(57)【要約】  【課題】  三次元的・立体的に増殖させることができる新規な細胞培養手段を提供すること。  【解決手段】  本発明では、ハイドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウム類を含有する繊維状シートからなる細胞培養用基材を提供する。この細胞培養用基材を用いて細胞培養を行うと、はじめは、繊維状シート及びその繊維枝を足場とし、細胞はその足場に付着して増殖するが、次第に、足場から離れた位置でも、細胞同士が接着することにより、三次元的・立体的に増殖しはじめ、最終的には、細胞培養用基材全体を覆うように細胞塊を形成する。即ち、この細胞培養用基材を用いる場合、細胞同士の接着により、細胞と足場が接していない部分でも増殖させることができるため、細胞を、三次元的・立体的に増殖させることができる。  【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸カルシウム類を含有する繊維状シートからなる細胞培養用基材。
【請求項２】
前記繊維状シートは不織布である請求項１記載の細胞培養用基材。
【請求項３】
前記リン酸カルシウム類はハイドロキシアパタイトであることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の細胞培養用基材。
【請求項４】
三次元立体培養に用いることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項記載の細胞培養用基材。
【請求項５】
前記不織布の単位面積あたりの重量が、０．１２〜０．２０ｇ／１００ｃｍ２であることを特徴とする請求項２から請求項４のいずれか一項記載の細胞培養用基材。
【請求項６】
請求項１から請求項５のいずれか一項記載の細胞培養用基材を少なくとも備える高密度培養用器具。
【請求項７】
請求項１から請求項５のいずれか一項記載の細胞培養用基材、若しくは請求項６記載の高密度培養用器具を用いる細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸カルシウム類（ハイドロキシアパタイトなど）を含有する繊維状シートからなる細胞培養用基材、該基材を備える高密度培養用器具、細胞培養方法などに関する。また、本発明は、長期間連続培養、三次元立体的培養などにも関連する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、浮遊系細胞と付着系細胞に大きく分けることができる。浮遊細胞は、生育・増殖に足場を必要としない細胞であり、付着細胞は、生育・増殖に足場を必要とする細胞である。再生医療などで重要な幹細胞のほとんどは付着細胞であり、人為的に作製した足場に細胞を付着させることにより、培養を行っている。
【０００３】
付着細胞の足場として、例えば、ポリスチレンなどの合成高分子、コラーゲンなどの生物由来タンパク質などが利用されている。また、足場となる基材に対する細胞接着性を促進したり、足場となる基材へのタンパク質の吸着性を高めたりする改良も種々行われている。その他、臨床応用の観点から、足場用の基材に、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）などの生体吸収性素材を用いる試みも行われている。
【０００４】
本発明に関連のある先行文献として、例えば、以下の特許文献１から特許文献３が開示されている。特許文献１には、親水性成分と微粒子（ハイドロキシアパタイトも例示されている）とを含むゲルからなる細胞培養基材が記載されている。特許文献２には、生分解性ポリマーを含むハニカム構造体からなる細胞培養用基材が記載されている。特許文献３には、生体吸収性有機多孔体（形態として不織布が例示されている）と骨親和性無機材料（ハイドロキシアパタイトが例示されている）とを複合化した骨再生用基材が記載されている。
【特許文献１】特開２００５−２７５３２号公報
【特許文献２】特開２００１−１５７５７４号公報
【特許文献３】特開２００５−５２２２４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来の細胞培養は、高密度培養も含め、各細胞が足場に付着する必要があるという点で、基本的に、単層培養である。そのため、細胞を三次元的に増殖させることが難しい。
【０００６】
そこで、本発明は、三次元的・立体的に増殖させることができる新規な細胞培養手段を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、リン酸カルシウム類を含有する繊維状シートからなる細胞培養用基材を提供する。
【０００８】
この細胞培養用基材を用いて細胞培養を行うと、はじめは、繊維状シート及びその繊維枝を足場とし、細胞はその足場に付着して増殖するが、次第に、足場から離れた位置でも、細胞同士が接着することにより、三次元的・立体的に増殖しはじめ、最終的には、細胞培養用基材全体を覆うように細胞塊を形成する。
即ち、この細胞培養用基材を用いる場合、細胞同士の接着により、細胞と足場が接していない部分でも増殖させることができるため、細胞を、三次元的・立体的に増殖させることができる。
【０００９】
なお、この基材を用いた細胞培養は、高密度培養、連続長期培養などに適用可能である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、細胞を三次元的・立体的に増殖させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、説明する。
【００１２】
＜細胞培養用基材について＞
本発明に係る細胞培養用基材は、リン酸カルシウム類を含有する繊維状シートからなる。
【００１３】
繊維状シートは、不織布が好適であるが、それに限定されない。
不織布は、メッシュなど規則的に織られたものと異なり、繊維枝同士が不規則に結合しており、適度な空間、厚み、弾力を有している。そのため、細胞と足場（不織布）が接していない部分で細胞同士が接着する際、不織布は、その細胞間の適度な距離を保つ機能を持ち、細胞同士の接着を促していると推測する。
【００１４】
不織布の材質（原料）は、リン酸カルシウム類を含有可能であれば特に限定されず、公知なものを用いることができる。不織布の材質（原料）として、例えば、天然繊維（木綿、麻、羊毛など）、再生繊維（レーヨン、キュプラ）、半合成繊維（アセテート、プロミックス）、合成繊維（ナイロン、ポリエステル、アクリル系、ビニロン、ポリ塩化ビニル、ビニリデン、ポリオレフィン系、ポリウレタン、ポリクラール、フルオロカーボン系、ノボロイド系など）、無機繊維（ガラス繊維、炭素繊維、アルミナ繊維、シリコンカーバイド繊維、スラグ繊維、金属繊維など）、などが挙げられる。
また、不織布を、公知の生体内分解吸収性の素材、例えば、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体）などで形成してもよい。
【００１５】
不織布の繊維密度は、比較的高い方が、細胞密度（培養効率）を高くできる点で、好適である。例えば、不織布の繊維密度を、繊維状シートの単位面積あたりの重量に換算した場合、少なくとも、０．１〜０．３ｇ／１００ｃｍ２の範囲内のものは、効率的な細胞培養に好適である。
【００１６】
リン酸カルシウム類として、第１リン酸カルシウム、第２リン酸カルシウム、第３リン酸カルシウム、各種アパタイト類（例えば、ハイドロキシアパタイト、フッ素アパタイト、塩酸アパタイト、炭酸アパタイトなど）などが挙げられる。
リン酸カルシウム類は、培養開始時において、不織布に対する細胞の付着を促進していると推測する。
【００１７】
リン酸カルシウム類を不織布に含有させる方法は、公知技術を用いることができ、特に限定されない。その方法として、例えば、不織布にリン酸カルシウム類を塗布する方法、バインダー（接着剤）を用いる方法、などが挙げられる。なお、再生医療などに用いる細胞を培養する場合や、人体などに適用するコラーゲンなどを産生する場合、バインダーを用いない方法の方が、健康保持などの観点から、より好ましい。
【００１８】
＜高密度培養用器具について＞
前記の通り、本発明に係る細胞培養用基材を用いることにより、細胞を三次元的・立体的に増殖させることができるため、本発明は、高密度培養に適用可能である。
【００１９】
本発明に係る高密度培養用器具は、例えば、フラスコ、シャーレなど、培養に一般に用いられている容器に、細胞培養用基材を入れて形成する。細胞培養用基材は、１枚でもよいし、又は２〜３枚重ねた状態で用いてもよい。細胞培養用基材を２〜３枚重ねた場合、細胞密度（培養効率）を増大できる利点がある。その他、この高密度培養用器具には、予め、培地、培養用試薬、前記基材を固定する試薬又は部材、などを含む構成にしてもよい。
【００２０】
＜細胞培養方法について＞
前記細胞培養用基材又は前記高密度培養用器具を用いることにより、高効率な細胞培養を行うことができる。
【００２１】
即ち、例えば、培養容器に、所定の培地を入れた後、細胞培養用基材を入れ、その基材を培地に馴染ませる。そして、細胞をその中にまき込み、細胞培養を行う。培地は、公知のものを用いることができる。
【００２２】
この細胞培養方法を用いることには、以下のような有利性がある。
（１）この細胞培養方法は、ヒト繊維芽細胞などに適用可能なほか、幹細胞や他のほとんどの付着細胞に広く適用可能である。
（２）この細胞培養方法を用いることにより、三次元的・立体的な細胞培養が可能になるため、足場を複雑・立体的に構成しなくても、高密度培養ができる。また、細胞密度・培養効率を高くすることができる。
（３）この細胞培養方法は、細胞の増殖性を維持した状態で、長期間連続培養を行うことができる。即ち、継代培養を行わず、定期的な培地交換のみで、長期間連続培養を行うことができる。
（４）この細胞培養方法では、足場と接触していない細胞同士が接着することにより、三次元的・立体的に増殖する。即ち、連続培養を行うことにより、足場がない状態でも、細胞が自己増殖できる状態になる。従って、例えば、繊維状シートを生体内分解吸収性の素材で形成する場合、この細胞培養方法を用いて、組織・器官を構築できる可能性があり、再生医療などに適用できる可能性がある。
【００２３】
なお、この細胞培養方法において、長期間連続培養が可能な理由は、次のような機序に基づくと推測する。
本発明に係る細胞培養用基材を用いて細胞培養を行う場合、細胞と足場が接触していない部分で、細胞同士が接着し、生体内における細胞間間隙と同様の構造を構築する。それにより、個々の細胞が、直接、培地を用いて代謝を行い、必要な物質を自ら合成できるようになり、壊死を回避する。
【実施例１】
【００２４】
実施例１では、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布を、足場として用いて、細胞培養を行った。
【００２５】
７５ｃｍ２のフラスコに、培地を入れた後、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布（９×８ｃｍ、滅菌済み）を入れた。そして、その不織布に培地を馴染ませた後、１×１０６個のヒト正常線維芽細胞をまき込み、培養を行った。
培地には、ＦＢＳ（最終濃度５％）、抗生物質、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩０．２ｍＭの組成のものを用い、１週間間隔で培地交換を行った。
【００２６】
結果は次の通りである。
培養開始当初、細胞は、不織布とフラスコ底面の両方に付着し、不織布よりもフラスコ底面に多く付着した。これは、フラスコ底面の方が足場面積の大きいためと推測する。
培養開始から１週間後、不織布の線維に、細胞が絡みつくように付着し、増殖していることを確認した（図１参照）。
培養開始から１ヵ月後、足場となる線維がない部分でも、細胞同士が接着し、膜状に拡がって増殖していることを確認した（図２参照）。
培養開始から２ヵ月後、細胞がさらに膜状に拡がって増殖し、細胞が不織布の厚みの全体に立体的に拡がった（図３参照）。
培養開始から３ヵ月後、細胞が膜状に拡がって不織布の全体を覆い、三次元的な細胞塊を形成した（図４参照）。
【００２７】
以上のように、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布を足場として用いた場合、細胞と足場（不織布）が全く接していない場所でも、細胞同士が接着して膜状に拡がるため、細胞を三次元的・立体的に増殖させることができることが分かった。
【実施例２】
【００２８】
実施例２では、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布を用いた場合における、付着細胞数とコラーゲン産生量を検討した。
【００２９】
ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布を用いて、実施例１と同様の方法により、培養を行い、１００％コンフルエントの状態における表面積当たりの付着細胞数と、培養上清中のコラーゲン量を測定した。付着細胞数は、トリプシン処理により、細胞を浮遊させた後、細胞数をカウントした。なお、不織布に付着した細胞は強固に結合したため、トリプシン処理を、３７℃、１時間で３回繰り返して行った。
また、対照として、７５ｃｍ２のフラスコを用いて通常のフラスコ培養を行い、同様に、１００％コンフルエントの状態における表面積当たりの付着細胞数と、培養上清中のコラーゲン量を測定した。
なお、不織布を用いた場合の培養表面積は７２ｃｍ２で、フラスコ培養を行った場合の培養表面積は７５ｃｍ２である。
【００３０】
結果を表１に示す。なお、細胞培養時には、不織布だけでなく、フラスコ底面にも細胞が付着し、増殖する。そこで、「不織布を用いた培養」から「フラスコ培養」を引いた値を、不織布で増殖した細胞に基づく値と推定する。
【表１】
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【００３１】
表１に示す通り、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布を用いて培養を行う場合、フラスコ培養（単層培養）の場合と比較して、付着細胞数が５．３倍、コラーゲン量が４．０倍に増加した。これは、培養細胞がこの不織布に好適に付着でき、かつ、立体的に増殖できたためであると推測する。
従って、以上の実験結果は、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布が細胞培養に適していること、及び、この不織布が高密度培養に適用可能であることを示す。
【実施例３】
【００３２】
実施例３では、実施例１と同様の細胞培養において、不織布にハイドロキシアパタイトを塗布した場合と、塗布しない場合とを比較した。
【００３３】
ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布と塗布しない不織布を準備し、それぞれ、実施例１と同様の方法で培養を行った。本実験では、ヒト正常線維芽細胞は５×１０５個まき込み、また、培地交換は４〜５日間隔で行った。
【００３４】
図５及び図６は、培養開始から２週間後の細胞の様子を示す顕微鏡写真である。それぞれ、図５は、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布を用いて培養を行った場合、図６は、ハイドロキシアパタイトを塗布しない不織布を用いて培養を行った場合、の顕微鏡写真である。
図５及び図６に示す通り、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布を用いた場合、不織布の多くの繊維で細胞の付着を観察できた（図５）のに対し、ハイドロキシアパタイトを塗布しない不織布を用いた場合、不織布の一部分の繊維でしか細胞の付着を観察できなかった（図６）。
【００３５】
また、培養開始から１ヶ月後に、細胞のコラーゲン産生量（培養上清中のコラーゲン量）を測定した結果、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布を用いた場合、コラーゲン産生量は５．６μｇ／ｍｌであったのに対し、ハイドロキシアパタイトを塗布しない不織布を用いた場合、コラーゲン産生量は、１．３μｇ／ｍｌ（不織布以外の部分に付着した細胞が産生したコラーゲン量を除いた値）であった。
【００３６】
以上の結果は、不織布にハイドロキシアパタイトを塗布することにより、細胞の付着及び増殖が促進することを示し、コラーゲンなどの物質生産が促進することを示す。
【実施例４】
【００３７】
実施例４では、実施例１などで示した細胞培養において、不織布の好適な繊維密度を検討した。
【００３８】
不織布の繊維の密度は、不織布の単位面積あたりの重量で調節できる。そこで、密度（単位面積あたりの重量）の異なる３種類の不織布（サンプル１〜３）を準備し、それぞれ、実施例１などと同様の方法で培養を行った。本実験では、ヒト正常線維芽細胞は４×１０５個まき込んだ。
そして、培養開始から１ヶ月後に、培養上清中のコラーゲン量を測定した。
その他、対照として、ハイドロキシアパタイトを塗布しない不織布を用いて、同様の実験を行った。
【００３９】
なお、用いた不織布（サンプル１〜３）の単位面積（１０ｃｍ×１０ｃｍ）あたりの重量は表２に示す通りである。
表中、「不織布＋ＨＡｐ」の欄は、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布の単位面積あたりの重量を示す。
表中、「ＨＡｐ」の欄は、その不織布に含有するハイドロキシアパタイトの重量を示す。ハイドロキシアパタイトの重量は、不織布を燃焼した際における残渣の重量を測定することにより取得した。
表中、「不織布のみ」の欄は、不織布の単位面積あたりの重量を示す。不織布の単位面積あたりの重量は、「不織布＋ＨＡｐ」の欄の値（Ａ）から「ＨＡｐ」の欄の値（Ｂ）を減じることにより算出した。
【表２】
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【００４０】
結果を表３に示す。
【表３】
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【００４１】
表３の結果は、不織布の単位面積あたりの重量が、少なくとも、０．１２（０．１１７１８８）〜０．２０（０．１９８８０４）ｇ／１００ｃｍ２の範囲内である場合、細胞培養を良好に行うことができること、即ち、その場合における不織布の繊維の密度は、少なくとも細胞培養に好適であることを示す。
また、不織布の繊維の密度（単位面積あたりの重量）が大きい方が、培養上清中のコラーゲン量も多かった。これは、密度が大きい不織布の方が、付着できる細胞数が多いためであると推測する。
なお、表３中、対照の値は、実施例３と同様、不織布以外の部分に付着した細胞が産生したコラーゲン量を除いた値である。
【実施例５】
【００４２】
実施例５では、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布を複数枚用いて、細胞培養を行った。
【００４３】
７５ｃｍ２のフラスコに、培地を入れた後、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布を、複数枚、層状になるように入れ、実施例１などと同様の方法で培養を行った。本実験では、実施例３と同様、ヒト正常線維芽細胞は５×１０５個まき込み、また、培地交換は４〜５日間隔で行った。
そして、培養開始から３ヵ月後に、培養上清中のコラーゲン量を測定した。
【００４４】
結果を表４に示す。
【表４】
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【００４５】
表４に示す通り、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布を、複数枚、層状に重ねた場合、少なくとも３枚までは、コラーゲン産生量が増加した。このことより、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布を２枚又は３枚重ねた培養環境は、培養細胞の付着・増殖に好適なことが分かった。
【実施例６】
【００４６】
実施例６では、実施例１などと同様の細胞培養において、不織布を固定した場合と、固定しない場合とを比較した。
【００４７】
本実験では、不織布の固定手段として、メビオールジェル（登録商標、メビオール株式会社製、以下同じ）を用いた。メビオールジェルは、低温条件では流動性のゾル状に、転移温度以上の条件（例えば、培養条件）ではゲル状になるため、低温条件で混和した後、培養条件に移すことにより、不織布を固定できる。
【００４８】
１０ｃｍシャーレに、培地、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布（３ｃｍ×７ｃｍ、滅菌済み）、メビオールジェルを入れ、不織布を固定した後、実施例１などと同様の方法により、培養を行った。本実験では、ヒト正常線維芽細胞は２×１０５個まき込み、また、培地交換は４〜５日間隔で行った。
そして、培養開始から２ヶ月後に、培養上清中のコラーゲン量を測定した。
なお、対照では、メビオールジェルを入れずに、同様の方法で培養を行った。
【００４９】
結果を表５に示す。
【表５】
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【００５０】
表５に示す通り、不織布を固定した方が、コラーゲン量は多かった。これは、不織布を固定しない場合、不織布が浮遊・移動することにより、シャーレ底面に付着した細胞に物理的なダメージを与え、細胞を死滅させるため、及び、その死滅した細胞の影響により、生きた細胞のコラーゲン産生量も低下するため、であると推測する。
【実施例７】
【００５１】
実施例７では、実施例１などと同様の細胞培養において、マイクロキャリアに細胞を付着させた後、細胞をまきこむ方法について、検討した。
【００５２】
まず、マイクロキャリアに細胞を付着させた。１０ｃｍシャーレに２×１０６個のヒト繊維芽細胞をまき込み、翌日、マイクロキャリア「ＣＥＬＬＹＡＲＤ  ｂｅａｄｓ（ペンタックス株式会社製）」を０．５〜２．０ｇ添加し、１〜３日間、培養した。それにより、細胞の半数以上がマイクロキャリアに付着した。
次に、フラスコ内に入れた不織布の上に、そのマイクロキャリアを吐出し、実施例１などと同様の方法で培養を行った。
【００５３】
その結果、実施例１では、コラーゲン産生量が２０μｇ／ｍｌ以上になるまでに約２ヶ月間かかったのに対し、本実験では、約３週間で、コラーゲン産生量が同量以上になった。
【００５４】
この結果は、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布に細胞をまき込む場合、細胞をマイクロキャリアに付着させた後まき込むほうが、通常のようにトリプシン処理して細胞を浮遊させた後まき込むよりも、細胞の定着・増殖を速くできることを示す。
【実施例８】
【００５５】
実施例８では、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布を用いて細胞培養を行う場合、その不織布がどのような細胞に適用可能か、検討した。
【００５６】
２５ｃｍ２のフラスコに、培地を入れた後、ハイドロキシアパタイトを塗布した不織布（３×６ｃｍ、滅菌済み）を入れ、実施例１などと同様の方法により、各種細胞をまき込み、培養を行った。培養は３ヶ月以上継続した。
なお、まき込んだ各種細胞は、下記表６の左欄に列記した。
【００５７】
その結果、表６に示す通り、実験を行った全ての細胞において、培養を行うことができた。また、細胞の形態や増殖速度を見る限り、培地変更などの環境変化に伴う影響もほとんど観察しなかった。
【表６】
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【００５８】
以上の結果は、本発明に係る培養方法が、どの細胞にも適用可能であることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、ほとんど全ての付着細胞の培養に適用できる。また、長期間連続培養が可能であるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】培養開始から１週間後の顕微鏡写真（図面代用写真）。
【図２】培養開始から１ヵ月後の顕微鏡写真（図面代用写真）。
【図３】培養開始から２ヵ月後の顕微鏡写真（図面代用写真）。
【図４】培養開始から３ヵ月後の顕微鏡写真（図面代用写真）。
【図５】ハイドロキシアパタイトを塗布した場合の顕微鏡写真（図面代用写真）。
【図６】ハイドロキシアパタイトを塗布しない場合の顕微鏡写真（図面代用写真）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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