(57)【要約】【課題】抗原に対する特異性および親和性に優れた抗体を表面に提示できるバキュロウイルスを提供すること。【解決手段】本発明は、抗体またはそのＦａｂフラグメントを表面に提示し得る出芽型組換えバキュロウイルスを提供し、このバキュロウイルスは、バキュロウイルスエンベロープ構成糖タンパク質と該抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する一方のペプチド鎖との融合タンパク質として発現し、かつ該抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する他方のペプチド鎖を分泌タンパク質として発現し、表面に提示された抗体またはそのＦａｂフラグメントが抗原と結合し得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体またはそのＦａｂフラグメントを表面に提示し得る出芽型組換えバキュロウイルスであって、バキュロウイルスエンベロープ構成糖タンパク質と該抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する一方のペプチド鎖との融合タンパク質として発現し、かつ該抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する他方のペプチド鎖を分泌タンパク質として発現し、表面に提示された該抗体またはそのＦａｂフラグメントが抗原と結合し得る、出芽型組換えバキュロウイルス。
【請求項２】
抗体またはそのＦａｂフラグメントを表面に提示し得る出芽型組換えバキュロウイルスを作製する方法であって、
バキュロウイルスエンベロープ構成糖タンパク質と該抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する一方のペプチド鎖との融合タンパク質を発現し、かつ該抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する他方のペプチド鎖を分泌タンパク質として発現する、組換えバキュロウイルスを作製する工程
を含む、方法。
【請求項３】
前記組換えバキュロウイルスを作製する工程が、前記バキュロウイルスエンベロープ構成糖タンパク質をコードする遺伝子の５’末端側に連結した、該糖タンパク質の分泌シグナル配列および前記抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する一方のペプチド鎖をコードする遺伝子を含み、かつ分泌シグナル配列および該抗体またはそのＦａｂフラグメントの他方のペプチド鎖をコードする遺伝子を含むトランスファーベクターを構築する工程；および
該トランスファーベクターを介して目的遺伝子を昆虫細胞に導入する工程
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組換えバキュロウィルスを昆虫細胞に感染させる工程；および
前記感染させた昆虫細胞を培養してバキュロウイルスを出芽させる工程
をさらに含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
抗体またはそのＦａｂフラグメントを表面に提示する出芽型組換えバキュロウイルスディスプレイライブラリーを作製する方法であって、
異なる抗体またはそのＦａｂフラグメントを発現する少なくとも２種の組換えバキュロウイルスを作製する工程であって、該組換えバキュロウイルスが各々、バキュロウイルスエンベロープ構成糖タンパク質と抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する一方のペプチド鎖との融合タンパク質を発現し、かつ該抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する他方のペプチド鎖を分泌タンパク質として発現する、工程；
該少なくとも２種の組換えバキュロウィルスを昆虫細胞に感染させる工程；および
該感染させた昆虫細胞を培養して、バキュロウイルスを出芽させる工程
を含む、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法により作製されたバキュロウイルスディスプレイライブラリー。
【請求項７】
抗体またはそのＦａｂフラグメントをスクリーニングする方法であって、
請求項６に記載のライブラリーに抗原を結合させる工程；および
該抗原が結合した該ライブラリーの抗体またはそのＦａｂフラグメントを検出する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体を表面に提示した組換えバキュロウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体作製の手段として、一般に、ファージディスプレイ法が用いられている。ファージディスプレイ法では、大腸菌を宿主として繊維状ファージを構成するタンパク質の遺伝子に各々連結させた抗体断片の遺伝子群を発現させて、その表面にさまざまな抗体断片が提示されたファージのライブラリーを作製し、そしてその中から特定の抗原に対する特異性または親和性を有する抗体断片が提示されたファージを選択する。抗体断片を発現したファージは、その抗体断片の遺伝子をコードしたＤＮＡを有するので、特定の抗原に結合するファージを回収すれば、目的の抗体の遺伝子を単離することができる。得られた抗体遺伝子を動物細胞などにおいて発現させることにより、抗体タンパク質の生産が可能となる。
【０００３】
ファージディスプレイ法は、動物を免疫する必要がないこと、ヒト由来の抗体のファージディスプレイライブラリーを用いればヒト型の抗体を取得できることなどの利点を有する。しかしながら、ファージディスプレイ法は、大腸菌を宿主とするため、高分子量のタンパク質ほど提示効率が悪い。このため、抗体の可変部（ＶＨとＶＬ）をペプチドリンカーで接続した一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を提示する場合が多く、プロテアーゼによる分解または抗原との親和性の低下が避けられない。また、固相に固定した抗原に対して特異的に結合するファージを選択および回収するバイオパンニングによる選択効率が悪いなどの欠点を有している。
【０００４】
昆虫に感染して病気を起こすウイルスであるバキュロウイルスは、環状の二本鎖ＤＮＡを遺伝子としてもつエンベロープウイルスで、鱗翅目、膜翅目および双翅目などの昆虫に感受性を示す。核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）は、このようなバキュロウイルスの一種であり、感染した昆虫細胞の核内に多角体（ポリヒドラ）と呼ばれる封入体を大量に生成する一群のウイルスである。多角体は、分子量３１ｋＤａのポリヘドリンタンパク質から構成され、感染後期に大量に生成されて、その中に多数のウイルス粒子を埋め込んでいる。多角体はウイルスが自然界で生存するためには必須であるが、ウイルスの増殖には必要ないので、ポリヘドリン遺伝子の代わりに発現を意図する外来遺伝子を挿入してもウイルスは全く支障なく感染し増殖する。このような性質を利用して、昆虫細胞−バキュロウイルス系は、ポリヘドリンプロモーターの下流に外来遺伝子を挿入した組換えバキュロウイルスを培養昆虫細胞に感染させ、ウイルス感染した細胞に外来タンパク質を生産させる組換えタンパク質発現系として利用されている。
【０００５】
バキュロウイルスの１種であるオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（Autographa californica nucleopolyhedrovirus, AcNPV）のエンベロープを構成する糖タンパク質ｇｐ６４をコードする遺伝子の５’末端側に連結させた外来タンパク質の遺伝子を発現させることにより、そのタンパク質は、ｇｐ６４と融合した形でウイルスの表面に提示されることが報告されている（非特許文献１）。非特許文献１に記載の方法は、昆虫細胞を宿主として用いるため、哺乳動物細胞により発現されるような、複雑な構造を有するタンパク質または翻訳後修飾されたタンパク質を、本来の機能を保持した状態でウイルスの表面に提示し得る。
【特許文献１】特開２００６−０８７４２７号公報
【非特許文献１】Grabherr, R.ら, Trends Biotechnol., 19, 231-236 (2001)
【非特許文献２】Miyashita, H.ら, J. Mol. Biol., 267, 1247-1257 (1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、抗原に対する特異性および親和性に優れた抗体を表面に提示できるバキュロウイルスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、抗体またはそのＦａｂフラグメントを表面に提示し得る出芽型組換えバキュロウイルス（以下、単に「出芽型組換えバキュロウイルス」ともいう）を提供し、このバキュロウイルスは、バキュロウイルスエンベロープ構成糖タンパク質と該抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する一方のペプチド鎖との融合タンパク質として発現し、かつ該抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する他方のペプチド鎖を分泌タンパク質として発現し、表面に提示された該抗体またはそのＦａｂフラグメントが抗原と結合し得る。
【０００８】
本発明はまた、抗体またはそのＦａｂフラグメントを表面に提示し得る出芽型組換えバキュロウイルスを作製する方法を提供し、この方法は、
バキュロウイルスエンベロープ構成糖タンパク質と該抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する一方のペプチド鎖との融合タンパク質を発現し、かつ該抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する他方のペプチド鎖を分泌タンパク質として発現する、組換えバキュロウイルスを作製する工程
を含む。
【０００９】
１つの実施態様では、上記組換えバキュロウイルスを作製する工程が、上記バキュロウイルスエンベロープ構成糖タンパク質をコードする遺伝子の５’末端側に連結した、該糖タンパク質の分泌シグナル配列および上記抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する一方のペプチド鎖をコードする遺伝子を含み、かつ分泌シグナル配列および該抗体またはそのＦａｂフラグメントの他方のペプチド鎖をコードする遺伝子を含むトランスファーベクターを構築する工程；および
該トランスファーベクターを介して目的遺伝子を昆虫細胞に導入する工程
を含む。
【００１０】
別の実施態様では、上記抗体またはそのＦａｂフラグメントを表面に提示し得る出芽型組換えバキュロウイルスを作製する方法は、
前記組換えバキュロウィルスを昆虫細胞に感染させる工程；および
前記感染させた昆虫細胞を培養してバキュロウイルスを出芽させる工程
をさらに含む。
【００１１】
本発明はまた、抗体またはそのＦａｂフラグメントを表面に提示する出芽型組換えバキュロウイルスディスプレイライブラリーを作製する方法を提供し、この方法は、
異なる抗体またはそのＦａｂフラグメントを発現する少なくとも２種の組換えバキュロウイルスを作製する工程であって、該組換えバキュロウイルスが各々、バキュロウイルスエンベロープ構成糖タンパク質と抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する一方のペプチド鎖との融合タンパク質を発現し、かつ該抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する他方のペプチド鎖を分泌タンパク質として発現する、工程；
該少なくとも２種の組換えバキュロウィルスを昆虫細胞に感染させる工程；および
該感染させた昆虫細胞を培養して、バキュロウイルスを出芽させる工程
を含む。
【００１２】
本発明はまた、上記方法により作製されたバキュロウイルスディスプレイライブラリーを提供する。
【００１３】
本発明はさらに、抗体またはそのＦａｂフラグメントをスクリーニングする方法を提供し、この方法は、
上記ライブラリーに抗原を結合させる工程；および
該抗原が結合した該ライブラリーの抗体またはそのＦａｂフラグメントを検出する工程
を含む。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、抗原に対する特異性および親和性に優れた抗体を表面に提示できる出芽型バキュロウイルスが得られる。このバキュロウイルスは、抗体分子のＨ鎖とＬ鎖とが本来の形で会合したＦａｂフラグメントを表面に提示できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の出芽型組換えバキュロウイルスは、バキュロウイルスエンベロープ構成糖タンパク質と該抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する一方のペプチド鎖との融合タンパク質として発現し、かつ該抗体またはそのＦａｂフラグメントを構成する他方のペプチド鎖を分泌タンパク質として発現し得る。便宜上、糖タンパク質と連結されるペプチド鎖を鎖Ａとし、他方のペプチド鎖を鎖Ｂという。鎖ＡがＨ鎖である場合、鎖ＢはＬ鎖であり、その逆であってもよい。
【００１６】
本発明において、出芽型組換えバキュロウイルスの表面に提示される抗体は、任意の抗体であり得る。本発明によって出芽型組換えバキュロウイルスの表面に提示される抗体は、その抗原と結合可能な任意の形態をとり得、代表的には、Ｆａｂフラグメントの形態となり得る。抗体のＨ鎖のＦｄフラグメントとＬ鎖とがジスルフィド結合したＦａｂ形態を構成するように、その抗体のＨ鎖およびＬ鎖が選択される。Ｈ鎖は、少なくともＦａｂ形成に必要な領域を含む一部分、例えば、Ｆｄフラグメントおよびこれを含むフラグメントであり得、または全長であってもよい。Ｆｄフラグメントが好適に用いられ得る。Ｌ鎖は、全長、またはＨ鎖とＦａｂを形成するのに必要な領域を含む任意の長さのフラグメントであり得る。全長のＬ鎖が好適に用いられ得る。Ｈ鎖およびＬ鎖は、Ｆａｂの形成に影響しない限り、変異が導入されていてもよい。
【００１７】
バキュロウイルスとしては、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）およびボンビックス・モリ（Bombyx mori）核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）が用いられ得る。
【００１８】
宿主としては、バキュロウイルスの宿主となる昆虫細胞であれば特に制限なく利用できる。宿主は、トランスファーベクターの移入により組換えバキュロウイルスを生成し得、そして感染によりバキュロウイルスを増殖し得る。ＡｃＮＰＶの宿主としては、ハスモンヨトウの近縁種のスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）由来のＳｆ細胞などが挙げられる。細胞株Ｓｆ９およびＳｆ２１などは、スポドプテラ・フルギペルダ幼虫の卵巣組織から確立しており、インビトロジェン株式会社、メルク株式会社、もしくは日本ベクトンディッキンソン株式会社、または寄託機関からも入手可能である。また、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）由来のBTI-TN-5B1-4細胞（High FiveTM）も利用することができ、本細胞株はインビトロジェン株式会社から入手可能である。ＢｍＮＰＶの宿主としてはＢｍＮ４細胞などが挙げられ、日本農産工業株式会社から入手可能である。
【００１９】
本発明の出芽型組換えバキュロウイルスの作製は、当業者が通常用いる方法に従って行われ得る。以下、簡単に説明する。
【００２０】
発現させるべきペプチド鎖（鎖Ａまたは鎖Ｂ、あるいはその両方）の遺伝子をトランスファーベクターに挿入して組換えトランスファーベクターを構築する。例えば、抗体産生細胞のｍＲＮＡから逆転写酵素により調製されたｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして、ＰＣＲにより、上記で説明したようなＦａｂフラグメントを形成する組合せとなるペプチド鎖をコードする抗体遺伝子の組合せ、例えば、Ｆｄフラグメント遺伝子およびＬ鎖遺伝子、または、Ｈ鎖遺伝子およびＬ鎖遺伝子をクローニングする。この際、ＰＣＲに用いるプライマーには、遺伝子増幅後にベクターに組込めるように制限酵素認識配列のオリゴヌクレオチドを付加しておくことが好ましい。増幅した抗体遺伝子およびベクターを制限酵素で消化した後、抗体遺伝子をベクターに挿入する。鎖Ａをコードする遺伝子は、バキュロウイルスエンベロープ構成糖タンパク質（例えば、ｇｐ６４）をコードする遺伝子の５’末端側に配置され得る。トランスファーベクターの全体の大きさは一般的には数ｋｂ〜１０ｋｂ程度であり、そのうちの約３ｋｂはプラスミド由来の骨格であり、アンピシリンなどの抗生物質耐性遺伝子および細菌のＤＮＡ複製起点を含んでいる。トランスファーベクターには、挿入遺伝子を発現させるためのプロモーターを含むことが好ましい。プロモーターとしては、ポリヘドリンプロモーター（ＰＰＨ）、ｐ１０遺伝子のプロモーター（Ｐｐ１０）、キャプシド遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。これらのベクターはさらに、分泌のためのシグナル配列を含み得る。分泌シグナル配列としては、ショウジョウバエ（Drosophila）由来のＢｉＰ分泌シグナル配列、ミツバチメリチン分泌シグナル配列などが挙げられる。バキュロウイルスエンベロープ構成糖タンパク質と連結する鎖Ａの場合は、この糖タンパク質の分泌シグナル配列が好ましく用いられ、その場合、鎖Ａをコードする遺伝子は、この分泌シグナル配列と、糖タンパク質をコードする構造遺伝子との間に配置され得る。トランスファーベクターは、目的遺伝子とポリヘドリン遺伝子との間で相同組換えを生じさせるために、ポリヘドリン遺伝子の５’領域および３’領域をそれぞれ数ｋｂずつ含んでいてもよいが、これは必ずしも必要ではない。
【００２１】
以下の実施例では、鎖Ａおよび鎖Ｂをコードする両方の遺伝子を挿入したトランスファーベクターを用いているが、鎖Ａおよび鎖Ｂのそれぞれを単独で挿入している複数のトランスファーベクターを用いてもよい。トランスファーベクターの種類は特に限定されない。トランスファーベクターの具体例としては、ＡｃＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、pVL1392/1393、pAcG1、pAcG2T、pAcG3X、pAcGHLT-A/B/C、pAcGP67-A/B/C、pAcHLT-A/B/C、pAcMP2/3、pAcSG2、pAcSecG2T、pAcUW21、pAcAB3/4、pAcDB3、pAcUW51、pBACシリーズ、pFastBacTMシリーズ（pFastBacTM 1、pFastBacTM Dualなど）、pDESTTM8/10/20、pBlueBacシリーズ、pMelBac A/B/Cなどが挙げられる（以上、日本ベクトンディッキンソン株式会社、メルク株式会社、インビトロジェン株式会社などから入手可能）。
【００２２】
鎖Ａおよび鎖Ｂをコードする両方の遺伝子の発現を可能にするトランスファーベクターとしては、pFastBacTM Dual（インビトロジェン株式会社）が好ましく用いられ得る。pFastBacTM Dualは、２つのプロモーターＰＰＨおよびＰｐ１０が向かい合って互いに反対の方向に配置されており、これらのプロモーターからそれぞれの挿入遺伝子を発現させ得る。ＰＰＨおよびＰｐ１０のプロモーターの下流に配置される遺伝子は特に制限されず、鎖Ａまたは鎖Ｂ、あるいはＨ鎖またはＬ鎖のどちらの遺伝子も、いずれかのプロモーターの下流に配置され得る。このトランスファーベクターにおいても、鎖Ａをコードする遺伝子は、バキュロウイルスエンベロープ構成糖タンパク質（例えば、ｇｐ６４）をコードする遺伝子の５’末端側に配置され得る。これらの鎖をコードする遺伝子は、上述したような分泌シグナル配列と連結され得、特に、鎖Ａをコードする遺伝子は、好ましくは、連結される糖タンパク質の分泌シグナル配列とこの糖タンパク質をコードする構造遺伝子との間に配置され得る。
【００２３】
次に、上記のトランスファーベクターを介して目的遺伝子を昆虫細胞に導入する。この導入された昆虫細胞内での相同組換えが利用され得る。相同組換えを利用する方法の場合、上記の組換えトランスファーベクターをバキュロウイルスゲノムＤＮＡと混合し、宿主として用いる培養細胞に移入するか、あるいは予めバキュロウイルスに感染させた宿主として用いる培養細胞に上記のトランスファーベクターを移入し、組換えトランスファーベクターとウイルスゲノムＤＮＡとの間に相同組換えを起こさせ、組換えバキュロウイルスを作製し得る。また、組換えバキュロウイルスを作製するために、昆虫細胞での相同組換えを利用せずに、大腸菌内で組換えバキュロウイルスＤＮＡを作製し、これを昆虫細胞にトランスフェクトする方法も使用され得る。このような方法としては、例えば、Bac-to-Bac（登録商標）バキュロウイルス発現システム（インビトロジェン株式会社）の使用が挙げられる。Bac-to-Bacバキュロウイルス発現システムを用いる方法では、トランスファーベクターを直接昆虫細胞に移入するのではなく、まずpFastBacTMベクターのようなトランスファーベクターで大腸菌（例えば、DH10Bacコンピテント大腸菌（インビトロジェン株式会社）；これは、lacZ-mini-attTn7融合を含むバクミドを含む）を形質転換し、この大腸菌が形成した組換えバクミドＤＮＡを分離し、その後このＤＮＡを昆虫細胞にトランスフェクトして目的遺伝子の導入された組換えバキュロウイルスを作製する。宿主として用いる培養細胞としては、上記の宿主が挙げられる。通常、昆虫培養細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）が用いられ得る。培養条件は、当業者により適宜決定されるが、Ｓｆ９細胞を用いた場合は、１０％ウシ胎児血清を含む培地または市販の無血清培地などで、２７℃前後で培養することが好ましい。
【００２４】
このようにして作製された組換えバキュロウイルスは、常法、例えばプラークアッセイなどによって精製することができる。なお、このようにして作製された組換えウイルスは、核多角体病ウイルスのポリヘドリンの遺伝子領域に外来のＤＮＡが置換または挿入されており多角体を形成することができないため、非組換えウイルスと容易に区別することが可能である。
【００２５】
さらに、上記組換えバキュロウイルスを宿主（例えば、Ｓｆ９およびＳｆ２１などの培養細胞）に感染させて、一定時間（例えば、４８〜１２０時間）インキュベートすることにより、組換えバキュロウイルスを増殖させることもできる。増殖した組換えバキュロウイルスは、感染に際して出芽し得、さらに出芽型バキュロウイルスとして細胞外に放出され得る。組換えバキュロウイルスは１種類のみ感染させてもよいし、２種類以上の組換えバキュロウイルスを組み合わせて感染させることもできる。
【００２６】
出芽型バキュロウイルスの回収は、例えば、以下のように行われ得る。感染細胞の培養液を５００〜２，０００ｇで遠心分離して、出芽型バキュロウイルスを含む上清を回収し得る。さらに、この上清を約３０，０００〜５０，０００ｇで遠心分離して出芽型バキュロウイルスを含む沈殿物を得ることもできる。
【００２７】
本発明の出芽型組換えバキュロウイルスは、鎖Ａおよび鎖Ｂで構成される抗体をその表面に提示し得る。本発明によれば、組換えバキュロウイルスは、その出芽に際して、鎖Ａと鎖Ｂとの間のジスルフィド結合により形成されたＦａｂフラグメントまたはそのようなＦａｂ形態を含む抗体を、感染した昆虫細胞の表面に提示し得る。このＦａｂフラグメントまたはそのようなＦａｂ形態を含む抗体は、組換えバキュロウイルスが昆虫細胞から出芽する際に、出芽型バキュロウイルスの表面に提示され得る。このＦａｂフラグメントまたはそのようなＦａｂ形態を含む抗体は、その抗原と結合可能な形態である。
【００２８】
したがって、本発明によれば、特定の抗原と反応する抗体をスクリーニングまたは同定するために、細胞外に放出された出芽型組換えバキュロウイルスまたは出芽型組換えバキュロウイルスが感染した昆虫細胞が用いられ得る。例えば、蛍光標識した抗原をウイルス感染細胞の表面に発現したＦａｂフラグメントと結合させ、フローサイトメーターを用いて強い蛍光を発する細胞をソーティングすることにより、目的の抗体を発現したバキュロウイルスを選択し得る。これにより、バイオパンニングにおいて問題となる非特異吸着を回避でき、そして簡便かつハイスループットな選択が可能となると期待される。
【００２９】
さらに、本発明によれば、ゲノム由来の抗体遺伝子ライブラリーまたは変異体遺伝子プールから、Ｆａｂフラグメントを網羅的に表面提示したバキュロウイルスディスプレイライブラリーを作製することもできる。バキュロウイルスディスプレイライブラリーは、上記と同様にして、異なるＦａｂフラグメントを発現する少なくとも２種の組換えバキュロウイルスを作製し、これらのウイルスを昆虫細胞に感染させ、感染した昆虫細胞を培養してバキュロウイルスを出芽させることにより作製され得る。鎖Ａおよび鎖Ｂをコードする両方の遺伝子の発現を可能にするトランスファーベクター（例えば、pFastBacTM Dual）を異なるＦａｂフラグメントを発現するようにそれぞれ構築し、これらの構築された複数のトランスファーベクターを用いて種々の組換えバキュロウイルスを作製し、これらの組換えバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させることが好ましい。バキュロウイルスディスプレイライブラリーを用いて抗原を結合させ、抗原が結合したＦａｂフラグメントを検出することによって、抗原が結合する抗体を同定することができる。検出を容易にするために、抗原は、蛍光などにより標識され得る。さらに、この目的とするＦａｂを提示したバキュロウイルスを選別することにより、目的抗体の遺伝子も取得することができる。取得した目的の抗体遺伝子は哺乳動物細胞などに導入して抗体を産生できる。
【００３０】
本発明の出芽型組換えバキュロウイルスが提示するＦａｂフラグメントは、抗体のＨ鎖とＬ鎖が本来の形で会合しているため、抗体の可変部をペプチドリンカーで接続したｓｃＦｖに比べて、抗原に対する特異性と親和性に優れているのみならず安定性も高い。したがって、本発明は、タンパク質の網羅的な定量解析を目的とした抗体マイクロアレイの構築、および治療用抗体医薬の開発などにおける新規抗体の創出手段として有用であり得る。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例では、クロラムフェニコールモノエステルの加水分解反応を触媒するマウス由来の触媒抗体６Ｄ９（非特許文献２）のＦａｂフラグメントの発現を検討した。６Ｄ９のＦａｂフラグメントを構成するＦｄフラグメント（またはＬ鎖（Ｌｃ））をｇｐ６４との融合タンパク質として発現し、一方Ｌｃ（またはＦｄ）を分泌タンパク質として発現するような組換えＡｃＮＰＶの作製を試みた。
【００３２】
以下の実施例で使用したプラスミドpXIHA-6D9 HcおよびpXIHA-6D9 Lcは、ＦｄフラグメントおよびＬ鎖をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドpARA-6D9Fabから構築したプラスミドである。pARA-6D9Fabの構築に関しては、非特許文献２に記載されている。このプラスミドpARA-6D9Fabは、大阪府立大学先端科学研究所の藤井郁雄教授から分与された。pXIHA-6D9 HcおよびpXIHA-6D9 Lcは、プラスミドpARA-6D9Fabから特許文献１に記載の方法に従って調製した（pARA-6D9Fabは、特許文献１では「pARA7Fab」と記載のプラスミドに相当する）。
【００３３】
（実施例１：Ｆａｂフラグメント表面提示ベクターの構築）
（１−１．pBACsurf-1への６Ｄ９のＦｄフラグメント遺伝子の挿入）
pARA-6D9Fabを鋳型とし、上流部分に制限酵素KpnIの認識塩基配列（プライマーの４位〜９位に相当、そして１０位にフレームシフトを防ぐためにアデニンを挿入）を有するプライマー１（配列番号１）および下流部分に制限酵素SmaIの認識配列（プライマーの４位〜９位、そして１０位にフレームシフトを防ぐためにアデニンを挿入）を有するプライマー２（配列番号２）を用いて、６Ｄ９のＦｄフラグメントの遺伝子をＰＣＲにより増幅した。増幅したＦｄフラグメント遺伝子およびプラスミドpBACsurf-1（メルク株式会社）を、いずれもKpnIおよびSmaIで消化し、次いでＦｄフラグメント遺伝子をpBACsurf-1と連結し、pBACsurf-1-Fdを得た。
【００３４】
（１−２．pBACsurf-1への６Ｄ９のＬ鎖遺伝子の挿入）
pARA-6D9Fabを鋳型とし、上流部分に制限酵素KpnIの認識配列（プライマーの４位〜９位に相当、そして１０位にフレームシフトを防ぐためにアデニンを挿入）を有するプライマー３（配列番号３）および下流部分に制限酵素SmaIの認識配列（プライマーの４位〜９位に相当、そして１０位にフレームシフトを防ぐためにアデニンを挿入）を有するプライマー４（配列番号４）を用いて、６Ｄ９のＬ鎖の遺伝子をＰＣＲにより増幅した。増幅したＬ鎖遺伝子およびpBACsurf-1を、いずれもKpnIおよびSmaIで消化し、次いでＬ鎖遺伝子をpBACsurf-1と連結し、pBACsurf-1-Lcを得た。
【００３５】
（１−３．pFastBacTM Dualのポリヘドリンプロモーター（ＰＰＨ）の下流へのＦｄフラグメント遺伝子の挿入）
pXIHA-6D9 Hcを鋳型とし、上流部分に制限酵素EcoRIの認識配列（プライマーの４位〜９位に相当）および引き続きDrosophila由来のＢｉＰ分泌シグナル配列の一部（プライマーの１０位〜３９位に相当）を有するプライマー５（配列番号５）および下流部分に制限酵素HindIIIの認識配列（プライマーの４位〜９位に相当）を有するプライマー６（配列番号６）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅で得られたＢｉＰ分泌シグナル配列が連結された６Ｄ９のＦｄフラグメントの遺伝子およびプラスミドpFastBacTM Dual（インビトロジェン株式会社）を、いずれもEcoRIおよびHindIIIで消化し、次いでＢｉＰ分泌シグナル配列が連結されたＦｄフラグメント遺伝子をpFastBac Dualと連結し、pFastBac -/Fdを得た。
【００３６】
（１−４．pFastBacTM Dualのｐ１０プロモーター（Ｐｐ１０）の下流へのＦｄフラグメント遺伝子の挿入）
pXIHA-6D9 Hcを鋳型とし、上流部分に制限酵素SmaIの認識配列（プライマーの４位〜９位に相当）および引き続きDrosophila由来のＢｉＰ分泌シグナル配列の一部（プライマーの１０位〜３３位に相当）を有するプライマー７（配列番号７）および下流部分に制限酵素KpnIの認識配列（プライマーの４位〜９位に相当）を有するプライマー８（配列番号７）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅で得られたＢｉＰ分泌シグナル配列が連結された６Ｄ９のＦｄフラグメントの遺伝子およびプラスミドpFastBacTM Dualを、いずれもSmaIおよびKpnIで消化し、次いでＢｉＰ分泌シグナル配列が連結されたＦｄフラグメント遺伝子をpFastBac Dualと連結し、pFastBac Fd/-を得た。
【００３７】
（１−５．pFastBac DualのＰＰＨの下流へのＬ鎖遺伝子の挿入）
pXIHA-6D9 Lcを鋳型とし、上記のプライマー５および下流部分に制限酵素HindIIIの認識配列（プライマーの４位〜９位に相当）を有するプライマー９（配列番号９）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅で得られたＢｉＰ分泌シグナル配列が連結された６Ｄ９のＬ鎖の遺伝子およびプラスミドpFastBacTM Dualを、いずれもEcoRIおよびHindIIIで消化し、次いでＢｉＰ分泌シグナル配列が連結されたＬ鎖遺伝子をpFastBac Dualと連結し、pFastBac -/Lcを得た。
【００３８】
（１−６．pFastBacTM DualのＰｐ１０の下流へのＬ鎖遺伝子の挿入）
pXIHA-6D9 Lcを鋳型とし、上記のプライマー７および下流部分に制限酵素KpnIの認識配列（プライマーの４位〜９位に相当）を有するプライマー１０（配列番号１０）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅で得られたＢｉＰ分泌シグナル配列が連結された６Ｄ９のＬ鎖の遺伝子およびプラスミドpFastBacTM Dualを、いずれもSmaIおよびKpnIで消化し、次いでＢｉＰ分泌シグナル配列が連結されたＬ鎖遺伝子をpFastBac Dualと連結し、pFastBac Lc/-を得た。
【００３９】
（１−７．pFastBac -/FdへのＬ鎖遺伝子およびｇｐ６４遺伝子のハイブリッド遺伝子の挿入）
上記実施例１−２で得られたpBACsurf-1-Lcを鋳型とし、上流部分に制限酵素NheIの認識配列（プライマーの４位〜９位に相当）および引き続きｇｐ６４の分泌シグナル配列の一部（プライマーの１０位〜３７位に相当）を有するプライマー１１（配列番号１１）および下流部分に制限酵素NheIの認識配列（プライマーの４位〜９位に相当）を有するプライマー１２（配列番号１２）を用いて、ｇｐ６４の分泌シグナル配列、６Ｄ９のＬ鎖の遺伝子、およびｇｐ６４遺伝子からなるハイブリッド遺伝子をＰＣＲにより増幅した。増幅したハイブリッド遺伝子および上記実施例１−３で得られたpFastBac -/Fdを、いずれもNheIで消化し、次いでハイブリッド遺伝子をpFastBac -/Fdと連結し、そして正しい方向にハイブリッド遺伝子が挿入されたpFastBac Lc-gp64/Fdを回収した。
【００４０】
（１−８．pFastBac Fd/-へのＬ鎖遺伝子およびｇｐ６４遺伝子のハイブリッド遺伝子の挿入）
上記実施例１−２で得られたpBACsurf-1-Lcを鋳型とし、上流部分に制限酵素EcoRIの認識配列（プライマーの４位〜９位に相当）および引き続きｇｐ６４の分泌シグナル配列の一部（プライマーの１０位〜３４位に相当）を有するプライマー１３（配列番号１３）および下流部分に制限酵素HindIIIの認識配列（プライマーの４位〜９位に相当）を有するプライマー１４（配列番号１４）を用いて、ｇｐ６４の分泌シグナル配列、６Ｄ９のＬ鎖の遺伝子、およびｇｐ６４遺伝子からなるハイブリッド遺伝子をＰＣＲにより増幅した。増幅したハイブリッド遺伝子および上記実施例１−４で得られたpFastBac Fd/-を、いずれもEcoRIおよびHindIIIで消化し、次いでハイブリッド遺伝子をpFastBac Fd/-と連結し、pFastBac Fd/Lc-gp64を得た。
【００４１】
（１−９．pFastBac -/LcへのＦｄフラグメント遺伝子およびｇｐ６４遺伝子のハイブリッド遺伝子の挿入）
上記実施例１−１で得られたpBACsurf-1-Fdを鋳型とし、プライマー１１およびプライマー１２を用いて、ｇｐ６４の分泌シグナル配列、６Ｄ９のＦｄフラグメントの遺伝子、およびｇｐ６４遺伝子からなるハイブリッド遺伝子をＰＣＲにより増幅した。増幅したハイブリッド遺伝子および上記実施例１−５で得られたpFastBac -/Lcをいずれも、NheIで消化し、次いでハイブリッド遺伝子をpFastBac -/Lcと連結し、そして正しい方向にハイブリッド遺伝子が挿入されたpFastBac Fd-gp64/Lcを回収した。
【００４２】
（１−１０．pFastBac Lc/-へのＦｄフラグメント遺伝子およびｇｐ６４遺伝子のハイブリッド遺伝子の挿入）
上記実施例１−１で得られたpBACsurf-1-Fdを鋳型とし、プライマー１３およびプライマー１４を用いて、ｇｐ６４の分泌シグナル配列、６Ｄ９のＦｄフラグメントの遺伝子、およびｇｐ６４遺伝子からなるハイブリッド遺伝子をＰＣＲにより増幅した。増幅したハイブリッド遺伝子および上記実施例１−６で得られたpFastBac Lc/-を、いずれもEcoRIおよびHindIIIで消化し、次いでハイブリッド遺伝子をpFastBac Lc/-と連結し、pFastBac Lc/Fd-gp64を得た。
【００４３】
（実施例２：組換えバキュロウイルスの作製）
大腸菌内で組換えバキュロウイルスＤＮＡを作製する方法（Bac-to-Bacバキュロウイルス発現システム（インビトロジェン株式会社）を使用し、基本的にマニュアルに記載の方法にしたがって、組換えバキュロウイルスを作製した。
【００４４】
上記実施例１で作製した４種類のベクターのpFastBac Lc-gp64/Fd、pFastBac Fd/Lc-gp64、pFastBac Fd-gp64/Lc、およびpFastBac Lc/Fd-gp64のそれぞれ１ngを、DH10Bacコンピテント大腸菌（インビトロジェン株式会社）100μlに対して加え、大腸菌を形質転換した。その後、S.O.C.培地（２％トリプトン、0.5％酵母エキス、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM グルコース）４mlを加え、試験管にて３７℃で２〜３時間振とう培養を行った。細胞懸濁培地100μlをＬＢ寒天培地（１％トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5％ NaCl、２％寒天、50μg/mlカナマイシン、７μg/mlゲンタマイシン、10μg/mlテトラサイクリン、100μg/ml Bluo-gal、40μg/ml IPTG）に塗布して２４時間インキュベートした。生成した白色のコロニーを採取し、S.N.A.P.TMミディプレップキット（インビトロジェン株式会社）を用いて組換えバクミドＤＮＡを分離した。直径35mmのペトリディッシュまたは６ウェルプレートに昆虫細胞Ｓｆ９（インビトロジェン株式会社）を２×１０６細胞／cm3の細胞密度で２mlのグレース培地（インビトロジェン株式会社）に播種し、２７℃にて２４時間培養した。この培養液に、上記組換えバクミドＤＮＡ１μgに対してトランスフェクション試薬FuGENE 6（ロシュ・ダイアグノスティックス）を３μlの割合で含む混合液を添加して、昆虫細胞Ｓｆ９をトランスフェクトし、２７℃にて７２時間インキュベートした。これにより、出芽型組換えバキュロウイルスが昆虫細胞から生じた。インキュベート後、出芽型組換えバキュロウイルスを含む培養上清を2000rpmにて５分間の遠心分離により回収し、10％ウシ胎児血清を含むTNM-FH培地（シグマアルドリッチジャパン）を用いて培養しているＳｆ９細胞に添加し、２７℃にて７２時間インキュベートした。再度この操作を繰り返し、組換えバキュロウイルスを増殖させた。
【００４５】
（実施例３：組換えバキュロウイルスの抗体表面提示の解析）
上記実施例２の出芽型組換えバキュロウイルスを含む培養上清を、抗原としてクロラムフェニコールモノエステルの加水分解反応の遷移状態アナログをハプテン基として結合したウシ血清アルブミン、および検出抗体としてヤギ抗マウスκ鎖-HRP（Exalpha Biologicals）を用いる酵素免疫測定法（ELISA）によって分析した。４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【００４６】
図１は、pFastBac Fd/Lc-gp64、pFastBac Fd-gp64/Lc、およびpFastBac Lc/Fd-gp64のそれぞれを含む培養上清をELISAにより分析した結果を示す。図１において、コントロールは、比較のためにウイルス未感染のＳｆ９の培養上清を用いた場合の結果である。図１から明らかなように、上記のいずれのベクターを用いた場合もウイルス未感染のＳｆ９の培養上清と比べて、高い吸光度が得られた。
【００４７】
また、上記実施例２の出芽型組換えバキュロウイルスを含む培養上清をＳｆ９の細胞懸濁培地２mlに添加し、そして２７℃にて２４時間インキュベートして、組換えバキュロウイルスをＳｆ９に感染させた。この細胞懸濁培地に、FITC標識したヤギ抗マウスIgGであるFITC-F(ab’)2ヤギ抗マウスIgG（インビトロジェン株式会社）５μlを加えて３０分間インキュベートし、引き続き細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、そしてフローサイトメーター（FACSCalibur、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて解析した。
【００４８】
pFastBac Fd/Lc-gp64およびpFastBac Fd-gp64/Lcを用いて作製した組換えバキュロウイルスの場合のフローサイトメーター解析結果を、それぞれ図２および３に示す。これらの図に見られるように、これら２種類の組換えバキュロウイルスに感染した細胞は、ウイルス未感染のＳｆ９と比較して、高い蛍光強度を示した。
【００４９】
これらの結果は、作製した組換えバキュロウイルスの感染によって、昆虫細胞Ｓｆ９の表面にマウスの抗体分子が発現および提示されることを示している。組換えバキュロウイルスが出芽する際に、抗体分子は、出芽型バキュロウイルスの表面に提示され得る。これらの結果から、作製した組換えバキュロウイルスは、出芽の際に抗原結合活性を有するＦａｂフラグメントを表面に提示したと考えられる。
【００５０】
この結果はまた、蛍光標識した抗原をウイルス感染細胞の表面に発現したＦａｂフラグメントと結合させ、そしてフローサイトメーターを用いて強い蛍光を発する細胞をソーティングすることにより、目的の抗体が発現されたバキュロウイルスを選択できることを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の出芽型組換えバキュロウイルスを用いることにより、抗原に対する特異性および親和性に優れ、そして安定性も高い抗体を作製することができる。このような抗体作製技術は、タンパク質の網羅的な定量解析を目的とした抗体マイクロアレイの構築や治療用抗体医薬の開発などにおいて、新規抗体の創出手段として有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】pFastBac Fd/Lc-gp64、pFastBac Fd-gp64/Lc、およびpFastBac Lc/Fd-gp64のそれぞれを含む培養上清をELISAにより分析した結果を示すグラフである。
【図２】pFastBac Fd/Lc-gp64を用いて作製した組換えバキュロウイルスを感染させたＳｆ９および未感染Ｓｆ９のフローサイトメーターによる解析結果を示す図である。
【図３】pFastBac Fd-gp64/Lcを用いて作製した組換えバキュロウイルスを感染させたＳｆ９および未感染Ｓｆ９のフローサイトメーターによる解析結果を示す図である。
【図１】
2008194014.tif 000002
【図２】
2008194014.tif 000003
【図３】
2008194014.tif 000004
【配列表】
2008194014000001.app