミノ酸置換及び１以上１０以下のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードする、項１記載のＤＮＡ。
［項４］配列番号１１〜１５記載の塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡにおいて１若しくは数個の塩基が置換されたＤＮＡで、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも記載）活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［項５］以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする、項４記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質
［項６］配列番号１１に記載のアミノ酸配列において、１つのアミノ酸置換及び１以上１０以下のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードする、項４記載のＤＮＡ。
［項７］配列番号１６〜２０記載の塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡにおいて１若しくは数個の塩基が置換されたＤＮＡで、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも記載）活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［項８］以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする、項７記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質
［項９］配列番号１６に記載のアミノ酸配列において、１つのアミノ酸置換及び１以上１０以下のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードする、項７記載のＤＮＡ。
［項１０］項１〜９のいずれかのＤＮＡを含む組換えベクター。
［項１１］項１０に記載の組換えベクターにより形質転換された大腸菌Ｋ１２株形質転換体。
［項１２］項１１に記載の大腸菌Ｋ１２株形質転換体を栄養培地にて培養し、ＧＤＨ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするＧＤＨ活性を有するタンパク質を製造する方法。
［項１３］項１２に記載の製造方法により得られた、ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、効率的にフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼを生産し、取得することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成するために、まずＮＣＢＩのデータベースを利用し、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨと示す）と推測される遺伝子ＤＮＡを見出した。
【００１２】
本発明者らは、非特許文献１〜４、ＮＣＢＩのデータベースなどから、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の同定は容易になしうると予想していた。そしてさらに、当該遺伝子を含有する組換えベクターを作製し、形質転換した形質転換体を作り、形質転換体が発現する当該遺伝子がコードするタンパク質を精製することも容易になしうると考えていた。具体的には、非特許文献１〜４に記載された方法や公知技術を参考にしてアスペルギルス・オリゼを培養し、その培養上清から各種クロマトグラフィーを用いてＧＤＨを精製して、その末端アミノ酸配列などを分析してプローブを作製し、ＧＤＨをコードする遺伝子を単離することを試みた。
【００１３】
本発明者らは種々検討したが、通常行う塩析、クロマトグラフィー等を用いた精製法では、アスペルギルス・オリゼ培養上清から、高純度で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ではっきりと確認できるＧＤＨ標品を得るのは困難であることが分かった。酵素タンパク質に結合しているであろう糖鎖が精製、確認を困難にしている原因の１つであると推察した。したがって、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングを断念せざるを得ないと判断した。このため、遺伝子取得には多くの試行錯誤をともない、非常な困難を極めたが、鋭意検討の結果、アスペルギルス・オリゼ由来のＧＤＨをコードする遺伝子を単離した。その詳細は実施例に後述する。
【００１４】
また、本発明者らは他起源のＧＤＨ遺伝子の取得についても種々検討し、ペニシリウム属（Penicillium lilacinoechinulatum）由来のＧＤＨをコードする遺伝子、およびアスペルギルス・テレウス由来のＧＤＨをコードする遺伝子を単離した。その詳細も実施例に後述する。
【００１５】
本発明のＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡのサイズは、ＧＤＨ活性を有するタンパク質の予想される好適な分子量範囲を鑑み、１５００〜２０００ｂｐが好ましく、１７００〜１８００ｂｐがより好ましい。
【００１６】
また後述のように、本発明のＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、タンパク質の生産を行う際に重要な遺伝子の翻訳効率の向上を指標として設計されている。このような翻訳効率の向上に関与する因子として、ＧＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ読み取りに主として関与する二次構造をとり得る配列の存在確率と、タンパク質合成に主として関与するコドン使用頻度とが挙げられる。
【００１７】
なお、本発明では、二次構造をとり得る配列はＧＤＨ遺伝子内のヘアピン構造をとり得る領域として定義する。ヘアピン構造領域は、ステム部位の長さが１０〜５０塩基対、ループ部位の長さが１〜５０塩基、ステム部位のマッチングの確率が８０％を超えるものと定義する。同一ステム部位を有するヘアピン構造については、ステム部位のマッチングの確率がより高いものをピックアップし、ステム部位のマッチングの確率が同じであればループ部位の長さが短いものを選択する。二次構造をとり得る配列の存在確率は、上記ヘアピン構造領域を構成する塩基の全体に対する割合とする。
【００１８】
また、本発明では、コドン使用頻度を表わす指標として、各コドンの大腸菌Ｋ１２株最適コドン使用頻度の総計を採用する。最適コドンとは、同じアミノ酸に対応するコドンのうち出現頻度が最も高いコドンと定義する。大腸菌Ｋ１２株の遺伝子は全て決定されており、各アミノ酸の最適コドンは既に判明している。以下に、大腸菌Ｋ１２株の最適コドンを記す。
【００１９】
グリシン：ｇｇｃ
プロリン：ｃｃｇ
アラニン：ｇｃｇ
バリン：ｇｔｇ
ロイシン：ｃｔｇ
イソロイシン：ａｔｔ
メチオニン：ａｔｇ
フェニルアラニン：ｔｔｔ
チロシン：ｔａｔ
トリプトファン：ｔｇｇ
セリン：ａｇｃ
スレオニン：ａｃｃ
システイン：ｔｇｃ
ヒスチジン：ｃａｔ
アルギニン：ｃｇｃ
リジン：ａａａ
アスパラギン：ａａｃ
グルタミン：ｃａｇ
アスパラギン酸：ｇａｔ
グルタミン酸：ｇａａ
【００２０】
本発明のＧＤＨをコードするＤＮＡ（遺伝子）は、後述するＧＤＨの活性とタンパク質生産とのバランスを良好にする観点から、その二次構造をとり得る配列の存在確率が、下限は１％、上限は２０％がそれぞれ好ましく、かつその各コドンの大腸菌Ｋ１２株最適コドン使用頻度の総計が３５％以上であるように実現されてなるのが好ましい。
【００２１】
一般に、二次構造をとり得る配列の存在確率が低ければ低いほどｍＲＮＡ読み取り速度は大きく、したがって二次構造をとり得る配列の存在確率の低い遺伝子はＧＤＨの翻訳効率は向上されるが、余りに低いとアミノ酸残基の選択性が低くなってしまうので、十分なＧＤＨ活性を有するタンパク質が得られる可能性も低くなってしまう。
【００２２】
またＧＤＨをコードするＤＮＡは異種遺伝子であり、元々大腸菌Ｋ１２株には存在せず、コドン使用頻度がかなり異なっている。したがって、ある程度の翻訳は見込まれるが、コドン使用頻度の総計が大きくなるほどタンパク質合成の速度が大きくなり、ＧＤＨの翻訳効率が向上する。このコドン使用頻度の総計の値は、大きい分には特に問題とはならないが、大きい値を得るためには二次構造をとり得る配列の存在確率とのバランスや、さらには採り得る遺伝子操作の手法までも制約を受けることになる。
【００２３】
本発明のＤＮＡにおいて、生成するｍＲＮＡが二次構造をとり得る配列の存在確率は、全塩基配列に対して、下限は好ましくは１％、さらに好ましくは７％であり、上限は好ましくは２０％、さらに好ましくは１５％である。
上記確率が全塩基配列に対して１％未満であると、アミノ酸残基の選択性が低くなってしまうので、十分なＧＤＨ活性を有するタンパク質が得られる可能性も低くなる傾向にあるためであり、また上記確率が全塩基配列に対して２０％を超えると、遺伝子の発現に悪影響を及ぼし、ＧＤＨ生産の効率が低下する傾向にあるためである。
【００２４】
本発明のＤＮＡにおいて、その各コドンの大腸菌Ｋ１２株最適コドン使用頻度の総計が３５％以上であるのが好ましく、４０％以上であるのがより好ましい。
上記確率が全塩基配列に対して３５％未満であると、タンパク質合成の速度に悪影響を及ぼし、ＧＤＨ生産の効率が低下する傾向にあるためである
【００２５】
本発明の一実施形態は、以下に示すＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）である。
【００２６】
配列番号１〜１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子）は、ＧＤＨをコードするＤＮＡ（遺伝子）を含む、イントロンを除去したＤＮＡ配列である。配列番号１〜１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子）において１若しくは数個の塩基が置換されたＤＮＡは、本発明に含まれる。また、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＧＤＨ活性をコードする領域を含むＤＮＡも、本発明に含まれる。
【００２７】
配列番号１１〜１５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子）は、ＧＤＨをコードするＤＮＡ（遺伝子）を含む、イントロンを除去したＤＮＡ配列である。配列番号１１〜１５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子）において１若しくは数個の塩基が置換されたＤＮＡは、本発明に含まれる。また、配列番号１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＧＤＨ活性をコードする領域を含むＤＮＡも、本発明に含まれる。
【００２８】
配列番号１６〜２０に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子）は、ＧＤＨをコードするＤＮＡ（遺伝子）を含む、イントロンを除去したＤＮＡ配列である。配列番号１６〜２０に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子）において１若しくは数個の塩基が置換されたＤＮＡは、本発明に含まれる。また、配列番号１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＧＤＨ活性をコードする領域を含むＤＮＡも、本発明に含まれる。
【００２９】
本発明の別の一実施形態は、以下に示すＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）である。
【００３０】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、アスペルギルス・オリゼ由来のＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の全配列を示し、本発明に含まれる。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）も、本発明に含まれる。
【００３１】
配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、アスペルギルス・テレウス由来のＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の全配列を示し、本発明に含まれる。また、配列番号１１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）も、本発明に含まれる。
【００３２】
配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、アスペルギルス・テレウス由来のＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の全配列を示し、本発明に含まれる。また、配列番号１６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）も、本発明に含まれる。
【００３３】
本発明の別の一実施形態は、以下に示す組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換された大腸菌Ｋ１２株形質転換体、さらには該大腸菌Ｋ１２株形質転換体を栄養培地にて培養し、ＧＤＨ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするＧＤＨ活性を有するタンパク質を生産する方法を含む。
【００３４】
例えば、アスペルギルス・オリゼ、ペニシリウム属（Penicillium lilacinoechinulatum）、またはアスペルギルス・テレウス由来のＧＤＨ遺伝子を発現用ベクター（プラスミド等多くのものが当該技術分野において知られている）に挿入し、大腸菌Ｋ１２株（ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等多くのものが当該技術分野において知られている）を形質転換する。得られた形質転換体を栄養培地にて培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。
【００３５】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００３６】
これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。
（ａ）タンパク質実験プロトコール第１巻 機能解析編，第２巻 構造解析編 （秀潤社） 西村善文，大野茂男 監修
（ｂ）改訂 タンパク質実験ノート 上 抽出と分離精製 （洋土社） 岡田雅人，宮崎香 編集
（ｃ）タンパク質実験の進めかた （洋土社） 岡田雅人，宮崎香 編集
【００３７】
あるいは以下に例示する方法によって進めることもできる。
すなわち、作成されたタンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡを、ベクターと連結された状態にて宿主大腸菌Ｋ１２株中に移入し、タンパク質を生産する形質転換体を調製する。
ベクターとしては、宿主大腸菌Ｋ１２株内で自立的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばＬａｍｂｄａ  ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが例示される。なかでも、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど、クローニングサイト上流にエシェリヒア・コリ内で認識されうるプロモーターを保持するものが好ましい。
【００３８】
また、適当な宿主大腸菌Ｋ１２株しては、組換えベクターが安定であり、かつ自立増殖可能で外来遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＤＨ５αなどを用いることができる。
【００３９】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えばカルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＤＨ５α、コンピテントハイＪＭ１０９、コンピテントハイＨＢ１０１；東洋紡績製）を用いても良い。
【００４０】
本発明において、ＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。アスペルギルス・オリゼのゲノム配列情報を用い、予測ＧＤＨ遺伝子を見出すことができる。ついで、アスペルギルス・オリゼの菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。こうして得られたｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法によりＧＬＤ遺伝子を増幅させ、本遺伝子をベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主大腸菌に移入した後、ベクターのマーカーを利用してＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換え大腸菌を得る。
【００４１】
上記のように得られた形質転換体である組換え体の選択は、ベクターのマーカーとＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する大腸菌を選択すればよい。
【００４２】
ＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００４３】
上記のようにして、一度選択されたＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、他の組換えベクターへのＧＤＨ遺伝子の移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる大腸菌Ｋ１２株の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法、プロトプラスト法などを用いることができる。
【００４４】
なお、本発明のＧＤＨ遺伝子は、ＧＤＨ活性を有する限り、該遺伝子の翻訳後のアミノ酸配列の各アミノ酸残基の一部が欠失または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよい。
【００４５】
野生型ＧＤＨをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変ＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。また、ＤＮＡを幾つかの断片に分割して化学合成し、ＤＮＡリガーゼで結合するという手法を採ることも可能である。
【００４６】
形質転換体の培養形態は、宿主大腸菌の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００４７】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００４８】
培養温度は菌が成育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜４０℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は１０〜５０時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【００４９】
培養物中のＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ＧＤＨ含有溶液と菌体とを分離した後に利用される。ＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００５０】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。
【００５１】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ  （ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ  （ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００５２】
本発明の別の一実施形態は、上記の製造方法により得られた、ＧＤＨ活性を有するタンパク質である。
【００５３】
本発明の別の一実施形態は、以下に示すＧＤＨ活性を有するタンパク質である。
例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１つのアミノ酸置換及び１以上１０以下のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質が挙げられる。
また、配列番号１１に記載のアミノ酸配列において１つのアミノ酸置換及び１以上１０以下のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質が挙げられる。
また、配列番号１６に記載のアミノ酸配列において１つのアミノ酸置換及び１以上１０以下のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００５４】
本発明において、ＧＤＨ活性の測定は以下の条件で行う。
＜試薬＞
５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１４ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．８ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
＜測定条件＞
反応試薬２．９ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝{−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／（１６．３×０．１×１．０）
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５６】
後述の実施例に記載される、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子の取得手順の概略は以下の通りである。
【００５７】
アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・テレウス培養上清から、塩析、クロマトグラフィー等を用いてＧＤＨの精製を試みたが、高純度のＧＤＨを得るのは困難であった。（実施例１［１］）
よって、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングは断念せざるを得なくなった。
【００５８】
そこで、我々はＧＤＨを生産する微生物を上記以外に求め鋭意探索した結果、Penicillium lilacinoechinulatum NBRC6231株がＧＤＨを生産することを見出し、本菌株の培養液から高純度の精製酵素を得ることに成功した。（実施例１［２］）
次いで、該酵素を用いて部分アミノ酸配列を決定することに成功し、決定したアミノ酸配列を元に、ＰＣＲ法により、Penicillium lilacinoechinulatum NBRC6231由来ＧＤＨ遺伝子を一部取得し、塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。（実施例１［３］［４］）
最終的に、この塩基配列を元に、公開されているアスペルギルス・オリゼのゲノムデータベースより、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子を推定（実施例１[５]）、取得した。
【００５９】
＜実施例１＞
アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨとも記載）遺伝子の推定
［１］アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの取得
アスペルギルス・オリゼは、土壌より入手し定法に従ってＬ乾燥菌株とし保管していたものを使用した。以下これをアスペルギルス・オリゼＴＩ株と呼ぶ。アスペルギルス・オリゼＴＩ株のＬ乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃１５分オートクレーブ滅菌して放冷した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、３０℃、通気攪拌培養を行った。培養開始から６４時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去してＧＤＨ活性を含む濾過液を回収した。回収した上清を限外ろ過膜（分子量１０，０００カット）により低分子物質を除去した。次いで、硫酸アンモニウムを６０％飽和度となるように添加、溶解し、硫安分画を行い、遠心機によりＧＤＨを含む上清画分を回収後、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて脱塩を行った後、６０％飽和度の硫酸アンモニウムを添加、溶解し、これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。更にこれを５０℃で４５分加温した後、遠心分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得られた溶液を精製ＧＤＨ標品（ＡＯＧＤＨ）とした。尚、上記精製過程においては、緩衝液として２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用した。さらに、ＡＯＧＤＨの部分アミノ酸配列を決定するため、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。また、我々はアスペルギルス・テレウスに属する微生物を独自に探索入手し、上記と同様にその培養上清より、塩析、Ｏｃｔｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ等による精製を試みたが、アスペルギルス・オリゼ同様部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。通常、一般的に行われる精製法を用いて、高純度で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ではっきりと確認できるＧＤＨ標品を得ることができなかったのは、酵素タンパク質に結合しているであろう糖鎖が原因の一つとなってるのではないかと推察した。したがって、遺伝子取得の常法の１つである該タンパク質の部分アミノ酸配列を利用したクローニングを断念せざるを得なくなった。
【００６０】
［２］ペニシリウム属糸状菌由来ＧＤＨの取得
ペニシリウム属糸状菌由来のＧＤＨ生産菌としてPenicillium lilacinoechinulatum NBRC6231（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）を用い、上記アスペルギルス・オリゼＴＩ株と同用の手順に従って、培養および精製を行い、ＳＤＳ電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。
【００６１】
［３］ｃＤＮＡの作製
Penicillium lilacinoechinulatum NBRC6231について上記方法に従い（ただしジャーファーメンターでの培養時間は２４時間）培養を実施し、濾紙濾過により菌糸体を回収した。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル（東洋紡社製）を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにセパゾールＲＮＡ  Ｉ（ナカライテスク社製）を用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡからはＯｒｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０（第一化学薬品社製）をもちいてｍＲＮＡを精製し、これをテンプレートにReverTra-Plus-TM（東洋紡社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた産物はアガロース電気泳動を行い、鎖長０．５〜４．０ｋｂに相当する部分を切り出した。切り出したゲル断片からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ―（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを抽出・精製してｃＤＮＡサンプルとした。
【００６２】
［４］ＧＤＨ遺伝子部分配列の決定
上記で精製したPenicillium lilacinoechinulatum NBRC6231由来ＧＤＨを０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）に溶解し、ここにＧｌｕ特異的Ｖ８エンドプロテアーゼを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し３７℃１６時間インキュベートすることで部分分解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度１６％のゲルを用いて電気泳動してペプチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー（1.4％グリシン、0.3％トリス、20％エタノール）を用いてセミドライ法によりＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜上に転写したペプチドはＣＢＢ染色キット（ＰＩＥＲＣＥ社製ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部分２箇所を切り取ってペプチドシーケンサーにより内部アミノ酸配列の解析を行った。得られたアミノ酸配列はＩＧＧＶＶＤＴＳＬＫＶＹＧＴ（配列番号２５）およびＷＧＧＧＴＫＱＴＶＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴ（配列番号２６）であった。この配列を元にミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製し、Penicillium lilacinoechinulatum NBRC6231由来ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ増幅産物が得られ、アガロースゲル電気泳動により確認したところ１．４ｋｂ程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出して東洋紡製ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ−を用いて抽出・精製した。精製ＤＮＡ断片はＴＡｒｇｅｔ  Ｃｌｏｎｅ  −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）によりＴＡクローニングし、得られたベクターで大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡社製）をヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でインサート挿入が確認されたコロニーについてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡社製）を用いてプラスミドをミニプレップ抽出・精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。
【００６３】
［５］ＡＯＧＤＨ遺伝子の推定
決定した塩基配列を元に「ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ」のホームページ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）からホモロジー検索を実施し、ＡＯＧＤＨ遺伝子を推定した。検索により推定したＡＯＧＤＨとP.lilacinoechinulatum NBRC6231由来ＧＤＨ部分配列とのアミノ酸レベルでの相同性は４９％であった。
【００６４】
＜実施例２＞
アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得、大腸菌への導入
ＡＯＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼＴＩ株の菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号２１、２２に示す２種類のオリゴＤＮＡを合成し、調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いてＡＯＧＤＨ遺伝子増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換体より、常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＯＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号２３）。この結果、ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は５９３アミノ酸（配列番号２４）からなることが明らかとなった。形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体培地（Terrific broth）２００ｍｌ中で、３０℃、１６時間振とう培養を行った。菌体破砕液についてＧＤＨ活性を確認したところ、ＴＩ株由来ＧＤＨの配列を有する形質転換体は菌体内に培養液１ｍｌ当たり８．０Ｕの高いＧＤＨ活性が得られた。尚、実施例１で実施したアスペルギルス・オリゼＴＩ株の培養上清のＧＤＨ活性は、０．２Ｕ／ｍｌであった。
【００６５】
＜実施例３＞
アスペルギルス・テレウス由来グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得、大腸菌への導入
［１］ｃＤＮＡの作製
Aspergillus terreus NBRC33026（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）Ｌ乾標本をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元させた。５００ｍｌ  坂口フラスコに１．５％大豆ペプチド、２％グルコース、１％マルトエキスｐＨ６．５を５０ｍｌ調製し、復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収して植菌し、３０℃,２４時間振とう培養を行い、菌体を回収した。得られた菌体は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、東洋紡製クールミルを用いて、粉砕した。粉砕菌体より直ちにナカライテスク社製セパゾールＲＮＡ Ｉを用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出し、これをテンプレートに東洋紡製ReverTra-Plus-TMを用いてＲＴ−ＰＣＲを行いｃＤＮＡを調製した。
【００６６】
［２］ＧＤＨ遺伝子配列の決定
本発明者らは、既に上述の通りAspergillus oryzae、Penicillium lilacinoechinulatum 、およびPenicillium italicum由来 GDH遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列情報を取得している。A.terreusよりGDH遺伝子をクローニングするために、上記３種のGDHの推定アミノ酸配列をアラインさせ、相同性の高い領域の配列をもとに、ディジェネレートプライマーを作製した。ゲノムＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ、増幅産物が認められた。増幅産物をサブクローニングし、塩基配列を決定した。決定したＧＤＨ部分配列を元に、該配列部分の５‘側および３’側隣接領域をＲＡＣＥ法により決定した。
【００６７】
［３］GDH組換えプラスミドの作成、および大腸菌への導入
アミノ酸配列について、SignalP 3.0 Serverを利用して、シグナルペプチド予測を行った。この結果を元に、シグナルペプチドを除去すべく、Ｎ末端配列25コドンが削除され、開始コドン（ＡＴＧ）を付加した配列増幅が増幅されるようにＰＣＲプライマーを作製した。これらのプライマーを用いて、NBRC33026 ｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）により遺伝子増幅を実施した。増幅断片は制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンＡＴＧに合わせＮｄｅＩ認識配列のＡＴＧを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイト間に挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換し、A.terreus GDH 組換え体を取得した。
【００６８】
＜実施例４＞
大腸菌K12株での翻訳に合わせたグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の設計、大腸菌Ｋ１２株への導入
実施例２で取得したＧＤＨ遺伝子を基に、大腸菌K12株での翻訳に合わせた遺伝子（ＤＮＡ）の設計を実施した（配列番号１〜１０）。ＧＤＨの活性とタンパク質生産とのバランスを良好にする観点から、その二次構造をとり得る配列の存在確率が１〜２０％であって、かつその各コドンの大腸菌Ｋ１２株最適コドン使用頻度の総計が３５％以上であるように、設計を行った。二次構造をとり得る配列は、ＧＤＨ遺伝子内のヘアピン構造をとり得る領域としてピックアップした。ヘアピン構造領域は、ステム部位の長さが１０〜５０塩基対、ループ部位の長さが１〜５０塩基、ステム部位のマッチングの確率が８０％を超えるものとして、ＧＤＨ遺伝子内を検索した。同一ステム部位を有するヘアピン構造については、ステム部位のマッチングの確率がより高いものをピックアップし、ステム部位のマッチングの確率が同じであればループ部位の長さが短いものを選択した。二次構造をとり得る配列の存在確率は、上記ヘアピン構造領域を構成する塩基の全体に対する割合とした。
【００６９】
なお、ＧＤＨ遺伝子中の非最適コドンのうち、大腸菌K12株での出現頻度が０．７％以下のものが以下の２５個存在しており、これらについては優先的に最適コドンへの変更を行った（配列番号１０）。
ロイシン：ｃｔａ；１個
イソロイシン：ａｔａ；１個
アルギニン：ｃｇａ；１個，ａｇｇ；２個
プロリン：ｃｃｔ；９個，ｃｃｃ；８個
スレオニン：ａｃａ；３個
合計２５個
【００７０】
設計したＧＤＨ遺伝子の作成は、実施例１の野生型ＧＤＨ遺伝子を基に、QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用い、そのプロトコールに従って変異処理操作を行うことにより実施した。更に塩基配列を決定して、改変を確認した。
【００７１】
実施例２と同様の方法で、各遺伝子の大腸菌Ｋ１２株への導入、形質転換体の培養、ＧＤＨ生産性の確認を行った。結果を表１にまとめた。
【００７２】
【表１】
2008206433.tif 000002
【００７３】
また、実施例３で取得したＧＤＨ遺伝子についても、大腸菌K12株での翻訳に合わせた遺伝子（ＤＮＡ）の設計を実施した（配列番号１１〜１５）。また、特許文献２のＧＤＨ遺伝子についても、これを基に大腸菌K12株での翻訳に合わせた遺伝子（ＤＮＡ）の設計を実施した（配列番号１６〜２０）。
実施例３と同様の方法で、各遺伝子（配列番号１１〜１５）の大腸菌Ｋ１２株への導入、形質転換体の培養、ＧＤＨ生産性の確認を行った。結果を表２にまとめた。
【００７４】
【表２】
2008206433.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、組換え大腸菌Ｋ１２株により、効率的にフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼを製造することを可能にするものである。また、本発明により、マルトースに作用しない、グルコースセンサ等に適したフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼを生産することを可能にする。
【配列表】
2008206433000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月21日(2007.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008206433000001.app