(57)【要約】【課題】細胞を容易にクランプすることができ、しかも、クランプ後の細胞の外表面に薬品を迅速に行渡らせることができる細胞の電気生理学的特性分析装置を提供することを目的とする。【解決手段】液体流路１４に細胞６０を混入させた細胞外液を流通させ、液体流路１４内に設置した細胞クランプ手段によって液体内の細胞６０をクランプした状態でその細胞６０の電気生理学的特性を分析する細胞の電気生理学的特性分析装置１において、細胞クランプ手段が、液体流路１４内に設けられて内部管路２３の先端開口部２４を液体流路１４の上流側に向けたキャピラリ５と、キャピラリ５の内部管路２３を介して液体流路１４内の液体を吸引し、液体内の細胞６０をキャピラリ５の内部管路２３の先端開口部２４に吸着させる第２吸引ポンプ４３とから成る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体流路に細胞を混入させた液体を流通させ、前記液体流路内に設置した細胞クランプ手段によって液体内の細胞をクランプした状態でその細胞の電気生理学的特性を分析する細胞の電気生理学的特性分析装置であって、
前記細胞クランプ手段が、前記液体流路内に設けられて内部管路の先端開口部を前記液体流路の上流側に向けたキャピラリと、キャピラリの内部管路を介して前記液体流路内の液体を吸引し、液体内の細胞をキャピラリの内部管路の先端開口部に吸着させる吸引手段とから成ることを特徴とする細胞の電気生理学的特性分析装置。
【請求項２】
前記液体流路の上方にウェルを有し、前記ウェルの底部が前記液体流路のキャピラリの上流側に開口していることを特徴とする請求項１に記載の細胞の電気生理学的特性分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体流路に細胞を混入させた液体を流通させ、液体流路内に設置した細胞クランプ手段によって液体内の細胞をクランプした状態でその細胞の電気生理学的特性を分析する細胞の電気生理学的特性分析装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞膜に含まれるイオンチャンネルの開閉挙動から細胞の電気生理学的特性を調べる研究が進んでおり、創薬分野にも応用されるようになってきている。パッチクランプ法は細胞膜のイオンチャンネルの開閉挙動を解析するための準備として細胞をクランプする方法のひとつであり、内部管路の先端開口部が１μｍ程度のキャピラリを細胞膜に押し付けた後、軽く吸引して細胞膜をキャピラリに密着させることによって、細胞膜のイオンチャンネルを通る電流を計測できるようにするものである。
【０００３】
パッチクランプ法では、クランプされた細胞膜はキャピラリの内部管路の先端開口部に極めて密接に接触し、キャピラリ外部の液体流路に満たされる細胞外液と、キャピラリ内部に満たされる細胞内液との間には極めて高い電気的抵抗が生じる。このような接触状態は一般に「ギガシール状態」と称され、良好なＳ／Ｎ比でイオンチャンネルを通過する電流を記録することができるので、細胞の電気生理学的特性をｐＡ（ピコアンペア）レベルで計測することが可能となる。
【０００４】
パッチクランプ法によってギガシール状態を作り出す方法としては、細胞の外径よりも小さい内径を有するテーパ状のキャピラリの内壁に細胞を接触させてクランプさせるもの（特許文献１）や、細胞が混入された液体の流路中に内部管路の先端開口部を流れに対して直交する方向に向けたキャピラリ（吸引チャンネル）を配置し、キャピラリを介して液体を吸引することにより、液体内の細胞をキャピラリの先端開口部に吸着させるようにしたもの（特許文献２）等が知られている。
【特許文献１】特表２００４−５１８１０９号公報
【特許文献２】特表２００４−５０２９３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、細胞は勿論のこと、キャピラリ自体も非常に微小であるため、実際に細胞のギガシール状態を作り出すのは容易なことではなく、１日に数多くのスクリーニングを行う創薬分野においては、如何にして容易に細胞のギガシール状態を作り出すかが大きな課題である。
【０００６】
また、創薬スクリーニングでは試験用の薬品をクランプ後の細胞の外表面に迅速に行渡らせて次々と必要な計測を行っていく必要があるが、特許文献１に開示された方法では、細胞はテーパ状のキャピラリの内壁に接触してクランプされるため、試験用の薬品はキャピラリが詰まらないように少量ずつ送らざるを得ず、必要な計測を短時間で行うことが困難であるという問題点がある。
【０００７】
更に、特許文献２に開示された方法では、細胞はキャピラリに対して外部から密着するようにクランプされるため、クランプ後の細胞の外表面に対して薬品を行渡らせることは比較的容易であるが、液体流路内を細胞が流れる方向と細胞を吸い付ける方向とが一致しないことから細胞をクランプすること自体が難しいうえ、細胞をクランプした後であっても、細胞は液体流路内を流れる液体から常時横力を受けることとなるため、クランプ後の
細胞が液体によって流されてしまうおそれがあるという問題点がある。
【０００８】
そこで本発明は、細胞を容易にクランプすることができ、しかも、クランプ後の細胞の外表面に薬品を迅速に行渡らせることができる細胞の電気生理学的特性分析装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
請求項１に記載の細胞の電気生理学的特性分析装置は、液体流路に細胞を混入させた液体を流通させ、前記液体流路内に設置した細胞クランプ手段によって液体内の細胞をクランプした状態でその細胞の電気生理学的特性を分析する細胞の電気生理学的特性分析装置であって、前記細胞クランプ手段が、前記液体流路内に設けられて内部管路の先端開口部を前記液体流路の上流側に向けたキャピラリと、キャピラリの内部管路を介して前記液体流路内の液体を吸引し、液体内の細胞をキャピラリの内部管路の先端開口部に吸着させる吸引手段とから成る。
【００１０】
請求項２に記載の細胞の電気生理学的特性分析装置は、請求項１に記載の細胞の電気生理学的特性分析装置において、前記液体流路の上方にウェルを有し、前記ウェルの底部が前記液体流路のキャピラリの上流側に開口している。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の細胞の電気生理学的特性分析装置では、液体流路内を流通する液体内に混入された細胞をクランプする細胞クランプ手段が、液体流路内に設けられたキャピラリ及びキャピラリの内部管路を介して液体流路内の液体を吸引し、液体内の細胞をキャピラリの先端開口部に吸着させる吸引手段から成るが、キャピラリは内部管路の先端開口部を液体流路の上流側に向けているので、その先端開口部にクランプされた細胞が液体流路を流れる液体によってキャピラリに押し付けられるようにすることができ、クランプした後の細胞が液体によって流されにくくすることができる。また、細胞はキャピラリの先端開口部にキャピラリの外部から密着しているので、クランプ後に液体流路内に供給した薬品を細胞の外表面に迅速に行渡らせることができ、薬品の試験を効率的に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。図１は本発明の一実施の形態における細胞の電気生理学的特性分析装置の断面側面図、図２は本発明の一実施の形態における細胞の電気生理学的特性分析装置の部分断面平面図、図３は本発明の一実施の形態におけるキャピラリの分解斜視図、図４は本発明の一実施の形態における上下のプレート部材の斜視図である。
【００１３】
図１において、本発明の一実施の形態における細胞の電気生理学的特性分析装置（以下、分析装置１と称する）は、ベース部２、ベース部２の上方に設けられた液体流路形成部３、液体流路形成部３の上方に設けられたウェル形成部４から成る。
【００１４】
液体流路形成部３は電気絶縁性材料から形成された上側プレート部材１１、下側プレート部材１２及びプレート保持部材１３から成る。上側プレート部材１１と下側プレート部材１２は上下に重ねられた状態でプレート保持部材１３によってベース部２上に保持されている。プレート保持部材１３は（すなわち液体流路形成部３の全体は）ベース部２に対して着脱自在であり、プレート保持部材１３とベース部２との間に介装されているシール部材３ａはプレート保持部材１３の下面に固定されている。
【００１５】
図１及び図２において、液体流路形成部３の内部には液体流路１４が形成されている。この液体流路１４の一端側の液体導入部１４ａはベース部２を垂直に延びて設けられた連
通路２ａを介してベース部２の外部に設けられたリザーバ４１に繋がっており、液体流路１４の他端側の液体排出部１４ｂはベース部２を垂直に延びて設けられた連通路２ｂを介してベース部２の外部に設けられた第１吸引ポンプ４２に繋がっている。
【００１６】
図１において、液体流路１４内にはキャピラリ５が設けられている。キャピラリ５は電気絶縁性材料から形成された上下のキャピラリ半体２１，２２が上下に接合されて成り（図３）、内部に内部管路２３を有している。この内部管路２３は水平方向に延びた水平部２３ａと水平部２３ａの一端部から下方に延びた垂直部２３ｂを有して全体としてＬ字形状に形成されており、水平部２３ａの先端開口部２４は先端側にいくほど内径が小さくなるテーパ状に形成されている。キャピラリ５の先端開口部２４の内径は細胞６０の直径よりも小さく、約数μｍ程度であるが、この水平部２３ａは上側のキャピラリ半体２１に設けられた溝部２１ａと下側のキャピラリ半体２２に設けられた溝部２２ａが上下に合体することによって形成されるため、その工作は比較的容易である。
【００１７】
図１において、キャピラリ５の内部管路２３の（水平部２３ａの）先端開口部２４は液体流路１４の上流側（液体導入部１４ａ側）に向けられており、内部管路２３の垂直部２３ｂはベース部２を垂直に延びて設けられた連通路２ｃを介してベース部２の外部に設けられた第２吸引ポンプ４３に繋がっている。キャピラリ５は図１及び図２から分かるように、その上下面を上下のプレート部材１１，１２に接触させているが、その側面は上下のプレート部材１１，１２から離間しており、キャピラリ５の側方には細胞６０が通過できる隙間１４ｃが形成されている。以下、説明の便宜上、キャピラリ５の先端開口部２４が向けられている側を本分析装置１の前方とし、その反対側を本分析装置１の後方とする。
【００１８】
図１、図２及び図３において、下側のキャピラリ半体２２の上面には導電性の金属板から形成された第１電極部材３１が取り付けられている。第１電極部材３１の一端側に弧状に曲げ形成されたキャピラリ内電極３１ａは下側のキャピラリ半体２２の溝部２２ａ内（但し先端開口部２４よりも内側）に配置されており、第１電極部材３１の他端側にリング状に形成されたリード用電極３１ｂは溝部２２ａの後方（上側のキャピラリ半体２１との接合面）に配置されている。
【００１９】
図１、図２及び図４において、液体流路形成部３の下側プレート部材１２には導電性の金属板から形成された第２電極部材３２が取り付けられている。第２電極部材３２の一端側に断面コの字状に曲げ形成されたキャピラリ外電極３２ａは液体流路１４の形成面であってキャピラリ５の前方（すなわちキャピラリ５の上流側）に配置されており、第２電極部材３２の他端部にリング状に形成されたリード用電極３２ｂは液体流路１４の形成面の前方（上側のプレート部材１１との接合面）に配置されている。
【００２０】
図１において、ウェル形成部４には、すり鉢状のウェル４ａが設けられている。ウェル４ａの底部、すなわち上側プレート部材１１には、液体流路１４のキャピラリ５の上流側に開口する細胞供給口１５が設けられている。
【００２１】
図１において、第１電極部材３１のリード用電極３１ｂの中心部を上下に貫通する位置には第１電極ピン３３が設けられている。この第１電極ピン３３は上下のキャピラリ半体２１，２２に設けられた貫通穴２１ｂ，２２ｂ（図３も参照）及び上下のプレート部材１１，１２に設けられた貫通穴１１ａ，１２ａ（図４も参照）を上下に貫通しており、下端部はプレート保持部材１３に、上端部はウェル形成部４にそれぞれ係止されている。そして、第１電極部材３１の上端部は液体流路形成部３とウェル形成部４との間に設けられた板状の第１リード部材３４を上下方向に貫通してこれと接触している。
【００２２】
また、図１において、第２電極部材３２のリード用電極３２ｂの中心部を上下に貫通す
る位置には第２電極ピン３５が設けられている。この第２電極ピン３５は上下のプレート部材１１，１２に設けられた貫通穴１１ｂ，１２ｂ（図４も参照）を上下に貫通しており、下端部はプレート保持部材１３に、上端部はウェル形成部４にそれぞれ係止されている。そして、第２電極部材３２の上端部は液体流路形成部３とウェル形成部４との間に設けられた板状の第２リード部材３６を上下方向に貫通してこれと接触している。
【００２３】
これら第１電極ピン３３と第２電極ピン３５は、第１電極部材３１と第１リード部材３４との間の電通路及び第２電極部材３２と第２リード部材３６との間の電通路を確保する役割を果たすほか、上下のプレート部材１１，１２をプレート保持部材１３に対して位置決めする役割と、キャピラリ５を上下のプレート部材１１，１２に対して位置決めする役割とを果たす。
【００２４】
上下のプレート部材１１，１２の後方位置には、ベース部２に固定された第１電極プローブ３７が液体流路形成部３を上下に貫通して延びており、この第１電極プローブ３７の上端部は第１リード部材３４に下方から接触している。また、上下のプレート部材１１，１２の前方位置には、ベース部２に固定された第２電極プローブ３８が液体流路形成部３を上下に貫通して延びており、この第２電極プローブ３８の上端部は第２リード部材３６に下方から接触している。これら第１電極プローブ３７及び第２電極プローブ３８はベース部２の外部に設けられた電流測定部３０に繋がっており、電流測定部３０は両電極プローブ３７，３８、両リード部材３４，３５、両電極ピン３３，３５及び両電極部材３１，３２を介してキャピラリ５の先端開口部２４を挟んで位置するキャピラリ内電極３１ａとキャピラリ外電極３２ａの間の電位差によって流れる電流を計測し得るようになっている。
【００２５】
リザーバ４１内に細胞外液（細胞６０を浸す液体）を蓄えるとともに、リザーバ４１から液体流路１４を経て第１吸引ポンプ４２に至る液体の流路内にこの細胞外液を満たし、かつ、キャピラリ５の内部管路２３内に細胞内液を満たした状態から第１吸引ポンプ４２及び第２吸引ポンプ４３を作動させると、リザーバ４１内の細胞外液は液体流路１４内を通って分析装置１の前方から後方へ移動し、キャピラリ５の側方の隙間１４ｃから液体排出部１４ｂを通って第１吸引ポンプ４２側へ流出する（図１中に示す矢印Ａ）。このような状態では、キャピラリ外電極３２ａとキャピラリ内電極３１ａとの間に一定の微弱な電位差を印加すると電流測定部３０において電流が測定される。
【００２６】
上記状態では、液体流路１４内の細胞外液は細胞供給口１５からウェル４ａ内に入り込んでおり、そのウェル４ａ内の細胞外液に細胞６０を投入すると、その細胞６０は自重によって細胞外液内を沈んだ後、細胞供給口１５を通って液体流路１４内に入る。そして、第１吸引ポンプ４２によって吸引されて液体流路１４内を移動している細胞外液の流れに乗って、液体流路１４を前方から後方へ移動する。このように液体流路１４内を移動する細胞６０はキャピラリ５の側方の隙間１４ｃを通り抜けてしまうものが殆どであるが、一部の細胞６０はキャピラリ５の内部管路２３の先端開口部２４に近接したときに第２吸引ポンプ４３による吸引力に引き寄せられて、その先端開口部２４に吸着される。これにより細胞６０はキャピラリ５にクランプされた状態となり、ギガシール状態が実現される。このときキャピラリ５の外部の細胞外液と、キャピラリ５の内部の細胞内液との間には極めて高い電気的抵抗が生じるので、細胞６０がギガシール状態となったか否かは、電流測定部３０により測定されるキャピラリ外電極３２ａとキャピラリ内電極３１ａとの間を流れる電流が急激に減少したことに基づいて検知することができる。
【００２７】
ここで、前述のように、キャピラリ５の内部管路２３の先端開口部２４は先端側（液体流路１４の上流側）にいくほど内径が小さくなるテーパ状に形成されており、先端開口部２４から内部管路２３内に流入する細胞内液の流速を大きくすることができるので、キャ
ピラリ５の先端開口部２４に細胞６０を吸着させ易く、また先端開口部２４に吸着された細胞６０を密着状態に（ギガシール状態に）保持するための大きな吸着力を得易い。
【００２８】
細胞６０がギガシール状態となったら、細胞外液に検査対象である薬品を混入させてその薬品を細胞６０の外表面に行渡らせ、細胞６０に対して所定の電気生理学的な測定を行って、その特性分析を行う。このような測定・分析を行うにおいて、細胞６０の一部を破る必要があるときには、第２吸引ポンプ４３の吸引力を増大させるようにすればよい。
【００２９】
このように本分析装置１では、液体流路１４内を流通する細胞外液に混入された細胞６０をクランプする手段（細胞クランプ手段）が、液体流路１４内に設けられたキャピラリ５及びキャピラリ５の内部管路３４を介して液体流路１４内の細胞外液を吸引し、細胞外液内の細胞６０をキャピラリ５の先端開口部２４に吸着させる吸引手段（第２吸引ポンプ４３）から成るが、キャピラリ５は内部管路２３の先端開口部２４を液体流路１４の上流側に向けているので、その先端開口部２４にクランプされた細胞６０が液体流路１４を流れる液体によってキャピラリ５に押し付けられるようにすることができ、クランプした後の細胞６０が液体によって流されにくくすることができる。また、細胞６０はキャピラリ５の先端開口部２４にキャピラリ５の外部から密着しているので、クランプ後に液体流路１４内に供給した薬品を細胞６０の外表面に迅速に行渡らせることができ、薬品の試験を効率的に行うことができる。
【００３０】
また、本分析装置１では、液体流路１４の上方に設けられたウェル４ａの底部が液体流路１４のキャピラリ５の上流側に開口しているので、ウェル４ａから細胞６０を投入すれば、その細胞６０はキャピラリ５の先端開口部２４に極めて近い位置に供給されることになる。このため、キャピラリ５の先端開口部２４に細胞６０を吸着させる確率を高くでき、ギガシール状態の形成率を向上させることができる。
【００３１】
また、本分析装置１では、前述のように液体流路形成部３の全体がベース部２に対して着脱自在であるので、リザーバ４１、第１及び第２吸引ポンプ４２，４３、第１及び第２電極プローブ３７，３８と繋がるベース部２はそのままに、液体流路形成部３のみを交換しながら薬品の試験を連続的に行うことができる。従って、試験に用いる細胞を変える場合は液体流路形成部３ごと交換すればよいので作業効率を向上させることができる。
【００３２】
これまで本発明の実施の形態について説明してきたが、本発明は上述の実施の形態に示したものに限定されない。例えば、上述の分析装置１では、液体流路１４の上方に設けられたウェル４ａから細胞供給口１５を介して液体流路１４内に細胞６０を供給する構成になっていたが、このようなウェル４ａ及び細胞供給口１５は必ずしも設けられていなくてもよく、リザーバ４１内に細胞６０を混入し、リザーバ４１から吸い上げられる細胞外液に乗せて細胞６０を液体流路１４内に供給するようにしてもよい。
【００３３】
更に、本実施の形態では、キャピラリ５とプレート部材１１，１２を別体としていたが、キャピラリ半体２１とプレート部材１１を一体的に形成したものと、キャピラリ半体２２とプレート部材１２を一体的に形成したものとを上下に重ねるようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明によれば、クランプした後の細胞が液体によって流されにくくすることができる。また、クランプ後に液体流路内に供給した薬品を細胞の外表面に迅速に行渡らせて効率よく薬品の試験を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の一実施の形態における細胞の電気生理学的特性分析装置の断面側面図
【図２】本発明の一実施の形態における細胞の電気生理学的特性分析装置の部分断面平面図
【図３】本発明の一実施の形態におけるキャピラリの分解斜視図
【図４】本発明の一実施の形態における上下のプレート部材の斜視図
【符号の説明】
【００３６】
１  分析装置
２  ベース部
３  液体流路形成部
４  ウェル形成部
４ａ  ウェル
５  キャピラリ
１４  液体流路
１５  細胞供給口
２３  内部管路
２４  先端開口部
４３  第２吸引ポンプ（吸引手段）
６０  細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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