(57)【要約】 【課題】  内在性遺伝子の発現がジーンサイレンシングによって抑制された、病徴を示さないダイズとその製造方法を提供することを目的とする【解決手段】  本発明は、ダイズの内在性遺伝子又はその一部をコードする塩基配列及びダイズ感染性RNA3を有するキュウリモザイクウイルスの感染によって当該内在性遺伝子の発現が抑制されている形質転換されたダイズを提供する。このダイズは、ダイズの内在性遺伝子又はその一部をコードする塩基配列を有するキュウリモザイクウイルスの感染によって当該内在性遺伝子の発現が抑制されている形質転換されたダイズの製造方法であって、ダイズの内在性遺伝子を選択する工程１）、前記内在性遺伝子又はその一部をコードする塩基配列及びダイズ感染性RNA3をコードする塩基配列を有するキュウリモザイクウイルスベクターを作製する工程２）、及び工程２）で作製されたキュウリモザイクウイルスベクター又はその感染性RNAクローンをダイズに感染させて当該内在性遺伝子の発現が抑制されているダイズを得る工程３）を含む、前記方法によって製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイズの内在性遺伝子又はその一部をコードする塩基配列及びダイズ感染性RNA3を有するキュウリモザイクウイルスの感染によって当該内在性遺伝子の発現が抑制されている形質転換されたダイズ。
【請求項２】
ダイズの内在性遺伝子がフラボノイド合成系遺伝子である、請求項１に記載のダイズ。
【請求項３】
フラボノイド組成比が改変された、請求項２に記載のダイズ。
【請求項４】
キュウリモザイクウイルスがキュウリモザイクウイルスＳｊ株由来のRNA3を含むウイルスである、請求項１〜３の何れか一項に記載のダイズ。
【請求項５】
キュウリモザイクウイルスが、さらにキュウリモザイクウイルスY株由来のRNA2を含むウイルスである、請求項４に記載のダイズ。
【請求項６】
ダイズの内在性遺伝子又はその一部をコードする塩基配列を有するキュウリモザイクウイルスの感染によって当該内在性遺伝子の発現が抑制されている形質転換されたダイズの製造方法であって、ダイズの内在性遺伝子を選択する工程１）、前記内在性遺伝子又はその一部をコードする塩基配列及びダイズ感染性RNA3をコードする塩基配列を有するキュウリモザイクウイルスベクターを作製する工程２）、及び工程２）で作製されたキュウリモザイクウイルスベクター又はその感染性RNAクローンをダイズに感染させて当該内在性遺伝子の発現が抑制されているダイズを得る工程３）を含む、前記方法。
【請求項７】
ダイズの内在性遺伝子がフラボノイド合成系遺伝子である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
ダイズ感染性RNA3がキュウリモザイクウイルスＳｊ株由来のRNA3である、請求項６又は７に記載の製造方法。
【請求項９】
キュウリモザイクウイルスベクターがさらにキュウリモザイクウイルスY株由来のRNA2をコードする塩基配列を含む、請求項８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内在性遺伝子の発現が抑制されたダイズとその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学的手法によって植物の遺伝的形質を改変して有用な作物をつくり出すことは、食用作物の生産量の向上あるいは植物を用いた有用物質の効率的な生産という目的において植物の工業的利用を可能とする技術であり、現在も盛んに研究開発が行われている。遺伝子工学的手法による植物の遺伝的形質の改変操作として、これまでは植物に導入した外来遺伝子を植物内で発現させることによって該遺伝子産物による有用性を植物に獲得させる方法が主流であった。この方法で作成される植物は一般にトランスジェニック植物と呼ばれる。
【０００３】
近年、外来遺伝子を植物内で発現させるのではなく、外来遺伝子の導入によって植物の内在性遺伝子の発現を抑制することで植物に有用性を獲得させる方法が開発されつつある。この方法の一つが、いわゆるジーンサイレンシング（Gene silencing、以下GSと表す）を利用した方法である。GSは、組み換え的に導入した外来遺伝子の発現が抑制される、という現象であり、ウイルス等の感染による外来遺伝子発現に対する植物の自己防衛機能の一種であると考えられている。特にGSは、外来遺伝子の発現だけではなく、外来遺伝子を組み込んだ植物の当該外来遺伝子に相当する内在性の（染色体上に存在する）遺伝子の発現も抑制することから、この現象を利用して植物の内在性遺伝子の発現を制御しようとする試みも行われている（例えば非特許文献１、２）。
【０００４】
GSは、転写後型GS（Post-transcriptional gene silencing、以下PTGSとする）と、転写型GS（Transcriptional gene silencing、以下TGSとする）に大別される。PTGSの機構は、細胞内に2本鎖RNAが存在する場合、当該2本鎖RNAが分解されて生じる21〜26ヌクレオチドほどの短い2本鎖RNA（short interfering RNA、siRNAと呼ばれる）の働きによって、当該siRNAと相同な配列を有するｍRNAが分解され、そのｍRNAにコードされる遺伝子の発現が抑制される、と理解されている。またTGSの機構は、細胞内に存在する2本鎖RNAの塩基配列と相同な配列を有するDNAがメチル化される、あるいはヒストンの修飾状態の変化が生じることで、当該DNAからのｍRNAの転写が抑制される、と理解されている。
【０００５】
植物細胞内で人為的に2本鎖RNAを生じさせ、GSによる内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、発現を抑制しようとする内在性遺伝子をコードする核酸を組み込んだ植物感染性RNAウイルスを感染させる方法（Virus Induced Gene Silencing、以下VIGSとする）と、発現を抑制しようとする内在性遺伝子の塩基配列と逆向きの塩基配列を反復して有するRNAを転写することのできる核酸構築物（トランスジーンと呼ばれる）を植物ゲノム内に組み込む方法とが開発されている。
【０００６】
トランスジーンを用いたGSを行うには、トランスジーン自体の構築及びトランスジーンが組み込まれた植物個体の再生に要する作業が繁雑で、かつ通常数ヶ月以上の時間を要することから、植物個体に直接適用することができるVIGSの利用が有利である。
【０００７】
VIGSの種々の植物種への応用という点から見ると、Zhangらによる、ダイズの内在性フィトエンデサチュラーゼ（Phytoene desaturase、PDS）遺伝子の発現をビーンポッドモットルウイルス（Bean Pod Mottle Virus、BPMV）を利用して抑制したダイズに関する報告（非特許文献３）の他には、意外にもダイズに対してVIGSを行った例は殆ど報告されていない。また、ZhangらによるBPMVを用いたGSの例では、PDS遺伝子の発現抑制は達成されるが、一方でダイズが同ウイルス感染による種々の病変を呈してしまうという問題を伴っている。この様に、VIGSの利用は、産業的に利用可能な形質転換されたダイズを提供するまでには至っていない。
【０００８】
一方、ウイルスベクターを用いたダイズの形質転換に関する報告としては、キュウリモザイクウイルス（Cucumber Mosaic Virus、CMV）のRNA2にコードされている2bタンパク質遺伝子をヒトの酸性繊維芽細胞増殖因子（acidic Fibroblast Growth Factor、aFGF）をコードする異種遺伝子と組み換えたCMVベクターを用いてダイズを形質転換させた例がある（非特許文献４）が、この技術はダイズを宿主とする異種蛋白質の生産に関し、VIGSを目的とするものではない。
【特許文献１】国際特許出願公開WO2003／097841号
【非特許文献１】Sijen T ら.、Curr Biol.、2001年、第11巻、第436-440頁
【非特許文献２】Cigan AM ら、Plant J.、2005年、第43巻、第929-940頁
【非特許文献３】Zhang C.ら、Virology、2006年、第344巻、第401-411頁
【非特許文献４】Matsuo K.ら、Planta、2007年、第225巻、第277-286頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、内在性遺伝子の発現が抑制された、新しい形質転換ダイズとその作成方法を提供することを目的とする発明である。                        
本発明者らは、ダイズ内在性遺伝子又はその一部をコードする塩基配列をダイズ感染性CMVベクターに組み込んで感染させることで、ダイズにウイルス感染による好ましくない病徴を発生させることなく、ダイズ内在性遺伝子の発現を抑制することができることを見いだし、下記の各発明を完成させた。
【００１０】
（１）ダイズの内在性遺伝子又はその一部をコードする塩基配列及びダイズ感染性RNA3を有するCMVの感染によって当該内在性遺伝子の発現が抑制されている形質転換されたダイズ。
【００１１】
（２）ダイズの内在性遺伝子がフラボノイド合成系遺伝子である、（１）に記載のダイズ。
【００１２】
（３）フラボノイド組成比が改変された、（２）に記載のダイズ。
【００１３】
（４）CMVがCMV-Ｓｊ株由来のRNA3を含むウイルスである、（１）〜（３）の何れか一項に記載のダイズ。
【００１４】
（５）CMVベクターがさらにCMV-Y株由来のRNA2を含むウイルスである、（４）に記載のダイズ。
【００１５】
（６）ダイズの内在性遺伝子又はその一部をコードする塩基配列を有するキュウリモザイクウイルスの感染によって当該内在性遺伝子の発現が抑制されている形質転換されたダイズの製造方法であって、ダイズの内在性遺伝子を選択する工程１）、前記内在性遺伝子又はその一部をコードする塩基配列及びダイズ感染性RNA3をコードする塩基配列を有するキュウリモザイクウイルスベクターを作製する工程２）、及び工程２）で作製されたキュウリモザイクウイルスベクター又はその感染性RNAクローンをダイズに感染させて当該内在性遺伝子の発現が抑制されているダイズを得る工程３）を含む、前記方法。
【００１６】
（７）ダイズの内在性遺伝子がフラボノイド合成系遺伝子である、（６）に記載の製造方法。
【００１７】
（８）ダイズ感染性RNA3がキュウリモザイクウイルスＳｊ株由来のRNA3である、（６）又は（７）に記載の製造方法。
【００１８】
（９）CMVベクターがさらにCMV-Y株由来のRNA2をコードする塩基配列を含む、（８）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の形質転換ダイズは、ダイズ内在性遺伝子の発現、特にフラボノイド合成系遺伝子の発現が抑制されており、野生型のダイズと異なるフラボノイド組成比を有するダイズである。また、本発明のダイズは、ウイルス感染による好ましくない病徴は示さず、形質転換ダイズとしての安全性が確保された、産業応用性の高いダイズである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の形質転換ダイズは、ダイズの内在性遺伝子又はその一部をコードする塩基配列及びダイズ感染性RNA3を有するCMVの感染によって当該内在性遺伝子の発現が抑制されている形質転換ダイズである。この形質転換ダイズは、ダイズの内在性遺伝子を特定する工程１）、前記内在性遺伝子又はその一部をコードする塩基配列及びダイズ感染性RNA3をコードする塩基配列を有するCMVベクターを作製する工程２）、及び工程２）で作製されたCMVベクター又はその感染性RNAクローンをダイズに感染させて当該内在性遺伝子の発現が抑制されているダイズを得る工程３）を含む方法によって製造することができる。以下、本発明の形質転換ダイズを、その製造方法に沿って詳細に説明する。
【００２１】
本発明の形質転換植物の生産方法における工程１）は、ダイズ内在性遺伝子を選択する工程である。具体的には、ダイズあるいはその他の植物について研究され、報告されている植物性有用物質の生合成あるいは分解代謝に関連する遺伝子の中から、その遺伝子をサイレンシングすることによってダイズに目的とする形質変化をもたらし得る遺伝子を、本発明のダイズ内在性遺伝子として選択すればよい。その様な内在性遺伝子をサイレンシングすることによって、当該遺伝子が関与する有用物質の生合成あるいは分解代謝の経路の一部が遮断あるいは抑制され、結果的に植物内の代謝産物組成を、サイレンシングが行われないダイズ植物とは異なる組成へと変更することができる。特に、不飽和脂肪酸やビタミンなどの有用物質生合成系や分解代謝系に関連する遺伝子を内在性遺伝子として選択してサイレンシングすることで、ダイズ内での有用物質の蓄積量を高めることも可能である。
【００２２】
ダイズ内在性遺伝子の例としては、フラボノイド生合成あるいは分解代謝に関与する遺伝子、不飽和脂肪酸の生合成あるいは分解代謝に関与する遺伝子、トコフェロールなどのビタミンの生合成あるいは分解代謝に関与する遺伝子、ダイズタンパク質の生合成あるいは分解代謝に関与する遺伝子等を挙げることができるが、これらには限定されない。
【００２３】
本発明の形質転換植物の生産方法における工程２）は、前記内在性遺伝子又はその一部をコードする塩基配列及びダイズ感染性RNA3をコードする塩基配列を有するCMVベクターを作製する工程である。
【００２４】
CMVは非常に幅広い宿主域を持つRNAウイルスの一種で、１種類の外被タンパク質と１本鎖ゲノミックRNAからなる正20面体ウイルス粒子の形態を有する。ＣＭＶのゲノミックRNAはRNA1、RNA2、RNA3に分節されている。RNA1には1aタンパク質と呼ばれるタンパク質がコードされており、またRNA2の3´末端側にはGSサプレッサー蛋白質である2bタンパク質（Ding, S.-W. et al. Virology、1994年、第198巻、第593-601頁）がコードされている。2bタンパク質は、ウイルス感染に対して植物が自己をウイルス感染から防御しようとして機能させる植物によるウイルス遺伝子のサイレンシングをさらに抑制する機能を有するタンパク質である。ただし、この2bタンパク質はCMVの植物への感染には必ずしも必須ではないと考えられている。
【００２５】
感染した後にダイズに対する病徴をもたらさない点で、本発明では、CMV-Y株由来のRNA2、特に当該RNA2にコードされる2bタンパク質のC末端部分が欠損する様に改変された改変型RNA2の利用が特に好ましい。例えば、Otagakiら（Plant Biotechnol.、2006年、第23巻、第259-265頁）に開示されている改変型RNA2をコードするベクタープラスミドCMV2-A1は、CMV-Y株由来のプラスミドpCY2（Suzukiら、Virology、1991年、第183巻、第106-113頁）上のRNA2の2b蛋白質をコードしている領域に存在するStuIサイトにクローニングサイトを挿入することによって作成される、当該StuIから終止コドンまでの領域を欠損させた変異2b蛋白質をコードするプラスミドである。このクローニングサイトは、工程１）で特定した内在性遺伝子のプロモーター配列を組み込むために有用である。本発明で利用可能なRNA1についてはその由来等に特別の制限はないが、CMV-Y株由来のRNA1 の利用が好ましい。
【００２６】
RNA3は、CMVの植物種に対する感染能を決定する重要な分節RNAであり、CMVの外被タンパク質がコードされている。本発明ではダイズに対する感染能を有するRNA3、すなわちダイズ感染性RNA3を使用する必要がある。この様なダイズ感染性RNA3は、野生ダイズ（ツルマメ）又は栽培ダイズから分離されたCMVが有するRNA3であれば、いずれも利用可能である。これまでに報告されている代表的なダイズ感染性CMVは、東北農試研報（Bull. Tohoku Natl. Agric. Exp. Stn.、1980年、第62巻、第31〜53）に報告されている。しかしながら、上記東北農試研報に報告されたCMV以外にもダイズ感染性CMVが存在することが知られている。例えばHongらがツルマメからのCMVの単離を報告している（Hongら、Theor. Appl. Genet.、2003年、第107巻、第49-53頁、Arch. Virol.、2007年、第152巻、第321-328頁）また、ダイズ以外の植物に対する感染性を有することが知られているCMVであっても、まれにそのままダイズに対する感染性を示すCMVもあり得る。さらに、ダイズ以外の植物に対する感染性を有するCMVのRNA3の塩基配列を改変してダイズ感染性を付与することも、技術的には可能である。本発明では、上記に述べた様なダイズ感染性を有するCMV由来のRNA3、人為的にダイズへの感染性が付与されたRNA3も利用可能である。
【００２７】
本発明では、特にダイズ感染能を有し、かつ感染後にダイズに対して病徴を発生させないか、あるいはダイズの産業利用を妨げるような病症を発生させないRNA3の利用が特に好ましい。その様なRNA3の例としては、前記東北農試研報に記載されているCMV-Sj、韓国ダイズから分離されたCMV-Sk、インドダイズから分離されたCMV-Sin、中国ダイズから分離されたCMV-Sch、ロシアダイズから分離されたCMV-Srの各RNA3を挙げることができる。これらのCMVは、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 東北農業研究センター（岩手県盛岡市下厨川字赤平４）又は国立大学法人北海道大学大学院農学研究院に保存されている。
【００２８】
特に本発明では、CMV-Sj由来のRNA3の使用が好ましい。CMV-Sj株由来のRNA3は、ダイズに対する感染性をCMVに与える一方、CMVの感染による病徴をダイズにもたらさないという特徴を有しており、CMVをベクターとして用いてダイズの形質転換を行う上で、特に有利なダイズ感染性RNA3である。
【００２９】
本発明で特に好ましいCMVベクターは、CMV-Y由来のRNA1をコードするプラスミドベクターｐCY1と、前記Otagakiら（Plant Biotechnol.、2006年、第23巻、第259-265頁）に記載された改変型RNA2をコードする塩基配列を有するCMV2-A1と、前記非特許文献４に記載されたCMV-Sj株由来のRNA３をコードする塩基配列を有するpCSD3の複数のプラスミドからなるCMVベクターである。ただし、RNA１〜３は、上記の様にそれぞれ別々にプラスミドに組み込まれていてもよく、また全て一つのプラスミドに組み込まれていてもよい。
【００３０】
本発明の形質転換植物の生産方法における工程３）は、上で説明した工程２）で作製されたCMVベクター又はその感染性RNAクローンをダイズに感染させて当該内在性遺伝子の発現が抑制されているダイズを得る工程である。CMVベクターをダイズに感染させるには、具体的には、工程２）で作製されたRNA１、RNA２及びRNA3をコードするプラスミドベクターから定法、例えば前記Otagakiら（Plant Biotechnol.、2006年、第23巻、第259-265頁）に記載された方法に準じて各分節RNAに相当する感染性RNAクローンを調製し、これをダイズの葉その他の組織に塗布するなどによってダイズに接種すればよい。通常、接種後10日〜14日程度で、接種された感染性RNAクローンはダイズ全体に広がり、CMVが感染したダイズが得られる。その様なCMV感染ダイズでは、CMVベクターに組み込まれたダイズ内在性遺伝子の一部と相同性を有するダイズ染色体上の内在性遺伝子の発現がPTGSにより抑制されることになる。
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を例示する目的で提供するものであり、特許請求の範囲に記載された発明を限定するものではない。また、実施例における各実験操作とその条件は、特別に断らない限り、前記Otagakiらの記載ならびに各種市販キットに添付された取扱説明書の記載に従って行った。
【実施例】
【００３２】
１）内在性遺伝子の特定
ダイズの内在性遺伝子として、フラボノイド合成系に関与するフラボノイド３´ヒドロキシラーゼ（F3'H）をコードするsf3'h1遺伝子（DDBJ／Genbank／EMBL accession number AB061212）を選択した。F3'HはフラボノイドB環の３´位の水酸化を触媒し、ケンフェロールからのケルセチン合成に関与すると考えられている（Todaら、Plant Mol. Biol.、2002年、第50巻、第187-196頁）。
【００３３】
２）sf3'h1遺伝子の一部の塩基配列を有するCMVベクターの調製
栽培ダイズであるTo7B（TT）株（Takahashiら、Crop Sci.、1996年、第36巻、第559-562頁）のゲノムDNAを鋳型とし、下記の塩基配列からなるプライマーDNAを用いたPCRを行なった。
【００３４】
プライマーF：5′-AGGCCTGTGCTACACTCTTGGTGAAC-3′（配列番号１）
プライマーR：5′-ACGCGTGTTAGCCCATACGCTTCATC-3′（配列番号２）
プライマーFの最初の6塩基は制限酵素StuIの制限サイトであり、またプライマーRの最初の６塩基は制限酵素MluIの制限サイトである。上記プライマーを用いたPCR反応により、sf3'h1遺伝子のエキソン３の3'末端部分約300bpのDNA断片が増幅される。PCR反応後、PCR産物をアガロースゲル電気泳動にかけて増幅DNA断片を単離、精製した。これをｐGEM-T Easy vector（Promega社）に組み込み、大腸菌を宿主としてTAクローニングを行った。挿入断片の塩基配列をABI PRISM（Applied Biosystems社）を用いて確認した。
【００３５】
前記OtagakiらによるプラスミドCMV2-A1を制限酵素StuIとMluIで開環させ、TAクローニング後のベクターから制限酵素StuIとMluIを用いて切り出したDNA断片を組み込んで、sf3'h1遺伝子のエキソン３に含まれる300塩基対の部分塩基配列からなるDNAと、CMVの2b蛋白質の一部をコードするDNAとを有する、クローンプラスミドであるCMV-A1-sf3'h1ベクターを得た。
【００３６】
1.5mlチューブに下記の組成からなる制限酵素反応ミックスを調製し、CMV-Y株由来のRNA1をコードするｐCY１（Suzukiら、Virology、1991年、第183巻、第106-113頁）と２）で調製したCMV-A1-sf3'h1を制限酵素NotIで、またpCSD3（前記Hongら、Arch. Virol.、2007年、第152巻、第321-328頁）を制限酵素EcoRIで、それぞれ制限酵素の最適温度で2時間静置して、プラスミドを直鎖化した。
【００３７】
プラスミド                          5μl
10×制限酵素添付バッファー         2μl
制限酵素                           0.5μl
滅菌水                           12.5μl
20μl
上記反応液からクロロホルム法で精製したDNA（DNAテンプレート）１μgを用い、25UのT7 RNApolymerase（TakaraBio社）、5mM DTT、1mM ATP、1mM UTP、1mM CTP、0.1mM GTP、1mM m7G(5')PPP(5')G／40mM Tris-HCl （pH8.0）（Invitrogen社）、8mM MgCl２、2mM spermidine-HClの存在下で37℃、60分間インビトロ転写反応を行い、転写産物（感染性RNAクローン）を調製した。
【００３８】
３）ダイズへの接種
10μlの0.1Mリン酸緩衝液（0.1Mリン酸二ナトリウム水溶液（pH9.0-9.4）に0.1Mリン酸一カリウム水溶液（pH4.2-4.6）を混ぜてpH7.1に調製）に、使用直前にDIECA(N,N-ジエチルチオカルバミド酸ナトリウム)を最終濃度10mMになるように加えて、ａ）で調製した転写産物をそれぞれ5μlずつ加えて混合溶液を得た。
【００３９】
Nicotiana benthamianaを三共培養土とタキイソイルと黒土を4：4：1の割合で混合したものの上にバーミキュライトをまいた土に播種し、2〜3cm程度の大きさに成長し、子葉が十分展開した個体を、ディスポカップ200ml（アズワン）の底に穴を開けたものに入れた三共培養土とタキイソイルと黒土を4：4：1の割合で混合した土に移植した。土はオートクレーブ滅菌後に使用した。移植後1週間ほど経過し、本葉が3〜6枚展開したN. benthamianaの葉数枚に、上記の転写産物を含む混合溶液を塗布して接種した。接種から7日後のN. benthamiana個体の上葉0.1 gを、0.1 M リン酸緩衝液 (pH 7.1) 1 ml 、および、DIECA [N, Nジエチルジチオカルバミド酸ナトリウム(Wako)]とともに乳鉢で磨砕して粗汁液を調製した。
【００４０】
栽培ダイズである前記To7B（ジェノタイプ：TT）株をポットエースとバーミキュライトを9：1で混合した土に播種し、本葉が展開した後、上記N. benthamianaから調製した粗汁液を初生葉に塗布し、ただちに水道水で洗い流した後、一週間栽培して、感染性RNAクローンすなわちCMV感染ダイズを得た。また、CMV-A1-sf3'h1由来の感染性RNAクローンの代わりに、sf3'h1遺伝子のエキソン３に含まれる300塩基対の部分塩基配列からなるDNAを含まないプラスミドCMV2-A1由来の感染性RNAを用い、上記と同様の操作を行ってEmpty vector感染ダイズを得た。このダイズはCMVを感染させないダイズと比較観察しても、外観上の病徴は示さず、また生育状況もCMVを感染させないダイズと比べて差は認められなかった。
【００４１】
４）CMV感染ダイズにおけるGSの確認
ａ）定量RT-PCR
CMV感染ダイズ、Empty vector感染ダイズ、非感染ダイズ及び栽培ダイズToG（ジェノタイプ：tt）の葉から、Napoliら（Plant cell、1990年、第2巻、第279-289頁）の方法にDNaseI（TakaraBio社）を用いたゲノムDNAの除去を行う改変を加えた方法でそれぞれの全RNAを調製し、さらに全RNAからOligotex super30（TakaraBio社）を用いてポリ(A)＋RNAを精製した。精製したポリ(A)＋RNAを鋳型として、Kosekiら（Plant Cell Physiol.、2005年、第46巻、第1879-1883頁）の方法を参考に、定量RT-PCRを行った。まず下記の組成からなる反応液（水を加えて最終量を19μlとした）に１μlのM-MLV reverse transcriptase（Invitrogen社）を加えて42℃で1時間、反応させ、cDNAを合成した。
【００４２】
5×reaction buffer                      ４μl
0.1M DTT                             ２μl
RNaseOUT inhibitor（Invitrogen社）  0.5μl
100μM  oligo(dT)20primer             １μl
2.5mM dNTPs                         ４μl
精製ポリ(A)＋RNA
（上記5×reaction bufferは250mM Tris-HCl(pH8.3)、375mM KCl、15mM  MgCl2を含む）    
上記反応液１μlを取り、SYBR Premix ExTaq Perfect Real Time（TakaraBio社）及びDNA Engine Opticon 2 System（MJ Research社）を用いて定量RT-PCRを行った。RT-PCR反応は、94℃30秒、61℃30秒、72℃１分、78℃２分を１サイクルとして計40サイクル行い、78℃2分のインキュベーション前後の蛍光を定量測定して、プライマーのダイマー形成をモニターした。sf3'h1遺伝子に対しては下記のプライマーセットを使用した
5'-GCAGGAACTGACACATCATC-3' （配列番号３）
5'-GCCAAGTCCTCTTCTTTGAC-3'（配列番号４）
また、PCRコントロールとしてのβ-tubulinに対しては下記のプライマーセットを使用した。
【００４３】
5'-GAGAAGAGTATCCGGATAGG-3'（配列番号５）
5'-GAGCTTGAGTGTTCGGAAAC-3'（配列番号６）
M-MLV reverse transcriptaseを加えないサンプルをゲノムDNAが混在していないことを確認するためのコントロールとして用いた。その結果、CMV-A1-sf3'h1由来の感染性RNAクローンを感染させたダイズ（A1:F3'H）におけるsf3'h1遺伝子の発現量は、Empty vector感染ダイズの37.8%にまで抑制され、ToG株とほぼ同等の発現量であった（図１）。
【００４４】
ｂ）siRNAの検出
CMV感染ダイズ、Empty vector感染ダイズ及び非感染ダイズの葉から回収した低分子量のRNA60μgを用い、Gotoら（Plant Mol. Biol. Rep.、2003年、第21巻、第51-58頁）の方法に従って、sf3'hl遺伝子に相補的なsiRNAをGel-blot法によって検出した。sf3'hl遺伝子に特異的なアンチセンスRNAプローブは、DIG RNA labeling Mix（Roche社）を用いて作製した。なお、ポジティブコントロールとして、５S rRNAとｔRNAの検出を行った。その結果、  CMV-A1-sf3'h1由来の感染性RNAクローンを感染させたダイズ（A1:F3'H）において、sf3'h1遺伝子に相補的なsiRNAの蓄積が認められた（図２）。
【００４５】
ｃ）フラボノイド含有量の測定
Porterら（Environ. Exp. Bot.、1986年、第26巻、第65-73頁）の方法に準じてCMV感染ダイズ、Empty vector感染ダイズ、非感染ダイズ及び栽培ダイズToG（ジェノタイプ：tt）の各フラボノイド及びフラボノイド−糖コンジュゲートの含有量（総量）を、LC-MS-MS法によって下記の条件で測定した（ｎ＝４）。
【００４６】
使用した機器：オートサンプラー、カラムオーブン、ポンプ、UV検出器及びデガッサーを備えたLCQDO 液体クロマトグラフ−マススペクトルメーター（Thermo Finnigan社）
セッティング：ESI（Electronspray ionization）をpositive modeにして利用した。
【００４７】
sheath gas flow rateは70ユニット、aux gas flow rateは５ユニット、スプレー電圧は4kV、スプレー電流は0.63μA、キャピラリー温度は200℃、キャピラリー電圧は3V、チューブレンズのオフセットは-10V。
【００４８】
分離カラム：Cadenza CD-18カラム（150mm×2mm、Imtakt社）
移動層    ：溶媒A（MeOH：H2O：TFA＝30：70：0.1）と溶媒B（MeOH：TFA＝100：0.1）の混合溶媒
溶出条件  ：溶媒A：溶媒B＝80：20〜10：90／11.5分のグラジエント、溶媒A：  
溶媒B＝10：90で11.5分〜15分溶出（流速0.2ml／分）
カラム温度：40℃
サンプル量：２μl
ケンフェロールとケルセチンの含有量は、それぞれm/z 287とm/z 303を選択し、25％の衝突エネルギー（normalized collision energy）でさらにイオン化することで分析、定量した（図３、図４）。
【００４９】
ケンフェロールに対するケルセチンの相対量比はEmpty vector感染ダイズよりもCMV-A1-sf3'h1由来の感染性RNAクローンを感染させたダイズにおいて低く、ケンフェロールからケルセチンを生合成する経路にあるsf3'hl遺伝子が抑制された結果であると推察される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、CMV-A1-sf3'h1由来の感染性RNAクローンを含むＣＭＶベクターが感染したダイズにおいてsf3'h1遺伝子の発現が抑制（ジーンサイレンシング）されていることを示す。縦軸はsf3'h1遺伝子の発現とポジティブコントロールであるβtubulinの発現との相対比を示す。
【図２】図２は、CMV-A1-sf3'h1由来の感染性RNAクローンを含むＣＭＶベクターが感染したダイズにおいて、sf3'h1遺伝子プローブにハイブリダイズするsiRNAが蓄積していることを示す。
【図３】図３は、LC-MS-MS法で測定したときのケルセチンとケンフェロールのチャートを示す。
【図４】図４は、CMV-A1-sf3'h1由来の感染性RNAクローンを含むＣＭＶベクターが感染したダイズにおいて、ケンフェロールに対するケルセチンの相対量比が低下していることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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