(57)【要約】【課題】安全性に優れ、中性脂肪およびグリセロリン脂質およびグリセロ糖脂質をｐＨ６付近で加水分解する能力を有し、ある程度熱的に安定であり、レシチンを加水分解するとともに、リゾレシチンは加水分解しない性質を有し、製パン用途に用いると、単剤で膨らみ効果があり、不適当な臭いが残存しない、グリセロ糖脂質リパーゼの提供。【解決手段】糸状菌アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）に由来するグリセロ糖脂質リパーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性質を示すグリセロ糖脂質リパーゼ：
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約２９，０００を示す；
２）中性脂肪及びレシチン及びグリセロ糖脂質をｐＨ６．０において加水分解する；
３）ｐＨ３．６乃至ｐＨ８．９のｐＨ範囲で、レシチン分解活性に対するグリセロ糖脂質分解活性が、少なくとも１０倍である。
【請求項２】
さらに以下の性質を示す請求項１に記載のグリセロ糖脂質リパーゼ：
４）グリセロ糖脂質に対する相対分解活性はｐＨ４．１乃至ｐＨ７．７のｐＨ範囲で少なくとも８０％以上である；
５）レシチンに対する相対分解活性はｐＨ５．１乃至ｐＨ７．１のｐＨ範囲で少なくとも８０％以上である；
６）８０℃以上の温度で上記５）記載の加水分解活性を有さない；
７）ｐＨ４．１乃至ｐＨ１０．７のｐＨ範囲で７５％以上のグリセロ糖脂質に対する相対残存分解活性を有する。
【請求項３】
糸状菌アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）に由来する、請求項１または２に記載のグリセロ糖脂質リパーゼ。
【請求項４】
糸状菌がアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）ＳＡＮＫ  １１２９８株である請求項３に記載のグリセロ糖脂質リパーゼ。
【請求項５】
下記のａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載の蛋白質であるグリセロ糖脂質リパーゼ：
ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
ｂ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１１０乃至９９１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質；
ｃ）ａ）またはｂ）に記載のアミノ酸配列において、一つまたは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロ糖脂質分解活性を有する蛋白質；
ｄ）上記ａ）に記載の蛋白質と７０％以上のアミノ配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロ糖脂質分解活性を有する蛋白質；
ｅ）ａ）またはｂ）に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質。
【請求項６】
下記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のＤＮＡ：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１１０乃至９９１に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）上記ａ）に記載のＤＮＡと７０％以上のヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、グリセロ糖脂質分解活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
ｃ）上記ａ）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件化でハイブリダイズし、かつ、グリセロ糖脂質分解活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ；
ｅ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１１０乃至９９１に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載のＤＮＡによってコードされるグリセロ糖脂質リパーゼ。
【請求項８】
請求項１〜５または７のいずれかに記載のグリセロ糖脂質リパーゼを産生する能力を有する単離された糸状菌アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）ＳＡＮＫ  １１２９８株。
【請求項９】
下記１）乃至２）を含む、グリセロ糖脂質リパーゼの製造方法：
１）アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）を、グリセロ糖脂質リパーゼを産生する条件下で培養する工程。
２）１）の培養産物からグリセロ糖脂質リパーゼを分離・精製する工程。
【請求項１０】
アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）がアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）ＳＡＮＫ  １１２９８株である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０に記載の方法により製造されるグリセロ糖脂質リパーゼ。
【請求項１２】
請求項１〜５、７又は１１のいずれか１項に記載のグリセロ糖脂質リパーゼを用いる、パンの製造方法。
【請求項１３】
パンの製造のための、請求項１〜５、７又は１１のいずれか１項に記載のグリセロ糖脂質リパーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリセロ糖脂質リパーゼ、該リパーゼを産生する糸状菌、糸状菌の培養物から該リパーゼを分離精製する方法、該リパーゼをコードするＤＮＡおよび該リパーゼの製造方法等に関する。具体的には、本発明は、食品工業及び医薬品工業における使用に特に適する該リパーゼ、特に糸状菌アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）に由来する、グリセロ糖脂質リパーゼ、該リパーゼを産生する糸状菌、糸状菌の培養物から該リパーゼを分離精製する方法、該リパーゼをコードするＤＮＡおよび該リパーゼの製造方法、該リパーゼを用いるパンの製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
〔１〕糖脂質リパーゼ
植物および微生物がグリセロ糖脂質を加水分解するリパーゼを産生することが知られている。植物由来の酵素は主として、グリセロリン脂質及びグリセロ糖脂質を加水分解する能力を有するが、中性脂肪、なかでもトリグリセリドを加水分解する能力は極めて低い。また、微生物のなかでは放線菌、細菌およびカビ由来のリパーゼが知られている。放線菌および細菌由来のリパーゼは、グリセロ糖脂質とともにグリセロリン脂質をも加水分解する性質を有している。糸状菌由来のリパーゼは、中性脂肪及びグリセロリン脂質及びグリセロ糖脂質を加水分解することが知られている。本明細書においてグリセロ糖脂質リパーゼとはグリセロ糖脂質をリゾグリセロ糖脂質および脂肪酸とに加水分解する活性（以下「グリセロ糖脂質分解活性」と言う。）を有する酵素をいう。ジガラクトシルジアシルグリセロール分解活性（以下「ＤＧＤＧ分解活性」と言う。）は、グリセロ糖脂質分解活性に含まれる概念である。また、本明細書において「相対分解活性」とは、最も活性が高かったｐＨまたは温度条件でのＤＧＤＧ分解活性またはレシチン分解活性を１００％とし、各ｐＨまたは温度条件におけるＤＧＤＧ分解活性またはレシチン分解活性それぞれの相対値とする。さらに、本明細書において「相対残存分解活性」とは、各ｐＨまたは温度条件で処理した後において最も活性が高かったｐＨまたは温度条件におけるＤＧＤＧ分解活性またはレシチン分解活性を１００％とし、各ｐＨまたは温度条件で処理した後の各ｐＨまたは温度条件におけるＤＧＤＧ分解活性またはレシチン分解活性それぞれの相対値とする。
【０００３】
細菌由来のグリセロ糖脂質を加水分解するリパーゼとしては、例えばコルネバクテリウム・エフィシェンス（Cornebacterium efficiens）、サーモビフィダ・ファスカ（Thermobifida fusca）等に由来するリパーゼが知られている（特許文献１）。
【０００４】
放線菌由来のグリセロ糖脂質を加水分解するリパーゼとしては、例えばストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）に由来するリパーゼが知られている（特許文献１）。
【０００５】
カビ由来のグリセロ糖脂質を加水分解するリパーゼとしては、例えばフザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、フザリウム・スルフレウム（Fusarium sulfureum）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、フザリウム・オキシスポラム（Fusariumu oxysporum）、アクレモニウム・ベルケレヤナム（Acremonium berkeleyanum）、アスペルギルス・フミガータス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）等に由来するリパーゼが知られている（特許文献２〜４）。
【０００６】
〔２〕グリセロ脂質
グリセロ糖脂質は、主として、グラム陽性細菌や高等植物葉緑体に存在する。グリセロ糖脂質とは、１，２−ジアシルグリセロールの３位に糖鎖が共有結合している化合物である。糖鎖としてはガラクトース等が含まれており、その組成割合は由来により異なる。たとえばグリセロ糖脂質には、モノガラクトシルジアシルグリセロール（以下「ＭＧＤＧ」と言う。）およびジガラクトシルジアシルグリセロール（以下「ＤＧＤＧ」と言う。）等が含まれる。
【０００７】
グリセロリン脂質は、動物、植物、菌類に広く分布している。グリセロリン脂質とは、１，２−ジアシルグリセロールの３位にホスホリル塩基が共有結合している化合物である。塩基としてはコリン、エタノールアミン、セリン、イノシトールおよびグリセロール等が含まれており、その組成割合は由来により異なる。たとえばグリセロリン脂質には、レシチン等が含まれる。
【０００８】
中性脂肪も動物、植物、菌類に広く分布している。中性脂肪とは、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロールの総称である。
【０００９】
〔３〕レシチンあるいはグリセロ糖脂質の酵素処理
レシチンあるいはグリセロ糖脂質は分子中に疎水性の脂肪酸を２つ有しており、親油性の界面活性剤として知られている。リパーゼによりこのうちの１つを加水分解することにより親水性が増し、レシチンあるいはグリセロ糖脂質とは異なった性質を有する物質になる。実際レシチンにホスホリパーゼを作用させた結果生成するリゾレシチンは水溶性であり、食品添加物として使用した場合に、得られる食品の物性がレシチンとは異なることから、食品工業における適用が検討されている。
【００１０】
グリセロ糖脂質もグリセロ糖脂質リパーゼにより部分的に加水分解することにより、リゾグリセロ糖脂質を産生することができる。リゾグリセロ糖脂質も親水性が増加した物質となる。たとえば、リゾグリセロ糖脂質には、ジガラクトシルモノグリセリド（以下「ＤＧＭＧ」と言う。）等が含まれる。
【００１１】
〔４〕食品中でのグリセロ糖脂質リパーゼの使用
グリセロ糖脂質リパーゼを用いれば、下図に示すように水の存在下でグリセロ糖脂質からリゾグリセロ糖脂質を産生することができる。
【化１】
2008206515.tif 000002
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれアルキル基を、Ｇａｌはガラクトースを意味する。）
【００１２】
レシチン分解活性を併せ持つ酵素であれば、レシチンからリゾグリセロリン脂質であるリゾレシチンも同時に産生することもできる。
【化２】
2008206515.tif 000003
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれアルキル基を、Ｒ３は、コリン、エタノールアミン、グリセロール、イノシトール等の塩基を意味する。）
【００１３】
食品素材中でこのような反応を起こさせることにより、親水性界面活性剤を含有した商品を提供することができる。
【００１４】
また、食品工業においては、食品の変質を防ぐため中性から弱酸性域でさまざまな処理を行うことが多く、酵素剤はこのｐＨ域に高い活性を有していることが望まれる。
【００１５】
〔５〕製パンにおけるグリセロ糖脂質リパーゼの使用
パンを製造する際には、ボリュームの増大および食感の改善等の理由により化学的に合成された界面活性剤が用いられることが多い。しかし近年の自然志向への高まりから、合成界面活性剤を添加しない製パンが望まれている。また、食感の改善を目的として、油脂あるいは卵黄等をパンに添加することも行われているが、健康志向の高まりあるいはアレルギーの問題から、これらの添加物を加えないパンの製造も望まれている。
【００１６】
パンに使用される小麦粉には、中性脂肪、グリセロ糖脂質およびグリセロリン脂質等が含まれていることが知られている（非特許文献１）。このうちグリセロ糖脂質とグリセロリン脂質には界面活性剤としての働きを期待できるが、このままでは親油性のため性能が十分に発揮できているとはいえない。そこでこれら脂質類を部分的に加水分解してリゾグリセロ糖脂質およびリゾグリセロリン脂質とし、親水性の界面活性剤とすることで、性能を十分に引き出すことができる。小麦粉自身の成分で界面活性剤を補充できれば、合成界面活性剤を使用する必要はなくなるか、あるいは使用量を減じることができる。小麦粉中の成分としては、グリセロリン脂質に比べてグリセロ糖脂質がより多く含有されていることが知られている（非特許文献１）。したがって、グリセロリン脂質に比べてグリセロ糖脂質をより効率よく加水分解して、リゾグリセロ糖脂質を産生し、その界面活性能を高めることが、製パン分野において望まれている。さらに産生したリゾグリセロ糖脂質およびリゾレシチンに対する酵素活性は低い方が望ましい。すなわち、リゾホスファチジルコリン（以下「ＬＰＣ」と言う。）に対する酵素活性は低い方が望ましい。
【００１７】
また、グリセロ糖脂質およびグリセロリン脂質に加え、中性脂肪をも加水分解する酵素が製パンにおいて効果があることが示されている（特許文献５）。一方で、中性脂肪は加水分解しにくい酵素のほうが、製パンにおいて効果があるとの例もある(特許文献６）。
【００１８】
さらに、製パンにおいてはｐＨ６付近で原料を混合し、３０〜４２℃に保温して醗酵を行うことが多い。したがって、使用されるグリセロ糖脂質リパーゼは、これらの条件下で活性を有するとともに、安定であることが望ましい。
【００１９】
〔６〕既知のグリセロ糖脂質リパーゼの問題点
【００２０】
植物起源のリパーゼは汎用性に問題がある。細菌起源のリパーゼについては詳細な記載がない。放線菌に由来するグリセロ糖脂質リパーゼは、レシチン分解活性を併せ持つものである。さらに、糸状菌起源のリパーゼは、病原菌に由来するものが多く、安全性に一部で問題がある。さらに、詳細な酵素の性質が記載されていない。たとえば、植物病原菌であるフザリウム・オキシスポラム起源のリパーゼは実際の製パンにおいても効果があると推定される。しかし、該リパーゼは至適ｐＨがｐＨ９付近であり、製パンに重要なｐＨ６における酵素活性は、至適ｐＨの酵素活性のわずか３５％以下である。また、非病原菌であるアスペルギルス・ニガー起源のリパーゼは、ｐＨ４．５あるいはｐＨ５での酵素活性は記載されているものの、製パンにおいて重要と考えられるｐＨ６付近での活性が示されておらず効果があるかどうか不明である。
【００２１】
このように従来知られているグリセロ糖脂質リパーゼでは、不十分な効果しか得られない可能性が高い、あるいは安全性に問題がある、あるいは酵素反応の効率が悪い等の問題点がある。望ましいグリセロ糖脂質リパーゼの性質としては、安全性に問題がない微生物由来であり、グリセロ糖脂質およびグリセロリン脂質をｐＨ６付近で効率よく加水分解する能力を有し、ある程度熱的に安定であり、さらには、リゾレシチンは加水分解しないことが挙げられる。
【特許文献１】ＷＯ２００６００８６５３
【特許文献２】ＷＯ２００２０００８５２
【特許文献３】ＵＳ２００６０７５５１８
【特許文献４】ＷＯ２００４０１８６６０
【特許文献５】特許第３８２４１７４号
【特許文献６】特表２００７−５２８７３２
【非特許文献１】Carr N. et. al., Critical Reviews in Food Science and Nutrition、１９９２年、３１巻、ｐ．２３７−２５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
上述のように、望ましいグリセロ糖脂質リパーゼの性質としては、安全性に問題がない微生物由来であり、グリセロ糖脂質をｐＨ６付近で効率よく加水分解する能力を有し、ある程度熱的に安定であることが挙げられる。さらには、レシチンを加水分解するとともに、リゾレシチンは加水分解しない性質を有するグリセロ糖脂質リパーゼが挙げられる。
【００２３】
また、製パン分野においては、従来のリパーゼでは、単剤では膨らみ効果が小さく、かつ、チーズ臭等の食品として不適当な臭いが残存するという欠点があった。したがって、単剤で膨らみ効果があり、不適当な臭いの残存しないグリセロ糖脂質リパーゼの開発が所望されていた。
【００２４】
このようなグリセロ糖脂質リパーゼを提供することは、この技術分野において非常に関心の高いことであった。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者らは、安全性に優れ、グリセロ糖脂質をｐＨ６付近で効率よく加水分解する能力を有し、ある程度熱的に安定であり、レシチンを加水分解するとともに、リゾレシチンは加水分解しない性質を有し、製パン用途に用いると、単剤で膨らみ効果があり、不適当な臭いが残存しない、小麦粉中にグリセロリン脂質に比べて多く含有されるグリセロ糖脂質に対して効率よく加水分解するグリセロ糖脂質リパーゼを見出すべく鋭意検討を行ったところ、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）ＳＡＮＫ  １１２９８株由来のグリセロ糖脂質リパーゼを精製し、当該遺伝子をクローニングし、本発明を完成するに至った。
【００２６】
すなわち本発明は、
（１）以下の性質を示すグリセロ糖脂質リパーゼ：
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約２９，０００を示す；
２）中性脂肪及びレシチン及びグリセロ糖脂質をｐＨ６．０において加水分解する；
３）ｐＨ３．６乃至ｐＨ８．９のｐＨ範囲で、レシチン分解活性に対するグリセロ糖脂質分解活性が、少なくとも１０倍である、
（２）さらに以下の性質を示す請求項１に記載のグリセロ糖脂質リパーゼ：
４）グリセロ糖脂質に対する相対分解活性はｐＨ４．１乃至ｐＨ７．７のｐＨ範囲で少なくとも８０％以上である；
５）レシチンに対する相対分解活性はｐＨ５．１乃至ｐＨ７．１のｐＨ範囲で少なくとも８０％以上である；
６）８０℃以上の温度で上記５）記載の加水分解活性を有さない；
７）ｐＨ４．１乃至ｐＨ１０．７のｐＨ範囲で７５％以上のグリセロ糖脂質に対する相対残存分解活性を有する。
（３）糸状菌アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）に由来する、上記（１）または（２）に記載のグリセロ糖脂質リパーゼ、
（４）糸状菌がアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）ＳＡＮＫ  １１２９８株である上記（３）に記載のグリセロ糖脂質リパーゼ、
（５）下記のａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載の蛋白質であるグリセロ糖脂質リパーゼ：
ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
ｂ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１１０乃至９９１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質；
ｃ）ａ）またはｂ）に記載のアミノ酸配列において、一つまたは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロ糖脂質分解活性を有する蛋白質；
ｄ）上記ａ）に記載の蛋白質と７０％以上のアミノ配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロ糖脂質分解活性を有する蛋白質；
ｅ）ａ）またはｂ）に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質、
（６）下記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のＤＮＡ：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１１０乃至９９１に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）上記ａ）に記載のＤＮＡと７０％以上のヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、グリセロ糖脂質分解活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
ｃ）上記ａ）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件化でハイブリダイズし、かつ、グリセロ糖脂質分解活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ；
ｅ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１１０乃至９９１に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ、
（７）上記（６）に記載のＤＮＡによってコードされるグリセロ糖脂質リパーゼ、
（８）上記（１）〜（５）または（７）のいずれかに記載のグリセロ糖脂質リパーゼを産生する能力を有する単離された糸状菌アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）ＳＡＮＫ  １１２９８株、
（９）下記１）乃至２）を含む、グリセロ糖脂質リパーゼの製造方法：
１）アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）を、グリセロ糖脂質リパーゼを産生する条件下で培養する工程。
２）１）の培養産物からグリセロ糖脂質リパーゼを分離・精製する工程、
（１０）アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）がアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）ＳＡＮＫ  １１２９８株である上記（９）記載の方法、
（１１）上記（９）または上記（１０）に記載の方法により製造されるグリセロ糖脂質リパーゼ、
（１２）上記（１）〜（５）、（７）又は（１１）のいずれか１に記載のグリセロ糖脂質リパーゼを用いる、パンの製造方法、
（１３）パンの製造のための、上記（１）〜（５）、（７）又は（１１）のいずれか１に記載のグリセロ糖脂質リパーゼ
に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明はグリセロ糖脂質を分解するために有用な糸状菌である、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）に由来するグリセロ糖脂質リパーゼに関する。
【００２８】
本発明のグリセロ糖脂質リパーゼには、グリセロ糖脂質リパーゼを産生する微生物の培養物中のグリセロ糖脂質分解活性を有する蛋白質が含まれる。このようなグリセロ糖脂質リパーゼの例としては、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）由来のグリセロ糖脂質リパーゼが挙げられる。より好適なものは、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）ＳＡＮＫ  １１２９８株由来のグリセロ糖脂質リパーゼである。
【００２９】
また、本発明のグリセロ糖脂質リパーゼの別の例としては、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
【００３０】
また、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質において、１個または数個の部位に、１個または数個のアミノ酸残基が、置換、欠失、挿入および／または付加した蛋白質も、グリセロ糖脂質分解活性を有する限り、本発明に含まれる。数個とは１０個を超えない個数を意味し、好適には５個を超えない個数をいう。置換したアミノ酸配列を有する蛋白質が、天然型蛋白質と同等の活性を有する例として、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）遺伝子のシステインに相当するヌクレオチド配列をセリンに相当するヌクレオチド配列に変換して得られた蛋白質が、ＩＬ−２活性を保持することが知られている（Wang, A. et al. (1984) Science 224, 1431-1433)。
【００３１】
本発明の蛋白質の別の例としては、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有する蛋白質も、グリセロ糖脂質分解活性を有する限り、本発明に含まれる。
【００３２】
本発明において、「本発明のＤＮＡ」とは、本発明のグリセロ糖脂質リパーゼをコードするＤＮＡをいう。ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、人工的に改変されたＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡなど、現在知られる限りどのような形態をとっていても良い。
【００３３】
本発明のＤＮＡの例としては、配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１１０から９９１に示されるヌクレオチド配列であり、且つ、グリセロ糖脂質分解活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３４】
本発明のＤＮＡの別の例としては、配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１１０から９９１に示されるヌクレオチド配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有し、且つ、グリセロ糖脂質分解活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型ＤＮＡ、人為的に改変した変異型ＤＮＡ、異種生物由来の相同ＤＮＡなどが含まれる。
【００３５】
本発明のＤＮＡの別の例としては、配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１１０から９９１に示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、グリセロ糖脂質分解活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３６】
本発明で「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Sambrookら編「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.）」〔（Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕等に記載の条件が挙げられる。具体的には、例えば、(i) ６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍＬ 変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％ ホルムアミドを含む溶液中、プローブと共に４２℃で一晩保温し、(ii) 非特異的にハイブリダイズしたプローブを洗浄により除去するステップ、ここで、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃以下、よりストリンジェントには、３０℃以下、さらにストリンジェントには、２５℃以下、よりさらにストリンジェントには、１０℃以下、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、２５℃以上、よりストリンジェントには、３７℃以上、さらにストリンジェントには、４２℃以上、よりさらにストリンジェントには、５０℃以上、より一層ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下で洗浄を行う、という条件が挙げられる。
【００３７】
なお、Ｔｍは、例えば、下記式：Ｔｍ＝81.5+16.6（log[Na+]）+0.41（%G+C）-（600/N）（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチド中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）により求められる。
【００３８】
また、本発明のヌクレオチドのさらに他の例としては、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。なお、所望のアミノ酸に対応するコドンは、その選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる。（Grantham, R. et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 143-174）。さらに、これらヌクレオチド配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した、部位特異的変異導入法（Mark, D. F. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662-5666）などに従うことができる。
【００３９】
本発明のＤＮＡのまた別の例としては、配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１１０から９９１に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挙げられる。また、配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１１０から９９１に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含むことからなるＤＮＡも、グリセロ糖脂質分解活性を有する蛋白質をコードする領域を含む限り、本発明に含まれるものである。
【００４０】
また、本発明のグリセロ糖脂質リパーゼには、本発明のＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げることができる。また、本発明のグリセロ糖脂質リパーゼにおいて、任意の一つもしくは二つ以上のアミノ酸を欠失させた改変体を作製するためには、エキソヌクレアーゼＢａｌ３１等を用いてＤＮＡを末端から削る方法（岸本  利光ら“続生化学実験講座１・遺伝子研究法ＩＩ”335-354）、カセット変異法（岸本  利光、“新生化学実験講座２・核酸ＩＩＩ  組換えＤＮＡ技術”242-251）などに従うことができる。このように、本発明のＤＮＡを基に遺伝子工学的手法により得られる蛋白質であっても、グリセロ糖脂質分解活性を有する限り本発明に含まれる。このようなグリセロ糖脂質リパーゼは、必ずしも配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の全てを有するものである必要はなく、例えばその部分配列からなる蛋白質であっても、該蛋白質がグリセロ糖脂質分解活性を示す限り本発明のグリセロ糖脂質リパーゼに包含される。また、このようなグリセロ糖脂質リパーゼをコードするＤＮＡも本発明に含まれる。
【００４１】
本発明に用いるグリセロ糖脂質リパーゼはグリセロ糖脂質リパーゼ産生菌の培養液から精製したもの、粗精製したもの、菌体の破砕液の他、菌体の培養上清をそのまま用いたものでも良い。グリセロ糖脂質リパーゼ産生菌を培養する際には、培地中に炭素源、窒素源の他に界面活性剤を添加して培養するのが好ましい。あるいは大豆粉、スリゴマ、綿実粕、米ぬか等天然素材の培地で培養するのが好ましい。界面活性剤としては、トライトン、トゥイーン、ショ糖脂肪酸エステル、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムおよびサポニン等が挙げられる。
【００４２】
グリセロ糖脂質リパーゼ産生菌の培養は通常の培地を培養装置、培地を用いて行なうことができる。培養は液体培養、固体培養等の方法を適宜選択できる。液体培養の場合はフラスコ培養や発酵槽を用いた培養を行なうことができ、培養開始後は培地の追加のないバッチ培養法や培養中に適宜培地を添加していく流加培養法を用いることができる。培地には炭素源、窒素源を添加し、必要に応じてビタミン、微量金属等を添加することができる。炭素源としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース等の単糖類、マルトース、セロビオース、イソマルトース、ラクトース、スクロース等の二糖類、デンプン等の多糖類、マルトエクストラクト等を挙げることができるがグリセロ糖脂質産生菌が生育する限りこれらに限定されない。窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素、イーストエクストラクト、マルトエクストラクト、コーンスティープリカー、ペプトン等の有機窒素が用いられるがグリセロ糖脂質リパーゼ産生菌が生育する限りこれらに限定されない。また、グリセロ糖脂質リパーゼ産生菌のグリセロ糖脂質リパーゼの産生量を増やすために培地中にトライトン、トゥイーン、ショ糖脂肪酸エステル、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、レシチンおよびサポニン等の界面活性剤を添加することもできる。これらの培地中の組成物量は適宜選択することができる。培養温度、ｐＨ、通気攪拌量はグリセロ糖脂質リパーゼ産生に適するように適宜選択することができる。
【００４３】
グリセロ糖脂質リパーゼ産生菌の培養終了後に、菌体を除いて、培養上清をそのまま粗酵素液として用いることができる。また、粗酵素液を通常の再構成処理、蛋白沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、凍結融解法、超音波破砕、限外ろ過、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アッフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、それらの組み合わせ等によって粗精製したり、精製したりしたものを用いることもできる。
【００４４】
周知の通り、糸状菌は自然界において、または人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）もその点は同じである。本発明にいうアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）はその全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等によりえられたものも含有される。即ち、グリセロ糖脂質リパーゼを産生するアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）に包含される。
【００４５】
また、本発明のグリセロ糖脂質リパーゼは、ベクターに本発明のＤＮＡが挿入された組換えプラスミドで宿主細胞を形質転換し、該形質転換された細胞の培養産物から得る事もできる。このように適当なベクターに本発明のＤＮＡが挿入された組換えプラスミドも本発明に含まれる。このような目的に用いるベクターとしては、一般に知られているさまざまなベクターを用いることができる。好適なものとしては、原核細胞用ベクター、真核細胞用ベクター、哺乳動物由来の細胞用ベクターなどが挙げられるが、これに限定されない。このような組換えプラスミドにより、他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、適当なプロモーター配列および／または形質発現に関わる配列を有するベクターを用いるか、もしくはそのような配列を導入することにより、発現ベクターとすることで、それぞれの宿主において遺伝子を発現させることが可能である。このような発現ベクターは、本発明の組換えプラスミドの好適な態様である。
【００４６】
本発明の組換えプラスミドを、各種細胞に導入することにより、宿主細胞を得ることができる。このような細胞は、プラスミドを導入することができる細胞であれば原核細胞であっても真核細胞であってもよい。
【００４７】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【００４８】
例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、およびベクターがいずれも使用できる。
【００４９】
プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（trp）プロモーター、ラクトース（lac）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（tac）プロモーター、リポプロテイン（lpp）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Tu（tufB）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも本発明のグリセロ糖脂質リパーゼの産生に使用することができる。
【００５０】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐTUB228（Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93）などが用いられるが、これに限定されるものではない。
【００５１】
プロモーターとしては、枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【００５２】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、哺乳動物由来の細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182、ATCC CRL-1650）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ATCC CCL-61）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【００５３】
脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864）等が挙げられるが、これに限定されない。
【００５４】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を具えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham, F. L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457）、および電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845）などによりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Sambrook, J. et al. (1989) : "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341）などをコトランスフェクションし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のグリセロ糖脂質リパーゼを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【００５５】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のSpodoptera frugiperdaの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やTrichoplusia niの卵細胞由来High  Five細胞（Wickham, T. J. et al, (1992) Biotechnol. Prog. I: 391-396）などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリン蛋白質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Kidd, I. M. and V.C. Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors. Applied Biochemistry and Biotechnology 42, 137-159)。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性蛋白質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面蛋白質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的蛋白質のＮ末端側に繋げることにより、組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能である（Zhe-mei Wang, et al. (1998) Biol. Chem., 379, 167-174)。
【００５６】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Saccharomyces cerevisiaeや石油酵母Pichia pastorisが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Bennetzen, J. L. and Hall, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1-5）などを好ましく利用できる。また、分泌型蛋白質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Andrew, L. Niles,et al. (1998) Biotechnol.Appl. Biochem. 28, 125-131）。
【００５７】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に本発明のグリセロ糖脂質リパーゼが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ改変イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。培養条件としては、ＣＯ２濃度は０乃至５０％の範囲であればよく、好適には１乃至１０％でありより好適には５％である。培養温度は０乃至９９℃であればよく、好適には２０乃至５０℃であり、より好適には３５乃至４０℃である。
【００５８】
上記培養により形質転換体の細胞内または細胞外に組換え蛋白質として産生される本発明のグリセロ糖脂質リパーゼは、培養産物中から、その蛋白質の物理化学的性質、化学的性質、生化学的性質(酵素活性など)等を利用した各種の分離操作（「生化学データブックII」、1175-1259項、第１版第１刷、1980年6月23日株式会社東京化学同人発行;Biochemistry, vol. 25, No.25, p8274-8277 (1986); Eur. J. Biochem., 163, p313-321 (1987)等参照）により分離、精製することができる。該方法としては、具体的には例えば通常の再構成処理、蛋白沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、凍結融解法、超音波破砕、限外ろ過、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アッフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、それらの組み合わせ等を例示できる。上記により、高収率で所望の組換え蛋白質を工業的規模で製造できる。また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で本発明のグリセロ糖脂質リパーゼを大量に製造できる。
【００５９】
以上のような方法により製造されたグリセロ糖脂質リパーゼも本発明の好適な例としてあげる事ができる。
【００６０】
グリセロ糖脂質リパーゼ産生菌とはグリセロ糖脂質リパーゼ産生能を本質的に先天的に有する微生物をいい、グリセロ糖脂質リパーゼを菌体内に蓄積する微生物や、菌体外に分泌する微生物等を含む。グリセロ糖脂質リパーゼ産生菌の培養上清又は培養上清から精製したグリセロ糖脂質リパーゼを用いる場合には菌体外にグリセロ糖脂質リパーゼを分泌する菌を用いることができる。
【００６１】
本発明に用いるグリセロ糖脂質リパーゼとしては、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）のグリセロ糖脂質リパーゼを用いることができ、より好適なものは、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）ＳＡＮＫ  １１２９８株由来のグリセロ糖脂質リパーゼを用いることができる。グリセロ糖脂質リパーゼは、これらアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）自身に由来するものでもよいし、その変異体または修飾体に由来するものであってもよく、更に、これらグリセロ糖脂質リパーゼ産生菌のグリセロ糖脂質リパーゼをコードする遺伝子を宿主に導入して得られた形質転換体から産生される組換えタンパク質であってもよい。
【００６２】
グリセロ糖脂質リパーゼを産生する微生物としては、特に限定されるものではないが、アスペルギルス属の糸状菌を挙げることができ、好適にはアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）であり、より好適にはアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）ＳＡＮＫ  １１２９８株（以下、「ＳＡＮＫ  １１２９８株」という。）である。ＳＡＮＫ  １１２９８株は、群馬県において採集された土壌より分離された。
【００６３】
ＳＡＮＫ  １１２９８株をクリックの文献（Klich, M. A. (2002) Identification of common Aspergillus species. The Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands）に従い、３種類の培地（ＣＹＡ培地、ＭＥＡ培地及びＣＹ２０Ｓ培地）に接種して、菌学的性状を観察した。３種類の培地（ＣＹＡ培地、ＭＥＡ培地及びＣＹ２０Ｓ培地）の組成は以下のとおりである。
ＣＹＡ培地（Czapek Yeast Extract Agar培地）
ＫＨ２ＰＯ４        １ｇ
ザペック濃縮液  １０ml
（ＮａＮＯ３  ３０ｇ，ＫＣｌ  ５ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ５ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．０５ｇ，蒸留水  １００ml）
イーストエキス    ５ｇ
スクロース      ３０ｇ
寒天            １５ｇ
蒸留水      １０００ml
ＭＥＡ培地（Malt Extract Agar培地）
モルトエキス    ２０ｇ
ペプトン          １ｇ
グルコース      ２０ｇ
寒天            ２０ｇ
蒸留水      １０００ml
ＣＹ２０Ｓ培地（Czapek Yeast Extract Agar with 20% sucrose培地）
ＫＨ２ＰＯ４        １ｇ
ザペック濃縮液  １０ml
イーストエキス    ５ｇ
スクロース    ２００ｇ
寒天            １５ｇ
蒸留水      １０００ml
【００６４】
ＣＹＡ培地上でのコロニーの直径は、２５℃、７日間の培養で６２−６４mmである。コロニーは放射状の溝を有する。分生子形成部はビロード状でイエロイッシュブラウン（５Ｆ４）を呈する。菌糸体は白色を呈する。菌核、可溶性色素や浸出液は観察されない。裏面はペルオレンジ（５Ａ３）を呈する。ＭＥＡ培地上でのコロニーの直径は、２５℃、７日間の培養で６２−６５mmである。分生子は密には形成されない。菌糸体は白色を呈する。浸出液は観察されない。裏面は色に変化がない。ＣＹ２０Ｓ培地上でのコロニーの直径は、２５℃、７日間の培養で５８−６１mmである。コロニーは厚く、菌糸体は白色を呈する。分生子、浸出液は観察されない。裏面はイエロイッシュホワイト（４Ａ２）を呈する。３７℃でのＣＹＡ培地上でのコロニーの直径は、７日間の培養で１３−１７mmである。コロニーは放射状の溝を有する。可溶性色素が観察され、淡褐色、中心部で淡赤色を呈する。裏面はブラウン（７Ｆ４）またはグレイッシュブラウン（７Ｅ３）を呈する。なお、色調の表示は、「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー」（Kornerup A. & Wanscher J.H. 1978. Methuen handbook of colour (3rd. edition). Erye Metuen, London）に従った。
【００６５】
分生子頭は放射状である。分生子柄は(100-)300-800(-1200)×3.5-9μｍ、平滑、無色または先端で淡褐色を呈する。頂のうは幅(11-)20-39μｍで球形である。アスペルジラは単列である。フィアライドは6-8×3-3.5μｍで、頂のうの３／４以上に形成される。分生子は直径3.5-5×3-4μｍ、球形から亜球形またはしばしば楕円形であり、表面は針状である。
【００６６】
以上の菌学的性状より、ＣＹ２０Ｓ培地上での性状を除き、クリックの文献（上掲）に記載されているアスペルギルス・ジャポニクスの性状に一致することから、ＳＡＮＫ  １１２９８株は、アスペルギルス・ジャポニクスと同定される。
【００６７】
ＳＡＮＫ  １１２９８株は、平成１８年１２月２７日付けで、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７５３で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００６８】
グリセロ糖脂質リパーゼ産生菌から得られたグリセロ糖脂質リパーゼの具体的な性質について以下に示すが、本発明のグリセロ糖脂質リパーゼの有する性質はこれらに限定されるものではない。
【００６９】
ＳＡＮＫ  １１２９８株により産生され、精製されたグリセロ糖脂質リパーゼは、以下の性質を有する。
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約２９，０００を示す；
２）中性脂肪及びレシチン及びグリセロ糖脂質をｐＨ６．０において加水分解する；
３）ｐＨ３．６乃至ｐＨ８．９のｐＨ範囲で、レシチン分解活性に対するグリセロ糖脂質分解活性の比が、少なくとも１０倍である；
４）グリセロ糖脂質に対する相対分解活性はｐＨ４．１乃至ｐＨ７．７のｐＨ範囲で少なくとも８０％以上である；
５）レシチンに対する相対分解活性はｐＨ５．１乃至ｐＨ７．１のｐＨ範囲で少なくとも８０％以上である；
６）８０℃以上の温度で上記５）記載の加水分解活性を有さない；
７）ｐＨ４．１乃至ｐＨ１０．７のｐＨ範囲で７５％以上のグリセロ糖脂質に対する相対残存分解活性分解活性を有する。
【００７０】
種々のｐＨにおける、グリセロ糖脂質であるＤＧＤＧに対する脂肪酸遊離活性(以下「ＤＧＤＧ分解活性」と言う)および大豆レシチンに対する脂肪酸遊離活性(以下「レシチン分解活性」と言う)を測定した。各ｐＨにおけるＤＧＤＧ分解活性を１００％としたときの相対レシチン分解活性について、本発明の酵素と製パン業界において広く使用されているリパーゼであるリポパンＦ（登録商標、Lipopan F、ノボザイムズジャパン）との比較を下記に示した。なお、大豆由来レシチンは辻製油（株）から購入した。以下、レシチンとは大豆由来レシチンのことをさす。
【００７１】
本発明の酵素（グリセロ糖脂質リパーゼＧ−２）
ｐＨ        ＤＧＤＧ分解活性    レシチン分解活性
３．６        １００                  ２．６
４．１        １００                  ４．６
４．９        １００                  ５．９
５．９        １００                  ６．１
６．７        １００                  ５．３
７．７        １００                  ４．６
８．１        １００                  ６．８
８．９        １００                  ８．５
【００７２】
リポパンＦ精製酵素
ｐＨ        ＤＧＤＧ分解活性    レシチン分解活性
３．４        １００                    ４１．４
４．１        １００                  １４２
５．１        １００                  ２２０
５．９        １００                  １８６
６．９        １００                  １７１
７．７        １００                  １１８
８．５        １００                  １１８
９．２        １００                  １１０
９．９        １００                  １０６
【００７３】
上記から、本発明の酵素は、ｐＨ３．６乃至ｐＨ８．９のｐＨ範囲で、レシチン分解活性に対するグリセロ糖脂質分解活性が、少なくとも１０倍であることがわかる。これに対して、市販のリパーゼであるリポパンＦは、ｐＨ３．４乃至ｐＨ９．９のｐＨ範囲で、レシチン分解活性に対するグリセロ糖脂質分解活性が、多くとも３倍であり、ｐＨ４．１乃至ｐＨ９．９のｐＨ範囲では、レシチン分解活性に対するグリセロ糖脂質分解活性が、同等以下である。
【００７４】
また、ＳＡＮＫ  １１２９８株により産生され、精製されたグリセロ糖脂質リパーゼは、配列番号３に示す部分アミノ酸配列を有する。配列はＮ末端から記す。
【００７５】
以上のことから、本発明のグリセロ糖脂質リパーゼの有する性質としては以下のようなものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約２９，０００を示す；
２）中性脂肪及びレシチン及びグリセロ糖脂質をｐＨ６．０において加水分解する；
３）ｐＨ３．６乃至ｐＨ８．９のｐＨ範囲で、レシチン分解活性に対するグリセロ糖脂質分解活性の比が、少なくとも１０倍である；
４）グリセロ糖脂質に対する相対分解活性はｐＨ４．１乃至ｐＨ７．７のｐＨ範囲で少なくとも８０％以上である；
５）レシチンに対する相対分解活性はｐＨ５．１乃至ｐＨ７．１のｐＨ範囲で少なくとも８０％以上である；
６）８０℃以上の温度で上記５）記載の加水分解活性を有さない；
７）ｐＨ４．１乃至ｐＨ１０．７のｐＨ範囲で７５％以上のグリセロ糖脂質に対する相対残存分解活性分解活性を有する。
【００７６】
また、本発明のグリセロ糖脂質リパーゼを製造する方法も本発明に含まれる。
ＳＡＮＫ  １１２９８株をはじめとするグリセロ糖脂質リパーゼ産生微生物を培地で培養することにより、グリセロ糖脂質リパーゼを産生することができる。例えば、０．１〜５．０％グルコース（和光純薬（株）製）、０．１〜５．０％イーストエクストラクト（Ｄｉｆｃｏ（株）製）、０．１〜５．０％カザミノ酸（Difco）、０．１〜５．０％トゥイーン８０（Sigma-Aldrich Japan Co.Ltd.）、０．０１〜１．０％リン酸水素２カリウム、０．００５〜１．０％硫酸マグネシウムに０．０５〜５．０％すりゴマを添加した培地の培地で、１６〜４５℃で１〜１５日間、１００〜２５０ｒｐｍで振とう培養する。
【実施例】
【００７７】
以下に、実施例及び試験例を挙げるが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００７８】
実施例１．ＳＡＮＫ  １１２９８株からのグリセロ糖脂質リパーゼの精製
１）粗酵素液の調製
滅菌した下記の組成の培地１００ｍｌが入っている５００ｍｌ容の三角フラスコにＳＡＮＫ  １１２９８株の菌体を接種し、２６℃にて４日間、１７０ｒｐｍの振とう培養を行った。
培地組成
グルコース                            ２０ｇ
イーストエクストラクト                １０ｇ
カザミノ酸                            １０ｇ
すりゴマ                              ２０ｇ
トゥイーン８０                        １０ｇ
リン酸水素２カリウム                    ０．１ｇ
硫酸マグネシウム                        ０．０５ｇ
純水で１，０００ｍｌとした。
培養終了後、４℃、１０，０００×Ｇにて１０分間の遠心分離を行った。得られた上清を粗酵素液とした。
【００７９】
２）酵素活性測定法
グリセロ糖脂質リパーゼの加水分解活性は以下のようにして測定した。
１．ＤＧＤＧを基質として用いた場合（ＤＧＤＧ分解活性）
日清製粉株式会社の日清フラワー薄力小麦粉から抽出・精製し、ＴＬＣでワンスポットを示し、マススペクトロメトリーにおいてもＳＩＧＭＡ  Ｄ４６５１−１０ＭＧ  ジガラクトシルジグリセリドと同様の結果を示す画分を、以下ＤＧＤＧとして用いた。
ＤＧＤＧ２００ｍｇを４％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  １０ｍｌに溶解し、２％ＤＧＤＧ溶液とした。２％ＤＧＤＧ溶液２１０μｌと４００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６）３０μｌの混合液を５分間３７℃で保温したものに、酵素液３０μｌを添加しよく攪拌後、３７℃で１０分間保温した。１Ｎ塩酸３０μｌを加えて酵素反応を停止した。酵素液は１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で希釈して用いた。
【００８０】
２．レシチンまたはＬＰＣを基質として用いた場合（レシチン分解活性）
レシチン（ＳＬＰ−ホワイト、辻製油（株）製）２００ｍｇを４％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  １０ｍｌに溶解し、２％レシチン溶液とした。２％レシチン溶液５００μｌと２００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６）２５０μｌの混合液を５分間３７℃で保温したものに、酵素液１５０μｌを添加しよく攪拌後、３７℃で１０分間保温した。１Ｎ塩酸１００μｌを加えて酵素反応を停止した。酵素液は１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で希釈して用いた。ＬＰＣを基質とする場合も、上記の条件と同様に行った。
【００８１】
３．オリーブ油を基質として用いた場合（中性脂肪分解活性）
オリーブ油（ナカライテスク（株）製）２００ｍｇとアラビアガム（和光純薬工業（株）製）１００ｍｇに水１０ｍｌを加え、ブレンダー（日本精機（株）製）で、１０，０００r.p.m.、１分間の条件で乳化した。この溶液２００μｌ、２００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ６  １００μｌおよび１００ｍＭカルシウムクロライド溶液２０μｌの混合液を５分間３７℃で保温したものに、酵素液４０μｌを添加しよく攪拌後、３７℃で１０分間保温した。１Ｎ塩酸４０μｌを加えて酵素反応を停止した。この混合液に４％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ４００μｌを加えて遊離脂肪酸を溶解させた。
【００８２】
４．遊離脂肪酸の定量
酵素反応の結果生じた遊離脂肪酸をＮＥＦＡ（協和メデックス（株）製）で定量した。上記１．あるいは２．あるいは３．で得られた反応液３０μｌに遮光条件下ＮＥＦＡの溶液を３ｍｌ添加し、３７℃で１０分間反応した。この混合液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。ＤＧＤＧ分解活性は、ＤＧＤＧから１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生じせしめる酵素量を１ユニットと定義した。レシチン分解活性は、レシチンから１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生じせしめる酵素量を１ユニットと定義した。中性脂肪分解活性は、オリーブ油から１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生じせしめる酵素量を１ユニットと定義した。
【００８３】
３）精製酵素液の調製
１）で得られた粗酵素液５００ｍｌに硫安（和光純薬（株）製）を加え、終濃度１Ｍになるように調整した。これを、予め１Ｍ硫安で平衡化したトヨパールＢｕｔｙｌ  ６５０Ｍ（東ソー（株）製）カラム（直径２．２ｃｍ×長さ２０ｃｍ）に添加し、吸着させた。１Ｍ硫安で該カラムを十分洗浄した後、６００ｍｌ中に１乃至０Ｍ/０．１％トゥイーン８０の硫安の直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。レシチン分解活性は硫安濃度が０Ｍ乃至０．２Ｍの画分（１２０ｍｌ）に溶出された。これを粗精製酵素画分とした。
【００８４】
得られた活性画分１２０ｍｌを１０ｍＭトリス・塩酸／０．１％トゥイーン８０緩衝液（ｐＨ８）４，０００ｍｌに対して１２時間ずつ３回透析した後、予め１０ｍＭトリス・塩酸/０．１％トゥイーン８０緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したトヨパールＤＥＡＥ  ６５０Ｍ（東ソー（株）製）カラム（直径２．２ｃｍ×長さ２０ｃｍ）に添加し、吸着させた。該カラムを１０ｍＭトリス・塩酸/０．１％トゥイーン８０緩衝液（ｐＨ８）で十分洗浄した後、１０ｍＭトリス・塩酸/０．１％トゥイーン８０緩衝液（ｐＨ８）中に０乃至１．０Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。レシチン分解活性は塩化ナトリウム濃度が０．４２Ｍ乃至０．５９Ｍの画分（１２０ｍｌ）に溶出された。
【００８５】
得られた活性画分４０ｍｌを濃縮し、予め０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）製）カラム（直径１６ｍｍ×６０ｃｍ）に添加した後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて溶出させた。レシチン分解活性は、溶出量が６０ｍｌ乃至６７．５ｍｌおよび８１ｍｌ乃至９０ｍｌの画分に溶出された。前者をグリセロ糖脂質リパーゼＧ−１、後者をグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２とした。
この画分を精製酵素溶液とした。
【００８６】
４）精製酵素の分子量測定
１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法（Laemmli, U.K., Nature, 227, 680(1970)参照）により、精製酵素の分子量を求めた。標準タンパク質として次のものを用いた：ａ．ホスホリラーゼ、分子量９７，０００：ｂ．アルブミン、分子量６６，０００：ｃ．オバルブミン、分子量４５０００：ｄ．カルボニック・アンヒドラーゼ、分子量３０，０００：ｅ．トリプシン・インヒビター、分子量２０，１００：ｆ．α−ラクトアルブミン、分子量１４，４００。グリセロ糖脂質リパーゼＧ−１およびグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２ともに分子量約２９，０００の単一バンドを示した。
【００８７】
５）等電点の測定
ファストゲルＩＥＦ  ３−９（アマシャムバイオサイエンス（株）製）を用いて測定した。グリセロ糖脂質リパーゼＧ−２はｐＩ４．５付近を示した。標準タンパク質として次のものを用いた：ａ．アミルグルコシダーゼ、ｐＩ３．５０：ｂ．トリプシン・インヒビター、ｐＩ４．５５：ｃ．β−ラクトグロブリン  Ａ、ｐＩ  ５．２０：ｄ．カルボニック・アンヒドラーゼ  Ｂ（ウシ）、ｐＩ  ５．８５：ｅ．カルボニック・アンヒドラーゼ  Ｂ（ヒト）、ｐＩ  ６．５５：ｆ．ミオグロビン・酸性バンド、ｐＩ  ６．８５：ｇ：ミオグロビン・塩基性バンド、ｐＩ  ７．３５：ｈ．レンチ・レクチン  酸性、ｐＩ  ８．１５：ｉ．レンチ・レクチン  中性、ｐＩ  ８．４５：ｊ．レンチ・レクチン  塩基性、ｐＩ  ８．６５：ｋ．トリプシノーゲン、ｐＩ  ９．３０。
【００８８】
実施例２．リポパンＦからのグリセロ糖脂質リパーゼの精製
リポパンＦ（２０ｇ）に１Ｍ硫安溶液を加えて酵素を溶出させた後、沈殿を除去した。上澄を、予め１Ｍ硫安で平衡化したトヨパールＢｕｔｙｌ  ６５０Ｍ（東ソー（株）製）カラム（直径２．２ｃｍ×長さ２０ｃｍ）に添加し、吸着させた。１Ｍ硫安で該カラムを十分洗浄した後、６００ｍｌ中に１乃至０Ｍ/０．１％トゥイーン８０の硫安の直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。レシチン分解活性は硫安濃度が０Ｍ乃至０．２Ｍの画分（１２０ｍｌ）に溶出された。これをリポパンＦ粗精製酵素画分とした。
【００８９】
得られた活性画分１２０ｍｌを１０ｍＭトリス・塩酸/０．１％トゥイーン８０緩衝液（ｐＨ８）４，０００ｍｌに対して１２時間ずつ３回透析した後、予め１０ｍＭトリス・塩酸/０．１％トゥイーン８０緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したトヨパールＤＥＡＥ  ６５０Ｍ（東ソー（株）製）カラム（直径２．２ｃｍ×長さ２０ｃｍ）に添加し、吸着させた。該カラムを１０ｍＭトリス・塩酸/０．１％トゥイーン８０緩衝液（ｐＨ８）で十分洗浄した後、１０ｍＭトリス・塩酸/０．１％トゥイーン８０緩衝液（ｐＨ８）中に０乃至１．０Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。レシチン分解活性は塩化ナトリウム濃度が０．４２Ｍ乃至０．５９Ｍの画分（１２０ｍｌ）に溶出された。
この画分をリポパンＦの精製酵素とした。
【００９０】
実施例３． ＳＡＮＫ１１２９８株由来のグリセロ糖脂質リパーゼのN末端アミノ酸配列の決定
精製した酵素を実施例１．４）に示した方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたのち、ＰＶＤＦ膜にブロッティングした。これについてアミノ酸配列解析装置（Procise cLC、Applied Biosystem）でアミノ酸配列を解析した。その結果得られた部分アミノ酸配列をアミノ末端側から記す（配列番号３）。
【００９１】
実施例３．ＳＡＮＫ１１２９８株のグリセロ糖脂質リパーゼをコードするＤＮＡの同定
１）全ＲＮＡの精製
ＳＡＮＫ）１１２９８株を液体培地（２％ポリペプトン（和光純薬（株）製）、０．５％イースト・エキストラクト、０．０２％燐酸水素２カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム）２０mlで２６℃、２日間前培養した。その後、液体培地（２％グルコース、１％イースト・エキストラクト、１％カザミノ酸、２％すりゴマ、１％トゥイーン８０、０．１％燐酸水素２カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム）に１％植菌し、２６℃で４日間培養した。培養した菌体を吸引集菌し、−８０℃に冷やした乳鉢（オートクレーブ滅菌済）に移した。液体窒素を加えながら、乳棒で菌体を破砕し、粉末状にした。完全に粉末状になった菌体をＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ ＭｉｎｉＫｉｔ(キアゲン（株）製)を用いて全ＲＮＡの精製を行った。６６０ｎｇ／μｇの濃度の溶液が、５０μｌ得られた。
【００９２】
２）グリセロ糖脂質リパーゼ遺伝子の解読
５’ＲＡＣＥ法および３’ＲＡＣＥ法にて遺伝子配列の解読をおこなった。具体的には、５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍおよび３’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ（いずれもインビトロジェン（株）製）を使用し、ポリメラーゼとしてＥＸ  ＴａｑＴＭ(タカラバイオ（株）製)を用いてＰＣＲをおこなった。このときに使用したＰＣＲプライマーは、５’側の遺伝子配列増幅用に配列番号４および５、３’側の遺伝子配列増幅用に配列番号６および７を用いた。ＰＣＲサイクルは、９４℃・５分、（９４℃・３０秒、５５℃・３０秒、７２℃・２分３０秒）×３０、７２℃・１０分、４℃で増幅した。５’側の遺伝子配列約１，０００bp、３’側の遺伝子配列約１，２００bpの長さのＤＮＡが増幅された。
【００９３】
各々のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動をおこなった後、Qiaquick Gel Extraction Kit（キアゲン（株）製）で精製した。精製物をTOPOTMTAクローニングキット（インビトロジェン（株）製）を用いてベクターに連結し、形質転換をおこなった。形質転換した大腸菌を３７℃、一晩寒天培地（ＬＢ／Ａｇａｒ（和光純薬(株)製））上で培養した後、生育したコロニーを３７℃、一晩液体培地（ＬＢｂｒｏｔｈ（和光純薬（株）製））で培養した。増殖した大腸菌からプラスミドをQiaprep Spin Miniprep Kit（キアゲン（株）製）を用いて精製し、ＤＮＡ配列解析をおこなった。ＤＮＡ配列解析の結果を配列番号１に示した。また、ＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示した。
【００９４】
試験例１．ＳＡＮＫ  １１２９８株由来グリセロ糖脂質リパーゼの精製酵素液の諸性質
実施例１．３）で得られた精製酵素液について、活性測定を行なった。
１）基質選択性
各基質の２％溶液を調整し、実施例 1．２）の方法により、酵素は実施例１．３）に示したグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２あるいは実施例２．に示したリポパンＦ精製酵素を用いて測定した。ＤＧＤＧ分解活性を１００％とした相対活性で表す。レシチンはＳＬＰ−ホワイトを示す。ＬＰＣは大豆由来であり、シグマアルドリッチジャパンから購入した。
基質                        Ｇ−２      リポパンＦ未精製酵素  リポパンＦ精製酵素
ＤＧＤＧ                    １００          １００                １００
レシチン                        ６．１      ２２９                １８６
ＬＰＣ                          ０．５          ９．９                ０．７
オリーブオイル                ２８．３        ２７．４                ＮＤ
【００９５】
２）ｐＨ活性
１．ＤＧＤＧを基質に用いた場合
実施例１．２）１．に示した方法に拠って活性測定をおこなった。酵素は、実施例１．３）に示したグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２あるいは実施例２．に示したリポパンＦ精製酵素を用いた。緩衝液は、ｐＨ３−６：酢酸緩衝液、ｐＨ６−８：ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ８−１１：Atkins-Pantin緩衝液を用いた。各ｐＨにおける両酵素の相対分解活性を下記に記載した。またグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２を用いたときの結果を図１にリポパンＦ精製酵素の結果を図２に示した。
【００９６】
ｐＨ活性（図１および図２）
Ｇ−２                        リポパンＦ精製酵素
ｐＨ        相対活性（％）        ｐＨ        相対活性（％）
３．６      ７８．２              ３．４        ８．７
４．１      ８７．０              ４．１      １２．３
４．９      ９６．４              ５．１      １８．４
５．９      ９９．３              ５．９      ３１．１
６．７    １００                  ６．９      ５２．７
７．７      ９０．５              ７．７      ８８．２
８．１      ６４．１              ８．５      ９２．７
８．９      ４３．７              ９．２    １００
９．６      １３．５              ９．９      ９４．３
なお、本発明では、相対活性で８０％以上の活性を有しているｐＨを至適ｐＨと定義した。したがって、本発明のグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２の至適ｐＨは、ｐＨ４．１〜７．７である。またリポパンＦ精製酵素の至適ｐＨは、ｐＨ７．７〜９．９である。また、相対活性で９０％以上の活性を有しているｐＨは、グリセロ糖脂質リパーゼＧ−２で４．９〜７．７であり、リポパンＦ精製酵素で８．５〜９．９である。
【００９７】
２．レシチンを基質に用いた場合
実施例１．２）２．に示した方法に拠って活性測定をおこなった。酵素は、実施例１．３）に示したグリセロ糖脂質リパーゼＧ−１あるいはグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２を用いた。緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ３．４乃至ｐＨ６．１の場合、酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ６．０乃至ｐＨ８．０の場合、ＭＯＰＳ緩衝液：ｐＨ７．５乃至ｐＨ９．０の場合、トリス・塩酸緩衝液。各ｐＨにおける両酵素の相対分解活性を下記に記載した。またグリセロ糖脂質リパーゼＧ−１を用いたときの結果を図３にグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２の結果を図４に示した。
ｐＨ活性（図３および図４）
ｐＨ                  相対活性（％）
Ｇ−１              Ｇ−２
３．４      ３７．９            ４０．１
４．１      ６２．９            ６７．６
５．１      ７９．３            ９４．２
６．０    １００              １００
７．１      ８８．３            ９３．９
８．０      ７２．９            ７１．８
９．０      ５５．０            ６０．３
なお、本発明では、相対活性で８０％以上の活性を有しているｐＨを至適ｐＨと定義した。したがって、レシチンを基質としたときの本発明のグリセロ糖脂質リパーゼＧ−１の至適ｐＨは、ｐＨ６．０〜７．１である。またグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２の至適ｐＨは、ｐＨ５．１〜７．１である。
【００９８】
３）ｐＨ安定性
１．ＤＧＤＧを基質に用いた場合
酵素は、実施例１．３）に示したグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２あるいは実施例２．に示したリポパンＦ精製酵素を１０μｌと２０ｍM緩衝液/１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液１９０μｌの混合液を３７℃で３０分間保温したのち、すぐに氷冷した。緩衝液はｐＨ３−６：酢酸緩衝液、ｐＨ６−８：ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ８−１１：Atkins-Pantin緩衝液を用いた。相対残存分解活性は、各加温酵素液を水で１０倍希釈したのち直ちに実施例１．２）１．の方法により測定した。最も活性が高かったｐＨ条件での残存分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素の相対残存分解活性を相対値として下記に記載した。またグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２を用いたときの結果を図５にリポパンＦ精製酵素の結果を図６に示した。
【００９９】
ｐＨ安定性（図５および図６）
相対残存分解活性（％）
ｐＨ          Ｇ−２                リポパンＦ精製酵素
３．４      ４５．７                  ６８．１
４．１      ７７．８                  ８１．０
５．１      ９９．６                  ９３．７
６．１      ９９．０                  ９６．３
６．９      ９６．３                １００
７．８      ９７．４                  ９９．０
８．４      ９３．５                  ９１．８
９．０      ９４．６                  ９２．５
９．８    １００                      ８９．１
１０．７      ９１．５                  ３９．０
なお、本発明では、相対残存分解活性で８０％以上の活性を有しているｐＨを安定ｐＨと定義した。したがって、本発明のグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２の安定ｐＨは、ｐＨ５．１〜１０．７である。またリポパンＦ精製酵素の安定ｐＨは、ｐＨ４．１〜９．８である。
【０１００】
２．レシチンを基質に用いた場合
実施例１．３）に示したグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２  ５０μｌに、以下に述べる各ｐＨの２００ｍＭ緩衝液５０μｌを添加し、３７℃にて３０分間保温した。緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ３．０乃至ｐＨ６．０の場合、酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ５．９乃至ｐＨ７．９の場合、ＭＯＰＳ緩衝液：ｐＨ７．６乃至ｐＨ９．０の場合、トリス・塩酸緩衝液。相対残存分解活性は、各加温酵素液を水で１０倍希釈したのち直ちに実施例１．２）２．の方法により測定した。最も活性が高かったｐＨ条件での残存分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素の相対残存分解活性を相対値として下記に記載した。また結果を図７に示した。
【０１０１】
ｐＨ安定性（図７）
ｐＨ      相対残存分解活性（％）
３．０      ６９．４
４．０      ８５．４
４．９      ８７．１
６．０    １００
７．０    １００
７．５    １００
７．９    １００
９．０    １００
【０１０２】
なお、本発明では、相対残存分解活性で８０％以上の活性を有しているｐＨを安定ｐＨと定義した。したがって、レシチンを基質としたときの本発明のグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２の安定ｐＨは、ｐＨ４．０〜９．０である。
【０１０３】
４）温度活性
１．ＤＧＤＧを基質に用いた場合
ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ６における温度活性を測定した。酵素は、実施例１．３）に示したグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２あるいは実施例２．に示したリポパンＦ精製酵素を用いた。測定法は実施例１．２）１．に示した方法に拠った。各温度における両酵素の相対分解活性を下記に記載した。またグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２を用いたときの結果を図８にリポパンＦ精製酵素の結果を図９に示した。
【０１０４】
温度活性（図８および図９）
温度（℃）                相対活性（％）
Ｇ−２              リポパンＦ精製酵素
３７          ９５．１                  ９４．９
４０          ９７．７                １００
４５        １００                      ９５．６
５０          ８６．１                  ９０．５
５５          ５０．４                  ５５．５
６０          ３３．５                  １７．３
６５          １２．１                    ４．８
７０            ８．２                    ７．６
【０１０５】
なお、本発明では、相対活性で８０％以上の活性を有している温度を至適温度と定義した。したがって、ＤＧＤＧを基質としたときの本発明のグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２の至適温度は、３７〜５０℃である。またリポパンＦ精製酵素も同じである。
【０１０６】
２．レシチンを基質に用いた場合
ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ６における温度活性を測定した。酵素は、実施例１．３）に示したグリセロ糖脂質リパーゼＧ−１あるいはグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２を用いた。測定法は実施例１．２）２．に示した方法に拠った。各温度における両酵素の相対分解活性を下記に記載した。またグリセロ糖脂質リパーゼＧ−１を用いたときの結果を図１０にグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２の結果を図１１に示した。
【０１０７】
温度活性（図１０および図１１）
温度（℃）                相対活性（％）
Ｇ−１                Ｇ−２
３０        １００                    １００
３５          ９６．２                  ９４．７
４０          ９９．５                  ８７．６
４５          ８８．０                  ９０．０
５０          ８８．５                  ７５．６
５５          ７９．３                  ７９．９
６０          ７６．０                  ７０．８
６５          ６８．８                  ６５．６
７０          ４７．６                  ４５．４
７５          １０．１                  １２．４
８０            ０．５                    ６．７
なお、本発明では、相対活性で８０％以上の活性を有している温度を至適温度と定義した。したがって、レシチンを基質としたときのグリセロ糖脂質リパーゼＧ−１の至適温度は、３０〜５０℃である。またグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２は３０〜４５℃である。
【０１０８】
５）温度安定性
１．ＤＧＤＧを基質に用いた場合
あらかじめ処理温度に保持した４００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６）３７．５μｌおよび１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液６２．５μｌに精製酵素液５０μｌを加え撹拌して均一にし、３０分間保温したのちすぐに氷冷した。酵素は、実施例１．３）に示したグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２あるいは実施例２．に示したリポパンＦ精製酵素を用いた。測定法は実施例１．２）１．に示した方法に拠った。最も活性が高かった温度条件での残存分解活性を１００％とし、各温度における酵素の相対残存分解活性を相対値として下記に記載した。またグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２を用いたときの結果を図１２にリポパンＦ精製酵素の結果を図１３に示した。
【０１０９】
温度安定性（図１２および図１３）
温度（℃）                    相対残存活性（％）
Ｇ−２              リポパンＦ精製酵素
４                ９９．０                １００
３７              １００                      ９９．４
４０                ９９．０                  ９８．１
４５                ６８．３                  ７５．２
５０                ３２．８                    ６．５
５５                ２６．１                    ０．１
６０                  ９．６                    ０．０
６５                  ３．２                    １．２
７０                  １．９                    ０．０
なお、本発明では、相対残存活性で８０％以上の活性を有している温度を安定温度と定義した。したがって、ＤＧＤＧを基質としたときの本発明のグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２の安定温度は、４〜４０℃である。またリポパンＦ精製酵素も同じである。
【０１１０】
２．レシチンを基質に用いた場合
あらかじめ処理温度に保持した４００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６）３７．５μｌおよび１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液６２．５μｌに精製酵素液５０μｌを加え撹拌して均一にし、３０分間保温したのちすぐに氷冷した。酵素は、実施例１．３）に示したグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２を用いた。測定法は実施例１．２）２．に示した方法に拠った。最も活性が高かった温度条件での残存活性を１００％とし、各温度における酵素の相対残存分解活性を相対値として下記に記載した。また結果を図１４に示した。
温度活性（図１４）
温度（℃）  相対残存活性（％）
４        １００
３０        １００
３５        １００
４０        １００
４５        １００
５０        １００
５５        １００
６０          ８６．２
６５          ２２．５
７０            ０．０
なお、本発明では、相対残存活性で８０％以上の活性を有している温度を安定温度と定義した。したがって、レシチンを基質としたときの本発明のグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２の安定温度は、４〜６０℃である。
【０１１１】
試験例２．  リゾグリセロ糖脂質生成の確認
１）試料の作成
実施例１．２）１．記載の２％ＤＧＤＧ溶液２１０μｌに４００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ６）３０μｌ、および実施例１．３）記載のグリセロ糖脂質リパーゼ酵素Ｇ−２  ３０μｌを加え、３７℃４時間で酵素反応を行った。シリカゲルプレート（Ｎｏ．５６２６）３×１０ｃｍにキャピラリーを用いて１μｌずつスポットし、展開溶媒にて展開した。展開後、発色試薬を噴霧して、ホットプレートにて加熱し、発色させた。
ＴＬＣ条件
プレート：薄層クロマトグラフィーガラスプレート
（メルク（株）製  シリカゲル６０  Ｎｏ．５６２６）
展開溶媒：クロロホルム：メタノール：水：酢酸エチル：２−プロパノール
（５：２：１：５：５）
発色試薬（オルシノール硫酸）：オルシン一水和物（ナカライテスク（株）製）２０ｍｇを濃硫酸１．１ｍｌに溶解し、氷で冷却しながら攪拌している蒸留水９ｍｌに徐々に加えて調製した。（冷暗所保存）
呈色反応・・展開後のプレートに発色試薬を噴霧し、ホットプレートにて加熱し発色させた。
Ｒｆ値：ＤＧＤＧ  ０．３５付近、ＤＧＭＧ  ０．２０付近
【０１１２】
２)マススペクトラムによるＤＧＭＧの確認
ＬＣ／ＭＳ法にて分子量を測定した。
測定条件  ＬＣ：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ
カラム：ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  ２．１×１００ｍｍ  １．７μｍ
溶離液条件：Ａ＝Ｈ２Ｏ（０．１％ＨＣＯＯＨ）  Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ
グラジェント条件：０ｍｉｎ．１０％Ｂ→８ｍｉｎ．１００％Ｂ（２ｍｉｎ．Ｈｏｌｄ）
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ．
ＭＳ：Ｗａｔｅｒｓ  ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥ
イオン化法：ＥＳＩ（＋／−）
Ｃｏｎｅ電圧：＋／−５０Ｖ
【０１１３】
ＤＧＤＧあるいは１）にて分離したＤＧＭＧをＬＣにて分離し、最大のピーク部分についてＭＳにて分子量を測定した。ＤＧＤＧはｍ／ｚ９７４、ＤＧＭＧはｍ／ｚ７０１にピークが観察された。
【０１１４】
試験例３．製パン試験
１）パンの焼成
強力粉２８０ｇ、バター１１ｇ、砂糖大さじ２、スキムミルク大さじ１、塩小さじ１、水２００ｍｌ、ドライイースト小さじ１、グリセロ糖脂質リパーゼＧ−２あるいはリポパンＦ精製酵素７２．５ユニット（ＤＧＤＧ分解活性）を混合し、ホームベーカリー（パナソニック（株）ＳＤ−ＢＴ５０）でパンを焼いた。焼成後室温付近まで冷却し、ビニール袋に入れて密封後、水を入れたバットを置いた２０℃の恒温槽内に一日保存した。その後比容積等を測定した。
【０１１５】
２）パンの比容積
なたね置換法で求めた。酵素を添加しない場合に比べて、本発明のグリセロ糖脂質リパーゼＧ−２を添加した場合２．７％の増量が見られた。リポパンＦ精製酵素を添加した場合には１３％の減量となった。
【０１１６】
３）パンの香り
１．官能による評価
パンを焼き、１日経過後のパンに不適なチーズ臭を３名の被験者が判断した平均値を示す。ただし、リポパンＦ精製酵素を用いたときの臭いを１０として表した。
酵素無添加            Ｇ−２            リポパンＦ精製酵素
チーズ臭                ０                  ４                    １０
【０１１７】
２．ＧＣ／ＭＡＳＳを用いた、臭い成分の分析
パンの中心部分約１ｇを下記の条件で分析した。
ＧＣ／ＭＳ（ＥＩ）条件
装置（ＧＣ）：ＨＰ６８９０（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
(ＭＳ)：ＭＡＳＳ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ５９７３Ｎ
（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
カラム      ：ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（６０ｍ・Ｌ＊０．２５・ＩＤ，０．５μｍ・Ｄｆ
（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
カラム流量  ：１．８ｍｌ／ｍｉｎ．（コンスタントフロー）
キャリアガス：ヘリウム
脱着条件    ：２５０℃（８分間）ａｔ  ＧＣ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ
注入口温度  ：２５０℃
カラム温度  ：４０℃：１３ｍｉｎ．〜１０℃／ｍｉｎ．〜２５０℃＊１５ｍｉｎ．
検出器      ：ＭＳ（ＥＩ  Ｓｃａｎ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）
標品のリテンションタイムと比較することにより、ピークの同定をおこなった。
【０１１８】
下記の化合物について差がみられた。リポパンＦ精製酵素を用いたときを１００とした相対値を示す。
酵素無添加        Ｇ−２      リポパンＦ精製酵素
へキサン酸エチル                  ２２．５        ２６．４        １００
オクタン酸エチル                  １５．９        ４６．３        １００
デカン酸エチル                    １２．１        ６５．７        １００
９−デセン酸エチル                Ｎ．Ｄ．        ６４．６        １００
ミリスチン酸イソプロピル          Ｎ．Ｄ．        Ｎ．Ｄ．        １００
オクタン酸                        Ｎ．Ｄ．        ４３．２        １００
【０１１９】
ここでＮ．Ｄ．は検出されないことを示す。上記のうち、オクタン酸はパンに不適なヤギのチーズ臭がすることが一般的に知られている。本発明の酵素を用いたほうが、上記化合物の生産量が少なかった。
【０１２０】
以上述べたように、本発明のグリセロ糖脂質リパーゼは、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）ＳＡＮＫ  １１２９８株由来であり、安全性に優れ、中性脂肪およびグリセロリン脂質およびグリセロ糖脂質を加水分解する能力を有し、弱酸性付近に最も高い活性を有するとともにある程度熱的に安定であり、リゾグリセロ糖脂質およびリゾグリセロリン脂質を実質加水分解しない酵素であり、食品工業および製パン工業いずれの分野においても優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】ＳＡＮＫ  １１２９８株由来の精製グリセロ糖脂質リパーゼＧ−２のＤＧＤＧを基質としたｐＨ活性
【図２】リポパンＦ精製酵素のＤＧＤＧを基質としたｐＨ活性
【図３】ＳＡＮＫ  １１２９８株由来の精製グリセロ糖脂質リパーゼＧ−１のレシチンを基質としたｐＨ活性
【図４】ＳＡＮＫ  １１２９８株由来の精製グリセロ糖脂質リパーゼＧ−２のレシチンを基質としたｐＨ活性
【図５】ＳＡＮＫ  １１２９８株由来の精製グリセロ糖脂質リパーゼＧ−２のＤＧＤＧを基質としたｐＨ安定性
【図６】リポパンＦ精製酵素のＤＧＤＧを基質としたｐＨ安定性
【図７】ＳＡＮＫ  １１２９８株由来の精製グリセロ糖脂質リパーゼＧ−２のレシチンを基質としたｐＨ安定性
【図８】ＳＡＮＫ  １１２９８株由来の精製グリセロ糖脂質リパーゼＧ−２のＤＧＤＧを基質とした温度活性
【図９】リポパンＦ精製酵素のＤＧＤＧを基質とした温度活性
【図１０】ＳＡＮＫ  １１２９８株由来の精製グリセロ糖脂質リパーゼＧ−１のレシチンを基質とした温度活性
【図１１】ＳＡＮＫ  １１２９８株由来の精製グリセロ糖脂質リパーゼＧ−２のレシチンを基質とした温度活性
【図１２】ＳＡＮＫ  １１２９８株由来の精製グリセロ糖脂質リパーゼＧ−２のＤＧＤＧを基質とした温度安定性
【図１３】リポパンＦ精製酵素のＤＧＤＧを基質とした温度安定性
【図１４】ＳＡＮＫ  １１２９８株由来の精製グリセロ糖脂質リパーゼＧ−２のレシチンを基質とした温度安定性
【図１】
2008206515.tif 000004
【図２】
2008206515.tif 000005
【図３】
2008206515.tif 000006
【図４】
2008206515.tif 000007
【図５】
2008206515.tif 000008
【図６】
2008206515.tif 000009
【図７】
2008206515.tif 000010
【図８】
2008206515.tif 000011
【図９】
2008206515.tif 000012
【図１０】
2008206515.tif 000013
【図１１】
2008206515.tif 000014
【図１２】
2008206515.tif 000015
【図１３】
2008206515.tif 000016
【図１４】
2008206515.tif 000017
【配列表】
2008206515000001.app