(57)【要約】【課題】植物における防御タンパク質を含む免疫グロブリンの発現およびこのような免疫グロブリンを発現するトランスジェニック植物を開発することが本発明の課題である。これらの免疫グロブリンの哺乳動物への治療的使用の開発もまた課題とする。【解決手段】少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖と会合した防御タンパク質を含み、かつ植物内で産生されている、免疫グロブリンを提供することにより解決される。【選択図】図１
2008194054.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖と会合した防御タンパク質を含み、かつ植物内で産生されている、免疫グロブリン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファンレンス
これは、本発明に参考として包含させる１９９４年１２月３０日出願の同時継続出願番号第０８／３６７,３９５号の一部継続出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、植物における防御タンパク質を含む免疫グロブリンの発現およびこのような免疫グロブリンを発現するトランスジェニック植物に関する。これらの免疫グロブリンの治療的使用にもまた関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
モノクローナル抗体は、多くの治療目的に非常に可能性を有する。モノクローナル抗体治療の慣用医薬を越える利点は、その著しい選択性、多重エフェクター機能および分子操作、例えば放射性同位元素標識および他のタイプの結合の行い易さを含む。広範な標的抗原が特異的モノクローナル抗体を製造するのに使用されている。例えば、Ｔherapeutic Ｍonoclonal Ａntibodies, Ｃ.Ａ.Ｋ. ＢorrebaeckおよびＪ.Ｗ. Ｌarrick編, Ｓtockton Ｐress, Ｎew Ｙork, 1990およびＴhe Ｐharmacology of Ｍonoclonal Ａntibodies, Ｍ. ＲosenbergおよびＧ.Ｐ. Ｍoore編, Ｓpring-Ｖerlag, Ｂerlin. 1994参照。
モノクローナル抗体の一つの治療的使用は、外因性に製造した免疫グロブリンを直接、処置する動物に注射または経口により投与する、受動免疫治療である。成功するには、受動免疫治療は処置する動物の免疫応答に拠るものではないため、受動免疫治療は適切な量の免疫グロブリンを動物に送達しなければならない。投与する免疫グロブリンは処置を行うことが望ましい病原菌または分子に特異的でなければならない。受動免疫治療の一つの利点は、正常免疫応答と比較した、抗体が標的に接触し得る速度である。受動免疫治療は疾病または感染が発症するのを予防する予防剤としても使用できる。
【０００４】
受動免疫治療の主要な使用の可能性は、細菌感染を防除することである。近年の抗生物質耐性細菌の出現は、受動免疫治療による細菌感染の処置を望ましいものにしている。一つの病原菌を標的にした抗生物質処置は、しばしば正常微生物の大集団の絶滅を含み、これは望ましくない副作用をもたらし得る。別の試みは、非常に特異的な微生物集団における特異的病原機能を阻止するための免疫グロブリンの固有な特異性の利用である。この概念において、適切な特異性の精製免疫グロブリンを病原菌侵入の受動障壁を提供するために投与する。
【０００５】
加えて、例えば、免疫グロブリンの経口投与のための受動免疫治療に使用する免疫グロブリンは、ある要求を満たさなければならない。第１に、免疫グロブリンは胃腸管のような非常に厳しい環境で機能しなければならない。第２に、免疫グロブリンは標的を不活性化する前に分解されないように、プロテアーゼの作用に耐性でなければならない。
【０００６】
上皮細胞および肝細胞を含むあるタイプの細胞は、厳しい環境で機能するのに特に適した免疫グロブリンの集合(assemble)をできる。これらの免疫グロブリンは、分泌型免疫グロブリン(ＳＩｇ)と呼ばれ、分泌型ＩｇＡ(ＳＩｇＡ)および分泌型ＩｇＭ(ＳＩｇＭ)を含む。内因性分泌型免疫グロブリンにより提供される防御は証明されている。分泌型免疫グロブリンによる細菌感染から防御するための幾つかの機構が提案されており、直接の殺菌、凝集、外皮への結合および侵入の阻害、酵素および毒素の不活性化、オプソニン作用および補体活性化を含むが、これらに限定されない。動物において、内因性ＳＩｇＡは、消化および細菌性酵素のような多くのプロテアーゼが非常に活性で、胃酸のような変性剤も存在する非常に苛酷な環境にさらされる。
【０００７】
分泌型免疫グロブリンの一つの成分である分泌成分は、免疫グロブリンをこれらの不活性化剤に対して防御するのを助け、それにより分泌型免疫グロブリンの生物学的効果を増加させる。
【０００８】
ＳＩｇＡまたはＳＩｇＭのようなこれらの分泌型免疫グロブリンの合成および集合の機構は非常に複雑である。動物細胞において、分泌型免疫グロブリンは異なる細胞型が含まれる工程で集合する。各分泌型免疫グロブリンは、免疫グロブリン重および軽鎖、結合鎖(Ｊ鎖)および分泌成分からなる。免疫グロブリン製造Ｂ細胞は免疫グロブリン重および軽鎖をＪ鎖と共に製造し、集合させ、二量体または多量体ＩｇＭまたはＩｇＡを製造する。分泌成分は、上皮細胞または肝細胞の何れかである細胞の第２のタイプで製造され、分泌型免疫グロブリンがこれらの細胞中で集合し、そこから分泌される。これらの細胞が分泌型免疫グロブリンを集合させ、分泌させる機構は非常に複雑であり、例えば、粘膜組織により提供される独特な微細環境を必要とする。微細環境は、多量体免疫グロブリンを産生するＢ細胞を、免疫グロブリンを集合させ、動物の粘膜表面に分泌させる細胞の近くに置く。
【０００９】
上皮細胞は、多量体免疫グロブリン／Ｊ鎖含有を特異的に認識および結合し、それを内部移行させ、上皮細胞を経由して輸送する受容体であるポリ免疫グロブリン受容体(ｐＩｇＲ)を有する。側底細胞表面上へ発現して、ｐＩｇＲは１８アミノ酸のＮ−末端シグナルペプチド、６２９アミノ酸の細胞外ポリ免疫グロブリン結合部分、２３の疎水性残基の膜伸長セグメント、１０３アミノ酸の細胞質テールを有する。細胞外部分は、それぞれ１００−１１１アミノ酸の５つの免疫グロブリン様ドメインを含み、分子の分泌形を形成する。例えば、Ｍostov, Ａnn. Ｒev. Ｉmmol., 12:63-84(1994)参照。ポリ免疫グロブリン受容体が成熟分泌成分を産生するために開裂される部位は正確に決定されていない。
【００１０】
ポリ免疫グロブリン受容体は動物上皮細胞の側底表面(basolateral surface)に位置する。Ｂ細胞中で製造される多量体、Ｊ鎖含有免疫グロブリンは、受容体と相互作用し、結合し、小胞化、上皮細胞を経由した輸送および最後に粘膜表面への分泌をもたらす。上皮細胞経由輸送はまたタンパク質分解およびリン酸化も関与し、分泌成分を含む成熟ＳＩｇを製造する。粘膜微細環境で見られる必要な細胞、特にＢリンパ球と上皮細胞の緊密な関係は、分泌型免疫グロブリン集合に必要である。
【００１１】
トランスジェニック生物、例えばマウスにおける免疫グロブリンの製造のターゲンティングは非常に困難であり、真菌または植物から作られたトランスジェニック生物は、分泌型免疫グロブリンを製造するための適切な細胞型および粘膜微細環境を含まない。トランスジェニック生物および細胞培養中の大量の分泌型免疫グロブリンの製造は、本発明の前は不可能であった。細胞培養中またはトランスジェニック生物中に分泌型免疫グロブリンを製造したいと望む者は、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖およびＪ鎖をＢリンパ球中に発現しなければならない。機能的分泌型免疫グロブリンを集合させる試みですら、正しい粘膜微細環境を模倣するために、その表面にｐＩｇＲ受容体を有する細胞もまた存在させ、そのＢリンパ球と緊密に関係させなければならない。
【００１２】
天然分泌成分集合に必要なこの手の込んだ工程は、細胞培養中またはトランスジェニック生物中で複製するのが非常に困難である。細胞培養中またはトランスジェニック生物中でのＳＩｇの製造は、免疫グロブリンを産生する細胞の機能と上皮細胞の機能を人工的(イン・ビトロ)システムで組み合わせることが必要である。更に、望ましいトランスジェニック生物が真菌、細菌または植物である場合、受容体媒体細胞性内面化、トランスサイトシスおよび分泌の細胞型および経路は単に存在しない。これらの生物は上皮細胞および必要な粘膜微小環境を欠く。
【００１３】
今日まで、同じ細胞内での軽、重およびＪ鎖を有する免疫グロブリンの集合のみが報告されている。Ｃarayannopoulos et al., Ｐroc. Ｎat Ａcad. Ｓci., USA, 91:8348-8352(1994)参照。しかしながら、付加タンパク質成分、分泌成分を有する免疫グロブリンの一細胞内での集合は記載されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、これらの複合分子の集合の新規な方法を記載する。膜結合ポリ免疫グロブリン受容体と免疫グロブリンの相互作用による上皮細胞表面での四量体複合体の集合よりむしろ、我々は、ｐＩｇＲ由来の防御タンパク質と会合したアルファ、Ｊおよびカッパ免疫グロブリン鎖からなる分泌型免疫グロブリンを集合させた。本発明は、非常に効率的に分泌型免疫グロブリンを集合させるトランスジェニック植物を製造する。本発明は、受動免疫治療を経済的に実行可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の要約
本発明は免疫グロブリン分子の新規タイプに関する。本発明の免疫グロブリンは少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖と会合した(in association)防御タンパク質を含む。他の態様において、本発明の免疫グロブリンは、更に、免疫グロブリン由来重鎖と結合した少なくとも抗原結合ドメイン部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖を含む。
【００１６】
本発明の防御タンパク質は、これらのタンパク質を含む免疫グロブリンに化学的および酵素的分解に対する耐性および変性に対する耐性を含む有用な特性を付与する。これらの防御タンパク質は免疫グロブリンの環境条件への耐性が増加する。
【００１７】
本発明のタンパク質の防御タンパク質は、任意の種の天然ポリ免疫グロブリン受容体(ｐＩｇＲ)の少なくともアミノ酸残基１から６０６のセグメントを含む。他の有用な防御タンパク質は、ｐＩｇＲ分子の一部を含む防御タンパク質を含む。例えば、防御タンパク質は：アミノ酸１−１１８(ウサギｐＩｇＲのドメインＩ)、アミノ酸１から２２３(ウサギｐＩｇＲのドメインＩおよびII)；アミノ酸１から３３２(ウサギｐＩｇＲのドメインＩ、II、III)；アミノ酸１から４４１(ウサギｐＩｇＲのドメインＩ、II、IIIおよびIV)；アミノ酸１から５５２(ウサギｐＩｇＲのドメインＩ、II、III、IVおよびＶ)；およびｐＩｇＲのアミノ酸１から６０６または１から６２７の全てまたは一部を含む。ｐＩｇＲ配列６５３−７５５または他の源のいずれか由来の付加アミノ酸が、機能的膜通過伸長セグメントを形成しない限り、含まれ得る。
【００１８】
他の好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基１から６０６または１から６２７に対応する第１アミノ酸配列および第１アミノ酸配列に隣接した第２アミノ酸残基配列(ここで、第２アミノ酸残基配列はウサギポリ免疫グロブリン受容体の膜通過セグメントに対応するアミノ酸残基配列を有しない)を有する防御タンパク質を有する。
【００１９】
更に好ましい態様において、第２アミノ酸残基配列は、少なくともポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基６５５から７５５に対応するアミノ酸配列の部分を有する。他の好ましい態様において、第２アミノ酸残基は少なくとも以下のものの一個またはそれ以上の部分である；ポリ免疫グロブリン分子の細胞内ドメイン、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーのドメイン、酵素、毒素またはリンカー。
【００２０】
本発明は、ウサギポリ免疫グロブリンの膜通過セグメントに対応するアミノ酸残基を有しないが、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の細胞内ドメインに対応するアミノ酸残基を有し得る防御タンパク質に関し、これは受容体の欠失変異体である。
【００２１】
本発明はまた、ウサギ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基２８８から７５５に類似の種由来のポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基を含まないが、アミノ酸セグメント：ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基２０−４５に対応するアミノ酸；ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基１から１２０に対応するまたは類似のアミノ酸：ウサギ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基数１２０から２３０に対応するまたは類似のアミノ酸；ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基数２３０−３４０に対応するまたは類似のアミノ酸；ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基３４０−４５６に対応するまたは類似のアミノ酸；ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基数４５０−５５０から５７０に対応するまたは類似のアミノ酸；ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基５５０から５７０−６０６から６２７に対応するまたは類似のアミノ酸の少なくとも１個またはそれ以上と類似の種のポリ免疫グロブリン受容体由来のアミノ酸残基またはドメインの部分を有する防御タンパク質を含む免疫グロブリンに関する。
【００２２】
本発明の防御タンパク質は、多くの種由来であり得、哺乳類、囓歯類、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、家禽、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、ニワトリまたは他の鳥類およびウサギ由来の防御タンパク質を含む。
【００２３】
好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、防御タンパク質に結合する少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する２個または４個の免疫グロブリン由来重鎖および免疫グロブリン由来重鎖のそれぞれに結合した少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する２個または４個の免疫グロブリン由来軽鎖を含む。
【００２４】
他の好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、少なくとも一つの免疫グロブリン由来重鎖に結合した免疫グロブリンＪ鎖を更に含む。好ましい態様においては、本発明の免疫グロブリンの成分パーツは、水素結合、ジスルフィド結合、共有結合、イオン性相互作用またはこれらの結合の組み合わせにより互いに結合する。他の好ましい態様においては、本発明の免疫グロブリンは、Ｎ−結合および／またはＯ−結合オリゴサッカライドを含まない、防御タンパク質および／または免疫グロブリン由来重、軽またはＪ鎖を含む。
【００２５】
本発明の免疫グロブリンは例えば、粘膜病原体抗原に対して、治療的免疫グロブリンとして使用し得る。好ましい態様においては、本発明の免疫グロブリンはＳ. mutans血清型ｃ、ｅおよびｆ；およびＳ. sobrinus血清型ｄおよびｇ、より古い命名法ではＳ. mutans  ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈ由来の抗原に結合することにより、虫歯を防止できる。
【００２６】
本発明はまた本発明の免疫グロブリンを含む、植物細胞を含む真核生物にも関する。防御タンパク質をコードするヌクレオチド配列および少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞を含む真核細胞にもまた関する。少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖をコードするヌクレオチド配列を更に含む、植物細胞を含む真核細胞にも関する。好ましい態様において、抗原結合ドメインを有する免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む本発明の植物細胞を含む真核細胞は、Ｓ. mutans血清型ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｇ、ｈ(新しい命名法ではＳ. mutans血清型ｃ、ｅおよびｆ；およびＳ. sobrinus血清型ｄおよびｇ)由来の抗原に結合できる。ＲＮＡおよび適当なＤＮＡ分子を含むヌクレオチド配列を発現のために配列できる。
【００２７】
好ましい態様において、本発明の植物細胞は全植物のような植物の一部である。本発明は、全てのタイプの植物、アルファルファおよびタバコを含む双子葉植物および単子葉植物の両方の使用を含む。
【００２８】
本発明はまた本発明の免疫グロブリンおよび本発明の実施に有用な植物の一つ由来の植物高分子物質を含む組成物にも関する。特に、リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ、集光性複合体、色素、二次代謝物またはクロロフィルおよび本発明の免疫グロブリンを含む組成物に関する。好ましい組成物は、水以外の質量の０.００１％から９９.９％の間の免疫グロブリン濃度を有する。より好ましい態様においては、組成物中に存在する免疫グロブリンの濃度は０.１から９９％の間である。他の好ましい組成物は、水以外の質量の１％から９９％の間の植物高分子物質を有する。
【００２９】
本発明はまた、植物細胞中への、転写プロモーターと操作可能に結合した、防御タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する発現ベクターの挿入；および同じ植物細胞への、転写プロモーターと操作可能に結合した、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖をコードする配列を含む発現ベクターの挿入を含む、本発明の免疫グロブリンの製造法にも関する。他の方法は、更に、同じ植物細胞への、転写プロモーターと操作可能に結合した、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖をコードするヌクレオチドを含む発現ベクターの挿入の段階を含む。他の好ましい方法は、また、植物細胞への、転写プロモーターと操作可能に結合した免疫グロブリンＪ鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターの挿入も含む。
【００３０】
本発明は、発現のために操作可能に結合した少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン重鎖、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリンＪ鎖および防御タンパク質をコードするヌクレオチド配列の真核細胞への挿入による集合免疫グロブリン重、軽およびＪ鎖および防御タンパク質を製造する方法にも関する。本方法は、更に、防御タンパク質を含む免疫グロブリンを形成させるための、免疫グロブリン由来重および軽鎖と免疫グロブリンＪ鎖および防御タンパク質の製造および集合を可能にする条件下に真核細胞を維持することを含む。
【００３１】
本発明はまた、免疫グロブリン重鎖由来の少なくとも望ましい抗原結合ドメインの部分をコードするヌクレオチドを、免疫グロブリンμまたはα(ＩｇＭまたはＩｇＡ)重鎖(または環境に増加した安定性を有する他の免疫グロブリン)由来の少なくとも一つのドメインをコードするヌクレオチド配列と操作可能に結合させ、キメラ免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を形成させ、そのヌクレオチド配列を真核生物中で発現させることによる種々の環境的条件および厳しい条件に耐性(より安定)な免疫グロブリンの製造法にも関し、それはまた以下に列記の少なくとも一つの分子も含む：防御タンパク質、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖および免疫グロブリンＪ鎖。本方法は、更に、キメラ免疫グロブリン重鎖を、同じ細胞中に存在する他の分子と集合させ、環境的条件に耐性であり、より安定な免疫グロブリンを製造することを含む。
【００３２】
本発明の免疫グロブリンの大規模製造は、本発明の植物を生育させ、免疫グロブリンをこれらの植物から抽出することにより考慮される。好ましい態様においては、植物高分子物質を含む治療的免疫グロブリン組成物の製造法は、圧力下で、本発明の植物の一部を切り、植物のアポプラストまたはシンプラスト由来の液体中に治療的免疫グロブリンおよび植物高分子を含み、かつ固体植物由来物質を含むパルプを産生する段階を含む。更に、処理段階は、固体植物由来材料を液体から分離することを含み、葉、幹、塊茎、花、果実、種子を含む植物の部分または全植物を使用することに関する。本発明は、植物のアポプラストまたはシンプラスト由来の液体を放出し、続いて、所望により、遠心、沈殿、フロキュレーションまたは濾過を使用して分離する機械または酵素的方法の使用を考慮する。
【００３３】
本発明は、キメラであり、したがって異なる免疫グロブリン由来の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンに関する。特に好ましくは、免疫グロブリンはＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡのドメインを含む。
【００３４】
本発明は、免疫グロブリン由来重鎖が二つの異なる免疫グロブリンのアイソタイプ由来の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンに関する。好ましい態様において、使用する免疫グロブリンドメインは、少なくともマウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインもしくはＣvarドメインを含む。他の好ましい態様において、免疫グロブリン重鎖は、マウスＩｇＭのＣμ１、Ｃμ２、Ｃμ３またはＣμ４ドメインから成る。
【００３５】
本発明はまた、ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２またはＩｇＤの少なくともＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン；またはヒトＩｇＭの少なくともＣμ１、Ｃμ２、Ｃμ３またはＣμ４ドメイン；またはＣvarドメインを含む免疫グロブリンを構成する免疫グロブリン由来重鎖に関する。ＩｇＧイソタイプ、ＩｇＡイソタイプ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤを含む、哺乳類、動物または囓歯類由来の免疫グロブリンドメインの使用が考慮される。
【００３６】
本発明はまた、それぞれ異なるマルチペプチド分子のポリペプチド(ここで、少なくともこれらの一つはマルチペプチド分子を形成するために互いに関連している)をコードする４つの異なるトランスジーンを含む細胞を含む、テトラトランスジェニック生物にも関する。本発明により考慮されるトランスジェニック生物は、存在する４つのトランスジーンの一つとして防御タンパク質をコードするトランスジーンを含むトランスジェニック生物に関する。トランスジェニック生物細胞中に存在する防御タンパク質は、防御タンパク質を含む免疫グロブリンを形成するために、存在する場合、免疫グロブリン重鎖と集合できる。
【００３７】
好ましいトランスジェニック生物において、生物の細胞は、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する重鎖由来免疫グロブリン、少なくとも抗原結合ドメインの部分を含む免疫グロブリン由来軽鎖、免疫グロブリンＪ鎖および防御タンパク質をコードする４つのトランスジーンを発現する。他の好ましいトランスジェニック生物において、細胞は、キメラ免疫グロブリン重鎖、ＩｇＡ重鎖由来免疫グロブリン重鎖、ＩｇＭ重鎖由来免疫グロブリンまたは重鎖の他のアイソタイプ由来の免疫グロブリンをコードするトランスジーンを含む。
【００３８】
最も好ましい態様において、本発明のトランスジェニック生物は植物である。植物の種々のタイプおよび種が、本発明により考慮される。加えて、本発明はまた本発明の種々の分子を含むトランスジェニック生物である哺乳類も考慮する。哺乳類トランスジェニック生物は本発明により考慮され、異なるポリペプチドをコードする４つのトランスジーンを含む哺乳類トランスジェニック生物を含む。
【００３９】
図面の簡単な説明
図面を最初に簡単に説明する。
【００４０】
図１は、ハイブリッドＩｇＧ／Ａ重鎖の構築におけるＧuy's 13およびアルファ鎖ドメインＤＮＡフラグメントの増幅に使用した合成オリゴヌクレオチドＪ１−Ｊ５(制限酵素部位は下線を引いている)を説明する。各オリゴヌクレオチドによりコードされる領域の相対的位置を図式的に示す。植物中に発現される種々のＤＮＡフラグメントを合わせることにより製造する得られる組換え重鎖も示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
発明の詳細な説明
Ａ．定義
双子葉植物(双子葉)：胚芽が二つの半分の種子または子葉を有する顕花植物。双子葉の例は：タバコ；トマト；アルファルファを含むマメ科植物；オーク；カエデ；バラ；ハッカ；カボチャ；ヒナギク；クルミ；サボテン；スミレ；およびキンポウゲである。
単子葉植物(単子葉)：胚芽が一つの子葉または種子葉を有する顕花植物。単子葉の例は：ユリ；芝生；トウモロコシ；オート麦、小麦および大麦を含む穀類；ラン；アイリス；タマネギおよびヤシである。
下等植物：シダ、裸子植物、球果植物、トクサ、ヒカゲノカズラ、ゼニゴケ、ツノゴケ、コケ、紅藻類、褐藻類、配偶体、シダ植物の胞子体および緑藻類を含む非顕花植物。
真核ハイブリッドベクター：その手段により、ポリペプチドをコードするＤＮＡ(挿入体)を真核細胞に挿入できるＤＮＡ。
染色体外リボソームＤＮＡ(ｒＤＮＡ)：リボソームＲＮＡをコードする１個またはそれ以上の遺伝子を有し、自主的に複製する(染色体の複製と無関係)、単細胞真核細胞内で染色体の外に見られるＤＮＡ。
回帰性ＤＮＡ：１個またはそれ以上の対称性中心を有するＤＮＡ。
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸。
Ｔ−ＤＮＡ：移入ＤＮＡのセグメント。
ｒＤＮＡ：リボソームＤＮＡ。
ＲＮＡ：リボ核酸。
ｒＲＮＡ：リボソームＲＮＡ。
Ｔｉ−プラスミド：癌誘発プラスミド。
Ｔｉ−ＤＮＡ：Ｔｉ−プラスミド由来のＤＮＡのセグメント。
挿入体：構造遺伝子および所望により付加ＤＮＡ配列を含む、ｒＤＮＡに無関係のＤＮＡ配列。
構造遺伝子：ポリペプチドをコードする遺伝子であり、適当なプロモーター、停止配列および所望により他の調節ＤＮＡ配列を伴い、正しいリーディングフレームを有する。
シグナル配列：ポリペプチドを小胞体に結合させ、ポリペプチドに結合したアミノ酸配列をコードする、タンパク質分泌に必須である、ＤＮＡ配列。
(選択)遺伝子マーカー：その手段により形質転換細胞が非形質転換細胞から選択できる、表現型形質をコードするＤＮＡ配列。
プロモーター：遺伝子の発現制御要素を発現し、それにＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合し、その遺伝子のＲＮＡ合成(転写)を開始させる、ＤＮＡ配列またはＤＮＡ配列のグループの認識部位。
【００４２】
誘導性プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼ結合および開始の速度を外的刺激により調節する所のプロモーター。このような刺激は光、熱、無酸素ストレス、栄養条件の置換、代謝物の存在または非存在、リガンドの存在、微生物攻撃、傷等を含む。
ウイルスプロモーター：ウイルス遺伝子の５'末端に見られるプロモーターと実質的に同一のＤＮＡ配列を有するプロモーター。典型的ウイルスプロモーターは、Ｈuang et al., Ｃell, 27:245(1981)記載のＭＭＴＶのｐ２１タンパク質をコードする遺伝子の５'末端に見られる。他の例は、Ｂenfey et al., Ｓcience, 250:959(1990)記載のようなカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ転写物に見られるプロモーターを含む。
合成プロモーター：生物由来よりむしろ化学的合成したプロモーター。通常合成プロモーターはＲＮＡポリメラーゼ開始の能率を最適化するための配列変化を含む。
構成プロモーター：ＲＮＡポリメーラゼ結合および開始がほぼ一定あり、外的刺激に相対的に無関係な所のプロモーター。構成プロモーターの例は、Ｐoszkowski et al., ＥＭＢＯ Ｊ., 3:2719(1989)およびＯdell et al., Ｎature, 313:810(1985)により記載されたカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターを含む。
制御プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼ結合および開始の速度が発育の特定の時期、または生物の特定の構造またはこれらのタイプの調節の両方で制御される所のプロモーター。制御プロモーターの例は、Ｃhua et al., Ｓcience, 244:174-181(1989)に記載されている。
【００４３】
一本鎖抗原結合タンパク質：ＶＬ配列のカルボキシル末端をＶＨ配列のアミノ末端に結合させるペプチドにより、免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列(ＶＨ)につながれた免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列(ＶＬ)ポリペプチドを有するポリペプチド。一般に、重鎖および軽鎖抗原結合ドメインの同じポリペプチドへの、リンカーポリペプチドを使用した任意の組み合わせは、有用な構造を確実にするための結合ドメインを可能にするリンカーを使用する。このような組み合わせはＶＨ-リンカー−ＶＬ、ＶＨ-直線−軽鎖、またはＶＬ-直線−Ｆｄを含む。
一本鎖抗原結合タンパク質コード遺伝子：一本鎖抗原結合タンパク質をコードする組換え遺伝子。
ポリペプチドおよびペプチド：隣接残基のアルファ−アミノおよびカルボキシ基の間のペプチド結合により他のものに結合したアミノ酸残基の連続直線。
タンパク質：ポリペプチドでのように他のものに結合した約５０アミノ酸残基より大きい連続直線。
免疫グロブリン生産物：免疫グロブリン重鎖の少なくとも免疫活性部位を含むポリペプチド、タンパク質またはタンパク質であり、従って抗原と特異的に結合できる。免疫グロブリン生産物の例は、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン分子、実質的に無傷な免疫グロブリン分子、当分野でＦａｂフラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、Ｆ(ａｂ')フラグメントおよびＦｖフラグメントとして知られている部分を含む、パラトープを含む免疫の部分である。
免疫グロブリン分子：互いに共有結合した免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の免疫学的活性部分を含むタンパク質であり、抗原と特異的に結合できる。
免疫グロブリン由来重鎖：免疫グロブリンの少なくとも抗原結合ドメインの部分および免疫グロブリン重鎖の少なくとも可変領域の部分または免疫グロブリン重鎖の少なくとも定常領域の部分を含むポリペプチド。従って、免疫グロブリン由来重鎖は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーとアミノ酸配列相同性の明白な領域を有する。例えば、Ｆａｂフラグメントの重鎖は、免疫グロブリン由来重鎖である。
免疫グロブリン由来軽鎖：免疫グロブリンの少なくとも抗原結合ドメインの部分および少なくとも免疫グロブリン軽鎖の可変領域または定常領域の部分を含むポリペプチド。従って、免疫グロブリン由来軽鎖は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーとアミノ酸配列相同性の明白な領域を有する。
【００４４】
抗原結合ドメイン：抗原と特異的に結合する免疫グロブリンポリペプチドの部分。この抗原は、典型的に、免疫グロブリン重および軽鎖の抗原結合ドメインにより結合される。しかしながら、抗原結合ドメインは単一ポリペプチド上に提示され得る。
Ｊ鎖：免疫グロブリンの重合化および重合化免疫グロブリンの上皮細胞への輸送に関与するポリペプチド。Ｔhe Ｉmmunoglobulin Ｈelper：Ｔhe Ｊ Ｃhain in Ｉmmunogloburin Ｇenes, 345頁, Ａcademic Ｐress(1989)参照。Ｊ鎖は、五量体ＩｇＭおよび二量体ＩｇＡにみられ、典型的にジスルフィド結合により結合している。Ｊ鎖はマウスおよびヒトの両方で研究されている。
Ｆａｂフラグメント：互いに共有結合し、抗原と特異的に結合できる免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む免疫グロブリン分子の部分からなるタンパク質。Ｆａｂフラグメントは典型的に、実質的に無傷な免疫グロブリン分子の、当分野で既知の方法を使用したパパインによるタンパク質分解的消化により製造される。しかしながら、Ｆａｂフラグメントは、当分野で既知の方法を使用して、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の望ましい部分を好適な宿主細胞中で発現させることにより製造し得る。
Ｆｖフラグメント：互いに共有結合し、抗原と特異的に結合できる免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の免疫学的活性部分を含むタンパク質。ＦＶフラグメントは典型的に、当分野で既知の方法を使用して、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の望ましい部分を好適な宿主細胞中で発現させることにより製造し得る。
無性繁殖：切った葉、切った幹、切った根、一個の植物細胞(原形質体)またはカルスから全植物を再生することにより子孫を産生すること。
自家授粉：同植物上での雄花部分から雌花部分への花粉の移動。この工程は典型的に種子を産生する。
交差授粉：別植物上での雄花部分から雌花部分への花粉の移動。この工程は典型的に種子を産生し、そこから種々の子孫が成育できる。
【００４５】
エピトープ：免疫グロブリン生産物により特異的に認識される分子の部分。これはまた決定基または抗原決定基とも呼ばれる。
キメラ免疫グロブリン重鎖：異なるイソタイプまたはサブタイプまたはある別のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の免疫グロブリン重鎖由来のアミノ酸配列残基の一部を有する免疫グロブリン由来重鎖。典型的に、キメラ免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン重鎖の少なくとも二つの異なるイソタイプまたはサブタイプ由来のアミノ酸残基配列を有する。
トランスジーン：動物の生殖細胞系に挿入された遺伝子。遺伝子は初期発育段階で動物内に挿入し得る。しかしながら、遺伝子は、動物細胞に、例えば、レトロウイルスベクターにより、遅い段階で挿入できる。
多重分子：互いに化学結合を含む手段で結合した１ペプチド以上またはポリペプチドからなる分子。
【００４６】
Ｂ．防御タンパク質含有免疫グロブリン
本発明は、防御タンパク質含有免疫グロブリン分子の新規な製造法を提供する。免疫グロブリンは、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖と結合した防御タンパク質を含む。
【００４７】
本発明の防御タンパク質は、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の少なくともアミノ酸残基配列の残基１から６２７の部分に実質的に対応するまたは類似のアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基６２７より大きいアミノ酸残基配列を含まないか、ウサギ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基６２７と類似のアミノ酸は含まない前駆体タンパク質由来である。ウサギポリ免疫グロブリン受容体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、現在、Ｍostov et al., Ｎature, 308:37(1984)およびＥＭＢＬ/Ｇene Ｂank K01291により記載されている。ポリ免疫グロブリン受容体のヌクレオチド配列は配列番号１および対応するアミノ酸配列は配列番号２である。
【００４８】
任意の種由来のポリ免疫グロブリン受容体は、防御タンパク質として使用し得、これらの防御タンパク質はウサギ免疫グロブリン配列のアミノ酸１−６２７と類似のアミノ酸数より大きい数を有するアミノ酸を含まない前駆体タンパク質を含まず、それに由来する。好ましい態様において、防御タンパク質は、任意の種および少なくともウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸１−６０６の部分と類似のアミノ酸を含み、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の残基６０７−７５５と類似のアミノ酸残基を含まない前駆体タンパク質由来である。
【００４９】
ヒトポリ免疫グロブリン受容体配列は、Ｋrajci et al., Ｅur. Ｊ. Ｉmmunol., 22:2309-2315(1992)およびＫrajci et al., Ｂiochem. Ｂiophys. Ｒes. Ｃomm., 158-783-789(1989)およびＥＭＢＬ/Ｇene Ｂank Ａccession Ｎo. X73079により決定および報告されている。ヒトポリ免疫グロブリンのヌクレオチド配列は配列番号３および対応するアミノ酸残基配列は配列番号４である。ヒトポリ免疫グロブリン受容体は、ウサギポリ免疫グロブリン受容体のものと非常な配列相同性を有し、類似のドメイン構造を有する。Ｋraehenbuhl et al., Ｔrends in Ｃell Ｂiol. 2:170(1992)参照。ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインおよび／またはアミノ酸残基配列と類似のヒトポリ免疫グロブリン受容体の部分を表１に示す。
【００５０】
ラットポリ免疫グロブリン受容体配列は、Ｂanting et al., ＦＥＢＳ Ｌett., 254:177-183(1989)およびＥＭＢＬ/Ｇene Ｂank Ａccession Ｎo. X15741により決定および報告されている。ラットポリ免疫グロブリン受容体ヌクレオチド配列のヌクレオチドは配列番号９および対応するアミノ酸残基配列は配列番号１０である。ラットポリ免疫グロブリン受容体は、ウサギおよびヒトポリ免疫グロブリン受容体のものと非常な配列相同性を有し、類似のドメイン構造を有する。Ｋraehenbuhl et al., Ｔ. Ｃell Ｂiol. 2:170(1992)参照。ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインおよび／またはアミノ酸残基配列と類似のラットポリ免疫グロブリン受容体の部分を表１に示す。
【００５１】
ウシポリ免疫グロブリン受容体配列は、ＥＭＢＬ/Ｇene Ｂank Ａccession Ｎo. X81371により決定および報告されている。ウシポリ免疫グロブリン受容体ヌクレオチド配列は配列番号５および対応するアミノ酸残基配列は配列番号６である。ウシポリ免疫グロブリン受容体は、ウサギおよびヒトポリ免疫グロブリン受容体のものと非常な配列相同性を有し、類似のドメイン構造を有する。ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインおよび／またはアミノ酸残基配列と類似のウシポリ免疫グロブリン受容体の部分を表１に示す。
【００５２】
マウスポリ免疫グロブリン受容体配列は、Ｐiskurich et al., Ｊ. Ｉmmunol., 150:38(1993)およびＥＭＢＬ/Ｇene Ｂank Ａccession Ｎo. U06431により決定および報告されている。マウスポリ免疫グロブリン受容体ヌクレオチド配列は配列番号７および対応するアミノ酸残基配列は配列番号８である。マウスポリ免疫グロブリン受容体は、ウサギおよびヒトポリ免疫グロブリン受容体のものと非常な配列相同性を有し、類似のドメイン構造を有する。ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインおよび／またはアミノ酸残基配列と類似のマウスポリ免疫グロブリン受容体の部分を表１に示す。
【００５３】
広範な種由来のポリ免疫グロブリンの上記の核酸および対応するアミノ酸残基配列に加えて、本発明は任意の種由来のポリ免疫グロブリン受容体の使用に関する。種間のポリ免疫グロブリン受容体の保存的ドメイン構造は異なる種由来のそれぞれのポリ免疫グロブリン受容体中の類似アミノ酸残基配列の選択を可能にする。本発明は、ポリ免疫グロブリン由来のこのような類似アミノ酸残基配列の使用に関する。幾つかのポリ免疫グロブリンアミノ酸配列由来の類似配列は、表１に示す通りである。
【表１】
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【００５４】
本発明の防御タンパク質は、実質的にポリ免疫グロブリン受容体の全アミノ酸配列より少なく含み得る。好ましい態様において、防御タンパク質はウサギの天然ポリ免疫グロブリン受容体の少なくともアミノ酸残基１から６０６の部分を含み得る。天然ポリ免疫グロブリン受容体と異なり、本発明の防御タンパク質は天然ポリ免疫グロブリン受容体由来のアミノ酸残基６２７より大きい全アミノ酸残基配列を含まない前駆体タンパク質由来であり、従って、分泌成分より多いアミノ酸または少ないアミノ酸を含み得る。好ましい態様において、本発明の防御タンパク質はウサギの天然免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基６０６より大きい全アミノ酸残基配列を含まない。本発明は、防御タンパク質として、天然ポリ免疫グロブリンの部分のみを使用することを考慮する。他の態様において、防御タンパク質が、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６のような６０６から６２７の間の全アミノ酸部分を含むアミノ酸残基６０６から６２７の間の任意のアミノ酸で終わり得ることを考慮する。
【００５５】
好ましい態様において、本発明の防御タンパク質は、以下のアミノ酸セグメントの１個またはそれ以上に対応するアミノ酸配列を有する：
１）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩのアミノ酸(ＡＡ)２１−４３に対応するＡＡ；
２）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩのアミノ酸(ＡＡ)１−１１８に対応するＡＡ；
３）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIIのアミノ酸(ＡＡ)１１９−２２３に対応するＡＡ；
４）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIIIのアミノ酸(ＡＡ)２２４−３３２に対応するＡＡ；
５）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIVのアミノ酸(ＡＡ)３３３−４４１に対応するＡＡ；
６）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＶのアミノ酸(ＡＡ)４４２−５５２に対応するＡＡ；
７）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインVIのアミノ酸(ＡＡ)５５３から６０６または５５３から６２７に対応するＡＡ；およびウサギポリ免疫グロブリン受容体のＡＡ残基６０７から７５５または６２８から７５５に対応するアミノ酸残基は含まない。
【００５６】
ドメインの正確な境界は約２０アミノ酸内で変化し得る。しかしながら、ドメイン構造および境界は当業者に理解できる。
【００５７】
加えて、本発明は、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の以下のアミノ酸残基でまたは以下の残基に対応するが、他の種のポリ免疫グロブリン受容体中であるアミノ酸残基で終わる防御タンパク質に関する：５８０−６０５。
【００５８】
他の好ましい態様において、防御タンパク質は特定の種のポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸配列に対応し、以下のアミノ酸セグメントと類似であるアミノ酸を有する：
１）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩのアミノ酸(ＡＡ)２１−４３に対応するＡＡ；
２）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩのアミノ酸(ＡＡ)１−１１８に対応するＡＡ；
３）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIIのアミノ酸(ＡＡ)１１９−２２３に対応するＡＡ；
４）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIIIのアミノ酸(ＡＡ)２２４−３３２に対応するＡＡ；
５）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIVのアミノ酸(ＡＡ)３３３−４４１に対応するＡＡ；
６）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＶのアミノ酸(ＡＡ)４４２−５５２に対応するＡＡ；
７）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインVIのアミノ酸(ＡＡ)５５３から６０６または５５３から６２７に対応するＡＡ；およびウサギポリ免疫グロブリン受容体のＡＡ残基６０７から７５５または６２８から７５５に対応するアミノ酸残基は含まない。
【００５９】
他の好ましい態様において、防御タンパク質は、ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩ、IV、ＶおよびドメインVIのＡＡ５５０−６０６または５５０−６２７または類似ドメイン由来のアミノ酸配列および異なる種のポリ免疫グロブリン受容体の領域を含む。
【００６０】
他の態様において、本発明の防御タンパク質は、少なくともウサギ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基１−６２７と類似の種のポリ免疫グロブリン受容体由来のアミノ酸残基の部分と実質的に対応するアミノ酸残基を有する。このアミノ酸配列の部分は、この種の少なくとも細胞外ドメインの部分と対応する。
【００６１】
好ましい態様において、本発明の防御タンパク質は、少なくともウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基１−６０６のアミノ酸と類似の種のポリ免疫グロブリン受容体由来のアミノ酸残基の部分と実質的に対応するアミノ酸配列を有する。
【００６２】
他の好ましい態様において、本発明の防御タンパク質は、少なくとも以下のアミノ酸残基配列の部分に対応するまたは類似(ウサギ以外の種由来であれば)のアミノ酸残基配列を有する：
１）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩのアミノ酸(ＡＡ)２１−４３に対応するＡＡ；
２）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩのアミノ酸(ＡＡ)１−１１８に対応するＡＡ；
３）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIIのアミノ酸(ＡＡ)１１９−２２３に対応するＡＡ；
４）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIIIのアミノ酸(ＡＡ)２２４−３３２に対応するＡＡ；
５）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIVのアミノ酸(ＡＡ)３３３−４４１に対応するＡＡ；
６）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＶのアミノ酸(ＡＡ)４４２−５５２に対応するＡＡ；
７）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインVIのアミノ酸(ＡＡ)５５３から６０６または５５３から６２７に対応するＡＡ；およびウサギポリ免疫グロブリン受容体のＡＡ残基６２８から７５５に対応するアミノ酸残基は含まない。
【００６３】
他の好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の少なくともアミノ酸残基１から６０６または１から６２７の部分と実質的に対応する第１のアミノ酸を有し、該第１アミノ酸に続いて第２アミノ酸残基配列を有し、第２アミノ酸残基配列は、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の膜通過セグメントに対応するアミノ酸残基配列を有しない。
【００６４】
より好ましい態様において、第２アミノ酸残基配列は、少なくともポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基６５５から７５５に対応するアミノ酸配列の部分を有する。他の好ましい態様において、第２アミノ酸残基は、少なくとも１個またはそれ以上の以下の部分を有する：ポリ免疫グロブリン分子の細胞内ドメイン、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーのドメイン、酵素、毒素またはリンカー。
【００６５】
本発明は、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の膜通過セグメントに対応するアミノ酸残基を含まないが、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の細胞内ドメインに対応するアミノ酸を有し得る防御タンパク質に関し、これは受容体の欠損変異体である。
【００６６】
他の態様において、本発明の防御タンパク質は、特定の種のポリ免疫グロブリンの細胞外ドメインの少なくとも一つに実質的に対応するアミノ酸配列を有する。防御タンパク質は、そのアミノ酸配列のセグメントが一つの種のポリ免疫グロブリン受容体の細胞外ドメインに実質的に対応し、そのアミノ酸配列の異なるセグメントは第２の種由来であり、異なる種の細胞外ドメインに実質的に対応するものである、アミノ酸配列を有し得る。本発明は、防御タンパク質が、一つの種のポリ免疫グロブリン受容体の細胞外ドメインに実質的に対応するアミノ酸配列セグメントを有し、および同ドメイン中に異なる種のポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸および配列に対応する第２アミノ酸配列を有する、態様に関する。従って、防御タンパク質は異なる種由来のポリ免疫グロブリン受容体に対応するアミノ酸配列から成る個々のドメインまたは特定ドメインの一部を有し得る。
【００６７】
他の態様は、そのアミノ酸配列が免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの分子由来のアミノ酸配列の部分を有する防御タンパク質に関する。Ｉmmunoglobulin Ｇenes, 361頁, Ａcademic Ｐress(Ｈonjo ＡltおよびＲabbits編, 1989)中のＷilliamsおよびＢarclay, "Ｔhe Ｉmmunoglobulin Ｓuperfamily"参照。これら由来の部分は、免疫グロブリンスーパーファミリー分子由来のペプチド、ドメインまたは多重ドメインをコードするアミノ酸配列を含み得る。
【００６８】
本発明はまた、少なくともウサギポリ免疫グロブリン受容体ヌクレオチド配列のアミノ酸１−６０６または１−６２７の部分をコードする第１ヌクレオチド配列を有し、第１ヌクレオチド配列の機能的膜通過セグメント３'をコードするヌクレオチドを有しない防御タンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。更に好ましい態様は、ウサギポリ免疫グロブリン受容体配列のアミノ酸１−６０６または１−６２７をコードする、第１ヌクレオチド配列の３'位に位置する第２ヌクレオチド配列を含む。この第２ヌクレオチド配列は、ウサギポリ免疫グロブリン受容体または他のポリ免疫グロブリン受容体の細胞内ドメインの部分または免疫グロブリンスーパーファミリー分子の部分を含む種々の分子をコードし得る。加えて、第２ヌクレオチド配列が種々のエフェクター分子、酵素、毒素等をコードする態様に関する。好ましい態様は、ウサギポリ免疫グロブリン受容体または他の種由来のポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基６５５から７５５に対応するアミノ酸残基をコードする第２ヌクレオチド配列を含む。
【００６９】
本発明は、また、発現のために操作可能に結合した防御タンパク質をコードするヌクレオチ配列を含む発現ベクターに関する。これらの発現ベクターは、ヌクレオチド配列を特定細胞中で発現させるために、ヌクレオチドを転写および発現させるプロモーター配列の３'に置く。発現ベクターは、またこの転写の効率を改善する種々のエンハンサー配列も含み得る。加えて、ターミネーター、ポリアデニル化(ポリＡ)部位および他の３'末端処理シグナルのような配列が特定細胞中で転写されるヌクレオチド配列の量を促進するために含まれ得る。
【００７０】
好ましい態様において、この防御タンパク質は、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖と関係している免疫グロブリンの部分である。少なくとも抗原結合ドメインの部分を含む免疫グロブリン由来重鎖は当分野で既知であり、例えば、Ｈuse et al., Ｓcience, 246:1275(1989)、ＬernerおよびＳorge, ＰＣＴ出願ＷＯ９０／１４４３０、１９９０年１１月２９日公開に記載されている。これらの刊行物の記載は、本明細書に参考として包含させる。
【００７１】
他の態様において、本発明の免疫グロブリンは、防御タンパク質および免疫グロブリン由来重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含み、それは免疫グロブリン由来重鎖に会合した、少なくとも抗原結合部位を含む。少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン軽鎖は当分野で既知であり、種々のものに記載されている。例えば、ＥarlyおよびＨood, Ｇenetic Ｅngineering, Ｓetlow＆Ｈollaender(編), Ｖol. 3, Ｐlenum Ｐublishing Ｃorp., Ｎew Ｙork(1981)157-188；およびＫabat et al., Ｓequences of Ｉmmunologic Ｉnterest, Ｎational Ｉnstitutes of Ｈealth, Ｂethesda, Ｍaryland(1987)参照。本明細書に記載のすべての参考文献の記載は、本明細書に参考として包含する。
【００７２】
複合体の免疫グロブリン成分(アルファ、Ｊ、カッパまたはラムダ)は、ポリペプチドの完全な長さの全てまたは一部を含むことができる。これらの鎖の一部は全鎖に代わって使用し得る。例えば、完全免疫グロブリンアルファ重鎖は、可変領域に置換し得、アルファ定常領域のみが他の成分との集合を可能にするのに充分である。同様に、定量領域の小さい部分しか含まない切断カッパまたはラムダ鎖を完全な長さのカッパまたはラムダ鎖と置き換えることができる。複合体の必須条件は、防御タンパク質を結合する能力である。
【００７３】
切断成分に加えて、本発明は異なるタイプの免疫グロブリンの組み合わせに関する。例えば、ＩｇＧのＣＨ１およびＣＨ２領域、続いてＩｇＡ由来のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む重鎖定常領域は防御タンパク質を含む安定な複合体を形成する。これは、例として特記する。
【００７４】
本発明の防御タンパク質を含む免疫グロブリンは、好ましくは、免疫グロブリン重鎖が免疫グロブリンＪ鎖と結合するのを可能にし、それにより防御タンパク質と結合するのを可能にする、少なくともＩｇＭまたはＩｇＡ重鎖の部分を含む。本発明の免疫グロブリン重鎖がＩｇＡ重鎖またはＩｇＭ重鎖または他の重鎖のイソタイプの個々ドメインから成り得ることが考慮される。ＩｇＡまたはＩｇＭ以外の免疫グロブリン重鎖由来の免疫グロブリンドメインが免疫グロブリンＪ鎖と結合するのに分子操作し得、即ち、本発明の免疫グロブリンを製造するのに使用し得ることも考慮される。
【００７５】
当業者は、免疫グロブリンが約１００から１１０アミノ酸残基であるドメインから成ることを理解できる。これらの種々のドメインは当分野で既知であり、既知の境界を有する。単一ドメインの除去および他の抗体分子のドメインとの置換は現在の分子生物学で容易に達成される。ドメインは鎖内ジスルフィド結合で安定化している球状構造である。これは、別々の形を付与し、ドメインを他の同様な形のドメインとの置換または交換できる内蔵ユニットにする。免疫グロブリンの重鎖定常領域は、そのドメインを含む特定の分子に抗体エフェクター機能として知られている種々の特性を付与する。エフェクター機能の例は、補体固定、胎盤移動、ブドウ球菌タンパク質への結合、連鎖球菌タンパク質Ｇへの結合、単核細胞、好中球または肥満細胞および好塩基球への結合を含む。特定のドメインおよび特定の免疫グロブリンとこれらのエフェクター機能の関係は既知であり、例えば、Ｉmmunology, Ｒoitt et al., Ｍosby Ｓt. Ｌouis, Ｍissouri(1993第３版)に記載されている。
【００７６】
本発明の免疫グロブリンは、防御タンパク質に加えて、免疫グロブリン由来重鎖に結合した免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリンＪ鎖を含み得る。好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、免疫グロブリン由来重鎖の少なくとも一つに結合した、２個または４個の免疫グロブリン由来軽鎖およびＪ鎖と共に２個または４個の免疫グロブリン由来重鎖を有する。免疫グロブリンＪ鎖は記載され、当分野で既知である。例えば、Ｍ. Ｋoshland, Ｔhe Ｉmmunoglobulin Ｈelper：Ｔhe Ｊ Ｃhain, Ｉmmunoglobulin Ｇenes, Ａcademic Ｐress, Ｌondon, 345頁, (1989)およびＭatsuuchi et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. USA, 83:456-460(1986)参照。免疫グロブリンＪ鎖の配列は、米国に拠点を置く種々のデータから入手可能である。
【００７７】
本発明の免疫グロブリンは、少なくとも免疫グロブリン由来重鎖と会合した防御タンパク質を有する。この会合は、水素結合、ジスルフィド結合、共有結合、イオン性相互作用またはこれらの種々の結合の組み合わせであり得る。典型的に、免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖の間のジスルフィド結合により互いに結合している。防御タンパク質と免疫グロブリンの相互作用は、非共有またはジスルフィド結合である。
【００７８】
防御タンパク質、免疫グロブリン由来重鎖および所望により免疫グロブリン由来軽鎖およびＪ鎖を含む本発明の免疫グロブリンは、典型的に以下のものの一つで互いに結合する：水素結合、ジスルフィド結合、共有結合、イオン性相互作用またはこれらの種々の結合の組み合わせ。本発明は、必要な免疫グロブリン重、軽および／またはＪ鎖部分が単一ポリペプチド中にあり、抗原および防御タンパク質を結合させるのに機能する分子に関する。このようなタンパク質の例は、一本鎖抗原結合タンパク質である。
【００７９】
本発明は、免疫グロブリンＪ鎖の全てまたは一部をコードするＤＮＡセグメントおよび免疫グロブリンアルファ鎖の全てまたは一部をコードするＤＮＡセグメントおよび免疫グロブリンカッパ鎖または免疫グロブリンラムダ鎖の何れかの全てまたは一部をコードするＤＮＡセグメントの生物への挿入；および防御タンパク質の同生物への挿入(ここで、防御タンパク質は、セグメントが機能的膜伸長領域を含むアミノ酸残基を含まない前駆体タンパク質由来であり、アミノ酸配列が膜伸長領域の開始(ウサギポリ免疫グロブリン受容体の約残基６３０)からタンパク質のカルボキル末端(ウサギポリ免疫グロブリン受容体の約残基７５５)が完全に無傷である前駆体タンパク質由来のセグメントであるように、少なくともウサギポリ免疫グロブリン受容体(ｐＩｇＲ)アミノ酸残基配列のアミノ酸残基１から残基６０６のセグメントまたは他の種由来の類似アミノ酸残基を含む)：の工程を含む、多量体免疫グロブリンを集合させる方法に関する。好ましい態様において、前駆体タンパク質はウサギポリ免疫グロブリンまたは他の種由来の類似アミノ酸残基の６０６以上のアミノ酸残基を含まない。
【００８０】
当業者に理解されるように、膜伸長領域または機能的膜通過セグメントは、全ての残基が荷電しておらず、事実上、全ての残基が疎水性または非極性である、約２０から約３０アミノ酸からなるアミノ酸残基の隣接領域から成り、セグメントはアルファ螺旋を形成している。機能的膜通過セグメントは、生体膜の伸長をできる。膜伸長領域は荷電残基により固定できる。ｐＩｇＲの膜伸長領域の例は、ウサギのポリ免疫グロブリン受容体アミノ酸残基配列の残基６３０から６５３である。
【００８１】
防御タンパク質を含む免疫グロブリンを形成する鎖は、タンパク質のアミノ末端にシグナル配列を含む前駆体由来であり得る。各成分は、従って、膜内システムに統合され、そこで集合が起こる。シグナル配列に加えて、複合体の種々の生物が、Ｎ末端糖付加または複合体の構造に影響を与えることができる種々の他の修飾のための付加シグナルを含み得、または含み得ない。本発明の一つの態様において、糖付加のためのシグナル(即ち、アスパラギン−Ｘ−セリンまたはスレオニンまたはＯ−結合糖付加のシグナル)は存在しないか、ヌクレオチド配列内の多少の場所に存在する。従って、得られる抗体は炭水化物を含まず、炭水化物が免疫応答を誘発する投与において、有利であり得る。
【００８２】
好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは免疫グロブリン由来重鎖と会合した防御タンパク質を含み、防御タンパク質はＮ−結合および／またはＯ−結合オリゴサッカライドを含まない。当業者は、そのアミノ酸残基配列内にＮ−結合糖付加シグナルアスパラギン−Ｘ−セリン(ここで、Ｘは恐らくプロリンおよびアスパラギン酸以外のアミノ酸残基)を有するポリペプチドをコードする遺伝子が、植物細胞に挿入したとき、配列のアスパラギン残基(Ｎ−結合)と結合したオリゴサッカライドにより糖付加されることを理解する。糖付加シグナルとして機能するポリペプチド配列の一般的レビューのために、Ｍarshall, Ａnn. Ｒev. Ｂiochem., 41:673(1972)およびＭarshall, Ｂiochem. Ｓoc. Ｓymp. 40:17(1974)参照。これらのシグナルは、哺乳類および植物細胞の両方で認識される。当業者は、Ｎ−結合糖付加シグナルが本発明の防御タンパク質をコードするＤＮＡ配列を変化させるための通常の変異誘発法を使用して容易に除去し得ることを理解する。この変異誘発は、典型的に、Ｎ−結合糖付加シグナル欠損を有するオリゴヌクレオチドの合成および、次いで、その中に挿入される該オリゴヌクレオチド配列とのＤＮＡ鎖の製造を含む。このような変異誘発法および試薬はＳtratagene(Ｌa Ｊolla, ＣＡ)のような多くの源から商品として入手可能である。
【００８３】
マルチペプチド分子(例えば、免疫グロブリン)を形成する個々のポリペプチドの集合は、単一細胞中に、直接全ての個々のポリペプチドをコードするトランスジーンをその細胞に連続して、または全て一度に挿入して発現させることにより得られ得る。ポリペプチドをコードするトランスジーンは、個々の構築物またはＤＮＡセグメントに存在し得るか、またはＤＮＡセグメントまたは構築物中に、１個またはそれ以上のトランスジーンと共に含まれ得る。
【００８４】
これらの成分の集合は、Ｍendelにより最初に述べられたような交差授粉によりでき、全ての鎖を発現する分離体の集団を製造する。先の記載は、これが多量体糖付加体の集合および共分離に適した方法であることを証明する。米国特許第５,２０２,４２２号の記載は本明細書に参考として包含し、これらの方法を記載する。本発明の好ましい態様において、グリカンの減少した数を含む抗体分子およびグリカンの無い抗体分子が考慮される。
【００８５】
防御タンパク質、免疫グロブリン由来重鎖および所望により免疫グロブリン由来軽鎖、およびＪ鎖を含む本発明の免疫グロブリンは、Ｎ−結合オリゴサッカライドの無い防御タンパク質を含み得る。
【００８６】
防御タンパク質を含む本発明の免疫グロブリンは、好ましくは動物における疾病を予防するのに有用な治療的免疫グロブリンである。好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、粘膜病原体抗原と結合できる。他の好ましい態様において、本発明の治療的免疫グロブリンは、虫歯を防止できる。最も好ましい態様において、防御タンパク質を含む本発明の免疫グロブリンは、Ｓ. mutans血清型ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈ(新しい命名法ではＳ. mutans血清型ｃ、ｅおよびｆ；およびＳ. sobrinus血清型ｄおよびｇ)由来の抗原に結合できる抗原結合ドメインを含む。このような抗原結合ドメインは当分野で既知であり、例えば、米国特許第５,３５２,４４６号、Ｊ. Ｋ-Ｃ. Ｍa et al., Ｃlin. Ｅxp. Ｉmmunol. 77:331(1989)；およびＪ. Ｋ-Ｃ Ｍa et al., Ｅur. Ｊ. Ｉmmunol. 24：131-138(1994)；米国特許第５,３５２,４４６号；米国特許第４,５９４,２４４号；および欧州特許公開第３７１０１７Ｂ１号に記載の結合ドメインを含む。これらの刊行物の記載は、本発明に参考として包含する。好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、動物またはヒトのいずれかに治療活性を有する組成物の一部である。治療的免疫グロブリンの例は多いが、我々は、最も適切な治療効果を、食用植物由来の組成物の直接経口投与による粘膜および腸病原体の予防と意図する。
【００８７】
治療的組成物の投与は、植物または他のトランスジェニック生物からの抽出前または後にできる。一度抽出すれば、免疫グロブリンはまたサイズ排除、イオン交換または親和性クロマトグラフィーにより更に精製もし得る。好ましい態様において、トランスジェニック生物は食用植物であり、複合体の投与は、部分的精製後の摂取による。植物分子は複合体と共投与し得る。
【００８８】
本発明はまた植物由来分子および動物由来分子の相対的比率が変化できることも考慮する。ＲuＢisＣoまたはクロロフィルのような特定植物タンパク質の量は、水を除く抽出物の質量の最小１％または最大９９.９％であり得る。
【００８９】
本発明はまた防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む治療的植物抽出物の、特異的治療成分、例えば、抗体の更なる精製無しの直接の使用を含む。投与は、局所、経口摂取または抗体を粘膜標的病原体に送達させるのに適切な他の方法により得る。この投与形態は、直接注射または血流内への治療的植物抽出物のカミングリング(comingling)を含む非経口投与と区別する。
【００９０】
本発明はまた抽出物の味または風味を操作した後の、防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む治療的植物抽出物の使用にも関する。ゲル化物質または香味剤の適当な量は例えば、直接経口投与による抗体の標的病原体への接触を促進するために添加できる。
【００９１】
好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、動物の粘膜表面と予め選択したリガンドを結合できる、本発明の防御タンパク質を含む免疫グロブリンを含む組成物を接触させることにより、予め選択したリガンドに対して動物を受動的に免疫化するのに使用する。受動免疫は大量の抗体を必要とし、広範な使用のために、この抗体は安価でなければならない。
【００９２】
予め選択した抗原と結合できる防御タンパク質を含む免疫グロブリン分子は植物細胞中で効率的におよび経済的に製造できる。好ましい態様において、免疫グロブリン分子は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、分泌型ＩｇＭまたは分泌型ＩｇＡまたはキメラ免疫グロブリン重または軽鎖を有する免疫グロブリンである。
【００９３】
防御タンパク質を含む免疫グロブリンは、タンパク質分解および変性に耐性であり、したがって、厳しい環境での使用に望ましい。考慮される厳しい環境は、酸性環境、プロテアーゼ含有環境、高温環境および他の厳しい環境を含む。例えば、動物の胃腸管は、プロテアーゼおよび酸の両方が存在し、厳しい環境である。Ｋobayashi et al., Ｉmmunochemistry, 10:73(1973)参照。
【００９４】
これらのより耐性な本発明の免疫グロブリンを使用した動物の受動免疫は、防御タンパク質を含む免疫グロブリンと動物の粘膜表面を接触させることにより作る。動物は、肺、消化管、鼻咽頭腔、泌尿生殖器等を含む種々の粘膜表面を有する。典型的にこれらの粘膜表面は、唾液、涙液、鼻水、気管気管支液、腸液、胆汁、子宮頸液等のような種々の分泌物を製造する細胞を含む。
【００９５】
好ましい態様において、防御タンパク質を含む免疫グロブリンは、予め選択した抗原に免疫特異的である。典型的に、この抗原は壊死性全腸炎、下痢疾患、潰瘍および腸への癌源物質吸収による癌のような粘膜表面に関連する疾病をもたらす病原体に存在する。例えば、ＭcＮabbおよびＴomasi, Ａnn. Ｒevl. Ｍicrobiol., 35:477(1981)およびＬawrence et al., Ｓcience, 243:1462(1989)参照。粘膜表面と関連した疾病をもたらす典型的病原体は、Ｅ. coli、Ｓ. typhimurium、Ｖ. cholera、Ｈ. pyloriおよびＳ.mutansのような細菌性およびウイルス性病原体の両方を含む。本発明に参考として包含する、欧州特許出願第４８４１４８Ａ１号、５／６／９２公開もまた参照。本発明の免疫グロブリンはこれらの病原体と結合でき、粘膜関連疾患をもたらすのを予防する。
【００９６】
Ｓ. mutansと結合でき、虫歯の予防をする免疫グロブリンは、本明細書に参考として包含する欧州特許明細書第３７１,０１７号に記載されている。米国特許第５,３５２,４４０号の記載もまた本明細書に参考として包含する。
【００９７】
細菌感染または癌腫に対して有効である防御タンパク質を含む本発明の治療的免疫グロブリンが考慮される。治療的活性を有するモノクローナル抗体は、本明細書に参考として包含する米国特許第４,６５２,４４８号、第４,４４３,５４９号および第５,１８３,７５６号に記載されている。
【００９８】
好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、植物材料および予め選択したリガンドと結合できる本発明の免疫グロブリンを含む、動物粘膜表面と接触する組成物の一部である。植物材料は植物細胞壁、植物細胞小器官、植物細胞質、無傷植物細胞、生存植物等であり得る。この植物細胞材料は、約１０,０００グラムの植物材料対約１００ナノグラムの免疫グロブリンから存在する１０グラムの免疫グロブリンについて約１００ナノグラムの植物材料の範囲で存在する。より好ましい態様において、植物材料は約１０,０００グラムの植物材料対存在する免疫グロブリンの各１グラムから存在する１グラムの免疫グロブリンについて約１００ナノグラムの植物材料の範囲で存在する。他の好ましい態様において、植物材料は、存在する免疫グロブリン１ミリグラムについて約１０,０００グラムの植物材料から存在する５００ミリグラムの免疫グロブリンについて約１ミリグラムの植物材料の範囲で存在する。
【００９９】
好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンを含む組成物は治療的組成物である。活性成分としてポリペプチドまたはタンパク質を含む治療的組成物の製造は当分野で周知である。治療的組成物は液体または懸濁液であり得、摂取前に溶液にするまたは液体中に懸濁させるのに適当な固体形も製造し得る。活性治療的成分は典型的に薬学的に許容され、活性成分と適合する無機および／または有機担体と混合する。担体は典型的に、治療的組成物に添加したとき１個またはそれ以上の不活性物質を含む薬学的に許容される賦形剤であり、組成物に適当な濃度および形を付与する。適当な担体は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール等およびこれらの混合物である。加えて、望ましい場合、組成物は活性成分の効果を促進する湿潤剤または乳濁剤およびｐＨ緩衝剤のような補助物質を少量含むことができる。栄養価値を有する担体を含む治療的組成物もまた考慮される。
【０１００】
本発明の防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む組成物を哺乳類の歯または口に適用する態様において、慣用法を使用し得る。このような組成物を歯に適用する方法は既知であり、種々の目的のために種々の物質で適用されている。例えば、組成物は、歯の表面に本組成物を塗ることにより直接適用し得る。あるいは、本発明の組成物を、最後に歯に適用される、練り歯磨き、うがい薬、チューインガム、甘味錠剤またはジェルに含ませ得る。ある製剤において、組成物、したがって防御タンパク質を含む免疫グロブリンの歯への接触を延長する製剤の提供が望ましいことがある。この目的の製剤は既知であり、歯を覆うのに使用されている種々の歯科用トレイ(dental tray)および種々の条件に併せて歯に使用される他の歯科用道具に置き得る。
【０１０１】
特定適用中の歯に適用すべき組成物の正確な量は、このような処置が一定間隔で容易に繰り返し得るため、厳密ではない。例えば、練り歯磨きに存在する組成物は歯に練り歯磨きを使用した全ての場合、典型的に一日２回適用される。例えば、防御タンパク質を有する免疫グロブリンの１０から１００マイクログラムの程度を各歯に、組成物が歯に適用される各場合に適用できる。しかしながら、有害作用なしに使用し得る、本発明の免疫グロブリンを多かれ少なかれ有する組成物の適用として、特定適用期間中に適用し得る範囲の限定と取るべきではない。本発明の免疫グロブリンのより低い濃度での使用は、ある点で、このような製剤により提供される防御の減少をもたらす。
【０１０２】
本発明の組成物の正確な製剤は使用する適用法および適用頻度に依存して変化し得る。一般に、適切なｐＨを有し、本発明の防御タンパク質を有する免疫グロブリンを不活性にする物質を有しない製剤であり得る。例えば、本発明の組成物は、本発明の組成物は、溶液１００マイクロリットル当たり組成物が免疫グロブリンで０.１から１０ミリグラムで全体に分散している単純水性溶液として適用し得る。一般に、このような溶液は、歯当たり約１から１０マイクロリットルの溶液で歯科手術中に適用される。
【０１０３】
自己投与用に設計された本発明の組成物の製剤は、変化し得、それを使用する生産物の適用頻度を考慮に入れて製剤する。
【０１０４】
好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンを含む組成物は、病原体抗原に免疫特異的な免疫グロブリン分子を含む。病原体は、他の生物の疾病の原因となる生物である。特に好ましくは、免疫グロブリンが粘膜病原体抗原に免疫特異的である。粘膜病原体抗原は、粘膜組織を経由して生物に侵入するかまたは粘膜関連疾病をもたらす病原体に提示される。粘膜病原体は肺病原体、鼻病原体、胃腸病原体、口病原体等を含む。病原体の一般的記載として、含まれる粘膜病原体は、Ｄavis et al., Ｍicrobiology, 第３版, ＨaperおよびＲaw, Ｈagerstown, ＭＤ(1980)参照。
【０１０５】
病原体に免疫特異的な抗体は標準モノクローナル抗体製造法により製造し得る。Ａntibodies：Ａ Ｌaboratory Ｍanual, Ｈarlow et al.編, Ｃold Ｓpring Ｈabor, ＮＹ(1988)参照。軽鎖および重鎖可変領域をコードする遺伝子は、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応および適切な選択プライマーの使用により単離できる。Ｏrlandi et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci., ＵＳＡ, 86:3833(1989)およびＨuse et al., Ｓcience, 246:1275(1989)参照。次いで、可変領域を植物発現ベクターに、Ｈiatt et al., Ｎature, 342:76-78(1989)記載の発現ベクターのように挿入する。
【０１０６】
好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは胃腸病原体抗原に免疫特異的である。特に好ましくは、免疫グロブリンが胃腸管の疾病をもたらす細菌、ウイルスおよび寄生虫、例えば、Ｅ. coli、Ｓalmonellae、Ｖibrio cholerae、Ｓalmonellae typhimurium、ＳhigellaおよびＨ. pyloriのような胃腸病原体に免疫特異的である。
【０１０７】
他の好ましい態様において、組成物に存在する防御タンパク質に含まれる免疫グロブリンは、Ｓtreptococcus mutans等のような歯科病原体に免疫特異的な免疫グロブリン分子である。特に好ましくは、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ15B2(ＡＴＣＣ番号  HB8510)；ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セルズ受託番号86031901で寄託のハイブリドーマ；およびＭa et al., Ｅur. Ｊ. Ｉmmunol., 24:131(1994)およびＳmithおよびＬehner, Ｏral Ｍicro. Ｉmmunol. 4:153(1989)に記載のＧuy's１３モノクローナル抗体により製造される免疫グロブリンのようにＳtreptococcus mutansに免疫特異的である。
【０１０８】
本発明は、脊椎動物のような動物における受動免疫を製造することに関する。好ましい態様において、受動免疫は魚、鳥、爬虫類、両性類または昆虫で製造される。他の好ましい態様において、受動は、ヒト、家畜、例えば反芻動物、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ等の哺乳類で製造される。特に好ましい態様において、受動免疫は成熟または幼少哺乳類で製造される。
【０１０９】
好ましい態様において、受動免疫は、離乳し、したがってもはや母親から乳を哺乳しない哺乳類のような動物において製造する。受動免疫は、このような動物において、動物に予め選択したリガンドに免疫特異的な防御タンパク質を含む免疫グロブリンを含む組成物を、動物に免疫グロブリンの予防的濃度を作るのに充分な量を動物に投与することにより製造する。免疫グロブリンの予防的濃度は、存在する病原体に結合し、その病原体が動物中で検出可能な疾病をもたらすのを予防するのに充分な量である。予防的濃度を作るのに必要な本発明の免疫グロブリンを含む組成物の量は、動物の大きさ、存在する病原体の量、特定免疫グロブリンの病原体への親和性、特定免疫グロブリンが動物内でその活性部位に送達される効率等により、当分野で既知のように変化する。
【０１１０】
Ｃ．防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む真核細胞
本発明は、本発明の免疫グロブリンを含む植物細胞を含む真核細胞に関する。本発明はまた本発明の免疫グロブリンの種々の成分をコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞にも関する。当業者は、防御タンパク質および種々の免疫グロブリン重鎖および軽鎖およびＪ鎖をコードするヌクレオチド配列が、典型的にはプロモーターに操作可能に結合し、発現ベクターまたはカセットの一部として存在することを理解する。
【０１１１】
免疫グロブリン重および軽鎖遺伝子、およびＪ鎖遺伝子を単離した後、それらは典型的に発現ベクター中の転写プロモーターと操作可能に結合させる。
【０１１２】
選択した生物中での成分の発現は、プラスミドの非依存的複写または染色体の永久成分または成分をコードする転写物を一時的に発生し得るＤＮＡ断片に由来する。形質転換に好適な生物は原核または真核のいずれでもよい。複合体の成分の挿入は、直接ＤＮＡ形質転換、生物への弾道送達によるかまたは例えば、植物細胞上の組換えＡgrobacteriaの活性化のように、他の生物により媒介されることができる。トランスジェニック生物におけるタンパク質の発現は、通常、適当なプロモーター要素およびポリアデニル化シグナルの共挿入を必要とする。本発明の一つの態様において、プロモーター要素は植物の細胞の全てにおける成分の構造的発現をもたらす可能性がある。多くのまたは全ての細胞で起こる構造的発現は、前駆体が、集合が起きるために必要な同じ細胞性膜内システムを占領することができることを確認する。
【０１１３】
宿主細胞と適合する発現ベクター、好ましくは植物細胞と適合するものを、本発明の遺伝子の発現に使用する。植物中での遺伝子の発現に有用な典型的発現ベクターは当分野で既知であり、Ｒogers et al., Ｍeth. in Ｅnzymol., 153:253-277(1987)記載のようなＡgrobacterium tumefaciensの癌誘発(Ｔｉ)プラスミドである。しかしながら、幾つかの他の発現ベクターシステムが植物中で機能することが知られている。例えば、Ｖerma et al., ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／００５５１；およびＣockingおよびＤavey, Ｓcience, 236:1259-1262(1987)参照。
【０１１４】
上記の発現ベクターはプロモーターを含む発現制御要素を含む。発現すべき遺伝子は発現ベクターに操作可能に結合し、プロモーター配列がＲＮＡポリメラーゼ結合および所望のポリペプチドコード遺伝子の合成を指示できる。遺伝子の発現において有用なのは、誘導可能、ウイルス性、合成、構造的および制御プロモーターである。発現ベクターおよび結局どのプロモーターに、本発明の免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列が操作可能に結合するかの選択は、当分野で既知のように、直接、望ましい機能的特性、例えば、タンパク質発現の位置および時期および形質転換すべき宿主細胞に依存し、これらは構築組換えＤＮＡ分子の分野で本来制限される。しかしながら、本発明の実施に好ましい発現ベクターは、それが操作可能に結合しているＤＮＡセグメントに含まれるポリペプチドコード遺伝子の、少なくとも複製および好ましくはまた発現の指示ができる。
【０１１５】
好ましい態様において、遺伝子の発現に使用する発現ベクターは、植物細胞で有効な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを含む。好ましい医薬耐性マーカーは、その発現がカナマイシン耐性をもたらす遺伝子、すなわち、Ｒogers et al, Ｍethods Ｆor Ｐlant Ｍolecular Ｂiology, Ａ. ＷeissbachおよびＨ. Ｗeisscach編, Ａcademic Ｐress Ｉnc., Ｓan Ｄieco, ＣＡ(1988)記載のようなノパリン合成プロモーター、Ｔｎ５ネオマイシンホスホトランスフェラーゼIIおよびノパリンシンターゼ３'非翻訳領域を含むキメラ遺伝子である。
【０１１６】
植物中の異種遺伝子を発現するための発現ベクターおよびプロモーターは、本明細書に参考として包含させる米国特許第５,１８８,６４２号；第５,３４９,１２４号；第５,３５２,６０５号および第５,０３４,３２２号に記載されている。
【０１１７】
種々の方法が、ＤＮＡをベクターに、相補的粘着性末端により操作可能に結合させるために開発されている。例えば、相補的ホモポリマートラックを挿入するＤＮＡセグメントに付加でき、次いで、相補的ホモポリマー尾の間の水素結合により結合させ、組換えＤＮＡ分子を形成できる。
【０１１８】
あるいは、１個またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーをＤＮＡセグメントを発現ベクターに結合させるのに使用できる。合成リンカーを平滑末端ＤＮＡセグメントを大過剰の合成リンカー分子と、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼのような平滑末端のライゲーションを触媒できる酵素の存在下でインキュベートすることにより結合できる。従って、反応生産物は、その末端に合成リンカー配列を有するＤＮＡセグメントである。これらのＤＮＡセグメントを、次いで、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化させ、これらの合成リンカーと適合する末端を作った酵素で開裂した発現ベクターにライゲートする。種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、Ｎew Ｅngland ＢioＬabs, Ｂerverly, ＭＡを含む多くの源から商品として入手可能である。
【０１１９】
本発明の防御タンパク質および他の免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列を、同じ植物細胞中に、直接またはそれぞれの成分を植物細胞に挿入し、植物を再生し、種々の生物を交差ハイブリダイズし、全ての必要な成分を含む最終植物細胞を作ることにより挿入する。
【０１２０】
本発明の免疫グロブリンの成分をコードするヌクレオチド配列を真核細胞に挿入するのに任意の方法が使用し得る。例えば、遺伝子を植物に挿入する方法は、Ａgrobacterium媒体植物形質転換、原形質形質転換、花粉への遺伝子移入、生殖器官への注入および非成熟胚への注入を含む。これらの方法のそれぞれは、明白な利点および欠点がある。従って、遺伝子を特定の真核細胞または植物腫に挿入する一つの特定の方法が、必ずしも他の真核細胞または植物細胞で最も有効ではない。
【０１２１】
Ａgrobacterium tumefaciens媒体移入は、ＤＮＡを全植物組織に挿入でき、原形質から無傷細胞を再生する必要を迂回できるため、遺伝子を植物へ挿入するのに広範に適用可能なシステムである。Ａgrobacterium媒体発現ベクターの、ＤＮＡを植物細胞へ挿入するための使用は当分野で既知である。例えば、Ｆraley et al., Ｂiotechnology 3:629(1985)およびＲogers et al., Ｍethods in Ｅnzymology, 153:253-277(1987)記載の方法参照。更に、Ｔｉ−ＤＮＡの統合は僅かな再配列をもたらす相対的に精密な方法である。形質転換すべきＤＮＡの領域は広い配列により定義され、介在ＤＮＡを、通常、Ｓpielmann et al., Ｍol. Ｇen. Ｇenet., 205:34(1986)およびＪorgensen et al., Ｍol. Ｇen. Ｇenet., 207:471(1987)記載のように植物ゲノム中に挿入する。現在のＡgrobacterium形質転換ベクターは、Ｅscherichia coliおよびＡgrobacterium中で複製でき、Ｋlee et al., Ｐlant ＤＮＡ Ｉnfectious Ａgent, Ｔ. ＨohnおよびＪ. Ｓchell編, Ｓpringer-Ｖerlag, Ｎew Ｙork(1985)179-203頁記載のように簡便な操作を可能にする。更にＡgrobacterium媒体遺伝子移入の最近の技術的利点は、種々のポリペプチドコード遺伝子の発現を可能にするベクターの構築を容易にする、ベクターの遺伝子および制限部位の改善された配列を有する。Ｒogers et al., Ｍethods in Ｅnzymology, 153:253(1987)に記載のベクターは、挿入ポリペプチドコード遺伝子の発現を指示するためのプロモーターおよびポリアデニル化部位にフランキングである、簡便なマルチリンカー領域を有し、本発明の目的に適する。
【０１２２】
葉ディスクおよび他の組織のＡgrobacterium媒介形質転換はＡgrobacterium tumefaciensが本来感染する植物種に限定されるように思える。従って、Ａgrobacterium媒介形質転換は、双子葉植物で最も有効である。しかしながら、Ａgrobacteriumを使用したアスパラガスの形質転換も達成できている。例えば、Ｂytebier, et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. 84:5345(1987)参照。
【０１２３】
Ａgrobacterium媒体形質転換が有効なこれらの植物種において、遺伝子移入の容易さおよび限定された性質のため、これが最良の方法である。しかしながら、ほとんどの単子葉がＡgrobacteriumの天然宿主ではないように思えるが、アスパラガスのトランスジェニック植物が、Ｂytebier et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. U.S.A., 84:5345(1987)に記載のように、Ａgrobacteriumベクターを使用して製造されている。従って、米、トウモロコシおよび小麦のような商業的に重要な穀類を別法を使用して形質転換しなければならない。植物原形質の形質転換は、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、電気泳動およびこれらの処理の組み合わせを基本にした方法を使用して達成できる。例えば、Ｐotrykus et al., Ｍol. Ｇen. Ｇenet., 199:183(1985)；Ｌorz et al., Ｍol. Ｇen. Ｇenet., 199:178(1985)；Ｆromm et al., Ｎature, 319:791(1986)；Ｕchimiya et al., Ｍol. Ｇen. Ｇenet., 204:204(1986)；Ｃallis et al., Ｇenes and Ｄevelopment, 1:1183(1987)；およびＭacrotte et al., Ｎature. 335:454(1988)参照。
【０１２４】
これらのシステムの異なる植物種への使用は、原形質からその特定植物種を再生できる能力に依存する。原形質からの穀類の再生の実例方法は、Ｆujimura et al., Ｐlant Ｔissue Ｃulture Ｌetters, 2:74(1985)；Ｔoriyama et al., Ｔheor Ａppl. Ｇenet., 73:16(1986);Ｙamada et al., Ｐlant Ｃell Ｒep., 4:85(1986);Ａbdullah et al., Ｂiotechnology, 4:1087(1986)に記載されている。
【０１２５】
原形質から充分に再生できない植物種を形質転換するために、ＤＮＡを無傷細胞または組織に挿入する他の方法が使用できる。例えば、未成熟胚または外植物からの穀類の再生は、Ｖasil, Ｂiotechnology, 6:397(1988)に記載のように行うことができる。加えて、“粒子銃”または高速微小投射物技術が同様に使用できる。このような技術を使用して、ＤＮＡを細胞壁を通して、Ｋlein et al., Ｎature, 327:70(1987)；Ｋlein et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. U.S.A., 85:;8502(1988)；およびＭcＣabe et al., Ｂiotechnology, 6:923(1988)に記載のように、１から数百メートル／秒の速度に加速する小さい(０.５２５μm)金属粒子の表面の細胞質に運ぶ。金属粒子は、細胞の数層を通って浸透し、従って組織外植物の細胞の形質転換を可能にする。金属粒子は、トウモロコシ細胞の充分な形質転換におよび稔性、安定形質転換タバコおよび大豆植物の製造に使用される。組織外植物の形質転換は、原形質段階を通る必要性を除き、トランスジェニック植物の製造を速くする。
【０１２６】
ＤＮＡは、Ｚhou et al., Ｍethods in Ｅnzymology, 101:433(1983)；Ｄ. Ｈess, Ｉntern Ｒev. Ｃytol., 107:367(1987)；Ｌuo et al., Ｐlant. Ｍol. Ｂiol. Ｒeporter, 6:165(1988)記載のように、直接ＤＮＡを花粉に移入することによりまた挿入できる。ポリペプチドコード遺伝子の発現は、Ｐena et al., Ｎature, 325:374(1987)記載のように、ＤＮＡの植物の生殖器官への注入により得ることができる。ＤＮＡはまた、Ｎeuhaus et al., Ｔheor. Ａpl. Ｇenet., 75:30(1987)；およびＢenbrook et al., Ｐroceedings Ｂio Ｅxpo 1986, Ｂutterworth, Ｓtoneham, ＭＡ, 27-54頁(1986)に記載のように、直接未成熟胚細胞へも注入でき、乾燥胚を再水和する。
【０１２７】
単一細胞原形質または種々の外植物からの植物の再生は当分野で既知である。例えば、Ｍethods for Ｐlant Ｍolecular Ｂiology, Ａ. ＷeisbachおよびＨ. Ｗeissbach編, Ａcademic Ｐress, Ｉnc., Ｓan Ｄiego, ＣＡ(1988)参照。この再生および成育法は、形質転換細胞および新芽、根および形質転換新芽の選択および土壌での小植物の生育の段階を含む。
【０１２８】
Ａgrobacterium tumefaciensにより葉外植物から挿入された異種遺伝子を含む植物の再生は、Ｈorsch et al., Ｓcience, 227:1229-1231(1985)記載のように達成できる。この方法において、形質転換体を選択試薬の存在下成育させ、新芽の形質転換された植物種への再生を誘発する媒体は、Ｆraley et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. U.S.A., 80:4803(1983)に記載の通りである。この方法は、典型的に、２から４週間内に新芽を製造し、これらの形質転換新芽を次いで、選択試薬および細菌成育を防止するための抗生物質を含む適当な根誘発媒体に移す。選択試薬存在下で発根し、小植物を形成する形質転換新芽を、次いで、土壌に移植し、根を作らせる。これらの方法は、用いる特性植物種に依存して変化し、このような変化は当分野で既知である。
【０１２９】
本発明の免疫グロブリンは、双子葉植物または単子葉植物、ナス科植物、アルファルファ、マメ科植物またはタバコである植物由来の植物細胞を含む植物細胞中に製造し得る。
【０１３０】
本発明のトランスジェニック植物は、当業者に既知の方法を使用して形質転換できる性的交差可能植物から製造できる。有用な植物種は、タバコ、トマト、マメ科植物、アルファルファ、オークおよびカエデを含む双子葉植物；芝生、トウモロコシ、穀類、オート麦、小麦および大麦を含む単子葉植物；および裸子植物、球果植物、トクサ、ヒゲノカズラ、ゼニゴケ、ツノゴケ、コケ、藻、配偶体およびシダ植物の胞子体を含む下等植物である。
【０１３１】
本発明の植物細胞は、防御タンパク質および免疫グロブリン由来重鎖に加えて、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖をコードするヌクレオチド配列も含み得る。
【０１３２】
本発明の植物細胞は、免疫グロブリン由来重および軽鎖でＳ. mutans血清型ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈ(新しい命名法ではＳ. mutans血清型ｃ、ｅおよびｆ；およびＳ. sobrinus血清型ｄおよびｇ)由来の抗原に結合できる抗原結合ドメインを有し得る。これらの植物細胞上に提示される抗原結合ドメインはまた原因の粘膜病原体と結合でき、虫歯を予防できる。
【０１３３】
本発明の植物細胞は、植物の一部であり得、以下のタイプの植物を作る：双子葉植物、単子葉植物、ナス科植物、アルファルファ、タバコまたは他のタイプの植物。
【０１３４】
Ｄ．防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む組成物
本発明は、本発明の免疫グロブリンおよび植物高分子物質を含む組成物に関する。典型的に、これらの植物高分子物質は本発明で有用な植物由来である。植物高分子物質は、本発明の免疫グロブリンと共に、例えば、植物細胞中、植物細胞の抽出物中または植物中に存在する。組成物中で本発明の免疫グロブリンと結合した典型的植物高分子物質は、リボースビホスフェートカルボキシラーゼ、集光複合体、(ＬＨ６)色素、二次代謝物またはクロロフィルである。本発明の組成物は、本発明の免疫グロブリンを、水以外の質量の１％から９９％の間の濃度で有する。他の好ましい組成物は、水以外の質量の１％から５０％の間の濃度で存在する本発明の免疫グロブリンを有する組成物を含む。他の好ましい組成物は、水以外の質量の１％から２５％の間の濃度の免疫グロブリンを含む。
【０１３５】
本発明の組成物は、植物高分子物質を、水以外の質量の１％から９９％の間の濃度で含む。典型的に組成物中に存在する質量は、植物高分子物質および本発明の免疫グロブリンから成る。本発明のグロブリンが、より高いまたは低い濃度で存在するとき、組成物中に存在する植物高分子物質の濃度は、逆比例して変化する。好ましい態様において、植物高分子の組成物は、水以外の質量の５０％から９０％の間の濃度で存在する。最も好ましい組成物において、植物高分子物質は、水以外の質量の７５％から９９％の間の濃度で存在する。
【０１３６】
本発明は、以下の全てまたは一部を含む組成物に関する：ＩｇＡ重鎖、カッパまたはラムダ鎖、Ｊ鎖。これらの成分は複合体を形成し、先に定義のように防御タンパク質に結合する。組成物はまた植物由来の分子も含む。この組成物は、機能的抗体および植物由来分子を製造する抽出工程の後に得られ得る。
【０１３７】
抽出法は、複合体を含む植物に力を掛け、それにより植物のアポプラスト成分が裂けて、複合体が遊離する工程を含む。力は、dyn／cm２としての剪断を、アポプラスト液体を遊離する最初の方法として含む。
【０１３８】
全植物または植物抽出物は、抗体および他の植物の高分子物質の混合物を含む。混合物中に含まる高分子物質の中の一つはリブロースビホスフェートカルボキラーゼ(ＲuＢisＣo)またはＲuＢisＣoのフラグメントである。他の高分子物質はＬＨＣＰである。他の分子はクロロフィルである。
【０１３９】
剪断力は、アポプラスト領域の断絶のために植物に掛ける全ての力の有用な成分である。他のタイプの力は、また剪断の効果を最適にするために含み得る。例えば、lbs／in２で測定する直接の圧力は剪断を掛けるのに使用する装置の効果を促進し得る。抗体抽出に適当ではない一般に使用される均質化技術は、全ての植物構造を爆発的に破壊する高速刀またはシリンダーの使用を含む。
【０１４０】
本発明の組成物は、本発明の免疫グロブリンおよび双子葉植物、単子葉植物、ナス科植物、アルファルファ、タバコまたは他の植物由来の植物分子を含み得る。本発明の組成物に存在する植物分子は、リブロースビホスフェートカルボキシラーゼ、集光性複合体、色素、二次代謝物、クロロフィルおよび他の植物分子を含む。
【０１４１】
防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む組成物の製造のための他の有用な方法は、植物材料の種々の溶媒での抽出および真空適用を含む。本発明の組成物は、本発明の免疫グロブリンを水以外の質量の１％から９９％の間の濃度で含み得る。本発明の組成物は、植物高分子物質を水以外の質量の１％から９９％の間の濃度で含み得る。
【０１４２】
本発明の免疫グロブリンおよび植物高分子物質を含む治療的組成物は、本発明の植物を、圧力下にその植物の一部を剪断し、治療的免疫グロブリンおよび植物高分子物質を、植物のアポプラストまたはシンプラスト由来の液体中に含み、固体植物由来材料もまた含むパルプを製造させることにより処理することにより製造し得る。固体植物由来材料を本発明の免疫グロブリンを含む液体から分離することにより、更なる処理を行い得る。このような過程の出発物質は、植物葉、幹、根、塊根、種子、果実または全植物を含み得る。典型的に、この処理は、植物のアポプラストまたはシンプラストから液体を放出させる機械的装置により達成される。更なる処理段階は、遠心沈殿フロキュレーションまたは濾過を使用した液体からの固体植物由来材料の分離を含み得る。当業者は、これらの分離法が本発明の免疫グロブリンを含む液体からの固体植物由来材料の分離をもたらすことを理解する。本発明の方法は、防御タンパク質および免疫グロブリンアルファ鎖または免疫グロブリンガンマ鎖のドメインまたは部分を含む免疫グロブリン由来重鎖を含む免疫グロブリンを製造し得る。本発明の方法は、防御タンパク質および免疫グロブリンカッパまたはラムダ鎖のドメインまたは部分を含む免疫グロブリン由来軽鎖を含む免疫グロブリンを製造し得る。
【０１４３】
本発明の方法は、植物細胞または植物の部分で操作可能である。本発明の方法は、更にまた植物の成育を含む方法も含み得る。本発明の方法は、双子葉植物、単子葉植物、ナス科植物、マメ科植物、アルファルファまたはタバコ植物を含む植物に使用し得る。本発明の方法は、葉、幹、根、塊根、種子、果実または全植物のような植物の部分から免疫グロブリンを抽出するのに使用し得る。本発明の方法は、植物のアポプラストまたはシンプラストから液体を放出させる機械的を使用し得る。本発明の植物パルプは、固体植物材料を除去するために、以下の方法のいずれか一つを使用して分離し得る：遠心、沈殿、フロキュレーションまたは濾過。
【０１４４】
Ｅ．防御タンパク質を含む免疫グロブリンの製造法
本発明は：
(ａ)転写プロモーターに操作可能に結合した防御タンパク質をコードするヌクレオチドを含む発現ベクターの植物細胞への挿入；および
(ｂ)転写プロモーターに操作可能に結合した少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖をコードするヌクレオチドを含む発現ベクターの同じ植物細胞への挿入：
の段階を含む、防御タンパク質を含む免疫グロブリンの製造法に関する。
【０１４５】
本発明の方法は、所望により、防御タンパク質および転写プロモーターに操作可能に結合した少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖のヌクレオチド配列の、発現ベクターを含む植物細胞への挿入を含む。方法は、また、既にヌクレオチド配列ならびに防御タンパク質および免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖、Ｊ鎖をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合したプロモーターを既に含む細胞への挿入も考慮する。これは、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖、Ｊ鎖および防御タンパク質のプロモーターに操作可能に結合したヌクレオチド配列を含む細胞をもたらす。
【０１４６】
本発明の植物細胞は、成育できる植物の一部として存在し得る。本発明で特に有用な植物は、双子葉植物、単子葉植物、ナス科植物、マメ科植物、アルファルファ、トマトおよびタバコ植物を含む。
【０１４７】
本発明の方法は、真核細胞中で集合した、重、軽およびＪ鎖を有する免疫グロブリンおよび防御タンパク質を含む。この真核細胞は、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖、免疫グロブリンＪ鎖および防御タンパク質をコードする発現のために操作可能に結合したヌクレオチド配列をその細胞に挿入することにより製造する。これらのヌクレオチド配列は、各個々のヌクレオチド配列にまたは１個以上のヌクレオチド配列に適当なプロモーターを付け、それにより、種々の分子をコードする二つのヌクレオチド配列をタンデムに置くことにより、発現のために操作可能に結合している。
【０１４８】
本方法により製造される、免疫グロブリン重、軽およびＪ鎖および防護タンパク質をコードするこれらのヌクレオチド配列を含む真核細胞は、これらの分子を再生し、本発明の防御タンパク質を含む免疫グロブリンに集合できるようにする条件下に維持する。
【０１４９】
本発明は、特定免疫グロブリンまたは環境条件に耐性でより安定な免疫グロブリンの抗原結合ドメインまたはドメイン群を、免疫グロブリン重鎖由来の少なくとも抗原結合ドメインの部分をコードするヌクレオチド配列を免疫グロブリンαまたはμ重鎖由来の少なくとも一つのドメインに操作可能に結合させ、キメラ免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を形成させることにより製造する方法にも関する。キメラ免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列は、防御タンパク質、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖および免疫グロブリンＪ鎖のような他の分子をまた少なくとも一つ含む真核細胞中で発現する。好ましい態様において、細胞は、免疫グロブリン由来重鎖に存在する抗原結合ドメインと相補的な抗原結合ドメインを有する免疫グロブリン由来軽鎖を含むすべての分子を含む。この方法は、キメラ免疫グロブリン重鎖を他の分子、例えば、相補的抗原結合ドメインを有する免疫グロブリン由来軽鎖および免疫グロブリンＪ鎖および防御タンパク質Ｊ鎖の少なくとも一つと結合させ、環境条件に耐性な防御タンパク質を含む免疫グロブリンを形成させる。
【０１５０】
これらの免疫グロブリンは環境条件に耐性であり、従って、高いまたは低い温度、高いまたは低いｐＨ、高いイオンまたは低いイオン濃度タンパク質分解酵素および他の厳しい条件に付されたときにより安定である。このような厳しい条件は、典型的に、人体内、例えば、腸内の天然水源および粘膜表面上および哺乳類のような動物の表面上に見られる。
【０１５１】
Ｆ．防御タンパク質を含むキメラ免疫グロブリン
本発明は、重および軽鎖を含む免疫グロブリンドメインが、重または軽鎖免疫グロブリンのいずれかの異なるアイソタイプ由来である、防御タンパク質を含む免疫グロブリンに関する。当業者は、分子技術を使用して、これらのドメインが同じドメインに置換でき、従って、二つの異なる免疫グロブリンの間のハイブリッドである免疫グロブリンを製造することを理解する。これらのキメラ免疫グロブリンは、異なる免疫グロブリンから付与された種々の望ましい特性を含む、構築すべき防御タンパク質を含む免疫グロブリンを可能にする。
【０１５２】
本発明はまた、異なる分子由来の完全より少ないドメイン含む重、軽およびＪ鎖を含むキメラ免疫グロブリンにも関する。同分子技術は、このようなキメラ免疫グロブリンの製造に使用し得る。
【０１５３】
好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤの少なくともＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ドメインを含む。本発明の好ましい他の態様は、マウスＩｇＭの少なくともＣμ１、Ｃμ２、Ｃμ３またはＣμ４ドメインを含む免疫グロブリンドメインを含む。好ましい免疫グロブリンは、マウス免疫グロブリンＩｇＥのＣε２、Ｃε３およびＣε４ドメインを含む免疫グロブリンを含む。
【０１５４】
本発明はまたヒト免疫グロブリン由来のキメラ免疫グロブリンにも関する。これらのキメラ免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンの異なる二つのアイソタイプ由来のドメインを含む。好ましい免疫グロブリンは、ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３を含む免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンを含む。他の好ましい免疫グロブリンは、少なくともヒトＩｇＭまたはＩｇＥのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメイン由来のドメインを含む免疫グロブリンを含む。本発明はまた哺乳類免疫グロブリンの少なくとも二つの異なるアイソタイプ由来の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンにも関する。一般に、哺乳類免疫グロブリンは、以下のアイソタイプのような好ましい態様で使用できる：ＩｇＧのイソタイプ、ＩｇＡのイソタイプ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭ。本発明の免疫グロブリンは、哺乳類免疫グロブリンの二つの異なるアイソタイプ由来の少なくとも一つの定常領域を含む。
【０１５５】
本発明はまた囓歯類免疫グロブリンの二つの異なるアイソタイプ由来の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンにも関する。囓歯類免疫グロブリンのアイソタイプは当分野で既知である。本発明の免疫グロブリンは、以下の免疫グロブリンの少なくとも一つを含む免疫グロブリン由来重鎖を含み得る：マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン；マウスＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４ドメイン；ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２またはＩｇＤのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン；ヒトＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４ドメイン；哺乳類ＩｇＧのイソタイプ、ＩｇＡのイソタイプ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン；哺乳類ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４ドメイン；囓歯類ＩｇＧのイソタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン；囓歯類ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン；動物ＩｇＧのイソタイプ、ＩｇＡのアイソタイプ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン；動物ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン。本発明はまた免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである分子由来のタンパク質ドメインの置換または付加にも関する。免疫グロブリンスーパーファミリーに属する分子は、免疫グロブリンと相同なアミノ酸残基配列および核酸配列を有する。免疫グロブリンスーパーファミリーの一部である分子はアミノ酸または核酸配列相同性により同定できる。例えば、Ｉmmunoglobulin Ｇenes, Ａcademic Ｐress(1989)の361頁参照。
【０１５６】
テトラトランスジェニック生物：
本発明はまた、その細胞または植物内に、細胞内にそれぞれ異なるポリペプチドをコードする４つのトランスジーン核酸に挿入された核酸を有する細胞を含むトランスジェニック生物に関する。これらのトランスジーンは、そのトランスジーンから製造されるメッセンジャーＲＮＡが４つのトランスジーンの他のものから製造されるメッセンジャーＲＮＡおよびポリペプチドと異なることとにより異なる。従って、本発明で記載されているトランスジーンの数は、通常トランスジェニック生物で見られるような同じトランスジーンの多重コピーは含まない。本発明は、他のトランスジーンの同一コピーではない４つのトランスジーンを有するトランスジェニック生物を指向する。本発明は、それぞれのトランスジーンが多重コピーで存在し得る可能性を除外しない。しかしながら、少なくとも４つの別の異なるトランスジーンがトランスジェニック生物の細胞中に存在する。
【０１５７】
加えて、本発明は、４つのトランスジーンが、多重ポリペプチド分子の一部であるポリペプチドをコードするトランスジーンという点で関連していることを考慮する。従って、本発明は、多重ペプチド分子の各個々のポリペプチド鎖がトランスジェニック生物の細胞内のトランスジーンに存在することを考慮する。多重ペプチド分子の各個々の異なるポリペプチドの発現は、トランスジェニック動物細胞内で、異なるポリペプチドが、互いに集合し、多重ペプチド分子を形成することを可能にする。従って、本発明は、個々のそれぞれの細胞中の４つの異なるトランスジーンに、多重ペプチド分子を行うために集合しないポリペプチドをコードするトランスジーンを含まない。互いに結合しない分子をコードするこのようなトランスジーンの例は、カナマイシンまたはネオマイシンまたはチミジンキナーゼのような抗生物質耐性のポリペプチドである。
【０１５８】
好ましい態様において、本発明のトランスジェニック生物に存在するトランスジーンは、以下の４つの異なるポリペプチドをコードする：防御タンパク質；少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖；少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖；および免疫グロブリンＪ鎖。他の好ましい態様において、トランスジェニック生物に存在するトランスジーンの一つは、キメラ免疫グロブリン重、軽またはＪ鎖をコードする。他の好ましい態様において、本発明のトランスジェニック生物のトランスジーンは、ＩｇＡまたはＩｇＭの少なくとも一部由来の免疫グロブリン重鎖をコードする。他の好ましい態様は、少なくともＩｇＡまたはＩｇＭ免疫グロブリン重鎖由来の免疫グロブリン重鎖由来のアミノ酸配列の部分をコードするトランスジーンを含むトランスジェニック生物を含む。
【０１５９】
本発明は、哺乳類、植物、囓歯類、爬虫類、昆虫、両生類、魚または他の生物由来のトランスジェニック生物に関する。好ましい態様において、本発明のトランスジェニック生物は植物または哺乳類である。このような生物を製造する方法は既知である。本明細書に参考として包含する、即ち、米国特許第４,７３６,８６６号；第４,６０７,３８８号；第４,８７０,００９号および第４,８７３,１９１号参照。
【０１６０】
本発明はまた、特定の種においてこれらのドメインを余り免疫原性でないように工作した免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリン由来重鎖または免疫グロブリン由来軽鎖を含む免疫グロブリンにも関する。典型的に、免疫グロブリン分子は、他の種由来のものであっても、ヒト免疫グロブリンのようにする“ヒト化”として工作する。
【０１６１】
実施例
以下の実施例は本発明の記載を説明する。これらの実施例はいかなる意味でも本発明の請求の範囲を限定しない。
【実施例１】
【０１６２】
実施例１．抗体を植物で発現させるＤＮＡベクターの構築
ａ．Ｇuy'13免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列の単離
Ｇuy's13抗Ｓ. mutans抗体のガンマおよびカッパ鎖の分子クローニングは、Ｍa et al., Ｅur. Ｊ. Ｉmmunol., 24:131(1994)記載の方法で行った。簡単には、Ｇuy's13ハイブリドーマ細胞系からｍＲＮＡを抽出し、標準工程によりｃＤＮＡに変換した。次いで、ｃＤＮＡをガンマまたはカッパｃＤＮＡのいずれかに特異的に相補的なオリゴヌクレオチドのペアを使用して増幅した。増幅は、記載のように熱サイクラー(thermal cycler)を使用してＴaq １ポリメラーゼで触媒した。増幅ｃＤＮＡを次いで適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、標準植物発現ベクターの対応する制限部位にライゲートした。このようなベクターの多くの例が文献で報告されており、一般に入手可能である。使用し得る一つのベクターの例はpBIN19である。
実験の関連するシリーズにおいて、ｃＤＮＡを細菌ベクターbluescriptにクローンした。この構築物を使用して、ガンマおよびカッパｃＤＮＡを、ＭaxamおよびＧilbert法を使用して決定した。
ＰＣＲ技術を含み、または得られたｃＤＮＡの適当なベクター中へのライゲーションに続くｃＤＮＡライブラリーの構築による抗体ｃＤＮＡをクローニングする方法は、当業者に慣用の平凡な技術である。
【０１６３】
ｂ）Ｇuy's13重鎖可変領域、ガンマ鎖定常領域の一部およびアルファ鎖定常領域の一部をコードするハイブリッド
これらの構築物は、Ｍa et al., Ｅur. Ｊ. Ｉmmunol., 24:131(1994)記載の方法で行い、上記のように適当な植物発現ベクターにライゲートした。最終構築物は構造：ＩｇＧ２Ａ重鎖と呼ぶＧuy's13可変領域−(ＩｇＧ１  ＣＨ１)−(ＩｇＧ１  ＣＨ２)−(ＩｇＡ  ＣＨ２)−(ＩｇＡ  ＣＨ３)およびＧuy's13可変領域−(ＩｇＧ１  ＣＨ１)−(ＩｇＡ  ＣＨ２)−(ＩｇＡ  ＣＨ３)を有した。
【０１６４】
ｃ）防御タンパク質およびＪ鎖
クローンウサギポリ免疫グロブリン受容体(ｐＩｇＲ)ｃＤＮＡは、Ｍostov, Ｎature, 308:37(1984)に記載され、図８に示した。防御タンパク質部分は(ｐＩｇＲ)をコードするヌクレオチド配列の部分のＰＣＲ増幅により得、上記のように適当な植物発現ベクター中にライゲートした。これらの構築に使用するｐＩｇＲの防御タンパク質部分は、アミノ酸数１のコドンからアミノ酸数６０６のコドンを含む。この構築を達成する方法は当分野で既知であり、オリゴヌクレオチドがｐＩｇＲ核酸配列を使用して選択できる。
【０１６５】
ｄ）重鎖定常領域の非糖付加誘導体をコードするｃＤＮＡ
変異誘発方法は、Ｓtratageneプロトコールに従って行った。いずれの場合(即ち、アルファ定常領域または防御タンパク質)も、炭水化物の結合部位として使用したアスパラギンのコドンは、ヒスチジンのコドンに変えた。
【実施例２】
【０１６６】
実施例２．治療的抗体を発現するトランスジェニック植物の製造
防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む植物および植物細胞は、以下の方法で製造した。
ａ）ベクターのＡgrobacterium tumefaciensへの移入
植物形質転換は、Ａgrobacterium tumefaciensを使用して行った。組換えpMON530植物発現ベクターを有するＥ. coli  ＤＨ５αは、移入機能を提供するのに、ヘルパー株(pRK2013)の存在下でＡgrobacteriumと組み合わせた。あるいは、pMON530プラスミドＤＮＡを直接形質転換によりＡgrobacteriumに挿入した。この方法において、Ａgrobacterium株を最初にＹＥＰ培地中で一晩２８℃で成育させた。一晩培養物の２mlを、ＹＥＰ  ５０mlに接種するのに使用し、ＯＤ６００が１.０になるまで成育させた。次いで、細胞を４℃で冷却し、遠心してペレットにし、氷冷２０mＭ  ＣａＣｌ２  １mlに再懸濁した。約１μｇのＤＮＡを、氷冷細胞の０.１mlのアリコートに添加した。次いで、細胞を、液体窒素に浸すかまたはドライアイスエタノール浴で急速に凍結させた。細胞を、３７℃で５分のインキュベーション、続くＹＥＰ培地１mlの添加により融解した。細胞を、穏やかに振盪しながら２−４時間インキュベートした。組換えベクターを有する個々のベクターを、適当な抗生物質を含むＹＥＰ寒天プレート上でインキュベートすることにより単離した。
pMON530を含むＡgrobacteriaをカナマイシン、スペクチノマイシンおよびクロラムフェニコールを含む培地で成育させた。次いで、タバコ葉の小断片をＡgrobacteriumと２日間共インキュベートし、その後葉切片をＡgrobacteriumを殺すためのカルベニシリン含有プレートに移した。形質転換葉細胞の全植物への再生は、植物が土壌での成育ができるまでカナマイシン選択の存在下で行わせた。
【０１６７】
ｂ）形質転換タバコおよびペチュニア植物の再生
温室で育てたタバコまたはペチュニア植物由来の葉を２０％(容量)Ｃhlorox漂白剤、０.１％ドデシル硫酸ナトリウムで、室温で８分滅菌した。次いで、葉を７０％エタノールで簡単に濯ぎ、滅菌ペトリ皿で乾燥させた。
約０.５cm直径の葉ディスクを滅菌穴開け器で除き、ＭＳ１０培地(ＭＳ１０培地リットル当たり：最小有機物含有４.４ｇ  ＭurashigeおよびＳkoog基本塩[Sigma #M68991]、３０ｇシュークロース、０.２mg酢酸ナフタレン、２mgベンジルアミノプリン、０.１mgニコチン酸、０.１mgピリドキシン、０.１mgチアミン、１０ｇ寒天、ＫＯＨでｐＨ５.７)含有寒天培地に置いた。
次いで、ＬＢ中のＡgrobacterium(約１×１０８Ａgrobacterium／ml)の２mlのアリコートを葉片に加えた。葉ディスクの全ての表面をＡgrobacteriumと接触させ、過剰な液体をプレートから注ぎ出し、ディクスを細菌と２日間室温で共培養した。次いで、このディスクをＭＳ１０培地、５０μg／mlカナマイシンおよび２５０μg／mlカルベニシリン含有(ＭＳ１０−ＫＣ)寒天プレートに移した。再生は、ディスクを、再生新芽が見えるまで週毎に新鮮ＭＳ−１０−ＫＣプレートに移すことにより行った。次いで、新芽をＭＳＯ−ＫＣ培地(ＭＳＯ−ＫＣリットル当たり：最小有機物含有４.４ｇ  ＭurashigeおよびＳkoog基本塩[Sigma #M68991]、３０ｇシュークロース、１mgニコチン酸、１mgピリドキシン、０.１mgチアミン、５０μg／mlカナマイシンおよび２５０μg／mlカルベニシリン、１０ｇ寒天、ＫＯＨでｐＨ５.７)を含む寒天プレートに移した。
根形成後、小植物を土壌に移し、成熟するまで成育させた。
【０１６８】
ｃ）形質転換アルファルファの再生
３つ葉のアルファルファを温室植物から切り、２０％(容量)Ｃhlorox漂白剤、０.１％ドデシル硫酸ナトリウムで、室温で８分滅菌した。次いで、３つ葉を７０％エタノールで簡単に濯ぎ、滅菌ペトリ皿で乾燥させた。
約１cm×４mmの葉片を滅菌外科用メスで切り取り、Ｂ５Ｈ培地(Ｂ５Ｈ培地リットル当たり：３.１ｇガンボルグ粉末培地(Ｓigma#G8593)、５００mg  ＫＮＯ３、２５０mg  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３０ｇシュークロース、５００mgプロリン、１mg  ２,４−ジクロロフェノキシ酢酸、１００μgカイネチン、１００mgイノシトール、１mgニコチン酸、１mgピリドキシン、１０mgチアミン、１０ｇ寒天、３０ml貯蔵アミノ酸、ＫＯＨでｐＨ５.７；貯蔵アミノ酸はリットル当たり２６.６ｇ  Ｌ−グルタミン、３.３２ｇセリン、１６.８mgアデニン、３３３mgグルタチオンから成り、オートクレーブ後、培地が約５０℃になった時に添加する)を含む寒天プレートに置いた。
次いで、葉片にＬＢ中のＡgrobacteriumの懸濁液(約１×１０８Ａgrobacterium／ml)２mlを加えた。葉の全ての表面をＡgrobacteraと接触させ、過剰な液体をプレートから注ぎ出し、葉を細菌と２日間室温で共培養した。次いで、葉片をＢ５Ｈ培地、２５μg／mlカナマイシンおよび２５０μg／mlカルベニシリン(Ｂ５Ｈ−ＫＣ)含有寒天プレートに移した。再生は、葉片を、体細胞胚が見えるまで週毎に新鮮Ｂ５Ｈ−ＫＣプレートに移すことにより行った。次いで、胚をＢＩＯ２Ｙ−ＫＣ培地(ＢＩＯ２Ｙ−ＫＣリットル当たり：２５ml多量栄養素、１０ml微量栄養素、２５ml鉄、１mlビタミン、１mlアミノ、２ｇ酵母抽出物、１００mgミオイノシトール、３０ｇシュークロース、１０ｇ寒天、２５ｇカナマイシン、２５０mgカルベニシリン、ＫＯＨでｐＨ５.９；多量栄養素はリットル当たり４０ｇ  ＫＮＯ３、４０ｇ  ＮＨ４ＮＯ３、１３.８８ｇ  Ｃａ(ＮＯ３)２−４ＦＵＯ、１.４ｇ  ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、２.６ｇ  ＫＣｌ、１２ｇ  ＫＨ４ＰＯ４から成る４０×貯蔵を作る；ビタミンはリットル当たり１００mgチアミンＨＣｌ、５００mgニコチン酸、１００mgピリドキシンＨＣｌから成る１０００×貯蔵を作る；アミノはリットル当たり２ｇグリシンから成る１０００×貯蔵を作る；微量栄養素はリットル当たり５８０mgＭｎＳＯ４−４Ｈ２Ｏ、１５５０mg  ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、１６０mg  Ｈ３ＢＯ３、８０mg  ＫＩを含む１００×貯蔵を作る；鉄はリットル当たり１.２８ｇ  ＮａＦｅＥＤＴＡを含む４０×貯蔵を作る)を含む寒天プレートに移した。
根形成後、小植物を土壌に移し、成熟するまで成育させた。
【０１６９】
ｄ）形質転換トマト植物の再生
７日齢苗木由来の子葉を２０％(容量)Ｃhlorox漂白剤、０.１％ドデシル硫酸ナトリウムで、室温で８分滅菌した。次いで、葉を７０％エタノールで簡単に濯ぎ、滅菌ペトリ皿で乾燥させた。
約０.５cm直径の子葉片を滅菌外科用メスで切り、ＭＳ４培地(ＭＳ４培地リットル当たり：最小有機物含有４.４ｇ  ＭurashigeおよびＳkoog基本塩[Sigma #M68991]、３０ｇシュークロース、２mgゼアチンリボシド、５mgニコチン酸、０．５mgピリドキシン、０.５mgチアミン、１mＭアセトシリンゴン、１０ｇ寒天、ＫＯＨでｐＨ５.７)含有寒天培地に置いた。
次いで、ＬＢ中のＡgrobacterium(約１×１０８Ａgrobacterium／ml)の２mlの懸濁液を葉片に加えた。葉ディスクの全ての表面をＡgrobacteriumと接触させ、過剰な液体をプレートから注ぎ出し、ディクスを細菌と２日間室温で共培養した。次いで、このディスクをＭＳ４培地、５０μg／mlカナマイシンおよび２５０μg／mlカルベニシリン含有(ＭＳ４−ＫＣ)寒天プレートに移した。再生は、ディスクを、再生新芽が見えるまで週毎に新鮮ＭＳ−４−ＫＣプレートに移すことにより行った。次いで、新芽をＭＳＯ−ＫＣ培地(ＭＳＯ−ＫＣリットル当たり：最小有機物含有４.４ｇ  ＭurashigeおよびＳkoog基本塩[Sigma #M68991]、３０ｇシュークロース、１mgニコチン酸、１mgピリドキシン、１０mgチアミン、５０μg／mlカナマイシンおよび２５０μg／mlカルベニシリン、１０ｇ寒天、ＫＯＨでｐＨ５.７)を含む寒天プレートに移した。
根形成後、小植物を土壌に移し、成熟するまで成育させた。
【０１７０】
ｅ）形質転換シロイヌナズナ属の再生
無菌培養で成育したシロイヌナズナ(Ａrabidopsis thalliana)植物由来の無傷根を、最初、暗所で３日間、２８℃でカルス誘発培地(ＣＩＭ)で前処理した(ＣＩＭ培地リットル当たり：３.１ｇガンボルグ粉末培地(Ｓigma#G8593)、３０ｇシュークロース、１mg  ２,４−ジクロロフェノキシ酢酸、１００μgカイネチン、１mgイノシトール、０.１mgニコチン酸、０.１mgピリドキシン、０.１mgチアミン、８ｇ寒天、ＫＯＨでｐＨ５.７)。
次いで、無傷根にＬＢ中のＡgrobacteriumの懸濁液(約１×１０８Ａgrobacterium／ml)２mlを加えた。根の全ての表面をＡgrobacteraと接触させ、過剰な液体をプレートから注ぎ出した。次いで、無傷根を５mmセグメントに切断し、細菌と２日間、２８℃でＣＩＭプレート上で共培養した。次いで、根片を５０μg／mlカナマイシンおよび２５０μg／mlカルベニシリン含有新芽誘発培地(ＳＩＭ)(ＳＩＭ培地リットル当たり：３.１ｇガンボルグ粉末培地(Ｓigma#G8593)、３０ｇシュークロース、５mg  Ｎ６−(２−イソペンテニル)アデニン、１５０μgインドール−３−酢酸、１mgイノシトール、０.１mgニコチン酸、０.１mgピリドキシン、０.１mgチアミン、８ｇ寒天、ＫＯＨでｐＨ５.７)に移した。
再生は、根片を、緑色新芽が見えるまで週毎に新鮮ＳＩＭプレートに移すことにより行った。次いで、新芽をＥＭ培地(ＭＳＯ−ＫＣリットル当たり：最小有機物含有４.４ｇ  ＭurashigeおよびＳkoog基本塩[Sigma #M6899]、１０ｇシュークロース、１mgインドール−３−酪酸、１mgニコチン酸、０.１mgピリドキシン、０.１mgチアミン、２５０μg／mlカルベニシリン、８ｇ寒天、ＫＯＨでｐＨ５.７)を含む寒天プレートに移した。
根形成後、小植物を土壌に移し、成熟するまで成育させた。
【実施例３】
【０１７１】
実施例３．トランスジェニック植物の同定
個々の免疫グロブリン鎖を発現するカナマイシン耐性形質転換体を記載のようにELISAで同定した。形質転換体の更なる分析は、ノーザンブロッティングによるＲＮＡの評価およびウエスタンブロッティングによる免疫グロブリンポリペプチドの評価を含み、両方ともＭaniatis et al.に記載されていた。
各免疫グロブリン鎖については、抗原性物質、ＲＮＡまたはタンパク質を各検定で検出した。最も高いレベルの免疫グロブリンを有すると同定された形質転換体を、交差授粉プロトコールに使用した。
【実施例４】
【０１７２】
実施例４．形質転換体の交差授粉による抗体の集合
交差授粉を、記載の抗体の種々の成分を共発現する植物を得るために行った。これらの交配は、以下の集合成分を含むアルファルファ、トマト、タバコおよびシロイヌナズナ植物を産生し、全てＧuy's13抗原結合ドメインもまた含んだ。
【表２】
2008194054.tif 000004
【実施例５】
【０１７３】
実施例５．トランスジェニック植物由来のＧuy'sタイプ１、２および３＆４抗体の抽出および評価
ａ）葉に含まれる抗体の抽出および富化
葉片を約１cm２片に切った。次いで、これらの切片を、両方約４℃の冷却磁気乳鉢に含まれる、１０μg／mlロイペプチン含有ＴＢＳの冷却溶液に添加した(１mlＴＢＳ／グラム葉)。植物液体を、回転動および手で押して、切片を冷却乳棒で粉砕することにより抽出した。粉砕は、切片がほとんど均質なパルプになるまで続けた(約３分の粉砕)。パルプを４℃で約５０,０００×ｇで遠心し、固体植物片がない上清を作った。あるいは、パルプを、孔サイズ約１００ミクロンのプラスティックメッシュを通して濾過した。
特定植物に含まれる抗体の力価に依存して、上清は抗原に直接さらすのに適当であるかまたは適当な濃度までの富化が必要であった。粗抽出物中のＩｇＧ１またはＩｇＧ／Ａは、決まりきって、１０μg／ml以下であり、平均約５μg／mlであった。Ｇuy's13抗体の粘膜表面への適用のため、１から４mg／mlの濃度までの富化が必要であり得る。１、２または３構築物のタイプについて、Ｇuy's13抗体は、１０から１４倍の富化が、所望の濃度を作るのに必要であった。これは、親和性吸着(プロテインＡまたはプロテインＧのいずれかを使用して)、または水を除去するための凍結乾燥により達成された。サイズ排除クロマトグラフィーもまた富化に使用したが、必要な濃度の抗体を産生するために、粗抽出物の完全フラクションが必要であった。ELISA検定およびポリアクリルアミドゲル電気泳動により、共発現鎖は、複合体中に、タイプ１＆２については約１８０−２００ｋダルトンおよびタイプ３については約４００ｋダルトンが集合した。粗抽出物は、決まり切って、約５−１０μg／mlを含んで得られた。
抗体蓄積の劇的増加は、防御タンパク質が、タイプ４抗体を含む植物を産生するタイプ３抗体を含む植物に交配されたときに見られた。ELISAおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動により、共発現鎖は、複合体中に約４７０,０００ダルトンで集合された。粗抽出物は、決まり切って、２００μg／ml以上を含み、平均約２５０μg／mlを含んで得られた。従って、Ｇuy's13抗体のＳＩｇＡ構築物は標的濃度を達成するために、最小富化を必要とした。この富化は、上記技術で達成された。あるいは、抗体が分子排除２００,０００ｄの膜を使用した限外濾過により、植物分子の多くから容易に分離されることが分かった。
【０１７４】
ｂ．Ｇuy's13タイプ４抗体の機能
機能的抗体研究をELISAにより行った。抗体軽および重鎖を発現する全ての植物は、連鎖球菌抗原(ＳＡ  Ｉ／II)を特異的に認識する機能的抗体を集合させた。結合のレベルおよび力価曲線は、マウスハイブリドーマ細胞上清のものと類似していた。ＳＡ  Ｉ／II結合は、Ｊ鎖のみまたは防御タンパク質のみを発現する植物では検出されなかった。同様に、免疫グロブリンを発現しない野生型植物も、結合の検出可能レベルは示さなかった。
同様な一連の実験で、抗体の固定化精製連鎖球菌抗原または細菌細胞表面上の天然抗原への結合が、抗分泌成分抗血清を使用して検出された。これらの検定において、タイプ４抗体結合のみが検出された。機能的タイプ１、２または３抗体は抗分泌成分抗血清に結合しなかった。これらの結果は、防御タンパク質がタイプ４構築物を発現する植物中の抗体と、抗原結合を妨げない方法で、集合することを確認する。
【実施例６】
【０１７５】
実施例６．キメラ免疫グロブリンの発現
マウスモノクローナル抗体(mＡb Ｇuy's13)の重および軽鎖をコードする遺伝子を、タバコ(Ｎicotiana tabacum)にクローンし、発現させた。トランスジェニック植物は、完全長Ｇuy's13抗体を分泌するものに再生した。重鎖遺伝子配列の操作により、免疫グロブリンアルファ重鎖由来の定常領域が挿入され、Ｇuy's13mＡbと共にキメラガンマ／アルファ重鎖も分泌する植物がまた製造される。各植物抗体について、軽および重鎖はウエスタンブロットにより分析し、集合の忠実度を、抗原結合研究により、抗体が完全に機能することを証明することにより確認する。更に、植物抗体は、連鎖球菌を凝集する能力を残し、これは完全長抗体の２価抗原結合能力が無傷であることを証明する。
【０１７６】
ａ．重および軽鎖のクローニング
メッセンジャーＲＮＡをＧuy's13およびマウスＩｇＡ(ＭＯＰＣ３１５)ハイブリドーマ細胞系から、酸グアニジニウムチオシアナート−フェノール−クロロホルム抽出を使用して精製した。相補的ＤＮＡを、Ｍoloneyマウス白血病ウイルス逆転写酵素(Ｐromega, ＧＢ)を使用して作った。Ｇuy'13のガンマおよびカッパ鎖をコードするＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により増幅した。変性ＰＣＲに使用したオリゴヌクレオチドは、増幅ＤＮＡフラグメントの５'末端ＸhoＩおよび３'末端ＥcoＲＩ制限部位を含むように設計された。制限酵素消化に続き、免疫グロブリン鎖コードＤＮＡを、クローニング部位の上流にマウス免疫グロブリンリーダー配列を含む構築植物発現ベクター(pMON 530)にライゲートした。組換えベクターをＥ. coli(ＤＨ５−α, Ｇibco ＢＲＬ)形質転換に使用し、サザンブロッティングでスクリーニングし、本来のＰＣＲ生産物由来の放射標識ＤＮＡプローブを使用した。プラスミドＤＮＡを陽性形質転換体から精製し、Ａgrobacterium tumefaciensに挿入した。
同様な研究を、ハイブリッドＧuy's13重鎖の二つの形を構築するのに使用した。図１に示す合成オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲで：(ａ)Ｃγ１ドメイン(Ｊ１−Ｊ５)の３'末端にＧuy's13シグナル配列、(ｂ)Ｃγ２ドメイン(Ｊ１−Ｊ２)の３'末端にＧuy's13シグナル配列および(ｃ)MOPC315ハイブリドーマ(Ｊ３−Ｊ４)由来のＤＮＡの３'末端にＣα２ドメインの５'末端領域を増幅するために使用した。フラグメントを精製し(Ｇeneclean II, Ｂio101, ＬaＪolla, ＣＡ)、１時間、３７℃でＨindIIIで消化させた。Ｇuy's13フラグメントをMOPC315フラグメントにＴ４ＤＮＡリガーゼ(Ｇibco, ＢＲＬ)で、１６℃で１６時間ライゲートし、反応混合物のアリコートを、Ｇuy's13(Ｊ１)の５'末端オリゴヌクレオチドおよびMOPC315(J4)の３'末端オリゴヌクレオチドを使用した、更なるＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして使用した。増幅ＤＮＡフラグメントを精製し、上記のようにpMON530ベクターにライゲートした。この方法で使用したベクターは、予め挿入されたマウスリーダー配列を有せず、この場合は、天然Ｇuy's13リーダー配列をコードするＤＮＡをＰＣＲ増幅に含んだ。
【０１７７】
ｂ．植物形質転換および再生
約６mm直径の葉ディスクを表面滅菌タバコ葉(Ｎicotiana tabacum, var. xanthii)から切り、一晩、２８℃で、免疫グロブリンｃＤＮＡ挿入体含有組換えＡ. tumefaciensの培養と共にインキュベートした。このディスクを新芽の再生を誘発する、カナマイシン(２００mg／ｌ)およびカルベニシリン(５００mg／ｌ)添加培地を含む培養プレートに移した。この段階後の新芽発育を切除し、カナマイシン(２００mg／ｌ)を添加した根誘発培地に移植した。発根小植物を、根の出現のできるだけ直後に土壌に移植した。植物を、下記のように、免疫グロブリン鎖発現についてスクリーニングした。重鎖を発現したものは、軽鎖を発現したものと、交差授粉により交配させた。得られた種子を土壌に蒔き、発芽させた。２２トランスジェニック植物が、ELISAで測定して、軽または重鎖構築物を伴って形質転換体から再生した。軽および重鎖分泌植物の交差は、カッパおよびガンマ鎖を共に発現するＦ１植物３／１０、カッパおよび植物Ｇ１／Ａ重鎖を両方発現する植物４／１７およびカッパおよび植物Ｇ２／Ａ重鎖を両方とも発現する植物３／８をもたらした。
植物中でのＧuy's13モノクローナル抗体発現の３つの異なる形は、従って、全て、同一な軽(カッパ)鎖であるが、異なる重鎖を含む。これらは、この報告を通して、以下(図１)のように略する：本来のガンマ重鎖のＧuy's13ＩｇＧ、植物Ｇ１３、var−γ１−γ２−α２−α３ドメインを含むＩｇＧ／ＩｇＡハイブリッド重鎖のＧuy's13、植物Ｇ２／Ａ。陽性対照として使用するＧuy's13ハイブリドーマ細胞培養上清をマウスＧ１３と略す。陰性対照植物は、無関係マウスタンパク質をコードする挿入体を含むpMON530ベクターで形質転換したものである。
【０１７８】
ｃ．抗体鎖検出
ガンマ、カッパまたはガンマ／アルファ鎖ハイブリッドの製造をELISAで検出した。マイクロタイターウェルを、１５０mＭ  ＮａＣｌ、２０mＭ  Ｔris−ＨＣｌ(ｐＨ８)(ＴＢＳ)中のヤギ抗マウス重または軽鎖特異的ＩｇＧ(Ｆisher, ＵＳＡ；Ｓigma, ＧＢ；Ｎordic Ｐharmaceuticals, ＧＢ)で覆った。ブロッキングは、ＴＢＳ中の５％脱脂粉乳で４℃で一晩行った。植物葉をＴＢＳ中で、ロイペプチン(１０μg／ml)(Ｃalbiochem, ＵＳＡ)と共に均質化した。上清を連続２倍希釈でマイクロタイタープレートに添加し、４℃で一晩インキュベートした。０.０５％トゥイン２０含有ＴＢＳで洗浄後、結合免疫グロブリン鎖を適当な西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス重または軽鎖特異的抗体(Ｆisher；Ｓigma；Ｎordic Ｐharmaceuticals)で、２時間、３７℃で検出した。検出は、２,２'−アジノ−ジ(３−エチル−ベンズチアゾリン−スルホネート)(Ｂoehringer, ＦＲＧ)で行った。
同様な検定を使用して、マウスおよび植物Ｇuy's13抗体の濃度の測定を行った。これらを、既知の濃度で使用したマウスＩｇＧ１(MOPC21)およびマウスＩｇＡ  mＡb(TEPC21)(Ｓigma)と比較した。ELISAプレートを抗マウスカッパ抗血清で覆った。ブロッキング後、結合抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスガンマまたはアルファ抗血清で検出した。抗体濃度を、各抗体の結合曲線を比較して測定した。
ELISAをまた集合抗体の結合機能測定の検出に使用した。ＳＡ  Ｉ／IIへの結合を、２μg／mlの最適濃度の精製ＳＡ  Ｉ／IIで覆ったマイクロタイタープレートを使用して検出した。ELISA法は上記の通りである。Ｓ. mutansまたはＥ. coli細胞を結合する能力は、静止期まで１８時間、３７℃で成育させ、固定した無傷細胞(株Ｇuy's ｃ、Ｓ. mutansおよびＤＨ５−α、Ｅ. coli)を使用して検出した。全ての抗体溶液を１.５μg／mlの最初の濃度に調節し、連続２倍希釈で使用した。Ｇuy's13重または軽鎖を単独に発現する植物の抽出物でまたこの検定を行い、単一免疫グロブリン鎖が抗原結合活性を示すか否か測定した。細胞または精製ＳＡ  Ｉ／IIに結合する抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス軽または重鎖抗血清(Ｎordic Ｐharmaceuticals)を使用して検出した。この結果は、３つの別の検定の二つの結果の平均±標準分散として示す。
競合ELISAは、精製ＳＡ  Ｉ／IIで覆ったマイクロタイタープレートで、上記のように行った。プレートを、１.５μg／mlのＧuy's13ハイブリドーマ上清の植物抽出物および連続二倍希釈で、３７℃で１時間および４℃で一晩行った。洗浄後、１２５Ｉ−標識マウスＧuy's13を添加し、２時間３７℃でインキュベートを続けた。プレートを再び洗浄し、結合放射活性をガンマカウンター(Ｈydragamma16,Ｉnnotec, ＧＢ)で計数した。結果を標識マウスＧuy's13の阻害％として示し、１００％はブロッキング溶液を添加していないウェルからの放射活性計数である。
【０１７９】
ｄ．ウエスタンブロット分析
葉均質物の１０μlのアリコートを、還元および非還元条件下で、７５mＭ  トリス−ＨＣｌ(ｐＨ６.８)、２％ＳＤＳと共に沸騰させた。１０％アクリルアミドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルをニトロセルロースにブロットした。ブロットを１６時間、０.０５％トゥイン２０および１％脱脂粉乳含有ＴＢＳ中でインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＩｇＧ１、カッパ(Ｎordic Ｐharmaceuticals)またはアルファ鎖特異的抗血清(Ｓigma)と２時間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、２層抗体、アルカリホスファターゼ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ(Ｓigma)を２時間、３７℃で適用した。抗体結合を、３００μg／mlニトロブルーテトラゾリウムおよび１５ｐ  μg／ml  ５−ブロモ−５−クロロ−３−インドリルホスフェート(Ｐromega)とのインキュベーションにより検出した。
【０１８０】
ｅ．ＤＮＡ配列決定
各クローン免疫グロブリン遺伝子挿入体のＤＮＡ配列は、ＰＣＲ増幅またはクローニング工程中に変異が起こっていないことを確認する。λ／γハイブリッド重鎖のＨindIII部位の挿入は、植物Ｇ２／ＡのＣγ２およびＣα２ドメインの間のロイシン残基および植物Ｇ１／ＡのＣγ１およびＣα２ドメインの間のロイシン−リジン残基の予定された挿入をもたらす。植物Ｇ２／Ａ構築物の付加Ｃγ２ドメインは、重鎖の長さを１４１アミノ酸残基(約１２０００Ｄa)まで増加させる。予定の植物Ｇ１／Ａ重鎖は、天然Ｇuy's13重鎖より、３３アミノ酸まで、約３０００Ｄa大きい。
Ｅ. coliの陽性形質転換体から精製されたプラスミドＤＮＡを配列決定した。免疫グロブリン遺伝子挿入体を切除し、Ｂluescript(Ｓtratagene, USA)にサブクローンした。ＤＮＡ配列を、ジデオキシ末端法(Ｓequenase, USB, USA)で測定した。
【０１８１】
ｆ．集合抗体の発現
これらの代表的Ｆ１子孫植物由来の抽出物のウエスタンブロット分析は行われ、Ｍa et al., Ｅur. Ｊ. Ｉmmunol., 24:131-138(1994)の図２に報告されている。還元条件で流したサンプルは、マウスＧuy'13ならびに３つのトランスジェニック植物での約２５Ｋｄの所の軽鎖の存在を証明するが、対照植物にはなかった。Ｇuy's13重(ガンマ)鎖はまた植物Ｇ１３の約５７Ｋｄの所で検出されるが、対照植物抽出物ではなかった。単一タンパク質種は検出され、Ｇuy's13抗体細胞培養上清を製造するハイブリドーマと異なり、２つのタンパク質種が矛盾しない発見であった。マウス重鎖の分子サイズの差異は恐らく糖付加差異によるものであり、この結果は、植物中で二つの重鎖が同じ方法で糖付加され得ることを示す。
植物Ｇ１／ＡおよびＧ２／Ａの重鎖を、抗アルファ鎖抗血清で検出する。マウスＧuy's13重鎖(約５７Ｋｄ)と比較して、植物Ｇ１／Ａの重鎖は僅かに大きい相対的分子質量(約６０Ｋｄ)を有し、植物ＧＡ／２重鎖はより大きい(約７０Ｋｄ)。これは配列分析で予期される分子量と一致する。幾つかの他のタンパク質種はトランスジェニック植物抽出物質で検出された。これらは、対照トランスジェニック植物からの抽出物で結合が検出されかったため、軽／重鎖複合体または重鎖のタンパク質分解フラグメントであるようである。抗アルファ鎖抗血清は、ガンマ鎖ドメインのみを含むマウスＧuy's13と交差反応しなかった。
サンプルをまた非還元条件でも流し、免疫グロブリン分子中への重および軽鎖の集合を確認し、Ｍa et al., Ｅur. Ｊ. Ｉmmunol., 24:131-138(1994)に報告されている。検出は、標識抗カッパ抗血清と行われ、全ての３つのトランスジェニック植物は、完全長抗体の上記１５０Ｋｄの正しいＭｒで集合免疫グロブリンを有した。植物Ｇ１３抗体は、マウスＧ１３と同じＭｒを有するが、植物Ｇ２／Ａおよび植物Ｇ１／Ａ抗体は予測したように、高いＭｒを有した。多くの小さいタンパク質分解フラグメントもまた検出され、それは先の発見および多くのプロテアーゼが抗体抽出工程中に遊離される事実と一致する。これらの抗体フラグメントは、対照植物抽出物における検出可能バンドの欠失により確認される。
【０１８２】
ｇ．抗原結合
免疫グロブリンを製造する１０個の植物を全部で製造し、植物抽出物中の免疫グロブリンの濃度は１から１０μg／ml(平均４.５μg／ml)の間で変化した。この研究で使用したマウス抗体および代表植物について、ELISAで測定した濃度は：マウスＩｇＧ−１５.４μg／ml、植物ＩｇＧ−７.７μg／ml、植物Ｇ１／Ａ−１.５μg／mlおよび植物Ｇ２／Ａ−２.１μg／ml。ハイブリッド重鎖を含む植物抗体について測定した濃度は、使用した標準ｍＡｂ  ＩｇＡと比較して、定常領域決定基の全ては有しないため、恐らく少なく見積もられる。
【０１８３】
ＳＡ  Ｉ／IIと結合する３つの代表トランスジェニック植物の抽出物の力価曲線は製造され、Ｍa et al., Ｅur. Ｊ. Ｉmmunol., 24:131-138(1994)に報告されている。特異的抗体は全ての３つのトランスジェニック植物から検出可能であり、力価曲線はマウスは、同じ濃度で使用したマウスハイブリドーマ細胞培養上清と同一であった。力価曲線は同じパターンに従うが、植物Ｇ１／Ａ抗体の結合は他の抗体より僅かに低いように見える。ＳＡ  Ｉ／II結合活性は、陰性対照植物で検出されず、また精製ＳＡ  Ｉ／IIに対して結合活性を有する軽または重鎖を個々に発現する植物からも抽出されなかった。これらの発見は、軽および重鎖の両方を発現するトランスジェニック植物が、抗体分子を正確に集合させ、機能的抗原結合部位を形成し、一つの軽または重鎖は抗原を結合できないことを証明する。
植物抗体はまたＭa et al., Ｅur. Ｊ. Ｉmmunol., 24:131-1387(1994)(Ｓ. mutans血清型ｃ)の図５に示されるように、連鎖球菌細胞表面の天然抗原も認識し、更に植物抗体の抗原結合部位の無傷さを確認する。異なる抗体の結合部位で明白な差はなかった。対照からのまたは重または軽鎖のみを発現する植物からの抽出物は、Ｓ. mutans細胞への結合を示さなかった。１.０および０.５μg／mlの濃度で、植物抽出物のＥ. coli細胞への結合はなかった。
植物抗体は、ＳＡ  Ｉ／IIへの結合について、本来のマウスＧuy's13  mＡbと競合する。１２５Ｉ−標識マウスＧuy's13  mＡbのＳＡ  Ｉ／IIへの結合の８５％までの阻害が、Ｍa et al., Ｅur. Ｊ. Ｉmmunol., 24:131-138(1994)の図６に示されるように、植物抗体を使用して証明された。前記のように、植物抗体の阻害力価曲線は互いに類似であり、マウスＧuy's13のものと同等であるが、対照植物抽出物は阻害しなかった。
【０１８４】
ｈ．Ｓ. mutansの凝集
細菌のＧuy's13抗原結合領域を有する植物で製造された免疫グロブリンの活性は、Ｍa et al., Ｅur. Ｊ. Ｉmmunol., 24:131-138(1994)の図７で測定および報告されている。植物抽出物は、０.２２μm孔サイズフィルターを通した濾過により滅菌し、Ｔodd Ｈewittブロスで１０倍希釈した。サンプルにＳ. mutans一晩培養物の０.０５容量を接種し、３７℃で一晩インキュベートした。サンプルをグラム染色し、油浸顕微鏡観察下に試験した。マウスＧuy's13、植物Ｇuy's13、植物Ｇ１／Ａまたは植物Ｇ２／Ａ存在下で成育したＳ. mutansは凝集し、細胞クランピングが明らかであった。しかしながら、対照植物抽出物は、Ｓ. mutans成育に何ら影響を与えなかった。８、１２および１６時間での生存生物の培養により測定し、植物ｍＡｂはＳ. mutansの成長速度に影響は与えなかった。この結果は、植物抗体が、抗原結合領域を正確に集合させているだけでなく、抗体分子が抗原に二価的に結合することも証明する。
【実施例７】
【０１８５】
実施例７．防御タンパク質を含む免疫グロブリンの製造
４種のトランスジェニックタバコ植物を生育させ、(１)Ｇuy's13軽鎖の抗原結合部位を有するマウスモノクローナル免疫グロブリンカッパ鎖、(２)Ｇuy's13重鎖のＣγおよびＣα鎖ドメイン並びに抗原結合部位を含むハイブリッドＩｇＡ／Ｇマウス免疫グロブリン重鎖、(３)マウスＪ鎖および(４)ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸１−６０６を含み、ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸６２７−６７５を含まない防御タンパク質を発現させた。実施例１参照。これらの植物間の連続的交配は、子孫植物における全ての４つのタンパク質鎖の同時発現をもたらした。ある場合、戻り交配を、ホモ接合植物を製造するために使用した。４つの組換えポリペプチドは、約４７０,０００Ｋｄの防御タンパク質を含む機能的、高分子量免疫グロブリンに結合した。防御タンパク質の免疫グロブリンへの集合は、抗体単独を発現する植物を防御タンパク質を発現するものと交配した場合に、防御タンパク質の結合が検出されていないため、Ｊ鎖の存在に依存する。防御タンパク質を含む免疫グロブリンを発現する植物の顕微鏡評価は、単一細胞中の防御タンパク質および免疫グロブリン重鎖の同時発現を証明した。単一細胞は、トランスジェニック植物中で防御タンパク質を有する免疫グロブリンを製造できるが、２つの細胞は、哺乳類で分泌型免疫グロブリンの天然の製造に必要である。結果は、組換えサブユニットを発現するトランスジェニック植物の交配が、受動免疫治療用防御タンパク質の大規模製造にならびに他の複合体タンパク質分子の発現に適していることを証明する。防御タンパク質を含む免疫グロブリンは、Ｓmith, Ｒ.＆Ｌehner, Ｔ. Ｏral Ｍicrobiol. Ｉmmunol. 4, 153-158(1989)に示される用に、経口連鎖球菌の細胞表面粘着分子ＳＡ  Ｉ／IIを特異的に認識するＧuy's13モノクローナル抗体由来の重および軽鎖抗原結合ドメインを有する。重および軽鎖のみを含むこのタイプのトランスジェニック免疫グロブリンは、実施例６に記載のように、Ｎicotiana tabacum植物で製造されている。コード長ｃＤＮＡを含むマウスＪ鎖構築物を、Ｍatsuuchi, Ｌ., Ｃann, Ｇ. Ｍ.＆Ｋoshland, Ｍ.Ｅ. ＰＮＡＳ 83, 456-460(1986)に記載のように、マウスＪ鎖のＮ末端ＭＫＴＨＬＬおよびＣ末端ＳＣＹＰＤに対応する合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。この増幅ヌクレオチド配列を、カリフラワー・モザイク・ウイルスの３５Ｓプロモーターを含み、Ｒogers, Ｓ. Ｇ., Ｋlee, Ｈ. Ｊ. Ｈorsch, Ｒ. Ｂ.＆Ｆraley, Ｒ.Ｔ. Ｍeth. Ｅnzymol. 153, 253-2796(1987)に記載されている構造的植物発現ベクター、pMON530にライゲートした。タバコ葉組織を、前実施例に記載のように組換えプラスミドを含むアグロバクテリウムを使用して形質転換した。再生植物を、Ｊ鎖をコードするメッセンジャーＲＮＡの製造についてスクリーニングし、陽性形質転換体を、ホモ接合子孫を製造するために自家授粉した。Ｊ鎖発現植物を最初に、キメラ免疫グロブリン重鎖およびカッパ鎖を発現するものと交配した。キメラ免疫グロブリン重鎖を発現する植物由来の植物抽出物の、抗カッパ抗血清による、非還元条件下でのウエスタンブロット分析は、本来のＩｇＧ１抗体と比較して、キメラ免疫グロブリン重鎖に存在する余分な定常領域の存在と一致する、約２１０Ｋｄのタンパク質種���明らかにした。免疫グロブリンを発現する植物とＪ鎖植物の間の交配は、相対的分子量約４００Ｋｄの約２倍の主要免疫グロブリンバンドの存在をもたらし、３ポリペプチドの集合が２量体免疫グロブリン(ｄＩｇＡ／Ｇ)を発生させることを証明した。
【０１８６】
コード長ｃＤＮＡを含む防御タンパク質構築物を、ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸６０１−６０６のＮ末端ＭＡＬＦＬＬおよびＣ末端ＡＶＱＳＡＥに対応するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。ウサギポリ免疫グロブリン受容体のヌクレオチド配列は、Ｍostov, Ｋ. Ｅ., Ｆriedlander, Ｍ.＆Ｂlobel, Ｇ. Ｎature 308, 37-43(1984)に報告されている。防御タンパク質を上記のようにトランスジェニック植物中で産生させ、防御タンパク質を発現する陽性形質転換体をウエスタンブロット分析により同定した。
【０１８７】
２量体を形成するために、ＩｇＡ／Ｇ重鎖を有する免疫グロブリンと会合させたＪ鎖を発現する植物を、次いで、防御タンパク質を発現するホモ接合植物と交配した。防御タンパク質を有する免疫グロブリンを発現する子孫植物は、非還元条件下でウエスタンブロット分析で測定して、約４７０Ｋｄの高分子量タンパク質種を含んだ。この分子サイズは、防御タンパク質を含む免疫グロブリンで予期されるものと一致した。この高分子量タンパク質は、防御タンパク質を特異的に認識する抗血清を使用したウエスタンブロットで確認して、防御タンパク質を含んだ。植物抽出物は、また、ＩｇＡ／Ｇの２量体に対応する約４００Ｋｄのタンパク質種およびキメラ重鎖の免疫グロブリンに対応する約２１０Ｋｄのタンパク質種も含んだが、これらは抗カッパ抗血清でのみ検出され、抗防御タンパク質抗血清では検出されなかった。防御タンパク質のみを製造するトランスジェニック植物において、高分子量タンパク質が非還元条件のウエスタンブロットで検出されたため、防御タンパク質が内因性植物タンパク質と会合しているまたは多量体を形成している証拠はなかった。ウエスタンブロット分析は、防御タンパク質またはＪ鎖のみを含む植物または野生型植物由来ではなく、免疫グロブリン重鎖(ＩｇＡ／Ｇ、２量体ＩｇＡ／Ｇおよび防御タンパク質を含む免疫グロブリン)由来の抽出物が同一の免疫グロブリン由来重および軽鎖を含むことを証明した。更に、防御タンパク質を含む植物および防御タンパク質を有するＩｇＧ／Ａ免疫グロブリンを含む植物のみが、防御タンパク質を特異的に認識する抗血清により認識されるタンパク質を発現した。野生型対照植物からの抽出物で、交差反応タンパク質は検出されなかった。
【０１８８】
哺乳類において、免疫グロブリンを有する分泌成分の集合は、Ｂrandtzaeg, Ｐ.＆Ｐrydz, Ｈ. Ｎature 311, 71-73(1984)に記載のように、Ｊ鎖の存在を必要とする。キメラ重鎖(ＩｇＡ／Ｇ)を含む免疫グロブリンを発現する植物を、防御タンパク質を発現する植物と交配させた。免疫グロブリンおよび防御タンパク質をＪ鎖無しで発現する子孫は１０のうち一つも集合複合体を製造しなかったが、比較して、Ｊ鎖２量体免疫グロブリンおよびＪ鎖無しの防御タンパク質を共発現する植物の１０／１０が防御タンパク質を含むＭｒ４７０Ｋｄ免疫グロブリンを集合させた。これは、哺乳類で見られるように、Ｊ鎖が防御タンパク質の免疫グロブリンへの会合に必要であることを確認する。抗カッパ抗血清で、約２１０Ｋｄ一量体形の免疫グロブリンのみが認識され、防御タンパク質と特異的に結合する抗血清は、遊離防御タンパク質を認識したが、免疫グロブリン重または軽鎖タンパク質は認識しなかった。
【０１８９】
機能的研究を、ELISAを使用して、５つの植物構築体で製造された免疫グロブリンを使用して行った。免疫グロブリン軽および重鎖を発現する全ての植物は、連鎖球菌抗原(ＳＡ  Ｉ／II)を特異的に認識する機能的免疫グロブリンを集合させた。結合のレベルおよび力価曲線は、天然マウスハイブリドーマ細胞上清と類似であった。Ｊ鎖のみまたは防御タンパク質のみを発現する植物または野生型植物でＳＡ  Ｉ／II結合は検出されなかった。免疫グロブリンの固定化精製連鎖球菌抗原または細菌細胞表面の天然抗原への結合もまた、防御タンパク質に特異的に結合する抗血清を使用して検出した。これらの検定において、防御タンパク質を含む免疫グロブリンの連鎖球菌抗原への結合が特異的に検出された。これらの結果は、防御タンパク質が免疫グロブリンと会合し、抗原結合を妨害しない方法で、防御タンパク質を含む免疫グロブリンを製造することを確認した。
【０１９０】
植物中での重および軽鎖の機能的免疫グロブリン分子への集合は、Ｈiatt, Ａ.Ｃ., Ｃafferkey, Ｒ.＆Ｂowdish, Ｋ. Ｎature 342, 76-78(1989)で示されるように非常に効率的である。シグナルペプチドは重および軽鎖構築物の両方に存在すべきであり、組換えタンパク質に、Ｈiatt, Ａ.Ｃ., Ｃafferkey, Ｒ.＆Ｂowdish, Ｋ. Ｎature 342, 76-78(1989)に先に示されているように、小胞体抗体の集合が植物内で起こるように、指示をする。この研究は、トランスジェニック植物中での一量体抗体のＪ鎖による２量体化を含む、免疫グロブリン集合の忠実性を証明している。これらの研究は、植物中で、免疫グロブリン集団が全抗体の主要集団(約５７％)を意味することを証明する。これらの結果はまた、防御タンパク質が取り込まれたとき、全抗体の主要集団(約４５％)を形成する、対応する抗原ならびに親マウスモノクローナル抗体と結合する防御タンパク質を含む集合免疫グロブリンの製造も証明する。
【０１９１】
植物内の防御タンパク質を有する２量体免疫グロブリンの共発現は、防御タンパク質を含む機能的免疫グロブリンの集合を導く。この複合体タンパク質の全４つのトランスジーンを、同一のpMON530カセットおよび天然リーダー配列と共に植物内に挿入した。このベクターは、Ｂenfey, Ｐ.Ｎ.＆Ｃhua, Ｎ-Ｈ. Ｓcience 250, 959-966(1990)；およびＢarnes, Ｗ.Ｍ. ＰＮＶＡＳ 87, 9183-9187(1990)により記載されているように、ほとんどの植物器官の種々の細胞型でトランスジーンの発現を指示するカリフラワー・モザイクウイルスの３５Ｓ転写物由来のプロモーター配列を含む。同じプロモーターでの全４トラスジーンの発現の指示は、共通植物細胞中の同時発現の可能性を最大にする。防御タンパク質を含む免疫グロブリンを発現する植物の顕微鏡観察は、葉の多くの細胞型が免疫グロブリンを形成する個々のタンパク質成分を含むことを明らかにした。これらのタンパク質は、維管束鞘細胞中に最も高い濃度で蓄積され、これらおよび他の細胞の細胞壁に限定されるが、細胞内領域には見られなかった。最大免疫グロブリン成分、防御タンパク質およびキメラ免疫グロブリン重鎖の、個々の細胞のプロトプラストまたはアポプラスト区画領域内の制限は、全ての成分分子が合成されるこれらの細胞への分泌型免疫グロブリンの集合をさせる。細胞下部位および集合の機構は、決定すべきままであり、植物のＩｇＧヘテロ４量体の集合は、Ｈiatt, Ａ.Ｃ., Ｃafferkey, Ｒ.＆Ｂowdish, Ｋ. Ｎature 342, 76-78(1989)；およびＨein, Ｍ.Ｂ., Ｔang, Ｙ., ＭcＬeod, Ｄ.Ａ., Ｊanda, Ｋ.Ｄ.＆Ｍatt, Ａ.Ｃ. Ｂiotechnol Ｐrog. 7, 455-461(1991)により先に示されているように、両方のタンパク質が膜内システムを標的とすることを必要とする。
【０１９２】
加えて、我々は、膜統合、トランスサイトーシスまたは続くタンパク質分解のシグナルを欠く成熟分泌成分由来の防御タンパク質が、免疫グロブリンガンマおよびアルファタンパク質ドメインを含むキメラ免疫グロブリン重鎖と会合できることを証明する。これらの結果は、ＩｇＧ定常領域の本来の機能(タンパク質Ａ結合、補体固定、Ｆｃ受容体活性)が２量体免疫グロブリンでも維持され得、防御タンパク質と結合できることを証明する。これらの付加的能力は、受動免疫治療に使用する免疫グロブリンの機能の促進に使用し得、防御タンパク質を含む機能的免疫グロブリンを製造できる植物の開発は、受動免疫治療において著しく密接である。防御タンパク質を含む免疫グロブリンの発現レベルは高く、製造は、モノクローナル抗体の経済的製造を可能にするために、農業的比率まで拡大できる。
【０１９３】
方法
以下の方法は、本実施例の免疫グロブリンの製造および分析に使用した。
ｉ）トランスジェニックＮicotiana tabacum中の抗体集合
葉切片を、ロイペプチン(１０μg／ml)含有１５０mＭ  ＮａＣｌ、２０mＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８)(ＴＢＳ)中で均質化した。抽出物を、非還元条件下で、７５mＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ６.８)、２％ＳＤＳ中で３分沸騰させ、４％アクリルアミドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをニトロセルロースにブロットした。ブロットを２時間、ＴＢＳ中で、０.０５％トゥイン２０および１％脱脂粉乳と共に２時間インキュベートし、続いて、適当な抗血清と共に、２時間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、第２層アルカリホスファターゼ結合抗体を２時間３７℃で適用した。抗体結合を、３００mg／mlニトロブリーテトラゾリウムおよび１５０mg／ml５−ブロモ−４−クロロ３−インドリルホスフェートとのインキュベーションにより検出した。
これらの抽出物を、ウエスタン分析を使用して分析し、免疫グロブリンが免疫グロブリン分子に集合しているか否かを測定し、ウエスタンブロット分析は、非還元条件下で製造した植物抽出物で、抗カッパ抗血清(Ｂradsure, ＵＫ)および防御タンパク質を特異的に認識する抗血清で行った。植物中で作られる免疫グロブリンを、Ｓmith, Ｒ.＆Ｌehner, Ｔ. Ｏral Ｍicrobiol. Ｉmmunol. 4, 153-158(1989)記載のモノクローナルＩgＧ１ Ｇuy's13免疫グロブリンと比較した。
【０１９４】
ii）ウエスタン分析
ウエスタン分析を、還元条件下で製造した各植物抽出物について行い、免疫グロブリンの個々のタンパク質成分を同定した。種々の植物抽出物のサンプルを、前記の様に、だたし５％β−メルカプトエタノールを添加して、製造した。１０％アクリルアミド中のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルのタンパク質をニトロセルロースに移した。個々のタンパク質を、抗マウスγ１重鎖(Ｓigma, ＵＫ)；抗マウスカッパ鎖(Ｂradsure, ＵＫ)；または防御タンパク質を特異的に認識する抗血清、続いて適当なアルカリホスファターゼ結合抗体を使用して検出した。
【０１９５】
iii)防御タンパク質を有する免疫グロブリンの製造を示すためのウエスタン分析
トランスジェニック植物抽出物のウエスタン分析を上記ii）に記載のように行った。防御タンパク質を含む免疫グロブリンを発現する植物由来の植物抽出物を非還元条件下および還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、タンパク質をニトロセルロースに移した。免疫グロブリン成分を、抗カッパ抗血清または防御タンパク質を特異的に認識するヒツジ抗血清、続いて、適当なアルカリホスファターゼ標識２°抗体で検出した。
【０１９６】
iv）トランスジェニックＮicotiana tabacumにおける防御タンパク質を含む抗原特異的免疫グロブリンの発現
植物が抗原特異的免疫グロブリンを製造することを証明するために、精製連鎖球菌抗原(ＳＡ)Ｉ／IIに結合する植物抽出物を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗カッパ鎖抗血清で検出して、測定した。抗原特異的免疫グロブリンにおける防御タンパク質の存在を、防御タンパク質に免疫特異的なヒツジ抗血清、続いてアルカリホスファターゼ標識ロバ抗ヒツジ抗血清で検出して、精製連鎖球菌抗原Ｉ／IIおよび連鎖球菌細胞に結合する植物抽出物により証明した。抗原特異的免疫グロブリンのこれらの試験を、ＴＢＳ中の精製ＳＡ  Ｉ／II(２μg／ml)または炭酸水素緩衝液(ｐＨ９.８)中の対数増殖期Ｓtrep, mutans(NCTC 10449)で覆ったマイクロタイタープレートで行った。ブロッキングを、ＴＢＳ中の５％脱脂粉乳で、室温で２時間行った。植物葉を１０μg／ml中のロイペプチン(Ｃalbiochem, ＵＳＡ)と、ＴＢＳ中で均質化した。マウスＧuy's13ハイブリドーマ細胞培養上清(ＩｇＧ)を陽性対象として使用した。上清を連続二倍希釈でマイクロタイタープレートに添加し、室温で２時間インキュベーションした。０.０５％トゥイン２０含有ＴＢＳで洗浄後、結合免疫グロブリン鎖を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス軽鎖特異的抗体(Ｎordic Ｐharmaceuticals, ＵＫ)またはヒツジ抗ＳＣ抗血清、続いてアルカリホスファターゼ標識ロバ抗ヒツジ抗体で、２時間、室温で検出した。２,２'−アジノ−ジ−[３−エチル−ベンズチアゾリン−スルフォネート](Ｂoehringer, Ｗ. Ｇermany)でＨＲＰＯ結合抗体またはジナトリウムｐ−ニトロフェニルホスフェート(Ｓigma, ＵＫ)でアルカリホスファターゼ抗体を検出した。
【０１９７】
ｖ）免疫グロブリン成分の植物中での局在化
防御タンパク質を含む免疫グロブリンを発現するトランスジェニック植物および対照Ｎicotiana tabacumの光顕微鏡写真を、マウスα鎖の免疫金(immunogold)を使用して製造した。簡単に、葉片を２mm×１０mm切片に切断し、１００mＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７.４)中の３％(ｗ／ｖ)パラホルムアルデヒド、０.５％(ｗ／ｖ)グルタールアルデヒド、５％(ｗ／ｖ)シュークロースに固定した。無水エタノールで脱水後、葉切片をキシレンで浸透させ、パラフィンに埋め、３mm切片に切り、スライドガラス上に、免疫化学染色のためにのせた。葉切片を一次抗体、親和性精製ウサギ抗マウスアルファ鎖(Ａ／Ｇハイブリッド重鎖と反応する)またはヒツジ抗ウサギＳＣと、次いで二次抗体；ヤギ抗ウサギ１０mn金またはウサギ抗ヒツジ１０mn金とインキュベートした。免疫金シグナルを銀促進により強めた。植物を、位相差および明視野顕微鏡の両方を使用して、同じ葉横断切片を見た。防御タンパク質の連続領域中の免疫局在化を、免疫グロブリンとして重鎖の細胞性局在化を示すために使用した。分析を以下の細胞および細胞区画で行った：海綿状葉肉組織細胞、表皮細胞、細胞間隙、さく状柔組織細胞および維束管。
【０１９８】
免疫グロブリン成分の正確な局在化の更なる分析を、Ｎicotiana tabacum維束管の連続部分および対照Ｎicotiana tabacum維束管で、免疫グロブリンの各成分について、免疫金検出で行った。分泌型免疫グロブリンを発現する植物由来のトランスジェニック植物葉の連続部分を、防御タンパク質を特異的に認識する抗体または抗ＩｇＡ抗体、続いて適当な金標識二次抗体とインキュベートした。免疫グロブリンコード配列を含まないトランスジェニック植物由来の対照葉部分もまた抗ＩｇＡ抗体、続いて金標識ヤギ抗ウサギ抗血清または金標識二次抗体単独とインキュベートし、染色の特性を確認した。植物を、位相差および明視野蛍光の両方を、防御タンパク質の局在化を示すのに使用した。維束管の連続葉横断切片の明視野蛍光は、防御タンパク質で示されたのと同じ、免疫グロブリン重鎖の局在化を証明する。
【実施例８】
【０１９９】
実施例８．防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む有用な植物抽出物の製造
防御タンパク質を含む免疫グロブリンを製造する植物の植物片(葉、幹、花、根または組み合わせ)を均質緩衝液(緩衝液２ml／植物材料ｇ；均質緩衝液：１５０mＭ  ＮａＣｌ、２０mＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７.５)と混合し、Ｗaring混合機を使用してパルプまで均質化し、１０,０００×ｇで遠心し、破片を除いた。次いで、上清を等量のＨＰＬＣグレード酢酸エチルで室温で振ることにより抽出し、続いて１０,０００×ｇで遠心した。水相を他の容器に移し、残っている酢酸エチル水相から、溶液を真空下に置くことにより除去した。得られた粗抽出物は、決まりきって防御タンパク質を有する免疫グロブリン１００μg／mlを含んだ。この方法は、防御タンパク質を含む植物で有用である。
乳鉢および乳棒またはＰolytronを含む均質化のための多くの方法が使用され、冷してまたは室温で行うことができる。
抽出物は、ヘキサンまたは他の有機溶媒での抽出による脱脂により更に精製し得る。脱脂は植物抽出物から有用な生産物を得るのに必須ではないが、最終生産物が防御タンパク質を有する精製免疫グロブリンである場合は有利である。多くの場合、粗抽出物が、更なる精製または富化なしに、使用するのに充分な高い量(即ち、１００μg／mＬ)の防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む。経口投与のために、抽出物は通常、香味剤および安定化剤と混合して使用する。歯への使用のために、抽出物は、加えて、ゲル化試薬と混合して、抽出物の歯への接触を持続する。胃投与において、香味抽出物を直接飲む。
【実施例９】
【０２００】
実施例９．防御タンパク質を含む免疫グロブリンの安定性
粗植物抽出物の２つのセットを上記のように製造した。第１の抽出物はＩｇＧ１抗体を発現する植物由来および第２の抽出物は防御タンパク質を発現する植物由来であった。植物由来のこのタイプの粗植物抽出物は種々のタンパク質分解酵素を含むことが知られている。抽出物の室温または３７℃での長時間のインキュベーションは、従って、タンパク質分解的消化を起こす。
ELISAを使用して、二つの抽出物中のガンマ−カッパ複合体の量を、室温および３７℃で時間の関数として測定した。これらの検定において、抗カッパ鎖抗体をプレートをコートするのに使用し、続いて、３７℃で１時間、植物抽出物とインキュベーションした。ＨＲＰＯに結合した抗ガンマ鎖抗体を植物由来の免疫グロブリンの検出に使用した。抽出直後の抽出物に含まれる防御タンパク質を有する免疫グロブリンの量を１００％として取った。室温で３時間後、ＩｇＧ１を４０％含み、防御タンパク質を含む免疫グロブリンを＞９５％含んだ。６時間後、残っているＩｇＧ１抗体は２０％および豊富な防御タンパク質を含む免疫グロブリンはまだ＞９５％であった。１２時間後、検出可能なＩｇＧ１は存在しなかったが、〜９０％の防御タンパク質を有する免疫グロブリンが残っていた。豊富な防御タンパク質の有意(〜７０％まで)の減少は、抽出物を製造して４８時間後まで観察されなかった。
【実施例１０】
【０２０１】
実施例１０．防御タンパク質を含む免疫グロブリンを発現する真核テトラトランスジェニック細胞
防御タンパク質を含む免疫グロブリンを構成する４つの鎖はまたインビトロ(細胞培養)またはインビボ(トランスジェニック動物)の他の細胞タイプでも発現できる。Ｍanipulating the Ｍouse Ｅmbryo；Ａ Ｌaboratory Ｍanual, Ｂ. Ｈogan et al., Ｃold Ｓpring Ｈabor Ｌaboratory(1986)参照。トランスジェニック動物の場合、適当なベクターＤＮＡの精製製造物を、１０mＭトリス、０.２mＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７.４中で２ng／μlの最終濃度に調整する。前核注入を、近交系動物から製造した接合体を使用して行う。次いで、注入卵を標準技術を使用して疑似妊娠雌に移入する。次いで、生存して生まれてきた動物をＰＣＲおよびELISAのような通常使用されている多くの方法を使用して、トランスジーンの存在についてスクリーニングする。次いで、防御タンパク質を含む免疫グロブリンの異なる成分を発現する血統の仲間を多トランスジーン動物を製造するために交尾させる。次いで、これらの交配の子孫を、全４つの鎖を発現するものを同定するためにスクリーニングする。接合体注入に使用したベクタータイプに依存して、種々の細胞タイプが、防御タンパク質を含む完全免疫グロブリンを集合させるトランスジェニック動物で同定できる。これらのベクターＤＮＡは、特定細胞タイプまたは組織中でトランスジーンの転写を可能にする特異的プロモーター要素を含むことができる。各ベクターは、防御抗体(ＩｇＧ／Ａ、Ｊ鎖、防御タンパク質またはカッパ鎖)の単一成分を発現するかまたは一つ以上の成分を発現し得るこの場合、ベクターは、各トランスジーンの転写をさせるための適当な数のプロモーター領域および制限部位を含む。
細胞培養系中の全４つの鎖の発現は、各成分を個々に促進できるＤＮＡベクターを使用して達成でき、そこから各成分を個々に促進できる。これは、同じベクターＤＮＡ上の発現カセット(プロモーター、多重クローニング部位およびポリアデニル化領域)を必要とする。あるいは、個々の細胞系を、各ベクターが細胞場で選択的耐性を付与する限り、一本鎖を発現する別の個々のベクターに連続移入できる。
pMAMneo(Ｃlontech)のような通常入手可能なベクターが、多重発現または別の選択可能マーカーを発現するベクターのシリーズのいずれにも適することができる。
線維芽細胞のような真核細胞の形質導入は慣用法で行う。簡単に、細胞を形質導入の前日に１：２０に分割し、１２５mＭ  ＣａＣｌ２、１４０mＭ  ＮａＣｌ、２５mＭ  Ｈepes、０.７５mＭ  ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７.０５および５μgＤＮＡ／１０cm皿を使用して、約３０％コンフルエントで形質導入する。ＤＮＡインキュベーションの１６時間後、細胞を１０％ジメチルスルフオキシドで３分間衝撃を与える。形質導入４８時間後、細胞を抗生物質または他の細胞毒性試薬を含む適当な培地での成育による選択に付す。
得られる細胞は、防御タンパク質を含む免疫グロブリンのためのすべての成分を製造する。これらの成分は、防御タンパク質を含む機能的免疫グロブリンを製造するために適切に集合する。
【実施例１１】
【０２０２】
実施例１１．ウサギポリ免疫グロブリン受容体の細胞質ドメインの部分に融合する防御タンパク質の操作
ウサギポリ免疫グロブリン受容体の細胞質ドメインのセグメントをコードするセグメントに融合した防御タンパク質の構築物を下記のように製造する。シグナル配列(ＭＥＴ−１８)からＧＬＵ６０６の第１アミノ酸をコードする防御タンパク質ｃＤＮＡを、Ｂgl II−Ｘho ＩフラグメントとしてpMOBN530ベクター(Ｂgl IIおよびＸho Ｉで消化した)のような植物発現ベクターにライゲートする。この防御タンパク質誘導体を、それぞれウサギポリ免疫グロブリン受容体の残基−１８から−１３および残基６０１から６０６をコードするＤＮＡに相補的でもあるＢgl IIまたはＸho Ｉ認識配列を含む適当なオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲ増幅により得る。ＭＥＴ−１８からＡＬＡ６２８をコードする防御タンパク質ｃＤＮＡを得るために、Ｘho部位を含むオリゴヌクレオチドがまた残基６２３から６２８をコードする防御タンパク質ｃＤＮＡに相補的でもある以外、同じ方法を行う。
ウサギポリ免疫グロブリン受容体細胞質ドメインフラグメントをコードするｃＤＮＡは、またＸho ＩフラグメントとしてＰＣＲ増幅により得られる。用いるオリゴヌクレオチドは、両方ともＸho Ｉ認識配列を含むＡＲＧ６５３からＡＬＡ７５５をコードするＤＮＡに相補的である。次いで、このフラグメントを上記の防御タンパク質ｃＤＮＡのいずれかを含むpMON530ベクターにライゲートする。細胞質ドメインｃＤＮＡの適当な方向を、制限消化および形質転換細菌コロニーから得たプラスミドの配列分析により決定する。
ＰＣＲ増幅に使用するオリゴヌクレオチドは、得られるｃＤＮＡが枠内であり、防御タンパク質および細胞質ドメインの両方を含む連続的融合タンパク質として翻訳されることができることを確実にするために、適当な数のヌクレオチドを含む。
適当な方向の得られる構築物は、植物細胞中での発現を可能にするＤＮＡセグメント(プロモーター)に操作可能に結合した、機能的膜通過セグメント無しに直接ポリ免疫グロブリン受容体細胞質ドメインに融合した防御タンパク質をコードする。構築物は、Ｘho Ｉ制限部位の挿入に由来し、防御タンパク質と細胞質ドメインのリンカーとして作用する２つの付加アミノ酸(ＳＥＲ−ＴＲＰ)を高度する。
次いで、これらのベクターは、前記のようにＡｇrobacteriumの形質転換に使用し、次に植物細胞の形質転換に使用する。上記実施例の記載と同じ技術が、免疫グロブリンの一部として本タンパク質を発現する植物の製造に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】ハイブリッドＩｇＧ／Ａ重鎖の構築におけるＧuy's 13およびアルファ鎖ドメインＤＮＡフラグメントの増幅に使用した合成オリゴヌクレオチドＪ１−Ｊ５(制限酵素部位は下線を引いている)を説明する。
【図１】
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【配列表】
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