(57)【要約】【課題】肺腺癌におけるTTF-1の役割・関与を明らかにし、肺腺癌に対する治療の奏功率向上をもたらす手段を提供すること。【解決手段】被検肺腺癌細胞に対する薬剤の有効性評価法であって、（１）生体より分離された被検肺腺癌細胞を用意するステップ、（２）前記被検肺腺癌細胞におけるTTF-1の発現量を調べるステップ、及び（３）TTF-1の発現量に基づき前記薬剤の有効性を評価するステップを含み、前記薬剤がプロテインキナーゼC（PKC）に対する阻害剤又はビタミンD受容体（VDR）に対する活性化剤であることを特徴とする方法が提供される。【選択図】図５
2008263837.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検肺腺癌細胞に対する薬剤の有効性評価法であって、
（１）生体より分離された被検肺腺癌細胞を用意するステップ、
（２）前記被検肺腺癌細胞におけるTTF-1（thyroid transcription factor 1）の発現量又は遺伝子増幅を調べるステップ、及び
（３）ステップ（２）の結果に基づき前記薬剤の有効性を評価するステップ、を含み、
前記薬剤が、プロテインキナーゼC（PKC）に対する阻害剤又はビタミンD受容体（VDR）に対する活性化剤である、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
TTF-1の発現量としてTTF-1蛋白発現量が調べられることを特徴とする、請求項１に記載の有効性評価法。
【請求項３】
TTF-1の発現量としてTTF-1 mRNA発現量が調べられることを特徴とする、請求項１に記載の有効性評価法。
【請求項４】
TTF-1の発現量が免疫組織化学によって調べられることを特徴とする、請求項１に記載の有効性評価法。
【請求項５】
前記ステップ（３）における評価が、TTF-1の発現の有無に基づき行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の有効性評価法。
【請求項６】
前記ステップ（３）における評価が、TTF-1の発現量の程度に基づき行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の有効性評価法。
【請求項７】
TTF-1の遺伝子増幅が、FISH法（Fluorescence in situ hybridization）によって調べられることを特徴とする、請求項１に記載の有効性評価法。
【請求項８】
前記ステップ（３）における評価が、TTF-1の遺伝子増幅の有無に基づき行われる、請求項１又は７に記載の有効性評価法。
【請求項９】
前記ステップ（３）における評価が、TTF-1の遺伝子増幅の程度に基づき行われる、請求項１又は７に記載の有効性評価法。
【請求項１０】
前記活性化剤が、ビタミンDアナログ又はCYP24A1（25-hydroxyvitamin D-24-hydroxylase）阻害剤である、請求項１〜９のいずれかに記載の有効性評価法。
【請求項１１】
抗TTF-1抗体からなることを特徴とする、肺腺癌細胞に対する薬剤の有効性評価用試薬。
【請求項１２】
TTF-1 mRNAを特異的に増幅する核酸プライマー、又はTTF-1 mRNAを特異的に検出する核酸プローブからなることを特徴とする、肺腺癌細胞に対する薬剤の有効性評価用試薬。
【請求項１３】
TTF-1遺伝子を特異的に増幅する核酸プライマー、又はTTF-1遺伝子を特異的に検出する核酸プローブからなることを特徴とする、肺腺癌細胞に対する薬剤の有効性評価用試薬。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の有効性評価用試薬を含む、肺腺癌細胞に対する薬剤の有効性評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は肺腺癌細胞に対する薬剤の有効性を評価する方法及びその用途、並びに当該方法に使用される試薬及びキットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の癌の生存メカニズムに「linage-specific dependency（生体内の細胞は、その細胞系列毎に生存及び／又は増殖に関して、特定の分子に対する依存性が存在する、という概念）」が存在することが示唆されている（非特許文献１、２）。TTF-1（thyroid transcription factor 1）は、肺の発達及び肺上皮細胞（非特許文献３、４）の機能維持においてマスター調節因子として決定的な役割を担う（非特許文献５）。
腺癌は肺癌において組織学的に最も高頻度で認められるものであり、高度の多様性を示す（非特許文献６、７）。我々はTTF-1が肺上皮細胞及び肺腺癌のlineage（系列）マーカーであることを提唱した（非特許文献８、９）。また、肺腺癌がその前駆細胞の特徴を保持していることを示した（非特許文献７）。Nkx2.1又は恒常性特異的エンハンサー結合タンパク質（thyroid-specific enhancer-binding potein）としても知られるTTF-1はホメオドメインを有する転写因子であり、肺上皮細胞に発現が認められる（非特許文献８、１０）。TTF-1は末梢肺の発達に必須且つ重要な役割を果たしており、マウスにおいてTTF-1の欠損は肺の形成不全を引き起こす（非特許文献５、１１）。
【非特許文献１】Garraway, L. A. & Sellers, W. R., Lineage dependency and lineage-survival oncogenes in human cancer. Nature Rev. Cancer 6, 593-602 (2006).
【非特許文献２】Osada, H. & Takahashi, T., The inclusion of the ASH1 gene governing neuroendocrine differentiation of lung epithelium as an additional prototypic “lineage-survival oncogene”. Nature Rev. Cancer, (in press) (2006).
【非特許文献３】Whitsett, J. A. & Glasser, S. W., Regulation of surfactant protein gene transcription. Biochim. Biophys. Acta 1408, 303-311 (1998).
【非特許文献４】Cassel, T. N., Suske, G. & Nord, M., C/EBP α and TTF-1 synergistically transactivate the Clara cell secretory protein gene. Ann. N. Y. Acad. Sci. 923, 300-302 (2000).
【非特許文献５】Minoo, P., Su, G., Drum, H., Bringas, P. & Kimura, S., Defects in tracheoesophageal and lung morphogenesis in Nkx2.1(-/-) mouse embryos. Dev. Biol. 209, 60-71 (1999).
【非特許文献６】Tomida, S., Yatabe, Y., Yanagisawa, K., Mitsudomi, T. & Takahashi, T., Throwing new light on lung cancer pathogenesis: updates on three recent topics. Cancer Sci 96, 63-68 (2005).
【非特許文献７】Takeuchi, T. et al., Expression profile-defined classification of lung adenocarcinoma shows close relationship with underlying major genetic changes and clinicopathologic behaviors. J. Clin. Oncol. 24, 1679-1688 (2006).
【非特許文献８】Yatabe, Y., Mitsudomi, T. & Takahashi, T., TTF-1 expression in pulmonary adenocarcinomas. Am. J. Surg. Pathol. 26, 767-773 (2002).
【非特許文献９】Yatabe, Y., Role of expression of thyroid transcription factor-1 in pulmonary adenocarcinoma. In: Hyat MA, editor, Immunohistochemistry and in situ hybridization of human carcinomas. New York: Elsevier Science/Academic Press, 169-179 (2004).
【非特許文献１０】Stahlman, M. T., Gray, M. E. & Whitsett, J. A., Expression of thyroid transcription factor-1(TTF-1) in fetal and neonatal human lung. J. Histochem. Cytochem. 44, 673-678 (1996).
【非特許文献１１】Kimura, S. et al., The T/ebp null mouse: thyroid-specific enhancer-binding protein is essential for the organogenesis of the thyroid, lung, ventral forebrain, and pituitary. Genes Dev. 10, 60-69 (1996).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、肺腺癌におけるTTF-1の役割・関与を明らかにし、肺腺癌に対する治療の奏功率向上をもたらす手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
以上の背景の下、TTF-1に注目して研究を進めた結果、TTF-1を発現する肺腺癌細胞の生存・増殖にとってTTF-1の発現が必須であることが判明した。また、TTF-1の遺伝子増幅と肺腺癌の進展（悪性度）との間に関連が認められた。更に、TTF-1遺伝子の下流に位置する中心的因子として、癌細胞に有利に働くプロテインキナーゼC（PKC）と、逆に癌細胞に不利に働くビタミンD受容体（VDR）を同定するとともにその関与を示す実験結果を得た。これらの成果より、TTF-1を発現する肺腺癌に対してはPKCに対する阻害剤又はVDRに対する活性化剤が有効であり、その使用によって良好な治療効果がもたらされると期待できる一方で、TTF-1を発現しない肺腺癌に対してはこれらの薬剤による治療効果を期待できないとの知見が導き出される。また、TTF-1の遺伝子増幅が認められる症例に対しては、これらの薬剤が特に有効であることが期待できる。
このように、PKCに対する阻害剤又はVDRに対する活性化剤による治療を行う際、その奏功率を評価・予測するための指標として、標的肺腺癌細胞におけるTTF-1の発現量とTTF-1の遺伝子増幅の有無又は程度が有用であることが判明した。尚、これまでにPKC阻害剤は抗癌剤として期待され多数開発されてきたが、その適応症例を限定化できるバイオマーカーの報告はない。上記の知見はPKC阻害剤を初め、肺腺癌の治療に有望な薬剤を使用する際の適応症例の限定化を可能とし、もって奏功率の向上をもたらすものであり、その臨床的意義は極めて大きい。
本発明は主として以上の知見に基づくものであり、以下の方法などを提供する。
［１］被検肺腺癌細胞に対する薬剤の有効性評価法であって、
（１）生体より分離された被検肺腺癌細胞を用意するステップ、
（２）前記被検肺腺癌細胞におけるTTF-1の発現量又は遺伝子増幅を調べるステップ、及び
（３）ステップ（２）の結果に基づき前記薬剤の有効性を評価するステップ、を含み、
前記薬剤が、プロテインキナーゼC（PKC）に対する阻害剤又はビタミンD受容体（VDR）に対する活性化剤である、ことを特徴とする方法。
［２］TTF-1の発現量としてTTF-1蛋白発現量が調べられることを特徴とする、［１］に記載の有効性評価法。
［３］TTF-1の発現量としてTTF-1 mRNA発現量が調べられることを特徴とする、［１］に記載の有効性評価法。
［４］TTF-1の発現量が免疫組織化学によって調べられることを特徴とする、［１］に記載の有効性評価法。
［５］前記ステップ（３）における評価が、TTF-1の発現の有無に基づき行われる、［１］〜［４］のいずれかに記載の有効性評価法。
［６］前記ステップ（３）における評価が、TTF-1の発現量の程度に基づき行われる、［１］〜［４］のいずれかに記載の有効性評価法。
［７］TTF-1の遺伝子増幅が、FISH法（Fluorescence in situ hybridization）によって調べられることを特徴とする、［１］に記載の有効性評価法。
［８］前記ステップ（３）における評価が、TTF-1の遺伝子増幅の有無に基づき行われる、［１］又は［７］に記載の有効性評価法。
［９］前記ステップ（３）における評価が、TTF-1の遺伝子増幅の程度に基づき行われる、請［１］又は［７］のいずれかに記載の有効性評価法。
［１０］前記活性化剤が、ビタミンDアナログ又はCYP24A1（25-hydroxyvitamin D-24-hydroxylase）阻害剤である、［１］〜［９］のいずれかに記載の有効性評価法。
［１１］抗TTF-1抗体からなることを特徴とする、肺腺癌細胞に対する薬剤の有効性評価用試薬。
［１２］TTF-1 mRNAを特異的に増幅する核酸プライマー、又はTTF-1 mRNAを特異的に検出する核酸プローブからなることを特徴とする、肺腺癌細胞に対する薬剤の有効性評価用試薬。
［１３］TTF-1遺伝子を特異的に増幅する核酸プライマー、又はTTF-1遺伝子を特異的に検出する核酸プローブからなることを特徴とする、肺腺癌細胞に対する薬剤の有効性評価用試薬。
［１４］［１１］〜［１３］のいずれかに記載の有効性評価用試薬を含む、肺腺癌細胞に対する薬剤の有効性評価用キット。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
（用語）
本発明において「被検肺腺癌細胞」とは、本発明の有効性評価法において試料として使用される細胞である。被検癌細胞は生体より分離される。即ち、生体より分離された状態の被検肺腺癌細胞に対して本発明が適用される。「生体より分離された」とは、被検癌細胞が存在する生体組織の一部を摘出することによって、被検癌細胞がその由来の生体と完全に隔離されている状態をいう。この条件を満たす限り、周囲の細胞とともに組織を形成した状態の肺腺癌細胞（即ち組織片の状態）であっても、周囲の細胞から分離された状態の肺腺癌細胞であっても本発明の被検肺腺癌細胞として利用できる。前者については例えば生検組織診（バイオプシー）を行う際の要領で細胞を調製すればよく、後者については例えば細胞診を行う際の要領で細胞を調製すればよい。
本発明における被検肺腺癌細胞には、他の診断法によって肺腺癌であると判断される細胞、肺腺癌である蓋然性が高いと判断される細胞、及び肺腺癌である可能性を有する細胞が含まれる。好ましくは、他の診断法によって肺腺癌であると判断される細胞、又は肺腺癌である蓋然性が高いと判断される細胞が用いられる。ここでの他の診断法としては例えば、臨床症状および病歴、X線造影検査、内視鏡検査、超音波検査、CT検査、MRI検査、PET/SPECT検査、腫瘍マーカーを用いた診断法などが該当する。通常は、これらの一つ以上によって肺腺癌が疑われる組織から被検肺腺癌細胞が採取される。
【０００６】
本発明において「薬剤の有効性」とは、当該薬剤が被検肺腺癌細胞に対して治療的効果を発揮し得るか否かを示す指標である。従って、「薬剤の有効性を評価する」とは、被検肺腺癌細胞の由来である肺腺癌の治療に当該薬剤が有効か否かを判断することをいう。当該薬剤の治療的効果の程度（例えば、高い治療的効果が期待できる、中程度の治療的効果が期待できる等の評価）を評価結果に含めても良い。
【０００７】
「TTF-1（thyroid transcription factor 1）」は別名Nkx2.1又は甲状腺特異的エンハンサー結合タンパク質（thyroid-specific enhancer-binding protein）とも呼ばれ、ホメオドメインをもつ転写因子である（UniGene Hs.652315, Homo sapiens, TITF1, NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。TTF-1はサーファクタント・アポプロテインA（SPA）、サーファクタント・アポプロテインB、サーファクタント・アポプロテインC、クララ細胞抗原（Clara cell antigen）及びT1α等の組織特異的発現を調節する。
TTF-1 mRNA発現量及びTTF-1蛋白発現量を包括的に表す表現として「TTF-1の発現量」を使用する。
【０００８】
本発明の第１の局面は、被検肺腺癌細胞に対する薬剤の有効性を評価する方法（省略して「本発明の有効性評価法」ともいう）に関する。本発明の有効性評価法は、被検肺腺癌細胞が由来する肺腺癌に対する治療戦略を立てる上で有益な情報を提供する。本発明の有効性評価法によって薬剤の有効性が認められた場合には治療的効果を期待できることになり、被検肺腺癌細胞が由来する肺腺癌に対して当該薬剤による治療が適切であると判断できる。一方で、薬剤の有効性が認められなかった場合には治療的効果を期待できないことになり、当該薬剤による治療を避けるべきであると判断できる。このように本発明の有効性評価法は、肺腺癌の治療に先だって適応症例を選択ないし限定化することに利用されるものであり、奏功率の向上に貢献する。
【０００９】
本発明の有効性評価法の評価対象である薬剤は、プロテインキナーゼC（PKC）に対する阻害剤、又はビタミンD受容体（VDR）に対する活性化剤である。後述するように、PKCとVDRはいずれもTTF-1遺伝子の下流に位置する中心的因子として同定されたものであるが、前者は肺腺癌細胞に有利に働き、逆に後者は肺腺癌に不利に働く。従って、PKC阻害剤及びVDR活性化剤は、TTF-1を発現する肺腺癌細胞に対する治療剤として有望といえる。本発明の有効性評価法によれば、これら有望な薬剤の有効性を被検肺腺癌毎に評価することができる。
ここで、PKC阻害剤は、直接又は間接的にPKCに作用して阻害活性を示せばよい。VDR活性化剤についても同様であり、作用態様の如何を問わずVDRを活性化する限り、ここでの活性化剤に該当する。尚、本明細書において特に言及しない場合の「薬剤」とは、PKC阻害剤及びVDR活性化剤を包括的に表現するものとする。
PKC阻害剤の例としてBisindolyl-maleimide I、Bisindolyl-maleimide VIII, Acetate、Bisindolyl-maleimide IX, Methanesulfonate、Staurosporineを挙げることができる。同様にVDR活性化剤の例として、ビタミンDアナログ、CYP24A1（25-hydroxyvitamin D-24-hydroxylase）阻害剤（例えばketoconazole、liarozole、genistein）を挙げることができる。
【００１０】
本発明の有効性評価法では以下のステップを実施する。
（１）生体より分離された被検肺腺癌細胞を用意するステップ。
（２）前記被検肺腺癌細胞におけるTTF-1（thyroid transcription factor 1）の発現量又は遺伝子増幅を調べるステップ、及び
（３）ステップ（２）の結果に基づき前記薬剤の有効性を評価するステップ。
【００１１】
ステップ（１）では生体より分離された被検肺腺癌細胞を用意する。ここでの生体（被検対象）はヒトに限らず、例えば、サル、チンパンジー等の非ヒト霊長類、マウス、ラット、モルモット等の齧歯類、ニワトリ、ウズラ等の鳥類等であってもよい。ヒト以外の動物を被検対象とした場合に得られる情報は、当該非ヒト動物の肺腺癌の治療にも利用され得るが、むしろそれをヒトの肺腺癌の治療に転用ないし活用できる点で有用である。
特にヒト生体から被検肺腺癌細胞を採取する場合は通常、他の診断法によって肺腺癌が疑われる者（患者）が被検対象となる。
【００１２】
被検肺腺癌細胞は、被検対象の肺組織より採取される。具体的には肺組織の一部を、生検組織診（バイオプシー）又は細胞診を行う際の要領で採取すればよい。被検肺癌細胞は通常、生体で存在していた状態、即ち周囲の各種の細胞や間質結合組織と結合した状態（即ち組織片として）で採取され、本発明の有効性評価法に供される。
【００１３】
ステップ（２）では、被検肺腺癌細胞におけるTTF-1の発現量又は遺伝子増幅を調べる。本明細書では、TTF-1の発現の有無を調べることも含む包括的な表現として「TTF-1の発現量を調べる」を使用する。同様に、TTF-1の遺伝子増幅の有無を調べること、及びTTF-1の遺伝子増幅の程度を調べることをまとめて「TTF-1の遺伝子増幅を調べる」と表現する。
尚、通例に従い、被検肺腺癌細胞にTTF-1の発現が認められることをTTF-1陽性又はTTF-1ポジティブとも表現し、被検肺腺癌細胞にTTF-1の発現が認められないことをTTF-1陰性又はTTF-1ネガティブとも表現する。
【００１４】
TTF-1発現量は通常、コントロール（比較対照）との比較に基づいて判定又は算出される。コントロールには、予めTTF-1発現量が判明している各種細胞や、被検肺腺癌細胞を生体より採取する際、被検肺腺癌細胞に混在して採取される正常細胞を用いることができる。尚、TTF-1発現量を厳密に定量することは必須でなく、コントロールと比較することによって、被検肺腺癌細胞に対する薬剤の有効性を評価可能となる程度にTTF-1発現量を測定できればよい。
【００１５】
TTF-1発現量としてTTF-1蛋白発現量を調べる場合、これに限定されるものではないが、ウエスタンブロット法や免疫組織化学（免疫染色）を利用するとよい。免疫組織化学によれば、被検肺腺癌細胞の形態や分布状態なども同時に調べることができ、付加的な情報も同時に得られる。
免疫組織化学ではTTF-1を特異的に認識する抗体（抗TTF-1抗体）が使用され、当該抗体の結合性（結合量）を指標としてTTF-1の発現量が調べられる。抗TTF-1抗体を使用した免疫組織化学は例えばABC（Avidin-Biotin Complex）法、PAP（Peroxydase-anti-Peroxydase Complex）法、LAB（Linked Avidin-Biotin）法、LSAB(Linked Streptavidin-Biotin)法等で行うことができる。これらの各方法についての標準的なプロコールは周知である（例えば、「酵素抗体法、改訂第３版」、渡辺慶一、中根一穂編集、学際企画を参照）。尚、文献「Yatabe, Y., Mitsudomi, T. & Takahashi, T., TTF-1 expression in pulmonary adenocarcinomas. Am. J. Surg. Pathol. 26, 767-773 (2002).」には抗TTF-1抗体を使用した免疫組織化学の実験方法の記述があり参考となる。
【００１６】
免疫組織化学に使用する抗TTF-1抗体の種類や由来などは特に限定されない。好ましくはモノクローナル抗体を使用するが、十分な特異性でTTF-1を検出可能である限り、オリゴクローナル抗体（数種〜数十種の抗体の混合物）又はポリクローナル抗体を使用することもできる。Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体などの抗体断片を使用することにしてもよい。
抗TTF-1抗体として市販のもの（例えばDAKO社、Santa Cruz biotechnology inc.社が提供する）を使用しても、或いは免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して新たに調製したものを使用することにしてもよい。
【００１７】
以下、免疫組織化学の方法・手順の一例を示す。
（１）固定・パラフィン包埋
生体（剖検症例の場合は死体）より採取した組織をホルマリンやパラフォルムアルデヒド等によって固定する。その後パラフィン包埋する。一般にアルコールで脱水した後キシレンで処理し、最後にパラフィンで包埋する。パラフィンで包埋された標本を所望の厚さ（例えば3〜5μm）に薄切し、スライドガラス上に伸展させる。尚、パラフィン包埋標本に代えて凍結標本を用いる場合もある。
（２）脱パラフィン
一般にキシレン、アルコール、及び精製水で順に処理する。
（３）前処理（抗原賦活）
必要に応じて抗原賦活のために酵素処理、加熱処理及び／又は加圧処理等を行う。
（４）内因性ペルオキシダーゼ除去
染色の際の標識物質としてペルオキシダーゼを使用する場合、過酸化水素水で処理して内因性ペルオキシダーゼ活性を除去しておく。
（５）非特異的反応阻害
切片をウシ血清アルブミン溶液（例えば1%溶液）で数分から数十分程度処理して非特異的反応を阻害する。尚、ウシ血清アルブミンを含有させた抗体溶液を使用して次の一次抗体反応を行うこととし、この工程を省略してもよい。
（６）一次抗体反応
適当な濃度に希釈した抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
（７）標識試薬の添加
標識物質としてペルオキシダーゼが頻用される。ペルオキシダーゼを結合させた２次抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
（８）発色反応
トリス緩衝液にDAB（3,3'-diaminobenzidine）を溶解する。続いて過酸化水素水を添加する。このようにして調製した発色用溶液を数分間（例えば5分間）切片に浸透させ、発色させる。発色後、切片を水道水で十分に洗浄し、DABを除去する。
（９）核染色
マイヤーのヘマトキシリンを数秒〜数十秒反応させて核染色を行う。流水で洗浄し色出しする（通常、数分間）。
（１０）脱水、透徹、封入
アルコールで脱水した後、キシレンで透徹処理し、最後に合成樹脂やグリセリン、ゴムシロップなどで封入する。
【００１８】
TTF-1発現量としてTTF-1 mRNA発現量を調べることにしてもよく、この場合のmRNAの検出／測定にはRT-PCR（Molecular Cloning, Third Edition,8.46,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）、ノザンブロット法（Molecular Cloning, Third Edition,7.42,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）、ドットブロット法（Molecular Cloning, Third Edition,7.46,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）、DNAチップ（DNAアレイ）を用いた方法、in situハイブリダイゼーションなどを利用できる。
当業者であればTTF-1 mRNAの配列（Genbank Accession No. NM_001079668, DEFINITION: Homo sapiens thyroid transcription factor 1 (TITF1), transcript variant 1, mRNA.（配列番号３２）、Genbank Accession No. NM_003317, DEFINITION: Homo sapiens thyroid transcription factor 1 (TITF1), transcript variant 2, mRNA.（配列番号３３）、NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）を基に各方法に適した核酸プライマー又は核酸プローブを常法で設計することができる。
【００１９】
TTF-1の遺伝子増幅を調べるためには、遺伝子の検出に通常用いられる手法を採用すればよい。例えば、サザンブロット法、PCR法及びその変法又は応用法、FISH法（Fluorescence in situ hybridization）等を利用できる。当業者であればTTF-1遺伝子の配列（UniGene Hs.652315, Homo sapiens, TITF1, NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を基に各方法に適した核酸プライマー又は核酸プローブを常法で設計することができる。
【００２０】
ステップ（３）では、ステップ（２）の結果、即ちTTF-1発現量又はTTF-1の遺伝子増幅の有無又は程度に基づいて薬剤の有効性を評価する。以下、TTF-1発現量に基づく評価の具体例を示す。尚、TTF-1の遺伝子増幅の有無又は程度に基づく評価についても、以下の例に準じて実施することができる。
まず、TTF-1発現量と、被検肺腺癌細胞に対する薬剤の有効性（換言すれば被検肺腺癌細胞の薬剤に対する感受性）とが関連付けられた複数の評価区分を設定しておく。そして、ステップ（２）で得られたTTF-1発現量に基づき、被検肺腺癌細胞が該当する評価区分を決定する。評価区分の設定に関する具体例として、TTF-1の発現の有無に注目した例（例１）と、TTF-1の発現量の程度に注目した例（例２）を以下に示す。尚、区分名：当該区分に関連付けられるTTF-1発現量：当該区分に関連付けられる評価結果の順で記載する。
＜例１＞
区分１：TTF-1陽性である：薬剤が有効である（薬剤に対して感受性である）
区分２：TTF-1陰性である：薬剤が無効である（薬剤に対して感受性でない）
＜例２＞
区分１：TTF-1の発現を認めず：薬剤が無効である
区分２：TTF-1の弱い発現を認める：薬剤の有効性は低い
区分３：TTF-1の中程度の発現を認める：薬剤の有効性は中程度である
区分４：TTF-1の強い発現を認める：薬剤の有効性は高い
【００２１】
評価区分の数、及び各評価区分に関連付けられるTTF-1発現量及び評価結果はいずれも上記の例に何らとらわれることなく、予備実験等を通して任意に設定することができる。
【００２２】
本発明の第２の局面は、本発明の有効性評価法に用いられる試薬（有効性評価用試薬）及びキット（有効性評価用キット）に関する。本発明の試薬の一態様は、免疫学的手法によって本発明の有効性評価法を実施する際に使用される試薬であり、TTF-1タンパク質に特異的結合性を示す物質からなる。当該試薬の好適な例は抗TTF-1抗体であるが、これに限られるものではない。抗TTF-1抗体の調製法ないし入手法については、上記の免疫組織化学の説明の欄に記載した通りである。尚、ここでの抗体はポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体（数種〜数十種の抗体の混合物）、及びモノクローナル抗体のいずれでもよく、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体などの抗体断片であってもよい。標識化などの修飾が施されている抗体であってもよい。
【００２３】
本発明の試薬の他の態様は、TTF-1 mRNAの発現量の検出／測定を伴う有効性評価法を実施する際に使用される核酸プライマー又は核酸プローブである。核酸プライマー及び核酸プローブは、採用する検出法／測定法に適合するよう、TTF-1 mRNAの配列に基づき設計すればよい（上記のmRNAの検出法／測定法についての説明の欄を参照）。尚、核酸プライマー及び核酸プローブは増幅対象又は検出対象に特異的である限りその具体的な配列は特に限定されない。標識化などの修飾が施されていても良い。
【００２４】
本発明の試薬の更に他の態様は、TTF-1の遺伝子増幅の検出／測定を伴う有効性評価法を実施する際に使用される核酸プライマー又は核酸プローブである。核酸プライマー及び核酸プローブは、採用する検出法／測定法に適合するよう、TTF-1遺伝子の配列に基づき設計すればよい（上記のTTF-1遺伝子の検出法／測定法についての説明の欄を参照）。尚、核酸プライマー及び核酸プローブは増幅対象又は検出対象に特異的である限りその具体的な配列は特に限定されない。標識化などの修飾が施されていても良い。
【００２５】
本発明のキット（有効性評価用キット）は上記の試薬（有効性評価用試薬）を含む。本発明のキットを用いることによって、本発明の有効性評価法をより簡便に且つより短時間で実施することが可能となる。
免疫学的手法用のキットの場合、例えば、標識化抗TTF-1抗体が用いられる。当該キットによれば抗TTF-1抗体の結合量を直接検出することができる。一方、未標識の抗TTF-1抗体と二次抗体（標識二次抗体）を組み合わせれば、間接的検出によって結果を得るキットが構築される。本発明のキットにTTF-1タンパク質（抗原）を更に含めることにしてもよい。TTF-1タンパク質は検量線の作成や、キットを使用して得られた染色性が抗TTF-1抗体とTTF-1との特異的結合に基づくものであることを確認するために使用される。
本発明のキットに、抗原抗体反応や染色等、免疫組織化学を実施する上で必要な一以上の試薬（例えば、組織固定・包埋用のホルマリンやパラフィン、非特異的結合を阻害するためのBSA、DAB等の発色試薬、核染色用のヘマトキシリン溶液など）や器具などを更に含めてもよい。
【００２６】
一方、TTF-1 mRNA発現量の検出／測定のためのキットの場合、TTF-1 mRNA特異的な核酸プライマー及び／又は核酸プローブが含まれることになる。この場合においても、各反応の実施に必要な一以上の試薬（逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、dNTP、各種バッファー等）や器具等をキットに含めることができる。TTF-1遺伝子の遺伝子増幅の検出／測定のためのキットの場合も同様であり、TTF-1遺伝子特異的な核酸プライマー及び／又は核酸プローブの他、任意の成分として反応用試薬や器具等が含まれることになる。
尚、本発明のキットには通常、使用説明書が添付される。
【実施例】
【００２７】
肺腺癌におけるTTF-1の役割を明らかにすべく以下の検討を行うことにした。
１．方法
（１）TTF-1 RNAの抑制実験（RNAi）
TTF-1標的ショートヘヤピンRNA発現プラスミドは、以下のTTF-1標的オリゴヌクレオチドと対照オリゴヌクレオチドを、ループ配列(小文字で示す)と共に、H1プロモーターを有するpH1-RNApuro或いはpH1-RNAneoベクターに挿入し作成した。
TTF-1：5'-ACCAGGACACCATGAGGAAttcaagagaTTCCTCATGGTGTCCTGGT-3'（配列番号１）
対照：5'-CGTAAACACGAAGCGCAAGttcaagagaCTTGCGCTTCGTGTTTACG-3'（配列番号２）
ノザンブロット法とウエスタンブロット法により、これらのプラスミドが機能する事を確認した。TTF-1発現プラスミドは、ヒトTTF-1遺伝子の配列をpcDNA3に挿入し作成した。全配列のシークエンスを確認した。TTF-1標的ショートヘヤピンRNAによる抑制を受けない変異型TTF-1発現プラスミドはPfu Turbo DNA Polymeraseを用いて、以下のプライマーにより作成した（下線部は変異配列）。
5'-TATCAAGATACGATGCGAAACAGCGCT-3'（配列番号３）
【００２８】
（２）ウエスタンブロット法とフローサイトメトリーによる解析
ウエスタンブロット法は以下の抗体、即ち、抗TTF-1抗体(DAKO社)；抗cleaved caspase-3（Cell Signaling Technology社）；抗cleaved caspase-7抗体（Cell Signaling Technology社）を用いて施行した。
フローサイトメトリー解析では、NCI-H358細胞にTTF-1標的ショートヘヤピンRNAとコントロールRNA発現プラスミドを第1日目にトランスフェクションし、第2日目から2日間ピューロマイシンによるセレクションを行った。引き続き24時間、新鮮培地で培養を行い、その後、細胞を0.5% NP-40で溶解し、propidium iodide (Sigma-Aldrich社)により核染色を行なった。細胞内DNA量はCELLQuestプログラムによりFACSCalibur 機器 (BD Biosciences社)を用いて検討した。解析は、3検体を用いた検討を、独立に3回繰り返し行った。
【００２９】
（３）サザンブロット法、TaqMan PCR法による遺伝子増幅、リアルタイムRT-PCR法、PCR?SSCP法による解析
サザンブロット法による解析はTTF-1遺伝子配列をプローブとして用いて施行した。対照としてT細胞受容体β鎖cDNA断片（CTβ）をプローブとした解析を行った。
TaqMan PCR法によるTTF-1遺伝子増幅解析は、以下に示すプライマー・プローブセットを用いて、TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems社)により、製品添付書通りに施行した。
TTF-1-copy#-F-プライマー：5'-AGAGAAGCCAAGAGGCAAAGC-3'（配列番号４）
TTF-1-copy#-R-プライマー： 5'-TACGGTAGACCCCAGTTTGGA-3'（配列番号５）
ALB-copy#-F-プライマー：5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3'（配列番号６）
ALB-copy#-R-プライマー：5'-ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3'（配列番号７）
TTF-1-copy#-プローブ：5'-CTCCAGCTTTTGGAAGTCAACACCCCC-3'（配列番号８）
ALB-copy#-プローブ：5'-CAAAACCTGTCATGCCCACACAAATCTCT-3'（配列番号９）
【００３０】
TTF-1遺伝子増幅の定量化は、対照のアルブミン遺伝子に対する比率を求め、正常肺組織混合試料（5症例）の数値を基準の1とし、腫瘍組織の数値を算出する事により行った。
TTF-1遺伝子発現の検討は、TaqMan gene expression assay (Assay ID: Hs00968939_m1, Applied Biosystems社) を用いて、製品添付書通りに施行した。リアルタイムRT-PCR法によるVDRとCYP24A1の発現検討は、以下のプライマーセットを用いて、SYBR Green試薬(Applied Biosystems社)により行った。
VDR-F-プライマー：5'- AATCCAAGCGAGGTCAACAGA -3'（配列番号１０）
VDR-R-プライマー：5'- ACATCCTTTCGCTGCCATATCT -3'（配列番号１１）
CYP24A1-F-プライマー：5'- GAGTACCACAAGAAGTATGGCAAGATT -3'（配列番号１２）
CYP24A1-R-プライマー：5'- GGTGCACCGACTCAAAGGAA -3'（配列番号１３）
【００３１】
TTF-1遺伝子の突然変異解析は、以下のプライマーセットを用いて、PCR_SSCP法により行った。
1F：5'- GCCTCCACTCAAGCCAATTA -3'（配列番号１４）
1R：5'- CTCCATGCCCACTTTCTTGT -3'（配列番号１５）
2F：5'- GACATCTTGAGTCCCCTGGA -3'（配列番号１６）
2R：5'- GCTGTTCCTCATGGTGTCCT -3'（配列番号１７）
3F：5'- CTACTGCAACGGCAACCTG -3'（配列番号１８）
3R：5'- CGCTACCAAGTGCCTGTTCT -3'（配列番号１９）
4F：5'- GGACGTGAGCAAGAACATGG -3'（配列番号２０）
4R：5'- ACTGCTGCTGAGCCTGTTG -3'（配列番号２１）
5F：5'- GACGCTTCAAGCAACAGAAG -3'（配列番号２２）
5R：5'- GTTTGCCGTCTTTCACCAG -3'（配列番号２３）
6F：5'- AACAGGCTCAGCAGCAGTC -3'（配列番号２４）
6R：5'- GTGGGACAGGCTGGATACCT -3'（配列番号２５）
7F：5'- CGGTCCTGGTGAAAGACG -3'（配列番号２６）
7R：5'- CAGGACATGGTGCCGTAGT -3'（配列番号２７）
8F：5'- CCAGGTATCCAGCCTGTCC -3'（配列番号２８）
8R：5'- GGCCAGGTTGTTAAGAAAAGTCGAAGCGCG -3'（配列番号２９）
9F：5'- CTGTGCGTTTGTCGCTTACA -3'（配列番号３０）
9R：5'- CGCCGACAGGTACTTCTGTT -3'（配列番号３１）
【００３２】
今回の検討は、名古屋大学及び愛知県がんセンターの内部倫理委員会の承認を得て、36症例の肺腺癌と共に214症例の非小細胞肺癌、さらには、3症例の小細胞肺癌と2症例のカルチノイド由来の試料を用いて遂行した。214症例の非小細胞肺癌の内訳は174症例の腺癌(8症例の肺胞上皮癌を含む)、32症例の扁平上皮癌、4症例の大細胞癌、1症例の腺扁平上皮癌、3症例の神経内分泌大細胞癌である。
【００３３】
（４）FISH解析と免疫組織学的染色法による解析
2色法によるFISHは、TTF-1遺伝子増幅の確認されているSK-LC5細胞と肺癌組織試料を用いて、以下のプローブにより施行した。2種類のBAC DNAクローン（RP11-465B6; 14q13.2b_14q13.3aとRP11-368G9; 14q11.2g_14q12a）を、それぞれnick translation kit (Vysis Inc.社)を用いて、製品添付書通りに、SpectrumGreen_dUTPとSpectrumOrange_dUTP色素により標識しプローブとした。TTF-1分子の免疫組織染色は、クローン8G7G3抗体（DAKO社）を用いて行い、ジアミノベンチジンにより可視化を行った。
【００３４】
（５）発現プロファイル解析とネットワーク解析
TTF-1遺伝子の発現亢進がもたらす網羅的な遺伝子の発現変化を、マイクロアレイ（Whole Human Genome Oligo Microarray）（Agilent Technologies社）を用いて解析した。TTF-1安定発現HPL1D株由来のRNAをcy5で、VC発現HPL1D由来のRNAをcy3でそれぞれ蛍光ラベルし、各遺伝子の発現量の変化（発現比率）を測定した。蛍光色素間の発現量補正には、loess normalization法を用いた。また、それぞれの蛍光色素を入れ替えたdye-swapを行い、発現比率の平均値を得ることで、蛍光色素によるノイズの低減を行った。
TTF-1安定発現HPL1D株にて、2倍以上の発現増強を示す遺伝子（「TTF-1誘導遺伝子群」）を抽出するとともに、分子間ネットワーク解析ソフトウェアであるKeyMolnet（(http://www.immd.co.jp/en/keymolnet/index.html）を用いて、「TTF-1誘導遺伝子群」の相互作用解析を行った。
【００３５】
２．結果及び考察
ウエスタンブロット法により、肺腺癌細胞株におけるTTF-1蛋白の発現を検討し、高発現株を見出した（図１ａ）。高発現株のNCI-H358細胞株及びA427細胞株と、TTF-1の発現が観察されないNCI-H23細胞株を以降の検討に使用した。ヒトH1プロモーターにより制御され、TTF-1標的ショートヘヤピンRNA（shRNA）を発現可能なプラスミドをNCI-H358細胞及びA427細胞に導入したところ、内因性のTTF-1蛋白の発現が消失し（図１ｂ）、且つコロニー形成能の著明な減弱を観察した（図１ｃ及び１ｄ）。これに対し、同ブラスミドをNCI-H23細胞に導入した際には有意な変化は観察されなかった（図１ｄ）。さらに、NCI-H358細胞株についてフローサイトメトリーによる解析を行ったところ、TTF-1発現抑制の結果、サブG1細胞の増加（細胞死の増加を示すと考えられる）を観察した（図１ｅ）。ウエスタンブロット法による更なる検討では、caspase3及びcaspase7の活性化が検出され（図１ｆ）、上記のコロニー形成能の減弱は、細胞死の誘導が一因であることが示唆された。
【００３６】
以上より、TTF-1を発現する肺腺癌細胞株では、細胞の生存又は増殖にTTF-1が重要な役割を担っているものと考えうる。TTF-1標的ショートヘヤピンRNAの特異性検証のために、ショートヘヤピンRNA結合部に変異を挿入したTTF-1遺伝子を発現させるプラスミドを作成し、以下の検討を行った。変異型TTF-1発現プラスミドを、TTF-1標的ショートヘヤピンRNA発現プラスミドとともにNCI-H358細胞に導入したところ、TTF-1標的ショートヘヤピンRNAによる細胞増殖抑制効果のキャンセルがMTT法により観察され、さらにはフローサイトメトリーによる解析から、細胞死の誘導効果も消失する事が観察された。以上から、TTF-1標的ショートヘヤピンRNAによる形質の変化は、TTF-1発現の抑制により惹起される事が示された。
【００３７】
この様な、実験系で検証されたTTF-1の重要性を、さらに臨床試料を用いて検討すべく、まず、PCR-SSCP法によるTTF-1遺伝子の突然変異解析を行ったが、肺腺癌において変異は検出されなかった。続いて、TTF-1遺伝子の発現をリアルタイムPCR法により検討した。36症例の肺腺癌腫瘍検体から抽出されたRNAを用いた解析結果から、正常肺に比して5倍以上の発現を認める腫瘍は17%の頻度であった（データ示さず）。さらに、肺腺癌腫瘍検体から抽出されたDNAにおけるTTF-1遺伝子増幅の有無の検討を、サザン法と同等の結果を得る事が可能であるTaqMan PCR法を応用し行った。その結果、約2倍の増幅を46症例中1症例で認めた（データ示さず）。さらに、検出感度を高めた大規模な検討を行うべく、腺癌174症例を含む非小細胞肺癌214症例に加えて、小細胞癌3症例、カルチノイド2症例の肺腫瘍組織に対してマイクロダイセクションを行い、腫瘍細胞由来DNAを抽出し、解析試料とした。2.5倍以上のTTF-1遺伝子増幅を認めた症例は腺癌174症例中4症例(2.2%)あり、その中には、20倍以上の増幅を認めた症例38が含まれる（図２ａ）。また、非小細胞肺癌の中でも比較的頻度の低い神経内分泌大細胞癌3症例中2症例（67%）においても、TTF-1遺伝子の増幅を検出した。この様なTTF-1遺伝子コピー数の増加は、原発巣に比して転移巣で高い傾向にある事は(2.5倍以上増加の観察された頻度はそれぞれ2%と13%で、フィッシャーテスト（two sided Fisher's exact test）により算出されたP値は0.07)、興味深い知見であると思われた。実際に、症例38の遠隔転移巣におけるTTF-1遺伝子増幅の検討は、FISH法を用いて確認を行っている（図２ｂ）。この様なTTF-1遺伝子増幅を認めた症例では、全てにおいてTTF-1蛋白の発現を免疫組織染色法にて確認している（図２ｂ）。
【００３８】
TTF-1の肺上皮細胞における機能に関して更なる知見を得るために、ヒト末梢肺正常細胞由来不死化細胞株であるHPL1D細胞（参考文献１３）にTTF-1遺伝子を導入した。HPL1D細胞は、TTF-1蛋白の発現の認められない細胞株であるが、TTF-1遺伝子導入により、肺上皮細胞のマーカーであるサーファクタント蛋白Bの発現上昇がPCR法により観察された（図３ｃ）。興味深い事に、コロニー形成能或いはMTT法による細胞増殖の検討から、HPL1D細胞にTTF-1遺伝子を外来性に導入する事により、有意な細胞増殖の抑制効果が観察された（図３ａ、３ｂ）。さらに解析を進める目的で、TTF-1安定発現HPL1D細胞を樹立し、遺伝子発現の網羅解析を施行した。発現データを用いたネットワーク解析の結果からは、プロテインキナーゼC(PKC)とビタミンD受容体(VDR)を基点とする相互関連ネットワークを形成する事が示された（図３ｄ）。VDRは、肺の発生において重要な働きを担っており（参考文献１４）、また、癌細胞に対して増殖や転移の抑制効果を有する事が示唆されているため（参考文献１５、１６）、我々は、肺腺癌におけるVDRとビタミンD3不活性化酵素であるCYP24A1（参考文献１５、１７）の発現変化が、癌細胞の増殖にとって不利に働くビタミンD経路の不活性化に寄与していると仮定し、リアルタイムPCR法によりそれらの検討を行った。肺腺癌36症例における解析結果から、10倍以上のCYP24A1遺伝子の発現増加を31%の症例で観察した（図４）。VDR遺伝子の発現は多くの症例で低下しており、また、TTF-1の発現と腫瘍（R=0.65, P<0.001）正常肺組織（R=0.73, P=0.005）とも関連が認められた（データ示さず）。以上の結果より、TTFを発現している肺腺癌では、VDRの不活性化が観察される事が明らかとなった。この知見に基づけば、TTF-1を発現する肺腺癌細胞の増殖を抑制するための手段としてVDRの活性化が有効であるといえる。一方、PKCは、VDRと異なり、その発現が癌細胞の増殖に有利に働くと考えられる（図３ｄ）。従って、PKCの阻害もまた、TTF-1を発現する肺腺癌細胞の増殖抑制の手段として有効であるといえる。
【００３９】
様々な癌表現型と「細胞系列（specific cell linage）」との間に深い相関関係が認められることは周知の通りである（参考文献１８、１９）。この事実に鑑みれば、細胞系列の発生を支配する細胞メカニズムが発癌過程にも関与すると予想される。「linage-specific dependency」という概念においては、癌細胞の生存及び／又は増殖を通して細胞系列を支配するマスター調節遺伝子への特異的依存性、及び系列特異的にジェネティック又はエピジェネティックな変化を形成する上でのこれらの遺伝子の重要性が重視される（参考文献１）。メラノーマにおけるMITF遺伝子が細胞系列に関わる遺伝子として報告されている（参考文献２０〜２３）。我々は、小細胞肺癌などの神経内分泌腫瘍に関する知見（参考文献２、２４）に基づき、achaete-scuteホモログ１（ASH1）／achaete-scute複合体様分子１を「prototypic lineage-dependency遺伝子」のリストに追加することを提案してきた。一方、上記の通り、TTF-1遺伝子の発現を維持する腺癌の生存にTTF-1遺伝子の発現が必要であることが示された。これまでに、TTF-1が肺の正常な機能の発達及び維持に決定的な役割を果たすことが示されている（参考文献３〜５）。従って、今回の知見は「linage-specific dependency」という概念に合致するものであると同時にこれを支持するものである。一方、上記の通りin vitro及びin vivoの実験において、著明なレベルではないものの腺癌症例の一部にTTF-1遺伝子増幅を認めた。また、様々な癌遺伝子及びMITF遺伝子に関して転移性メラノーマでしばしば観察されるのと同様に（参考文献２５）、肺腺癌の転移巣においてTTF-1遺伝子の増幅が高頻度で観察された。これらの結果を合わせて考えると、現在のところ該当する遺伝子が極めて少ない「prototypic lineage-dependency遺伝子」のリストにTTF-1遺伝子を追加することは妥当といえよう。
【００４０】
TTF-1遺伝子の導入によって、TTF-1発現欠損株であるヒト末梢肺正常細胞由来不死化細胞株における増殖抑制が引き起こされたという逆説的な結果は注目に値する。発現プロファイル解析及びin silicoネットワーク解析の結果は、TTF-1によって引き起こされる、正常末梢肺上皮細胞のトランスクリプトームの変化を介在する中心的分子の一つとしてVDR遺伝子（そのプロモーター領域に潜在的TTF-1結合部位を含むと思われる）の存在を示唆した。ビタミンD3を不活性化するCYP24A1の高頻度且つ顕著な発現増加が認められたことから、TTF-1が引き起こすVDRの誘導による増殖抑制効果からの回避を可能とする、腺癌にとって好ましい変化をこの発現増加が反映したと考えられる。この点において、疫学的研究が示唆するように、その主要成分のゲニステインがCYP24A1の発現抑制をするという大豆の消費と腺癌リスクが反相関関係にあるという事実（参考文献２６、２７）、及びビタミンＤ代謝物とともにCYP24A1の阻害剤で処理することが前立腺癌の治療の有望な候補になるとの報告（参考文献１７）は注目に値する。
【００４１】
ところで、MITFがサイクリン依存的キナーゼ阻害剤をトランス活性化することによって細胞周期を負調節することが報告されている（参考文献２２、２３）。このことはおそらく、メラノーマにおいてp16遺伝子が高頻度に且つ病因的な関与をすることへの説明となる（参考文献２８）。以前に我々は、EGFR遺伝子の突然変異など、TTF-1の発現と関連した遺伝子変異を報告した（参考文献７、２９）。これらの分子とTTF-1との間の潜在的な機能的相互作用に関する更なる研究、及び遺伝子の変化に関するlineage-specificなパターンの構築は非常に興味深い。
【００４２】
以上のように、TTF-1遺伝子の発現維持が腺癌症例の一部においてその生存に必須であること、及び肺の発達に関与するこのマスター調節分子が癌のlineage-specificな生存遺伝子のリストに加えられるべきであることを示した（図５）。サーファクタント蛋白の発現など、正常肺の機能維持に重要な役割を果たすことから、TTF-1自体は分子標的として適切でないであろう。しかしながら今回の知見は、TTF-1を発現する腺癌細胞の生存に関与する分子の同定（予後が極めて不良な患者に対する新規な治療法の確立への途が拓かれる）を容易にするものでありその意義は大きい。一方、TTF-1の下流に存在する中心的因子として、癌細胞に有利に働くPKCと、逆に癌細胞に不利に働くVDRを同定することに成功したことは、TTF-1を発現する肺腺癌に対する治療薬としてPKC阻害剤又はVDR活性化剤が有効であることを示唆するとともに、これらの薬剤による治療を行う際にTTF-1の発現状態を事前に確認すれば適応症例の限定化が可能であるとの注目すべき知見を提供する。この知見は、肺腺癌の治療における奏功率の向上をもたらすものであり、その価値は計り知れない。
【００４３】
参考文献
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【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の有効性評価法によれば、遺伝子の発現という客観的な指標に基づいて、肺腺癌の治療に使用される薬剤の有効性を事前に評価することができる。本発明によって提供される情報（評価結果）を基に適応患者を限定化した上で治療に望むことで奏功率の向上がもたらされる。
【００４５】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】肺腺癌におけるTTF-1依存性。ａ：各種細胞株についての、TTF-1を標的としたウエスタンブロットの結果。ｂ：ウエスタンブロットの結果。TTF-1標的RNAiの効果が示される。siScrはスクランブルsiRNAを表す。ｃ：ピューロマイシンによるセレクション後のNCI-H358細胞（位相差顕微鏡像）。TTF-1 RNAiによる著明な増殖抑制を認める。ｄ：ネオマイシンによるセレクション後のTTF-1 RNAi発現プラスミド導入細胞（ギムザ染色像）。NCI-H358細胞及びA427細胞では著明にコロニー数の減少を認めるが、NCI-H23細胞ではそのような減少はない。ｅ：ピューロマイシンによるセレクション後のNCI-H358細胞のフローサイトメトリー解析。TTF-1 RNAi発現プラスミド導入によって細胞死（アポトーシス）が誘導されている。ｆ：TTF-1 RNAi発現プラスミド導入後のNCI-H358細胞を使用したウエスタンブロットの結果。caspase3及びcaspase7の活性化が検出された。
【図２】TTF-1の遺伝子増幅。ａ：TTF-1に関するTaqMan PCR法による遺伝子増幅アッセイの結果。NSCLC（214症例）、SCLC（3症例）、カルチノイド（2症例）について検討した。一部の腺癌と神経内分泌大細胞癌に遺伝子増幅を認める。白丸（○）は原発巣、黒丸（●）は転移巣を示す。括弧内の数字は試料数を表す。ｂ：FISH解析の結果。症例38の遠隔転移巣においてTTF-1遺伝子（染色体14q13、緑色）の明らかな増幅を認める。14qのセントロメア近傍に対する対照プローブは赤色で示される。
【図３】ヒト末梢肺正常細胞由来不死化細胞株HPL1DにおけるTTF-1の細胞増殖抑制効果。ａ：TTF-1遺伝子の強制発現によって引き起こされたHPL1Dコロニー数の減少。ｂ：TTF-1導入HPL1D細胞のMTTアッセイ。細胞増殖の抑制を認める。ｃ：サーファクタント蛋白BのリアルタイムRT-PCR解析。肺上皮細胞の分化マーカーが誘導されていることがわかる。ｄ：TTF-1の強制発現によって上方調節される遺伝子のネットワーク。PKC及びVDRが基点となっていることがわかる。
【図４】腺癌試料を用いた、VDR及びCYP24A1のリアルタイムRT-PCR解析。ａ：VDR遺伝子の発現解析結果。腫瘍組織と正常肺組織との間で発現量の有意な差は認められない。ｂ：CYP24A1の発現解析結果。腫瘍組織で高頻度に発現増加が認められる。正常肺13試料のCYP24A1発現量の平均値を１とした。
【図５】新たに得られた知見のまとめ。腺癌において、TTF-1遺伝子がlineage-specificな生存に関わる遺伝子としての役割を担うことが示唆された。
【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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