(57)【要約】【課題】  生理活性物質又は生理活性物質と親和性を有する物質を基板表面上に均一形成させることで固定化量のバラツキを低減し、かつ、量産システムとして生産効率をあげることが可能なバイオチップ用基板の製造方法を提供する。【解決手段】  基板表面に高分子物質を含む層が形成され、生理活性物質又は生理活性物質と親和性を有する物質を固定化し、生理活性物質を検出する際に用いられるバイオチップ用基板の製造方法であって、前記高分子物質を含む層をスプレーノズルを使用してスプレーコーティング法で形成する工程を含むことを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法。【選択図】 図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面に高分子物質を含む層が形成され、生理活性物質又は生理活性物質と親和性を有する物質を固定化し、生理活性物質を検出する際に用いられるバイオチップ用基板の製造方法であって、前記高分子物質を含む層をスプレーノズルを使用してスプレーコーティング法で形成する工程を含むことを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法。
【請求項２】
前記スプレーノズルが２流体噴霧ノズルである請求項１記載のバイオチップ用基板の製造方法。
【請求項３】
前記スプレーノズルより噴霧される塗布液滴の平均粒径が１μｍ〜５０μｍである請求項１又は２記載のバイオチップ用基板の製造方法。
【請求項４】
前記高分子物質を含む層の膜厚が１nm〜２０nmである請求項１〜３いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
【請求項５】
前記高分子物質を含む層の膜厚CV値が１０％以内である請求項１〜４いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
【請求項６】
前記スプレーコーティング法の工程で使用する有機溶媒が、炭素数１〜４のアルコール単独溶媒、あるいはそれらの混合溶媒、又はそれらアルコールと水との混合溶媒である請求項１〜５いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
【請求項７】
前記基板の材質がプラスチックである請求項１〜６いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
【請求項８】
前記プラスチックが環状ポリオレフィン又は環状ポリオレフィンを含む混合物である請求項７記載のバイオチップ用基板の製造方法。
【請求項９】
前記高分子物質がホスホリルコリン基を有するものである請求項１〜８いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
【請求項１０】
前記ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である請求項９記載のバイオチップ 用基板の製造方法。
【請求項１１】
前記高分子物質が活性エステル基を有するものである請求項１〜１０いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
【請求項１２】
前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するものである請求項１１記載のバイオチップ用基板の製造方法。
【請求項１３】
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体である請求項１〜１２いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板表面に高分子物質を含む層が形成されたバイオチップ用基板の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に生理活性物質又は生理活性物質と親和性を有する物質を固相表面に固定化したバイオチップ では、基板表面内で前記物質の固定化量にバラツキがある。バラツキの原因としてはいくつか考えられ、前記物質の固定化反応時の問題などが挙げられるが、基板表面に前記物質を固定化するために必要な官能基を導入する際の問題が大きい。
基板表面に官能基を導入する際の基板面内の反応性バラツキを解消する方法として、あらかじめ官能基を有した高分子物質を基板表面に塗布する方法がある。しかし、高分子物質の塗布が均一に行われない限り、バラツキの問題が解消できないことに変わりはなかった。
【０００３】
従来バイオチップ用基板の製造において、有機膜の形成方法として浸漬塗布法で形成する方法が知られている。（特許文献１）この浸漬塗布法において塗布層の膜厚は、塗布液の粘度と基板の引き上げ速度で決まるが、基板を浸漬させる槽内の塗布液の乱れ、重力、風の流れ等の影響を受け易く、膜厚バラツキの要因となっている。特に、基板を浸漬して引き上げ後乾燥するまでの間に、湿った塗膜が重力の影響で下方に流動し、基板上下間で膜厚差を生じ易い。更には、浸漬塗布法では生産効率が悪く、連続的に大量生産する量産システムの構築には不向きである。
【特許文献１】特開２００５−１９５５７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、生理活性物質又は生理活性物質と親和性を有する物質を固相表面に配置・固定する際に使用するバイオチップ用基板の製造方法において、生理活性物質又は生理活性物質と親和性を有する物質を基板表面上に均一に形成させることで固定化量のバラツキの低減し、かつ、量産システムとして生産効率をあげることが可能なバイオチップ用基板の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、下記の通りである。
（１）基板表面に高分子物質を含む層が形成され、生理活性物質又は生理活性物質と親和性を有する物質を固定化し、生理活性物質を検出する際に用いられるバイオチップ用基板の製造方法であって、前記高分子物質を含む層をスプレーノズルを使用してスプレーコーティング法で形成する工程を含むことを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法。
（２）前記スプレーノズルが２流体噴霧ノズルである（１）記載のバイオチップ用基板の製造方法。
（３）前記スプレーノズルより噴霧される塗布液滴の平均粒径が１μｍ〜５０μｍである（１）又は（２）記載のバイオチップ用基板の製造方法。
（４）前記高分子物質を含む層の膜厚が１nm〜２０nmである（１）〜（３）いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
（５）前記高分子物質を含む層の膜厚CV値が１０％以内である（１）〜（４）いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
（６）前記スプレーコーティング法の工程で使用する有機溶媒が、炭素数１〜４のアルコール単独溶媒、あるいはそれらの混合溶媒、又はそれらアルコールと水との混合溶媒である（１）〜（５）いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
（７）前記基板の材質がプラスチックである（１）〜（６）いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
（８）前記プラスチックが環状ポリオレフィン又は環状ポリオレフィンを含む混合物である請求項７記載のバイオチップ用基板の製造方法。
（９）前記高分子物質がホスホリルコリン基を有するものである請求項（１）〜（８）いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
（１０）前記ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である（９）記載のバイオチップ 用基板の製造方法。
（１１）前記高分子物質が活性エステル基を有するものである（１）〜（１０）いずれか記載のバイオチップ 用基板の製造方法。
（１２）前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するものである（１１）記載のバイオチップ用基板の製造方法。
（１３）前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体である請求項（１）〜（１２）いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のバイオチップ用基板の製造方法によれば、生理活性物質又は生理活性物質と親和性を有する物質を固定化するために必要な官能基を有する高分子物質を均一に基板表面に形成させたバイオチップ用基板が得られので、固定化量のバラツキの低減が可能となり、かつ量産システムとして生産効率をあげることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
（基板の素材）
本発明に使用するバイオチップ用基板の材質は、プラスチックであることが好ましい。プラスチックとしては、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂を用いることができるが、熱可塑性樹脂の方が製造効率の観点から好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、例えばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等が挙げられる。耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα―オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。
【０００８】
前者の例としては、例えばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、および、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。
【０００９】
後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピル、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα―オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。
これら樹脂は単独で用いてもよく、２種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、樹脂成分以外に繊維状、球状その他の形状を有する無機物あるいは有機物充填材、または各種添加剤成分を含んでもよい。
【００１０】
（基板の形状）
本発明に使用する基板の形状としては、特に限定しないが、平板状基板あるいは微細流路形状を有した基板等が挙げられる。
【００１１】
（高分子物質）
本発明のバイオチップ用基板は、基板表面に生理活性物質又は生理活性物質と親和性を有する物質を固定化するための高分子物質を有する。高分子物質としては、ホスホリルコリン基を有する高分子物質であることが好ましく、ホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質であることが更に好ましい。ホスホリルコリン基は生理活性物質や蛍光物質の非特異的吸着を抑制するのに効果があり、活性エステルは生理活性物質を固定化するのに効果がある。
【００１２】
ホスホリルコリン基としては、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、デセニルホスホリルコリン等を挙げられるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンがより好ましい。
【００１３】
本発明に使用する「活性エステル基」は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
このような活性エステル基としては、例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、コハク酸イミドエステル基、フタル酸イミドエステル基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステル基等が挙げられるが、ｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基が好ましい。
本発明に使用する高分子物質は、ホスホリルコリン基又は活性エステル基以外に他の基を含んでもよく、ブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体が好ましい。
【００１４】
（高分子物質の塗布）
本発明では、基板表面に高分子物質を含む層をスプレーノズルを使用してスプレーコーティング法で形成する。具体的には有機溶媒に溶解した高分子物質溶液をスプレーノズルから液状微粒子として基板表面上に均一に噴霧し、溶媒を乾燥させて薄膜を形成する。この高分子物質の溶液濃度は、０．０１重量％〜１０重量％にすることが好ましい。前記下限値未満の低濃度では濃度が薄過ぎ、必要な膜厚を得ることが困難となる。また、前記上限値を超える高濃度では、厚膜となる為に厚み制御が難しくなるばかりか溶液が高粘度となり、スプレーで吹き付ける操作自体が不能となる恐れが考えられる。一方、基板表面上の高分子物質を含む層の膜厚は、１ｎｍ〜２０ｎｍであることが好ましい。基板上に固定化する生理活性物質の固定化量は、蛍光強度により評価を行うが、基板表面上に形成した高分子物質層の膜厚が前記下限値未満では十分なシグナル強度が得られず、また、前記上限値を超える膜厚ではバックグラウンド値が高くなる問題があり、いずれの場合も好ましくない。更に、高分子物質を含む層の膜厚ＣＶ値は１０％以内であることが好ましい。ここで膜厚ＣＶ値とは、任意に測定した基板上の膜厚平均値と標準偏差から算出した変動係数を示す。この値が１０％を超えると、基板表面内に生理活性物質又は生理活性物質と親和性を有する物質の固定化量のバラツキが大きくなり好ましくない。
【００１５】
本発明で使用するスプレーノズルに特に制限は無いが、液体供給部より供給される高分子物質を溶解させた溶液と、気体供給部から供給される高圧気体とをぶつけ合うことにより、高分子物質の溶液を微粒子化し、噴射口から噴霧することができる２流体ノズルであることが好ましい。
【００１６】
また、基板表面上にスプレーノズルから高分子物質溶液を噴霧する際、ノズルから噴霧される液滴のサイズは、均一な高分子物質を含む層の成膜に影響する為、微細化かつ均一化されていることが好ましい。特に噴霧する液滴のサイズに制限は無いが、平均粒径１μｍ〜５０μｍの範囲であることが好ましい。さらに好ましくは、平均粒径１μｍ〜２０μｍの範囲である。スプレーノズルと基板表面との距離は十分に高いほど塗布面積が広くなるが、ノズルから噴霧された高分子物質溶液の液滴が基板表面に達するまでに、乾燥しない程度の高さでなくてはならない。
また、本発明でのスプレーコーティング法において、基板表面上への塗布回数は特に制限は無く、1回の塗布で目的の膜厚を形成してもよいが、極めて薄い膜厚を形成する為には、固形分濃度の低い溶液で複数回塗布して目的の膜厚を形成する方が、均一性が向上する。
【００１７】
基板表面上にスプレーノズルから高分子物質溶液を噴霧した後の溶媒の乾燥方法としては、使用する溶媒によって異なる為、特に制限は無いが、例えば、風乾、熱盤、乾燥機等を使って溶媒を揮発させる方法が考えられる。
【００１８】
高分子物質を溶解する有機溶媒としては、使用する高分子物質にもよるが、沸点の低い溶媒のみをつかった場合、塗膜を形成すると塗膜表面に細かな荒れが発生してしまう。逆に沸点の高すぎる溶媒のみを選択すると塗布後の塗膜は乾きが遅くなり、液だれや膜厚バラツキが大きくなる原因となる。そのため、高分子物質に対して良溶媒でありかつ、スプレーコーティング法に適した沸点の有機溶媒を選択する必要がある。特に炭素数が１〜４のアルコール溶媒を用いることが好ましい。また、前記アルコール溶媒を混合したもの、あるいは、前記アルコール溶媒と水との混合溶媒でも良い。その際の混合比率は、高分子物質に対して良溶媒になる混合比率であれば、任意の混合比率で良い。
【００１９】
本発明のバイオチップ用基板を使用し各種の生理活性物質を固定化することができる。固定化する生理活性物質として核酸を用いる場合、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基の導入位置は分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端にアミノ基が導入されていることが好ましい。生理活性物質がアプタマー、蛋白質、オリゴペプチド、糖鎖、糖蛋白質の場合もアミノ基を有することが好ましい。
【００２０】
以下に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されるものではない。
【００２１】
(実施例１)
図１に実施方法の形態について示す。飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成し、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．１重量％１−ブタノール溶液を高分子物質溶液として調整した。固相基板６の上方の高さ１０．０ｃｍに２流体ノズル１（アトマックス社製アトマックスＡＭ６Ｓ−ＩＳＴ）を設置し、ノズルにエア供給ライン２よりエアー圧を０．５ＭＰａ、高分子物質溶液をシリンジポンプ４より１０．０ｍｌ／ｍinで高分子溶液供給ライン３を介して供給し、ベルトコンベア５上を１０．４ｃｍ／secで流れている固相基板６に噴霧した。高分子溶液の塗布に要した時間は、基板１枚当たり０．７秒であった。次いで、この基板を風乾することにより、基板上に高分子物質の膜厚が均一になるように形成した。
【００２２】
（実施例２）
実施例１記載の共重合体の０．０５重量％１−ブタノール溶液を調整し、ノズル設置高さ、エアー圧、溶液供給量、基板送り速度を実施例１と同条件で実施例１記載のプラスチック基板に２回塗布した。高分子溶液の塗布に要した時間は、基板１枚当たり１．４秒であった。次いで、この基板を風乾させて、基板上に高分子物質膜を形成した。
【００２３】
（比較例１）
実施例１記載のプラスチック基板を、実施例１記載の共重合体の０．３重量％エタノール溶液に浸漬した。この浸漬塗布に要する時間は、基板１枚当たり２０秒であった。次いで、この基板を風乾させて、基板上に高分子物質膜を形成した。
【００２４】
（高分子物質の膜厚評価）
基板表面上に形成した高分子膜の膜厚測定には、自動エリプソメーター「ＭＡＲＹ−１０２」（ファイブラボ社製）を用いた。使用レーザーはＨｅ−Ｎeレーザー（波長は６３２．８ｎｍ）、入射角度は７０度である。基板表面内を等間隔となるように、１６０箇所を選び膜厚測定し、平均値とＣＶ値（変動係数）を算出した。
【００２５】
（評価結果）
表１に実施例および比較例の膜厚平均値とＣＶ値を示す。実施例１および２は、比較例１と比較して膜厚のバラツキが低減しており、高分子物質の塗布均一性が向上していることが確認できた。更には、本発明によれば高分子物質溶液の塗布に要する時間を大幅に短縮することも可能であった。
【００２６】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例のバイオチップ用基板の製造方法の形態を示す概略図
【符号の説明】
【００２８】
１  ２流体ノズル
２  エアー供給ライン
３  高分子物質溶液供給ライン
４  高分子物質溶液供給用シリンジポンプ
５  基板搬送用ベルトコンベア
６  固相基板
【図１】
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