(57)【要約】【課題】麹菌のうち、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠損している菌株を簡便に識別する方法及びそのためのプライマーセットを提供すること。【解決手段】アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠損している麹菌の菌株のゲノムＤＮＡ中には、この欠損に起因して生じる特異的な分断部位が存在する。この特異的分断部位を、核酸増幅法等を駆使して検出することにより、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠損し、このためアフラトキシンを産生する可能性が全くない麹菌を同定することができる。【選択図】図１
2008011751.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
麹菌のゲノムＤＮＡ中に、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の3018ntと3019ntの間の分断部位Ａが存在すること、又は、配列番号２に示す塩基配列中の2453ntと2454ntの間の分断部位Ｂが存在することを指標として、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌を同定することを含む麹菌の同定方法。
【請求項２】
配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーと、前記分断部位Ａを含む部分領域にハイブリダイズするプライマーとを用い、麹菌のゲノムDNAを鋳型とした核酸増幅法を行ない、増幅が起きるか否かに基づいて行なう請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記1nt〜3018ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有し、前記分断部位Ａを含む部分領域にハイブリダイズするプライマーが、前記分断部位Ａを含む連続する１５塩基以上の領域と相補的な領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記1nt〜3018ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域と同一の塩基配列を有し、前記分断部位Ａを含む部分領域にハイブリダイズするプライマーが、前記分断部位Ａを含む連続する１５塩基以上の領域と相補的な領域と同一の塩基配列を有する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記各プライマーのサイズが１８塩基以上である請求項２ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
配列番号６と配列番号７にそれぞれ示される塩基配列を有する一対のプライマーを用いて行なう請求項５記載の方法。
【請求項７】
配列表の配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーと、前記分断部位Ｂを含む部分領域にハイブリダイズするプライマーとを用い、麹菌のゲノムDNAを鋳型とした核酸増幅法を行ない、増幅が起きるか否かに基づいて行なう請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記1nt〜2453ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有し、前記分断部位Ｂを含む部分領域にハイブリダイズするプライマーが、前記分断部位Ｂを含む連続する１５塩基以上の領域と相補的な領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記1nt〜2453ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域と同一の塩基配列を有し、前記分断部位を含む部分領域にハイブリダイズするプライマーが、前記分断部位Ｂを含む連続する１５塩基以上の領域と相補的な領域と同一の塩基配列を有する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記各プライマーのサイズが１８塩基以上である請求項７ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
配列表の配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーと、配列番号１に示す塩基配列中の3019nt以降のテロメア領域領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーとを用いた核酸増幅法又は配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーと、配列番号２に示す塩基配列中の2453nt以降のテロメア領域領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーとを用いた核酸増幅法であって3000bp以下のサイズの領域を増幅する核酸増幅法を行ない、該3000bp以下のサイズの断片の増幅が起きるか否かに基づいて行なう、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌を同定することを含む麹菌の同定方法。
【請求項１２】
前記配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有し、前記配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有し、前記配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列中のテロメア領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号１又は２に示すテロメア領域と相補的な１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域と同一の塩基配列を有し、前記配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域と同一の塩基配列を有し、前記配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列中のテロメア領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号１又は２に示すテロメア領域と相補的な１５塩基以上の領域と同一の塩基配列を有する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記各プライマーのサイズが１８塩基以上である請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
配列番号４と配列番号５にそれぞれ示される塩基配列を有する一対のプライマーを用いて行なう請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
配列表の配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーと、配列番号１に示す塩基配列中の3018ntと3019ntの間の分断部位Ａを含む部分領域又はテロメア領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーとから成る、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌を同定するためのプライマーセット。
【請求項１７】
前記1nt〜3018ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有し、前記分断部位Ａを含む部分領域にハイブリダイズするプライマーが、前記分断部位Ａを含む連続する１５塩基以上の領域と相補的な領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有し、前記テロメア領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号１に示すテロメア領域と相補的な１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有する請求項１６記載のプライマーセット。
【請求項１８】
前記1nt〜3018ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域と同一の塩基配列を有し、前記分断部位Ａを含む部分領域にハイブリダイズするプライマーが、前記分断部位Ａを含む連続する１５塩基以上の領域と相補的な領域と同一の塩基配列を有し、前記テロメア領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号１に示すテロメア領域と相補的な１５塩基以上の領域と同一の塩基配列を有する請求項１６記載のプライマーセット。
【請求項１９】
前記各プライマーのサイズが１８塩基以上である請求項１７又は１８記載のプライマーセット。
【請求項２０】
配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーと、配列番号２に示す塩基配列中の2453ntと2454ntの間の分断部位Ｂを含む部分領域又はテロメア領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーとから成る、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌を同定するためのプライマーセット。
【請求項２１】
前記1nt〜2453ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有し、前記分断部位Ｂを含む部分領域にハイブリダイズするプライマーが、前記分断部位Ｂを含む連続する１５塩基以上の領域と相補的な領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有し、前記テロメア領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号２に示すテロメア領域と相補的な１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有する請求項２０記載のプライマーセット。
【請求項２２】
前記1nt〜2453ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域と同一の塩基配列を有し、前記分断部位Ｂを含む部分領域にハイブリダイズするプライマーが、前記分断部位Ｂを含む連続する１５塩基以上の領域と相補的な領域と同一の塩基配列を有し、前記テロメア領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーが、配列番号２に示すテロメア領域と相補的な１５塩基以上の領域と同一の塩基配列を有する請求項２１記載のプライマーセット。
【請求項２３】
前記各プライマーのサイズが１８塩基以上である請求項２１又は２２記載のプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麹菌（アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）種の中からアフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似のゲノム配列の一部を欠損した株を同定する方法及び該菌株を同定するためのプライマーセットに関する。
【０００２】
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）は古来より日本の醸造産業に利用されており、人間に対する安全性は、GRAS（Generally Recognized As Safe:米国FDA）として認められている。一方、麹菌の類縁糸状菌であるアスペルギルス・フラブスには、強い発ガン性のあるアフラトキシンを生産する株が存在する。すでに、麹菌がアフラトキシンを生産しないことは種々の化学的方法で検証されている。しかしながら、アスペルギルス・フラブスが有するアフラトキシン生産に必要と推定される酵素など25遺伝子を含む約70Ｋｂに及ぶアフラトキシン生合成遺伝子クラスター（非特許文献１）と類似する領域を持つ麹菌の存在も報告されており（非特許文献２）、麹菌のアフラトキシン非生産性を遺伝子のゲノム構造から完全に証明するまでには到ってなかった。
【０００３】
しかし、麹菌の中には、上記アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠損している可能性のある株の存在も報告されている（非特許文献２及び３）。これらの株は、遺伝子（ゲノム）構造からアフラトキシンを生合成する能力が全くないことが確定的である。従って、これらの株を食品産業に使うことは消費者に対して安心感を与えることができ、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域をほとんど有する麹菌株を使用することに比べてより望ましい。しかし、現在このアフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域を欠損している麹菌株を簡便に識別する方法は確立されていない。
【０００４】
【非特許文献１】Appl. Environ. Microbiol. 70, 1253-1262 (2004)
【非特許文献２】Curr.Genet. 37, 104-111 (2000)
【非特許文献３】Appl. Environ. Microbiol. 72, 484-490 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、麹菌のうち、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域を欠損している菌株を簡便に識別する方法及びそのためのプライマーセットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠損している麹菌のグループが、該遺伝子クラスター類似領域の部分配列に続きテロメア配列を有していることを見出し、この遺伝子構造を指標として、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠損している麹菌を同定することが可能であることに想到し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、麹菌のゲノムＤＮＡ中に、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の3018ntと3019ntの間の分断部位Ａが存在すること、又は、配列番号２に示す塩基配列中の2453ntと2454ntの間の分断部位Ｂが存在することを指標として、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌を同定することを含む麹菌の同定方法を提供する。また、本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーと、配列番号１に示す塩基配列中の3019nt以降のテロメア領域領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーとを用いた核酸増幅法又は配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーと、配列番号２に示す塩基配列中の2453nt以降のテロメア領域領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーとを用いた核酸増幅法であって3000bp以下のサイズの領域を増幅する核酸増幅法を行ない、該3000bp以下のサイズの断片の増幅が起きるか否かに基づいて行なう、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌を同定することを含む麹菌の同定方法を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーと、配列番号１に示す塩基配列中の3018ntと3019ntの間の分断部位Ａを含む部分領域又はテロメア領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーとから成る、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌を同定するためのプライマーセットを提供する。さらに、本発明は、配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーと、配列番号２に示す塩基配列中の2453ntと2454ntの間の分断部位Ｂを含む部分領域又はテロメア領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーとから成る、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌を同定するためのプライマーセットを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する、アフラトキシンを生合成する能力が全くないことが確定的な麹菌を簡便に同定することができる。従って、本発明の方法を適用して同定された、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する、アフラトキシンを生合成する能力が全くないことが確定的な麹菌を容易に食品産業に利用することができ、ひいては消費者に対して安心感を与えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本願発明者らは、独立行政法人酒類総合研究所の保存株であるアスペルギルス・オリゼRIB 40株のゲノムDNA中のアフラトキシン生合成遺伝子群類似配列（以下、「AFクラスター」ということがある）の詳細を明らかにし、その塩基配列を公開している(DDBJ accession number: AB071288、AB076803、AB076804、AB182368)。RIB40株は、アスペルギルス・フラバスに存在するアフラトキシン生合成遺伝子クラスター全領域について、アスペルギルス・フラバスとほぼ同じ構造をしていることが明らかとなった。本願発明者らは、RIB 40株のクラスター内に分散して存在する７遺伝子（aflT, nor-1, aflR, norA, avnA, verB, vbs）を選択し、それぞれの塩基配列に基づき、麹菌ゲノム中の当該７遺伝子をＰＣＲ法により選択的に増幅、検出するためのプライマーセットを作成し、独立行政法人酒類総合研究所で保存している麹菌（アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）210株について、上記プライマーセットを用いて、上記７遺伝子のゲノム中の存在をＰＣＲ法にて調査した。その結果、そのうち122株については７遺伝子全てが増幅し、これら遺伝子の全てがゲノム上に存在することが確認された。これら122株をグループ１とした。また、75株についてはaflT, nor-1, aflR, norAの４遺伝子の増幅が認められず、これら75株をグループ２とした。さらに、８株は、vbsのみの増幅が認められ、クラスターの大規模な欠落が予想されたことから、これらの８株をグループ３とした。
【００１０】
グループ３中のRIB 143株についてAFクラスター周辺のゲノム構造（塩基配列）を解析したところ、AFクラスター中のordA遺伝子内でAFクラスターが切断され、これに染色体のテロメアが続いていることが明らかとなった。
【００１１】
RIB 143株に見いだされたAFクラスターの分断部位を含む領域（テロメア配列を含む領域）を増幅できるようなプライマーセットを設計し、このプライマーセットによるPCRを行ったところ、RIB 1353以外の全てのグループ３に属する菌株では同じサイズの増幅産物が得られ、グループ１及びグループ２株では増幅産物は得られなかった。以上の結果から、グループ３に属する７菌株では、AFクラスターからテロメアにわたるゲノムの構造は同じ構造をとっていると結論づけた。
【００１２】
さらに、グループ３に属するRIB 1353株についてAFクラスター周辺のゲノム構造（塩基配列）を解析したところ、RIB 143における分断部位より566nt上流でAFクラスター中のordA遺伝子内でAFクラスターが切断され、これに染色体のテロメアが続いていることが明らかとなった。
【００１３】
そこで、RIB 1353株に見いだされたAFクラスターの分断部位を含む領域（テロメア配列を含む領域）を増幅できるようなプライマーセットを設計し、このプライマーセットによるPCRを行ったところ、全てのグループ３に属する菌株で予想される約1.5bp又は1.0bpのサイズの増幅産物が得られ、グループ１及びグループ２株では増幅産物は得られなかった。以上より、グループ３に属する菌株は、その染色体構造からRIB 143型又はRIB 1353型に分類されることが明らかとなった。また、グループ３に属する麹菌株はAFクラスターの半分以上を欠損しており、ゲノム構造上からアフラトキシンを生産する能力が失われていることが明白となった。すでに安全性が確立されている麹菌ではあるが、消費者への安心感を与えるためには、グループ３に属する麹菌を食品産業に用いることが極めて有効である。本願発明は、グループ３に属する麹菌を簡便に同定することができる麹菌の同定方法及びそのための核酸を提供するものである。
【００１４】
アスペルギルス・オリゼRIB 40株、RIB 143株及びRIB 1353株のAFクラスター内の一部領域の構造を図１に示す。図１中、薄い灰色の矢印は、遺伝子及び転写の方向を示す。黒塗りの部分がアスペルギルス・オリゼのテロメア領域の繰返し配列である。該繰返しの一単位となるテロメア配列を配列表の配列番号３に示す。図１に示されるように、グループ３のRIB 143株及びRIB 1353では、アフラトキシンの合成に必須的なaflR等の遺伝子が欠失している。
【００１５】
RIB 143株における、vbs遺伝子中からテロメアに至る領域の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。配列番号１中の3019nt〜3151ntがテロメア領域であり、3018ntと3019ntの間の部位が、該菌株におけるAFクラスターの一部とそれに隣接するテロメア領域との分断部位である（本願明細書及び特許請求の範囲において、「分断部位Ａ」と呼ぶことがある）。
【００１６】
RIB 1353株における、vbs遺伝子中からテロメアに至る領域の塩基配列を配列表の配列番号２に示す。配列番号２中の2454nt〜2585ntがテロメア領域であり、2453ntと2454ntの間の部位が、該菌株におけるAFクラスターの一部とそれに隣接するテロメア領域との分断部位である（本願明細書及び特許請求の範囲において、「分断部位Ｂ」と呼ぶことがある）。
【００１７】
グループ３に属するRIB 143株及びRIB 1353株のAFクラスター周辺のゲノム構造を明らかにしたことにより、AFクラスター内の一部の領域とそれに隣接するテロメア領域との分断部位の存在を指標として、グループ３に属するAFクラスターの一部を欠損する麹菌を同定することが可能となった。分断部位の存在は、本発明により開示された配列番号１及び２に示される塩基配列を利用して、それ自体周知の種々の方法により調べることができる。
【００１８】
上記分断部位の存在は、例えば、麹菌のゲノムDNAを鋳型とし、上記分断部位を含む部分領域を増幅することができるプライマーを用いたＰＣＲ等の核酸増幅法を行ない、増幅が起きるか否かに基づいて調べることができる。この場合、プライマーの一方を分断部位を跨いでハイブリダイズするように設定し、もう一方を分断部位の上流又は下流(すなわちテロメア領域内)の部分領域にハイブリダイズするように設定してもよく、あるいは、一対のプライマーを、分断部位の上流の部分領域とテロメア領域内の部分領域とにそれぞれハイブリダイズするように設定してもよい。前者の場合には、上記分断部位が存在しなければプライマーがハイブリダイズしないため増幅が起こらず、後者の場合も、上記分断部位が存在しなければ増幅が起こらない（AFクラスターを完備するグループ１では、両プライマーとも鋳型DNAとハイブリダイズするが、ハイブリダイズした両プライマーの距離が離れすぎているため増幅が起きない）。従って、いずれの場合であっても、増幅が起きるということが、前記分断部位が存在するということを示すこととなる。なお、ここで、「ハイブリダイズする」とは、塩基配列の相補性に基づき、通常のPCRのアニーリング工程における条件下でハイブリダイズするという意味である。
【００１９】
すなわち、配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーと、前記分断部位Ａを含む部分領域にハイブリダイズするプライマーとを用い、麹菌のゲノムDNAを鋳型とした核酸増幅法を行ない、増幅が起きるか否かに基づいて分断部位Ａの存在を検出することができる。プライマーは、配列番号１又はその相補鎖内の連続する15塩基以上の領域から成る核酸であることが好ましいが、通常、10％以下の塩基が置換した配列を有するプライマーを用いても増幅が起きる場合が多い。従って、前記1nt〜3018ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーとして、配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有するプライマー、前記分断部位Ａを含む部分領域にハイブリダイズするプライマーとして、前記分断部位Ａを含む連続する１５塩基以上の領域と相補的な領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有するプライマーを用いて上記核酸増幅法を好ましく行なうことができる。同様に、配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーと、前記分断部位Ｂを含む部分領域にハイブリダイズするプライマーとを用い、麹菌のゲノムDNAを鋳型とした核酸増幅法を行ない、増幅が起きるか否かに基づいて分断部位Ｂの存在を検出することができる。分断部位Ａの場合と同様、前記1nt〜2453ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーとして、配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有するプライマー、前記分断部位Ｂを含む部分領域にハイブリダイズするプライマーとして、前記分断部位Ｂを含む連続する１５塩基以上の領域と相補的な領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有するプライマーを用いて上記核酸増幅法を好ましく行なうことができる。なお、配列番号１又は配列番号２中に示される分断部位Ａ又は分断部位Ｂが存在しない場合には、該分断部位を跨ぐ部分領域にハイブリダイズするプライマーがハイブリダイズしないことを確保するため、該プライマーの構成は、配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域又は配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域にハイブリダイズする部分と、テロメア領域にハイブリダイズする部分との比率（塩基数の比率）が好ましくは３：７〜７：３、さらに好ましくは４：６〜６：４となるようにする。
【００２０】
また、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーと、配列番号１に示す塩基配列中の3019nt以降のテロメア領域領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーとを用い、麹菌のゲノムDNAを鋳型として用いた核酸増幅法又は配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーと、配列番号２に示す塩基配列中の2454nt以降のテロメア領域領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーとを用い、麹菌のゲノムDNAを鋳型として用いた核酸増幅法であって3000bp以下のサイズの領域を増幅する核酸増幅法を行ない、該3000bp以下のサイズの断片の増幅が起きるか否かに基づいてアフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌を同定することを含む麹菌の同定を行なうこともできる。この場合、核酸増幅法に用いる２つのプライマーは、いずれもAFクラスターを完備した麹菌のゲノムDNAにもハイブリダイズするが、両プライマー間の距離は3000bpよりも遥かに大きいため増幅は起きず、少なくとも、3000bp以下の領域を増幅する条件下では増幅は起きない。この方法の場合も、プライマーは、配列番号１又はその相補鎖内の連続する15塩基以上の領域から成る核酸であることが好ましいが、通常、10％以下の塩基が置換した配列を有するプライマーを用いても増幅が起きる場合が多い。従って、配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーとして、配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有するプライマーを用い、配列番号１に示す塩基配列中のテロメア領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーとして、配列番号１に示すテロメア領域と相補的な１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有するプライマーを用いて上記核酸増幅法を好ましく行なうことができる。同様に、前記配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーとして、配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有するプライマーを用い、前記配列番号２に示す塩基配列中のテロメア領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーとして、配列番号２に示すテロメア領域と相補的な１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域と同一の塩基配列を有するプライマーを用いて上記核酸増幅法を好ましく行なうことができる。
【００２１】
上記いずれの核酸増幅法においても、プライマーのサイズは、特に限定されないが、通常、15塩基〜50塩基程度、好ましくは18塩基〜40塩基程度である。増幅領域のサイズは特に限定されないが、余りに大きいと増幅に時間がかかり、用いる試薬の量も増えるので、増幅領域のサイズは3000bp以下が好ましく、さらに1500bp以下が好ましい。一方、増幅断片を電気泳動等で容易に検出することができるために、増幅領域は、好ましくは50bp以上のサイズを有する。なお、PCR等の核酸増幅法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、それらを用いて容易に実施することができる。また、増幅が起きたか否かは、常法により、増幅反応の生成物を電気泳動にかけ、バンドが検出されるか否か等により容易に調べることができる。さらに、所望により、念のために増幅産物（好ましくは数十bpの短いもの）の塩基配列を直接決定して、分断部位の存在を確認してもよい。
【００２２】
本発明はまた、上記した核酸増幅法に用いるプライマーのセットをも提供する。
【００２３】
また、分断部位の存在は、該分断部位を含む部分領域(分断部位を跨ぐ領域)にハイブリダイズする核酸プローブを用い、該核酸プローブが試料となる麹菌のゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか否かを調べることによっても調べることができる。なお、ここで、「ハイブリダイズするか否か」は、サザンブロット等の常法において、核酸プローブがハイブリダイズするか否かに基づいて標的核酸の存否を判定するために採用されているストリンジェントな条件においてハイブリダイズするという意味である。このような条件は当業者にとって周知である。この場合、配列番号１又は配列番号２中に示される分断部位Ａ又は分断部位Ｂが存在しない場合にはハイブリダイズが起きないようにするため、核酸プローブの構成は、配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜3018ntの領域又は配列番号２に示す塩基配列中の1nt〜2453ntの領域にハイブリダイズする部分と、テロメア領域にハイブリダイズする部分との比率（塩基数の比率）が好ましくは３：７〜７：３、さらに好ましくは４：６〜６：４となるようにする。なお、周知の通り、通常、核酸プローブは、ハプテン標識、蛍光標識、放射標識、酵素標識、ビオチン標識等の周知の標識で標識される。
【００２４】
核酸プローブを用いる検出方法自体はこの分野において周知であり、例えば、サザンブロット法を例示することができる。検出感度を高めるために、サザンブロット法に先立ち、試料DNAをPCR等の核酸増幅法により増幅してもよい（PCR−サザンブロット）。あるいは、核酸プローブを固相化し、試料DNAを標識して試料DNAが固相プローブにハイブリダイズするか否かを調べることによっても実施することができる。この場合も、検出感度を高めるために、固相プローブとのハイブリダイゼーションに先立ち、試料DNAをPCR等の遺伝子増幅法により増幅してもよく、この際に用いるヌクレオチドの一部として、蛍光標識や放射標識等で標識したヌクレオチドを用いることにより増幅DNAを標識することもできる。
【００２５】
なお、本明細書において、「部分領域」とは、配列番号１又は２に示される塩基配列中の一部の領域を言い、好ましくは連続する15塩基以上の領域である。なお、規則により配列表には２本鎖DNAの場合でも１本鎖のみを記載することになっているから、配列番号１及び配列番号２には１本鎖のみが記載されているが、現実の領域は、二本鎖であり、従って、その検出には配列番号１及び配列番号２に示される１本鎖の相補鎖も用いることができる。すなわち、「配列番号１」及び「配列番号２」は、文脈からそうでないことが明らかな場合を除き、具体的に記載されている１本鎖及びその相補鎖並びに二本鎖を包含する意味で用いている。
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
１．  アフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の一部を欠損している麹菌グループ３株のゲノムの特徴
グループ３に属するRIB 143株及びRIB 1353株についてアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似する配列が存在する周辺のゲノム塩基配列を詳細に調査した。その結果、グループ１に属するRIB 40株のゲノム配列と比べて、RIB 40株に存在するaflT, nor-1, aflR, norA, avnA, verBの６遺伝子を含むアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似する配列中の約56kbが欠落し、その延長上に染色体のテロメア配列が続いていることが明らかになった。解読した塩基配列を上記の通り配列番号１及び配列番号２に示す。また、テロメア配列を配列番号３に示す。アフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の一部を欠損しているグループ３に属する麹菌の当該部分のゲノム塩基配列の解読は世界ではじめてのことである。RIB 143株及びRIB 1353株のゲノム構造の解析結果から、RIB 143株及びRIB 1353株はグループ１のRIB 40株と共通に存在するvbs配列の上流で染色体の分断が生じ、そこへテロメア配列が付加されたものと推定された。RIB 40株とRIB 143株及びRIB 1353株のアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似するクラスター構造の模式図は上記の通り図１に示されている。ここで、aflRは、アスペルギルス・フラブスにおいてアフラトキシンの生合成遺伝子を正に制御する重要な制御因子であり、本遺伝子の破壊によりアフラトキシンが生産されないことが確認されている。グループ３では、aflR遺伝子の欠失が確認され、従って、グループ３に属するアスペルギルス・オリゼ株はアフラトキシンの生産能力を全く有しないことが証明された。
【００２８】
２．  PCRによるグループ３株の同定
グループ３に属するRIB 143株及びRIB 1353株のordA遺伝子内でAFクラスター中が切断され、これに染色体のテロメアが続いており、グループ１及びグループ２には存在しないゲノム構造（塩基配列）となっていた。そこで、RIB 143株及びRIB 1353株の分断部分構造を含む領域を特異的にPCR法にて増幅するためのプライマーを設計した（配列a：配列番号４、配列b：配列番号５）。なお、配列番号４の配列は、配列番号１の3023nt〜3052ntのアンチセンス鎖と同一の配列であり、又、配列番号２の2457nt〜2486ntのアンチセンス鎖と同一の配列であり、配列番号５の配列は、配列番号１及び配列番号２のセンス鎖の1515nt〜1542ntと同一の配列である。従って、このプライマーセットを用いて配列番号１の配列を鋳型としてPCRを行なうと、これらのプライマーに挟まれる1538bpの領域が増幅され、また、配列番号２の配列を鋳型としてPCRを行なうと、これらのプライマーに挟まれる972bpの領域が増幅される。このプライマーセットを用いて全てのグループ３に分類された麹菌のゲノムを鋳型にしてPCRを行った。なお、PCRの内部コントロールとして、全ての菌株から増幅の得られる312bpのチューブリン遺伝子断片を増幅可能なプライマー(配列c：5'-ccaagaacatgatggctgct-3'、配列d：5'-cttgaagagctcctggatgg-3')を使用した。PCRは、具体的に次のようにして行なった。PCRには、それぞれのゲノムDNA、プライマー(a)、プライマー(b)、プライマー(c)、プライマー(d)、13μLのInsert Check-Ready-Mix(Code No.:PIK-251, TOYOBO Co. Ltd., Osaka, Japan) を含む15μＬの反応液を用いたPCR反応は、GeneAmp PCR sysytems9700(Applied Biosystems)を使用し、94℃で４分保持後、変性反応（94℃、20秒）、アニーリング（68℃、５秒）、伸長反応（72℃、30秒）で25サイクル行った。PCR反応終了液３μLを、１×Tris-Acetate-EDTA（TAE）バッファーを用い１％アガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイドで20分処理しゲルを紫外線照射してPCR産物を検出した。
【００２９】
その結果、グループ１に属する株及びグループ２に属する株ではPCR反応生成物は検出されず、RIB 143株及びRIB 1353株において配列から予想されるサイズと同じサイズのPCR増幅産物が検出された。また、グループ３に属する８株のうちRIB 1353株を除く全てにおいてRIB 143株と同じサイズのPCR増幅産物が検出された。これらグループ３の７株は、増幅産物のサイズが同じであることから、RIB 143型のアフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の欠損を生じた染色体ゲノム構造を有していることが明らかとなった。
【００３０】
また、プライマー(a)、(b)を用いたPCR反応ではグループ３でしか反応生成物ができないことから、本プライマーを用いたPCR反応によって、アフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の一部を欠損しているグループ３の菌株を特異的にかつ簡便に同定分類できることが証明された。
【００３１】
さらに、グループ３に属する株のうちRIB 143型の染色体構造をもつ菌株からのみ分断部分構造を含む領域を特異的にPCR法にて増幅するためのプライマーを設計した（配列e：配列番号６、配列f：配列番号７）。なお、配列番号６の配列は、配列番号１の3005nt〜3031のアンチセンス鎖と同一の配列であり、配列番号７の配列は、配列番号１及び配列番号１のセンス鎖の2417nt〜2438ntと同一の配列である。従って、このプライマーセットを用いて配列番号１の配列を鋳型としてPCRを行なうと、これらのプライマーに挟まれる615bpの領域が増幅される。このプライマーセットを用いて全てのグループ３に分類された麹菌のゲノムを鋳型にしてPCRを行った。PCRは、具体的に次のようにして行なった。PCRには、それぞれのゲノムDNA、プライマー(e)、プライマー(f)、プライマー(c)、プライマー(d)、13μLのInsert Check-Ready-Mix(Code No.:PIK-251, TOYOBO Co. Ltd., Osaka, Japan) を含む15μＬの反応液を用いたPCR反応は、GeneAmp PCR systems 9700(Applied Biosystems) を使用し、94℃で４分保持後、変性反応（94℃、20秒）、アニーリング（65℃、５秒）、伸長反応（72℃、30秒）で25サイクル行った。PCR反応終了液３μLを、１×Tris-Acetate-EDTA（TAE）バッファーを用い１％アガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイドで20分処理しゲルを紫外線照射してPCR産物を検出した。
【００３２】
その結果、グループ１に属する株及びグループ２に属する株ではPCR反応生成物は検出されず、グループ３に属しRIB 143株と同じ染色体構造を持つ６株においてのみRIB 143株と同じサイズのPCR増幅産物が検出された。
【００３３】
プライマー(e)、(f)を用いたPCR反応ではグループ３に属しRIB 143株と同じ染色体構造を持つ株でしか反応生成物ができないことから、本プライマーを用いたPCR反応によって、アフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の一部を欠損しているグループ３の菌株のうちRIB 143株と共通の染色体構造を持つ菌株を特異的にかつ簡便に同定分類できることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の方法により、遺伝子（ゲノム）構造からアフラトキシンを生合成する能力が全くないことが確定的な麹菌を簡便に同定することができる。本発明の方法を用いて同定された、アフラトキシンを生合成する能力が全くないことが確定的な麹菌を食品産業等において用いることにより、消費者に対して安心感を与えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域を有するアスペルギルス・オリゼRIB 40株の該領域の一部分の構造及びアフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠失した同RIB 143株及びRIB 1353株の一部分の構造を示す図である。
【図１】
2008011751.tif 000003
【配列表】
2008011751000001.app