(57)【要約】【課題】空間分解能の高い二次元分布像を取得し得る情報取得方法及びこの情報取得方法を実行する情報取得装置を提供する。【解決手段】対象物の質量に関する情報を飛行時間型質量分析計を用いて取得する情報取得方法であって、該対象物のイオン化を促進する金属コロイド粒子を、該イオン化を行う１次ビームに相対して該対象物の下部に配置する工程と、集束し、パルス化し、かつ走査可能な、イオン、中性粒子、及び電子、並びに集光し、パルス化し、かつ走査可能な、レーザー光からなる群から選択された１つの該１次ビームを用いて該対象物に照射を行い該対象物を構成する構成物をイオン化して飛翔させる工程と、該飛翔した構成物の質量に関する情報を、該飛行時間型質量分析計を用いて取得する工程と、を有することを特徴とする。【選択図】図１
2008185547.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物の質量に関する情報を飛行時間型質量分析計を用いて取得する情報取得方法であって、
該対象物のイオン化を促進する金属コロイド粒子を、該イオン化を行う１次ビームに相対して該対象物の下部に配置する工程と、
集束し、パルス化し、かつ走査可能な、イオン、中性粒子、及び電子、並びに集光し、パルス化し、かつ走査可能な、レーザー光からなる群から選択された１つの該１次ビームを用いて該対象物に照射を行い該対象物を構成する構成物をイオン化して飛翔させる工程と、
該飛翔した構成物の質量に関する情報を、該飛行時間型質量分析計を用いて取得する工程と、
を有することを特徴とする情報取得方法。
【請求項２】
前記の金属コロイド粒子を対象物の下部に配置する工程は、マイクロインジェクション法、ＰＥＧ法、レーザー法及びパーティクルガン法並びにインクジェット法からなる群から選択された少なくとも１種の方法を用いて行う工程である、請求項１に記載の情報取得方法。
【請求項３】
前記の金属コロイド粒子を対象物の下部に配置する工程は、前記１次ビームに相対して前記対象物の表面から０．１ｎｍ以上１００ｎｍ以下の位置に前記金属コロイド粒子を配置するように行う工程である、請求項１又は２に記載の情報取得方法。
【請求項４】
前記構成物の前記対象物における分布状態に関する情報を得る工程をさらに有する、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の情報取得方法。
【請求項５】
前記の構成物の前記対象物における分布状態に関する情報を得る工程は、前記構成物の前記対象物における２次元での分布状態を得る工程である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の情報取得方法。
【請求項６】
前記金属コロイド粒子の直径は、１ｎｍ以上１００ｎｍ以下である、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の情報取得方法。
【請求項７】
前記金属コロイド粒子は、金、銀、銅、白金、パラジウム、ロジウム、オスミウム、ルテニウム、イリジウム、鉄、錫、亜鉛、コバルト、ニッケル、クロム、チタン、タンタル、タングステン、インジウム及びケイ素からなる群から選択された少なくとも１種類の金属又は合金を有する、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の情報取得方法。
【請求項８】
前記１次ビームは、イオンからなる、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の情報取得方法。
【請求項９】
前記対象物は、細胞又は組織を含む生体由来である、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の情報取得方法。
【請求項１０】
対象物の質量に関する情報を飛行時間型質量分析計を用いて取得する情報取得装置であって、
該対象物のイオン化を促進する金属コロイド粒子を、該イオン化を行う１次ビームに相対して該対象物の下部に配置させる手段と、
集束し、パルス化し、かつ走査可能な、イオン、中性粒子、及び電子、並びに集光し、パルス化し、かつ走査可能な、レーザー光からなる群から選択された１つの該１次ビームを用いて該対象物に照射を行い該対象物を構成する構成物をイオン化して飛翔させる手段と、
該飛翔した構成物の質量に関する情報を、該飛行時間型質量分析計を用いて取得する手段と、
を有することを特徴とする情報取得装置。
【請求項１１】
前記構成物の前記対象物における分布状態に関する情報を得る手段をさらに有する、請求項１０に記載の情報取得装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、情報取得方法及び情報取得装置に係り、特に、飛行時間型質量分析計を用いて対象物の情報を取得する情報取得方法及びこの方法を実行する情報取得装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）解析の進展により、生体内に存在する遺伝子産物であるタンパク質の解析の重要性が急速にクローズアップされてきている。従来から、タンパク質の発現及び機能解析の重要性が指摘されており、その解析手法の開発が進められている。このタンパク質の解析手法は、以下の技術を組み合わせたものを基本としたものが多い。
【０００３】
（１）二次元電気泳動や高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）による分離精製
（２）放射線分析、光学的分析、質量分析等の検出系
【０００４】
タンパク質解析技術の基盤はプロテオーム（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）解析と呼ばれるもので、これは遺伝子（ｇｅｎｅ）から作り出され実際に生体内で働いているタンパク質を解析し、細胞の機能や疾患の原因を究明することを目的としている。代表的な解析手法としては、以下の手順のものが挙げられる。
【０００５】
（１）対象とする生体組織や細胞からのタンパク質の抽出
（２）二次元電気泳動によるタンパク質の分離
（３）ＭＡＬＤＩ法（マトリクス支援レーザー脱離−飛行時間型質量分析法：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）などの質量分析によるタンパク質またはその断片の分析
（４）ゲノムプロジェクトなどのデータベースを利用したタンパク質の同定
【０００６】
また、解析手法として、以下の手順のものも挙げられる（非特許文献１）。
【０００７】
（１）対象とする生体組織や細胞からのタンパク質の抽出
（２）抽出したタンパク質の消化（または変性）
（３）液体クロマトグラフ（ＬＣ）とイオントラップ型質量分析計（Ｉｏｎ−ｔｒａｐ  ＭＳ）を組み合わせたシステムを用いた上記消化（または変性）タンパク質の分析
（４）データベースの構築及びタンパク質の同定
【０００８】
これらのプロテオーム解析により、癌を例に挙げれば、再発や転移に関与するタンパク質が明らかになりつつあるなど、既に成果が出始めている。
【０００９】
一方、プロテインチップや生体組織切片におけるタンパク質の二次元分布の可視化を目的とした、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法（飛行時間型二次イオン質量分析法）をベースとする情報取得手法及び装置を本願発明者らが提案した（特許文献１）。この手法は、まず、インクジェット法などを用い、イオン化促進物質および／または消化酵素を上記のプロテインチップや生体組織切片に付与する。その後、タンパク質の種類に関する情報（消化酵素により限定分解されたペプチドの情報を含む）を、その位置情報を保持したままＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により可視化するというものである。
【００１０】
さらに、ＴＯＦ−ＳＩＭＳでポリペプチドを分析した例としては、以下の技術が挙げられる。
【００１１】
ＭＡＬＤＩ法と同様の前処理の適用、すなわちポリペプチドをマトリックス物質と混合することにより、分子量の大きなポリペプチド親分子を検出するもの（非特許文献２）
特定のポリペプチドの一部分を１５Ｎなどでアイソトープラベル化し、当該ポリペプチドをＣ１５Ｎ−のような２次イオンを用いてイメージング検出するもの（非特許文献３）
アミノ酸残基に対応するフラグメントイオン（２次イオン）の種類やその相対強度からポリペプチドの種類を推定するもの（非特許文献４）
各種基板上に吸着させたポリペプチドについてのＴＯＦ−ＳＩＭＳ検出限界を調べたもの（非特許文献５）
金ナノパーティクルをポリペプチドに化学修飾し検出感度の向上に利用したもの（非特許文献６）
【００１２】
本願発明者らが提案した情報取得方法（特許文献１）は、病変組織及び正常組織におけるタンパク質に関する情報（消化酵素により限定分解されたペプチドの情報を含む）を取得できるが、検出感度をさらに向上させることが好ましい。非特許文献１に開示の方法は、分子量の大きなポリペプチドでも１次イオン照射によるペプチドの分解を抑制し、元の質量を保持したまま親分子を検出できる方法である。しかし、この方法では、ポリペプチドとマトリックス物質とを混合したものを測定試料とするため、上述のタンパク質チップのような試料の場合には、元の二次元分布情報を取得することができない。また、非特許文献３に開示の方法では、特定のポリペプチドの一部分をアイソトープラベル化するもので、ＴＯＦ−ＳＩＭＳの持つ高空間分解能を十分生かせる方法である。しかしながら、測定毎に特定のポリペプチドをアイソトープラベル化するのは一般的ではない。また、非特許文献４に開示のアミノ酸残基に対応するフラグメントイオン（２次イオン）の種類やその相対強度からポリペプチドの種類を推定する方法は、アミノ酸の構成が似たポリペプチドが混在する場合は判別が難しくなる。
【００１３】
また、金属基板や金属微粒子を用いてポリペプチドの分解フラグメントイオン生成を極力抑えて親分子の検出感度を向上させる試みがなされている。非特許文献５に開示の方法は、ポリペプチド親分子のイオン化を促進して検出感度を向上させる方法である。つまり、この方法は、まず、ポリペプチドを金属基板上へ数分子層の薄膜状に配置する。これに、１次イオン照射によりポリペプチド膜を通過して基板に多くの衝撃を与え、基板より反跳したエネルギー伝播により基板上部に配置された分子を効率良く解離させ、薄膜ゆえ障害なく分子を上方へ飛翔させる。これによって、フラグメントイオン化を抑えつつ、ポリペプチド親分子のイオン化を促し、検出感度を向上させることができる。さらには、非特許文献６に開示の方法では、ポリペプチドの一端を金微粒子で修飾し基板上に配向させ、上記非特許文献５に開示の方法と同様に、１次イオン照射により金微粒子に衝撃を与える。これにより、金原子面より反跳したエネルギー伝播により微粒子表面の分子を解離・飛翔させて、ポリペプチド親分子のイオン化を促し検出感度を向上させる方法である。しかしながら、この両手法とも、基板上への数分子層状の薄膜化や金微粒子修飾処理の工程を経る必要があるため、上述のように、タンパク質チップや生体標本のポリペプチドの二次元分布情報を取得することはできなかった。
【００１４】
このようにして、タンパク質チップや生体標本に対してＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を応用する際、位置情報を維持しながら、２次イオンの分解フラグメント化を抑えてポリペプチドの親分子イオンの検出感度を向上させる技術改善が強く要望されている。しかしながら、従来開示されているものについては、これらの点で必ずしも十分なものではなかった。
【特許文献１】特開２００６−１０６５８号公報
【非特許文献１】磯辺俊明、高橋信弘編、「実験医学別冊  プロテオーム解析」、羊土社、２０００年
【非特許文献２】Ｋ．Ｊ．Ｗｕら著、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６年、６８巻、ｐ．８７３
【非特許文献３】Ａ．Ｍ．Ｂｅｌｕら著、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、７３巻、ｐ．１４３
【非特許文献４】Ｄ．Ｓ．Ｍａｎｔｕｓら著、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９３年、６５巻、ｐ．１４３１
【非特許文献５】Ｍ．Ｓ．Ｗａｇｎｅｒら著、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．、２００２年、１３巻、ｐ．４０７
【非特許文献６】Ｙ−Ｐ．Ｋｉｍら著、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００６年、７８巻、ｐ．１９１３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、上記の従来の問題に鑑みなされたものであって、空間分解能の高い二次元分布像を取得し得る情報取得方法及びこの情報取得方法を実行する情報取得装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明による情報取得方法は、対象物の質量に関する情報を飛行時間型質量分析計を用いて取得する情報取得方法であって、該対象物のイオン化を促進する金属コロイド粒子を、該イオン化を行う１次ビームに相対して該対象物の下部に配置する工程と、集束し、パルス化し、かつ走査可能な、イオン、中性粒子、及び電子、並びに集光し、パルス化し、かつ走査可能な、レーザー光からなる群から選択された１つの該１次ビームを用いて該対象物に照射を行い該対象物を構成する構成物をイオン化して飛翔させる工程と、該飛翔した構成物の質量に関する情報を、該飛行時間型質量分析計を用いて取得する工程と、を有することを特徴とする。
【００１７】
本発明による情報取得装置は、対象物の質量に関する情報を飛行時間型質量分析計を用いて取得する情報取得装置であって、該対象物のイオン化を促進する金属コロイド粒子を、該イオン化を行う１次ビームに相対して該対象物の下部に配置させる手段と、集束し、パルス化し、かつ走査可能な、イオン、中性粒子、及び電子、並びに集光し、パルス化し、かつ走査可能な、レーザー光からなる群から選択された１つの該１次ビームを用いて該対象物に照射を行い該対象物を構成する構成物をイオン化して飛翔させる手段と、該飛翔した構成物の質量に関する情報を、該飛行時間型質量分析計を用いて取得する手段と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、対象物を構成する構成物の親分子イオンを効率良く生成させることができる。また、この構成物の二次元分布状態を保持したままイメージング検出することが可能となる。また、物体表面の微細な領域での、構成物自体の分布を効率良く観察することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、図面を参照しながら、本発明をより詳細に説明する。
【００２０】
＜本発明による情報取得方法＞
図１は、本発明による情報取得方法の概要を示した概念図である。本発明による情報取得方法は、まず、対象物５のイオン化を促進する金属コロイド粒子３を、１次ビーム１に相対して情報の取得の対象とする対象物５の下部に配置する。次に、このように配置した対象物５の対象物目的位置４に１次ビーム１を照射して、対象物５を構成する構成物２をイオン化するとともに飛翔させる。その後、この飛翔した構成物２のそれぞれについて、飛行時間型質量分析計を用いて、その質量に関する情報を取得する。その後、この質量に関する情報を元に、情報の取得の対象とした対象物における各構成物の分布状態に関する情報を得る。
【００２１】
金属コロイド粒子を対象物の下部に配置する工程としては、１次ビームに相対して対象物の表面から一定の距離に金属コロイド粒子を配置させ得る方法であれば、特に制約はない。例えば、種々の混合物からなる溶液を情報の取得の対象物とする場合、あらかじめ基板上に金属コロイド粒子からなる層を形成させた後、その層上に先の溶液を塗布することで種々の混合物からなる層を積層して形成されてもよい。また、キャピラリーやカテーテルを用いて挿入するマイクロインジェクション法、ＰＥＧ法、レーザー法及びパーティクルガン法並びにインクジェット法を用いて、金属コロイド粒子を対象物の下部に配置してもよい。特に、これらの方法は、細胞や組織などの生体由来の物質を対象物とする場合に、有用である。
【００２２】
この金属コロイド粒子を対象物の下部に配置する工程として、１次ビームを用いる場合、１次ビームの入射エネルギーとしては、１５ｋｅＶ〜２５ｋｅＶであってもよい。これにより、有機膜中に２０〜４０ｎｍのオーダーで有機膜中にビームが打ち込まれることとなり、表面と対象物との間に金属コロイド粒子を配置しておけば、任意の深さからの上述の各種の情報を得ることが可能となる。
【００２３】
マイクロインジェクション法を用いてこの金属コロイド粒子を対象物の下部に配置する工程を行う場合、対象物の斜め上方向から入射せしめ、対象物目的位置の下部に一定の深さをもって配置してもよい。これにより、目的位置における構成物の分布状態を破壊することなく構成物の分布状態を、サブミクロンといった微細な空間分解能で検出（イメージング）することができる。
【００２４】
なかでも、ガス圧の調整により粒子の適度な深度の調整が可能で、かつ、比較的容易に多数の粒子を対象物質の目的位置に打ち込めるパーティクルガン法を用いることが好ましい。
【００２５】
また、この金属コロイド粒子を対象物の下部に配置する工程として、多数の金属コロイド粒子を均一に配置し得る点で、金属コロイド粒子を有する溶液を用いたインクジェット法を用いることが好ましい。
【００２６】
上述のマイクロインジェクション法やパーティクルガン法などの高圧力で金属コロイド粒子を対象物の下部に配置する方法は、確実性が高い反面、配置時の金属コロイド粒子のエネルギーが高いことから、精密な調整を必要とする点で、若干不利である。また、配置の際の金属コロイド粒子に与えられるエネルギーの分散性や、配置の方向を制御するのに、精度を要する。特に、組織切片などの組織由来のものを本発明による情報取得方法の情報の取得の対象とする場合、この対象物の分析に必要となるサブミクロンオーダーでの緻密な分散性を期待するのは困難を要する。そこで、より簡易に、より多数で、かつ、サブミクロンレベルの均一性を保持させながら、対象物の下部に粒子を配置する方法として、金属コロイド粒子を水溶液等の適当な溶媒に溶解させたものをインクジェット法によって配置する方法が好ましい。この際、金属コロイド粒子を溶媒に溶解させたものを用いて、この溶液の溶媒の成分及び量、並びにこの溶液の吐出角度及び距離等を調節して、溶媒が蒸散し金属コロイド粒子のみを対象物に到達させるように行うことが好ましい。このインクジェット法は、プリンターなどの通常の印字と同じ仕様で用いると、このような通常の印字の際の吐出速度が数１０ｍ／秒程度であり、この速度は、パーティクルガン法の際に得られるエネルギーに換算すると、数ｋｇｆ／ｃｍ２に相当する。このエネルギーから見ると、金属コロイド粒子を対象物の下部に配置するには、十分なエネルギーであると言える。しかしながら、インクジェット法を用いた場合、液滴の状態で対象物の表面に衝突させると、金属コロイド粒子の溶液が物理的なクッションのように働いて、エネルギーの散逸が生じてしまう。そのため、金属コロイド粒子の吐出の際のエネルギーが対象物の衝突時に激減してしまい、対象物の下部に注入配置することが困難となる。従って、上述のように、インクジェット法により金属コロイド粒子からなる溶液を用いて金属コロイド粒子を対象物の下部に配置する工程を行う場合、この溶液の溶媒が蒸散し金属コロイド粒子のみを対象物に到達させるように行うことが好ましい。
【００２７】
この金属コロイド粒子を対象物の下部に配置する工程において、配置させる際の金属コロイド粒子の形態としては、固体状、液体状のいずれであってもよい。特に、金属コロイド粒子を水などの溶媒に分散させた溶液を用いてもよい。
【００２８】
この金属コロイド粒子を対象物の下部に配置する工程において、金属コロイド粒子を対象物の下部に配置させる際の対象物に相対する配置方向としては、上述の要件を満たす方向であれば、特に限定されない。例えば、この配置方向としては、対象物を載置する基板から見て、対象物の上方から配置してもよく、また、対象物の表面に対して９０°未満の一定の角度をなす方向から配置してもよい。また、基板が存在しない試料を用い多針構造のマイクロインジェクションを対象物裏面より挿しこみ、目的位置下部に一度に多数の粒子を配置するような方法も充分に有効である。
【００２９】
この金属コロイド粒子を対象物の下部に配置する工程において、１次ビーム１を照射する対象物目的位置４における対象物５の破壊を抑える目的で、対象物目的位置４の上部に１次ビーム１の衝撃を抑える部材を配置してもよい。このような部材としては、紙やゲル溶液などの固形物又は液体が挙げられる。
【００３０】
本発明による情報取得方法において、１次ビームに相対して前記対象物の表面から０．１ｎｍ以上１００ｎｍ以下の位置に前記金属コロイド粒子を配置することが好ましい。１００ｎｍを越えると、本発明による情報取得方法において、１次ビームが有機物からなる細胞膜などの対象物を通過して、金属コロイド粒子に衝撃を与える必要性があることから、十分なエネルギーを金属コロイド粒子に与えることができない。また、０．１ｎｍ未満であると、粒子表面の物質量が少なくなりすぎて、十分なイオン信号を検出できなくなる。
【００３１】
１次ビームに相対した対象物からの金属コロイド粒子の配置位置（以下、配置深さとも称する。）を測定する方法としては、エリプソメトリー法などの偏光解析法が挙げられる。また、配置深さの絶対値としては得られないものの、後述の飛行時間型質量分析計を用いて、金属コロイド粒子を構成する金属イオン種の強度が配置深さに反比例することを利用して、外挿法などによって配置深さを求めてもよい。特に、金属コロイド粒子としてＡｕを用いる場合、後述の１次ビームの照射により発生するＡｕ３＋を配置深さを示す指標として用いて、配置深さを算出してもよい。
【００３２】
本発明による情報取得方法において、対象物を構成する構成物をイオン化して飛翔させる工程としては、対象物を構成する構成物をイオン質量分析法などに用いられる１次ビームを用いてイオン化し且つ飛翔させ得るものであれば、特に限定されない。
【００３３】
本発明による情報取得方法において、対象物を構成する構成物のイオン化を行う１次ビームとしては、集束することが可能で、パルス化することが可能で、かつ走査することが可能な、イオン、中性粒子及び電子からなるものが用いられる。また、この１次ビームとしては、集光することが可能で、パルス化することが可能で、かつ走査することが可能なレーザー光を用いてもよい。なかでも、１次ビームは、イオンからなることが好ましい。
【００３４】
１次ビームを構成する１次イオン種としては、イオン化効率、質量分解能等の観点からガリウムイオン、セシウムイオン、金（Ａｕ）イオン、ビスマス（Ｂｉ）イオン、カーボンフラーレン（Ｃ６０）が好ましい。なお、Ａｕイオン、Ｂｉイオン、Ｃ６０イオンを用いると、極めて高感度の分析が可能となる点でより好ましい。その際、Ａｕイオン、Ｂｉイオンのみならず、金、ビスマスの多原子イオンである、Ａｕ２イオン、Ａｕ３イオン、Ｂｉ２イオン、Ｂｉ３イオンを用いることができ、この順で感度の上昇が図られる場合も多い。特に、金、ビスマスの多原子イオンは、さらに好ましい。
【００３５】
さらに、１次イオンビームパルス周波数は、１ｋＨｚ〜５０ｋＨｚの範囲であることが好ましい。また、１次イオンビームエネルギーは、１２ｋｅＶ〜２５ｋｅＶの範囲であることが好ましい。また、１次イオンビームパルス幅は、０．５ｎｓ〜１０ｎｓの範囲であることが好ましい。
【００３６】
また、本発明は、定量精度を向上させるために、高い質量分解能を保持し、比較的短時間で測定を完了させる必要があることから（一測定が数１０秒から数１０分のオーダー）、１次イオンビーム径を多少犠牲にして測定することが好ましい。具体的には、１次イオンビーム径をサブミクロンオーダーまで絞らずに、１μｍから１０μｍの範囲に設定することが好ましい。
【００３７】
このように、１次ビームを用いて対象物に照射を行って対象物を構成する構成物をイオン化することで、１次ビームの持つ反跳エネルギー伝播により金属コロイド粒子の１次ビーム照射側に位置する構成物が上方へと障害なく飛翔することが可能となる。また、ＴＯＦ−ＳＩＭＳでのフラグメントイオンの生成を抑え、効率良く飛翔させることができる。
【００３８】
本発明による情報取得方法において、構成物の質量に関する情報を取得する工程は、飛行時間型質量分析計を用いて、先の対象物を構成する構成物をイオン化して飛翔させる工程で得た構成物の２次イオンの質量に関する情報を取得する工程である。この取得工程は、標準的なＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を用いて行えばよい。
【００３９】
なお、本発明による情報取得方法において、対象物を構成する構成物の質量に関する情報としては、対象物の下部に配置した金属コロイド粒子とともに１次ビームを照射して得られるもののうち、以下の一項から三項に挙げるイオンの質量数が含まれる。
【００４０】
（１）対象物に金属コロイド粒子を構成する金属が付加したものの質量数
（２）対象物に金属コロイド粒子を構成する金属が付加し、これに水素、炭素、窒素及び酸素からなる群から選択される１以上１０以下の数の原子が付加したものの質量数
（３）（２）に規定のものから、水素、炭素、窒素及び酸素からなる群から選択される１以上１０以下の数の原子が脱離したものの質量数
【００４１】
本発明による情報取得方法において、構成物の前記対象物における分布状態に関する情報を得る工程としては、対象物を載置した基板上における位置情報と、先の飛翔させた構成物の質量に関する情報とを用いて、画像化処理を行う方法が挙げられる。また、この構成物の前記対象物における分布状態に関する情報を得る工程としては、構成物の対象物における２次元での分布状態を得る工程であってもよい。
【００４２】
特に、この画像化処理として、この構成物に相当する質量スペクトルにおけるピーク （強度）をＸＹ平面で切り出したイメージ像を、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定で得た対象物の三次元データ上に、上記タンパク質の２次元分布像として表示させてもよい。対象物における取得の対象とする構成物が複数種ある場合は、この操作を繰り返せばよい。このような処理を行うことで、構成物毎に、対象物の基板上における存在量の分布として取得することが可能である。さらには、別途、顕微鏡観察において測定された対象物表面の画像と、２次イオン種のピーク強度を二次元的にイメージ表示させたものとを対応づけることで、対象物における、構成物の局在部位の特定を行うことが可能となる。
【００４３】
本発明による情報取得方法において、対象物の２次元分布状態の検出（イメージング）は、この対象物を識別できる２次イオンを用いることを特徴とするものである。この２次イオンは質量／電荷比が５００以上のイオンであることが好ましく、質量／電荷比が１０００以上のイオンであることが特に好ましい。
【００４４】
（対象物）
本発明による情報取得方法において、情報を取得する対象物としては、タンパク質やペプチド（以下、ポリペプチドと称する。）などの有機物であれば、特に限定されない。特に、対象物は、臓器から取得した細胞や組織などの生体組織切片であってもよい。また、対象物は、固形であることが好ましい。
【００４５】
本発明による情報取得方法において、この対象物は、本技術分野公知の種々の方法により、後述の基板上に載置され、上述の方法に供される。
【００４６】
（基板）
本発明による情報取得方法において、対象物を載置する基板としては、対象物に１次ビームを照射して得た上記の構成物についての質量情報の検出を妨げることのない固形物であれば、特に制約はない。具体的には、シリコンなどの導電性を有するもの、有機ポリマーやガラスなどの絶縁性を有するものが挙げられる。また、ここで「基板」と称しているが、板状の形態に限られることはなく、粉末状、粒状のようなあらゆる形態のものを用いることができる。
【００４７】
（金属コロイド粒子）
本発明による情報取得方法において、利用される金属コロイド粒子の構成物質としては、例えば以下の金属又はこれらの金属からなる合金を少なくとも１種類以上有するものが挙げられる。つまり、金、銀、銅、白金、パラジウム、ロジウム、オスミウム、ルテニウム、イリジウム、鉄、錫、亜鉛、コバルト、ニッケル、クロム、チタン、タンタル、タングステン、インジウム及びケイ素が挙げられる。なかでも、比較的容易に入手が可能で、かつ、イオン検出感度の向上が最も高い点で、金からなることが好ましい。金属コロイド粒子の粒径としては、特に制約はなく、例えば市販品のような数ｎｍから数百ｎｍまでのものであってもよい。なかでも、金属コロイド粒子の直径は、１ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることが好ましい。この範囲から外れると、上述の１次ビームが通常の測定条件において１個／１００ｎｍ２といった密度で入射され、またこの時、金属表面より反跳されるエネルギー伝播領域が１００ｎｍ２程度であることから考えて、反跳エネルギーが増大し過ぎてしまう。特に、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析における一般的な測定時間内での１次イオン入射密度、および、粒子入射における対象物のダメージを最小限に抑えることを考えると、金属コロイドの粒径としては、１０ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることがより好ましい。
【００４８】
＜本発明による情報取得装置＞
本発明による情報取得装置は、対象物の質量に関する情報を飛行時間型質量分析計を用いて取得する情報取得装置であって、該対象物のイオン化を促進する金属コロイド粒子を、該イオン化を行う１次ビームに相対して該対象物の下部に配置させる手段と、集束し、パルス化し、かつ走査可能な、イオン、中性粒子、及び電子、並びに集光し、パルス化し、かつ走査可能な、レーザー光からなる群から選択された１つの該１次ビームを用いて該対象物に照射を行い該対象物を構成する構成物をイオン化して飛翔させる手段と、該飛翔した構成物の質量に関する情報を、該飛行時間型質量分析計を用いて取得する手段と、を有することを特徴とする。また、本発明による情報取得装置において、前記構成物の前記対象物における分布状態に関する情報を得る手段をさらに有することを特徴とする。
【００４９】
本発明による情報取得装置において、金属コロイド粒子を対象物の下部に配置する手段は、上述の本発明による情報取得方法における金属コロイド粒子を対象物の下部に配置する工程を実行し得る手段に対応する。また、本発明による情報取得装置において、対象物を構成する構成物をイオン化して飛翔させる手段は、上述の本発明による情報取得方法における対象物を構成する構成物をイオン化して飛翔させる工程を実行し得る手段に対応する。また、本発明による情報取得装置において、構成物の質量に関する情報を取得する手段は、上述の本発明による情報取得方法における構成物の質量に関する情報を取得する工程を実行し得る手段に対応する。また、本発明による情報取得装置において、構成物の前記対象物における分布状態に関する情報を得る手段は、上述の本発明による情報取得方法における構成物の前記対象物における分布状態に関する情報を得る工程を実行し得る手段に対応する。
【実施例】
【００５０】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。
【００５１】
なお、実施例１では、対象物に金属コロイド粒子を単に分散した場合の例について示し、実施例２では、金属コロイド粒子上に対象物を配置した場合の例について示し、実施例３では、対象物の下部に金属コロイド粒子を配置した場合の例について示す。これらの実施例は、本発明の最良の実施形態を説明するものであるが、本発明は、斯かる具体的形態に限定されるものではない。
【００５２】
（実施例１）
金コロイド粒子を混合したポリペプチド膜のＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析
【００５３】
本発明の要件として、金属コロイド粒子を目的位置の下部にある一定の深さで配置することにあるが、前段階として本発明の効果確認をするため、単純にポリペプチド膜中に金コロイド粒子を分散させた試料を作成し、本発明の効果の検証をおこなった。
【００５４】
最初に試料作成について述べる。基板としては、不純物を含まない１×１ｃｍ□シリコン基板をアセトンおよび脱イオン水の順番で洗浄したものを用いた。使用したポリペプチドとして、下記の物質をそれぞれ１０ｎｇ／１μＭ水溶液となるように調製し、脱イオン水を用いてそれぞれ１ｎｇ／μＬに調製し、各１００μＬを全て混合した水溶液を調製した。以下、この水溶液を混合ポリペプチド溶液と呼ぶ。
【００５５】
アンジオテンシンＩ（配列番号１、ウシ由来、平均分子量：１２９５．５１、以下アンジオテンシンと表記）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）
ニューロテンシン（配列番号２、ウシ由来、平均分子量：１６７２．９６）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）
ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）（１８−３９）（配列番号３、ウシ由来、平均分子量：２４６５．７２、以下ＡＣＴＨと表記）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）
【００５６】
次に、この混合ポリペプチド溶液に、金コロイド粒子溶液（粒径４０ｎｍ、クエン酸１Ｍ水溶液に０．６ミリ質量％で分散）を１００μＬ混合した。これを、軽く攪拌したのち、シリコン基板上にマイクロピペッターにより２０μＬを滴下し、自然乾燥させて直径２ｍｍ程度で膜厚が数μｍ程度の膜を形成した。
【００５７】
また、参照試料として、上述の金コロイド粒子を用いずに、上述と同様に、数μｍ程度の膜を形成した。
【００５８】
続いて、測定条件について述べる。ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析では、ＩＯＮ  ＴＯＦ社製ＴＯＦ−ＳＩＭＳ５型装置を用いた。測定条件を以下に要約する。
【００５９】
１次イオン：２５ｋＶ  Ｂｉ＋、０．３ｐＡ（パルス電流値）、ｓａｗｔｏｏｔｈスキャンモード
１次イオンのパルス周波数：３．３ｋＨｚ（３００μ秒／ｓｈｏｔ）
１次イオンパルス幅：約０．８ｎ秒
１次イオンビーム直径：約３μｍ
測定領域：３００μｍ×３００μｍ
２次イオン像のピクセル数：１２８×１２８
積算時間：約４００秒
【００６０】
このような条件で正の２次イオン質量スペクトルを測定した。その結果として得られた実測スペクトルを図２に示す。それぞれのスペクトルにおいて、上段は、金コロイド粒子を用いずに調製した混合ポリペプチド溶液だけの参照試料で、下段は、金コロイド粒子を有する混合ポリペプチド溶液の試料から得られたスペクトルである。（ａ）は広域質量領域におけるスペクトルを表す。また、（ｂ）乃至（ｅ）は、広域質量領域におけるスペクトルをそれぞれ拡大したものであって、（ｂ）は、［アンジオテンシン＋Ｈ］＋、（ｃ）［ニューロテンシン＋Ｈ］＋、（ｄ）［ＡＣＴＨ＋Ｈ］＋、（ｅ）Ａｕ３＋についてのものである。
【００６１】
（実施例２）
金基板上に膜厚を変化させて配置したポリペプチド膜のＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析
上述のように、本発明の効果を最大限に得るため、金属コロイド粒子を対象物の目的位置下部の一定の深さに配置することが望ましい。この金属コロイド粒子の埋め込みの深さを最適化するため、金基板上にスピンコート法で種々の膜厚を持つポリペプチド薄膜を作製した。この薄膜について、ＴＯＦ−ＳＩＭＳでの測定によって、擬似的に金コロイド粒子を適用する際の配置深さの検討として、金表面におけるポリペプチド薄膜の最適な厚み評価を行った。
【００６２】
最初に試料の調製について述べる。基板としては不純物を含まない１×１ｃｍ□のシリコン基板をアセトンおよび脱イオン水の順番で洗浄し、金を加熱蒸着法で数１００ｎｍ程度に成膜したものを金基板として用いた。ポリペプチドとしては、実施例１で使用した混合ポリペプチド溶液を用い、マイクロピペッターを用いて、１０μＬずつを上記の金基板上にスポッティングし、回転数１５００回／分の速度でスピンコート法により成膜を行った。このとき、成膜する膜厚のコントロールとして、スポッティングの回数を１回から４回と変化させて、混合ポリペプチド溶液からなる膜の膜厚が異なる試料をそれぞれ作成した。この基板を自然乾燥した後、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析に用いた。
【００６３】
混合ポリペプチド溶液からなる膜の膜厚は、１次ビームを照射した際に得られる金表面のＡｕ３＋に由来するシグナルから、相対値として算出した。
【００６４】
測定条件についても、上述の実施例１と全く同様にして分析を行った。その結果として得られた実測スペクトルを図３に示す。それぞれのスペクトルは、（ａ）［アンジオテンシン＋Ｈ］＋、（ｂ）［ニューロテンシン＋Ｈ］＋、（ｃ）［ＡＣＴＨ＋Ｈ］＋、（ｄ）Ａｕ３＋を示す。各種ポリペプチドの親分子イオン（＋Ｈ付加）の信号が試料の膜厚（Ａｕ３＋の信号強度に反比例）に依存するように検出され、Ａｕ３＋の信号強度が２．５×１０４ｃｎｔ／秒となる試料膜厚の時に各種ポリペプチドの強度が最大となった。この実験結果により、金コロイド粒子を目的位置の下部に配置する際、本発明の効果を最大限に得られる最適な配置深さが存在することが明らかとなった。また、この最適な配置深さは、同ＴＯＦ−ＳＩＭＳの測定条件で計測してＡｕ３＋の信号強度が２．５×１０４ｃｎｔ／秒程度になるように調整することにより得ることができると予想される。
【００６５】
（実施例３）
インクジェット法を用いた生体試料下部への金コロイド粒子配置
上述のように、発明の効果を最大限に発揮するため、金属コロイド粒子を、より多数かつより均一に試料下部の一定深さに配置する方法として、金属コロイド粒子の溶液をインクジェット法で吐出して試料下部に注入配置する手段を用いた。用いた金属コロイド粒子溶液は、実施例１と同様に、金コロイド粒子溶液（粒径４０ｎｍ、クエン酸１Ｍ水溶液に０．６ｍ質量％で分散）をそのままの状態で使用した。インクジェット方式は熱加熱（バブルジェット（登録商標））方式を用い、市販のプリンター（キヤノン  ＰＩＸＵＳ９９０ｉ：１つの液滴サイズ８ｐＬ）の印字受け箇所を改造して、液滴の飛翔距離が１ｃｍのところに１ｃｍ角の基板試料を設置できるようにした。この液滴飛翔距離の改造により、液滴の飛翔中に溶媒成分を蒸発させ、金コロイド粒子を試料下部に注入配置させることが可能となる。用いた生体試料は、胃壁組織（健常人の胃部より摘出）をミクロトームで厚さ１μｍ程度に切片化し、パラフィンでＳｉ基板上に固定した後、エタノールで洗浄し、室温・大気下で十分に乾風したものを用いた。図４に、実際に金コロイド粒子を吐出した切片組織表面における走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の像を示す。図中、白く丸く写っている箇所は、直径４０ｎｍの金コロイド粒子を示す。そのうち、輝度が高い部分は、試料表面から露出している箇所を示し、少し輝度が低い部分は、金コロイド粒子が試料に埋没している様子を示す。この図に示されるように、このインクジェットの手法によって、金コロイド粒子が生体試料表面下部に埋め込まれて配置されている様子が判る。さらに、このインクジェット法によって金コロイド粒子を注入配置した試料を、実施例１と同様に、ＴＯＦ−ＳＩＭＳで計測した。その結果を図５に示す。図５（ａ）は、通常のバブルジェットプリンター（登録商標）での液滴飛翔距離２ｍｍで、金コロイド粒子溶液を試料表面に吐出した試料のＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルを示す。また、図５（ｂ）は、上述のように、液滴飛翔距離を１ｃｍにして、金コロイド粒子溶液を試料表面に吐出した試料のＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルを示す。この両スペクトルの高質量の領域（＞４００ａｍｕ）において、（ａ）からは、金のクラスターピークが検出されているだけであるのに対して、（ｂ）からは、脂肪酸由来と思われるピークが多数、かつ、強く検出されている。このことからも、液滴飛翔距離を十分に広げることにより、溶媒成分の蒸発によって、金属コロイド粒子が試料下部に注入配置され、そのことにより、ＴＯＦ−ＳＩＭＳの２次イオン感度が増強されたことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明による情報取得方法の概要を示した概念図である。
【図２】実施例１における正の２次イオン質量スペクトルの比較図である。
【図３】実施例２における、正の２次イオン質量スペクトルの比較図である。
【図４】実施例３で得た走査型電子顕微鏡写真像である。
【図５】実施例３で得た正の２次イオン質量スペクトルである。
【符号の説明】
【００６７】
１    １次ビーム
２    構成物
３    金属コロイド粒子
４    対象物目的位置
５    対象物
６    基板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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