(57)【要約】【課題】本発明は、主に、新規抗酸化化合物、抗酸化性藻類エキス、及びそれらの製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、下記構造式（Ｉ）、（Ｉ−Ｉ）、（Ｉ−ＩＩ）又は（Ｉ−ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩及びその製造方法、抗酸化性藻類エキス及びその製造方法、該化合物又はその塩、該抗酸化性藻類エキスを含有する食品組成物、医薬組成物、化粧料、油脂組成物、ペットフード及び飼料用組成物を提供する。2008247901.tif 000017【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（Ｉ）で表される化合物又はその塩：
【化１】
2008247901.tif 000014
ここで、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子（−Ｈ）、メチル基（−ＣＨ３）、１−カルボキシ−２−ヒドロキシプロピル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３）、１−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基、（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＯＨ）、１−カルボキシ−２−メチルプロピル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２（ＣＨ３）ＣＨ３）、１，３−ジカルボキシプロピル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）、２−ヒドロキシエチル基（−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、Ｅ／Ｚ  １−カルボキシ−１−プロペニル基（−Ｃ（ＣＯＯＨ）＝ＣＨＣＨ３）、カルボキシメチル基（−ＣＨ２ＣＯＯＨ）、１−プロペニル基（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３）、１−カルボキシエチル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ３）、４−アミノ−１−カルボキシ−４−オキソブチル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２）、１−ヒドロキシメチル−２−ヒドロキシエチル基（−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ）からなる群より選択される。
【請求項２】
下記構造式（Ｉ−Ｉ）、（Ｉ−ＩＩ）又は（Ｉ−ＩＩＩ）の構造で表される、化合物又はその塩（Ｒ１及びＲ２は、請求項１の通りである）：
【化２】
2008247901.tif 000015
ここで、点線で示した結合は共鳴状態の結合を示す。
【請求項３】
Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がカルボキシメチル基である、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
Ｒ１及びＲ２の一方がカルボキシメチル基であるとき、他方の官能基が１−カルボキシ−２−ヒドロキシプロピル基及び１−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する、酸化防止剤及び／又はラジカル消去剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する、一酸化窒素産生抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する食品組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する、医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する、化粧料。
【請求項１０】
皮膚の老化防止又は美白のための、請求項８の化粧料。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する、油脂組成物。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する、ペットフード及び／又は飼料用組成物。
【請求項１３】
下記の構造式（ＩＩ）
【化３】
2008247901.tif 000016
（ここで、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子（−Ｈ）、メチル基（−ＣＨ３）、１−カルボキシ−２−ヒドロキシプロピル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３）、１−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基、（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＯＨ）、１−カルボキシ−２−メチルプロピル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２（ＣＨ３）ＣＨ３）、１，３−ジカルボキシプロピル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）、２−ヒドロキシエチル基（−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、Ｅ／Ｚ  １−カルボキシ−１−プロペニル基（−Ｃ（ＣＯＯＨ）＝ＣＨＣＨ３）、カルボキシメチル基（−ＣＨ２ＣＯＯＨ）、１−プロペニル基（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３）、１−カルボキシエチル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ３）、４−アミノ−１−カルボキシ−４−オキソブチル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２）、１−ヒドロキシメチル−２−ヒドロキシエチル基（−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ）からなる群より選択される）で表される化合物又はその塩を含有する溶液、並びに／或いは、該化合物又はその塩の供給源を含有する溶液、懸濁液及び／又は溶媒をｐＨ６．５以上にて、以下の式（Ａ）又は（Ｂ）で規定される下限温度で加熱する工程を包含する、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩の製造方法：
（ｐＨ６．５〜７．６のとき）
Ｔ  （℃）  ＝  −２６ＰＨ  ＋  ２８９                  式（Ａ）
（ｐＨ７．６以上のとき）
Ｔ  （℃）  ＝  −６．３ＰＨ  ＋  １３９                式（Ｂ）
ここで、Ｔは下限温度、ＰＨは処理液のｐＨである。
【請求項１４】
逆相分配クロマトグラフィー、順相分配クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーからなる群より選択される少なくとも１種の精製方法により、前記加熱工程により得られた産物から請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を精製する工程をさらに包含する、請求項１３の製造方法。
【請求項１５】
以下の工程Ａ〜Ｅを包含し、該工程の順番が以下の製造方法１〜３のいずれかで規定される、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物を含む抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキスの製造方法：
工程Ａ：水、緩衝液、或いは、水及び／又は緩衝液と有機溶媒の混液と藻類とを７５℃以下で混合する工程
工程Ｂ：混合物のｐＨを６．５以上に調整する工程
工程Ｃ：加熱する工程
工程Ｄ：固液分離する工程
工程Ｅ：溶媒可溶性成分を分子量に基づき分画し、分子量約２０万以下の分子を含む画分を得る工程
製造方法１：工程Ａ→工程Ｂ→工程Ｃ→工程Ｄ→工程Ｅ
製造方法２：工程Ａ→工程Ｄ→工程Ｅ→工程Ｂ→工程Ｃ
製造方法３：工程Ａ→工程Ｄ→工程Ｂ→工程Ｃ→工程Ｅ
（ここで、工程Ａで得られる混合物のｐＨが６．５以上である場合には、工程Ｂを省略してもよい）。
【請求項１６】
前記工程Ｃの加熱温度の下限が、請求項１３に記載の式で表される、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
藻類と水とを混合する工程、
１２０℃以上１５０℃以下で３０分以上の加熱を行う工程、次いで、
分子量に基づき分画し、分子量約２０万以下の分子を含む画分を得る工程、
を包含する、請求項１又は２に記載の化合物を含む抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキスの製造方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７に記載の製造方法により得られた、抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキス。
【請求項１９】
請求項１４に記載の精製方法により、請求項１８に記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキスから請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を精製する工程を包含する、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩の製造方法。
【請求項２０】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を０．１重量％以上含有する、請求項１８に記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキス。
【請求項２１】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩と請求項１２に記載の構造式（ＩＩ）の化合物又はその塩との存在比が、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩：構造式（ＩＩ）の化合物又はその塩＝１０〜１００：９０〜０である、請求項１８又は２０に記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキス。
【請求項２２】
藻類が紅藻である、請求項１８又は２０に記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキス。
【請求項２３】
紅藻がＰｏｒｐｈｙｒａ属であることを特徴とする、請求項２２に記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキス。
【請求項２４】
請求項１８、２０〜２３のいずれかに記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキスを含む、食品組成物。
【請求項２５】
請求項１８、２０〜２３のいずれかに記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキスを含む、医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１８、２０〜２３のいずれかに記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキスを含む、化粧料。
【請求項２７】
皮膚の老化防止又は美白のための、請求項２６の化粧料。
【請求項２８】
請求項１８、２０〜２３のいずれかに記載の抗酸化性藻類エキスを含む、油脂組成物。
【請求項２９】
請求項１８、２０〜２３のいずれかに記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキスを含む、ペットフード及び／又は飼料用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に、新規な抗酸化化合物、一酸化窒素産生抑制化合物、抗酸化性藻類エキス、一酸化窒素産生抑制藻類エキス及びそれらの製造方法を提供する。本発明は、また、該新規抗酸化化合物、一酸化窒素産生抑制化合物、該抗酸化性藻類エキス及び／又は一酸化窒素産生抑制藻類エキスを含有する酸化防止剤（活性酸素・フリーラジカル消去剤）、一酸化窒素産生抑制剤、食品組成物、医薬組成物、化粧料、油脂組成物、飼料用組成物およびペットフードにも関する。
【背景技術】
【０００２】
食品や飼料、ペットフード、化粧品、サニタリー用品、洗剤、油脂、医薬品、化成品その他工業製品を変質させたり劣化させたりする原因として、空気中の酸素や溶存酸素、熱・光等によって起こる酸化が知られている。このような品質の劣化を防止する目的で、種々の酸化防止剤が開発されている。
【０００３】
例えば、人工合成により供給されている酸化防止剤としては、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキシルアニソール（ＢＨＡ）や、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキシルトルエン（ＢＨＴ）などが広く用いられている。これらは安定な化合物で、酸化防止効果に優れるが、人体の健康に対する悪影響（発がん性や脱毛促進作用）が報告されており、食品等への使用が制限されている。さらに、近年は、直接人体・生体に触れる可能性のある製品については、安心・安全を求める動き、使用が認められている分野においても、これらの酸化防止剤の使用を制限する動きが高まっている。
【０００４】
また、天然由来の酸化防止剤、たとえば、トコフェロールやアスコルビン酸等は、安全性が高いものの、安定性に欠けるため、逆に着色や変色、においの変化の原因となるなどの問題がある場合が多い。さらに、近年の流通環境の変化やコンビニエンスストアの普及、包装材料の多様化に伴って、製品が日光や蛍光灯などの光に曝される機会が増えており、安全でなおかつ安定性の高い酸化防止剤の開発がなおいっそう望まれている。
【０００５】
酸化は、生体防御や障害・炎症・疾病とも大きな関わりがあるといわれている。活性酸素種や活性窒素種、フリーラジカルが引き起こす酸化ストレスは、それが障害を引き起こさない程度の合目的的用量である場合には、生体防御力を高め、ヒトや動物に健康をもたらす。しかしながら、加齢・ストレスに伴う細胞機能の低下、高カロリー食、タバコ・汚染物質・紫外線等の暴露、過度の運動等による過剰な酸化ストレスは細胞構成成分に障害を与え、様々な疾病の原因となる。
【０００６】
活性酸素種としては、還元分子種であるスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）および励起分子種である一重項酸素（１Ｏ２）などが知られている。また、不飽和脂肪酸の酸化物である不飽和脂肪酸ペルオキシラジカル（ＬＯＯ・）、不飽和脂肪酸ラジカル（Ｌ・）、不飽和脂肪酸ヒドロペルオキシド（ＬＯＯＨ）、不飽和脂肪酸アルコキシラジカル（ＬＯ・）等も同様の酸化による障害を引き起こすことが知られている。これらの活性種が引き起こす疾病としては、動脈硬化性疾患、癌・腫瘍性疾患、細胞障害、糖尿病、脳神経疾患（脳梗塞・認知症・パーキンソン病）、皮膚の老化・色素沈着、白内障・網膜疾患、消化器・粘膜疾患、肺・気管支障害等が知られている。
【０００７】
さらに、生体内で多様かつ重要な役割（血管拡張・微生物の殺菌・神経伝達等）を有する生理活性ラジカルとして、一酸化窒素が知られている。単球等の免疫細胞は、微生物の刺激に対して、殺菌効果の高い一酸化窒素を産生することが知られている。しかしながら、一酸化窒素はフリーラジカルであり、その過剰産生が、生体内の酸化ストレス亢進を招いている。一酸化窒素産生の制御により、酸化ストレスが引き起こす様々な疾患（炎症、動脈硬化症、加齢性疾患）の予防が可能と考えられる。
【０００８】
以上のことから、ヒトにおける過剰な酸化ストレスを緩和することを目的とし、酸化防止作用、活性酸素種・一酸化窒素・フリーラジカル等の消去能を有する食品や化粧品、医薬品の開発が望まれている。また、ペットや家畜等においても同様の効果を有する飼料の開発が望まれている。
【０００９】
一方、藻類、例えば、岩礁地帯等に生息する紅藻類は、主に日光に由来する紫外線等に暴露されていることから、過剰な酸化ストレスを緩和する因子を有する可能性が指摘されている。中でも、スサビノリ（Porphyra yezoensis）、アサクサノリ（Porphyra tenera）、ウップルイノリ（Porphyra pseudolinearis）、壇紫菜（Porphyra haitanensis）等に代表されるアマノリ属藻類は東アジア地域で大量に栽培されていることから、上述の酸化防止効果を有する化合物の原料として期待されている。さらに、近年、スサビノリ生育環境の悪化により、ノリの色落ちや品質低下がもたらされており、商品価値の低い「色落ちノリ」や「下等ノリ」が大量に廃棄されている。このような廃棄ノリに新たな価値を見いだし、有効利用することが急務となっている。
【００１０】
非特許文献１は、スサビノリに含まれるカタラーゼの精製とその活性酸素消去能について言及している。カタラーゼは過酸化水素を不均化して酸素と水に変換する反応を触媒し、細胞内の酸化・還元制御に関与する重要な酵素である。しかしながらカタラーゼはタンパク質であり、高分子で安定性が低く、加熱やｐＨ変化等により容易に失活する、あるいは、経口による体内吸収が期待できないといった欠点がある。また、アマノリ属に含まれるカタラーゼの含量も極めて少ないことから、カタラーゼを核にしたアマノリ属の産業的利用は実現していない。
【００１１】
非特許文献２は、ヘキサン、酢酸エチル、アセトン、クロロホルム、メタノール、熱水を用いて抽出したスサビノリ抽出物の抗酸化性について言及しているが、９０℃でのスサビノリ熱水抽出物の抗酸化活性が低いという結論に至っている。また、メタノール抽出物より、ノリ由来の抗酸化性因子として既知物質ウスジレン（Ｕｓｕｊｉｒｅｎｅ）を特定しているが、産業的に利用するには本成分の含量は極めて少なく、現実的でない。
非特許文献３は、Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｈａｉｔａｎｅｎｓｉｓ中の硫酸化多糖類の抗酸化性について言及している。本文献における硫酸化多糖類の抗酸化性は低く、産業上利用することは難しい。また、硫酸化多糖類は高分子であり粘性を有することから、物性的な面から食品や医薬への応用が厳しく限定されてしまう。以上の点から硫酸化多糖類の酸化防止剤としての産業利用は未だ実現していない。
【００１２】
以上の背景から、酸化防止剤の原料としての藻類の利用は期待されていたものの、これまで、食用以外の用途に用いられることはなかった。
【非特許文献１】Nakano et al., Characterization of catalase from the seaweed Porphyra yezoensis., Plant Sci., 104 (1995) 127-133.
【非特許文献２】Nakayama et al., Antioxidant effects of the constituent of susabinori (Porphyra yezoensis)., JAOCS, 76 (1999) 649-653
【非特許文献３】Zhang et al., Antioxidant activities of sulfated polysaccharide fractions from Porphyra haitanesis., J. Appl. Phycol., 15 (2003) 305-310.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、主に、新規抗酸化化合物、一酸化窒素産生抑制化合物、抗酸化性藻類エキス、一酸化窒素産生抑制藻類エキス、及びそれらの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、マイコスポリン様アミノ酸（以下、ＭＡＡ（Ｍｙｃｏｓｐｏｒｉｎｅ−ｌｉｋｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ）とも呼ぶ）を含む溶液をｐＨ６．５以上にて、所定の温度条件で加熱することにより得られた処理物中に抗酸化成分が含まれていることを見いだし、その抗酸化成分を単離、精製、構造決定した。さらに、この抗酸化成分が一酸化窒素産生抑制作用も有することも見出した。さらに、この抗酸化成分の前駆体はＭＡＡであり、ＭＡＡをｐＨ６．５以上の環境下で所定の温度条件で加熱することにより、抗酸化成分が生成されることを見出した。さらに、藻類よりＭＡＡを含む画分を調整し、ｐＨ６．５以上の環境下で所定の温度条件で加熱することにより、抗酸化性を有するエキスが製造可能なことを見出した。本発明は、かかる知見に基づき完成された。
【００１５】
即ち、本発明は、主に、以下の事項に関する。
［項１］下記構造式（Ｉ）で表される化合物又はその塩：
【００１６】
【化１】
2008247901.tif 000002
【００１７】
ここで、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子（−Ｈ）、メチル基（−ＣＨ３）、１−カルボキシ−２−ヒドロキシプロピル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３）、１−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基、（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＯＨ）、１−カルボキシ−２−メチルプロピル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２（ＣＨ３）ＣＨ３）、１，３−ジカルボキシプロピル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）、２−ヒドロキシエチル基（−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、Ｅ／Ｚ  １−カルボキシ−１−プロペニル基（−Ｃ（ＣＯＯＨ）＝ＣＨＣＨ３）、カルボキシメチル基（−ＣＨ２ＣＯＯＨ）、１−プロペニル基（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３）、１−カルボキシエチル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ３）、４−アミノ−１−カルボキシ−４−オキソブチル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２）、１−ヒドロキシメチル−２−ヒドロキシエチル基（−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ）からなる群より選択される。
［項２］下記構造式（Ｉ−Ｉ）、（Ｉ−ＩＩ）又は（Ｉ−ＩＩＩ）の構造で表される、化合物又はその塩（Ｒ１及びＲ２は、項１の通りである）：
【００１８】
【化２】
2008247901.tif 000003
【００１９】
ここで、点線で示した結合は共鳴状態の結合を示す。
［項３］Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がカルボキシメチル基である、項１又は２に記載の化合物又はその塩。
［項４］Ｒ１及びＲ２の一方がカルボキシメチル基であるとき、他方の官能基が１−カルボキシ−２−ヒドロキシプロピル基及び１−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選択される、項１〜３のいずれかに記載の化合物又はその塩。
［項５］項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する、酸化防止剤及び／又はラジカル消去剤。
［項６］項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する、一酸化窒素産生抑制剤。
［項７］項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する食品組成物。
［項８］項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する、医薬組成物。
［項９］項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する、化粧料。
［項１０］皮膚の老化防止又は美白のための、項８の化粧料。
［項１１］項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する、油脂組成物。
［項１２］項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を含有する、ペットフード及び／又は飼料用組成物。
［項１３］下記の構造式（ＩＩ）
【００２０】
【化３】
2008247901.tif 000004
【００２１】
（ここで、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子（−Ｈ）、メチル基（−ＣＨ３）、１−カルボキシ−２−ヒドロキシプロピル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３）、１−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基、（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＯＨ）、１−カルボキシ−２−メチルプロピル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２（ＣＨ３）ＣＨ３）、１，３−ジカルボキシプロピル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）、２−ヒドロキシエチル基（−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、Ｅ／Ｚ  １−カルボキシ−１−プロペニル基（−Ｃ（ＣＯＯＨ）＝ＣＨＣＨ３）、カルボキシメチル基（−ＣＨ２ＣＯＯＨ）、１−プロペニル基（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３）、１−カルボキシエチル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ３）、４−アミノ−１−カルボキシ−４−オキソブチル基（−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２）、１−ヒドロキシメチル−２−ヒドロキシエチル基（−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ）からなる群より選択される）で表される化合物又はその塩を含有する溶液、並びに／或いは、該化合物又はその塩の供給源を含有する溶液、懸濁液及び／又は溶媒をｐＨ６．５以上にて、以下の式（Ａ）又は（Ｂ）で規定される下限温度で加熱する工程を包含する、項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩の製造方法：
（ｐＨ６．５〜７．６のとき）
Ｔ  （℃）  ＝  −２６ＰＨ  ＋  ２８９                  式（Ａ）
（ｐＨ７．６以上のとき）
Ｔ  （℃）  ＝  −６．３ＰＨ  ＋  １３９                式（Ｂ）
ここで、Ｔは下限温度、ＰＨは処理液のｐＨである。
［項１４］逆相分配クロマトグラフィー、順相分配クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーからなる群より選択される少なくとも１種の精製方法により、前記加熱工程により得られた産物から項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を精製する工程をさらに包含する、項１３の製造方法。
［項１５］以下の工程Ａ〜Ｅを包含し、該工程の順番が以下の製造方法１〜３のいずれかで規定される、項１〜４のいずれかに記載の化合物を含む抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキスの製造方法：
工程Ａ：水、緩衝液、或いは、水及び／又は緩衝液と有機溶媒の混液と藻類とを７５℃以下で混合する工程
工程Ｂ：混合物のｐＨを６．５以上に調整する工程
工程Ｃ：加熱する工程
工程Ｄ：固液分離する工程
工程Ｅ：溶媒可溶性成分を分子量に基づき分画し、分子量約２０万以下の分子を含む画分を得る工程
製造方法１：工程Ａ→工程Ｂ→工程Ｃ→工程Ｄ→工程Ｅ
製造方法２：工程Ａ→工程Ｄ→工程Ｅ→工程Ｂ→工程Ｃ
製造方法３：工程Ａ→工程Ｄ→工程Ｂ→工程Ｃ→工程Ｅ
（ここで、工程Ａで得られる混合物のｐＨが６．５以上である場合には、工程Ｂを省略してもよい）。
［項１６］前記工程Ｃの加熱温度の下限が、項１３に記載の式で表される、項１５に記載の製造方法。
［項１７］藻類と水とを混合する工程、
１２０℃以上１５０℃以下で３０分以上の加熱を行う工程、次いで、
分子量に基づき分画し、分子量約２０万以下の分子を含む画分を得る工程、
を包含する、項１又は２に記載の化合物を含む抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキスの製造方法。
［項１８］項１５〜１７に記載の製造方法により得られた、抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキス。
［項１９］項１４に記載の精製方法により、項１８に記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキスから項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を精製する工程を包含する、項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩の製造方法。
［項２０］項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を０．１重量％以上含有する、項１８に記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキス。
［項２１］項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩と項１２に記載の構造式（ＩＩ）の化合物又はその塩との存在比が、項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩：構造式（ＩＩ）の化合物又はその塩＝１０〜１００：９０〜０である、項１８又は２０に記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキス。
［項２２］藻類が紅藻である、項１８又は２０に記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキス。
［項２３］紅藻がＰｏｒｐｈｙｒａ属であることを特徴とする、項２２に記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキス。
［項２４］項１８、２０〜２３のいずれかに記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキスを含む、食品組成物。
［項２５］項１８、２０〜２３のいずれかに記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキスを含む、医薬組成物。
［項２６］項１８、２０〜２３のいずれかに記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキスを含む、化粧料。
［項２７］皮膚の老化防止又は美白のための、項２６の化粧料。
［項２８］項１８、２０〜２３のいずれかに記載の抗酸化性藻類エキスを含む、油脂組成物。
［項２９］項１８、２０〜２３のいずれかに記載の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキスを含む、ペットフード及び／又は飼料用組成物。
【００２２】
本発明の化合物
本発明の化合物は、構造式（Ｉ）で表される化合物又はその塩：
【００２３】
【化４】
2008247901.tif 000005
【００２４】
或いは、上記構造式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を水、メタノール、エタノール、アセトニトリル等のプロトン性溶媒に溶解させた時に、構造の一部が共鳴することにより得られる構造式（Ｉ−Ｉ）、構造式（Ｉ−ＩＩ）又は構造式（Ｉ−ＩＩＩ）で表される共鳴混成体である。
【００２５】
【化５】
2008247901.tif 000006
【００２６】
（ここで、点線で示した結合は共鳴状態の結合を示す。）
ここで、構造式（Ｉ）、（Ｉ−Ｉ）、（Ｉ−ＩＩ）及び（Ｉ−ＩＩＩ）において、Ｒ１及びＲ２は、前述の通りである。また、Ｒ１及びＲ２について、１−カルボキシ−２−ヒドロキシプロピル基はスレオニン由来、１−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基はセリン由来、１−カルボキシ−２−メチルプロピル基はバリン由来、１，３−ジカルボキシプロピル基はグルタミン酸由来、カルボキシメチル基はグリシン由来、１−カルボキシエチル基はアラニン由来、４−アミノ−１−カルボキシ−４−オキソブチル基はグルタミン由来の置換基である。なお、各アミノ酸は、Ｌ体であってもＤ体であってもよい。また、Ｒ１及びＲ２について、２−ヒドロキシエチル基はエタノールアミン由来、Ｅ／Ｚ  １−カルボキシ−１−プロペニル基は２−アミノクロトン酸由来、１−プロペニル基は１−プロペニルアミン由来、１−ヒドロキシメチル−２−ヒドロキシエチル基はセリノール由来の置換基である。ここで、アミノ酸又は化合物由来の置換基とは、アミノ酸又は化合物のα炭素から−ＮＨ２を除いた部分の置換基を意味する。
【００２７】
好ましいＲ１及びＲ２の組み合わせは、Ｒ１及びＲ２のうち一方が−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−Ｈ及び−ＣＨ３からなる群より選択される置換基であるのに対して、他方が−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２（ＣＨ３）ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ及び−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２ＯＨからなる群より選択される置換基である。
【００２８】
構造式（Ｉ）で表される化合物は、互変異性を有し得る。
【００２９】
構造式（Ｉ）で表される化合物の塩には、アミノ基の酸付加塩、或いは、カルボキシル基又は水酸基の塩基塩が含まれる。
【００３０】
酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。
【００３１】
塩基塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩、又は、カルシウム塩のようなアルカリ土類金属塩が挙げられる。
【００３２】
本書では、上記構造式（Ｉ）、（Ｉ−Ｉ）、（Ｉ−ＩＩ）又は（Ｉ−ＩＩＩ）で表される化合物をＭＡＣ（Ｍｙｃｏｓｐｏｒｉｎｅ−ｌｉｋｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  −ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ；マイコスポリン様アミノ酸由来抗酸化化合物）とも称する。
【００３３】
本書では、上記構造式（ＩＩ）で表される化合物又はマイコスポリン様アミノ酸をＭＡＡ（Ｍｙｃｏｓｐｏｒｉｎｅ−ｌｉｋｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ）とも称する。
【００３４】
ＭＡＣは、藻類、シアノバクテリア、光合成微生物、熱帯産の無脊椎動物等に普遍的に存在する紫外線吸収物質であるＭＡＡを前駆体とし、ＭＡＡが溶解している液体をｐＨ６．５以上の環境下、所定の温度条件で加熱することにより生成することができる。質量分析により帰属されるＭＡＡとＭＡＣの質量の差（ＭＷＭＡＡ−ＭＷＭＡＣ）が水（Ｈ２Ｏ）の分子量１８Ｄａに等しく、また、核磁気共鳴スペクトル等により帰属されるそれぞれの物質の分子構造の比較から、ＭＡＣはＭＡＡより脱水反応を経て生成されると推定される。
【００３５】
【化６】
2008247901.tif 000007
【００３６】
ＭＡＡとＭＡＣは類似する部分を有しているにもかかわらず、驚くべきことに、ＭＡＡは抗酸化作用を示さず、ＭＡＣは強い抗酸化作用を示す。これは、ＭＡＣに特異的な部分が抗酸化作用に関与していることを意味する。これより、ＭＡＣに特異的な部分を有するＭＡＣの塩も、同様の抗酸化作用を有すると考えられる。ＭＡＡの構造は、アミノ酸の窒素基が、シクロへキセノン環に結合した特徴的なものである。アミノ酸の置換基部分は、ＭＡＡとＭＡＣで変わりないことから、ＭＡＣの抗酸化性に直接的あるいは間接的に関与しているのは、アミノ酸の置換基を除いた部分の構造であると推定される。これより、前記構造式（Ｉ）、（Ｉ−Ｉ）、（Ｉ−ＩＩ）又は（Ｉ−ＩＩＩ）で表される化合物において、Ｒ１及びＲ２で表される前記アミノ酸由来の置換基が他のアミノ酸由来の置換基に置き換わった該化合物も、前記構造式（Ｉ）、（Ｉ−Ｉ）、（Ｉ−ＩＩ）又は（Ｉ−ＩＩＩ）で表される化合物と同様の抗酸化作用を有すると考えられる。
【００３７】
ＭＡＣ又はその塩の抗酸化作用のレベルは、ＤＰＰＨラジカル消去活性の測定試験により評価した。この試験に用いた１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）は分子内に安定なフリーラジカルを有する。ＤＰＰＨラジカル消去活性試験では、このフリーラジカルの消去率を吸光度の減少率によって求め、この消去率により試験物質の抗酸化作用を測定する。ＤＰＰＨラジカル消去活性を有する物質は、一重項酸素やヒドロキシラジカル、過酸化脂質のラジカルを消去することが期待されている。
【００３８】
本発明のＭＡＣ又はその塩の抗酸化作用は、概して、合成抗酸化剤として多用されるブチルヒドロキシルトルエン（ＢＨＴ）の抗酸化作用よりも顕著に高い。本発明のＭＡＣ又はその塩のＤＰＰＨラジカル消去活性におけるＩＣ５０値（モル）は、ＢＨＴのＤＰＰＨラジカル消去活性の例えば約５０％以下、好ましくは約４０％以下、より好ましくは約３５％以下であり得る。
【００３９】
ＭＡＣ又はその塩の製造方法
本発明は、下記の構造式（ＩＩ）
【００４０】
【化７】
2008247901.tif 000008
【００４１】
（ここで、Ｒ１及びＲ２は、前述の通りである）
で表される化合物又はその塩を含有する溶液、並びに／或いは、該化合物又はその塩の供給源を含有する溶液、懸濁液及び／又は溶媒をｐＨ６．５以上にて、以下の式（Ａ）又は（Ｂ）で規定される下限温度で加熱する工程を包含する、ＭＡＣ又はその塩の製造方法も提供する：
（ｐＨ６．５−７．６のとき）
Ｔ  （℃）  ＝  −２６  ＰＨ  ＋  ２８９                  式（Ａ）
（ｐＨ７．６以上のとき）
Ｔ  （℃）  ＝  −６．３  ＰＨ  ＋  １３９                式（Ｂ）
ここで、Ｔは生成効率５０％を満たす下限温度、ＰＨは処理液のｐＨである。
【００４２】
なお、生成効率とは、存在する構造式（ＩＩ）の化合物（ＭＡＡ）又はその塩が総てＭＡＣ又はその塩に変換した場合を１００％として表したものである。ＭＡＡ又はその塩を、本発明のＭＡＣ又はその塩に変換するためには、前記下限温度が肝要である。加熱温度の上限は特に限定されないが、１５０℃を超える温度での加熱はＭＡＣ又はその塩の分解を引き起こす恐れがあり、好適でない。
【００４３】
式（Ａ）及び（Ｂ）は、生成効率に及ぼす加熱時間およびｐＨの影響について検討することにより導き出された。
【００４４】
加熱時間は、ＭＡＡ又はその塩の濃度および溶媒のｐＨに依存しており、特に限定されない。例えば、ＭＡＡ又はその塩の濃度が１．２ｍＭである抽出溶媒を２０ｍＭリン酸緩衝液存在下１２０℃で加熱するとき、生成量がプラトーに達する時間は１０分である。しかしながら、ＭＡＡ又はその塩の濃度がこれより高濃度である場合には、通常、より長い加熱時間を要する。また、加熱時間は加熱方法、所望の収量等によっても異なっており、例えば、連続式熱交換器を用いた加熱を行う場合には、加熱温度は５秒以上３０分以下が好ましい。また、加熱釜等を用いてバッチ加熱する際には、効率よいＭＡＣの生成を促すため、５分以上の加熱が好ましい。省エネルギーおよびＭＡＣの変質防止の観点から、加熱時間の上限は、好ましくは１０時間以下、より好ましくは６時間以下である。
【００４５】
ＭＡＡ又はその塩の供給源としては、藻類、シアノバクテリア、光合成プランクトンあるいは暖海性の無脊椎動物、そのペースト、エキス、粉砕物、破砕物、乾燥物等が挙げられるが、ＭＡＡ又はその塩を含む物質であれば特に限定されない。原料の確保という点では、藻類（特に、紅藻類）、そのエキス、粉砕物、乾燥物等が好ましい。
【００４６】
紅藻類としては、例えば、Porphyridium（チノリモ）属、Bangia（ウシケノリ）属、Porphyra（アマノリ）属、Acanthopeltis（ユイキリ）属、Gelidiella（シマテングサ）属、Gelidium（テングサ）属、Pterocladia（オバクサ）属、Ptilophora（ヒラクサ）属、Yatabella（ヤタベグサ）属、Halosaccion（ベニフクロノリ）属、Palmaria（ダルス）属、Pseudorhododiscus（ベニゴロモ）属、Rhodophysema（フチトリベニ）属、Callophyllis（トサカモドキ）属、Carpopeltis（マツノリ）属、Cirrulicarpus（エゾトサカ）属、Constantinea（オキツバラ）属、Cryptonemia（カクレイト）属、Dudresnaya（ヒビロウド）属、Dumontia（リュウモンソウ）属、Gloiopeltis（フノリ）属、Gloiosiphonia（イトフノリ）属、Grateloupia（ムカデノリ）属、Halymenia（イソノハナ）属、Hyalosiphonia（イソウメモドキ）属、Kallymenia（ツカサノリ）属、Masudaphycus（ニセカレキグサ）属、Neodilsea（アカバ）属、Pachymeniopsis（フダラク）属、Peysonnelia（イワノカワ）属、Pikea（ミチガエソウ）属、Polyopes（マタボウ）属、Prionitis（キントキ）属、Schimmelmannia（ナガオバネ）属、Tichocarpus（カレキグサ）属、Ahnfeltiopsis（オキツノリ）属、Calosiphonia（ヌメリグサ）属、Catenella（イソモッカ）属、Caulacanthus（イソダンツウ）属、Ceratodictyon（カイメンソウ）属、Chondrus（ツノマタ）属、Eucheuma（キリンサイ）属、Gelidiopsis（テングサモドキ）属、Gigartina（スギノリ）属、Gracilaris（オゴノリ）属、Halarachnion（ススカケベニ）属、Hypnea（イバラノリ）属、Mastocarpus（イボノリ）属、Mazzaella（アカバギンナンソウ）属、Meristotheca（トサカノリ）属、Nemastoma（ヒカゲノイト）属、Phacelocarpus（キジノオ）属、Platoma（ニクホウノオ）属、Plocamiumn（ユカリ）属、Portieria（Chondracoccus）属、（ナミノハナ）属、Rhodoglossum（イボギンナン）属、Sarcodia（アツバグサ）属、Schizymenia（ベニスナゴ）属、Schmitzia（ホウノオ）属、Solieria（ミリン）属、Stenogramma（ハスジグサ）属、Tsengia（ヒカゲノイト）属、Tylotus（ナミイワタケ）属、Acanthophora（トゲノリ）属、Acrocystis（ツクシホウヅキ）属、Acrosorium（ハイウスバ）属、Acrothamnion（リュウノタマ）属、Amansia（ウスバヒオドシ）属、Antithamnion（フタツガサネ）属、Ardissonula（ヒヨクソウ）属、Benzaitenia（ベンテンモ）属、Bostrychia（コケモドキ）属、Brachioglossum（ヒゲムラサキ）属、Callithamnion（キヌイトグサ）属、Caloglossa（アヤギヌ）属、Campylaephora（エゴノリ）属、CarpoblepharisCentroceras（ゴノメグサ）属、Ceramium（イギス）属、Chondria（ユナ）属、Congregatocarpus（ノコハノリ）属、Dasya（ダジア）属、Delesseria（ヌメハノリ）属、Delesseriopsis（ウスムラサキ）属、Digenea（マクリ）属、Enantiocladia（アイソメグサ）属、Enelithosiphonia（マキイトグサ）属、Euptilota（ヨツガサネ）属、Griffithsia（カザシグサ）属、Herpochondria（ニクサエダ）属、Herposiphonia（ヒメゴケ）属、Heterosiphonia（イソハギ）属、シマダジアHypoglossum（ベニハノリ）属、Janczewskia（ソゾマクラ）属、Kurogia（イカダコノハ）属、Laurencia（ソゾ）属、Leveillea（ジャバラノリ）属、Marionella（ハブタエノリ）属、Martensia（アヤニシキ）属、Melanamansia（ヒオドシグサ）属、Membranoptera（ホソベニヤバネグサ）属、Murrayella（ナガミグサ）属、Myriogramme（スジギヌ）属、Neoholmesia（スズシロノリ）属、Neoptilota（カタワベニヒバ）属、Neorhodomela（フジマツモ）属、Neurymenia（イソバショウ）属、Nithophyllum（ウスバノリ）属、Odonthalia（ノコギリヒバ）属、Phycodrys（カシワバコノハノリ）属、Platysiphonia（ヒゲウスバ）属、Platythamnion（イトシノブ）属、Pleonosporium（クスダマ）属、Plumariella（イソシノブ）属、Polysiphonia（イトグサ）属、Pterosiphonia（ハネグサ）属、Ptilota（クシベニヒバ）属、Reinboldiella（チリモミジ）属、Rhodomela（フジマツモ）属、Schizoseris（ベニヤハズ）属、Sorella（ウスベニ）属、Spermathamnion（ヒビダマ）属、Spyridia（ウブゲグサ）属、Symphyocladia（イソムラサキ）属、Tolypiocladia（イトクズグサ）属、Vidalia（カエリナミ）属、Vanvoorstia（カラゴロ）属、Yamadaphycus（コノハノリモドキ）属、Asparagopsis（カギケノリ）属、Bonnemaisonia（カギノリ）属、Delisea（タマイタダキ）属、Ptilonia（ヒロハタマイタダキ）属、Pachymeniopsis（フダラク）属、Peysonnelia（イワノカワ）属、Pikea（ミチガエソウ）属、Polyopes（マタボウ）属、Prionitis（キントキ）属、Schimmelmannia（ナガオバネ）属、Tichocarpus（カレキグサ）属等が挙げられる。中でも、産業上利用される紅藻類で生産量が多く安定しているPorphyra属、Gelidiella 属、Palmaria属、Gloiopeltis属、Chondrus属、Eucheuma属、Gigartina属、Gracilaris属、Meristotheca属、Porphyridium属、Campylaephora属がより好ましい。さらには、安定生産が可能なPorphyra属、Chondrus属、Eucheuma属、Porphyridium属がより好ましい。
【００４７】
ＭＡＡ又はその塩は、資源量の豊富さおよび資源の有効活用の観点から、Ｒ１及びＲ２のうち一方が−ＣＨ２ＣＯＯＨであるのに対して他方が−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３である構造式（ＩＩ）の化合物（Ｐｏｒｐｈｙｒａ−３３４とも呼ばれる）、或いは、Ｒ１及びＲ２のうち一方が−ＣＨ２ＣＯＯＨであるのに対して他方が−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＯＨである構造式（ＩＩ）の化合物（Ｓｈｉｎｏｒｉｎｅとも呼ばれる）が好ましい。
【００４８】
ＭＡＡ又はその塩を含有する溶液、並びに／或いは、該化合物の供給源を含有する溶液、懸濁液及び／又は溶媒を調製するための溶媒の種類は、特に限定されないが、コストの面から、水、エタノール、メタノール、アセトン、アセトニトリル、或いは、それらの混合溶媒又は緩衝液が望ましい。
【００４９】
ｐＨ調整のための手段は、特に限定されず、アルカリを用いても、緩衝液を用いてもどちらでも構わない。使用するアルカリは、アルカリ水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア、アルカリイオン交換樹脂によるプロトン交換、脱塩等の手段によりｐＨを調整しても構わない。緩衝液を用いる場合の塩濃度は、特に限定されないが、１１０ｍＭを超える濃度で抽出する場合には、加熱工程の前までに、透析装置や逆浸透膜分離装置等を用いて塩濃度を１１０ｍＭ以下、より好ましくは８０ｍＭ以下に低減させることが望ましい。したがって、工程の簡略化の観点から、緩衝液の塩濃度は１１０ｍＭ以下、より好ましくは８０ｍＭ以下であることが望ましい。
【００５０】
前期加熱工程により得られた産物をさらに精製してもよい。精製方法としては、例えば、電気透析等による脱塩、限外ろ過膜等による分子量分画、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、合成吸着樹脂による精製、順相分配クロマトグラフィー、逆相分配クロマトグラフィー等を用いることができる。なかでも、陰イオン交換クロマトグラフィー、合成吸着樹脂法、順相分配クロマトグラフィー、逆相分配クロマトグラフィーが純度の点では好ましい。精製効率を上げる観点から、複数の精製方法を併用しても構わない。
【００５１】
陰イオンクロマトグラフィーによる精製の場合、強塩基性の担体を用いると溶出に高濃度の塩が必要となる。したがって、塩の使用量の低減という観点から、クロマトグラフィーにもちいる担体は弱塩基性のものが好ましい。
【００５２】
合成吸着樹脂法による精製の場合、ＭＡＣを吸着担体に保持させるために、平衡化液、洗浄液を酸性にするのが好ましい。また、逆相分配クロマトグラフィーによる精製の場合、分離度を挙げるために、移動相を酸性にするのが好ましい。酸性にするための酸としては、トリフルオロ酢酸、ギ酸、酢酸等が用いられるが、トリフルオロ酢酸等の強酸を用いた場合、分取後にＭＡＣが長期間強酸環境下に曝されることから、通常、分取後迅速に溶媒除去の操作を行わねばならない。したがって、ＭＡＣの安定性の観点から、使用する酸は酢酸およびギ酸が好ましい。移動相への酸の添加濃度は、０．０１〜０．１ｖｏｌ％の範囲内が好ましい。また溶離液（移動相）はメタノール、エタノールあるいはアセトニトリルと水の混液が好適に用いられる。
【００５３】
ＭＡＡ又はその塩の純度は、特に限定されず、精製物であってもよいし、粗分画又は粗精製物であってもよい。ＭＡＡ又はその塩の粗分画を得るための粗分画法としては、選択的溶媒抽出、限外ろ過膜による分子量分画等が挙げられる。ＭＡＡ又はその塩の精製物又は粗精製物を得るための精製方法としては、順相分配クロマトグラフィー、逆相分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等、特に好ましくは順相分配クロマトグラフィーならびに陰イオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。
【００５４】
ＭＡＣ又はその塩は、後述の抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキス抽出方法により得られる藻類エキス、好ましくは紅藻エキス、より好ましくはノリエキス中に多量に含まれている。そこで、本発明は、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相分配クロマトグラフィー、順相分配クロマトグラフィー等の精製方法により該藻類エキスからＭＡＣ又はその塩を精製する工程を包含する、ＭＡＣ又はその塩の製造方法も提供する。
【００５５】
藻類エキス抽出方法
本発明はまた、ＭＡＣ又はその塩を含む抗酸化性又は一酸化窒素産生抑制藻類エキスの製造方法を提供する。この製造方法は、少なくとも以下の工程を包含する。
工程Ａ：水、緩衝液、或いは、水及び／又は緩衝液と有機溶媒の混液と藻類とを７５℃以下で混合する工程、
工程Ｂ：混合物のｐＨを６．５以上に調整する工程、
工程Ｃ：加熱する工程、
工程Ｄ：固液分離する工程、
工程Ｅ：溶媒可溶性成分を分子量に基づき分画し、例えば、分子量約２０万以下、好ましくは約１０万以下、より好ましくは約５万以下の分子を含む画分を得る工程。
【００５６】
ここで、工程の順番は、
製造方法１：工程Ａ→工程Ｂ→工程Ｃ→工程Ｄ→工程Ｅ
製造方法２：工程Ａ→工程Ｄ→工程Ｅ→工程Ｂ→工程Ｃ
製造方法３：工程Ａ→工程Ｄ→工程Ｂ→工程Ｃ→工程Ｅ
のいずれの方法も採用できる（ここで、工程Ａで得られる混合物のｐＨが６．５以上である場合には、工程Ｂを省略してもよい）。
【００５７】
また、工程Ｅの前に工程Ｃが実施される場合、すなわち低分子成分を分画する工程の前に加熱を行う場合には（上記製造方法１および３）、工程Ｂそのものを省略することができる。具体的に、ＭＡＡからＭＡＣへの効率的な変換を促すためには、溶媒のｐＨを６．５以上に調整することが肝要であるが、藻類由来の高分子成分がＭＡＡと共存している場合には、例外的にｐＨの調整は不要である。このとき、加熱時のｐＨは、通常５．５から６．５の間である。この理由としては、工程Ｅによって除去される高分子成分のある特定の因子が、ＭＡＣの効率的生成に何らかの役割を果たしているためであると推察される。
【００５８】
工程Ｃにおける加熱温度の下限は、加熱する混合物、抽出物、分画物のｐＨにより異なり、前述の式（Ａ）及び式（Ｂ）で規定される。
【００５９】
加熱時間は特に規定されないが、５秒以上１０時間以下の範囲が好ましい。加熱時間は加熱方法、所望の収量等に応じて異なり、例えば、連続式熱交換器を用いた加熱を行う場合には、加熱温度は５秒以上３０分以下が好ましい。また、加熱釜等を用いてバッチ加熱する際には、効率よいＭＡＣの生成を促すため、５分以上の加熱が好ましい。ただし、製造方法１および３において緩衝液やアルカリを用いず且つ工程Ｂを省略した場合には、１２０℃〜１５０℃で３０分以上の加熱を行なうことが望ましい。省エネルギーおよびＭＡＣの変質防止の観点から、加熱時間の上限は、好ましくは１０時間以下、より好ましくは６時間以下である。
【００６０】
該製造方法は、必要に応じて、電気透析装置や逆浸透膜装置等によって分子量２００以下の塩を除去する工程（工程Ｆ）をさらに包含してもよい。ここで、工程Ｆは、工程Ｄの後であれば順番は問わない。
【００６１】
水、緩衝液、或いは、水及び／又は緩衝液と有機溶媒の混液としては、抗酸化作用又は一酸化窒素産生抑制作用を示すエキスを抽出できる限りにおいて特に限定されず、たとえば、水、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、含水メタノール、含水エタノール、含水プロパノール、含水アセトン、含水アセトニトリル等が挙げられる。好ましい使用溶媒は、水、含水メタノール、含水エタノールおよびそれらの緩衝液混合液である。含水メタノールおよび含水エタノールの有機溶媒濃度は、例えば８０％（ｖ／ｖ）以下、好ましくは２〜６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは２〜５０％（ｖ／ｖ）である。有機溶媒濃度が８０％（ｖ／ｖ）より高くてもＭＡＣ、及びＭＡＣの出発物質であるＭＡＡの抽出率は変わらないが、有機溶媒濃度が８０％（ｖ／ｖ）以下であればクロロフィル等のきょう雑の色素成分が抽出されにくい。ｐＨ調整のためのアルカリの種類は特に限定されない。
【００６２】
水に緩衝液を加えた際の最終の塩濃度は、特に限定されないが、１１０ｍＭ以上になる場合は、加熱工程の前に、脱塩処理して１１０ｍＭ以下に調整するのが好ましい。
【００６３】
抽出原料は、ＭＡＡ又はその塩が含まれている限り特に限定されないが、好ましくは前述の藻類、より好ましくは前述の紅藻類、例えば、Porphyra属、Gelidiella 属、Palmaria属、Gloiopeltis属、Chondrus属、Eucheuma属、Gigartina属、Gracilaris属、Meristotheca属、Porphyridium属、Campylaephora属等であり、特に好ましくはPorphyra属である。原料の安定確保の観点から、Porphyra属藻類の中でもPorphyra yezoeinsis、Porphyra tenera、Porphyra haitanensisが好ましい。
【００６４】
本発明は、これらの製造方法により得られた、抗酸化作用又は一酸化窒素産生抑制作用を示す藻類エキスも提供する。
【００６５】
本発明の藻類エキスは、ＭＡＣ又はその塩を例えば０．１重量％以上、好ましくは０．５重量％以上、より好ましくは１重量％以上含有する。
【００６６】
また、本発明の抽出方法により得られた藻類エキスのＭＡＣ又はその塩とＭＡＡ又はその塩の存在比は、例えばＭＡＣ又はその塩：ＭＡＡ又はその塩＝１０〜１００程度：９０〜０程度、好ましくは３０〜１００程度：７０〜０程度、より好ましくは５０〜１００程度：５０〜０程度である。
【００６７】
酸化防止剤
本発明のＭＡＣ又はその塩は、強い抗酸化作用を示すことから、酸化防止剤の有効成分として有用である。
【００６８】
本発明は、ＭＡＣ又はその塩を含有する酸化防止剤も提供する。
【００６９】
本発明の酸化防止剤は、高い品質（色彩、風味、香り、つや等）及び安全性が求められる分野、長期保存が求められる分野、酸化や過酸化によりラジカル種を発生し得る脂肪酸や油脂を用いる分野等で好適に使用することができる。例えば、食品組成物、医薬組成物、化粧料、油脂組成物、飼料組成物、ペットフード等の分野で好適に使用することができる。
【００７０】
本発明の酸化防止剤におけるＭＡＣ又はその塩の含量は、食品組成物、医薬組成物、化粧料、油脂組成物等に含有されたときの最終的なＭＡＣ又はその塩の含量が重要であるため特に限定されないが、通常、３〜１００％程度、好ましくは１０〜１００％程度である。食品組成物、医薬組成物、化粧料、油脂組成物等に添加される酸化防止剤におけるＭＡＣ又はその塩の含量は、後述する。酸化防止剤におけるＭＡＣ又はその塩の含量が、１００重量％であってもよい。
【００７１】
本書において、酸化防止剤、食品組成物、医薬組成物、化粧料、油脂組成物等におけるＭＡＣ又はその塩の含量は、特に言及しない限り、酸化防止剤、食品組成物、医薬組成物、化粧料、油脂組成物等における固形のＭＡＣ又はその塩の合計量（重量％）で表される。
【００７２】
一酸化窒素産生抑制剤
本発明のＭＡＣ又はその塩は、一酸化窒素産生抑制作用を示すことから、一酸化窒素産生抑制剤の有効成分として有用である。
【００７３】
本発明は、ＭＡＣ又はその塩を含有する一酸化窒素産生抑制剤も提供する。
【００７４】
本発明のＭＡＣ又はその塩は一酸化窒素消去作用も有し得る。
【００７５】
本発明の一酸化窒素産生抑制剤は、例えば、食品組成物、医薬組成物、化粧料、飼料組成物、ペットフード等の分野で好適に使用することができる。
【００７６】
本発明の一酸化窒素産生抑制剤におけるＭＡＣ又はその塩の含量は、食品組成物、医薬組成物、化粧料等に含有されたときの最終的なＭＡＣ又はその塩の含量が重要であるため特に限定されないが、通常、３〜１００％程度、好ましくは１０〜１００％程度である。一酸化窒素産生抑制剤におけるＭＡＣ又はその塩の含量が、１００重量％であってもよい。
【００７７】
食品組成物
本発明は、ＭＡＣ又はその塩を含有する食品組成物、並びに、抗酸化作用又は一酸化窒素産生抑制作用を示す紅藻エキスを含有する食品組成物を提供する。食品組成物には、動物（ヒトを含む）が摂取できるあらゆる食品組成物が含まれる。
【００７８】
本発明の食品組成物には、必要に応じて、ミネラル類、ビタミン類、フラボノイド類、キノン類、ポリフェノール類、アミノ酸、核酸、必須脂肪酸、清涼剤、結合剤、甘味料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤等を配合することができる。かかる添加物については、本書においてそれらの全体が援用される「指定品目  食品添加物便覧  １９９９年版」岸  眞之輔  編集、平成１１年１２月１０日発行、又は、「新訂版＝よくわかる  暮しのなかの食品添加物」日本食品添加物協会編集、１９９６年１２月２０日発行」に記載される添加物を用いることができる。
【００７９】
食品組成物としては、例えば、ハム・ソーセージ等の食肉加工品、たらこ・サーモン等の水産物加工品、バター・チーズ・ヨーグルト等の乳加工品、うどん・そば・中華そば・スパゲッティ・インスタントラーメン等の麺類、豆腐・豆乳・大豆粉・醤油・豆菓子・分離大豆タンパク質などの大豆加工品、農産物加工品、ジャム・プルーンエキス・ピューレ等の果実加工品、調味料、発泡酒・ワイン・ビール等の酒、清涼飲料水・炭酸飲料水・コーヒー・紅茶等の飲料、漬物、パン、菓子、氷菓、惣菜、レトルト、米製品等が好適に例示される。
【００８０】
食品組成物におけるＭＡＣ又はその塩の含量は、食品組成物の種類、形態、油脂含量、加工状態、設定される消費又は賞味期限、所望の効果、食品組成物の保存形態、共存する成分等によって異なるため限定されないが、例えば、０．００００１〜８０重量％、好ましくは０．０００１〜５０重量％、より好ましくは０．０００１〜３０重量％である。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の食品組成物は、食品組成物自体の酸化防止の目的でＭＡＣ又はその塩を含有する食品組成物である。この場合の食品組成物におけるＭＡＣ又はその塩の含量は、例えば、０．００００１〜１０重量％、好ましくは０．００００１〜５重量％、より好ましくは０．００００１〜３重量％である。
【００８２】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の食品組成物は、活性酸素、不飽和脂肪酸の酸化物、脂質の過酸化物等が一因となって引き起こされる疾患又は症状（例えば、動脈硬化性疾患、癌・腫瘍性疾患、細胞障害、糖尿病、脳神経疾患（脳梗塞・認知症・パーキンソン病）、皮膚の老化・色素沈着（しわ、しみ、そばかす、くすみ、たるみ）、白内障・網膜疾患、消化器・粘膜疾患、肺・気管支障害、腎障害等）を改善及び／又は予防し得る機能性食品組成物である。機能性食品組成物としては、例えば、粉末、錠剤、顆粒、タブレット、チュアブルタブレット、カプセル、ソフトカプセル、トローチ、飴、キャンディー、ガム、ゼリー、グミ、ビスケット、クッキー、飲料等の食品組成物が好適に例示される。この場合、食品組成物におけるＭＡＣ又はその塩の含量は、例えば、０．００１〜８０重量％、好ましくは０．００１〜５０重量％、より好ましくは０．００１〜３０重量％である。
【００８３】
本発明の藻類エキスを含む食品組成物における藻類エキスの含量は、上記の食品組成物におけるＭＡＣ又はその塩の含量を満足するような範囲であることが望ましい。
【００８４】
本発明の紅藻エキスを含む食品組成物は、活性酸素、フリーラジカル、不飽和脂肪酸の酸化、脂質の過酸化等によってもたらされる食品組成物自体の品質劣化を防ぎ、品質及び安全性を長期間保つことができる。本発明の食品組成物は、機能性食品組成物として、活性酸素、不飽和脂肪酸の酸化物、脂質の過酸化物等が一因となって引き起こされる前述の疾患又は症状を改善及び／又は予防し得る。
【００８５】
ペットフード及び又は飼料用組成物
本発明は、ＭＡＣ又はその塩を含有するペットフード及び／又は飼料用組成物、並びに、抗酸化作用又は一酸化窒素産生抑制作用を示す紅藻エキスを含有するペットフード及び／又は飼料用組成物も提供する。
【００８６】
本発明のペットフード及び／又は飼料用組成物には、必要に応じて、穀物類、豆類、イモ類、野菜、果物、肉及び魚介、油脂、糠又は粕、糖類、色素等の動物の生命維持に必要な栄養源が配合される。
【００８７】
ペットフード及び／又は飼料用組成物におけるＭＡＣ又はその塩の含量は、動物の種類や年齢等に応じて異なるので特に限定されないが、前述の食品組成物と同様の含量を用いることができる。本発明のペットフード及び／又は飼料用組成物は、前述の食品組成物と同様の効果を発揮し得る。
【００８８】
医薬組成物
本発明は、ＭＡＣ又はその塩を含有する医薬組成物、並びに、抗酸化作用又は一酸化窒素産生抑制作用を示す紅藻エキスを含有する医薬組成物も提供する。
【００８９】
本発明の医薬組成物には、必要に応じて、薬学的に許容される担体、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味剤、矯臭剤、安定剤等の通常の医薬組成物に用いられる成分を本発明の効果を損わない範囲で適当に配合することができる。これらの添加剤については、例えば、本書においてその全体が援用される「医薬品添加物事典２０００」日本医薬品添加剤協会  編集、２０００年４月２８日発行に記載の添加剤を用いることができる。
【００９０】
医薬組成物の投与形態及び製剤形態は、特に限定されない。投与形態としては、経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、経腸投与、直腸内投与、皮下投与等が挙げられる。製剤形態としては、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、トローチ剤、座剤、散剤、パウダー等の固形又は半固形剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、ローション剤、エアゾール剤、浸剤、煎剤等の液剤等が挙げられる。
【００９１】
医薬組成物におけるＭＡＣ又はその塩の含量は、使用目的、製剤形態、組成、設定される使用期限、共存する成分等によって異なるため限定されないが、例えば、０．００００１〜１００重量％、好ましくは０．００００１〜９０重量％、より好ましくは０．０００１〜９０重量％である。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、医薬組成物自体の酸化防止の目的でＭＡＣ又はその塩を含有する医薬組成物である。この場合の医薬組成物におけるＭＡＣ又はその塩の含量は、例えば、０．００００１〜２０重量％、好ましくは０．０００１〜１５重量％、より好ましくは０．０００１〜１０重量％である。
【００９３】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、動脈硬化性疾患、癌・腫瘍性疾患、細胞障害、糖尿病、脳・神経疾患（脳梗塞・認知症・パーキンソン病）、皮膚の老化・色素沈着（しわ、しみ、そばかす、くすみ、たるみ）、白内障・網膜疾患、消化器・粘膜疾患、肺・気管支障害、腎障害等）の治療及び／又は予防の有効成分としてＭＡＣ又はその塩を含有する医薬組成物である。この場合の医薬組成物におけるＭＡＣ又はその塩の含量は、例えば、０．０１〜１００重量％、好ましくは０．０１〜９０重量％、より好ましくは０．１〜９０重量％である。
【００９４】
本発明の紅藻エキスを含む医薬組成物における紅藻エキスの含量は、上記の医薬組成物におけるＭＡＣ又はその塩の含量を満足するような範囲であることが望ましい。
【００９５】
本発明の医薬組成物は、活性酸素、フリーラジカル、不飽和脂肪酸の酸化、脂質の過酸化等によってもたらされる医薬組成物の品質劣化（例えば、有効成分の効能、形態等における変化）を防ぎ、品質及び安全性を長期間保つことができる。また、ＭＡＣ又はその塩を有効成分として含有する本発明の医薬組成物は、活性酸素、不飽和脂肪酸の酸化物、脂質の過酸化物等が関与する上記疾患又は症状の治療及び／又は予防に有効である。
【００９６】
化粧料
本発明は、ＭＡＣ又はその塩を含有する化粧料（ヘアケア化粧料も含む）、並びに、抗酸化作用又は一酸化窒素産生抑制作用を示す藻類エキスを含有する化粧料も提供する。本発明の化粧料には、動物（ヒトを含む）の皮膚、粘膜、体毛、頭髪、頭皮、爪、歯、顔皮、口唇等に適用されるあらゆる化粧料が含まれる。
【００９７】
本発明の化粧料には、必須成分であるＭＡＣ又はその塩に加え、必要に応じて、粉末、顔料、油脂類、保湿剤、界面活性剤、酸化防止剤、増粘剤、洗浄剤、賦形剤、乳化剤、可塑剤、防腐剤、防黴剤、ｐＨ調整剤、紫外線吸収剤、アミノ酸、香料等の通常の化粧料に用いられる成分を本発明の効果を損わない範囲で適当に配合することができる。これらの添加剤については、本書においてその全体が援用される特開平９−８７１３３公報、特開平３−２６４５１０公報等の公報を参照することができる。
【００９８】
本発明の化粧料の剤型は任意であり、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系等のような剤型であり得る。皮膚への安全性の点からｐＨ４〜８程度に調整されることが好ましい。
【００９９】
本発明の化粧料の用途も任意であり、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック等のフェーシャル化粧料、シャンプー、ヘアリンス、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアムース、ヘアスプレー等の頭髪又は整髪化粧料、ファンデーション、口紅、グロス、アイシャドー、アイブロー、チーク、マスカラ等のメーキャップ化粧料、ボディーローション、ボディークリーム等のボディー化粧料  、クレンジングフォーム、洗顔料、ハンドソープ、ボディーソープ等の洗浄料、香水、デオドラント剤等の芳香化粧、マニキュア、ベースコート、トップコート、除光液等のネイル化粧料、入浴剤等に用いることができる。
【０１００】
本発明の化粧料におけるＭＡＣ又はその塩の含量は、化粧料の使用目的、剤型、組成、設定される使用期限、設定される保存状態、共存する成分等によって異なるため特に限定されないが、例えば、０．０００００１〜５０重量％、好ましくは０．００００１〜５０重量％、より好ましくは０．０００１〜３０重量％である。
【０１０１】
本発明の好ましい実施形態において、化粧料は、化粧料自体の酸化防止の目的でＭＡＣ又はその塩を含有する化粧料である。この場合の化粧料におけるＭＡＣ又はその塩の含量は、例えば、０．０００００１〜１０重量％、好ましくは０．００００１〜５重量％、より好ましくは０．０００１〜３重量％である。
【０１０２】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の化粧料は、皮膚の老化（しわ、しみ、そばかす、くすみ、たるみ）、皮膚の色素沈着、日焼け防止等の治療及び／又は予防の有効成分としてＭＡＣ又はその塩を含有する化粧料である。この場合の化粧料におけるＭＡＣ又はその塩の含量は、０．０００１〜５０重量％、好ましくは０．００１〜５０重量％、より好ましくは０．００１〜３０重量％である。
【０１０３】
本発明の藻類エキスを含む化粧料における藻類エキスの含量は、上記の化粧料におけるＭＡＣ又はその塩の含量を満足するような範囲であることが望ましい。
【０１０４】
本発明の化粧品は、活性酸素、不飽和脂肪酸の酸化、脂質の過酸化等によってもたらされる化粧品の品質劣化（例えば、香り、色彩、形態、効果等における変化）を防ぎ、品質及び安全性を長期間保つことができるとともに、ＭＡＣ又はその塩の抗酸化作用により、皮膚の老化予防又は美白効果を奏する。
【０１０５】
油脂組成物
本発明は、ＭＡＣ又はその塩を含有する油脂組成物、並びに、並びに、抗酸化作用を示す藻類エキスを含有する油脂組成物も提供する。本発明の油脂組成物には、油脂を主成分とする複数の成分からなる組成物はもちろんのこと、（ＭＡＣ又はその塩以外の成分が）全て油脂である組成物も含まれる。
【０１０６】
油脂組成物としては、ペンキ、ワックス、ニス等の塗料、クリーニング液等の洗浄料、食用油脂等が例示できるが、これらに限定されない。
【０１０７】
油脂組成物における油脂含量は、特に限定されないが、例えば約１〜１００重量％、好ましくは約２〜１００重量％、より好ましくは３〜１００重量％である。
【０１０８】
本発明の油脂組成物には、必須成分であるＭＡＣ又はその塩に加え、必要に応じて、顔料、光沢剤、界面活性剤、分散剤、増粘剤、増量剤、結合剤、緩衝剤、保存剤、安定剤、溶解補助剤、防腐剤等の通常の油脂組成物又は油脂製品に用いられる成分を本発明の効果を損わない範囲で適当に配合することができる。本発明の油脂組成物の形態は任意であり、液体、半液体（ゾル、ペーストを含む）、半固体（ゲルを含む）、固体、水−油脂二層体、水−油脂−粉末三層体等のような形態であり得る。
【０１０９】
油脂組成物におけるＭＡＣ又はその塩の含量は、使用目的、形態、組成、設定される使用期限、設定される保存状態、共存する成分等によって異なるため特に限定されないが、例えば、０．００００１〜１０重量％、好ましくは０．００００１〜５重量％、より好ましくは０．００００１〜３重量％である。本発明の藻類エキスを含む油脂組成物における藻類エキスの含量は、上記の油脂組成物におけるＭＡＣ又はその塩の含量を満足するような範囲であることが望ましい。
【０１１０】
本発明の油脂組成物は、活性酸素、不飽和脂肪酸の酸化、脂質の過酸化等によってもたらされる油脂組成物の品質劣化（例えば、色彩、形態、つや、におい、安全性等における変化）を防ぎ、品質及び安全性を長期間保つことができる。
【０１１１】
なお、本発明の食品組成物、医薬組成物及び化粧料に関し、酸化ストレスと各疾患又は各症状との関係については、例えば、以下の文献（これらは、本書においてその全体が援用される）を参照することができる：発癌については、「Toyokuni, Pathol. Internat., 49(1999) 91-102」、「Kitano ,Nat. Rev. Cancer., 4(3)(2004) 227-35」、「Feinberg et al., Nat. Rev. Genet., 7 (2006) 21-33」、老化については、「松尾ら, 老化と酸化ストレス., 酸化ストレス‐フリーラジカル医学生物学の最前線（吉川敏一編）, 医歯薬出版, 2001, 172-176.」、神経変性疾患（アルツハイマー病・パーキンソン病）については、「Tabner et al., Free Radic. Biol. Med., 32 (2002) 1076-1083」、「Jenner, Ann. Neurol., 53(Suppl 3) (2003) S26-36」、動脈硬化性疾患については、「Cynshi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(1998) 10123-10128」、炎症性腸疾患については、「内藤, 炎症性腸疾患と酸化ストレス., 酸化ストレス‐フリーラジカル医学生物学の最前線 ver 2（吉川敏一編）, 医歯薬出版, 2006, 286-290」、慢性腎不全については、「中尾, 慢性腎不全と酸化ストレス., 酸化ストレス‐フリーラジカル医学生物学の最前線 ver 2（吉川敏一編）, 医歯薬出版, 2006, 322-325.」、皮膚疾患・老化については、「Podda et al., Clin. Exp. Dermatol., 26 (2001) 578-582」「河野ら, 皮膚と活性酸素―酸化ストレスからの防御―, 炎症・再生, 20 (2000) 119-129」「金, 皮膚の抗老化最前線, エヌ・ティー・エス, 2006, 358-378.」「Lin et al., J. Invest. Dermatol., 125 (2005) 826-832」「尾藤ら, 臨床皮膚科, 59 (2005) 152-154.」、糖尿病関連疾患については、「Koba et al., J. Am. Soc. Nephrol., 14 (2003) S250-S253」、肺疾患については、「Rahman et al., Eur. J. Pharmacol., 533 (2006) 222-239」、気管支喘息については、「Ohrui et al., Tohoku J. Exp. Med., 199 (2003) 193-196」、網膜疾患については、「Blanks et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 33 (1992) 2814-2821.」、白内障については、「中西, 白内障と酸化ストレス, 酸化ストレス‐フリーラジカル医学生物学の最前線 ver 2（吉川敏一編）, 医歯薬出版, 2006, 411-413」、を参照することができる。
【発明の効果】
【０１１２】
本発明により、活性酸素の消去能、脂質の過酸化防止効果及びを示す新規抗酸化化合物及びその製造方法が提供された。本発明の抗酸化化合物の抗酸化作用は、合成抗酸化剤として多用されるブチルヒドロキシルトルエン（ＢＨＴ）の抗酸化作用よりも顕著に高いものであった。また、本発明の抗酸化化合物は、藻類等の天然素材から製造できる化合物であることから、安全性が高いと考えられる。本発明により、該抗酸化化合物を含有する酸化防止剤、食品組成物、医薬組成物、化粧料、油脂組成物が提供された。
【０１１３】
さらに、本発明により、抗酸化作用を示す藻類エキス及びその製造方法、該藻類エキスを含有する食品組成物、医薬組成物、化粧料、油脂組成物も提供された。
【０１１４】
また、本発明の抗酸化化合物は、一酸化窒素産生抑制作用も有しているので、一酸化窒素産生抑制化合物、一酸化窒素産生抑制作用を示す藻類エキス及びその製造方法、並びに該藻類エキスを含有する食品組成物、医薬組成物、化粧料も提供された。本発明の抗酸化化合物の一酸化窒素産生抑制作用は、同じ抗酸化作用をもつクロロゲン酸と比較しても顕著なものであった。
【０１１５】
本発明の酸化防止剤は、高い品質及び安全性が求められる各種組成物の酸化劣化を効果的に抑制することができる。
【０１１６】
本発明の食品組成物、医薬組成物、化粧料、油脂組成物は、活性酸素、不飽和脂肪酸の酸化、脂質の過酸化等によってもたらされる製品の酸化劣化による品質低下を起こすことなく、品質及び安全性を長期間保つことができる。本発明の食品組成物又は医薬組成物は、動脈硬化性疾患、癌・腫瘍性疾患、細胞障害、糖尿病、脳神経疾患（脳梗塞・認知症・パーキンソン病）、皮膚の老化・色素沈着（しわ、しみ、そばかす、くすみ、たるみ）、白内障・網膜疾患、消化器・粘膜疾患、肺・気管支障害、腎障害等の疾患又は症状を改善及び／又は予防するという優れた効果を奏する。本発明の化粧料は、皮膚の老化（しわ、しみ、そばかす、くすみ、たるみ）、皮膚の色素沈着、日焼け防止等の治療及び／又は予防するという優れた効果を奏する。
【０１１７】
本発明の抗酸化化合物の原料として下等ノリ、色落ちノリ等の廃棄ノリを用いる場合には、廃棄物利用の観点からも有益である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１８】
以下に実施例を示すが、この実施例は、本発明を何ら限定するものではない。また、本発明者らは、本発明が理論により拘束されることを望まない。
【実施例１】
【０１１９】
１．１  マイコスポリン様アミノ酸の粗分画
アマノリ属スサビノリ（Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ）の乾燥物１ｇを細切し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）５０ｍＬに懸濁させ、１時間撹拌した。懸濁液を遠心分離（２０，０００ｘＧ，２０分）して上清を得た。これを分画分子量３，０００Ｄａの限外ろ過膜付遠心式フィルター（ザルトリウス社製Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０）でろ過し、スサビノリ低分子抽出液を得た。これを、以下に示す条件で高速液体クロマトグラフ−エレクトロスプレーイオン化−イオントラップ型質量分析（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＩＴＭＳ）に供した：カラム，Ｕｎｉｓｏｎ  ＵＫ  Ｃ−１８（２．０ｘ１５０ｍｍ，ガードカラム付属，インタクト株式会社製）；移動相，Ａ液（アセトニトリル：水＝５：９５（ｖ／ｖ），０．０５％トリフルオロ酢酸），Ｂ液（アセトニトリル：水＝９５：５（ｖ／ｖ），０．０４％トリフルオロ酢酸），０→３分（Ａ１００％保持），３→１５分（Ｂ０％→５０％直線グラジエント）；流速，０．２ｍＬ／ｍｉｎ；検出，フォトダイオードアレイ（２００−６００ｎｍ），ＥＳＩ−ＩＴＭＳ（Ｓｃａｎ  ｒａｎｇｅ，１００−５００ｍ／ｚ；Ｐｏｒａｌｉｔｙ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｏｌｔａｇｅ，４０００Ｖ；Ｅｎｄ  ｐｌａｔｅ  ｏｆｆｓｅｔ  ｖｏｌｔａｇｅ，５００Ｖ；Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ，４５ｐｓｉ；Ｄｒｙ  ｇａｓ，８Ｌ／ｍｉｎ；Ｄｒｙ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，３５０℃）；注入量，３μＬ；ＨＰＬＣ，ＨＰ１１００  Ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）＋Ｅｓｑｕｉｒｅ  ＨＣＴ  Ｕｌｔｒａ（Ｂｒｕｃｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）；カラム温度，２５℃。
【０１２０】
ＨＰＬＣにおけるクロマトグラムを図１に示す。保持時間２．２４分ならびに２．８８分の位置に、マイコスポリン様アミノ酸（以下、ＭＡＡと定義する）を特徴づける吸収極大約３３４ｎｍのピークが認められた。各々のＩＴＭＳならびにＩＴＭＳ／ＭＳスペクトルを測定した結果を図２に示す。過去の文献値から、保持時間２．２４分のピークはＳｈｉｎｏｒｉｎｅ（化１，  プレカーサイオン［Ｍ＋Ｈ］＋，ｍ／ｚ３３３；プロダクトイオン，ｍ／ｚ１８６，２３０，２７４，３００）、保持時間２．８８分のピークはＰｏｒｐｈｙｒａ  ３３４（化２，プレカーサイオン［Ｍ＋Ｈ］＋，ｍ／ｚ３４７；プロダクトイオン，ｍ／ｚ３０３）と同定された。（引用文献；Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｉｍｐａｃｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｈａｒａｃｔａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｃｏｓｐｏｒｉｎｅ−ｌｉｋｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．  Ｋ．  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００３；１７：２１３３−２１３８，Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｃｏｓｐｏｒｉｎｅ−ｌｉｋｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ／ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．  Ｋ．  Ｈ．  Ｍ．  Ｃａｒｄｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００６；２０：２５３−２５８．）
１．２  ＭＡＡ粗分画液の加熱処理
１．１で得られたＭＡＡ粗分画液１ｍＬをねじ口バイアルに入れて密封し、ヒートブロックで１２０℃、１時間加熱した。
【０１２１】
１．３  抗酸化活性の評価
須田の方法（食品機能研究法，光琳，ｐｐ２１８−２２０，２０００）に準じてＭＡＡ粗分画液ならびに加熱処理液の１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ（ＤＰＰＨ）ラジカル消去能を測定した。各サンプルをメタノール（ＭｅＯＨ）で２２〜２５倍希釈した。これらを５０μＬのＭＥＳ緩衝液を予め入れておいた９６穴マイクロプレートに５０μＬづつ添加し、シェーカにて混合した。さらに、ＤＰＰＨ−メタノール溶液（８０μｇ／ｍＬ）を１００μＬ添加し、シェーカにて混合した。静置３０分後（２０℃）における５２０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅ社製Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ‐Ｍ５）にて測定した。同時に、Ｔｒｏｌｏｘを用いて検量線を作成し、ＤＰＰＨラジカル消去活性をＴｒｏｌｏｘ当量で算出した。その結果、図３に示すように、両方のサンプルにおいて濃度依存的なＤＰＰＨラジカル消去活性が認められたが、特に加熱処理液において、加熱前の液に比して高い抗酸化性が認められた。
【実施例２】
【０１２２】
２．１  ＨＰＬＣによる抗酸化因子の特定
１．１で得られたＭＡＡ粗分画液及びその加熱処理品を逆相分配クロマトグラフィーに供した。検出器出口よりフラクションコレクターを用いて分取し、ＤＰＰＨラジカル消去活性を測定した。クロマトグラフィーの条件を以下に示す：カラム，Ｃａｄｅｎｚａ  Ｃ−１８（２．０ｘ１５０ｍｍ，ガードカラム付属，インタクト株式会社製）；移動相，Ａ液（アセトニトリル：水＝５：９５（ｖ／ｖ），０．０５ｖｏｌ％トリフルオロ酢酸），Ｂ液（アセトニトリル：水＝９５：５（ｖ／ｖ），０．０４％トリフルオロ酢酸），０→１５分（Ｂ：０％→５０％直線グラジエント）；流速，０．２ｍＬ／ｍｉｎ；検出，フォトダイオードアレイ（２００−６００ｎｍ），ＥＳＩ−ＩＴＭＳ（Ｓｃａｎ  ｒａｎｇｅ，１００−５００ｍ／ｚ；Ｐｏｒａｌｉｔｙ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｏｌｔａｇｅ，４０００Ｖ；Ｅｎｄ  ｐｌａｔｅ  ｏｆｆｓｅｔ  ｖｏｌｔａｇｅ，５００Ｖ；Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ，４５ｐｓｉ；Ｄｒｙ  ｇａｓ，８Ｌ／ｍｉｎ；Ｄｒｙ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，３５０℃）注入量，３iｌ；装置，ＨＰ１１００  Ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）＋Ｅｓｑｕｉｒｅ  ＨＣＴ  Ｕｌｔｒａ（Ｂｒｕｃｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）；カラム温度，  ２５℃。その結果、図４に示すように、加熱処理品において、保持時間８．１分の画分におけるＤＰＰＨラジカル消去活性が認められた。活性に対応するピークは波長２２６ｎｍを吸収極大とする紫外線吸収性の化合物であった。また、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＩＴＭＳによる質量分析（ポジティブモード）により、活性ピークにおいて［Ｍ＋Ｈ］＋と考えられるｍ／ｚ３２９が検出された（図５）。この活性ピークのＭＳ／ＭＳスペクトルおよびＭＳ３スペクトルを図５に示した。プレカーサイオンｍ／ｚ３２９をトラップして得られる主要なプロダクトイオンはｍ／ｚ２７９、プロダクトイオンｍ／ｚ２７９をさらにトラップして得られる主要なプロダクトイオンはｍ／ｚ２３３，２０５，１８７であった。加熱前の液においても本活性ピークは認められたが、ピーク面積は加熱後に比べて顕著に少なかった。以後、この活性ピークで表現される化合物をＭＡＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＭＡＣ）と呼ぶことにする。
【０１２３】
２．２  ＴＬＣ−ＤＰＰＨによる抗酸化因子の特定
実施例１における加熱処理液５０μＬを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）用シリカゲルプレート（１００ｘ１００ｍｍ）にスポットし、展開溶媒（ブタノール／酢酸／水＝２／１／１（ｖ／ｖ／ｖ））で２回展開し、ドライヤーで十分乾燥させた。このプレートを０．４％ＤＰＰＨ−エタノール溶液に１０秒間浸し、速やかに乾燥させた。乾燥３０分の時点でスキャナに取り込み、濃色の背景に白く浮かび上がる抗酸化画分を可視化させた。その結果、図６に示すように、強いＤＰＰＨラジカル消去活性を示す複数のバンドが確認された。これらのバンドの内最も明るいものを掻き取り、ＨＰＬＣに供したところ、２．１におけるＭＡＣと同じ保持時間の位置にピークが検出されたことから、ＴＬＣ−ＤＰＰＨにより可視化される抗酸化活性バンドは、ＭＡＣより構成される成分であると推察された。
【実施例３】
【０１２４】
実施例２で示された抗酸化性因子ＭＡＣの精製方法を検討した。カラムとしてＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌｐａｋ  ６５０Ｓ（Ｔｏｓｏｈ製、２２ｍｍｘ２００ｍｍ）を用い、Ｈ２０を出発溶媒として０．５Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３によるグラジエント溶出（溶離液Ａ，Ｈ２Ｏ；溶離液Ｂ，０．５Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３；Ｂ：０％→５０％（０−９０ｍｉｎ）；流速，３ｍＬ／ｍｉｎ）を行った。実施例１における加熱処理液５００μＬをカラムにインジェクション後、検出器出口より溶離液を分取し、ＨＰＬＣ解析によりＭＡＣ含有画分を特定した。その結果、保持時間６７．２−７６．８分の画分にＭＡＣの存在が認められた（図７）。本画分を凍結乾燥し、ＭＡＣを高純度で含有する精製物を得た。
【実施例４】
【０１２５】
ＭＡＣの精製法をさらに検討した。カラムとしてＷａｋｏｓｉｌ−ＩＩ  ５Ｃ１８ＨＧ  Ｐｒｅｐ（２０．０ｍｍ  ｘ２５０ｍｍ，和光純薬工業株式会社製）を用いた。移動相に酢酸（ＡｃＯＨ）を含有した水／アセトニトリル（ＡｃＮ）混合溶媒を用いた（移動相Ａ：ＡｃＮ：Ｈ２Ｏ＝５：９５（ｖ／ｖ），０．０５％ＡｃＯＨ；移動相Ｂ，ＡｃＮ：Ｈ２Ｏ＝９５：５（ｖ／ｖ），０．０４％ＡｃＯＨ；Ｂ０％→８０％（０→４８ｍｉｎ）、流速：３ｍＬ／ｍｉｎ；検出，２００−６００ｎｍ）。実施例１における加熱処理液５００μＬをカラムにインジェクション後、検出器出口より溶離液を分取し、ＨＰＬＣ解析によりＭＡＣ含有画分を特定した。その結果、保持時間３３．５‐３６．５分のピークにＭＡＣを示す分子量関連イオンｍ／ｚ３２９が認められた（図８）。本画分を繰り返し分取後減圧濃縮し、ＭＡＣを高純度で含有する精製物を得た。次に、移動相に蟻酸をＡｃＯＨと同様の濃度で添加して、同様の操作でクロマトグラフィーを行ったところ、酢酸とほぼ同一の保持時間にＭＡＣが溶出され、これを分取して減圧濃縮することで、ＭＡＣを高純度で含有する精製物を得た。
【実施例５】
【０１２６】
ＭＡＣの精製法をさらに検討した。吸着担体として合成吸着樹脂ＨＰ−２０（三菱化学株式会社製）を用いた。アセトンで洗浄したＨＰ−２０をディスポーザブルカラムに充填し（５ｍＬ）、５倍量のＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝５：９５（ｖ／ｖ），０．０１％ＡｃＯＨで平衡化した。実施例１の加熱処理液５００μＬをカラムに添加し、３倍量のＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝５：９５（ｖ／ｖ），０．０１ｖｏｌ％ＡｃＯＨで洗浄した。次に、１０ｖｏｌ％濃度から１０ｖｏｌ％おきにメタノール濃度を上げた含水ＭｅＯＨ（ＡｃＯＨ非含有、カラム容量の３倍量）で段階的に担体吸着成分を溶出させ、各々の画分をＨＰＬＣ解析に供してＭＡＣ含有画分を特定した。その結果、１０−５０ｖｏｌ％ＭｅＯＨで溶出される画分にＭＡＣの存在が認められた（図９）。ＭＡＣの溶出が認められた画分を減圧濃縮し、ＭＡＣを高純度で含有する精製物を得た。
【比較例１】
【０１２７】
酸洗浄した強塩基性陰イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ  １  ｘ８，Ｃｌ  ｆｏｒｍ、室町ケミカル製）をディスポーザブルカラムに充填し（５ｍＬ）、５倍量の純水で平衡化した。実施例１の加熱処理液５００μＬをカラムに添加し、３倍量の純水で洗浄した。次に、０．２Ｍおきに塩濃度を上げたＮＨ４ＨＣＯ３水溶液（０−１．０Ｍ）で段階的に吸着成分を溶出させ、各々の画分をＨＰＬＣ解析に供した。しかしながら、１．０Ｍまで塩濃度を上げてもＭＡＣのカラムからの溶出は認められなかった。このことから、ＭＡＣ強塩基性の陰イオン交換樹脂に強く吸着し、溶出させるためにはイオン強度の高い塩を使用する必要があった。
【比較例２】
【０１２８】
カラムとしてＵｎｉｓｏｎ  ＵＫ  Ｃ−１８（２．０ｘ１５０ｍｍ，ガードカラム付属）を用い、酢酸の濃度を変えた水／ＡｃＮ混合溶媒を用いてグラジエント分析を行った。分析条件：移動相，０→３分（Ａ１００％保持），３→１５分（Ｂ０％→５０％直線グラジエント）；流速，０．２ｍＬ／ｍｉｎ；検出，フォトダイオードアレイ（２００−６００ｎｍ）。移動相に含まれるＡｃＯＨ濃度を０，０．０１，０．０４，０．１ｖｏｌ％に設定した。実施例１における加熱処理液３μＬをカラムにインジェクション後、検出器出口より溶離液を分取し、ＨＰＬＣ解析によりＭＡＣの溶出位置を比較した。その結果、酢酸無添加の移動相の場合、ＭＡＣのピークがブロードになり、良好な分離が得られなかった（図１０）。
【比較例３】
【０１２９】
カラムとしてＵｎｉｓｏｎ  ＵＫ  Ｃ−１８（２．０ｘ１５０ｍｍ，ガードカラム付属）を用い、蟻酸の濃度を変えた水／ＡｃＮ混合溶媒を用いてグラジエント分析を行った。分析条件：移動相，０→３分（Ａ１００％保持），３→１５分（Ｂ０％→５０％直線グラジエント）；流速，０．２ｍＬ／ｍｉｎ；検出，フォトダイオードアレイ（２００−６００ｎｍ）。移動相に含まれる蟻酸濃度を０，０．０１，０．０４，０．１ｖｏｌ％に設定した。実施例１における加熱処理液３μＬをカラムにインジェクション後、検出器出口より溶離液を分取し、ＨＰＬＣ解析によりＭＡＣの溶出位置を比較した。その結果、蟻酸無添加の移動相の場合、ＭＡＣのピークがブロードになり、良好な分離が得られなかった（図１１）。（比較例２）および（比較例３）より、ＭＡＣをカラムへ吸着させ、分離において高い分離能を得るためには、移動相への酸の添加が望ましいことを示している。
【比較例４】
【０１３０】
カラムとしてＵｎｉｓｏｎ  ＵＫ  Ｃ−１８（２．０ｘ１５０ｍｍ，ガードカラム付属）を用い、移動相にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有した水／ＡｃＮ混合溶媒を用いた（移動相Ａ：ＡｃＮ：Ｈ２Ｏ＝５：９５（ｖ／ｖ），０．０５ｖｏｌ％ＴＦＡ；移動相Ｂ，ＡｃＮ：Ｈ２Ｏ＝９５：５（ｖ／ｖ），０．０４％ｖｏｌ  ＴＦＡ；Ｂ０％→１００％（０→６０ｍｉｎ）、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ）。実施例１における加熱処理液３μＬをカラムにインジェクションし、ＥＳＩ−ＩＴＭＳ解析によりＭＡＣ由来ピークを特定した。その結果、酢酸、蟻酸とほぼ同位置のピークにＭＡＣを示す分子量関連イオンｍ／ｚ３２９が認められた。本画分を繰り返し分取後３日間冷蔵し、減圧濃縮して再度水に溶解させたところ溶液が黄色く着色し、このものを再度ＨＰＬＣ解析しても、同様の保持時間にＭＡＣを示すピークは認められなかった。これは、分取後より脱溶媒までの過程において、強酸酸性下に曝されることにより、ＭＡＣの構造が失われるためであると判断された。
【比較例５】
【０１３１】
アセトンで洗浄したＨＰ−２０をディスポーザブルカラムに充填し（５ｍＬ）、５倍量のメタノール：Ｈ２Ｏ＝５：９５（ｖ／ｖ）で平衡化した。実施例１の加熱処理液５００μＬをカラムに添加し、３倍量のメタノール：Ｈ２Ｏ＝５：９５（ｖ／ｖ）で洗浄した。素通り画分およびメタノール洗浄画分に、添加したＭＡＣのほとんどの量が回収され（図９）、カラムへの吸着はなかった。
【実施例６】
【０１３２】
６．１  性状
実施例４における精製物の乾燥物における性状は黄褐色粉末状である。
【０１３３】
６．２  ＭＳｎスペクトル
実施例４における精製物を２．４ｍｇ／ｍＬになるように純水に溶解させ、ＥＳＩ−ＩＴＭＳｎ分析に供した。結果を以下に記す。
ＭＳ(正イオン）：［Ｍ＋Ｈ］＋，ｍ／ｚ３２９；［Ｍ＋Ｎａ］＋，ｍ／ｚ３５１
ＭＳ２：ｍ／ｚ２９９，２７９（プレカーサイオン，ｍ／ｚ３２９）
ＭＳ３：ｍ／ｚ２３３，２１５，２０５，１８７（プレカーサイオン，ｍ／ｚ２７９）
ＭＳ４：ｍ／ｚ１８７（プレカーサイオン，ｍ／ｚ２３３）
ＭＳ（負イオン）：［Ｍ−Ｈ］−，ｍ／ｚ３２７
ＭＳ２：ｍ／ｚ２８３（プレカーサイオン，ｍ／ｚ３２７）
ＭＳ３：ｍ／ｚ２３９，２２４，２０７（プレカーサイオン，ｍ／ｚ２８３）
【０１３４】
６．３  精密質量測定
実施例４における精製物を１２μｇ／ｍＬになるように５０％ＡｃＮに溶解させ、エレクトロスプレーイオン化−飛行時間型質量分析（ＥＳＩ−ＴＯＦ）に供した。質量分析の結果は以下のとおりである。
質量分析：３２９．１３４８［Ｍ＋Ｈ］＋（計算値３２９．１３４８：Ｃ１４Ｈ２０Ｎ２Ｏ７）
【０１３５】
６．４  紫外吸収スペクトル
３．１で得られた精製品を純水に溶解させ、紫外可視吸収スペクトルを測定した。その結果、この化合物の吸収極大は２２６ｎｍであった（図１２）。
【０１３６】
６．５  構成アミノ酸
３．１で得られた製製品を窒素雰囲気下６Ｎ塩酸で加水分解し（１１０℃、２０時間）、加水分解物を中和後、内部標準としてα―アミノ酪酸を等量添加し、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）で処理した。これを、ＨＰＬＣに供し（カラム，Ｓｕｐｅｒ  ＯＤＳ（２．０  ｘ  １５０ｍｍ，Ｔｏｓｏｈ製）；移動相，Ａ液（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ：Ｗａｔｅｒ＝３：９７（ｖ／ｖ），０．０５％酢酸ナトリウム含有，Ｂ液（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ：Ｗａｔｅｒ＝６０：４０），０→３分（Ａ：１００％保持），３→１５分（Ｂ：０％→５０％直線グラジエント）；流速，０．２ｍＬ／ｍｉｎ；検出，紫外検出（２５４ｎｍ），注入量，３μＬ；カラム温度，４０℃）、構成アミノ酸について調査した。ＰＴＣ誘導体化したＭＡＣ−塩酸加水分解物のＨＰＬＣクロマトグラムを図１３−１に示す。主要な構成アミノ酸として、ＧｌｙｃｉｎｅおよびＴｈｒｅｏｎｉｎｅが検出された。
【０１３７】
６．６  核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル
精製物の核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ）を以下に示す。
（スペクトルデータ）
核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ，４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）
δ＝６．１７（１Ｈ，ｓ），６．１１（１Ｈ，ｓ），δ＝４．４５（２Ｈ，ｓ），δ＝４．１６，４．１４，４．１２，４．１１，４．０９（１Ｈ，ｍ，Ｊ＝６．３ＭＨｚ），δ＝３．８０（３Ｈ，ｓ），δ＝３．７４（２Ｈ，ｓ），δ＝３．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８ＭＨｚ），δ＝１．９２（２Ｈ，ｓ）δ＝１．３０，１．２９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４ＭＨｚ）
核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ−ＮＭＲ，１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）
δ＝１８４．０（Ｃ），１８２．４（Ｃ），δ＝１８１．８（Ｃ），δ＝１４３．８（Ｃ），δ＝１４３．７（Ｃ），δ＝１４０．４（Ｃ），δ＝１３６．１（Ｃ）δ＝７１．３（ＣＨ），δ＝６８．３（ＣＨ２），δ＝６６．９（ＣＨ），δ＝６１．７（ＣＨ３），δ＝５０．３（ＣＨ２），δ＝２５．９（ＣＨ２），δ＝２２．１（ＣＨ３）
６．７  構造決定
MACにおける重水（D2O）中でのHD交換挙動を調べた。MACの水溶液を乾固させ、MACの濃度が1mg/mLになるように重水を添加し、溶解後直ちにESI-IT-MSを測定し、その後経時的に測定した。主要な［Ｍ＋Ｈ］＋であるm/z 329は、重水置換直後にm/z 336にまで増加後、徐々に変化し、19時間後にはm/z 338にまで増大して、その後の変化は認められなかった（図１３−２）。m/zの経時的変化より、MAC中には、短期間で置換される6個の易動性水素と、徐々に置換される2個の水素が存在していることが明らかになった。このことは、MACにおいて、不飽和二重結合の位置変化を伴う互変異性体の存在を強く示唆するものであった。
【０１３８】
６．８  構造決定
以上の結果より、ＭＡＣの構造を構造式（ＩＩＩ）のように決定した。また、プロトン性溶媒中における構造を構造式（ＩＩＩ−Ｉ）、（ＩＩＩ−ＩＩ）及び（ＩＩＩ−ＩＩＩ）のように決定した。
【０１３９】
【化８】
2008247901.tif 000009
【０１４０】
ここで、点線で示した結合は共鳴状態の結合を示している。
【実施例７】
【０１４１】
７．１  ＭＡＡの加熱によるＭＡＣの生成
実施例６で決定されたＭＡＣの推定構造から、本抗酸化性因子は、ノリをはじめとする藻類に普遍的に含まれるＭＡＡの一種Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ３３４を前駆物質とする可能性が考えられた。そこで、ノリ中のＭＡＡを高度精製し、これを加熱することによる抗酸化因子の生成状況を調べた。Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ３３４は、下記構造式で表される：
【０１４２】
【化９】
2008247901.tif 000010
【０１４３】
７．２  ＭＡＡの精製
スサビノリ粉末品５０ｇに５０％（ｖ／ｖ）メタノールを１Ｌ添加し、４℃で２４時間撹拌した。この懸濁液を遠心分離（２０，０００ｘＧ，２０ｍｉｎ）し、上清を回収後、沈殿物に再度５０％メタノール１Ｌを加え、常温で３０分撹拌した。懸濁液を遠心し、上清を１回目の抽出液と合わせて粗抽出液とした。粗抽出液を分画分子量５，０００の限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２  ＭＩＮＩ）でろ過し、ＭＡＡを含む透過液を得た。これを減圧下乾固させ、純水２５ｍＬに溶解させた。精密ろ過フィルター（０．４５μｍ）を用いて不溶物をろ過し、電気透析装置（旭化成）により脱塩した。脱塩物を再度ろ過し、５０ｍＬに定容し、ＭＡＡ粗抽出品として−４０℃で保存した。
【０１４４】
ＭＡＡ粗抽出品を分取ＨＰＬＣに供し、波長３３０ｎｍ付近に吸収極大を有するピークを分取した（図１４）。ＨＰＬＣの条件を以下に記す：カラム，ＰＡ−１（２２  ｘ  ２００ｍｍ，ダイオネクス製）；流速，２ｍＬ／ｍｉｎ；溶離液，Ａ液（水），Ｂ液（１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３），Ｂ：０→１５％（０→４０分）；注入，５００μＬ（８回繰り返し分取）；検出，２８０ｎｍ；カラム温度，常温。分取物は、減圧乾固した後に窒素雰囲気下で再度乾固させ、純水を添加した後に真空凍結乾燥して乾燥物とした。分画物１および２の重量はそれぞれ、０．７１０ｇおよび０．２４７ｇであった。また、ＥＳＩ−ＩＴＭＳｎ解析の結果から、分画物１はＰｏｒｐｈｙｒａ  ３３４、分画物２はＳｈｉｎｏｒｉｎｅと同定された。Ｓｈｉｎｏｒｉｎｅは、下記構造式で表される：
【０１４５】
【化１０】
2008247901.tif 000011
【０１４６】
７．３  ＭＡＡの加熱
７．２で得られたＰｏｒｐｈｙｒａ  ３３４およびＳｈｉｎｏｒｉｎｅを０．１ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ８．０）に溶解させ、ねじ口バイアルに入れて密封し、１２０℃で３０分加熱した。加熱前後のサンプルをＬＣ−ＥＳＩ−ＩＴ−ＭＳｎ解析に供し、クロマトグラムおよび得られるピークのマススペクトルを比較した。その結果、加熱によりＰｏｒｐｈｙｒａ  ３３４のピーク（保持時間；２．９分）は減少し、代わりに保持時間１２．５分の位置にピークが新たに出現した（図１５）。このピークの［Ｍ＋Ｈ］＋は  ｍ／ｚ３２９で、これはＰｏｒｐｈｙｒａ  ３３４における［Ｍ＋Ｈ］＋であるｍ／ｚ３４７に対して１８Ｄａ低い値であった。
【０１４７】
Ｓｈｉｎｏｒｉｎｅのピーク（保持時間２．２分）も同様に減少（図１６）し、保持時間１１．２分の位置に新たなピークが出現した。本化合物のプレカーサイオンは［Ｍ＋Ｈ］＋と考えられるｍ／ｚ３１５であった。これは、Ｓｈｉｎｏｒｉｎｅにおける［Ｍ＋Ｈ］＋であるｍ／ｚ３３３に対して１８Ｄａ低い値であった。本化合物のＭＳ／ＭＳスペクトル（プレカーサイオン：ｍ／ｚ３１５）を図１６に示した。主要なプロダクトイオンはｍ／ｚ２６５で、これはＭＡＣのプレカーサイオンｍ／ｚ３２９より得られるプロダクトイオンｍ／ｚ  ２７９に対して１４Ｄａだけ低い値で、両社のプレカーサイオンの質量差［３２９−３１５＝１４Ｄａ］と同一であった。ＤＰＰＨラジカル消去活性を加熱前後で比較したところ、Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ３３４とＳｈｉｎｏｒｉｎｅの両者において、加熱後における活性の顕著な上昇が認められた（図１７）。
【０１４８】
以上の結果から考えて、ＭＡＣは、ＭＡＡの一種であるＰｏｒｐｈｙｒａ  ３３４が加熱により構造変化を受けて生成したものであることが実証された。また、Ｓｈｉｎｏｒｉｎｅも、同様に加熱により抗酸化活性の高いＭＡＣと類縁の化合物に変化することが明らかとなった。以後、構造式（ＩＩＩ）、構造式（ＩＩＩ−Ｉ）、（ＩＩＩ−ＩＩ）及び（ＩＩＩ−ＩＩＩ）で表されるＰｏｒｐｈｙｒａ  ３３４由来のＭＡＣをＭＡＣ−Ｐ３３４、構造式（ＩＶ）、構造式（ＩＶ−Ｉ）、構造式（ＩＶ−ＩＩ）及び構造式（ＩＶ−ＩＩＩ）で表されるＳｈｉｎｏｒｉｎｅ由来のＭＡＣをＭＡＣ−ＳＨＩと称する。なお、構造式（ＩＶ−Ｉ）、構造式（ＩＶ−ＩＩ）及び構造式（ＩＶ−ＩＩＩ）は、ＭＡＣ−ＳＨＩのプロトン性溶媒中における構造である。
【０１４９】
【化１１】
2008247901.tif 000012
【０１５０】
以上の結果から、ＭＡＣの基本構造は構造式（Ｉ）で表される構造で、Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ３３４やＳｈｉｎｏｒｉｎｅなどのＭＡＡを所定条件下で加熱することにより、脱水によるＣ−Ｃ単結合の不飽和化を経て生成されると考えられた。また、プロトン性溶媒中では、構造式（Ｉ−Ｉ）、構造式（Ｉ−ＩＩ）又は構造式（Ｉ−ＩＩＩ）で表される構造をとっている可能性が示唆された。
【０１５１】
図１８に、ＭＡＡからＭＡＣへの変換様式について記す。
【実施例８】
【０１５２】
ＭＡＣにおける抗酸化活性本体の解析
ＭＡＣにおける抗酸化活性本体を明らかにする目的で、ＭＡＣ−Ｐ３３４およびＭＡＣ−ＳＨＩの精製品における抗酸化活性を比較した。分取は、実施例１における加熱処理物を、実施例３の方法で陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、得られるＭＡＣ含有ピークをさらに、逆相クロマトグラフィーに供することにより行った。分取物は一旦減圧乾固した後、再度５０％メタノールに溶解させて窒素雰囲気下で乾固させ、残存の揮発性化合物を除去した。乾固物を精秤し、３０ｍＭの濃度になるよう水に溶解させた。これらのＤＰＰＨラジカル消去活性を測定した。測定方法は実施例１のとおりである。
【０１５３】
ラジカル消去活性に及ぼすＭＡＣの濃度依存的効果を図１９に示す。これより求められるＭＡＣ−Ｐ３３４およびＭＡＣ−ＳＨＩのＩＣ５０値（５０％抑制濃度）はそれぞれ５３μＭおよび５４μＭとなり、両者の活性にはほとんど差が認められなかった。また、この値はトコフェロール誘導体であるトロロックスの２４μＭには劣るものの、ＢＨＴの１６１μＭに比べ高い数値であった。比較としてＰｏｒｐｈｙｒａ  ３３４やＳｈｉｎｏｒｉｎｅの活性も測定したが、これらの化合物のＤＰＰＨラジカル活性はほとんど認められなかった。したがって、ＭＡＣの抗酸化活性は、結合するアミノ酸の種類によらず、その活性本体はＭＡＣ共通の骨格であると考えられた。
【実施例９】
【０１５４】
ＭＡＣ生成に及ぼすｐＨおよび温度の影響
ＭＡＣの効率よい生成のための加熱条件について検討した。スサビノリの乾燥物１ｇを細切し、純水５０ｍＬに懸濁させ、１時間撹拌した。懸濁液を遠心分離（２０，０００  ｘＧ，２０分）して上清を得た。これを分画分子量３，０００Ｄａの限外ろ過膜付遠心式フィルター（ザルトリウス社製Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０）でろ過し、ＭＡＡ粗分画液を得た。ねじ口バイアルに、ＭＡＡ粗分画液０．１ｍＬおよび純水０．８ｍＬを加え、さらに、ｐＨの異なる０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０，６．２５，６．５，６．７５，７．０，７．５，８．０）、０．２Ｍリン酸緩衝液−リン酸溶液（ｐＨ２．０，３．０，４．０，５．０）あるいは０．２Ｍリン酸緩衝液−ＮａＯＨ溶液（ｐＨ９．０，１０．０，１１．０）を０．１ｍＬ加えて総量を１．０ｍＬとした。これを密封し、ヒートブロックを用いて７５，８０，９０，１００，１２０℃で１時間加熱した。ＨＰＬＣにより加熱処理液に含まれるＭＡＣ−Ｐ３３４の含量を測定し、最も効率の高かった条件におけるＭＡＣ−Ｐ３３４生成量を１００として、生成率をパーセントで表した。生成率が最大条件の５０％以上となる条件を良好な生成条件と定義し、以下の方法で、各種処理温度において、生成率５０％となるｐＨを求めた：横軸にｐＨ、縦軸にＭＡＣ−Ｐ３３４の生成率をプロットしたグラフを作成し、グラフより各温度における生成効率が５０％となるｐＨを求めた。プロットしたグラフを図２０に示す。また、各種温度における、生成効率５０％を満たすｐＨを図２１に示す。図１９より、生成効率５０％を満たすためのｐＨの下限は、ｐＨ６．５であることがわかる。また、図２１より、あるｐＨにおける生成効率５０％を満たす下限温度は、以下の一次回帰式で近似されることが見出された。
【０１５５】
（ｐＨ６．５−７．６のとき）
Ｔ（℃）＝−２５．２５６ＰＨ＋２８８．０２（Ｒ２＝０．９９８１）
（ｐＨ７．６以上のとき）
Ｔ（℃）＝−６．２９６６ＰＨ＋１３９．３３（Ｒ２＝０．９９７６）
ここで、Ｔは生成効率５０％を満たす下限温度、ＰＨは処理液のｐＨである。
【実施例１０】
【０１５６】
ＭＡＣ生成に及ぼす加熱時間の影響−１
ねじ口バイアルに、実施例９と同一のＭＡＡ粗分画液０．１ｍＬおよび純水０．８ｍＬを加え、さらに、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、を０．１ｍＬ加えて総量を１．０ｍＬとした。これを密封し、ヒートブロックを用いて１２０℃で５−１２００分間加熱した。ＨＰＬＣにより加熱処理液に含まれるＭＡＣ−Ｐ３３４の含量を測定した。この結果、図２２に示すように、ＭＡＣ−Ｐ３３４の生成量は、長期間の加熱により低下する傾向が認められ、過熱によるＭＡＣの分解が生じている可能性が示唆された。生成効率５０％を満たす時間は、５分から６００分の範囲であった。
【比較例６】
【０１５７】
ＭＡＣ生成に及ぼす加熱時間の影響−２
添加する緩衝液のｐＨを６．０に変更して、実施例と同様の試験を行った。この結果、図２３に示すように、ＭＡＣ−Ｐ３３４の生成量は、測定した全加熱時間において生成効率５０％を超えなかった。
【実施例１１】
【０１５８】
ＭＡＣ生成に及ぼす塩濃度の影響
ねじ口バイアルに、実施例９と同一のＭＡＡ粗分画液０．１ｍＬを加え、さらに、系中の緩衝液濃度が０．２−１６０ｍＭになるように０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）および純水を加え、総量を１．０ｍＬとした。これを密封し、ヒートブロックを用いて１２０℃で１時間加熱した。ＨＰＬＣにより加熱処理液に含まれるＭＡＣ−Ｐ３３４の含量を測定した。この結果、図２４に示すように、ＭＡＣ−Ｐ３３４の生成量は、緩衝液濃度５−２０ｍＭを最大として、濃度の上昇とともに低下する傾向にあった。生成効率５０％を満たす塩濃度は、０．２ｍＭから１１０ｍＭの範囲であった。
【実施例１２】
【０１５９】
１５０℃加熱によるＭＡＣ生成
実施例９と同一のＭＡＡ粗分画液１０ｍＬに純水８０ｍＬおよび０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを加え、総量を１００ｍＬとした。これを、１５０℃に設定したオイルバスに浸漬したステンレス製熱交換コイル（内容積２ｍＬ）に通液し、１５０℃処理液を調製した。加熱時間は通液速度を変えることで設定した。ＨＰＬＣにより加熱処理液に含まれるＭＡＣ−Ｐ３３４の含量を測定した。この結果、図２５に示すように、ＭＡＣ−Ｐ３３４の生成量は、加熱時間３分以上では激減した。以上の結果は、加熱温度が高い場合には、至適加熱時間はより短時間側にシフトすることを示している。
【実施例１３】
【０１６０】
藻類エキスの調製
スサビノリ（板海苔下級品、有明海産，２００３年２月製）５０ｇに純水１Ｌを投入後、オートクレーブを用いて１２０℃で２時間加熱した。減圧濾過により加熱品を固液分離し、抽出液を限外ろ過膜（分画分子量５，０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２  ＭＩＮＩ）でろ過し、透過液を得た。冷却後凍結乾燥し、藻類エキス粉末約５ｇを得た。
【実施例１４】
【０１６１】
ＤＰＰＨラジカル消去活性
実施例１３の藻類エキスを純水に溶かして水溶液を調製し、ＤＰＰＨラジカル消去活性を実施例１に従って測定した。その結果、藻類エキスに濃度依存的なＤＰＰＨラジカル消去活性が認められた（図２６）。
【実施例１５】
【０１６２】
β−カロテン退色防止活性
また、以下の方法に従って藻類エキス水溶液のβ−カロテン退色防止活性を測定した：リノール酸溶液（０．１ｇ／ｍＬ  ＣＨＣｌ３）３００μＬ、β−カロテン溶液（１ｍｇ／ｍＬ  ＣＨＣｌ３）５００μＬ、Ｔｗｅｅｎ  ４０溶液（０．２ｇ／ｍＬ  ＣＨＣｌ３）８００μＬを混合し、窒素ガスを吹き付けて乾固させ、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）６０ｍＬを加えてエマルジョン溶液とした。多段階希釈した藻類エキス水溶液２０μＬにエマルジョン溶液１８０μＬを加え、５０℃で３０分静置し、β−カロテン溶液の退色を４７０ｎｍの吸光度を測定することで求めた。退色率を以下の式で求め、ＢＨＴの退色防止活性と比較した：退色率（％）＝サンプルの吸光度変化（０分−３０分）／サンプル無添加品の吸光度変化（０分−３０分）×１００。その結果、藻類エキスは濃度依存的にβ−カロテンの退色を防止した（図２７）。
【実施例１６】
【０１６３】
スサビノリ２ｇをねじ口瓶に入れ、５０ｍＬのリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６．０，７．０，８．０）および２０ｍＭリン酸緩衝液−ＮａＯＨ溶液（ｐＨ９．０，１０．０，１１．０）を加えて１００℃で１時間加熱した。加熱後の懸濁液をし、実施例１３と同様の操作で透過液を得た。透過液のＭＡＣ−Ｐ３３４相対含量をＨＰＬＣにて測定した。また、ＤＰＰＨラジカル消去活性を測定し、トロロックス当量で算出した。その結果、図２８に示すように、ｐＨ７．０以上の加熱処理品において顕著な抗酸化能の上昇とＭＡＣ含量の上昇が認められ、実施例９におけるＭＡＣ生成挙動と同様の挙動を示すことが明らかとなった。
【実施例１７】
【０１６４】
スサビノリ２ｇをねじ口瓶に入れ、５０ｍＬの純水を加えて５０〜１２０℃で１時間加熱した。１００℃以上の温度においてはオートクレーブを用いた。加熱後の懸濁液を遠心分離（２０，０００  ｘＧ，２０分）して上清を得た。この上清を遠心式限外ろ過フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−０．５，５−ｋＤａ−ｃｕｔｏｆｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，ミリポア社）でろ過し、低分子の透過液を回収した。透過液のＭＡＣ−Ｐ３３４相対含量をＨＰＬＣにて測定した。また、ＤＰＰＨラジカル消去活性を測定し、トロロックス当量で算出した。その結果、図２９に示すように、１２０℃抽出においてのみ、顕著な抗酸化能の上昇とＭＡＣ含量の上昇が認められた。
【実施例１８】
【０１６５】
スサビノリ２ｇをねじ口瓶に入れ、５０ｍＬの純水を加えて１２０℃で１５，３０，６０分間加熱した。加熱に際してはオートクレーブを用いた。加熱後急冷し、実施例１６と同様の操作で透過液を得た。透過液のＭＡＣ−Ｐ３３４相対含量およびＤＰＰＨラジカル消去活性を測定した。その結果、図３０に示すように、加熱時間３０分以降において、ＭＡＣ含量の上昇が認められた。この結果は、加熱媒体として純水を用いる際には、ＭＡＣ含量の上昇を促すために１２０℃‐３０分以上の加熱時間が望ましいことを示唆していた。
【実施例１９】
【０１６６】
スサビノリ２ｇをねじ口瓶に入れ、５０ｍＬの純水を加えて１２０℃で２時間加熱した。懸濁液を遠心分離（２０，０００ｘＧ，２０分）して上清を得た。この上清を遠心式限外ろ過フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−０．５，５−ｋＤａ−ｃｕｔｏｆｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，ミリポア社）でろ過し、低分子の透過液を回収した。透過液のＭＡＣ−Ｐ３３４含量を測定した。
【実施例２０】
【０１６７】
スサビノリ２ｇをねじ口瓶に入れ、リン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）を加えて１２０℃で２時間加熱した。懸濁液を遠心分離（２０，０００ｘＧ，２０分）して上清を得た。この上清を遠心式限外ろ過フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−０．５，５−ｋＤａ−ｃｕｔｏｆｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，ミリポア社）でろ過し、低分子の透過液を回収した。透過液のＭＡＣ−Ｐ３３４含量を測定した。
【実施例２１】
【０１６８】
スサビノリ２ｇをねじ口瓶に入れ、５０ｍＬの純水を加えて４℃で一晩撹拌した。懸濁液を遠心分離（２０，０００ｘＧ，２０分）して上清を得、これを遠心式限外ろ過フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−０．５，５−ｋＤａ−ｃｕｔｏｆｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，ミリポア社）でろ過し、低分子の透過液を回収した。透過液を遠心濃縮して一旦乾固させ、リン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）を濃縮した液量分だけ加えて十分に撹拌し、固形分を溶解させた。これを１２０℃で２時間加熱し、加熱処理液のＭＡＣ−Ｐ３３４含量を測定した。
【比較例７】
【０１６９】
実施例２１の透過液をそのまま１２０℃で２時間加熱し、加熱処理液のＭＡＣ−Ｐ３３４含量を測定した。
【実施例２２】
【０１７０】
実施例１９−２１ならびに比較例６におけるＭＡＣ−Ｐ３３４相対含量を図３１に示す。スサビノリから低温で純水抽出した透過液をそのまま１２０℃―２時間加熱したもの（比較例６）についてはＭＡＣの含量が低かった一方、この透過液をリン酸緩衝液で置換し、１２０℃―２時間加熱したもの（実施例２１）については良好なＭＡＣ−Ｐ３３４生成率ならびにＤＰＰＨラジカル消去活性を示した。また、分子量分画を行う前に加熱したものについては、抽出溶媒として純水を用いたもの（実施例１９）、リン酸緩衝液を用いたもの(実施例２０)のどちらも良好なＭＡＣ生成率を示した。
【実施例２３】
【０１７１】
産地および収穫時期の異なる８種類のスサビノリ（板海苔下級品，有明海産，２００３年２月製）５ｋｇに純水５０ｋｇを投入後、密閉釜中で１２０oＣにて約３時間加熱した。純水３５ｋｇの加水による冷却後固液分離を行い、熱水可溶性抽出液を得た。抽出液をセラミックフィルタ（１Ｍ４−２Ｐ型，株式会社ノリタケカンパニーリミテド，名古屋）を用いて限外濾過し、透過液を得た。透過液を噴霧乾燥装置（ＬＢ−８型，大川原化工機株式会社，横浜）にて乾燥し、藻類エキス粉末約５００ｇを得た。この藻類エキスに含まれるＰ３３４ならびにＭＡＣ−Ｐ３３４含量（粉末重量あたりの重量％）をＨＰＬＣにより測定した。表１に示すように、ＭＡＣを高含量で含む藻類エキスが大量調製可能であった。
【０１７２】
【表１】
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【実施例２４】
【０１７３】
２４．１  好中球と活性酸素
生体内の基礎免疫機構を担う白血球の主成分、好中球は種々の化学物質により活性化され、多様な細胞機能を発現する。血管内に存在する好中球は、細菌由来のペプチドによる刺激を受けて、スーパーオキサイドアニオンラジカル（活性酸素）を放出して殺菌する。通常、過剰に産生された活性酸素は、ＳＯＤに代表されるような酵素によって活性酸素を過酸化水素に分解し、さらにカタラーゼによって水と酸素に分解し無毒化しているが、加齢にともないこれらの酵素の生産量は減少することが明らかとなっており、分解できなかった活性酸素は、それ自身反応性があるため、それが細胞への障害となり、ガンや生活習慣病など様々な疾患に関与していると言われている。従って、上記のようなラジカルを消去することが出来る藻類エキスが持つ抗酸化作用により、過剰に存在する活性酸素を消去することが期待できる。そこで、好中球が産生する活性酸素の消去能を評価した。
２４．２  ヒト好中球の調製
健常人の静脈抹消血（全血）をヘパリン処理し、さらに３％デキストラン生理食塩水を抹消血と１：１の割合で添加した。赤血球が沈殿したので上清を採取した。さらに、上清を４℃で、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、未沈降の赤血球は水を加え溶血させた。次いで、Ｆｉｃｏｌｌ溶液（ファルマシア製）存在下、４℃‐１５００ｒｐｍで１５分間遠心することにより、上層から、リンパ球、単球、好中球の順に分かれた。チューブの底の好中球を採取した。
２４．３  好中球が産生する活性酸素消去能の評価
２４．２で調製した好中球の生理リン酸食塩水溶液（１．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）の溶液９７０μＬに１００ｍＭのＣａＣｌ２（塩化カルシウム、終濃度１ｍＭ）、５ｍＭのＤ−Ｇｌｃ（グルコース）、チトクロムＣをそれぞれ１０μＬづつ加え、全量で１０００μＬとした。この細胞浮遊液をセルに加え、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、実施例２０の藻類エキスを終濃度０．２ｍｇ／ｍＬとなるようにセルに加え１分間インキュベートし、藻類エキスそれ自身が好中球に対して刺激剤として作用していないことを確認後、走化性ペプチドｆＭＬＰをその濃度が最終的に１０−７Ｍになるように加えた（図３２左）。活性酸素によって還元されたチトクロムＣを二波長分光光度計（５４０−５５０ｎｍ）を用いて測定することで、活性酸素の量を算出した。また、活性酸素消去能は、１０−７ＭのｆＭＬＰによって好中球が産生する活性酸素量を１００％とした相対活性で表し（図３２右）、藻類エキス添加時における活性酸素量を算出することで、活性酸素消去能を評価した。
２４．４  藻類エキスの活性酸素消去能
藻類エキスの感作時間を詳細に検討した結果、およそ１分間で活性酸素を消去することが確かめられた（図３３）。そこで感作時間を１分に調整し、藻類エキスの活性酸素消去活性における濃度依存的効果を測定した結果、終濃度０．２ｍｇ／ｍＬで活性酸素量をおよそ５０％以下に低減させることが確かめられた（図３４）。このことは、藻類エキスが、好中球が産生する活性酸素を消去し、体内における酸化ストレスの緩和に役立つことを示唆していた。
【実施例２５】
【０１７４】
２５．１  ＭＡＣの一酸化窒素消去能
96穴マイクロプレート(Nunc社製)に各種濃度に希釈したＭＡＣ 10μLおよびBuffer 80μLを加え、一酸化窒素発生試薬であるNOC-7[1-ヒドロキシ-2-オキソ-3-(N-メチル-3-アミノプロピル)-3-メチル-1-トリアゼン]を10μL加える事で反応開始とした。20分後、Greiss試薬を共に50 μLずつ加え、10分後A540を測定した（一酸化窒素C-7の半減期（t=20 min）を考慮し、反応時間は20分とした。）。
【０１７５】
図３５に示す様に、ＭＡＣは一酸化窒素放出抑制活性を有し、その抑制量は濃度依存的であった。ＭＡＣ 0.1 mg/mL の濃度でおよそ半分の一酸化窒素の量が消去された。0.5 mg/mL以上のＭＡＣ量の添加は一酸化窒素抑制量にほとんど変化は見られなかった。
２５．２  ＭＡＣの一酸化窒素産生抑制
次に、実際の単球による一酸化窒素産生に対する抑制効果を検討した。実施２４に従い、鶏の単球を単離した。96穴マイクロプレート(Nunc社製)に各種濃度に希釈したＭＡＣを加えた後、サルモネラ死菌刺激により単球を刺激させ、22時間後 Greiss試薬により発色させ評価した。
【０１７６】
その結果、図３６に示すように、ＭＡＣは鶏単球から産生される一酸化窒素を濃度依存的に抑制し、単球から放出される一酸化窒素に関してもその抑制効果があることが確かめられた。
【比較例８】
【０１７７】
抗酸化作用と一酸化窒素消去活性の関係を検討するために、既知の抗酸化化合物として知られる、クロロゲン酸を用いて同様に一酸化窒素消去試験を行なった。図３７に示す様にクロロゲン酸は一酸化窒素放出抑制活性を有し、その抑制量は濃度依存的であったが、ＭＡＣと比べとても弱いものであった。ＭＡＣと同じ0.1 mg/mLの濃度において、クロロゲン酸添加前後の一酸化窒素発生量の相違は、無添加時で一酸化窒素発生量191μM、クロロゲン酸添加時で一酸化窒素発生量172μMであった（一酸化窒素産生抑制率換算で10.5％）。
【０１７８】
以上の結果より、ＭＡＣは同じ抗酸化作用をもつクロロゲン酸と比較してもおよそ５倍も高い一酸化窒素抑制効果を示す化合物である事が明らかであった。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】スサビノリ由来マイコスポリン様アミノ酸粗分画液の逆相ＨＰＬＣによる分析
【図２】スサビノリ由来マイコスポリン様アミノ酸のＩＴＭＳおよびＩＴＭＳ／ＭＳスペクトル
【図３】スサビノリ由来マイコスポリン様アミノ酸粗分画液のＤＰＰＨラジカル消去活性―加熱処理前後の比較
【図４】ＭＡＡ粗分画―加熱処理液における逆相ＨＰＬＣおよび分画物のＤＰＰＨラジカル消去活性
【図５】ＭＡＡ粗分画―加熱処理液由来ＤＰＰＨラジカル消去活性成分のＩＴＭＳおよびＩＴＭＳｎスペクトル
【図６】ＴＬＣ−ＤＰＰＨ法によるＤＰＰＨラジカル消去活性成分の可視化
【図７】ＭＡＡ粗分画―加熱処理液由来ＤＰＰＨラジカル消去活性成分の弱塩基性陰イオン交換樹脂による分取
【図８】逆相分配クロマトグラフィーによるＭＡＣの精製
【図９】合成吸着樹脂へのＭＡＣの吸着試験
【図１０】逆相分配クロマトグラフィーにおけるＭＡＣの溶出に及ぼす移動相中の酢酸含量の影響
【図１１】逆相分配クロマトグラフィーにおけるＭＡＣの溶出に及ぼす移動相中の蟻酸含量の影響
【図１２】ＭＡＣの紫外吸収スペクトル
【図１３−１】ＭＡＣを構成するアミノ酸
【図１３−２】ＭＡＣにおける重水中でのプロトン-重水素交換挙動
【図１４】分取ＨＰＬＣによるＭＡＡ粗分画品からのＭＡＡの精製
【図１５】分画物１（Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ３３４）およびその加熱処理物の逆相ＨＰＬＣならびにＭＳ，  ＭＳ／ＭＳスペクトル
【図１６】分画物１（Ｓｈｉｎｏｒｉｎｅ）およびその加熱処理物の逆相ＨＰＬＣならびにＭＳ，  ＭＳ／ＭＳスペクトル
【図１７】ＭＡＡのＤＰＰＨラジカル消去活性―加熱処理前後の比較
【図１８】加熱によるＭＡＡからＭＡＣへの変換様式
【図１９】ＭＡＣのＤＰＰＨラジカル消去活性
【図２０】ＭＡＣ生成率に及ぼすｐＨ及び温度の影響
【図２１】ＭＡＣ−Ｐ３３４における生成効率５０％を満たすために必要なｐＨ
【図２２】ＭＡＣ生成率に及ぼす加熱温度の影響−ｐＨ８．０の場合
【図２３】ＭＡＣ生成率に及ぼす加熱温度の影響−ｐＨ６．０の場合
【図２４】ＭＡＣ生成率に及ぼす塩温度の影響
【図２５】加熱温度１５０℃におけるＭＡＣ生成率に及ぼす加熱時間の影響
【図２６】藻類エキスのＤＰＰＨラジカル消去活性
【図２７】藻類エキスのβ−カロテン退色防止活性
【図２８】藻類エキスのＭＡＣ含量ならびに抗酸化活性に及ぼす加熱時のｐＨの影響
【図２９】藻類エキスのＭＡＣ含量ならびに抗酸化活性に及ぼす加熱温度の影響―純水を用いた場合
【図３０】藻類エキスのＭＡＣ含量に及ぼす加熱時間の影響―純水を用いた場合
【図３１】高分子成分の共存によるＭＡＣ含量の上昇
【図３２】藻類エキス添加後のｆＭＬＰ刺激による活性酸素量（左）、ｆＭＬＰ刺激による活性酸素量（右）。
【図３３】藻類エキスの活性酸素消去能に及ぼす感作時間の影響
【図３４】藻類エキスの活性酸素消去能における濃度依存的効果
【図３５】ＭＡＣの一酸化窒素消去能における濃度依存的効果
【図３６】鶏単球由来一酸化窒素の産生抑制におけるＭＡＣの濃度依存的効果
【図３７】クロロゲン酸の一酸化窒素消去能
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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