(57)【要約】【課題】脂質二重膜を形成する装置において、脂質二重膜を形成する度に外部ポンプと接続する必要のない方法を提供すること。【解決手段】第１チャンバー２０９、第２チャンバー２０５と、第１チャンバー２０９と第２チャンバー２０５とは、脂質二重膜形成部２０７を介して接続されており、脂質二重膜形成部２０７の断面積は、第１チャンバー２０９の断面積および第２チャンバー２０５の断面積のいずれよりも小さく、第２チャンバー２０５に電解液を満たす電解質第１充填工程、脂質二重膜形成部２０７に脂質二重膜の原料と有機溶媒との混合液を配置させる原料充填工程、第１チャンバー２０９他方のチャンバーに電解液を満たす電解質第２充填工程、および脂質二重膜形成装置を遠心することによって、脂質二重膜形成部２０９に脂質二重膜を形成する遠心工程を順に実行することで簡便に脂質二重膜が形成できる。【選択図】図２
2008194573.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質二重膜形成装置を用いて脂質二重膜を形成する方法であって、
前記脂質二重膜形成装置は、
基材と、
前記基材の内部に設けられた第１チャンバーと、
前記基材の内部に設けられた第２チャンバーと、
前記第１チャンバーと前記基材の外周面とを接続する孔とを備え、
前記第１チャンバーと前記第２チャンバーとは、脂質二重膜形成部を介して接続されており、
前記脂質二重膜形成部の断面積は、前記第１チャンバーの断面積および前記第２チャンバーの断面積のいずれよりも小さく、
前記第１チャンバーと回転中心との間の距離は、前記第２チャンバーと回転中心との間の距離よりも小さく、
前記方法は、
前記第１チャンバーまたは前記第２チャンバーのどちらか一方に電解液を満たす電解質第１充填工程、
前記脂質二重膜形成部に、脂質二重膜の原料と有機溶媒との混合液を配置させる原料充填工程、
他方のチャンバーに電解液を満たす電解質第２充填工程、および
前記回転中心を回転軸として前記脂質二重膜形成装置を遠心することによって、前記脂質二重膜形成部に前記脂質二重膜を形成する遠心工程
を順に包含する脂質二重膜形成方法。
【請求項２】
前記基材は樹脂またはガラスであることを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項３】
前記基材の外周面における前記孔の断面積は前記第１チャンバーにおける前記孔の断面積よりも小さいことを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項４】
前記孔の容積は、前記第１チャンバーおよび前記第２チャンバーの容積よりも大きいことを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項５】
前記脂質二重膜形成部は撥水性表面を有することを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項６】
前記脂質二重膜形成部は少なくとも一つのくびれを有することを特徴とする、請求項５に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項７】
前記脂質二重膜形成部は少なくとも一本の支柱を有することを特徴とする、請求項５に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項８】
前記第２チャンバーは前記基材の外周面と接続する孔を有していることを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項９】
前記第１チャンバーおよび前記第２チャンバーは前記電解液および前記混合液の充填を検知するための電極を有することを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項１０】
前記第１チャンバーおよび前記第２チャンバーは脂質二重膜に流れる膜電流を検出するための電極を有することを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項１１】
前記第２チャンバーおよび前記脂質二重膜形成部が回転中心に対して放射状に複数配置されていることを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項１２】
前記電解質第１充填工程では前記第２チャンバーに電解液を満たし、前記電解質第２充填工程では前記第１チャンバーに電解液を満たすことを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項１３】
前記電解質第１充填工程または前記電解質第２充填工程では、前記第１チャンバーおよび前記第２チャンバーの内部にそれぞれ設けられた電極を用いて電解液の充填を検知することを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項１４】
前記原料充填工程では、前記電解液の満たされた前記他方のチャンバーおよび前記混合液の配置された前記脂質二重膜形成部から気泡を取り除くことを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項１５】
前記電解質第２充填工程での前記脂質二重膜形成装置の回転速度は、前記遠心工程での脂質二重膜形成装置の回転速度よりも小さいことを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項１６】
前記遠心工程では、前記第１チャンバーおよび前記第２チャンバーの内部にそれぞれ設けられた電極から得られる電気信号により脂質二重膜の形成を検知することを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項１７】
前記第１チャンバーおよび前記第２チャンバーの内部にそれぞれ設けられた電極から得られる電気信号により、前記脂質二重膜形成装置の回転速度および回転時間を制御することを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項１８】
前記第２チャンバーおよび前記脂質二重膜形成部を回転中心に対して放射状に複数配置した前記脂質二重膜形成装置において、作成された複数の脂質二重膜はそれぞれ電気的に独立していることを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項１９】
前記脂質二重膜形成装置を電磁シールドボックス内で動作させることを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜形成方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の脂質二重膜形成方法を用いたことを特徴とする、イオンチャンネル解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イオンチャンネルをはじめとする膜タンパク解析に用いられる脂質二重膜の形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内と細胞外の間の物質輸送は膜貫通性タンパクを通じて行われる。なかでもイオンチャンネルはイオンの透過により膜電位の変化を生ずるので、神経の活動電位のような信号発生による情報伝達に重要な役割を果たすことが知られており、近年研究が盛んに進められている。
【０００３】
イオンチャンネル研究を進める上で不可欠なのがパッチクランプ法と呼ばれる実験手法であり、1976年にNeherとSakmannによって開発された。パッチクランプ法では、まずパッチ電極と呼ばれる微小ガラス管の先端を細胞膜表面に密着させる。その先端開口部の微小膜領域を電気的に他の領域から絶縁した状態で電位固定し、微小膜領域に含まれるイオンチャンネルを通るイオン電流を計測する。この方法の開発は、チャンネルタンパク分子の機能エレメントの同定、その動作メカニズムや構造解明に役立ち、生理学研究に大きな革新をもたらした。
【０００４】
しかしながら、パッチクランプ法は上述の通り生理学研究において極めて有効な方法であるにもかかわらず適用できない場合がある。例えば解剖学的にアクセスが困難な場合、すなわち細胞小器官上のチャンネルやシナプス前膜のような微小構造体上のチャンネルを解析する場合が、これに該当する。また、チャンネルの基本構造や詳細な構造機能相関研究を深めるためには単純な構成で実験を行う必要がある場合も適用できない。このときにはチャネル分子を単純な系、つまり水、塩類、リン脂質、チャンネルで構成される系で解析しなければならない。
【０００５】
これらのようにパッチクランプ法を適用できない時に有効な手段として脂質平面膜法が開発された。脂質平面膜法には大きく分けて、ペインティング法と貼り合わせ法がある（たとえば非特許文献１）。
【０００６】
図１１はペインティング法による従来の脂質二重膜の形成方法を示す。図１１において、容器１０をテフロン（登録商標）、ポリスチレンなどの疎水性表面を有する樹脂からなる平板１１で仕切り、平板１１で仕切られた空間へ電解液１２を満たし、平板１１に開けられた微小孔１３へ、脂質分子と有機溶媒との混合液１４を刷毛１５で塗布する。微小孔１３へ塗布された混合液１４に含まれる余剰な有機溶媒は微小孔１３の周辺縁を徐々に伝わって取り除かれるため、３０分から３時間程度待てば脂質二重膜が形成される。
【０００７】
一方、図１２（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は貼り合わせ法による従来の脂質二重膜の形成方法を示す。図１２（ａ）において、容器２０はテフロン（登録商標）、ポリスチレンなどの疎水性表面を有する樹脂からなる平板２１で仕切られている。まず前処理として平板２１に開けた微小孔２２へスクアレンを塗布しておく。容器２０の一方のチャンバーへ、電解液２３の液面の高さが微小孔２２下端の高さを越えない程度に、電解液２３を注入口２４から加える。次に電解液２３へ、脂質分子２５と有機溶媒との混合液を滴下して数分間放置すると、図１２（ａ）に示すように電解液２３の気−液界面には脂質単分子膜が形成される。脂質分子２５は親水性部と疎水性部を有しており、脂質分子２５の親水性部が電解液２３の方へ向くように配向する。
【０００８】
そして図１２（ｂ）に示すように電解液２３の液面の高さが微小孔２２上端の高さを通過するまで、電解液２３を加える。
【０００９】
次に、図１２（ｃ）において、容器２０の他方のチャンバーで同様の操作を行なう。すなわち、液面の高さが微小孔２２下端の高さを越えない程度に、電解液２６を加える。次に電解液２６へ脂質分子と有機溶媒との混合液を加えて数分間放置すると、電解液２６の気−液界面には脂質単分子膜が形成される。そして電解液２６の液面の高さが微小孔２２上端の高さを通過するまで、電解液２６を加える。以上の操作を行なうことにより、先に微小孔２２に形成された脂質単分子膜にもう一方の脂質単分子膜が貼り合わされて、その結果として脂質二重膜が形成される。
【００１０】
上述の２つの方法によって安定で再現性のある脂質二重膜を形成するには、かなりの熟練を要する。より簡便な脂質二重膜を形成する方法としては、マイクロ・ナノ加工技術を利用して小型チップ上に脂質二重膜を形成するという方法があった（たとえば特許文献１参照）。
【００１１】
図１３は、特許文献１に記載された従来の脂質二重膜形成装置を示す。図１３において、基板３１の表裏にマイクロチャンバー３２とマイクロチャンネル３３を設け、マイクロチャンバー３２とマイクロチャンネル３３を貫通する微小孔３４を設ける。マイクロチャンバー３２へは電解液を注入し、マイクロチャンネル３３へは電解液、脂質二重膜の原料と有機溶媒の混合液、電解液を順次注入する。マイクロチャンバー３２の電解液に圧力を印加可能にするためにマイクロチャンバー３２の壁３５を貫通する通路３６を設け、マイクロチャンバー３２の圧力を調整することにより、微小孔３４に脂質二重膜を形成する。
【特許文献１】特開２００６−３１２１４１公報（第１１頁、図３）
【非特許文献１】岡田泰伸著「パッチクランプ実験技術法」吉岡書店  １９９６年９月２５日（ｐ．１３３−１３９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
特許文献１では、脂質二重膜を薄膜化するには前記マイクロチャンバー３２の圧力調整を行うため、前記マイクロチャンバー３２の外部に設けられたシリンジポンプやダイアフラムポンプ、ペリスタティックポンプなどの加圧手段を用いていた。また前記マイクロチャンネル３３に電解液および脂質二重膜の原料と有機溶媒との混合液を搬送するため、前記マイクロチャンネル３３の外部に設けられたシリンジポンプやダイアフラムポンプ、ペリスタティックポンプなどの加圧手段を用いていた。
【００１３】
しかし、脂質二重膜形成の度に前記マイクロチャンバー３２およびマイクロチャンネル３３と加圧手段とをそれぞれ接続しなければならないという課題を有していた。
【００１４】
本発明は、前記従来の課題を解決し、初心者でも簡便に脂質二重膜を形成する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記従来の課題を解決する本発明は、脂質二重膜形成装置を用いて脂質二重膜を形成する方法であって、前記脂質二重膜形成装置は、基材と、前記基材の内部に設けられた第１チャンバーと、前記基材の内部に設けられた第２チャンバーと、前記第１チャンバーと前記基材の外周面とを接続する孔とを備え、前記第１チャンバーと前記第２チャンバーとは、脂質二重膜形成部を介して接続されており、前記脂質二重膜形成部の断面積は、前記第１チャンバーの断面積および前記第２チャンバーの断面積のいずれよりも小さく、前記第１チャンバーと回転中心との間の距離は、前記第２チャンバーと回転中心との間の距離よりも小さく、前記方法は、前記第１チャンバーまたは前記第２チャンバーのどちらか一方に電解液を満たす電解質第１充填工程、前記脂質二重膜形成部に、脂質二重膜の原料と有機溶媒との混合液を配置させる原料充填工程、他方のチャンバーに電解液を満たす電解質第２充填工程、および前記回転中心を回転軸として前記脂質二重膜形成装置を遠心することによって、前記脂質二重膜形成部に前記脂質二重膜を形成する遠心工程を順に包含する。
【００１６】
前記基材は樹脂またはガラスであることが好ましい。
【００１７】
前記基材の外周面における前記孔の断面積は前記第１チャンバーにおける前記孔の断面積よりも小さいことが好ましい。
【００１８】
前記孔の容積は、前記第１チャンバーおよび前記第２チャンバーの容積よりも大きいことが好ましい。
【００１９】
前記脂質二重膜形成部は撥水性表面を有することが好ましい。
【００２０】
前記脂質二重膜形成部は少なくとも一つのくびれを有することが好ましい。
【００２１】
前記脂質二重膜形成部は少なくとも一本の支柱を有することが好ましい。
【００２２】
前記第２チャンバーは、前記基材の外周面と接続する孔を有していることが好ましい。
【００２３】
前記第１チャンバーおよび前記第２チャンバーは前記電解液および前記混合液の充填を検知するための電極を有することが好ましい。
【００２４】
前記第１チャンバーおよび前記第２チャンバーは脂質二重膜に流れる膜電流を検出するための電極を有することが好ましい。
【００２５】
前記第２チャンバーおよび前記脂質二重膜形成部が回転中心に対して放射状に複数配置されていることが好ましい。
【００２６】
前記電解質第１充填工程では前記第２チャンバーに電解液を満たし、前記電解質第２充填工程では前記第１チャンバーに電解液を満たすことが好ましい。
【００２７】
前記電解質第１充填工程または前記電解質第２充填工程では、前記第１チャンバーおよび前記第２チャンバーの内部にそれぞれ設けられた電極を用いて電解液の充填を検知することが好ましい。
【００２８】
前記原料充填工程では、前記電解液の満たされた前記他方のチャンバーおよび前記混合液の配置された前記脂質二重膜形成部から気泡を取り除くことが好ましい。
【００２９】
前記電解質第２充填工程での前記脂質二重膜形成装置の回転速度は、前記遠心工程での脂質二重膜形成装置の回転速度よりも小さいことが好ましい。
【００３０】
前記遠心工程では、前記第１チャンバーおよび前記第２チャンバーの内部にそれぞれ設けられた電極から得られる電気信号により脂質二重膜の形成を検知することが好ましい。
【００３１】
前記第１チャンバーおよび前記第２チャンバーの内部にそれぞれ設けられた電極から得られる電気信号により、前記脂質二重膜形成装置の回転速度および回転時間を制御することが好ましい。
【００３２】
前記第２チャンバーおよび前記脂質二重膜形成部を回転中心に対して放射状に複数配置した前記脂質二重膜形成装置において、作成された複数の脂質二重膜はそれぞれ電気的に独立していることが好ましい。
【００３３】
前記脂質二重膜形成装置を電磁シールドボックス内で動作させることが好ましい。
【００３４】
請求項１に記載の脂質二重膜形成方法をイオンチャンネル解析装置で用いることが好ましい。
【００３５】
本構成によって、脂質二重膜の原料と有機溶媒との混合液から余剰な有機溶媒を取り除くための圧力は、電解液自身にかかる遠心力を用いることができるため、外部に加圧手段を設けることなく簡便に脂質二重膜を形成することができる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明に係る脂質二重膜形成方法によれば、まず第１チャンバーまたは第２チャンバーへ電解液を充填し、次に脂質二重膜形成部へ脂質二重膜の原料と有機溶媒との混合液を配置し、さらに他方のチャンバーへ電解液を充填し、さらに脂質二重膜形成装置の回転を続ければ脂質二重膜を簡便に形成することができる。したがって従来技術のように脂質二重膜を形成する度にチャンバーと加圧手段を接続するという煩わしい作業を行なわなくて良い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００３８】
図１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、本発明の実施の形態における脂質二重膜形成装置の斜視図および断面図である。
【００３９】
本実施の形態において、図１（ａ）に示すように基材であるマイクロチップ１００は基板１０１および上蓋１０２を接合することにより作製される。基板１０１および上蓋１０２は樹脂が好ましいがガラスでもよい。マイクロチップ１００は回転中心１０３を中心軸として回転させることができる。
【００４０】
マイクロチップ１００の内部には、電解液を充填するための容器として第１チャンバー１０５および第２チャンバー１０７が設けられている。第１チャンバー１０５および第２チャンバー１０７の内壁は平滑であることが好ましい。なお、第１チャンバー１０５および第２チャンバー１０７の内壁の中心線平均粗さ（Ｒａ）は１００ｎｍ以下が好ましいが、特に限定しない。また第１チャンバー１０５の一端にはマイクロチップ１００の外周面と接続する孔１０４が設けられており、この孔１０４から第１チャンバー１０５へ電解液を充填することができる。孔１０４の位置は第１チャンバー１０５の一端であれば特に限定しないが、回転中心１０３に近い方が好ましい。
【００４１】
第１チャンバー１０５および第２チャンバー１０７は、脂質二重膜形成部として設けられたくびれ１０６を介して接続されている。
【００４２】
図１（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、図１（ａ）でのＡ−Ｂ、Ｃ−ＤおよびＥ−Ｆ間の断面図を示す。断面積１１０、１１１、１１２はそれぞれ第１チャンバー１０５、くびれ１０６の最狭部、第２チャンバー１０７の断面積を表している。断面積１１１は小さければ小さいほど脂質二重膜が長時間安定に形成されるが、小さすぎると脂質二重膜の取り扱いが困難となるので、０．０００１ｍｍ2以上０．１ｍｍ2以下が好ましい。
【００４３】
また、くびれ１０６の断面の形状は図１（ｃ）に示すように正方形でも良いし、長方形、円形、楕円形などでも良いが、円形や正方形など対称性のある形状がより好ましい。
【００４４】
さらに、図１（ａ）に示されるように、第１チャンバー１０５および第２チャンバー１０７はいずれもテーパー形状を有し、これによってくびれ１０６が形成されている。すなわち、回転中心１０３からの距離が遠ざかるにつれて、第１チャンバー１０５の断面積１１０は徐々に小さくなっていき、逆に第２チャンバー１０７の断面積１１２は大きくなっている。
【００４５】
第１チャンバー１０５と回転中心１０３との間の距離は、第２チャンバー１０７と回転中心１０３との間の距離よりも小さくなるよう配置する。第１チャンバー１０５と回転中心１０３との間の距離は大きければ大きいほど、大きな遠心力が得られるので、その距離は１５ｍｍ以上が好ましい。また、本発明の脂質二重膜形成装置の取り扱いを容易にするため、第２チャンバー１０７と回転中心１０３との間の距離は２００ｍｍ以下が好ましい。
【００４６】
第１チャンバー１０５および第２チャンバー１０７にはそれぞれ電極１０９ａ、ｂが設けられている。電極１０９ａ、ｂを用いて、電解液の充填や脂質二重膜の形成を電気信号として検知する。なお図１（ａ）には代表的な電極を図示したが、電極の位置と形状と数はこれに限られない。
【００４７】
次に脂質二重膜形成の手順を説明する。図２（ａ）〜（ｅ）は本発明の実施の形態における脂質二重膜形成装置の動作図である。
【００４８】
まず電解質第１充填工程では、図２（ａ）に示すように、マイクロチップ２００に設けられた孔２０１からピペット２０２を用いて電解液を注入し、図２（ｂ）に示すように、回転中心２０３を中心としてマイクロチップ２００を回転させ、遠心力により電解液２０４を第２チャンバー２０５へ充填する。
【００４９】
このとき電解液として１００ｍＭのＫＣｌ水溶液を用いる。なお電解液はＫＣｌ水溶液に限定されず、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ2などの水溶液でも良いし、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）、ＨＥＰＥＳなどの緩衝液でも良い。また複数の電解質を混合しても良い。さらにイオンチャンネルを流れるイオン電流計測実験を行うときに一般的に用いられる電解液でも良い。また電解液の濃度は１ｍＭ以上１Ｍ以下が好ましい。さらに電解液の注入にはピペットを用いたが、注射器、チューブ、スポイド、オートサンプラー等を用いても良い。
【００５０】
なお電解質第１充填工程では、第２チャンバー２０５内に気泡が残らないよう電解液２０４を充填することが好ましい。また第２チャンバー２０５以外の領域に電解液２０４が残らないよう充填することが好ましい。
【００５１】
次に原料充填工程では、図２（ｃ）に示すように、孔２０１から脂質二重膜の原料と有機溶媒との混合液２０６を注入し、回転中心２０３を中心としてマイクロチップ２００を回転させ、遠心力により混合液２０６をくびれ２０７へ配置する。
【００５２】
このとき脂質二重膜の原料としてアゾレクチンが好ましい。なお、本発明は、脂質二重膜の原料がアゾレクチンに限定されず、その他の天然由来の脂質であっても良いし、合成脂質でも良い。合成脂質は高純度で化学的に安定なものが得やすいのでより好ましい。具体的にはリン酸脂質であるジフィタノイルフォスファジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンでも良いし、その他のリン酸脂質でも良い。また脂質分子の脂肪酸部分は炭素数が１０から２０の飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸が好ましい。これらの脂質は単独で用いても良いし、２種類以上混合して用いても良い。また有機溶媒に対する脂質の濃度は３〜５０ｍｇ／ｍＬが好ましい。
【００５３】
なお有機溶媒は非極性有機溶媒が好ましい。特にデカンが好ましいが、ヘキサデカン、ヘキサンを用いても良いし、その他の飽和炭化水素などを用いても良い。また複数の有機溶媒を混合しても良い。
【００５４】
さらに電解質第２充填工程では、図２（ｄ）に示すように、孔２０１から注入する電解液２０８を遠心力により第１チャンバー２０９へ充填する。なお電解液２０８は電解液２０４と同じ種類、濃度であっても良いし異なっても良い。
【００５５】
最後に遠心工程では、図２（ｅ）に示すように、電解液２０８にかかる遠心力により、図２（ｃ）に示す混合液２０６は加圧され、余剰な有機溶媒が排出されて脂質二重膜２１０が形成される。
【００５６】
脂質二重膜２１０の形成の検知は、電極２１１ａ、ｂを用いて脂質二重膜２１０に流れる膜電流を測定することで行うことができる。電極２１１ａ、ｂにプリアンプ、電流計、パッチクランプ用アンプなどイオンチャンネル解析で一般的に用いられる計測器を接続することで膜電流が測定できる。
【００５７】
かかる構成と動作の手順によれば、遠心力を用いて脂質二重膜を形成するので、混合液から余剰の有機溶媒を除去するためのポンプが不要となり、脂質二重膜形成の度にポンプと接続しなくても良く、簡便に脂質二重膜を形成することができる。
【００５８】
本発明の特長は、図１（ａ）に示すように第２チャンバー１０７の開口部がくびれ１０６のみであるため、電解液の充填はくびれ１０６を通過して行われることである。かかる構成は従来技術には見られない。つまり、ペインティング法や貼り合わせ法を始めとする従来技術は、くびれ１０６を単なる脂質二重膜の原料と有機溶媒との混合液を保持するための手段としてしか用いていなかった。
【００５９】
しかし本願発明においては、くびれ１０６を電解液の搬送経路としても用いることにより、第２チャンバー１０７に電解液の搬送経路を別途設ける必要がなくなる。ひいては搬送用のポンプそしてバルブを不要とすることが可能となる。
【００６０】
さらに図１（ａ）に示すように本装置全体の開口部は孔１０４のみとすることが可能であり、孔１０４を通過して電解液および混合液の注入が行われる。かかる構成は従来技術には見られない。つまり、ペインティング法や貼り合わせ法を始めとする従来技術は溶液注入や圧力印加、電極挿入のために開口部が複数あり、溶液が漏出、飛散することも起こりうる。
【００６１】
しかし本願発明の構成であればかかる溶液の漏出や飛散の抑制に有効である。加えて本願発明の構成によれば、脂質二重膜の形成に必要な試薬、すなわち電解液、脂質二重膜の原料の量が少なくて済む。なぜなら脂質二重膜の形成の際には、必要最小量だけ孔１０４から注入すればよいからである。これにより廃棄物の量を削減できるという効果も得られる。
【００６２】
なお、本実施の形態において、本装置全体の開口部を孔１０４の他に設けても良い。例えば第２チャンバー１０７の一端に孔を設けても良い。
【００６３】
ここで第２チャンバー１０７の一端に孔を設けた場合の脂質二重膜形成手順を図３（ａ）〜（ｅ）に説明する。なお、図２（ａ）〜（ｅ）と同様の構成および手順を有するものについては、同一符号を付し、その説明を省略する。
【００６４】
まず電解質第１充填工程では、図３（ａ）に示すように、第２チャンバー２０５に設けられた孔２１２からピペット２０２を用いて電解液を注入し、図３（ｂ）に示すように、電解液２０４を第２チャンバー２０５へ充填する。この充填が完了した後、孔２１２から電解液が漏出しないように孔２１２を封止することが好ましい。
【００６５】
次の原料充填工程から遠心工程までは図３（ｃ）〜（ｅ）に示すように、図２（ｃ）〜（ｅ）と同じ手順である。
【００６６】
以上図３（ａ）〜（ｅ）に示す手順で脂質二重膜を形成すると、電解質第１充填工程では電解液を充填するための遠心操作が不要になるので好ましい。
【００６７】
なお、本実施の形態において、基材は樹脂またはガラスが好ましい。樹脂はポリエチレンテレフタレート、塩化ビニル、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、アクリル、シクロオレフィン等が好ましい。ただし基材はこれらに限定しない。射出成型法やナノインプリント法、ホットエンボス法、切削加工、エッチング法、フォトリソグラフィー法、スクリーン印刷など一般的な加工方法が適用できる部材であれば良い。さらに、電解液の充填工程や遠心工程を含む脂質二重膜形成工程を光学的に観察できるよう、透光性が高く自家蛍光の少ない部材であればなお良い。
【００６８】
また、ガラスは石英ガラスが好ましいが、電解液および有機溶媒を充填、保持できれば、その他のガラス、例えば硼珪酸ガラス、ソーダガラス、低融点ガラス等を用いても良い。あるいはシリコン、窒化シリコン、アルミナなど他の無機材料を用いても良い。
【００６９】
また本実施の形態において、図１（ａ）に示すマイクロチップ１００の外周面における孔１０４の断面積は第１チャンバー１０５における孔１０４の断面積よりも小さいことが好ましい。孔１０４をテーパー形状にすることで、マイクロチップ１００を回転する時に、孔１０４へ注入した電解液がマイクロチップ１００の外部へ飛散するのを抑制できる。孔１０４の外周面における断面積は小さければ小さいほど電解液の飛散が抑制されるが、一方、小さすぎると電解液の注入が困難なばかりか、気−液交換がスムーズに行われないため第１チャンバーおよび第２チャンバーへの電解液の充填が難しい。孔１０４の外周面における断面積は０．０１ｍｍ2以上１ｍｍ2以下が好ましい。孔１０４の第１チャンバー１０５における断面積は１．５ｍｍ2以上４ｍｍ2以下が好ましい。
【００７０】
さらに本実施の形態において、図１（ａ）に示す孔１０４の容積は第１チャンバー１０５および第２チャンバー１０７の容積よりも小さいことが好ましい。孔１０４の容積は第１チャンバー１０５および第２チャンバー１０７の容積の１．５倍以上５倍以下が好ましく、２倍以上３倍以下がより好ましい。なお第２チャンバー１０７に孔を設けた場合も同様である。
【００７１】
また本実施の形態において、図１（ａ）に示すくびれ１０６は疎水性表面を有していることが好ましい。一般に樹脂の表面は疎水性を示すので、マイクロチップ１００を樹脂で形成すればくびれ１０６の表面も疎水的であるが、より効果的に脂質二重膜を形成するために、さらに疎水性の高い高分子、例えばフッ素樹脂をくびれ１０６の表面に塗布しても良い。一方、マイクロチップ１００をガラスや窒化シリコンなどの無機材料で形成する場合、くびれ１０６の表面は一般には親水性であるため、撥水処理を行うことが好ましい。ＨＭＤＳ（ヘキサメチレンジシラザン）をコートしても良いし、テフロン（登録商標）薄膜をコートしても良いし、プラズマ重合でフロロカーボン膜を成膜しても良い。なお本発明において撥水処理方法は限定されず、その他の撥水処理に関する公知技術を用いても良い。
【００７２】
さらに本実施の形態において、図１（ａ）に示す第１チャンバー１０５および第２チャンバー１０７はいずれもテーパー形状を有し、これによってくびれ１０６が形成されている。
【００７３】
すなわち、回転中心１０３からの距離が遠ざかるにつれて、第１チャンバー１０５の断面積１１０は徐々に小さくなっていき、逆に第２チャンバー１０７の断面積１１１は大きくなっている。
【００７４】
くびれ１０６は他の形状に置換され得る。図４に他の形状の例を示す。図４に示すように第１チャンバー１０５および第２チャンバー１０７はいずれも矩形形状を有し、これによってくびれ３０１が形成されている。なお、くびれ３０１の長さ３０２が非常に長い場合、すなわち一般的なバイオチップにおける「流路」形状のような場合であっても脂質二重膜を形成することは可能であるが、脂質二重膜の位置が定まらないのでくびれ３０１の長さ３０２は０．０１ｍｍ以上１ｍｍ以下が好ましい。
【００７５】
また本実施の形態において、図１（ａ）に示すくびれ１０６の途中に突起を設けても良い。すなわち図５に示すように突起４０１を複数並べることで、くびれ群４０２を形成しても良い。なお図５において前述の図１（ａ）に示した実施の形態と同様の構成を有するものについては、同一符号を付し、その説明を省略する。
【００７６】
さらに本実施の形態において、脂質二重膜形成部は図６に示すように支柱５０１を複数並べた支柱群５０２でも良い。なお図６において前述の図１（ａ）に示した実施の形態と同様の構成を有するものについては、同一符号を付し、その説明を省略する。支柱の形状は円柱が好ましいが、四角柱、三角柱、六角柱、星型柱など他の形状でも良い。なお支柱の数、大きさ、配置は限定しない。
【００７７】
なお脂質二重膜形成部は、図６に示す支柱群５０２と図１（ａ）に示すくびれ１０６とを組み合わせて形成しても良いし、他の形状のくびれと組み合わせて形成しても良い。
【００７８】
また本実施の形態において、図１（ａ）に示す基材はチューブ状であっても良い。図７に基材としてチューブ６０１を用いた例を示す。なお図７において前述の図１（ａ）に示した実施の形態と同様の構成を有するものについては、同一符号を付し、その説明を省略する。チューブの材料は樹脂が好ましいがガラスでも良いし、その他の無機材料でも良い。チューブの直径は０．０１ｍｍ以上３ｍｍ以下が好ましく、０．２ｍｍ以上１ｍｍ以下がより好ましい。くびれ１０６の断面積は０．０００１ｍｍ2以上０．１ｍｍ2以下が好ましい。第１チャンバー１０５の断面積はくびれ１０６の最狭部の断面積の少なくとも２倍以上が好ましい。また第２チャンバー１０７の断面積はくびれ１０６の最狭部の断面積の少なくとも２倍以上が好ましい。
【００７９】
さらに本実施の形態において、図１（ａ）に示す第１チャンバー１０５および第２チャンバー１０７への電解液の充填は、電極１０９ａ、ｂを用いて電気的に検出することが好ましい。図８に電解液の充填を検出する原理図を示す。例えば図８に示すように第２チャンバー１０７に一対の電極１０９ｃ、１０９ｄを設ける。電極１０９ｃと電極１０９ｄとの間に電圧を印加してイオン電流が流れるならば、電極１０９ｃと電極１０９ｄは電解液６０２で浸されていることを示している。第１チャンバー１０５についても同様である。また、第１チャンバー１０５および第２チャンバー１０７の内壁に電極を格子状に配置すればどの位置まで電解液が充填されたかを詳細に検出でき、より好ましい。なお、電極の形状、数、配置はこれに限定されず、同様の効果が得られるならばそれらは本発明の範囲に含まれる。
【００８０】
さらに、本実施の形態において、図２（ｃ）に示す原料充填工程では、電解液の満たされたチャンバーおよび混合液の配置された脂質二重膜形成部から、気泡を取り除くことが好ましい。なぜなら電解質第１充填工程および原料充填工程では、液中に気泡が混入する場合があるからである。なお気泡が除去されたことを検出するには、図１（ａ）に示す電極１０９ａ、ｂを用いて電気的に検出しても良いし、脂質二重膜形成装置の外部に光学観察部を別途設けて、光吸収、光散乱、イメージングなど光学的に検出しても良い。
【００８１】
また、本実施の形態において、図２（ｄ）に示す電解質第２充填工程での脂質二重膜形成装置の回転速度は、図２（ｅ）に示す遠心工程での脂質二重膜形成装置の回転速度よりも小さいことが好ましい。たとえば電解液であるＫＣｌ水溶液の比重は約１であり、有機溶媒であるデカンに比重は約０．７である。したがって、脂質二重膜の原料と有機溶媒との混合液は遠心力によって脂質二重膜形成部から脱離し易い。ゆえに電解質第２充填工程での脂質二重膜形成装置の回転速度は、脂質二重膜の原料と有機溶媒との混合液が遠心力によって脂質二重膜形成部から脱離しない回転速度が好ましい。一方、遠心工程における脂質二重膜形成装置の回転速度は、脂質二重膜の原料と有機溶媒との混合液が遠心力によって脂質二重膜形成部から脱離せず、しかも余剰な有機溶媒を排出できる回転速度が好ましい。
【００８２】
さらに、本実施の形態において、図２（ｅ）に示す遠心工程では、第１チャンバー２０９および第２チャンバー２０５の内部にそれぞれ設けられた電極２１１ａ、ｂから得られる電気信号により脂質二重膜の形成を検知することが好ましい。電気信号は脂質二重膜を流れる電流であることが好ましいが、脂質二重膜の両端にかかる電圧でも良いし、脂質二重膜の電気容量でも良い。また、電気信号は交流信号であることが好ましいが、直流信号でも良い。さらに電極２１１ａ、ｂからプリアンプまでの距離は短いほうがノイズを低減できるため好ましい。また脂質二重膜形成装置にプリアンプを設けて電気信号を増幅すればなお好ましい。また、この電気的な検出に加えて、脂質二重膜形成装置の外部に光学観察部を別途設けて、光吸収、光散乱、イメージングなど光学的な検出を行っても良い。
【００８３】
さらに、本実施の形態において、図１（ａ）に示す第１チャンバー１０５および第２チャンバー１０７の内部にそれぞれ設けられた電極１０９ａ、ｂから得られる電気信号により、各工程における脂質二重膜形成装置の回転速度および回転時間を制御することが好ましい。電気信号の解析には脂質二重膜形成装置の外部に設けたコンピュータを用いても良い。回転速度の計測には、脂質二重膜形成装置の外部に光学観察部を設けて光学的に行っても良いし、脂質二重膜形成装置を回転させるためのモーターにより機械的に行っても良い。
【００８４】
また、本実施の形態において、脂質二重膜形成装置を電磁シールドボックス内で動作させることが好ましい。高周波から低周波までの広範囲のノイズを除去できることが好ましい。磁気シールドについて、低周波磁場減衰（静磁場）は０．１Ｈｚ以下の周波数では２９ｄＢ以上が好ましく、１Ｈｚでは５０ｄＢが好ましく、２５Ｈｚ以上では８０ｄＢ以上が好ましく、ＤＣ（直流）では４０ｄＢが好ましい。また電磁シールドについて、遮蔽率は１００Ｈｚ〜１ＭＨｚの周波数では８０ｄＢ以上が好ましく、１Ｈｚ〜１ＭＨｚでは６０ｄＢ以上が好ましい。なお、本発明はこれに限定されず、一般的なシールド特性を示す電磁シールドボックスの使用は本発明の範囲に含まれる。また脂質二重膜形成装置を回転させるためのモーターは、この電磁シールドボックスの外に設けることが好ましいが、中に設けても良い。
【００８５】
さらに、本発明の実施において、図１（ａ）に示す第２チャンバー１０７およびくびれ１０６を回転中心に対して放射状に複数配置することが好ましい。これにより複数の脂質二重膜を同時に形成することができる。図１（ａ）に示すマイクロチップ１００を複数配置しても良いし、円板状の基材上に一括して第１チャンバー１０５、第２チャンバー１０７およびくびれ１０６などを配置しても良い。図９(ａ)、（ｂ）、（ｃ）には、円板状の基材上に一括して配置した脂質二重膜形成装置の正面図、断面図および脂質二重膜形成後の装置の拡大図を示す。なお図１(ａ)と同様の構成を有するものについては、同一符号を付し、その説明を省略する。
【００８６】
図９(ａ)において、図１（ａ）に示す実施の形態と相違する点は、複数の第２チャンバー１０７およびくびれ１０６を回転中心１０３に対して放射状に設けることである。
【００８７】
なお、図９(ａ)および図９（ｂ）に示すように、第１チャンバー１０５の底面にガイド溝７０１を設けても良い。これにより効率的に第２チャンバー１０７および第１チャンバー１０５へ電解液を分配、充填することができる。
【００８８】
さらに、本実施の形態において、図９(ａ)に示す脂質二重膜形成装置を用いて作成される複数の脂質二重膜は、それぞれ電気的に独立していることが好ましい。図９(ｃ)には脂質二重膜形成装置の一部の拡大図を示す。電解液７０２ａ、ｂ、ｃがそれぞれ互いに接触しないよう、各チャンバーへ適量を充填することができる。この構成であれば従来技術のように空気や有機溶液などの絶縁物等を用いることなく、複数の脂質二重膜を電気的に独立させることができる。
【００８９】
また、本実施の形態において、本発明にかかる脂質二重膜形成方法は、脂質二重膜へイオンチャンネルを組み込んで、イオンチャンネル解析装置に用いることが好ましい。またイオンチャンネルの機能解析装置、膜タンパク−イオンチャンネル間相互作用の解析装置、バイオセンシング装置などに用いても良い。
【００９０】
（実施例）
次に以上のように構成された図１に示す脂質二重膜形成装置の製造方法について説明する。図１０（ａ）〜（ｄ）は脂質二重膜形成装置の製造方法例を示す工程図である。
【００９１】
基板と上蓋はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）を用いた。図１０（ａ）に示すように、ホットエンボス法により金型８０１を用いて、上蓋８０２にチャンバー８０３を形成した。ホットエンボスは１１０℃、０．２ＭＰａの加熱加圧下において３分間保持して行なった。本製造方法例では金型はリソグラフィーとドライエッチングによりシリコンで作製したが、ステンレス製の金型でも良いし、石英、炭化シリコン、アルミナ、サファイア、ダイアモンド等でも良い。
【００９２】
上蓋の大きさは長さが２２ｍｍで幅は２２ｍｍで厚みは０．５ｍｍとした。また基板の大きさは長さが２６ｍｍで幅は２２ｍｍで厚みは０．５ｍｍとした。なお、図１０（ａ）には示していないがチャンバーと同時にくびれも形成した。チャンバーおよびくびれの深さは１００μｍであった。なお、チャンバーとくびれの深さは同じでなくても良い。くびれの幅は２００μｍであった。
【００９３】
次に図１０（ｂ）に示すように、ボール盤を用いて孔８０４を開けた。開口部の孔の直径は１．５ｍｍとした。孔を開ける方法は上記のボール盤に限定するものではなく、パンチング、エンドミルを用いても良い。さらに孔の内壁表面を親水性にすると、電解液は濡れ性が良くなり、脂質溶液は内壁表面への付着を抑制できるのでより好ましい。なお、図１０（ａ）と図１０（ｂ）の工程は順序が逆になっても良い。
【００９４】
また、チャンバー、くびれ、孔を射出成型により一括して形成すれば、安価で大量に製造できるのでより一層好ましい。
【００９５】
次に図１０（ｃ）に示すように基板８０５上に電極８０６を形成した。電極８０６は銀・塩化銀であることが最も好ましいが、金、白金、グラッシーカーボンなど一般的に電気化学計測に用いられる電極材料であれば特に限定しない。また電極の形成方法はフォトリソグラフィー法を用いることが好ましいが、スクリーン印刷やインクジェット印刷など電極形成方法として知られているその他の公知技術を用いても良い。
【００９６】
最後に図１０（ｄ）に示すように、上蓋８０２と基板８０５を７５℃、０．１５ＭＰａの加熱加圧下において５分間保持して接合した。本製造方法例では熱圧着を用いたが、２枚の基板の接合方法として知られているその他の公知技術を用いても良い。
【００９７】
以上のように製造された脂質二重膜形成装置において、以下にその動作について図２を用いて説明する。
【００９８】
まず、図２（ａ）に示すように、マイクロチップ２００に設けられた孔２０１からピペット２０２により電解液２μＬを注入した。このとき電解液として１００ｍＭのＫＣｌ水溶液を用いた。なお電解液の量および濃度は限定しない。
【００９９】
次に、図２（ｂ）に示すように、回転中心２０３を中心軸としてマイクロチップ２００を３０００ｒｐｍの回転速度で３秒間回転させ、遠心力により電解液２０４を第２チャンバー２０５へ充填した。回転速度は大きいほど電解液の充填が速やかに完了するので、３０００〜６０００ｒｐｍが好ましいが、本発明ではこれに限定しない。また回転時間については、充填の完了を検知するまで行えば良い。なお第２チャンバー２０５と回転中心２０３との間の距離は３５ｍｍとした。
【０１００】
次に、図２（ｃ）に示すように、孔２０１へ脂質二重膜の原料と有機溶媒との混合液０．２μＬを注入した。このとき脂質溶液としてアゾレクチン５０ｍｇとデカン１ｍＬとの混合液を用いた。回転中心２０３を中心としてマイクロチップ２００を３０００ｒｐｍの回転速度で３秒間回転させ、混合液２０６をくびれ２０７へ配置した。
【０１０１】
さらに、図２（ｄ）に示すように、孔２０１へ電解液１．５μＬを注入した。そして回転中心２０３を中心軸としてマイクロチップ２００を３０００ｒｐｍの回転速度で３秒間回転させ、電解液２０８を第１チャンバー２０９へ充填した。
【０１０２】
最後に、図３（ｅ）に示すように、マイクロチップ２００を回転させた。電解液２０８にかかる遠心力が混合液２０６を加圧し、余剰な有機溶媒が排出されて脂質二重膜２１０が形成された。このときの回転速度は３５００ｒｐｍであった。３０００ｒｐｍ以下の回転速度では、電解液２０８にかかる遠心力が不足するために、余剰な有機溶媒を排出できなかった。また、４０００ｒｐｍ以上の回転速度では、電解液２０８にかかる遠心力が強すぎるため、混合液２０６をくびれ２０７に保持することができず脂質二重膜は形成されなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明にかかる脂質二重膜形成装置は、遠心力を利用して脂質二重膜を形成するため外部に加圧手段を設ける必要がない。したがって脂質二重膜を形成する度に外部の加圧手段へ接続しなくても良いという効果を有し、簡便な脂質二重膜の形成方法として有用である。また本装置は樹脂で製造されるのでディスポーザブルにでき、廃棄物の処理を簡単化し、廃棄物の量を減量化することができる。
【０１０４】
本発明の脂質二重膜作成方法により作成する脂質二重膜へイオンチャンネル、受容体などの膜タンパクを組み込めば、膜タンパクの基本構造解析、機能解明および膜タンパク−膜タンパク間の相関研究への用途に応用できる。さらにイオンチャンネルに起因する疾患の診断や新薬開発のスクリーニングなどの医療、製薬分野への産業応用の可能性もある。また膜タンパクが有する特異的な分子認識性を利用すればバイオセンサに応用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】本発明の実施の形態における脂質二重膜形成装置の斜視図および断面図
【図２】同実施の形態における脂質二重膜形成装置の動作図
【図３】同実施の形態における他の脂質二重膜形成装置の動作図
【図４】同実施の形態における他の脂質二重膜形成部の例を示す正面図
【図５】同実施の形態における他の脂質二重膜形成部の例を示す正面図
【図６】同実施の形態における他の脂質二重膜形成部の例を示す正面図
【図７】同実施の形態における他の脂質二重膜形成装置の斜視図
【図８】同実施の形態における電解液の充填検知の原理図
【図９】同実施の形態における他の脂質二重膜形成装置の正面図、断面図および拡大図
【図１０】同実施の形態における脂質二重膜形成装置の製造方法例の工程図
【図１１】従来のペインティング法を示す模式図
【図１２】従来の貼り合わせ法を示す模式図
【図１３】従来の脂質二重膜形成装置の模式図
【符号の説明】
【０１０６】
１０  容器
１１  平板
１２  電解液
１３  微小孔
１４  混合液
１５  刷毛
２０  容器
２１  平板
２２  微小孔
２３  電解液
２４  注入口
２５  脂質分子
２６  電解液
３１  基板
３２  マイクロチャンバー
３３  マイクロチャンネル
３４  微小孔
３５  壁
３６  通路
１００  マイクロチップ
１０１  基板
１０２  上蓋
１０３  回転中心
１０４  孔
１０５  第１チャンバー
１０６  くびれ
１０７  第２チャンバー
１０９ａ〜ｄ  電極
１１０  第１チャンバーの断面積
１１１  くびれの最狭部の断面積
１１２  第２チャンバーの断面積
２００  マイクロチップ
２０１  孔
２０２  ピペット
２０３  回転中心
２０４  電解液
２０５  第２チャンバー
２０６  混合液
２０７  くびれ
２０８  電解液
２０９  第１チャンバー
２１０  脂質二重膜
２１１ａ、ｂ  電極
２１２  孔
３０１  くびれ
３０２  長さ
４０１  突起
４０２  くびれ群
５０１  支柱
５０２  支柱群
６０１  チューブ
６０２  電解液
７０１  ガイド溝
７０２ａ〜ｃ  電解液
８０１  金型
８０２  上蓋
８０３  チャンバー
８０４  孔
８０５  基板
８０６  電極
【図１】
2008194573.tif 000003
【図２】
2008194573.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2008194573.tif 000012
【図１１】
2008194573.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
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