(57)【要約】【課題】試料中の糖及び／又は糖アルコールをベンゾイル化し、固相抽出により夾雑物を除いて、逆相高速液体クロマトグラフィーで分離分析する、糖及び／又は糖アルコールの一斉分析方法の提供。【解決手段】試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法であって、糖及び／又は糖アルコールを含む試料をベンゾイル化し、液液抽出（減圧乾固）を用いることなく固相抽出法により糖及び糖アルコール以外の夾雑物を除き、試料中の糖及び／又は糖アルコールを逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離し、紫外線吸収を測定し分析することを含む、試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法であって、糖及び／又は糖アルコールを含む試料をベンゾイル化し、減圧乾固処理することなく固相抽出法により糖及び糖アルコール以外の夾雑物を除き、試料中の糖及び／又は糖アルコールを逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離し、紫外線吸収を測定し分析することを含む、試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
【請求項２】
試料をベンゾイル化する前に、除タンパク処理を行なう、請求項１記載の試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
【請求項３】
試料中の糖及び／又は糖アルコールがリボース、マンノース、グルコース、フルクトース、ミオイノシトール、マンニトール及びソルビトールからなる群から選択される１以上の糖又は糖アルコールである請求項１又は２に記載の試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
【請求項４】
試料が生体試料である請求項１〜３のいずれか１項に記載の試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
【請求項５】
固相抽出が逆相クロマトグラフィー用固定相、又はイオン交換クロマトグラフィー用固定相を用いて行なわれる請求項１〜４のいずれか１項に記載の試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
【請求項６】
固相抽出がオクタデシルシリル基又はオチクル基を有する固定相を用いて行なわれ、糖及び／又は糖アルコールの溶出がアセトニトリルを用いて行なわれる請求項５記載の試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
【請求項７】
逆相高速液体クロマトグラフィーが、オクタデシルシリル基又はオチクル基を有する充填剤を含むカラムを用いて行なわれ、糖及び／又は糖アルコールの溶出がアセトニトリルを用いて行なわれる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
【請求項８】
逆相高速液体クロマトグラフィーが、粒径３μｍのオクタデシルシリル基を有する充填剤を含むカラムを用いて行なわれる請求項７記載の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
【請求項９】
逆相高速液体クロマトグラフィーがアイソクラッティック溶出により行なわれる請求項１〜８のいずれか１項に記載の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法において、逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離したベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールの有機溶媒を固相抽出法を用いて100％の濃度の前記の有機溶媒に交換し、有機溶媒を蒸発させることにより試料中のベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールを高い回収率で濃縮する方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法により濃縮した糖及び／又は糖アルコールをNMRで分析することを含む、試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
【請求項１２】
請求項１〜９及び１１のいずれか１項に記載の方法において、糖及び／又は糖アルコールの代わりに試料中のOH基を有する化合物をベンゾイル化する、試料中のOH基を有する化合物を分析する方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法において、糖及び／又は糖アルコールの代わりに試料中のOH基を有する化合物をベンゾイル化する、試料中のOH基を有する化合物を濃縮する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学分野、医療分野における糖及び糖アルコールの分析方法に関し、特に、生体試料や食品中に微量に存在する糖及び糖アルコールを分析するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、メタボリック症候群の概念の一般化に伴い、糖尿病への関心が高まるとともに、生体内に存在する糖の代謝に関する研究が脚光を浴びている。生体内に存在する糖は、極めて微量（ppmオーダー）であり、そのレベルで定性、定量する技術は一般化していない。
【０００３】
糖や糖アルコールはUV吸収を持たないため、通常のUV検出器が備わっているHPLCシステムでは検出できない。よって、微量の糖、糖アルコールをHPLCで定量する場合、さらなる工夫が必要となる。現在のHPLCによる糖、糖アルコールの微量分析は、強アルカリ下で糖、糖アルコールをイオン化させ、イオン交換カラムを用いたHPLCで分離し、電気化学検出器などで検出する方法（非特許文献１を参照）、並びに糖、糖アルコールを逆相または順相カラムで分離した後、蛍光物質を反応させ、蛍光検出器で検出する方法(非特許文献２を参照)が一般的である。
【０００４】
しかし、これらの方法を行うには、特殊な機器を揃える必要がある。また、強アルカリ下で分析を行なうため、危険を伴う。
【０００５】
一方、糖及び糖アルコールをベンゾイル化させると、UV吸収を持つようになるので、通常のUV検出器で検出が可能である。この原理をHPLCに応用し、糖、糖アルコールの分析が可能である。（非特許文献３〜８を参照）。この方法による糖および糖アルコールの検出は通常のHPLCを用いて行なうことができるので利便性に優れている。
【０００６】
【非特許文献１】Watanabe N et al. J Chromatogr 330; 333-338, 1985
【非特許文献２】Yuh YS et al. J Pharm Biomed Anal 16; 1059-1066, 1998
【非特許文献３】Oehlke J et al. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 655; 105-111,1994
【非特許文献４】Jentofft N et al. Anal Biochem 148; 424-433, 1985
【非特許文献５】Dethy JM et al. Anal Biochem 143; 119-124, 1984
【非特許文献６】Daniel PF et al. Carbohydr Res 97; 161-180, 1981
【非特許文献７】Nojiri S et al. J AOAC Int 82; 134-140, 1999
【非特許文献８】Kwang-Hyok S et al. Clinica Chimica Acta 354; 41-47, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、非特許文献８に従い、糖、糖アルコールの分析を試みたが、試料中にppmオーダーで存在する微量な糖や糖アルコールを正確に分析することは極めて難しかった。さらに、非特許文献３〜８に記載されているような、ベンゾイル化に基づく方法では、ベンゾイル化させた糖を回収する際に酢酸エチル等の有機溶剤を用いる必要がある。この場合、有機溶剤及び生体試料中の有機物のHPLCサンプル中への混入をもたらし、それが、ベースラインの不安定性、カラムの汚染などを引き起こす原因となることを見出した。特に、ベースラインの不安定性は微量物質の定量には致命的であり、それが、本法が一般的にならない原因であると考えた。
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、利便性に優れるという特長を有するベンゾイル化に基づく糖微量分析法の問題点を改良し、生体内にppmオーダーで存在する糖及び糖アルコールをも分析することが可能で、かつ、利便性にすぐれた分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、糖成分を含む試料をベンゾイル化した後に、固相抽出カートリッジを用いることで(固相抽出を行うことで)、有機溶剤を用いることなく、夾雑物の混入が少ないHPLC試料の調製を可能にした。さらに夾雑物の混入が減じられたことで、充填剤の粒子径が３μmで高理論段数（50000段／本以上）を有する高い分離能を持つカラムをHPLC分析に用いることが可能となり、それにより、極めて高感度、すなわち試料中に存在する微量な糖成分を正確に分析することができるという新しい知見を得た。この２点の改良により、通常のHPLC機器で行える、安定した糖の微量分析が可能になった。
【００１０】
すなわち、本発明の方法は以下のとおりである。
[１]  試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法であって、糖及び／又は糖アルコールを含む試料をベンゾイル化し、有機溶剤を用いることなく固相抽出法により糖及び糖アルコール以外の夾雑物を除き、試料中の糖及び／又は糖アルコールを逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離し、紫外線吸収を測定し分析することを含む、試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
[２]  試料をベンゾイル化する前に、除タンパク処理を行なう、[１]の試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
【００１１】
[３]  試料中の糖及び／又は糖アルコールがリボース、マンノース、グルコース、フルクトース、ミオイノシトール、マンニトール及びソルビトールからなる群から選択される１以上の糖又は糖アルコールである[１]又は[２]の試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
[４]  試料が生体試料である[１]〜[３]のいずれかの試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
【００１２】
[５]  固相抽出が逆相クロマトグラフィー用固定相、又はイオン交換クロマトグラフィー用固定相を用いて行なわれる[１]〜[４]のいずれかの試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
[６]  固相抽出がオクタデシルシリル基又はオチクル基を有する固定相を用いて行なわれ、糖及び／又は糖アルコールの溶出がアセトニトリルを用いて行なわれる[５]の試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
【００１３】
[７]  逆相高速液体クロマトグラフィーが、オクタデシルシリル基又はオチクル基を有する充填剤を含むカラムを用いて行なわれ、糖及び／又は糖アルコールの溶出がアセトニトリルを用いて行なわれる、[１]〜[６]のいずれかの糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
[８]  逆相高速液体クロマトグラフィーが、粒径３μｍのオクタデシルシリル基を有する充填剤を含むカラムを用いて行なわれる[７]の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
[９]  逆相高速液体クロマトグラフィーがアイソクラッティック溶出により行なわれる[１]〜[８]のいずれかの糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
【００１４】
[１０]  [１]〜[９]のいずれかの糖及び／又は糖アルコールを分析する方法において、逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離したベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールの有機溶媒を固相抽出法を用いて100％の濃度の前記の有機溶媒に交換し、有機溶媒を蒸発させることにより試料中のベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールを高い回収率で濃縮する方法。
【００１５】
[１１]  [１０]の方法により濃縮した糖及び／又は糖アルコールをNMRで分析することを含む、試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
[１２]  [１]〜[９]及び[１１]のいずれかの方法において、糖及び／又は糖アルコールの代わりに試料中のOH基を有する化合物をベンゾイル化する、試料中のOH基を有する化合物を分析する方法。
[１３]  [１１]の方法において、糖及び／又は糖アルコールの代わりに試料中のOH基を有する化合物をベンゾイル化する、試料中のOH基を有する化合物を濃縮する方法。
【００１６】
[１４]  試料中の糖及び／又は糖アルコールを濃縮する方法であって、糖及び／又は糖アルコールを含む試料をベンゾイル化し、減圧乾固処理することなく有機溶媒を用いた固相抽出法により糖及び糖アルコール以外の夾雑物を除く工程、試料中の糖及び／又は糖アルコールを逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離する工程、分離した糖及び／又は糖アルコールの溶媒を固相抽出法を用いて100％の有機溶媒に交換し、有機溶媒を蒸発させることにより試料中のベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールを高い回収率で濃縮する方法。
[１５]  [１４]の方法により濃縮した糖及び／又は糖アルコールをNMRで分析することを含む、試料中の糖及び／又は糖アルコールを分析する方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法によれば、安定したHPLCのベースラインが得られ、試料中に微量に存在する糖及び糖アルコールを高感度に分析することができる。
【００１８】
本発明の方法によれば、生体試料等の各種試料中のリボース、マンノース、グルコース、フルクトース、ミオイノシトールなどの糖、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコールを従来のグラディエント法によらず、アイソクラティック法で迅速に分析ができる。
【００１９】
本発明の方法により、上記の糖及び糖アルコールを一度の分析で一斉分析することが可能である。特に、生体試料中のグルコース、マンノース、フルクトース、ミオイノシトール、ソルビトール等を一度に分析することができる。例えば、赤血球中の糖及び糖アルコールを一度に分析することができる。
【００２０】
本発明の方法により、測定対象の試料を従来の方法よりも簡便に調製できる。
また、通常用いられるUV検出器を備えたHPLC装置があれば分析可能であるため、利便性良く分析を行うことができる。
【００２１】
さらに、本発明の方法はランニングコストが廉価である。
本法により、生体に含まれる微量の糖を効率よく回収、濃縮し、NMRなどの構造解析を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の分析方法は、試料中に微量に含まれる糖及び／又は糖アルコールを高感度で分析することが可能であることを特徴とする。
【００２３】
本発明において、分析試料は限定されないが、生体試料、食品、食品素材、飲料、サプリメントなどの食品添加物、医薬品、医薬部外品等を含む。生体試料としては、全血液、血清、血漿、血液中の赤血球や、諸組織検体が挙げられる。また、食品としては、食品抽出物、醸造食品、発酵食品等が挙げられる。
【００２４】
本発明の方法で分析することができる糖及び糖アルコールに関しても特に制限はないが、具体的には、糖としてグルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、リブロース等の単糖や、マルトース、ラクトース、スクロース等の２糖、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖等のオリゴ糖等の多糖を挙げることができる。ただし、二糖類以上は、水系でベンゾイル化を受けると不溶性となるため、単糖とは異なる分析条件の設定が必要である。当業者ならば、二糖類以上の糖の分析条件を適宜決定することができる。また、デオキシリボース、フコースなどのアミノ糖も含まれる。また、糖アルコールとしては、ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、マルチトール、ラクチトール、イノシトール、ミオイノシトール等があげられる。特に、糖としてリボース、マンノース、グルコース、及びフルクトース、糖アルコールとしてミオイノシトール、マンニトール及びソルビトールが含まれている試料の分析に好ましく使用することができ、これら７種に関しては、一斉分析が可能である。
【００２５】
本発明の方法においては、分析しようとする糖及び糖アルコールを分析の前にベンゾイル化する。ベンゾイル化とは糖及び糖アルコールの主に水酸基にベンゾイル基（C6H5CO-)を導入することをいう。ベンゾイル化は公知の方法で行なうことができ、例えば、ベンゾクロライドやニトロベンゾクロライドを用いて行なうことができる。
【００２６】
ベンゾイル化により糖をHPLC  UV検出する方法において、試料としてタンパク質が多く含まれる生体試料等の試料を用いる場合、タンパク質もベンゾイル化されてしまう。このため、ベンゾイル化タンパク質の混入が糖及び糖アルコールの分析に影響を及ぼすため、あらかじめ試料からタンパク質を除く必要がある。
【００２７】
除タンパクは公知の種々の方法により行なうことができるが、例えばタンパク質の変性等による除タンパクがある。該方法は、過塩素酸、トリクロロ酢酸、メタリン酸等の酸を試料に添加し、又はアセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール糖の有機溶媒を試料に添加し、タンパク質を変性させ、変性したタンパク質をフィルター処理又は遠心分離により除くことにより達成することができる。その他、限外ろ過、ゲルろ過、透析、超遠心等により物理的に除タンパクしてもよい。
【００２８】
本発明のもうひとつの特徴は、上記のように必要に応じて除タンパク処理を行ない、ベンゾイル化した試料中に含まれる糖及び／又は糖アルコール以外の夾雑物を固相抽出により除去することである。ここで固相抽出とは、化学結合型シリカゲル、ポーラスポリマー、アルミナ、活性炭等の固定相（固相、吸着剤）を用いながら複雑な組成を有する試料中から特定の目的成分のみを選択的に抽出し、分離・精製を行っていく手法のことをいい、これにより試料中の夾雑物を除去することができる。従来の糖をベンゾイル化して分析する手法においては、減圧乾固等の前処理を必要としていたが、本発明の方法においては、減圧乾固処理は不要であり、固相抽出すれば足りる。固相抽出により、ベンゾイル化された糖及び糖アルコールの電荷や疎水性を利用して糖及び糖アルコールを選択的に抽出する。固相抽出には、逆相分配クロマトグラフィー用固定相、イオン交換クロマトグラフィー用固定相等を広く用いることができる。逆相クロマトグラフィー用固定相として、オクダデシルシリル基（C18）、オクチル基（C8）、ブチル基（C4）、トリメチル基（C3)、フェニル基（Ph)、ブチル基、トリアコンチル基（C30）等の基を有する充填剤を用いることができ、この中でもオクタデシルシリル基（C18）またはオクチル基（C8）を有する充填剤が好ましい。また、糖及び糖アルコールを溶出させる際に用いる溶媒としては、低波長UVの吸収がないものであれば特に制限はない。このようなものとして、アセトニトリル、メタノール、テトラヒドロフランが挙げられるが、UV吸収がないという点でアセトニトリルが好ましい。また、これらの抽出液を混合して用いてもよい。溶出溶媒としてアセトニトリルが選択された場合は、固定相としてオクタデシルシリル基を使用した場合に比べ、オクチル基を使用した方が固定相からベンゾイル化した糖を溶出させるためのアセトアニリルの量が減る。従って、サンプルの濃度が高まり、分析感度が向上する。よって、固定相としてはオクチル基を有する充填剤を用いることがより好ましい。固相抽出に使用するカートリッジは、市販品である、シリンジ型固相カートリッジや、ディスク型固相カートリッジを使用することができる。市販のカートリッジタイプのものとして、Sep-Pak（登録商標、Waters社）、Autoprep（登録商標、昭和電工社）、Discovery DSC-18（SUPELCO社）、Discovery DSC-8(SUPELCO社）等が挙げられる。
【００２９】
イオン交換クロマトグラフィー用固定相を用いる場合、陰イオン交換基としては、ジエチルアミノエチル(DEAE)基や、それより塩基性の強い第四級アミノエチル(QAE)基等を、陽イオン交換基としては、カルボキシメチル(CM)基や、それより酸性度の強いスルホプロピル(SP)基、リン酸基等を選択すればよい。
【００３０】
また、一般的に入手可能な固相抽出カートリッジなどにおいては、固相抽出用固定相はドライパッキングされているため、コンディショニング（洗浄）した後、ベンゾイル化した試料を添加する必要がある。固相抽出用固定相のコンディショニング（洗浄）は、まず100％アセトニトリルで数回洗浄した後、水に置換して行なうことができる。次いで、ベンゾイル化した試料を固定相に添加する。添加する試料の量は用いる固定相のサイズや用いる試料の種類により適宜選択することができるが、例えば血液試料の場合、ベンゾイル化した試料を100〜1000μL市販の固定抽出用カートリッジに添加すればよい。試料を添加したのち、水及び上記抽出用液で洗浄する。例えば、水で洗浄した後、40〜80％アセトニトリル、好ましくは60％に希釈したアセトニトリルで洗浄し、次いで80〜100％、好ましくは100％のアセトニトリルで洗浄し、その後さらに100％のアセトニトリルで抽出した溶出液を採取したものを、サンプルとする。固相抽出は室温で行うことができるが、25℃±2℃で行うことが好ましい。
【００３１】
本発明では、固相抽出により溶出されたサンプルを、次いでHPLCにより分析する。HPLCは逆相又は順相クロマトグラフィーにより行う。カラムとしてはシリカゲル、アルミナやスチレン-ジビニルベンゼン共重合体、ポリメタクリレート等のポリマーゲルを担体とし、オクタデシルシリル基（C18）を有するカラムが好ましいが、オクチル基（C8）、ブチル基（C4）、トリメチル基（C3)アミノプロピル基（NH2）等の基を有するカラムを用いることもできる。この中でもシリカゲルを担体とし、オクタデシル基を有するODSカラム(C18カラム）がより高精度の分析ができるという点で好ましい。C18カラムを用いた場合、それぞれの糖のピークの分離がよくなり、分析における信頼区間が上限、下限とも広がる。また、他のカラムでは分離不可能なフルクトースとミオイノシトール、マンニトールとソルビトールをアイソクラティック法で分離することができる。HPLCは市販の装置を用い、カラムも市販のものを用いればよい。カラムに充填する担体は、球形、破砕形を用いることができ、その粒子径は３〜10μmであり、高精度分析という観点から高理論段数を有することが要求され、球形で５μm以下が好ましく、さらに３μmが好ましい。なお、従来の減圧乾固処理を行なう方法では、粒子径３μmのカラムを用いた場合は、試料中の夾雑物による目詰まりを起こし、測定に影響を与える圧力の上昇をきたす。それに対して、本発明の方法では、試料調製に固相抽出の工程があるため、目詰まりの原因となる夾雑物のカラムへの流入を最小限にできる。従って、ガードカラムを用いることなく３μ径の粒子が充填されたカラムを長期間使用することが可能である。用いるカラムのサイズはサンプルとしてアプライする試料の容積にもよるが、例えば内径４〜６mm、長さ2.5〜30cmのものを用いればよい。好ましくは、内径4.6mm、長さ25cmのものを使用する。
【００３２】
HPLC分析の際の移動相は、UV吸収のないもの又は少ないものを用いる。このようなものとして、アセトニトリル、メタノール、テトラヒドロフラン等が挙げられるが、UV吸収がないという点でアセトニトリルが好ましい。また、これらの抽出液を混合して用いてもよい。アセトニトリル等の移動相の濃度は、60〜80％、好ましくは70〜80％、さらに好ましくは77.5〜78％である。溶出は移動相の組成及び濃度を徐々に変化させるグラディエント溶出により行なってもよいが、迅速に分析できるという点で移動相の組成及び濃度を変化させないアイソクラティック法が好ましい。分析をする際の移動相の流速は、0.1mL/分〜５mL/分、好ましくは0.5mL/分〜２mL/分である。
【００３３】
本発明の方法により、ベンゾイル化し、固相抽出により夾雑物を除去した試料を10〜60分で分析することができる。
【００３４】
HPLC分析の際の試料の注入量は、試料の種類や用いるカラムにより適宜決定することができるが、数十μL〜数百μL、例えば、10μL〜200μL、好ましくは10μL〜100μLである。
【００３５】
分離したベンゾイル化した糖及び糖アルコールはUV検出器を用いて紫外線吸収を測定すればよい。測定波長は、ベンゾイル化した糖及び糖アルコールの吸収極大付近の波長が好ましく、200〜250nm、好ましくは220〜240nm、さらに好ましくは228nmである。
【００３６】
分離した糖及び糖アルコールを分取し、分取した糖及び糖アルコールを医薬や種々の化合物の合成の材料として利用することができる。また、分離した糖及び糖アルコールを分取し、以下の方法で濃縮し、分析することができる。
【００３７】
HPLCを用いて分取したベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールは、60〜80％、好ましくは70〜80％、さらに好ましくは77.5〜78％のアセトニトリル等の移動相として用いた有機溶媒中に存在する。このように60〜80％の有機溶媒中のベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールを濃縮しようとする場合、60〜80％の有機溶媒から濃縮すると、濃縮が進むにつれて、ベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールが容器の壁に吸着を起こし、その回収率が悪くなる。これは、濃縮工程において、有機溶媒が先に蒸発し、有機溶媒濃度が薄くなってしまうために起こると予測される。しかしながら、NMRなどを用いた糖及び／又は糖アルコールの構造解析行う際には、高濃度の糖分画を調製する必要がある。また、生体試料中に微量にしか含まれていない糖及び／又は糖アルコールを解析する際にも、糖及び／又は糖アルコールを濃縮して高濃度分画を調製する必要がある。
【００３８】
そこで、HPLCにより分取した、ベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールを含む60〜80％中の有機溶媒を95％以上、好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上、特に好ましくは100％の有機溶媒に交換する。有機溶媒の交換は、試料を再度固相抽出処理することにより行うことができる。この場合、分取したベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールを含む60〜80％有機溶媒を希釈し、最終濃度を55〜65％、好ましくは60％に調製し、該調製液を固相抽出用担体と接触させ、固相抽出用担体に結合させ、次いで100％の有機溶媒を添加し、固相抽出用担体に結合したベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールを担体から分離し、回収する。その後、有機溶媒を蒸発させることによりベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールを濃縮する。この際、用いる固相抽出用担体は、上記の通りであるが、シリカゲルを担体とし、オクチル基を有するカラム（C8カラム）又はオクタデシル基を有するODSカラム(C18カラム）が好ましく、特にC8カラムが好ましい。固相抽出用担体としては、市販のカートリッジタイプのものを用いることができ、例えばDiscovery DSC-18（SUPELCO社）、Discovery DSC-8(SUPELCO社）等が挙げられる。
【００３９】
このように、HPLCにより分取したベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールを含む有機溶媒の濃度を一旦低くすることにより、ベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールは容器の壁への吸着が顕著に起こることなく、固相抽出用担体に結合する。固相抽出担体に結合したベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールを100％の有機溶媒で溶出することにより、ベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールの有機溶媒を100％の有機溶媒に交換することが可能である。100％の有機溶媒に交換した後に、ベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールを濃縮しても容器の壁への吸着はほとんど起こらないため、ベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールの構造を保ったまま、容器の壁への吸着を最小限に抑え高い回収率で濃縮することが可能になる。例えば、100％の有機溶媒を用いた場合、ほぼ100％の回収率で回収することができる。その結果、本発明の一連の工程により、生体試料から糖及び／又は糖アルコールを分取し、NMRなどを用いた構造解析を行うことが可能になる。また、生体に微量に存在する糖及び／又は糖アルコールを大量の検体から精製、濃縮することが可能になる。本発明は、試料より糖及び／又は糖アルコールを単離し、回収する方法も包含する。
【００４０】
なお、ここで100％の有機溶媒とは、試薬メーカーから供給される高純度の有機溶媒をいい、実際には純度が99％程度のものも含まれる。
【００４１】
このようにして、濃縮したベンゾイル化した糖及び／又は糖アルコールを核磁気共鳴（NMR)法や質量分析法により分析することが可能である。また、濃縮し得られた糖及び糖アルコールを分取し、分取した糖及び／又は糖アルコールを医薬や種々の化合物の合成の材料として利用することができる。
【００４２】
本発明の糖及び／又は糖アルコールをベンゾイル化し、減圧乾固処理することなく固相抽出法により糖及び糖アルコール以外の夾雑物を除き、試料中の糖及び／又は糖アルコールをHPLCにより分離する方法、及びHPLCで分離した後に濃縮する方法は、OH基を有する他の化合物についても利用することができる。OH基を有する他の化合物としては、種々のアルコール、アミノ酸、脂肪酸等が挙げられる。この場合、対象となる化合物の特性に応じて適宜条件を変更すればよい。
【実施例】
【００４３】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４４】
実施例１  正常人赤血球中の糖及び糖アルコールの分析
正常人赤血球中の糖及び糖アルコールの分析を行なった。
【００４５】
試料の調製
ヘパリン又はEDTA-2Na入り採血管に2mLの血液を採血し、混和後直ちに氷冷した。このとき、ヘマトクリット値及び赤血球数を測定しておいた。よく混和した全血１mLを正確に遠沈管（15mL）にとり、４℃、3000rpm 10分間  遠心分離した後、血漿は捨てた。４℃の生理食塩水で３回洗浄した。１回目及び２回目の洗浄は４℃で、1500rpm ５分間遠心分離することにより行なった。３回目の洗浄は、2000rpmで行い上清の生理食塩水をきれいに捨てた。
【００４６】
試料の除タンパク
除タンパクは以下のように過塩素酸を用いて行なった。
洗浄後の赤血球に、１N 過塩素酸を１mL加えて、直ちにボルテックスミキサーを用いてよく混和し、15分間静置した。次いで、４℃、3000rpmで10分間遠心分離を行い、上清0.8mLを別の遠沈管に採取した。採取した上清を1.25mol/LのK2CO3380μLで中和した。さらに４℃、3000rpmで５分間遠心分離を行い、上清を別の2.0mLエッペンドルフチューブに移し、-80℃で保存した。
また、検量線用の標準溶液及びBlank用の水も、上記の除タンパク操作を赤血球と同様に行った。
【００４７】
試料のベンゾイル化
除タンパクした試料のベンゾイル化は以下の方法により行なった。
除タンパク後の検量線用標準溶液及び試料の各200μLを蓋付きのポリプロピレン製チューブにとった。これに１mol/L KH2PO4 60μLを加えて、ボルテックスミキサーにより軽く混和した。さらに、ベンゾイルクロライド10μLを加えて、蓋をして良く混和した。次いで、８mol/L水酸化ナトリウムを45μL加えて蓋をし、ボルテックスミキサーを用いて50秒間混和した。混和後、添加後から10分間経過するまで静置した。正確に10分経過後、16mL/100mLのリン酸水溶液45μLを加えてボルテックスミキサーを用いてよく混和した。
【００４８】
固相抽出用カートリッジのコンディショニング
Discovery DSC-8（SUPELCO社）に、テフロン製ディスポーザブルバルブライナーを装着した。抽出は自然落下で行い、落下がなくなったことを確認して次の操作に進んだ。100％アセトニトリル１mLでカートリッジを３回洗浄した。１回目の洗浄は、充填剤のチャネリングを防ぐため、真空ポンプで減圧し、充填剤の中の気泡を出させた。その後、水で２回以上洗浄した。
【００４９】
固相抽出
コンディショニングの終わった固相抽出用カートリッジにベンゾイル化の完了した試料を添加した。試料を添加した後、水１mLで２回洗浄した。次いで、60％アセトニトリル0.8mLで１回洗浄し、さらに100％アセトニトリル0.3mLで１回洗浄した。次に100％アセトニトリル0.5mLを添加し、このときに溶出したものを採取し、HPLCで測定した。
【００５０】
HPLCによる分析
用いたHPLC装置の構成は以下のとおりであった。
HPLC    Shimadzu社製  System Controller：  SCL-10AVP
UV Detector：  SPD-10AVP
Pump：  LC-10ADVP
Auto Sampler：SIL-10ADVP
Integrator：  C-R8A
GL Science 社製  カラムオーブン；CO 631C
【００５１】
また、HPLCカラムは、Cadenza(5) CD-C18（C8カラム、粒子径３μm  4.6Φ×250mm、Imtakt社製）又はInertsil ODS3(C8カラム、粒子径５μm、4.6Φ×250mm GLサイエンス社製）を用いた。
【００５２】
固相抽出した試料の50μlを注入し、移動相としては、77％アセトニトリルを用いた。HPLC分析時の流速は、１mL/分であった。カラムオーブンは25℃に設定した。検出は228nmのUV吸収を測定することにより行なった。１つの試料の分析に要した時間は40分であった。
【００５３】
HPLC分析で定量限界及び定量の直線性を求めるための標準溶液には、リボース、マンノース、グルコース、myo-イノシトール、マンニトール及びソルビトールの標準品をそれぞれを水に溶かして、0.01、0.025、0.05、0.10、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0及び10.0μg/mLとして調製した。フルクトースは２倍量で調製した。検量線用標準溶液は、0.5、1.0、2.5、5.0及び10.0μg/mLの標準溶液（フルクトースは２倍量）を測定試料と同様に除タンパク処理を行ったものを用いた。最終濃度は、0.097、0.194、0.485、0.970及び1.940μg/mLであった（フルクトースは２倍量）。
【００５４】
なお、比較例として従来法で調製した試料も測定した。すなわち、ベンゾイル化し減圧乾固した試料を用いて測定した。また、従来法ではグラディエント法で溶出した。以下、糖及び／又は糖アルコールを含む試料をベンゾイル化し、減圧乾固処理を行い、HPLCを用いてグラディエント法で溶出する方法を従来のベンゾイル化法という。
【００５５】
ベンゾイル化は、固相抽出で行った方法と同様であり、Kwang-Hyok S et al. Clinica Chimica Acta 354; 41-47, 2005を参考にし、いくつかの検討を加えて測定感度が高くなる条件を見出した後、減圧乾固に適用した。
【００５６】
減圧乾固は、Kwang-Hyok S et al. Clinica Chimica Acta 354; 41-47, 2005を参考にし、いくつかの検討を加えて測定感度が高くなる条件を見出した。すなわちベンゾイル化した試料に、酢酸エチル150μLを加えてボルテックスによりよく混和した後、酢酸エチル層100μLを別のポリプロピレン製チューブに採取し、真空ポンプで１時間以上吸引して乾固させた。次に、100％アセトニトリル100μLで再溶解したものを試料とした。
【００５７】
グラジェント条件は、Kwang-Hyok S et al. Clinica Chimica Acta 354; 41-47, 2005を参考に、検討、改良して決定した。Kwang-Hyok S et al. Clinica Chimica Acta 354; 41-47, 2005に記載されている分析カラムと発明者らが使用した分析カラムはどちらも標準的なODSカラムで、同程度の分解能を持ち合わせると考えられるが、同一のものでないため、最適条件を決定する必要があった。その条件は以下のとおりであった。
【００５８】
０分から３分まで、82％アセトニトリル、次の３分から36分までは、78.5％アセトニトリル、36分から終了まで82％アセトニトリルのステップグラディエントで、流速は１mL/minで行った。１検体の分析時間は、70分とした。
【００５９】
図１に、各糖を0.5μg/mL含む標準溶液をベンゾイル化した後、固相抽出を行い、分析用カラムとしてC18カラム（Cadenza CD-C18)を用いた場合のクロマトグラムを示す。本発明の方法で標準物質として添加したリボース、マンノース、グルコース、フルクトース、ミオイノシトール、マンニトール及びソルビトールをすべて一度に一斉に分離分析することができる。
【００６０】
また、図２に正常人赤血球のクロマトグラムを示す。図２Aは従来のベンゾイル化法、すなわち、除タンパクした試料をベンゾイル化した後、蒸発乾固した試料を100％アセトアニリルへ再溶解し、標準的なODSカラムであるInertsil ODS3で分析した結果である。図２Bは、本発明の方法１、すなわち、除タンパクした試料をベンゾイル化した後、C8カートリッジを用いて固相抽出した試料をInertsil ODS3カラムで分析した場合の結果である。図２Cは本発明の方法２で分析カラムをInertsil ODS3カラムに変えて、理論段数の高いCadenza(5) CD-C18を用いて分析した結果を示す。従来のベンゾイル化法では、分析に１時間以上要したのに対し、本発明の方法では40〜50分で分析を完了した。
【００６１】
図２A及び図２Bを比較するとわかるように、固相抽出カラムを用いた本発明の方法で、従来のベンゾイル化法に比べ、ベースラインが安定し、より高精度の分析が可能になった。さらに、図２Cは、分析用カラムをCadenza(5) CD-C18に変えたことで、フルクトースとミオイノシトール、およびマンニトールとソルビトールの分離能が向上していることを示す。
【００６２】
また、図２Bの方法における定量の直線性は、フルクトース以外の糖及び糖アルコールは2.5μg/mLまで、フルクトースは５μg/mLまでであったのに対し、図２Cの方法においては、フルクトース以外の糖は５μg/mLまで、フルクトースは10μg/mLまでであった。
【００６３】
一方、図２Bの方法における定量限界は、フルクトースで100ng/mL、マンニトールおよびソルビトールで25ng/mL、そのほかの糖では50ng/mLであったのに対し、図２Cの方法では、フルクトース及びミオイノシトールで50ng/mL、マンニトール及びソルビトールで10ng/mL、そのほかの糖では25ng/mLであり、測定感度が向上した。
【００６４】
本発明の方法を用いることにより、試料調製時間が短縮された。従来のベンゾイル化法においては、減圧乾固法を行なうため、HPLC分析を行なう試料の調製に約60分要していたが、本発明の方法では減圧乾固を行なわずに固相抽出を行なうため、約30分で試料を調製することができた。また、HPLCにて分析する試料中への有機溶剤などの夾雑物の混入がなくなり、HPLCのベースラインが安定化し、糖の定量の精度が向上した。さらに、HPLC分析において、夾雑物を洗い出すためのグラディエントが必要なくなり、アイソクラティックで行うことができた。よって、１検体あたりの分析時間が短縮された。従来のベンゾイル化法では、約70分要していたが、本発明の方法では約40分であった。試料調製の時間とHPLCによる分析時間を併せると、従来のベンゾイル化法では分析に約130分かかっていたが、本発明の方法では約70分であった。
【００６５】
また、本発明の方法では減圧乾固処理を行なわず、固相抽出により夾雑物や微粒子の混入が軽減されたため、分析用カラムの寿命が延びるという利点が認められ、さらに、有機Cadenza CD-C18カラムのような充填剤の粒子径が３μmで、高性能であるが、目詰まりしやすいカラムを使用が可能になった。
【００６６】
さらに、本発明の方法では、HPLC分析で使用するアセトアニリルの量が減り、経済的であり、環境保全の観点からも意義があった。
【００６７】
実施例２  アセトニトリルによるベンゾイル化した糖及び糖アルコールの回収率の低下
グルコース、フルクトース、マンニトール及びソルビトールをベンゾイル化し、５、10、20、50、60、75及び100％のアセトニトリル中に溶解させ、30分後に回収し、HPLCにより糖濃度を測定した。
【００６８】
図３Aに各アセトニトリル濃度における30分後の糖及び糖アルコールの濃度を示し、図３Bに100％アセトニトリルにおける30分後の各糖及び糖アルコールの濃度を100とした場合の、各アセトニトリル濃度における相対的な各糖及び糖アルコールの濃度を示す。さらに、図４に100％アセトニトリル中のベンゾイル化等の安定性を示す。図３A及びBに示すように、調べたすべての糖において、アセトニトリル濃度が低いほど糖及び糖アルコールの回収率の低下が認められ、アセトニトリル濃度が50％を下回ると減少は顕著になった。なお、図４に示すように、アセトニトリル濃度が100％の場合、ベンゾイル化糖及び糖アルコールの回収率の低下は認められなかった。
【００６９】
実施例３  正常人赤血球中の糖及び糖アルコールの分析（その２）
試料の調製
ヘパリン加採血した血液を、50mL遠沈管に20mLずつ分注し、４℃、3000rpm、20分間遠心分離した後、血漿を捨てる。沈殿を冷却した生理食塩水で３回洗浄し、適量の生食を加えた後、転倒混和して４℃、3000rpm、20分間遠心し、上清を捨てた。沈殿し残った赤血球に、１N過塩素酸を赤血球４に対し、過塩素酸１０の割合で、Voltexミキサーによる混合を行いながら加え、除蛋白した。10分間放置した後、４℃、3000rpm、20分間遠心分離した。除蛋白した上清を3mLずつ、15mL遠沈管に分注し、1.25Mの K2CO3 850μLを加えた。この際、pH試験紙で、酸性を示した場合は、K2CO3を増量した。４℃、3000rpm、10分間遠心分離し、上清を別の50mL遠沈管にデカンテーションで移し、1本の遠沈管にまとめ、試料とした。調製したサンプルは、-20℃又は-80℃で検査まで保存可能であった。
【００７０】
ベンゾイル化
試料及び試薬を表１に示すように混合し試料中の糖及び糖アルコールをベンゾイル化した。
【００７１】
表１中、「通常スケール」は試料の量が数mL以下の場合のプロトコールであり、スケールアップは、試料の量が10mL以上の場合のプロトコールである。表１では、200倍にスケールアップした場合を示す。
【００７２】
【表１】
2008170428.tif 000002
【００７３】
通常スケールの場合は、表１の試薬１）〜３）を混ぜ、1分間 voltexで攪拌した後、水酸化ナトリウムムを添加し、16％リン酸で中和し、数秒間攪拌した。ベンゾイル化はガラスチューブ内で行うことが望ましい。
【００７４】
構造解析時などスケールアップして大量の検体を扱うときは、別プロトコールを用いた。
200倍にスケールアップする場合、表１の試薬１）〜３）を加えた後、200mL共栓付三角フラスコに、４cmの攪拌子を入れ、スターラーを10分間回した。回転速度は、攪拌子が飛び跳ねずに回る最大限の速度にした。その後、水酸化ナトリウムを添加し、16％リン酸で中和し、数秒間攪拌した。
【００７５】
固相抽出
Discovery CD-C18  500mg/6mL（５本）を、100％アセトニトリル5mLで３回、水で２回洗浄した。73mLの試料を、数回に分けて５本のカートリッジにすべてアプライした。次いで、カートリッジを水６mLで２回洗浄した。その後、75％アセトニトリル2.5mLで洗浄し、100％アセトニトリル0.85mLで洗浄した後、100％アセトニトリル1.7mLで、カートリッジ中の試料を回収した。
通常スケールの糖測定の場合には、回収した試料をHPLCにアプライした。
【００７６】
検体の濃縮
大量の糖を分取するスケールアップの場合は、事前に検体濃縮を行った。
固相抽出後回収した試料は100％アセトニトリル中にあるため、そのままで濃縮することが可能である。
【００７７】
回収試料を、1本の遠沈管にまとめ、再度濃縮のため2mLエッペンドルフチューブに、1mLずつ小分けした。小分けしたチューブを、小型バキュームコンセントレーター（Micro Vac MV-100）にセットし、約５０分間濃縮した。得られた濃縮液を1本のチューブにまとめた。空になったチューブに、100％アセトニトリルを少量加えて、Voltexし、洗浄し、次のチューブに洗浄液を移して順次洗浄した。最後のチューブを洗浄し終わった液を、３最初のチューブに移し、試料の回収率を高めた。最終的に得られた試料を、HPLCにアプライした。
【００７８】
HPLCによる試料の分取
HPLC条件は、以下のとおりであった。
移動相A：  100％アセトニトリル
移動相B：  蒸留水
グラジェント
0分〜35分   B Conc.  22.5%    （分離）
35分〜45分  B Conc.  0%        （洗浄）
45分〜58分  B Conc.  22.5%    （初期状態に戻す）
カラム；  Cadenza  CD-C18    3μm  4.6φ×250mm
流速；  1mL/min
注入  ；  25μL
検出  ；  228nm
温度  ；  25℃
【００７９】
分取装置としては、ADVANTEC CHF122SCを用いた。エッペンドルフチューブ1.5mL用を分取に必要な本数分を分取装置にセットした。次いで、HPLCの検出器からの配管を分取装置にセットし、必要な条件を入力し、分取を行った。
【００８０】
再固相抽出と濃縮
77.5％アセトニトリルの移動相中で分取した検体をそのまま小型バキュームコンセントレーターで濃縮すると、ベンゾイル化した糖の回収率が悪くなることが判明した。これは、アセトニトリルが先に蒸発し、水が多くなり、即ち、アセトニトリルの濃度が低くなり、その結果、ベンゾイル化した糖が、容器の壁に吸着してしまうためと推測した。実際に、アセトニトリルの濃度が低いほど、ベンゾイル化糖、ベンゾイル化糖アルコールの回収率は低かった。
【００８１】
そこで、77.5％の移動相中の水分を除去し、再度、Discovery CD-C18カートリッジを使用し100％アセトニトリルに置換した。この際、77.5％の移動相中の検体をそのままカートリッジにアプライすると、検体の多くの部分は、カートリッジに吸着されず、有効に回収されなかった。従って、検体の溶媒を容器の壁への吸着が顕著に起こらない、しかし、カートリッジに十分吸着され得る60％に希釈し、カートリッジに吸着させた後、100％アセトニトリルで回収することで、溶媒を100％アセトニトリルに置換した。
すなわち、分取後、以下のようにして溶媒を100％アセトニトリルに置換した。
【００８２】
分取したベンゾイル化した糖分画を集め、アセトニトリルの濃度を77.5%（HPLC移動相濃度）から、60％へ希釈した（例えば、糖又は糖アルコール分画3mLに対し、20％のアセトニトリルを1.4mL加えた）。Discovery CD-C18を100％アセトニトリル５mLで３回、水で２回、60％アセトニトリル２mLで１回洗浄し、コンディショニングした。
【００８３】
100％アセトニトリルに置換した試料をコンディショニングしたカートリッジへアプライした。順に60％アセトニトリル２mL、100％アセトニトリル0.85mLで洗浄した。100％アセトニトリル2.0mLで、カートリッジ中のベンゾイル化した糖分画を回収した。回収した試料を２mLのエッペンドルフチューブに１mLずつ小分けし、小型バキュームコンセントレーター（Micro Vac MV-100）にセットし、約60分間濃縮する。検体をNMR分析にアプライし、分析した。
【００８４】
結果を図５に示す。図５中Aが本実施例の方法により分離した２種類の糖アルコール（それぞれ、Ｘ及びＹとする）のNMR分析の結果を示す。Bは２種類のベンゾイル化糖アルコールＸ標品のNMR分析の結果を示し、Cはベンゾイル化糖アルコールＹ標品のNMR分析の結果を示す。本発明の方法により、赤血球中のベンゾイル化した糖及び糖アルコールは容器のへ壁への吸着が最小限に抑制され、効率よく回収され、高濃度に濃縮することができた。従って、NMRによる分析も可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の方法により、生体試料等の各種試料中の糖及び糖アルコールを分析することができ、食品、医薬、医療の分野に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】0.5μg/mLの標準溶液をベンゾイル化した後、Discovery C8カートリッジを用いて固相抽出を行い、分析用カラムとしてCadenza CD-C18カラムを用いた場合の糖分析のクロマトグラムを示す図である。
【図２】正常人赤血球のクロマトグラムを示す図である。図２Aは、試料を除蛋白した後、ベンゾイル化し、減圧乾固処理したものを、分析用カラムとしてInertsil ODS3を用いた場合の分析結果を示す。図２Bは、本発明の方法で、試料を除蛋白した後、ベンゾイル化し、固相抽出したものを、分析用カラムとしてInertsil ODS3を用いた場合の結果を示す。図２Cは、本発明の方法で分析用カラムとしてCadenza(5)CD-C18を用いた場合の結果を示す。
【図３】アセトニトリルによるベンゾイル化した糖及び糖アルコールの回収率を示す図である。
【図４】100％アセトニトリル中でのベンゾイル化した糖及び糖アルコールの経時的な回収率を示す図である。
【図５】ベンゾイル化し、HPLCにより精製し、さらに濃縮した糖及び糖アルコールのNMRによる分析の結果を示す図である。
【図１】
2008170428.tif 000003
【図２】
2008170428.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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