(57)【要約】 【課題】  微細で複雑な軟骨や骨の三次元構造を再現することが可能な、細胞を培養して再生軟骨などの再生骨を形成させるティッシュエンジニアリングに適した、多孔質スポンジ構造を有する多孔質骨再生医療用基材、及び、特定の孔径サイズ及び孔径分布を有する多孔質骨再生医療用基材の製造方法を提供する。【解決手段】  絹フィブロインからなり、連結孔を有する多孔質骨再生医療基材及びその製造方法。前記連結孔の孔径が１００〜４００μｍであり、且つ、該孔径の６０％以上が２５０〜３５０μｍの範囲であることが特徴。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
絹フィブロインからなり、連結孔を有する多孔質骨再生医療基材であって、前記連結孔の孔径が１００〜４００μｍであり、且つ、該孔径の６０％以上が２５０〜３５０μｍの範囲であることを特徴とする多孔質骨再生医療用基材。
【請求項２】
絹フィブロインが家蚕絹フィブロインである、請求項１に記載された多孔質骨再生医療用基材。
【請求項３】
前記多孔質骨再生医療基材の空隙率（空隙体積／スポンジ全体の体積）が８０％以上である、請求項１または２に記載された多孔質骨再生医療用基材。
【請求項４】
前記多孔質骨再生医療基材の形状が、再生をしようとする骨の形状である、請求項１〜３の何れかに記載された多孔質骨再生医療用基材。
【請求項５】
前記多孔質骨再生医療基材の形状がヒトの耳型形状である、請求項１〜３の何れかに記載された多孔質骨再生医療用基材。
【請求項６】
絹フィブロインからなり、連結孔を有する多孔質骨再生医療基材の製造方法であって、フッ素系溶媒に溶解した絹フィブロインを、水溶性多孔ペレットに浸透させ、前記水溶性多孔ペレットに染み込んだ絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液から絹フィブロインを水溶性有機溶媒を用いて析出させた後、水溶性溶媒を用いて水溶性多孔ペレットを溶解除去することを特徴とする多孔質骨再生医療用基材の製造方法。
【請求項７】
前記水溶性多孔ペレットが、粒径３００〜５００μｍの水溶性粒子を圧縮形成してなる水溶性多孔ペレットである、請求項６に記載された多孔質骨再生医療用基材の製造方法。
【請求項８】
前記水溶性粒子がショ糖粒子である、請求項７に記載された多孔質骨再生医療用基材の製造方法。
【請求項９】
前記フッ素系溶媒がヘキサフロロイソプロパノールである、請求項６〜８の何れかに記載された多孔質骨再生医療用基材の製造方法。
【請求項１０】
前記水溶性有機溶媒がメタノールである、請求項６〜９の何れかに記載された多孔質骨再生医療用基材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質骨再生医療用基材およびその製造方法に関し、より詳しくは、細胞を培養して再生軟骨などの再生骨を形成させるティッシュエンジニアリングにより、微細で複雑な軟骨や骨の三次元構造を再現することが可能な、絹フィブロインの多孔質スポンジ構造からなる多孔質骨再生医療用基材、および、該多孔質骨再生医療用基材の孔径サイズを任意にコントロールすることのできる多孔質骨再生医療用基材の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
形成外科および耳鼻咽喉科では、中耳から外耳におよぶ伝音系障害の患者を治療対象としている。特に、先天性耳介欠損症（小耳症）の形成外科的治療に際しては、胸部の肋軟骨を３本摘出し、耳介型フレームワークを作製することが一般的に行なわれている。この肋軟骨３本の犠牲は、自己組織の損失としては非常に大きいものであり、胸郭内部の肺や心臓を保護する機能が損なわれるだけでなく、胸郭変形、気胸などを生じるリスクも高くなる。また、先天的な外耳道や耳小骨の低形成、後天的な慢性中耳炎や真珠腫などのために、この外科的治療後に中耳の伝音機能が著しく低下することがしばしば認められる。
【０００３】
このような術後の障害に対しては、ハイドロキシアパタイトによる人工耳小骨や遊離軟骨の移植を含む鼓室形成術が耳鼻咽喉科で実施されている。しかしながら、これらの手法においては、人工物の長期予後や移植軟骨を加工する手技の煩雑性などが問題となることが多い。そこで、細胞を培養して再生軟骨を形成させるティッシュエンジニアリングにポリマー工学を組み合わせ、伝音系聴覚障害の臨床治療に応用することができれば、従来の手術におけるさまざまな問題点を回避し、障害の生じた身体機能を実質的に回復させることができるようになることが期待される。
【０００４】
一方、再生軟骨などの再生骨に必要な材料として、埋め込み先の環境において機械的に安定であり、ゆっくり分解される性質を有することに加え、生体適合性のあるスキャフォールド材料（足場材料）が必要である。このような足場材料は、細胞が該材料を介して立体的、三次元的に成長できる構造を有していることが必要であり、該三次元構造の中で細胞が定着し増殖しなければならない。現在、最も有効だと考えられている構造は多孔質スポンジ構造であり、スポンジ内部に細胞や血管が侵入できる約１００〜４００μｍの大きさの孔が連結しているスポンジが、細胞を培養する上で良いとされている（非特許文献１）。
【非特許文献１】Biomaterials,  26,  697-702,  (2005)
【０００５】
このような足場材料の原材料としては、従来ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）や乳酸−ＰＣＬ共重合体などが使用されているが（特許文献１）、ＰＣＬスポンジを用いた場合には、外側での軟骨再生は認められるものの足場材料内部における細胞の増殖が不十分であり、再生軟骨が中空構造となるという問題があった。そこで、足場材料の外側だけでなく内側でも再生軟骨等が形成され、微細で複雑な軟骨や骨の三次元構造を再現することのできる材料の開発が求められていた。
【特許文献１】特開２００５−５２２２４号公報
【０００６】
また、古くから手術用縫合糸として利用されているシルクを再生医療用素材として利用しようとする試みもなされており、シルクフィブロインのスポンジ形成技術も開発されている（非特許文献２〜４）。しかしながら、これらの技術においてはスポンジの孔径サイズや孔径分布をコントロールすることができないため、その性能が十分であるとは考えられず、更なる材料の開発が求められていた。
【非特許文献２】Polymer  Preprints,  Japan  Vol.51,  No.5(2002)
【非特許文献３】Polymer  Preprints,  Japan  Vol.51,  No.13(2002)
【非特許文献４】「農業生物資源研究所ニュース」、独立行政法人農業生物資源研究所、平成17年12月1日、No.19、p.6
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って本発明の第１の目的は、微細で複雑な軟骨や骨の三次元構造を再現することが可能な、細胞を培養して再生軟骨などの再生骨を形成させるティッシュエンジニアリングに適した、多孔質スポンジ構造を有する多孔質骨再生医療用基材を提供することにある。
本発明の第２の目的は、特定の孔径サイズおよび孔径分布を有し、ティッシュエンジニアリングに適した多孔質骨再生医療用基材の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記の諸目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、特定の粒径の水溶性粒子を用いて多孔質のペレットを作製し、該ペレットの細孔に絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液を含浸させることにより、ティッシュエンジニアリングに適した、骨再生用足場材料を得ることができることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
即ち本発明は、絹フィブロインからなり、連結孔を有する多孔質骨再生医療基材であって、前記連結孔の孔径が１００〜４００μｍであり、且つ、該孔径の６０％以上が２５０〜３５０μｍの範囲であることを特徴とする多孔質骨再生医療用基材である（請求項１）。特に、前記絹フィブロインが、家蚕絹フィブロインであることが好ましい（請求項２）。更に、本発明の多孔質骨再生医療基材の空隙率（空隙体積／スポンジ全体の体積）が８０％以上であることが好ましい（請求項３）。
本発明の多孔質骨再生医療基材の形状は、再生をしようとする骨の形状とすることが可能であり（請求項４）、小耳症の治療に用いられる場合には、ヒトの耳型形状とすることができる（請求項５）。
【００１０】
本発明の絹フィブロインからなり、連結孔を有する多孔質骨再生医療基材の製造方法は、フッ素系溶媒に溶解した絹フィブロインを水溶性多孔ペレットに浸透させ、前記水溶性多孔ペレットに染み込んだ絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液から絹フィブロインを水溶性有機溶媒を用いて析出させた後、水溶性溶媒を用いて水溶性多孔ペレットを溶解除去することを特徴とする多孔質骨再生医療用基材の製造方法である（請求項６）。
【００１１】
本発明においては、前記水溶性多孔ペレットが、粒径３００〜５００μｍの水溶性粒子を圧縮形成してなる水溶性多孔ペレットであることが好ましい（請求項７）。
また、本発明における前記水溶性粒子は、ショ糖粒子であることが好ましい（請求項８）。
本発明においては、前記フッ素系溶媒としてヘキサフロロイソプロパノールを用いること（請求項９）、前記水溶性有機溶媒としてメタノールを用いることが好ましい（請求項１０）。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の多孔質骨再生医療用基材は、細胞を培養して再生軟骨などの再生骨を形成させるティッシュエンジニアリングにより、微細で複雑な骨や軟骨の三次元構造を再現することができる上、被代謝性能にも優れている。また、孔径サイズを任意にコントロールすることができるため、均一で、生来の骨や軟骨に近い状態に再生させるのに適した多孔質骨再生医療用基材である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の多孔質骨再生医療用基材およびその製造方法について詳細に説明する。
本発明の多孔質骨再生医療用基材は、絹フィブロインからなり、連結孔を有する多孔質骨再生医療基材であり、前記連結孔の孔径が１００〜４００μｍであり、且つ、該孔径の６０％以上が２５０〜３５０μｍの範囲であることを特徴とする多孔質骨再生医療用基材である。
本発明において用いられる絹フィブロインは特に限定されるものではないが、家蚕絹のフィブロインが、溶解性に優れるため好ましく用いられる。
【００１４】
本発明の多孔質骨再生医療用基材の連結孔はできるだけ均一の大きさであることが好ましい。本発明においては、特に、連結孔の孔径が１００〜４００μｍで、連結孔の孔径の６０％以上が２５０〜３５０μｍの範囲に含まれるように調整するが、特に、連結孔の孔径は、３００〜４００μｍの範囲に調整されることが好ましく、また、連結孔の孔径の７０％以上が２５０〜３５０μｍの範囲に含まれるように調整することが好ましい。
ここで、連結孔の孔径は、本発明の多孔質骨再生医療用基材の断面について電子顕微鏡写真を撮影し、撮影された画像から孔径の測定を行うことによって算出される。
【００１５】
このように調製された多孔質骨再生医療用基材は、細胞が移動または増殖するに十分な間隙を有するので、多孔質骨再生医療用基材中に細胞に対する栄養供給路としての役割を果たす血管が侵入することも可能となる。また、多孔質骨再生医療用基材全体に、増殖細胞を均一に存在させることが可能となるため、均質な再生骨や再生軟骨が形成されると考えられる。
【００１６】
本発明の多孔質骨再生医療用基材における空隙率（空隙体積／スポンジ全体の体積）は、多孔質骨再生医療用基材中に、細胞が移動または増殖するに十分な間隙を確保するという観点から、５０％以上であることが好ましいが、特に、８０％以上であることが好ましい。上記空隙率は、溶媒置換法によって測定することができるが、絹フィブロインからなる多孔質骨再生医療用基材は水で膨潤する性質を有するため、溶媒としては、絹フィブロインを膨潤させない溶媒、例えば、ヘキサンを用いることが好ましい。
【００１７】
多孔質骨再生医療用基材の空隙率の測定方法を具体的に例示すると、トリミングして整形した本発明の多孔質骨再生医療用基材を、一晩真空乾燥させた後、体積既知のヘキサンの入ったメスシリンダーに５分間浸漬して合計体積を測定し、増加した体積から多孔質骨再生医療用基材全体の体積を測定する。次いで、ヘキサンが浸透した多孔質骨再生医療用基材を取り出した後に残ったヘキサンの体積を測定して、多孔質骨再生医療用基材内に取り込まれたヘキサンの体積（空隙体積）を求め、空隙率を算出する。
【００１８】
本発明の多孔質骨再生医療用基材は、その使用目的に応じて任意の形状および大きさに作製することができる。例えば、欠損した部位の骨や軟骨の形状、円柱状、ヒトの耳型、シート状に作製した所定の大きさおよび厚さとすることができる。特に、先天性耳介欠損症（小耳症）の形成外科的治療に用いられる耳介型フレームワークとして使用する場合には、ヒトの耳型とすることが好ましい。
【００１９】
次に、絹フィブロインからなり、連結孔を有する本発明の多孔質骨再生医療用基材の製造方法について説明する。
本発明の多孔質骨再生医療用基材の製造方法は、フッ素系溶媒に溶解した絹フィブロインを、水溶性多孔ペレットに浸透させ、前記水溶性多孔ペレットに染み込んだ絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液から絹フィブロインを、水溶性有機溶媒を用いて析出させた後、水溶性溶媒を用いて水溶性多孔ペレットを溶解除去することを特徴とする。
【００２０】
本発明の製造方法において使用される水溶性多孔ペレットは、本発明の多孔質骨再生医療用基材を作製する際の鋳型として用いられるものである。
この水溶性多孔ペレットは、本発明の製造方法において使用されるフッ素系溶媒および水溶性有機溶媒に難溶解性であり、水溶性溶媒にのみ溶解性を示す水溶性粒子であれば、特に制限されることはない。
【００２１】
例えば、水易溶性の単糖、オリゴ糖類および糖アルコールなどの水溶性糖類が、多孔質骨再生医療用基材の安全性確保の点から好ましい。中でも、ショ糖は、入手が容易であり、良好な連結孔が得られるため、特に好ましい。
【００２２】
水溶性多孔ペレットは、ファルコンチューブなどの適当な容器に、粒子径を揃えた上記水溶性粒子を量り取り、極少量の水を加えて湿らせた後、歯科用ゴム質弾性印象材などを用いて作製した型枠に詰め、適度に圧縮することによって得ることができる。
例えば、板状の印象材に穴を開けて水溶性多孔ペレットの型枠とし、この穴に湿らせたショ糖粒を入れ、ショ糖粒子が破壊されない範囲で圧縮して固め、一晩真空乾燥した後型枠から取り出すことにより、容易に作製することができる。水溶性多孔ペレットの型枠は、作製する多孔質骨再生医療用基材にあわせ、任意の形に作製することができる。従って、耳型の印象材を水溶性多孔ペレットの型枠としても良い。
【００２３】
上記の水溶性多孔ペレットの型枠は、型枠として用いることができる限り、何ら制限されることはなく、石膏、歯科用ゴム質弾性印象剤、その他の弾性プラスチック材料等を用いることができるが、加工の容易さや安全性の観点から、歯科用ゴム質弾性印象剤を用いることが好ましい。
【００２４】
このようにして得られた本発明の製造方法において使用される水溶性多孔ペレットの形状としては、欠損した部位の骨や軟骨の形状、円柱状、ヒトの耳型、シート状等を例示することができる。円筒状の水溶性多孔ペレットとしては、例えば、直径３ｍｍ〜８ｍｍで、高さ１０ｍｍ程度の円柱形ペレットを例示することができる。
【００２５】
本発明においては、湿った水溶性粒子を用いてペレットを作製するので、ペレット作製時に水溶性粒子の各粒子が連結する。従って、これを鋳型として用いて多孔質骨再生医療用基材を作製すると、連結孔を有する多孔質骨再生医療用基材が得られる。
【００２６】
上記水溶性粒子を湿らせる際に添加する水の量は、水溶性粒子の量に対し、１〜５w/w％程度が好ましい。添加する水の量が多すぎると水溶性粒子の溶解量が多くなるので、設計した連結孔を有する多孔質骨再生医療用基材を得ることができない。これに対し、添加する水の量が少なすぎると、水溶性粒子が連結しにくいため、所望する連結孔が形成されない場合がある。
【００２７】
例えば、所望の粒径範囲に調整したショ糖４ｇに対し、１２５μＬ程度の割合の水を用いることが好ましい。この場合、１２５μＬの水を数回（例えば４回）に分けて加え、１回加える毎にすぐに容器をよく振って混ぜることが好ましい。
【００２８】
水溶性粒子は、得られる多孔質骨再生医療用基材の連結孔の孔径を調整するために、予め、目的とする孔径の１．２〜１．４倍の粒子径に揃えたものを使用することが好ましい。例えば、目開き３００μｍ、５００μｍの金網で篩いにかけて、粒径を約３００〜５００μｍに揃えた糖類を使用することにより、連結孔の孔径が略１００〜４００μｍであると共に、該孔径の６０％以上が２５０〜３５０μｍの範囲である多孔質骨再生医療用基材が得られる。
【００２９】
本発明の製造方法において使用される絹フィブロインは、一般的には、精錬した絹繊維を一旦ＬｉＢｒ等の塩水溶液に溶解し、透析して当該塩を除去した後に、脱水・乾燥して絹フィブロインを得ることができる。
【００３０】
絹繊維の精練は、例えば、約１００℃に加熱した０．５重量％の石鹸水溶液に、上述した繭層を入れ、操糸後、撹拌しながら３０分煮沸し、その後１００℃に加熱した蒸留水中で洗浄する操作を３回行い、更に蒸留水で３０分間煮沸した後洗浄し、次いで、乾燥することによって行う。これにより、フィブロインを覆う蛋白質（セリシン）や、その他の脂肪分などを除去した絹フィブロインを得る。
【００３１】
次に、４０〜８０重量％濃度のＬｉＢｒ水溶液に得られた絹フィブロインを加えた後、４０℃程度に加熱して溶け残りが無くなるまで振とうする。水溶液中の絹フィブロイン濃度は、通常５〜４０重量％である。次いで、ガラスフィルターなどを用いて得られた絹フィブロイン／ＬｉＢｒ水溶液を減圧濾過し、水溶液中のゴミ等を除去した後、セルロース製の透析膜などを使用し、蒸留水を用いて透析することにより、ＬｉＢｒを除去した絹フィブロイン水溶液を得る。
【００３２】
得られた絹フィブロイン水溶液から水を除去して絹フィブロインを単離するには、通常、水溶液をプレート上に展開し、水を蒸発させてフィルムを作製したり、スプレー乾燥などを行なう。また、蒸留水を加えて絹フィブロイン濃度２ｗ／ｖ％以下の水溶液を調製し、凍結乾燥を行って絹フィブロインを得ることもできる。
【００３３】
本発明の多孔質骨再生医療用基材の製造方法においては、上記のようにして得られた絹フィブロインをフッ素系溶媒に溶解させた後、得られた絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液を、水溶性多孔ペレットで作製された多孔質骨再生医療用基材作製用の鋳型に浸透させ、その後、水溶性有機溶媒を用いて絹フィブロインを析出させることが好ましい。
本発明の製造方法において使用されるフッ素系溶媒としては、ヘキサフロロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、ヘキサフロロアセトン（ＨＦＡ）、これらの混合溶液などを使用することができるが、得られる絹フィブロインとして好ましい分子構造の繊維を得ることができるという点で、ＨＦＩＰを使用することが好ましい。なお、フッ素系溶媒は、使用する原料絹の性質を勘案して、適宜選択して用いられる。ＨＦＡを用いる場合には、家蚕絹繊維を直接溶解することもできる。
【００３４】
絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液は、通常、上記のフッ素系溶媒に、２〜１０ｗ／ｖ％、好ましくは４〜７ｗ／ｖ％、特に好ましくは、４〜６ｗ／ｖ％の範囲となるように絹フィブロインを加えて攪拌し、溶解させて作製する。
【００３５】
水溶性多孔ペレットに、絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液を浸透させる方法としては、絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液中に上記の水溶性多孔ペレットを浸漬する方法や、シリンジ等を用いて絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液を水溶性多孔ペレットに注入する方法などを採用することができる。浸漬法の場合、絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液濃度が高いほど力学強度（圧縮弾性率および２０％圧縮時応力）は増加するが、溶液粘度が高くなると水溶性多孔ペレット内部に液が侵入し難くなるので、力学強度を必要とする場合には、薄い溶液に浸漬して乾燥するという工程を繰り返すことが好ましい。
【００３６】
絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液を、シリンジを用いて水溶性多孔ペレットに注入する場合には、例えば、シリンジ（注射器）の筒部分に、余裕を持たせてショ糖を入れた後固めて水溶性多孔ペレットとし、次に、水溶性多孔ペレット上部に絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液を入れ、ピストンを使って液を圧入する。この様に、多孔質骨再生医療用基材作製の方法および条件を選択することにより、骨の補修部位に応じた所望の力学強度にコントロールすることが可能である。
【００３７】
上記のようにして絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液を浸透させた後、メタノール、エタノール、プロパノール等の水溶性有機溶媒を用いて水溶性多孔ペレットに染み込んだ絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液から絹フィブロインを、水溶性有機溶媒を用いて析出させる。水溶性有機溶剤は、水溶性多孔ペレットとの適性から適宜選択して用いられるが、製造コストの観点から特に、メタノールを使用することが好ましい。
【００３８】
水溶性有機溶媒を用いて析出させる方法は、特に制限されることはなく、上記の絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液の場合と同様に、水溶性有機溶媒中に絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液が染み込んだ水溶性多孔ペレットを浸漬する方法や、シリンジ等を用いて水溶性有機溶媒を絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液が染み込んだ水溶性多孔ペレット中に注入する方法により行なうことができる。
例えば、絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液中に水溶性多孔ペレットを一晩浸した後、水溶性多孔ペレットをメタノール中に３０分間浸漬することにより、染み込んだ絹フィブロインを水溶性多孔ペレットの細孔中に析出させることができる。次いで水溶性溶媒を用いて水溶性多孔ペレットを溶解除去することにより、連通した空隙が形成された本発明の多孔質骨再生医療用基材を得ることができる。更に、必要に応じてトリミングし、整形して用いることも可能である。
【００３９】
上記の様にして得られた多孔質骨再生医療用基材は、軟骨や骨再生のための足場材料として、骨欠損部の再生に好適に使用することができる。
軟骨の場合には、多孔質骨再生医療用基材内に軟骨細胞を含ませ、これを培養して軟骨を再生した後、欠損部位に再生軟骨を移植する。また、骨の場合には、欠損部に本発明の多孔質骨再生医療用基材を埋植することにより、骨が再生される。
【００４０】
以下、実施例によって、本発明の多孔質骨再生医療用基材およびその製造方法を更に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
＜絹フィブロイン凍結乾燥サンプルの調整＞
家蚕絹繊維を定法により精錬して、フィブロインを覆う蛋白質（セリシン）その他脂肪分などを除去した後、ＬｉＢｒ水溶液（９ｍｏｌ/Ｌ）に溶解した。この水溶液を、セルロース透析膜を用いて蒸留水で透析し、ＬｉＢｒを取り除いて、家蚕絹フィブロイン水溶液を得た。得られた家蚕絹フィブロイン水溶液を、液体窒素温度で凍結し、１日かけて凍結乾燥を行なった。十分に水分が抜けたサンプルを減圧乾燥下で保存し、絹フィブロイン凍結乾燥サンプルを得た。
【００４２】
＜水溶性多孔ペレットの作製＞
多孔質骨再生医療用基材（以下「多孔質スポンジ」という）の鋳型となるショ糖製の円柱形水溶性多孔ペレット（直径８ｍｍ×高さ１０ｍｍ）を次の様にして作製した。
まず、目開き３００μｍ、５００μｍの金網で篩いにかけて、ショ糖の粒径を約３００〜５００μｍに揃えた。ファルコンチューブ容器にショ糖４ｇを量りとり、１２５μＬの水を４回に分けて加えた。その際、水を１回加える毎にすぐに容器をよく振って混ぜた。
このようにして得られたわずかに湿ったショ糖を、歯科用ゴム質弾性印象材（エクザファイン：（株）ジーシー製）を用いて作製した円柱型水溶性多孔ペレット作製用の型枠（直径８ｍｍ×高さ１０ｍｍ）に詰め、よく圧縮して固め、鋳型ごと一晩真空乾燥させることにより、ショ糖製の円柱形水溶性多孔ペレットを得た。図１に得られた円柱形水溶性多孔ペレット断面の電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す。
【００４３】
＜多孔質骨再生医療基材の作製＞
上記した絹フィブロイン凍結乾燥サンプルを、１，１，１，３，３，３−ヘキサフロロイソプロパノール［ＨＦＩＰ］（和光純薬工業株式会社製）に溶解・混合し、３．３ｗ/ｖ％の絹フィブロイン／フッ素系溶媒溶液を調製した。この溶液に、予め作製した上記のショ糖製の円柱形水溶性多孔ペレットを一晩浸した後、メタノール中に３０分間つけることにより、水溶性多孔ペレットの鋳型に染み込んだ絹フィブロイン溶液から絹フィブロインを析出させた。メタノールを乾燥した後、水中に一晩浸して円柱形水溶性多孔ペレットを構成しているショ糖を溶解・除去することによって、連結孔が形成された円柱状の多孔質スポンジが得られた。得られた多孔質スポンジのサイズは直径５ｍｍ×高さ７ｍｍであり、空隙率は、８５％であった（ｎ＝３の平均値）。
【００４４】
上記のようにして得られた本発明の円柱状の多孔質スポンジを輪切りにし、断面の電子顕微鏡（ＳＥＭ）から孔径を測定した。図２にＳＥＭ写真を示す。
図２から、各孔が、ショ糖の各粒子に対応した独立孔ではなく、互いに連結していることが確認された。各孔径を測定したところ、細孔径は約２００〜５００μｍ、細孔径の平均は約３１０μｍであり、８０％以上の細孔の孔径が２５０μｍ〜３５０μｍの範囲に入ることが確認された（図３参照）。孔サイズのバラツキが小さいことは、円筒形水溶性多孔ペレットに用いた粒径サイズのバラツキが小さかったためと考えられる。また、本発明の多孔質スポンジは、乾燥状態では堅く、圧縮によりつぶれるが、湿潤状態では柔らかく、また圧縮後、元のサイズに戻ることが確認された。これは水分子がフィブロイン壁中に浸透し、可塑剤の役割を果たしているためと考えられる。
【００４５】
また、乾燥状態における本発明の円柱状の多孔質スポンジについて、13C  CP/MAS  NMR測定を行い、多孔質骨再生医療用基材中のフィブロインの二次構造を検討した結果、得られたスペクトルは絹繊維のスペクトルとほぼ同じであったことから、多孔質スポンジ中の局所的な分子構造は逆平行β−シート構造を主とするＳｉｌｋ  II型構造であることが明らかになった。絹フィブロイン分子はＨＦＩＰ溶液中でヘリックス様構造を形成することが示唆されている（Ha,  S.-W.  et  al.,  Biomacromolecules  2006,  7,  18-23参照）ことから、絹フィブロイン溶液の染み込んだショ糖製の円柱形水溶性多孔ペレットをメタノールに浸漬した際に、分子構造が変化したことが明らかになった。
【００４６】
＜比較例＞
実施例１で用いた、絹フィブロインに代えてポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を用い、これをクロロホルムに溶解させて水溶性多孔ペレットに染み込ませた後乾燥し、水中に一晩浸してショ糖を溶解・除去した他は、実施例１と同様にして同サイズの円柱形ＰＣＬスポンジを作製した。
【実施例２】
【００４７】
＜軟骨細胞培養試験＞
実施例１および比較例で得られた円柱状の骨再生医療用基材を用い、次の様にして、軟骨細胞培養試験を行なった。
軟骨細胞は、日本白色家兎の耳介軟骨を０．２％  type  II  collagenase  (Worthington社製)溶液中で、４時間、３７℃で処理することによって得た。
培地中（Ham’s  F12  +  10%  FBS  +  antibiotic/antimicotic）で、得られた軟骨細胞の増殖培養を行った後、円柱状の骨再生医療用基材にハイドロゲルを混合しないで播種し、TGF-beta2とdes(1-3)IGF-I含有無血清培養液（DMEM/F12  +  ITS+premix  +  5ng/ml  TGF-beta2  +  5ng/ml  des(1-3)  IGF-I  +  ascorbic  acid  glucocide  +  antibiotic/antimicotic）で、５％ＣＯ２下において１〜２カ月間、振盪培養下で軟骨再生を誘導した。
【００４８】
その結果、実施例１で得られた本発明の絹フィブロインからなる円柱状の多孔質スポンジ内部への細胞の浸透性および生存性は良好であった。１カ月間の振盪培養で、軟骨再生を免疫組織化学的に確認することができた。２カ月間の培養でさらに再生軟骨の厚みが増し、中空構造の消失あるいは改善が認められた。一方、比較例で得られた円柱形ＰＣＬスポンジでは、円柱形ＰＣＬスポンジ外側には軟骨再生が認められるものの、円柱形ＰＣＬスポンジ内部では認められず、その結果、再生軟骨が中空構造となった。
【００４９】
図４に、実施例１で得られた本発明の絹フィブロインからなる円柱状の多孔質スポンジを用いた培養２ヶ月後のスポンジを、サフラニン染色することにより軟骨基質を染色した結果を示す。図５は、比較例で得られた円柱形ＰＣＬスポンジを用いて同様の培養および染色をした写真である。円柱形ＰＣＬスポンジでは中空構造となっているのに対し、本発明の絹フィブロインからなる円柱状の多孔質スポンジでは、スポンジ内部まで一様に、軟骨の再生が認められる。
【００５０】
本発明の円柱状の多孔質スポンジと比較例の円柱形ＰＣＬスポンジにおいて、このような大きな差が生じた原因としては、絹フィブロインの孔壁における水、酸素、栄養素などの良好な透過性が考えられる。この良好な透過性により、軟骨形成に伴い栄養素等が届き難くなるスポンジ内部においても、軟骨細胞による充分な軟骨形成が行なわれたと考えられる。絹と水との親和性という観点から、この結果は、先の多孔質スポンジが、湿潤状態では柔らかくなるという圧縮特性結果とも整合している。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の多孔質骨再生医療用基材は、従来は不可能であったスポンジ深部における、骨や軟骨の再生を可能とするので、細胞を培養して再生軟骨などの再生骨を形成させるティッシュエンジニアリングに好適であり、微細で複雑な骨の三次元構造を再現する足場材料としての利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施例１で得られた本発明の製造方法において用いられるショ糖製の円柱形水溶性多孔ペレットの断面を撮影した電子顕微鏡写真対応図の例である。
【図２】実施例１で得られた本発明の絹フィブロインからなる円柱状の多孔質骨再生医療用基材の断面を撮影した電子顕微鏡写真対応図の例である。
【図３】実施例１で得られた本発明の絹フィブロインからなる円柱状の多孔質骨再生医療用基材における細孔の孔径の分布を示した図である。
【図４】実施例１で得られた本発明の絹フィブロインからなる円柱状の多孔質骨再生医療用基材を用いた軟骨細胞培養試験における、培養２ヶ月後の軟骨基質を染色した写真対応図の例である。
【図５】比較例で得られた円柱形ＰＣＬスポンジを用いた軟骨細胞培養試験における、培養２ヶ月後の軟骨基質を染色した写真対応図の例である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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