(57)【要約】【課題】加熱殺菌処理に供する微生物菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法、特に加熱殺菌後の酵素活性を保持しうる低コストの保存方法を提供する。【解決手段】 本発明は、加熱殺菌処理に供する微生物の菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法であって、液体のｐＨを６〜８に調整しながら通気および攪拌することを特徴とする菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼを含有する微生物を培養した後の菌体を含有する液体のｐHを６
〜８に調整しながら通気および攪拌して保存した後に加熱殺菌処理する加熱処理物の製造方法。
【請求項２】
前記加熱殺菌処理を、５０〜１２１℃、３〜２０分で実施することを特徴とする請求項１に記載の加熱処理物の製造方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の加熱処理物を用いて、ニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法。
【請求項４】
前記ニトリル化合物が、アクリロニトリルであることを特徴とする請求項３に記載のニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は加熱殺菌処理に供する微生物菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法
に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え微生物の作り出す酵素は、各種の化学反応にあわせて最適化され、多くの場合天然微生物の作り出す酵素よりも活性が高く、産業上有用なものが多い。遺伝子組換え微生物は環境・人体の保護等の観点から各種ガイドラインによりその取り扱いが定められている。遺伝子組換え微生物の組換えレベルによっては、生きた遺伝子組換え微生物の外部環境への漏洩及び人体への直接の接触を防止するために、当該微生物は閉鎖設備内で取り扱う必要があるとされている。通常、組換え微生物は、加熱処理により殺菌され、酵素のみが利用される。このとき加熱処理する菌体液もしくは菌体処理物を含有する液体を加熱処理終了まで安定に保存しておく必要がある。すなわち、酵素活性が失われたり、腐敗、溶菌を起こすことを防がねばならない。そこで一般的には、冷蔵や凍結などで保存されているが、低温に菌体もしくは菌体処理物を保つための冷却コストが大きい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、加熱殺菌処理に供する微生物菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法、特に加熱殺菌後の酵素活性を保持しうる低コストの保存方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、前述の加熱殺菌処理に供する微生物菌体もしくは菌体処理物含有液の保存方法 に関して鋭意検討を行ってきたところ、その保存を攪拌および通気を実施しなが
らｐHを制御することにより行なうと、極めて効率的に活性の保持をなしうるものである
ことを見出した。すなわち本発明は、下記のとおりである。
【０００５】
（１）ニトリルヒドラターゼを含有する微生物を培養した後の菌体を含有する液体のｐH
を６〜８に調整しながら通気および攪拌して保存した後に加熱殺菌処理する加熱処理物の製造方法。
（２）前記加熱殺菌処理を、５０〜１２１℃、３〜２０分で実施することを特徴とする前記（１）に記載の加熱処理物の製造方法。
（３）前記（１）または前記（２）に記載の加熱処理物を用いて、ニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法。
（４）前記ニトリル化合物が、アクリロニトリルであることを特徴とする前記（３）に記載のニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法。
（５）加熱殺菌処理に供する微生物の菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法 
であって、液体のｐＨを６〜８に調整しながら通気および攪拌することを特徴とする菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法 。
【０００６】
（６）通気量が、菌体液または菌体処理物を含有する液体の体積１に対して0.05以上、1.0以下（単位vvm）であることを特徴とする前記（５）に記載の保存方法 。
（７）攪拌所要動力数が、0.5W/m3から1800W/m3である前記（５）〜（６）のいずれかに
記載の保存方法 。
（８）無機酸を用いてＰＨを調整することを特徴とする前記（５）〜（７）のいずれかに記載の保存方法 。
（９）無機酸が、硫酸、硝酸、塩酸から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする前記（８）に記載の保存方法 。
（１０）微生物がニトリルヒドラターゼを含有する微生物であることを特徴とする前記（５）〜（９）のいずれか１項に記載の保存方法 。
【０００７】
本発明の微生物は、目的とする酵素を含有するものであれば特に制限されないが、ニトリルヒドラターゼ を含有する微生物が好適である。また、上記におけるニトリルヒドラ
ターゼ とは、ニトリル化合物を加水分解して対応するアミド化合物を生成する能力をも
つ酵素をいうものである。ここで、ニトリルヒドラターゼ を含有する微生物としては、
ニトリルヒドラターゼ を産生し、かつ５０重量％のアクリルアミド水溶液中でニトリル
ヒドラターゼ の活性を保持している微生物が好ましい。
【０００８】
具体的には、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、
バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロ
コッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム( Agrobacterium)属またはサーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する微生物を好適な例として挙げることができる。
【０００９】
また、該微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ 遺伝子を任意の宿主で発
現させた形質転換体も本発明でいう微生物に含まれる。なお、ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるのものではなく枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。その様なものの例として、ＭＴ−１０８２２（本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。）が挙げられる。また、組換えＤＮＡ技術を用いて該酵素の構成アミノ酸の１個または２個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、アミド化合物耐性やニトリル化合物耐性、温度耐性を更に向上させた変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体も、本発明でいう微生物に含まれる。
【００１０】
また、本発明における微生物の菌体処理物は、微生物菌体の抽出物や磨砕物、該抽出物や磨砕物の酵素活性画分を分離精製して得られる後分離物、該微生物菌体や該菌体の抽出物・磨砕物・後分離物を適当な担体を用いて固定化した固定化物等を指し、これらはニトリルヒドラターゼ等、所望の酵素の活性を有している限りは本発明の菌体処理物に相当するものである。
【００１１】
菌体または菌体処理物を含有する液体としては、微生物の培養液の他、菌体または菌体処理物を各種バッファー、生理食塩水、水などに溶解ないし懸濁させたものがあげられる。菌体または菌体処理物の濃度は任意であるが、2〜30wt% の範囲が好ましい。菌体または菌体処理物を含有する液体中に通気するガスとしては、空気を用いるのが好ましい。
【００１２】
通気量は、菌体または菌体処理物を含有する液体の体積１に対して0.05以上、1.0以下
（単位vvm、1分間に液体１Lに気体１Lを流した量が１vvm（volum/volum・分）となる）が好ましいが、空気の分散や発泡を考えると、0.2〜0.6であることがより望ましい。本発明
の攪拌所要動力数は、0.5W/m3から1800W/m3が好ましいが、菌体の沈降や発泡を考えると
、100W/m3から800W/m3がより望ましい。液体のｐHは通常６〜８、望ましくは７〜7.5に調整する。ＰＨの調整は、無機酸、有機酸などを使用できる。無機酸としては、硫酸、硝酸、塩酸などを挙げることができる。有機酸としては、アクリル酸、酢酸、メタクリル酸などを挙げることができる。なかでも無機酸を使用するのが好ましい。保存温度は短期間保存の場合は室温でもよいが、低温、例えば０℃〜２０℃で保存するのが好ましい。保存期間も任意であるが、３日以内の範囲が好ましい。
【００１３】
本発明の方法により所定の期間保存された菌体または菌体処理物含有液は、加熱殺菌処理が施される。加熱殺菌温度、時間などは任意に設定することができるが、例えば50〜121℃、3〜20分で行なうことができる。また、熱殺菌装置も特に限定されるものではないが、プレートヒータ式熱交換器、２重管式熱交換器などの間接加熱手段の熱交換器を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１４】
微生物菌体または菌体処理物を含有する液を本発明の方法により保存した場合、保存後に菌体または菌体処理物を含有する液体を加熱殺菌した後でも酵素活性の経時的な低下を抑制することができる。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって何等限定されるものではない。
実施例１（培養）５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、ＭＴ−１０８２２株（ＦＥＲＭ 
ＢＰ−５７８５）を一白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて２０時間培養した。
【００１６】
培地組成 酵母エキストラクト ５．０ｇ／Ｌ ポリペプトン １０．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ ５．０ｇ／Ｌ 塩化コバルト・六水和物 １０．０ｍｇ／Ｌ 硫酸第二鉄・七水和物 ４０．０ｍｇ／Ｌ ｐＨ７．５上記で得られた培養液を通気・攪拌・ｐHを変えながら保存し、１日ごとに液の一部をとりだして殺菌処理（60℃加熱、ホールド3分）後、活性測定をおこ
なった。なお、ｐＨの調整には硫酸を使用した。
【００１７】
（活性測定）培養液を少量とり、遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。ニトリルヒドラターゼ 活性の測定は、基質のアクリロニ
トリルの菌体懸濁液への添加にて開始し、２０℃、１５分の攪拌ののち、燐酸液を加えて反応を停止し、稀釈後、高速液体クロマトクラフィーで分析した。以下、すべてのデータで０日の活性を１とする。
【００１８】
【表１】
2008194048.tif 000002
【００１９】
【表２】
2008194048.tif 000003
【００２０】
【表３】
2008194048.tif 000004
実施例２（ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＭｅｔに置換するために、特開平９−２７５９７８で得られたｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、宝酒造社製の「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を用いた部位特異的な変異導入を行った。以後、「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を単にキットと呼ぶ。
【００２１】
以下の実施例では、基本的にキットの原理および操作方法を踏襲した。３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、実施例１と同様にＭＴ−１０８２２株を一白菌耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により該菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００２２】
ｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成は
キットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号３に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０質量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
【００２３】
Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（宝酒造社製）を用いてそれぞれのＰＣＲ反応終了液より過剰なプライマーおよびｄＮＴＰを除去した後、ＴＥを加えて各々５０μｌの溶液を調製した。該ＴＥ溶液を各０．５μｌずつ含む全量４７．５μｌのアニーリング溶液（組成はキットに記載の条件による）を調製し、熱変性処理（９８℃）を１０分間行った後、３７℃まで６０分間かけて一定の速度で冷却を行い、続いて３７℃で１５分間保持することによってアニーリング処理を行った。アニーリング処理液にＴＡＫＡＲＡＬＡ Ｔａｑを０．５μｌ加えて７２℃で３分間加熱処理を行い、ヘテロ２本鎖を完成させた。これにＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ加えて全量を５０μｌとした後、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことによるＰＣＲ反応Ｎｏ．３を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．３の反応終了液５μｌを用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．８質量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約２．０ｋｂｐの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
【００２４】
続いて、アガロースゲルから約２．０ＫｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対して常法に従ってフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。精製した約２．０ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIIIにより切断した後、この制限酵素処理液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
【００２５】
同様に、ｐＰＴ−ＤＢ１上の唯一の制限酵素サイトであるＥｃｏＲIおよびＨｉｎｄIIIによりｐＰＴ−ＤＢ１を切断し、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出した。切りだしたアガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
【００２６】
この様にして得られた増幅ＤＮＡ産物とｐＰＴ−ＤＢ１断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させた後、大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、大腸菌バンクを調製した。
【００２７】
３０ｍｌの試験管に４０μｇ／ｍｌの硫酸第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍｌの塩化コバルト・二水和物を含む１０ｍｌのＬＢ液体培地（以後、活性発現培地と呼ぶ）を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、該大腸菌バンクより任意に選別した５クローンを各一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐ
ｍ×５分）により菌体を分離した。
【００２８】
該菌体を２００μｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、これに１質量％のアクリロニトリルを添加して１０℃で２分間反応させた。反応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度を実施例２と同様のＨＰＬＣ分析により測定した。その結果、５クローン中４クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリルヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。
【００２９】
ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたプライマーエクステンション法により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、（表４）に示したクローンＮｏ．１においてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＭｅｔに置換されていた。
【００３０】
【表４】
2008194048.tif 000005
続いて、 αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒに置換するために、クローン
Ｎｏ．１のプラスミドＤＮＡを鋳型として、上述と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。すなわち、３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、得られたクローンＮｏ．１株を一白菌耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．１株のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００３１】
このクローンＮｏ．１株のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．４は、配列表の配列番号５記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．５は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号３に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．４と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．４およびＮｏ．５の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０質量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、クローンＮｏ．１の場合と全く同じ操作により大腸菌バンクを調製した。
【００３２】
該大腸菌バンクより任意に選別した５クローンをクローンＮｏ．１の場合と同じ活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブに分取した後、ニトリルヒドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリルヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製した。続いて、クローンＮｏ．１の場合と同様の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、（表５）に示したクローンＮｏ．２においてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＭｅｔに、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【００３３】
【表５】
2008194048.tif 000006
続いて、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒに置換するために、クローンＮｏ．２のプラスミドＤＮＡを鋳型として、上述と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。すなわち、３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、得られたクローンＮｏ．２株を一白菌耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．２株のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００３４】
このクローンＮｏ．２のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．６は、配列表の配列番号６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．７は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号３に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．６と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．６およびＮｏ．７の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０質量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、クローンＮｏ．１の場合と全く同じ操作により大腸菌バンクを調製した。
【００３５】
該大腸菌バンクより任意に選別した５クローンをクローンＮｏ．１の場合と同じ活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブに分取した後、ニトリルヒドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリルヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製した。続いて、クローンＮｏ．１の場合と同様の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、（表６）に示したクローンＮｏ．３においてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒに置換されていた。
【００３６】
【表６】
2008194048.tif 000007
このクローンＮＯ．３の菌体を実施例１と同様に培養し、反応に必要な菌体を得た。上記で得られた培養液を通気・攪拌・ｐHを変えながら保存し、１日ごとに液の一部をとり
だして殺菌処理（60℃加熱、ホールド3分）後、活性測定をおこなったが、結果は実施例
１と同じであった。
【配列表】
2008194048000001.app