(57)【要約】【課題】小サブユニットの分解が生じていない完全な状態のヒドロゲナーゼ酵素溶液を高回収率で調製することができ、且つ、単位重量当たりの活性が高い酵素溶液を容易に得ることを可能とするヒドロゲナーゼの単離精製方法を提供する。また、均質で酵素単位重量当たりの活性が高いヒドロゲナーゼ酵素溶液、及び、当該ヒドロゲナーゼ酵素溶液を触媒成分として用いた燃料電池を提供する。【解決手段】カラムクロマトグラフィーを用いてヒドロゲナーゼを単離精製するに際し、ヒドロゲナーゼを含む試料を、中性乃至弱酸性のみのバッファーを用いて、カラムに負荷し且つ該ヒドロゲナーゼを該カラムから溶出させることを特徴とするヒドロゲナーゼの単離精製方法、並びに、単離精製したヒドロゲナーゼ酵素溶液であって、分解物が混在しない高均質なヒドロゲナーゼを含有することを特徴とするヒドロゲナーゼ酵素溶液、並びに、前記ヒドロゲナーゼ酵素溶液を用いて作製した電極触媒を用いることを特徴とする燃料電池。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カラムクロマトグラフィーを用いてヒドロゲナーゼを単離精製するに際し、ヒドロゲナーゼを含む試料を、中性乃至弱酸性のバッファーを用いて、カラムに負荷し且つ該ヒドロゲナーゼを該カラムから溶出させることを特徴とする、ヒドロゲナーゼの単離精製方法。
【請求項２】
前記ヒドロゲナーゼが、ヒドロゲノビブリオ・マリナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ）由来である、請求項１に記載のヒドロゲナーゼの単離精製方法。
【請求項３】
前記カラムクロマトグラフィーによる単離精製工程の前に、ヒドロゲナーゼを含む試料を加熱する加熱処理工程を設ける、請求項１又は２に記載のヒドロゲナーゼの単離精製方法。
【請求項４】
単離精製したヒドロゲナーゼ酵素溶液であって、分解物が混在しない高均質なヒドロゲナーゼを含有することを特徴とする、ヒドロゲナーゼ酵素溶液。
【請求項５】
小サブユニット分解物の濃度が、分解を受けていない完全な分子量を持つ小サブユニットの１０％以下である、請求項４に記載のヒドロゲナーゼ酵素溶液。
【請求項６】
カラムクロマトグラフィーを用いてヒドロゲナーゼを単離精製するに際し、ヒドロゲナーゼを含む試料を、中性乃至弱酸性のバッファーを用いて、カラムに負荷し且つ該ヒドロゲナーゼを該カラムから溶出させた、請求項４又は５に記載のヒドロゲナーゼ酵素溶液。
【請求項７】
前記ヒドロゲナーゼが、ヒドロゲノビブリオ・マリナス由来である、請求項４乃至６のいずれかに記載のヒドロゲナーゼ酵素溶液。
【請求項８】
請求項４乃至７のいずれかに記載のヒドロゲナーゼ酵素溶液を用いて作製した電極触媒を用いることを特徴とする燃料電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、均質なヒドロゲナーゼの単離精製方法、当該単離精製方法により得られる均質なヒドロゲナーゼ酵素溶液、及び、当該ヒドロゲナーゼ酵素溶液を用いて作製した電極触媒を用いた燃料電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
燃料電池は、電気的に接続された２つの電極に燃料と酸化剤を供給し、電気化学的に燃料の酸化を起こさせることで、化学エネルギーを直接電気エネルギーに変換する。火力発電とは異なり、燃料電池はカルノーサイクルの制約を受けないので、高いエネルギー変換効率を示す。中でも、電解質膜として固体高分子電解質膜を用いた固体高分子電解質型燃料電池は、小型化が容易であること、低い温度で作動すること、などの利点があることから、特に携帯用、移動体用電源として注目されている。
【０００３】
固体高分子電解質型燃料電池において、アノード（燃料極）では（１）式の反応が進行する。
Ｈ2  →  ２Ｈ+  ＋  ２ｅ-    ・・・（１）
（１）式で生じる電子は、外部回路を経由し、外部の負荷で仕事をした後、カソード（酸化剤極）に到達する。そして、（１）式で生じたプロトンは、水と水和した状態で、電気浸透により固体高分子電解質膜内をアノード側からカソード側に移動する。
【０００４】
一方、カソードでは（２）式の反応が進行する。
４Ｈ+  ＋  Ｏ2  ＋  ４ｅ-  →  ２Ｈ2Ｏ    ・・・（２）
【０００５】
上記（１）式、（２）式の反応を促進させる電極触媒としては、触媒能の高さから、通常、白金や白金合金が賞用されてきた。しかしながら、白金には、枯渇資源であること、それに伴い非常に高価であること等の問題がある。そこで、白金や白金合金に代わる新規電極触媒の研究が進められている。
【０００６】
このような新規電極触媒として、ヒドロゲナーゼ（水素酸化還元酵素）が注目されている。ヒドロゲナーゼは、生物由来の触媒であるため、培養により大量生産が可能である。また、その水素酸化活性能も白金と同等、さらにはそれ以上と言われており、しかも、常温でも高い反応性を示す。
ヒドロゲナーゼについての研究は従来からなされてきている（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。ヒドロゲナーゼは、水素酸化還元触媒としての機能を持つ酵素で、多くの場合、水素酸化還元触媒としての機能を担う大サブユニットと、水素分子を電子とプロトンに分解する際やプロトンと電子から水素を合成する際の電子の伝達に関与する小サブユニットからなるタンパク質である。
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−３５０５８５号公報
【非特許文献１】E.C.Hatchikian et al. Biochem.Biophys.Res.Commun., vol.82, (1978) p451-461.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来、ヒドロゲナーゼの単離精製には、ヒドロゲナーゼを弱アルカリのバッファーを用いて、陰イオン交換カラムに負荷させ、該陰イオン交換カラムから溶出させる方法が多用されてきた。例えば、特許文献１の実施例においては、ジメチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）カラムとｐＨ７．７のトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝液が用いられている。また、非特許文献においては、ｐＨ７．６のリン酸バッファーを用いてヒドロゲナーゼを精製している。
また、特許文献１におけるヒドロゲナーゼの精製は、Ｎ−末端アミノ酸配列の解析を目的とするものであり、カラムクロマトグラフィーによる完全精製を達成できるものではない。
【０００９】
しかしながら、本発明者らは、ヒドロゲナーゼのカラムへの負荷及びカラムから溶出の際に、バッファーとして弱アルカリ性バッファーを用いた場合、ヒドロゲナーゼの小サブユニットが分解してしまうことを見出した。ヒドロゲナーゼは小サブユニットの分解により活性が低下乃至は失活する。すなわち、従来多用されてきた弱アルカリ性のバッファーを用いるヒドロゲナーゼの単離精製は、回収率が低く、また、得られるヒドロゲナーゼ酵素溶液は、水素酸化還元活性を有する生体内の状態と同様の完全な状態であるヒドロゲナーゼ以外に、小サブユニットの分解物を含むため、均質でなく、単位重量当たりの活性が低い。
このような弱アルカリバッファーによる小サブユニットの分解現象は、ヒドロゲノファーガスピーシーズ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ  ｓｐ．）由来のヒドロゲナーゼでも同様に観察されることから（図１−（Ｃ）参照）、膜結合型のヒドロゲナーゼ全般に共通する問題である可能性がある。
【００１０】
本発明は、上記実情を鑑みて成し遂げられたものであり、小サブユニットの分解が生じていない完全な状態のヒドロゲナーゼ酵素溶液を高回収率で調製することができ、且つ、単位重量当たりの活性が高い酵素溶液を容易に得ることを可能とするヒドロゲナーゼの単離精製方法を提供することを目的とする。
また、均質で酵素単位重量当たりの活性が高いヒドロゲナーゼ酵素溶液、及び、当該ヒドロゲナーゼ酵素溶液を触媒成分として用いた燃料電池を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のヒドロゲナーゼの単離精製方法は、カラムクロマトグラフィーを用いてヒドロゲナーゼを単離精製するに際し、ヒドロゲナーゼを含む試料を、中性乃至弱酸性のバッファーを用いて、カラムに負荷し且つ該ヒドロゲナーゼを該カラムから溶出させることを特徴とする。
本発明の単離精製方法によれば、カラムクロマトグラフィーによる単離精製工程におけるヒドロゲナーゼの小サブユニットの分解を抑制することができる。
【００１２】
前記ヒドロゲナーゼの採取源は特に限定されないが、触媒活性能が高く且つ安定性に優れ、しかも耐熱性を有するものとして、ヒドロゲノビブリオ・マリナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ）由来のヒドロゲナーゼが挙げられる。
ヒドロゲナーゼの回収率の向上、並びに、単離精製工程の簡素化及び短縮化の観点から、前記カラムクロマトグラフィーによる単離精製工程の前に、ヒドロゲナーゼを含む試料を加熱する加熱処理工程を設けることが好ましい。
【００１３】
本発明により提供されるヒドロゲナーゼ酵素溶液は、単離精製したヒドロゲナーゼ酵素溶液であって、分解物がほとんど混在しない高均質なヒドロゲナーゼを含有することを特徴とするものである。具体的には、小サブユニット分解物の濃度が分解を受けていない完全な分子量を持つ小サブユニットの１０％以下であるヒドロゲナーゼ酵素溶液を提供することが可能である。
前記ヒドロゲナーゼ酵素溶液は、本発明のヒドロゲナーゼの単離精製方法により得ることができる。すなわち、カラムクロマトグラフィーを用いてヒドロゲナーゼを単離精製するに際し、ヒドロゲナーゼを含む試料を、中性乃至弱酸性のバッファーを用いて、カラムに負荷し且つ該ヒドロゲナーゼを該カラムから溶出させることにより得ることができる。
触媒活性能の高さと安定性、及び耐熱性の観点から、前記ヒドロゲナーゼが、ヒドロゲノビブリオ・マリナス由来であることが好ましい。
【００１４】
上記ヒドロゲナーゼ酵素溶液を用いて、例えば、燃料電池の電極触媒を作製することができ、優れた発電性能を発現する燃料電池の提供が可能である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の単離精製方法によれば、生体内と同様のほぼ完全な状態、且つ、均質な状態のヒドロゲナーゼを含むヒドロゲナーゼ酵素溶液を調製することが可能である。ゆえに、本発明により得られるヒドロゲナーゼ酵素溶液は、タンパク質単位重量当たりの活性が高い。このような単位重量当たりの活性の高いヒドロゲナーゼ酵素溶液を用いて形成された触媒層を備える燃料電池は、単位面積あたりの発電性能に優れ、高効率な発電が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のヒドロゲナーゼ酵素溶液の単離精製方法は、カラムクロマトグラフィーを用いてヒドロゲナーゼを単離精製するに際し、ヒドロゲナーゼを含む試料を、中性乃至弱酸性のバッファーを用いて、カラムに負荷し且つ該ヒドロゲナーゼを該カラムから溶出させることを特徴とするものである。
【００１７】
本発明者らは、ヒドロゲナーゼをカラムクロマトグラフィーを用いて単離精製する際に、中性乃至弱酸性のバッファーを用いて、ヒドロゲナーゼをカラムに負荷且つカラムから溶出させることによって、ヒドロゲナーゼの小サブユニットの分解を抑制することが可能であることを発見した。
ヒドロゲナーゼの小サブユニットは、多くの場合、水素分子を電子とプロトンに分解する際やプロトンと電子から水素を合成する際の電子の伝達に関与するユニットであり、小サブユニットの分解によって、ヒドロゲナーゼは活性が低下乃至は失活する。しかしながら、従来ヒドロゲナーゼをカラムクロマトグラフィーで精製単離する際に多用されてきた弱アルカリ性のバッファーは、小サブユニットの分解物を生じさせるものであった。
【００１８】
これに対して、本発明の単離精製方法は、中性乃至弱酸性のバッファーを用いることによって、ヒドロゲナーゼの小サブユニットの分解を抑制し、完全精製することを可能とした。そのため、本発明によれば、高い回収率で、生体内と同様の水素酸化還元活性を有するほぼ完全な状態のヒドロゲナーゼを回収することができる。従って、本発明により得られるヒドロゲナーゼ酵素溶液は、小サブユニットの分解物等の分解物が混在しない高均質なものである。すなわち、本発明によればタンパク質（酵素）単位重量当たりの活性が高いヒドロゲナーゼ酵素溶液を提供することができる。
【００１９】
本発明において、中性乃至弱酸性のバッファーは、カラムクロマトグラフィーによる単離精製に際し、ヒドロゲナーゼを単離精製することを目的としてカラム内に通す全バッファーに用いられる。すなわち、ヒドロゲナーゼをカラムに負荷（吸着）する際の混合液試料、カラムに吸着したヒドロゲナーゼを溶出させる際の溶離液に用いられる。また、ヒドロゲナーゼをカラム担体に吸着した後、吸着しない夾雑タンパクを除去する洗浄液としても用いられる。カラムクロマトグラフィーによる単離精製を複数回行う場合には、もちろん全カラムによる単離精製において中性乃至弱酸性のバッファーを用いる。
【００２０】
中性乃至弱酸性のバッファーとは、具体的には、ｐＨ６．０〜７．０、特にｐＨ６．５〜７．０であることが好ましく、単離精製するヒドロゲナーゼや単離精製に用いるカラムによって適宜最適なものを用いることが好ましい。特に、弱酸性のバッファー、具体的には、ｐＨ６．５〜７．０のバッファーが好ましい。バッファーのｐＨは、例えば、Ｍｅｓ（2-Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）バッファー（ｐＨ５．５〜６．７）、Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌバッファー（ｐＨ５．８〜７．２）、リン酸カリウムバッファー（ｐＨ５．８〜８．０）、Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０〜９．０）等によって調節することができる。
【００２１】
尚、上記バッファーには、上記ｐＨを調節する成分の他、ヒドロゲナーゼの溶出を調整するための成分等のその他成分が含まれる。当該その他の成分は、当該成分を含むバッファーの使用目的によって異なり、例えば、ジチオスレイトール［ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）］、β-メルカプトエタノール（β-mercaptoethanol）等の還元剤；ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｏｃｔｙｌ-β‐Ｄ‐ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、ｄｏｄｅｃｙｌ‐β‐Ｄ‐ｍａｌｔｏｓｉｄｅ等の界面活性剤；ＭｇＣｌ2、ＭｎＣｌ2等の二価金属塩；ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）等のキレート試薬、ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）等のプロテアーゼ阻害剤；スクロース、グリセロール等が挙げられる。これらは、単独で或いは複数を組み合わせて用いることができる。
【００２２】
本発明において利用するカラムクロマトグラフィーの種類は特に限定されず、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト等による吸着クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて或いは単独で行うことができる。通常は、少なくともイオン交換クロマトグラフィーによる精製を行うことが好ましい。
【００２３】
ヒドロゲナーゼ回収率のさらなる向上、並びに、ヒドロゲナーゼの単離精製工程の簡素化及び短縮化の点から、単離精製するヒドロゲナーゼが耐熱性を有している場合には、上記カラムクロマトグラフィーによる単離精製工程の前に、耐熱性のない雑夾タンパク質を変性除去するため、ヒドロゲナーゼを含有する混合液試料を、加熱する加熱処理工程を設けることが好ましい。
耐熱性を有するヒドロゲナーゼを含む混合液試料に、単離精製の目的とするヒドロゲナーゼは変性や会合、凝集等を引き起こさないが、当該混合液試料中に共存するその他のタンパク質（夾雑タンパク質）は会合や凝集を引き起こすような条件で加熱処理を施すことによって、夾雑タンパク質を選択的に沈殿させることができる。沈殿した夾雑タンパク質は容易に除去することが可能であり、除去することによって上記混合液試料のヒドロゲナーゼの純度を向上させることができる。
【００２４】
このように予めカラムクロマトグラフィーの処理溶液である上記混合液試料におけるヒドロゲナーゼの純度を向上させることによって、精製に使用するカラムの本数を低減することができる。その結果、カラムクロマトグラフィーによる分離効率を向上させ、より高い回収率でヒドロゲナーゼを単離精製することが可能となり、且つ、単離精製に要する時間を大幅に短縮することが可能となる。このような使用カラムの本数減少によるメリットは、大きいカラムを用いてスケールアップした場合にさらに顕著になると予想される。
加熱処理による使用カラムの本数減少は、例えば、加熱処理工程を設けない場合、ヒドロゲノビブリオ・マリナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ）由来のヒドロゲナーゼの精製では、少なくともイオン交換クロマトグラフィーであるＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、疎水性クロマトグラフィーであるＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ、吸着クロマトグラフィーであるヒドロキシアパタイト、及びゲル濾過クロマトグラフィーであるＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００の４本のカラムを使用する等、複数のカラムを用いなければ、十分に精製することができなかった。
【００２５】
これに対して、加熱処理工程を設けることによって、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅとＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００といったように、カラムを適宜２本程度組み合わせることで、十分に精製することが可能となる。すなわち、加熱処理によって、カラム二本分の回収率のロスを低減すると共に、精製時間を短縮することができる。
さらには、その理由は解明できていないが、ヒドロゲノビブリオ・マリナス由来のヒドロゲナーゼでは、膜画分に非イオン界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加し、上記条件で加熱処理することで可溶化画分に得られたヒドロゲナーゼ活性が従来法（加熱処理なし）より大幅に上昇することが確認されている（実施例参照）。すなわち、加熱処理を施すことにより、カラムの本数を少なくできると共に、ヒドロゲナーゼの活性を大幅に上昇させることができる。
【００２６】
上記加熱処理工程における加熱温度、加熱時間等の加熱条件は、単離精製するヒドロゲナーゼ及び共存する夾雑タンパク質の性質を考慮して適宜設定すればよい。例えば、ヒドロゲノビブリオ・マリナス由来ヒドロゲナーゼの単離精製の際には、通常、５０〜６５℃で１５〜３０分間加熱処理を施すことが好ましい。
【００２７】
本発明において、ヒドロゲナーゼの採取源は特に限定されない。例えば、ヒドロゲノビブリオ・マリナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ）等のヒドロゲノビブリオ属に属する細菌；デスルフォビブリオ・バルガリス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）やデスルフォビブリオ・ギガス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｇｉｇａｓ）等のデスルフォビブリオ属に属する細菌；クロストリジウム・パストリアナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）等のクロストリジウム属に属する細菌；等が挙げられる。
その他にも、例えば、ヒドロゲノファガ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ）属に属する細菌（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ  ｓｐ．）、ピロジクチウム・ブロッキー（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ）由来のヒドロゲナーゼ、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のヒドロゲナーゼ、バチルス・シレーゲリー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ）由来のヒドロゲナーゼ、クロストリジウム・サーモアセチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）由来のヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
さらには、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）等のラルストニア属に属する細菌；チオカプサ・ロゼオペルシシーナ（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ  ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ）等のチオカプサ属に属する細菌；オリゴトロファ・カルボキシドボランス（Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ  ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ）；アキフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）；ヒドロゲノバクター・サーモフィラス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）；パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）等も挙げられる。
【００２８】
触媒活性の高さ及び安定性（熱安定性、酸素耐性）の観点から、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ（ヒドロゲノビブリオ・マリナス）由来のヒドロゲナーゼを好適に用いることができる。ヒドロゲノビブリオ・マリナスとしては、理化学研究所に寄託（申請書受理番号第７６８８号）されているヒドロゲノビブリオ・マリナスＭＨ−１１０が容易に入手できる。
ヒドロゲノビブリオ・マリナスとしては、特開２０００−３５０５８５号公報の配列番号２のアミノ酸配列を有する小サブユニットと、配列番号４のアミノ酸配列を有する大サブユニットとからなるものを例示できる。尚、ヒドロゲノビブリオ・マリナスは、ヒドロゲナーゼ活性を有する限り、これらアミノ酸配列において数個（例えば１〜３個程度）のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていたり、或いは、工学的に任意に変異を加えられたものでもよい。
【００２９】
上記したような微生物由来のヒドロゲナーゼは、微生物を培養することで増殖させることができる。微生物の培養方法は、培養する微生物の種類に応じて決めればよい。例えば、ヒドロゲノビブリオ・マリナスは、水素、酸素及び二酸化炭素からなる気相下で、無機化合物によりなる組成の培地で、液体又は固体培養することができる。
【００３０】
本発明のヒドロゲナーゼの単離精製方法は、カラムクロマトグラフィーの際に用いるバッファーを中性乃至弱酸性とする以外は、従来のヒドロゲナーゼ精製単離方法を適用可能である。
【００３１】
例えば、培養物からのヒドロゲナーゼの採取は、微生物からタンパク質を採取する際に常用される方法に従って行うことができる。例えば、ヒドロゲナーゼが菌体の内部に生産される場合には、まず菌体を適当な緩衝液に懸濁し、機械的破壊法、例えば、超音波破壊、フレンチプレス、ガラスビーズを用いるホモジナイザー、凍結融解法、凍結破砕法などにより、菌体を破砕した破砕液を得る。そして、得られた破砕液から遠心分離等により菌体を除去し、膜画分を調製する。膜画分には、界面活性剤を加えて膜タンパクの可溶化処理を行う。
一方、ヒドロゲナーゼが菌体の外部に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体を除去する。
【００３２】
そして、上記したようなイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーを単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、ヒドロゲナーゼを単離精製することができる。
カラムクロマトグラフィーによる単離精製工程の前には、必要に応じて、上記した加熱処理の他、硫酸アンモニウム等による塩析沈殿、有機溶媒による分別沈殿、ｐＨ処理による変性沈殿や等電点沈殿、調整型電気泳動等の方法により、ヒドロゲナーゼの分離、精製工程を設け、純度を上げておいてもよい。
尚、ヒドロゲナーゼは、ヒドロゲナーゼを持つ微生物の染色体ＤＮＡからヒドロゲナーゼ遺伝子を単離し、当該遺伝子を含有する組み換えベクターを含む形質転換体を培養し、得られる培養物から採取してもよい。
【００３３】
本発明によれば、単離精製したヒドロゲナーゼ酵素溶液であって、小サブユニットの分解物が混在しない均質なヒドロゲナーゼ酵素溶液を提供することが可能である。ここで、分解物が混在しないとは、水素酸化還元活性能を有するヒドロゲナーゼ以外の、小サブユニットの分解物やその他の分解物等の存在を完全に排除するものではない。分解物は電気泳動上で、本来の分子量をもつ小サブユニットタンパク質のバンドに加え、小分子化したタンパク質断片のバンドとしてラダー状に観察される（図１−Ｂ、Ｃ参照）。このような分解物由来のバンドができるだけ観察されないことが好ましい。具体的には、ヒドロゲナーゼの小サブユニット分解物濃度が分解を受けていない完全な分子量を持つ小サブユニットの１０％以下であることが好ましい。
【００３４】
以上のように、本発明のヒドロゲナーゼ酵素溶液は、小サブユニットの分解物等を含まないため、タンパク質（酵素）単位重量当たりの活性が高いものである。このような活性の高いヒドロゲナーゼ酵素溶液は、様々な分野において利用可能である。例えば、上記したように、アノード（燃料極）で（Ｈ2  →  ２Ｈ+  ＋  ２ｅ-）の反応を起こし、カソード（酸化剤極）で（４Ｈ+  ＋  Ｏ2  ＋  ４ｅ-  →  ２Ｈ2Ｏ）の反応を起こさせることで発電する燃料電池の燃料極における電極触媒としても利用が期待できる。
【００３５】
ヒドロゲナーゼは、水素還元反応に対する触媒活性を有していることから、アノード（燃料極）の電極触媒として用いることができる。ヒドロゲナーゼは、必要に応じて、適当な担体に担持させる等してアノードに組み込むことができる。また、ヒドロゲナーゼを電極触媒として備える燃料電池においては、通常、必要に応じて、電極の導電体−ヒドロゲナーゼ間の電子のやり取りをスムーズに進行させるため、電子を運搬する働きを有する化合物（電子伝達メディエータ）を用いることが好ましい。電子伝達メディエータとしては、例えば、メチルビオローゲン、ベンジルビオローゲン等を用いることができる。
【００３６】
本発明のヒドロゲナーゼ酵素溶液を用いた燃料電池は、タンパク質単位重量当たりの活性が高いヒドロゲナーゼ酵素溶液を用いることによって、従来の分解物を含むヒドロゲナーゼ酵素溶液を用いた燃料電池と比較して、水素酸化触媒として機能する完全な状態のヒドロゲナーゼを多く担持しているため、単位面積あたりの発電性能に優れ、高効率な発電が可能である。
また、アノードの電極触媒としてヒドロゲナーゼを用いることによって、白金使用量が低減し、燃料電池のコスト削減が可能である。さらに、ヒドロゲナーゼの中には、ヒドロゲノビブリオ・マリナス由来のように一酸化炭素による活性阻害が起こり難い耐性酵素もある。このような酵素を利用する場合、白金のような一酸化炭素による被毒問題がないという利点もある。すなわち、燃料ガス中の一酸化炭素汚染がある程度許容される。
【００３７】
ヒドロゲナーゼは燃料電池の電極触媒以外にも、化石燃料に代わる新しいエネルギー源として注目されている水素の生産プロセス等への利用等が期待できる。
【実施例】
【００３８】
［ヒドロゲノビブリオ・マリナスの培養］
ヒドロゲナーゼの採取源として、ヒドロゲノビブリオ・マリナスを以下のような条件下で培養した。
（１）使用株  ；  Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＨ−１１０株
（２）使用培地  ；  Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．７２，３５８−３６１，１９９１に記載の無機培地（１リットル当たり、２．０ｇ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、２．５ｇ  Ｋ2ＨＰＯ4、０．５ｇ  ＫＨ2ＰＯ4、０．２ｇ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２９．３ｇ  ＮａＣｌ、１０．０ｍｇ  ＣａＣｌ2、１０．０ｍｇ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．６ｍｇ  ＮｉＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２．０ｍｌ  ハーシュの微量元素溶液（ｐＨ７．０）を含む培地。ここで、ハーシュの微量元素溶液の組成は、１リットル当たり、１．０ｍｇ  ＭｏＯ3、７．０ｍｇ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｍｇ  ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１．０ｍｇ  Ｈ3ＢＯ3、１．０ｍｇ  ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１．０ｍｇ  ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏである。）
（３）通気ガス  ；  水素：酸素：炭酸ガス＝７：２：１、総流量２．５Ｌ／ｍｉｎ
（４）培養温度  ；  ３５℃
（５）その他  ；  ジャーファーメンターによる連続培養、攪拌回転数７５０ｒｐｍ
培養終了後、培養ブロースを４℃で８，０００×ｇ、２０分間遠心分離を行うことにより集菌した。
【００３９】
［ヒドロゲナーゼの単離精製］
（実施例１）
（１）膜画分の分離
上記にて得られた菌体（湿重量１ｇ）を５ｍｌの２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ社製、ＳＯＮＩＦＩＥＲ−４５０）を用いて、２０ｋＨｚの出力で２分間の破砕処理を３回行った。破砕液を４℃、８，０００×ｇで２０分間遠心した。次いで、遠心後の上清をさらに４℃、１２８，０００×ｇで１時間超遠心分離し、得られた沈殿物を膜画分とした。
【００４０】
（２）ヒドロゲナーゼの可溶化
得られた膜画分をタンパク質濃度が８ｍｇ／ｍｌ程度となるように２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁した。さらに、得られた膜画分懸濁液に、非イオン性界面活性剤の１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル）を含む２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を１：１の割合で混合し、膜画分のタンパク質濃度を４ｍｇ／ｍｌ程度、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の終濃度を０．５％ｖ／ｖ（約８．５ｍＭ）として、４℃、アルゴン気相下、１時間緩やかに攪拌しながら可溶化処理を行った。引き続き、加熱処理（６０℃、２０分間）を行い、その後、２０，０００×ｇ、４℃で２０分間、高速遠心分離することで沈殿を除去し、ヒドロゲナーゼ画分を得た。
【００４１】
（３）カラムクロマトグラフィーによる単離精製
（３−１）
上記高速遠心分離により得られた上清を、予め、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む、２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（アマシャムバイオサイエンス製）カラムに添加し、ヒドロゲナーゼを負荷させた。その後、上記Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファーでカラムを洗浄した。上記バッファーでカラムを洗浄した後、ＮａＣｌの濃度勾配によりヒドロゲナーゼの溶出を行った。ヒドロゲナーゼは１７０ｍＭ程度のＮａＣｌ濃度でカラムから溶出された。
【００４２】
（３−２）
次に、予め、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む、１ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．８）で平衡化したＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に、上記にてＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムから溶出させたヒドロゲナーゼ活性画分を添加し、ヒドロゲナーゼを負荷させた。その後、上記リン酸カリウムバッファーでカラムを洗浄した後、上記成分を含む１ｍＭ〜４００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．８）の濃度勾配によりヒドロゲナーゼを溶出させた。
【００４３】
（比較例１）
（１）膜画分の分離
実施例と同様にして、膜画分を得た。
（２）ヒドロゲナーゼの可溶化
得られた膜画分をタンパク質濃度が８ｍｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁した。さらに、得られた膜画分懸濁液に、非イオン性界面活性剤のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル）の１％溶液、２ｍＭのｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトサイドを添加し、４℃、アルゴン気相下、１２時間で可溶化処理を行った。
可溶化処理後、３０，０００ｒｐｍ、４℃で１時間、超遠心分離した。
【００４４】
（３）カラムクロマトグラフィーによる単離精製
上記超遠心分離により得られた上清を、予め、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（アマシャムバイオサイエンス製）カラムに添加し、ヒドロゲナーゼを負荷させた。その後、上記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーでカラムを洗浄した後、ＮａＣｌの濃度勾配によりヒドロゲナーゼの溶出を行った。ヒドロゲナーゼは２３０ｍＭ程度のＮａＣｌ濃度でカラムから溶出された。
【００４５】
次に、予め、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．２Ｍ  （ＮＨ4）2ＳＯ4を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８）で平衡化したＯｃｔｙｌ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ｆａｓｔ ｆｌｏｗカラム（アマシャムバイオサイエンス製）に、上記にてＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムから溶出させたヒドロゲナーゼを含む溶液に、終濃度０．２Ｍになるように（ＮＨ4）2ＳＯ4を添加した後、ヒドロゲナーゼを負荷させた。その後、０．２Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4を含む上記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーでカラムを洗浄した後、（ＮＨ4）2ＳＯ4０．２Ｍ〜０Ｍとエチレングリコール０％〜２０％の濃度勾配を同時にかけることにより、ヒドロゲナーゼを溶出させた。
【００４６】
さらに、予め、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む、１ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．８）で平衡化したＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に、上記にてＯｃｔｙｌ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ｆａｓｔ ｆｌｏｗカラム（アマシャムバイオサイエンス製）から溶出させたヒドロゲナーゼを含む溶液を添加し、ヒドロゲナーゼを負荷させた。その後、上記リン酸カリウムバッファーでカラムを洗浄した後、上記成分を含む１ｍＭ〜４００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．８）の濃度勾配によりヒドロゲナーゼを溶出させた。
【００４７】
さらに、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラムから溶出されたヒドロゲナーゼ活性画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を用いて濃縮し、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．８）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（アマシャムバイオサイエンス製）のゲル濾過カラムに供することで、精製を行った。
［ヒドロゲナーゼ酵素溶液の評価］
上記にて得られた実施例１及び比較例１のヒドロゲナーゼ酵素溶液の均質性を各ヒドロゲナーゼ酵素溶液中のヒドロゲナーゼを電気泳動させることにより評価した。また、各ヒドロゲナーゼ酵素溶液の水素酸化活性を水素酸化電流により評価した。
【００４８】
＜電気泳動＞
まず、各ヒドロゲナーゼ酵素溶液に等量の変性緩衝液（６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２０％  グリセロール、１０％  ２−メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を加え混合し、沸騰水中で５分間熱変性させた。その後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉの方法［Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５（１９７０）］に従って行った。分離ゲル濃度は１０％で、泳動緩衝液は、２５ｍＭトリス、０．１９２Ｍグリシン、０．１％ＳＤＳを用いた。
【００４９】
結果を図１に示す。図１（Ａ）は実施例のヒドロゲナーゼ酵素溶液の電気泳動結果、図１（Ｂ）は比較例のヒドロゲナーゼ酵素溶液の電気泳動結果である。図１（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、比較例のヒドロゲナーゼは小サブユニットの分解によって小分子化したタンパク質断片のバンドがラダー状に観察されたのに対して、実施例のヒドロゲナーゼ酵素溶液は、小サブユニットのバンドがシャープであった。すなわち、中性乃至弱酸性のバッファー（ｐＨ６．８、ｐＨ７．０）を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製することによって、弱アルカリ性（ｐＨ７．８）のバッファーを用いる場合と比較して、小サブユニットの分解を抑制することが可能であることがわかる。
【００５０】
さらに、図１（Ｃ）に、弱アルカリ性（ｐＨ７．４）のバッファーを用いてカラムクロマトグラフィーにより精製したヒドロゲノファーガ由来のヒドロゲナーゼの電気泳動結果を示す。比較例と同様、図１（Ｃ）でも小サブユニットのバンドがラダー状に広がっており、分解物が生じたことがわかる。これは、ヒドロゲノビブリオ・マリナス以外の微生物由来の膜結合型ヒドロゲナーゼでも、カラムクロマトグラフィーにより精製するに際し、弱アルカリ性のバッファーを用いることで小サブユニットの分解が生じることを示している。
【００５１】
＜水素酸化電流＞
図２に示す評価セルを用いて、水素酸化電流を測定し、下記の測定条件下、アノード活性を評価した。
尚、図２の評価セルにおいて、カーボン板を作用電極（アノード）、白金板を対極、Ａｇ／ＡｇＣｌを参照極とした。各極をポテンショスタットに接続し、作用電極の電位を３００ｍＶに制御しながら、作用電極（アノード）で発生した電流の測定を行った。
【００５２】
アノード側の電解液としては、上記実施例にて得られた酵素溶液、メディエータ（メチルビオローゲン）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）の混合液を用いた。酵素溶液の活性を正確に評価するため、メディエータであるベンジルビオローゲン（ＢＶ）は大過剰量（０．８ｇ／１００ｍｌ）添加した。
電解液には、測定前にＮ2ガスで十分にバブリングを行い、測定中はＨ2ガスをフローさせた。作用電極と対極の間には、電解質膜（Ｎａｆｉｏｎ  １１２）を配置し、これら電極間を仕切った。測定条件を以下に示す。
【００５３】
・温度  ：  ６０℃
・ｐＨ  ：  ６．４
・酵素溶液量  ：  ２ｃｃ
・メディエータ  ：  ベンジルビオローゲン（ＢＶ）
【００５４】
結果を図３に示す。
図３のグラフは、作用電極で発生する電流値の経時的な変化を示すものであり、電解液へのＨ2ガスの供給開始時間をゼロとしている。時間の経過と共に、電流値が高くなっていることから、時間の経過に伴い電解液中に含まれるヒドロゲナーゼに十分量の水素が供給され、ヒドロゲナーゼによる水素の酸化反応が進行することが確認できた。
【００５５】
＜ヒドロゲナーゼの単離精製プロフィール及び精製度の評価＞
実施例１及び比較例１におけるヒドロゲナーゼの単離精製プロフィールと精製度の評価を行った。結果を表１（実施例１）及び表２（比較例１）に示す。
【００５６】
尚、実施例１のヒドロゲナーゼの酵素単位（１Ｕｎｉｔ）は、５０ｍＭ  カリウムリン酸バッファー（ｐＨ７）、温度６０℃の条件下で１分間に１μｍｏｌのベンジルビオローゲンが還元される酵素量とした。
また、表１には、実施例１における上記Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅによる精製後、さらに、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．８）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（アマシャムバイオサイエンス製）を用いて精製することにより得られたヒドロゲナーゼの精製プロフィール及び精製度も示した。Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅにより精製した後の状態と、さらにＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムによって精製した後の状態を比較すると、その精製倍率に大きな差はなく、精製倍率の差に比べて回収率の低下があること、並びに、上記電気泳動及び水素酸化電流の結果から、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅと、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅの２本のカラム処理で充分であると判断できる。
【００５７】
表１において、「Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅａｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」とは膜画分（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）に界面活性剤を添加した後、可溶化と加熱処理を行った状態である。「Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ」とは、上記試料をさらに高速遠心分離を行った後の上清の状態である。可溶化と加熱処理によって活性上昇が見られたため、精製倍率（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び精製回収率（Ｙｉｅｌｄ）は、加熱処理後の膜画分の値を１００％として計算した。
また、「Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ」「Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ」「Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００」とは、それぞれをカラムによる精製後の状態である。
【００５８】
一方、比較例１のヒドロゲナーゼの酵素単位（１Ｕｎｉｔ）は、５０ｍＭ  カリウムリン酸バッファー（ｐＨ７）、温度５０℃の条件下で１分間に１μｍｏｌのメチルビオローゲンが還元される酵素量とした。
表２において、「Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ」とは膜画分（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）に界面活性剤を添加した後、可溶化を行い、さらに、超速遠心分離した後の状態、「Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ」「Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦＦ」「Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ」「Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００」とは、それぞれをカラムによる精製後の状態である。
【００５９】
【表１】
2008263803.tif 000002
【００６０】
【表２】
2008263803.tif 000003
【００６１】
上述したように、表１により、加熱処理前の膜画分の比活性が５．８７Ｕ／ｍｇであったのに対し、可溶化と加熱処理後の膜画分は約４．６倍の２７．２Ｕ／ｍｇにまで増加し、総活性が９２４８Ｕになったことから、加熱処理を行うことによって、酵素活性が著しく上昇することがわかる。この値を１００％として精製倍率及び精製回収率を求めた。
【００６２】
また、可溶化処理後に加熱処理工程を設けた実施例１では、使用カラム２本で充分な精製が可能であったのに対して、加熱処理工程を設けていない比較例１では、使用カラムが４本だった。実施例では、加熱処理によって予め酵素の純度を高めておくことによって、使用カラム数を半減させても精製が可能となったためである。さらに、比較例１において酵素の可溶化時間が１２時間であったのに対して、実施例１では、１時間と大幅な短縮が可能であった。しかも、実施例は超遠心分離を省略することが可能であり、可溶化処理の大幅な時間短縮と共に、工程の簡素化が実現された。
尚、実施例１において、可溶化処理時間の短縮、超遠心分離の省略及び使用カラム本数の減少等、精製工程の簡素化及び短縮化にも関わらず、充分な精製度が得られたことは、上記電気泳動によって支持されている。
【００６３】
尚、本出願において実施例及び比較例として行ったヒドロゲノビブリオ・マリナス由来のヒドロゲナーゼ精製の精製回収率（実施例１：６８．４％、比較例１：４１．９％）は、文献（例えば、以下の２文献）に記載されたヒドロゲナーゼ精製の値と比較して著しく高い。
（文献１）
Ｍ．Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：４９２−５０２
微生物種：Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
精製回収率：６．７％
（文献２）
Ｒ．Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：３４２３−３４２８
微生物種：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｆｕｒｉｏｓｕｓ
精製回収率：７．０％
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】実施例における電気泳動の結果を示す図である。
【図２】実施例において水素酸化電流に用いたセルを示す概念図である。
【図３】実施例における水素酸化電流の結果を示すグラフである。
【図１】
2008263803.tif 000004
【図２】
2008263803.tif 000005
【図３】
2008263803.tif 000006