(57)【要約】【課題】特別な試薬を用いずに、細胞種によらず、高い導入率で遺伝子を細胞に導入すること。【解決手段】培養液６２中に浸漬されて培養される細胞１４を大気にさらし、該大気にさらされた細胞に、当該細胞に導入される遺伝子を付着させ、その細胞に遺伝子を付着させたときから所定時間経過した後で、当該細胞を再び培養液６２に浸漬させる。【選択図】      図３
2008136403.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液に浸漬されて培養される細胞を大気にさらす曝露手段と、
前記曝露手段によって大気にさらされた前記細胞に、当該細胞に導入される遺伝子を付着させる付着手段と、
前記付着手段が前記細胞に前記遺伝子を付着させたときから所定時間経過した後で、当該細胞を再び前記培養液に浸漬させる浸漬手段と、
を具備することを特徴とする遺伝子導入装置。
【請求項２】
前記付着手段は、前記遺伝子を含む溶液に前記細胞を浸漬させた後、再び大気にさらす遺伝子浸漬手段であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子導入装置。
【請求項３】
前記浸漬手段は、前記遺伝子を含む溶液を前記細胞に対して供給排出する遺伝子溶液供給排出手段であることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子導入装置。
【請求項４】
前記浸漬手段は、前記遺伝子を含む溶液に対して前記細胞を入出する細胞入出手段であることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子導入装置。
【請求項５】
前記付着手段は、前記遺伝子を含む溶液を前記細胞に噴霧する噴霧手段であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子導入装置。
【請求項６】
前記付着手段は、前記遺伝子を含む溶液を前記細胞に滴下する滴下手段であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子導入装置。
【請求項７】
大気にさらされている前記細胞の培養環境を制御する環境制御手段をさらに具備することを特徴とする請求項１に記載の遺伝子導入装置。
【請求項８】
培養液中に浸漬されて培養される細胞を大気にさらす工程と、
大気にさらされた前記細胞に、当該細胞に導入される遺伝子を付着させる工程と、
前記細胞に前記遺伝子を付着させたときから所定時間経過した後で、当該細胞を再び培養液に浸漬させる工程と、
を有することを特徴とする遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞へ遺伝子を導入する遺伝子導入装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子導入方法としては、リポフェクション試薬を用いた方法が主流である。その他、エレクトロポレーション法が挙げられる。
【０００３】
特許文献１には、エレクトロポレーション法を応用し、細胞に培養状態のまま遺伝子を導入するようにした遺伝子導入方法が開示されている。
【特許文献１】特開２００６−１９７８７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
リポフェクション法では試薬に毒性のため対応できない細胞種があり、ＰＣ１２、海馬神経細胞などの細胞種によっては、良好な導入率が得られ難いなど、適用できる細胞が限られている。また、高額な試薬も必要である。
【０００５】
エレクトロポレーション法は物理的に細胞膜表面を穿孔するため、細胞に対する損傷も大きく、導入率と生存率を両立することが難しい。上記特許文献１に開示の方法においても同様の課題を有し、希少な細胞を多量に準備する必要がある。
【０００６】
本発明は、上記の点に鑑みてなされたもので、リポフェクションなどの特別な試薬を用いずに、細胞種によらず、導入率が高い遺伝子導入装置及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の遺伝子導入装置の一態様は、
培養液に浸漬されて培養される細胞を大気にさらす曝露手段と、
上記曝露手段によって大気にさらされた上記細胞に、当該細胞に導入される遺伝子を付着させる付着手段と、
上記付着手段が上記細胞に上記遺伝子を付着させたときから所定時間経過した後で、当該細胞を再び上記培養液に浸漬させる浸漬手段と、
を具備することを特徴とする。
【０００８】
また、本発明の遺伝子導入方法の一態様は、
培養液中に浸漬されて培養される細胞を大気にさらす工程と、
大気にさらされた上記細胞に、当該細胞に導入される遺伝子を付着させる工程と、
上記細胞に上記遺伝子を付着させたときから所定時間経過した後で、当該細胞を再び培養液に浸漬させる工程と、
を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞に遺伝子を付着させた状態で一度乾かしてから、細胞を培養液に浸漬させることで、細胞の種類によらず遺伝子を高い導入率で導入できる遺伝子導入装置及び方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための最良の形態を図面を参照して説明する。
【００１１】
［第１実施形態］
まず、本発明の第１実施形態に係る遺伝子導入装置及び遺伝子導入方法について、図１乃至図３（Ｅ）を参照して説明する。
【００１２】
本実施形態に係る遺伝子導入装置は、図１に示すように、培養器１０中に配されたガラス基板であるディッシュ１２上に培養された細胞１４に対して遺伝子を導入するもので、培養器１０内に培養液や遺伝子溶液等を注入・排出するためのポンプ・アスピレータ１６と、ＣＯ２，Ｏ２，Ｎ２等のガス発生器１８と、該ガス発生器１８からの各ガスをそれぞれ所定の濃度で混合するガス混合機２０と、該ガス混合機２０からの混合ガスを加湿する加湿器２２と、該加湿器２２からの加湿混合ガスを培養器１０内に導入するノズル２４と、ポンプ・アスピレータ１６、ガス混合機２０及び加湿器２２を制御するコントローラ２６とからなる。
【００１３】
培養器１０は、図２（Ａ）に示すように、チャンバ２８内に収容された後、上蓋３０が閉じられて、コントロールされた環境に設定される。上蓋３０には、図２（Ｂ）に示すように、培養液ポート３２、遺伝子ポート３４、洗浄液バッファ液ポート３６、廃液口３８、及びガス排出口４０が円周上に設けられ、中央に照明光を入射するための照明窓４２が配されている。培養液ポート３２、遺伝子ポート３４、及び洗浄液バッファ液ポート３６は、それぞれ、培養器１０内に伸びるロッド４４を有しており、また、廃液口３８はディッシュ１２に接触するロッド４６を有している。このロッド４６の先端は、斜めカットされ、隙間を空けられている。
【００１４】
なお、図２（Ａ）には、ガス排出口４０の構成を示すために、洗浄液バッファ液ポート３６に並べて示しているが、図２（Ｂ）に示すように、他のポートと同一円周上に設けられている。勿論、図２（Ａ）に示すように円周上に配置しなくても構わない。更に、これら培養液ポート３２、遺伝子ポート３４、洗浄液バッファ液ポート３６、廃液口３８、及びガス排出口４０の位置及び並び順はこれに限定されるものでないことは勿論である。
【００１５】
培養液ポート３２、遺伝子ポート３４、及び洗浄液バッファ液ポート３６は、それぞれの送液チューブ４８を介して、図２（Ｃ）に示すような培養液ボトル５０、遺伝子溶液ボトル５２、及び洗浄液ボトル５４に接続されている。培養液ボトル５０、遺伝子溶液ボトル５２、及び洗浄液ボトル５４は、コントローラ２６によって制御される図示を省略したそれぞれのポンプにより、内部の溶液が送液チューブ４８を介して対応するポートよりロッド４４の先端から培養器１０内に注入される。
【００１６】
また、廃液口３８は、廃液チューブ５６を介して図示しない廃液ボトルに接続され、コントローラ２６によって制御されるアスピレータにより、培養器１０内部の溶液が廃液口３８のロッド４６の先端から吸引されて、廃液チューブ５６を介して廃液ボトル内に排出される。
【００１７】
チャンバ２８の側面にはノズル２４が取り付けられており、ガス供給チューブ５８により加湿器２２からの加湿混合ガスが該チャンバ２８内に導入される。
【００１８】
また、チャンバ２８の底面には、細胞観察窓６０が設けられており、倒立型顕微鏡によって、培養器１０内の細胞１４を確認できるようになっている。
【００１９】
このように構成された本実施形態に係る遺伝子導入装置を用いた遺伝子導入方法について以下に説明する。
【００２０】
図３（Ａ）に示すように培養器１０内の培養液６２中で細胞１４が培養されている。本実施形態に係る遺伝子導入装置を用いて、この細胞１４に遺伝子を導入するには、その培養器１０をチャンバ２８内にセットして、まず、アスピレータを作動させてロッド４６の先端から培養液６２を吸引させて、培養器１０内から培養液６２を抜き取る。
【００２１】
培養液６２が抜き取れたならば、次に、ポンプを作動させて遺伝子溶液ボトル５２内の、導入しようとする遺伝子が混濁した遺伝子溶液６４を、送液チューブ４８を介して遺伝子ポート３４のロッド４４より培養器１０内に注入する。図３（Ｂ）に示すように、細胞１４を浸すまで遺伝子溶液６４を注入する。
【００２２】
その後、アスピレータを作動させてロッド４６の先端から遺伝子溶液６４を吸引させて、培養器１０内から遺伝子溶液６４を抜き取る。そして、図３（Ｃ）に示すように、一定時間（数分、５〜１０分）、細胞１４を大気中にさらす。このとき、溶液を抜き取った状態で細胞１４が死滅しないよう環境コントロールを行うことが望ましい。例えば、湿度９０％以上、ＣＯ２が５％、Ｏ２が２〜５％程度の加湿混合ガスをノズル２４よりチャンバ２８内に導入する。
【００２３】
このように一定時間、細胞１４を大気中にさらすことで、細胞膜の物理的な変化によって、細胞１４表面に付着していた遺伝子溶液６４から遺伝子が細胞１４内に浸透する。
【００２４】
そして、上記一定時間が経過したならば、ポンプを作動させて洗浄液ボトル５４内の洗浄液６６を、送液チューブ４８を介して洗浄液バッファ液ポート３６のロッド４４より培養器１０内に注入する。図３（Ｄ）に示すように、細胞１４を浸すまで遺伝子溶液６４を注入したならば、アスピレータを作動させてロッド４６の先端から洗浄液６６を吸引させて、培養器１０内から洗浄液６６を排出する。このように、洗浄液６６を注入・排出することで、残った遺伝子を取り除く。
【００２５】
その後、ポンプを作動させて培養液ボトル５０内の培養液６２を、送液チューブ４８を介して培養液ポート３２のロッド４４より培養器１０内に、図３（Ｅ）に示すように、細胞１４を浸すまで注入し、再び細胞１４の培養を行う。
【００２６】
以上のように、本発明の第１実施形態によれば、細胞１４を遺伝子の混濁した遺伝子溶液６４中に浸した後に、遺伝子溶液６４を抜き取り、大気中に開放した状態として遺伝子を浸透させてから、培養液６２を入れるようにしている。よって、大気中にさらすことによる細胞膜の物理的な変化によって遺伝子を浸透させるため、細胞の種類によらず導入が可能であり、高い導入率が得られる。
【００２７】
また、試薬類が不要であるため、低コストで遺伝子導入を行える。
【００２８】
［実施例］
図４（Ａ）は、遺伝子を細胞内に導入する前の状態の顕微鏡観察画像を示す図である。本実施例では、この細胞をＧＦＰ蛍光タンパク質を発現する遺伝子の混濁した遺伝子溶液（ＧＦＰ：０．１μｇ／μＬ）中に浸漬した後、数分間、大気中に開放状態として、遺伝子を細胞内に導入することを試みている。図４（Ｂ）は、導入の成否を確認した顕微鏡観察像を示す図である。導入が成功した細胞では、遺伝子が発現し強い蛍光強度が得られている。この結果より、非常に効率良く、細胞に遺伝子が導入されていることが確認できる。
【００２９】
［第２実施形態］
次に、本発明の第２実施形態に係る遺伝子導入装置及び遺伝子導入方法について、図５（Ａ）乃至６（Ｃ）を参照して説明する。
【００３０】
上記第１実施形態では、ポンプを作動させて遺伝子溶液ボトル５２内の、導入しようとする遺伝子が混濁した遺伝子溶液６４を、送液チューブ４８を介して遺伝子ポート３４のロッド４４より培養器１０内に注入するようにしていた。これに対して、本第２実施形態に係る遺伝子導入装置は、図５（Ａ）に示すように、ＤＮＡ溶液を噴霧ノズル６８より噴霧するようにしたものである。
【００３１】
即ち、図６（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、チャンバ２８の上蓋３０に、ＤＮＡ溶液を収容したＤＮＡ溶液タンク７０と、該ＤＮＡ溶液タンク７０から供給されるＤＮＡ溶液を霧化して噴霧ノズル６８より噴霧するための霧化ユニット７２とが取り付けられている。この霧化ユニット７２は、コントローラ２６の制御によって、ＤＮＡ溶液の噴霧状態を制御できるようになっている。
【００３２】
従って、本実施形態では、図６（Ｂ）に示すように、上蓋３０には培養液ポート３２、洗浄液バッファ液ポート３６、廃液口３８及びガス排出口４０のみが設けられて、遺伝子ポート３４は備えておらず、また、図６（Ｃ）に示すように、培養液ボトル５０と洗浄液ボトル５４のみが用意され、遺伝子溶液ボトル５２は用いられない。
【００３３】
このように構成された本第２実施形態に係る遺伝子導入装置を用いた遺伝子導入方法について、図５（Ｂ）を参照して説明する。
【００３４】
本実施形態では、培養器１０内の培養液６２中で細胞１４が培養されている。本実施形態に係る遺伝子導入装置を用いて、この細胞１４に遺伝子を導入するには、該培養器１０をチャンバ２８内にセットして、まず、アスピレータを作動させてロッド４６の先端から培養液６２を吸引させて、培養器１０内から培養液６２を抜き取る。
【００３５】
培養液６２が抜き取れたならば、次に、霧化ユニット７２を作動させて、ＤＮＡ溶液タンク７０内の、導入しようとする遺伝子が混濁したＤＮＡ溶液を霧化して、その霧化したＤＮＡ溶液７４を所定時間、噴霧ノズル６８より培養器１０内のディッシュ１２上の細胞１４に噴霧する。ここで、噴霧するＤＮＡ溶液は、ＨＢＳＳ等のバッファ液もしくは培地に、導入しようとする遺伝子を混合した溶液である。
【００３６】
また、このとき、溶液を抜き取った状態で細胞１４が死滅しないよう、噴霧と同時に環境コントロールを行うことが望ましい。例えば、湿度９０％以上、ＣＯ２が５％、Ｏ２が２〜５％程度の加湿混合ガスをノズル２４よりチャンバ２８内に導入する。
【００３７】
上記所定時間のＤＮＡ溶液７４の噴霧中、細胞１４は大気中にさらされ、遺伝子が浸透しやすい状態へと変化する。従い、噴霧により細胞１４表面に付着したＤＮＡ溶液７４は、直ちに細胞１４内に浸透する。
【００３８】
そして、上記一定時間が経過したならば、洗浄液ボトル５４内の洗浄液６６を培養器１０内に注入・排出することで、残った遺伝子を取り除く。
【００３９】
その後、ポンプを作動させて培養液ボトル５０内の培養液６２を、送液チューブ４８を介して培養液ポート３２のロッド４４より培養器１０内に、細胞１４を浸すまで注入し、再び細胞１４の培養を行う。
【００４０】
以上のように、本発明の第２実施形態によれば、噴霧したＤＮＡ溶液７４が大気中で直接的に細胞１４と接触するため、確実に細胞１４に貼り付き浸透する。このため、微量のＤＮＡ溶液７４で、より高い細胞への遺伝子の導入効率が得られる。
【００４１】
［第３実施形態］
次に、本発明の第３実施形態に係る遺伝子導入装置及び遺伝子導入方法について、図７（Ａ）乃至図８（Ｂ）を参照して説明する。
【００４２】
本第３実施形態に係る遺伝子導入装置は、図７（Ａ）に示すように、遺伝子溶液６４を１滴１００ｐＬ程度の液滴として吐出する液滴吐出デバイス７６と、該液滴吐出デバイス７６の吐出エリアに選定した細胞を配置するために培養器１０をＸ−Ｙ方向に駆動するＸ−Ｙステージ７８と、を備えている。液滴吐出デバイス７６としては、例えば、ノズル内に充填した遺伝子溶液６４を空気圧によって吐出するものや、特開２００１−２３５４００号公報や特開２００２−１１６２０５号公報に開示されているような圧電素子の伸縮を利用した慣性力によって吐出するものなどが適用できる。
【００４３】
Ｘ−Ｙステージ７８は、図８（Ａ）に示すように、倒立型顕微鏡８０上に設置され、チャンバ２８内に収容された培養器１０をＸ−Ｙ方向に駆動する。但し、培養器１０の移動範囲は、チャンバ２８の上蓋から延びるロッド４４，４６（図８（Ａ）には図示せず）の位置により制限される。液滴吐出デバイス７６は、チャンバ２８内に設置されたＺステージ８２によってＺ方向に駆動される滴下ヘッド８４に取り付けられており、Ｚ方向に移動するようになっている。チャンバ２８の照明窓４２は、本実施形態では上蓋ではなく側面に設けられ、倒立型顕微鏡８０の照明８６からの照明光を斜め上方から培養器１０に当てる構成となっている。
【００４４】
この構成により、倒立型顕微鏡８０で観察しながらＸ−Ｙステージ７８を駆動して、培養器１０内の細胞のうち選定した細胞１４を液滴吐出デバイス７６の吐出エリアに設定することができる。
【００４５】
上記液滴吐出デバイス７６、Ｘ−Ｙステージ７８、倒立型顕微鏡８０、Ｚステージ８２及び照明８６は、コントローラ２６により制御される。
【００４６】
また、本実施形態においても、図８（Ｂ）に示すように、培養液ボトル５０と洗浄液ボトル５４のみが用意され、遺伝子溶液ボトル５２は用いられない。同様に、チャンバ２８の上蓋３０には培養液ポート３２、洗浄液バッファ液ポート３６、廃液口３８及びガス排出口４０のみが設けられて、遺伝子ポート３４は備えていない。
【００４７】
このように構成された本第３実施形態に係る遺伝子導入装置を用いた遺伝子導入方法について、図７（Ｂ）を参照して説明する。
【００４８】
本実施形態では、培養器１０内の培養液６２中で細胞１４が培養されている。本実施形態に係る遺伝子導入装置を用いて、この細胞１４の内の選定した細胞１４に遺伝子を導入するには、該培養器１０をチャンバ２８内にセットして、倒立型顕微鏡８０で観察しながら、その選定した細胞１４を液滴吐出デバイス７６の吐出エリアに設定する。
【００４９】
そして、アスピレータを作動させてロッド４６の先端から培養液６２を吸引させて、培養器１０内から培養液６２を抜き取る。
【００５０】
培養液６２が抜き取れたならば、次に、Ｚステージ８２を作動させて、滴下ヘッド８４を所定の滴下位置まで下げた後、液滴吐出デバイス７６を作動させて、培養器１０内のディッシュ１２上の選定した細胞１４に遺伝子溶液６４を滴下する。なお、滴下する吐出エリアは所望のエリアであり、特にエリア数等の限定はない。
【００５１】
そして、一定時間（数分、５〜１０分）、細胞１４を大気中にさらす。このとき、溶液を抜き取った状態で細胞１４が死滅しないよう環境コントロールを行うことが望ましい。例えば、湿度９０％以上、ＣＯ２が５％、Ｏ２が２〜５％程度の加湿混合ガスをノズル２４よりチャンバ２８内に導入する。
【００５２】
このように一定時間、細胞１４を大気中にさらすことで、細胞膜の物理的な変化によって、細胞１４表面に付着していた遺伝子溶液６４から遺伝子が細胞１４内に浸透する。
【００５３】
そして、上記一定時間が経過したならば、洗浄液ボトル５４内の洗浄液６６を培養器１０内に注入・排出することで、残った遺伝子を取り除く。
【００５４】
その後、ポンプを作動させて培養液ボトル５０内の培養液６２を、送液チューブ４８を介して培養液ポート３２のロッド４４より培養器１０内に、細胞１４を浸すまで注入し、再び細胞１４の培養を行う。
【００５５】
以上のように、本発明の第３実施形態によれば、遺伝子を導入したい細胞１４が存在するエリアにのみ遺伝子溶液６４を滴下することにより、所望のエリアの細胞のみに遺伝子を導入することが可能である。
【００５６】
また、遺伝子溶液を複数種類用いることにより、複数種類の遺伝子を同一エリアもしくは異なるエリアに導入することもできる。
【００５７】
［第４実施形態］
次に、本発明の第４実施形態に係る遺伝子導入装置及び遺伝子導入方法について、図９を参照して説明する。
【００５８】
本実施形態に係る遺伝子導入装置は、図９に示すように、チャンバ２８内の遺伝子溶液槽８８が配されたＹステージ９０上に、培養器１０が載置される構成となっている。細胞の培養は、培養液６２が浸された培養器１０中に配された培養基板１２Ａ上になされる。ここで培養基板１２Ａは、ガラス基板上にポリリシンコートなどを施したものなどが用いられる。また、チャンバ２８内には、培養器１０内の培養液６２中の培養基板１２Ａを吸着するためのシリコン製の吸着パット９２と、該吸着パット９２を昇降するための昇降機構９４が設けられている。なお、吸着パット９２に吸着力を与えるための吸引ポンプ９６が、チャンバ２８内又は外に設けられている。
【００５９】
本実施形態においては、上記第１実施形態のような培養液ボトル５０、遺伝子溶液ボトル５２、洗浄液ボトル５４は用いず、よって、チャンバ２８の上蓋３０にはそのためのポートは設けられていない。
【００６０】
このように構成された本第４実施形態に係る遺伝子導入装置を用いた遺伝子導入方法について、以下に説明する。
【００６１】
培養器１０内の培養液６２中で細胞１４が培養されている。本実施形態に係る遺伝子導入装置を用いて、この細胞１４に遺伝子を導入するには、その培養器１０をチャンバ２８内のＹステージ９０上の遺伝子溶液槽８８横にセットする。
【００６２】
そして、Ｙステージ９０を駆動して、培養器１０を吸着パット９２下に移動させる。その後、昇降機構９４を作動させて吸着パット９２を、培養器１０内の培養基板１２Ａに接触するまで下降させる。そして、吸引ポンプ９６を作動させて、培養基板１２Ａを吸着パット９２に吸引、把持させる。その状態で昇降機構９４を作動させて吸着パット９２を、培養器１０の側壁よりも上位置まで上昇させる。
【００６３】
次に、Ｙステージ９０を駆動して、遺伝子溶液槽８８を吸着パット９２下に移動させる。その後、昇降機構９４を作動させて吸着パット９２を、遺伝子溶液槽８８内の遺伝子溶液６４に十分浸る位置まで下降させる。これにより、吸着パット９２に把持された培養基板１２Ａ上の細胞１４が遺伝子溶液６４に浸される。
【００６４】
その後、昇降機構９４を作動させて吸着パット９２を、遺伝子溶液槽８８の側壁よりも上位置まで上昇させることにより、吸着パット９２に把持された培養基板１２Ａ上の細胞１４を遺伝子溶液６４から取り出す。そして、一定時間（数分、５〜１０分）、細胞１４を大気中にさらす。このとき、細胞１４が死滅しないよう環境コントロールを行うことが望ましい。例えば、湿度９０％以上、ＣＯ２が５％、Ｏ２が２〜５％程度の加湿混合ガスをノズル２４よりチャンバ２８内に導入する。
【００６５】
このように一定時間、細胞１４を大気中にさらすことで、細胞膜の物理的な変化によって、細胞１４表面に付着していた遺伝子溶液６４から遺伝子が細胞１４内に浸透する。
【００６６】
そして、上記一定時間が経過したならば、Ｙステージ９０を駆動して、培養器１０を吸着パット９２下に移動させる。その後、昇降機構９４を作動させて吸着パット９２を、把持している培養基板１２Ａが培養器１０の底面に接触するまで下降させる。これにより、吸着パット９２に把持された培養基板１２Ａ上の細胞１４が培養液６２に浸され、再び培養が行われることになる。
【００６７】
そして、吸引ポンプ９６の作動を停止して、吸着パット９２による培養基板１２Ａの把持を解除した後、昇降機構９４を作動させて吸着パット９２を、培養器１０の側壁よりも上位置まで上昇させる。
【００６８】
以上のように、本発明の第４実施形態によれば、細胞１４を遺伝子の混濁した遺伝子溶液６４中に浸した後に、遺伝子溶液６４から取り出し、大気中に開放した状態として遺伝子を浸透させてから、培養液６２に戻すようにしている。よって、大気中にさらすことによる細胞膜の物理的な変化によって遺伝子を浸透させるため、細胞の種類によらず導入が可能であり、高い導入率が得られる。更に、本実施の形態４の構成によれば、培養器１０を交換する搬送機を組み合わせることで、連続かつ自動で複数の培養基板１２Ａを処理することが可能であり、大量のサンプルに遺伝子を導入する用途に適している。
【００６９】
なお、培養器１０と遺伝子溶液槽８８との位置を移動させるのではなく、吸着して引き上げた培養基板１２Ａを培養器１０と遺伝子溶液槽８８の間で移動させるようにしても、同様の効果が得られる。
【００７０】
また、更に洗浄液６６を収容した洗浄液槽を用意して、培養器１０に戻す前に、その洗浄液槽により培養基板１２Ａ上の細胞１４から残った遺伝子を取り除くようにしても構わない。
【００７１】
以上実施形態に基づいて本発明を説明したが、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で種々の変形や応用が可能なことは勿論である。
【００７２】
例えば、細胞内に導入する物質は、遺伝子に限らず、色素、量子ドットなどの蛍光試薬、イオン、ペプチド、タンパク質、多糖類、等、溶液中に混濁できるものであれば良い。
【００７３】
（付記）
前記の具体的実施形態から、以下のような構成の発明を抽出することができる。
【００７４】
（１）  培養液に浸漬されて培養される細胞を大気にさらす曝露手段と、
上記曝露手段によって大気にさらされた上記細胞に、当該細胞に導入される遺伝子を付着させる付着手段と、
上記付着手段が上記細胞に上記遺伝子を付着させたときから所定時間経過した後で、当該細胞を再び上記培養液に浸漬させる浸漬手段と、
を具備することを特徴とする遺伝子導入装置。
【００７５】
（対応する実施形態）
この（１）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第１乃至第４実施形態が対応する。それらの実施形態において、培養液６２が上記培養液に、細胞１４が上記細胞に、アスピレータ，廃液口３８，ロッド４６及び廃液チューブ５６又は吸着パット９２，昇降機構９４及び吸引ポンプ９６が上記曝露手段に、ポンプ，遺伝子ポート３４，送液チューブ４８，遺伝子溶液ボトル５２，アスピレータ，廃液口３８，ロッド４６及び廃液チューブ５６、又は噴霧ノズル６８，ＤＮＡ溶液タンク７０及び霧化ユニット７２、又は液滴吐出デバイス７６，Ｚステージ８２及び滴下ヘッド８４、又はＹステージ９０及び昇降機構９４が上記付着手段に、ポンプ，培養液ポート３２，送液チューブ４８及び培養液ボトル５０又はＹステージ９０及び昇降機構９４が上記浸漬手段に、それぞれ対応する。
【００７６】
（作用効果）
この（１）に記載の遺伝子導入装置によれば、大気中にさらすことによる細胞膜の物理的な変化によって遺伝子を浸透させるため、細胞の種類によらず導入が可能であり、高い導入率が得られる。
【００７７】
また、試薬類が不要であるため低コストで遺伝子導入を行える。
【００７８】
（２）  上記付着手段は、上記遺伝子を含む溶液に上記細胞を浸漬させた後、再び大気にさらす遺伝子浸漬手段であることを特徴とする（１）に記載の遺伝子導入装置。
【００７９】
（対応する実施形態）
この（２）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第１及び第４実施形態が対応する。それらの実施形態において、遺伝子溶液６４が上記遺伝子を含む溶液に、ポンプ，遺伝子ポート３４，送液チューブ４８，遺伝子溶液ボトル５２，アスピレータ，廃液口３８，ロッド４６及び廃液チューブ５６、又はＹステージ９０及び昇降機構９４が上記遺伝子浸漬手段に、それぞれ対応する。
【００８０】
（作用効果）
この（２）に記載の遺伝子導入装置によれば、遺伝子を含む溶液に細胞を浸漬させるだけで、容易に遺伝子を付着させることができる。
【００８１】
（３）  上記浸漬手段は、上記遺伝子を含む溶液を上記細胞に対して供給排出する遺伝子溶液供給排出手段であることを特徴とする（２）に記載の遺伝子導入装置。
【００８２】
（対応する実施形態）
この（３）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第１実施形態が対応する。その実施形態において、ポンプ，遺伝子ポート３４，送液チューブ４８，遺伝子溶液ボトル５２，アスピレータ，廃液口３８，ロッド４６及び廃液チューブ５６が上記遺伝子溶液供給排出手段に対応する。
【００８３】
（作用効果）
この（３）に記載の遺伝子導入装置によれば、遺伝子を含む溶液を細胞を供給排出するだけで、容易に遺伝子を付着させることができる。
【００８４】
（４）  上記浸漬手段は、上記遺伝子を含む溶液に対して上記細胞を入出する細胞入出手段であることを特徴とする（２）に記載の遺伝子導入装置。
【００８５】
（対応する実施形態）
この（４）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第４実施形態が対応する。その実施形態において、Ｙステージ９０及び昇降機構９４が上記細胞入出手段に対応する。
【００８６】
（作用効果）
この（４）に記載の遺伝子導入装置によれば、遺伝子を含む溶液に細胞を入れて出すだけで、容易に遺伝子を付着させることができる。
【００８７】
（５）  上記付着手段は、上記遺伝子を含む溶液を上記細胞に噴霧する噴霧手段であることを特徴とする（１）に記載の遺伝子導入装置。
【００８８】
（対応する実施形態）
この（５）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第２実施形態が対応する。その実施形態において、ＤＮＡ溶液７４が上記遺伝子を含む溶液に、噴霧ノズル６８，ＤＮＡ溶液タンク７０及び霧化ユニット７２が上記噴霧手段に、それぞれ対応する。
【００８９】
に対応する。
【００９０】
（作用効果）
この（５）に記載の遺伝子導入装置によれば、噴霧した遺伝子を含む溶液が大気中で直接的に細胞と接触するため、確実に細胞に貼り付き浸透する。このため、微量の溶液で、より高い細胞への遺伝子の導入効率が得られる。
【００９１】
（６）  上記付着手段は、上記遺伝子を含む溶液を上記細胞に滴下する滴下手段であることを特徴とする（１）に記載の遺伝子導入装置。
【００９２】
（対応する実施形態）
この（６）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第３実施形態が対応する。その実施形態において、遺伝子溶液６４が上記遺伝子を含む溶液に、液滴吐出デバイス７６，Ｚステージ８２及び滴下ヘッド８４が上記滴下手段に、それぞれ対応する。
【００９３】
に対応する。
【００９４】
（作用効果）
この（６）に記載の遺伝子導入装置によれば、遺伝子を導入したい細胞が存在するエリアにのみ遺伝子を含む溶液を滴下することにより、所望のエリアの細胞のみに遺伝子を導入することが可能である。
【００９５】
（７）  大気にさらされている上記細胞の培養環境を制御する環境制御手段をさらに具備することを特徴とする（１）に記載の遺伝子導入装置。
【００９６】
（対応する実施形態）
この（７）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第１乃至第４実施形態が対応する。それらの実施形態において、ガス発生器１８，ガス混合機２０，加湿器２２，ノズル２４及びガス供給チューブ５８が上記環境制御手段に対応する。
【００９７】
（作用効果）
この（７）に記載の遺伝子導入装置によれば、細胞を大気にさらしても細胞が死滅しないようにすることができる。
【００９８】
（８）  培養液中に浸漬されて培養される細胞を大気にさらす工程と、
大気にさらされた上記細胞に、当該細胞に導入される遺伝子を付着させる工程と、
上記細胞に前記遺伝子を付着させたときから所定時間経過した後で、当該細胞を再び培養液に浸漬させる工程と、
を有することを特徴とする遺伝子導入方法。
【００９９】
（対応する実施形態）
この（８）に記載の遺伝子導入方法に関する実施形態は、第１乃至第４実施形態が対応する。それらの実施形態において、培養液６２が上記培養液に、細胞１４が上記細胞に、それぞれ対応する。
【０１００】
（作用効果）
この（８）に記載の遺伝子導入方法によれば、大気中にさらすことによる細胞膜の物理的な変化によって遺伝子を浸透させるため、細胞の種類によらず導入が可能であり、高い導入率が得られる。
【０１０１】
また、試薬類が不要であるため低コストで遺伝子導入を行える。
【０１０２】
（９）  培養液に浸漬されて培養される細胞を大気にさらす曝露手段と、
上記曝露手段によって大気にさらされた上記細胞に、当該細胞に導入される導入物質を付着させる付着手段と、
上記付着手段が上記細胞に上記導入物質を付着させたときから所定時間経過した後で、当該細胞を再び上記培養液に浸漬させる浸漬手段と、
を具備することを特徴とする導入装置。
【０１０３】
（対応する実施形態）
この（９）に記載の導入装置に関する実施形態は、第１乃至第４実施形態が対応する。それらの実施形態において、培養液６２が上記培養液に、細胞１４が上記細胞に、アスピレータ，廃液口３８，ロッド４６及び廃液チューブ５６又は吸着パット９２，昇降機構９４及び吸引ポンプ９６が上記曝露手段に、ポンプ，遺伝子ポート３４，送液チューブ４８，遺伝子溶液ボトル５２，アスピレータ，廃液口３８，ロッド４６及び廃液チューブ５６、又は噴霧ノズル６８，ＤＮＡ溶液タンク７０及び霧化ユニット７２、又は液滴吐出デバイス７６，Ｚステージ８２及び滴下ヘッド８４、又はＹステージ９０及び昇降機構９４が上記付着手段に、ポンプ，培養液ポート３２，送液チューブ４８及び培養液ボトル５０又はＹステージ９０及び昇降機構９４が上記浸漬手段に、それぞれ対応する。
【０１０４】
（作用効果）
この（９）に記載の導入装置によれば、大気中にさらすことによる細胞膜の物理的な変化によって導入物質を浸透させるため、細胞の種類によらず導入が可能であり、高い導入率が得られる。
【０１０５】
また、試薬類が不要であるため低コストで導入物質の導入を行える。
【０１０６】
（１０）  上記導入物質は、遺伝子、色素、蛍光試薬、イオン、ペプチド、タンパク質、多糖類の何れかであることを特徴とする（９）に記載の導入装置。
【０１０７】
（対応する実施形態）
この（１０）に記載の導入装置に関する実施形態は、第１乃至第４実施形態が対応する。
【０１０８】
（作用効果）
この（１０）に記載の導入装置によれば、遺伝子を始め、色素、量子ドットなどの蛍光試薬、イオン、ペプチド、タンパク質、多糖類、等、溶液中に混濁できる物質を導入できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、本発明の第１実施形態に係る遺伝子導入装置の概略構成を示す図である。
【図２】図２（Ａ）は、第１実施形態に係る遺伝子導入装置におけるチャンバの構造を示す図であり、図２（Ｂ）は、該チャンバの上蓋の平面図であり、図２（Ｃ）は、第１実施形態に係る遺伝子導入装置における培養液ボトル、遺伝子溶液ボトル及び洗浄液ボトルを示す図である。
【図３】図３は、本発明の第１実施形態に係る遺伝子導入方法を説明するための工程流れ図である。
【図４】図４（Ａ）は、遺伝子を細胞内に導入する前の状態の顕微鏡観察画像を示す図であり、図４（Ｂ）は、第１実施形態に係る遺伝子導入装置及び方法によって色素溶液を細胞内に導入した結果の顕微鏡画像を示す図である。
【図５】図５（Ａ）は、本発明の第２実施形態に係る遺伝子導入装置の概略構成を示す図であり、図５（Ｂ）は、本発明の第２実施形態に係る遺伝子導入方法を説明するための工程流れ図である。
【図６】図６（Ａ）は、第２実施形態に係る遺伝子導入装置におけるチャンバの構造を示す図であり、図６（Ｂ）は、該チャンバの上蓋の平面図であり、図６（Ｃ）は、第２実施形態に係る遺伝子導入装置における培養液ボトル及び洗浄液ボトルを示す図である。
【図７】図７（Ａ）は、本発明の第３実施形態に係る遺伝子導入装置の概略構成を示す図であり、図７（Ｂ）は、本発明の第３実施形態に係る遺伝子導入方法を説明するための工程流れ図である。
【図８】図８（Ａ）は、第３実施形態に係る遺伝子導入装置におけるチャンバの構造及びその設置状態を示す図であり、図８（Ｂ）は、第３実施形態に係る遺伝子導入装置における培養液ボトル及び洗浄液ボトルを示す図である。
【図９】図９は、本発明の第４実施形態に係る遺伝子導入装置の概略構成を示す図である。
【符号の説明】
【０１１０】
１０…培養器、  １２…ディッシュ、  １２Ａ…培養基板、  １４…細胞、  １６…ポンプ・アスピレータ、  １８…ガス発生器、  ２０…ガス混合機、  ２２…加湿器、  ２４…ノズル、  ２６…コントローラ、  ２８…チャンバ、  ３０…上蓋、  ３２…培養液ポート、  ３４…遺伝子ポート、  ３６…洗浄液バッファ液ポート、  ３８…廃液口、  ４０…ガス排出口、  ４２…照明窓、  ４４，４６…ロッド、  ４８…送液チューブ、  ５０…培養液ボトル、  ５２…遺伝子溶液ボトル、  ５４…洗浄液ボトル、  ５６…廃液チューブ、  ５８…ガス供給チューブ、  ６０…細胞観察窓、  ６２…培養液、  ６４…遺伝子溶液、  ６６…洗浄液、  ６８…噴霧ノズル、  ７０…ＤＮＡ溶液タンク、  ７２…霧化ユニット、  ７４…ＤＮＡ溶液、  ７６…液滴吐出デバイス、  ７６…液滴吐出デバイス、  ７８…Ｘ−Ｙステージ、  ８０…倒立型顕微鏡、  ８２…Ｚステージ、  ８４…滴下ヘッド、  ８６…照明、  ８８…遺伝子溶液槽、  ９０…Ｙステージ、  ９２…吸着パット、  ９４…昇降機構、  ９６…吸引ポンプ。
【図１】
2008136403.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008136403.tif 000009
【図８】
2008136403.tif 000010
【図９】
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