(57)【要約】【課題】  複数の測定対象物質の濃度の総和を高感度で検出時間が短く、かつ、簡便な操作で測定することが可能な免疫測定方法及び免疫測定用キットを提供する。【解決手段】複数の異なる測定対象物質と、前記複数の異なる測定対象物質の各々と特異的に結合する抗体を共通する標識物質で標識した複数の異なる標識抗体とを用い、前記標識物質量を測定することにより前記複数の測定対象物質の濃度の総和を測定する免疫測定方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異なる測定対象物質と、前記複数の異なる測定対象物質の各々と特異的に結合する抗体を共通する標識物質で標識した複数の異なる標識抗体とを用い、前記標識物質量を測定することにより前記複数の測定対象物質の濃度の総和を測定することを特徴とする免疫測定方法。
【請求項２】
複数の異なる測定対象物質と、前記複数の異なる測定対象物質の各々と特異的に結合する抗体を共通する標識物質で標識した複数の異なる標識抗体とを混合して混合液を調製する工程と、
前記混合液を、捕捉物質が固定化された固定相上に展開させる工程と、
前記固定相上に固定された前記標識物質量を測定することにより前記複数の測定対象物質の濃度の総和を測定する工程を有する
ことを特徴とする請求項１記載の免疫測定方法。
【請求項３】
捕捉物質は、複数の異なる測定対象物質、又は、複数の測定対象物質の各々と特異的に結合する抗体と結合する１種の化学物質であることを特徴とする請求項２記載の免疫測定方法。
【請求項４】
複数の異なる測定対象物質は、それぞれ異性体であることを特徴とする請求項１、２又は３記載の免疫測定方法。
【請求項５】
複数の異なる測定対象物質は、ダイオキシン類及び／又はＰＣＢ類であることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の免疫測定方法。
【請求項６】
免疫クロマト法を用いて分析を行うことを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の免疫測定方法。
【請求項７】
標識物質は、磁性粒子であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６記載の免疫測定方法。
【請求項８】
請求項１、２、３、４、５、６又は７記載の方法を実施するために用いることを特徴とする免疫測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の測定対象物質の濃度の総和を高感度で検出時間が短く、かつ、簡便な操作で測定することが可能な免疫測定方法及び免疫測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ダイオキシン類、ＰＣＢ類や、その他の環境汚染物質による汚染が深刻化し、人体及び生体への影響が懸念されている。これまでダイオキシン類等の環境汚染物質の検出方法としては、ガス・クロマトグラフ質量分析法（ＧＣ−ＭＳ法）を中心とした分析法が用いられてきた。ＧＣ−ＭＳ法は、公定分析法として用いられており、その感度、精度ともに非常に優れた方法であるが、特殊な装置を必要とするため、分析コストが高く、分析の手順自体も煩雑で、分析に長時間要する等の問題点があった。
【０００３】
このような問題に対して、ＧＣ−ＭＳ法よりも簡便な方法として、ダイオキシン類等の環境汚染物質に対する抗体を用いるＥＬＩＳＡ法を用いた測定が一般的に行われている。
しかしながら、ＥＬＩＳＡ法は、定量性に優れ、高感度であるという特徴を有するものの、通常、サンプルの検出に特殊な機器を必要とし、このような機器を必要としない場合であっても、検出するまでの時間が１時間以上かかるという欠点があった。
【０００４】
従って、これらの欠点を補うため、高感度で検出時間が短く、操作が簡単な免疫クロマト法が近年注目されている。例えば、特許文献１には、競合反応を利用した免疫クロマト法が開示されている。
【０００５】
このような免疫クロマト法では、例えば、ダイオキシン類やＰＣＢ類等のように、塩素化量の異なる異性体からなる混合物を測定対象物質とする場合、主に１種類の異性体に対してのみの測定が行われる。一方、環境の汚染度等の評価においては、ダイオキシン類やＰＣＢ類の各異性体個々の濃度ではなく、各異性体の濃度の総和が必要となるが、ダイオキシン類やＰＣＢ類の総濃度を一括して測定できなかった。従って、従来の免疫クロマト法を用いた場合、ダイオキシン類やＰＣＢ類の濃度が同じ試料を測定した場合であっても、異性体の分布が異なる場合は、違った分析結果になるという問題があった。
【０００６】
これに対して、代表的な異性体に対する抗体を利用した免疫測定を、複数の異性体について別々に行い、それら個々の分析結果を足しあわせることで、各異性体の総量を求める方法が行われているが、一つの分析試料に対する分析回数が増加するため、分析作業が煩雑になり、また、複数の免疫測定試薬やキットを用いるため分析コストが増大する問題点があった。
従って、複数の測定対象物質の濃度の総和を高感度で検出時間が短く、かつ、簡便な操作で測定することが可能な免疫測定方法が必要とされていた。
【特許文献１】特開２００４−１３８５５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記現状に鑑み、複数の測定対象物質の濃度の総和を高感度で検出時間が短く、かつ、簡便な操作で測定することが可能な免疫測定方法及び免疫測定用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、複数の異なる測定対象物質と、前記複数の異なる測定対象物質の各々と特異的に結合する抗体を共通する標識物質で標識した複数の異なる標識抗体とを用い、前記標識物質量を測定することにより前記複数の測定対象物質の濃度の総和を測定する免疫測定方法ある。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明は、複数の測定対象物質の濃度の総和を一度に測定する免疫測定方法である。
本発明において、複数の異なる測定対象物質としては、特に限定されないが、測定対象物質のそれぞれが共通の特徴を有し、かつ、複数の測定対象物質の濃度の総和が測定結果として重要となるものであることが好ましく、具体的には例えば、上記複数の異なる測定対象物質がダイオキシン類である場合、ＰＣＢ類である場合、アレルゲン特異的ＩｇＥである場合等が挙げられる。また、例えば、野菜など食品の禁止物質（農薬）やスポーツ選手のドーピング薬物等や、病態のスクリーニング的な検査として複数の病原体ウイルス等のように、検出対象物質が複数存在する場合が挙げられる。なかでも、ダイオキシン類やＰＣＢ類が好ましい。また、複数の異なる測定対象物質は、それぞれ異性体同士であることが好ましい。
【００１０】
上記複数の異なる測定対象物質の各々と特異的に結合する抗体としては特に限定されず、測定対象物質に応じて適宜決定することができる。具体的には、測定対象物質がＰＣＢ類の場合、低塩素化ＰＣＢに対する標識抗体、及び、中塩素化ＰＣＢに対する標識抗体を用いる。これにより、塩素化量の異なる異性体の分布によらず、広く検出できるようになる。
【００１１】
上記標識物質としては、複数の抗体を各々標識することが可能な標識物質であれば、特に限定されず、例えば、色素含有ラテックス、金、銀、セレン等の金属コロイド、又は炭素コロイド等の色素粒子；ユーロピウム、フルオロセインイソシアネート、ジクロロトリアジニルフルオロセイン、又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質を含有する蛍光粒子、磁性粒子等が挙げられる。これらのなかでは、退色の影響がない磁性粒子が好ましい。
ただし、本発明において、上記標識物質は全て共通のものを用いる。
【００１２】
上記磁性粒子としては、磁性を有するものであれば特に限定されず、例えば、磁性体を内包した有機粒子、磁性体をマイクロカプセル化した粒子、磁性体と金等を複合化した無機粒子等が挙げられる。
【００１３】
上記磁性体としては特に限定されず、残留磁気がない超常磁性を有するものが好ましい。残留磁気を有すると自己凝集しやすくなり、例えば、免疫クロマト法に用いる場合、クロマト担体の孔を通過しにくくなり、クロマト展開性が劣るものとなることがある。
【００１４】
上記超常磁性を有する磁性体としては特に限定されず、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ２Ｏ３）等の各種フェライト類；鉄、マンガン、コバルト等の金属又はこれらの合金等が挙げられる。なかでもフェライト類が好ましく、なかでも四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）が好ましい。
【００１５】
上記磁性粒子は、平均粒子径の好ましい下限が５０ｎｍ、好ましい上限が５００ｎｍである。５０ｎｍ未満であると、媒体中に懸濁させたときの分散安定性が悪くなって自己凝集しやすくなることがあり、５００ｎｍを超えると、例えば、免疫クロマト法の場合、クロマト担体の孔を通過しにくくなり、クロマト展開性が劣ることがある。より好ましい下限は１００ｎｍ、より好ましい上限は４００ｎｍである。
【００１６】
上記磁性粒子は、粒子径のＣＶ値が５０％未満であることが好ましい。５０％以上であると、粒子径の大きい粒子がクロマト担体の孔を通過しにくくなり、クロマト担体中に残存することがある。
【００１７】
上記複数の異なる測定対象物質に特異的に結合する抗体と、標識物質とは物理結合等によって、結合又は吸着されていることが好ましい。具体的には例えば、静電結合、疎水結合又は配位結合等による結合等が挙げられる。
【００１８】
本発明では、特に複数の異なる測定対象物質と、前記複数の異なる測定対象物質の各々と特異的に結合する抗体を共通する標識物質で標識した複数の異なる標識抗体とを混合して混合液を調製する工程と、前記混合液を、捕捉物質が固定化された固定相上に展開させる工程と、前記固定相上に固定された前記標識物質量を測定することにより前記複数の測定対象物質の濃度の総和を測定する工程を有する方法を用いることが好ましい。
【００１９】
上述の方法では、通常移動相として、複数の異なる測定対象物質と、前記複数の異なる測定対象物質の各々と特異的に結合する抗体を共通する標識物質で標識した複数の異なる標識抗体とを含有する混合液等を用いるが、上記移動相の展開を補助するために展開液を用いてもよい。上記展開液としては、通常の免疫アッセイ法に使用されるような、少量の蛋白質、塩、界面活性剤等を含む緩衝液が望ましい。
【００２０】
上記捕捉物質としては、標識抗体を捕捉可能な物質又は標識抗体が結合した測定対象物質を捕捉可能な物質等を用いることができる。具体的には例えば、測定対象物質と疑似的な物質や、測定対象物質と特異的に結合する抗体等を用いることができる。なお、測定対象物質の種類によって、単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
なかでも、上記捕捉物質は、複数の異なる測定対象物質、又は、複数の測定対象物質の各々と特異的に結合する抗体と結合する１種の化学物質であることが好ましい。
【００２１】
上記捕捉物質は、各測定対象物質の量に応じて各標識抗体が検出部位に捕捉されるように、固定化する。例えば、測定試料が測定対象物質Ａ、Ｂの２種を含有し、測定対象物質Ａの試料中濃度がＸである場合、Ａと特異的に結合する標識抗体が検出部位に標識量ｘだけ捕捉されるように捕捉物質を固定化し、測定対象物質Ｂの試料中濃度がＸの場合、Ｂと特異的に結合する標識抗体が標識量ｘだけ捕捉されるように捕捉物質を固定化する。この場合、Ａ及びＢの試料中濃度がＸ／２であれば、標識量はｘとなる。つまり、ＡとＢの試料中濃度の総和Ｘは、ＡとＢの存在比（Ａ＝Ｘ：Ｂ＝０、Ａ＝Ｘ−Ｙ：Ｂ＝Ｙ、Ａ＝０：Ｂ＝Ｘ）に関わらず、標識量ｘとして測定される。
【００２２】
本発明の免疫測定法としては、特に限定されないが、なかでも、高感度で検出時間が短く、操作が簡単な免疫クロマト法が好適に用いられる。本発明の免疫測定方法を用いた免疫クロマト法による検査試薬の一例を図１に示す。図１は検査試薬の上面図であり、図２は横断面図である。
図１、２に示すように、検査試薬６は、試料導入部位１、吸収部位３、試験片４及び薄膜５からなり、細長い形状の薄膜５の上面に、試料導入部位１、吸収部位３及び試験片４の全部又は一部が接着している。また、検出部位２は、試験片４上の捕捉物質に固定化した部分である。
また、薄膜５の一端には、試料導入部位１の一端側が接着されており、試料導入部位１の他端側は、その全面が薄膜５に接着している試験片４の一端側の上面に被さった状態で試験片４と接触している。更に、薄膜５の他端側には、吸収部位３の一端側が接着されており、この吸収部位３の他端側は、試験片４の他端側の上面に被さった状態で試験片４と接触している。
【００２３】
本発明では、まず、複数の異なる測定対象物質と、上記測定対象物質に特異的に結合する標識抗体とを混合した後、得られた混合物（移動相）を試料導入部位１に接触させる。試料導入部位１中の移動相は、毛細管現象によって吸収部位３に向けて移動するが、その際に検出部位２を通過する。このとき、測定対象物質の量に応じて、検出部位２に標識抗体が補足される。
【００２４】
本発明の免疫測定方法を用いて、測定対象物質がＡ、Ｂの２種類である測定試料について測定する場合を示す概略図を図３に示す。図３中、１１は測定対象物質Ａ（以下、単にＡともいう）、１１´はＡ疑似物質、１２は測定対象物質Ｂ（以下、単にＢともいう）、１２´はＢ疑似物質、１３は抗Ａ抗体、１４は抗Ｂ抗体、１５は標識物質、１６は抗Ａ標識抗体、１７は抗Ｂ標識抗体、２は検出部位を表す。なお、図３ａは測定試料がＡのみを含有する場合であり、図３ｂは測定試料がＢのみを含有する場合であり、図３ｂはＡ、Ｂの濃度が同じで濃度の総和が図３ａ、図３ｂの場合のＡ、Ｂの濃度と同じである場合を示す。即ち、図３の何れの場合も測定対象物質の濃度の総和は同じである。
【００２５】
図３ａ〜図３ｃでは、各測定対象物質の量に応じて各標識抗体が検出部位２に捕捉されるように固定化されている。
図３ａでは、測定対象物質Ａと抗Ａ標識抗体６とが特異的に結合しており、これらを含む移動相を、捕捉物質としてＡ疑似物質１１´、Ｂ疑似物質１２´が捕捉物質として固定化された検出部位２に展開すると、測定対象物質Ａと結合していない抗Ａ標識抗体１６及び抗Ｂ標識抗体１７が捕捉物質に捕捉され、捕捉されなかった測定対象物質Ａと結合した抗Ａ標識抗体１６は排出される。この際、検出部位２の標識量を測定することにより、測定対象物質Ａの濃度を求めることができる。
また、図３ｂでは同様にして、測定対象物質Ｂの濃度を求めることができる。
【００２６】
一方、図３ｃでは、測定対象物質Ａと抗Ａ標識抗体１６、及び、測定対象物質Ｂと抗Ｂ標識抗体１７が特異的に結合しており、これらを含む移動相を、捕捉物質としてＡ疑似物質１１´、Ｂ疑似物質１２´が捕捉物質として固定化された検出部位２に展開すると、測定対象物質Ａと結合していない抗Ａ標識抗体１６、及び、測定対象物質Ｂと結合していない抗Ｂ標識抗体１７が捕捉物質に捕捉され、捕捉されなかった測定対象物質Ａと結合した抗Ａ標識抗体１６、及び、測定対象物質Ｂと結合した抗Ｂ標識抗体１７は排出される。この際、検出部位２の標識量を測定すると、図３ａ、図３ｂの場合と標識量が同じとなり、測定対象物質Ａ及び測定対象物質Ｂの濃度の総和を求めることができる。
【００２７】
なお、図１〜３に示した検査試薬では、複数の異なる測定対象物質を含有する測定試料と、上記複数の異なる測定対象物質と特異的に結合する標識抗体とを予め接触させた後、試料導入部位１に接触させることにより測定を行うものであるが、測定試料を、直接特異的に結合する標識抗体を有する試料導入部位に接触させた後、測定を行う従来の免疫クロマト法の形態を用いてもよい。
【００２８】
上記試料導入部位１は、移動相の展開速度や展開量等を制御することを目的として用いられるものであり、移動相を適度な速度で展開することができるものであれば特に限定されず、例えば、メンブランフィルターや、ニトロセルロース、ガラス濾紙等の多孔質体からなるもの等が挙げられる。
【００２９】
本発明では、検出部位２に捕捉された標識抗体に由来する信号を測定することにより、測定試料中の測定対象物質の濃度を測定することができる。
標識抗体に由来する信号を測定する方法としては、用いる標識物質の種類に応じて、公知の分析手段を用いることができる。例えば、標識物質として色素体を用いる場合には、目視又は色計測機器により測定することができ、標識物質として放射性同位体を用いる場合には、放射線測定機器により測定することができ、標識物質として蛍光物質を用いる場合には、蛍光分析器により測定することができる。
また、標識物質として磁性粒子を用いる場合は、ホールセンサーやＧＭＲセンサ等の磁気センサや、磁気緩和測定を用いることにより、磁性量（磁性粒子量）を測定する。
【００３０】
上記検出部位２の形状については、特に限定されず、例えば、帯状、ドット状等が挙げられる。
【００３１】
上記吸水部位３は、過剰の試料を迅速に吸収することを目的として用いられるものであり、毛細管現象により、多孔質の担体を展開した測定試料液を吸収するものであれば特に限定されず、例えば、セルロースやコットン等の吸水性材料からなるものが挙げられる。
【００３２】
上記試験片４としては、例えば、多孔質の担体に捕捉物質が固定化された固定層に、試料導入材料や吸収材料等が組み合わされもの等を用いることができる。
上記多孔質の担体としては、移動相を適度な速度で展開することができるものであれば特に限定されず、例えば、メンブランフィルターや、ニトロセルロース、ガラス濾紙等の多孔質体が挙げられる。本発明では移動相を展開した後に、磁性量を測定するため、非磁性材料からなる担体を用いることが好ましい。
【００３３】
本発明の免疫測定方法を実施するために用いる免疫測定用キットもまた、本発明の１つである。このような免疫測定用キットを用いることで、複数の測定対象物質の濃度の総和を高感度で検出時間が短く、かつ、簡便な操作で測定することが可能となる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、例えば、ダイオキシン類やＰＣＢ類等のように、複数の異性体同士からなる一群の測定対象物を、個々に測定して総和を算出する等の煩雑な作業を行うことなく、一回の測定により、簡便かつ高精度に測定することが可能な免疫測定方法及び免疫測定用キットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３６】
（実施例１）
（１−１）試験片１の作製
ＰＣＢ＃２８擬似物質（エンバイオテックス・ラボラトリーズ社製）をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合させた化合物Ａ及びＰＣＢ＃１１８擬似物質（エンバイオテックス・ラボラトリーズ社製）をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合させた化合物Ｂを作製した。
ニトロセルロースメンブレン（ＳＲＨＦ  Ｐ７０、日本ミリポア社製）を幅２０ｃｍ×長さ６ｃｍに裁断し、長さ方向の上端より２ｃｍの部位（反応部位）に、化合物Ａを１．０ｍｇ／ｍＬ及び化合物Ｂを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにトリス塩酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解した溶液を幅０．７ｍｍの直線状に塗布した。その後、室温で一晩乾燥した。
【００３７】
次いで、化合物Ａ及び化合物Ｂを固定化したメンブレンの長さ方向上端に幅５ｍｍ×長さ２０ｍｍの吸水パッド（ＡＰ２２、日本ミリポア社製）を、下端に幅５ｍｍ×長さ２０ｍｍのコンジュゲートパッド（グラスファイバー、日本ミリポア社製）を重ね、透明なテープで固定した後、幅５ｍｍに裁断し、試験片１とした。  
【００３８】
（１−２）試験片２の作製
試験片１の作製で用いた化合物Ａを１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにトリス塩酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解した溶液を、試験片１と同様の材料、方法で塗布した。その後、室温で一晩乾燥した。次いで、試験片１と同様の材料、方法を用いることにより、試験片２とした。
【００３９】
（２）磁性粒子標識抗ＰＣＢ＃２８抗体の作製
磁性体含有粒子（ポリスチレン系、磁性体量６０％、平均粒子径０．３μｍ、積水化学工業社製）１０ｍｇに、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＬを加え、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行った。得られた沈渣に、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に抗ＰＣＢ＃２８モノクローナル抗体（エンバイオテックス・ラボラトリーズ社製）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶解した溶液を２ｍＬ加え、充分に混和して、室温にて１時間撹拌した。
【００４０】
その後、未反応の抗ＰＣＢ＃２８モノクローナル抗体を除去するため、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、沈渣を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）３ｍＬに懸濁させ、再度遠心分離を行った。その沈渣を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解した溶液３ｍＬに懸濁させ、室温で１時間撹拌し、ブロッキング処理を行った。その後、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、沈渣を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解し、更にアジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解した溶液２ｍＬに懸濁させて磁性粒子標識抗ＰＣＢ＃２８モノクローナル抗体の懸濁液を調製し、使用までこれを冷蔵保存した。
【００４１】
（３）磁性粒子標識抗ＰＣＢ＃１１８抗体の作製
抗ＰＣＢ＃１１８モノクローナル抗体（エンバイオテックス・ラボラトリーズ社製）を用いて、０．３ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶解した溶液を２ｍＬ加えたこと以外は、（２）磁性粒子標識抗ＰＣＢ＃２８抗体の作製と同様の操作を行い、磁性粒子標識抗ＰＣＢ＃１１８モノクローナル抗体の懸濁液を調製した。
【００４２】
（４）試験液の調製
試験液として、カネクロールＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００（クロマトサイエンス社製）を用い、表１に示す濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を調整した。
【００４３】
【表１】
2008170377.tif 000002
【００４４】
（５）評価１
磁性粒子標識抗ＰＣＢ＃２８モノクローナル抗体の懸濁液２００μＬ及び磁性粒子標識抗ＰＣＢ＃１１８モノクローナル抗体の懸濁液１００μＬを混合した試薬液に、調製した各試験液２０μＬを混合した後、試験片１のコンジュゲートパッド部位にキャピラリーを用いて１００μＬ滴下した。滴下２０分後、試験片１の検出部位の磁性量を、市販のＧＭＲセンサ（差動磁界センサ、ＮＶＥ社製）を用いて測定した。測定結果を表２に示した。
【００４５】
【表２】
2008170377.tif 000003
【００４６】
（６）評価２
磁性粒子標識抗ＰＣＢ＃２８モノクローナル抗体の懸濁液１００μＬ及び磁性粒子標識抗ＰＣＢ＃１１８モノクローナル抗体の懸濁液１００μＬを混合した試薬液に、調製した各試験液２０μＬを混合した後、試験片２のコンジュゲートパッド部位にキャピラリーを用いて１００μＬ滴下した。滴下２０分後、試験片２の検出部位の磁性量を、市販のＧＭＲセンサ（差動磁界センサ、ＮＶＥ社製）を用いて測定した。測定結果を表３に示した。
【００４７】
【表３】
2008170377.tif 000004
【００４８】
表２、３に示すように、ＰＣＢ濃度が１ｐｐｍである試験液１〜４は、カネクロールの種類（異性体の存在比）に関わらず、同等の標識量（磁性量）となることが確認された。
また、ＰＣＢ濃度が更に高い５ｐｐｍの試験液５〜７については、カネクロールの種類（異性体の存在比）に関わらず、試験液１〜４よりも磁性量が低く、かつ、同等の標識量（磁性量）となることが確認された。
即ち、ＰＣＢ濃度にかかわらず、何れの試験液もＰＣＢ総量に応じた磁性量を示す結果が得られた。これにより、実施例１の方法では、予め検量線を作成することにより、検出部位の磁性量でＰＣＢの総和を測定可能であることがわかる。
【００４９】
（実施例２）
（１）磁性粒子標識抗体の作製
磁性体含有粒子（ポリスチレン系、磁性体量６０％、平均粒子径０．３μｍ、積水化学工業社製）１０ｍｇに、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＬを加え、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行った。得られた沈渣に、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に抗β−ｈＣＧ抗体（コスモバイオ社より購入）が０．８ｍｇ／ｍＬ、及び、抗β−ＬＨ抗体（コスモバイオ社より購入）が１．１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶解した溶液を２ｍＬ加え、充分に混和して、室温にて１時間撹拌した。
その後、未反応の抗体を除去するため、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、沈渣を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）３ｍＬに懸濁させ、再度遠心分離を行った。その沈渣を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解した溶液３ｍＬに懸濁させ、室温で１時間撹拌し、ブロッキング処理を行った。その後、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、沈渣を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解し、更にアジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解した溶液２ｍＬに懸濁させて磁性粒子標識抗体の懸濁液を調製し、使用までこれを冷蔵保存した。
【００５０】
（２）試験片３の作製
コンジュゲートパッド（グラスファイバー、日本ミリポア社製）を幅５ｍｍ×長さ２０ｍｍに裁断し、（１）で作製した磁性粒子標識抗体懸濁液に、ショ糖が２％（ｗ／ｖ）の濃度になるように調整した２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を等量混合した懸濁液を磁性粒子量が１００μｇになるように塗布し、デシケーターで一晩乾燥した。
ニトロセルロースメンブレン（ＳＲＨＦ  Ｐ７０、日本ミリポア社製）を幅６ｍｍ×長さ２０ｍｍに裁断し、長さ方向の上端より２ｃｍの部位（反応部位）に、抗α−ｈＣＢ抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、ショ糖が２％（ｗ／ｖ）の濃度になるように添加したトリス塩酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解した溶液を幅０．７ｍｍの直線状に塗布した。その後、室温で一晩乾燥した。
次いで、抗α−ｈＣＢ抗体を固定化したメンブレンの長さ方向上端に幅５ｍｍ×長さ２０ｍｍの吸水パッド（ＡＰ２２、日本ミリポア社製）を、下端に磁性粒子標識抗体を固定化したコンジュゲートパッド、更にその下端に、幅５ｍｍ×長さ１５ｍｍに裁断しサンプルパッド（グラスファイバー、日本ミリポア社製）を重ね、透明なテープで固定した後、幅５ｍｍに裁断し、試験片３とした。
【００５１】
（３）評価
測定試料として、牛血清アルブミン１％（ｗ／ｖ）、及び、ｈＣＧ又はＬＨが、各々、濃度０ｍＩＵ／ｍＬ、５０ｍＩＵ／ｍＬ、１００ｍＩＵ／ｍＬになるように生理食塩水に溶解した試験液を調製し、各試験液を試験片３のサンプルパッド部位にキャピラリーを用いて７５μＬ滴下した。
滴下２０分後、試験片３の検出部位の磁性量を、市販のＧＭＲセンサ（差動磁界センサ、ＮＶＥ社製）を用いて測定した。測定結果を表４に示した。
【００５２】
【表４】
2008170377.tif 000005
【００５３】
表４に示すように、ｈＣＧ又はＬＨが同程度の場合、同等の標識量（磁性量）となることが確認された。また、ホルモンの量に応じて標識量（磁性量）が高くなることが確認された。即ち、ホルモンの種類にかかわらず、何れの試験液もホルモンの量に応じた磁性量を示す結果が得られた。これにより、実施例２の方法では、予め検量線を作成することにより、検出部位の磁性量でホルモンの総量を測定可能であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によれば、複数の測定対象物質の濃度の総和を高感度で検出時間が短く、かつ、簡便な操作で測定することが可能な免疫測定方法及び免疫測定用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明を用いた検査試薬の一実施態様を示した図（上面図）である。
【図２】本発明を用いた検査試薬の一実施態様を示した図（横断面図）である。
【図３】本発明を用いて、測定対象物質が２種類の測定試料を測定した場合を示す概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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