(57)【要約】 【課題】  ＳＭＭＤ法に含まれるライゲーション操作による変異検出効率を高める。【解決手段】  複数の電極上にそれぞれ固定された異なった塩基配列を有する複数のプローブを有するチップを準備し、複数のプローブの各々に所定の塩基配列を有するターゲットをハイブリタイゼーション反応させ、ハイブリダイゼーション反応させたプローブにインターカレータを作用させ、インターカレータを作用させた後、複数の電極から取り出される電流を測定することを特徴とする塩基変異の検出方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基変異を有する検出対象の核酸の一部と相補的な塩基配列を有し、かつ、伸長後に３’側に形成される塩基配列のうち変異部位に相当する塩基部位の上流側の塩基配列を含む塩基配列と相補的な塩基配列が、５’末端側に付加され、塩基変異を有する検出対象の核酸の変異部位に相当する塩基部位が、伸長後に３’側に形成される塩基配列内に位置するよう構成されたプライマーを準備し、
前記プライマーを、ポリメラーゼ又はクレノー酵素を用いて伸長反応させることにより、ターゲットを作成し，
変性により前記ターゲットを１本鎖とし、前記ターゲットを、３’末端領域に前記核酸の変異部位と相補的な塩基が存在するプローブとハイブリダイゼーション反応させ、
前記ハイブリタイゼーション反応させたプローブを、ライゲーション反応を経ることなく、電気化学的に検出することを特徴とする塩基変異の検出方法。
【請求項２】
前記プライマーは、オリゴヌクレオチドの全配列長が２０塩基以上で、５’末端側に付加された前記塩基配列の配列長が１３塩基以上で、Ｔｍが４０〜６０℃であることを特徴とする請求項１記載の塩基変異の検出方法。
【請求項３】
前記プローブは、その一端が固相に固定されてなることを特徴とする請求項１又は２記載の塩基変異の検出方法。
【請求項４】
前記固相は電極であり、この電極の電流値を検出することを特徴とする請求項３記載の塩基変異の検出方法。
【請求項５】
前記電極は金であり、かつ、前記プローブは、配列長が１５塩基以上のオリゴヌクレオチド部とチオール基からなる固相固定部とそれら両部間にアルカン鎖からなるリンカー部を有することを特徴とする請求項４記載の塩基変異の検出方法。
【請求項６】
前記電極はカーボンであり、かつ、前記プローブは、アミノ修飾された固相固定部を有することを特徴とする請求項４記載の塩基変異の検出方法。
【請求項７】
前記ハイブリダイゼーション反応後に、前記プローブに対して電気化学的試薬を反応させ、その際の電気化学的応答を検出することを特徴とする請求項３記載の塩基変異の検出方法。
【請求項８】
前記ハイブリダイゼーション反応は、核酸がハイブリダイゼーションするに十分な塩を含む溶液を用いて行なうことを特徴とする請求項１記載の塩基変異の検出方法。
【請求項９】
前記ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーションにより形成された２本鎖核酸を解離させない程度の塩を含む緩衝液を用いて洗浄を行なうことを特徴とする請求項１記載の塩基変異の検出方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９いずれか記載の塩基変異の検出方法を使用することを特徴とする塩基変異の検出システム。
【請求項１１】
塩基変異を有する検出対象の核酸の一部と相補的な塩基配列を有し、かつ、伸長後に３’側に形成される塩基配列のうち変異部位に相当する塩基部位の上流側の塩基配列（Ａ）と相補的な塩基配列（Ｂ）が、５’末端側に付加され、塩基変異を有する検出対象の核酸の変異部位に相当する塩基部位が、伸長後に３’側に形成される塩基配列内に位置するよう構成されたプライマーを準備し、
前記プライマーを伸長反応させることにより、ターゲットを作成し、
前記ターゲットを１本鎖とし、前記塩基配列（Ａ）と前記塩基配列（Ｂ）とを結合させて分子内自己ループを形成し、
前記分子内自己ループを形成した前記ターゲットとプローブとをハイブリダイゼーション反応させ、
前記ハイブリダイゼーション反応したプローブとターゲットにインターカレータを作用させ、
前記インターカレータを作用させたプローブとターゲットに流れる電流を測定することを特徴とする塩基変異の検出方法。
【請求項１２】
前記プローブに流れる電流を、前記ハイブリタイゼーション前後において、それぞれ測定することを特徴とする請求項１１記載の塩基変異の検出方法。
【請求項１３】
前記インターカレータは、フェロセン化ナフタレンジイミド、ヘキスト又はメティレンブルーのいずれかであることを特徴とする請求項１１又は請求項１２記載の塩基変異の検出方法。
【請求項１４】
請求項１１乃至１３いずれか記載の塩基変異の検出方法を使用することを特徴とする塩基変異の検出システム。
【請求項１５】
複数の電極と、前記複数の電極上にそれぞれ固定された異なった塩基配列を有する複数のプローブとを有するチップを準備し、
前記チップの前記複数のプローブの各々に所定の塩基配列を有するターゲットをハイブリタイゼーション反応させ、
前記ハイブリダイゼーション反応させたプローブとターゲットにインターカレータを作用させ、
前記インターカレータを作用させた際に前記複数の電極から取り出される電流を測定することを特徴とする塩基変異の検出方法。
【請求項１６】
前記チップは、前記複数の電極にそれぞれ対応して接続された複数の端子を具備し、前記チップとは別に設けられた電流検出システムと前記複数の端子とを接続することを特徴とする請求項１５記載の塩基変異の検出方法。
【請求項１７】
前記チップは、前記複数の電極にそれぞれ対応して接続され、電気信号を増幅する複数の増幅器を具備し、前記複数の増幅器は、前記チップとは別に設けられた電流検出システムに増幅信号を供給することを特徴とする請求項１５記載の塩基変異の検出方法。
【請求項１８】
前記ターゲットは、分子内自己ループを形成していることを特徴とする請求項１５乃至１７いずれか記載の塩基変異の検出方法。
【請求項１９】
前記複数のプローブの１つは配列番号１記載の塩基配列を有し、前記複数のプローブの他の１つは配列番号２記載の塩基配列を有することを特徴とする請求項１５乃至１８いずれか記載の塩基変異の検出方法。
【請求項２０】
前記インターカレータは、フェロセン化ナフタレンジイミド、ヘキスト又はメティレンブルーのいずれかであることを特徴とする請求項１５乃至１９いずれか記載の塩基変異の検出方法。
【請求項２１】
請求項１５乃至２０いずれか記載の塩基変異の検出方法を使用することを特徴とする塩基変異の検出システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ等の塩基配列で、特定位置にある塩基種を決定することにより、繰り返し塩基配列変異、塩基欠損変異、塩基挿入変異、転座変異等の５０塩基以上の領域で起きる種々な染色体再合成を迅速に解析する技術に関する。
【０００２】
より詳細には、ループ構造を有するターゲットを用い、かつ、インターカレータ等を用いた電気化学的に塩基変異を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
現在、ＤＮＡの塩基配列の変異を検出する方法の代表例としては、ＤＮＡシーケンシング法やＧ−ｂａｎｄｉｎｇ法、ＳＫＹ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＳＳＣＰ法、Ｔａｑｍａｎ法、インベーダー反応法等がある。
【０００４】
ＤＮＡシーケンシング法は、ＤＮＡ断片の広範囲の塩基配列を分析したい場合には向いているが、特定の部位の変異のみを検査したい場合には簡便さに欠ける。
【０００５】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法やＳＳＣＰ法は一塩基検出法であるが、前者は制限酵素に依存するため変異箇所の近辺（約３塩基以内の範囲）の制限酵素認識部位の存在に依存し、後者は、一度に多くのサンプルを迅速に解析することは困難である。
【０００６】
Ｔａｑｍａｎ法とインベーダー反応法も一塩基変異特定法であり、一方で、Ｇ−ｂａｎｄｉｎｇ法やＳＫＹ法は広範囲で起きる染色体再合成の検出に使用される。しかし、これらの技術は検出可能な変異の種類数は限られているため汎用性に欠ける。
【０００７】
非特許文献１には直鎖構造標的核酸に存在する一塩基変異や一塩基欠損検出の電気化学手法を用いて検出する例が開示されている。これらの変異は限られた領域に起きるため、周辺の配列の選択性が限られており、変異存在がＴｍ値（溶融温度）に影響する程度に依存する。従って、温度のコントロールが重要な要因となり、高検出制度を維持することが困難である。
【０００８】
現在、複数変異種を同時に検出可能な方法としてはＳＭＭＤ（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法がある。ＳＭＭＤ法はＤＮＡやＲＮＡの塩基配列の変異を検出するもので、固相に固定化したプローブ核酸に特殊なプライマーを利用して合成された一本鎖ＤＮＡがハイブリダイゼーション及びライゲーションすることにより変異の有無を判定する。ＳＭＭＤは下記特許文献１に詳細に記載されている。
【０００９】
図１７を参照して、ＳＭＭＤ法の原理を説明する。
【００１０】
はじめに、例えば１塩基多型ＳＮＰｓ等の変異を有するサンプル核酸（検出対象の核酸）と自己ループプライマー（伸長後に形成される領域の一部と水素結合するループ接合部位を５’末端側に有するプライマー）を結合させ、ＰＣＲ等の反応により、サンプル核酸と相補的な１本鎖（以下「１本鎖ターゲット」という）を合成させる。プライマーが結合する領域は変異箇所の上流（５’末端側）である（ステップ６１）。
【００１１】
このように合成された１本鎖ターゲットには、プライマーの下流（３’末端側）にループの一方の端部と相補的な塩基配列部位（以下、「ループ接合部位」という）やその下流にＳＮＰｓ部位等が存在する（ステップ６２）。
【００１２】
合成された１本鎖ターゲットのループ接合部位と伸長後に形成される領域の一部は水素結合を起こし、分子内自己ループを形成する（ステップ６３）。
【００１３】
電極上に固定化された２種類の短１本鎖核酸（以下「プローブ」という。）に塩存在条件下でターゲットを添加すると、ターゲットとプローブはハイブリダイゼーションを起こし、２本鎖核酸型となる。通常は片側のプローブは野生型遺伝子を検出するため、もう片側は変異型遺伝子を検出するためのプローブであり、両プローブは末端の１塩基のみが異なる。このため、ターゲットと両プローブのハイブリダイゼーション率はほぼ同じである。
【００１４】
更に電極上にリガーゼ（Ｌｉｇａｓｅ）酵素を作用させることにより、プローブとターゲットが完全相補である場合のみ両分子を連結させる。これがライゲーション反応である。例えばサンプルが野生型である場合、ターゲットは野生型検出プローブと完全に相補であるため、連結は可能である。しかし、野生型サンプルから得られたターゲットは、変異型検出プローブとは末端の１塩基が異なるため、連結反応は起きない（ステップ６４）。
【００１５】
ライゲーション反応が終了するとアルカリ液等を使用した強固な洗浄によりプローブとターゲットを変性させる。これにより、プローブと連結されなかったターゲット分子は洗い流され、電極上に残存するのは連結していないプローブ分子と連結されたプローブ及びターゲット分子のみとなる。このようにして、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列の変異を検出することが可能となる。
【００１６】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０１１６４６
【非特許文献１】Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ．  ａｌ，  “Ｆｅｒｒｏｃｅｎｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  Ｄｉｉｍｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａ  Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｐａｓｅ  Ｇｅｎｅ”、  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２００２、  １３、  １１９３−１１９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
ＳＭＭＤ法においては、前述したように、分子内自己ループを形成しているターゲットをプローブとハイブリダイゼーションさせた後、これに引き続いてライゲーション反応を固相上で行う。ＳＭＭＤ法におけるライゲーション反応は、分子内自己ループを形成しているターゲットの末端をプローブの末端に連結させる反応をいう。
【００１８】
しかしながら、このライゲーション反応においては、反応に用いる酵素（ライゲーション反応液として、例えば、６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、リガーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｔ４Ｌｉｇａｓｅ）８Ｕ／μ１を用いる。）の分子量が大きく、かつプローブが固相に固定化されているため、反応の進行に物理的障害が発生し、検出感度が減少することが予測される。そこで、検出感度を減少させないＳＭＭＤ法の改良が期待される。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記課題を解決するため、請求項１記載の発明においては、塩基変異を有する検出対象の核酸の一部と相補的な塩基配列を有し、かつ、伸長後に３’側に形成される塩基配列のうち変異部位に相当する塩基部位の上流側の塩基配列を含む塩基配列と相補的な塩基配列が、５’末端側に付加され、塩基変異を有する検出対象の核酸の変異部位に相当する塩基部位が、伸長後に３’側に形成される塩基配列内に位置するよう構成されたプライマーを準備し、プライマーを、ポリメラーゼ又はクレノー酵素を用いて伸長反応させることにより、ターゲットを作成し，変性によりターゲットを１本鎖とし、ターゲットを、３’末端領域に核酸の変異部位と相補的な塩基が存在するプローブとハイブリダイゼーション反応させ、ハイブリタイゼーション反応させたプローブを、ライゲーション反応を経ることなく、電気化学的に検出することを特徴とする塩基変異の検出方法を提供する。
【００２０】
また、上記課題を解決するため、請求項２記載の発明においては、プライマーは、オリゴヌクレオチドの全配列長が２０塩基以上で、５’末端側に付加された塩基配列の配列長が１３塩基以上で、Ｔｍが４０〜６０℃であることを特徴とする。
【００２１】
また、上記課題を解決するため、請求項３記載の発明においては、プローブは、その一端が固相に固定されてなることを特徴とする。
【００２２】
また、上記課題を解決するため、請求項４記載の発明においては、固相は電極であり、この電極の電流値を検出することを特徴とする。
【００２３】
また、上記課題を解決するため、請求項５記載の発明においては、固相は金であり、かつ、プローブは、配列長が１５塩基以上のオリゴヌクレオチド部とチオール基からなる固相固定部とそれら両部間にアルカン鎖からなるリンカー部を有することを特徴とする。
【００２４】
また、上記課題を解決するため、請求項６記載の発明においては、固相はカーボンであり、かつ、プローブは、アミノ修飾された固相固定部を有することを特徴とする。
【００２５】
また、上記課題を解決するため、請求項７記載の発明においては、ハイブリダイゼーション反応後に、プローブに対して電気化学的試薬を反応させた後、その際の電気化学的応答を検出することを特徴とする。
【００２６】
また、上記課題を解決するため、請求項８記載の発明においては、ハイブリダイゼーション反応は、核酸がハイブリダイゼーションするに十分な塩を含む溶液を用いて行なうことを特徴とする。
【００２７】
また、上記課題を解決するため、請求項９記載の発明においては、ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーションにより形成された２本鎖核酸を解離させない程度の塩を含む緩衝液を用いて洗浄を行なうことを特徴とする。
【００２８】
また、上記課題を解決するため、請求項１０記載の発明においては、上記塩基変異の検出方法を使用することを特徴とする塩基変異の検出システムを提供する。
【００２９】
また、上記課題を解決するため、請求項１１記載の発明においては、塩基変異を有する検出対象の核酸の一部と相補的な塩基配列を有し、かつ、伸長後に３’側に形成される塩基配列のうち変異部位に相当する塩基部位の上流側の塩基配列（Ａ）と相補的な塩基配列（Ｂ）が、５’末端側に付加され、塩基変異を有する検出対象の核酸の変異部位に相当する塩基部位が、伸長後に３’側に形成される塩基配列内に位置するよう構成されたプライマーを準備し、プライマーを伸長反応させることにより、ターゲットを作成し、ターゲットを１本鎖とし、塩基配列（Ａ）と塩基配列（Ｂ）を結合させて分子内自己ループを形成し、分子内自己ループを形成したターゲットとプローブとをハイブリダイゼーション反応させ、ハイブリダイゼーション反応したプローブとターゲットにインターカレータを作用させ、インターカレータを作用させたプローブとターゲットに流れる電流を測定することを特徴とする塩基変異の検出方法を提供する。
【００３０】
また、上記課題を解決するため、請求項１２記載の発明においては、プローブに流れる電流を、ハイブリタイゼーション前後において、それぞれ測定することを特徴とする。
【００３１】
また、上記課題を解決するため、請求項１３記載の発明においては、インターカレータは、フェロセン化ナフタレンジイミド、ヘキスト又はメティレンブルーのいずれかであることを特徴とする。
【００３２】
さらに、上記課題を解決するため、請求項１４記載の発明においては、上記塩基変異の検出方法を使用することを特徴とする塩基変異の検出システムを提供する。
【００３３】
また、上記課題を解決するため、請求項１５記載の発明においては、複数の電極と、複数の電極上にそれぞれ固定された異なった塩基配列を有する複数のプローブとを有するチップを準備し、チップの複数のプローブの各々に所定の塩基配列を有するターゲットをハイブリタイゼーション反応させ、ハイブリダイゼーション反応させたプローブとターゲットにインターカレータを作用させ、インターカレータを作用させた後、複数の電極から取り出される電流を測定することを特徴とする塩基変異の検出方法を提供する。
【００３４】
また、上記課題を解決するため、請求項１６記載の発明においては、チップは、複数の電極にそれぞれ対応して接続された複数の端子を具備し、チップとは別に設けられた電流検出システムと複数の端子とを接続することを特徴とする。
【００３５】
また、上記課題を解決するため、請求項１７記載の発明においては、チップは、複数の電極にそれぞれ対応して接続され、電気信号を増幅する複数の増幅器を具備し、複数の増幅器は、チップとは別に設けられた電流検出システムに増幅信号を供給することを特徴とする。
【００３６】
また、上記課題を解決するため、請求項１８記載の発明においては、ターゲットは、分子内自己ループを形成していることを特徴とする。
【００３７】
また、上記課題を解決するため、請求項１９記載の発明においては、複数のプローブの１つは配列番号１記載の塩基配列を有し、複数のプローブの他の１つは配列番号２記載の塩基配列を有することを特徴とする。
【００３８】
また、上記課題を解決するため、請求項２０記載の発明においては、インターカレータは、フェロセン化ナフタレンジイミド、ヘキスト又はメティレンブルーのいずれかであることを特徴とする。
【００３９】
さらに、上記課題を解決するため、請求項２１記載の発明においては、上記塩基変異の検出方法を使用することを特徴とする塩基変異の検出システムを提供する。
【発明の効果】
【００４０】
請求項１記載の発明においては、ＳＭＭＤ法においてライゲーション反応を省略することにより、変異検出効率の減少という問題を解決することができる。とりわけ、直鎖ではなく、ループ構造ターゲットについて用いた場合に、πスタック効果が現れ、検出感度の増加が顕著である。一方で、ＳＭＭＤ法の特徴であるところの、多種塩基変異の同時解析、高速な反応性、厳密な温度制御が不要、非特異的結合ＤＮＡを除去するための強固な洗浄を用いる必要がないという各種の利益も享受できる。
【００４１】
請求項２記載の発明においては、オリゴヌクレオチドの全配列長が２０塩基以上で、５’末端側に付加された前記塩基配列の配列長が１３塩基以上で、Ｔｍが４０〜６０℃であることより、より検出感度を増加することが可能となる。
【００４２】
請求項３記載の発明においては、プローブの一端が固相に固定されているので、容易にそのプローブに流れる微弱な電気信号を取り出して検出することが可能となる。
【００４３】
請求項４記載の発明においては、電極の電流値を検出することで微弱な電気信号を検出することが可能となる。
【００４４】
請求項５記載の発明においては、金電極を用い、かつ、チオール基とアルカン鎖からなるリンカー部とを有することにより、ハイブリタイゼーション時にも破壊されない十分な固定をすることが可能となる。
【００４５】
請求項６記載の発明においては、カーボン電極を用い、かつ、アミノ修飾された固相固定部を有することから、ハイブリタイゼーション時にも破壊されない十分な固定をすることが可能となる。
【００４６】
請求項７記載の発明においては、前記ハイブリダイゼーション反応後に、前記プローブに対して電気化学的試薬を反応させるため、電気化学的応答を検出することで簡単に塩基多型を検出することが可能となる。
【００４７】
請求項８記載の発明においては、ハイブリダイゼーション反応を、核酸がハイブリダイゼーションするに十分な塩を含む溶液を用いて行なうため、引き続く電気化学的応答の検出において、ターゲットとプローブとが解離することがない。
【００４８】
請求項９記載の発明においては、ハイブリダイゼーションにより形成された２本鎖核酸を解離させないため、ターゲットとプローブとが解離することがない
【００４９】
請求項１０記載の発明においては、上記効果を有する塩基変異の検出システムを提供することが可能となる。
【００５０】
請求項１１記載の発明においては、ＳＭＭＤ法においてライゲーション反応を省略することにより、変異検出効率の減少という問題を解決することができる。とりわけ、直鎖ではなく、ループ構造ターゲットについて用いた場合に、πスタック効果が現れ、検出感度の増加が顕著である。一方で、ＳＭＭＤ法の特徴であるところの、多種塩基変異の同時解析、高速な反応性、厳密な温度制御が不要、非特異的結合ＤＮＡを除去するための強固な洗浄を用いる必要がないという各種の利益も享受できる。
【００５１】
請求項１２記載の発明においては、白血病にて高頻度で検出される染色体再合成の一種であるＢＣＲ／ＡＢＬ転座等を容易に検出することができる。
【００５２】
請求項１３記載の発明においては、電流検出感度の高い測定が可能となる。
【００５３】
請求項１４記載の発明においては、上記効果を有する塩基変異の検出システムを提供することが可能となる。
【００５４】
請求項１５記載の発明においては、ＳＭＭＤ法においてライゲーション反応を省略することにより、変異検出効率の減少という問題を解決することができる。とりわけ、直鎖ではなく、ループ構造ターゲットについて用いた場合に、πスタック効果が現れ、検出感度の増加が顕著である。一方で、ＳＭＭＤ法の特徴であるところの、多種塩基変異の同時解析、高速な反応性、厳密な温度制御が不要、非特異的結合ＤＮＡを用いる必要がないという各種の利益も享受できる。さらに、電流によって検出することから、簡易な検出が可能となる。
【００５５】
請求項１６記載の発明においては、前記チップは、電流検出システムと別に構成するため、チップを取り替えるだけで新たなサンプルで塩基変異を検出でき、取扱に便利なシステムを構成できる。
【００５６】
請求項１７記載の発明においては、前記チップは、電気信号を増幅する複数の増幅器を具備するため、より感度の高い検出が可能となる。
【００５７】
請求項１８記載の発明においては、分子内自己ループの存在により、πスタック効果が十分現れる。
【００５８】
請求項１９記載の発明においては、白血病にて高頻度で検出される染色体再合成の一種であるＢＣＲ／ＡＢＬ転座を容易に検出することができる。
【００５９】
請求項２０記載の発明においては、電流検出感度の高い測定が可能となる。
【００６０】
請求項２１記載の発明においては、上記効果を有する塩基変異の検出システムを提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
以下、図面を参照して、本発明の原理を説明する。
【００６２】
図１は本発明にかかる改良されたＳＭＭＤ法の原理を説明した図である。
【００６３】
はじめに、塩基変異を有する検出対象の核酸の一部と相補的な塩基配列を有し、かつ、伸長後に３’側に形成される塩基配列のうち変異部位に相当する塩基部位の上流側の塩基配列と相補的な塩基配列が、５’末端側に付加され、塩基変異を有する検出対象の核酸の変異部位に相当する塩基部位が、伸長後に３’側に形成される塩基配列内に位置するよう構成されたプライマー２１を準備する。プライマー２１は、後述するように、分子内自己ループを形成する。このプライマー２１は、オリゴヌクレオチドの全配列長が２０塩基以上で、５’末端側に付加された塩基配列の配列長が１３塩基以上で、Ｔｍが４０〜６０℃であることを特徴とする。このように、プライマー２１は、伸長後に形成される領域の一部と水素結合するループ接合部位を５’末端側に有する。
【００６４】
ついで、（塩基多型ＳＮＰｓの変異を有する）サンプル核酸２０と自己ループプライマー２１を結合させる。プライマー２１がサンプル核酸２０と結合する領域は変異箇所の上流（５’末端側）である（ステップ１１）。
【００６５】
このプライマー２１を、ポリメラーゼ又はクレノー酵素を用いて伸長反応させることによりサンプル核酸と相補な鎖を合成させる。このように合成された相補鎖には、プライマーの下流（３’末端側）にループの一方の端部と相補的な塩基配列部位（ループ接合部位）やその下流にＳＮＰｓ部位等が存在する（ステップ１２）。
【００６６】
このようにして合成されたターゲットとサンプル核酸とからなる二本鎖を、変性により１本鎖核酸とし、合成された１本鎖である１本鎖ターゲット２２を得る。１本鎖ターゲット２２の一端側にはプライマー２１由来のループ接合部位とループの一方の端部とは水素結合をおこし、分子内自己ループを形成する（ステップ１３）。
【００６７】
電極（固相）上に固定化された２種類の短１本鎖核酸であるプローブ２３を準備する。電極は、金、カーボン、白金等を用いることができるが、これらには限られない。電極が金電極の場合は、プローブ２３は、配列長が１５塩基以上のオリゴヌクレオチド部とチオール基からなる固相固定部とそれら両部間にアルカン鎖からなるリンカー部を有する。電極がカーボンの場合は、プローブ２３は、アミノ修飾された固相固定部を有する。通常は片側のプローブは野生型遺伝子を検出するため、もう片側は変異型遺伝子を検出するためのプローブである。
【００６８】
このような電極に固定化されたプローブ２３は、１つのチップ上に多数形成される。このチップには、複数の電極にそれぞれ対応して接続された複数の端子が存在し、後述する電気化学的応答検出においては、チップとは別に設けられた電流検出システムとこの複数の端子とを接続する。チップは、この複数の電極にそれぞれ対応して接続され、電気信号を増幅する個々の増幅器を具備してもよい。
【００６９】
このプローブ２３に、塩存在条件下でターゲット２２を添加すると、ターゲット２２とプローブ２３はハイブリダイゼーションを起こし、２本鎖核酸型となる。ハイブリダイゼーション反応は、核酸がハイブリダイゼーションするに十分な塩を含む溶液を用いる（ステップ１４）。
【００７０】
ついで、ハイブリダイゼーションにより形成された２本鎖核酸を解離させない程度の塩を含む緩衝液を用いたマイルドな洗浄を行ない、ライゲーション反応を経ることなく、電気化学的に検出を行う。具体的には、フェロセン化ナフタレンジイミド、ヘキスト又はメティレンブルー等（これらには限定されない）のインターカレータ２４を作用させ、電気化学的応答（電圧−電流特性）を検出する（ステップ１５）。
【００７１】
以下の実施例に示されるとおり、ライゲーション反応を経ることなく電気化学的に検出を行った例（本発明）と、ライゲーション反応を起こした例（従来例ＳＭＭＤ法）とを比較すると、プローブを流れる電流量に顕著な差が生じる。すなわち、ライゲーション反応を経ることなく電気化学的に検出を行った例（本発明）においては、電極から取り出される電流量が大きくなる。
【００７２】
図２に、電極上で生じる核酸のイメージを示した。Ａ及びＢはリガーゼ酵素によりプローブ核酸とターゲット核酸分子が連結し、強固アルカリ洗浄を行った直後の状態を表す図である。Ｃ及びＤはハイブリタイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）のみによりプローブ核酸とターゲット核酸分子が結合した後、マイルド洗浄を行った直後の状態である。
【００７３】
電極に流れる電流量に顕著な差が生じる理由は、ライゲーション反応の進行に物理的障害が発生し、ハイブリタイゼーションを行った分子の一部しかプローブと連結されない。次の強固なアルカリ洗浄を行うことにより連結されなかったターゲット分子が洗い流され、結果的にハイブリタイゼーションのみに比べて検出感度が減少することからである。
【実施例１】
【００７４】
（比較例１）
合成オリゴＤＮＡを金の微小電極上に共有結合させたセラミック・チップであり、このチップのアレイが微小電極と相同したＥＣＡチップ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｒｒａｙ）を準備した。このＥＣＡチップの金電極にはＡｒｉｔａ一塩基欠損変異検出用プローブ（配列番号５記載の塩基配列を持つ野生型Ｗと、配列番号６記載の塩基配列を持つ変異型Ｍ、ただし、５’末端にはＨＳ−が付されている。）が存在する。
【００７５】
ついで、配列番号７記載の塩基配列を持つ自己ループプライマーを用いて、配列番号８記載の塩基配列を持つ人工合成核酸野生型ターゲットを準備した。
【００７６】
このプローブに、この人工合成核酸野生型ターゲットをハイブリダイゼーション緩衝液存在下で１０分間ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション緩衝液としては、０．１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ７．０）、１Ｍ  ＮａＣｌを用いた。
【００７７】
ついで、余分なターゲットをタオルペーパー吸収により除去してからリガーゼ酵素を含むリガーゼ反応液を５分作用させライゲーション反応を進めた。リガーゼ反応液として、６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、リガーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｔ４Ｌｉｇａｓｅ）８Ｕ／μ１を用いた。ついで、アルカリ変性溶液を用いて変性洗浄を行い、更に水洗を行った。アルカリ変性溶液としては、０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＫＣｌを用いた（以上は、従来例ＳＭＭＤ法である。）。
【００７８】
（実施例１）
一方で、同じＥＣＡチップ上の別の電極に固定化した同様の二種のプローブ（配列番号５記載の塩基配列を持つ野生型Ｗと、配列番号６記載の塩基配列を持つ変異型Ｍ、ただし、５’末端にはＨＳ−が付されている。）を準備した。
【００７９】
このプローブに、配列番号８記載の塩基配列を持つ人工合成核酸野生型ターゲットを前述したハイブリダイゼーション緩衝液存在下で１０分ハイブリダイゼーションし、蒸留水で３倍希釈した同一のバイブリダイゼーション緩衝液で５分間洗浄した（本発明）。
【００８０】
（実施例１と比較例１との電気化学的特性の比較）
ついで、電気化学測定緩衝液を用いてチップ上の全電極の電気化学測定を行った。電気化学測定緩衝液は、０．１Ｍ  ａｃｅｔａｔｅ−ａｃｅｔｉｃ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．６）、０．１Ｍ  ＫＣｌ、５０μＭ  ＦＮＤを用いた。ここにＦＮＤとは、フェロセン化ナフタレンジイミドであり、二重鎖に取り込まれるとプローブの電気的特性を変化させるインターカレータである。
【００８１】
測定結果は、金電極から取り出されるプローブを流れる電流の増加分ΔＩで表すことができる。
【００８２】
ΔＩは、以下の式１で表される。
【００８３】
ΔＩ＝（Ｉ１−Ｉ０）／Ｉ０  ×  １００（％）    ・・・（式１）
【００８４】
ここで、固定化プローブのみの電流値をＩ０、ハイブリダイゼーションのみ（本発明）あるいはライゲーション後（従来例ＳＭＭＤ法）の電流値をＩ１とする。
【００８５】
この結果、ライゲーションを行った（従来例ＳＭＭＤ法）野生型プローブ固定化電極の電流値増加は７４．７（±２１．３）％であった。一方、ハイブリダイゼーションのみを行った（本発明）同種類プローブ固定化電極の電流値増加は１２４．５（２０．７）％であった。従って、ハイブリダイゼーションのみの操作（本発明）はライゲーションを行った（従来例ＳＭＭＤ法）電極より電流値の増加が高く、有意差が得られ、検出感度の増幅に関わる可能性が示された。
【００８６】
なお、本変異は一塩基欠損であるため、ハイブリダイゼーション操作のみでは野生型と変異型の区別は不可能である。これらの結果を図３に示した。図中、電極Ａは野生型検出用プローブ＋ライゲーション操作，電極Ｂは変異型検出用プローブ＋ライゲーション操作、電極Ｃは野生型検出用プローブ＋ハイブリダイゼーション操作のみ，電極Ｄは変異型検出用プローブ＋ハイブリダイゼーション操作のみのものである。
【実施例２】
【００８７】
（比較例２）
ＥＣＡチップ金電極に固定化したＹ６１Ｘ一塩基多型変異検出用プローブ（配列番号９記載の塩基配列を持つ野生型Ｗと配列番号１０記載の塩基配列を持つ変異型Ｍ、ただし、５’末端にはＨＳ−が付されている。）を準備した。
【００８８】
ついで、配列番号１１記載の塩基配列を持つ自己ループプライマーを用いて、配列番号１２記載の塩基配列を持つ人工合成核酸野生型ターゲットを準備した。
【００８９】
この人工合成核酸野生型ターゲットをハイブリダイゼーション緩衝液存在下で１０分間ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション緩衝液としては、０．１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ７．０）、１Ｍ  ＮａＣｌを用いた。
【００９０】
ついで、余分なターゲットをタオルペーパー吸収により除去してからリガーゼ酵素を含むリガーゼ反応液を５分作用させライゲーション反応を進めた。リガーゼ反応液として、６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、リガーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｔ４Ｌｉｇａｓｅ）８Ｕ／μ１を用いた。ついで、アルカリ変性溶液を用いて変性洗浄を行い、更に水洗を行った。アルカリ変性溶液としては、０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＫＣｌを用いた（以上は、従来例ＳＭＭＤ法である。）。
【００９１】
（実施例２）
一方で、同じＥＣＡチップ上の別の電極に固定化した同様の二種のプローブ（配列番号９記載の塩基配列を持つ野生型Ｗと配列番号１０記載の塩基配列を持つ変異型Ｍ、ただし、５’末端にはＨＳ−が付されている。）を準備した。
【００９２】
このプローブに、配列番号８記載の塩基配列を持つ人工合成核酸野生型ターゲットを前述したハイブリダイゼーション緩衝液存在下で１０分ハイブリダイゼーションし、蒸留水で３倍希釈した同一のバイブリダイゼーション緩衝液で５分間洗浄した（本発明）。
【００９３】
（実施例２と比較例２との電気化学的特性の比較）
ついで、電気化学測定緩衝液を用いてチップ上の全電極の電気化学測定を行った。電気化学測定緩衝液は、０．１Ｍ  ａｃｅｔａｔｅ−ａｃｅｔｉｃ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．６）、０．１Ｍ  ＫＣｌ、５０μＭ  ＦＮＤを用いた。
【００９４】
この結果、ライゲーションを行った（従来例ＳＭＭＤ法）野生型プローブ固定化電極の電流値増加は１０５．６（±１７．２）％であった。一方、ハイブリダイゼーションのみを行った（本発明）同種類プローブ固定化電極の電流値増加は１５４．５（１７．５）％であった。従って、ハイブリダイゼーションのみの操作（本発明）はライゲーションを行った（従来例ＳＭＭＤ法）電極より電流値の増加が高く、有意差が得られ、検出感度の増幅に関わる可能性が示された。
【００９５】
なお、本変異は一塩基欠損であるため、ハイブリダイゼーション操作のみでは野生型と変異型の区別は不可能である。これらの結果を図４に示した。図中、電極Ａは野生型検出用プローブ＋ライゲーション操作，電極Ｂは変異型検出用プローブ＋ライゲーション操作、電極Ｃは野生型検出用プローブ＋ハイブリダイゼーション操作のみ，電極Ｄは変異型検出用プローブ＋ハイブリダイゼーション操作のみのものである。
【実施例３】
【００９６】
ＥＣＡチップ金電極に固定化した配列番号１記載の塩基配列を持つＢＣＲ／ＡＢＬ転座（白血病にて高頻度で検出される染色体再合成の一種）検出用プローブと、配列番号２記載の野生型ＡＢＬ遺伝子検出用プローブを準備した。ただし、いずれのプローブも、５’末端にはＨＳ−が付されている。
【００９７】
ついで、配列番号３記載の塩基配列を持つ自己ループプライマーを用いて、配列番号４記載の塩基配列を持つ人工合成核酸野生型ターゲットを準備した。
【００９８】
この人工合成核酸野生型ターゲットをハイブリダイゼーション緩衝液存在下で１０分間ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション緩衝液としては、０．１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ７．０）、１Ｍ  ＮａＣｌを用いた。
【００９９】
ついで、蒸留水で３倍希釈した同一のバイブリダイゼーション緩衝液で５分間洗浄した。
【０１００】
ついで、電気化学測定緩衝液を用いてチップ上の全電極の電気化学測定を行った。電気化学測定緩衝液は、０．１Ｍ  ａｃｅｔａｔｅ−ａｃｅｔｉｃ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．６）、０．１Ｍ  ＫＣｌ、５０μＭ  ＦＮＤを用いた。
【０１０１】
この結果、変異型プローブ固定電極の電流値増加は２６７．７（±２１．６）％であり、野生型ＡＢＬ遺伝子プローブ固定化電極の電流値増加は２９．６（５．３）％であった。従って、ハイブリダイゼーションのみの操作で有意差が得られ、本発明が有用であることが示された。これらの結果を図５に示した。ＨＳ−ＢＣＲ／ＡＢＬ３８ｍｅｒは、変異型遺伝子検出用プローブ、ＨＳ−ＡＢＬ  ３８ｍｅｒは野生型遺伝子検出用プローブにそれぞれ対応する。
【実施例４】
【０１０２】
高頻度で白血病の原因になる変異１０種類（転座８種類、逆位１種類、欠損１種類）およびポジティブコントロールであるＧ６ＰＤＨ遺伝子とネガティブコントロールであるＷＴ−１遺伝子を検出するために必要な固定化プローブ（表１参照）、逆転写用プライマー（［表２］参照）、ＰＣＲによる核酸増幅用プライマー（表３参照）とループ構造を有する１本鎖ターゲット合成用プライマー（表４参照）を準備した。
【０１０３】
【表１】
2008136384.tif 000003
【０１０４】
【表２】
2008136384.tif 000004
【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
【表４】
2008136384.tif 000006
【０１０７】
準備したＥＣＡチップの電極に表１に記載された配列のプローブを固定化した。ただし、５’末端はＨＳ−が付加されている。
【０１０８】
Ｋ５６２、ＭＥＧ−０１、ＲＥＨ、ＭＶ４−１１、ＭＬ−２、ＴＨＰ−１、ＮＢ−４、Ｋａｓｕｍｉ、ＭＥ−１、ＲＰＭＩ及びＨＬ−６０培養細胞よりＲＮＡｅａｓｙキット(Ｑｉａｇｅｎ社)を用いてトータルＲＮＡを精製し、各精製トータルＲＮＡを分光光度測定により濃度を測定した後、
ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）と表２に記載された配列のプライマー群を用いて逆転写反応を行なった。それぞれの操作や条件設定等は各キット付属の取扱説明書に従って行なった。
【０１０９】
上記反応で得られた産物をマルチプレックスＰＣＲの鋳型として、表３記載のプライマー群やＴａｋａｒａ社ＨＳ−Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素を用いて核酸増幅を行なった。増幅条件は、（ａ）９５℃１０分熱変性、（ｂ）９５℃３０秒熱変性、（ｃ）６０℃６０秒アニーリング、（ｄ）７２℃６０秒伸長、（ｅ）ｂ〜ｄを４０回繰り返し、というものであった。
【０１１０】
更にマルチプレックスＰＣＲの産物と表４記載の配列のプライマー群を用いて、一本鎖ターゲットを合成したＴａｋａｒａ社ＨＳ−Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素を用いて、増幅条件は、（ａ）９５℃５分熱変性、（ｂ）９５℃３０秒熱変性、（ｃ）６８℃４５秒アニーリング＋伸長、（ｄ）ｂ〜ｃを４０回繰り返し、というものであった。
【０１１１】
上記反応で得られた産物に１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅになるように塩を添加し、上記したＥＣＡチップに滴下し、１０分間ハイブリダイゼーションし、蒸留水で３倍希釈した同一のハイブリダイゼーション緩衝液で５分洗浄した。
【０１１２】
ついで、電気化学測定緩衝液を用いてチップ上の金電極の電気化学測定を行なった。電気化学測定緩衝液は、０．１Ｍ  ａｃｅｔａｔｅ−ａｃｅｔｉｃ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．６）、０．１Ｍ  ＫＣｌ、５０μＭ  ＦＮＤを用いた。
【０１１３】
この結果、各培養細胞が特異的に発現している変異遺伝子の検出が可能であった。Ｋ５６２とＭＥＧ−０１はＢＣＲ−ＡＢＬ転座、ＲＥＨはＴＥＬ−ＡＭＬ転座、ＭＶ４−１１はＭＬＬ−ＡＦ４転座、ＭＬ−２はＭＬＬ−ＡＦ６転座、ＴＨＰ−１はＭＬＬ−ＡＦ９転座、ＮＢ−４はＰＭＬ−ＲＡＲα転座、ＫａｓｕｍｉはＡＭＬ−ＭＴＧ８転座、ＭＥ−１はＣＢＦβＭＹＨ逆位、ＲＰＭＩはＳＩＬ−ＴＡＬ欠損検出用プローブの電流値が増加した。また、全てのサンプルではポジティブコントロールプローブにおいて電流値増加が得られ、逆にネガティブコントロールを含む他のプローブの増加は誤差範囲程度であった。ＨＬ−６０は上記他細胞株と同様、白血病由来の細胞株であるが、転座を有しないため、ポジティブコントロールであるＧ６ＰＤＨ遺伝子検出用プローブのみが電流値の増加を示した。これらの結果を図６〜図１６に示した
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ等の塩基配列で、特定位置にある塩基種を決定することにより、繰り返し塩基配列変異、塩基欠損変異、塩基挿入変異、転座変異等の５０塩基以上の領域で起きる種々な染色体再合成の解析に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】本発明の原理を示した図である。
【図２】電極上で生じる核酸のイメージを示した図である。
【図３】実施例１（Ａｒｉｔａ）の効果を従来例ＳＭＭＤ法と比較したグラフである。
【図４】実施例２（Ｙ６１Ｘ）の効果を従来例ＳＭＭＤ法と比較したグラフである。
【図５】実施例３の効果を表したグラフである。
【図６】実施例４の効果を表したグラフである。
【図７】実施例４の効果を表したグラフである。
【図８】実施例４の効果を表したグラフである。
【図９】実施例４の効果を表したグラフである。
【図１０】実施例４の効果を表したグラフである。
【図１１】実施例４の効果を表したグラフである。
【図１２】実施例４の効果を表したグラフである。
【図１３】実施例４の効果を表したグラフである。
【図１４】実施例４の効果を表したグラフである。
【図１５】実施例４の効果を表したグラフである。
【図１６】実施例４の効果を表したグラフである。
【図１７】ＳＭＭＤ法の原理を示した図である。
【符号の説明】
【０１１６】
１１  結合ステップ
１２  伸長ステップ
１３  自己ループ形成ステップ
１４  ハイブリタイゼーションステップ
１５  電気化学的検出ステップ
２０  サンプル核酸
２１  自己ループプライマー
２２  ターゲット
２３  プローブ
２４  インターカレータ
【図１】
2008136384.tif 000007
【図２】
2008136384.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
2008136384.tif 000011
【図６】
2008136384.tif 000012
【図７】
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【図８】
2008136384.tif 000014
【図９】
2008136384.tif 000015
【図１０】
2008136384.tif 000016
【図１１】
2008136384.tif 000017
【図１２】
2008136384.tif 000018
【図１３】
2008136384.tif 000019
【図１４】
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【図１５】
2008136384.tif 000021
【図１６】
2008136384.tif 000022
【図１７】
2008136384.tif 000023
【配列表】
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