(57)【要約】【課題】簡便、迅速かつ正確に抗酸化物質の抗酸化能を評価することができる抗酸化能評価方法を提供する。【解決手段】遷移金属イオン、キレート剤及びｐH緩衝剤を含有する遷移金属イオン含有溶液と、発光物質及びｐH緩衝剤を含有する発光物質含有溶液と、測定対象である抗酸化物質を含有する抗酸化物質含有溶液とを予備混合し、その予備混合溶液を所定の温度で所定の時間保持した後、過酸化水素含有溶液とを混合し、混合溶液において発生した活性酸素と発光物質との反応による発光の強度を測定することにより、簡便、迅速かつ正確に抗酸化物質の抗酸化能を評価することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗酸化物質の抗酸化能を評価する抗酸化能評価方法であって、
遷移金属イオン、キレート剤及びｐH緩衝剤を含有する遷移金属イオン含有溶液と、発光物質及びｐH緩衝剤を含有する発光物質含有溶液と、測定対象である抗酸化物質を含有する抗酸化物質含有溶液とを予備混合する予備混合工程と、
前記予備混合した予備混合溶液を所定の温度で所定の時間保持するプレインキュベーション工程と、
前記保持した溶液と、過酸化水素を含有する過酸化水素含有溶液とを混合する混合工程と、
前記混合した混合溶液において発生した活性酸素と前記発光物質との反応による発光の強度を測定する発光量測定工程と、
を含み、
前記測定した発光の強度に基づいて前記抗酸化物質の抗酸化能を評価することを特徴とする抗酸化能評価方法。
【請求項２】
請求項１に記載の抗酸化能評価方法であって、
前記遷移金属イオンが２価のコバルトイオン、前記キレート剤がＥＤＴＡ系キレート剤であることを特徴とする抗酸化能評価方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗酸化能評価方法であって、
前記ｐH緩衝剤がホウ酸であることを特徴とする抗酸化能評価方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗酸化能評価方法であって、
前記発光物質がルミノールであることを特徴とする抗酸化能評価方法。
【請求項５】
請求項１に記載の抗酸化能評価方法であって、
前記遷移金属イオンが２価のコバルトイオン、前記キレート剤がＥＤＴＡ系キレート剤、前記ｐH緩衝剤がホウ酸、前記発光物質がルミノールであることを特徴とする抗酸化能評価方法。
【請求項６】
請求項５に記載の抗酸化能評価方法であって、
前記混合溶液におけるコバルトイオン、ルミノール及び過酸化水素の濃度比がモル比で１：（０．００２〜０．０１２）：（０．００２５〜０．０２）の範囲であることを特徴とする抗酸化能評価方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗酸化能評価方法であって、
前記発光量測定工程における測定温度が３５℃〜４０℃の範囲であることを特徴とする抗酸化能評価方法。
【請求項８】
請求項７に記載の抗酸化能評価方法であって、
前記プレインキュベーション工程における保持温度が前記測定温度−５（℃）〜前記測定温度の範囲であることを特徴とする抗酸化能評価方法。
【請求項９】
抗酸化物質の抗酸化能を評価するための抗酸化能評価キットであって、
遷移金属イオン、キレート剤及びｐH緩衝剤を含有する遷移金属イオン含有溶液と、
発光物質及びｐH緩衝剤を含有する発光物質含有溶液と、
過酸化水素を含有する過酸化水素含有溶液と、
を含むことを特徴とする抗酸化能評価キット。
【請求項１０】
請求項９に記載の抗酸化能評価キットであって、
前記遷移金属イオンが２価のコバルトイオン、前記キレート剤がＥＤＴＡ系キレート剤、前記ｐH緩衝剤がホウ酸、前記発光物質がルミノールであることを特徴とする抗酸化能評価キット。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の抗酸化能評価キットであって、
前記遷移金属イオン含有溶液及び発光物質含有溶液の２５℃におけるｐＨが８．９５〜９．０５の範囲であることを特徴とする抗酸化能評価キット。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の抗酸化能評価キットであって、
コバルトイオン含有溶液におけるコバルトイオンとＥＤＴＡ系キレート剤との濃度比がモル比で１：３．９〜１：４．１の範囲であることを特徴とする抗酸化能評価キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化物質の抗酸化能を評価するための抗酸化能評価方法及び抗酸化能評価キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、過酸化脂質、活性酸素等によって体内で生じる障害と多くの疾病や老化との関連が明らかにされてきた。エネルギー産生のためには酸素の消費は不可欠なことであるが、酸素の摂取によって取り込んだ酸素の数パーセントは常に体内で活性酸素に変化していると考えられている。したがって、活性酸素及び活性酸素より生じる過酸化脂質による障害、いわゆる酸素毒性を何らかの方法で最小限に抑制することが健康な生活を営むためには必須なことである。こうした背景の下、多くの抗酸化物質が食品、飲料、医薬品（医薬部外品を含む）などの形で市場に出回ってきている。抗酸化物質を有効に利用するためには、これらの抗酸化能（抗酸化活性）を定量的に正しく評価することが必要である。
【０００３】
抗酸化物質としては、（１）体内での活性酸素、フリーラジカル等の生成を抑制する物質、（２）体内で生成した活性酸素、フリーラジカル等を消去、安定化できる物質、（３）活性酸素、フリーラジカル等により生じた障害を元の状態へ戻すことができる物質、（４）活性酸素、フリーラジカル等による障害を防御できる状態を誘導しうる物質等に分類することができる。
【０００４】
これらのうち上記（２）に分類される、いわゆるラジカル捕捉型の抗酸化物質の抗酸化能を評価する方法としては、実際に食品等を摂取した場合の生体内での効果を判定する方法であることが望ましいが現実には難しく、例えば、アゾ化合物等の連鎖開始剤によるリノール酸の酸化に対する抗酸化物質の抑制効果を見る方法（ロダン鉄法、例えば非特許文献１参照）、比較的安定なラジカルを持つ１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ（ＤＰＰＨ）が抗酸化物質によって還元されることによる吸光度の変化を捕らえて抗酸化能を評価する方法（ＤＰＰＨ法、例えば非特許文献１、特許文献１参照）等が知られている。
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−１８３４６３号公報
【非特許文献１】徳江ら、「ウメの抗酸化性の検討（２００３）」、群馬県立産業技術センター研究報告（２００３年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ロダン鉄法及びＤＰＰＨ法は抗酸化物質の抗酸化能評価として現在広く用いられているが、感度が低く、前処理が煩雑である。そのため、簡便、迅速かつ正確に抗酸化物質の抗酸化能を評価できる方法が求められている。また、ロダン鉄法及びＤＰＰＨ法ともに、生体内で実際に発生するラジカルに対する抗酸化能を評価する方法ではない。
【０００７】
本発明は、簡便、迅速かつ正確に抗酸化物質の抗酸化能を評価することができる抗酸化能評価方法及び抗酸化能評価キットである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、抗酸化物質の抗酸化能を評価する抗酸化能評価方法であって、遷移金属イオン、キレート剤及びｐH緩衝剤を含有する遷移金属イオン含有溶液と、発光物質及びｐH緩衝剤を含有する発光物質含有溶液と、測定対象である抗酸化物質を含有する抗酸化物質含有溶液とを予備混合する予備混合工程と、前記予備混合した予備混合溶液を所定の温度で所定の時間保持するプレインキュベーション工程と、前記保持した溶液と、過酸化水素を含有する過酸化水素含有溶液とを混合する混合工程と、前記混合した混合溶液において発生した活性酸素と前記発光物質との反応による発光の強度を測定する発光量測定工程と、を含み、前記測定した発光の強度に基づいて前記抗酸化物質の抗酸化能を評価する。
【０００９】
また、前記抗酸化能評価方法において、前記遷移金属イオンが２価のコバルトイオン、前記キレート剤がＥＤＴＡ系キレート剤であることが好ましい。
【００１０】
また、前記抗酸化能評価方法において、前記ｐH緩衝剤がホウ酸であることが好ましい。
【００１１】
また、前記抗酸化能評価方法において、前記発光物質がルミノールであることが好ましい。
【００１２】
また、前記抗酸化能評価方法において、前記遷移金属イオンが２価のコバルトイオン、前記キレート剤がＥＤＴＡ系キレート剤、前記ｐH緩衝剤がホウ酸、前記発光物質がルミノールであることが好ましい。
【００１３】
また、前記抗酸化能評価方法において、前記混合溶液におけるコバルトイオン、ルミノール及び過酸化水素の濃度比がモル比で１：０．００２：０．００２５〜１：０．０１２：０．０２の範囲であることが好ましい。
【００１４】
また、前記抗酸化能評価方法において、前記発光量測定工程における測定温度が３５℃〜４０℃の範囲であることが好ましい。
【００１５】
また、前記抗酸化能評価方法において、前記プレインキュベーション工程における保持温度が前記測定温度−５（℃）〜前記測定温度の範囲であることが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、抗酸化物質の抗酸化能を評価するための抗酸化能評価キットであって、遷移金属イオン、キレート剤及びｐH緩衝剤を含有する遷移金属イオン含有溶液と、発光物質及びｐH緩衝剤を含有する発光物質含有溶液と、過酸化水素を含有する過酸化水素含有溶液と、を含む。
【００１７】
また、前記抗酸化能評価キットにおいて、前記遷移金属イオンが２価のコバルトイオン、前記キレート剤がＥＤＴＡ系キレート剤、前記ｐH緩衝剤がホウ酸、前記発光物質がルミノールであることが好ましい。
【００１８】
また、前記抗酸化能評価キットにおいて、前記遷移金属イオン含有溶液及び発光物質含有溶液の２５℃におけるｐＨが８．９５〜９．０５の範囲であることが好ましい。
【００１９】
また、前記抗酸化能評価キットにおいて、コバルトイオン含有溶液におけるコバルトイオンとＥＤＴＡ系キレート剤との濃度比がモル比で１：３．９〜１：４．１の範囲であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明では、遷移金属イオン、キレート剤及びｐH緩衝剤を含有する遷移金属イオン含有溶液と、発光物質及びｐH緩衝剤を含有する発光物質含有溶液と、測定対象である抗酸化物質を含有する抗酸化物質含有溶液とを予備混合し、その予備混合溶液を所定の温度で所定の時間保持した後、過酸化水素含有溶液とを混合し、混合溶液において発生した活性酸素と発光物質との反応による発光の強度を測定することにより、簡便、迅速かつ正確に抗酸化物質の抗酸化能を評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００２２】
＜抗酸化能評価方法＞
本実施形態では、食品等の中に含まれる抗酸化物質の抗酸化能を評価するため、主として上記（２）に分類される、いわゆるラジカル捕捉型の抗酸化物質の抗酸化能を評価することを対象とする。
【００２３】
活性酸素は、普通の酸素分子よりも活性化された状態の酸素分子とその関連物質を指し、スーパーオキシド（Ｏ・−）、ヒドロキシルラジカル（ＨＯ・）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素（１Ｏ２）等が知られている。本実施形態では、活性酸素の中でも特に強い障害性を示し、酸素毒性の初発過程で作用すると考えられているヒドロキシルラジカルに対する抗酸化物質の消去能を抗酸化能として主として評価する。
【００２４】
本実施形態に係る抗酸化能評価方法は、遷移金属イオン、キレート剤及びｐH緩衝剤を含有する遷移金属イオン含有溶液と、発光物質及びｐH緩衝剤を含有する発光物質含有溶液と、測定対象である抗酸化物質を含有する抗酸化物質含有溶液とを予備混合する予備混合工程と、予備混合した予備混合溶液を所定の温度で所定の時間保持するプレインキュベーション工程と、保持した溶液と、過酸化水素を含有する過酸化水素含有溶液とを混合する混合工程と、混合した混合溶液において発生した活性酸素と前記発光物質との反応による発光の強度を測定する発光量測定工程と、を含み、測定した発光の強度に基づいて抗酸化物質の抗酸化能を評価する。本方法により簡便、迅速かつ正確に抗酸化物質の抗酸化能を評価することができる。
【００２５】
本方法では、例えば下記反応式で表されるように、過酸化水素と例えば２価の遷移金属イオン（Ｍ２＋）によりヒドロキシルラジカルを主に発生させると考えられているフェントン（Ｆｅｎｔｏｎ）反応を利用する。そして、そのフェントン反応で発生したヒドロキシルラジカル等のラジカルの量を化学発光プローブである発光物質の発光量により測定する。なお、濃度条件によってはフェントン反応だけではなく、Ｈａｒｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応が関与する場合もある。
Ｍ２＋  ＋  Ｈ２Ｏ２  →  Ｍ３＋  ＋  ＨＯ・  ＋  ＨＯ−
発光物質  ＋  ＨＯ・  →  ｌｉｇｈｔ
Ｏ２・−  ＋  Ｍ３＋  →  Ｏ２  ＋  Ｍ２＋
【００２６】
（遷移金属イオン含有溶液）
遷移金属イオン含有溶液は、遷移金属イオン、キレート剤及びｐH緩衝剤を含有する。遷移金属イオン含有溶液は、例えば、遷移金属塩と、キレート剤と、ｐH緩衝剤と、溶媒とを混合することにより得られる。
【００２７】
２価鉄や２価コバルトのような遊離の還元型金属を単独で用いるよりも、キレート剤の存在下の方が恒常的で安定なヒドロキシルラジカル等のラジカルが産生される。
【００２８】
遷移金属イオンとしては、２価のコバルトイオン、２価の鉄イオン、２価のクロムイオン、１価の銅イオン等が挙げられるが、発光強度が比較的高いことやラジカル濃度に対する発光強度の直線性が良好である等の点から２価のコバルトイオンが好ましい。
【００２９】
２価のコバルトイオンの発生源となるコバルト塩としては、例えば、塩化コバルト六水和物（ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、塩化コバルト無水物（ＣｏＣｌ２）、酢酸コバルト四水和物（Ｃｏ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・４Ｈ２Ｏ）、臭化コバルト六水和物（ＣｏＢｒ２・６Ｈ２Ｏ）、臭化コバルト無水物（ＣｏＢｒ２）、等が挙げられる。
【００３０】
キレート剤としては、抗酸化能をほとんど有さないキレート剤であることが好ましく、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）系、ＤＰＴＡ系、ＥＤＤＰ系、ＤＴＰＡ系、ＥＧＴＡ系、ＮＴＡ系、ＮＴＰ系、ＮＴＰＯ系等のキレート剤が挙げられる。これらのうち、抗酸化能をほとんど有さないこと、キレート形成能、入手のし易さ等の点からＥＤＴＡ系キレート剤が好ましい。ＥＤＴＡ系キレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物（ＥＤＴＡ−２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ）、エチレンジアミン四酢酸二水素二カリウム二水和物（ＥＤＴＡ−２Ｋ・２Ｈ２Ｏ）等が挙げられる。
【００３１】
ｐH緩衝剤としては、遷移金属に対するキレート剤として働かないものであることが好ましく、例えば、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液等の緩衝液等が挙げられる。これらのうち、過酸化水素由来のラジカルとルミノールの発光が起こりやすいアルカリ性のｐＨ範囲に調整することができる等の点からホウ酸緩衝液が好ましい。
【００３２】
溶媒としては、例えば、水や、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられる。これらのうち、発生するヒドロキシルラジカル等のラジカルの安定性等の点から水が好ましい。また、水としては、蒸留水、イオン交換水等の純水、超純水等を用いることが好ましい。
【００３３】
遷移金属イオン含有溶液の２５℃におけるｐＨは、コバルトイオン等の安定性、最終の測定溶液（上記混合溶液）において過酸化水素由来のラジカルとルミノールの発光が安定して起こるアルカリ性にｐＨを調整するため等の点から７．５〜９．４の範囲であることが好ましく、８．９５〜９．０４の範囲であることがより好ましく、８．９９〜９．０１の範囲がさらに好ましい。このため、例えばコバルト塩等の遷移金属塩と、ＥＤＴＡ系キレート剤等のキレート剤と、ホウ酸等のｐH緩衝剤と、水等の溶媒とを混合した後、水酸化ナトリウム等のアルカリを用いてｐＨを上記範囲に調整することが好ましい。
【００３４】
コバルトイオン含有溶液中の、コバルトイオンとＥＤＴＡ系キレート剤との濃度比（モル比）は、１：３．９〜１：４．１が好ましく、１：４がより好ましい。この範囲であると恒常的で安定なヒドロキシルラジカル等のラジカルが産生されやすい。
【００３５】
（発光物質含有溶液）
発光物質含有溶液は、発光物質及びｐH緩衝剤を含有する。発光物質含有溶液は、例えば、発光物質と、ｐH緩衝剤と、溶媒とを混合することにより得られる。
【００３６】
発光物質としては、ルミノール（ｌｕｍｉｎｏｌ）、イソルミノール、８−Ａｍｉｎｏ−５−ｃｈｌｏｒｏ−７−ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｏ［３，４−ｄ］ｐｙｒｉｄａｚｉｎｅ−１，４−（２Ｈ，３Ｈ）ｄｉｏｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ等を挙げることができる。これらのうち、入手のし易さ、発光強度の測定における感度が最適である等の点からルミノールが好ましい。ルミノールは、化学発光プローブとして働き、ヒドロキシルラジカルと反応して、約４３０ｎｍに強い発光を示す化合物である。
【００３７】
ｐH緩衝剤、溶媒としては、遷移金属イオン含有溶液に用いるものと同様のものを用いることができる。
【００３８】
発光物質含有溶液の２５℃におけるｐＨは、最終の測定溶液において過酸化水素由来のラジカルとルミノールの発光が安定して起こるアルカリ性にｐＨを調整するため等の点から、７．５〜９．４の範囲であることが好ましく、８．９５〜９．０４の範囲であることがより好ましく、８．９９〜９．０１の範囲がさらに好ましい。このため、例えばルミノール等の発光物質と、ホウ酸等のｐH緩衝剤と、水等の溶媒とを混合した後、水酸化ナトリウム等のアルカリを用いてｐＨを上記範囲に調整することが好ましい。
【００３９】
（過酸化水素含有溶液）
過酸化水素含有溶液は、過酸化水素を含有する。過酸化水素は、上記反応の通り、ヒドロキシラジカル等のラジカルの発生源となる。過酸化水素含有溶液は、例えば、過酸化水素と溶媒とを混合することにより得られる。溶媒としては、コバルトイオン含有溶液に用いるものと同様のものを用いることができる。
【００４０】
（抗酸化物質含有溶液）
抗酸化物質含有溶液は、測定対象である抗酸化物質を含有する。抗酸化物質含有溶液は、例えば、測定対象である抗酸化物質と溶媒とを混合することにより得られる。溶媒としては、コバルトイオン含有溶液に用いるものと同様のものを用いることができる。なお、抗酸化物質は脂溶性の物質も多々あり、アルコール系溶媒のエタノール、ジメチルスルホキシド等の各種有機溶媒による抽出物を測定対象とせざるを得ない場合には、有機溶媒によるラジカルの消去による影響を避けるために、また、測定の再現性を良好にするために、エタノール等のアルコール系溶媒の濃度は最終測定溶液中１２容量％以下であることが好ましく、ジメチルスルホキシドの濃度は最終測定溶液中１０容量％以下であることが好ましい。したがって、最終測定溶液における有機溶媒の濃度が上記範囲になるように、抗酸化物質含有溶液中の有機溶媒濃度が低くなるようにすればよい。
【００４１】
測定対象となる抗酸化物質は、抗酸化性を有する物質であれば特に制限はなく、例えば、マンニトール、ケルセチン、アスコルビン酸、ソルビトール、メラトニン、トロロックス、クルクミン、ＢＨＡ、ＢＨＴ、カテキン、β−カロテン、リン酸トコフェノール、ＤＬ−α−トコフェノール、トコミン、α−リポ酸、キンコリドＡ、ギンコール酸、コエンザイムＱ１０、プロポリス、グルタチオン等、またはそれらの抗酸化物質を含有する食品類等が挙げられる。
【００４２】
（抗酸化能評価手順）
図１に本実施形態に係る抗酸化能評価方法の一例のフローチャートを示す。まず、以上の遷移金属イオン含有溶液、発光物質含有溶液、抗酸化物質含有溶液を所定の容器にそれぞれ分注し、予備混合する（Ｓ１０：予備混合工程）。予備混合時間、予備混合温度は各溶液が十分に混合することができれば良く特に制限はない。
【００４３】
次に、予備混合した予備混合溶液を所定の温度で所定の時間保持する（Ｓ１２：プレインキュベーション工程）。プレインキュベーションを行うことにより、測定時の発光強度や、最大発光強度に至る時間等を安定化させることができる。プレインキュベーションの時間としては、液温が安定化するのに必要な時間、例えば好ましくは１分〜１５分、より好ましくは２分〜１０分、さらに好ましくは５分〜１０分である。また、プレインキュベーションの温度は、好ましくは後述する発光強度の測定温度−５℃〜発光強度の測定温度、より好ましくは発光強度の測定温度−２℃〜発光強度の測定温度である。これにより、以下の発光量測定工程における測定温度を速やかに所定の範囲にすることができる。プレインキュベーション工程は、恒温装置等を用いて行うことができるが、後述する発光測定装置に備えた恒温手段を利用して、発光測定装置の測定室内で行ってもよい。これにより、発光強度の測定温度とほぼ同じ温度条件でプレインキュベーション処理を行うことができる。
【００４４】
次に、プレインキュベーション処理により保持した予備混合溶液と過酸化水素含有溶液とを混合する（Ｓ１４：混合工程）。混合時間、混合温度は各溶液が十分に混合することができれば良く特に制限はない。遷移金属イオン含有溶液、発光物質含有溶液、抗酸化物質含有溶液及び過酸化水素含有溶液を一度に混合して発光強度の測定を行うよりも、遷移金属イオン含有溶液、発光物質含有溶液及び抗酸化物質含有溶液を予備混合してプレインキュベーション処理の後に、過酸化水素含有溶液を添加し、ラジカル発生の反応を開始させた方が発光量のピーク値が高く、最大ピーク値への到達時間が短くなる傾向にあり、より正確にかつ迅速に発光強度を測定することができる。
【００４５】
測定する混合溶液（最終測定溶液）のｐＨ（２５℃）は、用いる抗酸化物質含有溶液のｐＨにも依存するが、７．５〜９．４の範囲であることが好ましい。混合溶液（最終測定溶液）のｐＨが７．５未満の場合及び９．４を超える場合には発光強度が安定しない場合がある。
【００４６】
発光強度の最適化、発光反応の再現性等の点から、混合溶液におけるコバルトイオン、ルミノール及び過酸化水素の濃度比がモル比で１：（０．００２〜０．０１２）：（０．００２５〜０．０２）の範囲であることが好ましく、１：（０．００２２５〜０．０１１）：（０．００３〜０．０１６）の範囲であることがより好ましく、１：（０．００２２５〜０．０１１）：（０．００３５〜０．０１５）の範囲であることがさらに好ましい。したがって、最終の測定溶液（混合溶液）において、コバルトイオン、ルミノール、過酸化水素のモル比が上記範囲になるようにコバルトイオン含有溶液中のコバルトイオン濃度、ルミノール含有溶液中のルミノール濃度、過酸化水素含有溶液中の過酸化水素濃度を決め、それらの分注量を決めればよい。コバルトイオン、ルミノール及び過酸化水素の濃度比が上記範囲外であると、発光強度が不足あるいは過剰となり、定量性が悪くなることがある。
【００４７】
そして、混合した混合溶液において、前記反応式により、Ｃｏ／ルミノール系の場合は下記反応式により発生した活性酸素（主にヒドロキシラジカル）と発光物質（ルミノール）との反応による発光の強度を測定する（Ｓ１６：発光量測定工程）。発光強度は、発光測定装置等を用いて測定することができる。発光測定装置としては、シングルフォトンカウント方式の発光測定装置が好ましく、低濃度でも発光強度を正確に測定することができるように高感度でダイナミックレンジが広く、直線性の高い発光測定装置、例えば、ルミネッセンスリーダ（アロカ株式会社製、ＡｃｃｕＦＬＥＸ  Ｌｕｍｉ４００）等が挙げられる。発光測定装置は、ラジカル発生等の反応を恒温で行うために、恒温手段を備えた測定室を有することが好ましい。
【００４８】
Ｃｏ２＋  ＋  Ｈ２Ｏ２  →  Ｃｏ３＋  ＋  ＨＯ・  ＋  ＨＯ−
Ｌｕｍｉｎｏｌ  ＋  ＨＯ・  →  ｌｉｇｈｔ（４３０ｎｍ）
Ｏ２・−  ＋  Ｃｏ３＋  →  Ｏ２  ＋  Ｃｏ２＋
【００４９】
また、発光強度は、通常、測定開始からの経過時間によって変化する場合があるので、最大発光強度（ピーク発光強度）を発光強度としても良いし、所定の経過時間範囲の積算値を発光強度としても良く、抗酸化物質の種類、濃度等の違いによるピーク挙動の変動等を考慮し、より正確な値を求めるためには所定の経過時間範囲の積算値を発光強度とすることが好ましい。例えば、測定開始から８０秒〜１２０秒間の積算値を発光強度とすることができる。
【００５０】
測定温度（発光測定装置の測定室内温度）は特に制限はないが、発光強度の安定化の点から液温を安定化するために、なるべく一定の温度で測定することが好ましい。また、同様の理由で、発光測定装置を設置する環境温度もなるべく一定にすることが好ましい。測定温度が高い方が、発光量のピーク値が高く、最大ピーク値への到達時間が短くなる傾向にあり、より正確にかつ迅速に発光強度を測定することができるため、好ましい。また、測定環境や、生体内での抗酸化物質の効果を正確に評価することを考慮すると、生体の体温に近い温度、例えば、３５℃〜４０℃の範囲が好ましく、３６℃〜３８℃の範囲で測定することがより好ましい。
【００５１】
発光測定装置等を用いて測定した発光の強度に基づいて抗酸化物質の抗酸化能を評価する（Ｓ１８：評価工程）。評価方法としては、例えば、ＩＣ５０値を得る方法、抑制率を計算する方法等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
［ＩＣ５０値による方法］
抗酸化物質の濃度を変化させて発光強度を測定し、抗酸化物質濃度と発光強度または発光強度の積算値とをプロットする。これがＳｉｇｍｏｉｄカーブを与える場合には、抗酸化物質無添加時の積算値からの差を百分率で出した値をプロビット変換し、この値とｌｏｇ表示の濃度とのプロットを取ると直線となる。これから回帰直線を求め、プロビット＝５に相当する濃度を求め、ＩＣ５０値を得ることができる。
【００５３】
また、抗酸化物質無添加時の積算値（Ｉ０）と、各濃度の抗酸化物質添加時の積算値（Ｉ）との比（Ｉ０／Ｉ）のｌｏｇ値から、［ｌｏｇ（Ｉ０／Ｉ）］×１００を得て、ｌｏｇ表示の濃度に対してプロットし、得られる直線上で［ｌｏｇ（Ｉ０／Ｉ）］×１００＝３０に対応する抗酸化物質の濃度を求め、ＩＣ５０値（５０％  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を得ることもできる。
【００５４】
［抑制率による方法］
極めて正確な抗酸化能を必要としないときは、一定濃度の抗酸化物質を添加して、発光量の積算値（Ｉ）を測定し、抗酸化物質無添加時の積算値（Ｉ０）と比較し、％表示で抗酸化能を見積もることができる。
抑制率（％）＝［（Ｉ−ブランク値）／（Ｉ０−ブランク値）］×１００
【００５５】
具体的な評価方法の一例を以下に示す。まず、２価のコバルトイオン、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）系キレート剤及びホウ酸を含有するコバルトイオン含有溶液と、ルミノール及びホウ酸を含有するルミノール含有溶液と、測定対象である抗酸化物質を含有する抗酸化物質含有溶液とを程度予備混合する（予備混合工程）。次に、予備混合した予備混合溶液を、好ましくは測定温度−２℃〜発光強度の測定温度で、好ましくは１分〜１５分間保持する（プレインキュベーション工程）。さらに、温度を保持した溶液と、過酸化水素を含有する過酸化水素含有溶液とを混合し（混合工程）、混合した混合溶液において発生した活性酸素（ヒドロキシラジカル等）とルミノールとの反応による発光（約４３０ｎｍ）の強度を測定する（発光量測定工程）。この測定した発光の強度に基づいて、ＩＣ５０値等を求め、抗酸化物質の抗酸化能を評価する（評価工程）ことができる。
【００５６】
＜抗酸化能評価キット＞
上記抗酸化能評価方法に用いられる本実施形態に係る抗酸化能評価キットは、
（１）遷移金属イオン、キレート剤及びｐH緩衝剤を含有する遷移金属イオン含有溶液
（２）発光物質及びｐH緩衝剤を含有する発光物質含有溶液
（３）過酸化水素を含有する過酸化水素含有溶液
を含む。
【００５７】
好ましくは、本実施形態に係る抗酸化能評価キットは、
（１）２価のコバルトイオン、ＥＤＴＡ系キレート剤及びホウ酸を含有するコバルトイオン含有溶液
（２）ルミノール及びホウ酸を含有するルミノール含有溶液
（３）過酸化水素を含有する過酸化水素含有溶液
を含む。
【００５８】
ここで、遷移金属イオン含有溶液及び発光物質含有溶液の２５℃におけるｐＨは、前述の通り、７．５〜９．４の範囲であることが好ましく、８．９５〜９．０４の範囲であることがより好ましく、８．９９〜９．０１の範囲がさらに好ましい。これにより、最終の測定溶液（混合溶液）において過酸化水素由来のラジカルとルミノールの発光が安定して起こるアルカリ性にｐＨを調整することができる。
【００５９】
コバルトイオン含有溶液中の、コバルトイオンとＥＤＴＡ系キレート剤との濃度比（モル比）は、前述の通り、１：３．９〜１：４．１の範囲が好ましく、１：４がより好ましい。
【００６０】
最終の測定溶液（上記混合溶液）におけるコバルトイオン、ルミノール、過酸化水素のモル比が上記範囲となるように、キットのコバルトイオン含有溶液におけるコバルトイオン濃度、ルミノール含有溶液におけるルミノール濃度、過酸化水素含有溶液における過酸化水素濃度、及び各溶液の分注量を決めることが好ましい。また、最終測定溶液の量がなるべく少なくなるように、各溶液の濃度及び分注量を決めることが好ましい。
【００６１】
また、キットにおける過酸化水素含有溶液は、キットとしての長期保存性を考慮して、保存中の過酸化水素の分解等が起こっても必要量の過酸化水素が不足しないように、所定の濃度、例えば最終の過酸化水素含有溶液濃度の９００倍〜１１００倍の過酸化水素含有原液として提供し、使用時に所定の濃度に薄めて使用することが好ましい。溶液中の過酸化水素濃度が薄すぎると保存中の過酸化水素の分解等により必要量が不足する場合がある。また、キットとしての長期保存性を考慮して、必要に応じて安定化剤を各溶液に添加しても良い。
【００６２】
キットにおける各溶液は、ガラス容器や、低密度ポリエチレン及び高密度ポリエチレン等のポリエチレン、ポリプロピレン等の樹脂容器等に収容することができる。このうち、キットの長期保存性を実現するために、ガラス容器、または樹脂容器としては酸素透過能の低いもの、例えば酸素透過率（ＪＩＳ  Ｋ７１２６）が２００ｃｃ／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であることが好ましく、例えば高密度ポリエチレンが好ましい。特に遷移金属含有溶液の容器には、２価のコバルトイオン、２価の鉄イオン等が３価のコバルトイオン、３価の鉄イオン等に変化することを防止するために酸素を透過しないガラス容器を用いることが好ましい。
【００６３】
その他、キットとして、抗酸化物質の標準品を含む標準抗酸化物質溶液等を含めても良い。また、本実施形態に係る抗酸化能評価キットと、ダイナミックレンジが広く、直線性の高いシングルフォトンカウント方式の発光測定装置とを組み合わせた抗酸化能評価システムとして提供しても良い。
【００６４】
以上のような、本実施形態に係る抗酸化能評価方法及び抗酸化能評価キットにより、抗酸化物質及び抗酸化物質を含有する食品、飲料、医薬品（医薬部外品を含む）等の抗酸化能を簡便、迅速かつ正確に評価することができる。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００６６】
まず準備段階として発光強度測定条件の最適化を行った。
【００６７】
（コバルトイオン含有溶液の調製）
Ｃｏ２＋とＥＤＴＡとの濃度比はモル比で１：４に固定して、以下の実験を行った。まず、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＥＤＴＡ−２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ、ホウ酸を水中に室温で懸濁させた。その後、１０％ＮａＯＨ水溶液を添加し、ｐＨ（２５℃）＝９．００に調整し、さらに水を加え、コバルトイオン含有溶液を調製した。水は、超純水製造装置（ＭＩＬＬＰＯＲＥ製）により精製した超純水を使用した（以下、同じ。なお、蒸留水を用いても良い。）。また、溶液のｐＨは、温度補正機能付きｐＨ測定器（ＨＯＲＩＢＡ社製、Ｆ−８型）により、液温２５℃の条件で測定した（以下、同じ）。なお、ｐＨ測定器の較正はｐＨ＝４及びｐＨ＝９の標準液を用いて行った。
【００６８】
（ルミノール含有溶液の調製）
ホウ酸を水中に室温で懸濁させた。その後、１０％ＮａＯＨ水溶液を添加し、ｐＨ（２５℃）＝９．００に調整し、さらに水を加え、ホウ酸緩衝液を調整した。ルミノールをホウ酸緩衝液に添加し、ルミノール含有溶液を調製した。
【００６９】
（過酸化水素含有溶液の調製）
３０％過酸化水素水溶液を水で希釈し、過酸化水素含有溶液を調製した。
【００７０】
＜各溶液中の試薬濃度の最適化＞
［過酸化水素濃度の検討（１）］
（発光強度測定）
測定用容器に、コバルトイオン含有溶液、ルミノール含有溶液、過酸化水素含有溶液をそれぞれピペッタで分注し、測定溶液中の終濃度がモル比で、コバルトイオン：ルミノール＝０．５，１，２：０．００５となるように、ルミノール：過酸化水素＝０．００５：０．００１，０．００２５，０．００５，０．０１，０．０１５，０．０２となるようにして測定溶液をそれぞれ調製した。それぞれの溶液について、予め測定室の温度を３７℃±１℃に設定したルミネッセンスリーダ（アロカ株式会社製、ＡｃｃｕＦＬＥＸ  Ｌｕｍｉ４００）の測定室にセットし、発生したラジカルとルミノールとの反応による発光（４３０ｎｍ）の強度を測定した。過酸化水素濃度と発光強度の最大値（ピーク発光強度）（ＲＬＵ／ｓｅｃ、ＲＬＵ＝Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）との関係を図２に示す。この結果、コバルトイオン：ルミノール：過酸化水素のモル比が１：０．００５：０．００５〜０．０１付近が最適のピーク値を与えるため好ましいと考えられる。また、コバルトイオン濃度がルミノール０．００５に対して、モル比０．５〜２付近、すなわちコバルトイオン１に対してルミノール０．００２５〜０．０１付近が最適のピーク値を与えるため好ましいと考えられる。
【００７１】
［過酸化水素濃度の検討（２）］
（発光強度測定）
測定用容器に、コバルトイオン含有溶液、ルミノール含有溶液、過酸化水素含有溶液をそれぞれピペッタで分注し、測定溶液中の終濃度がモル比で、コバルトイオン：ルミノール：過酸化水素＝１：０．００５：０．００２５，０．００５，０．００７，０．００７５，０．００８，０．０１となるようにして測定溶液をそれぞれ調製した。それぞれの溶液について、ルミネッセンスリーダの測定室にセットし、発光強度を測定した。過酸化水素濃度と発光強度の最大値（ピーク発光強度）との関係を図３に示す。この結果、最適ピーク値７〜９×１０６ＲＬＵ／ｓｅｃを与えるコバルトイオン：ルミノール：過酸化水素のモル比が１：０．００５：０．００６〜０．００８付近が好ましく、最適ピーク値７．７〜８．５×１０６ＲＬＵ／ｓｅｃを与えるコバルトイオン：ルミノール：過酸化水素のモル比が１：０．００５：０．００７〜０．００７５付近がより好ましいと考えられる。
【００７２】
［ルミノール濃度の検討（１）］
（発光強度測定）
測定用容器に、コバルトイオン含有溶液、ルミノール含有溶液、過酸化水素含有溶液をそれぞれピペッタで分注し、測定溶液中の終濃度がモル比で、コバルトイオン：ルミノール：過酸化水素＝１：０．００１，０．００２５，０．００５，０．０１，０．０１５，０．０２、コバルトイオン：過酸化水素＝１：０．００５，０．０１５となるようにして測定溶液をそれぞれ調製した。それぞれの溶液について、ルミネッセンスリーダの測定室にセットし、発光強度を測定した。ルミノール濃度と発光強度の最大値（ピーク発光強度）との関係を図４に示す。
【００７３】
［ルミノール濃度の検討（２）］
（発光強度測定）
測定用容器に、コバルトイオン含有溶液、ルミノール含有溶液、過酸化水素含有溶液をそれぞれピペッタで分注し、測定溶液中の終濃度がモル比で、コバルトイオン：ルミノール：過酸化水素＝１：０．０００５，０．００１，０．００２，０．００５，０．０１，０．０１５，０．０２：０．００７となるようにして測定溶液をそれぞれ調製した。それぞれの溶液について、ルミネッセンスリーダの測定室にセットし、発光強度を測定した。ルミノール濃度と発光強度の最大値（ピーク発光強度）との関係を図５に示す。この結果、最適ピーク値７〜９×１０６ＲＬＵ／ｓｅｃを与えるコバルトイオン：ルミノール：過酸化水素のモル比が１：０．００４〜０．００６：０．００７付近が好ましく、最適ピーク値７．７〜８．５×１０６ＲＬＵ／ｓｅｃを与えるコバルトイオン：ルミノール：過酸化水素のモル比が１：０．００４５〜０．００５５：０．００７付近がより好ましいと考えられる。
【００７４】
以上の結果から、最適の測定溶液中の終濃度のモル比を、コバルトイオン：ルミノール：過酸化水素＝１：０．００５：０．００７と設定した。
【００７５】
＜溶媒の検討＞
ヒドロキシラジカル等のラジカルはエタノール等の各種有機溶媒により消去されるおそれがあるので、溶媒は水が望ましいが、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等による抽出物を測定対象とする場合があるため、エタノール及びＤＭＳＯの影響を検討した。
【００７６】
測定溶液中の終濃度がモル比で、コバルトイオン：ルミノール：過酸化水素＝１：０．００５：０．００７となるように、それぞれ上記各溶液を分注、混合し、そこにエタノールが全溶液量の３容量％、６容量％、１２容量％となるようにエタノールをそれぞれ添加した。同様に、ＤＭＳＯが全溶液量の３容量％、６容量％、１２容量％となるようにＤＭＳＯをそれぞれ添加した。有機溶媒添加無しのサンプルを対照サンプルとした。それぞれの溶液について、予め測定室の温度を３７℃±１℃に設定したルミネッセンスリーダ（アロカ株式会社製、ＡｃｃｕＦＬＥＸ  Ｌｕｍｉ４００）の測定室にセットし、発生したヒドロキシラジカルとルミノールとの反応による発光（４３０ｎｍ）の強度を測定した。対照サンプルに対する抑制率（％）と有機溶媒添加量（容量％）との関係を図６に示す。エタノールの場合、エタノールを１２容量％添加すると、水の場合の値の７０％程度の発光量の低下が認められ、ＤＭＳＯの場合、ＤＭＳＯを１２容量％添加すると、水の場合の値の８４％程度の発光量の低下が認められる。これより、ＤＭＳＯの方がエタノールよりラジカルの消去能が高いことがわかる。また、測定溶液中、エタノールは１２容量％以下、ＤＭＳＯは１０容量％以下が好ましいことがわかる。
【００７７】
＜混合順序の検討＞
各溶液の混合順序を検討した。
（方法１）
コバルトイオン含有溶液、ルミノール含有溶液、過酸化水素含有溶液を混合した後、発光強度を測定する方法
（方法２）
コバルトイオン含有溶液、ルミノール含有溶液を予備混合し、３７℃で２分間保温後、過酸化水素含有溶液を添加、混合した後、発光強度を測定する方法
【００７８】
測定溶液中の終濃度がモル比で、コバルトイオン：ルミノール：過酸化水素＝１：０．００５：０．０１５となるように、上記各溶液を使用し、３７℃で測定を行った。方法１の場合、ピーク発光強度（２回測定の平均値）が１５，９２０，０００（ＲＬＵ／ｓｅｃ）で最大ピーク値への到達時間が１３５ｓｅｃ〜１４０ｓｅｃであったのに対し、方法２の場合、ピーク発光強度（２回測定の平均値）が１７，３３５，０００（ＲＬＵ／ｓｅｃ）で最大ピーク値への到達時間が８０ｓｅｃ〜８５ｓｅｃであった。この結果より、方法２の方が、発光量のピーク値が高く、最大ピーク値への到達時間も短かった。これより、方法２の方が好ましいことがわかる。
【００７９】
＜方法２における保温時間の検討＞
上記方法２における保温時間（プレインキュベーション時間）の検討を行った。測定溶液中の終濃度がモル比で、コバルトイオン：ルミノール：過酸化水素＝１：０．００５：０．０１５となるように、上記各溶液を使用し、過酸化水素含有溶液添加前のプレインキュベーション時間を２分、５分、１０分として３７℃（測定室温度）で測定を行った。プレインキュベーション時間（ｍｉｎ）とピーク発光強度（ＲＬＵ／ｓｅｃ）（１０回測定の平均値）との関係を図７に、プレインキュベーション時間（ｍｉｎ）と最大ピーク値への到達時間（ｓｅｃ）（１０回測定の平均値）との関係を図８に、プレインキュベーション時間（ｍｉｎ）と測定開始から８０秒〜１２０秒間の積算値（ＲＬＵ）（１０回測定の平均値）との関係を図９にそれぞれ示す。プレインキュベーション時間５分以上になると、ピーク発光強度、最大ピーク値への到達時間、測定開始から８０秒〜１２０秒間の積算値がいずれもほぼ一定値に達した。したがって、プレインキュベーション時間は５分〜１０分が好ましいことがわかる。また、ピーク発光強度（ＲＬＵ／ｓｅｃ）の１０回測定の結果より、平均値±ＳＤは、８，７３７，５００±２６９，５８５であり、ＣＶ値は３．０９６％であった。これより、測定の同時再現性に優れることがわかる。
【００８０】
＜測定温度の検討＞
測定温度の検討を行った。測定溶液中の終濃度がモル比で、コバルトイオン：ルミノール：過酸化水素＝１：０．００５：０．００５となるように、上記各溶液を使用し、測定温度（測定室温度）を２６℃，３０℃，３１℃，３５℃，３７℃，４０℃として測定を行った。測定温度（℃）とピーク発光強度（ＲＬＵ／ｓｅｃ）との関係を図１０に、測定温度（℃）と最大ピーク値への到達時間（ｓｅｃ）との関係を図１１に示す。これより、測定温度はなるべく高い方が好ましく、最適ピーク値を与える３５℃〜４０℃の範囲が好ましいことがわかる。
【００８１】
＜実施例１＞
（抗酸化物質含有溶液（１）の調製）
水溶性抗酸化物質であるアスコルビン酸を水で希釈し、抗酸化物質含有溶液を調製した。また、対照サンプルとして、アスコルビン酸無添加の溶液を調製した。
【００８２】
（抗酸化能測定）
測定用容器に、測定溶液中の終濃度がモル比で、コバルトイオン：ルミノール：過酸化水素：抗酸化物質＝１：０．００５：０．００７：０．００５となるように、上記各溶液を使用した。コバルトイオン含有溶液、ルミノール含有溶液、抗酸化物質含有溶液をそれぞれピペッタで分注し、ボルテックスミキサにより室温で１秒間撹拌した（予備混合工程）。次に、予備混合溶液を含む測定用容器を、予め測定室の温度を３７℃±１℃に設定したルミネッセンスリーダ（アロカ株式会社製、ＡｃｃｕＦＬＥＸ  Ｌｕｍｉ４００）の測定室にセットし、当該温度で５分間保温した（プレインキュベーション工程）。次に、保持した溶液に、過酸化水素含有溶液をピペッタで添加し、ボルテックスミキサにより１秒間撹拌した（混合工程）。混合溶液を含む測定用容器を、上記ルミネッセンスリーダの測定室にセットし、測定を開始した（発光量測定工程）。測定温度（測定室温度）３７℃±１℃、測定時間は３００秒とし、発生したラジカルとルミノールとの反応による発光（４３０ｎｍ）の強度を測定した。なお、過酸化水素含有溶液添加から発光量測定開始までの時間はなるべく同じになるようにした。予備混合工程〜測定終了まで１サンプル当たり約８分間を要した。同様にして、測定溶液中の終濃度がモル比で、コバルトイオン：ルミノール：過酸化水素：抗酸化物質＝１：０．００５：０．００７：０．０１，０．０２５，０．０５，０．１となるようにして、発光強度を測定した。測定開始からの時間（ｓｅｃ）に対する発光強度（ＲＬＵ／ｓｅｃ）の関係を図１２に示す。また、抗酸化物質の濃度（μｍｏｌ／Ｌ）に対する、測定開始から８０秒〜１２０秒間の積算値（ＲＬＵ）の関係を図１３に示す。これらの結果からＩＣ５０値を求めたところ、９．０４μＭであった。結果を表１に示す。
【００８３】
＜実施例２〜１７＞
表１に示した各種抗酸化物質について、実施例１と同様にして抗酸化能を評価した。抗酸化物質の溶解に使用した溶媒及び評価結果（ＩＣ５０値）を併せて表１に示す。なお、表１において、実施例７，１７では抗酸化物質として溶液状態のものを使用したので、ＩＣ５０値の単位は「ｍｇ／ｍＬ」となっている。また、実施例９，１０，１６では、サンプルが白濁したため、対照サンプル比５０％まで測定することができず、ＩＣ５０値の表記が異なっている。
【００８４】
【表１】
2008203088.tif 000003
【００８５】
＜比較例１＞
ＤＰＰＨ法を用いて、アスコルビン酸の抗酸化能を測定した。ＩＣ５０値は９．４３μＭであった。液の混合〜測定終了まで１サンプル当たり約３０分間を要した。
【００８６】
このように、実施例１で評価したＩＣ５０値と、ＤＰＰＨ法で評価したＩＣ５０値との間に良好な相関関係が得られた。実施例１の方法により、簡便、迅速かつ正確に抗酸化物質の抗酸化能を評価することができた。
【００８７】
＜実施例１８＞
（Ｌ−０１２含有溶液の調製）
発光試薬として、ルミノールの代わりにＬ−０１２（和光純薬製、８−Ａｍｉｎｏ−５−ｃｈｌｏｒｏ−７−ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｏ［３，４−ｄ］ｐｙｒｉｄａｚｉｎｅ−１，４−（２Ｈ，３Ｈ）ｄｉｏｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）を用いて、Ｌ−０１２含有溶液を調製した。
【００８８】
測定用容器に、測定溶液中の終濃度がモル比で、コバルトイオン：発光試薬（Ｌ−０１２）：過酸化水素：抗酸化物質（ＢＨＡ）＝１：０．０００５：０．００８：０．００５となるように、上記各溶液を使用した。この溶液について、実施例１と同様にして、発生したラジカルと発光試薬（Ｌ−０１２）との反応による発光の強度を測定した。同一溶液について２回測定したところ、図１４に示すように、ルミノールに比べて、Ｌ−０１２の方が発光強度のばらつきがやや大きかった。これより、発光試薬としてはルミノールの方が良好であることがわかる。
【００８９】
＜実施例１９＞
（長期保存性確認）
実施例１で調整したコバルトイオン含有溶液、ルミノール含有溶液及び過酸化水素含有溶液をそれぞれガラス管あるいは高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）容器（ポリプロピレンキャップ）に封入し、長期保存性を確認した。所定の期間保存（冷蔵庫内暗所５℃保存）後、アスコルビン酸を含む抗酸化物質含有溶液を用いて、実施例１と同様の方法で発光強度を測定し、抑制率を求めた。結果を図１５に示す。図１５からわかるように、本キットが良好な長期保存性を示すことがわかる。
【００９０】
＜実施例２０＞
各種プロポリス抽出物（１）〜（５）について，実施例１と同様にして抗酸化能を測定した。抗酸化物質含有溶液としては、プロポリス原塊の含水エタノール抽出液を８０％エタノールにより希釈した希釈液を使用した。測定結果より抑制率を求めた。結果を図１６に示す。プロポリスの品質管理の指標の一つとして本測定方法を用いることが可能と考えられる。
【００９１】
＜実施例２１＞
市販の各種茶飲料（１）〜（１６）について，実施例１と同様にして抗酸化能を測定した。抗酸化物質含有溶液としては、各茶飲料の遠心分離により得られた上清を水で希釈した希釈液を使用した。測定結果より抑制率を求めた。結果を図１７に示す。茶飲料中の抗酸化物質としての主たる物質はカテキンと考えられ、茶飲料の有効性を判断する指標の一つとして本測定方法を用いることが可能と考えられる。
【００９２】
＜実施例２２＞
市販の各種野菜あるいは果物ジュース（１）〜（１６）について，実施例１と同様にして抗酸化能を測定した。抗酸化物質含有溶液としては、各ジュースの遠心分離により得られた上清を水で希釈した希釈液を使用した。測定結果より抑制率を求めた。結果を図１８に示す。各種野菜あるいは果物ジュースの有効性を判断する指標の一つとして本測定方法を用いることが可能と考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明の実施形態に係る抗酸化能評価方法の一例を説明するためのフローチャートである。
【図２】本発明の実施例における、過酸化水素濃度（ルミノール０．００５に対するモル比）とピーク発光強度（ＲＬＵ／ｓｅｃ）の関係を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例における、過酸化水素濃度（コバルトイオン１に対するモル比）とピーク発光強度（ＲＬＵ／ｓｅｃ）の関係を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例における、ルミノール濃度（コバルトイオン１に対するモル比）とピーク発光強度（ＲＬＵ／ｓｅｃ）の関係を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例における、ルミノール濃度（コバルトイオン１に対するモル比）とピーク発光強度（ＲＬＵ／ｓｅｃ）の関係を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例における、有機溶媒添加量（容量％）と抑制率（％）の関係を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例における、プレインキュベーション時間（ｍｉｎ）とピーク発光強度（ＲＬＵ／ｓｅｃ）の関係を示すグラフである。
【図８】本発明の実施例における、プレインキュベーション時間（ｍｉｎ）と最大ピーク値への到達時間（ｓｅｃ）の関係を示すグラフである。
【図９】本発明の実施例における、プレインキュベーション時間（ｍｉｎ）と測定開始から８０秒〜１２０秒間の積算値（ＲＬＵ）の関係を示すグラフである。
【図１０】本発明の実施例における、測定温度（℃）とピーク発光強度（ＲＬＵ／ｓｅｃ）の関係を示すグラフである。
【図１１】本発明の実施例における、測定温度（℃）と最大ピーク値への到達時間（ｓｅｃ）の関係を示すグラフである。
【図１２】本発明の実施例１における、測定開始からの時間（ｓｅｃ）に対する発光強度（ＲＬＵ／ｓｅｃ）の関係を示すグラフである。
【図１３】本発明の実施例１における、抗酸化物質の濃度（μｍｏｌ／Ｌ）に対する、測定開始から８０秒〜１２０秒間の積算値（ＲＬＵ）の関係を示すグラフである。
【図１４】本発明の実施例１８における、測定開始からの時間（ｓｅｃ）に対する発光強度（ＲＬＵ／ｓｅｃ）の関係を示すグラフである。
【図１５】本発明の実施例１９における保存期間（ｍｏｎｔｈ）と抑制率（％）の関係を示すグラフである。
【図１６】本発明の実施例２０における各種プロポリス抽出物の抗酸化能の評価結果（抑制率）を示すグラフである。
【図１７】本発明の実施例２１における市販の各種茶飲料の抗酸化能の評価結果（抑制率）を示すグラフである。
【図１８】本発明の実施例２２における市販の各種ジュースの抗酸化能の評価結果（抑制率）を示すグラフである。
【図１】
2008203088.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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