(57)【要約】【課題】肥満を予防または改善する脂肪蓄積抑制剤およびそれを含む薬剤、飲食品を提供すること。【解決手段】ミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体を有効成分として含む脂肪蓄積抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体を有効成分として含む脂肪蓄積抑制剤。
【請求項２】
請求項１に記載の脂肪蓄積抑制剤を含む薬剤。
【請求項３】
請求項１に記載の脂肪蓄積抑制剤を含む飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体を含有する、脂肪蓄積抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタボリックシンドロームは過栄養・運動不足という先進国にみられる典型的な生活習慣によってもたらされる文明病であり、心筋梗塞や脳血管疾患などの動脈硬化性疾患のリスクが２〜３倍上昇すると考えられている。日本では現在、メタボリックシンドローム（内蔵脂肪症候群）が強く疑われる者と予備軍と考えられる者を併せた割合は、２０歳以上の男性で２３．０％、女性で７．８％という報告がある。日本におけるメタボリックシンドロームは２００５年４月に診断基準が策定され、腹部肥満、内臓脂肪蓄積を必須項目として基盤をおき、高血圧、脂質代謝異常（高ＴＧ血症または低ＨＤＬコレステロール血症）、高血糖のうち２項目以上存在する場合、メタボリックシンドロームと診断する。
【０００３】
内蔵脂肪型肥満はメタボリックシンドロームの危険因子として報告されている。内臓脂肪型肥満になると、空腹時にトリグリセリドの分解産物である遊離脂肪酸とグリセリドが内臓脂肪から過剰に放出され、内臓脂肪は門脈につながっているため、放出された遊離脂肪酸とグリセロールが直接肝臓に流入し、高脂血症、高血糖、さらにインスリンの異化障害を起こし、インスリン抵抗性につながる。
【０００４】
また、メタボリックシンドロームの要因には生活環境因子、遺伝因子がある。生活環境因子には食事も含まれ、最近ではメタボリックシンドロームになりにくい食事が注目されている。アメリカのZemelらの研究（非特許文献１および２）によると、肥満者に対して乳製品の摂取量の増加は、総体脂肪量と内臓脂肪量を減少させた。しかも乳製品中のカルシウムは他のカルシウム源より明らかに効果的であったことを示した。しかし上記の研究では脂肪量減少に乳製品摂取は効果的であったが、実際のところ脂肪蓄積抑制に効果的なものは乳製品中の乳成分の何かであるのか、それとも乳由来のカルシウムによるものなのか現在明確になっていない。
【０００５】
一方、乳由来のカルシウムについては、様々な研究や特許出願がなされており、例えば吸収性及び生体利用性に優れ、中性の水溶液に可溶であるカルシウム・ホスホペプチド複合体（特許文献１および特許文献２）、カルシウム複合体の製造方法（特許文献３）などがある。
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−２９０６８２号公報
【特許文献２】特開平１１−３１０５９９号公報
【特許文献３】特開２００４−２１５５２１号公報
【非特許文献１】Sun X, Zemel MB, Calcium and dairy products inhibit weight and fat regain during ad libitum consumption following energy restriction in Ap2-agouti transgenic mice, J Nutr. 2004 Nov;134(11):3054-60.
【非特許文献２】Zemel MB, Miller SL, Dietary calcium and dairy modulation of adiposity and obesity risk, Nutr Rev. 2004 Apr;62(4):125-31. Review.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、肥満を予防または改善する脂肪蓄積抑制剤およびそれを含む薬剤、飲食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、乳中のカルシウムがカルシウムアパタイトの形でカゼインミセルに組み込まれたミセル性リン酸カルシウムと、カゼイン由来のホスホペプチドとの複合体である、ミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体が、脂肪蓄積を抑制する効果を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明の特徴は要約すると以下の通りである。
（１）ミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体を有効成分として含む脂肪蓄積抑制剤。
（２）（１）に記載の脂肪蓄積抑制剤を含む薬剤。
（３）（１）に記載の脂肪蓄積抑制剤を含む飲食品。
【００１０】
なお、本明細書において「薬剤」または「飲食品」は、ヒトを対象としたものだけではなく、ヒト以外の動物、例えば家畜、愛玩動物、ヒト以外の霊長類、齧歯類等の哺乳動物、鳥類、魚類等を対象とした薬剤または飲食品（例えばペットフード、飼料）を含む。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、飲食品または飼料をヒトまたはヒト以外の動物が摂取したときに、脂肪が体内に蓄積することを抑制することができ、それにより内臓脂肪型肥満を予防または改善し、ひいてはメタボリックシンドロームを予防することができる。本発明の脂肪蓄積抑制剤を含む薬剤または飲食品は、人体を含む動物の体に安全で、容易に摂取することができ、薬剤または飲食品の商品価値を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の第１の態様の脂肪蓄積抑制剤は、ミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体を有効成分として含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明で用いられるミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体は、乳中のカルシウムがカルシウムアパタイトの形でカゼインミセルに組み込まれたミセル性リン酸カルシウムと、カゼイン由来のホスホペプチドとが、複合体を形成したものであり、例えば牛乳、ヤギ乳、水牛乳、羊乳などの哺乳動物の乳から、好ましくは牛乳から製造できる。
【００１４】
乳中のカルシウムは、可溶性カルシウムと、カゼインミセル中に存在するカルシウムに分けられる。カゼインミセル中に存在するカルシウムは、さらにカゼイン結合性カルシウムとミセル性リン酸カルシウムとに分けられる。なお、ミセル性リン酸カルシウムはコロイド状リン酸カルシウムとも呼ばれる。
【００１５】
カゼイン結合性カルシウムは、例えばリン酸カルシウム−カゼイン複合体あるいはリン酸カルシウム−クエン酸−カゼイン複合体の形を有する、カゼインミセルに結合しているカルシウムである。ミセル性リン酸カルシウムは、上述のようにカルシウムがカルシウムアパタイトの形でカゼインミセルに組み込まれているものである。
【００１６】
カルシウムの形態別吸収性については、可溶性カルシウムも吸収性が良いが、それ以上にカゼイン結合性カルシウムとミセル性リン酸カルシウムの方が利用性の良いことが報告されている（Nutr.Rep.Int.,21,6738 (1980)）。そして乳に含有するこれらのカルシウムのうち60〜70％近くはカゼイン結合性カルシウムとミセル性リン酸カルシウムの形態である。
【００１７】
カゼインミセルは、通常、カゼインが会合して溶液中で安定なミセル構造を形成しているものを指すが、本明細書では、カゼイン結合性カルシウム及び／又はミセル性リン酸カルシウムを含有したカゼインミセルを含む画分をいう。
【００１８】
本発明で用いられるミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体は、好ましくは、カゼインミセル（好ましくは牛乳カゼインミセル又はレンネットカゼインミセル）をプロテアーゼで加水分解した後、酸を加えてｐＨ５．４以下にし、次いで不溶性ペプチドと未分解のカゼインとを除去することによって得られる溶液をｐＨ６．６以上に調整することにより、その溶液中で形成させることができる。本明細書において「ミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体」は、ホスホペプチドと、ミセル性リン酸カルシウム、場合によりカゼイン結合性カルシウムの複合体を含むことを意味する。ミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体は、具体的には、以下のようにして製造できる。
【００１９】
まず、牛乳、山羊乳、水牛乳、羊乳等の哺乳動物の乳から、カゼインミセルを調製する。例えば、カゼインミセルとしてレンネットカゼインを調製する場合には、常法に従い、ｐＨ５．５以上の脱脂乳に適当量のレンネットを添加して乳を凝固させた後、カードナイフで細かくカットする。次に、カットしたカードを加温し、静置した後、ホエーを排除する。そして、カードに水を加えて数分間攪拌し、カードを洗浄した後、静置して水を排除するという操作を２〜３回実施し、レンネットカゼインを得る。また、例えば、カゼインミセルとして乳糖及び可溶性ミネラルを除去したカゼインを調製する場合、常法に従い、ｐＨ５．５以上の全乳や脱脂乳を限外濾過膜（分画分子量５０，０００Ｄａ以上）、精密濾過膜、逆浸透膜等の膜で処理するか、あるいは電気透析することにより、乳糖及び可溶性ミネラルを除去したカゼインを得る。調製したカゼインミセル中には、カゼイン結合性カルシウム及びミセル性リン酸カルシウムが含まれている。
【００２０】
次に、このようにして調製したカゼインミセルを蛋白質分解酵素で加水分解する。蛋白質分解酵素としては、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、プロナーゼ、サーモリジン等を用いることができる。カゼイン重量に対して０．００１〜２％量の蛋白質分解酵素を加え、１５〜６０℃で約５分〜１００時間程度インキュベーションする。反応後８０〜１２０℃で約２秒〜１０時間程度加熱し、酵素反応を停止させる。
【００２１】
次にその反応物のｐＨを５．４以下に調整した後、不溶性ペプチドと未分解のカゼインを除去することにより、カゼインミセルからカゼイン結合性カルシウム及びミセル性リン酸カルシウムを分離し、回収する。
【００２２】
ｐＨを５．４以下に調整する方法としては、例えば酸を添加する方法や、乳酸菌を添加して乳酸発酵を利用する方法等が挙げられる。具体的には、カゼインミセルに塩酸等の無機酸や酢酸、乳酸、クエン酸等の有機酸を加えてｐＨを５．４以下にする方法がある。この際、ホモミキサーやコロイドミル等を使用して団塊形成を防止すると共に、酸が均一に分散するよう十分に攪拌、混練、磨砕等を行うことが好ましい。
【００２３】
こうして酸処理などによってｐＨ調整を行った後、例えば、１０００×g、１５分で遠心分離を行うことにより、不溶性ペプチドと未分解のカゼイン（蛋白質分解酵素による処理を受けなかったカゼイン）を除去することができる。このような不溶性ペプチド及び未分解のカゼインの除去は、当業者に公知の通常の手法を用いて行えばよい。
【００２４】
こうして得られたカゼインミセル溶液は、後述の通りｐＨを６．６以上に調整する前に、さらに限外濾過等によって濃縮してもよい。これにより、カゼインミセルからカゼイン結合性カルシウム及びミセル性リン酸カルシウムを分離し、回収することができる。例えば、カゼインミセルのｐＨを５．４以下に調整した後に、溶液を攪拌して均一化し、その溶液を限外濾過膜（分画分子量５０，０００Ｄａ以下）を用いて限外濾過することにより、カゼイン結合性カルシウム及びミセル性リン酸カルシウムを透過液側に回収し、その透過液を次のｐＨ調整に供する。なお、限外濾過して得られるカゼイン結合性カルシウム及びミセル性リン酸カルシウムは、塩素イオン等の陰イオンを多く含んでいるので、電気透析等の処理により陰イオンを除去してカルシウム含量を高めると良い。
【００２５】
以上のようにして調整した、不溶性ペプチドと未分解のカゼインを除去したカゼインミセル溶液中には、ミセル性リン酸カルシウム、場合によりカゼイン結合性カルシウム、そしてホスホペプチドが含まれている。この溶液のｐＨを６．６以上になるように調整することにより、ミセル性リン酸カルシウムとホスホペプチドとの複合体を形成させることができる。ｐＨを６．６以上に調整する方法としては、例えば上記溶液にアルカリを添加する方法等が挙げられる。用いるアルカリとしては水酸化ナトリウムが好ましい。不溶性ペプチドと未分解のカゼインを除去した溶液のｐＨが６．６未満の条件では、ミセル性リン酸カルシウムとホスホペプチドとの複合体は形成されにくい。
【００２６】
こうして得られるミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体は通常は液状である。本発明ではこの液状ミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体を脂肪蓄積抑制剤に直接使用することができる。その液状ミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体をさらにエバポレーターや限外濾過等で濃縮処理して、得られるミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体含有濃縮液を脂肪抑制蓄積剤として用いてもよい。また、その液状ミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体を、（好ましくは濃縮処理した後で）乾燥処理して、固体状又は粉末状で用いることもできる。乾燥処理法としては、風乾法、凍結乾燥法、スプレードライ法、減圧乾燥法、及び加熱乾燥法等の任意の手法が挙げられる。なお、限外濾過膜や精密濾過膜等の膜で処理することにより、１価のイオンを除去し、複合体を形成していない遊離のカゼイン結合性カルシウム、ミセル性リン酸カルシウム、及びホスホペプチド等を除去することができるので、より高純度の複合体を得ることができる。
【００２７】
以上の方法によって得られるミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体は、中性域のｐＨでも、粉末状でも、高い溶解性を示す。この方法で得られるミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体は、カゼインミセルから単一工程にて得ることができるため、非常に低コストで製造できるだけでなく、例えば牛乳から直接製造できるものである点で安全・安心を求める消費者にとってより受け入れやすい。
【００２８】
本発明におけるミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体を有効成分とする脂肪蓄積抑制剤の種々の組成物への配合量は、組成物の種類や目的等によって調整することができるが、組成物の全量に対して、例えば１００重量％、９９重量％、９８重量％、９５重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％であるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の第２の態様である薬剤は、上記脂肪蓄積抑制剤を含むことを特徴とする。脂肪蓄積抑制剤に例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤等の添加剤を加え、常法により好ましくは経口用製剤、具体的には、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、錠剤等の剤形に製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものを用いればよく、例えば、賦形剤としては乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、硅酸等、結合剤としては水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等、着色剤としてはカラメル色素、パプリカ色素、コチニール色素、インジゴカルミン等、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。また、液体製剤の剤形に製造してもよく、脂肪蓄積抑制剤に矯味剤、緩衝剤、安定化剤等を加えて常法により、内用液剤、シロップ剤等を製造してもよい。この場合矯味剤としては上記に挙げられたものでよく、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００３０】
本発明の薬剤は、例えば、ミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体として１日当たり４０ｍｇ〜４００ｍｇ／Ｋｇ体重、より好ましくは１２０ｍｇ〜４００ｍｇ／Ｋｇ体重の範囲で投与されるように含まれていればよいが、肥満の程度、性別、年齢などによって、またヒト以外の動物の場合、そのほかに動物種等に応じて適宜調整することができる。本発明の薬剤は、例えば生活習慣、体質、遺伝などの要素によって肥満しやすい傾向にある人に予め投与して、脂肪の体内蓄積を抑制し、肥満を予防したり、あるいは肥満患者に投与して、例えば内臓脂肪型肥満の状態を改善することが可能である。また、予防剤として使用する場合は、肥満改善剤として使用する場合と比べてより少量〜同量としてもよい。
【００３１】
本発明の第３の態様である飲食品は、上記脂肪蓄積抑制剤を含むことを特徴とする。
上記脂肪蓄積抑制剤は、当業者が利用可能である任意の適切な方法によって、飲食品に含有させることができる。例えば、脂肪蓄積抑制剤は、液状、固体若しくは顆粒状に加工してから食品に含有させてもよい。あるいは飲食品中に直接混合又は溶解してもよいし、飲食品中に埋め込んでもよい。また脂肪蓄積抑制剤を、食品に塗布、被覆、浸透又は吹き付けてもよい。脂肪蓄積抑制剤は、飲食品中に均一に分布していてもよいし、不均一に分布していてもよい。あるいは脂肪蓄積抑制剤は、食品中の特定部位に偏在していてもよい。脂肪蓄積用製剤を、凍結乾燥させた状態で飲料に溶解する場合には、例えば水に溶解させ、攪拌により均一に混合させた後、飲料、水等に添加することが好ましい。また、脂肪蓄積抑制剤を固形食品に混合する場合は、例えば食品材料に添加し、攪拌により均一に混合した後、加工することが好ましい。また、脂肪蓄積抑制剤を含有させた飲食品をさらに加工することもできる。そのような加工製品も、本発明の範囲に包含される。あるいはまた、脂肪蓄積抑制剤自体を、固形成形したり、カプセルや糖衣錠等の形状に製剤したりしたものも、本発明の飲食品に包含される。
【００３２】
本発明の飲食品には、例えばヒトを対象とする飲食品の場合、ミセル性リン酸カルシウム−ホスホペプチド複合体の１日の摂取量として２.４ｇ〜２４ｇ、より好ましくは１０ｇ〜２４ｇの範囲で配合されるように脂肪蓄積抑制剤を添加することが好ましいが、摂取対象者などによって、またヒト以外の動物の場合、そのほかに動物種等に応じて適宜調整することができる。またヒト以外の動物の場合、例えばネコを対象としたペットフードの場合、ミセル性リン酸カルシウム複合体の１日の摂取量として１ｇ〜２ｇの範囲で配合されるように脂肪蓄積抑制剤を添加するのが好ましいが、年齢や性別によって適宜調整することができる。本発明の飲食品を摂取することにより脂肪の体内蓄積を抑制し、内臓脂肪型肥満を予防したり、肥満の状態を改善することが可能である。
【００３３】
本発明の飲食品の製造においては、飲食品に慣用的に使用される各種添加物を使用してもよい。添加物としては、限定するものではないが、発色剤（亜硝酸ナトリウム等）、着色料（クチナシ色素、赤１０２等）、香料（オレンジ香料等）、甘味料（ステビア、アステルパーム等）、保存料（酢酸ナトリウム、ソルビン酸等）、乳化剤（コンドロイチン硫酸ナトリウム、プロピレングリコール脂肪酸エステル等）、酸化防止剤（ＥＤＴＡ二ナトリウム、ビタミンＣ等）、ｐＨ調整剤（クエン酸等）、化学調味料（イノシン酸ナトリウム等）、増粘剤（キサンタンガム等）、膨張剤（炭酸カルシウム等）、消泡剤（リン酸カルシウム等）、結着剤（ポリリン酸ナトリウム等）、栄養強化剤（カルシウム強化剤、ビタミンＡ等）等が挙げられる。さらに、オタネニンジンエキス、エゾウコギエキス、ユーカリエキス、杜仲茶エキス等の機能性素材を添加してもよい。
【００３４】
本発明の飲料の種類は、特に限定されない。本発明の飲料は、例えば、乳飲料（コーヒー牛乳、フルーツ牛乳、機能性牛乳等）、乳酸菌飲料（ドリンクヨーグルト等）、お茶系飲料（不発酵茶、発酵茶、半発酵茶、杜仲茶等を含む飲料）、果物・野菜系飲料（オレンジ、りんご、ぶどう、ももなどの果汁や、トマト、ニンジン、キャベツ、セロリなどの野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料（ビール、発泡酒、ウイスキー、ワイン、リキュール類等を含む飲料）、炭酸飲料、清涼飲料、低カロリー飲料等の飲料を具体的に例示することができる。各種飲料の製造法等については、既存の参考書、例えば「最新・ソフトドリンクス」(2003)（株式会社光琳）等を参考にすることができる。
【００３５】
本発明の食品の種類は、特に限定されない。本発明の食品は、生鮮食品であってもよいし、加工食品であってもよい。好ましくは、脱脂粉乳、ヨーグルト、チーズ、バターなどの乳製品、クッキー、パン、ケーキ、煎餅などの焼き菓子、ラムネ菓子等などの錠菓、羊羹などの和菓子、プリン、ゼリー、アイスクリーム類などの冷菓、チューインガム、キャンディ等の菓子類、クラッカー、チップス等のスナック類、うどん、そば等の麺類、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ、スープ、シチュー等の各種総菜が挙げられる。
【００３６】
上記脂肪蓄積抑制剤を含有する飲食品は、機能性食品であってもよい。本発明の「機能性食品」は、一定の機能をもつ食品を意味し、例えば、特定保健用食品、条件付きトクホ（特定保健用食品）及び栄養機能食品を含む保健機能食品、特別用途食品（病者用食品、妊産婦・授乳婦用粉乳、乳児用調整粉乳、高齢者用食品等）に加えて、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント及び美容食品（例えばダイエット食品）等のいわゆる健康食品全般を包含する。本発明の機能性食品はまた、コーデックス（FAO/WHO合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Health claim）が適用される健康食品を包含する。
【００３７】
本発明の機能性食品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤等の固形製剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤等の液体製剤、あるいはジェル剤等の製剤の形状であってもよいし、通常の飲食品の形状（例えば、飲料、菓子等）であってもよい。
【００３８】
機能性食品への脂肪蓄積抑制剤の配合量、配合方法、並びに機能性食品に配合しうる添加物については、上記の飲食品と同じである。
【００３９】
本発明の機能性食品は、限定するものではないが、特に脂肪の蓄積を予防するためのものであることが好ましい。脂肪蓄積予防に適した飲食品である旨の記載又は表示は、例えば特定保健用食品及び栄養機能食品等の保健機能食品について法令上の規定に基づいて認められた機能表示（栄養成分機能表示又は保健用途の表示）に従ったものであってよい。そのような表示の例としては、「体脂肪の蓄積（増加）を抑制する」「内臓脂肪型肥満になりにくい」「肥満を気にする方に適した」等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【００４１】
なお、実施例におけるすべての測定結果は平均±標準偏差で示した。平均値の差の検定はTukey-Kramerの多重比較法を用いた。有意水準は5％とした。統計解析はstat view  ver5.0（SAS Institute社）を用いた。
【００４２】
実施例１では、カルシウムの質の違い(主に吸収率)に着目し、乳製品のカルシウム強化に用いられている炭酸カルシウム、グルコン酸と乳酸を含み吸収率が高いことが報告されているグルコン酸乳酸カルシウム、牛乳中のカルシウム形態の一つであるミセル性リン酸カルシウム-ホスホペプチド複合体（以下MCP-PP複合体）を用い、各種カルシウム素材の摂取がＫＫマウスの体脂肪蓄積に及ぼす影響を比較した。ＫＫマウスは一般飼料でも生後17〜18週齢で80％前後が尿糖陽性を示す。血糖値の上昇は体重が35〜40ｇを超える頃に発現することから体脂肪の蓄積（肥満が）高血糖発症の一義的役割を果たしていると考えられる。これらの症状は複数の遺伝子の関与によって発症すると考えられている。
【００４３】
１．カルシウム素材
カルシウム素材として、炭酸カルシウム（CaCO３）、グルコン酸乳酸カルシウム、MCP-PP複合体を用いた。
炭酸カルシウム（CaCO３）は、和光純薬工業株式会社の試薬を用いた。カルシウム含量は80.0%であった。
グルコン酸乳酸カルシウムは、PURACAL XPerform（ピューラック社製）を用いた。カルシウム含量は10.4%であった。
【００４４】
MCP-PP複合体は、以下の方法で調製したものを用いた。5kgのレンネットカゼイン（ニュージーランド NZMP社製）を、牛乳殺菌機中で80リットルの水に懸濁させた後、６０ｇのトリプシン（Novo Nordisk Bioindustrial P/L, type PTN 6.0S）を１リットルの水に溶解したものを加えた。これを50℃で4時間、レンネットカゼインが沈殿しないように攪拌しながら保持してカゼインを分解した後、90℃で10分間加熱して酵素反応を停止させた。25℃に冷却した後、1N-HClでpHを4.6に調整し、ミセルリン酸カルシウム（MCP）を遊離させ、生じた不溶性のペプチドと未分解のカゼインをナイロンメッシュで濾過除去した後、Advantec No. 6の濾紙で濾過して、透明の濾液を得た。この濾液に1N-NaOHを添加してpH9に調整した後、サンコー株式会社製 DDSS式RO/UF装置を使用し、GR60PP膜（カットオフ値：25kDa）で約8リットルにまで濃縮し、凍結乾燥した。得られたMCP-PP複合体は1.24kgであった。調製したMCP-PP複合体には、タンパク質が61.69%、カルシウムが8.66%含まれていた。
【００４５】
２．動物実験
対照飼料はAIN−93G組成を基本とし、カルシウム含量が250mg/100gの低カルシウム飼料とした。なお、脂肪エネルギー比が25％となるようにラードをコーンスターチと置換して添加した。試験群は、対照飼料のうち、カルシウム含量が500mg/100gとなるように炭酸カルシウム、グルコン酸乳酸カルシウム、MCP-PP複合体をそれぞれ配合した。飼料組成を表１に示す。
【００４６】
【表１】
2008266259.tif 000002
【００４７】
４週齢の雄性ＫＫマウス（日本クレア株式会社）を用い、１週間の予備飼育後、１群8匹の４群に群分けした。表１に示した実験飼料と水を58日間自由摂取させ、体重と飼料摂取量を測定した。なお、飼育環境は室温22±1℃、湿度50±5℃、12時間明暗サイクル（12〜24時）とした。解剖当日は、体重と飼料摂取量を測定後、４時間絶食させ、エーテル麻酔下で開腹し、心臓より血液を採取、肝臓、後腹壁脂肪、副睾丸周辺脂肪、腸間膜脂肪組織を摘出し、重量を測定した。その後、肝臓は凍結乾燥後、粉砕し、後腹壁脂肪、副睾丸周辺脂肪、腸間膜脂肪組織は10％ホルマリン溶液で固定し、それぞれの分析用の試料とした。
【００４８】
マウスの成長結果を表２に示す。初体重、終体重はいずれの群も有意差が見られなかった。体重増加量は、グルコン酸乳酸カルシウム群を他の3群と比較すると、やや高値を示した。飼料摂取量、飼料効率はいずれの群も有意差が見られなかった。
【００４９】
【表２】
2008266259.tif 000003
【００５０】
マウスの臓器重量を表３に示す。肝臓重量は有意差が見られなかった。後腹壁脂肪組織重量は、MCP-PP複合体群が低カルシウム、グルコン酸乳酸カルシウム群に比べて有意に低値を示した。副睾丸周辺脂肪組織重量は、MCP-PP複合体群がグルコン酸乳酸カルシウム群に比べて有意に低値を示した。腸間膜脂肪ではいずれも有意な差は見られなかった。したがって、ＫＫマウスにおいてMCP-PP複合体には腹腔内脂肪蓄積抑制作用があることが認められた。
【００５１】
【表３】
2008266259.tif 000004
【００５２】
３．血清生化学分析
採血した血液は、血清を分離し、血清コレステロール、血清遊離脂肪酸、血清トリグリセリド濃度は酵素法にて分析した。血清総コレステロールの定量には、「コレステロールＥ−テストワコー」、血清トリグリセリドには「トリグリセライドＥ―テストワコー」、血清遊離脂肪酸は「ＮＥＦＡＣ−テストワコー」、血糖は「グルコースＣII-テストワコー」、血清カルシウムは「カルシウムＣ-テストワコー」（いずれも和光純薬工業株式会社）を用い、各キットの指示書に従って測定した。
【００５３】
血清レプチン濃度は、マウスレプチンイムノアッセイキット（R&Dシステムズ社製）を用いて、血清副甲状腺ホルモン（PTH）濃度は、マウスインタクトPTHエライザキット（Immutopics社製）を用いて、各キットの指示書に従って、ELISA法で分析した。
【００５４】
血清生化学値ならびにホルモン濃度を表４に示す。
血清脂質濃度はいずれも有意差は見られなかった。血清トリグリセリド濃度は、炭酸カルシウム群が低カルシウム群に比べてやや低値を示した。血清遊離脂肪酸濃度は、グルコン酸乳酸カルシウム群が低カルシウム、MCP-PP群に比べてやや高値を示した。血清コレステロール濃度は、各群間に差が見られなかった。
【００５５】
血糖値は各群間に有意差が見られなかった。ラットの血糖値は食後約30分でピークに達し、その後衰退して、3時間後にほぼ元のレベルに戻る。本実施例では、4時間絶食させた後に解剖したので、この血糖値は4時間後の血糖値である。正常ラットの血糖値は50〜135mg/dlであるのに対し、本実施例では、いずれの群も正常値よりも高値を示した。
【００５６】
血清カルシウム濃度は各群間に有意差が見られなかった。低カルシウム群はMCP-PP複合体群と比較すると、やや高値を示した。血清カルシウム濃度の正常値は7.2〜13.9mg/dlであるので、いずれの群も正常範囲であった。
【００５７】
レプチン濃度は各群間に有意差が見られなかった。低カルシウム群が他の群に比べ高値を示し、グルコン酸乳酸カルシウム群が最も低値を示した。
【００５８】
PTHは各群間に有意差が見られなかった。低カルシウム群とMCP-PP複合体群は炭酸カルシウム群とグルコン酸乳酸カルシウム群と比較すると、やや高値を示した。しかしPTHの正常範囲は10〜65pg/mlであるので、どの群も正常範囲内であった。
【００５９】
【表４】
2008266259.tif 000005
【００６０】
４．肝臓脂質の分析
肝臓を凍結乾燥後、粉砕し、クロロホルム：メタノール（2：1）溶液を用いたFolch法により、肝臓脂質を抽出した。Folch法による水洗後、10%TritonX-100を含むイソプロパノールに溶解し、総コレステロール、トリグリセリドを酵素法にて分析した。総コレステロールの定量には、「コレステロールＥ−テストワコー」、トリグリセリドには「トリグリセライドＥ―テストワコー」（いずれも和光純薬工業株式会社）を用い、各キットの指示書に従って測定した。
【００６１】
肝臓脂質を表５に示す。肝臓あたりのトリグリセリドおよびコレステロール量は、低カルシウム群と比べてMCP-PP複合体群が有意に蓄積量が少なく、MCP-PP複合体群は肝臓におけるトリグリセリド蓄積を抑制する効果があると考えられた。
【００６２】
【表５】
2008266259.tif 000006
【００６３】
５．糞中脂質及び糞中カルシウムの分析
糞を凍結乾燥後、粉砕し、４％酢酸酸性のクロロホルム：メタノール（2：1）溶液を用いたFolch法により、糞中脂質を抽出し、水洗した。その後、総脂質量を重量法で測定した。脂質摂取量、総脂質排泄量から見かけの消化吸収率を求めた。
脂質摂取量、脂質排泄量、見かけの消化吸収率を表６に示す。脂質排泄量はグルコン酸乳酸カルシウム群がMCP-PP複合体群、低カルシウム群に比べて有意に高値を示した。見かけの消化吸収率はグルコン酸乳酸Ca群がMCP-PP複合体群に比べて有意に低かった。
【００６４】
【表６】
2008266259.tif 000007
【００６５】
摂取カルシウム量と糞中排泄カルシウム量と見かけのカルシウム消化吸収量と吸収率を表７に示す。摂取カルシウム量と糞中排泄カルシウム量は低カルシウム群が他の３群に比べて有意に低値を示した。見かけの消化吸収量は、グルコン酸乳酸カルシウムが、低カルシウム、炭酸カルシウム群と比べて有意に高値を示した。また、MCP-PP複合体群が低カルシウム群に比べて有意に高値を示した。見かけのカルシウム吸収率は、グルコン酸乳酸Ca群とMCP-PP複合体群で高かったが、有意差はみられなかった。
【００６６】
【表７】
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【００６７】
６．脂肪細胞のサイズ分析および脂肪細胞数の算出
後腹壁脂肪、副睾丸脂肪、腸間膜脂肪組織を10％ホルマリン溶液に浸漬して、固定した後、脱水、脱脂、パラフィン浸透、パラフィン包埋、薄切、伸展、乾燥後、ヘマトキシリン・エオジン染色し、封入した。各脂肪組織を光学顕微鏡で観察し、標本をデジタルカメラで撮影した。同時に撮影したスケール付きのプレパラートの目盛りから、各脂肪組織の画像をScion Image(alpha4.0.3.2)を用いて、マウス１匹当たり、約100個の細胞の直径を測定して、平均値を求めた。
【００６８】
脂肪細胞の数はMORIN,C.L.らの方法により算出した(Endocrinology, 139,4998,1998)。
g／脂肪細胞＝平均細胞サイズ（pl）×0.95（ng脂肪／pl）×g／10９ng
すなわち脂肪組織重量をg／脂肪細胞で割った値を脂肪細胞数とした（×10６個で表示）。
【００６９】
脂肪細胞のサイズと脂肪細胞数を表８に示す。後腹壁脂肪組織の脂肪細胞のサイズは、グルコン酸乳酸カルシウム群が炭酸カルシウム群と比べ、MCP-PP複合体群が低カルシウム、炭酸カルシウム群と比べて有意に大きかった。副睾丸、腸間膜脂肪組織の脂肪細胞サイズは各群間で差が見られなかった。
【００７０】
後腹壁脂肪組織の脂肪細胞数は、MCP-PP複合体群が低カルシウム、炭酸カルシウム群に比べて有意に少なかった。副睾丸周辺脂肪組織では、各群間で差が見られなかった。腸間膜脂肪組織では、グルコン酸乳酸カルシウムが他の群と比較してやや高値を示した。
【００７１】
【表８】
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【００７２】
７．後腹壁脂肪組織および肝臓の脂質代謝関連酵素のmRNA解析
後腹壁脂肪組織および肝臓よりセパゾールRNA I Super（ナカライテスク）、クロロホルム、イソプロパノールを用いてRNAを抽出した。ReverTra Ace（東洋紡）、ランダムプライマー（Invitrogen）を用いて逆転写を行い、cDNAを調製した。後腹壁脂肪については、ホルモン感受性リパーゼ（HSL）、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２(DGAT2)、脂肪酸合成酵素（FAS）、リポタンパク質リパーゼ（LPL）のmRNA発現量を、肝臓については、DGAT1、DGAT2、FAS、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）のmRNA発現量をリアルタイムPCR（7300 Real Time PCR System、Applied Biosystems)にて定量した。定量値は、AIN-93G飼料で飼育した肥満を呈さないC57BL/6Jマウスを１として相対比較した。
【００７３】
後腹壁脂肪組織のホルモン感受性リパーゼ（HSL）、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２(DGAT2)、脂肪酸合成酵素（FAS）、リポタンパク質リパーゼ（LPL）のmRNA発現量を図１に、肝臓のDGAT1、DGAT2、FAS、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）のmRNA発現量を図２に示す。後腹壁脂肪組織においては、通常マウス（C57BL/6Jマウス）に比べてＫＫマウスでは脂肪の分解（HSL）とトリグリセリド合成（DGAT2）のmRNA発現量が有意に多かったが、MCP-PP複合体に特異的な現象は認められなかった。肝臓においても、通常マウスに比べて脂質合成酵素のmRNA発現が10数倍亢進していたが、MCP-PP複合体に特異的な現象は認められなかった。
【実施例２】
【００７４】
実施例２では、体脂肪蓄積に影響を及ぼす成分がMCP-PP複合体以外に存在するか調べる目的で、カルシウム源を脱脂乳とした場合とMCP-PP複合体とした場合の比較を同一条件にて行った。
【００７５】
１．実験試料
カルシウム源は、炭酸カルシウム（CaCO３）、脱脂粉乳、MCP-PP複合体を用いた。炭酸カルシウムとMCP-PP複合体は実験１と同一のものを用いた。脱脂粉乳は雪印乳業株式会社製のものを用いた。脱脂粉乳中のタンパク質含量は36.7%、カルシウム含量は1.2%であった。
【００７６】
２．動物実験
対照飼料はAIN−93G組成を基本とし、カルシウム含量が100mg/100gの低カルシウム飼料とした。なお、脂肪エネルギー比が25％となるようにラードをコーンスターチと置換して添加した。試験群は、対照飼料のカルシウム含量が500mg/100gとなるように炭酸カルシウム、脱脂粉乳、MCP-PP複合体をそれぞれ配合した。飼料組成を表９に示す。
【００７７】
【表９】
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【００７８】
４週齢の雄性ＫＫマウス（日本クレア株式会社）を用い、１週間の予備飼育後、１群8匹の４群に群分けした。表９に示した実験飼料と水を56日間自由摂取させ、体重と飼料摂取量を測定した。なお、飼育環境は室温22±1℃、湿度50±5℃、12時間明暗サイクル（12〜24時）とした。解剖当日は、体重と飼料摂取量を測定後、４時間絶食させ、エーテル麻酔下で開腹し、心臓より血液を採取、肝臓、後腹壁脂肪、副睾丸周辺脂肪、腸管膜脂肪組織を摘出し、重量を測定した。その後、肝臓は凍結乾燥後、粉砕し、後腹壁脂肪組織は10％ホルマリン溶液で固定し、それぞれの分析用の試料とした。
【００７９】
マウスの成長結果を表１０に示す。初体重、終体重、体重増加量、飼料摂取量、飼料効率において各群間に有意差が見られなかった。
【００８０】
【表１０】
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【００８１】
マウスの臓器重量を表１１に示す。肝臓重量は有意差が見られなかったが、MCP-PP複合体群が他の群に比べて低値を示した。
【００８２】
後腹壁脂肪組織重量は、MCP-PP複合体群が低カルシウム群に比べて有意に低値を示した。脱脂粉乳群も同様の傾向を示したが有意差は見られなかった。副睾丸周辺脂肪組織および腸間膜脂肪組織重量は各群間に有意な差は見られなかった。したがって、ＫＫマウスにおいてMCP-PP複合体には腹腔内脂肪蓄積抑制作用があることが認められた。しかし、脱脂粉乳群はMCP-PP複合体ほどの作用が認められなかったことから、脱脂粉乳中のその他の成分の寄与は本実験系では少ないと考えられる。
【００８３】
【表１１】
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【００８４】
３．血清生化学分析
採血した血液は、血清を分離し、血清コレステロール、血清遊離脂肪酸、血清トリグリセリド、カルシウム濃度ならびにレプチン濃度を実験１と同様にして測定した。血清生化学値ならびにレプチン濃度を表１２に示す。
【００８５】
血清脂質濃度はいずれも有意差は見られなかった。血清コレステロールおよびトリグリセリド濃度は、脱脂粉乳群ならびにMCP-PP複合体群で低い傾向にあった。血清遊離脂肪酸濃度は、低カルシウム群ならびにMCP-PP複合体群で低い傾向にあった。血糖値は各群間に有意差が見られなかったが、低カルシウム群で高値を示した。血清カルシウム濃度は各群間に有意差が見られなかった。血清レプチン濃度は各群間に有意差が見られなかったが、MCP-PP複合体群が低値を示した。
【００８６】
【表１２】
2008266259.tif 000013
【００８７】
４．肝臓脂質の分析
肝臓コレステロール、トリグリセリドの分析は実験１と同様に行った。
肝臓脂質を表１３に示す。肝臓コレステロール量は、低カルシウム群が他の3群に比べて有意に高値を示した。肝臓あたりのトリグリセリド量は、低カルシウム群に比べて脱脂粉乳群およびMCP-PP複合体群が有意に低い値を示した。特に、脱脂粉乳群が蓄積量の低下が顕著であった。低カルシウム群が、肝臓コレステロール、トリグリセリド量ともに蓄積量が多くなったことから、カルシウムの不足は肝臓脂肪の蓄積を促進するようである。特に、肝臓トリグリセリド量は脱脂粉乳、MCP-PP複合体群で有意に低くなったことから、乳成分中のカルシウム等が肝臓トリグリセリドの蓄積を抑制することが明らかとなった。
【００８８】
【表１３】
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【００８９】
５．脂肪細胞のサイズと数の分析
後腹壁脂肪組織の脂肪細胞のサイズと数の分析は実験１と同様に行った。
後腹壁脂肪組織の脂肪細胞のサイズと数を表１４に示す。脂肪細胞のサイズは各群間で差が見られなかった。後腹壁脂肪組織の脂肪細胞数は、MCP-PP複合体群が低カルシウム、炭酸カルシウム群に比べて有意に少なかった。実施例１の６．と本実施例の結果より、MCP-PP複合体の腹腔内脂肪の蓄積抑制作用は少なくとも脂肪細胞の肥大抑制によるものではないことが認められ、また、MCP-PP複合体は、後腹壁脂肪の脂肪細胞の肥大化を抑制するものでなく、脂肪細胞数の減少を介して脂質重量を減少させたものと考えられた。
【００９０】
【表１４】
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【００９１】
従来、乳成分が体脂肪を減少させるメカニズムとして、ビタミンＤのホルモン作用が関与してカルシウムの摂取が多くなると体脂肪が減少するという報告や、遺伝性肥満症のマウスにおいてカルシウム摂取が高まるとエネルギーが熱として発散させることになって脂肪が蓄積されにくくなるという報告がある。しかし、ＫＫマウスを用いた上記実施例では、血清カルシウム濃度もPTHもどの群も正常範囲内であったので、このメカニズムでは説明できない結果となった。また上記実施例では、MCP-PP複合体群では脂質摂取量が多かったが、むしろ排泄量が少なく、したがって、肝臓脂質ならびに後腹壁脂肪の蓄積抑制は、食餌性脂肪の排泄によって体脂肪蓄積が減少しているのではなく、体内で脂肪を燃焼させ、エネルギーとして利用することにより、減少しているものであると考えられた。
【００９２】
実施例１および２の脂肪細胞のサイズと数の結果より、脂肪細胞数の減少が推定されたことから、MCP-PP複合体の脂肪蓄積抑制効果は、主に脂肪細胞の分化抑制によることが推定され、ミセル性リン酸カルシウムの形態をとるにより、体内の生体利用性、ひいては肝臓ならびに脂肪組織の代謝に影響を与えた可能性が考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、薬剤、飲食品、飼料などに広く応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】後腹壁脂肪の脂質代謝関連酵素のmRNA発現量を示す。
【図２】肝臓の脂質代謝関連酵素のmRNA発現量を示す。
【図１】
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【図２】
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