(57)【要約】【課題】  本発明は老化サンプル、ホルマリン固定サンプル、パラフィン包埋サンプル、異数性細胞を含むサンプル、及び断片化核酸を含む細胞等の問題のあるサンプルに由来する核酸の定量方法を提供する。【解決手段】  方法としては、有機抽出に依存せずに保存臨床サンプルから非変性条件下で核酸を効率的に可溶化する方法、異数性に関係なく細胞数を正規化する方法、核酸の断片化状態を検出する方法、及び分解核酸サンプルの標準曲線を提供する方法が挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性成分と会合した細胞から核酸を採取する方法であって、
細胞と４０℃を上回る融点をもつ会合疎水性成分を水溶液に懸濁する段階と、
細胞の２本鎖ＤＮＡに対して実質的に非変性条件下で４０℃を上回る温度で懸濁液をインキュベートすることにより、疎水性成分を溶解させ、核酸を細胞から水溶液中に放出させる段階と、
前記インキュベーション後に疎水性成分から水溶液を物理的に分離することにより、核酸を細胞から採取する段階を含む前記方法。
【請求項２】
核酸がＤＮＡ、分解核酸、及びＲＮＡから構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ホルマリン固定パラフィン包埋組織が細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
疎水性成分がパラフィンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記懸濁が細胞を顕微鏡スライドからのスクラッピング、ダウンス型ホモジナイザーによる処理、又はボルテックスを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
水溶液がＰＥＧ、ＳＤＳ、ＳＳＣバッファー、ＮａＨＰＯ４、ＥＤＴＡ、変性サケ精子ＤＮＡ、ホルムアミド、及びＳＳＰＥバッファーから構成される群から選択される成分を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
水溶液がブロッキングプローブ、キャプチャーエキステンダー、ラベルエキステンダー、プレ増幅剤、ラベルプローブ、増幅用プローブ、増幅用マルチマー、プロテアーゼ、リパーゼ、界面活性剤、又はヌクレアーゼインヒビターから構成される群から選択される成分を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
水溶液が１５０μｌ／ｍｌを上回るプロテイナーゼを含有する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
プロテアーゼがプロテイナーゼＫを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
インキュベーション温度が約５２℃〜８０℃未満までの温度を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
インキュベーション温度が約６５℃の温度を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記インキュベーション段階が懸濁液をインキュベーション温度に１２時間以上維持することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記非変性条件がｐＨ８．５を越えないｐＨ条件又は７０℃の温度を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記分離段階が遠心、デカント、吸引、濾過、ピペッティング、及び疎水性成分を融点未満の温度で固化させる方法から構成される群から選択される技術を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
核酸を固体支持体上に捕獲する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
核酸を定量する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記定量段階がｂＤＮＡ分析、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング法、及びアガロースゲル電気泳動から構成される群から選択される技術を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
分離した水溶液のフェノール抽出を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
水溶液を有機溶媒で化学的に抽出しない請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
既知数の参照細胞から参照核酸サンプルを取得する段階と、
参照サンプル中のリボソームＤＮＡの量を定量する段階と、
参照リボソームＤＮＡ量に対する参照細胞数の標準関数を提供する段階と、
試験細胞から試験核酸サンプルを取得する段階と、
試験サンプル中のリボソームＤＮＡの量を定量する段階と、
標準関数と試験リボソームＤＮＡ量に基づいて試験細胞数を測定する段階を含む試験細胞数の測定方法。
【請求項２１】
試験細胞が腫瘍細胞、細胞株、顕微鏡スライド上の細胞、ＦＦＰＥ細胞、及びポリプロイド細胞から構成される群から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
腫瘍細胞が肺腫瘍細胞又は結腸腫瘍細胞を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
参照核酸サンプルを取得する段階が実質的に正常な核型をもつ細胞からの核酸抽出を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
リボソームＤＮＡが１８Ｓ  ｒＤＮＡ、５．８Ｓ  ｒＤＮＡ及び２８Ｓ  ｒＤＮＡから構成される群から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記定量段階がｂＤＮＡ分析、サザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応、及びアガロースゲル電気泳動から構成される群から選択される技術を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
細胞数を測定する段階が標準関数への試験リボソームＤＮＡ量の入力、細胞対ｒＤＮＡ比を含む式への試験リボソームＤＮＡ量の入力、及びコンピューターへの試験ｒＤＮＡ値の入力から構成される群から選択される方法を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
測定した試験細胞数を使用して試験細胞分析結果を正規化する段階を更に含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
既知試験細胞数と測定した試験細胞数に基づいて試験核酸抽出効率を測定する段階を更に含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
試験サンプル中の細胞数を測定する段階と、
分解ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ標準アッセイ入力に対するＲＮＡアッセイ出力の標準関数を提供する段階と、
標準関数を使用してＲＮＡアッセイにより試験サンプル中の試験ＲＮＡの量を測定する段階と、
細胞数と試験ＲＮＡの測定量に基づいて細胞中のＲＮＡのコピー数を決定する段階を含むＲＮＡコピー数の測定方法。
【請求項３０】
試験サンプルが腫瘍細胞、細胞株、顕微鏡スライドからの細胞、１年を上回る臨床サンプル、ホルマリンで固定した細胞、パラフィン包埋細胞、及び異数性細胞から構成される群から選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
保存時間、高ｐＨ、低ｐＨ、剪断応力、ヌクレアーゼ、光、熱、及びホルムアルデヒドとの接触から構成される群から選択される分解手段によりＲＮＡ標準を分解する請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
定量分析がｂＤＮＡ分析、ノーザンブロット分析、ＲＴ−ポリメラーゼ連鎖反応、分光分析法、蛍光分析法、及びアガロースゲル電気泳動から構成される群から選択される方法を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
反復ＤＮＡの量に対する細胞数の標準関数を提供する段階と、
４０℃以上のプロテアーゼ溶液中でインキュベーション後にパラフィンを細胞から分離する段階と、
標準関数とプロテアーゼ溶液中の反復ＤＮＡの量に基づいてプロテアーゼ溶液中の相当細胞数を測定する段階と、
分解ＩＶＴ  ＲＮＡ標準アッセイ入力に対するＲＮＡアッセイ出力の標準関数を提供する段階と、
分解ＩＶＴ  ＲＮＡ標準関数に基づいてプロテアーゼ溶液中のＲＮＡ量を測定する段階と、
測定細胞数を測定ＲＮＡ量で割ることにより細胞当たりのＲＮＡコピー数を計算する段階を含むＦＦＰＥサンプル中の細胞のＲＮＡコピー数の測定方法。
【請求項３４】
反復ＤＮＡがリボソームＤＮＡを含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
プロテアーゼがプロテイナーゼＫであり、インキュベーション温度が約６５℃である請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ＲＮＡアッセイがｂＤＮＡアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、又はノーザンブロットを含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
オフセットｂＤＮＡアッセイの結果に従って分解ＩＶＴ  ＲＮＡ標準を選択するか又は標準曲線の傾きを修正する段階を更に含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
１個以上のオフセットキャプチャーエキステンダープローブＣ３配列が各々核酸の配列に相補的であり、１個以上のオフセットラベルエキステンダーＬ１配列が全Ｃ３相補配列から５’又は３’側に少なくとも１ヌクレオチド塩基の間隔をあけて配置された核酸の配列と相補的であるオフセットｂＤＮＡアッセイで核酸のサンプルを分析する段階を含み、
核酸がＣ３及びＬ１相補配列間で断片化していない場合よりも核酸がＣ３及びＬ１相補配列間で断片化している場合のほうが弱いシグナルがｂＤＮＡアッセイで発生される核酸の断片化の検出方法。
【請求項３９】
２個以上のコントロールキャプチャーエキステンダープローブＣ３配列が核酸の異なる位置の配列に相補的であり、１個以上のコントロールラベルエキステンダーＬ１配列が核酸配列の異なる位置の配列に相補的であり、コントロールＬ１配列の１個以上がコントロールＣ３配列の２個以上に相補的な位置間の位置の核酸に相補的である第２のｂＤＮＡアッセイで核酸のサンプルを分析する段階を更に含み、
核酸が断片化していない場合よりも核酸が断片化している場合のほうがオフセットアッセイ結果に対するコントロールアッセイ結果の比が大きい請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
核酸が断片化している請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
核酸がＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＦＦＰＥサンプルに由来する核酸、イントロン配列をもたない核酸、及び１年を上回る細胞又は組織サンプルに由来する核酸から構成される群から選択される請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
オフセットＣ３配列に相補的な核酸配列が核酸ヌクレオチドの７５％以上の間隔をあけてオフセットＬ１配列に相補的な核酸配列から分離している請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
１個以上のオフセットラベルエキステンダーＬ１配列が全Ｃ３相補配列から５’又は３’側に少なくとも２５ヌクレオチド塩基の間隔をあけて配置された配列と相補的である請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
１個以上のスペーシングヌクレオチドがブロッキングプローブに相補的な配列を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
２個のＣ３相補配列間にＬ１相補配列が存在しない請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
比を核酸の平均フラグメント長と相関させる段階を更に含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
アッセイ標準を選択する段階又は比に基づく標準関数を選択する段階を更に含む請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は先願米国仮出願第６０／８３８，５７８号、発明の名称「組織スライドからの核酸定量（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｌｉｄｅｓ」、発明者Ｇａｒｙ  ＭｃＭａｓｔｅｒら、出願日２００６年８月１７日の優先権と特典を主張する。先願の開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は細胞及び組織からの核酸抽出及び定量の分野に関する。疎水性溶媒を使用せずに包埋臨床サンプルから核酸を抽出する。リボソームＤＮＡ参照及び／又は分解ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡを使用して標準曲線を正規化し、細胞当たりの核酸コピー数を設定する。
【背景技術】
【０００３】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織は臨床結果が十分に記録された生検検体の膨大な供給源となるので回顧調査の最適資源となる（Ｌｅｗｉｓ，Ｆ．ら，２００１；Ｙａｎｇら，２００６）。ヒト検体の入手と使用は癌研究と薬剤発見基盤の必須部分であり、研究者らが薬剤ターゲットを同定し、リード化合物を開発し、薬剤代謝を解明するのに役立つ。ヒト検体を使用する研究は薬剤応答及び毒性と、短期及び長期臨床結果を予測するのに役立つ。新技術とヒトゲノムのマッピングから得られる情報に伴い、学術界と営利及び非営利目的の産業界の研究者が抗癌薬発見を促進させるために良好な品質のヒト検体を入手する必要はますます増大している。これらの研究を促進するためには、正常及び悪性組織、血液、他の体液、並びにこれらから抽出可能な蛋白質、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の多数の異なる形のヒト検体が必要である。
【０００４】
米国で実施される全外科処置は病理診断用組織サンプルを取得する必要があるため、ヒト検体の一次供給源は病院の手術室と病理研究室である。現在米国では１６０，０００，０００を越える病理検体（その大半はロウブロックに固定されている）が保存されている（Ｅｉｓｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｇａ，１９９９）。
【０００５】
組織ブロックは固定し、パラフィン包埋した後、ミクロトームで切断し、切片を顕微鏡スライドに固定するのが通例である。パラフィン包埋組織切片は核酸分析前に水溶液を浸透できるように脱ロウする必要があった。
【０００６】
例えば、無菌レザーブレードを使用してＦＦＰＥ切片をスライドからこそげ落とし、処理のためにマイクロ遠心管に移している。従来のパラフィン除去方法はキシレンと高グレードアルコールを使用する有機抽出を伴う。この方法は時間がかかり、煩瑣であり、キシレンは有害ガスを発生する猛毒性薬品であるため、特殊な取り扱いを要する。スカルペルを使用して同一組織ブロックからＦＦＰＥ検体切片（６０〜１００ミクロン／２５〜２５０ｍｍ２）１０枚をガラススライドから遠心管にこそげ落とした後、疎水性溶媒（例えばキシレン含有ＥＺＤｅＷａｘ（登録商標）（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ））１ｍｌを加える；図１参照。ボルテックス混合と室温で５分間インキュベーション後に組織サンプルを１６，０００×ｇで２分間マイクロ遠心管で遠心し、上清を捨てる。７０％エタノール１ｍｌをサンプルに加え、サンプルをボルテックス混合し、１６，０００×ｇで２分間マイクロ遠心管で遠心してもよい。次に、サンプルロウをキシレン相に繰返し抽出し、残渣を７０％エタノールで２〜５回洗浄した後、次の組織ホモジネート調製又は全ＲＮＡ単離段階に進む（Ｙａｎｇら，２００６）。
【０００７】
相抽出脱ロウプロトコールは時間と労力がかかる。反復操作、吸引及び管移動の結果、核酸回収が非定量的になる可能性がある。反復ボルテックスと苛酷な溶媒暴露によりサンプルが分解する可能性がある。
【０００８】
保存臨床検体に由来する核酸の定量には別の問題もある。例えば、サンプル採取、ホルマリン固定及び組織処理によりＲＮＡ品質が低下する可能性がある。その結果、例えば、ＦＦＰＥ組織ブロック中のＲＮＡを測定する能力が低下する可能性がある。包埋臨床サンプルから最終的に抽出された核酸は高度に分解及び断片化していることが多い。これらの抽出液を標準分析法により評価すると、定性及び定量アッセイ誤差を生じることが多い。その上、不完全な抽出によりｍＲＮＡコピー数測定等の計算に誤差を生じる可能性がある。ＦＦＰＥ組織ブロックに由来するＲＮＡの測定に伴う問題としてはＲＮＡフラグメントの断片化、架橋の及びホルマリン固定法による塩基修飾が挙げられる。ホルマリン固定組織中のＲＮＡ分子長を減らす２つのプロセスは分解と断片化（加水分解）である。ＲＮＡ分解は組織を固定剤と接触させてサンプル採取操作に付す前に酵素分解により生じる可能性がある。ＲＮＡ分子の断片化はホルマリン固定剤に起因し得るので、使用するホルマリン条件に応じて実質的に変化する（Ｌｅｈｍａｎｎ  Ｕ，Ｋｒｅｉｐｅ  Ｈ：  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ  ａｎｄ  ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１，２５：４０９−４１８）。断片化の厳密な原因は不明であるため、この問題の解決方法も不明であった。
【０００９】
現在の最新ＲＮＡ測定技術は定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）である。しかし、凍結組織とＦＦＰＥ組織でＲＮＡ定量を比較した数件の最近の報告によると、ホルマリン固定後のＱＰＣＲによる検出にはＲＮＡ転写産物の３〜５％しか利用できないことが実証されている（Ｂｉｂｉｋｏｖａ  Ｍ，Ｔａｌａｎｔｏｖ  Ｄ，Ｃｈｕｄｉｎ  Ｅ，Ｙｅａｋｌｅｙ  ＪＭ，Ｃｈｅｎ  Ｊ，Ｄｏｕｃｅｔ  Ｄ，Ｗｉｃｋｈａｍ  Ｅ，Ａｔｋｉｎｓ  Ｄ，Ｂａｒｋｅｒ  Ｄ，Ｃｈｅｅ  Ｍ，Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｆａｎ  ＪＢ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ，ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｕｓｉｎｇ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙｓ，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００４，１６５：１７９９−１８０７）。この問題は逆転写段階がオリゴ−ｄＴ又はランダムプライミングのどちらを使用するかに関係ない。この問題は、逆転写及び／又はＱＰＣＲがＲＮＡ中のホルマリンによるモノメチロール化により著しく悪化するためであると説明することができる。この問題を解決するために、該当遺伝子の発現が内部ハウスキーピング遺伝子に正規化されている。しかし、アデニンはホルマリン固定により変性し易いため、Ａ／Ｕリッチ配列はＧ／Ｃリッチ配列よりも正確に測定されないので、この方法は不十分である（Ｍａｓｕｄａ  Ｎ，Ｏｈｎｉｓｈｉ  Ｔ，Ｋａｗａｍｏｎｏ  Ｓ，Ｍｏｎｄｅｎ  Ｍ，Ｏｋｕｂｏ  Ｋ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ  ｓａｍｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｕｃｈ  ｓａｍｐｌｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９９，２７：４４３６−４４４３）。従って、ホルマリン固定組織中のｍＲＮＡの測定効率及び再現性には遺伝子特異的な差異が生じる。ホルマリンによるその変性に加え、固定及び／又はその後の単離工程中の高度断片化により特殊なプライマーデザインが必要になる。従って、ホルマリン固定組織でのＰＣＲによるＲＮＡ測定には大きな限界がある。ＲＮＡ定量の確度を改善するためには、ホルマリンによる変性に反応しにくい代替方法が必要である（Ｂｕｓｔｉｎ  ＳＡ：Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ  （ＲＴ−ＰＣＲ）：ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２００２，２９：２３−３９；Ｂｕｓｔｉｎ  ＳＡ，Ｎｏｌａｎ  Ｔ：Ｐｉｔｆａｌｌｓ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｔｅｃｈ  ２００４，１５：１５５−１６０  Ｇｕｎｔｈｅｒ  ＥＣ，Ｓｔｏｎｅ  ＤＪ，Ｇｅｒｗｉｅｎ  ＲＷ，Ｂｅｎｔｏ  Ｐ，Ｈｅｙｅｓ  ＭＰ：Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｂｙ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｏ��ｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００３，１００：９６０８−９６１３）。
【００１０】
定量的ＰＣＲは一般に７５〜８５ｂｐアンプリコンサイズに限定されており、複数のプールされた遺伝子特異的プライマーが必要であるため、ＦＦＰＥ  ＲＮＡの定量ではその性能は不良であった（Ｃｒｏｎｉｎ  Ｍ，Ｐｈｏ  Ｍ，Ｄｕｔｔａ  Ｄ，Ｓｔｅｐｈａｎｓ  ＪＣ，Ｓｈａｋ  Ｓ，Ｋｉｅｆｅｒ  ＭＣ，Ｅｓｔｅｂａｎ  ＪＭ，Ｂａｋｅｒ  ＪＢ：  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｒｃｈｉｖａｌ  ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ９２−ｇｅｎｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００４，１６４：３５−４２）。ＱＰＣＲはｂＤＮＡアッセイよりも著しく高いＲＮＡ純度を必要とするため、ｂＤＮＡ法と比較して分析前にサンプルを処理するために多くの段階が必要である。脱ロウ後に、ＲＮＡをプロテイナーゼＫで消化し、単離し、１〜２回ＤＮＡａｓｅ  Ｉで処理してＤＮＡ汚染を除去する必要がある。ＱＰＣＲによるＲＮＡ定量に伴う第２の問題は該当ｍＲＮＡ配列をｃＤＮＡに変換するために逆転写段階が必要な点である。この酵素反応はホルマリンによる塩基修飾、二次ｍＲＮＡ構造及びＲＮＡ調製における不純物により妨げられる。逆転写を阻害する因子はＦＦＰＥ組織ブロックにより異なる。ＰＣＲ増幅段階に高温加熱段階を加えると、ＲＮＡ塩基修飾を多少抑制できるが、多くのサンプルではこれらの修飾は不可逆的である。サンプルが古くなるほど損傷することが多く、平均ＱＰＣＲシグナルの低下が＞９０％となるため、入力ＲＮＡを増やし、Ｃｔ値を３５〜４０まで上げる必要がある（Ｍａｓｕｄａ  Ｎ，Ｏｈｎｉｓｈｉ  Ｔ，Ｋａｗａｍｏｎｏ  Ｓ，Ｍｏｎｄｅｎ  Ｍ，Ｏｋｕｂｏ  Ｋ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ  ｓａｍｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｕｃｈ  ｓａｍｐｌｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９９，２７：４４３６−４４４３）。これらの全問題により、ＱＰＣＲはＦＦＰＥサンプルに由来するＲＮＡの定量方法として満足な方法ではなかった。
【非特許文献１】Ｌｅｈｍａｎｎ  Ｕ，Ｋｒｅｉｐｅ  Ｈ：  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ  ａｎｄ  ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１，２５：４０９−４１８
【非特許文献２】Ｂｉｂｉｋｏｖａ  Ｍ，Ｔａｌａｎｔｏｖ  Ｄ，Ｃｈｕｄｉｎ  Ｅ，Ｙｅａｋｌｅｙ  ＪＭ，Ｃｈｅｎ  Ｊ，Ｄｏｕｃｅｔ  Ｄ，Ｗｉｃｋｈａｍ  Ｅ，Ａｔｋｉｎｓ  Ｄ，Ｂａｒｋｅｒ  Ｄ，Ｃｈｅｅ  Ｍ，Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｆａｎ  ＪＢ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ，ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｕｓｉｎｇ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙｓ，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００４，１６５：１７９９−１８０７
【非特許文献３】Ｍａｓｕｄａ  Ｎ，Ｏｈｎｉｓｈｉ  Ｔ，Ｋａｗａｍｏｎｏ  Ｓ，Ｍｏｎｄｅｎ  Ｍ，Ｏｋｕｂｏ  Ｋ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ  ｓａｍｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｕｃｈ  ｓａｍｐｌｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９９，２７：４４３６−４４４３
【非特許文献４】Ｂｕｓｔｉｎ  ＳＡ：Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ  （ＲＴ−ＰＣＲ）：ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２００２，２９：２３−３９
【非特許文献５】Ｂｕｓｔｉｎ  ＳＡ，Ｎｏｌａｎ  Ｔ：Ｐｉｔｆａｌｌｓ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｔｅｃｈ  ２００４，１５：１５５−１６０
【非特許文献６】Ｇｕｎｔｈｅｒ  ＥＣ，Ｓｔｏｎｅ  ＤＪ，Ｇｅｒｗｉｅｎ  ＲＷ，Ｂｅｎｔｏ  Ｐ，Ｈｅｙｅｓ  ＭＰ：Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｂｙ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００３，１００：９６０８−９６１３
【非特許文献７】Ｃｒｏｎｉｎ  Ｍ，Ｐｈｏ  Ｍ，Ｄｕｔｔａ  Ｄ，Ｓｔｅｐｈａｎｓ  ＪＣ，Ｓｈａｋ  Ｓ，Ｋｉｅｆｅｒ  ＭＣ，Ｅｓｔｅｂａｎ  ＪＭ，Ｂａｋｅｒ  ＪＢ：  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｒｃｈｉｖａｌ  ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ９２−ｇｅｎｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００４，１６４：３５−４２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記に鑑み、包埋臨床組織サンプルから核酸を回収するためのより迅速で簡単な方法が必要である。有害な溶媒を使用せずにホルマリン固定パラフィン包埋サンプルから核酸を取得する方法を提供することが望ましい。より定量的で損傷の少ない核酸抽出法により、核酸分析の確度を増すことが望ましい。ターゲット分解を考慮するように分析物を調整する方法により効果が得られる。本発明は上記特徴及び以下の記載から自明となる他の特徴を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の方法は物理的に処理しにくいか又は分解している核酸サンプルの分析に伴う問題に対処するのに有用である。本方法は組織病理評価のために予め処理されたサンプルから良好な代表的試験材料を得るのに役立つ。本方法はより代表的な標準材料を提供することによりサンプル分析の確度と感度を増すことができる。ターゲット断片化に対する感度を増すように構成した本発明のオフセットｂＤＮＡアッセイによると、核酸が分解している場合にその状態を測定することができる。本方法は未知数の正常及び／又は異常細胞に由来する試験材料のｍＲＮＡコピー数の推定値を改善することができる。これらの技術は例えば正常及び／又は異数性細胞、ホルマリン固定細胞、パラフィン包埋細胞、老化臨床サンプル等に由来する試験材料の核酸分析を最適化するように併用することができる。
【００１３】
本発明の方法は核酸測定の感度と確度を増加するために本発明の技術の併用実施を含む。例えば、（例えば、試験サンプルｒＤＮＡ値をｒＤＮＡ対細胞数の標準関数と比較することにより）試験サンプル中の細胞数を測定し、ＲＮＡアッセイの標準関数（例えば、分解ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ標準アッセイ入力に対するアッセイ出力−例えばオフセットｂＤＮＡアッセイにより測定したサンプル又は標準の分解）を作成し、ＲＮＡアッセイ標準関数を使用して試験サンプル中の試験ｍＲＮＡの量を測定し、細胞数と試験ｍＲＮＡの測定値に基づいて試験細胞中のｍＲＮＡコピー数を決定することにより、ｍＲＮＡコピー数を正確に推定することができる。この方法は各種細胞及び組織型（例えばヒト、植物、又は動物に由来する例えば腫瘍細胞、細胞株、顕微鏡スライドからの細胞、１年を上回る臨床サンプル、新鮮な組織、新たに固定した細胞、新たに固定したパラフィン包埋細胞、ホルマリンで固定した細胞、パラフィン包埋細胞、正常及び／又は異数性細胞等）でｍＲＮＡコピー数を有効に測定することができる。
【００１４】
本発明の方法の１態様では、疎水性媒体のマトリックスに包埋したホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）臨床サンプル等のサンプルから核酸を放出させるための迅速で簡単で定量的で確実な方法が提供される。一般的な側面では、疎水性成分と会合した細胞から核酸を採取する方法は、サンプルを懸濁する段階と、サンプルをインキュベートする段階と、サンプル及び疎水性成分から核酸を分離する段階を含むことができる。融点が４０℃を上回る疎水性成分と会合した細胞又は組織サンプルを水溶液に懸濁することができる。細胞の２本鎖ＤＮＡに対して実質的に非変性条件下で４０℃を上回る温度で懸濁液をインキュベートし、疎水性成分を溶解させ、核酸を細胞から水溶液中に放出させる。最後に、インキュベーション後に疎水性成分から水溶液を物理的に分離し、細胞から放出された核酸を採取することができる。
【００１５】
この核酸放出又は可溶化方法は多くの細胞及び／又は組織サンプルで良好に機能することができる。例えば、本方法はＤＮＡ、分解核酸、ＲＮＡ等の分析で有用な水性試験材料を調製するために使用することができる。本方法はホルマリン固定パラフィン包埋組織又は細胞等のロウを含有する臨床サンプルの核酸分析用試験サンプルを提供するために特に有用である。
【００１６】
細胞又は組織の水溶液懸濁は適当な方法により実施することができる。例えば、顕微鏡スライド上の組織サンプルをエッペンドルフチューブ内にこそげ落とし、ボルテックスする。厚いサンプルや頑固なサンプルは例えば粉砕、細断、加圧、ダウンス型ホモジナイザーによる処理、微粉砕等により小粒子に分解することができる。水溶液は細胞及び組織を破砕し易くし、核酸の可溶化を助長し、及び／又は所期分析のために溶液を条件付けするための成分を含有することができる。例えば、水溶液（溶質を含有する水）はＰＥＧ、ＳＤＳ、ＳＳＣバッファー、ＮａＨＰＯ４、ＥＤＴＡ、変性サケ精子ＤＮＡ、２価カチオン、ホルムアミド、ＳＳＰＥバッファー、ブロッキングプローブ、キャプチャーエキステンダー、ラベルエキステンダー、プレ増幅剤、ラベルプローブ、増幅用プローブ、増幅用マルチマー、プロテアーゼ、リパーゼ、界面活性剤、又はヌクレアーゼインヒビター、及び／又は同等成分を含有することができる。好ましい態様では、水溶液は場合により１０μｌ／ｍｌ、５０μｌ／ｍｌ、１００μｌ／ｍｌ、１５０μｌ／ｍｌ、２５０μｌ／ｍｌ、５００μｌ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ以上のプロテアーゼ（例えばプロテイナーゼＫ）を含有する。
【００１７】
本方法のインキュベーションは所期分析に適した量及び濃度の所望核酸をサンプルから放出させるのに適した時間と温度で実施する。本発明の関連方法を使用すると、有意義な結果が得られるように分析を標準化及び正規化することができるので、多くの場合にはサンプルから全核酸を完全に放出させる必要がない。典型的な態様では、インキュベーションは約３５℃〜約９０℃、約４５℃〜約９５℃、約５２℃〜約９０℃、約６０℃〜８０℃未満、又は約６５℃の温度で実施される。インキュベーション温度は主要サンプル疎水性成分の融点よりも少なくとも２〜３度高く、且つ懸濁液の条件下でサンプルＤＮＡのＴｍよりも低いことが好ましい。インキュベーションは特に高温又はデリケートもしくは繊細なサンプルでは迅速にすることができる。インキュベーション時間は＞２０分間、又は約３０分間〜約３日間以上、約１時間〜１日間、約３時間〜約１８時間、又は１２時間とすることができる。好ましい態様では、インキュベーションは午後に開始し、一晩続け、午前に分析することができる。本発明の方法は処理変数を補正できるため、多数のサンプル処理段階で多少の精度低下を許容できる。
【００１８】
多くの態様では、水溶液及びインキュベーション条件は核酸変性条件（例えば、サンプルＤＮＡの大部分を２本鎖形態から１本鎖形態に溶解させる条件）を含まない。変性条件としては当分野で周知の通り、溶液温度増加、高ｐＨ、及び高イオン強度が挙げられる。
【００１９】
疎水性成分を水溶液又は懸濁液から分離するには、例えば単純な機械的（例えば単なる物理的）手段により実施することができる。化学的抽出（例えば有機相抽出）を使用してパラフィンをＦＦＰＥサンプルから分離するのが常法であったが、本発明者らは水溶液中の核酸回収が少なくとも同等でありながら、労力と危険を減らして試験サンプルを調製する疎水性成分の物理的分離（例えば、有機溶媒を使用しない機械的操作）を見いだした。疎水性成分は本発明の水溶液及びインキュベーション条件に暴露すると、（例えば疎水性相互作用により）自然分離する傾向がある。一般に、疎水性成分は水溶液と同一密度ではないので、例えば懸濁液の上又は下に疎水性層を形成することができる。これは遠心により加速又は低下させることができる。このような層は（例えば疎水性層を頂部から物理的にデカントするか、水層又は疎水性層を他方から吸引するか、層を相互にピペットで分離するか、固体又は半固体として水層から物理的に除去できるように疎水性成分を融点よりも低い温度で固化させることにより）各種物理的手段により水層から分離することができる。好ましい態様では、サンプルから疎水性成分バルクを分離するのに、インキュベーション段階前及び／又はインキュベーション段階後に有機抽出段階を使用しない。
【００２０】
本方法により細胞又は組織から放出された核酸は任意数の核酸分析法の入力用として優れた試験サンプル材料となり得る。多くの場合には、水溶液中に放出された核酸は当分野で公知の各種アッセイにより検出するために固体支持体上に捕獲することができる。可溶化方法は一般に本明細書に記載する相補的方法と併用し、正確な定量を行うために有用であり得る。本方法で可溶化した核酸を更に精製するために、細胞溶解液成分による破砕に感受性のアッセイでは、当分野で公知の通り、分離した溶液をフェール抽出し、エタノール沈殿させることができる。好ましい態様では、有機抽出及び／又は変性段階を使用せずに（物理的疎水性成分分離により）分離した溶液を例えばｂＤＮＡアッセイにより分析する。放出された核酸溶液（一般に溶解液）は例えばｂＤＮＡ分析、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、アガロースゲル電気泳動、ディファレンシャルディスプレイ法等の各種アッセイに良好なアッセイ入力材料を提供することができる。
【００２１】
本発明の別の側面では、細胞又は組織のゲノム中で殆ど欠失又は複製されない反復ＤＮＡの量に基づいて溶解液中の相当試験細胞数を推定することができる。試験細胞数の測定方法は例えば、既知数の参照細胞から参照核酸サンプルを取得する段階と、参照サンプル中のリボソームＤＮＡの量を定量する段階と、参照リボソームＤＮＡ量に対する参照細胞数の標準関数（例えば回帰分析により得られる標準曲線又は標準式）を提供する段階と、試験細胞から試験核酸サンプルを取得する段階と、試験サンプル中のリボソームＤＮＡの量を定量する段階と、標準関数と試験リボソームＤＮＡ量に基づいて試験細胞数を測定する段階を含むことができる。
【００２２】
本発明の方法により細胞数を測定するための試験細胞及び標準細胞は１種以上の任意型とすることができる。数測定を必要とする参照細胞又は試験細胞は例えば腫瘍細胞、細胞株からの細胞、顕微鏡スライドからの細胞、ＦＦＰＥ細胞、正常細胞、ポリプロイド細胞等とすることができる。所定態様では、試験細胞は肺腫瘍細胞又は結腸腫瘍細胞であった。他の態様では、参照核酸サンプルを提供する試験細胞は実質的に正常な核型をもつ。
【００２３】
試験細胞数測定方法で正規化に好ましい反復ＤＮＡはリボソームＤＮＡである。これらのＤＮＡは高度に反復しており、転位、欠失又は挿入を生じにくい位置で複数の染色体に配置されている。従って、高度異数性細胞株でも一貫して正常数であることが判明した。より好ましい態様では、リボソームＤＮＡは１８Ｓ  ｒＤＮＡ、５．８Ｓ  ｒＤＮＡ及び／又は２８Ｓ  ｒＤＮＡである。
【００２４】
反復ＤＮＡは標準関数の決定のために例えば適切な任意技術（例えばｂＤＮＡ分析、サザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応、アガロースゲル電気泳動等）により（例えば希釈系列で）定量することができる。結果を使用して試験サンプル結果と比較し、試験サンプル中の相当細胞数を決定する。例えば、試験細胞数の測定は試験細胞サンプルのリボソームＤＮＡ量を標準関数に入力することにより実施することができ、例えば細胞対ｒＤＮＡ比を含む式、分析ソフトウェアを搭載したコンピューター、又は標準曲線上の標準値との比較に試験リボソームＤＮＡ量を入力することができる。測定試験細胞数を使用し、他の分析の結果を細胞数に正規化することができ、例えばｍＲＮＡアッセイ結果を細胞当たりのコピーに正規化することができる。
【００２５】
試験サンプル中の細胞数が分かっている場合には、既知細胞数と反復ＤＮＡに基づいて決定した標準関数を使用して可溶化効率を測定することもできる。例えば、可溶化溶解液中の既知試験細胞数を標準曲線から計算した試験細胞溶解液中の相当試験細胞数と比較することにより試験核酸抽出効率を測定することができる。
【００２６】
本発明の別の側面では、分解ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ標準曲線を使用して分解したＲＮＡをより正確に定量することができる。例えば、試験サンプル中の細胞数を測定し、分解ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ標準アッセイ入力に対するＲＮＡアッセイ出力の標準関数を作成し、標準関数を使用してＲＮＡアッセイにより試験サンプル中の試験ＲＮＡの量を測定し、細胞数と試験ＲＮＡの測定量に基づいて細胞中のＲＮＡのコピー数を決定することにより、ｍＲＮＡコピー数を測定することができる。好ましい態様では、オフセットｂＤＮＡアッセイ（以下に記載）の結果に従って適当な分解ＩＶＴ  ＲＮＡ標準を選択するか又は標準曲線の傾きを補正することができる。
【００２７】
本発明の別の側面では、キャプチャーエキステンダーとラベルエキステンダーがターゲット核酸で相互にオフセットしているアッセイによりｂＤＮＡターゲット核酸の断片化レベルを測定することができる。例えば、（全長であるか又はある程度まで断片化しているかが分かっていないターゲット配列をもつ）ターゲット核酸の断片化は、１個以上のオフセットキャプチャーエキステンダープローブＣ３配列が各々核酸の配列に相補的であり、１個以上のオフセットラベルエキステンダーＬ１配列が全Ｃ３相補配列から５’又は３’側に少なくとも１ヌクレオチド塩基の間隔をあけて配置された位置の核酸の配列に相補的であるオフセットｂＤＮＡアッセイで核酸のサンプルを分析することにより検出することができる。このようなｂＤＮＡアッセイ構成では、核酸がＣ３及びＬ１相補配列間で断片化していない場合よりも核酸がＣ３及びＬ1相補配列間で断片化している場合のほうが発生可能なシグナルは弱くなる。例えば、核酸の有意部分が断片化形態である場合には発生可能なシグナルは弱くなる。
【００２８】
多くの場合には、オフセットアッセイはキャプチャーエキステンダーとラベルエキステンダーを散在させた標準ｂＤＮＡアッセイを使用してサンプルで適当なコントロールアッセイを実施することにより確度と信頼性を増すことができる。例えば、２個以上のコントロールキャプチャーエキステンダープローブＣ３配列が核酸の異なる位置の配列と相補的であり、１個以上のコントロールラベルエキステンダーＬ１配列が核酸配列の異なる位置の配列と相補的であり、コントロールＬ１配列の１個以上がコントロールＣ３配列の２個以上に相補的な位置間の位置の核酸と相補的である第２のｂＤＮＡアッセイで核酸のサンプルを分析することができる。オフセットアッセイ結果に対するコントロールアッセイ結果の比は核酸が断片化していない場合よりも核酸が断片化している場合のほうが大きくなる。
【００２９】
オフセットアッセイはラベルエキステンダーがターゲット核酸のキャプチャーエキステンダーからオフセットされている度合が大きいほど感度を高くすることができる。好ましい態様では、オフセットＣ３配列に相補的な核酸配列は核酸ヌクレオチドの７５％以上の間隔をあけてオフセットＬ１配列に相補的な核酸配列から分離されている（即ち、全長ターゲット核酸に対して最近接ＬＥ及びＣＥ部位間の間隔はターゲット核酸長の少なくとも７５％となる）。ＣＥ／ＬＥスペーシングを言い換えると、オフセットラベルエキステンダーＬ１配列は全Ｃ３相補配列から５’及び／又は３’側に少なくとも２５ヌクレオチド塩基の間隔をあけて配置された核酸の配列に相補的であることが好ましい。好ましい態様では、２個のＣ３相補配列間にＬ１相補配列は存在しない。
【００３０】
オフセットｂＤＮＡアッセイ法の別の側面では、例えば、アッセイバックグラウンドシグナルを低減するために、ＬＥ及びＣＥ相補配列間のスペースでターゲットの配列に相補的な配列をもつブロッキングプローブがハイブリダイゼーション中に加えられる。
【００３１】
オフセットｂＤＮＡアッセイの出力とコントロールに対する比はサンプルの状態を特徴付けることができる。例えば、オフセットアッセイシグナル、又はコントロールに対する比をターゲット核酸配列の平均長と相関させることができる。こうして得られた断片化レベルは例えばアッセイ標準を選択するため又は分解ＩＶＴ  ＲＮＡ標準に対するＲＮＡ定量用標準関数を選択するために使用することができる。
定義
【００３２】
本欄及び以下に特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。
【００３３】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定方法又は分析法に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの記載を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「成分」と言う場合には２個以上の成分の組合せを含むことができ、「核酸」と言う場合には核酸混合物を含むことができ、他の用語についても同様である。
【００３４】
本明細書に記載する方法及び材料の多数の類似、改変又は等価方法及び材料を使用し、過度の実験を要することなしに本明細書に基づいて本発明を実施できるが、本明細書には多数の好ましい材料と方法を記載する。本発明の記載及び特許請求の範囲において、以下の用語は以下の定義に従って使用する。
【００３５】
本明細書で使用する「約」なる用語は所与量の値が記載値の±１０％、又は場合により記載値の±５％、又は所定態様では記載値の±１％の範囲内であることを意味する。
【００３６】
「ポリヌクレオチド」なる用語（及び「核酸」なる同義語）はヌクレオチド鎖に対応させることができるモノマー単位の任意物理的連鎖を意味し、例えばヌクレオチドポリマー（例えば典型的ＤＮＡ又はＲＮＡポリマー）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、修飾オリゴヌクレオチド（例えば生物ＲＮＡ又はＤＮＡには一般的でないヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチド）等が挙げられる。ポリヌクレオチドのヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のポリマーとすることができ、天然でも非天然でもよく、置換されていなくても、修飾されていなくても、置換されていても、修飾されていてもよい。ヌクレオチドはホスホジエステル結合、又はホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ボラノホスフェート結合等により結合することができる。ポリヌクレオチドは更にラベル、クエンチャー、ブロッキング基等の非ヌクレオチドエレメントを含むことができる。ポリヌクレオチドは例えば１本鎖でも２本鎖でもよい。
【００３７】
「ポリヌクレオチド配列」又は「ヌクレオチド配列」とは状況に応じてヌクレオチドポリマー（オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸等）又はヌクレオチドポリマーを表す文字列である。任意特定ポリヌクレオチド配列から所与核酸又は相補的ポリヌクレオチド配列（例えば相補的核酸）を決定することができる。
【００３８】
２個のポリヌクレオチドは例えば該当アッセイ条件下で会合して安定な２本鎖を形成するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている。
【００３９】
「相補的」なる用語は例えば該当アッセイ条件下でその「相補体」と安定な２本鎖を形成するポリヌクレオチドを意味する。一般に、相互に相補的な２個のポリヌクレオチド配列はミスマッチ（ミスマッチ塩基対）が塩基の約２０％未満、塩基の約１０％未満、好ましくは塩基の約５％未満、１カ所であり、より好ましくはミスマッチがない。
【００４０】
「キャプチャーエキステンダー」ないし「ＣＥ」とは該当核酸及びキャプチャープローブとハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドである（又はこのようなヌクレオチドを含む）。キャプチャーエキステンダーは一般にキャプチャープローブに相補的な第１のポリヌクレオチド配列Ｃ−１と、該当核酸のポリヌクレオチド（ターゲット）配列に相補的な第２のポリヌクレオチド配列Ｃ−３をもつ。配列Ｃ−１及びＣ−３は一般に相互に非相補的である。キャプチャーエキステンダーは１本鎖であることが好ましい。
【００４１】
「キャプチャープローブ」ないし「ＣＰ」とは少なくとも１個のキャプチャーエキステンダーとハイブリダイズすることが可能であり、固体支持体、空間的に指定可能な固体支持体、スライド、粒子、マイクロスフェア、ビーズ等と（例えば共有又は非共有的、直接又はリンカー（例えばストレプトアビジン等）を介して）緊密に結合されるポリヌクレオチドである。キャプチャープローブは一般に少なくとも１個のキャプチャーエキステンダーのポリヌクレオチド配列Ｃ−１に相補的な少なくとも１個のポリヌクレオチド配列Ｃ−２を含む。キャプチャープローブは１本鎖であることが好ましい。
【００４２】
「ラベルエキステンダー」ないし「ＬＥ」とは該当核酸及びラベルプローブシステムとハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドである。ラベルエキステンダーは一般に該当核酸のポリヌクレオチド配列に相補的な第１のポリヌクレオチド配列Ｌ−１と、ラベルプローブシステムのポリヌクレオチド配列に相補的な第２のポリヌクレオチド配列Ｌ−２をもつ（例えば、Ｌ−２は増幅用マルチマー、プレ増幅剤、ラベルプローブ等のポリヌクレオチド配列に相補的であり得る）。ラベルエキステンダーは１本鎖であることが好ましい。
【００４３】
「ラベル」は（例えば、検出可能なシグナルを提供することにより）分子の検出を助長する部分である。本発明で一般的なラベルとしては蛍光、発光、光散乱、及び／又は比色ラベルが挙げられる。適切なラベルとしては酵素及び蛍光部分に加え、放射性核種、基質、補因子、阻害剤、化学発光部分、磁性部分等が挙げられる。このようなラベルの使用を教示している特許としては米国特許第３，８１７，８３７号；３，８５０，７５２号；３，９３９，３５０号；３，９９６，３４５号；４，２７７，４３７号；４，２７５，１４９号；及び４，３６６，２４１号が挙げられる。多数のラベルが市販されており、本発明で使用することができる。
【００４４】
「ラベルプローブ」ないし「ＬＰ」とは検出可能なシグナルを直接又は間接的に提供するラベルを含む（か又は、場合によりこのようなラベルと結合するように構成された）１本鎖ポリヌクレオチドである。ラベルプローブは一般に増幅用マルチマーの反復ポリヌクレオチド配列Ｍ−２に相補的なポリヌクレオチド配列を含むが、ｂＤＮＡアッセイで増幅用マルチマーを使用しない場合には、ラベルプローブは例えばラベルエキステンダーと直接ハイブリダイズすることができる。
【００４５】
「ラベルプローブシステム」は１個以上のラベルを含む１個以上のポリヌクレオチドと、各々ラベルエキステンダーとハイブリダイズすることが可能な１個以上のポリヌクレオチド配列Ｍ−１を含む。ラベルは直接又は間接的にシグナルを提供する。ポリヌクレオチド配列Ｍ−１は一般にラベルエキステンダーの配列Ｌ−２に相補的である。１個以上のポリヌクレオチド配列Ｍ−１は場合により同一配列又は異なる配列である。ラベルプローブシステムは複数のラベルプローブ（例えば複数の同一ラベルプローブ）と増幅用マルチマーを含むことができ、場合により更にプレ増幅剤等を含むか、又は場合により例えばラベルプローブのみを含む。
【００４６】
本明細書で使用する「水溶液」とは該当核酸を溶液に保持するのに適した水溶液（１種以上の溶質を含有する水）を意味する。例えば、水溶液は核酸を溶液に溶解及び保持するのに適したｐＨとイオン強度をもつことができる。本発明の水溶液は場合により細胞及び組織から核酸を放出するのに有用な成分（例えば、ｐＨ緩衝剤、塩類、界面活性剤及び／又はプロテアーゼ）を含有することができる。水溶液は場合により核酸アッセイ又はハイブリダイゼーションの成分として有用な成分（例えば、ホルムアミド、塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）バッファー、核酸プローブ等）を含有する。
【００４７】
細胞又は組織サンプルと会合した「疎水性成分」とは実質的に非水溶性（例えば純水溶解度１％未満）の化合物である。サンプルと会合した典型的な疎水性成分は脂質、脂肪、油類、炭化水素、ロウ、疎水性膜成分等である。本発明の所定態様では、疎水性成分はパラフィン、例えば臨床サンプル包埋用ロウである。
【００４８】
本明細書で使用する「物理的に分離する」とは疎水性成分層を物理的手段により水溶液層から分離することを意味する。サンプルの水性懸濁液からの疎水性成分の有機抽出は例えばＦＦＰＥサンプルからの疎水性成分の化学的分離とみなし、有機抽出相が残りの水相から除去される時点でも物理的分離とはみなさない。物理的分離は一般に例えば捕捉、圧出、吸込み、吸引、注出、吐出、濾過、吸着、吸収、吸出、及び／又は同等手段により（固体、半固体又は液体状態の）疎水性成分を水溶液から除去するための機械的方法である。分離は疎水性成分を水溶液から除去すること又は水溶液を疎水性成分から除去することを含むことができる。
【００４９】
本明細書で使用する「標準関数」とは例えば既知アッセイ入力と得られる出力等の２個のアッセイパラメーター間の関係を表す関数又は関数の表現法である。出力は未加工データ出力又は出力から誘導される値（例えば分析物の分子数又は濃度）とすることができる。標準関数とその表現法（例えば標準曲線）は当分野で周知である。標準関数は代数関数（例えば直線式）の形態でもよいし、Ｘ−Ｙ図表上の（例えば回帰分析により得られる）標準曲線の形態で提供することもできる。標準関数は比、定数、又は（例えばコンピューターソフトウェア形態の）アルゴリズムとして表すこともできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
本発明は細胞及び組織から核酸を採取及び定量する方法に関する。例えばホルマリン固定とパラフィン包埋により予め処理した細胞を非変性条件下で高温の均質化用水溶液に懸濁し、パラフィン材料から分離した溶解液中に細胞から核酸を放出させる。リボソームＤＮＡ参照に基づく正規化により、元の細胞数と核酸抽出効率を正確に測定することができる。適当に分解したｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ標準材料で正規化した分析を使用して細胞当たりのｍＲＮＡコピー数をより正確に測定することができる。例えば、以下に記載するように、キャプチャー部位とラベル部位をＲＮＡターゲットに沿って分散させたコントロールアッセイからのｂＤＮＡシグナルを、ターゲットＲＮＡの他端のラベル部位から分離したターゲットＲＮＡの一端にキャプチャー部位を配置する試験アッセイのシグナルと比較することにより、サンプルＲＮＡ分解を推定することができる。
【００５１】
包埋臨床サンプルにおける従来技術の核酸測定方法はサンプルから核酸を可溶化する前に有機化学抽出（脱ロウ）を繰返すことが必要であった。本発明はこのような抽出段階を全く不要にする。例えば、ブロックからの６０〜１００ミクロン（２５〜２５０ｍｍ２）プール組織切片又は未切断組織１０ｍｇ当たりプロテイナーゼＫ（０．３ｍｇ／ｍｌ）補充Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ  Ｆｒｅｍｏｎｔ  ＣＡ）３００μＬを加えることにより、パラフィンブロック中のこそげ落とした組織切片又は塊を直接可溶化し、６５℃で一晩消化させればよい。その後、６５℃で一晩プロテイナーゼＫ消化中にパラフィンが組織ホモジネートから分離し、多量の場合には、水性ホモジネートの上に明白な層を形成する。液体パラフィンをピペッターで物理的に除去するか、又は遠心中に室温で固化させて穴を開け、可溶化材料（溶解液）を例えば吸引により疎水性成分の下から除去すればよい。水性溶解液を新しいマイクロ遠心管に移し、すぐに使用するか又は後期使用に備えて−８０℃で保存する。本発明はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルからのＲＮＡ又はＤＮＡの定量の確度を有意に改善し、定量を簡単にする。
【００５２】
ＦＦＰＥサンプルの細胞等の細胞による示差的遺伝子発現試験における主要な問題は遺伝子不均一性を如何に正規化するかという点である。遺伝子転写産物数（ｍＲＮＡコピー）は一般に細胞当たりのコピー数として表される。残念ながら、細胞カウントは多くのＦＦＰＥ組織又は細胞スライドには実際的ではない。多くの場合、コピー数計算はサンプルから回収された全ＤＮＡ又は全ＲＮＡに基づいて正規化されている。しかし、全細胞ＤＮＡ及びＲＮＡ含量は例えば腫瘍異数性と共に増減し得る（Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｂ  ｄｅ  Ｋｏｋ，Ｒｉａｎ  Ｗ  Ｒｏｅｌｏｆｓ，Ｂｅｌｉｎｄａ  Ａ  Ｇｉｅｓｅｎｄｏｒｆ，Ｊｅｒｏｅｎ  Ｌ  Ｐｅｎｎｉｎｇｓ，Ｅｒｗｉｎ  Ｔ  Ｗａａｓ，Ｔｏｎ  Ｆｅｕｔｈ，Ｄｏｒｉｎｅ  Ｗ  Ｓｗｉｎｋｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｎ  Ｓｐａｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２００５）８５，１５４−１５９）。従って、ＦＦＰＥサンプル中の相当細胞数を正確に定量する方法は不明であった。本発明者らは腫瘍異数性に左右されないことが確認された１又は複数の遺伝子に基づいて正規化する方法が有望であることを見いだした。検出感度を増すためにゲノム内の複数コピーとして遺伝子を表すことが好ましい。更に、任意１個の染色体上の遺伝子の一部の増減が総細胞数測定にあまり影響を与えないように、遺伝子は安定しており、複数の染色体に分布していることが好ましい。
【００５３】
ヒトゲノムの約３０％は反復配列から構成され（Ｂｒｉｔｔｅｎ，Ｒ．Ｊ．＆  Ｋｏｈｎｅ，Ｄ．Ｅ．（１９６８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６１，５２９−５４０）、その半数以上がゲノム当たり１０５回以上反復している。これらの反復配列には長いタンデムアレー状のものと、構造遺伝子を含む低頻度配列間に散在しているものがある。多数のヒト散在性反復ＤＮＡ配列ファミリーが同定されている。最大のファミリーは各々約３００ヌクレオチド長の関連配列３×１０５コピーから構成され、殆どのメンバーは制限エンドヌクレアーゼＡｌｕＩにより開裂可能な部位をもつ（Ｒｕｂｉｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｈｏｕｃｋ，Ｃ．Ｍ．，Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ，Ｐ．Ｌ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｔ．＆  Ｓｃｈｍｉｄ，Ｃ．Ｗ．１９８０  Ｎａｔｕｒｅ  ２８４，３７２−３７４）。他の短い低頻度散在性反復配列（ＳＩＮＥＳ）もＤｅｉｎｉｎｇｅｒら（Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ，Ｐ．Ｌ．，Ｊｏｌｌｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｒｕｂｉｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｔ．＆  Ｓｃｈｍｉｄ，Ｃ．Ｗ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５１，１７−３３）及びＭｉｅｓｆｅｌｄら（Ｍｉｅｓｆｅｌｄ，Ｒ．，Ｋｒｙｓｔａｌ，Ｍ．＆  Ａｒｎｈｅｉｍ，Ｎ．（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９，５９３１−５９４７）により報告されている。Ａｄａｍｓら（Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｗ．，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒ，Ｐ．Ｊ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｍ．＆  Ｎｉｅｎｈｕｉｓ，Ａ．Ｗ．（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８，６１１３−６１２７）はゲノム当たり４×１０３回程度の頻度の平均６，４００ヌクレオチド長の長い散在性反復ＤＮＡ配列（ＬＩＮＥＳ）ファミリーを報告している。これらの反復ＤＮＡ配列は多数の生物のゲノムで組換え率を変化又は増加させることが知られており（Ｊｅｌｉｎｅｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄ  １９８２；Ｈａｒｄｍａｎ  １９８６；Ｖｏｇｔ  １９９０）、従って、散在性反復ＤＮＡはゲノム中に分散した反復単位から構成される。このような反復単位間の誤対合は欠失や重複の多くの原因となることが示されている（Ｓｍｉｔａ  Ｍ．Ｐｕｒａｎｄａｒｅ，ａｎｄ  Ｐｒａｇｎａ  Ｉ．Ｐａｔｅｌ，１９９７  ７：７７３−７８６  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．）ため、ＦＦＰＥ組織サンプル中の細胞数を測定するために使用するのは実際的でないことが多い。
【００５４】
５．８Ｓ、１８Ｓ及び２８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子（ｒＤＮＡ）はヒト二倍体ゲノム当たり〜８００コピー存在しており、５本の末端動原体型染色体１３、１４、１５、２１、２２のＰ１２ショートアームにクラスター形成しており、４６染色体の二倍体ゲノム当たり１０クラスターとなり、合計６．４×１０９ｂｐであるが、これらの遺伝子を使用するほうが実際的である（Ｗｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｇ．，Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｊ．，Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｗｉｌｌａｒｄ，Ｆ．Ｈ．，Ｂｏｄｒｕｇ，Ｓ．，Ｄｕｂｅ，Ｉ．，Ｄｕｆｆ，Ｃ．，Ｋｅａｎ，Ｖ．，Ｒａｙ，Ｎ．Ｐ．ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｃｋｅｌ，Ｒ．Ｄ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，６４−６８）。各リボソーム遺伝子は、リボソームの１８Ｓ、５．８Ｓ及び２８Ｓ  ｒＤＮＡサブユニットに高度に保存された遺伝子を含む１３．３ｋｂ転写領域と、３０ｋｂ非転写スペーサー（ＮＴＳ）の２つの領域に分けることができる４３ｋｂ反復単位の一部である（Ｇｏｎｚｅｌｅｚ，Ｌ．Ｉ．，Ｗｕ，Ｓ．，Ｌｉ，Ｗ．，Ｋｕｏ，Ａ．Ｂ．ａｎｄ  Ｓｖｌｖｅｓｔｅｒ，Ｅ．Ｊ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，５８４６−５８４７）。反復単位クラスターは〜８０個の反復単位の頭−尾アレーから構成される（Ｓａｋａｉ，Ｋ．，Ｏｈｔａ，Ｔ．，Ｍｉｎｏｓｈｉｍａ，Ｓ．，Ｋｕｄｏｈ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｄｅ  Ｊｏｎｇ，Ｊ．Ｐ．ａｎｄ  Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｎ．（１９９５））。
【００５５】
ＮＣＢＩは調査者らがその分子細胞遺伝学的データを共有及び比較できるような公共プラットフォームを提供するためにＳＫＹ／Ｍ−ＦＩＳＨ及びＣＧＨデータベースを開設した。ＳＫＹ／比較ゲノムハイブリダイゼーションデータベースウェブサイトでは数百種の腫瘍の核型を確認することができる。このデータベースはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅによるＣａｎｃｅｒ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔの一環である（Ｋｉｒｓｃｈ，Ｉ．Ｒ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｅ．Ｄ．，Ｙｏｎｅｓｃｕ，Ｒ．，Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ，Ｒ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｎ．，Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｄ．，Ｌｅｖｅｒｓｈａ，Ｍ．Ａ．，Ｄｕｎｈａｍ，Ｉ．，Ｂｒａｄｅｎ，Ｖ．Ｖ．，Ｈｉｌｇｅｎｆｅｌｄ，Ｅ．，Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｇ．，Ｌａｓｈ，Ａ．Ｅ．，Ｓｈｅｎ，Ｇ．Ｌ．，Ｍａｒｔｅｌｌｉ，Ｍ．，Ｋｕｅｈｌ，Ｗ．Ｍ．，Ｋｌａｕｓｎｅｒ，Ｒ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｒｉｅｄ，Ｔ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２４：３３９−３４０，２０００）。更に、細胞株核型の代表的な画像を含む５９種の細胞株の全核型をインターネットで確認することができる（Ａｎｎａ  Ｖ．Ｒｏｓｃｈｋｅ，Ｇｉｏｖａｎｎｉ  Ｔｏｎｏｎ，Ｋｒｉｓｔｅｎ  Ｓ．Ｇｅｈｌｈａｕｓ，Ｎｉｃｏｌａｓ  ＭｃＴｙｒｅ，Ｋｉｍｂｅｒｌｙ  Ｊ．Ｂｕｓｓｅｙ，Ｓａｍｉｒ  Ｌａｂａｂｉｄｉ，Ｄｏｍｉｎｉｃ  Ａ．Ｓｃｕｄｉｅｒｏ，Ｊｏｈｎ  Ｎ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，２  ａｎｄ  Ｉｌａｎ  Ｒ．Ｋｉｒｓｈ  ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ６３，８６３４−８６４７，２００３）。
【００５６】
個々の腫瘍核型（肺癌、結腸癌、乳癌等）と５９種の細胞株核型をそのリボソームＤＮＡ含量について検討した後、本発明者らはリボソームＤＮＡ遺伝子含量が一次腫瘍ではほんの僅かしか変動しないが、その一因はリボソーム遺伝子が５本の末端動原体型染色体のＰ１２ショートアームでクラスター形成しており、従って、１本のショートアームの増減は正常組織リボソーム遺伝子含量と１０％しか相違しないためであると判断した。各細胞株及び腫瘍の倍数性及び全ＤＮＡは変動するが、リボソームＤＮＡ数は変動が少ないので、リボソームＤＮＡによる正規化を使用すると、より正確な細胞数予想値が得られることに気付いた。
【００５７】
本発明の別の側面では、同様に分解したＲＮＡ標準に従う正規化により、例えば予め顕微鏡スライドに包埋した細胞のｍＲＮＡコピー数を高確度で測定することができる。包埋細胞に由来する核酸の均質化後に分離した溶液中の相当細胞数は反復ＤＮＡ（例えばリボソームＤＮＡ）の量に対する細胞数の標準関数（例えば標準曲線）に基づいて決定することができる。ｍＲＮＡの量は例えばＲＮＡアッセイ（例えばｂＤＮＡ）出力に対する分解ＩＶＴ  ＲＮＡの標準曲線に基づいて核酸溶液で測定することができる。このようなコピー数測定の確度は、本明細書に記載するように、反復ＤＮＡデータからの抽出効率と分解ＲＮＡ曲線によるｍＲＮＡ正規化を考慮することにより改善することができる。
【００５８】
本発明の多くの方法では、ｂＤＮＡ法が好ましい核酸定量法である。ｂＤＮＡ法はＲＮＡの定量におけるＱＰＣＲの問題の多くを回避するという利点がある。実際に、ｂＤＮＡアッセイのハイブリダイゼーション段階はＲＮＡのホルマリン修飾により助長することができる。更に、このアッセイは酵素活性を必要とせず、ハイブリダイゼーションに依存するので、ＱＰＣＲで逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの活性を低下させる不純物がこの分岐連鎖アッセイでは問題とならない。ＲＮＡ分解及び断片化の問題を解決するために、ユニークなプローブデザインアプローチがｂＤＮＡアッセイ用に開発されている（Ｗｅｎ  Ｙａｎｇ，Ｂｏｔｏｕｌ  Ｍａｑｓｏｄｉ，Ｙｕｎｑｉｎｇ  Ｍａ，Ｓｏｎ  Ｂｕｉ，Ｋｉｍｂｅｒｌｙ  Ｌ．Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｇａｒｙ  Ｋ．ＭｃＭａｓｔｅｒ，Ｆｒａｎｋ  Ｗｉｔｎｅｙ，ａｎｄ  Ｙｕｌｉｎｇ  Ｌｕｏ，Ｄｉｒｅｃｔ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ  ｏｆ  ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ，ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．４（２００６），ｐｐ４８１−４８６；Ｗａｒｒｉｏｒ  Ｕ，Ｆａｎ  Ｙ，Ｄａｖｉｄ  ＣＡ，Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＪＡ，ＭｃＫｅｅｇａｎ  ＥＭ，Ｋｏｆｒｏｎ  ＪＬ，Ｂｕｒｎｓ  ＤＪ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ２０００，５：３４３−３５２；Ｂｕｓｈｎｅｌｌ  Ｓ，Ｂｕｄｄｅ  Ｊ，Ｃａｔｉｎｏ  Ｔ，Ｃｏｌｅ  Ｊ，Ｄｅｒｔｉ  Ａ，Ｋｅｌｓｏ  Ｒ，Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＭＬ，Ｍｏｌｉｎｏ  Ｇ，Ｓｈｅｒｉｄａｎ  Ｐ，Ｍｏｎａｈａｎ  Ｊ，Ｕｒｄｅａ  Ｍ：ＰｒｏｂｅＤｅｓｉｇｎｅｒ：ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｒｏｂｅｓｅｔｓ  ｆｏｒ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １９９９，１５：３４８−３５５）。本発明の多くの方法は問題のあるサンプルに関するｂＤＮＡ分析、及び他の定量的核酸アッセイを改善する手段を提供する。
ＦＦＰＥ組織サンプルからの核酸採取
【００５９】
細胞及び組織に由来する核酸について高感度の定量的で確実なアッセイ結果を得るためには、物理化学的干渉物質を実質的に含まない有用な量の核酸を回収することが重要である。この問題は疎水性防腐剤やロウ状支持マトリックスと会合したパラフィン包埋臨床サンプル等のサンプルで特に難題となり得る。本発明では、例えばサンプルを小寸法の粒子に分解し、プロテアーゼを含有する適当な溶解用溶液に粒子を懸濁し、疎水性成分の融点よりも高い温度で懸濁液をインキュベートして核酸を水相中に放出させると共に別個の疎水性成分相を生成し、水相を疎水性相から分離することにより、疎水性サンプル成分から細胞及び組織内容物を確実に定量的に分離できることが判明した。
細胞又は組織サンプルの小粒子の獲得
【００６０】
細胞又は組織サンプルが小粒子又は表面積対体積比の大きいシート状でない場合には、核酸を比較的定量的で適時に水溶液中に抽出できるようにサンプルを小片に分解することが一般に有益である。サンプルからの核酸回収量を増加するために当分野で公知の適当な任意方法を使用して、乾燥細胞バルク、包埋組織、ホルマリン固定パラフィン包埋細胞又は組織、顕微鏡スライドに保存された臨床サンプル等のサンプルを微粉末又はペーストに分解することができる。
【００６１】
例えば、本発明の方法により細胞及び組織から核酸を放出するのに十分に適した粒度までサンプルを細断、粉砕、微粉砕、スクラッピング、ダウンス型ホモジナイザーによる処理、均質化、剪断、及び／又は同等方法で処理することができる。例えば、平均粒径１ｍｍ未満、０．１ｍｍ未満、１０μｍ未満、１μｍ未満、又はそれ以下の粒子にサンプルを分解することができる。好ましい態様では、細胞の体積の約１００倍、細胞の体積の１０倍、又はほぼ細胞の寸法の粒子までサンプルを分解する。
【００６２】
サンプルは液体マトリックスの存在下又は不在下で適当な寸法まで物理的及び／又は化学的に分解することができる。液体マトリックスは後期操作及び／又は分析段階に導入するのに適した成分を含有する水溶液とすることができる。例えば、液体マトリックスは酵素反応又はストリンジェント核酸ハイブリダイゼーションに適した環境を提供することができる。
粒子の水溶液懸濁
【００６３】
溶解液を形成する溶液にサンプル細胞から核酸を放出する処理のためにサンプル粒子を水溶液に加える。水溶液は核酸を溶解するための水程度の単純なものとすることができる。一般に、水溶液は核酸の溶解度を増し、核酸の放出を妨げる細胞／組織構造を崩壊させ、及び／又は核酸の分析に適した環境を提供する成分を含有する。
【００６４】
水溶液は後期分析操作及び／又は保存条件に有用な成分を含有することができる。例えば、水溶液は核酸ハイブリダイゼーションバッファーの成分（例えばＰＥＧ、ＳＤＳ、ＳＳＣバッファー、ＮａＨＰＯ４、ＥＤＴＡ、変性サケ精子ＤＮＡ、ホルムアミド、及びＳＳＰＥ等）を含有することができる。水溶液は例えばブロッキングプローブ、キャプチャーエキステンダー、ラベルエキステンダー、プレ増幅剤、ラベルプローブ、増幅用プローブ、増幅用マルチマー等のｂＤＮＡ成分を含有することができる。多数のホルマリン処理又はパラフィン包埋サンプルから核酸を放出するための好ましい態様では、水溶液はプロテアーゼ、リパーゼ、界面活性剤、又はヌクレアーゼインヒビターの１種以上を含有することができる。
【００６５】
サンプルを小粒子に分解しながらサンプル粒子を均質化用水溶液に懸濁することができる。例えば、サンプルを所望水溶液の存在下で粉砕、微粉砕又はダウンス型ホモジナイザーで処理することができる。あるいは、サンプルを例えば乾燥粉砕し、粒子サイジング後に水溶液に移してもよい。あるいは、粒子を例えば遠心するか又は粒子サイジングに使用した液体マトリックスから濾過し、（例えば遠心又は濾過後に透析、透析濾過、再懸濁等により）核酸を懸濁及び放出するための所望水溶液に交換してもよい。
【００６６】
サンプル粒子を水溶液に懸濁し、核酸を放出する条件に粒子を暴露することができる。懸濁は例えば撹拌、ダウンス型ホモジナイザーによる処理、ボルテックス、転倒、混合、振盪、又は単に粒子を溶液に導入することにより実施することができる。混合物は粒子懸濁液として出発することが多いが、サンプル材料の大半又は全部が一般に懸濁及びインキュベーション処理の終了までに溶液又は疎水性相となる。
【００６７】
好ましい態様では、水溶液は核酸の溶媒であり、所期核酸アッセイに適したアッセイ溶液である。例えば、水溶液は核酸と固体支持体（例えばブロッティング膜）の結合又は核酸と１個以上の核酸ターゲットもしくはプローブのストリンジェントハイブリダイゼーションに適したｐＨ、イオン強度、粘度、界面活性剤、ブロッキング剤等の条件を提供することができる。
【００６８】
多くの場合には、１種以上のプロテアーゼを均質化用水溶液に加えることが望ましい。多くの場合に有意量の所望核酸が細胞及び組織の蛋白質及び蛋白質マトリックスに取り込まれる。プロテアーゼはこれらの蛋白質を破砕するのに役立ち、核酸を放出するのに役立つ。好ましい態様では、プロテアーゼは例えば＞５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、又はそれ以上の濃度のプロテイナーゼＫである。
懸濁液のインキュベーション
【００６９】
サンプルの水溶液懸濁液は１種以上のサンプル疎水性成分の融点以上でインキュベートすることができる。インキュベーションにより疎水性成分が溶解してサンプル材料から放出され、細胞及び／又は組織構造を崩壊し、該当核酸を含有する水性溶解液を形成することができる。
【００７０】
サンプルの疎水性成分としては細胞又は組織サンプルに天然に存在するか又は存在しない脂質、脂肪及び／又は油類が上げられる。臨床サンプルに由来する核酸の分析で一般に最大の問題となる疎水性成分はサンプルの防腐、操作、及び／又は保存を助長するためにサンプルに添加された防腐剤と包埋用組成物である。本発明の方法で使用されるサンプルに関して一般に問題となる疎水性成分はパラフィン包埋用ロウ等の細胞及び組織包埋用媒体である。
【００７１】
懸濁液のインキュベーションはサンプルのゲノムＤＮＡに対して非変性条件下で実施することが好ましい。温度、イオン強度、ｐＨ、２価カチオン濃度、ホルムアミド濃度等の当分野で周知の条件はサンプル中の主要ＤＮＡを変性（溶解）させる条件よりも有意に低い条件とすることができる（Ｒａｐｌｅｙ，Ｒ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）参照）。例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＴｍは下式：
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．７２（％ｆ）−５００／ｎ
［式中、Ｍは１価カチオン（通常はＮａ＋）のモル濃度であり、（％Ｇ＋Ｃ）はグアノシン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）ヌクレオチドの百分率であり、（％ｆ）はホルムアミドの百分率であり、ｎはハイブリッドのヌクレオチド塩基数（即ち長さ）である］を使用して推定することができる。ＴｍはカチオンがＤＮＡ２本鎖形成に及ぼす安定化作用により溶媒のイオン濃度が増加すると共に上昇する。成分１本鎖よりも２本鎖ＤＮＡに多くのカチオンが結合する。カチオンによりＴｍに種々の作用がある。最も一般的な１価カチオンはＮａ＋であるが、Ｔｍの観点から、ナトリウムとカリウムは機能的に等価である。２価カチオン（例えばＭｇ＋＋）もＤＮＡハイブリッドを安定化する（Ｔｍを上昇させる）が、その作用は１価カチオンと定量的に著しく相違する。ｐＨが上昇すると、ＤＮＡ鎖間の電荷反発力も増すので、Ｔｍは低下する。好ましい態様では、可溶化中のインキュベーション温度は懸濁液中のサンプルのＤＮＡのＴｍよりも少なくとも２℃、５℃、又は１０℃低い。
【００７２】
懸濁液はサンプル中に存在する１種以上の疎水性成分の融点よりも高い温度でインキュベートすることができる。例えば、懸濁液は約４０℃〜約１００℃、約４１℃〜約９５℃、約４５℃〜約９０℃、約５０℃〜約８０℃、約６０℃〜約７０℃、又は約６５℃の温度でインキュベートすることができる。好ましいインキュベーション温度はサンプル中の最高融点の疎水性成分又は最も多量に存在する疎水性成分の融点よりも少なくとも高い。好ましいインキュベーション温度は更に溶液中のプロテアーゼ等の酵素の所望活性を補助する温度である。パラフィン包埋臨床サンプルでは、融点は鎖長と精製度に応じて例えば約４３℃〜７１℃、より一般には５２℃〜６４℃とすることができる。大半の包埋臨床サンプルは温度６５℃の水溶液から容易に溶解分離するパラフィンを含むことが判明した。
【００７３】
サンプル懸濁液は所望分析を実施するために十分な量の核酸を放出するのに十分な時間インキュベートすることができる。時間は例えば組織中の結合繊維の量、インキュベーション温度、プロテアーゼの活性、パラフィン存在量、界面活性剤の存在量と種類、物理的因子（例えば撹拌）の存在、所望核酸の感受性（及び分解性ヌクレアーゼ酵素及び／又はその阻害剤の有無）、ｐＨ、イオン強度等により変えることができる。懸濁液インキュベーション時間は例えば約３０分未満〜５日間、３時間〜３日間、約６時間〜約２日間、約９時間〜約１日間、又は約１２時間（例えば一晩）とすることができる。本発明の方法によると、一晩インキュベーションで約９０％の高収率の核酸放出を達成できることが判明した。
疎水性成分から水溶液の物理的分離
【００７４】
本発明の方法では、疎水性成分は水溶液によりはねかえされるので、本発明の溶液及びインキュベーション条件の作用下で自己分離する傾向がある。更に、疎水性成分は一般に水溶液と異なる（例えば低い）密度をもつので、例えば本発明の方法によりサンプルから放出されると、水溶液上に浮上する傾向がある。疎水性成分は残りの懸濁液から分離されると、水溶液中に残存するサンプル成分から物理的に分離することができる。
【００７５】
場合により、疎水性成分は単にインキュベーション容器の頂部から吸引することにより、インキュベーション後に放出された核酸を含有する溶解液水溶液から分離することができる。あるいは、インキュベートした懸濁液を疎水性成分の融点よりも低い温度まで冷却し、固体として機械的に除去するか、又は溶解液を効率的にデカントもしくはその下部から吸引することができる。
【００７６】
インキュベートした懸濁液を密度の異なる別々の層に遠心分離すると有用なことが多い。例えば、インキュベートした懸濁液を１０００×ｇ〜約２０，０００×ｇで１分間〜約１時間遠心し、懸濁液を例えば下部細胞／組織破片層と、中間溶解液層と、上部疎水性成分層に分離することができる。このような遠心は微小脂質球のコロイド又は懸濁液の形態であり得る疎水性成分をより離散的でより定量的に分離するという利点がある。遠心によると、例えば化学抽出法に頼らずに日常的な液体操作法により容易に除去可能な清澄化溶解液層等の不連続層が得られる。
【００７７】
核酸を含む可溶化細胞／組織成分を含有する水溶液の溶解液は当分野で公知の他の方法により疎水性成分及び細胞破片から分離することもできる。例えば、インキュベートした懸濁液を適当な材料と細孔寸法の膜で濾過することができる。破片及び／又は固化した疎水性成分をフィルター膜に保持することができ、清澄化溶解液は膜を通過する。湿潤疎水性膜は疎水性反発力により疎水性成分を保持しながら、溶解液を通過させることができる。疎水性膜は疎水性成分を吸着保持しながら、溶解液を通過させることができる。
【００７８】
所定態様では、懸濁液のインキュベーション中にサンプルから分離された疎水性成分をキシレン又はフェノール抽出等の有機抽出（化学的分離）で除去することができる。好ましい態様では、疎水性成分の分離に有機抽出段階は不要である。例えば溶解液をｂＤＮＡアッセイで使用する場合にはこのケースが多い。
【００７９】
本発明の方法によりサンプルから得られた溶解液は任意数の核酸アッセイ法による分析に適合可能な試験材料となる。多くの場合には、水溶液成分と分離法の賢明な選択の結果として、ｂＤＮＡ分析、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応、分光分析法、蛍光分析法、核酸シーケンシング、アガロースゲル電気泳動等のアッセイに直接入力可能なサンプルが得られる。他の場合には、例えばバッファー交換法又はバッファー、基質等の添加により溶解液を必要に応じて特定アッセイに対応するように調整することができる。ＦＦＰＥ溶解液の場合には、例えば本発明の下記方法を使用してサンプル抽出効率及び／又は分析物分解の正規化によりアッセイ結果の確度を増すことができる。
マルチコピーＤＮＡ標準に基づく核酸定量
【００８０】
臨床サンプル、特に組織サンプル又は包埋サンプルから細胞溶解液を調製する場合には、その内容物を溶解液中に放出した細胞数がはっきりしない場合がある。全ＤＮＡ存在量に従って溶解液回収量を正規化することは知られているが、この測定は例えば各種細胞間のＤＮＡ含量の不一致により誤差を生じる可能性がある。本発明者らは、各種染色体間に分散し、好ましくは末端動原体型染色体のショートアームに位置する所定の反復遺伝子を使用すると、細胞株や腫瘍細胞等の所定の異数性細胞でも一貫した正確な細胞数推定値が得られることを見いだした。
【００８１】
溶解液中の相当細胞数はセントロメアの近傍の部位の２個以上の異なる染色体（例えば末端動原体型染色体のショートアーム）に存在する反復遺伝子（好ましくはリボソーム遺伝子）に対して正規化することにより、一般により良好に推定することができる。例えばその検出感度を増すために、反復遺伝子が多数コピー存在するならば有益であると思われる。本発明では、例えば一般的な異数性細胞の溶解液中の相当細胞数を正規化するための優れた参照遺伝子としてリボソーム遺伝子、特に１８Ｓ、２８Ｓ及び５．８ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を同定した。
【００８２】
細胞数をカウントするためにｒＤＮＡを使用する方法は任意細胞成分に関する任意数の定量アッセイと併用することができる。例えば、アッセイした分析物量とｒＤＮＡ分析により誘導された細胞数に基づいて任意分析物（例えば核酸、蛋白質、又は小分子）の分子コピー数を計算することができる。
ｒＤＮＡに対する細胞数の標準関数の提供
【００８３】
溶解液中の相当試験細胞数を決定するためには、例えば細胞数に対するリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の標準関数を誘導し、ｒＤＮＡ存在量に基づいて未知溶解液中の相当細胞数を補間するためのデータを取得すればよい。標準関数は例えばアッセイ入力とアッセイ出力等のある量と別の量の関係、又は細胞の溶解液中の細胞数とＲＮＡ量の一定比例関係を表す式とすることができる。典型的な標準関数としては例えば、チャート上に関連値のＸ−Ｙ座標をプロットする標準曲線、標準アッセイ結果の回帰分析により設定された式、又は関連パラメーター間の一定比もしくは割合があげられる。標準関数の表現法は当分野で公知の通り、紙チャート上の「ベストフィット」線；細胞数とそのｒＤＮＡの比例を表す比又は線傾き；回帰分析法により決定された式；適当なプログラムを使用してコンピューターにより得られた結果等とすることができる。
【００８４】
例えば、試験溶解液中の相当細胞数は既知数の細胞に由来する参照溶解液を取得し；参照溶解液中のリボソームＲＮＡをコードする遺伝子の量を定量し；サンプル中のｒＤＮＡ量に対する細胞数の比を決定し；試験細胞の溶解液中のｒＤＮＡ量を定量し；比に基づいて試験溶解液中の相当試験細胞数を計算することにより決定することができる。
【００８５】
参照サンプル中の細胞数は例えば当分野で公知の方法を使用してカウントすることにより測定することができる。例えば、懸濁増殖させた参照細胞を血球計算盤、コールターカウンター、セルソーター、赤血球沈層容積による推定等でカウントすることができる。参照組織中の細胞は顕微鏡によりカウントするか、組織容積から推定するか、又は機械的、化学的及び／又は酵素法による放出後に懸濁細胞をカウントすることができる。参照細胞は正常細胞、一次培養細胞、細胞株、組織から放出された細胞、生物体液に由来する細胞、及び／又は同等細胞とすることができる。参照細胞は試験細胞と同一型でも異なる型でもよい。細胞は均質に同一でもよいし、異なる細胞型の混合物でもよい。
【００８６】
標準曲線により計数される試験細胞は任意該当型とすることができる。試験細胞は参照細胞と同一型であるか、又は少なくとも参照細胞と同一動物種に由来することができる。好ましい態様では、試験細胞が参照細胞と同一細胞型でなくてもよいという特定利点が得られる。例えば、所定態様では、参照細胞は正常細胞又は各種細胞の混合物とすることができ、試験細胞は異数性細胞、「不死化」細胞株に由来する細胞、癌細胞、腫瘍細胞等である。
核酸及び試験細胞数の定量
【００８７】
細胞数を測定するためのｒＤＮＡ定量は有用な出力を提供するために十分な感度と確度の任意方法により実施することができる。しかし、参照ｒＤＮＡと試験ｒＤＮＡの両者の測定誤差は最終細胞数結果の誤差につながるので、核酸定量法は高精度で高確度であることが好ましい。一般に、試験サンプルと参照サンプルの両者のｒＤＮＡ測定はアッセイ間変動を避けるために同一方法を使用すべきであるが、方法は同一でなくてもよい。
【００８８】
本発明の方法におけるｒＤＮＡ定量は例えばＱＰＣＲ、ｂＤＮＡ分析、ノーザンブロット分析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等により実施することができる。ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルに由来する溶解液の測定では、サンプル分解と不純物に反応しにくいｂＤＮＡ法を使用することが好ましい。
抽出効率計算
【００８９】
（試験溶解液ｒＤＮＡを標準関数による細胞数対ｒＤＮＡに対比することにより）上記未知試験細胞数を測定することに加え、同一標準曲線により試験細胞の溶解について抽出効率を測定することができる。
【００９０】
（例えば上記カウント方法により）試験細胞数が不明の場合には、これらの細胞の溶解について抽出効率を測定すればよい。例えば、試験溶解液のｒＤＮＡ量を測定し、上記のように作成した標準曲線から相当細胞数を読取ることができる。試験溶解液中の相当細胞数を溶解液の調製に使用した既知細胞数で割り、１００を掛けた値として抽出効率百分率を計算することができる。このような情報は例えば溶解法の最適化又は分析結果を正規化するために有用であると思われる。
【００９１】
細胞溶解液を分析物の有無についてアッセイし、細胞当たりの分析物存在量が重要であるとするならば、分析物量を実際の細胞数に正規化することにより計算の確度を改善するために抽出効率を使用することができる。例えば、多くの場合には、細胞中の所定遺伝子の発現レベルを知ることが有用である。既知数の細胞を溶解させ、遺伝子から転写したｍＲＮＡを例えばＲＴ−ＰＣＲ又はｂＤＮＡ法により定量することができる。溶解液のｒＤＮＡ値を細胞数対ｒＤＮＡの標準曲線に対比すると、溶解液中の相当細胞数を見いだすことができる。抽出効率は既知細胞数に対する相当細胞の比として表すことができる。細胞当たりのｍＲＮＡ量は溶解液中の全ｍＲＮＡを既知細胞数で割り、抽出効率を掛けた値として計算することができる。
ｍＲＮＡコピー数を測定するための分解ＩＶＴ  ＲＮＡ曲線の使用
【００９２】
分解サンプルの核酸アッセイは誤った結果を生じることが多い。特に、老化サンプル又は苛酷な処理に暴露したサンプルに由来する核酸の分析の結果として、シグナルが低下し、誤って低い出力値や偽陰性アッセイ出力を生じることが多い。この問題を解決するために、本発明者らは分解ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡを使用して作成した標準曲線がこのような分解サンプルで実施されるＲＮＡアッセイの確度を改善できると判断した。
分解ＲＮＡの標準関数
【００９３】
既知量の分解ＩＶＴ  ＲＮＡの入力と定量的ＲＮＡアッセイの出力の関係を表すために標準関数を設定することができる。次に、一般に分解形であることが分かっているか又は予想される未知ＲＮＡをＲＮＡアッセイにより分析し、出力値を得ることができる。この未知ＲＮＡのアッセイ出力を標準関数に入力すると、例えば、全長未分解ＩＶＴ  ＲＮＡ標準を使用して作成した標準曲線の回帰分析により得られる標準関数よりも正確なＲＮＡ量値が得られる。未知ＲＮＡサンプルが既知数の細胞に由来する場合には、ＲＮＡ量を細胞数で割ると、細胞当たりのＲＮＡコピー数をより正確に測定することができる。
【００９４】
標準関数は分解ＲＮＡ量とＲＮＡアッセイの出力の関係を表すことができる。ＲＮＡアッセイは例えばｂＤＮＡ分析、ノーザンブロット分析、ＲＴ−ポリメラーゼ連鎖反応、アガロースゲル電気泳動等の当分野で公知の任意のものとすることができる。標準関数の確度は当分野で公知の通り、例えば標準濃度数を増して標準データを取得する、反復数を増して各標準を試験する、確度を増して標準量を測定する、ベストフィット回帰分析を使用する等の方法により増すことができる。
標準及び試験サンプル
【００９５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡは大量の高純度材料が得られるので多くのＲＮＡ分析に好ましい標準である。分解ＩＶＴ  ＲＮＡは適当な処理により全長未分解ＩＶＴ  ＲＮＡから得ることができる。好ましい態様では、ＩＶＴ  ＲＮＡは被分析ＲＮＡと同一方法で（例えば老化、光、薬品、酵素、熱、及び／又は同等手段により）分解される。多くの場合には、ＲＮＡの断片化がアッセイに最大の効果をもつ分解型である。これは試験ＲＮＡとのハイブリダイゼーション反応に基づく多くのＲＮＡ分析に特に該当する。本発明の好ましい態様では、ＩＶＴ  ＲＮＡ標準材料を高ｐＨ暴露により分解し、試験ＲＮＡサンプルの既知又は予想断片化と同等の断片化を生じる。
【００９６】
各種既知分解度をもつＲＮＡのアッセイ出力とサンプル入力の関係を表す定量的ＲＮＡアッセイについて標準関数を設定することができると考えられる。試験サンプル中のＲＮＡ量が分かっている場合には、標準関数に対する試験サンプルのアッセイにより、試験ＲＮＡサンプルの分解度を示す結果が得られる。
【００９７】
分解ＲＮＡ等のＲＮＡの量は定量的アッセイと分解ＲＮＡ標準を使用して設定した標準関数に基づいて測定することができる。試験サンプルＲＮＡは任意型とすることができ、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＩＶＴ  ＲＮＡ、ホルマリン（ホルムアルデヒド、メタノール、水）処理したＲＮＡ、脱水組織に由来するＲＮＡ、老化ＲＮＡ（例えば、１年を上回る細胞又は組織サンプルに由来するＲＮＡ）、ヒト臨床サンプル、ＦＦＰＥ細胞及び組織サンプル、顕微鏡スライドからのＲＮＡサンプル、ＲＮａｓｅ酵素暴露により分解したＲＮＡサンプルに由来するＲＮＡ等が挙げられる。
アッセイ結果
【００９８】
試験ＲＮＡについて測定した量は例えば相対的又は絶対的に表すことができる。アッセイの初期出力値は一般に所定の大きさの単位であり、例えば、吸光度単位、蛍光単位、相対発光量（ＲＬＵ）、電圧、光強度、放射性粒子数等が挙げられる。アッセイ値を標準関数に入力し、関連ＲＮＡの量等のより明白な値（例えば質量、重量、濃度、モル数、ヌクレオチド塩基数、分子数等）を出力することができる。
【００９９】
分解ＩＶＴ  ＲＮＡ標準（又は予め設定された標準関数）の選択は試験サンプルＲＮＡ中の既知又は予想分解度に基づいて行うことができる。例えば、時間を変えて保存したＦＦＰＥサンプルでの実験（例えば、図１８アガロースゲル参照）に基づき、標準曲線を作成するために同等分解度の標準を選択することができる。あるいは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析、ゲル電気泳動、オフセットｂＤＮＡ分析（下記に記載）等のサイジング法により実際の試験サンプルについてサンプルＲＮＡの分解度を評価することもできる。多くの場合には、手持ちの情報に基づいて標準関数を選択することにより、分解ＲＮＡ分析の定量結果を改善することができる。
【０１００】
分解ＩＶＴ  ＲＮＡ標準曲線を使用して測定した定量的ｍＲＮＡ結果を更に計算式に入力することができる。例えば、ｍＲＮＡ源である細胞数が分かっている場合には、細胞当たりのｍＲＮＡの量又は分子数を計算することができる。例えば、上記のように細胞をカウントすることによりｍＲＮＡサンプルの相当細胞数を知ることができ、あるいは、細胞対ｒＤＮＡの適当な標準曲線を参照してｒＤＮＡアッセイに基づいて測定することができる。
散在性プローブシステムとオフセットプローブシステムの比較による核酸分解の測定
【０１０１】
核酸に分散した複数のキャプチャーエキステンダー（ＣＥ）相補ターゲット配列と、核酸に散在した複数のラベルエキステンダー（ＬＥ）相補ターゲット配列を使用する核酸のコントロールｂＤＮＡアッセイは、核酸が高度に断片化していても強いシグナルを発生することができる。他方、核酸配列の一端に配置されたＣＥターゲット配列の全部又は殆どと、核酸配列の他端に間隔をあけて配置されたＬＥターゲット配列の全部又は殆どを使用する試験ｂＤＮＡアッセイは、例えば試験核酸がＣＥターゲットとＬＥターゲットの間のスペースの１点で断片化している場合にはシグナルを発生することができない。ＬＥターゲット配列位置とＣＥターゲット配列位置に依存するこのシグナル差をアッセイで利用し、核酸の断片化度を推定することができる。
ｂＤＮＡアッセイ
【０１０２】
ｂＤＮＡアッセイは一般に例えば固体支持体と結合したキャプチャーエキステンダーによるターゲット核酸の捕獲であると言うことができ、ターゲットは強いシグナルを発生するために多数のラベルプローブと結合することが可能な分岐ＤＮＡ分子と一般に結合したラベルエキステンダーで１点以上を修飾されている。
【０１０３】
例えば、ｂＤＮＡ分析の１側面では、ターゲット核酸を捕獲し、標識分岐鎖ＤＮＡ（ｂＤＮＡ−増幅用マルチマー）を使用して固体支持体上のその存在を検出する。固体支持体上のターゲット核酸の存在を検出するには、１個以上のラベルエキステンダー（一般に２個以上のラベルエキステンダー）の第１のセットとラベルを含むラベルプローブシステムを第１のターゲット核酸にハイブリダイズさせ、固体支持体上のラベルの存在を検出することができる。ラベルプローブシステムは一般に増幅用マルチマーと複数のラベルプローブを含む。増幅用マルチマーはラベルエキステンダーと複数のラベルプローブに同時にハイブリダイズすることが可能である。ラベルプローブはラベルを含むことができるか、又はラベルと結合するように構成することができる。適切なラベルとしては限定されないが、酵素又は蛍光ラベルが挙げられる。酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）をラベルとして使用する場合には、当分野で周知の通り、化学発光法、比色法等によりその活性を検出することができる。蛍光ラベルを使用する場合には、固体支持体上のラベルの存在を検出するには一般にラベルから蛍光シグナルを検出する。
【０１０４】
ｂＤＮＡアッセイを使用して単一ターゲット核酸を捕獲及び検出する代表的な態様を図１７に模式的に示す。細胞又は組織サンプルを溶解させ、ターゲット核酸１１４を含む溶解液を調製する。合成オリゴヌクレオチドキャプチャーエキステンダーセット１１１を介して固体支持体１０１（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）上のキャプチャープローブ１０４によりターゲット核酸１１４（例えば、発現を検出しようとするｍＲＮＡ）を捕獲する。各キャプチャーエキステンダーはターゲット核酸とハイブリダイズすることができる第１のポリヌクレオチド配列Ｃ−３（１５２）と、キャプチャープローブの配列Ｃ−２（１５０）を介してキャプチャープローブとハイブリダイズすることができる第２のポリヌクレオチド配列Ｃ−１（１５１）をもつ。一般に、２個以上のキャプチャーエキステンダーを使用するが、場合により、１個のＣＥを使用してターゲットを捕獲することもできる。ラベルエキステンダーセット１２１の各ラベルエキステンダーはターゲット核酸に相補的な配列Ｌ−１（１５４）を介してターゲット核酸上の別の配列とハイブリダイズし、配列Ｌ−２（１５５）を介して増幅用マルチマー（１４１）上の配列Ｍ−１（１５７）とハイブリダイズする。ｂＤＮＡアッセイでは非特異的ターゲットプローブ結合を減らすために、キャプチャーエキステンダー又はラベルエキステンダーと結合しないターゲット核酸の配列とハイブリダイズするブロッキングプローブ（１２４）を使用することが多い。従って、所与ターゲット核酸のプローブセットはキャプチャーエキステンダーと、ラベルエキステンダーと、場合によりターゲット核酸のブロッキングプローブ１２４から構成される。キャプチャーエキステンダー、ラベルエキステンダー、及び場合によりブロッキングプローブはターゲット核酸のオーバーラップしない配列に相補的であり、必ずしもそうでなくてもよいが、一般に隣接している。この例では、単一ブロッキングプローブを使用しているが、一般に、最適化ｂＤＮＡアッセイでは別個のブロッキングプローブのアレーを使用する。
【０１０５】
シグナル増幅はラベルエキステンダーをターゲット核酸と結合することから開始することができる。次に増幅用マルチマーをラベルエキステンダーとハイブリダイズさせる。増幅用マルチマーはラベルプローブ１４２に相補的な配列Ｍ−２（１５８）の多重コピーをもつ（なお、増幅用マルチマーは必ずしもそうでなくてもよいが、一般には分岐鎖核酸であり、例えば増幅用マルチマーは分岐、フォーク形、もしくは櫛形核酸又は線状核酸とすることができる）。ラベル１４３（例えばアルカリホスファターゼ）を各ラベルプローブに共有結合させる。（あるいは、ラベルを例えばラベルプローブと非共有的に結合してもよい。）最終段階で、例えば、化学発光基質（例えばジオキセタン）のアルカリホスファターゼ分解により、標識複合体を検出する。発光はマイクロタイタープレートリーダーで相対発光量（ＲＬＵ）として報告される。蛍光発光量はサンプル中に元々存在するターゲット核酸レベルに比例する（標準関数で表すことができる関係）。
【０１０６】
上記例では、増幅用マルチマーとラベルプローブはラベルプローブシステム１４０を構成する。別の例では、ラベルプローブシステムは例えばＵＳＰＮ５，６３５，３５２及びＵＳＰＮ５，６８１，６９７に記載されているような単一ターゲットｍＲＮＡからのシグナルを更に増幅するプレ増幅剤も含む。更に別の例では、ラベルエキステンダーはラベルプローブと直接ハイブリダイズし、増幅用マルチマー又はプレ増幅剤を使用しないので、単一ターゲットｍＲＮＡ分子からのシグナルはこのｍＲＮＡとハイブリダイズする個々のラベルエキステンダーの数だけ増幅される。
【０１０７】
基本的なｂＤＮＡアッセイは詳細に記載されており、例えば細胞株におけるｍＲＮＡ転写産物を検出及び定量し、ウイルス負荷を測定するために使用されている。ｂＤＮＡアッセイは核酸分子を生理的レベルで直接定量することができる。この技術は他のＤＮＡ／ＲＮＡ増幅技術にまさるいくつかの利点があり、直線的増幅、良好な感度とダイナミックレンジ、優れた精度と確度、単純なサンプル調製手順、及びサンプル間変動の低下が挙げられる。ｂＤＮＡアッセイの更に詳細については、例えば、ＵＳＰＮ４，８６８，１０５，発明者Ｕｒｄｅａら，発明の名称「溶液相核酸サンドイッチアッセイ（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ａｓｓａｙ）」；ＵＳＰＮ５，６３５，３５２，発明者Ｕｒｄｅａら，発明の名称「バックグラウンドノイズを低下した溶液相核酸サンドイッチアッセイ（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ａｓｓａｙｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｎｏｉｓｅ）」；ＵＳＰＮ５，６８１，６９７，発明者Ｕｒｄｅａら，発明の名称「バックグラウンドノイズを低下した溶液相核酸サンドイッチアッセイとそのキット（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ａｓｓａｙｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｎｏｉｓｅ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ  ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ）」；ＵＳＰＮ５，１２４，２４６，発明者Ｕｒｄｅａら，発明の名称「核酸マルチマー及び前記マルチマーを使用する増幅核酸ハイブリダイゼーションアッセイ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ）」；ＵＳＰＮ５，６２４，８０２，発明者Ｕｒｄｅａら，発明の名称「核酸マルチマー及び前記マルチマーを使用する増幅核酸ハイブリダイゼーションアッセイ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ）」；ＵＳＰＮ５，８４９，４８１，発明者Ｕｒｄｅａら，発明の名称「大型櫛形分岐ポリヌクレオチドを使用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ｌａｒｇｅ  ｃｏｍｂ−ｔｙｐｅ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」；ＵＳＰＮ５，７１０，２６４，発明者Ｕｒｄｅａら，発明の名称「大型櫛形分岐ポリヌクレオチド（Ｌａｒｇｅ  ｃｏｍｂ−ｔｙｐｅ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」；ＵＳＰＮ５，５９４，１１８，発明者Ｕｒｄｅａ  ａｎｄ  Ｈｏｒｎ，発明の名称「増幅核酸ハイブリダイゼーションアッセイ用修飾Ｎ−４ヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎ−４  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ）」；ＵＳＰＮ５，０９３，２３２，発明者Ｕｒｄｅａ  ａｎｄ  Ｈｏｒｎ，発明の名称「核酸プローブ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉ��  ｐｒｏｂｅｓ）」；ＵＳＰＮ４，９１０，３００，発明者Ｕｒｄｅａ  ａｎｄ  Ｈｏｒｎ，発明の名称「核酸プローブの作製方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅｓ）」；ＵＳＰＮ５，３５９，１００；ＵＳＰＮ５，５７１，６７０；ＵＳＰＮ５，６１４，３６２；ＵＳＰＮ６，２３５，４６５；ＵＳＰＮ５，７１２，３８３；ＵＳＰＮ５，７４７，２４４；ＵＳＰＮ６，２３２，４６２；ＵＳＰＮ５，６８１，７０２；ＵＳＰＮ５，７８０，６１０；ＵＳＰＮ５，７８０，２２５，発明者Ｓｈｅｒｉｄａｎら，発明の名称「精製親水性アルカリホスファターゼと結合したオリゴヌクレオチドプローブ及びその使用（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｔｏ  ａ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ）；米国特許出願公開第ＵＳ２００２１７２９５０号，発明者Ｋｅｎｎｙら，発明の名称「ｉｎ  ｓｉｔｕ分岐ＤＮＡハイブリダイゼーションを使用する高感度遺伝子検出及び位置決定（Ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｂｒａｎｃｈｅｄ−ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）；Ｗａｎｇら（１９９７）“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｐｒｅＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｇｌｕｃｏｓｅ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：４３６０−４３６５；Ｃｏｌｌｉｎｓら（１９９８）“Ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ”  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｆ  Ｆｅｒｒｅ編；及びＷｉｌｂｅｒ  ａｎｄ  Ｕｒｄｅａ（１９９８）“Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＣＶ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ｂｙ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ  （ｂＤＮＡ）  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  １９：７１−７８参照。更に、基本的ｂＤＮＡアッセイを実施するための試薬（例えば、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）キット、増幅用マルチマー、アルカリホスファターゼ標識ラベルプローブ、化学発光基質、固体支持体に固相化したキャプチャープローブ等）は例えばＰａｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｄ．（ワールドワイドウェブｗｗｗ．ｐａｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）から市販されており、本発明の実施に応用することができる。所与ｍＲＮＡターゲットのプローブセットを設計するため（即ち、キャプチャーエキステンダー、ラベルエキステンダー、及び場合によりターゲットに相補的なブロッキングプローブの領域を設計するため）のソフトウェアも市販されている（例えばＰａｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．製品ＰｒｏｂｅＤｅｓｉｇｎｅｒ（登録商標））；Ｂｕｓｈｎｅｌｌら（１９９９）“ＰｒｏｂｅＤｅｓｉｇｎｅｒ：  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｒｏｂｅ  ｓｅｔｓ  ｆｏｒ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ  （ｂＤＮＡ）  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １５：３４８−５５も参照。
オフセットプローブアッセイ
【０１０８】
ｂＤＮＡアッセイの変動を使用してターゲット核酸配列中の断片化を検出することができる。ラベルエキステンダーと（キャプチャープローブを介して固体支持体に結合した）キャプチャーエキステンダーの分離したターゲット相補配列部位間の核酸配列に切れ目が存在する場合には、シグナルの消失又は低下としてターゲット核酸の断片化を検出することができる。ＣＥとＬＥの間のこのような切れ目はラベルと固体支持体の間の結合を切断し、ラベルシグナルを固体支持体の処理で消失させる可能性がある。アッセイの感度及び／又は有効検出範囲はＣＥとＬＥの両者がターゲット核酸切れ目の両側に存在するコントロールアッセイとオフセットアッセイからのシグナルを比較することにより改善することができる。得られたオフセットシグナルとコントロールシグナルの比は、特にターゲット核酸量が不明の場合に絶対値よりも明確な断片化の指標となり得る。
【０１０９】
図１８Ａ及び１８Ｂに示すような代表的アッセイでは、コントロールプローブセットはターゲット核酸が断片化しているか否かのシグナルを提供することができ、オフセットプローブシステムを使用する同一断片化ターゲットのアッセイはシグナルを発生することができない。図１８Ａに示すように、散在性ＬＥ１２１及びＣＥ１１１プローブのコントロールプローブシステムは分散性ラベルエキステンダー１２１で修飾された全長ターゲット核酸１１４を有効に捕獲することができるので、強いコントロールシグナルを発生することができる。キャプチャーエキステンダーとキャプチャープローブ１０４を介してオフセットラベルエキステンダーを固体支持体に結合することにより、オフセットプローブシステムでも全長ターゲットに強いシグナルを発生させることができる。図１８Ｂに示すように、試験サンプルのターゲット核酸配列１７７が断片化されている場合でも、コントロールプローブセットではシグナルが発生され続ける。コントロールプローブセットは切れ目の両側でターゲット配列を（ラベルエキステンダーと共に）捕獲するので、例えば固体支持体のプロセス洗浄中にシグナル発生能は失われない。他方、ターゲット核酸はオフセットシステムＬＥターゲット配列部位とＣＥターゲット配列部位の間のスペースで切断されているので、図１８Ｂのオフセットプローブセットを使用してシグナルを発生することはできない。ＬＥプローブを結合していないフラグメントは捕獲されるが、ＬＥプローブを結合したフラグメントは捕獲されない。ハイブリダイゼーション溶液が固体支持体から洗い流されると、結合したオフセットＬＥプローブに関連する全シグナルは失われる。ターゲット核酸配列の特定領域又は点の切れ目（又はその不在）を検出できるようにオフセットＬＥ及びＣＥの位置を設定できると考えられる。
【０１１０】
１態様では、ターゲット核酸の一端又はその近傍に１個のＣＥターゲット配列部位を配置し、ターゲット核酸の他端に１個以上のＬＥターゲット配列部位が配置するようにオフセットプローブを設計する。好ましい態様では、ＬＥ及びＣＥ部位は直接隣接せず、ＬＥ又はＣＥプローブに非相補的な核酸セクションにより分離される。ＣＥ相補ターゲット部位とＬＥターゲット部位の間の任意位置に切れ目があると、この断片化ターゲットに相当するシグナルはオフセットシステムにより発生されない。このような切れ目をもつサンプルではターゲット核酸の割合が高いほど、発生可能なシグナルは弱くなるので、このようなシステムを使用して定量的標準曲線を作成することができる。好ましい態様では、ＬＥ部位はターゲット核酸の両端の近傍のみに存在し、１個以上のＣＥ部位は両端間のみ、例えばシステムのＬＥ又はＣＥに非相補的な配列により分離された例えばターゲット核酸の中心の近傍に存在する。このような場合には、ＣＥ部位と一端の間に切れ目があると、シグナル発生能は例えば２分の１に減り、ＣＥ部位と各末端の間に切れ目があると、システムはシグナルを全く発生できなくなる。
【０１１１】
オフセットプローブシステムの好ましい態様では、ＬＥターゲット配列部位はこの部位とターゲット核酸上の最近接３’及び／又は５’ＣＥターゲット配列部位の間の切断に反応するように設計される。例えば、この技術の多くの場合では、ＬＥ部位と他端側の１個以上のＣＥ部位の間に切れ目がある場合にＬＥがそのシグナルポテンシャルと共に失われる（固体支持体と結合しない）ように、ＬＥ部位とターゲット核酸の一端の間にＣＥ部位が存在しないことが好ましい。ＬＥターゲット配列とＣＥターゲット配列の間にターゲット核酸の実質的部分が存在することが好ましい。例えば、好ましい態様では、試験核酸の核酸配列の１０％以上が核酸の２個の最近接ＬＥ及びＣＥ部位間に存在する。断片化を試験する核酸の＞２５％、＞５０％、＞７５％、＞９０％、又はそれ以上が最近接ＣＥ／ＬＥ部位対のメンバー間に存在することがより好ましい。オフセットプローブシステムの１個以上のオフセットラベルエキステンダーＬ１配列は全Ｃ３相補配列から５’又は３’側に少なくとも１ヌクレオチド塩基の間隔をあけて配置された核酸の配列と相補的であることが好ましく、試験核酸のＬ１及びＣ３相補配列間は５塩基以上、１０塩基以上、２５塩基以上、５０塩基以上、１００塩基以上、５００塩基以上であることがより好ましい。
【０１１２】
オフセットプローブスキームの他の態様では、ターゲット核酸上のＬＥターゲット間に所定のＣＥターゲットが散在していてもよいし、及び／又はＣＥターゲット間に所定のＬＥターゲットが散在していてもよい。例えば、ターゲット核酸が両端の近傍で捕獲され、ＬＥターゲット配列部位が例えばターゲット核酸の中心の近傍でＣＥ部位から間隔をあけて配置されているオフセットプローブシステムを設計することができる。このような場合には、シグナル発生能は核酸の切れ目が１個では失われないが、ＬＥターゲット部位の各側に切れ目があると失われる。ＣＥ／ＬＥスペーシング及び分散の付加変形構成の結果、ＣＥ及びＬＥ部位間に十分な切れ目があると、シグナル発生能は漸次又は最終的に失われると考えられる。他方、他の好ましい態様では、２個以上のＣＥターゲット部位間にＬＥターゲット部位の２５％以下が存在するか、又は２個以上のＬＥ部位間にＣＥ部位の２５％以下が存在する。より好ましい態様では、２個以上のＣＥターゲット部位間にＬＥターゲット部位の１０％以下が存在するか、又は２個以上のＬＥ部位間にＣＥ部位の１０％以下が存在する。より好ましい態様では、２個以上のＣＥターゲット部位間にＬＥターゲット部位の５％以下が存在するか、又は２個以上のＬＥ部位間にＣＥ部位の５％以下が存在する。最も好ましい態様では、ＣＥ及びＬＥターゲット配列部位はターゲット核酸配列に散在せず、即ち２個のＣＥターゲット部位間にＬＥターゲット部位は存在せず、及び／又は２個のＬＥ部位間にＣＥ部位は存在しない。
【０１１３】
オフセットプローブアッセイ結果を正規化し、アッセイ間比較を助長するためには、コントロールアッセイ結果に対する試験アッセイ結果の比として断片化アッセイ結果を提供することが有用であり得る。別の核酸、試験核酸全長、及び／又は分析する同一サンプルからの試験核酸で例えば複数の散在ＬＥ／ＣＥプローブターゲット部位を使用するコントロールアッセイを実施することができる。好ましい態様では、コントロールアッセイとオフセットアッセイの両者により同一試験サンプルを分析し、比を提供する。特定比を所定断片化度と相関させることができる。例えば、特定サンプルの比をこのサンプルの断片化レベルと相関できるように、断片化度に対する比の標準曲線を提供することができる。このような情報は例えば、サンプル中のｍＲＮＡの定量で使用するための分解ＩＶＴ  ＲＮＡ標準の選択で有用であり得る。
【０１１４】
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１１５】
ＦＦＰＥ組織スライド疎水性成分の均質化後分離と均質化前抽出の比較
均質化後分離が均質化前有機抽出と同等以上であることを実証するために、可溶化前に脱ロウを実施した場合と実施しない場合とで分岐ＤＮＡ法を使用してＦＦＰＥサンプルｍＲＮＡを比較した。＞１０年マッチヒト肺正常及び腫瘍ＦＦＰＥサンプルに由来するサンプルを１０ミクロン切片３枚としてプールした。１対のサンプル（「０」）では、可溶化後にロウを分離することによりホモジネートを調製した。第２対のサンプル（「１」）では、可溶化前に脱ロウ有機抽出段階を１回実施することによりホモジネートを調製した。第３対のサンプル（「２」）では、脱ロウ有機抽出サイクルを２回実施することによりホモジネートを調製した。Ｙａｎｇら，２００６に記載されているようにリボソーム蛋白質Ｓ３（ＲＰＳ３，ＮＭ＿００１００５ハウスキーパー又は参照コントロールＲＮＡ）と乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ，ＮＭ＿００５５６６；腫瘍サンプルでの誘導倍率２〜３倍）を使用して抽出液を試験した。分岐ＤＮＡアッセイでターゲット遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブセットをデザインするように改変プローブデザインソフトウェアが開発されている（Ｂｕｓｈｎｅｌｌら，１９９９）。ターゲット遺伝子のプローブセットはターゲットの隣接領域をカバーする３種のオリゴヌクレオチドプローブ（ＣＥ−キャプチャーエキステンダー、ＬＥ−ラベルエキステンダー、及びＢＬ−ブロッキングプローブ）から構成され、プレートウェルの表面へのターゲットＲＮＡの捕獲と、分岐ＤＮＡシグナル増幅分子とのハイブリダイゼーションを可能にする。ターゲット配列毎に、ソフトウェアアルゴリズムは残りのスペースを実質的に充填するようにＣＥ（遺伝子当たり５〜１０）、ＬＥ（遺伝子当たり１０〜２０）、又はＢＬのアニーリング鋳型として機能できる領域を識別した。分岐ＤＮＡアッセイは既に詳細に記載されているＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）の手順に従って実施した（Ｗａｎｇら，１９９７，Ｋｅｒｎら，１９９６）。要約すると、組織ホモジネート１０μＬをＬｙｓｉｓ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）４０μＬ、Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）４０μＬ、及びターゲット遺伝子特異的プローブセット（ＣＥ，１．６５ｆｍｏｌ／μＬ；ＬＥ，６．６ｆｍｏｌ／μＬ；ＢＬ，３．３ｆｍｏｌ／μＬ）１０μＬと混合した。各サンプル混合物をその後、Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）の各ウェルに分配する。
【０１１６】
図３のグラフから明らかなように、可溶化後分離で測定したｍＲＮＡ発現レベルは相抽出段階を１回又は２回実施した場合に比較して改善されていないとしても同等である。
【実施例２】
【０１１７】
ＦＦＰＥサンプルからの等価スパイク回収率
ＦＦＰＥ切片からのＲＮＡ回収が可溶化後分離と可溶化前抽出で等価であることを実証する付加実験を実施した。方法は、細菌遺伝子ジヒドロジピコリン酸レダクターゼに由来する既知量のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ（ヒト肺組織で発現されないｄａｐＢ，Ｌ３８４２４）を可溶化ＦＦＰＥサンプルに加えた以外は、乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ，ＮＭ＿００５５６６）とリボソーム蛋白質Ｓ３（ＲＰＳ３，ＮＭ＿００１００５）について上述したように実施した。データによると、収率は脱ロウ抽出段階２回と物理的ロウ分離法で同等であった。どちらの方法を使用した場合も、スパイクインｄａｐＢ  ＩＶＴ  ＲＮＡのキャプチャー効率（スパイク回収率）は９０〜１１０％であった。
【実施例３】
【０１１８】
ＦＦＰＥ組織可溶化効率とＦＦＰＥサンプル中の細胞数を測定するための反復リボソームＤＮＡの使用
反復ＤＮＡに基づいて細胞数を正確に予想できるか否かを調べた。特に、リボソームＤＮＡ遺伝子の定量に基づく標準曲線を使用して腫瘍及び他の異数性細胞の細胞数を測定した。
【０１１９】
二倍体ゲノム当たりリボソーム遺伝子クラスター平均約１０個となるように１０種の細胞株を選択した。各細胞株の細胞４０００個をＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）で溶解させ、１０個の細胞株溶解液をプールした（即ち、合計細胞株１０種ないし細胞４０，０００個で総容量１１０μｌ）。
【０１２０】
各々３０μｌを別々のマイクロ遠心管に移し、一方はリボソームＤＮＡ（１８Ｓ及び２８Ｓ  ｒＤＮＡ）を測定するためにＤＮＡを変性させ、他方はアッセイのバックグラウンドを測定するために非変性コントロールとした。次に、ＴＥバッファー２７０μｌを加えることにより各管を合計３００μｌまで希釈した。変性及びコントロールサンプル各１８０μｌを反応管に移した。変性用ＤＮＡを入れた管には２．５Ｎ  ＮａＯＨ  １８μｌを加え、コントロールアリコートにはＴＥ  １８μｌを加えた後、管を５３℃に１５分間加熱した（図６参照）。加熱段階後、２Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ９０μｌをコントロール（非変性）及び変性サンプルの両者に加えた。コントロールサンプル中のＤＮＡは２本鎖のままであったが、変性ＤＮＡサンプルは実質的に１本鎖状態であった。変性サンプル（３０μｌ、１５μｌ、７．５μｌ、３．８μｌ、１．９μｌ、０．９５μｌ又は夫々６８３、３４１、１７１、８５、４３、２１細胞等量）をＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイに加えることにより細胞数標準曲線を作成した（図７参照）。ｍＲＮＡを測定するための典型的アンチセンスプローブセットを使用する代わりに、センスプローブセットを使用してサンプル中の１８Ｓ及び２８ＳリボソームＤＮＡ量を定量する。
【０１２１】
１８Ｓ及び２８Ｓリボソームプローブは細胞株プールにほぼ同一結果を与えたので、１８Ｓリボソームプローブセットのみを使用してＦＦＰＥ腫瘍サンプル及びＦＦＰＥ細胞株コントロール中のリボソームＤＮＡ量を測定した。ＦＦＰＥ腫瘍及び細胞株コントロール切片を上記のように可溶化及び試験した。要約すると、切片をＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３００μｌで可溶化し、２μｌを１０３倍に希釈した。１０３倍に希釈したサンプル６０μｌをマイクロ遠心管に移し、２．５Ｎ  ＮａＯＨ  ６μｌを加えた後に５３℃まで１５分間加熱することにより変性させた。変性後に、２Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ３０μｌをボルテックス混合下に加えることにより溶液を中和させた。変性溶液３０μｌをＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイに加え、上記のような１８Ｓ  ｒＤＮＡ細胞数標準曲線（プールした１０種の細胞株）を使用して１８ＳリボソームＤＮＡを定量した。
【０１２２】
４種の細胞株に由来する既知数の細胞をホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。各細胞株切片２０枚（６μｍ×２０ｍｍ２＝〜１００，０００細胞／切片＝合計〜２×１０６細胞）をＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ６００μｌで可溶化し、ＤＮＡ変性させ、上記のような１８Ｓ  ｒＤＮＡプローブセットを使用して定量した。１８Ｓ  ｒＤＮＡ細胞数標準曲線を使用し、細胞株ＦＦＰＥサンプル切片各２０枚で２〜２．５×１０６の細胞数が測定された。図８参照。
【実施例４】
【０１２３】
ＦＦＰＥ腫瘍組織切片からの細胞数定量
４９個の腫瘍（肺２４個、結腸２５個）に由来する切片各１０枚（６μｍ×２４ｍｍ２；全切片＞８５％腫瘍）をＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３００μｌで可溶化し、ＤＮＡ変性させ、上記のような１８Ｓ  ｒＤＮＡプローブセットを使用して定量した。１８Ｓ  ｒＤＮＡ細胞数標準曲線を使用し、合計切片１０枚で１．２〜１．７×１０６細胞／ＦＦＰＥ腫瘍サンプルが定量された。図９参照。
【実施例５】
【０１２４】
無傷及び分解ＩＶＴ  ＲＮＡ標準曲線を使用するＲＮＡ分子の定量
ＲＮＡ分子数を計算するためには、クローン遺伝子を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ）を標準曲線として使用することができる。ＦＦＰＥ  ｍＲＮＡは一般に例えば断片化プロセスにより多少分解される。本発明者らは分解サンプルの分析アッセイ効率を測定するためには分解ＩＶＴ標準分析曲線を未分解全長ＲＮＡの曲線と比較すればよいことを見いだした。例えば、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイを使用して臨床サンプルに由来する分解ｍＲＮＡを正確に定量することができる。
【０１２５】
Ａｍｂｉｏｎの指示に従ってＩＶＴを合成した。ＦＦＰＥ  ＲＮＡのサイズと同等にするために無傷ＲＮＡの一部を１００〜３００ｂｐまで分解した。所望サイズの分解ＲＮＡを得るためには、未分解全長ＩＶＴ  ＲＮＡを０．１Ｎ  ＮａＯＨで９分間分解する。等容量の０．１Ｎ  ＮａＯＨを使用して反応を中和し、分解プロセスを停止した。図１０に示すゲルは７個の未分解全長ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（レーン２にプール）と、ゲル電気泳動用にプールした同数の７個の分解ＩＶＴ  ＲＮＡを示す。
【０１２６】
次に、ＩＶＴ濃度を測定し、溶液を４０、１０、２．５、０．６２５、０．１５６、及び０．０３９アトモル（−１８ｍｏｌ）まで系列希釈した。図１１に示すように、例えば、β−Ａｃｔｉｎ特異的プローブセット（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を使用してβ−Ａｃｔｉｎ（ＡＣＴＢ）ＩＶＴ未分解全長ＲＮＡ（１７３９ｂｐ）と対応するＩＶＴ分解ＲＮＡ（図１０ゲル参照）を定量し、標準曲線を作成した。標準曲線を相互に比較すると、１のＲ２値が決定される（Ｒ２は分散比を表す）。結果から明らかなように、分解ＡＣＴＢ  ＩＶＴ（１００〜３００ｂｐ）を使用するＡＣＴＢ特異的プローブセットの感度は全濃度で未分解ＡＣＴＢ  ＩＶＴ（１７３９ｂｐ）の〜４０％（傾き３８．６％）である。未分解全長（９８５ｂｐ〜４４０７ｂｐ）及び分解ＩＶＴの両者を使用する他の６個の遺伝子でも同様の結果が認められた（図１２参照）。
【０１２７】
（実施例３の末尾に記載した）４種の細胞株の既知数の細胞をホルマリンで固定し、パラフィン包埋し（切片２０枚、６μｍ×２０ｍｍ２＝〜１００，０００細胞／切片＝合計〜２×１０６細胞）、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ６００μｌで可溶化し、全４種の細胞株で全６個のｍＲＮＡに等容量の入力サンプルを使用して定量した。まず、ｂＤＮＡアッセイを使用して６個のｍＲＮＡの各々について各細胞株における相対発現量を測定した（図１３参照）。次に、未加工データから、両者のＩＶＴ標準曲線（未分解と分解、上記参照）を使用して６個のｍＲＮＡの各々のアトモルを計算した。最後に、１８Ｓ  ｒＤＮＡ／細胞数標準曲線を使用してアトモルを各細胞株の細胞数で割り、各ｍＲＮＡ及び細胞株の細胞当たりコピー数を決定した（図１４参照）。分解ＩＶＴ標準曲線から計算したコピー数は未分解ＩＶＴ標準曲線を使用して新鮮な全長ＩＶＴ  ＲＮＡサンプルについて計算したコピー数と密接に相関した。従って、分解ＩＶＴは均質化ＦＦＰＥサンプルに由来するｍＲＮＡを良好に表し、このようなｍＲＮＡの定量のために良好な標準材料となる。
【０１２８】
ｍＲＮＡ定量とコピー数測定の付加例では、１８Ｓ及び２８Ｓ  ｒＤＮＡについて上述したように、４９個の腫瘍（肺２５個、結腸２４個）に由来する切片各１０枚（６μｍ×２４ｍｍ２；全切片＞８５％腫瘍）をＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３００μｌで可溶化した。得られたホモジネートを使用し、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ特異的プローブセット（上記参照）を使用して６個のｍＲＮＡの量を定量した。４種の細胞株でｍＲＮＡを測定するために使用したものと同一のＩＶＴ標準曲線を使用した。図１５は全４９個の腫瘍におけるｍＲＮＡの各々の未加工相対定量データを示す。
【０１２９】
分解ＩＶＴ標準曲線から全腫瘍における各ｍＲＮＡのアトモルを計算し、細胞当たりのｍＲＮＡコピーの計算に使用する腫瘍サンプル（合計切片１０枚）の各々の細胞数で割った。このデータを図１６に示す。遺伝子の一部で発現レベル（ｍＲＮＡ）の細胞当たりコピー数は肺腫瘍（１〜２５）では高いが、結腸腫瘍（２６〜４９）ではそうではないという明白な傾向が存在することが認められた。
【実施例６】
【０１３０】
サンプルＤＮＡ分解の測定
組織ブロックについてＲＮＡのフラグメント長を評価した。この評価は例えば十分なＲＮＡ完全性をもつＦＦＰＥブロックの選択や、サンプルで使用するためのＩＶＴ  ＲＮＡアッセイ標準の選択に役立つ。ＦＦＰＥ可溶化後、該当ｍＲＮＡ（遺伝子）に２個のプローブセットを使用してサンプルを試験した。標準分散コントロールプローブセット（図１８Ａ及び１８Ｂ参照）又はオフセットＣＥ及びＬＥ部位をもつ試験プローブセットを組織均質化バッファーに加え、一晩ハイブリダイゼーションした。翌日、標準ｂＤＮＡアッセイ手順に従ってコントロール及び試験サンプルを処理した。
【０１３１】
図９から明らかなように、ＲＮＡ品質の異なるＦＦＰＥサンプルを試験した。まず、ゲル電気泳動により精製ＲＮＡの品質を評価する。３年サンプル（腫瘍及び正常ＲＮＡ）中のＲＮＡは１０年サンプルのＲＮＡよりも断片化が少なかった。次に、無傷コントロールＲＮＡと３年及び１０年ＦＦＰＥサンプルに由来するＲＮＡを分散コントロールプローブ又はオフセット断片化試験プローブでｂＤＮＡ分析した。オフセットアッセイ結果に対するコントロールのアッセイシグナルの比を測定することによりＲＮＡの品質を評価した。比はＲＮＡ分解の増加と共に増加することが判明した（コントロール比〜１；３年＝３〜４；１０年＝７〜２４）。オフセットｂＤＮＡプローブスキームは任意サンプルに由来するＲＮＡの品質を評価するための簡単なアプローチを提供する。
【０１３２】
当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に示唆され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
【０１３３】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記技術及び装置の多くは種々に組合せて使用することができる。
【０１３４】
本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】核酸可溶化「均質化」プロトコールの開始前にホルマリン固定パラフィン包埋臨床サンプルからパラフィンを除去するための有機溶媒（例えばＤｅｗａｘ）と相抽出技術を使用する従来技術の脱ロウプロトコールのブロックフローチャートである。
【図２】サンプルを予め脱ロウする必要がない１段階の非抽出非変性物理的分離段階により水性核酸ホモジネート（溶解液）からパラフィンを最終的に分離する本発明の代表的な可溶化（「均質化」）プロトコールを示す。
【図３】ｍＲＮＡ発現誘導のグラフを示す。正常細胞に対する腫瘍細胞中のＬＤＨＡ  ｍＲＮＡレベルの誘導倍率測定値は可溶化後に溶解液から疎水性成分を分離した場合と、均質化（溶解液調製）前に有機相抽出を行う旧来の技術とで実質的に同一であることが明らかである。
【図４Ａ】各種正常細胞、異数性細胞、及び腫瘍細胞で実質的に一貫した発現を維持するリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の例を示す。
【図４Ｂ】各種正常細胞、異数性細胞、及び腫瘍細胞で実質的に一貫した発現を維持するリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の例を示す。
【図４Ｃ】各種正常細胞、異数性細胞、及び腫瘍細胞で実質的に一貫した発現を維持するリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の例を示す。
【図４Ｄ】各種正常細胞、異数性細胞、及び腫瘍細胞で実質的に一貫した発現を維持するリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の例を示す。
【図４Ｅ】各種正常細胞、異数性細胞、及び腫瘍細胞で実質的に一貫した発現を維持するリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の例を示す。
【図５】ｒＤＮＡの細胞株細胞数とアッセイシグナル出力の間の直線応答を実証するｂＤＮＡアッセイ標準曲線を示す。
【図６】ｒＤＮＡに基づいて細胞数標準曲線を作成するためのプロトコールの概略フローチャートを示す。
【図７】１８Ｓ及び２８ＳリボソームＤＮＡの細胞数対ｂＤＮＡアッセイ出力の標準曲線を示す。
【図８】細胞数対１８Ｓ  ＤＮＡの標準曲線を示す。ヒストグラムから明らかなように、１８Ｓ  ＤＮＡ標準曲線により異数性細胞株でも実質的に正確に細胞数を測定できる。
【図９】ＦＦＰＥスライドからの４９個の腫瘍組織スクレーピングの１８Ｓ  ＤＮＡのｂＤＮＡアッセイにより得られた細胞数の定量を示す。
【図１０】無傷全長ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡと水酸化物で分解したＩＶＴ  ＲＮＡのゲル電気泳動を示す。
【図１１】全長又は分解ＩＶＴ転写ＲＮＡ標準のｂＤＮＡアッセイ入力ＲＮＡアトモル対アッセイシグナル出力の標準曲線を示す。無傷対分解ＲＮＡのアッセイ出力間の関係の標準式を示す。
【図１２】６個のｍＲＮＡの無傷及び分解ＩＶＴ  ＲＮＡ標準曲線を示す。
【図１３】４種のホルマリン固定パラフィン包埋細胞株における６個のｍＲＮＡの発現を示す未加工アッセイ出力データを示す。
【図１４】無傷又は分解ＩＶＴ  ＲＮＡ標準曲線に基づいて計算した６個のｍＲＮＡの細胞当たりコピー数を示す。
【図１５】４９個のヒト腫瘍で測定した６個のｍＲＮＡの未加工ｂＤＮＡアッセイ出力データを示す。
【図１６】４９個の腫瘍細胞サンプルで６個のｍＲＮＡについて分解ＩＶＴ  ＲＮＡ標準に基づいて測定した細胞当たりｍＲＮＡコピー数を示すチャートを示す。
【図１７】代表的ｂＤＮＡアッセイシステムの模式図を示す。
【図１８Ａ】ターゲット核酸断片化を検出するためのオフセットプローブ及びコントロールスキームの模式図を示す。図１８ＡのターゲットＲＮＡは断片化していないので、コントロールプローブシステム又はオフセットプローブシステムを使用して固体支持体に保持したラベルエキステンダーからシグナルを発生することができる。他方、コントロールシステムの同一断片化ターゲットＲＮＡ配列では切れ目の両側にＣＥ結合点とＬＥ相補部位が存在するので、コントロールプローブシステムを使用してｂＤＮＡアッセイのシグナルを発生することができる。
【図１８Ｂ】ターゲット核酸断片化を検出するためのオフセットプローブ及びコントロールスキームの模式図を示す。図１８ＢのターゲットＲＮＡはオフセットプローブシステムのＣＥ結合点とＬＥ相補部位の間で断片化しているので、ｂＤＮＡアッセイによりシグナルは発生されない。他方、コントロールシステムの同一断片化ターゲットＲＮＡ配列では切れ目の両側にＣＥ結合点とＬＥ相補部位が存在するので、コントロールプローブシステムを使用してｂＤＮＡアッセイのシグナルを発生することができる。
【図１９】コントロール対オフセットプローブシグナルの比をアガロースゲル上に可視化されるようなＲＮＡ分解と相関させる方法を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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