(57)【要約】【課題】  本発明はインターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進する補助剤をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明の方法は、  ａ）上記補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない、細胞と核酸アジュバントの系において、当該細胞を核酸アジュバントと、補助剤候補化合物を共に又は無しでインキュベートし；そして  ｂ−１）補助剤候補化合物の存在により、核酸アジュバントがエンドソーム小胞に細胞内移動したことを確認する、あるいは  ｂ−２）補助剤候補化合物の存在により、ＩＦＮ−α／βの発現が誘導されたことを確認する  ｃ）工程ｂ−１）又はｂ−２）において、核酸アジュバントのエンドソーム小胞への移動またはＩＦＮ−α／βの発現誘導が確認された場合に、上記化合物を有効な補助剤と判断することを含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進する補助剤をスクリーニングする方法であって、
ａ）上記補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない、細胞と核酸アジュバントの系において、当該細胞を核酸アジュバントと、補助剤候補化合物を共に又は無しでインキュベートし；そして
ｂ−１）補助剤候補化合物の存在により、核酸アジュバントがエンドソーム小胞に細胞内移動したことを確認する、あるいは
ｂ−２）補助剤候補化合物の存在により、ＩＦＮ−α／βの発現が誘導されたことを確認する
ｃ）工程ｂ−１）又はｂ−２）において、核酸アジュバントのエンドソーム小胞への移動またはＩＦＮ−α／βの発現誘導が確認された場合に、上記化合物を有効な補助剤と判断する
ことを含む、上記スクリーニング方法。
【請求項２】
補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない系における細胞が、コンベンショナル樹状細胞（ｃＤＣ）、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）、ＲＡＷ細胞、マクロファージ、ヒト末梢血由来細胞、及び線維芽細胞からなる群から選択される、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない系における核酸アジュバントが、非自己と認識される核酸である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
核酸アジュバントが、非メチル化ＣｐＧ  オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）、一本鎖ＲＮＡ、並びに不活性化ウイルス又は細菌からの核酸抽出物からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
核酸アジュバントが、塩基配列ｇｇｔｇｃａｔｃｇａｔｇｃａｇｇｇｇｇｇを有するＣｐＧ−Ａ、ポリウリジル酸、塩基配列ｔｃｇｔｃｇｔｔｃｇａａｃｇａｃｇｔｔｇａｔを有するＣｐＧ−Ｃ、及び塩基配列ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｔｇｃｔ若しくはｔｃｃａｔｇｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｇｃｇｔｔを有するＣｐＧ−Ｂからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ−１）において、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）、ＭｙＤ８８、インターフェロン制御因子７（ＩＲＦ−７）又はデキストランと核酸アジュバントの細胞内共局在が観察される場合に、核酸アジュバントがエンドソーム小胞へ移動したと確認する、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ−２）において、ＩＦＮ−α／βの発現誘導を、細胞中のＩＦＮ−α／βのｍＲＮＡ、あるいは細胞培養上清中のＩＦＮ−α／βのタンパク質の濃度を測定することによって確認する、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法によって得られた、インターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進する補助剤。
【請求項９】
インターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進する補助剤を含む、上記補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない、細胞と核酸アジュバントの系において、ＩＦＮ−α／βの発現誘導を促進する、免疫促進剤。
【請求項１０】
インターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進する補助剤が、陽イオン性脂質である、請求項９に記載の免疫促進剤。
【請求項１１】
インターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進する補助剤が、１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）である、請求項９又は１０に記載の免疫促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進する補助剤をスクリーニングする方法、並びに当該スクリーニング方法によって得られた新規補助剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）あるいはＴｏｌｌ様受容体７、８（ＴＬＲ７、ＴＬＲ８）の活性化の結果、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｃ  ｃｅｌｌ（ｐＤＣ））において、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／β）が高レベルで発現される（非特許文献１−６）。この誘導は、ＭｙＤ８８−ＩＲＦ７シグナル伝達経路に依存すると考えられる；しかしながら、ｐＤＣがどのようにそしてなぜこの経路を活性化するのか、そして、なぜ通常の樹状細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＤＣ（ｃＤＣ）のような他の細胞では活性化しないのか、解明されていない。
【０００３】
ｐＤＣにおけるＴＬＲ７、８、９−依存性ＩＦＮ−α／β誘導経路は、ＤＮＡアジュバントにより誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答において重要な側面を構成する。そして、この誘導はＭｙＤ８８と相互作用する転写因子ＩＲＦ−７が活性化されることによって生じる（非特許文献１１、１２）。この発見から、同じＴＬＲ９リガンドに対する応答として、何故ｐＤＣは大量のＩＦＮを産生するが、他の細胞型、例えば通常のＤＣ（ｃＤＣ）は産生しないのか、という興味深い、解明されていない疑問が生じる。ｐＤＣは他の細胞と比較して高レベルのＩＲＦ−７を発現するという仮説が提案されているが（非特許文献６、１３、１４）、このモデルをサポートする実験証拠はほとんど得られていない。
【０００４】
一方、ＴＬＲ９を活性化するリガンドとして２つのクラスの非メチル化ＣｐＧモチーフを含む合成ＯＤＮ、ＣｐＧ−Ａ（「Ｄ型ＯＤＮ」とも名称付けられている）、及びＣｐＧ−Ｂ（「Ｋ型ＯＤＮ」とも名称付けられている）が知られているが、これらはｐＤＣ及びｃＤＣから異なる応答を導く。即ち、ｐＤＣをＣｐＧ−Ａで刺激した場合のみ、効率的に高レベルのＩＦＮ−α／β産生が誘導される（非特許文献７−１０，１５）。ｐＤＣをＣｐＧ−Ｂで刺激してもＩＦＮ−α／βはほとんど産生されない。また、ｃＤＣでは、ＣｐＧ−Ａ及びＣｐＧ−Ｂのいずれで刺激した場合もＩＦＮ−α／β産生は誘導されない。しかしながら、これらの現象が知られているにもかかわらず、ｐＤＣにおいてＣｐＧ−Ａで刺激した場合に高レベルのＩＦＮ−α／β産生が誘導されるメカニズムは知られていない。
【０００５】
インターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導のメカニズムの解明、並びに、ＩＦＮ−α／βの発現を制御できるような補助剤の開発が希求されている。
【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｄｏｗａｋｉ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．１９４，  ８３３−８３９  （２００１）
【非特許文献２】Ｌｕｎｄ，  Ｊ．，  Ｓａｔｏ，  Ａ．，  Ａｋｉｒａ，  Ｓ．，  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｉｗａｓａｋｉ，  Ａ．  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−２  ｂｙ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９８，  ５１３−５２０  （２００３）
【非特許文献３】Ｈｅｍｍｉ，  Ｈ．，  Ｋａｉｓｈｏ，  Ｔ．，  Ｔａｋｅｄａ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ａｋｉｒａ，  Ｓ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９，  ＭｙＤ８８，  ａｎｄ  ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ＣｐＧ  ＤＮＡｓ  ｏｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７０，  ３０５９−３０６４  （２００３）
【非特許文献４】Ｋｒｕｇ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｍｕｒｉｎｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９．  Ｂｌｏｏｄ  １０３，  １４３３−１４３７  （２００４）
【非特許文献５】Ｋｒｕｇ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  ＴＬＲ９−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＣＭＶ  ｂｙ  ＩＰＣ  ａｎｄ  ＤＣ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｈａｔ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２１，  １０７−１１９  （２００４）
【非特許文献６】Ｃｏｌｏｎｎａ，  Ｍ．，  Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｌｉｕ，  Ｙ．  Ｊ．  Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５，  １２１９−１２２６  （２００４）
【非特許文献７】Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ，  Ｄ．，  Ｉｓｈｉｉ，  Ｋ．  Ｊ．，  Ｇｕｒｓｅｌ，  Ｍ．，  Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｋｌｉｎｍａｎ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ＣＰＧ  ｍｏｔｉｆｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６，  ２３７２−２３７７  （２００１）
【非特許文献８】Ｋｒｕｇ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＦＮ−α／β ｉｎ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３１，  ２１５４−２１６３（２００１）
【非特許文献９】Ｋｒｉｅｇ，  Ａ．  Ｍ．  ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０，  ７０９−７６０  （２００２）
【非特許文献１０】Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ，  Ｄ．  ａｎｄ  Ｚｅｕｎｅｒ，  Ｒ．  Ａ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ＣｐＧ  ＤＮＡ  ｉｎ  ＤＣｓ  ａｎｄ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ：  ｎｏｔ  ｊｕｓｔ  ＴＬＲ９．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４，  ５１９−５２２  （２００３）
【非特許文献１１】Ｈｏｎｄａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎａｌ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ＭｙＤ８８  ａｎｄ  ＩＲＦ−７  ｉｎ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １０１，  １５４１６−１５４２１  （２００４）
【非特許文献１２】Ｋａｗａｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＲＦ７  ｗｉｔｈ  ＭｙＤ８８  ａｎｄ  ＴＲＡＦ６．  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５，  １０６１−１０６８（２００４）
【非特許文献１３】Ｉｚａｇｕｉｒｒｅ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＩＲＦ  ａｎｄ  ＩＦＮ−α ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  ７４，  １１２５−１１３８  （２００３）
【非特許文献１４】Ｋｅｒｋｍａｎｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＣｐＧ−Ａ  ａｎｄ  ＣｐＧ−Ｂ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７０，  ４４６５−４４７４  （２００３）
【非特許文献１５】Ｋｒｉｅｇ，  Ａ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｄｉｒｅｃｔ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３７４，  ５４６−５４９  （１９９５）
【非特許文献１６】Ｌａｔｚ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  ＴＬＲ９  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＥＲ  ｔｏ  ＣｐＧ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｙｓｏｓｏｍｅ．  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５，  １９０−１９８  （２００４）
【非特許文献１７】Ｈａｃｋｅｒ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  ＣｐＧ−ＤＮＡ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｓｔｒｅｓｓ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｓ  ｐｒｅｃｅｄｅｄ  ｂｙ  ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １７，  ６２３０−６２４０  （１９９８）
【非特許文献１８】Ｈｅｉｌ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｖｉａ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ７  ａｎｄ  ８．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，  １５２６−１５２９  （２００４）
【非特許文献１９】Ｈａｔａ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ＩＦＮ−α／β  ｓｉｇｎａｌ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＩＦＮ−  α／  β  ｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｖｉｒｕｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２８５，  ５１８−５２５  （２００１）
【非特許文献２０】Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｓｔｅｎｍａｒｋ，  Ｈ．  Ｔｈｅ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５，  ３１７−３２３  （２００４）
【非特許文献２１】Ｍａｘｆｉｅｌｄ，  Ｆ．  Ｒ．  ａｎｄ  ＭｃＧｒａｗ，  Ｔ．  Ｅ．  Ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５，  １２１−１３２  （２００４）
【非特許文献２２】Ｗａｇｎｅｒ，  Ｈ．，  Ｈｅｉｔ，  Ａ．，  Ｓｃｈｍｉｔｚ，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｂａｕｅｒ，  Ｓ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｐｌｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５，  ５３８−５４２  （２００４）
【非特許文献２３】Ａｓｓｅｌｉｎ−Ｐａｔｕｒｅｌ，  Ｃ．，  Ｂｒｉｚａｒｄ，  Ｇ．，  Ｐｉｎ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｂｒｉｅｒｅ，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，  Ｇ．  Ｍｏｕｓｅ  ｓｔｒａｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７１，  ６４６６−６４７７  （２００３）
【非特許文献２４】Ｓａｔｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ａｎｄ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ＩＲＦ−３  ａｎｄ  ＩＲＦ−７  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｒ  ＩＦＮ−  α／  β ｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３，  ５３９−５４８  （２０００）
【非特許文献２５】Ｈｏｎｄａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＦＮ−α／β ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｏｒ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １００，  １０８７２−１０８７７  （２００３）
【非特許文献２６】Ｎａｇａｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０，  ８７−９０  （２００２）
【非特許文献２７】Ｄｉｅｂｏｌｄ，  Ｓ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｎｏｎ−ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｈｉｇｈ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４２４，  ３２４−３２８  （２００３）．
【非特許文献２８】Ｍａｔｓｕｙａｍａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＲＦ−１  ｏｒ  ＩＲＦ−２  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮ  ｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｃｅｌｌ  ７５，  ８３−９７  （１９９３）
【非特許文献２９】Ｋｉｎｍａｎ，  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４，  ２４９−２５９  （２００４）
【非特許文献３０】Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１４４−１１５０，２００１
【非特許文献３１】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  ｖｏｌ．１９４，ｐｐ．１１７１−１１７８，２００１
【非特許文献３２】Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｖｏｌ．２８４，ｐｐ．１８３５−１８３７，１９９９
【非特許文献３３】Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．４０８，ｐｐ．７４０−７４５，２０００
【非特許文献３４】Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ｖｏｌ．４５，ｐｐ．３３２−３３９，１９９７
【非特許文献３５】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，  ｖｏｌ．１７，ｐｐ．５７４８−５７５７，１９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、インターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進する補助剤をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
本発明の方法は、
ａ）上記補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない、細胞と核酸アジュバントの系において、当該細胞を核酸アジュバントと、補助剤候補化合物を共に又は無しでインキュベートし；そして
ｂ−１）補助剤候補化合物の存在により、核酸アジュバントがエンドソーム小胞に細胞内移動したことを確認する、あるいは
ｂ−２）補助剤候補化合物の存在により、ＩＦＮ−α／βの発現が誘導されたことを確認する
ｃ）工程ｂ−１）又はｂ−２）において、核酸アジュバントのエンドソーム小胞への移動またはＩＦＮ−α／βの発現誘導が確認された場合に、上記化合物を有効な補助剤と判断する
ことを含む。
【０００８】
本発明の方法において、補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない系における細胞は、好ましくは、コンベンショナル樹状細胞（ｃＤＣ）、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）、ＲＡＷ細胞、マクロファージ、ヒト末梢血由来細胞、及び線維芽細胞からなる群から選択される。
【０００９】
本発明の方法において、補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない系における核酸アジュバントは、好ましくは、非自己と認識される核酸である。
本発明の一態様において、工程ｂ−１）において、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）、ＭｙＤ８８、インターフェロン制御因子７（ＩＲＦ−７）又はデキストランと核酸アジュバントの細胞内共局在が観察される場合に、核酸アジュバントがエンドソーム小胞へ移動したと確認してもよい。あるいは、本発明の一態様において、工程ｂ−２）において、ＩＦＮ−α／βの発現誘導を、細胞中のＩＦＮ−α／βのｍＲＮＡ、あるいは細胞培養上清中のＩＦＮ−α／βのタンパク質の濃度を測定することによって確認してもよい。
【００１０】
本発明はまた、本発明のスクリーニング方法によって得られた、インターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進する、補助剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記問題の解決のために鋭意研究に努めた結果、ｐＤＣにおいてＩＦＮ−α／βを強く誘導することが知られている、ＴＬＲ９リガンドであるＡ／Ｄ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）（ＣｐＧ−Ａ）（非特許文献７−１０）が、ｐＤＣのエンドソーム小胞に長時間留まることを見出した。さらに、ＯＤＮがエンドソーム小胞内でＭｙＤ８８と相互作用するＩＲＦ−７と共在することを発見した。これに対し、ｃＤＣ及びＲＡＷ２６４．７マクロファージでは、ＣｐＧ−Ａは迅速にリソソーム小胞に輸送されることも明らかとなった（実施例１、２）。こうした核酸アジュバントの精巧な時間的空間的細胞内輸送制御によって、様々な病原体関連核酸に対し、細胞又は核酸の種類によって、異なる応答が誘導されると考えられる。
【００１２】
本発明者らは上記核酸アジュバントの時空間制御の重要性の発見に基づき、ｃＤＣにおいてもｐＤＣの場合と同様に、ＣｐＧ−Ａがエンドソームに長時間留まるようにＣｐＧ−Ａを操作すれば、ｃＤＣにおいても大量のＩＦＮを産生できるのではないか、と考えた。実際に、ＣｐＧ−Ａの操作、具体的には陽イオン脂質の一種である、１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）と複合体を形成させることにより、ｃＤＣにおいてもｐＤＣにおいても、ＣｐＧ−Ａはエンドソームに長時間留まり、かつ大量のＩＦＮが産生されることが確認された。これにより、エンドソームにおいてＭｙＤ８８−ＩＲＦ−７シグナルが持続することが、大量のＩＦＮ−α／βを産生するというｐＤＣの特有の能力を決定づけるものであることが明らかにされた（実施例３）。同様に、ＲＡＷ２６４．７細胞でもＤＯＴＡＰ／ＣｐＧにより大量のＩＦＮ−α／βの産生が観察された（実施例４）。
【００１３】
また、ｐＤＣについても、ＣｐＧ−Ｂ（「Ｋ型ＯＤＮ」）で刺激した場合は、ＣｐＧ−Ａの場合と異なり、ＩＦＮ−α／βはほとんど産生されないことが知られていた。本発明者は、ｃＤＣとＣｐＧ−Ａとの組み合わせの系の場合と同様に、ｐＤＣとＣｐＧ−Ｂの系にＤＯＴＡＰを共在させた場合は、ＩＦＮ−αの発現の上昇が観察されることを見出した（実施例５）。
【００１４】
本発明は上記発見に基づき、上記補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない、細胞と核酸アジュバントの系を用いて、ＤＯＴＡＰと同様の機能を有する補助剤、即ち、ＣｐＧ−Ａ、ＣｐＧ−Ｂを含む核酸アジュバントの細胞内輸送を制御し、インターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進するような補助剤、をスクリーニングする方法を見出し、本発明を想到した。
【００１５】
インターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進する補助剤をスクリーニングする方法
よって、本発明はインターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進する補助剤をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法は、
ａ）上記補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない、細胞と核酸アジュバントの系において、当該細胞を核酸アジュバントと、補助剤候補化合物を共に又は無しでインキュベートし；そして
ｂ−１）補助剤候補化合物の存在により、核酸アジュバントがエンドソーム小胞に細胞内移動したことを確認する、あるいは
ｂ−２）補助剤候補化合物の存在により、ＩＦＮ−α／βの発現が誘導されたことを確認する
ｃ）工程ｂ−１）又はｂ−２）において、核酸アジュバントのエンドソーム小胞への移動またはＩＦＮ−α／βの発現誘導が確認された場合に、上記化合物を有効な補助剤と判断する
ことを含む。
【００１６】
本発明は、核酸アジュバントの時空間制御の重要性の発見に基づき、補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない、細胞と核酸アジュバントの系を用いることにより、核酸アジュバントの細胞内輸送を制御し、インターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進するような補助剤、をスクリーニングする方法を提供するものである。
【００１７】
Ｉ）補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない、細胞と核酸アジュバントの系における細胞
本発明のスクリーニング方法において使用しうる細胞は、核酸アジュバントとの組み合わせの系において、補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない細胞を意味し、細胞の種類および由来は特に限定されず、公知の培養細胞、動物生体内の細胞等を使用することができる。好ましくは培養細胞を使用する。培養細胞を用いる場合には、例えば、培養細胞を核酸アジュバントと補助剤候補化合物との複合体とともにインキュベーションし、細胞からのＩＦＮ産生応答を観察する。あるいは、動物生体内の細胞を用いる場合には、核酸アジュバントと補助剤候補化合物とを、例えば静脈注射などにより動物生体内に投与し、細胞からのＩＦＮ産生応答を観察することも可能である。
【００１８】
同じ細胞でも、共に使用する核酸アジュバントの種類によって、補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない場合と、する場合とがある。「核酸アジュバントとの組み合わせの系において」とは、補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない、細胞と核酸のアジュバントの系であれば、その組み合わせにおいて本発明のスクリーニング方法に使用しうることを意味する。例えば、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）は、ＣｐＧ−Ａと組み合わせて使用した場合には補助剤の非存在下でもＩＦＮ−α／βの発現を誘導する。しかし、ＣｐＧ−Ｂと組み合わせた場合には誘導しない。よって、ｐＤＣとＣｐＧ−Ｂの系は、本発明の方法に使用しうる。
【００１９】
補助剤の存在により、免疫系に関わる細胞に限らず、他の体細胞などでもＩＦＮ−α／βの発現を誘導が可能となる。よって、本発明の方法に使用しうる細胞は特に限定されず、「核酸アジュバントとの組み合わせの系において、補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない」という条件を満たす限り、あらゆる細胞が使用しうる。本発明の細胞は、好ましくは、コンベンショナル樹状細胞（ｃＤＣ）、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）、ＲＡＷ細胞（例えば、ＲＡＷ２６４．７細胞）、マクロファージ、ヒト末梢血由来細胞、及び線維芽細胞からなる群から選択される。これらの細胞は公知であり、例えば、本明細書中の実施例に記載の方法、あるいは、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  ２，  ｐｐ．１１４４−１１５０，  ２００１；  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ｖｏｌ．  １９４，  ｐｐ．１１７１−１１７８，  ２００１；  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｖｏｌ．  ２８４，  ｐｐ．  １８３５−１８３７，  １９９９等の文献に記載の公知の方法に従って、当業者が容易に入手することが可能である。
【００２０】
ＣｐＧ−Ａのような核酸アジュバントの存在のみでＩＦＮ−α／βの発現誘導が生じるプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）との比較が明確かつ容易であることから、コンベンショナル樹状細胞（ｃＤＣ）が好ましい。あるいは、入手及び取扱いの容易性からＲＡＷ細胞、特にＲＡＷ２６４．７細胞も好ましい。また、ＣｐＧ−Ｂのような核酸アジュバント単独ではＩＦＮ−α／βの発現が誘導されないｐＤＣも、陽性コントロールのＣｐＧ−ＡとｐＤＣとを組み合せた陽性コントロールの系と対比解析しやすいことから、該ＣｐＧ−Ｂのような核酸アジュバントとの組み合わせにおいては好ましい細胞である。
【００２１】
ＩＩ）核酸アジュバント
本発明のスクリーニング方法において使用しうる核酸アジュバントは、細胞との組み合わせの系において、補助剤の非存在下では当該細胞におけるＩＦＮ−α／βの発現を誘導しないが、補助剤の存在下では発現を誘導しうる、核酸を意味する。例えば、ＣｐＧ−Ａはコンベンショナル樹状細胞（ｃＤＣ）に使用した場合、補助剤の非存在下ではｃＤＣにおいてＩＦＮ−α／βの発現を誘導しないが、補助剤（１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ））の存在下では発現を誘導することが、本発明において明らかにされた。よって、ＣｐＧ−Ａは、例えばｃＤＣとの組み合わせにおいて本発明の方法に使用しうる。また、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）は、ＣｐＧ−Ｂと組み合わせた場合には、補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しないが、補助剤が存在した場合に初めて誘導することがみいだされた。よって、ｐＤＣとＣｐＧ−Ｂの系も、本発明の方法に使用しうる。
【００２２】
核酸の種類、配列等は特に限定されない。好ましくは、細胞によって非自己と認識される核酸である。「非自己として認識される」とは、より具体的には、哺乳動物の細胞において非自己と認識されうる、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、或いは哺乳類より下等な生物のゲノム由来核酸を意味する。
【００２３】
本発明の方法に使用しうる核酸アジュバントは、例えば、非メチル化ＣｐＧ  オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ、並びに不活性ウイルス又は細菌からの核酸抽出物等を含む。好ましくは、非メチル化ＣｐＧ  オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）又は一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ、より好ましくは、ＣｐＧ  ＯＤＮである。これらの核酸アジュバントは、例えば、本明細書中の実施例に記載の方法、あるいは、公知の核酸合成方法を用いて容易に作製することが可能である。
【００２４】
非メチル化ＣｐＧ  オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）とは、単一又は複数の非メチル化ＣｐＧモチーフを核酸分子内（５’末端又は３’末端でない）に有する、オリゴデオキシヌクレオチドである。本発明の方法に使用し得るＣｐＧ  ＯＤＮは、細胞との組み合わせの系において、補助剤の非存在下では当該細胞におけるＩＦＮ−α／βの発現を誘導しないが、補助剤の存在下では発現を誘導しうる、という性質を有することが望ましい。ただし、ＣｐＧ  ＯＤＮは、別の特定の細胞との組み合わせの系では、補助剤の非存在下でも、ＩＦＮ−α／βの発現誘導を促進する活性を有するものであってもよい。例えば、後述するＣｐＧ−Ａは、例えばｃＤＣとの組み合わせにおいては補助剤の存在下で初めてＩＦＮ−α／βの発現を誘導するが、ｐＤＣとの組み合わせにおいては、補助剤の非存在下でもＩＦＮ−α／βの発現を誘導する。よって、ｃＤＣ等のとの組み合わせにおいては、本発明の方法にＣｐＧ−Ａも好適に使用し得る。
【００２５】
本発明の方法に使用可能なＣｐＧ  ＯＤＮは、好ましくは、１８−２５のデオキシヌクレオチド、より好ましくは２０−２２のデオキシヌクレオチドからなり、好ましくはホスホジエステル／ホスホロチオエート混合骨格、あるいはホスホロチオエートの骨格を有する。本発明の方法に使用可能なＣｐＧ  ＯＤＮの例は、例えば、非特許文献７、２９、３、８、９、１０、１５等の文献に記載されている。
【００２６】
非メチル化ＣｐＧ  オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）の好ましい例は、例えば、非特許文献２９等に記載されたＣｐＧ−Ａ（「Ｄ型オリゴデオキシヌクレオチド」と呼称されることもある）、ＣｐＧ−Ｂ（「Ｋ型オリゴデオキシヌクレオチド」と呼称されることもある）、ＣｐＧ−Ｃである。これらのＣｐＧ  ＯＤＮは各々下記の塩基配列を有する。
【００２７】
ＣｐＧ−Ａ  （非特許文献７、２９）
ｇｇｔｇｃａｔｃｇａｔｇｃａｇｇｇｇｇｇ    （配列番号１）
対マウスＣｐＧ−Ｂ  （非特許文献１５）  （配列番号２）
ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｔｇｃｔ  
対ヒトＣｐＧ−Ｂ
ｔｃｃａｔｇｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｇｃｇｔｔ  （配列番号３）
ＣｐＧ−Ｃ  （非特許文献２９）
ｔｃｇｔｃｇｔｔｃｇａａｃｇａｃｇｔｔｇａｔ    （配列番号４）
【００２８】
ＣｐＧ−Ｂには、対マウスＣｐＧ−Ｂと対ヒトＣｐＧ−Ｂが知られている。本発明の方法において好ましくは、マウス細胞を使用する場合は対マウスＣｐＧ−Ｂを、ヒト細胞を使用する場合には対ヒトＣｐＧ−Ｂを使用する。
【００２９】
ＣｐＧ−Ａの構造上の特徴は以下の通りである。特に、ｉ）の特徴が細胞との組み合わせの系において、補助剤の非存在下では当該細胞におけるＩＦＮ−α／βの発現を誘導しないが、補助剤の存在下では発現を誘導しうる、という性質に重要である。また、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）等において、補助剤の非存在下でＩＦＮ−α／βの発現を誘導する。
【００３０】
ｉ）配列番号１の塩基８−９に非メチル化ＣｐＧモチーフを１つ有する。
ｉｉ）配列番号１の塩基３−１４にパリンドロームｔｇｃａｔｃｇａｔｇｃａを有する。上記塩基８−９に非メチル化ＣｐＧモチーフは、パリンドローム中に含まれる。
ｉｉｉ）配列番号１の塩基３−１５はホスホジエステル結合、その他の塩基はホスホロチオエート結合である、ホスホジエステル／ホスホロチオエート混合骨格を有する。
ｉｖ）３’末端に５塩基のＧからなるｐｏｌｙＧテイルを有する。
【００３１】
ＣｐＧ−Ｂの構造上の特徴は以下の通りである。特に、ｉ）の特徴が細胞との組み合わせの系において、補助剤の非存在下では当該細胞におけるＩＦＮ−α／βの発現を誘導しないが、補助剤の存在下では発現を誘導しうる、という性質に重要である。Ｂ細胞増殖、並びにＩｇＭ及びＩＬ−６産生の誘因となりうる。
【００３２】
ｉ）対マウスＣｐＧ−Ｂの場合は配列番号２の塩基８−９に非メチル化ＣｐＧモチーフを１つ、対ヒトＣｐＧ−Ｂの場合は配列番号３の塩基９−１０及び塩基１９−２０の２箇所に非メチル化ＣｐＧモチーフを有する。
ｉｉ）ホスホロチオエートの骨格を有する。
【００３３】
ＣｐＧ−Ｃの特徴は以下の通りである。特に、ｉ）の特徴が細胞との組み合わせの系において、補助剤の非存在下では当該細胞におけるＩＦＮ−α／βの発現を誘導しないが、補助剤の存在下では発現を誘導しうる、という性質に重要である。また、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）等において、補助剤の非存在下でＩＦＮ−α／βの発現を誘導する。
【００３４】
ｉ）配列番号４の塩基９−１０及び塩基１６−１７の２箇所に非メチル化ＣｐＧモチーフを有する。
ｉｉ）配列番号４の塩基２−１７にパリンドロームｃｇｔｃｇｔｔｃｇａａｃｇａｃｇ（パリンドローム１）、塩基１１−１９に別のパリンドロームａａｃｇａｃｇｔｔ（パリンドローム２）を有する。パリンドローム１は、上記塩基９−１０及び塩基１６−１７の２箇所の非メチル化ＣｐＧモチーフを含む。パリンドローム２は、塩基１６−１７の非メチル化ＣｐＧモチーフを含む。
ｉｉｉ）ホスホロチオエートの骨格を有する。
ｉｖ）５’末端にＴＣＧダイマーを有する。
【００３５】
あるいは、単一鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）もある種の細胞において、ＣｐＧ−Ａ等と同様に、ＩＦＮ−α／βの発現誘導を促進しうることが知られている。例えば、ヒト末梢血単核細胞はｓｓＲＮＡであるポリウリジル酸単独での刺激ではＩＦＮ−αを産生しないが、ポリウリジル酸とＤＯＴＡＰとの複合体により刺激すると、高レベルのＩＦＮ−αを産生することが報告された（非特許文献１１）。よって、このようなｓｓＲＮＡも本発明の方法に使用することが可能である。ｓｓＲＮＡの配列は特に限定されないが、好ましくは単一の塩基の繰り返し配列、例えばポリウリジル酸、を含む。ｓｓＲＮＡの配列の長さは特に限定されない。
【００３６】
あるいは、本発明の核酸アジュバントは、不活性化ウイルス又は細菌からの核酸抽出物であっってもよい。不活性化ウイルスとは、例えば、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、水泡性口炎ウイルス等のウイルスを、紫外線や熱処理等の処理により不活性化したものである。細菌は、例えば、大腸菌、結核菌等を含む。不活性化ウイルス又は細菌からの核酸の抽出は公知であり、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  ｖｏｌ．１９８，ｐｐ．５１３−５２０，２００３；Ｊ．Ｎ．Ｃ．Ｉ  ｖｉｌ．７２，ｐｐ．９５５−９６２，１９８４等の文献に記載の方法を使用することができる。
【００３７】
ＩＩＩ）工程ａ）について
本発明のスクリーニング方法は、先ず工程ａ）において、上記補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない、細胞と核酸アジュバントの系において、当該細胞を核酸アジュバントと、補助剤候補化合物を共に又は無しでインキュベートする。「補助剤候補化合物」は限定されないが、例えば、核酸アジュバントと複合体を形成する可能性のある物質から選択することが可能である。核酸は「−」の電荷を帯びているので、例えば、陽イオン性の物質は核酸と複合体を形成しやすい性質をもつと考えられる。例えば、陽イオン脂質は様々なものが市販されており、このような、公知の陽イオン脂質を補助剤候補化合物として、本発明のスクリーニング方法に供することが可能である。また、候補化合物全体として核酸との親和性を有する必要はなく、その一部位でも親和性を有していれば複合体を形成する可能性がある。例えば核酸に対し親和性を有する抗核酸抗体なども補助剤候補化合物として選択することが可能である。
【００３８】
補助剤候補化合物は核酸アジュバントと、例えば共有結合により複合体化させてもよく、あるいは、同時に細胞に投与するだけでもよい。補助剤候補化合物の核酸アジュバントの使用割合はモル比で、好ましくは１：１で使用する。核酸アジュバント及び補助剤候補化合物の濃度は細胞の種類、インキュベーション時間等の条件に応じて当業者が適宜適用できる。インキュベーションの条件（温度及び時間）は、使用する細胞の種類、補助剤候補化合物の種類等に応じて当業者が適宜選択可能である。限定されるわけはないが、例えば、室温で１０−１５分程度のインキュベーションを行ってもよい。
【００３９】
次いで、ｂ−１）補助剤候補化合物の存在により、核酸アジュバントがエンドソーム小胞に細胞内移動したことを確認する、あるいは
ｂ−２）補助剤候補化合物の存在により、ＩＦＮ−α／βの発現が誘導されたことを確認する。
【００４０】
ＩＶ）工程ｂ−１）について
工程ｂ−１）において、核酸アジュバントがエンドソーム小胞に細胞内移動したことの確認は、例えば、公知の方法を用いて核酸アジュバントの位置とエンドソーム小胞の位置とが細胞内で一致することを観察することによって行うことができる。
【００４１】
例えば、核酸アジュバントを先ず任意の蛍光分子、放射性物質、発光物質等で標識する。蛍光分子としては、例えば、シアニン５（Ｃｙ５）等のシアニン色素、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラメチル−６−カルボキシローダミン及びそれらの誘導体などの核酸分子を標識できる公知の蛍光分子を使用することができる。本明細書の実施例では、Ｃｙ５標識されたＣｐＧ−ＯＤＮｓをＳｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｉｓから購入して使用した。また、ＦＩＴＣ標識されたＣｐＧ−ＯＤＮｓをＨｏｋｋａｉｄｏ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅから購入して使用した。
【００４２】
蛍光分子の種類に応じて、本発明のヌクレオチドを含む核酸（の位置）を検出することが可能である。それぞれの物質によって蛍光色が異なるため、多重染色に使用することも可能である。核酸の検出は共焦点顕微鏡分析（例えば、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ−１０００共焦点顕微鏡）、蛍光顕微鏡検査（例えば、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７１倒立顕微鏡、等を用いて行うことが可能である。
【００４３】
放射性物質は、３５Ｓ、３２Ｐ、３Ｈ等の核酸を標識できる公知の物質を使用することができる。放射性物質の検出は公知の方法を用いて行うことができる。あるいは、核酸アジュバントの標識は核酸塩基をビオチン又はアビジンで修飾し、公知のビオチン−アビジン結合を用いて行ってもよい。
【００４４】
発光物質は、核酸を標識できる公知の発光物質を使用することができる。発光物質の検出は公知の方法を用いて行うことができる。
エンドソーム小胞の位置は、例えば、エンドソーム小胞を可視できる標識されたデキストラン、トランスフェリン等を用いて確認することができる。標識デキストランは、例えば、ＦＩＴＣ−又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７−標識されたデキストラン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を使用できる。あるいは、エンドソームに局在する蛋白質に蛍光蛋白質、例えばＧＦＰ誘導体等のタグを付けることによる同定法、特異的抗体を用いた免疫組織化学法による同定法なども使用可能である。
【００４５】
具体的には、本発明者らは、核酸アジュバントが、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）、ＭｙＤ８８、及びインターフェロン制御因子７（ＩＲＦ−７）の複合体（ＴＬＲ９−ＭｙＤ８８−ＩＲＦ７複合体）と結合しあるいは挙動を共にし、エンドソーム小胞へと細胞内移動すること、そして、ＴＬＲ９−ＭｙＤ８８−ＩＲＦ７複合体がエンドソームに安定して存在することが、インターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進するためのメカニズムとして重要であることを見出した。ＭｙＤ８８、ＩＲＦ７は核酸アジュバントの非存在下でもエンドソームで常時検出されうる、エンドソームに局在するタンパク質である。さらに、「デキストラン」は、α１→６結合を主体とする粘質性のグルカンであり、細胞内においてエンドソームに局在することが知られている。本発明者らは、核酸アジュバントが適切な補助剤の存在によりエンドソームに細胞内移動すると、デキストランと細胞内共局在することを見出した。
【００４６】
よって、本発明の一態様において、工程ｂ−１）において、核酸アジュバントのエンドソーム小胞への細胞内移動は、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８又はＩＲＦ−７のいずれか（ＴＬＲ９−ＭｙＤ８８−ＩＲＦ７複合体又はその構成部分）、あるいはデキストランと核酸アジュバントの細胞内共局在が観察される場合に、核酸アジュバントがエンドソーム小胞へ移動したと確認してもよい。
【００４７】
ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８又はＩＲＦ−７のいずれか（ＴＬＲ９−ＭｙＤ８８−ＩＲＦ７複合体又はその構成部分）の位置は、例えば、公知の遺伝子工学的手法を用いて調べることができる。例えば、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８又はＩＲＦ−７のいずれかの遺伝子と蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む形質転換ベクターで、本発明のスクリーニング方法に使用する細胞を宿主細胞として形質転換する。形質転換細胞内で、蛍光標識されたＴＬＲ９、ＭｙＤ８８又はＩＲＦ−７のいずれかのタンパク質が発現する。ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＦ−７の遺伝子はいずれも公知であり、例えば、文献Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．４０８，ｐｐ．７４０−７４５，２０００；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ｖｏｌ．４５，ｐｐ．３３２−３３９，１９９７；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，  ｖｏｌ．１７，ｐｐ．５７４８−５７５７，１９９７に各々記載されている。
【００４８】
ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８又はＩＲＦ−７タンパク質を、蛍光タンパク質との複合タンパク質として発現させると、ベクターを導入した細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体において蛍光を測定して検出することが可能である。蛍光蛋白質の例としては、好ましくは緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）若しくはその変異体である。ＧＦＰは発光クラゲ類の有する緑色蛍光蛋白質の総称である。オワンクラゲのＧＦＰは、約３９５ｎｍと４７０ｎｍの可視光より励起され約５０９ｎｍの緑色蛍光を発する。この蛍光には酸素以外に特別の因子を必要としない。外来遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を導入すると、蛍光を有する培養細胞、植物、線虫、ハエ、魚、マウスなどが得られるため、生きている細胞中で、発現を直接観察できる。さらに、ＧＦＰの変異体でより強い蛍光を発するＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、あるいは蛍光特性の異なるＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＦＰ（ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲＦＰ（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）等が開発されており、市販されている（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より入手可能）。本発明の方法では、蛍光の測定により、目的とする蛋白質の、細胞内局在、組織局在、又は時間的局在に関する情報を得ることが可能である。すなわち補助剤候補化合物の存在による、上記ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８又はＩＲＦ−７タンパク質の位置を蛍光タンパク質によって検出することが可能である。
【００４９】
または、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８又はＩＲＦ−７のいずれか（ＴＬＲ９−ＭｙＤ８８−ＩＲＦ７複合体又はその構成部分）の細胞内の位置は、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８又はＩＲＦ−７タンパク質と反応する抗体を用いて検出してもよい。ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８又はＩＲＦ−７タンパク質と反応する抗体は公知の方法を用いて作製し、検出に使用することができる。
【００５０】
ｃＤＣとＣｐＧ−Ａ等の、補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現誘導しない、細胞と核酸アジュバントの系において、補助剤の非存在下では核酸アジュバントがリソソームに細胞内移動されることが、本発明によって明らかにされた。よって、本発明の方法の好ましい態様において、補助剤候補化合物の非存在下では核酸アジュバントがリソソーム小胞に存在するが、補助剤候補化合物の存在により核酸アジュバントがエンドソーム小胞に細胞内移動することを確認することにより、補助剤をスクリーニングすることができる。リソソーム小胞の位置は、リソソーム小胞を可視化する、例えばＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｂｌｕｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）等の標識物質を用いて確認することができる。あるいは、リソソーム小胞に局在する蛋白質に蛍光蛋白質、例えばＧＦＰ誘導体等のタグを付けることによる同定法、特異的抗体を用いた免疫組織化学法による同定法なども使用可能である。
【００５１】
Ｖ）工程ｂ−２）について
工程ｂ−１）の代わりに、工程ｂ−２）において、ＩＦＮ−α／βの発現が誘導されたことを確認してもよい。ＩＦＮ−α／βの発現は、核酸アジュバントがエンドソーム小胞に細胞内移動したことに因ると考えられる。即ち、工程ｂ−２）では、補助剤候補化合物によるＩＦＮ−α／βの発現誘導の効果を直接観察する。ＩＦＮ−α／βの発現誘導は、例えば、細胞中のＩＦＮ−α／βのｍＲＮＡ、あるいは細胞培養上清中のＩＦＮ−α／βのタンパク質の濃度を測定することによって確認することができる。
【００５２】
ＩＦＮ−α／βのｍＲＮＡの発現量は、例えば、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ等の公知の定量ＰＣＲを用いて行うことができる。補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現誘導しない細胞からのＲＮＡの調製、並びにリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲは、例えば非特許文献２４に記載された方法に従って行うことができる。リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ等の装置及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）等を用いて行うことができる。ＩＦＮ−α／βのｍＲＮＡの発現量は、各個別試料中のＲＮＡ量をβ−アクチン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート  デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）等の標準的なｍＲＮＡの発現のレベルを基にデータを標準化することによって、相対量を求めることができる。本明細書中の後述の実施例では、β−アクチンのｍＲＮＡの発現量を１とし、その相対量としてＩＦＮ−α／βのｍＲＮＡの発現量を示した。ＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−β、β−アクチン、及びＩＲＦ−７のためのプライマーは、これらの遺伝子の公知の塩基配列から適宜選択することができる。例えば、非特許文献２５に記載されたものを使用することができる。ＩＦＮ−α／βのｍＲＮＡの発現量が、補助剤候補化合物の存在により有意に増加したとき、好ましくは、例えば１０倍以上増加したとき、候補化合物が補助剤として有効であると判断する。
【００５３】
あるいは、ＩＦＮ−α／βタンパク質の発現濃度を測定してもよい。ＩＦＮ−α／βタンパク質の発現濃度は、タンパク質の定量のための公知の方法を用いて行うことができる。例えば、ＩＦＮ−α又はβタンパク質と反応する抗体を用いたＥＬＩＳＡ、細胞内染色法等の公知の免疫化学的法を用いて、ＩＦＮ−α／βタンパク質の産生濃度を測定することができる。ＩＦＮ−α又はβタンパク質と反応する抗体は、例えば、非特許文献１、２、３、４、５、７、８、１１、１２等の文献に記載されている。あるいは、公知の方法を用いて作製してもよい。ＩＦＮ−α／βのタンパク質の発現濃度が、補助剤候補化合物の存在により有意に増加したとき、候補化合物が補助剤として有効であると判断する。
【００５４】
後述の実施例では特に記載しない限り、細胞を２×１０５細胞／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートに播き、種々の試薬で２４時間刺激した。上清中のＩＦＮ−α又はβタンパク質濃度をＥＬＩＳＡで測定した。マウスＩＦＮ−α及びＩＬ−１２ｐ４０のためのＥＬＩＳＡキットは、各々ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＴＥＣＨＮＥ  Ｃｏｒｐ．から購入したものを使用した。限定するわけではないが、例えば、上記条件でｃＤＣ細胞を用いて本発明のスクリーニング方法を実施した場合に、ＩＦＮ−αのタンパク質の発現濃度が、補助剤候補化合物の存在により有意に増加したとき、候補化合物が補助剤として有効であると判断する。
【００５５】
インターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進する補助剤
本発明はまた、本発明のスクリーニング方法によって得られた、インターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進する補助剤を提供する。本発明者らは、ＤＯＴＡＰ等の補助剤を核酸アジュバントともに使用すると、補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現誘導しない細胞においても、ＩＦＮ−α／βの発現誘導を促進できることを見出した。よって、本発明の補助剤はこのような細胞において、あるいはこのような細胞を含む生体内において、免疫応答の調節を可能にする。
【００５６】
本発明はさらにまた、このようなインターフェロン−α及び／又はβ（ＩＦＮ−α／β）の発現誘導を促進する補助剤を含む、上記補助剤の非存在下ではＩＦＮ−α／βの発現を誘導しない、細胞と核酸アジュバントの系において、ＩＦＮ−α／βの発現誘導を促進する、免疫促進剤を提供する。本発明の免疫促進剤において、補助剤は、限定されるわけではないが、好ましくは、正電荷性高分子（陽イオン性脂質及び陽イオン性ペプチド等）、並びに抗核酸抗体からなる群から選択される。より好ましくは、１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，３−ジ−オレオイロキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピラミド（ＤＯＳＰＥＲ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及び抗ＤＮＡ抗体からなる群から選択される。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００５８】
材料及び方法
本明細書中の実施例においては、特に言及しない限り、下記の材料及び方法を用いた。
１）試薬
合成オリゴヌクレオチドはＨｏｋｋａｉｄｏ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（札幌、日本）から購入した。
【００５９】
ＯＤＮの配列は下記の通りである；
ＣｐＧ−Ａ  （ＯＤＮ１９  非特許文献７）：
ｇｇＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡｇｇｇｇｇＧ；（配列番号１）
対マウスＣｐＧ−Ｂ  （ＯＤＮ１６６８、  非特許文献１５）：
ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｔｇｃｔ  （配列番号２）
及び
コントロールＧｐＣ  ＯＤＮ（コントロールＤ、  非特許文献７）
ｇｇＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡｇｇｇｇｇｇ  （配列番号５）。
【００６０】
なお、大文字及び小文字は各々、ホスホジエステル修飾された骨格、ホスホロチオエート修飾された骨格を伴う塩基を示す。Ｃｙ５標識されたＣｐＧ−ＯＤＮｓはＳｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｉｓから購入した。ＦＩＴＣ標識されたＣｐＧ−ＯＤＮｓはＨｏｋｋａｉｄｏ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅから購入した。
【００６１】
ＣｐＧ−ＡとＤＯＴＡＰの複合体（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）は、製造者の推奨に従って調製した。典型的には、５μｇのＣｐＧ  ＯＤＮｓを、１２０μｌのＰＢＳ中の３０μｌのＤＯＴＡＰと混合した。
【００６２】
ＦＩＴＣ−及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７−標識されたデキストラン、及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｂｌｕｅは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから購入し、各々１００μｇ／ｍｌ及び１μＭの最終濃度で使用した。クロロキン、バフィロマイシン及びシクロヘキシミドはＳｉｇｍａから購入し、各々５μｇ／ｍｌ、３０ｎＭ及び１００μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。
【００６３】
２）ＤＣの調製
骨髄細胞を１００ｎｇ／ｍｌヒトＦｌｔ３Ｌ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）と共に、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中で６日間培養した。回収された細胞を、ｐＤＣ特異的なラットモノクローナル抗体（１２０Ｇ８；非特許文献２３；Ｇ．Ｔｒｉｎｃｈｉｒｅｉ氏より提供された）、及び抗ラットＩｇＧマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）とともにインキュベートし、ＭＡＣＳカラムを用いてｐＤＣ（陽性に選択された細胞群）とｃＤＣ（通り抜けた細胞群）に分離した。いくつかの実験において、回収された細胞を抗Ｂ２２０及び抗ＣＤ１１ｃ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に培養し、Ｂ２２０−／ＣＤ１１ｃ＋  ｃＤＣ及びＢ２２０＋／ＣＤ１１ｃｉｎｔ  ｐＤＣをＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて選別した。
【００６４】
３）サイトカイン産生の測定
細胞を２×１０５細胞／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートに播き、種々の試薬で２４時間刺激した。上清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡで測定した。マウスＩＦＮ−α及びＩＬ−１２ｐ４０のためのＥＬＩＳＡキットは、各々ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＴＥＣＨＮＥ  Ｃｏｒｐ．から購入した。
【００６５】
ＲＮＡ分析のために、先に記載されたように（非特許文献２４）全ＲＮＡを調製し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。各個別試料中のβ−アクチン発現のレベルによってデータを標準化した。β−アクチン、ＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−β及びＩＲＦ−７のためのプライマーは、先行技術文献に記載されているものを使用した（非特許文献２５）。
【００６６】
４）遺伝子導入
レンチウイルスベクターｐＣＳＩＩ（独立行政法人 理化学研究所 筑波研究所 バイオリソースセンター  三好 浩之氏より入手）を用いて、ｐＣＳＩＩ−ＹＦＰ−ＩＲＦ−７、ｐＣＳＩＩ−ＹＦＰ−ＩＲＦ−３及びｐＣＳＩＩ−ＥＣＦＰ−ＭｙＤ８８を作成した。ＩＲＦ−７、ＩＲＦ−３及びＭｙＤ８８をコードする核酸断片は公知の文献に基づき、各々調製した。実施例において、Ｖｅｎｕｓ（非特許文献２６）と呼ばれるＹＦＰ変異体を使用した。レンチウイルスベクターを、ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（パッケージプラスミド）及びｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−Ｒｅｖ（Ｒｅｖ及びＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド）とともに２９３Ｔ細胞に導入した。
【００６７】
トランスフェクションの４８時間後、培養上清中の感染性レンチウイルスを回収した。ＲＡＷ２６４．７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）−ＴＩＢ７１）又は骨髄細胞をレンチウイルスと共に、各々２４時間及び７２時間培養した。形質導入された骨髄細胞を次いで、ヒトＦｌｔ３Ｌの存在下でさらに３日間培養することにより、ＤＣへ分化させた。いくつかの実験において、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ｐＣＡＧＧＳ−ＹＦＰ−ＩＲＦ−３、ｐＣＡＧＧＳ−ＹＦＰ−ＩＲＦ−７、又はｐＣＡＧＧＳ−ＣＦＰ−ＭｙＤ８８（非特許文献１１）を、ＲＡＷ２６４．７細胞に導入した。
【００６８】
５）免疫細胞化学
細胞を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を浸透させた。そして、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中で抗−マウス  トランスフェリン受容体抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とインキュベートした。次いで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７−結合  抗Ｒａｔ  ＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とさらにインキュベートした。
【００６９】
６）イメージング
細胞をガラス底３５−ｍｍ組織培養皿（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ  ＧＬＡＳＳ）上で培養した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ−１０００共焦点顕微鏡を用いて共焦点顕微鏡分析を行った。交差励起を避けるために、逐次走査モードにて二重又は三重カラーイメージを獲得した。ＭｉｃｒｏＭａｘ５１２  ＢＦＴ冷却ＣＣＤカメラ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＬｕｄＩ  ＭＡＣ５０００フィルターホイールを装備したＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７１倒立顕微鏡を用いて蛍光顕微鏡検査を行った。ＭｅｔａＭｏｒｐｈ  ソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）を用いて、ＣＣＤカメラとフィルターホイールの制御、並びに細胞画像データの分析を行った。
【００７０】
ＦＲＥＴ効率の算出は、先に記載されたように（非特許文献１１）行った。
【００７１】
実施例１  骨髄細胞由来のｐＤＣ及びｃＤＣにおけるＣｐＧ−Ａ及びＣｐＧ−Ｂ）の細胞内輸送
本発明者らは先ず、共焦点顕微鏡によって、骨髄細胞の培養によって得られたｐＤＣ及びｃＤＣにおける、Ｃｙ−５−標識  ＣｐＧ−Ａ（ＣｐＧ−ＡＣｙ５）及びＣｙ−５−標識  ＣｐＧ−Ｂ（ＣｐＧ−ＢＣｙ５）の細胞内輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を研究した。Ｄ１９（非特許文献７）及びＯＤＮ１６６８（非特許文献１５）を各々ＣｐＧ−Ａ及びＣｐＧ−Ｂの代表として選択した。結果を図１−６に示す。
【００７２】
図１ａ及びｂは、３μＭ  ＣｐＧ−ＡＣｙ５（ａ中、赤）、又はＣｐＧ−ＢＣｙ５（ｂ中、赤）と９０分間インキュベートしたＦｌｔ３Ｌ−培養  骨髄由来ｐＤＣ（１２０Ｇ８＋細胞）の共焦点及び微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）のイメージを示す。エンドソーム又はリソソームを可視化するために、細胞をｄｅｘｔｒａｎＦＩＴＣ又はＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（緑）で最後の１０分間インキュベートした。代表的な細胞を図１ａ、ｂ及び続く図２−４に示した。図１ａ及びｂ中、赤色はＣｐＧ−ＡＣｙ５（図１ａ）又はＣｐＧ−ＢＣｙ５（図１ｂ）の位置、緑色はｄｅｘｔｒａｎＦＩＴＣ又はＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒで染色された位置を示す。ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ−Ａ又はＣｐＧ−Ｂ）とデキストラン（エンドソームのマーカー）又はＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（リソソームのマーカー）の位置が一致すると黄色が観察される。
【００７３】
図２は、ｐＤＣをＣｐＧ−ＡＦＩＴＣ及びＣｐＧ−ＢＣｙ５の両方とインキュベーションし、次いで、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒでインキュベーションした結果を示す。図２の左パネル中、ＣｐＧ−ＡＦＩＴＣ、ＣｐＧ−ＢＣｙ５及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの位置は、各々赤色、青色、及び緑色で示されている。
【００７４】
図２の右パネルにおいて、ＣｐＧがＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒと共局在した細胞の数の平均値を標準偏差（ＳＤ）とともに示した。図２の右パネルの縦軸は、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒと共局在した各ＣｐＧの％割合を示す。
【００７５】
図３は、図１のｐＤＣの場合と同様に骨髄由来ｃＤＣ（１２０Ｇ８−細胞）を、ＣｐＧ−ＡＣｙ５又はＣｐＧ−ＢＣｙ５（赤）とインキュベーションし、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（緑）とインキュベーションした結果を示す。
【００７６】
図４は、レンチウイルスによってＩＲＦ−７ＹＦＰ（緑）を遺伝子導入したｐＤＣ（上パネル）及びｃＤＣ（下パネル）を、３μＭ  ＣｐＧ−ＡＣｙ５と９０分間インキュベートした結果を示す。
【００７７】
図５は、ＩＲＦ−７ＹＦＰをコードするレンチウイルスで遺伝子導入した骨髄細胞におけるＹＦＰの発現と、ＣｐＧ−Ａ又はＣｐＧ−Ｂとの共局在の有無調べた結果を示す。
先ず、骨髄細胞をＩＲＦ−７ＹＦＰをコードするレンチウイルスで感染させた。形質導入された骨髄細胞は、ヒトＦｌｔ３Ｌ存在下でのさらなる３日間の培養によって、ＤＣ細胞へ分化できる。回収された細胞をフィコエリスリンと結合させた抗−ＣＤ１１ｃ抗体で染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂａｒによって分析した。典型的には、１０−２５％のＤＣがＹＦＰについて陽性であった（上パネル）。
【００７８】
培養骨髄細胞より、ｐＤＣ特異的な１２０Ｇ８抗体及び抗ラットＩｇＧ結合マイクロビーズによってＭＡＣＳカラムを用いてｐＤＣを除去した細胞をｃＤＣとして用いた。ＩＲＦ−７ＹＦＰをコードするレンチウイルス又は陰性コントロールウイルスで感染させたｃＤＣの代表的なイメージを示す（中パネル）。図５の下パネルは、ｃＤＣ中におけるＩＲＦ−７及びＣｐＧ  ＯＤＮｓの細胞内局在を示す。ｃＤＣをＣｐＧ−ＡＣｙ５又はＣｐＧ−ＢＣｙ５（赤）で刺激し、共焦点顕微鏡上で観察した（下パネル）。ＣｐＧ−ＡＣｙ５とＣｐＧ−ＢＣｙ５のいずれもＩＲＦ−７ＹＦＰとの共在は観察されなかった。
【００７９】
図６は、骨髄細胞からｐＤＣ細胞の単離、及びｐＤＣ細胞におけるＣｐＧ刺激によるＩＲＦ−７  ｍＲＮＡ及びＩＦＮ−α  ｍＲＮＡの発現誘導を示す。
Ｆｌｔ３Ｌ培養した６日目の骨髄細胞を抗−Ｃｄ１１ｃ及び抗−Ｂ２２０抗体で染色した。ＣＤ１１ｃｉｎｔＢ２２０＋  ｐＤＣ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａで精製し、（＞９５％純度；右パネル）、１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）の存在下、又は非存在下、図に示した時間３μＭ  ＣｐＧ−Ａで刺激した。ＩＲＦ−７  ｍＲＮＡ及びＩＦＮ−α  ｍＲＮＡの発現レベルを定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって検討した（左パネル）。図６の右パネルに示されたように、ｐＤＣにおけるＩＲＦ−７  ｍＲＮＡ及びＩＦＮ−α  ｍＲＮＡの発現は、ＣｐＧ−Ａ刺激後１２時間に至るまで持続的に増加した。ＩＲＦ−７、ＩＦＮ−α  ｍＲＮＡの発現誘導はタンパク質合成阻害剤であるＣＨＸの存在によって、有意に抑えられた。
【００８０】
図１−６に示した本実施例の結果、ｐＤＣ中では、ＣｐＧ−ＡＣｙ５は９０分後においてもエンドソームのマーカーであるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−標識デキストランと共局在が観察されたが、（図１ａ）、リソソームマーカーであるＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒとは投与後５時間後においても共局在を認めなかった（図１ａ）。反対に、ＣｐＧ−ＢＣｙ５は９０分後には既にＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒと共局在を認めたが、デキストランとの共局在は認めなかった（図１ｂ）。
【００８１】
ＣｐＧ−ＢＣｙ５及びＦＩＴＣ−標識ＣｐＧ−ＡをｐＤＣ培養中に同時に加えたところ、殆どの細胞においてＣｐＧ−Ｂｃｙ５がＣｐＧ−ＡFITCと比べ優位にＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒと共局在した（図２）。しかしながら、ｃＤＣ中では、９０分後にはＣｐＧ−ＡＣｙ５及びＣｐＧ−ＢＣｙ５の双方がＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒと共局在を示した（図３）。この観察は以前の報告と一致する（非特許文献１６）。ＣｐＧ−ＡＣｙ５はまた、ｐＤＣ中のレンチウイルスを用いた遺伝子導入によって発現された黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）−ＩＲＦ−７融合タンパク質（本明細書中、「ＩＲＦ−７ＹＦＰ」と呼称することもある）とも共局在を示した。一方、ｃＤＣ中で発現されたＩＲＦ−７ＹＦＰとは同様の共局在は認めなかった（図４及び図５）。
【００８２】
本実施例の結果から、ＴＬＲ９シグナル伝達の時空間制御モデルが考えられる。即ち、ＴＬＲ９に結合したＣｐＧ−ＡはｐＤＣのエンドソーム小胞に留まり、持続的にＭｙＤ８８−ＩＲＦ−７−ＩＦＮ遺伝子誘導経路を活性化するが、ＣｐＧ−Ｂは素早くリソソーム内へ輸送され、このようなシグナル伝達経路を活性化出来ないというモデルである。実際、ｐＤＣにおけるＣｐＧ−Ａ刺激時のＩＲＦ−７とＩＦＮ−α  ｍＲＮＡの双方の誘導は、１２時間後でも継続し、そして、これは新規タンパク質合成に依存している（図６）。
【００８３】
実施例２  ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＭｙＤ８８及びＩＲＦ−７の細胞内局在とＣｐＧ  ＯＤＮｓの輸送
本実施例では、種々の遺伝子導入がより容易であるマクロファージ系細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞を使用して、ＣｐＧ  ＯＤＮｓ、ＭｙＤ８８及びＩＲＦ−７の空間的制御のモデルを検討した。
【００８４】
まず、ＩＲＦ−７ＹＦＰ又はＩＲＦ−３ＹＦＰをシアン蛍光タンパク質で標識したＭｙＤ８８（ＭｙＤ８８ＣＦＰ）とともに発現させた。結果を図７及び８に示す。
図７は、ＲＡＷ２６４．７細胞において、レンチウイルスによる遺伝子導入によって、ＭｙＤ８８ＣＦＰ（赤）及びＩＲＦ−７ＹＦＰ（緑；上パネル）又はＩＲＦ−３ＹＦＰ（緑；下パネル）を発現させ、蛍光顕微鏡によって分析した結果を示す。左パネルは共焦点顕微鏡の写真図であり、左から右に各々ＹＦＰ、ＣＦＰ及びそれらを重ねた像（マージ像）を示したものである。マージ像中に示した線に沿ったＣＦＰ及びＹＦＰの蛍光強度を測定し、グラフ化した。右のグラフにおける０及び１はマージ像において示した０及び１に相当する。ＩＲＦ−７ＹＦＰの蛍光強度の頂点はＭｙＤ８８ＣＦＰの頂点と重なるが、ＩＲＦ−３ＹＦＰの頂点は重ならなかった。
【００８５】
図８は、図７と同様に調製されたＲＡＷ２６４．７細胞のＣＦＰ、ＹＦＰ、ＦＥＲＴイメージを収集し、ＦＲＥＴ効率（「補正」ＦＲＥＴ［ＦＲＥＴｃ］）（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ＦＲＥＴ）を計算した結果を示す。２０細胞の平均ＦＲＥＴｃ／ＣＦＰ値を標準偏差と共に示した。
【００８６】
図７に示されたように、ＩＲＦ−７ＹＦＰは細胞質中に発現し、ＭｙＤ８８ＣＦＰとともに顆粒状構造を形成するが、ＩＲＦ−３ＹＦＰは形成しない。加えて、ＦＲＥＴは、ＩＲＦ−７ＹＦＰとＭｙＤ８８ＣＦＰとの間に優位に観察され（図８）、このことは、この構造中のＩＲＦ−７とＭｙＤ８８との直接結合を示唆する。
【００８７】
ＩＲＦ−７とＭｙＤ８８との複合体の細胞内局在についてさらに調べた。結果を図９−１１に示す。
先ず、ＭｙＤ８８ＣＦＰ（青）及びＩＲＦ−７ＹＦＰ（緑）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７標識デキストラン（赤）と１０分間インキュベートした。共焦点顕微鏡によって観察した代表的な細胞の結果を図９に示す。白いボックス内の高倍率像は右下のパネルに示されている。白い矢は、デキストランＡｌｅｘａ６４７、ＭｙＤ８８ＣＦＰ及びＩＲＦ−７ＹＦＰの共局在を示している。
【００８８】
図１０は、ＭｙＤ８８ＣＦＰ（青）及びＩＲＦ−７ＹＦＰ（緑）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、１μＭ  ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（赤）と９０分間インキュベートし、共焦点顕微鏡によって分析した結果を示す。
【００８９】
図１１は、ＭｙＤ８８ＣＦＰ及びＩＲＦ−７ＹＦＰを発現するＲＡＷ２６４．７細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、抗−トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）抗体で染色し、共焦点顕微鏡によって観察した結果を示す。白い矢は、ＩＲＦ−７（緑）、ＭｙＤ８８（青）及びＴｆＲ（赤）の共局在を示す。
【００９０】
図９−１１の結果で示されたように、ＩＲＦ−７とＭｙＤ８８の複合体構造は、蛍光標識されたデキストランとすべてではないとしても共局在を認める（図９）。しかし、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒとは共局在を認めない（図１０）。ＩＲＦ−７とＭｙＤ８８の複合体構造はまた抗−トランスフェリン受容体抗体でも染色される（図１１）。これらの結果はＭｙＤ８８−ＩＲＦ−７複合体はエンドソーム小胞に存在することを示唆する。
【００９１】
本発明者らはさらに、ＲＡＷ２６４．７細胞内のＣｐＧ−Ａ又はＣｐＧ−Ｂ輸送を調べた。先ず、図１２は、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（緑）及びＣｐＧ−ＡＣｙ５（赤）と９０分間インキュベートしたＲＡＷ２６４．７細胞の共焦点画像を示す。
【００９２】
図１３はＲＡＷ２６４．７細胞を、１μＭ  ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（緑）、並びに１μＭ  ＣｐＧ−ＡＣｙ５、１μＭ  ＣｐＧ−ＢＣｙ５、あるいはＤＯＴＡＰと複合体化した１μＭ  ＣｐＧ−ＡＣｙ５（ＣｐＧ−Ａ／ＤＯＴＡＰ）（赤）と共に図中に示した時間インキュベートし、固定後、落射型蛍光顕微鏡下で細胞を観察した結果を示している。
【００９３】
図１４は、ＭｙＤ８８ＣＦＰ（青）及びＩＲＦ−７ＹＦＰ（緑）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、ＣｐＧ−ＡＣｙ５（赤）と９０分間インキュベートし、共焦点顕微鏡によって分析した結果を示す。ＲＡＷ２６４．７細胞において、ＣｐＧ−ＡＣｙ５とＭｙＤ８８ＣＦＰ／ＩＲＦ−７ＹＦＰとの共局在は観察されなかった。
【００９４】
図１２−１４の結果で示されたように、ＲＡＷ２６４．７細胞内での場合、インキュベーション後１５分ほどからＣｐＧ−ＡＣｙ５とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒとの共局在が観察された（図１２及び図１３参照）。同様の現象がＣｐＧ−ＢＣｙ５でも観察された（図１３）。よって、ＲＡＷ２６４．７細胞におけるこれらのＯＤＮの輸送のパターンは、ｃＤＣで観察されるのと同様である。ＣｐＧ−ＡＣｙ５は、ＭｙＤ８８−ＩＲＦ−７複合体とは共局在せず（図１４）、そして、ＣｐＧ−ＡによるＩＦＮ−α／β  ｍＲＮＡの誘導はＲＡＷ２６４．７細胞では生じなかった（後述参照）。これらの結果は、持続的なＴＬＲ９シグナル及びエンドソーム小胞におけるＭｙＤ８８−ＩＲＦ−７経路の活性化がＩＦＮ遺伝子誘導経路の活性化に重要である、という上記モデルを更に支持している。
【００９５】
実施例３  ＤＯＴＡＰ処理によるｃＤＣにおけるＣｐＧ−Ａ輸送の操作
実施例２で言及した、持続的なＴＬＲ９シグナル及びエンドソーム小胞におけるＭｙＤ８８−ＩＲＦ−７経路の活性化がＩＦＮ遺伝子誘導経路の活性化に重要である、というモデルをさらに裏付けるアプローチとして、本実施例では、ｐＤＣにおけるＣｐＧ−Ａのエンドソームへの輸送に類似するようにＣｐＧ−Ａ輸送を操作することによって、ｃＤＣにおいても高レベルのＩＦＮ誘導を達成しうるか否かを調べた。本発明者らは脂質１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）がＣｐＧ−ＯＤＮの細胞内輸送システムを変化させることを見出した。
【００９６】
図１５−１８は、ＣｐＧ−ＡをＤＯＴＡＰで処理することによるｃＤＣにおける細胞内輸送とＩＦＮ等の産生を示す。先ず、骨髄細胞由来のｃＤＣを、ＣｐＧ−ＡＣｙ５／ＤＯＴＡＰ（赤）及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（青）と８０分間インキュベートした。洗浄後、次いで細胞をデキストランＦＩＴＣ（緑）と１０分間インキュベートした。代表的な蛍光像及び微分干渉（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ；ＤＩＣ）像を図１５に示した。次いで、ＩＲＦ−７ＹＦＰ（緑）を発現するｃＤＣを、ＣｐＧ−ＡＣｙ５／ＤＯＴＡＰ（赤）と９０分間インキュベートした。代表的な蛍光及びＤＩＣ像を図１６に示した。Ｎは核を示す。ＩＲＦ−７の核移行を伴う細胞の割合を計測し、３回の独立した実験の平均値を標準偏差とともに示した（右下パネル）。
【００９７】
ＤＯＴＡＰと複合体化したＣｐＧ−ＡＣｙ５（ＣｐＧ−Ａ／ＤＯＴＡＰ）でｃＤＣを刺激すると、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒとの共局在は認めず、インキュベーション開始から９０分後であってもデキストランとの共局在を認めた（図１５）。さらに、ＣｐＧ−ＡＣｙ５／ＤＯＴＡＰはｃＤＣにおいてレンチウイルスによって発現されたＩＲＦ−７ＹＦＰとの共局在し、ＩＲＦ−７ＹＦＰの有意な画分がｃＤＣの核中に見出された（図１６）。このことは、この核酸とＤＯＴＡＰという補助剤の存在により、核酸がエンドソームに留まりｃＤＣにおいても、ＴＬＲ９−ＭｙＤ８８−ＩＲＦ−７経路がエンドソーム小胞において活性化されたことを示唆する。
【００９８】
図１７は、ＣｐＧ−Ａで刺激したｃＤＣ又はｐＤＣにおける、ＩＦＮ−αタンパク質の産生（ｐｇ／ｍｌ）を示す。先ず、ｐＤＣ又はｃＤＣを、ＤＯＴＡＰと複合体を形成した又は形成していない、種々の濃度のＣｐＧ−Ａ又はコントロールＧｐＣ  ＯＤＮで２４時間刺激した。ＥＬＩＳＡによって培養上清中のＩＦＮ−α濃度を測定した。同様に調整した３サンプルの平均＋／−標準偏差の結果を示す。ＣｐＧ−Ａ／ＤＯＴＡＰでの刺激によりｃＤＣでもＩＦＮ−αタンパク質が産生された（左パネル）。ＴＬＲ９を活性化することのできない、ＣｐＧ−Ａ配列中に逆向きのＣＧダイマーを有するＯＤＮ（コントロールＧｐＣ  ＯＤＮ）で刺激した場合は、いずれの細胞でも誘導は観察されなかった（図１７；非特許文献３，７）。また、ｐＤＣにおけるＣｐＧ−ＡによるＩＦＮ−α誘導は、ＤＯＴＰＡによる増強効果を全く受けなかった（右パネル）。
【００９９】
図１８は、ｐＧ−Ａ／ＤＯＴＡＰで刺激されたｃＤＣにおけるＩＲＦ−７  ｍＲＮＡ及びＩＦＮ−α  ｍＲＮＡの相対的な発現量を示す。Ｆｌｔ３Ｌ培養した６日目の骨髄細胞からＦＡＣＳ  ＤｉｖａによってＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０−  ｃＤＣを精製し、図に示した時間シクロヘキサミド（ＣＨＸ）の存在下又は不存在下で、３μＭ  ＣｐＧ−Ａ／ＤＯＴＡＰで刺激した。ＩＲＦ−７及びＩＦＮ−α  ｍＲＮＡの発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定した。
【０１００】
図１７及び１８に示されたように、ｐＤＣにおいて見られるのと同様に、ＣｐＧ−Ａ／ＤＯＴＡＰで刺激されたｃＤＣにおいても、高レベルのＩＦＮ−α誘導が観察された（図１７）。併せて、ＩＲＦ−７及びＩＦＮ−α  ｍＲＮＡｓ双方の誘導が認められた（図１８）。ＩＲＦ−７及びＩＦＮ−α  ｍＲＮＡｓ双方の誘導は、タンパク質合成阻害剤であるＣＨＸの存在によって、有意に抑えられた。さらに、ＤＯＴＡＰは、ｐＤＣにおけるＣｐＧ−ＡによるＩＦＮ−α誘導に増強効果を全く示さなかった（図１７）。このことはさらに、核酸刺激に対し、通常はＩＦＮを産生しない細胞においても、核酸を効率的にエンドソームに留まるようにする補助剤の存在により、ＩＦＮ誘導経路が活性化されることを示唆する。
【０１０１】
実施例４  ＤＯＴＡＰを用いたＲＡＷ２６４．７細胞中におけるＣｐＧ−Ａ輸送の操作
本実施例では、ＲＡＷ２６４．７細胞において、ＤＯＴＡＰを用いてＯＤＮ輸送の操作を行った場合のＩ型ＩＦＮの産生等を調べた。結果を図１９−２２に示す。
【０１０２】
図１９は、ＭｙＤ８８ＣＦＰ（青）／及びＩＲＦ−７ＹＦＰ（緑）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、ＣｐＧ−ＡＣｙ５／ＤＯＴＡＰ（赤）と９０分間インキュベートした場合の、代表的な細胞を共焦点顕微鏡によって分析した結果を示す。
【０１０３】
図２０は、３μＭ  ＣｐＧ−Ａ又は３μＭ  ＣｐＧ／ＤＯＴＡＰとのインキュベーションの１２時間後、ＲＡＷ２６４．７細胞からＲＮＡを調製し、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を行った結果を示す。縦軸は、各々左のグラフからＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α及びＩＲＦ−７のｍＲＮＡの相対的な発現を示す。比較のために、水疱口炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＶＳＶ）で刺激した脾臓ｐＤＣ中のＩＦＮ−α／β及びＩＲＦ−７  ｍＲＮＡレベルも示す。
【０１０４】
図２１は、ＣｐＧ−Ａ／ＤＯＴＡＰで刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞の細胞内ＩＦＮ−α染色を、先に記載されたように（非特許文献１）行った結果を示す。具体的には、ＲＡＷ２６４．７細胞をＤＯＴＡＰのみ、ＣｐＧ−Ａ（３μＭ）、又はＣｐＧ−Ａ（３μＭ）／ＤＯＴＡＰとで１４時間刺激した。ブレフェルディンＡ（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ）（Ｓｉｇｍａ；５μｇ／ｍｌ）を培養の最後の４時間加えた。４％パラホルムアルデヒドで固定し、１％  ＦＣＳ及び０．１％サポニン（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳ中で、ラット抗−マウスＩＦＮ−α抗体群（ＲＭＭＡ−１、ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びクローンＦ１８、ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の混合物、次いで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−結合二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）によって染色した。ＦＡＣＳ分析によって発現レベルを測定し、ヒストグラムで示した。
【０１０５】
図２２は、野生型骨髄由来のＣＤ１１ｂ＋Ｂ２２０−細胞をＦＡＣＳによって精製し、ＣｐＧ−Ａ又はＣｐＧ−Ａ／ＤＯＴＡＰで刺激し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−αレベルを測定した結果を示す。
【０１０６】
図１９−２１に示したように、ＣｐＧ−ＡＣｙ５／ＤＯＴＡＰとＭｙＤ８８−ＩＲＦ−７複合体との間の共局在が、ＣｐＧ−ＡＣｙ５／ＤＯＴＡＰとのインキュベーション開始から９０分後にＲＡＷ２６４．７細胞中で観察され（図１９）、ＩＦＮ−α／β  ｍＲＮＡｓの誘導もこれらの細胞中で観察された（図２０）。ＲＡＷ２６４．７細胞中ＩＦＮ−α分泌は観察されなかったが（データ示さず）、抗−ＩＦＮ−α抗体での細胞内染色によってＩＦＮ−αタンパク質が検出された（図２１）。これはこの細胞系でのＩＦＮ−αの分泌機能がｐＤＣそれと比べ発達していないことを示唆する。いずれにしても、これらのＲＡＷ２６４．７細胞を用いた実験結果はさらに、エンドソームにおけるＴＬＲ９−ＭｙＤ８８−ＩＲＦ−７活性化経路を介したＩＦＮ遺伝子誘導モデルを支持する。さらにこのモデルと合致して、骨髄由来のＣＤ１１ｂ＋Ｂ２２０−細胞でも（ｐＤＣを除く骨髄系列細胞）、ＣｐＧ−Ａ／ＤＯＴＡＰの刺激に対し、有意なレベルのＩＦＮ−α分泌が観察された（図２２）。
【０１０７】
実施例５  ＤＯＴＡＰ処理におけるＣｐＧ−Ｂ輸送の操作
本実施例では本発明者らは、ＤＯＴＡＰと複合体を形成したＣｐＧ−Ｂ（ＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰ）に対するｐＤＣ及びｃＤＣの応答を研究した。
【０１０８】
図２３は、ＤＯＴＡＰに複合体化させたＣｐＧ−Ｂで刺激したｃＤＣ又はｐＤＣにおける、ＩＦＮ−αタンパク質の産生（ｐｇ／ｍｌ）を示す。ＣｐＧ−Ｂによる刺激はＣｐＧ−Ａに関する図１７に関して記載したのと同様に行った。
【０１０９】
図２４は、ｐＤＣにおけるＣｐＧ−Ｂ輸送の用量依存性の挙動を調べた結果である。骨髄由来のｐＤＣを１μＭ（上パネル）又は３μＭ（下パネル）の、ＣｐＧ−ＢＣｙ５／ＤＯＴＡＰで刺激した。次いで、デキストランＦＩＴＣ又はＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒとともにインキュベートした。代表的な細胞について、共焦点顕微鏡によって分析した共焦点及びＤＩＣ像を示す。
【０１１０】
ＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰで刺激されたｐＤＣにおいて、ＣｐＧ−Ｂ濃度依存的で強力なＩＦＮ−α産生が認められた。また、先に報告されたように高濃度による抑制効果も観察された（図２３、非特許文献３）。さらにまた、ＣｐＧ−ＢＣｙ５は最適のリガンド濃度（１μＭ）においてのみ、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒよりもデキストランに優位に共局在することが観察された（図２４）。
【０１１１】
図２４の観察に基づいて本発明者らは、リガンドがＤＯＴＡＰとともに輸送される際に、ＴＬＲ９に結合したＣｐＧ−Ｂを保持することによってＭｙＤ８８−ＩＲＦ７経路の活性化に関与することのできる、さらなる因子（群）がｐＤＣ中に存在すると推論する。この推定因子（群）は、ｐＤＣ中でＤＯＴＡＰなしで、そしてｃＤＣ中でＤＯＴＡＰとともに、エンドソーム中でＴＬＲ９と結合した状態のＣｐＧ−Ａによるシグナル伝達に関与しうる。即ち、ＤＯＴＡＰはエンドソームへのリガンド輸送の運命を決定しうるが、さらに未知の因子（群）もまた、ＭｙＤ−８８経路のＣｐＧ−ＴＬＲ−９媒介エンドソーム活性化に決定的に関与する。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１ａ及びｂは、３μＭ  ＣｐＧ−ＡＣｙ５（ａ中、赤）、又はＣｐＧ−ＢＣｙ５（ｂ中、赤）と９０分間インキュベートしたＦｌｔ３Ｌ−培養  骨髄由来ｐＤＣ（１２０Ｇ８＋細胞）の共焦点及び微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）像を示す。
【図２】図２は、ｐＤＣをＣｐＧ−ＡＦＩＴＣ及びＣｐＧ−ＢＣｙ５の両方とインキュベーションし、次いで、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒとインキュベーションした結果を示す。
【図３】図３は、図１のｐＤＣの場合と同様に骨髄由来ｃＤＣ（１２０Ｇ８−細胞）を、ＣｐＧ−ＡＣｙ５又はＣｐＧ−ＢＣｙ５（赤）とインキュベーションし、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（緑）とインキュベーションした結果を示す。
【図４】図４は、レンチウイルスによってＩＲＦ−７ＹＦＰ（緑）を遺伝子導入したｐＤＣ（上パネル）及びｃＤＣ（下パネル）を、３μＭ  ＣｐＧ−ＡＣｙ５と９０分間インキュベートした結果を示す。
【図５】図５は、ＩＲＦ−７ＹＦＰをコードするレンチウイルスで遺伝子導入した骨髄細胞におけるＹＦＰの発現と、ＣｐＧ−Ａ又はＣｐＧ−Ｂとの共局在の有無調べた結果を示す。
【図６】図６は、骨髄細胞からのｐＤＣ細胞の単離、及びｐＤＣにおけるＣｐＧ刺激によるＩＲＦ−７  ｍＲＮＡ及びＩＦＮ−α  ｍＲＮＡの発現誘導を示す。
【図７】図７は、ＲＡＷ２６４．７細胞において、レンチウイルスによる遺伝子導入によって、ＭｙＤ８８ＣＦＰ（赤）及びＩＲＦ−７ＹＦＰ（緑；上パネル）又はＩＲＦ−３ＹＦＰ（緑；下パネル）を発現させ、蛍光顕微鏡によって分析した結果を示す。
【図８】図８は、図７と同様に調製されたＲＡＷ２６４．７細胞のＣＦＰ、ＹＦＰ、ＦＲＥＴイメージを収集し、ＦＲＥＴ効率（「補正」ＦＲＥＴ［ＦＲＥＴｃ］）（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ＦＲＥＴ）を計算した結果を示す。２０細胞の平均ＦＲＥＴｃ／ＣＦＰ値を標準偏差と共に示した。
【図９】図９は、ＭｙＤ８８ＣＦＰ（青）及びＩＲＦ−７ＹＦＰ（緑）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７標識デキストラン（赤）と１０分間インキュベートし、代表的な細胞について、共焦点顕微鏡によって分析した結果である。白いボックスで示された部分の高倍率像は右下のパネルに示されている。白い矢は、デキストランＡｌｅｘａ６４７、ＭｙＤ８８ＣＦＰ及びＩＲＦ−７ＹＦＰの共局在を示す。
【図１０】図１０は、ＭｙＤ８８ＣＦＰ（青）及びＩＲＦ−７ＹＦＰ（緑）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、１μＭ  ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（赤）と９０分間インキュベートし、共焦点顕微鏡によって分析した結果を示す。
【図１１】図１１は、ＭｙＤ８８ＣＦＰ及びＩＲＦ−７ＹＦＰを発現するＲＡＷ２６４．７細胞をパラホルムアルデヒトで固定し、抗−トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）抗体で染色し、共焦点顕微鏡によって分析した結果を示す。白い矢は、ＩＲＦ−７（緑）、ＭｙＤ８８（青）及びＴｆＲ（赤）の共局在を示す。
【図１２】図１２は、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（緑）及びＣｐＧ−ＡＣｙ５（赤）と９０分間インキュベートしたＲＡＷ２６４．７細胞の共焦点像を示す。
【図１３】図１３は、ＲＡＷ２６４．７細胞を、１μＭ  ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（緑）、並びに１μＭ  ＣｐＧ−ＡＣｙ５、１μＭ  ＣｐＧ−ＢＣｙ５、あるいは又はＤＯＴＡＰと複合体化した１μＭ  ＣｐＧ−ＡＣｙ５（ＣｐＧ−Ａ／ＤＯＴＡＰ）（赤）と共に図中に示した時間インキュベートし、固定化後、落射型蛍光顕微鏡下で細胞を観察した結果を示す。
【図１４】図１４は、ＭｙＤ８８ＣＦＰ（青）及びＩＲＦ−７ＹＦＰ（緑）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、ＣｐＧ−ＡＣｙ５（赤）と９０分間インキュベートし、共焦点顕微鏡によって分析した結果を示す。
【図１５】図１５は、ＣｐＧ−ＡＣｙ５／ＤＯＴＡＰ（赤）及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（青）と８０分間インキュベートし、洗浄後、デキストランＦＩＴＣ（緑）と１０分間インキュベートした、骨髄細胞由来のｃＤＣの蛍光及びＤＩＣ像を示す。
【図１６】図１６は、ＩＲＦ−７ＹＦＰ（緑）を発現するｃＤＣを、ＣｐＧ−ＡＣｙ５／ＤＯＴＡＰ（赤）と９０分間インキュベートした場合の、代表的な蛍光及びＤＩＣ像示す。Ｎは核を表す。ＩＲＦ−７の核移行を伴う細胞の割合を計測し、３回の独立した実験の平均値を標準偏差とともに示した（右下パネル）。
【図１７】図１７は、ＣｐＧ−Ａで刺激したｃＤＣ又はｐＤＣにおける、ＩＦＮ−αタンパク質の産生（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【図１８】図１８は、ｐＧ−Ａ／ＤＯＴＡＰで刺激されたｃＤＣにおけるＩＲＦ−７  ｍＲＮＡ及びＩＦＮ−α  ｍＲＮＡの相対的な発現量を示す。
【図１９】図１９は、ＭｙＤ８８ＣＦＰ（青）／及びＩＲＦ−７ＹＦＰ（緑）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、ＣｐＧ−ＡＣｙ５／ＤＯＴＡＰ（赤）で９０分間インキュベートした場合の、代表的な細胞を共焦点顕微鏡によって分析した結果を示す。
【図２０】図２０は、３μＭ  ＣｐＧ−Ａ又は３μＭ  ＣｐＧ／ＤＯＴＡＰとのインキュベーションの１２時間後、ＲＡＷ２６４．７細胞から全ＲＮＡを調製し、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を行った結果を示す。縦軸は、各々左のグラフからＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α及びＩＲＦ−７のｍＲＮＡの相対的な発現を示す。
【図２１】図２１は、ＣｐＧ−Ａ／ＤＯＴＡＰで刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞の細胞内ＩＦＮ−α染色を行った結果を示す。
【図２２】図２２は、野生型骨髄由来のＣＤ１１ｂ＋Ｂ２２０−細胞をＦＡＣＳによって精製し、ＣｐＧ−Ａ又はＣｐＧ−Ａ／ＤＯＴＡＰで刺激し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−αレベルを測定した結果を示す。
【図２３】図２３は、ＤＯＴＡＰに複合体化させたＣｐＧ−Ｂで刺激したｃＤＣ又はｐＤＣ細胞における、ＩＦＮ−αタンパク質の産生（ｐｇ／ｍｌ）の用量依存性を示す。
【図２４】図２４は、ｐＤＣにおけるＣｐＧ−Ｂ輸送の濃度依存性の挙動を調べた結果である。骨髄由来のｐＤＣを１μＭ（上パネル）又は３μＭ（下パネル）の、ＤＯＴＡＰと複合体化したＣｐＧ−ＢＣｙ５で刺激した。次いで、デキストランＦＩＴＣ又はＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒとともにインキュベートし、エンドソーム又はリソソームを可視化した。代表的な細胞について、共焦点顕微鏡によって分析した共焦点及びＤＩＣ像を示す。
【図６】
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【図８】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２２】
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【図２３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２４】
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【配列表】
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