(57)【要約】 【課題】組換えアデノ随伴ウイルスのストックの生産における従来技術上の課題を解決する手段の提供。【解決手段】組換えアデノ随伴ウイルスのストックを生産する方法であって、a) AAV REPタンパク質を野生型レベルより低いレベルで発現しかつアデノ随伴ウイルスの複製を可能にする細胞を、i)外来DNA配列を含みかつ感染性AAV ビリオンに組み込むことができる組換えアデノ随伴ウイルスベクターと、ii)該組換えアデノ随伴ウイルスベクターの複製および感染性ビリオンへのパッケ ージングにとって十分なウイルス機能を提供する組換えヘルパーアデノ随伴ウイルスDNAとで同時トランスフェクトし、そしてb) 産生されたビリオンを回収する、 ことを含んでなる方法。 【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書等に記載されるような、組換えＡＡＶ生産の効率を上昇させる方法。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【数１−２】
2008043349.tif 000002
【背景技術】
【０００２】
【数１−３】
2008043349.tif 000003
【０００３】
【数２】
2008043349.tif 000004
【０００４】
【数３】
2008043349.tif 000005
【０００５】
【数４】
2008043349.tif 000006
【０００６】
【数５−１】
2008043349.tif 000007
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によって、以下が提供される： 
【数３８】
2008043349.tif 000008
【０００８】
【数５−２】
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【０００９】
【数６】
2008043349.tif 000010
【００１０】
【数７−１】
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【００１１】
【数９】
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【００１２】
【数１０】
2008043349.tif 000013
【００１３】
【数１１】
2008043349.tif 000014
【００１４】
【数１２】
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【００１５】
【数１３】
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【００１６】
【数１４】
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【００１７】
【数１５】
2008043349.tif 000018
【００１８】
【数１６】
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【００１９】
【数１７】
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【００２０】
【数１８】
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【００２１】
【数１９】
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【００２２】
【数２０】
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【００２３】
【数２１】
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【００２４】
【数２２】
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【００２５】
【数２３】
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【００２６】
【数２４】
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【００２７】
【数２５】
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【００２８】
【数２６】
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【００２９】
【数２７】
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【００３０】
【数２８】
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【００３１】
【数２９】
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【００３２】
【数３０】
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【００３３】
【数３１】
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【００３４】
【数３２】
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【００３５】
【数３３】
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【００３６】
【数３４】
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【００３７】
【数３５】
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【００３８】
【数３６】
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【００３９】
【数３７】
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【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１：ＡＡＶ  ヘルパープラスミドの構築。プラスミドＡＡＶ／ＡＤおよびＡＣＧ−２は、内因性ｐ５プロモーター（白のボックスで示す）を含み、プラスミド  ＣＭＶ／ＡＡＶ、ＨＩＶ／ＡＡＶおよびＳＶ／ＡＡＶは、元のｐ５プロモーターに代わる異種プロモーター（影付きのボックスで示す）を含む。全ての構築体は、同じＡＡＶコード配列すなわちＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子（影付きボックス中に図示）を含む。ただし、構築体ＡＣＧ−２は、Ｒｅｐの翻訳開始コドンにおいてＡＴＣがＡＣＧに変異している。
【図２】図２：種々のＡＡＶヘルパープラスミドからのＲｅｐ遺伝子発現のウエスタン分析。Ａｄ感染を行わずに（レーン１〜５）またはＡｄ感染を行って（レーン６〜１０）、プラスミドＡＡＶ／ＡＤ（レーン１および６）、ＡＣＧ−２（レーン２および７）、ＣＭＶ／ＡＡＶ（レーン３および８）、ＨＩＶ／ＡＡＶ（レーン４および９）およ  びＳＶ／ＡＡＶ（レーン５および１０）を２９３細胞にトランスフェクトした。細胞分解産物のサンプルを１０％ＰＡＧＥにより分離した。４種のＲｅｐタンパク質全てを認識する抗−Ｒｅｐモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロットを行った（Ｈｕｎｔｅｒら、１９９２年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６６：３１７−３２４）。
【図３】図３：ｒＡＡＶ  ＤＮＡ複製のサザン分析。ＡＡＶベクタープラスミドｐｄｘ３１−ＬａｃＺを、アデノウイルス感染を行わずに（レーン１、２、５、６）またはアデノウイルス  感染を行って（レーン３、４、７、８）、ヘルパープラスミドＣＶＭ／ＡＡＶ（レーン１〜４）またはＨＩＶ／ＡＡＶ（レーン５〜８）と共に２９３細胞に同時  トランスフェクトした。低分子量ＤＮＡを細胞から回収し、予めＤｐｎＩで消化せずに（レーン１、３、５、７）またはＤｐｎＩで消化してから（レーン２、  ４、６、８）、１％アガロースゲルで分離した。３２Ｐ標識ＬａｃＺプローブ（２．１ｋｂ  ＣｌａＩ／ＮｄｅＩ断片）を用いてサザンブロットを行った。
【図４】図４：  異なるヘルパープラスミドでトランスフェクトした細胞におけるｒＡＡＶ  ＤＮＡ複製の比較。ＡＡＶベクタープラスミドｐｄｘ３１−ＬａｃＺを、Ａｄ感染を行って、ヘルパープラスミドＣＭＶ／ＡＡＶ（レーン１および２）、ＨＩＶ／ＡＡＶ（レーン３および４）、ＳＶ／ＡＡＶ（レーン５および６）、ＡＡＶ／ＡＤ（レーン７および８）およびＡＣＧ−２（レーン９および０１）と共  に２９３細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後（レーン１、３、５、７および９）または４８時間後（レーン２、４、６、８お  よび１０）に細胞から低分子量ＤＮＡを回収した。３２Ｐ標識ＬａｃＺプローブ（２．１ｋｂ  Ｃｌａ  Ｉ／Ｎｄｅ  Ｉ断片）を用いてサザンブロットを行った。
【図５】図５：各種のＡＡＶヘルパープラスミドからのＣａｐ遺伝子発現のウェスタン分析。ＡＡＶ  ベクタープラスミドｐｄｘ３１−ＬａｃＺを、Ａｄ感染を行って（レーン１〜５）またはＡｄ感染を行わずに（レーン６〜１０）、ヘルパープラスミド  ＣＭＶ／ＡＡＶ（レーン１および６）、ＨＩＶ／ＡＡＶ（レーン２および７）、ＳＶ／ＡＡＶ（レーン３および８）、ＡＡＶ／ＡＤ（レーン４および９）および  ＡＣＧ−２（レーン５および１０）と共に２９３細胞に同時トランスフェクトした。１０％ＰＡＧＥにより細胞溶解産物のサンプルを分離した。３種のＣａｐタ  ンパク質全てを認識する抗−Ｃａｐポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロットを行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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