(57)【要約】【課題】正常なＰＣＲ反応系や後工程へ影響を与えることなくＰＣＲ反応の阻害要因を排除して、初期標的核酸量が稀少な場合でも増幅効率の高いＰＣＲ増幅方法を提供すること。【解決手段】標的核酸を増幅するためのＰＣＲ方法であって、前記標的核酸を鋳型とするＰＣＲ反応を補助核酸の存在下で行い、前記補助核酸が、前記標的核酸及びプライマーと相補性及び相同性を有さないことを特徴とする標的核酸増幅方法。【選択図】図１
2008136421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を増幅するためのＰＣＲ方法であって、
前記標的核酸を鋳型とするＰＣＲ反応を補助核酸の存在下で行い、
前記補助核酸が、前記標的核酸及びプライマーと相補性及び相同性を有さないことを特徴とする標的核酸増幅方法。
【請求項２】
前記ＰＣＲ反応の反応溶液に含まれる前記補助核酸の量が、前記標的核酸の量よりも多いことを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
前記補助核酸の核酸配列長が、前記ＰＣＲ反応によって生成された増幅産物の核酸配列長と異
なることを特徴とする請求項１もしくは２に記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
前記補助核酸がヒトゲノムＤＮＡである請求項１乃至３の何れかに記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
前記補助核酸が合成ＤＮＡである請求項１乃至３の何れかに記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
標的核酸を増幅するためのＰＣＲ試薬キットであって、
ａ）標的核酸の増幅に必要とされるＰＣＲ試薬
ｂ）前記標的核酸の配列と相補性および相同性を有さない補助核酸
を少なくとも含むことを特徴とする核酸増幅キット。
【請求項７】
前記補助核酸がヒトゲノムＤＮＡである請求項６に記載の核酸増幅キット。
【請求項８】
前記補助核酸が合成ＤＮＡである請求項６に記載の核酸増幅キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法による核酸増幅法に関する。より詳細には、検査試料中の微量核酸の安定的で高効率な増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムシーケンスプロジェクトの進展に伴って、ゲノム上の特定遺伝子の検出、ＳＮＰＳ解析、発現解析等がポストゲノムの課題として注目されている。そういった中で、最近の医療、分子生物学の分野では、収集した検体から微量な標的核酸を増幅、検出する必要性が大きくなってきている。
【０００３】
また、実際の臨床医療の現場においても核酸検出の重要度が増している。従来、ウイルスや細菌による感染症の臨床検査方法としては、血清抗体の検出や患者からの病原体分離培養などの方法が取られてきた。しかし、血清抗体の検出法においては、感染から抗体生産までの時間が長期間かかることや、抗体生産が安定していない等の理由により、検出できない場合がある。また、病原体分離培養の場合にも、病原体を判定するために３日程度にわたる長時間培養が必要であるという問題があった。このような問題から、患者から採取した検体中に含まれる病原体の核酸を増幅し、病原体由来の特定配列を直接検出する方法が提案されている。
【０００４】
核酸の増幅方法としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が一般的に用いられている。ＰＣＲ法とは、増幅させたいＤＮＡ領域を挟む２種類のプライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を繰り返すことによって、目的とするＤＮＡ断片を短時間で数１０万から１００万倍以上に増幅させる方法である。より詳しくは、標的核酸、プライマ−、ＤＮＡポリメラーゼ、各種バッファ、塩類等を含んだ反応液を、９５℃程度にすることによってＤＮＡの２本鎖を１本鎖に乖離させる。その後６５℃程度にすることにより標的配列とプライマ−を結合させ、７０℃程度にすることでＤＮＡポリメラーゼによってプライマ−から標的核酸を鋳型としたＤＮＡ合成反応が進む。この温度サイクルを２０〜４０回繰り返すことによって、３０分〜数時間で数百万倍にまで増幅する。従ってＰＣＲ法は、原理的には、ＤＮＡが１コピーあれば、これを増幅させて極めて多数個になし得る方法である。
【０００５】
核酸の検出、定量するための方法としては、アガロースゲル電気泳動にかけて染色する方法が一般的である。また、標的核酸を固体担体上に固定し標識プローブをハイブリダイゼーションさせる方法（特許文献１参照）や、固体担体上にプローブを固定して標識した標的核酸をハイブリダイゼーションさせる方法（特許文献２参照）等が提案されている。これらの方法は微小な標的配列も検出可能な感度を有しているが、一般的には検体そのままの標的核酸の濃度では検出不可能であり、ＰＣＲ等の核酸増幅処理が前段階として必要である。
【０００６】
今後、遺伝子解析が進むに従って、解析対象がより詳細で微量な標的となることが予想される。また、感染症の病原体の検出においては、検体中には非常に稀少な数の病原体しか含まれていない。そのような検体を上述のアガロース電気泳動法やハイブリダイゼーション法で検出可能な量まで増幅する必要がある。
【０００７】
原理的にＰＣＲ法では、１コピーの標的核酸があればそれを数百万倍まで増幅できることになっているが、一般的には初期標的核酸として数百〜数千コピーが必要である。初期の標的核酸がこれ以上少ないと、全く増幅されなかったり、増幅産物量が一定しなかったりという現象が見られる。
【０００８】
このような現象の原因としては、様々なものが想定される。一例としては、プライマー同士が結合をおこしてプライマーダイマーを形成することや、検体中の標的類似配列とプライマーが反応を起こし、正常なプライマーの結合を阻害することによる増幅効率の低下が考えられる。また、検体中の成分やＰＣＲ試薬、反応器具等が標的核酸やＤＮＡポリメラーゼに作用することによって、ＰＣＲ反応が阻害されてしまうことも原因と考えられている。前者の例の阻害要因に対しては反応溶液を定温で調整するような方法（特許文献３参照）等が提案されている。また、後者の例の要因に対しては熱工程を加える方法や、ｐＨの調整、フィルタレーション等をすることによって回避する方法が提案されている（特許文献４参照）。
【特許文献１】米国特許第４３５８５３５号明細書
【特許文献２】米国特許第５６８８６４２号明細書
【特許文献３】特開平０５−２４４９５号公報
【特許文献４】特開平１１−１１３５７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、これらの方法を行っても阻害要因の排除は不完全であり、初期標的核酸量が稀少な場合には、残った阻害要因の影響を強く受けてしまい、増幅効率が低くなってしまう場合がある。
【００１０】
また、各種薬品の添加やフィルタレーションを行う場合には、それらがＰＣＲ反応の新たな阻害要因になる可能性や、ＰＣＲ条件が変わってしまうことによる増幅産物の組成の変化、ＰＣＲ後の核酸精製工程に影響を与えてしまう可能性があった。
【００１１】
本発明の目的は、これらの課題を克服し、正常なＰＣＲ反応系や後工程へ影響を与えることなくＰＣＲ反応の阻害要因を排除し、安定的で高効率な核酸増幅方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的を達成するため本発明は、第一に、標的核酸を増幅するためのＰＣＲ方法であって、
前記標的核酸を鋳型とするＰＣＲ反応を補助核酸の存在下で行い、
前記補助核酸が、前記標的核酸及びプライマーと相補性及び相同性を有さないことを特徴とする標的核酸増幅方法である。
【００１３】
本発明の第二は、標的核酸を増幅するためのＰＣＲ試薬キットであって、
ａ）標的核酸の増幅に必要とされるＰＣＲ試薬
ｂ）前記標的核酸の配列と相補性および相同性を有さない補助核酸
を少なくとも含むことを特徴とする核酸増幅キットである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の核酸増幅方法により、正常なＰＣＲ反応系および後工程に影響を与えることなく、増幅効率を向上させることが可能となる。よって、ごく微量な初期標的核酸であっても効率良く安定的に増幅させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明に係わる核酸増幅方法の具体的な実施の形態を説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明において、標的核酸とは、ＰＣＲ反応により増幅される標的配列を有する核酸を指す。標的核酸としては、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、その他の二本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＤＮＡなどが挙げられる。核酸検体とは、標的核酸を含む検体としてＰＣＲ反応液に加えられる検体を指す。核酸検体が生体由来である場合は、抽出および精製方法の条件により、標的核酸およびその他の生体由来ＤＮＡ以外にＲＮＡおよびその他の夾雑物成分を含むこともある。
【００１７】
一般的に本発明が利用される分野としては、生体由来物質から抽出したＤＮＡ等を標的核酸とする増幅処理であるが、これに限定されるものではなく、人工合成核酸の増幅であっても利用可能である。生体由来物質とは、例えば動植物組織、体液、排泄物等をいい、細胞、細菌、ウィルス等であっても良い。体液には血液、唾液、髄液、尿、乳等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、これらの生体由来物質に含まれる検体核酸としては、特に限定されないが、例えば、特定の遺伝子の増幅に用いられる。
【００１８】
本発明に係るＰＣＲ反応は、通常用いられる方法であればどのようなＰＣＲ法でも用いることができる。一般的なＰＣＲ法を下記に示すが、本発明のＰＣＲ反応は、これらの反応試薬組成および反応条件に限定されるものではない。
【００１９】
ＰＣＲ法では、ＰＣＲ反応液に対して加熱冷却を行って温度サイクルをかけることが基本となる。一般的なＰＣＲ反応液は、増幅対象となる標的配列を有する標的核酸（鋳型ＤＮＡ）、ｐＨ緩衝用バッファー、塩類、プライマー、ｄＮＴＰ等の基質及びＤＮＡポリメラーゼを含むものである。さらに、界面活性剤やゼラチン等を含む場合もある。ｐＨ緩衝用バッファーとしては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の１０ｍＭから１００ｍＭ程度の濃度のものが好適に使用される。ｐＨは８〜９付近に調整することが多い。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ＰｏｌｉｍｅｒａｓｅやＴ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ等様々なものが使用可能であるが、増幅対象や増幅反応を勘案して適宜選択する。さらに、ＤＮＡポリメラーゼに各種抗体を付加して不活性化しておき、ＰＣＲの１回目の加熱工程で抗体を乖離させてＤＮＡポリメラーゼを活性化する方法等もあるので、適宜反応条件も含めて選択する。通常１反応に０．５〜２．５単位を加える。塩ではＭｇＣｌ2が好適に用いられ、通常１．５ｍＭ程度の濃度で添加されるが、増幅対象等によって最適化して使用する場合が多い。プライマーは標的核酸に応じて設計する。増幅したい領域の両側に数十〜数百塩基の長さで設計する。プライマー同士で結合するような配列や、高次構造をとるような配列は一般的に使用しない。また、標的核酸との結合しやすさの目安となるｔｍ（溶解温度）も考慮して設計する必要がある。
【００２０】
上述のような組成に調整したＰＣＲ反応液に対して、市販のサーマルサイクラー等を用いて温度サイクルを繰り返すことによって核酸増幅を行う。温度サイクルは、標的核酸である２本鎖ＤＮＡを１本鎖に乖離する工程（熱変性）、前記１本鎖とプライマーを結合させる工程（アニーリング）、プライマーからＤＮＡを合成させる工程（伸長）の繰り返しである。熱変性工程は、９５℃程度で行い、２０〜６０秒程度行うことができる。アニーリング工程はプライマーの構成によって異なるが、通常は５０〜６５℃程度で、１０〜９０秒程度で行うことができる。伸長工程は選択したＤＮＡポリメラーゼによって異なるが、概ね７２℃程度であり、１０〜６０秒程度が一般的である。このようなサイクル以外にも、アニール工程と伸長工程を同一温度で行うサイクルであってもよい。また、上記温度サイクルの前後に補助的な温度条件を与える場合も多い。
【００２１】
本発明の特徴は、上述のＰＣＲ反応の反応溶液に、標的配列およびプライマー配列に対して相補性も相同性も有さない配列からなる補助核酸を含むことである。補助核酸は生体由来物質から抽出したものであっても良いし、人工的に合成したものでも良い。補助核酸を人工的に合成して得る場合は、標的核酸およびプライマー配列に対して相補性および相同性を有さないように設計する。補助核酸を生体から抽出して調製する場合は、さまざまな公的機関が公開する各種ゲノムデータベースを利用して、塩基配列のホモロジーおよび相補性を検証することができる。標的配列に対して相補性があるとアニーリング工程で標的配列と結合してしまい、本来のプライマーとのアニーリングを阻害してしまうことになるので、避ける必要がある。また、標的配列に対して相同性があると、プライマーと結合してしまったり、後の検出工程で本来の増幅産物と区別できなくなるので避ける必要がある。さらに、プライマーに対しても相補性あるいは相同性があると、プライマーと結合したり、標的核酸とプライマーとの結合を阻害してしまったりするので避ける必要がある。以上のとおり、本発明における補助核酸の相同性および相補性は、好ましくは、検出に用いる標的核酸あるいはプライマーとＰＣＲ反応のアニーリング工程温度域においてハイブリダイゼーションしない程度であればよい。
【００２２】
補助核酸として生体由来の核酸を用いる場合、補助核酸は検体が由来する生物と分類属性上の異なる種類から選択することが好ましい。ここで、分類属性上の種類が異なるとは、生物学的特性に基づいて分類した場合に、互いに異なる種類に属することをいい、たとえば分類学的な観点では、界、門、網、目、科、属、種から選択されるいずれかの階層（分類属性）に着目して、検体由来生物が属する種類と異なることである。たとえば、界に着目すれば、検体由来の生物は動物界、植物界、菌界のいずれかに分類され、補助核酸は、検体由来生物の属する界と異なる界の生物のゲノムＤＮＡあるいはその一部を補助核酸として用いることが好ましい。前記の分類学的な階層は、表記した順に上位から下位への階層構造を有する。補助核酸を選択する基準としてどの分類属性を採用するかは、検出しようとする標的遺伝子の配列の特異性の特性を考慮して選択される。例えば、種特異的な遺伝子配列を標的とする場合、異なる種に属する生物のゲノムＤＮＡまたはその一部を補助核酸に選択すれば、標的遺伝子およびＰＣＲプライマーの配列に相補性および相同性を有さず、ハイブリダイゼーションを防止することができ好ましい。具体的には、標的核酸の配列がある種の菌に特異的な配列を有する遺伝子配列である場合、補助核酸は、異なる種の菌のゲノムＤＮＡあるいはその一部を選択する。さらに種特異的な遺伝子を標的とする場合でも、種よりも上位の階層（たとえば属、界）において、標的核酸が由来する生物と分類属性上の異なる種類の生物のゲノムＤＮＡまたはその一部から選択されることがより好ましい。たとえば、標的遺伝子がある種の菌に特異的な配列である場合、菌と異なる界である、動物または植物の界に属する生物のゲノムＤＮＡあるいはその一部を選択することがより好ましく、ヒトゲノムＤＮＡを好適に用いることができる。ヒトゲノムＤＮＡを補助核酸として好適に利用できる検出には実施例に挙げるもの以外にも白血病等で白血球の減少が著しい血液や微生物検査に供する食品での微生物の検出を挙げることができる。また分類学的な属性に限定されず、真核生物と原核生物との違いによる分類や近年明らかになっているゲノム解析に基づいた分類を用いてもよい。
【００２３】
このような生体由来の補助核酸の選択方法は、プライマー配列と相補的な配列以外の配列が不明である標的核酸に対しても、補助核酸の配列が標的核酸配列と相補性および相同性を有しないことの信頼性を確保することができる。また、これらの補助核酸の選択方法が好適に利用できる本発明の増幅方法の例として、生物種の検出を目的として、当該生物種に特異的な標的配列について行うＰＣＲ増幅が挙げられる。
【００２４】
ＰＣＲ法で増幅する標的配列は通常数百〜数千塩基長である。後工程で増幅産物と区別することを考慮すると、補助核酸は標的配列と異なる核酸配列長を有することが望ましい。十分異なる長さにしておくことによって、アガロースゲル電気泳動等によって分別可能である。実際には、補助核酸は標的配列よりも長い核酸配列長を有することによって配列特異性が高まり、プライマーや標的配列との結合防止に優利である。標的核酸配列に対して短い核酸配列長を有する補助核酸を用いることも考えられるが、それだけ配列特異性が下がってしまうために、プライマーや標的配列との結合に注意する必要がある。よって、補助核酸の核酸配列長は、標的配列の配列長の５倍以上もしくは１／５倍以下であることが好ましい。より好ましくは、補助核酸の核酸配列長は標的配列の配列長の１０倍以上であることが望ましい。
【００２５】
ＰＣＲ反応液に補助核酸を含有することにより、様々な阻害要因を補助核酸が吸収し、その反面、標的核酸やプライマー等への阻害要因の影響が軽減される。よって、標的核酸と比較して補助核酸を大量に添加したほうが、阻害要因をより多く吸収できる。補助核酸は２０ｎｇ／ｍｌ以上８μｇ／ｍｌ以下の範囲でＰＣＲ反応液に添加することが望ましい。補助核酸も標的核酸と同じ核酸で構成されているので、ＰＣＲ法に本来不要な薬品を添加する方法等とは異なり、新たな阻害や後工程での問題を起こすことがない。よって、後工程に影響を与えることなくＰＣＲ反応における阻害要因の影響を排除することが可能となり、高効率で安定した増幅反応が可能となる。
【００２６】
通常のＰＣＲ反応液中の補助核酸は検体核酸に含まれる標的核酸以外の核酸に対しても大幅に多く含まれるが、ＰＣＲ反応液中に含まれる全核酸量が２０ｎｇ／ｍｌ以上２０μｇ／ｍｌ以下の範囲にあるように補助核酸を添加することが反応効率の点から望ましい。
【００２７】
また本発明の補助核酸にはＤＮＡだけでなくＲＮＡを用いることも可能である。
【００２８】
また、本発明は、標的核酸の増幅に必要とされるＰＣＲ試薬と、本発明に係る補助核酸と、を有する核酸増幅キットにも関する。ＰＣＲ試薬に含まれる試薬としては、ｐＨ緩衝用バッファー、塩類、基質であるｄＮＴＰを少なくとも含むものである。さらに、ＰＣＲプライマー、またはＤＮＡポリメラーゼを含んでもよい。
【実施例】
【００２９】
以下に本発明の核酸増幅方法の実施例を示すが、以下の実施例で本発明の内容が限定されるものではない。
（実施例１）
本実施例では、人の喀痰から肺炎の病原菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（以降Ｓ．ｐ．と記載する）の遺伝子を検出する例を示す。本実施例で検出対象となるｒＲＮＡ配列はタンパク合成の主要な機能を担っていることもあり、その塩基配列は種内において非常によく保存されている。しかし、分類属性上の種類が異なれば異なる程に配列の相同性は少なくなることから、種の同定や系統解析によく利用されている。本実施例において補助核酸として用いるヒトゲノム中にも２８ｓ、１８ｓ、５．８ｓ、５ｓのｒＲＮＡ配列が含まれているが、原核生物である細菌の１６ｓｒＲＮＡの配列と比較すると相同性はほとんどなく、１０塩基以上相同している配列はほとんどない。
【００３０】
まず、Ｓ．ｐ．に存在する特異的な配列として、１６ｓｒＲＮＡ中に存在する１５００塩基配列を選択し、この配列をコードする領域のＤＮＡを特異的に増幅するための両端２種類のプライマーを設計した。プライマー配列を表１に示す。
【００３１】
【表１】
2008136421.tif 000003
【００３２】
人の喀痰２ｍｌを採取し、そのうち２００μｌをＤｎｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて核酸を抽出した。抽出液量は５０μｌであった。この時点では、ごく微量な核酸しか含まれていないものと思われ、アガロースゲル電気泳動や吸光を測定しても核酸の存在を確認できなかった。同じ喀痰を培地で３日間培養したところＳ．ｐ．のコロニーが形成され、コロニー数から初期菌数が喀痰１ｍｌあたり約５０菌と判明した。よって、核酸抽出液５０μｌ中には１０菌分に相当するゲノムＤＮＡが上限として含まれ得る。
【００３３】
上述の方法で抽出した核酸を本発明の核酸増幅法によって増幅した。反応液の組成としては、ＰＣＲバッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ混合物）、２単位ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、前記プライマーを各５μＭとし、前記抽出物１０μｌを含め、全体量を４８μｌとした。そして、この反応液に補助核酸として、市販の１００ｎｇ／μｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）を２μｌ添加し、全量を５０μｌとした。反応液中に含まれる補助核酸２００ｎｇに対して標的核酸の量は上限でも２菌分のゲノムＤＮＡに相当するため、反応液中の核酸量の大半は補助核酸であった。また、ｒＲＮＡ配列のコピー数から標的遺伝子の増幅生成量を考慮しても、補助核酸は反応を通して全核酸量の大半を占めていた。
【００３４】
前記ＰＣＲ溶液をＴ３０００サーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社製）にセットし、ＰＣＲ反応を行った。サーマルサイクルとしては、一次加熱９５℃  １０分とし、変性９５℃  ４５秒、アニール６５℃  ４５秒、伸長７２℃  ４５秒を４０回繰り返し、その後７２℃で１０分間最終伸長を行った。同検体を用いた同様の増幅反応を計１０回行った。また、Ｓ．ｐ．が含まれていないことを培養法によって確認した喀痰検体に関しても、同様の操作を行った。
【００３５】
反応後、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて、電気泳動法による核酸の存在確認を行った。電気泳動の結果を図１に示す。図中、（ａ）〜（ｊ）がＳ．ｐ．が含まれていた喀痰から抽出したＤＮＡを増幅した結果であり、（ｋ）はＳ．ｐ．が含まれていない喀痰から抽出したＤＮＡを増幅した結果である。図から明らかなように、本発明の１０回の増幅では全て１５００塩基長の増幅産物が生成されていることが分かる。核酸が含まれていない検体からの増幅反応では増幅産物が出来ていないことから、Ｓ．ｐ．由来の核酸から所望の標的配列が増幅されていることが確認できる。このように、ごく微量の病原菌であっても安定して遺伝子検査を行えることが分かった。
（比較例１）
増幅反応の反応液に、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを加える代わりに２μｌの純水を添加して一般的なＰＣＲ反応組成にした以外は、全て実施例１と同様に抽出、増幅反応を行った。
【００３６】
実施例１と同量のＳ．ｐ．が含まれる喀痰検体に対して、１０回の増幅反応を行った。また、Ｓ．ｐ．が含まれていない検体に対しても同様の反応をおこなった。反応後、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて、電気泳動法による核酸の存在の確認を行った。
【００３７】
電気泳動の結果を図２に示す。図中、（ａ）〜（ｊ）がＳ．ｐ．が含まれていた喀痰から抽出したＤＮＡを増幅した結果であり、（ｋ）はＳ．ｐ．が含まれていない喀痰から抽出したＤＮＡを増幅した結果である。図から明らかなように、同様の検体を用いたにも関わらず１０反応で増幅産物の量に差異があり、半数では全く増幅が行われていない。
【００３８】
このように、本発明の核酸増幅方法を用いると、従来の増幅方法では増幅できないもしくは増幅量が不安定であった検体であっても、安定して効率良く増幅できる。
（実施例２）
本実施例では、人の髄液から髄膜炎の病原菌であるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（以降Ｈ．ｉ．と記載する）の遺伝子を検出する例を示す。
【００３９】
まず、Ｈ．ｉ．に存在する特異的な配列として、１６ｓｒＲＮＡ中に存在する１０００塩基配列を選択し、この配列をコードする領域のＤＮＡを特異的に増幅するための両端２種類のプライマーを設計した。プライマー配列は表２に示す。
【００４０】
【表２】
2008136421.tif 000004
【００４１】
人の髄液２ｍｌを採取し、そのうち１ｍｌをＭＯＲＡ−ＥＸＴＲＡＣＴ（極東製薬社製）を用いてＤＮＡ抽出を行った。抽出産物は５０μｌであった。この時点では、ごく微量な核酸しか含まれておらず、アガロースゲル電気泳動や吸光を測定しても核酸の存在を確認できなかった。同じ髄液を培地で３日間培養し、初期菌数が髄液１ｍｌあたり約１０菌と判明した。
【００４２】
上述の方法で抽出した核酸を本発明の核酸増幅法によって増幅した。反応液の組成としては、ＰＣＲバッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ混合物）、２単位ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、及び前記プライマーを各５μＭとし、前記抽出物２０μｌを含め、全体量を４８μｌとした。そして、この反応液に市販の１００ｎｇ／μｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）を２μｌ添加し、全量を５０μｌとした。
【００４３】
前記ＰＣＲ溶液をＴ３０００サーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社製）にセットし、ＰＣＲ反応を行った。サーマルサイクルとしては、一次加熱９５℃  １０分とし、変性９５℃  ４５秒、アニール６５℃  ４５秒、伸長７２℃  ４５秒を４０回繰り返し、その後７２℃で１０分間最終伸長を行った。同様の増幅反応を１０回行った。また、Ｈ．ｉ．が含まれていないことを培養法によって確認した髄液検体に関しても、同様の操作を行った。
【００４４】
反応後、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて、電気泳動法による核酸の存在の確認を行った。電気泳動の結果を図３に示す。図中、（ａ）〜（ｊ）がＨ．ｉ．が含まれていた髄液から抽出したＤＮＡを増幅した結果であり、（ｋ）はＨ．ｉ．が含まれていない髄液から抽出したＤＮＡを増幅した結果である。図から明らかなように、本発明の１０回の増幅では全て１０００塩基長の増幅産物が生成されていることが分かる。核酸が含まれていない検体からの増幅反応では増幅産物が出来ていないことから、Ｈ．ｉ．由来の核酸から所望の標的配列が増幅されていることが確認できる。このように、ごく微量の病原菌であっても安定して遺伝子検査を行えることが分かった。
（比較例２）
増幅反応の反応液に、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを加える代わりに２μｌの純水を添加して一般的なＰＣＲ反応組成にした以外は、全て実施例２と同様に抽出、増幅反応を行った。
【００４５】
実施例２と同量のＨ．ｉ．が含まれる喀痰検体に対して、１０回の増幅反応を行った。また、Ｈ．ｉ．が含まれていない検体に対しても同様の反応をおこなった。反応後、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて、電気泳動法による核酸の存在の確認を行った。
【００４６】
電気泳動の結果を図４に示す。図中、（ａ）〜（ｊ）がＨ．ｉ．が含まれていた髄液から抽出したＤＮＡを増幅した結果であり、（ｋ）はＨ．ｉ．が含まれていない髄液から抽出したＤＮＡを増幅した結果である。図から明らかなように、同様の検体を用いたにも関わらず１０反応で増幅産物の量に差異がある。（ａ）、（ｅ）のみかろうじて増幅されており、あとの８反応では全く増幅が行われていない。
【００４７】
このように、本発明の核酸増幅方法を用いると、従来の増幅方法では増幅できない、もしくは増幅量が不安定であった検体であっても、安定して効率良く増幅できる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の好適な実施例の結果を示す電気泳動結果の写真である。
【図２】従来の核酸増幅法による増幅結果を示す電気泳動結果の写真である。
【図３】本発明の好適な実施例の結果を示す電気泳動結果の写真である。
【図４】従来の核酸増幅法による増幅結果を示す電気泳動結果の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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