(57)【要約】【課題】低侵襲で生存率が高く維持しつつ、導入効率も高い遺伝子導入装置及び方法を提供すること。【解決手段】細胞６４へ遺伝子を導入する遺伝子導入装置１０は、細胞へ挿入されることによって当該細胞の細胞膜を穿孔する導入針４４と、該導入針４４が挿入される上記細胞の周囲に上記細胞に導入される遺伝子を分散させる溶液吐出ノズル４６と、を備える。【選択図】図１
2008136402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞へ挿入されることによって当該細胞の細胞膜を穿孔する穿孔手段と、
前記穿孔手段が挿入される前記細胞の周囲に前記細胞に導入される遺伝子を分散させる分散手段と、
を具備することを特徴とする遺伝子導入装置。
【請求項２】
前記分散手段は、前記遺伝子が導入される前記細胞が占める範囲よりも広い範囲に当該遺伝子を分散させることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子導入装置。
【請求項３】
前記分散手段は、前記穿孔手段が前記細胞に挿入されているときには当該細胞の周囲に前記遺伝子を分散させていることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子導入装置。
【請求項４】
前記穿孔手段と前記分散手段との位置関係を固定する固定手段をさらに具備することを特徴とする請求項１に記載の遺伝子導入装置。
【請求項５】
前記分散手段は、開口から前記遺伝子を含む液体を吐出する液体吐出ノズルであって、
前記固定手段は、前記液体吐出ノズルの前記開口から吐出される前記液体が前記穿孔手段の先端よりも鉛直方向上方から降り注ぐ位置に配置された状態で、前記位置関係を固定することを特徴とする請求項４に記載の遺伝子導入装置。
【請求項６】
遺伝子が導入される対象の細胞の周囲に当該遺伝子を分散させる工程と、
前記遺伝子が分散されているときに、前記細胞の細胞膜を穿孔する穿孔手段を当該細胞へ挿入する工程と、
を有することを特徴とする遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞へ遺伝子を導入する遺伝子導入装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、微細針先端に遺伝子等の導入物質を電気的に吸着させ、この微細針を細胞内に侵入させて、この微細針にパルス電圧を印加することにより、細胞内に導入物質を導入するマイクロインジェクション方法及び装置が開示されている。ここで、微細針の侵入は、微細針と同軸に伸縮する圧電素子を用いて微動することにより行うようになっている。
【特許文献１】ＷＯ０４／０９２３６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記特許文献１は、微細針先端部に遺伝子を保持する方式であり、細胞に対して低侵襲で遺伝子を導入することが可能で、高い生存率を得ることができる。
【０００４】
しかしながら、遺伝子を保持する表面積が微小であるため遺伝子の保持量が非常に少なく、有効な量の遺伝子を細胞内に導入することが難しい。このため、高い導入効率が得られにくいことが課題となっている。
【０００５】
また、微細針に保持する遺伝子の量は極微量であるが、微細針に保持する工程では多量の遺伝子が必要となっている。
【０００６】
本発明は、上記の点に鑑みてなされたもので、低侵襲で生存率を高く維持したまま、導入効率も高い遺伝子導入装置及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の遺伝子導入装置の一態様は、
細胞へ挿入されることによって当該細胞の細胞膜を穿孔する穿孔手段と、
上記穿孔手段が挿入される上記細胞の周囲に上記細胞に導入される遺伝子を分散させる分散手段と、
を具備することを特徴とする。
【０００８】
また、本発明の遺伝子導入方法の一態様は、
遺伝子が導入される対象の細胞の周囲に当該遺伝子を分散させる工程と、
上記遺伝子が分散されているときに、上記細胞の細胞膜を穿孔する穿孔手段を当該細胞へ挿入する工程と、
を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞の周囲に遺伝子を分散させながら、細胞の細胞膜を穿孔することで、低侵襲で、生存率が高く、導入効率も高い遺伝子導入装置及び方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための最良の形態を図面を参照して説明する。
【００１１】
本発明の一実施形態に係る遺伝子導入装置１０は、図１に示すように、細胞を観察するための倒立型顕微鏡１２に備えられる。
【００１２】
倒立型顕微鏡１２は、細胞を収容したワーク１４を載置するワークホルダ１６と、該ワークホルダ１６上の細胞を照明する照明装置１８と、細胞において反射あるいは透過した光、あるいは細胞から発生した蛍光を観察する観察装置２０と、上記ワークホルダ１６をＸ方向及びＹ方向に移動する顕微鏡ＸＹステージ２２と、該顕微鏡ＸＹステージ２２を駆動制御する顕微鏡ＸＹステージコントローラ２４と、上記照明装置１８及び観察装置２０を制御する顕微鏡コントローラ２６と、上記観察装置２０により得られた画像を処理する画像処理装置２８と、該画像処理装置２８により処理された画像を表示するモニタ３０を備え、上記遺伝子導入装置１０及び該倒立型顕微鏡１２の全体を制御する制御コンピュータ３２と、を備えている。
【００１３】
また、上記照明装置１８には、細胞に対して、上記観察装置２０とは反対側から照明光を照射する透過照明光源３４と、該透過照明光源３４から発せられた照明光を細胞に集光するコンデンサレンズ３６と、細胞に対して上記観察装置２０と同一方向から照明光を照射する落射照明光源３８とが備えられている。
【００１４】
一方、上記観察装置２０には、図示しない対物レンズを含む観察光学系と、該観察光学系を介した細胞からの光を撮像して画像を取得するＣＣＤカメラ４０と、細胞からの光を直接観察する接眼レンズ４２とが備えられている。
【００１５】
そして、本実施形態に係る遺伝子導入装置１０は、上記倒立型顕微鏡１２のワークホルダ１６近傍に配置され、細胞に対して挿入される導入針４４と、該導入針４４と一体的に保持され、導入する遺伝子を含む溶液を分散させる溶液吐出ノズル４６と、上記導入針４４及び溶液吐出ノズル４６を保持する導入針保持具４８と、該導入針保持具４８を移動させることで上記導入針４４及び溶液吐出ノズル４６を移動させる駆動ユニット５０と、該遺伝子導入装置１０を制御するコントロールボックス５２と、を備えている。ここで、駆動ユニット５０は、Ｘ，Ｙ，Ｚ方向に導入針４４及び溶液吐出ノズル４６を移動させる、例えば、３軸の直線移動機構を備えている。
【００１６】
上記導入針４４と溶液吐出ノズル４６は、図２に示すように、導入針保持具４８の駆動軸４８Ａに取り付けられた一体の保持具５４に保持され、一体に移動する。ここで、溶液吐出ノズル４６は、導入針４４の上側に取り付けられている。この溶液吐出ノズル４６は、その径が細胞１個の大きさよりも小さい例えばガラス管によって構成される。この溶液吐出ノズル４６は、上記保持具５４に着脱自在となっており、導入する遺伝子を含む溶液が充填されて上記保持具５４に取り付けられるようになっている。
【００１７】
この溶液吐出ノズル４６からの遺伝子を含む溶液の放出は、ポンプ５６により溶液吐出ノズル４６に空気圧を与えることにより行われる。
【００１８】
上記コントロールボックス５２は、駆動ユニット５０を制御する駆動ユニット制御回路５８と、ポンプ５６を制御する遺伝子放出駆動回路６０とを備えている。
【００１９】
このように構成された本一実施形態に係る遺伝子導入装置１０を用いた遺伝子導入方法について、図３を参照して以下に説明する。
【００２０】
本一実施形態に係る遺伝子導入装置１０を用いて、ワーク１４の基板６２上に播種された細胞６４に遺伝子を導入するには、まず、ワーク１４内の細胞の中から遺伝子導入を行う細胞６４を選定し、顕微鏡ＸＹステージコントローラ２４及び顕微鏡コントローラ２６を作動させ、顕微鏡ＸＹステージ２２の作動により選定した細胞６４を顕微鏡観察下に配置する。その後、駆動ユニット制御回路５８の作動により駆動ユニット５０を作動させ、導入針４４及び溶液吐出ノズル４６を細胞の上方から細胞に近接させる（ステップＳ１０）。
【００２１】
そして、遺伝子放出駆動回路６０によりポンプ５６を作動させて、溶液吐出ノズル４６から遺伝子溶液６６を細胞６４に向けて散布を開始する（ステップＳ１２）。この散布状態で、細胞６４上面より、導入針４４を更に降下させていき、導入針４４を細胞６４内に侵入させて、細胞膜６８及び核７０に穿孔する（ステップＳ１４）。このとき、細胞膜６８表面に形成された孔を通じて溶液中の遺伝子が細胞６４内に流入する。
【００２２】
その後、導入針４４及び溶液吐出ノズル４６を上昇させ（ステップＳ１６）、遺伝子溶液６６の散布を終了する（ステップＳ１８）。細胞膜６８は自己修復により回復し、細胞６４内に遺伝子が取り込まれた状態となる。
【００２３】
このようにして、従来と同様に低侵襲で生存率は高いまま、本実施形態では、更に、遺伝子を細胞６４内に確実且つ高い導入効率で導入することができる。
【００２４】
また、溶液吐出ノズル４６に保持する遺伝子溶液６６の量は極微量で良く、その溶液吐出ノズル４６に保持する工程でも多量の遺伝子溶液６６は必要とせずに充填できるので、遺伝子溶液６６の使用量を削減できる。
【００２５】
［実施例１］
図４（Ａ）は、ＨｅｌａＳ３細胞を蛍光色素溶液中に浸漬し、レーザ走査型顕微鏡で観察した例であり、細胞が接着している基板面より、２〜３μｍ上方の細胞の水平断面像となる。蛍光色素はスルホローダミンを用いている。レーザ走査型顕微鏡では、この蛍光像を観察するため、細胞周辺の溶液部が観察されている。
【００２６】
本実施例１では、この細胞に対して、導入針４４を細胞に侵入させながら色素溶液を溶液吐出ノズル４６から放出して色素溶液を細胞内に導入することを試みている。図４（Ｂ）は、この結果を示す図である。孔を空けた細胞には、細胞周辺の色素溶液が流入するため、細胞内の蛍光強度が大きくなり、細胞内に取り込まれたことが確認できる。
【００２７】
［実施例２］
実施例１と同様に、ＨｅｌａＳ３細胞への遺伝子の導入を試みた例を示す。導入した遺伝子は、ＧＦＰ蛍光タンパク質を発現する遺伝子であり、導入の正否は蛍光観察により確認することができる。
【００２８】
図５（Ａ）は、遺伝子導入直後の導入を試みた細胞の顕微鏡観察像を示す。観察画像中の複数の細胞を選定し導入を試みている。図５（Ｂ）及び（Ｃ）は、導入２４時間経過後に導入の成否を確認した顕微鏡観察像である。図５（Ｂ）は、位相差観察像であり、２４時間経過後の細胞の状態を示している。図５（Ｃ）は、この細胞を蛍光観察により観察したものであり、導入が成功した細胞では、遺伝子が発現し強い蛍光強度が得られている。この結果より、非常に効率良く、細胞に遺伝子が導入されていることが確認できる。
【００２９】
以上、一実施形態に基づいて本発明を説明したが、本発明は上述した一実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で種々の変形や応用が可能なことは勿論である。
【００３０】
例えば、溶液吐出ノズル４６から吐出して細胞内に導入する物質は、遺伝子に限らず、色素、量子ドットなどの蛍光試薬、イオン、ペプチド、タンパク質、多糖類、等、溶液中に混濁できるものであれば良い。
【００３１】
また、溶液吐出ノズル４６の位置は、導入針４４の上側に限定されるものではなく、溶液吐出ノズル４６の開口から吐出される溶液が導入針４４の先端よりも鉛直方向上方から降り注ぐ位置であれば、どのような配置であっても構わない。
【００３２】
また、上記一実施形態では、溶液吐出ノズル４６は空気圧によって遺伝子溶液６６を吐出するようにしているが、例えば特開２００１−２３５４００号公報や特開２００２−１１６２０５号公報に開示されているような圧電素子などを用いた吐出ヘッドなどを保持具５４に取り付け使用することも可能である。この場合、標的となる細胞に対して、より微量の溶液が指向的に吐出されるため、溶液の更なる使用量の削減が期待できる。
【００３３】
（付記）
前記の具体的実施形態から、以下のような構成の発明を抽出することができる。
【００３４】
（１）  細胞へ挿入されることによって当該細胞の細胞膜を穿孔する穿孔手段と、
上記穿孔手段が挿入される上記細胞の周囲に上記細胞に導入される遺伝子を分散させる分散手段と、
を具備することを特徴とする遺伝子導入装置。
【００３５】
（実施形態との対応）
一実施形態において、細胞６４が上記細胞に、細胞膜６８が上記細胞膜に、導入針４４が上記穿孔手段に、溶液吐出ノズル４６及びポンプ５６が上記分散手段に、それぞれ対応する。
【００３６】
（作用効果）
この（１）に記載の遺伝子導入装置によれば、導入される遺伝子が細胞に形成される孔に向かって放出されるため細胞外の遺伝子が細胞内に流入し易いので、遺伝子が効率良く細胞内に取り込まれ、高い導入効率が得られる。
【００３７】
（２）  上記分散手段は、上記遺伝子が導入される上記細胞が占める範囲よりも広い範囲に当該遺伝子を分散させることを特徴とする（１）に記載の遺伝子導入装置。
【００３８】
（作用効果）
この（２）に記載の遺伝子導入装置によれば、遺伝子の分散範囲は、標的となる細胞の範囲以上であれば良いので、遺伝子の使用量が微量である。
【００３９】
（３）  上記分散手段は、上記穿孔手段が上記細胞に挿入されているときには当該細胞の周囲に上記遺伝子を分散させていることを特徴とする（１）に記載の遺伝子導入装置。
【００４０】
（作用効果）
この（３）に記載の遺伝子導入装置によれば、穿孔手段の細胞への挿入のタイミングと連動して遺伝子の分散がなされるため、遺伝子の使用量が微量である。
【００４１】
（４）  上記穿孔手段と上記分散手段との位置関係を固定する固定手段をさらに具備することを特徴とする（１）に記載の遺伝子導入装置。
【００４２】
（実施形態との対応）
一実施形態において、保持具５４が上記固定手段に対応する。
【００４３】
（作用効果）
この（４）に記載の遺伝子導入装置によれば、細胞に対する分散位置のズレがなく、常に安定した状態で細胞に対して遺伝子が分散される。また、分散位置にあわせて導入針の位置を制御する必要がなく、操作が簡単である。
【００４４】
（５）  上記分散手段は、開口から上記遺伝子を含む液体を吐出する液体吐出ノズルであって、
上記固定手段は、上記液体吐出ノズルの上記開口から吐出される上記液体が上記穿孔手段の先端よりも鉛直方向上方から降り注ぐ位置に配置された状態で、上記位置関係を固定することを特徴とする（４）に記載の遺伝子導入装置。
【００４５】
（実施形態との対応）
一実施形態において、遺伝子溶液６６が上記遺伝子を含む液体に、溶液吐出ノズル４６が上記液体吐出ノズルに、それぞれ対応する。
【００４６】
（作用効果）
この（５）に記載の遺伝子導入装置によれば、液体吐出ノズルと穿孔手段との位置関係が固定されているため、細胞に対する遺伝子を含む液体の吐出位置のズレがなく、常に安定した状態で細胞に対して遺伝子を含む液体が吐出される。
【００４７】
（６）  遺伝子が導入される対象の細胞の周囲に当該遺伝子を分散させる工程と、
上記遺伝子が分散されているときに、上記細胞の細胞膜を穿孔する穿孔手段を当該細胞へ挿入する工程と、
を有することを特徴とする遺伝子導入方法。
【００４８】
（実施形態との対応）
一実施形態において、ステップＳ１２が上記遺伝子を分散させる工程に、ステップＳ１４が上記穿孔手段を細胞へ挿入する工程に、それぞれ対応する。
【００４９】
（作用効果）
この（６）に記載の遺伝子導入方法によれば、導入される遺伝子が細胞に形成される孔に向かって放出されるため細胞外の遺伝子が細胞内に流入し易いので、遺伝子が効率良く細胞内に取り込まれ、高い導入効率が得られる。
【００５０】
（７）  細胞へ挿入されることによって当該細胞の細胞膜を穿孔する穿孔手段と、
上記穿孔手段が挿入される上記細胞の周囲に上記細胞に導入される導入物質を分散させる分散手段と、
を具備することを特徴とする導入装置。
【００５１】
（実施形態との対応）
一実施形態において、細胞６４が上記細胞に、細胞膜６８が上記細胞膜に、導入針４４が上記穿孔手段に、溶液吐出ノズル４６及びポンプ５６が上記分散手段に、それぞれ対応する。
【００５２】
（作用効果）
この（７）に記載の導入装置によれば、導入される物質が細胞に形成される孔に向かって放出されるため細胞外の導入物質が細胞内に流入し易いので、導入物質が効率良く細胞内に取り込まれ、高い導入効率が得られる。
【００５３】
（８）  上記導入物質は、遺伝子、色素、蛍光試薬、イオン、ペプチド、タンパク質、多糖類の何れかであることを特徴とする（７）に記載の導入装置。
【００５４】
（作用効果）
この（８）に記載の導入装置によれば、遺伝子を始め、色素、量子ドットなどの蛍光試薬、イオン、ペプチド、タンパク質、多糖類、等、溶液中に混濁できる物質を導入できる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る遺伝子導入装置を示す全体構成図である。
【図２】図２は、導入針と溶液吐出ノズルの構造を示す拡大図である。
【図３】図３は、本発明の一実施形態に係る遺伝子導入方法を説明するための工程流れ図である。
【図４】図４（Ａ）は、ＨｅｌａＳ３細胞を蛍光色素溶液中に浸漬し、レーザ走査型顕微鏡で観察した顕微鏡画像を示す図であり、図４（Ｂ）は、一実施形態に係る遺伝子導入装置及び方法によって色素溶液を細胞内に導入した結果の顕微鏡画像を示す図である。
【図５】図５（Ａ）は、一実施形態に係る遺伝子導入装置及び方法によってＨｅｌａＳ３細胞にＧＦＰ蛍光タンパク質を発現する遺伝子を導入した直後の顕微鏡画像を示す図であり、図５（Ｂ）及び（Ｃ）はそれぞれ２４時間経過後の位相差観察顕微鏡画像及び蛍光観察による顕微鏡画像を示す図である。
【符号の説明】
【００５６】
１０…遺伝子導入装置、  １２…倒立型顕微鏡、  １４…ワーク、  １６…ワークホルダ、  １８…照明装置、  ２０…観察装置、  ２２…顕微鏡ＸＹステージ、  ２４…顕微鏡ＸＹステージコントローラ、  ２６…顕微鏡コントローラ、  ２８…画像処理装置、  ３０…モニタ、  ３２…制御コンピュータ、  ３４…透過照明光源、  ３６…コンデンサレンズ、  ３８…落射照明光源、  ４０…ＣＣＤカメラ、  ４２…接眼レンズ、  ４４…導入針、  ４６…溶液吐出ノズル、  ４８…導入針保持具、  ４８Ａ…駆動軸、  ５０…駆動ユニット、  ５２…コントロールボックス、  ５４…保持具、  ５６…ポンプ、  ５８……駆動ユニット制御回路、  ６０…遺伝子放出駆動回路、  ６２…基板、  ６４…細胞、  ６６…遺伝子溶液、  ６８…細胞膜、  ７０…核。
【図１】
2008136402.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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