(57)【要約】【課題】本発明は、パターン培養された細胞であっても、パターンを維持した状態で転写することを可能とする細胞転写用部材、およびその細胞転写用部材を用いた細胞転写用具を提供することを主目的とするものである。【解決手段】本発明は、片面に細胞転写層を有する細胞転写基材からなる細胞転写膜と、細胞培養時において、上記細胞転写膜の平坦性を維持する固定部と、上記固定部に接続し、かつ上記細胞転写膜の上記細胞転写層が形成されていない面側に配置された把持部と、からなることを特徴とする細胞転写用部材を提供することにより、上記課題を解決するものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
片面に細胞転写層を有する細胞転写基材からなる細胞転写膜と、細胞培養時において、前記細胞転写膜の平坦性を維持する固定部と、前記固定部に接続し、かつ前記細胞転写膜の前記細胞転写層が形成されていない面側に配置された把持部と、からなることを特徴とする細胞転写用部材。
【請求項２】
前記細胞転写層が、細胞をパターン状に培養することができるパターン培養機能を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞転写用部材。
【請求項３】
前記細胞転写層が、前記細胞転写層の表面に生理活性物質を有することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の細胞転写用部材。
【請求項４】
前記細胞転写基材が、微細な多孔質構造であることを特徴とする請求項１から請求項３までのいずれかの請求項に記載の細胞転写用部材。
【請求項５】
前記把持部が、前記固定部と脱着可能であることを特徴とする請求項１から請求項４までのいずれかの請求項に記載の細胞転写用部材。
【請求項６】
請求項１から請求項５までのいずれかの請求項に記載の細胞転写用部材と、培養プレートと、からなる細胞転写キットであって、前記細胞転写膜が前記培養プレート内壁と接触しないことを特徴とする細胞転写キット。
【請求項７】
請求項１から請求項５までのいずれかの請求項に記載の細胞転写用部材を用いることを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項８】
請求項１から請求項５までのいずれかの請求項に記載の細胞転写用部材の前記細胞転写層上に細胞が接着していることを特徴とする細胞転写用具。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞転写用具を用いることを特徴とする細胞組織の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の加工や移植等に用いられ、細胞を活性なまま転写可能とする細胞転写用部材、およびその細胞転写用部材を用いた細胞転写用具に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞を培養して組織化させたものをそのまま移植するという技術が注目されている。これは、合成高分子を用いた人工皮膚や人工血管等では移植後に拒絶反応が生じる可能性があり、使用が難しいという問題があるが、本人の細胞を培養して組織化させた培養細胞組織等を用いる場合には、拒絶反応の心配がなく、移植用に好ましく用いることができることによるものである。
【０００３】
しかしながら、細胞培養基板上で培養された上記培養細胞組織等は、例えば生体組織へ移植することや、加工のために別の培養基板上に移し変えたりすることが難しい、という問題があった。これは、例えば細胞培養基板上でパターン状に培養された培養細胞組織を回収する際、培養細胞組織のみを細胞培養基板から剥離させることが難しいからである。
【０００４】
そこで、例えばたんぱく質分解酵素や化学薬品等を用いて細胞培養基板上から剥離させて、培養細胞組織を回収する方法が提案されている。しかしながらこの方法においては、上記薬品や酵素等により細胞が変性もしくは損傷し、細胞本来の機能が損なわれる可能性があった。また、処理工程が煩雑であり、またコンタミネーションの可能性がある等の問題もあった。
【０００５】
また特許文献１には、基材上に、感温性高分子によるパターンを形成した細胞培養支持体を作製し、その細胞培養支持体上で細胞を培養した後、細胞組織を剥離する方法も提案されている。この方法によれば、感温性高分子上で培養された細胞を、例えば高分子膜等に密着させた状態で、感温性高分子の温度を変化させることにより、シート状の細胞（細胞シート）を感温性高分子から剥離させ、培養液の表面張力の作用で上記細胞シートを高分子膜に密着させることができる。その後、高分子膜側に保持された細胞シートを、培養基板や生体組織等と密着させることによって、上記細胞シートを別の培養基板上に移し変えたり、生体組織上に移植することができるのである。しかしながらこの方法においては、細胞シートの大きさが非常に小さい場合や、細胞がまばらな状態や小さなコロニーを形成した状態で培養された場合には、高分子膜との間の表面張力の作用が十分でなく、細胞が高分子膜上を流れ滑る等して、高分子膜側に密着させることができない、という問題があった。また、血管やリンパ管等の脈管網や神経網等、パターン状に培養された細胞を高分子膜に密着させた場合には、パターン状の細胞が高分子膜状を流れ滑る等してこれらのパターンが維持できない、という問題があった。
【特許文献１】特開２００３−３８１７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、パターン培養された細胞であっても、パターンを維持した状態で転写することを可能とする細胞転写用部材、およびその細胞転写用部材を用いた細胞転写用具を提供することを主目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、片面に細胞転写層を有する細胞転写基材からなる細胞転写膜と、細胞培養時において、上記細胞転写膜の平坦性を維持する固定部と、上記固定部に接続し、かつ上記細胞転写膜の上記細胞転写層が形成されていない面側に配置された把持部と、からなることを特徴とする細胞転写用部材を提供する。
【０００８】
本発明によれば、上記細胞転写膜が固定部により固定されていることにより、上記細胞転写膜は、細胞培養容器からの取り出しの際に、変形・破断を起こすことなく取り出すことができる。
【０００９】
また、上記把持部を有していることにより、上記細胞転写層上で培養した細胞を、上記把持部を把持して転写することで、例えば、ピンセット等により上記細胞転写用部材上に培養した細胞を転写する場合において、上記細胞転写用部材を掴むピンセットの先端により、生体組織等の被転写体を損傷するといったことを防ぐことができる。
【００１０】
上記発明においては、上記細胞転写層が、細胞をパターン状に培養することができるパターン培養機能を有することが好ましい。血管やリンパ管等の脈管網や神経網等の細胞をパターン状に培養できることで、例えば、培養した細胞組織等にパターン状に培養した血管細胞を転写することにより、細胞組織等への栄養分等の供給や、老廃物の排出等が可能となり、機能を保持した細胞組織等を作製することができるようになるからである。また、細胞を微小な部分にのみ接着させ、配列させるようにパターン培養することで、培養細胞を人工臓器やバイオセンサ、バイオリアクターなどに応用することが可能になるからである。
【００１１】
また、上記発明においては、上記細胞転写層が、上記細胞転写層の表面に生理活性物質を有していることが好ましい。上記細胞転写層が、上記細胞転写層の表面に上記生理活性物質を有することで、上記細胞転写層上で培養される細胞の成長、分化、機能等を調節することができるため、所望の機能を与えられた細胞を培養し、転写に用いることができるからである。
【００１２】
さらに、上記発明においては、上記細胞転写基材が微細な多孔質構造であることが好ましい。上記細胞転写基材が微細な多孔質構造であることにより、上記細胞転写層に接着した細胞は、上記細胞転写膜の細胞転写層が形成されていない面側から、所望の機能を得るのに必要な因子等の供給を受けることができる。これにより、例えば上皮細胞のように、細胞の表裏で機能の異なる細胞を培養することが可能となるからである。
【００１３】
またさらに、上記発明においては、上記把持部が、上記固定部と脱着可能であることが好ましい。上記把持部が上記固定部と脱着可能であることにより、例えば、上記細胞転写層において培養した細胞を、生体組織等の被転写体に転写する場合において、転写が完了するまで、ガーゼその他滅菌された保護素材等で被覆することがあるが、そのような際に、上記把持部を脱着可能としておくことで、上記保護素材での被覆の障害とならないものとするからである。
【００１４】
本発明は、上記本発明の細胞転写用部材と、培養プレートと、からなる細胞転写キットであって、上記細胞転写膜が上記培養プレート内壁と接触しないことを特徴とする細胞転写キットを提供する。
【００１５】
本発明によれば、上記本発明の細胞転写用部材の上記細胞転写膜と、上記培養プレート内壁とが接触しないことにより、上記細胞転写膜の上記細胞転写層上において細胞を内壁に接着させることなく安定な条件下で培養することができる。また上記細胞転写層上と上記培養プレートの内壁とで細胞を培養する場合においては、上記細胞転写層上で培養する細胞に、上記培養プレートの内壁上で培養する細胞がコンタミネーションすることなく、上記細胞転写層上、および上記培養プレート内壁において細胞を共培養することができる。
【００１６】
本発明は、上記本発明の細胞転写用部材を用いることを特徴とする細胞の培養方法を提供する。
【００１７】
本発明によれば、上記本発明の細胞転写用部材を用いることにより、上記細胞転写膜の上記細胞転写層の形成されていない面が細胞培養容器の内壁と接触することなく、上記細胞転写層上において細胞を培養することができる。これにより上記細胞転写膜の上記細胞転写層が形成されていない面側から、細胞が所望の機能を得るのに必要な因子等を供給しながら、細胞を培養することができる。したがって、例えば上皮細胞のように、細胞の表裏で機能の異なる細胞を培養することが可能となる。また、上記細胞転写用具を用いることで、培養した細胞を、生体組織等の被転写体に転写することを容易にすることができる。
【００１８】
本発明は、上記本発明の細胞転写用部材の上記細胞転写層上に細胞が接着していることを特徴とする細胞転写用具を提供する。
【００１９】
本発明によれば、上記細胞転写層が平坦性を維持するように固定されていることから、この細胞転写層上において安定に培養することができ、また培養された細胞は、転写時においては、パターンや機能を損なうことなく転写することができる。
【００２０】
本発明は、上記本発明の細胞転写用具を用いることを特徴とする細胞組織の製造方法を提供する。
【００２１】
本発明によれば、上記細胞転写用具は細胞の培養パターン、および機能を維持した状態で転写することができることにより、パターン培養された細胞、および機能を維持した細胞を組み合わされた細胞組織を容易に製造することができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、細胞の培養パターン、および機能を維持した状態で転写することを可能とする細胞転写用部材、およびその細胞転写用部材を用いた細胞転写用具を提供するといった効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、細胞の培養パターン、および機能を維持した状態で転写することを可能とする細胞転写用部材と、その細胞転写用部材を用いた細胞転写用具、細胞転写キット、および細胞の培養方法と、およびその細胞転写用具を用いた細胞組織の製造方法に関するものである。以下、本発明の細胞転写用部材、細胞転写キット、細胞の培養方法、細胞転写用具、細胞組織の製造方法について詳細に説明する。
【００２４】
Ａ．細胞転写用部材
まず、本発明の細胞転写用部材について説明する。本発明の細胞転写用部材は、片面に細胞転写層を有する細胞転写膜と、細胞培養時において、上記細胞転写膜の平坦性を維持する固定部と、上記固定部に接続し、かつ上記細胞転写膜の上記細胞転写層が形成されていない面側に配置された把持部と、からなることを特徴とするものである。
【００２５】
次に、本発明の細胞転写用部材について図を参照しながら説明する。図１は、本発明の細胞転写用部材の一例を示す概略断面図である。図１に示すように、本発明の細胞転写用部材１０は、細胞転写基材１と、上記細胞転写基材１上に形成された細胞転写層２と、からなる細胞転写膜３と、上記細胞転写膜３を固定する固定部４と、上記固定部４に接続し、かつ上記細胞転写膜３の上記細胞転写層２が形成されていない面側に配置された把持部５と、からなるものである。
【００２６】
本発明の細胞転写用部材は、細胞転写性を有する細胞転写層が形成されていることから、上記細胞転写層上で培養された細胞を、直接細胞培養基板や生体組織等の被転写体に転写することができる。また、上記細胞転写膜が上記固定部により固定されていることにより、上記細胞転写膜は、細胞培養容器からの取り出しの際に、変形・破断を起こすことなく取り出すことができる。
【００２７】
また、本発明の細胞転写用部材は、上記把持部を有していることにより、上記細胞転写用部材上で培養した細胞の転写作業においては、上記把持部を把持することで、例えば、ピンセット等により上記細胞転写用部材上に培養した細胞を転写する場合において、上記細胞転写用部材を掴むピンセットの先端により、生体組織等の被転写体を損傷するといったことを防ぐことができる。
【００２８】
本発明の細胞転写用部材は、細胞転写膜と、固定部と、把持部とからなるものである。以下、本発明の細胞転写用部材の各構成について詳細に説明する。
【００２９】
１．細胞転写膜
まず、本発明の細胞転写用部材に用いられる細胞転写膜について説明する。本発明に用いられる細胞転写膜は、片面に細胞転写層を有する細胞転写基材からなるものである。
【００３０】
（１）細胞転写層
本発明に用いられる細胞転写膜における細胞転写層について説明する。本発明に用いられる細胞転写層は、上記細胞転写基材上に形成されるものであり、その表面に細胞を接着させて培養することが可能であって、培養された細胞を、その培養パターン、および機能を損なうことなく、他の細胞培養基板や生体組織等の被転写体に転写するものである。
【００３１】
本発明における、細胞転写性とは、細胞転写層上で接着培養した細胞を、上記細胞転写層上に接着したままの状態で被転写体に生きたまま接触させ、所定時間後、その細胞を被転写体に転写することができる性質をいう。本発明において、細胞転写層上で接着培養した細胞を被転写体に接触させてから遅くとも４８時間以内に、細胞転写層上に接着していた細胞の８０％以上の細胞が被転写体に転写されたとき、細胞転写層は細胞転写性を有するものとする。  
【００３２】
なお、上記細胞転写性の評価は、細胞転写層上に接着した細胞を被転写体に所定時間接触させてから細胞転写層を剥がし、細胞転写層と被転写体とが細胞を介して接触していた所定の領域の細胞転写層および被転写体の表面に存在する細胞の数を、市販の顕微鏡で観察することにより評価することができる。被転写体が生体組織等の場合は、被転写体の顕微鏡観察が困難である場合があるが、この場合は、転写操作前の細胞転写層の所定の領域の細胞数をあらかじめ数えておき、細胞転写後、細胞転写層の上記領域に残存する細胞の数を数えることにより評価することができる。
【００３３】
また、本発明に用いられる細胞転写層は、上記細胞転写層上で培養された細胞のうちの８０％以上を転写するのに必要な時間が、２４時間以内であるものが好ましく、６時間以内であるものがより好ましい。
【００３４】
上記細胞転写層は、上記細胞転写性を有する材料からなるものであれば特に限定されるものではない。このような材料としては、例えばフッ素および酸素を含有する材料等が挙げられ、具体的にはナフィオン（商品名）等のイオン性フッ素高分子や、フッ素系シランカップリング剤、フルオロアルキル鎖と水酸基を含むゲル、エチレングリコール系シランカップリング剤等が挙げられる。
【００３５】
また、上記細胞転写層としては、親水性の高分子材料も用いることができる。具体的にはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）等の感温性高分子や、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコールブロック共重合体等のポリアルキレングリコールおよびその誘導体、リン脂質極性基を有するＭＰＣポリマー（商品名）等の両性イオン高分子等が挙げられる。
【００３６】
さらに、上記細胞転写層は、光触媒を含有していてもよい。具体的には上記細胞転写層を、上記細胞転写性を有する材料と光触媒微粒子との混合物からなる層とすることや、上記細胞転写層を、少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層と上記細胞転写性を有する材料からなる層との２層からなる層等とすることができる。この際、用いられる光触媒としては、例えば特開２００１−２４９２１９号公報に記載されているものと同様とすることができる。
【００３７】
本発明に用いられる細胞転写層は、細胞転写性を有するものであれば特に限定されるものではなく、他の機能を付与しても良い。本発明においては、細胞をパターン状に培養することができるパターン培養機能を有することが好ましい。血管やリンパ管等の脈管網や神経網等の細胞をパターン状に培養できることで、例えば、培養した細胞組織等にパターン状に培養した血管細胞を転写できることにより、細胞組織等への栄養分等の供給や、老廃物の排出等が可能となり、機能を保持した細胞組織等を作製することができるようになるからである。また、細胞を微小な部分にのみ接着させ、配列させるようにパターン培養することで、培養細胞を人工臓器やバイオセンサ、バイオリアクターなどに応用することが可能になる。
このようなパターン培養機能を付与する方法としては、例えば、図２に示すように、細胞転写層２が、細胞との接着性を有する細胞接着領域６と細胞接着性を有しない細胞接着阻害領域７とからなるものとする方法が挙げられる。細胞転写層が、細胞接着領域と細胞接着阻害領域とを有する場合、細胞接着領域上にのみ細胞を接着させて培養することが可能となり、パターン状に細胞を転写することが可能となる。細胞転写層に形成された細胞接着領域は一箇所であってもよいし複数個所であってもよい。その形状も特に限定されず、円形、多角形、ライン、分岐を有するライン、ネットワーク状、リング状、これらが組合された形状など様々な態様が考えられる。
【００３８】
上記細胞転写層にパターン培養機能を付与するために、細胞接着領域および細胞接着阻害領域を形成する方法としては、特に限定されるものでないが、例えば、水との接触角を調整する接触角調整法、水和能を調整する水和能調整法、細胞と結合することができるバインダー物質をパターン状に付与するバインダー付与法、表面の凹凸形状により調整する形状調整法等を挙げることができる。
【００３９】
上記接触角調整法としては、細胞接着領域および細胞接着阻害領域の水との接触角を異なるように設定することによりパターン培養機能を付与するものである。ここで、細胞を培養し、かつ転写するために用いられる細胞接着領域は、転写する細胞の種類等により適宜選択されるものであるが、通常、細胞転写層表面の水との接触角が１０°〜６０°程度の領域、中でも１５°〜５５°の範囲内の領域とされていることが好ましい。このような水との接触角を有するものとすることにより、細胞を細胞転写層上に接着させて培養し、活性なまま被転写体に転写することができるからである。また上記範囲より水との接触角が大きい場合には、細胞を細胞転写層上に接着させることは可能であるが、転写することが困難となり、上記範囲より水との接触角が小さい場合には、細胞を細胞転写層上に接着させることが困難となるからである。なお、細胞を転写するパターンの幅が１ｍｍ以下のラインやドットである場合等には特に、上記細胞接着領域表面の水との接触角が、１０°〜４５°の範囲内、中でも１５°〜３５°の範囲内とされていることが好ましい。このような範囲内とすることにより、高精細なパターン状に細胞を転写することが可能となるからである。
【００４０】
また、細胞転写層が細胞接着阻害領域を有する場合には、この細胞接着阻害領域は、細胞接着領域の水との接触角より１０°〜４０°程度、中でも１５°〜３５°程度水との接触角が小さい領域とすることが好ましい。このような領域では、細胞との接着性が悪いものとすることができるからである。また、細胞接着領域の水との接触角より、５０°〜１６０°程度、中でも６０°〜１５０°程度水との接触角が大きい領域も細胞との接着性を悪いものとすることができ、当該領域は細胞接着阻害領域とすることができる。
【００４１】
上記細胞転写層に、上記細胞接着領域と、上記細胞接着阻害領域とを形成する方法としては、例えば細胞と接着阻害性を有する層を形成した後、細胞接着領域とする部分のみ水との接触角を変化させる方法や、細胞接着性を有する層を形成した後、細胞接着阻害領域とする部分のみの水との接触角を変化させる方法等が挙げられる。例えば上述したような材料を用いて細胞転写層を形成した後、細胞接着領域とする部分のみ、もしくは細胞接着阻害領域とする部分のみ、水との接触角を低下させる方法や、上述したような材料を用いて細胞転写層を形成した後、細胞接着領域とする部分のみ、もしくは細胞接着阻害領域とする部分のみ水との接触角を高くする方法等が挙げられる。
【００４２】
上述したような細胞転写層の水との接触角を大きいものとする方法としては、例えば細胞転写層表面に微細な凹凸を形成する方法等が挙げられ、例えば、資料ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・アプライド・フィジックス、パート２、３２巻、Ｌ６１４〜Ｌ６１５、１９９３年  Ｏｇａｗａら、に開示されている方法や、資料ラングミュア、１９巻、１０６２４〜１０６２７、２００３年  Ｔｅｓｈｉｍａら、に開示されている方法を用いることができる。
【００４３】
また、上記細胞転写層の水との接触角を小さくする方法としては、例えばエネルギー照射に伴う光触媒の作用を利用し、撥液性を有する基を分解または変性させる方法や、熱照射、紫外光照射、電子線照射等により撥液性を有する基を分解または変性させる方法等が挙げられる。上述したように、細胞転写層中に光触媒が含有されている場合には、この細胞転写層中の光触媒の作用を利用して、細胞転写層との水との接触角を低下させることができる。また、細胞転写層中に光触媒が含有されていない場合には、例えば特開２００１−２４９２１９号公報に記載されている光触媒を用いたパターニング方法や、特開２００３−２２２６２６号公報に記載されている光触媒を用いたパターニング方法等を用いて、細胞転写層の水との接触角を低下させることができる。また、熱照射や紫外光照射、電子線照射等によるパターニングは、これらのエネルギーを用いてパターニングする一般的な方法と同様とすることができるので、ここでの詳しい説明は省略する。
【００４４】
上記水和能調整法としては、細胞接着領域および細胞接着阻害領域の水との水和能が異なるように設定することによりパターン培養機能を付与するものである。ここで、細胞接着領域は、転写する細胞の種類等により適宜選択されるものであるが、水和能の小さい材料により形成し、細胞接着阻害領域は水和能の高い材料を用いて形成される。水和能の高い材料を用いることにより、材料の周りに水分子が集まった水和層が形成される。このような水和能の高い物質は水分子との親和性の方が細胞との親和性より高いことから、細胞が上記水和能の高い材料と接着することができず、細胞接着阻害領域となるのである。ここで、上記水和能とは、水分子と水和する性質をいい、水和能が高いとは、水分子と水和しやすいことをいうこととする。
また、上記細胞転写層の細胞接着領域としたい部分の水和能を小さくする方法としては、例えば、上記接触角の調整に用いたものと同様に光触媒の作用を用いる方法や、熱照射、紫外光照射、電子線照射等により水和能を有する基を分解または変性させる方法等が挙げることができる。
【００４５】
上記バインダー付与法としては、通常は、バインダー物質を付与された領域が細胞接着領域として機能し、バインダー物質が付与されていない領域が細胞接着阻害領域として機能することになる。このようなパターニング方法としては、例えば、細胞転写層の全面に細胞接着阻害領域を形成した後、所望のパターン状にバインダー物質を付与してもよく、細胞転写層の全面にバインダー物質を付与した後、上記接触角の調整に用いたものと同様に光触媒の作用を用いる方法や、熱照射、紫外光照射、電子線照射等によりバインダー物質を分解または変性させる方法等が挙げることができる。
ここでバインダー物質としては、細胞と結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、細胞表面に発現しているレセプターと結合可能な糖鎖、蛋白質等を挙げることができる。本発明においては、なかでも細胞特異的に発現しているレセプターと特異的結合をすることができるバインダー物質を用いることが好ましい。このような細胞特異的結合を行うバインダー物質を上記細胞転写層上にパターニングすることで、例えば、同一細胞転写層上に、二以上の異なる細胞が混ざることなくパターニングすることを可能とするからである。
【００４６】
上記形状調整法としては、後述するように細胞転写層が形成される細胞転写基材表面に凹凸形状を付与して、例えば上記凸部上にのみ、もしくは凹部上にのみ細胞転写層を形成して高精細なパターン状に細胞を培養し、転写することが可能となる。
【００４７】
本発明においては、上記パターン培養機能は、上述した１種類の方法によって形成したものであっても良く、また２種類以上の方法を組み合わせたものであってもよい。
【００４８】
また、本発明に用いられる細胞転写層は、上記細胞転写層の表面に生理活性物質を有することが好ましい。本発明に用いられる生理活性物質は、何らかの生物学的機能を有する物質のことで、例えば、抗体、接着分子、サイトカイン、成長因子、酵素阻害剤やレセプターに限らず、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、蛋白質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、糖蛋白質、単糖類、多糖類、及びビタミン類など低分子物質から高分子物質までの種々の物質を用いることができる。上記細胞転写層が、このような生理活性物質を有することで、上記細胞転写層上で培養される細胞の成長、分化、機能等を調節することができるため、所望の機能を与えた細胞を培養し、転写に用いることができるからである。
【００４９】
本発明に用いられる細胞転写層の形成方法としては、上記細胞転写層の種類や、上記細胞転写用部材の形状等に合わせて適宜選択されるものであるが、通常ロールコート法、ダイコート法、ビードコート法、スピンコート法等の湿式コーティング法や、熱ＣＶＤ法、シランカップリング法、吸着法、交互吸着法等を用いることができる。
【００５０】
ここで、上述したような細胞転写層の膜厚としては、上記細胞転写層の種類等により適宜選択されるものであるが、通常１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲であり、好ましくは１．５ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲が好ましく、中でも２０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲が好ましい。上記細胞転写層の厚みを上記範囲内とすることにより、細胞を安定して培養し、転写することが可能となるからである。
【００５１】
（２）細胞転写基材
本発明に用いられる細胞転写基材について説明する。本発明に用いられる細胞転写基材は、上記細胞転写層を均一に形成可能なものであり、公知の方法で滅菌できることが可能なものであれば細胞転写基材の種類等は特に限定されるものではない。公知の滅菌方法としては、例えばγ線を照射して滅菌する方法、紫外光を照射して滅菌する方法、電子線を照射して滅菌する方法、オートクレーブにより滅菌する方法、アルコールにより滅菌する方法、エチレンオキサイドガスにより滅菌する方法等が挙げられる。
【００５２】
このような細胞転写基材としては、一般的な細胞培養基板の基材として用いることが可能なものを用いることができる。具体的には、ガラスや金属、シリコン等の無機材料、およびプラスチックに代表される有機材料等を用いることができる。これは、培養条件等により適宜選択されるものであるが、本発明においては、なかでも、有機材料からなるものが好ましい。上記有機材料は、成形性に優れ、かつ柔軟性等の調整が容易であることから、例えば、上記細胞転写基材を、柔軟性の高いものとすることにより、上記細胞転写基材からなる細胞転写膜についても柔軟性を有する膜とすることで、曲面を有する生体組織等の被転写体にも、パターンおよび機能を維持したまま細胞を転写することを可能とする等、種々の用途に用いることが容易であるからである。
【００５３】
このような有機材料としては可撓性や透明性等、上記細胞転写基材を用いた上記細胞転写膜に必要とされる機能に基づき適宜選択され、例えば、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン共重合体、テフロン（登録商標）やエチレン−テトラフロオロエチレン共重合体等のフッ素樹脂、ポリカーボネート、アセタール樹脂、ポリサルフォン、ポリ塩化ビニル、シリコーン樹脂、ポリスチレン、スチレン−アクリロニトリル共重合体、ポリメタクリル酸メチルなどのアクリル樹脂、ポリウレタン、ポリエステル、ポリイミド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン、エラスチン等の生体吸収性高分子等を用いることができる。また、不織布や織布等も用いることができる。
【００５４】
本発明において、上記有機材料としてポリエステルなどの高分子基材を用いる場合において、上記細胞転写基材は、上記細胞転写層との密着性を向上させるために中間層を設けてもよい。上記中間層は、上記細胞転写基材および細胞転写層と接着し細胞転写層を均一に設けることができれば特に限定されないが、極性高分子や金属酸化物であることが好ましい。上記極性高分子としては、例えばポリビニルアルコール、ポリメタクリル酸２−ヒドロキシエチル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリリジン等を挙げることができる。上記金属酸化物としては、例えばケイ素系酸化物、チタン系酸化物、アルミ系酸化物、りん酸化物等を挙げることができる。これら金属酸化物層は有機物やフッ化物を含んでいても良い。
【００５５】
このような中間層の成膜方法は、ロールコート、ダイコート、ビードコートなどの湿式コーティング法、スパッタ、ＰＶＤ（physical vapor deposition）、ＣＶＤ（chemical vapor deposition）、プラズマなどの乾式コーティング法を好適に用いることができる。
【００５６】
本発明に用いられる細胞転写基材は、微細な多孔質構造であることが好ましい。上記細胞転写基材が、微細な多孔質構造であることにより上記細胞転写層に接着した細胞は、上記細胞転写膜の細胞転写層が形成されていない面側から、所望の機能を得るのに必要な因子等の供給を受けることができる。これにより、例えば上皮細胞のように、細胞の表裏で機能の異なる細胞を培養することが可能となるからである。
【００５７】
このような微細な多孔質構造である細胞転写基材は、細胞転写層上に培養された細胞を転写する前に、フィーダー細胞を用いて共培養する必要がある場合等に特に有用である。またこの場合、細胞転写操作時に、培養液や酸素が全ての細胞に均一に行き渡るという効果もある。この場合、孔の平均の大きさは細胞の種類に依存するが、通常０．１μｍ〜５μｍであることが好ましく、特に０．２μｍ〜１．５μｍであることがさらに好ましい。孔の大きさが０．１μｍ未満だと栄養や液性因子などの培養細胞への供給効率が悪くなるからである。また孔の大きさが５μｍを超えると孔の中や細胞転写基材の裏面まで培養細胞が接着する割合が増し、培養細胞を効率良く転写できなくなるからである。
【００５８】
ここで、上述した細胞転写基材の厚みは、選択する材料によって異なるが、１μｍ〜２５０μｍの範囲が好ましく、なかでも５μｍ〜２００μｍの範囲であることが好ましい。上記細胞転写基材の厚みが、上記範囲より薄い場合には、柔軟性が非常に高いため、強度が不足し、簡単に裂けたり破れたりする場合があるなど、取り扱いが非常に難しくなるからである。また上記範囲より厚みが厚い場合には、柔軟性が不足することから、細胞転写用部材上に培養された細胞を転写する際、被転写物との密着性が悪くなる場合があるからである。
【００５９】
また、例えば図３に示すように、上記細胞転写基材１は細胞転写層２が形成されるパターン状に凹部や凸部が形成されたものであってもよい。この場合、上記凸部上にのみ、もしくは凹部上にのみ細胞転写層を形成して高精細なパターン状に細胞を培養し、転写することが可能となる。このような凹部や凸部の幅としては、通常１０μｍ〜５００μｍ程度、中でも２０μｍ〜２００μｍ程度とすることができる。また、上記凹部や凸部の高さとしては、０．１μｍ〜１００μｍ程度、中でも０．２μｍ〜２０μｍ程度とすることができる。本発明において上記細胞転写基材の凹凸を上記範囲に規定したのは、上記範囲より大きいと、上記細胞転写基材の凹部の厚みが薄くなりすぎることにより強度が不足し、簡単に裂けたり破れたりする場合があるからである。
【００６０】
（３）細胞転写膜
本発明に用いられる細胞転写膜は、上記細胞転写基材と、上記細胞転写基材の片面に形成された細胞転写層とからなるものである。
【００６１】
上記細胞転写膜は、上記細胞転写基材、および細胞転写層を有するものであれば、特に限定されるものではなく、必要に応じて適宜他の層を有していてもよく、例えば上記細胞転写層上に細胞転写補助層等が形成されているもの等とすることができる。以下、本発明に用いられる細胞転写補助層について説明する。
【００６２】
（細胞転写補助層）
上記細胞転写補助層としては、細胞転写層上に形成されるものであり、この細胞転写補助層上に細胞が接着されることとなる。このような細胞転写補助層は、細胞転写補助層上で細胞を培養した後、細胞を転写する際、細胞と一緒に被転写体側に少なくとも一部が一緒に転写される。本発明においては、このような細胞転写補助層が形成されていることにより、より効率よく細胞を被転写体上に転写させることが可能となるのである。このような細胞転写補助層としては、被転写体側に影響を及ぼさないものが選択され、例えばコラーゲン等のポリペプチドや、ヒアルロン酸等の多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ポリリジン等が挙げられる。また上記細胞転写補助層中には、カルシウムイオンやマグネシウムイオン等の金属イオンが含まれていてもよい。
【００６３】
本発明において、上記細胞転写膜の形状およびサイズは、特に限定されるものではなく、本発明の細胞転写用部材の用途に応じて選択することができる。
【００６４】
２．固定部
次に、本発明の細胞転写用部材に用いられる固定部について説明する。本発明に用いられる固定部は、上記細胞転写膜を固定し、細胞培養時において、上記細胞転写膜の平坦性を維持するものであり、細胞培養容器からの取り出しの際に、上記細胞転写膜を、変形・破断を起こすことなく取り出すことができるものであれば、特に限定されるものではない。
【００６５】
このような固定部としては、図４に示すように、上記細胞転写膜の上記細胞転写層が形成されていない面側に接続したリング状のもの、図５に示すように上記細胞転写膜の上記細胞転写層が形成されていない面側に張り合わせたシート状のもの、図６に示すように、固定部４を、上側固定部８と下側固定部９とからなる分割可能な部材とし、上記上側固定部８と上記下側固定部９との間に上記細胞転写膜３を配置し、上記上側固定部８と上記下側固定部９を嵌め合わせることで、上記細胞転写膜３を固定するものなどが挙げられる。また、上記上側固定部と上記下側固定部とからなる分割可能な固定部としては、図７に示すように、リング状の上側固定部８と下側固定部９との隙間に上記細胞転写膜３を巻き込むように固定するものとしてもよい。本発明においては、なかでも、図４に示すような上記細胞転写膜の上記細胞転写層が形成されていない面側に接続したリング状のものが好ましい。細胞転写時において、被転写体に損傷を与えることなく転写を行うことができるからであり、また上記細胞転写層上で培養する細胞に、上記細胞転写膜の上記細胞転写層が形成されていない面側から、細胞に必要な因子等を供給することが容易である、上記細胞転写膜が柔軟性を有している場合には、上記柔軟性を損なうことなく上記細胞転写膜を固定することができる、といった利点があるからである。
【００６６】
本発明において、図４に示すような固定部の上記細胞転写膜の固定方法は、上記細胞転写膜と上記固定部を積層したものを加熱圧着して固定する方法や、接着剤を介して固定する方法が挙げられる。本発明においては、細胞を培養する部材であることを考慮して、加熱圧着して固定する方法が好ましい。また接着剤を使用する際には、細胞への影響がない成分からなることが好ましい。
【００６７】
このような固定部に用いられる材料としては、上記「１．細胞転写膜」の項に記載した、細胞転写基材と同様のものを用いることができるため、ここでの説明は省略する。
【００６８】
３．把持部
次に、本発明の細胞転写用部材に用いられる把持部について説明する。本発明に用いられる把持部は、上記細胞転写膜を固定する固定部に接続し、かつ上記細胞転写膜の上記細胞転写層が形成されていない面側に配置されたものであり、上記細胞転写層上で培養した細胞を、上記把持部を把持して転写することが可能なものであれば、特に限定されるものではない。
【００６９】
このような把持部としては、上記固定部との接続位置が、図８に示すように上記細胞転写膜を上記固定部により固定してなる膜固定物２０の上記細胞転写層が形成されていない面側である固定部面２１であるものや、図９に示すように上記固定部の上記固定部面と垂直な面である固定部側面２２であるものを挙げることができる。
また、上記把持部５の配置は、図８に示すように、上記固定部の全周に配置した円錐台状のものや、離間した柱状の把持部を用いるものが挙げられる。離間した柱状の把持部の一例を示す概略図を図１０に示す。図１０（ａ）に示すように上記離間した柱状の把持部は、上記固定部に接続し、上記細胞転写膜の上記細胞転写層が形成されていない面側に配置したものである。図１０（ｂ）は図１０（ａ）の矢視断面を示す概略断面図であり、上記細胞転写膜と上記固定部が円形であり、かつ上記離間した柱状の把持部が４本配置された場合を示すものである。本発明の細胞転写用部材を用いた細胞培養時の安定性のために、上記離間した柱状の把持部は、３本以上からなることが好ましい。また、上記把持部は、上記把持部が上記離間した柱状である場合において、図１１に示すように、収束部３０に接続したものであってもよい。本発明の細胞転写用部材のサイズによっては、転写の際に上記離間した柱状の把持部が上記収束部に接続していることにより、より安定的に把持することができるからである。上記収束部の数は、上記離間した柱状の把持部の数より少ない数であれば、特に限定されない。本発明において、上記収束部の数は、取り扱い性の観点から１乃至２本が好ましい。
【００７０】
本発明における、上記把持部と上記固定部との接続位置、および上記把持部の配置は、培養条件等に応じて適宜組み合わせて用いることができる。本発明においては、上記把持部と上記固定部との接続位置を、上記固定部の上記固定部面とするのが好ましい。転写時において被転写体に損傷を与える可能性を小さくすることができるからである。また本発明においては、上記把持部の配置を、図８に示すような、上記固定部の全周に配置した円錐台状のものとすることが好ましい。培養容器上に上記本発明の細胞転写用部材を配置し、細胞を培養する場合において、上記細胞転写用部材の安定性を良好なものとするからである。この場合、上記把持部５と上記固定部の固定部面２１とがなす角度２３が、４５°〜１３５°の範囲が好ましく、特に６５°〜１１５°の範囲が好ましい。本発明において、上記把持部と上記固定部の固定部面とがなす角度を上記範囲とするのは、上記範囲より小さいと細胞培養時の、上記細胞転写用部材の安定性が低下し、上記範囲より大きいと、転写の際に、上記把持部の把持が困難となるからである。
【００７１】
また、本発明に用いられる把持部は、上記把持部が図８に示すような上記固定部の全周に配置した円錐台状のものである場合において、側面に孔を配置したものであってもよい。上記転写用部材の細胞転写層上において培養される細胞に、所望の機能を得るのに必要な因子等を産生させる目的で、培養容器の底面においてフィーダー細胞を培養する場合において、培養容器の底面で培養するフィーダー細胞への、栄養分の補給、培地の交換が容易となったり、培養容器の底面で培養するフィーダー細胞に産生させた因子等を、上記細胞転写層上で培養する細胞へ、上記細胞の上記細胞転写層と接着している面側からだけでなく、上記細胞転写層と接着していない面側からも供給することができるからである。また、上記把持部の孔の有無、孔のサイズ等については特に限定されるものではなく、本発明の細胞転写用部材の用途等に応じて選択することができる。
【００７２】
本発明に用いられる把持部は、上記固定部と脱着可能であることが好ましい。上記把持部が上記固定部と脱着可能であることにより、例えば、上記細胞転写層において培養した細胞を、生体組織等の被転写体に転写する場合において、転写が完了するまでガーゼその他滅菌された保護素材で被覆することがあるが、そのような際に、上記把持部を脱着可能としておくことで、上記保護素材での被覆の障害とならないものとするからである。
【００７３】
このような脱着可能とする方法としては、上記固定部と上記把持部の接続部に粘着剤を塗布しておく方法や、上記固定部に配置した孔に上記把持部の一端を挿入することにより固定する、嵌め込み式とする方法が挙げられる。本発明においては、細胞転写用の細胞を培養する部材であることから、嵌め込み式とすることにより脱着可能とすることが好ましい。また粘着剤を使用する際には、細胞への影響がない成分からなることが好ましい。
【００７４】
本発明に用いられる把持部の材料としては、上記「１．細胞転写膜」の項に記載した、細胞転写基材と同様のものを用いることができるため、ここでの説明は省略する。
【００７５】
４．細胞転写用部材
本発明の細胞転写用部材は、片面に細胞転写層を有する細胞転写基材からなる細胞転写膜と、細胞培養時において、上記細胞転写膜の平坦性を維持する固定部と、上記固定部に接続し、かつ上記細胞転写膜の上記細胞転写層が形成されていない面側に配置された把持部と、を有するものであれば、特に限定されるものではない。
【００７６】
本発明の細胞転写用部材は、上記細胞転写層上で培養された細胞を、加工のために別の培養基板上に移し変えたり、上記細胞を生体組織等の被転写体に転写することに用いられることとなる。
【００７７】
Ｂ．細胞転写キット
次に、本発明の細胞転写キットについて説明する。本発明の細胞転写キットは、上記本発明の細胞転写用部材と、培養プレートと、からなる細胞転写キットであって、上記細胞転写膜が上記培養プレート内壁と接触することがないことを特徴とするものである。
【００７８】
本発明によれば、上記本発明の細胞転写用部材の上記細胞転写膜と、上記培養プレート内壁とが接触しないことにより、上記細胞転写膜の上記細胞転写層上において細胞を、振動等がない安定な条件下で培養することができる。また上記細胞転写層上と上記培養プレートの内壁とで細胞を培養する場合においては、上記細胞転写層上で培養する細胞に、上記培養プレートの内壁で培養する細胞がコンタミネーションすることなく、上記細胞転写層上、および上記培養プレート内壁において細胞を共培養することができる。
【００７９】
本発明の細胞転写キットは、細胞転写用部材と培養プレートとからなるものである。以下、本発明の細胞転写キットの各構成について詳細に説明する。
【００８０】
１．細胞転写用部材
まず、本発明に用いられる細胞転写用部材について説明する。本発明に用いられる細胞転写用部材については、上記「Ａ．細胞転写用部材」の項に記載したものと同様の内容であるので、ここでの説明は省略する。
【００８１】
２．培養プレート
次に、本発明に用いられる培養プレートについて説明する。本発明に用いられる培養プレートは、上記細胞転写膜と、上記培養プレート内壁とが接触することがないものであれば、特に限定されるものではない。このような培養プレートとしては、上記培養プレートが、上記細胞転写膜と上記培養プレート内壁とが接触しない状態で、上記細胞転写用部材を固定可能なものとするものが挙げられる。
【００８２】
本発明において、上記培養プレートが、上記細胞転写用部材を固定する固定方法は、特に限定されるものではないが、接着剤を用いる方法や、上記培養プレートに配置した孔に上記細胞転写用部材の上記把持部の片端を挿入することにより固定する、嵌め込み式とする方法が挙げられる。本発明においては、細胞転写に用いる細胞を培養するものであることを考慮して、嵌め込み式等の方法が好ましい。このような培養プレートとしては、例えば、図１２に示すように、上記細胞転写用部材１０の把持部５の一端を挿入することで固定可能とする底面凹部４２を備えた培養プレート４１を挙げることができる。
【００８３】
また、本発明において、上記培養プレートが上記細胞転写用部材を固定可能とすることにより、上記細胞転写膜と上記培養プレート内壁とを接触しないものとした場合には、上記細胞転写用部材の上記細胞転写層上において、不要な振動を与えることなく細胞を培養することができ、さらに、上記細胞転写用部材上、および上記培養プレート底面上の両方で細胞を培養する際に、上記細胞転写用部材が上記培養プレート底面上を移動しないことにより、上記培養プレート底面上の細胞に損傷を与えることなく、上記細胞転写用部材上、および上記培養プレート底面上で細胞を共培養することができる。
【００８４】
本発明においては、上記培養プレートが、上記細胞転写用部材を２個以上挿入可能なものとしてもよい。このように上記培養プレートを、上記細胞転写用部材を２個以上挿入可能なものとすることは、例えば、２種類以上の細胞種を互いにコンタミネーションすることなく共培養することが必要な場合において有用である。
【００８５】
本発明において、上記培養プレートに用いられる材料としては、一般的な細胞培養基板の基材として使用されるものを用いることができる。具体的には、ガラスや金属、シリコン等の無機材料、およびプラスチックで代表される有機材料等を用いることができ、必要に応じて、上記培養プレートの底面に、表面処理を施しても良い。このような表面処理としては、上述した「Ａ．細胞転写用部材」の項に記載した、細胞転写性を有する層や、生理活性物質を有する層を形成するもの等が挙げられる。
【００８６】
３．細胞転写キット
本発明の細胞転写キットは、細胞転写用部材と培養プレートとからなるものであれば、特に限定されるものではない。このような細胞転写キットとしては、例えば、既に説明した、図１２に示すように、本発明の細胞転写キット４０が、上記本発明の細胞転写用部材１０と、上記細胞転写用部材１０を固定可能な底面凹部４２を備えた培養プレート４１と、からなるものを挙げることができる。また、本発明の細胞転写キットは、上記細胞転写用部材の上記細胞転写層が、上記培養プレートの底面と対向するように固定するものであってもよい。このような細胞転写キットとしては、図１３に示すように、上記細胞転写用部材１０の上記把持部５と上記培養プレート４１の内壁に設けられた壁面凹部４３とを、嵌め合わせることで固定するものが挙げられる。本発明においては、上記細胞転写層と上記培養プレートの底面とを対向させるものとするか、対向させないものとするかは、目的とする細胞培養条件等によって適宜選択されるものであり、特に限定するものではない。
【００８７】
Ｃ．細胞の培養方法
次に、本発明の細胞の培養方法について説明する。本発明は、上記本発明の細胞転写用部材を用いることを特徴とするものである。本発明によれば、上記本発明の細胞転写用部材を用いることにより、上記細胞転写膜の上記細胞転写層の形成されていない面が細胞培養容器の内壁と接触することなく、上記細胞転写層上において細胞を培養することができる。これにより上記細胞転写膜の上記細胞転写層が形成されていない面側から、細胞が所望の機能を得るのに必要な因子等を供給しながら、細胞を培養することができる。したがって、例えば上皮細胞のように、細胞の表裏で機能の異なる細胞を培養することが可能となる。また、上記細胞転写用具を用いることで、培養した細胞を、生体組織等の被転写体に転写することを容易にすることができる。
【００８８】
本発明の細胞の培養方法は、上記本発明の細胞転写用部材を用いて細胞を培養するものであれば、特に限定されるものではない。このような細胞の培養方法としては、細胞培養プレートに細胞転写用部材を挿入し、細胞培養用部材とする細胞培養用部材準備工程と、上記細胞培養用部材の上記細胞転写層に細胞を播種し、接着させ、上記細胞を培養する細胞培養工程と、からなるものを挙げることができる。以下、これらの各工程について説明する。
【００８９】
１．細胞培養用部材準備工程
まず、本発明における細胞培養用部材準備工程について説明する。本工程は、細胞転写用部材を細胞培養プレートに挿入し細胞培養用部材とする工程である。本工程に用いられる細胞転写用部材としては、上記本発明の細胞転写用部材を用いるものである。上記本発明の細胞転写用部材については、上述した「Ａ．細胞転写用部材」の項に記載したものと同様の内容であるので、ここでの説明は省略する。
【００９０】
本工程に用いられる細胞培養プレートは、一般的な細胞培養プレートを用いることができ、特に限定されるものではない。本発明においては、なかでも、上述した「Ｂ．細胞転写キット」の項に記載した培養プレートを最も好ましく用いることができる。上記細胞培養プレートに挿入する細胞転写用部材が上記本発明の細胞転写用部材であるため、上記細胞培養プレートとして、上記本発明の細胞転写キットに用いられた上記細胞転写用部材を固定可能な培養プレートを用いることで、上記細胞転写用部材の上記細胞転写膜が上記細胞培養プレート内壁と接触することなく、上記細胞培養層上において細胞を培養することができる細胞培養用部材とすることができるからである。
【００９１】
また、本工程に用いられる細胞培養プレートは、上記細胞培養プレートの底面に表面処理を施しても良い。このような表面処理としては、上述した「Ａ．細胞転写用部材」の項に記載した、細胞転写性を有する層や、生理活性物質を有する層を形成するもの等が挙げられる。
【００９２】
本工程において、上記細胞転写用部材を上記細胞培養プレートに挿入する方法としては、上記細胞転写用部材と上記細胞培養プレートを、公知の方法で滅菌した後、挿入するものであれば、特に限定されるものではない。公知の滅菌方法としては、例えばγ線を照射して滅菌する方法、紫外光を照射して滅菌する方法、電子線を照射して滅菌する方法、オートクレーブにより滅菌する方法、エチレンオキサイドガスで滅菌する方法、アルコールで滅菌する方法等が挙げられる。本発明においては、上記細胞転写用部材の上記細胞転写層を上記細胞培養プレートの底面と対向させるように配置してもよく、配置しなくてもよい。本工程における挿入方法は、本発明に用いられる細胞培養条件に応じて適宜選択されるものである。
【００９３】
２．細胞培養工程
次に、本発明における細胞培養工程について説明する。本工程は、上記細胞培養用部材の上記細胞転写層上に細胞を播種し、細胞を接着させ、培養する工程である。
【００９４】
このような細胞の播種方法としては、例えば細胞を培養可能な培地を上述した「１．細胞培養部材準備工程」において準備した細胞培養用部材に添加した後、上記培地上に細胞を播種する方法が挙げられる。
【００９５】
本工程において、上記細胞転写層上に播種し、接着させ、培養する細胞としては、血球系細胞やリンパ系細胞などの浮遊細胞でもよく、また接着性細胞でもよい。本工程においては、特に接着性を有する細胞であることが好ましい。このような接着性を有する細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、水晶体上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられる。またこれらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。また株化された細胞でもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞であるＥＳ細胞、多分化能を有する多能性幹細胞、単分化能を有する単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであっても良い。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養したものであってもよい。
【００９６】
本工程においては、上記細胞培養用部材の上記細胞培養プレートの底面に、フィーダー細胞を播種し、培養してもよい。上記細胞培養プレートの底面においてフィーダー細胞を培養することで、上記細胞培養用部材の上記細胞転写層上において培養する細胞に必要な因子等を、産生させることができるためである。
【００９７】
本工程においては、細胞転写層上で効率よく細胞培養するために、上記細胞転写層表面に細胞が接着するまでの間、細胞転写層を細胞転写層と密着し適当な高さを有するリング状の囲いで囲ってもよい。囲いの形状は特に限定されないが、Ｏ−リング状が好ましい。このような囲いの材質としては、公知の方法で滅菌できるものであれば特に限定されないが、例えば、シリコーン樹脂製であることが好ましい。シリコーン樹脂製は、上記細胞転写層に対する密着性がよいからである。また上記囲いの高さは、用いる培地の量に応じて選択することができるが、２ｍｍ〜２０ｍｍが好ましい。
【００９８】
３．細胞の培養方法
本発明の細胞の培養方法は、上記本発明の細胞転写用部材を用いて細胞を培養するものであれば、特に限定されるものではない。本発明において、上記細胞転写層上で培養する細胞に必要な因子等を供給させる目的で、上記細胞培養プレートの底面でフィーダー細胞を培養する場合には、上記細胞転写用部材を上記細胞培養プレートに挿入する前に、上記細胞培養プレートの底面上に、フィーダー細胞の播種、接着、培養をしておいてもよい。先にフィーダー細胞を播種し、接着させておくことで、後述する細胞培養工程において、上記細胞培養用部材の上記細胞転写層上で培養する細胞へのフィーダー細胞のコンタミネーションを防ぐことができるからである。
【００９９】
また、本発明において、上記細胞転写用部材と上記細胞培養プレートとを、上記細胞転写層と上記細胞培養プレートの底面とが対向するように挿入する場合には、予め、上述した細胞培養工程において、上記細胞転写層上に細胞を播種し、接着させた後、上記細胞培養用部材準備工程において、上記細胞転写用部材を上記細胞培養プレートに挿入してもよい。上記細胞転写層と上記細胞培養プレートの底面とが対向するように挿入した場合に、上記細胞転写層上に所望の細胞を播種し、接着させ、培養させるのは困難だからである。
【０１００】
本発明においては、細胞転写層上で効率よく細胞培養するために、上記細胞転写層表面に細胞が接着するまでの間、細胞転写層を細胞転写層と密着し適当な高さを有するリング状の囲いで囲ってもよい。囲いの形状は特に限定されないが、Ｏ−リング状が好ましい。このような囲いの材質としては、公知の方法で滅菌できるものであれば特に限定されないが、例えば、シリコーン樹脂製であることが好ましい。シリコーン樹脂製は、上記細胞転写層に対する密着性がよいからである。また上記囲いの高さは、用いる培地の量に応じて選択することができるが、２ｍｍ〜２０ｍｍが好ましい。
【０１０１】
Ｄ．細胞転写用具
次に、本発明の細胞転写用具について説明する。本発明の細胞転写用具は、上記本発明の細胞培養用部材の細胞転写層上に細胞が接着していることを特徴とするものである。
【０１０２】
本発明の細胞転写用具について図を参照しながら説明する。図１４は、本発明の細胞転写用具の一例を示す概略断面図である。図１４に示すように、上記本発明の細胞転写用具６０は、上記本発明の細胞転写用部材１０と、上記細胞転写用部材１０の細胞転写層２上において培養された細胞５０と、からなるものである。
【０１０３】
本発明によれば、上記細胞転写層が平坦性を維持するように固定されていることから、この細胞転写層上において安定に培養することができ、また培養された細胞は、転写時においては、パターンや機能を損なうことなく転写することができる。したがって、細胞の培養パターン、および機能を維持した状態で転写することができる細胞転写用具とすることができる。
【０１０４】
本発明の細胞転写用具は、上記本発明の細胞転写用部材と、細胞とからなるものである。以下、本発明の細胞転写用具の各構成について詳細に説明する。
【０１０５】
１．細胞転写用部材
本発明に用いられる細胞転写用部材については、上記「Ａ．細胞転写用部材」の項に記載したものと同様の内容であるので、ここでの説明は省略する。
【０１０６】
２．細胞
本発明に用いられる細胞としては、上記「Ｃ．細胞の培養方法」の項において記載したものと同様のものを用いることができるため、ここでの説明は省略する。
【０１０７】
３．細胞転写用具
本発明の細胞転写用具は、上記本発明の細胞転写用部材、および上記細胞転写用部材の細胞転写層上に細胞を有するものであれば、特に限定されるものではない。本発明の細胞転写用具の製造方法としては、上記「Ｃ．細胞の培養方法」に記載したものと同様のものを用いることができるため、ここでの説明は省略する。
【０１０８】
本発明の細胞転写用具は、上記細胞転写用部材の細胞転写層上で培養された細胞を、加工のために別の培養基板上に移し変えたり、上記細胞を生体組織等の被転写体に転写する際に用いられることとなる。
【０１０９】
Ｅ．細胞組織の製造方法
本発明の細胞組織の製造方法は、上記本発明の細胞転写用具を用いることを特徴するものである。本発明によれば、上記細胞転写用具を用いることにより、細胞の培養パターン、及び機能を維持した状態で転写することができるため、種々の機能を持った細胞を組み合わせた細胞組織を製造することができる。したがって、例えば、細胞組織としての機能を維持するためには、血管等により、必要な栄養分の供給や、老廃物の排出等が必要になるが、血管をパターン培養した細胞を転写し、血管網を張り巡らせた細胞組織を構築することにより、人工的に構築した細胞組織でありながら、恒常的に機能を維持することが可能な細胞組織とすることができる。
【０１１０】
本発明は、上記本発明の細胞転写用具を用いて、細胞組織を製造する方法であれば、特に限定されるものではない。このような方法としては、上記細胞転写用具を製造する細胞転写用具製造工程と、上記細胞転写用具上において培養された細胞を被転写体へと転写する転写工程からなるものを挙げることができる。以下、これらの各工程について説明する。
【０１１１】
１．細胞転写用具製造工程
本発明における細胞転写用具製造工程は、上記本発明の細胞転写用具を製造するものである。このような方法としては上記「Ｄ．細胞転写用具」の項において記載したものと同様の内容であるため、ここでの説明は省略する。
【０１１２】
２．転写工程
本発明における転写工程は、上記細胞転写用具上の細胞を、被転写体の被転写先細胞に転写させる工程である。本工程においては、上記細胞転写用具上の細胞を、被転写体の被転写先細胞に転写させることができるものであれば、特に限定されるものではない。このような工程としては、例えば、図１５（ａ）に示すように、上記細胞転写用具製造工程において製造された細胞転写用具６０と、被転写先細胞培養基材７１、および上記被転写先細胞培養基材７１上において培養した被転写先細胞７２からなる被転写体７０とを、上記細胞転写用具６０の細胞５０と上記被転写先細胞７２とが対向するように配置した後、図１５（ｂ）に示すように、上記細胞５０と上記被転写先細胞７２とを接触させ、両者を培養可能な培地を加え、共培養する。次いで、図１５（ｃ）に示すように、上記細胞転写用部材１０を剥がすことにより、上記被転写体７０を、上記被転写先細胞７２上に上記細胞５０が接着した細胞組織体７３を有する被転写体８０とする工程を挙げることができる。本工程において、上記共培養の条件は、上記細胞転写用具の細胞、被転写体の被転写先細胞の条件等により、適宜選択させるものである。
【０１１３】
本工程に用いられる被転写体としては、特に限定されるものではなく、一般的な培養容器上において培養された細胞でもよく、上記本発明の細胞転写用部材上で培養された細胞でもよい。また、生体組織や臓器でもよい。上記被転写体は目的とする細胞組織に応じて、適宜選択するものである。また上記被転写体の被転写先細胞としては、平面上のものに限らず、立体的な形状を持った細胞塊であってもよい。
【０１１４】
本工程に用いられる細胞としては、上記「Ｃ．細胞の培養方法」の項において記載したものと同様のものを用いることができるため、ここでの説明は省略する。
【０１１５】
なお、本発明の細胞組織の製造に用いられる細胞としては、１種類に限定されるものではなく、複数種類の細胞を組み合わせて用いられるものであってもよい。
【０１１６】
３．細胞組織の製造方法
本発明は、上記本発明の細胞転写用具を用いて、細胞組織を製造する方法であれば、特に限定されるものではない。本発明においては、上記細胞転写用具上の細胞を、被転写体の被転写先細胞に転写し、細胞組織としたり、またその細胞組織を有する被転写体に対して、上記細胞転写用具の細胞を転写する作業を複数回行うことにより、より高度な機能を有する細胞組織とすることもできる。
【０１１７】
なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は、例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。
【実施例】
【０１１８】
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。
【０１１９】
［実施例１］
１．細胞転写用部材の準備
（１）中間層の形成
細胞転写基材は厚み１０μｍの多孔質なポリエステルフィルムを使用した。フィルムサイズ２５ｍｍφ、ポアサイズ０．４μｍ、ポア密度１．６×１０６個／ｃｍ２、水接触角６５°であった。これをＣＶＤチャンバー内に設置し、ヘキサメチルジシロキサン、酸素ガス、ヘリウムガスをそれぞれ所定量投入した。その際の真空度を３０ＭＰａに制御した。これにより、プラズマ気相成長法（ＣＶＤ法）による酸化珪素系薄膜（中間層）を厚さ約１００ｎｍで形成した。
【０１２０】
（２）細胞転写層の形成
次いで、ＣＶＤ処理を施したフィルムをペンタフルオロフェニルプロピルトリメトキシシラン０．２ｃｃを含むテフロン（登録商標）容器に入れ、容器を密閉し１００℃のオーブン内で５時間保持した。上記の方法で得られた細胞転写層の水接触角は１２０°であった。
【０１２１】
（３）細胞転写層の露光処理
酸化チタン系光触媒を全面に塗布した５インチ角の石英板の光触媒含有層と、上記細胞転写層とを対向させ、上記石英板側より水銀ランプにより３．５Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行った。これにより、上記細胞転写層を構成するペンタフルオロフェニルプロピルトリメトキシシランが酸化分解処理（露光処理）された細胞転写膜を得た。露光処理後における上記細胞転写膜の上記細胞転写層の水接触角は１５°であった。
【０１２２】
（４）細胞転写用部材の形成
上記細胞転写膜に取り付ける固定部及び把持部は、ポリスチレンからなるものを使用した。上記の方法で作製した細胞転写膜をオートクレーブ滅菌し、上記固定部及び把持部は７０％エタノール滅菌した。上記細胞転写膜と、上記固定部及び把持部との接着に一液型ＲＴＶゴム脱オキシムタイプ（信越シリコーン製）を使用し、バイオクリーンベンチ内で図１と同じ構成にした。
【０１２３】
２．細胞培養
上記細胞転写層をシリコーン樹脂性のＯ−リングで囲った後、細胞転写用部材を上記細胞転写層が上面となるように、培養プレート内に配置した。次いで、５％血清を含むＭＥＭ培地をＯ−リングが培地に触れる程度にまで培養プレート内に加えた。次いで、予め上記ＭＥＭ培地に懸濁させたウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を５．３×１０５個／ｃｍ２になるようＯ−リング内の細胞転写層上に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で、１６時間培養した。細胞転写層上に細胞がコンフルエントに接着していることを位相差顕微鏡で確認した。これにより上記細胞転写部材の細胞転写層上に細胞が接着した細胞転写用具とした。
【０１２４】
３．細胞転写
あらかじめ市販の細胞培養用ディッシュ内でコンフルエントになるように培養しておいたマウス由来線維芽細胞シートと、上記細胞転写用部材上の細胞（ｂＥＣ）とを接触させ、５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。２４時間後に上記細胞転写用部材を除去した後、位相差顕微鏡で観察した結果、上記細胞転写層上に接着していた全ての細胞は、線維芽細胞シート上に転写されていることを確認した。また、上記細胞転写層が形成された細胞転写膜は、上述した細胞培養操作、および細胞転写操作において変形・破断を起こすことはなかった。
【０１２５】
［実施例２］
１．細胞転写用部材の準備
（１）中間層の形成
細胞転写基材は厚み２０μｍの多孔質なポリエステルフィルムを使用した。フィルムサイズ２５ｍｍφ、ポアサイズ１．０μｍ、ポア密度１．６×１０６個／ｃｍ２、水接触角７０°であった。これをＣＶＤチャンバー内に設置し、ヘキサメチルジシロキサン、酸素ガス、ヘリウムガスをそれぞれ所定量投入した。その際の真空度を３０ＭＰａに制御した。これにより、プラズマ気相成長法（ＣＶＤ法）による酸化珪素系薄膜を厚さ約１００ｎｍで形成した。
【０１２６】
（２）細胞転写層の形成
次いで、ＣＶＤ処理を施したフィルムをペンタフルオロフェニルプロピルトリクロロシラン０．２ｃｃを含むテフロン（登録商標）容器に入れ、容器を密閉し１００℃のオーブン内で５時間保持した。上記の方法で得られた細胞転写層の水接触角は１１５°であった。
【０１２７】
（３）細胞転写層の露光処理
１００μｍ角の開口部が１００μｍピッチで均一に配置された碁盤パターンで、且つ、接触角測定用として周囲に幅約１．５ｃｍの開口部を有するフォトマスクに、酸化チタン系光触媒を全面に塗布した５インチ角の露光用フォトマスクを作製した。次いで、上記露光処理用フォトマスクの光触媒含有層と、上記細胞転写層とを対向させ、フォトマスク側から、水銀ランプにより４．０Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行った。これにより、上記細胞転写層を構成するペンタフルオロフェニルプロピルトリメトキシシランが酸化分解処理（露光処理）され、１００μｍ角の細胞接着領域が１００μｍピッチで均一に配置したパターン状の細胞接着領域を有する細胞転写層が形成された細胞転写膜を得た。また、接触角測定用として上記マスク周囲に形成した幅１．５ｃｍの開口部箇所において表面水接触角を測定したところ、表面水接触角は１５°であった。
【０１２８】
（４）細胞転写用部材の形成
上記露光処理をした細胞転写膜に取り付ける固定部及び把持部は、ポリスチレンからなるものを使用した。上記の方法で作製した細胞転写膜をオートクレーブ滅菌し、上記固定部及び把持部は７０％エタノール滅菌した。上記細胞転写膜と、上記固定部及び把持部との接着には、一液型ＲＴＶゴム脱オキシムタイプ（信越シリコーン製）を使用し、バイオクリーンベンチ内で図１と同じ構成にした。
【０１２９】
２．細胞培養
上記細胞転写層をシリコーン樹脂性のＯ−リングで囲った後、細胞転写用部材を上記細胞転写層が上面となるように、培養プレート内に配置した。Ｃａｓｃａｄｅ製のＭｅｄｉｕｍ  １０６Ｓ（２％ＦＢＳ＆ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）をＯ−リングが培地に触れる程度まで加え、同培地に懸濁させた正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）を２．０×１０５個／ｃｍ２になるようＯ−リング内の細胞転写層上に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で、１６時間培養した。位相差顕微鏡による観察の結果、細胞転写層の露光処理を受けた箇所にのみ細胞が接着していることを確認した。これにより上記細胞転写部材の細胞転写層上にパターン状に細胞が接着した細胞転写用具を得た。
【０１３０】
３．細胞転写
ピンセットでＯ−リングを除去した後、氷冷した成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）２００μｌをセルスクレイパーを用いて３５ｍｍディッシュ（ファルコン）上に広げ、室温で約２分間放置した後、上記細胞転写層上で接着させた細胞(ＨＤＦａ)を所定時間接触させ５％血清を含むＭＥＭ培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。１２時間後に細胞転写用部材を除去した後、位相差顕微鏡で確認した結果、上記細胞転写層上に接着していた全ての細胞は、パターンを維持した状態でマトリゲル上に転写されていることを確認した。また、上記パターン状の細胞接着領域を有する細胞転写層が形成された細胞転写膜は上述した細胞培養操作、および細胞転写操作において変形・破断を起こすことはなかった。
【０１３１】
［実施例３］
１．細胞転写用部材の準備
細胞転写基材として、厚み２５μｍの豚皮由来Ｉ型コラーゲンシートを用い、上記細胞転写基材上に、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を物理吸着させた細胞転写層を有する細胞転写膜を作製した。以下、細胞転写用部材の作製方法を示す。
【０１３２】
（１）細胞転写用部材の形成
細胞転写基材として用いるコラーゲンシートは、あらかじめ紫外線滅菌処理を施した。次いでポリスチレンからなる固定部及び把持部を、７０％エタノール滅菌した。細胞転写基材と固定部及び把持部との接着には、一液型ＲＴＶゴム脱オキシムタイプ（信越シリコーン製）を使用し、バイオクリーンベンチ内で図１と同じ構成にした。このようにして作製した細胞転写層形成前の部材の細胞転写層形成面にＯ−リングを密着させた。
【０１３３】
（２）細胞転写層の形成
次いで、濃度１００ｎｇ／ｍＬのフィルタ滅菌済みのＶＥＧＦリン酸バッファー溶液を上記Ｏ−リングで囲まれた細胞転写基材上に展開し、当該部材を密閉容器内に配置し、室温で２時間保持した。これにより細胞転写層としてＶＥＧＦ吸着層が形成された細胞転写膜からなる細胞転写用部材を得た。
【０１３４】
２．細胞培養
Ｏ−リングを配置したままの上記細胞転写用部材を培養プレート内に配置し、ＶＥＧＦ溶液を吸引除去した後、速やかに、クラボウ製のＨｕＭｅｄｉａ-ＥＧ２（２％ＦＢＳ＆ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）をＯ−リングが培地に触れる程度まで加え、同培地に懸濁させた正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を５．３×１０５個／ｃｍ２になるようＯ−リング内の細胞転写層上に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で、１６時間培養した。細胞転写層に細胞がコンフルエントに接着していることを位相差顕微鏡で確認した。
【０１３５】
３．細胞転写
ピンセットでＯ−リングを除去した後、氷冷した成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）２００μｌをセルスクレイパーを用いて３５ｍｍディッシュ（ファルコン）上に広げ、室温で約２分間放置した後、上記細胞転写層上で接着させた細胞（ＨＵＶＥＣ）を接触させＨｕＭｅｄｉａ-ＥＧ２（２％ＦＢＳ＆ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を加え、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。１２時間後に細胞転写用部材を除去した後、位相差顕微鏡で確認した結果、上記細胞転写層上に接着していた全ての細胞は、マトリゲル上に転写されていることを確認した。また上記細胞転写基材としてコラーゲンシートを用いた細胞転写膜は上述した細胞培養操作、および細胞転写操作において変形・破断を起こすことはなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】本発明の細胞転写用部材の一例を示す概略図である。
【図２】本発明に用いられる細胞転写膜の一例を示す概略図である。
【図３】本発明に用いられる細胞転写膜の他の例を示す概略図である。
【図４】本発明に用いられる固定部の一例を示す概略図である
【図５】本発明に用いられる固定部の他の例を示す概略図である
【図６】本発明に用いられる固定部の他の例を示す概略断である
【図７】本発明に用いられる固定部の他の例を示す概略図である
【図８】本発明に用いられる把持部の一例を示す概略図である。
【図９】本発明に用いられる把持部の他の例を示す概略図である。
【図１０】本発明に用いられる把持部の他の例を示す概略図である。
【図１１】本発明に用いられる収束部の一例を示す概略図である。
【図１２】本発明の細胞転写キットの一例を示す概略図である。
【図１３】本発明の細胞転写キットの他の例を示す概略図である。
【図１４】本発明の細胞転写用具の一例を示す概略図である。
【図１５】本発明の細胞組織の製造方法の一例を示す概略図である。
【符号の説明】
【０１３７】
１  …  細胞転写基材
２  …  細胞転写層
３  …  細胞転写膜
４  …  固定部
５  …  把持部
６  …  細胞接着領域
７  …  細胞接着阻害領域
８  …  上側固定部
９  …  下側固定部
１０  …  細胞転写用部材
３０  …  収束部
４０  …  細胞転写キット
４１  …  培養プレート
４２  …  底面凹部
４３  …  壁面凹部
５０  …  細胞
６０  …  細胞転写用具
７０、８０  …  被転写体
７１  …  被転写先細胞培養基材
７２  …  被転写先細胞
７３  …  細胞組織体
【図１】
2008043239.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008043239.tif 000009
【図８】
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【図９】
2008043239.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
2008043239.tif 000013
【図１２】
2008043239.tif 000014
【図１３】
2008043239.tif 000015
【図１４】
2008043239.tif 000016
【図１５】
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