(57)【要約】 【課題】  生細胞の機能を高く維持したまま、長期間に亘って使用可能な、生細胞を用いる人工臓器を提供すること。【解決手段】  ラミニンを５０重量％以上含むマトリックスと、該マトリックス中に分散された生細胞と、該マトリックス及び生細胞を収納し、外部との液体の流出入が可能な収納体とを具備する人工臓器を提供した。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラミニンを５０重量％以上含むマトリックスと、該マトリックス中に分散された生細胞と、該マトリックス及び生細胞を収納し、外部との液体の流出入が可能な収納体とを具備する人工臓器。
【請求項２】
前記マトリックスはラミニンとコラーゲンIVを含む請求項１記載の人工臓器。
【請求項３】
前記生細胞は肝細胞、膵細胞又は腎細胞である請求項１又は２記載の人工臓器。
【請求項４】
前記生細胞は肝細胞である請求項３に記載の人工臓器。
【請求項５】
前記収納体は、中空繊維膜であり、前記マトリックス及び生細胞は、該中空繊維膜中又は膜外に充填される請求項１ないし４のいずれか１項に記載の人工臓器。
【請求項６】
液体流入口と液体流出口とを具備するカートリッジに複数本の前記中空繊維膜が収納されている請求項５記載の人工臓器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞、膵細胞、腎細胞等の生細胞を用いた人工臓器に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、肝細胞等の生細胞を、マトリックスの中に分散させて保持した人工臓器が知られている。公知のこの種の人工臓器は、マトリックス中に分散された生細胞を中空繊維膜の内部に収納し、体液を循環させて生細胞にその細胞本来の生理作用を行わせ、処理後の体液を再び患者に戻すことにより、機能が低下又は喪失された患者の臓器を補助又は代行するものである。マトリックスとしては、コラーゲン、フィブロネクチンのような細胞間物質や、ポリ−Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−Ｄ−ラクトアミド（ＰＶＬＡ）等の樹脂が知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、生細胞を用いる従来の人工臓器では、生細胞の機能を高く維持したまま、長期間に亘って生細胞を生かしておくことができず、現在までのところ、この種の人工臓器は実用化されていない。
【０００４】
従って、本発明の目的は、生細胞の機能を高く維持したまま、長期間に亘って使用可能な、生細胞を用いる人工臓器を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ラミニンをマトリックスとして用いることにより、生細胞が自然な形で三次元的に保持され、その結果、生細胞の機能を高く維持したまま、長期間に亘って生細胞を生かしておくことができることを見出し本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、ラミニンを５０重量％以上含むマトリックスと、該マトリックス中に分散された生細胞と、該マトリックス及び生細胞を収納し、外部との液体の流出入が可能な収納体とを具備する人工臓器を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、生細胞を用いる人工臓器において、ラミニンを主成分とするマトリックスを用いることにより、生細胞が自然な形で三次元的に保持され、その結果、生細胞の機能を高く維持したまま、長期間に亘って生細胞を生かしておくことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の人工臓器に用いられる生細胞は、体液に対して何らかの生理作用を行う細胞であり、好ましい例として肝細胞、膵細胞、腎細胞を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。生細胞の由来は、特に限定されず、ヒト又はヒトの内臓と同様な性能を発揮する動物であればよく、好ましい動物としてブタ、ヒヒ、サル、ヒツジ、ウシ、イヌ等を挙げることができる。また、これらの動物には遺伝子操作を施された動物も含まれる。
【０００９】
生細胞を保持するマトリックスとしては、ラミニンを５０重量％以上含むものが用いられる。マトリックス中のラミニンの含量は５０重量％以上であり、全量がラミニンであってもよい。ラミニンとコラーゲンIVの混合物も好ましく、この場合、ラミニンとコラーゲンIVの重量比は、好ましくは６：４〜８：２程度である。ラミニンとコラーゲンIVの合計量は、マトリックス全体の７０重量％以上が好ましく、さらには９０重量％以上、特には９５重量％以上が好ましい。マトリックスには、ラミニン及びコラーゲンIV以外の物質も本発明の効果を有意に損なわない範囲で含まれていてもよい。このような物質の例として従来からマトリックスとして用いられているエンタクチン、プロテオグリカンやＰＶＬＡのような樹脂並びにラミニンやコラーゲンIVに付随することがある不純物等を例示することができる。これら、ラミニン及びコラーゲンIV以外の物質の量は本発明の効果を有意に損なわないであり、通常、３０重量％以下、好ましくは１０重量％以下、さらに好ましくは５重量％以下である。
【００１０】
生細胞は、上記マトリックス中に分散状態で保持される。上記マトリックスを用いることにより、生細胞は生体内に近い自然な状態で三次元的に維持されるので、細胞を高密度に充填しても細胞の機能を高く維持したまま長期間に亘って細胞を生きたまま保つことができる。マトリックスと生細胞の混合物中における生細胞の密度は、特に限定されないが、通常１０５個／ｍｌ〜１０９個／ｍｌ程度であり、好ましくは、１０７個／ｍｌ〜１０８個／ｍｌ程度である。また、生細胞の総数は、生細胞の種類や、求める人工臓器の性能等に応じ適宜選択されるが、例えば、肝細胞の場合、１０１０ないし４ｘ１０１０程度が適当である。
【００１１】
生細胞とマトリックスの混合物は、外部との液体の流出入が可能な収納体に収納される。収納体の好ましい形態として中空繊維膜を例示することができる。すなわち、中空繊維膜の内側（すなわち、繊維の内側の中空部分）又は外側に生細胞とマトリックスの混合物を充填する。この場合、中空繊維膜の分画分子量は、細胞が流出せず、かつ、体液の流出入が円滑に行われる大きさであり、すなわち、数万〜１００万ダルトン程度が好ましく、特に好ましくは約１０万ダルトン程度である。また、中空繊維膜の内径は特に限定されないが２５０〜３５０μｍ程度が好ましく、また、長さも特に限定されないが通常１００〜３５０ｍｍ程度である。また、中空繊維膜の材質は、体液に対して有害な作用を行うものでなければいずれのものであってもよく、例えばポリスルホン、ポリエステル等を挙げることができることができるがこれらに限定されるものではない。このような中空繊維膜に生細胞／マトリックス混合物を充填したものを数百本ないし数千本束ね、液体流入口と液体流出口とを具備するカートリッジに収納することが好ましい。なお、上記の物理的特性を有する中空繊維膜を数百本ないし数千本束ね、液体流入口と液体流出口とを具備するカートリッジに収納したものは、人工透析装置として市販されており、本発明では、このような市販の人工透析装置を人工臓器の収納体として好ましく利用することができる。
【００１２】
なお、収納体は、上記のような中空繊維膜に限定されるものではなく、例えば袋状の平膜や、通常の容器のような形態であってもよく、要するに前記マトリックス／生細胞混合物を収容して、これに体液を接触させ、かつ接触後の体液を取出せる構造になっているものは全て本発明の範囲に含まれる。
【００１３】
本発明の人工臓器は、上記マトリックスを構成する物質（以下、「マトリックス物質」ということがある）の溶液と、生細胞の懸濁液を混合し、この混合液を上記収納体に充填することにより製造することができる。マトリックス物質の溶液の溶媒としては、マトリックス物質を溶解することができ、生細胞に悪影響を与えないものならばいずれのものでも用いることができ、好ましい例として、培養液、生理食塩水、緩衝液等を挙げることができる。また、マトリックス物質溶液中のマトリックス物質の濃度は特に限定されないが、０．１〜１．５w/v％程度が好ましく、特には約１w/v％程度が好ましい。一方、生細胞の懸濁液の溶媒としては、生理食塩緩衝液等、生細胞の懸濁に常用されているものを用いることができる。生細胞懸濁液中の細胞密度は、特に限定されないが１０５〜１０９個／ｍｌ程度が好ましく、さらに好ましくは、１０７〜１０８個／ｍｌ程度である。マトリックス物質溶液と生細胞懸濁液との混合比率は、上記した好ましい生細胞密度を達成するように選択される。収納体が中空繊維膜である場合には、マトリックス物質溶液と生細胞懸濁液との混合物を中空繊維の中空部分に流し込み、３７℃で放置することにより、マトリックス物質がゲル化してゲル状のマトリックス中に生細胞が分散したものが得られる。
【００１４】
本発明の人工臓器の好ましい使用態様の１例を図１に基づいて説明する。患者の大腿動脈からポンプ１０により血液を抜き出してプラズマセパレーター１２に導き、血球成分と血漿に分離する。ポンプ１０による送液速度は６０〜１５０ｍｌ／分が好ましい。血漿成分をポンプ１４により熱交換器１６に導く。ポンプ１４の送液速度は３０ｍｌ／分程度が好ましい。熱交換器１６は、血漿の温度をヒトの体温（３７℃）に維持するために用いられる。血漿は次いで、熱交換器１６に隣接して設けられているオキシゲネーター１８に導かれ、ここで酸素を供給される。酸素の供給は、生細胞の生存にとって有利であるが、必須的ではない。オキシゲネーター１８を通った血漿は本発明の人工臓器２０に導かれ、マトリックス中に保持された生細胞と接触する。図示の人工臓器２０は、多数の中空繊維膜の中空部分にマトリックス／生細胞混合物を充填したものを、液体流入口２２と液体流出口２４とを具備するカートリッジに収納したものである。マトリックス／生細胞混合物が中空繊維膜に充填されている場合には、生細胞との接触を十分に確保するために、血漿を中空繊維膜の内側の中空部分に導き、中空繊維膜の側面にある多数の孔から流出してきた処理後の血漿を液体流出口２４から送り出すようにすることが好ましい。液体流出口２４から送り出された処理後の血漿は、プラズマセパレーター１２で分離された血球成分と合流して患者の体内に戻される。なお、人工臓器の使用態様は上記のものに限定されるものではなく、例えば、体内に埋め込むタイプも可能である。
【００１５】
本発明の人工臓器は、当該臓器の機能が低下し又は喪失された患者の当該臓器の補助又は代行を行うために利用することができる。例えば、生細胞が肝細胞の場合、本発明の人工臓器を用いることにより、劇症肝炎や術後肝不全のような重篤な肝疾患患者の生命を維持することができる。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例に限定されるものではない。
【００１７】
実施例１
(1)  人工肝臓の作製
体重２０ｋｇのブタ（雄、２０週齢）を畜殺し、肝臓を摘出した。脱血後、コラーゲナーゼ処理を行い、肝細胞を分散した。これを遠心して、緩衝液にて数回洗浄した。ラミニン、コラーゲンIV混合液（２：１）１．３％（w/v）１００ｍｌを洗浄した肝細胞懸濁液（溶媒：培養液）１００ｍｌと混合し、ホモゲナイズした。該混合物（２００ｍｌ）中の肝細胞の数は２×１０１０個であった。この混合物を市販の人工透析装置の中空繊維内に加圧しながら封入した。この市販の人工透析装置は、分画分子量１０万ダルトン、内径２６０μｍ、肉厚７５μｍ、長さ１８０ｍｍのポリスルホン中空繊維膜２５０本を直径５ｃｍ、長さ２０ｃｍのカートリッジに収納したものである。
【００１８】
一方、比較のため、マトリックス物質のみを変えて上記と同じ方法により、市販のプラスチック（ポリウレタン）（比較例１）、コラーゲンＩ（比較例２）、ＰＶＬＡ（比較例３）をマトリックス物質とする人工肝臓を作製した。
【００１９】
(2)  人工肝臓の性能評価
体重２５ｋｇのブタ（雄、２７週齢）を開腹し、肝動脈を結索、門脈と下大静脈を縫合した。これを肝不全モデルとして使用した。このブタの大腿動脈を図１に示す体外血液循環装置（人工臓器として、実施例１又は比較例１、２若しくは３の人工肝臓を具備する）に連結し、図１に基づいて先に説明した方法により、血液の処理を行った。
【００２０】
血液処理開始後１日、４日、９日に人工肝臓中の肝細胞の一部をサンプリングし、細胞中のアルブミン及びβ−アクチンのｍＲＮＡ量を常法であるノーザン分析により定量し、アルブミンｍＲＮＡ／β−アクチンｍＲＮＡの比率を計算した。結果を図２に示す。
【００２１】
β−アクチンｍＲＮＡは平面培養で最も高い値を示すことが知られており、これを分母としてアルブミンｍＲＮＡ量を分子とする比率をとることにより、肝細胞の活力の指標とすることができる。図２から明らかなように、本発明の人工肝臓を用いた場合には、血液処理開始後９日目においても、肝細胞は高い活力を維持しているのに対し、本発明で規定されるマトリックス以外のマトリックスを用いた比較例１〜３の人工肝臓では、肝細胞の活力が血液処理開始後１日から既に低く、９日後にはほとんど機能していないことがわかる。
【００２２】
実施例２、比較例４〜７
(1)  人工肝臓の作製
肝細胞がラット由来であり、マトリックス物質溶液と肝細胞懸濁液の混合物の量が２５ｍｌである（従って、肝細胞の総数は２．２５×１０９個）であることを除き、実施例１と同様の方法により人工肝臓を調製した（実施例２）。また、比較のため、マトリックス物質としてＰＶＬＡ（比較例４）、コラーゲンゲルサンドイッチ（肝細胞をコラーゲンゲルでサンドイッチ状に挟んだもの）（比較例５）、コラーゲンゲル（比較例６）、コラーゲンで市販のプラスチック（ポリウレタン）をコーティングしたもの（比較例７）を用いて同様に人工肝臓を作製した。
【００２３】
(2)  人工肝臓の性能評価
作製された人工肝臓を、実施例１と同じ体外血液循環システムに組み入れ、実施例１と同様な肝不全モデルブタを用いて血液処理を行った。血液処理開始１日〜２２日後に、処理後の血漿中のアルブミン量（すなわち、肝細胞による分泌アルブミン量）を、市販の血清アルブミン抗体を用いた免疫測定法により定量した。結果を図３に示す。
【００２４】
アルブミンの分泌は肝細胞の重要な機能である。本発明の人工肝臓では、肝細胞のアルブミン分泌量が血液処理開始１６日以降も高く維持されているのに対し、比較例の人工肝臓では、血液処理開始１６日以降は、最も高い比較例５のものでも本発明の半分以下である。よって、本発明によれば、肝細胞の能力を高く維持したまま、肝細胞を長期間に亘って維持できることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の人工臓器の好ましい使用態様の１例を示す模式図である。
【図２】本発明及び比較例の人工肝臓における、血液処理開始後の日数と、肝細胞中にアルブミンｍＲＮＡ／β−アクチンｍＲＮＡ比の関係を示す図である。
【図３】本発明及び比較例の人工肝臓における、血液処理開始後の日数と、肝細胞により分泌されたアルブミン量の関係を示す図である。
【符号の説明】
【００２６】
１０  ポンプ
１２  プラズマセパレーター
１４  ポンプ
１６  熱交換器
１８  オキシゲネーター
２０  人工臓器
２２  人工臓器の液体流入口
２４  人工臓器の液体流出口
【図１】
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【図２】
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【図３】
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