(57)【要約】【課題】  Ｘ線回折を用いて撮影した時の解像度が高い良質な結晶を得ることができるタンパク質の結晶化方法を提供すること。【解決手段】  本発明に係るタンパク質の結晶化方法は、タンパク質溶液に、タンパク質の結晶化に必要な試薬を添加してサンプル溶液を生成し、該サンプル溶液に、析出した結晶のＸ線回折の解像度が高くなる電圧を印加しながらタンパク質の結晶を析出させることを特徴とする。【選択図】    図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質溶液に、タンパク質の結晶化に必要な試薬を添加してサンプル溶液を生成し、
該サンプル溶液を所定の環境下においてサンプル溶液内のタンパク質を結晶化させるタンパク質の結晶化方法において、
該サンプル溶液に、析出した結晶のＸ線回折の解像度が高くなる電圧を印加しながらタンパク質を結晶化させる
ことを特徴とするタンパク質の結晶化方法。
【請求項２】
前記析出した結晶のＸ線回折の解像度が高くなる電圧が、１００Ｖより高い電圧である
ことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の結晶化方法。
【請求項３】
マイクロバッジ法による環境下においてタンパク質を結晶化させる
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の結晶化方法。
【請求項４】
蒸気拡散法による環境下においてタンパク質を結晶化させる
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の結晶化方法。
【請求項５】
バルクバッジ法による環境下においてタンパク質を結晶化させる
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の結晶化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質結晶を製造するためのタンパク質結晶化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学や医学の見地からタンパク質の構造や機能を知るためにタンパク質の構造解析の研究が盛んに行われている。
タンパク質の三次元構造を解析するための最も一般的な手法はＸ線構造解析法である。そして、このＸ線構造解析法によりタンパク質の三次元構造を解析するためには、タンパク質の良質な単結晶が必要になる。
そして、タンパク質の良質な単結晶を得るために従来から様々な方法が提案されている（特許文献１〜６参照）。
【０００３】
【特許文献１】特願２００５−１７６３３９
【特許文献２】特願２００５−１７６３４４
【特許文献３】特願２００５−１７６３５１
【特許文献４】特願２００５−１７６３５４
【特許文献５】特願２００５−１７６３５９
【特許文献６】特開２０００−６３１９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来は、サイズが大きい結晶が良質な結晶とされており、このため、如何にして、サイズが大きい結晶を析出させるかに研究開発の焦点が置かれていた。
発明者等は、鋭意研究の結果、たとえサイズが大きくても、Ｘ線回折を用いて撮影した時の解像度が低い結晶では十分な構造解析が行えないので、サイズが大きい結晶が必ずしも良質な結晶とはいえないことを見出した。
本発明は、Ｘ線回折を用いて撮影した時の解像度が高い良質な結晶を得ることができるタンパク質の結晶化方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記した目的を達成するために本発明に係るタンパク質の結晶化方法は、タンパク質溶液に、タンパク質の結晶化に必要な試薬を添加してサンプル溶液を生成し、該サンプル溶液に、析出した結晶のＸ線回折の解像度が高くなる電圧を印加しながらタンパク質の結晶を析出させることを特徴とする。
好ましくは、前記析出した結晶のＸ線回折の解像度が高くなる電圧は、１００Ｖより高い電圧であり得る。
タンパク質の結晶化は、様々な環境下において行うことができ、例えば、マイクロバッジ法による環境下においてタンパク質を結晶化させてもよく、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法又はサンドイッチドロップ法等の蒸気拡散法による環境下においてタンパク質を結晶化させてもよく、又は、バルクバッジ法による環境下においてタンパク質を結晶化させてもよい。
【発明の効果】
【０００６】
本発明に係るタンパク質の結晶化方法は、タンパク質溶液に、タンパク質の結晶化に必要な試薬を添加してサンプル溶液を生成し、該サンプル溶液に、析出した結晶のＸ線回折の解像度が高くなる電圧を印加しながらタンパク質の結晶を析出させるため、Ｘ線回折を用いて撮影した時の解像度が高く構造解析を行い易い結晶を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、添付図面に示した一実施例を参照して、本発明に係る結晶化方法の実施の形態を説明していく。
【０００８】
図１（ａ）及び（ｂ）は、本発明に係る結晶化方法の一例としてのマイクロバッジ法を用いて結晶化を行う結晶化装置の概略斜視図及び概略横断面図である。
図面に示すように、この結晶化装置は、
基板１上に一対の電極２ａ及び２ｂを複数列配置した電極板６と、
サンプル液滴５を保持するためのサンプル液滴と混じりあわない溶液４からなる液滴保持手段と
を有する。前記電極２ａ及び２ｂは絶縁体３で覆われている。
沈殿剤、塩及び界面活性剤等のような様々なタンパク質結晶化のための試薬とタンパク質溶液との混合物から成るサンプル液滴５は、絶縁体３の上に配置され、各サンプル液滴５が一対の電極の中間に位置するように配置される。
サンプル液滴５は、蒸発を防止するために油等のようなサンプル液滴と混じりあわない溶液４で囲まれている。このサンプル液滴と混じりあわない溶液４によってサンプル液滴５を囲むセットアップは、いわゆる、マイクロバッチ方法に対応している。
電極２ａ及び２ｂ間に電位差を与えると、サンプル液滴５が置かれている電極２ａ及び２ｂ上に電場が生じる。継続的な電場を作り出すために不図示の高圧電源が用いられる。また、図示していないが、例えば、増幅器に接続された信号発生器を用いることにより交流電場を生成することも可能である。
前記サンプル液滴５は、例えば、疎水性の表面上に親水化スポットを作ることによって位置決めすることができる。親水化スポットにより位置決めされた液滴は、しっかりと固定される。
【０００９】
図２は、上記したタンパク質結晶化装置を用いて、実際にサンプル液滴５に所定の電場を付与して、タンパク質（ソーマチン）の結晶化を観察した結果を示すグラフである。
この実験では、ソーマチンを0.1 Mリン酸緩衝液（pH 6.25）に溶解し、100 mg/mL に調製したものをタンパク溶液とし、沈殿剤として1.0 M酒石酸ナトリウム溶液を0.1 Mリン酸緩衝液（pH 6.25）に溶解したものを用い、それぞれ1.0 μL （直径1.2 mm ）を混合したサンプル液滴（2 μL ）を60個生成して、パラフィンオイルから成る不活性溶液中で前記サンプル液滴を保持したサンプルホルダーを４つ準備し、
第１のサンプルホルダーには電場を付与せず、
第２のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流500V/mm(100V)の電場を付与し、
第３のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流1000V/mm(200V)の電場を付与し、
第４のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流1350 V/mm(270V)の電場を付与し、結晶化の状態を観察した。
尚、実験に使用したタンパク質結晶化装置における電極板の電極間の間隔は０．２ｍｍであり、上記括弧内に記載した電圧は実際に印加した電圧値を示している。
図２は、最終的に各サンプルの各サンプル液滴に生成された結晶数の平均値を示したグラフである。
図２の実験結果から明らかなように、電場を全く付与しない第１のサンプルに比べて電場を付与した場合に、電場強度を上げるにつれて１つの液滴中に生成する結晶数が減少することを表している。このことより、電場を付与した場合、結晶化が促進され、析出される結晶のサイズが増加することが分かる。
電場を付与しない第１のサンプルのように各サンプル液滴中に生成される結晶の数が多いと、大きな結晶に成長しないため必要な結晶が得られないが、前記条件の電場を与えると、各サンプル液滴中に生成される結晶の数が少なくなり、その分、結晶の大きさが大きくなる。
図３は、第１〜４のサンプルから一つずつピックアップした結晶に対してＸ線回折装置（超高輝度Ｘ線発生装置 FR-E SuperBright（リガク））を用いてＸ線を照射し、検出器（高速イメージングプレートＸ線検出器 R-AＸIS VII（リガク））により検出した回折像である。その解像度を表１に示す。
【表１】
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図２の実験結果によれば、電場を全く付与しない第１のサンプルに比べて電場を付与した場合に、電場強度を上げるにつれて１つの液滴中に生成する結晶数が減少しており、この傾向は、500V/mm(100V)の電場を付与した場合にも現れている。一方、図３及び表１から、Ｘ線回折により得られる結晶の解像度は、電場を付与していない第１のサンプル及び500V/mm(100V)の電場を付与した第２のサンプルにおいては共に1.54Åであるのに対して、1000V/mm(200V)の電場を付与した第３のサンプルでは1.37Åに上がり、1350 V/mm(270V)の電場を付与した第４のサンプルでは1.35Åに向上することが確認できる。
上記した実験結果により、500V/mm(100V)の電場を付与した場合には、１つの液滴中に生成される結晶数は減少するものの、Ｘ線回折により得られる結晶の解像度は向上しないが、それ以上の電場を付与した場合には、Ｘ線回折により得られる結晶の解像度が向上することが確認できた。
【００１０】
上記した実施例では、本発明による結晶化方法をマイクロバッチ法に適用した例を挙げて説明しているが、本発明による結晶化方法を適用し得る結晶化の方法は本実施例に限定されることなく、任意の結晶化の方法、例えば、コンテナーレスバッチ法、バルクバッチ法又はマイクロオイルバッチ法等のバッチ法、並びにハンギングドロップ法、シッティングドロップ法又はサンドイッチドロップ法等の蒸気拡散法にも適用することができる。
図４は、蒸気拡散法におけるハンギングドロップ法に、本発明による結晶化方法を適用した例を示す概略図である。
図中符号１０は容器を示し、符号１１は容器１０内に収容される平衡化溶液を示し、符号１２はカバーガラスを示し、符号１３はタンパク質結晶化のための試薬とタンパク質溶液との混合物から成るサンプル液滴を示す。
前記カバーガラス１２には、サンプル液滴１３に電圧を印加するための電極２０が設けられており、この電極２０により、サンプル液滴１３に析出した結晶のＸ線回折の解像度を高くする電圧が印加される。
図５は、蒸気拡散法におけるシッティングドロップ法に、本発明による結晶化方法を適用した例を示す概略図である。
図中符号１０は容器を示し、符号１１は容器１０内に収容される平衡化溶液を示し、符号１２はカバーガラスを示し、符号１３はタンパク質結晶化のための試薬とタンパク質溶液との混合物から成るサンプル液滴を示す。
容器１０にはサンプル液滴１３を載せる台座１４が設けられている。この台座１４は中空に形成され、その内部にサンプル液滴１３に電圧を印加するための電極２０が設けられている。この電極２０により、サンプル液滴１３に析出した結晶のＸ線回折の解像度を高くする電圧が印加される。
図６は、蒸気拡散法におけるサンドイッチドロップ法に本発明による結晶化方法を適用した例を示す概略図である。
図中符号１０は容器を示し、符号１１は容器１０内に収容される平衡化溶液を示し、符号１２はカバーガラスを示し、符号１３はタンパク質結晶化のための試薬とタンパク質溶液との混合物から成るサンプル液滴を示す。
容器１０には台座１４が設けられており、サンプル液滴１３は前記台座１４とカバーガラス１２との間に挟まれるように配置される。
前記カバーガラス１２には、サンプル液滴１３に電圧を印加するための電極２０が設けられており、この電極２０により、サンプル液滴１３に析出した結晶のＸ線回折の解像度を高くする電圧が印加される。尚、図６の例では、カバーガラス１２のみに電極２０を設ける例を示しているが、例えば、カバーガラス１２と台座１４とに各々プラス電極及びマイナス電極を設けるように電極を配置してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は、本発明に係る結晶化方法の一例としてのマイクロバッジ法を用いて結晶化を行う結晶化装置の概略斜視図及び概略横断面図である。
【図２】ソーマチンを用いた各サンプルの各サンプル液滴に生成された結晶数の平均値を示したグラフである。
【図３】（ａ）〜（ｄ）は、０、５００、１０００，１３５０V/mmで電場付与した各サンプルから一つずつピックアップした結晶に対してＸ線回折装置（超高輝度Ｘ線発生装置 FR-E SuperBright（リガク））を用いてＸ線を照射し、検出器（高速イメージングプレートＸ線検出器 R-AＸIS VII（リガク））により検出した回折像である。
【図４】蒸気拡散法におけるハンギングドロップ法に、本発明による結晶化方法を適用した例を示す概略図である。
【図５】蒸気拡散法におけるシッティングドロップ法に、本発明による結晶化方法を適用した例を示す概略図である。
【図６】蒸気拡散法におけるサンドイッチドロップ法に本発明による結晶化方法を適用した例を示す概略図である。
【符号の説明】
【００１２】
１  基板
２  電極
３  絶縁体
４  サンプル液滴と混じりあわない溶液
５  サンプル液滴
６  電極板
１０  容器
１１  平衡化溶液
１２  カバーガラス
１３  サンプル液滴
１４  台座
２０  電極
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図３】
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