(57)【要約】【課題】  従来、有機高分子の免疫測定用担体では、濁度の変化を計測する凝集免疫測定において高感度の測定ができないという問題があったところ、凝集免疫測定法の測定感度を向上できる免疫測定用担体及びこれを用いた免疫測定法を提供する。【解決手段】  酸化チタン微粒子を含むベース担体と、測定対象物に対するリガンドとが結合してなることを特徴とする免疫測定用粒状担体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化チタン微粒子（Ａ）を含むベース担体と、測定対象物に対するリガンドとが結合してなることを特徴とする免疫測定用粒状担体。
【請求項２】
ベース担体が、（Ａ）と酸化チタン以外の微粒子（Ｂ）との複合粒子である請求項１記載の粒状担体。
【請求項３】
（Ｂ）が、ポリスチレン微粒子にカルボキシル基を導入したカルボキシ変性ポリスチレン微粒子である請求項２記載の粒状担体。
【請求項４】
（Ａ）の含有量（重量％）が、粒状担体の重量に基づいて１〜２０である請求項１〜３のいずれか記載の粒状担体。
【請求項５】
リガンドの量が、ベース担体１ｍｇ当たり２〜２００μｇである請求項１〜４のいずれか記載の粒状担体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の粒状担体を、測定対象物を含む検体と反応させ、反応による生じる粒状担体の凝集を、反応液の濁度変化を計測することで、測定対象物を測定することを特徴とする凝集免疫測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫測定用粒状担体に関する。詳しくは凝集免疫測定用として好適である粒状担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
凝集免疫測定に用いられる担体としては、従来ポリスチレンの微粒子が用いられている。さらに、グリシジル（メタ）アクリレートの重合体微粒子（例えば、特許文献１参照）、スチレンとグリシジル（メタ）アクリレートとの共重合体粒子（例えば、特許文献２、３参照）、スチレンとグリシジル（メタ）アクリレートとの共重合体粒子の表面をさらにポリグリシジル（メタ）アクリレートで覆った微粒子（例えば、特許文献４、５参照）が開示されている。
【特許文献１】特開昭５８−１７１６７０号公報
【特許文献２】特開昭５５−１１０１１８号公報
【特許文献３】特開平４−２１８７７２号公報
【特許文献４】特許第２７５３７６２号公報
【特許文献５】特許第３０８６４２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、これらの有機高分子の担体では、濁度の変化を計測する凝集免疫測定において高感度の測定ができないという問題がある。
本発明の目的は、このような現状に鑑み、凝集免疫測定法の測定感度を向上できる免疫測定用担体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の免疫測定用粒状担体の特徴は、酸化チタンを含む担体と、測定対象物に対するリガンドとを結合してなる点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の免疫測定用粒状担体は、これを用いることにより、高感度に測定対象物を定量することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明において、ベース担体に含まれる酸化チタン微粒子（Ａ）としては、ルチル型、アナターゼ型、ブルッカイト型の結晶型を任意の割合で含むものが使用できるが、測定感度の観点からアナターゼ型結晶を６０〜９０重量％含むものが好ましい。
【０００７】
（Ａ）は、通常ナトリウム、鉄、シリカ、バナジウム及びカルシウムの酸化物等の不純物を含有するが、酸化チタンの純度は、測定感度の観点から９５％以上が好ましく、さらに好ましくは９８％以上である。
（Ａ）の体積平均粒子径（ａ）（ｎｍ）は、測定対象物及び必要とする測定感度等により適宜選択できるが、測定感度および試薬の安定性の観点から１０〜４０が好ましく、さらに好ましくは１５〜３０である。
ここにおいて、体積平均粒子径はレーザー回折散乱式粒径分布測定装置［たとえば、(株)堀場製作所製、Ｐａｒｔｉｃａ  ＬＡ−９５０］等により測定される。
また、（Ａ）の体積平均粒子径（ａ）のバラツキ（分布）は粒子径の変動係数（％）で表され、該変動係数は、測定感度の観点等から３０以下が好ましく、さらに好ましくは０〜１５、特に好ましくは０〜１０である。
ここにおいて、粒子径の変動係数（％）は、上記のレーザー回折散乱式粒径分布測定装置により計測された体積平均粒子径及び同時に計測される粒子径分布の標準偏差から下記の式により求められる値である。
変動係数  ＝ ｛粒子径分布の標準偏差｝／｛体積平均粒子径｝  ×  １００
【０００８】
（Ａ）の具体例としては、たとえばＰＶＳ法（Physical Vapor Synthesis法）によって形成される酸化チタン微粒子が挙げられ、種々の市販品［例えば、シーアイ化成（株）製、ナノテック（登録商標）シリーズ］が使用できる。
【０００９】
（Ａ）を含むベース担体は、（Ａ）自体であっても、また、（Ａ）が酸化チタンと後述の酸化チタン以外の無機微粒子（Ｂ）から形成されてなる複合微粒子や、（Ａ）と有機高分子（ポリスチレン等）の微粒子から形成されてなる複合微粒子を含むベース担体であってもよい。
ここにおいて、複合微粒子とは、複数の異種の微粒子が物理的な接合（吸着、付着、融着等）または化学結合により結合され複合化された微粒子を意味するものとする。また、吸着又は付着とは、微粒子の表面同士が物理的に接合している状態である。この場合の接合力としてはファンデルワールス力及び電荷による吸引力のいずれでもよい。また、融着とは、微粒子の一部と他の微粒子の一部とが溶融して、相互に混和された状態である。  また、化学結合とは、微粒子の表面に存在する官能基と他の微粒子の表面に存在する官能基とが化学結合した状態である。化学結合としては、共有結合、水素結合、イオン結合及び配位結合のいずれでもよい。（Ａ）を含むベース担体としては測定感度の観点から好ましいのは、（Ａ）と有機高分子（ポリスチレン等）の微粒子から形成されてなる複合微粒子を含むベース担体、さらに好ましいのは、（Ａ）と有機高分子（ポリスチレン等）の微粒子が化学結合されてなる複合微粒子を含むベース担体である。
【００１０】
酸化チタン以外の無機微粒子（Ｂ）には、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化ビスマス、酸化コバルト、酸化ホルミウムおよび酸化イットリウム等が含まれる。（Ｂ）は、表面に官能基（カルボキシル基、アミノ基、チオール基、エポキシ基、アルデヒド基等）を有していることが好ましい。該官能基は、（Ｂ）に、シランカップリング剤（γ−アミノプロピルトリエトキシシラン等）を反応させることで導入することができる。
有機高分子の微粒子としては、従来公知のもの（例えば、「検査と技術」vol.28, No.11, 2000年10月,1378-1381頁、「検査と技術」vol.16, No.7, 1988年増刊号,606-613頁、「化学工業」1990年4月号,32-40頁等に記載されているもの｛表面に官能基を有する有機高分子の微粒子（カルボキシル基、アミノ基、チオール基、エポキシ基、アルデヒド基等の官能基を有する変性された、ポリスチレン微粒子、ポリプロピレン微粒子、エポキシ樹脂微粒子、ポリアクリロニトリル微粒子等）、表面に官能基を有しない有機高分子の微粒子（ポリビニルトルエン微粒子、ポリスチレン微粒子等）等｝等から適宜選択できるが、酸化チタン微粒子（Ａ）との化学結合形成および後述するリガンドとの化学結合形成の観点から、表面に官能基を有する有機高分子の微粒子が好ましく、さらに好ましくは表面にカルボキシ基、アミノ基及びチオール基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有する有機高分子の微粒子、つぎにさら特に好ましくは表面にカルボキシ基、アミノ基及びチオール基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有する変性ポリスチレンの微粒子、最も好ましくは表面にカルボキシル基を有する変性ポリスチレンの微粒子である。
【００１１】
酸化チタン以外の無機微粒子（Ｂ）及び有機高分子の微粒子の体積平均粒子径（ｂ）（ｎｍ）は、酸化チタン微粒子（Ａ）の粒子径、測定対象物及び必要とする測定感度等により適宜選択することができるが、測定感度および試薬の安定性の観点から２０〜１，０００が好ましく、さらに好ましくは３０〜５００、特に好ましくは５０〜３００である。
（Ｂ）及び有機高分子の微粒子の体積平均粒子径（ｂ）のバラツキ（分布）は前記の粒子径の変動係数（％）で表され、該変動係数は、測定感度の観点等から１０以下が好ましく、さらに好ましくは０〜５、特に好ましくは０〜３である。
（Ｂ）及び有機高分子の微粒子の体積平均粒子径（ｂ）と（Ａ）の体積平均粒子径（ａ）との比（ｂ／ａ）は、測定感度および試薬の安定性の観点から、１．５〜２４０が好ましく、さらに好ましくは２〜１００、特に好ましくは４〜５０、最も好ましくは５〜１０である。
【００１２】
（Ａ）と（Ｂ）又は有機高分子の微粒子を結合する方法としては、後述する担体とリガンドの化学結合法を適宜組み合わせて行う方法が挙げられる。
例えば、好ましい方法として、（Ａ）にシランカップリング剤（例えば、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン）でアミノ基を導入し、該アミノ基を有する（Ａ）と、可溶性カルボジイミド［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド等。以下同じ。］等を反応させてカルボキシル基を活性化したカルボキシ変性ポリスチレン微粒子とを反応させる方法［（Ａ）のアミノ基と、活性化されたカルボキシル基とを直接化学結合させる方法］が挙げられる。
【００１３】
ベース担体は、ベース担体とリガンドとの化学結合形成の観点から、官能基を有することが好ましく、カルボキシル基、アミノ基及び／又はチオール基を有することがさらに好ましい。
【００１４】
本発明において、ベース担体の体積平均粒子径（ｎｍ）は、測定対象物及び必要とする測定感度等により適宜選択できるが、測定感度および試薬の安定性の観点から２０〜１，０００が好ましく、さらに好ましくは１００〜９００、特に好ましくは３００〜５００である。ベース担体の体積平均粒子径は、用いる（Ａ）の体積平均粒子径及び（Ｂ）又は有機高分子の微粒子の体積平均粒子径を適宜選択することで、前述の範囲に制御することができる。
ベース担体の体積平均粒子径のバラツキ（分布）は前記の粒子径の変動係数（％）で表され、該変動係数は、測定感度の観点等から１０以下が好ましく、さらに好ましくは０〜５、特に好ましくは０〜３である。
ベース担体の形状は、種々取りうるが、測定感度の観点から球状（真球状、楕円球状等）が好ましく、特に測定感度の観点から、さらに好ましいのは表面に凹凸を有する球状である。
ベース担体中の酸化チタンの含有量（重量％）は、測定対象物及び必要とする測定感度等により適宜選択できるが、測定感度および試薬の安定性の観点から、ベース担体の重量に基づいて、１〜２０が好ましく、さらに好ましくは２〜１５、特に好ましくは３〜１０である。
【００１５】
本発明において、測定対象物に対するリガンドとは、測定対象物に特異的に結合する物質を意味する。すなわち、たとえば、測定対象物が抗原の場合、リガンドは抗原に対する抗体である。また、測定対象物が抗体の場合、リガンドは抗体が認識する抗原である。また、測定対象物が糖鎖の場合、リガンドはレクチンである。また、測定対象物がビオチンの場合、リガンドはアビジンである。また、測定対象物が遺伝子の場合、リガンドは相補的な遺伝子である。
上記測定対象物及びリガンドは、抗原及び抗体の関係におけるように、特異的に結合する関係の物質同士であればよく、いずれの該物質も測定対象物又はリガンドになり得る。
【００１６】
リガンドとしては、例えば「免疫化学的同定法（第３版）」（東京化学同人、１９９３）に記載の抗原に対する抗体、MSRS catalog［Manufacturers' Specification & Reference Synopsis catalog Primary Antibodies（ISBN No.0-9643268-3-3, 1995, Aerie Corporation）］に記載の抗体、および特開２００１−２６４３３２号公報に記載の特異的結合物質が挙げられる。
これらのうち、測定感度および特異性の観点から、抗体が好ましく、さらに好ましくは癌マーカー（ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＰＳＡ、ＣＡ１９−９及びＣＡ１２５等）に対する抗体、高分子ホルモン（甲状腺刺激ホルモン、インシュリン及びプロラクチン等）に対する抗体、血清蛋白（β２−ミクログロブリン、フェリチン及びＣＲＰ等）に対する抗体、並びにウイルス及びウイルス関連抗原（ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＢｓ抗原及びＨＢｅ抗原等）に対する抗体である。
なお、これらの抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又はこれらの混合のいずれであってもよい。モノクローナル抗体の場合、測定感度および特異性の観点から測定対象物に対する認識部位の異なる複数の抗体を組み合わせて使用することが好ましい。さらに、抗体は、抗体の分解物であるＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等であってもよい。
【００１７】
ベース担体とリガンドとの化学結合は、ベース担体とリガンドとが直接化学結合しても、結合剤を介して間接的に化学結合してもよい。化学結合させる方法については、種々の方法、例えば、「Immunochemistry、１９６９年、第6巻, 43-52頁」、「Immunochemistry、１９６９年、第6巻, 53-66頁」、「Immobilised Affinity Ligand Techniques, Academic Press 、１９９２年」、「Bioconjugate Techniques, Academic Press、１９９６年」、及び「Analytical Letters、１９８５年、第18(B9)巻, 1143-1155 頁」、「Proceedings of the National Academy of Sciences  USA、１９８７年、第84巻, 5374-5378頁」に記載された方法等が適用できる。
【００１８】
化学結合は、例えば、（１）ベース担体の官能基がカルボキシル基の場合、可溶性カルボジイミド等とベース担体とを反応させて、担体のカルボキシル基を活性化した後、これとリガンドとを反応させる方法（リガンドのアミノ基と活性化されたカルボキシル基とを直接化学結合させる方法）；（２）ベース担体の官能基がカルボキシル基の場合、方法（１）と同様にカルボキシル基を活性化した後、アミノ基とカルボキシル基を有する物質（例えばε−アミノカプロン酸）を反応させ、さらに該アミノ基とカルボキシル基を有する物質のカルボキシル基を方法（１）と同様に活性化した後、これとリガンドとを反応させる方法（結合材を介して、カルボキシル基とアミノ基とを間接的に化学結合させる方法）；（３）ベース担体の官能基がアミノ基の場合、グルタルアルデヒドと担体とを反応させて、担体のアミノ基を活性化した後、これとリガンドとを反応させる方法（リガンドのアミノ基とベース担体のアミノ基とをグルタルアルデヒドによるシッフ塩基で架橋して化学結合させる方法）；（４）ベース担体の官能基がチオール基の場合、チオール基とリガンドのアミノ基とを二架橋性試薬［N-(4-Maleimidobutylyloxy)succinimide等］で架橋反応させる方法等により形成される。
【００１９】
これらの化学結合は、上記の（Ａ）と有機高分子（ポリスチレン等）の微粒子を結合する方法と組み合わせて適宜選択することができる。
例えば、ベース担体が、（Ａ）にシランカップリング剤（例えば、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン）でアミノ基を導入した微粒子と、可溶性カルボジイミド等とを反応させてカルボキシル基を活性化したカルボキシル基変性ポリスチレン微粒子とを反応させる方法で形成された場合、ベース担体とリガンドは（１）又は（３）の方法で結合させることができる。
ベース担体へのリガンドの結合部位は、ベース担体の表面であればよく、ベース担体の調製法及びリガンドとの結合方法に応じて適宜選択できる。測定感度の観点から好ましいのは少なくとも一部のリガンドが酸化チタン微粒子（Ａ）の表面に結合している場合である。
【００２０】
ベース担体に化学結合するリガンドの量は、リガンドの力価、測定対象物又は測定感度等により適宜設定できるが、測定感度およびコストの観点からベース担体１ｍｇ当たり２〜２００μｇが好ましく、さらに好ましくは５〜１５０μｇ、特に好ましくは１０〜１００μｇである。
本発明の免疫測定用粒状担体の粒子径、粒子径のバラツキ、粒子形状、免疫測定用粒状担体中の酸化チタンの含量等は、前述したベース担体と同様であり、好ましい範囲も同様である。
【００２１】
ベース担体及び免疫測定用粒状担体の具体的な作成方法を例示する。
例えば、ベース担体が、（Ａ）とカルボキシル基変性ポリスチレン微粒子の場合、ベース担体は次の手順で作成できる。
（１）酸化チタン微粒子（Ａ）への官能基の導入
（Ａ）に、種々の官能基を有するシランカップリング剤を反応させ、カルボキシル基と反応し得る官能基（アミノ基、チオール基、カルボキシル基等）を導入する。例えば、（Ａ）をγ−アミノプロピルトリエトキシシラン１重量％アセトン溶液に懸濁し、撹拌（６０ｒｐｍ）下、２５℃、１時間反応させた後、遠心分離し沈殿させた粒子を脱イオン水で洗浄することで、アミノ基導入酸化チタンが得られる。
（２）複合微粒子ベース担体の作成
官能基導入酸化チタンと有機高分子の微粒子の結合方法は、各々の有する官能基の種類により、前記ベース担体とリガンドとを化学結合させる方法として示した文献に記載の方法等から選択できる。
例えば、上述のアミノ基導入酸化チタンとカルボキシル基変性ポリスチレン微粒子を結合させる場合、カルボキシル基変性ポリスチレン微粒子を緩衝液（例えば、ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に加え、さらに可溶性カルボジイミド溶液（例えば、１Ｍ水溶液）を加え、室温（２０〜３０℃）で１時間撹拌し、カルボキシル基変性ポリスチレン微粒子と可溶性カルボジイミドとを反応させた後、粒子を脱イオン水で洗浄（１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心した後、上清を除き、脱イオン水で再懸濁）して、粒子表面の官能基を活性化したポリスチレン微粒子を得る。このポリスチレン微粒子と上記で調製したアミノ基導入酸化チタン微粒子とを緩衝液（例えば、０．０２モル、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液）に分散させ、撹拌（６０ｒｐｍ）下、２５℃、５時間反応させることで、２種類の粒子が複合した複合微粒子（ベース担体）を得る。この時、用いる（Ａ）及びラテックスの体積平均粒子径、導入する官能基の個数等を制御することで、得られるベース担体の体積平均粒子径を制御できる。
（３）免疫測定用粒状担体の調製
上記で得たベース担体にリガンドを結合させることで本発明における免疫測定用粒状担体を得ることができる。リガンドとベース担体の結合方法は、前記記載された方法等から選択できる。
例えば、上記（２）で調製したベース担体の場合、（Ａ）表面に存在するラテックスとの結合に利用されていないアミノ基とリガンドのアミノ基等を架橋する方法が利用できる。例えば、上記（２）で調製したベース担体を、グルタルアルデヒドを５％重量含む緩衝液（例えば０．０２モル、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液）に分散させ、撹拌（６０ｒｐｍ）下、２５℃、１時間反応させた後、洗浄（１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した後、上清を除き、脱イオン水で再懸濁）し、リガンド（例えば、抗体）を１ｍＬ当たり１００μｇ含む緩衝液（例えば０．０２モル、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液）に分散させ、撹拌（６０ｒｐｍ）下、２５℃、５時間反応させる。反応後、ブロッキング剤（例えば牛血清アルブミン）を含む緩衝液（例えば０．０２モル、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液）で洗浄後、再度ブロッキング剤（例えば牛血清アルブミン）を含む緩衝液（例えば０．０２モル、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液）に分散させることで、免疫測定用粒状担体を得ることができる。
【００２２】
本発明の免疫測定用粒状担体は、従来公知の凝集免疫測定用の粒状担体と同様に免疫測定に使用できる。
凝集免疫測定方法には、本発明の免疫測定用粒状担体と、測定対象物を含む検体とを反応させる工程、及びこの反応の前後で生じた濁度変化を計測する工程等が含まれる。
免疫測定の方法は、粒子の凝集を検出する方法であれば、特に限定はなく従来公知の方法（例えば、特許２６８２６９７号公報、特開２００２−２５０７２８号公報又は特開２００２−３６５２９６号公報に記載された測定法）等が適用できる。
本発明の免疫測定用粒状担体は、緩衝剤、凝集促進剤等と組み合わせて免疫測定用キットとすることもできる。
本発明の免疫測定用粒状担体は、緩衝液に分散させた試薬（１）として調製され、保存及び測定に使用される。緩衝液としては、リガンドと測定対象物質とが反応することを妨げるものでなければよく、ｐＨ５．０〜１０．０（好ましくは６．５〜８．５）において緩衝作用を有する緩衝液（リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液及びホウ酸緩衝液等）等が使用できる。なお、これらの緩衝液中の緩衝剤の濃度（ｍＭ）としては、試薬の安定性および測定感度の観点から好ましくは１〜５００、さらに好ましくは５〜３００、特に好ましくは１０〜２００である。
【００２３】
試薬（１）中の免疫測定用粒状担体の含有量は、測定対象物、免疫測定用粒状担体の体積平均粒子径、要求される測定感度等により適宜設定できるが、測定感度および試薬の安定性の観点から試薬１００ｍｌ当たり０．０１〜１ｇが好ましく、さらに好ましくは０．０２〜０．５ｇ、特に好ましくは０．０５〜０．３ｇである。
【００２４】
該試薬（１）は、測定感度や測定操作の簡便性の観点等から、凝集促進剤を含有する試薬（２）と組み合わせて使用することが好ましい。
試薬（２）は、試薬（１）に使用されるものと同様な緩衝液と凝集促進剤からなり、凝集促進剤の含有量（重量％）は、試薬（２）の重量に基づいて、０．１〜１０が好ましく、さらに好ましくは０．２〜８、特に好ましくは０．５〜５である。この範囲であると、測定感度がさらに良好となる。
凝集促進剤としては、抗原抗体反応によるラテックスの凝集を促進させる作用を有するものであればよく、従来公知のものが使用でき、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロリドン及びポリ塩化ビニル等が挙げられる。これらのうち、測定感度の観点からポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンが好ましく、さらに好ましくはポリエチレングリコールである。なお、複数の凝集促進剤を組み合わせて使用することもできる。
【００２５】
凝集促進剤の数平均分子量［以下Ｍｎと略記。測定はゲルパーミエイションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）法による。］は、測定感度の観点から好ましくは３，０００〜１，０００，０００、さらに好ましくは５，０００〜１００，０００、特に好ましくは５，０００〜５０，０００である。
【００２６】
試薬（１）及び／又は試薬（２）には、上記リガンドと測定対象物質とが反応することを妨げない範囲で、糖類（グルコース、シュークロース等）、無機塩（塩化ナトリウム等）、界面活性剤（モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、防腐剤（アジ化ナトリウム等）、非特異反応防止剤（正常動物由来のＩｇＧ抗体等）等を含有させてもよい。
糖類、無機塩、界面活性剤、防腐剤、非特異反応防止剤の使用量は、試薬（１）又は及び試薬（２）の合計重量に基づいて、糖類は通常１５％以下、好ましくは０．１〜１０％、無機塩は通常１０％以下、好ましくは０．０１〜５％、界面活性剤は通常１０％以下、好ましくは０．０２〜５％、防腐剤は通常１％以下、好ましくは０．００１〜０．１％、非特異反応防止剤は通常１０％以下、好ましくは０．００１〜５％である。
【００２７】
試薬（１）は、構成試薬として、上記試薬（２）、標準試薬（濃度既知の測定対象物溶液等）、希釈用試薬（高濃度検体の希釈用試薬等）、洗浄試薬（反応容器の洗浄用試薬等）等を含むことが好ましく、さらに取り扱い説明書、測定に必要な治具等（例えば検体容器等）を含んだ測定用キットとして用いられることが好ましい。
【００２８】
本発明の免疫測定用粒状担体を含む測定用キットは例えば、以下のようにして免疫測定に適用できる。
１）検体の準備工程；たとえば、血液からの血漿、血清等の分離処理等を行う。必要により希釈等を実施する。
２）工程［１］：反応容器に、試薬（２）及び検体を分注し混合液（１）とし、一定時間放置する。
３）工程［２］：工程［１］の混合液（１）に試薬（１）を分注し、混合液（２）とする。混合液（２）の濁度ｘを計測した後、一定時間反応（免疫反応）させる。そして、反応後の濁度ｙを計測し、濁度変化（ｙ−ｘ）を求める。
４）測定対象物質の濃度算出；あらかじめ濃度既知の検体を測定し、それぞれの濁度を計測し、この濁度から検量線を作成しておく。そして、この検量線から、濁度変化（ｙ−ｘ）を濃度に換算する。
【００２９】
工程［１］及び工程［２］の反応時間は、測定対象物、反応性及び要求される測定感度の観点等から適宜設定可能であるが、測定感度及び測定時間の短縮の観点等から好ましくは２〜６０分、さらに好ましくは３〜３０分、特に好ましくは４〜２０分である。
【００３０】
工程［２］で、免疫測定用粒状担体が凝集するので、この凝集を従来公知の方法（濁度の変化、凝集粒子の計測等）で計測することにより、測定対象物質を定量できる。
濁度変化の計測は、例えば、分光光度計｛測定波長：３４０〜１，０００ｎｍ（測定感度の観点から好ましくは５００〜９００ｎｍ）｝で、工程［２］の始めと終わりの時間ポイント（例えば、１ポイント目は試薬（２）の分注・混合の３０秒後等、２ポイント目は工程（２）の終了直前等）で濁度をそれぞれ計測し、その濁度の差を濁度変化として求めることができる。
【００３１】
検体、試薬（１）及び試薬（２）の分注量、反応温度等の条件は自由に設定できる。例えば、検体量としては、通常１〜１００μＬ、測定感度および簡便性の観点から好ましくは２〜２０μＬ、さらに好ましくは５〜１０μＬである。試薬（１）及び試薬（２）の分注量は、通常２０〜５００μＬ、測定感度および簡便性の観点から好ましくは５０〜２００μＬ、さらに好ましくは５０〜１００μＬである。反応温度は、通常２５〜４５℃、測定感度および簡便性の観点から好ましくは３５〜３９℃、さらに好ましくは３６〜３８℃である。
なお、市販の臨床検査用の生化学自動分析機｛たとえば、日立ハイテクノロジーズ（株）製、自動分析機７１８０等｝を用いると、検体、試薬（１）及び試薬（２）の分注量、工程［１］及び工程［２］の反応時間、濁度の計測の条件等を設定することができ、自動分析が可能である。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下において「％」は重量％を表す。
実施例１
酸化チタン微粒子水分散液［商品名「ナノテックＴｉＯ2スラリー」、シーアイ化成（株）製、体積平均粒子径３０ｎｍ、粒子含有量１０％、以下同じ。］（Ａ−１）５０μＬ、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液（γ−アミノプロピルトリエトキシシランを１％含む純水）９５０μＬを遠心管に入れ、室温（２０〜３０℃）で１時間、チューブローラー［型番ＶＭＲ−５、アズワン（株）製、以下同じ。］を用い１００ｒｐｍで撹拌させた。次いで、この遠心管を１５，０００ｒｐｍ（約２０，０００Ｇ）で、１５分間遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去した。沈殿に酢酸緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ５．０）１，５００μＬを加え、ボルテックスミキサー［旭テクノグラス（株）製、品番ＴＭ−２０００、以下同じ。］を用いて再分散させ、再度１５，０００ｒｐｍ（約２０，０００Ｇ）、１５分間遠心し、上清をアスピレーターで吸引除去した。さらに、この工程（酢酸緩衝液を加え、遠心し、上清を除去する工程）を３回繰り返した。得られた沈殿にリン酸緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）５００μＬを加え、超音波破砕機［型番ＵＤ−２０１、トミー（株）製、以下同じ。］で２分間分散処理して再分散させた。さらに、二架橋性試薬Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ［同仁化学（株）製、以下同じ。］０．８１ｍｇを純水に溶解した水溶液４０μＬを加え、室温（２０〜３０℃）で２時間、チューブローラーを用い１００ｒｐｍで撹拌させた。次いで、この遠心管を１５，０００ｒｐｍ（約２０，０００Ｇ）で、１５分間遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去した。沈殿にリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）１，５００μＬを加え、ボルテックスミキサーを用いて再分散し、再度１５，０００ｒｐｍ（約２０，０００Ｇ）で、１５分間遠心し、上清をアスピレーターで吸引除去した（この工程を３回繰り返した）。この沈殿にリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）５００μＬを加え、超音波破砕機で２分間分散処理し再分散させ、二架橋性試薬導入酸化チタン微粒子分散液（Ａ−２）を得た。
抗ＡＦＰポリクローナル抗体［商品名「Ａ０００８」、ダコ・サイトメーション（株）製、以下同じ。］２ｍｇを含むリン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．０）１ｍＬに２−イミノチオラン塩酸塩１ｍｇを加え、室温（２０〜３０℃）で１時間、チューブローラーを用い１００ｒｐｍで撹拌させた。次いで、この溶液をセファデックスＧ−２５カラム［ファルマシア（株）製、カラム溶出液はリン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．０）使用］により脱塩して抗体画分を分取することで、チオール基導入抗体を得た。
（Ａ−２）５００μＬにチオール基導入抗体２ｍｇを加え、室温（２０〜３０℃）で８時間、チューブローラーを用い１００ｒｐｍで撹拌、反応させた。反応後、８，０００ｒｐｍ（約６，５００Ｇ）で、１０分間遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去し、免疫測定用粒状担体｛抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合酸化チタン微粒子（沈殿）｝を得た。
引き続き、この沈殿に１％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液［同人化学（株）製、０．１Ｍ、ｐＨ７．４、以下同じ。］２，０００μＬを加え、超音波破砕機で２分間分散処理し再分散させることにより、抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合酸化チタン微粒子分散液を調製した。
この抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合酸化チタン微粒子分散液を、１％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）で、微粒子の含有量が０．０５％となるように希釈して、免疫測定用粒状担体分散液（１）を得た。
【００３３】
実施例２
実施例１において、酸化チタン微粒子水分散液の代わりに、酸化チタン粉体［テイカ（株）製、体積平均粒子径１５ｎｍ）含量が１０％となるように純水に分散した酸化チタン粒子分散液を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、免疫測定用粒状担体分散液（２）を得た。
【００３４】
実施例３
酸化チタン微粒子分散液（Ａ−１）５０μＬ、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液（γ−アミノプロピルトリエトキシシランを１重量％含む純水）９５０μＬを遠心管に加え、室温（２０〜３０℃）で１時間、チューブローラーを用い１００ｒｐｍで撹拌させた。次いで、この遠心管を１５，０００ｒｐｍ（約２０，０００Ｇ）で、１５分間遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去した。沈殿に酢酸緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ５．０）１，５００μＬを加え、ボルテックスミキサーを用いて再分散し、再度１５，０００ｒｐｍ（約２０，０００Ｇ）で、１５分間遠心し、上清をアスピレーターで吸引除去した。さらに、この工程（酢酸緩衝液を加え、遠心し、上清を除去する工程）を３回繰り返した。得られた沈殿にリン酸緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ６．０）５００μＬを加え、超音波破砕機で２分間分散処理して再分散させてアミノ基導入酸化チタン微粒子分散液（Ａ−３）を得た。
カルボキシ変性ポリスチレン微粒子分散液［商品名「イムテックス」、ＪＳＲ（株）製、カルボキシ変性ラテックス、含有微粒子の体積平均粒子径２００ｎｍ、微粒子含有量１０％］（Ｂ−１）１００μＬ、１％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液９００μＬ、可溶性カルボジイミド溶液［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライドの１Ｍ水溶液、以下同じ。］５００μＬを、遠心管に加え、室温（２０〜３０℃）で１時間、チューブローラーを用い１００ｒｐｍで撹拌させた。次いで、この遠心管を１５，０００ｒｐｍ（約２０，０００Ｇ）、１５分間遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去し、沈殿に純水１，５００μＬを加え、ボルテックスミキサーを用いて再分散させ、再度１５，０００ｒｐｍ（約２０，０００Ｇ）、１５分間遠心し、上清をアスピレーターで吸引除去し、この沈殿に１％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液５００μＬを加え、超音波破砕機で２分間分散処理して再分散させ、カルボキシル基活性化ポリスチレン微粒子分散液（Ｂ−２）を得た。
（Ａ−３）８８μＬとカルボキシル基活性化ポリスチレン微粒子分散液（Ｂ−２）５００μＬを遠心管に入れ、室温（２０〜３０℃）で２時間、チューブローラーを用い１００ｒｐｍで撹拌させた。次いで、この遠心管を１５，０００ｒｐｍ（約２０，０００Ｇ）で、１５分間遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去した。沈殿にリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．１）１，５００μＬを加え、ボルテックスミキサーを用いて再分散させ、酸化チタン−ポリスチレン複合微粒子分散液（ＡＢ−１）を得た。
（ＡＢ−１）を密度勾配遠心法により遠心分離し、比重１．２の画分（複合粒子中の酸化チタン含量５％）を得た。この画分を遠心管に入れ、１５，０００ｒｐｍ（約２０，０００Ｇ）で、１５分間遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去した。沈殿にリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．１）１，５００μＬを加え、さらに、二架橋性試薬Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ０．８１ｍｇを純水に溶解した水溶液４０μＬを加え、室温（２０〜３０℃）で２時間、チューブローラーを用い１００ｒｐｍで撹拌させた。次いで、この遠心管を１５，０００ｒｐｍ（約２０，０００Ｇ）で、１５分間遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去した。得られた沈殿に実施例１で調製したチオール基導入抗体２ｍｇを加え、室温（２０〜３０℃）で８時間、チューブローラーを用い１００ｒｐｍで撹拌、反応させた。反応後、８，０００ｒｐｍ（約６，５００Ｇ）で、１０分間遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去し、免疫測定用粒状担体｛抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合酸化チタン−ポリスチレン複合微粒子（沈殿）｝を得た。
引き続き、この沈殿に１％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液２，０００μＬを加え、超音波破砕機で２分間分散処理して再分散させることにより、抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合酸化チタン−ポリスチレン複合微粒子分散液を調製した。
この抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合酸化チタン−ポリスチレン複合微粒子分散液を、１％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液で、微粒子の含有量が０．０５％となるように希釈して、免疫測定用粒状担体分散液（３）を得た。
【００３５】
＜実施例４＞
実施例３において、比重１．２の画分（複合粒子中の酸化チタン含量５％）の代わりに、比重１．０８の画分（複合粒子中の酸化チタン含量１％）を用いたこと以外は、実施例３と同様にして、免疫測定用粒状担体分散液（４）を得た。
【００３６】
＜実施例５＞
実施例３において、比重１．２の画分（複合粒子中の酸化チタン含量５％）の代わりに、比重１．６の画分（複合粒子中の酸化チタン含量２０％）を用いたこと以外は、実施例３と同様にして、免疫測定用粒状担体分散液（５）を得た。
【００３７】
＜実施例６＞
実施例３において、カルボキシ変性ポリスチレン微粒子分散液（Ｂ−１）の代わりに、カルボキシ変性ポリスチレン微粒子分散液［商品名「イムテックス」、ＪＳＲ（株）製、カルボキシ変性ラテックス、含有微粒子の体積平均粒子径８００ｎｍ、微粒子含有量１０％］（Ｂ−３）を用いたこと以外は、実施例３と同様にして、免疫測定用粒状担体分散液（６）を得た。
【００３８】
比較例１
カルボキシ変性ポリスチレン微粒子分散液（Ｂ−１）１００μＬ、１％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液９００μＬ、可溶性カルボジイミド溶液５００μＬを、遠心管に入れ、室温（２０〜３０℃）で１時間、チューブローラーを用い１００ｒｐｍで撹拌し、カルボキシ変性ラテックスと可溶性カルボジイミドとを反応させた。次いで、この遠心管を１５，０００ｒｐｍ（約２０，０００Ｇ）で、１５分間遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去し、沈殿に純水１５００μＬを加え、ボルテックスミキサーを用いて再分散させ、再度１５，０００ｒｐｍ（約２，００００Ｇ）で、１５分間遠心し、上清をアスピレーターで吸引除去し、この沈殿に１％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液９００μＬを加え、超音波破砕機で２分間処理し再分散させた。この分散液に、抗ＡＦＰポリクローナル抗体を蛋白量として０．３ｍｇ加え、室温（２０〜３０℃）で２時間、撹拌しながら反応させた。反応後、８，０００ｒｐｍ（約６，５００Ｇ）で、１０分間遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去し、抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ポリスチレン微粒子（沈殿）を得た。
引き続き、この沈殿に１％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液２，０００μＬを加え、超音波破砕機で２分間分散処理して再分散させることにより、抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ポリスチレン微粒子分散液を調製した。
この抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ポリスチレン微粒子分散液を、１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液で、微粒子の含有量が０．０５％となるように希釈して、免疫測定用粒状担体分散液（Ｈ１）を得た。
【００３９】
比較例２
比較例１において、カルボキシ変性ポリスチレン微粒子分散液（Ｂ−１）の代わりに、カルボキシ変性ポリスチレン微粒子分散液［商品名「イムテックス」、ＪＳＲ（株）製、カルボキシ変性ラテックス、体積平均粒子径３０ｎｍ、微粒子含有量１０重量％］（Ｂ−４）を用いたこと以外は、比較例１と同様にして、免疫測定用粒状担体分散液（Ｈ２）を得た。
【００４０】
比較例３
実施例３において、酸化チタン微粒子分散液（Ａ−１）の代わりに、酸化ケイ素微粒子分散液［シーアイ化成（株）製、体積平均粒子径２５ｎｍ、微粒子含有量１０％］を用いたこと以外は、実施例３と同様にして、免疫測定用粒状担体分散液（Ｈ３）を得た。
【００４１】
免疫測定用粒状担体の性能評価
上記で得た免疫測定用粒状担体分散液（１）〜（３）、（Ｈ１）〜（Ｈ３）について、標準ＡＦＰ溶液［商品名「スフィアライト  ＡＦＰコントロールセット」、三洋化成工業（株）製、ＡＦＰ濃度０ｎｇ／ｍＬ及び４００ｎｇ／ｍＬ、以下同じ。］を用いて、以下の方法で感度を評価した。結果を表１に示す。
なお、該分散液の体積平均粒子径の測定、および凝集促進剤含有試薬の作成は下記のようにして行なった。
＜体積平均粒子径の測定＞
測定装置「ゼータサイザーナノＺＳ」［シスメックス（株）製］の測定用キャピラリーセルに、検体（免疫測定用粒状担体分散液）７５０μＬを分注し、測定温度３７℃で動的散乱法により粒子径を測定した。この測定を３回繰り返し、これらの算術平均値を得た。結果を表１に示す。
＜凝集促進剤含有試薬の作成＞
ポリエチレングリコール［商品名「ＰＥＧ−６０００Ｓ」、三洋化成工業（株）製］１ｇを１％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）１００ｍＬに溶解させ、凝集促進剤含有試薬を得た。
【００４２】
＜感度評価＞
以下の工程を含む全ての操作は、３７℃に管理された恒温室で実施した。
（１）分光光度計測定セル［（株）島津製作所製、ミクロブラックセルＬ、光路長１０ｍｍ］に、凝集促進剤含有試薬１００μＬ、検体１０μＬを入れて均一撹拌した後、５分間保持した。
なお、検体として、標準ＡＦＰ溶液（ＡＦＰ濃度０ｎｇ／ｍＬ）を使用した。
（２）引き続き、検体を１００μＬ加えて均一撹拌し、直ちに濁度（α１）を計測した後、５分間反応させ、その後直ちに濁度（α２）を計測した。なお、濁度の計測は、濁度計［ＵＶｍｉｎ−１２４０、(株)島津製作所製］を用いて、測定波長５７０ｎｍで測定した。
（３）下記の計算式に従って濁度変化量（β１）を求めた。
濁度変化量（β１）＝［（α２）−（α１）］×１０，０００
（４）検体として、標準ＡＦＰ溶液（ＡＦＰ濃度４００ｎｇ／ｍＬ）を使用したこと以外は、上記（１）〜（３）と同様にして、濁度変化量（β２）を求めた。
（５）下記の計算式に従って感度を求めた。
感度＝（β２）／（β１）
【００４３】
【表１】
2008241357.tif 000002
【００４４】
表１の結果から、本発明の免疫測定用粒状担体は、比較のものに比べて、免疫反応に伴う著しい濁度変化が認められ、感度が大きいことが分かる。濁度変化量は原理的に粒子径の大きな粒子を担体とする方が大きく、感度が大きくなるが、ほぼ同一の粒子径である免疫測定用粒状担体での比較（実施例１と比較例２との比較、実施例３と比較例３との比較）から、明らかに本発明の粒状担体の方が高感度であることがわかる。また、実施例２と、比較例１及び３との比較から、極めて小さい粒子径の粒状担体であっても、本発明の粒状担体は１０〜２０倍の粒径を有する粒状担体と同等またはそれ以上の感度を有することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の免疫測定用粒状担体は、非常に高感度であることから、従来酵素免疫測定法等の高感度な免疫測定法により測定されていた癌マーカー等の測定を凝集免疫測定法で可能とし、高感度な凝集免疫測定法等として幅広く好適に用いられ極めて有用である。