(57)【要約】【課題】緑膿菌では、他の色素産生性のシュードモナスと区別する迅速な技術の開発が望まれており、特に、食品加工分野で重要な、生きた菌を計測する技術の開発が望まれている。【解決手段】現実に検出対象細菌種および非検出細菌種を培養併用インサイチュ-ハイブリダイゼーション法を用いて特異性判定を行うことができるプローブを選抜して本願発明を完成させた。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列中連続する少なくとも１８以上の塩基からなる緑膿菌を検出、同定、及び/又は計測するためのプローブ。
【請求項２】
配列番号１からなる塩基配列又はその相補配列からなる核酸に標識を付した緑膿菌を特異的に検出、同定、及び/又は計測するための請求項１記載のプローブ。
【請求項３】
微生物試料を培養し微小集落を形成させ、請求項１記載のプローブを用いて、インサイチューハイブリダイゼーション法により、緑膿菌を検出、同定及び/又は計数する方法。
【請求項４】
試料微生物を、選択剤を含まない培地で、３７℃から４５℃で培養する請求項３記載の方法。
【請求項５】
ハイブリダイゼーション条件が、ハイブリダイゼーション温度が４６℃から６０℃で、ホルムアミド濃度が４６℃で２０％〜４０％、又は６０℃で１０％〜１５％である範囲内とする、請求項３の方法。
【請求項６】
請求項１記載のプローブ、ハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄液を含む、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により、緑膿菌を検出、同定及び/又は計数するためのキット。
【請求項７】
微生物試料を培養し微小集落を形成させ、請求項１に記載の緑膿菌に特異的なプローブを用いて、インサイチューハイブリダイゼーション法により、食中毒細菌を検出、同定及び/又は計数する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、衛生指標細菌群の迅速な検出及び計測する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)は、γプロテオバクテリア綱に属し、運動性を有するグラム陰性桿菌であり、土壌や水中など自然環境中に広く存在している。バイオフィルム形成能が高く、乾燥や高温条件下でも生残する力が強い。ヒトを含む動物の腸管内や上皮にも常在しており、海洋環境もその分布域となっている。緑膿菌はピオシアニンという青緑色の色素を産生し、火傷や切り傷などの傷口に感染すると緑色の膿がでることから、緑膿菌と呼ばれる。緑膿菌は、健康なヒトに感染する可能性は低いが、免疫能が低下している易感染宿主に肺炎や敗血症などの日和見感染症を引き起こす。バイオフィルム形成能の強い株では、厚いバイオフィルムにより薬剤が細胞内へ浸透しにくく、また多剤耐性株も知られ、化学療法の効果が低いことでも知られる。これらの特徴は、緑膿菌の院内感染で問題視される。また、プール、温泉などの閉鎖型レクリエーション施設の利用者に、ヘチマのスポンジを介して、毛嚢炎を引き起こした例も知られる。
【０００３】
さらに、食品衛生法では、ミネラルウォーターの製造基準として、殺菌および除菌を行なわない種類では、特定の条件下（二酸化炭素分圧が20℃で98kPa未満）で容器包装された製品あるいは原水で、緑膿菌が検出されないことが必要である。緑膿菌の検査は、アスパラギンブイヨンやmPA-B寒天培地などの選択培地を用いて増菌培養を行なった後、セトリミド培地などの選択培地で純粋分離し、色素産生性、グラム染色性、及びオキシダーゼ試験などの性状を調べ、緑膿菌と確定する。この確定までには、10日近くを要する。他にも、緑膿菌の選択培地として、ナリジキシン酸−セトリミド(NAC)寒天培地、緑膿菌選択(PASA寒天培地、Pseudosel(CET)寒天培地、及びナリジキシン酸−セトリミド−カナマイシン(CKNA)寒天培地が知られ、緑膿菌に特有の色素産生性を手がかりに検出するものがあるが、P. aeruginosaの非色素産生株、Pseudomonas fluorescensやP. putidaなどの色素産生性シュードモナス、及び非シュードモナスの色素産生菌種、例えばStenotrophomonas maltophilaなどを区別できないこともある(非特許文献１)。
【０００４】
最近では、微生物の同定に、微生物に特異的な遺伝子配列に対するプローブ又はプライマーを用いる検出方法が使用されるようになってきている。緑膿菌については、特許文献１及び非特許文献２にプライマー/プローブが記載されている。しかし、緑膿菌のみを特異検出する優れたプローブは未だなく、多くのプローブ又はプライマーが緑膿菌に近縁なシュードモナス、例えばP. fuluvaやP. pavonaceaを検出してしまう（非特許文献２）。
【０００５】
また、rRNAは、細胞あたり104個も存在することから、プローブの感度を格段に上げられ、更に、生物種間で保存領域と可変領域が存在することから、この可変領域から、生物の分類群に特異的な配列が見出されてきている(非特許文献３)。
【０００６】
【特許文献１】特開平11-332596
【非特許文献１】Journal of Basic Microbiology Vol. 43, pp.407-413 (2003年)
【非特許文献２】Journal of Microbiological Methods Vol. 47, pp.281-292 (2001年)
【非特許文献３】Applied and Environmental Microbiology Vol.63, pp.1557-1563 (1997年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の公定法とされる食品衛生検査指針に従った食中毒原因菌の検出・同定法では生菌数測定の最終結果を確定するまでに、早いものでも１０日間を要する。また菌株によっては二週間以上かかるものもあり、製品の出荷時に評価できるデータの提供ができなかった。
【０００８】
また、緑膿菌では、他の色素産生性のシュードモナスと区別する迅速な技術の開発が望まれている（Applied and Environmental Microbiology Vol.63, pp.1557-1563）。さらに、緑膿菌を包括的に検出、計測する技術が望まれており、なるほどPCR法では迅速な菌検出ができるが、死菌と生菌の区別ができない問題がある。特に、食品加工分野で重要な、生きた菌を計測する技術の開発が望まれていた。
【０００９】
また、従来からのFISH（Flurorescent in situ hybridization）法における、FISH用プローブの作成は、配列比較により所望の特性の標的領域をrRNA上に見出すことはできても、実際にFISHを行なって十分な強度の蛍光が得られるか否かは予測できないものである。これは、標的細胞自体にかかわるもの（細胞中のrRNA濃度が低い、細胞膜の透過性の問題）などに加え、rRNA上の標的領域の２次元又は３次元構造や、リボゾームタンパク質の効果により、プローブがrRNA接近できないためということもある。そこで、緑膿菌を同定検出できる、FISH法に現実的に利用可能な具体的なプローブの作成が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、まず（１）遺伝子データベースから検出対象細菌及び近縁の他の細菌群のリボソーマルRNA遺伝子の配列情報を集め、他の細菌群と区別が可能な遺伝子配列を探し出し特異遺伝子配列を決定した。なお、前記特異的遺伝子配列で表される核酸分子をプローブと呼ぶ。更に、（２）プローブに蛍光物質等で標識を行った後、現実に検出対象細菌種および非検出細菌種を培養併用インサイチュ-ハイブリダイゼーション法を用いて特異性判定を行うことができるプローブを選抜して本願発明を完成させた。
【発明の効果】
【００１１】
本願発明の方法により、緑膿菌の検出・同定法では生菌数測定の最終結果を得るまで１０時間以内で終わらせることも可能であり、きわめて優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、短時間培養で生じた微小な細菌集落(マイクロコロニー)の中から、食中毒細菌あるいは衛生指標細菌を特異的に検出することを可能にする一連の方法である。培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法では、検査対象細菌の持つ遺伝子(DNA または RNA)の特定塩基配列に相補的に結合するオリゴヌクレオチドを調製すれば、様々な食中毒細菌や衛生指標細菌の検出・計数に応用ができる。本発明者らは、新しい遺伝子プローブ、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法で検査対象細菌を特異的に検出する反応条件及び微小集落至適形成条件を初めて決定した。
【００１３】
１．培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法
１−１．培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法の特徴／利点
従来からの蛍光ラベルしたプローブを用いるインサイチューハイブリダイゼーション法では、次のような問題点があった。（１）特に食品を汚染する微生物の同定検出のためには、蛍光標識プローブでは、微生物が増殖した段階、すなわち汚染が相当に進まないと検出できない。（２）食品汚染においては、特に生菌数が問題となるところ、プローブは死菌に対してもハイブリダイズしてしまうので、生菌と死菌との区別がつかなかった。
【００１４】
これに対し、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法では、十分に希釈された試料を１〜１０時間程度培養することにより、生菌のみを増殖させ、微小な集落状とすることにより、通常の蛍光顕微鏡下で、集落を観測、計数することができるようになったものである。（３）更に、通常のインサイチューハイブリダイゼーション法では、誤って陽性と判別される混入菌を、培養併用することで、培養条件を調節して、擬陽性を除くこともできる。（４）また、従来法による病原菌や衛生指標菌を自然界から検出する場合、目的の微生物に選択性のある薬剤を添加し、検出効率を高めることがよく行なわれている。しかし、このような選択剤を添加した培地は、環境中にいる多くの生理活性の弱くなっている微生物は選択剤のために、増殖しない。他方、この培養併用FISH法の利点は、このような生理活性の弱っている微生物を選択剤を含まない培地で増殖させ、プローブで特異的に検出できる。
【００１５】
１−２．培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法の概要
（１）試料の固着、例えば、メンブレンフィルター上への試料の捕集
食品、環境等から分離された試料が試料支持体、例えば、ポリカーボネート製やセルロースアセテート製フィルター上へ吸引することにより捕集させられる。フィルターとしては、例えば、ヌクレオポアフィルター、アイソポアフィルター、マイレクスフィルターを用いることができ、好適には、例えば0.2μｍの孔径のフィルターアイソポアメンブレンフィルターを用いることができる。
（２）試料の培養  微小集落の形成
試料が付着した試料支持体、例えば、メンブレンフィルターは、培地の入ったペトリ皿に移される。37℃で、微小集落が形成されるまで、例えば、１〜１０時間、好適には５〜７時間、例えば、６時間培養される。
（３）蛍光標識を用いた場合の細菌の検出及び細菌数計測の概要
（イ）  エタノールなどでスライドグラス又はフィルター上の細胞が固定される。フィルターはスライドガラスに固定される。
（ロ）エタノール浸漬又はオーブン等で乾燥される。
（ハ）ハイブリダイゼーション用バッファーにスライドガラスごとフィルターは浸漬されハイブリダイゼーション温度でインキュベートする。
（ニ）オリゴヌクレオチドプローブが添加され、インキュベーションを継続する。
（ホ）試料の載せられたフィルター又はスライドガラスを洗浄し、空気乾燥される。
（ヘ）蛍光顕微鏡で観察する。通常X10〜X1000で観察できる。
【００１６】
１−３．本件発明の緑膿菌検出用プローブの調製
１６Ｓ ｒＲＮＡを同定、検出及び/又は計数用のプローブの対象遺伝子として用いた。
具体的には、（１）緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)及びこれに近縁の系統の細菌、具体的には、P. agarici, P. fulva, P. monteillii, P. flavescens, Acinetobacter radioresistensの16S rＲＮＡの塩基配列を例えば、GenBankデータベース及びリボソーマルデータデースプロジェクトが運用するデータベース(http://rdp.cme.msu.edu/)から収集し、緑膿菌株に共通である塩基配列であって、しかも近縁の系統の細菌、具体的にはP. agarici, P. fulva, P. monteillii, P. flavescens, Acinetobacter radioresistensとはミスマッチする約２０塩基の塩基配列を検索する。（２）検索により、緑膿菌株に共通な塩基配列とマルチプルアライメントに用いた上記各菌種の16S rRNAの同領域の塩基配列を比較し、緑膿菌以外の菌種に対しては比較的ミスマッチ数が大きく、緑膿菌株に対してはミスマッチの少ないものを、緑膿菌特異的プローブ候補として選択した。この操作は、on-line probemer（http://probemer.cs.loyola.edu/）で検証することが可能である。（３）つぎに、実際に、緑膿菌プローブ候補を用いて緑膿菌及び非緑膿菌をFISH法によりアッセイした。その結果、緑膿菌試料の全てから蛍光が検出され、またプローブを加えないFISHでは蛍光が認められないプローブを緑膿菌検出用プローブとすることができる。
【００１７】
また、見いだした配列はギブスの自由エネルギー計算を行い(Yilmaz et al., 2004. Appl. Environ. Microbiol. 70:7126-7139.)、プローブの特異性を維持したままで標的のrRNAの特異領域と最も反応性が高くなるように配列を調整したものである（表１）。
【００１８】
その配列は、TGAATCCAGGAGCAAGCTCCCTTC（配列番号1：プローブ名PAE75）（24塩基）、AGATCCCCCACTTTCTCCCTCAGGA(配列番号2：プローブ名PAE184）（25塩基）、GGATTTCACATCCAACTTGCTGAA(配列番号3：プローブ名PAE589）（24塩基）あるいは、３者ともその近辺、例えば、その両側又は片側に1塩基から3塩基を含くむ配列を含むものである。
【表１】
2008263829.tif 000002
【００１９】
２．新規プローブを用いた培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法の確立
２−１．培養条件の検討
緑膿菌は普通寒天培地で、37℃でよく増殖するが、最高45℃まで増殖可能である。培養時間及び温度としては、例えば、１〜１０時間、37℃〜45℃で培養でき、好適には、６〜８時間培養することができる。
【００２０】
２−２．ハイブリダイゼーション条件の検討
それぞれのプローブについて、ハイブリダイゼーション温度及びホルムアルデヒドの濃度を変化させ、プローブの特異性を確認した。例えば、ハイブリダイゼーション温度としては、45℃から60℃までの間の温度で、ホルムアルデヒド濃度を20％から40％まで変化させ、目的の特異性が示されるハイブリダイゼーション条件を定めることができる。
【００２１】
たとえば、緑膿菌特異的プローブTGAATCCAGGAGCAAGCTCCCTTC（配列番号１：プローブ名PAE75）（24塩基）については、以下の通りハイブリダイゼーション条件を検討した。
【００２２】
PAE75の配列とミスマッチが少ない16S rRNAを有する微生物をまず、データベースより抽出し、これら微生物について、上記したハイブリダイゼーション条件下で、 蛍光標識したPAE75とハイブリダイズするかを蛍光顕微鏡で確認し、PAE75が緑膿菌にのみ又は、緑膿菌以外へのハイブリダイズが少なく、緑膿菌とは十分ハイブリダイズするハイブリダイズする条件を検討し決定した。
【００２３】
PAE75プローブは、ホルムアミド濃度が30-40%の反応液を用い、46℃で反応させること、又は、ホルムアミド濃度が20-40%の反応液を用い、60℃で反応させることにより、高い特異性を示した。
【００２４】
各プローブがハイブリダイズする条件は、以下のハイブリダイズ固有値の範囲を用いて表すこともできる。
【００２５】
ハイブリダイゼーション固有値は次の通り定義される。
【００２６】
[数１]
ハイブリダイズ固有値(K)(℃)＝ハイブリダイゼーション温度（℃）+0.7（℃）×ホルムアミド濃度（%）
【００２７】
PAE75プローブについては、ハイブリダイゼーション固有値は、46（℃）+0.7（℃）×30以上、46（℃）+0.7（℃）×40以下、又はハイブリダイゼーション固有値は、60（℃）+0.7（℃）×20以上、60（℃）+0.7（℃）×40以下の範囲を採用できる。
【００２８】
２−３．標的細菌の検出及び細菌数の計測及びそのためのキット
培養されたフィルター等の細菌を固定する。好適には、室温で、エタノールで固定する。その後フィルターは、透過性のフィルター固定支持体に載せられる。計測を蛍光顕微鏡で行う場合には、固定支持体としては、スライドガラスを用いることができるが、他の標識測定装置により計測する場合には、当該標識測定装置に取り付けでき計測可能な支持体であれば、いかなる固定支持体も用いることができる。支持体に固定されたフィルターは乾燥される。好適には、８０℃１０分間乾燥機で乾燥させる。
【００２９】
乾燥されたスライドグラス等の固定支持体に、ハイブリダイゼーションバッファーが与えられる。ハイブリダイゼーションバッファーとしては、例えば、0.9mol/L  NaCl、２０％フォルムアミド、２０mmol/L Tris-HCl、及び0.01％ SDSからなるハイブリダイゼーション溶液を挙げることができる。ハイブリダイゼーションバッファーで、1分〜５分間のプレインキュベーション後、標識された特異的プローブを添加する。プローブとのハイブリダイゼーションは、５分−１時間行うことができる。ハイブリダイゼーション後、フィルターの乗せられた固定支持体は、緩衝液で洗浄される。洗浄用の緩衝液としては、例えば、２０mmol/l Tris-HCl、180mmol/l  NaCl、及び0.01％SDSを含む洗浄液を用いることができる。緩衝液での洗浄後、蒸留水で洗浄する。
【００３０】
前記標識プローブを用いた場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄は、例えば、ハイブリダイゼーションを４６℃で５分−１時間をおこない、洗浄を４８℃で、２０分間行なう、あるいは、ハイブリダイゼーションを６０℃で５分−１時間をおこない、洗浄を６２℃で２０分間行うことができる。
【００３１】
洗浄後、乾燥し、液浸し、蛍光を用いる蛍光顕微鏡などの標識を観測又は測定する装置で微小集落を観測、計数することができる。
【００３２】
培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により同定及び/又は計数するための試薬などをキットとすることができる。
【００３３】
キットとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列中、連続する少なくとも１８以上の塩基で示される塩基配列又はその相補配列を含む緑膿菌特異的プローブ、ハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄液を含む培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により、緑膿菌を検出及び/又は計数するためのキットを挙げることができる。これらのキットには、更に、メンブレンフィルター、又は培地のいずれか、又はその組み合わせを含ませることができる。ハイブリダイゼーションバッファー、洗浄液、及び培地は、前記したものを用いることができる。
【実施例】
【００３４】
[実施例１]
緑膿菌特異的プローブを用いた培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法による緑膿菌の検出、計数
１．プローブの調製
プローブとしては、TGAATCCAGGAGCAAGCTCCCTTC（配列番号1：プローブ名PAE75）（24塩基）を用いた。プローブは、FITCで、5’末端側に付与したアミノ基を介して蛍光標識された。
【００３５】
１−１.プローブの特異性の予備確認
PAE75のプローブの配列の特異性は、(i)リボゾームデータベースプロジェクト(RDP)のプローブチェックプログラム及び(ii)実際の菌株に対する特異性試験により判別した。
まず、RDPのプローブチェックプログラムにより、各プローブ配列との配列の差異が0塩基から３塩基の細菌を選択した（表２）。このオンラインプログラムにより、各プローブの特異性が予備的に判定でき、この結果から、実際のプローブ特異反応のための陽性及び陰性対照菌株を設定した。
【００３６】
【表２】
2008263829.tif 000003
【００３７】
実際のプローブの特異性の判定は、PAE75では、P. aeruginosaをプローブとの差異のない（0塩基ミスマッチ）陽性菌株とし、P. agariciを1塩基の差異を持つ陰性の対照菌株、P. fulva、P. monteilli、Acinetobacter radioresistansを2塩基の差異、P. flavescensを３塩基の差異を持つ陰性対照菌株とすることとした。
【００３８】
２．スライドグラス上でのインサチューハイブリダイゼーション
１）各種細菌株を液体培地 で一晩前培養（28℃〜37℃の間で、各菌株の至適増殖温度）した細胞(100μL)に４％パラフォルムアルデヒド‐リン酸緩衝液（PBS）を300μl加え、４℃で１−３時間固定した。
２）この固定した細菌細胞の３μLをスライドグラス上に載せ、風乾後、５０、８０および１００％エタノールに順次３分間浸漬することで脱水を行った。
３）スライドグラス上の固定した細菌細胞上へあらかじめ４６℃あるいは６０℃に加温しておいたハイブリダイゼーション溶液（0.9M NaCl、20mM Tris-HCl、0.01% SDS、pH 7.4、なおホルムアミドは20-40%濃度で変化させた。）を8マイクロリッターを注加し、４６℃あるいは６０℃で５分間プレハイブリダイゼーションを行った後、5 pmol/μLのプローブ溶液を１μL加え、いずれのプローブとも、４６℃あるいは６０℃で1時間ハイブリダイゼーションを行った。
４）ハイブリダイゼーション後、スライドグラスをあらかじめ４８℃又は６２℃で加温した（４６℃でハイブリダイゼーションした場合は４８℃で洗浄し、６０℃でハイブリダイゼーションした時は６２℃で洗浄した）洗浄液（20mM Tris-HCl、 56-225mM NaCl、 0.01% SDS、 pH7.4）に２０分間浸漬した後、滅菌蒸留水で残留する洗浄液を洗い流した。
５）スライドグラスを風乾後、ガラス上の細菌細胞を蛍光顕微鏡で観察し、細菌細胞の蛍光具合からプローブの特異性を判定した。
【００３９】
３．特異培養条件の設定
培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により、上記特異性を評価したプローブの特異性を向上させるための培養条件を鋭意設定した。具体的には、プローブ陽性菌及び陰性菌をフィルター上に捕集した後、4-8時間培養し、微小集落を形成させた。このフィルター上の集落をエタノール固定した後、スライドグラス上でインサイチューハイブリダイゼーションを行なった。
【００４０】
[結果]
結果を表３に示す。
【００４１】
【表３】
2008263829.tif 000004
【００４２】
PAE75は、濃度20%以上の40%以下のホルムアミドを加えた反応液中で46℃で反応させること、又は、濃度30%以上の40%以下のホルムアミドを加えた反応液中で60℃で反応させることで特異性が認められ、緑膿菌を特異的に検出した。また、このプローブは、15のP. aeruginosa株と反応した。結果を表４に示す。
【００４３】
【表４】
2008263829.tif 000005
【００４４】
また、緑膿菌は、普通寒天培地上で、37℃で、5-8時間培養することにより、観察可能な微小集落を形成し、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により特異検出が可能であった。結果を図１−２に示す。
【００４５】
[比較例]
プローブとして、AGATCCCCCACTTTCTCCCTCAGGA(配列番号2：プローブ名PAE184）（25塩基）、及びGGATTTCACATCCAACTTGCTGAA(配列番号3：プローブ名PAE589）（24塩基）を用いて実施例と同様に行なった。
結果、PAE184及びPAE589とも、緑膿菌以外の種と反応し、特異性は認められなかった、配列２を用いた場合の特異性判定結果を表５に示す。緑膿菌とP. stutzeriを区別する条件は容易には見いだせなかった。
【００４６】
【表５】
2008263829.tif 000006
【００４７】
また、配列３を用いた場合は、緑膿菌に対する反応が認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本願発明は、病原菌の検出及び又は同定などの保健衛生、及び食品衛生などの産業で利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により、フィルター上に捕集した後、８時間培養し、培養時間と形成した微小集落の直径の関係を示す。
【図２】FISH反応後のP. aeruginosa の微小集落の写真。いずれも倍率は100倍で撮影した。なお、(A)４時間培養後、(B)５時間培養後、(C)６時間培養後、(D)８時間培養後をそれぞれ示す。
【図１】
2008263829.tif 000007
【図２】
2008263829.tif 000008
【配列表】
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