(57)【要約】【課題】高圧を使用して、タンパク質凝集体を脱凝集し、そして変性したタンパク質をリフォールディングする改善された方法を提供することを本発明の課題とする。【解決手段】上記課題は、凝集体解離およびタンパク質リフォールディングの速度および程度を上昇させるための、圧力下での攪拌、高温、「段階的」減圧、透析および希釈の使用を提供することによって解決された。１つの局面において、本発明は、タンパク質凝集体から脱凝集した、生物学的に活性なタンパク質を生成する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質凝集体から脱凝集した、生物学的に活性なタンパク質を生成する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）タンパク質凝集体を提供する工程；
（ｉｉ）該タンパク質凝集体を、その中のジスルフィド結合を還元するために十分量の還元剤と混合する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の混合物を、周囲圧力と比べて増加した圧力に供する工程であって、ここで、該タンパク質凝集体が解離する、工程；
（ｉｖ）該混合物を圧力下で透析し、これにより該還元剤を除去し、そしてジスルフィド結合を再形成する、工程；および
（ｖ）増加した圧力から該解離したタンパク質を回収する工程、
を包含し、これによって、該タンパク質は、生物学的活性が保持されるように、リフォールディングする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、一般的に、タンパク質生化学の分野に関連する。より詳細には、本発明は、ポリペプチド凝集体の再生およびリフォールディングのための改良した方法に関係する。
【背景技術】
【０００２】
（２．関連技術の説明）
タンパク質の凝集体は、バイオテクノロジー、製薬、および医療業界で非常に重要である。インビトロにおいて、凝集体は、実質的にタンパク質治療薬の製造、リフォールディング、精製、保存、および運送における実質的にすべての段階でみられる（非特許文献１および２）。インビボでは、ヒトにおける多数の病原性の状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびプリオン病（Ｋｅｌｌｙ，１９９６；Ｋｅｌｌｙ，１９９８；Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，１９９８；Ｓｃｈｅｒｚｉｎｇｅｒら，１９９９））はタンパク質凝集体を有し、そしてその状態に関連した不溶性沈着物の形成を有する。その結果、これらの疾患における凝集体の特徴付けおよび凝集体の機構に関する研究は、医学研究の積極的な領域である。
【０００３】
ヒトタンパク質の沈着疾患における凝集体は、不溶性原線維の形態での組織化を表し、一般的にタンパク質の誤アセンブリおよび凝集プロセスの研究に益々の意義をもたらしてきた（Ｗｅｔｚｅｌ，１９９９）。凝集の逆転および沈殿プロセスの研究は、治療タンパク質の製造、精製、および送達に即実践的な意味を有する。
【０００４】
治療タンパク質の製造において、凝集沈殿物（例えば、封入体）は通常、カオトロープ（例えば、６Ｍ塩酸グアニジン）の高濃度の存在下で沈殿した凝集体の解離により逆転される。そのような過酷な条件は、脱凝集（溶解）およびタンパク質がほぼ完全にフォールディングされていない状態の両方を生じさせる。
【０００５】
通常、リフォールディングは、透析を介したカオトロープの除去または約１０〜５０μｇ／ｍＬのタンパク質濃度までの希釈によりもたらされる（Ｃｌａｒｋら，１９９９）。なぜなら、リフォールディングは通常、一次（タンパク質濃度における）プロセスであり、凝集は２次またはより高次のプロセスであって、リフォールディングの収量は低タンパク質濃度で改善されるからである（Ｃｌａｒｋら，１９９９）。可溶性凝集体はしばしば、ネイティブタンパク質から、高価で時間のかかるカラムクロマトグラフィーにより分離される。分離された可溶凝集体は代表的に廃棄され、これにより全タンパク質収量を減少させ、そしてタンパク質の産生はコストを実質的に増加させる。不溶性凝集体を解離するためのカオトロピックな解離または可溶凝集体を除去するためのカラム精製に代わるものは、圧力による脱凝集である（Ｆｏｇｕｅｌら，１９９９；Ｇｏｒｏｖｉｔｓ＆Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，１９９８；Ｓｔ．Ｊｏｈｎら，１９９９）。
【０００６】
いくつかの研究グループはネイティブなタンパク質オリゴマーを解離するために、圧力能を利用している（Ｓｉｌｖａ＆Ｗｅｂｅｒ，１９９３）。さらに、他の研究グループは、可溶性の非ネイティブタンパク質凝集体から（Ｆｏｇｕｅｌら，１９９９；Ｇｏｒｏｖｉｔｓ＆Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，１９９８）および沈殿した不溶性の非ネイティブ凝集体から（Ｓｔ．Ｊｏｈｎら，１９９９）脱凝集およびタンパク質をリフォールドするための圧力の利用を研究した。ＧｏｒｏｖｉｔｓおよびＨｏｒｏｗｉｔｚ（１９９８）は、ロダネーゼの３．９Ｍの尿素溶液下で可溶凝集体の形成を阻害するため、そして可溶凝集体の形成を逆転させるために高圧力を使用した。しかし、Ｇｏｒｏｖｉｔｓ＆Ｈｏｒｏｗｉｔｚ（１９９８）は、「圧力は多くの凝集体の逆転をし得ない」と報告している。Ｐ２２テイルスパイク（ｔａｉｌｓｐｉｋｅ）タンパク質から形成された可溶凝集体の９０分間２．４キロバールでの処理は、凝集レベルを４１．１％〜１７．６％に下げた（Ｆｏｇｕｅｌら，１９９９）。
【０００７】
Ｓｔ．Ｊｏｈｎら（１９９９）は、封入体として形成された凝集体を含む、大きな不溶性凝集体から２００ＭＰａのオーダーの圧力で、ネイティブタンパク質を解離し、そして回収するために、高圧力を使用した。不溶性で、沈殿した凝集体からのリフォールドされた活性なヒト成長ホルモン、リゾチーム、およびβ−ラクタマーゼの高タンパク質濃度での高収率は、非変性濃度の塩酸グアニジンを圧力と併用して用いてか、または塩酸グアニジンのない条件下での圧力を用いて達成された。（Ｓｔ．Ｊｏｈｎら，１９９９）。不溶性沈殿物を架橋するはたらきを有する非ネイティブ分子間共有ジスフィルド結合を含むリゾチームの不溶性凝集体の特定の場合では、高収率でフォールドした、生物学的に活性のあるタンパク質を産出するために、高圧力および０．８Ｍ塩酸グアニジンを併用して、還元グルタチオンおよび酸化グルタチオンの混合物のようなレドックスシャッフリング剤が用いられた。凝集および沈殿されたヒト成長ホルモンならびに凝集されたヒト成長ホルモンの特定の場合、可溶性ネイティブタンパク質の回収を最適化するために、塩酸グアニジンのような低レベルのカオトロピック剤が用いられた。Ｂ−ラクタマーゼ封入体の特定の場合では、塩酸グアニジンの添加は、生物学的に活性なＢ−ラクタマーゼの収率を増加させなかったが、夾雑タンパク質のより高い可溶化を引きおこした。
【０００８】
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
【非特許文献１】Carpenter,J. F., Pikal, M. J., Chang, B. S., and Randolph, T.W. (1997).「Rational designof stable lyophilized protein formulations: Some practical advice.」PharmaceuticalResearch, 14 (8), 969-975.
【非特許文献２】Clark,E. D., Schwarz, E., and Rudolph, R. (1999).「Inhibition of aggregation sidereactions during in vitro protein folding.」Amyloid, Prions, and Other ProteinAggregates, Academic Press Inc, San Diego, 217-236.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
にもかかわらず、タンパク質凝集体の高圧力解離についての改良法および可溶性タンパク質のリフォールディングについての改良法が所望される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
従って、本発明に従い、タンパク質の脱凝集およびリフォールディングにおける高圧力の使用についての改良法が提供される。ひとつの実施形態において、タンパク質の凝集体から生物学的に活性のある脱凝集タンパク質を生成する方法が提供される。この方法は、以下を包含する：
（ｉ）タンパク質凝集体を提供する工程；
（ｉｉ）凝集体の中にあるジスフィルド結合を還元するために十分な量の還元剤と、このタンパク質凝集体を混合する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の混合物を、雰囲気圧と比較して高い圧力に供する工程であって、これによりこのタンパク質凝集体が解離する工程；
（ｉｖ）圧力下でこの混合物を透析する工程であって、これによりこの還元剤が除去され、そしてジスルフィド結合を再形成する、工程；および
（ｖ）高い圧力から解離タンパク質を取り出す工程であって、
これにより、生物学的活性を保持するようにこの上記タンパク質がリフォールドする、工程。この方法は解離および／もしくはリフォールディングを増強するために、このタンパク質凝集体および／もしくは解離したタンパク質を攪拌する工程をさらに包含し得るか；または、リフォールディングの前に約３０℃〜約１２５℃の温度にこのタンパク質凝集体を供する工程をさらに含み得る。この方法は、必要に応じて、カオトロピック剤を排除し得る。適切な還元剤としては、ジオチオトレイトール、グルタチオン、ジチオエリトリトール、またはβ−メルカプトエタノールが挙げられる。高い圧力は約５００気圧〜約１０,０００気圧を含み得る。
【００１１】
（ｉｉ）〜（ｖ）の工程は約３時間〜約１２時間、特に約６時間で実施され得る。（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の工程は、カオトロピック剤の存在下でおこなわれ得、この方法はこのカオトロピック剤を除去する工程をさらに包含し得る。適切なカオトロピック剤としては、グアニジン、硫酸グアニジン、塩酸グアニジン、尿素、チオシアネート、サルコシル、ドデシル硫酸ナトリウム、またはオクチル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００１２】
タンパク質凝集体は、封入体、可溶性および不溶性沈殿物、可溶性非ネイティブオリゴマー、ゲル、原線維、フィルム、フィラメント、プロト原線維、アミロイド沈着物、プラーク、または分散した非ネイティブな細胞内オリゴマーを含み得る。タンパク質凝集体はまた、高濃度で、例えば、約５〜２０ｍｇ／ｍｌ、またはより特には、約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、圧力に供され得る。次いで、タンパク質凝集体は、圧力下で、例えば約１ｍｇ／ｍｌに希釈され得る。
【００１３】
他の実施形態として、タンパク質の凝集体から生物学的に活性のある脱凝集タンパク質を生成する方法が提供される。この方法は、以下を包含する：
（ｉ）タンパク質凝集体を提供する工程；
（ｉｉ）このタンパク質凝集体を、雰囲気圧と比較して高い圧力および攪拌に供する工程であって、これによりこのタンパク質凝集体が解離する工程；および
（ｉｉｉ）高い圧力から解離タンパク質を取り出す工程であって、
これにより、生物学的活性を保持するようにこのタンパク質がリフォールドする、工程。この方法は、リフォールディングを増強するために、解離したタンパク質を攪拌する工程をさらに包含し得る。攪拌は超音波エネルギー、機械的攪拌、振とう、または静止装置をとおしたポンピング（ｐｕｍｐｉｎｇ）により提供され得る。この方法は、リフォールディングの前に、約３０℃〜約８０℃の温度にこのタンパク質凝集体を供する工程をさらに含み得る。必要に応じて、この方法はカオトロピック剤を利用しない。高い圧力は、約５００気圧〜約１０,０００気圧を含み得る。
【００１４】
（ｉｉ）〜（ｖ）の工程は、約３時間〜約１２時間、特に、約６時間で実施され得る。（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の工程は、カオトロピック剤の存在下でおこなわれ得、上記方法は、このカオトロピック剤を除去する工程をさらに包含し得る。適切なカオトロピック剤としては、グアニジン、硫酸グアニジン、塩酸グアニジン、尿素、チオシアネート、サルコシル、ドデシル硫酸ナトリウム、またはオクチル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００１５】
この方法はさらに、タンパク質凝集体中のジスルフィド結合を還元するために十分な量の還元剤と、このタンパク質凝集体を混合する工程を含み得る；そしてさらに、圧力下でこの混合物を透析し、これにより、この還元剤を除去し、そしてジスルフィド結合を再形成する工程を含み得る。還元剤は、ダイアフィルトレーションまたは限外濾過により取り除かれ得るか、あるいは酸化剤の添加によって打ち消され得る。適切な還元剤は、ジチオトレイトール（ｄｉｏｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、グルタチオン、ジチオエリトリトール、またはβ−メルカプトエタノールである。
【００１６】
このタンパク質凝集体は、封入体、可溶性および不溶性沈殿物、可溶性非ネイティブオリゴマー、ゲル、原線維、フィルム、フィラメント、プロト原線維、アミロイド沈着物、プラーク、または分散した非ネイティブ細胞内オリゴマーを含み得る。このタンパク質凝集体はまた、高濃度で、例えば、約５〜２０ｍｇ／ｍｌ、またはより特に、約１０ｍｇ／ｍｌである濃度で、圧力に供され得る。次いで、タンパク質凝集体は、圧力下で、例えば、約１ｍｇ／ｍｌに希釈され得る。
【００１７】
さらに別の実施形態として、タンパク質凝集体から生物学的に活性のある脱凝集タンパク質を生成する方法が提供される。この方法は、以下を包含する：
（ｉ）タンパク質凝集体を提供する工程；
（ｉｉ）このタンパク質凝集体を、雰囲気圧と比較して高い圧力および約３０℃〜約１２５℃の高い温度に供する工程であって、これによりこのタンパク質凝集体が解離する、工程；および
（ｉｉｉ）高い圧力および高い温度から解離タンパク質を取り出す工程であって、
これにより、生物学的活性を保持するようにこのタンパク質がリフォールドする、工程。必要に応じて、この方法はカオトロピック剤を利用しない。この方法は、解離および／もしくはリフォールディングを増強するために、このタンパク質凝集体および／もしくは解離したタンパク質を攪拌する工程をさらに包含し得るか；または、この方法はさらに、タンパク質凝集体中のジスルフィド結合を還元するために十分な量の還元剤と、このタンパク質凝集体を混合する工程を含み得る。圧力下でこの混合物を透析し得、これにより上記還元剤を除去し、そしてジスルフィド結合を再形成する。あるいは、還元剤Ｉが、ダイアフィルトレーションまたは限外濾過により取り除かれるか、あるいは酸化剤の添加によって打ち消される。適切な還元剤としては、ジチオトレイトール（ｄｉｏｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、グルタチオン、ジチオエリトリトール、またはβ−メルカプトエタノールが挙げられる。高い圧力は約５００気圧〜約１０,０００気圧を含み得る。
【００１８】
（ｉｉ）〜（ｖ）の工程は、約３時間〜約１２時間、特に、約６時間で実施され得る。（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の工程は、カオトロピック剤の存在下でおこなわれ得、そしてこの方法はこのカオトロピック剤を除去する工程をさらに包含し得る。適切なカオトロピック剤としては、グアニジン、硫酸グアニジン、塩酸グアニジン、尿素、チオシアネート、サルコシル、ドデシル硫酸ナトリウム、またはオクチル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００１９】
このタンパク質凝集体は、封入体、可溶性および不溶性沈殿物、可溶性非ネイティブオリゴマー、ゲル、原線維、フィルム、フィラメント、プロト原線維、アミロイド沈着物、プラーク、または分散した非ネイティブ細胞内オリゴマーを含み得る。タンパク質凝集体はまた、高濃度で、例えば、約５〜２０ｍｇ／ｍｌ、またはより特に、約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、圧力に供され得る。次いで、タンパク質凝集体は、圧力下で、例えば、約１ｍｇ／ｍｌに希釈され得る。
【００２０】
なお、さらに他の実施形態として、タンパク質の凝集体から生物学的に活性のある脱凝集タンパク質を生成する方法が提供される。この方法は、以下を包含する：
（ｉ）タンパク質凝集体を提供する工程；
（ｉｉ）凝集体の中にあるジスフィルド結合を還元するために十分な量の還元剤と、このタンパク質凝集体を混合する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の混合物を、雰囲気圧と比較して高い圧力、約３０℃〜約１２５℃の高温および攪拌に供する工程であって、これによりこのタンパク質凝集体が解離する、工程；
（ｉｖ）この還元剤を除去または中和することにより、ジスルフィド結合を再形成する、工程；ならびに、
（ｖ）高い圧力および高温から解離タンパク質を取り出す工程であって、
これにより、生物学的活性を保持するようにこのタンパク質がリフォールドする、工程。必要に応じて、この方法はカオトロピック剤を利用しない。この方法は、圧力下で上記混合物を透析し、これにより、上記還元剤を除去し、そしてジスルフィド結合を再形成する工程をさらに含み得るか；あるいは、この方法は、ダイアフィルトレーションまたは限外濾過によりこの還元剤を除去する工程をさらに含み得る。あるいは、この還元剤の効果は、酸化剤の添加によって打ち消される。適切な還元剤としては、ジチオトレイトール（ｄｉｏｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、グルタチオン、ジチオエリトリトール、またはβ−メルカプトエタノールが挙げられる。高い圧力は約５００気圧〜約１０,０００気圧を含み得る。
【００２１】
（ｉｉ）〜（ｉｉｉ）の工程は、約１時間〜約１２時間、特に約６時間で実施され得る。このタンパク質凝集体は、封入体、可溶性および不溶性沈殿物、可溶性非ネイティブオリゴマー、ゲル、原線維、フィルム、フィラメント、プロト原線維、アミロイド沈着物、プラーク、または分散した非ネイティブ細胞内オリゴマーを含み得る。このタンパク質凝集体はまた、高濃度、例えば、約５〜２０ｍｇ／ｍｌ、またはより特に、約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、圧力に供され得る。次いで、タンパク質凝集体は、圧力下で、例えば、約１ｍｇ／ｍｌに希釈され得る。
【００２２】
（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の工程は、カオトロピック剤の存在下でおこなわれ得、この方法はこのカオトロピック剤を除去する工程をさらに包含する。適切なカオトロピック剤としては、グアニジン、硫酸グアニジン、塩酸グアニジン、尿素、チオシアネート、サルコシル、ドデシル硫酸ナトリウム、またはオクチル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００２３】
さらなる実施形態として、タンパク質の凝集体から生物学的に活性のある脱凝集タンパク質を生成する方法が提供される。この方法は、以下を包含する：
（ｉ）タンパク質凝集体を提供する工程；
（ｉｉ）このタンパク質凝集体を、雰囲気圧と比較して高い第１圧力に供する工程であって、これによりこのタンパク質凝集体が解離する、工程；
（ｉｉｉ）解離タンパク質を、上記の高い第１圧力より低いが、雰囲気圧と比較するとなお高い圧力である第２圧力を供する工程、および
（ｉｖ）この高い第２圧力から解離タンパク質を取り出す工程であって、
これにより、生物学的活性を保持するようにこのタンパク質がリフォールドする、工程。高い第１圧力は、約２００ＭＰａ〜約１,０００ＭＰａであり得る。高い第２圧力は、約１００ＭＰａであり得る。この方法は、圧力下でこのタンパク質を攪拌する工程をさらに包含し得る；もしくは、この方法は、高温、例えば約３０℃〜約１２５℃の高温に、このタンパク質を供する工程をさらに含み得る。
【００２４】
この方法は、加圧の前に、タンパク質凝集体を還元剤と混合する工程をさらに含み得る。この方法はまた、圧力下で上記混合物を透析する工程を含み得、これにより上記還元剤を除去し、そしてジスルフィド結合を再形成する。あるいは、還元剤は、ダイアフィルトレーションまたは限外濾過により取り出される。あるいは、還元剤は、酸化剤の添加によって打ち消される。還元剤としては、ジチオトレイトール（ｄｉｏｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、グルタチオン、ジチオエリトリトール、またはβ−メルカプトエタノールが挙げられる。
【００２５】
このタンパク質凝集体はまた、高濃度、例えば、約５〜２０ｍｇ／ｍｌ、またはより特に、約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、圧力に供され得る。次いで、タンパク質凝集体は、圧力下で、例えば、約１ｍｇ／ｍｌに希釈され得る。
【００２６】
（ｉｉ）〜（ｉｖ）の工程は、約３時間〜約１２時間、またはより特に、約６時間で実施され得る。必要に応じて、この方法は、カオトロピック剤を排除する。（ｉｉ）〜（ｉｖ）の工程は、カオトロピック剤の存在下でおこなわれ得、そしてこの方法は、このカオトロピック剤を除去する工程をさらに包含する。適切なカオトロピック剤としては、グアニジン、硫酸グアニジン、塩酸グアニジン、尿素、チオシアネート、サルコシル、ドデシル硫酸ナトリウム、またはオクチル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００２７】
タンパク質凝集体は、タンパク質多量体、たとえばヘテロ多量体またはホモ多量体を含み得る。多量体は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、および九量体からなる群から選択され得る。多量体タンパク質の例としては、インターフェロン−γ、ヘモグロビン、乳酸デヒドロゲナーゼ、抗体および抗体フラグメントが挙げられる。
【００２８】
上述のすべての方法は、可溶性の変性タンパク質上でも同様に実施され得る。
【００２９】
さらなる実施形態としては、以下が提供される；
カオトロープ、界面活性剤、および／もしくは加温による解離に対してタンパク質凝集体を感受性にする方法であって、１つ以上のカオトロープ、界面活性剤、および／もしくは加温と組み合わせて、高圧に、このタンパク質凝集体を供する工程を包含する方法であって、；
タンパク質サンプルの有効期間を増加させる方法であって、高圧に続いて減圧を適用することにより、可溶タンパク質凝集体を取り出す工程を包含する方法；
リフォールディング状態についてタンパク質組成物をスクリーニングする方法であって、以下：
（ｉ）物理的に異なる複製サンプル中のタンパク質組成物を提供する工程；
（ｉｉ）高圧および温度変化、ｐＨを変化させた緩衝液、塩濃度を変化させた緩衝液、タンパク質濃度変化、還元剤濃度変化、安定剤の変化、カオトロピック剤の変化、界面活性剤変化、表面活性剤の変化を含む、異なる条件に、この複製サンプルを供する工程；および
（ｉｉｉ）高圧からこの複製サンプルを取り出す工程；および
（ｉｖ）タンパク質のリフォールディングを評価する工程、
を包含する方法；
目的のタンパク質を含有するサンプルにおいてウイルスを不活性化する方法であって、以下：
（ｉ）ネイティブもしくは非ネイティブ状態にある、所望されるタンパク質を含有するサンプルを提供する工程；
（ｉｉ）このサンプルを、そのサンプル中の感染性のウイルス粒子を低減もしくは排除させるために処理する工程；および
（ｉｉｉ）このサンプルを、高圧のタンパク質リフォールディング手順に供する工程、
を包含する方法；
ならびに、タンパク質凝集体からの、生物学的に活性な脱凝集タンパク質を生成する方法であって、以下：
（ｉ）タンパク質凝集体を提供する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）の混合物を、雰囲気圧と比較して高い圧力、約３０℃〜約１２５℃の高温、および攪拌に供する工程であって、これによりこのタンパク質凝集体が解離する、工程；
（ｉｉｉ）透析により、工程（ｉｉ）の混合物のｐＨを変化させる工程；ならびに
（ｉｖ）高い圧力および高温から、解離タンパク質を取り出す工程であって、これにより生物学的に活性を保持するようにこの上記タンパク質がリフォールドする、工程、
を包含する方法。
【００３０】
また、本発明は、以下を提供する。
（項目１）  タンパク質凝集体から脱凝集した、生物学的に活性なタンパク質を生成する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）タンパク質凝集体を提供する工程；
（ｉｉ）該タンパク質凝集体を、その中のジスルフィド結合を還元するために十分量の還元剤と混合する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の混合物を、周囲圧力と比べて増加した圧力に供する工程であって、ここで、該タンパク質凝集体が解離する、工程；
（ｉｖ）該混合物を圧力下で透析し、これにより該還元剤を除去し、そしてジスルフィド結合を再形成する、工程；および
（ｖ）増加した圧力から該解離したタンパク質を回収する工程、
を包含し、これによって、該タンパク質は、生物学的活性が保持されるように、リフォールディングする、方法。
（項目２）  解離および／またはリフォールディングを増強するために前記タンパク質凝集体および／または解離したタンパク質を攪拌する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）  リフォールディングの前に、前記タンパク質凝集体を約３０℃〜約１２５℃の温度に供する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目４）  カオトロピック剤を利用しない、項目３に記載の方法。
（項目５）  前記還元剤が、ジチオトレイトール、グルタチオン、ジチオエリトリオールまたはβ−メルカプトエタノールである、項目１に記載の方法。
（項目６）  前記増加した圧力が、約５００気圧〜約１０，０００気圧を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）  工程（ｉｉ）〜（ｖ）が約３時間〜約１２時間実施される、項目１に記載の方法。
（項目８）  工程（ｉｉ）〜（ｖ）が約６時間実施される、項目７に記載の方法。
（項目９）  工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が、カオトロピック剤の存在下で実施され、該カオトロピック剤を除去する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１０）  前記カオトロピック剤が、グアニジン、硫酸グアニジン、塩酸グアニジン、尿素、チオシアネート、ザルコシル、ドデシル硫酸ナトリウムまたはオクチル硫酸ナトリウムである、項目８に記載の方法。
（項目１１）  前記タンパク質凝集体が、封入体、可溶性沈降物および不溶性沈降物、可溶性非ネイティブオリゴマー、ゲル、フィブリル、フィルム、フィラメント、プロトフィブリル、アミロイド沈着、斑、または分散した非ネイティブ細胞内オリゴマーを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）  タンパク質凝集体から脱凝集した、生物学的に活性なタンパク質を生成する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）タンパク質凝集体を提供する工程；
（ｉｉ）該タンパク質凝集体を、周囲圧力と比べて増加した圧力、および攪拌に供する工程であって、これにより該タンパク質凝集体が解離する、工程；ならびに
（ｉｉｉ）増加した圧力から該解離したタンパク質を回収する工程、
を包含する方法であって、
これにより、該タンパク質は、生物学的活性が保持されるようにリフォールディングされる、方法。
（項目１３）  リフォールディングを増強するために前記解離したタンパク質を攪拌する工程をさらに包含する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）  リフォールディングの前に、前記タンパク質凝集体を約３０℃〜約８０℃の温度に供する工程をさらに包含する、項目１２に記載の方法。
（項目１５）  カオトロピック剤を利用しない、項目１４に記載の方法。
（項目１６）  前記増加した圧力が、約５００気圧〜約１０，０００気圧を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１７）  工程（ｉｉ）〜（ｉｉｉ）が約３時間〜約１２時間実施される、項目１２に記載の方法。
（項目１８）  工程（ｉｉ）〜（ｉｉｉ）が約６時間実施される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）  工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が、カオトロピック剤の存在下で実施され、該カオトロピック剤を除去する工程をさらに包含する、項目１２に記載の方法。
（項目２０）  前記カオトロピック剤が、グアニジン、硫酸グアニジン、塩酸グアニジン、尿素、チオシアネート、ザルコシル、ドデシル硫酸ナトリウムまたはオクチル硫酸ナトリウムである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）  前記タンパク質凝集体を、その中のジスルフィド結合を還元するために十分量の還元剤と混合する工程をさらに包含する、項目１２に記載の方法。
（項目２２）  前記混合物を圧力下で透析する工程をさらに包含し、これにより該還元剤を除去し、そしてジスルフィド結合が再形成する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）  前記還元剤を、ダイアフィルトレーションまたは限外濾過によって除去する工程をさらに包含する、項目２１に記載の方法。
（項目２４）  酸化剤の添加によって前記還元剤の効果を打ち消す工程をさらに包含する、項目２１に記載の方法。
（項目２５）  前記還元剤が、ジチオトレイトール、グルタチオン、ジチオエリトリオールまたはβ−メルカプトエタノールである、項目２１に記載の方法。
（項目２６）  前記タンパク質凝集体が、封入体、可溶性沈降物および不溶性沈降物、可溶性非ネイティブオリゴマー、ゲル、フィブリル、フィルム、フィラメント、プロトフィブリル、アミロイド沈着、斑、または分散した非ネイティブ細胞内オリゴマーを含む、項目１２に記載の方法。
（項目２７）  タンパク質凝集体から脱凝集した、生物学的に活性なタンパク質を生成する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）タンパク質凝集体を提供する工程；
（ｉｉ）該タンパク質凝集体を、周囲圧力と比べて増加した圧力、および約３０℃〜約１２５℃の温度に供する工程であって、これにより該タンパク質凝集体は解離する、工程；ならびに
（ｉｉｉ）増加した圧力および高温から該解離したタンパク質を回収する工程、
を包含する方法であって、
これにより、該タンパク質は、生物学的活性が保持されるようにリフォールディングされる、方法。
（項目２８）  カオトロピック剤を利用しない、項目２７に記載の方法。
（項目２９）  解離および／またはリフォールディングを増強するために前記タンパク質凝集体および／または解離したタンパク質を攪拌する工程をさらに包含する、項目２７に記載の方法。
（項目３０）  前記タンパク質凝集体を、その中のジスルフィド結合を還元するために十分量の還元剤と混合する工程をさらに包含する、項目２７に記載の方法。
（項目３１）  前記混合物を圧力下で透析する工程をさらに包含し、これにより該還元剤を除去し、そしてジスルフィド結合が再形成する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）  前記還元剤を、ダイアフィルトレーションまたは限外濾過によって除去する工程をさらに包含する、項目３０に記載の方法。
（項目３３）  酸化剤の添加によって前記還元剤の効果を打ち消す工程をさらに包含する、項目３０に記載の方法。
（項目３４）  前記還元剤が、ジチオトレイトール、グルタチオン、ジチオエリトリオールまたはβ−メルカプトエタノールである、項目３０に記載の方法。
（項目３５）  前記増加した圧力が、約５００気圧〜約１０，０００気圧を含む、項目２７に記載の方法。
（項目３６）  工程（ｉｉ）〜（ｉｉｉ）が約３時間〜約１２時間実施される、項目２７に記載の方法。
（項目３７）  工程（ｉｉ）〜（ｉｉｉ）が約６時間実施される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）  前記タンパク質凝集体が、封入体、可溶性沈降物および不溶性沈降物、可溶性非ネイティブオリゴマー、ゲル、フィブリル、フィルム、フィラメント、プロトフィブリル、アミロイド沈着、斑、または分散した非ネイティブ細胞内オリゴマーを含む、項目２７に記載の方法。
（項目３９）  工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が、カオトロピック剤の存在下で実施され、該カオトロピック剤を除去する工程をさらに包含する、項目２７に記載の方法。
（項目４０）  前記カオトロピック剤が、グアニジン、硫酸グアニジン、塩酸グアニジン、尿素、チオシアネート、ザルコシル、ドデシル硫酸ナトリウムまたはオクチル硫酸ナトリウムである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）  タンパク質凝集体から脱凝集した、生物学的に活性なタンパク質を生成する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）タンパク質凝集体を提供する工程；
（ｉｉ）該タンパク質凝集体を、その中のジスルフィド結合を還元するために十分量の還元剤と混合する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の混合物を、周囲圧力と比べて増加した圧力，約３０℃〜約１２５℃の高温、および攪拌に供する工程であって、ここで、該タンパク質凝集体が解離する、工程；
（ｉｖ）該還元剤を除去または中和する工程であって、これによりジスルフィド結合が再形成する、工程；ならびに
（ｖ）増加した圧力および高温から該解離したタンパク質を回収する工程、
を包含する方法であって、
これにより、該タンパク質は、生物学的活性が保持されるようにリフォールディングされる、方法。
（項目４２）  カオトロピック剤を利用しない、項目４１に記載の方法。
（項目４３）  前記混合物を圧力下で透析する工程をさらに包含し、これにより該還元剤を除去し、そしてジスルフィド結合が再形成する、項目４１に記載の方法。
（項目４４）  前記還元剤を、ダイアフィルトレーションまたは限外濾過によって除去する工程をさらに包含する、項目４１に記載の方法。
（項目４５）  酸化剤の添加によって前記還元剤の効果を打ち消す工程をさらに包含する、項目４１に記載の方法。
（項目４６）  前記還元剤が、ジチオトレイトール、グルタチオン、ジチオエリトリオールまたはβ−メルカプトエタノールである、項目４１に記載の方法。
（項目４７）  前記増加した圧力が、約５００気圧〜約１０，０００気圧を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４８）  工程（ｉｉ）〜（ｉｉｉ）が約１時間〜約１２時間実施される、項目４１に記載の方法。
（項目４９）  工程（ｉｉ）〜（ｉｉｉ）が約６時間実施される、項目４８に記載の方法。
（項目５０）  前記タンパク質凝集体が、封入体、可溶性沈降物および不溶性沈降物、可溶性非ネイティブオリゴマー、ゲル、フィブリル、フィルム、フィラメント、プロトフィブリル、アミロイド沈着、斑、または分散した非ネイティブ細胞内オリゴマーを含む、項目４１に記載の方法。
（項目５１）  工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が、カオトロピック剤の存在下で実施され、該カオトロピック剤を除去する工程をさらに包含する、項目４１に記載の方法。
（項目５２）  前記カオトロピック剤が、グアニジン、硫酸グアニジン、塩酸グアニジン、尿素、チオシアネート、ザルコシル、ドデシル硫酸ナトリウムまたはオクチル硫酸ナトリウムである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）  タンパク質凝集体から脱凝集した、生物学的に活性なタンパク質を生成する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）タンパク質凝集体を提供する工程；
（ｉｉ）該タンパク質凝集体を、周囲圧力と比べて第１の増加した圧力に供する工程であって、ここで、該タンパク質凝集体が解離する、工程；
（ｉｉｉ）該解離したタンパク質を、該第１の増加した圧力より低いが周囲圧力と比べてなお増加した圧力である、第２の圧力に供する工程；ならびに
（ｉｖ）該第２の増加した圧力から該解離したタンパク質を回収する工程、
を包含する方法であって、
これにより、該タンパク質は、生物学的活性が保持されるようにリフォールディングされる、方法。
（項目５４）  該第１の増加した圧力が約２００ＭＰａ〜約１０００ＭＰａである、項目５３に記載の方法。
（項目５５）  該第２の増加した圧力が約１００ＭＰａである、項目５３に記載の方法。
（項目５６）  圧力下での前記タンパク質の攪拌をさらに包含する、項目５３に記載の方法。
（項目５７）  前記タンパク質を高温に供する工程をさらに包含する、項目５３に記載の方法。
（項目５８）  前記高温が約３０℃〜約１２５℃である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）  増加した圧力の前に、前記タンパク質凝集体を還元剤と混合する工程をさらに包含する、項目５３に記載の方法。
（項目６０）  前記混合物を圧力下で透析する工程をさらに包含し、これにより該還元剤を除去し、そしてジスルフィド結合が再形成する、項目５９に記載の方法。
（項目６１）  前記還元剤を、ダイアフィルトレーションまたは限外濾過によって除去する工程をさらに包含する、項目５９に記載の方法。
（項目６２）  酸化剤の添加によって前記還元剤の効果を打ち消す工程をさらに包含する、項目５９に記載の方法。
（項目６３）  前記還元剤が、ジチオトレイトール、グルタチオン、ジチオエリトリオールまたはβ−メルカプトエタノールである、項目５９に記載の方法。
（項目６４）  前記タンパク質凝集体が、高濃度で圧力に供される、項目５３に記載の方法。
（項目６５）  前記高濃度が約５〜２０ｍｇ／ｍｌである、項目６４に記載の方法。
（項目６６）  前記高濃度が約１０ｍｇ／ｍｌである、項目６５に記載の方法。
（項目６７）  前記タンパク質凝集体が圧力下で希釈される、項目６５に記載の方法。
（項目６８）  前記タンパク質凝集体が約１ｍｇ／ｍｌに希釈される、項目６７に記載の方法。
（項目６９）  工程（ｉｉ）〜（ｉｖ）が約３時間〜約１２時間実施される、項目５３に記載の方法。
（項目７０）  工程（ｉｉ）〜（ｉｖ）が約６時間実施される、項目５３に記載の方法。
（項目７１）  カオトロピック剤を利用しない、項目５３に記載の方法。
（項目７２）  工程（ｉｉ）〜（ｉｖ）が、カオトロピック剤の存在下で実施され、該カオトロピック剤を除去する工程をさらに包含する、項目５３に記載の方法。
（項目７３）  前記カオトロピック剤が、グアニジン、硫酸グアニジン、塩酸グアニジン、尿素、チオシアネート、ザルコシル、ドデシル硫酸ナトリウムまたはオクチル硫酸ナトリウムである、項目７２に記載の方法。
（項目７４）  前記タンパク質凝集体がタンパク質マルチマーを含む、項目５３に記載の方法。
（項目７５）  前記マルチマーがヘテロマルチマーである、項目７４に記載の方法。
（項目７６）  前記マルチマーがホモマルチマーである、項目７４に記載の方法。
（項目７７）  前記マルチマーが、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマーおよびノナマーからなる群より選択される、項目７４に記載の方法。
（項目７８）  前記マルチマーが、インターフェロン−γ、ヘモグロビン、乳酸デヒドロゲナーゼ、抗体および抗体フラグメントからなる群より選択される、項目７４に記載の方法。
（項目７９）  変性したタンパク質をリフォールディングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）変性したタンパク質組成物を提供する工程；
（ｉｉ）該タンパク質組成物を、その中のジスルフィド結合を還元するために十分量の還元剤と混合する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の該混合物を、周囲圧力と比べて増加した圧力に供する工程；
（ｉｖ）該混合物を圧力下で透析する工程であって、これにより該還元剤を除去しそしてジスルフィド結合を再形成させる工程；ならびに
（ｖ）増加した圧力から該タンパク質組成物を回収する工程、
を包含する方法であって、
これにより、該タンパク質は、生物学的活性が保持されるようにリフォールディングされる、方法。
（項目８０）  変性したタンパク質をリフォールディングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）タンパク質組成物を提供する工程；
（ｉｉ）該タンパク質組成物を、周囲圧力と比べて増加した圧力、および攪拌に供し、これにより該タンパク質凝集体が解離する工程；ならびに
（ｉｉｉ）増加した圧力から該タンパク質組成物を回収する工程、
を包含する方法であって、
これにより、該タンパク質は、生物学的活性が保持されるようにリフォールディングされる、方法。
（項目８１）  変性したタンパク質をリフォールディングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）タンパク質組成物を提供する工程；
（ｉｉ）該タンパク質組成物を、周囲圧力と比べて増加した圧力、および約３０℃〜約１２５℃の高温に供する工程；ならびに
（ｉｉｉ）増加した圧力および高温から該タンパク質組成物を回収する工程、
を包含する方法であって、
これにより、該タンパク質は、生物学的活性が保持されるようにリフォールディングされる、方法。
（項目８２）  変性したタンパク質をリフォールディングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）タンパク質組成物を提供する工程；
（ｉｉ）該タンパク質組成物を、その中のジスルフィド結合を還元するために十分量の還元剤と混合する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の該混合物を、周囲圧力と比べて増加した圧力、および約３０℃〜約１２５℃の高温、および攪拌に供する工程；
（ｉｖ）該還元剤を除去または中和する工程であって、それによってジスルフィド結合が再形成させる工程；ならびに
（ｖ）増加した圧力および高温から該タンパク質組成物を回収する工程、
を包含する方法であって、
これにより、該タンパク質は、生物学的活性が保持されるようにリフォールディングされる、方法。
（項目８３）  変性したタンパク質をリフォールディングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）タンパク質組成物を提供する工程；
（ｉｉ）該タンパク質組成物を、周囲圧力と比べて第１の増加した圧力に供する工程；
（ｉｉｉ）該タンパク質組成物を、該第１の増加した圧力より低いが周囲圧力と比べてなお増加した圧力である、第２の圧力に供する工程；ならびに
（ｉｖ）該第２の増加した圧力から該タンパク質を回収する工程、
を包含する方法であって、
これにより、該タンパク質は、生物学的活性が保持されるようにリフォールディングされる、方法。
（項目８４）  タンパク質凝集体を、カオトロピック剤、洗浄剤および／または上昇した温度による解離に感受性にさせる方法であって、該方法は、該タンパク質凝集体を、１つ以上のカオトロピック剤、洗浄剤および／または上昇した温度と組合わせて高圧に供する工程を包含する、方法。
（項目８５）  リフォールディング条件についてタンパク質組成物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）生理学的に異なる複製サンプル中にタンパク質組成物を提供する工程；
（ｉｉ）該複製サンプルを、以下を含む異なる条件に供する工程：高圧および種々の温度、種々のｐＨの緩衝液、種々の塩濃度の緩衝液、種々のタンパク質濃度、種々の還元剤濃度、種々の安定化剤、種々のカオトロピック剤、種々の洗浄剤、種々の界面活性剤；
（ｉｉｉ）該複製サンプルを高圧から回収する工程；ならびに
（ｉｖ）タンパク質リフォールディングを評価する工程、
を包含する、方法。
（項目８６）  所望のタンパク質を含むサンプル中のウイルスを不活化する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該所望のタンパク質を含むサンプルを提供する工程であって、該タンパク質がネイティブな状態または非ネイティブな状態にある、工程；
（ｉｉ）その他の感染性ウイルス粒子を減少または除去するために該サンプルを処理する工程；
（ｉｉｉ）該サンプルを、高圧タンパク質リフォールディング手順に供する工程、
を包含する、方法。
（項目８７）  前記サンプルが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、エプスタインバーウイルス、ＨＨＶ６およびサイトメガロウイルスを含むか、または含むと予想される、項目８６に記載の方法。
（項目８８）  前記サンプルが、血漿、血液、血漿由来タンパク質産物、培養ヒト細胞由来タンパク質産物、血清、または血清含有細胞培養培地である、項目８６に記載の方法。
（項目８９）  前記高圧タンパク質リフォールディング手順が、高温、カオトロピック剤、可溶化剤、還元剤、攪拌および「段階的」減圧からなる群より選択される処理の１つ以上をさらに含む、項目８６に記載の方法。
（項目９０）  高圧、次いで、減圧を適用することによって、可溶性タンパク質凝集体を除去する工程を包含する、タンパク質サンプルの保存期を増加させる、方法。
（項目９１）  タンパク質凝集体から脱凝集した、生物学的に活性なタンパク質を生成する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）タンパク質凝集体を提供する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）の混合物を、周囲圧力と比べて増加した圧力、約３０℃〜約１２５℃の高温、および攪拌に供する工程であって、これによって、該タンパク質凝集体が解離する、工程；
（ｉｉｉ）透析によって工程（ｉｉ）の混合物のｐＨを変化させる工程；および
（ｉｖ）増加した圧力および高温から該解離したタンパク質を回収する工程、
を包含する方法であって、
これにより、該タンパク質は、生物学的活性が、保持されるようにリフォールディングする、方法。
【００３１】
（例示的実施形態の説明）
（Ｉ．本発明）
明らかではないが、可溶性の凝集体は、タンパク質産物を生産する場合、極めて困難かつ有害な問題を提示する。可溶性凝集体は、産物の価値を低下させ、そして薬学的調製物の場合、患者において致死的であり得る危険なアナフィラキシー反応を引き起こし得る。多くの処理工程は、可溶性凝集体の形成を引き起こし得、この工程としては、濾過、限外濾過、抽出、沈降、結晶化、噴霧／凍結乾燥、濃縮およびクロマトグラフィーが挙げられる。濾過は、可溶性凝集体のさらなる形成を生じ得るため、これらの凝集体の除去は、極めて複雑でありかつ困難である。実際に、市販のタンパク質産物は、処方物中の可溶性凝集体の含量によりしばしば等級化されており、そして産物の価値は、可溶性凝集体における比較的小さな低減（２〜５％）により、劇的に改善され得る。ヒト血清アルブミンは、凝集体の低減により価値が向上された、優れた産物の例である。
【００３２】
同様に、非天然タンパク質の不溶性沈降物は、タンパク質の生産、精製、パッケージング、貯蔵、輸送（ｓｈｉｐｐｉｎｇ）および送達の間にしばしば形成される。これらの凝集体は、非経口投与された産物の場合に、ヒトの健康に有害である。なぜなら、これらの凝集体は、アナフィラキシー・ショックを含む、深刻な免疫応答を誘発し得る。さらに、組換え体細胞の培養物におけるヒトタンパク質の合成は、しばしば封入体と呼ばれるネイティブでない凝集したタンパク質の不溶沈降物の形成をもたらす。封入体が、しばしば透過型電子顕微鏡で観察されるに十分大きく、そしてネイティブでない共有結合性分子間ジスルフィド結合を含み得ることは注意されるべきである。カオトロピック剤（例えば、尿素またはグアニジン）の高濃度中でこれらの封入体をまず溶解し、ジスルフィド結合を切るために還元剤を添加することによって、これらの封入体は、典型的に処理される。溶解後、次いで、溶解した、フォールディングされていないタンパク質は、典型的に１ｍｇ／ｍｌ未満の濃度に希釈され、そして尿素またはグアニジンは、ダイアフィルトレーションにより徐々に除かれる。酸化還元条件は、しばしばネイティブなジスルフィド結合が再形成し得るリフォールディング工程の間の種々の時点で特定される。全ての工程は、大量の高価な試薬、大量の溶液を扱うための設備、および高価で不用な処分工程を必要とする。さらに、適切にフォールディングされたネイティブなタンパク質の収率は、しばしば５０％未満であり、そして所望のタンパク質は、リフォールディング後の希釈溶液中に見出され、リフォールディングの完了後の高価な濃縮工程をさらに必要とする。
【００３３】
これまでに、本発明者らは、不溶性タンパク質凝集体の脱凝集を容易にし、そしてタンパク質のリフォールディングを容易にするための高圧の使用について本発明者らの研究を記載した。Ｓｔ．Ｊｏｈｎら（１９９９）、およびＲａｎｄｏｌｐｈらによる米国特許第０９／３５０，３２７号。静水圧を、低い、および非変性濃度のグアニジン塩酸と組合わせて、ヒト成長ホルモン凝集体は、脱凝集され、そして適切にリフォールディングしたタンパク質は、１００％回収された。２４℃およびグアニジンの非存在下における、２４時間の２ｋｂａｒでの圧力処理後のネイティブのヒト成長ホルモンの回収率は、２０％に過ぎなかった。
【００３４】
特に、Ｒａｎｄｏｌｐｈらによる米国特許第０９／３５０，３２７号（参考として援用される）は、溶液中で変性し、凝集したタンパク質の、脱凝集およびリフォールディングに有効な方法を提供し、その結果、溶液中で適切にフォールディングされ、生物学的に活性なタンパク質が、高収率で回収される。タンパク質凝集体の脱凝集は、圧力が、約０．２５ｋｂａｒからもはや約１２ｋｂａｒまで増加される場合に生じる。リフォールディングは、約０．２５ｋｂａｒから約３．５ｋｂａｒの間の圧力で生じ、約１．５ｋｂａｒから約３ｋｂａｒで有利に生じる。典型的に、カオトロピック剤は、大気圧でタンパク質を変性することに有効ではない濃度で存在し、そして完全に欠くこともある。必要に応じて、酸化−還元剤は、リフォールディング溶液中に組み込まれ得、その結果、ネイティブな分子内ジスルフィド結合が、所望の部位に形成され得る。方法は、実質的に全てのタンパク質、特に不溶性タンパク質凝集体、封入体、または異常性のオリゴマー状（可溶性）凝集体に適用可能である。
【００３５】
本発明は、この研究を以下の方法で拡張する：
・種々の段階（特に、タンパク質が圧力下にある場合）でのタンパク質の撹拌は、脱凝集工程およびリフォールディング工程を促進および改善する；
・タンパク質が脱凝集およびリフォールディングを被る場合、特にカオトロープの非存在の場合、種々のインキュベーションの間の温度の上昇はまた、工程を促進させ、そして収率を向上させる；
・圧力下での還元剤の除去または中和；
・加圧直後の作業濃度へのタンパク質の希釈。これは実質的な経費の削減を与える、高圧リフォールディング装置のための小容量を可能にする；そして、
・分子内および分子間相互作用が独立して「ソートされる」ことを可能にするための、リフォールディングの間の中程度の圧力の使用。
これらの要素を、以前開示した方法と組合わせて、個々にか、または、相互に組合わせてのいずれかで、本発明者らは、顕著な時間の節約を含む、圧力下での、タンパク質の脱凝集およびリフォールディングの改良された方法を提供する。以下の項は、本発明の種々の実施形態を記載する。
【００３６】
（従来のリフォールディング工程の増強；移行工程）  多くのリフォールディング工程において、特定の試薬または条件が除去または無効にされる重要な段階が存在する。これらの段階は、リフォールディングしたタンパク質をアンフォールディング、または凝集および沈降させる機会を提供する。この段階を生じることを防ぐために、本発明は、ある処理条件を次へと「橋渡し（ｂｒｉｄｇｅ）」をするために利用され得る。例えば、界面活性剤またはカオトロピック剤の除去、あるいはタンパク質サンプルのさらなる処理に重要な温度の低減は、凝集の危険性を生成する。界面活性剤またはカオトロピック剤のない溶液へ、あるいは室温ヘと移行する間に、サンプルを加圧することによって、沈降の機会を低減させる。
【００３７】
同様に、タンパク質の脱凝集および／またはリフォールディングを容易にするために、不十分および自然な（ｏｆ  ｔｈｅｍｓｅｌｖｅｓ）、いくつかの試薬または条件は、高圧を用いることで増強され得る。特定の使用は、カオトロピックまたは界面活性剤の排除により成功するが、他の使用は、これらの比較的苛酷な処理により、影響され得ない。これらの試薬または条件を、高圧と組合わせて使用することによって、それらの性能を改善し得、そして、いくつかの場合においては、実施可能なリフォールディングプロセスを形成し得る。そのような組合わせは、圧力および温度上昇、圧力および界面活性剤、圧力およびカオトロープなどを含む。
【００３８】
（遺伝子産物に対するフォールディング条件のスクリーニング）  当業者に周知の技術を用いて、既知または未知のタンパク質産物を宿主細胞に産生させるために、適切な宿主細胞を遺伝子改変することによって、タンパク質産生は、容易にされ得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと。残念なことに、これらの産物は、しばしば宿主細胞内に不溶性沈降物として見出され、そして、適切にフォールディングしたタンパク質をこれらの沈降物から回収することは、かなりの困難性が存在し得る。しかし、各タンパク質−宿主細胞の組合わせは独特であるので、適切なリフォールディング条件を決定するために、しばしば困難な経験的な実験を行う。
【００３９】
本発明の１つの局面において、所望のタンパク質産物の不溶性沈降物を含む、細胞「ペースト」のホモジナイズされたサンプル、または（例えば、細胞片を除くための遠心分離、次いで、脂質を除くための界面活性剤を含む緩衝化溶液を用いる沈降物の洗浄によって）部分的に精製された調製物は、個々のサンプル容器にそれらを配置することにより、最適な溶解条件およびフォールディング条件についてスクリーニングされ得る。さらに種々の緩衝液（例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＰＳ）、塩（例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ナトリウム、亜鉛、カルシウム、アンモニウムおよびカリウムの、塩酸塩、硫酸塩および炭酸塩）、可溶化剤（例としては、以下を含むが、これらに限らない：尿素、グアニジン塩酸、グアニジン硫酸、およびサルコシン）、および安定化剤（例としては、以下を含むが、これらに限定されない：非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＢｒｉｊ）、保存料（例えば、ベンジルアルコール）、ならびに炭水化物（例えば、蔗糖、ラフィノース、ヒドロキシエチル澱粉、デキストラン、およびトレハロース））を含み得る水溶液もまた、これらの容器に添加される。
【００４０】
好ましい容器は、複数のウェル（例えば、９６ウェル）のサンプルホルダーであり、複数のタンパク質サンプルは、サンプルウェルのアレイの中に配置され得、ここで各ウェルは、異なるｐＨ、イオン強度、塩の型、緩衝液の型、および安定化剤の溶液をおそらく含む。複数のウェルのサンプルホルダーは、市販の自己接着性のプラスチックカバーを用いて、簡便に密封され得る。次いで、容器、または複数のウェルのサンプルホルダー全体は、圧力管（例えば、Ｆｌｏｗ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ.またはＨｉｇｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．からの市販されるもの）の中に置かれ得る。次いで、高圧管の内部容積の残りは、水または他の圧力伝達性の流体で満たされ得る。次いで、圧力は、特許請求の範囲に記載されるように上昇され得、そしてタンパク質サンプルの溶解およびフォールディングがもたらされる。
【００４１】
（ウイルスの不活性化プロセス後の、タンパク質の脱凝集およびリフォールディング）  ウイルスの不活性化プロセスは、しばしばヒト血漿、血漿由来のタンパク質産物、および細胞培養培地に対して使用される。これらのプロセスは、熱、高圧のサイクル、または溶媒−洗浄剤混合物による溶液の処理と関連する。これらのいずれの方法についても、ウイルスを不活性化する同じプロセスもまた、タンパク質の変性および凝集を生じるという問題を生じる。したがって、ウイルス不活性化プロトコルは、しばしば最適なウイルス不活性化と所望のレベルの活性なタンパク質の最適な保持との間の平衡を示す。その結果は、不活性化が不完全であるか、貴重なタンパク質成分が損なわれるか、またはこれらの両者のいずれかである。問題は、処理された産物（例えば、第ＶＩＩＩ因子）の中で最も貴重なタンパク質のいくつかが、ストレス誘発性の凝集に最も感受性であるもののいくつかであるという事実により、さらに複雑にされる。
【００４２】
本発明者らのプロセスを用いて、ウイルスを含む溶液は、ウイルスを不活性化するために使用される標準的方法のいずれかを用いて処理され得る。この処理の後、次いで、溶液は、ネイティブで活性なタンパク質のレベルを増加するために、本発明者らの高圧脱凝集工程およびリフォールディング工程に供される。さらに、所定のウイルス不活性化の間に損傷したタンパク質を再生するための能力を用いて、さらに効果的な（例えば、高温下へのより長い曝露、および／または、より高温への曝露）ウイルス不活性化プロセスを使用し得る。
【００４３】
関連し得るウイルスとしては、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、エプスタイン・バーウイルス、ＨＨＶ６、ならびにサイトメガロウイルスが挙げられる。サンプルは、血漿、血液、血漿由来のタンパク質産物、培養されたヒト細胞由来のタンパク質産物、血清、または血清含有細胞培養培地であり得る。高圧タンパク質リフォールディング手順は、さらに、高温、カオトロピック剤、可溶化剤、還元剤、撹拌および「段階的」減圧を含む、１つ以上の処理を含む。
【００４４】
（タンパク質沈降に対して核または前核として作用する可溶性凝集体のレベルの低減）  タンパク質産物の精製、貯蔵、およびプロセシングの間に、ネイティブでない可溶性タンパク質凝集体、および／またはネイティブでないタンパク質凝集体上の不溶性沈降物の形成を促進するいくつかの工程が、存在する。これらとしては、濾過、透析、クロマトグラフィー、凍結融解、例えば、保持槽、すなわち、まさに最終産物の瓶の充填のプロセスの間の気泡への曝露などが挙げられる。これらの凝集体を除去または低減することは、沈降に起因する、引き続くプロセシング工程の間の、非常に大量のタンパク質の損失の危険性を低減させる。これは、可溶性凝集体がしばしば沈降に対して核または前核として働くからである。それ自体、これらの種は、比較的低レベルで存在し得（例えば、全タンパク質質量の１％）、そして全タンパク質集団の大きな画分（例えば、３０〜５０％より多く、またはそれより多く）の迅速な沈降をなお誘発し得る。沈降は、与えられたプロセシング工程が、閾値を越える可溶性凝集体のレベルの形成を促進する場合、および／またはアセンブリを臨界的な核のサイズへ促進するストレス（例えば、濾過）へ存在する可溶性凝集体を曝露することにより、誘発され得る。また、長期間の保存という単なる事実が、可溶性凝集体に起因する沈降を生じ得る。
【００４５】
従って、１つの実施形態において、これらの核または前核は、全細胞のスラリー、または部分的に精製されたスラリーを、本発明の高圧脱凝集および／またはリフォールディングプロセスを用いて、プロセシングすることによって、簡単に除去され得る。あるいは、沈降したタンパク質は、濾過、クロマトグラフィーまたは遠心分離により、可溶性画分から分離され得、次いで、同一の高圧法を用いてリフォールディングされ得る。これらの凝集体の除去（すなわち、まさにレベルの低減）は、引き続くプロセシング工程におけるタンパク質の沈降に対する危険を最小にし、そしてリフォールディングするタンパク質調製物の保存期間を改善し得る。
【００４６】
本発明の種々の局面は、以下の議論の中で詳細に記載される。
【００４７】
（ＩＩ．規定）
本明細書中で使用される場合、「タンパク質凝集体」は、多数のタンパク質分子から構成されるとして規定され、ここで、ネイティブでない非共有結合性相互作用および／または分子間ジスルフィド結合のようなネイティブでない共有結合は、タンパク質分子を互いに保持する。典型的には（常ではないが）、凝集体は、十分な分子を含み、その結果、凝集体は不溶性である。溶液中に凝集体を生じる異常なオリゴマーのタンパク質もまた存在する。さらに、典型的に（常ではないが）、ネイティブで凝集していないタンパク質の表面には示されない、少なくとも１つのエピトープまたは領域が、凝集体表面上に示される。「封入体」は、本発明を適用し得る、特に目的の凝集体の型である。
【００４８】
「大気」圧または「雰囲気」圧は、約１５ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）または１バール（ｂａｒ）として規定される。
【００４９】
「結合パートナー」または「リガンド」は、リフォールディングする混合物中に含まれ得る。「結合パートナー」は、目的の標的タンパク質と特異的に結合する（またはさもなくば相互作用する）化合物である。「リガンド」としては、限定なく以下が挙げられる：抗体、レセプター、ペプチド、ペプチド模倣物、ビタミン、補因子、補欠分子団、基質、産物、拮抗インヒビター、金属および他の低分子または高分子。このような結合パートナーの存在は、リフォールディング混合物において、特に有利であり、ここで、結合パートナーがリフォールディングする標的タンパク質と相互作用する場合、この結合パートナーは、標的タンパク質のネイティブなコンフォーメーションを好む。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、タンパク質の「生物学的活性」は、タンパク質の既知の有用性または意図される有用性と相関されることが当該分野において一般的に受け入れられるアッセイで測定されるような既知の最大比活性の少なくとも１０％を意味する。治療用途が意図されるタンパク質について、選択されるアッセイは、管理機関により承認されるアッセイであり、ここで、タンパク質の安全性および有効性に対するデータは、提出されねばならない。１０％よりも高い既知の最大比活性タンパク質は、本発明の目的で、「生物学的に活性」である。
【００５１】
本文脈においてタンパク質に適用される場合、「変性した」とは、ネイティブな２次構造および３次構造が、そのタンパク質が「生物学的活性」をもたない程度に分裂されることを意味する。
【００５２】
「脱気」は、本発明において使用される溶液中に溶解した気体の除去として規定される。気体は、大気圧と比較して、高圧において液体にはるかによく溶解する。その結果、サンプルの頭隙の全ての気体は、加圧の際に溶液中へ押し込まられ得る。結果は、２通りある：溶液中のさらなる酸素は、タンパク質産物を化学的に分解し得、そして減圧の際に溶液中に存在する気体は、さらなる凝集を引き起こし得る。従って、サンプルは、脱気した溶液を用いて調製されるべきであり、そして全ての頭隙は加圧に先立ち液体で満たされるべきである。
【００５３】
「減圧」は、高圧から、より低圧（通常は、大気圧または雰囲気圧）へ、圧力を減少させるプロセスである。減圧は、１０秒から１０時間の範囲の、予め決められた期間にわたって行われ、そして（周囲と比較してなお高いが）中間の圧力レベルで、最適なリフォールディングを可能にするため、１つ以上の時点で中断され得る。減圧または中断は、１秒、２秒、５秒、１０秒、２０秒、１分、２分、５分、１０分、３０分、６０分、２時間、３時間、４時間、および５時間であり得る。
【００５４】
「異種」タンパク質は、正常には特定の宿主細胞により産生されないタンパク質である。組換えＤＮＡ技術は、形質転換された宿主細胞（例えば、大腸菌）から比較的大量の異種のタンパク質（例えば、成長ホルモン）の発現を可能にしてきた。これらのタンパク質は、しばしば宿主細胞の細胞質、および／またはペリプラズムの中の、不溶性の封入体の中に隔離される。封入体または細胞質の凝集体は、少なくとも部分的に、回収されるべき異種のタンパク質を含む。これらの凝集体は、しばしば位相差顕微鏡の下で、輝点として観察される。
【００５５】
タンパク質凝集体を解離させる目的で、「高圧」は、約０．２５ｋｂａｒから約１２ｋｂａｒを意味する。この範囲内で特に企図される圧力は、０．３０ｋｂａｒ、０．３５ｋｂａｒ、０．４０ｋｂａｒ、０．５０ｋｂａｒ、０．５５ｋｂａｒ、０．６０ｋｂａｒ、０．６５ｋｂａｒ、０．７０ｋｂａｒ、０．７５ｋｂａｒ、０．８０ｋｂａｒ、０．８５ｋｂａｒ、０．９０ｋｂａｒ、０．９５ｋｂａｒ、１．０ｋｂａｒ、１．１ｋｂａｒ、１．２ｋｂａｒ、１．３ｋｂａｒ、１．４ｋｂａｒ、１．５ｋｂａｒ、１．６ｋｂａｒ、１．７ｋｂａｒ、１．８ｋｂａｒ、１．９ｋｂａｒ、２．０ｋｂａｒ、２．１ｋｂａｒ、２．２ｋｂａｒ、２．３ｋｂａｒ、２．４ｋｂａｒ、２．５ｋｂａｒ、２．６ｋｂａｒ、２．７ｋｂａｒ、２．８ｋｂａｒ、２．９ｋｂａｒ、３．０ｋｂａｒ、３．１ｋｂａｒ、３．２ｋｂａｒ、３．３ｋｂａｒ、３．４ｋｂａｒ、３．５ｋｂａｒ、３．６ｋｂａｒ、３．７ｋｂａｒ、３．８ｋｂａｒ、３．９ｋｂａｒ、４．０ｋｂａｒ、４．１ｋｂａｒ、４．２ｋｂａｒ、４．３ｋｂａｒ、４．４ｋｂａｒ、４．５ｋｂａｒ、４．６ｋｂａｒ、４．７ｋｂａｒ、４．８ｋｂａｒ、４．９ｋｂａｒ、５．０ｋｂａｒ、５．１ｋｂａｒ、５．２ｋｂａｒ、５．３ｋｂａｒ、５．４ｋｂａｒ、５．５ｋｂａｒ、５．６ｋｂａｒ、５．７ｋｂａｒ、５．８ｋｂａｒ、５．９ｋｂａｒ、６．０ｋｂａｒ、６．１ｋｂａｒ、６．２ｋｂａｒ、６．３ｋｂａｒ、６．４ｋｂａｒ、６．５ｋｂａｒ、６．６ｋｂａｒ、６．７ｋｂａｒ、６．８ｋｂａｒ、６．９ｋｂａｒ、７．０ｋｂａｒ、７．１ｋｂａｒ、７．２ｋｂａｒ、７．３ｋｂａｒ、７．４ｋｂａｒ、７．５ｋｂａｒ、７．６ｋｂａｒ、７．７ｋｂａｒ、７．８ｋｂａｒ、７．９ｋｂａｒ、８．０ｋｂａｒ、８．１ｋｂａｒ、８．２ｋｂａｒ、８．３ｋｂａｒ、８．４ｋｂａｒ、８．５ｋｂａｒ、８．６ｋｂａｒ、８．７ｋｂａｒ、８．８ｋｂａｒ、８．９ｋｂａｒ、９．０ｋｂａｒ、９．１ｋｂａｒ、９．２ｋｂａｒ、９．３ｋｂａｒ、９．４ｋｂａｒ、９．５ｋｂａｒ、９．６ｋｂａｒ、９．７ｋｂａｒ、９．８ｋｂａｒ、９．９ｋｂａｒ、１０．０ｋｂａｒ、１０．１ｋｂａｒ、１０．２ｋｂａｒ、１０．３ｋｂａｒ、１０．４ｋｂａｒ、１０．５ｋｂａｒ、１０．６ｋｂａｒ、１０．７ｋｂａｒ、１０．８ｋｂａｒ、１０．９ｋｂａｒ、１１．０ｋｂａｒ、１１．１ｋｂａｒ、１１．２ｋｂａｒ、１１．３ｋｂａｒ、１１．４ｋｂａｒ、１１．５ｋｂａｒ、１１．６ｋｂａｒ、１１．７ｋｂａｒ、１１．８ｋｂａｒ、１１．９ｋｂａｒ、および１２．０ｋｂａｒである。リフォールディング工程の目的で、「高圧」は、約０．２５ｋｂａｒから約３．３ｋｂａｒを意味する。この範囲内で特に企図される圧力は、０．３０ｋｂａｒ、０．３５ｋｂａｒ、０．４０ｋｂａｒ、０．５０ｋｂａｒ、０．５５ｋｂａｒ、０．６０ｋｂａｒ、０．６５ｋｂａｒ、０．７０ｋｂａｒ、０．７５ｋｂａｒ、０．８０ｋｂａｒ、０．８５ｋｂａｒ、０．９０ｋｂａｒ、０．９５ｋｂａｒ、１．０ｋｂａｒ、１．１ｋｂａｒ、１．２ｋｂａｒ、１．３ｋｂａｒ、１．４ｋｂａｒ、１．５ｋｂａｒ、１．６ｋｂａｒ、１．７ｋｂａｒ、１．８ｋｂａｒ、１．９ｋｂａｒ、２．０ｋｂａｒ、２．１ｋｂａｒ、２．２ｋｂａｒ、２．３ｋｂａｒ、２．４ｋｂａｒ、２．５ｋｂａｒ、２．６ｋｂａｒ、２．７ｋｂａｒ、２．８ｋｂａｒ、２．９ｋｂａｒ、３．０ｋｂａｒ、３．１ｋｂａｒ、３．２ｋｂａｒ、３．３ｋｂａｒである。
【００５６】
「宿主細胞」は、目的の異種のタンパク質を発現するように形質転換された、微生物細胞（例えば、細菌、および酵母）、または他の適切な細胞（動物細胞もしくは植物細胞を含む）である。本発明において企図される宿主細胞は、細胞により発現される異種タンパク質が屈折体（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ  ｂｏｄｉｅｓ）中に隔離されるものを含む。例示的な宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２、Ｗ３１１ＯＧ（ｐＢＧＨＩ）系統、であり、これは、所望の異種タンパク質の発現をもたらすために形質転換されてきた。
【００５７】
タンパク質の「ネイティブなコンフォメーション」は、本文脈において、タンパク質がその完全に活性な状態で天然に存在する場合、タンパク質の２次構造、３次構造、および４次構造をいう。
【００５８】
「加圧」は、圧力を（通常、大気圧または雰囲気圧から）高い圧力へ圧力を増加させる工程である。加圧は、０．１秒から１０時間の範囲の、予め決められた期間にわたって行われる。このような時間として、１秒、２秒、５秒、１０秒、２０秒、１分、２分、５分、１０分、３０分、６０分、２時間、３時間、４時間、および５時間が挙げられる。
【００５９】
「タンパク質」は、広範な種々のペプチド含有分子を含み、以下のタンパク質を含んでいる：モノマータンパク質、ダイマータンパク質、マルチマータンパク質、ヘテロダイマータンパク質、ヘテロトリマータンパク質、およびヘテロテトラマータンパク質；ジスルフィド結合されたタンパク質；グリコシル化タンパク質；螺旋タンパク質；ならびにアルファシート含有タンパク質およびベータシート含有タンパク質。特定のタンパク質としては、ホルモン、抗体、酵素、および金属結合タンパク質が挙げられる。
【００６０】
「リフォールディング」、「再生」、または「ネーチャリング（ｎａｔｕｒｉｎｇ）」は、本文脈において、これによって完全にかまたは部分的に変性したタンパク質が、同族のネイティブな分子の構造と同様の、２次構造、３次構造、および４次構造を採用するプロセスを意味する。適切にリフォールディングしたタンパク質は、変性していない分子の実質的な活性である生物学的活性を有する。ネイティブなタンパク質がジスルフィド結合を有する場合、ネイティブな分子内ジスルフィド結合を形成するための酸化は、リフォールディングプロセスの所望される要素である。
【００６１】
「界面活性剤」は、水の表面張力を減少させる界面活性な化合物である。
【００６２】
（ＩＩＩ．試薬および手順）
（Ａ．カオトロピック剤）
カオトロピック剤は、以下を含むが、これらに限定されない、ポリペプチド鎖を実質的にランダムなコンフォメーションにし得る化合物である：グアニジン塩酸（グアニジウム塩酸、ＧｄｍＨＣｌ）、グアニジン硫酸、尿素、チオシアン酸ナトリウム、ザルコシル、ドデシル硫酸ナトリウム、オクチル硫酸ナトリウム、および／またはタンパク質内の非共有結合性の分子間結合を破壊する他の化合物。
【００６３】
カオトロピック剤は、使用される場合、「低」濃度で用いられる。そのような低濃度は、０〜約４．５Ｍである。特定の濃度としては、以下が挙げられる：０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ、１．０Ｍ、１．２５Ｍ、１．５Ｍ、１．７５Ｍ、２．０Ｍ、２．２５Ｍ、２．５Ｍ、３．０Ｍ、３．５Ｍ、４．０Ｍ、および４．５Ｍ。
【００６４】
（Ｂ．還元剤および酸化剤）
還元剤は、電子を移動し得、その際、種々の原子間の結合を「還元する」。本発明の文脈において、還元剤は、分子内相互作用および分子間相互作用、特に、ジスルフィド架橋を伴う相互作用を、破壊し得る。本発明に従って、例示的な還元剤は、ジチオスレイトール（ｄｉｏｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、グルタチオン、ジチオエリスリトール、またはβ−メルカプトエタノールである。
【００６５】
酸化剤は、還元剤を中和するために使用され得る。酸化剤としては、酸化型グルタチオン、分子酸素、空気、または過酸化物が挙げられる。
【００６６】
（Ｃ．界面活性剤）
界面活性剤は、特定のタンパク質の溶解性を改善するために用いられる。有用な界面活性剤としては、以下が挙げられる：非イオン性薬剤（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシ−エタノールおよびポリオキシエチレンソルビタンが挙げられるが、これらに限定されない）、アニオン性薬剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）およびカチオン性薬剤（例えば、塩化セチルピリジニウム）ならびに両性薬剤を含む。適切な界面活性剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：デオキシコレート、オクチル硫酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンエーテル、コール酸ナトリウム、オクチルチオグルコピラノシド、ｎ−オクチルグルコピラノシド、臭化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、およびビス（２−エチルヘキシル）スルフォサクシネートナトリウム。
【００６７】
（Ｄ．緩衝化剤）
緩衝化剤は、所望のｐＨの値またはｐＨ範囲を維持するために、脱凝集および／またはリフォールディングする混合物中に有利に存在する。無機緩衝化系（とりわけ、ホスフェート、カルボネート）および有機緩衝化系（とりわけ、シトレート、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ）は、当該分野において周知である。
【００６８】
（Ｅ．安定化剤）
非特異的なタンパク質安定化剤は、タンパク質の最もコンパクトなコンフォーメーションを有利にするように作用する。このような薬剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：蔗糖、トレハロース、グリセロール、ベタイン、アミノ酸、およびトリメチルアミンオキシド。
【００６９】
（Ｆ．分光法）
リフォールディング条件を最適にするための別の有用な技術は、圧力下におけるサンプルのインサイチュ分光学的測定である。これは、圧力下においてタンパク質の安定性を試験するために周知の工程であるが、タンパク質凝集の研究において活用されている。圧力下での凝集体の溶解を観察するために高圧分光技術を用いることは、凝集体からタンパク質を回収するために最適な圧力範囲を決定することに役立つ。特注の高圧セルは、高圧下のアンフォールディングの研究のために慣用的に使われており、そして高圧下における脱凝集およびリフォールディングの使用に対して適応され得る。
【００７０】
（ＩＶ．タンパク質のリフォールディングのための現在の方法論）
以下に、「最新技術」を示す種々の一般的なタンパク質リフォールディング技術を記載する：
米国特許第５，０７７，３９２号（１９９１）は、原核生物において産生された組換えタンパク質の活性化のためのプロセスを記載し、凝集したタンパク質は、４〜８Ｍのグアニジン塩酸または６〜１０Ｍの尿素に溶解される。一旦可溶化されると、緩衝液は、ｐＨ１とｐＨ４との間のｐＨに透析される。最終的に、溶液を、非変性環境および酸化環境を提供するように希釈して、リフォールディングを可能にする。
【００７１】
米国特許第５，５９３，８６５号（１９９７）は、原核生物宿主における発現の後、ジスルフィド結合を含有する、真核生物の組換えタンパク質を活性化するためのプロセスを記載する。封入体タンパク質は、還元剤を含む強力な変性剤（６Ｍグアニジン塩酸）中に溶解される。リフォールディング工程において、タンパク質は、酸化しかつ変性しない環境の中へ導入される。
【００７２】
米国特許４，６７７，１９６号（１９８７）はまた、不溶性の封入体からの、生物学的に活性なタンパク質の精製および産生を記載する。これは、不溶性の形態からタンパク質を回収するための一般的な方法であり、ＳＤＳ中にタンパク質凝集体を溶解させる工程を含む。一旦溶解されると、タンパク質溶液は、カラムクロマトグラフィーにより、ＳＤＳから分離される。ＳＤＳの非存在下において、タンパク質は、リフォールディングし得る。最終的に、タンパク質は、カラムから溶出される。尿素はまた、溶解したタンパク質溶液の中に含まれている。アニオン交換クロマトグラフィーの後、リフォールディングしたタンパク質溶液に由来する尿素は、透析により除去される。
【００７３】
米国特許５，６０５，６９１（１９９７）は、ＳＤＳおよび熱を使用した封入体タンパク質の可溶化を記載する。いったん溶液にしたら、タンパク質は、初めにＳＤＳを希釈し、次に非変性濃度になるまでＳＤＳを透析することによって再び折りたたまれる。
【００７４】
米国特許４，６５９，５６８（１９９７）は、不溶性タンパク質の凝集体または複合体からのタンパク質の可溶化、精製および特徴付けのプロセス、ならびにそれからの組成物を記載する。その不溶性タンパク質の凝集体または封入体は、尿素の段階的な勾配（３Ｍ〜７Ｍの尿素）の上部に重層される。サンプルが遠心分離されるにつれ、凝集体はそれらが溶けるまで勾配を通って移動する。この方法はタンパク質が溶ける尿素濃度を決定する手段を提供する。
【００７５】
米国特許５，７２８，８０４（１９９５）は、変性または凝集させたタンパク質を、５〜７Ｍの塩酸グアニジンを含んだ、界面活性剤を含まない水性媒質に懸濁し、そして一晩インキュベートするプロセスを記載する。いったん懸濁したら、サンプルを、タンパク質が再び折りたたまれることを助けるに十分なシクロデキストリンと接触させる。最終的にシクロデキストリンは透析によって取り除かれる。
【００７６】
以下は、特定のタンパク質の再折りたたみのために開発されたプロセスを開示した特許である。
【００７７】
米国特許４，６５２，６３０（１９８７）は、活性なソマトトロピンを生産するための方法を記載する。この方法では、凝集体または封入体はカオトロープ（３Ｍ〜５Ｍの尿素）で可溶化され、そしてｐＨは完全な可溶化を可能にするために調整される。次に条件は、非変性濃度のカオトロープの存在下で酸化を可能にするために改変される。
【００７８】
米国特許５，０６４，９４３（１９９１）もまた、ソマトトロピンを可溶化し、そして再生するための方法を記載するが、それはカオトロープの使用を必要としない。ここではｐＨは１１．５と１２．５との間に調整されており、そして５から１２時間にわたって維持されている。これらの条件下において、ソマトトロピンは可溶化し、そして再生する。
【００７９】
米国特許５，０２３，３２３（１９９１）は、ソマトトロピン（成長ホルモン）凝集体を変性性カオトロープ（１Ｍ〜８Ｍの尿素）に溶解する、この凝集体の再生（ｎａｔｕｒａｔｉｏｎ)のためのプロセスを記載する。可溶化工程に続いて、このサンプルは、非変性濃度のカオトロープの存在下で酸化環境にさらされる。
【００８０】
米国特許５，１０９，１１７（１９９２）は、有機アルコールおよびカオトロープ（１Ｍ〜８Ｍの尿素）の存在下でソマトトロピン凝集体を溶かす方法を記載する。次いで、可溶化されたタンパク質は、非変性酸化環境中で再生される。
【００８１】
米国特許５，７１４，３７１（１９９８）は、Ｃ型肝炎ウイルスのプロテアーゼの凝集体を再び折りたたむための方法を提供する。凝集体は５Ｍ塩酸グアニジンで可溶化される。二番目に、還元剤を溶液に加え、酸性を与えるようにｐＨを調整する。三番目に、変性剤を透析によって溶液から取り除き、そして最終的にｐＨを出発点まで高くする。
【００８２】
米国特許４，９２３，９６７（１９９０）は、ヒトのインターロイキン２について特異的なプロセスを記載する。タンパク質の凝集体は、亜硫酸分解剤（ｓｕｌｆｉｔｏｌｙｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含む４〜８Ｍの塩酸グアニジンに溶かされる。タンパク質がいったん溶けたら、亜硫酸分解剤を溶媒変換によって取り除く。最終的に、温度を上昇させて、インターロイキン２を純粋な形態で沈殿させる。再折りたたみを可能にするために、沈殿物を塩酸グアニジンに還元剤を加えたものに再び溶かす。最終的に溶液を希釈してタンパク質を再折りたたみさせる。
【００８３】
米国特許５，１６２，５０７（１９９２）は、微生物から組換え型のインターロイキン２を回収、精製、酸化、再生するためのプロセスを記載する。微生物から単離した不溶性のインターロイキン２は２Ｍ〜４Ｍの塩酸グアニジン中で可溶化される。塩酸グアニジン溶液は、次に溶液からタンパク質が沈殿するまで希釈される。沈殿物は次に再び塩酸グアニジン溶液に溶かされる。タンパク質は次に酸化されて、ネイティブなジスルフィド結合が再形成される。最終的に溶液は希釈され、そしてインターロイキン２は溶解したままである。
【００８４】
米国特許４，９８５，５４４（１９９１）は、魚の成長ホルモンを再生するプロセスを記載する。このプロセスでは、凝集体または封入体は、グアニジン、尿素、ＳＤＳ、酸またはアルカリを用いて溶かされる。還元剤は次に取り除かれ、そして酸化剤を加える。最終的に変性剤を取り除いて、再折りたたみを可能にする。
【００８５】
米国特許５，４１０，０２６（１９９５）は、不溶性の誤って折りたたまれたインスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）が活性高次構造に再び折りたたまれる方法を記載する。いったんＩＧＦ−１が単離されたら、これを、凝集体が可溶化し再び折りたたまれるまで１〜３Ｍの尿素または１Ｍの塩酸グアニジンとともにインキュベートする。
【００８６】
タンパク質の再折りたたみを扱う他の米国特許としては、米国特許５，７０８，１４８；４，９２９，７００および４，７６６，２２４が挙げられる。
【００８７】
（Ｖ．攪拌）
これまでの研究によって、タンパク質の攪拌が凝集および沈殿を生じ得ることが実証されている  Ｂａｍら（１９９８）。しかし、質量の輸送の一般的影響はタンパク質の再折りたたみにおいてほとんど無視されている。本発明者らは驚いたことに、物理的な混合、すなわち「攪拌」（攪拌、振盪、回転など）がタンパク質の再折りたたみの速度および程度の両方を増大させることをみいだした。
【００８８】
したがって、本発明に従って、タンパク質の攪拌を用いて、圧力下でのタンパク質の再折りたたみを助けそして改良し得る。攪拌は、高圧力下で水性媒質中に懸濁しているタンパク質の沈殿した凝集体に適用され得る。最適には、このような攪拌は、沈殿したタンパク質の凝集体が水溶液の全体に均一に分散するが、攪拌によって誘導される凝集が生じるようなレベルよりも下の強度で適用される。このような攪拌は、タンパク質が凝集しなくなるときまで、分散を維持するために必要に応じて適用されるべきである。攪拌は、超音波を用いて、または静的混合デバイスを通してのポンピングによって、成し遂げられ得る。
【００８９】
（ＶＩ．高温での再折りたたみ）
高温はしばしばタンパク質の凝集を引き起こすために用いられているが、本発明者らは、温度が不可逆的な変性を引き起こすほど高くなければ、高温が、高圧処理によってもたらされる再折りたたみの回収率を高め得ることを決定した。一般に、再折りたたみのための高温は、活性の不可逆的な喪失が起こる温度より約２０℃低くすべきである。相対的に高い温度（例えば、約６０℃〜約１２５℃、約８０℃〜約１１０℃（約１００℃、約１０５℃、約１１０℃、約１１５℃、約１２０℃、約１２５℃を含んでいる））は、減圧する前に温度が適切に低い温度まで下げられる限り、溶液が圧力下にある間に使用され得る。そのような適切に低い温度は、熱により誘導される変性または凝集が大気条件で生じる温度より低い温度として定義されている。
【００９０】
（ＶＩＩ．圧力下での透析および希釈）
圧力下でのタンパク質の再折りたたみは、タンパク質の濃度に依存しないようである。これは高いタンパク質濃度が、タンパク質の凝集を誘導すると知られていることを考えると驚くべきことである。しかし、それは高濃度で、脱凝集した
適切に再折りたたみされたタンパク質を得ることが可能である一方で、まだ高濃度の間にタンパク質を圧力下から取り出すことは、再凝集という結果になるのかもしれない。さらに、すべての加圧工程を低濃度下で行なうと、処理されなければならない物質の体積を非常に増加させ、それゆえ時間的要因が増加する。あるいは、機械をスケールアップして、より大きな体積を取り扱うようにすることは、速度を速める。しかしながら、機械の加圧面のスケールアップの費用は非常に高い。
【００９１】
したがって、本発明者らは、高濃度タンパク質下での脱凝集および再折りたたみの実験を行なうことを提案している。問題のタンパク質に依存して、「高」濃度は、１ｍｇ/ｍｌ〜１００ｍｇ/ｍｌの範囲にわたり得る。脱凝集に続いて、そして、再折りたたみの間またはその後、タンパク質を０．１ｍｇ/ｍｌ〜１０ｍｇ/ｍｌ、好ましくは１ｍｇ/ｍｌの保存安定濃度まで希釈する。この濃度は、上記で議論した様々な緩衝液を使用して調整される。
【００９２】
さらに、圧力下での透析および希釈は、圧力下にありながら、例えば還元剤を用いて、タンパク質をとりまく化学的な環境を変えることを可能にする。透析は、バッチ様式で行なわれ得、ここで、タンパク質溶液は透析膜の一方の側に配置され、そして化学物質は時間がたつにつれ、拡散させられる。しかし、タンパク質は、利用した膜を通して拡散するには大きすぎる。対照的に、希釈は、圧力下にありながら、二つの溶液を注入または混合して、化学的条件のより突然の変化をひきおこすことを必要とする。さらに、再折りたたみプロセスで使用される溶液のｐＨを変えることが望まれるかもしれない。例えば、タンパク質の二次構造の安定性は典型的に、より低いｐＨでより高いのに対して、酸化還元剤の存在下でのジスルフィド交換の速度は、典型的にｐＨ１０〜１１でより高い。したがって、酸化還元剤の除去を認めることに加えて、圧力下での透析はｐＨでの同時の変化を可能にする。
【００９３】
（ＶＩＩＩ．「段階的な」減圧）
本発明の別の局面では、出願人らは「段階的な」減圧を提供する。このプロセスは、使用される最高圧力から、最高レベルと周囲圧力との間の中間の、少なくとも第２のレベルへと圧力を下げることを含む。目的は、タンパク質が望ましいコンホメーションをとるのを可能にするこの中間範囲またはその付近の圧力でのインキュベーション期間を提供することである。
【００９４】
１つの実施形態では、本発明は、最高圧力と周囲圧力との間のどこかに位置する中間圧力でのインキュベーションを単に意図する。あるいは、約５０ＭＰａ〜５００ＭＰａ、約１００ＭＰａ〜４００ＭＰａ、および約２００ＭＰａ〜３００ＭＰａを含むがこれらに限定されない、「中間」圧力工程として適しているかもしれない特定の圧力範囲がある。中間的な加圧の特定のレベルとしては、約１００ＭＰａ、約１５０ＭＰａ、約２００ＭＰａ、約２５０ＭＰａ、約３００ＭＰａ、約３５０ＭＰａ、約４００ＭＰａ、約４５０ＭＰａおよび約５００ＭＰａが挙げられる。唯一の制限は、使用するときに、先の圧力が、加圧の第一のレベルまたは最高レベルより低くなければならないことである。中間の減圧工程のタイミングとしては、１分、５分、１０分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、および１２時間のインキュベート期間が挙げられる。
【００９５】
（ＩＸ．バッチ対連続したプロセシング）
機械的に、高圧力プロセシングの方法は主に２つある：バッチ法および連続法。バッチプロセスは単純に、指定のチャンバを満たすこと、このチャンバを一定時間加圧すること、およびバッチを減圧することを含んでいる。対照的に、連続プロセスは、圧力チャンバ（ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｈａｍｂｅｒ）に凝集体を常に送り込み、そして再折りたたみした可溶性タンパク質を圧力チャンバから運び出す。両方の状況の間、よい温度制御および圧力制御は必須である。なぜならこれらのパラメーターの変動は収率の不一致を引き起こし得るからである。温度および圧力の両方とも圧力チャンバの中で測定され、そして適切に制御されるべきである。
【００９６】
バッチサンプル：それぞれのタンパク質の特定の安定性の問題に依存して、バッチサンプルを扱う方法は多数ある。タンパク質溶液は、圧力チャンバにローディングされ得、この場合、再折りたたみの緩衝液は圧力媒質として用いられる。あるいはサンプルは、任意の種々の、封をしたフレキシブルコンテナにローディングされ得る。これは、圧力媒質、ならびにタンパク質がさらされている表面でのより大きな柔軟性を可能にする。考えられるところでは、サンプル容器は均等に作用して、化学分解から目的のタンパク質を保護し得る（すなわち、酸素スカベジングプラスチックが利用可能である）。
【００９７】
連続プロセシング：連続プロセシングでは、スケールアップは簡単である。圧力下での小さな容積を使用して、大きな容積のタンパク質溶液を再折りたたみさせ得る。さらに、連続プロセスの出口に適切なフィルターを使用することにより、可溶性および不溶性の両方の凝集体を保持しながら、適切に再折りたたみしたタンパク質がチャンバから選択的に放出される。
【００９８】
（Ｘ．多量体タンパク質）
ヒトの疾患治療、予防適用および診断適用に使用される可能性のあるたくさんのタンパク質は、複数のタンパク質鎖から構成される。組換え技術によるこれらのタンパク質の産生は、適切な鎖がアセンブリしてネイティブな二次、三次、および四次構造を形成することを必要とする。不適切に会合した鎖または会合していない鎖は特に、ネイティブでない凝集体および沈殿物を形成する傾向がある。一つの例では、これらのネイティブでない凝集体は、サンプルコンテナ中で適切な処方物に懸濁され得、Ｆｌｏｗ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．または、Ｈｉｇｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．から市販されている高圧容器のような市販の高圧容器に配置され得、そして加圧してタンパク質を脱凝集し、折りたたみおよびネイティブな構造へのアセンブリを促進させ得る。別の例では、個々の鎖は周知の組換え技術を通して別々に合成され得る。個々の鎖の精製または半精製溶液は、適切な処方物中でサンプルホルダー中で組み合わされ得、上記の高圧容器中に配置され得、そして加圧して折りたたみおよびアセンブリがもたらされてネイティブな多量体タンパク質となり得る。
【００９９】
特定の実施形態では、本発明は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体などのような、多量体タンパク質の再折りたたみを提供する。ポリペプチドのサブユニットは、同一（ホモ二量体など）であってもよく、または一つ以上がネイティブなタンパク質（ヘテロ二量体など）内で異なり得る。下記で議論する特定の例では、タンパク質（ホモ二量体である、ヒトのインターフェロンーγ）は、組換え的に生産される。
【０１００】
（Ａ．インターフェロン）
ｒｈＩＦＮ−γは、穏やかな濃度の塩酸グアニジンにさらすことによって形成された凝集体と比較して、熱転位の開始より少し低い温度にさらした場合、完全に異なった形態の凝集体を形成する。熱で誘導されたｒｈＩＦＮ−γの凝集体は繊維状の構造であり、これに対して塩酸グアニジンで誘導された凝集体は非晶質の沈殿物を形成する。ネイティブな状態とは異なる二次および三次構造の凝集体は、凝集物の形態とは独立である。
【０１０１】
圧力は、二次微分ＵＶおよびＦＴＩＲによって測定した場合、ｒｈＩＦＮ−γの繊維状および非晶質の凝集体の両方の溶解、ならびにネイティブな構造の回収に有効である。非晶質の凝集体の溶解速度は速く、圧力による解離状態の獲得は２５０ＭＰａで３０分以内に成し遂げられる。熱誘導された凝集体からの圧力による解離状態の獲得は、非晶質の凝集体の溶解速度よりおよそ四倍遅い。しかし、いったん圧力による解離状態が成し遂げられると、二次微分ＵＶによって測定した場合、ネイティブ状態の回収の速度および程度（すなわち、再折りたたみの速度および収量）は、最初の凝集形成とは独立している。
【０１０２】
１．５時間、１００ＭＰａで再折りたたみの程度は、再折りたたみの間のタンパク質濃度に依存しており、ネイティブ様構造の回収は、タンパク質濃度が減少するとともに増加した。再折りたたみプロトコールの後、１ｍｇ／ｍＬに希釈したサンプルについて、再折りたたみの程度は再折りたたみの間、タンパク質濃度に独立していた。タンパク質濃度依存性の違いは、減圧の際に高タンパク質濃度のサンプル中に残っている単量体の有意な集団に起因している。再折りたたみプロトコールに従った高タンパク質濃度のサンプルの１ｍｇ／ｍＬへの迅速な希釈は、単量体を経て進行する、凝集よりも再折りたたみに有利な条件となる。それゆえ、二量体の獲得は本質的に完全であり、再折りたたみの間のタンパク質濃度によって影響されない。圧力処理後の高タンパク質濃度のサンプルの希釈の失敗は、再折りたたみよりも凝集に有利な条件となり、高濃度の単量体は有意な凝集を導く。
【０１０３】
２５０ＭＰａまでの圧力によるｒｈＩＦＮ−γの平衡反応は、二次微分ＵＶ分光法に従い得る。この平衡反応は濃度依存性であり、したがってネイティブな二量体の解離である。この解離は−２０９＋／−１３ｍＬ／ｍｏｌの二量体に等しいΔＶを有し、これはタンパク質およびスクロースの濃度に独立である。さらにコンパクトでネイティブな状態に向かって平衡を移動させることによって、タンパク質表面での優先的な排除を介して、スクロースは解離に対してｒｈＩＦＮ−γを安定化する。解離の表面積の変化は、１２．７＋／−１．６ｎｍ２／分子の二量体であると測定され、これはネイティブな二量体と比較して溶媒露出表面積が約３０％増加したことを表している。包括的な方程式は、圧力、スクロースおよびタンパク質の濃度の関数としてｒｈＩＦＮ−γのΔＧｄｉｓｓを予想する実験データから開発された。
【０１０４】
平衡解離として同様の判定基準を使用すれば、二次微分ＵＶ分光法を使用して、ｒｈＩＦＮ−γの凝集速度を追跡し得る。しかし、同様の判定基準を使用するので、有意な解離が凝集と同時に起きないように溶液条件を選ばなければならない。本発明者らは、一次の塩酸グアニジンで誘導した凝集のＥａが１３０＋／−３０ｋＪ／ｍｏｌの二量体であると測定されたこと、これが二次の熱誘導した凝集プロセスのＥａとは有意に異なるということを示した。異なったストレスによって誘導された凝集反応の活性化エネルギーの不均衡は、塩酸グアニジンで誘導した凝集反応速度が、Ｎから２Ｍへの解離によって支配されていることの確認である。
【０１０５】
以前に報告された（Ｋｅｎｄｒｉｃｋら、１９９８ａ）ように、スクロースは、タンパク質表面からスクロースを優先的に排除することにより塩酸グアニジンの存在中でｒｈＩＦＮ−γの凝集速度を減じ、コンパクトでネイティブな状態Ｎに向かって平衡を移動させ、そしてひろがった遷移状態Ｎ＊から遠ざける。しかし、圧力は、ｒｈＩＦＮ−γタンパク質の溶媒化の増加を通して、塩酸グアニジンによる凝集に対してｒｈＩＦＮ−γを不安定化する。溶媒化の増加は、タンパク質の露出表面積を増加させ、ＮからＮ＊に平衡を移動させる、このようにして、スクロースの安定化効果を妨げる。露出表面積の変化、および拡大したＮ＊とＮとの間の部分モル容積の変化が、それぞれ３．５＋／−０．２ｎｍ２／分子および−３９＋／−９ｍＬ／ｍｏｌの二量体であることが見出された。したがって、遷移状態種の形成に必要とされる摂動は、凝集体となる能力のある単量体の形成を導き、その摂動はネイティブな状態と解離した状態との間の違いと比較して小さい。
【０１０６】
（Ｂ．他の多量体）
本発明に従って再折りたたみされ得る他の多量体タンパク質の例としては、ヘモグロビン、乳酸デヒドロゲナーゼ、抗体および抗体フラグメントが挙げられる。
【実施例】
【０１０７】
（ＸＩ．実施例）
下記の実施例は、発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は本発明の実施に良好に機能することが本発明者によって発見された技術を表し、従って、その実施の好ましい形態を構成するとみなされ得ることが当業者によって認識されるべきである。しかし、本開示の観点からみると、当業者は、開示された特定の実施形態において多くの変更が行なわれ得、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果がさらに得られることを認識すべきである。
【０１０８】
（実施例１：高圧での脱凝集および再折りたたみ）
（手順１：高圧でのタンパク質の脱凝集および再折りたたみを変化させる温度）
タンパク質凝集：組換えヒトの成長ホルモン（ｒｈＧＨ）を、１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％アジ化ナトリウム）に懸濁した。１０ｍＬのｒｈＧＨ溶液を、１５ｍｌの円錐状のファルコンチューブで、少なくとも２４時間８ｒｐｍで回転させた。
より大きな構造の損傷を示す凝集体を、クエン酸緩衝液中に０．７５Ｍの塩酸グアニジンを加えて、同一の条件下で回転させた。
【０１０９】
サンプルの調製：必要とする容積の半分を、１５分間、１３，０００ｇで遠心分離して、不溶性の凝集体を沈殿させた。上清を捨て、最終容積の緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％アジ化ナトリウム）で交換した。凝集体のペレットを、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓの商標の超音波処理器（５０％デューティ、１秒間のパルスサイクル）で再懸濁した。いったん再懸濁したら、サンプルを１ｍｌのシリンジに移した（末端をヒートシールし、そしてプランジャーを適所にして全てのヘッドスペースを除去した）。
【０１１０】
加圧および分析：温度を平衡にした後、サンプルを圧力チャンバーに移した。圧力は２４時間にわたって２ｋｂａｒに増加させた。大気中のサンプルを同一の温度に置いた。圧力を１５分かけて穏やかかつ均等に開放した。減圧後、サンプルを１５分間、１，３０００ｇで遠心分離した。上清を、可溶性タンパク質について２７８ｎｍの吸光度によって分析した。光散乱成分を、ＬｅａｃｈおよびＳｃｈｅｒａｇａ（１９６０）によって記述された方法を利用して差し引いた。ｒｈＧＨの吸光係数は１８，８９０である（ｃｍ  ｍｏｌ／ｌ）−１。
【０１１１】
高圧でのタンパク質の脱凝集および再折りたたみを変化させる温度の結果：グアニジニウムの非存在下で、圧力処理後の再折りたたみしたヒトの成長ホルモンの収率は、温度が上昇するとともに増加し、６０℃の温度でおおよそ１００％に到達する。高圧処理なしで同様の温度にさらすことでは、折りたたまれたネイティブなタンパク質の収率の有意な向上はみられなかった。
【０１１２】
（手順２：高圧透析を使用した再折りたたみ凝集体）
タンパク質の凝集およびサンプルの調製：Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．からのニワトリ卵白リゾチーム（４０ｍｇ／ｍｌ）を８Ｍの塩酸グアニジン（ＧｄｍＨＣｌ）、４０ｍＭのＤＴＴで一時間、変性および還元させた。次いで、タンパク質溶液を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で２０倍にショック希釈して凝集誘導した。サンプルを次に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０＋ＧｄｍＨＣｌ＋ＤＴＴ）でさらに二倍希釈して、透析チュービング（１ｍｇ／ｍＬリゾチームを含んだ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．８Ｍ  ＧｄｍＨＣｌ、１００ｍＭ  ＤＴＴ）に入れられる最終的な再折りたたみ溶液を作製した。サンプルを次に透析チュービングに注入した（３５００分子量カットオフ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０に一晩浸したもの）。加圧の直前に、透析チュービングを２５倍の容積過剰なＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０、０．８Ｍ  ＧｄｍＨＣｌ、３ｍＭ酸化型グルタチオン）に入れ、加圧のために封鎖した。
【０１１３】
加圧および分析：変換緩衝液への透析チューブの挿入後できるかぎりすぐに、サンプルを２ｋｂａｒまで加圧した。圧力を五日間維持した。サンプルを１５分間かけて穏やかに減圧した。いったん大気圧になったら、サンプルを１３，０００ｇで１５分遠心分離して、不溶性の凝集体を沈殿させた。上清を以前記述された（Ｓｔ．Ｊｏｈｎら、１９９９）ように酵素活性について分析した。
【０１１４】
（実施例２：高圧でのｒｈＩＦＮ−γの繊維状および非晶質の凝集体の再折りたたみ）
（材料および方法）
５ｍＭのコハク酸ナトリウムｐＨ５．０（コハク酸緩衝液）中の精製された組換えＤＮＡ由来ｒｈＩＦＮ−γは、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．によって提供され、使用するまで４℃で保存し、これ以上精製せずに使用した。４０ｍＭの酢酸ピリジンｐＨ５．０緩衝液（ＰｙｒＡｃ緩衝液）を、気相電気泳動度の質量分析（ＧＥＭＭＡ）に使用した。コハク酸緩衝液を、他のすべての実験に使用した。標準タンパク質（ウシ血清アルブミン、グルコースオキシダーゼ、ヘモグロビン、ユビキチンおよびサイログロブリン）をＳｉｇｍａから購入した。すべての化学物質は、試薬等級以上のものであり、これもまたＳｉｇｍａから購入した。
【０１１５】
（凝集体の調製）
凝集体を、溶液の温度を４０℃に上昇させるか、または塩酸グアニジンを終濃度０．４５Ｍになるようにタンパク質溶液に加えることかのいずれかによって調製した。すべての場合において、凝集反応の程度は９５％を超えていた。本発明者らは、十分に特徴付けられた凝集速度から、反応の程度を、熱誘導性凝集（タンパク質濃度において二次的であるとわかった）および塩酸グアニジン誘導性凝集（タンパク質濃度において一次的である）の両方に対して決定した。塩酸グアニジン誘導性凝集体は十分量の新しい緩衝液で洗浄し、塩酸グアニジンの終濃度が５ｍＭ未満になるようにした。再折りたたみ実験のための凝集体をほぼ１、１０、あるいは２０ｍｇ／ｍｌ濃度のｒｈＩＦＮ−γに新しい緩衝液中に懸濁した。
【０１１６】
（高圧下での実験）
再折りたたみ実験に使った高圧実験装置は、高圧反応器、高圧紫外線分光セル、金属ゲージ（＋／−２ＭＰａ以下の精度）、および発生器から構成された。高圧反応器と高圧紫外線分光セルを設計し、本発明者らの研究室で作製した。ゲージと発生器をＨｉｇｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ, Ｃｏ（Ｅｒｉｅ, ＰＡ）から購入した。すべての所定の実験において高圧反応器または高圧紫外線分光セルのいずれかを使用した。
【０１１７】
高圧紫外線分光セルを３１６ステンレス鋼から作製し、Ｂｕｎａ-Ｎ  ９０  デューロメーター  Ｏ-リングで密封し、このセルは、直径６ｍｍ、パス長７．６５ｍｍの光学ポートを有していた。セルは、円柱状のサファイヤの窓（直径１６ｍｍ、厚さ５．１ｍｍ）を使用していて、２５０ＭＰａまで実験に耐えることができた。圧力伝達流体（シリコンオイル）からのサンプルの分離を、セル外部のピストンデバイスによって促進した。すべての濡れた金属表面を、３１６ステンレス鋼で構成した。すべてのインサイチュの高圧紫外実験を、タンパク質濃度約１ｍｇ／ｍｌで行った。
【０１１８】
高圧反応器中で行われた実験において、凝集体懸濁液を、約１ｍｌのポリプロピレンの管に詰め込み、熱封し、反応器に詰め込んだ。反応器を密封し、圧力を２５０ＭＰａまで上げた。この圧力は、本発明者らによって決められた、平衡状態でｒｈＩＦＮ−γが完全に単量体に解離していることを保証するのに十分な圧力である。サンプルを、インサイチュの二次微分紫外線測定値に基づいて（以下を参照のこと）、凝集体が解離するのに十分な時間、タンパク質が平衡に達するように、２５０ＭＰａに保持した。その後、圧力を１００ＭＰａに下げ、ｒｈＩＦＮ−γ濃度が約１ｍｇ／ｍｌの平衡に達するために十分な時間再び保持した（以下を参照のこと）。その後、圧力を０．１ＭＰａに下げ、サンプルを高圧反応器から取り出した。
【０１１９】
（透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ））
ＴＥＭを、総タンパク質濃度約１ｍｇ／ｍｌで２％酢酸ウラン溶液でネガティブ染色されたネイティブのｒｈＩＦＮ−γサンプル、凝集体ｒｈＩＦＮ−γサンプル、および高圧処理凝集体ｒｈＩＦＮ−γサンプルで行った。標本をホルムバール／炭素の４００メッシュの銅盤上で染色し、加速電圧８０,０００ｋＶで ＪＯＥＬ １００ＣＸ  ＴＥＭで観察した。凝集体構造の顕微鏡写真を、２０,０００から８０,０００倍の倍率で得た。
【０１２０】
（気相電気泳動度質量解析（ＧＥＭＭＡ））
ＧＥＭＭＡを用いた粒子径分析の手順は、Ｋａｕｆｍａｎらの方法（Ｋａｕｆｍａｎら（１９９６））に基づいていた。装置を分子量（ＭＷ）既知の標準タンパク質を用いて較正した。線形の較正曲線は電気泳動度（ＥＭ）直径の自然対数対ＭＷの自然対数から求めた。ネイティブｒｈＩＦＮ−γサンプル、凝集体ｒｈＩＦＮ−γサンプル、および高圧処理凝集体ｒｈＩＦＮ−γサンプルを、電気伝導度が約２ｍΩ-1 ｃｍであるＰｙｒＡｃ緩衝液によって約１μｇ/ｍｌから２μｇ/ｍｌに希釈し、ただちにＴＳＩ（Ｓｔ.Ｐａｕｌ, ＭＮ）のＧＥＭＭＡ分析器を用いて分析した。ＰｙｒＡｃ緩衝液は、サンプル中の不揮発性物質が１ｐｐｍより低いというＧＥＭＭＡの要件のために使われた。
【０１２１】
本ＧＥＭＭＡ分析器は、３４８０型電気スプレーエアロゾル生成器、３０８５型微分移動度解析機（ＤＭＡ）、および３０２５Ａ型超微細凝縮粒子計測計（ＣＰＣ）から成っていた。フィルターろ過された乾燥空気を、空気供給設備から３０７４０２型フィルター／乾燥機を通して１Ｌｐｍの速度で送り込んだ。ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ−ｇｒａｄｅの二酸化炭素を０．０５Ｌｐｍから０．１Ｌｐｍの速度で送り込んだ。溶融二酸化珪素電気スプレーキャピラリーは、２５ｃｍの長さで、２５μｍの内径であった。サンプルの流れ（毎分約１００ｎＬ）を、キャピラリーにかかっている２５ｋＰａ（３．７ｐｓｉ）の圧力差によって促進した。２ｋＶの電圧をキャピラリー中で維持した。これは、２００から２５０ｎＡの電流に対応する。
【０１２２】
データ収集を、マイクロソフトウィンドウズ（登録商標）９５（著作権）が作動しているＩＢＭ互換性ＰＣ上で、ＴＳＩのＡｅｒｏｓｏｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｍａｎａｇｅｒ（ＡＩＭ（著作権））β４．１０版ソフトウェアを用いて行った。このデータ収集ソフトウェアは、電気泳動度直径１０個につき６４の対数で区切ったチャンネルを使った。空気の粘度（μ）に関しては１．８２ｘ１０−５ｋｇ/(ｍ  ｓ)、平均自由行程（λ）に関しては７．７５ｘ１０−８ｍ、およびタンパク質の密度(ρ)に関しては１．２ｇ/ｍｌという推定値を用いることにより、サンプル分析を、約２．５から５８ｎｍの間、データ取得時間は３分から６分で行った。質量パーセント濃度単位のデータファイルを、テキストファイルとして出力し、マイクロソフトエクセル（著作権）に入力した。電気泳動度直径は、所定のピークの最大値により決定された。単量体対二量体の比および反応の程度を（二量体の質量パーセントに基づく）、質量パーセントの分布での個々のピークの有限積分によって決定した。
【０１２３】
(動的光散乱（ＤＬＳ）)
動的光散乱計測を、Ｎｉｃｏｍｐ  ３７０  Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ, Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ, ＣＡ）を用いて、ｒｈＩＦＮ−γの熱誘導凝集体について行った。総タンパク質濃度は、１ｍｇ／ｍｌであった。
【０１２４】
（微分紫外線分光）
吸収スペクトルを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ３Ｂ  デュアルビーム分光光度計を用いて、ｒｈＩＦＮ−γ約１ｍｇ／ｍｌで測定した。スキャンを、毎分１５ｎｍのスキャン速度で３１０ｎｍから２５０ｎｍの間で行った。データ収集を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ａｕｓｔｉｎ, ＴＸ）のモデルＡＴ-ＭＩＯ-１６Ｅ-１０  データ収集盤を用いて、毎秒５サンプルの速度で行った。Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＬａｂＶｉｅｗ（著作権）ソフトウェアをデータの収集を制御するために、マイクロソフトエクセル（著作権）を、波長および吸収データを電圧からそれぞれｎｍおよび吸収単位に変換するために用いた。吸収スペクトルの二次微分（ｄ2Ａ／ｄλ2）を、Ｇｒａｍｓ／３８６（ｖ．３．０２）ソフトウェア（Ｇａｌａｃｔｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）上で、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法を用い、＋／−２ｎｍにわたって二次の多項式で平滑化して計算した。
【０１２５】
Ｌａｕｄａ  Ｍ３型再循環式浴槽温度コントローラーで一定温度に保たれた流体を再循環させることによって、温度を制御した。高圧反応器で処理されたサンプルのスペクトルを、適切なブランクを分光光度計の参照セル中に置き、標準的な光路長１０ｍｍの石英キュベット中で、大気圧下で収集した。高圧のセル中で行う実験については、参照サンプルを分光光度計中に置かずに、吸収スペクトルを試料および緩衝液別々に収集した。適当な圧力下で収集された緩衝液スペクトルをタンパク質のスペクトルから引き算することを、二次微分の計算の前に、Ｇｒａｍｓ／３８６（ｖ．３．０２）ソフトウェアで行った。
【０１２６】
（フーリエ変換赤外線分光法（ＦＴＩＲ））
ＩＲスペクトルを、８μｍに合わせた調整可能な光路長のセルを用いて収集した。ブランクの緩衝液スペクトルを、タンパク質を加えずに同じセルを用いて、同じ溶液条件下で収集した。すべてのスペクトルを、大気圧下でＤＴＧＳ検出器を備えたＮｉｃｏｌｅｔ  Ｍａｇｎａ−ＩＲ（著作権）  ７５０  ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ分光光度計（Ｍａｄｉｓｏｎ, ＷＩ）で収集した。シングルビームモードで、ＮｉｃｏｌｅｔのＯｍｎｉｃ（著作権）（ｖ．２．１）ソフトウェアを用いることにより、４ｃｍ-1分解能で、約２０ｍｇ／ｍｌ濃度のサンプルに対しては２５６スキャンに対してシグナルを平均して、約１０ｍｇ/ｍｌ濃度のサンプルに対しては１０２４スキャンに対してシグナルを平均して、インターフェログラムを収集した。光学ベンチおよび試料チャンバーを、常にＷｈａｔｍａｎ  ７５−５２型ＦＴＩＲパージガス生成器（Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ,ＭＡ）から供給された乾燥空気でパージした。タンパク質含有緩衝液および緩衝液両方のシングルビームスペクトルを、それぞれのバックグラウンドのスペクトルを引くことによって、吸収スペクトルに再加工した。Ｎｉｃｏｌｅｔのソフトウェアを、緩衝液および水蒸気の寄与をタンパク質含有緩衝液から引き算することおよび二次微分を計算することのために用いた。差スペクトルを、白色ノイズを除くために７点ごとに平滑化し、Ｇｒａｍｓ／３８６（著作権）（ｖ．３．０２）ソフトウェア（Ｇａｌａｃｔｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）に出力した。ここでスペクトルのベースラインは補正され、１９９５年のＤｏｎｇらの方法によって、面積が規格化された。
【０１２７】
（サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ））
可溶な凝集体の存在および高圧処理凝集体の単量体／二量体の含有量を、ＳＥＣで測定し、液体コントロールと比較した。不溶性凝集体を、遠心分離で取り除き、その上清をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）でアッセイした。上清の５０μｌのアリコートをコハク酸緩衝液中に１ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、二酸化珪素担体のＴｏｓｏｈａａｓ  ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ２０００ＳＷＸＬ  カラムに充填した。１．２Ｍ  ＫＣｌの移動層を、毎分０．８ｍｌの流速でポンプで流し、時間の関数として２１４ｎｍの吸光度をモニターした。結果として出てきたクロマトグラムを、Ｇｒａｍｓ／３８６（著作権）（ｖ．３．０２）ソフトウェアに入力した。このソフトウェア上で、データが面積規格化され、単量体と二量体の％寄与と溶出時間とを決定するために曲線にあてはめた。自動で求めたカーブフィット関数を、二つのピークのより大きなピーク、ガウス曲線、中間の感度、およびオフセットベースラインについて設定したパラメーターとともに使用した。本装置を、既知のＭＷの標準タンパク質を用いて較正した。線形較正曲線を、溶出時間の自然対数対ＭＷの自然対数から求めた。
【０１２８】
（結果と考察）
（凝集体の特徴付け：物理的特徴付け）
５ｍｇ／ｍｌを超えたタンパク質濃度では、熱誘導性ｒｈＩＦＮ−γ凝集体は、高い粘性の無色透明のゲルを形成し、このゲルを遠心分離で濃縮することは不可能であった。約１ｍｇ／ｍｌの濃度では、タンパク質濃度は十分に低く、凝集による粘度の上昇は最小で、遠心分離で分離することは可能であった。より高いタンパク質濃度で形成された凝集体と同様に、約１ｍｇ／ｍｌの濃度で形成された凝集体は、無色で比較的ごくわずかな光を散乱した。高温で形成された凝集体とは対照的に、塩酸グアニジンをｒｈＩＦＮ−γ溶液に加えることによって、白色不透明の沈殿が形成された。この沈殿は、凝集体のタンパク質濃度によらず、溶液から簡単に遠心分離できた。
【０１２９】
凝集体の電子顕微鏡写真によって、熱誘導性凝集体は中間程度の長さの繊維状鎖のマトリクスを形成している（図２Ａ）のに対して、塩酸グアニジン誘導性凝集体はアモルファスの沈殿を形成している（図２Ｂ）ことが明らかになった。熱誘導性凝集体の小繊維は、１０ｎｍ程度の一定した直径を有している。熱誘導性凝集体中には、アモルファス構造は見られなかった。逆に、塩酸グアニジン誘導性凝集体サンプル中には繊維状構造は見られなかった。
【０１３０】
ネイティブのｒｈＩＦＮ−γおよび熱誘導性凝集体のＥＭにおける直径の分布を、ＧＥＭＭＡで測定し、その結果を図３に示す。ＰｙｒＡｃ緩衝液中で２５度、１ｍｇ／ｍｌ濃度で平衡化したネイティブのタンパク質は、４．４ｎｍおよび５．５ｎｍに中心を持つ二つの大きなピークを持つことがわかった（図３Ａ）。既知の標準タンパク質を用いた較正曲線から、これらピークはそれぞれ１６ｋＤおよび３２ｋＤの分子量を持つ粒子に対応した。これらの分子量は単量体および二量体のｒｈＩＦＮ−γの既知の分子量（それぞれ１６．４５ｋＤおよび３２．９ｋＤ）とよく一致する。サンプル濃度が約３μｇ／ｍｌ未満に保たれている場合は、ネイティブサンプルには、他の大きなピークは検出されなかった。ＧＥＭＭＡで検出された単量体の質量パーセント（図３Ａ中の約１２％）は、解離平衡実験から人工的に高い値であることが決定された。単量体に対するバイアスは、電気泳動キャピラリーでのネイティブ二量体の表面誘導性解離が原因で生じる。ネイティブのｒｈＩＦＮ−γに対する較正された単量体の質量パーセントそして、ＧＥＭＭＡで決定された単量体および二量体に対するＥＭ直径および実効分子量を表１Ａで報告する。
【０１３１】
【表１Ａ】
2008031182.tif 000002
【０１３２】
【表１Ｂ】
2008031182.tif 000003
コハク酸緩衝液中で４０℃、２１ｍｇ／ｍｌで４８時間で凝集させた、熱誘導性凝集体サンプルは、単量体および二量体、それぞれ約１％および４％の質量パーセントであった。質量パーセントで９５％を超える凝集体（図３Ｂ）は、質量平均直径が１６．５ｎｍであった。これは既知の標準タンパク質による較正曲線を基にすると９８０ｋＤの平均実効ＭＷに対応する。このＧＥＭＭＡの実効直径は、実効水和直径が１９００ｎｍであることを示すＤＬＳの結果とあまり一致しなかった。また凝集体が目に見えたという事実ともあまり一致しなかった。小滴がキャピラリーの出口で形成されるように、繊維状の凝集体がより小さな凝集体へ剪断されること（Ｋａｕｆｍａｎ，２０００）は、ありそうなことである。従って、ＧＥＭＭＡは凝集体の大きさを評価するには適した技術ではないということが決定された。しかし、凝集体の存在の検出および凝集体の質量パーセントを決定するには適している。ＤＬＳ測定から得られた粒子の直径は、熱誘導性凝集体の形態に起因して正しくないと考えられ、単にＧＥＭＭＡの結果とおおまかに比較するためだけに使われた。塩酸グアニジン誘導性凝集体は、サンプル中の不揮発性物質の濃度が１ｐｐｍ未満であることが必要であるので、ＧＥＭＭＡで解析されていなかった。
【０１３３】
（凝集体の特徴付け：構造的特徴付け）
二次微分紫外線スペクトルにおける２７５ｎｍから２９５ｎｍの領域は、トリプトファン残基およびチロシン残基の微視的環境を反映し、この領域はタンパク質のコンフォメーション状態により影響を受ける（Ｂａｌｅｓｔｒｉｅｒｉら，１９７８；Ｒａｇｏｎｅら，１９８４；Ｓｅｒｖｉｌｌｏら，１９８２）。チロシンおよびトリプトファンの微分紫外線スペクトルは、ほとんど圧力の影響を受けない（Ｌａｎｇｅら，１９９６）ので、圧力によるｒｈＩＦＮ−γの二次微分紫外線スペクトルへの変化は、本発明者らがここで示したように、ネイティブコンフォメーションへの変化の結果である。５ｍＭコハク酸ナトリウム緩衝液中での、ネイティブタンパク質、圧力解離性可溶性タンパク質、およびｒｈＩＦＮ−γの熱誘導性凝集体ならびに塩酸グアニジン誘導性凝集体の二次微分紫外線スペクトルを、図４に示す。ｒｈＩＦＮ−γのネイティブ型および解離型に対する２８６ｎｍ近辺に存在する極大波長の位置は、解離の度合いに依存せず、その相対的な高さは本発明者らによって、ｒｈＩＦＮ−γの解離の度合いを表すことが示された。従って、この極大値の相対的高さはまた、凝集体非存在下で、ｒｈＩＦＮ−γの再会合および再折りたたみの度合いを追跡するのに利用可能である。
【０１３４】
二つの凝集体型（熱誘導性または塩酸グアニジン誘導性凝集体）のスペクトルは、ネイティブの二次微分紫外線スペクトルから、同程度のずれ（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を示し、ネイティブスペクトルおよび圧力解離性スペクトル両方と異なる（図４）。凝集体のスペクトルは、全体的にシグナルの振幅が減衰し、吸収スペクトルがブルーシフトしていることを示す。このことはともに、トリプトファン残基およびチロシン残基がネイティブ構造に比較して親水性の環境への露出が増加したことを示す（Ｌａｎｇｅら，１９９６；ＭａｃｈおよびＭｉｄｄａｕｇｈ，１９９４）。加えて、両凝集体のスペクトルは、２８０ｎｍ近辺の極小値の深さが大きく減少することを示す。しかし、凝集体の二次微分紫外線スペクトルの間に顕著な違いがある。振幅の減衰および波長シフトにより測定されるネイティブスペクトルからの摂動の大きさは、塩酸グアニジン誘導性凝集体のスペクトルに比べて熱誘導性凝集体のスペクトルでより小さい。さらに、塩酸グアニジン誘導性凝集体スペクトルでは、２８８ｎｍおよび２８０ｎｍ近辺の極大値において大きなバンドの広がりが見られたが、熱誘導性凝集体スペクトルでは見られなかった。
【０１３５】
二つの凝集体型の二次構造を互いに、およびネイティブ型と比較するために、これら三つの状態全てのＦＴＩＲ吸収スペクトルを収集し、二次微分スペクトルを計算し、比較した。図５は、緩衝液中のネイティブｒｈＩＦＮ−γおよびｒｈＩＦＮ−γの熱誘導性凝集体ならびに塩酸グアニジン誘導性凝集体の二次微分ＦＴＩＲスペクトルのプロットである。ネイティブ状態からの大きな摂動が、両方の凝集体型で観測された。その変化とともに、吸収の波長シフトおよびαへリックスバンドでの吸収の減少（ネイティブスペクトル中の１６５６ｃｍ−１近辺）、それに伴う１６２０ｃｍ−１および１６９５ｃｍ−１近辺の分子内βシートバンドの出現（図５）、が観察された。１６２０ｃｍ−１および１６９５ｃｍ−１近辺の分子内βシートバンドの寄与は、両凝集体型でほぼ同等であり、αへリックスバンドの減少の程度についても同様である。βシート構造（１６３０ｃｍ−１から１６４５ｃｍ−１近辺の領域）およびターン構造（１６７０ｃｍ−１から１６８５ｃｍ−１近辺の領域）とでのほんのわずかな違いが、熱誘導性凝集体と塩酸グアニジン誘導性凝集体との間で認められた。
【０１３６】
（高圧性解離（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）と再折りたたみの反応速度論）
圧力は、タンパク質のサブユニットの高次の会合に、よくないと知られている（ＳｉｌｖａおよびＷｅｂｅｒ  １９９３）。従って以前に示されているように（Ｆｏｇｕｅｌら，１９９９；ＧｏｒｏｖｉｔｓおよびＨｏｒｏｗｉｔｚ  １９９８；Ｓｉｌｖａら，１９８９；Ｓｔ．Ｊｏｈｎら，１９９９）、凝集体の解離に使用され得る。ｒｈＩＦＮ−γの塩酸グアニジン誘導性凝集体が２５０ＭＰａ下にさらされると、３１０ｎｍの吸収により測定されるように（図６Ａ）、光散乱性凝集体の迅速で完全な消失が起こった。総ｒｈＩＦＮ−γ濃度は１ｍｇ／ｍｌであり、溶液中の塩酸グアニジン濃度は約５ｍＭであった。いったん、凝集体の解離を完結させて、吸収のスキャンを２５０ＭＰａで行い、微分スペクトルを計算した。圧力を二次微分スペクトルが経時的に変化を起こさなくなるまで（約３０分）、２５０ＭＰａに維持した。本発明者らは、２５０ＭＰａ下では、塩酸グアニジン誘導性凝集体の二次微分スペクトルが、ネイティブのｒｈＩＦＮ−γが２５０ＭＰａの圧力によって解離したときに得られるスペクトル（図４）に平衡化していることを発見した。このことは、凝集体構造の完全な破壊および二量体構造の単量体への解離を示す。
【０１３７】
いったん、２５０ＭＰａ下で二次微分スペクトルがさらに経時的に変化を生じなくなったら、圧力を１００ＭＰａに下げ、吸収スペクトルを経時的に収集した。二次微分スペクトルを、再度計算し、経時的な変化がもはや観測されなくなるまで比較した。１００ＭＰａでは、２８６ｎｍ近辺の極大値（圧力解離スペクトルでの最大値、図４を参照のこと）は、時間とともに高さが減少し、最終的に、タンパク質がよりネイティブのコンフォメーションを示し始めたとき、最小値に達した。図６Ｂは、塩酸グアニジン誘導性凝集体が２５０ＭＰａで解離した後の、１００ＭＰａで１ｍｇ／ｍｌでのｒｈＩＦＮ−γの再会合／再折りたたみに関する、２８６ｎｍ近辺の極大値の高さの時間に対するプロットである。図６Ｂに重ねて書かれているものは、ｒｈＩＦＮ−γの圧力解離型およびネイティブ型のスペクトル、さらに圧力を０．１ＭＰａに下げることによって生成された、圧力再折りたたみ平衡型（１ｍｇ／ｍｌ  ｒｈＩＦＮ−γ）のスペクトルの高さである。１００ＭＰａでの再折りたたみは、約１時間で完了し、圧力処理凝集体の２８６ｎｍ近辺の極大値の高さは、ほぼ完全にネイティブのコントロールの極大値の高さにまで復帰した。
【０１３８】
熱誘導性凝集体の圧力による解離速度は、３１０ｎｍの吸収の時間変化による定量化はできない。なぜなら、凝集体は光を十分に散乱しないからである。同様に、凝集体の圧力による解離も、２７５ｎｍと２９５ｎｍの間の領域で追跡することは不可能である。凝集体の解離および圧力解離型への構造変化（図４）はいずれも同時に起こるからである。従って、圧力による熱誘導性凝集体の解離の速度は、塩酸グアニジン誘導性凝集体の圧力解離と直接比較することはできない。しかし、二次微分のＵＶから測定された、熱誘導性凝集体が圧力解離状態を示すまでに必要な時間（約２時間）は、塩酸グアニジン誘導性凝集体が圧力解離状態を示すまでに必要な時間（約３０分）に比べて十分に遅い（データは示さず）。しかし、いったん、圧力解離状態が達成されると再折りたたみ速度は、同等である（図６Ｂ）。
【０１３９】
（圧力処理凝集体の性格付け）
緩衝液中で、タンパク質濃度が約１ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、および２０ｍｇ／ｍｌであるｒｈＩＦＮ−γの熱誘導性凝集体および塩酸グアニジン誘導性凝集体を、２５０ＭＰａで５時間加圧した。その後、圧力を１時間半の間１００ＭＰａに下げ、さらに再び０．１ＭＰａにまで下げた。凝集体由来のネイティブ様の性質の取得に対する圧力処理の効果および再凝集に対する圧力処理凝集体の安定性をそれぞれ評価するために、圧力処理凝集体の解析を、圧力処理直後および２週間後両方に行った。ＴＥＭ、ＧＥＭＭＡ、およびＨＰＬＣを圧力処理凝集体の物理的特徴付けに利用し、二次微分ＵＶおよび二次微分ＦＴＩＲ分光法を、圧力処理凝集体の構造的特徴付けに利用した。各々の技術の結果の比較を、圧力処理凝集体、凝集体コントロール、およびネイティブの液体ｒｈＩＦＮ−γコントロールの間で行った。
【０１４０】
（圧力処理後の物理的特徴付け）
減圧によって、すべての熱誘導性凝集体および塩酸グアニジン誘導性凝集体のサンプルは目に見える粒子は存在せず、光学的に透明であった。そのうえ、１０ｍｇ／ｍｌおよび２０ｍｇ／ｍｌ濃度の熱誘導性凝集体サンプルは、圧力処理前はゼラチン状の固体であったのが、ネイティブの液体コントロールと区別できない程度（定性的に判断した）の粘度をもつ液体であった。
【０１４１】
ＴＥＭを、液体コントロールおよび両タイプの凝集体の１ｍｇ／ｍｌならびに２０ｍｇ／ｍｌ（圧力処理およびコントロール）サンプルについて、総タンパク質濃度約１ｍｇ／ｍｌで行った（２０ｍｇ／ｍｌサンプルは、圧力処理後すぐに希釈された）。図７は、ｒｈＩＦＮ−γの（Ａ）熱誘導性凝集体、（Ｂ）塩酸グアニジン誘導性凝集体および（Ｃ）液体コントロールに対する圧力処理体の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真を含む。凝集体コントロールは、最初に観察したものと構造が変化していなかったので、凝集体コントロールのＴＥＭ写真を、図７に示さない（凝集体コントロールの代表的な構造は、図２を参照のこと）。図７のすべての電子顕微鏡写真は、４０,０００倍である。圧力処理サンプルおよび液体コントロールの両方において、アモルファス構造および繊維状構造が観察された。アモルファス物質は繊維状物質よりも多く存在した。図７Ａ２は、熱誘導性凝集体の圧力処理体からのアモルファス構造を示す。これは三つ全てのｒｈＩＦＮ−γサンプルで多く見出される構造の代表例である。両圧力処理凝集体および液体コントロールにおいて、観測された構造および繊維状物質に対するアモルファス物質の頻度は一定であった。そのうえ、両熱誘導性凝集体および塩酸グアニジン誘導性凝集体の１ｍｇ／ｍｌまたは２０ｍｇ／ｍｌ濃度で圧力処理されたサンプル間に、違いは観察されなかった（比較は示さず）。圧力処理前に熱誘導性凝集体サンプル中に観察された繊維状ネットワークは、破壊されていて、圧力処理熱誘導性凝集体の大部分は、アモルファスであった。さらに、圧力処理塩酸グアニジン誘導性サンプル中に観察された繊維状物質は、塩酸グアニジン誘導性凝集体コントロール中には見出されなかった。
【０１４２】
圧力処理凝集体および液体コントロールに見られる繊維状構造は、熱誘導性凝集体コントロール中に見られる繊維状構造よりも、長さが短く、直径がよりまちまちであった。圧力処理凝集体および液体コントロール中の繊維状構造の長さは、一般的に１００ｎｍから１０００ｎｍ長で、直径は代表的に約１２ｎｍであったが、約２５ｎｍにまで達するものもあった。いくつかの絡み合った繊維のネットワークは、三つすべてのサンプルセットで観測され、その例を図７Ａ３および図７Ｃ２に示す。圧力処理凝集体の形態は、コントロールとはっきり区別できず、ＴＥＭサンプルの調製（タンパク質サンプルの乾燥を含む）は、アモルファス凝集体および繊維状凝集体両方と一致した構造を誘導する、ということが結論付けられた。
【０１４３】
（圧力処理後の構造的特徴付け）
圧力処理に続いて、ＵＶおよびＦＴＩＲ吸収スペクトルを収集し、加圧サンプルおよびコントロールサンプルに対して、二次微分ＵＶおよび二次微分ＦＴＩＲの吸収スペクトルを計算した。すべてのＵＶ解析が１ｍｇ／ｍｌ  ｒｈＩＦＮ−γ濃度で行われるように、１０ｍｇ／ｍｌおよび２０ｍｇ／ｍｌのサンプルを、減圧後すぐに希釈した。技術上の濃度限界により、ＦＴＩＲ分光法を１０ｍｇ／ｍｌおよび２０ｍｇ／ｍｌのサンプルのみにおいて行った。
【０１４４】
図８は、（Ａ）熱誘導性凝集体および（Ｂ）塩酸グアニジン誘導性凝集体の圧力処理体に対する二次微分ＵＶスペクトルのプロットである。圧力処理プロトコール後、スペクトルを０．１ＭＰａで記録した。参照として、ネイティブｒｈＩＦＮ−γの二次微分ＵＶスペクトルを、図８の両方のパネルに重ねている。凝集体のコントロールスペクトルを、明瞭にするために図８から省略する（凝集体のスペクトルは、図４を参照のこと）。ネイティブの二次微分ＵＶスペクトルの復帰の大きさは、凝集体型に独立である。しかし、ネイティブの二次微分ＵＶスペクトルの復帰の程度は、濃度依存的で、低タンパク質濃度においてネイティブスペクトルは大きな回復を示した。１ｍｇ／ｍｌで、圧力処理凝集体は、ネイティブｒｈＩＦＮ−γ液体コントロールとほぼ同程度の二次微分ＵＶスペクトルにまで復帰する。表２は、再折りたたみ状態と圧力解離状態との間の、ネイティブおよび圧力解離状態に対する２８６ｎｍ近辺の極大値の高さの違いの比を使って、二次微分ＵＶ分光学によって測定されたネイティブスペクトルの復帰のパーセンテージの要約を含む。
【０１４５】
【表２】
2008031182.tif 000004
図９は、１０ｍｇ／ｍＬおよび２０ｍｇ／ｍＬで行った圧処理についての、（図９Ａ）圧処理した熱誘導ｒｈＩＦＮ−γ凝集体、および（図９Ｂ）圧処理したグアニジン塩酸塩誘導ｒｈＩＦＮ−γ凝集体の、面積を標準化した二次導関数ＦＴＩＲスペクトルのプロットである。ＦＴＩＲ技術に関連する調製時間およびサンプル収集時間が原因で、ＦＴＩＲスペクトルは、３時間の減圧中に収集した。比較目的のために、ネイティブｒｈＩＦＮ−γの二次導関数ＦＴＩＲスペクトルを、図９の両方のウィンドウ上に重ねている。ＵＶスペクトル分析の結果と同様に、ＦＴＩＲによって定性的に測定されたネイティブ二次構造の回復は、凝集体形態非依存的である。なぜなら１０ｍｇ／ｍＬおよび２０ｍｇ／ｍＬにおける二次導関数ＦＴＩＲスペクトルは、各々、両方の凝集体形態ついて同じであるからである。しかしながら、ネイティブ様の二次構造の回復は、圧処理中のタンパク質の濃度に依存する。１０ｍｇ／ｍＬのサンプルおよび２０ｍｇ／ｍＬのサンプルの両方について、圧処理により、１６２０ｃｍ−１および１６９５ｃｍ−１付近において分子間のβシートバンドで大幅の減少が存在する。しかし、ネイティブのスペクトルで観察されるレベルへの、これら分子間のβシートバンドの減少は、１０ｍｇ／ｍＬのスペクトルについてはほぼ完全であり、一方、２０ｍｇ／ｍＬのスペクトル各々について、１６２０ｃｍ−１および１６９５ｃｍ−１付近に有意なバンドが存在したままである。二次導関数ＦＴＩＲで測定した場合、圧処理した１０ｍｇ／ｍＬのサンプルは、ネイティブ構造で見られるα−へリックスの全て（１６５６ｃｍ−１付近のバンド）を回復している。重なった面積で測定した場合（Ｋｅｎｄｒｉｃｋら、１９９６）、ネイティブ二次構造の回復は、１０ｍｇ／ｍＬおよび２０ｍｇ／ｍＬの圧処理について、各々約９０％および７０％である。表２は、重なった面積で測定した場合のＦＴＩＲによるネイティブ構造の回復を、二次導関数ＵＶ分光法によるネイティブ構造の回復と比較する。ＵＶおよびＦＴＩＲで測定した、ネイティブ様性質の回復のパーセントは、１０ｍｇ／ｍＬおよび２０ｍｇ／ｍＬの圧処理サンプルの両方について適度に一致した。なぜなら各方法の再現性は、約５％であるからである。
【０１４６】
（圧処理した凝集体の安定性：物理的特徴付け）圧処理に続く最初の分析後、圧処理した凝集体サンプル、凝集体コントロールおよびネイティブコントロールを、４℃に配置した。圧処理後２週間で、熱誘導凝集体およびグアニジン塩酸塩誘導凝集体の両方における１０ｍｇ／ｍＬの圧処理サンプルおよび２０ｍｇ／ｍＬの圧処理サンプルは、圧処理を行っていない熱誘導凝集体に類似した、無色で透明なゲルを形成した。しかしながら、（定性的に判断した）これらサンプルの粘度は、熱誘導凝集体コントロールについて観察された粘度と比較して著しく低かった。１ｍｇ／ｍＬで圧処理した凝集体間の定性的な時間依存的差異は、認められなかった。
【０１４７】
ＧＥＭＭＡおよびＳＥＣを、圧処理直後にコハク酸緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬになるように希釈した後、４℃で２週間保存した、圧処理した凝集体に対して行った。圧処理したサンプルに関するＧＥＭＭＡの結果およびＳＥＣの結果を、液体コントロールおよび凝集体コントロールと比較した。開始凝集体の型またはリフォールディングタンパク質の濃度について、ＧＥＭＭＡまたはＳＥＣのいずれかにより得られる効果は、観察されなかった。ＧＥＭＭＡおよびＳＥＣにより測定した場合、圧処理した凝集体はただ２種類のみ含んでおり、そしてそれらは単量体および２量体と同定された。圧処理した凝集体サンプルまたはネイティブコントロールいずれにおいても、より高次の凝集体は検出されなかった。熱誘導凝集体コントロールのＧＥＭＭＡ分析は、凝集体の巨大集団（９５質量パーセントを超える）を示した（図３）（また、ＧＥＭＭＡ分析は、グアニジン塩酸塩誘導コントロールに対しては行わなかった。）。
【０１４８】
ＧＥＭＭＡおよびＳＥＣに関するネイティブコントロールと圧処理した凝集体との間の結果の概要を、表１Ａおよび２Ｂに各々表示する。開始凝集体の型またはリフォールディングタンパク質の濃度について、効果は観察されなかったので、表１中の圧処理した凝集体に関するデータは、試験した全ての開始凝集体の型およびリフォールディングタンパク質の濃度の平均を計算したものである。ＧＥＭＭＡで測定した、圧処理した粒度分布における２つのピークは、４．６ｎｍおよび５．７ｎｍに集中した。これらは、コントロール（単量体または２量体）の分布中に存在する各々の対応部分よりも、ＥＭ直径が大きかった。更に、ＧＥＭＭＡにより、ネイティブコントロールと比較して大きな単量体の質量パーセントが、リフォールディングされた凝集体で確認された。ＳＥＣにより、圧処理した凝集体について２量体の溶出時間がコントロールと比較して短かったが、単量体の溶出時間に、差異は測定されなかった。コントロールと圧処理した凝集体との間で、単量体の質量パーセントの差異は、ＳＥＣにより、測定されなかった。ＧＥＭＭＡのデータとＳＥＣデータとは、単量体の質量パーセントの増加に関して矛盾しているので、そのデータは、圧処理した凝集体サンプルにおける、コントロールに対して増加した単量体の質量パーセントという結論を支持しない。
【０１４９】
ＧＥＭＭＡのデータおよびＳＥＣのデータについて、圧処理した凝集体サンプルおよびネイティブコントロールサンプル中にある単量体および２量体の分子量の推定は、既知の分子量を持つタンパク質を用いて作製された検量線から行った。そして、これらの分子量の推定を、表１に表示する。コントロールサンプルの単量体および２量体に関する分子量の推定は、ＧＥＭＭＡおよびＳＥＣの両方によって正確であった。なぜなら、ｒｈＩＦＮ−γ単量体およびｒｈＩＦＮ−γ２量体の既知の分子量は、各々１６．４５ｋＤおよび３２．９ｋＤであるからである。圧処理した凝集体サンプルの２量体の分子量の推定値は、ＧＥＭＭＡおよびＳＥＣの両方によって、コントロールサンプルについての２量体の分子量の推定値と比較して大きかった。２量体の見かけの分子量の増加は、不適切にフォールディングし膨張した状態の２量体に起因すると考えられる。単量体に関する見かけの分子量は、ＧＥＭＭＡによって、コントロールに対して大きかったが、ＳＥＣによっては、コントロールに対して変化はなかった。
【０１５０】
（圧処理した凝集体の安定性：構造の特徴付け）圧力によるリフォールディングを行った２週間後、減圧直後に１ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したサンプルを、４℃保存より取り出し、ＵＶにより分析した。濃度制限は、ＦＴＩＲによるこれらサンプルの分析を妨げた。図１０は、１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬおよび２０ｍｇ／ｍＬで圧処理した、熱誘導した圧処理凝集体の二次導関数ＵＶスペクトルのプロットである。参考のために、図１０にネイティブｒｈＩＦＮ−γの二次導関数ＵＶスペクトルを重ね合わせる。１ｍｇ／ｍＬで圧処理した凝集体サンプルのスペクトルは、圧処理直後に得たスペクトルと同じあり、ネイティブ様特徴の本質的に完全な回復を示した。しかしながら、１０ｍｇ／ｍＬで圧処理した凝集体サンプルおよび２０ｍｇ／ｍＬで圧処理した凝集体サンプルのスペクトルは、圧処理直後に得たそれぞれのスペクトルから変化した（図８）。１ｍｇ／ｍＬにて、４℃において２週間保存した後、２８６ｎｍ付近の極値の高さにより測定したネイティブ構造の回復は、１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬおよび２０ｍｇ／ｍＬの圧処理した熱誘導凝集体に関して、各々１００％、９７％および９４％であった。１０ｍｇ／ｍＬで圧処理した熱誘導凝集体および２０ｍｇ／ｍＬで圧処理した熱誘導凝集体に関するネイティブ構造の回復は、圧処理直後に測定した、各々、８９％および７９％（表２）から増加した。圧処理直後の場合と同じように、圧処理の２週間後、ネイティブの二次導関数ＵＶスペクトルの回復の程度は、凝集体型に非依存的である。圧処理したグアニジン塩酸塩誘導凝集体サンプルの二次導関数ＵＶスペクトルは示していないが、２８６ｎｍ付近の極値の高さによって測定したネイティブ構造の回復は、１ｍｇ／ｍＬのサンプル、１０ｍｇ／ｍＬのサンプルおよび２０ｍｇ／ｍＬのサンプルに関して、各々１００％、９７％および９５％であった。１ｍｇ／ｍＬにて、４℃において保存した後、二次導関数ＵＶで測定したネイティブ構造の回復は、リフォールディング中に、タンパク質濃度について減少傾向を示す。しかし、回復の差異は、この方法の精度の範囲内にある。
【０１５１】
（ネイティブ２量体の回復に関する濃度依存性）凝集体からのネイティブ２量体の回復は、興味深いタンパク質濃度依存性を示した。リフォールディングプロトコルが完了した直後に得たＵＶ分光データおよびＦＴＩＲ分光データは、回復の程度に関する強い濃度依存性を示す。更に、圧処理後に得た二次導関数ＦＴＩＲスペクトルは、凝集の明らかな徴候を、特に２０ｍｇ／ｍＬでリフォールディングしたサンプルについて（図９における、１６２０ｃｍ−１および１６９５ｃｍ−１での分子間βシートバンドの存在）、示した。更に、４℃において２週間保存した後、希釈していない１０ｍｇ／ｍＬで圧処理した凝集体サンプルおよび希釈していない２０ｍｇ／ｍＬで圧処理した凝集体サンプルは、これらのサンプルの粘度における明確な増加によって、凝集の巨視的な証拠を示した。しかしながら、同じ圧処理サンプルであって、圧処理直後に１ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したものは、リフォールディング中のタンパク質の濃度に関わらず、ＧＥＭＭＡおよびＳＥＣによって凝集体の何の徴候も示さず、ＴＥＭによって、液体コンとロールと区別できず、そして、ＵＶ分析によって、ネイティブ構造がほぼ完全に回復したことを示した。この興味深いタンパク質濃度依存性を説明するために、ｒｈＩＦＮ−γの凝集経路に対する圧力の効果およびこの凝集経路を理解する必要がある。
【０１５２】
静水圧は、オリゴマータンパク質を解離させることが公知であり（ＧｒｏｓｓおよびＪａｅｎｉｃｋｅ  １９９４；ＳｉｌｖａおよびＷｅｂｅｒ  １９９３）、本発明者らによって、凝集体分離のために本明細書で使用している圧力域において、ｒｈＩＦＮ−γを解離させることが示された。このリフォールディングプロトコル中に収集したインサイチュＵＶデータは、１００ＭＰａで約１時間後に、リフォールディングが本質的に完了することを示した。このインサイチュＵＶデータは、その技術の吸光度限界が原因で、１０ｍｇ／ｍＬおよび２０ｍｇ／ｍＬではなく、１ｍｇ／ｍＬで収集された。ゆえに、１００ＭＰａにおける濃度の関数としてのリフォールディング速度は、知られていない。もし、１００ＭＰａにおけるリフォールディング速度が、より高いタンパク質濃度で減少したならば、１００ＭＰａで１．５時間のリフォールディング時間後、かなりの単量体が、１０ｍｇ／ｍＬのサンプルおよび２０ｍｇ／ｍＬのサンプル中に存在しただろう。本発明者らは、減圧直後に収集した、１０ｍｇ／ｍＬのサンプルおよび２０ｍｇ／ｍＬのサンプルに関する二次導関数ＵＶスペクトル（図８）が、増加した単量体の濃度と一致することを示した。更に、単量体を経たｒｈＩＦＮ−γ凝集体、そして、ゆえに、減圧の際の単量体ｒｈＩＦＮ−γの存在が、凝集を導くと予測されることが、本発明者らによって確立された。このように、圧処理した凝集体の二次導関数ＵＶスペクトル（図８）において（圧処理直後に）観察される濃度依存性は、増加したタンパク質濃度で、増加した単量体集団を反映するようである。
【０１５３】
そこで、１０ｍｇ／ｍＬで圧処理した凝集体サンプルおよび２０ｍｇ／ｍＬで圧処理した凝集体サンプルに関して、なぜ、希釈していないサンプルで凝集が観察され、１ｍｇ／ｍＬ  ｒｈＩＦＮ−γとなるように希釈したサンプルでは凝集は観察されないのか？回答は、タンパク質の凝集とタンパク質のフォールディングとの間の関係に存在する。タンパク質の凝集は、フォールディング中間体を介して進行するので、凝集とフォールディングとは、競合するプロセスである（Ｂｅｔｔｓら  １９９７；Ｃｌａｒｋら  １９９９；Ｆｉｎｋ  １９９８）。タンパク質のリフォールディング段階は、一般に一次のプロセスである（Ｃｌａｒｋら  １９９９）が、本発明者らは、高電解質濃度非存在下におけるｒｈＩＦＮ−γ凝集は、タンパク質濃度中で２次であるということを、決定した。もし、ｒｈＩＦＮ−γのフォールディングの律速段階が、２次より低次（例えば１次）であるならば、より低いタンパク質濃度は、凝集よりもリフォールディングを支持するだろう。２量体のもつれ合った性質を考慮した場合（Ｅａｌｉｃｋら  １９９１）、ｒｈＩＦＮ−γのリフォールディング反応速度を１次と想定することは、適当である。もし、２量体取得における律速段階が、単量体同士の衝突速度ではなく、リフォールディングが起こり得る正確な構造を呈した速度であるならば、１次反応速度が観察されるだろう。その上、温度低下は、凝集阻害および２量体取得に寄与し得る。なぜならば、凝集反応は大きな活性化エネルギーを有するが、２量体を導く会合反応は、比較的に温度非感受性であるからである（Ｂｏｔｅｖａら  １９９６）。このように、より低い温度は、凝集よりもリフォールディング反応を促す。
（実施例３：リゾチームリフォールディング）
圧力は、液圧式１０倍増圧装置（Ｈｉｇｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅｒｉｅ，ＰＡ）に連結させた高圧窒素（４０ＭＰａ）を用いて発生させた。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０，２４℃）、ＧｄｎＨＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、および、望ましい最終比のＧＳＳＧ（ＧＳＳＧ：ＧＳＨ；最適比は１：１）中の１ｍｇ／ｍＬリゾチーム凝集体懸濁液を、ＳＡＭＣＯ（登録商標）移動ピペットのヒートシールした球状部の中で調製し、水のバック中でシールし、そして、２００ＭＰａに調節した２リットルのクローバー型反応器中に置き、油で満たした。サンプルを、加圧誘導加熱を最小とするために、目的の最終圧力へとゆっくり（２０分をかけて）加圧した。減圧を、各々の減圧段階に約５分を要しながら、２０ＭＰａずつ変化させて実施した。サンプルを、減圧の間、各中間圧において１５分間インキュベートして、１ＭＰａ／分（１０バール／分）となる全体の減圧速度を生じた。圧力器中に取り付けた熱電対によりモニターした場合、圧力誘導加熱により引き起こされる熱過渡は、この加圧速度で最小（＜２℃）であった。他のように述べない限り、全ての圧力実験を２４℃で行った。
（実施例４：ビクニンリフォールディング）
リフォールディングの研究を、６つのジスルフィド結合を有する、１７０アミノ酸タンパク質であるビクニンについて、実施した。このタンパク質は、発酵中に、頻繁に凝集体を形成する。この凝集体は、ネイティブでないジスルフィド結合から構成され、４〜８つの単量体のオリゴマーである。これらジスルフィド結合が乱雑になったタンパク質凝集体をリフォールディングするために高静水圧（１０００バール〜３０００バール）を使用し得るか否かを決定するために、実験を実施した。
【０１５４】
凝集したビクニンを、シールしたシリンジ内に置き、様々な反応器条件で圧力下に保持した。圧力、ｐＨ、酸化還元条件、温度および減圧速度を、全て制御した。基本ケースと同様に、次の条件を使用した：凝集したビクニンの１ｍｇ／ｍＬサンプルを、４ｍＭ酸化型グルタチオン（ＧＧＳＧ）、２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）中に、２００ＭＰａ、２５℃で１６時間、保持した。その後、圧力が１００ＭＰａに達するまで、サンプルを、３０分毎に１０ＭＰａづつ減圧した。０．１ＭＰａに達するまで、サンプルを更に、１５分毎に２５ＭＰａづつ減圧した。加圧後、リフォールディング収率を決定するために、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、サンプルを分析した。検量線を使用して、質量バランスが実験中に維持されていることを確実にした。サンプルをまた、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）および活性アッセイを介した分析のために、２次実験へまわした。これら２次研究は、ＳＥＣが、不活性単量性タンパク質の存在が原因で、約１０％だけリフォールディング収率を過大評価した事を、示した。依然として、ＳＥＣを最適化手段として使用したが、最終リフォールディング収率は、活性アッセイで確認した。
【０１５５】
４５％＋／−４％のリフォールディング収率を、上記した「基本ケース」の条件で活性定量によって測定した場合に、得た。リフォールディング条件の急速な最適化を、「基本ケース」の条件付近で溶液条件を変化させることにより、行った。単純なアルゴリズムを使用した：産業科学者に周知の、より複雑に設計された実験は、より少ない実験でより最適な条件をもたらす可能性がある。しかしながら、基本ケースの条件付近で酸化還元条件、温度、圧力および減圧速度を別々に変化させるという単純な技術を使用することによってさえ、適正な最適条件を素早く発見した。
【０１５６】
酸化型グルタチオンおよび還元型グルタチオンを、リフォールディング溶液中で酸化還元条件を制御するために、使用し得る。これらの化合物は、ネイティブでないジスルフィド結合を破壊し、そしてネイティブのジスルフィドを再形成するために、必要である。代表的には、全グルタチオン濃度が６ｍＭ〜１６ｍＭの間である場合に、最適酸化還元条件が存在し、この系に特異的である還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンとの比率は、しばしば１と３との間である。サンプルを、種々の酸化還元条件を用いて作製し、リフォールディング収率に対する効果を決定するために、３つの異なる圧力条件で試験した。単量体のＳＥＣピークと凝集体ＳＥＣピークとの比率を、リフォールディングの効果を測定するために、使用した。この結果を図１１に示す。これらの研究にとって、最も最適なケースは、２０００バールで４ｍＭ酸化型グルタチオン、２ｍＭ  ＤＴＴであることが認められた。
【０１５７】
ネイティブでないジスルフィド結合を含むタンパク質凝集体について予想されるように、このグルタチオンシャッフリング系は、どの有意なリフォールディング収率を得るためにも、必要であった。圧力およびＤＴＴだけでは効果的でなかった。酸化還元条件のさらなる最適化を行えたかもしれない；しかしながら、２０００バールにおける４ｍＭ  ＧＧＳＧ、２ｍＭ  ＤＴＴ中で得た収率は、残りのリフォールディング条件の効果を決定するために十分に適切であった。
【０１５８】
リフォールディング温度の効果を評価した。サンプルを、種々のリフォールディング温度で１２時間保持し、それから室温にし、更に１２時間保持した。２０００バールの圧力および以前に最適化した酸化還元条件を、使用した。リフォールディングは、２５℃で最大であることが認められた。これらの結果を図１２に示す。
【０１５９】
リフォールディング圧力の効果を評価した。サンプルを、種々のリフォールディング圧で１６時間保持し、それから８時間をかけてゆっくりと減圧した。このサンプルを、以前使用した酸化還元条件を用いて、室温で保持した。２０００バールが最適リフォールディング圧力であることが認められ、１０００バールおよび３０００バールの両方では、リフォールディング収率が減少した。これらの結果を、図１３に示す。
【０１６０】
タンパク質収率に対する減圧の効果を決定するために、タンパク質単量体を、高減圧速度および低減圧速度に供した。サンプルを、標準酸化還元条件（４ｍＭ  ＧＧＳＧ、２ｍＭ  ＤＴＴ）中に２０００バール、２５℃で、１６時間保持した。１セットのサンプルを、３０秒間かけて減圧した。第２のサンプルセットを、実験方法中に記載している手順に従い減圧した。（１００ＭＰａの圧力に達するまで、サンプルを、３０分毎に１０ＭＰａづつ減圧し、それから更に、０．１ＭＰａに達するまで、１５分毎に２５ＭＰａづつ減圧した）ゆっくりと減圧したサンプルは、２１％＋／−３％の単量体を、凝集体に損失した。この値は、サンプルを急速減圧した場合の５９％＋／−１６％の損失よりかなり低かった。この研究は、タンパク質がネイティブ構造を維持することを確実にするために、一定時間にわたりゆっくりとした減圧を使用する必要性を、立証した。
（実施例５：ａＶＥＧＦリフォールディング）
高圧リフォールディング研究を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養における生成中に不可逆的２量体形成する、ヒト血管内皮増殖因子（ａＶＥＧＦ）に対する抗体、ジスルフィド結合しグリコシル化した、全長ヘテロテトラマー抗体の、ネイティブでない２量体性凝集体に対して実施した。リフォールディング研究を、ネイティブａＶＥＧＦ単量体を取得するために高静水圧を使用ことができるかどうかを決定するために、実施した。更に、実験は、リフォールディング収率に対する温度の影響を決定するために、行った。
【０１６１】
３つの異なる温度で、２０００バールに保持したサンプルのリフォールディング収率を決定するために、実験を、実施した。この実験手順は、次の通りである：ａＶＥＧＦ（２２％凝集体、７８％単量体）を、ｐＨ６．０の、２５ｍＭ  ２−（４−モルフォリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液中に、１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように希釈した。各々のサンプルは、密閉したシリンジ中に充填したＭＥＳタンパク質溶液（１ｍｇ／ｍＬ）０．４ｍＬから作製した。このシリンジは、適切な圧力をサンプルに伝えることを確実にするために、必要である。３つのサンプルを、各々の条件のために作製し、室温で圧力器中へ置いた。このサンプルを、２０００バールに加圧し、圧力器の温度を０℃、２５℃または５０℃に調製した。温度が変化しても２０００バールに維持するために、この時間中圧力を測定した。サンプルを、所望の温度および所望の圧力で１６時間保持し、冷却または加温して室温にし、そして減圧した。減圧は、３０分毎に１００バールずつ変化させ、１０００バールに達したら、１５分毎に２５０バールずつ落とした。このサンプルを圧力器から取り出し、４℃で２日間保存した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、単量体と２量体との質量の割合を決定した。
【０１６２】
上記した手順を通して、３つのサンプルを、２０００バールで、そして０℃、２５℃および５０℃で試験した。リフォールディング収率（ＲＹ％）は、次の式を使用して、ＳＥＣの結果より計算した。
【０１６３】
【数１】
2008031182.tif 000005
ここで、Ｍｆ＝最終的単量体の割合およびＭｉ＝初発単量体の割合である。
【０１６４】
温度がリフォールディング収率に影響することが、認められた。これらの研究は、５０℃におけるリフォールディング収率２９％（＋／−１％）が達成され得ることを示した。これは、図１４に示す。
（実施例６−ＧＣＳＦ封入体の高圧リフォールディング）
Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）より供給された、濃縮精製封入体を、種々の濃度のグアニジン塩酸塩（ＧｄｎＨＣｌ）を含むリフォールディング緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＮａＮ３）に懸濁した。三通りのサンプルを、２０００バールに加圧し、２４時間インキュベートした。圧力は、２００バールずつ容器の圧力を減少させることで緩めた。サンプルは、各変化圧において１５分間保持した。
【０１６５】
減圧が完了すると、サンプルを、１３，０００ｇで１５分間遠心分離した。この結果できた上清を、Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＴＰＡ全タンパク質アッセイを用いて分析した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）スタンダードを、このアッセイを較正するために用いた。この結果を、図１５に示す。
【０１６６】
本明細書中にて開示されそして特許請求される組成物、方法、および装置すべては、本開示を考慮すると、過度の実験を伴わずに作製および実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、本明細書中に記載される組成物、方法、および装置、ならびにその方法中の工程および工程の順序に対して、本発明の概念、趣旨、および範囲から逸脱することなく変形が適用され得ることが、当業者にとって明らかである。より詳細には、本明細書中に記載される薬剤を、同じ結果または同様の結果を達成しながら、化学的および生理学的に関連する特定の薬剤で置換し得ることが、明らかである。当業者にとって明らかなこのような同様の置換および改変すべてが、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の趣旨、範囲、および概念の内にあると、見なされる。
【０１６７】
（ＸＩＩ．参考文献）
以下の参考文献は、例示的手順または本明細書に示された手順に対する他の詳細な補遺を提供する範囲で、具体的に本明細書中に参考として援用される。
【０１６８】
【表３】
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下記の図面は、本明細書の一部を構成し、そして本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提供される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、ひとつ以上のこれらの図面を参照することにより、より良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】図１：緩衝液単独および０．７５Ｍ  ＧｄｍＨＣｌの両方における、ｒｈＧＨ凝集体の高圧回収。大気標準は白抜き記号で標識され、加圧したサンプルは黒塗り記号で標識される。リフォールディング緩衝液は、ＧｄｍＨＣｌを含まない。
【図２】図２Ａ−２Ｂ：ｒｈＩＦＮ−γの（図２Ａ）熱的に誘導された凝集体および（図２Ｂ）塩酸グアニジンで誘導された凝集体のＴＥＭ顕微鏡写真。枠Ａ１およびＢは倍率４０，０００倍（バーは２００μｍ）、および枠Ａ２は倍率８０，０００倍（バーは１００μｍ）である。
【図３】図３：ｒｈＩＦＮ−γのネイティブ凝集体（太線）および熱誘導による凝集体（細線）について、ＧＥＭＭＡにより測定した、ＥＭの直径に対する質量％濃度。（Ａ）は、単量体のＥＭ直径領域（約４．４ｎｍ）および二量体のＥＭ直径領域（約５．５ｎｍ）を示し、（Ｂ）は、凝集体のＥＭ直径領域を示す。粒径分布は分かりやすくするために二つの枠に分割し、この二つの枠は異なった質量％スケールを有することに留意のこと。７〜１０ｎｍの範囲（枠Ｂ）のネイティブのｒｈＩＦＮ−γの応答は、装置のノイズレベル内である。
【図４】図４：圧力処理前における、ｒｈＩＦＮ−γの熱誘導（□）および塩酸グアニジン誘導（▲）凝集体の二次微分ＵＶスペクトル。図内に含まれた凝集体のスペクトルは、ｒｈＩＦＮ−γの０．１ＭＰａにおける液体コントロール（実線）および、２５０（×）ＭＰａにて圧力解離したものである。ネイティブおよび圧力解離したスペクトルでの２８６ｎｍ付近の極値を、凝集解離後のリフォールディング事象を追跡するために使用した。２５０ＭＰａスペクトルを除いて、すべてのスペクトルを０．１ＭＰａで収集した。
【図５】図５：圧力処理前における、熱誘導凝集体（□）および塩酸グアニジン誘導凝集体（▲）の、面積により正規化された二次微分ＦＴＩＲスペクトル。ネイティブｒｈＩＦＮ−γのスペクトルは、比較目的で含まれており、実線にて表される。すべてのスペクトルを０．１ＭＰａで収集した。
【図６】図６Ａ〜６Ｂ：図６Ａは、スクシネート緩衝液中での２５０ＭＰａにおける、塩酸グアニジン誘導凝集体の時間に対する３１０ｎｍでの吸光度を示している。全ｒｈＩＦＮ−γ濃度は１．０ｍｇ／ｍＬであり、溶液中の塩酸グアニジン濃度は、約５ｍＭであった。凝集体の非存在下におけるネイティブｒｈＩＦＮ−γの３１０ｎｍでの吸光度は、約０．０６ＡＵ  ｍＬ／ｃｍ  ｍｇである（データには示していない）。図６Ｂは、２５０ＭＰａで解離したｒｈＩＦＮ−γ（１ｍｇ／ｍＬ）の塩酸グアニジン誘導（▲）および熱誘導（□）凝集体の、１００ＭＰａにおける、時間に対する二次微分極値（ほぼ２８６ｎｍ）の高さを示している。スペクトルの高さにおいて、エラーバーは９５％信頼区間である。２５０ＭＰａで圧力解離した形態（破線）、ネイティブ液体コントロール（×つき実線）、および０．１ＭＰａでの平衡後の圧力リフォールドされたもの（点線）についてのスペクトル高は、参考のためのプロットとして含まれる。
【図７】図７Ａ〜７Ｃ：圧力処理した凝集体（図７Ａ）、熱誘導凝集体（図７Ｂ）、塩酸グアニジン誘導凝集体（図７Ｃ）、およびネイティブコントロールのｒｈＩＦＮ−γ（圧力処理していない）の倍率４０，０００倍でのＴＥＭ顕微鏡写真である。すべてのサンプルにおいて、短繊維構造が観察されたが、主要な構造は不定形であった（たとえばＡ２）。バーは２００μｍである。
【図８】図８Ａ〜８Ｂ：熱誘導（図８Ａ）および塩酸グアニジン誘導（図８Ｂ）の圧力処理した凝集体の二次微分ＵＶスペクトル。すべてのスペクトルは、圧力リフォールディングプロトコール完了後、すぐに０．１ＭＰａで収集した。リフォールディングは２０ｍｇ／ｍＬ（黒塗り記号）、１０ｍｇ／ｍＬ（白抜き記号）、および１ｍｇ／ｍＬ（点線）でおこなわれたものであり、約１ｍｇ／ｍＬでの希釈後、すぐにスペクトルを収集した。ネイティブコントロールのｒｈＩＦＮ−γ（実線）のスペクトルは、参考のために両枠において、重ねて表示している。
【図９】図９：圧力処理した、熱誘導凝集体（図９Ａ）および塩酸グアニジン誘導凝集体（図９Ｂ）、面積により正規化された二次微分ＦＴＩＲスペクトル。すべてのスペクトルは、圧力リフォールディングプロトコール完了後３時間以内に、０．１ＭＰａで収集された。ＦＴＩＲスペクトルは、２０ｍｇ／ｍＬ（黒塗り記号）、１０ｍｇ／ｍＬ（白抜き記号）で行われたリフォールディングについて記録された。ネイティブコントロールのｒｈＩＦＮ−γ（実線）のスペクトルは、参考のために両方の枠において、重ねて表示している。
【図１０】図１０：４℃、０．１ＭＰａ、および１ｍｇ／ｍＬでの２週間後の熱誘導圧力処理凝集体の二次微分ＵＶスペクトル。リフォールディングは、２０ｍｇ／ｍＬ（黒塗り記号）、１０ｍｇ／ｍＬ（白抜き記号）、および１ｍｇ／ｍＬ（点線）で行われ、そしてサンプルを約１ｍｇ／ｍＬに迅速に希釈した。ネイティブコントロールのｒｈＩＦＮ−γ（実線）のスペクトルは、参考のために重ねて表示している。
【図１１】図１１：リフォールディング収量に対する種々の圧力におけるレドックス状態の効果。条件は、２５℃で１６時間のリフォールディング、および６時間の減圧であった。最高収量は、ＧＧＳＧ  ４ｍＭ、ＤＴＴ  ２ｍＭ、および２０００バールに保たれたサンプルについて得られた。
【図１２】図１２：リフォールディング収量に対する温度効果。条件は、２０００バールで、２４時間のリフォールディング、ＧＧＳＧ  ４ｍＭ、ＤＴＴ  ２ｍＭ、ｐＨ７．２、および８時間の減圧であった。最高収量は、リフォールディング温度が２５℃に保たれた場合に得られた。
【図１３】図１３：リフォールディング収量に対する圧力効果。条件は、１６時間のリフォールディング、ＧＧＳＧ  ４ｍＭ、ＤＴＴ  ２ｍＭ、２２℃、ｐＨ７．２、および８時間の減圧であった。リフォールディング収量は、２０００バールで最高になることが見出された。
【図１４】図１４：ａＶＥＧＦリフォールディングに対する温度効果。条件は１６時間、緩徐な減圧で２０００バールであった。２９％の収量が５０℃に保たれたサンプルで達成された。エラーバーは、９５％信頼区間を示す。
【図１５】図１５：ＧＣＳＦ封入体由来の可溶性タンパク質。丸（●）は大気圧でのサンプルを表す。四角（■）は２４時間２０００バールでインキュベートしたサンプルを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年10月17日(2007.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図２】
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【図７】
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