(57)【要約】      （修正有）【課題】塩基対の長い標識核酸産物を効率良く得る、また標識核酸の生成を増加させるための手段を提供する。【解決手段】核酸の標識反応において、ＤＮＡ組換え修復に関与する蛋白質（１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質、Ｔ４ファージ遺伝子３２、４１、４４、４５、または６１蛋白質、複製蛋白質Ａ、放射線Ａ蛋白質）を一種以上用いることにより、塩基対の長い標識核酸産物を効率良く得ると共に、標識核酸の生成を増加させる方法。標識反応には、ランダムプライマー法、またはＰＣＲ法のいずれかを用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の標識反応中に、ＤＮＡ組換え修復に関与する蛋白質を１種類以上添加することにより、塩基対の長い標識核酸産物を得るための標識方法。
【請求項２】
核酸の標識反応中に、ＤＮＡ組換え修復に関与する蛋白質を１種類以上添加することにより、標識核酸の生成を増加させる標識方法。
【請求項３】
前記蛋白質が、１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質［Ｓｉｎｇｌｅ‐ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＳＢ）］、Ｔ４ファージ遺伝子３２、４１、４４、４５、または６１蛋白質（Ｔ４  Ｇｅｎｅ  ３２、４１、４４、４５、または６１  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、複製蛋白質Ａ［Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＲＰＡ）］、放射線Ａ蛋白質［Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ａ  （ＲａｄＡ）］のいずれかである、請求項１または２に記載の標識方法。
【請求項４】
前記標識反応が、ランダムプライマー法、またはＰＣＲ法のいずれかである、請求項１〜３のいずれかに記載の標識方法。
【請求項５】
核酸を標識するための化合物が、蛍光色素化合物、核酸類似化合物、およびラジオアイソトープ含有化合物のすべてないしいずれかである、請求項１〜４のいずれかに記載の標識方法。
【請求項６】
標識反応に用いる酵素が、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１〜５のいずれかに記載の標識方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ組換え修復が、相同組換え修復である、請求項１〜６のいずれかに記載の標識方法。
【請求項８】
標識核酸産物の長さが、少なくとも５００ｂｐから６０００ｂｐ以上である請求項１〜７のいずれかに記載の標識方法。
【請求項９】
前記標識反応は、反応液中で１本鎖核酸を生成するステップを含み、その反応液へＤＮＡ組換え修復に関与する蛋白質、ＤＮＡポリメラーゼ、ランダムプライマー、ｄＮＴＰを添加し、等温でおこなう、請求項１〜８のいずれかに記載の標識方法。
【請求項１０】
標識核酸を調製するために使用されるキットであって、少なくとも１つ以上のＤＮＡ組換え修復に関与する蛋白質を含有することを特徴とする標識核酸調製用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩基対の長い標識核酸産物を効率良く得ること、また、標識核酸の生成を増加させることに関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
重要な遺伝子解析法の１つであるハイブリダイゼーションに用いるための核酸標識方法は、主に、ニックトランスレーション法、ランダムプライマー法の２種類が用いられている（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ.  Ｂｉｏｃｈｅｍ.  １３２，  ６−１３，  １９８３）。ニックトランスレーション法は、ＤＮａｓｅＩで二本鎖ＤＮＡにニックを入れる際に、注意しなければ、ＤＮＡが過剰に分解されてしまい標識反応に支障をきたす、また、標識されたＤＮＡの収量が低いことから、高い感度を望むことが難しいなどの問題がある。一方、ランダムプライマー法は、ＤＮＡを変性した後、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとランダムプライマーで相補鎖を合成させるときに標識ヌクレオチドを基質として取り込ませてＤＮＡの標識をおこなうので、標識されたＤＮＡを高い収量で得ることが可能である。しかし、ＤＮＡポリメラーゼの能力のみに依存しているので、得られる標識ＤＮＡの量には限界があり、実験に使用できる標識ＤＮＡの量も必然的に決まってしまい、標識ＤＮＡを大量に使用したい場合などには、効率の良い方法は未だ存在しないのが現状である。また、鋳型の濃度が薄いなどの条件では、ランダムプライマーによる非特異的な短い増幅産物が大量に出来てしまい、ハイブリダイゼーションの結果に悪影響を及ぼす。そのため、長い標識ＤＮＡを得られる方法が望まれるが、良い方法も未だ存在していない。
【０００３】
【非特許文献１】ＡＮＤＲＥＷ  Ｐ．ＦＥＩＮＢＥＲＧ  ＡＮＤ  ＢＲＥＴ  ＶＯＧＥＬＳＴＥＩＮ  （１９８３）  ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  １３２，６−１３．
【非特許文献２】Ｄｅｌｉｕｓ  Ｈ，Ｍａｎｔｅｌｌ  ＮＪ，Ａｌｂｅｒｔｓ  Ｂ．，ＪＯＵＮＡＬ  ＯＦ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１９７２，６７，３４１−３５０．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
電気化学的な検出法や煩雑技術、高価な機器を使用せずに、ハイブリダイゼーションのシグナルを高感度で検出するためには、反応に使用する標識核酸の量や核酸への標識効率を増やすこと、または、標識反応による非特異的な標識核酸の生成を低減させることで、高いシグナル強度が望めると考えられる。しかし、単純に標識反応スケールを倍に増やすのでは労力とコストが掛かるだけで、効率的な方法ではない。本発明の目的は、ハイブリダイゼーションのシグナルを高感度で検出するために、簡便に標識核酸を多量に得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は以下の通りである。
１）核酸の標識反応中に、ＤＮＡ組換え修復に関与する蛋白質を１種類以上添加することにより、塩基対の長い標識核酸産物を効率良く得るための標識方法。
２）核酸の標識反応中に、ＤＮＡ組換え修復に関与する蛋白質を１種類以上添加することにより、標識核酸の生成を増加させる標識方法。
３）前記蛋白質が、１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質［Ｓｉｎｇｌｅ‐ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＳＢ）］、Ｔ４ファージ遺伝子３２、４１、４４、４５、または６１蛋白質（Ｔ４  Ｇｅｎｅ  ３２、４１、４４、４５、または６１  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、複製蛋白質Ａ［Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＲＰＡ）］、放射線Ａ蛋白質［Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ａ  （ＲａｄＡ）］のいずれかである、上記１）または２）に記載の標識方法。 
４）前記標識反応が、ランダムプライマー法、またはＰＣＲ法のいずれかである、上記１）〜３）のいずれかに記載の標識方法。
５）核酸を標識するための化合物が、蛍光色素化合物、核酸類似化合物、およびラジオアイソトープ含有化合物のすべてないしいずれかである、上記１）〜４）のいずれかに記載の標識方法。
６）標識反応に用いる酵素が、ＤＮＡポリメラーゼである、上記１）〜５）のいずれかに記載の標識方法。
７）前記ＤＮＡ組換え修復が、相同組換え修復である、上記１）〜６）のいずれかに記載の標識方法。
８）標識核酸産物の長さが、少なくとも５００ｂｐから６０００ｂｐ以上である上記１）〜７）に記載の標識方法。
９）前記標識反応は、反応液中で１本鎖核酸を生成するステップを含み、その反応液へＳＳＢ、ＤＮＡポリメラーゼ、ランダムプライマー、ｄＮＴＰを添加し、等温でおこなう、上記１）〜８）のいずれかに記載の標識方法。
１０）標識核酸を調製するために使用されるキットであって、少なくとも１つ以上のＤＮＡ組換え修復に関与する蛋白質を含有することを特徴とする標識核酸調製用キット。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、核酸の標識方法、特にランダムプライマー法において、ＤＮＡ組換え修復に関与する蛋白質を用いることにより、塩基対の長い標識核酸、また標識核酸を高い収量で得ることができ、ハイブリダイゼーションなどのシグナル強度を高めることが可能となる。また、一度に大量の標識核酸が得られるので、実験の効率化、コスト削減などを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
核酸を標識させる方法として、ランダムプライマー法が比較的簡便であるので、以下、ランダムプライマー法を例にとって本発明を説明するが、本発明はランダムプライマー法に限定されるものではなく、核酸標識に用いられる方法であれば、何でも利用できる。例えば、ランダムプライマー法以外にＰＣＲ法等が挙げられる。
ＤＮＡ組換え修復に関与する蛋白質（以下、「組換え修復蛋白質」ともいう）は、細胞内でＤＮＡの複製や組換え修復などに関与する蛋白質であり、その機能としては、一本鎖ＤＮＡに配列非特異的に結合することにより、一本鎖ＤＮＡの安定化や保護をおこなっており、また、その後に続く相同組換えなどの修復をおこなうためには必須の蛋白質である。主に研究用途では、一本鎖ＤＮＡ構造の安定化のために使用されている（Ｄｅｌｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．１９７２，６７，３４１−３５０）。
この組換え修復蛋白質を標識したい核酸に結合させることにより、核酸の高次構造をなるべく直線状に保持した状態とすることにより、当該核酸の複製反応が促進され、標識核酸の生成を増加させると共に塩基対の長い標識核酸産物を効率良く得ることができることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明の標識方法としては、上述のように組換え修復蛋白質を用いる態様であれば、特に制限されるべきものではない。
本発明の標識方法としては、例えば、反応液中で１本鎖核酸を生成するステップを含み、その反応液へ組換え修復蛋白質、ＤＮＡポリメラーゼ、ランダムプライマー、ｄＮＴＰを添加し、等温で核酸の標識反応おこなうことが挙げられる。ここで、等温とは具体的に４〜６０℃の一定温度（ただし、±５℃程度の変動は許容される）を意味する。
標識される核酸は、１本鎖であってもよいが、２本鎖である場合は、変性により１本鎖として組換え修復蛋白質と接触、結合させることが好ましい。
標識反応終了後、組換え修復蛋白質は、失活させ、必要により反応液から除去する。また、得られた標識核酸は、必要により所望サイズに分離してもよい。
組換え修復蛋白質としては、１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質［Ｓｉｎｇｌｅ‐ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＳＢ）］、Ｔ４ファージ遺伝子３２、４１、４４、４５、または６１蛋白質（Ｔ４  Ｇｅｎｅ  ３２、４１、４４、４５、または６１  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、複製蛋白質Ａ［Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＲＰＡ）］、放射線Ａ蛋白質［Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ａ  （ＲａｄＡ）］等が挙げられ、単独乃至組合せて用いられる。ＳＳＢとしては、例えば、大腸菌、ショウジョウバエもしくはアフリカツメガエル由来のものが挙げられる。また、他の種由来のその相当物も好ましく用いることが出来る。
【０００９】
また、組換え修復蛋白質は、上記機能を有する限り、天然型の蛋白質のアミノ酸配列中、１つ若しくは複数のアミノ酸を置換、欠失、および／または挿入したアミノ酸配列からなる蛋白質（変異体）であってもよい。このような変異体は、自然界において生じることもあるが、公知の方法を適宜利用して人為的に調製することも可能である。
【００１０】
組換え修復蛋白質は、天然の蛋白質として、または組換え蛋白質として、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画等の公知の方法を適宜組み合わせて調製することが可能である。また、組換え蛋白質で発現量が多い場合には、陽イオン交換カラムおよびゲル濾過カラムを用いたクロマトグラフィーのみにより容易に調製することも可能である。一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質は市販品も利用することができる。一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質の使用量は、通常、試料の核酸１μｇに対して１〜５０μｇ、好ましくは３〜２０μｇである。
【００１１】
ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｅｘｏ-Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ等が挙げられる。ランダムプライマーとしては、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ランダムオクタマー）等が挙げられる。ｄＮＴＰとは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ（ｄＵＴＰ）、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを意味する。
上記標識反応には核酸を標識するための化合物が用いられるが、このような化合物としては、蛍光色素化合物、核酸類似化合物、およびラジオアイソトープ含有化合物等が挙げられ、単独または組み合わせて用いられる。
蛍光色素化合物としては、シアニン５（Ｃｙ５）、シアニン３（Ｃｙ３）、Ａｌｅｘａ色素等が挙げられる。核酸類似化合物としては、蛍光標識ｄＮＴＰ、ジゴキシゲニンｄＮＴＰ、ビオチンｄＮＴＰ、ヘキシルアクリルアミドリンカーｄＮＴＰ等が挙げられる。ラジオアイソトープとしては、３２Ｐ等が挙げられる。
【００１２】
本発明において、標識核酸、即ち、標識される核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられるが、ＤＮＡが好ましい。また、標識される核酸としては、人工合成した配列であっても、天然物由来の配列であってもよい。例えば、ヒトの血液、体液、組織、細胞、細菌、及びウイルスから抽出されたゲノム等を好ましく用いることが出来る。
本発明により得られる標識核酸産物は、塩基対の長さが長いものが増幅して得られるが、その塩基対の長さは、少なくとも５００ｂｐから６０００ｂｐ以上であるものが好ましい。
本発明の標識核酸を調製するために使用されるキットは、少なくとも１つ以上の組換え修復蛋白質を含有する形態であれば、特に制限されない。例えば、上記本発明の標識方法に用いる材料（組換え修復蛋白質、対象核酸、ランダムプライマー、核酸を標識するための化合物、緩衝液、水等）を１以上の容器に該材料を適宜選定して収容した形態であれば、特に限定されない。
本発明により得られた標識核酸産物は、ハイブリダイゼーションの種類に限定しないが、好ましくはアレイハイブリダイゼーション、蛍光インサイチュウハイブリダイゼーション［Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）］、より好ましくは比較ゲノムハイブリダイゼーション［Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＣＧＨ）］が好ましい。
【実施例】
【００１３】
ＳＳＢを用いたヒトゲノムＤＮＡの標識
ランダムプライマー法によるヒトゲノムＤＮＡの標識におけるＳＳＢの効果を調べるために、ヒト男性ゲノムＤＮＡ（プロメガ社）をＢｉｏＰｒｉｍｅ  Ａｒｒａｙ  ＣＧＨ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、Ｓｉｎｇｌｅ-Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（プロメガ社）を用いて蛍光色素Ｃｙ５‐ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケア）で標識をおこなった。具体的には、ヒトゲノムＤＮＡ（０．４μｇ）を９５℃、５分間で変性、氷上に５分間放置後、ＳＳＢ  ０μｇ、０．１８μｇ、１．８μｇ、５．４μｇを各チューブに添加、各々０．６ｍＭ ｄＡＴＰ、０．６ｍＭ ｄＴＴＰ、０．６ｍＭ ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ ｄＣＴＰ及び０．３ｍＭ  Ｃｙ５−ｄＣＴＰ存在下で、ＢｉｏＰｒｉｍｅ Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍにより標識した。その後、６５℃、２０分間で蛋白質を失活させた。各サンプルの標識ＤＮＡの生成を１％アガロースゲル電気泳動（Ｆｉｇ.１Ａ）、また、ＦＬＡ８０００（富士フイルム社）を用いて確認した（Ｆｉｇ.１Ｂ）。
その結果、ＳＳＢを添加した場合では、約５００ｂｐ以上の標識ＤＮＡが増加し、明らかに標識ＤＮＡ産物量が増加していること、また、Ｃｙ５の蛍光シグナル強度が最大約５倍増加することを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例におけるＳＳＢ添加による標識ＤＮＡ産物の増加を示す。図１Ａは、各サンプルの標識ＤＮＡの生成を１％アガロースゲル電気泳動の結果を示し、図１Ｂは、各サンプルの標識ＤＮＡの生成をＦＬＡ８０００（富士フイルム社）を用いた結果を示す。図中、Ｍはサイズマーカーであるλ/ＨｉｎｄＩＩＩ（２００ｎｇ）、１はＳＳＢ添加量０μｇの標識ＤＮＡ、２はＳＳＢ添加量０．１８μｇの標識ＤＮＡ、３はＳＳＢ添加量１．８μｇの標識ＤＮＡ、４はＳＳＢ添加量５．４μｇの標識ＤＮＡを示す。
【図１】
2008148638.tif 000002