(57)【要約】【課題】多糖及び糖ペプチドを含む、水溶液に溶解する抗原物質（ＡＳＭＰ）の調製方法を提供すること。【解決手段】多糖及び／又は糖ペプチドを含む、水溶液に溶解する抗原物質（ＡＳＭＰ）の調製方法であって、トリコフィトン、ミクロスポルム又はカンジダ属の好ケラチン性真菌又は酵母の真菌細胞を水性アルカリ条件下で処理する工程、その調製物の固相と液相を分離する工程、分離後にその上清を鉱酸又は有機酸で処理する工程、及び分離後にその上清からＡＳＭＰを沈殿させる工程、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖及び／又は糖ペプチドを含む、水溶液に溶解する抗原物質（ＡＳＭＰ）の調製方法であって、
- トリコフィトン、ミクロスポルム又はカンジダ属の好ケラチン性真菌又は酵母の真菌細胞を水性アルカリ条件下で処理する工程、
- その調製物の固相と液相を分離する工程、
- 分離後にその上清を鉱酸又は有機酸で処理する工程、及び
- 分離後にその上清からＡＳＭＰを沈殿させる工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
- 前記真菌細胞を0.１〜５％ (w/v)ＫＯＨ又はＮａＯＨで２０〜１５０℃において３０分間までの間処理する工程、
- 遠心分離する工程、
- 遠心分離後にその上清を0.２〜1.５M有機酸又は0.０５〜１M鉱酸で処理する工程、
- 遠心分離後にその上清を適切な有機溶媒又は塩で処理する工程、及び
- その沈殿を回収する工程、
を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
多糖及び／又は糖ペプチドを含む、水溶液に溶解しない抗原物質（ＡＮＭＰ）の調製方法であって、
- トリコフィトン、ミクロスポルム又はカンジダ属の好ケラチン性真菌又は酵母の真菌細胞を水性アルカリ条件下で処理する工程、
- その調製物の固相と液相を分離する工程、及び
- 分離後にその固相を鉱酸又は有機酸で処理する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
- 前記真菌細胞を0.１〜５％ (w/v)ＫＯＨ又はＮａＯＨで２０〜１５０℃で３０分までの間処理する工程、
- その固相を0.２〜1.５M有機酸又は0.０５〜１M 鉱酸で処理する工程、及び
- 水溶液で洗浄する工程、
を含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
多糖及び／又は糖ペプチドを含む外因性抗原物質（ＡＥＭＰ）の調製方法であって、
- トリコフィトン、ミクロスポルム又はカンジダ属の好ケラチン性真菌又は酵母の真菌細胞を液体培養液中で培養する工程、
- その調製物の固相と液相を分離する工程、及び
- 分離後にその上清からＡＥＭＰを沈殿させる工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
- その培養が２５０時間までの間である工程、
- 分離後にその上清にアルコールを加える工程、及び
- その沈殿を回収する工程、
を含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
- 分離後にその上清を凍結乾燥する工程、
- 水溶液に溶解する工程、
- １〜５容量のアルコールで沈殿させた後にその沈殿を水溶液に溶解する工程、
- その溶液を凍結乾燥する工程、
を含むことを特徴とする請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
前記真菌が下記の真菌種のいずれか１種に属することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- トリコフィトン・エクイナム(Trichophyton equinum)、
- トリコフィトン・メンタグロフィテス(Trichophyton mentagrophytes)、
- トリコフィトン・サルキソビイ(Trichophyton sarkisovii)、
- トリコフィトン・ベルコサム(Trichophyton verrucosum)、
- ミクロスポルム・カニス(Microsporum canis)、
- ミクロスポルム・ジプセウム(Microsporum gypseum)、又は
- カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)。
【請求項９】
前記真菌が下記の真菌株のいずれか１種に属することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- トリコフィトン・エクイナム DSM No.7276、
- トリコフィトン・メンタグロフィテス DSM No.7279、
- トリコフィトン・サルキソビイ DSM No.7278、
- トリコフィトン・ベルコサム、DSM 7277、
- ミクロスポルム・カニス DSM No.7281、
- ミクロスポルム・カニス  オベサム(obesum)型 DSM No.7280、
- ミクロスポルム・カニス  ディストルタム(distortum)型 DSM No.7275、
- ミクロスポルム・ジプセウム DSM No.7274、又は
- カンジダ・アルビカンス DSM No.9656。
【請求項１０】
多糖及び／又は糖ペプチドを含有し、哺乳動物において抗アレルギー活性を有する抗原物質であって、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られる前記抗原物質。
【請求項１１】
T.メンタグロフィテス株 DSM No.7279からのＡＳＭＰ、M.ジプセウム株 DSM No.7274からのＡＳＭＰ及びC.アルビカンス株 DSM No.9656からのＡＳＭＰを含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗原物質。
【請求項１２】
T.メンタグロフィテス株 DSM No.7279からのＡＮＭＰ、M.ジプセウム株 DSM No.7274からのＡＮＭＰ及びC.アルビカンス株 DSM No.9656からのＡＮＭＰを含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗原物質。
【請求項１３】
T.メンタグロフィテス株 DSM No.7279からのＡＥＭＰ、M.ジプセウム株 DSM No.7274からのＡＥＭＰ及びC.アルビカンス株 DSM No.9656からのＡＥＭＰを含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗原物質。
【請求項１４】
請求項１０に記載の抗原物質の組合わせを含む抗原物質。
【請求項１５】
ＡＳＭＰ及びＡＥＭＰを含むことを特徴とする請求項１０又は１４記載の抗原物質。
【請求項１６】
ＡＳＭＰ及びＡＥＭＰ及びＡＮＭＰを含むことを特徴とする請求項１０又は１４記載の抗原物質。
【請求項１７】
ＡＥＭＰ及びＡＮＭＰを含むことを特徴とする請求項１０又は１４記載の抗原物質。
【請求項１８】
ＡＳＭＰ及びＡＮＭＰを含むことを特徴とする請求項１０又は１４記載の抗原物質。
【請求項１９】
請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の抗原物質を含むワクチン。
【請求項２０】
請求項１０〜１９のいずれか１項に記載の抗原物質を適切な生理的担体と共に含むワクチン。
【請求項２１】
請求項１０〜２０のいずれか１項に記載の抗原物質を含むアレルギーの治療用又はサマー湿疹に対するワクチン用注射用液。
【請求項２２】
請求項１０〜２１のいずれか１項に記載の抗原物質を含有するアレルギーの治療用医薬組成物。
【請求項２３】
アレルギーの予防及び／又は治療用医薬品を調製するための請求項１０〜２１のいずれか１項に記載の抗原物質の使用。
【請求項２４】
免疫応答をモジュレートする医薬品を調製するための請求項１０〜２１のいずれか１項に記載の抗原物質の使用。
【請求項２５】
サマー湿疹の予防又は治療用医薬品を調製するための請求項１０〜２１のいずれか１項に記載の抗原物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好ケラチン性真菌及び酵母から調製可能な多糖及び／又は糖ペプチドを含む抗原製剤、その抗原製剤の調製方法、アレルギーの予防と治療用を含むがそれらに限定されない及び免疫応答をモジュレートするための医薬物質又はワクチンとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人口の２０％を超えるヒトが様々な形のアレルギーに罹患しており、その驚くべき流行の増加、過去１０年間の罹患率及び死亡率から環境疾患と呼ばれるようになった(非特許文献１)。ヒトと動物は、同様の程度までアレルギーに罹患している。
アレルギーの発症には、免疫反応が重要な役割を果たしてい(非特許文献２)。原則として２つの異なる種類のアレルギー反応が述べられている。１つは、即時型過敏症（ＩＴＨ）であり、アレルゲンに対する最大アレルギー応答が数分から数時間で見られる。第２は遅延型過敏症（ＤＴＨ）である。ＤＴＨの場合、アレルゲンに対するアレルギー応答は、通常、２４〜４８時間後に最大に達する。おそらくＩＴＨは主にＩｇＥ経路によって仲介されるが、ＤＴＨは更に複雑である。ＤＴＨの発症には、更に細胞仲介応答（即ち、Ｂリンパ球及びＴリンパ球）が関係しているらしい。例えば、アレルギー供与動物から非アレルギー受容動物へリンパ球と抗体を移入した後、受容動物はＤＴＨを発症した(非特許文献３)。
環境抗原に直接曝露したために最もアレルギーに罹った組織は上皮組織、特に皮膚である。例えば、皮膚科クリニックでは急性アレルギー性接触性皮膚炎及び慢性アレルギー性接触性湿疹が全皮膚病の１５％とみなしている。アレルギー性喘息はヒトにおける全喘息症例の約２０％とみなしている。
【０００３】
ＩＴＨとして分類されるアレルギー疾患は、例えば、アトピー性湿疹、アレルギー性気管支喘息、枯草喘息、鼻炎、結膜炎である。これらは、同様に慢性に移行することがあり、ＩｇＥ依存性反応とのみみなされるべきではない。ＤＴＨの例は、急性アレルギー性接触性皮膚炎及び慢性アレルギー性接触性湿疹であり、表皮の症状によってＤＴＨ（ＩＶ型）として分類される。そのような患者は、以前にアレルゲンとの接触によって感作されており、過敏症を発症している。アレルゲンに新たに接触すると急性、亜急性又は慢性炎症性接触性皮膚炎が引き起こされるのである。
動物クリニックからのアレルギー性皮膚炎の一例は、スウィートそう痒症又はクインズランドそう痒症とも呼ばれるサマー湿疹である。サマー湿疹は、ウマのアレルギー性皮膚炎であり、アトピー型のアレルギー疾患に属する（Ｉ型及びＩＶ型反応を含む）。サマー湿疹は、カ科及びヌカカ科の小昆虫の刺傷によって引き起こされ、主にたてがみ、しっぽ及び腹部の部分に永続的なびらん及び滲出を呈する皮膚病変を特徴とする。罹患した動物は、刺激、即ち、接触、雨、風等に対して皮膚の強い感受性を示し、全体の健康状態及び動作に障害をきたす。他のアレルギーのようにこの疾患の発症は栄養によっても影響されると考えられる。この疾患の症状は３月から９月までだけ目に見えるが、皮膚のアレルゲン誘発感受性は一年中認められる。サマー湿疹は、アレルギーの研究及び抗アレルギー物質の開発の興味深い一般モデル系となる。
アレルギーの多くの治療が提案されており、臨床像に左右される。急性アレルギー性接触性皮膚炎、慢性アレルギー性接触性湿疹及び／又はアトピー性湿疹の治療については、通常、糖質副腎皮質ステロイド、抗菌物質、抗炎症剤及び／又はカルシウムを含む親油性クリームが用いられる。サマー湿疹の治療については、種々の化合物、例えば、ステロイド製剤、殺虫剤、種々のガレヌス製剤、サリチル酸塩、油又は微生物から単離したペプチドが局所又は非経口適用されている。上記の治療は全て対症療法であり、アレルギーの原因療法ではない。
免疫応答障害又は免疫不全は、たいていアレルギーの発症に重要な役割を果たしている。従って、湿疹、アトピー性湿疹、皮膚膿瘍及び自己免疫疾患の治療については、免疫治療法、例えば、ＢＣＧ、レバミゾール及び他の刺激物質のような免疫刺激物質の投与が用いられた（非特許文献４）。
【０００４】
ノミアレルギー性皮膚炎の治療については、抗体由来ペプチドの投与が巧妙に用いられた（特許文献１）。アトピー性湿疹の治療については、脱感作を用いて相対的に良好な結果が得られた（非特許文献４）。
アレルギーを治療するのに様々な異なった方法があるにもかかわらず我々の知る限り好ケラチン性真菌又は酵母から調製可能な抗原化合物はアレルギーの治療に用いられていない。
本発明の関係において、“可溶性”又は“不溶性”という用語は、水溶液中の溶解性を意味する。“抗原製剤”という用語は、抗原又は免疫原応答を誘発することができる物質の組成物を意味する。“免疫応答をモジュレートする”という用語は、免疫応答を刺激又は亢進する本発明の抗原製剤の能力を意味し、例えば、細胞培養内でリンパ球の増殖を刺激する能力によって証明される（詳細な説明は非特許文献５と６に見出される）。
【０００５】
【特許文献１】英国特許出願第8913737号
【非特許文献１】Sutton & Gould，Nature 1993，366，p.421-428
【非特許文献２】Paul，William E.(Edit.)，Fundamental Immunology，Raven Press Books Ltd.,ニューヨーク，1984
【非特許文献３】Askenase，P.W．(1973)，J．exp．Med.，138，p.1144-1155
【非特許文献４】A.M．Tschernucha(Edit.)，Koscha，Medicina，1982，モスクワ
【非特許文献５】Strubeら（1989）Vet．Med．Rev.，60，p.3-15，
【非特許文献６】Buettner M.（1993）Comp．Immun．Microbiol．Infect．Dis.，16，No．1，p．1-10
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで驚くべきことに、好ケラチン性真菌又は酵母から調製可能な抗原製剤が特に哺乳動物においてアレルギーの予防と治療のために及び免疫応答をモジュレートするために用いられることが見出された。
そこで、好ケラチン性真菌及び酵母から抗原物質を調製する方法も開発された。その方法に従って調製可能な抗原製剤は、多糖及び／又は糖ペプチドを含む。抗原製剤は、動物及びヒトの治療用、特にアレルギーの治療用及び免疫応答をモジュレートするための医薬組成物及びワクチンとして用いられる。本発明の医薬組成物の効用は、免疫学的及び薬理学的であることが理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の抗原物質は、好ケラチン性真菌又は酵母、例えば、真菌又は酵母細胞壁に由来する物質から調製される。
本発明の抗原製剤の調製については、３種類の異なる方法が開発された。その方法によれば、３種類の異なる抗原画分（ＡＳＭＰ、ＡＮＭＰ又はＡＥＭＰ）は、以後一般に“画分”と呼ばれる、好ケラチン性真菌及び酵母から調製される。１種類を超える画分を含む抗原製剤は、以後“複合製剤”又は短く“複合体”と呼ばれる。
方法１: 本方法に従って調製可能な画分は、多糖及び／又は糖ペプチドを含む可溶性抗原物質（ＡＳＭＰ）からなる。実施例１に詳述される本方法は、概要として下記の工程を含む。
好ケラチン性真菌又は酵母を、欧州特許第0564620号に記載されるような寒天平板上で培養する。好適培地は、例えば、Oxoid製の麦芽エキス寒天である。好ケラチン性真菌又は酵母の増殖を行わせる他の培地も用いられる。得られた真菌バイオマスを取り上げ、アルカリ水溶液で処理する。好ましいアルカリ水溶液は、好適濃度0.1〜５％(w/v)のＮａＯＨ又はＫＯＨである。アルカリ処理は、２０〜１５０℃で３０時間が好ましい。水性アルカリ条件下で処理した後、調製物の固相と液相を遠心分離、ろ過又は沈降等で分離する。好ましくは、分離は、真菌細胞片の良好な分離を行わせる遠心分離、例えば約３５００ｇの遠心力で達成される。水性アルカリ条件下での処理、及び分離工程は、数回繰り返される。
アルカリ処理後、得られた上清を水性酸性条件下で、例えば、0.2〜1.5M有機酸又は0.05〜１M鉱酸処理する。例えば、ＨＣｌ又は酢酸が好ましくはｐＨ2.5〜4.5のｐＨ値で用いられる。好ましくは、水性酸性条件下での処理は４〜８℃の温度で２〜４時間であり、その後に固体層と液体層の分離が起こる。水性酸性条件下での処理、及び分離工程は、好ましくは上記の条件下で数回繰り返される。
【０００８】
次に、分離工程からの上清を沈殿工程に供する。好ましくは、沈殿は、上清に適当な有機溶媒、例えば、低級アルカノールのようなアルコール、例えば、メタノール又はエタノールを加えることにより行われる。２〜５容量のアルコールに対して１容量の上清の割合から抗原物質の良好な沈殿が生じる。当業者に既知の他の非アルコール沈殿方法も用いられ、例えば、硫酸アンモニウム又は他の塩沈殿から抗原物質の沈殿が生じる。次に、固相を分離工程に、好ましくは上記の条件下に供する。得られた固相を回収し、場合によっては水溶液、好ましくは蒸留水に溶解する。典型的には２５〜１００mlが用いられる。最後に、ＡＳＭＰ製剤を凍結乾燥し、乾燥条件下で長時間貯蔵される。
方法２: 本方法に従って調製可能な画分は、多糖及び／又は糖ペプチドを含む不溶性抗原物質（ＡＮＭＰ）からなる。実施例２に詳述される本方法は、概要として下記の工程を含む。
好ケラチン性真菌又は酵母を、欧州特許第0564620号に記載されるような寒天平板上で培養する。好適培地は、例えば、Oxoid製の麦芽エキス寒天である。好ケラチン性真菌又は酵母の増殖を行わせる他の培地も用いられる。得られた真菌バイオマスを取り上げ、アルカリ水溶液で処理する。好ましいアルカリ水溶液は、好適濃度0.1〜５％(w/v)のＮａＯＨ又はＫＯＨである。アルカリ処理は、２０〜１５０℃で３０時間が好ましい。水性アルカリ条件下で処理した後、調製物の固相と液相を遠心分離、ろ過又は沈降等で分離する。好ましくは、分離は、真菌細胞片の良好な分離を行わせる遠心分離、例えば約３５００ｇの遠心力で達成される。水性アルカリ条件下での処理、及び分離工程は、数回繰り返される。アルカリ処理後、固相を鉱酸又は有機酸で処理する。好ましくは0.2〜1.5M酢酸又は0.05〜１MＨＣｌを固相に７０〜１００℃の温度で0.5〜３時間加える。酸処理後、固相を水溶液、好ましくは蒸留水で洗浄する。有利には、洗浄は約５回繰り返される。最後に固相を蒸留水に懸濁させる。
方法３: 本方法に従って調製可能な画分は、多糖及び／又は糖ペプチドを含む外因性抗原物質（ＡＥＭＰ）からなる。実施例３に詳述される本方法は、概要として下記の工程を含む。
【０００９】
好ケラチン性真菌又は酵母を、２４０時間水溶液中でインキュベートするか又は液体培養液中で培養する（ここで溶液又は培養液の容量は一次容量として定義される）。蒸留水（実施例3.I.を参照されたい）及び欧州特許第0564620号に記載された培養液が用いられる。インキュベート又は培養した後、真菌細胞を、例えば、遠心分離、ろ過又は沈降、好ましくは上記の条件下の遠心分離で分離する。得られた上清を凍結乾燥し、引き続き水に溶解する。好ましくは、水の容量は0.1〜0.2容量の一次容量（ＰＶ）と同量である。次に、得られた溶液を沈殿工程に供する。好ましくは、沈殿は、上清に適当な有機溶媒、例えば、低級アルカノールのようなアルコール、例えば、メタノール又はエタノールを加えることにより行われる。２〜５容量のアルコールに対して１容量の上清の割合から抗原物質の良好な沈殿が生じる。当業者に既知の他の非アルコール沈殿方法も用いられ、例えば、硫酸アンモニウム又は他の塩沈殿から抗原物質の沈殿が生じる。得られた沈殿を回収し、場合によっては水性溶媒、好ましくは蒸留水に溶解する。好ましくは、0.5〜50mgの沈殿を１mlの水性溶媒に溶解する。最後に、ＡＥＭＰ溶液を凍結乾燥し、乾燥条件下で、好ましくは２〜１０℃で長時間貯蔵される。
上で定義された画分が調製可能である好ましい真菌属は、トリコフィトン(Trichophyton)、ミクロスポルム(Microsporum)又はカンジダ(Candida)である。
好ましい菌種は下記のものである。
‐トリコフィトン・エクイナム(Trichophyton equinum)、
‐トリコフィトン・メンタグロフィテス(Trichophyton mentagrophytes)、
‐トリコフィトン・サルキソビイ(Trichophyton sarkisovii)、
‐トリコフィトン・ベルコサム(Trichophyton verrucosum)、
‐ミクロスポルム・カニス(Microsporum canis)、
‐ミクロスポルム・ジプセウム(Microsporum gypseum)、又は
‐カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)。
【００１０】
上記菌種の好ましい菌株は次のものである。
‐トリコフィトン・エクイナム DSM No.7276、
‐トリコフィトン・メンタグロフィテス DSM No.7279、
‐トリコフィトン・サルキソビイ DSM No.7278、
‐トリコフィトン・ベルコサム、DSM 7277、
‐ミクロスポルム・カニス DSM No.7281、
‐ミクロスポルム・カニス オベサム(obesum)型 DSM No.7280、
‐ミクロスポルム・カニス ディストルタム(distortum)型 DSM No.7275、
‐ミクロスポルム・ジプセウム DSM No.7274、又は
‐カンジダ・アルビカンス DSM No.9656。
上記の菌株は全て、出願人により微生物の寄託に関するブダペスト条約の規定によってＤＳＭ(“Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH”，Mascheroder Weg 1B，D-38124ドイツ国ブラウンシュワイク)に寄託されている。カンジダ・アルビカンス DSM No.9656を除く菌株は全て、1991年10月21日出願のUSSR特許出願第5006861号及び対応出願、即ち、1992年10月17日出願の欧州特許第0564620号の公開特許出願に記載されている。
画分は、得られる菌種によって下記のものに従って呼ばれる。
【００１１】
下記の菌種に由来する画分：
(i) トリコフィトン・エクイナムはASMP-TE、ANMP-TE又はAEMP-TEと呼ばれる、
(ii) トリコフィトン・メンタグロフィテスはASMP-TM、ANMP-TM又はAEMP-TMと呼ばれる、
(iii) トリコフィトン・サルキソビイはASMP-TS、ANMP-TS又はAEMP-TSと呼ばれる、
(iv) トリコフィトン・ベルコサムはASMP-TV、ANMP-TV又はAEMP-TVと呼ばれる、
(v) ミクロスポルム・カニスはASMP-MC、ANMP-MC又はAEMP-MCと呼ばれる、
(vi) ミクロスポルム・ジプセウムはASMP-MG、ANMP-MG又はAEMP-MGと呼ばれる、
又は(vii) カンジダ・アルビカンスはASMP-CA、ANMP-CA又はAEMP-CAと呼ばれる。
個々の菌株に関する情報が示される場合、菌種の略号に続いて個々のＤＳＭ寄託物の数字が示される。例えば、ＡＥＭＰ−ＣＡ９６５６は、カンジダ・アルビカンス株 DSM No.9656から調製可能なＡＥＭＰ画分を意味する。
上記方法（１〜３）のいずれかで定義される調製可能な画分は、上記真菌の少なくとも１種から調製可能な少なくとも１種の単一抗原を含む。本発明の抗原製剤は、上で定義した画分の少なくとも１種又はその組合わせを含む。
【００１２】
実施例１及び３に記載される抗原製剤（ＡＳＭＰ及びＡＥＭＰ）は、下記のものを含む。
１）単糖、アミノ酸及びヌクレオチドを含み、大部分は高分子構造で結合されており、少ない部分は遊離モノマーである。
２）主として、単糖単位：マンノース、ガラクトース、グルコース及びキシロース等を異なる相対量で含む。
３）単糖の有意量で形成された高分子構造の混合物を含む。高分子構造の有意部分は、２００００ｋＤより大きい分子量を示す。
４）遊離又は結合アミノ酸の少量を含む。
５）ＤＮａｓｅＩによる消化に感受性のあることがわかったＤＮＡ分子の少量を含む。
抗原製剤ＡＳＭＰ及びＡＥＭＰのＮＭＲ分光法から図１〜図４に示されるＮＭＲスペクトログラムが得られた。
ケミカルシフト及びシグナル多重性（表１２に纏めた）は炭水化物とアミノ酸の文献データと一致する。
【００１３】
ＡＥＭＰ及びＡＳＭＰの画分、例えば、MG 7274、TM 7279及びCA 9656については、炭水化物シグナルは3.2〜5.5 ppmの範囲であり、アミノ酸シグナルは0.75〜3.45の範囲である（αプロトンを含まない）。
ＡＳＭＰは、酢酸塩−ＣＨ3の典型的シグナル1.92 ppmを示す。
ＡＥＭＰ画分は、二糖及びアミノ酸の典型的シグナルを示す。例えば、TM 7279スペクトルは、7.15〜7.9 ppmの範囲にフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンのような芳香族アミノ酸のシグナルを示す。
ＡＳＭＰ又はＡＥＭＰの単一画分については、0.1〜５０mg/mlの濃度が好ましい。ＡＮＭＰの単一画分については、0.1〜５％(v/v)の濃度が好ましい。
本発明の抗原製剤の好適実施態様は、例えば、下記の画分の組合わせ（複合体）を含んでいる。
複合体１は、ＡＳＭＰ−ＴＭとＡＳＭＰ−ＭＧとＡＳＭＰ−ＣＡを含む。好ましくは、各画分の濃度は0.1〜５０mg/mlである。複合体１の非常に好適な実施態様は、ＡＳＭＰ−ＴＭ７２７９、ＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４及びＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６の組合わせである。
複合体1.1は、ＡＳＭＰ−ＭＧとＡＳＭＰ−ＣＡを含む。好ましくは、各画分の濃度は、0.1〜５０mg/mlである。複合体1.1の非常に好適な実施態様は、ＡＳＭＰ−ＴＭ７２７４及びＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６の組合わせである。
【００１４】
複合体２は、ＡＮＭＰ−ＴＭとＡＮＭＰ−ＭＧとＡＮＭＰ−ＣＡを含む。好ましくは、各画分の濃度は0.1〜５０％(v/v)である。複合体２の非常に好適な実施態様は、ＡＮＭＰ−ＴＭ７２７９、ＡＮＭＰ−ＭＧ７２７４及びＡＮＭＰ−ＣＡ９６５６の組合わせである。
複合体３は、ＡＥＭＰ−ＴＭとＡＥＭＰ−ＭＧとＡＥＭＰ−ＣＡを含む。好ましくは、各画分の濃度は0.1〜５０mg/mlである。複合体３の非常に好適な実施態様は、ＡＥＭＰ−ＴＭ７２７９、ＡＥＭＰ−ＭＧ７２７４及びＡＥＭＰ−ＣＡ９６５６の組合わせである。
複合体４は、ＡＮＭＰとＡＥＭＰを含む。次の画分の組合わせが好ましい。
（１）ＡＮＭＰ−ＣＡ及びＡＥＭＰ−ＴＭ又は（２）ＡＮＭＰ−ＭＧ、ＡＮＭＰ−ＴＭ及びＡＥＭＰ−ＴＭ。好ましくは、ＡＮＭＰの濃度は0.1〜５０％（v/v）であり、ＡＥＭＰは0.1〜５０mg/mlである。複合体４の非常に好適な実施態様は下記の組合わせである。
4.1 ANMP-CA9656と 4.2 ANMP-MG7274と AEMP-TM7279; ANMP-TM7279と AEMP-TM7279; 複合体５は、ＡＮＭＰとＡＳＭＰを含む。好ましい組合わせは、ＡＮＭＰ−ＭＧとＡＮＭＰ−ＴＭとＡＳＭＰ−ＣＡである。好ましくは、個々のＡＮＭＰ画分の濃度は0.1〜５０％(v/v)であり、個々のＡＳＭＰ画分の濃度は0.1〜５０mg/mlである。ＡＮＭＰ−ＭＧ７２７４とＡＮＭＰ−ＴＭ７２７９とＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６の組合わせが非常に好ましい。
【００１５】
本発明の好ましい抗原複合体は、また、例えば、ＡＳＭＰとＡＥＭＰ又はＡＳＭＰとＡＥＭＰとＡＮＭＰをＡＳＭＰ及びＡＥＭＰの濃度が0.1〜５０mg/ml及びＡＮＭＰの濃度が0.1〜５０％（v/v）で含む。
本発明の抗原製剤は、不利な生理的副作用を引き起こさずバッファー、溶液又はアジュバント、例えば、塩溶液、乳酸塩溶液又はリンゲル液が挙げられる適切な生理的に許容しうる担体と共に適用される。好ましい担体は、例えば、担体Ａ：0.85％(w/v)ＮａＣｌ；担体Ｂ：５％(w/v)グルコース、0.3％(w/v)肉エキス“lab-lemco”(Oxoid)及び0.1％(w/v)酵母エキス(Oxoid);担体Ｃ：RPMI 1640培養液(Servaから購入した、カタログNo.12-702)である。
本発明の抗原製剤は、それ自体又は注射用液剤、クリーム剤、噴霧剤、エアゾル剤、錠剤及び当業者に既知の他の適用剤形として適用される。本発明の抗原製剤は、また、非常に効率のよいワクチンを供給することができる。
本発明の抗原製剤は、免疫系の細胞の増殖を促進することができ、免疫応答をモジュレートすることができる。本発明の抗原製剤は、また、ヒトケラチノサイトの増殖を阻止することができる。
【００１６】
本発明の抗原製剤は、アレルギー反応、特に上皮組織の、更には皮膚のアレルギー反応に対して高度の耐性を与えることができる。アレルギーを予防及び治癒するために興味深いものであり、進行中の、実験動物（即ち、モルモット及びホワイト系マウス）及びウマ（即ち、交雑種及びアイスランド産ウマ）において生体内で証明される不利な副作用を示さない。
特に、急性アレルギー性皮膚炎及び皮膚病変は、本発明の抗原製剤を投与することにより、即ち、ワクチン注射することにより副作用なく効果的に治癒される。本発明の抗原製剤を筋肉内注射した後、アレルギー性皮膚炎に罹患した個体の皮膚のアレルギー性炎症、かゆみ及び皮膚の感受性の症状は消失する。全てのアレルギー症状からの完全な回復は最後の注射の２〜８週間後に得られ、刺激物質に対する皮膚のアレルゲン誘発感受性は消失した。更に、最後の注射の１〜６週間後にはかゆみも消える。
好適実施態様においては、本発明の抗原製剤は、ウマ、特にアイスランド産ウマのいわゆるサマー湿疹を防御及び治癒する。本発明の抗原製剤を１〜３回筋肉内又は皮内注射した後、サマー湿疹に罹患したウマのサマー湿疹が治癒及び防御される。複合体１及び1.1が好ましい。
好適実施例においては、本発明の抗原製剤は、また、哺乳動物において脱毛症を防御及び治癒する。本発明の抗原製剤を１〜３回筋肉内又は皮内注射した後、脱毛症に罹患した哺乳動物の脱毛症が治癒又は防御される。複合体１又は1.1が好ましい。
【００１７】
他の好適実施態様においては、本発明の抗原製剤は、哺乳動物の毛の状態及び毛の季節的変化を回復する。１〜３回の筋肉内又は皮内注射した後、毛の状態は著しく回復し、毛の不完全変化に罹った個体においては正常な季節毛への完全変化がもたらされる。複合体１又は1.1が好ましい。
他の好適実施態様においては、本発明の抗原製剤は、湿疹を防御及び治癒する。本発明の抗原製剤を１〜３回筋肉内又は皮内注射した後又は局所処置した後、湿疹に罹患した哺乳動物、即ち、ヒトの湿疹が治癒又は防御される。画分ＡＳＭＰ−ＭＧ、ＡＳＭＰ−ＣＡ及びＡＳＭＰ−ＴＭ、即ち、ＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４、ＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６及びＡＳＭＰ−ＴＭ７２７９又は複合体１及び1.1が好ましい。
好適実施態様においては、本発明の抗原製剤は、また、神経皮膚炎を防御及び治療する。本発明の抗原製剤を局所処置した後、神経皮膚炎に罹患した哺乳動物、即ち、ヒトの神経皮膚炎が治癒又は防御される。画分ＡＳＭＰ−ＭＧ、ＡＳＭＰ−ＣＡ及びＡＳＭＰ−ＴＭ、即ち、ＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４、ＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６及びＡＳＭＰ−ＴＭ７２７９又は複合体１及び1.1が好ましい。
本発明の抗原製剤は、Urban & Schwarzenberg，“Klinische Immunologie”，Peter，H.H．(edit.)，publ．1991，Urban & Schwarzenberg，ドイツ国ミュンヘンに記載されたもののような種々の症状を治療するために用いられる。例えば：
【００１８】
１．アレルギー性気道疾患
1.1．アレルギー性鼻炎及び結膜炎
1.1.1．季節的鼻腔結膜炎
1.1.2．多年性鼻炎
1.2．気管支喘息
1.3．喘息状態
1.4．小児喘息
1.4.1．感染性細気管支炎後の閉塞性肺疾患
1.4.2．軽度エピソード又は軽度多年性気管支喘息
1.4.3．重度多年性気管支喘息
２．アレルギー性気管支肺アスペルギルス症
３．食物アレルギー
3.1．ＩｇＥ仲介食物アレルギー
3.1.1．乳児のＩｇＥ仲介食物アレルギー
3.1.2．幼少年及び成人のＩｇＥ仲介食物アレルギー
3.2．ＩｇＥ及びＴ細胞仲介食物アレルギー
3.3．牛乳不耐性
3.4．ハイナー症候群
3.5．好酸球性胃腸炎
3.6．セリアック病
４．昆虫刺傷アレルギー
【００１９】
５．じんま疹（全ての形状）
5.1．接触性じんま疹
5.2．アレルギー反応に随伴するじんま疹
5.3．添加物及びプロスタグランジン合成のインヒビターに対する不耐性に随伴するじんま疹（仮性アレルギー）
5.4．物理性じんま疹
5.4.1．皮膚描記症（人工じんま疹）
5.4.2．コリン性及びアドレナリン性じんま疹
5.4.3．寒冷じんま疹
5.4.4．光じんま疹
5.4.5．気圧じんま疹
5.4.6．他のまれな物理性じんま疹
5.5．血管炎じんま疹
5.6．肥満細胞腫及び色素性じんま疹
5.7．感染症に随伴するじんま疹
5.8．免疫甲状腺炎に随伴するじんま疹
5.9．じんま疹及びアミロイドーシス
６．血管浮腫
6.1．遺伝性血管神経性浮腫（ＨＡＮＥ）
6.2．後天性血管神経性浮腫
７．アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹
８．薬物アレルギー
【００２０】
【表１】
2008266352.tif 000002
【００２１】
本発明は、更に、１９９０年に人から単離された流行菌株No.００８の培養形態学的特徴の安定化及び弱毒化に基づいて直接選択することにより得られたカンジダ・アルビカンス株ＤＳＭ No.９６５６に関する。
カンジダ・アルビカンス株ＤＳＭ No.９６５６の生物学的性質を表１に記載する。
カンジダ・アルビカンス株ＤＳＭ No.９６５６は、集団安定性、栄養培地に長時間通過させることによる形態学的特徴及び毒性の低い流行菌株と異なる。本発明の抗原製剤の調製法の教示に従い、本発明の非常に効果的かつ安全な抗原製剤がこの菌株から調製される。
当業者は、本発明が目的を行うために及び言及された結果及び利点並びにその中の固有のものを行うために十分に修正されることを容易に理解するであろう。本明細書に記載された化合物、方法及び技術は、現在代表的な好適実施態様であり、例示するものであり、かつ範囲を限定するものではない。
これまで本発明を一般的に記載してきたが、具体的な説明によって示されかつ本発明を限定するものではない下記の実施例によって本発明がより容易に理解されるであろう。
【実施例】
【００２２】
全ての実施例について、３０００〜３５００ｇの遠心力で約３０〜５０分間遠心分離を行った。培地をOxoid(Unipath GmbH，Am Lippeglacis 6-8，46483 Wesel,ドイツ)又はServa（Serva Feinbiochemica GmbH & Co．KG，Carl-Benz-Str．7，69115 Heidelberg，ドイツ）から購入した。特にことわらない限り、真菌をOxoidカタログ“5．aktualisierte deutsche Ausgabe”又は欧州特許第0564 620号に記載されているように培養した。本発明の抗原製剤の調製に用いられる真菌株は、N.V．Mazkevitch，1981，“Spontannaja ismentchivost ikariologia nesovershennich gibov”，Isdatelstwo Nauka，モスクワ; 及びIvanova，L.G.，1992，“Sistematika，morphologitcheskaja charakteristika，biologitcheskii svojstva vosbuditelej dermatophitosov，obshih dljagivotnih i tcheloveka”，モスクワ，モスクワ大学図書館に記載されるように真菌株の選択及び弱毒化によって得られた。哺乳動物の細胞培養物の基本的培養技術は、Doyle，Griffiths & Newell(Eds.)，Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures，John Wiley & Sons(1995)に容易に見出される。ケラチノサイト分析については、ＨａＣａＴ細胞を用いた(Boukampら，(1988)，J．Cell Biol.，106，p.761-771，Ryleら(1989)，Differentiation，40，p.42-54)。単離したケラチノサイト又は他のケラチノサイト系も用いられる。ウマリンパ球は、Friemel，H.，“Immunologische Arbeitsmethoden”，publ．VEB Gustav Fischer Verlag，Jena，1984; 又はPaul，E.，“Fundamental Immunology”，publ．Raven Press,ニューヨーク，1984に記載されるように単離及び培養した。ラジオアッセイは、実質的にBoehnckeら，1994，Scand．J．Immunol．39，p.327-332及びその中に引用された文献に記載されるように行った。ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＨＣｌ及び酢酸を水溶液として調製した。特にことわらない限り、可溶性という用語は水溶液中の溶解性を意味する。下記の実験に用いられる生理的に許容しうる担体は、例えば、担体Ａ: 0.85％(w/v)ＮａＣｌを含む水溶液; 担体Ｂ: ５％(w/v)グルコース、0.3％(w/v)肉エキス“lab lemco”(Oxoid)及び0.1％(w/v)酵母エキス(Oxoid)を含む水溶液; 担体Ｃ: 培養液 RPMI 1640(Serva)である。
【００２３】
実施例１
多糖及び／又は糖ペプチドを含む可溶性抗原物質（ＡＳＭＰ）を、トリコフィトン・メンタグロフィテス（ＡＳＭＰ−ＴＭ）、ミクロスポルム・ジプセウム（ＡＳＭＰ−ＭＧ）又はカンジダ・アルビカンス（ＡＳＭＰ−ＣＡ）から下記の手順に従って調製した。
真菌を欧州特許第0564620号に記載されるように寒天平板上で培養した。真菌バイオマスを取り上げ、下記のものを生産した。
Ｉ．ＡＳＭＰ−ＴＭ：
（ｉ）トリコフィトン・メンタグロフィテスバイオマスを4.5％(w/v)ＮａＯＨで約１４０℃において１時間処理し、続いて４５分間遠心分離した。上清に４M酢酸溶液を最終ｐＨが3.5になるまで加えた。２時間後、沈降物を遠心分離で分離し、３容量のエタノールを１容量の上清に加えた。アルコール沈殿から得られた沈降物を遠心分離で沈降させ、蒸留水に溶解した。最後に個々のＡＳＭＰ製剤を凍結乾燥した。
（ii）トリコフィトン・メンタグロフィテスバイオマスを0.2％(w/v)ＫＯＨで約１４０℃において１時間処理し、続いて遠心分離した。上清を１M ＨＣｌ溶液で最終ｐＨが3.5になるまで４〜1０℃で４時間処理した。次に、沈降物を遠心分離で分離し、２容量のエタノールを１容量の上清に加えた。アルコール沈殿から得られた沈降物を遠心分離で沈降させ、蒸留水に溶解した。最後に個々のＡＳＭＰ製剤を凍結乾燥した。
【００２４】
ＩＩ．ＡＳＭＰ−ＭＧ：
（ｉ）ミクロスポルム・ジプセウムバイオマスを0.2％(w/v)ＮａＯＨで約１４０℃において２時間処理し、続いて遠心分離した。沈降物を再び0.2％（w/v）ＮａＯＨで約１４０℃において２時間処理し、続いて遠心分離し、この手順を３回繰り返した。次に、最後の上清を８M酢酸溶液で最終ｐＨが3.5になるまで１８〜２０℃で３時間処理した。次に、沈降物を遠心分離で分離し、３容量のエタノールを１容量の上清に加えた。アルコール沈殿から得られた沈降物を遠心分離で沈降させ、蒸留水に溶解した。最後に個々のＡＳＭＰ製剤を凍結乾燥した。
（ii）ミクロスポルム・ジプセウムバイオマスを３％(w/v)ＫＯＨで約７５℃において６時間処理し、続いて遠心分離した。沈降物を再び３％(w/v)ＫＯＨで約７５℃において６時間処理し、続いて遠心分離した。次に、上清を0.5M ＨＣｌ溶液で最終ｐＨが3.5になるまで４〜１０℃で４時間処理した。次に、沈降物を遠心分離で分離し、３容量のメタノールを１容量の上清に加えた。アルコール沈殿から得られた沈降物を遠心分離で沈降させ、蒸留水に溶解した。最後に個々のＡＳＭＰ製剤を凍結乾燥した。
ＩＩＩ．ＡＳＭＰ−ＣＡ：
（ｉ）カンジダ・アルビカンスバイオマスを3.0％(w/v)ＮａＯＨで約７５℃において６時間処理し、続いて遠心分離した。沈降物を再び3.0％(w/v)ＮａＯＨで約７５℃において６時間処理し、続いて遠心分離し、次に、最後の上清を１２M酢酸溶液で最終ｐＨが3.5になるまで４〜１０℃で２時間処理した。次に、沈降物を遠心分離で分離し、２容量のメタノールを１容量の上清に加えた。アルコール沈殿から得られた沈降物を遠心分離で沈降させ、蒸留水に溶解した。最後に個々のＡＳＭＰ製剤を凍結乾燥した。
（ii）カンジダ・アルビカンスバイオマスを4.5％(w/v)ＫＯＨで約３５℃において３時間処理し、続いて遠心分離した。沈降物を再び4.5％(w/v)ＮａＯＨで約３５℃において３時間処理し、続いて遠心分離し、この手順を３回繰り返した。次に、最後の上清を0.25M ＨＣｌ溶液で最終ｐＨが3.5になるまで１８〜２０℃で４時間処理した。次に、沈降物を遠心分離で分離し、２容量のエタノールを１容量の上清に加えた。アルコール沈殿から得られた沈降物を遠心分離で沈降させ、蒸留水に溶解した。最後に個々のＡＳＭＰ製剤を凍結乾燥した。
【００２５】
実施例２
多糖及び／又は糖ペプチドを含む不溶性抗原物質（ＡＮＭＰ）を、トリコフィトン・メンタグロフィテス（ＡＮＭＰ−ＴＭ）、ミクロスポルム・ジプセウム（ＡＮＭＰ−ＭＧ）又はカンジダ・アルビカンス（ＡＮＭＰ−ＣＡ）から下記の手順に従って調製した。
真菌を欧州特許第0564620号に記載されるように寒天平板上で培養した。真菌バイオマスを取り上げ、下記のものを生産した。
Ｉ．ＡＮＭＰ−ＴＭ：
（ｉ）トリコフィトン・メンタグロフィテスバイオマスを0.2％(w/v)ＮａＯＨで約３５℃において２４時間処理し、続いて遠心分離した。沈降物を0.3M酢酸で約６０℃において約３時間処理し、蒸留水で５回洗浄した。各々洗浄工程に続いて遠心分離した。最後の沈降物を0.85％(w/v)ＮａＣｌ水溶液（担体Ａ）に最終濃度0.5％(w/v)ＡＮＭＰ−ＴＭまで懸濁した。ＡＮＭＰ−ＴＭ製剤を２〜１０℃で浮遊液として貯蔵した。
（ii）トリコフィトン・メンタグロフィテスバイオマスを0.2％(w/v)ＫＯＨで約３５℃において２４時間処理し、続いて遠心分離した。沈降物を0.1M ＨＣｌで約７０℃において約３０分間処理し、蒸留水で５回洗浄した。各々洗浄工程に続いて遠心分離した。最後の沈降物をRPMI 1640(担体Ｃ)に最終濃度1.5％(v/v)ＡＮＭＰ−ＴＭまで懸濁した。ＡＮＭＰ−ＴＭ製剤を２〜１０℃で浮遊液として貯蔵した。
【００２６】
ＩＩ．ＡＮＭＰ−ＭＧ：
（ｉ）ミクロスポルム・ジプセウムバイオマスを３％(w/v)ＮａＯＨで約７５℃において６時間処理し、続いて遠心分離した。沈降物を再び３％(w/v)ＮａＯＨで約７５℃において６時間処理し、続いて遠心分離した。得られた沈降物を0.7M酢酸で約６０℃において約４時間処理し、蒸留水で５回洗浄した。各々洗浄工程に続いて遠心分離した。最後の沈降物を５％(w/v)グルコース、0.1％（w/v）酵母エキス（Oxoid製）及び0.3％(w/v)肉エキス“lab lemco”(Oxoid製)を含む水溶液（担体Ｂ）に最終濃度2.5％(v/v)ＡＮＭＰ−ＭＧまで懸濁した。ＡＮＭＰ−ＭＧ製剤を２〜１０℃で浮遊液として貯蔵した。
（ii）ミクロスポルム・ジプセウムバイオマスを３％(w/v)ＫＯＨで約３５℃において３時間処理し、続いて遠心分離した。沈降物を再び３％(w/v)ＫＯＨで約３５℃において３時間処理し、続いて遠心分離し、この手順を３回繰り返した。得られた沈降物を0.5M ＨＣｌで約８０℃において約３０分間処理し、蒸留水で５回洗浄した。各々洗浄工程に続いて遠心分離した。最後の沈降物をRPMI1640(担体Ｃ)に最終濃度2.0％(v/v)ＡＮＭＰ−ＭＧまで懸濁した。ＡＮＭＰ−ＭＧ製剤を２〜１０℃で浮遊液として貯蔵した。
ＩＩＩ．ＡＮＭＰ−ＣＡ：
（ｉ）カンジダ・アルビカンスバイオマスを4.5％(w/v)ＮａＯＨで約１４０℃において２時間処理し、続いて遠心分離した。沈降物を再び4.5％(w/v)ＮａＯＨで約１４０℃において２時間処理し、続いて遠心分離し、この手順を３回繰り返した。得られた沈降物を１M酢酸で約６０℃において１時間処理し、蒸留水で５回洗浄した。各々洗浄工程に続いて遠心分離した。最後の沈降物を0.85％(w/v)ＮａＣｌ水溶液（担体Ａ）に最終濃度1.5％(v/v)ＡＮＭＰ−ＣＡまで懸濁した。ＡＮＭＰ−ＣＡ製剤を２〜１０℃で浮遊液として貯蔵した。
（ii）カンジダ・アルビカンスバイオマスを4.5％(w/v)ＫＯＨで約１４０℃において２時間処理し、続いて遠心分離した。沈降物を再び4.5％(w/v)ＮａＯＨで約１４０℃において２時間処理し、得られた沈降物を0.1M ＨＣｌで約１００℃において約３０分間処理し、蒸留水で５回洗浄した。各々洗浄工程に続いて遠心分離した。最後の沈降物をRPMI 1640(担体Ｃ)に最終濃度2.5％(v/v)ＡＮＭＰ−ＣＡまで懸濁した。ＡＮＭＰ−ＣＡ製剤を２〜１０℃で浮遊液として貯蔵した。
【００２７】
実施例３
多糖及び／又は糖ペプチドを含む外因性抗原物質（ＡＥＭＰ）を、トリコフィトン・メンタグロフィテス（ＡＥＭＰ−ＴＭ）、ミクロスポルム・ジプセウム（ＡＥＭＰ−ＭＧ）又はカンジダ・アルビカンス（ＡＥＭＰ−ＣＡ）の液体培養液から調製した。その液体培養液を実質的に欧州特許第0564620号に記載される条件下で培養した。個々のＡＥＭＰ製剤を下記の手順に従って得た。
Ｉ．ＡＥＭＰ−ＴＭ:トリコフィトン・メタグロフィテスを１０００mlの蒸留水中２６℃で２４０時間インキュベートした。次に、約1.2×１０8細胞／mlを含有する培養物を遠心分離した。上清を凍結乾燥し、１００mlの蒸留水に溶解し、３容量のメタノールを加え、沈殿を水溶液に溶解した。上清を凍結乾燥し、ＡＥＭＰ−ＴＭを得た。
ＩＩ．ＡＥＭＰ−ＭＧ:ミクロスポルム・ジプセウムを２００mlの担体Ｃ(RPMI 1640培養液 Serva製)中２８℃で５０時間培養した。約３×１０7細胞／mlを含有する培養物を遠心分離した。上清を凍結乾燥し、２０mlの蒸留水に溶解し、２容量のメタノールを加え、沈殿を水溶液に溶解した。上清を凍結乾燥し、ＡＥＭＰ−ＭＧを得た。
ＩＩＩ．ＡＥＭＰ−ＣＡ: カンジダ・アルビカンスを８００mlの担体Ｂ（１％(w/v)肉エキスlab-lemco Oxoid製、0.1％(w/v)酵母エキスOxoid製及び５％(w/v)デキストロース）中で３７℃で３０時間培養した。約１０8細胞／mlを含有する培養物を遠心分離した。上清を凍結乾燥し、少量の蒸留水に溶解し、２容量のメタノールを加え、沈殿を水溶液に溶解した。上清を凍結乾燥し、ＡＥＭＰ−ＣＡを得た。
【００２８】
実施例４
ケラチノサイト細胞培養物（ＨａＣａｔ細胞培養物）の増殖に対する種々の抗原製剤の影響を求めた。
Ｉ．抗原画分トリコフィトン・メタグロフィテス DSM No.7279から調製したＡＳＭＰ−ＴＭ、ＡＮＭＰ−ＴＭ及びＡＥＭＰ−ＴＭ、ミクロスポルム・ジプセウム DSM No.7274から調製したＡＳＭＰ−ＭＧ、ＡＮＭＰ−ＭＧ及びＡＥＭＰ−ＭＧ及びカンジダ・アルビカンス DSM No.9656から調製したＡＳＭＰ−ＣＡ、ＡＮＭＰ−ＣＡ及びＡＥＭＰ−ＣＡを種々の濃度で用いた。実施例２に従って調製されるＡＮＭＰ画分を凍結乾燥し、ＰＢＳ（リン酸塩濃度6.7mMのリン酸塩緩衝食塩水、生理的ｐＨ約7.2；Servaから購入、カタログNo.17-516）に懸濁した。
培養については、Falcon製１２ウェル組織培養プレート(平底、表面積9.6cm2)を用いた。各ウェルに約１×１０6細胞／ml栄養培地(１０％(w/v)ウシ胎仔血清で補足したRPMI 1640)の0.15mlのケラチノサイト細胞浮遊液（ＨａＣａｔ細胞）、２mlの栄養培地、及びＰＢＳに溶解した0.02〜0.1mlの抗原画分を加えた。対照ウェルに抗原画分物質を加えた。５％(v/v)ＣＯ2と３７℃の温度で約４８時間対照ウェルに集密的単層が生じるまで培養した。
抗原画分で処理した細胞シートの面積の大きさを比較することにより抗原画分で処理しなかった対照（対照＝１００％）と比べた細胞増殖の阻止を求めた。結果を表２及び３に示す。
細胞増殖の阻止は、ＡＳＭＰ−ＭＧ濃度0.1mg/ml、ＡＳＭＰ−ＴＭ濃度0.3mg/ml及びＡＳＭＰ−ＣＡ濃度１mg/mlで認められた。ＡＮＭＰ（ＭＧ、ＴＭ及びＣＡ）については、１mg/mlの濃度で阻止が認められた。ＡＥＭＰ−ＭＧについては、0.3mg/mlの濃度で細胞増殖の阻止が認められ、ＡＥＭＰ−ＣＡについては１mg/mlの濃度であった。
【００２９】
実施例５
ウマリンパ球の細胞増殖に対する種々の抗原製剤の影響を求めた。
抗原画分真菌株T.メタグロフィテス DSM No.7279、M.ジプセウム DSM No.7274;及びC.アルビカンス DSM No.9656のＡＳＭＰ及びＡＥＭＰを用いた。約40 000細胞のリンパ球（Icelandic horses製）／ml栄養培地の浮遊液を調製した。栄養培地 RPMI 1640を１０％(w/v)ウシ胎仔血清で補足した。リンパ球の培養を９６ウェルU-底組織培養プレート(Falcon No.3077)で行った。２００μlの細胞浮遊液を各ウェルに分注し、ＰＢＳに溶解した２０μlの抗原画分を加えた。対照は抗原画分物質を加えずに行った。
組織培養プレートを５％(v/v)ＣＯ2と３７℃で７２時間インキュベートした。
次に、栄養培地を変え、Ｈ3-チミジン含有溶液（１μl/ウェル）を加えた。第２培養工程を１２時間行い、培養物をＰＢＳで洗浄した。細胞増殖を、Boehnckeら，1994，Scand．J．Immunol．39，p.327-332に記載されるラジオアッセイ法で求めた。試験培養物と抗原画分材料に曝露しなかった対照とを比べて細胞増殖を測定した。対照値を１００％として定義した。結果を表４に示す。個々の抗原画分はいずれもリンパ球細胞増殖に対して阻止又は刺激作用があった。
【００３０】
実施例６
本実施例は、典型的な複合体製剤を示すものである。本実施例に記載された複合体（１〜５）は、トリコフィトン・メンタグロフィテス DSM No.7279、ミクロスポルム・ジプセウム DSM No.7274又はカンジダ・アルビカンス DSM No.9656から調製したものである。
Ｉ．複合体１は、下記の例においては、適当な担体中にＡＳＭＰ−ＴＭ、ＡＳＭＰ−ＭＧ及びＡＳＭＰ−ＣＡを含む。
【００３１】
【表２】
2008266352.tif 000003
複合体1.1は、下記の例においては、適当な担体中にＡＳＭＰ−ＭＧ及びＡＳＭＰ−ＣＡを含む。
【００３２】
【表３】
2008266352.tif 000004
ＩＩ．複合体２は、下記の例においては、適当な担体中ＡＮＭＰ−ＴＭ、ＡＮＭＰ−ＭＧ及びＡＮＭＰ−ＣＡを含む。
【００３３】
【表４】
2008266352.tif 000005
ＩＩＩ．複合体３は、下記の例においては、適当な担体中にＡＥＭＰ−ＴＭ、ＡＥＭＰ−ＭＧ及びＡＥＭＰ−ＣＡを含む。
【００３４】
【表５】
2008266352.tif 000006
ＩＶ．複合体４は、下記の例においては、適当な担体中にＡＮＭＰ及びＡＥＭＰを含む。
（i）複合体
4.1 ANMP-CA9656 2.5%(v/v)
AEMP-TM7279 7.1mg/ml
担体Ａ又はＢ又はＣ中
【００３５】
【表６】
2008266352.tif 000007
Ｖ．複合体５は、下記の例においては、適当な担体中にＡＳＭＰ及びＡＮＭＰを含む。
【００３６】
【表７】
2008266352.tif 000008
【００３７】
実施例７
種々の抗原製剤の安全性を、動物モデル系（ホワイト系マウス、モルモット及びウマ）におけるワクチン注射実験で試験した。
抗原画分を、トリコフィトン・メンタグロフィテス DSM No.7279、ミクロスポルム・ジプセウム DSM No.7274又はカンジダ・アルビカンス DSM No.9656から実施例１〜３に記載されるように調製した。
ワクチン注射した動物の状態に関して下記の臨床的観察を各ワクチン注射の５日後まで毎日行った。
１．全身状態
‐食欲
‐歩行に対する影響
２．局所反応
‐注射部位の浮腫及び炎症
‐注射部位の温度変化
‐注射部位の痛みの発生
‐注射部位を薬剤で治療する必要性
Ｉ．抗原製剤を、ホワイト系マウスの腹内及びモルモットの皮下に１０日の間隔で１又は２回注射した。抗原製剤、濃度及び結果を表５及び表６（Ａ及びＢ）に示す。単一又は複合製剤としての真菌抗原の皮下又は腹内注射は、動物の全身状態にほとんど悪影響を及ぼさず、注射部位の局所反応は認められなかった。
ＩＩ．実施例６に記載される真菌抗原の複合製剤を同じウマの異なる場所（首の左右）及び胸筋の一方に各々１回筋肉内に注射した。３頭の異なるウマに（ｉ）妊馬、（ii）仔馬、年齢７〜８ヵ月及び(iii)牡馬、年齢６歳にワクチン注射した。抗原製剤、濃度及び結果を表７に示す。
真菌抗原の複合製剤としての筋肉内注射は、ウマの全身状態に影響を及ぼさず、注射部位の局所反応は認められなかった。これらの実験から、本発明の抗原製剤の優れた安全性が示される。
【００３８】
実施例８
皮膚と毛の状態に対する種々の抗原製剤の影響を、ホワイト系マウスで実験した。
抗原製剤を、トリコフィトン・メンタグロフィテス DSM No.7279、ミクロスポルム・ジプセウム DSM No.7274又はカンジダ・アルビカンス DSM No.9656から実施例１〜３及び６に記載されるように調製した。
抗原製剤を、ホワイト系マウスの腹内に１０日の間隔で２回注射した。皮膚と毛の状態の観察を５日間続けた。抗原製剤、濃度及び結果を表８に示す。抗原製剤を注射するとホワイト系マウスの皮膚と毛の状態が皮膚炎を罹患した対照マウスに比べて回復した。
【００３９】
実施例９
３種類の異なる抗原製剤の効能を、プラセボ試験においてサマー湿疹に罹患したアイスランド産ウマにワクチン注射することにより実験した。
抗原製剤を、T.メンタグロフィテス DSM No.7279、M.ジプセウム DSM No.7274及びカンジダ・アルビカンス DSM No.9656から実施例１〜３及び６に記載されるように調製した。個々の抗原製剤を含む担体Ａの１ml容量を筋肉内に３回注射した。各々の注射の間隔は５日とした。胸筋の左右に注射を交互に投与した。抗原製剤、濃度及び結果を表９と１０に示す。
ＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４、ＡＳＭＰ−ＴＭ７２７９及びＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６を含む抗原製剤を投与すると３回目の注射の４週間後にワクチン注射したウマ（３）全頭の完全な治癒がもたらされた。対照群（抗原を含まない担体Ａの注射）のウマは回復の徴候を示さなかった。
【００４０】
実施例１０
３種類の異なる抗原製剤の安全性を、プラセボ試験においてサマー湿疹に罹患したアイスランド産ウマにワクチン注射することにより実験した。
抗原製剤を、T.メンタグロフィテス DSM No.7279、M.ジプセウム DSM No.7274及びカンジダ・アルビカンス DSM No.9656から実施例１〜３及び６に記載されるように調製した。個々の抗原製剤を含む担体Ａの１ml容量を筋肉内に３回注射した。各々の注射の間隔は５日とした。胸筋の左右に注射を交互に投与した。各々の注射後３日以内に副作用がウマに認められた。抗原製剤、濃度及び結果を表１１に示す。熱又は食欲不振のような全身の副作用は認められなかった。抗原製剤の１つだけ注射部位の腫脹を引き起こした。この危険を伴わない副作用は、１頭にのみ認められた。痛みの徴候は認められなかった。
【００４１】
実施例１１
単一画分、ＡＳＭＰ−ＴＭ７２７９、ＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４及びＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６並びにＡＳＭＰ−ＴＭ７２７９、ＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４及びＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６を含む複合体１の抗アレルギー効能を実験動物モデルで実験した。
単一画分を、実施例１に従って調製した。複合体１は実施例１及び６に従って調製した。
ＣＦ−１マウスを、マウス耳腫脹試験のモデルと説明書に従って感作した(GadSC，Dimm BK，Dobbs DW，Reilly C，Walsh RD: Development and Validation ofan Alternative Dermal Sensitization Test: The Mouse Ear Swelling Test(MEST)．Toxicology & Applied Pharmacology 84，93-114，1986)。これは、アレルギー物質を試験するよく知られ、有効性のある及びＯＥＣＤが承認した試験である。実験動物における抗アレルギー効力について複合体又は単一画分の効能を証明するために、アレルゲンによって引き起こされる耳腫脹は予防されなければならない。マウス及び２種類の異なるアレルゲンを用いてプラセボ盲検法を行った。
アレルゲンに対して最も感受性のあるＣＦ−１を用いてＭＥＳＴを行った。生後６〜１０週のＣＲ−１マウスを、腹部皮膚を剃毛し、0.05mlのフロインドアジュバントを注射し、一方の試験で１００μlのアレルゲン１−クロロ-2,4−ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）及び他方の試験でダニアレルゲンを剃毛した腹部皮膚に０〜４日局所投与することにより調製した。７日後、２０μlのアレルゲンを試験の耳に、溶解液を対照の耳に局所投与した。２４及び４８時間後に耳の厚さを測定した。同じ手順を対照グループで行い、複合体、複合体の各画分の代わりにプラセボで処理した。
単一画分、ＡＳＭＰ−ＴＭ７２７９、ＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４及びＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６並びにＡＳＭＰ−ＴＭ７２７９、ＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４及びＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６を含む複合体１を投与するとダニアレルゲンで感作した後に耳腫脹が９０％減少し、抗原投与の４８時間後ＤＮＣＢで感作した後の耳腫脹が87.5％減少した。
【００４２】
実施例１２
実施例１に記載されるように調製した、抗原製剤ＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４及びＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６を含む複合体製剤の効能を、サマー湿疹に罹患したアイスランド産ウマにワクチン注射することにより証明した。
0.2mgのＭＧ及び0.2mgのＣＡを含む0.4ml容量の担体Ａを３回各々の注射の間隔を５日として皮内注射すると、臨床症状の著しい減少によって証明されるように最後の注射の３週間後にワクチン注射したウマが治癒した。
実施例１３
ミクロスポルム・ジプセウム DSM No.7274から実施例１に記載されるように調製した抗原製剤の効能を、第４と第５足指間の皮膚に炎症、かゆみ及びびらんのある湿疹に罹っている４１歳の男性にワクチン注射することにより証明した。
0.4mgのＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４を含む0.1ml容量の担体Ａを１回だけ皮内注射した。皮膚は、治療の４〜５日後に正常に回復した。
注射の２４時間後にかゆみは消失していた。重い副作用は認められなかった。
【００４３】
実施例１４
カンジダ・アルビカンス DSM No.9656から実施例１（ＡＳＭＰ）に記載されるように調製した抗原製剤の神経皮膚炎の治療のための効能を証明した。
ＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６をProcter & Gambleから購入した“Kamill Hand und Nagelcreme”を用いてクリームに最終濃度６０mgＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６／mlクリームまで混合した。この製剤を両耳付近の皮膚に黄色のかさぶたのある神経皮膚炎に罹っている３歳の少女に局所適用した。そのクリームを１日１回皮膚の傷部分に局所適用した。この治療の後、皮膚は正常に回復した。副作用は認められなかった。
実施例１５
ミクロスポルム・ジプセウム DSM No.7274から実施例１（ＡＳＭＰ）に記載されるように調製した抗原製剤の湿疹の治療のための効能を証明した。
ＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４をProcter & Gambleから購入した“Kamill Hand und Nagelcreme”を用いてクリームに最終濃度６０mgＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４／mlクリームまで混合した。薬指に炎症、びらん及びかゆみのある湿疹に罹っている３０歳の男性の皮膚の罹患部分に１日１回３０日間局所適用することにより治療した。これにより、治療後に完全に治癒した。かゆみは、治療開始の数日後に消失していた。副作用は認められなかった。
【００４４】
実施例１６
ミクロスポルム・ジプセウム DSM No.7274、トリコフィトン・メンタグロフィテス DSM No.7279及びカンジダ・アルビカンス DSM No.9656から実施例１（ＡＳＭＰ）に記載されるように調製した抗原製剤の湿疹の治療のための効能を、冬毛が６月まで生えかわらなかった５歳のウマにワクチン注射することにより試験した。１５mgの各抗原製剤ＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４、ＡＳＭＰ−ＴＭ７２７９及びＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６（最終濃度４５mgＡＳＭＰ／ml）を含む１ml容量の担体Ａを５日間隔で３回筋肉内に注射した。これにより、１５日以内に正常な季節毛に完全にかわった。副作用は認められなかった。
実施例１７
ミクロスポルム・ジプセウム DSM No.7274、トリコフィトン・メンタグロフィテス DSM No.7279及びカンジダ・アルビカンス DSM No.9656から実施例１（ＡＳＭＰ）に記載されるように調製した複合抗原製剤の脱毛症の治療のための効能を証明した。
体全体に３〜５ヵ所と７〜１０ヵ所の脱毛症をもつ２頭の７歳のウマに１mlの担体Ａ中１０mgの各抗原製剤ＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４、ＡＳＭＰ−ＴＭ７２７９及びＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６（最終濃度３０mg/ml）を含むワクチンを注射した。ワクチンを５日間隔で３回筋肉内に注射した。これにより、最後の投与の１０日後に双方のウマの毛が完全に回復した。副作用は認められなかった。
【００４５】
実施例１８
ミクロスポルム・ジプセウム DSM No.7274、トリコフィトン・メンタグロフィテス DSM No.7279及びカンジダ・アルビカンス DSM No.9656から実施例１（ＡＳＭＰ）に記載されるように調製した複合抗原製剤のウマにおける脱毛症の治療のための効能を証明した。
体全体に１０〜１２ヵ所の脱毛症をもつ１０歳のウマに１mlの担体Ａ中１５mgの各抗原製剤ＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４、ＡＳＭＰ−ＴＭ７２７９及びＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６（最終濃度４５mg/ml）を含むワクチンを注射した。ワクチンを５日間隔で３回筋肉内に注射した。これにより、最後の投与の１５日後に双方のウマの毛が完全に回復した。副作用は認められなかった。
実施例１９
ミクロスポルム・ジプセウム DSM No.7274、トリコフィトン・メンタグロフィテス DSM No.7279及びカンジダ・アルビカンス DSM No.9656から実施例１（ＡＳＭＰ）に記載されるように調製した複合抗原製剤のイヌにおける脱毛症の治療のための効能を証明した。
体全体に１０〜１２ヵ所の脱毛症をもつ３歳の雌イヌに１mlの担体Ａ中１０mgの各抗原製剤ＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４、ＡＳＭＰ−ＴＭ７２７９及びＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６（最終濃度３０mg/ml）を含むワクチンを注射した。ワクチンを５日間隔で３回筋肉内に注射した。これにより、最後の投与の１５日後に毛が完全に回復した。副作用は認められなかった。
【００４６】
実施例２０
ミクロスポルム・ジプセウム DSM No.7274、トリコフィトン・メンタグロフィテス DSM No.7279及びカンジダ・アルビカンス DSM No.9656から実施例１（ＡＳＭＰ）に記載されるように調製した複合抗原製剤のイヌにおける脱毛症の治療のための効能を証明した。
体全体に２〜４ヵ所の脱毛症をもつ５歳と８歳の２匹の雄イヌに１mlの担体Ａ中１５mgの各抗原製剤ＡＳＭＰ−ＭＧ７２７４、ＡＳＭＰ−ＴＭ７２７９及びＡＳＭＰ−ＣＡ９６５６（最終濃度４５mg/ml）を含むワクチンを注射した。ワクチンを５日間隔で３回筋肉内に注射した。これにより、最後の投与の３０日後に毛が完全に回復した。副作用は認められなかった。
【００４７】
【表８】
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【００４８】
【表９】
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【００４９】
【表１０】
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【００５０】
【表１１】
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【００５１】
【表１２】
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【００５２】
【表１３】
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【００５３】
【表１４】
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【００５４】
【表１５】
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【００５５】
【表１６】
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【００５６】
【表１７】
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【００５７】
【表１８】
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【００５８】
【表１９】
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【００５９】
【表２０】
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【００６０】
図１〜図４に示されるＡＳＭＰ及びＡＥＭＰ画分のＮＭＲ実験は、下記に従って行われた。
スペクトルは、２５０MHZブルッカーデジタルＮＭＲ分光計(DRX 400型)により1Ｈ周波数400.13Ｍｃを用いてＤ2Ｏ中で得られた。掃引幅は14.5ppmであり、周囲温度は３００Ｋである。ケミカルシフトは、溶媒距離によって示される。
1Ｈ一次元標準スペクトルは、適切なブルッカーとプログラムを用いて得られた。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】TM 7279からの画分のＮＭＲを示す。
【図１Ｂ】TM 7279からの画分のＮＭＲを示す。
【図１Ｃ】TM 7279からの画分のＮＭＲを示す。
【図２】CA 9656からの画分のＮＭＲを示す。
【図３】TM 7279からの画分のＮＭＲを示す。
【図４】MG 7274からの画分のＮＭＲを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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