(57)【要約】【課題】高病原性トリ（鳥）インフルエンザ、ＨＰＡＩに対し特異的に有効なワクチンも薬剤も未だ実用化されず、現行の薬剤は重大な副作用を生じるため、更に安全かつ有効な抗ウイルス剤、及びＨＰＡＩの基礎と応用研究の進展が待望されている。併せて、ＭＳＰが関与するペプチドホルモン産生異常の診断方法の確立も重要課題である。【解決手段】モザイクセリンプロテアーゼ、ＭＳＰに属するＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ及びＴＭＰＲＳＳ１３阻害剤；これ等の酵素による基質の分解度又は開裂度を指標に用いる上記阻害剤のスクリーニング方法；該阻害剤を有効成分とする抗ウイルス剤及びペプチドホルモン疾患の治療薬；ＨＰＡＩウイルスの感染と増殖を高め量産を可能にする活性化剤；前記酵素を有効成分とするペプチドホルモン疾患の治療薬；前記酵素の遺伝子発現量を指標として用いるホルモン疾患の診断剤等。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ、及びＴＭＰＲＳＳ１３からなる酵素群から選ばれる少なくとも１種の酵素に対する阻害剤。
【請求項２】
ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ、及びＴＭＰＲＳＳ１３からなる酵素群から選ばれる少なくとも１種の酵素による基質の分解度又は開裂度を指標として用いることを特徴とする酵素阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
請求項１に記載のスクリーニング方法により得られる酵素阻害剤。
【請求項４】
請求項１又は３に記載の阻害剤又は酵素阻害剤を有効成分として薬効を奏する量、含有する抗ウイルス剤。
【請求項５】
ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ、及びＴＭＰＲＳＳ１３からなる酵素群から選ばれる少なくとも１種の酵素を有効成分として薬効を呈する量、含有するウイルス感染及び／又は増殖の活性化剤。
【請求項６】
請求項５に記載の活性化剤を用いることにより製造されるウイルス粒子及び／又はその構成成分。
【請求項７】
ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ、及びＴＭＰＲＳＳ１３からなる酵素群から選ばれる少なくとも１種の酵素を有効成分として薬効を奏する量、含有するホルモン疾患の治療薬。
【請求項８】
ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ、及びＴＭＰＲＳＳ１３からなる酵素群から選ばれる少なくとも１種の酵素に対する阻害剤を有効成分として薬効を奏する量、含有するホルモン疾患の治療薬。
【請求項９】
ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ、及びＴＭＰＲＳＳ１３からなる酵素群から選ばれる少なくとも１種の酵素の遺伝子発現量を指標として用いるホルモン疾患の診断剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、モザイクセリンプロテアーゼとその用途に関するものである。更に詳しくは、上記プロテアーゼの基質特異性、阻害剤スペクトラム、該遺伝子発現等を指標として用いる抗ウイルス剤とそのスクリーニング方法、特に高病原性トリ（鳥）インフルエンザの治療あるいは重症化防止のための抗ウイルス剤とそのスクリーニング方法、上記インフルエンザウイルスの感染又は増殖の活性化剤、該活性化剤を用いることにより製造されるウイルス粒子とその構成成分、ホルモン産生異常の診断剤と治療薬等に関するものである。
【０００２】
＜略語の説明＞
ＭＳＰ：モザイクセリンプロテアーゼ（ｍｏｓａｉｃ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）；ＭＳＰＬ：ＭＳＰ長鎖（ｍｏｓａｉｃ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ，ｌｏｎｇ）；ＭＳＰＬ：ＭＳＰ短鎖（ｍｏｓａｉｃ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ，ｓｈｏｒｔ）；ＴＭＰＲＳＳ１３：トランスメンブランセリンプロテアーゼ１３（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｅｒｉｎｅ  １３）；ＨＡ：赤血球凝集素（ヘマグルチニン）；ＨＰＡＩ：高病原性トリ（鳥）インフルエンザ（ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）；ＲＴ−ＰＣＲ：逆転写ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）。
＜配列番号の説明＞
以下の各配列は全て、後述される非特許文献１に記載の配列の、本件特許出願時、２００７年３月３０日現在での最新改訂版である。
配列番号１はＭＳＰＬ遺伝子ｃＤＮＡの完全長コドン領域の塩基配列を示す。
配列番号２はＭＳＰＬの完全長アミノ酸配列を示す。
配列番号３はＭＳＰＳ遺伝子ｃＤＮＡの完全長コドン領域の塩基配列を示す。
配列番号４はＭＳＰＳの完全長アミノ酸配列を示す。
配列番号５はＴＭＰＲＳＳ１３遺伝子ｃＤＮＡの完全長コドン領域の塩基配列を示す。
配列番号６はＴＭＰＲＳＳ１３の完全長アミノ酸配列を示す。
【背景技術】
【０００３】
筆頭発明者らは、ヒト肺由来のｃＤＮＡライブラリーから、新規な２種のＭＳＰ遺伝子をクローニングすると共に、これ等の各遺伝子の塩基配列の決定、それがコードするアミノ酸配列の解読、更に、これ等のペプチド鎖の構造解析等を行い、それぞれＭＳＰＬ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＢ０４８７９６）、及びＭＳＰＳ（同Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＢ０４８７９７）と命名し、２００１年に報告した（非特許文献１）。その後、これ等の酵素との相同性の検索から、ＴＭＰＲＳＳ１３（同Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１０７７２６３）を発見するに至った。しかし、これ等の酵素の機能を明確にしたという報告や公開文書等は未だ知られていない。
酵素ＭＳＰとその遺伝子、並びにこれ等の用途に関しては、次の技術が知られている：筆頭発明者らが発明の「ＭＳＰとその遺伝子」（特許文献１）及び「ＭＳＰ活性阻害を指標として用いる抗インフルエンザ剤のスクリーニング方法」（特許文献２）、体内におけるＭＳＰ産生の調節剤（特許文献３）、ＭＳＰとその遺伝子を用いる代謝活性剤（特許文献４）、ＭＳＰが関与する諸疾病の診断剤と治療薬（特許文献５及び６）等。
インフルエンザの予防や治療に関しては、ワクチン及び抗インフルエンザ薬が実用化されている。抗インフルエンザ薬としては、次の薬剤が臨床使用されている：塩酸アマンタジン（商品名シンメトリル、経口投与、Ｍ２タンパク質に作用してウイルスの脱殻を阻害するため、Ａ型インフルエンザに有効であるが、Ｍ２のないＢ型には無効、副作用は不眠などの中枢神経系への為害作用、食欲低下、嘔気等）、ザナミビル（商品名リレンザ、経口吸入投与、ノイラミニダーゼ阻害によりインフルエンザウイルスの細胞から細胞への感染・伝播を阻止するため、ＡとＢ両型に有効、副作用は稀に出るアナフィラキシー様症状、じんま疹、喘息発作の誘発等）、及びリン酸オセルタミビル（商品名タミフル、経口投与、作用はノイラミニダーゼ阻害によるもので上記ザナミビルに同じ、ＡとＢ両型に有効、副作用は腹痛、下痢、嘔気、精神神経症状、アナフィラキシー様症状、急性腎不全等）。
また、プロテアーゼによるインフルエンザウイルスのヌクシレオカブシドの開裂、その部位の解析、開裂阻害剤（プロテアーゼ阻害剤）、かかる開裂と感染との相関等に関する報告、知見、技術等としては、既に多種多様に知られている。例えば、フリン（ｆｕｒｉｎ、エンドプロテーゼ）による開裂（非特許文献２）、セリンプテアーゼによるＨＩＶの開裂とその断片ペプチドの分離（非特許文献３）、インフルエンザウイルス感染におけるミニプラスミンの必要性（非特許文献４）、インフルエンザウイルスの細胞内への進入にはプロテアーゼが必須（非特許文献５）等々。
尚、この発明では、後述される実験例及び実施例の記載において、これ等の文献に記載の技術が常法として援用される。
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−２５３８８７
【特許文献２】特開２００１−６９９８０
【特許文献３】ＷＯ  ０１／９６５３８
【特許文献４】ＷＯ  ０３／０９３４３２
【特許文献５】ＷＯ  ２００５／０４０４０１
【特許文献６】米国公開公報ＵＳ２００６／０２９２１５５（特許文献５の米国出願）
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１５１８，２０４−２０９，２００１．
【非特許文献２】ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１１（７），２４０７−２４１４，１９９２
【非特許文献３】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，              ２３７,６４−７４，１９９６．
【非特許文献４】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，              ２６８,２８４７−２８５５，２００１．
【非特許文献５】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｈｎ，１３，４０３−４１２，２００７．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＨＰＡＩウイルスの本来の宿主はトリであり、ヒトには感染し難いとは言え、高病原性トリ（鳥）インフルエンザに対し特異的に有効なワクチンも薬剤も未だ実用化されていない。また、現行の抗インフルエンザ薬は、稀ではあるにせよ、重大な副作用を生じるため、更に安全かつ有効な薬剤の開発、ＨＰＡＩに関するウイルス学やワクチン学分野の基礎及び応用研究の更なる進展等が切実に期待されている現状にある。併せて、ＭＳＰが関与するホルモン産生異常の診断方法の確立も重要課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
筆頭発明者らは、上述の通り、ＭＳＰＬ、及びＭＳＰＳの２酵素の発見を２００１年にいち早く報告して以来（非特許文献１）、相同酵素としてのＴＭＰＲＳＳ１３を発見し、          更に鋭意、該酵素の機能につき研究を重ねた結果、「これ等の酵素が、高病原性トリ（鳥）インフルエンザ、即ち、ＨＰＡＩウイルスのＨＡペプチド鎖を極めて特異的かつ効率的に切断ないしは開裂する」という驚くべき機能を発見した。この発明は、かかる発見に着想を凝らし、更なる創意工夫、試行錯誤、そして勤勉の結果、完成されたものである。
【０００７】
この発明によれば、前述の課題を解決するための手段として、次の（１）〜（９）がそれぞれ提供される：
（１）ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ及びＴＭＰＲＳＳ１３からなる酵素群から選ばれる少なく
とも１種の酵素に対する阻害剤。
（２）ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ及びＴＭＰＲＳＳ１３からなる酵素群から選ばれる少なく
とも１種の酵素による基質の分解度又は開裂度を指標として用いることを特徴とする酵素阻害剤のスクリーニング方法。
（３）上記スクリーニング方法により得られる酵素阻害剤。
（４）上記（１）又は（３）の阻害剤又は酵素阻害剤を有効成分として薬効を奏する量、含有する抗ウイルス剤。
（５）ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ及びＴＭＰＲＳＳ１３からなる酵素群から選ばれる少なく
とも１種の酵素を有効成分として薬効を呈する量、含有するウイルス感染及び／又は増殖の活性化剤。
（６）上記（５）の活性化剤を用いることにより製造されるウイルス粒子及び／又はその構成成分。
（７）ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ及びＴＭＰＲＳＳ１３からなる酵素群から選ばれる少なく
とも１種の酵素を有効成分として薬効を奏する量、含有するホルモン疾患の治療薬。
（８）ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ及びＴＭＰＲＳＳ１３からなる酵素群から選ばれる少なく
とも１種の酵素に対する阻害剤を有効成分として薬効を奏する量、含有するホルモン疾患の治療薬。
（９）ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ及びＴＭＰＲＳＳ１３からなる酵素群から選ばれる少なく
とも１種の酵素の遺伝子発現量を指標として用いるホルモン疾患の診断剤。
【発明の効果】
【０００８】
（１）ＨＰＡＩに由来し感染による死亡率が３０％を超える新型インフルエンザ、エイズ等のウイルス感染症の治療や重症化阻止において極めて特異的に機能する、安全かつ有効な抗ウイルス剤とそのスクリーニング方法が提供される。
（２）ペプチドホルモンの産生異常に起因する疾患の治療薬及び診断剤が提供される。
（３）この発明により提供されるウイルス感染及び／又は増殖の活性化剤は、培養や量産が困難
なウイルス、例えば鳥インフルエンザのウイルス粒子とその構成成分、ウイルス抗原、ウイルス遺伝子、抗体等々の量産を可能し、ウイルス学やワクチン学分野の基礎研究及び応用研究の更なる発展に大きく役立つ。
（４）上記の（１）〜（３）は、人類の保健と文明の進展に多大に寄与し、その私生活、社会生活、ビジネス活動、学術活動等々の諸活動に対し計り知れない精神的効果と経済的効果をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
この発明の実施の形態に関し、次の通り詳述する：
（１）抗ウイルス剤の対象疾患
この発明に係る抗ウイルス剤の対象となるウイルス疾患は、ＫＲ、ＲＲ、ＲＫＲ、ＲＲＲＲ等、２個以上のＲ（アルギニン）やＫ（リジン）等の塩基性アミノ酸が連続してペプチド結合した一次構造が存在するヌクレオカプシドを保有し、かつ、該ヌシレオカプシドの切断又は開裂が病原性の発現に関与する一連のウイルスによる感染症である。
例えば、ＨＰＡＩを起源とする新型インフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、イヌジステンパーウイルス、ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、黄熱病ウイルス、ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトサイトメガルウイルス、水痘ウイルス、強毒ＮＤＶ（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）等による感染症を上げることができる。
【００１０】
（２）ホルモン疾患
この発明に係るホルモン疾患とは、ＫＲ、ＲＲ、ＲＫＲ、ＲＲＲＲ等、２個以上のＲ（アルギニン）やＫ（リジン）等の塩基性アミノ酸が連続してペプチド結合した一次構造が存在するペプチドホルモン前駆体が、ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ及びＴＭＰＲＳＳ１３からなる酵素群から選ばれる少なくとも１種の酵素により切断又は開裂されることにより、活性化されるペプチドホルモンの産生異常に起因する疾患を意味する。
例えば、レニン（ｒｅｎｉｎ）、フォンウィルブランド因子（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ）、ｂ−神経増殖因子（ｂ−ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）等のペプチドホルモンの産生異常に起因する疾患を上げることができる。
【００１１】
（３）阻害剤ないしは酵素阻害剤
発明に係る阻害剤又は酵素阻害剤とは、ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ及びＴＭＰＲＳＳ１３に対する各ポリクロナール抗体、これ等の酵素のエピトープ、即ち、配列番号２、４及び６に記載のアミノ酸配列から選定されるエピトープに対するモノクローナル抗体、これ等の酵素をコードする遺伝子、即ち、配列番号１、３及び５に記載のｃＤＮＡ塩基配列から設計されるｓｉＲＮＡ、天然物から抽出精製される化合物、合成化合物等を意味する。ウイルス感染症やホルモン疾患の治療薬として用いる阻害剤としては、反復使用や非経口投与を考慮し、免疫原性ないしは抗原性のない低分子化合物が望ましい。尚、実験段階での阻害剤の具体例は、表２に列記されている。
【００１２】
（４）酵素
この発明では酵素として、ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ及びＴＭＰＲＳＳ１３をそれぞれ用いる。これ等の酵素は、遺伝子組換えの常法により量産できる。例えば、各酵素遺伝子の発現ベクターをそれぞれ構築の後、かかるベクターを各々、ヒト細胞、酵母、大腸菌等の宿主に移入して得られる形質転換体を培養することにより量産できる。その具体例は、実験例３に記載されている。
これ等の酵素の遺伝子のその構造は図１〜図３、アミノ酸配列の比較は図４、そしてＭＳＰＬの構造は図５にそれぞれ、実験例１の結果として記載されている。
また、該酵素の種々のヒト組織における発現度は図６にそれぞれ、実験例２の結果として記載されている。
【００１３】
（５）基質
この発明に係る上述(4)の酵素の基質特異性を考慮し、ＫＲ、ＲＲ、ＲＫＲ、ＲＲＲＲ等、２個以上のＲ（アルギニン）やＫ（リジン）等の塩基性アミノ酸が連続してペプチド結合した一次構造が存在するペプチドの使用が望ましい。その具体例は、表１と表３に列記されている。尚、治療薬候補としての阻害剤のスクリーニングに用いる基質は、目的に応じて適宜、選定できる。例えば、ＨＰＡＩウイルスに対する抗ウイルス剤のスクリーニングには、該ウイルスそれ自体のＨＡを基質として用いる。ペプチドホルモン疾患の治療薬のスクリーニングには、該ホルモンの前駆体を基質として用いる。
【００１４】
（６）酵素活性の測定
測定は、酵素反応方法とその測定の常法により行う。即ち、濃度が一定の酵素と基質とを混合の後、溶媒組成とそのｐＨ、並びに温度が一定の条件下で、一定時間、酵素反応を行った後、酵素による分解物を定量することにより測定する。具体例は、実験例４に記載されている。
【００１５】
（７）酵素の基質特異性
基質特異性は、上記の酵素活性の測定と同様にして、酵素による種々の基質の分解活性を測定することにより決定できる。その具体例は、実施例１に記載されている。
【００１６】
（８）種々の阻害剤に対する酵素の特異性（阻害剤スペクトラム）
阻害剤スペクトラムは、阻害剤の共存で酵素反応を行うことにより検定する。酵素と阻害剤とを混合の後、かかる混合物につき、前述した酵素活性の測定と同様にして、酵素反応を行い、基質の分解度あるいは未分解基質の残存度を定量することにより検定することができる。その具体例は、実施例２に記載されている。
【００１７】
（９）抗ウイルス剤のスクリーニング方法
抗ウイルス剤は、上記の阻害剤スペクトラムに基づきスクリーニングする。この場合、基質としては、対象病原体ウイルスそのものから調製したウイルス構成タンパク質であって、かつ、本発明に係る酵素の基質特異性が高い物質、例えば、ＨＰＡＩウイルスではそのヌクレオカブシド、カプソメア、ＨＡ等の使用が望ましい。スクリーニングの阻害剤の候補物質としては、前述の通り、免疫原性あるいは抗原性のない低分子化合物の使用が望ましい。その具体例は、実施例３に記載されている。
【００１８】
（１０）ウイルス感染及び／又は増殖の活性化剤
この発明に係る活性剤に関し、前述の酵素ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ及びＴＭＰＲＳＳ１３を活性化剤の有効成分として用いる。この活性化剤は、ＨＰＡＩウイルスやＨＩＶ等の培養や量産が困難なウイルスの全粒子、また、ウイルス遺伝子、抗原、ウイルス酵素、構造タンパク質、ヌクレオカプシド、カプソメア等々の構成成分の量産、更には、かかる抗原に対する抗体の作製を可能かつ容易にする。活性化剤の用法としては、例えば、ウイルス培養培地への添加混合、シードウイルスの前処理液への添加混合等のかたちで使用することができる。
【００１９】
（１１）ペプチドホルモン疾患の治療薬
疾患がペプチドホルモンの産生過剰に起因する場合は、その治療薬として、この発明によりスクリーンされ提供される阻害剤を使用できる。逆に該ホルモンの産生過少による場合は、本発明に係る酵素を補充療法剤として用いることができる。
以下、実験例及び実施例を上げ、この発明の構成と効果を具体的に説明する。但し、この発明は、これ等の実験例及び実施例にのみに制限されるわけではない。
【００２０】
［実験例１］
ＭＳＰＬ、ＭＤＰＳ及びＴＭＰＲＳＳ１３各遺伝子のクローニング、発現及び解析
上記の各遺伝子は、ヒト肺ｃＤＮＡライブラリー［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（米国）製の商品名Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ−ｃＤＮＡ］からＰＣＲによりクローニングの後、それぞれ発現させた。また、これ等の遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列を決定する共に、これ等がコードするアミノ酸配列をそれぞれ解読した。その材料と方法、並びに結果の詳細は、筆頭発明者らによる既報（非特許文献１）の記載を援用する。
（１）更に、既報の記載を再確認した結果、塩基配列とアミノ酸配列において誤りが発見された。その結果に基づく訂正データを図１、図２及び図３にそれぞれ示す。
図１は、ＭＳＰＬ遺伝子ｃＤＮＡの完全長コドン領域の塩基配列とそれがコードする完全長アミノ酸配列を示す。□で囲まれたアミノ酸は活性中心、↑は活性体になるための切断部位、下線太線は推定膜貫通領域、及び＊は推定Ｎ型糖鎖付加部位をそれぞれ示す。
図２は、ＭＳＰＳ遺伝子ｃＤＮＡの完全長コドン領域の塩基配列とそれがコードする完全長アミノ酸配列を示す。□で囲まれたアミノ酸は活性中心、↑は活性体になるための切断部位、及び＊は推定Ｎ型糖鎖付加部位をそれぞれ示す。
図３は、ＴＭＰＲＳＳ１３遺伝子ｃＤＮＡの完全長コドン領域の塩基配列とそれがコードする完全長アミノ酸配列を示す。□で囲まれたアミノ酸は活性中心、↑は活性体になるための切断部位、下線太線は推定膜貫通領域、及び＊は推定Ｎ型糖鎖付加部位をそれぞれ示す。
（２）併せて、これ等の３アミノ酸配列を相互に比較した。その結果を図４に示す。この図では、翻訳開始部位Ｍｅｔを第１番アミノ酸とし、相同部位を□で囲んだ。
（３）また、ＭＳＰＬの構造解析を行った。その結果を図５に示す。この図では、ＭＳＰＬが有するドメイン構造を模式的に示した。
尚、ＴＭはｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ（膜貫通ドメイン）、ＳＲＣＲはｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｉｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎ（スカベンジャーレセプターシステインリッチドメイン）、及びＳＰＤはｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ（セリンプロテアーゼドメイン）をそれぞれ意味する。
また、ＴａｎｄｅｍはＮ末端側細胞内領域に認められるｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅのアミノ酸配列を意味し、更に、各種キナーゼによるリン酸化部位認識配列、即ち、Ｃｄｃ２キナーゼによる認識配列Ｓ／Ｔ−Ｐ−Ｘ−Ｋ／Ｒ、ＣａＭキナーゼＩＩによるＲ−Ｘ−Ｘ−Ｓ／Ｔ、及びプロテインキナーゼＣによるＲ−Ｘ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｒの各認識配列をそれぞれ太字で示した。更にまた、繰り返し認められるアミノ酸配列ＡＳＰＡを下線で示した。
【００２１】
［実験例２］
種々のヒト組織におけるＭＳＰＬ及びＴＭＰＲＳＳ１３遺伝子発現の解析
ＭＳＰＬ及びＴＭＰＲＳＳ１３のヒト各組織におけるｍＲＮＡ発現は、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  ｐａｎｅｌｓ［ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国）より購入］を使用し、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により解析した。ＰＣＲ用の遺伝子特異的プライマーとしては、ＭＳＰＬとＴＭＰＲＳＳ１３に共通のｓｅｎｓｅ鎖には５’−ＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＣＴ−３’、ＭＳＰＬのａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖には５’−ＣＣＴＣＴＧＣＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣＣＴ−３’、及びＴＭＰＲＳＳ１３のａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖には５’−ＣＴＧＧＴＴＡＧＧＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＧＣＡＣ−３’をそれぞれ用いた。ＰＣＲは次の条件で行った：ＭＳＰＬでは、変性が９４℃で３０秒間、アニーリングが６６℃で３０秒間、伸長が７２℃で３０秒間を３５サイクル、また、ＴＭＰＲＳＳ１３では、変性が９４℃で３０秒間、アニーリングが  ６２℃で３０秒間、伸長が７２℃で３０秒間を３５サイクル。内部標準には、ヒトＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅｓ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の特異的プライマーとして、ＧＡＰＤＨのｓｅｎｓｅ鎖には５’−ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴ−３’、ＧＡＰＤＨのａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖には５’−ＣＡＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ−３’をそれぞれ使用した。ＰＣＲは次の条件で行った：変性が９４℃で３０秒間、アニーリング及び伸長が６８℃で２分間を２５サイクル。ＰＣＲ産物は２％アガロース／ＴＡＥ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ酢酸、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）ゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色にて検出した。ＰＣＲ産物が目的遺伝子であることはシークエンスを行い確認した。その結果を図６に示す。
図６において、レーン１は比較対照（鋳型なし）、レーン２は脳、レーン３は心臓、レーン４は肺、レーン５は胸腺、レーン６は肝臓、レーン７は脾臓、レーン８は膵臓、レーン９は腎臓、レーン１０は小腸、レーン１１は大腸、レーン１２は前立腺、レーン１３は精巣、レーン１４は卵巣、レーン１５は骨格筋、レーン１６は胎盤、レーン１７は白血球ないしは末梢血リンパ球、レーン１８は単核球細胞、レーン１９はＣＤ１４＋細胞、レーン２０はＣＤ４＋細胞、レーン２１はＣＤ８＋細胞、及びレーン２２はＣＤ１９＋細胞。
ＭＳＰＬでは、肺、膵臓、前立腺、及び胎盤において高い遺伝子発現を認めた。また、ＴＭＰＲＳＳ１３では、肺、膵臓、前立腺及び胎盤のみならず、胸腺、脾臓及び末梢血リンパ球においても高い遺伝子発現を認めると共に、脳と大腸においても遺伝子発現を認めた。
また、ＭＳＰＳについても、特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲを上記と同様にして行った結果、肺、膵臓、前立腺及び胎盤のみならず、卵巣と末梢血リンパ球においても高い遺伝子発現を認めた。
【００２２】
［実験例３］
ＭＳＰＬとＴＭＰＲＳＳ１３の調製
（１）リコンビナントＭＳＰＬ及びＴＭＰＲＳＳ１３の各発現ベクターの構築
ＭＳＰＬ及びＴＭＰＲＳＳ１３の各全長ｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲで増幅した後、その産物を発現用ベクターｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ１４［ＳＩＧＭＡ社（米国）より購入］の制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩサイトに組み込み、発現ベクターを構築した。同時に、ＭＳＰＬ及びＴＭＰＲＳＳ１３の各細胞外領域（ＳＲＣＲドメインからセリンプロテアーゼドメインまで）のみをそれぞれ、発現用ベクターｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ９［ＳＩＧＭＡ社（米国）より購入］のエンテロキナーゼ認識配列（ＤＤＤＤＫ）の直下に組み込み、発現ベクターを構築した。次に、これ等の発現ベクターは全て、シークエンス解析により配列を確認した。
（２）リコンビナントＭＳＰＬ及びＴＭＰＲＳＳ１３の生産と精製
上記の各発現ベクターをそれぞれ、Ｈｉｌｙ  Ｍａｘ［同仁化学研究所（日本）より購入］を用いてＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞）に移入した後、無血清培地で培養し、得られた培養上清（ＳＦＣＭ；  Ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）を採取した。次いで、その上清を、限外濾過Ｂｉｏｍａｘ−１０メンブレン［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（米国）より購入］を用いて濃縮の後、最終濃度が５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化した後、ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２−ａｇａｒｏｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌカラム［ＳＩＧＭＡ社（米国）より購入］にかけ、０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ  ３．５）で溶出し、精製した。得られた精製タンパクは、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  （ＰＢＳ）にて透析後、使用するまで−３０℃にて保存した。
（３）トリプシンによるＭＳＰＬ及びＴＭＰＲＳＳ１３の活性化
２μｇのリコンビナントＭＳＰＬを１０μｌのトリプシンビーズ［ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｔｏｓ−Ｐｈｅ−ＣＨ２Ｃｌ（ｔｏｓｙｌｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）−ｔｒｙｐｓｉｎ］［Ｐｉｅｒｃｅ社（米国）より購入］と０．１Ｍ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ（ｐＨ８．０）中にて、３７℃で２時間反応させた。反応終了の後は、２０，４００ｘｇ、２分間の遠心によりトリプシンビーズを除去した後、上清を回収し、そのＭＳＰＬ酵素活性を、実験例４に記載の方法で測定することにより確認した。
【００２３】
［実験例４］
酵素活性の測定
酵素活性測定は、トリス緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）中で活性化リコンビナントＭＳＰＬと蛍光標識人工ペプチド基質とを反応させ、その反応産物（ＡＭＣ；７−ａｍｉｎｏ−４ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ）の生成量を蛍光分光光度計［ＨＩＴＡＣＨＩ社（日本）製のＭｏｄｅｌ  ６５０−１０ＭＳ］を用い、Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  波長３７０ｎｍ、及びＥｍｉｓｓｉｏｎ波長４６０ｎｍで測定した。酵素活性は１分間当たり１μｍｏｌのＡＭＣを生成する酵素量を１単位（Ｕｎｉｔ）とした。
【実施例１】
【００２４】
酵素の基質特異性
実験例４の記載と同様にして、酵素による種々の基質の分解活性を測定した。得られた測定値は、人工基質Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡの分解活性を１００とし、各基質の分解活性の割合（％：相対活性）で表記した。その結果を表１に示す。
表１において、Ｂｏｃはｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＭＣＡは４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｌ−７−ａｍｉｄｅ、Ｂｚはｂｅｎｚｏｙｌ、及びＯＢｚｌはｂｅｎｚｙｌｏｘｙをそれぞれ意味する。
ＭＳＰＬは、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、及びＢｏｃ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを極めて特異的に分解した。
【００２５】
【表１】
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【実施例２】
【００２６】
酵素の各種阻害剤に対する特異性（阻害剤スペクトラム）
また、各種阻害剤の影響は活性化リコンビナントＭＳＰＬと阻害剤をあらかじめ緩衝液中で３７℃、５分間反応させた後、残存するＭＳＰＬ酵素活性を、実験例４の記載と同様にして測定した。得られた測定値は、阻害剤非存在下での人工基質Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡの分解活性を１００とし、各阻害剤存在下での残存活性の割合（％：相対残存活性）で表記した。その結果を表２に示す。
表２において、Ｅ−６４ｃはｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｅ−６４［ｔｒａｎｓ−ｅｐｏｘｙｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｙｌａｍｉｄｏ−（４−ｇｕａｎｉｄｉｎｏ）ｂｕｔａｎｅ］ａｎａｌｏｇｕｅ、ＵＴＩはｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＳＬＰＩはｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｌｅｕｋｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒをそれぞれ意味する。
ＭＳＰＬ活性は、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、及びｄｅｃ−ＲＶＫＲ−ｃｍｋにより特異的に阻害された。
【００２７】
【表２】
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【実施例３】
【００２８】
ＭＳＰＬによるインフルエンザウイルスのヘマグルチニン限定分解部位ペプチドの切断効率
ＭＳＰＬによる高病原性鳥インフルエンザウイルスとヒト低病原性インフルエンザウイルスの膜
融合活性と感染性の発現に係わる、ヘマグルチニン限定分解部位ペプチドの切断効率を次の通り測定した。
高病原性鳥インフルエンザＨ５Ｎ１とＨ７Ｎ７、並びに低病原性ヒトインフルエンザＨ３Ｎ２のヘマグルチニンの限定的分解部位を含むペプチドを常法により合成の後、これらのペプチド１０μｇに対し、０．１μｇのＭＳＰＬを添加混合して反応させ、ＭＳＰＬによるペプチドの切断活性を検定した。反応は、１００ｍＭトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＨ７．０）５０μｌ中で３７℃にて３時間、行った。反応終了の後、１％になるようにトリクロロ酢酸を添加混合して停止させ、次いで、反応産物を常法（非特許文献３）により、ＯＤＳ−１２０Ｔの逆相クロマトかけ分離した。分離したペプチドのアミノ酸配列を常法（非特許文献４）により、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｍｏｄｅｌ  ４９２  プロテインシークエンサー［Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社（米国）製］を用いて解析し、切断部位と切断ペプチドの量を決定した。切断率（％）は、加えたペプチド量（ｍｏｌ）を１００としたときの分解産物の割合で表記した。その結果を表３に示す。
ＭＳＰＬは、低病原性ヒトインフルエンザＨ３Ｎ２ヘマグルチニンのペプチド構造はほとんど切断せず、高病原性鳥インフルエンザＨ５Ｎ１とＨ７Ｎ７両マグルチニンのペプチド構造を、いずれも極めて特異的に切断することが確認された。
【００２９】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００３０】
この発明は、抗ウイルス剤とそのスクリーニング、ウイルス感染及び／又は増殖の活性化剤、ペプチドホルモン疾患の治療薬とそのスクリーニング、診断剤等に関するものであり、ウイルス学、ワクチン学、医薬、創薬、診断剤、獣医薬等の分野で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ＭＳＰＬのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ＭＳＰＳのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、ＴＭＰＲＳＳ１３のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、ＭＳＰＬ、ＭＳＰＳ及びＴＭＰＲＳＳ１３のアミノ酸配列比較を示す。
【図５】図５は、ＭＳＰＬの構造を示す。
【図６】図６は、ヒト各組織におけるＭＳＰＬ及びＴＭＰＲＳＳ１３の遺伝子発現の比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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