(57)【要約】【課題】凍結保護剤を提供する。【解決手段】糖類、高分子物質および親水性有機溶媒からなる群から選ばれる化合物を有効成分として含有する、生体試料のための凍結保護剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖類、高分子物質および親水性有機溶媒からなる群から選ばれる化合物を有効成分として含有する、生体試料のための凍結保護剤。
【請求項２】
該糖類が、シュークロース、トレハロース、ラクトース、マンニトール及びグルコースからなる群より選ばれる、請求項１記載の凍結保護剤。
【請求項３】
該高分子物質が、デキストラン、デキストラン硫酸、プルラン、ポリエチレングリコール及びカルボキシメチルセルロースからなる群より選ばれる、請求項１または２記載の凍結保護剤。
【請求項４】
該親水性有機溶媒が、グリセロール及びジメチルスルホキサイドからなる群より選ばれる、請求項１〜３のいずれかに記載の凍結保護剤。
【請求項５】
生体試料中の変性リポ蛋白質の定量のために使用される、請求項１〜４のいずれかに記載の凍結保護剤。
【請求項６】
循環器系疾患の検出のために使用される、請求項１〜４のいずれかに記載の凍結保護剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結保護剤に関する。
【０００２】
本発明は、生体試料中の変性リポ蛋白質をホスホコリンに対する抗体を用いて定量することを特徴とする生体試料中の変性リポ蛋白質の定量方法、生体試料中の変性リポ蛋白質をホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を用いて定量することを特徴とする生体試料中の変性リポ蛋白質の定量方法、生体試料中の変性リポ蛋白質をホスホコリンに対する抗体を用いて定量し、その定量値から循環器系疾患を検出することを特徴とする循環器系疾患の検出方法、生体試料中の変性リポ蛋白質をホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を用いて定量し、その定量値から循環器系疾患を検出することを特徴とする循環器系疾患の検出方法、ホスホコリンに対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用試薬およびホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用試薬に関する。
【背景技術】
【０００３】
動脈硬化症は大動脈、冠状動脈、脳動脈及び頚動脈などの筋型動脈に多く発生し、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞などの主因となる疾患である。その原因として血清コレステロールの上昇、血小板凝集、内皮傷害などが提唱されているが、その成因はほとんど解析されていない。
【０００４】
血清脂質は、心筋梗塞や狭心症などの冠動脈系疾患、脳梗塞や脳血管系痴呆などの脳動脈系疾患、あるいは腎症、糖尿病性腎症などの腎動脈系疾患および末梢動脈閉塞症などの末梢動脈系疾患などの各種循環器系疾患との関わりが強く示唆されており、その測定は、これら疾患の診断、病態の解明、治療の効果検出などに極めて重要であると考えられている。
【０００５】
しかしながら、最近の研究で、上記の疾患患者群と健常者群との血清脂質の絶対量の比較を行った結果、両群間でそれほど大きな違いはなく、むしろ変性されたリポ蛋白質（以下、変性リポ蛋白質と称す）の血清中の存在量が明確に両群間で異なっていることが報告された［例えば、非特許文献１］。また、変性リポ蛋白質の一つである酸化リポ蛋白質と粥状硬化病巣の進展との関連性が、スタインバーグ(Steinberg)らにより指摘された［例えば、非特許文献２］。
【０００６】
さらにスカベンジャー受容体などの、変性リポ蛋白質に対する受容体の存在が明らかにされ、変性リポ蛋白質がこれらの受容体を介して細胞内に取り込まれることによって、泡沫細胞となり粥腫形成のイニシエーションが起こるという仮説、また変性リポ蛋白質が内皮細胞を傷害することで、血小板の粘着凝集や、白血球の集結、血球成分の血管内への浸潤がおこり、これらが引き金になって、平滑筋細胞の遊走や増殖を引き起こすといった仮説が提唱されている。
【０００７】
変性リポ蛋白質が病巣に蓄積していることは、例えば１９８８年にハーバーランド(Haberland)等がマロンジアルデヒドで修飾した低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）に対する抗体［抗マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）−ＬＤＬ抗体］により動脈硬化病巣部が染色されること［非特許文献３］、また１９８９年にイラーハーテエアラ(Yla Herttuala)等が、抗ＭＤＡ−ＡｐｏＢ抗体によるイムノブロッティング法により、病巣部から抽出されたアポＢ(ａｐｏＢ)を検出されること［非特許文献４］などが報告されている。しかしながら、上述の抗ＭＤＡ−ＡｐｏＢ抗体はマロンジアルデヒドを用いて人工的に酸化修飾したリポ蛋白質を抗原として得られた抗体であるが、酸化生成物だけでなく他の変性蛋白質、例えば酸化アルブミンなどとも交叉反応を示すという性質を有するため、変性リポ蛋白質を測定しているかどうかは不明である。
【０００８】
上記のように、変性されたリポ蛋白質としては、アセチル化リポ蛋白質、糖化リポ蛋白質、マロンジアルデヒド化リポ蛋白質、４−ヒドロキシ−２−ノネナール（ＨＮＥ）修飾リポ蛋白質、酸化リポ蛋白質等が知られているが、生体内での変性リポ蛋白質の実体は未だ不明確である。
【０００９】
また、リポ蛋白質が凝集をおこすことによって性質が変化し、マクロファージによって取り込まれやすくなることが知られており［J. Biol. Chem., 272, 31700, (1997)］、これもリポ蛋白質の変性の一種と考えられる。この変性は酸化、チオール化、ある種の酵素処理などによって引き起こされることが知られており［非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２］、さらにボルテックス処理などの物理的処理においてもこのような変性は引き起こされる［非特許文献１３］。またこのような変性を起こしたリポ蛋白質は、マクロファージによって容易に取り込まれるようになる。そのため、マクロファージにコレステロールの蓄積を引き起こし、動脈硬化性病巣の発生・進展に深く関与していると考えられている。
【００１０】
以上のことから、動脈硬化をはじめとする循環器疾患の診断として、変性リポ蛋白質の測定方法が開発されている。
【００１１】
具体的には、ホスファチジルコリンの酸化物を認識する抗体を用いて酸化リポ蛋白質を測定する方法（特許文献１、２）、ＨＤＬの酸化リン脂質（特にリゾホスファチジルコリン）を認識する抗体である９Ｆ５−３ａと、抗ａｐｏ−ＡＩ抗体とを用いた酸化ＨＤＬを測定する方法（特許文献３）、アセチル化、マロンジアルデヒド化、酸化など化学処理したＬＤＬをすべて認識する抗体と酸化剤とを組み合わせて酸化ＬＤＬを測定する方法（特許文献４）、プラスミノーゲン及びＬＤＬと交差反応性がなく、リポ蛋白質（ａ）の酸化、還元、加水分解などの分解、加熱、又は蛋白質変性剤などの変性剤等により、一次構造、高次構造若しくは立体構造の変化、分解又は化学的修飾を受け構造、組成又は立体的配置が変化する特定のペプチドを認識する抗体を用いて変性又は修飾リポ蛋白質（ａ）を測定する方法（特許文献５）、マロンジアルデヒド化されたリポ蛋白質に対する抗体と界面活性剤とを併用して変性リポ蛋白質類を測定する方法（特許文献６）などがこれまでに報告されているが、十分な成果を示しているものはない。
【特許文献１】特開平８−３０４３９５号公報
【特許文献２】特開平９−２８８１０６号公報
【特許文献３】特開平９−３３５２５号公報
【特許文献４】特開平９−５３２３号公報
【特許文献５】特開平９−２９７１３７号公報
【特許文献６】特開平８−１０１１９５号公報
【非特許文献１】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  ９４，  Ｓｕｐｐｌ．  Ｉ，  １２８８  （１９９６）
【非特許文献２】Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３２０，  ９１５  （１９８９）
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４１，  ２１５  （１９８８）
【非特許文献４】Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ８４，  １０８６  （１９８９）
【非特許文献５】Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｉｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．，  １１，  １２０９  （１９９１）
【非特許文献６】Ａｒｃｈ．  Ｂｉａｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  ３１０，  ４８９  （１９９４）
【非特許文献７】Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  １２１５，  ７９  （１９９４）
【非特許文献８】Ｎｕｔｒ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｄｉｓ．，  ４，  ７０  （１９９４）
【非特許文献９】Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｉ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８６，  ２７１３  （１９８９）
【非特許文献１０】Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｉｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．，  １１，  １６４３  （１９９１）
【非特許文献１１】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６８，  ２０４１９  （１９９３）
【非特許文献１２】Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．，  ７１，  ２１８  （１９９２）
【非特許文献１３】Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  ８，  ３４８（１９８８）
【発明の開示】
【００１２】
本発明の目的は、生体試料中の変性リポ蛋白質の定量方法、循環器系疾患の検出方法、変性リポ蛋白質の定量用試薬および循環器系疾患の検出試薬を提供することである。
【００１３】
本発明は、下記（１）〜（３６）に関する。
【００１４】
（１）  生体試料とホスホコリンに対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中の変性リポ蛋白質の定量方法。
【００１５】
（２）  生体試料とホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中の変性リポ蛋白質の定量方法。
【００１６】
（３）  生体試料とホスホコリンに対する抗体および低密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中の変性低密度リポ蛋白質の定量方法。
【００１７】
（４）  低密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポＢ蛋白質に対する抗体である上記（３）記載の方法。
【００１８】
（５）  生体試料とホスホコリンに対する抗体および高密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中の変性高密度リポ蛋白質の定量方法。
【００１９】
（６）  高密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポＡ蛋白質に対する抗体である上記（５）記載の方法。
【００２０】
（７）  生体試料とホスホコリンに対する抗体およびアポプロテイン（ａ）に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中のリポプロテイン(a)の定量方法。
【００２１】
（８）  生体試料とホスホコリンに対する抗体、高密度リポ蛋白質に対する抗体および低密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中の変性高密度リポ蛋白質および変性低密度リポ蛋白質の定量方法。
【００２２】
（９）  高密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポＡ蛋白質に対する抗体である上記（８）記載の方法。
【００２３】
（１０）  低密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポＢ蛋白質に対する抗体である上記（８）記載の方法。
【００２４】
（１１）  生体試料とホスホコリンに対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。
【００２５】
（１２）  生体試料とホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。
【００２６】
（１３）  生体試料とホスホコリンに対する抗体および低密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。
【００２７】
（１４）  低密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポＢ蛋白質に対する抗体である上記（１３）記載の方法。
【００２８】
（１５）  生体試料とホスホコリンに対する抗体および高密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。
【００２９】
（１６）  高密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポＡ蛋白質に対する抗体である上記（１５）記載の方法。
【００３０】
（１７）  生体試料とホスホコリンに対する抗体およびアポプロテイン（ａ）に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。
【００３１】
（１８）  生体試料とホスホコリンに対する抗体、高密度リポ蛋白質に対する抗体および低密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。
【００３２】
（１９）  高密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポＡ蛋白質に対する抗体である上記（１８）記載の方法。
【００３３】
（２０）  低密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポＢ蛋白質に対する抗体である上記（１８）記載の方法。
【００３４】
（２１）  ホスホコリンに対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用試薬。
【００３５】
（２２）  ホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用試薬。
【００３６】
（２３）  リポ蛋白質に対する抗体が、アポＢ蛋白質に対する抗体、アポＡ蛋白質に対する抗体およびアポプロテイン（ａ）に対する抗体からなる群から選ばれる上記（２２）記載の試薬。
【００３７】
（２４）  凍結保護剤を含む、上記（２１）〜（２３）のいずれか１項に記載の試薬。
【００３８】
（２５）  ホスホコリンに対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用キット。
【００３９】
（２６）  ホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用キット。
【００４０】
（２７）  リポ蛋白質に対する抗体が、アポＢ蛋白質に対する抗体、アポＡ蛋白質に対する抗体およびアポプロテイン(a) に対する抗体からなる群から選ばれる上記（２３）記載のキット。
【００４１】
（２８）  凍結保護剤を含む、上記（２５）〜（２７）のいずれか１項に記載の変性リポ蛋白質の定量用キット。
【００４２】
（２９）  ホスホコリンに対する抗体を含有する循環器系疾患の検出試薬。
【００４３】
（３０）  ホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する循環器系疾患の検出試薬。
【００４４】
（３１）  リポ蛋白質に対する抗体が、アポＢ蛋白質に対する抗体、アポＡ蛋白質に対する抗体およびアポプロテイン(a)に対する抗体からなる群から選ばれる上記（３０）記載の検出試薬。
【００４５】
（３２）  ホスホコリンに対する抗体を含有する循環器系疾患の検出用キット。
【００４６】
（３３）  ホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する循環器系疾患の検出用キット。
【００４７】
（３４）  リポ蛋白質に対する抗体が、アポＢ蛋白質に対する抗体、アポＡに対する抗体およびアポプロテイン(a) に対する抗体からなる群から選ばれる上記（３３）記載のキット。
【００４８】
（３５）  凍結保護剤を含む、上記（３２）〜（３４）のいずれか１項に記載の循環器系疾患の検出用キット。
【００４９】
（３６）  糖類、高分子物質および親水性有機溶媒からなる群から選ばれる化合物を有効成分として含有する、生体試料のための凍結保護剤。
【００５０】
変性リポ蛋白質としては、変性を受けていないリポ蛋白質であればいかなるものも包含される。具体的には、糖化変性リポ蛋白質、酸化変性リポ蛋白質、アセチル化変性リポ蛋白質、マロンジアルデヒド等の作用によるアルデヒド化変性リポ蛋白質、４−ヒドロキシ−２−ノネナール修飾変性リポ蛋白質などの化学変化を受けた変性リポ蛋白質、酸化、チオール化、リポプロテインリパーゼ等の酵素処理、ボルテックスなどの物理処理、凍結などの温度処理などにより引き起こされる凝集や結合といった形態的変性を受けた変性リポ蛋白質、表面構造の変化や３次元構造の変化といった構造的変性を受けた変性リポ蛋白質等があげられる。また、未変性のリポ蛋白質に比較して荷電の変化、分子量の変化、生体内リセプターへの親和性変化、マクロファージなどの細胞への取り込まれ易さの変化などの生物学的変化が見られるリポ蛋白質も、変性リポ蛋白質に包含される。
【００５１】
本発明の変性リポ蛋白質の定量方法としては、ホスホコリンに対する抗体を用いて、変性リポ蛋白質を免疫学的に測定する方法であれば特に制限されるものではなく、測定方法の工程には生体試料とホスホコリンに対する抗体とを接触させる工程、反応により生じる変性リポ蛋白質−抗ホスホコリン抗体複合体（免疫複合体）量を測定する工程が含まれる。
【００５２】
測定方法としては、免疫学的測定方法があげられる。免疫学的測定方法としては、イムノアッセイ法、イムノブロッティング法、凝集反応、補体結合反応、溶血反応、沈降反応、金コロイド法、クロマトグラフィー法、免役染色法など抗原抗体反応を利用した方法であればいかなるものも包含されるが、好ましくはイムノアッセイ法があげられる。
【００５３】
イムノアッセイ法は、各種標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体または抗原を検出或いは定量する方法であり、抗原または抗体の標識方法に応じて、放射免疫検出法（RIA）、酵素免疫検出法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫検出法（ＦＩＡ）、発光免疫検出法（luminescent immunoassay）、物理化学的検出法（ＴＩＡ，ＬＡＰＩＡ，ＰＣＩＡ）、フローサイトメトリーなどがあげられるが、好ましくは酵素免疫検出法があげられる。
【００５４】
放射免疫検出法で用いる放射性標識体としては、任意の公知［J.CLAUSEN著、佐々木  實  監訳、加藤泰治・戸谷敬子訳、生化学実験法１５  免疫化学的同定法、東京化学同人(1993)］の放射性同位元素を用いることができる。例えば、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等を用いることができる。
【００５５】
酵素免疫検出法で用いる酵素標識体としては、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の酵素を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等を用いることができる。
【００５６】
発光免疫検出法で用いる発光標識体としては、任意の公知［今井一洋編、生物発光と化学発光、廣川書店；臨床検査４２（１９９８）］の発光体を用いることができる。例えば、アクリジニウムエステル、ロフィン等を用いることができる。
【００５７】
蛍光免疫検出法で用いる蛍光標識体としては、任意の公知（川生明著、蛍光抗体法、ソフトサイエンス社製）の蛍光を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ等を用いることができる。
【００５８】
イムノアッセイ法における測定方法としては、競合法、サンドイッチ法［免疫学イラストレイテッド  第５版（南光堂）］等があげられる。
【００５９】
具体的には、生体試料とホスホコリンに対する抗体（以下、抗ホスホコリン抗体と称す）とを接触させたのちに、標識物質を結合させた抗ホスホコリン抗体に反応する抗体を反応させることにより、生体試料中の変性リポ蛋白質を検出または定量することができる。また、標識物質を結合させた抗ホスホコリン抗体と生体試料とを接触させて反応させることにより、生体試料中の変性リポ蛋白質を検出または定量することができる。
【００６０】
上述のイムノアッセイ法で用いる抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２などの抗体フラグメントを用いてもよい。また、モノクローナル抗体としては、生体内において自然に生産された抗体、非ヒト動物を用いて取得されたハイブリドーマから生産された抗体、抗体分子を形成する重鎖および軽鎖の可変領域および定常領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをもとに遺伝子工学的な手法を用いて抗体分子を発現させる遺伝子組換え抗体などいかなるものでもよい。
【００６１】
本発明で用いられる抗ホスホコリン抗体としては、ホスホコリンに反応する性質を有すれば上記のいずれの抗体でもよい。具体的には、Ｔ−１５抗体［J. Exp. Med., 132, 737 (1970)］、ハイブリドーマＫＴＭ−２８５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８９）により生産されたモノクローナル抗体ＫＴＭ−２８５、形質転換細胞ＫＴＭ−２００１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５４９）により生産された遺伝子組換え抗体ＫＴＭ−２００１などがあげられる。
【００６２】
また、本発明は、ホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を用いて、変性リポ蛋白質を免疫学的に測定する方法をも包含する。
【００６３】
具体的には、固相に第一の抗体（一次抗体）を固定した後、生体試料を第一の抗体と接触させ、試料中の非反応のサンプル成分を洗浄した後、生体試料中の目的物質と第一の抗体との免疫複合体に、第二の抗体（二次抗体）を反応させ、生体試料中の変性リポ蛋白質を検出または定量することもできる。
【００６４】
一次抗体および二次抗体として用いられる抗体としては、抗ホスホコリン抗体と抗リポ蛋白質抗体があげられる。一次抗体と二次抗体の組み合わせとしては、好ましくは一次抗体として抗ホスホコリン抗体、二次抗体として抗リポ蛋白質抗体があげられる。
【００６５】
リポ蛋白質とは、血中ではコレステロールエステル、トリグリセライドなどの脂質類が中心（core）をなし、それらの表面をリン脂質と遊離コレステロール、さらに蛋白質（アポ蛋白質）で覆われた構造で存在するものをいう。
【００６６】
リポ蛋白質としては、超低密度リポ蛋白質（以下、ＶＬＤＬと略す）、低密度リポ蛋白質（以下、ＬＤＬと略す）、高密度リポ蛋白質（以下、ＨＤＬと略す）、中間比重リポ蛋白質（以下、ＩＤＬと略す）、リポ蛋白質（ａ）（以下、（Ｌｐ（ａ）と略す）などがあげられる。
【００６７】
ＶＬＤＬは、トリグリセライドを中心とする脂質とアポＢ−４８、アポＣ、アポＥなどの蛋白質などから構成される比重０．９６〜１．００６の粒子で、内因性脂肪の運搬体としての機能を有する。
【００６８】
ＬＤＬは、コレステロールに富んだリポ蛋白質で、主要蛋白質としてアポＢ−１００を持つ比重１．００６から１．０６３の粒子で、コレステロールを肝臓から末梢組織へ運搬する機能を有している。
【００６９】
ＨＤＬは、脂質としてリン脂質やコレステロールを主に含み、アポＡ−Ｉ、アポＡ−ＩＩ、アポＣなどが主な蛋白質として含まれる比重１．０６３〜１．２１の粒子で、末梢組織からコレステロールを運び出し肝臓で代謝する機能を有している。
【００７０】
ＩＤＬは、ＶＬＤＬからＬＤＬへの変換過程での中間代謝物で、ＶＬＤＬよりコレステロールに富み、アポＢ−１００，アポＣ、アポＥなどが主な蛋白質として含まれた比重１．００６〜１．０１９を持つ粒子である。
【００７１】
Ｌｐ（ａ）は、ＬＤＬ類似のリポ蛋白粒子に独特の構造を持つアポ蛋白質（ａ）が結合した比重１．０３〜１．０８の粒子で、血液凝固に関連した機能を有している。
【００７２】
したがって、各種リポ蛋白質に対する抗体として、各種リポ蛋白質に含まれる主要なアポ蛋白質を用いることができ、抗ホスホコリン抗体と種々のリポ蛋白質に含まれる主要なアポ蛋白質に反応する抗体（以下、抗アポ蛋白質抗体ということもある）とを用いることにより、種々の変性リポ蛋白質の検出および定量を行うことができる。
【００７３】
変性リポ蛋白質に含まれるアポ蛋白質に反応する抗体としては、具体的には抗Ａｐｏ−ＡＩ蛋白質抗体、抗Ａｐｏ−ＡＩＩ蛋白質抗体、抗Ａｐｏ−ＡＩＶ蛋白質抗体、抗Ａｐｏ−Ｂ−１００蛋白質抗体、抗Ａｐｏ−Ｂ−４８蛋白質抗体、抗Ａｐｏ−ＣＩ蛋白質抗体、抗Ａｐｏ−ＣＩＩ蛋白質抗体、抗Ａｐｏ−ＣＩＩＩ蛋白質抗体、抗Ａｐｏ−Ｄ蛋白質抗体、抗Ａｐｏ−Ｅ蛋白質抗体等があげられる。
【００７４】
例えば、変性リポ蛋白質として、変性ＬＤＬを検出または定量する場合、使用する抗アポ蛋白質抗体としては、抗Ａｐｏ−Ｂ蛋白質抗体があげられる。変性ＶＬＤＬを検出または定量する場合、使用する抗アポ蛋白質抗体としては、抗Ａｐｏ−Ｅ蛋白質抗体があげられる。変性ＨＤＬを検出または定量する場合、使用する抗アポ蛋白質抗体としては、抗Ａｐｏ−ＡＩ蛋白質抗体があげられる。変性Ｌｐ（ａ）を検出または定量する場合、使用する抗アポ蛋白質抗体としては、抗アポプロテイン（ａ）抗体があげられる。
【００７５】
以上のように、特定のリポ蛋白質に対する抗体を用いることで、特定の種類の変性リポ蛋白質を定量または検出することができる。また、本方法は特定の変性リポ蛋白質のみを定量または検出できるだけではなく、いくつかの抗アポ蛋白質抗体を組み合わせることにより、２種類以上の変性リポ蛋白質を同時に定量または検出することができる。
【００７６】
具体的には、ＨＤＬに対する抗体、すなわち抗Ａｐｏ−ＡＩ蛋白質抗体とＬＤＬに対する抗体、すなわち抗Ａｐｏ−Ｂ蛋白質抗体とを用いることにより、変性ＨＤＬと変性ＬＤＬとを定量または検出することができる。
【００７７】
また、各種変性リポ蛋白質の定量方法としては、予め生体試料を遠心分離処理等で精製し、精製試料にホスホコリンに対する抗体を反応させることにより、特定の種類の変性リポ蛋白質を定量または検出することもできる。
【００７８】
生体試料から遠心分離でＬＤＬを精製する方法としては、正常ヒト血清に、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）と、ＮａＢｒとを用いた密度勾配遠心分離法を行い、ＬＤＬ画分を取得する方法（特開平７−２３８０９８号公報）、ヘパリン採血で得られたヒト血漿にＥＤＴＡを添加して、遠心分離した後、さらにＫＢｒ溶液を添加して遠心分離してＬＤＬ画分を取得する方法（特開平８−３０４３９５号公報）、ヒト血漿から超遠心分離法でＬＤＬを回収する方法（特開平９−２８８１０６号公報）などがあげられる。
【００７９】
また、生体試料から遠心分離でＬｐ（ａ）を精製する方法としては、ヘパリン採血で得たヒト血漿にＥＤＴＡを加え、ＥＤＴＡ含有ＮａＣｌを重層して遠心分離したのち、ＫＢｒを加えて遠心分離し、得られた溶液をゲル濾過、リジンセファロース４Ｂに通塔しＬｐ（ａ）を分画する方法（特開平８−３０４３９５号公報）などがあげられる。
【００８０】
また、遠心分離でＨＤＬを精製する方法としては、ヒト血清に、四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）、ＮａＣｌをそれぞれ加え、溶媒密度を１．０６３とした溶液を用いて遠心分離して得られた溶液に、ＮａＢｒを加えて溶媒密度を１．２１とした溶液を用いて遠心分離してＨＤＬ分画を取得する方法［山村卓、新生化学実験講座  脂質Ｉ、１９５（１９９３）、東京化学同人］などがあげられる。
【００８１】
さらに本発明の測定方法では、抗リポ蛋白質抗体の代わりに、例えばアポ蛋白質のレセプター、アポ蛋白質結合蛋白質などを用いることができる。具体的には、Ａｐｏ−ＡＩを認識するレシチン・コレステロール・アシルトランスフェラーゼ、Ａｐｏ−Ｂ−１００を認識する肝臓、小腸の細胞のＬＤＬリセプター、Ａｐｏ−ＣＩＩを認識するリポプロテインリパーゼ、Ａｐｏ−Ｅを認識する肝臓のＥレセプター等があげられる。
【００８２】
以下に、具体例として、抗ホスホコリン抗体と抗アポＢ蛋白質抗体を用いるイムノアッセイ法について説明する。
【００８３】
９６ウエルマイクロプレート等の固相に抗ホスホコリン抗体を緩衝液で希釈した溶液を添加し、低温で例えば１〜２４時間インキュベートしたのち溶液を捨て、１％（ｗ／ｖ）程度のＢＳＡを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）等の緩衝液を加えて室温で例えば１〜１２時間インキュベートすることによりブロッキングした後、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）等で洗浄し抗ホスホコリン抗体結合固相を作成する。
【００８４】
次に、血漿等の生体試料を１％ＢＳＡ、５％ポリエーテル、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）等の検体希釈液で希釈しウェルに添加し、室温で１〜１２時間インキュベートした後、０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）等で洗浄する。
【００８５】
さらに、各ウェルに１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈されたペルオキシダーゼ等で標識した抗ヒトアポＢ蛋白質抗体を二次抗体として加えて、室温で１０〜６０分間インキュベートする。次に、０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）等で洗浄した後、標識を測定する。予め既知濃度の標準物質を用いて得られる検量線から、検体中の変性ＬＤＬの定量を行うことができる。パーオキシダーゼの検出は例えば、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）液を用いることができる。
【００８６】
本アッセイにより、変性ＬＤＬを定量することができる。
【００８７】
本発明は、生体試料とホスホコリンに対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法に関する。
【００８８】
循環器系疾患としては、心筋梗塞や狭心症などの冠動脈系疾患、脳梗塞や脳血管系痴呆などの脳動脈系疾患、腎症や糖尿病性腎症などの腎動脈系疾患および末梢動脈閉塞症のような末梢動脈系疾患などの各種循環器系疾患があげられる。
【００８９】
本発明では、変性リポ蛋白質の定量値、即ち生体試料中の変性リポ蛋白質を抗ホスホコリン抗体、または抗ホスホコリン抗体とリポ蛋白質に対する抗体とを用いて変性リポ蛋白質を定量することにより、循環器系疾患を検出することができる。
【００９０】
上記の定量で用いられるリポ蛋白質に対する抗体としては、変性リポ蛋白質を構成するアポ蛋白質に対する抗体があげられ、例えば、変性ＬＤＬを構成するＡｐｏ-Ｂ蛋白質に対する抗体、変性ＶＬＤＬを構成するＡｐｏ−Ｅ蛋白質に対する抗体、変性ＨＤＬを構成するＡｐｏ−ＡＩ蛋白質に対する抗体、変性Ｌｐ（ａ）を構成するアポプロテイン（ａ）に対する抗体があげられる。これらの抗体を組み合わせて用いることにより、各種変性リポ蛋白質を定量することが可能となり、循環器系疾患を検出することができる。
【００９１】
循環器系疾患患者の生体試料中に含まれる変性リポ蛋白質濃度は、健常人の生体試料中に含まれる変性リポ蛋白質に比べて有意に上昇している。したがって、変性リポ蛋白質にカットオフ値を設けて、採取した生体試料中の変性リポ蛋白質を定量し、変性リポ蛋白質がカットオフ値より高い場合に循環器系疾患であると検出することができる。
【００９２】
健常者の変性リポ蛋白質の値は、予め循環器系疾患でないことを臨床的に確認された健常者から生体試料を採取し、該生体試料中の変性リポ蛋白質を本発明の変性リポ蛋白質の定量方法で定量することにより得ることができる。
【００９３】
臨床的に各種循環器系疾患を確認する方法は特に制限がないが、例えば冠動脈造影法、負荷心電図および心エコー等の機器診断方法、胸痛症状等の自覚症状等から確認する方法等があげられる。
【００９４】
カットオフ値とは、ある物質に着目して目的とする疾患群と非疾患群とを判定する場合に定める値をいう。目的とする疾患と非疾患とを判定する場合に、カットオフ値以下であれば陰性、カットオフ値以上であれば陽性として、またはカットオフ値以下であれば陽性、カットオフ値以上であれば陰性として疾患を判定することができる（金井正光編、臨床検査法提要  金原出版株式会社）。
【００９５】
カットオフ値の臨床的有用性を評価する目的で用いられる指標としては、感度と特異度があげられる。
【００９６】
ある母集団をカットオフ値を用いて判定し、疾病患者のうち、判定で陽性とされたものをａ（真陽性）、疾病患者でありながら判定で陰性とされたものをｂ（偽陰性）、疾病患者でないにも関わらず判定で陽性とされたものをｃ（偽陽性）、疾病患者でなく判定で陰性とされたものをｄ（真陰性）と表したときに、ａ／（ａ＋ｂ）で表される値を感度（真陽性率）、ｄ／（ｃ＋ｄ）で表される値を特異度（真陰性率）として表すことができる。
【００９７】
目的とする疾患群と非疾患群との測定値の分布は通常、一部重複する。したがって、カットオフ値を上下させることにより、感度と特異度は変化する。カットオフ値を下げることにより感度は高くなるが、特異度は低下し、カットオフ値を上げることにより感度は低くなるが、特異度は上がる。判定方法としては、感度と特異度の両者の値が高いほうが好ましい。また、感度と特異度の値が０．５を超えない判定方法は、有用とは認められない。
【００９８】
カットオフ値を設定する方法としては、非疾患群の分布の９５％を含む、中央からの両端のいずれかの値をカットオフ値として設定する方法、非疾患群の分布が正規分布を示す場合、平均値＋２倍の標準偏差（ＳＤ）または平均値−２ＳＤをカットオフ値として設定する方法などがあげられる。
【００９９】
生体試料としては、血液、尿、髄液、穿刺液などいかなるものでもよいが、好ましくは血液があげられる。血液としては、全血、血漿、血清、血球溶血液、血球内液などがあげられるが、好ましくは血清または血漿があげられる。
【０１００】
本発明の変性リポ蛋白質の定量用試薬および循環器系疾患の検出方法に用いる試薬としては、抗ホスホコリン抗体を含有する試薬があげられる。さらにリポ蛋白質に対する抗体、例えば、抗アポ蛋白質抗体を含有していてもよく、抗ホスホコリン抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する試薬は、各種変性リポ蛋白質を分別定量または検出が可能である。また、抗ホスホコリン抗体または抗アポ蛋白質抗体が、標識物質を結合した抗体であってもよい。
【０１０１】
抗ホスホコリン抗体としては、ホスホコリンに反応する性質を有すれば上記のいずれの抗体でもよい。具体的には、Ｔ−１５抗体［J. Exp. Med., 132, 737 (1970)］、ハイブリドーマＫＴＭ−２８５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８９）により生産されたモノクローナル抗体ＫＴＭ−２８５、形質転換細胞ＫＴＭ−２００１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５４９）により生産された遺伝子組換え抗体ＫＴＭ−２００１などがあげられる。
【０１０２】
リポ蛋白質に対する抗体としては、各種アポ蛋白質例えばＡｐｏ−ＡＩ、Ａｐｏ−ＡＩＩ、Ａｐｏ−ＡＩＶ、Ａｐｏ−Ｂ−１００、Ａｐｏ−Ｂ−４８、Ａｐｏ−ＣＩ、Ａｐｏ−ＣＩＩ、Ａｐｏ−ＣＩＩＩ、Ａｐｏ−Ｄ、Ａｐｏ−Ｅ等に対する抗体があげられる。
【０１０３】
本発明のキットとしては、機器または試薬の組み合わせにより構成されるが、以下に述べる各構成要素と本質的に同一、またはその一部と本質的に同一な物質が含まれていれば、構成または形態が異なっていても、本発明のキットに包含される。
【０１０４】
試薬としては抗ホスホコリン抗体、または抗ホスホコリン抗体および抗リポ蛋白質抗体を含み、また、必要に応じ、生体試料の希釈液、抗体固定化固相、反応緩衝液、洗浄液、標識された二次抗体またはその抗体断片、標識体の検出用試薬、変性リポ蛋白質などの標準物質なども含まれる。また、抗ホスホコリン抗体または抗リポ蛋白質抗体が、標識物質を結合した抗体であってもよい。
【０１０５】
生体試料の希釈液としては、界面活性剤、緩衝剤などにＢＳＡやカゼインなどの蛋白質を含む水溶液などがあげられる。
【０１０６】
抗体固定化固相としては、各種高分子素材を用途に合うように整形した素材に、抗ホスホコリン抗体あるいは抗リポ蛋白質抗体またはそれらの抗体断片を固相化したものが用いられる。形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックスなどの微粒子、スティック等が、素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックスや金属等があげられる。抗体の固相化の方法としては物理的方法と化学的方法またはこれらの併用方法等、公知の方法により調製することができる。例えば、ポリスチレン製９６ウェルの免疫測定用マイクロタープレートに抗体または抗体断片等を疎水固相化したものがあげられる。
【０１０７】
反応緩衝液は、抗体固定化固相の抗体と生体試料中の抗原とが結合反応をする際の溶媒環境を提供するものであればいかなるものでもよいが、界面活性剤、緩衝剤、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、防腐剤、安定化剤、反応促進剤等があげられる。
【０１０８】
標識された二次抗体またはその抗体断片としては、本発明に用いられる抗体または抗体断片に西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどの標識用酵素をラベルしたもの、緩衝剤、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、防腐剤などを混合したものが用いられる。
【０１０９】
標識体の検出用試薬としては前記の標識用酵素に応じて、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼであれば、テトラメチルベンジジンやオルトフェニレンジアミンなどの吸光測定用基質、ヒドロキシフェニルプロピオン酸やヒドロキシフェニル酢酸などの蛍光基質、ルミノールなどの発光基質が、アルカリホスファターゼであれば、４−ニトロフェニルフォスフェートなどの吸光度測定用基質、４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどの蛍光基質等があげられる。
【０１１０】
標準物質としては、超遠心分離法によりリポ蛋白質を単離・精製し、これを銅イオン等の金属イオンで酸化させる、無水酢酸と反応させてアセチル化する、あるいは、マロンジアルデヒド等と反応させるなどの方法等の方法により得られた変性リポ蛋白質、凍結融解して凝集した変性リポ蛋白質、物理的振動を与えて変性させた変性リポ蛋白質等があげられる。
【０１１１】
生体試料中の変性リポ蛋白質の定量は、生体試料を採取後直ちに行うのが好ましいが、保存した生体試料を用いることもできる。生体試料の保存方法としては、変性リポ蛋白質の量が変化しない条件で有れば特に制限は無いが、例えば０〜１０℃の凍結しない程度の低温条件、暗所条件および無振動条件下が好ましい。
【０１１２】
また、本発明で使用する生体試料としては凍結保存されたものであってもよい。生体試料を凍結するに際しては、以下にあげる凍結保護剤を共存させて凍結を行うのが好ましい。
【０１１３】
凍結保護剤としては、例えばシュークロース、トレハロース、ラクトース、マンニトール、グルコースなどの糖類、デキストラン、デキストラン硫酸、プルラン、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースなどの高分子物質、グリセロールやジメチルスルホキサイドなどの水溶性有機溶媒があげられる。これらの物質は生体試料中に例えば０．１〜５０％、好ましくは１〜３０％、さらに好ましくは５〜２０％で共存させて使用する。
【０１１４】
凍結は、溶媒温度を氷結点以下にして行うが、温度降下は過冷却開始温度から過冷却温度まで急速冷却し、凝固潜熱を一気に回収することが望ましく、プログラムフリーザーを使用することが好ましい。例えば冷却開始温度である１０℃まで冷却した後、この温度から過冷却開始温度である−５〜−１０℃付近まで−１℃／分の速度で冷却し、この温度より過冷却温度である−４０℃まで急激に冷却する。この後必要に応じて−１８℃の自然昇温保持温度まで急速に昇温させ、以後目標到達温度まで−１℃／分で冷却する。また自然昇温温度にすることなく過冷却温度である−４０℃から目標到達温度まで−１℃／分で冷却してもよい。凍結温度降下速度は、−０．１℃／分以上が好ましく、−１．０℃／分以上がより好ましい。到達温度は、−２０℃以下が好ましく、−３０℃以下がより好ましく、液体窒素で達成できる−１９６℃が特に好ましい。
【０１１５】
凍結保存された生体試料中の変性リポ蛋白質を測定する際に、解凍試料の解凍方法は特に制限は無いが、例えば振動を加えながら水浴、湯浴する方法等があげられる。
【０１１６】
したがって、本発明の変性リポ蛋白質の定量用試薬およびキット、循環器系疾患の検出試薬またはキットには、上記の凍結保護剤を含めてもよい。
【０１１７】
以下に、本発明に用いるモノクローナル抗体の製造方法の一例を詳細に説明する。
【０１１８】
１．モノクローナル抗体の製造方法
（１）抗原の調製
抗原としては、ホスホコリンを直接免疫抗原として用いてもよいが、ホスホコリンを他の高分子と結合させたものを免疫抗原として用いるのが好ましい。高分子としては、牛血清アルブミン、蛋白質、多糖体、核酸、合成高分子等があげられるが、例えばリポ蛋白質が好ましい。また、ホスホコリンは、ホスホコリンを含む化合物、例えばホスホコリン誘導体の形態が好ましい。ホスホコリン誘導体としては、ホスホコリン基がエピトープとして認識される誘導体で有れば特に制限はないが、例えば１−パルミトイル−２−（９−オキソノナノイル）−グリセロ−３−ホスホコリンや１−パルミトイル−２−（５−オキソバレロイル）−グリセロ−３−ホスホコリンがあげられる。これらホスホコリン誘導体は、文献[J. Biol. Chem., 266(17), 11095 (1991)]に記載の方法により調製される。
【０１１９】
また高分子としてのリポ蛋白質は、例えばＬＤＬ、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬなどがあげられるが、ＬＤＬが好ましい。ＬＤＬとしては特に制限はなく、例えばヒト、ウマ、ウシ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジなど各種動物の血液、卵黄、ミルクなどに由来するＬＤＬがあげられ、ヒト血液由来のＬＤＬが好ましい。リポ蛋白質上にホスホコリン誘導体を結合させるには、リポ蛋白質溶液にホスホコリン誘導体を滴下混合する等両者をまぜあわせることにより行うことができる。
【０１２０】
（２）動物の免疫と抗体生産細胞の調製
３〜２０週令のマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジやニワトリに（1）で調製した抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体生産細胞を採取する。ポリクローナル抗体を作製する場合にはウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ニワトリなどを用いるのが好ましく、モノクローナル抗体作製にはマウス、ラットを用いるのが好ましい。
【０１２１】
免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント［例えば、フロインドの完全アジュバント（complete freund’s adjuvant）や水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど］とともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
【０１２２】
抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法［Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988］などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたはハムスターを抗体生産細胞の供給源として提供する。
【０１２３】
ポリクローナル抗体の場合には、免疫を完成させた動物より、定期的に採血、または全採血により一回で血液を集める。通常血液は凝固防止を行わずに採血し、一旦血液を凝固させてから遠心分離などの方法を用いて血清画分を回収して用いる。血液中の抗体は必要に応じて精製して使用することができる。精製方法としては例えば硫酸アンモニウムなどを用いた塩析分画法、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー法、プロテインＡやプロテインＧを用いたアフィニティカラムクロマトグラフィー法、および抗原を固相化したゲルを用いるアフィニティカラムクロマトグラフィー法などがあげられ、これらの方法を単独または組合せて用いることができる。
【０１２４】
モノクローナル抗体作製に用いる抗体生産細胞の採取源としては免疫した動物の脾臓、リンパ節、末梢血液などがあげられる。また免疫を行っていない動物の脾臓、リンパ節、末梢血液等より抗体生産担当細胞を取り出し、これら細胞に対し直接免疫を行って抗体生産細胞とする所謂 in vitro 免疫［新井、太田、実験医学、6, 43 (1988)］を行った細胞を用いてもよい。
【０１２５】
抗体生産細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄して融合用脾細胞として提供する。
【０１２６】
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）[Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1-7 (1978)]、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）[European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)]、ＳＰ２／Ｏ  −Ａｇ１４（ＳＰ−２）[Nature, 276, 269-270 (1978)]、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）[J. Immunology, 123, 1548-1550 (1979)]、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）[Nature, 256, 495-497 (1975)]などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌｅｓ／Ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌｅｓ／Ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えた培地（以下、正常培地という。）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍＬ）を加えた培地］で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
【０１２７】
（４）細胞融合
細胞融合はKohlerとMilstein［Nature, 256, 495 (1975)］によって発明され、急速に発展し、様々に改良されてきた方法が用いられる。
【０１２８】
（２）で免疫した抗体生産細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体生産細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１，０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド  ０．７ｍＬの混液０．２〜１ｍＬ／１０８抗体生産細胞を加え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地［正常培地にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌｅｓ／Ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌｅｓ／Ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌｅｓ／Ｌ）を加えた培地］１００ｍｌ中に懸濁する。この懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μＬ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
【０１２９】
培養後、培養上清の一部をとり下記に述べる酵素免疫測定法などにより、ホスホコリンに反応し、ホスホコリンを含まない抗原に反応しないものを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものを抗ホスホコリンモノクローナル抗体生産ハイブリドーマ株として選択する。
【０１３０】
酵素免疫測定法
抗原あるいは抗原を発現した細胞などを９６ウェルプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは精製抗体を第一抗体として反応させる。
【０１３１】
第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。
【０１３２】
第二抗体とは、第一抗体のイムノグロブリンを認識できる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗体である。具体的にはハイブリドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としては、マウスイムノグロブリンを認識できる抗体を用いる。
【０１３３】
反応後、第二抗体を標識した物質に応じた反応を行ない、抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
【０１３４】
（５）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（３）で得られた抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体生産ハイブリドーマ細胞２×１０６〜５×１０７細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析した後、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧあるいは、ＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
【０１３５】
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
【０１３６】
以上の方法で製造される本発明の方法に使用するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの具体例としては、ハイブリドーマＫＴＭ−２８５があげられる。ハイブリドーマＫＴＭ−２８５は、平成１３年５月１６日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８９として寄託されている。以下、ハイブリドーマＫＴＭ−２８５の生産するモノクローナル抗体を、単にＫＴＭ−２８５抗体と称する。
【０１３７】
２．ヒト化抗体の製造方法
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
本発明の方法に用いられたモノクローナル抗体は、前記１のモノクローナル抗体の製造方法に従って取得する以外に、上述の細胞から遺伝子工学的手法を用いて該抗体の重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）をコードするｃＤＮＡを取得し、抗体発現用ベクターのプロモーターの下流にＨ鎖およびＬ鎖をコードするｃＤＮＡを挿入した組換えベクターを造成し、それを宿主細胞に導入することにより得られた該抗体発現細胞を適当な培地中で培養するか、動物に投与して該細胞を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離精製することにより調製することができる。また、ハイブリドーマにより生産されたモノクローナル抗体がＩｇＡ型、ＩｇＭ型などの多量体である場合に、本項の方法を用いて抗体を生産すれば、ＩｇＧ型の抗体を取得することができる。
【０１３８】
このような抗体発現用ベクターは、適当な動物抗体の定常領域（Ｃ領域）である定常領域重鎖（ＣＨ）および定常領域軽鎖（ＣＬ）をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターに適当な動物抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれ挿入することにより構築される。
【０１３９】
動物抗体のＣ領域としては、例えばヒト抗体Ｈ鎖ではＣγ１やＣγ４、マウス抗体Ｈ鎖ではＣγ１やＣγ２ａ、Ｃγ２ｂ、Ｃγ３、ヒト抗体Ｌ鎖ではＣκ、マウス抗体Ｌ鎖ではＣκ等の任意の動物抗体のＣ領域を用いることができる。抗体のＣ領域をコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンよりなる染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターとしては、抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。
【０１４０】
該ベクターとしては例えば、ｐＡＧＥ１０７［Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochem, 101, 1307 (1987)］、ｐＨＳＧ２７４［Gene, 27, 223 (1984)］、ｐＫＣＲ［Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 1527 (1981)］、ｐＳＧ１βｄ２−４［Cytotechnology, 4, 173 (1990)］等があげられる。動物は発現用ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［J. Biochem, 101, 1307 (1987)］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー［Biochen. Biophys. Res. Comun., 149, 960 (1987)］、および免疫グロブリンH鎖のプロモーター［Cell, 41, 479 (1985)］、エンハンサー［Cell, 33, 717 (1983)］等があげられる。
【０１４１】
発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖、Ｌ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一ベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、発現ベクターの構築のし易さ、動物細胞への導入のし易さ、動物細胞内での抗体H鎖およびL鎖の発現量のバランスが取れる点でタンデム型の発現用ベクターの方が好ましい［J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)］。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ  ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８（Hybridoma, 17, 559-567, 1998）などがあげられる。
【０１４２】
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型CDR移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
【０１４３】
（２）抗体の可変領域をコードするＤＮＡの取得
抗体、例えばマウス抗ホスホコリン抗体の可変領域重鎖（ＶＨ）および可変領域軽鎖（ＶＬ）をコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得する。自然抗体であるマウス抗ホスホコリン抗体を生産する細胞、例えばマウス末梢血細胞あるいはマウス脾臓細胞等より、常法［モレキュラー・クローニング  第２版（Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Lab. Press New York(1989)；以下モレキュラー・クローニング 第２版と略す）やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、サプルメント１〜３８（Current Protocols in Molecular Biology Supplement 1-38；以下カレント・プロトコールズと略す）］によりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
【０１４４】
ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング  第２版 (1989年)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（1987年)およびDNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング［SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning；Gibco BRL社製］やザップ−ｃＤＮＡ・シンセシス・キット［ZAP-cDNA Synthesis Kit、ストラタジーン社製］を用いる方法などがあげられる。更に市販のｃＤＮＡライブラリー、例えば宝酒造社製のマウス脾臓細胞ｃＤＮＡライブラリー等を利用することもできる。
【０１４５】
ｃＤＮＡライブラリーを作成するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであればファージベクター、プラスミッドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［Stratagene社製、Strategies, 5, 58 (1992)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)］、λｚａｐ  ＩＩ（Stratagene社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)］、λ  ＴｒｉｐｌＥｘ（クローンテック社製）、λ  ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ（ファルマシア社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２［Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)］、ｐＵＣ１８［Gene, 33, 103 (1985)］等をあげることができる。
【０１４６】
ｃＤＮＡを組み込んだベクターを導入する大腸菌としては、大腸菌に属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、Escherichia coli XL1-Blue MRF’［Stratagene社製、Strategies, 5, 81 (1992)］、Escherichia coli C600［Genetics、39, 440 (1954)］、Escherichia coli Y1088［Science, 222, 778 (1983)］、Escherichia coli Y1090［Science, 222, 778 (1983)］、Escherichiacoli NM522［J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)］、Escherichia coliK802［J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)］、Escherichia coli JM105［Gene, 38, 275 (1985)］等を用いることができる。ｃＤＮＡを上述クローニングベクターに組み込み、該クローニングベクターを宿主細胞に導入することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。該クローニングベクターがプラスミドの場合には、エレクトロポレーション法あるいはカルシウムクロライド法等により宿主細胞に導入する。該クローニングベクターがファージの場合には、インビトロパッケージング法等により宿主細胞に導入する。
【０１４７】
上述で取得されたｃＤＮＡライブラリーから、マウス抗ホスホコリン抗体のＶＨならびにＶＬをコードするＤＮＡを含む形質転換株については、例えば文献［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73 , 2109 (1985)］に掲載されたマウス抗ホスホコリン抗体のＶＨならびにＶＬをコードするＤＮＡの塩基配列を基にプローブを作製して、蛍光物質、放射線、酵素等で該プローブをラベル化し、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション等を行うことにより該プローブにハイブリダイズする形質転換株を選択することができる。
【０１４８】
プローブは具体的には、配列番号１に示されるＶＨの塩基配列および配列番号２に示されるＶＬの塩基配列の全部あるいは一部を有するＤＮＡがあげられる。
【０１４９】
ＶＨをコードするＤＮＡは、例えば配列番号３に示される塩基配列を有する合成ＤＮＡをセンスプライマーおよび配列番号４に示される塩基配列を有する合成ＤＮＡをアンチセンスプライマーとして、マウス脾臓細胞ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Polymerase Chain Reaction；以下ＰＣＲと記す）により増幅することで取得できる。同様にＶＬをコードするＤＮＡは、配列番号５に示される塩基配列を有する合成ＤＮＡをセンスプライマーおよび配列番号６に示される塩基配列を有する合成ＤＮＡをアンチセンスプライマーとして、マウス脾臓細胞ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲにより増幅することで取得できる。またＰＣＲを利用することでＶＨ並びにＶＬの全配列を含むＤＮＡを取得する事もできる。
【０１５０】
上述で取得されたマウス抗ホスホコリン抗体のＶＨならびにＶＬをコードするＤＮＡの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
【０１５１】
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
前記で構築した抗体発現ベクターの抗体ＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にマウス抗ホスホコリン抗体のＶＨならびにＶＬをコードするｃＤＮＡを挿入し、発現ベクターを構築することができる。例えば、発現ベクターの抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にあらかじめマウス抗ホスホコリン抗体のＶＨならびにＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングするための制限酵素の認識配列を設けておき、このクローニングサイトにマウス抗ホスホコリン抗体のＶＨならびにＶＬをコードするｃＤＮＡを下記に述べる合成ＤＮＡを介して挿入することにより、発現ベクターを製造することができる。合成ＤＮＡは、マウス抗ホスホコリン抗体のＶ領域の３’末端側の塩基配列と、発現ベクター上の抗体のＣ領域の５’末端側の塩基配列とからなるものであり両端に適当な制限酵素部位を有するようにＤＮＡ合成機を用いて製造する。
【０１５２】
（４）ヒト化抗体の発現
前記の発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより抗ホスホコリン抗体を安定に生産する形質転換株を得ることができる。宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１号公報, Cytotechnology, 3, 133 (1990)］等があげられる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、抗体を発現させることができる宿主細胞であればいかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ＤＨＦＲ遺伝子と称す）が欠損したＣＨＯ細胞［Proc. Natl. Acad. Sci., 77, 4216 (1980)］、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２，以下ＹＢ２／０細胞と称す）等があげられる。
【０１５３】
ベクターの導入後、抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１号公報に開示されている方法に従い、Ｇ４１８およびＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地により選択する。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養液中に組換え抗体を生産蓄積させることができる。また、形質転換株は特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用して組換え抗体の生産量を上昇させることができる。
【０１５４】
抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（アンチボディズ、第8章）。また、その他に通常の蛋白質に用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて精製することができる。精製した組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）［Nature, 227, 680 (1970)］やウェスタンブロッティング法（アンチボディズ  第12章）等で測定する。
【０１５５】
本発明の方法に使用する抗体を生産する抗体生産細胞の具体例としては、例えば抗体生産細胞ＫＴＭ−２００１があげられる。抗体生産細胞ＫＴＭ−２００１は、平成１３年４月１８日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号305-8566）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−７５４９として寄託されている。抗体生産細胞ＫＴＭ−２００１の生産する抗体を、以下、単にＫＴＭ−２００１抗体と称する。
【０１５６】
以下に本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１５７】
発明を実施するための最良の形態
実施例１    抗ホスホコリン抗体の製造（ＫＴＭ−２００１抗体）
（１）  マウス抗ホスホコリン抗体遺伝子の取得
１）  マウス脾臓細胞ｃＤＮＡライブラリーの作製
通常に飼育したＢａｌｂ／ｃマウスを脱血死させた後、開腹手術を施して脾臓を摘出した。脾臓をＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）中で、裁断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒ．ｐ．ｍ．、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ  ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＲＰＭＩ１６４０培地で３回、さらに生理食塩水で３回洗浄し、ｍＲＮＡの抽出に用いた。ｍＲＮＡ抽出キットであるＱｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ．  ｍＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（商品番号２７−９２５４−０１、アマシャム・ファルマシア社製）を用い、キットに添付の使用説明書に従って、上記脾臓細胞５．０×１０７個よりｍＲＮＡを取得した。
【０１５８】
ｍＲＮＡ５μｇから、ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（商品番号  ２７−９２６０−０１、ファルマシア社製）を用い、キットに添付の使用説明書に従って、両端にＥｃｏ  ＲＩ−Ｎｏｔ  Ｉアダプターを有するｃＤＮＡを合成した。作製したそれぞれのｃＤＮＡ約６μｇを１０μＬの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、抗体のＨ鎖に対応する約１．８ｋｂｐのｃＤＮＡ断片とＬ鎖に対応する約１．０ｋｂｐのｃＤＮＡ断片をそれぞれ約０．１μＬ回収した。次に、各々Ｈ鎖に対応する約１．８ｋｂｐのｃＤＮＡ断片０．１μＬおよびＬ鎖に対応する約１．０ｋｂｐのｃＤＮＡ断片０．１μＬと、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰＩＩベクター［Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰＩＩベクターをＥｃｏ  ＲＩで切断後、ウシ腸アルカリフォスファターゼ(CalfIntestine Alkaline Phosphatase)で処理したもの：ストラタジーン社製］１μＬをＴ４  リガーゼ緩衝液１１．５μＬに溶解し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃にて２４時間インキュベートし、さらに室温にて２時間インキュベートした。各々の反応液のうち４μＬを常法［マニアティス(Maniatis)ら編集、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、2. 95、Cold Spring Harbor Laboratory1989刊行］に従い、ギガパックゴールド（ストラタジーン社製、商品番号ＳＣ２００２０１）を使用してラムダファージにパッケージングし、これらを常法［マニアティス(Maniatis)ら編集、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、2, 95-107、Cold SpringHarbor Laboratory 1989刊行］に従って、ギガパックゴールドに付属の大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［バイオテクニクス(Biotechniques)、5, 376 (1987)］に感染させて、マウス脾臓細胞ｃＤＮＡライブラリーとしてファージクローンを取得した。次にファージを常法に従い、ハイバンドＮ＋フィルター（商品番号ＲＰＮ８７Ｂ、アマシャム・ファルマシア社製)上に固定した［マニアティス(Maniatis)ら編集、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、2, 112 、Cold Spring HarborLaboratory 1989刊行］。
【０１５９】
２）  ＶＨ用プローブＤＮＡの調製
配列番号７および配列番号８で表される塩基配列を有するプライマー12.5pmole、前記１）で作製したマウス脾臓細胞ｃＤＮＡ  １０ｎｇ、および、２００μｍｏｌ／Ｌ  デオキシヌクレオチド三リン酸を含むＥｘ  Ｔａｑ．ポリメラーゼ反応液（宝酒造社製）中に１単位のＥｘ  Ｔａｑ．ポリメラーゼ（商品番号ＲＲ００１Ａ、宝酒造社製）を加えて、９５℃で５分間の前処理をした後に、９５℃で２分間、５５℃で２分間、７２℃で２分間のポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）を３０回繰り返し、約２６０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１６０】
PCR反応は全てＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Perkin Elmer社製）を用いて行った。増幅断片は、下記５に示した方法で配列を決定し、マウス抗ホスホコリン抗体Ｈ鎖ｃＤＮＡの塩基配列（ＧＥＮＢＡＮＫ  アクセッションナンバーＭ１６３３４）と一致することを確認した。
【０１６１】
３）  ＶＬ用プローブＤＮＡの調製
配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列を有するプライマー１２．５ｐｍｏｌｅ、上記１）で作製したマウス脾臓細胞ｃＤＮＡ  １０ｎｇ、および、２００μｍｏｌ／Ｌ  デオキシヌクレオチド三リン酸を含むＥｘ  Ｔａｑ．ポリメラーゼ反応液（宝酒造社製）中に１単位のＥｘ  Ｔａｑ．ポリメラーゼ（商品番号ＲＲ００１Ａ、宝酒造社製）を加えて、９５℃で５分間の前処理をした後に、９５℃で２分間、５５℃で２分間、７２℃で２分間のＰＣＲ反応を３０回繰り返し、約２２０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。増幅断片は、下記５に示した方法で配列を決定し、マウス抗ホスホコリン抗体Ｌ鎖ｃＤＮＡの塩基配列（ＧＥＮＢＡＮＫ  アクセッションナンバーＵ２９４２３）と一致することを確認した。
【０１６２】
４）  マウス抗ホスホコリン抗体ｃＤＮＡのクローニング
前記１）で作製したマウス脾臓細胞ｃＤＮＡライブラリーを転写したメンブレンより、常法［マニアティス(Maniatis)ら編集、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、2.108 、Cold Spring Harbor Laboratory 1989年刊行］に従い、前記２）および３）で作製したプローブをECL Direct Labelling and detection Kit（商品番号ＲＰＮ３０００、アマシャム・ファルマシア社製）に添付のプロトコールに従い標識したプローブに強く結合したファージクローンを選択した。次に、ｃＤＮＡ合成キットであるZAP-cDNA Synthesis Kit（商品番号ＳＣ２００４００、ストラタジーン社製）を用いて、ファージクローンをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）にサブクローニングし、マウス抗ホスホコリン抗体のＨ鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＢＳＰＣＶＨ（第１図）およびマウス抗ホスホコリン抗体のＬ鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＢＳＰＣＶＬ（第２図）を取得した。ｐＢＳＰＣＶＨおよびｐＢＳＰＣＶＬをＥｃｏＲＩで切断したところ、ｐＢＳＰＣＶＨには約１．８ｋｂｐのｃＤＮＡ断片が、ｐＢＳＰＣＶＬには約１．１ｋｂｐのｃＤＮＡ断片がそれぞれ挿入されていた。
【０１６３】
（２）  Ｈ鎖ｃＤＮＡおよびＬ鎖ｃＤＮＡの可変領域の塩基配列
前記４）で得られたＨ鎖ｃＤＮＡおよびＬ鎖ｃＤＮＡの可変領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Perkin Elmer社製、商品番号 ４０２１２３）を用いてダイデオキシ法［マニアティス(Maniatis)ら編集、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、13.42 、Cold Spring Harbor Laboratory 1989年刊行］により決定した。すべて５’末端に開始コドンＡＴＧと推定されるメチオニンが存在し、リーダー配列を含む完全長のｃＤＮＡであった。配列番号１にＶＨの塩基配列、配列番号２にＶＬの塩基配列をそれぞれ示した。
【０１６４】
（３）  組換え抗体発現ベクターの構築
１）  ヒトIgG1型組換え抗体発現ベクターの構築
ＷＯ  ９７／１０３５４に記載のヒトＩｇＧ１型キメラ化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（第３図）に、上記４）で得られたＨ鎖ｃＤＮＡおよびＬ鎖ｃＤＮＡの可変領域を下記の手順に従って、挿入した。
【０１６５】
２）  マウス抗ホスホコリン抗体ＶＨ領域の挿入
マウスＶＨ領域のｃＤＮＡをヒト定常領域と遺伝子工学的に融合させるために、配列番号３および配列番号４で表される２種の合成ＤＮＡの２５ｐｍｏｌｅずつを１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴおよび５０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウムからなる緩衝液１０μＬに溶解し、７０℃の水浴中で１０分間反応させた後、徐冷することにより会合反応を行い、二本鎖合成ＤＮＡカセットを作製した。
【０１６６】
一方、Ｈ鎖全長ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳＰＣＶＨ  １μｇを３０μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴおよび５０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウムからなる緩衝液に溶解し、１０単位のＢｓｔＰＩと１０単位のＳｐｅＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、ｃＤＮＡのＶＨ領域およびＡｐ耐性遺伝子を含む約３．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１６７】
上記で得られたプラスミドｐＢＳＰＣＶＨ由来のＢｓｔＰＩ−ＳｐｅＩ断片（３．４ｋｂｐ）０．１μｇおよび二本鎖合成ＤＮＡカセット（１０ｆｍｏｌｅ）を滅菌水９μＬに溶解し、ＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（商品番号６０２２、宝酒造社製）９μＬを加え、１６℃で１時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第４図に示したプラスミドｐＢＳＶＨ−２を得た。
【０１６８】
次に、上記で得られたｐＢＳＶＨ−２  １μｇを３０μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴからなる緩衝液に溶解し、１０単位のＡｐａＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液に終濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．０１％  ＢＳＡとなるように緩衝液６０μＬを調製し、１０単位のＮｏｔＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、ＶＨ領域のｃＤＮＡを含む約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１６９】
一方、第３図に示されるヒト型キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３  １μｇを３０μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴからなる緩衝液に溶解し、１０単位のＡｐａＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液に終濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．０１％  ＢＳＡとなるように緩衝液６０μＬを調製し、１０単位のＮｏｔＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、ヒトγ１  Ｈ鎖定常領域ｃＤＮＡ、ヒトκ  Ｌ鎖定常領域ｃＤＮＡ、二カ所のモロニーマウス白血病ウィルスプロモーター、二カ所のスプライシングシグナル、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、およびＧ４１８耐性遺伝子を含む約１３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１７０】
上記で得られたプラスミドｐＢＳＶＨ−２（第４図）由来のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片（０．５ｋｂｐ）０．０５μｇおよびｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片（１３．２ｋｂｐ）０．１μｇを滅菌水９μＬに溶解し、ＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造社製）９μＬを加え、１６℃で１時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第６図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸＰＣＶＨを得た。
【０１７１】
３）  マウス抗ホスホコリン抗体ＶＬ領域の挿入
マウスＶＬ領域のｃＤＮＡをヒト定常領域と遺伝子工学的に融合させるために、配列番号５および配列番号６で表される２種の合成ＤＮＡの２５ｐｍｏｌｅずつを１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴおよび５０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウムからなる緩衝液１０μＬに溶解し、７０℃の水浴中で１０分間反応させた後、徐冷することにより会合反応を行い、二本鎖合成ＤＮＡカセットを作製した。
【０１７２】
一方、Ｌ鎖全長ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳＰＣＶＬ  １μｇを３０μＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴおよび１００ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウムからなる緩衝液に溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＳｆｃＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、ｃＤＮＡのＶＬ領域を含む約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１７３】
また、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ  社製）１μｇを３０μＬの２０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴおよび１００ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カリウムからなる緩衝液に溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）を含む約２．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１７４】
上記で得られたプラスミドｐＢＳＰＣＶＬ由来のＥｃｏＲＩ−ＳｆｃＩ断片（０．４ｋｂｐ）０．１μｇ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）由来のＥｃｏ  ＲＩ−Ｂａｍ  ＨＩ断片（２．９ｋｂｐ）０．１μｇおよび二本鎖合成ＤＮＡカセット（１０ｆｍｏｌｅ）を滅菌水９μＬに溶解し、ＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（商品番号６０２２、宝酒造社製）９μＬを加え、１６℃で１時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第５図に示したプラスミドｐＢＳＶＬ−２を得た。また、次に、上記で得られたｐＢＳＶＬ−２  １μｇを３０μＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウムからなる緩衝液に溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＢｓｉＷＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、ＶＬ領域のｃＤＮＡを含む約３．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１７５】
一方、上記（３）の２）で得られた発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸＰＣＶＨ  １μｇを５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウムからなる緩衝液に溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＢｓｉＷＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、マウス抗ホスホコリン抗体Ｈ鎖可変領域ｃＤＮＡ、ヒトγ１  Ｈ鎖定常領域ｃＤＮＡ、ヒトκ  Ｌ鎖定常領域ｃＤＮＡ、二カ所のモロニーマウス白血病ウィルスプロモーター、二カ所のスプライシングシグナル、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、およびＧ４１８耐性遺伝子を含む約１３．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１７６】
上記で得られたｐＢＳＰＣＶＬ由来のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片（０．５ｋｂｐ）０．０５μｇおよびｐＫＡＮＴＥＸＰＣＶＨ由来の断片（１３．７ｋｂｐ）０．１μｇを滅菌水９μＬに溶解し、ＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造社製）９μＬを加え、１６℃で１時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第７図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸＰＣｈＣγ１を得た。
【０１７７】
（４）  組換え抗ホスホコリン抗体発現ベクターの発現
マウスキメラ化抗ホスホコリン抗体発現ベクターのＹＢ２／０細胞への導入は、Ｍｉｙａｊｉらの方法に従い、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー(Cytotechnology)、3, 133 (1990)］にて行った。キメラ化抗ホスホコリン抗体発現ベクターの４μｇを４×１０６個のＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）へ導入後、４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）  ［ＦＣＳ  を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）］に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレートに２００μＬずつ分注した。ＣＯ２インキュベーターで３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８（ギブコ社製）を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養液を回収し、組換え抗体の発現量を以下に示す酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）にて測定した。
【０１７８】
（５）  酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）
１）  抗体活性測定用ＥＬＩＳＡ
実施例２の（２）で調製したＰＣ９ＣＨＯ−ＬＤＬコンジュゲートをＰＢＳにて１μｇ／ｍＬに調製した。この溶液５０μＬまたはこの溶液の希釈液５０μＬを９６ウェルマイクロタイタープレート（ファルコン社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、風乾後、０．１％  ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングを行った。これに形質転換株の培養上清、あるいは精製した組換え抗ホスホコリン抗体を５０〜１００μＬ加え、１〜２時間室温で反応させた。反応後、各ウェルをＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトγ１抗体（商品番号Ａ１１０ＰＯＤ、アメリカンカレックス社製）を５０〜１００μＬ加え、１〜２時間室温で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウムの５５０ｍｇを０．１ｍｏｌ／Ｌ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素１μＬ／ｍＬを加えた溶液］を５０〜１００μＬ加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度を測定した。
【０１７９】
２）  抗体量測定用ＥＬＩＳＡ
抗ヒトκＬ鎖抗体（ザイメッド社製、商品番号０５−３９００）溶液の希釈液５０μＬを９６ウェルマイクロタイタープレート（ファルコン社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、風乾後、０．１％  ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングを行った。これに形質転換株の培養上清、あるいは精製した組換え抗ホスホコリン抗体を５０〜１００μＬ加え、１〜２時間室温で反応させた。反応後、各ウェルをＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトγ１抗体（商品番号Ａ１１０ＰＯＤ、アメリカンカレックス社製）を５０〜１００μＬ加え、１〜２時間室温で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウムの５５０ｍｇを０．１ｍｏｌ／Ｌ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素１μＬ／ｍＬを加えた溶液］を５０〜１００μＬ加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度を測定した。
【０１８０】
（６）遺伝子増幅による高発現株の取得
上記で得られたクローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、メソトレキセート（以下、ＭＴＸと略記する）を５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１．０〜２．０×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェルプレートに１ｍＬ分注した。ＣＯ２インキュベーターで３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ耐性クローンを誘導した。得られた５０ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ耐性クローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、１００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸを含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１．０〜２．０×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェルプレートに１ｍＬ分注した。ＣＯ２インキュベーターで３７℃で１〜２週間培養して、１００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ耐性クローンを誘導した。得られた１００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ耐性クローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、２００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸを含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１．０〜２．０×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェルプレートに１ｍＬ分注した。
【０１８１】
ＣＯ２インキュベーターで３７℃で１〜２週間培養して、２００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ耐性クローンを誘導した。コンフルエントになった時点で、培養液中の各キメラ化抗体発現量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。得られたクローンの中で、最も高い発現量を示した２００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ耐性クローンを限界希釈法により、シングルセルクローニングを行った。コンフルエントになった時点で、培養液中の各キメラ化抗体発現量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。得られたクローンの中で、最も高い発現量を示した２００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ耐性クローンのキメラ化抗体量は約１０μｇ／ｍＬであった。ｐＫＡＮＴＥＸＰＣｈＣγ１導入ＹＢ２／０細胞から得られた２００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ耐性クローンを形質転換株ＫＴＭ−２００１（ヒト型キメラ化抗体ＫＴＭ−２００１生産株）と命名した。
【０１８２】
実施例２    抗ホスホコリン抗体の製造（ＫＴＭ−２８５抗体）
（１）  ヒト血漿中のＬＤＬ画分の調製
ヘパリン採血で得られたヒト血漿に最終濃度で０．２５ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＥＤＴＡを加えて、その０．７５ｍＬずつを超遠心分離用試験管（４ｍＬ容）に採り、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含む０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを２５０μＬ重層して１８５，０００×ｇにて１０℃で２．５時間遠心分離した。
上層１５０μＬを捨て、下層７５０μＬを分取して、ＫＢｒ溶液（５０ｗ／ｖ％）１５０μＬを加えて、密度１．０６３とした。超遠心分離用試験管（４ｍＬ容）の底に密度調整した血漿を移して２４０，０００×ｇにて１０℃で１６時間遠心分離し、上層の榿色バンド（約１００〜１５０μＬ）を注意深く回収し、０．２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含むＰＢＳに対して４℃、６時間（３リットルを２時間間隔で３回交換）透析した。得られたＬＤＬ試料は、アガロース電気泳動法と脂質染色法に単一のバンドを与えることでＬＤＬ純度を確認した後、ローリー法にてＢＳＡを標準物質として蛋白質を定量し、この値をＬＤＬ濃度とした。
【０１８３】
（２）  免疫用抗原および固相用抗原の調製
１−パルミトイル−２−（９−オキソノナノイル）−グリセロ−３−ホスホコリンは、文献[J.Biol.Chem., 266(17), 11095 (1991)]に記載の方法に従って調製した。１−パルミトイル−２−オレオイル１０−グリセロ−３−ホスホコリン（Avanti社製）のクロロホルム溶液にオゾンガスを吹き込み、生成したジアシルグリセロホスホコリンのオゾニド体をジメチルスルフィドにより還元して合成した。得られた酸化物を薄層クロマトグラフ法により展開溶媒（クロロホルム：メタノール：水＝１０：５：１）の条件で展開し、１−パルミトイル−２−（９−オキソノナノイル）−グリセロ−３−ホスホコリン（以下、ＰＣ９ＣＨＯと略す）を単離した。ＰＣ９ＣＨＯの純度は、逆相ＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、メタノール：２０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化コリン水溶液：アセトニトリル＝８７５：１００：２５）にて単一ピークを与えることを確認し、クロロホルム−エタノール（１：１）溶液中にて−２０℃で保存した。
【０１８４】
（１）項で取得した精製ＬＤＬを１ｍｇ／ｍＬになるように０．２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液を用いて調整し、この溶液１ｍＬに対し、５，０００ｎｇの上記ＰＣ９ＣＨＯを溶解したＤＭＳＯ溶液１００μＬを加えて撹拌し、ＰＣ９ＣＨＯ−ＬＤＬコンジュゲートを得た。
【０１８５】
（３）  モノクローナル抗体の調製
６週令の雄Ｂａｌｂ／ｃマウスの背中皮下にフロインドの完全アジュバントと等量混合したホスホコリン−ＬＤＬを０．１ｍｇ／匹投与した。以後該等量混合物０．１ｍｇ／匹を背中皮下に３週間毎に２回投与し、その３週間後、尾静脈よりＰＢＳに溶解したＰＣ９ＣＨＯ−ＬＤＬコンジュゲートを０．１ｍｇ／匹投与し、３日後に抗体生産細胞を下記のとおり脾臓より採取した。
【０１８６】
免疫動物から脾臓を無菌的に摘出し、血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地（日水製薬社製）中にて解し、１００メッシュの網を通過させて単独細胞化し、低張液中に懸濁し赤血球を溶解した後、血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地で３回遠心洗浄し抗体生産細胞を得た。
【０１８７】
一方マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｘ−Ａｇ８−Ｕ１を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養して対数増殖期で細胞を回収し、血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地で３回遠心洗浄した。
【０１８８】
上記で得られた抗体生産細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｘ−Ａｇ８−Ｕ１懸濁液を１０：１の比率で混合し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培養液を取り除いた。残った細胞に５０％ポリエチレングリコール１５００液（ベーリンガー・マンハイム社製）１ｍＬをゆっくり加え、さらに血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地５０ｍＬを徐々に加えてから１２００ｒｐｍで５分間遠心分離して培地を取り除き、残った細胞をＨＡＴ培地（１×１０−４ｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン、４×１０−７ｍｏｌ／Ｌアミノプテリン、２×１０−５ｍｏｌ／Ｌチミジンを含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地）に１×１０６細胞／ｍＬとなるよう懸濁し、懸濁液を９６ウェルマイクロタイタープレートに各ウェル２００μＬずつ分注した。細胞はこのままの状態でＣＯ２インキュベーターにて５％ＣＯ２を含む空気中、３７℃で培養した。１０日後全ウェルにハイブリドーマのコロニーが観察された。
【０１８９】
目的抗体を生産している細胞を含むウェルを選択する目的で、下記のとおり培養上清中の抗体価をＥＬＩＳＡ法で定量した。９６ウェルマイクロタイタープレートに５０μＬのＰＣ９ＣＨＯ−ＬＤＬコンジュゲ−ト溶液（２０μｇ／ｍＬ  ０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液、ｐＨ９．５）またはＬＤＬ溶液（コントロール、２０μｇ／ｍＬ  ０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液、ｐＨ９．５）を分注し、４℃で一夜静置した。プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液２５０μＬを分注して室温で１時間静置し、ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄して反応用プレートとした。反応用プレートに０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで１１倍に希釈した培養上清５０μＬを入れ、室温で３時間静置反応させた。反応終了後プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した後、５０μＬのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識−抗マウスイムノグロブリンズ−ウサギＩｇＧ（ダコ社製）を加え、室温で１時間反応させた。反応後プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した後、５０μＬのＴＭＢ発色試薬溶液（インタージェン社製）を加え、３０分間室温で反応させ、最後に５０μＬの１ｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液を加え、マイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−１２０、コロナ電気）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。コントロールに比較し、１．０以上の吸光度を示したウェルの細胞を選択した。
【０１９０】
クローニングは限界希釈法でおこなった。上記で得られたウェル内の細胞を１×１０７個／ｍＬの胸腺細胞を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地にて０．５個／ｍＬになるよう希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに２００μＬ分注し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で培養を行った。培養開始１０〜１４日後に各ウェルを観察し、生育コロニーが１個／ウェルのウェルを選び出し、その培養上清中抗体価を上記ＥＬＩＳＡ法にて定量し、目的抗体を生産している細胞株を含むウェルを選択した。さらに同様の操作を２回繰り返し、安定して目的抗体を生産するモノクローナル抗体生産細胞株を得た。得られた株が生産する抗体の免疫グロブリンクラスをモノクローナル抗体タイピングキット（ザイメット社製）を用い、培養上清中の抗体について同定し、採取した。取得された抗体はＩｇＭタイプであった。
【０１９１】
８週令以上の雄Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に０．５ｍＬ／匹のプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を注入し、２週間飼育した。
【０１９２】
このマウスに１×１０６／匹のモノクローナル抗体生産細胞を腹腔内接種した。
【０１９３】
７〜１４日後、マウス腹腔に十分腹水が貯留した時点で、腹腔から１８Ｇの注射針を用いて腹水を回収し、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を回収した。この上清をＰＢＳで３倍に希釈した後、この希釈腹水と等量の飽和硫酸アンモニウム／ＰＢＳ溶液を撹拌しながら滴下混合し、滴下し終わった後もしばらくの間撹拌を継続した。この混合液を回収して３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、残査を回収した後、この残査を３倍希釈腹水と等量のＰＢＳで溶解し、上記と同様の操作を繰り返した。回収した残査を腹水量と等量の０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含むＰＢＳで溶解した。０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含むＰＢＳで平衡化したセファクリルＳ−３００カラムに前記溶解液を通塔した後、０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含むＰＢＳで溶出し、溶出液の２８０ｎｍ吸光度をモニターしながら分子量８００ＫＤ付近のピーク部分を回収し、これを精製抗体とした。
【０１９４】
（４）抗体の選択
９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌンク社製）に５０μＬの上記（２）で作製したＰＣ９ＣＨＯ−ＬＤＬ溶液（２０μｇ／ｍＬ  ０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液、ｐＨ９．５）を分注し、４℃で一夜静置した。プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液２５０μＬを分注して室温で１時間静置し、ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄して反応用プレートとした。該反応用プレートに、種々の種類および濃度の物質を加えた０．１％ＢＳＡ含有０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）または０．１％ＢＳＡ含有０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）のみ（コントロール：阻害０％）を５０μＬ加え、これに、上記（３）で得られた抗体を０．１％ＢＳＡ含有０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したものをプレートを撹拌しながら５０μＬ分注し、混合して４℃で一夜静置反応させた。反応終了後プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した後、ＰＯＤ標識−抗マウスイムノグロブリンズ−ウサギＩｇＧを５０μＬ加え、室温で１時間反応させた。反応後プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した後、５０μＬのＴＭＢ発色溶液（インタージェン社製）を加え、３０分間室温で反応させ、最後に５０μＬの反応停止液を加え、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。反応性は、反応に用いたホスホコリンの濃度／吸光度曲線を作成し、コントロールの吸光度を１００％としたときの、各物質、各濃度の反応阻害率から相対決定した。この結果をもとに、上記（３）で得られたモノクローナル抗体生産株からホスホコリンによる阻害が最も低濃度で得られたものを選択し、当該生産株をＫＴＭ−２８５と命名した。
【０１９５】
実施例３    抗体の特異性
９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌンク社製）に５０μＬの実施例２の（２）で作製したＰＣ９ＣＨＯ−ＬＤＬ溶液（２０μｇ／ｍＬ  ０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液、ｐＨ９．５）を分注し、４℃で一夜静置した。プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液２５０μＬを分注して室温で１時間静置し、ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄して反応用プレートとした。該反応用プレートに、種々の種類・濃度の物質を加えた０．１％ＢＳＡ含有０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）または０．１％ＢＳＡ含有０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）のみ（コントロール：阻害０％）を５０μＬ加え、これに、実施例２で得られたＫＴＭ−２８５抗体および実施例１で得られたＫＴＭ−２００１抗体を０．１％ＢＳＡ含有０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したものをプレートを撹拌しながら５０μＬ分注し、混合して４℃で一夜静置させ反応させた。反応終了後プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した後、ＰＯＤ標識−抗マウスイムノグロブリンズ−ウサギＩｇＧを５０μＬ加え、室温で１時間反応させた。反応後プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した後、５０μＬのＴＭＢ発色溶液（インタージェン社製）を加え、３０分間室温で反応させ、最後に５０μＬの反応停止液を加え、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。反応性は、反応に用いたホスホコリンの濃度／吸光度曲線を作成し、コントロールの吸光度を１００％としたときの、各物質、各濃度の反応阻害率から相対決定した。ＫＴＭ−２８５抗体、ＫＴＭ−２００１抗体ともにホスホコリンにのみ低濃度で阻害が観察され、ホスフォセリン、ホスフォスレオニン、ニトロフェニルホスホコリン、ホスファチジルコリン、ホスフォリルエタノールアミン、精製ヒトＬＤＬ、精製ヒトＨＤＬには実質的に阻害されなかった。
【０１９６】
実施例４    ＫＴＭ−２００１抗体を用いた生体内変性リポ蛋白質の測定および疾患との相関
（１）  パーオキシダーゼ標識抗体の作製
精製抗ヒトアポＢ抗体（ヤギ、カッペル社製）溶液（５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０）１ｍＬに、５０μＬの２−イミノチオラン−ＨＣｌ溶液（６０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０）を加え、３０℃で３０分間反応させた後、５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含む０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１ｃｍ×３０ｃｍ、Amersham-Pharmacia社製）にかけ、溶出された抗体画分を回収した。西洋ワサビぺルオキシダーゼ（ＨＲＰと略す。東洋紡社製）溶液（１０ｍｇ／ｍＬ  ０．１ｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）１ｍＬに５０μＬのＥＭＣＳ溶液（同人化学社製、５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＭＳＯ溶液）を加え、３０℃で３０分間反応させた後、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１ｃｍ×３０ｃｍ、Amersham-Pharmacia社製）にかけ、溶出されたＨＲＰ画分を回収した。上記回収した抗体画分およびＨＲＰ画分を混合し、３０℃で３０分間反応させた後、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセファデックスＧ−２００カラム（１ｃｍ×１００ｃｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にかけ、溶出された抗体−ＨＲＰコンジュゲート画分を回収し、これをペルオキシダーゼ標識抗ヒトアポＢ抗体とした。回収した画分は直ちに終濃度１％になるようにＢＳＡを添加し、使用するまで−５０℃で保存した。
【０１９７】
（２）  ＥＬＩＳＡ法
９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社製）の各ウエルに、実施例１で作製したＫＴＭ−２００１抗体をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で１０μｇ／ｍＬに希釈したものを、１００μＬ／ウエルとなるように加えて、４℃で１６時間インキュベートした。溶液を捨て、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）３５０μＬを加えて室温で２時間インキュベートすることによりブロッキングした後、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した。
【０１９８】
次に、新鮮な動脈硬化患者血漿ならびに健常者血漿を検体希釈液（１％ＢＳＡ、５％ポリエーテル、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で１，０００倍に希釈し、さらにこれを同検体希釈液で４／５、３／５、２／５、１／５にそれぞれ希釈して、検体希釈液のみと合わせてそれぞれ１００μＬずつウェルに分注し、室温で２時間インキュベートした後、０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した。
【０１９９】
さらに、各ウェルに１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１，０００倍に希釈されたペルオキシダーゼ標識抗ヒトアポＢ抗体１００μＬを加えて、室温で３０分間インキュベートした。次に、０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した後、発色液（ＴＭＢＺ液、ＴＳＩ社製）１００μＬを加えて３０分間３７℃で発色させた後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸５０μＬを加えて反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０２００】
結果を第８図に示す。第８図より、動脈硬化患者血漿中にはＫＴＭ−２００１抗体と親和性を持つ変性リポ蛋白質が含まれ、また本発明の方法はこの変性リポ蛋白質を定量的に測定できることが明らかとなった。
【０２０１】
実施例５    ＫＴＭ−２８５抗体を用いた生体内変性リポ蛋白質の測定および疾患との相関
９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社製）の各ウエルに、実施例２で作製したＫＴＭ−２８５抗体をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で１０μｇ／ｍＬに希釈したものを、１００μＬ／ウエルとなるように加えて、４℃で１６時間インキュベートした。溶液を捨て、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）３５０μＬを加えて室温で２時間インキュベートすることによりブロッキングした後、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した。
【０２０２】
次に健常人と冠動脈造影法にていずれかの冠動脈に７５％以上の狭窄が観察される患者の血中変性リポ蛋白質を本発明の測定法にて測定した。生体試料としては血清を用いた。被検者に対し、１０時間以上の絶食を課した後、早朝空腹状態で全血１０ｍＬを真空採血管で採血し、室温で３０分間放置して凝固させた後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清の液体成分を回収し血清とした。
【０２０３】
この血清を検体希釈液（１％ＢＳＡ、５％ポリエーテル、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で１，０００倍に希釈し、それぞれ１００μＬずつウェルに分注し、室温で２時間インキュベートした後、０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した。
【０２０４】
さらに、各ウェルに１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１，０００倍に希釈されたペルオキシダーゼ標識抗ヒトアポＢ抗体１００μＬを加えて、室温で３０分間インキュベートした。次に、０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した後、発色液（ＴＭＢＺ液、ＴＳＩ社製）１００μＬを加えて３０分間３７℃で発色させた後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸５０μＬを加えて反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を第９図に示す。
【０２０５】
健常人に比較し、冠動脈に７５％以上の狭窄のある患者の測定値が有意に高く、本発明により得られる変性リポ蛋白質の定量値から循環器系器官である冠動脈の疾患が検出できる。
【０２０６】
実施例６    狭心症患者の本発明生体内物質の測定
健常人と狭心症発作をおこし、負荷心電図にてＳＴ波の低下を認めた狭心症患者に対し全血１０ｍＬをＥＤＴＡ入り真空採血管で採血し、直ちに３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清の液体成分を回収し血漿とした。回収した血清を実施例４と同様にしてＫＴＭ−２００１抗体を用いてＥＬＩＳＡ法にて測定した。結果を第１０図に示す。第１０図に示した通り健常人に比較し、狭心症患者の変性リポ蛋白質の測定値が有意に高く、本発明により得られる変性リポ蛋白質の定量値から循環器系器官の疾患が検出できる。
【０２０７】
実施例７    心筋梗塞患者の本発明生体内物質の測定
胸痛症状を示し、心電図にてＳＴ波の上昇が確認された心エコーにて局所壁運動異常が観察された心筋梗塞患者と健常人より全血１０ｍＬをＥＤＴＡ入り真空採血管で採血し、直ちに３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清の液体成分を回収し血漿とした。各血漿にエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）水溶液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を加え、最終濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌとし、これにＮａＢｒを加え、密度１．０００に合わせた。遠心チューブに分注し、その上にＮａＢｒで、密度１．１５０、１．０６３、１．０１９及び１．００６に合わせた緩衝液を順に重層し、これを４℃で２４時間遠心分離（１２０，０００ｇ）した。上端から順に分画し、各画分の密度を屈折計で測定し、密度１．０１９〜１．０６３の画分をＬＤＬ画分として採取した。このようにして得られたＬＤＬ分画を、採取後直ちに、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで透析した。回収したＬＤＬ画分を実施例４と同様にしてＥＬＩＳＡ法にて測定した。結果を第１１図に示す。第１１図に示したとおり健常人に比較し、心筋梗塞患者の変性ＬＤＬの測定値が有意に高く、本発明により得られる変性ＬＤＬの定量値から循環器系器官の疾患が検出できる。
【０２０８】
実施例８    変性ＬＤＬの測定（１）
健常人と健常人と冠動脈造影法にて主要冠動脈に７５％以上の狭窄が観察される患者を１０時間以上の絶食を課した後、早朝空腹状態で全血１０ｍＬをＥＤＴＡ入り真空採血管で採血し、直ちに３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清の液体成分を回収し血漿とした。各血漿にエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）水溶液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を加え、最終濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌとし、これにＮａＢｒを加え、密度１．０００に合わせた。遠心チューブに分注し、その上にＮａＢｒで、密度１．１５０、１．０６３、１．０１９及び１．００６に合わせた緩衝液を順に重層し、これを４℃で２４時間遠心分離（１２０，０００ｇ）した。上端から順に分画し、各画分の密度を屈折計で測定し、密度１．０１９〜１．０６３の画分をＬＤＬ画分として採取した。このようにして得られたＬＤＬ分画を、採取後直ちに、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで透析した。回収した精製ＬＤＬを１５ｍＬのコニカルチューブに各４分割し、所定の時間ボルテックスで撹拌してリポ蛋白質を変性させた。変性は披検体の６８０ｎｍの吸光度が上昇していくことで確認した。変性操作後、この精製ＬＤＬを実施例４と同様にしてＥＬＩＳＡ法にて測定した。結果を第１２図に示す。
【０２０９】
第１２図に示した通り、ボルテックスで撹拌して変性させることによりその測定値は健常人、患者ともに高くなり、また変性時間を長くしてより大きな変性をさせることにより、さらに測定値は高くなることが示された。
実施例９    変性ＬＤＬの測定（２）
健常人に１０時間以上の絶食を課した後、早朝空腹状態でＥＤＴＡ入り真空採血管で採血し、採血後  ５〜５０Ｕ／ｋｇのドーズでヘパリンを静脈投与し、さらに投与１５分後、全血１０ｍＬをＥＤＴＡ入り真空採血管で採血し、直ちに３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清の液体成分を回収し血漿として一部を−５０℃で凍結保存した。回収した各血漿にエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）水溶液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を加え、最終濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌとし、これにＮａＢｒを加え、密度１．０００に合わせた。遠心チューブに分注し、その上にＮａＢｒで、密度１．１５０、１．０６３、１．０１９及び１．００６に合わせた緩衝液を順に重層し、これを４℃で２４時間遠心分離（１２０，０００ｇ）した。上端から順に分画し、各画分の密度を屈折計で測定し、密度１．０１９〜１．０６３の画分を精製ＬＤＬとして採取した。このようにして得られた精製ＬＤＬを、採取後直ちに、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで透析した。この精製ＬＤＬを実施例４と同様にしてＥＬＩＳＡ法にて測定した。一方凍結保存してあった血漿中のリポプロテインリパーゼ濃度をリポプロテインリパーゼ測定試薬（第一化学社製）にて測定し、血漿中のリポプロテインリパーゼ濃度とその血漿由来の精製ＬＤＬのＥＬＩＳＡ測定値とを比較検討した。結果を第１３図に示す。
【０２１０】
第１３図に示した通り、リポプロテインリパーゼ濃度が高い血漿由来の精製ＬＤＬほど高い測定値が得られ、本発明の定量方法によりリポプロテインリパーゼによって変性された変性リポ蛋白質を測定することができる。
【０２１１】
実施例１０    変性ＬＤＬおよび変性ＨＤＬの測定
（１）  ヒト血漿中のＨＤＬ画分の調製
ヘパリン採血で得られたヒト血漿に最終濃度で０．２５ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＥＤＴＡを加えて、その０．７５ｍＬずつを超遠心分離用試験管（４ｍＬ容）に採り、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含む０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを２５０μＬ重層して１８５，０００×ｇにて１０℃で２．５時間遠心分離した。
【０２１２】
上層１５０μＬを捨て、下層７５０μＬを分取して、ＫＢｒ溶液（５０ｗ／ｖ％）１５０μＬを加えて、密度１．０６３とした。超遠心分離用試験管（４ｍＬ容）の底に密度調整した血漿を移して２４０，０００×ｇにて１０℃で１６時間遠心分離し、上層の榿色バンド（約１００〜１５０μＬ）を捨て、残った画分を注意深く回収した。この回収した分画にＫＢｒ溶液（５０ｗ／ｖ％）を加えて密度１．２１に調整し、超遠心分離用試験管に分注して２４４，０００×ｇで１０時間遠心分離し、上層７５０μＬを回収して、０．２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含むＰＢＳに対して４℃、６時間（３リットルを２時間間隔で３回交換）透析した。得られたＨＤＬ試料は、アガロース電気泳動法と脂質染色法に単一のバンドを与えることでＨＤＬ純度を確認した後、ローリー法にてＢＳＡを標準物質として蛋白質を定量し、この値をＨＤＬ濃度とした。
【０２１３】
（２）変性ＬＤＬおよび変性ＨＤＬの調製
実施例２（１）で精製したＬＤＬおよび上記（１）で精製したＨＤＬを共にＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１ｃｍ×３０ｃｍ、Amersham-Pharmacia社製）に通筒し、含まれているＥＤＴＡを除いた後、ローリー法にてＢＳＡを標準物質として蛋白質を定量し、ＰＢＳにて１ｍｇ／ｍＬとなるよう調整した。この溶液に最終濃度５μｍｏｌ／ＬとなるようＣｕＳＯ４を添加し、３７℃で３時間空気下酸化を行った。３時間後、０．０１％となるようＥＤＴＡを加えて酸化反応を停止させ、直ちに０．０１％ＥＤＴＡを含むＰＢＳにて４℃で透析し、回収してローリー法にてＢＳＡを標準物質として蛋白質定量し、変性ＬＤＬ、変性ＨＤＬ溶液の濃度をそれぞれ決定した。
【０２１４】
（３）変性ＬＤＬおよび変性ＨＤＬの測定
９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌンク社製）に５０μＬの上記で作製した変性ＬＤＬおよび変性ＨＤＬならびに酸化する前のＬＤＬおよびＨＤＬ溶液（１０μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ）を分注し、４℃で一夜静置した。プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液２５０μＬを分注して室温で１時間静置し、ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄して反応用プレートとした。該反応用プレートに実施例２で得られたＫＴＭ−２８５抗体および実施例１で得られたＫＴＭ−２００１抗体を０．１％ＢＳＡ含有０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したものを５０μＬ分注、混合して４℃で一夜静置し反応させた。反応終了後プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した後、ＰＯＤ標識−抗マウスイムノグロブリンズ−ウサギＩｇＧを５０μＬ加え、室温で１時間反応させた。反応後プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した後、５０μＬのＴＭＢ発色溶液（インタージェン社製）を加え、３０分間室温で反応させ、最後に５０μＬの反応停止液を加え、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を第１４図に示す。第１４図に示した通り、ＫＴＭ−２８５抗体およびＫＴＭ−２００１抗体は変性操作前のＬＤＬおよびＨＤＬとは反応しないが、変性ＬＤＬおよび変性ＨＤＬとは反応することが示された。これにより、変性ＬＤＬおよび変性ＨＤＬの測定ができることが確認された。
【０２１５】
実施例１１  変性リポ蛋白質の測定
実施例１０で作製した変性ＬＤＬをウェルマイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液２５０μＬを分注して室温で１時間静置し、ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄して反応用プレートとした。この反応用プレートのウェルに実施例１０で作製した変性ＬＤＬ、変性させる前のＬＤＬ溶液（１７０μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ）および変性ＬＤＬをそれぞれ１／２希釈、１／４希釈、１／８希釈した溶液を１００μＬ／ウェル分注し、さらに各ウェルに実施例２で得られたＫＴＭ−２８５抗体を０．１％ＢＳＡ含有０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で９７０μｇ／ｍＬに希釈したものを５０μＬ分注、混合して２４℃で２０分間静置し反応させた。反応終了後、プレートをマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を第１５図に示す。第１５図に示した通り、ＫＴＭ−２８５抗体は変性させる前のＬＤＬとは反応しないが、これらに変性操作を加えた変性ＬＤＬとは反応することが示され、本発明により変性ＬＤＬの測定ができることが確認された。さらに同様の結果は実施例１０で作製した変性ＨＤＬを用いても再現された。
【産業上の利用可能性】
【０２１６】
本発明により、生体試料中の変性リポ蛋白質をホスホコリンに対する抗体を用いて定量することを特徴とする生体試料中の変性リポ蛋白質の定量方法、生体試料中の変性リポ蛋白質をホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を用いて定量することを特徴とする生体試料中の変性リポ蛋白質の定量方法、生体試料中の変性リポ蛋白質をホスホコリンに対する抗体を用いて定量し、その定量値から循環器系疾患を検出することを特徴とする循環器系疾患の検出方法、生体試料中の変性リポ蛋白質をホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を用いて定量し、その定量値から循環器系疾患を検出することを特徴とする循環器系疾患の検出方法、ホスホコリンに対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用試薬およびホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用試薬が提供される。
【０２１７】
「配列表フリーテキスト」
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】第１図は、組換えプラスミドｐＢＳＰＣＶＨの構造を示す。
【図２】第２図は、組換えプラスミドｐＢＳＰＣＶＬの構造を示す。
【図３】第３図は、発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の構造を示す。
【図４】第４図は、プラスミドｐＢＳＶＨ−２の構造を示す。
【図５】第５図は、プラスミドｐＢＳＶＬ−２の構造を示す。
【図６】第６図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸＰＣＶＨの構造を示す。
【図７】第７図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸＰＣｈＣγ１の構造を示す。
【図８】第８図は、健常者ならびに冠動脈硬化疾患患者の血漿、さらにコントロールとして検体希釈液を５段階希釈し、測定した結果を示す。−●−は、動脈硬化患者の血漿、−▲−は、健常人の血漿および−○−は、検体希釈液のみの結果をそれぞれ示す。
【図９】第９図は、健常者ならびに冠動脈狭窄疾患患者の血漿中の変性リポ蛋白質の測定値を示す。
【図１０】第１０図は、健常者ならびに狭心症患者の血漿中の変性リポ蛋白質の測定値を示す。
【図１１】第１１図は、健常者ならびに心筋梗塞患者の血漿中の変性リポ蛋白質の測定値を示す。
【図１２】第１２図は、健常者ならびに冠動脈硬化疾患患者の血漿由来のリポ蛋白質に種々物理的変性を加えて測定した結果を示す。−○−は、健常人の血漿、−●−は、患者の血漿について測定した結果をそれぞれ示す。
【図１３】第１３図は、健常者のリポ蛋白質にリポプロテインリパーゼを作用させて酵素的変性を加えて測定した結果を示す。
【図１４】第１４図は、精製リポ蛋白質に変性を加えて、ＫＴＭ−２８５抗体およびＫＴＭ−２００１抗体との反応性を測定した結果を示す。
【図１５】第１５図は、精製リポ蛋白質に変性を加えて、ＫＴＭ−２８５抗体との反応性を測定した結果を示す。
【図１】
2008203269.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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