(57)【要約】【課題】本発明は発芽玄米含有成分の新たな機能を見出すことを課題とし、安全かつ有効な神経障害若しくは糖尿病性神経障害予防若しくは改善剤又は機能性食品の提供を課題とする。【解決手段】本発明は、発芽玄米全脂質画分を有効成分とする神経障害若しくは糖尿病性神経障害予防若しくは改善剤又は機能性食品を提供する。【選択図】図4
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
発芽玄米脂質画分を有効成分とする神経障害予防又は改善剤。
【請求項２】
発芽玄米脂質画分が発芽玄米のクロロホルム-メタノール可溶成分である請求項1に記載の剤。
【請求項３】
神経障害が糖尿病性神経障害である請求項1に記載の剤。
【請求項４】
神経障害が有髄神経の損傷である請求項1に記載の剤。
【請求項５】
神経障害が神経膜由来ナトリウム/カリウムATPase活性の低下である請求項1に記載の剤。
【請求項６】
神経障害が血清由来HDL中のHTase活性の低下を伴ったものである請求項1に記載の剤。
【請求項７】
発芽玄米脂質画分を有効成分とする神経障害予防又は改善機能性食品。
【請求項８】
発芽玄米脂質画分が発芽玄米のクロロホルム-メタノール可溶成分である請求項7に記載の機能性食品。
【請求項９】
神経障害が糖尿病性神経障害である請求項7に記載の機能性食品。
【請求項１０】
神経障害が有髄神経の損傷である請求項7に記載の機能性食品。
【請求項１１】
神経障害が神経膜由来ナトリウム/カリウムATPase活性の低下である請求項7に記載の機能性食品。
【請求項１２】
神経障害が血清由来HDL中のHTase活性の低下を伴ったものである請求項7に記載の機能性食品。
【請求項１３】
発芽玄米脂質画分を投与することからなる神経障害の予防又は治療方法。
【請求項１４】
発芽玄米脂質画分が発芽玄米のクロロホルム-メタノール可溶成分である請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
神経障害が糖尿病性神経障害である請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
神経障害が有髄神経の損傷である請求項13に記載の方法。
【請求項１７】
神経障害が神経膜由来ナトリウム/カリウムATPase活性の低下である請求項13に記載の方法。
【請求項１８】
神経障害が血清由来HDL中のHTase活性の低下を伴ったものである請求項13に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は発芽玄米に含まれる脂質画分の利用に関し、さらに詳しくは発芽玄米に含まれる脂質画分の糖尿病性神経障害を予防又は改善する用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病患者数は、2000年の統計ではアジアでは8,450万人、世界では1億5,100万人である。日本では2002年の厚生労働省糖尿病実態調査によれば、糖尿病患者とその予備軍が1,620万人にのぼり、実に成人の6.3人に1人にあたる。また、患者数は2015年にはアジアでは1億3,230万人、世界では2億2,100万人に達すると予測されている(非特許文献1参照)。
【０００３】
糖尿病(とうにょうびょう、Diabetes Mellitus: DM)は、糖代謝の異常によって起こるとされ、血液中のグルコース濃度が病的に高まることによって、様々な特徴的な合併症をきたすか、きたす危険性のある病気である。ここで、合併症とはその病気がもとになって起こる病気や症状のことをいう。糖尿病自体には重篤な自覚症状がなく、合併症を引き起こすまで治療を受けず病態を悪化させる場合が多い。
【０００４】
糖尿病の合併症としては、脳梗塞、脳卒中、心筋梗塞、糖尿病腎症、下肢閉塞性動脈硬化症、糖尿病網膜症、皮膚疾患、感染症、糖尿病性神経障害、高脂血症、脳血管性痴呆症などがあり、中でも糖尿病腎症、糖尿病網膜症、糖尿病性神経障害は三大合併症と呼ばれる。
【０００５】
糖尿病の原因としては、遺伝的な要因によるものもあるが、食事などの生活習慣に起因するものが大半を占め、健康食品・機能性食品に対する期待は高まっている。近年、発芽玄米の糖尿病の合併症に対する有用性が注目され、高脂血症の改善効果、心臓血管系疾患の予防(血栓形成抑制)、糖尿病腎症の予防効果などが報告されている。
【０００６】
ここで、発芽玄米は玄米を発芽させたもので、出芽の状態がおよそ1mm未満のものをいう。発芽の過程で、降圧作用や抗ストレス作用が知られているγ-アミノ酪酸(γ-aminobutyric acid (GABA))が産生されることが特徴的である。さらに、発芽玄米は豊富な食物繊維、ビタミン、ミネラル、未知の脂質をぬかの層や芽に含んでおり、日本では新しい全粒穀物として、さらには、主食とするための研究対象として一般的である。発芽玄米では様々な健康に対する有用性が研究されており、動物実験においては、ストレプトゾトシン(Streptozotocin (STZ))により誘導された糖尿病ラットの血中グルコース濃度を低下させる作用があることが報告されている(非特許文献2参照)。また、白米と比較して発芽玄米の食事は健常者(非特許文献3参照)及び高血糖の患者(非特許文献4参照)において食後の血中グルコース濃度及びインスリンを低下させることが知られており、糖尿病の予防のための主食としての意義が高いと評価されている。
【０００７】
以上のように、発芽玄米の糖尿病に対する改善効果が調べられているが、糖尿病の三大合併症の一つである、糖尿病性神経障害に対する効果はまだ研究されていない。そこで本発明者らは、糖尿病性神経障害に対する発芽玄米及び玄米の摂取の効果の違いをSTZ誘導糖尿病ラットで調べた。
【０００８】
【特許文献１】特開2001-352916号公報
【特許文献２】特開2002-136263号公報
【特許文献３】特開2002-360192号公報
【非特許文献１】Zimmet P, Alberti KG, Shaw J. Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature. 2001 Dec 13;414(6865):782-7. Review
【非特許文献２】Hagiwara H, Seki T, Ariga T. The effect of pre-germinated brown rice intake on blood glucose and PAI-1 levels in streptozotocin-induced diabetic rats. Biosci Biotechnol Biochem. 2004 Feb;68(2):444-7.
【非特許文献３】Ito Y, Mizukuchi A, Kise M, Aoto H, Yamamoto S, Yoshihara R, Yokoyama J.  Postprandial blood glucose and insulin responses to pre-germinated brown rice in healthy subjects. J Med Invest. 2005 Aug;52(3-4):159-64.
【非特許文献４】Ito Y, Shen M, Kise M, Hayamizu K, Yoshino G, Yoshihara R, Yokoyama J: Effect of pre-germinated brown rice on postprandial blood glucose and insulin level in subjects with hyperglycemia. Jpn J Food Chem 2005;12(2):80-4.
【非特許文献５】Abbott CA, Mackness MI, Kumar S, Boulton AJ, Durrington PN.  Serum paraoxonase activity, concentration, and phenotype distribution in diabetes mellitus and its relationship to serum lipids and lipoproteins.  Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1995 Nov;15(11):1812-8.
【非特許文献６】Silva IV, Caruso-Neves C, Azeredo IM, Carvalho TL, Lara LS, de Mello MC, Lopes AG.   Urea inhibition of renal (NA+ + K+)ATPase activity is reversed by cAMP. Arch Biochem Biophys. 2002 Oct 15;406(2):183-9.
【非特許文献７】Andersen H, Nielsen JF, Nielsen VK. Inability of insulin to maintain normal nerve function during high-frequency stimulation in diabetic rat tail nerves. Muscle Nerve. 1994 Jan;17(1):80-4.
【非特許文献８】Sugimoto K, Yagihashi S. Peripheral nerve pathology in rats with streptozotocin-induced insulinoma. Acta Neuropathol (Berl). 1996;91(6):616-23.
【非特許文献９】Rodrigues Filho OA, Fazan VP. Streptozotocin induced diabetes as a model of phrenic nerve neuropathy in rats. J Neurosci Methods. 2006 Mar 15;151(2):131-8. Epub 2005 Aug 25.
【非特許文献１０】Kosaka T, Yamaguchi M, Motomura T, Mizuno K. Investigation of the relationship between atherosclerosis and paraoxonase or homocysteine thiolactonase activity in patients with type 2 diabetes mellitus using a commercially available assay. Clin Chim Acta. 2005 Sep;359(1-2):156-62.
【非特許文献１１】Chung BH, Wilkinson T, Geer JC, Segrest JP. Preparative and quantitative isolation of plasma lipoproteins: rapid, single discontinuous density gradient ultracentrifugation in a vertical rotor. J Lipid Res. 1980 Mar;21(3):284-91.
【非特許文献１２】Vignini A, Nanetti L, Bacchetti T, Ferretti G, Curatola G, Mazzanti L. Modification induced by homocysteine and low-density lipoprotein on human aortic endothelial cells: an in vitro study. J Clin Endocrinol Metab. 2004 Sep;89(9):4558-61.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発芽玄米は、従来から健康食品として利用されてきているため、安全性も高く長期運用が可能な製剤や食品を提供できる可能性を持つ。さらに、近年、発芽玄米の高脂血症に対する改善効果、心臓血管系疾患の予防(血栓形成抑制)、糖尿病腎症の予防効果などが注目されている。
【００１０】
本発明者らは予備実験において、発芽玄米が糖尿病の三大合併症の一つである糖尿病性神経障害に対する改善効果を有することを見出した。発芽玄米に含まれる当該神経障害に対する改善効果を有する成分を特定し、それを利用することは、人又は動物の健康維持、増進や疾病の予防、治療等に有用であり、本発明は発芽玄米含有成分の新たな機能を見出すことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決すべく、鋭意検討を行った結果、発芽玄米又は発芽玄米のぬかの層に含まれる脂質画分に糖尿病性神経障害を改善することを見出し本発明に至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
(1)発芽玄米脂質画分を有効成分とする神経障害予防又は改善剤。
(2)発芽玄米脂質画分が発芽玄米のクロロホルム-メタノール可溶成分である(1)に記載の剤。
(3)神経障害が糖尿病性神経障害である(1)に記載の剤。
(4)神経障害が有髄神経の損傷である(1)に記載の剤。
(5)神経障害が神経膜由来ナトリウム/カリウムATPase活性の低下である(1)に記載の剤。
(6)神経障害が血清由来HDL中のHTase活性の低下を伴ったものである(1)に記載の剤。
(7)発芽玄米脂質画分を有効成分とする神経障害予防又は改善機能性食品。
(8)発芽玄米脂質画分が発芽玄米のクロロホルム-メタノール可溶成分である(7)に記載の機能性食品。
(9)神経障害が糖尿病性神経障害である(7)に記載の機能性食品。
(10)神経障害が有髄神経の損傷である(7)に記載の機能性食品。
(11)神経障害が神経膜由来ナトリウム/カリウムATPase活性の低下である(7)に記載の機能性食品。
(12)神経障害が血清由来HDL中のHTase活性の低下を伴ったものである(7)に記載の機能性食品。
(13)発芽玄米脂質画分を投与することからなる神経障害の予防又は治療方法。
(14)発芽玄米脂質画分が発芽玄米のクロロホルム-メタノール可溶成分である(13)に記載の方法。
(15)神経障害が糖尿病性神経障害である(13)に記載の方法。
(16)神経障害が有髄神経の損傷である(13)に記載の方法。
(17)神経障害が神経膜由来ナトリウム/カリウムATPase活性の低下である(13)に記載の方法。
(18)神経障害が血清由来HDL中のHTase活性の低下を伴ったものである(13)に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の発芽玄米又は発芽玄米のぬかの層を原料とした脂質抽出物又は脂質画分は、糖尿病性神経障害改善効果を有する。
したがって、本発明によれば糖尿病性神経障害の予防剤又は改善剤として利用することができる。
そして、安全性が高く、継続的な摂取も可能であり、かつ大量に製造することもでき、食品等への添加が容易であることからも、人又は動物の健康増進や疾病予防などとして貢献できる可能性が大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の神経障害予防又は改善効果は、少なくとも発芽玄米を原料として、発芽玄米の脂質画分抽出物から得られる。発芽玄米は、公知の方法により調製することができる(特許文献1、特許文献2、特許文献3参照)。
本発明でいう発芽玄米の脂質画分とは、第一義的には参考例及び実施例で使用した全脂質画分を意味するが、それに限定されるものではない。また、本出願を優先権の基礎とするいかなる出願においても発芽玄米の脂質画分の定義は本出願の定義に限定されるものではない。
発芽玄米の当該全脂質画分には糖脂質、リン脂質、ステロール類、スフィンゴ脂質、γオリザノール、フェルラ酸、疎水性タンパク質などが含まれることが知られている。脂質画分としては全脂質画分を利用することができるが、更に細かく分画した、単一の若しくは複数の物質の混合物からなる脂質画分であってもよい。
【００１５】
脂質画分の抽出方法としては、揮発性有機溶媒若しくはアルコール類、又はそれらの混合物を用いることができる。有機溶媒としてはクロロホルム、アルコール類としてはメタノールを用いるのが効果的であるが、これらに限るものではない。両者の混合比としては、例えば、容積比で1:1から2:1(クロロホルム濃度が50%以上かつ67%以下)が好ましいが、これに限るものではない。5gの発芽玄米に対し30mlのクロロホルム・メタノール混合液(容積比1:1)を用いて1回抽出し、20mlのクロロホルム・メタノール混合液(容積比2:1)を用いて再度抽出し、当該両抽出液を一緒に合わせてから溶媒留去して乾固することによって脂質画分を得ることができる。
【００１６】
得られた当該脂質画分はそのまま用いることもできるが、更にシリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロムマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどの分離方法により単一成分の脂質分子あるいは脂質分子種にまで精製してから用いることもできる。
【００１７】
本発明の脂質画分は、上記の方法により得られた抽出物をそのまま直接使用してもよいが、一般的には適当な液体に溶解するかもしくは分散させ、または、適当な粉末担体と混合するかもしくはこれに吸着させ、場合によっては、さらにこれらに乳化剤、分散剤、懸濁剤、展着剤、浸透剤、湿潤剤、安定剤等を添加し、乳剤、油剤、水和剤、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤等の製剤として使用する。
製剤として使用する場合における、抽出物の使用量は製剤の形態によっても異なるが、有効な投与量であれば良く、安全性に問題がないので特に上限は規定しない。
【００１８】
また、本発明でいう機能性食品とは、発芽玄米脂質画分を有効成分とし、神経障害を予防する機能又は改善する機能を有する食品、あるいは食品の摂取によりこれらの機能の発揮が期待される食品をいい、健康食品、特定保健用食品、栄養機能食品のいずれをも含む。
【００１９】
食品としては、チューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、チョコレート、ビスケットまたはスナック等の菓子、アイスクリーム、シャーベットまたは氷菓等の冷菓、飲料、プリン、ジャム、乳製品、調味料等が挙げられ、これらの食品を目常的に摂取することが可能である。これらの食品に対する本発明の脂質画分の添加量としては、食品の形態によっても異なるが、安全性に問題がないのでその濃度に上限を設ける必要はない。
【００２０】
本発明でいう糖尿病性神経障害とは、糖尿病がもとになって起こる合併症の一つであり、末梢神経障害と自律神経障害のことである。臨床的には初期には手足などのしびれや痛み、慢性期には感覚麻痺、運動神経失調を引き起こす障害である。病理学的には、神経組織のミエリン鞘と軸索の変性と損傷が挙げられる。これらの神経障害は、末梢神経伝導速度の低下、神経軸索膜由来ナトリウム/カリウムATPase(Na, K-ATPase)活性の低下として観察、定量することができる。本発明の発芽玄米の脂質画分の摂取は糖尿病性神経障害改善効果を有する。本発明でいう糖尿病性神経障害の改善効果とは、発芽玄米の脂質画分が有する効果であって、人又は動物の個体、組織、細胞又は体液において、糖尿病性神経障害を原因として低下したナトリウム/カリウムATPase活性又はHTase活性を正常値に近づけるべく上昇させる効果あるいは運動神経伝導速度の低下を防止する効果をいう。ここでいうHTaseとは、動脈硬化の危険因子であるホモシステイン・チオラクトン(homocysteine thiolactone)の加水分解酵素のことであり、パラオキソナーゼ(paraoxonase)ファミリーに分類される。神経障害を伴った患者ではパラオキソナーゼ活性が低下することが報告されていることから(非特許文献5参照)、HTase活性の低下は動脈硬化の危険因子となるだけではなく、神経障害の進行程度にも関連すると考えられている。
【００２１】
本発明でいう神経障害とは、糖尿病性神経障害と同一又は類似の生理学的、細胞組織学的、又は生化学的所見を示す病態をいうが、糖尿病を原因とするものに限られない。すなわち、有髄神経、特に、有髄神経軸索の損傷、運動神経伝導速度の低下、神経膜由来ナトリウム/カリウムATPase活性の低下、又は血清由来HDL中のHTase活性の低下として観察、定量することができる全ての神経障害をいう。
【００２２】
これらの効果は、具体的には以下、参考例1から4において示すように、ラット個体を用いて尾神経の運動神経伝導速度を電気生理学的測定(in vivo)および神経組織の病理学的評価をすることにより、また、実施例1及び2において示すように、糖尿病性神経障害の指標となるナトリウム/カリウムATPase活性を糖尿病ラットの坐骨神経を用いて調べた実験(in vitro)等により本発明の脂質画分の神経障害改善効果を知ることができる。
【００２３】
[参考例1]
発芽玄米、玄米、又は白米を摂取したラットの体重及び血中グルコース濃度比較実験
(実験材料及び方法)
動物実験の設計
ラットはSTZの腹腔内注射を受け、2週間コントロールの飼料(AIN93G)で飼育された。この糖尿病ラットは白米、玄米、発芽玄米の飼料に応じて、それぞれ3群に分けられた。正常のラットもそれぞれ3群に分けられた。その後、3週間、全てのラットは当該実験食と水を自由に摂取できるようにした。実験の最後に、神経障害を評価するために当該ラットを用いて尾の神経伝導速度の測定を行い、さらに、坐骨神経を取り出して病理学的形態評価試験、及びナトリウム/カリウムATPase活性試験を行った。同時に全血清を採取し、生化学解析を行った。以下、適宜、コントロールの飼料のみを与えた正常ラットの群をC群、コントロールの飼料のみを与えた糖尿病のラットの群をDC群と、それぞれ略称する。また、白米、玄米、又は発芽玄米の飼料を与えた正常ラットの群を、それぞれWR、BR、又はPR群と略称し、白米、玄米、又は発芽玄米の飼料を与えた糖尿病のラットの群を、それぞれDWR、DBR、又はDPR群と略称する。
【００２４】
STZ糖尿病ラット及び実験食
体重120-140gの雄ウィスター(Wistar)系ラットに対してSTZ(65mg/kg、クエン酸ナトリウム(100mM 、pH4.5)に溶解。)の腹腔内注射を行った。注射の一週間後に、尾を穿刺して血液サンプルを得た。血中グルコース濃度は、血中グルコースメーター(Accu-Chek Advantage Blood Glucose Meter, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)を用いて測定した。測定は各実験群につき週1回ずつ定期的に22時間の絶食後に行った。
ラットは管理された環境で飼育され、実験はジョージア州立医科大学の実験動物利用に関する指針に従って行われた。
【００２５】
全ての米の飼料及びコントロールの飼料はHarlan Teklad(Madison, WI)によって粉末の飼料として製造された。コントロールの飼料(AIN93G)は、トウモロコシ澱粉、39.7%、αトウモロコシ澱粉13.2%、カゼイン20.0%、L-システイン(L-cystein)0.3%、スクロース10%、大豆油7.0%、セルロースパウダー5.0%、ミネラルミックス3.5%、ビタミンミックス1.0%、コリン・2クエン酸塩(choline bicitrate)0.25%、ブチルヒドロキノン(butylhydroquinone)0.0014%から調製した。発芽玄米、玄米、又は白米の飼料は、トウモロコシ澱粉及びαトウモロコシ澱粉を発芽玄米、玄米、白米で置き換えて調製した。
【００２６】
統計解析
糖尿病ラットの飼料群と正常ラットの飼料群の飼料群間の多重比較は一元配置分散分析(one-way analysis of variance (ANOVA))を実施し、統計的な差異は、パラメトリックならはTukey検定で、ノンパラメトリックならばKruskal-Wallis検定で、評価を行った。0.05以下のp値は統計的に有意とした。さらに、二群比較解析を(糖尿病ラット群ではDC群と他の飼料群、正常ラット群ではC群と他の飼料群で(パラメトリックならばDunnet検定で、ノンパラメトリックならばDunnet検定で))行った。データは平均値±平均標準誤差(SEM)で表した。
【００２７】
(結果)
WR、BR及びPR群の体重は滑らかに増加し、それぞれの飼料の摂取間で特に差が無いことが示された(図1B)。DWR、DBR及びDPR群については、糖尿病に伴う中程度の体重の増加が見られた。正常ラットの場合、米の飼料摂取群(WR、BR及びPR群)とコントロールの飼料摂取群(C群)の間で体重の増加における有意差は見られなかった。ところが、糖尿病ラットの場合、DPR群ではDC群と比較して、統計的に有意な体重の増加の差が見られた(P<0.01, Dunnet検定)。C群及び米の飼料群(WR、BR及びPR)全てについて、血中グルコース濃度は実験期間を通じて正常の範囲内であった(図1A、正常ラットのコントロール飼料食群(C群)については示さず)。一方で、DC群及び糖尿病の米の飼料群(DWR、DBR及びDPR)の血中グルコース濃度は上昇した(DC群については示さず)。DPR群のラットの血中グルコース濃度は最初の3週間は高かったが、その後、DWR及びWBR群と比較して有意に低くなった(p<0.05, Tukey検定)。
【００２８】
(考察)
本発明者らは、以前に報告されているように、発芽玄米と玄米の飼料が血中グルコースの濃度を低下させること及び発芽玄米の飼料は玄米の飼料と比較して糖尿病に有意に高い効果を有することを見出した。
【００２９】
[参考例2]
発芽玄米、玄米、又は白米を摂取したラットの抹消神経障害の改善比較実験
(実験材料及び方法)
尾神経伝導速度
Andersonらが報告した方法を修正して、ラット尾神経の運動神経伝導速度(NCV)を測定した。かかる修正とは、針電極の代わりに、ねじれワイヤー付デジタルリング電極(Medtronic Functional Diagnostics, Skovlunde, Denmark)で刺激することであった。簡単に述べると、尾の付け根から6cmの部位に測定のための電極を巻き、付け根に向かって2cmと5cmの部位に刺激のための電極を巻き、その2箇所から別々に電気刺激をして、電流の到達時間を測定した。NCVは尾の表面温度を34から35℃に保温した状態で測定された。
【００３０】
ナトリウム/カリウムATPase活性のための粗精製坐骨神経膜の調製
粗精製膜は以前に報告された手順(非特許文献6参照)により調製した。簡単に述べると、ラットの坐骨神経を、冷却等浸透圧溶液(250mM スクロース、10mM HEPES-Tris緩衝液(pH7.6)、2mM EDTA、1mM PMSF)中で破砕均質化した。当該均質化した液を10分間4℃で3000rpmで遠心分離し、上澄み液を回収し、さらに45分間45000rpmで遠心分離した。上澄み液を捨てた後に、沈殿を100μlの250mMスクロース溶液(10mM HEPES-Tris緩衝液(pH7.6)に溶解)に懸濁した。
【００３１】
ナトリウム/カリウムATPase活性測定
ナトリウム/カリウムATPase活性は以前の報告(非特許文献6参照)のように測定した。簡単に述べると、ナトリウム/カリウム依存的活性を測定するための、ナトリウム/カリウムATPase活性測定溶液(0.2ml)の組成は10mM MgCl2、20mM HEPES-Tris(pH7.0)、120mM NaCl、30mM KCl、0.5mg/mlの粗精製膜タンパク質、及び25mM [γ-32P]ATP(10,000cpm)であった。別組成の測定溶液として、上記溶液に1mMウワバイン(ouabain)を添加したものも作った。ウワバイン感受性ナトリウム/カリウムATPase活性は、ナトリウム/カリウム依存的活性の値とウワバイン感受性の活性値との差を求めることにより計算した。どちらの測定混合液も37度で15分インキュベートした後、0.1mg/mlの活性炭を加え、15,000rpmで15分間遠心分離した。上澄み液を回収し、無機の32P放射活性をシンチレーションカウンターで測定した。
【００３２】
統計解析
糖尿病ラットの飼料群と正常ラットの飼料群の飼料群間の多重比較は一元配置分散分析(one-way analysis (ANOVA))を実施し、統計的な差異は、パラメトリックならばTukey検定で、ノンパラメトリックならばKruskal-Wallis検定で、評価した。0.05以下のp値は統計的に有意とした。さらに、二群比較解析を糖尿病ラット群ではDC群と他の飼料群(正常ラット群ではC群と他の飼料群)で(パラメトリックならばDunnet検定で、ノンパラメトリックならばDunn検定で)行った。データは平均値±平均の標準誤差(SEM)で表した。
【００３３】
(結果)
糖尿病のラット及び正常ラットのNCV及びナトリウム/カリウムATPase活性は、平均値±平均の標準誤差で表して、表1に示した。コントロールの飼料の糖尿病ラット(DC群)のNCVは正常ラット(C群)と比較して有意に低かった。全ての実験ラットのNCVの値は、糖尿病のラットと正常ラットの両方で、各個体から得た坐骨神経膜画分のウワバイン感受性ナトリウム/カリウムATPase活性と、良い相関が見られた(相関係数r=0.835, n=24、表1、結果は示さず)。この結果から、抹消神経障害の程度を評価するためにNCVの代わりにウワバイン感受性ナトリウム/カリウムATPase活性を用いることができると考えられる。DWR及びDBR群と比較して、DPR群のNCV値は高い値を示し(p<0.05)、末梢神経障害は軽減していると考えられた。DPR群のナトリウム/カリウムATPase活性は糖尿病のコトロール群(DC群)の場合と比較してDunnet検定で有意差が見られた(p<0.01)。
【００３４】
(考察)
本発明者らの実験では糖尿病性神経障害はSTZ処理から5週目で惹起されることが、NCV値の低下、ウワバイン感受性ナトリウム/カリウムATPase活性の低下などで確認された。ナトリウム/カリウムATPase活性値はNCV値と統計的に相関し、末梢運動神経の臨床的重篤度を推測するためのNCV測定の代替法となることが報告されているが(非特許文献7参照)、本件発明の発明者らも同様の結果を得た。このことから、本件発明の実験系においても末梢運動神経障害の程度を評価するため、NCV値の代わりにウワバイン感受性ナトリウム/カリウムATPase活性値を用いることができることがわかった。これは多数の検体を迅速に処理できる点で有利である。
【００３５】
【表１】
2008266326.tif 000003
C、WR、BR、PR、DC、DWR、DBR及びDPRは、それぞれ、コントロール飼料食の正常ラット、白米食の正常ラット、玄米食の正常ラット、発芽玄米食の正常ラット、コントロール飼料食の糖尿病ラット、白米食の糖尿病ラット、玄米食の糖尿病ラット、発芽玄米食の糖尿病ラット、の群を表す。n、検体数;Weight、体重;Glucose、グルコース濃度;NCV、神経伝導速度;ATPase、ATPase 活性値;HTase/HDL、HDL単位量(1ミリグラムのタンパク質)あたりのHTase活性値。値は平均値±平均の標準誤差を表す。同じ行の中で異なる文字(a、b)を付した値の平均値は相互に有意差があった(P<0.05)。*を付した値は、DC群と比較した場合P<0.01であった。**を付した値は、DC群と比較した場合P<0.001であった。
【００３６】
[参考例3]
発芽玄米、玄米、又は白米を摂取したラットの末梢神経形態比較測定解析
(実験材料及び方法)
形態測定解析
右側坐骨神経は動物実験終了時点で屠殺したラットを解剖して採取し、一晩固定液に漬けた。カコジル酸(cacodylate)緩衝液(pH7.2)で3回洗った後、当該神経を2つに切りエポキシ樹脂(Poly/Bed812, Polysciences Inc., Warrington, PA)に埋め込んだ。神経軸索に対して横断面切片を作製し、1%トルイジンブルー(toluidine blue)で染色し、Axicamを搭載したAxiphot光学顕微鏡(Carl Zeiss, Jena, Germany)で観察した。保存した映像はAxioVisionで解析した。それぞれの神経束の有髄神経線維(myelinated fiber)の総数は目視により同定し、数えた。有髄神経線維においては、軸索(axon)の直径及び全線維の直径の両者を測定した。それぞれの直径は長径と短径の平均値として計算した。有髄神経線維の直径、軸索の直径、及びG比率(軸索直径/有髄神経線維直径で算出される軸索直径)を決定し、有髄神経線維・軸索のサイズ頻度およびG比率の変動をそれぞれの分布を表すヒストグラムとして示した。
【００３７】
(結果)
ラット坐骨神経の有髄神経線維の直径、有髄神経軸索(myelinated axon)の直径、及びG比率(ミエリン化の程度の指標)のサイズ頻度分布ヒストグラムをDPR群又はC若しくはDC群の相互間で比較した(図2)。有髄神経線維の直径、有髄神経軸索の直径、G比率には、サイズ分布の比較における横ずれ又は分割によって、同一個体での差および同一郡内での個体間差は無かった。
【００３８】
有髄神経線維のサイズ分布は頂点を6.0μmとする単一形式(頂点が一つ)であり、3群間で統計的に有意な差異は見られなかった。
糖尿病の発芽玄米飼料食群(DPR群)の有髄神経軸索の直径は4.0及び7.0μmを頂点とする双形式(頂点が二つ)に分布した。この分布形式は正常ラットのコントロール飼料食群(C群)の分布形式と類似しており、糖尿病のコントロール飼料食群(DC群)の明らかに左側へ歪んだ分布形式とは大きく異なった。この分布形式はC群に類似するものであった。
G比率(ミエリン化の程度を表す)サイズ分布は3群すべてについて単一形式であったが、C群、DC群、及びDPR群の間で0.7と0.6の間での頂点の移動が見られた。DPR群は0.7を頂点とする単一形式に分布した。この分布形式はC群に類似するものであった。
【００３９】
(考察)
軸索変性及び脱髄(ミエリン損傷)を伴う末梢神経線維の異常が、慢性的な高血糖症のSTZ糖尿病ラットの坐骨神経(非特許文献8参照)及び横隔膜神経(非特許文献9参照)に現れることが報告されている。しかし、本試験の形態測定解析では、STZ糖尿病ラットにおいては軸索の障害がほとんどであり、ミエリンの障害は余りないことが確認された。つまり、C群とDC群の間でミエリンの分布に大きな差が見られなかったのに対し、軸索の分布には差が見られ、糖尿病STZラットモデルにおいては主に軸索が影響を受けていることが分かった。
【００４０】
発芽玄米の餌飼料を与えた糖尿病ラットにおける軸索の直径分布及びG比率(ミエリン化の程度を表す)は、正常ラットのものと似た分布を示した。これらの知見は発芽玄米の摂取によって、糖尿病性神経障害を呈するSTZラットモデルの有髄神経軸索の損傷を防止又は修復しうるということを示している。
【００４１】
[参考例4]
発芽玄米、玄米、又は白米を摂取したラットのHTase活性比較実験
(実験材料及び方法)
HTase測定
ラット血清HDL中のHTase活性は市販の測定キットを用いて測定した(Alfresa Auto HTLase; Alfresa Pharma Corp., Osaka, Japan)。このキットはγ-チオブチロラクトン(thiobutyrolactone)を基質として利用する。HTaseは当該基質のラクトン環を加水分解し、遊離チオール(thiol)基を生成する。チオール基は5,5'-ジチオビス(5,5'-dithiobis (2-netrobenzoic acid))と反応して450nmの吸収で測定される5-チオ-2-ニトロベンゾイック酸(5-thio-2-netrobenzoic acid)を生成する。450 nmの吸収を測定して酵素活性を算出した。
【００４２】
統計解析
糖尿病ラットの飼料群と正常ラットの飼料群の飼料群間の多重比較は一元配置分散分析(one-way analysis (ANOVA))を実施し、統計的な差異は、パラメトリックならばTukey検定で、ノンパラメトリックならばKruskal-Wallis検定で、評価した。0.05以下のp値は統計的に有意とした。さらに、二群比較解析を糖尿病ラット群ではDC群と他の飼料群(正常ラット群ではC群と他の飼料群)で(パラメトリックならばDunnet検定で、ノンパラメトリックならばDunnet検定で)行った。データは平均値±平均の標準誤差(SEM)で表した。
【００４３】
(結果)
糖尿病ラット及び正常ラットのHTaseの血清中濃度又は活性値を表1に平均値±標準誤差(SEM)で示した。
血清HDL中のHTase活性は、以前に報告されたように(非特許文献10参照)、STZ糖尿病のラットでは低下していた。発芽玄米食の糖尿病のラット(DPR群)は、コントロールの飼料(AIN93G)のラット(DC群)と比較して、HTase活性の低下が抑えられていることが統計的に有意な差を持って示された(表1)。
【００４４】
玄米食の糖尿病ラット群(DBR群)及びDPR群の相関解析によると、それぞれのHTase活性はDPR群においてのみナトリウム/カリウムATPase活性との相関が見られ、DBR群においては両者の相関は見られなかった(図3)。
【実施例１】
【００４５】
ラット坐骨神経膜由来ナトリウム/カリウムATPase活性の全脂質画分添加による影響の比較実験
背景技術に記載したように、発芽玄米は発芽の過程において降圧作用や抗ストレス作用が知られるγ-アミノ酪酸(γ-aminobutyric acid (GABA))を産生する。このGABAや様々な有効成分であって玄米には含まれていないものが発芽玄米の脂質画分に含まれることが知られている。なお、本発明の神経障害改善効果を有する成分は、少なくとも、単一の物質としてのGABAではない(データを示さず)。そこで発明者らは、発芽玄米由来及び玄米由来の全脂質画分(以下、発芽玄米由来及び玄米由来のものを、それぞれTLp及びTLbと表す。)に着目し、それぞれが抹消神経障害に対して改善効果を有するかを調べた。参考例2で示したように、抹消神経障害の程度を評価するため、NCVのかわりにウワバイン感受性ナトリウム/カリウムATPase活性を用いることができる。そこで、全脂質画分がウワバイン感受性ナトリウム/カリウムATPase活性に与える影響を調べた。
【００４６】
(実験材料及び方法)
リポタンパク質の分離
リポタンパク質は以前に報告された手順(非特許文献11参照)に準じた方法で得た。。簡単に述べると、正常ラットから採取した新鮮な血清を集め、固体KBrを用いて密度を1.3g/mlに合わせた。上記の調製した血清(1.5ml、1.3g/ml)の上に通常の生理食塩水(3.5ml、1.006g/ml)を重層し、遠心管の中で不連続の密度勾配超遠心を実施した。リポタンパク質はTV865ローターで369548g、4℃、45分間の超遠心により分離した。3種の主なリポタンパク質画分(VLDL、LDL、HDL)を回収し、PBSに対して4℃で一晩透析した。本明細書においてはLDL及びHDLは当該方法で得られたそれぞれの画分を意味する。
【００４７】
全脂質画分の調製
全脂質画分(TLp又はTLb)は5gの発芽玄米又は玄米から、30ml及び20mlのクロロホルム・メタノール(1:1及び2:1、容積比)を用いて2回抽出した。
【００４８】
Hcy-チオラクトンと低密度リポタンパク質(LDL)の反応
試験管内でのLDLのHcy-チオラクトン化は以前に報告された実験条件で行った(非特許文献Vignin参照)。簡単に述べると、適量のLDL溶液(LDLタンパク質、100μg)を10mM PBS(pH8.2)に懸濁し、全体を37℃で優しく掻き混ぜながらHcy-チオラクトン(100μmol/L)及び表示した量の全脂質画分(TLp又はTLb)(0.1から1.0μg)と2時間インキュベートした。インキュベート後に、未反応のHcy-チオラクトンを除去するため、10mM PBS(ph8.2)で平衡させたBio-gel P-2カラムに当該混合液を通した。
【００４９】
ナトリウム/カリウムATPase活性のための粗精製坐骨神経膜の調製
粗精製膜は以前に報告された手順(非特許文献6参照)により調製した。簡単に述べると、ラットの坐骨神経を、冷やした等浸透圧溶液(250mM スクロース、10mM HEPES-Tris緩衝液(pH7.6)、2mM EDTA、1mM PMSF)中で破砕均質化した。当該均質化した液を10分間4℃で3000rpmで遠心分離し、上澄み液を回収し、さらに45分間45000rpmで遠心分離した。上澄み液を捨てた後に、沈殿を100μlの250mMスクロース溶液(10mM HEPES-Tris緩衝液(pH7.6)に溶解)に懸濁した。
【００５０】
ナトリウム/カリウムATPase活性測定
ナトリウム/カリウムATPase活性は以前の報告(非特許文献6参照)のように測定した。簡単に述べると、ナトリウム/カリウム依存的活性を測定するためのナトリウム/カリウムATPase活性測定溶液(0.2ml)の組成は10mM MgCl2、20mM HEPES-Tris(pH7.0)、120mM NaCl、30mM KCl、0.5mg/mlの粗精製膜タンパク質、及び25mM [γ-32P]ATP(10,000cpm)であった。別組成の測定溶液として、上記溶液に1mMウワバイン(ouabain)を添加したものも作った。ウワバイン感受性ナトリウム/カリウムATPase活性は、ナトリウム/カリウム依存的活性の値とウワバイン感受性の活性値との差を求めることにより計算した。どちらの測定混合液も37度で15分インキュベートした後、0.1mg/mlの活性炭を加え、15,000rpmで15分間遠心分離した。上澄み液を回収し、無機の32P放射活性をシンチレーションカウンターで測定した。LDL、Hcy-チオラクトン、及びTLb又はTLpについては図4の簡単な説明に記載した量をLDL、Hcy-チオラクトン、TLb又はTLpの順で反応液中に添加した。
【００５１】
統計解析
各群間の多重比較は一元配置分散分析(one-way analysis of variance (ANOVA))を実施し、その後、統計的な差異はTukey検定を行った。0.05以下のp値は統計的に有意と考えた。
【００５２】
(結果)
正常ラット組織におけるナトリウム/カリウムATPase活性の変化はHcy-チオラクトン(Thiolactone)で修飾したLDLとHcy-チオラクトン(Hcy-thiolactone)をTLp又はTLbとインキュベートすることにより調べた(図4)。Hcy-チオラクトンで修飾したLDLと共にインキュベートした粗精製坐骨神経膜タンパク質サンプルにおいては、修飾していないLDLの場合と比較して、ナトリウム/カリウムATPase活性が有意に低下した(P<0.05)(図4A棒グラフ2,3)。TLpとインキュベートすると、Hcy-チオラクトンで修飾したLDLによって阻害されたナトリウム/カリウムATPase活性が、ある程度回復した(図4A棒グラフ7,8,9)。一方、TLbの場合にはそのような効果は見られなかった(図4A棒グラフ4,5,6)。TLp及びTLbのいずれも単独ではナトリウム/カリウムATPase活性に影響を与えなかった(データを示さず)。
【００５３】
(考察)
本発明者らは、発芽玄米中に末梢神経障害改善効果について玄米よりも高い効能を有する何らかの因子が含まれているかを調べるために、発芽玄米及び玄米のぬかから抽出された全脂質画分(TLp及びTLb)の酵素活性を調べた。Hcy-チオラクトン修飾LDLが、培養ヒト大動脈内皮細胞におけるナトリウム/カリウムATPase活性を低下させることが報告されている(非特許文献12参照)。このことから発明者らは糖尿病性神経障害におけるナトリウム/カリウムATPase活性の低下もLDLのHcy-チオラクトンによる修飾を介しているのではないかと推測した。本発明者らは正常ラットの坐骨神経由来の生体材料においてもHcy-チオラクトン修飾LDLが、ナトリウム/カリウムATPase活性を低下させることを見出した(図4A棒グラフ2,3)。本発明者らの実験に置いては、Hcy-チオラクトンで修飾したLDLにTLp(0.1から10μg)を加えた場合にはナトリウム/カリウムATPase活性の低下が弱かったのに対し、Hcy-チオラクトンで修飾したLDLにTLbを加えた場合には、Hcy-チオラクトンで修飾したLDLの場合と同様のナトリウム/カリウムATPase活性の低下が見られた。TLp及びTLbのいずれも単独ではナトリウム/カリウムATPase活性に影響を与えなかった(データを示さず)。この結果は、TLpには、Hcy-チオラクトンで修飾したLDL中のナトリウム/カリウムATPase活性に対する効果をなくす又は減少させる、何らかの阻害因子が含まれることを示す。
【００５４】
発明者らは発芽玄米の神経障害改善効果が発芽玄米中のどの成分によってもたらされるのかを明らかにするために研究を続けている。将来的には、全脂質画分をさらに細かく分画し、単一の物質又は比較的少数の共同的に働く物質を同定することを目的とする。また、将来的には糖尿病ラットの末梢神経系由来の生体材料を用いて同様の研究を行うことを目的とし、究極的には糖尿病の人又は動物の個体で上記同定された単一の物質又は比較的少数の共同的に働く物質を用いて研究を行うことを目的とする。また、将来的には上記同定された単一の物質又は比較的少数の共同的に働く物質が作用する生体内分子を同定することを目的とする。
【実施例２】
【００５５】
ラット血清由来HDL中のHTase活性の全脂質成分添加による影響の比較実験
参考例4で示したように、糖尿病のラットでは血清由来HTase活性は低下しており、DWR、DBR群及びDC群と比較して、DPR群の場合にのみ当該活性低下が抑えられた(表1)。また、坐骨神経膜由来ナトリウム/カリウムATPase活性はDPR群においてラット血清由来HTase活性との相関が見られた(図3)。そこで、本発明者らは参考例1から4で観察された神経障害の改善効果及び実施例1で観察されたナトリウム/カリウムATPase活性の低下を抑える効果の作用機序を明らかにするためにHDL中のHTase活性に着目した。本発明者らはHTase活性についてもTLpが、TLbと比較した場合に、活性の低下を抑える又は活性を上げる働きがあるかを調べた。HTaseは血清HDL中に存在し、LDLの抗酸化に重要な役割を果たす。
【００５６】
(実験材料及び方法)
リポタンパク質の分離
リポタンパク質は以前に報告された手順(非特許文献11参照)で準備した。簡単に述べると、正常ラットから採取した新鮮な血清を集め、固体KBrを用いて密度を1.3g/mlに合わせた。上記の調製した血清(1.5ml、1.3g/ml)の上に通常の生理食塩水(3.5ml、1.006g/ml)を重層し、超遠心により遠心管の中に不連続の密度勾配を作製した。リポタンパク質はTV865ローターで369548g、4℃、45分間の超遠心により分離した。3種の主なリポタンパク質画分(VLDL、LDL、HDL)を回収し、PBSに対して4℃で一晩透析した。本明細書においてはLDL及びHDLは当該方法で得られたそれぞれの画分を意味する。
【００５７】
全脂質画分の調製
全脂質画分(TLp又はTLb)は5gの発芽玄米又は玄米から、30ml及び20mlのクロロホルム・メタノール(1:1及び2:1、容積比)を用いて2回抽出した。
【００５８】
HTase測定
ラット血清HDL中のHTase活性は市販の測定キットを用いて測定した(Alfresa Auto HTLase; Alfresa Pharma Corp., Osaka, Japan)。このキットはγ-チオブチロラクトン(thiobutyrolactone)を基質として利用する。HTaseはラクトン環を加水分解し、遊離チオール(thiol)基を生成する。チオール基は5,5'-ジチオビス(5,5'-dithiobis (2-netrobenzoic acid))と反応することにより、450nmの吸収で測定される5-チオ-2-ニトロベンゾイック酸(5-thio-2-netrobenzoic acid)を生成した。450 nmの吸収を測定して酵素活性を算出した。TLp及びTLbについては図5の簡単な説明に記載した量を反応液中に添加した。
【００５９】
統計解析
各群間の多重比較は一元配置分散分析(one-way analysis of variance (ANOVA))を実施し、その後、Tukey検定を行った。0.05以下のp値は統計的に有意と考えた。
【００６０】
(結果)
TLp又はTLbがHTase活性に影響を与えるかを調べるために、正常ラットの血清から用意したHDLをHTaseの源として使用した。TLpと共にインキュベートした場合のHTase活性は、TLbの場合又はTLp若しくはTLbの何れも加えなかった場合と比較して、有意な差が見られた(P<0.05)(図4B棒グラフ6,7,8,9)。TLpはHTase活性に対して量依存的(0.1から1.0μg)な促進効果を示し、その効果は5μgで飽和した。一方、TLbは、同じ帯域内で、HTase活性に対して効果を示さなかった(図4B棒グラフ2,3,4,5)。
【００６１】
(考察)
本発明者らは、TLpがHDL中のHTase活性を直接的に強化することも示した。このことから、TLpのナトリウム/カリウムATPase活性の低下を抑える効果はHDL中のHTase活性分子への作用を通じてもたらされる可能性が示唆された。ただし、TLp中の有効成分は単一とは限らないし、当該有効成分の標的分子も単一とは限らない。
また、本実施例によってTLpの摂取が糖尿病性神経障害の症状の一つであるHDL中のHTase活性の低下を改善することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の発芽玄米に含まれる全脂質画分は糖尿病性神経障害を予防又は改善する効果を有する。
したがって、本発明によれば糖尿病性神経障害の予防又は改善剤として利用することができる。
そして、発芽玄米は、従来から健康食品として利用されてきているため、安全性が高く、継続的な摂取も可能であり、かつ大量に製造することもでき、食品等への添加が容易であることからも、人又は動物の健康増進や疾病予防などとして貢献できる可能性が大きい。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図1は発芽玄米食(DPR, n=9)、玄米食(DBR, n=9)、白米食(DWR, n=9)の糖尿病ラット、発芽玄米食(PR, n=6)、玄米食(BR, n=6)、白米食(WR, n=6)の正常ラットの体重(A)及び血中グルコース濃度(B)を表す。それぞれの値は平均値±平均の標準誤差を表す。
【図２】図2は有髄神経線維(A1, B1, C1)、有髄神経軸索(A2, B2, C2)及びG比率(A3, B3, C3)のヒストグラムを表す。(A):コントロールの飼料(AIN93G)を与えられた正常の群(C, n=4)、(B):コントロールの飼料(AIN93G)を与えられた糖尿病の群(DC, n=4)、(C):発芽玄米の飼料を与えられた糖尿病の群(DPR, n=4)。
【図３】図3は(A):玄米の飼料を与えられた糖尿病の群(DBR)、(B):発芽玄米の飼料を与えられた糖尿病の群(DPR)における、HTase活性とナトリウム/カリウムATPase活性の相関を表す。全てのデータポイント(n=9)を含む解析による回帰線を示す。変数間の単純な線形関係を評価するためにはピアソン(Pearson)の相関係数を用いた。
【図４】図4AはHcy-チオラクトンで修飾されたLDLがナトリウム/カリウムATPase活性に与える効果を表す:棒グラフ1、添加物なし;棒グラフ2、LDL;棒グラフ3、LDL+Hcy-チオラクトン;棒グラフ4、LDL+Hcy-チオラクトン+TLb(0.1μg);棒グラフ5、LDL+Hcy-チオラクトン+TLb(1.0μg);棒グラフ6、LDL+Hcy-チオラクトン+TLb(10μg);棒グラフ7、LDL+Hcy-チオラクトン+TLp(0.1μg);棒グラフ8、LDL+Hcy-チオラクトン+TLp(1.0μg);棒グラフ9、LDL+Hcy-チオラクトン+TLp(10μg)。それぞれの値は平均値±標準誤差を表す。n =6。異なる文字(a, b, c, d)を付した棒グラフの平均値は、相互に有意であった(P<0.05)。  図4Bは脂質画分(TLb又はTLp)がHTase活性に与える効果を表す。:棒グラフ1、添加物なし;棒グラフ2、TLb(0.1μg);棒グラフ3、TLb(0.5μg);棒グラフ4、TLb(1.0μg);棒グラフ5、TLb(5.0μg);棒グラフ6、TLp(0.1μg);棒グラフ7、TLp(0.5μg);棒グラフ8、TLp(1.0μg);棒グラフ9、TLp(5.0μg)。それぞれの値は平均値±平均の標準誤差を表す。n=6。異なる文字(a, b, c, d, e, f)を付した棒グラフの平均値は、相互に有意差があった(P<0.05)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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