(57)【要約】      （修正有）【課題】  ウイルスに対し、強い吸着阻害活性、感染阻害活性を有し、かつ安価に製造される抗ウイルス剤を提供する。【解決手段】シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン含有人工ポリペプチドのシアロ糖鎖部を改変した、シアリル−ポリＮ−アセチルラクトサミン含有人工ポリペプチド、シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン含有人工ポリペプチドの骨格であるαポリグルタミン酸を天然物で安価なγポリグルタミン酸に変更し、かつリンカー部を変更したシアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチド、シアロ糖鎖部をシアリル−ポリＮ−アセチルラクトサミンに変換したシアリル−ポリＮ−アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表され、γ−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマーを有効成分とする抗ウイルス剤。
【化１】
2008031156.tif 000018
（Ｉ）
2008031156.tif 000019
（ＩＩ）
（式（Ｉ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＩ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＩＩ）中、Ｙ１及びＹ２は水酸基又はＮ−アセチルノイラミン酸残基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒは炭化水素又はオリゴ糖、ｎは１０以上の整数を示す。ただし、Ｙ１とＹ２は同一ではない。）
【請求項２】
Ｒで表されるオリゴ糖が、下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）である、請求項１記載の抗ウイルス剤。
【化２】
2008031156.tif 000020
（ＩＩＩ）
2008031156.tif 000021
（ＩＶ）
（式中、Ｌは炭化水素、Ｘ１及びＸ２は水酸基又はアセチルアミノ基を示す。ただし、Ｘ１とＸ２は同一であっても相違していてもよい）
【請求項３】
下記式（Ｖ）で表され、α−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマーを有効成分とする抗ウイルス剤。
【化３】
2008031156.tif 000022
（Ｖ）
2008031156.tif 000023
（ＩＩ´）
（式（Ｖ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＩ´）で表されるシアロ糖鎖部であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＩＩ´）中、Ｙ１及びＹ２は水酸基又はＮ−アセチルノイラミン酸残基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒ’はオリゴ糖を示す。ただし、Ｙ１とＹ２は同一ではない。）
【請求項４】
Ｒ’で表されるオリゴ糖が、下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）である、請求項３記載の抗ウイルス剤。
【化２】
2008031156.tif 000024
（ＩＩＩ）
2008031156.tif 000025
（ＩＶ）
（式中、Ｌは炭化水素、Ｘ１及びＸ２は水酸基又はアセチルアミノ基を示す。ただし、Ｘ１とＸ２は同一であっても相違していてもよい）
【請求項５】
抗インフルエンザウイルス剤である、請求項１〜４いずれか１項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項６】
分子量が２００〜５００万である請求項１〜５いずれか１項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項７】
グルタミン酸単位重合度が１０〜１０，０００である請求項１〜６いずれか１項に記載
の抗ウイルス剤。
【請求項８】
グルタミン酸残基に対するシアロ糖鎖の導入率が１０〜８０％である請求項１〜７いず
れか１項に記載抗ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シアロ糖鎖含有ポリマーを有効成分として含有する抗ウイルス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、有効な治療法や感染防御法が見出されていない病原体の一つである。インフルエンザウイルスは、極めて感染性が強く、抗原変異を繰り返し、それまでの抗原性とは異なる新種が出現するため、ワクチンなどによる効果的な防御対策が立てにくい問題がある。
【０００３】
最近では、トリインフルエンザウイルスを起源とした新たなヒトインフルエンザウイルスの発生が危惧されており、インフルエンザ予防・治療薬の開発が期待されている。
【０００４】
インフルエンザウイルスの宿主細胞への感染は、ウイルス表面蛋白質であるヘマグルチニン（赤血球凝集素：ＨＡ）が細胞表面のシアル酸含有複合糖鎖を受容体として認識して結合することによると考えられている。たとえば、トリ類から単離したインフルエンザウイルスＡ型は末端にＮ−アセチルノイラミン酸α２，３ガラクトース（ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ）を有する糖鎖に優先的に結合するが、このウイルスと非常に類似したヒトインフルエンザウイルスは末端のＮｅｕＡｃ(α２，６)Ｇａｌ構造に高い結合親和性を示すことが報告されている。
【０００５】
インフルエンザウイルスには変異により種々の亜型が存在するため、より有効な抗インフルエンザウイルス剤としてはウイルスの亜型に関係なく広く受容体の結合を阻害する抗インフルエンザウイルス剤の開発が望まれている。このような状況下、たとえば、シアル酸含有糖鎖（シアロ糖鎖）化合物が、インフルエンザウイルス感染の最初のステップであるウイルス受容体への結合を阻害する感染阻害剤として機能しうることが期待される。
【０００６】
具体的には、赤血球凝集阻止活性を指標としたインフルエンザウイルスの付着阻止実験が種々のシアロ糖鎖化合物において行われたものの、ウイルスの付着阻止活性が低かったり、あるいはシアロ糖鎖化合物の合成法が複雑で実用的でないなどの理由から、シアロ糖鎖化合物を有効成分とするインフルエンザウイルスの感染阻害剤は未だに開発されていない（非特許文献１、非特許文献２、特許文献１、特許文献２、特許文献３）。
【０００７】
その中で、小林らは、Ａ型インフルエンザウイルスのレセプターであるシアリルラクトース（ＮｅｕＡｃ（α２，６又はα２，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ）は、インフルエンザウイルスに対する付着阻止効果は低いが、ポリスチレン誘導体にシアリルラクトースを結合させた高分子体が、インフルエンザウイルスと強い結合能を有することを見出した（特許文献４）。しかし、当該高分子体は、シアリルラクトースを乳から調製しなければならないといった製造上の問題があり、到底実用的な化合物と言えるものではなかった。
【０００８】
また、戸谷らは、α−ポリグルタミン酸を骨格としてＮ−アセチルラクトサミンをαポリグルタミン酸の側鎖にｐ−アミノフェニル基をリンカーとして導入し、さらにオリゴ糖鎖の非還元末端にシアル酸を付与した、分子量２０００〜１００万のシアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチドを合成し、この化合物が広範囲なインフルエンザウイルス分離株に対し感染阻害活性を有することを見出した（特許文献５、非特許文献３）。
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒ，１２５９−１２６０（１９９９）
【非特許文献２】Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ. J., ７，３４９−３５９（１９９０）
【非特許文献３】Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３，３１５−３２６ (２００３)
【特許文献１】特表２００２−５１４１８６
【特許文献２】特表２００３−５３５９６５
【特許文献３】ＷＯ２００３／０７４５７０
【特許文献４】特開平１０−３１０６１０
【特許文献５】特開２００３-７３３９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチドのインフルエンザウイルスに対する感染阻害活性は、必ずしも高いものとは言えず、また、ポリペプチドの原料であるαポリグルタミン酸やＮ-アセチルグルコサミン誘導体（Ｐ-ニトロフェニル配糖体）などが高価な上、製造法も煩雑であるという問題が指摘されていた。
【００１１】
このため、インフルエンザウイルスに対し、吸着阻害活性、感染阻害活性などの強い抗ウイルス活性を有し、かつ安価な製造コストで製造されうる新規人工シアロ糖鎖ポリマーの開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、（１）戸谷らのシアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン含有人工ポリペプチドのシアロ糖鎖部を改変し、シアリル−ポリＮ−アセチルラクトサミン含有人工ポリペプチドとすることで、これまでの数十から数百倍のインフルエンザ感染阻害活性を有すること、（２）シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン含有人工ポリペプチドの骨格であるαポリグルタミン酸を天然物で安価なγポリグルタミン酸に変更し、かつリンカー部を変更したシアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチドが高いインフルエンザウイルス感染阻害活性を有すること、（３）そのシアロ糖鎖部をシアリル−ポリＮ−アセチルラクトサミンに変換したシアリル−ポリＮ−アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチドは、さらに高いインフルエンザウイルス感染阻害活性があること、及び（４）そのシアロ糖鎖部をシアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンの還元末端とリンカー部の間にラクトースを導入したシアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン−ラクトース含有人工糖鎖ポリペプチドにも高いインフルエンザウイルス感染阻害活性を有することを見出し、本発明を完成させた。従って、本発明は以下の通りである。
【００１３】
〔１〕式（Ｉ）で表され、γ−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマーを有効成分とする抗ウイルス剤。
【化１】
2008031156.tif 000002
（Ｉ）
2008031156.tif 000003
（ＩＩ）
（式（Ｉ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＩ）で表されるシアロ糖鎖部であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＩＩ）中、Ｙ１及びＹ２は水酸基又はＮ−アセチルノイラミン酸残基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒは炭化水素又はオリゴ糖を示す。ただし、Ｙ１とＹ２は同一ではない。）
【００１４】
〔２〕Ｒで表されるオリゴ糖が、下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）である、上記〔１〕記載の抗ウイルス剤。
【化２】
2008031156.tif 000004
（ＩＩＩ）
2008031156.tif 000005
（ＩＶ）
（式中、Ｌは炭化水素、Ｘ１及びＸ２は水酸基又はアセチルアミノ基を示す。ただし、Ｘ１とＸ２は同一であっても相違していてもよい）
【００１５】
〔３〕式（Ｖ）で表され、α−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマーを有効成分とする抗ウイルス剤。
【化３】
2008031156.tif 000006
（Ｖ）
2008031156.tif 000007
（ＩＩ´）
（式（Ｖ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＩ´）で示されるシアロ糖鎖部であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＩＩ´）中、Ｙ１及びＹ２は水酸基又はＮ−アセチルノイラミン酸残基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒ’はオリゴ糖を示す。ただし、Ｙ１とＹ２は同一ではない。）
【００１６】
〔４〕Ｒ’で表されるオリゴ糖が、下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）である、上記〔３〕記載の抗ウイルス剤。
【化２】
2008031156.tif 000008
（ＩＩＩ）
2008031156.tif 000009
（ＩＶ）
（式中、Ｌは炭化水素、Ｘ１及びＸ２は水酸基又はアセチルアミノ基を示す。ただし、Ｘ１とＸ２は同一でも相違していてもよい）
【００１７】
〔５〕抗インフルエンザウイルス剤である、上記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の抗ウイルス剤。
〔６〕分子量が２００〜５００万である上記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載の抗ウイルス剤。
〔７〕グルタミン酸単位重合度が１０〜１０，０００である上記〔１〕〜〔６〕いずれか１項に記載
の抗ウイルス剤。
〔８〕グルタミン酸残基に対するシアロ糖鎖の導入率が１０〜８０％である上記〔１〕〜〔７〕いずれか１項に記載抗ウイルス剤。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、従来のシアロ糖鎖含有ポリペプチドのシアロ糖鎖部及びポリペプチド部のどちらか一部、もしくは両部を改変した化合物を有効成分とすることで、従来のシアロ糖鎖含有ポリペプチドの数十から数百倍のインフルエンザウイルス感染阻害活性を示す抗ウイルス剤を提供する。特に、本発明の有効成分の中で、γ−ポリグルタミン酸をポリペプチド部とするシアロ糖鎖含有ポリマーは、安価な原料から製造可能であり、安定な供給も可能である。
【００１９】
このため、本発明の抗ウイルス剤は、インフルエンザウイルスの感染やインフルエンザの流行を防止する様々な手段・場所において適用可能である。具体的には、インフルエンザイウイルスの感染の予防・治療のための抗ウイルス剤としての点鼻薬、口腔スプレーなどへの適用はもとより、フィルターへ充填することによる空気中からのインフルエンザウイルス除去、マスクへ充填することによるウイルスの拡散防止や感染予防などにも利用でき、その適用範囲は極めて広い。
【００２０】
さらに、糖鎖部の非還元末端のシアル酸の付与をα２，６型とすれば、ヒト感染型のインフルエンザウイルスに対する感染阻害のための抗ウイルス剤として利用でき、糖鎖部の非還元末端のシアル酸の付与をα２，３型とすれば、トリ感染型のインフルエンザウイルスに対する感染阻害のための抗ウイルス剤としての利用でき、また、α２，６型とα２，３型とを混合して使用することで、トリ感染型からヒト感染型への変異にも対応可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の抗ウイルス剤の有効成分は、下記（Ｉ）又は（Ｖ）で表されるシアロ糖鎖含有ポリマー化合物である。ただし式（Ｉ）及び（Ｖ）中、Ｚは、水酸基又は式（ＩＩ）若しくは式（ＩＩ´）で表されるシアロ糖鎖部であり、ｎは１０以上の整数を示す。シアロ糖鎖含有ポリマー中、シアロ糖鎖置換グルタミン酸残基と未置換グルタミン酸残基とは、任意の比率で混在し、その比率は糖残基置換度（Ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ（ＤＳ））で表す。
【００２２】
【化１】
2008031156.tif 000010
（Ｉ）
2008031156.tif 000011
（ＩＩ）
【化３】
2008031156.tif 000012
（Ｖ）
2008031156.tif 000013
（ＩＩ´）
【００２３】
式（Ｉ）又は式（Ｖ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＩ）若しくは（ＩＩ´）で表されるシアロ糖鎖部であり、Ｚが水酸基の場合は未置換グルタミン酸残基、式（ＩＩ）若しくは式（ＩＩ´）で表されるシアロ酸糖鎖部であればシアロ糖鎖置換グルタミン酸残基である。式（Ｉ）又は式（Ｖ）に示すように、ポリグルタミン酸ポリマー中のシアロ糖鎖置換グルタミンの数及び位置は特に限定されない。
【００２４】
また、式（ＩＩ）又は式（ＩＩ´）中、Ｙ１及びＹ２は水酸基又はＮ−アセチルノイラミン酸残基を示す。ただし、Ｙ１とＹ２は同一ではなく、一方が水酸基であれば、他方はＮ−アセチルノイラミン酸残基である。具体的に、Ｙ１がＮ−アセチルノイラミン酸残基でＹ２が水酸基であるα２，６型とすれば、ヒト感染型のインフルエンザウイルスに対する感染阻害のための抗ウイルス剤となり、Ｙ１が水酸基でＹ２がＮ−アセチルノイラミン酸残基であるα２，３型とすれば、トリ感染型のインフルエンザウイルスに対する感染阻害のための抗ウイルス剤とすることができる。なお、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基は、その水酸基、カルボキシル基およびアミド基が、同一または別異にハロゲン基、アルキル基、アシル基等で化学的に修飾されていてもかまわない。
【００２５】
式中、Ｒで表される炭化水素としては、炭素数１〜２０のものが好ましく、飽和炭化水素基及び不飽和炭化水素基のいずれでもよく、具体的にはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基等が挙げられる。
【００２６】
ここで、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基としては、炭素数１〜２０の直鎖又は分枝鎖のものが挙げられる。アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基等の直鎖アルキル基；イソプロピル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、２−エチルヘキシル基等の分枝鎖アルキル基が挙げられる。
【００２７】
アルケニル基の具体例としてはビニル基、プロペニル基、アリル基等が挙げられる。アルキニル基の具体例としては、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基などが挙げられる。シクロアルキル基としては、炭素数３〜１０のものが挙げられ、特に炭素数３〜８のもの、例えばシクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が好ましい。
【００２８】
アリール基としては炭素数６〜１４のもの、例えばフェニル基、トリル基、ナフチル基等が挙げられる。アラルキル基としては、炭素数７〜１４のアラルキル基、具体的にはベンジル基、フェネチル基などが挙げられる。シクロアルキル置換アルキル基としてはＣ３−Ｃ８シクロアルキル置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、例えばシクロプロピルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、シクロプロピルエチル基、シクロペンチルエチル基、シクロヘキシルエチル基、シクロプロピルプロピル基、シクロペンチルプロピル基、シクロヘキシルプロピル基等が挙げられる。
【００２９】
また、当該炭化水素は置換基を有していても良く、そのような置換基としては、ヒドロキシル基、アジド基、シアノ基、アルコキシ基、シクロアルキルオキシ基、アリールオキシ基、エステル化されていてもよいカルボキシル基等が挙げられる。
【００３０】
式中、Ｒ又はＲ’で表されるオリゴ糖としては、二糖〜六糖からなるオリゴ糖を指し、具体的には、下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）で表されるものを例示することができる。
【化２】
2008031156.tif 000014
（ＩＩＩ）
2008031156.tif 000015
（ＩＶ）
（式中、Ｌは炭化水素、Ｘ１及びＸ２は水酸基又はアセチルアミノ基を示す。ただし、Ｘ１とＸ２は同一であっても相違していてもよい）
【００３１】
上記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）におけるＸ及びＬは上記定義の通りであり、Ｌで表される炭化水素としては、Ｒの炭化水素と同じものを例示することができる。
【００３２】
本発明の有効成分であるシアロ糖鎖含有ポリマーは、塩型、遊離酸型のいずれであってもよく、塩型としては、例えは、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）；アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等）；有機塩基塩（例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩等）等が挙げられる。また、水和物あるいはアルコール等との溶媒和物であってもよい。
【００３３】
また、本発明の有効成分であるシアロ糖鎖含有ポリマーの分子量は、例えば、２０００〜５００万の範囲であり、グルタミン酸単位重合度（ｎ）は、例えば、１０〜１００００、好ましくは１００〜６０００の範囲であり、グルタミン酸残基に対するシアリルオリゴ糖の導入率である糖残基置換度（ＤＳ）は、１０〜８０％、好ましくは３０〜７０％の範囲である。
【００３４】
このような本発明の有効成分の中で、好ましいものとしては、以下の条件にあてはまるものを挙げることができる。
（ａ）式（Ｉ）に属する化合物。
（ｂ）式（Ｉ）に属する化合物で、Ｒがアミノアルキルである化合物。
（ｃ）式（Ｉ）に属する化合物で、Ｒがアミノアルキルで、Ｙ１がＮ−アセチルノイラミン酸残基でＹ２が水酸基である化合物。
（ｄ）式（Ｉ）に属する化合物で、Ｒがアミノアルキルで、Ｙ１がＮ−アセチルノイラミン酸残基で、Ｙ２が水酸基で、Ｘがアセチルアミノである化合物。
【００３５】
（ｅ）式（Ｉ）に属する化合物で、Ｒが式（ＩＩＩ）のオリゴ糖である化合物。
（ｆ）式（Ｉ）に属する化合物で、Ｒが式（ＩＩＩ）のオリゴ糖で、Ｙ１がＮ−アセチルノイラミン酸残基でＹ２が水酸基である化合物。
（ｇ）式（Ｉ）に属する化合物で、Ｒが式（ＩＩＩ）のオリゴ糖で、Ｙ１がＮ−アセチルノイラミン酸残基で、Ｙ２が水酸基で、Ｘ及びＸ１がアセチルアミノである化合物。
（ｈ）式（Ｉ）に属する化合物で、Ｒが式（ＩＩＩ）のオリゴ糖で、Ｙ１がＮ−アセチルノイラミン酸残基で、Ｙ２が水酸基で、Ｘがアセチルアミノで、Ｘ１が水酸基である化合物。
【００３６】
（ｉ）式（Ｉ）に属する化合物で、Ｒが式（ＩＶ）のオリゴ糖である化合物。
（ｊ）式（Ｉ）に属する化合物で、Ｒが式（ＩＶ）のオリゴ糖で、Ｙ１がＮ−アセチルノイラミン酸残基でＹ２が水酸基である化合物。
（ｋ）式（Ｉ）に属する化合物で、Ｒが式（ＩＶ）のオリゴ糖で、Ｙ１がＮ−アセチルノイラミン酸残基で、Ｙ２が水酸基で、Ｘ、Ｘ１及びＸ２がアセチルアミノである化合物。
（ｌ）式（Ｉ）に属する化合物で、Ｒが式（ＩＶ）のオリゴ糖で、Ｙ１がＮ−アセチルノイラミン酸残基で、Ｙ２が水酸基で、Ｘ及びＸ１がアセチルアミノで、Ｘ２が水酸基である化合物。
【００３７】
（ｍ）式（Ｖ）に属する化合物で、Ｒが式（ＩＩＩ）のオリゴ糖である化合物。
（ｎ）式（Ｖ）に属する化合物で、Ｒが式（ＩＩＩ）のオリゴ糖で、Ｙ１がＮ−アセチルノイラミン酸残基でＹ２が水酸基である化合物。
（ｏ）式（Ｖ）に属する化合物で、Ｒが式（ＩＩＩ）のオリゴ糖で、Ｙ１がＮ−アセチルノイラミン酸残基で、Ｙ２が水酸基で、Ｘ及びＸ１がアセチルアミノである化合物。
【００３８】
（ｐ）式（Ｖ）に属する化合物で、Ｒが式（ＩＶ）のオリゴ糖である化合物。
（ｑ）式（Ｖ）に属する化合物で、Ｒが式（ＩＶ）のオリゴ糖で、Ｙ１がＮ−アセチルノイラミン酸残基でＹ２が水酸基である化合物。
（ｒ）式（Ｖ）に属する化合物で、Ｒが式（ＩＶ）のオリゴ糖で、Ｙ１がＮ−アセチルノイラミン酸残基で、Ｙ２が水酸基で、Ｘ、Ｘ１及びＸ２がアセチルアミノである化合物。
【００３９】
本発明の有効成分として使用するシアロ糖鎖含有ポリマーは、アシアロ糖鎖を合成する工程１、アシアロ糖鎖とポリグルタミン酸を縮合する工程２、及びアシアロ糖鎖ポリマーのシアル化を行う工程３により調製することが可能である。工程１〜工程３について、以下、詳細に説明する。
【００４０】
（工程１）アシアロ糖鎖の合成
工程１は、糖受容体（たとえは、糖−パラニトロフェノール、５−アミノアルキル化糖など）と糖供与体である糖ヌクレオチド（たとえば、ウリジン５’−ジリン酸ガラクトース、ウリジン５’−ジリン酸Ｎ−アセチルグルコサミンなど）を含有する反応系に合目的性な糖転移酵素（たとえば、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼなど）を添加して、目的とするアシアロ糖鎖部を合成する工程である。
【００４１】
反応系に添加する糖転移酵素としては、目的とする酵素活性を有する限りどのような形態であってもよい。酵素調製の簡便さと共に調製効率を高めるため、該酵素遺伝子をクローン化し、微生物菌体内で大量発現させ、該酵素の大量調製を行う、いわゆるＤＮＡ組換え技術を用いた酵素生産により生産された酵素が最も都合がよい。
【００４２】
酵素標品としては具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示することができる。微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、３０〜５０℃で１０〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより、目的の酵素活性を有する微生物菌体を調製することができる。
【００４３】
微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
【００４４】
酵素調製物としては、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。
【００４５】
反応に使用する糖ヌクレオチドおよび糖受容体は、それぞれ市販の製品を使用することができる。使用濃度としては１〜２００ｍＭ、好ましくは５〜５０ｍＭの範囲から適宜設定できる。なお、糖受容体として５−アミノアルキル化糖を使用する場合には、後述実施例に示すように、セルラーゼの逆反応を利用して、糖類の水酸基をアルキルアミノ化することも可能である。
【００４６】
アシアロ糖鎖の合成は、上記の糖受容体及び糖ヌクレオチドを含有する反応系に、糖転移酵素を０．００１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは、０．０１〜１０ユニット／ｍｌ程度になるようにそれぞれ添加し、５〜５０℃、好ましくは１０〜４０℃で１〜１００時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
【００４７】
このようにして製造したアシアロ糖鎖は、オリゴ糖の通常の分離精製手段を用いればよく、例えば、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィーやイオン交換カラムクロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることで単離精製できる。
【００４８】
（工程２）アシアロ糖鎖とポリグルタミン酸の縮合
工程２は、工程１で合成したアシアロ糖鎖をポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に化学的に縮合する工程である。
【００４９】
工程１で、糖受容体としてｐ−ニトロフェニル基を有する糖受容体を使用した場合には、ニトロ基を還元してアミノ基へと変換後、糖受容体として５−アミノアルキル化糖を使用した場合には、アミノ基の保護基を常法により脱保護した後、トリエチルアミンやトリブチルアミンなどの塩基存在下、ポリグルタミン酸を縮合剤と処理して、アシアロ糖鎖含有ポリマーを製造する。
【００５０】
ｐ−ニトロフェニル基の還元反応に用いる条件としては、通常、芳香族ニトロ基の還元に適用する条件であればよく、具体例としては、水やメタノール、エタノールなどの有機溶媒中、水素あるいはギ酸アンモニウム、シクロヘキセンなどの水素供与剤存在下、パラジウム炭素と処理することで実施できる。
【００５１】
原料ポリマーとして用いるポリグルタミン酸は、α−型、γ−型のいずれであってもよい。
【００５２】
縮合工程は、ジメチルホルムアミドやジメチルスルホキシドなどの有機溶媒中で、原料ポリマーをトリエチルアミンやトリブチルアミンなどの塩基存在下、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニルやジスクシミジルカーボネート、カルボニルジイミダゾールなどのカルボキシル基の活性エステル化剤で処理した後、５−アミノアルキル化糖叉は上記還元反応の生成物と反応処理することで実施される。
【００５３】
５−アミノアルキル化糖又は上記還元反応の生成物の使用量は、目的とするシアロ糖鎖含有ポリマーの糖置換率に応じて添加すればよく、通常、ポリグルタミン酸のグルタミン酸単位に対して０．１当量以上あればよい。また、縮合反応に用いる塩基の使用量は、ポリグルタミン酸のグルタミン酸単位に対して１当量以上あればよい。
【００５４】
縮合反応は−１０℃〜１００℃で実施することができる。また、必要に応じて４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンや１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾールなどの一般的なアシル化反応の触媒を添加してもかまわない。
【００５５】
合成されたアシアロ糖鎖含有ポリマーの精製は、通常、タンパクの精製に用いる方法で行えばよく、例えば、透析やゲルろ過などを適宜組み合わせることで単離精製することができる。
【００５６】
（工程３）アシアロ糖鎖ポリマーのシアル化
工程３は、工程２で合成したアシアロ糖鎖ポリマーの糖鎖部の非還元末端を糖ヌクレオチドであるシチジン５’−モノリン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を基質としてシアル酸転移酵素を用いてシアル化する工程である。
【００５７】
シアル酸転移酵素としては、ヒト感染型のインフルエンザウイルスに対する感染阻害用ポリマーの製造のためにはα２，６−シアル酸転移酵素を、またトリ感染型のインフルエンザウイルス感染阻害用ポリマーの製造のためにはα２，３−シアル酸転移酵素を使用する。反応に使用するシアル酸転移酵素は、工程１と同様の方法で調製可能であり、また反応も工程１と同様の方法で実施できる。
【００５８】
合成されたシアロ糖鎖含有ポリマーの精製は、通常、タンパクの精製に用いる方法で行えばよく、例えば、透析やゲルろ過などを適宜組み合わせることで単離精製することができる。なお、上記した工程以外にも、あらかじめシアロ糖鎖を合成し、シアロ糖鎖とポリグルタミン酸を縮合することによりシアロ糖鎖含有ポリマーを調製することも可能である。
【００５９】
本発明の抗ウイルス剤は、ウイルス感染、ならびにウイルスの流行を防止する各種の手段に適用でき、例えば、医薬品はもとより、マスクや空気清浄機、エアコンなどのフィルターにおけるウイルス吸着剤としての利用もあげられる。
【００６０】
対象となるウイルスとしては、インフルエンザウイルスが好適なウイルスであり、具体的には、高病原性Ａ型トリインフルエンザウイルス、ヒトＡ型インフルエンザウイルスおよびヒトＢ型インフルエンザウイルス等が挙げられる。
【００６１】
また、有効成分として用いるシアロ糖鎖含有ポリマーに対応し、インフルエンザウイルス以外の様々なウイルスにも適用可能である。そのようなウイルスとしては、例えば、パラミクソウイルス群、パラインフルエンザウイルス群、ロタウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ポリオーマウイルス等が例示される。
【００６２】
本発明の抗ウイルス剤を医薬品として利用する場合、特にその剤型に制限されるものではないが、点鼻用の液剤及びゲル剤、口腔スプレーなどのエアロゾルなどの鼻腔や咽頭に直接適用する点鼻適用製剤、あるいは軟膏剤、乳剤及びクリーム剤などの経皮吸収用製剤が好ましい剤型として例示され、それらは常法により調製することができる。
【００６３】
たとえば、点鼻適用製剤としては、液剤、ゲル剤、懸濁剤、エアゾール剤等の剤形として用いることが好ましい。上記剤形を製造するための基剤成分について説明すると、液剤、ゲル剤、懸濁剤及びエアゾール剤を製造する場合の基剤成分としては、オクチルドデカノール等の高級アルコール；ミリスチン酸イソプロピル、アジピン酸ジイソプロピル及びパルミチン酸イソプロピル等の脂肪酸エステル；ポリソルベート８０及びポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の懸濁化剤；カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びヒアルロン酸ナトリウム等の高分子化合物；グリセリン、プロピレングリコール及び１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール；ジイソプロパノールアミン、水酸化ナトリウム、リン酸二水素カリウム及びリン酸水素ナトリウム等のｐＨ調節剤；リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム及びエデト酸ナトリウム等の安定化剤；メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウム等の防腐剤等が挙げられる。
【００６４】
液剤、ゲル剤、懸濁剤及びエアゾール剤を製造する場合、本発明の有効成分であるシアロ糖鎖含有ポリマー及び水等の媒体を混合して製造するが、その配合割合に特に制限はなく、たとえば水（媒体）５０〜９９重量％、高級アルコール０〜２５重量％、脂肪酸エステル０〜２０重量％、懸濁化剤０〜５重量％、高分子化合物０〜１０重量％、多価アルコール０〜３０重量％、ｐＨ調節剤０〜１０重量％、安定化剤０〜１０重量％及び防腐剤０〜５重量％である。
【００６５】
軟膏剤、乳剤及びクリーム剤を製造する場合の基剤成分としては、白色ワセリン、流動パラフィン、パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、スクワラン及びプラスチベース等の炭化水素；セタノール、ステアリルアルコール及びベヘニルアルコール等の高級アルコール；イソステアリン酸及びオレイン酸等の高級脂肪酸；中鎖脂肪酸トリグリセリド、ミリスチン酸イソプロピル、アジピン酸ジイソプロピル及びパルミチン酸イソプロピル等の脂肪酸エステル；ポリソルベート８０及びポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤；カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びヒアルロン酸ナトリウム等の高分子化合物；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール；ジイソプロパノールアミン、水酸化ナトリウム、リン酸二水素カリウム及びリン酸水素ナトリウム等のｐＨ調節剤；リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム及びエデト酸ナトリウム等の安定化剤；メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウム等の防腐剤等が挙げられる。
【００６６】
軟膏剤、乳剤及びクリーム剤を製造する場合、本発明の有効成分であるシアロ糖鎖含有ポリマー及び水等の媒体を混合して製造するが、その配合割合に特に制限はなく、たとえば水（媒体）０〜８０重量％、炭化水素０〜９０重量％、高級アルコール０〜２５重量％、高級脂肪酸０〜２５重量％、脂肪酸エステル０〜２０重量％、界面活性剤０．０１〜１０重量％、高分子化合物０〜１０重量％、多価アルコール０〜３０重量％、ｐＨ調節剤０〜１０重量％、安定化剤０〜１０重量％及び防腐剤０〜５重量％である。
【００６７】
また、本発明の抗ウイルス剤をウイルスの拡散防止や感染予防のためにフィルターやマスクへ充填して利用する場合、たとえば、本発明の抗ウイルス剤をシートに担持させることにより実施することができる。
【００６８】
用いられるシートとしては、合成繊維または天然繊維からなる不織布または織布で、材質としてはポリエステル、ポリアミド、ポリアクリル、ポリプロピレン、レーヨン、木綿、木材パルプ等が挙げられる。特にメルトブローン不織布は繊維径を細くでき、ポアサイズを小さくできることから、マスクや空気清浄機用並びにエアコン用フィルターとして好ましい。また、シートに有効成分であるシアロ糖鎖含有ポリマーを担持させる方法は任意であるが、たとえば接着剤を用いて担持させる方法を採用することができる。
【実施例】
【００６９】
つぎに、本発明の実施例（合成例、試験例、製剤例）について説明する。なお、本発明は、下記の実施例によって、なんら制限されない。
【００７０】
＜材料調製法および分析方法＞
（１）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
サンプルはすべて０．４５μｌのフィルター濾過した後、分析した。分析条件は下記に示したものを用いた。
カラム      ：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  Ｓｉ６０（φ４．６×２５０ｍｍ）
カラム温度  ：４０℃
流速        ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長    ：２１０ｎｍ
溶媒        ：９０％  ＣＨ３ＣＮ
あるいは、
カラム      ：ＹＭＣ  Ｐｒｏ  Ｃ１８ＲＳ（φ６．０×１５０ｍｍ）
カラム温度  ：４０℃
流速        ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長    ：３００ｎｍ
溶媒        ：２０％  ＭｅＯＨ−５０ｍＭ  ＴＥＡＡ
【００７１】
（２）核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）
分析機器：ＪＥＯＬ  ＥＸ−２７０  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ，
ＪＥＯＬ  ｌａｍｄａ  ５００ＦＴ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ−５００  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
外部標準：ＴＰＳ［ｓｏｄｉｕｍ３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ］
溶媒    ：Ｄ２Ｏ
温度    ：２５℃あるいは６０℃
サンプル管：φ３または５ｍｍ
【００７２】
（３）酵素の調製
（３−１）β１，４−ガラクトース転移酵素（β１，４−ＧａｌＴ）の調製
β１，４−ＧａｌＴの調製は、野口らの方法（特開２００２−３３５９８８）に記載されている発現プラスミドｐＴＧＦ−Ａを用いて行った。ｐＧＴＦ−Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地５０ｍｌに植菌し、３０℃で振とう培養した。４×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で１６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ，２０分）により菌体を回収し、５ｍｌの緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により菌体残さを除去し、得られた上清画分を酵素液とした。酵素液におけるβ１，４−ＧａｌＴ活性は特開２００５−３３５９８８号公報に記載されている方法で測定した。
【００７３】
（３−２）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（β１，３−ＧｌｃＮＡｃＴ）の調製
（３−２−１）β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素をコードするｌｇｔＡ遺伝子のクローニング
【００７４】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ＭＣ５８の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−３３５Ｄ）を鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ｌｇｔＡ遺伝子（ＥＭＢＬ／ＧＥＮＥＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＤＡＴＡ  ＢＡＮＫＳ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ５３６８１７）を増幅した。
【００７５】
プライマー（Ａ）：５’−ｔｔｃｃａｔｇｇｃｇｔｃｔｇａａｇｃｃｔｔｃａｇａｃｇｇｃａｔｃｇ−３’
プライマー（Ｂ）：５’−ｔｔａａｇｃｔｔａａｃｇｇｔｔｔｔｔｃａｇｃａａｔｃｇｇｔｇｃａａａ−３’
【００７６】
ＰＣＲによるｌｇｔＡ遺伝子の増幅は、反応液５０μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ  ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット（タカラバイオ社製）、ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、４５秒）、伸長反応（７２℃、２分３０秒）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
【００７７】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ、（Ｍａｎｉａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２））の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．０ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同じく制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（現アマシャムバイオサイエンス社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＮＭＧｎＴを単離した。
【００７８】
ｐＴｒｃ−ＮＭＧｎＴは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位にＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ｌｇｔＡ構造遺伝子を含有するＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００７９】
（３−２−２）β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移活性を有する酵素液の調製
プラスミドｐＴｒｃ−ＮＭＧｎＴを保持する大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地５０ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。２×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２０℃で２０時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、５ｍｌの緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭ２−メルカプとエタノール、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．２％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により菌体残さを除去した。
【００８０】
このように得られた上清画分を酵素液とし、酵素液におけるβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移活性を測定した結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９）と共に下記表１に示す。なお、本発明におけるβ１，３−アセチルグルコサミン転移酵素活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法でＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンとラクトースからのラクトーＮ−トリオース（ＬＮＴ−２）の合成活性を測定、算出したものである。
【００８１】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の測定と単位の算出法；
１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ塩化マンガン、２０ｍＭラクトース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を添加して３０℃で３０分間反応させた。また、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の代わりにｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸ＪＭ１０９株の菌体破砕液を用い同様の反応を行い、これをコントロールとした。
【００８２】
反応液に１／１０容量の１Ｍ水酸化ナトリウムを添加することにより反応を停止し、これを希釈した後、Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＸ−５００装置による分析を行った。分離には日本ダイオネクス社製のＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１カラムを用い、溶出液として脱イオン水、０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液および１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を用いた。ＤＸ−５００分析結果から反応液中のＬＮＴ−２量をラクトース換算で算出し，３０℃で１分間に１μｍｏｌｅのＮ−アセチルラクトサミンを合成する活性を１単位（ユニット）としてβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を算出した。
【００８３】
【表１】
2008031156.tif 000016
【００８４】
（３−３）ヒトβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（β３ＧｎＴＩＩ）の調製
文献（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．,３５，５４−６１（２００４））に従って調製した。
【００８５】
（３−４）シアル酸転移酵素
α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（Ｒａｔ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、α２，６−シアリルトランスフェラーゼ（Ｒａｔ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社より購入した。
【００８６】
（３−５）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来セルラーゼの調製
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ＸＬ−５２２）は、ナガセケムテックスより購入し、以下に記載する部分精製後、使用に供した。
【００８７】
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来セルラーゼの粗酵素溶液（１０００ｍｌ，８７５ｋＵ）を２５%飽和硫安で処理後、高速微量遠心機（ＫＵＢＯＴＡ  １７２０；ＲＡ−２００Ｊ  ローター使用、ＫＵＢＯＴＡ製）を用いて４℃で遠心分離を行い（６０１０ｇ×２０ｍｉｎ）上清を回収した。これを、７５%飽和硫安で処理し、同様の条件で遠心分離後、生じた沈殿を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した。分画分子量３００００の限外ろ過膜（ＰＭ−３０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）を用いて脱塩後、凍結乾燥を行い、７．８ｇの酵素粉末を得た。そのうち１．０ｇを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、予め同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムクロマトグラフィー（φ２．６×１８ｃｍ）に供した。カラムを１０００ｍｌの同緩衝液で洗浄後、６００ｍｌの５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む同緩衝液でステップワイズ溶出を行った。カラム吸着部を限外ろ過により脱塩、濃縮後、凍結乾燥を行い、部分精製酵素（０．７ｇ，０．７Ｕ／ｍｇ）を得た。
【００８８】
さらに得られた部分精製酵素（５０ｍｇ，Ｌａｃβ−ｐＮＰ加水分解活性３５Ｕ，Ｇａｌβ−ｐＮＰ加水分解活性１９Ｕ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０（１．０ｍｌ）に溶解し、予め同溶媒で平衡化しておいたＧａｌ−ａｍｉｄｉｎｅアフィニティーカラムクロマトグラフィー（φ１．２×１．７ｃｍ）に供した。流速１０ｍｌ／ｈにおいて各エッペンドルフチューブに１ｍｌずつ分取して、非吸着部を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０（３０ｍｌ）で洗浄した。吸着部を１．０Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０（２０ｍｌ）で溶出し、さらに０．５Ｍ  ｍｅｔｈｙｌ  β−Ｇａｌを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０（１０ｍｌ）で溶出した。タンパク質の検出は２８０ｎｍの吸光度を測定することで行い、Ｌａｃβ−ｐＮＰおよびＧａｌβ−ｐＮＰの加水分解活性を測定した。それぞれの画分を分画分子量３００００の限外ろ過膜（ＰＭ−３０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）を用いて濃縮後、凍結乾燥を行い、非吸着部よりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを除去した部分精製酵素（Ｌａｃβ−ｐＮＰ加水分解活性３２Ｕ，Ｇａｌβ−ｐＮＰ加水分解活性０．３Ｕ）を得た。なお、以後の反応には全てβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを除去した部分精製酵素を用いた。Ｌａｃβ−ｐＮＰおよびＧａｌβ−ｐＮＰの加水分解活性を測定法は以下の通りである。
【００８９】
（Ｌａｃβ−ｐＮＰ加水分解活性）
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来セルラーゼの酵素活性測定法はＬａｃβ−ｐＮＰからのｐＮＰの遊離量を定量して行った。１０ｍＭ  Ｌａｃβ−ｐＮＰ（２５μｌ）と５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０（７０μｌ）とを混合し、適当量の酵素を加えて全量を１００μｌとし、４０℃で２０分間反応を行った。経時的に反応液から１０μｌとり、予め９６穴マイクロプレートに分注しておいた１．０Ｍ炭酸ナトリウム溶液（１９０μｌ）と混合し、反応停止後、直ちにプレートリーダーを用い４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、遊離したｐＮＰを定量した。酵素活性１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのｐＮＰを遊離させる酵素量と定義した。
【００９０】
（Ｇａｌβ−ｐＮＰ加水分解活性）
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来セルラーゼ中に夾雑するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性測定法はＧａｌβ−ｐＮＰからのｐＮＰの遊離量を定量して行った。１０ｍＭ  Ｇａｌβ−ｐＮＰ（２５μｌ）と５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０（２５μｌ）とを混合し、適当量の酵素を加えて全量を１００μｌとし、４０℃で２０分間反応を行った。経時的に反応液から１０μｌとり、予め９６穴マイクロプレートに分注しておいた１．０Ｍ炭酸ナトリウム溶液（１９０μｌ）と混合し、反応停止後、直ちにプレートリーダーを用い４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、遊離したｐＮＰを定量した。酵素活性１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのｐＮＰを遊離させる酵素量と定義した。
【００９１】
（４）材料：反応基質および試薬
Ｌａｃｔｏｓｅ  Ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、５−ａｍｉｎｏ−１−ｐｅｎｔａｎｏｌは、和光純薬（株）より購入した。γ−ＰＧＡは、明治製菓（株）より、糖ヌクレオチド（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ，ＵＤＰ−Ｇａｌ，ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）はヤマサ醤油（株）より、ＬａｃＮＡｃは焼津水産（株）より購入した。Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏは、和光純薬（株）より購入した。α−ＰＧＡ、ＢＯＰ、ＨＯＢｔ、およびＢＳＡは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入した。
【００９２】
なお、使用材料の略語は以下の通りである。
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：ＵＤＰ−Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ
ＵＤＰ−Ｇａｌ：ＵＤＰ−Ｇａｌａｃｔｏｓｅ
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ：ＣＭＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ
ｐＮＰ：ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ
ｐＡＰ：ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌ
Ｌａｃ：Ｌａｃｔｏｓｅ（Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ）
ＬａｃＮＡｃ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ）
ＮｅｕＡｃ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ
α−ＰＧＡ：α−ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄｓ
γ−ＰＧＡ：γ−ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄｓ
ＢＯＰ：Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌｏｘｙｔｒｉｓ−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  
ＨＯＢｔ：１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ  ｈｙｄｒａｔｅ
ＰＢＳ：１０  ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）
ＴＰＳ：Ｓｏｄｉｕｍ  ３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ
ＢＳＡ：Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ
【００９３】
（５）合成例
［合成例１］
３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／α−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ  β−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／α−ポリグルタミン酸））、および６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／α−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（ＮｅｕＡｃ（α２，６）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ  β−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／α−ポリグルタミン酸））の調製
【００９４】
［１−１］３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／α−ＰＧＡの調製
文献（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３，３１５−３２６（２００３））の方法に従い、糖置換度４０％、シアル化率９７％の３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／α−ＰＧＡを９．４ｍｇの収量で得た。
【００９５】
［１−２］６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／α−ＰＧＡの調製
文献（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３，３１５−３２６（２００３））の方法に従い、糖置換度４０％、シアル化率９０％の６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／α−ＰＧＡを１３．２ｍｇの収量で得た。
【００９６】
［合成例２］
３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ  β−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／α−ポリグルタミン酸））、および６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ  β−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／α−ポリグルタミン酸））の調製
【００９７】
［２−１］（ＬａｃＮＡｃ）２  β−ｐＮＰの調製
１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．８，９．２ｍｌ）に受容体基質となるＬａｃＮＡｃβ−ｐＮＰを１０１ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、供与体基質としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ，２Ｎａを２６０ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）、補因子としてＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏを３２ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）溶解させ、防腐剤として１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３を０．３ｍｌ加えた後、６６ｍＵのβ３ＧｎＴＩＩを添加して反応を行った。４３５時間後、ＧｌｃＮＡｃ転移が８３％進んだところで反応液を５分間煮沸することにより反応を停止した。次に、反応液にＵＤＰ−Ｇａｌ，２Ｎａを２３８ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）加え、β１，４−ＧａｌＴ４００ｍＵを添加してＧａｌ転移反応を行った。ＧｌｃＮＡｃ転移反応の時と同様に、反応をＨＰＬＣで追跡した。４８３時間後、ＨＰＬＣ上でＧｌｃＮＡｃ（β１−３）ＬａｃＮＡｃ  β−ｐＮＰのピークが消失したことを確認し、反応液を５分間煮沸することによって反応を停止した。
【００９８】
反応液に１５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．８）を１０．７ｍｌ、１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３を０．３ｍｌ加えた。そこにＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ，２Ｎａ  １３０ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）溶解し、最後にβ３ＧｎＴＩＩを４７２ｍＵ添加しＧｌｃＮＡｃ転移反応を開始させた。反応をＨＰＬＣで追い、反応が進まなくなった５５６時間後、さらにβ３ＧｎＴＩＩ  ４７２ｍＵを添加した。再び反応が進まなくなった６４８時間後、反応液を１０分間煮沸することによって反応を停止した。続いて、反応液にＵＤＰ−Ｇａｌ，２Ｎａを１１９ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）加え、β１、４−ＧａｌＴ  ４００ｍＵを添加してＧａｌ転移反応を行った。８１３時間後、ＧｌｃＮＡｃ（β１−３）（ＬａｃＮＡｃ）２  β−ｐＮＰのピークがほぼ消失したことを確認して、反応液を１０分間煮沸することにより反応を停止した。
【００９９】
次に、反応液を、あらかじめ２５％ＭｅＯＨで平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０Ｓカラムに供した（φ６．０ｘ１００ ｃｍ；Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ, １．０ｍｌ／ｍｌ；２５％ＭｅＯＨ；Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｓｉｚｅ, １０ｍｌ／ｔｕｂｅ；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、２６０ｎｍ＆３００ｎｍ）。その結果、２６０ｎｍおよび３００ｎｍの吸収を示す３つのピークが現れ、Ｆ−１（Ｎｏ．２８−４６），Ｆ−２（Ｎｏ．５２−７０），Ｆ−３（Ｎｏ．７１−９１），Ｆ−４（Ｎｏ．９２−１２４）とした。ロータリーエバポレイターで濃縮、凍結乾燥後、１Ｈ−ＮＭＲおよびＨＰＬＣで分析した。Ｆ−１は（ＬａｃＮＡｃ）４  β−ｐＮＰ、Ｆ−２は（ＬａｃＮＡｃ）３  β−ｐＮＰ、Ｆ−３はＧｌｃＮＡｃ（β１−３）（ＬａｃＮＡｃ）２  β−ｐＮＰと（ＬａｃＮＡｃ）３  β−ｐＮＰをそれぞれ含んでいた。Ｆ−４は（ＬａｃＮＡｃ）２  β−ｐＮＰであり、収量３０ｍｇであった。
【０１００】
［２−２］（ＬａｃＮＡｃ）２  β−ｐＡＰの調製
Ｈ２Ｏ３０ｍｌに、上記（１）の方法で調製された（ＬａｃＮＡｃ）２  β−ｐＮＰ  １０５ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）、ギ酸アンモニウム２１０ｍｇ（３．３ｍｍｏｌ）を完全に溶解させた。そこに１０％Ｐｄ／Ｃを１３．６ｍｇ添加し、ソニケーション（ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ  ＴＲＡＮＳＤＵＣＥＲ）を行ないながら反応させた。ＨＰＬＣにより反応を追跡し、（ＬａｃＮＡｃ）２  β−ｐＮＰのピークが消失したことを確認した後、８，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清を回収し、残存するＰｄ／Ｃを０．４５μｍのフィルターでさらに除去した。次に、この反応液をロータリーエバポレイターで濃縮（３０℃）し、乾固させないようにＨ２Ｏで置換した。そして、あらかじめ１００％ＭｅＯＨで洗浄し、Ｈ２Ｏで平衡化したＳｅｐ−ｐａｋ  Ｃ１８カラム（φ２．５×５．５ｃｍ，Ｗａｔｅｒｓ社）に供した。Ｈ２Ｏを流しながら、カラムを通過してきた液をときどきサンプリングし、ギ酸アンモニウムに由来する２１０ｎｍの吸光度を測定した。ギ酸アンモニウムが溶出しきったことを確認後、溶媒を１０％ＭｅＯＨに換えて、ｐ−アミノフェニル基に由来する３００ｎｍの吸光度を確認しながら、（ＬａｃＮＡｃ）２  β−ｐＡＰを溶出させた。溶出液はロータリーエバポレイターで濃縮（３０℃）、Ｈ２Ｏに置換し、凍結乾燥し、（ＬａｃＮＡｃ）２  β−ｐＡＰを８３．３ｍｇ得ることができた。
【０１０１】
［２−３］（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（（ＬａｃＮＡｃ）２  β−ｐＡＰ／α−ＰＧＡ））の調製
α−ＰＧＡ（ＭＷ：１１，０００）６．５ｍｇ、ＢＯＰ７４．５ｍｇ、ＨＯＢｔ８．４ｍｇを５００μｌのＤＭＳＯに溶解後、最後に（ＬａｃＮＡｃ）２  β−ｐＡＰ  ５２．５ｍｇを溶解し、室温で一昼夜（２０時間）攪拌しながら反応を行なった。反応終了後、１．４ｍｌとなるようにＰＢＳを加え、６，５００×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。その後、沈殿を約５００μｌのＰＢＳに懸濁し、再び遠心して上清を回収した。同様の操作を再度行った後、上清を合わせ、全量が２．５ｍｌになるようにＰＢＳを添加した。
【０１０２】
その後、あらかじめＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に供し、３．５ｍｌのＰＢＳで（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡを溶出した。次に、この画分を、煮沸してグリセリンを除いたセルロースチューブに入れ、Ｈ２Ｏで６日間透析した。その間、Ｈ２Ｏの交換は５回行った。透析後、ロータリーエバポレイターで濃縮、凍結乾燥し、１Ｈ−ＮＭＲ構造解析を行った。糖残基置換度は、１Ｈ−ＮＭＲより、糖鎖由来ｐＡＰのプロトンの積分比（ａ）と、ポリグルタミン酸のβ位とγ位のプロトンおよびＧｌｃＮＡｃのＮ−アセチル基由来メチルプロトンの積分比の和（ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、糖置換度３７％の（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡを収量２０．３ｍｇで得た。
【０１０３】
糖残基置換度（％）＝（（ａ／４）／（（ｂ−６ａ／４）／４））ｘ１００
【０１０４】
［２−４］３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）（ＬａｃＮＡｃ）２  β−ｐＡＰ／α−ＰＧＡ））の合成
上記［２−３］で合成した（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡ  ６．１ｍｇとＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ・ナトリウム塩をそれぞれ終濃度８ｍＭ，１６ｍＭとなるように５０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に溶解した。そこに、ＭｎＣｌ２、ＢＳＡ、アルカリフォスファターゼをそれぞれ終濃度が２．５ｍＭ，１．０ｍｇ／ｍｌ，１０Ｕ／ｍｌになるように加え、最後に２，３−シアリルトランスフェラーゼを４０ｍＵ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で４８時間反応を行った。この反応液を５分間煮沸し反応を停止させ、５，５００×ｇで５分間遠心分離し、上清を回収した。
【０１０５】
次に、Ｈ２Ｏで沈殿を数回洗浄して上清をさらに回収し、全量を２．５ｍｌとした。これを、あらかじめＨ２Ｏで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍカラム（ＰＤ−１０）に対して２．５ｍｌチャージし、３．５ｍｌのＨ２Ｏで目的物を含む画分を溶出させた。この画分をＨ２Ｏに対し透析後、イオン交換樹脂であるＤｏｗｅｘ  ＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８（Ｎａ＋  ｆｏｒｍ）カラムに供した。その後、濃縮、凍結乾燥を行い、１Ｈ−ＮＭＲにより構造を確認した（図１）。シアリル化率は、１Ｈ−ＮＭＲより、糖鎖由来のｐＡＰのプロトンの積分比（ａ）、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルプロトンの積分比（ｃ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率が、９４％の３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡを、５．５ｍｇの収量で得た。
【０１０６】
なお、図中、シアロ糖鎖含有ポリマーの構造式は、ポリマー中の未置換グルタミン酸残基及びシアロ糖鎖置換グルタミン酸残基の構造のみを示しており、未置換グルタミン酸残基とシアロ糖鎖置換グルタミン酸残基の数及び位置は図に示すものに限定されない。また、図中の波線部分は未置換グルタミン酸残基とシアロ糖鎖置換グルタミン酸残基とが任意の比率で混在していることを意味している。以下、他の合成例で合成されたシアロ糖鎖含有ポリマーについても同様とする。
【０１０７】
シアリル化率（％）＝（（ｃ／１）／（ａ／４））×１００
【０１０８】
［２−５］６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（ＮｅｕＡｃ（α２，６）（ＬａｃＮＡｃ）２  β−ｐＡＰ／α−ＰＧＡ）の合成
上記［２−３］で合成した（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡ  ６．０ｍｇとＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ・ナトリウム塩をそれぞれ終濃度８ｍＭ，１６ｍＭとなるように５０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に溶解した。そこに、ＭｎＣｌ２、ＢＳＡ、アルカリフォスファターゼをそれぞれ終濃度が２．５ｍＭ，１．０ｍｇ／ｍｌ，１０Ｕ／ｍｌになるように加え、最後に２，６−シアリルトランスフェラーゼを５０ｍＵ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で４８時間反応を行った。この反応液を上記［２−３］と同様の方法で処理し、その構造は１Ｈ−ＮＭＲにより確認した（図２）。シアリル化率は、１Ｈ−ＮＭＲより、糖鎖由来のｐＡＰのプロトンの積分比（ａ）、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルプロトンの積分比（ｃ）と３位アキシアルプロトンの積分比（ｄ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率が、１００％の６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡを、６．３ｍｇの収量で得た。
【０１０９】
シアリル化率  ＝（（（ｃ＋ｄ）／２）／（ａ／４））×１００
【０１１０】
［合成例３］
３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／α−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ  β−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／α−ポリグルタミン酸））、および６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／α−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ  β−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／α−ポリグルタミン酸））の調製
【０１１１】
［３−１］（ＬａｃＮＡｃ）３  β−ｐＮＰの調製
合成例２［２−１］のＴｏｙｏｐｅｒａｌ  ＨＷ−４０Ｓカラムで回収された画分（Ｆ−３）をＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓカラムに供し、（ＬａｃＮＡｃ）３  β−ｐＮＰを含む画分を回収し、（ＬａｃＮＡｃ）３  β−ｐＮＰを８８ｍｇ得ることができた。
［３−２］（ＬａｃＮＡｃ）３  β−ｐＡＰの調製
Ｈ２Ｏ  ５５ｍｌに、上記［３−１］の方法で調製した（ＬａｃＮＡｃ）３  β−ｐＮＰ  １８０ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）、ギ酸アンモニウム３６０ｍｇ（５．７ｍｍｏｌ）を完全に溶解させた。そこに１０％Ｐｄ／Ｃを２３．４ｍｇ添加し、ソニケーション（ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ  ＴＲＡＮＳＤＵＣＥＲ）を行ないながら反応させた。ＨＰＬＣにより反応を追跡し、（ＬａｃＮＡｃ）３  β−ｐＮＰのピークが消失したことを確認した後、８，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清を回収し、残存するＰｄ／Ｃを０．４５μｍのフィルターでさらに除去した。次に、この反応液をロータリーエバポレイターで濃縮（３０℃）し、乾固させないようにＨ２Ｏで置換した。そして、あらかじめ１００％ＭｅＯＨで洗浄し、Ｈ２Ｏで平衡化したＳｅｐ−ｐａｋ  Ｃ１８カラム（φ２．５×５．５ｃｍ，Ｗａｔｅｒｓ社）に供した。Ｈ２Ｏを流しながら、カラムを通過してきた液をときどきサンプリングし、ギ酸アンモニウムに由来する２１０ｎｍの吸光度を測定した。ギ酸アンモニウムが溶出しきったことを確認後、溶媒を２０％ＭｅＯＨに換えて、ｐ−アミノフェニル基に由来する３００ｎｍの吸光度を確認しながら、（ＬａｃＮＡｃ）３  β−ｐＡＰを溶出させた。溶出液はロータリーエバポレイターで濃縮（３０℃）、Ｈ２Ｏに置換し、凍結乾燥し、（ＬａｃＮＡｃ）３  β−ｐＡＰを１５２．３ｍｇ得ることができた。
【０１１２】
［３−３］（ＬａｃＮＡｃ）３／α−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（（ＬａｃＮＡｃ）３  β−ｐＡＰ／α−ＰＧＡ））の調製
α−ＰＧＡ（ＭＷ：１１，０００）５．２ｍｇ、ＢＯＰ５９．６ｍｇ、ＨＯＢｔ６．８ｍｇを６００μｌのＤＭＳＯに溶解後、最後に（ＬａｃＮＡｃ）３  β−ｐＡＰ  ６０．３ｍｇを溶解し、室温で一昼夜（２０時間）攪拌しながら反応を行なった。反応終了後、１．４ｍｌとなるようにＰＢＳを加え、６，５００×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。その後、沈殿を約５００μｌのＰＢＳに懸濁し、再び遠心して上清を回収した。同様の操作を再度行った後、上清を合わせ、全量が２．５ｍｌになるようにＰＢＳを添加した。
【０１１３】
あらかじめＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に供し、３．５ｍｌのＰＢＳでＰｏｌｙ（ＬａｃＮＡｃ）３  β−ｐＡＰ／α−ＰＧＡ）を溶出した。次に、この画分を、煮沸してグリセリンを除いたセルロースチューブに入れ、Ｈ２Ｏで６日間透析した。その間、Ｈ２Ｏの交換は５回行った。透析後、ロータリーエバポレイターで濃縮、凍結乾燥し、１Ｈ−ＮＭＲ構造解析を行った。糖残基置換度は、１Ｈ−ＮＭＲより、糖鎖由来ｐＡＰのプロトンの積分比（ａ）と、ポリグルタミン酸のβ位とγ位のプロトンおよびＧｌｃＮＡｃのＮ−アセチル基由来メチルプロトンの積分比の和（ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、糖残基置換度３６％の（ＬａｃＮＡｃ）２  ／α−ＰＧＡを収量２０．９ｍｇで得た。
【０１１４】
糖残基置換度（％）＝（（ａ／４）／（（ｂ−９ａ／４）／４））ｘ１００
【０１１５】
［３−４］３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／α−ＰＧＡの合成
上記［３−３］で合成した（ＬａｃＮＡｃ）３／α−ＰＧＡ  ６．０ｍｇとＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ・ナトリウム塩をそれぞれ終濃度８ｍＭ，１６ｍＭとなるように５０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に溶解した。そこに、ＭｎＣｌ２、ＢＳＡ、アルカリフォスファターゼをそれぞれ終濃度が２．５ｍＭ，１．０ｍｇ／ｍｌ，１０Ｕ／ｍｌになるように加え、最後に２，３−シアリルトランスフェラーゼを４０ｍＵ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で４８時間反応を行った。この反応液を５分間煮沸し反応を停止させ、５，５００×ｇで５分間遠心分離し、上清を回収した。
【０１１６】
次にＨ２Ｏで沈殿を数回洗浄して上清をさらに回収し、全量を２．５ｍｌとした。これを、あらかじめＨ２Ｏで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍカラム（ＰＤ−１０）に対して２．５ｍｌチャージし、３．５ｍｌのＨ２Ｏで目的物を含む画分を溶出させた。この画分をＨ２Ｏに対し透析後、イオン交換樹脂であるＤｏｗｅｘ  ＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８（Ｎａ＋  ｆｏｒｍ）カラムに供した。その後、濃縮、凍結乾燥を行い、１Ｈ−ＮＭＲにより構造を確認した（図３）。シアリル化率は、１Ｈ−ＮＭＲより、糖鎖由来のｐＡＰのプロトンの積分比（ａ）、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルプロトンの積分比（ｃ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率が、１００％の３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／α−ＰＧＡを６．０ｍｇの収量で得た。
【０１１７】
シアリル化率（％）＝（（ｃ／１）／（ａ／４））×１００
【０１１８】
［３−５］６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）3  ／α−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（ＮｅｕＡｃ（α２，６）（ＬａｃＮＡｃ）３  β−ｐＡＰ／α−ＰＧＡ）の合成
上記［３−３］で合成した（ＬａｃＮＡｃ）３／α−ＰＧＡ  ６．９ｍｇとＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ・ナトリウム塩をそれぞれ終濃度８ｍＭ，１６ｍＭとなるように５０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に溶解した。そこに、ＭｎＣｌ２、ＢＳＡ、アルカリフォスファターゼをそれぞれ終濃度が２．５ｍＭ，１．０ｍｇ／ｍｌ，１０Ｕ／ｍｌになるように加え、最後に２，６−シアリルトランスフェラーゼを５０ｍＵ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で４８時間反応を行った。この反応液を上記［３−３］と同様の方法で処理し、その構造は１Ｈ−ＮＭＲにより確認した(図４)。シアリル化率は、１Ｈ−ＮＭＲより、糖鎖由来のｐＡＰのプロトンの積分比（ａ）、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルプロトンの積分比（ｃ）と３位アキシアルプロトンの積分比（ｄ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率が１００％の６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）3  ／α−ＰＧＡを６．９ｍｇの収量で得た。
【０１１９】
シアリル化率  ＝（（（ｃ＋ｄ）／２）／（ａ／４））×１００
【０１２０】
［合成例４］
３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／γ−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／γ−ＰＧＡ））および６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／γ−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／γ−ＰＧＡ））の調製
【０１２１】
［４−１］５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏ−１−ｐｅｎｔａｎｏｌの化学合成
はじめに、５−ａｍｉｎｏ−１−ｐｅｎｔａｎｏｌ（１０ｇ，９７ｍｍｏｌ）をピリジン（２０ｍｌ）を加えて溶解した。これを氷冷、攪拌し、そこへ無水トリフルオロ酢酸（２５ｍｌ，１８０ｍｍｏｌ）を滴下しながら添加し反応を開始した。反応開始から５分おきにＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：アセトン＝８：２）で、リンモリブデン酸発色を用い反応を確認した。１時間後、ＴＬＣで原料が消失したのを確認した後、クラッシュアイスを反応液と同量程度加えて反応を停止させ、続いて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を２００ｍｌを加えて反応液を中和した。
【０１２２】
反応液を濃縮後、アセトンを適量加え再び濃縮を行った。この操作を３回程度繰り返したのち、反応液をアセトンで溶解し、多量に存在する炭酸水素ナトリウムを析出させた。これをろ過後、濃縮し、クロロホルム：アセトン＝８：２で平衡化（１０ｍｌ／ｍｉｎ）したシリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ４．５×３５ｃｍ）に供した。約２５ｍｌごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分はＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：アセトン＝８：２）で、リンモリブデン酸発色を用い生成物を確認した。目的物を含む画分を濃縮し、目的物である５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏ−１−ｐｅｎｔａｎｏｌを収量１８ｇ、収率９４%で得た。
【０１２３】
［４−２］５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅの合成
基質としてＮ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（２０．０ｇ，５２．２ｍｍｏｌ）と５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏ−１−ｐｅｎｔａｎｏｌ（１５．６ｇ，７８．４ｍｍｏｌ）とを１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０（５２．２ｍｌ）に溶解し、そこへガラクトシダーゼを除去したＴ．ｒｅｅｓｅｉ由来セルラーゼ（６２００Ｕ）を加えて反応を開始した。反応を追跡するために反応液１０μｌを経時的に採取し、１９０μｌの脱塩水を加えた後、１００℃で１０分間煮沸して反応を停止させ、０．４５μｍフィルターでろ過した後、ＨＰＬＣにより分析した。反応液を激しく振とう（２００ｒｐｍ）し、４０℃で１４４時間反応を行った。その後、１００℃、１０分間の煮沸により反応を停止した。
【０１２４】
反応液を濃縮後、水で平衡化（５．０ｍｌ／ｍｉｎ）した活性炭−セライトクロマトグラフィー（φ４．５×１００ｃｍ）に供した。まず、０%（５．０Ｌ）−２５%（５．０Ｌ）のエタノール直線濃度勾配法により、基質として用いたＬａｃＮＡｃを溶出した。６０ｍｌ／ｔｕｂｅずつ分取後、各フラクションをＮ−アセチル基に由来する２１０ｎｍの吸光度で測定した。ＬａｃＮＡｃを含む画分を濃縮することで、ＬａｃＮＡｃを回収量１７．２ｇ、回収率８６%で得た。次に８０%エタノール（５．０Ｌ）に切り換え吸着部を溶出した。６０ｍｌ／ｔｕｂｅずつ分取後、各フラクションを２１０ｎｍの吸光度で測定した。続いて、目的画分を含む画分を濃縮し、クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５で平衡化（１０ｍｌ／ｍｉｎ）したＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ  カラムクロマトグラフィー（φ４．５×５０ｃｍ）に供し同溶媒で溶出し、２８ｍｌ／ｔｕｂｅずつ分取してＴＬＣ（クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５）で分析した。目的画分を含む画分を濃縮し、５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅを収量３２２ｍｇ、収率１．１%で得た。
【０１２５】
［４−３］５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅの合成
５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ（１００ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）に１．０Ｍ  ＮａＯＨ（１．２ｍｌ）を加えて溶解し、室温で反応を開始した。反応開始から３０分おきにＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）で、オルシノール硫酸発色とリンモリブデン酸発色とを用い反応を確認した。１時間後、ＴＬＣで原料が消失したのを確認したのち反応液を、水で平衡化（１．０ｍｌ／ｍｉｎ）したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムクロマトグラフィー（φ２．５×５５ｃｍ）に供した。約２．０ｍｌごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分はＮ−アセチル基に由来する２１０ｎｍの吸光度と、ＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）でリンモリブデン酸発色とを用い生成物を確認した。目的物を含む画分を濃縮し、目的物である５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅを収量８２ｍｇ、収率９９%で得た。  
【０１２６】
［４−４］Ｐｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ／γ−ＰＧＡ）の合成
γ−ＰＧＡ（ＭＷ：９９００００，１５．０ｍｇ）を１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３水溶液（１．３ｍｌ、ｐＨ１０．０）に溶解後、予めＤＭＳＯ（３．５ｍｌ）に溶解しておいたＢＯＰ（１１９ｍｇ）、ＨＯＢｔ（１５ｍｇ）を加えスターラーで攪拌した。最後に５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ（１４０ｍｇ）を１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３水溶液（０．９ｍｌ、ｐＨ１０．０）に溶解後、攪拌しながら室温で２４時間反応を行った。反応終了後、反応液が７．５ｍｌになるようにＰＢＳを添加した。その後、ＰＤ−１０カラム１本あたり２．５ｍｌの反応液をＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０（φ１．７×５．０ｃｍ，Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）カラムに供し、３．５ｍｌのＰＢＳでＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ／γ−ＰＧＡ）を溶出した。
【０１２７】
次に、この画分を２．５Ｌの超純水に対して３日間透析した。その間、超純水の交換を６回行った。透析後、濃縮し、凍結乾燥した。糖残基置換度（%）の計算は１Ｈ−ＮＭＲより、γ−ＰＧＡのβおよびγ位プロトンとＮ−アセチル基の積分比（Ａ）と５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅのアグリコン部位のプロトン６個分の積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、糖残基置換度４３%のＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ／γ−ＰＧＡ）を収量２０．７ｍｇで得た。
【０１２８】
糖残基置換度（％）＝（４×１００）／（Ａ−（Ｂ／６ｘ３））
【０１２９】
［４−５］３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／γ−ＰＧＡの合成
受容体基質としてＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ／γ−ＰＧＡ）［４３%，  ２２００ｋＤａ］  ５．２ｍｇをＬａｃＮＡｃ−単位当たり８．０ｍＭ、供与体基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  １６．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＢＳＡ  ０．１%、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＭとなるよう調整した。次に、反応液に対し１０Ｕ／ｍｌのアルカリフォスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）および４０ｍＵ／ｍｌのα２，３−シアリルトランスフェラーゼを添加し、３７℃で４８時間反応を行った。続いて、この反応液を合成例２の「２−４」と同様の方法で処理した。シアリル化率は１Ｈ−ＮＭＲより、５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅのアグリコン部位のプロトン８個分の積分比（Ａ）と、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルとアキシアルプロトンの積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率１００%の３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／γ−ＰＧＡを収量６．２ｍｇで得た（図５）。
【０１３０】
シアリル化率（％）＝（（Ｂ／２）×１００）／（Ａ／８）
【０１３１】
［４−６］６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／γ−ＰＧＡの合成
受容体基質としてＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ／γ−ＰＧＡ）［４３  %，  ２２００  ｋＤａ］  ５．７ｍｇをＬａｃＮＡｃ−単位当たり８．０ｍＭ、供与体基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  １６．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＢＳＡ  ０．１%、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＭとなるよう調整した。次に、反応液に対し１０Ｕ／ｍｌのアルカリフォスファターゼおよび４０ｍＵ／ｍｌのα２，６−シアリルトランスフェラーゼを添加し、３７℃で４８時間反応を行った。続いて、この反応液を合成例２の［２−５］と同様の方法で処理した。シアリル化率は１Ｈ−ＮＭＲより、５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅのアグリコン部位のプロトン８個分の積分比（Ａ）と、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルとアキシアルプロトンの積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率１００%の６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／γ−ＰＧＡを収量６．８ｍｇで得た（図６）。
【０１３２】
シアリル化率（％）＝（（Ｂ／２）×１００）／（Ａ／８）
【０１３３】
［合成例５］
３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／γ−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／γ−ポリグルタミン酸））、および６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／γ−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／γ−ポリグルタミン酸））の調製
【０１３４】
［５−１］５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）２の合成
１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．８，４４．６ｍｌ）に合成例４の「４−２」で調製した５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅを３００ｍｇ（０．５３ｍｍｏｌ）、供与体基質としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ・２Ｎａを６９２ｍｇ（１．０６ｍｍｏｌ）、補因子としてＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏを８４．１ｍｇ（０．４２ｍｍｏｌ）溶解させ、防腐剤として１%（ｗ／ｖ）ＮａＮ２を０．５３ｍｌ加えた後、７．９ｍｌ（６００ｍＵ）の精製β３ＧｎＴＩＩを添加して３７℃で反応を行った。９７時間後、ＧｌｃＮＡｃ転移が１００%進んだところで反応液を５分間煮沸することにより反応を停止した。
【０１３５】
次に、反応液にＵＤＰ−Ｇａｌ・２Ｎａを６７１ｍｇ（１．１０ｍｍｏｌ）加え、β４ＧａｌＴＩ３００μｌ（６０００ｍＵ）を添加してＧａｌ転移反応を行った。１６２時間後、反応液を５分間煮沸することにより反応を停止した。反応液を濃縮後、１０%  ＭｅＯＨで平衡化（１．５ｍｌ／ｍｉｎ）したＯＤＳカラムクロマトグラフィー（φ２．５×５０ｃｍ）に供した。２２ｍｌ／ｔｕｂｅずつ分取後、各フラクションを２１０ｎｍの吸光度で測定した。原料等が完全に溶出しきった後、溶媒を２０%ＭｅＯＨに切り替えて目的画分を含む画分を濃縮し、５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）２を収量３５５ｍｇ、収率７２%で得た。
【０１３６】
［５−２］５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）２の合成
５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）２（１５４ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）に１．０Ｍ  ＮａＯＨ（１．０ｍｌ）を加えて溶解し、室温で1時間反応した。ＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）で、オルシノール硫酸発色とリンモリブデン酸発色とを用い、原料が消失したのを確認したのち反応液を、水で平衡化（０．５ｍｌ／ｍｉｎ）したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムクロマトグラフィー（φ２．５×５５ｃｍ）に供した。溶出画分はＮ−アセチル基に由来する２１０ｎｍの吸光度と、ＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）でリンモリブデン酸発色とを用い生成物を確認した。目的物を含む画分を濃縮し、目的物である５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）２を収量１３６ｍｇ、収率９８%で得た。
【０１３７】
［５−３］Ｐｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）２／γ−ＰＧＡ）の合成
γ−ＰＧＡ（Ｍ．Ｗ．：９９００００，１５．０ｍｇ）を１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３水溶液（２．０ｍｌ、ｐＨ１０．０）に溶解後、予めＤＭＳＯ（５．５ｍｌ）に溶解しておいたＢＯＰ（１１８ｍｇ）、ＨＯＢｔ（１５ｍｇ）を加えスターラーで攪拌した。最後に５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）２（８３ｍｇ）を１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３水溶液（１．０ｍｌ、ｐＨ１０．０）に溶解後、添加し、攪拌しながら室温で２４時間反応を行った。反応終了後、反応液が１０．０ｍｌになるようにＰＢＳを添加した。
【０１３８】
その後、ＰＤ−１０カラム１本あたり２．５ｍｌの反応液をＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０（φ１．７×５．０ｃｍ，Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）カラムに供し、３．５ｍｌのＰＢＳでＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ／γ−ＰＧＡ）を溶出した。次にこの画分を２．５Ｌの超純水に対して３日間透析した。その間、超純水の交換を６回行った。透析後、濃縮し、凍結乾燥した。糖残基置換度（%）の計算は１Ｈ−ＮＭＲより、γ−ＰＧＡのβおよびγ位プロトンとＮ−アセチル基の積分比（Ａ）と５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）２のアグリコン部位のプロトン６個分の積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、糖残基置換度４８%のＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）２／γ−ＰＧＡ）を収量３１．８ｍｇで得た。
【０１３９】
糖残基置換度（％）＝（４×１００）／（Ａ−（Ｂ／６ｘ６））
【０１４０】
［５−４］３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／γ−ＰＧＡの合成
上記「５−３」のＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）２／γ−ＰＧＡ）［４８%，  ３５００ｋＤａ］  ５．８ｍｇを（ＬａｃＮＡｃ）２−単位当たり８．０ｍＭ、供与体基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  １６．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＢＳＡ  ０．１%、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＭとなるよう調整した。次に、反応液に対し１０Ｕ／ｍｌのアルカリフォスファターゼおよび４０ｍＵ／ｍｌのα２，３−シアリルトランスフェラーゼを添加し、３７℃で４８時間反応を行った。続いて、この反応液を合成例２の［２−４］と同様の方法で処理した。シアリル化率は１Ｈ−ＮＭＲより、５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）２のアグリコン部位のプロトン８個分の積分比（Ａ）と、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルとアキシアルプロトンの積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率１００%の３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／γ−ＰＧＡを収量６．６ｍｇで得た（図７）。
【０１４１】
シアリル化率（％）＝（（Ｂ／２）×１００）／（Ａ／８）
【０１４２】
［５−５］６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／γ−ＰＧＡの合成
前記「５−３」のＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）２／γ−ＰＧＡ）［４８%，  ３５００ｋＤａ］  ５．９ｍｇを（ＬａｃＮＡｃ）２−単位当たり８．０ｍＭ、供与体基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  １６．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＢＳＡ  ０．１%、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＭとなるよう調整した。次に、反応液に対し１０Ｕ／ｍｌのアルカリフォスファターゼおよび４０ｍＵ／ｍｌのα２，６−シアリルトランスフェラーゼを添加し、３７℃で４８時間反応を行った。続いて、この反応液を合成例２の［２−５］と同様の方法で処理した。シアリル化率は１Ｈ−ＮＭＲより、５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）２のアグリコン部位のプロトン８個分の積分比（Ａ）と、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルとアキシアルプロトンの積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率１００%の６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／γ−ＰＧＡを収量６．５ｍｇで得た（図８）。
【０１４３】
シアリル化率（％）＝（（Ｂ／２）×１００）／（Ａ／８）
【０１４４】
［合成例６］
３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／γ−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／γ−ポリグルタミン酸））および６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／γ−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／γ−ポリグルタミン酸））の調製
【０１４５】
［６−１］５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）３の合成
１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．８，８．８ｍｌ）に合成例５の（１）の方法で調製した５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）２を１９７ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ）、供与体基質としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ・２Ｎａを２７６ｍｇ（０．４２ｍｍｏｌ）、補因子としてＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏを３３．６ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）溶解させ、防腐剤として１%（ｗ／ｖ）ＮａＮ２を０．２１ｍｌ加えた後、１２．２ｍｌ（３４５ｍＵ）の精製β３ＧｎＴＩＩを添加して３７℃で反応を行った。４８時間後、ＧｌｃＮＡｃ転移が１００%進んだところで反応液を５分間煮沸することにより反応を停止した。次に、反応液にＵＤＰ−Ｇａｌ・２Ｎａを２５９ｍｇ（０．４２ｍｍｏｌ）加え、β４ＧａｌＴＩ  ２００μｌ（２０００ｍＵ）を添加してＧａｌ転移反応を行った。２８８時間後、Ｇａｌ転移が１００%進んだところで反応液を５分間煮沸することにより反応を停止した。反応液を濃縮後、１０%ＭｅＯＨで平衡化（１．５ｍｌ／ｍｉｎ）したＯＤＳカラムクロマトグラフィー（φ３．５×６０ｃｍ）に供した。原料等が完全に溶出しきった後、溶媒を２０%ＭｅＯＨに切り替えて目的物質を含む画分を濃縮し、５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）３を収量２３２ｍｇ、収率８５%で得た。
【０１４６】
［６−２］５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌβ−（ＬａｃＮＡｃ）３の合成
５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌβ−（ＬａｃＮＡｃ）３（１９７ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）に１．０Ｍ  ＮａＯＨ（１．３ｍｌ）を加えて溶解し、室温で1時間反応した。ＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）で、オルシノール硫酸発色とリンモリブデン酸発色とを用い反応を確認し、原料が消失したのを確認したのち反応液を、水で平衡化（１．０ｍｌ／ｍｉｎ）したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムクロマトグラフィー（φ２．５×５５ｃｍ）に供した。溶出画分はＮ−アセチル基に由来する２１０ｎｍの吸光度と、ＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）でリンモリブデン酸発色とを用い生成物を確認した。目的物を含む画分を濃縮し、目的物である５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）３を収量１４５ｍｇ、収率８１%で得た。
【０１４７】
［６−３］Ｐｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）３／γ−ＰＧＡ）の合成
γ−ＰＧＡ（ＭＷ：９９０，０００、１５．０ｍｇ）を１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３水溶液（２．０ｍｌ、ｐＨ１０．０）に溶解後、予めＤＭＳＯ（５．５ｍｌ）に溶解しておいたＢＯＰ（１１８ｍｇ）、ＨＯＢｔ（１５ｍｇ）を加えスターラーで攪拌した。最後に５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬＡｃＮＡｃ）３（１１９ｍｇ）を１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３水溶液（１．０ｍｌ、ｐＨ１０．０）に溶解後、攪拌しながら室温で２４時間反応を行った。反応終了後、反応液が１０．０ｍｌになるようにＰＢＳを添加した。その後、ＰＤ−１０カラム１本あたり２．５ｍｌの反応液をＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０（φ１．７×５．０ｃｍ，Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）カラムに供し、３．５ｍｌのＰＢＳでＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ／γ−ＰＧＡ）を溶出した。次にこの画分を２．５Ｌの超純水に対して３日間透析した。その間、超純水の交換を６回行った。透析後、濃縮し、凍結乾燥した。糖残基置換度（%）の計算は１Ｈ−ＮＭＲより、γ−ＰＧＡのβおよびγ位プロトンとＮ−アセチル基の積分比（Ａ）と５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬＡｃＮＡｃ）３のアグリコン部位のプロトン６個分の積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、糖残基置換度４４%のＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）３／γ−ＰＧＡ）を収量３８．６ｍｇで得た。
【０１４８】
糖残基置換度（％）＝（４×１００）／（Ａ−（Ｂ／６ｘ９））
【０１４９】
［６−４］３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／γ−ＰＧＡの合成
受容体基質として上記［６−３］で合成したＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）３／γ−ＰＧＡ）［４４%，  ４３００ｋＤａ］  ５．６ｍｇを（ＬａｃＮＡｃ）３−単位当たり８．０ｍＭ、供与体基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  １６．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＢＳＡ  ０．１%、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＭとなるよう調整した。次に、反応液に対し１０Ｕ／ｍｌのアルカリフォスファターゼおよび４０ｍＵ／ｍｌのα２，３−シアリルトランスフェラーゼを添加し、３７℃で４８時間反応を行った。続いて、この反応液を合成例３の「３−４」と同様の方法で処理した。シアリル化率は１Ｈ−ＮＭＲより、５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）３のアグリコン部位のプロトン８個分の積分比（Ａ）と、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルとアキシアルプロトンの積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率１００%の３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／γ−ＰＧＡを収量６．０ｍｇで得た（図９）。
【０１５０】
シアリル化率（％）＝（（Ｂ／２）×１００）／（Ａ／８）
【０１５１】
［６−５］６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／γ−ＰＧＡの合成
受容体基質として前記［６−３］で合成したＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）３／γ−ＰＧＡ）［４４%，  ４３００ｋＤａ］  ５．５ｍｇを（ＬａｃＮＡｃ）３−単位当たり８．０ｍＭ、供与体基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  １６．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＢＳＡ  ０．１%、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＭとなるよう調整した。次に、反応液に対し１０Ｕ／ｍｌのアルカリフォスファターゼおよび４０ｍＵ／ｍｌのα２，６−シアリルトランスフェラーゼを添加し、３７℃で４８時間反応を行った。続いて、この反応液を合成例３の［３−５］と同様の方法で処理した。シアリル化率は１Ｈ−ＮＭＲより、５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−（ＬａｃＮＡｃ）３のアグリコン部位のプロトン８個分の積分比（Ａ）と、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルとアキシアルプロトンの積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率１００%の６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／γ−ＰＧＡを収量５．４ｍｇで得た（図１０）。
【０１５２】
シアリル化率（％）＝（（Ｂ／２）×１００）／（Ａ／８）
【０１５３】
［合成例７］
６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ−Ｌａｃ／γ−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／γ−ポリグルタミン酸））の調製
【０１５４】
［７−１］５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ（Ｌａｃ−５ＡＰ−ＴＦＡ）の合成
基質としてｌａｃｔｏｓｅ（５４．３ｇ，１５１ｍｍｏｌ）と５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏ−１−ｐｅｎｔａｎｏｌ（３０．０ｇ，１５１ｍｍｏｌ）とを５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０（１５１ｍｌ）に溶解し、そこへガラクトシダーゼを除去したＴ．ｒｅｅｓｅｉ由来セルラーゼ（４５００Ｕ）を加えて反応を開始した。反応液を激しく振とう（２００ｒｐｍ）し、４０℃で１２０時間反応を行った後、１００℃、１０分間の煮沸により反応を停止した。反応液を濃縮後、クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５で平衡化（１０ｍｌ／ｍｉｎ）したＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ  カラムクロマトグラフィー（φ４．５×５０ｃｍ）に供し同溶媒で溶出し、２３ｍｌ／ｔｕｂｅずつ分取してＴＬＣ（クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５）で分析した。目的画分を含む画分を濃縮し、重水に溶解して１Ｈ−ＮＭＲにより構造解析した結果、５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅを収量８４９ｍｇ、収率１．０%で得た。
【０１５５】
［７−２］ＬａｃＮＡｃ−Ｌａｃ−５ＡＰ−ＴＦＡの合成
１０ｍＭ  Ｌａｃ−５ＡＰ−ＴＦＡ（１００ｍｇ）、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ  塩化マンガン、１５ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、３Ｕ／ｍＬ  ＣＩＡＰ、０．３Ｕ／ｍＬ  β１，３−ＧｌｃＮＡｃ転移酵素を含む溶液２０ｍｌを２０℃、４２時間インキュベーションした。３分間の煮沸により反応を停止した後、当該反応停止液に終濃度がそれぞれ２０ｍＭ、１２ｍＭになるよう塩化マンガン、ＵＤＰ−ガラクトースを添加し、０．１Ｕ／ｍＬ  β１，４−ガラクトース転移酵素存在下、３７℃、２０時間の反応を行った。３分間の煮沸後、遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により残さを取り除いた後、得られた上清を蒸留水で平衡化したクロマトレックスカラム（２００ｍｌ、富士シリシア化学（株））にアプライした。４００ｍｌ蒸留水で水洗後、２０％メタノールで目的物質を溶出させ、これをエバポレーター濃縮、真空乾燥（５０℃）行うことでＬａｃＮＡｃ−Ｌａｃ−５ＡＰ−ＴＦＡ粉末１０８ｍｇを取得した。
【０１５６】
［７−３］ＬａｃＮＡｃ−Ｌａｃ−５ＡＰの調製
ＬａｃＮＡｃ−Ｌａｃ−５ＡＰ−ＴＦＡ  ９８．９ｍｇを１Ｍ  水酸化ナトリウム４００ｍｌに溶解し、室温で３０分間撹拌した。反応の終了をＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４：５：１、アニスアルデヒドで呈色）で確認した後、０．５Ｍ  塩化水素でｐＨ５．５に調整した。反応液を蒸留水で５ｍｌにした後、蒸留水で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）、１５０ｍｌ）を用いて精製を行った。目的物の溶出位置をＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４：５：１、アニスアルデヒドで呈色）により確認した後、目的画分を回収し、エバポレーター濃縮、真空乾燥（５０℃）を行うことでＬａｃＮＡｃ−Ｌａｃ−５ＡＰ粉末を１０３ｍｇ回収した。
【０１５７】
［７−４］ＬａｃＮＡｃ−Ｌａｃ／γ−ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ  β−５―ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／γ−ＰＧＡ）の合成
ＬａｃＮＡｃ−Ｌａｃ−５ＡＰ  ９２．７ｍｇ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール無水（ＨＯＢｔ）  １５ｍｇ、γ−ＰＧＡ  １３ｍｇ、トリエチルアミン  １５μｌを蒸留水  １ｍｌ、ＤＭＦ  ０．８ｍｌで完全に溶解させた後、この溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）  ５８ｍｇを添加し、室温で一晩撹拌した。反応液に１ｍｌの蒸留水を添加後、０．５Ｍ  水酸化ナトリウム溶液を１ｍｌ添加することでｐＨ１１に調整し、室温で１時間撹拌した。塩基処理液を透析チューブに入れ、４００ｍｌ蒸留水で２回透析を行った。透析内液を回収後、蒸留水で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラム（８ｍｌ）にかけ、回収画分を更に４００ｍｌ蒸留水で３回、４００ｍｌ超純水で３回の透析を行った。透析内液を回収し、ＡＧ５０Ｗ樹脂カラム（６ｍｌ、ナトリウム型、バイオラッド）を用いてナトリウム塩に置換した後、エバポレーターにより濃縮した。得られた濃縮液を凍結乾燥することでＬａｃＮＡｃ−Ｌａｃ−５ＡＰ／γ−ＰＧＡを４４．４ｍｇ取得した。なお、１Ｈ−ＮＭＲ分析により、糖残基置換率（ＤＳ）は５５％であった。
【０１５８】
［７−５］６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ−Ｌａｃ／γ−ＰＧＡの合成
５０ｍＭ  カコジル酸緩衝液（ｐＨ６．０）、２．５ｍＭ  塩化マンガン、２０ｍｇ  ＬａｃＮＡｃ−Ｌａｃ−５ＡＰ／γＰＧＡ、２０ｍＭ  ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡ，２０Ｕ／ｍＬ  ＣＩＡＰ、０．０２Ｕ／ｍＬ  α２，６−シアル酸転移酵素（カルビオケム社）を含む溶液２ｍｌを３７℃で４４時間インキュベーションした後、１分間煮沸した。遠心分離（２０，０００ｘｇ，１０分）により残さを取り除いた後、上清を超純水平衡化ゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０，８ｍｌ）にかけた。目的画分を回収し、これを４００ｍｌ蒸留水で３回、４００ｍｌ超純水で３回の透析を行った。透析内液を回収後、ＡＧ５０Ｗ樹脂カラム（６ｍｌ、ナトリウム型）を用いてナトリウム塩に置換した後、エバポレーターにより濃縮した。得られた濃縮液を凍結乾燥することで６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ−Ｌａｃ／γＰＧＡを２２．１ｍｇ取得した。なお、１Ｈ−ＮＭＲ分析により、シアル酸化率は９４％であった（図１１）。
【０１５９】
試験例１
３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／α−ＰＧＡ、３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡ、および３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／α−ＰＧＡ並びに６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／α−ＰＧＡ、６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡ、および６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／α−ＰＧＡのin  vitroにおけるインフルエンザウイルス感染阻害活性の測定
インフルエンザウイルスとして、Ｈｕｍａｎ  ｓｔｒａｉｎ  Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（感染価  ２−６ＨＡＵ）、Ｈｕｍａｎ  ｓｔｒａｉｎ  Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８  （Ｈ３Ｎ２）（感染価  ２−６ＨＡＵ）、Ａｖｉａｎ  ｓｔｒａｉｎ  Ａ／Ｄｕｃｋ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／３１３／４／７６（Ｈ５Ｎ３）（感染価  ２−３ＨＡＵ）を、感染させる細胞としてＭａｒｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ（ＭＤＣＫ）を用いた。
【０１６０】
１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地にて１．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液に調製したＭＤＣＫ細胞を９６ｗｅｌｌプレートに０．１ｍｌずつまきこみ、３７℃で一晩培養した。翌日、インフルエンザウイルス溶液を上記の感染価となるようにＳｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ＭＥＭ（ＳＦ−ＭＥＭ）で希釈した。希釈したウイルス溶液と段階希釈した阻害剤溶液を別のマイクロプレート上にて等量ずつ混合し、４℃にて１時間プレインキュベーションした。
【０１６１】
細胞培養ｗｅｌｌをＳＦ−ＭＥＭで３回リンスした後、プレインキュベーション溶液を細胞に感染させた。感染は３４．５℃で３０分間行った。ウイルス−阻害剤溶液を除いた後、ＳＦ−ＭＥＭで細胞を３回洗浄、Ｏｖｅｒｌａｙ  ｍｅｄｉｕｍ（０．５％トラガガントガム、０．２％ＢＳＡ含有ＭＥＭ）をｗｅｌｌに加え、３４．５℃で２０〜２４時間培養した。
【０１６２】
培養終了後、Ｏｖｅｒｌａｙ  ｍｅｄｉｕｍを除き、１００％ＭｅＯＨで室温、１０分間細胞を固定した。ＰＢＳで３回リンスした後、１次抗体としてマウス抗ＮＰ単クローン抗体（クローンＨ１６：Ｌ１０−４Ｒ５）を室温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回リンスした後、２次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体を室温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回リンスした後、コニカイムノステイン（ＨＲＰ−１０００）試薬を加えて、感染細胞を検出した。光学顕微鏡下で感染細胞（青色の細胞集団、フォーカス）を計数した。各サンプル、各濃度において三重測定した。阻害剤を入れなかった場合のフォーカス数の平均を１００％とした時の書く阻害剤濃度での相対的なフォーカス数の割合を求めた。
【０１６３】
Ｈｕｍａｎ  ｓｔｒａｉｎ  Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルス感染阻害実験の結果を図１２に、Ｈｕｍａｎ  ｓｔｒａｉｎ  Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）ウイルス感染阻害実験の結果を図１３に、Ａｖｉａｎ  ｓｔｒａｉｎ  Ａ／Ｄｕｃｋ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／３１３／４／７６（Ｈ５Ｎ３）の結果を図１４に示す。なお、化合物であるシアロ糖鎖含有ポリマーの濃度は、ポリマー自体のモル濃度で示す。また、試験１ではコントロールとして、ＬａｃＮＡｃの繰り返し単位が異なる３種類のアシアロ糖鎖含有αポリグルタミン酸ポリマー（ＬａｃＮＡｃ／α−ＰＧＡ、（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡ、α−ＰＧＡ、（ＬａｃＮＡｃ）３／α−ＰＧＡ）を用いた。図１２〜図１４で明らかのように、α２，６−結合型のシアロ糖鎖含有ポリマーは、ヒトインフルエンザウイルスに対し特異的に感染阻害を起こし、一方、α２，３−結合型シアロ糖鎖含有ポリマーは、トリインフルエンザウイルスに対して特異的に感染阻害を起こすことが確認された。
【０１６４】
また、ポリラクトサミン型シアロ糖鎖含有ポリマー（Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡ、およびＳｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／α−ＰＧＡ）は、従来のＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ型ポリマー（ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／α−ＰＧＡ）の１／１０あるいは１／１００の濃度で感染阻害を起こしており、ポリラクトサミン型シアロ糖鎖含有ポリマーが従来のＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ型ポリマーの１０から１００倍高い感染阻害活性を有すること確認された。
【０１６５】
試験例２
６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／α−ＰＧＡおよび６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／α−ＰＧＡのインフルエンザウイルスのin  vivoにおける動物感染阻害活性の測定
感染させるウイルスとしては、Ｈｕｍａｎ  ｓｔｒａｉｎ，  Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）を、対象動物としてはＢＡＬＢ／ｃマウス（ｆｅｍａｌｅ、５ｗｅｅｋｓ）を使用し、マウス６匹を一投与群とした。シアロ糖鎖含有ポリマー溶液とウイルス溶液を等量ずつよく混合した後（ウイルスタイターはｆｉｎａｌで２ｘ１０４ｐｆｕ／ｍｌ、最終シアロ糖鎖含有ポリマー濃度（糖鎖単位）は１５μＭとした）、マウスの鼻腔内に片側２５μｌずつ、マウス１匹当たり５０μｌ投与した。
【０１６６】
コントロールであるアシアロ糖鎖含有ポリマー（ＬａｃＮＡｃ／α−ＰＧＡおよび（ＬａｃＮＡｃ）３／α−ＰＧＡ）および６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／α−ＰＧＡを用いた場合、感染１６日めで全てのマウスが死に至ったのに対し、６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／α―ＰＧＡを投与したマウス群は、１匹のマウスが死亡したのみで、残りの５匹は生存した。
【０１６７】
試験例３
シアロ糖鎖含有ポリマーのin  vitroにおける抗ヒトインフルエンザウイルス活性の測定
抗インフルエンザウイルス活性は、ＣＰＥ抑制法（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２，２４３−２４８（１９９１））で試験した。ただし、感染させるウイルスはヒトインフルエンザウイルス（Ａ  ｓｔｒａｉｎ  Ｉｓｈｉｋａｗａ（Ｈ３Ｎ２））を用い、感染させる細胞は前述のＭＤＣＫ細胞を使用し、また感染させるウイルス量は５０ＴＣＩＤ５０及び１０２ＴＣＩＤ５０の２系列で検討した。また、ポジティブコントロールとしてリバビリンを使用した。
【０１６８】
その結果、表２に示すように、従来の６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／α−ＰＧＡの抗インフルエンザウイルス活性は弱く、それに対し本発明におけるα−ＰＧＡ骨格ポリラクトサミン型シアロ糖鎖含有ポリマーおよびγ−ＰＧＡ骨格シアロ糖鎖含有ポリマーは高い抗インフルエンザウイルス活性を有することが確認された。
【０１６９】
【表２】
2008031156.tif 000017
【０１７０】
試験例４
３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／γ−ＰＧＡ、３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／γ−ＰＧＡ、３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／γ−ＰＧＡ、並びに６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／α−ＰＧＡ、６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡ、および６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／α−ＰＧＡのin  vitroにおけるインフルエンザウイルス感染阻害活性の測定
１．実験操作
フォーカスアッセイ法によるインフルエンザウイルス感染価の測定
培養用９６ウェルマイクロプレートにＭＤＣＫ細胞を１．５×１０５個／ｗｅｌｌの細胞数となるように播き込み、コンフレントになるまで３７℃で培養した。０．１μＭ  ｚａｎａｍｉｖｉｒ含有ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ（ＳＦ）−ＭＥＭ培地で希釈したウイルス（ヒトＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）株）とポリマーを混合した溶液を４℃、１時間静置させた。ＭＤＣＫ細胞をｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ（ＳＦ）−ＭＥＭ培地で１００μｌ／ｗｅｌｌずつ３回洗浄後、ウイルス−ポリマー混合溶液を５０μｌ／ｗｅｌｌとなるように加え、３４．５℃、３０分間、ＣＯ２インキュベーター内で感染させた。感染後、各ウェルをＳＦ−ＭＥＭ培地で１００μｌ／ｗｅｌｌずつ３回洗浄し、０．２％ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｕｂｍｉｎ（ＢＳＡ）、０．５％ｔｒａｇａｃａｎｔｈ  ｇｕｍ含有ＭＥＭ培地を５０μｌ／ｗｅｌｌとなるように加え、３４．５℃、ＣＯ２インキュベーターで約２０時間培養した。培養終了後、培地を除き、ｅｔｈａｎｏｌを１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように加え、室温で１０分間静置し、細胞を固定化した。Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で１００μｌ／ｗｅｌｌずつ３回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で希釈した抗ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ単クローン抗体溶液を５０μｌ／ｗｅｌｌとなるように加えて室温、１時間静置した。ＰＢＳで１００μｌ／ｗｅｌｌずつ３回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体溶液を５０μｌ／ｗｅｌｌとなるように加えて、室温、１時間静置した。反応後、ＰＢＳで１００μｌ／ｗｅｌｌずつ３回洗浄し、ＯＰＤ発色基質溶液（１００ｍＭ  Ｃｉｔｒａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ５．５、０．４ｍｇ／ｍｌ  ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、０．０１２％Ｈ２Ｏ２）を５０μｌ／ｗｅｌｌとなるように加え、室温で静置した。発色後、反応停止液（１Ｎ  ＨＣｌ）を０μｌ／ｗｅｌｌとなるように加えた。吸光度をマイクロプレートリーダーで、測定波長４９２ｎｍ、対照波長６３０ｎｍにて測定した。ポリマーを反応させずにウイルス感染を行ったウェルの吸光度を１００％とした時の各ポリマー反応時の吸光度を相対的感染価として求めた。グラフの横軸にポリマー自体のモル濃度を示した。
【０１７１】
２．実験結果
図１５に示すように、いずれのポリマーおいても内部糖鎖（ＬａｃＮＡｃ）を伸長させることでインフルエンザウイルス感染阻害効果が増強されることが観察された。特に、（ＬａｃＮＡｃ）を３回繰り返し有するポリマーの効果が最大であった。なお、図中「３’ＳＬＮ１」は３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／γ−ＰＧＡ、「３’ＳＬＮ２」は３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／γ−ＰＧＡ、「３’ＳＬＮ３」は３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／γ−ＰＧＡを示す。また、「６’ＳＬＮ１」は６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ／γ−ＰＧＡ、「６’ＳＬＮ２」は６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／γ−ＰＧＡ、「６’ＳＬＮ３」は６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／γ−ＰＧＡを示す。
【０１７２】
製剤例１
本発明の有効成分であるシアロ糖鎖含有ポリマーを精製水に溶解後、必要によりクエン酸、リン酸水素二ナトリウム等を加え、本発明の点鼻適用製剤（液剤）を得る。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】図１は、３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡのＮＭＲチャートを示す。
【図２】図２は、６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／α−ＰＧＡのＮＭＲチャートを示す。
【図３】図３は、３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／α−ＰＧＡのＮＭＲチャートを示す。
【図４】図４は、６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／α−ＰＧＡのＮＭＲチャートを示す。
【図５】図５は、３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）／γ−ＰＧＡのＮＭＲチャートを示す。
【図６】図６は、６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）／γ−ＰＧＡのＮＭＲチャートを示す。
【図７】図７は、３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／γ−ＰＧＡのＮＭＲチャートを示す。
【図８】図８は、６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）２／γ−ＰＧＡのＮＭＲチャートを示す。
【図９】図９は、３’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／γ−ＰＧＡのＮＭＲチャートを示す。
【図１０】図１０は、６’−Ｓｉａｌｙｌ（ＬａｃＮＡｃ）３／γ−ＰＧＡのＮＭＲチャートを示す。
【図１１】図１１は、６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ−Ｌａｃ／γ−ＰＧＡのＮＭＲチャートを示す。
【図１２】図１２は、試験例１のＨｕｍａｎ  ｓｔｒａｉｎ  Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルス感染阻害実験の結果を示す。
【図１３】図１３は、試験例１のＨｕｍａｎ  ｓｔｒａｉｎ  Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）ウイルス感染阻害実験の結果を示す。
【図１４】図１４は、試験例１のＡｖｉａｎ  ｓｔｒａｉｎ  Ａ／Ｄｕｃｋ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／３１３／４／７６（Ｈ５Ｎ３）の結果を示す。
【図１５】図１５は、試験例４のフォーカスアッセイ法によるインフルエンザウイルス感染阻害活性測定の結果を示す。
【図１】
2008031156.tif 000026
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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