(57)【要約】【課題】幹細胞の初代培養および継代培養を無血清で行うことを可能にする。【解決手段】基本培地に、５〜１０％濃度のパネキシンと、１〜１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦと、１〜１００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦと、１〜１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、１〜１０００μｇ／ｍＬのビタミンＣとを混合してなる無血清培地を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基本培地に、
５〜１０％濃度のパネキシンと、
１〜１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦと、
１〜１００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦと、
１〜１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、
１〜１０００μｇ／ｍＬのビタミンＣとを混合してなる無血清培地。
【請求項２】
５〜１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含む請求項１に記載の無血清培地。
【請求項３】
５〜１０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦを含む請求項１に記載の無血清培地。
【請求項４】
１０〜２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む請求項１に記載の無血清培地。
【請求項５】
５０〜１００μｇ／ｍＬのビタミンＣを含む請求項１に記載の無血清培地。
【請求項６】
請求項１から請求項５のいずれかに記載の無血清培地を用いて培養する幹細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無血清培地および幹細胞の培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞培養のために、培地に１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を添加する必要がある。しかしながら、ＢＳＥやヒト細胞表面への異種タンパク質の付着などの問題から、再生医療製品の開発には無血清培地の使用が望まれている。幹細胞の継代培養のために無血清培地を使用することが報告されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５９０８７８２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の方法によっても、無血清培地を使用して幹細胞の初代培養を行うことは困難である。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、幹細胞の初代培養および継代培養を無血清で行うことができる無血清培地および幹細胞の培養方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、基本培地に、５〜１０％濃度のパネキシンと、１〜１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦと、１〜１００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦと、１〜１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、１〜１０００μｇ／ｍＬのビタミンＣとを混合してなる無血清培地を提供する。
本発明によれば、幹細胞を初代培養から培養でき、ＢＳＥや異種タンパク質の付着等の問題のない再生医療製品を製造することができる。
【０００６】
上記発明においては、５〜１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むこととしてもよい。
また、上記発明においては、５〜１０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦを含むこととしてもよい。
また、上記発明においては、１０〜２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含むこととしてもよい。
また、上記発明においては、５０〜１００μｇ／ｍＬのビタミンＣを含むこととしてもよい。
また、本発明は、上記いずれかの無血清培地を用いて培養する幹細胞の培養方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、幹細胞の初代培養および継代培養を行う無血清で行うことができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の一実施形態に係る無血清培地および幹細胞の培養方法について、図１および図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る無血清培地は、基本培地に、５〜１０％濃度のパネキシンと、１〜１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦと、１〜１００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦと、１〜１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、１〜１０００μｇ／ｍＬのビタミンＣとを混合することにより構成されている。
基本培地としては、例えば、ＤＭＥＭまたはα−ＭＥＭが使用される。
【０００９】
本実施形態に係る幹細胞の培養方法は、ヒトの骨髄液等から抽出した間葉系幹細胞を、培養容器内に貯留した上記無血清培地内に投入し、温度３７℃±０．５℃、ＣＯ２濃度５％で初代培養する。初代培養は１２日間行う。
次いで、初代培養終了後、培養容器からトリプシン等の蛋白質分解酵素により剥離して回収した間葉系幹細胞を、他の培養容器に播種して、上記無血清培地内において温度３７℃±０．５℃、ＣＯ２濃度５％で継代培養する。
図１に、本実施形態に係る幹細胞の培養方法により初代培養した結果を示す。
【００１０】
本実施形態に係る無血清培地およびそれを用いた幹細胞の初代培養によれば、図１に示されるように、１０％ウシ胎児血清のみを使用した場合の初代培養と比較して遜色なく、培養９日目には、１０％ウシ胎児血清よりも多くの幹細胞を得ることができたことがわかる。
なお、１０％ウシ胎児血清および他の増殖因子を添加した場合と比較すると増殖率においては及ばないが、本実施形態に係る無血清培地とそれを用いた幹細胞の培養方法によれば、ＢＳＥや異種タンパク質の付着等の問題を生ずることなく、十分な増殖率で幹細胞を初代培養することができるという利点がある。
【００１１】
図２に、本実施形態に係る幹細胞の培養方法により継代培養した結果を示す。図２のＰＧＦｓが本実施形態に係る無血清培地を用いた場合の細胞数である。図中のＯＢＧＭは比較例として、無血清培地に代えて本実施形態に係るの１０％ウシ胎児血清を用いた場合の細胞数である。また、図中のＰＧＦｓ＿ＦＮは、培養容器内面にフィブロネクチンコーティングを施した場合の比較例である。さらに、図中のＢ２ＧＦｓは本実施形態における無血清培地内のパネキシンに代えて他の増殖因子を使用した場合の比較例である。
【００１２】
本実施形態に係る無血清培地およびそれを用いた幹細胞の継代培養によれば、ウシ胎児血清を用いた場合と比較して、約半分程度の増殖率であるが、十分な増殖を示していることがわかる。ウシ胎児血清の場合には、ＢＳＥや異種タンパク質の付着等の問題が考えられるが、本実施形態に係る無血清培地とそれを用いた幹細胞の培養方法によれば、そのような問題を生ずることなく、十分な増殖率で幹細胞を継代培養することができるという利点がある。
【００１３】
また、培養容器内面にフィブロネクチンコーティングを施した場合と比較しても、本実施形態に係る無血清培地においては、結果にほとんど差異はない。また、パネキシン以外の増殖因子を用いた無血清培地と比較して、本実施形態に係る無血清培地を使用することにより、継代培養において大きな増殖率を実現でき、多くの幹細胞を得ることができる。
【００１４】
なお、本実施形態に係る無血清培地においては、１〜１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むこととしたが、５〜１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むことが望ましい。また、１〜１００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦを含むこととしたが、５〜１０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦを含むことが好ましい。さらに、１〜１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含むこととしたが、１０〜２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含むことが好ましい。また、１〜１０００μｇ／ｍＬのビタミンＣを含むこととしたが、５０〜１００μｇ／ｍＬのビタミンＣを含むことが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施形態に係る無血清培地を用いた幹細胞の初代培養による細胞数の変化を示すグラフである。
【図２】図１の無血清培地を用いた幹細胞の継代培養により得られる細胞数の他の培地を用いた場合との比較を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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