(57)【要約】【課題】安定して高精度な測定を実現できる細胞の電気生理現象の測定装置およびこれを用いた測定方法を提供することを目的とする。【解決手段】貫通孔５を有した薄板３とこれを保持する枠体４とからなるセンサチップ２を、内部に空洞を有した筒部品１の空洞の内部に固着した細胞電気生理センサと、このセンサチップ２のキャビティ６の内部に測定液１２を充填する分注手段とからなる細胞の電気生理現象の測定装置であって、分注手段として液滴１２ａをキャビティ６の内部に飛滴させる非接触式ジェットディスペンサのヘッド部８を配置するとともに、可動機構を設けた構成とする。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つ以上の貫通孔を有した薄板とこの薄板を保持する枠体とからなるセンサチップを空洞を有した筒部品の空洞の内部に固着した細胞電気生理センサと、前記センサチップのキャビティの内部に細胞の電気変化を測定するための測定液を充填する分注手段とからなる細胞の電気生理現象の測定装置であって、前記分注手段としてキャビティの内部に液滴を飛滴する非接触式ジェットディスペンサのヘッド部を前記キャビティの上方に配置するとともに、このヘッド部に可動機構を設けた細胞の電気生理現象の測定装置。
【請求項２】
ヘッド部を水平方向に可動させる可動機構とした請求項１に記載の細胞の電気生理現象の測定装置。
【請求項３】
ヘッド部をキャビティの内形の範囲内において水平方向に反復移動させる可動機構とした請求項２に記載の細胞の電気生理現象の測定装置。
【請求項４】
ヘッド部をキャビティの内形の範囲内において水平面内で周回させる可動機構とした請求項２に記載の細胞の電気生理現象の測定装置。
【請求項５】
ヘッド部の中心線とキャビティの中心線を一直線上に配置した請求項１に記載の細胞の電気生理現象の測定装置。
【請求項６】
細胞電気生理センサに反転機構を設けた請求項１に記載の細胞の電気生理現象の測定装置。
【請求項７】
筒部品をガラスとした請求項１に記載の細胞の電気生理現象の測定装置。
【請求項８】
センサチップをシリコンとし、このシリコンの表面に二酸化ケイ素を形成した請求項１に記載の細胞の電気生理現象の測定装置。
【請求項９】
細胞電気生理センサの表面を酸素プラズマによるアッシング処理した請求項１に記載の細胞の電気生理現象の測定装置。
【請求項１０】
細胞電気生理センサの表面を硫酸と過酸化水素水または過硫酸アンモニウムにより酸化処理した請求項１に記載の細胞の電気生理現象の測定装置。
【請求項１１】
一つ以上の貫通孔を有した薄板とこの薄板を保持する枠体とからなるセンサチップを内部に空洞を有した筒部品の空洞の内部に固着した細胞電気生理センサと、前記センサチップのキャビティの内部に細胞の電気変化を測定するための測定液を充填する分注手段を有し、この分注手段としてキャビティの内形よりも小さな液滴をキャビティの内部に飛滴する非接触式ジェットディスペンサのヘッド部を前記センサチップのキャビティの上方に配置するとともに、このヘッド部に可動機構を設けた細胞の電気生理現象の測定装置を用いて細胞の電気生理現象を測定する方法であって、
少なくとも、前記ヘッド部からキャビティの内部にキャビティの内形より小さな液滴を飛滴させ、キャビティの内部に測定のための所定の液量の測定液を充填する分注方法を含む細胞の電気生理現象の測定方法。
【請求項１２】
細胞電気生理センサをヘッド部に対して反転させて、センサチップの上下面に測定液を分注する工程を含む請求項１１に記載の細胞の電気生理現象の測定方法。
【請求項１３】
分注の最初から１０回目以下までは液滴を不連続に分注し、その後は連続的に液滴を分注する工程を含む請求項１１に記載の細胞の電気生理現象の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞内電位あるいは細胞外電位等の細胞の電気生理現象をスムーズにかつ確実に測定するための細胞の電気生理現象の測定装置およびこれを用いた測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心事であり、これは薬剤の開発にも応用されている。
【０００３】
例えば、プローブを細胞またはその部分の表面近くに制御し、プローブを該表面に垂直になるように表面に接触させるというパッチクランプ法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
また、基質上または内に形成された管状通路内における電気浸透流を用いて細胞を測定位置に自動的に配置するための手段を備えたオートパッチ方式が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特表２００４−５２８５５３号公報
【特許文献２】特表２００４−５１０９８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記従来の構成である自動的に細胞を捕捉できるオートパッチ方式において、自動分注器のピペットを用いてピペット先端の外径よりも小さな内形の微小容器部に液体を分注する時、滴下する液体の液滴の大きさが液体の表面張力により微小容器の内形よりも大きくなってしまい、この液滴を微小容器の内部に注入するとき、微小容器の内部に気泡が残ることがある。この残留した気泡が貫通孔の近傍に存在すると、貫通孔に細胞を安定して保持することが難しくなる、あるいは安定した測定ができないといった課題を有していた。
【０００６】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、安定して高精度な測定を実現できる細胞の電気生理現象の測定装置およびこれを用いた測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記従来の課題を解決するために、本発明は、貫通孔を有した薄板と枠体とからなるセンサチップを筒部品の空洞の内部に固着した細胞電気生理センサと、キャビティの内部に測定液を充填する分注手段を有し、この分注手段としてキャビティの内形よりも小さな液滴を飛滴する非接触式ジェットディスペンサのヘッド部をキャビティの上方に配置するとともに、このヘッド部に可動機構を設けた構成とするものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の細胞の電気生理現象の測定装置およびこれを用いた測定方法は、キャビティの内形よりも小さな直径の液滴を飛滴させることができる非接触式ジェットディスペンサを用いることによって、キャビティの内部へキャビティの内形よりも小さな液滴を飛滴させながら測定液を充填していくことができることから、キャビティの内部の気泡残りを防止することができ、安定して高精度な測定を行うことができる細胞の電気生理現象の測定装置およびこれを用いた測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞の電気生理現象の測定装置およびこれを用いた測定方法について、図面を用いて説明する。
【００１０】
図１は本発明の実施の形態１における細胞の電気生理現象の測定装置の断面図、図２は測定液の分注方法を説明するための断面図、そして図３は測定方法を説明するための断面図である。
【００１１】
まず始めに、細胞電気生理センサの構成について説明する。
【００１２】
図１において、１はガラスよりなる筒部品であり、この筒部品１の外観形状は円柱状であり、内部は中空構造をしている。そして、この筒部品１にはガラスなどの親水性に優れた材料を用いることが好ましい。また、生産性の観点から射出成形による樹脂材料を用いることも可能である。
【００１３】
そして、この筒部品１の先端には微細加工性に優れた材料よりなるセンサチップ２を設置しており、このセンサチップ２はシリコンを主成分とする材料よりなる薄板３および枠体４とから構成することが好ましく、この薄板３には貫通孔５を形成している。そして、この貫通孔５の大きさは細胞を貫通孔５の上にうまく保持することができる形状が好ましく、細胞の大きさによって異なってくるが、直径；１〜５μｍが好ましい。なお、この貫通孔５は薄板３に少なくとも一個以上あれば良いが、複数の貫通孔５を形成し、複数個の細胞をそれぞれの貫通孔５の上に配置することができれば、同時に測定して信号レベルを高めて測定することも可能である。
【００１４】
そして、このセンサチップ２は薄板３と枠体４に囲まれたキャビティ６を構成している。このキャビティ６は細胞を保持するとともに測定液を充填しておくための空間でもある。また、このセンサチップ２は筒部品１の内壁部に漏れのないように強固に固着している。これによって、センサチップ２は筒部品１の上部と下部を完全に仕切るとともに、貫通孔５を通してのみ、上部と下部の空間が連通する構造としている。
【００１５】
なお、センサチップ２を固着する場所は筒部品１の端部のみでなく、中間部であってもよい。この場合は、後に使用方法でも説明するが、センサチップ２の上下に溶液を入れることが容易になるという利点を有している。
【００１６】
また、開口部１８の内径はセンサチップ２よりも少し大きな直径とし、センサチップ２を容易に挿入し固定することができるようにすることが好ましい。
【００１７】
また、キャビティ６の大きさは直径；５０〜１０００μｍが好ましく、一般的な規格である３８４ｃｈウエルフォーマットや１５３６ｃｈウエルフォーマットに適用することができ、現在の仕様の測定装置に組み込んで測定を行うことができる。さらにまた、測定液や細胞を微小容量で扱うのに適している。
【００１８】
次に、細胞電気生理センサの製造方法を以下に説明する。
【００１９】
センサチップ２はフォトリソグラフィー、ドライエッチング等の半導体加工技術によって一体的に形成することができる。例えば、シリコン基板をエッチング加工することによって枠体４によって囲まれたキャビティ６と、このキャビティ６の底面に薄板３と、この薄板３に貫通孔５を設けた構造からなるセンサチップ２を作製することができる。
【００２０】
なお、このセンサチップ２の形状あるいはキャビティ６の内形は円形、あるいは正方形などの多角形としても良い。
【００２１】
一方、筒部品１はガラス管を所定の長さに切断したもの、または樹脂材料を筒状に成型したものなどを用いることができる。
【００２２】
その後、センサチップ２を筒部品１の中に挿入し、接着剤または加熱によって溶融させる。このとき、センサチップ２の挿入の簡単な方法としては、センサチップ２を濡らした状態にしておき、これを筒部品１の入り口に一部挿入することで筒部品１の端にセルフアライメントさせることができる。これはガラスの筒部品１の内壁の親水性が高く水が管内に浸入していき、これに引っ張られてセンサチップ２も挿入されるからである。またセンサチップ２が筒部品１の端にある状態から、所定の量の水を加えることで水は管内へ浸入し、それにつれてセンサチップ２も移動し、筒部品１の内部の所定の位置にセンサチップ２を移動させることができる。
【００２３】
そして、このセンサチップ２を任意の位置に移動させた後は熱源を用いて、筒部品１とセンサチップ２を溶融させることができる。この熱源としては、ガスバーナーあるいは電気炉などを用いることで容易に溶融させてセンサチップ２を実装することができる。これで細胞電気生理センサが完成となる。
【００２４】
次に、前記細胞電気生理センサを用いた測定装置の構成と分注方法について説明する。この測定装置の大きな特徴は、図１に示すようにキャビティ６の上方にキャビティ６の内径よりも小さな液滴をキャビティ６の内部へ飛滴させることができる非接触式ジェットディスペンサの第一のヘッド部８を設け、センサチップ２の下面側には下部空間１１の内部に液滴を飛滴させることができる第二のヘッド部９を配置した構成としていることである。
【００２５】
このような測定装置を用いた分注方法は、図２に示すように貫通孔５によって分断されたキャビティ６の上部空間１０に非接触式ジェットディスペンサの第一のヘッド部８を用いて測定液である細胞外液１２ａの液滴を飛滴させながら分注していく。このとき、飛滴させる液滴の容量は１〜３０ｎＬが好ましく、このような液滴を飛滴させることができる仕様の第一のヘッド部８とすることによって、キャビティ６の内部または薄板３の上に気泡残りを抑制しながら細胞外液１２を充填することができる。この細胞外液１２を介して測定のための電極へ接続することとなるので、測定電極への接続が容易となる所定の量の細胞外液１２を充填するとこのセンサチップ２への分注は完了する。
【００２６】
次に、筒部品１の下部空間１１には、測定液である細胞内液１３を充填した第二のヘッド部９を用いて前記の分注方法と同様にして非接触式ジェットディスペンサの第二のヘッド部９を用いて下部空間１１に細胞内液１３ａの液滴を飛滴させながら分注していく。
【００２７】
これによって、前記と同様に気泡残りを抑制しながら細胞内液１３を分注することができる。
【００２８】
このように、キャビティ６の内径より小さな直径からなる液滴状の細胞外液１２ａをキャビティ６の内部や薄板３の上に飛滴させることができる非接触式ジェットディスペンサのヘッド部８、９を配置した測定装置とすることによって、キャビティ６の上方から微小な寸法形状を有する貫通孔５の近傍に正確に微少な液滴を飛滴させて測定液を分注しながら充填していくことによって、気泡残りを抑制しながら分注・充填していくことができる。その結果、細胞の電気生理現象の測定を確実にかつスムーズに行うことができる。
【００２９】
これは、測定液の液滴の直径が自動分注機のピペット先端部の外径の大小に依存しない非接触式ジェットディスペンサのヘッド部８、９を用いることによって、キャビティ６の内径より小さな直径の液滴の測定液１２ａをキャビティ６の内部、さらには薄板３の貫通孔５の近傍へ直接飛滴させながら測定液を充填していくことが可能となるものである。
【００３０】
これに対して、従来の方法である自動分注器のピペットによる分注を行った場合には、測定液の表面張力によりキャビティ６の内径よりも大きな液滴となり、キャビティ６の内部あるいは貫通孔５の近傍にある気泡の逃げ場がない状態で測定液が滴下されることとなり、キャビティ６の内部や貫通孔５の近傍に気泡が残留することによって、導通抵抗値は高い値を示すかまたは無限大の異常値を示し測定不良となる。もし、このような気泡が残留していれば、この気泡を除去する必要があり、スムーズに測定することが困難となる。
【００３１】
なお、図１では細胞電気生理センサの上下に第一のヘッド部８と第二のヘッド部９を配置しているが、少なくとも第一のヘッド部８のみにて測定液を充填することも可能であり、この場合には第一のヘッド部８に回転機構を設けておき筒部品１の上下に回転させる機構を設けて構成すればよい。どちらの構成にするかは測定液の選択と効率の観点から適宜、選択することができる。
【００３２】
次に、細胞の電気生理現象の測定方法について説明する。
【００３３】
まず、図３に示すようにセンサチップ２を固着した筒部品１を保持部７にて所定の位置に保持し、このキャビティ６の上方に第一のヘッド部８を設置し、筒部品１の下面側には第二のヘッド部９を設置した状態としている。前記第一のヘッド部８には細胞外液１２を充填し、第二のヘッド部９には細胞内液１３を充填している。
【００３４】
なお、筒部品１の内部に固定されたセンサチップ２の方向はキャビティ６が上側であり、薄板３が下側としているが、上下を反転させて測定することも可能であり、これは細胞の大きさ、形状などによって、適宜選択することができる。
【００３５】
そして、この第一のヘッド部８を用いて貫通孔５より上部の上部空間１０には細胞外液１２を充填し、反対面の下部空間１１には第二のヘッド部９を用いて細胞内液１３を分注する。
【００３６】
ここで、測定液である細胞内液１３とは、例えば哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ+イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ+イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液であり、測定液である細胞外液１２とはＫ+イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ+イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液である。
【００３７】
また、センサチップ２をマトリックス状に多数並べたとき、複数のセンサチップ２に対して測定液の分注を行う必要がある場合、ヘッド部８、９を移動させることも可能であり、さらにヘッド部８、９を複数配置し、一括して高速に分注できるという点において効果を発揮することもできる。
【００３８】
次に、筒部品１の上部空間１０側の細胞外液１２の内部に第一の電極１４を設置し、筒部品１の下部空間１１側の細胞内液１３の内部に第二の電極１５を設置し、さらに下部空間１１に圧力を伝えることのできる圧力伝達チューブ１６を取り付けるとともにシール材１９により封止した状態とする。この状態において、第一の電極１４と第二の電極１５の間で１００ｋΩ〜１０ＭΩ程度の導通抵抗値を観測することができる。これは測定液である細胞外液１２あるいは細胞内液１３が貫通孔５に浸透し、第一の電極１４と第二の電極１５が細胞外液１２と細胞内液１３を介して導通するからである。
【００３９】
ここで、貫通孔５を塞ぐような気泡が残留している場合には、導通抵抗値は高い値を示すか、または無限大の異常値を示し測定不良となる。
【００４０】
次に、開口部１８から細胞１７を投入し、圧力伝達チューブ１６により減圧を行うと、細胞１７は貫通孔５に引き付けられ、この貫通孔５を塞ぎ、上部空間１０と下部空間１１の間の電気抵抗が十分に高い５００ＭΩ以上の状態となる。この状態において、細胞１７の電気生理活動によって細胞内外の電位が変化した場合のわずかな電位差あるいは電流であっても測定が可能となる。
【００４１】
以上のように、本実施の形態１における測定装置を用いることによって、スムーズかつ確実に細胞の電気生理現象の測定を行うことができる。
【００４２】
ここで、筒部品１を使用することによって、測定液である細胞内液１３を筒部品１の内部に安定して保持することができるとともに、細胞内液１３の内部から第二の電極１５の取り出しや圧力伝達チューブ１６を容易に筒部品１に取り付けることができるため、測定時において容易に安定した細胞１７の測定を実施することができる。
【００４３】
また、本実施の形態１における測定装置において、第一のヘッド部８の中心線と第二のヘッド部９の中心線とキャビティ６の中心線を一直線上に配置するようにヘッド部８、９を配置することによって、直線的にキャビティ６の底面または薄板３の上面に飛滴させることができることから、より確実に気泡残りを抑制しながら測定液を分注して充填することができる。
【００４４】
また、筒部品１をガラスとすることによって、筒部品１の内壁の親水性が向上し、第一のヘッド部８と第二のヘッド部９からの分注時の測定液が表面張力により浸透しやすいため、筒部品１の内部の気泡残りを抑制することができる。
【００４５】
また、センサチップ２の材質をシリコンとし、このセンサチップ２の表面にＳｉＯ2をＣＶＤ、熱酸化、スパッタリングまたは真空蒸着法により形成することによって、センサチップ２の表面の親水性が向上し、第一のヘッド部８と第二のヘッド部９からの分注時の測定液が表面張力により浸透しやすいため、キャビティ６の内部や薄板３の上に気泡残りを抑制しながら測定液を分注して充填することができる。
【００４６】
また、筒部品１とセンサチップ２を酸素プラズマによるアッシング処理を行うことによって、筒部品１とセンサチップ２の表面全体の親水性が向上し、前記と同様の効果を得ることができる。
【００４７】
また、筒部品１とセンサチップ２を硫酸と過酸化水素水または過硫酸アンモニウムを用いて酸化処理することによっても、前記と同様の効果を得ることができる。
【００４８】
また、第一のヘッド部８および／または第二のヘッド部９を水平方向に反復移動させる可動機構を持たせることによって、キャビティ６の底面の側壁付近なども含め比較的大きな面積に対して測定液を均一に飛滴させることが可能となり、確実にキャビティ６の内部や薄板３の上、筒部品１の内部に気泡の発生を抑制しながら測定液を分注して充填することができるとともに、気泡を見つけた場合、気泡に向かって液滴を飛滴させることによって気泡を破壊させて消滅させることも可能である。
【００４９】
また、第一のヘッド部８および／または第二のヘッド部９を水平面内で周回させる可動機構を持たせることによって、所定の箇所に目標を定めて飛滴させることが可能となり、より確実にキャビティ６の内部や薄板３の上下面および筒部品１の内部に気泡の発生を抑制しながら測定液を分注して充填することができる。
【００５０】
しかしながら、条件によっては第一のヘッド部８または第二のヘッド部９を用いて、始めから数回目までの非接触式ジェットディスペンサによる液滴状の測定液を不連続に分注する時に運悪く気泡が残る場合がある。これに対して、その後、数回の不連続の液滴状の測定液を分注することによって、気泡抜きを行うことができる。これは、不連続の液滴は飛滴速度が速くなり、大きなエネルギーをもって気泡に衝突させることができるためであることが分かった。そして、この非接触式ジェットディスペンサの測定液の分注による気泡抜きは１０回以下で確実に行うことができることが分かった。その後、液滴が連続した連続方式で測定液を分注すると良い。
【００５１】
このように、測定液の分注方法を分注の最初から１０回目以下までは液滴状の測定液を不連続に分注し、その後は連続的に液滴を分注することによって、短時間で気泡抜きを行って筒部品１の内部に測定液を充填することができる。
【００５２】
（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２における細胞の電気生理現象の測定装置について図面を参照しながら説明する。基本的な構成は実施の形態１とほぼ同様であり、センサチップ２が固定された筒部品１を保持部７により中空に保持し、筒部品１の上方にキャビティ６の内径より小さな液滴をキャビティの内部または薄板３の上に飛滴することができる非接触式ジェットディスペンサの第一のヘッド部８を設置した状態である。
【００５３】
図４に示したように、本実施の形態２における細胞の電気生理現象の測定装置が実施の形態１と大きく異なっている点は非接触式ジェットディスペンサのヘッド部を一つで行う方法であり、測定液の分注時の方法が異なり、本実施の形態２における測定装置が実施の形態１における測定装置と大きく異なっている点は回転部２０を設けていることである。
【００５４】
このような構成とすることによって、まず筒部品１の内部の貫通孔５によって分断された第一のヘッド部８を設置した側の上部空間１０に、第一のヘッド部８を用いて測定液である細胞外液１２を充填していく。
【００５５】
これによって、キャビティ６の内部または薄板３の上に気泡残りを抑制しながら細胞外液１２を分注することができる。
【００５６】
次に、回転部２０によって筒部品１の上下を反転させる。この時、先ほど充填した細胞外液１２は筒部品１が細く、そして表面張力が働いているため重力による液だれは発生せずに保持されている状態となる。
【００５７】
次に、筒部品１の下部空間１１に細胞内液１３を第一のヘッド部８を用いて充填する。この場合、第一のヘッド部８には測定液の交換機構を設けておくと効率よく細胞外液１２と細胞内液１３を入れ替えて分注することが可能である。
【００５８】
なお、これに対して、測定液の混入を防止したいときには細胞外液１２を充填した第一のヘッド部８と、細胞内液１３を充填した第一のヘッド部８を準備しておき、都度これを制御することによっても分注することができる。
【００５９】
このような測定装置の構造と分注手段によって、気泡残りを抑制しながら細胞外液１２または細胞内液１３を分注しながら正確に測定液の量を制御して充填することができることから、細胞の電気生理現象を安定して高精度に測定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
以上のように、本発明にかかる細胞の電気生理現象の測定装置およびこれを用いた測定方法は、高速で薬理判定を行う薬品スクリーニングなどに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞の電気生理現象の測定装置の断面図
【図２】同分注方法を説明するための断面図
【図３】同測定方法を説明するための断面図
【図４】本実施の形態２における細胞の電気生理現象の測定装置の断面図
【符号の説明】
【００６２】
１  筒部品
２  センサチップ
３  薄板
４  枠体
５  貫通孔
６  キャビティ
７  保持部
８  第一のヘッド部
９  第二のヘッド部
１０  上部空間
１１  下部空間
１２、１２ａ  細胞外液（測定液）
１３、１３ａ  細胞内液（測定液）
１４  第一の電極
１５  第二の電極
１６  圧力伝達チューブ
１７  細胞
１８  開口部
１９  シール材
２０  回転部
【図１】
2008185516.tif 000003
【図２】
2008185516.tif 000004
【図３】
2008185516.tif 000005
【図４】
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