(57)【要約】【課題】ヒトＥＳ細胞等の未分化細胞を効率よく増殖させることができ、かつ、その未分化状態を保持しつつ継代することができる未分化細胞培養担体およびそれを用いた継代培養法を提供する。【解決手段】培養される細胞の大きさに対して１倍以上５０倍以下の径を有する複数の凹部が基材表面に形成されている培養担体を用いて、未分化細胞を該培養担体の凹部の少なくとも１ヶ所に撒種して培養し、未分化な状態のままで増殖した細胞塊を得る。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養される細胞の大きさに対して１倍以上５０倍以下の径を有する複数の凹部が基材表面に形成されていることを特徴とする未分化細胞培養担体。
【請求項２】
前記凹部の径が１０μｍ以上１０００μｍ以下、深さが３０μｍ以上５００μｍ以下であることを特徴とする請求項１記載の未分化細胞培養担体。
【請求項３】
前記凹部の径が１００μｍ以上４００μｍ以下、深さが５０μｍ以上２００μｍ以下であり、マウスＥＳ細胞の培養に用いられることを特徴とする請求項１記載の未分化細胞培養担体。
【請求項４】
前記凹部の径が２５０μｍ以上１０００μｍ以下、深さが１２５μｍ以上５００μｍ以下であり、ヒトＥＳ細胞の培養に用いられることを特徴とする請求項１記載の未分化細胞培養担体。
【請求項５】
前記凹部が規則的に配列していることを特徴とする請求項１から請求項４までのいずれかに記載の未分化細胞培養担体。
【請求項６】
前記基材がジルコニア、イットリア、チタニア、アルミナ、シリカ、ハイドロキシアパタイトおよびβ−リン酸三カルシウムのうちの少なくともいずれか１種のセラミックスまたはガラスからなることを特徴とする請求項１から請求項５までのいずれかに記載の未分化細胞培養担体。
【請求項７】
請求項１から請求項４までのいずれかに記載の培養担体を用いて、未分化細胞を前記培養担体の凹部の少なくとも１ヶ所に撒種して培養し、未分化な状態のままで増殖した細胞塊を得ることを特徴とする未分化細胞の継代培養方法。
【請求項８】
培養して得られた前記細胞塊を単一細胞または細胞小集団に分離し、得られた未分化細胞を用いて、請求項７記載の培養方法を繰り返すことにより継代培養を行うことを特徴とする未分化細胞の継代培養方法。
【請求項９】
前記細胞塊の分離が、トリプシン処理またはピペッティングにより行われることを特徴とする請求項８記載の未分化細胞の継代培養方法。
【請求項１０】
培養して得られた未分化細胞が、未分化マーカーの発現を維持しているものであることを特徴とする請求項７から請求項９までのいずれかに記載の未分化細胞の継代培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や成体多能性幹細胞等の多能性を有する未分化な細胞の培養技術、特に、継代培養に好適な培養担体およびこれを用いた継代培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト骨髄液からの幹細胞の分離、目的とする組織細胞への分化・誘導、３次元培養技術、足場材料の開発等の進歩に伴い、細胞培養によって幹細胞から皮膚、骨、軟骨、血管、心臓弁、靭帯等の組織を作製することが可能となり、一部では、既に臨床応用が始められている。
【０００３】
一方、ＥＳ細胞に代表される未分化細胞は、他のすべての組織細胞に分化することができる全能性を有する細胞であることから、再生医療への応用が期待されている細胞である。
このため、未分化細胞から組織細胞への分化制御法の研究が盛んに進められている。
【０００４】
前記ＥＳ細胞を再生医療の目的で使用するためには、核を除外した卵子と他の個体の体細胞の核とを融合して作製されるＥＳ細胞株を大量に増殖させる技術が必要である。
しかしながら、未分化状態を維持しながら、大量培養を行うことができる最適な培養法は未だ確立されていない。
【０００５】
現在のところ、マウスＥＳ細胞は、ＬＩＦ（白血病阻害因子）存在下で、かつ、ＳＴＯ（マウス胎児繊維芽細胞）等に代表されるフィーダ細胞上で共培養することにより、未分化性を維持することができることが確認されている（例えば、非特許文献１参照）。
また、最近では、ヒト胚盤胞期胚からも、多分化能を有し、長期間未分化のままで細胞分裂可能なヒトＥＳ細胞株の樹立が報告されつつある。
【０００６】
従来、上記のようなＥＳ細胞等に代表される未分化な細胞を増殖または維持するための一般的な培養担体としては、プラスチックシャーレ上に、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、マトリゲル等の生体内成分をコーティングしたものに、マウス由来やヒト組織由来の支持細胞を増殖させたものが用いられている。
【非特許文献１】Li Cui, Katsunori Sasaki, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 2004, 52, p.1447-1457
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記のような培養担体でＥＳ細胞を増殖させた場合、細胞はコロニー（細胞塊）を形成し、それが巨大化するにつれて、ＥＳ細胞が有している未分化状態が消失していく。
このため、未分化細胞を継代培養するためには、顕微鏡下でＥＳ細胞コロニーを観察し、ある程度の大きさになったところで、トリプシン処理によりコロニーを細分化し、他の担体に継代することによって、ＥＳ細胞を増殖し、維持していく方法が採用されている。
この方法においては、得られるＥＳ細胞コロニーのサイズ制御が難しく、得られるＥＳ細胞コロニーのサイズが一定とならない。このため、継代培養するタイミングの判断が難しく、タイミングを誤ると、分化した細胞と未分化細胞とが混在してしまうという課題を有していた。
【０００８】
本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、ヒトＥＳ細胞等の未分化細胞を効率よく増殖させることができ、かつ、その未分化状態を保持しつつ継代することができる未分化細胞培養担体およびそれを用いた継代培養法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る未分化細胞培養担体は、培養される細胞の大きさに対して１倍以上５０倍以下の径を有する複数の凹部が基材表面に形成されていることを特徴とする。
上記のような培養担体を用いれば、その基材表面の凹部の大きさにより、ＥＳ細胞等の未分化細胞コロニーのサイズ制御が可能となり、培養後の回収も容易であり、操作性にも優れ、効率的な培養を行うことができる。
【００１０】
前記培養担体は、凹部の径が１０μｍ以上１０００μｍ以下、深さが３０μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましい。
ＥＳ細胞コロニーが、ある一定のサイズ以上になると、未分化状態を失うため、凹部のサイズは、上記範囲内であることが好ましい。
【００１１】
特に、前記培養担体が、マウスＥＳ細胞の培養に用いられる場合は、凹部の径は１００μｍ以上４００μｍ以下、深さは５０μｍ以上２００μｍ以下であり、また、ヒトＥＳ細胞の培養に用いられる場合は、凹部の径は２５０μｍ以上１０００μｍ以下、深さは１２５μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましい。
【００１２】
また、前記凹部は、効率的かつ均等に細胞増殖を行う観点から、基材表面に規則的に配列していることが好ましい。
【００１３】
また、前記基材は、ジルコニア、イットリア、チタニア、アルミナ、シリカ、ハイドロキシアパタイトおよびβ−リン酸三カルシウムのうちの少なくともいずれか１種のセラミックスまたはガラスからなることが好ましい。
これらのセラミックスまたはガラスは、未分化細胞の分化・誘導を促進することがなく、生体安定性が高いため、好適に用いられる。
【００１４】
本発明に係る未分化細胞の継代培養方法は、上記のような培養担体を用いて、未分化細胞を該培養担体の凹部の少なくとも１ヶ所に撒種して培養し、未分化な状態のままで増殖した細胞塊を得ることを特徴とする。
上記のような本発明に係る培養担体を用いて未分化細胞を培養することにより、未分化細胞を分化させることなく、効率的に大量継代培養することができる。
【００１５】
さらに、本発明に係る未分化細胞の継代培養方法は、上記において培養して得られた細胞塊を単一細胞または細胞小集団に分離し、得られた未分化細胞を用いて、上記培養方法を繰り返すことにより継代培養を行うことを特徴とする。
上記のような本発明に係る培養担体を用いれば、同様の培養操作を容易に繰り返し行うことができ、効率的な継代培養を行うことができる。
【００１６】
前記継代培養方法においては、細胞塊の分離は、トリプシン処理またはピペッティングにより容易に行うことができる。
培養担体の基材表面の特定の凹部形状により、細胞の担体からの剥離および分離操作を容易に行うことができ、効率化が図られる。
【００１７】
上記方法により培養して得られた未分化細胞においては、未分化マーカーの発現を維持したまま、継代培養することが可能である。
【発明の効果】
【００１８】
上述したとおり、本発明に係る培養担体は、その基材表面の所定の凹部が物理的隔壁を形成するため、該凹部内において未分化の状態を保持したまま、未分化細胞の培養を行うことができ、また、培養された細胞塊の取り扱いも容易となる。
また、上記培養担体を用いた本発明に係る継代培養方法によれば、フィーダ細胞を用いることなく、未分化細胞を、未分化な状態を保持したまま、効率的に大量継代培養することができる。
したがって、本発明は、ＥＳ細胞や成体多能性幹細胞等の多能性を有する未分化な細胞の培養技術の発展、ひいては、生体組織の再生治療への応用に貢献し得るものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
本発明に係る未分化細胞用培養担体は、培養される細胞の大きさに対して１倍以上５０倍以下の径を有する複数の凹部が基材表面に形成されているものである。
このような形状の培養担体を用いることにより、基材表面に形成された凹部内のみで細胞を増殖させることが可能となり、ＥＳ細胞等の未分化細胞コロニーのサイズ制御を行うことができる。
すなわち、ＥＳ細胞等は、培養されて凹部の大きさに達すると増殖を鈍化させる性質があり、常時観察していなくても、所望の大きさの細胞塊を得ることができる。未分化を維持することができる大きさの凹部を用いることにより、未分化細胞の増殖が容易になる。
また、上記のようなサイズの凹部内で増殖した細胞塊は、ピペッティング等による回収が容易であり、効率的な培養を行うことができる。
【００２０】
なお、細胞の大きさの１倍の大きさの凹部は、未分化状態を維持することはできるが、増殖の余地があまりなく、また、細胞は、凹部から突出しない方が好ましいことから、２倍以上の径であることが好ましい。
また、未分化の確実性を高めるため、２５倍以下が好ましい。
【００２１】
前記培養担体は、凹部の径が１０μｍ以上１０００μｍ以下、深さが３０μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましい。
上記のような凹部のミクロポア構造が、培養細胞に対して物理的障壁になることにより、未分化細胞コロニーの巨大化が抑制され、その未分化状態を保持することができる。
【００２２】
なお、本発明においては、凹部のサイズを径と深さで表現しているが、該凹部の形状は、半球状に限定されるものではなく、種々の形状とすることができる。ただし、培養担体の製造容易性、培養細胞に対する操作容易性等の観点から、半球状であることが好ましい。
本発明でいう凹部の径は、培養担体の基材表面の凹部の開口面積を円に置き換えた場合の直径である。また、深さは、凹部の最も深い部分の深さである。
【００２３】
ＥＳ細胞１個の大きさは直径約１０μｍであり、細胞が凹部外で増殖することを防止するため、凹部の径は１０μｍ以上、深さは３０μｍ以上であることが好ましい。
一方、前記凹部のサイズが大きすぎると、増殖した未分化細胞の細胞塊が大きくなりすぎ、細胞が分化するおそれがあるため、該凹部の径は５００μｍ以下、深さは１０００μｍ以下であることが好ましい。
【００２４】
特に、前記培養担体をマウスＥＳ細胞の培養に用いる場合は、凹部の径は１００μｍ以上４００μｍ以下、深さは５０μｍ以上２００μｍ以下であることが好ましい。
凹部の径が１００μｍ未満、深さが５０μｍ未満である場合、該凹部はマウスＥＳ細胞の増殖空間としては狭すぎて、培養液交換時のピペッティング操作等において、培養した細胞を吸い込みやすくなる等の不都合が生じる。
より好ましくは、凹部の径は２００μｍ以上、深さは１００μｍ以上である。
一方、凹部の径が４００μｍを超える場合、深さが２００μｍを超える場合は、該凹部はマウスＥＳ細胞の増殖空間としては大きすぎて、好ましいＥＳ細胞コロニーを形成することができない。
【００２５】
また、前記培養担体をヒトＥＳ細胞の培養に用いる場合は、上記マウスＥＳ細胞の場合と同様の理由から、凹部の径は２５０μｍ以上１０００μｍ以下、深さは１２５μｍ以上５００μｍ以下であることが、好ましい。
【００２６】
また、前記凹部は、効率的かつ均等に細胞増殖を行うためには、規則的に配列していることが好ましい。
規則的に配列されていることにより、機械的にピペッティング等を行うことが可能となり、均一な大きさの細胞塊が得られることから、培養細胞の量産が可能となる。
なお、該凹部の形状は、特に限定されるものではなく、基材表面に上記サイズでの加工が可能である限り、円形状であっても、多角形状であってもよい。多角形の場合は、凹部の大きさは、開口部の面積を円形に換算して対応させる。
【００２７】
本発明に係る培養担体の基材としては、非金属無機材質が好ましく、特に、セラミックスまたはガラスが好適に用いられる。具体的な材質としては、生体安全性の高い、ジルコニア、イットリア、チタニア、アルミナ、シリカ、アルミナ−シリカ、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム等が挙げられるが、これらの中でも、生体安定性が確認されている、アルミナ、ジルコニア、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、チタニアがより好ましい。特に、ジルコニアまたはハイドロキシアパタイトが好ましい。
【００２８】
上記のようなセラミックスからなる基材自体は、緻密体であることが好ましく、また、多孔体の場合には、径が１μｍを超える気孔を有しないものであることが好ましい。
径が１μｍを超える気孔が存在する場合、未分化細胞が培養担体に接着しやすくなり、前記凹部内に細胞が集まりにくくなり、未分化細胞コロニーのサイズ制御が困難となる。
【００２９】
また、本発明に係る未分化細胞の継代培養方法は、上記のような本発明に係る培養担体を用いて、未分化細胞を該培養担体の凹部の少なくとも１ヶ所に撒種して培養し、未分化な状態のままで増殖した細胞塊を得ることを特徴とするものである。
上記のような特定の形状を有する培養担体を用いることにより、未分化細胞を分化させることなく、効率的に大量継代培養することができる。
【００３０】
さらに、本発明に係る未分化細胞の継代培養方法においては、上記における初期（１次）培養により得られた細胞塊を単一細胞または細胞小集団に分離し、得られた未分化細胞を用いて、上記培養方法と同様にして、２次培養、３次培養、……と繰り返すことにより継代培養を行う。
【００３１】
本発明において培養する細胞は、ＥＳ細胞等に代表される未分化細胞である。
未分化細胞とは、自分自身と同じ細胞に増殖する能力と、分化誘導因子の付与により決まった組織細胞に分化する能力とを有している、未分化の状態にある細胞であり、一旦、他の組織細胞に分化すると、未分化な状態に戻ることはできない。具体的には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、皮膚幹細胞等が挙げられる。
本発明においては、これらの未分化細胞のうち、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞を用いることが好ましい。
【００３２】
前記未分化細胞は、上記のようなセラミックスからなる培養担体上に、フィーダ細胞に代表される支持細胞を介することなく、直接、撒種して培養することが可能であり、また、そのようにすることが好ましい。
セラミックス培養担体に直接撒種することにより、培養する未分化細胞への他の細胞由来の危機因子の混入が防止される。
【００３３】
また、本発明に係る培養方法において用いられる培地は、特に限定されるものではなく、培養する細胞に応じて、適宜選択することができる。例えば、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、イーグル培地等が好適に用いられる。
これらの培地には、さらに、ＦＢＳ（fetal bovine serum；ウシ胎児血清）、ＫＳＲ（KnockOutTM Serum Replacement）、ＬＩＦ（leukemia inhibitory factor；白血病阻害因子）、非必須アミノ酸、ピルビン酸等の細胞を維持するために必要な物質を添加することが好ましい。
【００３４】
継代培養を行う際には、前記培養担体にＥＳ細胞を撒種し、凹部内が増殖した細胞により埋め尽くされた後、別の培養担体にＥＳ細胞を撒き替える。
この撒き替えの際、細胞塊を培養担体から引き離し、単一細胞再または細胞小集団に分離する必要があるが、これは、トリプシン処理または数回のピペッティングにより行うことができる。
ただし、ヒト等の哺乳類系ＥＳ細胞は、トリプシン処理によって、細胞塊が完全に分離されると、生存することができなくなるため、ピペッティングを数回行うことにより、細胞小集団に分離し、別の培養担体に撒き替えることが好ましい。
【００３５】
上記方法により培養して得られた未分化細胞は、アルカリフォスファターゼに代表される未分化マーカーの発現を維持しているものであることが好ましい。
これらが確認されることにより、ＥＳ細胞が未分化状態であることが分かる。すなわち、未分化状態であると発現し、分化すると発現しなくなる抗原を染色し、アルカリフォスファターゼ等の未分化マーカーが発現していることを確認することにより、未分化状態であることを確認することができる。
本発明に係る継代培養方法によれば、上記のような特性を維持した状態で継代培養することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は、下記実施例により制限されるものではない。
［実施例１］
２４穴プレートの穴に、ジルコニアセラミックスからなる培養担体を浸漬させ、予め培養されたマウスＥＳ細胞を凹部１ヶ所あたり３．０×１０4個撒種し、ＫＳＲ、ピルビン酸、非必須アミノ酸、ＬＩＦを含んだＤＭＥＭ培地において、５％ＣＯ2インキュベータ内で、３７℃で３日間培養した。
【００３７】
上記培養においては、径が約３００μｍの逆四角錐状の凹部が規則的に配列している表面形状を有するジルコニアセラミックスを培養担体として用いた。該培養担体の電子顕微鏡写真（３０倍、１００倍）をそれぞれ、図１，２に示す。
【００３８】
また、培養後の細胞の電子顕微鏡写真（５０倍、５００倍）を、図３，４に示す。
図３，４の電子顕微鏡写真から分かるように、ジルコニアセラミックス培養担体表面の凹部内で、ＥＳ細胞コロニーが形成されていることが認められた。
【００３９】
さらに、培養後のＥＳ細胞コロニーについて、アルカリフォスファターゼ組織染色キット（８６−Ｒ；ＳＩＧＭＡ社製）を用いて、下記の操作により、アルカリフォスファターゼ染色を行い、未分化状態を調べた。
２４穴プレート内の培地を吸引除去し、ＰＢＳバッファーを用いて洗浄後、アルデヒド溶液で固定処理を行った。さらに、この固定処理した担体と染色液とを１５ｍｌチューブに入れ、室温で３０〜６０分間静置して染色した。
染色後の細胞の顕微鏡写真（５０倍）を、図５に示す。
図５の顕微鏡写真に示された染色状況から、培養されたマウスＥＳ細胞は、ほぼ均一なコロニーを形成しており、その未分化性は、アルカリフォスファターゼ活性により確認された。
【００４０】
［実施例２］
径が約２５０μｍの半球状の凹部が規則的に配列している表面形状を有するジルコニアセラミックスを培養担体として用い、実施例１と同様にして、マウスＥＳ細胞の培養を行った。該培養担体の電子顕微鏡写真（１００倍）を図６に示す。
また、培養後のアルカリフォスファターゼ染色後の顕微鏡写真を図７に示す。
図７の顕微鏡写真に示された染色状況から、培養されたマウスＥＳ細胞は、ほぼ均一なコロニーを形成しており、その未分化性は、アルカリフォスファターゼ活性により確認された。
【００４１】
［実施例３］
径が約４５０μｍの半球状の凹部が規則的に配列している表面形状を有するジルコニアセラミックスを培養担体として用い、実施例１と同様にして、マウスＥＳ細胞の培養を行った。該培養担体の電子顕微鏡写真（１００倍）を図８に示す。
また、培養後のアルカリフォスファターゼ染色後の顕微鏡写真を図９に示す。
図９の顕微鏡写真に示された染色状況から、培養されたマウスＥＳ細胞の未分化性はアルカリフォスファターゼ活性で確認されたが、培養担体の凹部内の細胞コロニーは、球状の単一コロニーにはならず、歪んだ形のコロニーが複数存在していた。
【００４２】
［比較例１］
凹部のない平坦なジルコニアセラミックスを培養担体として用い、実施例１と同様にして、マウスＥＳ細胞の培養を行った。該培養担体の電子顕微鏡写真（１００倍）を図１０に示す。
また、培養後のアルカリフォスファターゼ染色後の顕微鏡写真を図１１に示す。
図１１の顕微鏡写真に示された染色状況から、培養されたマウスＥＳ細胞のコロニーは、形が歪んでおり、巨大化していた。また、アルカリフォスファターゼ染色の程度が劣り、未分化性が低下している傾向が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】実施例１に係るジルコニアセラミックス培養担体の電子顕微鏡写真（３０倍）である。
【図２】実施例１に係るジルコニアセラミックス培養担体の電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【図３】実施例１においてジルコニアセラミックス培養担体上で培養した細胞の電子顕微鏡写真（５０倍）である。
【図４】実施例１においてジルコニアセラミックス培養担体上で培養した細胞の電子顕微鏡写真（５００倍）である。
【図５】実施例１においてジルコニアセラミックス培養担体上で培養した細胞をアルカリフォスファターゼ染色したものの顕微鏡写真（５０倍）である。
【図６】実施例２に係るジルコニアセラミックス培養担体の電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【図７】実施例２においてジルコニアセラミックス培養担体上で培養した細胞をアルカリフォスファターゼ染色したものの顕微鏡写真（５０倍）である。
【図８】実施例３に係るジルコニアセラミックス培養担体の電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【図９】実施例３においてジルコニアセラミックス培養担体上で培養した細胞をアルカリフォスファターゼ染色したものの顕微鏡写真（５０倍）である。
【図１０】比較例１に係るジルコニアセラミックス培養担体の電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【図１１】比較例１においてジルコニアセラミックス培養担体上で培養した細胞をアルカリフォスファターゼ染色したものの顕微鏡写真（５０倍）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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