(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチド、それらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらの産生方法等を提供する。【解決手段】以下からなる群から選択されるメンバーに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド：（ａ）特定のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）特定のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｃ）特定の配列のアミノ酸３９〜アミノ酸２３３を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド；および（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；それらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの改変体または誘導体；それらのポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにそれらの改変体および誘導体を作製するためのプロセス；それらのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト；ならびにそれらのポリヌクレオチド、ポリペプチド、改変体、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニストの使用に部分的に関する。特に、これらおよび他の点に関して、本発明は、ヒト腫瘍壊死因子δおよびεのポリヌクレオチドおよびポリペプチド（本明細書中以下で時々「ＴＮＦδ」および「ＴＮＦε」と呼ばれる）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびβ（ＴＮＦ−βまたはリンホトキシン）は、ポリペプチド媒介物の広範なクラスのメンバーに関連し、これは、インターフェロン、インターロイキンおよび成長因子を含み、集合的にサイトカインと呼ばれる（Ｂｅｕｔｌｅｒ，  Ｂ．およびＣｅｒａｍｉ，  Ａ．，  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ７：６２５−６５５，  １９８９）。
【０００３】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）は、最初、その抗腫瘍活性の結果として発見されたが、今日では、いくつかの形質転換細胞株のアポトーシス、細胞活性化および増殖の媒介を含む多数の生物学的活性を可能とする多面的なサイトカインとして、そしてさらに免疫調節および炎症において重要な役割を演じると認識されている。
【０００４】
今日までに、ＴＮＦ−リガンドスーパーファミリーの９つの既知のメンバー、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン−α）、ＬＴ−β、ＯＸ４０Ｌ、ＦＡＳＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ４０Ｌおよび４−１ＢＢＬが存在する。ＴＮＦリガンドスーパーファミリーのリガンドは、細胞外ドメインにおいて約２０％の配列相同性（範囲；１２〜３６％）を有する酸性のＴＮＦ様分子であり、そして主として膜結合形態として存在し、生物学的活性形態はトリマー／マルチマー複合体である。ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの可溶性形態はこれまで、ＴＮＦ、ＬＴα、およびＦＡＳＬに関してのみ同定されている（一般的な総説については、Ｇｒｕｓｓ，  Ｈ．およびＤｏｗｅｒ，  Ｓ．Ｋ．，  Ｂｌｏｏｄ，  ８５  （１２）：３３７８−３４０４  （１９９５）（これは、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）。
【０００５】
これらのタンパク質は、細胞生存またはアポトーシスまたは細胞傷害性による細胞死の制御を含む、細胞増殖、活性化、および分化の調節に関与する（Ａｒｍｉｔａｇｅ，  Ｒ．Ｊ．，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ６：４０７  （１９９４）およびＳｍｉｔｈ，  Ｃ．Ａ．，  Ｃｅｌｌ，  ７５：９５９  １９９４）。
【０００６】
ＴＮＦは、単球、繊維芽細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む多数の細胞タイプによって産生され、そして活性化マクロファージによって優勢に産生される。ＴＮＦ−αは、腫瘍の迅速な壊死、免疫刺激、自己免疫疾患、移植片拒絶、寄生体に対する耐性、抗ウイルス応答の産生、敗血症性ショック、成長調節、血管内皮影響および代謝性影響において役割を有することが報告されている。ＴＮＦ−αはまた、ＰＡＦ−１、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−６を含む、種々の因子を分泌するように内皮細胞をトリガーし、細胞増殖を促進する。さらに、ＴＮＦ−αは、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１のような種々の細胞接着分子をアップレギュレートする。
【０００７】
ＴＮＦリガンドスーパーファミリーのメンバーによって媒介される種々の細胞性応答の誘導における最初の工程は、特定の細胞表面レセプターへのそれらの結合である。ＴＮＦレセプタースーパーファミリーは、現在は１０の既知の膜タンパク質およびＴＮＦＲ関連分子をコードするいくつかのウイルスのオープンリーディングフレームを含む。ｐ７５低親和性神経成長因子（ＮＧＦ）レセプターは、このファミリーの最初にクローン化されたレセプターであった（Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｄ．ら、Ｃｅｌｌ，  ４７：５４５  （１９８６））。引き続いて、ＴＮＦに対する２つの特定のレセプターのクローニングは、それらがＮＧＦレセプターに関連したことを示す（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ，  Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ，  ６１：３５１  （１９９０））。近年、新規のＩ型膜貫通ＴＮＦレセプタースーパーファミリーが確立されている。このファミリーは、ｐ７５神経成長因子レセプター、ｐ６０  ＴＮＦＲ−１、ｐ８０  ＴＮＦＲ−ＩＩ、ＴＮＦＲ−ＲＰ／ＴＮＦＲ−ＩＩＩ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、およびＦＡＳ／ＡＰＯ−１を含む。さらに、可溶性ＴＮＦレセプターをコードするいくつかのウイルスのオープンリーディングフレームが同定されている（例えば、Ｓｈｏｐｅ線維腫ウイルスのＳＦＶ−Ｔ２（Ｓｍｉｔｈ，  Ｃ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，  １７６：３３５，  １９９１）およびワクシニアウイルスのＶａ５３またはＳａＩＦ１９Ｒ（Ｈｏｗａｒｄ．  Ｓ．Ｔ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  １８０：６３３，  １９９１））。これらのレセプターは、細胞外（アミノ末端）ドメイン中の複数のシステインリッチドメインによって特徴付けられ、これはリガンド結合に関与することが示されている。ヒトファミリーメンバー間のシステインリッチ細胞外領域における平均相同性は、２５〜３０％の範囲にある。
【０００８】
明白に、正常および異常細胞の活性化および分化を調節する因子に関する必要性が存在する。それゆえ、正常および疾患状態の両方の細胞の活性化および分化を調節するそのような因子の同定および特徴付けに関する必要性が存在する。特に、形質転換細胞株のアポトーシスを制御し、細胞活性化および増殖を媒介し、そして免疫調節および炎症応答の一次媒介物として機能的に関連し、そしてとりわけ、機能障害または疾患を予防、改善または矯正することにおいて役割を演じ得る、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーのメンバーに類似したさらなるＴＮＦリガンドを単離し、そして特徴付ける必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチド、それらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドを産生する方法（特にそれらのポリヌクレオチドを発現させることによって）、ならびにそれらのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストに関する。本発明は、さらに、このようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト、およびアンタゴニストを応用に利用する方法に関する。この応用は、部分的に研究、診断、および臨床技術に関する。従って、本発明は、ヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチド、それらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドを産生する方法、ならびにそれらのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
１つの局面において、本発明は、以下からなる群から選択されるメンバーに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３９〜アミノ酸２３３を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド；および
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】
１つの実施形態において、本発明の上記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり得る。
【００１２】
１つの実施形態において、本発明の上記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり得る。
【００１３】
１つの実施形態において、本発明の上記ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡであり得る。
【００１４】
好ましい実施形態において、本発明の上記ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸を含むポリペプチドをコードし得る。
【００１５】
より好ましい実施形態において、本発明の上記ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸３９〜アミノ酸２３３を含むポリペプチドをコードし得る。
【００１６】
さらに好ましい実施形態において、本発明の上記ポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸を含むポリペプチドをコードし得る。
【００１７】
なお好ましい実施形態において、本発明の上記ポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸１〜１８８を含むポリペプチドをコードし得る。
【００１８】
１つの局面において、本発明は、以下からなる群から選択されるメンバーに対して少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド：
（ａ）ＡＴＣＣ受託番号第９７３７７号に含まれるヒトｃＤＮＡによって発現されるアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第９７４５７号に含まれるヒトｃＤＮＡによって発現されるアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の上記ポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の上記ポリヌクレオチドの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００１９】
１つの実施形態において、本発明の上記ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド４４７〜ヌクレオチド１７１７を含み得る。
【００２０】
好ましい実施形態において、本発明の上記ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド３３２〜ヌクレオチド１７１７を含み得る。
【００２１】
より好ましい実施形態において、本発明の上記ポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド１〜ヌクレオチド５６４を含み得る。
【００２２】
さらなる実施形態において、本発明のベクターは、上記ＤＮＡを含み得る。
【００２３】
１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、上記ベクターを含み得る。
【００２４】
１つの実施形態において、本発明は、上記宿主細胞から上記ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現させる工程を包含する、ポリペプチドを産生するためのプロセスを提供する。
【００２５】
他の実施形態において、本発明は、上記ベクターを用いて細胞を遺伝子操作する工程を包含し、それによって上記ベクターに含まれるヒトｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドを発現する、細胞を産生するためのプロセスを提供する。
【００２６】
１つの局面において、本発明は、以下からなる群から選択されるメンバーを含むポリペプチド：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；および
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸３９〜２３３を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸１〜１８８を含むポリペプチド；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを提供する。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜アミノ酸２３３を含み得る。
【００２８】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸３９〜アミノ酸２３３を含み得る。
【００２９】
より好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１〜アミノ酸１８８を含み得る。
【００３０】
他の実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドの活性化を阻害する化合物を提供する。
【００３１】
１つの局面において、本発明は、ＴＮＦδの必要を有する患者の処置のための方法であって、上記ポリペプチドの治療有効量を上記患者に投与する工程を包含する方法を提供する。
【００３２】
１つの局面において、本発明は、ＴＮＦεの必要を有する患者の処置のための方法であって、請求項１７に記載のポリペプチドの治療有効量を上記患者に投与する工程を包含する方法を提供する。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドの前記治療有効量が、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡを上記患者に提供する工程およびインビボで上記ポリペプチドを発現する工程によって投与される上記方法を提供する。
【００３４】
他の実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドの前記治療有効量が、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡを上記患者に提供する工程およびインビボで上記ポリペプチドを発現する工程によって投与される上記方法を提供する。
【００３５】
１つの局面において、本発明は、ＴＮＦδポリペプチドを阻害する必要を有する患者の処置のための方法であって、上記化合物の治療有効量を上記患者に投与する工程を包含する方法を提供する。
【００３６】
１つの局面において、本発明は、ＴＮＦεポリペプチドを阻害する必要を有する患者の処置のための方法であって、上記化合物の治療有効量を上記患者に投与する工程を包含する方法を提供する。
【００３７】
１つの局面において、本発明は、上記ポリペプチドの過小発現に関連する疾患または疾患に対する感受性を診断するためのプロセスであって、上記ポリペプチドをコードする核酸配列中の変異を決定する工程を包含するプロセスを提供する。
【００３８】
１つの局面において、本発明は、宿主由来のサンプル中の上記ポリペプチドの存在を分析する工程を包含する診断プロセスを提供する。
【００３９】
１つの局面において、本発明は、上記ポリペプチドに結合し、そしてその活性化を阻害する化合物を同定するための方法であって、
上記ポリペプチドに対するレセプターであって、上記レセプターが化合物の上記レセプターへの結合に応答して検出可能なシグナルを提供し得る第２の成分と会合する、レセプターをその表面に発現する細胞と、分析的に検出可能なＴＮＦδポリペプチドおよび化合物とを上記レセプターに結合し得る条件下で接触させる工程；および
ＴＮＦδと上記レセプターとの相互作用から産生されるシグナルの非存在を検出することによって、上記化合物が上記レセプターに結合し、そして阻害するか否かを決定する工程を包含する方法を提供する。
【発明の効果】
【００４０】
本発明は、ヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチド、それらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドを産生する方法（特にそれらのポリヌクレオチドを発現させることによって）、ならびにそれらのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストに関する。本発明は、さらに、このようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト、およびアンタゴニストを応用に利用する方法に関する。この応用は、部分的に研究、診断、および臨床技術に関する。従って、本発明により、ヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチド、それらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドを産生する方法、ならびにそれらのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
（発明の要旨）
これらおよび他の目的に向かって、新規のＴＮＦδおよびＴＮＦεと呼ばれる、図１および図２に示されるアミノ酸配列とヒトＴＮＦαおよびＴＮＦβのような腫瘍壊死因子ファミリー中の他のタンパク質の既知のアミノ酸配列との間の相同性によって腫瘍壊死因子リガンドであると仮説的に同定されている新規のポリペプチドを提供することが本発明の目的である。
【００４２】
本発明のポリペプチドは、構造的および生物学的類似性に基づいてＴＮＦリガンドスーパーファミリーの新規メンバーとして同定されている。
【００４３】
さらに、ＴＮＦδおよびＴＮＦεをコードするポリヌクレオチド、特に本明細書中でＴＮＦδおよびＴＮＦεと命名されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することが本発明のさらなる目的である。
【００４４】
本発明のこの局面の特に好ましい実施態様において、ポリヌクレオチドは、図１および図２に示される配列中のヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεをコードする領域を含む。
【００４５】
本発明のこの局面に従って、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含む、ヒトＴＮＦδをコードする単離された核酸分子が提供され、そして本発明のこの局面のさらなる実施態様において、生物学的、診断的、臨床的、または治療的に有用なその改変体、アナログ、または誘導体、あるいはそれらのフラグメント（改変体、アナログおよび誘導体のフラグメントを含む）が提供される。
【００４６】
本発明のこの局面の特に好ましい実施態様には、ヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεの天然に存在する対立遺伝子改変体が含まれる。
【００４７】
本発明のこの局面に従って、１９９５年１２月８日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号第９７３７７号に含まれるヒトｃＤＮＡによって発現される成熟ヒトＴＮＦδポリペプチドおよび１９９６年３月１日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号第９７４５７号に含まれるヒトｃＤＮＡによって発現される成熟ヒトＴＮＦεポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。
【００４８】
いくつかの形質転換細胞株を破壊し、細胞活性化および増殖を媒介し、そして免疫調節および炎症応答の一次媒介物として機能的に関連するＴＮＦδポリペプチド、特にヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチドを提供することがまた、本発明の目的である。
【００４９】
本発明のこの局面に従って、本明細書中でＴＮＦδおよびＴＮＦεと呼ばれるヒト起源の新規のポリペプチド、ならびに生物学的、診断的、または治療的に有用なそのフラグメント、改変体、および誘導体、そのフラグメントの改変体および誘導体、ならびに前記これらのアナログが提供される。
【００５０】
本発明のこの局面の特に好ましい実施態様には、ヒトＴＮＦδおよびＴＮＦε遺伝子の天然に存在する対立遺伝子によってコードされるヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεの改変体が存在する。
【００５１】
前述のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、改変体および誘導体、改変体および誘導体のフラグメント、ならびに前記これらのアナログを産生するためのプロセスを提供することが本発明の別の目的である。本発明のこの局面の好ましい実施態様において、前述のＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチドを産生する方法が提供される。この方法は、そこに発現可能に組み込まれた外因性由来ヒトＴＮＦδコードポリヌクレオチドおよびＴＮＦεコードポリヌクレオチドを有する宿主細胞を、宿主中でのヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεの発現のための条件下で培養する工程、次いで発現されたポリペプチドを回収する工程を包含する。
【００５２】
本発明の別の目的に従って、とりわけ、研究、生物学的、診断的、および治療的目的のために前述のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する、産物、組成物、プロセス、および方法が提供される。
【００５３】
本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様に従って、産物、組成物、およびとりわけ以下の方法が提供される：ＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチドまたはＴＮＦδコードｍＲＮＡまたはＴＮＦεコードｍＲＮＡポリペプチドを決定することによって、細胞におけるＴＮＦδおよびＴＮＦε発現を評価する方法；ＴＮＦδおよびＴＮＦε遺伝子における欠損のような遺伝的変異および異常をアッセイする方法；ならびにＴＮＦδまたはＴＮＦε機能を増大するかまたはＴＮＦδまたはＴＮＦε機能障害を治療するために、ＴＮＦδまたはＴＮＦεポリペプチドまたはポリヌクレオチドを生物に投与する方法。
【００５４】
本発明のこの局面および他の局面の特定の好ましい実施態様に従って、ヒトＴＮＦδまたはＴＮＦε配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドおよび特にプローブが提供される。
【００５５】
本発明のこの局面の特定のさらなる好ましい実施態様において、ＴＮＦδまたはＴＮＦεポリペプチドに対する抗体が提供される。この点に関して特定の特に好ましい実施態様において、抗体は、ヒトＴＮＦδまたはＴＮＦεに対して高度に選択的である。
【００５６】
本発明の別の局面に従って、ＴＮＦδまたはＴＮＦεアゴニストが提供される。好ましいアゴニストには、ＴＮＦδ結合分子またはレセプター分子あるいはＴＮＦε結合分子またはレセプター分子に結合する、ＴＮＦδまたはＴＮＦεを模倣する分子、およびＴＮＦδ誘導またはε誘導応答を誘発するかまたは増大する分子が存在する。さらに、好ましいアゴニストには、ＴＮＦδおよびＴＮＦεまたはＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチド、あるいはＴＮＦδ活性の他のモジュレーターと相互作用し、それによってＴＮＦδおよびＴＮＦεの効果または１つより多いＴＮＦδおよびＴＮＦεの効果を増強または増大する分子がある。
【００５７】
本発明のさらに別の局面に従って、ＴＮＦδおよびＴＮＦεアンタゴニストが提供される。好ましいアンタゴニストには、ＴＮＦδおよびＴＮＦεレセプターまたは結合分子に結合するが、ＴＮＦδおよびＴＮＦε誘導応答または１つより多いＴＮＦδおよびＴＮＦε誘導応答を誘発しないようにＴＮＦδおよびＴＮＦεを模倣するアンタゴニストがある。さらに、好ましいアンタゴニストには、ＴＮＦδおよびＴＮＦεの効果あるいは１つより多いのＴＮＦδおよびＴＮＦεの効果を阻害するようにＴＮＦδおよびＴＮＦεに結合または相互作用するか、またはＴＮＦδおよびＴＮＦεの発現を防止する分子がある。
【００５８】
アゴニストおよびアンタゴニストは、ＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチドの作用を模倣するか、増大するか、または阻害するために使用され得る。それらは、例えば、敗血症性ショック、炎症、大脳マラリア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植片宿主拒絶、骨吸収、慢性関節リウマチ、および悪液質を防止するために用いられ得る。
【００５９】
本発明のさらなる局面では、インビトロ、エキソビボおよびインビボでの細胞への投与、または多細胞生物への投与のためのＴＮＦδおよびＴＮＦεポリヌクレオチドまたはＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチドを含有する組成物が提供される。本発明のこの局面の特定の特に好ましい実施態様において、組成物は、疾患の処置のための宿主生物におけるＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチドの発現のためのＴＮＦδおよびＴＮＦεポリヌクレオチドを含有する。この点に関して特に好ましいのは、ＴＮＦδおよびＴＮＦεの異常な内在性の活性と関連する機能障害の処置のためのヒト患者における発現である。
【００６０】
本発明の他の目的、特徴、利点、および局面は、以下の記載から当業者に明らかになる。しかし、以下の記載および特定の実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すが、説明のためのみに示されることを理解されるべきである。開示される本発明の精神および範囲内の種々の変化および修飾が、以下の記載を読むことから、そして本開示の他の部分を読むことから当業者に容易に明らかになる。
【００６１】
以下の例示的説明は、本明細書中、特に実施例で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提供される。この説明は、便宜のために提供され、本発明を限定しない。
【００６２】
用語ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡの特定の配列にのみ作用する制限酵素でのＤＮＡの触媒性切断をいう。本明細書中で言及される種々の制限酵素は市販されており、そして使用のための反応条件、コファクターおよび他の必要なものは、当業者に公知であり、そして日常的である。
【００６３】
分析目的では、代表的には１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントが、約２０μｌの反応緩衝液中で約２ユニットの酵素で消化される。プラスミド構築のためにＤＮＡフラグメントを単離する目的では、代表的に５〜５０μｇのＤＮＡが、比例してより大きな容量中で２０〜２５０ユニットの酵素で消化される。
【００６４】
特定の制限酵素に関する適切な緩衝液および基質量は、下記に引用されるような標準的な研究室マニュアルに記載されており、そしてそれらは、商業的供給者によって特定される。
【００６５】
３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常用いられるが、条件は、標準的手順、供給者の指示および反応の特殊性に従って変化し得る。消化の後、反応が分析され得、そしてフラグメントは、当業者にとって日常的である周知の方法を用いて、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルを通す電気泳動によって精製され得る。
【００６６】
用語「遺伝因子」は、一般に、ポリペプチドをコードする領域を含むポリヌクレオチド、あるいは転写もしくは翻訳または宿主細胞におけるポリペプチドの発現に重要である他のプロセスを調節する領域を含むポリヌクレオチド、あるいはポリペプチドをコードする領域およびそれに作動可能に連結された発現を調節する領域の両方を含むポリヌクレオチドを意味する。
【００６７】
遺伝因子は、エピソーム因子として複製するベクター内に含まれ得る；すなわち、宿主細胞ゲノムと物理的に独立した分子である。それらは、真核細胞におけるメトトレキセート選択によるトランスフェクトされたＤＮＡの増幅の間に生じるような、ミニ染色体内に含まれ得る。遺伝因子はまた、宿主細胞ゲノム内に；それらの天然の状態ではなく、むしろ操作（例えば、単離、クローニングおよび宿主細胞への導入）の後の精製されたＤＮＡまたはとりわけベクター内の形態で含まれ得る。
【００６８】
用語「単離された」は、天然の状態から「人間の手によって」変化したことを意味する；すなわち、それが天然に存在する場合、それは、本来の環境から変化されるか、または取り出されるか、あるいは両方である。この用語が本明細書中で用いられるように、例えば、天然に存在するポリヌクレオチドまたは生存する動物において天然に存在するポリペプチドは、「単離されて」いないが、その天然の状態の共存する物質から分離された同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いる。例えば、ポリヌクレオチドに関して、用語単離されたは、それが天然に存在する染色体および細胞から分離されていることを意味する。
【００６９】
単離の一部として、または単離の後に、このようなポリヌクレオチドは、例えば、変異誘発のため、融合タンパク質を形成するため、そして宿主における伝播または発現のために他のポリヌクレオチドに結合され得る。単離されたポリヌクレオチド（単独またはベクターのような他のポリヌクレオチドと結合された）は、培養物または生物全体の宿主細胞に導入され得、この用語が本明細書中で用いられるように、この後でもこのようなＤＮＡは依然として単離されている。なぜなら、それらは、天然に存在する形態または環境ではないからである。
【００７０】
同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、天然に存在する組成物ではなく、そして、本明細書中で用いられるようなその用語の意味内の単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドをそこに残存する、例えば、細胞へのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入のための培地処方物、溶液のような組成物、例えば、化学または酵素反応のための組成物または溶液のような組成物中に存在し得る。
【００７１】
用語「連結」は、２以上のポリヌクレオチド（しばしば、２本鎖ＤＮＡである）間にホスホジエステル結合を形成するプロセスをいう。連結のための技術は、当該分野で周知であり、そして連結に関するプロトコルは、標準的研究室マニュアルおよび参考文献（例えば、以下で引用されるような、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９）およびＭａｎｉａｔｉｓら、１４６頁）に記載されている。
【００７２】
用語「オリゴヌクレオチド」は、比較的短いポリヌクレオチドをいう。しばしばこの用語は、１本鎖デオキシリボヌクレオチドをいう。しかし、同様に、とりわけ、１本鎖または２本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび２本鎖ＤＮＡを意味し得る。
【００７３】
オリゴヌクレオチド（例えば、１本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチド）は、自動化オリゴヌクレオチド合成機において実行されるような化学法によってしばしば合成される。しかし、オリゴヌクレオチドは、種々の他の方法（インビトロ組換えＤＮＡ媒介技術を含む）ならびに細胞および生物におけるＤＮＡの発現によって作製され得る。
【００７４】
最初に、化学的に合成されたＤＮＡは、代表的には、５’ホスフェートを伴わないで得られる。このようなオリゴヌクレオチドの５’末端は、組換えＤＮＡ分子を形成させるために代表的に用いられるＤＮＡリガーゼを使用する連結反応によるホスホジエステル結合形成のための基質ではない。このようなオリゴヌクレオチドの連結が所望される場合、ホスフェートが、キナーゼおよびＡＴＰを使用するような標準的技術によって付加され得る。
【００７５】
化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの３’末端は、一般に遊離ヒドロキシル基を有し、そしてリガーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）の存在下で、別のポリヌクレオチド（例えば、別のオリゴヌクレオチド）の５’ホスフェートとともにホスホジエステル結合を容易に形成する。周知であるように、この反応は、所望である場合、連結の前に他のポリヌクレオチドの５’ホスフェートを除去することによって、選択的に阻止され得る。
【００７６】
プラスミドは、本明細書中で一般に、当業者に馴染み深い標準的な命名慣習に従って、先行する小文字のｐおよび／またはそれに続く大文字および／または数字によって命名される。本明細書中に開示される開始プラスミドは、商業的に入手可能であるか、非制限的原則において公然に入手可能であるか、または周知の公開された手順の日常的な適用によって入手可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかである。本発明に従って用いられ得る多くのプラスミドならびに他のクローニングおよび発現ベクターは、当業者に周知であり、そして容易に入手可能である。さらに、当業者は、本発明における使用に適する任意の数の他のプラスミドを容易に構築し得る。本発明における、このようなプラスミド、ならびに他のベクターの特性、構築および使用は、本開示から当業者に容易に明白である。
【００７７】
用語「ポリヌクレオチド」は、一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。これは、未改変のＲＮＡまたはＤＮＡあるいは改変されたＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。従って、例えば、本明細書中で用いられるポリヌクレオチドは、とりわけ、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、ならびに１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖またはより代表的には、２本鎖あるいは１本鎖および２本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子をいう。さらに、本明細書中で用いられるポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む３本鎖領域をいう。このような領域における鎖は、同じ分子または異なる分子に由来し得る。これらの領域は、１以上の分子の全てを含み得るが、より代表的には、いくつかの分子の領域のみを含む。３重らせん領域の分子の１つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。
【００７８】
本明細書中で用いる用語ポリヌクレオチドは、１以上の改変塩基を含む上記のようなＤＮＡまたはＲＮＡを含む。従って、安定性または他の理由のために改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、この用語が本明細書中で意図されるような「ポリヌクレオチド」である。さらに、ほんの２つの例を挙げれば、イノシンのような通常ではない塩基、またはトリチル化塩基のような改変塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、この用語が本明細書中で用いられるようなポリヌクレオチドである。
【００７９】
種々の改変が、当業者に公知の多くの有用な目的に役立つＤＮＡおよびＲＮＡに行われていることが理解される。本明細書中で用いられるような用語ポリヌクレオチドは、このような化学的、酵素学的または代謝的に改変された形態のポリヌクレオチド、ならびにとりわけウイルスおよび細胞（単細胞および多細胞を含む）に特徴的である化学形態のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。
【００８０】
本明細書中で用いられる用語「ポリペプチド」は、下記のようなポリペプチドの全てを含む。ポリペプチドの基本構造は、周知であり、そして当該分野の無数の教科書および他の刊行物に記載されている。これに関連して、この用語は、本明細書中では、ペプチド結合によって直鎖状に互いに結合した２以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を意味するように用いられる。本明細書中で用いられるように、この用語は、短い鎖（これはまた、当該分野で一般に、例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと呼ばれる）および長い鎖（これは当該分野で一般にタンパク質と呼ばれ、多くの型が存在する）の両方をいう。
【００８１】
ポリペプチドが、２０の天然に存在するアミノ酸と一般に呼ばれる２０のアミノ酸以外のアミノ酸をしばしば含有すること、および多くのアミノ酸（末端のアミノ酸を含む）が、天然のプロセス（例えば、プロセシングおよび他の翻訳後改変）、ならびに当該分野で周知である化学的改変技術のいずれかによって所定のポリペプチドにおいて改変され得ることが理解される。ポリペプチドにおいて天然に存在する一般的な改変でさえ、余りにも多くて本明細書中に完全に列挙し得ないが、それらは、基本的教科書、およびより詳細な論文、ならびに多数の研究文献に十分に記載されており、そしてそれらは当業者に周知である。本発明のポリペプチド中に存在し得る既知の改変の中には、少数の例を挙げれば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合性の付着、ヘム部分の共有結合性の付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合性の付着、脂質または脂質誘導体の共有結合性の付着、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合性の付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、共有結合性架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介性付加（例えば、アルギニル化）、およびユビキチン結合が存在する。
【００８２】
このような改変は当業者に周知であり、そして科学文献に非常に詳細に記載されている。数種の特に一般的な改変、例えば、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、水酸化，およびＡＤＰ−リボシル化が、ほとんどの基本的教科書（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  第２版、Ｔ．Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９３））に記載されている。この表題で多くの詳細な総説が入手可能である（例えば、Ｗｏｌｄ，  Ｆ．，  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，  １〜１２頁、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｂ．Ｃ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  編、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８３）：  Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ
ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ．  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １８２：  ６２６−６４６  （１９９０）およびＲａｔｔａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ６６３：４８−６２  （１９９２）により提供される総説）。
【００８３】
周知であり、そして上記のように、ポリペプチドは、必ずしも完全に直鎖ではないことが理解される。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン結合の結果として分枝状であり得、そしてそれらは、一般に翻訳後事象（天然のプロセシング事象、および天然に生じないヒト操作によりもたらされる事象）の結果として分枝を有するかまたは有さない環状であり得る。環状、分枝状、および分枝した環状ポリペプチドは、同様に非翻訳の天然のプロセスおよび完全な合成法によって合成され得る。
【００８４】
改変は、ポリペプチドの任意の場所に存在し得、これはペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む。実際、共有結合的改変による、ポリペプチドにおけるアミノ基またはカルボキシル基あるいは両方の妨害は、天然に存在するポリペプチドおよび合成ポリペプチドに共通であり、そしてこのような改変は、同様に、本発明のポリペプチド中に存在し得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて作製されたポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク質分解性プロセシングの前には、ほとんど必ずＮ−ホルミルメチオニンである。
【００８５】
ポリペプチド中に存在する改変は、しばしば、それがどのように作製されるかに相関している。宿主においてクローン化された遺伝子を発現することによって作製されるポリペプチドに関して、例えば、大部分の改変の特性および程度は、宿主細胞の翻訳後改変能力およびポリペプチドアミノ酸配列中に存在する改変シグナルによって決定される。例えば、周知であるように、グリコシル化は、しばしば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌宿主において存在しない。従って、グリコシル化が所望である場合、ポリペプチドは、グリコシル化する宿主（一般に真核細胞）において発現されるべきである。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物細胞と同じ翻訳後グリコシル化を実行する。この理由のために、昆虫細胞発現系は、とりわけ、グリコシル化の天然のパターンを有する哺乳動物のタンパク質を効率的に発現させるために開発されている。同様の考慮が他の改変に適用される。同じ型の改変が、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じまたは異なる程度で存在し得る。さらに、所定のポリペプチドは、多くの型の改変を含有し得る。一般に、本明細書中で用いられるように、用語ポリペプチドは、このような改変の全て、特に宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現することによって合成されるポリペプチド中に存在する改変を含む。
【００８６】
本明細書中で用いられるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの用語「改変体」は、それぞれ、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。この意味における改変体は、以下に記載されており、そして本開示中の他の場所で非常に詳細に記載されている。
【００８７】
ポリヌクレオチド改変体は、ヌクレオチド配列において、別の基準ポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドである。一般に、差異は、基準と改変体とのヌクレオチド配列が全体にわたって緊密に類似しており、そして多くの領域で同一であるように限定される。以下に記載されるように、改変体のヌクレオチド配列における変化は、サイレントであり得る。すなわち、それらは、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を変化し得ない。変化が、この型のサイレント変化に限定される場合、改変体は、基準と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。以下に記載されるように、改変体のヌクレオチド配列における変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化し得る。このようなヌクレオチド変化は、以下に考察されるように、基準配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠損、融合および切断を生じ得る。
【００８８】
ポリペプチド改変体は、アミノ酸配列において、別の基準ポリペプチドとは異なるポリペプチドである。一般に、差異は、基準と改変体との配列が、全体に亘って緊密に類似しており、そして多くの領域で同一であるように限定される。改変体および基準ポリペプチドは、１以上の置換、付加、欠損、融合および切断によってアミノ酸配列において異なり得、これらは任意の組み合わせで存在し得る。
【００８９】
本明細書中で用いられる用語「レセプター分子」は、本発明のＴＮＦδまたはＴＮＦεポリペプチドと特異的に結合または相互作用する分子をいい、これには、古典的レセプター（これらが好ましい）のみならず、本発明のポリペプチドと特異的に結合または相互作用する他の分子もまた含まれる（これらはまた、それぞれ、「結合分子」および「相互作用分子」、そして「ＴＮＦδ結合分子」および「ＴＮＦδ相互作用分子」または「ＴＮＦε結合分子」および「ＴＮＦε相互作用分子」と呼ばれる）。本発明のポリペプチドとこのような分子（レセプターあるいは結合分子または相互作用分子を含む）との間の結合は、本発明のポリペプチドに独占的であり得る（これは非常に高度に好ましい）か、または本発明のポリペプチドに対して高度に特異的であり得る（これは高度に好ましい）か、または本発明のポリペプチドを含むタンパク質の群に高度に特異的であり得る（これは好ましい）か、または少なくとも１つの群が本発明のポリペプチドを含む、タンパク質のいくつかの群に特異的であり得る。
【００９０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、とりわけ、以下に非常に詳細に記載されるような、新規のＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチドに関する。特に、本発明は、アミノ酸配列相同性によってＴＮＦリガンドスーパーファミリーに関連するポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、図１に示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するＴＮＦδ、およびＡＴＣＣ受託番号９７３７７のヒトｃＤＮＡのＴＮＦヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関する。本発明はまた、特に、図２に示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するＴＮＦε、およびＡＴＣＣ受託番号９７４５７のヒトｃＤＮＡのＴＮＦεヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関する。これらの寄託物は、本明細書中で以降、寄託クローンまたは「寄託クローンのｃＤＮＡ」と呼ばれる。図１および２に示されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、寄託クローンのヒトｃＤＮＡを配列決定することによって得られたことが理解される。従って、これらの２つの間の任意の矛盾に関しては、寄託クローンの配列が支配しており、そして図１および２の配列に対する任意の言及は、寄託クローンのヒトｃＤＮＡの配列に対する言及を含む。
【００９１】
本発明の１つの局面に従って、図１および２の推定アミノ酸配列を有するＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチドをコードする単離されたポリペプチドが提供される。
【００９２】
図１に示されるポリヌクレオチド配列のような本明細書中に提供される情報を用いて、ヒトＴＮＦδポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、開始物質としてヒト組織の細胞由来のｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡをクローニングするための手順）を用いて入手され得る。本発明の実例として、図１に示されるポリヌクレオチドは、ヒト心臓組織の細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーにおいて発見された。
【００９３】
本発明のヒトＴＮＦδは、寄託されたクローンにおけるヒトＴＮＦδをコードするｃＤＮＡの配列決定の結果によって示されるように、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの他のタンパク質に構造的に関連する。このようにして得られたｃＤＮＡ配列を、図１に示す。これは、推定分子量約２５．８７１ｋＤａを有する約２３３アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、公知のタンパク質のうち、ＴＮＦαに最も高い相同性を示す。図１のＴＮＦδの全アミノ酸配列は、ＴＮＦαのアミノ酸配列に対して約３８％の同一性を有する。
【００９４】
ヒトＴＮＦεポリぺプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、開始物質としてのヒト組織の細胞由来のｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡをクローニングするためのもの）を用いて得られ得る。本発明の例示として、図２に示されるポリヌクレオチドは、ヒト心臓組織の細胞由来のｃＤＮＡライブラリーから発見された。
【００９５】
本発明のヒトＴＮＦεは、寄託されたクローンにおけるヒトＴＮＦεをコードするｃＤＮＡの配列決定の結果によって示されるように、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの他のタンパク質に構造的に関連する。このようにして得られたｃＤＮＡ配列を、図２に示す。ＴＮＦε配列は、図１に示されるＴＮＦδの配列とほとんど同一であり、最初の５０アミノ酸およびアミノ酸８６からアミノ酸９２を含むＴＮＦδの領域を含まない。従って、ＴＮＦεは、ＴＮＦδのスプライシング改変体である。ＴＮＦεは、１６８アミノ酸残基を含み、そして図２の配列は、Ｎ−末端疎水性領域を全く含まないＴＮＦεの成熟タンパク質を示す。このタンパク質は、ＴＮＦαに対して最も高い相同性を示す。図２のＴＮＦεは、ＴＮＦαのアミノ酸配列に対して約２０％の同一性を有する。
【００９６】
本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態、またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングによって得られるか、または化学合成技術によって産生されるか、あるいはそれらの組合せによるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であり得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは非コード鎖（アンチセンス鎖ともいわれる）であり得る。
【００９７】
ポリぺプチドをコードするコード配列は、図１および２に示すポリヌクレオチドのコード配列に同一であり得る。これはまた、遺伝子コードの縮退（縮重）の結果として、図１および図２のＤＮＡのポリヌクレオチドをコードする異なる配列を有するポリヌクレオチドであり得る。
【００９８】
図１および図２のポリぺプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、以下を含み得るがこれらに限定されない：成熟ポリペプチドのコード配列それ自体；成熟ポリぺプチドのコード配列およびさらなるコード配列（例えば、プレ−またはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列のようなリーダー配列または分泌配列をコードする配列）；前述のさらなるコード配列を含むかまたは含まない成熟ポリぺプチドのコード配列、ならびにさらなる非コード配列（例えば、イントロンならびに転写、ｍＲＮＡプロセシング（例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む）、リボソーム結合、およびｍＲＮＡの安定性において役割を果たす転写された非翻訳配列のような非コード５’および３’配列；さらなる機能性を提供するアミノ酸のようなさらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列。
【００９９】
従って、例えば、ポリぺプチドはペプチドのようなマーカー配列に融合され得、これにより、融合されたポリぺプチドの精製を容易にする。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、マーカー配列は、とりわけｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．）において提供されるタグのようなヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くが市販されている。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ８６：８２１−８２４  （１９８９）に記載されるように、例えばヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。ＨＡタグは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，  ３７：７６７  （１９８４）に記載されているインフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する。
【０１００】
上記に従って、本明細書中で用いられる用語「ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド」は、本発明のポリぺプチド、特に図１および図２に示すアミノ酸配列を有するヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。この用語は、コードおよび／または非コード配列をもまた含み得るさらなる領域とともに、（例えば、イントロンによって中断された）ポリぺプチドをコードする単一の連続する領域または非連続的領域を含むポリヌクレオチドを包含する。
【０１０１】
本発明は、図１および２の推定アミノ酸配列を有するポリぺプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体にさらに関する。ポリヌクレオチドの改変体は、天然に存在する対立遺伝子改変体のような天然に存在する改変体であり得るか、または天然に存在することが知られていない改変体であり得る。このような天然に存在しないポリぺプチドの改変体は、ポリヌクレオチド、細胞、または生物に適用される技術を含む変異誘発技術によってなされ得る。
【０１０２】
この点に関する改変体には、上記のポリヌクレオチドとはヌクレオチド置換、欠失、または付加において異なる改変体がある。置換、欠失、または付加は、１つ以上のヌクレオチドを包含し得る。改変体はコードもしくは非コード領域またはその両方における変更であり得る。コード領域における変更は、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を生成し得る。
【０１０３】
この点に関して本発明の特に好ましい実施態様には、図１および２に示すＴＮＦδおよびＴＮＦεのアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；その改変体、アナログ、誘導体、およびフラグメント、ならびに改変体、アナログ、および誘導体のフラグメントがある。
【０１０４】
この点に関してさらに特に好ましいものは、数個の、いくつかの、５〜１０個の、１〜５個の、１〜３個の、２個の、１個の、または０個のアミノ酸残基が、任意の組合せで置換、欠失、または付加されている、図１および図２のＴＮＦδおよびＴＮＦεポリぺプチドのアミノ酸配列を有するＴＮＦδおよびＴＮＦεをコードするポリヌクレオチドである。これらのうちで特に好ましいものは、サイレント置換、付加、および欠失であり、これらはＴＮＦδおよびＴＮＦεの特性および活性を変更しない。この点に関してまた特に好ましいものは、保存的置換である。最も高度に好ましいものは、図１および図２のアミノ酸配列を置換無しで有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明のさらに好ましい実施態様は、図１および２に示すアミノ酸配列を有するＴＮＦδおよびＴＮＦεポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドに少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。あるいは、最も高度に好ましいものは、ＴＮＦδおよびＴＮＦεポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドに少なくとも８０％同一である領域を含むポリヌクレオチド、およびそれに相補的なポリヌクレオチドである。この点に関して、ＴＮＦδおよびＴＮＦεポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドに少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、これらの特に好ましいポリヌクレオチドのうち、少なくとも９５％の同一性を有するものが特に好ましい。さらに、少なくとも９５％の同一性を有するもののうち、少なくとも９７％同一性を有するものが高度に好ましく、そしてこれらのうち少なくとも９８％および少なくとも９９％同一性を有するものが特に高度に好ましく、少なくとも９９％同一性を有するものがより特に好ましい。
【０１０５】
この点に関する特に好ましい実施態様は、さらに、図１および２のｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリぺプチドと実質的に同一の生物学的機能または活性を保持するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【０１０６】
本発明はさらに、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関して、本発明は特に、ストリンジェントな条件下で本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられるように、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間の塩基の少なくとも９５％そして好ましくは少なくとも９７％が相補的（例えば、Ｇ：Ｃ；  Ａ：Ｔ）である場合に起こることを意味する。
【０１０７】
本発明のポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書中においてさらに議論されるように、例えば、上述の本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡについてのハイブリダイゼーションプローブとして、ＴＮＦδおよびＴＮＦεをコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するため、そしてヒトＴＮＦδおよびＴＮＦε遺伝子に対して高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために用いられ得る。このようなプローブは一般に少なくとも１５個の塩基を含む。好ましくは、このようなプローブは少なくとも３０塩基を有し、そして少なくとも５０塩基を有し得る。
【０１０８】
例えば、ＴＮＦδおよびＴＮＦε遺伝子のコード領域は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために、公知のＤＮＡ配列を用いたスクリーニングによって単離され得る。次いで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするために用いられ、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかが決定される。
【０１０９】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリぺプチドは、特に本明細書中でポリヌクレオチドアッセイに関してさらに議論されるように、ヒト疾患に対する処置および診断の発見のための研究試薬および材料として利用され得る。
【０１１０】
ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質であるポリぺプチドおよびさらなるアミノ末端もしくはカルボキシル末端アミノ酸、または成熟ポリぺプチドに対して内部のアミノ酸（例えば、成熟形態が１つより多いポリぺプチド鎖を有している場合）をコードし得る。このような配列は、とりわけ、前駆体から成熟形態までのタンパク質のプロセシングにおいて役割を果たし得るか、タンパク質トラフィッキングを容易にし得るか、タンパク質の半減期を延長もしくは短縮し得るか、またはアッセイもしくは産生のためのタンパク質の操作を容易にし得る。インサイチュの場合に一般的であるが、さらなるアミノ酸が、細胞性酵素によって成熟タンパク質とは離れてプロセシングされ得る。
【０１１１】
１つ以上のプロ配列に融合したポリぺプチドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は、ポリぺプチドの不活性な形態であり得る。プロ配列が除去される場合、このような不活性な前駆体は、一般に活性化される。プロ配列のいくつかまたは全ては、活性化前に除去され得る。一般に、このような前駆体はプロタンパク質と呼ばれる。
【０１１２】
まとめると、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、成熟タンパク質およびリーダー配列（これは、プレタンパク質と呼ばれ得る）、プレタンパク質のリーダー配列ではない１つ以上のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列および１つ以上のプロ配列（これらは一般に、ポリぺプチドの活性でかつ成熟した形態を産生するプロセシング工程の間に除去される）を有するプレプロタンパク質（これはプロタンパク質に対する前駆体である）をコードし得る。
【０１１３】
ヒトＴＮＦδおよびヒトＴＮＦεｃＤＮＡを含有する寄託物は、上記のように、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。また上記のように、ｃＤＮＡ寄託物は、本明細書中で「寄託されたクローン」または「寄託されたクローンのｃＤＮＡ」といわれる。クローンは１９９５年１２月８日および１９９６年３月１日にアメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１  Ｐａｒｋ  Ｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２  ＵＳＡに寄託され、そしてそれぞれＡＴＣＣ受託番号第９７３７７号および第９７４５７号を割り当てられた。寄託された物質は、全長ＴＮＦδおよびＴＮＦεヒトｃＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）である。
【０１１４】
寄託は、特許手順の目的のための微生物の寄託の国際的認識の上にＢｕｄａｐｅｓｔ条約の規約の下になされた。株は、特許権の発行と同時に、変更不能にそして制限または条件なしに公衆に開放される。寄託物は、単に当業者に対する利便性としてのみ提供され、寄託物が米国特許法第１１２条のもとに要求されるような特許可能性のために要求されるという許可ではない。寄託された物質に含まれるポリヌクレオチドの配列、およびそれによりコードされるポリぺプチドのアミノ酸配列は、本明細書中の配列の任意の記載とのいかなる対立の事象においても管理される。寄託された物質を作製したり、使用したり、または販売するためには、ライセンスが必要とされ得、そしていかなるこのようなライセンスもここでは与えられない。
【０１１５】
本発明はさらに、図１および２の推定アミノ酸配列を有するヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεポリぺプチドに関する。本発明のポリぺプチドは、組換えポリぺプチド、天然のポリぺプチド、または合成ポリぺプチドであり得る。特定の好ましい実施態様において、それは組換えポリぺプチドである。
【０１１６】
本発明はまた、これらのポリぺプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１および２のポリぺプチドをいう場合、このようなポリぺプチドと本質的に同一の生物学的機能または活性を保持するポリぺプチドを意味する。従って、アナログは、プロタンパク質部分の切断によって活性化され、活性な成熟ポリぺプチド産生し得るプロタンパク質を含む。
【０１１７】
図１および２のポリぺプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、以下のものであり得る：（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存されたアミノ酸残基もしくは非保存的アミノ酸残基（好ましくは、保存されたアミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによってコードされたものであり得るかもしくはあり得ないもの、あるいは（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリぺプチドがポリぺプチドの半減期を増大させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物に融合されたもの、あるいは（ｉｖ）さらなるアミノ酸が成熟ポリぺプチド（例えば、リーダー配列、もしくは分泌配列、または成熟ポリぺプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に使用される配列）に融合されたもの。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の技術範囲内にあると考えられる。
【０１１８】
この点に関して本発明の特に好ましい実施態様には、図１および２に示されるＴＮＦδおよびＴＮＦεのアミノ酸配列を有するポリぺプチド、その改変体、アナログ、誘導体、およびフラグメント、ならびにそのフラグメントの改変体、アナログ、および誘導体がある。あるいは、この点に関して特に好ましい本発明の実施態様は、寄託されたクローンにおけるヒトｃＤＮＡのＴＮＦδおよびＴＮＦεのアミノ酸配列を有するポリぺプチド、その改変体、アナログ、誘導体、およびフラグメント、ならびにそのフラグメントの改変体、アナログ、および誘導体である。
【０１１９】
好ましい改変体には、保存的アミノ酸置換が参照と異なる改変体がある。このような置換は、ポリぺプチドの所定のアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸で置換する置換である。保存的置換として代表的に観察されるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間での互いの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間での置換である。
【０１２０】
この点に関してさらに特に好ましいものは、図１および２のＴＮＦδおよびＴＮＦεポリぺプチドのアミノ酸配列、または寄託されたクローンにおけるｃＤＮＡのアミノ酸配列を有する改変体、アナログ、誘導体、およびフラグメント、ならびにそのフラグメントの改変体、アナログ、および誘導体であり、ここでは数個の、いくつかの、５〜１０個の、１〜５個の、１〜３個の、２個の、１個の、または０個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換されたり、欠失されたり、または付加されている。これらのうちで特に好ましいものは、ＴＮＦδおよびＴＮＦεの特性および活性を変更しないサイレント置換、付加、および欠失である。この点に関してまた特に好ましいものは、保存的置換である。最も高度に好ましいものは、置換なしで図１および２のアミノ酸配列を有するポリぺプチドである。
【０１２１】
本発明のポリぺプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは均一にまで精製される。
【０１２２】
本発明のＴＧＦδポリぺプチドは、配列番号２のポリぺプチド（特に成熟ポリぺプチド）ならびに配列番号２のポリぺプチドに少なくとも７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一性）、そしてより好ましくは配列番号２のポリぺプチドに少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）、そしてなお好ましくは配列番号２のポリぺプチドに少なくとも９５％の類似性（より好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリぺプチドを含み、そしてまたこのようなポリぺプチドの部分であって、ポリぺプチドのこのような部分が、一般に少なくとも３０アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含有するものを含む。
【０１２３】
本発明のＴＧＦεポリぺプチドは、配列番号４のポリぺプチド（特に成熟ポリぺプチド）ならびに配列番号４のポリぺプチドに少なくとも７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一性）、そしてより好ましくは配列番号４のポリぺプチドに少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）、そしてなお好ましくは配列番号４のポリぺプチドに少なくとも９５％の類似性（より好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリぺプチドを含み、そしてまたこのようなポリぺプチドの部分であって、ポリぺプチドのこのような部分が、一般に少なくとも３０アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含有するものを含む。
【０１２４】
当該分野で公知のように、２つのポリぺプチドの間の「類似性」は、１つのポリぺプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第二のポリぺプチドの配列と比較することによって決定される。
【０１２５】
本発明のポリぺプチドのフラグメントまたは部分は、対応する全長ポリぺプチドをペプチド合成によって産生するために使用され得る；それゆえ、フラグメントは、全長ポリぺプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために用いられ得る。
【０１２６】
フラグメントは、前述のＴＮＦδおよびＴＮＦεポリぺプチドおよびそれらの改変体または誘導体のアミノ酸配列の部分であるが全てではない配列に完全に同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドである。このようなフラグメントは、「フリースタンディング」（すなわち他のアミノ酸またはポリぺプチドの一部ではなくまたは融合されていない）であり得、またはそれらは、それらが一部もしくは領域を形成するより大きなポリぺプチド内に含まれ得る。より大きなポリぺプチド内に含まれた場合、現在議論されているフラグメントは、最も好ましくは単一の連続する領域を形成する。しかし、いくつかのフラグメントは単一のより大きなポリぺプチド内に含まれ得る。例えば、特定の好ましい実施態様は、異種プレおよびプロポリぺプチド領域がＴＮＦδおよびＴＮＦεフラグメントのアミノ酸末端に融合され、そしてさらなる領域がそのフラグメントのカルボキシル末端に融合された、宿主内での発現のために設計された前駆体ポリぺプチド内に含まれる本発明のＴＮＦδおよびＴＮＦεポリぺプチドのフラグメントに関する。それゆえ、本明細書中で意図する意味の１つの局面におけるフラグメントは、ＴＮＦδおよびＴＮＦεに由来する融合ポリぺプチドまたは融合タンパク質の部分をいう。
【０１２７】
本発明のポリぺプチドフラグメントの代表的な例として、約３０〜約２３３アミノ酸を有するフラグメントが言及され得る。この文脈において、「約」は、特に示された範囲、および数個、いくつか、５、４、３、２、または１個のアミノ酸だけいずれかの極限でまたは両方の極限でより大きいかまたはより小さい範囲を含む。例えば、この文脈での約１００〜２３３アミノ酸は、１００±数個、いくつか、５、４、３、２、または１個のアミノ酸から２３３±数個、いくつか、５、４、３、２、または１個のアミノ酸残基（すなわち１００マイナス数個のアミノ酸〜２３３プラス数個のアミノ酸までの広さから、１００プラス数個のアミノ酸〜２３３マイナス数個のアミノ酸までの狭さまで）のポリぺプチドフラグメントを意味する。
【０１２８】
この点において非常に好ましいのは、いずれかまたは両方の端の値（ｅｘｔｒｅｍｅ）に５アミノ酸程度の増減を含む示した範囲（ｒｅｃｉｔｅｄ  ｒａｎｇｅ）である。特に非常に好ましいのは、いずれかまたは両方の端の値に３アミノ酸程度の増減を含む示した範囲である。とりわけ特に非常に好ましいのは、いずれかまたは両方の端の値に１アミノ酸の増減を含む示した範囲、あるいは付加または欠失を伴わない示した範囲である。この点においてとりわけ最も非常に好ましいのは、約１５〜約２３３アミノ酸のフラグメントである。
【０１２９】
本発明のとりわけ好ましいフラグメントの中には、ＴＮＦδおよびＴＮＦεの切断変異体がある。切断変異体は、アミノ末端を含む連続する一連の残基（すなわち、連続する領域、一部、または部分）またはカルボキシル末端を含む連続する一連の残基の欠失、あるいは、二重切断変異体のように、２つの連続する一連の残基（１つはアミノ末端を含み、そして１つはカルボキシル末端を含む）の欠失を除く、図１もしくは２のアミノ酸を有するＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチド、またはその改変体もしくは誘導体を包含する。上記サイズ範囲を有するフラグメントもまた、切断フラグメントの好ましい実施態様であり、これは一般的にフラグメントの中でとりわけ好ましい。
【０１３０】
また、本発明のこの局面において好ましいのは、ＴＮＦδおよびＴＮＦεの構造または機能属性によって特徴づけられるフラグメントである。この点において本発明の好ましい実施態様では、ＴＮＦδおよびＴＮＦεのαヘリックスおよびαヘリックス形成領域（「α領域」）、βシートおよびβシート形成領域（「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可動部、表面形成領域、ならびに高抗原性指標領域を含むフラグメントを包含する。
【０１３１】
これらの点における特定の好ましい領域は、ＴＮＦδについては図４およびＴＮＦεについては図５に示され、図１および２に示されるアミノ酸配列の分析によって同定された前述の型の領域を含むが、これに限定されない。図４および５に示されるように、このような好ましい領域は、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ
α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ  α領域、β領域およびターン領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  親水性領域および親水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  αおよびβ両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ  可動部、Ｅｍｉｎｉ表面形成領域、ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ  高抗原性指標領域を包含する。
【０１３２】
この点において非常に好ましいフラグメントの中には、いくつかの構造的特徴（例えば、上記に示されるいくつかの特徴）を組み合わせるＴＮＦδおよびＴＮＦεの領域を含むものがある。この点において、図１、２、４、および５のシグナルペプチド領域に続く残基によって規定される領域（これらは全て、ターン領域、親水性領域、可動部、表面形成領域、および高抗原性指標領域に非常に特徴のあるアミノ酸組成によって特徴づけられる）は、とりわけ非常に好ましい領域である。このような領域は、より大きなポリペプチド内に含まれ得るか、または上記で議論されたように、本発明の好ましいフラグメント自身であり得る。この段落（ｐａｒａｇｒａｐｈ）で用いられる用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、一般的に、フラグメントに関して上述の意味を有すると理解される。
【０１３３】
さらに好ましい領域は、ＴＮＦδおよびＴＮＦε活性を媒介するものである。この点において最も非常に好ましいのは、ＴＮＦδおよびＴＮＦεの化学的、生物学的、または他の活性を有するフラグメントであり、これは、同様の活性もしくは改良された活性、または減少した所望でない活性を有するものを含む。この点において非常に好ましいのは、配列もしくは位置または両方の配列において、そして関連したポリペプチド（例えば、図３に示される関連したポリペプチド）の活性領域に対して相同である領域を含むフラグメントであり、これは、ヒトＴＮＦαおよびβを含む。この点において特に好ましいフラグメントの中には、上記のような切断変異体がある。
【０１３４】
本発明はまた、とりわけ、前述のフラグメントをコードするポリヌクレオチド、フラグメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（特に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするもの）、およびフラグメントをコードするポリヌクレオチドを増幅するためのポリヌクレオチド（例えば、ＰＣＲプライマー）に関することが理解される。これらの点において、好ましいポリヌクレオチドは、上述のような好ましいフラグメントに相当するものである。
【０１３５】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。
【０１３６】
宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを組み込み、そして本発明のポリペプチドを発現するように遺伝子操作され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション、および形質転換の周知技術を用いて、宿主細胞に導入され得る。ポリヌクレオチドは、単独または他のポリヌクレオチドと組み合わせて導入され得る。このような他のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドに独立して導入され得るか、同時導入され得るか、または結合させて導入され得る。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、哺乳動物細胞における同時トランスフェクションおよび選択のための標準的な技術を用いて、選択可能なマーカーをコードする別の別個のポリヌクレオチドとともに宿主細胞にトランスフェクトされ得る。この場合、ポリヌクレオチドは、一般的に、宿主細胞ゲノムに安定して組み込まれる。
【０１３７】
あるいは、ポリヌクレオチドは、宿主中で増殖するための選択可能なマーカーを含むベクターに結合され得る。ベクター構築物は、前述の技術によって宿主細胞に導入され得る。一般的には、プラスミドベクターは、沈殿物（例えば、リン酸カルシウム沈殿）または荷電した脂質との複合体におけるＤＮＡとして導入される。エレクトロポレーションもまた、ポリヌクレオチドを宿主に導入するために用いられ得る。ベクターがウイルスである場合、インビトロで封入され得るかまたはパッケージング細胞に導入され得、そして封入されたウイルスは、細胞に形質導入され得る。本発明のこの局面に従って、ポリヌクレオチドを作製するため、および細胞にポリヌクレオチドを導入するために適切な広範な種々の技術は当業者に周知であり、そして日常的である。このような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）に完全に概説され、これはこれらの技術を詳述する多くのラボラトリーマニュアルの説明である。本発明のこの局面に従って、ベクターは、例えば、プラスミドベクター、一本鎖もしくは二本鎖ファージベクター、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターであり得る。このようなベクターは、細胞にＤＮＡおよびＲＮＡを導入するための周知技術によって、ポリヌクレオチド（好ましくは、ＤＮＡ）として細胞に導入され得る。ベクター（ファージおよびウイルスベクターの場合）はまた、感染および形質導入のための周知技術によって、封入されたまたはキャプシド化されたウイルスとして細胞に導入され得、そして好ましくは導入される。ウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は一般的に、相補宿主細胞においてのみ生じる。
【０１３８】
ベクターの中で好ましいのは、特定の点において、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現のためのものである。一般的には、このようなベクターは、発現されるポリヌクレオチドに作動可能に連結された、宿主における発現に有効なシス作用制御領域を含む。適切なトランス作用因子は、宿主によって供給されるか、相補ベクターによって供給されるか、または宿主への形質導入の際のベクター自身によって供給されるかのいずれかである。
【０１３９】
この点において特定の好ましい実施態様では、ベクターは、特定の発現を提供する。このような特定の発現は、誘導性発現または細胞の特定の型においてのみの発現、あるいは誘導性および細胞特異的の両方であり得る。誘導性ベクターの中で特に好ましいのは、操作が容易な周囲の要因（例えば、温度および栄養添加物）によって発現が誘導され得るベクターである。本発明のこの局面に適切な種々のベクターは、原核生物および真核生物宿主における使用のための構成性および誘導性発現ベクターを含み、これは、当業者に周知であり、そして日常的に使用される。
【０１４０】
操作された宿主細胞は、従来の栄養培地で培養され得、これは、特に、プロモーターを活性化すること、形質転換体を選択すること、または遺伝子を増幅することに適切なように改変され得る。発現について選択された宿主細胞で以前に使用された培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、一般的に、当業者に明らかなように、本発明のポリペプチドの発現に適切である。
【０１４１】
非常に種々の発現ベクターは、本発明のポリペプチドを発現させるために用いられ得る。このようなベクターは、染色体、エピソーム、およびウイルス由来ベクターを包含する。例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母染色体エレメント由来、バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルスのようなウイルス由来のベクター、およびそれらの組合せ由来のベクター（例えば、コスミドまたはファージミドのようなプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝エレメント由来のもの）。これらは全て、本発明のこの局面による発現のために用いられ得る。一般的には、宿主においてポリペプチドを発現するためのポリヌクレオチドを、維持するか、増殖させるか、または発現するのに適切な任意のベクターが、この点において発現のために用いられ得る。
【０１４２】
適切なＤＮＡ配列は、任意の種々の周知および日常的な技術によって、ベクターに挿入され得る。一般的には、発現のためのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列および発現ベクターを１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで切断し、次いで、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて共に制限フラグメントに結合することによって、発現ベクターに結合される。この目的に用いられ得る制限および連結のための手順は、当業者に周知であり日常的である。この点における適切な手順、および別の技術を用いて発現ベクターを構築するための適切な手順（これらもまた、当業者に周知であり日常的である）は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（本明細書中の他に引用される）に非常に詳細に示されている。
【０１４３】
発現ベクターのＤＮＡ配列は、適切な発現制御配列（単数または複数；例えば、ｍＲＮＡ転写を指向するプロモーターを含む）に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代表としては、λファージＰＬプロモーター、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターが挙げられ、周知のプロモーターのうちほんの少数を挙げる。本発明のこの局面に用いられるのに適切である、述べられていない多数のプロモーターが周知であり、そして本明細書中の議論および実施例によって例示される様式で当業者によって容易に使用され得ることが理解される。
【０１４４】
一般的には、発現構築物は、転写開始および終止のための部位を含み、そして転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、開始部に転写開始ＡＵＧ、および翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置した終止コドンを含む。
【０１４５】
さらに、構築物は、発現を調節ならびに発生させる制御領域を含み得る。一般的には、多くの通常実施される手順に従って、このような領域は転写を制御することによって作動する（例えば、特に、リプレッサー結合部位およびエンハンサー）。
【０１４６】
増殖および発現のためのベクターは、一般的に、選択可能なマーカーを含む。このようなマーカーはまた、増幅に適切であり得るか、またはこのベクターは、この目的のためのさらなるマーカーを含み得る。この点において、発現ベクターは、好ましくは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性を提供する。好ましいマーカーとしては、真核生物細胞培養物のためのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．  ｃｏｌｉおよび他の細菌を培養するためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【０１４７】
本明細書中の他に記載のような適切なＤＮＡ配列、ならびに適切なプロモーター、および他の適切な制御配列を含むベクターは、所望のポリペプチドのその中における発現に適切な種々の周知技術を用いて、適切な宿主に導入され得る。適切な宿主の代表例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞のような細菌細胞；酵母細胞のような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ
Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞のような動物細胞；および植物細胞が挙げられる。種々の発現構築物のための宿主は周知であり、そして当業者は、本開示によって、本発明のこの局面に従うポリペプチドを発現するための宿主を容易に選択し得る。
【０１４８】
より詳細には、本発明はまた、発現構築物のような組換え構築物を含み、これは、上記の配列の１つ以上を含む。構築物は、プラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターを含み、これは、本発明のこのような配列に挿入される。配列は、正方向または逆方向に挿入され得る。この点において特に好ましい実施態様では、構築物は、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを含む）をさらに含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターは、当業者に公知であり、そして本発明における使用に適切な多くの市販のベクターが存在する。
【０１４９】
以下のベクターは、市販されており、実施例として提供される。細菌における使用に好ましいベクターの中には、Ｑｉａｇｅｎから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；およびＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５がある。好ましい真核生物ベクターの中には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬがある。これらのベクターは、多くの市販および周知のベクターの例示として単独で列挙され、本発明のこの局面による使用のために当業者には利用可能である。例えば、宿主における本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入、維持、増殖、または発現に適切ないかなる他のプラスミドまたはベクターもが、本発明のこの局面において使用され得ることが理解される。
【０１５０】
プロモーター領域は、プロモーター領域を欠くレポーター転写単位（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ｃａｔ」）転写単位）を、候補プロモーターフラグメント（すなわち、プロモーターを含み得るフラグメント）を導入するための制限部位（単数または複数）の下流に含むベクターを用いて任意の所望の遺伝子から選択され得る。周知のように、ｃａｔ遺伝子の上流の制限部位のプロモーター含有フラグメントのベクターへの導入は、ＣＡＴ活性の産生を発生させ、これは、標準的なＣＡＴアッセイによって検出され得る。この目的に適切なベクターは、周知であり、そして容易に入手可能である。このような２つのベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。従って、本発明のポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターは、周知で容易に入手可能なプロモーターだけでなく、前述の技術によって、レポーター遺伝子を用いて容易に得られ得るプロモーターもまた含む。
【０１５１】
本発明によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適切な公知の細菌プロモーターの中には、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｌａｃＩおよびｌａｃＺおよびプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲ、ＰＬプロモーター、ならびにｔｒｐプロモーターがある。この点において適切な公知の真核生物プロモーターの中には、ＣＭＶ即時初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のようなレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターがある。宿主細胞における発現のための適切なベクターおよびプロモーターの選択は、周知の手順であり、そしてベクター構築物の発現、宿主へのベクターの導入、および宿主における発現のために不可欠な技術は、当業者には日常的である。
【０１５２】
本発明はまた、上記で議論された上記の構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核生物細胞、または酵母細胞のような下等真核生物細胞であり得るか、あるいは宿主細胞は、細菌細胞のような原核生物細胞であり得る。
【０１５３】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によって行われ得る。このような方法は、多くの標準的な実験室マニュアル（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  （１９８６））に記載される。宿主細胞中の構築物は、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を産生する従来の方法において使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチドシンセサイザーによって合成的に産生され得る。
【０１５４】
成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で、適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を産生するために使用され得る。原核生物および真核生物宿主での使用のための適切なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（１９８９）によって記載される。
【０１５５】
一般的には、組換え発現ベクターは、複製起点、下流の構造配列の転写を指向する高発現遺伝子由来のプロモーター、およびベクターに曝露した後のベクター含有細胞の単離を可能にする選択可能なマーカーを含む。適切なプロモーターの中には、特に、糖化酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（「ＰＧＫ」））、ａ−因子、酸ホスファターゼ、および熱ショックタンパク質をコードする遺伝子由来のものがある。選択可能なマーカーは、Ｅ．  ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｔｒｐ１遺伝子を包含する。
【０１５６】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増大され得る。エンハンサーは、通常は約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用エレメントであり、与えられた宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増大させるように作用する。エンハンサーの例としては、ＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０位の複製起点の後期側に位置する）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０１５７】
本発明のポリペプチドの異種構造配列をコードする本発明のポリヌクレオチドは、一般的に、それが発現のためのプロモーターに作動可能に連結されるように、標準的な技術を使用してベクターに挿入される。ポリヌクレオチドは、転写開始部位がリボソーム結合部位の５’に適切に位置されるように、配置される。リボソーム結合部位は、発現されるべきポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧの５’である。一般的に、開始コドン（通常、ＡＵＧ）で開始する他のオープンリーディングフレームは存在せず、そしてリボソーム結合部位と開始ＡＵＧとの間に位置される。また、一般的に、ポリペプチドの末端に翻訳停止コドンが存在し、そして転写された領域の３’末端に適切に配置されたポリアデニル化シグナルおよび転写末端シグナルが存在する。
【０１５８】
小胞体の内腔、周辺腔、または細胞外環境への翻訳されたタンパク質の分泌のために、適切な分泌シグナルが、発現されるポリペプチドへ組み込まれ得る。シグナルはポリペプチドに対して内因性であり得るか、またはそれらは異種のシグナルであり得る。
【０１５９】
ポリペプチドは、改変された形態（例えば、融合タンパク質）で発現され、そして分泌シグナルだけでなくさらなる異種の機能性領域も含み得る。従って、例えば、さらなるアミノ酸（特に変更されたアミノ酸）の領域は、精製の間またはその後の取扱いおよび保管の間の、宿主細胞における安定性および持続性を改良するためにポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、領域は、精製を容易にするためにポリペプチドに添加され得る。このような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を引き起こすため、安定性を改良するため、および精製を容易にするための、ポリペプチドへのペプチド部分の付加は、当該分野において、良く知られておりかつ日常的な技術である。
【０１６０】
本発明に従う、増殖、維持、またはポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適切な原核生物宿主には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの種々の種は、この点において適切な宿主である。さらに、当業者に公知である多くの他の宿主もまた、この点において使用され得る。
【０１６１】
代表的であるが非限定的な例として、細菌の使用のための有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）の遺伝因子を含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含み得る。このような市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。
【０１６２】
以下の適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖（ここで、選択されたプロモーターは、誘導性である）は、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導剤への曝露）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。次いで、細胞は、代表的には、遠心分離により収集され、物理的または化学的手段により破壊され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために維持される。タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、任意の簡便な方法（凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む）により破壊され得、これらの方法は当業者に周知である。
【０１６３】
種々の哺乳動物細胞培養系が、同様に発現のために使用され得る。哺乳動物発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎら、Ｃｅｌｌ，２３：１７５（１９８１）に記載されるサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株が挙げられる。適合性のベクターを発現し得る他の細胞株には、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎臓２９３およびＢＨＫ細胞株が挙げられる。
【０１６４】
哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサーを含み、そしてまた任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー、およびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’隣接非転写配列（これらは発現のために必要である）を含む。この点における特定の好ましい実施態様において、ＳＶ４０スプライス部位由来のＤＮＡ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化部位は、これらのタイプの必要とされる非転写の遺伝的エレメントのために使用される。
【０１６５】
本発明のポリペプチドは回収され、そして周知の方法（硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む）により組換え細胞培養物から精製される。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために使用される。タンパク質のリフォールディングのための周知の方法は、ポリペプチドが単離および精製の間に変性された場合に、活性コンフォメーションを再生するために使用され得る。
【０１６６】
本発明のポリペプチドには、天然の精製産物、化学的合成手順の産物、および組換え技術により原核生物または真核生物宿主（例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から産生される産物が挙げられる。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもよいし、またはグリコシル化されなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、宿主媒介性プロセスの結果のようないくつかの場合において、開始改変メチオニン残基を含み得る。
【０１６７】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、種々の適用（特にＴＮＦδおよびＴＮＦεの化学的および生物学的特性を利用する適用）のために本発明に従って使用され得る。これらには、形質転換細胞株のアポトーシス、細胞活性化および増殖の媒介、ならびに免疫調節抗菌剤、抗ウイルス剤、および病原に対する炎症応答感受性の一次メディエーターにおける適用がある。さらなる適用は、細胞、組織および生物の障害の診断および処置に関する。本発明のこれらの局面は、以下の考察によりさらに説明される。
【０１６８】
本発明はまた、相補的なポリヌクレオチドを検出するための本発明のポリヌクレオチドの使用（例えば、診断試薬としての）に関する。機能障害に関連する本発明のポリペプチドの変異形態の検出は、本発明のポリペプチドの過小発現、過剰発現、または変化した発現から生じる疾患（例えば、腫瘍のような新生物形成）または疾患への感受性の診断を加えるかまたは規定し得る診断ツールを提供する。
【０１６９】
本発明の遺伝子に変異を有する個体は、種々の技術によってＤＮＡレベルで検出され得る。診断用の核酸は、患者の細胞（血液、尿、唾液、組織生検、および剖検材料）から得られ得る。ゲノムＤＮＡは、直接検出に用いられ得るか、またはＰＣＲを用いて分析前に酵素的に増幅され得る。ＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３２４：１６３−１６６  １９８６）。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、同様に用いられ得る。一例として、ＴＮＦδまたはＴＮＦεをコードする核酸に相補的であるＰＣＲプライマーは、ＴＮＦδまたはＴＮＦεの発現および変異を同定および分析するために用いられ得る。例えば、欠失および挿入は、増幅された産物の正常遺伝子型に比較した場合のサイズの変化によって検出され得る。点変異は、増幅されたＤＮＡを放射性標識されたＴＮＦδまたはＴＮＦεのＲＮＡあるいは放射性標識されたＴＮＦδまたはＴＮＦεのアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることにより同定され得る。完全に適合した配列は、ＲＮａｓｅ  Ａ消化によりまたは融解温度の差により、ミスマッチした二重鎖から識別され得る。
【０１７０】
基準の遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の相違はまた、直接的ＤＮＡ配列決定法により明らかにされ得る。さらに、クローン化ＤＮＡセグメントは、特定のＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして用いられ得る。このような方法の感度は、ＰＣＲまたは別の増幅方法の適切な使用により大きく増強され得る。例えば、配列決定プライマーは、改変ＰＣＲによって生成された二本鎖ＰＣＲ産物または一本鎖鋳型分子と共に使用される。配列決定は、放射能標識されたヌクレオチドを用いる従来の手順により、または蛍光タグを用いる自動配列決定手順により行われる。
【０１７１】
ＤＮＡ配列の差異に基づいた遺伝子試験は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により達成され得る。小さな配列欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動によって視覚化され得る。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲルにおいて識別され得る。ここでゲル中の異なるＤＮＡフラグメントの移動度は、それらの特異的融解温度または部分的融解温度に従って異なる位置でゲル内で遅れる（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３０：１２４２  （１９８５）を参照のこと）。
【０１７２】
特定の位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護およびＳ１保護または化学的切断法（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８３：４３９７−４４０１  （１９８５）））により明らかにされ得る。従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、化学的切断、直接的ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用（例えば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングのような方法によって達成され得る。より従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、インサイチュ分析によって検出され得る。
【０１７３】
本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識化試薬はほとんどない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子との相関付けにおいて重要な第１工程である。
【０１７４】
この点における特定の実施態様において、本明細書中に開示されるｃＤＮＡは、本発明の遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニングするために使用される。これは、種々の周知の技術および一般に市販されているライブラリーを使用して達成され得る。ゲノムＤＮＡは、この目的のための周知の技術を使用してインサイチュ染色体マッピングのために使用される。代表的には、染色体マッピングの日常的な手順に従う、いくつかの試みおよび誤りが、良好なインサイチュハイブリダイゼーションシグナルを与えるゲノムプローブを同定するために必要であり得る。
【０１７５】
いくつかの場合において、さらに、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することにより染色体にマップされ得る。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。
【０１７６】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを本発明と共に使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式での大きなゲノムクローンのプールを用いて、部分的局在性の決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピングストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識してフロー選別した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる予備選択を包含する。
【０１７７】
ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、５０または６０ほどの短いｃＤＮＡを用いて使用され得る。この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら，  Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，
Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）を参照のこと。
【０１７８】
一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝子地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、Ｖ．
ＭｃＫｕｓｉｃｋ，  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能である）において見出される。次いで、同じ染色体領域にマップされる遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。
【０１７９】
次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤＮＡ配列またはゲノム配列における差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたは全ての罹患個体に観察されるが、いずれの正常な個体にも観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であるようである。
【０１８０】
物理的マッピング技術および遺伝子マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガベースのマッピング解像度、および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定する）。
【０１８１】
本発明はまた、診断的アッセイ（例えば、細胞および組織における本発明のタンパク質のレベルを検出する（正常レベルおよび異常レベルの決定を含む）ための定量的および診断的アッセイ）に関する。従って、例えば、正常コントロール組織サンプルと比較した本発明のＴＮＦタンパク質の過剰発現を検出するための、本発明に従う診断的アッセイは、例えば、新生物形成の存在を検出するために使用され得る。宿主由来のサンプルにおいてタンパク質（例えば、本発明のタンパク質）のレベルを決定するために使用され得るアッセイ技術は、当業者に周知である。このようなアッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。これらの中でＥＬＩＳＡがしばしば好まれる。ＥＬＩＳＡアッセイは、まず、本発明のタンパク質に特異的な抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を調製する工程を包含する。さらに、モノクローナル抗体に結合するレポーター抗体が、一般的に調製される。レポーター抗体は、検出試薬（例えば、放射性、蛍光性、または酵素的であり、本実施例においては西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素）に付着される。
【０１８２】
ＥＬＩＳＡアッセイを実施するために、サンプルが宿主から取り出され、そしてサンプル中でタンパク質と結合する固相支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意のフリーのタンパク質結合部位が、非特異的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）とインキュベートすることにより覆われる。次に、モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体がポリスチレンディッシュに付着した本発明の任意のタンパク質に付着する時間の間、ディッシュ中でインキュベートされる。非結合のモノクローナル抗体が、緩衝液で洗い出される。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したレポーター抗体がディッシュ中に置かれ、本発明のタンパク質に結合した任意のモノクローナル抗体へのレポーター抗体の結合が生じる。次いで、付着していないレポーター抗体が洗い出される。次いで、ペルオキシダーゼ活性のための試薬（比色定量基質が含まれる）がディッシュに添加される。一次および二次抗体を介して本発明のタンパク質に結合した固定されたペルオキシダーゼは、有色の反応産物を産生する。所定の時間において発色した色の量は、サンプル中に存在する本発明のタンパク質の量を示す。定量的な結果は、代表的には、検量線を参考にして得られる。
【０１８３】
競合アッセイが使用され得、ここで、固相支持体に付着した本発明のタンパク質に特異的な抗体および本発明の標識されたタンパク質ならびに宿主由来のサンプルが、固相支持体を通され（ｐａｓｓ  ｏｖｅｒ）、そして固相支持体に付着して検出された標識の量がサンプル中の本発明のタンパク質の量と相関され得る。
【０１８４】
ポリペプチド、それらのフラグメント、もしくは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞が、それらに対する抗体を産生するための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物を含む。当該分野で公知の種々の方法が、このような抗体およびフラグメントの産生のために使用され得る。
【０１８５】
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドの動物への直接注入か、またはポリペプチドの動物（好ましくは、非ヒト）への投与により得られ得る。次いで、そのように得られた抗体は、ポリペプチド自体へ結合する。このように、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえ、ネイティブなポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、ポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。
【０１８６】
モノクローナル抗体を調製するために、連続的な細胞株培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例には、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，  ４：７２（１９８３））、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、７７−９６頁，  Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５））が挙げられる。
【０１８７】
単鎖抗体の産生について記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を産生するために適合化され得る。また、トランスジェニックマウスまたは他の動物のような他の生物は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現するために使用され得る。
【０１８８】
上記の抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離するためかもしくは同定するために、またはアフィニティークロマトグラフィーによる単離および／または精製のための固相支持体へ抗体を吸着させることにより、本発明のポリペプチドを精製するために使用され得る。
【０１８９】
従って、本発明のポリペプチドは、新生物形成（例えば、腫瘍細胞増殖）を阻害するために使用され得る。本発明のポリペプチドは、アポトーシスおよび特定の細胞への細胞障害性を介して腫瘍の破壊を担い得る。本発明のポリペプチドはまた、接着細胞（例えば、ＬＦＡ−１）のアップレギュレーションを誘導し、それゆえ、創傷治癒のために使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、増殖促進活性を必要とする疾患（例えば、再狭窄）の処置のために使用され得る。なぜなら、本発明のポリペプチドは、内皮起源の細胞における増殖効果を有するからである。それゆえ、本発明のポリペプチドはまた、内皮細胞発達において血管新生を調節するために使用され得る。
【０１９０】
本発明のポリペプチドはまた、Ｔ細胞の活性化を刺激し、それゆえ、種々の寄生虫感染、細菌感染、およびウイルス感染に対する免疫応答を刺激するために使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、この点において、自己免疫疾患を処置および／または予防するために自己応答性のＴ細胞を排除するために使用され得る。自己免疫疾患の例には、Ｉ型糖尿病が挙げられる。
【０１９１】
本発明はまた、本発明のタンパク質を結合するレセプター分子のような分子を同定する方法を提供する。本発明のタンパク質に結合するタンパク質（例えば、レセプタータンパク質）をコードする遺伝子は、当業者に公知である多数の方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング）により同定され得る。このような方法は、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（２）：第５章（１９９１）のような多くの研究室マニュアルに記載される。
【０１９２】
例えば、発現クローニングがこの目的のために使用され得る。このために、ポリアデニル化ＲＮＡは本発明のタンパク質に応答性の細胞から調製され、ｃＤＮＡライブラリーはこのＲＮＡから作製され、このライブラリーはプールに分割され、このプールは本発明のタンパク質に応答性でない細胞へ個々にトランスフェクトされる。次いで、トランスフェクト細胞は、本発明の標識されたタンパク質へ曝される。本発明のタンパク質は、種々の周知の技術（放射性ヨウ素化または部位特異的タンパク質キナーゼに対する認識部位の包含の標準的方法を含む）により標識され得る。曝露に続いて、この細胞は固定され、そしてサイトスタチン（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｎ）の結合が決定される。これらの手順は、スライドガラス上で簡便に実施される。
【０１９３】
ＴＮＦδまたはＴＮＦε結合細胞を産生したｃＤＮＡのプールが同定される。サブプールは、これらの陽性物（ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）から調製され、上記のように宿主細胞へトランスフェクトされ、そしてスクリーニングされる。繰り返しのサブプーリング（ｓｕｂ−ｐｏｏｌｉｎｇ）および再スクリーニングプロセスを使用して、推定の結合分子（例えば、レセプター分子）をコードする一つ以上の単一のクローンが単離され得る。
【０１９４】
あるいは、標識されたリガンドは、それが結合する分子（例えば、レセプター分子）を発現する細胞から調製された細胞抽出物（例えば、膜または膜抽出物）に光親和性結合され得る。架橋物質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）により分離され、そしてＸ線フィルムに曝される。リガンド−レセプターを含む標識複合体が切除され、ペプチドフラグメントに分解され、そしてタンパク質ミクロシーケンシングに供され得る。ミクロシーケンシングにより得られたアミノ酸配列は、推定のレセプター分子をコードする遺伝子を同定するためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、独特のまたは縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチドプローブを設計するために使用され得る。
【０１９５】
本発明のポリペプチドはまた、細胞中または無細胞調製物中でのＴＮＦδまたはＴＮＦε結合分子（例えば、レセプター分子）のＴＮＦδまたはＴＮＦε結合能力を評価するために使用され得る。
【０１９６】
本発明はまた、細胞上のＴＮＦδまたはＴＮＦεの作用（例えば、レセプター分子のようなＴＮＦδまたはＴＮＦε結合分子との相互作用）を増強またはブロックする化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。アゴニストは、本発明のポリペプチドの天然の生物学的機能を上昇させるか、または本発明のポリペプチドと類似の様式で機能する化合物であり、一方、アンタゴニストは、このような機能を減少させるかまたは排除する。
【０１９７】
例えば、細胞コンパートメント（例えば、膜または膜調製物のようなその調製物）は、ＴＮＦδまたはＴＮＦεに結合する分子（例えば、ＴＮＦδまたはＴＮＦεにより変調されるシグナル伝達経路または調節性経路の分子）を発現する細胞から調製され得る。この調製物は、ＴＮＦδまたはＴＮＦεのアゴニストまたはアンタゴニストであり得る候補分子の非存在下または存在下において、標識されたＴＮＦδまたはＴＮＦεと共にインキュベートされる。候補分子の結合分子に結合する能力は、標識リガンドの結合の減少を反映する。無償で（すなわち、ＴＮＦδまたはＴＮＦε結合分子に結合することにおける、ＴＮＦδまたはＴＮＦεの効果を誘導することなく）結合する分子は、おそらく良好なアンタゴニストである。十分に結合し、そしてＴＮＦδまたはＴＮＦεと同一であるかまたは密接に関連する効果を導き出す分子は、アゴニストである。
【０１９８】
潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストのＴＮＦδまたはＴＮＦε様の効果は、例えば、候補分子の細胞または適切な細胞調製物との相互作用に続くセカンドメッセンジャー系の活性を測定すること、およびこの効果とＴＮＦδまたはＴＮＦεあるいはＴＮＦδまたはＴＮＦεと同じ効果を導き出す分子の効果とを比較することにより測定され得る。この点において有用であり得るセカンドメッセンジャー系には、ＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネル、またはホスホイノシチド加水分解のセカンドメッセンジャー系が挙げられるが、これらには限定されない。
【０１９９】
ＴＦＮδまたはＴＦＮεアンタゴニストについてのアッセイの別の例は、ＴＦＮδまたはＴＦＮεおよび潜在的アンタゴニストと、膜結合ＴＦＮδまたはＴＦＮεレセプター分子または組換えＴＦＮδまたはＴＦＮεレセプター分子とを競合阻害アッセイに適切な条件下で組み合わせる競合アッセイである。ＴＦＮδまたはＴＦＮεは、レセプター分子に結合したＴＦＮδまたはＴＦＮε分子の数が決定され、潜在的アンタゴニストの有効性を正確に評価し得るように放射能などにより標識され得る。
【０２００】
潜在的アンタゴニストは、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、および本発明のポリペプチドに結合しそれによりその活性を阻害するか消失させる抗体を含む。潜在的アンタゴニストはまた、小有機分子、ペプチド、ＴＦＮδまたはＴＦＮε誘導活性を誘導することなしにレセプター分子のような結合分子上の同じ部位に結合し、それにより本発明のポリペプチドの作用をそのレセプターへの結合から排除することにより防止する密接に関連したタンパク質または抗体のようなポリペプチドであり得る。
【０２０１】
別の潜在的アンタゴニストは、ＴＦＮδまたはＴＦＮεに結合しそして膜結合ＴＦＮδまたはＴＦＮεレセプターとの相互作用からそれを防止するＴＦＮδまたはＴＦＮεレセプターの可溶性形態である。この様式において、レセプターはそのリガンドにより刺激されない。
【０２０２】
潜在的アンタゴニストは、ポリペプチドの結合部位に結合しそして占有し、それにより正常な生物学的活性が防止されるようにレセプター分子のような細胞性結合分子に結合することを防止する小分子を含む。小分子の例は、小有機分子、ペプチド、または非ペプチドアンタゴニストを含むが、これらに限定されない。
【０２０３】
他の潜在的アンタゴニストはアンチセンス分子を含む。アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを通じてまたは三重らせん形成を通じて遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，  ５６：５６０，  １９９１；  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ  （１９８８）において議論される。三重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
６：３０７３  （１９７９）；  Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４１：４５６  （１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５１：１３６０（１９９１）において議論される。これらの方法は、ポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コード部分は、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用され得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され、それによりＴＦＮδまたはＴＦＮεの転写および産生を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＴＦＮδまたはＴＦＮεポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現されて本発明のポリペプチドの産生を阻害するように細胞に送達され得る。
【０２０４】
アンタゴニストは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、本明細書中以下に記載のような）を有する組成物において用いられ得る。
【０２０５】
アンタゴニストは、例えば、ＴＦＮδまたはＴＦＮεにより抑制されるリポタンパク質リパーゼの全身性欠失から生じる脂質除去欠損である悪液質を処置するために用いられ得る。アンタゴニストはまた、本発明のポリペプチドが病因性役割を果たしているようである大脳性マラリアを処置するために用いられ得る。アンタゴニストはまた、ＴＦＮδまたはＴＦＮε誘導性炎症性サイトカイン（例えば、滑膜細胞におけるＩＬ１）の産生を阻害することにより慢性関節炎リウマチを処置するために用いられ得る。関節炎を処置する場合、本発明のポリペプチドは好ましくは関節内注入される。
【０２０６】
アンタゴニストはまた、移植片の存在における免疫系の刺激を防止することにより、移植片−宿主拒絶を予防するために用いられ得る。
【０２０７】
アンタゴニストはまた、骨吸収を阻害するため、従って、骨粗鬆症を処置および／または予防するために用いられ得る。
【０２０８】
アンタゴニストはまた、抗炎症性因子として、および内毒素ショックを処置するために用いられ得る。この重要な症状は、細菌性および他の型の感染に対する過度な応答から生じる。
【０２０９】
本発明はまた、上記のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはアゴニストもしくはアンタゴニストを含む組成物に関する。従って、本発明のポリペプチドは、細胞、組織または器官で使用するための非滅菌または滅菌キャリア（単数または複数）（例えば、被験体に投与するために適切な薬学的キャリア）と組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、例えば、添加媒液または治療的有効量の本発明のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは添賦剤を含む。このようなキャリアは、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。処方は投与の様式に適するべきである。
【０２１０】
本発明はさらに、本発明の上記の組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む、薬学的パックおよびキットに関する。このような容器に、薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により処方された形態での注意書であって、ヒトへの投与のための製品の製造、使用、または販売の機関による認可を反映する注意書が付随し得る。
【０２１１】
本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独または他の化合物（例えば、治療的化合物）と組み合わせて用いられ得る。
【０２１２】
薬学的組成物は、任意の効果的、便利な様式（例えば、なかでも、局所的、経口、経肛、経膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路）で投与され得る。
【０２１３】
薬学的組成物は一般に、特定の病徴（単数または複数）の処置または予防のための有効量で投与される。一般に、組成物は少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量で投与される。ほとんどの場合、これは１日当たり約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与される。好ましくは、ほとんどの場合、用量は１日約１０μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重である。最適な投与は、各処置の様式および病徴について、病徴、重篤度、投与の経路、症状の複雑さなどを考慮して、標準的な方法により決定されることが理解される。
【０２１４】
本発明のポリペプチドであるポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト、およびアンタゴニストは、このようなポリペプチドのインビボ発現により、「遺伝子治療」としばしばいわれる処置様式において本発明に従って用いられ得る。
【０２１５】
従って、例えば、患者由来の細胞はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）でエクスビボで操作され得、次いで操作された細胞はポリペプチドで処置されるべき患者に提供され得る。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターの使用によりエクスビボで操作され得る。このような方法は当該分野で周知であり、そして本発明におけるこの使用は本明細書中の教示から明らかである。
【０２１６】
同様に、細胞は、当該分野で公知の手順によりインビボでのポリペプチドの発現のためにインビボで操作され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、上記のように、複製欠損レトロウイルスベクターにおける発現のために操作され得る。次いで、レトロウイルス発現構築物は、単離され得、そして本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターで、形質導入されたパッケージング細胞に導入され得、その結果、パッケージング細胞は今や目的の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する。これらのプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作しそしてインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらおよび他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかである。
【０２１７】
本明細書中上記のレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。１つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウイルスに由来する。
【０２１８】
このようなベクターは、ポリペプチドを発現するために１つ以上のプロモーターを含む。用いられ得る適切なプロモーターは、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびＭｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ７：９８０−９９０（１９８９）に記載されるヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または任意の他のプロモーター（例えば、ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモーターを含むが、これらに限定されない真核生物細胞性プロモーターのような細胞性プロモーター）を含むが、これらに限定されない。用いられ得る他のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から、当業者には明白である。
【０２１９】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下に置かれる。用いられ得る適切なプロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター：またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのような異種プロモーター；、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターのような誘導性プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（本明細書中に上記の改変レトロウイルスＬＴＲを含む）；β−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターを含むが、これらに限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり得る。
【０２２０】
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入して、プロデューサー細胞株を形成するために使用される。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例は、Ｍｉｌｌｅｒ，  Ａ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ    Ｔｈｅｒａｐｙ，  １：５−１４  （１９９０）に記載のＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株を含むが、これらに限定されない。ベクターは、当該分野に公知の任意の手段を通じてパッケージング細胞に形質導入され得る。このような手段は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈殿を含むが、これらに限定されない。１つの代替として、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム内にカプセル化されるか、または脂質に結合され、次いで宿主に投与され得る。
【０２２１】
プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生じる。次いで、このようなレトロウイスルベクター粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで真核生物細胞を形質導入するために用いられ得る。形質導入される真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞は、胚幹細胞、胚性癌腫細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を含むが、これらに限定されない。
【０２２２】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。実施例は、特定の実施態様に参照することにより本発明を例示するためにのみ提供される。これらの例示は、本発明の特定の局面を例示しているが、開示される発明の範囲の限定または制限を表現するものではない。
【０２２３】
全ての実施例は、別に詳細に記載されているところを除いて、当業者に周知かつ日常的である標準的技術を用いて実施された。以下の実施例の日常的分子生物学技術は、標準的研究参考書（例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」として本明細書中でいわれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９）に記載されるように実施され得る。
【０２２４】
別に特定される場合を除いて、以下の実施例中に示される全ての部または量は重量による。別に述べられない場合、以下の実施例においてフラグメントのサイズ分離は、Ｓａｍｂｒｏｏｋおよび他の多数の参照（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ８：４０５７  （１９８０））におけるアガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）の標準的な技術を用いて実施される。別に記載されない場合、連結は、標準的緩衝液、インキュベーション温度および時間を用いて（０．５μｇのＤＮＡ当たり、ほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメントおよび約１０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」））が達成された。
【実施例】
【０２２５】
（実施例１）
（細菌を用いた可溶形態のヒトＴＦＮδおよびＴＦＮεの発現および精製）
寄託されたポリヌクレオチドにおいてヒトＴＮＦδまたはＴＮＦεをコードするＤＮＡ配列を、ヒトＴＮＦδまたはＴＮＦεタンパク質のアミノ酸カルボキシル末端配列に特異的なそして遺伝子の３’側のベクター配列に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。クローニングを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、それぞれ５’および３’配列に添加する。
【０２２６】
５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’  ＧＣＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  Ｇ  ３’を有し、これは下線を付した制限部位、それに続くＡＴＧコドンの１１５番目の塩基で始まる図に示される１６ヌクレオチドのコード配列を含む。
【０２２７】
３’プライマーは、配列５’  ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＡＣＡ  ＡＴＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＡＣ  ３’は、下線を付したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、続いてストップコドンを含む図１および２に示すコード配列の最後の１３ヌクレオチドに相補的な２０ヌクレオチドを含む。
【０２２８】
制限部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ−９の制限酵素部位に対して便利であり、これらの実施例において細菌発現のために使用された（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  ＣＡ）。ｐＱＥ−９は、アンピシリン抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）をコードし、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ誘導プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、６−Ｈｉｓタグ、および制限酵素部位をコードする。
【０２２９】
増幅されたヒトＴＮＦδＤＮＡおよびベクターｐＱＥ−９の両方をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで消化されたＤＮＡは一緒に連結された。ＴＮＦδＤＮＡのｐＱＥ−９制限ベクターへの挿入は、ＴＮＦδコード領域を、ベクターのＩＰＴＧ誘導プロモーターの下流に、これに作動可能に連結するように、そしてＴＮＦδの翻訳のために適切に位置された開始ＡＵＧにインフレームに配置した。
【０２３０】
連結混合物を、標準的な手順を用いて、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。このような手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９）に記載されている。プラスミドｐＲＥＰ４の多数のコピーを含有するＥ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（これは、ｌａｃリプレッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）を付与する）を本明細書中に記載の例示的な実施例を行うにあたって使用した。この株（これは、ＴＮＦδを発現するために適切である多くの内の唯一である）は、Ｑｉａｇｅｎから市販されている。形質転換体をアンピシリンの存在下でＬＢプレート上で増殖するそれらの能力により同定した。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてクローン化ＤＮＡの同定を制限分析により確認した。
【０２３１】
所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）との両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖させた。Ｏ／Ｎ培養物を用いて約１：１００〜１：２５０の希釈で大規模な培養物に接種する。細胞を、０．４と０．６との間の６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）にまで増殖させた。次いで、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を加えて１ｍＭの最終濃度にし、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することにより、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導した。細胞をさらに３〜４時間引き続きインキュベートした。次いで、細胞を遠心分離により収集し、標準的方法によって破壊した。日常的な収集技術を用いて破壊した細胞から封入体を精製し、タンパク質を封入体から８Ｍ尿素中へ可溶化した。可溶化したタンパク質を含む８Ｍ尿素溶液を、２×リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）中でＰＤ−１０カラムを通し、それによって尿素を除去し、緩衝液を交換し、そしてタンパク質を再び折り畳んだ。タンパク質をクロマトグラフィーのさらなる工程によって精製してエンドトキシンを除去した。次いで、滅菌濾過した。滅菌濾過したタンパク質調製物を、９５μｇ／ｍＬの濃度で２×ＰＢＳ中で保存した。
【０２３２】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の標準的方法によるＴＮＦδの調製物の分析によって、調製物が約２０．８ｋＤａの予想された分子量を有する約８０％のモノマーを含んでいることが明らかになった。
【０２３３】
タンパク質を、ニッケルキレートカラム上で６−ＨＩＳタグを含むタンパク質による型結合を可能にする条件下でクロマトグラフィーによって精製する。タンパク質を、６モルグアニジンＨＣｌ（ｐＨ５．０）中でカラムから溶出し、再生する。
【０２３４】
（実施例２）
（バキュロウイルス発現系における可溶性ヒトＴＦＮδおよびＴＦＮεのクローニングおよび発現）
寄託されたクローンにおける全長のヒトＴＮＦδまたはＴＮＦεタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する：
５’プライマーは、配列５’  ＧＣＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＡＧ  ３’を有し、下線を付したＢａｍＨＩ制限酵素部位、それに続く図１および２のＴＮＦδまたはＴＮＦεの配列の１６塩基を含有する。発現ベクター中に挿入されて、以下に記載のように、ヒトＴＮＦδまたはＴＮＦεをコードする増幅されたフラグメントの５’末端は、効率的なシグナルペプチドを提供する。真核生物細胞における翻訳の開始のための効率的なシグナルは、Ｋｏｚａｋ，  Ｍ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：  ９４７−９５０  （１９８７）によって記載されるように、構築物のベクター部分に適切に位置される。
【０２３５】
３’プライマーは、配列５’  ＣＧＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＣＡ  ＡＴＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＡＣ  ３’を有し、下線を付したＸｂａＩ制限部位、続いて終結コドンを含んで、図１および２に示すＴＮＦδまたはＴＮＦεコード配列の最後の１３ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含む。
【０２３６】
増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」  ＢＩＯ
１０１  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａ．）を用いて、１％アガロースゲルより単離する。次いで、このフラグメントをＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、そして１％アガロースゲルで再び精製する。このフラグメントを、本明細書中でＦ２と命名する。
【０２３７】
ベクターｐＡ２ＧＰを用いて、ＴＮＦδまたはＴＮＦεタンパク質をバキュロウイルス発現系において、標準的な方法（例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，  Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．  １５５５（１９８７）に記載される方法）を用いて発現する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強いポリヘドリンプロモーター、それに続く便利な制限部位を含む。ＡｃＭＮＰＶ  ｇｐ６７のシグナルペプチド（Ｎ末端メチオニンを含む）は、ＢａｍＨＩ部位のちょうど上流に位置する。サルウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、その後ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。ポリヘドリン配列を、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列で両端で隣接させ、クローン化ポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成する。
【０２３８】
当業者が容易に理解するように、構築が転写、翻訳、トラフィッキングなどのために適切に位置したシグナル（例えば、インフレームのＡＵＧおよび必要ならばシグナルペプチド）を提供するならば、多くの他のバキュロウイルスベクターが、ｐＡ２−ＧＰの代わりに用いられ得る。例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１である。このようなベクターは、とりわけ、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  １７０：３１−３９に記載される。
【０２３９】
当該分野で公知の日常的な手順を用いて、プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩおよＸｂａＩで消化し、次いで仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａ）を用いてＤＮＡを１％アガロースゲルより単離する。このベクターＤＮＡを、本明細書中で「Ｖ２」と命名する。
【０２４０】
フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１細胞を連結混合物で形質転換し、そして培養プレート上に広げる。ＢａｍＨＩおよびＸｈａＩを用いて個々のコロニーからのＤＮＡを消化し、次いでゲル電気泳動によって消化産物を分析することによって、ヒトＴＮＦδまたはＴＮＦε遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定する。クローン化フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認する。このプラスミドを本明細書中でｐＢａｃＴＮＦδを命名する。
【０２４１】
５μｇのプラスミドｐＢａｃＴＮＦδを、Ｆｅｌｇｎｅｒら  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４：７４１３−７４１７  （１９８７）によって記載されるリポフェクション法を用いて、１．０μｇの市販の線状化したバキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ」，  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ．）とともに同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＴＮＦδを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポフェクチンおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートする。次いで、そのトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）に滴下する。プレートを、新たに添加した溶液を混合するために、前後に振盪する。次いでプレートを、２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。プレートをインキュベーターに戻し、そして２７℃で４日間培養を続ける。
【０２４２】
４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）に記載されるようにプラークアッセイを行う。青く染色されたプラークを産生するｇａｌ発現クローンの容易な同定および単離を可能にするために、「Ｂｌｕｅ  Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロースゲルを用いる。（このタイプの「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜１０頁）においても見い出され得る）。
【０２４３】
連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に添加する。適切なインキュベーションの後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌのグレース培地を含むエッペンドルフチューブに再懸濁する。寒天を、短時間の遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞に感染するために用いる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いでそれらを４℃で保存する。適切に挿入されたＴＮＦδまたはＴＮＦεを含むクローンを、制限マッピングおよび配列決定を含むＤＮＡまたはＴＮＦε分析によって同定する。これを、本明細書中でＶ−ＴＮＦδと命名する。
【０２４４】
Ｓｆ９細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳを補充したグレース培地中で増殖させる。細胞を、約２（約１〜約３）の感染多重度（ＭＯＩ）で組換えバキュロウイルスＶ−ＴＮＦδで感染させる。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００  ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇから入手可能）に置き換える。４２時間後、５μＣｉの３５Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの３５Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに１６時間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離により収集し、溶解し、そして標識されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより可視化する。
【０２４５】
（実施例３）
（ＴＦＮδ発現の組織分布）
ヒト組織におけるＴＦＮδの発現レベルを調べるために、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏｋら（前出）によって記載される方法を用いて、ノーザンブロット分析を行った。全細胞ＲＮＡサンプルをＲＮＡｚｏｌＴＭ  Ｂシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．  ６０２３  Ｓｏｕｔｈ  Ｌｏｏｐ  Ｅａｓｔ，  Ｈｏｕｓｔｏｎ，  ＴＸ  ７７０３３）で単離する。
【０２４６】
約１０μｇの全ＲＮＡを組織サンプルから単離した。ＲＮＡを、１％アガロースゲルを通じて強度の変性条件下で電気泳動によりサイズ分離した。ＲＮＡをゲルからナイロンフィルター上にブロットし、次いでフィルターを検出可能に標識したポリヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションのために調製した。
【０２４７】
ＴＦＮδをコードするｍＲＮＡを検出するためのプローブとして、寄託されたクローンのｃＤＮＡインサートのコード領域のアンチセンス鎖を、高い比活性で標識した。ｃＤＮＡを、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）を用いてプライマー伸張により標識した。反応を、５０ｎｇのｃＤＮＡを用いて、供給者によって推奨される標準的な反応プロトコルに従って行った。標識ポリヌクレオチドを、Ｓｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラム（５６０３  Ａｒａｐａｈｏｅ  Ｒｏａｄ，  Ｂｏｕｌｄｅｒ，  ＣＯ  ８０３０３の５−Ｐｒｉｍｅ−３−Ｐｒｉｍｅ，  Ｉｎｃ．  から入手）を用いて、他の標識反応成分からカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【０２４８】
標識プローブを、１，０００，０００ｃｐｍ／ｍｌの濃度で、７％ＳＤＳ、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．４の小用量において、６５℃にて一晩フィルターにハイブリダイズした。
【０２４９】
その後、プローブ溶液を捨て、フィルターを室温にて２回洗浄し、そして０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回、６０℃で洗浄する。次いでフィルターを乾燥させ、そして増感スクリーンを用いて−７０℃で一晩フィルムに感光させる。
【０２５０】
オートラジオグラフィーは、心臓において、次いで胎盤および腎臓において最も高い発現を有して、ＴＦＮδのｍＲＮＡが１６個全ての組織において検出されたことを示す。
【０２５１】
（実施例４）
（ヒトＴＦＮδまたはＴＦＮεの遺伝子治療的発現）
線維芽細胞は皮膚生検により被験体から得る。得られた組織を組織培養培地に置き、そして小片に分離する。組織の小さな塊を、組織培養フラスコの湿った表面に置き、それぞれのフラスコには約１０個の塊を置く。フラスコを逆さまにし、きつく閉め、そして室温に一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを逆さまにし、そして組織の塊をフラスコの底に固定したままで、そして新鮮な培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むＨａｍのＦ１２培地）を加える。次いで、この組織を３７℃で約一週間インキュベートする。この時点で、新鮮な培地を添加し、そして数日おきに次々に交換する。培養でのさらに２週間後、線維芽細胞の単層が現れる。単層をトリプシン処理し、そしてより大きいフラスコに移す。
【０２５２】
遺伝子治療用のベクターを、発現されるべきフラグメントをクローニングするために制限酵素で消化する。消化ベクターを、自己連結を防止するために仔ウシ小腸ホスファターゼで処理する。脱リン酸化した直線状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そして精製する。
【０２５３】
活性ＴＦＮδまたはＴＦＮεを発現し得るｃＤＮＡを単離する。必要な場合、ベクターへのクローニングのためにフラグメントの端を修飾する。例えば、５’オーバーハングを、ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作製し得る。３’オーバーハング末端を、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて除去し得る。リンカーをＴ４
ＤＮＡリガーゼで平滑末端に連結し得る。
等量のモロニーマウス白血病ウイルス線形骨格およびＴＦＮδまたはＴＦＮεフラグメントを混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換するのに使用し、次いでこの細菌をカナマイシン含有寒天上にプレートする。カナマイシン表現型および制限分析は、ベクターが適切に挿入された遺伝子を有することを確認する。
【０２５４】
パッケージング細胞を、組織培養中で、１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリン、およびストレプトマイシン添加Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中、コンフルエント濃度にまで増殖させる。標準的技術によりパッケージング細胞にＴＦＮδまたはＴＦＮε遺伝子を含むベクターを形質導入する。パッケージング細胞から回収されるＴＦＮδまたはＴＦＮε遺伝子を含む感染性ウイルス粒子は、ここでプロデューサー細胞と呼ばれる。
【０２５５】
新鮮な培地をプロデューサー細胞に加え、適切なインキュベーション時間の後に培地をコンフルエントプロデューサー細胞のプレートから回収する。培地（感染性ウイルス粒子を含む）を、ミリポアフィルターを通じて濾過し、剥離したプロデューサー細胞を除去する。次いでこの濾過した培地を線維芽細胞を感染させるのに使用する。培地を線維芽細胞のサブコンフルエントのプレートから除去し、そして即座に濾過した培地と交換する。ポリブレン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を形質導入を容易にするために培地に含ませ得る。適切なインキュベーションの後この培地を除去し新鮮な培地と交換する。ウイルス力価が高い場合、実質的にすべての線維芽細胞が感染しており、選択は必要でない。力価が低い場合は、拡大のための形質導入細胞を選択するためにｎｅｏやｈｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。
【０２５６】
次いで、操作された線維芽細胞を、単独でか、またはサイトデックス３ビーズのようなマイクロキャリアビーズ上でコンフルエントにまで増殖させた後のいずれかでラットに注入し得る。注入された線維芽細胞はＴＦＮδまたはＴＦＮε産物を産生し、そしてタンパク質の生物学的作用は宿主に伝達される。
【０２５７】
上述の説明および実施例において特に記載された以外にも、本発明は実施され得ることが明らかである。本発明の多くの改変および変形が上記の教示を考慮すれば可能であり、従って添付の請求の範囲の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０２５８】
以下の図面は本発明の特定の実施態様を示す。それらは、例に過ぎず、本明細書に他に開示される本発明を限定しない。
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトＴＮＦδのヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトＴＮＦδのヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ヒトＴＮＦεのヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒトＴＮＦεのヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチドのアミノ酸配間の類似性の領域（アラインメント報告）を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチドのアミノ酸配間の類似性の領域（アラインメント報告）を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、アミノ酸配列の関数としての、示された技術によって推定されるＴＮＦδの構造的および機能的特徴を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、アミノ酸配列の関数としての、示された技術によって推定されるＴＮＦδの構造的および機能的特徴を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、アミノ酸配列の関数としての、示された技術によって推定されるＴＮＦεの構造的および機能的特徴を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、アミノ酸配列の関数としての、示された技術によって推定されるＴＮＦεの構造的および機能的特徴を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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