(57)【要約】【課題】麹菌において、アフラトキシンのような毒性物質の生合成遺伝子クラスターのような数十〜数百ｋｂにも及ぶ大きな染色体領域を効率的に欠失させる方法を提供すること。【解決手段】トリコモナス科糸状菌に属し有性世代を持たない菌であってKu遺伝子が抑制されていることにより相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌を、該形質転換菌において欠失の対象となる染色体領域の両端の断片と相同な塩基配列を有する一組の相同領域アームを有する染色体領域欠失用ベクター（直接欠失型ベクター）で形質転換させ、該染色体領域欠失用ベクターと形質転換菌の染色体との間の相同組換えにより、該染色体領域を欠失させる方法、及び、該方法によって作製された、染色体領域の一部が欠失している形質転換菌。【選択図】    図１
2008263927.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリコモナス科糸状菌に属し有性世代を持たない菌であってKu遺伝子が抑制されていることにより相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌を、該形質転換菌において欠失の対象となる染色体領域の両端の断片と相同な塩基配列を有する一組の相同領域アームを含む染色体領域欠失用ベクターで形質転換させ、該染色体領域欠失用ベクターと形質転換菌の染色体との間の相同組換えにより、該染色体領域を欠失させる方法。
【請求項２】
相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌が、Aspergillus sojae ASKUPTR8株(wh, ΔpyrG, ku70::ptrA)(FERM BP-10453)である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌が、Aspergillus oryzae RkuN16ptr1株である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
相同領域アームの長さが１〜３ｋｂである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
相同領域アームが欠失の対象となる染色体領域のいずれかの端の最も外側に位置する遺伝子又はその一部を含む塩基配列から成る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
染色体領域欠失用ベクターの相同領域アームの間に選択マーカー遺伝子が含まれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
選択マーカー遺伝子がpyrG, sC 又はniaDから選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
欠失の対象となる染色体領域の長さが１５ｋｂ〜２００ｋｂである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
欠失の対象となる染色体領域が毒性物質の生合成に関与する遺伝子クラスターを構成している、請求項８記載の作製方法。
【請求項１０】
毒性物質がアフラトキシンである、請求項９記載の作製方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法で作製された、染色体領域の一部が欠失している形質転換菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）及びアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryze）等の麹菌に代表される、トリコモナス科糸状菌に属し有性世代を持たない菌であってKu遺伝子が抑制されていることにより相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌を、染色体領域欠失用ベクターで形質転換させ、該染色体領域欠失用ベクターと形質転換菌の染色体との間の相同組換えにより、該染色体領域を欠失させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae ）及びアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）等の麹菌は、醤油、酒、味噌などの伝統的な食品の醸造や酵素の生産等のために工業的に広く用いられている、また近年の麹菌（アスペルギルス・オリゼ）の全ゲノム配列の決定やマイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析などの進展に伴い、遺伝子工学的な改変、特に染色体レベルの改変により酵素等の生産性や増殖速度の改良などの効果が期待される糸状菌である。
【０００３】
しかしながら、麹菌は相同組換え頻度が低く、従来の方法では染色体の任意の領域に対する大領域欠失株を作製することは極めて困難であった。例えば一つのベクターを染色体上の任意の領域に組込む場合においても相同組換えの頻度1〜2％と低いために形質転換体を数十から百株程度取得し、その中から目的の株を取得する必要があった（非特許文献１）。またここから大領域の欠失株を取得するには、欠失させる領域の両端間の組換え株を選択する必要があるが、これは相同組換え頻度の低い麹菌では極めて困難であった。しかしながら、本発明者による最近の研究により非相同組換えに関与する遺伝子を破壊することで遺伝子ターゲッティング頻度（相同組換え頻度）が非常に向上することが明らかとなった（特許文献１）。
【０００４】
ところで、アフラトキシンはAspergillus flavus あるいはAspergillus parasiticusと呼ばれるアスペルギルス属のカビが生産する毒素で、天然物の中では最強の発ガン物質として知られている。熱帯地方ではこのカビによる穀物汚染が大きな問題となっており、１９６０年には英国でカビに汚染された穀物を食べた七面鳥が大量に死亡する事件（七面鳥X病事件）の原因となった。また麹菌はアフラトキシン生産菌と類縁菌であるため、麹菌にアフラトキシン生産性があるのではないかと疑われ、様々な面から研究が進められた（非特許文献２）。その結果、麹菌はいかなる条件においてもアフラトキシンを生産しないものの、アフラトキシン生産菌が持つアフラトキシンを生合成する為の約60 kbに及ぶ遺伝子クラスター（非特許文献３）のホモローグを保持していることが判明した。
【０００５】
そこで、食の安全をより高めるためにもこの遺伝子クラスターを除去することが強く望まれていたが、麹菌の相同組換え頻度が低いことに加えて、アフラトキシン生合成クラスターの遺伝子群は麹菌では発現しておらず（非特許文献４）、表現型による選択が出来ないためにアフラトキシンクラスターの欠失変異株を人為的に作製することは極めて困難であった。
【特許文献１】特開２００６−１５８２６９号公報
【非特許文献１】Takahashi et al. Mol. Gen. Genet. (2004) 272: 344-52
【非特許文献２】松島ら（2004）日本醤油研究所雑誌31: 5-11
【非特許文献３】Yu et al. (2004) Appl Environ Microbiol 70: 1253-1262
【非特許文献４】Matsushima et al. (2001) Appl Microbiol Biotechnol 55: 771-776
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の主な目的は、アフラトキシンのような毒性物質の生合成遺伝子クラスターのような数十〜数百ｋｂにも及ぶ大きな染色体領域を効率的に欠失させる方法、及びこうのような方法で作製された、例えば、遺伝子工学的操作を加えても、該領域にコードされる毒性物質が産生され得ないような形質転換菌を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決すべく研究の結果、特許文献１に記載されたような相同組換え頻度の向上した麹菌、及び、欠失させたい染色体領域の両端の断片と相同な塩基配列を含む欠失用ベクターを用いることで、効率的に十数ｋｂ〜約２００ｋｂにも及ぶ長い領域の欠失株が取得できることが判明し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、トリコモナス科糸状菌に属し有性世代を持たない菌であってKu遺伝子が抑制されていることにより相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌を、該形質転換菌において欠失の対象となる染色体領域の両端の断片と相同な塩基配列を有する一組の相同領域アームを有する染色体領域欠失用ベクター（直接欠失型ベクター）で形質転換させ、該染色体領域欠失用ベクターと形質転換菌の染色体との間の相同組換えにより、該染色体領域を欠失させる方法、及び、該方法によって作製された、染色体領域の一部が欠失している形質転換菌に係るものである。尚、本発明方法の一例を模式的に図１に示す。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、元々、相同組換え頻度の低い麹菌において、例えば、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターのような十数ｋｂから数百ｋｂに及ぶ長い染色体領域を、極めて効率的に欠失させることが出来、その結果、例えば、染色体において大きな領域を占める遺伝子クラスターの欠失株が容易に作製でき、安全性の面から極めて好ましい菌株を提供することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の方法で使用する「トリコモナス科糸状菌に属し有性世代を持たない菌であってKu遺伝子が抑制されていることにより相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌」は、特許文献１に記載された方法で作製することが出来る。即ち、該形質転換菌は、トリコモナス科糸状菌に属し有性世代を持たない菌のKu遺伝子を抑制することにより作製されたものである。ここで、「有性世代を持たないトリコモナス科糸状菌」に菌学的に分類される菌の種類及び範囲は当業者に明らかであり、その代表的な例としては、アスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼ等のアスペルギルス属に、及びペニシリウム属等に属する菌を挙げることが出来る。これらの菌は、市販品として、又は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）等の公的寄託機関から入手することも可能である。
【００１１】
「Ku遺伝子」は、既に記載したように、例えば、Ku70遺伝子及びKu80遺伝子等の非相同組換え機構に関与する遺伝子である。その具体例として、アスペルギルス・ソーヤ由来のKu70遺伝子（配列番号１）及びKu80遺伝子（配列番号２又は配列番号３）、並びに、アスペルギルス・オリゼ由来のKu70遺伝子（配列番号４）及びKu80遺伝子（配列番号５又は配列番号６）を挙げることが出来る。尚、これらアスペルギルス・ソーヤとアスペルギルス・オリゼーのKu70遺伝子及びKu80遺伝子の相同性（アミノ酸レベル）は９５％以上と高いことが判明した。又、これら遺伝子とアカパンカビのホモログとの相同性（アミノ酸レベル）は約５０％である。
【００１２】
即ち、Ku遺伝子の好適例として、配列番号１ないし６のいずれか一つの配列に示されたアミノ酸配列から成るタンパク質、又は、該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、又は、相同性（同一性）の程度が、全体の平均で、約９０％以上、好ましくは約９５％以上であり、かつ非相同組換え機構に関与する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることが出来る。
【００１３】
更に、Ku遺伝子の好適例として、配列番号１ないし６のいずれか一つの配列に示されたコード領域を含むＤＮＡ、又は、該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、非相同組換え機構に関与する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることが出来る。
【００１４】
配列番号１ないし６における各コード領域は、アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼーのゲノム配列に関する情報に基づいて、アカパンカビKuホモログとの配列の比較及びGT-AG則などによるイントロン配列の規則性を基に決定した。アスペルギルス・ソーヤのKuのゲノム配列はプライマーkuU459-kuL4222およびku2U830-ku2L4937（アスペルギルス・オリゼーのゲノム配列及びアカパンカビKuホモログのゲノム配列を基に作成）を用いてアスペルギルス・ソーヤATCC46250のゲノムDNAを鋳型としＰＣＲにより増幅した断片をTOPO-TAクローニングkit（invitrogen社）によってクローニングした後、定法に従って配列を読むことによって決定した。
【００１５】
ここで、ハイブリダイゼーションは、Molecular cloning third.ed.（Cold Spring Harbor Lab.Press，2001）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００１６】
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００１７】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度150〜900mM、好ましくは600〜900mM、pH 6〜8であるような条件を挙げることが出来る。
【００１８】
従って、配列番号１ないし配列番号４に示されたコード領域を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約９０％以上、好ましくは約９５％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることができる。尚、塩基配列間の同一性は、当業者に公知のアルゴリズム、例えば、Blastを用いて決定することができる。
【００１９】
本発明の形質転換菌において、Ku遺伝子の抑制は当業者に公知の任意の方法で実施することが出来る。例えば、本明細書中の実施例に具体的に記載されているような方法で、Ku遺伝子破壊ベクターを使用してKu遺伝子を破壊したり、又は、Ku遺伝子のアンチセンス発現ベクターを利用するアンチセンスＲＮＡ法によって、Ku遺伝子を不活化することが可能である。こうして得られる形質転換菌は、このようなKu遺伝子の抑制に関する遺伝子操作が施される前の元の菌と比較して、相同組み換え頻度が顕著に上昇している。具体的には、少なくとも１０倍、好ましくは、少なくとも約６０倍上昇している。
【００２０】
このような形質転換菌の代表的な例として、特許文献１に記載されているAspergillus sojae ASKUPTR8株(wh, ΔpyrG, ku70::ptrA)、及び、Aspergillus oryzae RkuN16ptr1株を上げることが出来る。尚、Aspergillus sojae ASKUPTR8株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６に所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに平成１６年１２月２日付で寄託され、受領番号FERM P-20311が付されている。その後、平成１７年１１月１７日付で特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブタペスト条約に基く国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-10453が付与されている。
【００２１】
本発明方法において、該形質転換菌の或る染色体領域を欠失させるために使用される染色体領域欠失用ベクターは、該染色体領域の両端の断片と相同な塩基配列を有する一組の相同領域アームを含むことを特徴とする。この相同領域アームの長さは、欠失させる染色体領域等に応じて適宜選択することが出来るが、高い相同組換え頻度を得るには、或る程度の長さ、例えば、約１〜３ｋｂであることが好ましい。尚、ここで、「染色体領域の両端の外側の断片と相同な塩基配列」とは、該染色体領域欠失用ベクターと形質転換菌の染色体との間に相同組換えを起こさせるに十分な程度の同一性が塩基配列の間に見られることを意味し、塩基配列が完全に同一である必要はない。
【００２２】
欠失の対象となる染色体領域が遺伝子クラスターである場合には、染色体領域欠失用ベクターに含まれる相同領域アームが欠失の対象となる染色体領域のいずれかの端の最も外側に位置する遺伝子又はその一部を含む塩基配列を有するものとすることができる。このような場合には、欠失の対象となる染色体領域のいずれかの端の最も外側に位置する遺伝子又はその一部を含む塩基配列をＰＣＲ等の適当なＤＮＡ増幅技術で増幅し、増幅された配列を相同領域として使用することによって、相同領域アームを容易に作製することが出来る。従って、例えば、欠失の対象となる染色体領域がアフラトキシン遺伝子クラスターの場合には、本明細書中の実施例に記載されたように、夫々、moxY遺伝子を含む塩基配列及びpksA遺伝子を含む塩基配列を相同領域アームとして使用することができる。
【００２３】
このような場合には、相同領域に含まれている遺伝子クラスターの両端に位置する遺伝子又はその一部の塩基配列は相同領域アームに含まれているために、対象となる染色体領域が欠失した後も染色体に残る。しかしながら、遺伝子クラスターに含まれる該遺伝子以外の遺伝子群が欠失したことにより、その遺伝子クラスターが関与する物質がもはや生合成されなくなっているので、安全性の面から極めて好ましい菌株を提供するという、本発明の目的は充分に達せられることになる。従って、本発明において欠失の対象となる線束帯領域（遺伝子クラスター）には、或る物質の生合成に関与する全ての遺伝子が必ずしも含まれている必要はない。
【００２４】
或いは、相同組換えによって欠失した染色体領域に含まれていた当該遺伝子の他の一部の塩基配列が失われたことにより、当該遺伝子の機能がもはや保持されていない状態（転写不能、機能性の蛋白質又はペプチドの翻訳不能等）になっている限り、本発明の効果は得られる。従って、欠失対象となる遺伝子クラスターの両端に位置する遺伝子が完全に欠失されている必要はない。
【００２５】
更に本発明方法において相同組換えを利用して作製した染色体領域の欠失株を効率的に選択する目的で、上記の染色体領域欠失用ベクターの相同領域アームの間に当業者に公知の適当な選択マーカー遺伝子が含ませることが好ましい。このような選択マーカー遺伝子の例として、pyrG, sC 及びniaD等を挙げることが出来る。従って、本発明の方法で作製された、染色体領域の一部が欠失している形質転換菌は、培養過程において、このような選択マーカーを利用して容易に選択することができる。
【００２６】
本発明方法によって欠失される染色体領域の染色体上の位置及び大きさ等に特に制約はないが、本発明方法によって、十数〜数百ｋｂ、例えば、１５ｋｂ〜２００ｋｂにも及ぶ大きな染色体領域を欠失させることが可能である。このような染色体領域の一例として、アフラトキシンのような毒性物質の生合成に関与する遺伝子クラスターを構成しているものを挙げることが出来る。尚、このような染色体領域の染色体上の位置及び大きさ、並びに該染色体領域の両端の外側の領域の塩基配列等は当業者に公知である。
【００２７】
尚、染色体領域欠失用ベクターによる形質転換は、プロトプラストＰＥＧ法及びエレクトロポレーション法等の当業者に公知の任意の方法で行うことが出来る。
【００２８】
以下、実施例に則して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。尚、以下の実施例における各遺伝子操作の手段・条件等は、特に断わりがない限り、例えば、特開平８−８０１９６号公報等に記載されている当業者に公知の一般的な方法に従い実施した。
【実施例】
【００２９】
実験方法
［使用菌株］
Aspergillus sojae ASKUPTR8株(wh, ΔpyrG, ku70::ptrA)およびAspergillus oryzae RkuN16ptr1株(wh, ΔpyrG, ku70::ptrA)を使用した。A. sojae Askuptr8はA. sojae I-6株から作製したku70破壊株であり、A. sojae  I-6株は ATCC46250から作成したpyrG deletion株（Takahashi et al.2004）。RkuN16ptr1株はRIB40株から作製したku70破壊株であり、その作製方法は特許文献１に詳細に記載されている。
【００３０】
［使用培地］
ポリペプトンデキストリン（ＰＤ）培地（polypepton 1%, dextrin 2%, KH2PO4 0.5%, NaNO3 0.1%, MgSO4 0.05%, casamino acid 0.1%, pH 6.0）、CzapekDox (CZ) 最小培地、再生培地として1.2M ソルビトール CZを使用した。2mg/ml 5fluoroortic acid (SIGMA) および20mM Uridine含有CZ培地はpyrG-（ウリジン要求）株のポジティブセレクション用の培地として使用した。
【００３１】
［形質転換］
150ｍl容三角フラスコ中の20ｍＭ Uridineを含むポリペプトンデキストリン液体培地50ｍlに分生子を接種し、30℃で約20時間振とう培養を行い、菌体を回収した。回収した菌体を0.7M KCl bufferで洗浄し、1％Lysing enzyme(シグマ社)を含む0.7M KCl buffer中で30℃、3時間緩やかに振とうし、プロトプラストを調製した。得られたプロトプラストを1.2Ｍソルビトール bufferで洗浄した後、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行った。形質転換体の再生は0.5％agarを含む1.2Ｍソルビトール-ＣＺ培地上で行った。
【００３２】
［大領域欠失用ベクターの構築］
本実験で使用したプライマーを表１に示す。
【００３３】
【表１】
2008263927.tif 000003
【００３４】
［アフラトキシン生合成遺伝子クラスター（60 kb）欠失用ベクターの作製］
pksAを含む2 kbの領域とmoxYを含む2 kbの領域を両端のアームとし、pyrGを選択マーカーに持つアフラトキシン生合成遺伝子クラスター欠失用のベクターpPkvb1をfusion PCRにより構築した。まずプライマーA-B、C-D、PU-PLを用いて麹菌ゲノムDNAを鋳型として1st PCRを行い、pksA側のアーム、moxY側のアームおよびpyrGマーカー領域を増幅した。次にこれらの断片をQIAquick Gel Extraction kitを用いて精製し、混合したものを鋳型として新たにプライマーpksU-AF-Lで2nd PCRを行い、アフラトキシン生合成遺伝子クラスター欠失用ベクターpPkvb1を得た。
【００３５】
［190 kb領域欠失用ベクターの作製］
pksAを含む2 kbの領域と、そこから186kb離れた領域に位置する2 kbの領域を両端のアームに持つ190 kb領域欠失用のベクターpPk217-20kのベクターをfusion PCRにより構築した。まずプライマーA-B、E-F、PU-PLを用いて麹菌ゲノムDNAを鋳型として1st PCRを行い、pksA側のアーム、190 kb側のアームおよびpyrGマーカー領域を増幅した。次にこれらの断片をQIAquick Gel Extraction kitを用いて精製し、混合したものを鋳型として新たにプライマーpksU-190Lで2nd PCRを行い、190 kb領域欠失用ベクターpPk217-20kを得た。
【００３６】
［200 kb領域欠失用ベクターの作製］
pksAを含む2 kbの領域とそこから203-kb離れた領域に位置する2 kbの領域を両端のアームに持つ200 kb領域欠失用のベクターpPk217のベクターをfusion PCRにより構築した。まずプライマーA-B、G-H、PU-PLを用いて麹菌ゲノムDNAを鋳型として1st PCRを行い、pksA側のアーム、200 kb側のアームおよびpyrGマーカー領域を増幅した。
次にこれらの断片をQIAquick Gel Extraction kitを用いて精製し、混合したものを鋳型として新たにプライマーpksU-200Lで2nd PCRを行い、200 kb領域欠失用ベクターpPk217を得た。
【００３７】
［fusion PCRの条件］
一般的なfusion PCRの手法を用いて実験を行った（Yang et al. (2004) Eukaryot Cell 3: 1359-1362）。1st PCR：94℃で1分30秒保持した後、 94℃20秒-70℃1秒-55℃30秒-72℃2分を35サイクル。2nd PCR：94℃で1分30秒保持した後、 94℃20秒-70℃1秒-55℃30秒-72℃5分30秒を35サイクル繰り返した。増幅にはKOD plus（東洋紡製）を使用した。
【００３８】
［サザンハイブリダイゼーション］
サザンハイブリダイゼーションはHybond-N+のメンブレンフィルター（アマシャムファルマシア社）を使用し、一般的な方法により行った。検出にはDIG Luminescent Detection Kit（ロシュ社）を使用し、メーカーの推奨する方法で行った。pksAおよびmoxYのプローブの作製はそれぞれpkUとpkLおよびmoxUとmoxLのプライマーを用い、PCR DIG Probe Synthesis Kit（ロシュ社）によって行った。
【００３９】
結果と考察
fusion PCRにより構築したアフラトキシン生合成クラスター欠失用ベクターpPkvb1および190kb領域欠失用のベクターpPk217-20kおよび200kb領域欠失用のベクターpPk217を用いてA. sojae Askuptr8株を親株として形質転換を行った。pPkvb1を用いて得られた形質転換体各2株およびpPk217-20k で得られた5株そしてpPk217で得られた10株からそれぞれゲノムDNAを抽出し、PCRおよびサザンハイブリダイゼーションによるベクター組込みの確認を行った。まずPCRによる解析を行ったところ、欠失領域の外側に立てたプライマーpksUとAF-L (moxyL) を用いるとアフラトキシン生合成クラスター欠失株No.1、2（図2-丸数字１、レーン1、2）でバンドが増幅されることが確認された。同様にプライマーpksUと190Lを用いると、190kb領域欠失株No.4、5（図2-丸数字２、レーン4、5）でバンドが増幅されることが確認された。またプライマーpksUと200Lを用いた場合には200-kb領域欠失株No.2、5、6（図2-丸数字３、レーン2、5、6）でバンドが増幅されることが確認された。欠失が起きていないゲノムDNAではバンドは増幅されないため、これらのバンドが増幅された株には目的部位が欠失した核と元のままの核が混在したヘテロカリオンのものが含まれることが予想される。
【００４０】
そこで次にサザンハイブリダイゼーションを行った。Bgl IIで消化した各形質転換体のゲノムDNAを用い、pksAプローブを用いた場合には親株で5.7 kbのバンド(図3A、レーン１)がアフラトキシンクラスター欠失株No.1、2では10 kbへとシフトした（図3A、レーン7-8）。また190 kb欠失株No.4では15 kbへとシフトしていた（図3A、レーン5）。またmoxYをプローブとした場合には、親株では5.7 kbのバンドが見られる（図3B、レーン1）のに対し、アフラトキシンクラスター欠失株では10 kbへのシフトが見られ、190 kb領域欠失株では全くバンドが見られない（図３B、レーン5）ことが判明した。また200 kb領域欠失株でも同様にサザンハイブリダイゼーションによる確認を行ったところ、pksAをプローブとした場合には親株で5.7 kbのバンドが見られる（図４A、レーン1）のに対し、200 kb領域欠失株No.6、7ではバンドが15 kbへとシフトしていた（図４A、レーン6-7）。またmoxYをプローブとした場合には親株では5.7 kbのバンドが見られる（図４B、レーン1）が、200 kb領域欠失株No.6、7ではバンドが全く見られない（図４B、レーン6-7）ことが判明した。これらのことからアフラトキシン生合成クラスター欠失株No.1、2および190 kb領域欠失株No.4および200 kb領域欠失株No.6、7では、最終的に目的の領域が欠失していることが確認された。欠失株の取得頻度はアフラトキシン生合成クラスター全長では100％（2株中2株）、190 kb領域の欠失で20％（5株中1株）、200 kb領域の欠失で20％（10株中2株）であった。
【００４１】
次にKu70が破壊されていない株を親株としてアフラトキシン生合成クラスターの欠失を試みた。親株としてはA.sojae I-6株を使用（非特許文献１）し、アフラトキシン生合成クラスター欠失用ベクターpPkvb1を用いて形質転換を行った。得られた形質転換体10個からゲノムDNAを抽出しサザンハイブリダイゼーションを行った結果を図５に示す。pksAをプローブとしたところ、親株（図5、レーン１）と比較して形質転換体（図５、レーン2〜11）のバンドパターンに全く変化はなかった。このようにKu70が破壊されていない株を親株とした場合にはアフラトキシン生合成クラスターの欠失株は全く取得出来なかった。
【００４２】
またA.oryzaeについても同様にアフラトキシン生合成遺伝子クラスター欠失用ベクターpPkvb1を用いて形質転換を行った。親株としてA.oryzae RKuN16ptr1株（ΔKu70株）を用いて得られた形質転換体８株からゲノムDNAを抽出し、プライマーpksUとmoxyLを用いてPCRによる欠失の確認を行った。親株ではバンドが増幅されないに対し（図６、レーン１）、形質転換体では８株中７株で6 kbのバンドが増幅されることが確認された（図６、レーン２、３、５〜９）。この結果から6 kbのバンドが増幅された形質転換体にはアフラトキシンクラスターが欠失した核が少なくとも一つ存在することが明らかとなった。  
【００４３】
続いてこれらの形質転換体に対し、サザンハイブリダイゼーションを行った。BglIIで消化した各形質転換体のゲノムDNAを用い、pksAをプローブとしてハイブリを行ったところ、親株では2.4 kbのバンドが見られるのに対し（図７、レーン１）、形質転換体では８株中５株でバンドのシフトが起きていることが判り、これらの株においてアフラトキシンクラスターが欠失していることが確認された（図７、レーン２、３、７〜９）。また８株中２株では2.4 kbのバンドと17.2 kbのバンドの両方が見られることから、アフラトキシンクラスターの欠失が起きた核と元のままの核が混在したヘテロカリオンであることが確認された（図７、レーン５、６）。
【００４４】
続いてKu70が破壊されていない株であるA.oryzae RIB40 ΔpyrG株を親株としてpPkvb1を用いて形質転換を行い、得られた10株の形質転換体を同様にサザンハイブリダイゼーションにより解析したところ、pksAプローブに対し、いずれの株でも親株と同じ2.4kbのBglIIバンドのみが見られたことからアフラトキシンクラスターは欠失していないことが確認された。
【００４５】
これらの頻度をまとめたものが表２である。Ku70が破壊されていない株からは欠失株は得られないが、Ku70破壊株を用いた場合にはA.sojae、A.oryzaeともに高い頻度で大領域の欠失株が得られることが判明した。以上の結果から、本発明方法により麹菌ではこれまで作製することが非常に困難であった染色体大領域の欠失変異株、少なくとも200 kbの欠失株が効率的に取得できることが示された。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
更に、アフラトキシン生合成クラスターが存在する第３染色体のテロメア近傍以外の領域に対しても大領域欠失株の取得を試みた。即ち、Aspergillus oryzae Ku70破壊株 （RkuN16ptr1株）を用いて第８染色体のセントロメア近傍のタンナーゼ遺伝子を含む約15kbの領域の欠失を試みたところ、得られた形質転換体10株全てで欠失が起きており、高い頻度で欠失株が取得できることが確認された。このことからKu70破壊株を用いるとアフラトキシン生合成クラスター近傍に限らず、染色体上の任意の位置で大領域の欠失株を効率的に取得できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の方法を用いることでアフラトキシン生合成クラスターのように食の安全性を高めるために麹菌を用いるにあたって除去が望まれる部位の欠失株を効率的に作製できるだけでなく、染色体レベルでの遺伝的な改変が麹菌で可能となり、工業的にも大きく役に立つものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の方法の一例を模式的示したものである。
【図２】A. sojae ASKUPTR8株を用いる本発明方法で得られた染色体領域欠失株ゲノムのPCRによる解析の概要及びその結果を示す電気泳動の写真である。
【図３】A. sojae ASKUPTR8株を用いる本発明方法で得られたアフラトキシン生合成遺伝子クラスター（60kb）欠失株ゲノムのサザンハイブリダイゼーションの概要及びその写真である。
【図４】A. sojae ASKUPTR8株を用いる本発明方法で得られた染色体上の190kb領域欠失株ゲノムのサザンハイブリダイゼーションの概要及びその写真である。
【図５】A. sojae ASKUPTR8株を用いる本発明方法で得られた染色体上の200kb領域欠失株ゲノムのサザンハイブリダイゼーションの概要及びその写真である。
【図６】RkuN16ptr1株を用いる本発明方法で得られた染色体領域欠失株ゲノムのPCRによる解析の概要及びその結果を示す電気泳動の写真である。
【図７】RkuN16ptr1株を用いる本発明方法で得られたアフラトキシン生合成遺伝子クラスター（60kb）欠失株ゲノムのサザンハイブリダイゼーションの概要及びその写真である。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【配列表】
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