(57)【要約】 【課題】  骨格筋または脂肪組織に特異的な移行能を有する物質と、これを利用したドラッグデリバリーシステムを提供する。【解決手段】  塩基性アミノ酸残基を３〜６残基、並びに疎水性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸以外の親水性アミノ酸残基を少なくとも１残基含む、脂肪組織又は骨格筋に特異的な移行能を有するヘプタペプチド、また該ヘプタペプチドが結合した、脂肪組織特異的な移行能を有するリポソーム。本発明のペプチドは、脂肪組織に対する特異的な移行能を有しており、これを脂質膜の表面に結合させたリポソームを脂肪組織にターゲッティングさせる能力を有している。また、このリポソームはエンドソームから細胞質への脱出能を有していることから、該リポソームにII型糖尿病に対する治療薬を内包させることで、II型糖尿病の治療に有効なドラッグデリバリーシステムとなり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基性アミノ酸残基を３〜６残基、並びに疎水性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸以外の親水性アミノ酸残基を少なくとも１残基含む、脂肪組織又は骨格筋に特異的な移行能を有するヘプタペプチド。
【請求項２】
疎水性アミノ酸がロイシン、イソロイシン又はプロリンである、請求項１に記載のヘプタペプチド。
【請求項３】
親水性アミノ酸がグルタミン、スレオニン、メチオニン、セリン又はアスパラギンである、請求項１に記載のヘプタペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列がIRQRRRRである、請求項１に記載のヘプタペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のヘプタペプチドが結合したリポソーム。
【請求項６】
脂肪組織特異的な移行能を有する請求項５に記載のリポソーム。
【請求項７】
カベオラを経由した細胞内移行能を有する請求項５に記載のリポソーム。
【請求項８】
ヘプタペプチドが結合した脂質を含む、請求項５に記載のリポソーム。
【請求項９】
ヘプタペプチドが、該ヘプタペプチドに付加されたシステイン残基及びマレイミド化された親水性ポリマーを介して結合した脂質を含む、請求項８のリポソーム
【請求項１０】
さらにヘプタペプチドが結合していない親水性ポリマーと結合した脂質を含む、請求項８又は９に記載のリポソーム。
【請求項１１】
ヘプタペプチドが結合した脂質を、リポソームを構成する脂質総量あたり５〜10モル％含む、請求項８〜１０のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項１２】
ヘプタペプチドが結合していない親水性ポリマーと結合した脂質を、リポソームを構成する脂質総量あたり５〜10モル％含む、請求項１０に記載のリポソーム。
【請求項１３】
親水性ポリマーがポリアルキレングリコールである、請求項９〜１２のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項１４】
塩基性アミノ酸残基を３〜６残基、並びに疎水性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸以外の親水性アミノ酸残基を少なくとも１残基含むヘプタペプチドをリポソームに結合させて、カベオラを経由した細胞内移行能を有するリポソームを製造する方法。
【請求項１５】
ヘプタペプチドのアミノ酸配列がIRQRRRRである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪組織に対して特異的な移行能を有するペプチド、及び該ペプチドを有するリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、大きくI型糖尿病とII型糖尿病とに分けられる。I型糖尿病はインスリン要求性糖尿病 (IDDM)とも呼ばれ、膵臓ランゲルハンス島が炎症等を起こしてβ細胞によるインスリン分泌能が著しく低下することにより発症する糖尿病で、インスリンを補充しなくては生存できないインスリン依存型の病像を呈する。一方のII型糖尿病は、インスリン非依存性糖尿病 (NIDDM)とも呼ばれ、肥満、過食、運動不足、ストレス等の環境因子の関与が大きく、中年以降の比較的高齢の肥満者に発症しやすい。
【０００３】
II型糖尿病における非インスリン抵抗性は、本来インスリン応答性の末梢組織である骨格筋や脂肪組織が、インスリン抵抗性を獲得することに起因するとされている。よって、II型糖尿病治療などの疾患治療を行う上で、糖代謝に大きく関与する骨格筋や脂肪組織へ薬物や遺伝子等を送達させるデリバリーシステムを構築する事は、重要な課題である。
【０００４】
蛋白質、薬物あるいは遺伝子等の物質を生物個体の標的部位に送達する為のシステムの一つとして、レトロウイルス、アデノ関連ウイルス等のウイルスベクター系が開発されている。このウイルスベクター系は、一般に標的細胞に対する特異性に優れる一方、抗原性や特に毒性等の問題が指摘されている。
【０００５】
ウイルスに代わるデリバリーシステムとして、リポソームベクターが知られている。リポソームは人工的に調製される脂質二重膜を基本構成とするベクターで、様々な物質を内包して標的細胞内に送り込む能力を有している。しかし、標的細胞に対する特異性に乏しく、薬物等の標的細胞への送達効率は高くない。そのため、リポソームに標的細胞への特異性を付与する様々な方法が研究され、報告されている。
【０００６】
例えば、リポソームを構成する脂質膜の表面に親水性ポリマーを結合させ、血中滞留性を高めることで、腫瘍細胞に対する取り込みを向上させる方法が報告されている（特許文献１）。また、特定の細胞に対する特異性を高める方法として、標的細胞の表面に存在する蛋白質、例えば受容体蛋白質や抗原に対する特異リガンドを脂質膜の表面に結合させたリポソームも報告されている（特許文献２）。
【０００７】
しかしながら、II型糖尿病治療に有用な、骨格筋や脂肪組織へ薬物や遺伝子等を送達させるための、骨格筋や脂肪組織に対する特異的に優れたデリバリーシステムは構築されていない。
【特許文献１】特開平１−２４９７１７号
【特許文献２】特開平４−３４６９１８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、骨格筋あるいは脂肪組織に対して特異性を有するリガンド、ならびに該リガンドを用いた、骨格筋又は脂肪組織へ薬物や遺伝子等を送達させるための、II型糖尿病治療に有用なデリバリーシステムを提供する。
【０００９】
本発明者らは、動物個体を用いたファージディスプレイ法を行い、骨格筋又は脂肪組織に対して特異性を有するペプチドリガンドの探索を試み、特定のオリゴペプチドが脂肪組織に対して高い特異性を有していることを見出し、下記の各発明を完成した。
【００１０】
（１）塩基性アミノ酸残基を３〜６残基、並びに疎水性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸以外の親水性アミノ酸残基を少なくとも１残基含む、脂肪組織又は骨格筋に特異的な移行能を有するヘプタペプチド。
【００１１】
（２）疎水性アミノ酸がロイシン、イソロイシン又はプロリンである、（１）に記載のヘプタペプチド。
【００１２】
（３）親水性アミノ酸がグルタミン、スレオニン、メチオニン、セリン又はアスパラギンである、（１）に記載のヘプタペプチド。
【００１３】
（４）アミノ酸配列がIRQRRRRである、（１）に記載のヘプタペプチド。
【００１４】
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のヘプタペプチドが結合したリポソーム。
【００１５】
（６）脂肪組織特異的な移行能を有する（５）に記載のリポソーム。
【００１６】
（７）カベオラを経由した細胞内移行能を有する（５）に記載のリポソーム。
【００１７】
（８）ヘプタペプチドが結合した脂質を含む、（５）に記載のリポソーム。
【００１８】
（９）ヘプタペプチドが、該ヘプタペプチドに付加されたシステイン残基及びマレイミド化された親水性ポリマーを介して結合した脂質を含む、（８）に記載のリポソーム
（１０）さらにヘプタペプチドが結合していない親水性ポリマーと結合した脂質を含む、（８）又は（９）に記載のリポソーム。
【００１９】
（１１）ヘプタペプチドが結合した脂質を、リポソームを構成する脂質総量あたり５〜10モル％含む、（８）〜（１０）のいずれかに記載のリポソーム。
【００２０】
（１２）ヘプタペプチドが結合していない親水性ポリマーと結合した脂質を、リポソームを構成する脂質総量あたり５〜10モル％含む、（１０）に記載のリポソーム。
【００２１】
（１３）親水性ポリマーがポリアルキレングリコールである、（９）〜（１２）のいずれかに記載のリポソーム。
【００２２】
（１４）塩基性アミノ酸残基を３〜６残基、並びに疎水性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸以外の親水性アミノ酸残基を少なくとも１残基含むヘプタペプチドをリポソームに結合させて、カベオラを経由した細胞内移行能を有するリポソームを製造する方法。
【００２３】
（１５）ヘプタペプチドのアミノ酸配列がIRQRRRRである、（１４）に記載の方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のペプチドは、脂肪組織に対する特異的な移行能を有しており、これを脂質膜の表面に結合させたリポソームを脂肪組織にターゲッティングさせる能力を有している。また、このリポソームはエンドソームから細胞質への脱出能を有していることから、該リポソームにII型糖尿病に対する治療薬を内包させることで、II型糖尿病の治療に有効なドラッグデリバリーシステムとなり得る。さらに、IRQRRRRというアミノ酸配列からなるヘプタペプチドは、これをリポソームに結合させることで、リポソームをカベオラ経由で細胞に移行させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明のペプチドは、塩基性アミノ酸残基を３〜６残基、並びに少なくとも一つの疎水性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸以外の親水性アミノ酸残基を含む、脂肪組織特異的な移行能を有するヘプタペプチドである。
【００２６】
これらのペプチドは、ラットに対するファージディスプレイ法によって、ラット骨格筋並びに脂肪組織から回収される、タイター価の高いファージが提示するオリゴペプチドである。
【００２７】
本発明のヘプタペプチドの特徴の一つは、塩基性アミノ酸残基を３〜６残基を有していることである。塩基性アミノ酸はアルギニン（R、Arg）又はリジン（K、Lys）のいずれでもよいが、Argの使用が好ましい。
【００２８】
また、本発明のヘプタペプチドのもう一つの特徴は、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基又は親水性アミノ酸残基を有していることである。好ましい疎水性アミノ酸は、ロイシン（L、Leu）、イソロイシン（I、Ile）またはプロリン（P、Pro）であるが、バリン（V、Val）やフェニルアラニン（F、Phe）その他の疎水性アミノ酸であってもよい。また親水性アミノ酸は、グルタミン（Q、Gln）、スレオニン（T、Thr）、メチオニン（M、Met）、セリン（S、Ser）、アスパラギン（N、Asn）等である。
【００２９】
好ましいヘプタペプチドは、塩基性アミノ酸残基を４残基以上含み、疎水性アミノ酸及び親水性アミノ酸をそれぞれ１残基含むヘプタペプチドであり、さらに好ましくは、疎水性アミノ酸残基がイソロイシンであり、親水性アミノ酸残基がグルタミンである。
【００３０】
なお、３〜６残基の塩基性アミノ酸残基、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基又は親水性アミノ酸残基は、ヘプタペプチドのアミノ酸配列上、どの様な順序で出現してもよく、塩基性アミノ酸残基は連続して出現しても、あるいは不連続に出現してもよい。
【００３１】
本発明で、脂肪細胞に対して特異性の高いヘプタペプチドは、アミノ酸配列がIRQRRRRであるヘプタペプチド（以下、これをIRQペプチドとする）である。IRQペプチドは、後に実施例で示すように、これを結合させたリポソームを脂質細胞に対して特異的に誘導する機能を示す。
【００３２】
特にIRQペプチドは、実施例で示すように、該ペプチドを結合させたリポソームに対して、カベオラを介して細胞内に取り込ませる機能を付与することができる。カベオラは膜ミクロドメインの一つであり、細胞膜に存在し、特定の脂質とタンパク質からなる直径数十nm程度の小さな窪み構造（直径〜50nm）である。カベオラは糖脂質とコレステロールに富み、コレステロールに結合し自己会合するカベオリンというこの構造に特徴的な膜蛋白質によって形成されており、エンドサイトーシスがおこる部位の一つとして、特に血管内皮細胞においてトランスサイトーシスを介して血管側から基底膜側に物質を輸送する上で有用な機構であることが示唆されている。従って本発明のIRQペプチドは、正常組織実質細胞へ遺伝子やsiRNAなどの機能分子を送達するためのデリバリーシステムの構築に、極めて有用である。
【００３３】
なお、本発明にいうヘプタペプチドは、塩基性アミノ酸残基を３〜６残基、並びに疎水性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸以外の親水性アミノ酸残基を少なくとも１残基含み、脂肪組織又は骨格筋に特異的な移行能を有する限り、ヘプタペプチドにさらに１若しくは数個のアミノ酸残基が付加あるいは挿入されたペプチドも含むものである。
【００３４】
例えば後述するように、本発明のヘプタペプチドをリポソームに結合させる際に、ヘプタペプチドにチオール基を有するアミノ酸残基を付加あるいは挿入することもあるが、かかるペプチドも依然として本発明のヘプタペプチドに含まれる。
【００３５】
本発明のヘプタペプチドは、一般的な遺伝子組み換え手法を用いて組み換え的に生産してもよく、また広く市販され、利用されているペプチド合成機等の機器を用いて化学的に合成してもよい。なお、組み換え的生産、化学的合成いずれも、当業者により広く知られている一般的な手法を利用すればよく、本発明のヘプタペプチドの合成に際して、格別な工夫は必要ではない。
【００３６】
本発明のもう一つの態様は、上記に説明したヘプタペプチドが結合した、脂肪組織特異的な移行能を有するリポソームである。好ましい態様は、ヘプタペプチドが結合した脂質を含むリポソームであり、より好ましい態様は、該ヘプタペプチドのＣ末端に付加されたシステイン残基及びマレイミド化されたポリエチレングリコールを介して結合した脂質を含むリポソームである。
【００３７】
リポソームは、人工的に調製される脂質膜を基本構成とするベクター粒子である。この脂質膜を構成させる際に、薬物、蛋白質、DNA、アンチセンスRNA、siRNAその他の生理活性物質を膜に内包させることができる。この様にして生理活性物質を内包したリポソームは、主に細胞のエンドサイトーシスによってエンドソームに取り込まれることで、内包する生理活性物質を細胞に取り込ませることが出来る。このリポソームの原理において重要な特性の一つは、目的とする細胞に特異的に取り込まれることであり、またもう一つは、エンドソームに取り込まれた後に、エンドソームから細胞質あるいは核、ミトコンドリアその他のオルガネラに特異的に移動することである。
【００３８】
本発明のヘプタペプチド、特にIRQペプチドが結合したリポソームは、脂肪組織に特異的な移行能を有し、またエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれた後に、細胞質に移動する能力も有していることが明らかとなった。このエンドサイトーシスはカベオラを介して行われる。この様なリポソームに対して、糖尿病、特にII型糖尿病の治療に有効な種々の薬物、蛋白質、DNA、アンチセンスRNA、siRNAその他の生理活性物質を内包させることで、脂肪組織特異的にかかる生理活性物質を到達させることが出来る、優れたデリバリーシステムとして利用可能である。特に、IRQペプチドが結合したリポソームはカベオラを介してデリバリーされることから、正常組織実質細胞への遺伝子やsiRNAなどの機能分子を送達するためのデリバリーシステムとして極めて有用である。
【００３９】
本発明のリポソームは、上記に説明したヘプタペプチド以外は、脂質層を構成する必須成分である脂質（リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等）、任意成分である膜安定化剤、抗酸化剤、荷電物質、膜タンパク質等の、一般的なリポソームを構成する従来公知の成分から構成される。
【００４０】
リン脂質としては、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等のホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等のホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、又はこれらの水素添加物等を挙げることができる。
【００４１】
糖脂質としては、例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等のグリセロ糖脂質、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質を挙げることができる。また、ステロールとしては、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール等の動物由来ステロール、フィトステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来のステロール、チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロールを挙げることができる。
【００４２】
飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸を挙げることができる。
【００４３】
脂質の配合量は、リポソームの脂質層を構成する成分の総量に対して、50〜100％（モル比）、好ましくは70〜100％（モル比）、さらに好ましくは85〜100％（モル比）である。
【００４４】
また、本発明のリポソームの脂質層にアニオン性脂質を含ませることで、リポソームに対して核内移行能を付与することも可能である。特に、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジル酸又はカルジオリピンから選ばれるアニオン性脂質の利用が好ましい。アニオン性脂質を含有させる場合には、脂質層に含有される総脂質量の20〜80モル％に相当する量となるように添加することが好ましい。
【００４５】
膜安定化剤は、脂質膜を物理的又は化学的に安定させたり、脂質膜の流動性を調節したりするために添加される、任意成分である。その配合量は、リポソームの脂質層を構成する成分の総量に対して、０〜50％（モル比）の範囲で適宜調節することが出来る。好適な膜安定化剤は、グリセリン又はトリオレイン、トリオクタノイン等とグリセリンの脂肪酸エステルである。
【００４６】
抗酸化剤は、脂質膜の酸化を防止するために添加される任意成分である。その配合量は、リポソームの脂質層を構成する成分の総量に対して、０〜10％（モル比）の範囲で適宜調節することが出来る。抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等を挙げることができる。
【００４７】
荷電物質は、脂質膜に正又は負の荷電を付与するために添加される任意成分である。その配合量は、リポソームの脂質層を構成する成分の総量に対して、０〜95％（モル比）の範囲で適宜調節することが出来る。
【００４８】
正の荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族アミン、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和カチオン性合成脂質等を挙げることができる。負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。
【００４９】
膜タンパク質は、脂質膜の構造を維持したり、脂質膜に機能性を付与したりするために添加される任意成分である。その配合量は、リポソームの脂質層を構成する成分の総量に対して、０〜10％（モル比）、好ましくは０〜８％（モル比）、さらに好ましくは０〜５％（モル比）である。
【００５０】
本発明のリポソームは、前記ヘプタペプチドが結合したリポソーム構成成分を含むリポソーム、好ましくはペプタペプチドが結合した上記に例示される脂質を含むリポソームである。より好ましくは、ヘプタペプチドに付加したシステイン残基を介してマレイミド化された親水性ポリマーの一部に結合し、さらにこの親水性ポリマーがリポソームの構成成分、特に脂質と結合した構造を有するリポソームである。
【００５１】
親水性ポリマーとヘプタペプチドとは、親水性ポリマーが有する官能基と、ヘプタペプチドが有する官能基との間に共有結合を形成させて結合させることができる。一般的に、共有結合を形成できる官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基／カルボキシル基、アミノ基／ハロゲン化アシル基、アミノ基／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基／ベンゾトリアゾールカーボネート基、アミノ基／アルデヒド基、チオール基／マレイミド基、チオール基／ビニルスルホン基等が挙げられるが、本発明のヘプタペプチドの場合には、３以上の塩基性アミノ酸残基を含むペプチドであることから、ヘプタペプチドにチオール基を有するアミノ酸残基を新たに付加させ、このチオール基を用いて親水性ポリマーと結合させることが好ましい。
【００５２】
チオール基を有するペプチド、あるいはシステイン等のチオール基を有するアミノ酸残基を付加させたペプチドを、チオール基を介して親水性ポリマー、典型的にはポリアルキレングリコールに結合させる方法、ならびにこの様な親水性ポリマーと脂質との結合は、Luら（J. Controlled release、2006年、第110巻、第505-513頁）によって報告されている。本発明のリポソームは、このLuらの方法を利用して調製することができるが、かかる方法には限定されない。チオール基を有するアミノ酸残基の付加は、ヘプタペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側のいずれでもよい。また、ヘプタペプチドのＮ末端あるいはＣ末端以外の部分にチオール基を有するアミノ酸残基を挿入してもよい。従って、本発明のヘプタペプチドは、塩基性アミノ酸残基を３〜６残基、並びに疎水性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸以外の親水性アミノ酸残基を少なくとも１残基含む、脂肪組織又は骨格筋に特異的な移行能を有する限り、１若しくは数個のアミノ酸残基が付加あるいは挿入されたヘプタペプチドを含むものである。
【００５３】
本発明のリポソームは、ヘプタペプチドが結合した脂質、好ましくはヘプタペプチドが親水性ポリマーを介して結合した脂質を、リポソームを構成する脂質総量あたり０．１〜15％（モル比）、好ましくは１〜10％（モル比）、さらに好ましくは５〜10％（モル比）含むことが好ましい。後の実施例に示すように、ヘプタペプチドが結合した脂質をリポソームを構成する脂質総量あたり10％（モル比）以上含んでも、脂肪組織への特異的移行能に大きな変化は見られない。
【００５４】
また、本発明のリポソームは、ヘプタペプチドが結合していない親水性ポリマーと結合した脂質をさらに含むことが好ましい。一般的には、ペプチドが結合していない親水性ポリマーと結合した脂質をリポソームに含ませることで、リポソームの血中滞留能が向上することが知られているが、本発明のリポソームでは、ペプチドが結合していない親水性ポリマーと結合した脂質をリポソームに含ませることで、リポソームの脂肪組織以外の組織への非特異的移行の抑制が出来る。本発明におけるヘプタペプチドが結合していない親水性ポリマーと結合した脂質の含有量は、リポソームを構成する脂質総量あたり５〜10％（モル比）とすることが好ましい。この範囲の含有量において、リポソームの脂肪組織以外の組織への非特異的移行の抑制が観察される。
【００５５】
本発明の好適な態様において利用される親水性ポリマーは、一般的にリポソームの血中滞留性を向上させる機能を有することが知られているものであれば、いずれも利用可能である。その様な例としては、ポリエチレングリコール 、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレングリコール、ポリヘキサメチレングリコール等のポリアルキレングリコール、その他デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナン等を挙げることができる。
【００５６】
本発明において好ましい親水性ポリマーはポリアルキレングリコールであり、特にポリエチレングリコールが好ましい。ポリアルキレングリコールの分子量は、300〜10000、中でも500〜10000、特に1000〜5000であることが好ましい。
【００５７】
本発明のリポソームは、MLV（多重膜リポソーム、Multi Layer Vesicle）、SUV（small unilamellar vesicle）、LUV（large unilamellar vesicle）、GUV（giant unilamellar vesicle）等のいずれの形態であってもよい。また本発明のリポソームのサイズは直径30〜1000nmであればよく、好ましくは直径50〜300nmであればよいが、これらには特に限定されない。
【００５８】
本発明のリポソームは上記の様にその構成に特徴を有するが、調製は通常の方法に基づいて行うことが出来る。通常の方法としては、単純水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法等を挙げることができる。また、多重膜リポソームから単一膜リポソームへの転換、あるいはその逆の変換も可能である。
【００５９】
本発明のリポソームの内部には、細胞内に送達しようとする目的物質を封入することができる。目的物質としては、糖尿病、特にII型糖尿病の治療に有効な薬物、核酸、ペプチド、タンパク質又はこれらの複合体等を挙げることができる。目的物質が水溶性である場合には、脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に目的物質を溶解することで、リポソーム内部の水相に目的物質を封入することができる。また、目的物質が脂溶性である場合には、リポソームの製造の際に使用する有機溶剤に目的物質を溶解させることで、リポソームの脂質層に目的物質を封入することができる。
【００６０】
本発明のリポソームは、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液等の適当な水性溶媒に分散させて使用することができる。分散液には、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を適宜添加してもよい。また本発明のリポソームは、上記の分散液を乾燥させた状態で保存することが出来る
また、本発明のリポソームは経口投与することができ、また静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与も可能である。
【００６１】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６２】
実施例１  脂肪組織特異的な移行能を有するペプチドの決定
１）ファージディスプレイ
任意の塩基配列を有する合成DNA（21ヌクレオチド：７アミノ酸相当）がM13ファージのコート蛋白質pIIIをコードするDNAの５’末端に挿入された、New England Biolabs社製Ph.D.ファージライブラリー2x1011pfuをBalb/cマウスに尾静脈投与した。このファージは、５’末端に挿入された合成ＤＮＡにコードされる７アミノ酸に相当する任意のペプチド配列をファージ粒子外側に提示する特徴を有する。投与10分後、心臓より100mlのPBS/EDTAを潅流し、組織に結合せずに血管内に残っているファージを除去した。
【００６３】
大腿部より筋肉組織と脂肪組織とを摘出し、20 mM Hepes, 250 mM Sucrose, 1 mM EDTA, 10 mg/mL aprotinin, 10 mg/mL Leupeptin, 1 mM PMSFを含むhomogenate buffer 中でそれぞれホモジナイズした。ホモジナイズ後の上清中のM13ファージのタイターを測定した。また、回収されたファージを大腸菌株ER2738培養液200mLに感染させて増殖させたファージを、PEG/HClによって沈殿させ、回収した。以上のファージの感染、増殖、精製の各操作は、New England Biolabs社製Ph.D.ファージライブラリーキットの添付文書に従った。
【００６４】
回収したファージを1.5 mLの 50mM Tris-HCl; pH7.5, 150 ml NaClを含むTBS solutionに懸濁した。15000 r.p.m (TOMY MX-200)にて10分間４℃で遠心分離を行い、上清にファージ懸濁液を回収した。
【００６５】
新しい遠心チューブに1.5 mLの高濃度CsCl溶液（0.93 g/mL in TBS）を加え、その上から上記ファージ懸濁液1.5 mLを重層し、さらに低濃度CsCl溶液（0.47 g/mL in TBS）1.5 mLを重層して、チューブ内を満たし、265,000×ｇ、15℃で15時間遠心した。
【００６６】
遠心後、ＵＶ照射によって確認したファージ由来のバンドをシリンジを用いて回収し、TBSバッファーに対して透析を行い、初回回収ファージを得た。
【００６７】
2x1011pfuの初回回収ファージをBalb/cマウスに尾静脈投与し、上記の操作を繰り返して、2nd回収ファージを得た。さらに2x1011pfuの2nd回収ファージをBalb/cマウスに尾静脈投与し、再び上記の操作を繰り返して3rd回収ファージを得た。
【００６８】
それぞれの回収ファージのタイターを測定したところ、図１（筋肉組織）及び図２（脂肪組織）に示すように、回を重ねるごとに、筋肉組織、脂肪組織それぞれより回収されるファージのタイターが上昇することが確認された。
【００６９】
両組織からの3rd回収ファージをそれぞれ、プレート上に蒔いた大腸菌ER2738に感染させ、96個づつのプラークを回収して、ペプチドをファージ粒子外側に提示している96種類のファージを得た。得られたファージDNAを回収し、ファージ粒子外側に提示されているペプチドのアミノ酸配列を決定した。これら９６種類のペプチドを、表１（筋肉組織）、表２（脂肪組織）に示す。
【表１】
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【表２】
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【００７０】
２）ペプチドの配列解析
96種類のペプチドから任意の一つのペプチドを選択し、他の95種類のペプチド全てと総当たりでアミノ酸残基の出現頻度を検索し、95種類のペプチド中で７アミノ酸残基のうち３以上の同一アミノ酸残基を有するペプチドがいくつ存在するかを調べ、その数を当該任意のペプチドについてのFrequency Valueと規定した。アミノ酸残基の出現頻度の評価については、出現の順序は考慮せず、共通する３以上のアミノ酸残基が連続してあるいは等間隔に存在していれば可とした。この基準に従って得られた96アミノ酸全てのFrequency Valueを図３（骨格筋）、図４（脂肪組織）に示す。この中から、Frequency valueが20以上のペプチドを選択した（表３：骨格筋、表４：脂肪組織）。
【表３】
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【表４】
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【００７１】
また、上記とは別に、96種類のペプチドから任意の一つのペプチドを選択し、他の95種類のペプチド全てと総当たりでアミノ酸残基の出現頻度を検索し、95種類のペプチド中で７アミノ酸残基のうち５以上の同一アミノ酸残基を有するペプチドが存在するものを選択した。アミノ酸残基の出現頻度の評価については、出現の順序は考慮せず、共通する５以上のアミノ酸残基が連続してあるいは等間隔に存在していれば可とした。
【００７２】
この基準に適合し、かつ上記のFrequency Valueが20に満たないペプチドを表５（骨格筋）、表６（脂肪細胞）に示す。
【表５】
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【表６】
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【００７３】
３）ペプチドの選択
表２と表５に示すファージそれぞれ1x1010pfu/mouseをラット尾静脈内よりインジェクションし、投与10分後、心臓より100mlのPBS/EDTAを潅流した。筋肉組織を摘出し、ホモジナイズを行った後、上清中のファージのタイターを測定した。なお、コントロールとして、Ph.D.ファージライブラリーのセレクション前のファージ（non-selective phage）を用いた。
【００７４】
その結果、図５に示すように、Clone95、52、12、30、37、8、47で高い筋肉組織への蓄積が確認された。特に、Clone52はコントロールに比べて10倍程度の高い蓄積を示した。
【００７５】
実施例２  ペプチド結合型リポソームの調製
１）リポソームの調製
Luら（前述）の方法に従い、Clone 52のC末端にシステインを付加したペプチドIRQRRRRC（以下IRQペプチドと呼ぶ）と、マレイミド基を結合させたポリエチレングリコール（Mal-PEG）とDi Stearyl Phosphatidyl Ethanolamine（DSPE）との結合体（Mal-PEG-DSPE）とを、それぞれ10mMとなるように純水中に溶かし、スターラーで撹拌しながら室温で２４時間インキュベーションした。
【００７６】
インキュベーション後の反応液5 μlに100 μlのacetonitrile/0.1% TFAを加えて希釈し、そのうちの50μLを等量のmatrix sinapinic acid (3,5-dimethoxy-4-hydroxy cinnamic acid) 溶液（10 mg/mL in acetonitrile/0.1% TFA）と混合し、さらにイオン化促進剤として少量のNaClを加えた試料をスライドにのせ、室温にて乾燥を行った後、MALDI-TOF MS測定を行い、IRQペプチドがMal-PEG-DSPEに結合した脂質IRQ−Mal-PEG-DSPEを確認した。
【００７７】
ホスファチジルコリン（EPC）／コレステロール（Chol）=2:1の組成からなる脂質に総脂質の５％に相当するMal-PEG-DSPEを加えた脂質から、さらに前記総脂質の５％に相当するMal-PEG-DSPEの一部を漸次IRQ-Mal-PEG-DSPEに置換した脂質から、それぞれ単純水和法にてリポソームを調製した。またリポソームの体内動態を解析する為に、トレーサー量(30μCi)の[3H]cholesteryl hexadecyl ether(CHE)をリポソーム調製時に加えて、リポソームをラベルした。
【００７８】
上記のリポソームを尾静脈よりインジェクションし、24時間後に各リポソームの血中残存量を測定した。その結果、IRQ-Mal-PEG-DSPEの置換率の増加に伴って、当該リポソームの血中残存量の低下が観察された（図６）。
【００７９】
一方、筋肉組織並びに脂肪組織へのリポソームの蓄積を観察した結果、IRQ-Mal-PEG-DSPEの含有量が増加しても筋肉組織へのリポソームの蓄積量の増加は認められず（図７)、むしろ脂肪組織での当該リポソームの蓄積量が増加していた（図８）。また、IRQ-Mal-PEP-DSPEの脂質総量に対する含有量を10％にしても、脂肪組織、肺への蓄積の格別な上昇は認められなかった（図９）
IRQ-Mal-PEG-DSPEを含むリポソームは、上記の条件において、IRQペプチドの含有量に依存して肺にも移行する事が明らかとなった（図１０）。そこで、IRQ-Mal-PEP-DSPEの脂質総量に対する含有量を５％に固定し、さらにMal-PEG-DSPEを加えたリポソームを調製し、その体内動態を解析したところ、Mal-PEG-DSPEの含有量を5%、10%と増加させるに従って、肺へのリポソームの蓄積を抑制できる事が確認された(図１１)。同条件で、脂肪組織へのリポソームの蓄積は殆ど変化しなかったことから、IRQ-Mal-PEP-DSPEの含有量が、脂肪へリポソームを蓄積させる決定因子である事が示された。
【００８０】
２）リポソームの細胞内動態解析
上記４）で調製した、IRQ-Mal-PEP-DSPEを含むリポソームがエンドソーム脱出能力を有するか否かについて、共焦点レーザー顕微鏡を用いて評価を行った。10 mMのローダミンを内部に封入したIRQ-Mal-PEP-DSPEを含むリポソームを上記４）に記載の方法に準じて調製した。このリポソーム75.7μｇをDMEM培地でコンフルエントにまで増殖させたNIH3T3細胞１×１０５個に添加し、１時間あるいは３時間インキュベーションを行った。共焦点レーザー顕微鏡による観察の30分前に、ライソセンサー（Lysosenser、Invitrogen社製）を２μMになるように加え、さらに37oCで30分間インキュベーションを行った。この後、共焦点レーザー顕微鏡でリポソームの細胞内局在を観察した結果、１時間、３時間ともに、ライソセンサー（緑に発色する）とローダミンのシグナル（赤に発色する）が重なるドットも認められたが、ローダミン単独（赤のみ）が観察されるものも多く存在した(図１２)。この事より、本ペプチドは、エンドソームから細胞質画分に移行していることが示された。
【００８１】
３）リポソームの取込経路の確認
ホスファチジルコリン（EPC）／コレステロール（Chol）=7:3の組成からなる脂質に、総脂質の５％に相当する４）で調製した脂質IRQ−Mal-PEG-DSPE（PEGはPEG2000）及び総脂質の１モル％に相当するRho-DOPE（Avanti社）を加え、単純水和法によってRho-DOPEでラベルされたリポソーム（IRQ-Lip）を調製した。また、比較対照として、IRQペプチドに換えてオクタアルギニンのC末端にシステインを付加したペプチド（R8ペプチド）を用い、前記４）に記載の方法に従って脂質R8−Mal-PEG-DSPE（PEGはPEG2000）を調製し、さらに脂質IRQ−Mal-PEG-DSPEに換えてR8−Mal-PEG-DSPEを用い、上記の方法に従ってRho-DOPEでラベルされたリポソーム（R8-Lip）を調製した。
【００８２】
また、脂質IRQ−Mal-PEG-DSPEに換えてステアリン酸を付加したIRQペプチド（STR-IRQ)を用いてRho-DOPEでラベルされたリポソーム（STR-IRQ-Lip）を、脂質IRQ−Mal-PEG-DSPEに換えてステアリン酸を付加したR8ペプチド（STR-R8-Lip）を用い、上記の方法に従ってRho-DOPEでラベルされたリポソーム（STR-R8-Lip）を、それぞれ調製した。
【００８３】
NIH3T3細胞２×１０５個を、10％牛胎児血清を含む2mLのDMEM培地／3.5cm plastic plate dish（3.5cm）に添加して一日静置した後、培地を除去し、細胞を1mLのPBSで洗浄した。無血清のDMEM培地に洗浄後の細胞を懸濁し、5mMのアミロライド、0.4Mのスクロース、１μg/mLのfilipin IIIをそれぞれ添加して37℃で１時間インキュベーションした細胞を用意した。ここに上記に示した各種リポソームをRho-DOPEの最終量が0.05mM／dishとなるように別々に加えてさらに37℃で1時間インキュベートした。細胞をPBSで1回、20units/mLのヘパリンを含む氷冷PBSで３回洗浄、Krebs緩衝液で１回洗浄した。Krebs緩衝液に懸濁した細胞の核をSyto-24（最終濃度0.5μM）で染色した後、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。
【００８４】
その結果を下記表に示す。＋＋は顕著なリポソームの取込阻害が観察されたことを、＋は弱い取込阻害が観察されたことを、−は殆ど取込阻害が確認されなかったことを示す。
【００８５】
2008031142.tif 000008
【００８６】
アミロライド及びスクロースはマクロピノサイトーシスおよびクラスリン介在性エンドサイトーシスの阻害剤であり、またfilipin IIIはカベオラ経由のエンドサイトーシスの阻害剤であることから、IRQペプチドを結合させたリポソームの細胞内への取込はカベオラ経由で行われることが明らかとなった。
【００８７】
実施例３  siRNAを封入したリポソームの調製
１）ルシフェラーゼの発現を抑制することの出来る抗ルシフェラーゼsiRNA（McCaffreyら、Nature、2002年、第418巻、第38-39頁）を0.5μg/μLの濃度で含む水溶液 (18μL)を２μg/μLのSTR-R8水溶液（9μL）に徐々に滴下し、 siRNAコア（N/P比は2.9）を調製した。DOPE（Avanti社）とCHEMS（Sigma社）を9:2でクロロホルムに溶解した混合溶液をガラスチューブに入れて乾燥させ、先の脂質封入体（最終脂質濃度0.05mM）を含むプラスに荷電させた水0.25mLを加え、1分間超音波処理して、IRQ-MEND1（siRNAとSTR-IRQを含む、DOPEとCHEMSからなるmulti functional envelop type nano device)を作製した。また、上記の操作をPA（Sigma社）とCHEMSを2:7でクロロホルムに溶解した混合溶液について行い、IRQ-MEND2（siRNAとSTR-IRQを含む、PAとCHEMSからなるmulti functional envelop type nano device)を作製した。
【００８８】
２）ルシフェラーゼを安定に発現しているHela細胞（５ｘ１０４個／（10％牛胎児血清を含むDMEM培地））に対して、１）で作製した各MENDをdiRNAの最終量が0.4μgとなるように加え、lipofectamine2000（Invitrogen社）を用いて該細胞を形質転換させた。３時間後、血清を含むDMEM培地1mLを加え、37℃で24時間培養した後に、それぞれの細胞のルシフェラーゼ活性を測定した（図１３）。
【００８９】
コントロール細胞におけるルシフェラーゼ活性を100としたときの発現抑制（％）を確認したところ、IRQ-MENDにおいて50％の、IRQ-MEND2において30％の発現抑制促成が確認された。またIRQ-MEND2の脂質膜をNakamuraらの方法（Nakamura T et al.、Biol Pharm.Bull.、2006年、第29巻、第6号、第1290-1293頁）に従って２重膜に換えたところ、52％にまで発現抑制が上昇した。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】ファージディスプレイ法により骨格筋より回収されるファージのタイターの変化を示す。
【図２】ファージディスプレイ法により脂肪組織より回収されるファージのタイターの変化を示す。
【図３】骨格筋より回収されるファージが呈するペプチド９６種類についてのFrequency Valueを示す。
【図４】脂肪組織より回収されるファージが呈するペプチド９６種類についてのFrequency Valueを示す。
【図５】表３のペプチドを呈するファージを用いたファージディスプレイ法によって回収されるファージのタイターを示す。
【図６】本発明のリポソームを尾静脈よりインジェクションした24時間後の、該リポソームの血中残存量を示す。
【図７】本発明のリポソームにおける、IRQ-Mal-PEP-DSPEの含有量とリポソームの骨格筋への移行能との関係を示す。
【図８】本発明のリポソームにおける、IRQ-Mal-PEP-DSPEの含有量とリポソームの脂肪組織への移行能との関係を示す。
【図９】本発明のリポソームにおける、IRQ-Mal-PEP-DSPEの含有量とリポソームの脂肪組織への移行能との関係を示す。
【図１０】本発明のリポソームにおける、IRQ-Mal-PEP-DSPEの含有量と肺組織への移行能との関係を示す。
【図１１】本発明のリポソームにおける、Mal-PEP-DSPEの含有量と肺組織への移行能との関係を示す。
【図１２】本発明のリポソームを取り込んだ繊維芽細胞におけるローダミンならびにサイソセンサーの発色を示す。
【図１３】siRNAを封入したリポソームによる、ルシフェラーゼ発現の抑制効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１２】
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【配列表】
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