(57)【要約】【課題】固定化固相体表面上の微小物体と他の成分との相互作用について良好な検出特性を得ることができる光固定化用固相担体を提供する。【解決手段】光固定化用固相担体２として、表面の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であり光応答性成分を含有する光応答性層４を備えるようにする。表面を超平滑化した光応答性層４を備えることで、この光応答性層４に微小物体を固定化した後において良好な光学的特性を得ることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光固定化用固相担体であって、
表面の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であり、光応答性成分を含有する光応答性層、
を備える、固相担体。
【請求項２】
支持体と、
前記支持体と前記光応答性層との間に介在される下地層と、
を備え、
前記下地層の前記光応答性層側の表面の算術平均粗さＲａが１０ｎｍ以下である、請求項１に記載の固相担体。
【請求項３】
前記下地層はシランカップリング剤を含有する、請求項２に記載の固相担体。
【請求項４】
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に２４時間浸漬し乾燥後の前記光応答性層の表面の算術平均粗さＲａが５ｎｍ以下である、請求項１〜３のいずれかに記載の固相担体。
【請求項５】
前記光応答性層は、前記光応答性層が担持される担体を対照としたときの吸光度が０．０１以下の領域を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の固相担体。
【請求項６】
前記光応答性層は、前記光応答性成分としてアミノ型アゾベンセン系化合物を含有する、請求項１〜５のいずれかに記載の固相担体。
【請求項７】
前記光応答性層に固定化された微小物体と他の成分との相互作用を光学的シグナルによる検出するための固相担体である、請求項１〜６のいずれかに記載の固相担体。
【請求項８】
タンパク質を多数個固定化したアレイ用である、請求項１〜７のいずれかに記載の固相担体。
【請求項９】
光応答性層形成用の担体であって、
支持体と、
光応答性成分を含有する光固定化層用に前記支持体表面に配される下地層と、
を備え、
前記下地層表面の算術平均粗さＲａが１０ｎｍ以下である、担体。
【請求項１０】
光固定化用固相担体の製造方法であって、
表面の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であり、光応答性成分を含有する光応答性層を形成する工程、
を備える、製造方法。
【請求項１１】
前記光応答性層形成工程に先立って、表面の算術平均粗さＲａが１０ｎｍ以下の下地層を備える担体を準備する工程を備え、
前記光応答性層形成工程は、前記下地層の表面に前記光応答性層を形成する工程である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記担体準備工程は、算術平均粗さＲａが１０ｎｍを超える前記下地層の表面を平滑化処理する工程である、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記平滑化処理は、前記下地層の表面をワイプ材で擦過する処理を含む、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記下地層はシランカップリング剤を含有する、請求項１１〜１３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１５】
前記光応答性層形成工程は、湿度５０％以下の雰囲気下で実施する工程である、請求項１０〜１４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１６】
前記光応答性層形成工程は、前記光応答性層を形成する表面又はその近傍の水分を低減した後に実施する工程である、請求項１０〜１５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１７】
前記光応答性層がポリマーを含有するとき、
前記光応答性層を前記ポリマーのガラス転移温度以上の温度で熱処理する工程を備える、請求項１０〜１６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１８】
前記光応答性層は、前記光応答性成分としてアミノ型アゾベンセン系化合物を含有する、請求項１０〜１７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１９】
光応答性層形成用の担体の製造方法であって、
支持体上に、表面の算術平均粗さＲａが１０ｎｍ以下の前記光応答性層形成用の下地層を形成する工程を備える、製造方法。
【請求項２０】
微小物体が保持された固相体であって、
表面の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であり、光応答性成分を含有する光応答性層と、
前記光応答性層に固定化された前記微小物体と、
を備える、固相体。
【請求項２１】
微小物体が保持された固相体の製造方法であって、
表面の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であり光応答性成分を含有する光応答性層を備える光固定化用固相担体の前記光応答性層表面に、微小物体を光固定化する工程、
を備える、方法。
【請求項２２】
微小物体と他の成分との相互作用の検出方法であって、
表面の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であり光応答性成分を含有する光応答性層と、前記光応答性層に固定化された前記微小物体と、を備える固相体を用いる、方法。
【請求項２３】
前記微小物体は生体成分である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記相互作用を光学的シグナルで検出する、請求項２２又は２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小物体を光照射により固定化するための光固定化用固相担体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微小物体を基板などの固相表面に固定化する技術の一つとして、光照射により固定化する技術が知られている。この技術は、タンパク質などの微小物体を、光により変形する光応答性成分を含有する固相の表面に配し、光照射によって固相表面近傍に変形を生じさせタンパク質等を固定（光固定）するものである（特許文献１）。光応答性成分を含有する固相は、スライドガラスなどの基板表面に光応答性成分であるアゾ色素のポリマーをコートして作製されている。このようにして作製されたタンパク質固定化固相体は、タンパク質−タンパク質相互作用のスクリーニングプロテイン用チップ、抗体チップ等として利用することが期待されている。
【０００３】
スクリーニングや診断手段に用いられるプロテインチップ等において、固定化されたタンパク質と被験試料中のターゲット成分との相互作用を検出するためのシグナルが必要である。通常こうした検出シグナルとしては蛍光又は発光などの光学的シグナルが利用されている。
【０００４】
一般に、光学的な検出感度や検出精度は、バッググラウンドのシグナルをいかに低下させるかに依存しており、残留不純物あるいは固相表面の凹凸などの固相表面の特性により変動することが知られている。固相表面における凹凸による光の分散・反射は光学的シグナルの検出精度や検出感度の低下を引き起こすため、例えば、共有結合等によりＤＮＡなどの核酸を固相表面に固定化して、光学的シグナルを用いて相互作用を検出する場合、一定以下の表面粗さのガラススライド等の基板等を用いることが開示されている（特許文献２、３等）。
【０００５】
また、光学的な検出感度や検出精度の向上には、固相表面に対して微小物体が安定的に固定化されていることも重要である。共有結合などによってタンパク質等を固相担体に結合する場合、表面を一定範囲で粗面化することでプローブ等の固定化量が増大することが開示されている（特許文献４）。
【特許文献１】特開２００３−３２９６８２
【特許文献２】特開２００３−１２１４３８
【特許文献３】特開２００３−２４７９７０
【特許文献４】特開２００２−２１１９５４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
微小物体が光固定化された固相体を用いる場合であっても、光学的シグナルを検出手段として用いることが分析上好ましい場合、従来のチップ等と同様に光学的シグナルの検出精度や検出感度等の検出特性が問題となる。
【０００７】
しかしながら、光固定に用いる光応答性固相において良好な光学的特性を発揮する表面特性については全く知られていなかった。また、良好な光学的特性を得るための表面特性は固定化方法によっても異なると考えられ、上記した特許文献における開示をそのまま適用できるわけでもない。
【０００８】
さらに、光固定化には、溶液中での光照射などの従来の固定化とは異なる特有な処理を伴う。このため、光固定化用固相担体は光固定化前のみならずこうした処理後においても良好な光学的特性を備えている必要がある。さらに、微小物体の固定化までの間において微小物体の固定化量が変化せずに安定的に保持されるようにしなければ分析精度を確保できない。
【０００９】
現状において、光固定化固相体表面上の微小物体と他の成分との相互作用を検出する際の検出精度や検出感度等を向上させることができる固相担体の特性やその製造方法については未だ知られていなかった。
【００１０】
そこで、本発明は、光固定化固相体表面上の微小物体と他の成分との相互作用について良好な検出特性を得ることができる光固定化用固相担体及びその製造方法を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、微小物体を安定して保持できる光固定化用固相担体及びその製造方法を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、自ら作製した種々の光固定化用固相担体について、微小物体を固定化し光学的手法で検出することについて検討していたところ、光学的検出特性が、光応答性層表面又はその下にある下地層などの表面の平滑性に予想を超えて依存していることを見出した。また、光学的な検出特性の低下は、光応答性層形成時あるいはその後における環境に依存した平滑性の低下にも影響されることを見出した。これらの知見に基づき、本発明を完成した。本発明によれば以下の手段が提供される。
【００１２】
本発明によれば、光固定化用固相担体であって、表面の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であり光応答性成分を含有する光応答性層、を備える、固相担体が提供される。この固相担体は、タンパク質を多数個固定化したアレイ用とすることができる。
【００１３】
この固相担体においては、支持体と、前記支持体と前記光応答性層との間に介在される下地層と、を備え、前記下地層の前記光応答性層側の表面の算術平均粗さＲａが１０ｎｍ以下とすることができる。前記下地層はシランカップリング剤を含有することができる。さらに、この固相担体においては、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に２４時間浸漬し乾燥後の前記光応答性層の表面の算術平均粗さＲａが５ｎｍ以下とすることもできる。また、前記光応答性層は、前記光応答性層が担持される担体を対照としたときの吸光度が０．０１以下の領域を有することもできる。
【００１４】
また、前記光応答性層は、前記光応答性成分としてアミノ型アゾベンセン系化合物を含有することができる。
【００１５】
この固相担体は、前記光応答性層に固定化された微小物体と他の成分との相互作用を光学的シグナルによる検出するための固相担体とすることができる。
【００１６】
本発明によれば、光応答性層形成用の担体であって、支持体と、光応答性成分を含有する光固固定化層用に前記支持体表面に配される下地層と、を備え、前記下地層表面の算術平均粗さＲａが１０ｎｍ以下である、担体が提供される。
【００１７】
本発明によれば、光固定化用固相担体の製造方法であって、表面の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であり光応答性成分を含有する光応答性層を形成する工程、を備える、製造方法も提供される。
【００１８】
この製造方法においては、前記光応答性層形成工程に先立って、表面の算術平均粗さＲａが１０ｎｍ以下の下地層を備える担体を準備する工程を備え、前記光応答性層形成工程は、前記下地層の表面に前記光応答性層を形成する工程とすることができる。また、この担体準備工程は、算術平均粗さＲａが１０ｎｍを超える前記下地層の表面を平滑化処理する工程とすることができる。さらに、前記平滑化処理は、前記下地層の表面をワイプ材で擦過する処理を含むことができる。また、前記下地層はシランカップリング剤を含有することができる。
【００１９】
さらに、前記光応答性層形成工程は、湿度５０％以下の雰囲気下で実施する工程とすることができるし、前記光応答性層を形成する表面又はその近傍の水分を低減した後に実施する工程とすることもできる。また、前記光応答性層がポリマーを含有するとき、前記光応答性層を前記ポリマーのガラス転移温度以上の温度で熱処理する工程を備えることもできる。
【００２０】
この製造方法においては、前記光応答性層は、前記光応答性成分としてアミノ型アゾベンセン系化合物を含有することもできる。
【００２１】
本発明によれば、光応答性層形成用の担体の製造方法であって、支持体上に、表面の算術平均粗さＲａが１０ｎｍ以下の前記光応答性層形成用の下地層を形成する工程を備える製造方法が提供される。
【００２２】
本発明によれば、微小物体が保持された固相体であって、表面の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であり、光応答性成分を含有する光応答性層と、前記光応答性層に固定化された前記微小物体と、を備える、固相体が提供される。
【００２３】
本発明によれば、微小物体が保持された固相体の製造方法であって、表面の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であり光応答性成分を含有する光応答性層を備える光固定化用固相担体の前記光応答性層表面に、微小物体を光固定化する工程、を備える、方法が提供される。
【００２４】
本発明によれば、微小物体と他の成分との相互作用の検出方法であって、表面の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であり光応答性成分を含有する光応答性層と、前記光応答性層に固定化された前記微小物体と、を備える固相体を用いる、方法が提供される。この検出方法においては、前記微小物体は生体成分としてもよいし、前記相互作用を光学的シグナルで検出するものとしてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の光固定化用固相担体は、表面の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であり光応答性成分を含有する光応答性層、を備えることができる。このような平滑性の光応答性層を備えることで、良好な光学的検出特性を得ることができる。すなわち、良好な光学的な検出感度、検出精度を得ることができる。この結果、良好な分析精度及び再現性を得ることができる。また、こうした平滑性を備えることで、結果として、微小物体を安定的に光応答性層に保持することができる。微小物体の光固定化は、光応答性層の変形を伴う点において、通常の化学結合あるいは単なる表面への物理的吸着による固定化とは相違している。しかしながら、光固定化のための固相表面の平滑性が、微小物体を光固定化した固相体の光学的特性に大きな影響を及ぼすことは従来知られていなかった。本発明者らは、光固定化用固相担体の光学的特性向上や微小物体の安定保持性のための新たな指標を見出したといえる。
【００２６】
また、本発明の光固定化用固相担体は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に２４時間浸漬し乾燥後の表面の算術平均粗さＲａが５ｎｍ以下である光応答性層を備えることもできる。こうした光応答性層であれば、良好な光学的検出特性を得ることができ、この結果、良好な分析精度及び再現性を得ることができる。また、こうした平滑性を備えることで、結果として、微小物体を安定的に光応答性層に保持することができる。
【００２７】
本発明の光固定化用固相担体は、光応答性層が担持された担体を対照として測定したとき、表面（光応答性層）の吸光度が０．０１以下の領域を有することができる。こうした領域は空隙（ボイド）のない平滑な光応答性層となっており、光学的検出特性及び微小物体の保持安定性に優れる固相担体を提供できる。
【００２８】
また、本発明の光固定化用固相担体は、アミノ型アゾベンセン系化合物を含有する光応答性層を備えることができる。こうした光応答性成分を含有することで、光固定化のための光応答性能を確保しつつ光応答性層に由来するバックグラウンドを効果的に低減することができる。結果として、光学的検出特性に優れた固相担体を得ることができる。
【００２９】
本発明は、こうした特徴を備えることができる光固定化用固相担体、光応答性層形成用担体、微小物体固定化固相体及びこれらの製造方法並びにこれらの利用等に関している。以下、本発明の実施の形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。図１には、本発明の光固定化用固相担体の一例が示され、図２には、本発明の光固定化固相担体の製造工程の一例が示され、図３には、本発明の微小物体保持固相体の製造工程の一例が示されている。
【００３０】
（光固定化用固相担体）
光固定化用固相担体２は、光応答性層４それ自体によって構成されていてもよいし、図１に示すように、適当な担体１２上に担持されていてもよい。担体１２は、適当な支持体８を備えており、支持体８のみから構成されていてもよいし、光応答性層４を形成するための適当な下地層１０などの層を備えていてもよい。
【００３１】
（光応答性層）
本固相担体２は、光応答性成分を含有する光応答性層４を備えることができる。光応答性層４は、微小物体２０を光固定化により固定化するために用いる層である。ここで光固定とは、光応答性成分を含有する光応答性層４の表面に配した微小な物体１０に光照射して光応答性層４の表面において光異性化ないしは光変形を生じさせて固定することをいう。
【００３２】
光応答性層４は、光応答性成分を含有すること及び光による分子構造の変化等により結果として形状変形（以下、光変形ともいう。）を生じるように構成されている（光変形材料ともいう。）ことが好ましい。本明細書において光変形とは、通常のマクロな意味での形状変化のほか、分子レベルでの運動による微小物体と光固定化材料表面との絡み合いになどによる変形も含む。このような変形の中には、変形量や変形形態の問題から通常の観察手段によっては明瞭に観察できないものもある。光変形は、光応答性成分が光固定化材料中に存在することにより、光照射時に、例えば、光応答性層４のマトリックス６若しくは光応答性成分の体積、密度、自由体積などが変化することにより誘起されることにより生じると考えられる。
【００３３】
（光応答性成分）
光応答性層４に含まれる光応答性応答性成分は、光により分子構造の変化又は分子配列の変化を生じる成分である。光により分子構造の変化が生じる現象は、フォトクロミズムと一般にいわれている。本発明で用いる光応答性成分としては、一般にフォトクロミック化合物といわれる化合物を用いることができるが、なかでも、光異性化を生じる化合物を用いることが好ましい。なお、光異性化等の分子構造変化を伴って又は光異性化等の分子構造変化を伴わないで光誘起配向、光会合等の分子配列の変化（特に異方的な変化）を生じる化合物も、光応答性層４を構成することができる限り本発明の光応答性成分として用いることができる。
【００３４】
光応答性成分としては、こうした光固定にこれまで用いられてきている各種成分を用いることができる。光応答性成分のフォトクロミック材料としては、アゾ系化合物、スピロピラン系化合物、スピロオキサジン系化合物、ジアリールエテン系化合物、フルギド系化合物などを用いることができる。光応答性成分としては、例えば、トランス−シス光異性化を生じる光異性化化合物等があり、例えば、アゾ系化合物、スチルベン系化合物、アゾメチン系化合物などを例示できる。
【００３５】
光応答性成分としては、アゾ基（−Ｎ＝Ｎ−）を有する色素構造を有する化合物（アゾ化合物）であることが好ましい。アゾ化合物は、光照射等によりシス−トランス異性化を起こし、この異性化による分子レベルの運動が光応答性層４を可塑化させて変形を容易にする。なかでも、アミノアゾベンゼンやその誘導体の構造を持つアミノ型アゾベンゼン化合物が好ましい。アミノ型アゾベンゼン化合物は、典型的には、式（１）で表すことができる。式（１）中、Ｘは、水素原子又は電子吸引性置換基などの各種置換基を表し、好ましくは水素原子を表す。
【化１】
2008170241.tif 000003
【００３６】
Ｘ部分が水素であるアミノ型アゾベンゼンは、電子吸引性置換基を備えるものよりも吸収スペクトルが短波長側にシフトする傾向があるため、効果的に自家蛍光を抑制でき、より短波長での蛍光検出における感度を上昇できる。このため、特に蛍光検出を目的とするプロテインチップ用等の光固定化基板材料として有用である。また、これにより、特にＣｙ３などの短波長での蛍光標識についての検出感度を向上させることができる。この結果、より広い波長範囲で高感度に蛍光標識を検出することができ、複数の蛍光標識を同等の感度で検出できる蛍光検出用チップを提供できる。また、例えば、式（２）及び式（３）に示すように、アゾベンゼン骨格の一方のベンゼン環に電子吸引性置換基（−ＣＮ、−ＮＯ２）が、他方に電子供与性置換基（−ＮＲ１Ｒ２）が結合したものも、光照射中にシス−トランスの異性化を繰り返し大きな光応答性層４の可塑化作用を有すると考えられるため好ましい。
【化２】
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【化３】
2008170241.tif 000005
【００３７】
式（１）〜（３）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、置換基を表す。式（１）〜（３）において、置換基は、アルキル基、水酸基、ヒドロキシアルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、カルボキシル基、アリール基、アリル基、アルキルエステル基、アルキルエーテル基、アルキルアミノ基、アルキルアミド基、イソシアネート基、エポキシ基等を例示することができる。特に、Ｒ１及びＲ２における前記置換基の一方が、末端に重合性の二重結合等を有するアクリル酸やメタクリル酸等のアクリル系化合物及びその他の二重結合性成分であるときには、式（１）〜（３）は、二重結合性モノマーを表すことができるほか、前記二重結合性成分に由来する重合基を備える光応答性ポリマーを表す。また、Ｒ１及びＲ２における前記置換基の一方が、イソシアネート基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の重縮合あるいは重付加性の重合性成分であるときは、式（１）〜（３）は、重合性モノマーを表すほか、前記重合性成分に由来する重合基を備える光応答性モノマーを表す。アゾ化合物である光応答性成分は、１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３８】
その他、本発明において使用可能な光応答性成分又は光応答性成分を含有する光応答性層４としては、特開２００３−３２９６８２号公報、特開２００４−９３９９６号公報及び特開２００４−２５１８０１号公報に記載の担体や光固定化材料を用いることができる。また、本明細書には、特開２００３−３２９６８２号公報、特開２００４−９３９９６号公報、特開２００４−２５１８０１号公報、特開２００６−２３３００４号及び特開２００６−３２１７１９号に記載されるすべての事項が引用により取り込まれるものとする。
【００３９】
光応答性層４は、光応答性成分を保持するマトリックス６を有することができる。光応答性成分は、光応答性層４のマトリックス６に分散される別個の成分として光応答性層４に含まれていてもよいし、光応答性層４のマトリックス６を構成する１種又は２種以上のマトリックス材料に共有結合などの化学的結合を介して連結されてその一部となっていてもよい。
【００４０】
光応答性層４の加工性、可塑性を確保する観点からは、マトリックス６は、単量体ユニット中に光応答性成分を含有する高分子材料であるほか、光応答性成分を分散保持する高分子材料であることが好ましい。マトリックス６が高分子材料を含む場合には、式（１）等において、Ｒ１又はＲ２が重合基への連結基である場合などのように、光応答性成分は、高分子材料の一部（主鎖、側鎖あるいは修飾基）に含まれて存在することが好ましい。
【００４１】
マトリックス６を構成する高分子材料としては、特に限定しないで、各種の熱可塑性又は熱硬化性ポリマーを用いることができる。こうした高分子材料は、光応答性成分等の共重合による導入性を考慮して使用されることが好ましい。したがって、例えば、（１）エチレン性モノマーなど二重結合を含有する重合性体の重合体であるアクリル系ポリマー、メタクリル系モノマー、ビニル系ポリマー、スチレン系ポリマー、（２）重合性官能基の重縮合により得られるアミド系ポリマー、エステル系ポリマー、（３）ウレタン系ポリマー、ウレア系ポリマーなど付加重合性ポリマーが挙げられる。これらのなかでも、アクリル系ポリマー、メタクリル系ポリマー及びアクリル−メタクリル系コポリマーを好ましく用いることができる。これらのポリマーは、抗体等のタンパク質を固定化する際の比特異的吸着が少ないため、抗体チップなどにおいてバックグラウンドシグナルを抑制できるため、高感度測定が可能となる。
【００４２】
式（１）〜（３）などのアゾ化合物系の光応答性成分は二重結合性のモノマーとして、ホモポリマー又はＭＭＡ等の二重結合性モノマーとのコポリマーとして使用することが好ましい。
【００４３】
光応答性層４の三次元形態は特に限定しない。フィルム状体、シート状体、板状体の他、球状、不定形状、針状、棒状、薄片状等の各種の粒子形態を取ることもできる。さらに、光応答性層４は、図１に示すように、基板や粒子などの適当な担体１２の一部又はその表面に対して固定されていてもよい。担体１２又はその一部である支持体８としては、ガラス、シリコン、金などの無機材料、高分子材料などの有機材料であってもよい。
【００４４】
光応答性層４は、それ自体適度な剛性を持って分析に適した固相に構成されていてもよいが、適当な支持体８の表面に直接又は支持体８上の適当な下地層１０を介して備えられていてもよい。下地層１０は、支持体８と光応答性層４との密着性を向上させるものであることが好ましい。下地層１０は、例えば、支持体８がスライドガラス等である場合には、各種のシランカップリング剤層とすることができる。シランカップリング剤としては、ハロゲン、アミノ基、水酸基、エポキシ基等の反応基を備えるものが挙げられる。保存安定性の観点から、例えば、シランカップリング剤としてアミノ基を有するもの、例えば、アミノプロピルトリエトキシシランなどのアミノアルキル基を有するトリアルコキシシラン及びその誘導体等を用いることができる。
【００４５】
光応答性層４の厚み及び固相担体２の厚みは特に限定しない。基板状の支持体８上に光応答性層４が備えられる場合には、少なくとも１０ｎｍ以上であることが好ましい。１０ｎｍ以上であれば、所望の部分に欠陥なく光固定化材料薄膜を作製することが容易になる。支持体８や下地層１０上への薄膜状の光応答性層４の作製は、スピンコート、ディップコート、インクジェット、ロールを用いた方法など既存の方法を使用することができる。
【００４６】
次に、こうした固相担体２における光応答性層４が有することができる特徴について説明する。
【００４７】
（１．光応答性層の平滑性）
光応答性層４は、その表面の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であることが好ましい。算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であると、良好な光学的検出精度や検出感度を得ることができ、結果として良好な分析精度及び再現性を得ることができる。また、この範囲であると、後述するように、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に２４時間浸漬し乾燥後においても、光応答性層４の表面の算術平均粗さＲａを５ｎｍ以下に容易に維持することができる。より好ましくは算術平均粗さＲａが１ｎｍ以下である。
【００４８】
（２．所定処理後の光応答性層の平滑性）
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に２４時間に浸漬し乾燥後の光応答性層４の算術平均粗さＲａが５ｎｍ以下であることも好ましい。こうした処理後の光応答性層４の算術平均粗さＲａは、光応答性層４が下地層１０等によって支持体８表面に良好に密着されている場合に生じる傾向にある。光応答性層４に内部応力を有しやすいからである。算術平均粗さＲａが５ｎｍ以下であれば、良好な光学的検出精度や検出感度を得ることができる。より好ましくは、２ｎｍ以下である。
【００４９】
例えば、室温のＰＢＳ緩衝液を滴下し、ギャップカバーガラスで覆うことでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）への浸漬状態を形成してこの状態を２４時間維持し、乾燥後の光応答性層４の表面の算術平均粗さＲａが５ｎｍ以下であることがより好ましい。この条件はより光固定化工程における反応条件に近いからである。より好ましくは、この条件下で２ｎｍ以下である。
【００５０】
以上のことから、例えば、微小物体２０の上記処理前の光応答性層４の表面の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であり、かつ上記処理後の算術平均粗さＲａが５ｎｍ以下であってもよい。すなわち、上記処理前後の光応答性層４の表面の好ましい算術平均粗さＲａをそれぞれ組み合わせて光応答性層４を特徴付けることもできる。例えば、上記処理前の光応答性層４の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であり、処理後に同２ｎｍ以下であってもよいし、上記処理前に同１ｎｍ以下であり、処理後に同５ｎｍ以下であってもよいし、上記処理前に同１ｎｍ以下であり、処理後に同２ｎｍ以下であってもよい。
【００５１】
光応答性層４の表面の算術平均粗さＲａは、以下のようにして求めることができる。すなわち、光応答性層４の表面上の２μｍ×２μｍ領域（２μｍ方形状領域）で原子間力顕微鏡（NanoScope III）（商品名である。）を用いて測定した画像を使用し、当該原子間力顕微鏡 NanoScope III付属のソフトウエアにおいて，Roughnessコマンドによる解析を行った。Raの算出式は以下（数式１）のとおりとした。なお、算術平均粗さRaの計測対象領域は、計測対象領域から、１０μｍ×１０μｍの大きさの領域（１０μｍ方形状領域）を選択し、さらに、この領域から５個の上記２μｍ方形状領域をランダムに選択し、それぞれについて算術平均粗さRaを算出しこれらの平均値とするか、あるいは原子間力顕微鏡下の観察においてもっとも標準的であると認められる上記方形状領域を適数個選択し、それぞれについて算術平均粗さRa算出し、これらの平均値とすることが好ましい。より好ましくは、計測対象領域から、５個の１０μｍ方形状領域をランダムに選択し、さらに個々の１０μｍ方形状領域について２μｍ方形状領域を５個ランダムに選択して得られた結果の平均値とする。なお、下記式においてデータポイント数は６５５５３６（２５６×２５６）以上であることが好ましく、より好ましくは２６２１４４（５１２×５１２)である。
【数１】
2008170241.tif 000006
【００５２】
なお、本発明における算術平均粗さＲａは、上記測定方法と同等あるいはそれ以上の精度及び正確性を有する他の測定方法によって測定することもできる。
【００５３】
（３．光応答性層を担持する担体表面の平滑性）
こうした光応答性層４の表面平滑性は、支持体８又は支持体８上に備えられた下地層１０など担体１２の表面平滑性にも依存する。すなわち、支持体８又は支持体８上に備えられた下地層１０の表面（これらの表面を一括して担体表面という。）の算術平均粗さＲａが１０ｎｍ以下であることが好ましい。担体表面の算術平均粗さＲａが１０ｎｍを超えていると、こうした担体表面に形成される光応答性層４の算術平均粗さＲａが２ｎｍを超えることになりやすいからである。より好ましくは、５ｎｍ以下であり、さらに好ましくは１ｎｍ以下である。なお、これらの下地表面の算術平均粗さＲａは、支持体８又は下地層１０の表面上の一定領域を測定対象とする以外は、光応答性層４の表面の算術平均粗さＲａと同様にして測定することができる。
【００５４】
（４．光応答性層の吸光度）
光応答性層４にボイドなどの空隙がある場合には、光応答性層４自体の非吸収領域であって可視領域における吸光度が０．０１以下であることが好ましい。この場合、対照として光応答性層４が固定化されている担体１２（例えば、固光応答性層４が支持される支持体８又は支持体８と下地層１０とからなる担体）を用いる。こうした吸光度が０．０１以下であると、ボイドが少なく散乱因子が少ないことを意味している。こうした光応答性層４によれば、光学的シグナルの検出時にも光学的シグナルに干渉せず、良好な検出感度及び精度を得ることができる。また、ボイドが少ないことから、安定的に微小物体２０を保持することができる。なお、通常、こうした吸光度は、光応答性層４を備えない担体１２をリファレンス側に配置し、光応答性層４を備える担体１２をサンプル側に配置して測定される。
【００５５】
なお、吸光度を測定する波長については、光応答性層４の非吸収領域、すなわち、ベースラインと認められる波長領域にありかつ可視領域における任意の波長であればよい。例えば、アゾポリマーを用いる場合には６６０ｎｍ以上７４０ｎｍ以下程度における任意の波長が好ましく、より好ましくは６８０ｎｍ以上７２０ｎｍ以下における任意の波長であり、さらに好ましくは約７００ｎｍである。
【００５６】
（５．光応答性層の光応答性成分）
光応答性層４は、式（１）に示す光応答性成分を含有することが好ましい。この光応答性成分は、光固定化のための光変形能及び固定化能を備えるとともに、光応答性層４のバックグラウンド値を低下させかつ検出感度を向上させることができる。このアゾベンゼン化合物は、例えば、式（４）に示す二重結合性のモノマーとして用いるとき、式（５）に示すアゾポリマーを構成することができる。ただし、式（５）において、０＜ｍ≦１００及び０≦ｎ＜１００である。
【化４】
2008170241.tif 000007
【化５】
2008170241.tif 000008
【００５７】
式（５）に示すような式（１）においてＸが水素原子であるアゾベンゼンモノマーユニットを有するアゾポリマーの場合、極大吸収波長は４１０ｎｍ以上４２０ｎｍ以下（４１５ｎｍ前後）であり、蛍光色素であるＣｙ３の極大吸収波長粋においてほとんど吸収を示さなくなる。
【００５８】
式（１）に示すアゾ化合物を含むモノマーユニットを用いる場合、特にＸが水素原子の場合など、アゾポリマーとしては、こうしたモノマーユニットのみからなるホモポリマーのほか、上記した一般的なモノマーと組み合わせてコポリマーとすることができる。コポリマーとする場合、式（１）に示すアゾ化合物モノマーのモノマー比率は５モル％以上１００モル％未満であることが好ましい。この範囲であると良好な固定化能とバックグランドを得ることができる。より好ましくは８モル％以上６０モル％以下である。また、コポリマーとするときの、好ましいモノマーとしてはメチルメタクリレート（ＭＭＡ）などのアクリル酸系の二重結合性モノマーを用いることができる。
【００５９】
本発明の光固定化用固相担体は、光応答性層４における上記１．〜５．の５つの特性のいずれかを備えることにより、良好な光学的検出特性及び分析特性を得ることができる。また、これらの有利な特性のうち、２種類以上の特徴を有していてもよいし、３つ以上であってもよいし、４つ以上であってもよいし、全てを備えていてもよい。例えば、上記１．の光応答性層４の表面平滑性とともに、３．の担体表面の面平滑性を備えることが好ましい。また、４．の吸光度は、良好な光学的検出特性を得るため他の観点からの有利な特性であり、単独でこの特性を有していても良好な光学的検出特性等を得ることができる。５．の特性は、表面平滑性や吸光度特性とさらに別の観点からの有利な特性であり、単独でこの特性を備えることで、光学的検出特性を改善することができる。したがって、これら５つの有利な特性を２以上組み合わせて備える光応答性層４は、一層光学的検出特性が改善され、又は確実に光学的特性等が改善されたものとなっている。
【００６０】
こうした光固定化用固相担体２は、図２に示すように、微小物体２０を光照射して光固定化するのに適しており、特に、微小物体２０と他の成分との相互作用を光学的シグナルを用いて検出するのに適したものとなっている。ここで、光学的シグナルとしては特に限定されない。蛍光、発光、消光、発色等、光のシグナル変化であればよい。例えば、Ｃｙ３やＣｙ５のような蛍光標識試薬、インターカレーション等による発光又は消光のための試薬、ＦＲＥＴなどの発光試薬、酵素反応による発色用試薬が挙げられる。こうしたシグナル変化のための試薬は、微小物体２０側に予め備えることもできるし、微小物体２０に向けて供給される被験試料又は他の成分に備えられていてもよく、検出試薬の種類等に応じて適宜選択される。光固定化用固相担体２はタンパク質の固定化に適している。したがって、担体２は、タンパク質を多数個固定化するアレイ用担体として好ましく、より好ましくはタンパク質光固定化によるアレイ用担体として用いることができる。
【００６１】
（光応答性層形成用の担体）
本発明の光応答性層形成用の担体は、支持体と、光応答性成分を含有する光応答性層用に支持体表面に配される下地層とを備えることができる。本発明の担体は、光応答性固相担体の現材料の一つでもある。本発明の担体の一例を図１に示している。担体１２は、例えば、支持体８とその光応答性層４側の表層を構成している下地層１０とによって構成することができる。担体１２は、他の層をさらに備えることもできるが、光応答性層４を形成するための層としての下地層１０を最表層に備えていることが好ましい。
【００６２】
担体１２の表面は、既に、「３．担体表面の平滑性」において説明したように、その算術平均粗さＲａが１０ｎｍ以下であることが好ましい。より好ましくは、５ｎｍ以下であり、さらに好ましくは１ｎｍ以下である。担体１２が下地層１０を備える場合には、下地層１０の表面がこうした特性を有していればよい。また、なお、下地層１０を構成する材料は、支持体８や光応答性層４の種類によっても異なるが、既に説明した各種のシランカップリング剤を含むことができる。シランカップリング剤としては、保存安定性の観点からアミノ基を有していることが好ましい。
【００６３】
こうした本発明の担体は、表面平滑性に優れる光応答性層４を形成することができる。このため、光固定化のみならず他の光応答性を利用した用途にも用いることができる。
【００６４】
（光固定化用固相担体等の製造方法）
本発明の光固定化用固相担体の製造方法は、光固定化用固相担体の製造方法であって、表面の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であり光応答性成分を含有する光応答性層を形成する工程、を備えることができる。本発明の製造方法によれば、光応答性層４の表面の算術平均粗さＲａが所定値以下となるため、良好な光学的検出特性及び分析特性を得ることができる光固定化用固相担体を得ることができる。光固定化用固相担体の製造方法の一例を図２に示す。図２に示すように、本製造方法は、典型的には、担体１２を準備する工程と、担体１２上に光応答性層４を形成する工程とを備えることができる。
【００６５】
（担体の準備工程）
光固定化用固相担体２として、担体１２表面に光応答性層４を形成することができる。この場合、本製造方法は、担体準備工程を備えることができる。担体１２は、図１に例示する支持体８に下地層１０を備えるもののほか、支持体８のみから構成することができる。
【００６６】
担体１２としては、支持体８上に下地層１０を備えることが好ましい。既に説明したように、支持体８が無機材料等の場合、光応答性層４の密着性が低下しやすい。支持体８が無機系材料の場合、シランカップリング剤層などの密着性を向上させるような下地層１０を備えることが好ましい。こうした下地層１０は、例えば、シランカップリング剤材料を公知の方法で支持体８の表面に付与することで形成することができる。なお、下地層１０は、必ずしも支持体８の表面に形成されなくてもよく、さらに別の層が介在されていてもよい。
【００６７】
担体準備工程は、算術平均粗さＲａが１０ｎｍ以下の表面を備える担体１２を準備するようにすることが好ましい。こうした表面を備えることでこの表面に形成する光応答性層４が良好な光学的特性を得ることができる。算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下の光応答性層４を容易に得ることができる。特に、スピンコート等の湿式法により光応答性層４を形成する場合に好適である。
【００６８】
担体１２の表面、すなわち、支持体８の表面や下地層１０の表面の算術平均粗さＲａを１０ｎｍ以下とするには、予めそうした担体１２を入手してもよいし、下地層１０の形成時等において表面粗さを制御してそうした担体１２を作製してもよい。あるいは、担体１２の表面に対して、溶媒への浸漬、超音波処理、擦過、加圧、加熱及び研磨並びにこれらを組み合わせてその表面を平滑化するようにしてもよい。担体１２の表面平滑化の手法は、担体１２が下地層１０を備えるか否かや下地層１０の種類や特性にもよって異なる。例えば、担体１２がアミノアルキル基を備えるアルコキシシラン等のシランカップリング剤を下地層１０を備える場合には、この表面を擦過することで、効果的に平滑化することができる。
【００６９】
通常、下地層１０を形成することにより、光応答性層４の密着性は向上する。本発明者らの検討によれば、下地層１０を形成することで密着性は向上するがその一方で光応答性層４の光学的検出特性が低下する傾向があること、こうした特性低下は、光応答性層４の表面の凹凸であり、さらにこの凹凸は下地層１０の凹凸に原因があることがわかった。さらに、シランカップリング剤などが強固に結合した下地層１０であると、その表面の凹凸を平滑化するのも困難であることが多いことがわかった。したがって、表面が所定の算術平均粗さＲａを備える下地層１０を形成することは、密着性が良好でかつ光学的特性に優れた光応答性層４を得るために有用である。以下、下地層１０の平滑化について主として説明する。
【００７０】
下地層１０の擦過による平滑化にあたっては、適当なワイプ材を用いることができる。ワイプ材の材質は特に限定されないが、セルロースなどを主体とする一般的な植物繊維の抄造体（典型的には紙である。）などを用いることができる。またセルロースなど物繊維を含む各種繊維の織成体（布）や編成体を用いることもできる。さらに、ワイプ材としては、ゴムやプラスチック製等のロール体、ヘラ状体、スクレーパーなども用いることができる。
【００７１】
下地層１０の表面をワイプ材で擦過させる形態としては、上記したワイプ材を用いて下地層１０表面を強く押しながら移動させるなど、一般に「擦る」、「ふき取る」及び「こそげる」等の操作を採用することができる。下地層１０側とワイプ材との移動形態は、結果として、下地層１０の表面が擦過される形態であればよい。ワイプ材を移動させる形態であっても、下地層１０側を移動させる形態であっても、両者を同時に反対方向に移動させる形態であってもよい。
【００７２】
下地層１０を擦過させる場合には、特に無液体下で行ってもよいが、ワイプ材及び／又は下地層１０に液体を含浸又は供給するなどしてワイプ材と下地層１０との間に液体を存在させるようにすることが好ましい。液体が存在することで効果的に下地層１０表面を平滑化することができる。液体は、水、メタノール、エタノール等のアルコール、アセトンやＭＥＢＫなどのケトン等の有機溶媒並びにこれらの混腋などを、特に限定することなく用いることができる。また、これらの液体には界面活性剤を含んでいてもよい。好ましくは、メタノールやエタノール等の極性有機溶媒を用いる。こうした溶媒を用いたとき、より高度に平滑化できる傾向にある。こうした溶媒は、シランカップリング剤層に特に有効である。
【００７３】
担体１２が下地層１０を有していない場合には、表面の算術平均粗さＲａが１０ｎｍ以下となる支持体８を担体１２として準備すればよい。
【００７４】
（光応答性層形成工程）
光応答性層４の形成工程は、上記した所定の表面平滑性が得ることができれば特に限定されない。光応答性層４を、それ自体で適度な剛性を持って分析に適した固相となるように成形してもよいし、直接又は必要に応じて適当な下地層１０を介して担体１２上に形成してもよい。適当な表面への薄膜状の光応答性層４の形成はスピンコート、ディップコート、インクジェット、ロールを用いた方法など既存の方法を使用することができる。光学的検出特性が良好な光応答性層を得るには、式（５）中において表されるアゾベンゼンモノマーユニットを含むポリマーを用いて光応答性層４を形成することが好ましい。
【００７５】
（光応答性層形成工程における水分の制限）
光応答性層形成工程は、水分を制限した状態で行うことが好ましい。具体的には、光応答性層４を下地層１０や支持体８の表面等における水分や雰囲気湿度を一定以下に制限することで、ボイドが抑制されて、平滑であって散乱による曇りが抑制された光応答性層４を形成することができる。例えば、スピンコート等により光応答性層４を成膜する際、雰囲気の相対湿度（ＲＨ）を５０％ＲＨ以下とすることで効果的にボイドの発生を低減できる。より好ましくは、４０％ＲＨ以下である。４０％ＲＨ以下であると、一層効果的にボイドの発生を低減して光学的に均一な光応答性層４を得ることができる。さらに好ましくは３０％ＲＨ以下である。３０％ＲＨ以下であると一層良好な光応答性層４を得ることができる。特に、光応答性層４が２００ｎｍ以上の厚膜である場合においては、低湿度条件が好ましい。
【００７６】
また、下地層１０又は支持体８の表面若しくはこれらの近傍の水分を低減させた後、光応答性層４を形成することが好ましい。特に、スピンコート等の湿式成膜に好適である。こうした水分の低減には、強制乾燥が好ましく、例えば、常温の送風乾燥又は熱風乾燥が挙げられる。なお、送風又は熱風の温度や供給時間は、こうした操作がボイドの低減に有効な範囲で行うえばよい。ボイドの低減効果は、既に説明したように、光応答性層４の吸光度特性を測定することによって知ることができる。
【００７７】
特に、光応答性層４の形成に際する水分制限は、下地層１０を形成した場合において有効である。ボイドの発生は、下地表面に由来する光応答性層の平滑性劣化程度をさらに増大してしまうからである。
【００７８】
（光応答性層の加熱処理工程）
光応答性層４がポリマーを含有するとき、形成した光応答性層４をこのポリマーのガラス転移温度以上の温度で加熱処理する工程を備えることが好ましい。換言すれば、応力緩和可能に加熱することが好ましい。こうすることで、光応答性層４に表面等の応力が緩和され、光固定化工程やその他の工程において水溶液処理などを行ったときに開放される応力による亀裂の発生を防ぐことができる。この結果、光固定化工程や洗浄工程後等にも光応答性層４の表面平滑性が確保されることになる。また、こうした工程においても表面平滑性を維持できる結果、微小物体２０をこうした工程を通じて安定して保持することができる。なお、ガラス転移温度については、公知の方法で測定することができる。
【００７９】
ガラス転移温度以上の温度による加熱処理時間は、加熱処理による応力緩和ないしクラック減少効果が得られる範囲であればよく、特に限定されない。クラック減少効果は、例えば、既に説明したように、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に２４時間に浸漬し乾燥後の光応答性層４の表面のＡＦＭによる観察や算術平均粗さＲａの算出により評価することができる。あるいは、リン酸塩緩衝食塩水等の水溶液処理後に光学顕微鏡やＡＦＭ等によっても評価できる。
【００８０】
こうした加熱処理工程は、光応答性層形成工程とは別個の工程として実施することができるほか、光応答性層形成工程の一部あるいはその後に、例えば、スピンコート等湿式条件下で形成した光応答性層４の乾燥工程として行うこともできる。
【００８１】
特に、こうした応力緩和のための加熱処理工程は、下地層１０を介して光応答性層４を形成した場合において有用である。下地層１０によって良好な密着性で固定された光応答性層４は大きな内部応力を有しており、このためにその後の処理工程によってクラック等が派生しやすい傾向にあるからである。
【００８２】
また、算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下の光応答性層４の形成工程は、既に形成された光応答性層４の表面を平滑化処理する工程であってもよい。
【００８３】
算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下である光応答性層４を得るには、上記した各種方法のいずれかを採用することが効果的である。なかでも、光応答性層４の形成時の水分制限、光応答性層４の加熱処理、算術平均粗さＲａが所定値以下の下地層１０の方法のうちいずれかを採用することが効果的であり、これらの２種類以上を採用することがより一層効果的であり、さらに全てを採用することが最も効果的である。
【００８４】
以上説明したように、本発明の光固定化用固相担体の製造方法によれば、表面の算術平均粗さＲａが所定値以下の光応答性層４を得ることができるため、光学的検出特性及び分析特性に優れた光固定化用固相担体を提供できる。しかも、下地層１０を備える場合には、光応答性層４の良好な密着性が確保される結果、安定して微小物体が保持され、安定した分析特性を得ることができる。
【００８５】
上記した本発明の光固定化用固相担体の製造方法における、支持体８に対して、算術平均粗さＲａが１０ｎｍ以下の下地層１０を形成する工程は、光応答性層形成用の担体の製造方法でもある。この工程によれば、光応答性層４の形成に適した担体を容易に得ることができる。すなわち、この担体によれば、光応答性層４の密着性に優れ、しかも、光応答性層４の表面平滑性に優れる固相担体を得ることができる。
【００８６】
（微小物体が保持された固相体）
本発明は微小物体が保持された固相体にも関する。図３（ｃ）に例示するように、本発明の微小物体保持固相体３０は、光応答性成分を含有する光応答性層４と、光応答性層４に固定化された微小物体２０と、を備えることができる。光学的検出特性及び分析特性の観点から、光応答性層４は、算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であることが好ましい。
【００８７】
本発明の光固定化用固相担体２に固定化される微小物体２０は特に限定されない。微小物体２０は、有形である限り、その存在形態を問うものではない。微小物体２０の形状は、必ずしも固定的である必要はなく、フレキシブルに変形し得るものでも良い。また、微小物体２０は、１ｍｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１００μｍ以下、さらに好ましくは５０μｍ以下、とりわけ好ましくは１０μｍ以下のサイズのものを対象とすることができる。また、微小物体２０は、好ましくは１ｎｍ以上の大きさである。本明細書においては、微小物体２０の大きさは、固定化前及び固定化後のいずれかで微小物体２０が測定しやすい状態にあるときに測定することができ、微小物体２０の観察時における最大寸法で規定するものとする。例えば、微小物体２０の最大寸法が１μｍ以上程度であれば光学顕微鏡で測定することができ、１μｍ未満程度の場合には、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡）で測定することができる。さらに、１０ｎｍ以上１００μｍ以下程度の範囲にあっては、走査型電子顕微鏡で測定することもできる。
【００８８】
微小物体２０に含有され、あるいは微小物体を構成する材料としては、特に限定しないが、例えば、金属、金属酸化物、半導体、セラミックス、ガラスなどの無機材料；プラスチック、抗菌性、抗炎症性、各種の生体プロセスのブロック作用、ある種のアゴニスト又はアンタゴニストであるなど生理活性を有する有機化合物などの有機材料；タンパク質、核酸、糖類、脂質及び骨形成材料などの生体材料；各種の生物細胞及びその一部、組織及び生物体などの生物材料及びこれらの材料の複合材料等が挙げられる。
【００８９】
なお、タンパク質としては、本明細書において使用する場合、任意のサイズ、構造、または機能の、タンパク質、ポリペプチド、およびオリゴペプチドを含んでいる。タンパク質としては、例えば、各種タンパク質、酵素、抗原、抗体、レクチン又は細胞膜レセプターが挙げられる。また、抗体は、天然の又は全体的若しくは部分的に合成的に産生された免疫グロブリンを意味する。特異的結合能を保持するその全ての誘導体も包含される。核酸は、１本鎖であっても、２本鎖であってもよい。人工及び天然を問わず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ及び塩基等の修飾体を含んでいてもよい。さらにその鎖長も特に限定しない。
【００９０】
これらの微小物体には、被験試料との相互作用を検出するためのインターカラント、蛍光物質及び発色物質等が結合されていてもよい。
【００９１】
本発明の微小物体保持固相体３０は、微小物体２０として各種の材料を固相担体２に固定化することで各種用途に用いることができるデバイスとして利用できる。特に、本発明の固相担体２はその光学的検出特性及び分析特性が向上されているため、固相体３０は、分析や診断用途に適している。また、光固定は、抗体を含むタンパク質、糖鎖、核酸及び細胞等の生体材料及び生物材料の固定化に適している。したがって、本発明の固相体３０は、タンパク質、酵素、抗体チップ、糖鎖チップ、ＤＮＡ等の核酸チップ、細胞チップ等の分析ないし診断用デバイスに好適である。また、酵素、細胞などを固相担体２に固定化したバイオリアクターにも好適である。光学的検出特性が優れるために、リアクターの設計や制御が容易であり、また、微小物体２０の保持安定性に優れるからである。したがって、高効率なバイオリアクター、特にマイクロリアクターを作製することができる。
【００９２】
（微小物体が保持された固相体の製造方法）
本発明は、表面の算術平均粗さＲａが２ｎｍ以下であり光応答性成分を含有する光応答性層に微小物体を光固定化する工程を備える、方法にも関する。光固定化工程について図３を参照しながら説明する。
【００９３】
（微小物体の供給）
まず、図３（ａ）に示すように、所定の算術平均粗さＲａを備えるように準備された光応答性層４に対して微小物体２０を供給する。微小物体２０を光応答性層４の表面に供給する方法は特に限定しないが、液状媒体を介して液状媒体に溶解又は懸濁させた状態で適用することが好ましい。液状媒体中に浸漬した光応答性層４の表面に対して微小物体２０を容易に展開させることができ、微小物体２０たるタンパク質、細胞、微生物の機能維持や生存に最適の液状媒体中で固定化を行うことができるからである。
【００９４】
なお、液状媒体として、水又は水を主媒体とする組成液が特に好ましい。水を主媒体とする組成液としては、緩衝液、ｐＨを調整した緩衝液、細胞や微生物の栄養分を溶解させた液等が挙げられる。また、液状媒体は、微小物体２０と光応答性層４との相互作用を高めるようなものを選択することもできる。例えば、液状媒体のｐＨ、電解質濃度、極性などを調整することにより相互作用を高めることができる。こうした液状媒体としては、水、水と相溶性のある有機溶媒である水性溶媒、非水性溶媒を単独であるいは組み合わせるなどして、光応答性層４及び微小物体２０の種類に応じて適切なものを選択することができる。また、光応答性層４と微小物体２０との相互作用を高めるための上記した液性を付与するのに必要な成分を添加してもよい。さらに、例えば、界面活性剤が液状媒体に添加されていてもよい。界面活性剤が液状媒体に含有されていることで、微小物体２０の分散性が向上し、微小物体２０そのものの表面状態を利用しやすくなる。
【００９５】
微小物体２０は、その個体ごとにバラバラに配置・固定化される態様、多数の微小物体２０が特定の分布パターンに従って配置・固定化される態様、自己組織化（例えば、結晶化など）する性質を持つ微小物体２０においては、多数の微小物体を自己組織化した状態において光固定化材料の表面に配置させ、固定化する態様等がある。微小物体２０のパターニングには、従来公知の各種の印刷法（インクジェットなど）を用いることができる。パターニングの一例としては、微小物体２０のスポットをアレイ状に供給するパターンが挙げられる。また、光応答性層４の所定部位への微小物体２０の配置には、レーザートラッピング（ただし、配置のみに用いる場合には、光応答性成分が反応しない波長域を用いる）を利用することもできる。さらに、自己組織化は、光応答性層４への供給に先立って行ってもよいし、光応答性層４の表面で行うようにしてもよい。
【００９６】
微小物体２０を光応答性層４に供給するのに際し、微小物体２０を配向させることができる。微小物体２０と光応答性層４との相互作用は、静電的相互作用、親水性相互作用、疎水性相互作用、水素結合等であるが、こうした相互作用を効果的に発現させるために、適宜熱などの熱力学的パラメータを付与したり変化させたりすることもできる。また、液状媒体を乾燥により除去してもよい。微小物体２０と光応答性層４との相互作用は、必要に応じて時間をかけて行う。特に限定しないが、例えば、数秒から数十分以上とすることができる。
【００９７】
（光固定化）
光応答性層４に対して固定化しようとする微小物体２０が供給されることで、微小物体２０は相互作用に基づいて光応答性層４に配置されていると考えられる。図３（ｂ）に示すように、こうした状態で光応答性層４上の微小物体２０に光照射することにより、微小物体２０を所定の配向性で固相に強固に固定（光固定）することができる。ここに、光固定とは、光応答性成分を含有する光応答性層４の表面に配した微小な物体１０に光照射して光応答性層４の表面において光異性化ないしは光変形を生じさせて固定することをいう。
【００９８】
光固定ではエネルギーの低い可視光の照射によっても固定が可能であるので生体分子などへの障害を抑制又は回避した固定が可能である。このため、固定化される微小物体２０がタンパク質などの生体材料の場合には、その立体構造や良好な活性を維持して固定化することができる。光照射による微小物体２０の光応答性層４への固定化メカニズムは必ずしも明らかではなく本発明を拘束するものではないが、以下のように考えられる。すなわち、光照射により微小物体２０の周囲に発生する電場に依存して光応答性成分及び光応答性層４において生じる微小物体２０の沿った変形など微小物体２０の形状に依存した何らかの変形による微小物体２０に対する支持効果、微小物体２０と光応答性層４の表面との接触面積の増大によるファンデルワールス力等の付着力の増加効果等によるものではないかと考えられる。こうした固定化の結果、微小物体２０が抗体などの機能を備える場合であっても、その機能性が維持されていると考えられる。
【００９９】
光照射による光固定化工程は、微小物体２０の供給と同時に光固定化工程を実施してもよい。なお、光応答性層４表面の微小物体２０への光照射は、液状媒体が存在する状態で実施することもできるし、液状媒体が存在しない状態で行うこともできる。微小物体２０と光応答性層４との相互作用が一旦形成されれば、液状媒体が除去されても配向性が維持されて光固定できる。なお、光固定化工程における光照射を液状媒体の存在下に行う場合の液状媒体は、光応答性層４への微小物体２０の供給に用いた液状媒体であってもよいし、供給時の液状媒体を除去した後に別途供給された同一又は別組成の液状媒体であってもよい。
【０１００】
光固定のための光照射の方法は特に限定しない。各種の伝播光、近接場光又はエバネッセント光などの任意の光が微小物体２０の存在する光応答性層４の表面又はその近傍に到達するように照射すればよい。さらに、光照射は公知の手法を用いて光応答性層４上の一部に対して選択的に行うこともできる。例えば、光応答性層４に対する照射光の照射領域あるいは照射強度に一定の分布を与えることにより、１種又は２種以上の多数の微小物体をそれぞれ異なる特定の分布パターンに従って固定化することができる。照射光の照射領域あるいは照射強度に一定の分布を与える手段として、フォトマスクの利用及び／又は干渉光の使用が挙げられる。この方法により、微小物体２０の固定化領域が回路等を形成するように固定化を行うことができる。
【０１０１】
また、光応答性層４の表面に対する微小物体２０の光固定化には、レーザートラッピングを利用することもできる。すなわち、光応答性層４の光応答性成分が反応する波長の光を集光して照射すると、集光された部分に微小物体２０が捉えられ、その位置で光応答性層４の表面に固定化される。なお、既に説明したように光応答性層４の光応答性成分が反応しない波長の光で微小物体をレーザートラッピングし、その後、光応答性成分が反応する波長の光で微小物体を固定化することも可能である。
【０１０２】
光固定に用いる波長域は、光応答性成分において分子構造又は分子配列の変化を生じさせる波長域であればよい。こうした波長域に関する情報は、各種の入手可能な光応答性成分について容易に取得できるか又は使用に際して確認することができる。
【０１０３】
なお、光固定のための光照射については、特開２００３−３２９６８２号公報、特開２００４−９３９９６号公報及び特開２００４−２５１８０１号公報に既に記載される照射光や光照射方法を採用することができる。光固定化については、特開２００３−３２９６８２号公報、特開２００４−９３９９６号公報及び特開２００４−２５１８０１号公報において本出願人が開示しており、これらの方法を本発明における光固定化についても適用することができる。
【０１０４】
（洗浄）
次に、図３（ｃ）に示すように、微小物体２０を光応答性層４に光固定した後は、光応答性層４の洗浄工程を実施することができる。洗浄工程を実施した固相体３０は、そのままあるいはさらなる加工や修飾を施すことにより各種用途のデバイスとして用いることができるようになる。
【０１０５】
（微小物体と他の物体との相互作用の検出方法）
本発明は、こうした微小物体保持固相体３０を用いる、相互作用の検出方法も提供される。本発明の検出方法によれば、光学的検出特性及び分析特性が良好な固相担体２を用いるため、精度、感度等の良好な検出が可能である。ここでいう相互作用とは、静電的結合性相互作用、イオン結合性相互作用、水素結合性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用等が挙げられる。また、例えば、リガンドと該リガンドに対するレセプター間における相互作用、特定のアミノ酸配列や構造を有するタンパク質とこのタンパク質と親和性を有するタンパク質などの物質との間の相互作用、酵素と該酵素に対する基質との相互作用、抗原と該抗原に対する抗体との相互作用、特定塩基配列を有する核酸又は修飾核酸と、該核酸又は修飾核酸の特定塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸又は修飾核酸との相互作用等をあげることができる。本検出方法においては、微小物体２０は生体材料や生物材料等の生体成分であることが好ましく、また、こうした相互作用を光学的シグナルで検出することが好ましい。
【０１０６】
以下、本発明を、具体例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０７】
（下地層の平滑化処理の検討１）
松浪硝子株式会社製のＭＡＳコートスライドガラス（Ｓ９２１５）を担体（基板）として用いた。この担体は、スライドガラス上にアミノ基を有する層を備えている。表１に示す条件で担体の表面処理を行い、試料１〜２を作製した。ワイプ材としては、無塵対策用のセルロース製の布であるＢＥＭＣＯＴ（旭化成株式会社社製）を用いた。未処理の同一担体を比較例１とした。処理後の各試料表面を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で観察した。結果を図４に示す。
【表１】
2008170241.tif 000009
【０１０８】
図４に示すように、試料１Ａは、ふき取り処理を行う時に、数回以上強く拭き取った後に観察したものであり、試料１Ｂ及び試料２Ｂは、それぞれ１回だけ軽く拭き取った後に観察したものである。図４において、色の濃淡は高さの違いを示しており，そのスケールから凹凸の程度を知ることができる。対照例との比較から、拭き取り操作により凹凸構造が平滑化していることがわかった。また、軽く拭き取った場合の拭き取り方向に依存した洗浄の凹凸構造も、拭き取り操作によって凹凸構造が平滑化していることを支持した。なお、試料１Ａの算術平均粗さＲａを測定したところ、０．７６１ｎｍであった。
【実施例２】
【０１０９】
（下地層の平滑化処理の検討２）
実施例１と同一の担体及びワイプ材を用い、表２に示す条件で担体の表面処理を行い、それぞれ乾燥して試料３〜７を作製した。作製した各試料について、１時間常温で真空乾燥した後、原子間力顕微鏡（ＮａｎｏＳｃｏｐｅ  ＩＩＩ）で観察した。また、未処理の実施例１と同一の担体を比較例として用いた。結果を図５に示す。また、処理表面上の２μｍ×２μｍ領域で原子間力顕微鏡を用いて測定した画像を使用し、当該原子間力顕微鏡  ＮａｎｏＳｃｏｐｅ  ＩＩＩ付属のソフトウエアにおいて，Ｒｏｕｇｈｎｅｓｓコマンドによる解析を行い、算術平均表面粗さＲａ及び自乗平均表面粗さＲＭＳを求めた。これらの算出式として既に記載した数式（１）及び以下の数式（２）をそれぞれ用いた。なお、算術平均粗さＲａの計測対象領域は、１０μｍ×１０μｍの大きさの領域から、５個の上記２μｍ方形状領域を選択し、前記式により自乗平均粗さＲＭＳ及び算術平均粗さＲａを算出しこれらの平均値を測定値とした。なお、データポイント数はいずれも５１２×５１２個とした。結果を表３に示す。
【数２】
2008170241.tif 000010
【０１１０】
【表２】
2008170241.tif 000011
【表３】
2008170241.tif 000012
【０１１１】
表３に示すように、拭き取り操作によれば、水系，有機溶剤系，無溶媒系いずれの溶媒系でも担体表面を平滑化することができることがわかった。なかでも、メタノールやエタノールなどのアルコールについて好ましい結果が得られた。また、拭き取り操作によって算術平均粗さＲａが０．２３１ｎｍ〜１．１４１ｎｍ程度にまで低下し、無溶媒以外では全て１ｎｍ以下となることがわかった。これに対して、未処理の対照例では、いずれも１０ｎｍを超えていた。
【実施例３】
【０１１２】
（アゾポリマースライド表面の観察）
表４に示す処理条件で実施例１と同一の担体を同一のワイプ材を用いて処理した後、その担体上に、別途合成したアゾポリマー（ＣＮ１５、後述する実施例８参照）のピリジン溶液（１２．５ｍｇ／ｍＬ）を０．２μｍのフィルターでろ過して得られたコーティング液１００μｌをスピンコート（４０００ｒｐｍ）により供給して４０ｎｍのフィルムを成膜し、試料８を作製した。また、未処理の同一の担体から同様にしてアゾポリマースライドを作製して比較例３とした。これらの試料と比較例の表面粗さを実施例２と同様にして計測した。結果を表５に示す。
【表４】
2008170241.tif 000013
【表５】
2008170241.tif 000014
【０１１３】
表５に示すように、平滑化処理しない担体を用いた場合であっても、スピンコートにより表面粗さが大きく減少していたが、算術平均粗さＲａは２ｎｍを超えていた。これに対し、拭き取りによる平滑化処理を行った担体を用いた場合には、算術平均粗さＲａが０．４６６ｎｍ以下であり、アゾポリマー層の算術平均粗さＲａが０．５ｎｍ以下となることがわかった。
【実施例４】
【０１１４】
（標識抗体の検出）
実施例１で作製した試料１Ａ（アセトンで長手方向に強く拭き取り）と同様にして試料９Ａを、試料１Ｂ（アセトンで長手方向に弱く拭き取り）と同様にして試料９Ｂ１及び試料９Ｂ２を、それぞれ作製した。さらに、アセトンで超音波洗浄しただけの担体を比較例４として準備した。これらの担体に対して実施例３と同様にしてアゾポリマー（ＣＮ１５）をそれぞれスピンコートしてアゾポリマースライドを作製した。これらのアゾポリマースライド上にＣｙ５標識したウサギＩｇＧ抗体を各種濃度でスポッティングした。短手方向には同一濃度であり、長手方向には濃度順にスポットした。これらの蛍光像をアレイ用の蛍光スキャナーＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘで測定し、表面の蛍光を観察した。また、蛍光強度と濃度との相関性（ｒ）を算出した。結果を図６及び表６に示す。
【表６】
2008170241.tif 000015
【０１１５】
図６及び表６に示すように、拭き取り程度が強い担体から得られるアゾポリマースライド上の蛍光シグナルは明確で形状も均一であり、蛍光強度は濃度と高く相関することがわかった。これに対して、拭き取り程度が弱い担体から得られるアゾポリマースライド上の蛍光シグナルは形状が不均一でありしかも蛍光強度がばらつき、濃度との相関性も０．５〜０．９と変動した。さらに、超音波洗浄のみを行った担体から得られるアゾポリマースライド上の蛍光シグナルは、明らかに形状が不均一であり、同一濃度においても相当大きな蛍光強度のばらつきがあることがわかった。また、蛍光強度にばらつきがある場合には、そうでない場合に比べて３倍程度大きく、検出感度が大きく低下した。さらに、拭き取り程度が軽い場合には、拭いた方向（長手方向）に沿ってバックグラウンド蛍光が観測されており、担体表面における凹凸がアゾポリマー層においても現れていることを示していた。
【実施例５】
【０１１６】
（アゾポリマーの密着性）
通常のスライドガラス（シランカップリング層なし）、実施例１で使用した担体（未処理）及び実施例１で使用した担体をアセトンに浸したＢＥＭＣＯＴで強く拭き取り操作を行ったものを準備した。これらの表面に実施例３と同様にしてＣＮ１５をスピンコートしてアゾポリマースライドを作製した。これら３種類のアゾポリマースライドをｐＨ７．４のＰＢＳ溶液に浸して，３時間溶液を強く攪拌した。その後，アゾスライドを取り出して，サンプル表面を観察したところ，通常のスライドガラスを担体に用いた時には，表面のアゾポリマーが大部分剥離してしまっていたが、後者の２つではまったく剥離することなく，見かけ上変化はなかった．強くふき取り操作を行ったフィルムにおいても十分な密着性が確保されていることが示された．
【実施例６】
【０１１７】
（アゾポリマー層形成条件の検討）
スピンコートを行うときの雰囲気湿度を、表７に示すように、７０％ＲＨ、５０％ＲＨ及び４０％ＲＨと異ならせてアゾポリマー層を形成し、得られるアゾポリマー層の比較を行った。アゾポリマー層を形成する担体としては、実施例１における試料１Ａと同様に処理したものを用いた。なお、５０％ＲＨ以下の雰囲気は、乾燥窒素ガスをスピンコーター内に導入することによって形成した。雰囲気湿度が異なる以外は同一条件でアゾポリマー層を担体表面に形成し、形成したアゾポリマーを肉眼及び光学顕微鏡で観察した。結果を表７に併せて示す。
【表７】
2008170241.tif 000016
【０１１８】
表７に示すように、７０％ＲＨ下では、表面の大部分が曇ったアゾポリマースライドを得、５０％ＲＨ下では、おおよそ透明なアゾポリマースライドを得ることができ、４０％ＲＨ以下では全面が透明で光学的に均一なアゾポリマースライドを得ることができた。また、曇ったアゾポリマースライドの表面を光学顕微鏡で観察したところ、表面に多くのボイドが観測された。一方、５０％ＲＨで作製したアゾポリマースライドは、ボイドは観測されなかった。すなわち、これらの曇りは、ボイドに起因する散乱によるものであることがわかった。以上のことから、雰囲気湿度を５０％ＲＨ以下とすると光学的に均一でしかもボイドが抑制されて微小物体の保持性に優れるアゾポリマー層が得られ、さらに４０％ＲＨ以下であるとより光学的均一性、平滑性及び微小物体の保持性に優れるアゾポリマー層が得られることがわかった。
【０１１９】
また、後述する実施例８で合成したＣＮ１００のアゾポリマーを用いて種々の条件でアゾポリマースライドを作製し、曇りのあるスライドと曇りのないスライドのアゾベンゼンの吸収が認められない波長（７００ｎｍ）（ベースライン領域）での吸光度を測定した。なお、対照としてアゾポリマー層を形成する前の担体を用いた。結果は、曇りを生じているスライドでは、０．０４２６（７００ｎｍ）（λｍａｘ４４９．５ｎｍ、ａｂｓ．０．４０２１）であり、曇りを生じてないスライドでは、０．００６５（７００ｎｍ）（λｍａｘ４４８．０、ａｂｓ．０．２６４４）であった。すなわち、曇りを生じていないスライドでは、ベースライン領域の波長において０．０１以下となることがわかった。したがって、こうした波長域にて吸光度を測定することで、簡易にボイドの有無ないしは表面平滑性を評価できることがわかった。
【０１２０】
一方、７０％ＲＨ下、アゾポリマー（ＣＮ１５）のスピンコート直前に担体表面をドライヤーにて数秒間加熱して、それから溶液を滴下してスピンコートを行ったところ、全面が透明で光学的に均一な透明フィルムを得ることができた。
【０１２１】
以上のことから、雰囲気湿度を下げるかあるいは担体表面又はその近傍の水分を除去することが、光学的な均一性、すなわち、表面平滑性に優れ、しかも微小物体の保持性に優れるアゾポリマー層を得るのに有効であることがわかった。
【実施例７】
【０１２２】
（アゾポリマー層の加熱処理条件の検討）
実施例１の試料１Ａと同様にして処理して作製した担体に対して、アゾポリマー（ＣＮ１５、ガラス転移温度１１７℃）を用いて実施例３と同様にしてスピンコートを行い、その後、表乾燥条件として、表８に示すように、（１）室温で２４時間真空乾燥、（２）６０℃で２時間真空乾燥、（３）１２０℃で１時間真空乾燥及び（４）１２０℃で２４時間真空乾燥での真空乾燥をそれぞれ行い、２種類のアゾポリマースライドを作製した。これらの各スライドに対して、アクチンのたんぱく質を溶解した水溶液（５０μｇ／ｍｌ）を滴下し、ギャップカバーガラスで覆った後、上方約２ｃｍより青色ＬＥＤを照射しながら光固定を行った。光固定終了後、スライドを洗浄し、表面をＡＦＭで観察した。結果を表８に併せて示す。
【表８】
2008170241.tif 000017
【０１２３】
表８に示すように、乾燥条件（１）及び（２）のアゾポリマー層においては、いずれも多数のクラックが発生していた。また、乾燥条件（３）のアゾポリマー層でも、クラックの発生は抑えられていたもののわずかに残存していた。乾燥条件（４）のアゾポリマー層では、クラックの発生は抑えられていた。なお、いずれの条件であっても、固定化されたアクチン分子を確認することができた。以上のことから、アゾポリマー層の成膜時における乾燥工程あるいはその後において、ポリマー層のガラス転移温度以上に加熱することで、アゾポリマー層に内在する応力を緩和してクラックの発生の抑制された平滑性が良好で、光学的特性及び微小物体保持性に優れた固相担体及び微小物体保持固相体が得られることがわかった。
【実施例８】
【０１２４】
（アゾポリマーの合成）
常法に従いアゾポリマーを合成した。合成スキームを図７に示す。まず、公知のジアゾカップリング法を用いて図７に示すに示す化合物Ａ（２種類）を合成した。次に、公知の酸クロリドとの反応により、化合物Ｂを合成した。これらの化合物Ａ及び化合物Ｂにおいて、アゾベンゼン構造部分が光応答性成分を構成している。
【０１２５】
化合物Ａを単独重合又は化合物Ａと市販のメタクリル酸メチルとを、表９に示す各種比率で共重合し、高分子化合物Ｃを合成した。
【表９】
2008170241.tif 000018
【０１２６】
なお、共重合反応の詳細は以下のとおりである。表９に示す各配合のモノマー混合物（合計１０ｍｍｏｌ）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、４０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解した。室温で３０分間窒素バブリングを行った後、窒素気流下、６０〜７０℃で４時間撹拌して重合反応を行った。反応溶液を室温まで冷却した後に、反応溶液をメタノール（５００ｍｌ）にゆっくりと滴下した。沈殿したポリマーをろ過により回収し、アセトン（１０ｍｌ）に溶解した。アセトン溶液をメタノール（５００ｍｌ）にゆっくりと滴下し、再度ポリマーを沈殿させた。ポリマーをろ過により回収し、４０℃で一晩真空乾燥させることにより、アゾポリマーを得た。
【０１２７】
得られたアゾポリマーの共重合比は、重クロロホルム溶媒で、日本電子製の超伝導フーリエ変換核磁気共鳴装置（ＪＮＭ−ＬＡ５００）を用いて１Ｈ−ＮＭＲを測定し、プロトンの積分値から算出した。また、分子量は、クロロホルム溶媒で、昭和電工（株）製のＧＰＣ（ＳｈｏｄｅｘＧＰＣ−１０１、カラム：Ｋ−８００ＲＬ＋Ｋ−８０５Ｌ×２）を用いて測定し、ポリスチレン換算の分子量を算出した。なお、表９には、化合物ＢにおいてＸがＮＯ２であり所定の配合比のモノマー混合物を上記と同様にして重合して得たアゾポリマーについても示す。
【実施例９】
【０１２８】
（アゾポリマー層を有する光固定化用固相担体の作製及び評価）
実施例１の試料１Ａと同様にして処理して得た担体の表面に実施例３と同様にして実施例８で合成した１０種類のアゾポリマーのピリジン溶液をスピンコートして成膜し（４０ｎｍ）、光固定化用固相担体１〜１０を得た。
【０１２９】
１．光変形能の評価
得られた光固定化用固相担体１〜１０につき、以下の方法で光変形能の評価を行った。評価方法の概要を図８に示す。すなわち、ポリスチレンの微小球（直径２５０ｎｍ）を一定量含む液体の一定量をアゾポリマー層表面に滴下し、その状態で所定強度の青色ＬＥＤ（波長４６５ｎｍ〜４７５ｎｍ）を一定時間照射した後、微小球を除去して、除去後の表面をＡＦＭで観察し、微小球の光固定の過程で生じた変形量（凹部の深さ）を測定した。結果を表１０に示す。
【表１０】
2008170241.tif 000019
【０１３０】
表１０に示すように、アゾ（Ｈ）ポリマー及びアゾ（ＣＮ）ポリマー間において変形量に大きな差は認められなかった。
【０１３１】
２．タンパク質の光固定化と活性の評価
光固定化用固相担体１、３，４，６〜９に対するタンパク質の光固定化と固定化されたタンパク質の活性について評価した。すなわち、これらの担体のアゾポリマー層表面にＣｙ５で標識した一定濃度のＩｇＧ溶液に浸漬した状態で、所定強度の青色ＬＥＤ（波長４６５ｎｍ〜４７５ｎｍ）を一定時間照射した後、洗浄して、蛍光強度を測定した。蛍光強度の観測結果から、光固定化固相担体８（アゾポリマー：ＣＮ１５）の蛍光強度を１００としたときの比を比固定化能として表１１に示す。
【表１１】
2008170241.tif 000020
【０１３２】
表１１に示すように、アゾ（Ｈ）ポリマーは十分にタンパク質を固定化する能力を有していることがわかった。特に、光固定化用固相担体（アゾポリマー：Ｈ１１）は、良好な固定化能を示した。
【０１３３】
３．アゾポリマーの吸収スペクトル
実施例８で合成したアゾ（Ｈ）ポリマー（Ｈ１１）及びアゾ（ＣＮ）ポリマー（ＣＮ１５）について吸光光度計にて吸収スペクトルを測定した。また、Ｃｙ３及びＣｙ５についても蛍光光度計にて蛍光スペクトルを測定した。参考例としてアゾ（ＮＯ2）ポリマーの吸収スペクトルも測定した。これらの結果をまとめて図９に示す。図９に示すように、アゾ（Ｈ）ポリマー及びアゾ（ＣＮ）ポリマーは、アゾ（ＮＯ2）ポリマーに比べて短波長側に吸収スペクトルがシフトしていることがわかった。特に、アゾ（Ｈ）ポリマーはアゾ（ＣＮ）ポリマーよりも短波長側にシフトしていた。この結果によれば、光固定化用固相担体の表層の自家蛍光を一層抑制できて、蛍光色素による検出感度を向上できることがわかった。
【０１３４】
４．アゾポリマー層における蛍光色素の検出
光固定化用固相担体１，３，４，６，７及び８について、Ｃｙ５及びＣｙ３の検出波長での蛍光強度を計測した。また、各種濃度のＣｙ５及びＣｙ３濃度の溶液を調製し、等量をアゾポリマー層上にスポッティングして、シグナル／バックグラウンドが２以上となる蛍光標識の最小濃度を検出感度とした。これらの結果を表１２及び表１３に示す。
【表１２】
2008170241.tif 000021
【表１３】
2008170241.tif 000022
【０１３５】
表１２に示すように、アゾ（ＣＮ）ポリマーに比較してアゾ（Ｈ）ポリマーのＣｙ３の検出領域におけるバックグラウンド値は約１０分の１程度であった。また、表１３に示すように、アゾ（Ｈ）ポリマー層を有する光固定化用固相担体のＣｙ３の検出領域における検出感度は、５〜２０ｐｇ／ｍｌであり、アゾ（ＣＮ）ポリマーを備える光固定化用固相担体のそれよりも１０倍〜２５倍であった。以上のことから、アゾ（Ｈ）ポリマーを光固定化層とする固相担体は、バックグラウンドが低く、光学的検出特性、特に、Ｃｙ３などの汎用標識についての光学的検出特性に優れる固相担体であることがわかった。また、Ｃｙ３及びＣｙ５など複数の蛍光標識を同等の感度で検出するのに適していることもわかった。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】本発明の光固定化用固相担体の一例を示す図。
【図２】本発明の光固定化用固相体の製造工程の一例を示す図。
【図３】本発明の微小物体保持固相体の製造工程の一例を示す図。
【図４】実施例１における平滑化処理後の担体表面のＡＦＭ像を示す図。
【図５】実施例２における平滑化処理後の担体表面のＡＦＭ像を示す図。
【図６】実施例４における標識抗体の蛍光像を示す図。
【図７】アゾポリマーの合成スキームを示す図。
【図８】光変形能の評価方法の概要を示す図。
【図９】各種アゾポリマーと蛍光標識のスペクトルを示す図。
【符号の説明】
【０１３７】
２  光固定化用固相担体、４  光応答性層、６  マトリックス、８  支持体、１０  下地層、１２  担体、２０  微小物体、３０  微小物体保持固相体。
【図１】
2008170241.tif 000023
【図２】
2008170241.tif 000024
【図３】
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【図４】
2008170241.tif 000026
【図５】
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【図６】
2008170241.tif 000028
【図７】
2008170241.tif 000029
【図８】
2008170241.tif 000030
【図９】
2008170241.tif 000031