(57)【要約】      （修正有）【課題】凝集性を示さないなど取り扱い性に優れ、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株と同様の生理作用を有し、飲食品や医薬品の製造に好適な新規乳酸菌株、該乳酸菌株を含有する飲食品および発酵飲食品、並びに該乳酸菌株を用いる発酵飲食品の製造方法を提供する。【解決手段】１６Ｓ  ｒＤＮＡの、５’末端〜４９０番目に特定の塩基配列があり、９１１番目〜１４１０番目に固有の塩基配列を持つラクトバチルス  ブレビスに属する乳酸菌株；ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株；かかる乳酸菌株を用いて発酵を行う工程を有する発酵飲食品の製造方法；かかる乳酸菌株を含有する飲食品；かかる乳酸菌株を用いて発酵を行って得られる発酵飲食品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１６Ｓ  ｒＤＮＡの、５’末端〜４９０番目の塩基配列が配列番号１で表わされ、９１１番目〜１４１０番目の塩基配列が配列番号２で表わされるラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する乳酸菌株。
【請求項２】
ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株。
【請求項３】
植物性原料の発酵に用いる請求項１または２に記載の乳酸菌株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の乳酸菌株を用いて発酵を行う工程を有する発酵飲食品の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の乳酸菌株を含有する飲食品。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の乳酸菌株を用いて発酵を行って得られる発酵飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規乳酸菌株、該乳酸菌株を含有する飲食品および発酵飲食品、並びに該乳酸菌株を用いる発酵飲食品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する乳酸菌株は、乳酸菌の中でも特に耐ストレス性が強く、極めて広範な優れた生理作用を有することが知られており、これまでに、例えば、抗アレルギー剤、抗胃炎剤、抗潰瘍剤、肝炎治療・予防剤、腫瘍増殖抑制剤、抗腫瘍活性剤、 γ−アミノ酪酸の生産への利用について報告されている。
なかでも、ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株はインターフェロン産生能向上剤として利用可能な事が知られており（特許文献１参照）、極めて有用な乳酸菌である。また、生きた状態で摂取すれば、容易に腸に到達して長く生存できるため、健康増進を志向した飲食品として、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株を生きた状態で含有する発酵飲食品が望まれている。
【特許文献１】特開平９−１８８６２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株は、発酵中に菌体外多糖を産出するため、十分な生菌数を含有する発酵物を得ようとすると、菌が凝集してしまい、発酵物中の菌数の分布が不均一になったり、発酵物の粘度が変化したり、製品の外観が悪くなる等の問題点があった。
【０００４】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、凝集性を示さないなど取り扱い性に優れ、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株と同様の生理作用を有し、飲食品や医薬品の製造に好適な新規乳酸菌株、該乳酸菌株を含有する飲食品および発酵飲食品、並びに該乳酸菌株を用いる発酵飲食品の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、１６Ｓ  ｒＤＮＡの、５’末端〜４９０番目の塩基配列が配列番号１で表わされ、９１１番目〜１４１０番目の塩基配列が配列番号２で表わされるラクトバチルス  ブレビスに属する乳酸菌株である。
請求項２に記載の発明は、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株である。
請求項３に記載の発明は、植物性原料の発酵に用いる請求項１または２に記載の乳酸菌株である。
請求項４に記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の乳酸菌株を用いて発酵を行う工程を有する発酵飲食品の製造方法である。
請求項５に記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の乳酸菌株を含有する飲食品である。
請求項６に記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の乳酸菌株を用いて発酵を行って得られる発酵飲食品である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の乳酸菌株は、凝集性を示さないため、取り扱い性に優れ、発酵物の品質を均一に保持でき、発酵物の製造に好適である。また、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株と同様の優れた生理作用を有する。したがって、飲食品や医薬品の製造に好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明について、詳しく説明する。
＜ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株の取得＞
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株（以下、「ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株」と略記することがある）を、市販のＭＲＳ液体培地（ＯＸＯＩＤ社製）で、３０℃、１８時間培養した。次に、その培養液を、トマト果汁１０ｍＬに1容量％植菌し、３０℃で１８時間培養し、この培養物を、ＭＲＳ寒天培地（ＯＸＯＩＤ社製）を用いて混釈培養した。
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株をＭＲＳ寒天培地で培養した時に通常観察されるコンペイトウ状の形態とは異なる円盤状のコロニーを、イノキュレーティングニードル（Ｎｕｎｃ社製）で穿刺し、付着した菌体をＭＲＳ液体培地に接種して、３０℃で１８時間培養した。
さらに純化するため、この培養液を、ＭＲＳ寒天培地を用いて混釈培養し、３０℃で２日間培養後に形成した円盤状のコロニーを同様に分離、培養し、これを４回繰り返した。
その結果、ＭＲＳ寒天培地で混釈培養した時のプレート中でのコロニー形態が、ラクトバチルス  ブレビスＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株とは明らかに異なる変異株として、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株（以下、「本菌株」と略記することがある）を得た。この時のコロニーの撮影画像を図１に示す。図１（ａ）は、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株の撮影画像、図１（ｂ）は、ラクトバチルス  ブレビスＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株の撮影画像である。
なお、ここで培養に用いたラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターより分譲可能である。
【０００８】
＜ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株の同定＞
（形態的性質）
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株の形態的性質は、前記各培地で培養した時のコロニーを顕微鏡観察することにより確認した。その結果、細胞形態は桿菌であり、ラクトバチルス  ブレビスＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株およびラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＪＣＭ１０５９Ｔ株（以下、「基準株」と略記することがある）同様、胞子を有さず、運動性も有していなかった。
【０００９】
（培養的性質）
前記ＭＲＳ寒天培地で培養した時のコロニー形態は、円形、半球形、スムース、白色であった。
また、ＢＬ寒天培地（栄研化学株式会社製）で培養した時のコロニー形態は、円形、半レンズ状、スムース、白色であった。
なお、ラクトバチルス  ブレビスＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株も、これら培地で培養した場合は、いずれも本菌株と同様の性質を示し、前記混釈培養の場合とは、異なるコロニー形態であった。
【００１０】
（生理学的性質）
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株の生理学的性質を公知の方法により評価し、ラクトバチルス  ブレビスＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株およびラクトバチルス  ブレビス  ＪＣＭ１０５９Ｔ株と比較した。結果を表１に示す。
表１に示すように、本菌株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株および基準株と同じ生理学的性質を示した。
【００１１】
【表１】
2008211994.tif 000002
【００１２】
（炭水化物の分解性）
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株の各種炭水化物の分解性を、細菌検査同定用キットＡｐｉ  ５０  ＣＨ（ｂｉｏ  Ｍｅｒｉｅｕｘ社製）を使用して評価し、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株およびラクトバチルス  ブレビス  ＪＣＭ１０５９Ｔ株と比較した。その結果を表２および３に示す。
表２および３から明らかなように、本菌株と基準株とは、リボース、β−メチル−Ｄ−キシロース、ガラクトース、Ｄ−フラクトース、α−メチル−Ｄ−グルコシドの資化性に相違が認められた（表中、「＊」で示した）。一方、本菌株とＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株との間に資化性の相違は認められなかった。
【００１３】
【表２】
2008211994.tif 000003
【００１４】
【表３】
2008211994.tif 000004
【００１５】
（塩基配列）
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列（部分配列）を公知の方法で決定した。決定した塩基配列のうち、５’末端（１番目）から４９０番目までの塩基配列を配列番号１に示し、９１１番目から１４１０番目までの塩基配列を配列番号２に示す。この決定した塩基配列について、大学共同利用機関法人  情報・システム研究機構  国立遺伝学研究所  生命情報・ＤＤＢＪ研究センターが運営している日本ＤＮＡデータバンクの相同性検索（ＢＬＡＳＴ）を行った。
その結果、本菌株の配列番号１に示す塩基配列は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株と同じであり、８１番目の塩基が基準株とは異なっていた。また本菌株の配列番号２に示す塩基配列は、３７６番目の塩基が基準株とは異なっており、４７０、４９１、４９２、４９６、４９８〜５００番目の塩基が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株および基準株と異なっていた（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株と基準株とでは同じであった）。そして、本菌株とＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株、本菌株と基準株とは、いずれも９９％以上の相同性を示したが、異なる菌である事が示唆された。
【００１６】
以上より、本菌株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株と比較すると、前記生理学的性質および炭水化物の分解性が同じであり、１６Ｓ  ｒＤＮＡの前記塩基配列が９９％以上の相同性を有し、前記混釈培養時のコロニー形態が異なっていた。そして、後記実施例に示すように、培養液の凝集性が全く異なっており、本菌株は凝集性を示さなかった。
以上の結果より、本菌株は、ラクトバチルス  ブレビスに属する新規の乳酸菌株であることが示された。
【００１７】
＜乳酸菌株＞
本発明の乳酸菌株は、１６Ｓ  ｒＤＮＡの、５’末端（１番目）〜４９０番目の塩基配列が配列番号１で表わされ、９１１番目〜１４１０番目の塩基配列が配列番号２で表わされるラクトバチルス  ブレビスに属するものである。
そして、該乳酸菌株に、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株は包含される。
【００１８】
本発明のラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株は、平成１９年２月１５日）付けで受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領され、現在寄託手続き中である。
【００１９】
本発明の乳酸菌株は、抗菌活性を有する。特に食品危害微生物であるバチルス  コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）やリステリア  モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等に優れた活性を示すため、飲食品や医薬品の成分として好適である。
【００２０】
また、本発明の乳酸菌株は、培養時および保存時に凝集性がない。したがって、本菌株を用いた発酵飲食品は、製造適性および保存適性に優れる。
【００２１】
本発明の乳酸菌株は、特に植物性原料の発酵に好適である。使用可能な植物性原料としては、例えば、野菜、果実、穀類および豆類が挙げられる。
野菜としては、例えば、トマト、赤ピーマン、ニンジン、キャベツ、はくさい、レタス、大根、ほうれん草、ケール、玉葱、なす、プチヴェール（登録商標）（ケールと芽キャベツの交雑種）、しいたけ、シメジ等が挙げられる。
果実としては、例えば、グレープフルーツ、オレンジ、リンゴ、ブドウ、イチゴ、パイナップル、キウイ、グアバ、マンゴー、アセロラ、ブルーベリー、ザクロ、モモ、洋なし、パパイヤ、メロン、スイカ、バナナ、イチジク等が挙げられる。
穀類としては、例えば、麦（麦芽）、米等を、豆類としてはダイズ、エンドウ等が挙げられる。
本発明においては、これら植物性原料を単独で用いても良く、二種以上を併用しても良い。目的に応じて、適宜最適な組み合わせを選択できる。
【００２２】
本発明の乳酸菌株は、前培養してから発酵に用いることが好ましい。前培養は公知の方法で行えば良く、例えば、市販の乳酸菌用培地を、必要に応じて所定の濃度となるように蒸留水に溶解させ、オートクレーブ滅菌した後、本発明の乳酸菌株を植菌して、所定時間培養する方法が挙げられる。前培養時に乳酸菌株は、固体培地に植菌しても良いが、上記のように液体培地に植菌することが好ましい。
【００２３】
本発明の乳酸菌株を用いた場合の発酵条件は、用いる原料および目的に応じて適宜選択すれば良いが、本発明の乳酸菌株の植菌量は０．１〜１０容量％であることが好ましく、発酵温度は２０〜４０℃であることが好ましく、発酵時間は１２〜７２時間であることが好ましい。
【００２４】
＜飲食品、発酵飲食品の製造方法＞
本発明の飲食品は、上記本発明の乳酸菌株を含有するものである。具体的には、例えば、別途調製した飲食品に本発明の乳酸菌株を添加したものでも良いし、本発明の乳酸菌株を用いて原料を発酵させて得られた発酵飲食品でも良い。
別途調製した飲食品に本発明の乳酸菌株を添加する場合の添加量は、特に限定されない。
本発明の乳酸菌株を用いて原料を発酵させる場合は、発酵物をそのまま発酵飲食品としても良いし、適宜後処理や加工を行って発酵飲食品としても良い。発酵条件は先に述べた条件と同様である。
【００２５】
発酵時の原料は、乳酸菌発酵に使用可能なものであれば特に限定されないが、前記植物性原料が好適である。そして所望の品質に応じて、適宜組み合わせて用いても良い。
また、発酵時の原料は、目的に応じて適宜加工した状態のものを用いることができる。例えば、植物性原料は、搾汁液、磨砕物または破砕物、あるいはこれらを濃縮物、希釈物または乾燥物等に加工した形態で用いることができる。具体的には、ダイズであれば、豆乳の形態で用いることもできる。本発明においては、発酵原料として液状のものが特に好適である。
【００２６】
本発明の飲食品には、本発明の効果を損なわない範囲で、食品用として一般的に用いられているその他の原料、ｐＨ調整剤、香料、糖液等の副資材を添加しても良い。
【実施例】
【００２７】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
【００２８】
＜ＭＲＳ培地の発酵特性＞
［実施例１］
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株の凍結保存菌液を、ＭＲＳ液体培地に１容量％接種し、３０℃で１８時間培養して賦活した後、同様の条件で継代したものを前培養液とした。得られた前培養液をＭＲＳ液体培地１０ｍＬに1容量％接種し、３０℃で培養して、下記の方法により経時的に生菌数、並びに培養液の濁度、ｐＨおよび酸度を測定した。結果を図２〜５に示す。図２は生菌数、図３は培養液の濁度、図４は培養液のｐＨ、図５は培養液の酸度の経時変化をそれぞれ示すグラフである。
（測定方法）
生菌数；段階希釈した培養液１ｍＬを分注したシャーレに、ＭＲＳ寒天培地約２０ｍＬを加えて混釈プレートを作成し、３０℃で２日間培養した後、形成したコロニーをカウントして算出した。
培養液の濁度；分光光度計Ｕ−３３１０（株式会社日立ハイテクノロジーズ製）を用いて、測定波長６６０ｎｍで測定した。
培養液のｐＨ；ｐＨメーターＦ−５２（株式会社堀場製作所製）を用いて測定した。
培養液の酸度；滴定法により算出した。すなわち、試料を約５ｇ量り採り、フェノールフタレイン溶液を約５００μＬ加えて、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、微赤色が呈する点を終点とした。そのときの滴定量から下記式を用いて酸度を算出した。
（算出式）
酸度（％）＝（水酸化ナトリウム水溶液の規定数）×（水酸化ナトリウム水溶液の滴定量（Ｌ））×（乳酸１ｇ当量）÷（試料採取量）×１００
【００２９】
［比較例１］
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株の凍結保存菌液に代わり、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株の凍結保存菌液を用いたこと以外は、実施例１と同様に測定を行った。結果を図２〜５に示す。
【００３０】
生菌数および培養液の濁度からみた増殖速度や到達菌数について、本菌株とＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株との間に大きな違いはなかった。
一方、長時間培養すると、本菌株の方がやや培養液の酸度が高く、それに伴い培養液のｐＨの低下がやや大きい傾向が認められた。
【００３１】
＜透明ニンジン果汁の発酵特性および凝集性＞
［実施例２］
Ｂｒｉｘ．６０％の透明ニンジン濃縮果汁を蒸留水で希釈して、Ｂｒｉｘ．１２％に調整し、３００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬ入れて、１１５℃、１５分間の条件でオートクレーブ滅菌したものを発酵培地とした。
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株の凍結保存菌液を、ＭＲＳ液体培地に１容量％接種し、３０℃で１８時間培養して賦活した後、同様の条件で継代したものを前培養液とした。
次いで、調製した発酵培地に、５容量％の前培養液を接種し、３２℃で１８時間静置培養し、下記の方法により培養前後における生菌数、並びに培養液の酸度およびｐＨを測定し、培養後の培養液の凝集性の有無を確認した。結果を表４に示す。
（測定および確認方法）
生菌数；段階希釈した培養液１ｍＬを分注したシャーレに、ＭＲＳ寒天培地約２０ｍＬを加えて混釈プレートを作成し、３０℃で２日間培養した後、形成したコロニーをカウントして算出した。
培養液の酸度およびｐＨ；実施例１と同様の方法で測定した。
培養液の凝集性；培養液を試験管に移し、試験管ミキサーで軽く攪拌後、目視することにより凝集性の有無を確認した。
【００３２】
［比較例２］
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株の凍結保存菌液に代わり、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株の凍結保存菌液を用いたこと以外は、実施例２と同様に測定および確認を行った。結果を表４に示す。
【００３３】
【表４】
2008211994.tif 000005
【００３４】
表４に示すように、いずれの菌株を用いた場合でも、生菌数、並びに培養液の酸度およびｐＨに大きな違いはなかった。しかし、凝集性に大きな違いが認められ、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株では凝集性があるのに対し、本菌株では凝集性がなかった。この時の培養液の撮影画像を図６に示す。図６（ａ）は本菌株の培養液の撮影画像、図６（ｂ）はＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株の培養液の撮影画像である。
【００３５】
＜抗菌活性＞
［実施例３］
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株の凍結保存菌液を、ＭＲＳ液体培地に１容量％接種し、３０℃で１８時間培養して賦活した後、さらに同条件で２回継代培養したものを培養液とした。
次いで、１３０００×ｇ、５分間の条件の遠心分離により、該培養液から菌体を除去し、さらに乳酸などの有機酸の影響を除去するために、得られた培養液上清をｐＨ６．０に調整した。これを滅菌フィルターＭＩＬＬＥＸＧＶ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ  ０．２２μｍ（ミリポア社製）でろ過滅菌したものを被評価培養液とした。
また、抗菌活性を評価する際の対象菌として、食品危害微生物であるバチルス  セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）ＪＣＡ１５０１株、バチルス  セレウス  ＩＦＯ１３６９０株、バチルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＡ５２７株、バチルス  ズブチリス  ＩＦＯ１３７１９株、バチルス  コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＪＣＭ２２５７Ｔ株、リステリア  モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ７６４４株、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＲＣＳＡ１株を使用した。これら対象菌は、その凍結保存菌液をＳＣＤ培地（日水製薬株式会社製）に１容量％接種し、３０℃で１８時間、好気培養した。さらに同条件で２回継代培養を行って供試菌体とした。
【００３６】
抗菌活性の評価は、対象菌を含む寒天培地に被評価培養液を滴下するＳｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ法により行った。ＭＲＳ寒天培地を分注し凝固させたプレートに、前記条件で培養した対象菌を１容量％接種したＳＣＤ寒天培地を重層した。そしてＳＣＤ寒天培地が凝固した後、蓋を開けてプレートを裏返した状態で保ち、寒天培地の表面を乾燥させた。次いで、滅菌水で被評価培養液の希釈物（１／２倍、１／４倍〜１／３２倍）を調製し、対象菌を重層した前記プレートに１０μＬずつ滴下した。これを、以下に示す各対象菌の至適温度で２４時間培養に供した後に、阻止円形成の有無を観察した。そして阻止円を形成する最大の希釈率から、抗菌活性（Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｕｎｉｔ（ＡＵ）／ｍｌ）を下記式に従って算出した。結果を表５に示す。
（至適温度）
バチルス  セレウス  ＪＣＡ１５０１株、バチルス  セレウス  ＩＦＯ１３６９０株、バチルス  ズブチリス  ＪＣＡ５２７株、バチルス  ズブチリス  ＩＦＯ１３７１９株；３０℃
バチルス  コアギュランス  ＪＣＭ２２５７Ｔ株、リステリア  モノサイトジェネス  ＡＴＣＣ７６４４株、スタフィロコッカス  アウレウス  ＲＣＳＡ１株；３５℃
（算出式）
抗菌活性（ＡＵ／ｍｌ）＝（最大希釈率（ＡＵ））÷０．０１
【００３７】
［比較例３］
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株の凍結保存菌液に代わり、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株の凍結保存菌液を用いたこと以外は、実施例３と同様に評価を行った。結果を表５に示す。
【００３８】
［比較例４］
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株の凍結保存菌液に代わり、ラクトバチルス  ブレビス  基準株の凍結保存菌液を用いたこと以外は、実施例３と同様に評価を行った。結果を表５に示す。
【００３９】
【表５】
2008211994.tif 000006
【００４０】
表５から明らかなように、本菌株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株と同様に、バチルス  コアギュランス  ＪＣＭ２２５７Ｔ株、およびリステリア  モノサイトジェネス  ＡＴＣＣ７６４４株に対して特異的に抗菌活性を示した。
【００４１】
以上のように、本発明のラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２２２株は、抗菌活性を有するなど、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株と同様の優れた生理作用を有するので、飲食品や医薬品の製造に好適である。また、本発明の菌株は凝集性を示さないため、発酵物の製造を安定して行うことができ、発酵物の品質を均一に保持できる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、飲食品や医薬品の製造に利用可能であり、特に、発酵飲食品の製造に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】コロニーの撮影画像であり、（ａ）は本菌株の撮影画像、（ｂ）はＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株の撮影画像である。
【図２】実施例１および比較例１における生菌数の経時変化を示すグラフである。
【図３】実施例１および比較例１における培養液の濁度の経時変化を示すグラフである。
【図４】実施例１および比較例１における培養液のｐＨの経時変化を示すグラフである。
【図５】実施例１および比較例１における培養液の酸度の経時変化を示すグラフである。
【図６】培養液の撮影画像であり、（ａ）は実施例２における本菌株の培養液の撮影画像、（ｂ）は比較例２におけるＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株の培養液の撮影画像である。
【図１】
2008211994.tif 000007
【図２】
2008211994.tif 000008
【図３】
2008211994.tif 000009
【図４】
2008211994.tif 000010
【図５】
2008211994.tif 000011
【図６】
2008211994.tif 000012
【配列表】
2008211994000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月22日(2007.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、１６Ｓ  ｒＤＮＡの、５’末端〜４９０番目の塩基配列が配列番号１で表わされ、９１１番目〜１４１０番目の塩基配列が配列番号２で表わされるラクトバチルス  ブレビスに属する乳酸菌株である。
請求項２に記載の発明は、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株である。
請求項３に記載の発明は、植物性原料の発酵に用いる請求項１または２に記載の乳酸菌株である。
請求項４に記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の乳酸菌株を用いて発酵を行う工程を有する発酵飲食品の製造方法である。
請求項５に記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の乳酸菌株を含有する飲食品である。
請求項６に記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の乳酸菌株を用いて発酵を行って得られる発酵飲食品である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
以下、本発明について、詳しく説明する。
＜ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株の取得＞
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株（以下、「ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株」と略記することがある）を、市販のＭＲＳ液体培地（ＯＸＯＩＤ社製）で、３０℃、１８時間培養した。次に、その培養液を、トマト果汁１０ｍＬに1容量％植菌し、３０℃で１８時間培養し、この培養物を、ＭＲＳ寒天培地（ＯＸＯＩＤ社製）を用いて混釈培養した。
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株をＭＲＳ寒天培地で培養した時に通常観察されるコンペイトウ状の形態とは異なる円盤状のコロニーを、イノキュレーティングニードル（Ｎｕｎｃ社製）で穿刺し、付着した菌体をＭＲＳ液体培地に接種して、３０℃で１８時間培養した。
さらに純化するため、この培養液を、ＭＲＳ寒天培地を用いて混釈培養し、３０℃で２日間培養後に形成した円盤状のコロニーを同様に分離、培養し、これを４回繰り返した。
その結果、ＭＲＳ寒天培地で混釈培養した時のプレート中でのコロニー形態が、ラクトバチルス  ブレビスＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株とは明らかに異なる変異株として、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株（以下、「本菌株」と略記することがある）を得た。この時のコロニーの撮影画像を図１に示す。図１（ａ）は、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株の撮影画像、図１（ｂ）は、ラクトバチルス  ブレビスＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株の撮影画像である。
なお、ここで培養に用いたラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターより分譲可能である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
＜ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株の同定＞
（形態的性質）
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株の形態的性質は、前記各培地で培養した時のコロニーを顕微鏡観察することにより確認した。その結果、細胞形態は桿菌であり、ラクトバチルス  ブレビスＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株およびラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＪＣＭ１０５９Ｔ株（以下、「基準株」と略記することがある）同様、胞子を有さず、運動性も有していなかった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
（生理学的性質）
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株の生理学的性質を公知の方法により評価し、ラクトバチルス  ブレビスＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株およびラクトバチルス  ブレビス  ＪＣＭ１０５９Ｔ株と比較した。結果を表１に示す。
表１に示すように、本菌株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株および基準株と同じ生理学的性質を示した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
（炭水化物の分解性）
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株の各種炭水化物の分解性を、細菌検査同定用キットＡｐｉ  ５０  ＣＨ（ｂｉｏ  Ｍｅｒｉｅｕｘ社製）を使用して評価し、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株およびラクトバチルス  ブレビス  ＪＣＭ１０５９Ｔ株と比較した。その結果を表２および３に示す。
表２および３から明らかなように、本菌株と基準株とは、リボース、β−メチル−Ｄ−キシロース、ガラクトース、Ｄ−フラクトース、α−メチル−Ｄ−グルコシドの資化性に相違が認められた（表中、「＊」で示した）。一方、本菌株とＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株との間に資化性の相違は認められなかった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
（塩基配列）
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列（部分配列）を公知の方法で決定した。決定した塩基配列のうち、５’末端（１番目）から４９０番目までの塩基配列を配列番号１に示し、９１１番目から１４１０番目までの塩基配列を配列番号２に示す。この決定した塩基配列について、大学共同利用機関法人  情報・システム研究機構  国立遺伝学研究所  生命情報・ＤＤＢＪ研究センターが運営している日本ＤＮＡデータバンクの相同性検索（ＢＬＡＳＴ）を行った。
その結果、本菌株の配列番号１に示す塩基配列は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株と同じであり、８１番目の塩基が基準株とは異なっていた。また本菌株の配列番号２に示す塩基配列は、３７６番目の塩基が基準株とは異なっており、４７０、４９１、４９２、４９６、４９８〜５００番目の塩基が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株および基準株と異なっていた（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株と基準株とでは同じであった）。そして、本菌株とＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株、本菌株と基準株とは、いずれも９９％以上の相同性を示したが、異なる菌である事が示唆された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
＜乳酸菌株＞
本発明の乳酸菌株は、１６Ｓ  ｒＤＮＡの、５’末端（１番目）〜４９０番目の塩基配列が配列番号１で表わされ、９１１番目〜１４１０番目の塩基配列が配列番号２で表わされるラクトバチルス  ブレビスに属するものである。
そして、該乳酸菌株に、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株は包含される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明のラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株は、平成１９年２月１５日）付けで受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
＜ＭＲＳ培地の発酵特性＞
［実施例１］
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株の凍結保存菌液を、ＭＲＳ液体培地に１容量％接種し、３０℃で１８時間培養して賦活した後、同様の条件で継代したものを前培養液とした。得られた前培養液をＭＲＳ液体培地１０ｍＬに1容量％接種し、３０℃で培養して、下記の方法により経時的に生菌数、並びに培養液の濁度、ｐＨおよび酸度を測定した。結果を図２〜５に示す。図２は生菌数、図３は培養液の濁度、図４は培養液のｐＨ、図５は培養液の酸度の経時変化をそれぞれ示すグラフである。
（測定方法）
生菌数；段階希釈した培養液１ｍＬを分注したシャーレに、ＭＲＳ寒天培地約２０ｍＬを加えて混釈プレートを作成し、３０℃で２日間培養した後、形成したコロニーをカウントして算出した。
培養液の濁度；分光光度計Ｕ−３３１０（株式会社日立ハイテクノロジーズ製）を用いて、測定波長６６０ｎｍで測定した。
培養液のｐＨ；ｐＨメーターＦ−５２（株式会社堀場製作所製）を用いて測定した。
培養液の酸度；滴定法により算出した。すなわち、試料を約５ｇ量り採り、フェノールフタレイン溶液を約５００μＬ加えて、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、微赤色が呈する点を終点とした。そのときの滴定量から下記式を用いて酸度を算出した。
（算出式）
酸度（％）＝（水酸化ナトリウム水溶液の規定数）×（水酸化ナトリウム水溶液の滴定量（Ｌ））×（乳酸１ｇ当量）÷（試料採取量）×１００
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
［比較例１］
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株の凍結保存菌液に代わり、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株の凍結保存菌液を用いたこと以外は、実施例１と同様に測定を行った。結果を図２〜５に示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
＜透明ニンジン果汁の発酵特性および凝集性＞
［実施例２］
Ｂｒｉｘ．６０％の透明ニンジン濃縮果汁を蒸留水で希釈して、Ｂｒｉｘ．１２％に調整し、３００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬ入れて、１１５℃、１５分間の条件でオートクレーブ滅菌したものを発酵培地とした。
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株の凍結保存菌液を、ＭＲＳ液体培地に１容量％接種し、３０℃で１８時間培養して賦活した後、同様の条件で継代したものを前培養液とした。
次いで、調製した発酵培地に、５容量％の前培養液を接種し、３２℃で１８時間静置培養し、下記の方法により培養前後における生菌数、並びに培養液の酸度およびｐＨを測定し、培養後の培養液の凝集性の有無を確認した。結果を表４に示す。
（測定および確認方法）
生菌数；段階希釈した培養液１ｍＬを分注したシャーレに、ＭＲＳ寒天培地約２０ｍＬを加えて混釈プレートを作成し、３０℃で２日間培養した後、形成したコロニーをカウントして算出した。
培養液の酸度およびｐＨ；実施例１と同様の方法で測定した。
培養液の凝集性；培養液を試験管に移し、試験管ミキサーで軽く攪拌後、目視することにより凝集性の有無を確認した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
［比較例２］
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株の凍結保存菌液に代わり、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株の凍結保存菌液を用いたこと以外は、実施例２と同様に測定および確認を行った。結果を表４に示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
＜抗菌活性＞
［実施例３］
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株の凍結保存菌液を、ＭＲＳ液体培地に１容量％接種し、３０℃で１８時間培養して賦活した後、さらに同条件で２回継代培養したものを培養液とした。
次いで、１３０００×ｇ、５分間の条件の遠心分離により、該培養液から菌体を除去し、さらに乳酸などの有機酸の影響を除去するために、得られた培養液上清をｐＨ６．０に調整した。これを滅菌フィルターＭＩＬＬＥＸＧＶ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ  ０．２２μｍ（ミリポア社製）でろ過滅菌したものを被評価培養液とした。
また、抗菌活性を評価する際の対象菌として、食品危害微生物であるバチルス  セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）ＪＣＡ１５０１株、バチルス  セレウス  ＩＦＯ１３６９０株、バチルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＡ５２７株、バチルス  ズブチリス  ＩＦＯ１３７１９株、バチルス  コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＪＣＭ２２５７Ｔ株、リステリア  モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ７６４４株、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＲＣＳＡ１株を使用した。これら対象菌は、その凍結保存菌液をＳＣＤ培地（日水製薬株式会社製）に１容量％接種し、３０℃で１８時間、好気培養した。さらに同条件で２回継代培養を行って供試菌体とした。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
［比較例３］
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株の凍結保存菌液に代わり、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株の凍結保存菌液を用いたこと以外は、実施例３と同様に評価を行った。結果を表５に示す。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
［比較例４］
ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株の凍結保存菌液に代わり、ラクトバチルス  ブレビス  基準株の凍結保存菌液を用いたこと以外は、実施例３と同様に評価を行った。結果を表５に示す。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
以上のように、本発明のラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２２株は、抗菌活性を有するなど、ラクトバチルス  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株と同様の優れた生理作用を有するので、飲食品や医薬品の製造に好適である。また、本発明の菌株は凝集性を示さないため、発酵物の製造を安定して行うことができ、発酵物の品質を均一に保持できる。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008211994000001.app