(57)【要約】【課題】再計測を行うことなく、且つ、１ケース当たりのイオンの分析時間を延長することなく、試料中に含まれる微量成分を分析することができる質量分析システムを提供することにある。【解決手段】本発明のタンデム型質量分析システムによると、MS1マススペクトルのピークのイオンからMS2質量分析のための親イオンの候補が選択されるとき、データベースを検索し、データベースに格納されていない成分、又は、データベースに格納されているが所定数Ｎ以上の分子の配列が同定されていない成分が親イオンとして選択され、該選択された親イオンの各々に対して、所定数Ｎ以上の分子列が同定されるまで、MS2質量分析が行われる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象の物質に関する質量分析結果が格納されたデータベースと、上記物質を前処理するクロマトグラフと、上記物質に含まれる成分をイオン化するイオン化部と、イオン化した成分を解離させるイオン解離部と、イオンを質量対電荷比m/z毎に分離する質量分析部と、質量対電荷比m/z毎に分離されたイオンを検出してマススペクトルを生成するイオン検出部と、該イオン検出部によって得られたマススペクトルより上記成分に含まれる分子配列を同定するデータ処理部と、を有し、上記イオン化部からのイオンを上記質量分析部によって質量対電荷比m/z毎に分離し、上記イオン検出部によってMS1マススペクトルを得るMS1質量分析と、上記MS1マススペクトルのピークから親イオンを選択し、該親イオンを上記イオン解離部によって解離させ、該解離イオンを上記質量分析部によって質量対電荷比m/z毎に分離し、上記イオン検出部によってMS2マススペクトルを得るMS2質量分析と、を行い、該質量分析を所定の段繰り返すタンデム型質量分析システムにおいて、
MS1マススペクトルのピークのイオンからMS2質量分析のための親イオンの候補が選択されるとき、上記データベースを検索し、上記データベースに格納されていない成分、又は、上記データベースに格納されているが所定数Ｎ以上の分子の配列が同定されていない成分が親イオンとして選択され、該選択された親イオンの各々に対して、所定数Ｎ以上の分子列が同定されるまで、MS2質量分析が行われることを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項２】
請求項１記載のタンデム型質量分析システムにおいて、上記MS2質量分析において、親イオンの候補の１つに対して、MS2質量分析を行い、所定数Ｎ以上の分子配列が同定されない場合には、同一の親イオンに対して、MS2質量分析が再度繰り返され、所定数Ｎ以上の分子配列が同定された場合には、次の親イオンに対してMS2質量分析が行われることを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項３】
請求項２記載のタンデム型質量分析システムにおいて、同一の親イオンに対して、MS2質量分析を再度繰り返すとき、解離時間と解離電圧の少なくとも一方を前回とは異なる値に変化させてMS2質量分析を繰り返すことを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項４】
請求項２記載のタンデム型質量分析システムにおいて、同一の親イオンに対して、MS2質量分析を再度繰り返すとき、MS2マススペクトルのピークの値が、ピークの最大値より所定の割合まで減少したとき、その親イオンに対するMS2質量分析を停止し、次の親イオンのMS2質量分析を行うことを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項５】
請求項１記載のタンデム型質量分析システムにおいて、所定数Ｎ以上の分子配列が同定され、且つ、MS2マススペクトルのピークの積算値が所定値より大きくなるまで、MS2質量分析が行われることを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項６】
請求項１記載のタンデム型質量分析システムにおいて、上記データベースは、MS1マススペクトルのピークから読み取ったイオンの分子配列、配列数、質量、価数、クロマトグラフのリテンションタイム、イオン強度、MS2マススペクトルの各イオンの質量、価数、イオン強度、及び、イオン強度の積算値を有することを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項７】
請求項１記載のタンデム型質量分析システムにおいて、上記データベースを検索するとき、MS1マススペクトルのピークのイオンから読み取った分子配列、質量、価数、リテンションタイムを上記データベースの情報と照合することを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項８】
請求項１記載のタンデム型質量分析システムにおいて、該タンデム型質量分析装置はリニアトラップ型（ＬＩＴ）、リニアトラップ（ＬＩＴ）−飛行時間型(TOF)、四重極（Ｑポール）−飛行時間型(TOF)、飛行時間(TOF)−飛行時間型(TOF)、Ｏｒｂｉｔａｌ−Trap型、の何れかの型であり、イオンの解離手段として、CID（Collision Induced Dissociation：衝突誘起解離）、ECD（Electron Capture Dissociation：電子捕獲解離）、ETD(Electron Transfer Dissociation:電子移動解離)の何れかの手段を有することを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項９】
請求項１記載のタンデム型質量分析システムにおいて、上記イオン化部は、ＥＳＩ(Electro Spray Ionization)又はＭＡＬＤI(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)であることを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項１０】
請求項１記載のタンデム型質量分析システムにおいて、上記測定対象の物質は生体試料、薬品分子、ダイオキシン、又は、爆発物であることを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項１１】
請求項１記載のタンデム型質量分析システムにおいて、上記測定対象の物質はタンパク質であり、
MS1マススペクトルのピークからMS2質量分析のための親イオンの候補が選択されるとき、上記データベースを検索し、上記データベースに格納されていないペプチド、又は、上記データベースに格納されているが所定数Ｎ以上のアミノ酸の配列が同定されていないペプチドが親イオンとして選択され、該選択された親イオンの各々に対して、所定数Ｎ以上のアミノ酸配列が同定されるまで、MS2質量分析が行われることを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項１２】
請求項１１記載のタンデム型質量分析システムにおいて、上記アミノ酸の配列は、質量スペクトルの差からアミノ酸配列を読み取るde  novo法か、上記データベースに蓄積されている一種以上のタンパク質のアミノ酸配列データとの照合による検索法か、両者の併用かの何れかにより、同定されることを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項１３】
請求項１記載のタンデム型質量分析システムにおいて、測定途中の各時間におけるスペクトル、及び、解離電圧の両方若しくは片方をログとしてメモリ又はハードディスク装置に記憶することを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項１４】
請求項１記載のタンデム型質量分析システムにおいて、MS１質量分析が終了してからMS2質量分析が開始されるまでの上記親イオンの候補の選択処理は、１０m秒以下で好ましくは１m秒以下で実行されることを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項１５】
請求項１記載のタンデム型質量分析システムにおいて、MS1マススペクトルのピークからMS2質量分析のための親イオンの候補が選択されるとき、所定の質量範囲にあるピークのイオンが親イオンとして選択されることを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項１６】
タンパク質に含まれるペプチドをイオン化し、該イオンを質量対電荷比m/z毎に分離し、該分離したイオンを検出してMS1マススペクトルを得るMS1質量分析と、上記MS1マススペクトルのピークから親イオンを選択し、該親イオンを解離させ、該解離イオンを質量対電荷比m/z毎に分離し、MS2マススペクトルを得るMS2質量分析と、を行い、上記マススペクトルより上記ペプチドに含まれるアミノ酸配列を同定するタンデム型質量分析方法において、
MS1マススペクトルのピークのイオンからMS2質量分析のための親イオンの候補が選択されるとき、タンパク質に関する質量分析結果が格納されたデータベースを検索し、上記データベースに格納されていないペプチド、又は、上記データベースに格納されているが所定数Ｎ以上のアミノ酸配列が同定されていないペプチドが親イオンとして選択され、該選択された親イオンの各々に対して、所定数Ｎ以上のアミノ酸配列が同定されるまで、MS2質量分析が行われることを特徴とするタンデム型質量分析方法。
【請求項１７】
請求項１６記載のタンデム型質量分析方法において、上記MS2質量分析において、親イオンの候補の１つに対して、所定数Ｎ以上のアミノ酸配列が同定された場合には、次の親イオンに対して、MS2質量分析を行い、所定数Ｎ以上のアミノ酸配列が同定されない場合には、同一の親イオンに対して、MS2質量分析が再度繰り返されることを特徴とするタンデム型質量分析方法。
【請求項１８】
請求項１６記載のタンデム型質量分析方法において、親イオンの候補の１つに対して、MS2質量分析を行い、所定数Ｎ以上のアミノ酸配列が同定されない場合には、同一の親イオンに対して、MS2質量分析が再度繰り返され、所定数Ｎ以上のアミノ酸配列が同定された場合には、次の親イオンに対してMS2質量分析が行われることを特徴とするタンデム型質量分析方法。
【請求項１９】
質量分析により同定されたタンパク質由来のペプチドに関するデータが格納されたデータベースと、タンパク質を前処理するクロマトグラフと、タンパク質に含まれるペプチドをイオン化するイオン化部と、イオン化したペプチドを解離させるイオン解離部と、イオンを質量対電荷比m/z毎に分離する質量分析部と、質量対電荷比m/z毎に分離されたイオンを検出してマススペクトルを生成するイオン検出部と、該イオン検出部によって得られたマススペクトルより上記ペプチドに含まれるアミノ酸配列を同定するデータ処理部と、を有し、上記イオン化部からのイオンを上記質量分析部によって質量対電荷比m/z毎に分離し、上記イオン検出部によってMS1マススペクトルを得るMS1質量分析と、上記MS1マススペクトルのピークから親イオンを選択し、該親イオンを上記イオン解離部によって解離させ、該解離イオンを上記質量分析部によって質量対電荷比m/z毎に分離し、上記イオン検出部によってMS2マススペクトルを得るMS2質量分析と、を行い、該質量分析を所定の段繰り返すタンデム型質量分析システムにおいて、
MS1マススペクトルのピークのイオンからMS2質量分析のための親イオンの候補が選択されるとき、タンパク質に関する質量分析結果が格納されたデータベースを検索し、上記データベースに格納されていないペプチド、又は、上記データベースに格納されているが所定数Ｎ以上のアミノ酸配列が同定されていないペプチドが親イオンとして選択され、該選択された親イオンの各々に対して、所定数Ｎ以上のアミノ酸配列が同定されるまで、MS2質量分析が行われることを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項２０】
請求項１９記載のタンデム型質量分析システムにおいて、上記所定数Ｎは、４以上６以下の整数であることを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項２１】
請求項１６記載のタンデム型質量分析システムにおいて、選択された親イオンの各々に対して、所定数Ｎ以上のアミノ酸配列が同定されるまで実施されるMS2質量分析において、CIDの代わりにECDまたは、ETDを用いてイオン解離を行うことを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項２２】
請求項１７記載のタンデム型質量分析システムにおいて、所定数Ｎ以上のアミノ酸配列が同定されない場合に、同一の親イオンに対して実施されるMS2質量分析において、CIDの代わりにECDまたは、ETDを用いてイオン解離を行うことを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【請求項２３】
請求項１９記載のタンデム型質量分析システムにおいて、所定数Ｎ以上のアミノ酸配列が同定されるまで行われるMS2質量分析において、CIDの代わりにECDまたは、ETDを用いてイオン解離を行うことを特徴とするタンデム型質量分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド、糖鎖などの生体高分子、薬品分子、ダイオキシン、爆発物含有のイオン等の質量分析に好適なタンデム型質量分析システムに関し、特に、微量な成分を検出するのに好適なタンデム型質量分析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的な質量分析法では、測定対象の試料をイオン化し、生成された様々なイオンを質量分析装置に送り込む。質量分析装置では、イオンの質量数 m、価数zの比である質量対電荷比 m/z毎に、イオン強度を測定し、マススペクトルを生成する。マススペクトルは、横軸が質量対電荷比 m/z、縦軸がイオン強度のピーク（イオンピーク）のスペクトルである。このように、試料をイオン化したものをそのまま質量分析することをMS1質量分析と呼ぶ。
【０００３】
タンデム型質量分析法では、MS1質量分析にて検出されたイオンピークのうち、ある特定の質量対電荷比 m/zの値を有するイオンピークを選定し、そのイオンを、ガス分子との衝突等により解離分解させる。こうして、生成した解離イオン種に対して、質量分析を行い、同様にマススペクトルを生成する。このように選択したイオン種を親イオン又は前駆イオンと呼ぶ。また、この質量分析をMS2質量分析と呼ぶ。
【０００４】
タンデム型質量分析法では、このように、親イオンの選択及び解離、解離したイオンの質量分析を繰返し行い、マススペクトルを生成する。以下に、ｎ段目の質量分析をMSn+1質量分析と呼び、MSn+1質量分析にて得られたマススペクトルをMSn+1マススペクトルと呼ぶこととする。
【０００５】
タンデム型質量分析法を用いて、タンパク質に含まれるペプチドのアミノ酸の配列を解析することができる。MS2マススペクトルよりアミノ酸の配列を読み取る手法には、データベース検索による方法、de novo法等が知られている。病気に起因する未知タンパク質は通常にデータベースに存在しない場合が多い。そこで、このようなタンパク質に由来するペプチドを解析する場合には、de novo法が利用される。de novo法は、マススペクトルのピーク及び質量対電荷比 m/zに基づいてアミノ酸配列を同定する技術であり、当業者により既知であり、ここでは詳細な説明は省略する。また、de novo法を実現するコンピュータソフトウエアは市販されている。
【０００６】
通常のパーソナルコンピュータを用いてde novo法による解析を行う場合、１ケース当たり数秒かかる。そのため、MS2マススペクトルよりde novo法を用いてアミノ酸配列を同定する処理は、通常、全ての分析が終了した後に行われる。そのため、後処理と称される。即ち、de novo法による解析をリアルタイムで実行するのは困難である。例えば、特許文献１に記載された方法でも、全ての分析終了後に後処理を実施している。
【０００７】
【特許文献１】特表2005-510732
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、de novo法による解析では、１ケース当たりのイオンの分析時間は一定である。従って、MS2質量分析において、親イオンとして選択できるイオン数には限度がある。通常、親イオンを選択する場合、MS1マススペクトルよりイオン強度の高い順に選択する。そのため、MS1マススペクトルにおけるピーク強度が小さいイオン、即ち、微量イオンを選択することができないことになる。即ち、後処理データとして入手できるのは、多量に含まれる成分のデータのみとなる。
【０００９】
従来の方法は、試料中に多量に含まれる成分を分析する場合に好適であるが、試料中に微量に含まれる成分を分析する場合には利用できない。試料中に多量に含まれる成分は通常、既知のペプチドである場合が多いが、微量成分は未知ペプチドである場合が多い。
【００１０】
従来の方法では、試料中に微量に含まれる未知のペプチドを分析する場合には、再計測を行うか、又は、１ケース当たりのイオンの分析時間を延長する必要である。
【００１１】
本発明の目的は、再計測を行うことなく、且つ、１ケース当たりのイオンの分析時間を延長することなく、試料中に含まれる微量成分を分析することができる質量分析システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明のタンデム型質量分析システムによると、MS1マススペクトルのピークのイオンからMS2質量分析のための親イオンの候補が選択されるとき、データベースを検索し、データベースに格納されていない成分、又は、データベースに格納されているが所定数Ｎ以上の分子の配列が同定されていない成分が親イオンとして選択され、該選択された親イオンの各々に対して、所定数Ｎ以上の分子列が同定されるまで、MS2質量分析が行われる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、計測時間の無駄がなく、ユーザの欲する微量な未知タンパク質由来のペプチドの定性分析が可能な質量分析装置を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
図１を参照して本発明のタンデム型質量分析システムの第１の例を説明する。本発明のタンデム型質量分析システムは、ペプチド、糖鎖などの生体高分子、薬品分子、ダイオキシン、爆発物含有のイオン等を質量分析が可能であるが、ここでは、タンパク質の質量分析を行う場合について説明する。
【００１５】
本例のタンデム型質量分析システムは、同定したタンパク質由来のペプチドに関するデータを格納する内部データベース10、試料であるタンパク質をポリペプチドの大きさに分解し分画する前処理系11、ペプチドをイオン化するイオン化部12、イオンを質量対電荷比 m/z に応じて分離する質量分析部13、分離されたイオンを検出しマススペクトルを生成するイオン検出部14、マススペクトル等のデータを整理及び処理するデータ処理部15、分析結果である質量分析データを表示する表示部16、これらの構成部の処理を制御する制御部17、及び、ユーザがデータ及び命令を入力するための入力部18を有する。
【００１６】
試料であるタンパク質は、先ず、前処理系11に導入される。前処理系11は、液体クロマトグラフ（LC）を有する。前処理系11では、タンパク質を消化酵素によりポリペプチドの大きさに分解し、液体クロマトグラフ（LC）の吸着力の差異に従って、時間的に分離及び分画する。液体クロマトグラフ（LC）の代わりにガスクロマトグラフが用いられてよい。
MS1質量分析では、ペプチドはイオン化部12によってイオン化され、質量分析部13に送られる。イオン化部12は、ＥＳＩ(Electro Spray Ionization)又はＭＡＬＤI(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)であってよい。イオンは質量分析部13によって、質量対電荷比 m/z に応じて分離される。ここで、mはイオン質量、zはイオンの帯電価数である。イオン検出部14によって、MS1マススペクトルが生成される。
【００１７】
MS2質量分析では、MS1マススペクトルから選択された親イオンを解離する。本例では、親イオンの解離方法として、親イオンをヘリウムなどのバッファーガスに衝突させて解離させる衝突解離（Collision Induced Dissociation）法を用いる。本例では、内部に中性ガスを充填したコリジョンセル (collision cell) 13Aが設けられている。
【００１８】
質量分析部13は、特定の質量対電荷比（m/z）又は特定の質量対電荷比（m/z）の領域の親イオンを捕獲し、それをまとめてコリジョンセル13Aに投入する。特定の親イオンを捕獲するには、例えば、排除すべきイオンが共鳴状態となるように、所定の周波数の共鳴電圧をトラップ電圧に重畳印加させる。
【００１９】
親イオンは、コリジョンセル13Aに内の中性ガスと衝突し、解離する。親イオンを中性ガスと衝突させるには、親イオンに共鳴する周波数の電圧を印加する。尚、質量分析部13に中性ガスを充満させて、質量分析部13内で親イオンを中性ガスに衝突させ、解離させてもよい。その場合、コリジョンセル13Aは不要になる。
【００２０】
親イオンの解離方法として、親イオンに低エネルギーの電子を照射し、多量の低エネルギー電子を捕獲させることにより解離させる電子捕獲解離（Electron Capture Dissociation）法、親イオンにイオンビームを照射し、電子を移動させることにより解離させる電子移動解離（Electron Transfer Dissociation）法等を用いてもよい。
【００２１】
コリジョンセル13Aによって解離された親イオンは質量分析部13によって、質量対電荷比 m/z に応じて分離される。分離されたイオンは、イオン検出部14によって検出され、MS2マススペクトルが生成される。MS2マススペクトルは、データ処理部15によって処理され、その分析結果である質量分析データは表示部16にて表示される。データ処理部15による処理は後処理と称される。
【００２２】
この一連の質量分析過程、即ち、試料のイオン化、イオン化した試料の質量分析部13への輸送及び入射、親イオンの解離及び分離、親イオン検出、データ処理等の処理は、制御部17が制御する。
【００２３】
MS2マススペクトルからアミノ酸配列を同定するには高速de novo法が用いられてよい。de novo法は周知であり、ここでは詳細に説明しない。また、市販の高速de novo法のソフトウエアを用いてよい。
【００２４】
図２を参照して、本発明によるタンデム型質量分析方法の概念を説明する、ここでは、従来のタンデム型質量分析方法と比較しながら説明する。タンデム型質量分析方法では、先ず、試料のタンパク質をペプチドに分解し、MS1質量分析を行い、MS1マススペクトル200を得る。図示のように、MS1マススペクトル200は、横軸が質量対電荷比 m/z、縦軸がイオン強度のグラフであり、質量対電荷比 m/z毎のピークとして現れる。
【００２５】
図示の例では、MS1マススペクトル200は、ペプチドＡを表わすピーク201、ペプチドＢを表わすピーク202、ペプチドＣを表わすピーク203を含むものとする。MS1マススペクトル200のピーク201、202、203の高さは、各ペプチドＡ、Ｂ、Ｃの含有量の相対的な比を表わす。本例では、ペプチドＢの含有量が最も高く、次に、ペプチドＡの含有量が高く、ペプチドＣの含有量は最も低い。
【００２６】
一方、内部データベース10には、試料に対する質量分析結果が格納されている。ペプチドＡを親イオンとして選択した場合のMS2マススペクトル２１１、ペプチドＢを親イオンとして選択した場合のMS2マススペクトル２１２、ペプチドＣを親イオンとして選択した場合のMS2マススペクトル２１３が既に得られている。更に、内部データベース10には、MS2マススペクトル２１１から１個のアミノ酸配列が同定されたこと、MS2マススペクトル２１２から５個のアミノ酸配列が同定されたこと、MS2マススペクトル２１３からアミノ酸配列が同定されなかったこと、の情報が格納されている。
【００２７】
同定されたアミノ酸配列数が多いほど、ペプチド及びタンパク質を正確に同定することができる。
【００２８】
そこで、本例では、少なくとも５つのアミノ酸を同定することができれば、ペプチド及びタンパク質を相当な精度にて同定することができる判定する。アミノ酸の種類は約２０種類ある。従って、５つのアミノ酸を同定することができれば、２０の５乗の数（約１０万）のペプチド又はタンパク質の同定が可能であると考えられる。図２の例では、ペプチドＢから５つのアミノ酸が同定されているため、ペプチドＢに関するデータが十分な精度にて得られていると判定する。尚、ここでは、５つのアミノ酸が同定されていることを条件としたが、これは単なる例であり、例えば、６つのアミノ酸が同定されていることを条件としてもよく、４つのアミノ酸が同定されていることを条件としてもよい。
【００２９】
従来の技術では、MS1マススペクトル200のピークの中から、ピークの高い順に所定の数の親イオンを選択する。近年では、全てのピークを親イオンとして選択する場合もある。従来の技術では、内部データベース10にどのようなデータが格納されているかとは無関係に、親イオンを選択する。図２の例では、ピーク202が最も強度が高い。従って、最初にペプチドＢを、親イオンとして選択し、MS2質量分析を行う。MS2マススペクトルが得られたら、それによりアミノ酸を同定する。しかしながら、内部データベース10には、既に、ペプチドＢに由来する５つのアミノ酸配列が格納されている。そのため、ペプチドＢに関して重複したデータが得られる可能性がある。
【００３０】
そこで、本発明によると、内部データベース10に格納されているペプチドのうち、５つ以上のアミノ酸配列が同定されているペプチドは、親イオンとして選択しない。従って、内部データベース10には格納されていないペプチドであるか、又は、内部データベース10には格納されているが、同定されているアミノ酸が５つ未満であるペプチドを親イオンとして選択する。このようにデータ不足のペプチドを順に親イオンとして選択し、MS2質量分析を行い、MS2マススペクトルを得る。得られたMS2マススペクトルは、内部データベース10に蓄積される。内部データベース10に既に同一のペプチドのデータがある場合には、それに積算する。こうして、５つ以上のアミノ酸を同定することができるまで、MS2質量分析を繰り返す。これを全てのデータ不足のペプチドについて行うと、最終的には、内部データベース10の格納されている全てのペプチドに対して、少なくとも５つのアミノ酸が同定される。こうして本発明によると、試料であるタンパク質に含まれる微量のペプチドについても、アミノ酸配列を同定することができるから、未知のタンパク質に含まれる微量のペプチドを同定することができる。
【００３１】
図２の例では、ペプチドＡ、Ｃが親イオンとなる。ペプチドＡ、Ｃのうち、どちらを先に親イオンとして選択し、MS2質量分析を行うかは、特に限定されない。ペプチドＡ、Ｃのうち、ピークの高さが高い順にMS2質量分析を行ってもよい。また、MS2分析のイオン解離手法としては、CIDのほかにECD,ETDを選択しても良い。
【００３２】
図３を参照して本発明によるタンデム型質量分析方法の第１の例を説明する。ステップＳ１１にて、データ処理部15は、MS1質量分析によって得られたMS1マススペクトルを得る。ステップＳ１２にて、データ処理部15は、MS1マススペクトルからピーク判定を行う。即ち、MS1マススペクトルに含まれる全てのピークの強度及び質量対電荷比 m/zを検出する。こうして得られたピークの総数をＮｐとする。ステップＳ１３にて、同位体ピーク判定を行う。同位体ピーク判定では、質量数は同一であるが価数数が異なるため、質量対電荷比 m/zが異なるものを検出する。即ち、ピークの総数Ｎｐより同位体数を減算する。こうして得られたピークの総数Ｎｐｉには、同位体数が含まれない。尚、Ｎｐｉ≦Ｎｐである。
【００３３】
ステップＳ１４にて、MS1マススペクトルから得られた総数Ｎｐｉのピークの各々に対して、内部データベース10に格納されたデータと比較する。ここで比較するデータは、試料中の予め指定したタンパク質を酵素分解したときに生成されると予想される全ペプチドの質量数m及び価数z、液体クロマトグラフ（LC）のリテンションタイム（保持時間）、MS1マススペクトルの全てのピークの強度値、等である。これらの情報を、ここではピーク情報と称する。
【００３４】
ステップＳ１４１にて、各ピークの質量数 m及び価数zを算出し、ステップＳ１４２にて、各ピークのリテンションタイム（保持時間）を算出する。ステップＳ１４３にて、算出したデータを、内部データベース10に格納されているデータと比較し、一致するものがあるか否かを判定する。一致するものが無い場合には、ステップＳ１４６に進み、一致するものが有る場合には、ステップＳ１４４に進む。ステップＳ１４４にて、内部データベース10より、データが一致するペプチドに関する情報を読出し、そのペプチドに対して５つ以上のアミノ酸配列が同定されているか否かを判定する。５つ以上のアミノ酸配列が同定されている場合には、ステップＳ１４５に進み、そのペプチドをMS2質量分析用の親イオンの対象から除外する。５つ以上のアミノ酸配列が同定されていない場合には、ステップＳ１４６に進む。この場合の、イオン解離手法としては、CIDのほかにECD,ETDを選択しても良い。
【００３５】
ステップＳ１４６にて、MS2質量分析用の親イオンの候補を選定する。ここで、MS2質量分析用の親イオンの候補となるのは、内部データベース10に格納されていないペプチド、又は、内部データベース10に格納されているが、５つ以上のアミノ酸配列が同定されていないペプチドである。
【００３６】
ステップＳ１５にて、MS2質量分析用の親イオンを選択する。ステップＳ１４６にて用意された親イオンの候補から親イオンを選択する。ステップＳ１６にて、MS2質量分析を実行する。この場合の、イオン解離手法としては、CIDのほかにECD,ETDを選択しても良い。ステップＳ１７にて、MS2マススペクトルのピークの強度を、内部データベース10に格納する。既に、内部データベース10に、同一の親イオンに対するMS2マススペクトルのピーク情報が格納されている場合には、それに積算する。ステップＳ１８にて、MS2マススペクトルのピーク情報を分析して、アミノ酸配列を同定する。アミノ酸配列の同定は、de novo法によって行う。ステップＳ１９にて、同定されたアミノ酸配列数の総計が５つ以上であるか否かを判定する。
【００３７】
５つ以上のアミノ酸配列が同定されない場合には、ステップＳ２０に進む。ステップＳ２０にて、同一の親イオンに対して、MS2質量分析を再度実行する。尚、この場合、前回のMS2質量分析とは異なる条件にて実行する。例えば、積算回数を増加させてもよいが、解離時間を延ばしてもよい。こうして、解離時間を延ばすことにより、より多くのアミノ酸配列を同定することができる。解離時間を延ばす例は、後に、図５を参照して説明する。ここで、MS1マススペクトルのピークの強度が最大値の２０％まで減少した場合には、別の親イオンに変更して、MS2質量分析を行う。これについては、後に、図７を参照して説明する。
【００３８】
以下、同様に、MS2マススペクトルのピーク情報を、内部データベース10に格納されている同一の親イオンに対するMS2マススペクトルのピーク情報に積算する。これを繰り返すことにより、ステップＳ１９にて、５つ以上のアミノ酸配列が同定される。
【００３９】
５つ以上のアミノ酸配列が同定された場合には、ステップＳ１５に戻り、次の親イオンを選択する。この親イオンに対して、ステップＳ１６からステップＳ１９を繰り返す。こして本例によると、内部データベース10には、ステップＳ１４６に得られたMS2質量分析用の全ての親イオンの各々に対して、少なくとも５つのアミノ酸配列が得られる。従って、総数Ｎｐｉのピークの各々に対して、少なくとも５つのアミノ酸配列が得られる。
【００４０】
図４を参照して本発明によるタンデム型質量分析方法の第１の例の変形例を説明する。ここでは、図３の処理と異なる部分のみを説明する。本例では、ステップＳ１９にて、同定されたアミノ酸配列数の総計が５つ以上であり、且つ、MS2マススペクトルのピークの強度の積算値が所定値より大きいか否かを判定する。
【００４１】
図５Ａ及び図５Ｂを参照して説明する。ここでは、本発明のタンデム型質量分析方法において、図３に示した処理を実時間にて実行することを説明する。
【００４２】
図５Ａは、図３のタンデム型質量分析方法のタイムチャートを示し、縦軸が質量分析部13にて印加される電圧、横軸が時間のグラフである。先ず、時点ｔ１〜ｔ２まで、MS1質量分析を行い、時点ｔ２〜ｔ３までの準備時間ΔＴｐにて、ステップＳ１１からステップＳ１４までの処理を行う。時点ｔ３〜ｔ４まで親イオンＡに対してMS2質量分析を行う。時点Ｔ４〜ｔ５までの準備時間ΔＴｐにて、de novo法を用いて。MS2マススペクトルよりアミノ酸配列を同定する。本例では、少なくとも５つの親アミノ酸配列を同定することができたものとする。時点ｔ５〜ｔ６まで、次の親イオンＢに対してMS2質量分析を行う。
【００４３】
図５Ｂは、図３のタンデム型質量分析方法のタイムチャートを示し、縦軸が質量分析部13にて印加される電圧、横軸が時間のグラフである。先ず、時点ｔ１〜ｔ２まで、MS1質量分析を行い、時点ｔ２〜ｔ３までの準備時間ΔＴｐにて、ステップＳ１１からステップＳ１４までの処理を行う。時点ｔ３〜ｔ４まで親イオンＡに対してMS2質量分析を行う。時点ｔ４〜ｔ５までの準備時間ΔＴｐにて、MS2マススペクトルよりアミノ配列を同定する。本例では、３つの親イオンを同定することができた。即ち、少なくとも５つの親イオンを同定することができなかった。そこで、時点ｔ５〜ｔ６まで、同一の親イオンＡに対してMS2質量分析を繰り返す。この場合、前回のMS2質量分析の場合と比較してより長い解離時間が設定されている。
【００４４】
準備時間ΔＴｐは、例えば、約30msecである。図３に示す一連の処理は、データ処理部15が実行する。データ処理部15における処理を測定の実時間にて実行するためには、上述のように、図３に示す一連の処理を、この準備時間ΔＴｐ内で完了する必要がある。このような高速処理を実現するために、データ処理部15にキャッシュメモリやハードディスクを設けてよく、必要であれば、並列計算機を用いてもよい。本例によると、測定の実時間内に高速de novo法によってMS2マススペクトルからアミノ酸配列を同定し、同定したアミノ酸の数が５個以上か否かを判定する。こうして、微量のペプチドに対しても、タンデム質量分析が可能となる。さらに、高速de novoの処理と運転シーケンスを別々にする方法を採用しても良い。
【００４５】
図６は、内部データベース10に格納されているデータの例を示す。内部データベース10には、同定されたペプチドの質量数 m 、液体クロマトグラフ（LC）の保持時間τ、一定期間毎のMS1マススペクトルのピーク強度、MS2マススペクトルのピークのm,zと強度の積算値、アミノ酸配列とその数、着目するペプチドに関するMS2解離イオンの強度和が格納される。これらのデータは、計測後、自動的に内部データベース10に格納される。これらのデータの内部データベース10への格納処理は、測定の実時間内で実施するのが望ましいが、処理量が多い場合、例えば、タンパク質由来のペプチドの導出などが発生する場合、測定の実時間内で実施しなくても良い。
【００４６】
図７は、MS1マススペクトルのピーク強度の時間変化を示す図であり、縦軸は、MS1マススペクトルのピーク強度、横軸は時間である。上述のように、図３のステップＳ１９にて、MS2マススペクトルから５つ以上のアミノ酸配列を同定することができなかった場合には、図３のステップＳ２０にて、同一の親イオンに対して、MS2質量分析を繰り返す。しかしながら、MS1マススペクトルのピーク強度は、最大値を過ぎると、時間と共に減少する。そこで、MS1マススペクトルのピークの強度が最大値の２０％まで減少した場合には、別の親イオンに変更して、MS2質量分析を行う。
【００４７】
図８及び図９を参照して、本発明のタンデム型質量分析方法の第２の例を説明する。本例のタンデム型質量分析方法は、図３に示した第１の例と比較して、ステップＳ２０の動作が異なり、それ以外は、図３の第１の例と同一であってよい。ステップＳ２０にて、同一の親イオンに対して、MS2質量分析を実行する。このMS2質量分析は、前回のMS2質量分析とは異なる条件にて実行する。本例では、解離電圧を前回のMS2質量分析の場合と比べて、増加させる。例えば、１秒間のみ５０％増加させる。
【００４８】
図９は、図８のタンデム型質量分析方法のタイムチャートを示し、縦軸が質量分析部13にて印加される電圧、横軸が時間のグラフである。本例のタイムチャートは、図５に示した例と比較して、２回目のMS2質量分析が異なり、MS1質量分析及び１回目のMS2質量分析は、図５の例と同一である。１回目のMS2質量分析にて、少なくとも５つの親イオンを同定することができなかった。そこで、時点ｔ５〜ｔ６まで、同一の親イオンＡに対してMS2質量分析を繰り返す。この場合、前回のMS2質量分析の場合と比較してより高い解離電圧が設定されている。例えば、時点ｔ５〜ｔ６のうちの１秒間だけ、解離電圧を５０％増加させる。こうして解離電圧を増加させることにより、より多くのアミノ酸配列を同定することができる。
【００４９】
次に、本発明のタンデム型質量分析方法の第３の例を説明する。上述の第１の例及び第２の例では、ステップＳ１８にて、高速de novo法を用いて、アミノ酸配列の同定を行った。しかしながら、本例では、アミノ酸配列の同定を行う代わりに、MS2マススペクトルと同一のデータが内部データベース10に格納されているか否かを判定する。同一であるか否かは、例えば、一致度を所定の閾値と比較することによって判定してよい。一致度が、所定の閾値以上である場合には、同一であると判定し、所定の閾値未満である場合には、同一でないと判定する。
【００５０】
MS2マススペクトルと同一のデータが内部データベース10に格納されている場合には、ステップＳ１５に戻り、次の親イオンに対して、MS2質量分析を行う。MS2マススペクトルと同一のデータが内部データベース10に格納されていない場合には、ステップＳ２０に進み、同一の親イオンに対して、MS2質量分析を行う。この場合、上述の例のように、積算回数、解離時間、又は、解離電圧のいずれかを増加させてよい。
【００５１】
図１０を参照して、本発明のタンデム型質量分析方法の第４の例を説明する。MS1マススペクトル1001のピークから、MS2質量分析のための親イオンを選択する。この場合、親イオンの質量m又は質量対電荷比m/zは、横軸上にて所定の幅、即ち、質量範囲（マスウインドウ）を有する。この質量範囲に１種類のペプチドしか含まれない場合には、問題は無い。しかしながら、２種類以上のペプチドが含まれる場合には、問題となる。この場合、MS2質量分析によって得られたMS2マススペクトル1002は、２種類以上のペプチドに関するピークを含むことになる。このような場合、MS2マススペクトルからアミノ酸配列を同定するのは困難である。
【００５２】
そこで本例では、de novo法によって、MS2マススペクトル1002から２つ以上のペプチドのアミノ酸配列が読み取れる場合は、次回のMS2質量分析のための親イオンの選択にて、前回とは異なる質量範囲（マスウインドウ）を選択する。それによって、１つの質量範囲（マスウインドウ）に２種類以上のペプチドが含まれる場合であっても、高精度にてアミノ酸配列を同定することができる。
【００５３】
次に、本発明のタンデム型質量分析方法の第５の例を説明する。本例では、血液、尿、痰等の生体試料、糖鎖、修飾付のペプチドに対して、MS1質量分析及びMS2質量分析を行い、得られたデータを内部データベース10に格納する。本例によれば、病変の可能性のあるタンパク質由来のペプチドや、糖鎖を自動的に判定し、詳細に構造解析することが可能となる。
【００５４】
図１１を参照して、本発明のタンデム型質量分析装置の第２の例を説明する。本例のタンデム型質量分析装置は、図１の第１の例と比較して、質量分析部13及びコリジョンセル13Ａの代わりに、イオントラップを備えたイオントラップ型質量分析部20を用いる点が異なる。それ以外の構成は、図１の第１の例と同様であってよい。質量分析部20のイオントラップは、コリジョンセルの機能を有する。そのため、本例では、コリジョンセルを別途設ける必要が無い。イオントラップは、ｎ段（n≧3）のタンデム型分析、即ち、MSn質量分析を行うことができるため、本発明のように、自動的に次の親イオンを判定するシステムは非常に有効である。
【００５５】
図１２を参照して、本発明のタンデム型質量分析装置の第３の例を説明する。本例のタンデム型質量分析装置は、図１の第１の例と比較して、質量分析部13及びコリジョンセル13Ａの代わりに、イオントラップ22、及び、飛行時間型(TOF)質量分析部21を用いる点が異なる。それ以外の構成は、図１の第１の例と同様であってよい。イオントラップ22は、イオンの蓄積、及び、親イオンの選択の機能を有し、更に、コリジョンセルの機能を有する。イオントラップ22からのイオンは、飛行時間型(TOF)質量分析部21TOF部にて高分解能にて質量分析される。
【００５６】
MS2質量分析の場合には、イオントラップ22にて親イオンを選択及び解離し、飛行時間型(TOF)質量分析部21にて、MS2質量分析する。MS1質量分析の場合には、イオン化部12からのイオンは、イオントラップ22を通過し、飛行時間型(TOF)質量分析部21にて、MS1質量分析される。従って、本例によれば、タンデム分析の必要性を自動的に判定できる為、非常に高効率に分析が可能となる。
【００５７】
図１３を参照して、本発明のタンデム型質量分析装置の第４の例を説明する。本例のタンデム型質量分析装置は、図１２の第３の例と比較して、イオントラップ22の代わりにリニアトラップ23を用いる点が異なる。それ以外の構成は、図１２の第３の例と同様であってよい。リニアトラップは、ポール状の四重極電極からなり、四重極電極間に中性ガスが充填される。リニアトラップは、イオンの蓄積、及び、親イオンの選択の機能を有し、更に、コリジョンセルの機能を有する。リニアトラップを用いると、イオンのトラップ率が大幅（約８倍）に向上する。従って、本例によれば、高感度データに基づいて、次の分析内容を決定する為、非常に高精度に、判定を実施することが可能となる。
【００５８】
図１４を参照して、本発明のタンデム型質量分析装置の第５の例を説明する。本例のタンデム型質量分析装置は、図１２の第３の例と比較して、イオントラップ22の代わりに四重極（Ｑポール）24及びコリジョンセル25を用いる点が異なる。それ以外の構成は、図１２の第３の例と同様であってよい。本例の飛行時間型(TOF)質量分析部21では、基本的には、MS2質量分析までしか実施できない。しかし、１回目のMS2質量分析によって得られたMS2マススペクトルのピーク数が不十分でも、別の親イオンに代えることによって（特に質量数が同じで価数が異なるピークに代えることによって）、MS2質量分析を繰り返し実行することができる。また、その必要性の判定を測定の実時間で実施できる為、本実施例の質量分析部で、従来不可能であった、更に解離して分析することが可能となる。
【００５９】
以上のように、本発明によるタンデム型質量分析装置は、リニアトラップ型（ＬＩＴ）、リニアトラップ（ＬＩＴ）−飛行時間型(TOF)、四重極（Ｑポール）−飛行時間型(TOF)、飛行時間(TOF)−飛行時間型(TOF)、Ｏｒｂｉｔａｌ-Trap型の何れかであってよい。
【００６０】
本発明のタンデム型質量分析方法において、分析データの質量補正方法について、説明する。タンパク質のショットガン解析などでは、質量分析結果に基づいて、遺伝子やタンパク質などのデータを格納した外部データベース検索し、生体高分子の化学構造などを最終的に同定する。この場合、分析されたイオンの質量精度が高いほど、高精度かつ効率的に生体高分子の同定を行うことができる。そのため、このような解析には、比較的質量精度の高い飛行時間型（TOF）質量分析計やフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（FTICR）質量分析計を用いる。
【００６１】
ところが、例えば、飛行時間型（TOF）質量分析計の質量精度は、設置されている場所の室温などに影響されることがある。そして、何らかの理由で質量精度が予想外に変動した場合、外部データベースを検索しても、正確に生体高分子を同定できなくなる。
【００６２】
そこで、分析直前に予め検出イオンのm/zが分かっている内部標準物質を分析し、この分析結果に基づき、質量分析計のm/zを校正することがしばしば行われる。しかし、何時間も連続して分析を行う液体クロマトグラフ（LC）型質量分析システムでは、予想外に質量精度が変動する可能性がある。そこで、質量分析で検出されるイオンの中で、質量対電荷比m/zが予め分かっている既知イオンが検出されると、その情報に基づき他の検出イオンの質量対電荷比m/zの補正を行えばよい。
【００６３】
複数の既知イオンが検出されると、補正後の検出イオンの質量対電荷比m/zは非常に高精度となる。この方法の問題点は、分析データを一種のマニュアル操作により補正するため、煩雑性が要求される点である。しかし、内部データベース10に予め検出され得るイオンの質量mや質量対電荷比m/z、液体クロマトグラフ（LC）の保持時間τなどの情報が格納されている場合には、それを用いてMS1質量分析によって検出される既知イオンを同定することができる。
【００６４】
そして、複数の既知イオンを同定することにより、質量対電荷比m/zの時間的な変動も情報処理技術により推測することができ、解析イオンの質量対電荷比m/zを自動的に補正することができる。このことは、質量分析計の質量精度が予想外に変動した場合でも、高い質量精度のデータを容易に取得することができることを意味する。また、このような情報処理技術を有する質量分析計を用いる場合には、必ずしも分析開始前に既知物質を分析する必要がなく、ユーザの負担を低減することができる。このように、内部データベース10の情報は、実時間タンデム質量分析の制御のみならず、分析データの質量対電荷比m/z校正や補正に利用することが実質的に有効である。
【００６５】
以上本発明の例を説明したが本発明は上述の例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲にて様々な変更が可能であることは当業者に容易に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明のタンデム型質量分析システムの第１の例を示す図である。
【図２】本発明によるタンデム型質量分析方法の概念を説明する図である。
【図３】本発明によるタンデム型質量分析方法の第１の例を説明する図である。
【図４】本発明によるタンデム型質量分析方法の第１の例の変形例を説明する図である。
【図５Ａ】本発明によるタンデム型質量分析方法の第１の例において、MS2質量分析を行う場合のタイムチャートを示す図である。
【図５Ｂ】本発明によるタンデム型質量分析方法の第１の例において、MS2質量分析を行う場合のタイムチャートの他の例を示す図である。
【図６】本発明のタンデム型質量分析システムの内部データベースに格納されているデータの例を示す図である。
【図７】MS1マススペクトルのピーク強度の時間変化を示す図である。
【図８】本発明のタンデム型質量分析方法の第２の例を示す図である。
【図９】本発明のタンデム型質量分析方法の第２の例のタイムチャートを示す図である。
【図１０】本発明のタンデム型質量分析方法の第４の例を示す図である。
【図１１】本発明のタンデム型質量分析装置の第２の例を示す図である。
【図１２】本発明のタンデム型質量分析装置の第３の例を示す図である。
【図１３】本発明のタンデム型質量分析装置の第４の例を示す図である。
【図１４】本発明のタンデム型質量分析装置の第５の例を示す図である。
【符号の説明】
【００６７】
10：内部データベース、11：前処理系、12：イオン化部、13：質量分析部、14：イオン検出部、15：データ処理部、16：表示部、17：制御部、18：ユーザ入力部、19：質量分析システム全体、20：イオントラップ型質量分析部、21：飛行時間型質量分析部、22：イオントラップ、23：リニアトラップ、24：四重極（Ｑポール）、25：コリジョンセル、
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2008170346.tif 000015
【図１３】
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【図１４】
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