(57)【要約】【課題】エルゴチオネインを高収量で且つ安全に得ることができるエルゴチオネインの製造方法を提供する。【解決手段】エルゴチオネイン含有のきのこを溶媒中で粉砕しつつ抽出した、前記エルゴチオネインを含有する抽出物を、吸着クロマトグラフィを用いた分画手段によって分画した後、得られた分画液のうち、前記エルゴチオネインを含有する分画液を高速液体クロマトグラフィ装置によって、前記エルゴチオネインを分離し精製することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エルゴチオネイン含有のきのこから溶媒で抽出した、前記エルゴチオネインを含有する抽出物を、吸着クロマトグラフィを用いた分画手段によって分画した後、
得られた分画液のうち、前記エルゴチオネインを含有する分画液を高速液体クロマトグラフィ装置によって、前記エルゴチオネインを分離し精製することを特徴とするエルゴチオネインの製造方法。
【請求項２】
きのことして、人工栽培されたきのこを用いる請求項１記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項３】
きのことして、ヒラタケ科のきのこを用いる請求項１又は請求項２記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項４】
きのことして、タモギタケ、ヒラタケ、エリンギ及びエノキタケから選ばれた一種又は二種以上のきのこを用いる請求項１又は請求項２記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項５】
きのこを粉砕し溶媒で抽出する請求項１〜４の記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項６】
エルゴチオネイン含有のきのこを溶媒中で粉砕しつつ抽出する請求項１〜５のいずれか一項記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項７】
きのこからエルゴチオネインを抽出する溶媒として、水を用いる請求項１〜６のいずれか一項記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項８】
きのこからエルゴチオネインを熱水抽出する請求項１〜４の記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項９】
分画手段として、エルゴチオネインを吸着する吸着能を有するイオン交換樹脂と吸着クロマトグラフィとを用い、前記イオン交換樹脂を用いて分取したエルゴチオネインを含有する分取溶液を、前記吸着クロマトグラフィを用いて更に分画する請求項１〜８のいずれか一項記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項１０】
イオン交換樹脂として、陽イオン交換樹脂を用いる請求項９記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項１１】
吸着クロマトグラフィとして、カラムに粒状の吸着剤が充填されたカラムクロマトグラフィを用いる請求項１〜１０のいずれか一項記載のエルゴチオネインの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエルゴチオネインの製造方法に関し、更に詳細にはエルゴチオネインを低コストで製造し得るエルゴチオネインの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、エルゴチオネインは、その抗酸化特性に注目され、食品用、化粧品用或いは医薬用として注目されつつある。
かかるエルゴチオネインを人間が摂取するには、通常、菌類とマイコバクテリアによって生合成されたエルゴチオネインを、根から吸収した植物を食することによって可能である。
しかし、植物中に存するエルゴチオネインは極めて少量であるため、充分な量のエルゴチオネインを摂取するには、極めて大量の植物を食しなければならない。
このため、エルゴチオネインを大量に製造すべく、エルゴチオネインの製造方法として、化学合成法（下記特許文献１参照）や発酵法（下記特許文献２参照）が提案されている。
【特許文献１】特表平８−５０１５７５号公報
【特許文献２】特公昭４３−２０７１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このエルゴチオネインの製造方法としての化学合成法や発酵法によれば、植物を食することなくエルゴチオネインを摂取可能にできる。
しかしながら、化学合成法によれば、その工程が複雑となるため、得られるエルゴチオネインの製造コストが極めて高額となる。しかも、化学合成法では、その工程で種々の薬品を用いるため、得られたエルゴチオネインは、体内に直接摂取することのない化粧品用として用いることができるものの、食品用や医薬用としては安全面から問題がある。
一方、発酵法では、菌類を用いてエルゴチオネインを製造しており、化学合成法に比較して、安全面では優れているが、その収量が少ないため、得られるエルゴチオネインの製造コストは依然として極めて高額である。
そこで、本発明の課題は、エルゴチオネインを高収量で且つ安全に得ることができるエルゴチオネインの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者等は、前記課題を解決すべく検討したところ、タモギダケ等のきのこは、エルゴチオネインを多量に含有していることを知り、かかるきのこを原料とすることによって、エルゴチオネインを大量に且つ安価に得ることができるものと考え検討を重ねた結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、エルゴチオネイン含有のきのこから溶媒で抽出した、前記エルゴチオネインを含有する抽出物を、吸着クロマトグラフィーを用いた分画手段によって分画した後、得られた分画液のうち、前記エルゴチオネインを含有する分画液を高速液体クロマトグラフィー装置によって、前記エルゴチオネインを分離し精製することを特徴とするエルゴチオネインの製造方法にある。
かかる本発明において、きのことして、人工栽培されたきのこを用いることによって、更にエルゴチオネインの製造コストを安価にできる。
このきのことしては、エルゴチオネインの含有量の多いヒラタケ科のきのこを好適に用いることができ、特にタモギタケ、ヒラタケ、エリンギ及びエノキタケから選ばれた一種又は二種以上のきのこを好適に用いることができる。
【０００５】
かかるきのこを粉砕し溶媒で抽出すること、特に溶媒中で粉砕しつつ抽出することによって、きのこの細胞中に存するエルゴチオネインを効果的に溶媒中に抽出できる。この溶媒としては、安全面から水を用いることが好ましい。
また、きのこからエルゴチオネインを熱水抽出することによって、きのこの粉砕等を省略でき、エルゴチオネインの製造工程を簡素化できる。
本発明の分画手段には、エルゴチオネインを吸着する吸着能を有するイオン交換樹脂と吸着クロマトグラフィーとを併用できる。イオン交換樹脂を用いた場合には、アミノ酸等のイオン性化合物を分離できない。このため、分取したエルゴチオネインを含有する分取溶液を、吸着クロマトグラフィーを用いて更に分画することによって、エルゴチオネインを更に濃縮できる。このイオン交換樹脂としては、陽イオン交換樹脂を好適に用いることができる。
また、吸着クロマトグラフィーとしては、カラムに粒状の吸着剤が充填されたカラムクロマトグラフィーを好適に用いることができる。
尚、本発明において言う「きのこ」とは、茎部分と傘部分とから成る子実体は勿論のこと、石槌部分も含む。
【発明の効果】
【０００６】
本発明に係るエルゴチオネインの製造方法は、原料としてエルゴチオネイン含有のきのこを用いて、エルゴチオネインを抽出、濃縮及び精製するものである。このため、エルゴチオネインの製造コストの大幅な低減を図ることができる。更に、きのことして、人工栽培されたきのこを用いた場合には、更に一層のエルゴチオネインの製造コストの低減を図ることができる。
また、抽出等に用いる溶媒として、水やエチルアルコールを用いた場合、或いはきのこからエルゴチオネインを熱水抽出した場合には、得られるエルゴチオネインを食品添加用として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明においては、原料としてエルゴチオネイン含有のきのこを用いる。かかるきのことしては、人工栽培されたきのこを用いることによって、原料としてのきのこを安定して入手でき且つ最終的に得られるエルゴチオネインの製造コストの低減を更に一層図ることができる。
きのこの種類としては、ヒラタケ科のきのこには、エルゴチオネインの含有量が多く好ましい。特に、エルゴチオネインの含有量が多く且つ人工栽培されており入手が容易なきのことしては、タモギタケ、ヒラタケ、エリンギ及びエノキタケから選ばれた一種又は二種以上のきのこを好適に用いることができる。
尚、かかる「きのこ」としては、茎部分と傘部分とから成る子実体は勿論のこと、石槌部分も含む。
【０００８】
本発明では、エルゴチオネイン含有のきのこを溶媒によってエルゴチオネインを抽出する。この抽出は、きのこを粉砕し溶媒で抽出すること、特にきのこの粉砕を溶媒中で行い、きのこを粉砕しつつ抽出することが、きのこからエルゴチオネインを短時間で且つ充分に抽出でき好ましい。この粉砕は、市販の粉砕機で行うことができる。
かかる溶媒としては、きのこ中のエルゴチオネインを抽出できる溶媒、例えはアセトンでも用いることができるが、人体に摂取しても問題のない溶媒、例えば水やエチルアルコールが好ましい。特に、溶媒として水を用いた場合には、例え溶媒を人体に摂取しても問題ないことは勿論のことであるが、使用済の溶媒も容易に廃棄できる。
きのこを粉砕し溶媒で抽出した場合には、きのこの粉砕物と溶媒とから成るスラリーから、エルゴチオネインを抽出した抽出液を固形分と分離する。かかる分離操作では、スラリーをろ紙等のろ材を用いて吸引ろ過した後、ろ液にエタノール等のアルコール溶液を添加し静置して沈殿物を沈殿させた後、沈殿物と液体とをろ紙等のろ材を用いて吸引ろ過して分離した抽出液を得る。或いは、スラリーをろ紙等のろ材を用いて吸引ろ過した後、ろ液を凍結乾燥してもよい。
この様に、エルゴチオネイン含有のきのこをスラリー状とするには、きのこを粉砕してスラリー化することを要する。
この点、エルゴチオネイン含有のきのこからのエルゴチオネインの抽出を熱水抽出で行うことによって、きのこをスラリー化することなく行うことができる。かかる熱水抽出によれば、手で千切ったきのこを熱水中で保持することによって、エルゴチオネインを抽出できる。このため、きのこの粉砕及びスラリー化等の工程を省略でき且つエルゴチオネイン含有の抽出液のろ過等を容易に行うことができる。
【０００９】
この様にして得られた抽出物を、吸着クロマトグラフィーを用いた分画手段によって分画する。この吸着クロマトグラフィーとしては、カラムに粒状の吸着剤が充填されたカラムクロマトグラフィーを好適に用いることができる。
更に、かかるカラムクロマトグラフィーによって分画された複数の分画液について、ゲル状の吸着剤が薄層に形成された薄層クロマトグラフィーを用いて検査し、エルゴチオネインを含有する分画液を集める。この様に、エルゴチオネインを含有する分画液を集めることによって、その後の処理を効率的に施すことができる。
このカラムクロマトグラフィーでは、アルミナ等の粒状の吸着剤に、分離操作で分離した抽出物を付着させた後、吸着剤をカラムに充填してエタノール−水で展開し、溶出液をフリクションコレクターで分画する。
また、薄層クロマトグラフィーでは、シリカゲル等のゲル状の吸着剤から成る薄層に、複数の分画液をスポット状に滴下し、メターノール−水で展開する。スポットの移動距離を溶媒の移動距離で割ったRf値が０．２７で且つＵＶ（２５４ｎｍ）でクエンチングを示す成分を含む分画液を集める。かかる分画液中には、エルゴチオネインを含有している。
【００１０】
ところで、エルゴチオネインは、両性イオン構造を有するため、分離操作で分離したエルゴチオネイン含有の抽出液をイオン交換樹脂に通液することによって、エルゴチオネインを糖類等の非イオン性化合物から分離できる。但し、アミノ酸等のイオン性化合物は、イオン交換樹脂に吸着され易く、イオン交換樹脂のみでは、エルゴチオネインをアミノ酸等のイオン性化合物と分離できない。
このため、エルゴチオネイン含有の抽出液を分画する分画手段としては、イオン交換樹脂と吸着クロマトグラフィーとを併用した分画手段を採用できる。このイオン交換樹脂としては、陽イオン交換樹脂を好適に用いることができる。
かかる分画手段では、分離操作で分離したエルゴチオネイン含有の抽出液をイオン交換に通液し、複数の分取液を分取する。この際に、エルゴチオネイン含有の抽出液をイオン交換樹脂に付着させた後、アンモニア希釈液を通液して、イオン交換樹脂に付着していたエルゴチオネインを溶出させて分取する。分取した複数の分取液については、ゲル状の吸着剤が薄層に形成された薄層クロマトグラフィーを用いて検査し、エルゴチオネインを含有する分取液を集める。
【００１１】
集めた分取液は、必要に応じて塩酸等の酸を用いて中和した後、塩化アンモニウム等の塩や不純物を除去すべく、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを用いて複数の分画液に分画してもよい。この場合も、ゲル状の吸着剤が薄層に形成された薄層クロマトグラフィーを用いて検査し、エルゴチオネインを含有する分取液を集める。
集められたエルゴチオネインを含有する分取液は、吸着クロマトグラフィーを用いて複数の分画液に分画する。この吸着クロマトグラフィーは、カラムに粒状の吸着剤が充填されたカラムクロマトグラフィーを好適に用いることができる。
更に、かかるカラムクロマトグラフィーによって分画された複数の分画液についても、ゲル状の吸着剤が薄層に形成された薄層クロマトグラフィーを用いて検査し、エルゴチオネインを含有する分画液を集める。
【００１２】
この様に、集められたルゴチオネインを含有する分画液を、減圧下で濃縮して得た濃縮残渣を水に溶解させた後、不溶性成分を除去して得た溶液を高速液体クロマトグラフィー装置に供給し、エルゴチオネインを分離精製する。
この高速液体クロマトグラフィー装置では、カラムに充填される固定相としては、トリアコンチル基（Ｃ３０）を主成分とするアルキル鎖を有する固定相を用いている。
かかるカラムから流出する流出液については、検出器として設けられているＵＶ検出器によって、波長２５８ｎｍの紫外線を吸収するピークを検出し、所定時間に出現する所定ピークを分取する。
得られた分取液は、凍結乾燥して粉末状とする。この粉末について、ＮＭＲで測定した１Ｈスペクトルは、エルゴチオネインの１Ｈスペクトルと同一スペクトルであり、得られた粉末はエルゴチオネインであった。
【００１３】
以上、説明してきた本発明に係るエルゴチオネインの製造方法では、原料として用いるきのこに含まれているエルゴチオネインを、容易に抽出、濃縮及び精製できる。このため、エルゴチオネインの製造コストを、合成法や発酵法に比較して大幅に低減できる。
また、抽出液や展開液を水や水―エタノールを用いることができ、人体に対して安全で且つ処理済液の処理も容易である。
更に、人工栽培のきのこを原料に用いることができ、きのこの消費量が低下して生産調整がされる夏場でも安定してきのこを栽培できる。このため、きのこの人工栽培を年間を通して安定して行うことができる。
【実施例１】
【００１４】
タモギタケ子実体（新鮮重５００ｇ）を細片化してブレンダーに入れた後、蒸留水（１．５リットル）を加えて１〜２分間ブレンドし、粥状のスラリーとする。
得られたスラリーを、ハイフロスーパーセルをろ過助材に用い、ろ紙を用いて吸引ろ過する。得られたろ液は、２．３倍量のエタノールを添加して一夜静置した後、ハイフロスーパーセルをろ過助材に用い、ろ紙を用いて吸引ろ過する。
得られたろ液（５．３リットル）を、アルミナカラムに通す。このアルミナカラムは、アルミナ５００ｇ［Alminium oxide90 active neutral(Merck)］をカラム（内径50ｍｍ,高さ210mm）に充填したものである。
【００１５】
アルミナカラムの通過液を減圧下で濃縮して得られた濃縮物（４ｇ）を、カラムクロマトグラフィーによって分画する。このカラムクロマトグラフィーに用いたカラムは、アルミナ80ｇ［Alminium oxide90 active neutral(Merck)］をカラム（内径24ｍｍ,高さ200mm）に充填したものである。かかるアルミナには、得られた濃縮物を付着し、エタノール−水（体積比７：３）で溶出して、フラクションコレクターで分画した。
得られた複数の分画液を、シリカゲルの薄層クロマトグラフィー[ＴＬＣ；alminium sheet,silica gel 60 F254(Merck)］によって検査する。この薄層クロマトグラフィーでは、メタノール−水（６：１）で展開し、Rf値（スポットの移動距離を溶媒の移動距離で割った値）が０．２７で且つＵＶ（２５４ｎｍ）でクエンチングを示す成分を含む分画液を集める。集めた分画液を減圧下で濃縮し、濃縮残渣１．４ｇを得た。
【００１６】
得られた濃縮残渣（１．４ｇ）を水（３ｍｌ）に溶解した後、この溶解液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供給した。かかる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）では、ガードカラム（２０×５０ｍｍ）付のカラム［Develosil C30-UG-5(20×２５０ｍｍ)］に溶出液としての水を供給し、カラムからの流出液の流速を５ｍｌ／minに調整した。カラムからの流出液については、ＵＶ検出器によって波長２５８ｎｍの紫外線を吸収するピークを検出した。波長２５８ｎｍの紫外線を吸収するピークを図１に示す。図１において、横軸には、カラムからの流出液の流出開始からの経時（リテンションタイム）を示す。
本実施例では、リテンションタイム２２〜２４分に出現する吸収ピークの成分を分取した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分取した分画液を凍結乾燥して、１００ｍｇの白色粉末を得た。
この白色粉末について、ＮＭＲによって１Ｈスペクトルを測定した。その測定の結果を図２に示す。この図２に示す１Ｈのスペクトルは、エルゴチオネインについてＮＭＲで測定した図３に示す１Ｈスペクトルと同一である。
従って、得られた白色粉末は、エルゴチオネインである。
【実施例２】
【００１７】
実施例１において、カラムクロマトグラフィーによって分画した分画液のうち、実施例１で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付した分画液に隣接する分画液を、実施例１と同様にして処理した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、リテンションタイム２２〜２４分に出現する吸収ピークの成分を分取した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分取した分画液を凍結乾燥して、５０ｍｇの白色粉末を得た。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のカラムからの流出液について、波長２５８ｎｍの紫外線を吸収するピークを図４に示す。
【実施例３】
【００１８】
エノキタケ子実体（新鮮重１１０ｇ）をブレンダーに入れた後、蒸留水（３３０ｍｌ）を加えて１〜２分間ブレンドし、粥状のスラリーとする。
得られたスラリーを、ハイフロスーパーセルをろ過助材に用い、ろ紙を用いて吸引ろ過する。得られたろ液を凍結乾燥させて、水抽出物（７．４ｇ）を得た。
得られた水抽出物を、カラムクロマトグラフィーによって分画する。このカラムクロマトグラフィーに用いたカラムは、アルミナ100ｇ［Alminium oxide90 active neutral(Merck)］をカラム（内径24ｍｍ,高さ200mm）に充填したものである。かかるアルミナには、得られた水抽出物を付着し、エタノール−水（体積比７：３）で溶出して、フラクションコレクターで分画した。
得られた複数の分画液について、シリカゲルの薄層クロマトグラフィー[ＴＬＣ；alminium sheet,silica gel 60 F254(Merck)］によって検査する。この薄層クロマトグラフィーでは、メタノール−水（６：１）で展開し、Rf値（スポットの移動距離を溶媒の移動距離で割った値）が０．２７で且つＵＶ（２５４ｎｍ）でクエンチングを示す成分を含む分画液を集める。集めた分画液を減圧下で濃縮し、濃縮残渣１．７ｇを得た。
【００１９】
得られた濃縮残渣（１．７ｇ）を水（３ｍｌ）に溶解した後、セルロースアセテート（Cellulose Acetate 0.45mm:Advantec）のフィルタでシリンジを用いてろ過して、不溶成分を除去する。
次いで、得られたろ液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供給した。かかる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）では、ガードカラム（２０×５０ｍｍ）付のカラム［Develosil C30-UG-5(20×２５０ｍｍ)］に溶出液としての水を供給し、カラムからの流出液の流速を５ｍｌ／minに調整した。カラムからの流出液については、ＵＶ検出器によって波長２５８ｎｍの紫外線を吸収するピークを検出した。波長２５８ｎｍの紫外線を吸収するピークを図５に示す。図５において、横軸には、カラムからの流出液の流出開始からの経時（リテンションタイム）を示す。
本実施例では、リテンションタイム２２〜２４分に出現する吸収ピークの成分を分取した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分取した分画液を凍結乾燥して、１２ｍｇの白色粉末を得た。
この白色粉末について、ＮＭＲによって１Ｈスペクトルを測定した。その測定の結果を図６に示す。この図６に示す１Ｈのスペクトルは、エルゴチオネインについてＮＭＲで測定した図３に示す１Ｈスペクトルと同一である。
従って、得られた白色粉末は、エルゴチオネインである。
【実施例４】
【００２０】
エリンギ子実体（新鮮重１０５ｇ）をブレンダーに入れた後、蒸留水（３００ｍｌ）を加えて１〜２分間ブレンドし、粥状のスラリーとする。
得られたスラリーを、ハイフロスーパーセルをろ過助材に用い、ろ紙を用いて吸引ろ過する。得られたろ液を凍結乾燥させて、水抽出物（５．６ｇ）を得た。
得られた水抽出物を、カラムクロマトグラフィーによって分画する。このカラムクロマトグラフィーに用いたカラムは、アルミナ100ｇ［Alminium oxide90 active neutral(Merck)］をカラム（内径24ｍｍ,高さ240mm）に充填したものである。かかるアルミナには、得られた水抽出物を付着し、エタノール−水（体積比７：３）で溶出して、フラクションコレクターで分画した。
得られた複数の分画液について、シリカゲルの薄層クロマトグラフィー[ＴＬＣ；alminium sheet,silica gel 60 F254(Merck)］によって検査する。この薄層クロマトグラフィーでは、メタノール−水（６：１）で展開し、Rf値（スポットの移動距離を溶媒の移動距離で割った値）が０．２７で且つＵＶ（２５４ｎｍ）でクエンチングを示す成分を含む分画液を集める。集めた分画液を減圧下で濃縮し、濃縮残渣０．２ｇを得た。
【００２１】
得られた濃縮残渣（０．２ｇ）を水（２ｍｌ）に溶解した後、セルロースアセテート（Cellulose Acetate 0.45mm:Advantec）のフィルタでシリンジを用いてろ過して、不溶成分を除去する。
次いで、得られたろ液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供給した。かかる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）では、ガードカラム（２０×５０ｍｍ）付のカラム［Develosil C30-UG-5(20×２５０ｍｍ)］に溶出液としての水を供給し、カラムからの流出液の流速を５ｍｌ／minに調整した。カラムからの流出液については、ＵＶ検出器によって波長２５８ｎｍの紫外線を吸収するピークを検出した。波長２５８ｎｍの紫外線を吸収するピークを図７に示す。図７において、横軸には、カラムからの流出液の流出開始からの経時（リテンションタイム）を示す。
本実施例では、リテンションタイム２２〜２４分に出現する吸収ピークの成分を分取した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分取した分画液を凍結乾燥して、９ｍｇの白色粉末を得た。
この白色粉末について、ＮＭＲによって１Ｈスペクトルを測定した。その測定の結果を図８に示す。この図８に示す１Ｈスペクトルは、エルゴチオネインについてＮＭＲで測定した図３に示す１Ｈスペクトルと同一である。
従って、得られた白色粉末は、エルゴチオネインである。
【実施例５】
【００２２】
ヒラタケ子実体（新鮮重８９ｇ）をブレンダーに入れた後、蒸留水（２７０ｍｌ）を加えて１〜２分間ブレンドし、粥状のスラリーとする。
得られたスラリーを、ハイフロスーパーセルをろ過助材に用い、ろ紙を用いて吸引ろ過する。得られたろ液を凍結乾燥させて、水抽出物（６ｇ）を得た。
得られた水抽出物を、カラムクロマトグラフィーによって分画する。このカラムクロマトグラフィーに用いたカラムは、アルミナ100ｇ［Alminium oxide90 active neutral(Merck)］をカラム（内径24ｍｍ,高さ240mm）に充填したものである。かかるアルミナには、得られた水抽出物を付着し、エタノール−水（体積比７：３）で溶出して、フラクションコレクターで分画した。
得られた複数の分画液を、シリカゲルの薄層クロマトグラフィー[ＴＬＣ；alminium sheet,silica gel 60 F254(Merck)］によって検査する。この薄層クロマトグラフィーでは、メタノール−水（６：１）で展開し、Rf値（スポットの移動距離を溶媒の移動距離で割った値）が０．２７で且つＵＶ（２５４ｎｍ）でクエンチングを示す成分を含む分画液を集める。集めた分画液を減圧下で濃縮し、濃縮残渣０．３ｇを得た。
【００２３】
得られた濃縮残渣（０．３ｇ）を水（２ｍｌ）に溶解した後、セルロースアセテート（Cellulose Acetate 0.45mm:Advantec）のフィルタでシリンジを用いてろ過して、不溶成分を除去する。
次いで、得られたろ液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供給した。かかる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）では、ガードカラム（２０×５０ｍｍ）付のカラム［Develosil C30-UG-5(20×２５０ｍｍ)］に溶出液としての水を供給し、カラムからの流出液の流速を５ｍｌ／minに調整した。カラムからの流出液については、ＵＶ検出器によって波長２５８ｎｍの紫外線を吸収するピークを検出した。波長２５８ｎｍの紫外線を吸収するピークを図９に示す。図９において、横軸には、カラムからの流出液の流出開始からの経時（リテンションタイム）を示す。
本実施例では、リテンションタイム２２〜２４分に出現する吸収ピークの成分を分取した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分取した分画液を凍結乾燥して、３０ｍｇの白色粉末を得た。
この白色粉末について、ＮＭＲによって１Ｈスペクトルを測定した。その測定の結果を図１０に示す。この図１０に示す１Ｈスペクトルは、エルゴチオネインについてＮＭＲで測定した図３に示す１Ｈスペクトルと同一である。
従って、得られた白色粉末は、エルゴチオネインである。
【実施例６】
【００２４】
タモギタケ子実体（新鮮重５ｋｇ）をアセトン（１５リットル）中に１週間浸漬して抽出した後、タモギタケ子実体を除去した抽出液を濃縮して約３リットルとした。この濃縮液に酢酸エチルを加えて分配抽出し、水層（２．２リットル）を分離して濃縮（１．７リットル）に濃縮した。濃縮液のうち、１．４リットルを凍結乾燥して固体（６５．７９ｇ）を得た。
更に、得られた固体の一部（３７．５３ｇ）をカラムクロマトグラフィーによって分画する。このカラムクロマトグラフィーに用いたカラムとしては、Sephadex G-10(内径４．０ｍｍ，高さ５０ｍｍ)のものを用い、エタノール−水（体積比７：３）で溶出して、フラクションコレクターで分画した。
次いで、得られた分画液のうち、波長２５４ｎｍの紫外線の吸収が最も高い分画液を減圧濃縮して濃縮液（７２．５ｍｇ）とし、濃縮液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供給した。かかる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）では、ガードカラム（２０×５０ｍｍ）付のカラム［Develosil C30-UG-5(20×２５０ｍｍ)］に溶出液としての水を供給し、カラムからの流出液の流速を５ｍｌ／minに調整した。カラムからの流出液については、ＵＶ検出器によって波長２５８ｎｍの紫外線を吸収するピークを検出した。
本実施例では、リテンションタイム１８〜２１分に出現する吸収ピークの成分を分取した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分取した分画液を凍結乾燥して、44.2ｍｇの白色粉末を得た。
この白色粉末について、ＮＭＲによって１Ｈスペクトルを測定したところ、エルゴチオネインについてＮＭＲで測定した図３に示す１Ｈスペクトルと同一である。
従って、得られた白色粉末は、エルゴチオネインである。
【実施例７】
【００２５】
タモギタケ子実体（新鮮重１ｋｇ）を５回に分けてブレンダー処理を施した。一回のブレンダー処理では、ブレンダーにタモギタケ子実体２００ｇに対し、アセトン２００ｍｌと蒸留水２００ｍｌとを加えて粥状のスラリーとした。
５回のブレンダー処理を施したスラリーを集めて、ハイフロスーパーセルをろ過助材に用い、ろ紙を用いて吸引ろ過して２リットルのろ液を得た。得られたろ液を減圧下で濃縮し、凍結乾燥させて凍結乾燥抽出物（４０ｇ）を得た。
この凍結乾燥抽出物を蒸留水１００ｍｌで再度溶解させ、陽イオン交換樹脂（Amberlite IR120B H+形）を充填したカラム（直径４５ｍｍ×高さ４１０ｍｍ）に通液し、陽イオン交換樹脂に溶液中の陽イオンを吸着させた。更に、このカラムは蒸留水１リットルで洗浄した。
次いで、１／５に希釈したアンモニア水（１．５リットル）でカラムに充填されたイオン交換樹脂を洗浄し、イオン交換樹脂に吸着されている陽イオン性化合物を溶出した。カラムの下端側から流出する溶出液を３００ｍｌずつ分取した（合計３個の分取液を採取した）。
【００２６】
得た分取液について、シリカゲルの薄層クロマトグラフィー[ＴＬＣ；alminium sheet,silica gel 60 F254(Merck)］によって検査する。この薄層クロマトグラフィーでは、メタノール−水（６：１）で展開した。かかる薄層クロマトグラフィーを用いた検査では、Rf値（スポットの移動距離を溶媒の移動距離で割った値）が０．２７で且つＵＶ（２５４ｎｍ）でクエンチングを示す成分を含む分取液を、エルゴチオネインを含有する分画液であるとして集めた。
集めた分取液を６Ｎ塩酸で中和した後、塩化アンモニウム及びその他の不純物を除去すべく、セファデックスＧ−１０を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィー（直径６５ｍｍ×高さ３８０ｍｍ）を用いた。このゲルろ過カラムクロマトグラフィーでは、水を溶出液として用いた。ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによって分画した分画液についても、薄層クロマトグラフィーを用いた検査によって、Rf値が０．２７で且つＵＶ（２５４ｎｍ）でクエンチングを示す成分を含む分画液を集めた。集めた分画液を凍結乾燥させて凍結乾燥物（９．５ｇ）を得た。
【００２７】
得た凍結乾燥物をカラムクロマトグラフィーによって分画する。このカラムクロマトグラフィーに用いたカラムは、アルミナ２００ｇ［Alminium oxide90 active neutral(Merck)］をカラム（内径４０ｍｍ、高さ１７５mm）に充填したものである。かかるアルミナには、得た凍結乾燥物を少量の水に溶解して付着している。
かかるカラムクロマトグラフィーでは、エタノール−水（体積比７：３）を溶出液としてカラムに注ぎ分画した。得られた分画液についても、薄層クロマトグラフィーを用いた検査によって、Rf値が０．２７で且つＵＶ（２５４ｎｍ）でクエンチングを示す成分を含む分画液を集めた。集めた分画液を凍結乾燥させて凍結乾燥物（０．５ｇ）を得た。
【００２８】
得た凍結乾燥物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供給した。かかる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）では、ガードカラム（２０×５０ｍｍ）付のカラム［Develosil C30-UG-5(20×２５０ｍｍ)］に溶出液としての水を供給し、カラムからの流出液の流速を５ｍｌ／minに調整した。カラムからの流出液については、ＵＶ検出器によって波長２５８ｎｍの紫外線を吸収するピークを検出した。かかる紫外線吸収の経時変化を図１１に示す。
本実施例では、経時（リテンションタイム）２２〜２４分に出現する吸収ピークの成分を分取した。この分取した分画液を凍結乾燥したところ、９８ｍｇの白色粉末を得た。
得られた白色粉末について、ＮＭＲによって１Ｈスペクトルを測定したところ、エルゴチオネインについてＮＭＲで測定した１Ｈスペクトルと同一である。従って、得られた白色粉末は、エルゴチオネインである。
【実施例８】
【００２９】
タモギタケ子実体（新鮮重１．９ｋｇ）を適当な大きさに手で千切って容器に入れ、更に水８リットルを容器に加え、落し蓋をして１０分間沸騰して第１回目の抽出を行った。この第1回目の抽出を終了してから容器を放冷し、布製袋を用いてろ過を行った。
布製袋中にろ過されたタモギタケ子実体を再度容器に入れ、更に水３リットルを容器に加え、落し蓋をして１０分間沸騰して第２回目の抽出を行った。この第２回目の抽出を終了してから容器を放冷し、第１回面のろ過に用いた布製袋を用いて第２回目のろ過を行った。
第１回目及び第２回目の各ろ過で得たろ液中のエルゴチオネインの含有量について高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。
【００３０】
かかる測定は、先ず、ろ液中の脂溶性成分を除去すべく、各ろ液から採取した１ｍｌをSep-Pak（商標） Plus C18カートリッジ(Waters)を通過させた。
次いで、脂溶性成分を除去した溶液中のエルゴチオネインの含有量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供した。この高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、ガードカラム（４．６×１０ｍｍ）付のカラム［Develosil C30-UG-5(4.6×250ｍｍ)］に溶出液としての水を供給し、カラムからの流出液の流速を０．８ｍｌ／minに調整した。カラムからの流出液については、ＵＶ検出器によって波長２５８ｎｍの紫外線を吸収するピークを検出した。かかる紫外線吸収の経時変化を図１２に示す。図１２に示す経時変化は、第1回目のろ液についてのものであり、経時（リテンションタイム）６．９〜７．０分に出現する吸収ピークＥがエルゴチオネインの吸収ピークである。
また、第２回目のろ液についても、同様に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供したところ、図１２と同様な位置に吸収ピークＥが出現した。
尚、吸収ピークＥの成分がエルゴチオネインの吸収ピークであることは、予めエルゴチオネインのみを溶解した溶液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、吸収ピークＥの位置にエルゴチオネインの吸収ピークが出現することを確認している。
【００３１】
この様に、第１回目及び第２回目の各ろ過で得たろ液中のエルゴチオネインが含有されている。
このため、これらのろ液についても、実施例１で用いた吸着クロマトグラフィーとしてのアルミナカラムを採用した分画手段による分画処理、或いは実施例７で用いたイオン交換樹脂としての陽イオン交換樹脂と吸着クロマトグラフィーとしてのアルミナカラムとを併用した分画手段による分画処理を施した後、更に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってエルゴチオネインを分離・精製できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】タモギダケ子実体から抽出した抽出液を吸着クロマトグラフィーとしてのアルミナカラムを用いて得た分画液を、高速液体クロマトグラフィーに供給したとき、カラムから流出する流出液のＵＶ吸収状況を示すチャートである。
【図２】図１に示す高速液体クロマトグラフィーで分取した分取液を凍結乾燥して得た白色粉末についてのＮＭＲによって測定した１Ｈスペクトルである。
【図３】エルゴチオネインについてＮＭＲで測定した１Ｈスペクトルである。
【図４】タモギダケ子実体から抽出した他の抽出液を吸着クロマトグラフィーとしてのアルミナカラムを用いて得た分画液を、高速液体クロマトグラフィーに供給したとき、カラムから流出する流出液のＵＶ吸収状況を示すチャートである。
【図５】エノキタケ子実体から抽出した他の抽出液を吸着クロマトグラフィーとしてのアルミナカラムを用いて得た分画液を、高速液体クロマトグラフィーに供給したとき、カラムから流出する流出液のＵＶ吸収状況を示すチャートである。
【図６】図５に示す高速液体クロマトグラフィーで分取した分取液を凍結乾燥して得た白色粉末についてのＮＭＲによって測定した１Ｈスペクトルである。
【図７】エリンギ子実体から抽出した他の抽出液を吸着クロマトグラフィーとしてのアルミナカラムを用いて得た分画液を、高速液体クロマトグラフィーに供給したとき、カラムから流出する流出液のＵＶ吸収状況を示すチャートである。
【図８】図７に示す高速液体クロマトグラフィーで分取した分取液を凍結乾燥して得た白色粉末についてのＮＭＲによって測定した１Ｈスペクトルである。
【図９】ヒラタケ子実体から抽出した他の抽出液を吸着クロマトグラフィーとしてのアルミナカラムを用いて得た分画液を、高速液体クロマトグラフィーに供給したとき、カラムから流出する流出液のＵＶ吸収状況を示すチャートである。
【図１０】図９に示す高速液体クロマトグラフィーで分取した分取液を凍結乾燥して得た白色粉末についてのＮＭＲによって測定した１Ｈスペクトルである。
【図１１】イオン交換樹脂としての陽イオン交換樹脂と吸着クロマトグラフィーとしてのアルミナカラムとを併用した分画手段を用いて得た分画液を高速液体クロマトグラフィーに供給したとき、カラムから流出する流出液のＵＶ吸収状況を示すチャートである。
【図１２】タモギダケ子実体に熱水抽出を施して得らた抽出液を高速液体クロマトグラフィーに供給したとき、カラムから流出する流出液のＵＶ吸収状況を示すチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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