(57)【要約】      （修正有）【課題】デンプン生合成に関与する酵素−特にコムギ由来の酵素−をコードする核酸分子を提供し、それにより、これらの酵素の活性が上昇または減少するように遺伝的に改変された植物を生産し、それにより、これら植物において合成されるデンプンの物理的および／または化学的特性の改変を促す方法を提供する。【解決手段】コムギ由来の可溶性デンプン合成酵素をコードする核酸分子、および、該核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞、特に、該デンプン合成酵素の活性の増加または低下を示す、形質転換植物細胞およびこれらの細胞から再生された植物、および、その繁殖材料とそれから得られるデンプン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
（b）配列番号：１に示すヌクレオチド配列または対応するリボヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（c）（a）または（b）で述べた核酸分子とハイブリダイズし、可溶性デンプン合成酵素をコードする核酸分子；
（d）そのヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮重のために（a）、（b）または（c）に記載の核酸分子の配列とは異なる、核酸分子；
（e）配列番号：６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
（f）配列番号：５に示すヌクレオチド配列または対応するリボヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（g）（e）または(f)に記載の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子；および
（h）そのヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮重のために（e）〜（g）に記載の分子の配列とは異なる、核酸分子；
からなる群より選択される、コムギ由来のデンプン合成酵素をコードする核酸分子。
【請求項２】
DNA分子である、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
cDNA分子である、請求項２記載のDNA分子。
【請求項４】
RNA分子である、請求項１記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸分子の一本の鎖と特異的にハイブリダイズする核酸分子。
【請求項６】
少なくとも15ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドである、請求項５記載の核酸分子。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項８】
核酸分子が、原核または真核細胞における翻訳可能RNAの転写および合成を確実にする調節要素にセンス方向で結合している、請求項７記載のベクター。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸分子、または請求項７もしくは８記載のベクターで形質転換された宿主細胞、または該細胞に由来する宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸分子によってコードされるタンパク質。
【請求項１１】
請求項９記載の宿主細胞が、タンパク質の合成を可能にする条件下で培養され、かつ該タンパク質が培養細胞および／または培養培地から単離される、請求項10記載のタンパク質の製造法。
【請求項１２】
コムギの可溶性デンプン合成酵素をコードする核酸分子が、植物細胞における翻訳可能mRNAの転写を可能にする調節要素の制御を受ける、請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸分子または請求項７もしくは８記載のベクターで形質転換されたトランスジェニック植物細胞、または該細胞に由来するトランスジェニック植物細胞。
【請求項１３】
請求項12記載の植物細胞を含む植物。
【請求項１４】
有用植物である請求項13記載の植物。
【請求項１５】
デンプン貯蔵性植物である請求項14記載の植物。
【請求項１６】
コムギ植物である請求項15記載の植物。
【請求項１７】
請求項12記載の植物細胞を含む、請求項13〜16のいずれか一項記載の植物の繁殖材料。
【請求項１８】
請求項13〜16記載のいずれか一項記載の植物または請求項17記載の繁殖材料から得られるデンプン。
【請求項１９】
請求項10記載のタンパク質の活性がこの植物細胞において低下していることを特徴とする、トランスジェニック植物細胞。
【請求項２０】
この細胞における活性の低下が、請求項１記載のDNA分子の転写物に対するアンチセンスRNAの発現によって得られる、請求項19記載の植物細胞。
【請求項２１】
請求項19または20記載の植物細胞を含む植物。
【請求項２２】
有用植物である請求項21記載の植物。
【請求項２３】
デンプン貯蔵性植物である請求項22記載の植物。
【請求項２４】
コムギ植物である請求項23記載の植物。
【請求項２５】
請求項19または20記載の細胞を含む、請求項21〜24のいずれか一項記載の植物の繁殖材料。
【請求項２６】
請求項21〜24のいずれか一項記載の植物または請求項25記載の繁殖材料から得られるデンプン。
【請求項２７】
食品の製造を目的とする、請求項18または26記載のデンプンの使用。
【請求項２８】
食品がベーカリー商品またはパスタである、請求項27記載の使用。
【請求項２９】
包装材料または使い捨て商品の製造を目的とする、請求項18または26記載のデンプンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物のデンプン合成に関与する、コムギ由来の酵素をコードする核酸分子に関する。これらの酵素は、デンプン合成酵素のアイソタイプである。
本発明はさらに、これらの核酸分子を含むベクターおよび細菌、ならびに該核酸分子により形質転換された植物細胞および植物体に関する。さらに、特性が改変されたコムギ由来デンプン合成酵素をコードするDNA分子の組み込みによる、トランスジェニック植物の製造方法を記載する。
【背景技術】
【０００２】
原料再生資源として、最近、益々植物物質に重要性が見いだされていることに関係して、バイオテクノロジー研究の目的のひとつは、植物材料を加工工業の需要に適応させることを試みることである。可能な限り多くの分野において、改変された再生可能原料の利用を可能にするためには、多様な物質を得ることが、さらに重要である。油、脂肪およびタンパク質は別にして、多糖は植物由来の必須な再生原料を構成する。セルロースは別にして、デンプンは、高等植物における最も重要な貯蔵物質のひとつとして、多糖のなかで重要な位置を占めている。これらの内、コムギは、ヨーロッパ共同体で製造されるデンプンの総量の20％を産生するため、興味深い栽培植物である。
【０００３】
多糖であるデンプンは、化学的に均質な基本成分、すなわちグルコース分子から構成されるポリマーである。しかしそれは、重合の程度、グルコース鎖の分枝の程度において、お互いに異なる様々な分子の、高度に複雑な混合物を構成する。したがって、デンプンは均質な原料ではない。デンプンは、α-1,4-グルコシド結合したグルコース分子よりなり、基本的に分枝のないポリマーであるアミロースデンプンと、逆に様々に分枝したグルコース鎖の複雑な混合物であるアミロペクチンデンプンに区別される。分枝は、付加的なα-1,6-グルコシド結合で生じる。コムギの場合、合成されるデンプンは、品種に応じて約11〜37％がアミロースデンプンからなる。
【０００４】
可能な限り広範なデンプンの用途を促すためには、広範な用途に特に適している改変デンプンを合成できる植物が供給されることが望ましいと考えられる。育種はそのような植物を提供する一つの可能性である。しかし、これはコムギの場合には、栽培されたコムギの倍数体性（４倍体および６倍体）のために、非常に難しいことが分かる。近年、科学者は、天然に生じる変異体の交雑育種によって、ロウ質（アミロースを含んでいない）のコムギの製造に成功した（ナカムラら（Nakamura）、Mol. Gen. Genet. 248（1995）、253〜259（非特許文献１））。もう一つの可能性は、組換えDNA技術によるデンプン産生植物のデンプン代謝の特異的遺伝子修飾である。
【０００５】
しかし、そのための前提条件は、デンプン合成および／またはデンプン改変に関与する酵素を同定し特性を調べるとともに、それら酵素をコードする各々のDNA分子を単離することである。
【０００６】
デンプン生産の生化学的経路は基本的に知られている。植物細胞のデンプン合成は、色素体の中で起きる。光合成活性組織においては、これらは葉緑体であり、光合成をしないデンプン貯蔵組織では、アミロプラストである。
【０００７】
デンプン合成に関与する最も重要な酵素は、デンプン合成酵素および分枝酵素である。デンプン合成酵素の場合、様々なアイソタイプが記載されている。それらはすべて、ADPグルコースのグリコシル基をα-1,4-グルカンに転移することによって重合反応を触媒する。分枝酵素は、α-1,6 分枝を直鎖状のα-1,4-グルカンに導入することを触媒する。
【０００８】
デンプン合成酵素は、次の二つのグループに分類される：顆粒結合型デンプン合成酵素（GBSS）、および可溶性デンプン合成酵素（SSS）。あるデンプン合成酵素は、顆粒結合型であると同時に可溶性でもあるため、この分類は必ずしも明白ではない（Denyerら、Plant J.4 (1993), 191-198（非特許文献２）；Muら、Plant J.6 (1994), 151-159（非特許文献３））。各グループ内に、様々なアイソタイプが、様々な植物種において記載されている。これらのアイソタイプは、プライマー分子に対する依存性に関して、お互いに異なる（いわゆる「プライマー依存型」（タイプII）と「プライマー非依存型」（タイプI）デンプン合成酵素）。
【０００９】
これまでにアイソタイプGBSS I の場合のみにおいて、デンプン合成におけるその正確な機能が決定されている。この酵素活性が非常に低いかまたは完全に抑制されている植物は、アミロースの欠失しているデンプンを合成する（いわゆる「蝋状」（waxy）デンプン）（Shureら、Cell 35 (1983), 225-233（非特許文献４）;  Visserら、Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289-296（非特許文献５）; WO 92/11376（特許文献１））。したがって、この酵素は、アミロースデンプンの合成において、決定的な役割を持つと考えられている。この現象は、緑藻のクラミドモナス・レインハーディ（Chlamydomonas reinhardtii）の細胞でも観察されている（Delrueら、J. Bacteriol. 174 (1992), 3612-3620（非特許文献６））。クラミドモナス（Chlamydomonas）の場合、さらに、GBSS Iはアミロース合成に関与するばかりでなく、アミロペクチン合成にも影響を与えることが証明された。GBSS I 活性を全く持たない突然変異体においては、正常時に合成されるアミロペクチンのうち、長鎖グルカンを持つある分画が欠落している。
【００１０】
顆粒結合性デンプン合成酵素の他のアイソタイプ、特にGBSS II の機能や可溶性デンプン合成酵素の機能は、今までのところ明らかでない。可溶性デンプン合成酵素は、分枝酵素とともに、アミロペクチン合成に関与していることが考えられており（例えば、Ponsteinら、Plant Physiol. 92 (1990), 234-241（非特許文献７）を参照）、また、デンプン合成速度の制御においても重要な役割を担っていると考えられている。
【００１１】
コムギの場合、少なくとも２つのアイソタイプの顆粒結合型デンプン合成酵素（60 kDaおよび100〜105 kDa）、および可溶性デンプン合成酵素を表すと考えられるさらなるアイソタイプ（デニアーら（Denyer）、Planta 196 （1995）、256〜265（非特許文献８）；ラーマンら（Rahman）、Aust. J. Plant. Physiol. 22（1995）、793〜803（非特許文献９））が、タンパク質レベルで同定された。いくつかのSSS-アイソタイプが存在することはすでにクロマトグラフィー法によって証明されている（リユベン（Rijven）、Plant Physiol. 81（1986）、448〜453（非特許文献１０））。コムギ由来のGBSS IをコードするcDNAはすでに記述されている（アインスワースら（Ainsworth）、Plant  Mol. Biol. 22（1993）、67〜82（非特許文献１１））。
【００１２】
コムギ由来のさらに別のデンプン合成酵素アイソタイプをコードする核酸配列はまだわかっていない。
【００１３】
GBSS I以外のデンプン合成酵素をコードするcDNA配列は、これまでエンドウ豆（ドライら（Dry）、Plant J. 2（1992）、193〜202（非特許文献１２））、コメ（ババら（Baba）、Plant Physiol. 103（1993）、565〜573（非特許文献１３））およびジャガイモ（エドワーズら（Edwards）、Plant J.8（1995）、283〜294（非特許文献１４））に関して記述があるに過ぎなかった。
【００１４】
可溶性デンプン合成酵素は、コムギ以外に数種の他の植物種において同定されている。可溶性デンプン合成酵素は、例えば、エンドウ（Denyer and Smith, Planta 186 (1992), 609-617（非特許文献１５））およびジャガイモ（Edwardsら、Plant J.8 (1995), 283-294（非特許文献１４））から純粋な形で単離された。これらの場合、SSS IIとして同定された可溶性デンプン合成酵素のアイソタイプが、顆粒結合性デンプン合成酵素GBSS II と同一であることが明らかにされた（Denyerら、Plant J. 4 (1993), 191-198（非特許文献２）；Edwardsら、Plant J.8 (1995), 283-294（非特許文献１４））。他の植物種の場合、クロマトグラフィーの手法で、いくつかのSSS- アイソタイプの存在が記載されている。例として、大麦（Tyynela and Schulman, Physiologia Plantarum 89 (1993) 835-841（非特許文献１６）; Kreis, Planta 148 (1980), 412-416（非特許文献１７））がある。しかしながら、これらのタンパク質をコードするDNA配列は、今のところ記載されていない。
【特許文献１】WO 92/11376
【非特許文献１】ナカムラら（Nakamura）、Mol. Gen. Genet. 248（1995）、253〜259
【非特許文献２】Denyerら、Plant J.4 (1993), 191-198
【非特許文献３】Muら、Plant J.6 (1994), 151-159
【非特許文献４】Shureら、Cell 35 (1983), 225-233
【非特許文献５】Visserら、Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289-296
【非特許文献６】Delrueら、J. Bacteriol. 174 (1992), 3612-3620
【非特許文献７】Ponsteinら、Plant Physiol. 92 (1990), 234-241
【非特許文献８】デニアーら（Denyer）、Planta 196 （1995）、256〜265
【非特許文献９】ラーマンら（Rahman）、Aust. J. Plant. Physiol. 22（1995）、793〜803
【非特許文献１０】リユベン（Rijven）、Plant Physiol. 81（1986）、448〜453
【非特許文献１１】アインスワースら（Ainsworth）、Plant  Mol. Biol. 22（1993）、67〜82
【非特許文献１２】ドライら（Dry）、Plant J. 2（1992）、193〜202
【非特許文献１３】ババら（Baba）、Plant Physiol. 103（1993）、565〜573
【非特許文献１４】Edwardsら、Plant J.8 (1995), 283-294
【非特許文献１５】Denyer and Smith, Planta 186 (1992), 609-617
【非特許文献１６】Tyynela and Schulman, Physiologia Plantarum 89 (1993) 835-841
【非特許文献１７】Kreis, Planta 148 (1980), 412-416
【発明の開示】
【００１５】
所望のデンプン貯蔵性植物、特にコムギを改良して、改変を施されたデンプンが合成されるようにするためには、デンプン合成酵素のさらに別のアイソタイプをコードするDNA配列の同定が必須である。
したがって、本発明の目的は、デンプン生合成に関与する酵素−特にコムギ由来の酵素−をコードする核酸分子を提供し、それにより、これらの酵素の活性が上昇または減少するように遺伝的に改変された植物を生産し、それにより、これら植物において合成されるデンプンの物理的および／または化学的特性の改変を促すことであった。
【００１６】
この目的は、請求の範囲に記載される態様を提供することにより達成された。
したがって、第一の局面において、本発明は、それによってそのような分子が好ましくは、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、可溶性デンプン合成酵素の生物活性を有するコムギ由来のタンパク質をコードする核酸分子に関する。本発明は、特に、配列番号：１に示すヌクレオチド配列の全てまたは一部、好ましくは配列番号：１に示すコード領域、または場合によっては、対応するリボヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
【００１７】
本発明はさらに、コムギ由来の可溶性デンプン合成酵素をコードし、上記分子の一つとハイブリダイズする核酸分子に関する。
コムギ由来の可溶性デンプン合成酵素をコードし、その配列が遺伝子コードの縮重のために上記分子のヌクレオチド配列とは異なる核酸分子もまた、本発明の主題である。
【００１８】
本発明はまた、上記配列の全体または一部と相補的な配列を示す核酸分子に関する。
上記核酸分子によってコードされるタンパク質は、コムギに由来する可溶性デンプン合成酵素である。これらのタンパク質は、他の植物種からのこれまで既知の可溶性デンプン合成酵素と特定の相同領域を示す。
【００１９】
もう一つの局面において、本発明は、それによって、そのような分子が好ましくは配列番号：６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、コムギ由来のデンプン合成酵素の生物活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する。本発明は特に、配列番号：５に示すヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸分子、好ましくは、配列番号：５に示すコード領域または場合によっては対応するリボヌクレオチド配列を含む分子に関する。
【００２０】
本発明はさらに、コムギ由来のデンプン合成酵素をコードし、上記分子の一つとハイブリダイズする核酸分子に関する。
コムギ由来のデンプン合成酵素をコードし、その配列が遺伝子コードの縮重のために上記分子の核酸配列とは異なる核酸分子もまた、本発明の主題である。
【００２１】
本発明はまた、上記配列の全体または一部と相補的な配列を示す核酸分子に関する。
上記核酸分子によってコードされるタンパク質は、コムギ由来のデンプン合成酵素の生物活性を有するタンパク質である。他の既知の配列との相同性を比較すると、最も高度の相同性は、顆粒結合型デンプン合成酵素をコードするエンドウ豆について認められることが判明した。したがって、記述の核酸分子はコムギ由来の顆粒結合型デンプン合成酵素をコードすると想定される。
【００２２】
本発明の核酸分子は、RNA分子と共にDNAであってもよい。対応するDNA分子は例えば、ゲノムまたはcDNA分子である。本発明の核酸分子は、天然の供給源から単離してもよく、または既知の方法によって合成してもよい。
【００２３】
本発明において、「ハイブリダイゼーション 」という言葉は、例えば、（Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）に記載されているような通常条件下でのハイブリダイゼーション、好ましくは、厳密な条件下でのハイブリダイゼーションを意味する。
【００２４】
本発明の核酸分子にハイブリダイズするDNA分子は、コムギ組織由来の、ゲノムライブラリーやcDNA ライブラリーなどから単離される。
【００２５】
したがって、該核酸分子の同定および単離は、本発明の該分子、またはその一部、または臨機応変にそれら分子の逆相補性鎖を用いて、例えば、標準的方法（Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY参照）に従ったハイブリダイゼーションによりなされる。
【００２６】
ハイブリダイゼーションのためのプローブとして、例えば、配列番号：1または配列番号：5に示されているヌクレオチド配列またはその部分配列を正確に、または基本的に含んでいる核酸分子が使用される。また、通常の合成方法によって合成されるDNA断片であり、その配列が基本的に本発明の核酸分子と同一である合成DNA断片も、ハイブリダイゼーションのためのプローブとして使用される。本発明の核酸配列にハイブリダイズする遺伝子を同定し、単離した後、配列が決定され、その配列によりコードされているタンパク質の性質が分析される必要がある。
【００２７】
本発明の核酸分子にハイブリダイズする分子には、本発明に記載のコムギ由来タンパク質をコードする上記の核酸分子の断片、派生物および対立遺伝子変異体も含まれる。その場合、断片は、上記記載のタンパク質のうちの一つをコードするのに十分な長さを有している核酸分子の一部と定義される。これには、タンパク質をプラスチドへ転移させるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を欠損する、本発明の核酸分子の一部も含まれる。そのような断片は例えば、配列番号：２に示すアミノ酸残基34位〜671位をコードするヌクレオチド配列、または配列番号：６に示すアミノ酸残基58位〜799位、または61位〜799位をコードするヌクレオチド配列である。さらに、本発明において特に好ましい断片は、その5'末端でさらにG残基を含む断片および配列番号：２のヌクレオチド1084位〜2825位を含む断片と共に、配列番号：１のヌクレオチド186位〜2239位を含む断片である。ここで、派生物という言葉は、その分子の配列が上記記載の核酸分子の配列と、一箇所またはそれ以上の箇所で異なっていて、それらが、上記のDNA分子の配列と高い相同性を示していることを意味する。ここで相同性とは、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、さらには８０％、さらに好ましくは９０％以上の配列同一性を意味する。上記記載の核酸分子との差異は、遺伝子の欠損、置換、挿入または組換えによって生じ得る。
【００２８】
さらに、相同性とは、機能的および／または構造的同等性が、それぞれの核酸分子またはそれらがコードするタンパク質の間に存在することを意味する。上記記載の分子と相同であり、その派生物である核酸分子は、一般的に、同じ生物機能を保持する改変を有する変異体である。これらの変異は、例えば、他の生物由来の配列というように自然に生じる変異であり、または自然に生じる突然変異であり、または特異的な突然変異の誘導により導入される。さらに、変異は、合成で生産される配列でもよい。対立遺伝子変異体は、自然に生じる変異体でもよく、合成で生産される変異体でもよい。または、組換えDNA技術によって生産される変異体であってもよい。
【００２９】
本発明の核酸分子の様々な変異体によってコードされるタンパク質は、一定の共通な性質を示す。酵素活性、分子量、免疫学的反応性、構造等は、ゲル電気泳動での移動度、クロマトグラフィー上の挙動、沈降係数、溶解性、分光学的性質、安定性、至適ｐＨ、至適温度などの物理特性とともに、これらの特性に属する。デンプン合成酵素の重要な特性は、(i) 植物細胞の色素体のストロマへの局在；(ii) 基質として、ADPグルコースを用いて直鎖状のα-1,4-結合ポリグルカンを合成する能力、である。この活性は、デニヤーとスミス（Denyer and Smith）(Planta 186 (1992), 606-617)によって記載されている方法、または実施例で記載されている方法で測定できる。
【００３０】
本発明の核酸分子の鎖と特異的にハイブリダイズする核酸分子もまた、本発明の主題である。これらは、好ましくは長さが少なくとも10ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、特に少なくとも15ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも50ヌクレオチドの長さである。これらの核酸分子は本発明の核酸分子鎖と特異的にハイブリダイズする、すなわち、それらは他のタンパク質、特に他のデンプン合成酵素をコードする核酸配列とハイブリダイズしないか、またはわずかにハイブリダイズするに過ぎない。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えばPCR反応のプライマーとして用いてもよい。それらはまた、アンチセンス構築物の成分または適したリボザイムをコードするDNA分子であってもよい。
【００３１】
さらに本発明は、本発明の上記記載の核酸分子を含むベクター、特には、遺伝子工学でよく用いられるプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、およびその他のベクターに関する。
【００３２】
好ましい態様において、ベクターに含まれる該核酸分子は、原核生物、または真核生物の細胞において、翻訳可能なRNAの転写と合成を確実にする調節要素に結合される。
【００３３】
例えば、大腸菌のような原核細胞における、本発明の核酸分子の発現は、それが該酵素の酵素活性のさらに正確な特性記述を可能にする限りにおいて、興味が持たれる。特に、植物細胞のデンプン合成に関与する他の酵素の非存在下で、それぞれの酵素によって合成される産物を調査することが可能となる。これは、植物細胞におけるデンプン合成過程で、それぞれのタンパク質が果たす機能について結論を導くことを可能にする。
【００３４】
さらに、通常の分子生物学的技術（Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）を用いて、本発明の核酸分子に、様々な突然変異を導入することができる。それによって、改変された生物学的機能を有するタンパク質の合成が誘導される。この手法により、一方では、核酸分子が、そのコードDNA配列の５’または３’末端に連続的な欠損を有する、欠損突然変異体（deletion mutants）を生産することが可能である。これらの核酸分子は、それに相当する短いタンパク質の合成を導く。ヌクレオチド配列の５’末端における、そのような欠損は、例えば、色素体への該酵素の局在に関わるアミノ酸配列の同定を可能にする（輸送 (transit)ペプチド）。これは各配列の欠損により、もはや色素体に局在せず、細胞質に局在したり、または、他のシグナル配列の付加のために、他の部位に局在するような酵素の特異的生産を可能にする。
【００３５】
もう一方では、アミノ酸配列の改変が、例えば、酵素活性や酵素制御に影響するような部位に、点突然変異が導入され得る。この方法により、改変されたKm値を持つ突然変異体や、通常細胞内で生じているアロステリック制御や共有結合の改変による制御機構に、もはやさらされない突然変異体が生産できる。
【００３６】
さらに、基質として、ADPグルコースの代わりにADPグルコース-6-リン酸を使用する突然変異体のような、改変された基質または産物特異性を示す突然変異体が生産される。
さらには、改変された活性-温度相関を持つ突然変異体が生産されうる。
【００３７】
原核細胞の遺伝子操作のために、本発明の核酸分子またはそれら分子の一部は、DNA配列の組換えによって突然変異や配列の改変を可能にするプラスミドに組み込まれる。標準的手法によって（Sambrookら、Molecular Cloning:A laboratory manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,USA参照）、塩基の交換が実施されたり、天然または人工合成配列が付加される。DNA断片を結合させるために、アダプターやリンカーが該断片に付加される。さらに、適当な制限部位を組み入れたり、余分なDNAや制限部位を除去する操作が使用される。挿入、欠損、または置換のための操作としては、インビトロ突然変異誘発、「プライマー修復」、制限、またはライゲーションが利用される。分析のためには、配列分析、制限分析、およびさらに生化学的・分子生物学的方法が利用される。
【００３８】
さらなる態様において、本発明は、宿主細胞、特に本発明の上記核酸分子もしくは本発明のベクターによって形質転換および／または遺伝子修飾された、原核細胞または真核細胞と共に、そのように形質転換および／または遺伝子修飾され、本発明の核酸分子または本発明のベクターを含む細胞に由来する宿主細胞に関する。これは、好ましくは細菌細胞または植物細胞である。そのような細胞は、導入された本発明の核酸分子が、形質転換細胞に関して異種である、すなわちこれらの細胞において天然には生じないか、または対応する天然の配列とは異なるゲノム内の別の場所に存在するという特徴を有する。さらに、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質は、それによって本発明の宿主細胞がタンパク質を合成できるような条件下で栽培され、次に該タンパク質が培養細胞および／または培養培地から単離されるそれらの製造法と共に、本発明の主題である。
【００３９】
その上、本発明はまた、本発明の一つ以上の核酸分子によって形質転換されたトランスジェニック植物細胞にも関する。そのような細胞は、好ましくは、それによってこれ／これらが、特にプロモーターにより植物細胞の転写を確実にする調節要素に結合される、一つ以上の本発明の核酸分子を含む。そのような細胞は、それらが該細胞において天然では生じない本発明の核酸分子を少なくとも一つ含むという点において、または該分子が、天然では生じない細胞のゲノム中の位置、すなわち異なるゲノム環境の位置で組み込まれる、という点において天然の植物細胞とは異なる。
【００４０】
当業者に既知の方法によって、トランスジェニック植物細胞は完全な植物体へと再生することができる。したがって、本発明のトランスジェニック植物細胞の再生によって得られる植物もまた、本発明の主題である。本発明のさらなる主題は、上記トランスジェニック植物細胞を含む植物である。トランスジェニック植物は基本的にいかなる望ましい種の植物、すなわち双子葉植物であっても単子葉植物であってもよい。これらは、好ましくは有用植物、特に穀類（ライ麦、大麦、オート麦、コムギ等）、コメ、トウモロコシ、豆類、キャッサバ、またはジャガイモのようなデンプン合成性またはデンプン貯蔵性植物である。
【００４１】
本発明の核酸分子を利用することによって、今や−組換えDNA技法によって−これまで育種では不可能であった方法で、植物のデンプン代謝を特に妨害することが可能となる。これによって、デンプン代謝は、例えば、その物理化学特性、特にアミロース／アミロペクチン比、分枝の程度、平均鎖長、リン酸含量、ペースト化作用、デンプン顆粒のサイズおよび／または形状が、野生型植物で合成されたデンプンと比較して修飾されている修飾デンプンを合成するように、修飾してもよい。本発明において記述したタンパク質の活性を増加させることによって、例えば、各核酸分子を過剰発現させることによって、またはもはや細胞特異的制御機構の作用を受けない、および／もしくはそれらの活性に関して異なる温度依存性を示さないような変異体を利用することによって、遺伝的に修飾された植物の収量が増加する可能性がある。コムギのデンプン合成に変化を加える可能性が経済的に重要であることは、この植物がかなり大量のデンプンを産生することから明白である。
【００４２】
したがって、各デンプン合成酵素の活性を増加させるために、植物細胞において本発明の核酸分子を発現させること、または該酵素を通常発現しない細胞にそれらを導入することが可能である。さらに、もはや細胞特異的制御メカニズムを受けない、または修飾された温度依存性もしくは基質各産物特異性を示す本発明のデンプン合成酵素を産生するために、当業者に既知の方法によって本発明の核酸分子を修飾してもよい。
【００４３】
植物における本発明の核酸分子の発現において、合成されたタンパク質は、基本的に、植物細胞内のいかなる望ましい区画に存在してもよい。合成されたタンパク質を特定の区画内に局在させるためには、プラスチド内の局在を確実にする配列を欠失させ、残りのコード領域を、各区画に確実に存在させるDNA配列に選択的に結合させなければならない。そのような配列は既知である（例えば、ブラウンら（Braun）、EMBO J. 11（1992）、3219〜3227；ウォルターら（Wolter）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85（1988）、846〜850；ゾネワルドら（Sonnewald）、Plant J. 1（1991）、95〜106）。
【００４４】
本発明はまた、本発明の植物の繁殖材料、例えば、果実、種子、塊茎、根茎、実生、挿し木、カルス、細胞培養等にも関する。
本発明に係る繁殖材料と共に、トランスジェニック植物細胞、植物に由来するデンプンもまた、本発明の主題である。
【００４５】
本発明の少なくとも１つの核酸分子の発現により、または場合によってはさらなる発現により、本発明に記述されるトランスジェニック植物細胞および植物は、野生型植物において合成されるデンプンと比較して、例えばその物理化学特性、特に、アミロース／アミロペクチン比、分枝の程度、平均鎖長、リン酸含量、ペースト化作用、デンプン顆粒のサイズおよび／形状が修飾されているデンプンを合成する。野生型デンプンと比較して、そのようなデンプンは、特にその粘度および／またはこのデンプン糊のゲル形成特性に関して修飾してもよい。
【００４６】
非形質転換植物と比較して本発明の少なくとも一つのタンパク質の活性が低下しているトランスジェニック植物細胞は、本発明のさらなる主題である。
【００４７】
本発明の核酸分子によって、本発明に係る少なくとも一つのタンパク質の活性が低下している植物細胞および植物を製造することが可能である。この場合でも、野生型植物細胞由来のデンプンと比較して修飾された化学および／または物理特性を有するデンプンが合成される。
【００４８】
本発明の少なくとも一つのタンパク質の活性が低下した植物細胞の製造は、例えば、少なくとも一つの対応するアンチセンスRNAの発現、共抑制効果を得ることを目的とした少なくとも一つのセンスRNAの発現、または本発明の核酸分子を用いて本発明のタンパク質の一つをコードする転写物を特異的に開裂する、対応して構築された少なくとも一つのリボザイムの発現によって達成されうる。
【００４９】
アンチセンスRNAを発現させるために、一方で、これらの部分が細胞内におけるアンチセンス効果を促進するために十分に長くなければならないコード配列の一部のみを含むDNA分子と同様に、おそらく存在する隣接配列を含む、本発明のタンパク質をコードする完全な配列を含むDNA分子を使用することができる。基本的に、最小の長さの15 bpの配列、好ましくは長さが100〜500 bpの配列で、有効なアンチセンス阻害のためには特に、500 bp以上の長さの配列を用いてもよい。一般的には、5000 bpより短いDNA分子、好ましくは長さが2500 bp未満の配列を使用する。
【００５０】
本発明のDNA分子の配列と非常に相同な、しかし完全には同一でないDNA配列を使用してもよい。相同性は、最小でも約65％以上であるべきである。好ましくは、95〜100％の相同性を有する配列を使用すべきである。
【００５１】
共抑制効果によって植物細胞における本発明の酵素の活性を低下させる方法は、当業者に既知で、例えば、ヨーゲンセン（Jorgensen、Trend Biotechnol. 8（1990）、340〜344）ニーベルら（Niebel、Curr. Top. Microbiol. Immunol.197（1995）、91〜103）、フラベルら（Flavell、Curr. Top. Microbiol. Immunol.197（1995）、43〜46）パラキ&ボーシェル（Palaqui and Vaucheret、Plant  Mol. Biol. 29（1995）、149〜159）、ボーシェルら（Vaucheret、Mol. Gen. Genet. 248 （1995）、311〜317）、デボーンら（de Borne、Mol. Gen. Genet. 243（1994）、613〜621）およびその他の文献に記述されている。
【００５２】
細胞における特定の酵素活性を低下させるための、対応するリボザイムの発現もまた当業者には既知で、例えば欧州特許第B1 0 321 201号に記述されている。植物細胞におけるリボザイムの発現は、フェイターら（Feyter、Mol. Gen. Genet. 250（1996）、329〜338）によって記述された。
【００５３】
その上、本発明の上記トランスジェニック植物細胞を含む植物もまた、本発明の主題である。これらは、当業者に既知の方法によって本発明の植物細胞から完全な植物体へと再生させてもよい。これらの植物は、好ましくは、すでに先に記述した植物、特に有用植物、中でもデンプン合成性、または場合によってはデンプン貯蔵性植物である。ここでも、コムギは特に好ましい。
【００５４】
本発明はまた、本発明の植物の繁殖材料、特に果実、種子、塊茎、根茎、実生、挿し木、カルス、細胞培養等に関する。
その上、繁殖材料と共に、上記トランスジェニック植物細胞、植物に由来するデンプンは、本発明の主題である。
【００５５】
本発明のタンパク質のうち、少なくとも一つの活性を減少させることにより、本発明のトランスジェニック植物細胞および植物体は、野生型植物で合成されたデンプンと比較して、その物理化学的特性、特にアミロース／アミロペクチンの割合、分枝の程度、平均鎖長、リン酸含量、パスティフィケーション作用、サイズ、および／またはデンプン顆粒の形状が改変されているデンプンを合成する。このデンプンは、野生型植物に由来するデンプンと比較して、例えば、粘性および／またはその顆粒のゲル形成特性が改変されている場合がある。
【００５６】
本発明のデンプンは、熟練者に公知の技術でさらに改変されうる。該デンプンは、未改変、または改変された形で、食料品または、その他の分野への応用に適している。
【００５７】
基本的に、該デンプンの用途の可能性としては、2つの主な分野に分類される。１つは、酵素的または化学的処理で得られる、本質的にグルコースおよびグルカン成分である、デンプンの加水分解産物を利用する分野である。それらは、発酵のような、さらなる化学改変、処理工程の出発材料として用いることができる。この場合、その加水分解工程が、単純で、安価に実施されることが重要である。現在、この工程は、実質的にアミログルコシダーゼを用いた酵素処理で実施されている。その場合、デンプン構造の変換、例えば、粒子表面の増加、少分枝化による消化され易さの向上、酵素の接近を妨害するような立体構造の改善によって、使用する酵素量を減少させることにより、コストが削減される。
【００５８】
デンプンのもう一つの使用分野は、いわゆる天然デンプンとして、そのポリマー構造を利用する分野であり、それはさらに2つの分野に分類される。
【００５９】
１．食料品分野における使用
デンプンは、様々な食料品の古典的な添加物であり、デンプンは、本質的に水溶性添加物の結合および／または粘性増加、ゲル形成増加等の目的で使用される。重要な特性としては、流動性と収着性、膨潤とパスティフィケーション（Pastification）温度、粘性と濃化作用、デンプン溶解性、透明性とのり構造、熱・ずれ・酸抵抗性、レトログラデーション（retrogradation）の傾向、フィルム形成能、凍結／融解に対する抵抗性、消化性、無機または有機イオンとの複合物質形成能が挙げられる。天然デンプンの施用の好ましい分野は、ベーカリー品およびパスタの分野である。
【００６０】
２．食料品以外の分野での使用
デンプン使用の他の主な施用分野は、様々な生産工程におけるアジュバント（補剤）として、または工業生産物の添加剤としての分野である。アジュバントとしてのデンプン利用の主な応用分野は、とりわけ製紙および板紙工業である。この分野で、デンプンは主に、保持剤（背面固体の保持）、物質を凝固させるためのサイズ充填剤や細かい粒子、および脱水のために利用される。それに加えて、堅さ、丈夫さ、無傷性、グリップ性、光沢、なめらかさ、引裂き強さ、外観などのデンプンの有する特性が利用される。
【００６１】
２．１  紙および板紙工業
製紙生産工程においては、４種類の利用法が区別される。すなわち、サーフィス（surface）、コーティング（coating）、マス（mass）、およびスプレイイング（spraying）である。
サーフィス処理に関してデンプンに要求される特性は、本質上、高度な輝き、適当な粘性、高い粘度安定性、良好なフィルム形成、ほこり低形成である。コーティングの場合、固体含量、適当な粘性、高結合性、および高色素親和性が、重要な役割を担う。マスへの添加剤として、速く、均一で、ロスのない拡散、高機械強度、および紙パルプへの完全な保持が重要である。スプレイイングにおけるデンプンの使用は、固体含量、高粘性、および高結合性が重要である。
【００６２】
２．２  接着剤工業
接着剤工業における主な応用分野は、４つの分野に分けられる。それらは、純粋なデンプンにかわ、特定の化学薬品で調製されたデンプンにかわ、合成樹脂および分散高分子への添加剤、合成接着剤の添加剤分野である。すべてのデンプンに基づく接着剤のうちの90%は、波形ボード、紙包み、紙バッグ、紙とアルミニウムのための混合材料、箱、および封筒・切手などの湿りのりとして、使用されている。
【００６３】
２．３  織物工業・織物保護工業
補助剤、添加剤としての他の利用は、織物および織物保護製品においてである。織物工業においては、４つの応用分野がある。紡績中に働く張力に対しての糸の保護のために、および紡績中のすり切れに対する抵抗力上昇のために有効であり、糸のいが除去を円滑に、そして強力に促進するための添加剤として、脱色、染色等の、品質低下を招く前処理の後の、織物改良の薬剤として、色素のり生産時の、色素の拡散を抑制するための濃化剤として、縫い糸整経剤の添加物として利用される。
【００６４】
２．４  建築工業
デンプン利用分野の４番目は、建築材料への添加剤である。一つの例は、石膏プラスターボードの生産である。そこでは、薄いプラスターに混合されたデンプンは、水で糊状になり、石膏ボードの表面を拡散し、そしてボードに板紙を接着させる。他の応用分野は、デンプンをプラスターやミネラルファイバーに混合することである。すでに混合されているコンクリートにおいて、デンプンは整形工程の減速のために使用されうる。
【００６５】
２．５  土壌安定剤
さらに、デンプンは、水に対する土粒子の一時的な保護のため人為的な陸地移動の際の土壌安定化に寄与する。最新の知識によると、デンプンとポリマーエマルジョンから構成される製品は、今までに使用されている製品と同程度に、浸食および外皮形成を減少させる効果を持つと考えられている。しかし、それらは、著しくコストを削減する。
【００６６】
２．６  植物保護剤および肥料におけるデンプン使用
デンプンの他の利用分野は、デンプンを植物保護剤に添加し、これら調製物の特性を改変することである。例えば、デンプンは、植物保護剤や肥料の吸水性向上のために、活性成分の徐放のために、水性、揮発性および／または臭い成分を、微晶質で、安定な変形可能物質に変換するために、適合性のない成分を混合するために、そして遅い分解速度による有効期間の延長のために利用される。
【００６７】
２．７  薬物、医薬品および化粧品工業
デンプンはまた、薬品、医薬および化粧品工業の分野において利用される。製薬工業において、デンプンは錠剤のバインダーとして、またはカプセル中のバインダーの希釈のために使用される。さらにデンプンは、飲んだ時に溶液を吸収して、短い時間内でよく膨潤し、活性成分が素早く放出されるので、錠剤の分解促進剤として適している。さらに、質の面で、デンプンは、医用フローワンス（flowance）およびダスティングパウダー（dusting powders）に応用される。化粧品の分野においては、デンプンは、例えば、香水やサリチル酸のような粉末状添加物のキャリアーとして利用される。さらにデンプンの応用としては、ねり歯磨きがある。
【００６８】
２．８  石炭および練炭への添加剤としてのデンプン
石炭および練炭への添加物としてのデンプン利用が考えられる。デンプンを添加することにより、石炭は定量的に塊になり、および／または高品質に練炭化され、したがって、練炭の早期分解を防ぐ。バーベキュウ石炭は、４から６％のデンプンを含む。熱用石炭は、0.1 から0.5％のデンプンを含む。さらに、デンプンは、石炭や練炭への添加により、毒性物質の放出を著しく減少させるので、結合剤として適している。
【００６９】
２．９  鉱石および石炭スラリーの処理
さらにデンプンは、鉱石や石炭スラリーの処理において、凝結剤として使用されうる。
【００７０】
２．１０  鋳造における添加剤としてのデンプン
デンプン応用の他の分野は、鋳造における工程材料への添加剤としての利用である。様々な鋳造工程において、結合剤と混合された砂から作製される心型が必要である。現在、最も普通に使用されている結合剤は、改変デンプン（ほとんど膨潤デンプン）と混合されたベントナイトである。
デンプンを添加する目的は、流動抵抗を増加させ、結合力を上昇させることにある。さらに膨潤デンプンは、冷水中での分散能、再水和性、砂との良好な混合性および水との高結合性といった、生産工程のための前提条件を満たす。
【００７１】
２．１１  ゴム工業におけるデンプン使用
ゴム工業において、デンプンは、工業的および光学的な品質の向上に利用される。使用の目的は、表面光沢、グリップ性、および外観の向上である。この目的のために、デンプンは、冷和硫の前に、ゴム物質のねばねばした表面上に分散させられる。デンプンはまた、ゴムの印刷性改良のためにも使用される。
【００７２】
２．１２  レザー代替品の生産
改変デンプンの他の利用分野は、レザー代替物の生産である。
【００７３】
２．１３  合成ポリマーにおけるデンプン
プラスチック市場において、下記のデンプン利用分野が出現している。それらは、デンプン由来産物の加工工程への利用（この場合、デンプンは単なる充填剤で、合成ポリマーとデンプンとの間に直接結合はない）または、デンプン由来産物のポリマー生産物への統合（この場合、デンプンとポリマーは、安定な結合を形成する）である。
【００７４】
純粋な充填剤としてのデンプンの利用はタルクなどの他の物質には匹敵し得ない。こうした事情は、特定のデンプン特性が効果的となり、したがって最終産物の特性プロフィールが明らかに変化する場合は異なる。一つの例は、ポリエチレンなどの熱塑性物質の処置におけるデンプン生産物の利用である。したがってデンプン及び合成ポリマーを、顆粒状のポリエチレンを用いる通常の技術によって様々な生産物が作成される「マスターバッチ（master batch）」を形成するために同時発現によって１：１の割合で結合させる。ポリエチレンフィルムにデンプンを組み込むことにより、凹型における物質の浸透性の増加、水蒸気の浸透性の増加、静電気防止作用の増加、抗妨害作用の増加ならびに水性染料の有効な印刷がもたらされる。
【００７５】
他の可能性としてはポリウレタンフォームにおけるデンプンの利用がある。デンプン誘導体を適応させならびに操作技術を最適なものにすることによって、合成ポリマーとデンプンの水酸基との間の反応を特異的に調節することが可能となる。その結果、デンプンを使用することによる以下の特性プロフィールを有するポリウレタンフィルムが得られる。すなわち熱膨張の共同作因の減少、収縮作用の減少、圧力／張力作用の増加、水受容体の変化を伴わない水蒸気浸透度の増加、引火性及び熱分解密度の減少、可燃性部分の欠落がないこと、非ハロゲン化合物、ならびに時効の減少である。現在までのところまだ存在している不利な点は圧力及び衝撃強度が減少することである。
【００７６】
フィルムの生産物開発は単なるオプションではない。ポット（pot）、プレート及びボウルなどの固状プラスチック産物もまた、デンプンの含有量が50％以上であるため作成することができる。さらに、デンプン／ポリマー混合物により、遙かに簡単に生物分解されるという利点が提供される。
【００７７】
さらに、それらの非常に高い水結合性によって、デンプングラフトポリマーは、最大限の重要性を獲得している。それらは、デンプンのバックボーンと、ラジカルチェイン機序（radical chain mechanism）の原理に従って、それにグラフトされた合成モノマーのサイド格子を持つ製品である。現在利用できるデンプングラフトポリマーは、高粘性下において、デンプン g あたり水1000 g までの優れた結合性と保持能力によって特徴づけられる。これらの超吸収剤は、主に衛生分野（例えばおむつやシートのような製品）および農業分野（例えば、種ペレット）で使用されている。
【００７８】
組換えDNA技術によって改変される新しいデンプンの利用のための決定因子は、一方では、構造、含水量、タンパク質含量、脂質含量、繊維含量、灰／リン酸塩含量、アミロース／アミロペクチン比、相対分子量の分布、分枝の程度、顆粒のサイズと形、および結晶化であり、もう一方は、次に示す特徴をもたらす性質である。すなわち流動性と収着性、パスティフィケーション（Pastification）温度、粘性、濃化作用、溶解性、のり構造、透明性、熱・ずれ・酸抵抗性、レトログラデーション（retrogradation）の傾向、ゲル形成能、凍結／融解に対する耐性、複合体形成能、ヨウ素結合、フィルム形成能、接着力、酵素安定性、消化性、および反応性である。
【００７９】
トランスジェニック植物を遺伝学的に操作することによる改変デンプンの生産は、その植物から得られるデンプンの性質を、後の化学的または物理的方法による改変を不必要にするように改変するかもしれない。もう一方では、組換えDNA技術によって改変されたデンプンは、上記記載の応用分野に適合する品質にするために、さらに化学改変されてもよい。これらの化学改変は、原理的には、この分野の熟練者に公知である。これらは、とりわけ、下記の方法による改変である。
−熱処理
−酸処理
−酸化、および
−エステル化
これらは、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、キサントゲン酸塩、酢酸塩、およびクエン酸塩の形成に導く。他の有機酸もまた、エステル化のために使用される。
−デンプンエーテルの形成
デンプンアルキルエーテル、O-アリルエーテル、水酸化アルキルエーテル、O-カルボキシメチルエーテル、N-含有デンプンエーテル、P-含有デンプンエーテル、および  S-含有デンプンエーテル。
−分枝デンプンの形成
−デンプングラフトポリマーの形成。
本発明のデンプンは、好ましくは包装および使い捨て商品の製造に用いられる。
【００８０】
植物細胞において、本発明の核酸分子をセンスまたはアンチセンス方向に発現させるために、これらは、植物細胞内で転写を確実にする制御DNA因子に結合される。そのような制御DNA因子は、特にプロモーターである。基本的に、植物細胞において活性ないかなるプロモーターも、発現に用いることができる。
【００８１】
プロモーターは、発現が、構成的に生じたり、植物発生のある時期にある組織で生じたり、または、外部環境によって決定される時期に生じたりするように、選定される。植物に関して、プロモーターは、相同でもヘテロでもよい。構成的発現のために適切なプロモーターは、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35SRNAプロモーター、およびトウモロコシ由来のユビキチンプロモーターである。ジャガイモにおける塊茎特異的発現のためには、パタチン（patatin）遺伝子プロモーターB33（Rocha-Sosaら、EMBO J. 8 (1989), 23-29）を用いることができる。光合成活性組織でのみ発現を確実にするプロモーターとしては、例えばST-LS1プロモーター（Stockhausら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987),7943-7947;Stockhausら、EMBO J.8(1989)2445-2451）が使われる。胚乳特異的発現のためには、コムギ由来のHMGプロモーター、USPプロモーター、phaseolinプロモーター、もしくはトウモロコシ由来のzein遺伝子のプロモーターが適している。
【００８２】
さらに、該転写を確実に終止させ、該転写物を安定化させると思われるポリＡ末端を該転写物へ付加するのに有用な終止配列が存在する。そうした要素は文献（Gielenら、EMBO J. 8(1989)、23-29）に記載されており、要求に応じて改変しうる。
【００８３】
本発明により、コムギに由来する二つの異なる種類のデンプン合成酵素をコードする核酸分子が提供される。このことにより、デンプン生合成におけるこれらのアイソタイプの機能を同定することならびに少なくとも一つの該酵素の活性を修飾した遺伝的に修飾された植物を作成することが可能となる。これにより、そうした方法で操作した植物において修飾された構造を有し、したがって修飾された物理化学的特性を有するデンプンを合成することが可能となる。
【００８４】
また、本発明の核酸分子を、本発明の少なくとも一つのデンプン合成酵素の活性が増大しているかまたは減少しており、同時にデンプン生合成に関する他の酵素の活性が修飾されている植物を製造するために使用することができる。したがって、あらゆる種類の組み合わせ及び変更が考えられる。植物におけるデンプン合成酵素の一つ以上のアイソタイプの活性を修飾することによって、その構造が修飾されたデンプンの合成が得られる。トウモロコシもしくはコムギの内胚葉、またはジャガイモの塊茎におけるように、形質転換植物のデンプン貯蔵組織の細胞におけるデンプン合成酵素の一つ以上のアイソタイプの活性を増加させれば、収量の増加が得られると考えられる。例えば、内因性GBSS I-、SSS-またはGBSS II-タンパク質の合成がアンチセンス効果もしくは変異によってすでに阻害されている、または分枝酵素の合成が阻害されている（ナカムラら（Nakamura）、上記引用、が記述するように）植物細胞に、本発明のタンパク質をコードする核酸分子、または対応するアンチセンス構築物を組み込んでもよい。
【００８５】
形質転換植物においていくつかのデンプン合成酵素の合成を阻害することができれば、適当なプロモーターによってアンチセンス配向に調節された相補的デンプン合成酵素をコードするいくつかの領域を同時に含むDNA分子を形質転換に使用することができる。この結果、各配列をそれ自身のプロモーターによってまたは通常のプロモーターと融合して転写される他の配列によって調節することができる。こうした場合、個々のタンパク質の合成がほぼ同程度に抑制されているため、後者が一般的に好ましい。
【００８６】
さらに、デンプン合成酵素をコードするDNA配列以外に、デンプン合成または修飾に関与する他のタンパク質をコードする別のDNA配列を含むDNA分子を構築することが可能である。これにより該配列を再び連続して接続することができ、通常のプロモーターによって転写することができる。そうした構築物において様々な長さのコード領域が用いられるため、アンチセンス構築物の作成に関する上述の要素も事実である。該DNA分子中のプロモーターから転写されるアンチセンス断片の数に上限はない。しかし、結果として生じる転写物は10kbよりも短く、好ましくは5kbよりも短い。
【００８７】
該DNA分子において他のコード領域と共に、好ましいプロモーターの後にアンチセンス配向に位置するコード領域は、以下のタンパク質をコードするDNA配列由来である。すなわち顆粒結合性デンプン合成酵素（GBSS I及びGBSS II）、他の可溶性デンプン合成酵素、分枝酵素、脱分枝酵素、不均等化酵素（disproportionizing enzyme）及びデンプンホスホリラーゼである。これは単に例として列挙したものである。そうした組み合わせの枠内で他のDNA分子を使用することも考えられる。
【００８８】
そうした構築物により、これらの分子を用いて形質転換された植物細胞においていくつかの酵素の合成を同時に阻害することが可能である。
さらに、構築物はデンプン生合成の一つ以上の遺伝子を欠損する古典的な変異体に組み込んでもよい。これらの欠損は以下のタンパク質に関連してもよい：顆粒結合型デンプン合成酵素（GBSS-IおよびII）および可溶性デンプン合成酵素（SSS IおよびII）、分枝酵素（BE IおよびII）、脱分枝酵素（R酵素）、不均化酵素、ならびにデンプンフォフォリラーゼ。この列挙は単なる一例に過ぎない。
そのような方法を用いれば、これらの核酸分子で形質転換された植物細胞内で、同時にいくつかの酵素の合成を阻害することがさらに可能である。
【００８９】
外来遺伝子の高等植物への組み込みを調製するためには、大腸菌の複製シグナルおよび形質転換された細菌細胞の選択のためのマーカー遺伝子を含む、多数のクローニングベクターが自由に利用できる。そのようなベクターの例は、pBR322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、pACYC184等である。適した制限部位でベクターに所望の配列を組み込んでもよい。得られたプラスミドを大腸菌細胞の形質転換に用いる。形質転換された大腸菌細胞を適当な培地で培養し、その後回収して溶解させる。プラスミドを回収する。得られたプラスミドDNAの特徴付けのための分析方法として、一般に、制限分析、ゲル電気泳動およびその他の生化学−分子生物学的方法を利用する。各操作の後、プラスミドDNAを開裂し、得られたDNA断片を他のDNA配列に結合させてもよい。各プラスミドDNAは、同一または他のプラスミドの中にクローニングしてもよい。DNAを植物宿主細胞に組み込むためには、広範な技術が利用できる。これらの技法には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を形質転換媒体として用いるT-DNAによる植物細胞の形質転換、プロトプラストの融合、DNAのインジェクションおよび電気穿孔、バイオリスティック（biolistic）法と共に、これ以外の可能性によるDNAの組み込みが含まれる。
【００９０】
インジェクション、バイオリスティック法およびDNAの植物細胞への電気穿孔の場合、使用するプラスミドに特別な必要条件はない。pUC誘導体のような単純なプラスミドを用いてもよい。しかし、そのように形質転換された細胞から完全な植物体を再生させる場合には、選択的なマーカー遺伝子が存在しなければならない。
【００９１】
所望の遺伝子を植物細胞に組み込む方法に応じて、さらなるDNA配列が必要となりうる。Ti-またはRi-プラスミドを、例えば植物細胞の形質転換に用いる場合、通常少なくとも右境界部、しかし、より頻繁にはTi-およびRi-プラスミドT-DNAの左右境界部を外来遺伝子に結合させて、隣接領域として組み込むべきである。
【００９２】
アグロバクテリア（Agrobacteria）を形質転換に用いる場合には、組み込むべきDNAを特殊なプラスミド、すなわち、中間ベクターまたはバイナリベクターのいずれかの中にクローニングするべきである。T-DNA内での配列と相同な配列により、相同組換えによってアグロバクテリウムのTi-またはRi-プラスミドに中間ベクターを組み込んでもよい。これはまた、T-DNAの移入に必要なvir領域を含む。中間ベクターはアグロバクテリア内で複製することができない。ヘルパープラスミドを用いて、中間ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に移入してもよい（接合）。バイナリベクターは、アグロバクテリアと同様に、大腸菌において複製してもよい。それらは、T-DNAの左右境界領域によって囲まれるリンカーまたはポリリンカーと同様に、選択的なマーカー遺伝子を含む。それらは、アグロバクテリアの中に直接形質転換させてもよい（ホルスターズ（Holsters）、Mol. Gen. Genet. 163（1978）、181〜187）。宿主細胞として機能するアグロバクテリウムは、vir領域を有するプラスミドを含まなければならない。vir領域は通常、T-DNAの植物細胞への移入に必要である。さらなるT-DNAが存在してもよい。そのように形質転換されたアグロバクテリウムを、植物細胞の形質転換に用いる。
【００９３】
植物細胞の形質転換へのT-DNAの使用については、十分に研究されており、欧州特許第120 516号に詳しく記述されている；ホーケマ（Hoekema）、「バイナリー植物ベクターシステム」（The Binary Plant Vector System）、オフセットドルッケリ  カンターズB.V.（Kanters B.V.）、アルブラッセルダム（1985）、第V章；フラレーら（Fraley）、Crit. Rev. Plant. Sci., 4、１〜46、およびアンら（An）、EMBO J. 4（1985）、277〜287）。
【００９４】
DNAを植物細胞に移入するためには、植物外植片を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）と共培養することが適しているかもしれない。次に、感染した植物材料（例えば、葉片、茎の一部、根、さらに、プロトプラスト、または懸濁培養植物細胞）から、形質転換細胞を選択するために抗生物質またはバイオザイド（Biozide）を含んでもよい適当な培地において、植物体全体を再生させてもよい。次に、そのようにして得られた植物に組み込まれたDNAが存在するか否かを試験することができる。バイオリスティック法を用いることによって、またはプロトプラストを形質転換することによって、外来DNAを組み込むその他の可能性は、当業者に既知である（例えば、ウィルミッツァー（Willmitzer. L）、1993 「トランスジェニック植物」（Transgenic plants）：「バイオテクノロジー、大量包括論文」（Biotechnology,  A Multi-Volume Comprehensive Treatise、H.J.レーム、G.リード、A.ピューラー、P.スタドラー（H.J. Rehm, G. Reed, A. Puhler, P. Stadler）編、第２巻、627〜659、VCHバインハイム−ニューヨーク−バーゼル−ケンブリッジ、を参照のこと）。
【００９５】
単子葉植物を形質転換するための別のシステムは、バイオリスティックアプローチ、プロトプラストにおける電気的または化学的に誘導されたDNA組み込み、部分的透過性細胞の電気穿孔、花序へのDNAのマクロインジェクション、ミクロスフォアおよび前胚芽へのDNAのマイクロインジェクション、発芽した花粉によるDNA組み込み、および膨張による胚芽へのDNA組み込みによる形質転換である（ポトリカス（Potrykus）、Physiol. Plant（1990）、269〜273に総説が示される）。
【００９６】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いたTi-プラスミドベクター系による双子葉植物の形質転換は、よく確立された方法であるが、より最近の研究により、単子葉植物の場合にもアグロバクテリウムに基づくベクターによる形質転換を用いることができることが示されている（チャンら（Chan）、Plant Mol. Biol. 22（1993）、491〜506；ヒエイら（Hiei）Plant J. 6（1994）、271〜282；バイテビアら（Bytebier）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84（1987）、5345〜5349；ライネリら（Raineri）、Biol/Technology 8（1990）、33〜38；グッドら（Gould）、Plant  Pysiol. 95（1991）、426〜434；ムーネイら（Mooney）、Plant, Cell Tiss.& Org. Cult. 25（1991）、209〜218；リら（Li）、Plant Mol. Biol. 20 （1992）、1037〜1048）。
【００９７】
上記の形質転換系の３つは、過去に様々なタイプの穀類において確立されている：植物組織の電気穿孔、プロトプラストの形質転換、ならびに再生組織および細胞における粒子衝撃によるDNA移入（ジェーンら（Jahne）、Euphytica 85（1995）、35〜44の総説参照）。
【００９８】
対応する文献において、コムギの形質転換は、様々な方法で記述されている（マエシュワリら（Maheshwari）、Critical Reviews in Plant Science 14（2）（1995）、149〜178を参照のこと）。ヘスら（Hess、Plant Sci. 72（1990）、233）は、花粉とアグロバクテリアを互いに接近させるためにマクロインジェクションを用いた。選択可能マーカーとしてnpt II遺伝子を含むプラスミドが移動できることは、サザンブロット分析およびNPTII試験によって証明された。形質転換体は正常な表現型を構成したが、受精能力はなかった。カナマイシン耐性は２つの連続した世代において証明することができた。
【００９９】
微量発射物結合DNAによる衝撃後に再生することができた最初のトランスジェニック受精可能コムギ植物は、バジルら（Vasil、Bio/Technology 10（1992）、667〜674）が記述した。衝撃の標的組織は胚芽カルス培養（C型カルス）であった。フォスフィノトリシンホスホトランスフェラーゼをコードし、したがって、除草剤フォスフィノトリシンに対する耐性を伝えるbar遺伝子を、選択可能なマーカー遺伝子として用いた。
【０１００】
さらなる系は、ベッカーら（Bekker、Plant J. 5（2）（1994）、299〜307）と共にウィークスら（Weeks、Plant Physiol. 102（1993）、1077〜1084）が記述した。ここでは、未成熟な胚芽の小眉板をDNA形質転換の標的組織として用いた。導入インビトロ相において、小眉板に体細胞胚を誘導させた。形質転換効率は、「ボブホワイト」種の胚1000個あたり１または２個のトランスジェニック植物が得られたウィークらによって確立された系より、ベッカーら（上記引用）によって開発されたシステムではかなり高く、「フロリダ」種の胚83個あたり１個のトランスジェニック植物が得られた。
ベッカーら（上記引用）が開発した系を、実施例に記述される形質転換実験の基礎とする。
【０１０１】
導入されたDNAが植物細胞のゲノムに組み込まれると、それは通常、その位置で安定であり続け、最初に形質転換された細胞の子孫にも残っている。それは通常、フォスフィノトリシンのようなバイオザイド（biozide）またはカナマイシン、G418、ブレオマイシン、もしくはヒグロマイシン等のような抗生物質に対する耐性を形質転換植物細胞に付与する選択可能マーカーを含む。したがって個別に選択されたマーカーにより、組み込まれたDNAを欠損する細胞から形質転換細胞の選択が可能となるはずである。
【０１０２】
形質転換細胞は、植物内で通常の様式で増殖する（マコーミックら（McCormick）、Plant Cell Report 5（1986）、81〜84も参照）。得られた植物は、通常の方法で栽培し、同じく形質転換された遺伝子による遺伝またはその他の遺伝子による遺伝を有する植物と交雑育種することができる。得られたハイブリッド個体は対応する表現型特性を有する。植物細胞は種子を産生する。
【０１０３】
表現型特徴が安定に保持されているか否か、およびそれらが子孫に伝わるか否かを確実に保証するためには、２世代以上を生育させるべきである。さらに、対応する表現型またはその他の特性が残っていることを確実に保証するために、種子を回収すべきである。
【０１０４】
実施例では以下の方法を用いた。
１．クローニング法
大腸菌によるクローニングで、ベクターpBluescript II SK(Stratagene)を使用した。
【０１０５】
２．細菌株
Bluescriptベクターおよびアンチセンス構築物のために、大腸菌のDH5α株 (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, USA)を用いた。インビボ切除のために、大腸菌のXL1-Blue株を用いた。
【０１０６】
３. 未成熟コムギ胚の形質転換
用いた培地
MS：    100 ml/L  マクロ塩
１ml/L  ミクロ塩
２ml/L  Fe/Na EDTA
30  g/L  蔗糖
（ベッカー&レルツ（D. Becker and H. Lorz）、植物組織培養マニュアル（Plant Tissue Culture Manual）（1996）、B12：１〜20）
#30：   MS＋2.4-D（２mg/L）
#31：   MS＋2.4-D（２mg/L）＋フォスフィノトリシン（PPT、除草剤BASTA             （登録商標）の活性成分（２mg/L））
#32：   MS＋2.4-D（0.1 mg/L）＋ PPT（２mg/L）
#39：   MS＋2.4-D（２mg/ml）＋ 各0.5 M マンニトース／ソルビトール
上記の培地はKOHでpHを5.6に調整し、0.3％ゲルライトで強化した。
【０１０７】
コムギの未成熟胚を形質転換する方法は、ベッカー&レルツ（D. Becker and H. Lorz、植物組織培養マニュアル（Plant Tissue Culture Manual）（1996）、B12：１〜20）が開発し、最適化した。
以下に記述する実験において、ベッカー&レルツ（D. Becker and H. Lorz、上記引用文）が記述したプロトコルが認められた。
【０１０８】
形質転換に関しては、12〜14日の発生段階において穀果を有する耳状組織を開花後に回収し、表面を滅菌する。誘導培地#30上で、培地に面する胚軸と共に、単離した小眉板を播種する。
２〜４日の前培養（26℃、暗所）の後、浸透圧前培養（２〜４時間、26℃、暗所）のために外植片を培地#39に移す。
バイオリスティック（biolistic）形質転換のために、その上に標的DNA５μgまたは73 ngが沈殿している金粒子29 μgを各ショットに用いる。実施する実験は同時形質転換であるため、標的DNAは、標的遺伝子および耐性マーカー遺伝子（bar遺伝子）を１：１の比率で含む沈殿混合物に加える。
【０１０９】
４. DNA断片のDIG-標識
スクリーニングプローブとして用いられるDNA断片の標識は、DIG標識dUDPを組み入れることによって特異的PCRによって得られた（ベーリンガー・マンハイム社、ドイツ）。
【０１１０】
実施例１
コムギ（トリシタム・エスチバム（Tricitum aestivum L.）栽培品種フロリダ）の可溶性デンプン合成酵素をコードするcDNAの同定、単離、および特徴分析
cDNAの合成は、約21日齢のコムギ穀果のポリ（A）＋-RNAから実施した。以下に述べる実験は全て、製造元のプロトコル（ZAP-cDNA合成キットおよびZAP-cDNAギガパックIIゴールドクローニングキット、ストラタジーン社、GmbH、ハイデルベルク）に従って実施した。
【０１１１】
cDNAライブラリの力価を決定した後、一次力価1.25×10６ pfu/mlが認められた。スクリーニングはDIG-標識DNA断片を用いて実施した。これによって、コメの可溶性デンプン合成酵素からのサブ分画をコードするDIG-標識PCR断片（ババら（Baba）、上記引用文）をプローブとして用いた。PCRに用いたプライマーの配列は、以下の通りであった。
R１：ACA GGA TCC TGT GCT ATG CGG CGT GTG AAG（配列番号：３）
R２：TTG GGA TCC GCA ATG CCC ACA GCA TTT TTT TC（配列番号：４）
スクリーニングのため、プレート（直径15 cm）あたり約５×10４ pfuを播種した。陽性クローンを選び出した。インビボ切除により、選び出したクローンをpBluescript SK（-）ファージミドとして得た。
ミニプレパレーションによってクローンを分析し、プラスミド-DNAの制限後、TaSSSクローンをさらに処理した。
【０１１２】
実施例２
pTaSSSプラスミドのcDNAインサートの配列分析
クローンTaSSSのプラスミドDNAを単離し、ジデスオキシヌクレオチド法（サンガーら（Sanger）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74（1977）、5463〜5467）によってcDNAインサートの配列を決定した。
【０１１３】
まず、配列番号：１に示すように、その5'-末端でさらなるG残基を含むヌクレオチド186〜2239位を含む部分配列を決定した。クローンTaSSSのインサートは長さが2239 bpで、ほぼ全長のcDNAである。ヌクレオチド配列は配列番号：１に示す。対応するアミノ酸配列を配列番号：２に示す。推定されるシグナルペプチド開裂部位は、配列番号：１のアミノ酸残基33位と34位の間に位置する。
【０１１４】
配列分析およびすでに公表された配列との比較により、配列番号：１に示す配列が新規のもので、他の有機体からの可溶性デンプン合成酵素との相同性を示すほぼ全長のコード領域を含むことが示された。TaSSSの部分cDNA配列によって、分子生物学の当業者は、5'領域での欠失領域を単離することが可能となり、それによって完全なcDNAクローンを得ることができる。そうするためには、クローンTaSSSの5'領域を全cDNAのスクリーニングのプローブとして用いてもよく、ハイブリダイゼーションによる定法を用いて完全なクローンを単離してもよい。一方、欠失した5'末端は、5'-レース法（例えば、ベーリンガー・マンハイム社またはその他の製造元）を用いて得てもよい。
【０１１５】
実施例３
植物形質転換ベクターpTaSSS-asの作製
コムギからの単離cDNAに対するアンチセンス-RNAを発現するために、プラスミドpTaSSSのcDNAインサートがDNA断片とアンチセンス方向で結合し、それによって発現がユビキチン-プロモーターによって制御されている、ベースプラスミドとしてpUC19に基づいて、植物形質転換ベクターをデザインした。このプロモーターは、トウモロコシからのユビキチン遺伝子の第一の非翻訳エキソンおよび第一のイントロンを含む（クリステンセン（Christensen A.H.）、Plant Molecular Biology 18 （1992）、675〜689）
【０１１６】
ポリリンカーおよびNOSターミネーターの一部をプラスミドpAct1.cas（CAMBIA、TG 0063；カンビア社、GPO Box 3200, Canberra ACT 2601,  Australia）から得た。このターミネーターを含むベクター構築物およびpAct1.casに基づく構築物はマッケルロイら（McElroy、Molecular Breeding 1（1995）、27〜37）が記述している。コムギの形質転換にはpTaSSSを上記のように用いた。
【０１１７】
実施例４
コムギ（トリシタム・エスチバム（Tricitum aestivum L.）栽培品種フロリダ）のデンプン合成酵素をコードするもう一つのcDNAの同定、単離、および特徴分析
植物の可溶性および顆粒結合デンプン合成酵素をコードするこれまで既知の配列との配列比較を行うと、様々なタンパク質の間に強く保存された３つの領域が存在することが明白となった。
【０１１８】
コムギからの可溶性デンプン合成酵素を単離する目的において、ポリクローナルペプチド抗体を産生するために、これらの３つの領域を選択した。したがって、以下のアミノ酸配列を有する３つの合成ポリペプチドを産生した：
ペプチド１：NH２- PWSKTGGLGDVC -COOH（配列番号：７）
ペプチド２：NH２- PSRFEPCGLNQLY -COOH（配列番号：８）
ペプチド３：NH２- GTGGLRDTVENC -COOH（配列番号：９）
これらのペプチドをKLH担体（キーホール・リンペット・ヘモシアニン）にカップリングさせ、その後ウサギにおけるポリクローナル抗体の作製に用いた（Eurogentec、セレイン、ベルギー）。
得られた抗体を以下のように命名した：
ペプチド１に対する抗SS1ポリクローナル抗体
ペプチド２に対する抗SS2ポリクローナル抗体
ペプチド３に対する抗SS3ポリクローナル抗体
【０１１９】
抗体はその後、コムギからのデンプン合成酵素をコードする配列に関してコムギ穀果からのcDNAライブラリをスクリーニングするために用いた。この目的のため、実施例１に記述したcDNA発現ライブラリを用いた。ファージプラークの分析のため、予め10 mM IPTG溶液で30〜60分インキュベートしたニトロセルロースフィルターにこれらを移し、その後ホワットマン濾紙上で乾燥させた。移入には37℃で３時間を要した。その後濾紙をブロッキング溶液中で室温で30分インキュベートし、TBST-パッファー（puffer）で５〜10分２回洗浄した。濾紙を適当に希釈したポリクローナル抗体と共に室温で１時間、または４℃で16時間振盪した。抗体の一つによって認識されたタンパク質を発現するプラークの同定は、製造元の説明に従って、イムン-ブロットアッセイキット；ヤギ抗ウサギIgG（バイオラド）によって実施した。
【０１２０】
抗体の一つによって認識されたタンパク質を発現するcDNAライブラリのファージクローンを、定法を用いてさらに精製した。インビボ切除法（ストラテジーン社（Strategene））によって、陽性ファージクローンから、ポリリンカーのEcoRIとXhoI部位の間の対応するcDNAインサートを有する二本鎖pBluescript II SKプラスミドを含む大腸菌クローンを産生した。インサートのサイズおよび制限パターンをチェックした後、適したクローンTaSS1に配列分析を行った。
【０１２１】
実施例５
pTaSS1プラスミドのcDNAインサートの配列分析
プラスミドDNAをpTaSS1クローンから単離し、cDNAインサートの配列を、ジデスオキシヌクレオチド法（サンガーら（Sanger）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74（1977）、5463〜5467）を用いた定法によって決定した。
まず、配列番号：５に示すように、ヌクレオチド1084位〜2825位を含む部分配列を決定した。
【０１２２】
pTaSS1クローンのインサートの長さは2825 bpで完全なcDNAを構成する。ヌクレオチド配列は配列番号：５に示す。対応するアミノ酸配列を配列番号：６に示す。
配列分析およびすでに発表された配列との比較により、配列番号：５に示す配列が新規で、他の有機体からのデンプン合成酵素との相同性を示すコード領域を含むことが示された。このcDNAは、顆粒結合デンプン合成酵素の生物活性を有するタンパク質をコードすると予想される。
【０１２３】
さらに、シグナルペプチド開裂に関する既知のコンセンサス配列との相同性により、推定のシグナル通過ペプチドは、配列番号：６に示すアミノ酸配列の57位と58位の間、または60位と61位の間で開裂することが判明した。
【０１２４】
実施例６
植物形質転換ベクターpTaSS1-asの作製
コムギからの単離されたcDNAに対する部分アンチセンス-RNAを発現するために、ベースプラスミドとしてpUC19に基づいて植物形質転換ベクターを構築した。植物形質転換ベクターは、プラスミドpTaSS1のcDNAインサートをアンチセンス方向に含む。発現はユビキチン-プロモーターによって制御される。このプロモーターは、トウモロコシのユビキチン遺伝子の第一の非翻訳エキソンおよび第一のイントロンを含む（クリステンセンら（Christensen A.H.）、Plant Molecular Biology 18 （1992）、675〜689）。
【０１２５】
ポリリンカーおよびNOSターミネーターの一部は、pAct1.casプラスミド（CAMBIA、TG 0063；カンビア社、GPO Box 3200, Canberra ACT 2601,  Australia）に由来する。このターミネーターを含むベクター構築物およびpAct1.casに基づく構築物は、マッケルロイら（McElroy、Molecular Breeding 1（1995）、27〜37）が記述している。
コムギを形質転換するにはpTaSS1-asベクターを上記のように用いる。
【０１２６】
実施例７
コムギ可溶性デンプン合成酵素をコードするcDNAクローンを有する大腸菌変異体の相補性
cDNAクローンTaSSSによってコードされる可溶性デンプン合成酵素の酵素活性（実施例２）は、大腸菌変異体Hfr G6MD2（M.シュワルツ（M. Schwartz）株；CGSC # 5080；大腸菌遺伝子貯蔵センター（E. Coli Genetic Stock Center）、ニューヘブン、アメリカ）を遺伝子発現の宿主として用いた相補性実験によって分析した。大腸菌変異体は、細菌ADP-グルコースピロホスホリラーゼ（glg C）、グリコーゲン合成酵素（glg A）、および分枝酵素（glg B）をコードするglg-オペロンの欠失を示す。この変異の結果、ADP-グルコース経路を通じてのグリコーゲン合成ができなくなる。さらに、mal Aオペロンの欠失により、酵素アミロマルターゼ（mal Q）による直鎖状α-1,4-グルカンの合成が阻害される。
【０１２７】
可溶性デンプン合成酵素の機能性は、変異体G6MD2におけるpTaSSS△188およびpACAGの同時形質転換によって調べた。プラスミドpTaSSS△188は、可溶性デンプン合成酵素をコードする2239 bpのcDNA配列のヌクレオチド188位〜2239位を含む。cDNAはpBluescriptベクター（ストラタジーン社）のポリリンカー領域におけるEcoRI/XhoI断片として挿入される。これにより、ベクターによってコードされるβ-ガラクトシダーゼのαペプチドのN末端を、可溶性デンプン合成酵素の一部とフレーム内で融合させることが可能になる。
【０１２８】
G6MD2におけるグリコーゲン合成酵素（glg A）変異の相補性の成否は、α-1,4,グルカン合成の基質であるADP-グルコースを供給する、ADP-グルコースホスホリラーゼ活性の発現に依存する。したがって、lacZプロモーターの調節下で大腸菌株LCB 618（ベッカーら（Baecker）、J. Biol. Chem. 258（1983）、5084〜5088）から単離したglg C座のコード領域を含むプラスミドpACAG（アベル（Abel G.J.W.）、1995、「ジャガイモ（Solanum tuberosum L）のデンプン合成酵素機能に関する試験（Untersuchungen zur Funktion von Starke-Synthasen in der Kartoffel）」ベルリン大学学位論文）を同時に形質転換した。コードされるADP-グルコースピロホスホリラーゼ活性は、活性化因子であるフルクトース-1,6-二リン酸および阻害剤AMPによってあまり影響を受けず、その結果ADP-グルコースが十分量供給される。
【０１２９】
pTaSSS△188およびpACAGで同時に形質転換した細胞を、１％グルコース、１mM IPTGおよび50 μMジアミノピメリン酸を添加したLB-寒天プレート上に播種した。得られたコロニーをヨウ素蒸気で染色した。形質転換したG6MD2細胞は、非形質転換コロニーの黄色がかった色とは対照的に青〜明るい茶色がかった色を示し、これはADPグルコース：発現された融合タンパク質のα-1,4-D-グルカン４-α-グルコシルトランスフェラーゼ活性を示す。
【０１３０】
この系を、構築物pACAGおよびpEc5.3で同時に形質転換したG6MD2細胞のヨウ素染色によってチェックした。プラスミドpEc5.3は、PCR技術によって大腸菌株DH5αから単離したグリコーゲン合成酵素（glg A）遺伝子を含む（アベル（Abel G.J.W.）、1995、「ジャガイモ（Solanum tuberosum L）のデンプン合成酵素機能に関する試験（Untersuchungen zur Funktion von Starke-Synthasen in der Kartoffel）」ベルリン大学学位論文）。形質転換した細胞はヨウ素染色後暗青色を示し、これはα-1,4-グルカンの合成を示す。
【配列表】
2008136482000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月29日(2007.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）配列番号：２の６２〜６７１位のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
（b）配列番号：１の１８６〜２２３９位のヌクレオチド配列または対応するリボヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（c）（a）または（b）で述べた核酸分子と厳密な条件下でハイブリダイズし、可溶性デンプン合成酵素をコードする核酸分子；および
（d）そのヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮重のために（a）、（b）または（c）に記載の核酸分子の配列とは異なる、核酸分子；
からなる群より選択される、コムギ由来のデンプン合成酵素をコードする核酸分子。
【請求項２】
DNA分子である、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
cDNA分子である、請求項２記載のDNA分子。
【請求項４】
RNA分子である、請求項１記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１の（a）または（b）に記載の核酸分子の一本の鎖と厳密な条件下で特異的にハイブリダイズする核酸分子であって、少なくとも15ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドである、核酸分子。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
核酸分子が、原核または真核細胞における翻訳可能RNAの転写および合成を確実にする調節要素にセンス方向で結合している、請求項６記載のベクター。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸分子、または請求項６もしくは７記載のベクターで形質転換された宿主細胞、または該細胞に由来する宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸分子によってコードされるタンパク質。
【請求項１０】
請求項８記載の宿主細胞が、タンパク質の合成を可能にする条件下で培養され、かつ該タンパク質が培養細胞および／または培養培地から単離される、請求項９記載のタンパク質の製造法。
【請求項１１】
コムギの可溶性デンプン合成酵素をコードする核酸分子が、植物細胞における翻訳可能mRNAの転写を可能にする調節要素の制御を受ける、請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸分子または請求項６もしくは７記載のベクターで形質転換されたトランスジェニック植物細胞、または該細胞に由来するトランスジェニック植物細胞。
【請求項１２】
請求項１１記載の植物細胞を含む植物。
【請求項１３】
有用植物である請求項１２記載の植物。
【請求項１４】
デンプン貯蔵性植物である請求項１３記載の植物。
【請求項１５】
コムギ植物である請求項１４記載の植物。
【請求項１６】
請求項１１記載の植物細胞を含む、請求項１２〜１５のいずれか一項記載の植物の繁殖材料。
【請求項１７】
請求項１２〜１５記載のいずれか一項記載の植物または請求項１６記載の繁殖材料から得られるデンプン。
【請求項１８】
非形質転換植物と比較して、請求項９記載のタンパク質の活性がこの植物細胞において低下していることを特徴とするトランスジェニック植物細胞であって、細胞における前記タンパク質の活性の低下が、
（a）請求項１記載の核酸分子の転写物に対するアンチセンスRNAをコードするDNA分子の導入および発現、
（b）共抑制効果を得ることを目的とした、請求項１記載の核酸分子の転写物に対するセンスRNAをコードするDNA分子の導入および発現、または
（c）請求項９記載のタンパク質をコードする転写物を特異的に開裂するリボザイムをコードするDNA分子の導入および発現
によって達成される、植物細胞。
【請求項１９】
請求項１８記載の植物細胞を含む植物。
【請求項２０】
有用植物である請求項１９記載の植物。
【請求項２１】
デンプン貯蔵性植物である請求項２０記載の植物。
【請求項２２】
コムギ植物である請求項２１記載の植物。
【請求項２３】
請求項１８記載の細胞を含む、請求項１９〜２２のいずれか一項記載の植物の繁殖材料。
【請求項２４】
請求項１９〜２２のいずれか一項記載の植物または請求項２３記載の繁殖材料から得られるデンプン。
【請求項２５】
食品の製造を目的とする、請求項１７または２４記載のデンプンの使用。
【請求項２６】
食品がベーカリー商品またはパスタである、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
包装材料または使い捨て商品の製造を目的とする、請求項１７または２４記載のデンプンの使用。