(57)【要約】【課題】糖尿病網膜症に有効な新規薬剤及びその使用方法を提供すること。【解決手段】発明者らは、糖尿病患者において、網膜血液中の血糖値が上昇すると網膜色素上皮細胞からアンジオポエチン関連タンパク質４の発現が亢進し、アンジオポエチン関連タンパク質４が網膜血管内皮細胞の管腔形成を促進し、最終的に、網膜血管の血管新生が進行する、という糖尿病網膜症における血管新生のメカニズムを明らかにした。そこで、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制する抑制因子を含有する薬剤を、アンジオポエチン関連タンパク質４によって生じる網膜の血管新生に起因する疾患に対する治療薬とする。なお、対象となる疾患の例は、糖尿病網膜症や血管新生緑内障等である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースを有効成分として含有するアンジオポエチン関連タンパク質４（angiopoietin-like 4）の発現亢進剤。
【請求項２】
網膜色素上皮細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を亢進させることを特徴とする請求項１に記載の発現亢進剤。
【請求項３】
アンジオポエチン関連タンパク質４を有効成分として含有する網膜血管新生促進剤。
【請求項４】
前記アンジオポエチン関連タンパク質４が、網膜色素上皮細胞由来であることを特徴とする請求項３に記載の網膜血管新生促進剤。
【請求項５】
アンジオポエチン関連タンパク質４の機能を抑制するアンジオポエチン関連タンパク質４抑制因子を有効成分として含有する網膜血管新生抑制剤。
【請求項６】
前記アンジオポエチン関連タンパク質４抑制因子は、網膜色素上皮細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制することを特徴とする請求項５に記載の網膜血管新生抑制剤。
【請求項７】
網膜の血管新生に起因する疾患に対する予防・治療剤であって、
アンジオポエチン関連タンパク質４の機能を抑制するアンジオポエチン関連タンパク質４抑制因子を有効成分として含有することを特徴とする予防・治療剤。
【請求項８】
前記疾患が、糖尿病網膜症又は血管新生緑内障であることを特徴とする請求項７に記載の予防・治療剤。
【請求項９】
前記アンジオポエチン関連タンパク質４抑制因子は、網膜色素上皮細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制することを特徴とする請求項７又は８に記載の予防・治療剤。
【請求項１０】
ＨＩＦ１α又はＰＰＡＲγの機能を増強する機能増強剤を有効成分として含有するアンジオポエチン関連タンパク質４発現亢進剤。
【請求項１１】
ＨＩＦ１αの発現を亢進させる発現亢進剤又はＰＰＡＲγのアゴニストであることを特徴とする請求項１０に記載の発現亢進剤。
【請求項１２】
ＨＩＦ１α又はＰＰＡＲγの機能を抑制する機能抑制剤を有効成分として含有するアンジオポエチン関連タンパク質４発現抑制剤。
【請求項１３】
ＨＩＦ１α又はＰＰＡＲγの発現を抑制する発現抑制剤又はＰＰＡＲγのアンタゴニストであることを特徴とする請求項１２に記載の発現抑制剤。
【請求項１４】
前記発現抑制剤が、ｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする請求項１３に記載の発現抑制剤。
【請求項１５】
ＨＩＦ１α又はＰＰＡＲγの機能を増強する機能増強剤を有効成分として含有する網膜血管新生促進剤。
【請求項１６】
ＨＩＦ１αの発現を亢進させる発現亢進剤又はＰＰＡＲγのアゴニストであることを特徴とする請求項１５に記載の網膜血管新生促進剤。
【請求項１７】
ＨＩＦ１α又はＰＰＡＲγの機能を抑制する機能抑制剤を有効成分として含有する網膜血管新生抑制剤。
【請求項１８】
ＨＩＦ１α又はＰＰＡＲγの発現を抑制する発現抑制剤又はＰＰＡＲγのアンタゴニストであることを特徴とする請求項１７に記載の網膜血管新生抑制剤。
【請求項１９】
前記発現抑制剤が、ｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする請求項１７に記載の網膜血管新生抑制剤。
【請求項２０】
網膜色素上皮細胞を含む培養細胞において、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を亢進させる方法であって、
グルコースを前記培養細胞に投与すること、
を特徴とする方法。
【請求項２１】
網膜血管内皮細胞を含む培養細胞において、血管新生を促進する方法であって、
アンジオポエチン関連タンパク質４を前記培養細胞に投与すること、
を特徴とする方法。
【請求項２２】
前記アンジオポエチン関連タンパク質４が、網膜色素上皮細胞由来のものであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
網膜血管内皮細胞を含む培養細胞において、血管新生を抑制する方法であって、
アンジオポエチン関連タンパク質４抑制因子を前記培養細胞に投与すること、
を特徴とする方法。
【請求項２４】
網膜色素上皮細胞を含む培養細胞において、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を亢進させる方法であって、
ＨＩＦ1α又はＰＰＡＲγの機能を増強する機能増強剤を前記培養細胞に投与すること、
を特徴とする方法。
【請求項２５】
網膜色素上皮細胞を含む培養細胞において、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制する方法であって、
ＨＩＦ1α又はＰＰＡＲγの機能を抑制する抑制因子を前記培養細胞に投与すること、
を特徴とする方法。
【請求項２６】
網膜の血管新生に起因する疾患を診断する診断キットであって、
アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を診断マーカーとして使用すること、
を特徴とする診断キット。
【請求項２７】
前記疾患が、糖尿病網膜症又は血管新生緑内障であることを特徴とする請求項２６に記載の診断キット。
【請求項２８】
網膜の血管新生に起因する疾患に対する予防又は治療に効果を有する物質のスクリーニング方法であって、
基準値以上の濃度のグルコース存在下において網膜色素上皮細胞を培養し、前記網膜色素上皮細胞に被験物質を投与し、前記網膜色素上皮細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４を測定する工程を含むこと、
を特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２９】
前記疾患が、糖尿病網膜症又は血管新生緑内障であることを特徴とする請求項２８に記載のスクリーニング方法。
【請求項３０】
網膜の血管新生に起因する疾患に対する予防又は治療に効果を有する物質のスクリーニングに使用するアッセイ系であって、
基準値以上の濃度のグルコース存在下において培養した網膜色素上皮細胞を含むこと、
を特徴とするアッセイ系。
【請求項３１】
前記疾患が、糖尿病網膜症又は血管新生緑内障であることを特徴とする請求項３０に記載のアッセイ系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病網膜症の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病に罹患し、高血糖を主体とした代謝異常が長期間持続したり反復したりすると、網膜血管に異常をきたし、それを取り巻く網膜や硝子体に多様な病変を形成するようになる。これを糖尿病網膜症と呼ぶ。
【０００３】
網膜は、光学顕微鏡的に10層に分かれており、内側の9層は神経網膜からなり、外側の1層は網膜色素上皮細胞からなる。この網膜色素上皮細胞には網膜血管が取り巻き、この網膜血管の透過性が亢進したり閉塞が進行したりすると、網膜血管の内皮細胞から新生血管が生じる。
【０００４】
糖尿病網膜症患者の眼底所見では、主に新生血管、増殖組織、硝子体出血、網膜剥離等が観察される。これは、患者の網膜において、微小血管障害や網膜血管の内腔閉塞によって網膜血管内の酸素が欠乏し、その結果、網膜内部と硝子体の中で血管新生が起きるためである。こうして生じた新生血管は、網膜血管の透過性亢進（血管壁が弱くなり、血管内の物質が血管外に出やすくなること。）、及び、網膜血管の内腔閉塞（血管が詰まること。初期の閉塞は血栓によることが多い。）という特徴を有するため、脆弱で透過性が高く、血管壁はしばしば破綻して網膜前出血や硝子体出血を生じ、最終的には増殖組織や硝子体の牽引や収縮により牽引性網膜剥離をきたし、失明に至る。
【０００５】
現在、このような事態を回避すべく、糖尿病網膜症患者に対して、新生血管の発生を予防したり、発生した新生血管を凝固したりするため、網膜光凝固療法や薬物療法が行なわれている。しかしながら、現在行なわれている薬物療法は、血管強化薬、循環改善薬、血小板凝集抑制薬等を用いた補助的な治療であり（例えば、非特許文献１を参照）、糖尿病網膜症の基本病態である網膜血管の透過性亢進、内腔閉塞、血管新生のいずれかを抑制する薬物は、糖尿病黄斑症等ごく一部の特殊な病態を除き、ほとんど存在しない。
【非特許文献１】Bhavsar AR: Diabetic retinopathy. The latest in current management,Retina 26(6) S71-S79, 2006.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上のような現状から、糖尿病網膜症の基本病態を根本的に治療する薬剤の開発が期待されていた。  
そこで、本発明は、糖尿病網膜症に有効な新規薬剤及びその使用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
糖尿病網膜症の基本病態の発症、進展には種々のサイトカインが関与することが知られており、中でも、最も重要なサイトカインは、血管新生に関与するＶＥＧＦ（vascular endotheliaＬＧrowth factor; ＶＥＧＦ）であるとされている。
【０００８】
近年、アンジオポエチン関連タンパク質４（angiopoietin-like 4）（別名、ＰＧＡＲ、ＦＩＡＦ）も血管内皮細胞を増殖させることが明らかになった（Yoshida K, et al., Vet. Res. Commun., 28 (4), 299-305 (2004)））。しかし、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現は、肝臓や脂肪組織でしか知られておらず、しかも血糖値の低い空腹時に上昇し（Annual Report of Sankyo Research Laboratories, vol.57, 4, (2005)）、血糖値が高い糖尿病患者では低下する（Kersten, S. et al., J. Biol. Chem., 275, 28488-28493 (2000)）。従って、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現は、グルコース濃度に関係なく変化すると考えられ（Annual Report of Sankyo Research Laboratories, vol.57, 4, (2005)）、糖尿病網膜症における血管新生に関与するとは考えられていなかった。
【０００９】
本発明者らは、以下の実施例に示すように、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ cells）でアンジオポエチン関連タンパク質４が発現していること、低濃度のグルコースが存在する状態では、網膜色素上皮細胞においてアンジオポエチン関連タンパク質４はほとんど発現しないが、グルコースの濃度が上昇するにつれて、網膜色素上皮細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現量は増加すること、さらに、低濃度のグルコース濃度より、高濃度のグルコースの濃度で網膜色素上皮細胞を培養した方が、網膜色素上皮細胞から産生されるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現量が増加することを明らかにした。また、グルコース存在下で培養された網膜色素上皮細胞の培養上清を、血管内皮細胞の培地に添加した時に生じる管腔形成は、培地にアンジオポエチン関連タンパク質４を添加しても起きることや、培地のグルコース濃度を高めた状態で培養した網膜色素上皮細胞において、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制することによって得られた培養上清を用いると、網膜血管内皮細胞の管腔形成が生じないことを見出した。これらの結果より、本発明者らは、高濃度のグルコース存在下で培養された網膜色素上皮細胞の培養上清による網膜血管内皮細胞の管腔形成は、培養上清中のアンジオポエチン関連タンパク質４によって誘導されることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明にかかるアンジオポエチン関連タンパク質４（angiopoietin-like 4）発現亢進剤は、グルコースを有効成分として含有することを特徴とする。前記発現亢進剤は、網膜色素上皮細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を亢進させる発現亢進剤であることが好ましい。
【００１１】
また、本発明にかかる網膜血管新生促進剤は、アンジオポエチン関連タンパク質４を有効成分として含有することを特徴とする。ここで、前記アンジオポエチン関連タンパク質４は、網膜色素上皮細胞由来であってもよい。
【００１２】
さらに、本発明にかかる網膜血管新生抑制剤は、アンジオポエチン関連タンパク質４の機能を抑制するアンジオポエチン関連タンパク質４抑制因子を有効成分として含有することを特徴とする。ここで、前記アンジオポエチン関連タンパク質４抑制因子は、網膜色素上皮細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制する発現抑制剤であってもよい。
【００１３】
また、本発明にかかる網膜の血管新生に起因する疾患に対する予防・治療剤は、アンジオポエチン関連タンパク質４の機能を抑制するアンジオポエチン関連タンパク質４抑制因子を有効成分として含有することを特徴とする。ここで、前記アンジオポエチン関連タンパク質４抑制因子は、網膜色素上皮細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制する発現抑制剤であってもよい。なお、前記疾患は、例えば、糖尿病網膜症又は血管新生緑内障等である。
【００１４】
さらに、本発明にかかるアンジオポエチン関連タンパク質４発現亢進剤は、ＨＩＦ１又はＰＰＡＲγの機能を増強する機能増強剤を有効成分として含有することを特徴とする。前記発現亢進剤は、ＨＩＦ１αの発現を亢進させる発現亢進剤又はＰＰＡＲγのアゴニストであることが好ましい。
【００１５】
また、本発明にかかるアンジオポエチン関連タンパク質４発現抑制剤は、ＨＩＦ１α又はＰＰＡＲγの機能を抑制する機能抑制剤を有効成分として含有することを特徴とする。前記発現抑制剤は、ＨＩＦ１α又はＰＰＡＲγの発現を抑制する発現抑制剤又はＰＰＡＲγのアンタゴニストであることが好ましい。ここで、前記発現抑制剤は、ｓｉＲＮＡを含有していてもよい。
【００１６】
さらに、本発明にかかる網膜血管新生促進剤は、ＨＩＦ１α又はＰＰＡＲγの機能を増強する機能増強剤を有効成分として含有することを特徴とする。前記網膜血管新生促進剤は、ＨＩＦ１αの発現を亢進させる発現亢進剤又はＰＰＡＲγのアゴニストであることが好ましい。
【００１７】
また、本発明にかかる網膜血管新生抑制剤は、ＨＩＦ１α又はＰＰＡＲγの機能を抑制する機能抑制剤を有効成分として含有することを特徴とする。前記網膜血管新生抑制剤は、ＨＩＦ１α又はＰＰＡＲγの発現を抑制する発現抑制剤又はＰＰＡＲγのアンタゴニストであることが好ましい。ここで、前記発現抑制剤は、ｓｉＲＮＡを含有していてもよい。
【００１８】
さらに、本発明にかかるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を亢進させる方法は、網膜色素上皮細胞を含む培養細胞において、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を亢進させる方法であって、グルコースを前記培養細胞に投与することを特徴とする。
【００１９】
また、本発明にかかる血管新生を促進する方法は、網膜血管内皮細胞を含む培養細胞において、血管新生を促進する方法であって、アンジオポエチン関連タンパク質４を前記培養細胞に投与することを特徴とする。なお、前記アンジオポエチン関連タンパク質４は、網膜色素上皮細胞由来のものであってもよい。
【００２０】
さらに、本発明にかかる血管新生を抑制する方法は、網膜血管内皮細胞を含む培養細胞において、血管新生を抑制する方法であって、アンジオポエチン関連タンパク質４抑制因子を前記培養細胞に投与することを特徴とする。
【００２１】
また、本発明にかかるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を亢進させる方法は、網膜色素上皮細胞を含む培養細胞において、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を亢進させる方法であって、ＨＩＦ１α又はＰＰＡＲγの機能を増強する機能増強剤を前記培養細胞に投与することを特徴とする。
【００２２】
さらに、本発明にかかるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制する方法は、網膜色素上皮細胞を含む培養細胞において、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制する方法であって、ＨＩＦ１α又はＰＰＡＲγの機能を抑制する抑制因子を前記培養細胞に投与することを特徴とする。
【００２３】
また、本発明にかかる診断キットは、網膜の血管新生に起因する疾患を診断する診断キットであって、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を診断マーカーとして使用することを特徴とする。前記疾患は、例えば、糖尿病網膜症又は血管新生緑内障等である。
【００２４】
さらに、本発明にかかるスクリーニング方法は、網膜の血管新生に起因する疾患に対する予防又は治療に効果を有する物質のスクリーニング方法であって、基準値以上の濃度のグルコース存在下において網膜色素上皮細胞を培養し、前記網膜色素上皮細胞に被験物質を投与し、前記網膜色素上皮細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４を測定する工程を含むことを特徴とする。前記疾患は、例えば、糖尿病網膜症又は血管新生緑内障等である。
【００２５】
また、本発明にかかるアッセイ系は、網膜の血管新生に起因する疾患に対する予防又は治療に効果を有する物質のスクリーニングに使用するアッセイ系であって、基準値以上の濃度のグルコース存在下において培養した網膜色素上皮細胞を含むことを特徴とする。前記疾患は、例えば、糖尿病網膜症又は血管新生緑内障等である。
【００２６】
さらに、本発明にかかる網膜血管新生を抑制する方法は、ヒト又はヒト以外の脊椎動物において網膜血管新生を抑制する方法であって、前記網膜血管新生抑制剤を前記脊椎動物内に投与することを特徴とする。また、前記方法は、網膜の血管新生に起因する疾患に対する治療に用いてもよい。前記疾病は、例えば、糖尿病網膜症又は血管新生緑内障等である。
【００２７】
また、本発明にかかる診断方法は、ヒト又はヒト以外の脊椎動物において網膜の血管新生に起因する疾患を診断する方法であって、前記診断キットを前記脊椎動物に用いることを特徴とする。前記疾病は、例えば、糖尿病網膜症又は血管新生緑内障等である。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によって、本発明は、糖尿病網膜症に有効な新規薬剤及びその使用方法を提供することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に、本発明の実施の形態において実施例を挙げながら具体的かつ詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００３１】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００３２】
（１）薬理作用
本発明者らは、以下の実施例に示すように、糖尿病患者において、網膜血液中の血糖値が上昇すると網膜色素上皮細胞からアンジオポエチン関連タンパク質４の発現が誘導され、分泌されたアンジオポエチン関連タンパク質４が網膜血管内皮細胞の管腔形成を促進し、最終的に、網膜血管の血管新生が進行する、という糖尿病網膜症における血管新生のメカニズムを明らかにした。
【００３３】
同時に、網膜色素上皮細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制することにより、網膜血管内皮細胞の管腔形成（血管新生）を抑制することを可能にした。従って、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制する抑制因子は、アンジオポエチン関連タンパク質４によって生じる網膜の血管新生に起因する疾患に対する予防・治療等に用いることができる。
【００３４】
ここで、アンジオポエチン関連タンパク質４によって生じる網膜の血管新生に起因する疾患としては、糖尿病網膜症、血管新生緑内障等が挙げられる。なお、これらの疾患においては、網膜剥離、網膜出血、網膜血管増殖組織、硝子体出血等の眼底所見が観察される。また、糖尿病以外で網膜血液中の血糖値が上昇する疾患・状態としては、糖尿病、耐糖障害、急性・慢性膵炎、ラ島炎、膵摘出、クッシング症候群、甲状腺機能亢進症、グルカゴノーマ、褐色細胞腫、脳血管障害、脳腫瘍、髄膜炎、脂肪肝、慢性肝炎、インスリンレセプター異常、胃切除、糖過剰摂取、薬物副作用発現時等が挙げられる。
【００３５】
（２）本発明の薬剤
（i）グルコースを有効成分として含有する薬剤
以下の実施例に示すように、グルコースを網膜色素上皮細胞に投与すると、網膜色素上皮細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現が亢進した。さらに高濃度のグルコースを網膜色素上皮細胞に投与すると、網膜色素上皮細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現はさらに亢進した。従って、グルコースを含有する薬剤は、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を亢進させるのに有用である。なお、本発明の薬剤に含有するグルコースは、市販のものでもよいし、公知の方法を用いて製造してもよい。
【００３６】
グルコースを有効成分として含有する薬剤に用いられ得る薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質を用いてもよく、例えば、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等を含有してもよいし、軟膏製剤におけるワセリン等の基剤、流動パラフィン、精製ラノリン等を用いてもよい。さらに必要に応じて、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、吸着剤、ビタミン剤等の添加物を適宜、適量含有してもよい。また、本薬剤の剤形は特に限定されないが、ヒト又はヒト以外の脊椎動物に投与する場合は、外用剤の形態が好ましく、特に点眼剤が好ましい。
【００３７】
（ii）アンジオポエチン関連タンパク質４を有効成分として含有する薬剤
血管新生は、血管内皮細胞が遊走し、浸潤し、増殖し、最終的に管腔を形成する、という順序で起こる。培養系における血管内皮細胞の管腔形成は、血管新生のin vitroモデル系だと考えられており、以下の実施例に示すように、アンジオポエチン関連タンパク質４を血管内皮細胞に投与すると、これら血管内皮細胞の遊走、浸潤、増殖及び管腔形成を促進した。従って、アンジオポエチン関連タンパク質４を含有する薬剤は、網膜における血管新生を促進するのに有用である。
【００３８】
本薬剤に含有されるアンジオポエチン関連タンパク質４は、天然由来（例えば、網膜色素上皮細胞由来）であってもよいし、遺伝子組換え体であってもよい。組換えタンパク質の場合、アンジオポエチン関連タンパク質４を発現する細胞から公知の方法を用いて製造及び精製することができる。また、ファージプロモーター等を用いたin vitro転写系及び小麦胚芽抽出液やウサギ網状赤血球抽出液などのin vitro翻訳系を用いて、アンジオポエチン関連タンパク質４を合成後、精製してもよい。
【００３９】
また、本薬剤は、アンジオポエチン関連タンパク質４を発現する細胞を含有してもよいが、特に、その細胞は、アンジオポエチン関連タンパク質４を分泌することが好ましい。例えば、このような細胞として、網膜色素上皮細胞や、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現ベクターを含む組換え細胞などを用いることができる。
【００４０】
アンジオポエチン関連タンパク質４を有効成分として含有する薬剤に用い得る薬学的に許容される担体及び剤形は、（２）（i）に記載の通りである。
【００４１】
（iii）アンジオポエチン関連タンパク質４抑制因子を有効成分として含有する薬剤
以下の実施例に示す通り、網膜血管内皮細胞に対してアンジオポエチン関連タンパク質４の投与量を減少させた場合や、網膜色素上皮細胞のアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制し、これら網膜色素上皮細胞を培養する培養上清を用いたた場合（図５Ａ及び５Ｂ）において、網膜血管内皮細胞の管腔形成は抑制された。従って、アンジオポエチン関連タンパク質４の機能を抑制する抑制因子を含有する薬剤は、網膜における血管新生を抑制するのに有用である。
【００４２】
本薬剤に含有するアンジオポエチン関連タンパク質４抑制因子は、アンジオポエチン関連タンパク質４の機能を抑制するものであればよく、例えば、アンジオポエチン関連タンパク質４に特異的に結合し、その機能を特異的に抑制する抗体やアプタマーや、化合物等を用いてもよい。また、アンジオポエチン関連タンパク質４の機能を抑制するために、網膜色素上皮細胞のアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制してもよく、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制する発現抑制剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等を用いてもよい。
【００４３】
アンジオポエチン関連タンパク質４抑制因子を有効成分として含有する薬剤に用い得る薬学的に許容される担体及び剤形は、（２）（i）に記載の通りである。
【００４４】
（iv）ＨＩＦ１αの機能を抑制する機能抑制剤を有効成分として含有する薬剤
ＨＩＦ（hypoxia inducible factor）は、αサブユニット（α1、α2、α3）とβサブユニットからなる二量体である。ＨＩＦ１α（hypoxia inducible factor 1 subunit α）はほぼ全ての細胞で発現していることが知られているが、常酸素条件下ではユビキチン−プロテアソーム系により分解されるので、ほとんどその発現は検出されない。低酸素条件下では、分解抑制を受けて核内に移行し、ＤＮＡ上に存在するＨＲＥ（Hypoxia Responsive Element）に結合することによって、低酸素応答を引き起こす。
【００４５】
実施例に示すように、網膜色素上皮細胞において、ＨＩＦ１αの発現を阻害すると、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現が抑制される。そこで、ＨＩＦ１αの機能を抑制する機能抑制剤を有効成分として含有する薬剤は、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現抑制を通じ、アンジオポエチン関連タンパク質４の機能を抑制するのに有用である。
【００４６】
従って、ＨＩＦ１αの機能を抑制する抑制因子は、網膜の血管新生に起因する疾患に対する予防・治療等に用いることができる。なお、「網膜の血管新生に起因する疾患」は、前述の通りである。
【００４７】
本薬剤に含有されるＨＩＦ１α抑制因子は、ＨＩＦ１αの機能を抑制するものであればよく、例えば、ＨＩＦ１αに特異的に結合し、その機能を特異的に抑制する抗体やアプタマーや、化合物等を用いてもよい。また、ＨＩＦ１αの機能を抑制するために、網膜色素上皮細胞のＨＩＦ１αの発現を抑制してもよく、ＨＩＦ１αの発現を抑制する発現抑制剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等を用いてもよい。
【００４８】
ＨＩＦ１αの機能を抑制する機能抑制剤を有効成分として含有する薬剤に用い得る薬学的に許容される担体及び剤形は、（２）（i）に記載の通りである。
【００４９】
（v）ＨＩＦ１αの機能を増強する機能増強剤を有効成分として含有する薬剤
実施例に示すように、ＨＩＦ１αの発現を抑制すると網膜色素上皮細胞のアンジオポエチン関連タンパク質４の発現は抑制される。従って、ＨＩＦ１αの機能の強弱によってアンジオポエチン関連タンパク質４の発現が制御されている細胞においては、ＨＩＦ１αの機能を増強すれば、網膜色素上皮細胞のアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を亢進させることができると考えられる。そこで、ＨＩＦ１αの機能を増強する機能増強剤を有効成分として含有する薬剤は、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を亢進させるのに有用である。
【００５０】
本薬剤に含有される、ＨＩＦ１αの機能を増強する機能増強剤は、ＨＩＦ１αの機能を増強するものであればよく、典型的には、ＨＩＦ１α発現亢進剤を用いることができる。例えば、ＨＩＦ１αのタンパク質それ自体を含有したり、ＨＩＦ１αの発現ベクターや、その発現ベクターを含む組換え細胞を含有したりしてもよい。
【００５１】
ＨＩＦ１αの機能を増強する機能増強剤を有効成分として含有する薬剤に用いられ得る薬学的に許容される担体及び剤形は、（２）（i）に記載の通りである。
【００５２】
（vi）ＰＰＡＲγの機能を抑制する機能抑制剤を有効成分として含有する薬剤
ＰＰＡＲγ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma；ペルオキシゾーム増殖促進受容体ガンマ）は核内受容体型転写因子で、脂肪細胞の分化を促進する。ＰＰＡＲγアゴニストであるチアゾリジン誘導体は、糖尿病患者において、高インスリン血症、高中性脂肪血症、低ＨＤＬ血症、インスリン抵抗性を改善する。
【００５３】
実施例に示すように、網膜色素上皮細胞において、ＰＰＡＲγの発現を抑制すると、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現が抑制される。そこで、ＰＰＡＲγの機能を抑制する機能抑制剤を有効成分として含有する薬剤は、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現抑制を通じ、アンジオポエチン関連タンパク質４の機能を抑制するのに有用である。
【００５４】
従って、ＰＰＡＲγの機能を抑制する抑制因子は、網膜の血管新生に起因する疾患に対する予防・治療等に用いることができる。なお、「網膜の血管新生に起因する疾患」は、前述の通りである。
【００５５】
本薬剤に含有されるＰＰＡＲγ抑制因子は、ＰＰＡＲγの機能を抑制するもの、即ちＰＰＡＲγのアンタゴニストであればよく、例えば、ＰＰＡＲγに特異的に結合し、その機能を特異的に抑制する抗体やアプタマーや、化合物等を用いてもよい。また、ＰＰＡＲγの機能を抑制するために、網膜色素上皮細胞のＰＰＡＲγの発現を抑制してもよく、ＰＰＡＲγの発現を抑制する発現抑制剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等を用いてもよい。
【００５６】
ＰＰＡＲγの機能を抑制する機能抑制剤を有効成分として含有する薬剤に用い得る薬学的に許容される担体及び剤形は、（２）（i）に記載の通りである。
【００５７】
（vii）ＰＰＡＲγの機能を増強する機能増強剤を有効成分として含有する薬剤
実施例に示すように、網膜色素上皮細胞において、ＰＰＡＲγを刺激すると、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現が亢進する。そこで、ＰＰＡＲγの機能を増強する機能増強剤を有効成分として含有する薬剤は、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現亢進を通じ、アンジオポエチン関連タンパク質４の機能を増強するのに有用である。
【００５８】
本薬剤に含有される、ＰＰＡＲγの機能を増強する機能増強剤は、ＰＰＡＲγの機能を増強するものであればよく、典型的には、ＰＰＡＲγアゴニスト（例えば、チアゾリジン誘導体や、プロスタグランジンJ2代謝産物等）を用いることができる。
【００５９】
ＰＰＡＲγの機能を増強する機能増強剤を有効成分として含有する薬剤に用いられ得る薬学的に許容される担体及び剤形は、（２）（i）に記載の通りである。
【００６０】
（３）上記薬剤の投与方法及び投与量
（i）ヒト又はヒト以外の脊椎動物に投与する場合
上記薬剤の投与方法は特に限定されず、例えば、液状の薬剤を点眼しても、注入しても、塗布してもよく、また、脂質等のキャリアを用いて細胞に導入してもよい。上記薬剤の投与量は、年齢、体重、適応症又は投与・摂取経路によって異なるが、上記作用が発揮でき、かつ、生じる副作用が許容し得る範囲内であれば特に限定されない。また、本発明の薬剤の好ましい投与経路は、眼球内投与（眼内投与、網膜内投与等）等である。特に、本発明の薬剤にｓｉＲＮＡなどの核酸が含まれている場合は、脂質等のキャリアとともに局所に直接注入する（マイクロインジェクション、眼球注射、カニュレーション等）のが好ましい。また、各薬剤にタンパク質が含有されている時は、HIVのTATタンパク質を利用した導入やマイクロインジェクション等で、タンパク質を細胞内に導入することができる。
【００６１】
具体的投与方法としては、例えば、ヒト又はヒト以外の脊椎動物において、網膜血液又は網膜色素上皮細胞を含む組織や器官におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現量を測定し、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現量が所定値以下である場合に、本発明のグルコースを有効成分として含有する薬剤、又はＨＩＦ１αの機能を増強する機能増強剤を有効成分として含有する薬剤を投与することにより、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を亢進させることができる。一方、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現量の発現量が所定値以上である場合に、本発明のアンジオポエチン関連タンパク質４抑制因子を有効成分として含有する薬剤、又はＨＩＦ１αの機能を抑制する機能抑制剤を有効成分として含有する薬剤を投与することにより、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制することができる。
【００６２】
また、ヒト又はヒト以外の脊椎動物において、網膜血液又は網膜色素上皮細胞を含む組織や器官におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現量を測定し、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現量の発現量が所定値以下である場合に、本発明のアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を亢進させる発現亢進剤を有効成分として含有する薬剤を投与することにより網膜の血管新生を促進することができる。一方、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現量の発現量が所定値以上である場合に、アンジオポエチン関連タンパク質４抑制因子を有効成分として含有する薬剤を投与することにより網膜の血管新生を抑制することができる。
【００６３】
ここで、「所定値」とは、例えば、一般的に健常人におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現量又は当該患者の糖尿病発症前のアンジオポエチン関連タンパク質４の発現量等が考えられる。なお、アンジオポエチン関連タンパク質４は、網膜血液や網膜色素上皮細胞を含む細胞を採取し、ＰＣＲ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、免疫組織学的方法等によって測定することができる。
【００６４】
なお、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現量の測定すること無く、必要な時に各薬剤を投与してもよい。例えば、糖尿病網膜症特有の眼底所見が観察される時など、網膜の血管新生を抑制させたい場合に、アンジオポエチン関連タンパク質４抑制因子を有効成分として含有する薬剤又はＨＩＦ１αの機能を抑制する機能抑制剤を有効成分として含有する薬剤を投与することができる。
【００６５】
（ii）培養系の場合
網膜色素上皮細胞を含む細胞のアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を亢進させるためには、グルコース又はＨＩＦ１αの機能を増強する機能増強剤を有効成分として含有する薬剤を投与すればよい。
【００６６】
また、網膜血管内皮細胞を含む培養細胞において、血管新生を促進するためにはアンジオポエチン関連タンパク質４を有効成分として含有する薬剤を投与すればよい。
【００６７】
なお、各薬剤にｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、発現ベクターなどの核酸が含まれている場合は、薬剤の投与方法として、エレクトロポレーション、トランスフェクション等を用いて細胞内に導入することが好ましい。また、各薬剤にタンパク質が含有されている時は、HIVのTATタンパク質を利用した導入やマイクロインジェクション等で、タンパク質を細胞内に導入することができる。
【００６８】
培養網膜血管内皮細胞における血管新生は、顕微鏡を使用し、細胞等に管腔が形成されているかどうかを観察することで、容易に同定できる。また、培養網膜色素上皮細胞においてアンジオポエチン関連タンパク質４が発現しているかどうかは、これらの培養細胞を回収し、ＰＣＲ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、免疫組織学的方法等によって測定すればよい。
【００６９】
なお、ここで対象としている細胞は、単層培養細胞でもよく、また組織や器官の形態などの立体構造をとっていてもよい。
【００７０】
（４）診断マーカー及び推定マーカー
前述の通り、アンジオポエチン関連タンパク質４は、網膜血管内皮細胞の血管新生を促進する。従って、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現量は、網膜血管の血管新生に起因する疾患を診断するマーカーとして利用できる。例えば、網膜血管内皮細胞の血管新生が進行すると、網膜血管の血管新生に起因する疾患は増悪するため、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現量によって、網膜血管の血管新生に起因する疾患の病状推移を推定することも可能である。  
なお、「網膜の血管新生に起因する疾患」は、（１）に記載の通りである。
【００７１】
（i）アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を調べる場合
網膜血管又は網膜色素上皮細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の転写産物の量を指標とし、診断対象の個体から得た網膜血管又は網膜色素上皮細胞において、転写産物の量をノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲで検出することにより、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を調べることができる。
【００７２】
さらに、アンジオポエチン関連タンパク質４の量を指標とすることもでき、この場合、アンジオポエチン関連タンパク質４に対して特異的に反応する抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング法、免疫組織学的方法等を行えばよい。
【００７３】
このようにして調べた結果、診断対象の個体において、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現が所定値よりも高かったり、元々患者個人が有するアンジオポエチン関連タンパク質４の正常値よりも高かったりした場合には、網膜の血管新生に起因する疾患を発現していると診断する。また、網膜の血管新生に起因する疾患を既に合併している場合において、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現の推移を調べることにより、疾患が増悪しているかどうか推定することができる。
【００７４】
（ii）診断マーカー及び推定マーカーの有用性
本発明のマーカーは、網膜中心静脈、網膜中心動脈、網膜、網膜色素上皮細胞を含む細胞、組織又は器官等のサンプルにおいて測定することができる。  
また、網膜の血管新生に起因する疾患を診断するためのキットは、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現量を測定するための試薬を含み、具体例としては、ＲＴ−ＰＣＲ用の酵素、プライマー、バッファー等や、ＥＬＩＳＡ用の抗体、バッファー等、を含んでいてもよい。
【００７５】
（５）網膜の血管新生に起因する疾患に対する予防又は治療に効果を有する物質のスクリーニング方法
本発明の網膜の血管新生に起因する疾患に対する予防又は治療に効果を有する物質のスクリーニング方法においては、所定の濃度のグルコースの存在下で培養した網膜色素上皮細胞をアッセイ系とし、被験物質を投与し、これらの網膜色素上皮細胞が産生したアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制する物質を選択する。このようにして選択された物質は、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現抑制を通じ、最終的に網膜の血管新生を抑制する。ここで、培養液中のグルコース濃度は300mg/dl以上であることが好ましい。なお、網膜の血管新生に起因する疾患は、（１）に記載の通りである。
【実施例】
【００７６】
以下に、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【００７７】
（１）試料の調製
実験に使用する細胞、タンパク質及び培地は、以下のように調製した。
【００７８】
（i）ヒト網膜血管内皮細胞の調製
網膜における血管新生の観察は、ヒト網膜血管内皮細胞を用いて行った。これらの実験に用いるヒト網膜血管内皮細胞株は、Cell Systems社（Kirkaland, WA; catalog No. CS-ABI-181）から購入した。
【００７９】
Ｉ型コラーゲンでコーティングされた培養皿で、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン(Gibco BRＬＧrand Island, NY)含有CS-C Complete Medium（10%FBS含有DMEM/F12=1:1）を用いてヒト網膜血管内皮細胞を培養した。なお、CS-C Complete Mediumは、Cell Systems Corpoeationから購入した（カタログNo.CS-4ZO-500）。また、無血清培地CS-C Medium（DMEM/F12(成長因子及び血清の含有無し)も、Cell Systems Corpoeationから購入した（カタログNo.CS4Z3 500S）。また、継代は、細胞が90%のコンフルエンスに達した時、培地を継代培養試薬ACCUTASE（Innovative Cell Technologies, Inc. San Diego, CA）に交換して行った。
【００８０】
（ii）ＡＲＰＥ-１９細胞の調製
網膜色素上皮細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現、及び網膜色素上皮細胞から産生されるアンジオポエチン関連タンパク質４の機能の解析は、ＡＲＰＥ-１９細胞を用いて行った。これらの実験に用いるＡＲＰＥ-１９細胞は、Amerikan Type Culture Collection ( Rockville, MA, USA; catalog No. CRL-2302)から購入した。なお、培地には、D-MEM/F12 (Gibco BRＬＧrand Island, NY, USA; catalog No. 11330-032)（15mM HEPESバッファー、7.5mMグルコース、10%ウシ胎仔血清(FBS; Gibco BRＬＧrand Island, NY, USA)、100U/mlペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシンを含有）を用いてＡＲＰＥ-１９細胞を培養した。
【００８１】
（iii）アンジオポエチン関連タンパク質４（ANGPTL4）
アンジオポエチン関連タンパク質４は、組換え型ヒトANGPTL4（AdipoGen(ソウル(韓国)；カタログNo. 293-VE)）を使用した。
【００８２】
（iv）ＶＥＧＦ（VEGF）
ＶＥＧＦは、組換え型ヒトVEGF（R&D systems (カタログNo.293-VE)）を使用した。
【００８３】
（v）グルコース含有培地の作製
培地に存在するグルコースの濃度の違いによって、ＡＲＰＥ-１９細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現がどのように変化するかを調べるために、異なるグルコース濃度を含有する培地を作製した。  
ＶＬＧ培地：5mMグルコース含有培地（5mMグルコース、10％FBS、100U/mlペニシリン及び100μ/mlストレプトマイシン含有D-MEM/F12）
ＬＧ培地：7.5mMグルコース含有培地：（7.5mMグルコース、10％FBS、100U/mlペニシリン及び100μ/mlストレプトマイシン含有D-MEM/F12）
ＭＧ培地：12.5mMグルコース含有培地（12.5mMグルコース、10％FBS、100U/mlペニシリン及び100μ/mlストレプトマイシン含有D-MEM/F12）
ＨＧ培地：17.5mMグルコース含有培地（17.5mMグルコース、10％FBS、100U/mlペニシリン及び100μ/mlストレプトマイシン含有D-MEM/F12）
【００８４】
（２）網膜色素上皮細胞の培養上清の添加による網膜血管内皮細胞の管腔形成
まず、網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ-１９細胞）の培養上清が、ヒト網膜血管内皮細胞へどのように影響するのかを、管腔形成アッセイを用いて検討した。なお、管腔形成アッセイは、BD BioCoat angiogenesis system endothelial cell tube formationplates（BD Bioscience；カタログNo.354149）を用いて行った。
【００８５】
まず、ＡＲＰＥ-１９細胞をコンフルエントになるまで培養した後、ＬＧ培地（血清無添加）又はＨＧ培地（血清無添加）に交換し、さらに４８時間培養した培養上清を管腔形成アッセイに用いた。
【００８６】
このキットに付属のプレートの各ウェルにDMEM/F12（10％FBS、100U/mlペニシリン及び100μ/mlストレプトマイシン含有）を入れ、この中に網膜血管内皮細胞を2×104個ずつ入れ、3時間37℃でインキュベート（5％CO2）した（欠乏培養）後に、ＬＧ培地（培養上清）及びＨＧ培地（培養上清）、コントロールとしてＬＧ培地（血清無添加）及びＨＧ培地（コントロール、血清無添加）のそれぞれの培地に交換して、16時間37℃でインキュベート（5％CO2）した（管腔形成アッセイ）。
【００８７】
管腔形成アッセイ終了後、培地を除去し、HBSS培地で2回洗浄し、カルセインAM（Molecular Probes, Eugene, OR；カタログNo,C3099）含有HBSSを各ウェルに入れ、30分間37℃でインキュベート（5％CO2）した。HBSS培地で2回洗浄した後、蛍光顕微鏡下で、網膜血管内皮細胞の管腔形成を観察した（倍率×4）。さらに、各ウェルに存在する全ての管腔の長さを、Win Roof software (MITANI, corporation, Jpan)を用いて測定した。結果は、図１Ａ及びＢに示す通りである。なお、管腔の長さは、コントロールのＬＧ培地（血清無添加）を１００とした時の比率で示している。
【００８８】
上記管腔形成アッセイにおいて、ＡＲＰＥ-１９細胞の培養上清で培養した網膜血管内皮細胞は、コントロールに比較して管腔形成が進行していた（p<0.01）（図１Ａ）。特に、その管腔形成は、ＨＧ培地を用いて得られた培養上清において顕著に認められた。
【００８９】
従って、網膜色素上皮細胞がグルコース濃度に依存して分泌する液性因子に反応して、網膜血管内皮細胞の血管新生が誘導されることが明らかになった。
【００９０】
（３）培地中のグルコース濃度と網膜色素上皮細胞からのアンジオポエチン関連タンパク質４の発現の相関
この液性因子を同定するため、ＡＲＰＥ-１９細胞を高グルコースと低グルコースで培養し、各培養細胞から全ｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを介してｃＲＮＡを合成し、gene chipを用いて、高グルコース刺激で発現が上昇したクローンを解析したところ、そのうちの一つのクローンとして、アンジオポエチン関連タンパク質４が得られた。以下に記載する（３）〜（５）の解析により、アンジオポエチン関連タンパク質４が、網膜血管内皮細胞の血管新生を誘導する液性因子であることが明らかになった。
【００９１】
[１]網膜色素上皮細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現
環境中のグルコース濃度に対する網膜色素上皮細胞における遺伝子発現を検討するために、網膜色素上皮細胞のアンジオポエチン関連タンパク質４の発現量と、培地中のグルコース濃度の相関を調べた。
【００９２】
まず、10cmの培養プレートに10％FBS、100U/mlペニシリン及び100μ/mlストレプトマイシン含有DMEM/F12を入れ、この中に約2×106個のＡＲＰＥ-１９細胞を播種し、3時間37℃でインキュベート（5％CO2）した（欠乏培養）。3時間後に、培地を上記（１）（v）のＶＬＧ培地、ＬＧ培地、ＭＧ培地又はＨＧ培地に交換して、48時間37℃でインキュベート（5％CO2）した。なお、コントロールは、グルコースを添加していない培地を用いて、ＡＲＰＥ-１９細胞を培養した。
【００９３】
48時間後、培地を除去し、各々の培地で培養されたＡＲＰＥ-１９細胞を回収し、TRIzol試薬（Invitrogen, Carlsabad, CA, USA）を用いて、ＡＲＰＥ-１９由来のRNAを抽出した。その後、SuperScript II RTとオリゴdTプライマーを用いて、抽出したRNAからcDNAを作製した。ｍＲＮＡの発現量は、ABI Prism 7900 sequence-detection system ( Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を使用し、TaqManRプローブ(Applied Biosystem社)を用いて定量した。用いたプライマーは以下の通りである。なお、コントロールは、ヒトβアクチンｍＲＮＡ量とした。  
アンジオポエチン関連タンパク質４（ＡＮＧＰＴＬ4）プライマー（Applied Biosystem社；Hs00211522_ml）
ヒトβアクチン（ＡＣＴＢ）プライマー（Applied Biosystem社；Hs99999903_ml）
【００９４】
蛍光は、TaqManR Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて測定した。  
その結果、グルコースの濃度に依存して、アンジオポエチン関連タンパク質4の発現量は増加することが分かった（図２）。
【００９５】
[２]高濃度のグルコース存在下における網膜色素上皮細胞のアンジオポエチン関連タンパク質４の発現の時経的変化
[１]の実験より、高濃度のグルコース存在下において、網膜色素上皮細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４の発現が亢進することが明らかになった。そこで、網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ-１９細胞）に高濃度のグルコースを添加した後、どのようにアンジオポエチン関連タンパク質４の発現が変化するか、その発現の変化を時間ごとに測定した。
【００９６】
まず、6cmの培養プレートに上記（1）（vi）で作製したＬＧ培地を入れ、この中に約2×106個のＡＲＰＥ-１９細胞を入れ、37℃でインキュベート（5％CO2）した。ＡＲＰＥ-１９細胞がコンフルエンスに達した後に、培地をＨＧ培地に交換して、0分、30分、60分、90分、120分間37℃でインキュベート（5％CO2）した。  
各々の時間が経過した後、培地を除去し、各ＡＲＰＥ-１９細胞を回収し、TRIzol試薬（Invitrogen, Carlsabad, CA, USA）を用いて、ＡＲＰＥ-１９由来のRNAを抽出した。そして、上記（2）に記載のリアルタイムＰＣＲ法を用いて、アンジオポエチン関連タンパク質４ｍＲＮＡ量を測定した。なお、コントロールは、ヒトβアクチンｍＲＮＡ量とした。  
その結果、高濃度のグルコースを添加して60分経過した頃から、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現が増加することが分かった（図３）。
【００９７】
[３]結論
以上より、網膜色素上皮細胞において、環境のグルコース濃度に依存して、アンジオポエチン関連タンパク質４が発現することが示された。従って、網膜色素上皮細胞がグルコース濃度に依存して分泌し、網膜血管内皮細胞の血管新生を誘導する液性因子の候補として、アンジオポエチン関連タンパク質４が考えられた。
【００９８】
（４）アンジオポエチン関連タンパク質４の血管新生に対する関与
糖尿病網膜症で生じる血管新生は、血管内皮細胞が遊走し、浸潤し、増殖し、最終的に管腔を形成する、という順序で起こる。そこで、アンジオポエチン関連タンパク質４が、網膜血管内皮細胞の血管新生の各段階に関与しているかどうかを調べた。
【００９９】
[１]網膜血管内皮細胞を用いた浸潤アッセイ及び遊走アッセイ
まず、網膜血管内皮細胞の浸潤及び遊走に対するアンジオポエチン関連タンパク質４の影響を調べた。なお、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）は、網膜における血管内皮細胞を増殖させ、血管新生に関与することが知られているため、以下の実験において、ＶＥＧＦを入れた系をポジティブコントロールとした。
【０１００】
遊走アッセイ及び浸潤アッセイは、BD BioCoat angiogenesis system endothelial cell migration（BD Bioscience, カタログNo. 354141、カタログNo. 354143）を用いて、また、浸潤アッセイは、浸潤プレート（BD Bioscience, カタログNo. 354143）を用いて行った。
【０１０１】
まず、これらのキットに付属のプレートの下側のチャンバーに250μlの0.4％FBS含有CS-C Mediumを入れ、上側のチャンバーに以下に示す培地及び細胞１〜細胞３をそれぞれ入れた。  
細胞１：コントロール（250μlの0.4%FBS含有CS-C Medium、1×105のヒト網膜血管内皮細胞）
細胞２：ＶＥＧＦ（250μlの5ng/ml VEGF及び0.4%FBS含有CS-C Medium、1×105のヒト網膜血管内皮細胞)
細胞３：アンジオポエチン関連タンパク質４（250μlの0.1μg/mlアンジオポエチン関連タンパク質４及び0.4%FBS含有CS-C Medium、1×105のヒト網膜血管内皮細胞）
【０１０２】
遊走アッセイに関しては、これらのプレートを27時間37℃でインキュベート（5％CO2）し、血管内皮細胞を遊走させた。一方、浸潤アッセイに関しては、これらのプレートを21時間37℃でインキュベートし、マトリジェルコートのメンブレンを介して、血管内皮細胞を浸潤させた。
【０１０３】
遊走アッセイ終了後（27時間の培養後）又は浸潤アッセイ終了後（21時間の培養後）、カルセインAM（Molecular Probes, Eugene, OR；カタログNo,C3099）含有Hank’s balanced salt solutionを含むウェルにチャンバーを移し、1.5時間室温に放置し、その後蛍光プレートリーダー（Envision, PerkinElmer）（485/535nm）を用いて、蛍光を測定した。結果を、図４Ａ及び図４Ｂに示す。なお、遊走及び浸潤した細胞が発する蛍光の値は、コントロールを１００にした時の比率で示した。
【０１０４】
遊走アッセイにおいて、アンジオポエチン関連タンパク質４を添加した群及びＶＥＧＦを添加した群は、どちらも添加していないコントロール群と比較して、高い蛍光を発していた（p<0.01）（図４Ａ）。これは、アンジオポエチン関連タンパク質４及びＶＥＧＦがヒト網膜血管内皮細胞の遊走を引き起こしたことを示す。
【０１０５】
また、浸潤アッセイにおいて、アンジオポエチン関連タンパク質４を添加した群及びＶＥＧＦを添加した群は、コントロール群と比較して、高い蛍光を発していた（p<0.01）（図４Ｂ）。これは、アンジオポエチン関連タンパク質４及びＶＥＧＦがヒト網膜血管内皮細胞のマトリジェルへの浸潤を引き起こしたことを示す。
【０１０６】
[２]網膜血管内皮細胞を用いた増殖アッセイ
次に、アンジオポエチン関連タンパク質４が、網膜血管内皮細胞の増殖に対して、どのような影響を与えるのかについて調べた。なお、[１]と同様に、ＶＥＧＦを入れた系をポジティブコントロールとした。  
細胞増殖アッセイは、Cell Count Reagent SF（nacalai tesque, Japan；カタログNo. 07553-15）を用いて、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって行った。
【０１０７】
まず、96穴平底プレートの各ウェルに10％FBS含有CS-C Mediumを入れ、この中にヒト網膜血管内皮細胞を2×104個ずつ入れ、37℃でインキュベートした。これらの細胞をウェルの底に接着させた後に、接着した細胞を10％FBS含有CS-C Mediumで2回洗浄し、培地を欠乏培地（培地：CS-C Medium）に交換してさらに3時間37℃でインキュベートした。3時間後、各ウェルの培地を以下の培地４〜６のそれぞれと交換した。  
４： 250μlの0.4%FBS含有CS-C Medium（コントロール）
５： 250μlの5ng/mlＶＥＧＦ及び0.4%FBS含有CS-C Medium
６： 250μlの0.1μg/ml アンジオポエチン関連タンパク質４及び0.4%FBS含有CS-C Medium 
【０１０８】
このプレートを48時間37℃でインキュベート（5％CO2）した後、細胞増殖を見るために、細胞数計測用の試薬WST-8試薬を入れ、4時間放置した。その後マイクロプレートリーダーを用いて、450nmの吸光度を測定した。結果は、図４Ｃに示す通りである。なお、増殖した細胞が発する蛍光の値は、コントロールとの比率で示している。
【０１０９】
上記細胞増殖アッセイにおいて、アンジオポエチン関連タンパク質４を添加した群及びＶＥＧＦを添加した群は、コントロール群と比較して、高い吸光度を有していた（p<0.01）（図４Ｃ）。これは、アンジオポエチン関連タンパク質４及びＶＥＧＦがヒト網膜血管内皮細胞の増殖を促進したことを示す。
【０１１０】
[３]網膜血管内皮細胞を用いた管腔形成アッセイ
さらに、本発明にかかるアンジオポエチン関連タンパク質４が、網膜血管内皮細胞の管腔形成に対して、どのような影響を与えるのかについて調べた。なお、[２]と同様に、ＶＥＧＦを入れた系をポジティブコントロールとした。  
管腔形成アッセイは、BD BioCoat angiogenesis system endothelial cell tube formationplates（BD Bioscience；カタログNo.354149）を用いて行った。
【０１１１】
まず、このキットに付属のプレートの各ウェルに10％FBS含有CS-C Mediumを入れ、この中にヒト網膜血管内皮細胞を2×104個ずつ入れ、37℃でインキュベートした。これらの細胞をウェルの底に接着させた後に、接着した細胞を10％FBS含有CS-C Mediumで2回洗浄し、培地を欠乏培地（培地：CS-C Medium）に交換してさらに3時間37℃でインキュベートした。3時間後、各ウェルに以下の培地７〜９を入れた。  
７： 250μlのCS-C Medium（FBS含有無し）（コントロール）
８： 250μlの15ng/ml VEGF及びCS-C Medium（FBS含有無し）
９： 250μlの0.1μg/ml アンジオポエチン関連タンパク質４及びCS-C Medium（FBS含有無し）
【０１１２】
このプレートを16時間37℃でインキュベート（5％CO2）した後、培地を除去し、HBSS培地で2回洗浄した。カルセインAM（Molecular Probes, Eugene, OR；カタログNo,C3099）含有HBSSを各ウェルに入れ、30分間37℃でインキュベート（5％CO2）した後、HBSS培地で2回洗浄した。その後、蛍光顕微鏡下で、ヒト網膜血管内皮細胞の管腔形成を観察した（倍率×4）。各ウェルに存在する全ての管腔の長さを、Win Roof software (MITANI, corporation, Jpan)を用いて測定した。結果を、図４Ｄ及び図４Ｅに示す。なお、管腔の長さは、コントロールを１００にした時の比率で示した。
【０１１３】
上記管腔形成アッセイにおいて、アンジオポエチン関連タンパク質４を添加した群及びＶＥＧＦを添加した群は、コントロール群と比較して、長い管腔を形成していた（p<0.01）。特に、その管腔形成は、アンジオポエチン関連タンパク質４を添加した群において顕著に認められた。これは、アンジオポエチン関連タンパク質４及びＶＥＧＦがヒト網膜血管内皮細胞の管腔形成を促進したことを示す。
【０１１４】
[４]結論
これらの結果より、アンジオポエチン関連タンパク質４は、血管新生の各段階において、網膜血管内皮細胞の分化や増殖を促進することが明らかになった。この結果は、アンジオポエチン関連タンパク質４が、網膜血管内皮細胞が血管新生する過程に関与していることを示唆した。
【０１１５】
（５）アンジオポエチン関連タンパク質４の発現抑制
網膜色素上皮細胞の培養上清において、アンジオポエチン関連タンパク質４が、血管新生を誘導する液性因子かどうか調べるため、ｓｉＲＮＡを用いて、ＡＲＰＥ-１９細胞中でアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制し、得られた培養上清を用いて管腔形成アッセイを行った。
【０１１６】
まず、ＡＲＰＥ-１９細胞においてアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を抑制した場合、ＡＲＰＥ-１９細胞の培養上清が網膜血管内皮細胞の管腔形成に対してどのような影響を与えるか調べた。
【０１１７】
6穴培養プレートにＬＧ培地を入れ、各ウェルに約2×105個のＡＲＰＥ-１９細胞を播種し、24時間37℃でインキュベート（5％CO2）した。その後、トランスフェクション試薬Dharmafect R（Dharmacon, Inc. カタログNo.T-2001-01）をＬＧ培地（血清無添加）で希釈し、以下に示すｓｉＲＮＡを終濃度20nMになるように添加し、これらのｓｉＲＮＡを各ウェルに添加した。なお、コントロールには、Lamin A/C ｓｉＲＮＡを用いた。  
アンジオポエチン関連タンパク質４ ｓｉＲＮＡ（Dharmacon, Inc.; siGENOME SMART poolカタログNo.M_007807-01-0010）
ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ（Dharmacon, Inc.; siGENOME SMART poolカタログNo.M_003550-01-0010）
【０１１８】
細胞を48時間37℃でインキュベート（5％CO2）した後、新たに各ウェルにＨＧ培地又はＬＧ培地を加え、さらに48時間37℃でインキュベート（5％CO2）した。こうして得られた培養上清を管腔形成アッセイに用いた。なお、コントロールとして、ＡＲＰＥ-１９細胞を培養していないＨＧ培地、及びＡＲＰＥ-１９細胞を培養したが、ｓｉＲＮＡを添加しなかったＨＧ培地を用いた。
【０１１９】
管腔形成アッセイ終了後、培地を除去し、HBSS培地で2回洗浄した。その後、カルセインAM（Molecular Probes, Eugene, OR；カタログNo,C3099）含有HBSSを各ウェルに入れ、30分間37℃でインキュベート（5％CO2）した。その後、HBSS培地で2回洗浄した。その後、蛍光顕微鏡下で、網膜血管内皮細胞の管腔形成を観察した（倍率×4）。各ウェルに存在する全ての管腔の長さを、Win Roof software (MITANI, corporation, Jpan)を用いて測定した。結果を、図５Ａ及び図５Ｂに示す。なお、管腔の長さは、コントロール（ＡＲＰＥ-１９細胞を培養していないＨＧ培地）を１００とした時に比率で示した。
【０１２０】
その結果、網膜色素上皮細胞において、高濃度グルコースによってアンジオポエチン関連タンパク質４を誘導しても、アンジオポエチン関連タンパク質４ｓｉＲＮＡを添加しておくと、その培養上清は、網膜血管内皮細胞の管腔形成を促進しないことが明らかになった。  
従って、アンジオポエチン関連タンパク質４が、網膜色素上皮細胞から分泌され、血管新生を誘導する液性因子であることが証明された。
【０１２１】
（６）グルコース存在下におけるＰＰＡＲγアゴニスト処理後のアンジオポエチン関連タンパク質４の発現の変化
グルコースを含有する培地に、ＰＰＡＲγアゴニストであるチアゾリジン誘導体の一種シグリタゾンを入れ、このような培地において、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現がどのように変化するのかを調べた。
【０１２２】
（i）ＰＰＡＲγアゴニスト（シグリタゾン）処理後のアンジオポエチン関連タンパク質４の発現
まず、6cmの培養プレートに上記（1）（vi）で作製したＬＧ培地又はＨＧ培地を入れ、この中に約2×106個のＡＲＰＥ-１９細胞を入れ、37℃でインキュベート（5％CO2）した。ＡＲＰＥ-１９細胞が80％のコンフルエンスに達した後に、これらの培地に30μMのシグリタゾンを入れ、48時間37℃でインキュベート（5％CO2）した。なお、シグリタゾンを添加しないものをコントロールとした。
【０１２３】
48時間後、培地を除去し、ピペッティングによって各々の培地で培養されたＡＲＰＥ-１９細胞を回収し、TRIzol試薬（Invitrogen, Carlsabad, CA, USA）を用いて、ＡＲＰＥ-１９由来のRNAを抽出した。そして、上記（2）に記載のリアルタイムＰＣＲ法を用いて、アンジオポエチン関連タンパク質４ｍＲＮＡ量を測定した。なお、コントロールは、ヒトβアクチンｍＲＮＡ量とした。
【０１２４】
グラフに示すように、低濃度のグルコースを含有する培地では、ＡＲＰＥ-１９細胞にシグリタゾンを添加すると、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現は増加した（図６）。これより、ＰＰＡＲγを刺激すると、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現が増加することが明らかになった。なお、高濃度のグルコースを含有する培地では、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現が既に増加しているため、シグリタゾンを添加しても、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現の変化は認められないと考えられた。
【０１２５】
（ii）ＰＰＡＲαアゴニスト（WY14643）処理後のアンジオポエチン関連タンパク質４の発現
（６）（i）において、30μMシグリタゾンを10μM WY14643に変えた以外は、同様の方法を用いて、各々のアンジオポエチン関連タンパク質４ｍＲＮＡ量を測定した。  
その結果、低濃度のグルコースを含有する培地及び高濃度のグルコースを含有する培地共に、WY14643によってアンジオポエチン関連タンパク質４の発現は変化しないことが分かった（図７）。この結果は、ＰＰＡＲαアゴニストの抗糖尿病薬を投与した場合には、網膜の血管新生は起こらず、糖尿病網膜症は増悪しないという臨床上の観察結果に一致する。
【０１２６】
（iii）ＰＰＡＲγ及びＨＩＦ1-αの発現抑制
次に、（５）と同様に、以下のｓｉＲＮＡを用い、網膜色素上皮細胞において、ＰＰＡＲγ及びＨＩＦ1-αの発現抑制を行った。なお、コントロールには、ＥＧＲ-1ｓｉＲＮＡ及びLamin A/C ｓｉＲＮＡを用いた。  
ＰＰＡＲγ ｓｉＲＮＡ（Dharmacon, Inc.; siGENOME SMART poolカタログNo.M_003436-01）
ＨＩＦ1-α ｓｉＲＮＡ（Dharmacon, Inc.; siGENOME SMART poolカタログNo.M_004018-02）
ＥＧＲ-1 ｓｉＲＮＡ（Dharmacon, Inc.; siGENOME SMART poolカタログNo.M_006526-01）
Lamin A/C ｓｉＲＮＡ（Dharmacon, Inc.; siGENOME SMART poolカタログNo.M_001050-01-05）
【０１２７】
トランスフェクション48時間後、培地を除去し、ピペッティングによって、ＡＲＰＥ-１９細胞を回収し、TRIzol試薬（Invitrogen, Carlsabad, CA, USA）を用いて、ＡＲＰＥ-１９由来のＲＮＡを抽出した。そして、上記のリアルタイムＰＣＲ法を用いて、アンジオポエチン関連タンパク質４ｍＲＮＡ量を測定した。なお、コントロールは、ヒトβアクチンｍＲＮＡ量とした。
【０１２８】
その結果、図８に示すように、ＰＰＡＲγｓｉＲＮＡを添加した群において、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現が抑制された。従って、ＰＰＡＲγは、アンジオポエチン関連タンパク質４の発現を正に制御していることが明らかになり、（i）の結果と一致した。  
また、ＨＩＦ1-αがアンジオポエチン関連タンパク質４の発現を正に制御していることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１（Ａ）】本発明の一実施例において、高濃度のグルコース又は低濃度のグルコースを培地に添加した時の、網膜血管内皮細胞の管腔の長さを測定した結果を示す図である。
【図１（Ｂ）】本発明の一実施例において、高濃度のグルコース又は低濃度のグルコースを培地に添加した時の、網膜血管内皮細胞の管腔形成を観察した図である。
【図２】本発明の一実施例において、異なる濃度のグルコースを培地に添加した時の、ＡＲＰＥ-１９細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４のｍＲＮＡの発現を測定した結果を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、高濃度のグルコースを培地に添加した時の、網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ-１９細胞）におけるアンジオポエチン関連タンパク質４のｍＲＮＡの発現を経時的に測定した結果を示す図である。
【図４（Ａ）】本発明の一実施例において、アンジオポエチン関連タンパク質４又はＶＥＧＦを培地に添加した時の、網膜血管内皮細胞の遊走を測定した結果を示す図である。
【図４（Ｂ）】本発明の一実施例において、アンジオポエチン関連タンパク質４又はＶＥＧＦを培地に添加した時の、網膜血管内皮細胞の浸潤を測定した結果を示す図である。
【図４（Ｃ）】本発明の一実施例において、アンジオポエチン関連タンパク質４又はＶＥＧＦを培地に添加した時の、網膜血管内皮細胞の増殖を測定した結果を示す図である。
【図４（Ｄ）】本発明の一実施例において、アンジオポエチン関連タンパク質４又はＶＥＧＦを培地に添加した時の、網膜血管内皮細胞の管腔の長さを測定した結果を示す図である。
【図４（Ｅ）】本発明の一実施例において、アンジオポエチン関連タンパク質４又はＶＥＧＦを培地に添加した時の、網膜血管内皮細胞の管腔形成を観察した図である。
【図５（Ａ）】本発明の一実施例において、アンジオポエチン関連タンパク質４ ｓｉＲＮＡ又はＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡを培地に添加した時の、網膜血管内皮細胞の管腔の長さを測定した結果を示す図である。
【図５（Ｂ）】本発明の一実施例においてアンジオポエチン関連タンパク質４ｓｉＲＮＡ又はＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡを培地に添加した時の、網膜血管内皮細胞の管腔形成を観察した図である。
【図６】本発明の一実施例において、高濃度のグルコース又は低濃度のグルコースを培地に添加し、各々の培地にＰＰＡＲ γアゴニスト（シグリタゾン）を入れた時の、ＡＲＰＥ-１９細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４のｍＲＮＡの発現を測定した結果を示す図である。
【図７】本発明の一実施例において、高濃度のグルコース又は低濃度のグルコースを培地に添加し、各々の培地にＰＰＡＲ αアゴニスト（WY14643）を入れた時の、ＡＲＰＥ-１９細胞におけるアンジオポエチン関連タンパク質４のｍＲＮＡの発現を測定した結果を示す図である。
【図８】本発明の一実施例において、ＨＩＦ−１α ｓｉＲＮＡ、ＰＰＡＲγ ｓｉＲＮＡ又はＥＧＲ１ ｓｉＲＮＡを培地に添加した時の、網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ-１９細胞）におけるアンジオポエチン関連タンパク質４のｍＲＮＡの発現を測定した結果を示す図である。
【図１（Ａ）】
2008110950.tif 000002
【図２】
2008110950.tif 000003
【図３】
2008110950.tif 000004
【図４（Ａ）】
2008110950.tif 000005
【図４（Ｂ）】
2008110950.tif 000006
【図４（Ｃ）】
2008110950.tif 000007
【図４（Ｄ）】
2008110950.tif 000008
【図５（Ａ）】
2008110950.tif 000009
【図６】
2008110950.tif 000010
【図７】
2008110950.tif 000011
【図８】
2008110950.tif 000012
【図１（Ｂ）】
2008110950.tif 000013
【図４（Ｅ）】
2008110950.tif 000014
【図５（Ｂ）】
2008110950.tif 000015