(57)【要約】【課題】食品等を冷凍した際の凍結濃縮を防止することができる不凍活性剤として、従来、魚類や野菜類から抽出されたものが知られているが、従来の不凍活性剤は熱に弱く、加熱によって著しく不凍活性が低下するため、加熱処理を必須とする食品等へ利用することが困難であった。本発明は安価に提供され、加熱によって不凍活性が低下することのない不凍活性剤の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の不凍活性剤の製造方法は、海棲軟体動物の内臓に緩衝液を加えて抽出処理を行った後、抽出液を分子量分画して分子量１００００以上の画分を回収することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
海棲軟体動物の内臓に緩衝液を加えて抽出処理を行った後、抽出液を分子量分画して分子量１００００以上の画分を回収することを特徴とする不凍活性剤の製造方法。
【請求項２】
海棲軟体動物の内臓に緩衝液を加えて抽出処理を行った後、抽出液をアセトンまたはエタノールで処理し、処理後の沈殿物に緩衝液を加えて抽出処理して得た抽出液を分子量分画して分子量１００００以上の画分を回収することを特徴とする不凍活性剤の製造方法。
【請求項３】
海棲軟体動物の内臓を脱脂処理し、処理後の沈殿物に緩衝液を加えて抽出処理して得た抽出液を分子量分画して分子量１００００以上の画分を回収することを特徴とする不凍活性剤の製造方法。
【請求項４】
海棲軟体動物の内臓がホタテ貝中腸腺である請求項１〜３のいずれかに記載の不凍活性剤の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかの製造方法により得られた不凍活性剤。
【請求項６】
請求項５記載の不凍活性剤を含む冷凍食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は不凍活性剤の製造方法、不凍活性剤及びその不凍活性剤を含む冷凍食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
食肉類、野菜類、血液、臓器等を長期間保存する目的で冷凍保存が行われているが、凍結温度に冷却すると、細胞内において生成した氷核は結合しながら成長して凍結する。この際に成長した氷結晶が細胞内の組織を圧迫して分離濃縮する凍結濃縮が生じ、細胞組織が損傷を受けたり破壊される。そのため冷凍保存した食肉類や野菜類は、味が損なわれるという問題があった。凍結濃縮を防止する方法として北極や南極等に生息する魚類の体内に存在する不凍活性物質を用いることが有効であることが検討された。近年、北極や南極に生息する魚類以外にも、わかさぎや、野菜類のなかにも不凍活性物質が含まれることがわかり、種々の不凍活性物質が報告されている（特許文献１〜３等）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−２５０５７２号公報
【特許文献２】特開２００４−８３５４６号公報
【特許文献３】特開２００１−２４５６５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来から知られている魚類や野菜類由来の不凍活性物質は、熱に弱く加熱によって不凍活性が著しく低下するため、加熱処理を行うことが必須である食品等へ利用することはできなかった。本発明は上記従来の課題を解決でき、加熱処理工程を経ても不凍活性が低下しない優れた不凍活性剤を得ることのできる不凍活性剤の製造方法、不凍活性剤及びその不凍活性剤を含む冷凍食品を提供することを目的とする。
【０００５】
即ち本発明は、
（１）海棲軟体動物の内臓に緩衝液を加えて抽出処理を行った後、抽出液を分子量分画して分子量１００００以上の画分を回収することを特徴とする不凍活性剤の製造方法、
（２）海棲軟体動物の内臓に緩衝液を加えて抽出処理を行った後、抽出液をアセトンまたはエタノールで処理し、処理後の沈殿物に緩衝液を加えて抽出処理して得た抽出液を分子量分画して分子量１００００以上の画分を回収することを特徴とする不凍活性剤の製造方法
（３）海棲軟体動物の内臓を脱脂処理し、処理後の沈殿物に緩衝液を加えて抽出処理して得た抽出液を分子量分画して分子量１００００以上の画分を回収することを特徴とする不凍活性剤の製造方法、
（４）海棲軟体動物の内臓がホタテ貝中腸腺である上記（１）〜（３）の不凍活性剤の製造方法、
（５）上記（１）〜（４）のいずれかの製造方法により得られた不凍活性剤、
（６）上記（５）の不凍活性剤を含む冷凍食品、
を要旨とするものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明方法によれば、食品の廃棄物である海棲軟体動物の内臓より、優れた不凍活性剤を安価に製造することができる。また、アセトン、エタノール等の溶剤を用いて処理した後、抽出、分画を行うことにより、効率良く不凍活性剤を効率良く得ることができ、工業化が容易となる。本発明の不凍活性剤は、優れた不凍活性を有し、食品、化粧品、医薬品、研究用試薬等の分野において広い利用が可能である。また本発明不凍活性剤は熱安定性に優れ、加熱によって不凍活性が低下することがないため、加熱処理を必須とする食品等に添加して用いても、不凍活性が損なわれることがない。本発明の不凍活性剤を含む冷凍食品は、冷凍保存時の氷結晶の粗大化が防止でき、食品の品質を劣化させないという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の不凍活性剤は、海棲軟体動物の内臓から得ることができる。海棲軟体動物の内臓としては、イカ、タコ等の頭足類、ホタテ貝、アワビ、トコブシ、サザエ、カキ、アサリ等の貝類の内臓が挙げられるが、ホタテ貝の中腸腺、イカの内臓部（ゴロ）が好ましく、特にホタテ貝中腸腺が好適である。またこれら海棲軟体動物は低温域で生息するものが好ましい。海棲軟体動物を低温で順化させたものを用いることも可能である。本発明において不凍活性とは、氷結晶の成長を抑制、氷の再結晶化の阻害、溶液の凍結温度を低下させる作用である。本発明の不凍活性剤により成長を抑制された氷結晶は、その形態が岩型となることで、不凍活性の効果が確認される。さらに、本発明の不凍活性剤は凍結保存中の氷の再結晶化を阻害する効果については、−９℃で３０分保持した場合に氷結晶の平均直径を6μｍ以下に保つことができる。また、本発明の不凍活性剤は０．２℃以上の熱ヒステレシス活性を示し、８０℃で1時間処理した後でも８５％以上の活性を保持し、優れた溶液の凍結温度の低下作用を有する。
【０００８】
本発明の不凍活性剤はホタテ貝中腸腺等の海棲軟体動物の内臓抽出液を分子量分画して得ることが出来る。内臓は生のものをそのまま使用しても、煮沸、蒸煮等の加熱処理したものを使用しても構わない。内臓からの抽出処理を行うに際し、前処理として、内臓をフードプロセッサー等によりペースト状にして均質化する。抽出液としては、リン酸カリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、炭酸水素アンモニウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等の緩衝液を用いることができる。緩衝液はｐＨ＝６〜９、塩濃度５〜１００ｍモル／Ｌのものが好ましい。緩衝液は、ペースト量の１〜５倍量を添加し、攪拌して緩衝液中に不凍活性剤を抽出することが好ましい。
【０００９】
抽出処理後、遠心分離等を行って上清液と沈殿物とを分離して上清液を回収する。上清液を分離した後に、沈殿物に更に緩衝液を加えて抽出を行い、上清液を回収する処理を複数回繰り返すと、不凍活性剤の回収率を上げることが出来る。この処理は２、３回程度繰り返すのが好ましい。さらに上記緩衝液抽出液に、アセトンまたはエタノールを添加して処理を行うことにより、不凍活性成分を濃縮することが出来る。また濃縮することにより、緩衝液量が少なくなり、その後の処理における操作が簡便となる。このようなアセトンやエタノールによる処理を行うことにより、内臓に含まれるプロテアーゼ等の酵素が失活し、不凍活性の高い活性剤を得ることが出来る。アセトンやエタノールは、抽出液量に対し、１〜５倍量を添加することが好ましく、添加撹拌した後、遠心し上清を除去して不凍活性剤を含む沈殿を回収し、この沈殿に再度緩衝液を添加して抽出処理を行い、上清を回収する。次いで回収した上清液を分子量分画し、分子量１００００未満の成分を除去して、分子量１００００以上の画分を回収することで、本発明の不凍活性剤を得ることができる。抽出液中の分子量１００００未満の成分と１００００以上の成分とを分子量分画するには、透析、限外濾過等を採用することができる。限外濾過は精度の高い分子量分画処理に向いており、透析は大容量の抽出液の分子量分画処理に向いている。抽出液の容量が少ない場合には限外濾過のみで分子量１００００以上の成分を分画することができるが、抽出液の容量が多い場合には透析を行った後、限外濾過を行うことが好ましい。また透析や限外濾過を行うに先立って、精密濾過を行うことにより、透析膜や限外濾過膜の目詰まりを防止することができるため好ましい。上記分画に使用する膜としては、再生セルロース、酢酸セルロースなどのセルロース系、あるいはポリスルホンなどの合成高分子系の膜が使用され、分子量１００００以上の成分を分離するためには限外濾過が好適である。また分子量１００００以上の成分を分離する膜としては、セルロース膜やＰＶＤＦ膜が好適である。
【００１０】
本発明方法において、海棲軟体動物の内臓に緩衝液を加えて抽出を行う前に、内臓に含まれる脂質の脱脂を行うと、得られる不凍活性剤の精製度が高められ、高い不凍活性を有する不凍活性剤を得ることができる。内臓に含まれる脂質の脱脂は、内臓の加熱処理、溶剤処理、あるいは加熱処理と溶剤処理の併用により行うことができる。脱脂に用いる溶剤は、クロロホルム、ヘキサン、エーテル、アセトン、エタノール、メタノール、ブタノール等を用いることができるが、アセトン、ヘキサン、ヘキサンとエタノールの併用が好ましく、ヘキサンとエタノールを併用する場合、ヘキサンによる処理とエタノールによる処理とを別々に行っても、ヘキサン−エタノール混合液を用いて同時に行っても良い。脱脂処理の前に必要に応じ凍結乾燥、加熱乾燥等による脱水処理を行うことが好ましいが、行わなくても良い。
【００１１】
本発明の不凍活性剤を含む冷凍食品は、氷結晶の成長が阻害されることにより、解凍時のドリップが減少し、食品の食感を改善することができる。また、凍結中の氷の再結晶化が抑制されることにより、保存中の冷凍食品の品質を改善できる等があげられる。本発明の不凍活性剤の冷凍食品への添加量は１０〜１００ｐｐｍ程度が好ましい。
【実施例】
【００１２】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
実施例１
ホタテ貝中腸腺１００ｇをフードプロセッサーでペースト状とし、これにトリス−塩酸緩衝液（１００ｍモル、ｐＨ＝８．０）１００ｍｌを加え、氷水冷却下で攪拌した。次いで１００００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間遠心処理を行い、上清液を沈殿から分離回収した。分離した沈殿に、同様の緩衝液１００ｍｌを加えて同様に氷水冷却下で攪拌した後、１００００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間遠心処理して上清液を回収し、先の上清液と混合した。この上清液を精密濾過して精製した後、分子量カットオフ約１００００のセロハンチューブで透析して脱塩し、更に分子量分画１００００の限外濾過膜にて、分子量１００００未満の成分を除去し、分子量１００００以上の画分よりなる不凍活性剤を得た。
【００１３】
得られた不凍活性剤を加熱せずに用いた場合の氷結晶の成長抑制効果と、８０℃で１時間加熱して用いた場合の氷結晶の成長抑制効果を試験した結果を表１に示す。また不凍活性剤による氷結晶の再結晶化阻害効果、熱ヒステリシス測定試験の結果を表１にあわせて示す。
【００１４】
氷結晶の成長抑制効果の試験
１ｍｇ／ｍｌ濃度のサンプル溶液を、８０℃まで加熱した後、２０℃まで冷却した加熱処理サンプルと、同様の溶液を加熱することなく２０℃に調温した非加熱サンプルを、各々温度制御装置付き顕微鏡のステージ上に１μリットルセットし、１００℃／分の速度で−５０℃まで冷却し、次いで１００℃／分の速度で−１０℃まで昇温した後、５℃／分の速度で−２℃まで昇温して氷単結晶を形成させた。単結晶を１℃／分の速度で冷却し、氷結晶の形態の変化を観察した。一方、不凍活性剤の１ｍｇ／ｍｌ濃度のサンプルを、８０℃で１時間加熱した後、同様の試験を行った。
【００１５】
再結晶阻害効果の試験
スクロース濃度が３０％となるように不凍活性剤のサンプル溶液を調整し、これを８０℃まで加熱した後、２０℃まで冷却した加熱処理サンプルと、同様の溶液を加熱することなく２０℃に調温した非加熱サンプルを、各々温度制御装置付き顕微鏡のステージ上に１μリットルをセットし、１００℃／分の速度で−８０℃まで冷却して急速凍結させ、次いで５０℃／分の速度で−９℃まで昇温して温度を一定に保ち、３０分後の氷結晶の数を測定し、不凍活性剤無添加品を１としたときの氷結晶の数の比で示す。また、結晶の最小と最大値を示す。
【００１６】
熱ヒステリシス測定試験
不凍活性剤の１ｍｇ／ｍｌ濃度のサンプル溶液を８０℃まで加熱した後、２０℃まで冷却した加熱処理サンプルと、同様の溶液を加熱することなく２０℃に調温した非加熱サンプルとを、各々１００℃／分の速度で−５０℃まで冷却し、次いで１００℃／分の速度で−１０℃まで昇温した後、５℃／分の速度で−２℃まで昇温して氷単結晶を形成させた。この氷単結晶を１℃／分の速度で冷却し、氷結晶が成長し始めるまでの時間を測定して熱ヒステリシスを下記（１）式より算出した。８０℃まで加熱した加熱処理サンプルの熱ヒステリシスと、非加熱サンプルの熱ヒステリシスからヒステリシスの残存率を下記（２）式より求めた。結果を表１に示す。
【００１７】
（数１）
熱ヒステリシス：ＴＨ(℃)＝６０-1（℃／秒）×測定時間（秒）      （１）
【００１８】
（数２）
残存率＝加熱熱ヒステリシス値／非加熱熱ヒステリシス値×１００      （２）
【００１９】
実施例２
ホタテ貝中腸腺１００ｇをフードプロセッサーでペースト状とし、これにトリス−塩酸緩衝液（１００ｍモル、ｐＨ＝８．０）１００ｍｌを加え、氷水冷却下で攪拌した後、１００００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間遠心処理を行い、上清液を沈殿から分離回収した。分離した沈殿に同様の緩衝液１００ｍｌを加えて同様に氷水冷却下で攪拌した後、１００００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間遠心処理して上清液を回収し、先の上清液と混合した。回収した上清液に、３倍量のアセトンを加えて氷水冷却下で攪拌した後、４℃で一晩静置した。一晩静置後、１２０００ｒ．ｐ．ｍ．で３０分間遠心処理し、上清液を分離除去して沈殿を回収した。沈殿を風乾させた後、トリス−塩酸緩衝液（１００ｍモル、ｐＨ＝８．０）１００ｍｌを加えて攪拌した後、１２０００ｒ．ｐ．ｍ．で６０分間遠心処理して上清液を回収した。この上清液を０．２μｍまでの精密濾過を行い精製した後、分子量カットオフ約１００００のセロハンチューブで透析して脱塩し、更に分子量分画１００００のセルロース限外濾過膜にて分子量１００００未満の成分を除去し、分子量１００００以上の画分よりなる不凍活性剤を得た。得られた不凍活性剤の、単結晶の成長抑制効果、再結晶阻害効果、熱ヒステリシス測定試験を実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
【００２０】
実施例３
ホタテを貝ごと煮沸した後、貝を開いて取りだした中腸腺を用いた他は実施例２と同様にして抽出、分子量分画を行い、分子量１００００以上の画分を含む不凍活性剤を得た。得られた不凍活性剤の、単結晶の成長抑制効果、再結晶阻害効果、熱ヒステリシス測定試験を実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
【００２１】
実施例４
ホタテ貝中腸腺１００ｇをフードプロセッサーでペースト状とした後、中腸腺量の１０倍量のエタノールで２回洗浄した後、遠心分離して沈殿を回収し、この沈殿を更に沈殿量の１０倍量のヘキサンで２回洗浄して脱脂処理した。脱脂処理後の中腸腺に、トリス−塩酸緩衝液（１００ｍモル、ｐＨ＝８．０）１００ｍｌを加え、氷水冷却下で攪拌した。次いで１２０００ｒ．ｐ．ｍ．で６０分間遠心処理して上清液を回収した。この上清液を０．２μmまでの精密濾過を行い精製し、次いで分子量カットオフ約１００００のセロハンチューブで透析して脱塩した後、更に分子量分画１００００のセルロース限外濾過膜にて分子量１００００未満の成分を除去し、分子量１００００以上の画分よりなる不凍活性剤を得た。得られた不凍活性剤の、単結晶の成長抑制効果、再結晶阻害効果、熱ヒステリシス測定試験を実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
【００２２】
比較例１
わかさぎから得た不凍活性蛋白を用いた他は、実施例１と同様の試験を行った。単結晶の成長抑制効果、再結晶阻害効果、熱ヒステリシス測定試験の結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
2008031250.tif 000002
【００２４】
凍結濃縮試験
水５０ｍｌに赤インク1滴を滴下し、これに８０℃で加熱処理した実施例２の不凍活性剤１００ｐｐｍを加えて攪拌して試験液を調整した。同様にして比較例１の不凍活性剤を１００ｐｐｍ加え撹拌して試験液を調整した。これらの試験液を−２０℃で一週間凍結保存したところ、比較例１の不凍活性剤を添加した試験液の場合は、赤インクが凍結濃縮を起こしていたのに対し、実施例２の不凍液を添加した試験液の場合には、赤インクは均一に分散したままだった。
【００２５】
実施例５
水１００ｇに対し、３ｇの寒天を加え、加熱して寒天が融けきったところで、実施例２の不凍活性剤を１０ｐｐｍ加えて撹拌して調製したサンプルをシャーレに流して固めた。固まった後、−２０℃で一週間凍結保存し、その後解凍し、凍結融解時における、不凍活性剤の影響を調べた。同様の試験を不凍活性剤無添加のサンプルと、実施例２の不凍活性剤の代わりに比較例１の不凍活性剤を用いて調製したサンプルで行った。実施例２の不凍活性剤を用いた寒天では、解凍後、不凍活性剤無添加のサンプル、および比較例１の不凍活性剤を用いた場合に比べ、ドリップが減少していた。また、寒天を乾燥させると、寒天の縮みが抑えられており、組織破壊も少なかった。