(57)【要約】【課題】  ゲル・カウンタ・ディフュージョン法を用いて微量のサンプルで結晶化を実施できて、かつ、結晶を取り出すことなく結晶作製器具をそのままの状態でＸ線回折装置の試料ホルダーに取り付けることができるようにする。【解決手段】  流路２４の第１端部２６にはタンパク質溶液導入口１６が連通し、流路２４の第２端部２８には第１の沈殿剤導入口１８ａが連通している。流路２４の途中にはゲル導入口２０と空気抜き穴２２が連通している。流路プレート１０のサイズは１２．２ｍｍ×２６ｍｍと小さくなっている。流路２４は渦巻き状に曲がっており、流路２４に沿った第１端部２６から第２端部２８までの長さ（流路の全長）は、第１端部２６から第２端部２８までの直線距離Ｌ７の３倍以上である。これにより、小さな平面サイズで充分な流路長さを確保できる。【選択図】図２
2008126135.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶化すべき物質を含む物質溶液から前記物質の結晶を作製するための結晶作製器具において、次の（ア）乃至（ウ）を備える結晶作製器具。
（ア）次の（ａ）乃至（ｆ）を備える流路プレート。
（ａ）第１面と第２面を備える平板状の本体。
（ｂ）前記本体に形成された細長い流路であって、第１端部と第２端部を備えていて、流路の長手方向に延びるひとつの面が前記第２面に露出していて、流路に沿った前記第１端部から前記第２端部までの長さが前記第１端部から前記第２端部までの直線距離の３倍以上となるように流路が曲がっていることを特徴とする流路。
（ｃ）前記本体に形成された物質溶液導入口であって、一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の前記第１端部に連通している物質溶液導入口。
（ｄ）前記本体に形成された結晶生成溶液導入口であって、一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の前記第２端部に連通している結晶生成溶液導入口。
（ｅ）前記本体に形成されたゲル導入口であって、一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の途中において前記流路に連通しているゲル導入口。
（ｆ）前記本体に形成された空気抜き穴であって、一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の前記第１端部と前記ゲル導入口の間の地点において前記流路に連通している空気抜き穴。
（イ）前記第１面を覆う第１カバーシートであって、少なくとも前記物質溶液導入口の開口、前記結晶生成溶液導入口の開口、前記空気抜き穴の開口及び前記ゲル導入口の開口を気密に覆う第１カバーシート。
（ウ）前記第２面を覆う第２カバーシートであって、少なくとも前記流路の長手方向に延びる開口を気密に覆う第２カバーシート。
【請求項２】
請求項１に記載の結晶作製器具において、前記流路プレートの前記本体の平面サイズは５０ｍｍ×５０ｍｍの範囲内であることを特徴とする結晶作製器具。
【請求項３】
請求項１または２に記載の結晶作製器具において、前記流路プレートの前記本体の厚さは０．５〜２．０ｍｍの範囲内であることを特徴とする結晶作製器具。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか１項に記載の結晶作製器具において、前記流路は渦巻き状であることを特徴とする結晶作製器具。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項に記載の結晶作製器具において、前記結晶生成溶液導入口の平面サイズは前記空気抜き穴の平面サイズよりも大きく形成されていて、前記結晶生成溶液導入口と前記第２端部との連通部分には、前記空気抜き穴と実質的に同じ平面サイズのバランス穴が前記結晶生成溶液導入口と一体に形成されていることを特徴とする結晶作製器具。
【請求項６】
請求項５に記載の結晶作製器具において、前記ゲル導入口から前記空気抜き穴までの前記流路の長さと、前記ゲル導入口から前記バランス穴までの前記流路の長さが実質的に等しいことを特徴とする結晶作製器具。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか１項に記載の結晶作製器具において、前記流路プレートの前記本体の材質はポリジメチルシロキサンであることを特徴とする結晶作製器具。
【請求項８】
請求項７に記載の結晶作製器具において、前記第１カバーシート及び前記第２カバーシートの材質はポリエチレンテレフタレート、ポリイミドまたはポリテトラフルオロエチレンであることを特徴とする結晶作製器具。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか１項に記載の結晶作製器具において、前記流路の幅及び深さは０．０５〜１．００ｍｍの範囲内であることを特徴とする結晶作製器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液−液拡散法の一種であるゲル・カウンタ・ディフュージョン法を用いて結晶を作製するときに使う結晶作製器具に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を結晶化する手法のひとつとして、液−液拡散法が知られている。この液−液拡散法は、タンパク質溶液と沈殿剤とを接触させて、その自由界面で両者を拡散させて、タンパク質を部分的に過飽和状態にさせ、これによって、タンパク質を結晶化させるものである。この液−液拡散法を用いてタンパク質を結晶化させるときの条件をスクリーニングするためには、多数の条件について、同時に、微量のサンプルで結晶化の実験をできるようにすることが好ましい。そのような実験を可能にする器具として、特許文献１に開示されたような結晶化プレートが知られている。本発明はこの種の結晶化プレートに関連がある。
【特許文献１】米国特許公開２００５／０２０１９０１
【０００３】
この特許文献１に開示されている結晶化プレートは、微量のサンプルで多数の結晶化条件についてスクリーニングが可能であり、プレート中に多数の細長い溝を形成して、その溝の内部でタンパク質溶液と沈殿剤を接触させるようにしている。この結晶化プレートは、タンパク質溶液の通路と沈殿剤の通路との間を開閉する開閉弁と、タンパク質溶液の供給口付近に配置したタンパク質溶液供給弁と、沈殿剤の供給口付近に配置した沈殿剤供給弁とを備えていて、これらの弁の開閉を制御することで、タンパク質溶液及び沈殿剤の供給作業を実施するとともに、タンパク質溶液と沈殿剤両者の間の相互拡散の開始を制御している。弁の開閉は、気体の圧力を利用しているため、加圧するための専用装置が必要である。拡散を開始した後は、一定期間後に開閉弁を閉じて、溶液からの水分の蒸発による濃度変化を利用して、結晶を析出させている。
【０００４】
また、液−液拡散法の一種として、ゲル・カウンタ・ディフュージョン法が知られている（非特許文献１及び特許文献２）。このゲル・カウンタ・ディフュージョン法は、ゲルを挟んでタンパク質溶液と沈殿剤を配置するもので、これによって、タンパク質溶液と沈殿剤がゲルを通して混じり合って、タンパク質が結晶化するものである。本発明は、このゲル・カウンタ・ディフュージョン法に関連している。
【非特許文献１】J. Synchrotron Rad. (2004) 11, 45-48 "A simplified counter diffusion method combined with a 1-D simulation program for optimizing crystallization conditions"
【特許文献２】特開平６−３２１７００号公報
【０００５】
さらに、本発明は、結晶作製器具に結晶を収容したままの状態で、結晶のＸ線回折測定ができることに関係しているが、この点に関連の深い公知技術として、次の特許文献３が知られている。
【特許文献３】特開２００４−２０３９７号公報
【０００６】
この特許文献３は、蒸気拡散法でタンパク質の結晶を作製するための結晶化プレートを開示しており、この結晶化プレートで作製した結晶をＸ線回折測定をする際に、結晶化プレートをそのままＸ線回折装置の試料ホルダーに取り付けている。この結晶化プレートは、蒸気拡散法を用いているので、結晶化プレートを水平にした状態でＸ線を照射する必要があり、試料の取り付け方法に制約がある。また、蒸気拡散法は、ゲル・カウンタ・ディフュージョン法のような細長い通路を必要としないので、比較的小さな結晶化プレートとすることができるが、ゲル・カウンタ・ディフュージョン法は、充分な長さの細長い通路を必要とする。したがって、ゲル・カウンタ・ディフュージョン法のための結晶化プレートは、蒸気拡散法の結晶化プレートのようには小さくならず、Ｘ線回折装置の試料ホルダーにそのまま取り付けることはできない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ゲル・カウンタ・ディフュージョン法の結晶化プレートを用いて結晶を作製した場合には、その結晶をＸ線回折装置で測定するためには、結晶化プレートから結晶を取り出す必要があった。結晶化プレートの内部に存在する結晶をそのままの状態でＸ線回折装置で測定するためには、結晶を保有する結晶化プレートをＸ線回折装置の試料ホルダーに取り付ける必要がある。しかしながら、従来の結晶化プレートは、Ｘ線回折装置の試料ホルダーに取り付けるにはサイズが大きすぎる。結晶化プレートのサイズを小さくすると、今度は、結晶化のための流路の長さが不十分となる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、ゲル・カウンタ・ディフュージョン法を用いて微量のサンプルで結晶化を実施できて、かつ、結晶を取り出すことなく結晶作製器具をそのままの状態でＸ線回折装置の試料ホルダーに取り付けることができる結晶作製器具を提供することにある。
【０００９】
本発明の結晶作製器具は、結晶化すべき物質を含む物質溶液から前記物質の結晶を作製するための結晶作製器具において、次の（ア）乃至（ウ）を備えている。（ア）次の（ａ）乃至（ｆ）を備える流路プレート。（ａ）第１面と第２面を備える平板状の本体。（ｂ）前記本体に形成された細長い流路であって、第１端部と第２端部を備えていて、流路の長手方向に延びるひとつの面が前記第２面に露出していて、流路に沿った前記第１端部から前記第２端部までの長さが前記第１端部から前記第２端部までの直線距離の３倍以上となるように流路が曲がっていることを特徴とする流路。（ｃ）前記本体に形成された物質溶液導入口であって、一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の前記第１端部に連通している物質溶液導入口。（ｄ）前記本体に形成された結晶生成溶液導入口であって、一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の前記第２端部に連通している結晶生成溶液導入口。（ｅ）前記本体に形成されたゲル導入口であって、一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の途中において前記流路に連通しているゲル導入口。（ｆ）前記本体に形成された空気抜き穴であって、一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の前記第１端部と前記ゲル導入口の間の地点において前記流路に連通している空気抜き穴。（イ）前記第１面を覆う第１カバーシートであって、少なくとも前記物質溶液導入口の開口、前記結晶生成溶液導入口の開口、前記空気抜き穴の開口及び前記ゲル導入口の開口を気密に覆う第１カバーシート。（ウ）前記第２面を覆う第２カバーシートであって、少なくとも前記流路の長手方向に延びる開口を気密に覆う第２カバーシート。
【００１０】
流路が上述のように曲がっているので、流路プレートの平面サイズを小さくすることができる。流路プレートの本体の平面サイズは５０ｍｍ×５０ｍｍの範囲内であることが好ましい。このサイズであれば、結晶を保有したままの結晶作製器具をＸ線回折装置の試料ホルダーに取り付けることができる。
【００１１】
流路プレートの本体の厚さは０．５〜２．０ｍｍの範囲内であることが好ましい。厚さが０．５ｍｍ以下になると、流路プレートの強度が低下するとともに、結晶生成溶液導入口に充填できる結晶生成溶液の量が少なくなり過ぎる。厚さが２．０ｍｍ以上になると、結晶作製器具に収容したままの結晶をＸ線回折装置で測定する際に、流路プレートによるＸ線の吸収量が増加して好ましくない。より好ましくは、流路プレートの本体の厚さは０．８〜１．５ｍｍの範囲内とする。
【００１２】
流路は渦巻き状にすることが好ましい。こうすることで、小さな平面サイズの範囲内で流路の長さを十分長くできる。
【００１３】
結晶生成溶液導入口の平面サイズは空気抜き穴の平面サイズよりも大きく形成されているので、ゲル導入口から見て、結晶生成溶液導入口の側の流路抵抗と空気抜き穴の側の流路抵抗がアンバランスである。そこで、結晶生成溶液導入口と流路の第２端部との連通部分には、空気抜き穴と実質的に同じ平面サイズのバランス穴を結晶生成溶液導入口と一体に形成するのが好ましい。ゲル導入口に充填されたゲルは、流路の内部を両方向に流れて、一方は空気導入口に向かい、他方は結晶生成溶液導入口に向かう。この場合、空気抜き穴とバランス穴が実質的に同じ平面サイズなので、ゲル導入口から充填されたゲルは、その両側の流路にほぼ均等に充填される。そして、ゲル導入口から空気抜き穴までの流路の長さと、ゲル導入口からバランス穴までの流路の長さを実質的に等しくすれば、より均等にゲルが充填される。
【００１４】
流路プレートの本体の材質はポリジメチルシロキサンとすることが好ましい。また、その場合に、第１カバーシートと第２カバーシートの材質はポリエチレンテレフタレート、ポリイミドまたはポリテトラフルオロエチレンとすることが好ましい。このような材質の組み合わせによれば、第１カバーシートと第２カバーシートは、特に接着剤を要することなく、流路プレートの本体に密着して、流路を気密に保つことができる。これらのカバーシートは、流路プレートの本体から容易には剥がれることがない。また、これらの材質の組み合わせは、Ｘ線の吸収が比較的少なくて、結晶作製器具をそのままＸ線回折装置の試料ホルダーに取り付けるのに適している。
【００１５】
流路プレートの流路の幅及び深さは０．０５〜１．００ｍｍの範囲内であることが好ましい。その範囲内で、結晶生成溶液及び物質溶液の特性と、必要とする結晶の大きさとから、最適な値を設定することができる。より好ましくは、流路の幅及び深さは０．１〜０．５ｍｍの範囲内である。流路の幅と深さは、結晶生成の速度と、生成される結晶の大きさとに関連する。
【００１６】
本発明の結晶作製器具は、ゲル・カウンタ・ディフュージョン法を用いて微量のサンプルで特にタンパク質を結晶化させるのに最適であるが、その他の物質を結晶化させるのに用いることもできる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ゲル・カウンタ・ディフュージョン法を用いて微量のサンプルで結晶化を実施できて、かつ、結晶を取り出すことなく結晶作製器具をそのままの状態でＸ線回折装置の試料ホルダーに取り付けることができる。また、空気抜き穴を設けているので、ゲルと物質溶液を導入する際に、流路内部の空気が容易に抜け、あまり圧力をかけなくてもゲルと物質溶液を充填することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、図面を参照して本発明の実施例を詳しく説明する。図１は本発明の結晶作製器具の一実施例の分解斜視図である。この結晶作製器具は、ゲル・カウンタ・ディフュージョン法を用いて物質溶液（結晶化すべき物質を含む溶液）から結晶を作製するための器具である。以下の説明では、タンパク質結晶を作製することを例にして説明する。この結晶作製器具は、流路プレート１０、第１カバーシート１２及び第２カバーシート１４からなる。この結晶作製器具の使用方法を簡単に説明すると、流路プレート１０の底面（第２面）に第２カバーシート１４を貼り付けてから、物質溶液としてのタンパク質溶液と、結晶生成溶液としての沈殿剤と、ゲルを、それぞれ、タンパク質溶液導入口１６（物質溶液導入口に相当する）と沈殿剤導入口１８ａ，１８ｂ，１８ｃ（結晶生成溶液導入口に相当する）とゲル導入口２０を介して、流路プレート１０の流路内に充填する。それから、流路プレート１０の上面に第１カバーシート１２を貼り付ける。このように二つのカバーシート１２、１４で挟まれた状態の流路プレート１０を、所定の温度で所定時間保持することで、流路プレート１０の流路内でタンパク質の結晶が成長する。
【００１９】
流路プレート１０は、平板状の本体に、タンパク質溶液と沈殿剤とゲルとが流れる細長い流路と、タンパク質溶液と沈殿剤とゲルのためのそれぞれの導入口１６，１８ａ，１８ｂ，１８ｃ，２０と、空気抜き穴２２とを形成したものである。流路プレート１０の本体の平面形状は矩形であり、その平面サイズは２６ｍｍ×１２．２ｍｍである。流路プレート１０の厚さは１ｍｍである。流路プレート１０の本体の材質はポリジメチルシロキサン（Polydimethylsiloxane、略称はＰＤＭＳ）である。このＰＤＭＳは無色透明なシリコーンゴムである。
【００２０】
第１カバーシート１２と第２カバーシート１４の平面サイズは、流路プレート１０と同じ大きさか、それよりも若干大きくなっている。その材質は例えばポリエチレンテレフタレートである。これらのカバーシートは、厚さが０．０５〜０．２０ｍｍで、透明である。
【００２１】
流路プレート１０と二つのカバーシート１２，１４は、すべて、可視光に対して透明であり、これにより、流路プレート１０の内部の状況を外部から観察できる。
【００２２】
図２は流路プレート１０の上面（第１面）を示した平面図である。破線で示したものは、流路プレート１０の底面（第２面）側に露出するように形成された流路２４である。流路２４の第１端部２６にはタンパク質溶液導入口１６が連通しており、流路２４の第２端部２８には第１の沈殿剤導入口１８ａが連通している。第１の沈殿剤導入口１８ａは連通路３０ａを介して第２の沈殿剤導入口１８ｂに連通しており、第２の沈殿剤導入口１８ｂはさらに連通路３０ｂを介して第３の沈殿剤導入口１８ｃに連通している。沈殿剤導入口を３個直列に接続している理由は、沈殿剤の充填容量を増やすためである。流路プレート１０は、厚さが１ｍｍと薄くなっているので、沈殿剤の充填容量を増やすためには、沈殿剤導入口の平面サイズを大きくする必要がある。円形の沈殿剤導入口を形成する場合に、大きな直径のひとつの沈殿剤導入口を形成するよりも、小さな直径の沈殿剤導入口を複数個形成する方が、流路プレート１０の平面サイズを小さくできる。また、大きな直径のひとつの沈殿剤導入口を形成するよりも、小さな直径の沈殿剤導入口を複数個形成する方が、流路プレートの強度を確保できる。この実施例では、３個の沈殿剤導入口に、合計で約６０マイクロリットルの沈殿剤を充填できる。
【００２３】
流路２４の途中にはゲル導入口２０が連通している。流路２４において、ゲル導入口２０とタンパク質導入口１６の間の地点には、空気抜き穴２２が連通している。タンパク質導入口１６と沈殿剤導入口１８ａ，１８ｂ，１８ｃとゲル導入口２０と空気抜き穴２２は、それぞれ、流路プレート１０の厚さ方向に貫通している。流路２４は流路プレート１０の底面（第２面）側に露出するように、所定の深さの溝として形成されている。
【００２４】
流路プレート１０に形成された流路２４と各種の導入口１６，１８ａ，１８ｂ，１８ｃ，２０と空気抜き穴２２と連通路３０ａ，３０ｂのすべてをまとめて、以下、切り取り部と呼ぶことにする。
【００２５】
この流路プレート１０の寸法を説明する。流路プレート１０の平面形状は矩形であり、横方向の長さＬ１が１２．２ｍｍで、縦方向の長さＬ２が２６ｍｍである。Ｘ線回折装置の試料ホルダーにそのまま取り付けてＸ線回折測定が支障なく行われるためには、Ｌ１とＬ２がそれぞれ５０ｍｍ以下であることが好ましい。流路２４の形成位置を説明すると、流路プレート１０の図示の左辺から距離Ｌ３＝１．７ｍｍだけ離れたところに、流路２４が通っており、同様に、右辺から距離Ｌ４＝１．７ｍｍだけ離れたところに、流路２４が通っている。また、上辺から距離Ｌ５＝２．３７ｍｍだけ離れたところに、流路２４が通っており、下辺から距離Ｌ６＝２．９ｍｍだけ離れたところに、流路２４が通っている。流路２４は全体として、概略、渦巻き状に形成されていて、このように曲がった経路にすることで、比較的小さな平面サイズの中で、十分な流路長さを確保している。流路２４の第１端部２６から第２端部２８までの直線距離Ｌ７は約１６ｍｍであるが、流路２４に沿って第１端部２６から第２端部２８までの長さ（流路の全長）を測ると、７１．５ｍｍである。したがって、流路の全長を直線距離Ｌ７で割ると約４．５倍になる。このように、流路を直線状に形成した場合と比較して、流路を曲線状に形成することで、比較的小さな平面サイズの範囲内に、十分な長さの流路を確保できる。流路の全長は、上述の直線距離の少なくとも３倍にすることが好ましい。
【００２６】
図３（Ａ）は、流路プレートに形成された切り取り部を直線状に展開したときの展開図であり、流路プレートの底面側から見たものである。流路２４の第１端部２６から第２端部２８までの長さＬ８（すなわち全長）は７１．５ｍｍである。第１端部２６から空気抜き穴２２までの長さＬ９は６０ｍｍである。空気抜き穴２２から第２端部２８までの長さＬ１０は１０ｍｍである。長さＬ１０の中点の位置にゲル導入口２０が連通している。第１端部２６にはタンパク質導入口１６が連通しており、第２端部２８には三つの沈殿剤導入口１８ａ，１８ｂ，１８ｃが直列に連通している。タンパク質導入口１６の平面形状は直径Ｄ１の円形であり、Ｄ１は２．５ｍｍである。
【００２７】
図３（Ｂ）は、図３（Ａ）に示した展開図のうち、空気抜き穴２２から沈殿剤導入口１８ｃまでの切り取り部を拡大して示した拡大展開図である。３個の沈殿剤導入口１８ａ，１８ｂ，１８ｃの平面形状は直径Ｄ２の円形であり、Ｄ２は５ｍｍである。ゲル導入口２０と空気抜き穴２２の平面形状は直径Ｄ３の円形であり、Ｄ３は１．５ｍｍである。流路２４の第２端部２８と沈殿剤導入口１８ａとの連通部にはバランス穴３２が形成されている。このバランス穴３２の平面形状も直径Ｄ３の円形である。バランス穴３２と沈殿剤導入口１８ａは互いに一体につながっている。バランス穴３２は、ゲル導入口２０から見て、空気抜き穴２２とちょうど対称の位置に形成されていて、しかも、同じ平面サイズになっている。このバランス穴３２の存在により、ゲル導入口２０から両側の流路２４へと流れていくゲルは、空気抜き穴２２とバランス穴３２から均等にあふれ出すことになる。その結果、ゲルの充填が両側の通路へと均等になされる。空気抜き穴２２よりも沈殿剤導入口１８ａの方が平面サイズが大きいので、バランス穴３２が存在しないと仮定すると、ゲル導入口２０から導入されたゲルは沈殿剤導入口１８ａの方へより流れやすくなる。
【００２８】
流路２４の幅Ｗ１は０．２ｍｍである。三つの沈殿剤導入口１８ａ，１８ｂ，１８ｃを互いに連通させる二つの連通路３０ａ，３０ｂの幅Ｗ２は０．４ｍｍである。連通路３０ａ，３０ｂの長さＬ１１は１ｍｍである。
【００２９】
図４（Ａ）は流路２４を直角に横切る切断面で切断したときの流路プレートの部分断面図である。流路プレート１０の厚さｔ１は１ｍｍであり、流路２４の深さｔ２は０．２ｍｍである。流路２４の幅Ｗ１は０．２ｍｍである。流路プレート１０は上面（第１面）３４と底面（第２面）３６を備えていて、通路２４のひとつの面（下側の面）が流路プレート１０の底面（第２面）３６に露出している。図４（Ｂ）は連通路３０ａを直角に横切る切断面で切断したときの流路プレートの部分断面図である。連通路３０ａの深さは流路２４の深さｔ２と同じであり、連通路３０ａの幅Ｗ２は０．４ｍｍである。連通路３０ｂの断面形状も連通路３０ａと同じである。流路プレートに細長い流路を形成するには、フォトレジストを用いたリソグラフィー技術を用いることができる。
【００３０】
図５（Ａ）は図３（Ａ）に示した展開図の一部を拡大したものであり、図５（Ｂ）は、図５（Ａ）の展開図に対応して、流路の長手方向に沿った切断面で流路プレートを切断した断面図である。図５（Ｂ）において、流路２４の長手方向に延びるひとつの面（底面側の面）が流路プレート１０の底面（第２面）３６に露出するように形成されている。この流路２４はゲル・カウンタ・ディフュージョン法でタンパク質を結晶化するための流路である。タンパク質溶液導入口１６、沈殿剤導入口１８ａ、バランス穴３２、ゲル導入口２０及び空気抜き穴２２は、それらの一端（上端）が流路プレートの上面（第１面）３４に開口していて、それらの他端（下端）は流路プレートの底面（第２面）３６に開口するとともに、流路２４に連通している。
【００３１】
図６は、この結晶作製器具の使用方法を説明する断面図である。（Ａ）乃至（Ｃ）は、いすれも、流路の長手方向に沿って切断した断面図である。まず、図６（Ａ）に示すように、流路プレート１０の底面（第２面）３６に第２カバーシート１４を貼り付ける。流路プレート１０の本体の材質は弾力性のあるＰＤＭＳであり、第２カバーシート１４の材質はポチエチレンテレフタレートであって、両者の密着性は優れており、第２カバーシート１４を流路プレート１０の底面３６に押し付けるだけで、流路２４を気密に封止するだけの密着性がある。次に、マイクロピペット（または、比較的低圧の加圧式注入シリンジ）を用いて、ゲル導入口２０にゲル３８を導入する。ゲル３８はゲル導入口２０から通路２４の内部へと広がっていく。ゲルの導入量は、沈殿剤導入口１８ａに隣接するバランス穴３２と空気抜き穴２２のところにゲル３８が見え始めるまでとする。空気抜き穴２２とバランス穴３２は同じ平面サイズで、かつ、ゲル導入口２０から等距離の位置にあるので、ゲル３８はゲル導入口２０からその両側の流路へと均等に充填される。
【００３２】
次に、図６（Ｂ）に示すように、マイクロピペットを用いて、沈殿剤導入口１８ａに沈殿剤４０を導入する。このとき、３個の沈殿剤導入口１８ａ，１８ｂ，１８ｃ（図２を参照）のすべてに沈殿剤４０を導入する。沈殿剤４０の導入量は、沈殿剤導入口の開口付近まで沈殿剤４０を満たすまでとする。次に、マイクロピペット（または、比較的低圧の加圧式注入シリンジ）を用いて、タンパク質溶液導入口１６にタンパク質溶液４２を導入する。タンパク質溶液４２は流路２４の内部を進んでいくが、タンパク質溶液４２が空気抜き穴２２のところに到達すると、空気抜き穴２２の内部を上昇する。タンパク質溶液４２の導入量は、タンパク質溶液導入口１６及び空気抜き穴２２の開口付近までタンパク質溶液４２を満たすまでとする。もし、空気抜き穴２２が無いと仮定すると、充填済みのゲル３８と、導入するタンパク質溶液４２との間に、空気溜まりができてしまうおそれがある。空気抜き穴２２があるおかげで、空気溜まりができるおそれはなく、空気が容易に逃げていく。
【００３３】
沈殿剤４０とタンパク質溶液４２の導入が完了したら、図６（Ｃ）に示すように、流路プレート１０の上面（第１面）３４に第１カバーシート１２を貼り付ける。第１カバーシート１２も、第２カバーシート１４と同様に、ポリエチレンテレフタレートでできているので、第１カバーシート１２を流路プレート１０の上面３４に押し付けるだけで、タンパク質溶液導入口１６の開口、沈殿剤導入口１８ａ，１８ｂ，１８ｃの開口、ゲル導入口２０の開口、及び、空気抜き穴２２の開口を、気密に封止するだけの密着性がある。カバーシート１２、１４の材質のポリエチレンテレフタレートは、水分の透過性が低いので、水分の蒸発による結晶化はほとんど起きないと考えられる。タンパク質の結晶化は、ゲル３８を通して、タンパク質溶液４２が沈殿剤４０に拡散し、あるいは、沈殿剤４０がタンパク質溶液４２に拡散していく過程で、タンパク質溶液４２中でタンパク質の濃度が過飽和になることで達成されると考えられる。図６（Ｃ）では、通路２４内に生じたタンパク質結晶４４を模式的に示している。
【００３４】
上述のように準備された結晶作製器具は、複数個まとめて、適当な透明なケースの中に入れてから、恒温装置の中にセットして、所定時間だけ静置しておき、タンパク質が結晶化するのを待つ。ケースと流路プレート１０と二つのカバーシート１２、１４は、すべて透明なので、外部からタンパク質の結晶化の様子を確認できる。十分な大きさの結晶ができたことを確認できたら、結晶作製器具内に結晶を保持した状態で結晶作製器具をそのままＸ線回折装置の試料ホルダーに取り付けて、タンパク質結晶のＸ線回折測定を実施できる。これにより、例えば、タンパク質結晶の結晶構造解析ができる。流路プレート１０は二つのカバーシート１２，１４で挟まれているので、直立させた状態で試料ホルダーに取り付けても、結晶や溶液が流出することがない。
【００３５】
本発明の結晶作製器具は、ゲル導入口、沈殿剤導入口及びタンパク質溶液導入口に、それぞれ、ゲル、沈殿剤及びタンパク質溶液を導入するだけでセットアップが完了するので、非常に簡便であり、サンプル量が微量であっても、再現性が良好である。そして、空気抜き穴があるので、ゲルとタンパク質溶液を導入する際に、大きな加圧力を必要としない。ひとつの結晶作製器具当たり（ひとつの条件当たり）のサンプル量は非常に少なくて済み、例えば、タンパク質溶液の必要量はマイクロリットルのオーダーである。
【００３６】
図７は複数の流路プレート１０を共通のカバーシートで挟んだ状態を示す平面図である。本発明の結晶作製器具は、図１に示すように、ひとつの流路プレート１０を二つのカバーシート１２，１４で挟む構造のほかに、図７に示すように、複数の流路プレート１０を共通のカバーシートで挟んだ構造にすることもできる。このようにすると、小さいサイズの結晶作製器具を複数個まとめて取り扱うのに便利である。図７の例では、７個の流路プレート１０を隣り合うように並べてから、これらを共通の第２のカバーシート１４に貼り付けて、その状態で、ゲルと沈殿剤とタンパク質溶液の導入作業を行うことができる。その後、共通の第１のカバーシート１２を貼り付ける。二つのカバーシート１２，１４は、７個の流路プレート１０を並べた状態の寸法（８５．４ｍｍ×２６ｍｍ）に対して、その周囲に２ｍｍ程度突き出すようなサイズ（９０ｍｍ×３０ｍｍ）にしている。この状態のままで、結晶成長作業を行い、結晶をＸ線回折測定するときになって、個別の結晶作製器具に分離する。すなわち、隣り合う流路プレート１０の境界線４６のところで、上下のカバーシート１２，１４をカッターで切断することで、個別の結晶作製器具に分離できて、分離された結晶作製器具は、流路プレート１０が上下のカバーシート１２，１４で挟まれた状態のものとなる。この状態の結晶作製器具を、結晶を保持したままで、Ｘ線回折装置の試料ホルダーに取り付けることができる。
【００３７】
この結晶作製器具を用いてタンパク質結晶を作製するときの導入材質については、特に制約はないが、例えば、次のようなものを使用できる。タンパク質溶液としては、例えば、リゾチーム溶液やソーマチン溶液、インスリン溶液などを使用できる。沈殿剤としては、タンパク質溶液の材質に対応した適当な沈殿剤を使用できる。ゲルとしては、例えば、アガロースゲルを使用できる。
【００３８】
二つのカバーシート１２、１４の材質は、ＰＤＭＳとの間で密着性の良好なものとして、上述のポリエチレンテレフタレートを使うことができ、そのほかには、ポリイミドまたはポリテトラフルオロエチレンを使うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の結晶作製器具の一実施例の分解斜視図である。
【図２】流路プレート１０の上面（第１面）を示した平面図である。
【図３】流路プレートに形成された切り取り部を直線状に展開したときの展開図である。
【図４】流路を直角に横切る切断面で切断したときの流路プレートの部分断面図である。
【図５】（Ａ）は図３（Ａ）に示した展開図の一部を拡大した拡大展開図であり、（Ｂ）は流路の長手方向に沿った切断面で流路プレートを切断した断面図である。
【図６】結晶作製器具の使用方法を説明する断面図である。
【図７】複数の流路プレートを共通のカバーシートで挟んだ状態を示す平面図である。
【符号の説明】
【００４０】
１０  流路プレート
１２  第１カバーシート
１４  第２カバーシート
１６  タンパク質溶液導入口
１８ａ，１８ｂ，１８ｃ  沈殿剤導入口
２０  ゲル導入口
２２  空気抜き穴
２４  流路
２６  第１端部
２８  第２端部
３０ａ，３０ｂ  連通路
３２  バランス穴
３４  流路プレートの上面（第１面）
３６  流路プレートの底面（第２面）
３８  ゲル
４０  沈殿剤
４２  タンパク質溶液
４４  タンパク質結晶
４６  境界線
【図１】
2008126135.tif 000003
【図２】
2008126135.tif 000004
【図３】
2008126135.tif 000005
【図４】
2008126135.tif 000006
【図５】
2008126135.tif 000007
【図６】
2008126135.tif 000008
【図７】
2008126135.tif 000009