(57)【要約】【課題】新規のＤ−アミノ酸オキシダーゼを提供する。また、当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ及びそれらを用いたＬ−アミノ酸、２−オキソ酸、又は環状イミンの製造方法を提供する。【解決手段】キャンディダ  インターメディアから単離された新規Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子、当該遺伝子を含む組換えプラスミド、および当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を導入された形質転換体。およびキャンディダ  インターメディアあるいは上記形質転換体を培養し当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを採取する、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの製造方法。さらに、ラセミ体アミノ酸に当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを作用させることによる、Ｌ−アミノ酸、２−オキソ酸、又は環状イミンの製造方法。及びラセミ体アミノ酸にアミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素と同時に当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを存在させることによる、Ｌ−アミノ酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチド：
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と６９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチド：
（ｄ）配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｅ）配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｆ）配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列と６９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
キャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）に由来する請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
キャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株に由来する請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
以下の（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のＤＮＡ：
（ｇ）配列表配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｈ）配列表配列番号３に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ：
（ｉ）配列表配列番号３に示される塩基配列と６７％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
以下の（ｊ）、（ｋ）又は（ｌ）のＤＮＡ：
（ｊ）配列表配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｋ）配列表配列番号４に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ：
（ｌ）配列表配列番号４に示される塩基配列と６７％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項５から７のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに挿入して得られる組換えプラスミド。
【請求項９】
前記ベクターがｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＳＣ１０１、ｐＴ７Ｂｌｕｅ、又はｐＵＣＮＴ、若しくはそれらの誘導体である請求項８記載の組換えプラスミド。
【請求項１０】
前記組換えプラスミドが図１の制限酵素地図にて特定されるｐＣＤＡ００１である請求項８又は９記載の組換えプラスミド。
【請求項１１】
前記組換えプラスミドが図２の制限酵素地図にて特定されるｐＣＤＡ００６である請求項８又は９記載の組換えプラスミド。
【請求項１２】
請求項８から１１のいずれか１項に記載の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１３】
前記宿主微生物がエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）である請求項１２に記載の形質転換体。
【請求項１４】
前記形質転換体がエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００１）である請求項１３に記載の形質転換体。
【請求項１５】
前記形質転換体がエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００６）である請求項１３に記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求項１又は２に記載のポリペプチドを生産する能力を有し、かつ、キャンディダ（Candida）属に属する微生物。
【請求項１７】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取することを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造方法。
【請求項１８】
前記微生物が、請求項１２から１５のいずれか１項に記載の形質転換体、又は、請求項１６記載の微生物である、請求項１７に記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造方法。
【請求項１９】
請求項１から４のいずれか１項に記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼ、請求項１２の形質転換体、または請求項１６の微生物を、
一般式（１）
【化１】
2008048628.tif 000014
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基を表す。）で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、
一般式（２）
【化２】
2008048628.tif 000015
（式中、Ｒは前記と同じ）で表されるＬ−アミノ酸、又は、
一般式（３）
【化３】
2008048628.tif 000016
（式中、Ｒは前記と同じ）で表される２−オキソ酸を製造する方法。
【請求項２０】
請求項１から４のいずれか１項に記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼ、請求項１２の形質転換体、または請求項１６の微生物を、
一般式（４）
【化４】
2008048628.tif 000017
（式中、Ｒ’は置換基を有してもよい炭素数２〜７のアルキル鎖）で表される環状アミノ酸に作用させ、
一般式（５）
【化５】
2008048628.tif 000018
（式中Ｒ’は上記と同じ）で表される環状Ｌ−アミノ酸、又は、
一般式（６）
【化６】
2008048628.tif 000019
（式中Ｒ’は上記と同じ）で表される環状イミンを製造する方法。
【請求項２１】
請求項１から４のいずれか１項に記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼ、請求項１２の形質転換体、または請求項１６の微生物を、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素の存在下で、
一般式（１）
【化７】
2008048628.tif 000020
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基を表す。）で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、
一般式（２）
【化８】
2008048628.tif 000021
（式中、Ｒは前記と同じ）で表されるＬ−アミノ酸を製造する方法。
【請求項２２】
請求項１から４のいずれか１項に記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼ、請求項１２の形質転換体、または請求項１６の微生物を、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素の存在下で、
一般式（４）
【化９】
2008048628.tif 000022
（式中、Ｒ’は置換基を有してもよい炭素数２〜７のアルキル鎖）で表される環状アミノ酸に作用させることを特徴とする、
一般式（５）
【化１０】
2008048628.tif 000023
（式中Ｒ’は上記と同じ）で表される環状Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２３】
前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼが請求項１２から１５のいずれか１項に記載の形質転換体、又は請求項１６記載の微生物が生産するＤ−アミノ酸オキシダーゼである、請求項１９又は２１に記載のＬ−アミノ酸、又は２−オキソ酸の製造方法。
【請求項２４】
前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼが請求項１２から１５のいずれか１項に記載の形質転換体、又は請求項１６記載の微生物が生産するＤ−アミノ酸オキシダーゼである、請求項２０、又は２２に記載の環状Ｌ−アミノ酸又は環状イミンの製造方法。
【請求項２５】
前記アミノ酸脱水素酵素が、フェニルアラニン脱水素酵素、又はロイシン脱水素酵素である、請求項２１又は２３に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２６】
前記補酵素再生能を有する酵素が、ギ酸脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素である、請求項２１、２３、又は２５に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２７】
前記補酵素再生能を有する酵素が、ギ酸脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素である、請求項２２又は２４に記載の環状Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２８】
カタラーゼ存在下にておこなう、請求項１９から２７いずれか１項に記載のＬ−アミノ酸、２−オキソ酸、又は環状イミンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の生産する新規な２種類のＤ−アミノ酸オキシダーゼ、これらをコードするＤＮＡ、及びこれらのＤ−アミノ酸オキシダーゼを生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体を用いたＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造方法、また、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを用いた効率的なＬ−アミノ酸、２−オキソ酸、又は環状イミンの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（酵素番号［ＥＣ１．４．３．３］）は、酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、２−オキソ酸、およびアンモニアを生成する酵素である。このＤ−アミノ酸オキシダーゼは、例えばラセミ体アミノ酸を立体選択的に酸化して、Ｌ−アミノ酸および２−オキソ酸を生成するなど、産業上有意な活性を持つことが知られている。また、Ｌ−アミノ酸は医薬品等の合成中間体や甘味料として有用な化合物である。
【０００３】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを産生する微生物としては、例えばトリゴノプシス  バリアビリス（Trigonopsis variabilis）（特許文献１）、フザリウム  オキシスポラム（Fusarium oxysporum）（特許文献２）、キャンディダ  トロピカリス（Candida tropicalis）（非特許文献１）等が知られており、各々の酵素は精製、単離され、その性質が明らかにされている。また、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の形質転換体での発現に関しては、例えば、トリゴノプシス  バリアビリス（Trigonopsis variabilis）（特許文献３）、フザリウム  ソラニ（Fusarium solani）（特許文献４）、ロドトルーラ  グラシリス（Rhodotorula gracilis）（特許文献５）、キャンディダ  ボイディニー（Candida boidinii）（非特許文献２）由来の遺伝子について知られている。これら形質転換体によりＤ−アミノ酸オキシダーゼを高生産するためには、多くの場合、発現を抑制した状態で培養した後、誘導物質を添加するなどの手段で酵素を高生産化させる方法が知られている。
【０００４】
キャンディダ属に含まれるキャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）に関しては、粗酵素液の状態でＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性があることが知られている（非特許文献３）。
【０００５】
これまで知られているＤ−アミノ酸オキシダーゼは酵素の生産性や力価の面で劣っている。
【０００６】
さらに、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素の存在下で、ブタ腎臓由来、あるいはトリゴノプシス  バリアビリス（Trigonopsis variabilis）由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼを、ラセミ体アミノ酸に作用させ、Ｄ−アミノ酸が２−オキソ酸あるいはイミノ酸を経て、Ｌ−アミノ酸へと変換する反応はすでに知られている（非特許文献４、非特許文献５）。
【特許文献１】特公昭６２−５０１６７７号公報
【特許文献２】特開平１１−３１８４３９号公報
【特許文献３】特開昭６３−７１１８０号公報
【特許文献４】欧州特許出願公開第ＥＰ３６４２７５号
【特許文献５】国際公開第ＷＯ９７／０４０１７１号パンフレット
【非特許文献１】Ｓｏｍｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｄ−Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｏｘｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃ  ａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ．  Ａｇｒｉｃｕｌ.  ａｎｄ  Ｂｉｏｌ.    Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８６年、５０巻、１０号、２６３７頁
【非特許文献２】Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.  Ｂｉｏｃｈｅｍ.、２００１年、６５巻、３号、６２７頁
【非特許文献３】Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｏｘｉｄａｓｅ  ｂｙ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ．  Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１９７７年、５５巻、１号、１３頁
【非特許文献４】Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｃｅｍｉｃ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｌ−Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ．  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９０年、１３巻、９４７頁
【非特許文献５】Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｉｒａｌｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｏｍａｐａｔｒｉｌａｔ，ａｎ  ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｄｒｕｇ．  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００１年、１７巻、１６７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明で得たＤ−アミノ酸オキシダーゼは、酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、２−オキソ酸およびアンモニアを生成する酵素である。さらに、このＤ−アミノ酸オキシダーゼをアミノ酸脱水素酵素と組み合わせるか、またはアミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素と組み合わせることで、ラセミ体アミノ酸が、ケト酸あるいはイミノ酸を経て、Ｌ−アミノ酸へと定量的に変換される立体反転反応に利用できる有用な酵素である。
【０００８】
本発明の目的は新規なＤ−アミノ酸オキシダーゼを提供することにある。また、本発明の目的は、当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列、その遺伝子のＤＮＡ配列を明らかにし、当該酵素を生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体、及びそれらを用いた当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの製造方法を提供することにある。さらに本発明は、当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを利用した効率的なＬ−アミノ酸、２−オキソ酸、又は環状イミンの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題に鑑み、キャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）から新規な２種類のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の単離、ならびに宿主微生物での発現を達成し、形質転換体を育種した。本発明で得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼを単独、あるいはアミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素と組み合わせてラセミ体アミノ酸に作用させることにより、２−オキソ酸又はＬ−アミノ酸を製造することが可能となり、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、以下の１または複数の特徴を有する。
１）本発明の一つの特徴は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドである：
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と６９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド。
２）本発明の一つの特徴は、以下の（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドである：
（ｄ）配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｅ）配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｆ）配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列と６９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド。
６）本発明の一つの特徴は、以下の（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のＤＮＡである：
（ｇ）配列表配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｈ）配列表配列番号３に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ：
（ｉ）配列表配列番号３に示される塩基配列と６７％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
７）本発明の一つの特徴は、以下の（ｊ）、（ｋ）又は（ｌ）のＤＮＡである：
（ｊ）配列表配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｋ）配列表配列番号４に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ：
（ｌ）配列表配列番号４に示される塩基配列と６７％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
８）本発明の一つの特徴は、前記ＤＮＡを含む組換えプラスミドである。
１２）本発明の一つの特徴は、前記組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体である。
１６）本発明の一つの特徴は、前記ポリペプチドを生産する能力を有し、かつ、キャンディダ（Candida）属に属する微生物である。
１７）本発明の一つの特徴は、前記ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取することを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造方法である。
１９）本発明の一つの特徴は、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド）、形質転換体、または微生物を、
一般式（１）
【００１１】
【化１１】
2008048628.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基を表す。）で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、
一般式（２）
【００１３】
【化１２】
2008048628.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｒは前記と同じ）で表されるＬ−アミノ酸、又は、
一般式（３）
【００１５】
【化１３】
2008048628.tif 000004
【００１６】
（式中、Ｒは前記と同じ）で表される２−オキソ酸の製造方法である。
２０）本発明の一つの特徴は、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド）、形質転換体、または微生物を、
一般式（４）
【００１７】
【化１４】
2008048628.tif 000005
【００１８】
（式中、Ｒ’は置換基を有してもよい炭素数２〜７のアルキル鎖）で表される環状アミノ酸に作用させ、
一般式（５）
【００１９】
【化１５】
2008048628.tif 000006
【００２０】
（式中Ｒ’は上記と同じ）で表される環状Ｌ−アミノ酸、又は、
一般式（６）
【００２１】
【化１６】
2008048628.tif 000007
【００２２】
（式中Ｒ’は上記と同じ）で表される環状イミンの製造方法である。
２１）本発明の一つの特徴は、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド）、形質転換体、または微生物を、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素の存在下で、
一般式（１）
【００２３】
【化１７】
2008048628.tif 000008
【００２４】
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基を表す。）で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、
一般式（２）
【００２５】
【化１８】
2008048628.tif 000009
【００２６】
（式中、Ｒは前記と同じ）で表されるＬ−アミノ酸の製造方法である。
２２）本発明の一つの特徴は、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド）、形質転換体、または微生物を、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素の存在下で、
一般式（４）
【００２７】
【化１９】
2008048628.tif 000010
【００２８】
（式中、Ｒ’は置換基を有してもよい炭素数２〜７のアルキル鎖）で表される環状アミノ酸に作用させることを特徴とする、
一般式（５）
【００２９】
【化２０】
2008048628.tif 000011
【００３０】
（式中Ｒ’は上記と同じ）で表される環状Ｌ−アミノ酸の製造方法である。
【発明の効果】
【００３１】
本発明は上述の構成からなり、新規なＤ−アミノ酸オキシダーゼを効率よく製造することができる。また、当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、または、当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを生産する形質転換体、または微生物を利用することで、効率良くＬ−アミノ酸、２−オキソ酸、又は環状イミンを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、実施形態に基づいて本発明を詳細に説明する。本発明の範囲は、実施形態および実施例によって限定されるものではない。
【００３３】
１．ポリペプチド
まず、本発明の実施形態としてのポリペプチドについて説明する。実施形態としてのポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドであって、Ｄ−アミノ酸を立体選択的に酸化することが可能である。他のＤ−アミノ酸オキシダーゼと比べて、例えば以下のような点で異なる。
（ａ）  トリゴノプシス  バリアビリス（Trigonopsis variabilis）（特公昭６２−５０１６７７、特開招６３−７１１８０）のＤ−アミノ酸オキシダーゼとアミノ酸配列で比較した場合、配列番号１に示されるアミノ酸配列は相同性が３８．９％、配列番号２に示されるアミノ酸配列は相同性が２９.７％である。
（ｂ）  キャンディダ  ボイディニー（Candida boidinii）（Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.  Ｂｉｏｃｈｅｍ.、２００１年、６５巻、３号、６２７項、Ｙｅａｓｔ、２０００年、１６巻、１２１７頁）のＤ−アミノ酸オキシダーゼとアミノ酸配列で比較した場合、配列番号１に示されるアミノ酸配列は相同性が３１．１％、配列番号２に示されるアミノ酸配列は相同性が５９．８％である。
（ｃ）  ロドトルーラ  グラシリス（Rhodotorula gracilis）（国際公開第ＷＯ９７／０４０１７１号、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１９９８年、１４巻、２８９頁）のＤ−アミノ酸オキシダーゼとアミノ酸配列で比較した場合、配列番号１に示されるアミノ酸配列は相同性が２８．９％、配列番号２に示されるアミノ酸配列は相同性が３０．８％である。
（ｄ）  フザリウム  ソラニ（Fusarium solani）（欧州特許出願公開第ＥＰ３６４２７５号）のＤ−アミノ酸オキシダーゼとアミノ酸配列で比較した場合、配列番号１に示されるアミノ酸配列は相同性が３６．７％、配列番号２に示されるアミノ酸配列は相同性が２７．４％である。
【００３４】
なお、実施形態における「相同性」は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。ここでは、例示としてＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７遺伝情報処理ソフトウェア／ネットワーク版（ゼネティックス社製）のホモロジー検索を使用した。
【００３５】
２．Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性測定
実施形態において、ポリペプチドのＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性測定は、反応で生成する過酸化水素を、ぺルオキシダーゼを用いた酵素法で定量することができる。酵素法による過酸化水素の定量は次のように実施する。
【００３６】
酵素溶液を適宜希釈し、２５ｍＭ  Ｄ−アミノ酸、０．８０ｍＭ  ４−アミノアンチピリン、１．３１ｍＭ  Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン、６ｕ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ  Ｉｎｃ．社製）、および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）からなる発色液と１：５で混合し、３０℃で３０分間反応させ、５５５ｎｍの吸光度を測定し、予め作成した検量線に基づき、反応液中に生成した過酸化水素量を定量する。
【００３７】
３．微生物
実施形態のポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する微生物から取得できる。同ポリペプチドを生産する微生物であれば特に限定されないが、例えばキャンディダ（Candida）に属する微生物が挙げられ、なかでもキャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）が好ましく、より好ましくは、キャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株である。
【００３８】
なお、実施形態のポリペプチドを生産する微生物は、上述した微生物の野生株であっても良いし、変異改良された変異株であってもよい。変異株は、ＵＶ照射や、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の薬剤による処理といった当業者に周知の方法で取得することができる。
【００３９】
本発明のポリペプチドを生産する微生物を培養する培地としては、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用され得る。
【００４０】
更に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの生産を増強させるような物質、例えば、アミノ酸又はアミノ酸誘導体を少量添加することもできる。これらＤ−アミノ酸オキシダーゼ生産増強物質の培地中濃度は、０．００１重量％以上、１０重量％以下、好ましくは０．０１重量％以上、１重量％以下の範囲から選ばれる。
【００４１】
培養は通常好気的に行ない、温度として１０℃以上、６０℃以下、好ましくは２０℃以上、５０℃以下の範囲、ｐＨとしては３以上、１１以下、好ましくはｐＨ５以上、９以下の範囲が用いられ、培養時間は１日以上、５日間以下程度で行ない得る。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。
【００４２】
培養終了後に培養液から遠心分離などにより菌体を集め、超音波破砕などの手段により菌体を破砕して粗酵素液を得る。この粗酵素液を、塩析法、カラムクロマトグラフィー法などにより精製することで、本発明のポリペプチドを得ることができる。
【００４３】
４．アミノ酸配列
本発明のポリペプチドは、上記のように微生物から取得される天然酵素であってもよいし、遺伝子組換え技術を利用して生産される組換え酵素であってもよい。天然酵素としては、配列表の配列番号１又は２に示されるポリペプチドをあげることができる。
【００４４】
また、本発明の実施形態としてのポリペプチドは、配列表配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドであってもよいし、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列と６９％以上、好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。「数個のアミノ酸」とは、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性が失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは２０アミノ酸以下であり、より好ましくは１５アミノ酸以下、さらに好ましくは１０アミノ酸以下、最も好ましくは、５、４、３、または２個以下である。
【００４５】
また、「Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド」とは、上記の活性測定条件において、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性が検出可能なものであればよいが、好ましくは配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いた場合の１０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上の活性を示すポリペプチドのことをいう。
【００４６】
５．ＤＮＡ
本発明の実施形態としての「ＤＮＡ」について説明する。本発明のＤＮＡは、上記のようなポリペプチドをコードするＤＮＡであればよい。配列表の配列番号３又は４で示されるＤＮＡであってもよいし、配列表配列番号３又は４に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。「数個の塩基」とは、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドがＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは５０塩基以下であり、より好ましくは３０塩基以下、さらに好ましくは２０アミノ酸以下、最も好ましくは、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個以下である。
【００４７】
また、配列番号３又は４で示される塩基配列と６７％以上、好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。
【００４８】
本発明のＤＮＡ（Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子）は、前述したようなＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する微生物から取得することができる。目的のＤＮＡを取得するには、例えば以下の方法によることができる。
【００４９】
まず、既知Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの複数箇所の相同配列部位にもとづいて設計したＤＮＡプライマーを合成する。
【００５０】
次に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの起源となる微生物より、染色体ＤＮＡを単離する。染色体ＤＮＡは、培養された細胞から、Ｍａｒｍｕｒ法（J.Mol.Biol.,3,208(1961)参照）等の方法を用いて得られる。この染色体ＤＮＡを鋳型に、上記のＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、目的遺伝子の一部を取得できる。
【００５１】
次に、既に取得した部分遺伝子のさらにＮ末側とＣ末側をコードするＤＮＡ断片を、インバースＰＣＲ法により取得することができる（例えばNucleic Acids Res.16,8186(1988)を参照）。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、部分遺伝子の塩基配列とあわせることで、翻訳開始部位から終止コドンまでを含むと推定されるＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の全長塩基配列を得る。
【００５２】
得られた塩基配列の解析から、染色体ＤＮＡより得られるＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子中にイントロンの存在が推定される場合は、以下に示すような方法でイントロンを除去したＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を取得することができる。
【００５３】
まず、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの起源となる微生物を培養して得た菌体から、ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、TaKaRa RNA LA PCR Kit (AMV) Ver.1.1（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、全ＲＮＡを鋳型に相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製する。インバースＰＣＲ法により得られた上記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子全長配列のＮ末端、Ｃ末端部分の塩基配列からプライマーを設計する。設計したプライマーを用いて、ｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行ない、イントロンを含まない全長配列からオープンリーディングフレームを決定する。
【００５４】
６．形質転換体・ベクター
上記方法によって取得したＤＮＡ、または該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えプラスミドを用いることにより、宿主微生物を形質転換し形質転換体を得ることができる。
【００５５】
宿主、ベクターとしては、「組換えＤＮＡ実験指針」（科学技術庁研究開発局ライフサイエンス課編：平成８年３月２２日改定）に記載の宿主―ベクター系を用いることができる。例えば、宿主としては、エシェリヒア（Escherichia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、バチルス（Bacillus）属、セラチア（Serratia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属またはストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物を用いることができる。
【００５６】
ベクターは上記の宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたはその誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物としてエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いるのが好ましい。このようなベクターとしては、例えば、 ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＳＣ１０１、ｐＴ７Ｂｌｕｅ、又はｐＵＣＮＴ、若しくはそれらの誘導体を挙げることができる。それらの誘導体とは、酵素の生産量上昇、プラスミド安定化を目的として、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ＳＤ配列、複製開始部位（ｏｒｉ）、その他の調節などに関わる遺伝子を改質したもの、また、薬剤耐性、クローニング部位の制限酵素サイトを改質したものなどを指す。
【００５７】
形質転換体の一例として、キャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株から上記のようにして取得したＤＮＡをｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号参照）に組み込んだ組換えプラスミドｐＣＤＡ００１又はｐＣＤＡ００６を用いてエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１又はＪＭ１０９を形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００１）又はＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００６）を得ることができる。エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１又はＪＭ１０９の菌学的性質は、「BIOCHEMICALS  FOR  LIFE  SCIENCE」（東洋紡績株式会社、1993年、１１６−１１９頁）およびその他種々の公知文献に記載されており当業者に周知である。エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００１）又はＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００６）は、遺伝子組換えによって特定の酵素を産生し得る性質以外は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１又はＪＭ１０９と同様の菌学的性質を有する。
【００５８】
なお、本発明で用いた組換えＤＮＡ技術は当該分野において周知であり、例えば、Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)に記載されている。
【００５９】
７．形質転換体等の培養
本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼを生産しうる上記形質転換体等を培養することにより当該酵素を大量に生産することができ、Ｌ−アミノ酸又は２−オキソ酸の製造に利用することができる。
【００６０】
微生物の培養は、通常の培地を用いて行えば良い。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源および無機塩類などの栄養素を含む通常の培地で良い。これに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースやシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素などが用いられる。
【００６１】
培養は温度範囲２５℃から４０℃で行なえるが、２５℃から３７℃が特に好ましい。また、ｐＨは４から８で培養できるが５から７．５が好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。
【００６２】
必要に応じてイソプロピル−１−チオ−β―Ｄ−ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）、ラクトース等の添加等の酵素誘導のための処理を行なうこともできる。
【００６３】
８．Ｌ−アミノ酸等の製造方法
実施形態で得られるＤ−アミノ酸オキシダーゼを使用することによる、効率的なＬ−アミノ酸、２−オキソ酸、又は環状イミンの製造方法について説明する。２−オキソ酸は、ラセミ体アミノ酸にＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用させ、Ｄ−アミノ酸を酸化することにより得ることができる（分割反応）。本反応においてＤ−アミノ酸から２−オキソ酸に至るまでの中間体としてイミノ酸が生成すると推測されるが、イミノ酸は加水分解反応により、すぐに２−オキソ酸へと変換され、最終的に２−オキソ酸のみが得られる。環状イミンは環状アミノ酸にＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用させることで得ることができる。Ｌ−アミノ酸は、前記分割反応の残基質として得ることも可能であるし、前記反応で生成する２−オキソ酸、イミノ酸、あるいは環状イミンを、さらにアミノ酸脱水素酵素に接触せしめ、反応させることにより、Ｌ−アミノ酸へと変換することもできる（立体反転反応）。
【００６４】
９．アミノ酸脱水素酵素
ここで、アミノ酸脱水素酵素とは、２−オキソ酸又は環状イミンを還元的にアミノ化する活性を有する酵素であり、例えばフェニルアラニン脱水素酵素、ロイシン脱水素酵素、ピロリン−２−カルボン酸レダクターゼを挙げることができる。本発明で用いるアミノ酸脱水素酵素としては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。
【００６５】
微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物である、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、スポロサルシナ属（Sporosarcina）、サーモアクチノマイセス属（Thermoactinomyces）、マイクロバクテリウム属（Microbacterium）、ハルモナス属（Halomona）、クロストリジウム属（Clostridium）、バチルス属（Bacillus）、ニューロスポラ属（Neurospora）、エシェリヒア属（Escherichia）、アエロバクター属（Aerobactor）などがある。
【００６６】
好ましくはバチルス属（Bacillus）に属する微生物由来の酵素が挙げられる。さらに好ましくは、バチルス  バディウス（Bacillus badius）ＩＡＭ１１０５９、バチルス  スファエリカス（Bacillus sphaericus）ＮＢＲＣ３３４１由来の酵素が挙げられる。バチルス  バディウス（Bacillus badius）ＩＡＭ１１０５９はフェニルアラニン脱水素酵素を生産する微生物であり、欧州特許出願公開第ＥＰ２５６５１４号およびＢｉｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９５年、５９巻、１０号、１９９４頁で公知である。
【００６７】
また、バチルス  スファエリカス（Bacillus sphaericus）ＮＢＲＣ３３４１は、ロイシン脱水素酵素を生産する微生物であり、公知のバチルス  サチルス（Bacillus subtilis ）のロイシン脱水素酵素とアミノ酸残基数が同じであり、アミノ酸配列で１００％一致する。遺伝子配列では１０９５塩基中、１４塩基が異なっている。バチルス  サチルス（Bacillus subtilis）の遺伝子配列は、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年、３９０巻、２４９頁およびＮＣＢＩデータベースのアクセッションナンバーＣＡＢ１４３３９で公知である。また、ピロリン−２−カルボン酸レダクターゼがニューロスポラ属（Neurospora）、エシェリヒア属（Escherichia）、アエロバクター属（Aerobactor）で知られていることは、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９６２年、５巻、８８２頁で述べられている。
【００６８】
アミノ酸脱水素酵素を効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えばアミノ酸脱水素酵素活性を示す菌株からアミノ酸脱水素酵素遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換えＤＮＡ技術については当該分野において周知である。
【００６９】
１０．補酵素再生系
アミノ酸脱水素酵素による反応は、ＮＡＤＨのような還元型の補酵素を必要とし、
当該反応の進行に伴い、補酵素ＮＡＤＨは酸化型に変換される。この酸化型の補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素、および、当該酵素の基質となる化合物を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよびアミノ酸脱水素酵素と共存させて当該反応を行うことにより、補酵素の使用量を大幅に削減できる。
【００７０】
補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素などを使用できる。
【００７１】
好適には、ギ酸脱水素酵素が使用される。ギ酸脱水素酵素としては、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物である、キャンディダ属（Candida）、クロイッケラ属（Kloeckera）、ピキア属（Pichia）、リポマイセス属（Lipomyces）、シュードモナス属（Pseudomonas）、モラキセラ属（Moraxella）、ハイホマイクロビウム属（Hyphomicrobium）、パラコッカス属（Paracoccus）、チオバシラス属（Thiobacillus）、アンシロバクター属（Ancylobacter）がある。
【００７２】
好ましくはチオバシラス属（Thiobacillus）、アンシロバクター属（Ancylobacter）に属する微生物由来の酵素が挙げられる。さらに好ましくはチオバシラス  エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）、アンシロバクター  アクアティカス（Ancylobacter aquaticus）ＫＮＫ６０７Ｍ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３５）由来の酵素が挙げられる。
【００７３】
ギ酸脱水素酵素を効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えば国際公開第ＷＯ０３／０３１６２６号記載のように、ギ酸脱水素酵素活性を示す菌株からギ酸脱水素酵素遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換えＤＮＡ技術については当該分野において周知である。
【００７４】
このようにして得られたギ酸脱水素酵素を高生産する形質転換体としては国際公開第ＷＯ０３／０３１６２６号記載の、チオバシラス  エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含有するエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ-７６７２）又はエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７３）、又は国際公開第ＷＯ０２／４６４２７号記載の、アンシロバクター  アクアティカス（Ancylobacter aquaticus）ＫＮＫ６０７Ｍ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３５）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含有するエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＡ００１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３４）を挙げることができる。
【００７５】
これら形質転換体によるアミノ酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素の生産、前述のアミノ酸脱水素酵素活性を示す菌株によるアミノ酸脱水素酵素の生産、あるいはギ酸脱水素酵素活性を示す菌株によるギ酸脱水素酵素の生産は、例えば、国際公開第ＷＯ０３／０３１６２６号記載の、通常の栄養培地を用いて培養を行なえば良く、必要に応じて、酵素誘導のための処理を行うこともできる。
【００７６】
１１．カタラーゼの添加
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ反応には、カタラーゼを添加してもよい。カタラーゼを添加しない場合にも反応は進行し、生成物を得ることができるが、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ反応で生成する過酸化水素により基質あるいは生成物が分解され、収率が低下する可能性がある。カタラーゼを添加することで、そのような基質あるいは生成物の分解を抑えることができ、収率の向上が期待できる。カタラーゼは過酸化水素を水と酸素に分解する反応を触媒する酵素である。
【００７７】
カタラーゼとしては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物である、マイクロコッカス属（Micrococcus）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）等がある。また、市販の酵素も使用することもできる。市販酵素としては例えば、Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）、ＣＡＴＡＬＡＳＥ（Ｂｅｅｆ  Ｌｉｖｅｒ）（Ｐ−Ｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社製）がある。
【００７８】
１２．形質転換体等
なお、本発明において使用するＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、補酵素再生能を有する酵素、カタラーゼは、それぞれの酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産したものを使用してもよいし、複数の酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産したものを使用してもよい。
【００７９】
本発明において、生産されたＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素、およびカタラーゼは、酵素自体として用いることができるほか、微生物もしくはその処理物としても用いることができる。ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の破砕物を意味する。
【００８０】
更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化して得た固定化酵素として用いられ得る。固定化は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法などで行ない得る。
【００８１】
１３．Ｌ−アミノ酸等の生産
本発明の分割反応によるＬ−アミノ酸、２−オキソ酸又は環状イミンの生産、又は立体反転反応によるＬ−アミノ酸の生産は以下の方法で行なうことができる。
【００８２】
両酵素反応の基質として、前記一般式（１）で表されるラセミ体アミノ酸において、置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基を表す。上記Ｒにおける置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基としては、特に限定されず、例えば、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、１−メチルプロピル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、メルカプトメチル基、２−メチルチオエチル基、（１−メルカプト−１−メチル）エチル基、４−アミノブチル基、３−グアニジノプロピル基、４（５）−イミダゾールメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、クロロメチル基、メトキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−アミノプロピル基、２−シアノエチル基、３−シアノプロピル基、４−（ベンゾイルアミノ）ブチル基、又は、２−メトキシカルボニルエチル基、などが挙げられる。
【００８３】
置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基としては、特に限定されず、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、４−ヒドロキシベンジル基、２−フルオロベンジル基、３−フルオロベンジル基、４−フルオロベンジル基、又は、３，４−メチレンジオキシベンジル基等が挙げられる。置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基としては、フェニル基、または４−ヒドロキシフェニル基などが挙げられる。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。
【００８４】
また、前記一般式（４）で表される環状アミノ酸において、Ｒ’は置換基を有してもよい炭素数２〜７のアルキル鎖である。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。
【００８５】
１４．分割反応
分割反応では、上記基質に前述のＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用させ、水性溶媒中で反応を行なう。上記反応にはカタラーゼを添加してもよい。カタラーゼを添加することでＤ−アミノ酸オキシダーゼの反応で生成する過酸化水素を分解し、基質あるいは生成物の分解を抑えることができる。また、反応にＦＡＤを添加してもよい。ＦＡＤはＤ−アミノ酸オキシダーゼの補酵素であり、添加することにより、反応の効率が向上することが期待できる。ＦＡＤの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、１０当量以下、さらに好ましくは０当量以上、１当量以下、さらに好ましくは０当量以上、０．１当量以下である。
【００８６】
１５．立体反転反応
立体反転反応では、上記基質に前述のＤ−アミノ酸オキシダーゼ、前述のアミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行なう。反応にはカタラーゼを添加してもよい。カタラーゼを添加することでＤ−アミノ酸オキシダーゼの反応で生成する過酸化水素を分解し、基質あるいは生成物の分解を抑えることができる。
【００８７】
また、上記反応にＦＡＤを添加してもよい。ＦＡＤはＤ−アミノ酸オキシダーゼの補酵素であり、添加することにより、反応の効率が向上することが期待できる。ＦＡＤの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、１０当量以下、さらに好ましくは０当量以上、１当量以下、さらに好ましくは０当量以上、０．１当量以下である。
【００８８】
また、上記立体反転反応にはＮＡＤ等の補酵素を添加してもよい。ＮＡＤ等の補酵素を添加しない場合にも、微生物中に存在するＮＡＤ等の補酵素により反応が進行する場合もあるが、ＮＡＤ等の補酵素を添加することで、反応の効率が向上することが期待できる。ＮＡＤ等の補酵素の添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、２当量以下、さらに好ましくは０．００００１当量以上、０．１当量以下、さらに好ましくは０．０００１当量以上、０．０１当量以下である。
【００８９】
また、上記立体反転反応にアンモニア又はその塩を添加してもよい。アンモニアの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、１０当量以下、さらに好ましくは０当量以上、２当量以下、さらに好ましくは０．１当量以上、１．５当量以下である。
【００９０】
上記分割および立体反転反応の基質の仕込み濃度は０．１％（ｗ／ｖ）以上、９０％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上、６０％（ｗ／ｖ）以下で溶解または懸濁した状態で反応を行ない、上記分割および立体反転反応における反応温度は１０℃以上、８０℃以下、好ましくは２０℃以上、６０℃以下の適当な温度で調節し、ｐＨ４以上、１２以下、好ましくはｐＨ６以上、１１以下に保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。また、基質は一括添加してもよいし、分割添加してもよいし、連続的に添加してもよい。上記分割および立体反転反応は、バッチ法または連続方式で行ない得る。
【００９１】
本発明の分割および立体反転反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。水性媒体としては、水、緩衝液、これらにエタノールのような水溶性有機溶媒を含む水性媒体、あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒を含む水性媒体との２層系などの適当な溶媒を用いることができる。さらに必用に応じて、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、金属などを添加することもできる。
【００９２】
１６．生成物の単離
生成したＬ−アミノ酸、２―オキソ酸、又は環状イミンの単離は、常套分離方法、例えば、抽出、濃縮、晶析、またはカラムクロマトグラフィーなどの分離方法や、それらの組み合わせにより分離、精製することができる。
【実施例】
【００９３】
以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００９４】
（実施例１）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ１の遺伝子の単離
キャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株を、試験管内で滅菌した６ｍｌの培地（グルコース１．６５％、ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4０．５％、ＫＨ2ＰＯ4０．２５％、ＭｇＳＯ4０．１％、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ０．００２％、コーンスティープリカー０．１％、滅菌前ｐＨ５．２）に植菌して３０℃で１４時間、好気的に振とう培養した。この培養液１ｍｌを５００ｍｌ坂口フラスコ内で滅菌した１００ｍｌの培地（シュークロース１．６５％、ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4０．５％、ＫＨ2ＰＯ4０．２５％、ＭｇＳＯ4０．１％、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ０．００２％、コーンスティープリカー０．１％、ＦＡＤ０．０００５％、Ｄ−アラニン０．０８９％、滅菌前ｐＨ５．２、ただし、ＦＡＤおよびＤ−アラニンは０．０２μｍフィルターにて滅菌後、別に添加した。）に植菌して３０℃で２４時間、好気的に振とう培養した。
【００９５】
培養終了後、遠心分離で得た菌体から、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories, Inc.社製）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。次いで、既知Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ配列相同部位にもとづいて設計したＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１：配列表の配列番号５、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−２：配列表の配列番号６）を用いて、先に得た染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。その結果、目的のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の一部、塩基数約３７０ｂｐ（部分遺伝子と称す）のＤＮＡ断片を取得した。
【００９６】
次に、目的遺伝子の全長を取得するために以下の操作を行った。上記部分遺伝子において、酵素のＮ末端側、Ｃ末端側それぞれの部分に相当する塩基配列にもとづき、部分遺伝子の外側方向へ向けたＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−３：配列表の配列番号７、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−４：配列表の配列番号８）を合成した。このプライマーを用い、先に得た染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩ又はＨｈａＩで分解したものをＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて環化させて得たＤＮＡを鋳型に、インバースＰＣＲを行った。
【００９７】
これにより、既に取得した部分遺伝子のさらに外側の遺伝子部分を含む塩基数約１．０〜２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定後、先の部分遺伝子の塩基配列と合わせることで、配列表の配列番号３に示す開始コドンから終止コドンまでを含むＤ−アミノ酸オキシダーゼ１の遺伝子の全塩基配列を決定した。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ１の遺伝子にはイントロンは含まれなかった。次いでＤ−アミノ酸オキシダーゼ１の遺伝子のＮ末端、Ｃ末端部分にそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｃＩの切断部位を結合させた配列を持つプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−５：配列表の配列番号９、Ｐｒｉｍｅｒ−６：配列表の配列番号１０）を用いて、この間のＤＮＡを、染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにより増幅することで、配列表配列番号３に示されるオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片を取得した。
【００９８】
（実施例２）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ２の遺伝子の単離
既知Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ配列相同部位にもとづいて設計したＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−７：配列表の配列番号１１、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−８：配列表の配列番号１２）を用いて、実施例１と同様の方法で調製した染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。その結果、目的のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の一部、塩基数約３５０ｂｐ（部分遺伝子と称す）のＤＮＡ断片を取得した。
【００９９】
次に、目的遺伝子の全長を取得するために以下の操作を行った。上記部分遺伝子において、酵素のＮ末端側、Ｃ末端側それぞれの部分に相当する塩基配列にもとづき、部分遺伝子の外側方向へ向けたＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−９：配列表の配列番号１３、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−１０：配列表の配列番号１４）を合成した。このプライマーを用い、先に得た染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＶで分解したものをＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて環化させて得たＤＮＡを鋳型に、インバースＰＣＲを行った。
【０１００】
これにより、既に取得した部分遺伝子のさらに外側の遺伝子部分を含む塩基数約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定後、先の部分遺伝子の塩基配列と合わせることで、配列表の配列番号１５に示す開始コドンから終止コドンまでを含むＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の全塩基配列を決定した。その塩基配列の解析から、染色体ＤＮＡより得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子は、２個のエキソンと１個のイントロンを含んでいた。
【０１０１】
イントロンを除いたＤ−アミノ酸オキシダーゼ２の遺伝子を取得するために以下の操作をおこなった。まず、実施例１と同様の方法でキャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株を培養して得た菌体から、ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いて調製した全ＲＮＡを鋳型に、TaKaRa RNA LA PCR Kit (AMV) Ver.1.1（ＴａＫａＲａ社製）を用いて相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製した。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子のＮ末端に制限酵素ＮｄｅＩの切断部位を結合させた配列を持つプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１１：配列表の配列番号１６）、Ｃ末端部分に制限酵素ＳａｃＩの切断部位を結合させ、かつ終止コドンをＴＡＧからＴＡＡに変更した配列を持つプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１２：配列表の配列番号１７）を用いて、この間のＤＮＡを、ｃＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにより増幅することで、イントロンを除く配列表配列番号４に示されるオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片を取得した。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ２はＤ−アミノ酸オキシダーゼ１と相同性がアミノ酸配列で２９．２％、それらをコードする遺伝子の塩基配列で４８．２％であった。
【０１０２】
（実施例３）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ１の遺伝子を発現する組換えプラスミドｐＣＤＡ００１の作成
実施例１で得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＳａｃＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号参照）とＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、図１の制限酵素地図で表され、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ１の遺伝子を発現できるように設計されたｐＣＤＡ００１を取得した。
【０１０３】
（実施例４）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ２の遺伝子を発現する組換えプラスミドｐＣＤＡ００６の作成
実施例２で得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＳａｃＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号参照）とＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、図２の制限酵素地図で表され、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ２の遺伝子を発現できるように設計されたｐＣＤＡ００６を取得した。
【０１０４】
（実施例５）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ１の遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いた形質転換体の作成
実施例３で得られたプラスミドｐＣＤＡ００１をエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合することで形質転換を行ない、培地（トリプトン１．０％、イーストエキス０．５％、塩化ナトリウム１．０％、寒天１．５％、アンピシリン０．０１０％、脱イオン水に溶解、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）にプレーティングして、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００１）をコロニーとして取得した。
【０１０５】
得られた形質転換体のコロニーを、滅菌した培地（トリプトン１．０％、イーストエキス０．５％、塩化ナトリウム１．０％、アンピシリン０．０１０％、脱イオン水に溶解、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、３７℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体のＤ−アミノ酸オキシダーゼ酵素液を取得した。得られた酵素液を用いて、以下に示す方法でＤ−フェニルアラニン、Ｄ−アラニンおよびＤ−メチオニンに対するＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を測定した。その結果を表１に示す。
【０１０６】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの活性測定は、反応で生成する過酸化水素を、ぺルオキシダーゼを用いた酵素法で定量することによりおこなった。酵素法による過酸化水素の定量は次のように実施した。２５ｍＭ  上記Ｄ−アミノ酸、０．８０ｍＭ  ４−アミノアンチピリン、１．３１ｍＭ  Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン、６ｕ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ  Ｉｎｃ．社製）、および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）からなる発色液２５０μｌと適宜希釈した酵素液５０μｌを混合し、３０℃で３０分間反応させ、５５５ｎｍの吸光度を測定し、予め作成した検量線に基づき、反応液中に生成した過酸化水素量を定量することで活性を測定した。
【０１０７】
【表１】
2008048628.tif 000012
【０１０８】
（実施例６）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ２の遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いた形質転換体の作成
実施例４で得られたプラスミドｐＣＤＡ００６を用いて実施例５と同様の方法でＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００６）をコロニーとして取得した。
【０１０９】
得られた形質転換体のコロニーを、滅菌した培地（トリプトン１．０％、イーストエキス０．５％、塩化ナトリウム１．０％、アンピシリン０．０１０％、脱イオン水に溶解、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、３７℃で５時間振とうして好気的に培養した後、培養液にイソプロピル−１−チオ−β―Ｄ−ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭとなるように加え、さらに１９時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体のＤ−アミノ酸オキシダーゼ酵素液を取得した。得られた酵素液を用いて、実施例５に示す方法でＤ−フェニルアラニン、Ｄ−アラニンおよびＤ−メチオニンに対するＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を測定した。その結果を表２に示す。
【０１１０】
【表２】
2008048628.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、本発明の実施形態としてのＤ−アミノ酸オキシダーゼ１の遺伝子を含む組換えプラスミドｐＣＤＡ００１の構成を示す図である。
【図２】図２は、発明の実施形態としてのＤ−アミノ酸オキシダーゼ２の遺伝子を含む組換えプラスミドｐＣＤＡ００６の構成を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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