(57)【要約】【課題】精巣に特異的に発現するタンパク質であって、糖鎖関連酵素に会合し、該糖鎖関連酵素の活性を調節するタンパク質またはその遺伝子を含む組成物を提供することを目的とする。さらに、該タンパク質やその変異体の遺伝子工学的な生産、該タンパク質に会合する糖鎖関連酵素の同定や、該タンパク質またはそれをコードする遺伝子を含む組成物を用いた精子形成異常または受精困難による不妊症の予防、診断、または予防のための方法を提供する。【解決手段】本発明の組成物は、配列番号２に示されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有する、精巣に特異的に発現し、糖鎖関連酵素に会合するタンパク質を含む、糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有する、精巣に特異的に発現し、糖鎖関連酵素に会合するタンパク質を含む、糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物。
【請求項２】
前記タンパク質が配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記タンパク質が配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記タンパク質が、細胞外へ分泌されないタンパク質であることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記糖鎖関連酵素が糖転移酵素、糖鎖分解酵素、または糖鎖合成酵素である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記糖転移酵素が、ガラクトース転移酵素、グルコース転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素（ＧａｌＮＡｃ転移酵素）、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧｌｃＮＡｃ転移酵素）、フコース転移酵素、シアル酸転移酵素、グルクロン酸転移酵素、マンノース転移酵素、キシロース転移酵素、β−１，４−ガラクトース転移酵素、またはＣｏｒｅ１  β−１，３−ガラクトース転移酵素である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記糖鎖分解酵素が、糖鎖加水分解酵素、エステラーゼ、またはヒアルロニダーゼである、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記糖鎖合成酵素がコンドロイチン硫酸合成酵素、ヘパリン／ヘパラン硫酸合成酵素、または、ヒアルロン産合成酵素である、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
配列番号２に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有する、精巣に特異的に発現し、糖鎖関連酵素に会合するタンパク質、をコードする核酸を含む、糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物。
【請求項１０】
配列番号１に示される塩基配列を有する核酸；または
配列番号１に示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、精巣に特異的に発現し、糖鎖関連酵素に会合するタンパク質をコードする前記核酸；を含む、糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物。
【請求項１１】
精子形成および／または受精を調節するための、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
精子形成異常および／または受精困難による不妊症の治療または予防のための、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の組成物を使用して、試料中の糖鎖関連酵素を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖関連酵素に会合し、該酵素の活性を調節する、精巣に特異的に発現するタンパク質、またはそれをコードする核酸を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の受精は、精子と卵子の細胞表面に発現するまたは細胞外に分泌されるタンパク質の種類や、糖タンパク質、糖脂質などの糖鎖構造の違いによって調節されている。受精は種特異的に行われ、主に卵透明帯の糖タンパク質に発現した糖鎖を識別して精子が結合することに基づいていると考えられている。一方、受精に関連する糖タンパク質等の発現や機能を制御する、精子や卵子の細胞内の作用機序も明らかになってきた。
【０００３】
糖タンパク質の糖鎖は、タンパク質またはペプチド上のアルギニン残基に結合するＮ結合型糖鎖、およびセリン／スレオニン残基に結合するＯ結合型糖鎖に分類され、糖鎖を構成する糖残基の種類や数によって糖鎖構造は様々である。このような糖鎖構造は、細胞内の糖転移酵素、糖鎖合成酵素、または糖鎖分解酵素のような糖鎖関連酵素によって、糖タンパク質の発現過程において精密に制御されている。さらに、このような糖鎖関連酵素もまた、細胞内の各種調節因子によって機能が制御されている。
【０００４】
これまでに、糖鎖関連酵素を調節する因子としては、Ｃｏｓｍｃ［Ｊｕ，Ｔ．Ｚ．およびＣｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．，（２００５）：非特許文献１］などが知られている。
【０００５】
また、糖転移酵素では、コアタンパク質やペプチド配列のセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンを転移する活性を有するヒト糖転移酵素酵素としては１４種類が知られている。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、−Ｔ２［Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．ら（１９９５）：非特許文献２］、−Ｔ３［Ｂｅｎｎｅｔ，Ｅ．Ｐ．ら（１９９６）：非特許文献３］、−Ｔ４［Ｂｅｎｎｅｔ，Ｅ．Ｐ．ら（１９９８）：非特許文献４］、−Ｔ６［Ｂｅｎｎｅｔ，Ｅ．Ｐ．ら（１９９９）：非特許文献５］、−Ｔ７［Ｂｅｎｎｅｔ，Ｅ．Ｐ．ら（１９９９）：非特許文献６］、−Ｔ８［Ｗｈｉｔｅ，Ｋ．Ｅ．ら（２０００）：非特許文献７］、−Ｔ９［Ｔｏｂａ，Ｓ．ら（２０００）：非特許文献８］、-Ｔ１０［Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．ら（２００２）：非特許文献９］、-Ｔ１１［Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，Ｔ．ら（２００２）：非特許文献１０］、-Ｔ１２［Ｇｕｏ，Ｊ．−Ｍ．ら（２００２）：非特許文献１１］、-Ｔ１３［Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら（２００３）：非特許文献１２］、-Ｔ１４［Ｗａｎｇ，Ｈ．ら（２００３）：非特許文献１３］、および-Ｔ１５［Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．ら（２００４）：非特許文献１４］が同定され、遺伝子構造について明らかにしている。が公知となっている。
【０００６】
マウスの組織に発現する糖転移酵素および糖合成酵素としては、少なくとも１５０種類が知られている［Ｙｏｕｎｇ，Ｗ．Ｗ．ら（２００３）（１）：非特許文献１５］。また、マウス組織の中で、精巣特異的に発現する糖転移酵素としては、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３およびＴｂ［Ｙｏｕｎｇ，Ｗ．Ｗ．ら（２００３）（２）：非特許文献１６］が公知となっている。
【０００７】
糖鎖分解酵素で精巣特異的に発現するものとしては、ＰＨ−２０［Ｌｉｎ，Ｙ．，ら、（１９９３）：非特許文献１７］が知られている。
【０００８】
こうした糖鎖関連酵素の発現の有無、発現時期、発現量の変化に基づいて、細胞表面やタンパク質上の糖鎖構造や糖鎖密度が変化することに起因して、受精困難に伴う不妊症を
含む各種障害・疾患が引き起こされることが知られている［Ａｋａｍａ，Ｔ．Ｏ．ら、（２００２）：非特許文献１８、Ｈｏｎｋｅ，Ｋ．ら（２００２）：非特許文献１９］。
【０００９】
このように受精において糖鎖は極めて重要な役割を果たしており、糖鎖構造を決定する糖鎖関連酵素、さらには糖鎖関連酵素の機能を調節するタンパク質、および遺伝子改変による組換えタンパク質の利用は、受精のメカニズムの分子レベルでの解明だけでなく、受精に関する各種障害・疾患などに重要な役割を果たすと考えられる。
【非特許文献１】Ｊｕ，Ｔ．Ｚ．およびＣｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１６６１３−１６６１８（２００２）
【非特許文献２】Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２４１５６−２４１６５（１９９５）
【非特許文献３】Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｅ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１７００６−１７０１２（１９９６）
【非特許文献４】Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｅ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，３０４７２−３０４８１（１９９８）
【非特許文献５】Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｅ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７４，２５３６２−２５３７０（１９９９）
【非特許文献６】Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｅ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４６０，２２６−２３０（１９９９）
【非特許文献７】Ｗｈｉｔｅ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２４６，３４７−３５６（２０００）
【非特許文献８】Ｔｏｂａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１４９３，２６４−２６８（２０００）
【非特許文献９】Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５３１，１１５−１２１  （２００２）
【非特許文献１０】Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，２２６２３−２２６３８（２００２）
【非特許文献１１】Ｇｕｏ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５２４，２１１−２１８（２００２）
【非特許文献１２】Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，５７３−５８４（２００３）
【非特許文献１３】Ｗａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３００，７３８−７４４（２００３）
【非特許文献１４】Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５６６，１７−２４（２００４）
【非特許文献１５】Ｙｏｕｎｇ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ａｃｃｅｓｓ  （ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎ  Ｍａｒｃｈ  １９，２００３），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献１６】Ｙｏｕｎｇ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３，５４９−５５７（２００３）
【非特許文献１７】Ｌｉｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１００７１−１００７５（１９９３）
【非特許文献１８】Ａｋａｍａ，Ｔ．Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５：１２４−１２７（２００２）
【非特許文献１９】Ｈｏｎｋｅ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：４２２７−４２３２（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
糖転移酵素、糖鎖分解酵素、糖鎖合成酵素等の糖鎖関連酵素に会合し、該酵素の活性を調節する機能を有するタンパク質またはそれをコードする核酸を含む糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物を使用して、糖鎖関連酵素に基づく疾患の診断・治療を可能にすることを目的とする。
【００１１】
従って、本発明の目的は、精巣特異的に発現し、糖鎖関連酵素に会合し、該酵素の活性を調節するタンパク質、またはそれをコードする核酸を含む糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
受精を制御する糖鎖関連酵素の発現または機能を調節するタンパク質またはそれをコードする核酸は、これまで知られていない。一般に、細胞に微量しか含まれないタンパク質を単離・精製することは容易ではない。従って、現在に至るまで単離されていないタンパク質を細胞から単離することは容易でないことが予測される。そこで、本発明者らは、目的のタンパク質と比較して作用が類似していると考えられる種々の遺伝子の塩基配列間に、同一性が高いと考えられる領域を標的として、その相同配列を有すると思われるタンパク質を単離および同定した。具体的には、公知のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＫ０２５２８７）をクエリー配列として遺伝子データベース（ＮＣＢＩ、ｂｌａｓｔｎ）を検索し、相同領域を有するＥＳＴ配列を見出した。次に、このＥＳＴ配列をもとにしてプライマーを設計し、精巣のｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ法で全長のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定した（実施例１）。さらに、ＰＣＲで該タンパク質の遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列および推定アミノ酸配列を決定することによって、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は、糖鎖関連酵素の活性を調節するタンパク質およびそれをコードする核酸を含む糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物を提供することにより、当該技術分野におけるこれらの多様な必要性を満たすのを援助する。
【００１４】
即ち、本発明によれば、精巣特異的に発現するタンパク質であって、糖鎖関連酵素に会合し、該糖鎖関連酵素の活性を調節するタンパク質を含む糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物が提供される。
【００１５】
本発明の糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物に使用されるタンパク質は、典型的には、配列番号１に記載の塩基配列から推定される配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１６】
前記タンパク質には、配列番号２に記載のアミノ酸のみでなく、精巣特異的に発現するタンパク質であって、糖鎖関連酵素に会合し、該糖鎖関連酵素の活性を調節するという機能を有する限り、当該配列と少なくとも７０％の同一性を有するものも含まれ、当該配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、または当該配列において１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。
【００１７】
本発明の糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物に使用されるタンパク質は、好ましくは配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１８】
前記タンパク質には、細胞外へ分泌されないタンパク質が含まれる。ここで、「細胞外への分泌されない」とは、細胞において発現したタンパク質がその細胞外に全く分泌されないか、または細胞外に分泌されたとしてもプロテアーゼ等によって分解もしくは断片化してしまうため検出されないレベルをいう。本発明の組成物に使用されるタンパク質は、好ましくは、当該タンパク質のＮ末端の膜貫通領域を欠落させ、代わりにシグナルペプチドを連結させた形で発現させた場合においても、細胞外へ分泌されない。
【００１９】
本発明によれば、前記タンパク質をコードする核酸を含む糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物が提供される。
【００２０】
前記核酸は、典型的には、配列番号１に記載の塩基配列、前記配列中に１から複数個の塩基の置換、欠失、挿入および／または付加を有する塩基配列、あるいは前記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、および上記配列に相補的な核酸も含む。限定されるわけではないが、配列番号１に記載の塩基配列におけるヌクレオチド１−１３２９を含む核酸もまた本発明の一態様である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
【００２２】
本発明によれば、精巣に特異的に発現し、糖鎖関連酵素に会合するタンパク質またはそれをコードする核酸を含む、糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物が提供される。
【００２３】
（１）タンパク質
下記実施例において詳述する方法によりクローニングされた、本発明の糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物に使用されるタンパク質をコードする核酸は、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有する。該核酸がコードする推定アミノ酸配列を配列番号２に記載する。なお、当該核酸のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列はすでに公知となっている（Ｙｏｕｎｇ，Ｗ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３：５４９−５５７（２００３））。
【００２４】
下記実施例で得られたタンパク質（本明細書では、「Ｏ−１６」という）は、次の性質を有するタンパク質である。なお、該Ｏ−１６タンパク質の性質およびその活性の測定方法は後述の実施例等において詳述されている。
【００２５】
本発明によれば、精巣特異的に発現するタンパク質であって、糖鎖関連酵素に会合し、該糖鎖関連酵素の活性を調節するタンパク質を含む糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物が提供される。ここで、該タンパク質は、本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法等は限定されない。即ち、該タンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現されたタンパク質、または化学合成タンパク質の何れでもよい。
【００２６】
Ｏ−１６タンパク質は、典型的には、配列番号２に記載したアミノ酸残基４４３個からなるアミノ酸配列を有する。しかしながら、天然のタンパク質の中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生体型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在等に起因して、１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。なお、本明細書で使用する用語「変異タンパク質」とは、配列番号２に示されたアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、または該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、精巣特異的に発現するタンパク質であって、糖鎖関連酵素と会合し、該糖鎖関連酵素の活性を調節する機能を有するタンパク質等を意味する。ここで、「複数個」とは、好ましくは１−３００個、より好ましくは１−１００個、最も好ましくは１−５０個である。限定されるわけではないが、部位特異的な変異によってアミノ酸が置換された場合に、元々のタンパク質が有する活性は保存される程度に置換が可能なアミノ酸の個数は、一般的には、好ましくは１−１０個である。
【００２７】
Ｏ−１６タンパク質は、クローニングされた核酸の塩基配列からの推定に基づいて、配列番号２のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。同一性は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である。
【００２８】
本明細書において、アミノ酸配列のパーセント同一性は、重複部分と同一性を最大化する一方で、配列ギャップを最小化するように並列した場合のタンパク質（またはポリペプチド）のアミノ酸配列を比較することによって決定される。２つのアミノ酸配列のパーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。当業者により使用される配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌにより使用が可能なＢＬＡＳＴＰプログラム（バージョン２．２．７）が使用可能である。プログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳説されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。なお、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
【００２９】
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質はもとのタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００３０】
本発明の糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物に使用されるタンパク質は、例えば、後述する実施例に従って、本発明の核酸による配列番号１のＤＮＡ配列を大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入および発現させることにより、当該タンパク質を大量に得ることができる。
【００３１】
本発明によって、このタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列に基づいて、当該配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の核酸増幅反応等の遺伝子工学的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。
【００３２】
なお、本発明の糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物に使用されるタンパク質は、そのアミノ酸配列が上述した通りのものであり、糖鎖関連酵素に会合し、該酵素の活性を調節する活性を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。本明細書で使用する用語「会合」とは、分子間相互作用により２またはそれ以上の分子が１つの分子のように挙動することを意味する。「会合」には、結合、凝集、捕捉、融合、接触、共局在などが例示される。
【００３３】
より具体的には、Ｏ−１６タンパク質は、哺乳動物の精巣に発現するタンパク質である限り特に限定されないが、精子形成細胞において発現するタンパク質であることが好ましい。ここで、精子形成細胞とは、精巣の曲精細管を構成する精上皮から精子細胞を分化・発生するまでの全過程において現れる細胞の総称をいい、精祖細胞、精母細胞、精子細胞が例示される。さらに好ましい態様において、Ｏ−１６タンパク質は、精子細胞（ｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅ）に発現する。
【００３４】
本発明によれば、糖鎖関連酵素の活性を調節する機能を有するタンパク質を含む糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物が提供される。ここで、糖鎖関連酵素の活性の「調節」には、活性の抑制、増強、消失、および維持のいずれもが包含される。好ましくは、抑制である。
【００３５】
糖鎖関連酵素の活性の抑制は、好ましくは約５０％抑制、より好ましくは約７０％抑制、さらにより好ましくは約９０％抑制、最も好ましくは約１００％抑制である。
【００３６】
前記タンパク質が会合する糖鎖関連酵素は、糖転移酵素、糖鎖分解酵素、糖鎖合成酵素が含まれるが、該タンパク質が会合するタンパク質である限り特に限定されない。
【００３７】
糖転移酵素は、ガラクトース転移酵素、グルコース転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素（ＧａｌＮＡｃ転移酵素）、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧｌｃＮＡｃ転移酵素）、フコース転移酵素、シアル酸転移酵素、グルクロン酸転移酵素、マンノース転移酵素、キシロース転移酵素、β−１，４−ガラクトース転移酵素、Ｃｏｒｅ１  β−１，３−ガラクトース転移酵素、好ましくは、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、β−１，４−ガラクトース転移酵素、Ｃｏｒｅ１  β−１，３−ガラクトース転移酵素、である。より好ましくは、Ｎ−アセチルガラクトサミン糖転移酵素、β−１，４−ガラクトース転移酵素である。最も好ましくは、Ｎ−アセチルガラクトサミン糖転移酵素である。
【００３８】
糖鎖分解酵素は、糖鎖加水分解酵素、エステラーゼ、ヒアルロニダーゼである。好ましくはヒアルロニダーゼである。
【００３９】
糖鎖合成酵素は、コンドロイチン硫酸合成酵素、ヘパリン／ヘパラン硫酸合成酵素、ヒアルロン産合成酵素である。好ましくは、コンドロイチン硫酸合成酵素である。
【００４０】
また本発明のタンパク質は、細胞外へ分泌されないことを特徴とする。ここで、「細胞外への分泌されない」とは、細胞において発現したタンパク質がその細胞外に全く分泌されないか、または細胞外に分泌されたとしてもプロテアーゼ等によって分解もしくは断片化してしまうため検出されないレベルをいう。本発明のタンパク質は、好ましくは、当該タンパク質のＮ末端の膜貫通領域を欠落させ、代わりにシグナルペプチドを連結させた形で発現させた場合においても、細胞外へ分泌されない。
【００４１】
本発明によれば、本発明の糖鎖関連酵素活性調節用組成物タンパク質が糖鎖関連酵素と会合する特徴を有することを利用して、試料中の未知の糖鎖関連酵素を検出する方法が提供される。
【００４２】
本発明によれば、精子形成および／または受精を調節するための組成物が提供される。精子形成、受精を調節することには、精子形成異常および／または受精困難による不妊症の治療または予防が含まれる。
【００４３】
（２）核酸
本発明の糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物に使用される核酸は、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡ、およびそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる。本発明の核酸としては、ＤＮＡが好ましい。本明細書において、ある特定の塩基配列について記載する場合、特に言及しない限り、その相補鎖も含む。
【００４４】
前記核酸は、配列番号２に示されるアミノ酸をコードする核酸（その相補体を含む）である。典型的には、配列番号１の塩基配列（その相補体を含む）を有するが、これは本発明の一例を示すにすぎない下記の実施例で得られたクローンの塩基配列である。天然の核酸の中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生態型の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。従って、前記核酸は、配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸のみに限定されるわけではなく、本発明の糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物に使用されるタンパク質をコードする全ての核酸を包含する。
【００４５】
特に、本発明によってこのタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が開示されれば、この配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする核酸を容易に単離することができる。このような場合、そのような核酸も本発明の範囲に含まれる。
【００４６】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｖｏｌ，第６−７章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．
５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。ホルムアミドを含まない場合、適当なハイブリダイゼーション温度は前記より１０℃〜２０℃高くなる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。当業者に知られていて、以下にさらに記載したように、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整することが可能であると理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１を参照されたい）。核酸を未知配列の標的核酸へハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは核酸の配列を並列し、最適な配列相補性をもつ単数または複数の領域を同定することによって決定可能である。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−１０℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式により決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８塩基対を超える長さのハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ％）−（６００／Ｎ）であり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸は各々、少なくとも１５ヌクレオチド（または、より好ましくは、少なくとも１８ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）、またはそれがハイブリダイズする本発明の核酸の長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０％）である長さを有し、それ��ハイブリダイズする本発明の核酸と少なくとも６０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有し、ここで配列同一性は、上記により詳しく記載されるように、重複部分と同一性を最大化する一方、配列ギャップを最小化するように並列された、ハイブリダイズする核酸の配列を比較することによって決定される。
【００４７】
核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５）］、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）［Ｗｕ  Ｄ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９）；  Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９，１１７−１２２（１９９０）；  Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１８９−１９３（１９９１）］および転写に基づく増幅［Ｋｗｏｈ  Ｄ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９）］等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反
応（ＳＤＡ）［Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）；  Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２）］、自己保持配列複製（３ＳＲ）［Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０）］およびＱβレプリカーゼシステム［リザイルディら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，ｐ．１１９７−１２０２（１９８８）］等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
【００４８】
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。
【００４９】
核酸の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列のパーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マジソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定されれ；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５４４−７１も参照されたい）、または、短周期性
の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００５０】
（３）タンパク質の単離・精製
本明細書において、本発明の糖鎖関連酵素の活性を調節するための組成物に使用することができるタンパク質を「本タンパク質」と称することがある。
【００５１】
本タンパク質は、上記の核酸を組み込むことにより調製された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源若しくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源若しくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨおよび培養時間は、本発明のタンパク質が大量に生産されるように適宜選択される。
【００５２】
本タンパク質は、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本タンパク質が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が１０〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液。ｐＨは用いる緩衝液によって異なるが、ｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本タンパク質が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、本発明のタンパク質の単離・精製に供することができる。単離・精製の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンパクに６×ヒスチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。一方、そのようなタグを付けずに本発明のタンパク質を生産した場合には、例えば後述する実施例に詳しく述べられている方法、即ちイオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。
【００５３】
本タンパク質を免疫原として動物に投与することにより、該タンパク質に対する抗体を作製することができ、該抗体を用いて免疫測定法により該タンパク質を測定することが可能になる。従って、本発明のタンパク質およびこれをコードする核酸は、このような免疫原の作製に有用である。
【００５４】
本タンパク質はまた、精製および同定を容易にするために添加されるペプチドを含んでもよい。こうしたペプチドには、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４，１９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれるが、これらに限定さるものではない。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１０）、Ｍｙｃペプチド（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ（配列番号１１））であり、該ペプチドは非常に抗原性であり、そしてそれぞれに特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。また、４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ  ９２５９下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．，米国ミズーリ州セントルイス、より入手可能である。また、Ｍｙｃペプチドに結合するモノクローナル抗体は、ＢＡｂＣＯより入手可能である。
【００５５】
具体的には、後述される実施例５に記載されるように、本タンパク質を発現する発現ベクターにＭｙｃタグ（またはＦＬＡＧタグ）のｃＤＮＡを挿入し、および糖鎖関連酵素を発現する発現ベクターにＦＬＡＧタグ（またはＭｙｃタグ）のｃＤＮＡを挿入し、それぞれ標識したタンパク質および糖鎖関連酵素を発現させ、抗Ｍｙｃ抗体または抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、該タンパク質および該糖鎖関連酵素の発現を確認することができる。
【００５６】
なお、本タンパク質は、Ｏ−１６タンパク質であることが好ましい。
【００５７】
（４）組成物
本発明において使用されるタンパク質は、精巣特異的に発現し、糖鎖関連酵素の活性を調節する効果を有することが明らかにされた。具体的には、後述する実施例５および実施例６に記載したように、本発明のタンパク質は、糖鎖関連酵素、例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１などに結合し、これらの活性を抑制することが示された。また、本発明のタンパク質は、実施例７に記載したように、精巣特異的に発現していることが示された。これらの事実は、Ｏ−１６タンパク質は、精子形成細胞において、受精に必要とされる糖タンパク質等の発現を制御していることを示唆している。
【００５８】
このことは、Ｏ−１６タンパク質は、精巣で発現し、受精に関与すると思われる糖鎖関連酵素に結合し、さらに該糖鎖関酵素の活性を調節することを初めて明らかにし、有効なＯ−１６タンパク質を含む組成物を提供するものである。
【００５９】
本発明の前記タンパク質を含む組成物は、精子形成および／または受精を調節するために利用することができる。したがって、本発明の組成物を用いることによって、精子形成および受精を調節することに基づいた、精子形成異常および／または受精困難による不妊症の治療または予防を可能にする。また、本発明の組成物は、正常な妊娠を目的とした健康維持および増進のためのサプリメントとして使用することもできる。
【００６０】
本発明の組成物は、特に、医薬用組成物として有用である。具体的には、精子形成の異常に基づく不妊症の治療または予防のために使用可能である。
【００６１】
本発明の組成物は、薬学的に受容可能な担体との混合物中に、前記タンパク質を治療上有効な量を含む。本発明の組成物は、全身的にまたは局所的に、好ましくは静脈内、皮下内、筋肉内に非経口的に投与し得る。非経口的に投与可能な本発明の組成物は、ｐＨ、等張性、安全性等を考慮し、当業者の技術的範囲において行い得る。
【００６２】
本発明の組成物の用量用法は、薬剤の作用、例えば、患者の症状の性質および／若しくは重度、体重、性別、食餌、投与の時間、並びに他の臨床的作用を左右する種々の因子を考慮し、診察する医師により決定され得る。当業者は、これらの要素に基づき、本発明の組成物の用量を決定することができる。
【００６３】
（５）抗体
本発明により、本発明の組成物に使用されるタンパク質に免疫反応性である抗体が提供される。抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。こうした抗体は、（非特異的結合と対照的に）抗体の抗原結合部位を介して、該タンパク質に特異的に結合し得る。具体的には、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその断片、変異体若しくは融合タンパク質などを、それぞれに免疫反応性である抗体を産生するための免疫原として使用することが可能である。
【００６４】
より具体的には、タンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などは、抗体形成を引き出す抗原決定基またはエピトープを含むが、これら抗原決定基またはエピトープは、直鎖でもよいし、より高次構造（断続的）でもよい。なお、該抗原決定基またはエピトープは、当該技術分野に知られるあらゆる方法によって同定できる。したがって、本発明は、本発明のタンパク質の抗原性エピトープにも関する。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載されるように、抗体、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。
【００６５】
本発明のエピトープは、アッセイにおいて、そしてポリクローナル抗体（若しくは抗血清）または培養ハイブリドーマ由来の上清などの物質から特異的に結合する抗体を精製するための研究試薬として使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、タンパク質の化学的または酵素的切断などの当該技術分野において公知の技術を用いて、あるいは組換えDNA技術を用いて産生することができる。
【００６６】
前記タンパク質によってあらゆる態様の抗体が誘導される。該タンパク質のポリペプチド全部若しくは一部またはエピトープが単離されていれば、慣用的技術を用いてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも調製可能である。例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ
Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０；Ｂｕｒｄｏｎら編「生化学実験法１０  モノクローナル抗体」東京化学同人、１９８９を参照されたい。
【００６７】
本発明によれば、本発明のタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も提供される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生し、そして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を本発明の酵素タンパク質で免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。
【００６８】
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。こうしたヒト化型抗体は、ヒトに投与されて免疫原性を減少させるという利点を有する。
【００６９】
また本発明によれば、上記抗体の抗原結合断片も提供される。慣用的技術によって産生可能な抗原結合断片の例には、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子工学技術によって産生可能な抗体断片および誘導体もまた提供される。
【００７０】
本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいても、本発明のタンパク質またはそのポリペプチド断片の存在を検出するためのアッセイに使用可能である。また本発明の抗体は、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって該タンパク質またはそのポリペプチド断片を精製することにも使用することができる。
【００７１】
さらに本発明の抗体は、糖鎖関連酵素への本発明のタンパク質の会合を遮断することが可能な遮断抗体として提供されてよく、そのような抗体の結合により当該タンパク質および／または糖鎖関連酵素の活性を調節することができる。こうした遮断抗体は、糖鎖関連酵素を発現している特定の細胞への該タンパク質の結合を阻害する能力に関して抗体を試験するなど、あらゆる適切なアッセイ法を用いて同定することができる。
【００７２】
また遮断抗体は、糖鎖関連酵素に結合している本発明のタンパク質から生じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッセイにおいても同定可能である。こうした抗体は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ法で使用するかまたはｉｎ  ｖｉｖｏで投与して、抗体を生成した実体によって仲介される生物活性を阻害し得る。従って、本発明によれば、本発明のタンパク質と糖鎖関連酵素との間の直接または間接的な相互作用に起因して引き起こされるかまたは悪化する障害を治療するための抗体も提供され得る。こうした療法は、糖鎖関連酵素を介した生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を哺乳動物にｉｎ  ｖｉｖｏ投与することを含むであろう。一般に、こうした療法の使用にはモノクローナル抗体が好ましく、１つの態様として抗原結合抗体断片が使用される。
【実施例】
【００７３】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。当業者は、本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例１  遺伝子データベースの検索とＯ−１６の塩基配列決定
既存のＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＫ０２５２８７）（配列番号３）と類似遺伝子の高い相同性を有するアミノ酸配列領域を用いて、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮのプログラムにより遺伝子データベース（ＮＣＢＩ）から類似遺伝子を検索した。その結果、ＥＳＴ配列ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＣ０２２０２１（配列番号４）が見出された。このＢＣ０２２０２１において、ヌクレオチド２２９−１５６０に新規遺伝子のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）が見出された。次に、後述の実施例２において、上記ＥＳＴ配列に基づいて作成したプライマー（配列番号５−７）を用いて長さ１３３２塩基の遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号１）。
実施例２  Ｏ−１６遺伝子を組み込んだ発現ベクターの作成
Ｏ−１６遺伝子の発現系を作成するため、Ｏ−１６遺伝子の全長、あるいはＮ末端より３６アミノ酸をコードする核酸配列を欠く配列をヒト精巣ｃＤＮＡよりＲＴ−ＰＣＲにより増幅してＤＮＡ断片を精製後、Ｇａｔｅｗａｙ  ＰＣＲ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、ｐＤＯＮＲＴＭ２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
に組み込んだ。その後、シグナルペプチド（ＳＰ）を付加したＳＰ−ＦＬＡＧ−Ｏ−１６の発現は、発現ベクター（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３，Ｓｉｇｍａ）にＮ末端より３６アミノ酸をコードする核酸配列を欠くヒトＯ−１６遺伝子の配列を組み込んだものを用いた。シグナルペプチドとＭｙｃタグを付加したＯ−１６（以下、「ＳＰ−Ｍｙｃ−Ｏ−１６」という）を発現させるためにｐＭｙｃ−ＣＭＶ３（後述）を使用した。
【００７４】
（１）クローニングベクターへの組み込み
上記の実施例１で得られたＥＳＴ塩基配列（ＢＣ０２２０２１）に基づいて作成したプライマーＦ１（配列番号５：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＡＡＴＴＣＡＡＧＧＴＴ−３’）（配列番号５の塩基配列のうちヌクレオチド３２−５６が、配列番号１の塩基配列のヌクレオチド１−２５に対応する）、またはプライマーＦ２（配列番号６：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＣＴＣＴＧＴＣＡＧＣ−３’）（配列番号６の塩基配列のうちヌクレオチド３２−５７が、配列番号１の塩基配列のヌクレオチド１０９−１３４に対応する）、およびプライマーＲ（配列番号７：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＴＴＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣ−３’）（配列番号７の塩基配列のうちヌクレオチド３１−５２が、配列番号１の塩基配列のヌクレオチド１３１１−１３３２に対応する）、並びにＤＮＡポリメラーゼとしてＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１１４６  １７３）を用いて、９４℃１５秒、６８℃３分を３０サイクルの反応条件でＰＣＲを行った。プライマーＦ１およびプライマーＲの組合せでＰＣＲを行った場合は、Ｏ−１６遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片が増幅され、プライマーＦ２およびプライマーＲの組合せでＰＣＲを行った場合は、Ｎ末端の３６アミノ酸をコードする核酸配列を欠くＯ−１６遺伝子を含むＤＮＡ断片が増幅される。
【００７５】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動後、予想されたサイズのＤＮＡ断片をゲルから切りだし、凍結後、メンブレンフィルターカラムの中に入れて遠心してＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡ断片はＧａｔｅｗａｙエントリーベクター（ｐＤＯＮＲＴＭ２０１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して大腸菌にトランスフォームしてクローニングし、各クローンのプラスミドＤＮＡをミニプレップキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて精製後、ｐＤＯＮＲＴＭ２０１特異的プライマー（５’−ＴＣＧＣＧＴＴＡＡＣＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＴＣＴＣ−３’（配列番号８）および５’−ＧＴＡＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＴＴＴＴＧＡＧＡＣＡＣ−３’（配列番号９））を用い、ＢｉｇＤｙｅ  ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を用いてＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ）で塩基配列を決定した。
【００７６】
（２）発現ベクターへの組み込み
発現ベクターｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３（Ｓｉｇｍａ）のプレプロトリプシンのシグナル配列とＦＬＡＧエピトープの下流に、Ｎ末より３６アミノ酸をコードする核酸配列を欠くヒトＯ−１６遺伝子配列を組み込み、シグナル配列およびＦＬＡＧエピトープとＯ−１６のアミノ酸配列がｉｎ  ｆｒａｍｅになるような発現ベクターを構築した。また、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３を改変し、シグナル配列の下流のＦＬＡＧエピトープをＭｙｃエピトープに置換した発現ベクター（ｐＭｙｃＣＭＶ３）を作製し、上記と同様に、Ｎ末より３６アミノ酸をコードする核酸配列を欠くヒトＯ−１６遺伝子配列を組み込んで、Ｍｙｃエピトープタグを有するＯ−１６タンパク質を発現する発現ベクターを構築した。
実施例３  糖鎖関連酵素の酵素ドメインをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターの作成
（１）クローニングベクターへの組み込み
Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素であるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、−Ｔ２、−Ｔ３、−
Ｔ４、−Ｔ６、−Ｔ１０、−Ｔ１２、−Ｔ１４、および−Ｔ１５、糖転移酵素であるβ３−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、糖転移酵素であるβ４ＧａｌＴ１、精子特異的ヒアルロニダーゼ、ならびに、コンドロイチン硫酸合成酵素であるＣＳＳ１およびＣＳＳ３の各遺伝子について、各糖鎖関連酵素の細胞内ドメインをコードするＤＮＡを、それぞれ以下に示すプライマーを用いてヒトｃＤＮＡよりＲＴ−ＰＣＲで増幅し、アガロースゲル電気泳動および切り出し精製の後、Ｇａｔｅｗａｙ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いてｐＤＯＮＲＴＭ２０１に、あるいは、ｐＣＲ  ＩＩ  Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み換えた。
【００７７】
糖鎖関連酵素の酵素ドメインをクローニングするために使用したプライマー対は以下の通りである：
１．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ ０２０４７４）
５’プライマー（配列番号１２：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧＴＴ−３’）
３’プライマー（配列番号１３：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＡＧＡＡＴＡＴＴＴＣＴＧＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＧＴＴ−３’）
（このプライマー対により、アミノ酸４０位以降の部分をコードするＤＮＡ断片が得られる）
２．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ ００４４８１）
５’プライマー（配列番号１４：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＡＣＡＧＣ−３’）
３’プライマー（配列番号１５：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＴＧＡＧＣＧＴＧＡＡＣＴＴ−３’）
（このプライマー対により、アミノ酸５２位以降の部分をコードするＤＮＡ断片が得られる）
３．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ ００４４８２）
５’プライマー（配列番号１６：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＧＧＡＡＣＡＴＧ−３’）
３’プライマー（配列番号１７：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＡＡＴＣＡＴＴＴＴＧＧＣＴＡＡＧＴＡＴＣＣＡＴＴＴ−３’）
（このプライマー対により、アミノ酸５１位以降の部分をコードするＤＮＡ断片が得られる）
４．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ ００３７７４）
５’プライマー（配列番号１８：  ５’−  ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＴＴＴＣＡＴＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＧＡＧＣＣＧＧＣ−３’）
３’プライマー（配列番号１９：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＡＴＴＴＣＴＣＡＡＡＡＣＴＣＣＡＡＡＴＴＴＧＡＴＴ−３’）
（このプライマー対により、アミノ酸３３位以降の部分をコードするＤＮＡ断片が得られる）
５．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ６（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ ００７２１０）
５’プライマー（配列番号２０：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＣ−３’）
３’プライマー（配列番号２１：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＡＧＡＣＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＡＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧ−３’）
（このプライマー対により、アミノ酸５３位以降の部分をコードするＤＮＡ断片が得られる）
６．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ １９８３２１）
５’プライマー（配列番号２２：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＣＣＴＧＧＧＧＧＡ−３’）
３’プライマー（配列番号２３：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＡＡ−３’）
（このプライマー対により、アミノ酸３５位以降の部分をコードするＤＮＡ断片が得られる）
７．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ ０２４６４２）
５’プライマー（配列番号２４：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＣＧＧＣＧＣＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧＣＣＧＣＧＧＣ−３’）
３’プライマー（配列番号２５：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＣＡＴＡＡＣＡＴＧＣＧＣＴＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＣＣＡ−３’）
（このプライマー対により、アミノ酸６０位以降の部分をコードするＤＮＡ断片が得られる）
８．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ ０２４５７２）
５’プライマー（配列番号２６：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＴＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＡＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＣＧＣＴＧ−３’）
３’プライマー（配列番号２７：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＡＡＧＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧ−３’）
（このプライマー対により、アミノ酸３９位以降の部分をコードするＤＮＡ断片が得られる）
９．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１５（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０７８１４９）
５’プライマー（配列番号２８：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＣＣＡＧＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＴＧＧＧＧ−３’）
３’プライマー（配列番号２９：  ５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＡＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＣＡＴＴＧＡＴＣＴ−３’）
（このプライマー対により、アミノ酸５５位以降の部分をコードするＤＮＡ断片が得られる）
１０．β３−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＣ０２９５６４）
５’プライマー（配列番号３０：  ５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＡＴＴＴＣ−３’）
３’プライマー（配列番号３１：  ５’−ＡＡＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＣＴＧＴＴＡＴＣＴＴＧＣＴＴＧＡＣＡＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡ−３’）
１１．精子特異的ヒアルロニダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ
００３１１７）
５’プライマー（配列番号３２：  ５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴＴＣＣＡＡＡＴＧＴ−３’）
３’プライマー（配列番号３３：  ５’−ＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣＡＡＡＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡ−３’）
１２．コンドロイチン硫酸合成転移酵素ＣＳＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｎｏ．ＮＭ ０１４９１８）
５’プライマー（配列番号３４：  ５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧ−３’）
３’プライマー（配列番号３５：  ５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＴＡＧＧＣＴＧＴＣＣＴＣＡＣＴＧＡ−３’）
（このプライマー対により、アミノ酸４７位〜８０２位の部分をコードするＤＮＡ断片が得られる）
１３．コンドロイチン硫酸合成酵素ＣＳＳ３（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ １７５８５６）
５’プライマー（配列番号３６：  ５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＡＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＧＡ−３’）
３’プライマー（配列番号３７：  ５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＣＧＡＴＴ−３’）
（このプライマー対により、アミノ酸１３０位〜８８３位の部分をコードするＤＮＡ断片が得られる）
また、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素であるＧａｌＮＡｃ−Ｔ７（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ ０１７４２３）の酵素ドメイン；Ｃｏｒｅ１合成酵素であるＣｏｒｅ１−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｃ１）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ ０２０１５６）の酵素ドメインとしてアミノ酸３２位以降の部分；Ｃｏｒｅ１−Ｇａｌ−Ｔ１特異的シャペロンであるＣｏｓｍｃ（Ｃ２）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ ００１０１１５５）の酵素ドメインとしてアミノ酸３７位以降の部分；および、Ｃｏｒｅ２合成酵素であるＣｏｒｅ２−ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ ００１４９０）の酵素ドメイン；についても同様に、Ｇａｔｅｗａｙ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いてｐＤＯＮＲＴＭ２０１に、あるいは、ｐＣＲ  ＩＩ  Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み換えた。
（２）発現ベクターへの組み込み
また、発現ベクター、ｐＣＬＮ−ＩＦ−ａｔｔＲ、はｐＣＬＮＣＸ（ＲｅｔｒｏＭａｘＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＩＭＧＥＮＥＸ）のＣＭＶプロモーター下流にヒト免疫グロブリンｋａｐｐａ軽鎖のシグナルペプチド、ＦＬＡＧのエピトープ、および、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のａｔｔＲ１サイトからａｔｔＲ２サイトまでを組み込んでおり、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓ
ｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＤＯＮＲ２０１などのエントリーベクターにクローニングした遺伝子がコードするタンパク質をシグナルペプチドおよびＦＬＡＧエピトープと結合した形で発現することができる。
【００７８】
シグナルペプチドおよびＦＬＡＧエピトープ部分のＤＮＡ配列は５’−ＡＴＧＣＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＴＧＧＡＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧ−３’（配列番号３８）である。
【００７９】
Ｏ−１６以外の遺伝子では、Ｃ１（Ｃｏｒｅ１Ｇａｌ−Ｔ１）、Ｃ２（Ｃｏｓｍｃ）がｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３を、その他の遺伝子はｐＣＬＮ−ＩＦ−ａｔｔＲを発現ベクターとして用いた。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０、−Ｔ１２、−Ｔ１４、および−Ｔ１５の各遺伝子では、非特許文献に記載のＮ末の膜貫通ドメインを欠く各遺伝子の配列を、エントリークローンよりＧａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを用いてｐＣＬＮ−ＩＦ−ａｔｔＲに組換えて、シグナルペプチド付きＦＬＡＧエピトープ付き糖転移酵素の発現ベクターとして用いた。
実施例４  Ｏ−１６遺伝子と糖鎖関連酵素遺伝子のＨＥＫ−２９３細胞へのコトランスフェクション
ＨＥＫ−２９３細胞は、ＡＴＣＣ（寄託番号：ＣＲＬ−１５７３）から購入した。細胞は、１０％胎児仔牛血清および２０μＭ  ゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ培地で培養した。実施例２において作成したＯ−１６を組み込んだ発現ベクター、および実施例３において作成した糖鎖関連酵素遺伝子を組み込んだいずれか１つの発現ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合後、培養液に加えることによって細胞にトランスフェクトした。
実施例５  ウェスタンブロッティングによる発現タンパク質の解析
各発現ベクターを組み込んだＨＥＫ−２９３細胞におけるタンパク質の発現を各タンパク質に付加したＭｙｃタグまたはＦＬＡＧタグに対する抗体を用いて検出した。
【００８０】
（１）試料の調製
各遺伝子導入された各ＨＥＫ−２９３細胞の培養液を回収し、ＰＢＳで１回洗浄した。回収した培養液を「培養上清」の試料として保存した。その後、可溶化バッファー（１％
ＮＰ−４０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＦ、２ｍＭ  ポリリン酸ナトリウム、２０ｍＭ  イオドアセトアミド、０．２Ｕ／ｍｌ  アプロニチン、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、および０．４ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム）を各培養ディッシュ（直径１０ｃｍ）に氷上で０．５ｍｌずつ添加した。氷上で、スクラッペンで可溶化した細胞をかき集め、１．５ｍｌの遠心用チューブに回収した。さらに、氷上で１５分放置した後、遠心分離した（１５，０００ｒｐｍ×１０分、４℃）。遠心後、上清を別のチューブに移した。この上清を「溶解産物（ｌｙｓａｔｅ）」の試料として保存した。
【００８１】
（２）免疫沈降
上記で保存した培養上清と溶解産物の各２００μｌに対して、（ｉ）抗ＦＬＡＧ抗体結合ビーズ（Ｍ１−ビーズ、ＳＩＧＭＡ）、または（ｉｉ）抗Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ＢＡｂＣＯ）およびプロテインＡ結合ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をそれぞれ３０μｌ添加し、４℃で３−４時間、回転させながら撹拌させた。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×２分）によって各ビーズを沈降させ、ビーズを洗浄液（１％  ＮＰ−４０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、および１４０ｍＭ  ＮａＣｌ）で４回洗浄した。さらに、Ｌａｍｅｌｉ（ｓａｍｐｌｅ）バッファー（２％  ＳＤＳ、１０％グリセロール、６０ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８），０．００１％ブロモフェノールブルー、１００ｍＭ  ＤＴＴ）を添加し、５分間煮沸後、各試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いた。
【００８２】
（３）ウェスタンブロッティング
免疫沈降後の試料中のタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。電気泳動による分離条件は以下の通りである。
・電気泳動装置：ミニプロティアン３セル（ＢｉｏＲａｄ）
・ゲル：９％  アクリルアミドゲル
・電圧：１２０Ｖ
・泳動時間：約２時間
・分子量マーカー：ＲＰＮ８００（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
分離したタンパク質をニトロセルロース膜に転写した（ミニトランスブロットセル転写装置（ＢｉｏＲａｄ、条件：７０Ｖで２時間、または２０Ｖで一晩）。イムノブロットは、ＨＲＰ標識したマウス抗ＦＬＡＧモノクロナル抗体、または抗Ｍｙｃ  マウスＩｇ抗体（９Ｅ１０、ＢＡｂＣｏ）および抗マウスＩｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて行った。その後、分離したタンパク質をケミルミネッセンス試薬（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。ウェスタンブロットの結果を図１−３に示す。
【００８３】
（４）結果
（ａ）Ｏ−１６タンパク質の発現
ＨＥＫ−２９３細胞におけるＯ−１６タンパク質の発現のウエスタンブロットの結果を図１に示す。図１のパネルＡとパネルＢに示される各レーンの説明と検出されたバンドの結果については、それぞれ表１Ａと表１Ｂにまとめた。以下、ウェスタンブロットの結果は、表に基づいて説明する。
【００８４】
【表１ａ】
2008148594.tif 000002
【００８５】
【表１ｂ】
2008148594.tif 000003
【００８６】
図１のパネルＡ（表１Ａ）のレーン６−９は、シグナルペプチド付き（ＳＰ）−Ｍｙｃ−Ｏ−１６を単独で発現させ、ＨＥＫ−２９３細胞の溶解産物中（ｌｙｓａｔｅ）および培養上清中（ｓｕｐ）に存在するＭｙｃ−Ｏ−１６を抗Ｍｙｃ抗体（レーン７、９）あるいは抗ＦＬＡＧ抗体（レーン６、８）で免疫沈降を試みた後、タグのＭｙｃエピトープに対する抗Ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロットで検出したものである。レーン７は、溶解産物を抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降した試料を調べたものであるが、ウェスタンブロットにおいて同抗体で検出されている（表１中、「＋」で表示される）ことから、ＨＥＫ−２９３細胞の溶解産物中には、Ｏ−１６が発現されたことを示す。図１のパネルＡでは、約４５ｋＤａのバンドとして検出されている。一方、レーン９は、同細胞の培養上清を試料とし、レ−ン７と同様に同抗体で検出したものであるが、Ｏ−１６の存在は確認されなかった（「−」で表示される）。以上の結果から、Ｏ−１６は、細胞外に全く分泌されないか、または細胞外に分泌されたとしてもプロテーアーゼ等によって分解若しくは断片化してしまうため検出されないと考えられる。
【００８７】
（ｂ）Ｏ−１６タンパク質と糖鎖関連酵素との会合
Ｏ−１６と糖鎖関連酵素とをＨＥＫ−２９３細胞に発現させる系において、各タンパク質の発現をウエスタンブロットで解析した（図１および２）。図１および２に示されるレーンの説明と検出されたバンドの結果については、図１については上記の表１に、図２については表２にまとめた。以下、ウェスタンブロットの結果は、これら表に基づいて説明する。
【００８８】
【表２】
2008148594.tif 000004
【００８９】
図１のパネルＢ（表１Ｂ）のレーン２−５は、ＳＰ−Ｍｙｃ−Ｏ−１６とＳＰ−ＦＬＡＧ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３遺伝子をＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクション後、細胞の溶解産物と培養上清を抗ＦＬＡＧ抗体あるいは抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降した試料を用いて、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウェスタンブロットした結果を示す。レーン３は、細胞の溶解産物を抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降後、抗ＦＬＡＧ抗体で検出したものであり、約７０ｋＤａにバンドが観察された。この結果から、溶解産物を抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、さらに抗ＦＬＡＧ抗体で検出できたことから、Ｍｙｃ−Ｏ−１６とＦＬＡＧ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３が会合していることが示唆された。さらに、この結果を裏付けるために、図１のパネルＡ（表１Ａ）のレーン２−５では、同発現系において、抗Ｍｙｃ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。このうち、レーン２は溶解産物を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降後、抗Ｍｙｃ抗体で検出したものであり、約４５ｋＤａにバンドが観察された。上記の結果から、Ｏ−１６とＧａｌＮＡｃ−Ｔ３は、細胞内で発現後、会合することが示唆された。
【００９０】
一方、図１のパネルＡ（表１Ａ）のレーン５では、共発現系での細胞の培養上清を抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降後、ウェスタンブロットにおいて抗Ｍｙｃ抗体で検出したものであるがバンドは観察されなかった。この結果から、共発現系においてもＯ−１６は細胞外に分泌されないことを示唆している。
【００９１】
図２（抗ＦＬＡＧ抗体ウェスタンブロット）に示すようにＳＰ−ＦＬＡＧ−Ｔ３は単独でＨＥＫ２９３細胞に発現させた場合、抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降させても沈澱しないが（レーン３）、ＳＰ−Ｍｙｃ−Ｏ−１６と共発現させた場合には抗Ｍｙｃ抗体を用いた免疫沈降で沈澱して抗ＦＬＡＧ抗体ウェスタンブロットで検出されており（レーン８）、図１でみられたＴ３とＯ−１６の会合をより強く示唆している。
【００９２】
さらに、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３以外の糖鎖関連酵素についても上記と同様にＯ−１６と会合するのかどうかについて、同様にウェスタンブロッティングで検討した（図３）。
【００９３】
試料は全て細胞の溶解産物であり、抗ＦＬＡＧ抗体または抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降後、ウェスタンブロッティングでは、抗ＦＬＡＧ抗体（図３のパネルＡ）または抗Ｍｙｃ抗体（図３のパネルＢ）を用いた。パネルＡにおいて、Ｏ−１６と会合していることを示すレーンは、抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降した試料であって、抗ＦＬＡＧ抗体で検出されたものである。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１（レーン９）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４（レーン１１）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ６（レーン１３）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ７（レーン１７）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２（レーン２１）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４（レーン２３）、およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ１５（Ｏ１４：レ−ン２５）については、それぞれがＯ−１６と会合していることを示唆するバンドが観察された。また、Ｃｏｒｅ１−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｃ１：レーン３）、β３−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（Ｇ３４：レーン７）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０（レーン１９）、およびＣｏ
ｒｅ２−ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ１（Ｃｏｒｅ２：レーン１５）についても弱いバンドが観察され、これらもＯ−１６と会合することが示唆された。なお、図３のパネルＢは抗Ｍｙｃ抗体を用いた対照試験であり、観察されたバンドはいずれも共発現系におけて発現したＯ−１６を示す。
【００９４】
また、コンドロイチン硫酸合成酵素であるＣＳＳ１およびＣＳＳ３についても同様の実験を行ったところ、これら二つの酵素はそれぞれＯ−１６と会合することが明らかとなった。
実施例６  発現タンパク質の精製と活性
（１）タンパク質の精製
ＨＥＫ２９３細胞に発現ベクターをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを用いてトランスフェクションしてタグ付きタンパク質を発現させ、タグに対する抗体とビーズを用いた免疫沈降と洗浄によりタンパク質を精製した。免疫沈降した試料の一部をＬａｍｅｌｉ（ｓａｍｐｌｅ）バッファーを加えて煮沸後ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開、メンブレンに転写して抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより解析して免疫沈降試料に含まれるＦＬＡＧ−Ｔ３の量を調べ、ＦＬＡＧ−Ｔ３の密度が同じになるようにビーズを加えて調整した。
【００９５】
（２）酵素活性の測定
Ｏ−１６および糖鎖関連酵素によるＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素としての活性測定には、受容体基質としてＦＩＴＣ標識したＭｕｃ５ＡＣ（ＦＩＴＣ−ＧＴＴＰＳＰＶＰＴＴＳＴＴＡ（配列番号３９））と、供与体基質（ｄｏｎｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを使用した。
【００９６】
反応液は、受容体基質（５０ｐｍｏｌ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）（２５ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（５ｍＭ）、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（２００ｎＭ）から成り、これに酵素液を２．５μｌ加えて、さらにＨ２Ｏを加えて全量を２０μｌとした（カッコ内は最終濃度）。酵素液は、培養上清の場合には最大４０倍に希釈して使用し、溶解産物の場合には最大２倍に希釈して使用した。
【００９７】
上記反応混合液を３７℃で４時間反応させ、反応終了後、Ｈ２Ｏを４０μｌ加え、軽く遠心後、上清を取得した。得られた上清をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社の簡易フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ）を通して、２０μｌ−４０μｌをＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣカラムはＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ（ナカライテスク社Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３７８−６６）を用いた。展開バッファーＡは０．０５％  ＴＦＡを含むイオン交換水、展開バッファーＢとしては受容体基質によって０．０５％  ＴＦＡの２−プロパノール：アセトニトリル ＝ ７：３と０．０５％  ＴＦＡのアセトニトリルを用いた。分離にはバッファーＢの濃度勾配を用い、３０分で５０％まで上がるように勾配をかけた。検出条件は励起波長：４９２ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍとした。
【００９８】
（３）結果
Ｏ−１６によるＧａｌＮＡｃ−Ｔ３の糖転移酵素活性の抑制
ＨＥＫ−２９３細胞にＦＬＡＧ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３を単独で発現させた場合、およびＭｙｃ−Ｏ−１６との共発現させた場合のそれぞれの酵素活性を測定した。
【００９９】
図４のパネルＡは、ＦＬＡＧ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３を細胞に単独で発現させた場合の溶出パターンを示す。パネルＢおよびＣは、それぞれ共発現系において発現させたＦＬＡＧ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３とＭｙｃ−Ｏ−１６の溶出パターンを示す。各チャートにおいて、
「Ｓ」は基質のＭｕｃ５ＡＣのピークであり、「Ｐ」は酵素によって基質にＧａｌＮＡｃ残基が付加した産物を示す。
【０１００】
パネルＡとＢを比較すると、共発現系におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ３による産物を示すピークの高さが、単独で発現させたＧａｌＮＡｃ−Ｔ３による産物を示すピークよりも低いことが分かる。また、Ｓピークの面積率を比較すると、パネルＡは４２．７１％であり、パネルＢは５０．０３％であることから、単独で発現させたＧａｌＮＡｃ−Ｔ３の方が基質の残存量が小さくなっている。この結果より、Ｏ−１６との共発現によって、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３の活性が何らかの機構によって抑制させていることが示唆された。
【０１０１】
以上の結果は、Ｏ−１６と会合するＴ１、Ｔ２によっても同様であった。
【０１０２】
これらの結果から、Ｏ−１６は、糖鎖関連酵素と細胞内で会合し、Ｏ−１６によって一度会合した糖鎖関連酵素は酵素本来の活性が抑制される傾向にあるといえる。
実施例７  リアルタイムＰＣＲを用いたヒト組織におけるＯ−１６転写物の定量解析
Ｏ−１６転写物の定量解析には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘおよびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （アプライドバイオシステム社）を用い、定量リアルタイムＰＣＲを行った。種々のヒト組織のＭａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）ｃＤＮＡはクロンテックより購入した。ヒト組織ｃＤＮＡとしては、気管、脳全体、肝臓、骨格筋、子宮、腎臓、心臓、胎児脳、小脳、唾液腺、脊髄、胎児肝臓、胎盤、精巣、前立腺、乳腺、膵臓、副腎、甲状腺、小腸、骨髄、脾臓、胸腺、に由来するものを用いた。
【０１０３】
Ｏ−１６のプライマーセットおよびプローブは以下のものである；フォーワードプライマー、５’−ＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＴＣＧＡＡＡ−３’（配列番号４０）（配列番号１の塩基配列３２３−３４０に対応する）、リバースプライマー、５’−ＧＣＧＧＧＣＴＧＧＧＴＡＡＴＧＴＴ−３’（配列番号４１）（配列番号１の塩基配列３９６−３８０に対応する）、およびプローブ、マイナーグルーブバインダーを持つ５’−ＡＧＴＧＣＣＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＡＧＴＡＡＡＡＴＧＣＧＴＣＴＴ−３’（配列番号４２）（配列番号１の塩基配列３４５−３７５に対応する）。ＰＣＲ条件は、５０℃、２分間を１サイクル、９５℃、１０分間を１サイクル、９５℃、１５秒間、および６０℃１分間を５０サイクルで行った。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４の転写物の相対量は、同じｃＤＮＡ中のＧＡＤＰＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）転写物の量により標準化した。
【０１０４】
リアルタイムＰＣＲ法により、種々のヒト組織および細胞系列におけるＯ−１６転写物の発現レベルを決定した。Ｏ−１６は、そのレベルは異なるものの、殆どの組織中（図２）で発現した。かなり高いレベルの発現がみられた組織は、精巣であった。中程度の発現が、骨格筋、肝臓、気管、および前立腺で観察された。試験したその他の組織の発現レベルは、非常に低い、または検出不可能であった。
実施例７  精巣におけるＯ−１６転写物のｉｎ  ｓｉｔｕ発現解析
Ｏ−１６転写物の、精巣におけるｉｎ  ｓｉｔｕ発現解析を行った。
【０１０５】
マウス  Ｏ−１６  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＮＭ ０２６４４９）のヌクレオチド２４２−６１６位に対応する３７５ｂｐＤＮＡフラグメント（配列番号４３）を、ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクター（プロメガ）にサブクローニングし、そしてセンスまたはアンチセンスＲＮＡプローブの産生に用いた。ジゴキシゲニン標識したＲＮ
ＡプローブをＤＩＧ  ＲＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（ロシュ）で調製した。
【０１０６】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）のためのパラフィン包埋したマウス精巣の塊または切片を、Ｇｅｎｏｓｔａｆｆより入手した。精巣を、それ専用の手法により、灌流の後切開し、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｇｅｎｏｓｔａｆｆ）で固定化し、およびパラフィン中に包埋し、そして８μｍの切片に切開した。
【０１０７】
ＩＳＨのために、組織切片は、キシレンで脱ワックスし、そしてエタノールの系列およびＰＢＳを通して再水和した。切片は、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定化し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで再度固定化し、再度ＰＢＳで洗浄し、そして０．２Ｎ  ＨＣｌ中に１０分間置いた。ＰＢＳで洗浄後、切片を０．１Ｍ  トリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．２５％  無水酢酸、中での１０分間のインキュベーションによりアセチル化した。ＰＢＳで洗浄後、切片をエタノールの系列を通して脱水した。プローブで、ハイブリダイゼーションをＰｒｏｂｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｇｅｎｏｓｔａｆｆ）中、３００ｎｇ／ｍｌの濃度で、６０℃、１６時間行った。ハイブリダイゼーション後、切片を、５ｘＳＳＣと等価な、５ｘ  ＨｙｂｒｉＷａｓｈ（Ｇｅｎｏｓｔａｆｆ）中、６０℃で２０分間洗浄し、そして次いで、５０％ホルムアミド、２ｘ  ＨｙｂｒｉＷａｓｈ中、６０℃で２０分間、続いて、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１Ｍ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ中の５０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡ中、３０分間、３７℃でのＲＮａｓｅ処理を行った。次いで、切片は、２ｘ  ＨｙｂｒｉＷａｓｈで６０℃、２０分間の洗浄を２回行い、そしてＴＢＳＴ（ＴＢＳ中、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で１回洗浄した。ＴＢＳＴ中０．５％  ブロッキング試薬（ロシュ）で３０分間処理した後、切片を、ＴＢＳＴで１：１０００に希釈した抗ＤＩＧ  ＡＰコンジュゲート（ロシュ）とともに２時間インキュベートした。切片をＴＢＳＴで２回洗浄し、次いで１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５中でインキュベートした。染色反応をＢＭ  ｐｕｒｐｌｅ  ＡＰ基質（ロシュ）とともに一晩行い、そしてＰＢＳで洗浄した。切片はＫｅｒｎｅｃｈｔｒｏｔ染色溶液（Ｍｕｔｏｈ）で対比染色し、脱水し、次いでＭａｌｉｎｏｌを重層した（Ｍｕｔｏｈ）。
【０１０８】
結果
結果を図６に示す。Ｏ−１６転写物は、アンチセンスＲＮＡプローブ（Ａｎｔｉ−Ｓ）によって検出され、精巣において青く発色した。また、発色の局在から、Ｏ−１６転写物は精子細胞において強く発現していることが明らかとなった。なお、ネガティブコントロールであるセンスＲＮＡプローブ（Ｓｅｎｓｅ）で処理した場合は、発色は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明により、精巣に特異的に発現するタンパク質であって、糖鎖関連酵素に会合し、該糖鎖関連酵素の活性を調節するタンパク質が単離され、その遺伝子の構造が明らかにされた。したがって、該タンパク質やその変異体の遺伝子工学的な生産、該タンパク質に会合する糖鎖関連酵素の同定や、該タンパク質またはそれをコードする遺伝子を用いた精子形成異常または受精困難による不妊症の予防、診断、または予防が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、ＨＥＫ−２９３細胞に発現させたＭｙｃ−Ｏ−１６とＦＬＡＧ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３のウェスタンブロッティングによる検出結果を示す。発現タンパク質は、溶解産物および培養上清から精製し、Ｍｙｃタグに対する抗Ｍｙｃ抗体、またはＦＬＡＧタグに対する抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降後、抗Ｍｙｃ抗体（パネルＡ）または抗ＦＬＡＧ抗体（パネルＢ）を用いてイムノブロットした。
【図２】図２は、ＨＥＫ−２９３細胞に発現させたＭｙｃ−Ｏ−１６とＦＬＡＧ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３（またはＦＬＡＧ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１）のウェスタンブロッティングによる検出結果を示す。発現タンパク質は、溶解産物および培養上清から精製し、Ｍｙｃタグに対する抗Ｍｙｃ抗体、またはＦＬＡＧタグに対する抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降後、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてイムノブロットした。
【図３】図３は、ＨＥＫ−２９３細胞に発現させたＭｙｃ−Ｏ−１６と各種糖鎖関連酵素のウェスタンブロッティングによる検出結果を示す。細胞の溶解産物を試料とし、Ｍｙｃタグに対する抗Ｍｙｃ抗体、またはＦＬＡＧタグに対する抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降後、抗ＦＬＡＧ抗体（パネルＡ）または抗Ｍｙｃ抗体（パネルＢ）を用いてイムノブロットした。
【図４】図４は、Ｍｕｃ５ＡＣ受容体基質を用いたＯ−１６とＧａｌＮＡｃ−Ｔ３の糖転移酵素活性の測定におけるＨＰＬＣチャートである。パネルＡは、ＨＥＫ−２９３細胞にＧａｌＮＡｃ−Ｔ３を単独で発現させ、溶解産物を試料として抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降後、精製したＧａｌＮＡｃ−Ｔ３を用いてＭｕｃ５ＡＣと反応した場合のチャートを示す。パネルＢは、Ｏ−１６とＧａｌＮＡ−Ｔ３を共発現させ、溶解産物を試料として抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降後、精製したＧａｌＮＡｃ−Ｔ３とＭｕｃ５ＡＣの反応結果を示す。パネルＣは、同共発現の溶解産物を試料として抗Ｍｙｃ抗体を用いて免疫沈降後、精製したＯ−１６とＭｕｃ５ＡＣの反応結果を示す。図中、ＳはＭｕｃ５ＡＣの基質ピークを表し、Ｐは生成物ピークを表す。
【図５】図５は、リアルタイムＰＣＲによる種々のヒト組織におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１８転写物の定量解析の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、精巣におけるＯ−１６転写物のｉｎ  ｓｉｔｕ発現解析の結果を示す写真である。Ａｎｔｉ−Ｓは、アンチセンスＲＮＡプローブで処理した結果を示し、青く発色している箇所はＯ−１６転写物が局在する箇所に一致する。ＳｅｎｓｅはセンスＲＮＡプローブで処理したネガティブコントロールである。
【図１】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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