(57)【要約】 【課題】    海産アルカロイドであるノルゾアンタミンの作用機序を明らかにする。【解決手段】    刺胞動物スナギンチャクに共生するAspergillus  funmigatus属の微生物の単離及びその培養によって得られたノルゾアンタミンは骨粗鬆症モデルマウスの骨強度及び骨重量を増加する作用を有し、骨関連細胞の見かけ上のコラーゲン量を増大させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺胞動物スナギンチャクに共生するAspergillus funmigatus属の微生物の単離及びその培養によって得られたノルゾアンタミンによってコラーゲン分解酵素コラゲナーゼの作用を抑制することを特徴とする骨格タンパク質の関与する疾病の治療又は予防する方法。
【請求項２】
刺胞動物スナギンチャクに共生するAspergillus funmigatus属の微生物の単離及びその培養によって得られたノルゾアンタミンによるコラゲナーゼ抑制作用によってコラーゲン量を増大させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、刺胞動物スナギンチャクに共生するAspergillus funmigatus属の微生物の単離及びその培養によることによって得られるノルゾアンタミンがタンパク質に広く非特異的に結合することで一種のタンパク質保護作用を示すことによって、コラーゲンの分解を抑制する作用を利用してコラーゲンなどの骨格タンパク質の関与する疾病の治療及び予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、海産アルカロイド、ノルゾアンタミンは刺胞動物の一種スナギンチャク(Zoanthus sp.)をエタノール中で粉砕し、その濾液部分を濃縮した濃縮液を、水と酢酸エチルで分配したあとの酢酸エチル層をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて取り出すことが非特許文献１において公知技術として存在する。
一方、ノルゾアンタミンの医学的活性は、骨粗鬆症モデルマウスの骨強度及び骨重量を増大する作用を示すことが非特許文献２において知られており、この骨粗鬆症は、一般に女性の閉経後に起きる疾病で、これまではエストロゲン（女性ホルモン）投与による治療もしくはビスホスホネート投与による破骨細胞の活性抑制が代表的な治療法として知られる。
しかしながら、前者は子宮重量の増大、後者は胃腸障害などの副作用がある。このため非特許文献３において副作用のより少ない新しい作用機序による治療法が、高齢化社会である現代に求められることも知られているが、現状では必ずしもこのニーズに対応する研究又は実用化技術は存在しない。
【０００３】
本発明者らは、下記化学式１で示されるノルゾアンタミンの医薬的活性に着目はされていても、ノルゾアンタミンの量的供給の困難さによってその医薬的活性の研究や、その利用性が阻まれていることに鑑み、ノルゾアンタミンの経済的な多量供給方法を目的とし、さらに多量供給によって得られるノルゾアンタミンの作用機序を解明すると共に、ノルゾアンタミンの具体的な用途、利用分野を目指して本発明に至った。
【０００４】
従来、ノルゾアンタミンが含まれることの知られる刺胞動物スナギンチャクからノルゾアンタミンを生産するには、刺胞動物スナギンチャクを粉砕し、そこに含まれるノルゾアンタミンを抽出する方法しか知られていなかった。これでは、ノルゾアンタミンを大量に生産するために刺胞動物スナギンチャクを大量に採取せねばならず、天然資源の枯渇又は地球環境の破壊につながることは明らかである。
【０００５】
【化１】
2008266204.tif 000002
（式中、Ｍeはメチル基は示す）
化学式１
【０００６】
ノルゾアンタミンの化学合成による方法も公知であり、特許文献１には、以下の化学反応式に示すように（Ｒ）−５−メチル−２−シクロヘキセノンを出発原料として、ノルゾアンタミンアンタミン及びゾアンタミン等のゾアンタミン系アルカロイドの製造方法及びこれに用いる中間体等の製造方法が知られている。
【０００７】
【化２】
2008266204.tif 000003
ゾアンタミン系アルカロイドの製造方法
【０００８】
しかるに、上記公知の合成方法では、ノルゾアンタミン等の生成物の化学構造が複雑であるが故に、多くの複雑な合成段階が必要であり、合成されたノルゾアンタミンの全収率は極めて低く、（Ｒ）−５−メチル−２−シクロヘキセノンから出発して４０工程を超える上に、収率３．５％という低い収率でしか得られなかった。
これでは、大量の刺胞動物スナギンチャクを粉砕してノルゾアンタミンを得る方法と比較しても工業的に安価な製造方法とは言い難いばかりか、使用する多くの原料・試薬由来の副生成物の環境に対する影響を考慮すると、自然環境の保護の観点からも好ましいとは言えなかった。
【０００９】
本発明の対象となっているノルゾアンタミンについては、１９９５年、奄美大島近海のスナギンチャクから単離し、先の化学式１の構造式を有することがわかった。
また、ノルゾアンタミンは、卵巣除去マウスにおいて骨重量、骨強度の低下を顕著に抑制することが非特許文献２，４及び５に開示され、非特許文献２及び５においては骨粗鬆症治療薬の有力候補として期待されている。従って、ノルゾアンタミンは、特に新しいタイプの高齢者用骨粗鬆症治療薬の開発と関連して、大変興味が持たれている。
また、最近、非特許文献６では、ノルゾアンタミン誘導体が人間の血小板凝集に対する反血小板活性に加えて、Ｐ−３８８ネズミ科白血病細胞系の成長を強く防ぐことが証明されたことも公知となった。
【００１０】
【特許文献１】特開２００６−５２１８５号公報
【非特許文献１】Heterocyclic Commun. 1995, 1, 207-214
【非特許文献２】Biol. Pharm. Bull. 1999, 22, 920-924.
【非特許文献３】松本俊夫、新・分子骨代謝学と骨粗鬆症、メディカルレビュー、2001
【非特許文献４】Tetrahedron Lett. 38,5683(1997)
【非特許文献５】Bull. Chem. Soc. Jpn. 71,771(1998)
【非特許文献６】Bioorg. Med. Chem. 11,2301(2003)
【００１１】
上述するように、ノルゾアンタミンなる化合物の大量供給のための公知の生産方法は、天然動植物を大量採集し、その天然動植物から抽出する方法と化学合成によって製造する方法の二通りがあるが、上記方法のうち、前者の天然動植物を供給源とする場合は、その天然動植物の確保が問題であり、後者の化学合成法では、天然化合物の化学合成できる化合物が限られており、合成が可能でさえあれば、比較的安定的に供給できるが、多段階の工程を要することが多く、場合によっては長期間を要することもあり、普通、目的化合物によってその生産方法が使い分けられている。
【００１２】
ところで、目的とするノルゾアンタミンの化学合成は、工程の多い合成方法の典型例で、合成工程がおよそ４０工程にも及び、その取得までに多大な労力と費用を必要とする。このためにノルゾアンタミンを得るためには、上述するように刺胞動物スナギンチャクという天然物より取得が限られる一方、産生生物のスナギンチャクはきわめて限定されている地域のみに生息しているため、大量採集は種の絶滅につながり、ノルゾアンタミンはとても経済性を語れる化合物とは言えなかった。
結果的にノルゾアンタミンの確保も難しく、ノルゾアンタミンの研究開発や臨床試験は控えざるを得なかった。
【００１３】
そこで、本発明者らは、ノルゾアンタミンを含む刺胞動物スナギンチャクをノルゾアンタミンの多量供給のための重要素材として位置付け、これを如何に利用してノルゾアンタミンを地球にやさしい方法で生産することを命題に研究を進めた。
すなわち、本発明者らは、刺胞動物スナギンチャクに共生するAspergillus funmigatus属の微生物の利用によってノルゾアンタミンの大量供給と共にその利用開発に着目した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明では、自然環境の保護という命題の下に経済的に容易にノルゾアンタミンを大量に供給する方法の開発を課題とし、かつ分子レベルでのノルゾアンタミンの作用機序を解明し、その利用及び用途を明らかにすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであって、ノルゾアンタミンからの共生微生物を単離、培養することによってノルゾアンタミンを多量に産生するとともに、骨、軟骨、筋肉などの前駆細胞である間葉系幹細胞へのスナギンチャクの投与試験によりその作用機序を調べたものであり、その具体的構成は、以下のとおりである。
（１）刺胞動物スナギンチャクに共生するAspergillus funmigatus属の微生物の単離及びその培養によることを特徴とするノルゾアンタミン生産方法。
（２）刺胞動物スナギンチャクに共生するAspergillus funmigatus属の微生物の単離及びその培養によって生産したノルゾアンタミンによってコラーゲン分解酵素コラゲナーゼの作用を抑制することを特徴とする骨格タンパク質の関与する疾病の治療又は予防する方法。
（３）刺胞動物スナギンチャクに共生するAspergillus funmigatus属の微生物の単離及びその培養によって生産したノルゾアンタミンによるコラゲナーゼ抑制作用によってコラーゲン量を増大させる方法。
（４）刺胞動物スナギンチャクに共生するAspergillus funmigatus属の微生物の単離及びその培養によって得られたノルゾアンタミンを含有することを特徴とする化粧料又は飲食品。
【発明の効果】
【００１６】
従来の刺胞動物スナギンチャクからノルゾアンタミンを生産するには、刺胞動物スナギンチャクを粉砕し、そこに含まれるノルゾアンタミンを抽出する方法では、ノルゾアンタミンを大量に生産するために刺胞動物スナギンチャクを大量に採取せねばならず、天然資源の枯渇又は地球環境の破壊につながっていた。また、化学合成法による複雑な合成段階を経るノルゾアンタミンの大量生産では、使用する多くの原料・試薬類や複製する化合物の環境への影響から地球環境の観点から好ましくなく、ひいては安価なノルゾアンタミンの大量生産法とは言えなかった。
【００１７】
しかるに、本発明では、自然環境の保護の観点から、刺胞動物スナギンチャクという天然物に共生するAspergillus fumigates属の微生物に着目し、該Aspergillus funmigatus属の微生物を単離し、これを培養するという汎用的な手段の採用によって、ノルゾアンタミンを大量に産生し、収得することが可能になった。
また、本発明では、ノルゾアンタミンの大量供給によって分子レベルでのノルゾアンタミンの作用機序を解明することが可能となり、ノルゾアンタミンのコラーゲン分解酵素コラゲナーゼの作用を抑制する作用、コラゲナーゼ抑制作用によって骨と軟骨の前駆細胞である間葉系幹細胞の見かけ上のコラーゲン量を増大させることを見い出し、骨格タンパク質の関与する疾病の治療及び予防の効果を有することがわかった。
また、ノルゾアンタミンは、性質が大豆のイソフラボンに似ているので、これと同様に摂取することが考えられ、イソフラボンの利用分野の、健康食品等の飲食品や化粧料への利用を考えるに至った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、刺胞動物スナギンチャクにはAspergillus funmigatus属の微生物が共生していることを見いだし、この知見に基づき、本発明では、この共生するAspergillus funmigatus属の微生物を単離し、培養条件を整えて培養し、それを大量に培養することによってノルゾアンタミンを生産することが可能となった。
本発明の対象となっているノルゾアンタミンは、上述するように１９９５年、奄美大島近海のスナギンチャクから単離、上記化学式１の構造決定された化合物である。
本発明における培養条件は、それほど難しいものではなく、例えばデンプン、麦芽酵母培地中で30℃程度の温度であれば、誰でもが容易に培養でき、その抽出条件も厳しいものではないので、誰でもが生産することができる。
【００１９】
本発明においてノルゾアンタミンの生産に用いるAspergillus funmigatus属の微生物の菌株は、天然の刺胞動物スナギンチャクより新たに分離された子のう菌の一種で、その微生物学的性状は以下の通りである。
【００２０】
１）形態学的特徴（植物体上の特徴）
不完全菌類の一属であり、マユハキタケ科に属し、分生子は緑色から緑黄色、培養期は球形、培養時間の経過に伴い、円柱形になる。分生子柄は栄養菌糸から直立し、非分岐、無隔壁で、表面は平滑、無色からやや着色している。柄の先端部がふくらみ、球形からアレイ形の頂のうの形成が認められる。柄の基部はL字型からT字型の柄足細胞の形成が認められる。頂のうの周縁２／３から分生子形成細胞である首の短いアンプル形フィアライドが形成される単列型アスペルジラムの構造を示す。分生子はフィアロ型分生子で、球形から亜球形、１細胞、表面は微棘状から粗面、無色である。
【００２１】
２）各種培地上における培養上の特徴
ポテト・デキストロース寒天培地（ＰＤＡ）上、２５℃、７日間培養；コロニーは１週間で直径６．５〜７cmに拡がる、ビロード状。色調ははじめDull green(26D-3)、のちにGreyish green(26D-5)になる。
２％  麦芽寒天培地（ＭＡ）上、２５℃、７日間培養；コロニーは１週間で直径６．８〜７．５cmに拡がる、ビロード状。色調ははじめDark green(26F-8)、のちにWhite(26A-1)になる。
Bacto Oatmeal Agar（ＯＡ）上、２５℃、７日間培養；コロニーは１週間で直径５．６〜６cmに拡がる、ビロード状。色調ははじめDeep green(26E-7)、のちにDark green(26F-8)になる。
ＬＣＡ（日本菌学会報 １１巻 １１６−１１８、１９７０）上、２５℃、７日間培養；コロニーは１週間で直径６．５〜７cmに拡がる、ビロード状。色調はGreenish white(26A-2)になる。
【００２２】
３）生理的性質
適生育条件最適ｐＨ：ｐＨ３〜６（ＭＡ液体培地中、１０日間培養）
最適温度：２０〜３０℃（ＭＡ培地上、１週間培養）
生育範囲ｐＨ範囲：ｐＨ３〜９（ＭＡ液体培地中、１４日間培養）
温度範囲：２０〜３０℃（ＭＡ培地上、１週間培養）
【００２３】
４）分類学的考察
本微生物から得られた28S rDNA4)1/D2塩基配列は子のう菌類の一種であるAspergillus funmigatusの基準株NRRL 163 株(アクセッション番号U28460)を含むA. funmigatusの塩基配列と100％の相同性を示す。得られた配列をもとに作成した系統樹においても、Aspergillus funmigatusと同一の系統技を形成する。本微生物が含まれた系統枝にはAspergillus funmigatus  NRRL6113株(アクセッション番号U28466)も見られるが、これはNRRLカタログ(http://nrrl.ncaur.usda.gov/cgi-bin.usda/)にはAspergillus funmigatus のシノニム(Synonyms:同種異名)とされている。
本微生物から得られたITS-5.8S rDNA塩基配列は子のう菌類の一種であるAspergillus funmigatusの塩基配列と100％の相同性を示した。また、得られた配列をもとに作成した系統樹においてもAspergillus funmigatus と同一の系統枝を形成した。
従って、28S rDNA-D1/D2およびITS-5.8SrDNA塩基配列解析による解析結果から、本微生物はAspergillus funmigatus であることが推定できる。 
【００２４】
本微生物菌株は、コロニー性状及び形態観察の結果、緑色コロニーを形成し、単列アスペルジラムを形成するなどAspergillus属の中でもAspergillus funmigatus に類似した特徴が観察された。
この結果は、28SrDNA4-D1/D2及びITS-5.8S rDNA塩基配列解析結果を支持している。
【００２５】
以上の28S rDNA-D1/D2 及びITS-5.8S rDNA塩基配列解析、コロニー性状と形態観察の結果のうち、28S rDNA-D1/D2 及びITS-5.8S rDNA塩基配列解析を重視し、本微生物はAspergillus funmigatus と推定する。
本微生物の分類学的位置は
子のう菌門(Ascomycota)
子のう菌綱(Ascomycetes)
エウロチウム亜綱(Eurotiomycetidae)
エウロチウム目(Eurotiales)
マユハキタケ科(Trichocomaceae)
Aspergillus属
Funmigatus亜属
Funmigatus節
Aspergillus funmigatus Fresen.
となる。
【００２６】
なお、本菌株は産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ―２１２８３として寄託されている。
本発明においては、前記の菌を通常の微生物が利用し得る栄養物を含有する培地で培養する。栄養源としてはグルコース，水飴，デキストリン，シュクロース，澱粉，糖蜜，動・植物油等を使用できる。また窒素源として大豆粉，小麦胚芽，コーンスティープ・リカー，綿実粕，肉エキス，ペプトン，酵母エキス，硫酸アンモニウム，硝酸ソーダ，尿素等を使用できる。その他必要に応じて、ナトリウム，カリウム，カルシウム，マグネシウム，コバルト，塩酸，燐酸，硫酸及びその他のイオンを生成することの出来る無機塩類を添加することは有効である。また菌の生育を助け本物質の生産を促進するような有機及び無機物を適当に添加することができる。
【００２７】
本発明の上述する菌の培養法としては、好気的条件下での培養法が適している。培養に適当な温度は２０〜４０℃であるが、多くの場合、２０〜３７℃付近で培養する。本物質の生産は培地や培養条件により異なるが、振とう培養、タンク培養とも通常３〜１６日の間でその蓄積が最高に達する。培養物中の本物質の蓄積が最高になったときに培養を停止し、培養液から目的物質を単離精製する。
【００２８】
本物質を培養物から単離、精製するには、不純物との溶解度差を利用する手段、イオン結合力の差を利用する手段、吸着親和力の差を利用する手段、分子量の差を利用する手段のいずれも、それぞれ単独、又は適宜組み合わせて、又は反復して使用される。
例えば、(1) 培養濾液をクロロホルムで抽出し、抽出液を、逆相シリカゲル高速液体クロマトグラフィー等を組み合わせて精製する。
(2) 培養物をクロロホルムにて抽出後、菌体を除去、次いでクロロホルムを留去する。ｐＨを２程度に調整した後、酢酸エチルにて洗浄し、水槽のｐＨを１０程度に調整した後後、酢酸エチルにて抽出する。この濃縮液を順相シリカゲルクロマトグラフィー等を組み合わせて精製する、等の方法により、純粋な本物質が得られる。
【００２９】
また、本発明者らは、上述するようなノルゾアンタミンの生産方法によって得られたノルゾアンタミンの医薬活性を試験した結果、既にノルゾアンタミンが抗骨粗鬆症活性を有すること自体は公知であるが、本発明者らの新しい作用機序を見いだした。
すなわち、発明者らの試験によれば、ノルゾアンタミンの骨粗鬆症活性が、基本的にはコラーゲンの保護に由来するものであって、しかもノルゾアンタミンの有する基本活性は、骨粗鬆症のみならず、老化に由来する疾病の予防や、健康増進にその応用の道のあることを見いだすことができた。
さらに、本発明者らは、間葉系幹細胞の見かけ上のコラーゲン量を増大させることの原因がコラーゲン分解酵素コラゲナーゼの阻害によることも見いだした。
すなわち、ノルゾアンタミンによってコラーゲン分解酵素コラゲナーゼの作用を抑制する機能を有しており、さらに、ノルゾアンタミンによって骨と軟骨の前駆細胞である間葉系幹細胞の見かけ上のコラーゲン（タンパク質）量を増大させることを利用して骨以外にも皮膚や筋組織の老化予防の応用のあることがわかった。
したがって、本発明で得られるノルゾアンタミンは、具体的には老化に由来する疾病の治癒及び予防の用途、健康食品等の飲食品及び化粧料に利用できることがわかった。
【実施例】
【００３０】
(微生物の単離)
凍結スナギンチャク0．43ｇを解凍後、LB寒天培地（トリプトン 1%(w/v)、酵母エキス 0.5%(w/v)、塩化ナトリウム 1%(w/v)、寒天  2%(w/v)）約20ｇの平板培地上に転写後、37℃で静置培養し、平板培地上に生じたコロニーを30℃、3日培養して、MALDI型質量分析計でノルゾアンタミンの分子イオンピークを指標に、産生微生物のスクリーニングを行い、目的とする産生微生物を単離した。
単離したカビを麦芽酵母培地（デンプン 0.4%(w/v)、酵母エキス 0.4%(w/v)、麦芽エキス 1%(w/v)）800mLで30℃で、16日間液体培養した。
培養状態は図1に示す。
また、産生カビAspergillus funmigatusの走査型電子顕微鏡写真を図２に示す。
培養後、クロロホルム500mLで抽出することでノルゾアンタミンを容易に抽出した。
【００３１】
（産生微生物の同定）
抽出したノルゾアンタミンを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にて分析し、標品のノルゾアンタミンと同じ溶出時間の画分をESI型質量分析計で測定したところ、ノルゾアンタミンに相当する分子イオンピークとその衝突分解後(ESI-MS/MS)のフラグメントイオンピークパターンが一致したことにより同定した。これによりこのカビがノルゾアンタミンを産生することを確定した。
産生微生物の質量分析結果を図３に示す。
以上の質量分析の結果から微生物の産生した物質が標準物質であるノルゾアンタミンと一致していることからノルゾアンタミンであることを確認した。
【００３２】
（ノルゾアンタミンの間葉系幹細胞におけるコラーゲン増大作用）
96穴マイクロプレートを用いてマウス由来間葉系幹細胞にノルゾアンタミン（NZ）を添加して一週間培養した。実験操作を順次示すと、下記の通りである。
（１）培地を除き、PBSで洗浄。
（２）0.5 M 酢酸を各ウェルに100 mLずつ添加。
（３）15分撹拌。
（４）各ウェルから1.5 mLマイクロチューブに移し、Sircol Dye reagentを1 mL添加。
（５）30分撹拌。
（６）10,000 rpm×10 min.で遠心分離。
（７）0.5 M 水酸化ナトリウム水溶液を1 mL加え、1 min.撹拌。
（８）540 nmの吸光度を測定。
コラーゲン定量結果を図４に示す。
以上の結果よりマウス由来間葉系幹細胞にノルゾアンタミン（NZ）の添加量を増すにしたがって幹細胞にコラーゲンが増大し、0.1 μM以上ではコラーゲン量が増大して一定となった。
【００３３】
（ノルゾアンタミンのコラゲナーゼ阻害作用）
氷冷したコラーゲン溶液 88 mL (1 mg/mL)を用いて下記の実験操作によりコラゲナーゼ阻害作用を確認した。
※ 実験に用いた緩衝液 : Tris-HCl 0.1 M, NaCl, CaCl2, pH 7.4
コラーゲン溶液 88 mL (1 mg/mL)
（１）37℃で5分間保温。
（２）ノルゾアンタミン溶液10 mL (10 mM)を加える（対照は緩衝液10 mLのみ）。
（３）コラゲナーゼ溶液を2 mL (0.33 mg/mL)を加える（対照は緩衝液2 mLのみ）。
（４）一定時間馴養（0.5, 1, 2, 3, 24 時間）。
（５）直ちにSirius Red溶液1 mLを加え、酵素反応停止及びコラーゲン染色。
（６）常温で30分間攪拌。
（７）10,000 rpmで15分間遠心分離し、上清を除く。
（８）沈殿をNaOH水溶液1 mL（0.5 M）で溶解。
（９）540 nmの吸光度を測定。
（１０）検量線よりコラーゲン量を定量。
コラーゲン定量結果を図５に示す。
この結果よりAspergillus funmigatus属の微生物を利用して生産したノルゾアンタミンにはコラーゲン分解酵素であるコラゲナーゼの阻害活性があることが認められた。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】寒天培地上のノルゾアンタミン産生カビAspergillus funmigatus
【図２】産生カビAspergillus funmigatusの走査型電子顕微鏡写真
【図３】ESI-MS/MSの結果  上から  1）ノルゾアンタミンの標品、2）カビの培養液から抽出したノルゾアンタミン、3）ゾアンタミンの標品、4）カビの培養液から抽出したゾアンタミン）ゾアンタミンはノルゾアンタミンの同族体である。
【図４】ノルゾアンタミンの間葉系幹細胞におけるコラーゲン増大作用
【図５】ノルゾアンタミンのコラゲナーゼ阻害作用
【図１】
2008266204.tif 000004
【図２】
2008266204.tif 000005
【図３】
2008266204.tif 000006
【図４】
2008266204.tif 000007
【図５】
2008266204.tif 000008