(57)【要約】【課題】ハイブリダイゼーション法を利用することなく、標的核酸を簡便かつ高精度に検出する方法、及び該検出方法に用いる容器を提供する。【解決手段】検出対象の核酸に種類の異なる第一のリガンド３１及び第二のリガンド３２が結合された標的核酸３０の検出方法であって、第一のリガンド３１と特異的に結合する第一の受容体３３１が複数結合された第一の微粒子３３、及び第二のリガンド３２と特異的に結合する第二の受容体３４１が複数結合された第二の微粒子３４を調製する工程と、底面に沈降物捕捉部を有する容器内で、標的核酸３０を含有している可能性のある試料、第一の微粒子３３及び第二の微粒子３４を混合する工程と、混合工程後に、連結された標的核酸３０と第一の微粒子３３及び第二の微粒子３４からなる凝集物並びに／又は第一の微粒子３３及び第二の微粒子３３の沈降物の、容器底面における捕捉分布を観測する工程を有する標的核酸の検出方法。【選択図】図３
2008002948.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象の核酸に種類の異なる第一のリガンド及び第二のリガンドが結合された、標的核酸の検出方法であって、
前記第一のリガンドと特異的に結合する第一の受容体が複数結合された第一の微粒子、及び前記第二のリガンドと特異的に結合する第二の受容体が複数結合された第二の微粒子を調製する工程と、
底面に沈降物捕捉部を有する容器内において、前記標的核酸を含有している可能性のある試料、前記第一の微粒子及び第二の微粒子を混合する工程と、
前記混合工程後に、第一のリガンドと第一の受容体との結合及び第二のリガンドと第二の受容体との結合を介してそれぞれ連結された前記標的核酸と前記第一の微粒子及び第二の微粒子からなる凝集物並びに／又は前記第一の微粒子及び第二の微粒子の沈降物の、前記容器底面における捕捉分布を観測する工程を有することを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項２】
検出対象の核酸に種類の異なる第一のリガンド及び第二のリガンドが結合された、標的核酸の検出方法であって、
前記第一のリガンドと特異的に結合する第一の受容体が底面に複数結合された容器を調製する工程と、
前記第二のリガンドと特異的に結合する第二の受容体が複数結合された磁性微粒子を調製する工程と、
前記容器内に、前記標的核酸を含有している可能性のある試料及び前記磁性微粒子を添加する工程と、
該添加工程後に、前記磁性微粒子に対して前記容器外側より磁力を印加して該容器底面における磁性微粒子の分布を観測する工程を有することを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項３】
請求項１に記載の検出方法と、請求項２に記載の検出方法をいずれも行うことを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法において、濃度既知の標的核酸を含有している試料（１）を用いた時の観測結果と、該標的核酸を含有していない試料（２）を用いた時の観測結果と、該標的核酸を含有している可能性のある試料（３）を用いた時の観測結果とを比較して、前記試料（３）中の標的核酸の有無又は濃度を確認することを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法において、既知の異なる濃度の標的核酸を含有している試料を用いた時の観測結果と、該標的核酸を含有している可能性のある試料（４）を用いた時の観測結果とを比較して、前記試料（４）中の標的核酸の有無又は濃度を確認することを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項６】
前記リガンドが、親水性有機化合物、ジゴキシゲン、フルオロセイン、アレクサ、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、アミノ酸残基数が６以上のポリペプチド、単糖が２以上結合した糖鎖、ビオチン、タンパク質、ポリヒスチジン、ＨＡ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ｆｌａｇ）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法。
【請求項７】
前記標的核酸が、第一のリガンドを結合させた第一のプライマー、及び第二のリガンドを結合させた第二のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法によって調製されたものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法。
【請求項８】
前記標的核酸が、第一のプライマーを用いて、第一のリガンドを結合させたヌクレオチドを少なくとも一つ取り込ませながら、さらに第二のプライマーを用いて、第二のリガンドを結合させたヌクレオチドを少なくとも一つ取り込ませながら、ポリメラーゼ連鎖反応法によって調製されたものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法。
【請求項９】
前記標的核酸が複数の異なる種類であり、これら標的核酸中の第一及び第二のリガンドのうち少なくとも一方は標的核酸の種類ごとに異なることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法。
【請求項１０】
前記標的核酸が生体由来であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法。
【請求項１１】
前記第一及び第二の微粒子が、粒径０．１〜１０μｍであり、互いに光学的に区別可能であることを特徴とする請求項１及び３〜１０のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法。
【請求項１２】
複数の前記容器が同一プレート上に設けられており、各容器の容量が０．１〜０．５ｍｌであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法。
【請求項１３】
前記容器の沈降物捕捉部は、すり鉢状をなす底面に、その径方向断面が鋸歯状である複数の凹凸が同心円状に配されたものであり、中心から外側へ向けて山から谷を結ぶ第一の傾斜面の長さ（ｈ）が０．２〜２０μｍ、中心から外側へ向けて谷から山を結ぶ第二の傾斜面の長さ（ｌ）が０．５〜５０μｍであり、山と中心とを結ぶ直線が水平面とのなす角度（θ１）が１５〜４５°であることを特徴とする請求項１及び３〜１２のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法。
【請求項１４】
前記容器の沈降物捕捉部は、すり鉢状をなす底面に、複数個の凹部が独立して設けられたものであり、底面と水平面とのなす角度（θ２）が１５〜４５°であることを特徴とする請求項１及び３〜１２のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法。
【請求項１５】
前記凹部の、開口部の直径（Ｌ）が０．０５〜１００μｍ、深さ（ｄ）が０．０３〜６０μｍであることを特徴とする請求項１４に記載の標的核酸の検出方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の検出方法と、請求項１４又は１５に記載の検出方法をいずれも行うことを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項１７】
前記磁性微粒子の粒径が０．１〜２０μｍであることを特徴とする請求項２〜１０及び１２のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法。
【請求項１８】
前記容器が、底面が略半球面状もしくは略円錐面状であり、底面と水平面とのなす角度（θ３）が１５〜４５°であることを特徴とする請求項２〜１０、１２及び１７のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法。
【請求項１９】
請求項１及び３〜１２のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法で用いる容器であって、
すり鉢状をなす底面に、その径方向断面が鋸歯状である複数の凹凸が同心円状に配され、中心から外側へ向けて山から谷を結ぶ第一の傾斜面の長さ（ｈ）が０．２〜２０μｍ、中心から外側へ向けて谷から山を結ぶ第二の傾斜面の長さ（ｌ）が０．５〜５０μｍであり、山と中心とを結ぶ直線が水平面とのなす角度（θ１）が１５〜４５°であることを特徴とする標的核酸の検出用容器。
【請求項２０】
請求項１及び３〜１２のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法で用いる容器であって、
すり鉢状をなす底面に、複数個の凹部が独立して設けられ、底面と水平面とのなす角度（θ２）が１５〜４５°であることを特徴とする標的核酸の検出用容器。
【請求項２１】
前記凹部の、開口部の直径（Ｌ）が０．０５〜１００μｍ、深さ（ｄ）が０．０３〜６０μｍであることを特徴とする請求項２０に記載の標的核酸の検出用容器。
【請求項２２】
請求項２〜１０、１２及び１７のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法で用いる容器であって、
底面が略半球面状もしくは略円錐面状であり、底面と水平面とのなす角度（θ３）が１５〜４５°であることを特徴とする標的核酸の検出用容器。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の容器が、同一プレート上に複数個設けられていることを特徴とする標的核酸の検出用容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出対象の核酸の有無あるいは濃度を検出する方法及び該検出方法に用いる容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中に存在する特定の標的核酸を検出する代表的な技術としては、ハイブリダイゼーション法を利用したものが知られている（特許文献１参照）。そしてこの方法は、多種類の核酸が含まれる試料中から、非常に少量のＤＮＡやＲＮＡの標的核酸をプローブで検出する技術である。
【０００３】
一方、試料中に存在する特定の標的分子を、凝集させることで検出する方法も知られている。そして、この方法で凝集反応を行い、その結果得られた凝集物を検出する容器として、これまで種々のものが提案されてきており、例えば、凝集物の凝集パターンを目視で判定できる容器が提案されている（特許文献２参照）。
【特許文献１】特開平７−５１０９９号公報
【特許文献２】特公昭６３−６０８５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、核酸は、非特異的にハイブリダイゼーションすることがあり、例えば、標的核酸が非標的核酸と類似の塩基配列を有する場合などは、試料中から標的核酸だけを選択的に検出することが困難となることがあり、特許文献１に記載の方法では、必ずしも高い精度で標的核酸を検出することができないという問題点があった。
また、特許文献２に記載の容器は、赤血球の検出に用いるものであり、核酸と赤血球は分子サイズをはじめ構造に大きな相違があるため、そのまま標的核酸の検出に用いることができないという問題点があった。
【０００５】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、ハイブリダイゼーション法を利用することなく、標的核酸を簡便かつ高精度に検出する方法、及び該検出方法に用いる容器を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、検出対象の核酸に種類の異なる第一のリガンド及び第二のリガンドが結合された、標的核酸の検出方法であって、前記第一のリガンドと特異的に結合する第一の受容体が複数結合された第一の微粒子、及び前記第二のリガンドと特異的に結合する第二の受容体が複数結合された第二の微粒子を調製する工程と、底面に沈降物捕捉部を有する容器内において、前記標的核酸を含有している可能性のある試料、前記第一の微粒子及び第二の微粒子を混合する工程と、前記混合工程後に、第一のリガンドと第一の受容体との結合及び第二のリガンドと第二の受容体との結合を介してそれぞれ連結された前記標的核酸と前記第一の微粒子及び第二の微粒子からなる凝集物並びに／又は前記第一の微粒子及び第二の微粒子の沈降物の、前記容器底面における捕捉分布を観測する工程を有することを特徴とする標的核酸の検出方法である。
請求項２に記載の発明は、検出対象の核酸に種類の異なる第一のリガンド及び第二のリガンドが結合された、標的核酸の検出方法であって、前記第一のリガンドと特異的に結合する第一の受容体が底面に複数結合された容器を調製する工程と、前記第二のリガンドと特異的に結合する第二の受容体が複数結合された磁性微粒子を調製する工程と、前記容器内に、前記標的核酸を含有している可能性のある試料及び前記磁性微粒子を添加する工程と、該添加工程後に、前記磁性微粒子に対して前記容器外側より磁力を印加して該容器底面における磁性微粒子の分布を観測する工程を有することを特徴とする標的核酸の検出方法である。
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の検出方法と、請求項２に記載の検出方法をいずれも行うことを特徴とする標的核酸の検出方法である。
請求項４に記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法において、濃度既知の標的核酸を含有している試料（１）を用いた時の観測結果と、該標的核酸を含有していない試料（２）を用いた時の観測結果と、該標的核酸を含有している可能性のある試料（３）を用いた時の観測結果とを比較して、前記試料（３）中の標的核酸の有無又は濃度を確認することを特徴とする標的核酸の検出方法である。
請求項５に記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法において、既知の異なる濃度の標的核酸を含有している試料を用いた時の観測結果と、該標的核酸を含有している可能性のある試料（４）を用いた時の観測結果とを比較して、前記試料（４）中の標的核酸の有無又は濃度を確認することを特徴とする標的核酸の検出方法である。
請求項６に記載の発明は、前記リガンドが、親水性有機化合物、ジゴキシゲン、フルオロセイン、アレクサ、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、アミノ酸残基数が６以上のポリペプチド、単糖が２以上結合した糖鎖、ビオチン、タンパク質、ポリヒスチジン、ＨＡ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ｆｌａｇ）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法である。
請求項７に記載の発明は、前記標的核酸が、第一のリガンドを結合させた第一のプライマー、及び第二のリガンドを結合させた第二のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法によって調製されたものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法である。
請求項８に記載の発明は、前記標的核酸が、第一のプライマーを用いて、第一のリガンドを結合させたヌクレオチドを少なくとも一つ取り込ませながら、さらに第二のプライマーを用いて、第二のリガンドを結合させたヌクレオチドを少なくとも一つ取り込ませながら、ポリメラーゼ連鎖反応法によって調製されたものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法である。
請求項９に記載の発明は、前記標的核酸が複数の異なる種類であり、これら標的核酸中の第一及び第二のリガンドのうち少なくとも一方は標的核酸の種類ごとに異なることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法である。
請求項１０に記載の発明は、前記標的核酸が生体由来であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法である。
請求項１１に記載の発明は、前記第一及び第二の微粒子が、粒径０．１〜１０μｍであり、互いに光学的に区別可能であることを特徴とする請求項１及び３〜１０のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法である。
請求項１２に記載の発明は、複数の前記容器が同一プレート上に設けられており、各容器の容量が０．１〜０．５ｍｌであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法である。
請求項１３に記載の発明は、前記容器の沈降物捕捉部は、すり鉢状をなす底面に、その径方向断面が鋸歯状である複数の凹凸が同心円状に配されたものであり、中心から外側へ向けて山から谷を結ぶ第一の傾斜面の長さ（ｈ）が０．２〜２０μｍ、中心から外側へ向けて谷から山を結ぶ第二の傾斜面の長さ（ｌ）が０．５〜５０μｍであり、山と中心とを結ぶ直線が水平面とのなす角度（θ１）が１５〜４５°であることを特徴とする請求項１及び３〜１２のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法である。
請求項１４に記載の発明は、前記容器の沈降物捕捉部は、すり鉢状をなす底面に、複数個の凹部が独立して設けられたものであり、底面と水平面とのなす角度（θ２）が１５〜４５°であることを特徴とする請求項１及び３〜１２のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法である。
請求項１５に記載の発明は、前記凹部の、開口部の直径（Ｌ）が０．０５〜１００μｍ、深さ（ｄ）が０．０３〜６０μｍであることを特徴とする請求項１４に記載の標的核酸の検出方法である。
請求項１６に記載の発明は、請求項１３に記載の検出方法と、請求項１４又は１５に記載の検出方法をいずれも行うことを特徴とする標的核酸の検出方法である。
請求項１７に記載の発明は、前記磁性微粒子の粒径が０．１〜２０μｍであることを特徴とする請求項２〜１０及び１２のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法である。
請求項１８に記載の発明は、前記容器が、底面が略半球面状もしくは略円錐面状であり、底面と水平面とのなす角度（θ３）が１５〜４５°であることを特徴とする請求項２〜１０、１２及び１７のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法である。
【０００７】
請求項１９に記載の発明は、請求項１及び３〜１２のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法で用いる容器であって、すり鉢状をなす底面に、その径方向断面が鋸歯状である複数の凹凸が同心円状に配され、中心から外側へ向けて山から谷を結ぶ第一の傾斜面の長さ（ｈ）が０．２〜２０μｍ、中心から外側へ向けて谷から山を結ぶ第二の傾斜面の長さ（ｌ）が０．５〜５０μｍであり、山と中心とを結ぶ直線が水平面とのなす角度（θ１）が１５〜４５°であることを特徴とする標的核酸の検出用容器である。
請求項２０に記載の発明は、請求項１及び３〜１２のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法で用いる容器であって、すり鉢状をなす底面に、複数個の凹部が独立して設けられ、底面と水平面とのなす角度（θ２）が１５〜４５°であることを特徴とする標的核酸の検出用容器である。
請求項２１に記載の発明は、前記凹部の、開口部の直径（Ｌ）が０．０５〜１００μｍ、深さ（ｄ）が０．０３〜６０μｍであることを特徴とする請求項２０に記載の標的核酸の検出用容器である。
請求項２２に記載の発明は、請求項２〜１０、１２及び１７のいずれか一項に記載の標的核酸の検出方法で用いる容器であって、底面が略半球面状もしくは略円錐面状であり、底面と水平面とのなす角度（θ３）が１５〜４５°であることを特徴とする標的核酸の検出用容器である。
請求項２３に記載の発明は、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の容器が、同一プレート上に複数個設けられていることを特徴とする標的核酸の検出用容器である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、容器底面における沈降物の捕捉分布を視覚的に観測することで、標的核酸の有無あるいは濃度を簡便かつ高精度に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について、詳しく説明する。
本発明の標的核酸の検出方法は大別して、検出対象の核酸にリガンドが結合された構造の標的核酸を得る工程と、該標的核酸を検出する工程とに分かれる。以下、各工程ごとに詳しく説明する。
【００１０】
＜標的核酸を得る工程＞
まず、標的核酸を得る工程について説明する。
本発明において、検出対象の核酸は特に限定されず、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、合成ＲＮＡ等を含む全ての核酸又は核酸類似体であり、生体に由来するものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。
【００１１】
検出対象の核酸に結合されるリガンドは、従来公知のものを用いることができ、好ましいものとして、例えば、親水性有機化合物、ハプテン、ジゴキシゲン、フルオロセイン、アレクサ、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、アミノ酸残基数が６以上のポリペプチド、単糖が２以上結合した糖鎖、ビオチン、タンパク質、ポリヒスチジン、ＨＡ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ｆｌａｇ）及びこれらの誘導体等を用いることができるが、これらに限定されない。ビオチン、ジゴキシゲン、フルオロセイン、アレクサなどは市場からの入手が容易で低価格という利点がある。また、糖鎖やペプチドは化学構造のデザインに自由度が高く、複数種類をそろえることが容易であるという利点がある。使用するリガンドは、検出対象の核酸、試料等によって適宜選択すれば良い。
【００１２】
標的核酸中には、種類の異なる第一のリガンド及び第二のリガンドがそれぞれ一つ以上結合されている。検出対象の核酸に第一及び第二のリガンドが結合された構造の標的核酸を得る方法は、図１に示すように、例えば、（ｉ）検出対象の核酸１０に、光やプラチナを用いてあるいはリンカーを介して該核酸の塩基及び／又は５’末端に第一のリガンド３１及び第二のリガンド３２を共有結合させる方法（図１（ａ））、一例を挙げると、核酸の５’末端の塩基のアミノ基と、リガンドのカルボキシル基とを共有結合させる方法、（ｉｉ）核酸合成時に第一のリガンド３１を結合させた第一のプライマー１１、及び第二のリガンド３２を結合させた第二のプライマー１２を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により塩基配列を伸長させる方法（図１（ｂ））、（ｉｉｉ）ＰＣＲ法において、第一のリガンド３１を結合させたヌクレオチド１３を少なくとも一つ、及び第二のリガンド３２を結合させたヌクレオチド１４を少なくとも一つ、それぞれ取り込ませながら塩基配列を伸長させる方法（図１（ｃ））、（ｉｖ）ターミナルデオキシジルトランスフェラーゼを用いて、第一のリガンド３１又は第二のリガンド３２を結合させたヌクレオチドを、核酸の３’末端にテーリングする方法（図１（ｄ））等の各種方法を用いることができる。
【００１３】
生体試料又は任意の被検体等のように、標的核酸が他の核酸と共に存在する試料では、前記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の方法が好適である。標的核酸が単独で存在する場合には、何れの方法を用いてもよい。なお、例えば、生体試料等に含まれる検出対象の核酸は、ＰＣＲ法によって増幅させてから検出しても良いが、増幅させずにそのまま検出に供してもよい。
【００１４】
図１に示すように、標的核酸３０中のリガンドは、第一のリガンド３１及び第二のリガンド３２の二種類である。核酸の構造は柔軟であり、本発明においては、後述するように、標的核酸が種類の異なる第一の微粒子及び第二の微粒子に結合することが必須である。
【００１５】
また、標的核酸中の第一のリガンド及び第二のリガンドの数は、それぞれ一つずつでも良いが、それぞれ二つ以上でもよい。核酸対微粒子の体積比は極めて大きいため、一つの核酸に三つ以上の微粒子が結合する可能性は低い。従って、一つの標的核酸中に、複数のリガンドがあっても、標的核酸が結合した微粒子の凝集度には影響を与えないものと考えられる。
【００１６】
また、標的核酸が複数種類ある場合には、例えば、前記（ｉｉ）あるいは（ｉｉｉ）の方法を同時に行って、複数種類の標的核酸を同時に調製しても良い。この場合、各標的核酸中の第一のリガンド及び第二のリガンドのうち少なくとも一方は、標的核酸の種類ごとに異なることが好ましい。
【００１７】
＜標的核酸を検出する工程＞
次に標的核酸を検出する工程について説明する。
検出工程は大別して２つの手法に別れ、これら単独でも検出を行うことは可能であるが、二つの手法を組み合わせることによって、より精度の高い検出結果を得ることが可能である。以下２つの手法を順に説明する。
【００１８】
[第一の手法]
（第一の微粒子及び第二の微粒子を調製する工程）
第一のリガンドと特異的に結合する第一の受容体が複数結合された第一の微粒子、及び第二のリガンドと特異的に結合する第二の受容体が複数結合された第二の微粒子を調製する。
本発明で用いる微粒子とは分散性微粒子のことであり、例えば、コロイド粒子のように溶液中で分散する微粒子を意味し、ラテックス粒子が好適に用いられるが、これに限定されない。第一の微粒子及び第二の微粒子の粒径は、０．１〜１０．０ｎｍであることが好ましい。このような粒径の微粒子を用いれば、安定した凝集塊が得られ易い。
【００１９】
本発明において、特異的結合とは、例えば、抗原と抗体等のように、特定の物質間で選択的に形成される、特異性の高い分子間力に基づく結合を意味する。
【００２０】
ラテックス粒子は主にポリスチレンから成り、親水性と分散性とを高めるためメタクリル酸が共重合されている。ラテックス粒子には、表面に官能基がないプレーンタイプと官能基を有する官能基タイプがある。プレーンタイプの表面の荷電はメタクリル酸の存在のため負の電荷を有しており、タンパク質分子中の正の電荷を持つ領域とイオン結合することができる。また、タンパク質分子と疎水結合させることも可能である。プレーンタイプのラテックス粒子はタンパク質と混合するだけでタンパク質を吸着するので、タンパク質の固定操作が容易である。受容体としては、後述のように種々のものを用いることができるが、各種タンパク質を用いる場合に、このようなプレーンタイプのラテックス粒子が微粒子として好適に用いられる。
【００２１】
官能基を有するラテックス粒子は、表面にカルボキル基やアミノ基等が露出するように設計されており、様々なタイプの官能基タイプラテックス粒子が利用可能である。官能基タイプラテックス粒子に受容体を結合させる場合は、官能基タイプラテックス粒子中の官能基と、受容体の官能基を結合させれば良く、従来公知の方法を適用することができ、例えば、水溶性カルボジイミドでカルボン酸とアミノ基を結合させるＥＤＡＣ方法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とをあらかじめ混合してカルボン酸とアミノ基とを結合させる方法、双極性を有するリンカーを用いてアミノ基同士を架橋する方法、活性化したアルデヒド基やトシル基と受容体中の官能基を結合する方法等がある。本発明においては、本発明の効果を損なわない範囲で従来公知のいかなる方法を用いてもよいが、特にＥＤＡＣ法が好ましい。そして、プレーンタイプのラテックス粒子同様、受容体として各種タンパク質を用いる場合に、官能基タイプラテックス粒子は好適に用いられる。
なお、ラテックス粒子以外の微粒子であっても、微粒子の種類に応じて、従来公知の方法によって受容体を結合させることができる。
【００２２】
第一の微粒子に結合される第一の受容体には、標的核酸中の第一のリガンドと特異的に結合する受容体を用い、第二の微粒子に結合される第二の受容体には、第二のリガンドと特異的に結合する受容体を用いる。受容体としては、例えば、抗体、レクチン、ストレプトアビジン等を用いることができるが、これらに限定されない。なかでも、タンパク質、特に抗体が好適に用いられる。
【００２３】
本発明においては、一つの実施形態として、一つの微粒子には単一種類の受容体を結合させる。そして本実施形態においては、標的核酸には少なくとも二種類のリガンドが結合されているため、一種類の標的核酸に対して少なくとも二種類の微粒子を調製する。即ち、図２に示すように、第一のリガンド３１と特異的に結合する第一の受容体３３１が結合された第一の微粒子３３（図２（ａ））、及び第二のリガンド３２と特異的に結合する第二の受容体３４１が結合された第二の微粒子３４（図２（ｂ））を調製する。
【００２４】
また、本発明の他の実施形態として、一つの微粒子に二種類以上の受容体を結合させても良い。そして本実施形態では、一つの標的核酸中の二種類以上のリガンドのうち、一種のリガンドと特異的に結合する受容体と、残りの種類のリガンドと特異的に結合する受容体以外の受容体を一つの微粒子に結合させる。即ち、標的核酸中の二種類以上のリガンドのうち一種だけが一つの微粒子に結合するように設計する。
【００２５】
第一の微粒子及び第二の微粒子は、互いに光学的に区別可能であることが好ましい。具体的には、例えば、第一の微粒子及び第二の微粒子を、同色ではなく異なる色とすることが好ましい。このようにすることで、操作段階での微粒子の識別が容易となり、また凝集像を観察した時に一種類の微粒子で自己凝集を起こした場合にも色によって容易に区別が可能であり、自己凝集を第一の微粒子及び第二の微粒子による凝集と誤判定する可能性が低くなる。すなわち、標的核酸の検出をより高精度に行うことができる。
【００２６】
なお、本工程における微粒子への受容体の結合は、標的核酸を検出する際に実施しても良いが、予め受容体を結合させた微粒子を検出に供しても良い。また、本工程は、上記の標的核酸を調製する工程と前後して実施して良い。
【００２７】
（標的核酸を含有している可能性のある試料、第一の微粒子及び第二の微粒子を混合する工程）
次に、標的核酸を含有している可能性のある試料、前記第一の微粒子及び第二の微粒子を混合する工程について説明する。
本工程は、後述の、底面に沈降物捕捉部を有する容器内において行う。検出に供する標的核酸を含有している可能性のある試料が、実際に標的核酸を含有していれば、上記したような第一のリガンドと第一の受容体との結合、及び第二のリガンドと第二の受容体との結合を介して、標的核酸と微粒子が連結され、後述のように凝集物が生じる。検出に供する試料が標的核酸を含有していなければ、このような結合は生じず、凝集物も生じない。
本工程は、標的核酸を含有している可能性のある試料、第一の微粒子及び第二の微粒子を同時に混合して行っても良く、或いは、標的核酸を含有している可能性のある試料に対して、第一の微粒子及び第二の微粒子を順に混合して、逐次的に行っても良い。標的核酸を含有している可能性のある試料、第一の微粒子及び第二の微粒子は、それぞれ溶液として用いることが好ましい。
【００２８】
本工程で用いる溶液は緩衝液が好ましく、凝集を促進する緩衝液がより好ましい。このような好ましい緩衝液として、例えば、以下の組成からなる緩衝液；２００ｍＭ  ＭＯＰＳＯ（ｐＨ７．４）、４％デキストラン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％アジ化ナトリウムが挙げられるが、標的核酸及び微粒子の種類に応じて適宜選定すれば良い。本工程において異なる種類の緩衝液を混合する場合には、微粒子は当該異なる緩衝液で２〜３回洗浄してから用いることが好ましい。
【００２９】
混合に供する第一及び第二の微粒子の量は、多すぎると検出精度が低下するので、標的核酸より小過剰であることが好ましく、具体的には、数十〜数百ｎＭの標的核酸に対し、０．０１〜０．５ｗ／ｖ％の微粒子量であることがより好ましい。
【００３０】
前記のリガンド−受容体の組み合わせとして、例えば、抗原及び抗体を用いる場合は、本工程は、０〜３７℃で、５〜３０分間行うことが好ましい。その他のリガンド−受容体の組み合わせの場合も、この組み合わせの種類に応じて適した温度、時間、緩衝液を適宜選択すれば良い。
【００３１】
図３に、標的核酸と第一及び第二の微粒子が連結した様子を示す。図３において、標的核酸３０中の第一のリガンド３１は、第一の微粒子３３と第一の受容体３３１を介して連結する。また、標的核酸３０中の第二のリガンド３２は、第二の微粒子３４と第二の受容体３４１を介して連結する。即ち、一つの標的核酸３０が第一の微粒子３３及び第二の微粒子３４と連結することによって、第一の微粒子３３及び第二の微粒子３４が互いに連結される。さらに、一つの微粒子に複数の標的核酸３０が連結し、その標的核酸３０のそれぞれが他の微粒子と連結することによって、多数の微粒子が互いに連結された結果、微粒子の凝集が生じることになる。なお、図３において受容体から延ばされた点線は、結合された核酸を簡易的に表している。
これにより、標的核酸が試料中に含有されていれば、微粒子の凝集が生じる。
【００３２】
（容器底面における沈降物の捕捉分布を観測する工程）
続いて、容器の底面における沈降物の捕捉分布を観測する。
ここで沈降物とは、前記凝集物や、標的核酸との連結に供されることなく沈降した第一及び第二の微粒子のことを指す。本工程によって標的核酸を検出することができる。ここで、前記凝集物の有無あるいはその程度は、肉眼あるいは画像処理等によって判定する。画像処理であれば、例えば、ＣＣＤカメラにより取り込んだ画像データを解析するなどの手法を用いることができる。
【００３３】
次に、標的核酸の検出を行う具体的な方法について詳しく説明する。
上記のようなリガンドが結合している濃度既知の標的核酸を含有している試料（１）を用い、該標的核酸を前述の方法に従って微粒子と混合して、容器底面における凝集物の捕捉分布を観測し、陽性コントロールとする。さらに該標的核酸を含有していない試料（２）を前述の方法に従って微粒子と混合して、容器底面における沈降物の捕捉分布を観測し、陰性コントロールとする。そして、該標的核酸を含有している可能性のある試料（３）を同様に前述の方法に従って微粒子と混合し、容器底面における沈降物の捕捉分布を観測し、上記陽性コントロール及び陰性コントロールと比較することで、前記試料（３）中の標的核酸の有無または濃度を確認する。具体的には、試料（３）を用いた場合の捕捉分布のパターンが陽性コントロールに一致するか類似していれば、陽性と判断されて、試料（３）中には標的核酸が含有されていることが確認される。これに対して、試料（３）を用いた場合の捕捉分布のパターンが陰性コントロールに一致するか類似していれば、陰性と判断されて、試料（３）中には標的核酸が含有されていないことが確認される。一方、試料（３）を用いた場合の捕捉分布のパターンが、陽性コントロールと陰性コントロールの中間を示す場合には、擬陽性と判断される。この場合は、試料（３）中に標的核酸が少量含有されている可能性がある。このようにして、試料（３）中の標的核酸の有無を簡便に確認することができる。また同様にして、例えば、試料（３）を用いた場合の沈降物の捕捉量を陽性コントロール及び陰性コントロールと比較することで、試料（３）中の標的核酸の量を確認することができる。
【００３４】
また、既知の異なる濃度の標的核酸を含有する試料を用いて得られた、容器底面における凝集物の捕捉分布をコントロールとし、該標的核酸を含有している可能性のある試料（４）を用いた時の沈降物の捕捉分布をコントロールと比較することで、前記同様、該試料（４）中の標的核酸の有無または濃度を確認することも可能である。
また、あらかじめ標的核酸の有無や濃度の違いによる沈降物の捕捉分布の違いを確認して記録しておけば、前記コントロールを用いなくとも、該標的核酸を含有している可能性のある試料を検出に供するだけで、該試料中の標的核酸の有無または濃度を確認することも可能である。このようにすることで、検出工程を簡略化することができる。
【００３５】
また、試料中に複数種類の標的核酸が含有されている場合には、例えば、標的核酸の種類ごとに異なる第一及び第二のリガンドを用いて、複数種類のうちの一種の標的核酸中の第一及び第二のリガンドと特異的に結合する第一及び第二の受容体が結合された微粒子のみを混合に供すれば、当該一種の標的核酸を選択的に検出することができる。同様に標的核酸の種類に応じて、該標的核酸中の第一及び第二のリガンドと特異的に結合する第一及び第二の受容体が結合された微粒子を、各標的核酸ごとに調製し、これら微粒子を混合に供すれば、二種以上の標的核酸を同時に検出することができる。
このように、検出対象の核酸を単独で、或いは複数の検出対象の核酸を同時に検出することができる。
【００３６】
ここで、標的核酸中の第一及び第二のリガンドは、前述のように標的核酸の種類ごとに全て異なるリガンドを用いても良いが、第一及び第二のリガンドのうち一方のリガンドを、複数種類の核酸の間で共通のものとしても良い。このようにすることで、検出工程を簡略化することができる。
【００３７】
なお、以上述べた検出方法では、一種類の標的核酸について二種類のリガンドを用いているが、三種類以上のリガンドを用いても良い。この場合、リガンドに特異的に結合する受容体が複数結合された微粒子を、リガンドの種類ごとに調製すれば良い。
【００３８】
（標的核酸の検出に用いる容器）
標的核酸の検出に用いる本発明の容器について、以下詳しく説明する
本発明においては、該容器を単独で用いても良いが、該容器を複数同一プレート上に設けたものを用いることもでき、このようなものとして具体的には、例えば、該容器をウェルとする９６ウェルマイクロプレートを挙げることができる。ただしもちろん、ウェルの数は９６に限定されるものではない。このような複数の容器を備えている場合、一つの容器の容量は０．１〜０．５ｍｌであることが好ましい。
【００３９】
本発明の容器の底面には、沈降物を捕捉する部位が設けられており、標的核酸と微粒子が連結することで生じた凝集物と、該凝集物以外の沈降物をより簡便に且つ高精度に識別できるようになっている。沈降物捕捉部について具体的に説明すると、例えば、図４に示すような、容器４０のすり鉢状をなす底面４１に、その径方向断面が鋸歯状である複数の凹凸４２が同心円状に配されたものが挙げられる。ここで凹凸４２の、底面の中心４３から外側へ向けて山から谷を結ぶ第一の傾斜面の長さ（ｈ）は０．２〜２０μｍであることが好ましく、中心４３から外側へ向けて谷から山を結ぶ第二の傾斜面の長さ（ｌ）は０．５〜５０μｍであることが好ましく、山と中心４３とを結ぶ直線が水平面とのなす角度（θ１）は１５〜４５°であることが好ましい。また、凹凸４２の数は、１０〜５０個であることが好ましい。
【００４０】
また、沈降物捕捉部の他の具体例として、例えば、図５に示すような、容器５０のすり鉢状をなす底面５１に、複数個の凹部５２が独立して設けられたものが挙げられる。ここで、底面５１と水平面とのなす角度（θ２）は１５〜４５°であることが好ましい。なおθ２とは、より具体的には、底面５１の傾斜面における凹部５２を除いた任意の一点と、底面５１中心とを結ぶ直線が、水平面となす角度のことである。
そして、該凹部５２は略半球状であり、その開口部の直径（Ｌ）は０．０５〜１００μｍであることが好ましく、深さ（ｄ）は０．０３〜６０μｍであることが好ましい。
なお、凹部５２の形状は、ここに示す略半球状に限定されず、前記第一の微粒子及び／又は前記第二の微粒子を複数個、好ましくは３〜７個程度収容できるものであれば、異なる形状及びサイズのものでも良い。凹部５２の数は、数十〜数百程度であることが好ましい。
【００４１】
沈降物捕捉部の前述のサイズ及び形状は、前記凝集物と該凝集物以外の沈降物との識別を簡便に且つ高精度に行うことができるよう、特に見出されたものであり、このような沈降物捕捉部を備えた容器を用いることで、標的核酸を簡便に且つ高精度に検出することができる。したがって、前記範囲を外れた場合、沈降物の捕捉分布パターンが、前記凝集物と該凝集物以外の沈降物との間で区別がつきにくくなることがある。
また、図４及び図５で挙げた容器を併用することで、標的核酸の検出をより高い精度で行うことができる。
【００４２】
図４に示すような沈降物捕捉部を有する容器４０を使用した場合の、沈降物の捕捉分布について、図６を参照しながら説明する。
第一の微粒子３３及び第二の微粒子３４と混合した試料中に標的核酸が含有されていない時（陰性）は、図６（ａ）及び（ｂ）に示すように、標的核酸との連結に関与しなかった第一の微粒子３３及び第二の微粒子３４が底面４１に沈降し、大部分が凹凸４２を乗り越えて底面最下部近傍にまで到達する。一方、標的核酸が含有されている時（陽性）は、図６（ｃ）及び（ｄ）に示すように、前述のように第一の微粒子３３及び第二の微粒子３４が標的核酸を介して互いに連結されて凝集物が生じ、沈降する。該凝集物はサイズが大きいため、凹凸４２を乗り越えることなく、底面４１上の沈降した場所にそのまま留まって、底面４１全面に渡って薄く堆積する。標的核酸の量が多ければ凝集物の堆積量が多くなり、少なければ堆積量が少なくなるので、試料中の標的核酸濃度に応じて容器底面の色の濃さが変化する。なお、図６中、（ａ）及び（ｃ）は、凝集物及び／又は該凝集物以外の沈降物が、沈降物捕捉部に捕捉されている状態での容器４０の縦断面図、（ｂ）及び（ｄ）は、容器４０の底面を上方から見た時の図である。
【００４３】
次に、底面が図５に示すような形状の容器５０を使用した場合の、沈降物の捕捉分布について、図７を参照しながら説明する。
第一の微粒子３３及び第二の微粒子３４と混合した試料中に標的核酸が含有されていない時（陰性）は、図７（ａ）及び（ｂ）に示すように、標的核酸との連結に関与しなかった第一の微粒子３３及び第二の微粒子３４が底面５１に沈降し、大部分が凹部５２に捕捉され、底面５１の最下部近傍にまで到達せず、底面５１の、凹部５２が設けられている領域のほぼ全面に渡って保持される。一方、標的核酸が含有されている時（陽性）は、図７（ｃ）及び（ｄ）に示すように、前述のように第一の微粒子３３及び第二の微粒子３４が標的核酸を介して互いに連結されて凝集物が生じ、沈降する。該凝集物はサイズが大きいため、凹部５２に捕捉されることなく大部分が底面５１の最下部近傍にまで到達する。標的核酸の量が多ければ、底面５１の最下部近傍における凝集物の堆積量が多くなると共に底面５１を覆う面積が大きくなり、少なければ、底面５１の最下部近傍における凝集物の堆積量が少なくなると共に底面５１を覆う面積が小さくなる。したがって、試料中の標的核酸濃度に応じて容器底面の変色部位の色の濃さ及び領域が変化する。なお、図７中、（ａ）及び（ｃ）は、凝集物及び／又は該凝集物以外の沈降物が、沈降物捕捉部に捕捉されている状態での容器５０の縦断面図、（ｂ）及び（ｄ）は、容器５０の底面を上方から見た時の図である。
【００４４】
このように、測定に供する試料中の標的核酸の有無あるいは濃度の違いにより、容器底面における沈降物の捕捉分布が変化するので、標的核酸の検出を簡便に且つ高精度に行うことができる。
【００４５】
また、例えば、図４あるいは図５に示すような本発明の容器は、金型成型等の従来公知の手法により製造することができる。
【００４６】
[第二の手法]
（磁性微粒子及び容器底面への受容体の結合）
次に、標的核酸を検出する第二の手法について説明する。
まず磁性微粒子に、標的核酸中の第二のリガンドと特異的に結合する第二の受容体を結合する工程について説明する。
【００４７】
用いる磁性微粒子としては、例えば、四酸化三鉄（Ｆｅ3 Ｏ4 ）、三酸化二鉄（γ−Ｆｅ2 Ｏ3 ）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属あるいはコバルト、ニッケル、マンガンなどを含む合金からなる磁性微粒子、又はこれら磁性微粒子を内部に含んだポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレートなどの疎水性重合体、若しくはポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリレート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメタクリレートなどの架橋した親水性重合体、又は前記重合体のモノマーの２−４種程度の共重合体などのラテックス、ゼラチン、リポソーム、あるいは前記磁性微粒子をラテックス、ゼラチン、リポソームなどの表面に固定化した粒子などが挙げられる。
【００４８】
磁性微粒子の粒径は、０．１μｍ〜２０μｍであることが好ましい。
粒径が前記寸法を外れると、沈降物の捕捉分布パターンが、前記凝集物と該凝集物以外の沈降物との間で区別がつきにくくなることがある。
磁性微粒子に、標的核酸中の第二のリガンドに対する第二の受容体を結合する方法としては、該受容体を物理的に吸着させる方法、あるいは化学的に担持させる方法が挙げられる。
【００４９】
物理的に吸着させる方法としては、例えば、磁性微粒子に、受容体を直接吸着させて固定化する方法、受容体をアルブミンなどの他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固定化する方法が挙げられる。
化学的に担持させる方法としては、例えば、磁性微粒子の表面に存在するアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などの各種官能基を活性化して、受容体上の各種官能基と結合させて、直接磁性微粒子上に受容体を固定化する方法、磁性微粒子と受容体とをスペーサー分子を介して化学結合させることで固定化する方法、例えばアルブミンなどの他のタンパク質に受容体を化学結合させた後、該タンパク質を磁性微粒子に化学結合させる方法が挙げられる。ここで化学結合させる方法は、いずれも従来公知の方法を適用すれば良い
【００５０】
次に、容器底面に、標的核酸中の第一のリガンドと特異的に結合する第一の受容体を結合する工程について説明する。
ここで用いる容器は、透明、半透明、着色したものなどいずれでも良い。材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、メチルペンテン樹脂（ＴＰＸ） 、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、塩化ビニル樹脂等のプラスチック等が挙げられる。そして、金型成型等の従来公知の方法によって成型すれば良い。
容器底面に標的核酸中の第一のリガンドと特異的に結合する第一の受容体を結合する方法としては、微粒子や磁性微粒子へ受容体を結合する方法を適用することができ、結合させる受容体の種類に応じて適宜選択すればよい。
【００５１】
これら磁性微粒子や容器に結合される受容体としては、例えば、抗体、レクチン、ストレプトアビジン、ニッケル等を用いることができるが、これらに限定されない。ニッケルを用いることができるのは、これがキレート形成能を有するからである。
【００５２】
本手法においては、標的核酸には少なくとも二種類のリガンドが結合されているため、一種類の標的核酸に対して少なくとも二種類の受容体を準備する。そして、第一のリガンド３１と特異的に結合する第一の受容体３３１が底面に結合された容器８０（図８）、及び第二のリガンド３２と特異的に結合する第二の受容体３４１が結合された磁性微粒子９０（図９）を調製する。
【００５３】
また本発明では、一つの磁性微粒子、容器に二種類以上の受容体を結合させてもよい。本実施形態では、一つの標的核酸中の二種類以上のリガンドのうち、一種のリガンドと特異的に結合する受容体と、残りの種類のリガンドと特異的に結合する受容体以外の受容体を、一つの磁性微粒子あるいは容器に結合させる。即ち、標的核酸中の二種類以上のリガンドのうち一種だけが、一つの磁性微粒子あるいは容器に結合するように設計する。
【００５４】
（容器内に、標的核酸を含有している可能性のある試料及び前記磁性微粒子を添加する工程）
次に、標的核酸を含有している可能性のある試料及び前記磁性微粒子を添加する工程について説明する。
本工程は、標的核酸を含有している可能性のある試料と磁性微粒子を混合した後に、該混合物を容器に添加しても良く、標的核酸を含有している可能性のある試料と磁性微粒子を同時に容器に添加しても良いが、好ましくは標的核酸を含有している可能性のある試料を容器に添加した後に、磁性微粒子を該容器に添加する。標的核酸を含有している可能性のある試料、磁性微粒子は、それぞれ溶液として用いることが好ましい。この場合、緩衝液を用いることが好ましく、好ましい緩衝液として、例えば、ＰＢＳが挙げられるが、状況に応じて適宜選定すれば良い。
【００５５】
容器への添加に供する磁性微粒子の量は、多すぎると検出精度が低下するので、標的核酸より小過剰であることが好ましく、具体的には、数十〜数百ｎＭの標的核酸に対し、０．０１〜０．５ｗ／ｖ％の微粒子量であることがより好ましい。そして、容器底面に結合された第一の受容体の数は、標的核酸中の第一のリガンドの数よりも多ければ良く、リガンドの数の１．２〜２倍程度であることが好ましい。
【００５６】
検出に供する標的核酸を含有している可能性のある試料が、実際に図１０（ａ）に示すような標的核酸３０を含有していれば、図１０（ｂ）に示すように、第一のリガンド３１と第一の受容体３３１との結合を介して容器８０の底面８１に標的核酸３０が連結され、図１０（ｃ）に示すように、第二のリガンド３２と第二の受容体３４１との結合を介して、該標的核酸３０と磁性微粒子９０が連結される。即ち、容器８０及び磁性微粒子９０が標的核酸３０を介して連結される。検出に供する試料が標的核酸を含有していなければ、このような結合は生じず、磁性微粒子９０は容器８０に連結されない。
【００５７】
（容器底面における磁性微粒子の分布を観測する工程）
続いて、磁石等の磁性体を、容器外側から容器底面に当てることで、容器内の磁性微粒子に磁力を印加した時の、磁性微粒子の分布パターンを肉眼あるいは画像処理等の手法を用いて観察する。画像処理等は、前述と同様の方法を適用すれば良い。
【００５８】
これにより、標的核酸が試料中に含有されている時（陽性）は、図１１（ａ）〜（ｃ）に示すように、磁性体によって磁性微粒子９０を集めようと試みても、容器８０と磁性微粒子９０が標的核酸３０を介して連結しているので、磁性微粒子９０を集めることができず、磁性微粒子９０は容器８０の底面８１のほぼ全面に渡って保持される。標的核酸３０の量が多ければ、容器８０の底面８１を覆う磁性微粒子９０が多くなり、少なければ容器底面８１を覆う磁性微粒子９０が少なくなるので、試料中の標的核酸３０の濃度に応じて、底面８１の色の濃さが変化する。一方、標的核酸が試料中に含有されていない時（陰性）は、図１１（ｄ）〜（ｆ）に示すように、磁性体によって磁性微粒子９０が底面８１の磁性体近傍に集められる。
このように、測定に供する試料中の標的核酸の有無あるいは濃度の違いにより、容器底面における磁性微粒子の分布パターンが変化するので、標的核酸の検出を簡便且つ高精度に行うことができる。なお、図１１中、（ａ）及び（ｂ）は、磁性微粒子９０が容器８０に連結されている状態での容器８０の縦断面図、（ｄ）及び（ｅ）は、磁性微粒子９０が容器８０に連結されていない状態での容器８０の縦断面図、（ｃ）及び（ｆ）は、容器８０の底面を上方から見た時の図である。
【００５９】
前記のリガンド−受容体の組み合わせとして、例えば、抗原及び抗体を用いる場合は、本工程は、０〜３７℃で、５〜３０分間行うことが好ましい。その他のリガンド−受容体の組み合わせの場合も、この組み合わせの種類に応じて適した温度、時間、緩衝液を適宜選択すれば良い
【００６０】
次に、標的核酸の検出を行う具体的な方法について詳しく説明する。
上記のようなリガンドが結合している濃度既知の標的核酸を含有している試料（１）を用い、該標的核酸を前述の方法に従って容器内に添加し、磁性微粒子を容器内に添加して、磁力を印加した時の磁性微粒子の分布パターンを確認し、陽性コントロールとする。さらに、該標的核酸を含有していない試料（２）を前述の方法に従って容器内に添加し、磁性微粒子を容器内に添加して、磁力を印加した時の磁性微粒子の分布パターンを確認し、陰性コントロールとする。そして、該標的核酸を含有している可能性のある試料（３）を同様に前述の方法に従って容器内に添加し、磁性微粒子を容器内に添加して、容器底面における磁性微粒子の分布パターンを、上記陽性コントロール及び陰性コントロールと比較することで、前記試料（３）中の標的核酸の有無または濃度を確認する。
【００６１】
また、既知の異なる濃度の標的核酸を含有する試料を用いて得られた、容器底面における磁性微粒子の分布パターンをコントロールとし、該標的核酸を含有している可能性のある試料（４）を用いた時の磁性微粒子の分布パターンをコントロールと比較することで、該試料（４）中の標的核酸の有無または濃度を確認することも可能である。
また、あらかじめ標的核酸の有無や濃度の違いによる磁性微粒子の分布パターンの違いを確認して記録しておけば、前記コントロールを用いなくとも、該標的核酸を含有している可能性のある試料を検出に供するだけで、該試料中の標的核酸の有無または濃度を確認することも可能である。このようにすることで、検出工程を簡略化することができる。
【００６２】
また、試料中に複数種類の標的核酸が含有されている場合には、例えば、標的核酸の種類ごとに異なる第一及び第二のリガンドを用いて、複数種類のうちの一種の標的核酸中の第一のリガンドと特異的に結合する第一の受容体が結合された容器に、当該一種の標的核酸中の第二のリガンドと特異的に結合する第二の受容体が結合された磁性微粒子のみを添加すれば、当該一種の標的核酸を選択的に検出することができる。同様に、複数種類の標的核酸中の第一のリガンドと特異的に結合する第一の受容体がすべて結合された容器に、当該複数種類の標的核酸中の第二のリガンドと特異的に結合する第二の受容体が結合された磁性微粒子をすべて添加すれば、当該複数種類の標的核酸を同時に検出することができる。
このように、検出対象の核酸を単独で、或いは複数の検出対象の核酸を同時に検出することができる。
【００６３】
ここで、標的核酸中の第一及び第二のリガンドは、前述のように標的核酸の種類ごとに全て異なるリガンドを用いても良いが、第一及び第二のリガンドのうち一方のリガンドを、複数種類の核酸の間で共通のものとしても良い。このようにすることで、検出工程を簡略化することができる。
【００６４】
なお、以上述べた検出方法では、一種類の標的核酸について二種類のリガンドを用いているが、三種類以上のリガンドを用いても良い。この場合、各リガンドと特異的に結合する受容体を用いるが、これら三種類以上の受容体のうち、容器に結合するものと磁性微粒子に結合するものとは、目的に応じて適宜選択すれば良い。
【００６５】
（標的核酸の検出に用いる容器）
本工程で用いる容器は、磁性微粒子に磁力を印加した時の、該容器に連結されていない磁性微粒子の集まり易さを考慮して、例えば、図８に示すものが挙げられる。すなわち、底面８１が略半球面状であり、底面８１と水平面とのなす角度（θ３）が１５〜４５°であるものを好ましいものとして挙げることができる。底面８１は、ここに示す略半球面状以外にも、略円錐面状であっても良い。なおθ３とは、より具体的には、底面８１の傾斜面における任意の一点と、底面８１中心とを結ぶ直線が、水平面となす角度のことである。
そして第一の手法同様、このような容器を単独で用いても良いが、該容器を複数同一プレート上に設けたものを用いることもできる。このようなものとして具体的には、例えば、該容器をウェルとする９６ウェルマイクロプレートを挙げることができる。ただしもちろん、ウェルの数は９６に限定されるものではない。このような複数の容器を備えている場合、一つの容器の容量は０．１〜０．５ｍｌであることが好ましい。第二の手法で用いる容器は、金型成型等の従来公知の手法により成型した容器底面に、前述の手法で受容体を結合させれば良い。
【００６６】
ここまで第二の手法について述べた点以外については、概ね第一の手法と同様の手法を第二の手法でも適用することができる。
【００６７】
本発明においては、第一の手法及び第二の手法を併用することで、標的核酸の検出をより高精度に行うことができる。そして、第一の手法においては前述の通り、図４及び図５で挙げた容器を併用すれば、さらに一層高精度に標的核酸の検出を行うことができる。
【００６８】
以上詳述したように、本発明の標的核酸の検出方法によれば、検出対象の核酸を低コストで簡便且つ高精度に検出することができる。これにより、例えば、臨床検査の低コスト化、簡便化に有効である。
【００６９】
本発明の標的核酸の検出方法は、例えば、検出対象の核酸の１塩基多型（ＳＮＰ：Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を検出する手段として用いることができる。この場合、複数の異なるハプテンが結合された標的核酸を得る方法としてＰＣＲ法を適用する場合、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＰ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  −  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）を好適に用いることができる。ＰＣＲ−ＳＳＰ法は、二種類のプライマーの片方の３’末端が、検出対象の核酸中のＳＮＰサイトと重なるように配列を設計することで、ＳＮＰサイトとプライマーの３’末端とのマッチングの有無によって、ＰＣＲによる増幅を制御する方法である。
【００７０】
以下、さらに原理の詳細を説明する。
第一のリガンドが結合されたプライマーとして、例えば、配列番号２に示す塩基配列から成るプライマーの５’末端にジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を結合させたもの、配列番号３に示す塩基配列から成るプライマーの５’末端にＦＩＴＣを結合させたもの、配列番号４に示す塩基配列から成るプライマーの５’末端にビオチンを結合させたものを、それぞれ作製する。次に、配列番号５に示す塩基配列から成る検出対象の核酸に対して、ＰＣＲ−ＳＳＰ法で増幅反応を行う。この時、配列番号５に示す塩基配列中にｒとして記載したように、サンプルのＳＮＰサイトが塩基Ａ（アデニン）と塩基Ｇ（グアニン）の２タイプがアリルとして存在するとき、アリルタイプは、Ａ／Ａのホモ、Ａ／Ｇのヘテロ、Ｇ／Ｇのホモと３タイプとなる。
サンプルのＳＮＰサイトがＡ／Ａのホモである場合、ＤＩＧ標識された配列番号２のプライマーがＳＮＰサイトとマッチングし、ビオチン標識された配列番号４のプライマーとともにＰＣＲによって検出対象の核酸の増幅が行われる。ＦＩＴＣ標識された配列番号２のプライマーでは増幅が行われないので、増幅産物は両５’末端にＤＩＧとビオチンが別々に結合された２本鎖ＤＮＡ（標的核酸１）となる。
同様な考え方で、サンプルのＳＮＰサイトがＧ／Ｇのホモである場合、ＰＣＲ産物は両５’末端にＦＩＴＣとビオチンが別々に結合された２本鎖ＤＮＡ（標的核酸２）となる。
さらにサンプルのＳＮＰサイトがＡ／Ｇのヘテロであった場合、標的核酸１と標的核酸２が混合した増幅産物が得られる。これら核酸の増幅の有無を検出することで、ＳＮＰタイピングが可能となる。
上述の原理により、核酸のＳＮＰを検出する場合に、その多型に対応したハプテンで修飾された標的核酸を得ることが可能となる。
さらに、検出対象の核酸のＳＮＰを複数検出することも可能となる。この場合、ＳＮＰサイトが異なるごとに異なる種類のハプテンを結合したプライマーを用意して、前述の方法に従い、ＰＣＲ−ＳＳＰ法により検出対象の核酸を増幅させればよい。
【実施例】
【００７１】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
ここでは、前述の原理に基づいたＳＮＰタイピングの実施例を示す。
[実験例１]
＜ＤＮＡ（検出対象の核酸）の抽出＞
ヒト血液よりＤＮＡを抽出した。具体的には、核酸自動抽出機「Ｍａｇｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ６ＣＧ（プレジション・システム・サイエンス株式会社製）」を使用し、使用手順は、同製品取り扱い説明書に準じた。
（１）被験者の血液５ｍｌを採血した。
（２）採血した血液の全血１００μｌをスクリューキャップ式１．５ｍｌチューブに分注した。
（３）装置を立ち上げ、抽出試薬、被検体をセットし、操作プログラムに従い機械を操作してＤＮＡ抽出を開始した。抽出液はＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０  ｏｒ  ７．５）＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いた。
（４） 抽出後、分光光度計「ｎａｎｏ  ｄｒｏｐ (米国ナノドロップ社製)」を使用して、吸光度を測定し、抽出後濃度を計測した。
前記手法により、あらかじめ標的ＳＮＰのアリルタイプが判っている９人の被験者から血液を採取し、ＤＮＡ抽出を行った結果、１００μｌ全血液から表１に示す濃度のゲノム ＤＮＡ  １００μｌが得られた。
【００７２】
【表１】
2008002948.tif 000003
【００７３】
＜リガンドが結合された検出対象の核酸の増幅＞
配列番号２に示す塩基配列から成るプライマーの５’末端にＤＩＧを結合させたもの、配列番号３に示す塩基配列から成るプライマーの５’末端にＦＩＴＣを結合させたもの、配列番号４に示す塩基配列から成るプライマーの５’末端にビオチンを結合させたものそれぞれ用いて、前記ゲノムＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲによって、ＳＮＰを含む配列番号５に示す塩基配列を有する検出対象の核酸の増幅を行った。
（１）ゲノムＤＮＡを２０ｎｇ／μｌとなるようにＴＥで濃度調整した。
（２） 表２に示す通り、試薬を被検体分調製した。
（３）調製した試薬をＰＣＲ用チューブに２０μｌずつ分注した。
（４）被検体溶液を（３）のＰＣＲ用チューブに１μｌずつ加えた。
（５）ＰＣＲ用チューブをサーマルサイクラー「Ｇｅｎｅ  ＡｍｐＰＣＲｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）」にセットして、表３に示す条件によりＰＣＲ反応を行った。
【００７４】
【表２】
2008002948.tif 000004
【００７５】
【表３】
2008002948.tif 000005
【００７６】
上記手法により、被験者１〜９の被検体について標的核酸の増幅反応を行った。
また、配列番号６に示す塩基配列から成る核酸の５’末端にＤＩＧを結合させたものと、配列番号７に示す塩基配列から成る核酸の５’末端にビオチンを結合させたものとからなる二重鎖の人工合成標的核酸（Ｉ）を調製し、配列番号８に示す塩基配列から成る核酸の５’末端にＦＩＴＣを結合させたものと、配列番号９に示す塩基配列から成る核酸の５’末端にビオチンを結合させたものとからなる二重鎖の人工合成標的核酸（ＩＩ）を調製し、これら人工合成標的核酸（Ｉ）及び（ＩＩ）を混合して、人工合成標的核酸（Ｉ）及び（ＩＩ）がそれぞれ１００ｎＭになるようにＴＥを用いて濃度調整して、陽性コントロールとした。またＴＥを陰性コントロールとした。
【００７７】
＜標的核酸の検出＞
前記工程で作製した、リガンドが結合されている標的核酸の検出を行った。
以下に各検出方法の手順及び検出結果を示す。
[実施例１]
図４に示す容器を用いて標的核酸の検出を行った。
（１）抗ＤＩＧ抗体（ＤＡＫＯ社製、カタログＮｏ：Ｄ５１０５）に感作させたラテックス粒子Ａ（粒子径０．１μｍ、セラディン社製）の溶液を、緩衝液（２００ｍＭ  ＭＯＰＳＯ（ｐＨ７．４）、４％デキストラン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％アジ化ナトリウム）を用いて希釈し、金型成型により作製した図４に示す容器ａ（ｈ；０．２μｍ、ｌ；０．５μｍ、θ１；３０°）をウェルとする９６ウェル反応プレートに、一つのウェルにつき５０μｌずつ分注した。
（２）抗ビオチン抗体（ＤＡＫＯ社製、カタログＮｏ：Ｍ０７４３）感作ラテックス粒子溶液を、前記緩衝液を用いて希釈し、前記９６ウェルプレートに、一つのウェルにつき５０μｌずつ分注した。
（３）被検体、陽性コントロール及び陰性コントロールを各２０μｌずつ添加して、良く分散させた。
（４）室温で５分間静置後、陽性コントロール、陰性コントロールと比較して、被検体の沈降物の容器底面における捕捉分布を観測し、陽性、陰性を判定した。
【００７８】
[実施例２]
抗ＤＩＧ抗体に感作させたラテックス粒子Ａの溶液の代わりに、抗ＦＩＴＣ抗体（ＤＡＫＯ社製、カタログＮｏ：Ｄ５１０１）に感作させたラテックス粒子Ｂ（粒子径１０μｍ、マグスフェア社製）の溶液を用い、容器ａの代わりに金型成型により作製した図４に示す容器ｂ（ｈ；２０μｍ、ｌ；５０μｍ、θ１；３０°）をウェルとする９６ウェル反応プレートを用いたこと以外は実施例１と同様の手法にて、標的核酸の検出を行った。
【００７９】
[実施例３]
図５に示す容器を用いて標的核酸の検出を行った。
容器ａの代わりに、金型成型により作製した図５に示す容器ｃ（Ｌ；０．０５μｍ、ｄ；０．０３μｍ、θ２；３０°）をウェルとする９６ウェル反応プレートを用いたこと以外は、実施例１と同様の手法にて、標的核酸の検出を行った。
【００８０】
[実施例４]
抗ＤＩＧ抗体に感作させたラテックス粒子Ａの溶液の代わりに、抗ＦＩＴＣ抗体（ＤＡＫＯ社製、カタログＮｏ：Ｄ５１０１）に感作させたラテックス粒子Ｂの溶液を用い、容器ｃの代わりに金型成型により作製した図５に示す容器ｄ（Ｌ；１００μｍ、ｄ；６０μｍ、θ２；３０°）をウェルとする９６ウェル反応プレートを用いたこと以外は実施例３と同様の手法にて、標的核酸の検出を行った。
【００８１】
[実施例５]
図８に示す容器を用いて標的核酸の検出を行った。
（１）９６ウェルプレート「イモビライザーアミノロックウェルモジュールプレート(Ｎｕｎｃ社製、カタログＮｏ：４３６０２３)」の底面に、従来公知の方法に従って抗ビオチン抗体を結合させた。
（２）前記緩衝液を一つのウェルにつき５０μｌずつ分注した。
（３）被検体、前記陽性コントロール及び前記陰性コントロールを各２０μｌずつ分注した。
（４）５分間室温で静置した。
（５）抗ＤＩＧ抗体を結合した磁性微粒子「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  Ｅｐｏｘｙ(ＤＹＮＡＬ社製、カタログＮｏ：ＤＢ１４００１)」の溶液を、一つのウェルにつき５０μｌずつ分注してよく分散させた。
（６）５分間室温で静置した。
（７）プレートの底面外側より磁石をあて、陽性コントロール、陰性コントロールと比較して、磁性微粒子の容器底面における分布パターンを肉眼あるいは画像処理等の手法により観察して、陽性、陰性を判定した。
【００８２】
[実施例６]
抗ＤＩＧ抗体を結合した磁性微粒子の代わりに、抗ＦＩＴＣ抗体を結合した磁性微粒子を用いたこと以外は、実施例５と同様の手法にて、標的核酸の検出を行った。
【００８３】
（判定結果）
以上、実施例１〜６の検出結果と、該検出結果に基づく総合的な判定結果を表４に示した。総合的な判定として、実施例１〜６の判定結果のうち少なくとも３つの検出結果が同じであれば、その結果を最終的なタイピング結果とした。そして、本発明により、標的核酸の検出を高精度に行うことができることが確認された。
【００８４】
【表４】
2008002948.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明は、臨床検査の簡便化、低コスト化等に好適であり、医療関連分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】標的核酸を得る方法を示す概念図である。
【図２】受容体が結合された微粒子を示す図である。
【図３】標的核酸と連結されて凝集を生じる時の微粒子を示す概念図である。
【図４】本発明の容器の一例を示す断面図である。
【図５】本発明の容器の他の例を示す断面図である。
【図６】図４に示す容器を用いた場合の沈降物捕捉分布の一例を示す図である。
【図７】図５に示す容器を用いた場合の沈降物捕捉分布の一例を示す図である。
【図８】本発明の容器の他の例を示す断面図である。
【図９】受容体が結合された磁性微粒子を示す図である。
【図１０】標的核酸を介して、図８に示す容器及び図９に示す磁性微粒子を連結した状態を示す概念図である。
【図１１】図１０における磁性微粒子の分布パターンの一例を示す図である。
【符号の説明】
【００８７】
３０・・・標的核酸、３１・・・第一のリガンド、３２・・・第二のリガンド、３３・・・第一の微粒子、３３１・・・第一の受容体、３４・・・第二の微粒子、３４１・・・第二の受容体
【図１】
2008002948.tif 000007
【図２】
2008002948.tif 000008
【図３】
2008002948.tif 000009
【図４】
2008002948.tif 000010
【図５】
2008002948.tif 000011
【図６】
2008002948.tif 000012
【図７】
2008002948.tif 000013
【図８】
2008002948.tif 000014
【図９】
2008002948.tif 000015
【図１０】
2008002948.tif 000016
【図１１】
2008002948.tif 000017
【配列表】
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