(57)【要約】【課題】  珪藻類を基板上に二次元的かつ密に培養する方法及び当該方法により珪藻類を培養した基板を提供すること。【解決手段】平坦な基板表面を有機分子で修飾し、当該基板に珪藻類を吸着させ、有機分子に吸着した珪藻類と浮遊している珪藻類とを、培地で洗浄することで分離させた後、有機分子上に吸着した珪藻類を適正温度下で培養することによる。【選択図】図１
2008136462.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面に珪藻類をニ次元的かつ密に培養する方法であって、
（１）珪藻類を基板に吸着させるために、基板を有機分子で表面修飾するステップ、
（２）前記表面修飾後に、珪藻類を基板上に吸着させ、有機分子上に吸着した珪藻類と浮遊している珪藻類とを分離するステップ、
（３）前記分離作業により、有機分子上に吸着した珪藻類だけを培養するステップ、
を含むことを特徴とする珪藻類の二次元的培養方法。
【請求項２】
基板表面に珪藻類をニ次元的かつ密に培養する方法であって、
（１）基板表面をシラン化するステップ、
（２）前記シラン化をした基板上に珪藻類を吸着させ、自己組織化膜上に吸着した珪藻類と浮遊した珪藻類とを培地による洗浄によって分離するステップ、
（３）前記洗浄による分離作業後、自己組織化膜上に吸着した珪藻類だけを培養するステップ、
を含むことを特徴とする珪藻類の二次元的培養方法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の培養方法により作製された培養基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、珪藻類の基板上における自己組織的培養方法に関し、特に、密に二次元的に培養する方法及びその培養基板に関する。
【背景技術】
【０００２】  珪藻類とは、淡水にも海水にも存在する単細胞の植物プランクトンで、地球上の酸素生産の２５％を担うともいわれる主要な光合成生物である。珪藻は特殊な形態の藻類で、細胞は全て二つの行李状に重なった殻に覆われ、外側の殻は上殻、内側の殻は下殻と呼ばれている。珪藻殻は多孔質なバイオガラスであることが知られている。珪藻類は、水中に浮遊する場合もあるが固体表面に付着する場合もある。例えば、塩化ビニール板上に付着・増殖する珪藻の分布と分散の様式について、（１）分裂するとともに活発に滑走をして分布を広げているもの、（２）滑走運動が不活発で密集した集落を形成するもの、（３）付着柄や盤状付着器によって強固に付着しながら増殖し、垂直方向に立体的な群体を形成するもの、の３種のパターンがみられることが知られている。【０００３】  従来、これら付着珪藻の増殖方法として、例えば、特開昭５９−５９１２９号公報には、日光のあたる海水中に、その表面に珪藻等を繁殖させることができる多数の穴や凹凸を設けたガラス質基板を漁礁構造体に装着してなる人工漁礁が開示されているが、この人工漁礁はナノメートルレベルで細胞吸着を制御する機能を有しない。また、この方法は人工漁礁上に繁殖させるのみで、当然珪藻は三次元で集積され、単位面積当たりの繁殖密度についても考慮がなされていない。【０００４】  珪藻類は海洋での炭素固定の４０％を担うとされる光合成生物であり、またその種類や数を観測することで生息場所である川や湖、海の水質評価ができる環境生物でもある。さらに、水中のケイ素を体内に取り込み、細胞の内側に珪藻殻（ｆｒｕｓｔｕｌｅ）と呼ばれるナノ多孔質ガラスを形成することもよく知られている。珪藻殻は珪藻土として地中に大量に埋蔵されてもいることから、濾過フィルター材料として、環境建材（塗り壁等）としてなど、工業的にも広く利用されてきた。【０００５】  一方、ナノテクノロジーの発展により、多孔質ナノ材料に注目が集まっている。珪藻殻についても、従来からの巨視的な手法による工業利用とは異なる、ナノテクノロジーを用いた新しい利用法の模索が始まっている。その一つとして、例えば、珪藻殻の多孔質ナノ構造を、ナノパターニングの型（テンプレート）として用いる、というアプローチがある。しかしながら、先行報告では珪藻殻を粉体として扱っており、二次元的に広い面としてナノ多孔質構造を活用した事例は報告がない。【０００６】  その他には、光合成微生物を用いたバイオリアクター素子として、基板上に微生物と寒天を混合して塗布する方法がある。しかし、この方法では細胞が二次元的に集積しておらず、また、寒天は無色透明とはいえず、光合成効率を最大化できる環境とは考えづらい。【０００７】  特開２００２−２７２３１０号公報には、珪藻類を海（湖）域に供給することによって、赤潮の発生を未然に防止する方法、珪藻類を所定海（湖）域に長期にわたって簡便かつ多量に供給するための珪藻類の生産装置や、かかる生産装置を用いる珪藻類の生産方法を提案しているが、これは珪藻類の剥取りと、露出基面での珪藻類の増殖を繰り返し行う方法である。また、特開２００６−００６２８１号公報には、細胞固定化基板ならびに細胞固定化方法について、細胞の成長や接着を制御するための化学物質等を予め基板に固定することなく、基板の任意の特定位置に細胞を固定化及び分離ができる方法が、特開２００４−５１５２３６号公報は、微生物培養装置およびその使用法について、装備された堆積した培地において、容易に微生物の培養ができる装置が提案されている。【０００８】
【特許文献１】特開２００２−２７２３１０号公報
【特許文献２】特開２００６−００６２８１号公報
【特許文献３】特開２００４−５１５２３６号公報
【特許文献４】特開昭５９−５９１２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  このように、いずれもなんら微細な範囲における集積具合、まして二次元的な培養や単位面積あたりの細胞の数を最大化に言及する報告ではない。また、特定の構造物に吸着させて増殖させる方法においても、ナノレベルで細胞増殖を制御する手段は講じられておらず、三次元的に増殖して集積された状態が出来上がるものであった。【００１０】  そこで本発明は、基板上にて珪藻類を二次元的かつ密に培養する方法及び当該培養方法によって珪藻類を培養させた基板を提案する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究する過程で、珪藻類を基板に吸着させるために、基板を有機分子で表面修飾し、基板に吸着した珪藻類の内、浮遊している珪藻類を除去して有機分子上の残った珪藻類を密に培養することで、基板上に珪藻類を二次元にかつ密に培養できる方法を見出した。【００１２】  具体的には、まず、珪藻類を吸着させるため、アミノシラン等
（７−Ｏｃｔｅｎｙｌｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ（ＯＴＣ），２−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｅｔｈｙｌ  ３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ（ＣＭＳ），３，３，３−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（ＦＰＳ），３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（ＡＰＳ），）の有機分子でシラン化によって表面修飾したガラス基板に海洋産珪藻Ｎａｖｉｃｕｌａｒ  ｓｐ．を吸着させ、２０℃の培地中で一晩おいて、当該基板を培地が満たしてあるシャーレに漬け洗いして洗浄した。その後、洗浄してもとれなかった自己組織化膜上に吸着している珪藻類をそのまま２０℃の培地中で培養を続けることで、基板上で珪藻類を二次元的かつ密に増殖できた。
【発明の効果】
【００１３】  本発明によれば、珪藻類を基板上に二次元的かつ密に培養する方法及び当該方法により珪藻類を培養した基板を提供できる。なお、ここで「二次元的」とは、珪藻類が上下に集積することなく、前後左右平面的な広がりで培養される培養される様を表し、「密に」とは、単位面積当たりの珪藻類の数を最大にすることをいう。
【実施例】
【００１４】  以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
（実施例１）
本発明では、まず、珪藻類を吸着させるため、アミノシラン等
（７−Ｏｃｔｅｎｙｌｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ（ＯＴＣ），２−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｅｔｈｙｌ  ３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ（ＣＭＳ），３，３，３−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（ＦＰＳ），３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（ＡＰＳ），）で平坦な基板表面にシラン化によって共有結合で自己組織化膜を作製した。次に表面修飾したガラス基板に海洋産珪藻Ｎａｖｉｃｕｌａｒ  ｓｐ．を自己組織化膜表面に吸着して２０℃の培地中で一晩おいた後、当該基板を培地が満たしてあるシャーレに漬け洗いして洗浄した。その後、洗浄してもとれなかった自己組織化膜上に吸着している珪藻を、そのまま２０℃の培地中で培養を続けることで、基板上で珪藻を集積することなく二次元的かつ密に増殖する。この時、基板上にだけ増殖がみられた。【００１５】なお、メチルシランを用いた場合は、密に増殖させることができなかった。また、吸着後に洗浄しなかった場合はどの表面修飾を用いても密には生えず（図２（写真）参照）、基板以外の培地中にも増殖してしまった。【００１６】（実施例２）
本発明による珪藻類の二次元的培養によって一様に基板上に並んだ珪藻類に着目し、珪藻殼の多孔質ナノ構造を、ナノパターニングの型（テンプレート）として用いる方法が以下の手順によって可能である。
（１）雲母等の平坦な基板上を化学修飾する。
（２）珪藻類を基板上で培養し、２次元的に生きた珪藻を配列させる。
（３）適切な温度で焼成し、珪藻の有機部分を除去して珪藻殻だけを残し、ナノ多孔質ガラスによるテンプレートを作製する。【００１７】（実施例３）
上記ナノ多孔質ガラステンプレートを用い、ナノ多孔質電極の作製も可能である。すなわち、材料科学的手法を駆使して、センチメートル以上の大きさと数十ｎｍ以下のナノ多孔質構造を持つ電極の作製に応用される。これにより、全体としてセンチメートルサイズの大きさを持ち、かつ数ナノメートルから数百ナノメートル周期の多孔質構造を持つ、ナノ多孔質電極が作製できることが期待される。【００１８】（実施例４）
水環境中の様々な要因で発生・消滅する珪藻類の特性をいかして、本培養方法によって作製された基板を水環境調査用の試料（バイオデバイス）として活用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】基面上での珪藻類の培養手順を説明するイメージ図である。
【図２】アミノシランで表画修飾した基板上でのＮａｖｉｃｕｌａｒ  ｓｐ．の培養具合の図である。
【図１】
2008136462.tif 000003
【図２】
2008136462.tif 000004