(57)【要約】【課題】大腸癌の予後を判断する新規な診断方法および診断キット、並びにこれらに使用できる癌抑制遺伝子の提供すること。【解決手段】（１）染色体上の再現されるゲノム変化領域（ＲＡＲ）を観察し、および／または（２）前記ＲＡＲ上で特定遺伝子の発現変化を測定する過程によって、大腸癌（ＣＲＣ）の予後を判定する。【選択図】図１
2008011860.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）染色体上の再現されるゲノム変化領域（ＲＡＲ）を観察する道具、および／または（２）前記ＲＡＲ上に位置する特定遺伝子の発現変化を測定する道具を含む、大腸癌（ＣＲＣ）の予後を判定する診断キット。
【請求項２】
前記（１）における前記再現されるゲノム変化領域（ＲＡＲ）は、ＲＡＲ−Ｌ１（染色体１ｐ３６の消失）およびＲＡＲ−Ｌ２０（染色体２１ｑ２２の消失）の中から選択された一つ以上であることを特徴とする、請求項1に記載の診断キット。
【請求項３】
前記（２）の道具は、前記ＲＡＲ上に位置する癌抑制遺伝子ＣＡＭＴＡ１の発現減少を測定する道具であることを特徴とする、請求項1に記載の診断キット。
【請求項４】
大腸癌の診断に使用できる癌抑制遺伝子ＣＡＭＴＡ１。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な大腸癌診断方法および診断キットに係り、より詳しくは、（１）染色体上の再現されるゲノム変化領域（ＲＡＲ）を観察し、および／または（２）前記ＲＡＲ領域の遺伝子発現変化を測定する過程によって大腸癌（colorectal cancer、ＣＲＣ）の予後を判定する診断方法および診断キット、並びに大腸癌の診断に使用できる新規な癌抑制遺伝子(tumor suppressor genes)に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌（ＣＲＣ）は、２００２年に大略全世界的に１００万名の患者（世界全体の９．４％）が発生したものと推算されている。大腸癌は、発生率の面からみて、男性では４位、女性では３位を占める。また、大腸癌は、有病率(prevalence)が全世界的に乳房癌の次に高く、致死率は大略発生率の半分（２００２年に約５２９，０００名死亡）に達し、２．８万名の患者が大腸癌と診断を受けて５年以内に生存しているものと推定される。全世界的に大腸癌の発生において少なくとも２５倍程度の多様性が存在している。このような大腸癌の発病率は、先進国で最も高く、アフリカおよびアジアでは低い傾向がある。韓国では大腸癌が２００４年に癌死亡原因の４位を占めたが、これは、男性および女性の両方ともで、年齢を基準とする大腸癌の発病率が世界平均よりさらに高いものである。このような地理的差異は、大腸癌が多因子遺伝病(multifactoral disease)であるから、環境要因だけでなく、遺伝的背景によるものと判断される。
【０００３】
大腸癌の発病化過程において様々な突然変異(multiple mutations)が蓄積されることはよく知られている。大腸癌における遺伝的不安定性は、２つの主要形態、すなわちマイクロサテライト不安定性（ＭＩＮ；microsatellite instability）および染色体不安定性（ＣＩＮ）に分けられる。約１３％の大腸癌でミスマッチ修復が欠乏してマイクロサテライト不安定性が誘発される一方、残り８７％の大腸癌では染色体不安定性が誘電物質の獲得と消失をもたらすと考えられる。したがって、染色体不安定性に関する研究は、潜在的な癌遺伝子(oncogenes)および／または腫瘍抑制遺伝子を確認し、ひいては大腸癌の発病過程を解明することに役に立てる。
【０００４】
このような染色体不安定性を研究するために、既存の比較ゲノムハイブリダイゼーション（comparative genomic hybridization、以下「ＣＧＨ」という）が、単一実験から得られた試料における多重染色体の不均衡を調べるのに用いられてきた。ところが、既存のＣＧＨ方法は、顕微鏡的変化以外の微細な変化を正確に確認するにはその解像度が足りなかった。集められた実験証拠が、ゲノム量の変化が癌関連遺伝子の発現程度を変化させて腫瘍化を誘発するという事実を提示するため、高い解像度を持つより詳細な分析が必要である。最近、既存のＣＧＨ方法とマイクロアレイ技術とを組み合わせて、ゲノム全体のＤＮＡコピー数の分析を高い正確度で実施し得るようになった。アレイＣＧＨは、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子が存在するか否かのゲノム異常を探知する有用な道具として脚光を浴びている。また、アレイＣＧＨは、幾つかのゲノム異常が腫瘍の予後マーカーとして提示されたため、腫瘍を分子的に分類するのに使用できるとともに、治療または予防のためのターゲット遺伝子を確認するのに使用できる。
【０００５】
本発明者らは、大腸癌におけるゲノム変化およびその臨床病理学的意味を調べるために、５９名の大腸癌患者の非常に細かく切った組織から抽出されたゲノムＤＮＡｓを用いてゲノム規模のアレイＣＧＨを行った。その結果、大腸癌関連遺伝子のゲノムコピー数の様々な変化が新しく再現される変化領域（recurrently altered region、以下「ＲＡＲ」という）と共に観察され、アレイＣＧＨによって発見される遺伝的変化と臨床病理学的変数間の連関性を調べることができた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明者らは、新規な大腸癌診断法を開発するために鋭意努力を続けた結果、大腸癌で再現される変化領域（ＲＡＲ）２７個を確認し、それから得た大腸癌関連遺伝子の発現程度を測定して、否定的な予後を示す２種の遺伝子ＲＡＲ−Ｌ１およびＲＡＲ−Ｌ２０、並びに前記ＲＡＲ−Ｌ１から腫瘍抑制因子としてのＣＡＭＴＡ１遺伝子を単離し、これを用いた大腸癌診断方法および診断キットを提供することにより、本発明を成功的に完成した。
【０００７】
本発明の目的は、大腸癌の予後を判断する新規な診断方法および診断キット、並びにこれらに使用できる癌抑制遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は、（１）染色体上の再現されるゲノム変化領域（ＲＡＲ）を観察し、および／または（２）前記ＲＡＲ上で特定遺伝子の発現変化を測定する過程によって、大腸癌（ＣＲＣ）の予後を判定する診断方法を提供する。
また、本発明は、（１）染色体上の再現されるゲノム変化領域（ＲＡＲ）を観察する道具、および／または（２）前記ＲＡＲ上に位置する特定遺伝子の発現変化を測定する道具を含む、大腸癌（ＣＲＣ）の予後を判定する診断キットを提供する。
また、本発明は、大腸癌の診断に使用可能な癌抑制遺伝子を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
上述したように、本発明は、（１）染色体上の再現されるゲノム変化領域（ＲＡＲ）を観察し、および／または（２）前記ＲＡＲ領域の遺伝子発現変化を測定する過程によって、大腸癌（colorectal cancer、ＣＲＣ）の予後を判定する診断方法および診断キット、並びに大腸癌の診断などに使用できる新規な癌抑制遺伝子(tumor suppressor genes)を提供する。本発明の診断方法は、前記ＲＡＲ領域上で統計的に有意な癌抑制遺伝子を選択し、その発現変化を正確に観察および測定するので、大腸癌を含んだ各種癌および腫瘍の予後判断だけでなく、早期診断などが効果的に行われるように助ける。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、（１）染色体上の再現されるゲノム変化領域（ＲＡＲ）を観察し、および／または（２）前記ＲＡＲ上で特定遺伝子の発現変化を測定する過程によって、大腸癌（ＣＲＣ）の予後を判定する診断方法を提供する。
前記（１）過程における再現されるゲノム変化領域（ＲＡＲ）は、ＲＡＲ−Ｌ１（染色体１ｐ３６の消失）およびＲＡＲ−Ｌ２０（染色体２１ｑ２２の消失）の中から選択された一つ以上であることが好ましい。
【００１１】
また、前記（２）過程の特定遺伝子は、前記ＲＡＲ上に位置する癌抑制遺伝子であることが好ましく、さらに好ましくは前記ＲＡＲ上に位置する癌抑制遺伝子ＣＡＭＴＡ１である。
前記癌抑制遺伝子ＣＡＭＴＡ１は、遺伝子発現が減少するとき、大腸癌を含む各種癌の否定的な予後を示し、遺伝子発現が増加するとき、大腸癌を含む各種癌の肯定的な予後を示す。
【００１２】
また、本発明は、（１）染色体上の再現されるゲノム変化領域（ＲＡＲ）を観察する道具、および（２）前記ＲＡＲ上に位置する特定遺伝子の発現変化を測定する道具などを含む、大腸癌（ＣＲＣ）の予後を判定する診断キットを提供する。
前記（１）における再現されるゲノム変化領域（ＲＡＲ）は、ＲＡＲ−Ｌ１（染色体１ｐ３６の消失）およびＲＡＲ−Ｌ２０（染色体２１ｑ２２の消失）の中から選択された一つ以上であることが好ましい。
前記（２）の道具は、前記ＲＡＲ上に位置する癌抑制遺伝子ＣＡＭＴＡ１の発現減少を測定する道具であることが好ましい。
また、本発明は、大腸癌を含んで各種癌の診断に使用できる癌抑制遺伝子を提供する。
前記癌抑制遺伝子は、ＣＡＭＴＡ１遺伝子を含むことが好ましい。
【００１３】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。ところが、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００１４】
実施例１．大腸癌におけるゲノム変化の特徴調査
【００１５】
（１）大腸癌患者および細胞試料の収集
【００１６】
本発明では、１９９５年から１９９７年の期間中に檀国大学校病院（天安、韓国）で外科手術を受けた５９名の大腸癌（ＣＲＣ）患者の試料を収集し、江南聖母病院研究陣の承認下に使用した。各患者から得た腫瘍および近隣正常組織は、外科的に摘出されて冷凍庫で凍らせて保管された。各組織はクリオトーム(cryotom)を用いてゼラチンコートスライド上に準備された。この組織は、Ｈ＆Ｅ染色をした後、腫瘍細胞の多い領域（６０％以上）と正常細胞領域とが顕微鏡の下で選別され、手作業で解剖された。顕微解剖された(microdissected)組織は、細胞溶解緩衝溶液（１％プロテアーゼＫを溶かしたＴＥ緩衝溶液）に浸漬して５０℃で１２時間反応させてゲノムＤＮＡを抽出した。アレイＣＧＨの対照群として、正常組織から得たＤＮＡが使用された。単離されたＤＮＡは、ＤＮＡ単離キット（DNA purification kit、Ｓｏｌｇｅｎｔ製、韓国大田）を用いて純粋精製され、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００スペクトロフォトメーター（NanoDrop Technologies、デラウェア、米国）を用いて定量された。腫瘍の組織病理学的所見は、癌ガイドラインに関する米国学会の標準ＴＮＭ分類に基づき、訓練された病理学者によって行われた。
【００１７】
（２）アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションおよびデータプロセッシング
【００１８】
Ｓａｎｇｅｒ研究所のマイクロアレイ研究陣が作った全体ゲノムにおいて１Ｍｂの解像度を持つヒトクローンアレイを使用した。ＤＮＡラベリング、前ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および後ハイブリダイゼーションは下記の通りに行った。癌組織から得たゲノムＤＮＡはＣｙ３−ｄＣＴＰでラベルし、腫瘍組織から得たＤＮＡはＣｙ５−ｄＣＴＰでラベルした。オープンウェルハイブリダイゼーションは既存の方法によって行われた。アレイはＧｅｎｅＰｉｘ ４１００Ａスキャナ（エクソンインスツルメント社、米国）を用いてスキャンされ、イメージはＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ６．０を用いてプロセシングされた。アレイＣＧＨデータは、Ｗｅｂ上のアレイＣＧＨ分析インタフェースＡｒｒａｙＣｙＧＨｔを用いて正常化(print-tip loss normalization)され、再配列された。長い挿入クローンは、ＥｎｓｅｍｂｌおよびＵＣＳＣゲノムブラウザー上のゲノム位置に応じてマッピングされた。全体的に２，９８１ＢＡＣクローンが最初３，０１４クローンからプロセッシングされた。全体クローンセットに対する情報は、Ｅｎｓｅｍｂｌヒトゲノムブラウザーを用いて得ることができる。
【００１９】
（３）染色体変化に対するデータ分析
【００２０】
各クローンにおける染色体の変化に対するカットオフ値を設定するために、４つの正常ハイブリダイゼーションを別途のシリーズで行った。対照群のハイブリダイゼーション結果に基づいて、コピー数異常に対するカットオフ値は、各個人のデータにおける標準誤差の３倍内外と設定した。領域上のコピー数変化は、２以上のＢＡＣクローンに続くＤＮＡのコピー数変化と定義し、全体染色体を対象とするのではない。各クローンにおける高い程度の増幅は、強度がログ２の値１．０以上、または相同消失においてはその反対と定義した。コピー数変化の範囲は、隣り合うクローン間の半分程度に定めた。ＲＡＲは、少なくとも１０個の腫瘍試料において現れる領域上のコピー数変化によって定義した。
【００２１】
（４）ゲノム変化の調査
【００２２】
全体５９名の大腸癌患者の臨床病理学的データは、下記表１に示す通りである。３９名の男子患者と２０名の女子患者を選抜し、手術時の患者の平均年齢は５８．７才（２３才から８１才まで）であると調査された。５９名の患者のうち、４１名の患者（６９．５％）は直腸癌(rectosigmoid cancer)であり、３６名の患者（６１．０％）は初期段階の腫瘍と分類診断された。実験進行の際に、２３名の患者は死亡した（［表１］研究対象患者の一般な特性）。
【００２３】
【表１】
2008011860.tif 000003
【００２４】
前記５９名の大腸癌患者から発見されるゲノム変化の全ては図１に示した。染色体変化の頻度を調査した結果、これらのいずれも無作為に分布してあるものと調査されたが、全体ゲノムを介して幾つかの重要な領域(hot regions)は集中していた。５９名の患者におけるアレイＣＧＨの信号強度比率（ログ２単位）に関するデータはＷｅｂサイトからダウンロードすることができる。
【００２５】
各患者毎に変化したクローンは、平均的に全体２，９８１個のクローンのうち７６４．８個（５８個〜１，５４０個）であると測定された。変化したクローンの数字は男子、症状が悪化したグループ、および直腸癌で有意にさらに高かった。全体染色体のうち最も頻繁な変化は１３ｑ（３１／５９、５２．５％）、２０ｑ（３０／５９、５０．８％）、２０ｐ（２１／５９、３５．６％）、７ｐ（２０／５９、３３．９％）、および８ｑ（２９／５９、４９．２％）上の獲得、並びに１８ｑ（２９／５９、４９．２％）、１８ｐ（２７／５９、４５．８％）および１７ｐ（２６／５９、４４．１％）上の消失であると確認された。
【００２６】
実施例２．コピー数変化の確認
【００２７】
本発明は、コピー数の変化を調べるために、多重ライゲーション依存性プロブ増幅分析（multiplex ligation-dependent probe amplification analysis、以下「ＭＬＰＡ」という）を、ＭＬＰＡ−ＡｎｅｕｐｌｏｉｄｙテストキットＰ０９５（ＭＲＣ、オランダ）を用いて次の通りに行った。前記２５０ｎｇのゲノムＤＮＡを９８℃で１０分間変性させ、緩衝溶液含有プロブ混合液３μＬを添加した。その後、反応混合液を９５℃で１分間加熱し、６０℃で１６時間反応させた。ライゲーション反応は、熱に安定なリガーゼ６５を用いて５４℃で１５分間行った。１０μＬの反応溶液は、４０μＬの汎用プライマーが含まれたＰＣＲ反応混合液と混合した。一つのプライマーはそのままにして、残りのプライマーのみをＦＡＭ［Ｎ−（３−フルアンチル）マレイミド］でラベルした。熱反応は、９５℃で１分、９５℃で３０秒を１サイクルとして３５サイクル繰り返し行われ、さらに６０℃で３０秒、７２℃で６０秒間行われた。増幅された欠片は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３０ＸＬ ＤＮＡ分析器（アプライドバイオシステム、米国）によって、ＲＯＸ−５０をサイズマーカーとして用いて分析された。ＰＣＲ産物のピーク領域はＧｅｎｏｔｙｐｅｒソフトウェアで算定し、データはＣｏｆｆａｌｙｓｅｒ ｍａｃｒｏから得た単純化した分析法を用いて分析された。
【００２８】
実際アレイＣＧＨによってコピー数を調べるために、コピー数異常を示す１３名の初期大腸癌患者を対象としてＭＬＰＡ分析を行った。アレイＣＧＨによって確認されたコピー数異常はＭＬＰＡ結果とほぼ一致した。図２はＭＬＰＡ確認結果を説明しており、番号が付された１２個のピークはそれぞれ１３番、１８番、２１番よびＸ染色体のコピー数異常を示すものである。
【００２９】
実施例３．再現される変化領域の確認
【００３０】
全体染色体の変化に伴い、多くの領域上のコピー数変化が観察された。このような再現される変化領域(recurrently altered regions)のうち、少なくとも１０名の患者における染色体の再現される変化領域はＲＡＲと命名し、具体的には７個のＲＡＲ獲得（ＲＡＲ−Ｇ）および２０個のＲＡＲ消失（ＲＡＲ−Ｌ）が観察された。下記表２に、２７個のＲＡＲｓのマップ上の位置、大きさおよび癌関連遺伝子を羅列して示している。これらのうち５個のＲＡＲｓは４０％以上の患者から観察された：ＲＡＲ−Ｇ４（２８／５９、４７．５％）、ＲＡＲ−Ｌ２（２７／５９、４５．８％）、ＲＡＲ−Ｌ５（２５／５９、４２．２％）、ＲＡＲ−Ｌ１４（２８／５９、４７．５％）およびＲＡＲ−Ｌ１７（２８／５９、４７．５％）（［表２］５９名の大腸癌患者における再現される変化領域）。
【００３１】
【表２】
2008011860.tif 000004
【００３２】
前記ＲＡＲｓには幾つかの癌関連遺伝子が含まれる。たとえば、ＢＬＣ１１Ａ、ＰＬＤ１、ＥＣＴ２、ＡＧＲ２、ＴＷＩＳＴ１およびＢＩＲＣ４などの癌遺伝子(oncogenes)だけでなく、ＭＹＣおよびＲＥＬなどの既存の癌遺伝子が前記ＲＡＲ−Ｇｓに含まれる。また、ＣＡＭＴＡ１、ＦＡＦ１、ＣＴＨ、ＰＴＧＥＲ３、ＴＥＣ、ＣＬＤＮ２２、ＩＮＧ２、ＩＲＦ２、ＡＣＳＬ５、ＡＮＸＡ２、ＲＯＲＡおよびＳＣＯ１などの多くの癌抑制遺伝子が前記ＲＡＲ−Ｌｓに位置している。
【００３３】
実施例４．高いコピー数への変化
【００３４】
ＲＡＲｓに位置する癌関連遺伝子と共に高い程度の増幅および相同削除(homozygous deletion)を表３にまとめて示した（［表３］大腸癌患者における高いコピー数変化を示す遺伝的位置）。
【００３５】
【表３】
2008011860.tif 000005
【００３６】
増幅された１１個のゲノム分節と２個の同種削除は少なくとも１名の患者から確認された。最も高いコピー数変化は１名の患者から観察されたが、１７ｑ１２、２０ｑ１１および２０ｑ１３上の増幅は２名以上の患者から観察された。前記増幅領域ではＥＧＦＲ、ＣＣＮＤ２、ＥＲＢＢ２およびＭＹＢＬ２などの基地の癌遺伝子が位置し、且つ幾つかの癌関連遺伝子における高いコピー数の変化領域に含まれていた（表３参照）。
【００３７】
実施例５．ゲノム変化間の相関性調査
【００３８】
ＲＡＲｓ間の連関性分析は、これらの相互発生率の有意性を調査することにより行われた。互いに異なる染色体領域上の可能なすべてのＲＡＲｓ間の対が考慮された。ＲＡＲｓ間の５対が、多重テスト(multiple testing)で最適化させた結果、お互い有意に連関しているものと調査された。具体的に、染色体４ｐ１５上のＲＡＲ−Ｌ５は染色体１ｐ３３上のＲＡＲ−Ｌ２および染色体Ｘｑ２４上のＲＡＲ−Ｇ７と相互連関しており、染色体１７ｐ１３上のＲＡＲ−Ｌ１７は染色体４ｐ１５上のＲＡＲ−Ｌ５および染色体１４ｑ３２上のＲＡＲ−Ｌ１４と相互連関しており、染色体４ｐ１２上のＲＡＲ−Ｌ６は染色体１ｐ３３上のＲＡＲ−Ｌ２と相互連関していることが分かった。
また、有意に相互連関しているＲＡＲｓが、機能的に連関している遺伝子を共有するか否かを、遺伝子データベースＧＯ(Gene Ontology)を用いて調査した。また、同一の機能的表示を持つが、２つの連関しているＲＡＲｓ上に別途に位置する遺伝子を選別した。また、３つのＲＡＲ対が、１２個の表示によって、機能的に連関している遺伝子を共有するものと確認された（［表４］共通のＲＡＲｓが共有する機能的に連関している遺伝子）。
【００３９】
【表４】
2008011860.tif 000006
【００４０】
実施例６．臨床病理学的変数による遺伝的変化の差別化された分布調査
【００４１】
４種の臨床的変数（年齢、段階、性別、腫瘍位置）が予め確認されたゲノム変化との相互連関性を調査するために分析された。ＲＡＲ−Ｇ７、ＲＡＲ−Ｌ１１、ＲＡＲ−Ｌ１２、ＲＡＲ−Ｌ１３、ＲＡＲ−Ｌ１６、ＲＡＲ−Ｌ１７およびＲＡＲ−Ｌ１８、染色体８ｑ、１９ｐおよびＸの獲得、並びに１４ｑ、１５ｑ、ＸｑおよびＹの消失が性別と連関している。ＲＡＲ−Ｇ３、ＲＡＲ−Ｌ１、ＲＡＲ−Ｌ２、ＲＡＲ−Ｌ５、ＲＡＲ−Ｌ６およびＲＡＲ−Ｌ２０、並びに染色体１ｐおよび４ｐの獲得が癌進行段階と連関しているものと調査された。ＲＡＲ−Ｇ７、ＲＡＲ−Ｌ４、ＲＡＲ−Ｌ９、ＲＡＲ−Ｌ１１およびＲＡＲ−Ｌ１２、染色体１３ｑ、２０ｐおよび２０ｑの獲得、並びに１８ｐおよび１８ｑの消失が直腸癌部位と連関している。
【００４２】
実施例７．ゲノム変化による生存率の分析
【００４３】
臨床病理学的変数およびＲＡＲｓの予後診断価値を評価するために、生存率の分析が行われた。癌進行段階、ＲＡＲ−Ｌ１、ＲＡＲ−Ｌ４およびＲＡＲ−Ｌ２０は低い生存率と有意に関連している（図３参照）。特に、ＲＡＲ−Ｌ１の存在は統計的に最も高い有意性を持つものと観察された。
前記分析で調査された有意なゲノム変化と共に、年齢、性別および腫瘍進行段階などの臨床的変数を用いて、２つのＲＡＲｓ（ＲＡＲ−Ｌ１およびＲＡＲ−Ｌ２０）、年齢および段階が大腸癌の悪い予後を示す独立的予測因子になれることを確認させてくれた（［表５］Ｃｏｘ回帰分析結果）。図３は患者の生存率と有意に連関している２個のＲＡＲｓを示す。
【００４４】
【表５】
2008011860.tif 000007
【００４５】
実施例８．生存率と連関したＲＡＲｓにおける癌遺伝子の発現調査
【００４６】
（１）実時間定量的重合酵素連鎖反応の分析
【００４７】
１本鎖のｃＤＮＡが、４４対の癌／正常組織および３つの細胞株（ＲＫＯ、ＨＴ２９およびＨＣＴ１１６）から得た全体ＲＮＡからＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カナダ）を用いて合成された。本発明のＣＡＭＴＡ１遺伝子の発現プロファイルを分析するために、実時間定量的ＰＣＲがＭｘ３０００Ｐ ｑＰＣＲシステムおよびＭｘＰｒｏバーション３．０ソフトウェア（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を用いて行われた。２０μＬの実時間ＰＣＲ反応混合液は１０ｎｇ ｃＤＮＡ、１Ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｔｂｒポリメラーゼ組み合わせ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ、フィンランド）、０５Ｘ ＲＯＸおよび２０ｐｍｏｌｅプライマーを含むように構成された。ＧＡＰＤＨ遺伝子は、各実験過程で内部対照群として使用された。熱反応は、９５℃で１０分、９４℃で１０秒を１サイクルとして４０サイクル繰り返し行われ、さらに５４℃で３０秒、７２℃で３０秒間行われた。特定部位の増幅を確認するために、融点分析が５５〜９５℃で０．５℃／秒で行われた。比較定量は△△ＣＴ方法で行われ、癌組織におけるＣＡＭＴＡ１遺伝子の発現が４０％減少すると低い発現と判断した。全実験は２回繰り返し行われた。これにより、標準誤差内強度の平均値が各患者に対して測定された。この際、使用したＣＡＭＴＡ１遺伝子のプライマーは配列番号１および配列番号２の塩基配列をそれぞれ含むように製作された。
【００４８】
（２）ＣＡＭＴＡ１遺伝子の突然変異分析
【００４９】
ＣＡＭＴＡ１遺伝子の体細胞突然変異は、ＰＣＲ−ｄｉｒｅｃｔ塩基配列決定法によって検索された。特定なエクソンの増幅に対するプライマーセットは、若干変形させた既存の方法と同一に製作された。プライマー配列に対する詳細な情報は下記表６に示す通りである（［表６］プライマー配列）。全ての増幅過程はＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ、フィンランド）を用いて行われ、ＰＣＲ産物はＭＥＧＡ−ｓｐｉｎゲル抽出キット（ｉＮｔＲＯＮ、韓国）を用いて純粋分離された。
【００５０】
【表６】
2008011860.tif 000008
【００５１】
その結果、前記ＲＡＲ−１１および前記ＲＡＲ−２０遺伝子のコーディング領域のうち、ＣＡＭＴＡ１遺伝子は神経性腫瘍の腫瘍抑止遺伝子として提示されたことがあった。したがって、３つの大腸癌細胞株および４４対の初期大腸癌において、この遺伝子の発現プロファイルを実時間定量的ＰＣＲ(real-time quantitative PCR)によって調査した。これにより、遺伝子発現数値間の比率（癌：正常）が測定された。３つの細胞株および２６個の大腸癌が正常組織に比べてＣＡＭＴＡ１遺伝子の低い発現を示した（図４参照）。特にＣＡＭＴＡ１遺伝子の低い発現は正常ＣＡＭＴＡ１遺伝子に比べて低い生存率と有意に連関している。Ｃｏｘ回帰分析によって、年齢、性別および段階に応じて最適化させた後に、ＣＡＭＴＡ１遺伝子の低い発現が独立的予測因子として低い生存率とさらに有意に連関していることが分かった（表5参照）。
【００５２】
また、ＣＡＭＴＡ１遺伝子の低い発現は、ＲＡＲ−Ｌ１がない場合（７０％、７／１０）よりＲＡＲ−Ｌ１を持つ大腸癌（５５．９％、１９／３４）からさらに頻繁に観察された。また、発現水準も、ＲＡＲ−Ｌ１を持つ大腸癌において有意性はないがさらに低いものと確認された。また、ＣＡＭＴＡ１遺伝子の低い発現のメカニズムを調べるために、体細胞突然変異（２６個の大腸癌）およびメチル化の度合い（３８個の大腸癌）が検索された。１個のミスセンス突然変異が初期大腸癌（ＣＣＲＣ７１）から発見され、これによりＲＡＲ−Ｌ１がないＣＡＭＴＡ１遺伝子の低い発現が誘発されることが分かった（図４参照）。ところが、ＣＡＭＴＡ１遺伝子のプロモータ領域からは過メチル化(hypermethylation)が観察されていない。
【００５３】
［参考文献］
1. Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin 2005;55:74-108. 
2. National Statistical Office, Korea. Korean Statistical Information System. 2006. Available from:  URL: http://www.ncc.re.kr.
3. Shin HR, Won YJ, Jung KW, Kong HJ, Yim SH, Lee JK, Noh HI, Lee JK, Park JG. Nationwide Cancer Incidence in Korea, 1999-2001; First result using the National Cancer Incidence Database. Cancer Res Treat 2006;37:in press. 
4. Michor F, Iwasa Y, Lengauer C, Nowak MA. Dynamics of colorectal cancer. Semin Cancer Biol 2005;15:484-493. 
5. Yim SH, Chung YJ. Current Status and Future Clinical Applications of Array based Comparative Genomic Hybridization. Genomics & Informatics 2004;2:113-120. 
6. Pinkel D, Segraves R, Sudar D, Clark S, Poole I, Kowbel D, Collins C, Kuo WL, Chen C, Zhai Y, Dairkee SH, Ljung BM, Gray JW, Albertson DG. High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays. Nat Genet 1998;20:207-211. 
7. Fiegler H, Carr P, Douglas EJ, Burford DC, Hunt S, Scott CE, Smith J, Vetrie D, Gorman P, Tomlinson IP, Carter NP. DNA microarrays for comparative genomic hybridization based on DOP-PCR amplification of BAC and PAC clones. Genes Chromosomes Cancer 2003;36:361-374. 
8. Kim TM, Yim SH, Lee JS, Kwon MS, Ryu JW, Kang HM, Fiegler H, Carter NP, Chung YJ. Genome-wide screening of genomic alterations and their clinicopathologic implications in non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res 2005;11:8235-8242. 
9. Chung YJ, Jonkers J, Kitson H, Fiegler H, Humphray S, Scott C, Hunt S, Yu Y, Nishijima I, Velds A, Holstege H, Carter N, Bradley A. A whole-genome mouse BAC microarray with 1-Mb resolution for analysis of DNA copy number changes by array comparative genomic hybridization. Genome Res 2004;14:188-196. 
10. Kim SY, Nam SW, Lee SH, Park WS, Yoo NJ, Lee JY, Chung YJ. ArrayCyGHt: a web application for analysis and visualization of array-CGH data. Bioinformatics 2005;21:2554-2555. 
11. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001;25: 402-408. 
12. Henrich KO, Fischer M, Mertens D, Benner A, Wiedemeyer R, Brors B, Oberthuer A, Berthold F, Wei JS, Khan J, Schwab M, Westermann F. Reduced expression of CAMTA1 correlates with adverse outcome in neuroblastoma patients. Clin Cancer Res 2006;12:131-138. 
13. Barbashina V, Salazar P, Holland EC, Rosenblum MK, Ladanyi M. Allelic losses at 1p36 and 19q13 in gliomas: correlation with histologic classification, definition of a 150-kb minimal deleted region on 1p36, and evaluation of CAMTA1 as a candidate tumor suppressor gene. Clin Cancer Res 2005;11:1119-1128. 
14. Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res 2002;30:e57. 
15. He QJ, Zeng WF, Sham JS, Xie D, Yang XW, Lin HL, Zhan WH, Lin F, Zeng SD, Nie D, Ma LF, Li CJ, Lu S, Guan XY. Recurrent genetic alterations in 26 colorectal carcinomas and 21 adenomas from Chinese patients. Cancer Genet Cytogenet 2003; 144:112-118. 
16. Poeaim S, Rerkamnuaychoke B, Jesdapatarakul S, Campiranon A. Chromosome alterations in colorectal cancer in Thai patients. Cancer Genet Cytogenet 2005; 160:152-159. 
17. Ried T, Knutzen R, Steinbeck R, Blegen H, Schrock E, Heselmeyer K, du Manoir S, Auer G. Comparative genomic hybridization reveals a specific pattern of chromosomal gains and losses during the genesis of colorectal tumors. Genes Chromosomes Cancer 1996;15:234-245. 
18. Nakao K, Mehta KR, Fridlyand J, Moore DH, Jain AN, Lafuente A, Wiencke JW, Terdiman JP, Waldman FM. High-resolution analysis of DNA copy number 
alterations in colorectal cancer by array-based comparative genomic hybridization. Carcinogenesis 2004;25:1345-1357. 
19. Knosel T, Petersen S, Schwabe H, Schluns K, Stein U, Schlag PM, Dietel M, Petersen I. Incidence of chromosomal imbalances in advanced colorectal carcinomas and their metastases. Virchows Arch 2002;440:187-194. 
20. Jones AM, Douglas EJ, Halford SE, Fiegler H, Gorman PA, Roylance RR, Carter NP, Tomlinson IP. Array-CGH analysis of microsatellite-stable, near-diploid bowel cancers and comparison with other types of colorectal carcinoma. Oncogene 2005;24:118-129. 
21. Knosel T, Schluns K, Stein U, Schwabe H, Schlag PM, Dietel M, Petersen I. Genetic imbalances with impact on survival in colorectal cancer patients. Histopathology 2003;43:323-331. 
22. Aragane H, Sakakura C, Nakanishi M, Yasuoka R, Fujita Y, Taniguchi H, Hagiwara A, Yamaguchi T, Abe T, Inazawa J, Yamagishi H. Chromosomal aberrations in colorectal cancers and liver metastases analyzed by comparative genomic hybridization. Int J Cancer 2001;94:623-629. 
23. Douglas EJ, Fiegler H, Rowan A, Halford S, Bicknell DC, Bodmer W, Tomlinson IP, Carter NP. Array comparative genomic hybridization analysis of colorectal cancer cell lines and primary carcinomas. Cancer Res 2004;64:4817-4825. 
24. De Angelis PM, Clausen OP, Schjolberg A, Stokke T. Chromosomal gains and losses in primary colorectal carcinomas detected by CGH and their associations with tumour DNA ploidy, genotypes and phenotypes. Br J Cancer 1999;80:526-535. 
25. Shivapurkar N, Maitra A, Milchgrub S, Gazdar AF. Deletions of chromosome 4 occur early during the pathogenesis of colorectal carcinoma. Hum Pathol 2001;32:169-177. 
26. Finch R, Moore HG, Lindor N, Jalal SM, Markowitz A, Suresh J, Offit K, Guillem JG. Familial adenomatous polyposis and mental retardation caused by a de novo chromosomal deletion at 5q15-q22: report of a case. Dis Colon Rectum 2005;48:2148-2152. 
27. Flanagan JM, Healey S, Young J, Whitehall V, Trott DA, Newbold RF, Chenevix-Trench G. Mapping of a candidate colorectal cancer tumor-suppressor gene to a 900-kilobase region on the short arm of chromosome 8. Genes Chromosomes Cancer 2004;40:247-260. 
28. Frayling IM, Bodmer WF, Tomlinson IP. Allele loss in colorectal cancer at the Cowden disease/juvenile polyposis locus on 10q. Cancer Genet Cytogenet 1997;97:64-69. 
29. Bando T, Kato Y, Ihara Y, Yamagishi F, Tsukada K, Isobe M. Loss of heterozygosity of 14q32 in colorectal carcinoma. Cancer Genet Cytogenet 1999;111:161-165. 
30. Park WS, Park JY, Oh RR, Yoo NJ, Lee SH, Shin MS, Lee HK, Han S, Yoon SK, Kim SY, Choi C, Kim PJ, Oh ST, Lee JY. A distinct tumor suppressor gene locus on chromosome 15q21.1 in sporadic form of colorectal cancer. Cancer Res 2000;60:70-73. 
31. Risio M, Casorzo L, Chiecchio L, De Rosa G, Rossini FP. Deletions of 17p are associated with transition from early to advanced colorectal cancer. Cancer Genet Cytogenet 2003;147:44-49. 
32. Knosel T, Petersen S, Schwabe H, Schluns K, Stein U, Schlag PM, Dietel M, Petersen I. Incidence of chromosomal imbalances in advanced colorectal carcinomas and their metastases. Virchows Arch 2002;440:187-194. 
33. Donzelli M, Bernardi R, Negri C, Prosperi E, Padovan L, Lavialle C, Brison O, Scovassi AI. Apoptosis-prone phenotype of human colon carcinoma cells with a high level amplification of the c-myc gene. Oncogene 1999;18:439-448. 
34. Lakshman M, Subramaniam V, Rubenthiran U, Jothy S. CD44 promotes resistance to apoptosis in human colon cancer cells. Exp Mol Pathol 2004;77:18-25. 
35. Cummins JM, Kohli M, Rago C, Kinzler KW, Vogelstein B, Bunz F. X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) is a nonredundant modulator of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-mediated apoptosis in human cancer cells. Cancer Res 2004;64:3006-3008. 
36. Satterwhite E, Sonoki T, Willis TG, Harder L, Nowak R, Arriola EL, Liu H, Price HP, Gesk S, Steinemann D, Schlegelberger B, Oscier DG, Siebert R, Tucker PW, Dyer MJ.  The BCL11 gene family: involvement of BCL11A in lymphoid malignancies. Blood 2001;98:3413-3420. 
37. Ahn BH, Kim SY, Kim EH, Choi KS, Kwon TK, Lee YH, Chang JS, Kim MS, Jo YH, Min DS. Transmodulation between phospholipase D and c-Src enhances cell 
proliferation. Mol Cell Biol 2003;23:3103-3115. 
38. Zhang JS, Gong A, Cheville JC, Smith DI, Young CY. AGR2, an androgen-inducible secretory protein overexpressed in prostate cancer. Genes Chromosomes Cancer 2005;43:249-259.
39. Shoji Y, Takahashi M, Kitamura T, Watanabe K, Kawamori T, Maruyama T, Sugimoto Y, Negishi M, Narumiya S, Sugimura T, Wakabayashi K. Downregulation of prostaglandin E receptor subtype EP3 during colon cancer development. Gut 2004;53:1151-1158.
40. Bjorling-Poulsen M, Seitz G, Guerra B, Issinger OG. The pro-apoptotic FAS-associated factor 1 is specifically reduced in human gastric carcinomas. Int J Oncol 2003;23:1015-1023. 
41. Dunn JR, Risk JM, Langan JE, Marlee D, Ellis A, Campbell F, Watson AJ, Field JK. Physical and transcript map of the minimally deleted region III on 17p implicated in the early development of Barrett's oesophageal adenocarcinoma. Oncogene 2003;22:4134-4142. 
42. Kuo T, Fisher GA. Current status of small-molecule tyrosine kinase inhibitors targeting epidermal growth factor receptor in colorectal cancer. Clin Colorectal Cancer 2005;Suppl 2:S62-70. 
43. Gunther K, Leier J, Henning G, Dimmler A, Weissbach R, Hohenberger W, Forster R. Prediction of lymph node metastasis in colorectal carcinoma by expression of chemokine receptor CCR7. Int J Cancer 2005;116:726-733. 
44. Aligayer H, Boyd DD, Heiss MM, Abdalla EK, Curley SA, Gallick GE. Activation of Src kinase in primary colorectal carcinoma: an indicator of poor clinical prognosis. Cancer 2002;94:344-351. 
45. Villunger A, Michalak EM, Coultas L, Mullauer F, Bock G, Ausserlechner MJ, Adams JM, Strasser A. p53- and drug-induced apoptotic responses mediated by BH3-only proteins puma and noxa. Science 2003;302:1036-1038. 
46. Ogunbiyi OA, Goodfellow PJ, Gagliardi G, Swanson PE, Birnbaum EH, Fleshman JW, Kodner IJ, Moley JF. Prognostic value of chromosome 1p allelic loss in colon cancer. Gastroenterology 1997;113:761-766. 
47. Ray R, Cabal-Manzano R, Moser AR, Waldman T, Zipper LM, Aigner A, Byers SW, Riegel AT, Wellstein A. Up-regulation of fibroblast growth factor-binding protein, by beta-catenin during colon carcinogenesis. Cancer Res 2003;63:8085-8089.
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】大腸癌患者のゲノムを分析した結果である（Ａ：大腸癌患者のゲノムプロファイル、Ｂ：染色体上の獲得および消失の頻度）。
【図２】アレイＣＧＨを用いてコピー数のプロファイルを分析した結果である（Ａ：正常組織、Ｂ：ＣＣＲＣ８０腫瘍組織、Ｃ：腫瘍組織対正常組織）。
【図３】再現されるゲノム変化領域（ＲＡＲ）と生存率との相関性を分析した結果である（Ａ：段階、Ｂ：染色体１ｑ３６上のＲＡＲ−Ｌ１、Ｃ：染色体１ｐ３１上のＲＡＲ−Ｌ４、Ｄ：染色体２１ｑ２２上のＲＡＲ−Ｌ２０）。
【図４】本発明の癌抑制遺伝子の発現プロファイルを分析した結果である（Ａ：腫瘍／正常強度の比率、Ｂ：カプランマイヤー生存率曲線、Ｃ：ミスセンス突然変異）。
【図２】
2008011860.tif 000009
【図４】
2008011860.tif 000010
【図１】
2008011860.tif 000011
【図３】
2008011860.tif 000012