(57)【要約】      （修正有）【課題】カプサイシン配糖体の製造に有用な、糖転移酵素をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドによってコードされる糖転移酵素、当該ポリヌクレオチドを含むベクター、当該ベクターを含む形質転換体、当該形質転換体によって産生される組換え糖転移酵素、当該形質転換体又は組換え糖転移酵素を用いるカプサイシン配糖体の製造方法、当該製造方法によって得られるカプサイシン配糖体、及び当該ポリヌクレオチドのフラグメントの提供。【解決手段】糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードする下記の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド：（ａ）特定の塩基配列からなるポリヌクレオチド；または（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：（ｉ）（ａ）の配列からなるポリヌクレオチド；もしくは（ｉｉ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、
下記の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。    
【請求項２】
糖転移酵素活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１又は３に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む、形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体によって産生される組換え糖転移酵素。
【請求項７】
請求項５に記載の形質転換体又は請求項６に記載の組換え糖転移酵素を用いることを含む、カプサイシン配糖体の製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の製造方法によって得られるカプサイシン配糖体。
【請求項９】
請求項１又は請求項３に記載のポリヌクレオチドの連続する１５以上の塩基配列からなる、フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖転移酵素をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドによってコードされる糖転移酵素、当該ポリヌクレオチドを含むベクター、当該ベクターを含む形質転換体、当該形質転換体によって産生される組換え糖転移酵素、当該形質転換体又は組換え糖転移酵素を用いるカプサイシン配糖体の製造方法、当該製造方法によって得られるカプサイシン配糖体、及び当該ポリヌクレオチドのフラグメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
カプサイシンはトウガラシに１０〜２０％含まれ、香辛料の辛味成分としては最も辛いものである。また、カプサイシンは、脂質代謝亢進作用など種々の薬理活性を有することが知られているが激辛で水溶性が低いことから、有効量のカプサイシンを継続的に摂取することは困難である。
【０００３】
そこで辛味が弱く水溶性であるカプサイシン配糖体の使用が検討され、カプサイシン配糖体の製造方法については種々の方法が提案されている（特許文献１〜４）。しかしながら、化学的合成法又は培養細胞を用いて得られるカプサイシン配糖体には、不純物の混入の問題や、カプサイシン配糖体の単離・精製が困難である等の問題があり、特に食品用途の場合には、安全性が確保されないという問題があった。また、カプサイシン配糖体の生成に関与する糖転移酵素をコードする遺伝子は未だ見出されていない。
【特許文献１】特開平７−８２２８９号公報
【特許文献２】特開平１０−５３５１２号公報
【特許文献３】特開２００３−３１０２９４号公報
【特許文献４】特開２００４−２１７５５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、カプサイシン配糖体の製造に有用な、糖転移酵素をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドによってコードされる糖転移酵素、当該ポリヌクレオチドを含むベクター、当該ベクターを含む形質転換体、当該形質転換体によって産生される組換え糖転移酵素、当該形質転換体又は組換え糖転移酵素を用いるカプサイシン配糖体の製造方法、当該製造方法によって得られるカプサイシン配糖体、及び当該ポリヌクレオチドのフラグメントを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ヨウシュウヤマゴボウ（Phytolacca americana）から本発明の酵素をコードするポリヌクレオチドのクローニングに成功し、その全塩基配列並びに推定アミノ酸配列を決定した。さらに、取得したポリヌクレオチドを含むベクターを構築し、このベクターを保持する微生物を培養することにより、本発明の酵素を効率的に生産できることを見出すとともに、配糖体の合成に利用できることを確認し本発明を完成させた。
【０００６】
したがって、本発明は、下記：
１．糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、
下記の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、  ２．糖転移酵素活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
３．上記２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
４．上記１又は３に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター、
５．上記４に記載のベクターを含む、形質転換体、
６．上記５に記載の形質転換体によって産生される組換え糖転移酵素、
７．上記５に記載の形質転換体又は上記６に記載の組換え糖転移酵素を用いることを含む、カプサイシン配糖体の製造方法、
８．上記７に記載の製造方法によって得られるカプサイシン配糖体、
９．上記１又は上記３に記載のポリヌクレオチドの連続する１５以上の塩基配列からなる、フラグメント、
に関する。
【０００７】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）の形態であることができる。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であることができる。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）又は非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であることができる。
【０００８】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【０００９】
本発明で「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ（0.15M ＮａＣｌ、0.015Mクエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ（Sodium dodecylsulfate）を含むバッファーによる４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含むバッファーによる６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。上記ハイブリダイゼーションは、「Molecular Cloning (Third Edition)」 (J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することができる。
【００１０】
本発明で「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、もしくは付加ができる程度の数（例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、特に好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００１１】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
【００１２】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００１３】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、ヨウシュウヤマゴボウを挙げることができる。後述する実施例においては、ヨウシュウヤマゴボウから本発明にかかるポリヌクレオチドを取得しているが、これに限定されるものではない。
【００１４】
本発明のベクターは、本発明のポリペプチドを発現させるために用いることができる。本発明にかかるポリヌクレオチドがホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌等の細菌、酵母、植物細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００１５】
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、アグロバクテリウム感染法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００１６】
ヨウシュウヤマゴボウ細胞の培養
細胞培養のための細胞は、ヨウシュウヤマゴボウの茎、葉、根のいずれの部分から採取した細胞でも好適に使用することができる。培養細胞は、常法にしたがって調製することができる。例えば、ヨウシュウヤマゴボウの葉からムラシゲスクーク培地（ＭＳ培地）のもとで、カルスの誘導を行い、カルス化を行った。その後、２５℃で光条件下で培養を行った。
【００１７】
ヨウシュウヤマゴボウ細胞は、ＭＳ（Murashige-Skoog）培地を用い、２５℃で光照射下で振盪培養することができる。
【００１８】
遺伝子の抽出
まず、上記の細胞を培養して得られる培養物から常法にしたがって遺伝子を取得する。この操作には、市販のＲＮＡ抽出キットやＤＮＡ抽出キットを用いることができる。ＲＮＡを抽出する場合には、予めカプサイシンを添加して培養し、対象遺伝子の発現量を増加させることもできる。ＲＮＡ抽出物からは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いてｃＤＮＡを得ることができる。
【００１９】
ｃＤＮＡライブラリーの構築
得られた遺伝子をファージやプラスミドベクターに挿入し、遺伝子ライブラリーを作成することができる。この際、必要に応じ、遺伝子を適当な制限酵素で消化し、ホスファターゼ等の修飾酵素で処理したり、リンカーやアダプターを付加することもできる。
【００２０】
目的遺伝子のクローニング
ヨウシュウヤマゴボウ培養細胞から全ＲＮＡを抽出し、異種の糖転移酵素の保存アミノ酸配列から設計したプライマーとオリゴｄＴプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによりヨウシュウヤマゴボウの糖転移酵素遺伝子の断片を取得することができる。得られた遺伝子断片からヨウシュウヤマゴボウの糖転移酵素遺伝子に特異的なプローブを設計することができる。このプローブを用いて上記ｃＤＮＡライブラリーの遺伝子とハイブリダイゼーションさせることによって、目的遺伝子を選抜することができる。
【００２１】
このようにしてクローン化された遺伝子を適当なベクターに組込むことにより、他の原核生物または真核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーターおよび形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現させることが可能である。
【００２２】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌(Escherichia coli)や枯草菌(Bacillus subtilis)等を挙げることができる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質発現させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコン、すなわち複製起点および調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させればよい。また、ベクターは形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を持つものが望ましい。
【００２３】
例えば、大腸菌としてはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドがよく用いられるが、これに限定されず、公知の各種の菌株およびベクターがいずれも利用できる。プロモーターとしては、大腸菌においてはトリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、バクテリオファージ由来のラムダ（λ）ＰＬプロモーター、ポリペプチド鎖伸長因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等を挙げることができる。枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ohmura,K.et al.(1984)J.Biochem.95,87-93）等が用いられるが、これに限定されるものではない。プロモーターとしては、枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子の調節配列がよく用いられ、さらに必要によりα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。      
【００２４】
真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、植物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞(Gluzman,Y. (1981)Cell 23,175-182)やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,4216-4220)等がよく用いられているが、これらに限定されるわけではない。
【００２５】
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列等を有するものを使用でき、これはさらに必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ(Subramani,S. et al.(1981)Mol.Cell.Biol.1,854-864)等を例示できるが、これに限定されない。
また、植物としてはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）やその培養細胞が一般によく用いられているが，タバコ（Nicotiana tabacum）、他の園芸植物，あるいはそれらの培養細胞を用いてもよい。発現のためのプロモーターとしてはカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを，ターミネータとしてはノパリン合成酵素のＮＯＳ等を好ましく利用できるが，これに限定されない．
【００２６】
また、真核微生物としては酵母が一般によく用いられており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えばアルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター(Bennetzen,J.L.and Hall,B.D.(1982)J.Biol. Chem.257,3018-3025) や酸性ホスファターゼ遺伝子のプロモーター(Miyanohara,A.et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,1-5)等を好ましく利用できる。
【００２７】
該発現ベクターは、ＤＥＡＥ−デキストラン法(Luthman,H.and Magnusson,G.(1983) Nucleic Acids Res.11,1295-1308)、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法(Graham,F.L.and van der Ed,A.J.(1973)Virology 52,456-457) および電気パスル穿孔法(Neumann,E.et al.(1982)EMBO J.1,841-845)等により宿主細胞に取込ませることができ、所望の形質転換細胞を得ることができる。
【００２８】
得られた形質転換体を常法に従い培養することができ、該培養により細胞内または細胞外に本発明の酵素が産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択することができる。例えば、大腸菌の場合には、ＬＢ培地、ＹＴ培地、Ｍ９培地等を使用することができる。
【００２９】
上記により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される本発明の酵素は、その物理的性質や化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離・精製することができる。該方法としては、例えば、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等を例示することができる。上記方法により、容易に高収率、高純度で所望の本発明の酵素を工業的規模で製造できる。
【００３０】
なお、上記方法によって得ることができる本発明の糖転移酵素は、以下の性質を有する。
【００３１】
（ａ）作用
ウリジンヌクレオシド二リン酸（ＵＤＰ）によって活性化された糖を受容体に転移する。
【００３２】
（ｂ）糖供与体に対する特異性
ＵＤＰ−グルコース及びＵＤＰ−ガラクトースには作用するが、ＵＤＰ−グルクロン酸には作用しない。
【００３３】
（ｃ）糖受容体に対する特異性
ｍ−ヒドロキシ安息香酸、サリチルアルコール、trans−ｐ−クマリン酸、カフェイン酸、ダイゼイン、ゲニステイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、ナリンゲニン、４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン、アウレウシジン、エスクレチン、８−ノルジヒドロカプサイシン及びベタニジンを受容体とすることができるが、サリチル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシキノン及びシアニジンを受容体とすることはできない。
【００３４】
（ｄ）反応至適温度
４５℃
【００３５】
（ｅ）
温度安定性
４０℃以下で安定
【００３６】
（ｆ）反応至適ｐＨ
６．５
【００３７】
（ｇ）ｐＨ安定性
７．０で安定
【００３８】
（ｈ）金属イオンの影響
本発明の酵素に対する各種金属イオンの影響を下記に示す。なお、アッセイ系に１ｍＭＥＤＴＡを添加して場合においても、本発明の酵素の活性にほとんど影響が見られなかったことから、本発明の酵素はその触媒活性に金属イオンを必要としないと考えられる。
【００３９】
金属イオン（０．１ｍＭ）    本発明の酵素
Ｃａ２＋                    ３４
Ｃｄ２＋                      ９
Ｃｏ２＋                    ２３
Ｃｕ２＋                    ２１
Ｍｇ２＋                    ６７
Ｍｎ２＋                    ６７
Ｎｉ２＋                    ６２
Ｓｎ２＋                  １０４
Ｚｎ２＋                      −
ＥＤＴＡ（１mM）               １１０
数値はコントロールを１００とした相対値である。
Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｈｇ２＋、Ｚｎ２＋では酵素活性が認められない。
【００４０】
（ｉ）各種阻害剤の影響
ヒスチジン残基の修飾試薬であるＤＥＰＣによる触媒活性の阻害は見られない。また、セリン残基修飾試薬であるＰＭＳＦによる触媒活性の阻害も見られない。
【００４１】
上記形質転換体又は上記形質転換体から採取した組換え酵素を用いて各種配糖体を生産することができる。例えば、上記形質転換体を培養し、培養物から菌体を回収してこれを凍結乾燥し、カプサイシンを含むバッファーに凍結乾燥菌体とＵＤＰグルコースを加えて反応させることによってカプサイシン配糖体を得ることができる。
【実施例１】
【００４２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００４３】
ヨウシュウヤマゴボウ細胞の培養
ヨウシュウヤマゴボウ細胞は、国立大学法人岡山大学理学部基礎理学科生物化学研究室より入手し、４週間ごとに継代培養した。培養液（ＭＳ培地）１００mlに約２０ｇのヨウシュウヤマゴボウ細胞を加え、２５℃で、１０，０００Ｌｘの光を照射しながら、振盪培養した。
【００４４】
ヨウシュウヤマゴボウ糖転移酵素（ＰａＧＴ）遺伝子断片の取得
培養液１００mlあたり２０mgのカプサイシンを添加し、３日間培養したヨウシュウヤマゴボウ細胞からRNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)を用いて全ＲＮＡを抽出し、これをDNase-Free kitを用いて精製した。得られた全ＲＮＡを鋳型として、糖転移酵素の保存アミノ酸配列から設計したプライマー（ＬｃＧＴ１（配列番号３）及びｏｌｉｇｏ−ｄＴ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ-ＰＣＲは、One Step RT-PCR Kit (Qiagen)を用いて行い、反応液組成は、製造者の指示に従った。得られたＰＣＲ産物をPCR Purification Kit (Qiagen)を用いて精製し、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行った。この反応液の組成は、ＲＴ−ＰＣＲ産物１μｌ、ＥｘＴａｑバッファー２×、ｄＮＴＰｓ１００μＭ、ＬｃＧＴ２プライマー（配列番号４）０．２μＭ、オリゴｄＴ０．２μＭ、Ｅｘｔａｑポリメラーゼ（タカラ）２．５Ｕであった。反応条件は、最初に、９４℃で３０秒、次に９４℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で１分間を３０サイクル、最後に７２℃で７分間であった。増幅されたＤＮＡ断片をpCR2.1-TOPO vector (TOPO TA cloning Kit, Invitrogen)にＴＡクローニングし、塩基配列を決定した（ＤＮＡシークエンサー：Beckman Coulter CEQ 2000XL DNA Analysis System）。得られた塩基配列から推定されるアミノ酸配列を用いて相同性検索を行った。
【００４５】
相同性の結果、ＰａＧＴの相同性は、Beta vulgaris由来のＵＤＰグルコース：フラボノイド−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼとは７２％であり、Dorotheanthus bellidiformis由来のベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼとは７０％であり、Dianthus caryophyllus由来のＵＤＰグルコース：カルコノナリンゲニン２’−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼとは６７％であり、common tabacco由来のフェニルプロパノイドグルコシルトランフェラーゼ２（Ｕ３２６４４）とは５９％であり、そして、common tabacco由来のフェニルプロパノイドグルコシルトランフェラーゼ１（ＡＦ３４６４３１）とは５９％であった。
【００４６】
ｃＤＮＡライブラリーの構築
カプサイシン添加後のヨウシュウヤマゴボウ細胞からStraight A's mRNA Isolation System (Novagen)を用いてポリ（Ａ）＋−ＲＮＡを得た。得られたポリ（Ａ）＋−ＲＮＡを鋳型として、ZAP-cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE)を用いて二本鎖ｃＤＮＡを作製した。得られた二本鎖ｃＤＮＡをSizeSep 400 Spun Columns (Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精製し、ZAP-cDNA Synthesis Kitの処方に従って、Uni-ZAP XR insertion vectorにクローニングした。これをGigapack III Gold Cloning Kit (STRATAGENE)を用いてλファージにパッケージングし、ヨウシュウヤマゴボウ細胞のｃＤＮＡファージライブラリーを構築した。
【００４７】
ＰａＧＴのｃＤＮＡクローニング
上記で得られたヨウシュウヤマゴボウ糖転移酵素（ＰａＧＴ）遺伝子断片から設計されたプライマー（フォワードプライマー：ＰａＧＴ（Ｆ）（配列番号５）、リバースプライマー：ＰＣＲ２１（Ｒ）（配列番号６））を用いて、PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Biochemicals)により、ジゴキシゲニン（DIG）標識プライマーを作製した。
【００４８】
作製したＤＩＧ標識ＰａＧＴ特異的プローブを用いたプラークハイブリダイゼーションによって、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。その結果得られたポジティブクローンを製造者（STRATAGENE）の指示に従ってpBluescript SK(-)ファージミドベクターにサブクローニングした。得られたクローン（pBluescript-PaGT）について塩基配列を決定したところ、ＯＲＦの長さは１４５５bp（４８５アミノ酸）であった。
【００４９】
ＰａＧＴ発現プラスミドの構築
ＰａＧＴｃＤＮＡには、その内部にＢａｍＨＩ切断部位があることから、ＢｓａＩで消化したＢａｍＨＩ末端を有するプライマーを合成した（フォワードプライマー：PaGT(BsaI-BamHI-F)、配列番号７、リバースプライマー：PaGT(BsaI-BamHI-R)、配列番号８）。上記で得られたpBluescript-PaGTを鋳型としてＰＣＲを行った。反応液の組成は、pBluescript-PaGT 20ng、KOD-Plus Buffer 1x、dNTPs 0.2mM、PaGT(BsaI-BamHI-F) 0.3μM、PaGT(BsaI-BamHI-R) 0.3μM及びKOD-Plus-(TOYOBO) 1Uであった。反応条件は、９４℃２分、次いで９４℃１５秒、５１℃、３０秒及び６８℃、１．５分を３０サイクルであった。得られたＰＣＲ産物をZero Blunt TOPO PCR Cloning Kit For Sequencing (Invitrogen)を用いて製造者の推奨する方法に従い、pCR4Blunt-TOPOベクターへサブクローニングした。その結果、完全長ＰａＧＴが挿入されたプラスミド（pCR4-PaGT）を得た。塩基配列解析によりＰａＧＴ遺伝子に変異が生じていないことを確認した。ｐＣＲ４−ＰａＧＴをＢｓａＩで完全消化し、生成した約１．５ｋｂの断片を回収し、発現用ベクターpQE-30(QIAGEN)のBamHI部位にサブクローニングし、pQE-30-PaGTを構築した。得られたpQE-30-PaGTを用いて大腸菌XL1-Blueを形質転換した。
【００５０】
得られた形質転換体（XL1-Blue）を６０μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地（１０g/lトリプトン、５g/l酵母エキス、１０g/lＮａＣｌ）１０ml中で一晩振盪培養した。培養液全量を同組成の培地２lに接種し、３７℃で振盪培養した。ＯＤ６００が０．５に達した時点で、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、終濃度４００μM）を添加し、２０℃で一晩振盪培養した。
【００５１】
以下の操作は、全て４℃で行った。培養した形質転換体を遠心分離（５，０００×ｇ、１５分間）を用いて集菌し、破砕バッファー（１００mMリン酸カリウムバッファー：ＫＰＢ、ｐＨ７．２、１５mM２−メルカプトエタノール：２−ＭＥ）を加え、よく懸濁させた。次いで、超音波を用いて菌体を粉砕し（１分間×１０回）、遠心分離（８，０００×ｇ、２５分間）によって沈殿を分離した。この上清にポリエチレンイミン（終濃度０．１２％）を加え、よく攪拌し、氷浴中で３０分間静置した。その後、遠心分離（８，０００×ｇ、２５分間）によって上清を粗酵素液として回収した。
【００５２】
次いで、HisTrap Kit（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて粗酵素液を精製した。Buffer K（１００mMＫＰＢ、１５mM２−ＭＥ、１０mMイミダゾール）で平衡化したHiTrap Chelatingカラムに粗酵素液をアプライし、Buffer Kでカラムを洗浄した。つづいて、Buffer L（１００mM ＫＰＢ、１５mM２−ＭＥ、２００mMイミダゾール）を用いてカラムに結合したタンパク質を溶出した（１０ml）。これをAmicon Ultra-15 30,000 MWCO（MILLIPORE）を用いて１mlまで濃縮した。
【００５３】
ＰａＧＴ酵素活性の測定
反応液の組成は、５０μMグルコース受容体、１００μMＵＤＰグルコース、５０mMＫＰＢ pH７．２であり、最終液量は、１００μlであった。この反応液をDry Thermo Unit DTU（TAITEC）で３０℃、１０分間プレインキュベーションし、酵素液を添加し、反応を開始させた。同温度で１時間インキュベーションにした後、２．５％ＴＦＡ水溶液１５０μlを加え、反応を停止させた。反応液を遠心分離（１５，０００rpm、１分間）し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液を分析した。カラムは、ＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（nakalai tesque）を用いた。なお、酵素反応に使用する酵素量は反応生成物量が基質の初期量の約１０％になるように調節した。
【００５４】
ＰａＧＴがカプサイシンに対して活性があることが観察され、ヨウシュヤマゴボウ培養細胞によるカプサイシンの配糖体化がＰａＧＴによるものであることが示された。ＰａＧＴは８−ノルジヒドロカプサイシン、ベタニジン、フェノール類、フラボノイド類、クマリン類であるエスクレチンに対して活性を示した。
【００５５】
ｐＨ依存性
上記の反応液中のバッファーを酢酸−リン酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ４−１０）に代え、ＰａＧＴのpH依存性を評価した。
【００５６】
ｐＨ安定性
酵素液２０μlに対し、上記の１０μlの０．５Ｍバッファーを加え２０℃で８時間インキュベーションした。その後、１MＫＰＢ（pH７．２）を２０μl加え、残存活性を上記pH依存性に記載された方法によって測定し、ＰａＧＴのpH安定性を評価した。その結果、反応至適pHは６．５であり、pH７．０において安定であった。
【００５７】
温度依存性
酵素反応のインキュベーション温度を２０〜５５℃までの５℃間隔で行うことによりＰａＧＴ活性の温度依存性を評価した。
【００５８】
温度安定性
酵素液を上述した温度で１時間インキュベーションした。処理後の残存酵素活性を上記の方法によって測定し、ＰａＧＴの温度安定性を評価した。
【００５９】
その結果、ＰａＧＴの反応至適温度は４５℃であり、４０℃以下で安定であった。
【００６０】
阻害剤の影響
０．１mMの各種金属イオンを含むアッセイ系で酵素活性を測定し、金属イオンを含まない同条件のアッセイ系での酵素活性と比較することにより、各金属イオンの影響を調べた。また、１mMのウリジン、ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰ、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含むアッセイ系で酵素活性を測定し、生成物阻害を調べた。なお、これらの阻害剤の影響を評価するアッセイ系では、反応液の緩衝液としてＫＰＢに代えてＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（pH７．２）を用いた。
【００６１】
その結果、ＰａＧＴ活性は、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｈｇ２＋又はＺｎ２＋によって著しく阻害された。コントロールに対する相対活性は、Ｃａ２＋で３４％、Ｃｄ２＋で９％、Ｃｏ２＋で２３％、Ｃｕ２＋で２１％、Ｍｇ２＋で６７％、Ｍｎ２＋で６７％、Ｎｉ２＋で６２％、Ｓｎ２＋で１０４％であった。また、アッセイ系に１mMＥＤＴＡを添加して反応させたところ、酵素活性にはほとんど影響が見られなかった。また、ウリジン、ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰ、ＤＥＰＣ、ＰＭＳＦによるＰａＧＴ活性の阻害も見られなかった。
【００６２】
ＨＰＬＣによる基質特異性
ＵＤＰグルコースに代えて、ＵＤＰガラクトース、ＵＤＰグルクロン酸を用いて酵素反応を行った。また、ベタニジンに代えてサリチル酸、ｍ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、サリチルアルコール、ヒドロキノン、ｔｒａｎｓ−ｐ−クマリン酸、カフェイン酸、ダイゼイン、ゲニステイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、ナリンゲニン、４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン、アウレウシジン、エスクレチン、８−ノルジヒドロカプサイシンを用いて酵素反応を行った。アッセイ方法は、基質が異なる点以外は、上記の方法に従った。
【００６３】
ＰａＧＴは、ＵＤＰグルコースに比べると活性は低い（ＵＤＰグルコースに対する相対活性で４７％）が、ＵＤＰガラクトースも糖供与体として認識した。
【００６４】
また、各糖受容体に対する活性を下記に示す。なお、値はカフェイン酸に対する活性を１００％としたときの相対活性％である。
サリチル酸                                          −
ｍ−ヒドロキシ安息香酸                            ２７
ｐ−ヒドロキシ安息香酸                              −
サリチルアルコール                                  ３．２
ヒドロキノン                                        −
ｔｒａｎｓ−ｐ−クマリン酸                        １９
カフェイン酸                                    １００
ダイゼイン                                        ６６
ゲニステイン                                      ８０ 
ケンフェロール                                    ３７
ケルセチン                                        ８０
アピゲニン                                        ８３
ナリンゲニン                                      ５９
４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン    ７３
アウレウシジン                                    ９１
エスクレチン                                      ６５
８−ノルジヒドロカプサイシン                      ６５
ベタジニン                                        １８
【００６５】
なお、上記ＤＮＡプローブの作製に際して、本発明の塩基配列において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）を含むバッファーによる４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含むバッファーによる６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００６６】
本発明によれば、混入物が少なく食品用途に安全なカプサイシン配糖体を効率的に生産することができる。
【００６７】
本発明の酵素は、脂質代謝亢進作用など種々の薬理活性を有するカプサイシンの有効量を継続的に摂取することができるカプサイシン配糖体の製造に有用である。
【配列表】
2008048612000001.app