(57)【要約】【課題】膵β細胞増殖促進、血中インスリン濃度上昇、血糖値低下、及び糖尿病治療・予防に有効な新規薬剤を提供すること。【解決手段】肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強する薬剤を、膵β細胞増殖促進剤、血中インスリン濃度上昇剤、血糖値低下剤、及び糖尿病予防・治療剤とする。肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強する物質としては特に限定されず、MEKタンパク質の活性を増強する物質、内在性MEKタンパク質を活性化する物質、活性型MEKタンパク質をコードする遺伝子を発現する発現ベクター等、様々な物質が含まれる。これらの物質は、当業者に公知の技術を用いて作製してもよいし、市販のものでもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓においてERKタンパク質の機能を増強する膵β細胞増殖促進剤。
【請求項２】
肝臓において内在性MEKタンパク質を活性化することを特徴とする請求項１に記載の膵β細胞増殖促進剤。
【請求項３】
活性型MEKタンパク質又は活性型MEKタンパク質発現物質を含有することを特徴とする請求項１に記載の膵β細胞増殖促進剤。
【請求項４】
活性型MEKタンパク質をコードする遺伝子を発現する発現ベクターを含有することを特徴とする請求項３に記載の膵β細胞増殖促進剤。
【請求項５】
肝臓においてERKタンパク質の機能を増強する血中インスリン濃度上昇剤。
【請求項６】
肝臓において内在性MEKタンパク質を活性化することを特徴とする請求項５に記載の血中インスリン濃度上昇剤。
【請求項７】
活性型MEKタンパク質又は活性型MEKタンパク質発現物質を含有することを特徴とする請求項５に記載の血中インスリン濃度上昇剤。
【請求項８】
活性型MEKタンパク質をコードする遺伝子を発現する発現ベクターを含有することを特徴とする請求項７に記載の血中インスリン濃度上昇剤。
【請求項９】
肝臓においてERKタンパク質の機能を増強する血糖値低下剤。
【請求項１０】
肝臓において内在性MEKタンパク質を活性化することを特徴とする請求項９に記載の血糖値低下剤。
【請求項１１】
活性型MEKタンパク質又は活性型MEKタンパク質発現物質を含有することを特徴とする請求項９に記載の血糖値低下剤。
【請求項１２】
活性型MEKタンパク質をコードする遺伝子を発現する発現ベクターを含有することを特徴とする請求項１１に記載の血糖値低下剤。
【請求項１３】
肝臓においてERKタンパク質の機能を増強する糖尿病予防・治療剤。
【請求項１４】
肝臓において内在性MEKタンパク質を活性化することを特徴とする請求項１３に記載の糖尿病予防・治療剤。
【請求項１５】
活性型MEKタンパク質又は活性型MEKタンパク質発現物質を含有することを特徴とする請求項１３に記載の糖尿病予防・治療剤。
【請求項１６】
活性型MEKタンパク質をコードする遺伝子を発現する発現ベクターを含有することを特徴とする請求項１５に記載の糖尿病予防・治療剤。
【請求項１７】
前記糖尿病が、1型糖尿病又は2型糖尿病であることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれかに記載の糖尿病予防・治療剤。
【請求項１８】
前記糖尿病が、膵β細胞脱落による糖尿病又は膵β細胞障害による糖尿病であることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれかに記載の糖尿病予防・治療剤。
【請求項１９】
膵臓を支配する迷走神経を刺激する膵臓迷走神経刺激剤であって、
肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強することを特徴とする膵臓迷走神経刺激剤。
【請求項２０】
肝臓において内在性MEKタンパク質を活性化することを特徴とする請求項１９に記載の膵臓迷走神経刺激剤。
【請求項２１】
活性型MEKタンパク質又は活性型MEKタンパク質発現物質を含有することを特徴とする請求項２０に記載の膵臓迷走神経刺激剤。
【請求項２２】
活性型MEKタンパク質をコードする遺伝子を発現する発現ベクターを含有することを特徴とする請求項２１に記載の膵臓迷走神経刺激剤。
【請求項２３】
ヒト以外の脊椎動物において、膵β細胞の増殖を促進させる方法であって、
肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強することを特徴とする膵β細胞増殖促進方法。
【請求項２４】
肝臓において内在性MEKタンパク質を活性化することを特徴とする請求項２３に記載の膵β細胞増殖促進方法。
【請求項２５】
肝臓に活性型MEKタンパク質又は活性型MEKタンパク質発現物質を導入することを特徴とする請求項２３に記載の膵β細胞増殖促進方法。
【請求項２６】
肝臓に前記活性型MEKタンパク質をコードする遺伝子を発現する発現ベクターを導入することを特徴とする請求項２５に記載の膵β細胞増殖促進方法。
【請求項２７】
ヒト以外の脊椎動物において、血中インスリン濃度を上昇させる方法であって、
肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強することを特徴とする血中インスリン濃度上昇方法。
【請求項２８】
肝臓において内在性MEKタンパク質を活性化することを特徴とする請求項２７に記載の血中インスリン濃度上昇方法。
【請求項２９】
肝臓に活性型MEKタンパク質又は活性型MEKタンパク質発現物質を導入することを特徴とする請求項２７に記載の血中インスリン濃度上昇方法。
【請求項３０】
肝臓に前記活性型MEKタンパク質をコードする遺伝子を発現する発現ベクターを導入することを特徴とする請求項２９に記載の血中インスリン濃度上昇方法。
【請求項３１】
ヒト以外の脊椎動物において、血糖値を低下させる方法であって、
肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強することを特徴とする血糖値低下方法。
【請求項３２】
肝臓において内在性MEKタンパク質を活性化することを特徴とする請求項３１に記載の血糖値低下方法。
【請求項３３】
肝臓に活性型MEKタンパク質又は活性型MEKタンパク質発現物質を導入することを特徴とする請求項３１に記載の血糖値低下方法。
【請求項３４】
肝臓に前記活性型MEKタンパク質をコードする遺伝子を発現する発現ベクターを導入することを特徴とする請求項３３に記載の血糖値低下方法。
【請求項３５】
ヒト以外の脊椎動物において、糖尿病を予防・治療する方法であって、
肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強することを特徴とする糖尿病予防・治療方法。
【請求項３６】
肝臓において内在性MEKタンパク質を活性化することを特徴とする請求項３５に記載の糖尿病予防・治療方法。
【請求項３７】
肝臓に活性型MEKタンパク質又は活性型MEKタンパク質発現物質を導入することを特徴とする請求項３５に記載の糖尿病予防・治療方法。
【請求項３８】
肝臓に前記活性型MEKタンパク質をコードする遺伝子を発現する発現ベクターを導入することを特徴とする請求項３７に記載の糖尿病予防・治療方法。
【請求項３９】
前記糖尿病が、1型糖尿病又は2型糖尿病であることを特徴とする請求項３５〜３８のいずれかに記載の糖尿病予防・治療剤。
【請求項４０】
前記糖尿病が、膵β細胞脱落による糖尿病又は膵β細胞障害による糖尿病であることを特徴とする請求項３５〜３８のいずれかに記載の糖尿病予防・治療方法
【請求項４１】
ヒト以外の脊椎動物において、膵臓を支配する迷走神経を刺激する方法であって、
肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強することを特徴とする膵臓迷走神経刺激方法。
【請求項４２】
肝臓において内在性MEKタンパク質を活性化することを特徴とする請求項４１に記載の膵臓迷走神経刺激方法。
【請求項４３】
肝臓に活性型MEKタンパク質又は活性型MEKタンパク質発現物質を導入することを特徴とする請求項４１に記載の膵臓迷走神経刺激方法。
【請求項４４】
肝臓に前記活性型MEKタンパク質をコードする遺伝子を発現する発現ベクターを導入することを特徴とする請求項４３に記載の膵臓迷走神経刺激方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵β細胞増殖促進剤、血中インスリン濃度上昇剤、血糖値低下剤、及び糖尿病治療・予防薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
1型糖尿病は、膵臓のランゲルハンス島にあるインスリンを合成・分泌するβ細胞が破壊・消失して、インスリンの欠乏が生じることによって起こる。そのため、1型糖尿病を有する患者は、生涯を通じてインスリン治療を必要とする。しかしながら、実際のところ、1日3〜4回という頻回の注射を行っても、血糖値をコントロールすることは難しく、1型糖尿病治療のための薬剤や治療法の開発が望まれていた。
【０００３】
近年、1型糖尿病患者に対する膵臓移植や膵島移植等の治療法の開発が進められている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、膵臓移植や膵島移植には、拒絶反応や絶対的なドナー不足という問題があるため、これらの移植の実施は困難であることが予想される。そのため、膵臓移植や膵島移植以外の、1型糖尿病治療のための薬剤や治療法を開発する必要があった。
【０００４】
さらに、最近になって、2型糖尿病患者においても、膵β細胞の数が減少していることが示された。このことから、1型糖尿病のみならず、糖尿病患者の多数を占める2型糖尿病においても、膵β細胞の増加・インスリン分泌の増加をもたらす治療法を開発することが待望されている。
【非特許文献１】Ryan EA, Paty BW, Senior PA, Bigam D, Alfadhli E, Kneteman NM, Lakey JR, Shapiro AM: Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes 54:2060-2069, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、膵β細胞増殖促進、血中インスリン濃度上昇、血糖値低下、及び糖尿病治療・予防に有効な新規薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、アデノウイルスを用いて正常マウスの肝臓に活性型 MEKタンパク質をコードする遺伝子を導入し、その効果を検討したところ、ウイルス投与3日目のブドウ糖負荷試験で、糖反応性の血中インスリン濃度が亢進し、ブドウ糖負荷試験中の血糖値が低下することを見出した。また、ウイルス投与16日目の活性型 MEKタンパク質導入マウスの膵インスリン含量は、LacZ遺伝子を導入したマウスの膵インスリン含量の3倍程度にまで増加することを見出した。さらに、組織学的検査においては活性型 MEKタンパク質導入マウスにおいて膵島内細胞中のBrdU陽性細胞比率の有意な増加を認めたことから、活性型 MEKタンパク質導入マウスの膵島ではβ細胞が増殖することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明にかかる膵β細胞増殖促進剤、血中インスリン濃度上昇剤、血糖値低下剤、糖尿病予防・治療剤、及び膵臓迷走神経刺激は、肝臓においてERKタンパク質の機能を増強することを特徴とする。ここで、前記いずれの薬剤も、肝臓において内在性MEKタンパク質を活性化してもよい。また、前記いずれの薬剤も、活性型MEKタンパク質又は、活性型MEKタンパク質発現物質を含有してもよい。この活性型MEKタンパク質発現物質は、前記活性型MEKタンパク質をコードする遺伝子を発現する発現ベクターであってもよい。なお、予防・治療の対象となる糖尿病としては、例えば、1型糖尿病、2型糖尿病、膵β細胞脱落による糖尿病又は膵β細胞障害による糖尿病等が挙げられる。
【０００８】
さらに、本発明にかかる膵β細胞増殖促進方法、血中インスリン濃度上昇方法、血糖値低下方法、糖尿病予防・治療方法、膵臓迷走神経刺激方法は、ヒト又はヒト以外の脊椎動物において、肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強することを特徴とする。ここで、前記いずれの方法においても、肝臓において内在性MEKタンパク質を活性化してもよい。また、前記いずれの方法においても、肝臓に活性型MEKタンパク質又は活性型MEKタンパク質発現物質を導入してもよい。この活性型MEKタンパク質発現物質は、肝臓に前記活性型MEKタンパク質をコードする遺伝子を発現する発現ベクターであってもよい。なお、予防・治療の対象となる糖尿病としては、例えば、1型糖尿病、2型糖尿病、膵β細胞脱落による糖尿病又は膵β細胞障害による糖尿病等が挙げられる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、膵β細胞増殖促進、血中インスリン濃度上昇、血糖値低下、及び糖尿病治療・予防に有効な新規薬剤を提供することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明の実施の形態において実施例を挙げながら具体的かつ詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１１】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１２】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１３】
＝＝＝薬理作用＝＝＝
本発明者らは、以下の実施例に示す通り、肝臓へ効率的に遺伝子導入することができるアデノウイルスに活性型MEKタンパク質をコードする遺伝子を組み込み、このアデノウイルスを用いて正常マウス（C57Bl/6Nマウス）の肝臓に活性型MEKタンパク質を導入することにより、膵β細胞の増殖を促進し、膵インスリン含量を増加させ、血糖値を低下させることを可能にした。
【００１４】
MEKタンパク質は、ERKシグナル伝達系の構成要素であってERKキナーゼとも呼ばれており、細胞内では、ERKタンパク質をリン酸化し、活性化するという機能を有する。このように、MEKタンパク質はERKタンパク質を通じて機能しているため、肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強する物質は、膵β細胞の増殖促進、血中インスリン濃度の上昇、血糖値の低下、及び糖尿病の予防又は治療に用いることができる。なお、ERKシグナル伝達系は、細胞の基本的な機能を支配するので、広範な動物種においてその機能は保存されているため、MEKタンパク質やERKタンパク質など、ERKシグナル伝達系の構成要素の由来する動物種は特に限定されない。  
具体的には、以下の通りである。
【００１５】
（１）膵β細胞増殖促進剤
本発明者らは、正常マウスの肝臓に活性型MEKをコードする遺伝子を導入し、その後、膵β細胞数及び膵島面積を測定したところ、このマウスの膵島においてβ細胞の増殖が促進することを明らかにした。従って、肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強する物質は、膵β細胞増殖促進剤として有用である。
【００１６】
（２）血中インスリン濃度上昇剤
同時に、本発明者らは、正常マウスの肝臓に活性型MEKをコードする遺伝子を導入し、その後、膵インスリン含有量を測定したところ、膵インスリン含量が増加することを明らかにした。ここで、膵臓で合成されたインスリンはその後血中に分泌されることから、膵インスリン含量が増加すると、血中インスリン濃度が上昇することになる。実際、ブドウ糖負荷試験において、糖反応性のインスリン分泌が増加することを明らかにした。従って、肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強する物質は、血中インスリン濃度上昇剤として有用である。
【００１７】
（３）血糖値低下剤
また、本発明者らは、正常マウスの肝臓に活性型MEKをコードする遺伝子を導入し、その後、空腹時血糖値を測定したところ、空腹時血糖値が正常値まで低下することを明らかにした。また、上記と同様の方法を用いて、正常マウスの肝臓に活性型MEKをコードする遺伝子を導入し、その後、ブドウ糖負荷試験を行ない血糖値を測定したところ、ブドウ糖負荷試験2時間後の血糖値が正常値まで低下することを明らかにした。ここで、「正常値」とは、疾患等を有さない健常マウスの血糖値のことをいう。従って、肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強する物質は、血糖値低下剤として有用である。
【００１８】
（４）糖尿病予防・治療剤
本発明者らは、1型糖尿病モデルマウス（STZマウス：膵β細胞の破壊によって高血糖を生じる糖尿病モデルマウス）、進行性の膵β細胞の脱落をきたす糖尿病モデルマウス(AKITAマウス：小胞体ストレスにより膵β細胞がアポトーシスをおこし高血糖を生じる糖尿病モデルマウス）及び肥満により2型糖尿病を発症するモデルマウス（C57BL/KSJ-db/dbマウス：レプチン受容体変異により遺伝的肥満をきたしインスリン抵抗性となる糖尿病モデルマウス）の肝臓に活性型MEKをコードする遺伝子を導入し、その後、膵インスリン含有量及び空腹時血糖値を測定したところ、膵インスリン含量が増加すること、及び空腹時血糖値が正常値まで低下することを明らかにした。従って、本発明の肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強する物質は、糖尿病予防・治療剤として有用である。
【００１９】
ここで、一般に、1型糖尿病は、膵β細胞の破壊性病変によってインスリンの不足が進行するタイプで、多くの場合、インスリンの絶対的欠乏に陥るといわれている。一方、2型糖尿病は、糖尿病患者の95％以上を占める最も多いタイプで、インスリン分泌の低下とインスリン感受性の低下とが発病にかかわるといわれている。しかしながら、最近になって、2型糖尿病の発症においても、インスリン抵抗性の負荷と密接に関わりあって膵β細胞障害によってインスリンの不足が生じることが分かってきた。従って、本発明の肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強する物質は、膵β細胞破壊・消失に起因する1型糖尿病の予防・治療剤としてだけでなく、二次的に膵β細胞障害を生じる2型糖尿病（例えば、肥満・インスリン抵抗性による糖尿病）の予防・治療剤としても有用である。ここで、膵β細胞障害には、膵β細胞機能異常（インスリン分泌不全、膵β細胞分化異常、膵β細胞増殖異常）、膵β細胞数減少（既存の膵β細胞の脆弱性、既存の膵β細胞の増殖障害）、膵β細胞の疲幣等が含まれる。
【００２０】
なお、急性膵炎、慢性膵炎、壊死性膵炎、膵癌、先天異常、自己免疫疾患、薬剤投与による副作用、環境因子等に起因する二次性糖尿病にも、本発明の糖尿病予防・治療剤は有用である。
【００２１】
また、糖尿病の発症の予防や糖尿病の治療には、本発明の薬剤の投与の他に、1型糖尿病の場合はインスリン療法等を、2型糖尿病の場合はαグルコシダーゼ阻害薬（αGI）、速効型インスリン分泌促進薬等の食後過血糖抑制薬の投与、食事療法、運動療法等を組み合わせてもよい。
【００２２】
＝＝＝ERKタンパク質の機能増強方法＝＝＝
細胞内でERKタンパク質の機能を増強するには、ERKシグナル伝達系を活性化できれば特に限定されず、細胞内の内在性ERKタンパク質を活性化してもよく、細胞内に活性型ERKタンパク質又は活性型ERKタンパク質発現物質を導入してもよい。従って、ERKタンパク質の機能を増強する物質は、ERKシグナル伝達系を活性化できるものであれば特に限定されない。
【００２３】
（１）活性型ERKタンパク質又は活性型ERKタンパク質発現物質の導入方法
活性型ERKタンパク質を細胞に導入するための方法としては特に限定されず、Protein Transduction Domains (PTD) 融合タンパク質としてTATやVP22との融合タンパク質を用いてもよく、in vitroで合成した活性型MEKタンパク質を、例えば、BioPorterTM、ChariotTMなどのタンパク質導入試薬や、インジェクションなどにより細胞に導入すればよい。
【００２４】
活性型ERKタンパク質発現物質導入は、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ウイルス感染法、その他様々なDDS（drug delivery system）等、その方法は特に限定されない。
【００２５】
（２）内在性ERKタンパク質の活性化方法
細胞内の内在性ERKタンパク質を活性化するには、例えばTPAなどのERKタンパク質を活性化する薬剤を用いてもよく、ERKシグナル伝達系の上流を活性化してもよい。
【００２６】
細胞内でERKシグナル伝達系の上流を活性化するには、例えば、MEKタンパク質の機能を増強すればよい。その方法としては、内在性MEKタンパク質を活性化してもよく、活性型MEKタンパク質又は活性型MEKタンパク質発現物質を導入してもよい。
【００２７】
細胞内で内在性MEKタンパク質を活性化するには、例えば、ERKシグナル伝達系において、MEKタンパク質の上流を活性化させればよく、その方法は特に限定されないが、例えば、Rasタンパク質や、あるいはRafタンパク質やMEKK-1タンパク質などのMEKキナーゼを活性化させればよい。それらの活性化方法も特に限定されないが、例えば、EGFなどのERKシグナル伝達系の活性化因子を細胞に投与したり、活性型Rafタンパク質又は活性型Rafタンパク質発現物質を細胞に導入したりすればよい。その方法も特に限定されず、活性型Rafタンパク質を細胞にインジェクトしたり、活性型Rafタンパク質をコードする発現ベクターを、マイクロインジェクション、リポフェクション、ウイルスによるインフェクションなどによって細胞に導入したりすればよい。
【００２８】
活性型MEKタンパク質又は活性型MEKタンパク質発現物質を導入するには、（１）でERKタンパク質に対して記載した方法を活性型MEKタンパク質に適用すればよい。
【００２９】
（３）活性型タンパク質及び活性型タンパク質発現物質
ここで、活性型Rafタンパク質、活性型MEKタンパク質、あるいは活性型ERKタンパク質は、各タンパク質が活性化される際にリン酸化されるアミノ酸を、あらかじめ酸性アミノ酸に置換することによって製造できる。具体的には、例えば、Rafタンパク質の場合338番目のセリン、MEKタンパク質の場合218番目のセリン及び222番目のセリン、ERKタンパク質の場合183番目のスレオニン及び185番目のチロシンを、アスパラギン酸やグルタミン酸に置換することにより、各タンパク質を活性型にすることができる。
【００３０】
また、活性型タンパク質発現物質は、活性型タンパク質を細胞内で発現させる物質であれば特に限定されず、活性型タンパク質をコードするmRNAや活性型タンパク質をコードする遺伝子を発現する発現ベクター等が挙げられる。
【００３１】
活性型タンパク質をコードする遺伝子を発現する発現ベクターは、導入する宿主細胞で機能するプロモーターを備えていれば、どんなベクターでもよく、プラスミドベクターでも、ウイルスベクターでもよい。また、遺伝子導入に際しては、遺伝子を導入後、発現ベクターを染色体の外におく一過的発現（transient expression）であっても、発現ベクターが染色体に組み込まれた永久発現（permanent expression）であってもよい。
【００３２】
＝＝＝上記薬剤の製造方法＝＝＝
ERKタンパク質の機能を増強する薬剤に用いられ得る薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質を用いてもよく、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等を含有してもよい。さらに必要に応じて、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量含有してもよい。また、剤形としては、経口剤は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、シロップ剤、徐放性錠・カプセル・顆粒剤、カシュー剤、咀嚼錠剤又はドロップ剤等が、注射剤は、例えば、溶液性注射剤、乳濁性注射剤、又は固形注射剤等が挙げられる。
【００３３】
また、投与方法に対応して必要な担体を含有してもよく、例えば、リポフェクション法における脂質分子などがそれにあたる。
【００３４】
＝＝＝上記薬剤の動物個体における投与方法＝＝＝
本発明の薬剤を動物個体に対する投与は、上記細胞への投与方法を個体に適用することで行われ得る。
【００３５】
本発明の薬剤の投与量は、年齢、体重、適応症又は投与・摂取経路によって異なるが、上記作用が発揮でき、かつ、生じる副作用が許容し得る範囲内であれば特に限定されない。
【００３６】
本発明の薬剤の投与経路は、肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強することができる経路であれば特に限定されない。
【００３７】
本発明の薬剤を投与する状況としては、例えば、ヒト又はヒト以外の脊椎動物において、空腹時血糖値又はブドウ糖負荷試験2時間後の血糖値を測定し、これらの血糖値が異常高値を示す場合、本発明のERKタンパク質の機能を増強する薬剤を投与する。
【００３８】
なお、境界型糖尿病の場合や、糖尿病の典型的な症状（口渇、多飲、多尿、体重減少）が存在する場合や、HbA１cが健常人より高い（例えば、6.5％以上）と判断される場合や、糖尿病網膜症等の合併症が存在する場合に、本発明の薬剤を、糖尿病の発症の予防又は糖尿病の治療として用いてもよい。
【００３９】
＝＝＝膵臓迷走神経刺激方法＝＝＝
正常マウスの膵臓を支配する迷走神経を切断すると、肝臓に活性型MEKタンパク質をコードする遺伝子を導入した正常マウスにおいて認められた症状（膵β細胞の増殖、血中インスリン濃度の上昇、及び血糖値の低下）がほぼ完全に認められなくなる。従って、肝臓でERKタンパク質を活性化すると、膵臓を支配する迷走神経が刺激される。そのため、ヒト又はヒト以外の脊椎動物において膵臓を支配する迷走神経を刺激するには、肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強すればよい。ここで、ヒトの場合、「膵臓を支配する迷走神経」は、延髄の脳神経細胞から発する第Ｘ脳神経に対応する。なお、「肝臓におけるERKタンパク質の機能を増強する」方法は、前述の通りである。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を用いて、以上に説明した実施態様を具体的に説明するが、これは例示であって、本発明をこの実施例に限定するものではない。
【００４１】
＜実施例１：正常マウスの肝臓への活性型 MEK遺伝子導入の効果＞
本実施例では、正常マウス（野生型マウス）の肝臓に活性型 MEKをコードする遺伝子を導入し、そのマウスにおける血糖値、血清インスリン値、及び膵細胞数・膵島数を測定した。
【００４２】
（１）実験動物
本実施例において、正常マウスには8週齢雄C57Bl/6Nマウス（九動株式会社）を用いた。
【００４３】
（２）遺伝子改変アデノウイルスの作製
アフリカツメガエルのMEK1タンパク質（配列番号1にMEK1cDNAの塩基配列を、配列番号2にはMEK1のアミノ酸配列を示す。）（Fukuda M, Gotoh I, Adachi M, Gotoh Y, Nishida E: A novel regulatory mechanism in the mitogen-activated protein (MAP) kinase cascade. Role of nuclear export signal of MAP kinase kinase. J Biol Chem 272:32642-32648, 1997）において、218番目のセリンをアスパラギン酸に、222番目のセリンをグルタミン酸に、さらに11番目と37番目のロイシンをアラニンに変換した活性型MEK1タンパク質をコードする遺伝子（以下、CAM遺伝子と記す）（配列番号3にはCAMcDNAの塩基配列を、配列番号4にはCAMのアミノ酸配列を示す。）を作製した。具体的には、アフリカツメガエルのMEK1タンパクをコードするcDNAを鋳型として、上記アミノ酸変異を導入するための置換塩基を有するプライマーを用いてPCR反応を行い、変異を有する配列を含む２本鎖DNAを作製し、制限酵素による切断・ライゲーションを行って、野生型cDNAの一部を、変異を有するDNA断片と置換することにより、全長のCAM遺伝子を作製した。さらに、CAM遺伝子を、アデノウイルスゲノムE1領域をCAGプロモーター下に発現できるよう置換されたコスミドに組み込み、制限酵素EcoT22Iで切断後、DNA-terminal protein complexとともにHEK293細胞にトランスフェクションを行うこと（COS-TPC法）により（Miyake S, Makimura M, Kanegae Y, Harada S, Sato Y, Takamori K, Tokuda C,  Saito I. Efficient generation of recombinant adenoviruses using adenovirus DNA-terminal protein complex and a cosmid bearing the full-length virus genome. Proc Natl Acad Sci U S A, 93: 1320-1324, 1996）、CAM遺伝子を発現するアデノウイルスベクター（以下、CAM-Adと記す）を作製した。なお、コントロールには、β-ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込んで生産した、遺伝子改変アデノウイルスベクター（以下、LacZ-Adと記す。）を用いた。
【００４４】
（３）正常マウス肝臓へのCAM遺伝子の導入
（i）ERK経路の活性化
1.5×108 PFU / bodyのアデノウイルス（CAM-Ad及びlacZ-Ad）を正常マウス（C57Bl/6N）の尾静脈に注入し、ウイルスを肝臓に感染させた。ウイルス投与3日目に、肝臓におけるERKのリン酸化の程度をウエスタンブロッティング法で確認した。方法は、以下の通りである。
【００４５】
まず、マウスの肝臓を摘出し、その肝臓をバッファー(100mM Tris pH 8.5, 250mM NaCl, 1% BP-40, 1mM EDTA, 40mM Glycerol 2-phosphate , 50mM NaF, 1mM Na3VO4, 350μg/ml phenylmethane sulfonyl fuloride, 2μg/ml Aprotinin, 2μg/ml Leupeptin)に入れて氷上でホモジナイズした。ホモジナイズした組織を10分間、4℃、14,000 × gで遠心後、タンパク抽出物を含む上清(180 μg total protein)を10mMジチオスレイトールを含むLaemmliバッファー内で煮沸した。次に、Protein assay kit (Bio-Rad, Heracules, CA)を用いてタンパク質量を定量し、1サンプルあたり15μgのタンパク質をSDS-PAGEに供した。その後、常法によりタンパク質をメンブレンにブロットし、ECL plus a Western Blotting Detection System Kit(Amersham Buckinghamshire, UK)及び抗リン酸化ERK抗体(#4376, Cell Signaling Technology, Danvers, MA)を用いてERKのリン酸化を検出した。なお、ERKタンパク質発現量の検出には、抗ERK抗体(#9102, Cell Signaling Technology)を用いた。
【００４６】
その結果、CAM遺伝子を導入したマウス(以下、CAMマウスと記す。) の肝臓は、LacZの遺伝子導入を行ったマウス (以下、LacZマウスと記す。) の肝臓と比較して、有意なERKのリン酸化の亢進を認めた (図1a) 。このことから、CAM-Adがマウスの肝臓に感染したことが示された。
【００４７】
（ii）糖負荷試験
（ｉ）と同様に作製したCAMマウス及びLacZマウスに対して、ブドウ糖負荷試験を行なった。まず、ウイルス投与3日目に2 g/kg体重のグルコースを腹腔内投与し、グルコース投与前 (0分)、投与後15分、30分、60分、120分に尾静脈より採血を行い、血糖値及び血清インスリン値を測定した。なお、インスリン値は、高感度マウスインスリンアッセイキット又は超高感度マウスインスリンアッセイキット(大塚製薬株式会社)を用いて測定した。
【００４８】
図1b に示すように、CAMマウスではLacZマウスと比較して、空腹時血糖及び負荷後血糖が共に有意に低下していた 。一方、図1cに示すように、同時に測定した血清インスリン値は、CAMマウスにおいて糖負荷後15分値で有意な増加を認め、CAMマウスにおいては糖反応性のインスリン分泌が亢進し、その結果ブドウ糖負荷試験中の血糖値が低下していることが示された。  
また、ウイルス投与4日目、11日目、16日目、20日目の膵インスリン含量を以下のように測定した。まず、マウスより膵尾部を中心に全体のおよそ2/3の膵臓を採取し、Acidエタノール中でホモジナイズした後、−20℃の冷凍庫にて保存した。翌日と翌々日に5分間超音波処理を行った後、10,000 rpm、10分間で遠心して上清を採取し、上記キットでインスリン値を測定した。得られた値に対し、採取した膵重量で補正を行って、膵インスリン濃度とした。  
図1dに示すように、ウイルス感染後、徐々に膵インスリン含量が増加し、ウイルス投与16日目にはLacZマウスの膵インスリン含量の約2倍程度にまで増加した。  
このように、肝臓で活性型MEKを発現させることにより、空腹時血糖、及び負荷後血糖が低下し、糖反応性のインスリン分泌が亢進する。
【００４９】
（iii）組織学的検査
さらに、ウイルス投与後の膵臓組織の観察を行った。具体的には以下の通りである。  
まず、ウイルス投与3日目、9日目、15日目、21日目のマウスより膵臓を全摘した。膵臓を500μm毎に3μmの切片に切断し、インスリン染色を行い、切片上の全膵島数を計測した。計測した膵島数を組織切片数で割ることによって標準化し、単位体積あたりの膵島数を比較した。  
図2aに示すように、この組織学的検査では、CAMマウスにおいては経時的に膵島数が増加し、ウイルス投与15日目以降はLacZマウスと比較して有意な増加を認めた。
【００５０】
また、BrdU assay kit (BD bioscience, San Jose, CA)を用いて、BrdU染色を行って、細胞増殖を調べた。具体的には、ウイルス投与後3日目、9日目、15日目、21日目にBrdU（1mg/ml）を1 ml腹腔内に注射し、24時間後に膵臓を全摘し、上述の通り全割を行い、以下のようにBrdUの免疫染色に供した。まず、切片はキットに付属しているsolution1とsolution2の混合液中でオートクレーブにより89℃に加熱し抗原の賦活化を行った。その後キット内のビオチン化抗BrdU抗体を10倍に希釈したものを切片上に滴下し1時間室温にて抗原抗体反応を行った。さらにキット内のStreptavidin-HRPを加え、室温で30分間反応させた後、3,3’- ジアミノベンチジン (DAB) chromogen液と5分間反応させて発色を行った。
【００５１】
図2bに示すように、ウイルス投与3日目からCAMマウスの膵島内細胞中のBrdU陽性細胞比率の有意な増加が認められた。ウイルス投与9日目においてもBrdU陽性細胞比率の有意な増加が持続していたが、ウイルス投与15日目にはLacZマウスとの差を認めなかった (図2c)。このことから、CAMマウスの膵島では、ウイルス投与直後に増殖が亢進している細胞が存在することが示された。
【００５２】
さらに膵島中のどのような細胞の増殖が亢進しているのかを検討するために、CAMマウスのウイルス投与3日目の膵切片を用いてBrdUとインスリンの二重染色を行った。二重染色は上述の通りBrdU染色を行い、DAB液を用いて1色目の発色反応 (本来は茶色だが、図2dでは灰色で示されている) を行った後、抗インスリン抗体(Sigma, St.Louis, MO)を用いて1次抗体反応を1時間室温、ペルオキシダーゼ標識2次抗体(株式会社  ニチレイ)を用いて2次抗体反応を1時間室温で行った切片に対して、アミノエチルカルバゾール (AEC) 基質キット(ニチレイ) を用いて2色目の発色反応 (本来は赤色だが、図2dでは黒色で示されている) を行った。
【００５３】
その結果、図2dに示すように、灰色のシグナルを有する細胞のうち、97.6%の細胞が黒色のシグナルを有する、すなわち、膵島内のBrdU陽性細胞のうち、97.6%の細胞がインスリンにも陽性を示すことが明らかとなった。
【００５４】
ERK経路は細胞の増殖において重要な作用を有する経路であることから（Roux PP, Blenis J: ERK and p38 MAPK-activated protein kinases: a family of protein kinases with diverse biological functions. Microbiol Mol Biol Rev 68:320-344, 2004）、CAM Adが直接β細胞に作用して増殖を促している可能性が示唆された。
【００５５】
そこで、ウイルス投与3日目のLacZマウス、CAMマウスの単離膵島に対し、以下のようにリン酸化ERK抗体を用いてウエスタンブロティング法を行い、ERKのリン酸化の程度を調べた。
【００５６】
まず、対応するマウスから膵臓を摘出し、その膵臓をバッファー(100mM Tris pH 8.5, 250mM NaCl, 1% BP-40, 1mM EDTA, 40mM Glycerol 2-phosphate , 50mM NaF, 1mM Na3VO4, 350μg/ml phenylmethane sulfonyl fuloride, 2μg/ml Aprotinin, 2μg/ml Leupeptin)に入れてホモジナイズした。ホモジナイズした組織を10分間、4℃、14,000 × gで遠心後、タンパク質抽出物を含む上清(180 μg total protein)を10mMジチオスレイトールを含むLaemmliバッファー内で煮沸した。SDS-PAGE後、メンブレンにトランスファーし、抗リン酸化ERK抗体 (#4376, Cell Signaling Technology, Danvers, MA)で、リン酸化ERKを検出した。結果の検出はECL plus a Western Blotting Detection System Kit (Amersham Buckinghamshire, UK) を用いて行った。なお、抗ERK抗体(#9102, Cell Signaling Technology)を用いてウエスタンブロッティングを行い、ERKタンパク質の発現量には変化を認めないことを確認した。
【００５７】
その結果、図2eに示すように、両群間で明らかなERKのリン酸化の程度の差は認められなかったため、膵臓における細胞増殖は、CAM Adが膵臓に作用したものではないことが結論された。
【００５８】
このように、CAMマウスの膵島では、CAM Adが膵臓に感染したことによる直接的な増殖促進効果以外の機序によってβ細胞の増殖が亢進し、その結果、膵島数が増加し、膵インスリン含量が増加している。
【００５９】
＜実施例２：肝臓へのCAM遺伝子導入による膵β細胞増殖における、膵臓を支配する迷走神経の関与＞
膵臓は食道腹側、背側を走行する、迷走神経食道前後幹それぞれから神経支配を受けることが知られている。そこで、まず、マウスの腹部を正中切開にて開腹し、食道胃接合部を露出し、食道腹側を走行する迷走神経前幹を食道胃接合部付近で切断した。その後、腸管、胃、脾臓などの腹腔内臓器を右側に反転させ、腹部大動脈から分岐する腹腔動脈付近を露出した。食道背側を走行する迷走神経後幹から分岐し、腹腔動脈に沿って走行する迷走神経腹腔枝を膵臓に可能な限り近い部位で切断した(vagotomy (VG))。手術後1週間の回復期を置いてからウイルス投与を行った。ウイルス投与後の解析結果は、開腹後に食道胃接合部と腹腔動脈を露出するのみの手術を行った群 (sham operation (SO))と比較した。
【００６０】
VGを行ってCAMのウイルス投与を行ったマウス (VG-CAMマウス)においては、SOを行ってCAMのウイルス投与を行ったマウス (SO-CAMマウス)でウイルス投与3日目に認められた糖負荷試験中の血糖値の低下、糖反応性のインスリン分泌の亢進、16日目に認められた膵インスリン含量の増加がほぼ完全に認められなくなった (図3 a,b,c)。またVG-CAMマウスにおいては、SO-CAMマウスにおけるウイルス投与3日目の膵島でのBrdU陽性細胞の増加が認められなくなった (図3 d)。
【００６１】
このことから肝臓へのCAM遺伝子導入による糖反応性インスリン分泌の亢進、膵β細胞の増殖による膵インスリン含量の増加は、膵臓を支配する迷走神経を介して起こっていることが示されると同時に、ここでも、CAMの膵臓へのウイルス感染が原因でないことが示された。
【００６２】
＜実施例３：インスリン抵抗性モデルマウスの膵島肥大における肝臓のERK経路の関与＞
本実施例では、インスリン抵抗性モデルマウスの膵島肥大における肝臓のERK経路の関与を検討した。
【００６３】
既にob/obマウスの肝臓においてERKのリン酸化が亢進していることが報告されていることから（Yang S, Lin HZ, Hwang J, Chacko VP, Diehl AM: Hepatic hyperplasia in noncirrhotic fatty livers: is obesity-related hepatic steatosis a premalignant condition? Cancer Res 61:5016-5023, 2001）、高脂肪食を負荷したマウス(HFDマウス)とob/obマウスの肝臓においてERKのリン酸化の程度をウエスタンブロッティング法を用いて調べた。なお、高脂肪食 (サフラワー油 32%、カゼイン 33.1%、スクロース 17.6%、セルロース 5.6%) 負荷マウス(HFDマウス)は、5週齢のC57Bl/6Nマウスに4週間負荷したものを用い、ob/obマウス(日本チャールズリバー株式会社)については8週齢のものを用いた。その結果、HFDマウスの肝臓においても、ob/obマウスと同様、ERKのリン酸化の亢進が認められた (図4 a)。
【００６４】
また、同様にインスリン抵抗性を呈して、膵島が腫大するdb/db (C57Bl/6 KSJ back gound) マウスに、優性阻害型変異体MEK1遺伝子（dominant-negative mutant; DNM）（Ueyama T, Kawashima S, Sakoda T, Rikitake Y, Ishida T, Kawai M, Yamashita T, Ishido S, Hotta H, Yokoyama M: Requirement of activation of the extracellular signal-regulated kinase cascade in myocardial cell hypertrophy. J Mol Cell Cardiol 32:947-960, 2000）を発現するAdを、5×108 PFU/bodyで同様に感染させたところ、ウイルス投与7日目の肝臓でのERKのリン酸化は減少し (図4 b)、膵インスリン含量はLacZマウスと比較して有意に低下した(図4 c)。  
このように、肝臓におけるERK経路の活性化は、生理的な膵β細胞増殖、膵島肥大においても関与していた。
【００６５】
＜実施例４：インスリン欠乏モデルマウスに対するCAM遺伝子導入の効果＞
β細胞が脱落すると、インスリンは絶対的な欠乏や相対的な欠乏を呈する。そこで、糖尿病を発症したマウスの肝臓に1.5×108 PFU / bodyでCAMウイルス感染を行い、その効果を検討した。なお、以下の実験には、1型糖尿病モデルマウスであるSTZマウス、進行性にインスリン分泌が低下するAKITAマウス、また、肥満によりインスリン抵抗性が生じる2型糖尿病モデルマウスであるC57BL/KSJ-db/dbマウスを用いた。
【００６６】
(１)STZを投与してβ細胞を破壊したSTZマウス
(i)実験動物
STZマウスは8週齢のC57Bl/6NマウスにSTZ(Sigma)を150 mg/kgを投与して作製し、投与後16日で空腹時血糖値が250 mg/dl 以上に上昇しているものを用いた。  
（ii）遺伝子導入の効果
STZ投与後16日目の空腹時血糖値が250 mg/dl以上のマウスを選択し、肝臓へのCAMウイルス投与を同様にして行った (STZ-CAMマウス)。  
STZ-CAMマウスの血糖値はLacZ遺伝子を導入したSTZマウス (STZ-LacZマウス)と比較して、ウイルス投与4日目から有意な低下を認め、STZ-CAMマウスの血糖値は正常化した。さらに、その低下はウイルス投与16日目も持続した (図5a)。さらにSTZ-CAMマウスのウイルス投与3日目の膵島内のBrdU陽性細胞は有意に増加し(図5b)、ウイルス投与16日目の膵インスリン含量はSTZ-LacZマウスと比較して有意な増加を認めた (図5c)。
【００６７】
（２）小胞体ストレス (ER stress) によりβ細胞が脱落するAKITAマウス
（i）実験動物
5週齢雄AKITAマウス (九動株式会社)を以下の実験に用いた。  
（ii）遺伝子導入の効果
AKITAマウスに対しても同様にCAM、LacZの遺伝子導入を行った (AKITA-CAMマウス、AKITA-LacZマウス)。AKITA-CAMマウスの血糖値はAKITA-LacZマウスと比較して、ウイルス投与4日目から有意な低下を認め、その低下はウイルス投与16日目も持続した (図6a)。さらにAKITA-CAMマウスのウイルス投与3日目の膵島内のBrdU陽性細胞は、有意に増加し(図6b)、ウイルス投与16日目の膵インスリン含量はSTZ-LacZマウスと比較して有意な増加を認めた (図6c)。
【００６８】
（３）レプチン受容体の欠損により、著明なレプチン抵抗性、インスリン抵抗性を示すdb/dbマウス
（i）実験動物
8週齢雄db/db (C57Bl/6 KSJ back ground)マウス (日本チャールズリバー株式会社) を用いた。  
（ii）遺伝子導入の効果
db/db KSJマウスに対しても同様にCAM、LacZの遺伝子導入を行った (db/db-CAMマウス、db/db-LacZマウス)。db/db-CAMマウスの血糖値はdb/db-LacZマウスと比較して、ウイルス投与4日目から有意な低下を認め、その低下はウイルス投与8日目も持続した (図7a)。さらにdb/db-CAMマウスのウイルス投与3日目の膵島内のBrdU陽性細胞は、有意に増加し(図7b)、ウイルス投与8日目の膵インスリン含量はSTZ-LacZマウスと比較して有意な増加を認めた(図7c)。
【００６９】
（４）結論
このように、肝臓におけるERKタンパク質の機能増強は、β細胞の脱落により糖尿病を発症したマウスの血糖値を低下させ、β細胞を増殖させ、インスリンの分泌量を亢進する。従って、肝臓におけるERKタンパク質の機能増強は、糖尿病の予防・治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明の一実施例において、正常マウスの肝臓へ活性型MEK遺伝子を導入した時の各種測定結果を示す図である。（a）はERKタンパク質のリン酸化を測定した結果を、（b）は糖負荷試験実施後における血糖値を測定した結果を、（c）は糖負荷試験実施時における血清インスリン値を測定した結果を、（d）は膵インスリン含量を測定した結果を示す。
【図２】本発明の一実施例において、正常マウスの肝臓へ活性型MEK遺伝子を導入した時の組織学的解析結果を示す図である。（a）は経時的に膵島数を測定した結果を、（b）は膵島内細胞中のBrdU陽性細胞を観察した結果を、（c）は膵島内細胞中のBrdU陽性細胞数を測定した結果を、（d）は膵島内細胞においてBrdUとインスリンとの二重染色を行った結果を、（e）は単離膵島におけるERKタンパク質のリン酸化を測定した結果を示す。
【図３】本発明の一実施例において、vagotomyを行ったマウスの肝臓へ活性型MEK遺伝子を導入した時の各種測定結果を示す図である。（a）及び（b）は糖負荷試験実施時における血糖値及び血清インスリン値を測定した結果を、（c）は膵インスリン含量を測定した結果を、（d）は膵島内細胞中のBrdU陽性細胞数を測定した結果を示す。
【図４】本発明の一実施例において、2型糖尿病モデルマウスの肝臓におけるERK経路の活性化の測定結果を示す図である。（a）は2型糖尿病モデルマウスの肝臓におけるERKタンパク質のリン酸化を測定した結果を、（b）は優性阻害型変異体MEK1遺伝子を導入した時の肝臓でのERKタンパク質のリン酸化を測定した結果を、(c)は優性阻害型変異体MEK1遺伝子を導入した時の2型糖尿病モデルマウスの膵インスリン含量を測定した結果を示す。
【図５】本発明の一実施例において、1型糖尿病モデルマウス（STZマウス）の肝臓へ活性型MEK遺伝子を導入した時の各種測定結果を示す図である。（a）は空腹時血糖値を測定した結果を、（b）は膵島内細胞中のBrdU陽性細胞を測定した結果を、（c）は膵インスリン含量を測定した結果を示す。
【図６】本発明の一実施例において、1型糖尿病モデルマウス（AKITAマウス）の肝臓へ活性型MEK遺伝子を導入した時の各種測定結果を示す図である。（a）は空腹時血糖値を測定した結果を、（b）は膵島内細胞中のBrdU陽性細胞を測定した結果を、（c）は膵インスリン含量を測定した結果を示す。
【図７】本発明の一実施例において、2型糖尿病モデルマウス（db/db ksjマウス）の肝臓へ活性型MEK遺伝子を導入した時の各種測定結果を示す図である。（a）は空腹時血糖値を測定した結果を、（b）は膵島内細胞中のBrdU陽性細胞を測定した結果を、（c）は膵インスリン含量を測定した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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