(57)【要約】【課題】  消化管間葉系腫瘍症例において、予後不良症例と予後良好症例を高判別率で識別する腫瘍マーカーを提供する。【解決手段】  消化管間質腫瘍を患う患者のうち、フェチンの発現に基づき定義された患者の消化管間質腫瘍を処置するための医薬組成物であって、下式（Ｉ）：【化１】2008100958.tif 000008で示される４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容されるその塩を活性成分として含む医薬組成物、ならびに、消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測するためのキットおよび方法が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化管間質腫瘍を患う患者のうち、フェチンの発現に基づき定義された患者の消化管間質腫瘍を処置するための医薬組成物であって、
下式（Ｉ）：
【化１】
2008100958.tif 000007
で示される４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容されるその塩を活性成分として含む医薬組成物。
【請求項２】
病理学的悪性度に基づきさらに定義された患者の消化管間質腫瘍を処置するための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記患者が、消化管間質腫瘍を患う患者のうち、フェチン陰性の患者およびフェチン陽性かつ病理学的悪性度が高度である患者である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記患者が、消化管間質腫瘍を患う患者のうち、フェチン陰性かつ病理学的悪性度が高度または中等度である患者である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記患者が、消化管間質腫瘍を患う患者のうち、フェチン陰性かつ病理学的悪性度が高度である患者である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測するためのキットであって、前記患者から得られた試料におけるフェチンの発現を検出または定量する手段を含む、キット。
【請求項７】
消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測する方法であって、
前記患者から得られた試料を供するステップと、
前記試料におけるフェチンの発現を検出または定量するステップと、
フェチンの発現に基づき前記患者の予後を予測するステップと
を含む、方法。
【請求項８】
前記予測するステップにおいて、病理学的悪性度にさらに基づき前記患者の予後を予測する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記予測するステップにおいて、フェチン陰性である場合およびフェチン陽性かつ病理学的悪性度が高度である場合に予後不良と判断する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記予測するステップにおいて、フェチン陰性かつ病理学的悪性度が高度または中等度である場合に予後不良と判断する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記予測するステップにおいて、フェチン陰性かつ病理学的悪性度が高度である場合に予後不良と判断する、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ:gastrointestinal stromal tumor）を処置するための医薬組成物、ならびに消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測するためのキットおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
消化管間質腫瘍は、化学療法や放射線治療に抵抗性を示し、手術が唯一の完全寛解療法とされてきた。しかしながら、近年、チロシンリン酸化酵素阻害剤（メシル酸イマチニブ、商品名：グリベック）が治療に用いられるようになった（特許文献１：特表2004-512328）。メシル酸イマチニブは多くのＧＩＳＴ症例で奏効性を示す一方で重篤な副作用も引き起こすことが報告されている。このため、現在のところ、メシル酸イマチニブは術後再発症例や進行症例に主に処方されている。
【０００３】
予後不良症例を事前にみきわめることができればあらかじめメシル酸イマチニブによる治療を開始することが可能である。このような予後予測マーカーとして、臨床病理像と予後の関係や（非特許文献１：Hasegawa T et al.(2002 Jun)）、Ｋｉｔのエクソン１１における変異と予後の関係（非特許文献２：Andersson J et al.(2006)）が報告されている。しかしながら、これらは実用化のレベルでは十分なものではない。このように、治療方針を決定するほどの確度で信頼され、臨床の場で実用化できるレベルで予後を予測できる腫瘍マーカーや臨床病理学的因子は、ＧＩＳＴにおいては確立されていない。また、ｍＲＮＡやタンパク質発現解析による予後不良因子の同定は試みられた例がない。
【０００４】
【特許文献１】特表2004-512328  ／  WO02/34727
【特許文献２】特開平6-87834  ／  特許第2706682  ／  EP-A-0 564 409  ／  U.S.P. 5,521,184
【特許文献３】特表2001-510192  ／  特許第3276359  ／  WO99/03854
【非特許文献１】Hasegawa T, Matsuno Y, Shimoda T, Hirohashi S., "Gastrointestinal stromal tumor: consistent CD117 immunostaining for diagnosis, and prognostic classification based on tumor size and MIB-1 grade.", Human Pathology, 2002 Jun;33(6):pp669-676
【非特許文献２】Andersson J, Bumming P, Meis-Kindblom JM, Sihto H, Nupponen N, Joensuu H, Oden A, Gustavsson B, Kindblom LG, Nilsson B., "Gastrointestinal stromal tumors with KIT exon 11 deletions are associated with poor prognosis.", Gastroenterology, 2006 May;130(6):pp1573-1581
【非特許文献３】Resendes, BL et al, "Isolation from cochlea of a novel human intronless gene with predominant fetal expression", J. Assoc. Res. Otolaryngol., 2004 June;5(2):pp185-202
【非特許文献４】Hasegawa T, Yokoyama R, Lee YH, et al., "Prognostic relevance of a histological grading system using MIB-1 for adult soft-tissue sarcoma.", Oncology, 2000;58:pp66-74
【非特許文献５】Hasegawa T, Yamamoto S, Nojima T, et al., "Validity and reproducibility of histologic diagnosis and grading for adult soft tissue sarcomas.", Human Pathology, 2002 Jan;33(1):pp111-115
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、消化管間葉系腫瘍症例において、予後不良症例と予後良好症例を高判別率で識別する腫瘍マーカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一の側面によると、消化管間質腫瘍を患う患者のうち、フェチンの発現に基づき定義された患者の消化管間質腫瘍を処置するための医薬組成物であって、
下式（Ｉ）：
【化１】
2008100958.tif 000002
で示される４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容されるその塩を活性成分として含む医薬組成物が提供される。
【０００７】
本発明の他の側面によると、消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測するためのキットであって、前記患者から得られた試料におけるフェチンの発現を検出または定量する手段を含む、キットが提供される。
【０００８】
本発明の他の側面によると、消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測する方法であって、
前記患者から得られた試料を供するステップと、
前記試料におけるフェチンの発現を検出または定量するステップと、
フェチンの発現に基づき前記患者の予後を予測するステップと
を含む、方法が提供される。
【発明の効果】
【０００９】
以下に詳細に説明するように、本発明によると、消化管間葉系腫瘍症例において、予後不良症例と予後良好症例を高判別率で識別する腫瘍マーカーが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明の実施の形態を、添付図面を参照しながら説明する。もっとも、本発明は、以下に説明する実施の形態によって、限定されるものではない。
【００１１】
本発明者等は、驚くべきことに、フェチンというタンパク質の発現が消化管悪性腫瘍（ＧＩＳＴ）患者の予後不良と逆相関することを発見した。本発明者等は、プロテオーム解析によってＧＩＳＴ患者の予後を予測するための腫瘍マーカーの開発を行った。以下に詳細に説明するように、転移が２年以上なく病理学的悪性度も低かった症例群と、早期（１年以内）に転移を来し病理学的悪性度も高かった症例群とを比較した。手術検体に対して蛍光二次元電気泳動法によるタンパク質の網羅的発現解析を行い、約１６００個のタンパク質スポットの中から両群を区別しうる特定のタンパク質としてフェチンを見いだした。追加症例を用いた実験でもフェチンの予後予測マーカーとしての有用性が確認された。
【００１２】
このように、本発明の一の側面によると、消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測するためのキットおよび方法が提供される。すなわち、本発明によると、フェチンを腫瘍マーカーとすることで、ＧＩＳＴ症例のうち予後不良群を予め見出すことができる。さらに、このような症例には早期から消化管悪性腫瘍治療剤の投与を開始することでＧＩＳＴの治療成績を向上させることが見込まれる。なお、本発明による消化管間質腫瘍の予後の予測は、消化管間質腫瘍の術後または術前のいずれの時点でも行うことができる。例えば、本発明による消化管間質腫瘍の予後の予測は、術前および／または術後におけるメシル酸イマチニブの投与等の化学療法の要否を検討する際に利用することができる。なお、本明細書において、予後不良は、術後にＧＩＳＴが再発することや、ＧＩＳＴの病勢が悪化することをいう。
【００１３】
なお、フェチンは蝸牛に発現する遺伝子として同定されたものである（非特許文献３：Resendes BL et al.(2004)）。フェチンは、遺伝子配列に基づく構造予測から、イオンチャンネルではないかと推定されており、また、胎児の脳における発現が高いことが報告されている。しかしながら、フェチンに関する報告は上記文献以外に見当たらず、ＧＩＳＴを含む悪性腫瘍とフェチンとの関係は何ら示唆されていない。
【００１４】
フェチンの発現を検出または定量するための試料は、消化管間質腫瘍を患う患者の罹患組織、血液に由来することが好ましい。試験に供する試料は、患者から採取された検体自体であってもよく、また試験に応じて検体を処理して得られた試料であってもよい。例えば試料を免疫染色法に供する場合、試験に供する試料として、患者から得られた検体から調製したパラフィン切片を用いることができる。また、例えば試料をウェスタン・ブロッティング法またはＲＴ−ＰＣＲに供する場合、試験に供する試料として、患者から得られた検体から調製したタンパク質抽出液またはｍＲＮＡ抽出液を用いることができる。
【００１５】
試料におけるフェチンの発現は、以下に例示する通り、任意の方法で検出または定量することができる。なお、フェチン発現の検出または定量は、単にフェチン発現の有無を検出するものであってもよく、また、フェチンの発現量を相対的または絶対的に決定するものでもよい。また、フェチン発現は、タンパク質レベルで検出または定量してもよく、またｍＲＮＡレベルで検出または定量してもよい。
【００１６】
タンパク質レベルでの検出または定量は、例えば、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む）、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素等による検出または定量との組み合わせ（ウェスタン・ブロッティング法、蛍光二次元電気泳動法を含む）、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ドット・ブロッティング法等により行うことができる。また、ｍＲＮＡレベルでの検出または定量は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（好ましくはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザン・ブロッティング法、Branched DNAアッセイ等により行うことができる。
【００１７】
組織免疫染色法の具体例を以下に示す。ＧＩＳＴの手術検体を常法によりホルマリン固定をした後、パラフィンに包埋をしてミクロトームにて厚さ４μｍの組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付け、検体として使用する。検体はキシレン処理で完全にパラフィンを除き、１００％から徐々に濃度を下げたアルコール溶液にくぐらせ親水化し水洗する。その後、抗体の浸透性を高めるために耐熱ガラス容器に入れたｐＨ６．０のクエン酸緩衝液中に検体を漬け、オートクレーブにて１２１℃で２０分間熱処理し抗原を賦活化する。室温まで放置し冷却し流水で緩衝液を水洗後、０．３％過酸化水素加メチルアルコールに２０分間浸漬して内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングする。ＰＢＳで洗浄後、余分な試薬を取り除いた検体に、一次抗体溶液として抗フェチン抗体を滴下し常温で３０分間反応させる。ＰＢＳにて洗浄後、余分な試薬を取り除き二次抗体としてポリマー試薬（Envision+，DAKO社）を滴下し反応させる。ＰＢＳで洗浄後、ＤＡＢ溶液を滴下し発色を行う。流水にて洗浄後、ヘマトキシリン液にて検体の細胞核を染色する。流水にて水洗後、アルコール溶液、次いでキシレン溶液をくぐらせ脱水し、検体上に封入剤を滴下しカバーグラスを被せて顕微鏡にて観察する。顕微鏡下では腫瘍細胞のフェチンタンパク質は茶褐色の発色として観察される。以下に説明するように、その発色により陽性陰性の判定を行うことができる。組織免疫染色法としてＡＢＣ法を利用することも可能である。
【００１８】
フェチン発現の検出または定量の結果は、２種類の段階（陽性および陰性）または３種類以上の段階に分類することができる。フェチン発現の分類は、検出または定量方法に応じて、十分な経験を有する病理医、臨床医、検査技師または検査施設が行うことが好ましい。例えば、フェチン発現の分類は、免疫染色法を用いる場合は病理医が行うことができ、ＲＴ−ＰＣＲを用いる場合は検査技師が行うことができる。
【００１９】
なお、フェチン発現の分類は、患者からの試料におけるフェチンの発現量を、コントロールにおけるフェチンの発現量と比較することにより行うことが好ましい。フェチン発現の結果を分類する段階の数に応じて、複数のコントロールを用いることが好ましい。例えば、フェチン発現の結果を２種類の段階（陽性および陰性）に分類する場合は、それぞれの段階に対応した２種類のコントロール（フェチン陽性コントロールおよびフェチン陰性コントロール）を用いることが好ましい。また、フェチン発現の結果を３種類の段階に分類する場合は、それぞれの段階に対応した３種類のコントロールを用いることが好ましい。また、コントロールの１つとして、健常者または予後良好な消化管間質腫瘍患者に由来するコントロールを用いることが好ましい。なお、コントロールは、予め作成されたものでもよく、また、患者からの試料と同時に試験されたものでもよい。
【００２０】
例えば、免疫染色法により、フェチン発現の結果を陽性および陰性の２種類の段階に分類する場合、免疫染色の結果を以下のように判定することができる。ＧＩＳＴ腫瘍細胞の細胞質および細胞膜の免疫染色強度を、陽性染色なし、軽い、中程度、強いの４段階に分類し、染色強度と染色細胞の割合に基づきフェチン陽性と陰性の判定をする。腫瘍細胞全体が中程度から強い染色性を示す場合、陽性と判定する。それ以外の場合、すなわち、（１）腫瘍細胞全体体が染色性なしから軽い染色性を示す場合、および（２）大部分の腫瘍細胞が中程度から強い染色性を示すが、一部の腫瘍細胞が染色性なしから軽い染色性を示す場合、陰性と判定する。これに基づき免疫染色の結果を判定した例を図３に示す（上段：フェチン陽性、下段：フェチン陰性）。
【００２１】
本発明によると、消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測するためのキットが提供される。当該キットは、患者から得られた試料におけるフェチンの発現を検出または定量する手段を含む。すなわち、タンパク質レベルでの検出または定量を行う場合においては、発現を検出または定量する手段は、上記した免疫染色法等を行うための手段を含むことが好ましく、例えば、抗フェチン抗体（モノクローナルおよびポリクローナル抗体、標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにこれらの結合活性断片を含む）を含むことが好ましい。また、ｍＲＮＡレベルでの検出または定量を行う場合においては、発現を検出または定量する手段は、上記したＲＴ−ＰＣＲ等を行うための手段を含むことが好ましく、例えば、フェチンのｍＲＮＡに対するプローブを含むことが好ましい。さらに、当業者に明らかなように、発現を検出または定量する手段は、バッファー、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤等の試薬、試験に必要な器具、コントロール、ならびに取扱説明書および評価指導書（同等の内容の電子データを含むCD-ROM等の記録媒体も含む）等を含むことができる。
【００２２】
予後の予測は、フェチン発現に加えて、病理学的悪性度を考慮して判断することが好ましい。病理学的悪性度は、非特許文献１（Hasegawa H et al.(2002 Jun)）に記載の方法に準じて判断することができる。具体的には、ＧＩＳＴの病理学的悪性度は以下のように決定することができる。
【００２３】
第一に、成人軟部組織肉腫に対するＭＩＢ−１分類システムにより腫瘍を分類する。これは３つの指標（腫瘍分化度、ＭＩＢ−１スコア、および壊死）に基づき、３つのグレードに分類するシステムである（非特許文献４参照：Hasegawa T et al.(2000)）。各パラメータについてスコアを割り当て、その合計によりグレードを決定する。腫瘍分化度、腫瘍壊死およびＭＩＢ−１について病理医がスコアを決定することが好ましい。腫瘍分化度については、十分に分化した肉腫をスコア１、腫瘍型を確信できる肉腫をスコア２、滑膜肉腫、横紋筋肉腫、ユーイングまたは未分化神経外胚葉性腫瘍、および腫瘍型が不確かな肉腫をスコア３とする。平滑筋肉腫の際のように、ＧＩＳＴには腫瘍分化度のスコア２が充てられる（非特許文献５参照：Hasegawa T et al.(2002 Jan)）。ＭＩＢ−１については、ＭＩＢ−１に対して免疫反応性を示す細胞が０〜９％である病巣をスコア１、１０〜２９％である病巣をスコア２、３０％以上である病巣をスコア３とする。腫瘍壊死については、いずれのスライドにも壊死が認められない場合はスコア０、腫瘍壊死が５０％未満の場合はスコア１、腫瘍壊死が５０％以上の場合はスコア２とする。合計のスコアが２または３である病巣はグレード１に、スコアが４または５のものはグレード２に、スコアが６〜８のものはグレード３に分類する。
【００２４】
第二に、症例を、腫瘍の大きさにより３段階（＜５ｃｍ，５〜１０ｃｍ，＞１０ｃｍ）に分類する。さらに、グレードと腫瘍径に基づき、表１に従ってリスク分類を決定する。
【表１】
2008100958.tif 000003
【００２５】
実施例において詳細に説明するように、本発明者等は、フェチンの発現が患者の予後不良と逆相関することを見出した。すなわち、フェチンの発現がより低いほど予後不良となる可能性が高いと予測できる。同様に、病理学的悪性度が患者の予後不良と相関することが知られている。すなわち、病理学的悪性度が高いほど予後不良となる可能性が高い。これらを統合することで、さらに高い判別率で患者の予後を予測することができる。
【００２６】
具体的には、フェチンの発現および病理学的悪性度に基づき、例えば、フェチン陰性である場合およびフェチン陽性かつ病理学的悪性度が高度である場合、予後不良となる可能性が高いと判断することができ、または、フェチン陰性かつ病理学的悪性度が高度または中等度である場合、予後不良となる可能性が高いと判断することができ、または、フェチン陰性かつ病理学的悪性度が高度である場合、予後不良となる可能性が高いと判断することができる。一方で、フェチン陽性かつ病理学的悪性度が低度または中等度である場合、予後不良となる可能性が低いと判断することができる。また、フェチン陽性かつ病理学的悪性度が高度である場合およびフェチン陰性で病理学的悪性度が低度または中等度である場合、予後不良となる可能性が中等度であると判断することもできる。
【００２７】
なお、これらの判断基準は、治療の段階や治療手段（メシル酸イマチニブの投与等）に応じて個々に設定することができる。例えば、術前のメシル酸イマチニブの投与の要否を検討するための判断基準と、術後のメシル酸イマチニブの投与の要否を検討するための判断基準とは異ならせることができる。なお、メシル酸イマチニブは副作用の大きさや医療費の高さが問題となっているが、上記判断基準は、ＧＩＳＴの外科手術による摘出前および／または摘出後のメシル酸イマチニブの投与の要否を検討する際に用いることが好ましい。
【００２８】
このように本発明によると、ＧＩＳＴの予後をより高い判別率で予測することができ、ひいては、これに基づきより適切な治療計画を立てることが可能となり、より適切な治療を行うことが可能となる。例えば、ＧＩＳＴの外科手術による摘出前および／または摘出後のメシル酸イマチニブの投与の要否を検討するために患者の予後を予測する場合、上記したように予後不良となる可能性が高いと判断された際には、メシル酸イマチニブによる化学療法を受ける必要があると判断できる。また、予後不良となる可能性が低いと判断された際には、メシル酸イマチニブによる化学療法の必要はないと判断できる。また、予後不良となる可能性が中等度であると判断された際には、術後の経過を観察し、再発を早期に発見できるよう定期的画像検査（ＣＴ，ＭＲＩ，単純Ｘ線写真）を行う必要があると判断できる。
【００２９】
実施例において詳細に説明するように、本発明によると、非常に高い感度および特異度で患者の予後を予測することができる。さらに、メシル酸イマチニブは副作用の大きさや医療費の高さが問題となっているが、本発明によると、メシル酸イマチニブによる治療を必要としない患者に対して当該治療薬の投与を回避することで上記問題点を回避でき、さらに、メシル酸イマチニブによる治療を必要とする患者に対してはより迅速に当該治療薬による治療を開始できる。このように、本発明によると診断的価値が非常に高い予後予測方法およびキットが提供される。一方で、本発明による予測は、特殊な装置等を必要とせずに、例えば免疫染色法などの一般的に用いられている簡便な手法で通常の技術レベルの病理医等により廉価に行うことができる。
【００３０】
また、本発明の他の側面によると、消化管間質腫瘍を患う患者のうち、フェチンの発現に基づき定義された患者の消化管間質腫瘍を処置するための医薬組成物が提供される。本発明にかかる医薬組成物は、上記式（Ｉ）で示される４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容されるその塩を活性成分として含む。
【００３１】
４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容されるその塩の製造方法、および抗腫瘍剤としてのその使用は、特許文献２（欧州特許出願EP-A-0 564 409の実施例２１、ならびに他の対応出願および対応特許、例えば日本国特許第2706682号、米国特許第5,521,184号）に記載されている。
【００３２】
また、４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたは薬学的に許容されるその塩は、好ましくは薬学的に許容される酸付加塩であり、例えば塩酸、硫酸またはリン酸のような無機酸との塩であるか、あるいは適当な有機カルボン酸またはスルホン酸、例えばトリフルオロ酢酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸もしくはシュウ酸のようなモノ−もしくはジ−カルボン酸、またはアルギニンまたはリジンのようなアミノ酸、安息香酸、２−フェノキシ−安息香酸、２−アセトキシ−安息香酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸のような芳香族カルボン酸、マンデル酸またはケイ皮酸のような芳香族−脂肪族カルボン酸、ニコチン酸またはイソニコチン酸のような複素環式芳香族カルボン酸、メタン−、エタン−もしくは２−ヒドロキシエタン−スルホン酸のような脂肪族スルホン酸、またはベンゼン−、ｐ−トルエン−もしくはナフタレン−２−スルホン酸のような芳香族スルホン酸との塩である。
【００３３】
また、４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドのモノメタンスルホン酸付加塩およびその好ましい結晶形は、特許文献３（国際特許出願WO99/03854、ならびに他の対応出願および対応特許、例えば日本国特許第3276359号）に記載されている。
【００３４】
本発明にかかる医薬組成物の有効投与量は、患者の年齢、体重、病状、投与様式および臨床像等に依存して、体重約７０ｋｇの患者に対してイマチニブとして例えば１日約１００〜１０００ｍｇ、好ましくは２００〜６００ｍｇ、さらに好ましくは４００ｍｇである。
【００３５】
本発明にかかる医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。薬学的に許容される担体として、任意の標準的な担体、緩衝剤および賦形剤（例えばリン酸緩衝食塩水、５％デキストロース水溶液）を用いることができる。好ましい担体は、投与様式に依存する。典型的な投与様式には、経腸（例えば経口）投与または非経口投与（例えば皮下、筋肉内、静脈内もしくは腹腔内注射、または局所、経皮、または経粘膜投与）が含まれ、経口投与が好ましい。例えば、経口投与のためには、カプセル、錠剤および粉末などの固形剤形、またはエリキシル、シロップおよび懸濁液などの液体剤形で投与することができる。
【００３６】
上記したように、本発明にかかる医薬組成物は、フェチンの発現に基づき定義された患者を対象とする。さらに、本発明にかかる医薬組成物は、病理学的悪性度にさらに基づき定義された患者を対象とすることが好ましい。具体的には、本発明にかかる医薬組成物は、上記したように、フェチンの発現および病理学的悪性度に基づき予後不良と予測された患者を対象とすることが好ましい。以上のように、本発明によると、消化管間質腫瘍を患う患者のうち、フェチンの発現（および好ましくはさらに病理学的悪性度）に基づき定義された患者の消化管間質腫瘍を処置するための医薬組成物が提供される。
【００３７】
なお、ＧＩＳＴ治療薬であるメシル酸イマチニブが、ノバルティスファーマ株式会社よりグリベック（登録商標）として販売されている。その添付書類には、免疫組織学的検査によりＫＩＴ（ＣＤ１１７）陽性消化管間質腫瘍と診断された患者を当該治療薬の対象とする旨が明記されている。このように、本発明にかかる医薬組成物の対象患者群と、グリベック（登録商標）の対象患者群とは、当業者が明確に区別することが可能であり、本発明にかかる医薬組成物は、その対象患者、すなわち医薬用途において、グリベック（登録商標）とは一線を画する。
【００３８】
なお、本発明にかかる医薬組成物も、グリベック（登録商標）と同様に、さらに免疫組織学的検査によりＫＩＴ（ＣＤ１１７）陽性消化管間質腫瘍と診断された患者を対象とすることが好ましい。広く当業者に行われているように、ＫＩＴ（ＣＤ１１７）陽性の確認は、例えば、抗ヒトｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）ウサギポリクローナル抗体（コード番号：A4502、ダコ・ジャパン株式会社製）を用いた免疫染色法により行うことができる。免疫染色法は、製造業者の取扱説明書に記載の方法に準じて行うことができる。ＫＩＴ（ＣＤ１１７）陽性の確認は、上記抗ヒトｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）ウサギポリクローナル抗体の添付書類に記載のように、当該抗体を用いた免疫染色法により行うことができる。
【実施例】
【００３９】
以下に、本発明の実施例を、添付図面を参照しながら説明する。もっとも、本発明は、以下に説明する実施例によって限定されるものではない。
【００４０】
［材料および方法］
〔１．サンプル〕
（１−１．手術検体）
手術検体を研究に使用することについて文章による同意を得たＧＩＳＴ患者から得られた手術検体を使用した。ＧＩＳＴ症例の手術検体の使用について、本研究は国立がんセンターの遺伝子倫理委員会の審査および承認を受けた。
【００４１】
（１−２．タンパク質の回収）
症例の手術検体から腫瘍組織を回収し、液体窒素で凍らせた。凍らせた腫瘍組織をマルチビーズショッカー（安井機器、大阪）にて破砕して粉末状にした。粉末状にした組織にタンパク質抽出バッファー（６Ｍ  ウレア、２Ｍ  チオウレア、３％  ＣＨＡＰＳ、１％  TritonX-100）を加えてタンパク質を抽出した。
【００４２】
〔２．蛍光二次元電気泳動〕
（２−１．サンプル調整）
抽出したタンパク質を１５０００回転で遠心し、上精を回収した。上精に含まれるタンパク質をタンパク質定量キット（ＤＣプロテインアッセイキット、Bio-Rad社、米国）にて定量した。抽出したタンパク質５μｇを蛍光色素（サチュレーションダイＣｙ５、GE Healthcare Biosciences社）で標識した。標識は以下のように行った。（１）終濃度３０ｍＭとなるようにｐＨ８．０のトリスバッファーを加え、次に（２）１ｎｍｏｌのＴＥＣＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロライド，Sigma社）を加え、（３）３７度で６０分間処理した。次に、（４）Ｃｙ５蛍光色素を４ｎｍｏｌ加えて、３７度で６０分間処理した。今回の実験に用いたタンパク質サンプルから等量ずつタンパク質サンプルを集めて混合し、内部標準サンプルとした。内部標準サンプルの５μｇを蛍光色素（サチュレーションダイＣｙ３、GE Healthcare Biosciences社）で上記と同様に標識した。Ｃｙ５で標識した個別のサンプルとＣｙ３で標識した内部標準サンプルを混合し、ウレア可溶化液で最終容量４２０μｌとした。その際、終濃度が６５ｍＭとなるようにＤＴＴを、２％となるようにとアンフォライン（GE Healthcare Biosciences社）を加えた。Ｃｙ５で標識した個別サンプルとＣｙ３で標識した内部標準サンプルを混合したサンプルを一枚の二次元電気泳動ゲルで泳動した。
【００４３】
（２−２．電気泳動）
まず、一次元目の泳動はイモビラインゲル（２４ｃｍ、ｐＩ４−７、GE Healthcare Biosciences社）と、Multiphor II（GE Healthcare Biosciences社）を使用した。泳動するタンパク質サンプルでイモビラインゲルを室温にて一晩膨潤させた。泳動は４００００Ｖｈ行った。二次元目の泳動は９−１５％のポリアクリルアミドのグラジエントゲルと、EttanDalt II（GE Healthcare Biosciences社）を使用した。泳動は泳動装置一台につき１８Ｗで１７時間、２０度で行った。
【００４４】
（２−３.タンパク質検出）
泳動終了後は、タンパク質を検出する目的で、ガラス板に挟んだままの状態のゲルをレーザースキャナー（Typhoon Trio、GE Healthcare Biosciences社）に載せスキャンした。
【００４５】
（２−４．発現解析）
読み込んだ画像は画像解析ソフトDeCyder（GE Healthcare Bio-sciences社）で解析した。
【００４６】
〔３．タンパク質同定〕
（３−１．ゲル内消化法）
全自動スポット回収装置ProHunter（AsOne社）を用いて、ゲルから９６穴プレートにスポットを回収した。ゲルをメタノールで十分洗浄し、タンパク質分解酵素（トリプシン）で３７度にて一晩処理した。この処理によってタンパク質はペプチド化される。得られたペプチドは、６０％アセトニトリルにてゲルを洗浄することで回収した。
【００４７】
（３−２．質量分析）
ペプチドの質量を測定するためにＬＴＱ（サーモ社）を使用した。タンパク質同定のためのデータベース検索にはMasCotを使用した。
【００４８】
〔４．ウェスタン・ブロッティング〕
前述の方法により手術検体より抽出したタンパク質１０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。抗フェチン抗体として、非特許文献３（Resendes BL et al.(2004)）に記載された抗体を用いた。抗体の希釈濃度は１０００倍とし、検出にはＥＣＬキット（GE Healthcare Biosciences社）を使用した。
【００４９】
〔５．免疫染色〕
国立がんセンター中央病院に保存されていたパラフィンブロックを使用した。厚さ６μｍの切片を作成し、抗フェチン抗体にて免疫染色を行った。抗フェチン抗体として、非特許文献３（Resendes BL et al.(2004)）に記載された抗体を用いた。一次抗体の希釈は５００倍とし、検出にはＡＢＣキット（DAKO社）を用いた。フェチンの陽性、陰性の判定は、２名の熟練した病理医と１名の臨床医が行った。
【００５０】
〔６．病理判断〕
（６−１．転移の有無）
外来経過観察中の診察所見および定期的画像検査（ＣＴ，ＭＲＩ，単純Ｘ線写真）により、肺、リンパ節、腹腔など全身のいずれの場所にも明らかな病変の出現がない場合に転移なしと判断した。
【００５１】
（６−２．病理学的悪性度（リスク分類））
非特許文献１（Hasegawa H et al.(2002 Jun)）に記載の方法に準じて、表１およびこれに関連した上記記載の通りに病理学的悪性度を判断した。腫瘍分化度、腫瘍壊死およびＭＩＢ−１のそれぞれについて病理医がスコアを決定した。
【００５２】
［実施例１］
消化管間葉系腫瘍の手術検体からタンパク質を抽出し、蛍光二次元電気泳動法と質量分析装置にて転移、予後に関係するタンパク質を解析した。１）術後１年以内に転移を来しかつ病理学的悪性度（リスク分類）が高度であった８症例、２）術後２年間、転移がなくかつ病理学的悪性度が中等度あるいは低度であった９症例の手術検体を用いた。約１６００個のタンパク質スポットから、両群の間で濃度が異なるタンパク質スポット４３個を選別した（Wilcoxon検定のＰ値が０．０１以下）。
【００５３】
質量分析装置を用いたタンパク質同定の結果、フェチンというタンパク質に由来するタンパク質スポット（フェチン・スポット）が、４３個のスポット中８個含まれていた。フェチン・スポットの濃度によって、前述の予後不良であった８症例と、予後良好であった９症例を感度（真陽性率、予後不良の患者が検査陽性となる確率）、特異度（真陰性率、予後良好の患者が検査陰性となる確率）ともに１００％で識別することが可能であった（図１参照）。フェチンに対する特異抗体を用いたウェスタン・ブロッティング法を同じ手術検体に対して行った場合においても、感度、特異度ともに１００％の正確さで、予後不良の８症例を予後良好の９症例から識別できた（図２（ａ）参照）。
【００５４】
［実施例２］
結果を検証する目的で、追加症例として３）術後１年以内に転移を来しかつ病理学的悪性度（リスク分類）が高度であった２症例、４）術後２年間、転移がなくかつ病理学的悪性度が中等度あるいは低度であった２症例を、同様に蛍光二次元電気泳動法とウェスタン・ブロッティングを用いて調べた。この結果、上記と同様にフェチンの発現量に基づいて両群を感度、特異度ともに１００％で識別することができた（図２（ｂ）参照）。
【００５５】
［実施例３］
フェチンによる予後予測の可能性をさらに検証する目的で、フェチンに対する特異抗体を用いた免疫染色を２１６症例に対して実施した。免疫染色のインターナル陽性コントロールとして血管内皮細胞を用いた。フェチン陽性または陰性の判定は複数の病理医および研究者により独立して行われた。図３に、陽性と陰性のそれぞれについて、免疫染色の結果の例を示す。２１６症例中、フェチン陽性症例は１５９症例、フェチン陰性症例は５７症例だった。これらの症例について、術後５年間の転移とフェチンの発現の相関を調べた。術後５年間の転移について臨床情報が得られたのは２１６症例中１５２症例であった。１５２症例中、フェチン陽性症例は１０６例、陰性症例は４６症例だった。術後５年間の転移はフェチン陽性症例においてはほとんど認められなかったのに対し（１０６症例中６症例、５．６６％）、陰性症例では高頻度に認められた（４６症例中２９症例、６３．０９％）（表２参照）。
【００５６】
【表２】
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【００５７】
一方、リスク分類の結果も術後５年間の転移の有無と相関していた（表３参照）。
【表３】
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【００５８】
さらに、フェチンの発現とリスク分類の組み合わせと術後５年間の転移の有無との関係を検討した（表４参照）。フェチンの発現が陽性かつ病理学的悪性度が低度か中等度であった症例は合計９１症例であった。このうち術後５年間の転移症例数は２症例（２／９１、２．２０％）であり、転移割合は低かった。一方で、フェチンの発現が陰性かつ病理学的悪性度が高度であった症例は３１症例であった。このうち術後５年間の転移症例数は２５症例（２５／３１、８０．６５％）であり、転移割合は高かった。どちらの群にも属さない症例（フェチン陽性かつ病理学的悪性度が高度、フェチン陰性かつ病理学的悪性度が低度か中等度）は合計３０症例あった。これらの症例群の術後５年間の転移症例数はさまざまであった。具体的には、フェチン陽性かつ病理学的悪性度が高度の症例における術後５年間の転移割合は２６．６％（１５症例中４症例）であり、転移割合は比較的低かった。また、フェチン陰性かつ病理学的悪性度が低度の症例における術後５年間の転移割合は１６．７％（１２症例中２症例）であり、転移割合は比較的低かった。一方、フェチン陰性かつ病理学的悪性度が中等度の症例における術後５年間の転移割合は６６．７％（３症例中２症例）であり、転移割合は比較的高かった。しかしながら、この症例群は症例数が３症例と少ないため、転移の割合が有意に高いかどうかは不明確である。
【００５９】
【表４】
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【００６０】
［Logrank検定］
フェチン陽性および陰性の集団について、Logrank検定により再発（転移）率の検定を行った。これは、二つの集団の間での再発（転移）率の時間経過に統計学的有意差があるか否かを追跡調査したものである。図４に、個々の症例につき再発（転移）の時期を調べ、ある特定の時期における非再発症例の割合を累積で示す。還元すると、これは、再発（転移）が起こるまでの時間と割合を現している。この結果からも、フェチンが陽性である症例は再発率が極端に低く、予後が良好であることから、手術後の化学療法は必要がないと見込まれること、陰性である症例については、再発が高率に発生すると予測されるため手術後の化学療法を積極的に行うことを検討した方がよいことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】予後不良８症例および予後良好９症例において蛍光二次元電気泳動法により得られたフェチン・スポットの濃度を示すグラフである。
【図２】（ａ）予後不良８症例および予後良好９症例ならびに（ｂ）追加の予後不良２症例および予後良好２症例におけるウェスタン・ブロッティング法の結果を示す写真である。
【図３】免疫染色の結果の例（上段：予後良好３症例、下段：予後不良３症例）を示す写真である。
【図４】フェチン陽性および陰性の集団について、Logrank検定により特定の時期における非再発症例の割合を累積で示すグラフである。
【図１】
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【図４】
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【図２】
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【図３】
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