(57)【要約】【課題】抜去した毛からＲＮＡやＤＮＡ、タンパク、元素等の生体物質を、量的及び質的に安定して抽出するための方法、及び該方法に用いる毛採取器具の提供。【解決手段】抜去するために所定の基準値以上の引っ張り力を要する毛の毛根から生体物質を抽出する方法、並びに毛を抜去するための毛採取器具であって、毛を挟持する手段と、毛を抜去する際にこれに負荷される引っ張り力を測定する手段と、を備えることを特徴とする毛採取器具を提供する。【選択図】図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抜去するために所定の基準値以上の引っ張り力を要する毛の毛根から生体物質を抽出する方法。
【請求項２】
前記基準値が５０ｇであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記生体物質が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク、元素のいずれか１つから選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
毛を抜去するための毛採取器具であって、
毛を挟持する手段と、
毛を抜去する際にこれに負荷される引っ張り力を測定する手段と、
を備えることを特徴とする毛採取器具。
【請求項５】
前記毛の抜去方向の体表に対する角度を規定する手段を備えることを特徴とする請求項４記載の毛採取器具。
【請求項６】
抜去した毛の毛根の形状を拡大観察する手段を備えることを特徴とする請求項４記載の毛採取器具。
【請求項７】
抜去した毛の毛根画像情報を取得する取得手段と、
該取得手段により取得された前記毛根画像情報に基づいて毛根の形状を判定する判定手段と、
を備える請求項４記載の毛採取器具。
【請求項８】
さらに、予め取得された基準毛根画像情報を記憶する記憶手段を備え、
前記判定手段は、前記取得手段により取得された前記毛根画像情報と前記基準毛根画像情報との比較に基づいて毛根の形状を判定することを特徴とする請求項７記載の毛採取器具。
【請求項９】
前記判定手段は、毛根の輪郭線における変曲点を検出して、変曲点数を算出することにより、前記比較を行うことを特徴とする請求項８記載の毛採取器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛の毛根から生体物質を抽出する方法に関する。より詳しくは、抜去するために所定の基準値以上の引っ張り力を要する毛の毛根から、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク、元素等の生体物質を抽出する方法及び該方法に用いる毛採取器具に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、各種疾患の分子メカニズムの解明や、疾患マーカー及び創薬ターゲットの探索を目的として、ＤＮＡマイクロアレイをはじめとした各種遺伝子発現解析が広く普及してきている。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイでは、まず検体組織又は細胞からＲＮＡを抽出し、これを鋳型として逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。この際、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の蛍光物質によりｃＤＮＡを標識しておき、標識ｃＤＮＡをアレイ上に固相化したプローブＤＮＡとハイブリダイズさせて、ハイブリダイズしたｃＤＮＡの蛍光シグナルに基づいて発現遺伝子を解析する。
【０００４】
従来のＤＮＡマイクロアレイでは、上記の標識ｃＤＮＡを得るために、相当量（数マイクログラムオーダー）のＲＮＡが必要とされていた。従って、解析の対象が比較的大きな組織片や多量の細胞に限られており、バイオプシー（生検）サンプル等の微小組織片や少量の細胞についての解析は難しかった。
【０００５】
しかし近年になって、ナノグラムレベルの遺伝子サンプルを測定できる高感度ＤＮＡマイクロアレイが開発され、微小組織片や少量の細胞といった微量試料についても遺伝子発現解析が可能となった。さらに、遺伝子多型解析やプロテオーム解析等においても微量試料解析が可能となっていきている。
【０００６】
このような微量試料解析は、実際の臨床の場での試料採取を容易にし、試料及びその解析データの蓄積、さらにはこれに伴う迅速な診断方法の確立を可能にするものとして期待が高まっている。
【０００７】
例えば、遺伝子多型解析においては、従来、１０ｍｌ程度の血液を採血して血液中の白血球を集め、白血球を溶解してＤＮＡを抽出し、さらにＰＣＲによりＤＮＡを増幅した上で遺伝子多型解析を行なう必要があった。しかし、現在では、指先を小さく傷付けて得た血液滴や口腔粘膜をごく少量掻き採ったような微量試料から、全自動でＤＮＡの抽出、増幅、遺伝子型の判定までを行なう装置が登場している。
【０００８】
このような微量試料からのＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク、元素等の生体物質解析が盛んになるに伴い、試料として上述した血液滴や口腔粘膜に加え、毛髪が注目されるようになってきている。毛髪は、非侵襲的かつ簡便に採取することが可能で、試料提供者（患者）の肉体的及び精神的負担も軽いため、遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）解析による薬剤感受性診断等のオーダーメード医療の普及に向け、好適な生体物質抽出源として期待されている。
【０００９】
これまでに、体調の異変を診断するための診断方法として、毛根に含有されている元素を検出する診断方法が開発されている（特許文献１参照）。
【００１０】
また、特許文献２には、毛髪を含む毛からＲＮＡを回収する方法として、毛を抜去してから直ちに液体窒素を用いて超低温に凍結し、次いでＲＮＡ抽出用試薬液と接触させ、しかる後にボルテックス攪拌処理してＲＮＡを抽出する方法が開示されている。
【特許文献１】特開２００４−４５１３３号公報
【特許文献２】特開２００５−１９２４０９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述の特許文献1に開示される診断方法は、毛根に含有されている元素を検出することにより、体調の異変の簡便な診断を可能とするものであり、また特許文献２に開示されるＲＮＡ抽出方法は、毛から簡便かつ高収量、高純度にＲＮＡを抽出することを可能とするものである。
【００１２】
しかしながら、ＲＮＡやＤＮＡ、タンパク、元素等の生体物質の抽出に用いる毛の適切な条件については従来検討されてこなかった。
【００１３】
毛は、成長期、退行期、休止期の三期からなる毛周期と呼ばれる周期を繰り返していることが知られており、用いる毛がどの期間にあるかによって毛根の状態は著しく異なる。従って、毛根の状態によって、毛根から抽出されるＲＮＡや、ＤＮＡ、タンパク、元素等の生体物質の量や質にはバラつきが生じることとなり、これらの生体物質を用いた解析結果の再現性の確保を難しくする要因となっている。
【００１４】
さらに、生体物質の量や質のバラつきを防止するために、毛の採取時に必要本数以上の毛を抜去したり、試料提供者（患者）に再度の採取を強いることがあり、効率が悪いうえ、試料提供者とっても負担となっている。
【００１５】
そこで、本発明は、抜去した毛からＲＮＡやＤＮＡ、タンパク、元素等の生体物質を、量的及び質的に安定して抽出するための方法、及び該方法に用いる毛採取器具を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題解決のため、本発明は、抜去するために所定の基準値以上の引っ張り力を要する毛の毛根からＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク、元素等の生体物質を抽出する方法を提供する。基準値としては、５０ｇが好適となる。  また、本発明は、毛を抜去するための毛採取器具であって、毛を挟持する手段と、毛を抜去する際にこれに負荷される引っ張り力を測定する手段と、を備えることを特徴とする毛採取器具をも提供する。
この毛採取器具は、毛の抜去方向の体表に対する角度を規定する手段、及び、抜去した毛の毛根の形状を拡大観察する手段を備えていてもよい。
また、抜去した毛の毛根画像情報を取得する取得手段と、該取得手段により取得された前記毛根画像情報に基づいて毛根の形状を判定する判定手段と、を備えていてもよい。
さらに、予め取得された基準毛根画像情報を記憶する記憶手段を具備し、判定手段が、取得手段により取得された毛根画像情報と基準毛根画像情報との比較に基づいて、毛根の形状を判定するよう構成してもよい。
この場合、判定手段は、例えば、毛根の輪郭線における変曲点を検出して、変曲点数を算出することにより、取得手段により取得された毛根画像情報と基準毛根画像情報との比較を行う。
【００１７】
本発明において、「毛」とは、ヒト又は非ヒト動物の皮膚（体表）を覆う全ての体毛を意味し、例えばヒトを対象とする場合、頭髪や髭、腕や足の毛などが含まれる。また、「毛根」とは、体表内に埋没する側の毛の端部を意味する。抜去された毛の毛根には、内毛根鞘（inner root sheath）、外毛根鞘（outer root sheath）及び毛乳頭（papilla）等を形成する細胞群が付着し得る。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る生体物質抽出方法を用いることにより、毛からＲＮＡやＤＮＡ、タンパク、元素等の生体物質を、量的及び質的に安定して抽出することができる。また本発明に係る毛採取器具は、該抽出方法のために好適に使用することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
上述の通り、毛根から抽出されるＲＮＡや、ＤＮＡ、タンパク、元素等の生体物質の量や質は、当該毛が成長期、退行期、休止期のどの毛周期にあるかによって著しく異なる。
【００２０】
ここで、図１を参照しながら毛の構造及び毛周期について説明する。
【００２１】
図１は、皮膚の断面を示す模式図である。毛は皮膚外部に露出した毛幹と、皮膚真皮に埋没した毛根と、毛根を生み出す元になる毛乳頭細胞（図１符合ａ）や毛母細胞（同ｂ）などから形成されている。
【００２２】
毛周期は、成長期（Ｉ）、退行期（II）、休止期（III）の３期に分かれている。成長期（Ｉ）においては、毛乳頭細胞ａから毛母細胞ｂへ栄養分が供給され、毛母細胞ｂは盛んに分裂する。分裂した毛母細胞ｂは毛細胞となって角化し、次々に形成される毛細胞に押し上げられて毛を形成する。
【００２３】
その後退行期（II）に入ると、毛母細胞ｂは分裂を停止し、さらに休止期（III）に入ると、毛乳頭細胞ａから毛母細胞ｂへの栄養分の供給が止まり、毛母細胞ｂはアポトーシスにより死滅し、やがて脱毛する。一定期間の休止期（III）を経ると、毛周期は再び成長期（Ｉ）に入る。
【００２４】
このように、毛周期のうち成長期（Ｉ）は、毛根における細胞分裂が最も盛んであり、毛根に存在する細胞数が最も多くなる。従って、毛根から生体物質の抽出を行なう際には、成長期（Ｉ）にある毛から抽出を行なうことで、量及び質ともに十分な生体物質を抽出することが望ましい。
【００２５】
仮に、退行期（II）や休止期（III）にある毛の毛根から生体物質の抽出を行なうと、これらの期間では毛根の細胞は分裂を停止した状態にあり、例えばＲＮＡの場合、細胞内の転写活性が極めて低い状態となっているために十分な量を抽出することができない。
【００２６】
図２に、毛髪を任意に抜去した場合に、それぞれの毛髪の毛根から抽出されるＲＮＡ量を示した。図２横軸は、各毛髪のサンプル番号、縦軸は各サンプルから調製されたＲＮＡ溶液の濃度（ｎｇ／本）を示す。本発明におけるＲＮＡの抽出方法については詳しく後述する。
【００２７】
サンプル番号１〜１２の毛髪から調製されたＲＮＡ溶液の濃度は、数ｎｇ／本から４０ｎｇ／本と非常にばらついており、任意に抜去した毛髪からは安定した量のＲＮＡを抽出することができないことが分かる。
【００２８】
本願発明者らは、このようなばらつきを排除するため鋭意検討を行なった結果、抜去するために所定の基準値以上の引っ張り力を要する毛の毛根を選別して生体物質の抽出を行なうことにより、量的及び質的に安定して生体物質を得ることができることを見出した。
【００２９】
上述の通り、退行期（II）や休止期（III）においては、毛母細胞ｂは分裂を停止しアポトーシスにより死滅するため、毛は非常に脱毛し易い状態となっている。これに対して、成長期（Ｉ）では、毛母細胞ｂが盛んに分裂し、毛根は細胞が充実した状態となっているため、毛は抜けにくい。従って、成長期（Ｉ）にある毛は、退行期（II）や休止期（III）にある毛に比べて、毛を抜去する際により大きな引っ張り力を要する。すなわち、抜去するために所定の基準値以上の引っ張り力を要した毛は成長期（Ｉ）にある毛とみなすことができるため、このような毛を選別することにより、量的及び質的に安定して生体物質を得ることが可能になったものと考えられる。
【００３０】
この方法は、ヒト又は非ヒト動物の皮膚を覆う全ての毛に対して適用することが可能であり、特にヒトの毛髪に対して好適に適用することができる。また、採取部位の毛を一旦全て剃った後に、生えてきた毛を選択することで、より確実に成長期（I）にある毛を得ることもできる。
【００３１】
この際、成長期（Ｉ）にある毛と退行期（II）や休止期（III）にある毛を区別し得る所定の基準値は、本法を適用する動物種や毛の部位により適宜設定することができる。このうち、ヒトの毛髪に適用する場合には、基準値を５０ｇに設定することにより、抽出生体物質の量及び質を最適化し得ることが判明した。
【００３２】
ここで、上記基準値をあまりに大きく設定すると、毛が毛幹部で切れたり、毛根が損傷して毛乳頭細胞（図１符合ａ参照）が皮膚側に残ってしまったりすることが多くなり、毛根からの生体物質の抽出が不良となるおそれが生ずる。
【００３３】
また、本発明は、抜去するために所定の基準値以上の引っ張り力を要する毛を選別するための毛採取器具をも提供するものである。
【００３４】
以下、本発明に係る毛採取器具の好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００３５】
図３は、本発明に係る毛採取器具の第一実施形態の断面図である。
【００３６】
図３（Ａ）中、符号Ａで示される毛採取器具は、外筒１と、該外筒内部を矢印Ｐ方向に移動可能な内筒２と、毛を挟持する手段であるチャック部３を備える。毛採取器具Ａは、チャック部３において符号Ｈで示される毛を挟持して体表Ｔから抜去する。チャック部３は、後述する生体物質の抽出過程における作業を容易にするため、強力な磁石等を用いて、内筒２と着脱可能な設計とすることが好ましい。本図では、外筒１、内筒２、チャック部３は金属製の部材として示したが、材質については金属製に限定されず、樹脂製であってもよい。本発明において、各部材の材質は特に言及しない限り限定されないものとする。
【００３７】
チャック部３により毛Ｈを挟持する際には、毛Ｈのうち体表から１０ｍｍ以内の部位を挟持することが望ましい。これにより、抜去時に毛Ｈが毛幹で切れたり、毛根が損傷したりするのを防止することが可能である。
【００３８】
毛採取器具Ａは、さらに毛Ｈを抜去する際にチャック部３に負荷される引っ張り力を測定する手段として、外筒バネ５を備えている。外筒バネ５は、内筒２を外筒１の他端に位置するバネ力調整ネジ４に接続しており、矢印Ｑ０で示される復元力を発揮している。外筒１には内筒制止板１１が設けられており、内筒２は初期状態において、上記復元力Ｑ０により該内筒制止板１１に係止されている。ここで、外筒バネ５は、バネに替えて、復元力Ｑ０を発揮し得る弾性体を広く採用することが可能であり、後述する内筒バネ２１についても同様である。
【００３９】
毛採取器具Ａにより毛Ｈを引っ張ると、チャック部３及び内筒２に引っ張り力Ｆが負荷される。
【００４０】
引っ張り力Ｆが上記外筒バネ５によって内筒２に付与される復元力Ｑ０よりも小さい場合、すなわちＦ＜Ｑ０の場合には、チャック部３及び内筒２は、上述の初期状態（内筒制止板１１に係止された状態）に留まる。
【００４１】
すなわち、毛Ｈが抜けやすい状態にあって、毛Ｈの抜去に要する引っ張り力Ｆが復元力Ｑ０よりも小さい（Ｆ＜Ｑ０）場合には、チャック部３及び内筒２は、上述の初期状態（内筒制止板１１に係止された状態）を維持したまま、毛Ｈは抜去されることとなる。
【００４２】
一方、毛Ｈが抜けにくい状態にあって、引っ張り力Ｆが復元力Ｑ０を超えた場合、すなわちＦ＞Ｑ０となった場合には、チャック部３及び内筒２は、引っ張り力Ｆにより牽引されて、矢印Ｐ方向へ移動することとなる。この際、チャック部３及び内筒２の移動に伴って、外筒バネ５は伸展し、復元力を当初のＱ０からＱ１（Ｑ１＞Ｑ０）へと増加させる（図３（Ｂ）参照）。
【００４３】
ここで、内筒２内には、該内筒２の内壁に内筒バネ２１により接続されたストッパー２２が設けられている。ストッパー２２は、内筒バネ２１が発揮する復元力ｑにより、内筒２の壁面に開口するストッパー用窓２３を通して、外筒１へ押圧されている。また、外筒１の内壁には、ストッパー２２が嵌合し得る陥凹部１２が設けられている。
【００４４】
図３（Ｃ）に示すように、チャック部３及び内筒２が、引っ張り力Ｆにより矢印Ｐ方向へ移動すると、ストッパー２２が復元力ｑによる押圧を受けて陥凹部１２に嵌合し、内筒２及びチャック部３の矢印Ｐ方向への移動が制限（ロック）される。
【００４５】
このときの内筒２及びチャック部３に負荷される引っ張り力Ｆと拮抗する外筒バネ５の復元力をＱｓとすると、外筒バネ５は、その復元力（Ｑ０、Ｑ１、Ｑｓ）を基準として、下限値Ｑ０から上限値Ｑｓまでの範囲において引っ張り力Ｆを測定する機能を発揮するということができる。
【００４６】
図３（Ｃ）に示すように一旦内筒２及びチャック部３がロックされると、チャック部３は復元力Ｑｓとの拮抗を超えて、必要な大きさの引っ張り力Ｆを発揮し毛Ｈを抜去する。
【００４７】
すなわち、毛Ｈを抜去するために復元力Ｑｓ以上の引っ張り力Ｆを要した場合には、チャック部３及び内筒２がストッパー２２によりロックされた上、毛Ｈは抜去されることとなる。しかし、毛Ｈが復元力Ｑｓ以下の引っ張り力Ｆにおいて抜去された場合には、チャック部３及び内筒２はロックされることなく、復元力Ｑ１により初期状態（内筒制止板１１に係止された状態）にまで戻ることとなる。
【００４８】
このように毛採取器具Ａでは、ストッパー２２によるロックを１つの指標として、抜去するために所定の基準値（＝復元力Ｑｓ）以上の引っ張り力Ｆを要した毛Ｈのみを選別することが可能である。この際、復元力Ｑｓは、バネ力調整ネジ４により増減することが可能であり、抜去する毛Ｈの部位等に応じて適宜変更することができる。
【００４９】
図４は、本発明に係る毛採取器具の第二実施形態の正面図である。
【００５０】
図４中符号Ｂで示される毛採取器具は、毛Ｈを抜去する際にチャック部３に負荷される引っ張り力を測定する手段として、外筒１内部に図示しない力センサー部を備え、また外筒１表面には表示部１３を備えている。毛採取器具Ｂは、チャック部３に毛Ｈを挟持して引っ張ると、力センサー部によりチャック部３に負荷される引っ張り力Ｆを測定し、該表示部１３に引っ張り力Ｆを数値表示する。
【００５１】
既に説明したように、抜去するために所定の基準値以上の引っ張り力を要した毛は成長期（Ｉ）（図１参照）にある毛とみなすことができ、このような毛を選別することにより、量的及び質的に安定して生体物質を得ることが可能となった。しかしながら、本願発明者らは、基準値以上であっても過度に大きな引っ張り力で毛を抜去すると、毛が毛幹部で切れたり、毛根部が損傷して毛母細胞（図１符合ｂ参照）が皮膚側に残ってしまったりして、毛根からの生体物質の抽出が不良となることを見出した。従って、引っ張り力の基準値には、下限値に加えて上限値を設けることが望ましい。
【００５２】
この点、毛採取器具Ｂでは、抜去するために要した引っ張り力Ｆが数値表示されるため、引っ張り力Ｆが前記下限値と上限値の間に入っているか否かを確認することが可能となっている。さらに毛Ｈの抜去に要した引っ張り力Ｆが、所定の下限値と上限値内であった場合には、表示部１３に「ＯＫ」判定を表示させることにより、一層確認を容易にすることができる。これにより、毛採取器具Ｂではさらに生体物質の抽出に適した毛を選別することが可能となっている。
【００５３】
図５（Ａ）は、本発明に係る毛採取器具の第三実施形態のチャック部３の拡大正面図である。（Ｂ）に比較のため、毛採取器具Ａのチャック部３の拡大正面図を示した。また（Ｃ）は、毛Ｈが生えている方向の体表Ｔに対する角度を説明するための図である。
【００５４】
図５（Ａ）中符号Ｃで示される毛採取器具は、毛Ｈの抜去方向の体表Ｔに対する角度を規定する手段であるアーム２４を備えている。本図において、アーム２４は内筒２に連設されているが、これに限らず外筒１（図示なし）その他の部材に連設してもよく特に限定されない。
【００５５】
毛根から安定して生体物質を抽出するためには、成長期（Ｉ）（図１参照）にある毛を選別することに加え、上述のように、過度の引っ張り力による毛根の損傷を避ける必要がある。さらに、本願発明者らは、毛を引き抜く方向によっても毛根が損傷され得ることを見出し、これを防止するため、毛が生えている方向の体表に対する角度を変化させずに抜去することが有効であることを明らかにした。
【００５６】
すなわち、毛採取器具Ｃは、毛Ｈの生えている方向の体表に対する角度を変化させずに抜去することを可能とするものである。
【００５７】
より具体的には、まず図５（Ｃ）において、体表Ｔに対して毛Ｈは角度α方向に生えているものとする。このとき、アーム２４を具備しない毛採取器具Ａにより毛Ｈを抜去する場合には、毛Ｈとともに体表Ｈの一部が引っ張られ、毛Ｈの体表Ｈに対する角度はαからβへと変化してしまう。
【００５８】
一方、毛採取器具Ｃの場合には、アーム２４が体表Ｔを押圧するため、体表Ｔが引っ張られることがなく、体表Ｔに対する当初角度αを維持したまま毛Ｈを抜去することが可能である。
【００５９】
さらにアーム２４を、支持部２４１と体表当接部２４２とが屈曲点２４３により連設された構成とすることにより、毛Ｈ及び体表Ｔの部位に応じて適宜支持部２４１と体表当接部２４２がなす角度γを調整することが望ましい。これにより、体表Ｔに対する当初角度αを維持したまま毛Ｈを抜去することが一層容易となる。
【００６０】
図６（Ａ）に、毛採取器具Ａで抜去した毛の毛根の拡大図、（Ｂ）に毛採取器具Ｃで抜去した毛の毛根の拡大図を示す。図６（Ｂ）では（Ａ）に比べて、毛根の末端部（毛球）が大きく、多数の細胞（毛母細胞（図１符合ｂ参照））が含まれているものと推察できる。これらの毛根から生体物質の抽出を行なった成績については、実施例で説明する。
【００６１】
図７は、本発明に係る毛採取器具の第四実施形態の正面図である。
【００６２】
図７中、符号Ｄで示される毛採取器具は、抜去した毛の毛根の形状を拡大観察する手段である拡大鏡６を備えている。毛採取器具Ｄにおいては、抜去後チャック部に保持されている毛Ｈの毛根ｈを拡大鏡６に設けたレンズ６１により拡大観察することが可能である。これにより、図６に示したように、抜去した毛根ｈの形状を視認の上確認することができる。
【００６３】
ここで、毛採取器具Ｄでは、抜去した毛の毛根ｈの形状を拡大観察する手段として拡大鏡６を設けたが、拡大鏡６に替えてマイクロスコープなどを配設することも可能である。マイクロスコープなどを用いて毛根ｈの毛根画像情報を取得し、コンピュータープログラムによって毛根ｈの形状を自動判定して、その結果を採取者に通知することで、より簡便に良好な生体物質の抽出が可能な毛Ｈを選別することができる。
【００６４】
図８は、本発明に係る毛採取器具の第五実施形態を示す概念図である。
【００６５】
図８中、符号Ｅで示される毛採取器具は、毛根ｈの毛根画像情報を取得する取得手段８１と、予め取得された基準毛根画像情報を記憶する記憶手段８２と、取得された毛根画像情報に基づいて毛根の形状を判定する判定手段８３と、を備えている。
【００６６】
取得手段８１により取得された毛根画像情報は、判定手段８３へ出力される。取得手段８１には、通常用いられるＣＣＤカメラ等の撮影装置を採用することができる。
【００６７】
記憶手段８２には、予め取得手段８１による毛根画像情報を取得した後、生体物質の抽出を行った結果良好な抽出成績が得られた毛根についての毛根画像情報（基準毛根画像情報）が記憶されている。そして、記憶された基準毛根画面情報は、判定手段８３へ出力される。
【００６８】
判定手段８３は、取得手段８１から入力される毛根ｈの毛根画像情報と、記憶手段８２から入力される基準毛根画像情報との比較に基づいて、毛根ｈの形状を判定し、判定結果を表示部１３（図４も参照）に出力する。記憶手段８２及び判定手段８３は、図に示すように別体に構成してもよいが、汎用のコンピューターを用いて一体に構成してもよい。
【００６９】
判定手段８３による毛根ｈの毛根画像情報と基準毛根画像情報との比較は、汎用の画像解析プログラム、若しくはこれを改良したものを用いて行えばよい。一例として、毛根画像情報に基づいて、毛根ｈの輪郭線における変曲点を検出し、その数を算出することにより比較を行う方法や、毛根ｈの輝度を算出することにより比較を行う方法が考えられる。
【００７０】
以下、図９〜図１１を参照しながら、毛根ｈの輪郭線における変曲点を検出し、その数を算出することにより、毛根ｈの形状を判定する方法について説明する。
【００７１】
図９は、判定手段８３における判定方法を示すフローチャートである。
【００７２】
まず、ステップ１（図中、「Ｓ１」で示す。以下同じ。）において、判定手段８３は、取得手段８１から毛根ｈの毛根画像情報を獲得する。次にＳ２で毛根ｈの毛根画像情報に基づいて毛根ｈの輪郭線の抽出を行い、さらにＳ３で輪郭線における変曲点の抽出、Ｓ４で変曲点数の算出を行う。
【００７３】
ここで、「変曲点」とは、所定の関数の凹凸が変化する境目をいい、所定の関数の一次微分関数の傾きの正負が逆転する点をいう。本発明においては、毛根ｈの輪郭線の凹凸が変化する境目をいい、輪郭線に対する接線の傾きの正負が逆転する点をいうものとする。
【００７４】
図１０及び図１１は、Ｓ２及びＳ３で抽出される毛根ｈの輪郭線及びその変曲点の具体例を示す図である。それぞれ（Ａ）は取得手段８１により取得される毛根画像を示し、（Ｂ）はこの毛根画像から抽出した毛根ｈの輪郭線と変曲点を示している。（Ｂ）中、符号ｒで示す変曲点の数は、図１０では５、図１１では１である。
【００７５】
続いて、判定手段８３は、Ｓ５において算出された変曲点数を、同様の方法により基準毛根画像情報から算出された基準変曲点数と比較することで、毛根ｈの形状を判定し、判定結果を表示部１３に出力する（Ｓ６）。
【００７６】
基準変曲点数は、所望する生体物質の量及び質等に応じて、適宜設定されることとなるが、実施例において後述するように、本願発明者らは、変曲点数が多く毛根ｈの輪郭線が複雑な形状である場合、良好な生体物質の抽出が可能であることを見出している。従って、判定手段８３は、毛根ｈの変曲点数が基準変曲点数よりも多い場合に、「生体物質の抽出に適した毛である」との判定結果を出力し、その旨を表示部１３に表示させる。逆に、毛根ｈの変曲点数が基準変曲点数よりも少ない場合には、「生体物質の抽出に不適切な毛である」との判定結果を出力し、その旨を表示部１３に表示させる。
【００７７】
また、判定手段８３による毛根ｈの形状の判定は、毛根画像中における毛根ｈの輝度を算出することにより比較を行う方法も考えられる。
【００７８】
ここで、「輝度」とは、毛根ｈの画像中における明るさの差をいうものとし、最も明るく撮影された領域の明るさと、最も暗く撮影された領域の明るさとの明るさの比（明るい領域／暗い領域）をいうものとし、この明暗比が大きい程「輝度が大きい」というものとする。なお、明暗比は、毛根ｈの画像中における濃淡の比（濃い領域／淡い領域）ということもでき、最も濃く撮影された領域の濃さと、最も淡く撮影された領域の濃さとの濃淡の差の大きさと同義にみなすことができる。
【００７９】
実施例において後述するように、本願発明者らは、輝度が大きい場合、良好な生体物質の抽出が可能であることを見出している。このことから、判定手段８３により、毛根画像情報に基づいて輝度を算出し、基準毛根画像情報から算出された基準輝度と比較することで、毛根ｈの形状を判定することが可能となる。
【００８０】
以上のように、毛採取器具Ｅでは、毛根の形状を自動で判定し、判定結果を表示することで、生体物質の抽出に適した毛をより的確に選択することが可能とされている。
【００８１】
次に、図１２に基づいて、抜去した毛から生体物質を抽出するための具体的な方法について説明する。
【００８２】
本願発明者は、抜去した毛から簡便かつ確実に生体物質を抽出するためのキットとして、図１２に示す抽出キットを案出した。毛から生体物質を抽出する際の問題点として、採取後の毛の取り扱いが困難なため、抽出作業の過程で毛根の損傷や、コンタミネーションによる生体物質の品質劣化が生じていた。このため、これまで説明したような方法により、適切な毛を採取したとしても、解析結果が不安定となることがあった。そこで、作業者が簡単に扱うことができ、採取した毛の毛根を確実に内部に収容することができる抽出キットを提供する。
【００８３】
抽出キットの使用方法について以下に具体的に説明する。まず、毛採取器具Ａ〜Ｄのチャック部３に保持された毛Ｈを、チャック部３と一体に内筒２（図示なし）から取り外す（図１２（Ａ）参照）。チャック部３は、抽出過程における作業を容易にするため、強力な磁石等を用いて、内筒２と着脱可能な設計とすることが好ましい旨上述したが、チャック部３を取り外すことなく作業を行なうことも当然に可能である。
【００８４】
続いて、チャック部３に保持された毛Ｈを、キャップ７１に設けた切れ込み７２に、キャップ７１の中心方向へ押し込むようにして挟み込む（図１２（Ｂ）参照）。この操作により、抜去した毛Ｈの一本一本を確実に抽出作業へ進めることが可能となる。なお、図１２（Ｂ）において、（Ｂ１）はキャップ７１の切れ込み７２側の側面図、（Ｂ２）はキャップ７１の上面図を表している。
【００８５】
図１２（Ｃ）に示す本体７３は、蓋７４を備え、内部に抽出溶液７５を満たしている。キャップ７１を、前工程において切れ込み７２に挟み込まれた状態となっている毛Ｈとともに、本体７３内に嵌め込んでいくと、切れ込み７２が閉じて、キャップ７１は毛Ｈをより強固に挟み込むと同時に、抽出溶液７５を密封する。このとき、毛Ｈの毛根ｈは抽出溶液７５中に浸漬される（図１２（Ｄ）参照）。
【００８６】
次に、図１２（Ｅ）に示すように、キャップ７１の上から蓋７４を閉め、キャップ７１及び抽出溶液７５を完全に本体７３内に密封した後、本体７３を蓋７４が下面となるように引っ繰り返す（図１２（Ｆ）参照）。
【００８７】
容器底面には、ピペットチップｔの先端で穿孔することが可能なピペット挿入部７６が設けられており、ピペット操作により抽出溶液７５を攪拌、吸引し、また他の試薬を注入することができるように構成されている。
【００８８】
これにより、毛根ｈからの生体物質の抽出作業を本体７３内において完了させることが可能となる。例えば、抽出溶液７５内に核酸を吸着する樹脂やシリカビーズ等を含有させておくことにより、抽出溶液７５内で毛根ｈから溶出させた核酸を、該樹脂やシリカビーズに吸着させる。その後、ピペット操作により抽出溶液の吸引、及び洗浄溶液や再溶出溶液の注入を行なうことにより、核酸の抽出を行なう。
【実施例】
【００８９】
本発明に係る生体物質抽出方法の効果について以下に検討を行なった。ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク、元素等の生体物質のうち、ＲＮＡは特に分解しやすいため取り扱いが難しく、良質なＲＮＡを多量に確保することが、実験の再現性を左右する重要な要素となっている。従って、本実施例においては、以下生体物質として特にＲＮＡを対象として検討を行なった。
【００９０】
＜実施例１＞
引っ張り力の検討
本実施例では、ヒトの毛髪を用いて毛を抜去するために要した引っ張り力と、抽出されたＲＮＡの量及び質との関係を検討した。
【００９１】
毛髪は、後頭部のうち両側の耳の間に位置する部分で、かつ耳間中央（正中）部分から抜去した。抜去した毛髪の毛根から、Qiagen社のＲＮＡ抽出キット（RNeasy Micro Kit）を使用して、提供プロトコル（RNeasy micro.pdf、p11−16参照）に従いトータルＲＮＡ（以下単にＲＮＡという）溶液を調製した。その後Agilent RNA 6000 Nano Kit を用いて、Agilent社のBioanalyzer2100によってＲＮＡ濃度の測定を行なった。プロトコルはメーカーの提供プロトコルに従った（RNA6000 nano.pdf参照）。
【００９２】
結果を図１３に示す。図１３横軸は、毛髪を抜去するために要した引っ張り力（ｇ）、縦軸は該毛髪から抽出されたＲＮＡ溶液の濃度（ｎｇ／本）を示す。
【００９３】
５０ｇ以上の引っ張り力を要した毛髪（図中Ａ群）では、４０ｎｇ／本以上の高濃度のＲＮＡ溶液が抽出された。これに対して、引っ張り力が３５〜４０ｇであった毛髪（Ｂ群）及び５ｇであった毛髪（Ｃ群）では、ともにＲＮＡ溶液の濃度は２５ｎｇ／本以下と低濃度であった。なお、Ｃ群には、頭髪を手で梳いた際に抜け落ちたものを、引っ張り力５ｇで抜去された毛髪とみなして用いている。
【００９４】
以上より、引っ張り力５０ｇを基準値として、該基準値以上の引っ張り力を要する毛髪の毛根からＲＮＡを抽出することにより、安定して高濃度のＲＮＡ溶液を調製できることが示された。
【００９５】
次に、上記のＡ群〜Ｃ群の毛髪から抽出されたＲＮＡの質について検討を行なった。
【００９６】
既に述べたとおり、ＲＮＡは非常に不安定で分解されやすい性質を有する。分解されたＲＮＡでは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）も切断されているため、逆転写酵素によるｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を行なう際に、ｃＤＮＡ合成が不能となるか、もしくは短い断片のｃＤＮＡしか合成することができなくなるといった問題が生じる。この場合、当該ｃＤＮＡを用いた遺伝子発現解析も難しくなる。
【００９７】
ＲＮＡの質を確認する手段としては、従来、電気泳動によりＲＮＡを分離して、リボゾーマルＲＮＡ（１８ｓＲＮＡ及び２６ｓＲＮＡ）のバンドを確認することが行なわれている。分解が進んだＲＮＡでは、リボゾーマルＲＮＡのバンドが減少もしくは消失する。これに対して、分解していない良質なＲＮＡでは、リボゾーマルＲＮＡのバンドが明確に確認される。
【００９８】
上記のＡ群〜Ｃ群から抽出したＲＮＡ溶液を、Agilent RNA 6000 NanoKit を用いて、Agilent社のBioanalyzer2100を利用して電気泳動により分離し、リボゾーマルＲＮＡ（１８ｓＲＮＡ及び２６ｓＲＮＡ）のバンド強度を測定した。プロトコルはメーカの提供プロコルに従った（RNA6000 nano.pdf参照）。
【００９９】
結果を図１４に示す。図１４横軸は電気泳動時間（秒（ｓ））、縦軸はバンド強度（蛍光ユニット（ＦＵ））を示す。
【０１００】
図１４（Ａ）は、図１３のＡ群（５０ｇ以上の引っ張り力を要した毛髪）から抽出したＲＮＡの電気泳動パターンである。泳動時間３５ｓ付近において、１８ｓＲＮＡに由来するバンド（図中＊参照）が４ＦＵ以上の高強度で検出されている。同様に、泳動時間４０ｓ周辺では、２６ｓＲＮＡに由来するバンド（図中＊＊参照）が高強度に観察される。
【０１０１】
これに対して、図１３のＢ群（引っ張り力が３５〜４０ｇであった毛髪）から抽出したＲＮＡでは、１８ｓＲＮＡ及び２６ｓＲＮＡに由来するバンドは、ピークとして観察されるものの、その蛍光強度は１８ｓＲＮＡのバンドで２ＦＵ前後と、Ａ群に比べて顕著に低下している（図１４（Ｂ）参照、縦軸方向のスケールに注意）。このことは、Ｂ群では、Ａ群に比してＲＮＡの分解が進んでいることを示している。
【０１０２】
さらに、図１３のＣ群（引っ張り力が５ｇであった毛髪）から抽出したＲＮＡでは、１８ｓＲＮＡ及び２６ｓＲＮＡに由来するバンドが観察されず、電気泳動によってＲＮＡに由来する蛍光そのものが検出されなかった（図１４（Ｃ）参照）。
【０１０３】
以上より、引っ張り力５０ｇを基準値として、該基準値以上の引っ張り力を要する毛髪の毛根からＲＮＡを抽出することにより、安定して高品質のＲＮＡ溶液を調製できることが示された。
【０１０４】
次に、図１３のＡ群（５０ｇ以上の引っ張り力を要した毛髪）から抽出したＲＮＡを用いて、遺伝子発現解析結果の再現性について検討を行なった。
【０１０５】
対照群としては、Ａ群と同様の部位から任意に抜去した毛髪を用いた。Ａ群及び対照群の毛髪から上記の方法によりＲＮＡを抽出し、定法により逆転写酵素を用いたｃＤＮＡ合成を行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定した。ＧＡＰＤＨ遺伝子は、いわゆるハウスキーピング遺伝子として知られ、遺伝子発現解析において遺伝子発現量の指標として用いられている。
【０１０６】
結果を図１５に示す。図１５横軸はＡ群及び対照群における毛髪の各サンプル番号、縦軸は各サンプルにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の相対発現量を示す。
【０１０７】
図中丸印で示されるＡ群においてＧＡＰＤＨの発現量は、ひし形で示される対照群に比して、最大値と最小値の幅が小さく、ぶれが小さいことが分かる。すなわち、Ａ群においては各サンプル間で、高い再現性をもってＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を定量することができた。
【０１０８】
以上より、引っ張り力５０ｇを基準値として、該基準値以上の引っ張り力を要する毛髪の毛根からＲＮＡを抽出することにより、再現性の高い遺伝子発現解析が可能となることが明らかとなった。
【０１０９】
＜実施例２＞
抜去方向及び毛根形状の検討  本実施例では、毛の抜去方向の体表に対する角度及び抜去した毛根の形状と、抽出されたＲＮＡの量及び質との関係を検討した。
【０１１０】
図１６には、毛の抜去方向の体表に対する角度を規定する手段を用いて、毛の生えている方向の体表に対する角度を変化させずに抜去した毛髪（Ａ）と、任意の角度で抜去した毛髪（Ｂ）の毛根の拡大図及びこれらの毛根から抽出したＲＮＡ溶液の濃度（Ｃ）を示した。
【０１１１】
図１６（Ｂ）では（Ａ）に比べて、毛根の末端部（毛球）が大きく、多数の細胞（毛母細胞（図１符合ｂ参照））が含まれていると推察することができる。
【０１１２】
これらの毛根から抽出されたＲＮＡ量は、角度を規定して抜去した毛髪（Ｂ）では９３．９３nｇ／本であり、任意の角度で抜去した毛髪（Ａ）の４０．１４nｇ／本に比して有意に増加した。
【０１１３】
以上より、毛の抜去方向の体表に対する角度を規定する手段を用いて毛を抜去することにより、毛根からのＲＮＡ抽出量が増加することが示された。
【０１１４】
図１７には、抜去した毛髪について、毛根の輪郭線における変曲点の数が３以上であるもの（Ｄ群：（Ｄ１）〜（Ｄ４））と、２以下であるもの（Ｅ群：（Ｅ１）〜（Ｅ４））を示した。なお、（Ｅ４）に示す毛髪は、抜去の際に毛幹部で切断された毛髪である。
【０１１５】
表１には、Ｄ群及びＥ群の毛根から抽出されたＲＮＡの量及び質を示した。ＲＮＡ量は、実施例１に記載した方法により調製したＲＮＡ溶液の濃度（pg/μl）として示した。なお、（Ｅ４）の毛髪については、ＲＮＡの抽出が不能であった。
【０１１６】
ＲＮＡ品質は、実施例１と同様の方法によりＲＮＡの電気泳動及びバンド強度の測定を行って得たリボゾーマルＲＮＡの存在比（２６ｓＲＮＡ／１８ｓＲＮＡ）により示した。図１８には、各サンプルのＲＮＡ電気泳動パターンを示す。２６ｓＲＮＡ／１８ｓＲＮＡは、その値が高い程ＲＮＡの品質が良いことを意味している。なお、Ｅ群に関しては、ＲＮＡの抽出量が少なく、品質の評価は不能であった。
【０１１７】
【表１】
2008241687.tif 000003
【０１１８】
表に示すように、変曲点数が３以上であるＤ群の毛根からは、変曲点数が２以下であるＥ群毛根に比べて、抽出されるＲＮＡの量及び質がともに優れていることが確認された。このことは、毛根の輪郭線における変曲点の数が多く、複雑な形状を有する毛根ほど、良好な生体物質を抽出し得ることを示している。
【０１１９】
また、図１７から分かるように、Ｄ群の毛根は、Ｅ群毛根に比べて、輝度（明暗比もしくは濃淡比）が大きかったことから、輝度の大きい毛根ほど、良好な生体物質を抽出し得ることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明に係る生体物質抽出方法は、微量試料を用いた遺伝子発現解析、遺伝子多型解析、プロテオーム解析等の各種解析に用いることが可能であり、疾患メカニズムの解明や、創薬ターゲットの探索等に貢献し得る。また、本発明に係る毛採取器具は、臨床の現場での毛髪採取を容易にし、解析データの蓄積やこれによる診断方法の確立に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】毛周期を説明するための皮膚断面を表す模式図である。
【図２】任意に抜去した毛髪から抽出されたＲＮＡ量を示す図である。
【図３】本発明に係る毛採取器具の第一実施形態を示す断面図である。
【図４】本発明に係る毛採取器具の第二実施形態を示す正面図である。
【図５】本発明に係る毛採取器具の第三実施形態を示す正面図である。
【図６】毛採取器具Ａ及び毛採取器具Ｃを用いて抜去した毛の毛根の拡大図である。
【図７】本発明に係る毛採取器具の第四実施形態を示す正面図である。
【図８】本発明に係る毛採取器具の第五実施形態を示す概念図である。
【図９】判定手段８３における判定方法を示すフローチャートである
【図１０】毛根ｈの輪郭線及びその変曲点の具体例を示す図である。
【図１１】毛根ｈの輪郭線及びその変曲点の具体例を示す図である。
【図１２】抜去した毛から生体物質を抽出するためのキットを説明する図である。
【図１３】抜去するために要した引っ張り力と、抽出されたＲＮＡ量との関係を示す図である。
【図１４】抽出されたＲＮＡの電気泳動パターンを示す図である。
【図１５】ＧＡＰＤＨ遺伝子の遺伝子発現解析の結果を示す図である。
【図１６】毛の抜去方向を規定した場合の効果を説明するための図である。
【図１７】抜去後の毛髪を、輪郭線における変曲点の数により分類した図である。
【図１８】図１７に示した各毛髪から抽出されたＲＮＡの電気泳動パターンを示す図である。
【符号の説明】
【０１２２】
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ  毛採取器具
Ｆ  引っ張り力
Ｈ  毛
ｈ  毛根
Ｔ  体表
Ｑ、ｑ  復元力
ｒ  変曲点
１  外筒
１１  内筒制止板
１２  嵌合部
１３  表示部
２  内筒
２１  内筒バネ
２２  ストッパー
２３  ストッパー用窓
２４  アーム
２４１  支持部
２４２  体表当接部
２４３  屈曲点
３  チャック部
４  バネ力調整ネジ
５  外筒バネ
６  拡大鏡
６１  レンズ
８１  取得手段
８２  記憶手段
８３  判定手段
【図９】
2008241687.tif 000004
【図１】
2008241687.tif 000005
【図２】
2008241687.tif 000006
【図３】
2008241687.tif 000007
【図４】
2008241687.tif 000008
【図５】
2008241687.tif 000009
【図６】
2008241687.tif 000010
【図７】
2008241687.tif 000011
【図８】
2008241687.tif 000012
【図１０】
2008241687.tif 000013
【図１１】
2008241687.tif 000014
【図１２】
2008241687.tif 000015
【図１３】
2008241687.tif 000016
【図１４】
2008241687.tif 000017
【図１５】
2008241687.tif 000018
【図１６】
2008241687.tif 000019
【図１７】
2008241687.tif 000020
【図１８】
2008241687.tif 000021