(57)【要約】【課題】筋肉組織由来の新規な分子および該分子の特異的検出方法を見出すことを目的とする。【解決手段】本発明は、哺乳動物筋肉組織において特異的な局在を示す、ジヒドロリポアミド・スクシニル転移酵素の選択的スプライシング変異体である新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、および該ポリペプチドの製造方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）  配列番号２または４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）  配列番号２または４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）  配列番号２または４のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失または付加を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）  配列番号６または８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）  配列番号６または８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）  配列番号６または８のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失または付加を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
筋肉組織由来である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
哺乳動物由来である、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
哺乳動物がラットである、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
哺乳動物がヒトである、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）  配列番号１の塩基配列の４８９−１２９８位の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号１の塩基配列の４８９−１２９８位の塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）  配列番号１の塩基配列の４８９−１２９８位の塩基配列において、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失または付加を含む塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）  配列番号３の塩基配列の５２１−１３３０位の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号３の塩基配列の５２１−１３３０位の塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）  配列番号３の塩基配列の５２１−１３３０位の塩基配列において、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失または付加を含む塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）  配列番号５の塩基配列の１９６−１２４２位の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号５の塩基配列の１９６−１２４２位の塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）  配列番号５の塩基配列の１９６−１２４２位の塩基配列において、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失または付加を含む塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）  配列番号７の塩基配列の１７９−１２２５位の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号７の塩基配列の１７９−１２２５位の塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）  配列番号７の塩基配列の１７９−１２２５位の塩基配列において、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失または付加を含む塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１２】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む形質転換宿主細胞。
【請求項１３】
以下のステップ：
（ｉ）  哺乳動物筋肉組織から筋原線維を調製し、これをピロリン酸を含有する溶液中でインキュベートするステップ、
（ｉｉ）  （ｉ）の可溶性画分から、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドを回収するステップ、
を含む、筋肉組織から該ポリペプチドを取得する方法。
【請求項１４】
ピロリン酸の濃度が１５ｍＭ〜５０ｍＭである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
以下のステップ：
（ｉ）  請求項１２に記載の形質転換宿主細胞を培地中で培養するステップ、
（ｉｉ）  該宿主細胞または培地から、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドを回収するステップ
を含む、該ポリペプチドの製造方法。
【請求項１６】
配列番号１８〜２５の塩基配列を有するプライマーのうち１つ以上を用いる、配列番号１、３、５または７の塩基配列を有するＤＮＡの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な筋肉由来タンパク質、それをコードするＤＮＡ、および該タンパク質を筋肉組織から精製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む哺乳動物の骨格筋を構成する組織は、筋線維とも称される細長い筋細胞の集合である。筋細胞の細胞質中には、筋細胞の長軸方向に平行に延びる筋原線維が束のような状態で存在する。筋原線維には光の屈折率の異なる部分が周期的に繰り返されて存在し、それらの部分はＡ帯（暗帯とも呼ばれる）、Ｉ帯（明帯とも呼ばれる）、Ｚ線（Ｚ盤とも呼ばれる）と称される。より詳細には、筋原線維の長軸方向に沿ってＡ帯とＩ帯が交互に出現し、Ｚ線はＩ帯の中央に位置する。これらの筋原線維の各部分は、筋線維中の筋原線維の束においては横並びとなっており、それにより筋線維は縞状に見える。これまでの研究により、筋原線維のＡ帯にはミオシン線維が長軸方向に配置され、Ｉ帯にはアクチン線維が長軸方向に配置され、これらの線維同士が滑り運動を行うことにより筋肉の収縮が起きることが明らかになっている。また、Ｚ線はＩ帯を構成するアクチン線維を固定する部分であることが明らかになっている（非特許文献１および２）。
【０００３】
【非特許文献１】Ａｌｂｅｒｔｓら、細胞の分子生物学・第４版，ニュートンプレス（２００４），９６１−９６４
【非特許文献２】廣川タンパク質化学（第６巻、細胞骨格と筋肉のタンパク質）、矢原一郎（編集）、廣川書店、平成９年５月
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
筋肉の収縮運動は動物が正常な活動を行うにあたって必須の現象である。また、ある種の重篤な疾患においては筋力の低下が引き起こされ、健常な動物においても老化に伴って筋力が低下し、それにより正常な生命活動が損なわれる場合がある。したがって、正常な生命活動と疾患における筋肉収縮という現象の重要性を考えれば、筋肉に存在する新規なタンパク質を特定し、その機能を明らかにする必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、筋肉の作動メカニズムとはまったく異なるアプローチから特定されたポリペプチドが、哺乳動物の骨格筋に存在し、当該ポリペプチドが他のタンパク質と高度に絡まり易い性質を有すること、および筋線維内で特異的な局在を示すことを明らかにする。また、哺乳動物骨格筋から当該ポリペプチドを精製する方法を提供する。
【０００６】
より詳細には、本発明は、以下の特徴を有する。
（１）  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）  配列番号２または４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）  配列番号２または４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）  配列番号２または４のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失または付加を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）  配列番号６または８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）  配列番号６または８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）  配列番号６または８のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失または付加を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（３）  筋肉組織由来である、上記（１）または（２）に記載のポリペプチド。
（４）  哺乳動物由来である、上記（３）に記載のポリペプチド。
（５）  哺乳動物がラットである、上記（４）に記載のポリペプチド。
（６）  哺乳動物がヒトである、上記（４）に記載のポリペプチド。
（７）  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）  配列番号１の塩基配列の４８９−１２９８位の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号１の塩基配列の４８９−１２９８位の塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）  配列番号１の塩基配列の４８９−１２９８位の塩基配列において、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失または付加を含む塩基配列からなるＤＮＡ。
（８）  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）  配列番号３の塩基配列の５２１−１３３０位の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号３の塩基配列の５２１−１３３０位の塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）  配列番号３の塩基配列の５２１−１３３０位の塩基配列において、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失または付加を含む塩基配列からなるＤＮＡ。
（９）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）  配列番号５の塩基配列の１９６−１２４２位の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号５の塩基配列の１９６−１２４２位の塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）  配列番号５の塩基配列の１９６−１２４２位の塩基配列において、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失または付加を含む塩基配列からなるＤＮＡ。
（１０）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）  配列番号７の塩基配列の１７９−１２２５位の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号７の塩基配列の１７９−１２２５位の塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）  配列番号７の塩基配列の１７９−１２２５位の塩基配列において、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失または付加を含む塩基配列からなるＤＮＡ。
（１１）  上記（７）〜（１０）のいずれか１つに記載のＤＮＡを含むベクター。
（１２）  上記（７）〜（１０）のいずれか１つに記載のＤＮＡを含む形質転換宿主細胞。
（１３）  以下のステップ：
（ｉ）  哺乳動物筋肉組織から筋原線維を調製し、これをピロリン酸を含有する溶液中でインキュベートするステップ、
（ｉｉ）  （ｉ）の可溶性画分から、上記（１）〜（６）のいずれかに記載のポリペプチドを回収するステップ、
を含む、筋肉組織から該ポリペプチドを取得する方法。
（１４）  ピロリン酸の濃度が１５ｍＭ〜５０ｍＭである、上記（１３）に記載の方法。
（１５）  以下のステップ：
（ｉ）  上記（１２）に記載の形質転換宿主細胞を培地中で培養するステップ、
（ｉｉ）  該宿主細胞または培地から、上記（１）〜（６）のいずれかに記載のポリペプチドを回収するステップ
を含む、該ポリペプチドの製造方法。
（１６）  配列番号１８〜２５の塩基配列を有するプライマーのうち１つ以上を用いる、配列番号１、３、５または７の塩基配列を有するＤＮＡの検出方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、筋肉組織の構造的強度を高める働きを有すると考えられる新規なポリペプチドを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明者らは、ラット骨格筋に、ミトコンドリアマトリックスにおいてＴＣＡ回路を担う酵素群の一員であるＤＬＳＴ（ジヒドロリポアミド・スクシニル転移酵素）に対する抗体と免疫反応性のタンパク質が存在することを見出し、これをＰＣＰ（Protein Clinging to the other Proteins）およびＰＣＰ−２と名付けた。
【０００９】
ＰＣＰおよびＰＣＰ−２は、以下に詳細に説明するように、筋肉の筋原線維に強固に結合しており、また、酵素的に分解されにくいという特徴を有する。
【００１０】
ＤＬＳＴはα−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体を構成するメンバーであり、ミトコンドリアマトリックスに局在し、α−リポ酸を補酵素として用いる（Nakanoら(1991), Journal of Biol. Chem. 266(28), 19013-19017；Nakanoら(1994), Eur. J. Biochem. 244, 179-189）。
【００１１】
本発明者らは、ミトコンドリア膜間に、ＤＬＳＴのＣ末端側のポリペプチドに相当するタンパク質が存在することを明らかにし、これをＭＩＲＴＤ（Mitochondrial Respiration generator of Truncated DLST）と名付けた。このタンパク質は、ＤＬＳＴ遺伝子のイントロン７から転写されるｍＲＮＡの翻訳産物であることが示された（Kanamoriら(2003), EMBO Journal, vol.22, 2913-2923）。これは、細胞内局在などから、本発明のポリペプチドとは異なるものである。
【００１２】
また、本発明者らは、骨格筋から筋原線維を除いた可溶性画分において、抗ＤＬＳＴ抗体に反応性の約２０ｋＤａのポリペプチドが検出されたことを報告している（Matsudaら(1997), Biochem. Biophys. Res. Commun. 241, 151-156）。これはＤＬＳＴの分解産物であると考えられ、生化学的性質から判断して、筋原線維より単離された本発明のポリペプチドとは異なるものである。
【００１３】
本発明のＰＣＰは、ＤＬＳＴ遺伝子の転写産物の選択的スプライシングにより、そのｍＲＮＡにおいてＤＬＳＴ遺伝子のエキソン２および３が欠落し、その結果、エキソン８から翻訳が開始されるものである。
【００１４】
また、本発明のＰＣＰ−２は、上記ＰＣＰの同定の過程で発見された、ＰＣＰよりも分子量の大きなタンパク質である。ＰＣＰ−２は、ＤＬＳＴ遺伝子の転写産物の選択的スプライシングにより、そのｍＲＮＡにおいてＤＬＳＴ遺伝子のエキソン２、３および６が欠落し、その結果、エキソン５から翻訳が開始されるものである。
【００１５】
上記のとおり、ＤＬＳＴ遺伝子の選択的スプライシング変異体であるＰＣＰおよびＰＣＰ−２では、ＤＬＳＴ遺伝子のエキソン２および３、またはエキソン２、３および６が欠落している。本発明者らは、ＤＬＳＴ遺伝子のイントロン１および４の塩基配列が動物種間で保存されていることを報告している（Nakanoら(2002), DNA Sequence, 13(6), 363-367）。このことは、ＤＬＳＴ遺伝子のイントロン１および４が、該遺伝子の選択的スプライシングの調節において重要な役割を果たしていることを示唆している。したがって、上記ＰＣＰおよびＰＣＰ−２の発現量は、ＤＬＳＴ遺伝子のイントロン１および４の塩基配列に関連してその発現量が調節されていることが予想される。
【００１６】
以下に説明する、筋肉組織を強化するというＰＣＰおよびＰＣＰ−２の機能から、これらのタンパク質ｍＲＮＡの翻訳領域での塩基配列の改変（アミノ酸配列の改変）または非翻訳領域での塩基配列変異による発現量の変化が、特に現在原因不明とされている筋肉疾患および心筋疾患をはじめとする、疾患の病因に関与している可能性がある。特に、ＤＬＳＴ遺伝子のエキソン領域での変異、およびイントロン１および４での変異による選択的スプライシング変異体の発現量の変化が、特に筋肉疾患の病因に関与していることが考えられる。
【００１７】
免疫組織化学により、ＰＣＰおよびＰＣＰ−２はラット下肢筋において筋原線維のＩ−Ｚ−Ｉ帯に局在することが示された。さらに、これも免疫組織化学的検討から、ＰＣＰおよびＰＣＰ−２は心筋にも存在することが明らかになった。また、当該タンパク質は、筋肉組織からの精製過程で筋肉組織の他のタンパク質と絡む性質が強く、精製が非常に困難である。このタンパク質が他のタンパク質と絡んだ状態で精製されることは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動像から判断することができる。そのような事実から、当該タンパク質が筋肉組織の他のタンパク質（例えばアクチン、トロポミオシン、α−アクチニン、ミオシン等）と絡まり易い性質を有していることが明らかになった。これらのことから、本発明のＰＣＰおよびＰＣＰ−２は、アクチン線維をＺ盤に固定すること、すなわちＺ盤に存在するα−アクチニン等と協働してアクチン線維をＺ盤に結合させること等、筋肉組織において重要な働きを有していることが示唆される。さらに、Ｉ−Ｚ−Ｉ帯は筋収縮において物理的な力がかかる部位であると考えられるため、上記のような予想されるＰＣＰおよびＰＣＰ−２の機能は、筋肉の強靭さにも関与していると考えられる。
【００１８】
また、これに関して、本発明者らは、ＰＣＰ−２は若齢で発現し、老化に伴ってその発現が低下することを確認した。
【００１９】
一態様において、本発明は、ＰＣＰポリペプチドおよびＰＣＰ−２ポリペプチドを提供する。本明細書中、ＰＣＰおよびＰＣＰ−２は、横紋筋においてＩ−Ｚ−Ｉ帯に局在し、他のタンパク質と絡まり易い性質を有する、ＤＬＳＴの選択的スプライシング変異体である。
【００２０】
本発明のＰＣＰポリペプチドまたはＰＣＰ−２ポリペプチドは、好ましくは筋肉組織由来のＰＣＰまたはＰＣＰ−２のアミノ酸配列を有し、さらに好ましくは哺乳動物由来のＰＣＰまたはＰＣＰ−２のアミノ酸配列を有する。より好ましくは、本発明のＰＣＰまたはＰＣＰ−２は、ラットまたはヒト由来のアミノ酸配列を有する。
【００２１】
本発明のＰＣＰポリペプチドは、ラットまたはヒト由来のそれぞれ配列番号２または４のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。本発明のＰＣＰ−２ポリペプチドは、ラットまたはヒト由来のそれぞれ配列番号６または８のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。ＰＣＰおよびＰＣＰ−２には、配列番号２もしくは４または配列番号６もしくは８のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドが包含される。「機能的に同等」とは、対象となるポリペプチドが、配列番号２もしくは４または配列番号６もしくは８のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物学的特性、すなわち筋肉組織の他のタンパク質（例えばアクチン、トロポミオシン、α−アクチニン、ミオシン等）と絡まり易い性質を有することを指す。ここで、「絡まり易い性質」とは、生理的条件下で筋肉組織を形成する他のタンパク質と非共有的に結合し、容易に結合がはずれない性質を意味する。換言すれば、ＰＣＰおよびＰＣＰ−２はタンパク質−タンパク質間を接着させ、タンパク質−タンパク質の結合を強固にする性質を有するので、このタンパク質の性質をタンパク質接着剤と特定できる。
【００２２】
配列番号２もしくは４または配列番号６もしくは８のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドには、配列番号２もしくは４または配列番号６もしくは８のアミノ酸配列において、１または複数、好ましくは１または数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが含まれる。当該ポリペプチドは、上記のＰＣＰおよびＰＣＰ−２の特性を有する。
【００２３】
ここで、数個とは、通常２〜１５個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４個、または２〜３個である。
【００２４】
また本発明においてＰＣＰには、配列番号２または４のアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
【００２５】
本発明においてＰＣＰ−２には、配列番号６または８のアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
【００２６】
２つのアミノ酸配列または塩基配列の％同一性を決定するためには、最適な比較がなされるように配列をアライメントする。２つの配列間の％同一性は、配列が共有する同一な位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一な位置の数／位置（例えば、一部重複する位置）の総数×１００）。１つの態様において、比較対象の２つの配列は同じ長さである。２つの配列間の％同一性は、ギャップを許容する場合、許容しない場合の両方で、以下に述べるものに類似した方法を用いて決定し得る。％同一性の算出に関しては、一般的に、厳密に一致するもののみを算定する。
【００２７】
２つの配列間の％同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877において改変された、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264のアルゴリズムである。この種のアルゴリズムは、Altschulら, (1990) J. Mol. Biol., 215, 403のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。本発明のポリペプチドの変異体を得るには、ＢＬＡＳＴのタンパク質検索を、スコア＝３０、ワード長（wordlength）＝３としたＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて実行するとよい。本発明のＤＮＡの変異体を得るためには、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、スコア＝１００、ワード長＝１２としたＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて実行するとよい。比較用のギャップが入ったアライメントを得るためには、Altschulら, (1997) Nucleic Acid Res., 25, 3389に記載されたＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いるとよい。
【００２８】
本発明のポリペプチドについては、その配列を基に当業者に公知の手法、例えば、アミノ酸１つ１つを化学的に重合してポリペプチドを合成する方法（固相ペプチド合成法）に従って調製することができる。さらに、ＰＣＰまたはＰＣＰ−２をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含む組換えベクターを作製し、該ベクターを適切な宿主細胞中に導入して得られる形質転換宿主細胞を培地中で培養し、その培養細胞または培地から回収することによっても本発明のポリペプチドを得ることができる。ここで使用する組換えベクター、宿主細胞、培地、各操作法および条件等については、当業者に公知のものの中から目的に応じて適宜選択することができる。
【００２９】
配列番号２もしくは４または配列番号６もしくは８のアミノ酸配列における、１または複数のアミノ酸の欠失、付加または置換は、常用される技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Zollerら、Nucleic Acids Res. 10 6478-6500, 1982）、変異を導入したプライマーを用いる公知のＰＣＲ法（Sambrook, Jら, Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab.press (1989)等）により、配列番号２もしくは４または配列番号６もしくは８のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡの配列（例えば、配列番号１もしくは３または配列番号５もしくは７の塩基配列）を改変することにより実施することができる。
【００３０】
ここで、アミノ酸の置換に関して、アミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷などの化学的性質または構造的性質においてそれぞれ異なるものであるが、実質的にポリペプチド全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。本発明のアミノ酸間の置換は、化学的または構造的性質の類似したアミノ酸間の保存的置換でもよいし、あるいは、そのような性質の異なるアミノ酸間の非保存的置換でもよい。化学的または構造的性質の類似したアミノ酸は次のように分類することができる。
【００３１】
疎水性アミノ酸群には、アラニン（Ａｌａ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、プロリン（Ｐｒｏ）が含まれる。
極性アミノ酸群には、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）が含まれる。
芳香族アミノ酸群には、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）が含まれる。
酸性アミノ酸群には、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）が含まれる。
塩基性アミノ酸群には、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）が含まれる。
【００３２】
例えば、保存的置換の例としては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、グリシンとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とアスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、スレオニンとセリン（Ｓｅｒ）またはアラニン、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等のアミノ酸の間での置換が含まれる。
【００３３】
本発明はまた、ＰＣＰまたはＰＣＰ−２をコードするＤＮＡを提供する。ＰＣＰをコードするＤＮＡの具体例としては、配列番号１の塩基配列の４８９−１２９８位の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号３の塩基配列の５２１−１３３０位の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。ＰＣＰ−２をコードするＤＮＡの具体例としては、配列番号５の塩基配列の１９６−１２４２位の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号７の塩基配列の１７９−１２２５位の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。本発明のＤＮＡにはまた、配列番号１の塩基配列の４８９−１２９８位の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３の塩基配列の５２１−１３３０位の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５の塩基配列の１９６−１２４２位の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号７の塩基配列の１７９−１２２５位の塩基配列からなるＤＮＡと機能的に同等のＤＮＡが包含される。ここで「機能的に同等」とは、対象となるＤＮＡによってコードされるポリペプチドが、上記のＰＣＰおよびＰＣＰ−２の特性、すなわち筋肉組織の他のタンパク質と絡まり易い性質を有することを指す。
【００３４】
あるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドをコードするＤＮＡを調製する当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook, Jら, Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab.press (1989)）を利用する方法が挙げられる。
【００３５】
配列番号１の塩基配列の４８９−１２９８位の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３の塩基配列の５２１−１３３０位の配列からなるＤＮＡ、配列番号５の塩基配列の１９６−１２４２位の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号７の塩基配列の１７９−１２２５位の塩基配列からなるＤＮＡと機能的に同等のＤＮＡとしては、配列番号１の塩基配列の４８９−１２９８位の塩基配列、配列番号３の塩基配列の５２１−１３３０位の塩基配列配列番号５の塩基配列の１９６−１２４２位の塩基配列、または配列番号７の塩基配列の１７９−１２２５位の塩基配列と少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは上記各塩基配列において１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失または付加を含む塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。当該ＤＮＡによってコードされるポリペプチドは、上記のＰＣＰおよびＰＣＰ−２の特性を有する。
【００３６】
上記の機能的に同等のＤＮＡは、上記塩基配列からなるＤＮＡまたは少なくとも３０塩基、少なくとも５０塩基、または少なくとも１００塩基のその断片をプローブとして用いるストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションによって、ラットまたはヒト以外の哺乳動物の筋肉組織から得ることができる。
【００３７】
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、低ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件が挙げられるが、高ストリンジェントな条件が好ましい。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する条件であり、好ましくは５０℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する条件である。高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで洗浄する条件である。
【００３８】
あるいは、配列番号１の塩基配列の４８９−１２９８位の塩基配列、配列番号３の塩基配列の５２１−１３３０位の塩基配列、配列番号５の塩基配列の１９６−１２４２位の塩基配列、または配列番号７の塩基配列の１７９−１２２５位の塩基配列全長において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異、欠失、連結等により、部分的にその配列が変化したものであっても、これらの変異型ＤＮＡが配列番号１の塩基配列の４８９−１２９８位の配列、配列番号３の塩基配列の５２１−１３３０位の配列、配列番号５の塩基配列の１９６−１２４２位の配列、または配列番号７の塩基配列の１７９−１２２５位の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、上記ＰＣＰおよびＰＣＰ−２の特性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであれば、配列番号１の塩基配列の４８９−１２９８位の配列、配列番号３の塩基配列の５２１−１３３０位の配列、配列番号５の塩基配列の１９６−１２４２位の配列、または配列番号７の塩基配列の１７９−１２２５位の配列と相違する塩基配列も、本発明のＰＣＰまたはＰＣＰ−２をコードするＤＮＡに含まれる。
【００３９】
本発明はまた、ＰＣＰまたはＰＣＰ−２をコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。本発明のベクターは、本発明のＤＮＡを、一般的な遺伝子組み換え技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲）に従って適当なベクターに挿入することにより得ることができる。
【００４０】
本発明のＤＮＡを挿入する適当なベクターとしては、宿主細胞中で複製可能なものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８他）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４他）、酵母由来のプラスミド（例、ｐＳＨ１９他）、さらにバクテリオファージやレトロウィルスやワクシニアウィルス等の動物ウィルス等が利用できる。
【００４１】
また、挿入した遺伝子が確実に発現されるようにするため、該遺伝子の上流に適当な発現プロモーターを接続する。使用する発現プロモーターは、宿主に応じて当業者が適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合には、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λ−ＰＬプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ系プロモーター等が、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター等が、それぞれ使用できるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明のベクターには更に、所望により、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合部位、複製開始点、ターミネーター等を挿入してもよい。
【００４３】
本発明はまた、ＰＣＰまたはＰＣＰ−２をコードするＤＮＡを含む形質転換宿主細胞を提供する。本発明の形質転換宿主細胞は、前記ベクターを、常法または各宿主に対して一般に用いられる形質転換方法に従って、ＰＣＰまたはＰＣＰ−２が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００４４】
本発明のベクターの宿主細胞への導入は、限定するものではないが、例えばカルシウムイオン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、スフェロプラスト法、マイクロインジェクション等を用いて実施することができる。
【００４５】
宿主としては、限定するものではないが、エシェリヒア属菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの各種菌株、バチルス属菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの各種菌株、酵母としてはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの各種菌株、動物細胞としてはＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ６細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞等が利用できる。
【００４６】
本発明のポリペプチドは、前記形質転換宿主細胞を、当業者に公知の通常の方法に従って培養し、当該培養細胞または培地から本発明のポリペプチドを回収することにより製造できる。培養細胞から、当該細胞の破砕後、遠心分離等の分離操作により可溶性画分を得、この画分からポリペプチドを回収することができる。
【００４７】
本発明のポリペプチドはまた、他のポリペプチド（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡその他）との融合型ポリペプチドとして発現させてもよい。このようにして発現させた融合型ポリペプチドは、適当なプロテアーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出すことができる。
【００４８】
本発明者らはさらに、筋肉組織からＰＣＰおよびＰＣＰ−２を精製する際に、ピロリン酸を添加することにより他のタンパク質からのＰＣＰおよびＰＣＰ−２の分離を良好にし得ることを見出した（実施例１；図１および２）。
【００４９】
したがって、本発明は、哺乳動物筋肉組織から筋原線維を調製し、これをピロリン酸を含有する溶液中でインキュベートするステップ、遠心分離後に可溶性画分から本発明のポリペプチドを回収するステップを含む、該ポリペプチドの取得方法を提供する。ピロリン酸を添加することによって他のタンパク質と絡まり易い性質を有するタンパク質を精製し得るようになることは、本発明者らの知り得る限り、当業者に知られていない。用いるピロリン酸の濃度は、好ましくは１５ｍＭ以上、より好ましくは１５〜５０ｍＭである。
【００５０】
本発明のポリペプチドは、慣用の精製技術を組み合わせて単離することができる。そのような技術には、硫安分画、有機溶媒処理、遠心分離、限外濾過、各種クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動等を含む。
【００５１】
本発明のポリペプチドは、抗原抗体反応を利用する方法等により、特異的に検出することができる。
【００５２】
本発明者らは、特異的なプライマーを設計することにより、混合ｃＤＮＡからＰＣＰおよびＰＣＰ−２の存在を特異的に検出することに成功した。したがって、本発明は、ＤＮＡサンプル中のＰＣＰ配列およびＰＣＰ−２配列の特異的検出方法を提供する。
【００５３】
さらに、上記の通り、ＰＣＰおよびＰＣＰ−２はアクチン、ミオシン等の筋肉組織に存在するタンパク質を接着する性質を有することから、筋原線維を強固にする上で重要な構造タンパク質である。このことから、ＰＣＰおよびＰＣＰ−２の欠損、発現低下等が骨格筋および心筋の疾患に結びつくものであることが示唆される。したがって、本発明のＰＣＰおよびＰＣＰ−２は、筋疾患および心疾患の診断および／または治療において応用することができるものと考えられる。
【００５４】
以下に実施例を示すことにより本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５５】
ラット下肢筋組織からのＰＣＰの精製
（１）ラット下肢筋組織を、以下の組成を有するホモジナイズ液：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中でホモジナイズし（図１：サンプル１）、ガーゼで濾過した。濾液に最終濃度１％となるようにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加し、氷中にて２０分間攪拌した後、５，０００ｒｐｍで１５分間遠心した。沈殿を回収し、新たなホモジナイズ液に懸濁し、５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、沈殿を回収した。このステップを遠心後の沈殿が白くなるまで繰り返すことにより、筋原線維を調製した（図１：サンプル２）。
【００５６】
（２）得られた筋原線維を、以下の組成を有するＡ液：０．４Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭピロリン酸、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に加え、氷中にて２０分間攪拌した後、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心した。沈殿を回収し（上清＝図１：サンプル３）、新たなＡ液中に懸濁し、遠心後、沈殿を回収した。このステップを３回繰り返した。
【００５７】
（３）得られた沈殿を０．６Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭピロリン酸、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）中に懸濁し、氷中にて３０分間攪拌した。懸濁液を１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を回収した（沈殿＝図１：サンプル４；上清＝図１：サンプル５）。得られた上清を、１ｍＭピロリン酸、５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）に対して透析し、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を回収した（沈殿＝図１：サンプル６；上清＝図１：サンプル７）。
【００５８】
（４）得られた上清に、０．３３飽和まで硫酸アンモニウムを添加し、氷中にて３０分間攪拌した。１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を回収した（沈殿＝図１：サンプル８）。得られた上清に０．６飽和まで硫酸アンモニウムを添加し、氷中にて３０分間攪拌した。１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、沈殿を回収した（沈殿＝図１：サンプル９）。
【００５９】
（５）得られた沈殿を、１ｍＭピロリン酸、５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）に対して透析し、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を回収した（上清＝図１：サンプル１０；沈殿＝図１：サンプル１１）。
【００６０】
（６）精製の各ステップで得たサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クーマシーブルーを用いてタンパク質染色した（図１Ａ）。また、同じサンプルについて抗ＤＬＳＴ抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った（図１Ｂ）。２７ｋＤａ付近にＰＣＰに対応するバンドが見られる（図１：＊印）。
【００６１】
なお、図１では、ウエスタンブロットにおいて近い位置に２本のバンドが存在するが（図１Ｂ、＊印参照）、上記手順のうちステップ（３）で用いる懸濁用の溶液を１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭピロリン酸、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）とすることにより、当該位置に存在するバンドは下側の１本のみとなる。
【００６２】
また、上記手順のうちステップ（３）で用いる懸濁用の溶液にピロリン酸を加えずに同様の手順により処理した場合、硫酸アンモニウム沈殿により得られたサンプル（図２：サンプル１、２および３；それぞれ図１のサンプル１、９および１０に対応）は、ピロリン酸存在下で精製した場合と比較して、ＰＣＰが他のタンパク質と結合した形で精製されているのがわかる。
【実施例２】
【００６３】
アミノ酸配列解析用ＰＣＰサンプルの調製
（１）実施例１のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られたクーマシーブルー染色ゲルから、ＰＣＰに対応するバンド（図１Ａ：＊印）を切り出し、ウルトラタラックス（ＩＫＡ（登録商標）製）を用いて蒸留水中でホモジナイズし、遠心して沈殿を回収した。得られた沈殿を１００％メタノール中に懸濁し、３０分間静置した後、遠心して沈殿を回収した。このステップをもう一度繰り返した。得られた沈殿を風乾し、ＳＤＳサンプルバッファー中に懸濁し、３０分間静置した。
【００６４】
（２）得られたサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをクーマシーブルーで染色すると、２本のバンドが現れた（図３Ａ：ａおよびｂ）。それぞれのバンドを切り出し、上記ステップ（１）と同様にサンプルを調製し、抗ＤＬＳＴ抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った（図３Ｂ）。２本のバンドのうち、ａのみが抗ＤＬＳＴ抗体により認識された。
【実施例３】
【００６５】
ラットＰＣＰのアミノ酸配列決定
上記バンドａから調製したサンプルについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブル染色を行い、ゲルからバンドを切り出し、エドマン法により部分アミノ酸配列を決定した。その結果、ＰＣＰのＮ末端付近のアミノ酸配列と、５種類の鎖内アミノ酸配列を特定することができた（表１）。
【００６６】
【表１】
2008263976.tif 000002
【００６７】
これらの配列から、ＰＣＰは、ＤＬＳＴ遺伝子のエキソン８に存在する開始コドンから翻訳が開始され、Ｎ末端でプロセシングを受けることにより成熟タンパク質となっていることが示唆された。
【実施例４】
【００６８】
ラットＰＣＰのｃＤＮＡ配列決定
実施例３から示唆されたことを基に、ラット筋肉Ｃａｐ ｓｉｔｅ ｃＤＮＡライブラリー（日本ジーン株式会社）よりＰＣＰのｃＤＮＡをクローニングした。５’側プライマーとしてはライブラリーの供給元により指定された配列を用い（５’−ｃａａｇｇｔａｃｇｃｃａｃａｇｃｇｔａｔｇ−３’（配列番号９）および５’−ｇｔａｃｇｃｃａｃａｇｃｇｔａｔｇａｔｇｃ−３’（配列番号１０））、３’側プライマーにはＤＬＳＴ遺伝子のエキソン１５内の３’非翻訳領域の配列を用いた（５’−ｇｔｔｇｃａｃｇｇｇｃｔａｇａａｇａｃｔｇｇ−３’（配列番号１１））。
【００６９】
特定されたｃＤＮＡクローンの塩基配列（配列番号１）および予測されるアミノ酸配列（配列番号２）を図４に示す。アミノ酸配列中、二重下線はエドマン法により決定されたＮ末端配列、一重下線はエドマン法により決定された鎖内配列を示す。
【００７０】
ＤＬＳＴ遺伝子の構造およびＤＬＳＴ ｃＤＮＡの構造の模式図を図５Ａに示し、特定された塩基配列より明らかになったＰＣＰ ｃＤＮＡの構造の模式図を図５Ｂに示す。ＰＣＰ ｃＤＮＡでは、選択的スプライシングによりＤＬＳＴ遺伝子のエキソン２および３が欠落し、それによりエキソン８内の開始コドンから翻訳が開始される。その結果、ＤＬＳＴ遺伝子のエキソン６にあたる配列中に存在するα−リポ酸結合部位が失われている。ここで、ＰＣＰの翻訳開始部位であるエキソン８の開始コドン付近の塩基配列は、公知のＫｏｚａｋ配列（Kozak (1999), Gene, 234, 187-208）と矛盾しない。
【実施例５】
【００７１】
抗ＤＬＳＴ抗体によるラット下肢筋の免疫組織化学
ウサギ抗ＤＬＳＴポリクローナル抗体を用いてラット下肢筋から作製した切片に対して免疫染色を行い、筋線維でのＰＣＰおよびＰＣＰ−２の局在について調べた。ここで用いた抗ＤＬＳＴ抗体は、ラットＤＬＳＴ遺伝子のエキソン８中の開始コドンから始まる塩基配列を用いて組換え的に生成させたＤＬＳＴ部分ペプチドを抗原として、ウサギを免疫して得たものである。抗ＤＬＳＴ抗体はラットの骨格筋を縞状に染色した。α−アクチニン（Ｚ線に局在）およびリアノジン受容体（Ｉ帯とＡ帯の境界部に局在）との二重免疫染色から、ＰＣＰおよびＰＣＰ−２はＩ−Ｚ−Ｉ帯に選択的に存在していることが明らかになった。さらに、同様の免疫組織化学的検討から、ＰＣＰおよびＰＣＰ−２はラットの心筋にも存在していることが示された（データは示していない）。また、ヒト筋肉組織も抗ＤＬＳＴ抗体により免疫組織化学的に染色されるため、ヒトにおいても筋肉組織にＰＣＰおよびＰＣＰ−２に相当するタンパク質が存在することが示された（データは示していない）。
【実施例６】
【００７２】
ヒトＰＣＰのｃＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列決定
ヒトＰＣＰ ｃＤＮＡは、市販のヒト筋肉ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ株式会社製）を鋳型として、５’側プライマー（５’−ａｃａｇｇｃｇｇｇｃｇｇｇａｇｃｃｇ−３’（配列番号１２））およびヒトＤＬＳＴ遺伝子のエキソン１５の３’非翻訳領域内に設定した３’側プライマー（５’−ｇｇａｃａｇｇｇａｇａａｇａｃｔｇｇ−３’（配列番号１３））を用いてＰＣＲにより取得した（配列番号３）。ヒトにおいても、ＰＣＰ ｃＤＮＡではＤＬＳＴ遺伝子のエキソン２および３が欠落しており、ＤＬＳＴ遺伝子からの選択的スプライシングにより生じたものであることが予想された。得られたｃＤＮＡ配列中の予想されるコード領域から翻訳されるアミノ酸配列（配列番号４）は、ラットから得られたものと約９５％の同一性を有していた。
【実施例７】
【００７３】
ラットおよびヒトＰＣＰアミノ酸配列から予測される凝集性
上記のように決定したラットおよびヒトのＰＣＰのアミノ酸配列について凝集性の予測を行った。予測はＳｅｒｒａｎｏらのグループにより開発されたＴＡＮＧＯポリペプチド鎖凝集性予測アルゴリズム（http://tango.emble.de；Fernandez-Escamillaら(2004), Nature Biotech 22, 1302-1306）を用いて行った。結果を図７Ａ（ラット）および図７Ｂ（ヒト）に示す。Ｃ末端近傍に高い凝集性が予測される配列があることが明らかとなった。これらの配列はラットおよびヒトＰＣＰアミノ酸配列２３２−２４０位に保存されている、ＭＭＹＶＡＬＴＹＤの配列である。
【実施例８】
【００７４】
ラット下肢筋組織からのＰＣＰ−２の精製
上記ＰＣＰについての解析の過程で、筋組織からＰＣＰと同様に精製されるタンパク質の存在が示唆されたため、これについても解析した。
（１）上記実施例１と同様に、筋原線維を調製した。
【００７５】
（２）得られた筋原線維を、以下の組成を有するＡ液：０．６Ｍ ＫＣｌ、０．６Ｍ ＫＩ、１５ｍＭピロリン酸、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に加え、氷中にて１時間攪拌した後、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を回収した。得られた上清を、１ｍＭピロリン酸、５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）に対して透析し、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を回収した。
【００７６】
（３）得られた上清に、０．３５飽和まで硫酸アンモニウムを添加し、氷中にて２０分間攪拌した。１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、沈殿を回収した。
【００７７】
（４）得られた沈殿を、１ｍＭピロリン酸、５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）に対して透析し、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を回収した。
【００７８】
（５）ステップ４で得られた上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＤＬＳＴ抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った（図８）。３０ｋＤａ付近にＰＣＰに対応するバンドが見られ、４０ｋＤａ付近にＰＣＰ−２に対応するバンドが見られる。
【実施例９】
【００７９】
ラットＰＣＰ−２のアミノ酸配列決定
上記実施例２と同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでのＰＣＰ−２のバンドから調製したサンプルについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブル染色を行い、ゲルからバンドを切り出し、エドマン法により部分アミノ酸配列を決定した。その結果、ＰＣＰ−２の１種類の鎖内アミノ酸配列を特定することができた。配列を以下に示す：
ＡＡＰＥＡＰＡＡＰＰ
この配列は、以下の実施例１０で決定されたラットＰＣＰ−２のｃＤＮＡ配列のうち、ＤＬＳＴ遺伝子のエキソン８に含まれる配列によりコードされる部分である（図９；一重下線部）。
【実施例１０】
【００８０】
ラットＰＣＰ−２のｃＤＮＡ配列決定
実施例９から示唆されたことを基に、ラット筋肉Ｃａｐ ｓｉｔｅ ｃＤＮＡライブラリー（日本ジーン株式会社）よりＰＣＰのｃＤＮＡをクローニングした。５’側プライマーとしてはライブラリーの供給元により指定された配列を用い（５’−ｃａａｇｇｔａｃｇｃｃａｃａｇｃｇｔａｔｇ−３’（配列番号９）および５’−ｇｔａｃｇｃｃａｃａｇｃｇｔａｔｇａｔｇｃ−３’（配列番号１０））、３’側プライマーにはＤＬＳＴ遺伝子のエキソン１５内の３’非翻訳領域の配列を用いた（第１ＰＣＲ：５’−ｇｔｔｇｃａｃｇｇｇｃｔａｇａａｇａｃｔｇｇ−３’（配列番号１１）；第２ＰＣＲ：５’−ｇａｔｃａｇｔａｇｇｔａｇｇｃ−３’（配列番号１４））。
【００８１】
特定されたｃＤＮＡクローンの塩基配列（配列番号５）および予測されるアミノ酸配列（配列番号６）を図９に示す。アミノ酸配列中、一重下線はエドマン法により決定された鎖内配列を示す。二重下線は、ＤＬＳＴポリペプチドには存在しない、ＰＣＰ−２に特異的な６残基のアミノ酸配列を示す。なお、ｃＤＮＡ配列中、１３９および１４０位の「ＡＧ」は、解析するサンプルによっては欠落している場合もあった。この部分は、ＤＬＳＴ遺伝子のエキソン５の５’末端に相当する。
【００８２】
特定された塩基配列より明らかになったＰＣＰ−２ ｃＤＮＡの構造の模式図を図１１に示す。ＰＣＰ−２ ｃＤＮＡでは、選択的スプライシングによりＤＬＳＴ遺伝子（図５Ａ参照）のエキソン２、３および６が欠落し、それによりエキソン５内の開始コドンから翻訳が開始される。その結果、ＤＬＳＴ遺伝子のエキソン６にあたる配列中に存在するα−リポ酸結合部位が失われている。
【実施例１１】
【００８３】
ヒトＰＣＰ−２のｃＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列決定
ヒトＰＣＰ−２ ｃＤＮＡは、市販のヒト筋肉ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ株式会社製）を鋳型として、５’側プライマー（第１ＰＣＲ：５’−ｔｇｔｃｃｇｃｃｃｇｃｃｃｔｃｇｇｃ−３’（配列番号１５）；第２ＰＣＲ：５’−ｇｃｃｇｔｇａｔｇｃｔｇｔｃｃｃｇ−３’（配列番号１６））およびヒトＤＬＳＴ遺伝子のエキソン１５の３’非翻訳領域内に設定した３’側プライマー（第１ＰＣＲ：５’−ｇｇａｃａｇｇｇａｇａａｇａｃｔｇｇ−３’（配列番号１３）；第２ＰＣＲ：５’−ｃｃｔｇｃａｔｇａｔｃａａｃｔｔｇ−３’（配列番号１７））を用いてＰＣＲにより取得した（配列番号７）。
【００８４】
特定されたｃＤＮＡクローンの塩基配列（配列番号７）および予測されるアミノ酸配列（配列番号８）を図１０に示す。アミノ酸配列中、一重下線はラットについてエドマン法により決定された鎖内配列を示す。二重下線は、ＤＬＳＴポリペプチドには存在しない、ＰＣＰ−２に特異的な６残基のアミノ酸配列を示す。なお、ｃＤＮＡ配列中、１２２および１２３位の「ＡＧ」は、解析するサンプルによっては欠落している場合もあった。この部分は、ＤＬＳＴ遺伝子のエキソン５の５’末端に相当する。ヒトにおいても、ＰＣＰ−２ ｃＤＮＡではＤＬＳＴ遺伝子のエキソン２、３および６が欠落しており、ＤＬＳＴ遺伝子からの選択的スプライシングにより生じたものであることが予想された。得られたｃＤＮＡ配列中の予想されるコード領域から翻訳されるアミノ酸配列（配列番号８）は、ラットから得られたものと約９４％の同一性を有していた。
【実施例１２】
【００８５】
ＰＣＰおよびＰＣＰ−２の検出方法
まず、ヒトおよびラットのそれぞれについて、ＰＣＰまたはＰＣＰ−２に特異的な５’側プライマーを設計した。
【００８６】
ＰＣＰ特異的５’プライマー
ヒト１：５’−ｔｃｃｇｃｃｔｔｃｃａｇａａｇｃａｔ−３’（配列番号１８）
ヒト２：５’−ｔｃｃｇｃｃｔｔｃｃａｇａａｇｃａｔｔ−３’（配列番号１９）
ラット１：５’−ｔｃｔｇｃｃｔｔｃｃａｇａａｇｃａｔ−３’（配列番号２０）
ラット２：５’−ｔｃｔｇｃｃｔｔｃｃａｇａａｇｃａｔｔ−３’（配列番号２１）
上記のプライマー配列のうち、下線部はそれぞれヒトまたはラットのＤＬＳＴ遺伝子のエキソン１の３’末端側の配列であり、残りはそれぞれヒトまたはラットのエキソン４の５’末端の３または４塩基である。
【００８７】
ＰＣＰ−２特異的５’プライマー
ヒト１：５’−ｇｇａｇａｔｇｔｃａｇｇｔｇｇｇａｇａａａｇａｃａ−３’（配列番号２２）
ヒト２：５’−ｇｇａｇａｔｇｔｃａｇｇｔｇｇｇａｇａａａｇａｃａｔ−３’（配列番号２３）
ラット１：５’−ｇｇａｇａｔｇｔｃａｇｇｔｇｇｇａｇａａａｇａｃｔ−３’（配列番号２４）
ラット２：５’−ｇｇａｇａｔｇｔｃａｇｇｔｇｇｇａｇａａａｇａｃｔｔ−３’（配列番号２５）
上記のプライマー配列のうち、下線部はそれぞれヒトまたはラットのＤＬＳＴ遺伝子のエキソン５の３’末端側の配列であり、残りはそれぞれヒトまたはラットのエキソン７の５’末端の３または塩基である。
【００８８】
３’側プライマーとしては、ＰＣＰおよびＰＣＰ−２ともに、以下のＤＬＳＴ遺伝子のエキソン１５内の３’非翻訳領域の配列を用いた。
ヒト：第１ＰＣＲ：５’−ｇｇａｃａｇｇｇａｇａａｇａｃｔｇｇ−３’（配列番号１３）
第２ＰＣＲ：５’−ｃｃｔｇｃａｔｇａｔｃａａｃｔｔｇ−３’（配列番号１７）
ラット：第１ＰＣＲ：５’−ｇｔｔｇｃａｃｇｇｇｃｔａｇａａｇａｃｔｇｇ−３’（配列番号１１）
第２ＰＣＲ：５’−ｇａｔｃａｇｔａｇｇｔａｇｇｃ−３’（配列番号１４）
鋳型としてそれぞれヒトまたはラットｃＤＮＡライブラリーを用いて、実施例４、６、１０または１１と同様にして１回目のＰＣＲを行った。得られた増幅産物を鋳型として用い、上記のＰＣＰまたはＰＣＰ−２特異的５’プライマーを５’側プライマーとして用いて、２回目のＰＣＲを行った。
【００８９】
増幅産物の電気泳動の結果を図１２（ＰＣＰ）および図１３（ＰＣＰ−２）に示す。それぞれ、Ｍは分子量マーカー、レーン１はヒトｃＤＮＡからの増幅産物、２はラットｃＤＮＡからの増幅産物を示す。これらの結果は、特異的プライマーとして、上記のヒト１またはラット１を用いた場合の結果である。それぞれのレーンで、ＰＣＰまたはＰＣＰ−２が特異的に検出されている。
【００９０】
ＰＣＰではエキソン４に対応する配列、ＰＣＰ−２ではエキソン７に対応する配列が、上記の特異的プライマーでは３塩基または４塩基となっている。この配列が、それよりも長い（例えば、５塩基または６塩基）プライマー、またはそれよりも短い（例えば、１塩基または２塩基）プライマーでは、図に示されるような特異的な検出は達成することができなかった。
【００９１】
この方法は、血液または生検サンプルなどの患者サンプルにおいて、ＰＣＰおよびＰＣＰ−２を特異的に検出するために用いることができる。
【実施例１３】
【００９２】
ヒト骨格筋トータルＲＮＡ中のＰＣＰおよびＰＣＰ−２ ｍＲＮＡの検出
ヒト骨格筋トータルＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）について、Ｐｒｉｍｅ  ＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴ−ＰＣＲキット（タカラバイオ社）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。逆転写にはオリゴｄＴプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲには、５’側プライマーとして上記のヒトＰＣＰまたはＰＣＰ−２特異的５’プライマー（それぞれ配列番号１８または２０）、３’側プライマーとして以下の配列を有するプライマーを用いた。
エキソン７プライマー：５’−ｔｃａｃｇｃｃａｔｔｔｇｃｔｇｇｔｇａｔｇｇ−３’（配列番号２６）
エキソン８プライマー：５’−ｔｔｃａｇｃｃｇｇｃｔｔｇｇｃｃｔｔａｇｃ−３’（配列番号２７）
【００９３】
増幅産物の電気泳動の結果を図１４に示す。Ｍは分子量マーカー、レーン１および２はＰＣＰ特異的５’プライマーとエキソン７プライマーとの組み合わせ、レーン３および４はＰＣＰ特異的５’プライマーとエキソン８プライマーとの組み合わせ、レーン５および６はＰＣＰ−２特異的５’プライマーとエキソン７プライマーとの組み合わせを用いて行ったＰＣＲの増幅産物を示す。それぞれのレーンで、ＰＣＰまたはＰＣＰ−２の特異的なバンドが検出された。
【００９４】
これにより、ヒト骨格筋ＲＮＡ中に、ＰＣＰおよびＰＣＰ−２のｍＲＮＡが存在することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明のポリペプチドおよびＤＮＡは、哺乳動物の健康科学および病理学的適用において有用である。特に、筋肉構造を強化するというＰＣＰおよびＰＣＰ−２の筋肉組織における働きから、当該タンパク質は、筋肉の老化や弱体化に伴う筋疾患および心疾患の診断および治療に利用できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ラット筋原線維からのＰＣＰの精製を表す図である。図１ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをクーマシーブルーにより染色したものを示す。図１ＢはＡと同様のゲルからの抗ＤＬＳＴ抗体を用いたウエスタンブロットを示す。
【図２】ピロリン酸を用いなかった以外は図１と同様に行ったＰＣＰの精製を示す。図２ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをクーマシーブルーにより染色したものを示す。図２ＢはＡと同様のゲルからの抗ＤＬＳＴ抗体を用いたウエスタンブロットを示す。
【図３】アミノ酸配列決定のためのサンプルを取得するための、ＰＣＰのさらなる分離を示す図である。図３ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをクーマシーブルーにより染色したものを示す。図３ＢはＡのゲルからの抽出したサンプルについての抗ＤＬＳＴ抗体を用いたウエスタンブロットを示す。
【図４−１】ラット筋肉由来のＰＣＰ ｃＤＮＡの塩基配列およびアミノ酸配列を示す。下線はアミノ酸シーケンシングにより特定された配列を示す。
【図４−２】ラット筋肉由来のＰＣＰ ｃＤＮＡの塩基配列およびアミノ酸配列を示す。下線はアミノ酸シーケンシングにより特定された配列を示す。
【図５Ａ】ＤＬＳＴ遺伝子およびｍＲＮＡの構造を示す模式図である。
【図５Ｂ】ＰＣＰ ｍＲＮＡの構造を示す模式図である。
【図６】ラット下肢筋組織切片についての、ＤＬＳＴ（ＰＣＰ）とリアノジン受容体（上段パネル）およびα−アクチニン（下段パネル）の二重染色像を示す。
【図７Ａ】ラットＰＣＰポリペプチドの凝集性解析を示す図である。
【図７Ｂ】ヒトＰＣＰポリペプチドの凝集性解析を示す図である。
【図８】ラット筋原線維抽出物についての、抗ＤＬＳＴ抗体を用いたウエスタンブロットを示す。
【図９−１】ラット筋肉由来のＰＣＰ−２ ｃＤＮＡの塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図９−２】ラット筋肉由来のＰＣＰ−２ ｃＤＮＡの塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１０−１】ヒト筋肉由来のＰＣＰ−２ ｃＤＮＡの塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１０−２】ヒト筋肉由来のＰＣＰ−２ ｃＤＮＡの塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１１】ＰＣＰ−２ ｍＲＮＡの構造を示す模式図である。
【図１２】ｃＤＮＡライブラリーにおけるＰＣＰの特異的検出を表す電気泳動像である。
【図１３】ｃＤＮＡライブラリーにおけるＰＣＰ−２の特異的検出を表す電気泳動像である。
【図１４】ヒトトータルＲＮＡにおけるＰＣＰおよびＰＣＰ−２の特異的検出を表す電気泳動像である。
【配列表フリーテキスト】
【００９７】
配列番号９〜２７：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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