(57)【要約】【課題】固定化によるリパーゼ活性の損失が少なく、簡単な操作で製造することができ、且つ、従来の固定化リパーゼに比べてエステル交換活性が高く、長期にわたってエステル交換活性を高く保持することができる固定化リパーゼ、及びその製造方法を提供すること。【解決手段】シリカ及び珪藻土を担体とし、粒径１〜１００μｍの粒子が９０％以上(体積基準）であり、且つ粒径０．４５μm以下の粒子が１％以下（個数基準）であることを特徴とする固定化リパーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカ及び珪藻土を担体とし、粒径１〜１００μｍの粒子が９０％以上(体積基準）であり、且つ粒径０．４５μm以下の粒子が１％以下（個数基準）であることを特徴とする固定化リパーゼ。
【請求項２】
上記シリカ及び珪藻土の合計した含有量が５０〜９８質量％であることを特徴とする請求項１記載の固定化リパーゼ。
【請求項３】
上記シリカ及び珪藻土の比率が、２０：８０〜８０：２０（質量比）であることを特徴とする請求項１又は２記載の固定化リパーゼ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の固定化リパーゼの製造方法であって、シリカ、珪藻土、及びリパーゼ粉末を、油脂中に分散し、撹拌することにより、シリカ及び珪藻土にリパーゼ粉末を固定化することを特徴とする固定化リパーゼの製造方法。
【請求項５】
上記固定化時に油脂の水分含有量を１００〜１０００ｐｐｍとすることを特徴とする請求項４記載の固定化リパーゼの製造方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の固定化リパーゼを使用することを特徴とする油脂のエステル交換方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定化リパーゼ及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来からリパーゼを触媒として使用した油脂のエステル交換反応によって油脂の改質を行なう方法が広く行なわれている。この油脂のエステル交換反応には回分反応と連続反応があり、また、リパーゼを固定化して使用する方法と粉末のまま使用する方法がある。
従来はリパーゼを何らかの担体、例えば陰イオン交換樹脂（特許文献１）、フェノール樹脂（特許文献２）、疎水性担体（特許文献３）、陽イオン交換樹脂（特許文献４）、キレート樹脂（特許文献５）等に固定化して使用する方法が行なわれてきたが、これらに記載の方法は、リパーゼを担体に固定することでリパーゼ活性が低下する欠点に加え、高価な担体を使用するためコストが高くなる欠点、さらには、リパーゼをいったん水溶液とした後に担体に含浸させ、後に乾燥する必要があるため、製造工程が煩雑であるという問題があった。
【０００３】
一方、リパーゼを固定化せずに粉末のまま使用する方法も行なわれてきた。例えば、超音波処理などの方法で反応時の粉末リパーゼの粒径を９０％以上が１〜１００μｍとなるように調整して回分反応をおこなう方法や、濾過器内に粉末状リパーゼを単独または濾過助剤とともに層を形成するように封入し、その濾過器に油脂を通油させる方法（特許文献７）が提案されている。
しかしながら、これらの方法は、固定化して用いるよりリパーゼ活性は高まるものの、粉末リパーゼは極めて微細であるため、再利用のために回収する際に粉末リパーゼが流出して失われるため回収率が低く、エステル交換活性が短期間で低下してしまう問題があった。さらに、特許文献７の方法は、通油時の圧力損失が高く偏流が生じやすい問題もあった。
【０００４】
【特許文献１】特開昭６０−９８９８４号公報
【特許文献２】特開昭６１−２０２６８８号公報
【特許文献３】特開平２−１３８９８６号公報
【特許文献４】特開平３−６１４８５号公報
【特許文献５】特開平１−２６２７９５号公報
【特許文献６】特開平７−７９７８９号公報
【特許文献７】特開２００１−１７８４８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の目的は、固定化によるリパーゼ活性の損失が少ないため、従来の固定化リパーゼに比べてエステル交換活性が高く、且つ長期にわたってエステル交換活性を高く保持することができる固定化リパーゼ、及びこのような固定化リパーゼを簡単な操作で製造することができる、固定化リパーゼの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、固定化リパーゼの製造方法を検討する過程で、偶然にも、シリカも珪藻土も吸着力の弱い担体であるが、併用した場合には吸着力が改善されることを知見した。さらに検討をすすめたところ、リパーゼを水溶液として担体に吸着させる方法の場合は、シリカ単独、又は珪藻土単独であっても固定化が可能であるが、油脂中でリパーゼ粉末を担体に固定化する方法の場合は、おどろくべきことに、シリカ単独又は珪藻土単独では、ほとんど固定化されず、シリカ及び珪藻土を担体として併用してはじめて固定化が可能となることを知見した。そして、この固定化リパーゼの粒径を特定範囲とした場合、従来の固定化リパーゼに比べてエステル交換活性が高く、且つ長期にわたってエステル交換活性を高く保持することができることを知見した。
【０００７】
本発明は、上記知見に基づきなされたものであり、シリカ及び珪藻土を担体とし、粒径１〜１００μｍの粒子が９０％以上(体積基準）であり、且つ粒径０．４５μm以下の粒子が１％以下（個数基準）であることを特徴とする固定化リパーゼを提供することによって、上記目的を達成したものである。
【０００８】
また、本発明は、上記固定化リパーゼの製造方法であって、シリカ、珪藻土、及びリパーゼ粉末を、油脂中に分散し、撹拌することにより、シリカ及び珪藻土にリパーゼ粉末を固定化することを特徴とする固定化リパーゼの製造方法を提供することで上記目的を達成したものである。
【０００９】
さらに、本発明は、上記固定化リパーゼを使用する油脂のエステル交換方法を提供することで上記目的を達成したものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の固定化リパーゼは、固定化によるリパーゼ活性の損失が少ないため、従来の固定化リパーゼに比べてエステル交換活性が高く、且つ、反応・回収・再使用時の損失が少ないため、長期にわたってエステル交換活性を高く保持することができる。また、本発明の固定化リパーゼの製造方法によれば、固定化リパーゼの乾燥の工程を必要とせず、ただちにエステル交換反応に用いることができ、また、油脂への分散性が良好である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の固定化リパーゼについて詳細に説明する。
本発明で用いられるリパーゼとしては、特に限定されず、例えば、リゾプス属、ムコール属、アスペルギルス属、シュードモナス属、アルカリゲネス属、キャンディダ属等の微生物由来のもの、及び、動植物由来のものを挙げることができる。本発明においては、エステル交換能が最も高いことからアルカリゲネス属由来のリパーゼを使用することが好ましい。
【００１２】
本発明の固定化リパーゼにおける、リパーゼの含有量は、求める活性のレベルや由来の違いにより一概には言えないが、好ましくは、固形分を基準として、２〜５０質量％が好ましく、５〜３０質量%がさらに好ましい。２質量％未満では得られる固定化リパーゼのエステル交換活性が低くなるので好ましくなく、５０質量％を超えるとリパーゼが脱離しやすくなってしまうので好ましくない。
【００１３】
本発明の固定化リパーゼは、シリカ及び珪藻土を担体とし、リパーゼを該担体に担持させたものである。
担体が、シリカのみであるか又は珪藻土のみであると、本発明の効果は得られない。
まず本発明で使用するシリカについて述べる。
【００１４】
シリカとは、合成二酸化珪素のことであり、連続的に網の目のような微細な孔を形成しており、微粉末状、及び粒子状のようなものが使用できる。
シリカは硬度が高く、固定化時の撹拌程度では微細化しないため、求める固定化リパーゼの粒度と同じ粒度を有するシリカを使用することが好ましい。すなわち本発明では、粒径１〜１００μｍの粒子が９０％以上(体積基準）であり、且つ粒径０．４５μm以下の粒子が１％以下（個数基準）であるシリカを用いることが好ましく、より好ましくは、粒径１〜１００μｍの粒子が９５％以上(体積基準）であり、且つ粒径０．４５μm以下の粒子が１％以下（個数基準）であるシリカを用いる。
【００１５】
なお、本発明では、使用するリパーゼの至適ｐＨから１．０ｐＨ単位以上は偏位していないシリカを使用することが好ましい。リパーゼの至適ｐＨと１．０ｐＨ単位以上偏位したシリカを使用した場合は高活性な固定化リパーゼを得ることができない。
【００１６】
次に、本発明で使用する珪藻土について述べる。
珪藻土とは、二酸化珪素質の殻をもつ珪藻の化石を破砕、乾燥、焼成などの処理をしたものであり、シリカと異なり、多様・独特な構造と高次の微細な孔を有するものである。その粒径は最大で百数十μm、最小ではサブミクロン粒子も存在し、微粉末シリカよりは幅広い粒度分布を有するという特徴を有する。本発明では、粒径１〜１００μｍの粒子が９０％以上(体積基準）であり、且つ、粒径０．４５μm以下の粒子が１％以下（個数基準）である珪藻土を用いることが好ましく、より好ましくは、粒径１〜１００μｍの粒子が９５％以上(体積基準）、且つ粒径０．４５μm以下の粒子が１％以下（個数基準）である珪藻土を用いる。
【００１７】
この範囲外の珪藻土を使用すると、エステル交換活性が高く、長期にわたってエステル交換活性を高く保持することができる固定化リパーゼが得られにくい。例えば、１μｍ未満の粒子が１０％より多いと、固定化リパーゼの回収の際に超微細なメッシュの濾過装置を必要とし、その場合、すぐに目詰まりしてしまい、実質的に固定化リパーゼの回収、再利用が困難である。また、１００μｍを超える粒子が１０％より多いと、高いエステル交換活性を得ることができない。
【００１８】
本発明の固定化リパーゼは、上記シリカ及び珪藻土を合計した含有量が５０〜９８質量％であることが好ましく、より好ましくは７０〜９５質量％である。５０質量％未満であると、リパーゼの脱離が起こりやすく、９８質量％を超えると、相対的に酵素含量が減ってしまい、得られる固定化リパーゼの活性が低下してしまうため好ましくない。
【００１９】
また、上記シリカ及び珪藻土の比率は、２０：８０〜８０：２０（質量比）であることが好ましく、より好ましくは３０：７０〜７０：３０（質量比）である。シリカの割合が２０％未満、又は、８０％を超えると、極端に固定化率が低下するので好ましくない。
【００２０】
また、本発明の固定化リパーゼは、本発明の効果に影響のない限り、上記シリカ及び珪藻土以外の担体や、有機酸や脂肪酸などのリパーゼの活性化物質、さらには、トコフェロールなどの酸化防止剤などのその他の物質を含むものであってもよい。その他の物質の含有量は、好ましくは、２０質量％未満とすることが好ましく、より好ましくは１０質量％未満とする。
【００２１】
本発明の固定化リパーゼは、上記シリカ及び珪藻土を担体として、上記リパーゼを担持したものであって、粒径１〜１００μｍの粒子が９０％以上(体積基準）であり、且つ粒径０．４５μm以下の粒子が１％以下（個数基準）、好ましくは、粒径１〜１００μｍの粒子が９５％以上(体積基準）であり、且つ、粒径０．４５μm以下の粒子が１％以下（個数基準）である。この範囲外の粒径であると、エステル交換活性が高く、反応・回収・再使用時の損失がなく、長期にわたってエステル交換活性を高く保持することができる固定化リパーゼが得られない。
【００２２】
例えば、粒径１μｍ未満の粒子が１０％（体積基準）より多いか、又は粒径０．４５μm以下の粒子が１％（個数基準）を超えるような微細なものであると、固定化リパーゼの回収の際に超微細なメッシュの濾過装置を必要とし、その場合、すぐに目詰まりしてしまい、実質的に固定化リパーゼの回収、再利用が困難である。また、１００μｍを超える粒子が１０％より多いと、固定化時のリパーゼ活性の損失が多く、高いエステル交換活性を得ることができない。
【００２３】
次に本発明の固定化リパーゼの製造方法について述べる。
リパーゼを水溶液とし、これを、シリカ及び珪藻土の混合物に吸着させた後、乾燥、続いて粉末化する方法など公知の方法を採ることもできるが、本発明の固定化リパーゼは、シリカ、珪藻土及びリパーゼ粉末を、油脂中に分散し、撹拌することにより、シリカ及び珪藻土にリパーゼ粉末を固定化する方法を採ることが、固定化の際にダマを生じることなく、上記粒径の固定化リパーゼを容易に得ることができることに加え、固定化酵素の乾燥の工程を必要とせず、ただちに油脂のエステル交換反応に用いることができる点、さらには、得られた固定化リパーゼが極めて親油性の高い状態であるため、エステル交換時に原料油脂への分散性が極めて高く、簡単に分散させることが可能な点で好ましい。
【００２４】
そして、本発明の固定化リパーゼの製造方法においては、担体として、シリカ単独又は珪藻土単独ではほとんど固定化されず、担体として、シリカ及び珪藻土を併用してはじめて固定化が可能となるものである。
【００２５】
本発明の固定化リパーゼの製造方法では、リパーゼは粉末の形態で使用する。このリパーゼの粉末化方法は特に限定されず、例えば、リパーゼを含む微生物培養液をアセトン沈殿、精製、乾燥等の工程により粉末化したものを用いることができ、また、市販の粉末リパーゼを使用することができる。
【００２６】
なお、上記リパーゼ粉末の粒径は、リパーゼ剤の種類にもよるが、粒径１〜１００μｍの粒子の占める割合が５０〜１００％（体積基準）であり、且つ粒径０．１〜０．５μｍの粒子の占める割合が８０％〜１００％（個数基準）であるような微細なものを使用することが好ましい。
【００２７】
本発明の固定化リパーゼの製造方法で使用する油脂は特に限定されず、例えばパーム油、大豆油、菜種油、コーン油、ヒマワリ油、サフラワー油、オリーブ油、キャノーラ油、綿実油、米油、カカオ脂、サル脂、シア脂、マンゴー核油、ヤシ油、パーム核油、牛脂、豚脂、魚油、乳脂等の各種植物油脂、動物油脂、並びにこれらを水素添加、及び／又は、エステル交換、及び／又は、分別処理を施した加工油脂から選ばれた１種又は２種以上を挙げることができる。
【００２８】
本発明の固定化リパーゼの製造方法では、エステル交換油脂を使用することが、固定化時の油脂の物性変化がほとんどないことから好ましい。
なお、本発明の油脂のエステル交換油脂を使用するに際しては、上記原料油脂の水分を常法により、１００〜１０００ｐｐｍに調整することが好ましく、より好ましくは２００〜５００ｐｐｍに調整する。１００ｐｐｍ未満であると、固定化率が低下してしまう問題があり、１０００ｐｐｍを超えると大きなダマが生成しやすくなり、その場合、エステル交換活性が大きく低下してしまう問題がある。
【００２９】
なお、本発明の固定化リパーゼの製造方法で使用するシリカの粒度や、珪藻土の粒度、シリカと珪藻土の比率は上述のとおりである。
【００３０】
本発明の固定化リパーゼの製造方法では、リパーゼ粉末１重量部に対し、シリカ及び珪藻土を合計して１〜１９重量部の割合で添加することが好ましく、より好ましくは２．３〜１９重量部である。１重量部未満であると、リパーゼの脱離が起こりやすくなるという問題があり、１９重量部を超えると相対的に酵素含量が減ってしまい、得られる固定化リパーゼの活性が低下してしまうため好ましくない。
【００３１】
また、本発明の固定化リパーゼの製造方法では、油脂１００重量部に対し、リパーゼ粉末、シリカ及び珪藻土を合計して０．５〜３０重量部の割合で添加することが好ましく、より好ましくは１〜２５重量部である。０．５重量部未満であると、固定化に長時間を要するため好ましくなく、３０重量部を超えると、流動性が低下し、固定化率が低下しやすくなるため好ましくない。
【００３２】
以下、具体的な好ましい製造方法を述べる。
まず水分含有量を好ましくは１００〜１０００ｐｐｍに調整した油脂を加温し、溶解する。もちろん液状油を使用した場合は特に加温する必要はない。次いで、リパーゼ粉末、シリカ及び珪藻土を添加し、分散させ、パドル式撹拌機等を用いて好ましくは５０〜１０００ｒｐｍ、より好ましくは１００〜５００ｒｐｍで、好ましくは３０〜２００分撹拌する。
【００３３】
なお、本発明の固定化リパーゼの製造方法では、一度に上記リパーゼ粉末、シリカ及び珪藻土を添加、撹拌してもよいが、製造中のだまの発生を防止することが可能である点、及び、短時間で固定化酵素を得ることが可能な点で、まず、粉末リパーゼを添加、分散、撹拌した後、さらに、シリカ及び珪藻土を添加し、さらに撹拌する方法を採ることが好ましい。
【００３４】
この方法を採る場合、リパーゼ粉末を添加してからの撹拌は、好ましくはパドル式撹拌機、ホモミキサー等を用い、好ましくは５０〜１００００ｒｐｍ、より好ましくは１００〜５０００ｒｐｍで、好ましくは２０〜１８０分撹拌する。この撹拌により、リパーゼ粉末は微細化し、油脂中に均一に分散する。次にシリカ及び珪藻土を添加、分散した後、好ましくはパドル式撹拌機等を用い、好ましくは５０〜１０００ｒｐｍ、より好ましくは１００〜５００ｒｐｍで、好ましくは１０〜１８０分撹拌する。この撹拌により、先の撹拌により微細化し、均一に分散したリパーゼ粉末が、シリカ及び珪藻土に効率よく固定化され、遊離した微細なリパーゼ粉末が消失する。
【００３５】
なお、固定化の完了を知るには、リパーゼ粉末を、油脂中で分散、撹拌した際の粒度分布（個数基準）をあらかじめ測定しておき、担体を添加、分散、撹拌後の粒度分布と比較し、粉末リパーゼに由来する微細粉末、特に粒径０．４５μｍ未満の微粒子が消失していることをもって簡単に確認することができる。なお、油脂中の粒度分布は、レーザー式粒度分布測定器などを用いて簡単に測定することができる。
【００３６】
次に、密閉型加圧濾過、膜分離、遠心分離、有機溶媒による洗浄等の公知の方法で、油脂を濾別し、固定化リパーゼを得る。
なお、得られた固定化リパーゼは必要に応じ、乾燥してもよい。
【００３７】
上記のようにして得られた固定化リパーゼは、従来の固定化リパーゼとリパーゼ粉末の中間の粒度分布を示すため、従来の固定化リパーゼに比べ、固定化時の活性の損失が少ないため、エステル交換活性が高く、また、粉末リパーゼに比べ、反応・回収・再使用時の損失がなく、長期にわたってエステル交換活性を高く保持することができる。
さらに油脂中に分散して製造する本発明の固定化リパーゼの製造方法で得られた固定化リパーゼは、油脂中で製造されたものであるため、水分含量が極めて低く、そのため、水分が多いと反応が困難である、油脂のエステル交換反応に特に好ましく使用することができる。
【００３８】
次に、本発明の油脂のエステル交換方法について述べる。
本発明の油脂のエステル交換方法は、本発明の固定化リパーゼを使用するものであり、高いエステル交換活性を有し、且つ反応・回収・再使用時の損失がなく、長期にわたってエステル交換活性を高く保持することができるという特徴を有する。特に、本発明の製造方法によって得られた固定化リパーゼを使用する場合は、固定化リパーゼの乾燥の工程を必要とせず、ただちにエステル交換反応に用いることができる点でより好ましいものである。
【００３９】
なお、本発明の油脂のエステル交換方法は、連続反応または回分反応のどちらでも問題なく使用できる。
連続反応の場合、カラム等に本発明の固定化リパーゼを充填し、原料油脂を通液するだけでよくプロセスが簡略であるという利点を有する。原料油脂の通液速度はエステル交換油の反応率を測定しながら、随時所望の反応率が得られるよう調整する。
回分反応の場合、本発明の固定化リパーゼ分散原料油脂を、タンク中で回分反応を行なうものである。温度条件は好ましくは２０〜８０℃、より好ましくは４０〜７０℃、さらに好ましくは５０〜６０℃であり、反応時間は好ましくは５分〜２４時間である。また、反応は好ましくは窒素雰囲気下で行なう。
【００４０】
なお、本発明の油脂のエステル交換方法において、本発明の固定化リパーゼに加え、粉末のリパーゼや本発明の固定化リパーゼ以外の固定化リパーゼなどのその他のリパーゼを併用することを除外するものではないが、エステル交換活性が高く、長期にわたってそのエステル交換活性を保持するためには、その他のリパーゼの使用量は、好ましくは５０質量％以下とすることが好ましく、より好ましくは２０質量％以下、さらに好ましくは１０質量％以下、最も好ましくは使用しないことである。
【００４１】
そして、回分反応の場合、濾過終了後、定法により固定化リパーゼを濾別して再利用する。また、回分反応で得られた濾過液や、連続反応で得られた通液は定法により精製処理してエステル交換油脂を得る。
そして上記のエステル交換反応を繰り返すことで、長期にわたって高いエステル交換活性を保持したままの状態とすることができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等制限されるものではない。なお、例中に示す％は、特に記載がない限り質量％を意味する。
【００４３】
〔実施例１〕
２００ｍｌの４つ口フラスコにパームオレインのエステル交換油脂（水分５００ｐｐｍに調整）５０ｇとアルカリゲネス属由来の粉末リパーゼ（リパーゼＱＬＭ：名糖産業（株）製、至適ｐＨ７〜９、）１ｇを添加、分散し、６０℃、２０分間、窒素雰囲気下でパドル式撹拌機を用いて撹拌した。ここで原料油脂中に存在する粒子の粒径を、（株）島津製作所製レーザー式粒度分布計により測定したところ、粒径１〜１００μmの粒子が８５％（体積基準）、粒径０．２０〜０．４５μmの粒子が８５％（個数基準）であった。シリカ（Silopute２０２：富士シリシア化学製、ｐＨ７．６、粒径１〜１００μmの粒子が９９％（体積基準）、粒径0.45μm以下の粒子は0%（個数基準））３ｇ、及び、珪藻土（Celite Standard super-cel：Celite社製、粒径１〜１００μmの粒子が９８％（体積基準）、粒径0.45μm以下は0%（個数基準））６ｇを添加、分散し、２時間撹拌した。ここで油脂中に存在する粒子の粒径を、再度測定し、固定化率を次式により求め、その結果を表１に記載した。
【００４４】
固定化率（％）＝〔（固定化前の０．４５μm以下の粒子個数％−固定化後の０．４５μm以下の粒子個数％）／（固定化前の０．４５μm以下の粒子個数％−シリカ及び珪藻土由来の０．４５μm以下の粒子個数％）〕×１００
【００４５】
次に、加圧密閉型濾過機（加圧ヌッチェ機・ＩＨＩ製：３６０メッシュ金網使用）により濾過を行い固定化リパーゼを得た。
２０００ｍｌの４つ口フラスコにパームオレイン１０００ｇ（水分３００ｐｐｍ）、上記で得られた固定化リパーゼを添加し、撹拌羽根を用いて６０℃、３００ｒｐｍ、窒素雰囲気下で回分反応を行った。
反応生成物については、ＧＬＣでトリパルミチン含量を測定し、下記に示す式で反応率を求めた。
【００４６】
反応率＝（反応生成物のトリパルミチン含量−原料油脂のトリパルミチン含量）／（反応平衡組成物のトリパルミチン含量−原料油脂のトリパルミチン含量）
【００４７】
次いで、反応時間を横軸に、ｌｎ〔１／（１−反応率）〕を縦軸にプロットし、原点を通る一次近似式を設定して、１時間あたりのｌｎ〔１／（１−反応率）〕を読み取り、エステル交換活性能ａとした。
【００４８】
このエステル交換活性能ａと、Ｘ＝油脂１０００ｇに対する固定化リパーゼの添加量（％）及び、Ｙ＝粉末リパーゼ使用量／（粉末リパーゼ＋シリカ＋珪藻土の合計使用量）から下記に示す式で算出した値を、エステル交換初期活性値（固定化に使用した単位粉末リパーゼ重量を基準とした）とし、表１に記載した。
エステル交換初期活性値＝〔ａ／Ｘ／Ｙ〕×１００
【００４９】
さらに、固定化時の活性損失率（％）については、下記の式で算出した。
固定化時の活性損失率（％）＝１−（エステル交換初期活性値／比較例４のエステル交換初期活性値）
【００５０】
反応率が０．９以上になったところで、反応を終了し、加圧密閉型濾過機（加圧ヌッチェ機・ＩＨＩ製：３６０メッシュ金網使用）を使用して固定化リパーゼを回収し、その濾過液中の残存リパーゼ活性から活性回収率を算出し、表１に記載した。
次いで、回収した固定化リパーゼの全量を、１０００ｇの新たな原料油脂中に添加、分散し、２０００ｍｌの４つ口フラスコに再び投入し、上記同様の条件でエステル交換反応を再度行なった。
【００５１】
同一の操作を、エステル交換活性値が１／４となるまで繰り返し、その間に生産することができたエステル交換油の総生産量（ｋｇ）を、固定化時に投入した粉末リパーゼ量（ｇ）で除し、エステル交換活性値が１／４となるまでの期間における固定化時に使用した粉末リパーゼ１ｇあたりのエステル交換油の生産量（ｋｇ）を、エステル交換油脂の生産性の指標とし、表１に記載した。
【００５２】
〔実施例２〕
実施例１におけるシリカをSilopute３０３（富士シリシア化学製、ｐＨ７．５  粒径粒子の９９％が１〜１００μmの粒子が９９％（体積基準）、粒径0.45μm以下の粒子は0%(個数基準)）２ｇに変更し、及び、珪藻土をCelpure S300 （アドバンスドミネラルズ社製、粒径１〜１００μmの粒子が９８％（体積基準）、粒径0.45μm以下は0%（個数基準））２ｇに変更した他は実施例１と同様にして固定化操作、及び、エステル交換反応を行なった。
なお、粒径は実施例１と同一の方法で測定し、固定化率、エステル交換初期活性値、リパーゼ活性回収率、エステル交換活性値が１／４となるまでの期間における固定化時に使用した粉末リパーゼ１ｇあたりのエステル交換油の生産量は実施例１と同一の方法で算出し、それぞれ結果を表１に記載した。
【００５３】
〔比較例１〕
シリカを無添加とした以外は実施例２と同様にして固定化操作、及び、エステル交換反応を行なった。
なお、粒径は実施例１と同一の方法で測定し、固定化率、エステル交換初期活性値、リパーゼ活性回収率、エステル交換活性値が１／４となるまでの期間における固定化時に使用した粉末リパーゼ１ｇあたりのエステル交換油の生産量は実施例１と同一の方法で算出し、それぞれ結果を表１に記載した。
【００５４】
〔比較例２〕
珪藻土を無添加とした以外は実施例２と同様にして固定化操作、及び、エステル交換反応を行なった
なお、粒径は実施例１と同一の方法で測定し、固定化率、エステル交換初期活性値、リパーゼ活性回収率、エステル交換活性値が１／４となるまでの期間における固定化時に使用した粉末リパーゼ１ｇあたりのエステル交換油の生産量は実施例１と同一の方法で算出し、それぞれ結果を表１に記載した。
【００５５】
〔比較例３〕
固定化操作時に水を対油５％添加した以外は実施例２と同様にして固定化操作を行った後、実施例２同様にしてエステル交換反応を行なった。
固定化操作終了時、実施例１と同様の方法で、粒度を測定したところ、粒径１００μｍ以上の粒子含量が３４％（体積基準）であり、得られた固定化リパーゼは粒度が大きいものであった。
なお、固定化率、エステル交換初期活性値、リパーゼ活性回収率、エステル交換活性値が１／４となるまでの期間における固定化時に使用した粉末リパーゼ１ｇあたりのエステル交換油の生産量は実施例１と同一の方法で算出し、それぞれ結果を表１に記載した。
【００５６】
〔比較例４〕
２０００ｍｌの４つ口フラスコにパームオレイン（水分５００ｐｐｍに調整）５０ｇとアルカリゲネス属由来の粉末リパーゼ（リパーゼＱＬＭ：名糖産業（株）製、至適ｐＨ７〜９、）１ｇを入れ、パドル式撹拌機を用いて６０℃、３００ｒｐｍ、窒素雰囲気下で回分反応を行なった。
なお、固定化率、エステル交換初期活性値、リパーゼ活性回収率、エステル交換活性値が１／４となるまでの期間における固定化時に使用した粉末リパーゼ１ｇあたりのエステル交換油の生産量は実施例１と同一の方法で算出し、それぞれ結果を表１に記載した。
ここで、エステル交換初期活性値の計算式におけるＸ＝油脂１０００ｇに対する粉末リパーゼの添加量、Ｙ＝１として算出した。
【００５７】
〔実施例３〕
実施例２にて得られた固定化リパーゼをステンレス製カラムに充填し、６０℃でパームオレイン（水分５００ｐｐｍに調整）を反応率が０．９以上となる速度ｖ（ｇ／ｈ）で通液し、エステル交換を行った。
エステル交換初期活性値は、次式により求めた。
【００５８】
エステル交換初期活性値＝ｌｎ〔１／（１−反応率）〕×〔ｖ／ｘ／ｙ〕×１００
ｘ：固定化リパーゼ使用量
ｙ：固定化リパーゼ調整に供した粉末リパーゼの割合＝粉末リパーゼ使用量／（粉末  
リパーゼ使用量＋担体使用量）
また、リパーゼ活性回収率は、反応油中の残存リパーゼ活性から算出した。
なお、エステル交換活性値が１／４となるまでの期間における固定化時に使用した粉末リパーゼ１ｇあたりのエステル交換油の生産量は実施例１と同一の方法で算出し、それぞれ結果を表１に記載した。
【００５９】
【表１】
2008043274.tif 000002
【００６０】
上記表１に示す結果から、シリカ及び珪藻土を含有し、粒径１〜１００μｍの粒子が９０％以上(体積基準）であり、且つ、粒径０．４５μm以下の粒子が１％以下（個数基準）である固定化リパーゼは、固定化によるリパーゼ活性の損失が少なく（固定化時の活性損失率参照）、また、該固定化リパーゼを使用して油脂のエステル交換反応を行なうと、エステル交換活性が高く（固定化リパーゼの初期活性値参照）、反応・回収・再使用時の損失がなく（固定化リパーゼの活性回収率参照）、長期にわたってエステル交換活性を高く保持することができるため、生産性が極めて高いことがわかる。（固定化リパーゼのエステル交換油生産量参照）
【００６１】
それに対し、水分を多く添加した油脂を使用したため粒子径の大きな固定化リパーゼとなってしまった比較例３の固定化リパーゼは、固定化によるリパーゼ活性の損失が大きく、また、該固定化リパーゼを使用して油脂のエステル交換反応を行なうと、エステル交換活性が極めて低く、そのため、生産性も極めて低くなってしまうことがわかる。
【００６２】
また、固定化に際し珪藻土のみ使用した場合（比較例１）、又は、シリカのみを使用した場合（比較例２）、固定化リパーゼが得られず、そのため、濾過して得たリパーゼと担体の混合物を使用してエステル交換を行なうと、粉末リパーゼのみを用いてエステル交換を行なう場合（比較例４）と同様、初期のエステル交換活性は高いものの、反応・回収・再使用時の損失が大きいため、長期にわたってエステル交換活性を高く保持することができず、生産性は低くなってしまうことがわかる。