(57)【要約】【課題】  微弱な蛍光を検出することを目的とする。【解決手段】  そこで、本発明は、蛍光被写体からの蛍光を検出する蛍光検出装置であって、前記蛍光被写体を照明する光源と、前記蛍光被写体へ向かう光を遮断するシャッター手段と、前記シャッター手段と光源の間に配置された光出力計測手段と、前記蛍光被写体の発した蛍光を検出する撮像素子と、前前記撮像素子の蓄積時間、又は前記シャッター手段の開閉時間の少なくとも何れか一方を変更する変更手段とを備え、前記変更手段は、前記光出力計測手段の計測結果よりノイズ画像を撮影するための蓄積時間を演算する演算手段と、前記演算結果の前記蓄積時間で撮影したノイズ画像を用い蛍光を検出して形成した撮影画像を補正する補正手段とを有する蛍光検出装置を提供するものである。【選択図】  図１
2008203138.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光被写体からの発光を検出する発光検出装置であって、
前記発光被写体を照射する光源と、
前記光源からの光を遮断するシャッター手段と、
前記光源からの光を検出するための光出力計測手段と、
前記発光被写体から発光した光を検出する撮像素子と、
前記光出力計測手段の計測結果にもとづいて、設定時間を変更するための変更手段とを備えることを特徴とする発光検出装置。
【請求項２】
蛍光被写体からの蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
前記蛍光被写体を照明する光源と、
前記蛍光被写体へ向かう光を遮断するシャッター手段と、
前記シャッター手段と光源との光路間に配置された光出力計測手段と、
前記蛍光被写体の発した蛍光を検出する撮像素子と、
前記撮像素子の蓄積時間、又は前記シャッター手段の開閉時間の少なくとも一方を変更する変更手段とを備え、
前記変更手段は、前記光出力計測手段の計測結果よりノイズ画像を撮影するための蓄積時間を演算する演算手段と、
前記演算結果の前記蓄積時間で撮影したノイズ画像を用い蛍光を検出して形成した撮影画像を補正する補正手段とを有することを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項３】
前記光源は、前記蛍光被写体を励起する励起光を発し、且つ
前記蛍光被写体の発した蛍光を透過し前記撮像素子に導き、前記励起光を遮断する蛍光フィルターを有する撮像手段とを備えることを特徴とする請求項１記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記光源は、レーザー光源であることを特徴とする請求項１又は２のいずれか記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記変更手段は、メモリーに待ち時間を記憶させ、前記光源の点灯からの時間を計時し、前記待ち時間経過後、前記光源からの光出力計測を開始するための信号を送ることを特徴とする請求項１から３のいずれか記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
前記ノイズ画像の撮影は、前記蛍光被写体を配置する前で、且つ前記光源のウェイティング時間の終了後であることを特徴とする請求項１から４のいずれか記載の蛍光検出装置。
【請求項７】
前記蛍光被写体は複数であり、複数の前記蛍光被写体から得られる複数の前記撮影画像を同一の前記ノイズ画像に基づき補正することを特徴とする請求項１から５のいずれか記載の蛍光検出装置。
【請求項８】
予め、複数枚の画像を撮影し、前記複数枚の画像より一枚のノイズ画像を作成することを特徴とする請求項１から６のいずれか記載の蛍光検出装置。
【請求項９】
前記光出力計測手段は、前記蛍光被写体への光照射中も光を蓄積可能であり、且つ前記出力計測手段からの信号に基づき、前記シャッターを閉じるための信号を変更手段に送ることを特徴とする請求項１から請求項７のいずれか記載の蛍光検出装置。
【請求項１０】
前記変更手段は、前記光出力計測手段からの信号により、シャッターを閉じるための信号を前記シャッター手段に送り、且つ撮像素子の蓄積を終了する信号を前記撮像素子へ送る変更手段であり、さらに、蛍光撮影の蓄積時間を計時し記憶する手段と、前記ノイズ画像を蛍光撮影時の前記蓄積時間で補正する第二の補正手段とを有することを特徴とする請求項１から８のいずれか記載の蛍光検出装置。
【請求項１１】
投入された生体のＤＮＡを増幅するＤＮＡ増幅システムと、
増幅されたＤＮＡに標識蛍光分子を結合する標識システムと、
標識されたＤＮＡをＤＮＡチップのプローブと結合させるハイブリダイゼーションシステムとの内の少なくとも一つのシステムを有することを特徴とする請求項１から９のいずれか記載の蛍光検出装置。
【請求項１２】
ダーク画像を取得する装置であって、
光源からの光を検出するための光出力計測手段を備え、
前記光出力計測手段の計測結果をもとに、撮像素子の蓄積時間を変更する変更手段とを備え、
前記蓄積時間をもとに、前記撮像素子でダーク画像を取得することを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光被写体からの蛍光を検出する蛍光検出装置に関するものである。特に、ＤＮＡ解析等の臨床検査に用いる蛍光検出装置に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＤＮＡチップのプローブに結合したターゲットＤＮＡの標識の発する蛍光強度を画像化する装置においては、標識の発する蛍光が微弱であるため、長時間露光により蛍光画像を一括撮像する方法が知られている。ただし、一般的に長時間露光を行うとセンサー中に暗電流が発生し画像中にノイズが現れるため、冷却ＣＣＤを用いる方法が知られている。
【０００３】
冷却ＣＣＤを用いないノイズ除去方法として、長時間露光による被写体撮影後、被写体に光が入らないような状態にしてノイズ画像を作成し、被写体撮影画像からノイズ画像を減算して補正する方法が知られている。例えば、シャッターを閉じたまま、前記露光時間と同じ長さで蓄積したノイズ画像を撮影し、撮影画像から減算して補正する方法である。
【０００４】
また、被写体撮影前に撮影した黒画像で長時間露光時の固定パターンノイズを取除く方法として、次の方法が知られている。知られている方法は次のものがある。〔１〕被写体の測光値より演算した蓄積時間より短い時間で複数の黒画像を事前に取得し、前記蓄積時間で撮影した黒画像を演算で求めることにより黒画像の取得時間を短縮するカメラ（特許文献１参照）。〔２〕被写体の測光値で演算した蓄積時間を本撮影の前後で黒画像を撮影し双方の画像を用いて画像補正を行うカメラ（特許文献２参照）。
【０００５】
さらに、測光窓より外界の明るさを測光し、ＣＣＤの蓄積時間を演算する画像変換記録装置も知られている。（特許文献３参照）
【特許文献１】特開２００５−４５５５２号公報
【特許文献２】特開２００３−７８８２０号公報
【特許文献３】特許０３１１６３９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記従来例においては、
冷却ＣＣＤを使う方法は、冷却ＣＣＤが非常に高価であるため装置の値段が高く、実用性が低い。
【０００７】
一方、被写体からの光を遮断して、撮像素子又はその周辺の回路の出すノイズ画像を撮影し、それをもとに固定パターンノイズ画像を作成し、被写体画像を補正する方法は有効である。この固定パターンノイズ画像は、撮像素子の蓄積時間により異なるため、被写体撮影時の蓄積時間と同じ蓄積時間のノイズ画像を撮影する必要がある。撮影後ならば、被写体撮影時間と同一の蓄積時間でノイズ画像を撮影可能であり、正確な固定パターンノイズ画像が得られる。しかし、被写体撮影後にノイズ画像を撮影していたのでは、固定パターンノイズの補正に時間がかかり検査時間が長時間化する。特に、大量の複数のサンプルを測定する目的では、実用性が低い。
【０００８】
また、被写体からの光を遮断して撮影するノイズ像には、固定パターンノイズとランダムノイズが含まれている。ランダムノイズは、画像毎に異なるため、この影響をなくして固定パターンノイズのみを用いて補正したほうが、より精度の高い蛍光画像を得られる。この画像を得るためには、複数枚の黒画像を撮影し、それを平均化して固定パターン画像を作成する方法が有効だが、複数枚の黒画像を撮影する場合には、なおさら時間がかかる。さらに、複数個のＤＮＡチップの画像を撮影する場合、一枚毎に黒画像をとっていたのではさらに時間がかかる。
【０００９】
そこで、蛍光撮影前に、前記固定パターンノイズ画像を作成する必要があるが、その蓄積時間の算出することが難しい。
【００１０】
特許文献１には、撮影レンズを通して実際に撮像する被写体の明るさを測光しその測光量より演算した、撮影露光時間よりも短く、且つ異なる時間の２種類の蓄積時間をあらかじめ設定する。そして、その蓄積時間で事前に撮影した非露光画像を用いて固定パターンノイズを補正する方法が知られている。しかし、異なる撮影時間で撮影した黒画像から、所定時間の黒画像を演算で求める場合には、ランダムノイズの影響が強調される可能性があり、このランダムノイズを無くすためには、さらに数多くの黒画像が必要になることが考えられる。
【００１１】
さらに、蛍光標識は、励起光を照射することにより褪色し、蛍光強度が低下するため、精度良く計測するためには、計測前に光を照射したくない。したがって、あらかじめ撮影レンズを通して被写体の明るさを測光できないため蓄積時間を求めるための演算もできない。
【００１２】
また、被写体の明るさで露光時間を決めていたのでは、常に光量の積分値が一定の画像を撮像することになり、個々のプローブの蛍光輝度の絶対値を計測できる画像を得ることはできない。
【００１３】
特許文献２も被写体の明るさを用いて露光量を決める点において同様である。
【００１４】
また、特許文献３の周囲の明るさを内蔵のセンサーで検知する方法では、被写体（この場合は銀塩フィルム）を照明する正確な光量がわからないため精度のよい蛍光画像が得ることが難しい。
【００１５】
また、励起光源が、常に一定の明るさで標識蛍光を励起していれば、あらかじめ決めた蓄積時間でノイズ画像及び蛍光画像を撮影できるが、そのような常に一定のパワーを発するレーザー光源、特に固体レーザー光源は高価であり製品のコストが高騰してしまう。低価格なレーザー光源の出力は、気温、放熱環境等の影響により少なからず変動し、さらに、点灯時間とともに出力が低下する傾向が強いため、安定した照明が得られ難い。
【００１６】
上述のように、先行技術において微弱な蛍光を検出するために、種々の改良がなされているが、十分でない。そこで、本発明の目的は、微弱な蛍光を精度よく検出する蛍光検出装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
そこで、本発明は、
発光被写体からの発光を検出する発光検出装置であって、
前記発光被写体を照射する光源と、
前記光源からの光を遮蔽するシャッター手段と、
前記光源からの光を検出するための光出力計測手段と、
前記発光被写体から発光した光を検出する撮像素子と、
前記光出力計測手段の出力にもとづいて、設定時間を変更するための変更手段とを備える発光検出装置を提供するものである。
【００１８】
また、本発明は、
蛍光被写体からの蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
前記蛍光被写体を照明する光源と、
前記蛍光被写体へ向かう光を遮断するシャッター手段と、
前記シャッター手段と光源の間に配置された光出力計測手段と、
前記蛍光被写体の発した蛍光を検出する撮像素子と、
前前記撮像素子の蓄積時間、又は前記シャッター手段の開閉時間の少なくとも何れか一方を変更する変更手段とを備え、
前記変更手段は、前記光出力計測手段の計測結果よりノイズ画像を撮影するための蓄積時間を演算する演算手段と、
前記演算結果の前記蓄積時間で撮影したノイズ画像を用い蛍光を検出して形成した撮影画像を補正する補正手段とを有する蛍光検出装置を提供するものである。
【００１９】
さらに、本発明は、
ダーク画像を取得する装置であって、
光源からの光を検出するための光出力計測手段を備え、
前記光出力計測手段の計測結果をもとに、撮像素子の蓄積時間を変更する変更手段とを備え、
前記蓄積時間をもとに、ダーク画像を取得する装置を提供するものである。
【発明の効果】
【００２０】
光出力計測手段を設けることに、蛍光被写体に一定の光量を照射することが可能になり、ノイズの除去が容易になり蛍光の検出を精度よく行うことが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（実施例）
本発明を図示の実施の形態に基づいて詳細に説明する。
【００２２】
（装置構成）
図１は本発明を実施した一実施例形態の蛍光検出装置の構成図である。
【００２３】
蛍光被写体１は予めカセットトレイ２に配置され、蛍光被写体１からの蛍光を検出するための撮像素子３を備える。この蛍光被写体１に照射する光源４があり、蛍光被写体１へ向かう光を遮断するシャッター手段５を有する。そのシャッター手段５と光源４の光路間には、光出力計測手段６が配置されている。さらに、撮像素子の蓄積時間、又は前記シャッター手段の開閉時間の少なくとも何れか一方を変更する変更手段とを備える。この変更手段７内には、光出力計測手段６の計測結果よりノイズ画像を撮影するための蓄積時間を演算する演算手段７ａを備える。さらに、演算手段７ａの演算結果から算出された蓄積時間で撮影したノイズ画像を用い蛍光を検出して形成した撮影画像を補正する補正手段７ｂとを有する構成になっている。
【００２４】
本発明では、蛍光被写体を用いて説明するが、燐光を発光する燐光被写体を用いることができるため、発光被写体、発光検出装置であればよい。また、本発明は、光出力計測手段を設けることである。これを設けることにより、光出力計測手段の計測結果にもとづいて、設定時間（撮像素子の蓄積時間、シャッター手段の開閉時間）の変更の信号を送信し、設定時間を変更する変更手段とにより適切な設定にすることが可能になる。さらに、撮像素子の蓄積時間を決定することにより、予め取得すべきダーク画像を撮像素子で検出し、メモリーで保存することができる。
【００２５】
具体的な構成とより詳細な構成を次に示す。
【００２６】
波長５３２ｎｍのレーザー光を発生する固体レーザー光源４、入射面にはＭｇＦ２の単層膜、裏面は５３２ｎｍの光を略１００％透過する反射防止膜が施してあり、且つ表面の単層膜により２％程度レーザー光を反射する光路分離ミラー８を備える。レーザー光の照射非照射を制御するシャッター手段５、レーザー光線のビーム径を広げるビームエクステンダー９、ガウシアンビームであるレーザー光線を被写体面でフラットトップの均一な強度の光束に変換するビームホモジナイザー１０は、照明光学系を構成する。また、前記光路分岐ミラー８の分岐方向には、オパールガラス、擦りガラス等の拡散板１１、フォトディテクター１２が配置されレーザー出力計測手段を構成する。蛍光フィルター１３、撮像光学系１４、撮像素子３を有するデジタルカメラ１５は、蛍光撮像手段を構成する。前記撮像光学系の上方には、搬送ステージ１６の上にカセットトレイ２が配置されており、その中には、蛍光標識を施したＤＮＡプローブアレイを有する複数のカセットトレイ２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄを配置する。蛍光標識されたＤＮＡプローブアレイから発した蛍光は、撮像光学系を通して撮像素子へ蛍光が導かれる。
【００２７】
フォトディテクター１２からの出力を受ける光量計測回路１７は、電荷を蓄積するコンデンサー１７ａ、所定値とコンデンサーの電圧とを比較するコンパレーター１７ｂ、所定値に達するのに要する時間を計測するタイマー手段１７ｃを有する。制御回路（変更手段）７は、ＭＰＵボード７ａ、画像ボード７ｂ、メモリー７ｃを有し、前記計時された時間は、このメモリー７ｃに記憶される。具体的には、パソコンを用いて行う。この制御回路では、撮像素子３の蓄積時間又はシャッター手段の開閉時間を変更することを決定し、その信号を撮像素子やシャッター手段に送る。また、この制御回路７は、制御インターフェース１８を介して、デジタルカメラ１５の撮影時間の変更、及び、デジタルカメラ１５からの画像転送を行う。変更手段には、操作パネル１９が接続されており、操作パネルを通じて変更手段に電源のＯＮ／ＯＦＦ、計測のスタート、検体数の入力等の操作を行う。
【実施例】
【００２８】
実施例１（レーザー照射時間と蛍光画像の蓄積時間とが異なる蛍光検出装置）
次にこのような構成の装置を用いて、前記ＤＮＡチップ上の標識蛍光画像を撮影する方法について述べる。まず、検査者は、ＤＮＡチップのハイブリダイゼーション反応等の準備に先立ち操作パネル１９を操作し装置に電源を投入する。電源の投入により変更手段７は、装置のイニシャライズを行うとともにレーザー光源４の電源をＯＮする。これによりレーザー光源４は、レーザー光を発する。
【００２９】
（蓄積時間演算）
レーザー出力が一定の安定状態に達するウェイティング時間終了後、光出力計測手段７でレ−ザー光出力を測定する。
【００３０】
固体レーザー光源４の、パワー変動の様子を図２（Ａ）に示す。この図において横軸は時間であり、縦軸はレーザー出力を示す。例えば、図２（Ａ）では８０ｍＷから１００ｍＷのレンジで示している。この図に示すように、固体レーザー光源は、温度、湿度等の環境条件により複数の安定状態を持ち、２−Ａ−１に示すような離散的な出力変動及び、２−Ａ−２に示すような不安定な出力変動等が現れる。また、電源再投入により、出力が異なる安定状態に落ち着く現象や長期の使用に対して徐々に出力が低下する現象もある。また、点灯直後は、安定するまでに時間（ウェイティング時間）を要する。図２の（Ａ）は、既にウェイティング時間は終了している。図２（Ｃ）は、シャッター手段５の開閉を示すタイミングチャートであり、レーザーパワー測定の際は閉じられている。これによりレーザー光が、蛍光標識を励起することはない。変更手段７は、メモリー７ｃにデジタルカメラのＩＳＯ感度等を考慮した、蓄積電圧Ｖｃを記憶しており、レーザー出力測定開始に先立ち、コンパレータ１７ｂに蓄積電圧値Ｖｃを設定する。そしてレーザー出力計測開始とともにタイマー１７ｃをスタートする。レーザー光源４を発した波長５３２ｎｍの光は、分岐ミラー８の表面で一部が反射され、拡散板１１を照明する。拡散板１１により散乱された光の一部は、フォトディテクター１２に達し、電流に変換される。この様に拡散板を介して計測することにより、ビームの角度変動等の影響を低減し安定してレーザー出力を計測することができる。この電流は、コンデンサー１７ａに蓄積され、その電圧は、コンパレーターにより常に比較することができる。図２（Ｂ）は、このコンデンサー１７ａの電圧を示すタイミングチャートであり、計測開始とともに電圧が上昇し、やがて電圧Ｖｃに達する。タイマーは、この蓄積開始から、電圧がＶｃに達するまでの時間ｔｐを計測し、時間ｔｐは変更手段に信号が転送されメモリーに記憶される。変更手段７は、ｔｐをもとに補正のためのダーク画像撮像の蓄積時間ｔｄ、及び、蛍光画像撮像時の蓄積時間ｔｆを演算する。実際の露光時間は、レーザー光の強度変動分長くなる可能性があるため、１５％程度長く設定するとよい。
すなわち  ｔｄ＝ｔｆ＝ｔｐ＋δｔ
レーザー出力が安定している場合には、ＰＤの出力電流を電圧変換しその電圧値をもとに、レーザー出力を計測してもよい。しかし、本実施例に使用するような、出力変動のある光源を使う場合、決められた時間蓄積し、高い周波数の変動の影響をなくして計測するほうがより正確な計測ができる。これは、蛍光被写体への光照射中も光を蓄積可能である。
【００３１】
（ダーク画像撮影）
次に、蛍光画像補正のためのノイズ画像であるダーク画像を撮像する。ダーク画像とは、撮像素子に光の入力がないダークな状態で撮影する画像であり電気的なノイズを表す。
【００３２】
変更手段７は、制御インターフェース１８を介して通信を行い、デジタルカメラのセンサー３の蓄積を開始し、ｔｄ時間経過後、蓄積終了の指令を送り、その画像を変更手段７の画像ボードに転送しメモリー７ｃに保存する。図２のタイミングチャート（Ｄ）は、撮像素子の蓄積の様子を示しＨの部分は、蓄積中であることをしめす。この実施例ではこの動作を３回繰返し、３枚の蓄積時間ｔｄのダーク画像ｄｉ１、ｄｉ２、ｄｉ３を得る。変更手段７は、これらの画像を平均化することにより、ランダムノイズを取除き、ノイズ画像である固定パターンノイズ画像Ｉｄを作成しメモリーに保存する。これにより、蛍光撮影準備が完了する。ダーク画像は１枚でもよいが、複数枚とりダーク画像の精度をあげるほうが好ましい。
【００３３】
一定時間蛍光撮影のための操作が行われない場合、変更手段は、再び前記レーザー出力計測を行い、ダーク画像撮影を行いメモリー中の固定パターンノイズ画像を更新する。検査者が、操作パネルを操作し、暗箱の蓋を開ける等蛍光検出を行うための動作を行った場合には、上記ダーク画像撮影の動作を終了する。ただし、前記ダーク画像撮影動作は、トレー搬入、チップ配置の間は継続可能であり、実際の蛍光撮影の直前まで行うことができる。
【００３４】
レーザー出力の変動が一定値以上の場合に、ダーク撮影を再度行うようにプログラムすればダーク撮影の回数を減らせることは言うまでもないが、それは、使用するレーザーの出力変動を勘案して決めるのが効率がよい。
【００３５】
また、本実施例の場合複数のダーク画像を撮影し、それらの画像より一枚の固定パターン画像を求めたが、ダーク画像が一枚の場合には、ダーク画像をそのまま固定パターン画像として補正に利用してもよい。
【００３６】
（蛍光撮影）
操作者は、ハイブリダイゼーション反応等の準備の完了したＤＮＡチップをトレイにのせ、パネル１９を操作し、不図示の暗箱の蓋を開き、トレイを配置し蛍光撮影をスタートさせる。パネル１９への入力により蛍光撮影が行われることを検知した変更手段７は、ダーク画像撮影中の場合は、その撮影動作を中止し、暗箱の蓋を閉じて、カセット２ａを撮影光軸の上に配置する等の蛍光撮影の準備を行う。そして撮像素子３の蓄積を開始した後、レーザーシャッター５を開放する。図２（Ｃ）にレーザーシャッター開閉のタイミングチャートを示す。レーザー光は、ビームエクスパンダー９で広げられ、ビームホモジナイザー１０で被写体面におけるビーム断面の強度分布が均一な光束に変換されＤＮＡチップの蛍光標識を励起する。蛍光フィルター１３は、励起光の反射光及び散乱光を遮断し、標識の発した蛍光のみを透過する。透過した蛍光は、撮影光学系１４により撮像素子３上に結像し、蛍光画像を形成する。
【００３７】
フォトディテクター１２は前記と同様、光路分岐手段８で分岐したレーザー光を受光し、受光エネルギーを電流に変換しコンデンサー１７ａに蓄える。そして、設定電圧Ｖｃになったところで、変更手段７に信号を送るとともにコンデンサーに蓄えられた電荷を放電する。この信号を受けた変更手段７は、レーザーシャッター５を閉じる。これにより、蛍光標識の励起は終了するが、撮像素子の蓄積は前記演算により求めた蓄積時間ｔｆになるまで継続する。そして蓄積時間が、ｔｆになった時点で蓄積を終了し、蛍光画像Ｉｆを変更手段７に転送する。次に変更手段７は、搬送テーブル１６を制御し２番目のカセット２ｂを撮影光軸上に配置する。そして、前記と同様、撮像素子の蓄積を開始し、レーザーシャッター５を開放し蛍光標識を励起する。前記と同様、図２に示すように、コンデンサーはレーザー光を蓄積し、電圧がＶｃに達したところでレーザーシャッターを閉じ励起を終了する。そして、その後撮像素子の蓄積時間がｔｆに達した時、蓄積を終了し画像を変更手段に転送する。同様に変更手段は、３番目のＤＮＡチップを撮影光軸上に配置し蛍光撮影を行う。図２に示すように、このときにはレーザー出力が、上昇しているため、コンデンサーの電圧が早くＶｃに達するため図２の２−Ｃ−１に示したようにレーザーシャッターの開放時間は短い。しかし、撮像素子の蓄積時間は、演算で求めた時間ｔｆの間継続し、蓄積終了とともに蛍光画像を変更手段７に転送する。このように、レーザーの露光時間はレーザー強度により異なるが、撮像センサーの蓄積時間は、常に一定であるため、最初に作成した固定パターン画像を用いて補正することができる。これにより、早く解析画像を作成することができる。
【００３８】
（画像補正）
変更手段７は、蛍光画像Ｉｆから、前記のように求めた固定パターン画像Ｉｄを引き算し解析用の蛍光画像を作成する。図３は、ＤＮＡチップの蛍光プローブを撮影した蛍光画像を表す図であり、プローブ蛍光の部分が、明部としてアレー状に配列しており、背景部分は黒である。しかし、この黒部分には、撮像素子の出す固定パターンノイズ成分等も含まれるため、補正が必要である。
【００３９】
図４（ａ）は、蛍光撮影した画像の断面図でありＤＮＡチップ上の蛍光スポットに対応した部分３−ａ−１、３−ａ−２、３−ａ−３は図３の明部として示したように高い輝度に対応して信号が強く現れている。図４（ｂ）は、同じ部分の固定パターン画像の断面図である。この固定パターン画像を前記蛍光画像Ｉｆから画像減算することにより固定パターンノイズを取除くことができる。図４（ｃ）は、蛍光画像から固定パターン画像を引いた画像の同様の部分の断面図であり、ノイズ分がなくなり、プローブ蛍光の輪郭が明瞭に現れている。
【００４０】
変更手段７は、電源投入から、一定の時間を待ち、その後、カセット搬入までの間に自動的にレーザー出力測定、ダーク画像撮影を行うようにプログラムされている。その動作の流れを図５のフローチャートに示す。
【００４１】
以上、説明したように、レーザー出力を計測しその計測結果より蓄積時間を演算し、蛍光撮影前にダーク画像を撮影しておいたため、蛍光撮影後直ちに固定パターンノイズを補正した解析用画像を作成することができるため撮影の効率がよい。特に被写体が複数ある場合にも、一枚の固定パターンノイズ画像を使って複数の蛍光画像を補正できるため迅速な蛍光検出をおこなえる。
【００４２】
前記実施例においては、撮像素子の蓄積中にレーザー出力の積分値を求め、シャッター開放時間を制御する例を示した。このように制御することにより、常に励起光のエネルギーを一定にして撮影できるため、絶対値の信頼の高い測定値が得られる。しかし、絶対値の精度が要求されない場合には、シャッター制御を行わず、蓄積時間中励起レーザー光を照射するようにしてもよい。この場合でも、本発明のあらかじめ非露光画像を撮影してあるため、蛍光撮影後直ちに固定パターンノイズを補正でき効率よく解析用画像が得られるという効果は同様である。
【００４３】
実施例２（レーザー照射時間と蛍光画像の蓄積時間とが同じ蛍光検出装置）
前記実施例においては、蛍光撮像時の蓄積時間を常に一定にし、どのカセットの蛍光画像に対しても、同一の固定パターンノイズ画像をそのまま使えるようにした。しかし、励起光の露光時間に対応して蓄積時間も制御し、その蓄積時間を記録して、固定パターンノイズ画像を補正し、蛍光画像の補正に用いても良い。その実施例を次に示す。
【００４４】
構成は、第一の実施例を示す図１と同様である。第二の実施例のタイミングチャートを図６に示す。この実施例において、ダーク画像は、第一の実施例と同様に取得するが、蛍光画像取得時の蓄積時間は、その時のレーザー出力により異なる。
【００４５】
すなわち、蛍光画像蓄積とともに、タイマー１７ｃをスタートし、レーザーシャッター５を開放する。このタイミングに同期してレーザー計測手段１７のコンデンサーは、フォトディテクター１２からの電流の蓄積を開始する。前記レーザーシャッター５が開放している間、蛍光標識は励起され、蛍光像は、撮像素子に蓄積される。前記コンデンサーの電圧が、電圧Ｖｃに達したところで、レーザーシャッター５を閉じ標識の励起を終了する。そしてこれと同期して変更手段７は、インターフェース１８を介してデジタルカメラ１５に撮影終了の指令を送り、撮像素子３の蓄積を終了する。タイマー１７ｃは、コンデンサーの電圧がＶｃに達するまでの時間すなわち、撮像素子の蓄積開始から終了までの時間を計測しており、計測した時間を画像とともに変更手段７に送り、メモリーに記憶する。前記と同様このような撮影動作をカセット毎に行い、メモリーには、カセット２ａ〜２ｄに対応した画像と蓄積時間ｔ１〜ｔ４が記憶される。
【００４６】
変更手段７は、それぞれのカセットの画像を撮像したときの蓄積時間ｔ１〜ｔ４に応じて、前記固定パターン画像を補正する。
【００４７】
この実施例においては、蛍光標識励起中のレーザー出力の積分値の計測手段と、ダーク画像撮影の蓄積時間を求めるレーザー出力計測手段を兼用したため、簡単な構造で、信頼度の高い計測が可能である。
【００４８】
（固定パターンノイズの補正）
固定パターンノイズ画像Ｉｄは、蓄積時間ｔｄで撮影したダーク画像ｄｉ１，ｄｉ２、ｄｉ３より演算して求めたものであるから、精度良く蛍光画像を補正するためには、蛍光画像の蓄積時間ｔ１〜ｔ４に応じて補正する必要がある。図７（Ａ）に蓄積時間ｔｄの固定パターンノイズ画像の各画素に対応した画像データを示す。各画素のアドレス（ｉ，ｊ）に対応した画像データをＮｄ＿ｔｄ（ｉ．ｊ）で表す。同様に撮像時間ｔ１の固定パターンノイズ画像の各アドレスに対応した画素値を図７（Ｂ）に示すようにＮｄ＿ｔ１（ｉ，ｊ）とあらわすとＮｄ＿ｔ１（ｉ，ｊ）は、Ｎｄ＿ｔｄ（ｉ，ｊ）及び蓄積時間ｔ１、ｔｄを用いて以下の式で表すことができる。
Ｎｄ＿ｔ１（ｉ，ｊ）＝Ｎｄ＿ｔｄ（ｉ，ｊ）＊ｔ１／ｔｄ
固定パターンノイズには、時間に大きさが比例するセンサーの出す暗電流成分と、時間に比例しない読出し回路に依存する読出しノイズ成分よりなる。したがって、より正確には、平均的な読出しノイズ画像Ｎｄ＿ｒｏ（ｉ，ｊ）を記憶しておき
Ｎｄ＿ｔ１（ｉ，ｊ）＝（Ｎｄ＿ｔｄ（ｉ，ｊ）−Ｎｄ＿ｒｏ（ｉ，ｊ））＊ｔ１／ｔｄ＋Ｎｄ＿ｒｏ（ｉ，ｊ）
を計算しても良いが、蛍光撮影のように、蓄積時間が十分長い場合には、固定パターンノイズ画像の画素値は時間に比例するとして近似してもよい。以上と同様の計算により、各蓄積時間に対応した固定パターンノイズ画像データＮｄ＿ｔ１（ｉ，ｊ）〜Ｎｄ＿ｔ４（ｉ、ｊ）を求め各カセット対応した蛍光画像データｆｉ１（ｉ，ｊ）〜ｆｉ４（ｉ，ｊ）より減算し、固定パターンノイズの補正を行う。
【００４９】
以上説明した実施例によれば、レーザーシャッター５の開放時間と蓄積時間を同期することにより、非露光状態で蓄積する時間を無くせるため、検出にかかる時間を短縮することができる。さらに、画像の蓄積時間により固定パターンノイズ画像を補正して用いるため効率良く高い信頼性の検出が行える。
【００５０】
実施例３（ＤＮＡ増幅器を含めた装置）
以上説明した実施例は、蛍光検出部のみの実施例について説明したが、検体ＤＮＡの増幅、蛍光標識、ハイブリダイゼーション反応、検出までの一連の動作を一気に行う遺伝子診断システムにこの検出系を組み込んだ場合にさらに効果は大きい。組み込むシステムとしては、ＤＮＡ増幅システム、標識システム、ハイブリダイゼーションシステムがあり、これらをすべて組み込んでも、一部を組み込んだシステムでもよい。
【００５１】
図８は、生体から採取、抽出されたＤＮＡ検体の増幅から、蛍光検出、解析までを行う一気通貫システムの概略を示す図である。検体ＤＮＡの入力をおこなうピペット、注射器等を設置する検体セットユニット６１より投入された検体のＤＮＡは、増幅ユニット６２で増幅することにより飛躍的に数が増大し、さらに標識蛍光分子との結合反応が行われる。次に、反応ユニット（ハイブリダイゼーションシステム）６３に送られＤＮＡチップのプローブとのハイブリダイゼーション反応が行われる。反応ユニット６３には、ＤＮＡチップ２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄをのせたトレー６５が搬入される。増幅ユニット６２、反応ユニット６３には、試薬、及び廃液管理ユニット６６より、試薬供給、廃液処理が行われる。６４は、微弱蛍光を検出するため暗箱内に図１の蛍光検出手段を有する蛍光検出ユニットであり、各ＤＮＡプローブに結合した標識蛍光分子の像を撮像する。検出ユニットは、解析用画像をＰＣ６７に送り、ＰＣ６７は、この蛍光画像を用いてＤＮＡ解析を行う。６９は各操作スイッチを有する操作パネルである。
【００５２】
このような構成において各ユニットの動作タイミングを図９に示す。まずユーザーはユニット６１に検体ＤＮＡをセットし、パネル６９を操作して、検体数を入力し、スタートスイッチを操作し装置の動作をスタートさせる。すると変更手段６８は、開始時刻とともに検体数がメモリーに記録する。変更手段６８は、この検体数に基づいてトレイ６５にＤＮＡチップをセットし、反応ユニット６３に搬入する。そしてユニット６２において既知の手段によるＤＮＡ増幅を開始する。さらに変更手段６８は、検出ユニット６４におけるレーザー点灯時刻、レーザー出力測定時刻、ダーク画像撮影開始時刻等の図１０に示すタイムテーブルを作成する。このタイムテーブルは、増幅開始時刻と検体数より、蛍光検出開始時刻を演算し、この検出開始時刻を基準に各工程でかかる時間をもとに遡り、レーザー点灯時刻、レーザー出力測定時刻、ダーク画像撮影開始時刻を演算する。ただ、増幅反応ユニットでの時間が試薬投入、温度調整時間等のバラツキにより若干ずれることもあるので、各ユニットの進行状況をモニターして、前記タイムテーブルを補正したほう効率がよいことは言うまでもない。
【００５３】
増幅ユニット６２の中で増幅及び蛍光標識と結合された検体ＤＮＡは流路を通り、反応ユニット６３内の検体番号と対応したＤＮＡチップと接しすでに試薬の投入されたチャンバー内に搬入される。標識された検体ＤＮＡは、ここで、ＤＮＡチップ上のプローブとハイブリダイゼーション反応が行われ、より相補性の高いプローブと結合する。このため相補性の高いプローブほど多くの蛍光標識が結合し強い蛍光を発する。
【００５４】
これらの動作と平行して、検出ユニット６４内では、先に決めたタイムテーブルに従って、レーザー点灯、レーザー出力測定、ダーク画像撮影が行われる。
【００５５】
そして、ダーク画像撮影が終わった頃、ハイブリダイゼーション反応の終わったＤＮＡチップをのせたトレー２が、検出ユニット６４の暗箱内に搬入され、直ちに蛍光撮影が開始される。そして、検出画像は、実施例１、又は、実施例２で述べた補正方法に従い、既に取得したダーク画像を用いて固定パターンノイズが補正され、解析用ＰＣ６７へと転送される。
【００５６】
以上述べたように、他のユニットで反応を行っている蛍光画像撮影の前にダーク画像が取得してあるため、蛍光撮影後、ノイズ画像を蛍光撮影時の蓄積時間で補正することにより、迅速に固定パターンノイズを補正した解析用画像作成することができる。これにより増幅反応開始から、解析結果表示までの、時間を効率良く使って、精度のよい遺伝子解析を行うことができる。
【００５７】
実施例４（さらに付加できる構成）
本発明においては、光出力計測手段をもちいることにより、微弱な信号をより精度よく検出することが可能になる。さらに、微弱な信号を増幅させるために、ロックインアンプ等を用いたロックイン検出を利用してもよい。ロックイン検出を行う場合は、光の変調信号を作らなくてはならないが、これは、レーザー光源４で変調信号を作成する方法や、シャッター手段５で変調する方法や、別途変調用のシャッタ手段をレーザー光源４と蛍光被写体１の間に設ける方法がある。変調のための駆動信号（変調信号）はＭＰＵボード７ａに送られる。変調された光で励起された蛍光被写体は、変調された強度で蛍光を発光し、その蛍光を撮像素子３で検出する。撮像素子で検出された信号と駆動信号を参照信号としてＭＰＵボード７で画素ごとの信号を得て、画像を形成する。処理の都合によっては、演算手段のＭＰＵボードとロックイン検出の演算処理を行うＭＰＵボードを別々に設けてもよい。この方法を用いれば、ホワイトノイズが低減できる。
【００５８】
また、検出エリアが小さいものであれば、光をｐ偏光とｓ偏光とに分離し、その強度差を測定するアンバランス検出を用いることも可能である。ただし、画素ごとに検出器を増やす必要があるため、検出器をライン状にして、レーザー光源を走査するなどの工夫が必要になる。
【００５９】
さらに、レーザー光源自体をｓ偏光又はｐ偏光に偏光して、蛍光被写体に照射することも可能である。蛍光材料の特性に応じて、励起によって発光する強度の強い光を選ぶことも重要である。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の装置を用いたＤＮＡ解析結果は、臨床検査における遺伝子診断に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】実施の形態の蛍光検出装置の構成図
【図２】第一の実施形態のタイミングチャート
【図３】蛍光画像を示す図
【図４】蛍光画像と固定パターン画像を示す図
【図５】動作の流れを示すフローチャート
【図６】第二の実施形態のタイミングチャート
【図７】各画像の画素値を示す図
【図８】第三の実施形態のユニット構成を示す図
【図９】第三の実施形態のタイミングチャート
【図１０】タイムテーブルを示す図
【符号の説明】
【００６２】
１  蛍光被写体
２  カセットトレイ
３  撮像素子
４  光源
５  シャッター手段
６  光出力計測手段
７  変更手段
８  光分離ミラー
９  ビームエクステンダー
１０  ビームホモジナイザー
１１  拡散版
１２  フォトディテクター
１３  蛍光フィルター
１４  撮像光学系
１５  デジタルカメラ
１６  搬送ステージ
１７  光量計測回路
１８  制御インターフェイス
１９  操作パネル
【図１】
2008203138.tif 000003
【図２】
2008203138.tif 000004
【図３】
2008203138.tif 000005
【図４】
2008203138.tif 000006
【図５】
2008203138.tif 000007
【図６】
2008203138.tif 000008
【図７】
2008203138.tif 000009
【図８】
2008203138.tif 000010
【図９】
2008203138.tif 000011
【図１０】
2008203138.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月23日(2007.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光被写体からの発光を検出する発光検出装置であって、
前記発光被写体を照射する光源と、
前記光源からの光を遮断するシャッター手段と、
前記光源からの光を検出するための光出力計測手段と、
前記発光被写体から発光した光を検出する撮像素子と、
前記光出力計測手段の計測結果にもとづいて、設定時間を変更するための変更手段とを備えることを特徴とする発光検出装置。
【請求項２】
蛍光被写体からの蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
前記蛍光被写体を照明する光源と、
前記蛍光被写体へ向かう光を遮断するシャッター手段と、
前記シャッター手段と光源との光路間に配置された光出力計測手段と、
前記蛍光被写体の発した蛍光を検出する撮像素子と、
前記撮像素子の蓄積時間、又は前記シャッター手段の開閉時間の少なくとも一方を変更する変更手段とを備え、
前記変更手段は、前記光出力計測手段の計測結果よりノイズ画像を撮影するための蓄積時間を演算する演算手段と、
前記演算結果の前記蓄積時間で撮影したノイズ画像を用い蛍光を検出して形成した撮影画像を補正する補正手段とを有することを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項３】
前記光源は、前記蛍光被写体を励起する励起光を発し、且つ
前記蛍光被写体の発した蛍光を透過し前記撮像素子に導き、前記励起光を遮断する蛍光フィルターを有する撮像手段とを備えることを特徴とする請求項２記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記光源は、レーザー光源であることを特徴とする請求項２又は３のいずれか記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記変更手段は、メモリーに待ち時間を記憶させ、前記光源の点灯からの時間を計時し、前記待ち時間経過後、前記光源からの光出力計測を開始するための信号を送ることを特徴とする請求項２から４のいずれか記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
前記ノイズ画像の撮影は、前記蛍光被写体を配置する前で、且つ前記光源のウェイティング時間の終了後であることを特徴とする請求項２から５のいずれか記載の蛍光検出装置。
【請求項７】
前記蛍光被写体は複数であり、複数の前記蛍光被写体から得られる複数の前記撮影画像を同一の前記ノイズ画像に基づき補正することを特徴とする請求項２から６のいずれか記載の蛍光検出装置。
【請求項８】
予め、複数枚の画像を撮影し、前記複数枚の画像より一枚のノイズ画像を作成することを特徴とする請求項２から７のいずれか記載の蛍光検出装置。
【請求項９】
前記光出力計測手段は、前記蛍光被写体への光照射中も光を蓄積可能であり、且つ前記出力計測手段からの信号に基づき、前記シャッターを閉じるための信号を変更手段に送ることを特徴とする請求項２から８のいずれか記載の蛍光検出装置。
【請求項１０】
前記変更手段は、前記光出力計測手段からの信号により、シャッターを閉じるための信号を前記シャッター手段に送り、且つ撮像素子の蓄積を終了する信号を前記撮像素子へ送る変更手段であり、さらに、蛍光撮影の蓄積時間を計時し記憶する手段と、前記ノイズ画像を蛍光撮影時の前記蓄積時間で補正する第二の補正手段とを有することを特徴とする請求項２から９のいずれか記載の蛍光検出装置。
【請求項１１】
投入された生体のＤＮＡを増幅するＤＮＡ増幅システムと、
増幅されたＤＮＡに標識蛍光分子を結合する標識システムと、
標識されたＤＮＡをＤＮＡチップのプローブと結合させるハイブリダイゼーションシステムとの内の少なくとも一つのシステムを有することを特徴とする請求項１から１０のいずれか記載の蛍光検出装置。
【請求項１２】
ダーク画像を取得する装置であって、
光源からの光を検出するための光出力計測手段を備え、
前記光出力計測手段の計測結果をもとに、撮像素子の蓄積時間を変更する変更手段とを備え、
前記蓄積時間をもとに、前記撮像素子でダーク画像を取得することを特徴とする装置。