(57)【要約】【課題】生分解性のナノ粒子に対して、表面に抗体を立体障害無く高密度で整列提示可能とし、さらにビオチンを介することで高感度な免疫学的測定を可能とするツールおよびそれを用いた免疫学的測定方法を提供することを課題としている。【解決手段】自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子であって、自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合部位を有しており、自己組織化能を有するタンパク質がビオチンで標識されている、免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子であって、自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合部位を有しており、自己組織化能を有するタンパク質がビオチンで標識されている、免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子。
【請求項２】
抗体結合部位が、ＺＺタグである請求項１記載の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子。
【請求項３】
自己組織化能を有するタンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)タンパク質である請求項１または２に記載の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子。
【請求項４】
ビオチンが、タンパク質のリジン残基もしくはＮ末端アミノ酸残基に結合していることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子に、酵素とビオチン結合性タンパク質の複合体を結合させ、さらに抗体結合部位に抗体を結合させ、前記抗体により認識される測定対象物質を、前記酵素を用いて測定する、免疫学的測定方法。
【請求項６】
測定対象物質が抗体である、請求項５に記載の免疫学的測定用方法。
【請求項７】
ビオチン結合性タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジンもしくはニュートラアビジン（NeutrAvidin）である、請求項５または６に記載の免疫学的測定方法。
【請求項８】
自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子であって、自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合部位を有しており、自己組織化能を有するタンパク質がビオチンで標識されているビオチン化ナノ粒子の、免疫学的測定のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、直径がナノサイズの粒子がビオチン化された免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子および免疫学的測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ、組織染色などに代表される免疫学的測定は、１９４１年、Ｃｏｏｎｓらによる蛍光色素を標識した抗体で形質細胞のＩｇＧを検出した蛍光抗体法の確立から端を発しており、次いでＮａｋａｎｅ、Ｐｉｅｒｃｅらによる酵素抗体法の開発（１９６６年）を受け、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ａｎｔｉ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＰＡＰ法（１９７０年）、ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｙｌａｔｅｄ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＡＢＣ法（１９８１年）、ｌａｂｅｌｅｄ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｂｉｏｔｙｎｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＬＳＡＢ法（１９８４年）などが開発されてきた（非特許文献１参照）。
【０００３】
免疫学的測定は、抗原に対する特異抗体を反応させ、さらなる抗原−抗体反応、あるいは化学反応を巧みに組み合わせて特異抗体と標識物質の免疫複合体を形成し、最終的に標識酵素の発色反応や標識蛍光の蛍光強度によって抗原の存在を可視化・定量化する原理に基づいており、抗体を用いることでクルードなサンプル中においても抗原（検出のターゲット物質；タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖、化合物など）のみを選択的に染色することができる優れた研究手法である。これによって、検出のターゲットである抗原を精製せずしてその存在量を定量したり、細胞内における抗原の局在場所を特定することができるため、免疫学的測定技術はライフサイエンス分野やバイオ研究分野において広く普及している。
【０００４】
免疫学的測定の感度を向上させる手法が精力的に研究されており、その一例として、免疫学的測定に用いられる抗体をビオチンで標識し、アビジンと酵素の複合体やストレプトアビジンと酵素の複合体を結合させることによる免疫学的測定の高感度化が知られており、研究分野をはじめとして広く利用されている。
【０００５】
近年、ナノサイズのマテリアルを用いて、免疫学的測定の感度を向上させる手法が研究されており、その一例として、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)タンパク質が、自己組織化によって細胞内の脂質２重膜を取り込むことにより形成した中空ナノ粒子を用いた物質のセンシング方法が開示されている（特許文献１参照）。生分解性の該中空ナノ粒子の表面に抗体などの物質認識分子を提示させ、物質のセンシングへの適用する技術が開示されている。これは、自己組織化能を有するタンパク質が、脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子を用いた免疫学的測定について開示している。しかしナノサイズの粒子表面に抗体を立体障害無く高密度で整列提示することが依然として課題であり、その解決方法は開示されていない。また、自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子の標識にビオチンを用いる免疫学的測定の高感度化の記載はなく、さらに、標識されるビオチンの数を増加させる手法およびその効果も記載されていない。
【０００６】
一方、B型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質を含む中空ナノ粒子の表面に抗体結合部位を介して抗体を提示した例が知られているが（特許文献２参照）、組織特異的な薬剤の運搬や導入すなわちドラッグデリバリーシステムに関する発明であり、免疫学的測定を可能にするものではない。
【非特許文献１】ウルリケら（Ｕｌｒｉｋｅ、Ｋ．ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナルオブヒストケミストリアンドサイトケミストリ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００１年、第４９巻、ｐ６２３−６３０．
【特許文献１】国際公開第２００５／０９５９６８号パンフレット
【特許文献２】特開２００４−２３１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上のような状況に鑑み、本発明では、
１）生分解性であり
２）表面に抗体を立体障害無く高密度で整列提示可能であり
３）ビオチンを介して高感度な免疫学的測定を可能とする
免疫学的測定用のビオチン化ナノ粒子を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決する手法を鋭意検討した結果、自己組織化能を有するタンパク質が、脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子であって、自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合部位を有しており、自己組織化能を有するタンパク質がビオチンで標識されている、免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子を用いることにより、上記課題を解決できることを見出し本発明に至ったものである。
【０００９】
本発明は、以下の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子、該粒子を用いた免疫学的測定方法、及び、該粒子の免疫学的測定用の使用に関する。
１．  自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子であって、自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合部位を有しており、自己組織化能を有するタンパク質がビオチンで標識されている、免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子。
２．  抗体結合部位が、ＺＺタグである項１記載の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子。
３．  自己組織化能を有するタンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)タンパク質である項１または２に記載の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子。
４．  ビオチンが、タンパク質のリジン残基もしくはＮ末端アミノ酸残基に結合していることを特徴とする項１から３のいずれかに記載の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子。
５．  項１から４のいずれかに記載の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子に、酵素とビオチン結合性タンパク質の複合体を結合させ、さらに抗体結合部位に抗体を結合させ、前記抗体により認識される測定対象物質を、前記酵素を用いて測定する、免疫学的測定方法。
６．  測定対象物質が抗体である、項５に記載の免疫学的測定用方法。
７．  ビオチン結合性タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジンもしくはニュートラアビジン（NeutrAvidin）である、項５または６に記載の免疫学的測定方法。
８．  自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子であって、自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合部位を有しており、自己組織化能を有するタンパク質がビオチンで標識されているビオチン化ナノ粒子の、免疫学的測定のための使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子を、現在広く用いられているwestern解析やELISAなどの免疫学的測定に用いることにより、より高感度な免疫学的測定を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。また、この発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  １９９５等に記載されている。
【００１２】
本発明は、「自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子であって、自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合部位を有しており、自己組織化能を有するタンパク質がビオチンで標識されている、免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子」に関するものである。
【００１３】
本発明における「免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子」とは、免疫学的測定に用いられる生分解性のビオチン化ナノ粒子を示し、自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子であり、自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合部位を有しており、自己組織化能を有するタンパク質がビオチンで標識されているものを示す。
【００１４】
本発明における免疫学的測定とは、目的とする物質の存在や局在などの検出において、抗体を用い、かつ検出においては吸光、発光、蛍光、放射線、呈色、濁度などの変化を利用する手法を示す。本発明における免疫学的測定において、測定対象物質の種類は、特に制限はなく、ＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質、糖鎖などの生体物質、細胞、ウイルス、ファージ、および化学物質などが挙げられる。例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡを目的物質とする免疫学的測定の一例として、各種メンブレンもしくは樹脂包埋組織切片上の核酸にDigoxigeninやFluoresceinを結合したＤＮＡやＲＮＡをハイブリダイズさせ、DigoxigeninやFluoresceinに対する抗体を用いて目的とするＤＮＡもしくはＲＮＡを検出する工程を含むSouthern hybridizationやin situ hybridization、northern hybridizationなどが挙げられる。タンパク質を目的物質とする免疫学的測定の例としては、western blottingや免疫組織染色、免疫電子顕微鏡観察、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  酵素免疫検定法）、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  固相酵素免疫検定法）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｓｓａｙ  放射線免疫検定法）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  蛍光免疫検定法）、ＦＬＩＳＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  固相蛍光免疫検定法）、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｓｐｏｔ）、イムノクロマトなどが挙げられる。細胞、ウイルス、ファージ、および化学物質などを目的物質とする免疫学的測定としては、免疫組織染色、免疫電子顕微鏡観察、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  酵素免疫検定法）、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  固相酵素免疫検定法）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  放射線免疫検定法）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  蛍光免疫検定法）、ＦＬＩＳＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  固相蛍光免疫検定法）、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｓｐｏｔ）、フローサイトメトリー、イムノクロマトなどが挙げられる。
【００１５】
本発明における測定対象物質の種類は、好ましくは抗体であり、更に好ましくはアレルギーや感染症などの疾患に関連する血中抗体である。
【００１６】
本発明における免疫学的測定は、目的に応じて、
１）抗体により目的とする物質を直接認識し、抗体にビオチン化ナノ粒子を結合させ、ビオチンを検出する直接法、
２）目的とする物質を抗体により認識し、目的物質と結合した抗体を、標識もしくは未標識の２次抗体により認識し、２次抗体にビオチン化ナノ粒子を結合させ、ビオチンを検出する間接法、
３）競合法、
４）目的とする物質を固相化した抗体により捕捉し、さらに別の標識もしくは未標識の２次抗体により認識し、２次抗体にビオチン化ナノ粒子を結合させ、ビオチンを検出する二抗体サンドイッチ法、
５）目的とする物質を固相化した抗体により捕捉し、さらに別の抗体により目的とする物質を認識し、目的とする物質を認識した抗体をさらに別の標識もしくは未標識の３次抗体により認識し、３次抗体にビオチン化ナノ粒子を結合させ、ビオチンを検出する三抗体サンドイッチ法、
などが選択される。
【００１７】
上記１）〜５）において用いられるビオチン化ナノ粒子と結合させる抗体は、ビオチン化ナノ粒子の持つ抗体結合部位との結合力が高い抗体が望ましく、マウス由来ＩｇＧ、ウサギ由来ＩｇＧ、ヒト由来ＩｇＧ、イヌ由来ＩｇＧが好適に用いられる。
【００１８】
本発明の免疫学的測定法において、免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子は、抗体と同時に加えてもよく、予め抗体を該ナノ粒子の抗体結合部位に結合させた後に、従来の抗体として加えてもよく、抗体を加えた後に該ナノ粒子を加えてもよい。好ましくは抗体とナノ粒子は同時に加えるか、抗体を加える前にナノ粒子を加える。
【００１９】
抗体とナノ粒子が同時に加えられる場合、免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子の使用量は、粒子と結合する抗体の分子数の、０．０１〜１０倍量程度の分子数、好ましくは０．０５〜１倍量程度の分子数を使用する。粒子と結合する抗体の量（分子数）と比べて、ビオチン化ナノ粒子の使用量（分子数）が少なすぎると、該粒子による感度上昇効果が少なくなり、使用量が多すぎると、測定のバックグラウンドが高くなる。
【００２０】
本発明において「自己組織化能を有するタンパク質」とは、疎水的相互作用などのタンパク質間相互作用により自己集合する性質をもつタンパク質である。タンパク質間相互作用により自己集合する性質をもつタンパク質であることは、タンパク質が溶解した溶液の温度やｐＨ、塩濃度や溶媒を変化させることでタンパク質どうしで多量体を形成することにより確認することができる。
【００２１】
「自己組織化能を有するタンパク質」としては、種々のウイルスから得られるウイルス粒子構成タンパク質を適用することができる。具体的には、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ：ＨＢＶ）やＣ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ）、マイクロウイルス（Ｍｉｃｒｏ ｖｉｒｕｓ）、ファージウイルス（ｐｈａｇｅ ｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏ ｖｉｒｕｓ）、ヘパドナウイルス（ｈｅｐａｄｎａ ｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏ ｖｉｒｕｓ）、パポバウイルス（ｐａｐｏｖａ ｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏ ｖｉｒｕｓ）、レオウイルス（Ｒｅｏ ｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ）、カイコ細胞質多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、カリシウイルス、ノロウイルス、サポウイルスなどの構成タンパク質や膜タンパク質、表面抗原タンパク質、または多角体タンパク質等が例示される。
【００２２】
「自己組織化能を有するタンパク質」は、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、ウィルス、ファージ、細菌類、菌類等に由来する天然タンパク質や遺伝子工学的に組み替えられたタンパク質、種々の合成タンパク質等である。「自己組織化能を有するタンパク質」は、好ましくは、ウイルス由来タンパク質、更に好ましくは肝炎ウイルス由来のタンパク質、更に好ましくはＢ型肝炎ウイルス由来のタンパク質が用いられる。最も好ましくはＢ型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)タンパク質が用いられる。このとき、自己組織能が失われない限りにおいて、種々の変異を持つ変異体であってもよく、HBsAgタンパク質のｐｒｅＳ領域のアミノ酸の一部を欠失させることにより、ナノサイズの粒子の生産量や安定性を高めることができる。
【００２３】
本発明において、「自己組織化能を有するタンパク質」が、ウイルス由来タンパク質であることか好ましく、ウイルス（特にＢ型肝炎ウイルス）の表面抗原タンパク質を用いることがより好ましい。「自己組織化能を有するタンパク質」として、ウイルス（特にＢ型肝炎ウイルス）の表面抗原タンパク質を用い、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞(例えばCHO細胞)などの真核細胞内で発現させることで、このタンパク質が宿主真核細胞の小胞体の脂質２重膜を取り込みながら自己組織化を起こし、物理的にも強度の強い、直径がナノサイズの粒子を効率的に作ることができる。このタンパク質を酵母内で発現させることで、数〜数十ｍｇ／Ｌ培養のナノ粒子を生産できるため、非常に高効率な粒子の生産が可能であり、粒子生産のコストを非常に低くすることができる。これは、産業的に該粒子を利用する上でも重要なことである。
【００２４】
ウイルス表面抗原タンパク質が作り出すナノ粒子は物理的に非常に安定で、６０〜８０℃といった高温や８Ｍのウレア、または種々の界面活性剤存在下でもその形態を維持できる。このような粒子の安定性は様々な免疫学的測定手法に適用が可能になるため汎用性が高い、また保存性が高く、ハンドリングしやすい、さらには、測定中に他の不純物を除去する、あるいは非特異的結合を軽減するための洗浄処理（例えば、変性剤や界面活性剤による洗浄が可能になる）を加えることが可能になるため、検出の精度を上げられる。従って、ウイルス表面抗原タンパク質が作り出すナノ粒子を使うことで、免疫学的測定手法の幅が格段に広がる効果が期待できる。
【００２５】
本発明における「自己組織化能を有するタンパク質」は、抗体結合部位を有している。「自己組織化能を有するタンパク質」が抗体結合部位を有することにより、本発明における免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子の表面には「自己組織化能を有するタンパク質」の自己組織化の効果により抗体結合部位を高密度で整列させることが可能となる。その結果免疫学的測定に用いる抗体を、ナノ粒子表面に高密度で整列固定することが可能となり、そのため高感度で高精度な免疫学的測定が可能となる。
【００２６】
本発明における抗体結合部位は、抗体の抗原認識部位以外の領域と結合もしくは相互作用し得るポリペプチドであり、より好ましくは抗体Fc領域との結合部位である。本発明における抗体結合部位は、好ましくはFcレセプター、protein A、Protein G、Protein A/G、protein L、ＺＺタグのいずれかの全長もしくは一部およびそれらの変異体であり、さらに好ましくは、抗体結合部位が、ＺＺタグである。自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合部位としてＺＺタグを有しており、該自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子を、ＺＺ粒子と表記する。
【００２７】
本発明において、ＺＺタグとは、Ｚ領域と呼ばれるprotein Aのもつ「抗体Fc領域との結合部位」がタンデムにならんだ領域を示す。ＺＺタグのアミノ酸配列は、次のような繰返し配列もしくはその変異体である。ＡＱＨＤＥＡＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号１）。ＺＺタグは分子量が小さく立体障害を起こさない観点からも好ましく用いられる。このＺＺ領域（ＺＺタグ）と呼ばれるポリペプチドもしくはその変異体を用いることで、立体障害なく、抗体を高密度でナノ粒子表面に整列提示することが可能となり、免疫学的測定をより高感度にすることが可能となる。つまり本発明の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子では、「自己組織化能を有するタンパク質」が抗体結合部位としてＺＺタグを有することにより、免疫学的測定に用いる抗体を、ナノ粒子表面に、立体障害無く、より高密度で整列固定することが可能となり、そのためより高感度で高精度な免疫学的測定が可能となる。
【００２８】
また、ＺＺタグ配列は、１２２個のアミノ酸配列中に、１２個ものリジン配列を有しており、側鎖にアミノ基が豊富である。一方、特許文献１に記載の、自己組織化能を有するタンパク質であるＢ型肝炎ウイルスの表面抗原タンパク質は僅か３個しかリジン基を有しておらず、Ｎ末端アミノ酸残基を含めても、４カ所しかアミノ基を有していない。従って、アミノ基を標的としてビオチン化を行ったとき、最大でも４カ所しかビオチン化されない。一方、ＺＺタグ配列を有することにより、リジンの数は３個から１５個に増加し、Ｎ末端アミノ酸残基を含めて１６カ所のアミノ基を標的にしたビオチン化が効率的に起こり、結果としてビオチンがナノ粒子の表面に多く局在することになる。その結果、ビオチン結合性タンパク質と酵素の複合体が、ＺＺタグを持たない時と比較し、より多く結合することになり、免疫学的測定の感度は、ＺＺタグを持たない場合と比較し向上する。
【００２９】
本発明のナノ粒子は、自己組織化能を有するタンパク質が約１００個で１つの粒子を形成する。従って、本発明の粒子１つあたりのビオチンないし酵素標識の程度は、自己組織化能を有するタンパク質１つあたりの標識量の、約１００倍となる。
【００３０】
本発明の粒子１個あたりのビオチン化の程度は、自己組織化能を有するタンパク質１分子あたり、１〜１５個、好ましくは２〜１２個、より好ましくは３〜１０個である。
【００３１】
本発明の粒子１個あたりの酵素等の標識の数は、自己組織化能を有するタンパク質１分子あたり、０．１〜１０個、好ましくは０．１〜５個、より好ましくは０．１〜１個である。
【００３２】
本発明の粒子１個あたりに結合されたビオチン残基が少なすぎれば、粒子に結合される酵素などの標識の数が少なくなり、感度が低下する。一方、ビオチンの数が多すぎれば、抗体と抗体により認識される測定対象物質の結合に影響する可能性がある。
【００３３】
本発明の粒子１個あたりに結合された酵素等の標識の数が少なすぎれば測定感度が低下し、酵素などの標識の数が多すぎれば、抗体と抗体により認識される測定対象物質の結合に影響する可能性がある。
【００３４】
ビオチン結合性タンパク質は、ビオチン化された自己組織化能を有するタンパク質とビオチン化酵素などのビオチン化標識物質を連結できるものであればよく、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンが好ましく例示されるが、それ以外にもストレプトアビジン、ニュートラアビジン(NeutrAvidin)やアビジンが複数個結合した融合タンパク質(リンカーで化学的に結合されていてもよい)などの、複数のビオチンと結合可能なビオチン結合性タンパク質は広く包含される。
【００３５】
本発明の粒子は、自己組織化能を有するタンパク質の抗原結合部位に抗体が高密度で結合されているにもかかわらず、抗体による測定対象物質の認識能には影響がなく、少ない量の粒子で測定対象物質の高感度測定が可能である。
【００３６】
このように、自己組織化能を有するタンパク質が、抗体結合部位としてＺＺタグを有することは、抗体を立体障害無く高密度で整列提示可能とすることに加え、アミノ基を標的としたビオチン化を効率的に起こし、標識されるビオチンの数を増加させる効果を与える。これにより免疫学的測定の感度は大きく向上する。本発明者は、ＺＺタグなどの抗体結合部位のＬｙｓ残基にビオチンを１個または複数個結合させた場合にも、抗体結合能は維持されることを確認した。
【００３７】
抗体結合部位は「自己組織化能を有するタンパク質」と疎水的に結合していてもよく、化学結合などにより共有的に結合しても良い。抗体結合部位は、融合タンパク質として「自己組織化能を有するタンパク質」に融合していることが好ましい。また融合の部位は、自己組織化能を失わない限りにおいて、Ｎ末端からＣ末端までの全ての場所に存在し得るが、粒子を形成したときに外側に存在することが好ましい。
本発明において脂質２重膜とは５〜２０ｎｍの厚さで２枚の脂質の層からなっており、それぞれの層の中で、両親媒性脂質の極性の頭が親水系の溶媒と接触しており、非極性の炭化水素の部分が２重層の内部を向いているものをいう。脂質２重膜の例としては、細胞膜や核膜、小胞体膜、ゴルジ体膜、液胞膜のような生細胞における生体膜、または人工的に作製したリポソーム等が挙げられる。中でも小胞体膜由来の脂質２重膜がより好ましい。脂質２重膜としては、真核生物、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞など由来のものが好ましく、特に好ましくは酵母由来の脂質２重膜が用いられる。
【００３８】
本発明においてナノ粒子とは２０〜５００ｎｍの粒子である。本発明のナノ粒子は、好ましくは５０〜２００ｎｍ、更に好ましくは８０〜１５０ｎｍの直径を持つ粒子である。また、本発明のナノ粒子は、好ましくは内部に中空の空間を持つ中空ナノ粒子であり、その空間は必ずしも気体系の空間である必要はなく、溶液系の空間であってもよい。
【００３９】
本発明の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子が、自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成されることにより、目的とする物質以外の物質が免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子に非特異的に吸着・相互作用することを抑制し、免疫学的測定のノイズを低下させる効果や精度を向上させることができる。また、目的とする物質が抗体を介さず、直接、免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子と吸着・相互作用することによるノイズ抑制の効果を持つ。このことは免疫学的測定において重要なことであり、検出の精度を決める最重要因子となる。
【００４０】
本発明の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子は、好ましくは、主にタンパク質と脂質、糖を主要な構成成分とし、そのうち主要な成分はタンパク質である。
【００４１】
抗体結合部位を持つタンパク質が自己組織化する能力を有することは、抗体の高密度整列、高密度提示を可能にし、免疫学的測定における感度の向上において重要な性質である。さらに、自己組織化する能力を有することは、自己組織化の過程で、他の夾雑タンパク質を排除することを示し、これは免疫学的測定の精度を向上（非特異的シグナルを抑制）させる上で重要な性質である。さらに、脂質２重膜を取りこむことで、非特異的吸着や相互作用を抑制し、免疫学的測定の精度を向上（非特異的シグナルを抑制）させることもできる。
【００４２】
本発明の、自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成されるナノサイズの粒子を生産する生物種にとくに制限はなく、真核生物、原核生物いずれによる生産であっても良いが、自己組織化能を高めるため、真核生物による生産が好ましく、さらに好ましくは酵母細胞による生産である。ウイルス、ファージなどの感染工程を含むことや、組換え体も、本発明のナノサイズの粒子を生産する生物種の範囲である。
【００４３】
本発明における「ビオチンによる標識」の手法に特に制限はなく、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基などを標的に標識する市販のビオチン化試薬を用いることができる。好ましくは、自己組織化能を有するタンパク質にビオチンが標識されており、更に好ましくはＺＺタグ配列中にはリジン残基が豊富に含まれることから、リジン残基のアミノ基やＮ末端アミノ酸残基のアミノ基を標的とする試薬が用いられる。これによりビオチン標識量を増加させることができる。また、親水性や自由度を付与するスペーサーを有する試薬を用いても良い。
【００４４】
本発明における「酵素とビオチン結合性タンパク質の複合体」とは、免疫学的測定に用いる酵素とビオチン結合性タンパク質との複合体を示し、架橋剤による結合により複合体を形成していても良く、ビオチンを介して複合体を形成していても良い。また融合タンパク質として複合体を形成していてもよい。好ましくは、ビオチン化された酵素と、アビジン、ストレプトアビジン、NeutrAvidinなどのビオチン結合性タンパク質が結合している複合体が好ましい。
【００４５】
本発明における酵素とは、免疫学的測定の検出において用いられる酵素であれば特に制限はなく、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼなどが用いられる。好ましくは西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が用いられる。
【００４６】
本発明において抗体結合部位と結合する抗体とは、天然に産生されるか、または全体的にもしくは部分的に合成され産生されるかのいずれかの免疫グロブリンを意味する。抗原認識能を維持するその全ての誘導体や変異体も含まれる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。好ましくはFc領域を持つ抗体であり、さらに好ましくはFcレセプター、protein A、Protein G、Protein A/G、protein L、ＺＺタグのいずれかと結合し得る抗体を示す。抗体結合部位に結合する抗体は、酵素やビオチンなどで標識されていてもよい。
【００４７】
本発明における抗体の標識に特に制限はなく、抗体の抗原認識能が失われておらず、かつ検出可能な標識であれば良い。例えば、アルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼなどの酵素やその変異体による標識であっても良く、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ダンシル、ルシファーイエローＶＳ、ウンベリフェリル、希土キレート、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＴＲＩＴＣ、ＡＬＥＸＡ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）、量子ドットなどの蛍光物質による標識であっても良い。さらに、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、金粒子、鉄粒子、磁性粒子、磁気ビーズによる標識であっても良い。様々な環境に合わせて容易に標識物質を選ぶことが可能であり、複数の標識を組み合わせて用いることも可能である。汎用性と安全性の点から、好ましくはアルカリフォスファターゼやホースラディッシュペルオキシダーゼ、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＡＬＥＸＡ（登録商標）、ビオチン、金粒子が用いられる。更に好ましくは、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ビオチンが標識されている。
【００４８】
本発明における抗体Fc領域とは、抗体をパパインで消化して得られる抗原認識能を持たないフラグメントであり、一般に抗体のＨ鎖のＣ末端フラグメントの２量体である。
【００４９】
本発明における「自己組織化能を有するタンパク質」と抗体との結合様式は、抗体の抗原認識能が失われない限りにおいてとくに制限はなく、イオン結合、疎水結合、水素結合、金属結合、あるいはジスルフィド結合などの共有結合等、あるいはこれらの組み合わせであって良い。本発明の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子の抗体結合部位と抗体との結合は、好ましくは免疫学的測定の過程での抗体の脱落を防止する目的から、共有結合であることが好ましく、さらに好ましくは架橋剤による共有結合である。
【００５０】
本発明の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子は、ビオチン以外にも標識を有していても良い。免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子の標識にとくに制限はなく、抗体との結合能が失われておらず、かつ検出可能な標識であれば良い。
【００５１】
免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子の標識の一例として、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、NeutrAvidinなどのビオチン結合性タンパク質が用いられる。また、ナノ粒子がビオチンで標識されており、ビオチンをビオチン結合性タンパク質と酵素の複合体で標識するナノ粒子の間接標識を用いることもできる。
【００５２】
本発明において抗体の変異体もしくは「自己組織化能を有するタンパク質」の変異体もしくは抗体結合部位の変異体、ＺＺタグの変異体、ビオチン結合性タンパク質の変異体とは、１）これらタンパク質に遺伝子工学的に点、あるいは複数のアミノ酸置換を起こしたもの、２）タンパク質の全長から一部を削り取るか、新しくタンパク質配列を付け加えたもの、３）核酸・糖・脂質・化合物等によってタンパク質の一部に修飾を施したもの、であって、
４）変異を起こす前の抗体と同一の物質を認識する能力を持つ抗体変異体、
５）変異を起こす前の「自己組織化能を有するタンパク質」と同様に脂質２重膜を取りこんで自己組織化によりナノ粒子を形成する能力を有する変異体、
６）変異を起こす前の抗体結合部位やＺＺタグと同様に、抗体のFc領域と相互作用する能力を有する変異体、
７）変異を起こす前のビオチン結合性タンパク質と同様に、ビオチンとの結合能を保持する変異体を示す。
このような変異体を作製するには該タンパク質を発現する遺伝子を含む環状プラスミド上でアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を行うためのプライマーとＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ、またはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｍｕｌｔｉ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ、またはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）等の変異を起こすためのキットを用いて１２〜１８サイクルのＰＣＲを行い、その産物を制限酵素ＤｐｎＩで切断し、大腸菌に形質転換することにより可能である。
【００５３】
さらに、ランダム変異導入法、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて行うことができる。例えば亜硫酸水素ナトリウムを用いた化学的な処理によりシトシン塩基をウラシル塩基に置換する方法や、マンガンを含む反応液中でPCRを行い、DNA合成時のヌクレオチドの取り込みの正確性を低くする方法、部位特異的変異導入のための市販されている各種キットを用いることもできる。例えばSambrook等編［Molecular Cloning-A Laboratory Manual、第２版］Cold Spring Harbor Laboratory、1989、村松正實編［ラボマニュアル遺伝子工学］丸善株式会社、１９８８、エールリッヒ、ＨＥ．編［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］ストックトンプレス、１９８９等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができる。また、核酸・糖・脂質・化合物等によってタンパク質の一部に修飾を施したものとして具体的にはリン酸化酵素によるタンパク質中のセリン、またはスレオニン残基のリン酸化、糖鎖付加酵素によるアスパラギン、またはセリン、またはスレオニン残基の糖鎖付加、または還元・アルキル試薬によるシステイン残基の還元・アルキル化のようなものを例示することができ、これらのものを作製するにはタンパク質にリン酸、または糖鎖等を混ぜて、リン酸化酵素や糖鎖付加酵素を加え、その酵素が働く最適な条件（温度、ｐＨ、塩濃度等）を維持したり、タンパク質の入った溶液に還元剤であるジチオツレイトールやメルカプトエタノール等を終濃度で５ｍＭ濃度になるように入れ、温度６０℃付近、ｐＨ中性以上で１時間反応させ、更にアルキル化剤として５〜１５ｍＭ濃度のヨードアセトアミドを加え室温で１時間以上反応させることにより可能である。もちろん例示した上記の修飾以外にもタンパク質に対する様々な修飾が考えられる。
【００５４】
本発明の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子を用いる免疫学的測定方法は、各種のwestern blottingや免疫組織染色、免疫電子顕微鏡観察、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ、ＦＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、イムノクロマト、免疫電子顕微鏡観察、フローサイトメトリーなどに有効である。
【実施例】
【００５５】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００５６】
参考例１
（遺伝子組換え酵母によるＺＺタグを付加したナノ粒子（ＺＺ粒子）の発現）
特開２００４−００２３１３号公報実施例記載の方法に基づいて、抗体結合部位であるＺＺタグが融合したＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質を酵母で発現させ、ＺＺタグをもつナノ粒子（ＺＺ粒子）を作製した。ＰＢＳに溶解し、使用するまで４℃にて保存した。これをビオチン化されていない免疫学的測定用ナノ粒子として用いた。
【００５７】
参考例２
（遺伝子組み換え酵母によるＺＺタグを持たないナノ粒子（野生型ナノ粒子）の発現）
特開２００１−３１６２９８号公報実施例記載の方法に基づいて、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質を酵母で発現させ、抗体結合部位もしくはＺＺタグを持たないナノ粒子（野生型ナノ粒子）を作製した。ＰＢＳに溶解し、使用するまで４℃にて保存した。
【００５８】
実施例１
（ＺＺ粒子と野生型ナノ粒子のビオチン化反応、ビオチン標識）
参考例１記載のＺＺ粒子溶液、実施例２記載の野生型ナノ粒子を、６００μｇ／ｍｌ以上の濃度まで限外濾過フィルター（ミリポア社製）を用いて濃縮した。ＺＺナノ粒子、野生型ナノ粒子溶液１００μｌをＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ―Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて、添付のプロトコルに従って３０分間室温でビオチン化反応させ、リジン残基のアミノ基およびＮ末端アミノ基をビオチン標識した。フリーの未反応ビオチンを、ＺｅｂａＴＭ  Ｄｅｓａｌｔ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて、添付のプロトコルに従って除去した。ＺＺ粒子をビオチン化したビオチン化ＺＺ粒子を免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子として用い、対照として、野生型ナノ粒子をビオチン化した野生型ビオチン化ナノ粒子を用いて、以降の実験を行った。
【００５９】
実施例２
（免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子と、野生型ビオチン化ナノ粒子のビオチン定量）
ＥＺＴＭ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて、添付のプロトコルに従ってビオチン定量を行った。タンパク質の定量にはＱｕａｎｔｉＰｒｏ  ＢＣＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて、添付のプロトコルに従って行った。吸光度の測定は、分光光度計マルチスキャンスペクトラム（サーモラボシステム社製）を使用した。抗体結合部位であるＺＺタグが融合したＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質の分子量を４８ｋＤａ、ＺＺタグを持たないＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質の分子量を４４ｋＤａとし、タンパク質あたりのビオチン標識数を評価した。ＺＺタグが融合したＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質の分子量１分子あたり６分子のビオチンが標識されていたのに対し、ＺＺタグを持たないＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質１分子あたり３分子のビオチンが標識されていた。この結果から、側鎖にアミノ基をもつリジン残基を多く含むＺＺタグを抗体結合部位として用いることによる、ビオチン標識効率の向上が確認された。自己組織化能を有するタンパク質であるＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質およそ１００分子で、１つの粒子を形成する。従って、免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子１つあたり約６００個のビオチンを有していると考えられる。一方、野生型ビオチン化ナノ粒子１つあたり約３００個のビオチンを有していると考えられる。
【００６０】
実施例３
（免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子と野生型ビオチン化ナノ粒子、ビオチン標識されていない免疫学的測定用ナノ粒子を用いた、免疫学的測定）
抗原としてＯｖａｌｂｕｍｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液２０μｇ／ｍｌをマルチウエルプレート中でＰＢＳにより約１９．５ｎｇ／ｍｌまで順次２段階希釈し、１００μｌを４℃にて終夜静置し固層化させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳＴ溶液で３回洗浄後、１／４容量のブロックエースを含むＰＢＳＴで希釈した、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎに対するマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社製）４００ｎｇ／ｍｌを１次抗体として加え、室温にて１時間振とうした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、１／４容量のブロックエースを含むＰＢＳＴで希釈した酵素標識抗体、ＨＲＰ標識Ｒａｂｂｉｔ抗マウスＩｇＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）溶液２μｇ／ｍｌを室温にて１時間振とう反応させた。このとき、酵素標識抗体溶液に、何も加えないものと、実施例１で作製したＺＺ粒子を免疫学的測定用ナノ粒子として２．４μｇ／ｍｌ添加したもの、実施例１で作製したビオチン化ＺＺ粒子を免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子として２．４μｇ／ｍｌ添加したもの、実施例１で作製した野生型ビオチン化ナノ粒子を抗体結合部位を持たないビオチン化ナノ粒子として２．４μｇ／ｍｌ添加したものを同時に行った。酵素標識抗体反応後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。酵素とアビジンの複合体としてビオチン化ＨＲＰとアビジンの複合体であるＡＢＣ試薬（ＰＩＥＲＣＥ社製）を添付のプロトコルに従ってウェルに加え、室温で３０分間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄後、ＴＭＢ試薬を加え発色反応を行った。２Ｎ硫酸により反応停止後、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。測定には分光光度計マルチスキャンスペクトラム（サーモラボシステム社製）を使用した（図１）。検出感度の上昇倍率は、吸光度がある値を与えるときの抗原濃度から算出した。その結果、ナノ粒子を用いないときと比較し、抗体結合部位を持たないビオチン化ナノ粒子である野生型ビオチン化ナノ粒子を用いた場合に感度が全く向上しなかったのに対し、免疫学的測定用ナノ粒子を用いた場合、約１５倍検出感度が向上した。一方、免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子を用いた場合、３０倍以上検出感度が向上した。つまり免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子を用いることにより、ビオチン化されていない免疫学的測定用ナノ粒子を用いた場合と比較して、さらに２〜４倍感度が向上した。これは抗体結合部位としてビオチン標識効率の高いＺＺタグを用いることにより、自己組織化能を有するタンパク質のビオチン化効率を上げた結果、感度が向上したことを示す。
【００６１】
実施例４
（免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子と野生型ビオチン化ナノ粒子、ビオチン標識されていない免疫学的測定用ナノ粒子を用いた、免疫学的測定）
実施例３に記載の実験を、酵素標識抗体の代わりにビオチン標識抗体を用いて実験を行った。具体的には、抗原としてＯｖａｌｂｕｍｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液２０μｇ／ｍｌをマルチウエルプレート中でＰＢＳにより約１９．５ｎｇ／ｍｌまで順次２段階希釈し、１００μｌを４℃にて終夜静置し固層化させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳＴ溶液で３回洗浄後、１／４容量のブロックエースを含むＰＢＳＴで希釈した、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎに対するマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社製）４００ｎｇ／ｍｌを１次抗体として加え、室温にて１時間振とうした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、１／４容量のブロックエースを含むＰＢＳＴで希釈したビオチン標識抗体、ビオチン標識Ｒａｂｂｉｔ抗マウスＩｇＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）溶液１．５μｇ／ｍｌを室温にて１時間振とう反応させた。このとき、ビオチン標識抗体溶液に、何も加えないものと、参考例１で作製したＺＺ粒子を免疫学的測定用ナノ粒子として２．４μｇ／ｍｌ添加したもの、実施例１で作製したビオチン化ＺＺ粒子を免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子として２．４μｇ／ｍｌ添加したもの、実施例１で作製した野生型ビオチン化ナノ粒子を抗体結合部位を持たないビオチン化ナノ粒子として２．４μｇ／ｍｌ添加したものを同時に行った。ビオチン標識抗体反応後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。酵素とアビジンの複合体としてビオチン化ＨＲＰとアビジンの複合体であるＡＢＣ試薬（ＰＩＥＲＣＥ社製）を添付のプロトコルに従ってウェルに加え、室温で３０分間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄後、ＴＭＢ試薬を加え発色反応を行った。２Ｎ硫酸により反応停止後、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。測定には分光光度計マルチスキャンスペクトラム（サーモラボシステム社製）を使用した（図２）。検出感度の上昇倍率は、吸光度がある値を与えるときの抗原濃度から算出した。その結果、ナノ粒子を用いないときと比較し、抗体結合部位を持たないビオチン化ナノ粒子である野生型ビオチン化ナノ粒子を用いた場合に感度が全く向上しなかったのに対し、免疫学的測定用ナノ粒子を用いた場合、約２倍程度の検出感度向上であった。一方、免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子を用いた場合、４倍以上検出感度が向上した。つまり免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子を用いることにより、ビオチン化されていない免疫学的測定用ナノ粒子を用いた場合と比較して、さらに２〜４倍感度が向上した。ここれは抗体結合部位としてビオチン標識効率の高いＺＺタグを用いることにより、自己組織化能を有するタンパク質のビオチン化効率を上げた結果、感度が向上したことを示す。
【００６２】
実施例５
（免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子を用いた疾患関連血中抗体の免疫学的測定）
ＰＢＳで希釈したＯｖａｌｂｕｍｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液１５μｇ／ｍｌをマルチウエルプレート中に、１００μｌずつ加え４℃にて終夜静置し固相化させた。溶液を破棄した後、ＰＢＳＴで希釈した１／４容量のブロックエースを２００μlをウェルに加え、室温にて１時間ブロッキングを行った。ＰＢＳＴで３回洗浄後、ヒト血清で希釈した抗オボアルブミンマウスＩｇＥ抗体（ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃ社製）２５０ｐｇ／ｍＬを１００μＬずつウェルに加え、室温にて１時間静置し反応させた。次に、ＰＢＳＴで３回洗浄後、１／４容量のブロックエースを含むＰＢＳＴで希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＥウサギ抗体（コスモバイオ社製）溶液５μｇ／ｍｌを酵素標識抗体溶液として各ウェルに１００μｌずつ加え、室温にて１時間静置し反応させた。このとき、酵素標識抗体溶液に、何も加えないものと、参考例１で作製したＺＺ粒子を免疫学的測定用ナノ粒子として２．４μｇ／ｍｌ添加したもの、実施例１で作製したビオチン化ＺＺ粒子を免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子として２．４μｇ／ｍｌ添加したものを同時に行った。酵素標識抗体反応後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、酵素とアビジンの複合体としてビオチン化ＨＲＰとアビジンの複合体であるＡＢＣ試薬（ＰＩＥＲＣＥ社製）を添付のプロトコルに従ってウェルに加え、室温で３０分間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄後、ＴＭＢ試薬を加え発色反応を行った。２Ｎ硫酸により反応停止後、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。測定には分光光度計マルチスキャンスペクトラム（サーモラボシステム社製）を使用した。検出感度の上昇倍率は、２５０ｐｇ／ｍＬでの発色値を比較して算出した。その結果、ナノ粒子を用いないときの発色値平均が０．４２だったのに対し、免疫学的測定用ナノ粒子を用いた場合は１．３７であり、約３倍検出感度が向上した。一方、免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子を用いた場合は１．５６であり、約３．７倍以上検出感度が向上した。つまり免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子を用いることにより、ビオチン化されていない免疫学的測定用ナノ粒子を用いた場合と比較して、さらに約１．２倍感度が向上した。これは抗体結合部位としてビオチン標識効率の高いＺＺタグを用いることにより、自己組織化能を有するタンパク質のビオチン化効率を上げた結果、感度が向上したことを示す。
【００６３】
比較例１
（市販キットを用いた抗体価の免疫学的測定）
市販されているマウス抗オボアルブミンIgEの測定キットとしてDSマウスIgE ELISA（大日本住友製薬株式会社製）およびレビスOVA-IgEマウス（株式会社シバヤギ製）を選定し、添付のプロトコルに従って、n=24での測定によりそれぞれの検出限界の判定を行った。標準液としてマウス抗オボアルブミンＩｇＥ抗体（ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃ社製）を用いた。抗オボアルブミンIgEの検出限界の判定は、IgE濃度ゼロの時の平均値＋2SDと重ならない平均値-2SDを示す濃度を検出限界値とした。なお、本発明との比較を行うため、DSマウスIgE ELISAでの測定に用いた検体量は100μｌとしている。
【００６４】
DSマウスIgE ELISAのマウス抗オボアルブミンIgE検出限界値は2ng/mlであり、検出限界値でのCV値は10%であった（図３）。
レビスOVA-IgEマウスのマウス抗オボアルブミンIgE検出限界値は2ng/mlよりも高い濃度であり、2ng/mlを検出することはできなかった。
【００６５】
実施例６
（ビオチン標識されていない免疫学的測定用ナノ粒子を用いた、抗体価の免疫学的測定）
ビオチン標識されていない免疫学的測定用ナノ粒子を用いて、マウス抗オボアルブミンIgEの測定を行った。n=24での測定によりそれぞれの検出限界の判定を行った。標準液としてマウス抗オボアルブミンＩｇＥ抗体（ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃ社製）を用いた。抗オボアルブミンIgEの検出限界の判定は、IgE濃度ゼロの時の平均値＋2SDと重ならない平均値-2SDを示す濃度を検出限界値とした。
【００６６】
ＰＢＳで希釈したＯｖａｌｂｕｍｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液１５μｇ／ｍｌをマルチウエルプレート中に、１００μｌずつ加え４℃にて終夜静置し固相化させた。溶液を破棄した後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、洗浄液を破棄した。ＰＢＳＴで希釈した１／４容量のブロックエースで希釈した抗オボアルブミンマウスＩｇＥ抗体（ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃ社製）２０００〜０ｐｇ／ｍＬを１００μＬずつウェルに加え、室温にて１時間静置し反応させた。次に、ＰＢＳＴで３回洗浄後、１／４容量のブロックエースを含むＰＢＳＴで希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＥウサギ抗体（コスモバイオ社製）溶液５μｇ／ｍｌを酵素標識抗体溶液として各ウェルに１００μｌずつ加え、室温にて１時間静置し反応させた。このとき、酵素標識抗体溶液に、何も加えないものと、参考例１で作製したＺＺ粒子を免疫学的測定用ナノ粒子として２．４μｇ／ｍｌ添加したものを同時に行った。ＰＢＳＴで５回洗浄後、ＴＭＢ試薬を加え発色反応を行った。２Ｎ硫酸により反応停止後、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。測定には分光光度計マルチスキャンスペクトラム（サーモラボシステム社製）を使用した。ビオチン標識されていない免疫学的測定用ナノ粒子を用いた時のマウス抗オボアルブミンIgE検出限界値は250pg/mlであり、検出限界値でのCV値は8.1%であった。免疫学的測定用ナノ粒子を用いていないときのマウス抗オボアルブミンIgE検出限界値は500pg/mlであり、検出限界値でのCV値は7.4%であった。
【００６７】
実施例７
（免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子を用いた、抗体価の免疫学的測定）
本発明の免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子を用いて、マウス抗オボアルブミンIgEの測定を行った。n=24での測定によりそれぞれの検出限界の判定を行った。標準液としてマウス抗オボアルブミンＩｇＥ抗体（ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃ社製）を用いた。抗オボアルブミンIgEの検出限界の判定は、IgE濃度ゼロの時の平均値＋2SDと重ならない平均値-2SDを示す濃度を検出限界値とした。
【００６８】
ＰＢＳで希釈したＯｖａｌｂｕｍｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液１５μｇ／ｍｌをマルチウエルプレート中に、１００μｌずつ加え４℃にて終夜静置し固相化させた。溶液を破棄した後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、洗浄液を破棄した。ＰＢＳＴで希釈した１／４容量のブロックエースで希釈した抗オボアルブミンマウスＩｇＥ抗体（ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃ社製）２５０〜０ｐｇ／ｍＬを１００μＬずつウェルに加え、室温にて１時間静置し反応させた。次に、ＰＢＳＴで３回洗浄後、１／４容量のブロックエースを含むＰＢＳＴで希釈したビオチン標識抗マウスＩｇＥウサギ抗体（コスモバイオ社製）溶液５μｇ／ｍｌを酵素標識抗体溶液として各ウェルに１００μｌずつ加え、室温にて１時間静置し反応させた。このとき、ビオチン標識抗体溶液に、何も加えないものと、実施例１で作製したビオチン標識したＺＺ粒子を免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子として２．４μｇ／ｍｌ添加したものを同時に行った。ＰＢＳＴで３回洗浄し、酵素とアビジンの複合体としてビオチン化ＨＲＰとアビジンの複合体であるＡＢＣ試薬（ＰＩＥＲＣＥ社製）を添付のプロトコルに従ってウェルに加え、室温で３０分間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄後、ＴＭＢ試薬を加え発色反応を行った。２Ｎ硫酸により反応停止後、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。測定には分光光度計マルチスキャンスペクトラム（サーモラボシステム社製）を使用した。免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子を用いた時のマウス抗オボアルブミンIgE検出限界値は40pg/mlであり（図４）、検出限界値でのCV値は7.1%であった。免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子を用いていないときのマウス抗オボアルブミンIgE検出限界値は250pg/mlであった。
【００６９】
以上の結果、市販のキットと比較して、免疫学的測定用ナノ粒子を用いていないとき、測定限界値は４倍低下した。免疫学的測定用ナノ粒子を用いたとき、市販のキットと比較して測定限界値は８倍低下した。免疫学的測定用ナノ粒子や免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子を用いず、酵素とアビジンの複合体であるＡＢＣ試薬を用いたとき、市販のキットと比較して測定限界値は８倍低下した。さらに、免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子と酵素とビオチン結合性タンパク質の複合体であるＡＢＣ試薬を用いたとき、市販のキットと比較して測定限界値は５０倍低下した。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、免疫学的測定における免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子の効果を示す図である。
【図２】図２は、免疫学的測定における免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子の効果を示す図である。
【図３】図３は、市販キットの検出限界を示す図である。
【図４】図４は、免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子に、酵素とビオチン結合性タンパク質の複合体を結合させて用いたときに、検出限界が低下することを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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