(57)【要約】【課題】簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法による１，３−プロパンジオールの製造方法を提供すること。【解決手段】本発明は、培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物である１，３−プロパンジオールを回収するとともに、未濾過液を培養液に保持または還流する連続発酵方法において、分離膜として、高い透過性と高い細胞阻止率を持ち閉塞しにくい多孔性膜を用い、低い膜間差圧で濾過処理することで、安定に低コストで、発酵による１，３−プロパンジオールの生産効率を著しく向上させることが可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物もしくは培養細胞の培養液を、分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加する連続発酵であって、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理することを特徴とする連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項２】
多孔性膜の純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であることを特徴とする請求項１に記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項３】
多孔性膜が有機高分子膜であって、その平均細孔径が、０.０１μｍ以上０.２μｍ未満の範囲内にあり、かつ、該細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項４】
多孔性膜が有機高分子膜であって、その膜表面粗さが０.１μｍ以下の多孔性膜であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項５】
多孔性膜が多孔性樹脂層を含む多孔性膜である請求項１から４のいずれかに記載の１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項６】
多孔性膜の膜素材にポリフッ化ビニリデン系樹脂を用いていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項７】
微生物または培養細胞の培養液および発酵原料が、糖類を含むことを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項８】
微生物が（ａ）グリセロールデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｂ）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの遺伝子；及び （ｃ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する非−特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、グリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有することを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項９】
グリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有する微生物が、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シトロバクテル（Ｃｙｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクテル（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクテル（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）より成る群から選ばれる微生物または組換え微生物であることを特徴とする請求項８に記載の１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項１０】
組換え微生物が、さらに： （ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び （ｂ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む組換え微生物であることを特徴とする請求項９に記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項１１】
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子がｄｈａレギュロンから単離されるｏｒｆＸ及びｏｒｆＺによりコードされる組換え微生物であることを特徴とする請求項１０に記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項１２】
組換え微生物が、さらにグリセロールキナーゼ活性および／またはグリセロールデヒドロゲナーゼ活性および／またはトリオースリン酸イソメラーゼ活性を欠失した組換え微生物であることを特徴とする請求項１１に記載の連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養を行いながら、微生物又は培養細胞の培養液より、目詰まりが生じにくい多孔性分離膜を通して生産物を含む液を効率よく濾過・回収すること及び未濾過液を培養液に戻すことで発酵に関与する微生物濃度を向上させることで、高い生産性を得ることを特徴とする１，３−プロパンジオールの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
１，３−プロパンジオールの製造法に関する技術背景に関して説明する。１，３−プロパンジオールは合成繊維の分野において用いられている化学品であり、極めて有用である。この１，３−プロパンジオールを効率的に製造できれば、上記の繊維の供給が更に容易になることが期待できる。一方、現在、１，３−プロパンジオールは３−ヒドロキシプロパノールから触媒を用いた化学合成法（特許文献１）などが知られているが、石油価格の高騰、石油依存型の社会からの脱却、カーボンニュートラルな原料への転換等の社会的ニーズから石油非依存型の原料から製造の検討が行われている。グリセロールから１，３−プロパンジオールをクレブシエラの菌体によって変換させる休止菌体法（特許文献２）がある。この方法では安価な発酵原料であるグルコースから生産できないため、グリセロールまでを酵母で発酵生産し、グリセロールから１，３−プロパンジオールまでをクレブシエラで生産させるといった供培養の検討（特許文献３）も行われている。
【０００３】
また、最もシンプルな方法である一種類の菌体での発酵法も検討されており、組換え大腸菌による発酵法（非特許文献１、特許文献４）がある。
【０００４】
しかし、１，３−プロパンジオールの発酵法生産においては、供培養や流加式（フェドバッチ式）に関わるもののみであり、いずれの１，３−プロパンジオールの生産方法も、生産速度が十分ではなく、更に効率的な生産方法が望まれていた。
【特許文献１】特開平１１−５１５０２１号公報
【特許文献２】特開２００５−３０４３６２号公報
【特許文献３】特表平１０−５０７０８２号公報
【特許文献４】特公表２００３−５０７０２２号公報
【非特許文献１】Charles E Nakamura et.al.（チャーリーズ  イー  ナカムラら）、Current Opinion in Biotechnology（カレント  オピニオン  イン  バイオテクノロジー），１４，４５４−４５９（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明における課題は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法による１，３−プロパンジオールの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、微生物や細胞の分離膜内への侵入が少なく、微生物や細胞を膜間差圧が低い条件で濾過した場合に、膜の目詰まりが著しく抑制されることを見出し、課題であった高濃度の微生物の濾過が長期間安定に維持できることを可能とし、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を培養液に保持または還流させる連続発酵方法による１，３−プロパンジオールの製造方法において、分離膜として、平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満の範囲にある多孔性膜を用い、低い膜間差圧で濾過処理することで、安定に低コストで、発酵生産効率を著しく向上させる１，３−プロパンジオールの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物である１，３−プロパンジオールを低コストで安定に生産することが可能となる。
【０００９】
本発明の１，３−プロパンジオールの製造法により得られた１，３−プロパンジオールは、例えば、合成繊維の原料として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、微生物もしくは培養細胞の培養液を、分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加する連続発酵であって、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理することを特徴とする連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法である。
【００１１】
本発明で用いられる多孔性膜は、発酵に使用する微生物および培養細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ濾過性能が長期間安定に継続することが望ましい。
【００１２】
本発明で使用される多孔性膜は、平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満である。多孔質樹脂層が多孔性膜の両面に存在する場合、少なくとも一方の多孔質樹脂層が、この条件を満たしていればよい。平均孔径がこの範囲内にあると、菌体や汚泥などがリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立でき、さらに目詰まりしにくく、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。平均細孔径が、この範囲内にあれば、動物細胞、酵母、糸状菌などを用いた場合、目詰まりが少なく、また、細胞の濾液への漏れもなく安定に連続発酵が実施可能である。また、動物細胞、酵母、糸状菌より小さな細菌類を用いた場合は、０.４μｍ以下の平均細孔であればよりよく、０.２μｍ未満の平均細孔であればなお好適に実施可能である。平均孔径は、小さすぎると透水量が低下することがあるので、通常は、０．０１μｍ以上が好ましく、より好ましくは、０．０２μｍ以上、さらに好ましくは、０．０４μｍ以上である。ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋ、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした以下式（１）より算出した。
【００１３】
【数１】
2008043329.tif 000002
【００１４】
本発明で用いられる多孔性膜において、培養液の透過性が重要点の一つであり、透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。多孔性膜の純水透過係数が、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、２×１０−９以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
【００１５】
本発明で用いられる多孔性膜の表面粗さは、分離膜の目詰まりに影響を与える因子であり、好ましくは、表面粗さが０.１μｍ以下の時に分離膜の剥離係数や膜抵抗を低下させることができ、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能である。また、表面粗さが低いことで、微生物、培養細胞の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、微生物または培養細胞の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。ここで、表面粗さは、以下の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して以下の条件で測定することができる。
【００１６】
装置    原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
条件    探針        SiNカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
走査モード  コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
走査範囲    10μm,25μm 四方（気中測定）
5μm,10μm 四方（水中測定）
走査解像度  512×512
試料調製  測定に際し膜サンプルは常温でエタノールに15分浸漬後RO水中に24時間浸漬し洗浄した後風乾し用いた。
【００１７】
膜の表面粗さdroughはAFMにより各ポイントのＺ軸方向の高さから以下式（２）より算出した。
【００１８】
【数２】
2008043329.tif 000003
【００１９】
本発明における多孔性膜の材質は、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能が得られれば特に限定はされないが、阻止性能、透水性能や耐汚れ性といった分離性能の点からは多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましく採用できる。
【００２０】
多孔質樹脂層を含む多孔性膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与える。
【００２１】
本発明で用いられる多孔性膜が、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。
【００２２】
多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下である。
【００２３】
本発明における多孔性膜の材質は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維、ポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布や、無機材料からなる多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されたものでも良い。本発明を実現するための分離膜として、有機高分子膜を使用することができるが、有機高分子膜は、基本的に有機ポリマー材料から構成される分離膜のことであり、例えば、有機繊維の不織布やマクロポア構造多孔質有機基材と当該多孔質有機基材の孔径より小さな孔径を有する多孔質樹脂層が複合化された構造を持つ場合が多い。
【００２４】
多孔質樹脂層の材質としては、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂、セルローストリアセテート系樹脂などからなれば良く、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。中でも、溶液による製膜が容易で、物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂が好ましい。ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とするものが最も好ましい。ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられるが、フッ化ビニリデンの単独重合体の他、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。かかるビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン、三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００２５】
本発明の多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。
【００２６】
多孔性膜が平膜の場合、その厚みは用途に応じて選択されるが、例えば、２０μｍ以上５０００μｍ以下、好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。上述したように、多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されていても良い。その際、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。多孔質基材の厚みは、５０μｍ以上３０００μｍ以下の範囲で選択される。
【００２７】
多孔性膜が中空糸膜の場合、内径は２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、膜厚は２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編み物を含んでいても良い。
【００２８】
まず、多孔性膜のうち、平膜の作成法の概要の一例を例示して説明する。
【００２９】
多孔質基材の表面に、樹脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成すると共に、その原液を多孔質基材に含浸させる。その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。
【００３０】
原液は、樹脂を溶媒に溶解させて調整する。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。溶媒は、樹脂を溶解するものであり、樹脂に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促すものである。溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ −メチル− ２− ピロリドン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、テトラメチル尿素、リン酸トリメチル、シクロヘキサノン、イソホロン、γ −ブチロラクトン、メチルイソアミルケトン、フタル酸ジメチル、プロピレングリコールメチルエーテール、プロピレンカーボネート、ジアセトンアルコール、グリセロールトリアセテート、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。なかでも、樹脂の溶解性の高いＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が好ましく用いられる。これらの溶媒は、単独で用いても良いし２種類以上を混合して用いても良い。
【００３１】
また、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびグリセリンなどの溶媒以外の成分を溶媒に添加しても良い。溶媒に非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水や、メタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。なかでも、非溶媒として、価格の点から水やメタノールが好ましく用いられる。溶媒以外の成分および非溶媒は、混合物であってもよい。
【００３２】
原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。
【００３３】
次に、多孔性膜のうち、中空糸膜の作成法の概要の一例を例示して説明する。
【００３４】
中空糸膜は、樹脂と溶媒からなる原液を二重管式口金の外側の管から吐出すると共に、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷却固化して作製することができる。
【００３５】
原液は、上述の平膜の作成法で述べた樹脂を２０重量％以上６０重量％以下の濃度で、上述の平膜の生成法で述べた溶媒に溶解させることにより調整することができる。また、中空部形成用流体には、通常気体もしくは液体を用いることができる。また、得られた中空糸膜の外表面に、新たな多孔性樹脂層をコーティング（積層）することもできる。積層は中空糸膜の性質、例えば、親水・疎水性あるいは細孔径等を所望の性質に変化させるために行うことができる。積層される新たな多孔性樹脂層は、樹脂を溶媒に溶解させた原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させることによって作製することができる。その樹脂の材質は、例えば、上述有機高分子膜の材質と同様のものが好ましく用いられる。また、積層方法としては、原液に中空糸膜を浸漬してもよいし、中空糸膜の表面に原液を塗布してもよく、積層後、付着した原液の一部を掻き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることにより積層量を調整することもできる。
【００３６】
本発明の多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって膜分離エレメントとすることができる。支持体として支持板を用い、該支持板の少なくとも片面に、本発明の多孔性膜を配した多孔性膜エレメントは、本発明の膜エレメントの好適な形態の一つである。この形態では、膜面積を大きくすることが困難なので、透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することも好ましい。
【００３７】
本発明において、微生物や細胞を濾過処理する際の膜間差圧は、微生物や細胞および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよいが、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲とする。濾過の駆動力としては、培養液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホンにより多孔性膜に膜間差圧を発生させることが可能であり、また、濾過の駆動力として多孔性膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよいし、多孔性膜の培養液側に加圧ポンプを設置することも可能である。膜間差圧は培養液と多孔性膜処理水の液位差を変化させることで制御することができる、またポンプを使用する場合には吸引圧力により制御することができ、更に培養液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によって制御することができる。これら圧力制御を行う場合には培養液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
【００３８】
また、本発明において使用する多孔性膜は、０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲で濾過処理することができるものが好ましい。また、使用前の純水透過係数が、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、さらに２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下の範囲にあることが好ましい。
【００３９】
本発明で使用する発酵原料としては、培養する微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物である１，３−プロパンジオールを良好に生産させうるものであればよいが、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンなども使用される。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合にはその栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤も必要に応じて使用する。本発明において、培養液とは、発酵原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言い、追加する発酵原料の組成は、目的とする１，３−プロパンジオールの生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
【００４０】
本発明では、培養液中の糖類濃度は５ｇ／ｌ以下に保持される様にするのが好ましい。その理由は、培養液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。微生物の培養は通常ｐＨ４−８、温度２０−４０℃の範囲で行われる。培養液のｐＨは無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００４１】
本発明の培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物濃度を高くした後に連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から原料培養液の供給及び培養物の引き抜きを行うことが可能である。原料培養液供給と培養物の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、原料培養液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。原料培養液には上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましく、一例として、乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。
【００４２】
発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、通常、単一の発酵槽で行うのが、培養管理上好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵槽の数は問わない。発酵槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても発酵生産物の高生産性は得られる。 
【００４３】
本発明で使用される微生物や培養細胞は、１，３−プロパンジオールを生産可能であれば特に制限はないが、例えば、野生型株ではグリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有するクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が挙げられる。
【００４４】
本発明では、微生物は、（ａ）グリセロールデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｂ）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの遺伝子；及び （ｃ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する非−特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでいることが好ましい。本発明では、更に好ましくは、微生物は、組換え微生物で１，３−プロパンジオールを生産可能にすることが挙げられる。
【００４５】
本発明では、グリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有する微生物は、
好ましくは、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シトロバクテル（Ｃｙｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクテル（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクテル（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）より成る群から選ばれる組換え微生物で、更に好ましくはエッシェリシア  コリである。
【００４６】
また、組換え微生物は、グルコースから効率よく１，３−プロパンジオールを生産する事ができるようにする改良を行ったほうが好ましい。組換え微生物は、例えば、（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び （ｂ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んだ組換え微生物であることが好ましく。 更にグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子がｄｈａレギュロンから単離されるｏｒｆＸ及びｏｒｆＺによりコードされる遺伝子を含んだ組換え微生物であることが更に好ましい。更には、組換え微生物は、グリセロールキナーゼ活性および／またはグリセロールデヒドロゲナーゼ活性および／またはトリオースリン酸イソメラーゼ活性を欠失した組換え微生物であることが更に好ましい。
【００４７】
本発明の製造方法により製造された濾過・分離発酵液に含まれる１，３−プロパンジオールの分離・精製は、濃縮、晶析させて行うことができる。例えば、特開平−３５７８５号公報に示される減圧濃縮・晶析を用いた精製法を好適に用いることができる。
【００４８】
本発明の製造方法で用いる連続発酵装置１つの例は、主に、微生物もしくは培養細胞を保持し１，３−プロパンジオールを製造するための発酵反応槽、及び微生物もしくは培養細胞と発酵液を濾過分離するための多孔性膜を含む膜分離エレメントから構成される。膜分離エレメントは、発酵反応槽の内部または外部のいずれに設置されてもよい。本発明の製造方法は、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を使用し、濾過圧力である膜間差圧が０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理することを特徴としている。そのため、特別に発酵槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、濾過分離装置と発酵槽間で発酵液を循環させる動力手段が不要となり、膜分離エレメントを発酵槽内部に設置して発酵装置をコンパクト化することが可能である。
【００４９】
本発明の製造方法で用いる連続発酵装置のうち、分離エレメントは、発酵反応槽の内部に設置された代表的な一例を図１の概要図に示す。図１において、１は発酵反応槽、２は膜分離エレメントである。ここで、膜分離エレメント２には多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている膜、及び膜エレメントを使用することができる。
【００５０】
次に、図１の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。
【００５１】
培地供給ポンプ７によって培地を発酵反応槽１に連続的もしくは断続的に投入する。培地は投入前に必要に応じて加熱殺菌、あるいは加熱滅菌、あるいはフィルターを用いた滅菌を行うことができる。発酵生産時には、必要に応じて攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵液を攪拌し、また必要に応じて気体供給装置４によって必要とする気体を供給し、また必要に応じてｐＨセンサ・制御装置９、及びｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵液のｐＨを調整し、また必要に応じて温度調節器１０によって発酵液の温度を調節することで生産性の高い発酵生産を行うことができる。ここでは、計装・制御装置による発酵液の物理化学的条件の調節に、ｐＨ、および温度を例示したが、必要に応じて溶存酸素、ＯＲＰの制御、更にはオンラインケミカルセンサーなどの分析装置により発酵液中の１，３−プロパンジオールの濃度を測定し、それを指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入の形態に関しては、特に限定されるものではないが、上記計装装置による発酵液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。
【００５２】
発酵液は発酵反応槽１内に設置された膜分離エレメント２によって微生物もしくは培養細胞と発酵生産物に濾過・分離され、装置系から取り出すことができる。また、濾過・分離された微生物もしくは培養細胞は装置系内にとどまることで装置系内の微生物もしくは培養細胞濃度を高く維持でき、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、膜分離エレメント２による濾過・分離には発酵反応槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力は必要ない。また、必要に応じてレベルセンサ６、及び水頭差圧制御装置３によって膜分離エレメント２の濾過・分離速度、及び発酵反応槽内の発酵液量を適当に調節することができる。上記、膜分離エレメントによる濾過・分離には水頭差圧によって行うことを例示したが、必要に応じてポンプ等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧することにより濾過・分離することもできる。
【００５３】
図２は、本発明の１，３−プロパンジオールの製造方法で用いられる他の連続発酵装置の例を説明するための概要側面図である。図２は、膜分離エレメントが、発酵反応槽の外部に設置された連続発酵装置の代表的な例である。
【００５４】
図２において、連続発酵装置は、発酵反応槽１と、膜分離膜エレメント２を備えた膜分離槽１２と、水頭差制御装置３とで基本的に構成されている。ここで、分離膜エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性と膜分離エレメントとしては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および膜分離エレメントを使用することが好適である。また、膜分離槽１２は、培養液循環ポンプ１１を介して発酵反応槽１に接続されている。
【００５５】
図２において、培地供給ポンプ７によって培地を発酵反応槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機５で発酵反応槽１内の培養液を攪拌し、また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給された気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびよびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵液のｐＨを調整し、また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。さらに、装置内の培養液は、培養液循環ポンプ１１によって発酵反応槽１と膜分離槽１２の間を循環する。発酵生産物を含む培養液は、膜分離エレメント２によって微生物と発酵生産物に濾過・分離され、発酵生産物を装置系から取り出すことができる。また、濾過・分離された微生物は、装置系内にとどまることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。
【００５６】
ここで、膜分離エレメント２による濾過・分離は、膜分離槽１２の水面との水頭差圧によって行うことができ、特別な動力を必要としない。必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、膜分離エレメント２の濾過・分離速度および装置系内の培養液量を適当に調節することができる。必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を膜分離槽１２内に供給することができる。このとき、供給された気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で膜分離槽１２内に供給することができる。
【００５７】
膜分離エレメント２による濾過・分離は、必要に応じて、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。また、別の培養槽（図示せず）で連続発酵に微生物または培養細胞を培養し、それを必要に応じて発酵反応槽内に供給することができる。別の培養槽で連続発酵に微生物または培養細胞を培養し、得られた培養液を必要に応じて発酵槽内に供給することにより、常にフレッシュで１，３−プロパンジオールの生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
【００５８】
次に、本発明の１，３−プロパンジオールの製造方法で用いられる連続発酵装置で、好ましく用いられる膜分離エレメントについて説明する。
【００５９】
図３に示す膜分離エレメントについて説明する。図３は、本発明で用いられる膜分離エレメントを例示説明するための概略斜視図である。本発明の１，３−プロパンジオールの製造方法で用いられる連続発酵装置では、好ましくは、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および膜分離エレメントを用いることができる。膜分離エレメントは、図３に示されるように、剛性を有する支持板１３の両面に、流路材１４と前記の分離膜１５（多孔性膜）をこの順序で配し構成されている。支持板１３は、両面に凹部１６を有している。分離膜１５は、培養液を濾過する。流路材１４は、分離膜１５で濾過された透過水を効率よく支持板１３に流すためのものである。支持板１３に流れた透過水は、支持板１３の凹部１６を通り、集水パイプ１７を介して連続発酵装置外部に取り出される。透過水を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【００６０】
図４に示す膜分離エレメントについて説明する。図４は、本発明で用いられる別の分離膜エレメントを例示説明するための概略斜視図である。膜分離エレメントは、図４に示すように、中空糸膜（多孔性膜）で構成された分離膜束１８と上部樹脂封止層１９と下部樹脂封止層２０によって主に構成される。分離膜束１８は、上部樹脂封止層１９および下部樹脂封止層２０よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層２０による接着・固定化は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の中空部を封止しており、培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層１９は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の内孔を封止しておらず、集水パイプ２２に透過水が流れる構造となっている。この分離膜エレメントは、支持フレーム２１を介して連続発酵装置内に設置することが可能である。分離膜束１８によって濾過された透過水は、中空糸膜の中空部を通り、集水パイプ２２を介して連続発酵装置外部に取り出される。透過水を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【００６１】
本発明の１，３−プロパンジオールの製造方法で用いられる連続発酵装置の膜分離エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材であることが好ましい。連続発酵装置内が滅菌可能であれば、連続発酵時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避することができ、より安定した連続発酵が可能となる。膜分離エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である、１２１℃で１５分間に耐性であることが好ましい。膜分離エレメント部材は、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定できる。
【００６２】
本発明の１，３−プロパンジオールの製造方法で用いられる連続発酵装置では、膜分離エレメントは、図１のように発酵反応槽内に設置しても良いし、図２のように発酵反応槽外に設置しても良い。膜分離エレメントを発酵反応槽外に設置する場合には、別途、膜分離槽を設けてその内部に膜分離エレメントを設置することができ、発酵反応槽と膜分離槽の間を培養液を循環させながら、膜分離エレメントにより培養液を連続的に濾過することができる。
【００６３】
本発明の１，３−プロパンジオールの製造方法で用いられる連続発酵装置では、膜分離槽は、高圧蒸気滅菌可能であることが望ましい。膜分離槽が高圧蒸気滅菌可能であると、雑菌による汚染回避が容易である。
【００６４】
上記、本発明に従って、連続発酵をおこなった場合、従来のバッチ発酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここで、連続培養における生産速度は、次の式（３）で計算される。
【００６５】
【数３】
2008043329.tif 000004
【００６６】
また、バッチ培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の培養液量（Ｌ）で除して求められる。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明の１，３−プロパンジオールの製造方法をさらに具体的に説明するために、図１および図２の概要図に示す連続発酵装置を用いることによる連続的な１，３−プロパンジオールの発酵生産について、実施例を挙げて説明する。また、下記に示す１，３−プロパンジオールの製造に関する実施例においては、１，３−プロパンジオールを生産させる微生物として、クレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を用いた。
【００６８】
（参考例１）多孔性膜の作製（その１）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒として、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、下記組成を有する原液を得た。
［原液］
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％
次に、上記の原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに下記組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
［凝固浴］
・水 ：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％  。
【００６９】
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水透過係数を評価したところ、５０×１０-9ｍ3／ｍ2／ｓ／Ｐａであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。
【００７０】
（参考例２）多孔性膜の作製（その２）
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
【００７１】
次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社、商品名イオネットＴ−２０Ｃ）を５重量％、および水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させた本発明で用いる中空糸多孔性膜を製作した。得られた中空糸多孔性膜の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０５μｍであった。次に、上記の分離膜である中空糸多孔性膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。
【００７２】
１，３−プロパンジオールの単離及び同定
ＨＰＬＣによりグリセロールの１，３−プロパンジオールへの転換を確認した。分析は標準的方法及びクロマトグラフィーの技術分野における熟練者に利用可能な材料を用いて行われた。１つの適した方法は、ＵＶ（２１０ｎｍ）及びＲＩ検出を用いるＷａｔｅｒｓ Ｍａｘｉｍａ ８２０ ＨＰＬＣシステムを使用した。Ｓｈｏｄｅｘ ＳＨ−１０１１Ｐ プレカラム（６ｍｍｘ５０ｍｍ）が備えられ、５０℃で温度制御されたＳｈｏｄｅｘ ＳＨ−１０１１カラム（８ｍｍｘ３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡから購入）上に、移動相として０．０１Ｎ Ｈ2ＳＯ4を用い、０．５ｍＬ／分の流量で試料を注入した。定量的分析が望まれている場合、外部標準として既知量のトリメチル酢酸を用いて試料を調製した。グルコース（ＲＩ検出）、グリセロール、１，３−プロパンジオール（ＲＩ検出）及びトリメチル酢酸（ＵＶ及びＲＩ検出）の保持時間は、およそそれぞれ１５分、２０分、２６分及び３５分であった。
【００７３】
ＧＣ／ＭＳにより１，３−プロパンジオールの生産を確認した。分析は標準的方法及びＧＣ／ＭＳの技術分野における熟練者に利用可能な材料を用いて行われた。例えば、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ５９７１ Ｓｅｒｉｅｓ質量選択的検出器（ＥＩ）及びＨＰ−ＩＮＮＯＷａｘカラム（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚さ０．２５ミクロン）に連結されたＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ５８９０ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩガスクロマトグラフを用いた。生成した１，３−プロパンジオールの保持時間及び質量スペクトルを基準の１，３−プロパンジオール（ｍ／ｅ：５７，５８）のそれに比較した。
【００７４】
また、試料の誘導体化を行った。１．０ｍＬの試料（例えば培養上澄み液）に３０μＬの濃（７０％ｖ／ｖ）過塩素酸を加えた。混合の後、試料を凍結乾燥した。ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド：ピリジンの１：１混合物（３００μＬ）を凍結乾燥された材料に加え、激しく混合し、６５℃において１時間置いた。遠心により不溶性材料を除いて試料を透明にした。得られる液体は２相に分かれ、その上相を分析に用いた。試料をＤＢ−５カラム（４８ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚さ０．２５μｍ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから）上でクロマトグラフィーにかけ、培養上澄み液から得た１，３−プロパンジオール誘導体の保持時間及び質量スペクトルを基準の標準試料から得たそれに比較した。ＴＭＳ−誘導体化１，３−プロパンジオールの質量スペクトルは２０５、１７７、１３０及び１１５ＡＭＵの特徴的イオンを含有する。
【００７５】
実施例１  連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造（その１）
図１の膜一体型連続発酵装置を稼働させることにより、１，３−プロパンジオール連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表１に示す組成の１，３−プロパンジオール生産培地を用い、この装置の連続発酵試験を行った。尚、図１の膜一体型連続発酵装置は本発明の一実施の形態を示す概要側面図であり、本発明はこの形態になんら限定されるものではない。該培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。膜分離エレメント部材としては、ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としてはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。該多孔質膜の特性を調べたところ、平均細孔径が０.１μｍ、純水透過係数が５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａであった。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。
【００７６】
発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
発酵反応槽通気量：０．６（Ｌ／ｍｉｎ）窒素ガス
発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ  ＮａＯＨによりｐＨ７．０に調整
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎの
オートクレーブにより高圧蒸気滅菌
膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御（０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御した。（膜間差圧２０ｋＰａ以下は、水頭差制御では、２ｍ以内に相当する）。
【００７７】
微生物としてクレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を用い、培地として表１に示す組成の１，３−プロパンジオール生産培地を用い、生産物である１，３−プロパンジオールの濃度の評価はＨＰＬＣ法により測定した。
【００７８】
また、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。
【００７９】
【表１】
2008043329.tif 000005
【００８０】
まず、クレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を試験管で５ｍｌの１，３−プロパンジオール生産培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な１，３−プロパンジオール生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した膜一体型連続発酵装置の１．５Ｌの１，３−プロパンジオール生産培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、１，３−プロパンジオール生産培地（グリセロール濃度は１００ｇ／Ｌ）の連続供給を行い、膜一体型連続発酵装置の発酵液量を１．５Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置６により、発酵反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が０．１ｋＰa以上２０ｋＰａ以下となるように適宜水頭差を変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産された１，３−プロパンジオール濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該１，３−プロパンジオール、及び投入グリセロールから算出された１，３−プロパンジオール生産速度を表４に示した。２６４時間の発酵試験を行った結果、本膜一体型連続発酵装置を用いることで、安定した１，３−プロパンジオールの連続発酵による製造が可能であることが確認できた。
【００８１】
（実施例２）  連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造（その２）
微生物もしくは培養細胞としてＡＴＣＣ２５９５５株を用い発酵培地として表１に示す組成の１，３−プロパンジオール発酵培地を用い、図２に示す連続発酵装置用いて連続発酵試験を行った。また上記１，３−プロパンジオール発酵培地は１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としてはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。分離膜には、参考例２で作成したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。この実施例２における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
【００８２】
［運転条件］
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・分離膜エレメント有効濾過面積：４０００平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：０．６（Ｌ／ｍｉｎ）窒素ガス
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ  ＮａＯＨによりｐＨ７．０に調整
・培養液循環速度：１００ｍｌ／ｍｉｎ
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽および使用培地は、総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌した。
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御（０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）。
【００８３】
１，３−プロパンジオールおよびグルコース濃度は、実施例１と同様の方法を用いて評価した。
【００８４】
まず、クレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を試験管で５ｍｌの１，３−プロパンジオール発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮な１，３−プロパンジオール発酵培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示した連続発酵装置の２．０Ｌの１，３−プロパンジオール発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整、培養液循環速度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、１，３−プロパンジオール発酵培地（グリセロール濃度は１００ｇ／Ｌ）の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を２．０Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、膜間差圧として０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産された１，３−プロパンジオール濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該１，３−プロパンジオール、及び投入グリセロールから算出された１，３−プロパンジオール発酵生産性を表２に示した。
【００８５】
比較例１  フェドバッチ発酵による１，３−プロパンジオールの製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的なフェドバッチ発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、その１，３−プロパンジオール生産性を評価した。該培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。本比較例では、微生物としてクレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を用い、生産物である１，３−プロパンジオールの濃度の評価はＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。比較例１の運転条件を以下に示す。
【００８６】
発酵反応槽容量（１，３−プロパンジオール生産培地量）：１．０（Ｌ）
温度調整：３７（℃）
発酵反応槽通気量：０．４（Ｌ／ｍｉｎ）窒素ガス
発酵反応槽攪拌速度：３００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ  ＮａＯＨによりｐＨ７．０に調整。
【００８７】
まず、クレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を試験管で５ｍｌの１，３−プロパンジオール生産培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な１，３−プロパンジオール生産培地５０ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液をジャーファーメンターの１．５Ｌの１，３−プロパンジオール生産培地に植菌した。１，３−プロパンジオール生産培地（グリセロール濃度は５００ｇ／Ｌ）を用い、グリセロール濃度を０ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌになるように連続的に供給し、フェドバッチ発酵を行った。その結果を実施例１と実施例２の連続発酵試験で得られた１，３−プロパンジオール発酵生産性を比較して表２に示す。
【００８８】
【表２】
2008043329.tif 000006
【００８９】
これら比較の結果、図１および図２に示す連続発酵装置を用いることで、１，３−プロパンジオールの生産速度が大幅に向上することを明らかにできた。すなわち、本発明によって開示された多孔性膜を組み込んだ連続発酵装置を用い、膜間差圧を制御することで、培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を培養液に戻す連続発酵方法を可能とし、微生物量を高く維持しながら、連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造が可能であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、本発明で用いられる膜一体型連続発酵装置の例を説明するための概要側面図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる他の連続発酵装置の例を説明するための概要側面図である。
【図３】図３は、本発明で用いられる膜分離エレメントの例を説明するための概略斜視図である。
【図４】図４は、本発明で用いられる他の膜分離エレメントの例を説明するための断面説明図である。
【符号の説明】
【００９１】
１  発酵反応槽
２  膜分離エレメント
３  水頭差制御装置
４  気体供給装置
５  攪拌機
６  レベルセンサ
７  培地供給ポンプ
８  ＮａＯＨ溶液供給ポンプ
９  ｐＨセンサ・制御装置
１０  温度調節器
１１  培養液循環ポンプ
１２  膜分離槽
１３  支持板
１４  流路材
１５  分離膜
１６  凹部
１７  集水パイプ
１８  分離膜束
１９  上部樹脂封止層
２０  下部樹脂封止層
２１  支持フレーム
２２  集水パイプ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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