(57)【要約】  【課題】  本発明は、新規のキノロン系抗菌薬耐性大腸菌、E. coli C316株の、キノロン系抗菌薬耐性の原因を明らかにすることを課題とする。本発明はまた、その様なキノロン系抗菌薬耐性を有する細菌を特定する手段を開発することを課題とする。  【解決手段】  本発明は、細菌の細胞内からキノロン系抗菌薬を排出する活性を有するタンパク質およびこのタンパク質をコードする塩基配列を有する核酸を提供する。本発明はさらに、被検細菌サンプルに対してPCR反応またはまたはサザンブロットハイブリダイゼーション法を行って、qep遺伝子（SEQ ID NO: 1）の存在の有無を検出することによる、細胞内からキノロン系抗菌薬を排出する活性を有する細菌の検出方法もまた提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO: 2で示されるアミノ酸配列またはこの配列に類似するアミノ酸配列からなり、細胞内からキノロン系抗菌薬を排出する活性を有する、タンパク質。
【請求項２】
大腸菌由来である、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項３】
SEQ ID NO: 1で示される塩基配列またはこの配列に類似する塩基配列からなり、細胞内からキノロン系抗菌薬を排出する活性を有するタンパク質をコードする核酸。
【請求項４】
SEQ ID NO: 2で示されるアミノ酸配列またはこの配列に類似するアミノ酸配列からなる、細胞内からキノロン系抗菌薬を排出する活性を有するタンパク質をコードする核酸。
【請求項５】
大腸菌由来である、請求項3または4に記載の核酸。
【請求項６】
被検細菌サンプルに対してPCR反応を行って、qep遺伝子（SEQ ID NO: 1）の全体または部分を増幅することによる、細胞内からキノロン系抗菌薬を排出する活性を有する細菌の検出方法。
【請求項７】
フォワードプライマーとして以下のプライマー：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、およびSEQ ID NO: 25；からなる群から選択されるプライマーのいずれか、および
リバースプライマーとして以下のプライマー：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、およびSEQ ID NO: 26；からなる群から選択されるプライマーのいずれか
の組み合わせを使用してPCR反応を行う、請求項6に記載の検出方法。
【請求項８】
増幅配列の検出を、ゲル電気泳動により検出するか、またはレポーターとクエンチャーを結合させたプローブを使用して検出する、請求項6または7に記載の細菌の検出方法。
【請求項９】
以下のプライマー：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、およびSEQ ID NO: 25；からなる群から選択されるフォワードプライマー、および
以下のプライマー：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、およびSEQ ID NO: 26；からなる群から選択されるリバースプライマー、
を含む、qep遺伝子（SEQ ID NO: 1）検出用キット。
【請求項１０】
被検細菌のプラスミドサンプルに対してサザンブロットハイブリダイゼーション法を行って、プラスミド中のqep遺伝子（SEQ ID NO: 1）の存在の有無を調べる、細胞内からキノロン系抗菌薬を排出する活性を有する細菌の検出方法。
【請求項１１】
受託番号NITE P-249のプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌におけるキノロン系抗菌薬の排出に関するタンパク質およびそれをコードする遺伝子を同定することに関する。本発明はまた、そのような細菌におけるキノロン系抗菌薬の排出に関する遺伝子を検出することに関する。
【背景技術】
【０００２】
キノロン系抗菌薬、例えばフルオロキノロン系抗菌薬に対する耐性を有する細菌は、これまでにも複数の種類が知られており、様々な細菌がキノロン系抗菌薬に対する耐性を有することが知られていた。そのような耐性の原因としては複数のものが特定されていたが、大きく分けてDNAジャイレースと呼ばれるフルオロキノロンの標的タンパク質が変異すること、すなわちDNAジャイレース遺伝子が変異を起こすことによってフルオロキノロンのDNAジャイレースへの結合が阻害される標的部位変異型の場合（非特許文献1）、キノロン系抗菌薬を細胞外に排出する活性を有する分子による、機能獲得型のもの（非特許文献2、非特許文献3、非特許文献4）、のいずれかに分類できることが知られていた。
【０００３】
機能獲得型のキノロン系抗菌薬耐性のうち、グラム陰性菌の緑膿菌の既知のキノロン排出ポンプとして知られている、MexA-MexB-OprM遺伝子は、構造上、外膜及び内膜コンポーメントおよびこれらのコンポーメントを結合するコンポーメントの3種類のタンパクからなる複合体を形成する排出タンパク質であるRNDファミリーに属することが知られている（非特許文献2）。これに対して、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌において報告されている、染色体性遺伝子のNorAは、12回膜貫通型の排出タンパク質であるMFSファミリーに属し、細胞内のキノロンを細胞外へ排出することが知られている（非特許文献3）。
【０００４】
本発明の発明者らは、臨床現場において新規のキノロン系抗菌薬耐性大腸菌、E. coli C316株を取得したが、この大腸菌のキノロン系抗菌薬耐性を調べたところ、既存の耐性機構が当てはまらないことが分かった。
【非特許文献１】Yoshida, H., et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1990, Vol. 34, p. 1271-1272
【非特許文献２】Poole, K., Journal of Bacreriology, 1993, Vol. 175, p. 7363-7372
【非特許文献３】Yoshida, H., Journal of Bacteriology, 1990, Vol. 172, p. 6942-6949
【非特許文献４】Morita, Y., et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1998, Vol. 42, p. 1778-1782
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ヒトの患者から採取された新規のキノロン系抗菌薬耐性大腸菌、E. coli C316株の、キノロン系抗菌薬耐性の原因を明らかにすることを課題とする。本発明はまた、その様なキノロン系抗菌薬耐性を有する細菌を特定する手段を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の発明者らは、E. coli C316株中のプラスミド、pHPAを受容菌に伝達させたところ、受容菌の表現型が変化することを見いだし、このプラスミドpHPAの解析を行うことにより、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、細菌の細胞内からキノロン系抗菌薬を排出する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する核酸を提供する。上述する本発明の核酸は、SEQ ID NO: 1で示される塩基配列またはこの配列に類似する塩基配列からなり、キノロン系抗菌薬を排出する活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする（図1）。
【０００８】
また、本発明はまた、上述したような核酸によりコードされ、キノロン系抗菌薬を排出する活性を有するタンパク質もまた、提供する。上述する本発明のタンパク質は、SEQ ID NO: 2で示されるアミノ酸配列またはこの配列に類似するアミノ酸配列からなり、キノロン系抗菌薬を排出する活性を有することを特徴とする（図1）。
【０００９】
本発明はさらに、被検細菌サンプルに対してPCR反応を行って、qep遺伝子（SEQ ID NO: 1）の全体または部分を増幅・検出することによるか、またはサザンブロットハイブリダイゼーション法によってqep遺伝子の存在の有無を検出することによる、細胞内からキノロン系抗菌薬を排出する活性を有する細菌の検出方法、並びにqep遺伝子（SEQ ID NO: 1）の全体または部分を増幅するためのプライマーを含むqep遺伝子検出用キットもまた提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、キノロン系抗菌薬に対して耐性を賦与するqep遺伝子、およびその遺伝子によりコードされるQepタンパク質を提供する。本発明はまた、qep遺伝子の具体的な配列情報に基づいて、PCR法やサザンブロットハイブリダイゼーション法などの当該技術分野において周知の方法を使用して、この遺伝子並びに同等の遺伝子を保有する病原細菌を、より簡便にスクリーニングするための検出方法を提供する。その結果、医療現場において、qep遺伝子によりもたらされるキノロン系抗菌薬に対する耐性の臨床診断が可能になる。
【発明の実施の形態】
【００１１】
本発明の発明者らは、臨床の現場において、ヒトの患者から分離されたキノロン系抗菌薬に対して耐性を有する大腸菌、E. coli C316株の提供を受け、単離されたE. coli C316株中のキノロン系抗菌薬に対する耐性の遺伝的背景について調べたところ、大腸菌、E. coli C316株中において、これまで知られていなかったプラスミド、pHPAが存在することが明らかになった。このプラスミド、pHPAを受容菌（本発明においては、大腸菌E. coli KAM32）に伝達させたところ、受容菌の表現型がキノロン系抗菌薬耐性に変化することを見いだした。
【００１２】
本発明の発明者らは、E. coli C316株由来のプラスミド、pHPAを、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE：Incorporated Administrative Agency, National Institute of Technology and Evaluation）、特許微生物寄託センター（NPMD：NITE Patent Microorganisms Depositary）に寄託した。このプラスミドの受託番号は、NITE P-249である。
【００１３】
このプラスミドのヌクレオチド配列を解析した結果、511アミノ酸残基のタンパク質（SEQ ID NO: 2、図1）をコードする、1536塩基対からなる候補遺伝子、qep遺伝子（SEQ ID NO: 1、図1；DDBJ Accession No. AB263754）が得られ、このqep遺伝子によりコードされるQepタンパク質が、キノロン系抗菌薬耐性をもたらすことが明らかになった。このアミノ酸配列をさらに詳細に解析したところ、配列中に14箇所の疎水性部位が存在することが明らかになり、14回膜貫通型のポンプ型タンパク質であることが明らかになった。
【００１４】
このqep遺伝子を発現ベクター中に挿入して、大腸菌に導入したところ、形質導入大腸菌株が、キノロン系抗菌薬に対する耐性を獲得することが明らかになった。したがって、qep遺伝子によりコードされるQepタンパク質が、キノロン系抗菌薬に対する耐性を賦与する本体であることが明らかになった。本明細書中で「キノロン系抗菌薬」という場合、ノルフロキサシン（NFLX）、レポフロキサシン（LVFX）、シプロフロキサシン（CPFX）、ガチフロキサシン（GFLX）、などが含まれるが、これらには限定されない。本発明の新規キノロン系抗菌薬排出ポンプタンパク質は、プロトンに基づく膜電位を用いて、上述したキノロン系抗菌薬を、細胞内から細胞外へと排出する能力を有することが明らかになった。
【００１５】
本発明のqep遺伝子の核酸配列およびQepタンパク質のアミノ酸配列と、公知の核酸配列およびアミノ酸配列とのあいだでFASTAを用いた相同性解析を行ったところ、核酸レベルでは、最も高い相同性を有するPolaromonas sp. JS666由来の核酸分子（CP000316）であっても65.6％の同一性しか有さず、またアミノ酸レベルでは、最も高い相同性を有するStaphylococcus epidermidis strain SR1由来のポリペプチド（AF270282）であっても33.6％の同一性を有しているに過ぎなかった。そして、FASTAを用いた相同性解析において列挙された分子はいずれも、機能が解明されておらず、Qepタンパク質がキノロン系抗菌薬に対する耐性に関与する分子であるかどうかの推定をもたらすものではなかった。
【００１６】
また、これまでに知られていたキノロン系抗菌薬に対する耐性を賦与する分子（例えば、非特許文献1〜4）とのあいだでの核酸配列相同性およびアミノ酸配列相同性はともに低く、かつ、既知の分子が全て染色体性であったのに対して本発明のqep遺伝子はプラスミド上に存在する点で異なっていた。したがって、本発明のqep遺伝子およびQepタンパク質は、既知の分子との相同性が極めて低い、新規な分子であることが示された。
【００１７】
キノロン系抗菌薬を排出する活性を有する新規分子
以上の結果から、本発明は、キノロン系抗菌薬を排出する活性を有する新規タンパク質を提供することができ、ここで本発明のタンパク質には、SEQ ID NO: 2からなるアミノ酸配列またはこの配列に類似するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。より具体的には、上述する本発明のタンパク質には、
（1）SEQ ID NO: 2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（2）SEQ ID NO: 2で示されるアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質；もしくは
（3）SEQ ID NO: 2で示されるアミノ酸配列との間で少なくとも80％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質；
からなる群から選択されるタンパク質が含まれる。
【００１８】
ここで、「SEQ ID NO: 2からなるアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列からなるタンパク質」という場合、上述の（2）または（3）のタンパク質のことをいう。
【００１９】
本発明はまた、キノロン系抗菌薬を排出する活性を有するタンパク質をコードする核酸を提供することができ、ここで本発明の核酸には、
SEQ ID NO: 1で示される塩基配列またはこの配列に類似する塩基配列からなる核酸；または
SEQ ID NO: 2で示されるアミノ酸配列またはこの配列に類似するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸；
が含まれる。より具体的には、上述する本発明の核酸には、
（i）SEQ ID NO: 1で示される塩基配列；
（ii）SEQ ID NO: 1で示される塩基配列と縮重の関係にある塩基配列からなる核酸；
（iii）SEQ ID NO: 1で示される塩基配列において1もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる核酸；
（iv）SEQ ID NO: 1で示される塩基配列と相補的な塩基配列との間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列からなる核酸；もしくは
（v）SEQ ID NO: 1で示される塩基配列との間で少なくとも60％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の塩基配列相同性を有する塩基配列からなる核酸；
（a）SEQ ID NO: 2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸；
（b）SEQ ID NO: 2で示されるアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸；もしくは
（c）SEQ ID NO: 2で示されるアミノ酸配列との間で少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸；
からなる群から選択される核酸が含まれる。
【００２０】
上述した（i）〜（iv）に記載する核酸または（a）〜（c）に記載する核酸は、キノロン系抗菌薬を排出する活性を有する、上述した（1）〜（3）のタンパク質をコードすることができる。
【００２１】
ここで、「SEQ ID NO: 1で示される塩基配列に類似する塩基配列からなる核酸」という場合、上述の（ii）〜（v）に記載される核酸のことをいい、「SEQ ID NO: 2で示されるアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸」という場合、上述の（b）または（c）に記載される核酸のことをいう。
【００２２】
本発明において「縮重」という場合、1つのアミノ酸に対応して複数のコドンが使用されており、塩基配列上のあるコドンが、縮重の関係にある別のコドンに変化しても、そのコドンがコードするアミノ酸が変化しない状態をいう。したがって、「SEQ ID NO: 1で示される塩基配列と縮重の関係にある塩基配列からなる核酸」という場合、当該核酸の塩基配列自体はSEQ ID NO: 1の塩基配列とは異なるものの、SEQ ID NO: 1の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列（本発明においてはSEQ ID NO: 2）をコードする核酸のことをいう。
【００２３】
本発明において「1もしくは数個」とは、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個のことをいう。
【００２４】
また、本発明において塩基の「欠失」、「置換」、「付加」を有する核酸は、qep遺伝子の塩基配列（SEQ ID NO: 1）について生じ、かつQepタンパク質（SEQ ID NO: 2）と同様の性質、すなわちキノロン系抗菌薬を排出する活性を有するタンパク質をコードする核酸をいう。
【００２５】
一方、本発明においてアミノ酸の「欠失」、「置換」、「付加」を有するタンパク質は、Qepタンパク質のアミノ酸配列（SEQ ID NO: 2）について生じ、かつQepタンパク質（SEQ ID NO: 2）と同様の性質、すなわちキノロン系抗菌薬を排出する活性を有するタンパク質をいう。例えば、アミノ酸の「置換」の場合には、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換、例えばある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換、などの置換が含まれる。
【００２６】
上述のような「欠失」、「置換」、「付加」を有する塩基配列、または上述のような「欠失」、「置換」、「付加」を有するタンパク質を作成するためには、放射線照射や変異原処理などの細菌レベルでの変異生成処理の他、部位特異的変異生成（Site Directed Mutagenesis）やPCR増幅ミスを用いたランダム変異生成（Random Mutagenesis）、カセット導入変異生成（Cassette Mutagenesis）などの遺伝子工学的変異生成処理などの、本発明の技術分野において既知の様々な方法を用いることができる。
【００２７】
本発明のキノロン系抗菌薬を排出する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列には、qep遺伝子の塩基配列（SEQ ID NO: 1）と相補的な塩基配列との間で、高ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列からなるDNAを有し、かつキノロン系抗菌薬を排出する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。
【００２８】
本発明において、高ストリンジェントな条件とは、目的の塩基配列が、qep遺伝子をコードする塩基配列（例えば、SEQ ID NO: 1）もしくはこれと縮重の関係にある塩基配列との間で、特異的にハイブリダイズ可能である条件をいう。
【００２９】
ハイブリダイズ条件は、温度、イオン濃度などの条件を考慮して決定されるが、一般的には温度が高いほど、またイオン濃度が低いほどストリンジェントな程度が高くなることが知られている。このようなストリンジェントな条件の設定は、当業者であれば、例えば、SambrookおよびRussel（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (2001)）の記載に基づいて行うことができる。
【００３０】
本発明において利用することができる高ストリンジェントな条件の具体的な例としては、例えば、6×SSC、5×Denhardt's、0.1％SDS、25℃ないし68℃などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。この場合、ハイブリダイゼーションの温度としては、より好ましくは45℃ないし68℃（ホルムアミド無し）または25℃ないし50℃（50％ホルムアミド）を挙げることができる。
【００３１】
本発明においてアミノ酸あるいは塩基配列の配列相同性は、視覚的検査および数学的計算により決定してもよい。あるいは、2つのタンパク質配列の配列相同性は、NeedlemanおよびWunsch（J. Mol Biol., 48: 443−453, 1970）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（UWGCG）より入手可能なGAPコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（1）HenikoffおよびHenikoff（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、blosum62；（2）12のギャップ加重；（3）4のギャップ長加重；および（4）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００３２】
本発明においてアミノ酸あるいは塩基配列の配列相同性解析には、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた用いることができる。例えばAltschulら（Nucl. Acids. Res. 25., p. 3389-3402, 1997）に記載されているBLASTプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。具体的には、塩基配列解析の場合、Nucleotide BLAST（BLASTN）プログラムで、Query塩基配列を入力して、GenBank、EMBL、DDBJなどの塩基配列データベースと照合することができる。また、アミノ酸配列解析の場合、Protein BLAST（BLASTP）プログラムで、Queryアミノ酸配列を入力して、GenBank CDS、PDB、SwissProt、PIRなどのアミノ酸配列データベースと照合することができる。当該プログラムは、インターネット上でNational Center for Biotechnology Information（NCBI）、あるいはDNA Data Bank of Japan（DDBJ）のウェブサイトから利用することが可能である。BLASTプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラム、例えばClustalW ver. 1.7（Thompson, J.D., et al., (1994)、上述）もまた、用いてもよい。
【００３３】
qep遺伝子の検出方法
上述したqep遺伝子の配列解析の結果、本発明はまた、細菌が本発明のqep遺伝子を含有するか否かをDNAレベルで検出する方法を提供する。具体的には、細菌中のqep遺伝子の存在を、PCR反応もしくはサザンブロットハイブリダイゼーション法などの核酸検出方法を用いて検出することができる。
【００３４】
本発明の一態様において、本発明のqep遺伝子を、PCR法を用いて検出することができる。本発明のqep遺伝子の全部または部分を増幅することができるPCRプライマーは、SEQ ID NO: 1に示されるヌクレオチド配列をGENETYX-MAC ver. 12.2.3を用いて解析することにより、SEQ ID NO: 1を増幅できるが、他の公知のヌクレオチド配列を増幅しないようなものとして、得ることができる。フォワードプライマーとして以下のプライマー：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、およびSEQ ID NO: 25；からなる群から選択されるプライマーのいずれか、および
リバースプライマーとして以下のプライマー：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、およびSEQ ID NO: 26；からなる群から選択されるプライマーのいずれか
を使用することができる。これらのプライマーを用いてPCR反応を行うことにより、他の公知の配列は増幅されず、qep遺伝子の一部のみが増幅される。PCR法の具体的な手法は、当該技術分野において周知の方法を使用する。
【００３５】
本発明のフォワードプライマーとリバースプライマーの好ましいプライマー対には、例えば、SEQ ID NO: 3：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5：SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 7：SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9：SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 9：SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 13：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 13：SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16：SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 16：SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 18：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 19：SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 19：SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 20：SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 20：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 21：SEQ ID NO:22、SEQ ID NO: 21：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 21：SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 23：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 23：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 23：SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 25：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 25：SEQ ID NO: 4、およびSEQ ID NO: 25：SEQ ID NO: 26の各組み合わせが含まれる。
【００３６】
本発明においては、このようにしてPCRにより増幅したSEQ ID NO: 1の部分配列は、当該技術分野において一般的に利用されている配列検出手段のいずれかを使用して検出することができ、例えば、寒天ゲルやポリアクリルアミドゲルなどのゲルを用いたゲル電気泳動により検出するか、または部分配列の一部を認識するプローブであってレポーターとクエンチャーを結合させたプローブ（例えばTaqManプローブ（商標））により検出することができる。
【００３７】
本発明は一態様において、このようないずれかの増幅用プライマー対を含むqep遺伝子検出用キットもまた提供する。このようなキットには、上記プライマー対のいずれかの他に、PCR法による核酸増幅のために使用される他の成分（例えば、ポリメラーゼ、塩基（dNTP）、バッファーなど）のいずれかまたは任意の組み合わせを含んでいてもよい。
【００３８】
本発明の別の一態様において、本発明のqep遺伝子を、サザンブロットハイブリダイゼーション法を用いて検出することができる。上述したプライマーを用いたPCR法により、他の公知の配列は増幅されず、qep遺伝子の一部のみが増幅されることが明らかになったことから、上述したプライマーを用いたPCR法において使用することができる増幅用プライマーそれ自体または増幅用プライマーにより増幅された増幅断片を、検出用プローブとして使用して、サザンブロットハイブリダイゼーション法により、細菌が本発明のqep遺伝子を保持するか否かを検出することができる。サザンブロットハイブリダイゼーション法の具体的な手法は、当該技術分野において周知の方法を使用する。
【００３９】
本発明をさらに具体的に説明するため、以下に実施例を記載する。本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
実施例1：キノロン系抗菌薬を排出する活性をもたらす、新規分子の同定
本実施例においては、臨床の現場において取得された、ヒトの患者からキノロン系抗菌薬に対して耐性を有する大腸菌、E. coli C316株の、キノロン系抗菌薬に対する耐性の遺伝的背景を明らかにすることを目的として行った。
【００４１】
大腸菌、E. coli C316株を培養し、包含されるプラスミドを採取し、それらのそれぞれを大腸菌株、E. coli KAM32株（岡山大学薬学部、土屋友房先生より分与、Chen et al., Journal of Bacteriology 184: 572-576）に導入した。それぞれのプラスミド導入大腸菌株を、キノロン系抗菌薬であるノルフロキサシンを含有した寒天プレート（ミューラーヒントン培地、Becton, Dickinson and Company, NJ USA）上に塗布して培養を行い、キノロン系抗菌薬存在下において増殖することができるかどうかを確認したところ、プラスミドpHPAを導入した大腸菌株、E. coli KAM32（pHPA）のみがキノロン系抗菌薬ノルフロキサシンを含有した寒天プレート上で増殖することができた。
【００４２】
このプラスミドpHPAは、約100 kbpを有し、アミノグリコシドに対する耐性を有するrmtB遺伝子、CTX-Mタイプβ-ラクタマーゼ、を有する多剤耐性プラスミドであり、キノロン以外に第三世代セファロスポリンやアミノグリコシドに対して耐性を有する多剤耐性プラスミドであることが明らかになった。プラスミドpHPA上の遺伝子のうち、キノロン系抗菌薬耐性をもたらす遺伝子を解析することを目的として、核酸配列解析を行った。その結果、511アミノ酸残基のタンパク質（SEQ ID NO: 2、図1）をコードする、1536塩基対からなる候補遺伝子（SEQ ID NO: 1、図1；DDBJ Accession No. AB263754）が得られた。このアミノ酸配列を解析したところ、配列中に14箇所の疎水性部位が存在することが明らかになり、14回膜貫通型のポンプ型タンパク質であることが明らかになった。そこで、この候補遺伝子をqep遺伝子と命名し、qep遺伝子によりコードされるタンパク質をQepタンパク質と命名した。
【００４３】
qep遺伝子の核酸配列およびQepタンパク質のアミノ酸配列と、公知の核酸配列およびアミノ酸配列（GenBank）とのあいだで、FASTAを用いた相同性解析を行ったところ、核酸レベルでは、Polaromonas sp. JS666由来の核酸分子（CP000316）と65.6％、Nocardia farcinica IFM 10152由来の核酸分子（AP006618）と61.9％、Streptomyces sp. AM-7161由来の核酸分子（AB103463）と62.7％などの相同性を有しており、アミノ酸レベルでは、Staphylococcus epidermidis strain SR1由来のポリペプチド（AF270282）と33.6％、Mycoplasma bovis由来のポリペプチド（AY191419）と33.0％、Bacillus thuringiensis由来のポリペプチド（AY016410）と31.8％、Staphylococcus aureus由来のポリペプチド（AJ309184）と31.7％などの相同性を有していることが明らかになった。しかしながら、これらの分子はいずれも、機能が解明されておらず、Qepタンパク質がキノロン系抗菌薬に対する耐性に関与する分子であるかどうかの推定をもたらすものではなかった。
【００４４】
一方、公知のキノロン系抗菌薬耐性に関与する分子を検索したところ、14回膜貫通型のタンパク質は全く存在していなかった。
【００４５】
これらの結果から、本実施例において得られたqep遺伝子（SEQ ID NO: 1、図1；DDBJ Accession No. AB263754）およびQepタンパク質（SEQ ID NO: 2、図1）は、新規なキノロン系抗菌薬耐性分子であることが明らかになった。そして、このqep遺伝子を含有した大腸菌E. coli C316株由来のプラスミドpHPAを、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE）、特許微生物寄託センター（NPMD）に受託番号NITE P-249として寄託した。
【００４６】
実施例2：最小発育阻止濃度の測定
本実施例においては、E. coli C316株由来のプラスミド（pHPA）を導入したE. coli KAM32（pHPA）、qep遺伝子のクローニング株（E. coli KAM32（pSTVS-S-2））、qep遺伝子破壊株（E. coli KAM32（pSTVS-S-2ΔKM7））について最小発育阻止濃度（MIC）を測定することにより、pHPAの導入細菌株の薬剤感受性および抗菌薬耐性獲得に関して検討した。
【００４７】
実施例1において前述した大腸菌E. coli KAM32株に対して、E. coli C316株由来のプラスミド（pHPA）、形質導入用のプラスミドpSTV28単独（対照；タカラバイオ）、形質導入用のプラスミドpSTV28に対してクローニングされたqep遺伝子を組み込んだプラスミド、pSTVS-S-2、並びにqep遺伝子を組み込んだプラスミド、pSTVS-S-2のqep遺伝子コード配列中にTn5由来のトランスポゾン（Epicentre）を挿入することによりqep遺伝子を破壊したプラスミドpSTVS-S-2ΔKM7のいずれかを導入することにより、形質導入大腸菌を作製した。それぞれの形質導入大腸菌株を、E. coli KAM32（pHPA）、E. coli KAM32（pSTV28）、E. coli KAM32（pSTVS-S-2）、およびE. coli KAM32（pSTVS-S-2ΔKM7）と呼ぶ。
【００４８】
形質導入用のプラスミドpSTV28に対してクローニングされたqep遺伝子を組み込んだプラスミド、pSTVS-S-2は、プラスミドpSTV28のSalIおよびSacIによる制限酵素断片に対して、qep遺伝子およびその周辺構造を含むpHPA上のSalIおよびSacIにより切断される断片を挿入することにより作製された。
【００４９】
また、qep遺伝子を破壊したプラスミドpSTVS-S-2ΔKM7は、EZ-Tn5TM <KAN-2>挿入キット（Epicentre社）を利用して、上述したE. coli KAM32（pSTVS-S-2）のqep遺伝子中に、EZ-Tn5TM <KAN-2>トランスポゾンを挿入することにより作製した。トランスポゾンを挿入する際の手順は、製造者により推奨される手順を利用し、得られた複数の大腸菌株の中から、破壊対象であるqep遺伝子中にEZ-Tn5TM<KAN-2>トランスポゾンが挿入された大腸菌株、E. coli KAM32（pSTVS-S-2ΔKM7）を得た。
【００５０】
これらの4種類の大腸菌株および形質導入の宿主として使用した大腸菌E. coli KAM32株を用いて、種々の抗菌薬に対する最小発育阻止濃度（MIC）を測定した。測定方法はNCCLS（現CLSI）M7-A6を準拠した。具体的には、上述した4種類の大腸菌株および形質導入の宿主として使用した大腸菌E. coli KAM32株を、ミューラーヒントン液体培地に懸濁し625 nmの吸収度0.08〜0.10にあわせる。この菌液をさらにミューラーヒントン液体培地で10倍に希釈し、試験菌液とする。測定する薬剤は、ミューラーヒントン寒天培地と混和して任意の濃度となるように調整する。このミューラーヒントン寒天培地に試験菌液を2μl接種し、35℃で16時間培養する。
【００５１】
MICは、アンピシリン（ABPC）、エリスロマイシン（EM）、カナマイシン（KM）、テトラサイクリン（TC）、ナリジクス酸（NA）、ノルフロキサシン（NFLX）、レポフロキサシン（LVFX）、シプロフロキサシン（CPFX）、スパルフロキサシン（SPFX）、ガチフロキサシン（GFLX）、カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン（CCCP）、アクリフラビン、ローダミン6G、クリスタルバイオレット、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、エチジウムブロマイド、デオキシコール酸、ベンザルコニウムについて測定した。結果を表1に示す。
【００５２】
【表１】
2008011805.tif 000002
【００５３】
表1において示したように、形質導入用のプラスミドpSTV28単独を導入した大腸菌（E. coli KAM32（pSTV28））におけるMIC値とqep遺伝子のクローニング株（E. coli KAM32（pSTVS-S-2））におけるMIC値とを比較（E. coli KAM32（pSTVS-S-2）／E. coli KAM32（pSTV28））すると、キノロン系抗菌薬であるノルフロキサシン（NFLX）、レポフロキサシン（LVFX）、シプロフロキサシン（CPFX）、ガチフロキサシン（GFLX）に関して、qep遺伝子クローン株（E. coli KAM32（pSTVS-S-2））に対するMICが顕著に上昇していることが明らかになった。
【００５４】
このようなキノロン系抗菌薬に対するMIC値の上昇の傾向は、pHPA導入株（E. coli KAM32（pHPA））におけるキノロン系抗菌薬に対するMICの上昇と一致していた。しかし、その他の抗菌薬および薬剤に関してはMIC値の大きな変化は認められなかった。この結果から、E. coli C316株由来のプラスミド（pHPA）の伝達によりもたらされたキノロン系抗菌薬に対する耐性は、qep遺伝子（SEQ ID NO: 1）によりコードされるQepタンパク質（SEQ ID NO: 2）によりもたらされることが確認された。
【００５５】
実施例3：Qepタンパク質の機能評価
本実施例においては、本発明のQepタンパク質の能力を実際に調べることを目的として行った。
【００５６】
（1）エチジウムブロマイド排出能の計測
実施例2の表1においても示したように、pHPA導入株（E. coli KAM32（pHPA））およびqep遺伝子のクローニング株（E. coli KAM32（pSTVS-S-2））において、エチジウムブロマイドに対する細胞のMIC値が、他のqep遺伝子を含まない細菌株と比較して2倍に増加することが明らかになった。そのため、Qepタンパク質によるエチジウムブロマイド排出能を測定することとした。
【００５７】
実施例2において作製したE. coli KAM32（pSTV28）、E. coli KAM32（pSTVS-S-2）、E. coli KAM32（pSTVS-S-2ΔKM7）を、LB培地で対数増殖後期まで培養した後に集菌し、最少培地（K2HPO410.5 g、KH2PO4 4.5 g、（NH4）2SO41 g、クエン酸三ナトリウム二水和物0.5 g、水1000 ml）で2回洗浄する。10 mM乳酸カリウムを加えた最少培地に懸濁し650 nmでの吸光度が0.5となるように設定した。
【００５８】
24℃でエチジウムブロマイド（EtBr）（終濃度15μM）を加え、蛍光分光光度計を用いて菌体内への集積を経時測定する。蛍光分光光度計の測定条件は励起が500 nm、発光が580 nmとした。EtBr添加20分後にカルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン（CCCP）を終濃度0.75μM加え、薬剤排出ポンプの機能を止めるさらに菌体内へのEtBrの集積を測定した。
【００５９】
ベクターのみを導入したクローン（E. coli KAM32（pSTV28））およびqep遺伝子をトランスポゾンによって破壊したクローン（E. coli KAM32（pSTVS-S-2ΔKM7））のEtBrの菌体内への取り込みは、qep遺伝子を発現させたクローンと比較して高いことが明らかになった（図2）。また、CCCPを添加してQepタンパク質の機能を阻害すると、qep遺伝子発現クローン（E. coli KAM32（pSTVS-S-2））でも、菌体内へのEtBr取り込みはCCCP添加前と比較して高くなることが明らかになった（図2）。
【００６０】
これらの結果からqep遺伝子によりコードされるQepタンパク質は、EtBrを菌体外に排出する機能を有するため薬剤排出ポンプであるタンパク質であると考えられる。
【００６１】
（2）ノルフロキサシン（NFLX）の排出能の計測
実施例2において作製したE. coli KAM32（pSTV28）、E. coli KAM32（pSTVS-S-2）、E. coli KAM32（pSTVS-S-2ΔKM7）を、LB培地で対数増殖後期まで培養した後に集菌し0.2 M MOPS-Tris/10 mM MgSO4（pH 7.0）で洗浄する。遠心した後、集菌した菌体の湿重量を計測する。10 mg/mlとなるように0.2 M MOPS-Tris/10 mM MgSO4（pH 7.0）で懸濁し24℃で5分間静置する。菌液を24℃に保ち、NFLXを終濃度100μMとなるよう菌液に添加する。10分後カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン（CCCP）を終濃度100μMとなるように添加する。
【００６２】
NFLX添加後10分と30分に、1 mlの菌液を回収し、遠心後、0.2 M MOPS-Tris/10 mM MgSO4（pH 7.0）で1回洗浄する。再度遠心した後に、100 mMグリシン-HCl（pH 3.0）で菌体を懸濁し、16時間静置する。
【００６３】
菌液を遠心し、上清を回収し、蛍光分光光度計でNFLXの量を測定する。測定条件は励起370 nm、発光450 nmとする。菌体湿重量10 mgあたりのNFLX取り込み量に換算するためNFLXを100 mMグリシン-HCl（pH 3.0）で希釈し、検量線を作製し取り込み量を算出する。各群の比較にはStudent t-検定を用いてp＜0.05を有意差ありと判定した。
【００６４】
この結果、ベクターのみ導入したクローン（E. coli KAM32（pSTV28））と比較してqep遺伝子発現クローン（E. coli KAM32（pSTVS-S-2））は、NFLX添加後10分で有意にNFLXの取り込み量が低下していた（図3）。またCCCP添加後のサンプルでは、qep遺伝子発現クローン（E. coli KAM32（pSTVS-S-2））で菌体内へのNFLX取り込み量は有意に増加していた（図3）。qep遺伝子を破壊したクローン（E. coli KAM32（pSTVS-S-2ΔKM7））ではベクターのみを導入したクローン（E. coli KAM32（pSTV28））とほぼ同じ結果が得られた（図3）。
【００６５】
これらの結果から、qep遺伝子によりコードされるQepタンパク質はNFLXを菌体内から菌体外へ排出するポンプ機能を有するタンパク質であると考えられる。
【００６６】
実施例4：qep遺伝子の検出方法の検討
本実施例においては、細菌が本発明のqep遺伝子を含有するか否かを検出する方法の一例を検討した。具体的には、本実施例1においてqep遺伝子のヌクレオチド配列が同定されたことに基づいて、PCR法を用いたqep遺伝子の同定法を開発することを目的とした。
【００６７】
SEQ ID NO: 1に示されるヌクレオチド配列に関して、GENETYX-MAC ver. 12.2.3を用いて、SEQ ID NO: 1を増幅できるが、他の公知のヌクレオチド配列を増幅しないような、種々のプライマー対の候補を検索した。
【００６８】
その結果、フォワードプライマーとして以下のプライマー：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、およびSEQ ID NO: 25；からなる群から選択されるプライマーのいずれか、および
リバースプライマーとして以下のプライマー：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、およびSEQ ID NO: 26；からなる群から選択されるプライマーのいずれか
を使用することができることが明らかになった。これらのフォワードプライマーの候補およびリバースプライマーの候補を用いたプライマー対の例を、以下の表2に示す。
【００６９】
【表２−１】
2008011805.tif 000003
【００７０】
【表２−２】
2008011805.tif 000004
【００７１】
【表２−３】
2008011805.tif 000005
【００７２】
本実施例においてはさらに、これらのプライマー対の候補の中から、フォワードプライマーとしてSEQ ID NO: 3を、リバースプライマーとしてSEQ ID NO: 4をそれぞれ選択して利用し、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド配列の部分を増幅することができるか否かを確認した。SEQ ID NO: 3のフォワードプライマーとSEQ ID NO: 4のリバースプライマーが認識するSEQ ID NO: 1上の位置は、図1において示した通りであり、これらのプライマー対により、理論上202塩基対のDNA断片が増幅される。この202塩基対のDNA断片に関してFASTAを用いて相同性解析を行ったところ、公知のDNA配列の中には、相同性を有するものは全く見いだされなかった。
【００７３】
qep遺伝子を保持しない大腸菌株としてE. coli KAM32（pSTV28）を使用し、qep遺伝子を保持する大腸菌株としてE. coli KAM32（pSTVS-S-2）を使用して、PCR実験を行った。具体的には、これらの大腸菌株を500μlの滅菌蒸留水に懸濁し100℃で5分間加熱処理し遠心した後の上清を用いて、PCR用のサンプルを調製した。PCR反応は94℃・30秒、65℃・30秒、74℃・30秒を30回繰り返し、最後に74℃・5分でPCR反応物の伸長反応をおこなった。
【００７４】
この結果、qep遺伝子を保持しない大腸菌株E. coli KAM32（pSTV28）のサンプルでは、増幅産物が全く認められないが、qep遺伝子を保持する大腸菌株E. coli KAM32（pSTVS-S-2）のサンプルでは、予想された増幅産物のサイズ（202塩基対）と同サイズのバンドを見いだすことができた（図４）。このことから、プライマー対を用いてPCR反応により細菌がqep遺伝子を含有するか否か、ひいては被検細菌がキノロン系抗菌薬に対する耐性を有しているか否かを、簡便に検査することが可能になった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、キノロン系抗菌薬に対して耐性を賦与するqep遺伝子、およびその遺伝子によりコードされるQepタンパク質を提供する。本発明はまた、qep遺伝子の具体的な配列情報に基づいて、PCR法やサザンブロットハイブリダイゼーション法などの当該技術分野において周知の方法を使用して、この遺伝子並びに同等の遺伝子を保有する病原細菌を、より簡便にスクリーニングするための検出方法を提供する。その結果、医療現場において、qep遺伝子によりもたらされるキノロン系抗菌薬に対する耐性の臨床診断が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１−１】図1は、本発明において新たに取得されたQepの塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１−２】図1は、本発明において新たに取得されたQepの塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１−３】図1は、本発明において新たに取得されたQepの塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１−４】図1は、本発明において新たに取得されたQepの塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図２】図2は、Qepタンパク質が、EtBrを菌体外に排出する機能を有するため薬剤排出ポンプであることを示す図である。
【図３】図3は、E. coli KAM32（pSTV28）、E. coli KAM32（pSTVS-S-2）、E. coli KAM32（pSTVS-S-2ΔKM7）の、ノルフロキサシン（NFLX）の排出能を調べた結果を示す。
【図４】図4は、qep遺伝子を保持しない大腸菌株E. coli KAM32（pSTV28）（NS）、およびqep遺伝子を保持する菌株、E. coli KAM32（pSTVS-S-2）（PS）に対して、SEQ ID NO: 3のフォワードプライマーとSEQ ID NO: 4のリバースプライマーを用いたPCR法により増幅されたDNA断片を電気泳動した結果を示す。
【図１−１】
2008011805.tif 000006
【図１−２】
2008011805.tif 000007
【図１−３】
2008011805.tif 000008
【図１−４】
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【図３】
2008011805.tif 000010
【図２】
2008011805.tif 000011
【図４】
2008011805.tif 000012
【配列表】
2008011805000001.app