(57)【要約】【課題】マイクロチップを用いても非特異的増幅が生じることのない、少量の試料を簡便に増幅できる核酸増幅法の提供。【解決手段】試料導入部、反応部、および該反応部と該試料導入部とを結ぶ流路を有するマイクロチップにおいて核酸増幅を行う方法であって、増幅反応中に反応溶液が蒸発することを防止する手段を用いることを特徴とする核酸増幅方法、および、増幅反応中に反応溶液が蒸発することを防止する手段を備えた、試料導入部、反応部、および該反応部と該試料導入部とを結ぶ流路を有するマイクロチップ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料導入部、反応部、および該反応部と該試料導入部とを結ぶ流路を有するマイクロチップを用いて核酸増幅を行う方法であって、増幅反応中の反応溶液の蒸発を防止する手段を用いることを特徴とする、核酸増幅方法。
【請求項２】
増幅反応中の反応溶液の蒸発を防止することにより、増幅反応中のプライマー濃度を１０μＭ以下に維持することを特徴とする、請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
核酸増幅反応が等温増幅法で行われることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
等温増幅法による核酸増幅反応が６５℃以下の温度で行われることを特徴とする請求項３に記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
試料導入部、反応部、および該反応部と該試料導入部とを結ぶ流路を有し、核酸を含む試料が蒸発することを防止する手段を備えたマイクロチップ。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸増幅方法を用いて核酸増幅を行う核酸増幅システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロチップを用いた核酸増幅方法およびそれに用いるマイクロチップ、それを用いた核酸増幅システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微小な流路、すなわちマイクロスケールの流路を有するマイクロチップ（マイクロケミカルデバイス、マイクロリアクターともいう）は、微量検体中の微量成分の分析方法として、近年注目されている。
等価直径１ｍｍ以下の流路（チャンネル）をもつ微小ケミカルデバイスであるマイクロチップは、検体量を少なくできるという点、またデバイスを小型化できるという点から、迅速性、簡便性をも満足する新しい微量分析技術として脚光を浴びており、特に、血液や、尿、組織等に存在している微量成分の分析への応用が期待されている（例えば特許文献１）。
【０００３】
一方、微量な検体の遺伝情報を調べるために、核酸を増幅することが広く知られている。ＤＮＡやＲＮＡといった遺伝子を取り扱う上で核酸の増幅が行われている。核酸を増幅する際は、ＰＣＲ法のように指数関数的に増幅する方法が一般的であるため、得られる核酸の配列が元の核酸の配列と正確に一致することが求められる。
しかしながら、核酸増幅反応において、非特異的な反応も生じることが知られており、その改善が試みられている（例えば特許文献２）。
【特許文献１】特開２００１−２５８８６８号公報
【特許文献２】特表２００３-５２５０５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本願発明者らは、微量な検体からの容易な核酸増幅を達成するため、微小な反応系を有するマイクロチップを用いて核酸増幅を行うことを検討した。
しかしながら、マイクロチップ内で核酸増幅反応を行ったところ、驚くべきことに核酸の非特異的増幅が生じることがわかり、その対策が新たに求められた。
即ち、本発明の目的は、マイクロチップを用いても非特異的増幅が生じることのない核酸増幅法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題が生じる原因を検討した結果、増幅反応中に反応溶液が蒸発することが核酸の非特異的増幅と関係することを見出した。そして、増幅反応中に反応溶液が蒸発することを防止する手段を用いることにより、上記課題が達成されることが判明した。
即ち、本発明は下記構成よりなる。
【０００６】
＜１＞
試料導入部、反応部、および該反応部と該試料導入部とを結ぶ流路を有するマイクロチップを用いて核酸増幅を行う方法であって、増幅反応中の反応溶液の蒸発を防止する手段を用いることを特徴とする、核酸増幅方法。
＜２＞
増幅反応中の反応溶液の蒸発を防止することにより、増幅反応中のプライマー濃度を１０μＭ以下に維持することを特徴とする、上記＜１＞記載の核酸増幅方法。
＜３＞
核酸増幅反応が等温増幅法で行われることを特徴とする上記＜１＞または＜２＞に記載の核酸増幅方法。
＜４＞
等温増幅法による核酸増幅反応が６５℃以下の温度で行われることを特徴とする上記＜３＞に記載の核酸増幅方法。
＜５＞
試料導入部、反応部、および該反応部と該試料導入部とを結ぶ流路を有し、核酸を含む試料が蒸発することを防止する手段を備えたマイクロチップ。
＜６＞
上記１〜４のいずれかに記載の核酸増幅方法を用いて核酸増幅を行う核酸増幅システム。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、マイクロチップを用いても非特異的増幅が生じることのない核酸増幅法が提供される。これにより、より微量な検体から簡便な方法で短時間に正確な核酸増幅を行うことが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の核酸増幅方法は、試料導入部、反応部、および該反応部と該試料導入部とを結ぶ流路を有するマイクロチップにおいて核酸増幅を行う方法であって、増幅反応中に反応溶液が蒸発することを防止する手段を用いることを特徴とする。
また、本発明のマイクロチップは、試料導入部、反応部、および該反応部と該試料導入部とを結ぶ流路を有し、増幅反応中に反応溶液が蒸発することを防止する手段を備えていることを特徴とする。
【０００９】
＜核酸増幅＞
本発明において、マイクロチップ内にて核酸増幅を行うが、核酸の抽出、反応基質の添加などの反応系の準備や反応条件は、核酸増幅方法は従来の方法と同じ反応を用いることができる。
核酸増幅法としては、たとえば、ＰＣＲ法（特公平４−６７９６０号、特公平４−６７９５７号）、ＬＣＲ法（特開平５−２９３４号公報）、ＳＤＡ法（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：特開平５−１３０８７０号）、ＲＣＡ法（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ｖｏｌ．９２，４６４１−４６４５（１９９５））、ＩＣＡＮ法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ；Ｂｉｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，第１８巻、２号（２００１））、ＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ，３５０，９１〜（１９９１））、ＴＭＡ法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第３１巻、３２７０〜（１９９３））等が挙げられる。
【００１０】
核酸増幅法で最も一般的で普及している方法はＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）法である。ＰＣＲ法では、反応液の温度の上げ下げを周期的にコントロールすることにより、変性（核酸断片を２本鎖から１本鎖に変性する工程）→アニーリング（１本鎖に変性した核酸断片にプライマーをハイブイリダイズさせる工程）→ポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）伸長反応→ディネイチャーの周期的な工程を繰り返すことで、ターゲット核酸断片の目的部分を増幅する方法である。最終的に、ターゲット核酸断片の目的部位は初期量の１００万倍にも増幅し得る。
【００１１】
LCR法(特開平5-2934号)は、1本鎖DNAに2本の相補的なオリゴヌクレオチドプローブ鎖をend-to-tailに結合させて、耐熱性リガーゼで2本のオリゴヌクレオチド鎖間のニックを封じる。その結合したDNA鎖が熱変性で遊離し、また鋳型となり、増幅するという方法である。また、LCRを改良して、2つのプライマー間にギャップを設定し、その間をポリメラーゼで埋める方法（Gap-LCR：Nucleic Acids Research、第23巻、4号、675〜（1995））も開発されている。
【００１２】
SDA法（特開平5-130870号）は、エクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法であり、ポリメラーゼ伸長反応を利用したターゲット核酸断片の目的部位の増幅法の一つである。この方法はターゲット核酸断片の目的部位に特異的にハイブリダイゼーションしたプライマーを起点とした、ポリメラーゼ伸長反応とともに、５'→３'エクソヌクレアーゼを作用させて、プライマーを逆方向から分解する方法である。分解したプライマーの代わりに新たなプライマーがハイブリダイゼーションし、再度ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進行する。このポリメラーゼによる伸長反応と、この先に伸長した鎖を外すエクソヌクレーアゼによる分解反応が順次、周期的に繰り返される。ここで、ポリメラーゼによる伸長反応とエクソヌクレーアゼによる分解反応は等温条件で実施することが可能である。
【００１３】
LAMP法は、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。この方法は、ターゲット核酸断片の少なくとも6個所の特定部位を相補的に認識する少なくとも4種のプライマーと、5'→3'方向へのヌクレアーゼ活性がなく、かつ鋳型上の２本鎖DNAを１本鎖DNAとして遊離させながら伸長反応を触媒する鎖置換型のBst DNAポリメラーゼを使用することで、等温条件でターゲット核酸断片の目的部位を、特別な構造として増幅する方法である。
【００１４】
ICAN法も、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。RNA-DNAキメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性を有するDNAポリメラーゼ、RNaseHを用いる等温の遺伝子増幅方法である。キメラプライマーが鋳型と結合した後、DNAポリメラーゼにより相補鎖が合成される。その後,RNaseHがキメラプライマー由来のRNA部分を切断し、切断部分から鎖置換反応と鋳型交換反応を伴った伸長反応が起きるこの反応が繰り返し起こることにより遺伝子が増幅される。
【００１５】
いずれの増幅方法においても、非特異増幅は増幅産物を反応溶液に持ち込むことによるコンタミネーション、あるいは、同一もしくは異なるプライマー同士が二量体を形成することにより、これを起点に増幅が始まるといったことを原因に起こりうる。
【００１６】
そこで、プライマーがダイマーを形成しないように、プライマー配列を考慮して設計を行ったり、反応液中のプライマー濃度を高濃度にしすぎないようにする必要がある。プライマーの濃度はＰＣＲの場合、２本のプライマー合計で０．２〜１．０μＭが好ましく、ＬＡＭＰ法等の等温増幅の場合、全てのプライマーの合計で、４〜９μＭが好ましい。
【００１７】
等温増幅法の場合、反応効率を高めるため通常のＰＣＲよりも高濃度でプライマーを添加することが多い。そのため、増幅反応中に液の蒸発が起こることによりプライマーが濃縮され二量体を形成しやすくなっている。そこで、増幅反応中の液の蒸発を防止しプライマーが濃縮されないように工夫することは重要である。
【００１８】
また、核酸増幅に用いるその他の試薬も、ＬＡＭＰ増幅反応等の等温増幅反応や一般的なＰＣＲ増幅反応等のポリメラーゼ増幅反応、ＬＣＲ等のリガーゼ増幅反応など、公知の核酸増幅法に用いるものが利用できる。
具体的には、ポリメラーゼ及び／あるいはリガーゼ（好ましくはＴａｑポリメラーゼ等の耐熱酵素）、核酸基質（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ（ｄＵＴＰ）／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰのｄＮＴＰ）、それらに適した緩衝液（たとえばＴｒｉｓ−ＨＣｌなど）や融解温度調整剤（たとえばＤＭＳＯ）などであり、従来の核酸増幅と同様の種類、量および方法で用いることができる。
【００１９】
本発明においては、取り扱いの容易さや、小さなチップを用いる観点から、増幅反応のサイクルに応じて温度変化を要する従来のＰＣＲ法より、一定の温度で反応を行うことができるＬＡＭＰ法などの等温核酸増幅法を用いることが好ましい。
ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。ほぼ一定の温度条件とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味し、例えば１０℃程度の温度変化であれば許容される。
【００２０】
本発明において「核酸」は、特に制限されず、ＤＮＡおよびＲＮＡあるいはその他の人工核酸（所謂ＰＮＡ等）いずれも用いることができ、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等の天然試料であっても、合成ポリヌクレオチドであってもよい。また二本鎖核酸、並びに直鎖状核酸および環状核酸を含む。
【００２１】
＜マイクロチップ＞
本発明において、マイクロチップとは、少なくとも試料導入部、反応部、および該反応部と該試料導入部等とを結ぶ流路を有するものである。具体的には、等価直径１ｍｍ以下の流路（チャンネルとも称する。）を有する。
本発明でいう等価直径（equivalent diameter）は、相当(直)径とも呼ばれ、機械工学の分野で一般的に用いられている用語である。任意断面形状の配管(本発明では流路に当たる。)に対し等価な円管を想定するとき、その等価円管の直径を等価直径といい、ｄｅｑ：等価直径は、Ａ:配管の断面積、ｐ:配管のぬれぶち長さ(周長)を用いて、ｄｅｑ＝４Ａ／ｐと定義される。円管に適用した場合、この等価直径は円管直径に一致する。等価直径は等価円管のデータを基に、その配管の流動あるいは熱伝達特性を推定するのに用いられ、現象の空間的スケール（代表的長さ）を表す。等価直径は、一辺ａの正四角形管ではｄｅｑ＝４ａ2／４ａ＝ａ、路高さｈの平行平板間の流れではｄｅｑ＝２ｈとなる。これらの詳細は「機械工学事典」（（社）日本機械学会編１９９７年、丸善（株））に記載されている。
【００２２】
本発明に用いられる流路の等価直径は１ｍｍ以下であるが、好ましくは１０〜５００μｍであり、特に好ましくは２０〜３００μｍである。
また流路の長さには特に制限はないが、好ましくは１ｍｍ〜１００００ｍｍであり、特に好ましくは５ｍｍ〜１００ｍｍである。
本発明に用いられる流路の幅は、１〜３０００μｍであることが好ましく、より好ましくは１０〜２０００μｍであり、さらに好ましくは５０〜１０００μｍである。流路の幅が上記範囲であると、検体が、流路の壁から抵抗を受けて流動性が低下することが少なく、かつ、検体の量を少量にとどめることができるため、好ましい。
流路はマイクロチップに配置する要素の数に合わせて、１つのみでも、２つ以上に分岐していてもいずれでもよい。また、直線状、曲線状など、いずれの形態をとることも可能であるが、直線状であることが好ましい。
【００２３】
マイクロチップの流路は、固体基板上に微細加工技術により作成することができる。
【００２４】
固体基板として使用される材料の例としては、金属、シリコン、テフロン（登録商標）、ガラス、セラミックスおよびプラスチックなどが挙げられる。中でも、金属、シリコン、テフロン、ガラスおよびセラミックスが、耐熱、耐圧、耐溶剤性および光透過性の観点から好ましく、特に好ましくはガラスである。
【００２５】
流路を作成するための微細加工技術は、例えばマイクロリアクター  −新時代の合成技術−（２００３年  シーエムシー刊  監修：吉田潤一  京都大学大学院  工学研究科教授）、微細加工技術  応用編−フォトニクス・エレクトロニクス・メカトロニクスへの応用−（２００３年  エヌ・ティー・エス刊  高分子学会行事委員会編）等に記載されている方法を挙げることができる。
代表的な方法を挙げれば、Ｘ線リソグラフィを用いるＬＩＧＡ技術、ＥＰＯＮ  ＳＵ−８を用いた高アスペクト比フォトリソグラフィ法、マイクロ放電加工法（μ−ＥＤＭ）、Ｄｅｅｐ  ＲＩＥによるシリコンの高アスペクト比加工法、Ｈｏｔ  Ｅｍｂｏｓｓ加工法、光造形法、レーザー加工法、イオンビーム加工法、およびダイアモンドのような硬い材料で作られたマイクロ工具を用いる機械的マイクロ切削加工法などがある。これらの技術を単独で用いても良いし、組み合わせて用いても良い。好ましい微細加工技術は、Ｘ線リソグラフィを用いるＬＩＧＡ技術、ＥＰＯＮ  ＳＵ−８を用いた高アスペクト比フォトリソグラフィ法、マイクロ放電加工法（μ−ＥＤＭ）、および機械的マイクロ切削加工法である。
【００２６】
本発明に用いられる流路は、シリコンウエファー上にフォトレジストを用いて形成したパターンを鋳型とし、これに樹脂を流し込み固化させる（モールディング法）ことによっても作成することができる。モールディング法には、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはその誘導体に代表されるシリコン樹脂を使用することができる。
【００２７】
本発明のマイクロケミカルデバイスを組み立てる際、接合技術を用いることができる。
通常の接合技術は大きく固相接合と液相接合に分けられ、一般的に用いられている接合方法は、固相接合として圧接や拡散接合、液相接合として溶接、共晶接合、はんだ付け、接着等が代表的な接合方法である。
更に、組立に際しては高温加熱による材料の変質や大変形による流路等の微小構造体の破壊を伴わない寸法精度を保った高度に精密な接合方法が望ましく、その技術としてはシリコン直接接合、陽極接合、表面活性化接合、水素結合を用いた直接接合、ＨＦ水溶液を用いた接合、Ａｕ−Ｓｉ共晶接合、ボイドフリー接着などが挙げられる。
【００２８】
核酸を含む試料は試料投入部より流路を経て反応部位まで移動する。流路を移動させる方式として、連続流動方式、液滴（液体プラグ）方式、駆動方式等、あるいは毛細管現象の利用を用いることが好ましい。
【００２９】
連続流動方式の流体制御では、マイクロチップの流路内は全て流体で満たされることが必要であり、外部に用意したシリンジポンプなどの圧力源によって、流体全体を駆動するのが一般的である。連続流動方式は、比較的簡単なセットアップで制御システムを実現できる。
【００３０】
液滴（液体プラグ）方式は、チップ内部やチップに至る流路内で、空気で仕切られた液滴を動かすものであり、個々の液滴は空気圧によって駆動される。液滴方式では、液滴と流路壁あるいは液滴同士の間の空気を必要に応じて外部に逃がすようなベント構造、及び分岐した流路内の圧力を他の部分と独立に保つためのバルブ構造などを、チップ内部に用意する必要がある。また、圧力差を制御して液滴の操作を行うために、外部に圧力源や切り替えバルブからなる圧力制御システムを構築する必要がある。液滴方式では、複数の液滴を個別に操作して、いくつかの反応を順次行うなどの多段階の操作が可能で、システム構成の自由度が大きくなり、好ましい。
【００３１】
駆動方式として、流路（チャンネル）両端に高電圧をかけて電気浸透流を発生させ、これによって流体移動させる電気的駆動方式と、外部に圧力源を用意して流体に圧力をかけて移動させる圧力駆動方式、また毛細管現象を利用した駆動方式が一般に広く用いられている。
電気的駆動方式は、流体の挙動が流路断面内で、流速プロファイルがフラットな分布となることが知られている。圧力駆動方式では、流体の挙動が流路断面内で、流速プロファイルが双曲線状に、つまり流路中心部が速く、壁面部が遅い分布となることが知られている。このことからサンプルプラグなどの形状を保ったまま移動させるといった目的には、電気的駆動方式の方が、好ましい。
電気的駆動方式は、流路内が流体で満たされている必要があり、すなわち連続流動方式の形態をとる。電気的な制御によって流体の操作を行うことができるため、例えば連続的に２種類の溶液の混合比率を変化させることによって、時間的な濃度勾配をつくるといった比較的複雑な処理を行うことができる。
圧力駆動方式は、流体固有の電気的性質に影響されること無く、制御が可能である。発熱や電気分解などの副次的な効果を考慮しなくてよく、基質に対する影響がほとんどないことから、適用範囲が広い。圧力駆動方式では、外部に圧力源を用意する必要がある。
【００３２】
本発明においては、検体の種類や検査項目などに合わせて、適宜、検体を移動する方式を選ぶことができる。中でも、液滴（液体プラグ）方式、あるいは毛細管現象を利用した駆動方式が好ましい。より好ましくは、液滴（液体プラグ）方式における空気圧を陰圧とすることであり、特に好ましくは、空気の吸引による陰圧とすることである。
【００３３】
最も単純な実施態様を図１に示す。
試料導入部１は、検体を注入することが可能であれば、いずれの形態でもよい。注入された試料は、流路２を通り、反応部３に導かれる。反応部３において核酸増幅反応が行われる。尚、図６のように、１つのチップに複数のセル（試料導入部１、流路２、反応部３を含む反応経路）を複数含んでいてもよく、また１つのセルに試料導入部１が２つ以上あってもく、そのうちの１つを空気抜きとして用いることが好ましい。
【００３４】
＜増幅反応中に反応溶液が蒸発することを防止する手段＞
本願発明の核酸増幅方法は、上述のマイクロチップにおいて核酸増幅を行う際に、増幅反応中に反応溶液が蒸発することを防止する手段を用いることを特徴とする。
【００３５】
また、増幅反応中の反応溶液の蒸発すること自体を防止することがより好ましい。
核酸を含む試料が蒸発することを防止する手段としては、例えば、マイクロチップの試料導入部などの開口部に蓋をすることがあげられる。具体的には、ミネラルオイル等の不揮発性の液体による封止、試料導入部などの開口部に合わせて成型された樹脂やゴム、ガラスなどの材質を用いた蓋、あるいはフィルムなどを貼り付けることによる密閉などがあげられる。例えば、熱可塑性樹脂や光硬化性樹脂により密封することも好ましい。
また、蒸発を防止するために、核酸増幅反応を低い温度で行うことも有効な手段である。具体的には、一般的なＰＣＲ反応は９０℃以上への加熱を繰り返し行うが、ＬＡＭＰ法などを用いれば７０℃以下に保ったまま反応を行うことができ、蒸発する上で好ましい。
さらに、反応部のみを核酸増幅反応に適した温度（約４０〜９８℃、より好ましくは４５℃〜７５℃、更に好ましくは５５℃〜６５℃）に維持し、他の部位（特に試料導入部）を低い温度（例えば３５℃以下、より好ましいくは３０℃以下）に保つことも、増幅反応中に反応溶液が蒸発することを防止する上で好適である。
また、チップの形状を工夫することでも、増幅反応中に反応溶液が蒸発することを防止することが可能である。例えば、実施態様図１において、反応部３に通じる流路２の径を細くしたり蛇行させたりすることにより、流路２から試料導入部１にむけて蒸発することを防ぐことが出来る。
【００３６】
＜核酸増幅システム＞
本発明において、核酸増幅システムとは、個人における異常な遺伝子を検出するため、および検体中の病原性微生物を検出するため等の臨床的アッセイにおいて使用する、サンプル調製から増幅までを全自動で行うシステムを意図する。本発明における一般的な増幅システムは、前記マイクロ流路チップとこのチップへ液体を供給して検査を実行する検査装置及び検査に使用される核酸増幅用試薬キットを含むものである。
【００３７】
例えば、この検査装置は、マイクロ流路チップを載置するステージと、マイクロ流路チップ内の流路を介して液体を移動させるための移動手段と、マイクロチップ内の液体を適切な温度で化学反応を起こさせるための加熱手段と、検査試薬に含まれる検出試薬（例えば蛍光色素等）を用いて検出する検出手段と、検出手段により検出された検体の情報により結果を判定する判定手段とを設けることにより、検体の分析を行う。
【００３８】
核酸増幅用試薬キットは、試料核酸を増幅するために必要な物質を含む。例えば、ｄＮＴＰやその誘導体等の反応基質、Ｍｇ2+等の２価イオン、検査項目に対応した遺伝子を規定したプライマー、増幅反応に必要な核酸合成酵素及びその反応至適条件を決めるバッファー等である。場合によっては、ＤＭＳＯ等の融点調整剤やＢＳＡ等の酵素安定化剤を含んでも良い。
これらの試薬キットは、前記マイクロ流路チップの流路内に予め担架させておくことも、マイクロ流路チップとは別に提供することも可能である。
【００３９】
最も単純な実施態様を示す。例えば、マイクロ流路チップとして図１を用いる場合、まず、試料導入部１に検体を注入する。このとき、増幅試薬は、あらかじめ反応部に担架されているか、検体とともに試料導入部に注入する。次に、検査装置の液体を移動させる手段を用いて、注入された試料を流路２を通して、反応部３に移動させる。移動手段は、前述したように検体の種類や検査項目などに合わせて、適宜、設定することが可能である。
次いで、反応部３付近を該検査装置の加熱手段を用いて適切な温度まで加温する。加熱方式も、ヒートブロックや熱対流方式等を適宜、選択することが可能である。さらに、一定時間後に、試薬に予め含まれていた検出試薬を検査装置の検出手段を用いて検出する。例えば、核酸増幅の場合、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ等の蛍光インターカレーターを用いて、２本鎖の核酸を検出することが広く知られている。この場合も、検出試薬、検出手段ともに適宜、選択可能である。核酸増幅方法に関しても、等温増幅である限り特に選ばない。
【００４０】
本増幅システムの利点は、プロトコルが自動化されているため、
（１）  臨床的研究室のセッティングに対する適合性、
（２）  制御された、かつ一貫性のある（標準化可能な）結果を与える能力、
（３）  特定のサンプル中の核酸を定量する能力、
（４）  テストサンプル中の多数のターゲット核酸を検出し、かつ定量する能力、
（５）  血清サンプル中のおよびその場での、高感度かつ効率的な核酸の検出能力、および
（６）  ターゲット中の単一の突然変異を検出する能力、
を高めていることにある。
更に、本増幅システムは、後述する増幅反応中に反応溶液が蒸発することを防止する手段を備えていることが特徴である。これらの特徴により、日常的な診断テストが簡便・迅速・正確に行えるようになっている。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４２】
＜実施例1＞  ＬＡＭＰ法を用いて、蒸発の有無による非特異増幅の評価（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）１００ｎｇを９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、β−アクチン遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行い、核酸試料液(Genome)を得た。ネガティブコントロールとして、滅菌水（ｄｗ）を上記同様の条件で加熱したサンプルも作成した。
【００４３】
＜プライマー＞
基本的にＬＡＭＰ法に用いることが出来るように、βアクチン遺伝子を標的に設計を行った。フォワードプライマーは、鋳型と相補的な３'末端領域と５'末端領域にそのプライマーの伸長鎖上の、３'末端塩基から１０塩基下流にある領域とハイブリダイズされるように設計され、上記５'末端部と３'末端部の連結にＴを４塩基介在させた。リバースプライマーは、鋳型と相補的な３'末端領域と５'末端領域にそのプライマーの伸長鎖上の、３'末端塩基から２２塩基下流にある領域とハイブリダイズされるように設計され、上記５'末端部と３'末端部の連結にＴを４塩基介在させた。
【００４４】
また、フォワードプライマー、リバースプライマーのそれぞれ外側にアウタープライマー（ＯＦ、ＯＲ）を設計した。また、ループプライマーとして、以下に示すプライマーを用いた。各プライマーの位置関係図は、図１０に示す。
【００４５】
プライマー１(Forward)：
５'−CTCTGGGCCTCGTCGCTTTTGGGCATGGGTCAGAAGGATT−３' （配列番号１）
プライマー２(Reverse):
５'−TACCCCATCGAGCACGGTTTTCATGTCGTCCCAGTTGGTGA−３'（配列番号２）
アウタープライマー３（OF）
５'−GGGCTTCTTGTCCTTTCCTTC−３'                    （配列番号３）
アウタープライマー４（OR）
５'−CCACACGCAGCTCATTGTAG−３'                     （配列番号４）
ループプライマー５
５'−CGCTGCTCCGGGTCTC−３'                         （配列番号５）
【００４６】
（２）強制蒸発実験
下記の組成の液をチューブに添加して、チューブの蓋を開けたまま９８℃で一定時間（０，５，１０,２０  ｍｉｎ．の各時間）加熱を行い、反応液を強制的に蒸発させた。その後、各水準の残量を確認したのち、各水準の溶液に酵素（Bst.Polymersase及びTaq-MutS）を所定量添加した。
【００４７】
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF)                                  ２．５μＬ
100mM MgSO4                                         １．５μＬ
10%(v/v) Tween20                                  ０．２５μＬ
100% DMSO                                         １．２５μＬ
25mM dNTP each                                      １．４μＬ
SYBR Green I                                        ０．５μＬ
プライマー１（５０μＭ）                            １．６μＬ
プライマー２（５０μＭ）                            １．６μＬ
プライマー３（５０μＭ）                            ０．２μＬ
プライマー４（５０μＭ）                            ０．２μＬ
核酸試料液または滅菌水            １．０μＬ（核酸１００ｎｇ分）
精製水                                            １１．０μＬ
――――――――――――――――――――――――――――――
合計                                              ２３．０μＬ
【００４８】
得られた反応液を、加熱なし（実験水準１）、９８℃で５分間（実験水準２）、９８℃で１０分間（実験水準３）、９８℃で２０分間（実験水準４）の各条件に加熱した。その後、各条件の試料の残量を確認した。
次いで、各条件の試料に対して酵素（Bst.  Polymerase  １．０μＬおよびTaqMutS  １．０μＬ）を添加した。
【００４９】
(３)核酸増幅反応
上記の各条件の溶液を、６０℃で３０分反応させ、増幅反応を実施した。
【００５０】
（４）増幅反応の検出
前記（３）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。
結果を図２〜図５のグラフに示す。
【００５１】
結果から、水準１→水準４へと９８℃の加熱時間を長くすることにより、つまり、蒸発量が多いほど、水からの非特異な増幅が起きることがわかる。水準４に関しては、もはやゲノムからの増幅と水からの増幅が区別できない。ここで、Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間を算出した。同時に、各水準の蒸発量と蒸発量より換算した実質的なプライマーの濃度も併せて示す。尚、滅菌水試料と核酸試料の場合で蒸発量に差異はなかった。
結果を表１に示す。表において、Ｎｏ  Ｃｔは増幅が起きなかったことを示す。
【００５２】
【表１】
2008148690.tif 000002
【００５３】
表１より、蒸発量に応じて水からの増幅反応が起きやすくなっていることがわかる。これは、実質的なプライマー濃度に換算すると８．６μＭを超えたあたりに相当する。
【００５４】
＜実施例２＞  ＬＡＭＰ法を用いて、チップ上での蒸発の有無による非特異増幅の評価  （ミネラルオイルによる密封）
【００５５】
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製・プライマー
実施例１と同様にして核酸試料液および滅菌水（ｄｗ）、プライマーを作成した。
(２)核酸増幅反応
以下に示す反応液を、下記チップに導入し、６０℃、３０分反応させることで増幅反応を実施した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF)                                ２．５μＬ
100mM MgSO4                                        １．５μＬ
10% (v/v) Tween20                                 ０．２５μＬ
100% DMSO                                         １．２５μＬ
25mM dNTP each                                    １．４μＬ
SYBR Green I（５０μＭ）                          ０．５μＬ
プライマー１（５０μＭ）                          １．６μＬ
プライマー２（５０μＭ）                          １．６μＬ
プライマー３（５０μＭ）                          ０．２μＬ
プライマー４（５０μＭ）                          ０．２μＬ
Bst.  Polymerase                                  １．０μＬ
TaqMutS                                           １．０μＬ
核酸試料液または滅菌水                            １．０μＬ(核酸１００ｎｇ分)
精製水                                          １１．０μＬ
――――――――――――――――――――――――――――――
２５．０μＬ
【００５６】
（３）評価用チップの作成
図６に示すチップを用いて、蒸発の評価を行った。４つのセルは以下の表２の条件とした。試料導入部（１）の片方から反応液を導入後、２つのセルは蒸発対策のため上記反応液を添加後にセルの両端（２つの試料導入部（１））をミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ社製）が満たされるように添加することで封止した。残りの２つは、蒸発対策は行わず、上記反応液を添加しただけの状態で増幅反応を行った。
尚、図６は上面図であり、１は試料導入部、２は反応部、３は流路を表す。図９は図６のチップの斜視図であり、各符号は図６と同じものを示す。
【００５７】
（４）増幅反応の検出
増幅反応の検出は、LAS-3000（Fujifilm社製）を用いて、２min.おきに撮影を行った。次に、解析ソフトMultiGauge（Fujifilm社製）を用いて各セルの蛍光値を定量した。結果を表３および図７に示す。
【表２】
2008148690.tif 000003
【００５８】
結果より、蒸発が起きない状況にすることにより非特異的な増幅が抑制されることがわかる。
【００５９】
＜実施例３＞ＬＡＭＰ法を用いた、チップ上での蒸発の有無による非特異増幅の評価  （温度調整）
実施例２と同様にして核酸試料液および滅菌水（ｄｗ）、プライマーを作成し、反応液を調製し、下記チップに導入し、核酸増幅反応を行った。
評価用チップの作成
図６に示すチップを用いて、蒸発の評価を行った。チップを２枚用いて、１枚（セル５〜８）はチップ全面を６０℃で加熱できる温調装置上で増幅反応（３０分）を行い、もう１（セル９〜１２）枚は、対策として、図８に示すようにチップの中央部（５）を６０℃で加熱する温調手段と周り（４）の温度を２５℃で維持できる温調手段を有する装置上で増幅反応（３０分）を行った。セル中の４つのセルは以下の表３のようにした。
【００６０】
（４）増幅反応の検出
増幅反応の検出は、LAS-3000（Fujifilm社製）を用いて、２min.おきに撮影を行った。次に、解析ソフトMultiGauge（Fujifilm社製）を用いて各セルの蛍光値を定量した。結果を以下に示す。
【００６１】
【表３】
2008148690.tif 000004
【００６２】
上記の結果より、蒸発が起きない状況にすることにより非特異的な増幅が抑制されることがわかる。
【００６３】
＜実施例４＞  ＬＡＭＰ法を用いた、チップ上での蒸発の有無による非特異増幅の評価  （UV硬化型樹脂による密封）
【００６４】
実施例２と同様にして核酸試料液および滅菌水（ｄｗ）、プライマーを作成し、反応液を調製し、下記チップに導入し、核酸増幅反応を行った。
評価用チップの作成
図６に示すチップを用いて、増幅反応を行った（チップ全面を６０℃で加熱）。４つのセルは以下の表４の水準とした。２つのセルは、対策のためUV硬化型樹脂（8815K,協立化学産業）を一滴、試料導入部の両側（１）に添加後、UV光源（400nm）をセルの上１ｃｍの高さから３０秒間照射を行い、ポート部を封止した。残りの２つのセルに関しては、蒸発対策は行わず、上記反応液を添加しただけの状態で増幅反応（３０分）を行った。
【００６５】
（４）増幅反応の検出
増幅反応の検出は、LAS-3000（Fujifilm社製）を用いて、２min.おきに撮影を行った。
次に、解析ソフトMultiGauge（Fujifilm社製）を用いて各セルの蛍光値を定量した。結果を以下に示す。
【００６６】
【表４】
2008148690.tif 000005
【００６７】
上記の結果より、蒸発が起きない状況にすることにより非特異的な増幅が抑制されることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明のマイクロチップにおける流路の一例を示す模式図である。
【図２】実施例１の結果を示すグラフである。
【図３】実施例１の結果を示すグラフである。
【図４】実施例１の結果を示すグラフである。
【図５】実施例１の結果を示すグラフである。
【図６】実施例２〜４で用いたマイクロチップを示す模式図（上面図）である。
【図７】実施例２の結果を示すグラフである。
【図８】実施例３の加温条件を示す模式図である。
【図９】実施例２〜４で用いたマイクロチップを示す模式図（斜視図）である。
【図１０】プライマーの位置関係を示す図である。
【符号の説明】
【００６９】
１  検体導入部
２  流路
３  反応部
４  ６０℃調温部位
５  ２５℃調温部位
【図１】
2008148690.tif 000006
【図２】
2008148690.tif 000007
【図３】
2008148690.tif 000008
【図４】
2008148690.tif 000009
【図５】
2008148690.tif 000010
【図６】
2008148690.tif 000011
【図７】
2008148690.tif 000012
【図８】
2008148690.tif 000013
【図９】
2008148690.tif 000014
【図１０】
2008148690.tif 000015
【配列表】
2008148690000001.app