(57)【要約】【課題】  無血清培養での細胞増殖性が向上させると共に、感染因子の混入の危険性のない無血清培地を提供することである。【解決手段】  細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有する人工ポリペプチド（Ｐ）を含有することを特徴とする無血清培地を用いる。（Ｘ）はArg Gly Asp配列が好ましい。（Ｐ）は補助アミノ酸配列（Ｙ）を（Ｐ）の１分子中に少なくとも１個有してなることが好ましい。（Ｐ）が、（Ｘ）の両端に介在アミノ酸配列（Ｚ）を含むアミノ酸配列と（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造を有することが好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有する人工ポリペプチド（Ｐ）を含有することを特徴とする無血清培地（Ａ）。
【請求項２】
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）がArg Gly Asp配列である請求項１に記載の無血清培地。
【請求項３】
人工ポリペプチド（Ｐ）が、さらに、補助アミノ酸配列（Ｙ）を１分子中に少なくとも１個有してなる人工ポリペプチドである請求項１又は２に記載の無血清培地。
【請求項４】
人工ポリペプチド（Ｐ）が、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）の両端に介在アミノ酸配列（Ｚ）を含むアミノ酸配列と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造を有する請求項３に記載の無血清培地。
【請求項５】
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）の含有量が、無血清培地（Ａ）に対して、１ｎＭ〜１ｍＭである請求項１〜４のいずれかに記載の無血清培地。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の無血清培地を用いることを特徴とする細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は無血清培地に関する。さらに詳しくは、無血清培養の細胞増殖性に特に効果的な無血清培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
無血清培地としては、動物由来のフィブロネクチンを含有する培地（特許文献１）等が知られている。
【０００３】
【特許文献１】特表２００５−５１５７７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上記の培地では、無血清培養での細胞増殖性が不十分である。また、上記の培地では、動物由来成分を有するためウイルス等の感染因子の混入の危険性があるという問題がある。すなわち、本発明の目的は、無血清培養での細胞増殖性を向上させると共に、感染因子混入の危険性のない培地を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の無血清培地の特徴は、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有する人工ポリペプチド（Ｐ）を含有する点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の無血清培地は、優れた細胞増殖性を発揮する。また、動物由来成分を含まないため、ウイルス等の感染因子混入の危険性がない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され、細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年）。
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）としては、「病態生理、第９巻 第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が用いられる。
【０００８】
これらの最小アミノ酸配列（Ｘ）の中で、Arg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Leu Arg Glu配列、His Ala Val配列、Arg Glu Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Pro Asp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Asp Gly Glu Ala 配列（８）、Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro配列（９）、Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys配列（１０）、Tyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser配列（１１）、Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys配列（１２）、Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly配列（１３）、Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys配列（１４）、Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr（１５）及びPro His Ser Arg Asn（１６）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、細胞接着性の観点等から、さらに好ましくはArg Gly Asp配列、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr（１５）及びPro His Ser Arg Asn（１６）からなる群より選ばれる少なくとも１種、特に好ましくはArg Gly Asp配列である。
これらの最小アミノ酸配列（Ｘ）の両端には、他のアミノ酸｛アラニン（Ala）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、プロリン（Pro）、トリプトファン（Trp）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）及びヒスチジン（His）等｝を含んでなる介在アミノ酸配列（Ｚ）を結合していることが好ましい。
【０００９】
最小アミノ酸配列（Ｘ）のＮ末端には、細胞接着性の観点から、Gly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）、Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp配列（６６）、Gly Pro Ala Val Thr Gly配列（６７）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Val Thr Gly配列（６８）、Gly Ala Ala Val Cys Glu Pro Gly配列（６９）、Gly Ala Ala Leu Cys Val Ser Glu Pro Gly配列（７０）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Leu Cys Val Ser Glu Pro Gly配列（７１）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Val Cys Glu Pro Gly配列（７２）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Val Cys Glu Pro Gly配列（７３）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Leu Cys Val Ser Glu Pro Gly配列（７４）、Gly Pro Ala Val Cys Glu Pro Gly配列（７５）、Gly Pro Ala Leu Cys Val Ser Glu Pro Gly配列（７６）及びGly Ala Ala Pro Gly Ala Ser配列（７７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の介在アミノ酸配列（Ｚ）を結合していることが好ましく、Gly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）、Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp配列（６６）、Gly Pro Ala Val Thr Gly配列（６７）及びAla Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Val Thr Gly配列（６８）からなる群より選ばれる少なくとも１種がさらに好ましく、Gly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）が特に好ましい。
【００１０】
最小アミノ酸配列（Ｘ）のＣ末端には、細胞接着性の観点から、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Leu Cys Val Ser配列（７９）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Val Cys配列（８０）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro配列（８１）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Val Cys配列（８２）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Leu Cys Val Ser配列（８３）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro配列（８４）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Pro Val Gly Ser Pro配列（８５）、Cys Asp Ala Gly Tyr配列（８６）、Cys Asp Ala Gly Pro Val Gly Ser Pro配列（８７）及びSer Ala Gly Pro Ser Ala Gly Tyr配列（８８）からなる群より選ばれる少なくとも１種の介在アミノ酸配列（Ｚ）を結合していることが好ましく、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Leu Cys Val Ser配列（７９）、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Val Cys配列（８０）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro配列（８１）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Val Cys配列（８２）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ala Leu Cys Val Ser配列（８３）、Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro配列（８４）及びSer Pro Ala Ser Ala Ala Gly Pro Val Gly Ser Pro配列（８５）からなる群より選ばれる少なくとも１種がさらに好ましく、Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）が特に好ましい。
【００１１】
人工ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有すればよいが、細胞接着性の観点等から、１分子中に１〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは２〜５０個、次に好ましくは３〜３０個、特に好ましくは４〜２０個有するもの、最も好ましくは５〜１５個有するものである。なお、２種以上の最小アミノ酸配列（Ｘ）が一分子中に含まれてもよい。
【００１２】
人工ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）以外に、人工ポリペプチド（Ｐ）の熱安定性向上の観点等から、補助アミノ酸配列（Ｙ）を有することが好ましい。
【００１３】
補助アミノ酸配列（Ｙ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）以外のアミノ酸配列が使用でき、人工ポリペプチド（Ｐ）の熱安定性の観点等から、Gly 及び／又はAlaを有する配列が好ましい。
補助アミノ酸配列（Ｙ）としては、（Gly Ala）a 配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）ｄ配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e配列、｛Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala｝g配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly）i配列、（Ala）j配列、（Gly Gly Ala）k配列、（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列、（Gly Pro Pro）ｎ配列、（Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly）ｏ配列、（Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln）ｐ配列及び／又は（Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro）ｑ配列を有する配列等が含まれる。これらのうち、（Gly Ala）a配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e、｛Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala｝g配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列及び／又は（Gly Pro Pro）ｎ配列を有するものが好ましく、さらに好ましくは（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列及び／又は（Gly Pro Pro）ｎ配列を有するもの、特に好ましくは（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列を有するものである。
なお、aは５〜１００の整数、bは１〜３３の整数、ｃ、ｄ及びｅは２〜３３の整数、fは１〜１９４の整数、ｇは｛１｝〜｛２００／（６＋ｆ）｝の小数点以下を切り捨てした整数、hは２〜４０の整数、i及びjは１０〜２００の整数、kは３〜６６の整数、ｍは２〜４０の整数、ｎは３〜６６の整数、ｏは１〜２２の整数、ｐ及びｑは１〜１３の整数である。
【００１４】
補助アミノ酸配列（Ｙ）は、グリシン(Gly)及び／又はアラニン(Ala)を含むことが好ましい。グリシン（Gly）及びアラニン（Ala）を含む場合、これらの合計含有割合（％）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて、１０〜１００が好ましく、さらに好ましくは２０〜９５、特に好ましくは３０〜９０、最も好ましくは４０〜８５である。この範囲であると、熱安定性がさらに良好となる。
グリシン（Gly）及びアラニン（Ala）の両方を含む場合、これらの含有個数割合（Gly／Ala）は、０．０３〜４０が好ましく、さらに好ましくは０．０８〜１３、特に好ましくは０．２〜５である。この範囲であると、熱安定性がさらに良好となる。
【００１５】
補助アミノ酸配列（Ｙ）には、以上の例示の他に、他のアミノ酸｛アラニン（Ala）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、プロリン（Pro）、トリプトファン（Trp）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）及びヒスチジン（His）等｝を含んでいてもよい。
【００１６】
（Gly Ala）a配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１７）〜（１９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２０）〜（２２）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２３）〜（２５）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２６）〜（２８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２９）〜（３１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
｛Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala｝g配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３２）〜（３４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Val Pro Gly Val）h配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３５）〜（３８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly）i配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３９）〜（４１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ala）j配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４２）〜（４４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Gly Ala）k配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４５）〜（４７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４８）〜（５０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Pro Pro）ｎ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５１）〜（５３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly）ｏ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５４）〜（５６）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln）ｐ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５７）〜（５９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro）ｑ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（６０）〜（６２）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
【００１７】
これらの補助アミノ酸配列のうち、熱安定性の観点等から、配列番号（１７）、（１８）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２６）、（２７）、（２９）、（３０）、（３２）、（３３）、（３４）、（３５）、（３６）、（３８）、（３９）、（４０）、（４２）、（４３）、（４５）、（４６）、（４８）、（４９）、（５１）、（５２）、（５４）、（５５）、（５７）、（５８）、（６０）又は（６１）で表されるアミノ酸配列が好ましく、さらに好ましくは配列番号（１８）、（２０）、（２１）、（２２）、（２４）、（２７）、（３０）、（３４）、（３５）、（３６）、（３７）、（３８）、（４０）、（４３）、（４６）、（４９）、（５２）、（５５）、（５８）又は（６１）で表されるアミノ酸配列、特に好ましくは配列番号（２０）、（２１）又は（３８）で表されるアミノ酸配列である。
【００１８】
補助アミノ酸配列（Ｙ）を含む場合、（Ｙ）の含有個数は、熱安定性の観点等から、人工ポリペプチド（Ｐ）1分子中に、２〜５０が好ましく、さらに好ましくは３〜３０、特に好ましくは４〜２０、最も好ましくは５〜１５である。また、人工ポリペプチド（Ｐ）は、２種以上の補助アミノ酸配列（Ｙ）を含んでもよい。
【００１９】
人工ポリペプチド（Ｐ）は、分岐鎖を含んでいてもよく、一部が架橋されていてもよく、環状構造を含んでいてもよい。しかし、人工ポリペプチド（Ｐ）は、架橋されていないことが好ましく、さらに好ましくは架橋されていない直鎖構造、特に好ましくは環状構造を持たず架橋されていない直鎖構造である。なお、直鎖構造には、β構造（直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。
【００２０】
人工ポリペプチド（Ｐ）は、細胞接着性及び熱安定性の観点等から、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが、必要により（Ｘ）と（Ｙ）の間に他のアミノ酸配列を介して、交互に化学結合してなる構造であることが好ましく、（Ｘ）の両端に介在アミノ酸配列（Ｚ）を含むアミノ酸配列と（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造であることがさらに好ましい。この場合、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との繰り返し単位（Ｘ−Ｙ）の数（個）は、細胞接着性の観点等から、１〜５０が好ましく、さらに好ましくは２〜４０、特に好ましくは３〜３０、最も好ましくは４〜２０である。
また、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数は同じでも異なっていてもよい。異なっている場合は、いずれかの含有個数が他方の含有個数より１個少ないことが好ましい｛この場合、補助アミノ酸配列（Ｙ）が少ないことが好ましい｝。人工ポリペプチド（Ｐ）中の最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数割合（Ｘ／Ｙ）は、０．５〜２が好ましく、さらに好ましくは０．９〜１．４、特に好ましくは１〜１．３である。
また、人工ポリペプチド（Ｐ）の末端部分（最小アミノ酸配列（Ｘ）又は補助アミノ酸配列（Ｙ）からペプチド末端まで）に他のアミノ酸を含んでもよい。他のアミノ酸を含む場合、その含有個数は、人工ポリペプチド（Ｐ）１個当たり、１〜１０００個が好ましく、さらに好ましくは３〜３００、特に好ましくは１０〜１００である。
【００２１】
人工ポリペプチド（Ｐ）の重量平均分子量（以下、Ｍｗ）は、１，０００〜１，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは２，０００〜７００，０００、特に好ましくは３，０００〜４００，０００、最も好ましくは４，０００〜２００，０００である。
なお、人工ポリペプチド（Ｐ）のＭｗは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプル｛ポリペプチド等｝を分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法等の公知の方法によって求められる（以下、同じ）。
【００２２】
好ましい人工ポリペプチド（Ｐ）の一部を以下に例示する。
（１）最小アミノ酸配列（Ｘ）がArg Gly Asp配列（ｘ１）の場合
Arg Gly Asp配列（ｘ１）の１３個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（２１）（ｙ１）の１２個とを有し、（ｘ１）のＮ末端にGly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）、（ｘ１）のＣ末端にSer Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）を有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１１万のポリペプチド｛「プロネクチンＦ」、プロネクチンは三洋化成工業（株）の登録商標（日本及び米国）である。三洋化成工業（株）製＜以下同じ＞｝；（ｘ１）の５個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（２０）（ｙ２）の５個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約２万のポリペプチド（「プロネクチンＦ２」）；（ｘ１）の３個と（Gly Val Pro Gly Val）2 Gly Gly （Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（３８）（ｙ３）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１万のポリペプチド（「プロネクチンＦ３」）等。
【００２３】
（２）最小アミノ酸配列（Ｘ）がIle Lys Val Ala Val配列（ｘ２）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のArg Gly Asp配列（ｘ１）をIle Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ２）に、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＮ末端に結合するGly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）をGly Ala Ala Pro Gly Ala Ser配列（７７）に、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＣ末端に結合するSer Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）をSer Ala Gly Pro Ser Ala Gly Tyr配列（８８）に変更した「プロネクチンＬ」、「プロネクチンＬ２」、又は「プロネクチンＬ３」等。
【００２４】
（３）最小アミノ酸配列（Ｘ）がTyr Ile Gly Ser Arg配列（ｘ３）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のArg Gly Asp配列（ｘ１）をTyr Ile Gly Ser Arg配列（ｘ３）に、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＮ末端に結合するGly Ala Ala Val Thr Gly配列（６５）をGly Ala Ala Val Cys Glu Pro Gly配列（６９）に、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＣ末端に結合するSer Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr配列（７８）をCys Asp Ala Gly Tyr配列（８６）に変更した「プロネクチンＹ」、「プロネクチンＹ２」、又は「プロネクチンＹ３」等。
【００２５】
また、（１）〜（３）のポリペプチドの他、宝酒造（株）製ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（リコンビナントヒトフィブロネクチンＣＨ−２９６）｛最小アミノ酸配列（Ｘ）としてArg Gly Asp配列（ｘ１）及びLeu Asp Val配列を含有するＭｗ約6万のポリペプチド｝、同ＲＧＤＳ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ｛最小アミノ酸配列（Ｘ）としてArg Gly Asp配列（ｘ１）を含有するＭｗ約３万のポリペプチド｝も好ましく使用できる｛ただし、これらのポリペプチドは天然に由来し、補助アミノ酸配列（Ｙ）が含まれていない。よって、熱安定性等が上記の（１）〜（３）よりも劣る。また、これらのポリペプチドのアミノ酸配列は特開平２−３１１４９８号公報に開示されている。｝。
【００２６】
人工ポリペプチド（Ｐ）は、人工的に合成されるものであり、例えば、有機合成法（固相合成法、液相合成法等）及び生化学的合成法［遺伝子組換え微生物（酵母、細菌、大腸菌等）］等によって製造する。すなわち、人工ポリペプチド（Ｐ）は、動物由来のコラーゲンやフィブロネクチン等の細胞接着性蛋白質を含まない。
【００２７】
有機合成法に関しては、例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）」第６４１〜６９４頁（昭和６２年５月２０日；株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が用いられる。生化学的合成法に関しては、例えば、特表平３−５０２９３５号公報に記載されている方法等が用いられる。人工ポリペプチド（Ｐ）を容易に合成できる点で、遺伝子組換え微生物による生化学的合成法が好ましく、特に好ましくは遺伝子組換え大腸菌を用いて合成する方法である。
【００２８】
無血清培地（ＭＥ）としては、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、Ｏｐｔｉ−ＰＲＯTMＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭTMＩ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴTM培地、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。
これらのうち、細胞増殖性の観点からＯｐｔｉ−ＰＲＯTMＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭTMＩ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴTM培地、ＤＭＥＭ培地及びこれらの混合培地が好ましく、さらに好ましくはＯｐｔｉ−ＰＲＯTMＳＦＭ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM２９３培地、ＤＭＥＭ培地及びこれらの混合培地である。
【００２９】
人工ポリペプチド（Ｐ）を無血清培地（ＭＥ）に含有させることにより、本発明の無血清培地（Ａ）が得られる。
最小アミノ酸配列（Ｘ）の含有量（ｍｏｌ／Ｌ。以下、Ｍと略記する。）は、細胞増殖性を向上させる観点等から、無血清培地（Ａ）に対して、１ｎＭ〜１ｍＭが好ましく、さらに好ましくは１０ｎＭ〜１００μＭ、特に好ましくは１００ｎＭ〜１０μＭである。
【００３０】
無血清培地（Ａ）中には、必要に応じて、細胞増殖因子（Ｚ）を含有させることができる。細胞増殖因子（Ｚ）を含有させることにより、細胞増殖性をさらに高めることができる。
細胞増殖因子（Ｚ）としては、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インシュリン様増殖因子、血管内皮増殖因子、神経成長因子、幹細胞因子、白血病阻害因子、骨形成因子、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、神経栄養因子、結合組織成長因子、アンジオポエチン、サイトカイン、インターロイキン、アドレナモジュリン及びナトリウム利尿ペプチド等の生理活性ペプチドが含まれる。これらのうち、適用できる細胞の範囲が広く、細胞増殖性が高い観点から、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、インシュリン様増殖因子及び骨形成因子が好ましく、さらに好ましくは上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子及びインシュリン様増殖因子である。
細胞増殖因子（Ｚ）を使用する場合、細胞増殖因子の含有量（重量％）は細胞増殖因子の種類によって異なるが、無血清培地（Ａ）の重量に基づいて、１０-16〜１０-3が好ましく、さらに好ましくは１０-14〜１０-5、特に好ましくは１０-12〜１０-7である。
【００３１】
無血清培地（Ａ）には、さらに抗菌剤（アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、ペニシリン及びストレプトマイシン等）を含有させることができる。抗菌剤を含有させる場合、この含有量（重量％）は抗菌剤の種類によって異なるが、無血清培地（Ａ）の重量に基づいて、１０-6〜１０が好ましく、さらに好ましくは１０-5〜１、特に好ましくは１０-4〜０．１である。
【００３２】
本発明の無血清培地（Ａ）の製造方法としては、無血清培地（ＭＥ）に人工ポリペプチド（Ｐ）を投入し、混合して含有させることができ、例えば以下の方法が挙げられる。
ガラス製容器、マグネチックスターラー及び回転子を使用し、常温（２５℃±１０）、常圧（１atm）下で無血清培地（ＭＥ）を撹拌させながら、人工ポリペプチド（Ｐ）を投入する。特に限定しないが、マグネチックスターラーの回転数は１０〜２００ｒｐｍが好ましい。人工ポリペプチド（Ｐ）を投入後さらに１時間撹拌を続ける。次にクリーンベンチ内でディスポーザブルメンブレンフィルターユニット（商品名：ＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ、孔径：０．４５μｍ、アドバンテック東洋（株）製）を用いろ過滅菌する。
【００３３】
本発明の無血清培地（Ａ）を使用した細胞培養方法としては、例えば、組織培養用フラスコに無血清培地（Ａ）を投入し、細胞液を細胞濃度が１万〜１００万個／ｍｌとなるように分散させ、二酸化炭素（ＣＯ2）濃度５体積％、３７℃の条件下で５日間、必要に応じて１日毎に培地交換しなら培養をおこなう。
【００３４】
本発明の無血清培地で培養できる細胞（ＣＥ）としては細胞であれば制限がないが、本発明の無血清培地を用いると細胞増殖性が高いため、医薬品等の有用物質生産や治療等に用いられる哺乳動物由来の正常細胞、哺乳動物由来の株化細胞及び昆虫細胞が適している。
哺乳動物由来の正常細胞としては、皮膚に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、血管に関与する細胞（血管内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞等）、筋肉に関与する細胞（筋肉細胞等）、脂肪に関与する細胞（脂肪細胞等）、神経に関与する細胞（神経細胞等）、肝臓に関与する細胞（肝細胞等）、膵臓に関与する細胞（膵ラ島細胞等）、腎臓に関与する細胞（腎上皮細胞、近位尿細管上皮細胞及びメサンギウム細胞等）、肺・気管支に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、目に関与する細胞（視細胞、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞等）、前立腺に関与する細胞（上皮細胞、間質細胞及び平滑筋細胞等）、骨に関与する細胞（骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞等）、軟骨に関与する細胞（軟骨芽細胞及び軟骨細胞等）、歯に関与する細胞（歯根膜細胞及び骨芽細胞等）、血液に関与する細胞（白血球及び赤血球等）、及び幹細胞｛例えば、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞（oval cell、small hepatocyte等）、脂肪組織幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、表皮幹細胞、腸管幹細胞、精子幹細胞、胚生殖幹（ＥＧ）細胞、膵臓幹細胞（膵管上皮幹細胞等）、白血球系幹細胞、リンパ球系幹細胞、角膜系幹細胞、前駆細胞（脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、ＮＫ前駆細胞等）等｝等が挙げられる。
【００３５】
哺乳動物由来の株化細胞としては、３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞、ＡＨ１３０細胞、Ｂ９５−８細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＢＳ−Ｃ−１細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、Ｃ−６細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ−１細胞、Ｆ９細胞、ＦＬ細胞、ＦＬ５−１細胞、ＦＭ３Ａ細胞、Ｇ−３６１細胞、ＧＰ＋Ｅ−８６細胞、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２細胞、Ｈ４−II−Ｅ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥｐ−２細胞、ＨＬ−６０細胞、ＨＴＣ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、ＩＭＲ−３２細胞、ＩＭＲ−９０細胞、Ｋ５６２細胞、ＫＢ細胞、Ｌ細胞、Ｌ５１７８Ｙ細胞、Ｌ−９２９細胞、ＭＡ１０４細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞、Ｎ１８細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、ＮＧ１０８−１５細胞、ＮＲＫ細胞、ＯＣ１０細胞、ＯＴＴ６０５０細胞、Ｐ３８８細胞、ＰＡ１２細胞、ＰＡ３１７細胞、ＰＣ−１２細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＰＧ１３細胞、ＱＧＨ細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＲＰＭＩ−１７８８細胞、ＳＧＥ１細胞、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞、ＳＴ２細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ−９３７細胞、Ｖ７９細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ−１０８０細胞、ＷＩ−３８細胞、ψ２細胞及びψＣＲＥ細胞等が挙げられる｛細胞培養の技術（日本組織培養学会編集、株式会社朝倉書店発行、１９９９年）｝。
【００３６】
昆虫細胞としては、カイコ細胞（ＢｍＮ細胞及びＢｏＭｏ細胞等）、クワコ細胞、サクサン細胞、シンジュサン細胞、ヨトウガ細胞（Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等）、クワゴマダラヒトリ細胞、ハマキムシ細胞、ショウジョウバエ細胞、センチニクバエ細胞、ヒトスジシマカ細胞、アゲハチョウ細胞、ワモンゴキブリ細胞及びイラクサキンウワバ細胞（Ｔｎ−５細胞、ＨＩＧＨ  ＦＩＶＥ細胞及びＭＧ１細胞等）等が挙げられる｛昆虫バイオ工場（木村滋 編著、株式会社工業調査会 発行、２０００年）｝。
これらの細胞のうち、医薬品等の有用物質生産や治療等の観点から、哺乳動物由来の正常細胞及び哺乳動物由来の株化細胞が好ましい。そして、治療に有用な点で、さらに好ましくは平滑筋細胞、肝細胞、骨芽細胞、上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び幹細胞が好ましく、特に好ましくは上皮細胞である。また、医薬品等の有用物質生産に有用な点で、さらに好ましくは３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ−９２９細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ−１０８０細胞及びＷＩ−３８細胞、特に好ましくはＭＤＣＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞及びＨＴ−１０８０細胞である。
【００３７】
無血清培地に分散させる細胞の濃度（個／ｍＬ）としては特に制限はないが、無血清培地１ｍＬ当たり、１００〜１億が好ましく、さらに好ましくは１０００〜１千万、特に好ましくは１万〜１００万である。
細胞の個数の計数方法は公知の方法が使用でき、例えば、クリスタルバイオレットを用いた細胞核計数法で測定することができる｛細胞培養の技術（日本組織培養学会編集、株式会社朝倉書店発行、１９９９年）｝。
【００３８】
上記細胞を培養する場合の細胞培養用担体は、特に制限無く利用でき、例えば、マルチウエルプレ−ト、シャーレ、組織培養用フラスコ、ロ−ラ−ボトル、マイクロキャリヤ（ビーズ）、フィルム、不織布、多孔質粒子及びホロ−ファイバ−等が用いられる。これらのうち好ましくはマイクロキャリヤ（ビーズ）、フィルム、マルチウエルプレ−ト、シャーレ、組織培養用フラスコ及びローラーボトルであり、特に好ましくは、組織培養用フラスコ、マイクロキャリヤ（ビーズ）及びマルチウエルプレ−トである。
【００３９】
培養条件としては、特に制限は無く、二酸化炭素（ＣＯ2）濃度１〜２０体積％、５〜４５℃で１時間〜１００日間、必要に応じて１〜１０日毎に培地交換しなら培養する条件等が適用できる。好ましい条件としては、ＣＯ2濃度３〜１０体積％、３０〜４０℃、１〜２０日間、１〜３日毎に培地交換しながら培養する条件である。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されない。以下において、部および％はそれぞれ重量部および重量％を示す。
【００４１】
＜実施例１＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ１）「プロネクチンＦ」の準備＞
特表平３−５０２９３５号公報の実施例記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列（ｘ１）の１３個と(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)９配列（２１）の１２個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１１万の人工ポリペプチド（Ｐ１）「プロネクチンＦ」を製造した。
＜無血清培地（Ａ１）の準備＞
常温（２５℃±１０）、常圧（１atm）下で、ガラス製容器に無血清培地（ＭＥ１）（商品名：ＶＰ−ＳＦＭ、インビトロジェン（株）製）を１０００部仕込んだ。マグネチックスターラー及び回転子を使用し１２０ｒｐｍで撹拌しながら、この無血清培地（ＭＥ１）に抗菌剤｛商品名：抗菌剤ＧＡ溶液（ゲンタマイシン、アンテフォリンＢ）、倉敷紡績（株）製｝２部及びプロネクチンＦ８．４６×１０-6部を仕込んだ。仕込み後さらに１時間撹拌した。次にクリーンベンチ内でディスポーザブルメンブレンフィルターユニットを用いろ過滅菌し、無血清培地（Ａ１）を得た。
【００４２】
＜実施例２〜実施例７＞
実施例１において、プロネクチンＦの仕込み量を８．４６×１０-6部から、それぞれ、８．４６×１０-5部、８．４６×１０-4部、８．４６×１０-3部、８．４６×１０-2部、８．４６×１０-1部、８．４６部に変更すること以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ２）〜（Ａ７）を得た。
【００４３】
＜実施例８〜１４＞
実施例１において、プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を、それぞれ、ＧＲＧＤＳ｛人工ポリペプチド（Ｐ２）｝（商品名：Fibronectin Active Fragment、Arg Gly Asp配列（ｘ１）を１個有するＭｗ４９０のGly Arg Gly Asp Ser配列（６３）の人工ポリペプチド、株式会社ペプチド研究所製）４．９０×１０-7部、４．９０×１０-6部、４．９０×１０-5部、４．９０×１０-4部、４．９０×１０-3部、４．９０×１０-2部、４．９０×１０-1部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ８）〜（Ａ１４）を得た。
【００４４】
＜実施例１５＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ３）の準備＞
人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製：「ペプチド合成の基礎と実験」第１１４〜１１７貢（昭和６０年１月２０日、丸善株式会社発行）等に記載されているＤＣＣ法に準じて、人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させた架橋物を約５重量％の濃度で含む溶液を作製した。この溶液の１０ｍＬを、０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した後、ゲルろ過カラム（商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０ｐｇ、アマシャムバイオサイエンス（株）製）を用いて、流速：１ｍＬ／分、溶出液：リン酸緩衝液（脱イオン水に対してＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏを０．５１５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4を０．７６４ｇ／ｌ、ＮａＣｌを８．１６ｇ／ｌ含有させたｐＨ７．２のリン酸緩衝液。以下ＰＢＳと略記する。）の条件で分画した。予め同じ条件でゲルろ過した分子量マーカーの溶出時間を指標に、溶出時間がＭｗ約１千付近の分画を分取した。このＭｗ約１千付近の分画を、イオン交換水中で透析して脱塩した。脱塩後、−２０℃、０．１ｋＰａ以下の条件での凍結乾燥を２４時間行った。次に凍結乾燥し、人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）｛Gly Arg Gly Asp Ser配列（６３）を約２個有する。｝を得た。
人工ポリペプチド（Ｐ３Ｂ）の調製：「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）同士で反応させること」及び「Ｍｗ約１千付近の分画の代わりに、Ｍｗ約２千付近の分画を分取すること」以外、人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ３Ｂ）｛Gly Arg Gly Asp Ser配列（６３）を約４個有する。｝を得た。
人工ポリペプチド（Ｐ３Ｃ）の調製：「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ３Ｂ）同士で反応させること」及び「Ｍｗ約１千付近の分画の代わりに、Ｍｗ約４千付近の分画を分取すること」以外、上記の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ３Ｃ）｛Gly Arg Gly Asp Ser配列（６３）を約８個有する。｝を得た。
人工ポリペプチド（Ｐ３）の調製：「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）と人工ポリペプチド（Ｐ３Ｃ）とをモル比１：１で反応させること」及び「Ｍｗ約１千付近の分画の代わりに、Ｍｗ約５千付近の分画を分取すること」以外、上記の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ３）｛Gly Arg Gly Asp Ser配列（６３）を約１０個有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ１５）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ３）４．９０×１０-4部に変更すること」以外は、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ１５）を得た。
【００４５】
＜実施例１６＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ４）の準備＞
「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ３）同士で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０ｐｇを使用する代わりに、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇを使用すること」及び「Ｍｗ約１千付近の分画の代わりに、Ｍｗ約１万付近の分画を分取すること」以外、実施例１５に記載の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ４）｛Gly Arg Gly Asp Ser配列（６３）を約２０個有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ１６）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ４）４．９０×１０-4部に変更すること」以外は、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ１６）を得た。
【００４６】
＜実施例１７＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ５）の準備＞
「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ３）と人工ポリペプチド（Ｐ４）とをモル比１：１で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０ｐｇを使用する代わりに、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇを使用すること」及び「Ｍｗ約１千付近の分画の代わりに、Ｍｗ約１万５千付近の分画を分取すること」以外は、実施例１５に記載の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ５）｛Gly Arg Gly Asp Ser配列（６３）を約３０個有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ１７）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ５）４．９０×１０-4部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ１７）を得た。
【００４７】
＜実施例１８＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ６）の準備＞
「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ４）同士で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０ｐｇを使用する代わりに、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇを使用すること」及び「Ｍｗ約１千付近の分画の代わりに、Ｍｗ約２万付近の分画を分取すること」以外、実施例１５に記載の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ６）｛Gly Arg Gly Asp Ser配列（６３）を約４０個有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ１８）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ６）４．９０×１０-4部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ１８）を得た。
【００４８】
＜実施例１９＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ７）の準備＞
「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ２）とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）とをモル比１：１で反応させること」以外、実施例１５に記載の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ７）｛Gly Arg Gly Asp Ser配列（６３）の約１個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）の約１個とを有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ１９）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ７）９．０８×１０-4部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ１９）を得た。
【００４９】
＜実施例２０＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ８）の準備＞
人工ポリペプチド（Ｐ８Ａ）の調製：「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、Gly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）同士で反応させること」以外、実施例１５に記載の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ８Ａ）｛Gly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）を約２個有する。｝を得た。
人工ポリペプチド（Ｐ８Ｂ）の調製：「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ８Ａ）同士で反応させること」及び「Ｍｗ約１千付近の分画の代わりに、Ｍｗ約２千付近の分画を分取すること」以外、実施例１５に記載の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ８Ｂ）｛Gly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）を約４個有する。｝を得た。
人工ポリペプチド（Ｐ８Ｃ）の調製：「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ８Ｂ）同士で反応させること」及び「Ｍｗ約１千付近の分画の代わりに、Ｍｗ約３千付近の分画を分取すること」以外、実施例１５に記載の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ８Ｃ）｛Gly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）を約８個有する。｝を得た。
人工ポリペプチド（Ｐ８Ｄ）の調製：「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ８Ａ）と人工ポリペプチド（Ｐ８Ｃ）とをモル比１：１で反応させること」及び「Ｍｗ約１千付近の分画の代わりに、Ｍｗ約４千付近の分画を分取すること」以外、実施例１５に記載の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ８Ｄ）｛Gly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）を約１０個有する。｝を得た。
人工ポリペプチド（Ｐ８）の調製：「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ２）と人工ポリペプチド（Ｐ８Ｄ）とをモル比１：１で反応させること」及び「Ｍｗ約１千付近の分画の代わりに、Ｍｗ約５千付近の分画を分取すること」以外、実施例１５に記載の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ８）｛Gly Arg Gly Asp Ser配列（６３）の約１個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）の約１０個とを有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ２０）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ８）４．６７×１０-3部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ２０）を得た。
【００５０】
＜実施例２１＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ９）の準備＞
人工ポリペプチド（Ｐ９Ａ）の調製：「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ８Ｄ）同士で反応させること」及び「Ｍｗ約１千付近の分画の代わりに、Ｍｗ約８千付近の分画を分取すること」以外、実施例１５に記載の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ９Ａ）｛Gly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）を約２０個有する。｝を得た。
人工ポリペプチド（Ｐ９）の調製：「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ２）と人工ポリペプチド（Ｐ９Ａ）とをモル比１：１で反応させること」及び「Ｍｗ約１千付近の分画の代わりに、Ｍｗ約９千付近の分画を分取すること」以外、実施例１５に記載の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ９）｛Gly Arg Gly Asp Ser配列（６３）の約１個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）の約２０個とを有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ２１）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ９）８．８５×１０-3部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ２１）を得た。
【００５１】
＜実施例２２＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ１０）の準備＞
人工ポリペプチド（Ｐ１０Ａ）の調製：「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ８Ｄ）と人工ポリペプチド（Ｐ９Ａ）とをモル比１：１で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０ｐｇを使用する代わりに、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇを使用すること」及び「Ｍｗ約１千付近の分画の代わりに、Ｍｗ約１万３千付近の分画を分取すること」以外、実施例１５に記載の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ１０Ａ）｛Gly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）を約３０個有する。｝を得た。
人工ポリペプチド（Ｐ１０）の調製：「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ２）と人工ポリペプチド（Ｐ１０Ａ）とをモル比１：１で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０ｐｇを使用する代わりに、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇを使用すること」及び「Ｍｗ約１千付近の分画の代わりに、Ｍｗ約１万３千付近の分画を分取すること」以外、実施例１５に記載の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ１０）｛Gly Arg Gly Asp Ser配列（６３）の約１個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）の約３０個とを有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ２２）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ１０）１．３０×１０-2部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ２２）を得た。
【００５２】
＜実施例２３＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ１１）の準備＞
人工ポリペプチド（Ｐ１１Ａ）の調製：「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ９Ａ）と人工ポリペプチド（Ｐ１０Ａ）とをモル比１：１で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０ｐｇを使用する代わりに、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇを使用すること」及び「Ｍｗ約１千付近の分画の代わりに、Ｍｗ約２万１千付近の分画を分取すること」以外、実施例１５に記載の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ１１Ａ）｛Gly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）を約５０個有する。｝を得た。
人工ポリペプチド（Ｐ１１）の調製：「人工ポリペプチド（Ｐ２）同士で反応させる代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ２）と人工ポリペプチド（Ｐ１１Ａ）とをモル比１：１で反応させること」、「ゲルろ過カラムとして、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０ｐｇを使用する代わりに、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇを使用すること」及び「Ｍｗ約１千付近の分画の代わりに、Ｍｗ約２万１千付近の分画を分取すること」以外、実施例１５に記載の人工ポリペプチド（Ｐ３Ａ）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ１１）｛Gly Arg Gly Asp Ser配列（６３）の約１個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）の約５０個とを有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ２３）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ１１）２．１４×１０-2部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ２３）を得た。
【００５３】
＜実施例２４＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ１２）の準備＞
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列（ｘ１）の５個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（２０）（ｙ２）の５個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約２万の人工ポリペプチド（Ｐ１２）「プロネクチンＦ２」を製造した。
＜無血清培地（Ａ２４）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ１２）４．００×１０-3部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ２４）を得た。
【００５４】
＜実施例２５＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ１３）の準備＞
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列（ｘ１）の３個と（Gly Val Pro Gly Val）2 Gly Gly （Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（３８）（ｙ３）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１万の人工ポリペプチド（Ｐ１３）「プロネクチンＦ３」を製造した。
＜無血清培地（Ａ２５）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ１３）３．３３×１０-3部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ２５）を得た。
【００５５】
＜実施例２６＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ１５）の準備＞
「人工ポリペプチド（Ｐ２）の代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ１４）（Ｍｗ５２９のIle Lys Val Ala Val配列（７）、ＮＥＯＳＹＳＴＥＭ社製）を使用すること」以外、実施例１５に記載の人工ポリペプチド（Ｐ３）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ１５）｛Ile Lys Val Ala Val配列（７）を約１０個有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ２６）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ２）（商品名：ＭＥＭダルベッコ液体培地、大日本住友製薬（株）製）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ１５）５．２９×１０-4部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ２５）を得た。
【００５６】
＜実施例２７＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ１６）の準備＞
実施例１６において、「人工ポリペプチド（Ｐ３）の代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ１５）を使用すること」以外、実施例１６に記載の人工ポリペプチド（Ｐ４）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ１６）｛Ile Lys Val Ala Val配列（７）を約２０個有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ２７）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ２）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ１６）５．２９×１０-4部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ２７）を得た。
【００５７】
＜実施例２８＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ１７）の準備＞
実施例１７において、「人工ポリペプチド（Ｐ３）と人工ポリペプチド（Ｐ４）とを使用する代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ１５）と人工ポリペプチド（Ｐ１６）とを使用すること」以外、実施例１７に記載の人工ポリペプチド（Ｐ５）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ１７）｛Ile Lys Val Ala Val配列（７）を約３０個有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ２８）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ２）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ１７）５．２９×１０-4部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ２８）を得た。
【００５８】
＜実施例２９＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ１８）の準備＞
実施例１８において、「人工ポリペプチド（Ｐ４）の代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ１６）を使用すること」以外、実施例１８に記載の人工ポリペプチド（Ｐ６）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ１８）｛Ile Lys Val Ala Val配列（７）を約４０個有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ２９）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ２）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ１８）５．２９×１０-4部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ２９）を得た。
【００５９】
＜実施例３０＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ１９）の準備＞
実施例１９において、「人工ポリペプチド（Ｐ２）とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）とを使用する代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ１４）とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）とを使用すること」以外、実施例１９に記載の人工ポリペプチド（Ｐ７）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ１９）｛Ile Lys Val Ala Val配列（７）の約１個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）の約１個とを有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ３０）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ２）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ１９）９．４７×１０-4部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ３０）を得た。
【００６０】
＜実施例３１＞
＜無血清培地（Ａ３１）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ２）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ１４）５．２９×１０-4部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ３１）を得た。
【００６１】
＜実施例３２＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ２０）の準備＞
実施例２０において、「人工ポリペプチド（Ｐ２）と人工ポリペプチド（Ｐ８Ｄ）とを使用する代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ１４）と人工ポリペプチド（Ｐ８Ｄ）とを使用すること」以外、実施例２０に記載の人工ポリペプチド（Ｐ８）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ２０）｛Ile Lys Val Ala Val配列（７）の約１個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）の約１０個とを有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ３２）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ２）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ２０）４．７１×１０-3部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ３２）を得た。
【００６２】
＜実施例３３＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ２１）の準備＞
実施例２１において、「人工ポリペプチド（Ｐ２）と人工ポリペプチド（Ｐ９Ａ）とを使用する代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ１４）と人工ポリペプチド（Ｐ９Ａ）とを使用すること」以外、実施例２１に記載の人工ポリペプチド（Ｐ９）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ２１）｛Ile Lys Val Ala Val配列（７）の約１個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）の約２０個とを有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ３３）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ２）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ２１）８．８９×１０-3部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ３３）を得た。
【００６３】
＜実施例３４＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ２２）の準備＞
実施例２２において、「人工ポリペプチド（Ｐ２）と人工ポリペプチド（Ｐ１０Ａ）とを使用する代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ１４）と人工ポリペプチド（Ｐ１０Ａ）とを使用すること」以外、実施例２２に記載の人工ポリペプチド（Ｐ１０）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ２２）｛Ile Lys Val Ala Val配列（７）の約１個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）の約３０個とを有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ３４）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ２）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ２２）１．３１×１０-2部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ３４）を得た。
【００６４】
＜実施例３５＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ２３）の準備＞
「人工ポリペプチド（Ｐ２）と人工ポリペプチド（Ｐ１１Ａ）とを使用する代わりに、人工ポリペプチド（Ｐ１４）と人工ポリペプチド（Ｐ１１Ａ）とを使用すること」以外、実施例２３に記載の人工ポリペプチド（Ｐ１１）の調製と同様にして調製し、人工ポリペプチド（Ｐ２３）｛Ile Lys Val Ala Val配列（７）の約１個とGly Ala Gly Ala Gly Ser配列（６４）の約５０個とを有する。｝を得た。
＜無血清培地（Ａ３５）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ２）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ２３）２．１４×１０-2部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ３５）を得た。
【００６５】
＜実施例３６＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ２４）の準備＞
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ile Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ２）の１３個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（２１）（ｙ１）の１２個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１１万の人工ポリペプチド（Ｐ２４）「プロネクチンＬ」を製造した。
＜無血清培地（Ａ３６）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ２）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ２４）８．４６×１０-3部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ３６）を得た。
【００６６】
＜実施例３７＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ２５）の準備＞
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ile Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ２）の５個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（２１）（ｙ１）の５個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約２万の人工ポリペプチド（Ｐ２５）「プロネクチンＬ２」を製造した。
＜無血清培地（Ａ３７）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ２）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ２５）４．００×１０-3部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ３７）を得た。
【００６７】
＜実施例３８＞
＜人工ポリペプチド（Ｐ２６）の準備＞
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ile Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ２）の３個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（２１）（ｙ１）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１万の人工ポリペプチド（Ｐ２６）（「プロネクチンＬ３」を製造した。
＜無血清培地（Ａ３８）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ２）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ２６）３．３３×１０-3部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ３８）を得た。
【００６８】
＜実施例３９＞
＜無血清培地（Ａ３９）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ３）（商品名：Ｏｐｔｉ−ＰＲＯTMＳＦＭ培地、インビトロジェン（株）製）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を８．４６×１０-3部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ３９）を得た。
【００６９】
＜実施例４０＞
＜無血清培地（Ａ４０）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ３）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ２）４．９０×１０-4部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ４０）を得た。
【００７０】
＜実施例４１＞
＜無血清培地（Ａ４１）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ３）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ３）４．９０×１０-4部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ４１）を得た。
【００７１】
＜実施例４２＞
＜無血清培地（Ａ４２）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ３）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ４）４．９０×１０-4部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ４２）を得た。
【００７２】
＜実施例４３＞
＜無血清培地（Ａ４３）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ３）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ５）４．９０×１０-4部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ４３）を得た。
【００７３】
＜実施例４４＞
＜無血清培地（Ａ４４）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ３）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ６）４．９０×１０-4部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ４４）を得た。
【００７４】
＜実施例４５＞
＜無血清培地（Ａ４５）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ３）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ７）９．０８×１０-4部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ４５）を得た。
【００７５】
＜実施例４６＞
＜無血清培地（Ａ４６）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ３）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ８）４．６７×１０-3部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ４６）を得た。
【００７６】
＜実施例４７＞
＜無血清培地（Ａ４７）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ３）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ９）８．８５×１０-3部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ４７）を得た。
【００７７】
＜実施例４８＞
＜無血清培地（Ａ４８）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ３）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ１０）１．３０×１０-2部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ４８）を得た。
【００７８】
＜実施例４９＞
＜無血清培地（Ａ４９）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ３）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ１１）２．１４×１０-2部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ４９）を得た。
【００７９】
＜実施例５０＞
＜無血清培地（Ａ５０）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ３）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ１２）４．００×１０-3部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ５０）を得た。
【００８０】
＜実施例５１＞
＜無血清培地（Ａ５１）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ３）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を人工ポリペプチド（Ｐ１３）３．３３×１０-3部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（Ａ５１）を得た。
【００８１】
＜比較例１＞
＜無血清培地（ＲＡ１）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦの仕込み量を８．４６×１０-6部から０部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、比較用の無血清培地（ＲＡ１）を得た。
【００８２】
＜比較例２＞
＜無血清培地（ＲＡ２）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部をフィブロネクチン（Arg Gly Asp配列（ｘ１）を２個有する動物由来のポリペプチド、BD Bioscience製）１．１０×１０-5部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、比較用の無血清培地（ＲＡ２）を得た。
【００８３】
＜比較例３＞
＜無血清培地（ＲＡ３）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部をフィブロネクチン１．１０×１０-4部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、比較用の無血清培地（ＲＡ３）を得た。
【００８４】
＜比較例４＞
＜無血清培地（ＲＡ４）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部をフィブロネクチン１．１０×１０-3部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、比較用の無血清培地（ＲＡ４）を得た。
【００８５】
＜比較例５＞
＜無血清培地（ＲＡ５）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部をフィブロネクチン１．１０×１０-2部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、比較用の無血清培地（ＲＡ５）を得た。
【００８６】
＜比較例６＞
＜無血清培地（ＲＡ６）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部をフィブロネクチン１．１０×１０-1部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、比較用の無血清培地（ＲＡ６）を得た。
【００８７】
＜比較例７＞
＜無血清培地（ＲＡ７）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部をフィブロネクチン１．１０部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、比較用の無血清培地（ＲＡ７）を得た。
【００８８】
＜比較例８＞
＜無血清培地（ＲＡ８）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部をフィブロネクチン１１．０部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、比較用の無血清培地（ＲＡ８）を得た。
【００８９】
＜比較例９＞
＜無血清培地（ＲＡ９）の準備＞
実施例１において、「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部をフィブロネクチン１１０部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、比較用の無血清培地（ＲＡ９）を得た。
【００９０】
＜比較例１０＞
＜無血清培地（ＲＡ１０）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ２）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を０部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（ＲＡ１０）を得た。
【００９１】
＜比較例１１＞
＜無血清培地（ＲＡ１１）の準備＞
実施例１において、「無血清培地（ＭＥ１）１０００部を無血清培地（ＭＥ３）１０００部に変更すること」及び「プロネクチンＦ８．４６×１０-6部を０部に変更すること」以外、実施例１と同様にして、無血清培地（ＲＡ１１）を得た。
【００９２】
＜細胞増殖性評価１＞
実施例１〜１４及び比較例１〜９の無血清培地（Ａ１）〜（Ａ１４）及び（ＲＡ１〜ＲＡ９）について、各々の無血清培地を０．１ｍｌ／穴となるように、マルチウェルプレート（商品名：MICROTESTTM Flat Bottom、９６穴、ノントリートメント、ポリスチレン製、BECTON DICKINSON製）に投入した。次に予めプレ培養したＶＥＲＯ細胞（大日本住友製薬（株）製）を細胞濃度が１０万個／ｍｌになるように各々の無血清培地に播種した。３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で５日間培養を行った。培養５日目に各々の無血清培地を吸引除去し、ＰＢＳ５０μｌ／穴及びTetraColor ONE（生化学工業（株）製）１０μｌ／穴を投入し、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で４時間静置した。４時間後、プレートリーダー（和光純薬（株）製）を用いて、４９２ｎm（参考波長６２０ｎｍ）の吸光度を測定した。（ＲＡ１）の吸光度の測定値を吸光度（ブランク）とし、それぞれで測定した吸光度を吸光度（ブランク）で除した値を表１に示した。
【００９３】
【表１】
2008263955.tif 000002
【００９４】
表１の結果から、比較用の無血清培地を使用した場合細胞増殖性が低下するのに対し、本発明の無血清培地を使用した場合細胞増殖性が向上することが判明した。
【００９５】
＜細胞増殖性評価２＞
実施例４、１１、１５〜２５及び比較例１の無血清培地（Ａ４）、（Ａ１１）、（Ａ１５）〜（Ａ２５）及び（ＲＡ１）について、各々の無血清培地を０．１ｍｌ／穴となるように、マルチウェルプレートに投入した。次に予めプレ培養したＶＥＲＯ細胞を細胞濃度が１０万個／ｍｌになるように各々の無血清培地に播種した。３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で５日間培養を行った。培養５日目に各々の無血清培地を吸引除去し、ＰＢＳを５０μｌ／穴及びTetraColor ONEを１０μｌ／穴投入し、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で４時間静置した。４時間後、プレートリーダーを用いて、４９２ｎm（参考波長６２０ｎｍ）の吸光度を測定した。（ＲＡ１）の吸光度の測定値を吸光度（ブランク）とし、それぞれで測定した吸光度を吸光度（ブランク）で除した値を表２に示した。
【００９６】
【表２】
2008263955.tif 000003
【００９７】
表２の結果から、本発明の無血清培地は比較用の無血清培地に比べ、ＶＥＲＯ細胞の細胞増殖性が高いことが判明した。
【００９８】
＜細胞増殖性評価３＞
実施例２６〜３８及び比較例１０の無血清培地（Ａ２６）〜（Ａ３８）及び（ＲＡ１０）について、各々の無血清培地を０．１ｍｌ／穴となるように、マルチウェルプレートに投入した。次に予めプレ培養したＨＴ−１０８０細胞（大日本住友製薬（株）製）を細胞濃度が１０万個／ｍｌになるように各々の無血清培地に播種した。３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で５日間培養を行った。培養５日目に各々の無血清培地を吸引除去し、ＰＢＳを５０μｌ／穴及びTetraColor ONEを１０μｌ／穴投入し、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で４時間静置した。４時間後、プレートリーダーを用いて、４９２ｎm（参考波長６２０ｎｍ）の吸光度を測定した。（ＲＡ１０）の吸光度の測定値を吸光度（ブランク）とし、それぞれで測定した吸光度を吸光度（ブランク）で除した値を表３に示した。
【００９９】
【表３】
2008263955.tif 000004
【０１００】
表３の結果から、本発明の無血清培地は比較用の無血清培地に比べ、ＨＴ−１０８０細胞の細胞増殖性が高いことが判明した。
【０１０１】
＜細胞増殖性評価４＞
実施例３９〜５１及び比較例１１の無血清培地（Ａ３９）〜（Ａ５１）及び（ＲＡ１１）について、各々の無血清培地を０．１ｍｌ／穴となるように、マルチウェルプレートに投入した。次に予めプレ培養したＭＤＣＫ細胞（大日本住友製薬（株）製）を細胞濃度が１０万個／ｍｌになるように各々の無血清培地に播種した。３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で５日間培養を行った。培養５日目に各々の無血清培地を吸引除去し、ＰＢＳを５０μｌ／穴及びTetraColor ONEを１０μｌ／穴投入し、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で４時間静置した。４時間後、プレートリーダーを用いて、４９２ｎm（参考波長６２０ｎｍ）の吸光度を測定した。（ＲＡ１１）の吸光度の測定値を吸光度（ブランク）とし、それぞれで測定した吸光度を吸光度（ブランク）で除した値を表４に示した。
【０１０２】
【表４】
2008263955.tif 000005
【０１０３】
表４の結果から、本発明の無血清培地は比較用の無血清培地に比べ、ＭＤＣＫ細胞の細胞増殖性が高いことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明の無血清培地は、優れた細胞増殖性を発揮することができ、またウイルス等の感染因子の混入の危険性がないため、細胞が関係する、研究開発、有用物質生産及び治療等に極めて有用である。
研究開発用としては、分化機能等の細胞機能評価用細胞の培養、動物実験（毒性試験、刺激性試験及び代謝機能試験等）の代替用細胞の培養、遺伝子や蛋白質導入用細胞の培養等に利用できる。
有用物質生産用としては、サイトカイン、血栓溶解剤、血液凝固因子製剤、ワクチン、ホルモン、抗生物質、抗体及び増殖因子等の生産用細胞の培養に利用できる。これらのうち、ワクチンの生産用細胞の培養に好適である。
治療用としては、皮膚、頭蓋骨、筋肉、皮膚組織、骨、軟骨、血管、神経、腱、靭帯、毛胞組織、粘膜組織、歯周組織、象牙質、骨髄、網膜、漿膜、胃腸管及び脂肪等の組織、並びに肺、肝、膵及び腎等の臓器の細胞培養に利用できる。
【配列表】
2008263955000001.app