(57)【要約】      （修正有）【課題】標識された細胞核を有する細胞を幹細胞として選択する幹細胞の単離方法の提供。【解決手段】細胞核（例えば、核膜等）を標識することによって、幹細胞を単離する方法。ヘテロな細胞集団においてそれぞれの細胞の細胞核を標識し、細胞分裂後も標識された状態の細胞を選別することにより、効率的に幹細胞を単離することが可能である。動物の組織幹細胞を、その本質的な機能を利用して標識することにより、生存状態での視覚化も可能にし、かつ、遺伝子操作や人為的マーカーを一切用いず、新鮮な状態で簡便に単離できる。【選択図】図１１
2008148693.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、細胞集団から幹細胞を単離する方法。
（ａ）細胞集団に含まれる細胞の細胞核を標識する工程
（ｂ）前記細胞を分裂させる工程
（ｃ）標識された細胞核を有する細胞を幹細胞として選択する工程
【請求項２】
疾患組織から調製される細胞集団から請求項１に記載の方法によって幹細胞を単離する工程を含む、病的幹細胞の単離方法。
【請求項３】
臓器組織から調製される細胞集団から請求項１に記載の方法によって幹細胞を単離する工程を含む、体性幹細胞の単離方法。
【請求項４】
癌組織から調製される細胞集団から請求項１に記載の方法によって幹細胞を単離する工程を含む、癌性幹細胞の単離方法。
【請求項５】
幹細胞が生存状態で単離されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、被検細胞について幹細胞か否かの検査方法。
（ａ）被検細胞の細胞核を標識する工程
（ｂ）前記細胞を分裂させる工程
（ｃ）分裂後の細胞における細胞核が標識されている場合に、被検細胞は幹細胞であるものと判定する工程
【請求項７】
細胞の細胞核を標識する工程を含む、幹細胞を選択的に標識する方法。
【請求項８】
細胞分裂後も標識されていることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標識が少なくとも１ヶ月以上残存することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
細胞と細胞核標識剤とを接触させる工程を含む、生存状態で幹細胞を選択的に可視化する方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法によって幹細胞を可視化する工程を含む、幹細胞を生存状態で観察する方法。
【請求項１２】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、幹細胞マーカーの同定方法。
（ａ）請求項１に記載の方法によって、幹細胞を単離する工程
（ｂ）単離された幹細胞におけるマーカーを同定する工程
【請求項１３】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、癌性幹細胞特異的マーカーの同定方法。
（ａ）請求項４に記載の方法によって、癌性幹細胞を単離する工程
（ｂ）単離された幹細胞におけるマーカーを同定する工程
【請求項１４】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、幹細胞の抗原の同定方法。
（ａ）請求項１に記載の方法によって、幹細胞を単離する工程
（ｂ）単離された幹細胞における抗原を同定する工程
【請求項１５】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、幹細胞特異的発現遺伝子の同定方法。
（ａ）請求項１に記載の方法によって、幹細胞を単離する工程
（ｂ）前記幹細胞における遺伝子発現状態と、対照細胞における遺伝子発現状態を比較する工程
（ｃ）前記幹細胞において発現状態が変化している遺伝子を、幹細胞特異的発現遺伝子として選択する工程
【請求項１６】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、疾患の治療のための標的遺伝子の同定方法。
（ａ）請求項２に記載の方法によって、病的幹細胞を単離する工程
（ｂ）前記幹細胞における遺伝子発現状態と、対照細胞における遺伝子発現状態を比較する工程
（ｃ）前記幹細胞において発現状態が変化している遺伝子を、標的遺伝子として選択する工程
【請求項１７】
細胞核の核膜もしくは核酸が標識されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法によって単離される幹細胞を、臓器に移植することを特徴とする、該臓器に関連する疾患の治療方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法によって単離される幹細胞を分化させた臓器を移植することを特徴とする、該臓器に関連する疾患の治療方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法によって単離される幹細胞に対する抗体を個体へ投与することを特徴とする、抗体治療方法。
【請求項２１】
請求項１５または１６に記載の方法によって同定される遺伝子の発現を抑制する工程を含む、遺伝子サイレンシング治療方法。
【請求項２２】
以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、抗癌剤のスクリーニング方法。
（ａ）請求項４に記載の方法によって、癌性幹細胞を単離する工程
（ｂ）前記癌性幹細胞と被検化合物とを接触させる工程
（ｃ）前記癌性幹細胞の細胞増殖もしくは細胞死の状態を検出する工程
（ｄ）対照と比較して、癌性幹細胞の細胞増殖を抑制する、または細胞死を促進する化合物を選択する工程
【請求項２３】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法によって単離される幹細胞。
【請求項２４】
以下の（ａ）および／または（ｂ）の性質を有することを特徴とする、請求項２３に記載の幹細胞。
（ａ）自己複製能を有する
（ｂ）少なくとも1ヶ月以上生存する
【請求項２５】
標識された細胞核が細胞分裂後も標識されていることを特徴とする幹細胞。
【請求項２６】
生細胞であることを特徴とする、請求項２３〜２５のいずれかに記載の幹細胞。
【請求項２７】
臓器から調製される細胞集団から、請求項１に記載の方法によって単離される体性幹細胞。
【請求項２８】
試験管内で樹立された細胞株集団から、請求項１に記載の方法によって単離される幹細胞株。
【請求項２９】
細胞株が癌細胞である、請求項２８に記載の幹細胞株。
【請求項３０】
請求項１に記載の方法によって単離される幹細胞から樹立された幹細胞特異的細胞株。
【請求項３１】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法によって単離される幹細胞の細胞抗原。
【請求項３２】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法によって単離される幹細胞を特異的に認識する抗体。
【請求項３３】
請求項１に記載の方法によって単離される幹細胞が分化して成る、人工臓器。
【請求項３４】
請求項１に記載の方法によって単離される幹細胞を有効成分とする医薬組成物。
【請求項３５】
細胞核標識剤を有効成分とする、幹細胞標識用試薬。
【請求項３６】
請求項１に記載の方法によって単離される幹細胞の抗原を有効成分とする、幹細胞ワクチン。
【請求項３７】
請求項１に記載の方法によって単離される幹細胞に対する抗体を有効成分とする、抗体医薬。
【請求項３８】
請求項１２または１３に記載の方法によって同定される幹細胞マーカーを有効成分とする、疾患検査薬。
【請求項３９】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法によって幹細胞を単離する工程を含む、標識された幹細胞の製造方法。
【請求項４０】
前記幹細胞が生細胞であることを特徴とする、請求項３９に記載の製造方法。
【請求項４１】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、幹細胞特異的細胞株の製造方法。
（ａ）請求項１に記載の方法によって幹細胞を単離する工程
（ｂ）前記幹細胞について樹立細胞株を作製する工程
【請求項４２】
請求項１に記載の方法によって単離される幹細胞を分化させる工程を含む、人工臓器の製造方法。
【請求項４３】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、幹細胞の抗原を有効成分とする幹細胞ワクチンの製造方法。
（ａ）請求項１に記載の方法によって幹細胞を単離する工程
（ｂ）前記幹細胞の抗原を同定する工程
【請求項４４】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、幹細胞に対する抗体の製造方法。
（ａ）請求項１〜５のいずれかに記載の方法によって幹細胞を単離する工程
（ｂ）前記幹細胞もしくはその一部を抗原とする抗体を作製する工程
【請求項４５】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、特定の臓器に対する抗癌抗体の製造方法。
（ａ）  臓器に存在する癌組織から調製される細胞集団から請求項１に記載の方法によって癌性幹細胞を単離する工程
（ｂ）前記癌性幹細胞もしくはその一部を抗原とする抗体を作製する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞の単離方法、および該方法によって単離される幹細胞、並びに、該幹細胞の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医学領域は21世紀になり急速に研究が拡大している。とりわけ幹細胞（Stem cell）移植による難病治療の可能性が大きくクローズアップされており、既に心筋梗塞など一部の疾患では臨床応用されつつある。現在、移植に使用する幹細胞のソースとして主に考えられているのが、ES細胞（胚性幹細胞）、骨髄由来幹細胞（間葉系細胞）、組織幹細胞（体性幹細胞）であるが、各々長所・短所があり、決定的なソースやその品質管理に関してはコンセンサスを得られていない状況である。基礎研究の状況に比較し、臨床の現場での使用が先行しているが、実際に移植した幹細胞が生体内でどのように機能しているのかは全く不明である。しかしながら、安全かつ効果的な幹細胞移植治療を行うためには、ヘテロ（heterogenous）な細胞集団と考えられる幹細胞の、生体における幹細胞間相互作用、他の細胞との相互作用、動態や機能を制御する因子、などを明確化しておく必要がある（非特許文献１）。
【０００３】
ところが、驚くべき事に幹細胞をプロスペクティブに同定できる決定的なマーカーは現在存在しない。現時点では、各研究者によりピックアップされたc-kitなど幼若細胞のマーカーを組み合わせて用いるか、ピックアップされた遺伝子のプロモーターにGFPなどの検出物質を発現させるか、あるいは、培養後に分化してくる細胞を用いるか、いずれかの方法で「幹細胞」として研究に使用されている。このような従来法は基本的に人為的な方法であるため、必ずしも生体内の真の幹細胞のみを用いているとは言えない。上述のように、幹細胞療法が既に一部で臨床応用され始めている現在でさえ、移植した細胞の行方・生体内動態や癌化の危険性に関する研究が欠落しているという事実を直視し、早急に幹細胞のプロスペクティブなマーカーならびに生体内動態を同定しなければならない。これが、移植療法のみならず、より広義の再生療法を、安全かつ効果的に臨床導入するための最重要研究課題である。
【０００４】
とりわけ、組織幹細胞の生体内動態を理解することは、臨床的に重要な意義を持つ。現在、組織幹細胞に近い細胞を同定する方法としては、実験動物レベルではブロモデオキシウリジン（BrdU）標識法が良く用いられる。BrdUは、チミジン類似体であり、細胞周期のS期の間にDNA中に取り込まれるため、増殖細胞の指標となる。非特許文献２では、新生仔マウスにBrdUを投与すると、活発に増殖している細胞に取り込まれ、一部は成熟マウスに育つまで標識されたまま残る細胞が存在し、これをlabel-retaining cell（LRC）と定義し、幹細胞に近い細胞であるとしている。しかしながら、BrdUを取り込んだ細胞を「抗BrdU抗体」で同定するためには、塩酸などの核膜を破壊する手技は必須になるため、従来法では動物の組織切片上でしか評価ができなかった。
【０００５】
このように、幹細胞研究が盛んである現在においてすら、幹細胞をプロスペクティブに単離するための方法が皆無である事は、驚くべき事実である。
【０００６】
【非特許文献１】Ruth Kirschstein & Lana R Skirboll著、「Stem Cells: Scientific Progress and Future Research Directions」、National Institute of Health、2001年、1-106頁
【非特許文献２】Taylorら著、Cell、102巻、2000年、451-461頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、幹細胞をプロスペクティブに単離するための方法、および該方法によって単離される幹細胞、並びに、該幹細胞の治療もしくはワクチン等の医薬用途の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
癌にも自分だけが増殖する「癌性幹細胞」が存在し、癌は「幹細胞病」である、という考え方が提唱されている（Clarke MF. Cancer Chemother Pharmacol 2005、56、S64-68）。従来の癌治療はこの癌性幹細胞を標的としていないために、腫瘍を退縮できても根治できなかったのに対し、新しいアプローチとして癌性幹細胞を標的とする抗癌剤を開発することにより、癌を根治できる可能性が検討されている。したがって、生理的な幹細胞同様に未だ全く解明されていない、癌性幹細胞の分子マーカーを同定する事は、新規抗癌剤を開発するためにも、臨床的には極めて重要な課題である。
【０００９】
本発明者は、細胞核（例えば、核膜等）を標識することによって、幹細胞を効率的に単離することが可能であることを初めて見出した。即ち、細胞核が標識された幹細胞は、分裂後も標識されており、幹細胞の特性である自己複製能力（self renewal）、長期生存（long-lived）を示すことが明らかとなった。例えば、ヘテロな細胞集団においてそれぞれの細胞の細胞核を標識し、細胞分裂後も標識された状態の細胞を選別することにより、効率的に幹細胞を単離することが可能である。
【００１０】
また本発明は、動物の組織幹細胞を、その本質的な機能を利用して標識することにより、生存状態での視覚化も可能にし、かつ、遺伝子操作や人為的マーカーを一切用いず、新鮮な状態で（すなわち、細胞培養無しで）、簡便に単離する方法を提供する。
【００１１】
本発明には、幹細胞自身の機能的特性を自然の状態で応用する事により、選択的に幹細胞を標識し、かつ、新鮮な状態で単離する手法、ならびに、本手法により単離された幹細胞本体が含まれる。
【００１２】
機能的に単離された幹細胞を使用すれば、そのような細胞に選択的な抗原、抗体、遺伝子、細胞株、マーカーなどを、周知の実験手法により容易に同定できる。これらは本発明を使用する事無しでは不可能である。このように同定された各種の生理的・病理的幹細胞を対象とした因子を標的とする事により、臓器別あるいは個体別の幹細胞治療法のラインナップを作成する事が初めて可能となり、臨床応用の発展のみならず、医学史におけるインパクトも極めて高い発明である。
【００１３】
本発明は、幹細胞をプロスペクティブに単離するための方法、および該方法によって単離される幹細胞、並びに、該幹細胞の治療もしくはワクチン等の医薬用途に関し、より具体的には、
〔１〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、細胞集団から幹細胞を単離する方法、
（ａ）細胞集団に含まれる細胞の細胞核を標識する工程
（ｂ）前記細胞を分裂させる工程
（ｃ）標識された細胞核を有する細胞を幹細胞として選択する工程
〔２〕  疾患組織から調製される細胞集団から〔１〕に記載の方法によって幹細胞を単離する工程を含む、病的幹細胞の単離方法、
〔３〕  臓器組織から調製される細胞集団から〔１〕に記載の方法によって幹細胞を単離する工程を含む、体性幹細胞の単離方法、
〔４〕  癌組織から調製される細胞集団から〔１〕に記載の方法によって幹細胞を単離する工程を含む、癌性幹細胞の単離方法、
〔５〕  幹細胞が生存状態で単離されることを特徴とする、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法、
〔６〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、被検細胞について幹細胞か否かの検査方法、
（ａ）被検細胞の細胞核を標識する工程
（ｂ）前記細胞を分裂させる工程
（ｃ）分裂後の細胞における細胞核が標識されている場合に、被検細胞は幹細胞であるものと判定する工程
〔７〕  細胞の細胞核を標識する工程を含む、幹細胞を選択的に標識する方法、
〔８〕  細胞分裂後も標識されていることを特徴とする、〔７〕に記載の方法、
〔９〕  前記標識が少なくとも１ヶ月以上残存することを特徴とする、〔７〕に記載の方法、
〔１０〕  細胞と細胞核標識剤とを接触させる工程を含む、生存状態で幹細胞を選択的に可視化する方法、
〔１１〕  〔１０〕に記載の方法によって幹細胞を可視化する工程を含む、幹細胞を生存状態で観察する方法、
〔１２〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、幹細胞マーカーの同定方法、
（ａ）〔１〕に記載の方法によって、幹細胞を単離する工程
（ｂ）単離された幹細胞におけるマーカーを同定する工程
〔１３〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、癌性幹細胞特異的マーカーの同定方法、
（ａ）〔４〕に記載の方法によって、癌性幹細胞を単離する工程
（ｂ）単離された幹細胞におけるマーカーを同定する工程
〔１４〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、幹細胞の抗原の同定方法、
（ａ）〔１〕に記載の方法によって、幹細胞を単離する工程
（ｂ）単離された幹細胞における抗原を同定する工程
〔１５〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、幹細胞特異的発現遺伝子の同定方法、
（ａ）〔１〕に記載の方法によって、幹細胞を単離する工程
（ｂ）前記幹細胞における遺伝子発現状態と、対照細胞における遺伝子発現状態を比較する工程
（ｃ）前記幹細胞において発現状態が変化している遺伝子を、幹細胞特異的発現遺伝子として選択する工程
〔１６〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、疾患の治療のための標的遺伝子の同定方法、
（ａ）〔２〕に記載の方法によって、病的幹細胞を単離する工程
（ｂ）前記幹細胞における遺伝子発現状態と、対照細胞における遺伝子発現状態を比較する工程
（ｃ）前記幹細胞において発現状態が変化している遺伝子を、標的遺伝子として選択する工程
〔１７〕  細胞核の核膜もしくは核酸が標識されることを特徴とする、〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の方法、
〔１８〕  〔１〕に記載の方法によって単離される幹細胞を、臓器に移植することを特徴とする、該臓器に関連する疾患の治療方法、
〔１９〕  〔１〕に記載の方法によって単離される幹細胞を分化させた臓器を移植することを特徴とする、該臓器に関連する疾患の治療方法、
〔２０〕  〔１〕に記載の方法によって単離される幹細胞に対する抗体を個体へ投与することを特徴とする、抗体治療方法、
〔２１〕  〔１５〕または〔１６〕に記載の方法によって同定される遺伝子の発現を抑制する工程を含む、遺伝子サイレンシング治療方法、
〔２２〕  以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、抗癌剤のスクリーニング方法、
（ａ）〔４〕に記載の方法によって、癌性幹細胞を単離する工程
（ｂ）前記癌性幹細胞と被検化合物とを接触させる工程
（ｃ）前記癌性幹細胞の細胞増殖もしくは細胞死の状態を検出する工程
（ｄ）対照と比較して、癌性幹細胞の細胞増殖を抑制する、または細胞死を促進する化合物を選択する工程
〔２３〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法によって単離される幹細胞、
〔２４〕  以下の（ａ）および／または（ｂ）の性質を有することを特徴とする、〔２３〕に記載の幹細胞、
（ａ）自己複製能を有する
（ｂ）少なくとも1ヶ月以上生存する
〔２５〕  標識された細胞核が細胞分裂後も標識されていることを特徴とする幹細胞、
〔２６〕  生細胞であることを特徴とする、〔２３〕〜〔２５〕のいずれかに記載の幹細胞、
〔２７〕  臓器から調製される細胞集団から、〔１〕に記載の方法によって単離される体性幹細胞、
〔２８〕  試験管内で樹立された細胞株集団から、〔１〕に記載の方法によって単離される幹細胞株、
〔２９〕  細胞株が癌細胞である、〔２８〕に記載の幹細胞株、
〔３０〕  〔１〕に記載の方法によって単離される幹細胞から樹立された幹細胞特異的細胞株、
〔３１〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法によって単離される幹細胞の細胞抗原、
〔３２〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法によって単離される幹細胞を特異的に認識する抗体、
〔３３〕  〔１〕に記載の方法によって単離される幹細胞が分化して成る、人工臓器、
〔３４〕  〔１〕に記載の方法によって単離される幹細胞を有効成分とする医薬組成物、
〔３５〕  細胞核標識剤を有効成分とする、幹細胞標識用試薬、
〔３６〕  〔１〕に記載の方法によって単離される幹細胞の抗原を有効成分とする、幹細胞ワクチン、
〔３７〕  〔１〕に記載の方法によって単離される幹細胞に対する抗体を有効成分とする、抗体医薬、
〔３８〕  〔１２〕または〔１３〕に記載の方法によって同定される幹細胞マーカーを有効成分とする、疾患検査薬、
〔３９〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法によって幹細胞を単離する工程を含む、標識された幹細胞の製造方法、
〔４０〕  前記幹細胞が生細胞であることを特徴とする、〔３９〕に記載の製造方法、
〔４１〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、幹細胞特異的細胞株の製造方法、
（ａ）〔１〕に記載の方法によって幹細胞を単離する工程
（ｂ）前記幹細胞について樹立細胞株を作製する工程
〔４２〕  〔１〕に記載の方法によって単離される幹細胞を分化させる工程を含む、人工臓器の製造方法、
〔４３〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、幹細胞の抗原を有効成分とする幹細胞ワクチンの製造方法、
（ａ）〔１〕に記載の方法によって幹細胞を単離する工程
（ｂ）前記幹細胞の抗原を同定する工程
〔４４〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、幹細胞に対する抗体の製造方法、
（ａ）〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法によって幹細胞を単離する工程
（ｂ）前記幹細胞もしくはその一部を抗原とする抗体を作製する工程
〔４５〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、特定の臓器に対する抗癌抗体の製造方法、
（ａ）  臓器に存在する癌組織から調製される細胞集団から〔１〕に記載の方法によって癌性幹細胞を単離する工程
（ｂ）前記癌性幹細胞もしくはその一部を抗原とする抗体を作製する工程
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によって新鮮な状態で単離された幹細胞を用いることにより、より生体に近い状態での幹細胞解析が初めて可能となり、かつ、幹細胞選択的なマーカーの同定が可能となる。また、生存個体での幹細胞の生体内動態も視覚化できるため、臨床応用における危険因子である、幹細胞の行方の診断にも応用できる。
【００１５】
さらに、本手法によって、担癌患者の腫瘍部分を採取した後に試験管内（in vitro）で培養し樹立される癌細胞株（セルライン）への応用が容易であり、現在決定的なマーカーの無かった癌性幹細胞の同定が初めて可能となる。本手法が、各種幹細胞の真のマーカー群を同定できる、唯一の方法である。
【００１６】
本発明によって、従来は必ずしも本質的ではない人為的なマーカーを用いながらレトロスペクティブにしか解析できなかった幹細胞研究の様相を一変させ、プロスペクティブ、かつ、より生体の真実に近い状態で研究できる。また、１）単離した幹細胞の抗原、遺伝子を同定する事により、真の幹細胞マーカーが確立できる唯一の方法である。２）単離した幹細胞自身を使用した「細胞療法」は、現在行われている「培養後の細胞」を用いた「細胞療法」より、より安全で高い効果が期待できる。いずれも、本方法によって得られた幹細胞を使用しなければ獲得できないツールであり（細胞自体が存在すれば当該業者にとっては周知の方法で、抗原、遺伝子、抗体、細胞株、細胞療法まで容易に追試できる）、かつ、極めて発展性のある研究テーマ、治療案件を多数提供できる。
【００１７】
また、本発明の方法によって単離した幹細胞を加える（培養する）ことにより、機能的にも臓器として役割を果たす人工臓器を作製することが可能である。
【００１８】
例えば肝臓に関しては、これまでのところ人工肝臓の作製が困難な状況であった。今までは、一個一個の肝細胞がきちんとアルブミンを産生し、毒物排出が可能であれば、それで大丈夫であろうと考えられてきた。ところが、実際に一番重要なのは、肝細胞索（肝細胞の配列／アライメント）としての機能的構築を如何に保持するか、それにより、肝臓全体としての胆汁排出が可能かどうか、という点であると考えられ、その点を無視していたために、これまでは失敗を繰り返してきたと考えられる。現在までマトリックスを如何に3次元的に構築するかが盛んに研究されてきたが、結局は「肝細胞索の機能的構築とマスとしての胆汁排出」が出来なければ、臨床応用は不可能であった。その意味でも、本発明の方法によって単離された肝臓の肝細胞は、世界で初めて培養皿で肝細胞索構築を形成できる細胞である事が判明し、組織医工学的人工臓器に使用可能な細胞である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、細胞集団から幹細胞を単離する方法を提供する。
【００２０】
本発明における「幹細胞」とは、通常、生存状態の幹細胞（本明細書において「本発明の幹細胞」と記載する場合あり）を指す。本発明の幹細胞は、（１）自己複製能を有する、（２）長期生存能を有する、という特徴的な性質を有する。この性質は細胞が分裂した後も有する。即ち、細胞核が標識された幹細胞は、細胞分裂後も細胞核が依然として標識された状態であることから、この標識を指標とすることによって、幹細胞を単離することができる。
【００２１】
本発明の方法によって単離可能な幹細胞として、例えば、体性幹細胞、および胚性幹細胞を例示することができる。体性幹細胞は、より詳しくは、内胚葉系、中胚葉系、外胚葉系の幹細胞が挙げられる。内胚葉系としては胸腺、甲状腺、副甲状腺、咽頭、気管支、肺、膀胱、膣、尿管、消化器（食道・胃・小腸・大腸・肝臓・膵臓）等が挙げられる。中胚葉系としては骨髄（＝骨髄幹細胞もしくは造血幹細胞）、副腎皮質、リンパ節・リンパ管、骨、筋、心臓、体幹の結合組織（＝間葉系幹細胞）、血管（＝血管内皮幹細胞）、腎臓等が挙げられる。また、外胚葉系としては皮膚、中枢神経系（＝神経系幹細胞）、副腎髄質、下垂体、頭部・顔部の結合組織、眼、耳等が挙げられる。（Fuchs E & Segre JA. Cell 100:143-155, 2000）
【００２２】
本発明の幹細胞の単離方法の好ましい態様としては、細胞の細胞核を標識し、分裂後も標識されている細胞を選択することを特徴とする方法である。
【００２３】
本発明の方法は、好ましくは、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、細胞集団から幹細胞を単離する方法である。
（ａ）細胞集団に含まれる細胞の細胞核を標識する工程
（ｂ）前記細胞を分裂させる工程
（ｃ）標識された細胞核を有する細胞を幹細胞として選択する工程
【００２４】
上記工程（ａ）は、特に制限されないが、通常、細胞と細胞核を標識可能な物質（「標識化剤」と記載する場合あり）とを接触させることにより実施する。
【００２５】
本発明において細胞核とは、例えば、核膜または核酸（ゲノムDNA、ヒストン、クロマチン等を含む）を言うが、好ましくは、核膜を指す。即ち、本発明の好ましい態様においては、細胞の核膜を標識する。
【００２６】
本発明において「標識する」とは、標識されていない通常の細胞核と区別し得る程度に、細胞核を標識することを言う。即ち、本発明における「標識」は、通常の細胞核と区別可能な態様にて標識し得るものであれば、その標識の手法や標識するための物質の種類等は制限されない。本発明において「標識」とは、例えば、染色物質（色素）による標識、蛍光物質（色素）による標識、酵素による標識、放射性物質による標識等が挙げられるが、好ましくは、染色物質あるいは蛍光物質による標識である。
【００２７】
本発明の方法において細胞核の標識化に利用可能な物質（標識化剤）としては、例えば、市販の蛍光色素を利用することができる。具体的には、SYTO GREEN-Fluorescent Nuclear Acid Stain（モレキュラー・プローブ社製）を好適に示すことができる。この物質は、低親和性の核酸結合物質であり、生細胞の膜を介して受動的に拡散し、核酸を染色する(Chen A & McConnell SK, Cell 82: 631-341, 1995)。
【００２８】
上記以外にも、例えば、市販の蛍光色素である蛍光ナノクリスタル(QUANTUM DOT社製)、Cellestain-Hoechst 33258、Cyto-dye（メルク社）等を利用することが可能であるが、これらに特に制限されない。
【００２９】
また、本発明の標識化剤として、核酸と結合する磁気ビーズ（マグネティック・ビーズ）を好適に示すことができる。
【００３０】
本発明の標識化剤は、細胞の細胞核（核膜、核酸等）を標識し得るものであれば特に制限されず、任意の物質（色素、薬剤、試薬等）を利用することができる。
【００３１】
本発明の方法において、上記標識化剤を利用して細胞の細胞核を標識化する方法は、当業者であれば、該標識化剤の種類に応じて適宜実施することが可能である。使用する標識化剤が市販のものであれば、添付される説明書に沿って適宜細胞核を標識することができる。通常は、使用する細胞集団が含まれる細胞培養液に対して、標識化剤を適量添加することにより行う。標識化剤として上記SYTO GREENを用いる場合、具体的には、後述の実施例に記載の方法によって細胞核を標識することができる。
【００３２】
また、本発明によって細胞核を標識し得る物質（細胞核標識剤）は、幹細胞を特異的に標識し得ることが分った。即ち、細胞核標識剤の新たな用途が見出された。従って本発明は、細胞核標識剤を有効成分とする幹細胞標識用試薬を提供する。
【００３３】
本発明の上記方法における「細胞集団」は、その由来する組織、器官等は特に制限されず、例えば、通常の臓器組織から調製される（由来する）細胞集団、疾患組織から調製される細胞集団、または、癌組織から調製される細胞集団等を挙げることができる。また、種々の組織、器官等から調製される複数種の細胞が混合した状態の細胞集団であってもよい。なお、本発明の「細胞集団」は、「細胞群」あるいは単に「細胞」と呼ばれる場合がある。
【００３４】
本発明の方法において用いられる細胞集団としては、通常、各種臓器から調製される細胞集団を好適に示すことができる。該細胞集団から本発明の方法によって、所謂「体性幹細胞」を単離することができる。本発明における体性幹細胞は、成体幹細胞とも呼ばれる。
【００３５】
体性幹細胞は、分化済みの個別組織内部で作り出される未分化状態の細胞で、次に述べるように自らを新しく作り代えることができ、また分化によっていわばその出身母体である組織内のあらゆる個別細胞を作り出すこともできる。生体内の体性幹細胞は、その生体が生き続ける限り自分と同じ細胞を複製・製造する能力を持っており、この特質は「自己更新」と呼ばれる。体性幹細胞は、通常はまず先駆けとなる前駆細胞に分化し、この前駆細胞がさらに分化して特定の形を備え、特定の働き（たとえば、筋肉細胞の収縮、神経細胞の信号のやり取り）を担う「成熟」細胞に成長する。体性幹細胞が存在する場所は、骨髄、血液、目の角膜と網膜、脳、骨格筋、歯の髄、肝臓、皮膚、胃や腸などの消化管の内壁、すい臓である。体性幹細胞についての情報の多くは、骨髄や血液から分離された造血幹細胞に関する研究から得られている。血液を作り出すことのできる造血幹細胞については幅広く研究されており、さまざまな病気の治療にも応用されている。現時点では、身体のあらゆる細胞を作り出すことの可能な体性幹細胞の発見・分離には至っていない。体性幹細胞は数が少なく、これを特定して分離・精製するのが非常にむずかしい。また、移植に必要な十分な数の体性幹細胞を確保するのも困難であり、人工培養によってこれを無限に複製・増殖させることもできない。
【００３６】
体性幹細胞は、胚生殖細胞の3つの原始細胞層（外胚葉，内胚葉，中胚葉）から発生するすべての組織で発見されている。
【００３７】
体性幹細胞は、身体内で長期にわたって分化することなく増殖可能であり（この性質は「長期自己更新力（長期自己複製能力）」と呼ばれている）、また、ある生体組織に特有の形と働きを持った成熟細胞を作り出すこともできる。
【００３８】
本発明の方法によって幹細胞の単離が可能な臓器としては、生存個体に存在する全ての臓器が挙げられるが、具体的には、脳、皮膚、毛包、眼、耳、歯、爪、鼻、舌、脂肪、筋、血管、リンパ管、神経、リンパ節、脾臓、骨、軟骨、肺、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、消化管、乳腺、甲状腺、副甲状腺、副腎、前立腺、精巣、卵巣、子宮、または膀胱等を例示することができる。
【００３９】
本発明の方法によって、これらの臓器から幹細胞を単離することにより、それぞれの臓器固有の体性幹細胞を取得することができる。
【００４０】
本発明における細胞集団として疾患組織から調製される細胞集団を用いた場合、本発明の方法によって疾患に関与する幹細胞（病的幹細胞）を単離することができる。本発明において病的幹細胞とは、何らかの原因により病的状態（例えば、癌化や病原体の定着など）に陥った体性幹細胞であり、病的娘細胞を生み出しながら、自己も病的状態を保持したまま長期複製する細胞を言う。
【００４１】
本発明の方法によって、種々の疾患に関連する組織から幹細胞を単離することにより、それぞれの疾患の治療の標的となる病的幹細胞を取得することができる。例えば、後述のように、該病的幹細胞に特異的に発現する遺伝子について、発現の抑制が可能なsiRNA等を用いることによって、該疾患に対する治療（遺伝子サイレンシグ治療）を行うことが可能である。
【００４２】
また、本発明における細胞集団として癌組織から調製される細胞集団を用いた場合、本発明の方法によって癌性幹細胞を単離することができる。本発明において癌性幹細胞とは、何らかの原因により、癌化した体性幹細胞であり、娘細胞（癌細胞）を生み出しながら自己も癌細胞として無限に長期複製する細胞を言う(Beachy PA et al. Nature 432:324-331, 2004; Clarke MF & Fuller M. Cell 124:1111-1115,2006）。
【００４３】
本発明の方法によって、種々の癌に関連する組織から幹細胞を単離することにより、それぞれの癌について、選択的な治療の標的となり得る癌性幹細胞を取得することができる。例えば、後述のように、該癌性幹細胞に特異的に発現する遺伝子について、発現の抑制が可能なsiRNA等を用いることによって、特定の癌に対する治療（遺伝子サイレンシグ治療）を行うことが可能である。
【００４４】
また、細胞集団が由来する個体の生物種も特に制限されず、幹細胞を有する生物であれば、任意の生物について本発明の方法を実施することができる。本発明の方法によって単離可能な幹細胞の由来する生物種は特に制限されないが、例えば、ヒト、マウス、ハムスター、ラット、イヌ、サル、ヤギ、ブタ等を例示することができる。
【００４５】
上記工程（ｂ）において細胞を分裂させるためには、通常、細胞を培養することによって行うことができる。本発明における「細胞の分裂」には、「細胞の複製」、「細胞の増殖」が含まれる。
【００４６】
当業者であれば、所望の細胞について、その細胞の種類に応じて、適宜、細胞の培養を行うことができる。
【００４７】
バイアビリティーの良い条件で単離されている本発明の幹細胞は、好ましくは、自ら増殖し、補助的栄養素の有無によらず増殖・分化するものと考えられる（後述の実施例参照）。
【００４８】
本発明の幹細胞の培養は、特に制限されないが、一例を示せば、通常の培養条件、すなわち、RPMI培地もしくはダルベッコ改変イーグル培地／ハムF１２培地に１０％のウシ胎児血清、１００U/mLのペニシリンG、１００mg/mLのストレプトマイシン、４．５g/Lのグルコースを含む培養液を用いて培養し、３７℃、５％CO2条件下で、１６時間、もしくは２日に一回培養液を交換しながら１週間培養することによって実施することができる。
【００４９】
また、単離した細胞を実際に臨床的に細胞療法に用いる場合には、例えば、１）支持細胞（線維芽細胞）を加える、２）インスリン、白血病阻害因子（LIF）、上皮成長因子（EGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）などの増殖因子を添加する、あるいは３）細胞接着・伸展用間質としてのフィブロネクチンやマトリゲル（三次元的培養）を使用する、などの方法を採用してもよい。
【００５０】
上記工程（ｃ）において、標識された細胞核を有する細胞の選択は、該標識の有無を指標として行う。当業者であれば、標識のために用いた物質（標識化剤）の種類に応じて、該標識の有無を指標として目的の細胞（標識された細胞核を有する細胞）を適宜選択（選別）することができる。例えば、使用した標識化剤が蛍光物質である場合には、該蛍光の有無を指標として幹細胞の選択を、市販のセルソーターを利用して実施することができる。より具体的には、後述の実施例に記載の方法によって本発明の幹細胞を選択することができる。本発明の上記工程（ｃ）において、幹細胞を選択する方法は、特に上記のセルソーターを利用する方法に限定されない。
【００５１】
本発明の標識化剤として磁気ビーズを用いた場合には、該磁気ビーズを有する幹細胞が含まれる細胞浮遊液をマグネットカラム（ベリタス社、ミルテニーバイオテク社など）に通す事により、磁気ビーズを取込んだ幹細胞のみを、簡便に単離する事ができる。ナノ磁性ビーズであれば、細胞分裂により、幹細胞と通常細胞の磁性強度の差別化が簡単にできる。また、ナノ磁性ビーズを本発明の標識化剤として用いることにより、実際の臨床の場において、MRIを用いる事により幹細胞の画像追跡（磁性ビーズMRI）が可能となる。
【００５２】
本発明の単離方法においては、標識の存在が検出された細胞、即ち、標識された細胞核を有する細胞を幹細胞として選択する。
【００５３】
本発明の方法によって単離される幹細胞は、好ましくは、生きた細胞であることを特徴とするものである。
【００５４】
なお、本発明における単離方法は、例えば、幹細胞の選択方法、分離方法、選別方法、精製方法等と表現することも可能である。
【００５５】
本発明の単離方法の一例として、以下にマウスの幹細胞を単離する方法を示すが、本発明の方法はこの方法に特に制限されない。
【００５６】
まず、細胞の細胞核（核酸、核膜等）を染色する蛍光色素をマウスに投与、あるいは細胞株に添加する。これにより、一度全ての生細胞核を蛍光標識する。各臓器、細胞株のターンオーバーにより多少の時間的ずれは生じるが、1-2週間で「self-renewal」している細胞（すなわち幹細胞）の核だけに蛍光色素が残存する。蛍光色素の強度、毒性にもよるが、この時点で同定された細胞は、さらに少なくとも1ヶ月は標識が残存する。この方法は、人間の視点ではなく、マウスあるいは細胞自身の視点で、正確に幹細胞だけを光らせると言う、自然界の法則に忠実に従った方法である。
【００５７】
これにより、生存個体において、各臓器での幹細胞の解剖学的位置・動態を観察することができる。
【００５８】
また、周知の方法で調整した各細胞浮遊液から、セル・ソーター等の市販の細胞選別装置を用いて、蛍光標識された幹細胞だけを迅速に単離し（functional cell-sorting）、必要に応じてその後培養を行う。
【００５９】
本発明で単離される幹細胞は、正常すなわち生理的条件下における幹細胞のみならず、癌性幹細胞のような病理的条件下における幹細胞も含む。
【００６０】
本発明には、本発明の方法によって幹細胞を単離する工程を含む、標識された幹細胞の製造方法が含まれる。
【００６１】
また、細胞核が標識された細胞が細胞分裂後も標識されているか否かを指標とすることによって、所望の細胞について該細胞が幹細胞であるか否かについて検査を行うことが可能である。即ち本発明は、標識された細胞核の有無を指標とする、被検細胞について幹細胞か否かの検査もしくは判別方法を提供する。
【００６２】
本発明の検査方法の好ましい態様としては、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法である。
（ａ）被検細胞の細胞核を標識する工程
（ｂ）前記細胞を分裂させる工程
（ｃ）分裂後の細胞における細胞核が標識されている場合に、被検細胞は幹細胞であるものと判定する工程
【００６３】
上記の「被検細胞」とは、幹細胞か否かの検査（判別）に供したい細胞を指す。上記方法においては、分裂後の細胞における細胞核が標識されている場合に、被検細胞は幹細胞であるものと判定され、細胞核が標識されていない場合に、被検細胞は幹細胞ではないものと判定される。
【００６４】
また、本発明の単離方法において幹細胞は選択的に標識される。このように、幹細胞を選択的に標識する方法もまた本発明に含まれる。該方法は、通常、細胞の細胞核を標識する工程を含む方法である。
【００６５】
上記方法によって標識された幹細胞は、細胞分裂後も標識されており、また、該標識は長期残存することを特徴とする。この「長期」とは、通常の細胞が標識された場合と比べて有意に長い期間を指すが、例えば、２日乃至１週間以上、好ましくは２週間以上、より好ましくは３週間以上、さらに好ましくは１ヶ月以上の期間を指す。
【００６６】
例えば細胞分裂を二回繰り返すと、通常の細胞は標識物質（蛍光色素等）が消失すると考えられる。従って、臓器や細胞の種類によって相違するが、例えば、腸管であれば３日程度、皮膚であれば５日程度で、本発明の幹細胞と通常の細胞とを標識物質の有無を指標として区別することが可能である。また、本発明の上記（ｂ）の工程における細胞の分裂は、少なくとも1回分裂させればよいが、2回以上分裂させることが好ましい。
【００６７】
本発明の方法によって、生存状態の幹細胞を標識することができる。即ち本発明は、生存状態で幹細胞を選択的に可視化する方法に関する。該方法の好ましい態様としては、細胞と細胞核標識化剤とを接触させる工程を含む方法である。なお、本発明において「可視化」とは、必ずしも肉眼で観察される場合にのみ限定されない。種々の検出機器を利用して観測される、もしくは映像化される場合も、本発明の「可視化」に含まれる。
【００６８】
染色物質あるいは蛍光物質等を用いて標識された細胞は、当業者であれば、その標識に利用した物質の種類に応じて、観察手段を適宜選択することができる。標識化剤として染色物質を利用した場合には、例えば、光学顕微鏡を用いて観察することができる。また、蛍光物質（色素）を用いて標識された場合には、通常、蛍光顕微鏡を用いて観察することができる。
【００６９】
本発明はまた、本発明の方法によって可視化された幹細胞を生存状態で観察する方法に関する。該方法の好ましい態様としては、本発明の方法によって幹細胞を可視化する工程を含む方法である。
【００７０】
本発明の方法によって標識された幹細胞を、生存個体で可視化し、その動態を観察することにより画像診断が可能である。
【００７１】
本発明の方法によって単離された幹細胞は、種々の用途に利用することが可能である。例えば、本発明の幹細胞を利用して、幹細胞マーカーを同定することが可能である。
【００７２】
本発明は、本発明の方法によって単離された幹細胞を利用した幹細胞マーカーの同定方法を提供する。
【００７３】
本発明の上記方法の好ましい態様としては、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、幹細胞マーカーの同定方法である。
（ａ）本発明の方法によって、幹細胞を単離する工程
（ｂ）単離された幹細胞におけるマーカーを同定する工程
【００７４】
上記方法において「マーカーを同定する」とは、通常、本発明の方法によって単離される幹細胞が有する特徴であって、他の細胞と区別し得るような特徴を見出すことを言う。具体的には、細胞抗原を同定すること、または、細胞特異的抗体を作製すること等を例示することができる。
【００７５】
例えば、本方法で単離された幹細胞には標識（蛍光色素等）が残っていることから、ゲルシフトアッセイを行い、抗蛍光色素抗体でウエスタンブロッティングをする事により、バンドとして検出することができる。従って、MAS解析などにより、現実的に抗原を検索可能と考えられる。抗原が同定されれば、それに対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を、一般的な公知技術によって作製することができ、その抗体そのものがマーカーとなる。
【００７６】
また、細胞表面の糖鎖を同定すれば、極めて有効なマーカーとなる。さらに、本発明の方法によって単離された幹細胞自体を他種動物に免疫する事で、モノクローナル抗体を作製する事が可能である。この場合、免疫染色に使用できる抗体や、細胞除去機能を有する抗体を確立することができる。
【００７７】
本発明の方法によって単離された癌性幹細胞のマーカー（癌性幹細胞特異的マーカー）を利用することにより、例えば、各種癌の早期診断が可能となる。即ち、本発明の癌性幹細胞特異的マーカーは、癌診断マーカーとして有用である。
【００７８】
本発明の方法によって単離された幹細胞を用いて、幹細胞の抗原を同定する方法、または幹細胞に対する抗体（好ましくは、幹細胞特異的抗体）を作製する方法もまた、本発明に含まれる。
【００７９】
本発明の幹細胞の抗原の同定方法は、例えば、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む方法である。
（ａ）本発明の方法によって、幹細胞を単離する工程
（ｂ）単離された幹細胞における抗原を同定する工程
【００８０】
さらに、癌組織から調製される細胞集団を用いて本発明の方法によって単離される癌性幹細胞を用いて該細胞のマーカーを同定すれば、癌性幹細胞特異的マーカーを取得することができる。
【００８１】
本発明の方法によって同定されるマーカー（例えば、糖鎖や抗体）は実際の臨床現場において診断マーカーとして有用である。例えば、「取得した癌幹細胞特異的な糖鎖マーカーや抗体を用いることにより、血液や尿検体中の量を調べる事で癌を早期発見するための診断が可能である。また、癌性幹細胞特異的な糖鎖または抗体マーカーを核医学的に標識し、被験体に投与する事により、CT、MRI、PET/SPECTなどの一般的な画像診断装置を用いて、検診的に画像診断が可能である。さらに、本発明の標識化剤として生体内に投与しても安全な物質（例えば、安全な蛍光核酸標識物質など）を用いた場合には、被験体に標識物質を投与し、2-3週間後に蛍光検出画像装置（例えば、LEDレーザー顕微鏡、CCDカメラなど）を用いて標識残存幹細胞を、画像的に検出できる。この際、異常な塊を形成している部位があれば、それが超早期癌であると診断可能である。例えば、胃／大腸カメラ検査で事前に標識しておけば、極早期の癌を簡便に検出、診断、早期治療が可能である。
【００８２】
さらに本発明は、本発明の方法によって単離された幹細胞を利用した幹細胞特異的発現遺伝子の同定方法に関する。例えば、該方法によって取得される遺伝子の発現を抑制することにより、幹細胞に関連する疾患に対する治療が可能である。
【００８３】
遺伝子発現を抑える目的として、例えば、（１）siRNA／RNA干渉等により、癌性幹細胞や病的幹細胞に発現する遺伝子をノックダウン／サイレンシングする事によって、癌治療、慢性感染症（水虫、C型肝炎、帯状疱疹など）治療を行う、（２）特異的な遺伝子が見つかった場合、それをもとに幹細胞特異的なバイオマーカーを同定する、等が挙げられる。
【００８４】
本発明の上記方法の好ましい態様としては、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、幹細胞特異的発現遺伝子の同定方法である。
（ａ）本発明の方法によって幹細胞を単離する工程
（ｂ）該幹細胞における遺伝子発現状態と、対照細胞における遺伝子発現状態を比較する工程
（ｃ）該幹細胞において発現状態が変化している遺伝子を、幹細胞特異的発現遺伝子として選択する工程
【００８５】
上記方法において「対照細胞」とは、通常、幹細胞以外の細胞を指し、例えば、SYTO GREEN陰性等が挙げられる。
【００８６】
上記工程（ｃ）においては、幹細胞において発現状態が亢進している遺伝子を選択することが好ましい。
【００８７】
また、疾患組織から調製される細胞集団を用いて本発明の方法によって単離される病的幹細胞を用いて上記方法を実施することにより、疾患の治療のための標的遺伝子を同定することが可能である。
【００８８】
本発明の上記方法の一例を示せば、まず、本発明の標識化剤としてSYTO GREENを用いた場合、SYTO GREEN陽性、陰性、と別個に単離し、いわゆる対照となる別の細胞群（スタンダード）を加えた、最低限3種類の群で、発現の相違を検索する。そして、SYTO GREEN強陽性の幹細胞群で特に強く発現している遺伝子、もしくは、選択的に発現している遺伝子を同定し、治療標的とする。遺伝子発現解析法としては、Micro-array（DNA chip）法、ATAC-PCR法、iAFLP法、SAGE法、通常のRT-PCR法など、一般的な公知技術を利用することができる。
【００８９】
上記方法によって同定される幹細胞特異的発現遺伝子について、例えば、RNA干渉(RNAi)、アンチセンス分子（核酸）、アプタマー分子（核酸）等により該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００９０】
発現抑制の標的となる遺伝子の配列が判明していれば、該遺伝子の発現を効率的に抑制可能なRNAi効果を奏する核酸(siRNA)を、適宜調製することが可能である。siRNAを構成するRNAの配列は、例えば、市販のソフトウェア等を利用して、通常、標的遺伝子の配列を基に、適宜選択することができる。siRNAを構成するRNAの配列が決まれば、該配列を基に、siRNAまたはsiRNA発現ベクターを適宜作製することが可能である。
【００９１】
これらのsiRNAはそれ単体で、または該siRNAとアテロコラーゲン、もしくはリポソームなどの混和で薬剤を作製し、生体内に局所的・全身的に投与することにより、遺伝子サイレンシング治療を行うことが可能である。
【００９２】
従って本発明は、本発明の方法によって同定される遺伝子の発現を抑制する工程を含む、遺伝子サイレンシング治療方法を提供する。遺伝子の発現を抑制するためには、例えば、RNA干渉(RNAi)法を利用することができる。
【００９３】
また、RNAi干渉以外にも任意の遺伝子の発現を抑制し得る技術であれば、本発明の遺伝子サイレンシング治療に利用することが可能である。例えば、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー等を利用して、幹細胞特異的発現遺伝子の発現を抑制させることが可能である。
【００９４】
また本発明は、本発明の方法によって単離される幹細胞を提供する。即ち、本発明の方法によって単離される幹細胞自体も本発明に含まれる。
【００９５】
本発明には、細胞集団に含まれる幹細胞を濃縮もしくは精製する方法が含まれる。従って、本発明の幹細胞は、幹細胞のみからなる細胞集団に必ずしも限定されず、実質的に幹細胞が含まれる細胞集団であってもよい。実質的に幹細胞が含まれるとは、通常、本発明の方法を実施する前の細胞集団における幹細胞の割合と比較して、幹細胞の割合が増加している程度に幹細胞が含まれていることを指す。従って、幹細胞を実質的に含む細胞集団もまた本発明の幹細胞に含まれる。より具体的には、例えば、細胞集団における幹細胞の割合が、通常50%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、最も好ましくは99%以上であるような細胞集団である。
【００９６】
例えば、通常のセルソーティングの手法によって、８０〜９０％の純度で本発明の幹細胞を含む細胞集団を取得することができる。また、より狭い範囲にゲーティング（フローサイトメーター／セルソーターのモニター上で、厳密に単離するべく分画を設定する）をかけることにより、９９％以上の純度で本発明の幹細胞を含む細胞集団を得ることが可能である。
【００９７】
本発明の幹細胞の好ましい態様として、例えば、以下の幹細胞もしくは幹細胞株が挙げられる。なお、本発明の幹細胞は、通常、生きた状態の細胞（生細胞）であることを特徴とする。
（１）疾患組織から調製される細胞集団から、本発明の方法によって単離される病的幹細胞
（２）臓器組織から調製される細胞集団から、本発明の方法によって単離される体性幹細胞
（３）癌組織から調製される細胞集団から、本発明の方法によって単離される癌性幹細胞
（４）試験管内で樹立された細胞株集団から、本発明の方法によって単離される幹細胞株
（５）本発明の方法によって単離される幹細胞から樹立もしくは作製される幹細胞株（幹細胞特異的細胞株）
【００９８】
本発明の幹細胞から細胞株を樹立させるには、例えば、「Robertson EJ. Biology of Reproduction 44:238-245, 1991」などの一般的手法によって適宜実施することができる。
【００９９】
一例を示せば、以下の手順によって本発明の幹細胞から細胞株を樹立させることができる。
（１）幹細胞を単離する、（２）3-5日、フィーダー細胞（線維芽細胞）を添加し、もしくは添加せずに培養する、（３）コロニーを形成させる、（４）35mm程度の培養皿に移し替えて、さらに4-7日間培養する、（５）継代維持する。
使用する細胞培養用培地も、当業者においては細胞の種類等を勘案して適宜最適な培地を調製することができるが、例えば、「100mL/DMEM＋4.5g/グルコース＋0.5mL/NEAA＋1mL/ヌクレオシド溶液＋0.2mL/2-メルカプトエタノール溶液」を例示することができる。また必要に応じて、適宜サイトカインを該培地へ添加してもよい。
【０１００】
上記方法によって本発明の幹細胞を樹立させることにより幹細胞株（例えば、幹細胞特異的細胞株）を製造することができる。該製造方法もまた、本発明に含まれる。本発明の幹細胞株の製造方法の好ましい態様としては、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む方法である。
（ａ）本発明の方法によって幹細胞を単離する工程
（ｂ）該幹細胞について樹立細胞株を作製する工程
【０１０１】
また、本発明の幹細胞の好ましい態様としては、以下の性質を有する。
（ａ）自己複製(self renewal)能
（ｂ）長期生存(long-lived)能
さらに、本発明の幹細胞は、好ましくは、標識された細胞核が細胞分裂後も標識されていることを特徴とする。
【０１０２】
本発明の幹細胞自体も、疾患治療のための医薬として利用することが可能である。従って本発明は、本発明の方法によって単離される幹細胞を有効成分とする医薬組成物を提供する。
【０１０３】
体性幹細胞は全ての臓器・器官に認められる細胞であることから、本発明の医薬組成物は、全ての臓器についての疾患（機能不全等）を対象とする。
【０１０４】
本発明の医薬組成物は、例えば、アルツハイマー病やパーキンソン病といった神経変性疾患、心筋梗塞や心筋症などの心血管系疾患、腎不全、肝不全、糖尿病、癌、脊髄損傷、多発性硬化症などの自己免疫性疾患に対して、治療もしくは予防効果を有することが期待される。また、上記の他にも例えば、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、肺線維症、炎症性腸疾患などの難病の他、視力消失、聴覚消失、味覚消失、脱毛症、あるいは、乳ガン術後の再建など、極めて多彩な応用範囲が考えられる。
【０１０５】
本発明の方法によって単離される幹細胞の細胞抗原、および、該幹細胞と結合する抗体もまた、本発明に含まれる。該抗原は、幹細胞ワクチンとして利用することが可能である。該抗原は、幹細胞特異的に存在する抗原（幹細胞特異的抗原）であることが好ましい。例えば、癌性幹細胞（例えば乳ガン）から取得される特異的抗原は癌（乳ガンなど）の発症・発育に対して予防効果を有する。ヘルペスウイルス感染幹細胞から取得される特異的抗原は、成人後の帯状疱疹再発に対して予防効果を有する。また、網膜血管幹細胞から取得される特異的抗原は、糖尿病性網膜症による突然の失明に対して予防効果を有する。
【０１０６】
また、上記抗体は、所謂「抗体医薬」として利用することが可能である。該抗体は、幹細胞を特異的に認識する抗体であることが好ましい。癌性幹細胞（例えば乳ガン）から取得される幹細胞特異的抗体は、癌（例えば、乳ガン）に対して治療効果を有する。また、C型肝炎ウイルス感染幹細胞から取得される幹細胞特異的抗体は、インターフェロン療法の無効な慢性C型ウイルス性肝炎や、C型肝炎ウイルスによる急性／劇症肝炎に対して治療効果を有し、かつ慢性肝炎の肝硬変や肝癌への進行を阻止する。
【０１０７】
従って本発明は、本発明の方法によって単離される幹細胞の抗原を有効成分とする幹細胞ワクチン、および、本発明の幹細胞に対する抗体（好ましくは、本発明の幹細胞を特異的に認識する抗体）を有効成分とする抗体医薬を提供する。
【０１０８】
また、本発明の幹細胞ワクチン、または本発明の幹細胞に対する抗体を製造する方法もまた本発明に含まれる。
【０１０９】
本発明の幹細胞ワクチンの製造方法の好ましい態様としては、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む方法である。
（ａ）本発明の方法によって幹細胞を単離する工程
（ｂ）該幹細胞の抗原を同定する工程
【０１１０】
また、本発明の抗体の製造方法の好ましい態様としては、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む方法である。
（ａ）本発明の方法によって幹細胞を単離する工程
（ｂ）該幹細胞もしくはその一部を抗原とする抗体を作製する工程
【０１１１】
また、癌組織から調製される細胞集団から本発明の方法によって単離される癌性幹細胞に対する抗体を作製することにより、特定の臓器に対する抗癌抗体を製造することが可能である。
【０１１２】
幹細胞に対する抗体は、通常、幹細胞もしくはその一部を抗原として、一般的な抗体作製技術によって製造することが可能である。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明の幹細胞もしくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血ぺいを除去することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記細胞もしくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明の細胞の精製や検出などに利用することが可能である。本発明には、本発明の幹細胞に結合する抗体が含まれる。これらの抗体を用いることにより、本発明の幹細胞の存在部位の検出、または、本発明の幹細胞が含まれるか否かの判別等を行うことができる。
【０１１３】
本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、本発明の幹細胞もしくはその抗原と結合する限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかに、ヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、低分子抗体さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。即ち、本発明における抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体(scFv)、ヒト化抗体、並びに、Fab、Fab’、F(ab')2、Fc、Fv等の抗体断片が含まれる。このような抗体は必要に応じ、PEG等により修飾されていてもよい。また、β‐ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、GST、緑色蛍光タンパク質(GFP)等との融合タンパク質として製造して、二次抗体を用いずに検出できるようにすることも可能である。また、ビオチン等により抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の検出、回収を行い得るように改変することもできる。
【０１１４】
抗体取得の感作抗原として使用される本発明の幹細胞もしくはその一部のペプチドは、その由来となる動物種について制限されないが、哺乳動物、例えばマウス、ヒト由来であることが好ましく、特にヒト由来であることが好ましい。
【０１１５】
本発明の幹細胞に対する抗体は、本発明の幹細胞と結合することにより、該細胞の機能を抑制し、例えば、幹細胞の異常に起因する疾患に対する治療効果もしくは改善効果が期待される。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
【０１１６】
また本発明は、本発明の方法によって単離される幹細胞から作製される人工臓器に関する。該人工臓器は、臓器組織に通常存在する幹細胞を本発明の方法によって単離し、該幹細胞を人工的に分化誘導させることによって作製することができる。
【０１１７】
幹細胞から所望の臓器を作製するためには、一般的な技術（例えば、ティッシュエンジニアリング等）によって、使用する幹細胞の種類に応じ適宜実施することができる。
【０１１８】
一例を示せば、マトリックスなどを用いて人工的に構築した「疑似臓器」としての模型に、本発明の方法によって単離した幹細胞を加える（培養する）ことにより、機能的にも臓器として役割を果たす人工臓器を作製することができる。
【０１１９】
本発明の方法によって人工臓器を製造する方法もまた本発明に含まれる。本発明の人工臓器の製造方法の好ましい態様としては、本発明の幹細胞を分化させる工程を含む方法である。
【０１２０】
また本発明は、本発明の幹細胞、または該幹細胞を分化させた人工臓器を、個体へ移植することを特徴とする治療もしくは予防方法に関する。
【０１２１】
例えば、本発明の幹細胞を臓器へ移植することにより、該臓器に関連する疾患を治療することができる。また、本発明の人工臓器を移植することにより、該臓器に関連する疾患を治療もしくは予防することも可能である。
【０１２２】
また、本発明の幹細胞ワクチン、または本発明の抗体を個体へ投与することにより疾患を予防もしくは治療することが可能である。
【０１２３】
さらに本発明は、本発明の方法によって単離される癌性幹細胞株（癌性幹細胞特異的細胞株）、および／または通常の癌細胞株を用いて、細胞増殖や細胞死の状態を比較することより、抗癌剤もしくは抗癌剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。例えば、癌性幹細胞において特異的に発現している遺伝子の発現を抑制する化合物は、抗癌剤として期待される。
【０１２４】
本発明の抗癌剤のスクリーニング方法の好ましい態様としては、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む方法である。
（ａ）本発明の方法によって癌性幹細胞を単離する工程
（ｂ）該癌性幹細胞と被検化合物とを接触させる工程
（ｃ）該癌性幹細胞の細胞増殖もしくは細胞死の状態を検出する工程
（ｄ）対照と比較して、癌性幹細胞の細胞増殖を抑制する、または細胞死を促進する化合物を選択する工程
【０１２５】
本方法に用いる被検化合物としては、特に制限はない。例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
細胞への被検化合物の「接触」は、通常、細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。
【０１２７】
上記工程（ｃ）における細胞増殖または細胞死の状態は、例えば、工程（ｂ）の後、幹細胞を培養し、その培養液における幹細胞の生存数を指標に評価することができる。即ち、対照と比較して生存数もしくは増殖の程度が低下している場合には、細胞増殖が抑制されている、または、細胞死が促進されているものと判定される。
【０１２８】
本発明のスクリーニング方法における「対照」は、当業者においては、その実施の態様に応じて「対照」として適切なものを、適宜選択（設定）することができる。例えば、被検化合物を接触させていない状態の幹細胞、または、通常の幹細胞等を「対照」として利用することができる。即ち、被検化合物の有する効果の有無を判断し得るものであれば、本発明の「対照」に含まれる。
【０１２９】
上述のように本発明は、本発明の幹細胞、幹細胞ワクチン、または幹細胞に対する抗体を含んで成る薬剤（医薬組成物）を提供する。
【０１３０】
本発明の薬剤は、公知の製剤学的製造法によって、製剤化することもできる。例えば、薬剤として一般的に用いられる適当な担体、または媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油（例、ゴマ油、オリーブ油等）、着色剤、乳化剤（例、コレステロール）、懸濁剤（例、アラビアゴム）、界面活性剤（例、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系界面活性剤）、溶解補助剤（例、リン酸ナトリウム）、安定剤（例、糖、糖アルコール、アルブミン）、または保存剤（例、パラベン）、等と適宜組み合わせて、生体に効果的に投与するのに適した注射剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経口剤等の医薬用製剤、好ましくは注射剤に調製することができる。
【０１３１】
また体内への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することができる。
【０１３２】
また本発明は、幹細胞の単離・精製用キット、および、本発明の幹細胞ワクチン、幹細胞に対する抗体または人工臓器の製造用キットを提供する。
【０１３３】
本発明のキットは、例えば、細胞核標識剤、細胞を培養するための培地、培養液等を構成要素とすることができる。
【０１３４】
本発明の幹細胞の単離・精製用キットの好ましい態様においては、細胞核標識化剤、および、培地もしくは培養液を少なくとも構成要素として含むキットである。
【０１３５】
また本発明のキットには、サンプル（対照）として、本発明の幹細胞を含めることができる。さらに、標識された幹細胞を検出もしくは選別するための方法に使用するための試薬類を、本発明のキットに含めることができる。
【０１３６】
また、本発明の幹細胞ワクチン、幹細胞に対する抗体の製造用キットは、好ましくは細胞核標識化剤、細胞の培養のための培地、ワクチンもしくは抗体製造のための試薬類等を構成要素とする。
【０１３７】
上記「培地」としては、一般的に細胞の培養に使用される培地を利用することができる。当業者においては、上記「培地」の基本的な組成等について、公知文献あるいは市販のマニュアル等から容易に知ることができる。
【０１３８】
また本発明のキットには、本発明の細胞を分離するための各種方法、例えば、セルソーティングに用いる各種試薬類を含めることができる。また、本発明のキットの仕様書、該方法の指示書等を適宜パッケージングさせることができる。
【０１３９】
本発明において「個体」とは、通常ヒトを指すが、ヒト以外の動物であってもよい。即ち、幹細胞の単離が可能な動物であれば特に制限されず、通常ヒトであり、例えば、マウス、ハムスター、ラット、イヌ、サル、ヤギ、ブタ等の非ヒト動物を例示することができる。また、ショウジョウバエや線虫などから取得される幹細胞は、より基礎的な研究分野に応用することが可能である。
【０１４０】
さらに本発明は、個体へ細胞核標識剤を投与する工程を含む、幹細胞を標識する方法に関する。該方法により、生存個体のまま、幹細胞を標識もしくは検出することが可能である。
【０１４１】
また、本発明の上記方法は、幹細胞と幹細胞以外の細胞との識別に利用することができる。通常、本発明の上記方法によって標識された細胞の標識レベルを指標とすることにより、幹細胞と、それ以外の細胞とを識別することが可能である。後述の実施例で示すように、本発明の上記方法によって、例えば、癌性幹細胞、通常幹細胞、通常癌細胞の３種類の細胞を、適宜、識別することができる。
また、本発明の方法によって、複数種の細胞が含まれる細胞群から、幹細胞を選択的に単離することが可能である。
さらに、本発明の方法によって標識される幹細胞の量を指標とすることにより、幹細胞を選択的に殺傷する物質、または幹細胞の増殖を阻害もしくは上昇させる物質をスクリーニングすることが可能である。
【０１４２】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１４３】
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されない。
【０１４４】
〔実施例１〕生存マウスにおける組織幹細胞の組織切片における標識例：肝臓
生後2日齢のC57BL/6マウス（日本クレア社製）ではほぼすべての体細胞が活発に増殖している。このような増殖細胞核を標識する目的で、ブロモデオキシウリジン（BrdU；Sigma-Aldrich社製、5 mg／mL、20μL／匹）を12時間おきに合計3回皮下注射し、その後8週齢まで経時的に追跡調査した。BrdUはチミジン類似体であり、細胞周期のS期の間にDNA中に取り込まれる（Taylor et al. Cell 102:451-461, 2000）。経時的にマウスを屠殺し、その肝臓を採取した。採取した肝臓の第2葉の一部を凍結用包埋剤OCTコンパウンド（Miles社製）に包埋し、液体窒素で凍結ブロックを作製した。その凍結ブロックからクライオスタット（Microm社製）を用いて厚さ6μmの切片を作製した。得られた切片をアセトン（和光社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、BrdU染色キット（Zymed社製）を用いて添付書類通りに免疫染色反応を行い、BrdUを取り込んでいる細胞を、光学顕微鏡（ライカ社製）で観察した。
【０１４５】
得られた肝組織の免疫染色像の典型例を図１に示す。生後1週齢の肝臓ではほぼすべての肝細胞がBrdUを取り込んだままであるのに対し、2週齢では激減し、4週齢になるとわずかにしか検出されなくなった。これらのBrdU標識残存細胞は少なくとも観察した期間、8週齢まではわずかながら検出された。すなわち、生理的なターンオーバー（細胞分裂、分化という新陳代謝）に従い、ほぼすべての肝細胞が消失し、新しい肝細胞に置き換わっている事を示す。一方、BrdU標識残存細胞は肝細胞全体で数％存在している事から、これらの標識残存細胞は、臓器内で長期残存するという、幹細胞の性質を満たす小細胞集団である事が判明した。
【０１４６】
〔実施例２〕組織幹細胞の証左：肝修復
実施例１で作成した8週齢のマウスに、四塩化炭素（50μL/100 g体重；Sigma-Aldrich社製）を腹腔内注射し、経時的に実施例１と同様の方法で肝臓の免疫染色像を検討した。この実験系は、広範な肝細胞壊死を誘発した後に肝細胞の再生が促進される、肝障害-再生モデル（Morrison GR. Arch. Biochem. Biiphys. 111:448, 1965）として、最も汎用されている実験系である。四塩化炭素投与1日後には広範な肝細胞壊死が認められる一方、組織残存肝細胞の速やかな増殖を認めた（図２）。傷害後の肝細胞再生が促進されてくる3日目には、組織幹細胞が明確に一塊となって増加し、壊死組織を修復している像が見受けられた。すなわち、BrdU標識残存細胞は、機能的にも組織幹細胞であると考えられた。
【０１４７】
〔実施例３〕組織幹細胞の証左：肝癌形成
実施例１で作成した4週齢の雄マウスに、化学性発癌誘発剤として実験的に汎用されているDEN（N-nitrosodiethylamine；50μg／匹、Sigma-Aldrich社製）を腹腔内に注射し、肝細胞癌を誘発した（Yang X et al. Int J Cancer 118:1869-1876, 2006）。DEN投与3ヶ月後に実施例１と同様の方法で肝組織切片を作成し、BrdU染色により組織幹細胞の動態を解析した。結果を図３に示す。肉眼的な腫瘍像はまだ形成されていないが、組織学的には幹細胞を中心とした超早期の腫瘍形成像を観察した。本実施例により、組織幹細胞から癌化を生じてくる事が示された。
【０１４８】
〔実施例４〕生存マウスにおける組織幹細胞の蛍光標識例：肝臓
BrdU標識細胞を検出するためには、塩酸処理など、核膜や核酸に傷害を与える方法しか選択できない、すなわち、既に屠殺された後の組織切片や、組織から調整した細胞浮遊液でしか検出し得ないため、幹細胞を単離する事、ならびに、生存個体における幹細胞の動態を追跡調査する事は不可能であった。本発明者は、鋭意研究を進めた結果、このような技術的課題を克服する、新規の幹細胞単離法を発明した。
【０１４９】
２日齢のC57BL/6マウス（日本クレア社製）の全ての生細胞核を染色する目的で、核酸ならびに核膜に浸透する蛍光色素である、SYTO GREEN-Fluorescent Nuclear Acid Stain（モレキュラー・プローブ社製、50 nM、20μL／匹）を12時間おきに合計3回皮下注射し、その後同一のマウスで8週齢まで経時的に追跡調査した。SYTO GREENは低親和性の核酸結合物質で、生細胞の膜を介して受動的に拡散し、核酸を染色する（Chen A & McConnell SK, Cell 82:631-341, 1995）が、現在まで生存マウスで使用された事が全く無かった。
【０１５０】
腹腔麻酔後、上腹部正中切開を施し、肝臓の前葉を露出させ、蛍光実体顕微鏡（ライカ社製）で観察した。1週齢における典型的な結果を図４に示す。ほぼ全ての肝臓幹細胞の核が緑色の蛍光色素を取り込んでいた。本実施例により、SYTO GREENを生体に投与する事により、生存個体においても生細胞の核酸ならびに核膜も染色可能である事が示された。なお、他の蛍光ナノクリスタル（QUANTUM DOT社製）でも本標識法は代替可能である。
【０１５１】
同一マウスを4週齢で同様に観察したところ、図４の典型例に示すように、SYTO GREEN標識肝細胞は、肝細胞全体の数％に激減していた。すなわち、生後2日目では、SYTO GREEN陽性細胞、すなわち全ての肝細胞は活発に増殖・複製を示していたが、4週目には生理的ターンオーバーでほとんどの細胞が新しい肝細胞に置き換わっている事が示された。この結果は、4週齢におけるSYTO GRENN標識残存肝細胞が、自己複製能力と長期生存能力を兼ね備えた、組織幹細胞であることを示している。
【０１５２】
また、本マウスを用い実施例１と同様の方法で肝臓の組織切片を作成し、蛍光実体顕微鏡でその配置を確認した。SYTO GREEN標識残存肝細胞は、切片レベルでも実施例１のBrdU標識残存細胞とほぼ同じ分布を示した（図４）。
【０１５３】
〔実施例５〕生存マウスにおける組織幹細胞の蛍光標識例：大腸
実施例４と同一個体である4週齢のマウスの他臓器も検討し、一例として大腸を示した。大腸の組織幹細胞は、陰窩底部に配置する事がほぼ確立されてきたためである（総説；Fuchs E et al. Cell 116: 769-778, 2004）。実施例４と同様の方法で生存個体における蛍光実体顕微鏡を用いた観察では、大腸内腔にSYTO GREEN強陽性の細胞が散見された（図５）。また、実施例１と同様の方法で大腸組織切片を作成し、蛍光実体顕微鏡で観察したところ、既報のごとく陰窩底部に検出された（図５）。本標識法によって、生存個体のまま組織幹細胞を検出する事が初めて可能になった事が示された。
【０１５４】
〔実施例６ａ〕生存マウスにおける組織幹細胞の蛍光標識応用例：肝臓
2週齢のC57BL/6マウス（日本クレア社製）にSYTO GREEN（50 nM、100μL／匹）を一回静脈内注射し、4週間後、実施例４と同様の方法で、生存したまま蛍光実体顕微鏡で観察した。図６（下図）に示すように、より単純化した本実施例でも肝臓組織幹細胞が標識可能であった。また、実施例１と同様の方法で肝臓組織切片を作成し、IV型コラーゲンとの蛍光免疫組織学的解析を行った。共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、標識直後の肝臓においては全ての細胞核が染色されているのに対し（図６上左図）、4週間後の肝臓においては組織幹細胞のみが検出できた（図６上右図、矢印）。すなわち、組織学的な詳細な検討においても、本発明の原理を確認できた。
【０１５５】
〔実施例６ｂ〕生存マウスにおける組織幹細胞の蛍光標識応用例：肝臓癌性幹細胞
実施例３と同様の方法で、４週齢のC57BL/6マウスにDEN（５０μg／匹）を腹腔内に注射し、肝細胞癌を誘発した。DEN投与９ヶ月後のマウスにSYTO GREEN（50 nM、100μL／匹）を一回静脈内注射し、２週間後、実施例４と同様の方法で、生存したまま蛍光実体顕微鏡で観察した。図１２（左図）に示すように、サイズの小さい、早期癌形成巣と判定できる病巣には、癌性幹細胞の小集族と考えられる数個のSYTO GREEN輝度の高い細胞集団塊が認められた。一方、既に肉眼的に明確に検出できる程度のサイズまで増大した癌病巣（左図、点線内）には、このような癌性幹細胞は極わずかにしか認めなかった。したがって、癌性幹細胞から分化してきた娘細胞、すなわち、通常の癌細胞では、本発明の原理通り、色素の残存が認められない事が判明した。また、孤立するSYTO GREEN陽性細胞が散見されるが、これは通常の肝幹細胞である。図１２（右図）に強拡大像を示すと、点線内の癌病巣の中で、SYTO GREEN陽性癌性幹細胞の小集族巣と、SYTO GREEN陰性の娘癌細胞が一塊となって存在している様子が明らかである。本実施例により、本発明は癌性幹細胞、通常幹細胞、通常癌細胞という３種類の識別がその輝度レベルに応じて容易に成せる事が判明した。すなわち、本法によって、癌性幹細胞の画像的検出を、肉眼的には検出できないレベルの早期から明確に診断できる。
【０１５６】
〔実施例７〕組織幹細胞の単離
実施例４と同様の方法で作成した4週齢マウスの肝臓を採取し、既報のごとく肝細胞の細胞浮遊液を、RPMI1640培地に10％ウシ胎児血清（以下、FCSという）と100 U/mLのペニシリンGと100 mg/mLのストレプトマイシンとを添加した培養液中（全てGIBCO社製）に調整した（Yoneyama et al. J. Exp. Med. 193:35-49, 2001）。新鮮に調製した肝細胞浮遊液を直ちにフローサイトメーター（COPASセルソーター、Union Biometrica Inc.社製）で解析した。図７に示す通り、SYTO GREENにより蛍光は、肝細胞分離後も有効であった。ここでSYTO GREENhighとSYTO GREENnegativeの細胞で、各々96穴プレートに細胞1個ずつソーティングを行った。96穴プレートにはコーティングを施さず、肝細胞用無血清培地（HepatoZYME-SFM、GIBCO社製）で3日間培養したところ、SYTO GREENnegativeの細胞はコロニー形成を認めなかったのに対し、SYTO GREENhighの細胞群では、コロニーの形成を認めた（図７）。すなわちSYTO GREENhighの細胞群は、培地のコーティング処理や、培養液中の増殖因子などの添加無しに、極めて高い増殖能を有する事が判明した。
【０１５７】
〔実施例８〕単離した組織幹細胞による肝細胞索様構築の形成
実施例７で単離し、増殖してきたSYTO GREENhighの細胞群を、コーティング無しの10 cm培養ディッシュに播種し、24時間培養した。その結果、ディッシュ底部に、肝組織切片に酷似した、単層の肝細胞索様構築が迅速に形成されていた（図８）。本単離法により単離されたSYTO GREENhighの細胞群は、臓器固有の形状を構築させてくる能力を有している事が示された。
【０１５８】
〔実施例９〕ヒト癌細胞株における癌性幹細胞の蛍光標識例：肺胞上皮癌
ヒト肺癌由来の肺胞上皮細胞株A549（J. Nat. Cancer Inst. 51:1417-1423, 1973）をDMEM培地に10％FCSと100 U/mLのペニシリンGと100 mg/mLのストレプトマイシンとを添加した培養液中（全てGIBCO社製）で培養している条件下において、SYTO GREENを5 ng/mLの濃度で添加した。添加1時間後に全ての細胞核が標識されているのに対し、1週間後にはコンフルエントになっているにも関わらず、標識されている細胞は数％にまで減少していた（図９）。この結果は、培養細胞が分裂・増殖する過程においても、癌性幹細胞だけはその定義通りに自己複製を続け、核酸に結合したSYTO GREENが残存する事を示している。したがって本発明は、通常の癌細胞株においてもその原理を応用でき、あらゆる癌細胞株中に潜む癌性幹細胞を選択的かつ容易に標識する事が可能であると判明した。
【０１５９】
〔実施例１０〕ヒト癌細胞株からの癌性幹細胞の単離
SYTO GREENhighの細胞群は、実施例７と同様の方法で簡便にセルソーターを用いて単離できる。
更に、ヒト脳腫瘍である髄膜種由来の癌細胞株D54をDMEM培地に10％FCSと100 U/mLのペニシリンGと100 mg/mLのストレプトマイシンとを添加した培養液中（全てGIBCO社製）で培養している条件下において、SYTO GREENを5 ng/mLの濃度で添加した。添加1時間後に全ての細胞核が標識されているのに対し、４日後にはコンフルエントになっているにも関わらず、標識されている細胞は数％にまで減少していた（図１３）。この経過は図上のフローサイトメーターで明確かつ迅速に検出できるため、本培養中に被験物質などを添加した場合、癌性幹細胞だけを選択的に殺傷する物質だけを簡便にスクリーニングできる。セルソーターを用いた単離も同様に容易である。
【産業上の利用可能性】
【０１６０】
本発明の実験手技的には極めて簡便かつ再現性も良く、全世界どのような小規模の研究室でも可能であり、幹細胞研究の裾野を一気に拡大する。また、現時点ではヒトの細胞株を用いざるを得ないが、人体毒性のない蛍光色素が開発された場合、生存しているヒト個体でも幹細胞モニタリングが可能となる。これは、画像診断装置（ハード面）の改良・開発との共同作業にはなるが、癌の超早期診断を近未来に現実のものと出来る。
【０１６１】
一方、本発明は、「病的幹細胞」を選択的に治療標的とした抗体医薬品、RNAi医薬品としての開発や、人類医学史上初の幹細胞ワクチンによる癌治療開発への発展が、現実的に期待できる。また、単離した臓器固有の幹細胞の特性、培養条件、生体内での行方、などを詳細に解析する事により、より安全かつ有効な細胞療法への発展が期待できる。肝臓では、培養により容易に肝細胞索シートを形成する事から、組織医工学的に人工肝臓を作製する際に供給すべき最良のソースとなる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】肝組織幹細胞をBrdU標識法で免疫染色した写真である。
【図２】肝組織幹細胞の組織修復における移動を示した写真である。肝組織幹細胞（茶：BrdU）は増殖し、一塊となって壊死部の修復に向かっている。青はIV型コラーゲンを示す。
【図３】肝組織幹細胞による腫瘍化を観察した写真である。
【図４】生存マウスにおける肝組織幹細胞の標識を示した写真である。
【図５】生存マウスにおける大腸組織幹細胞の標識を示した写真である。
【図６】生存マウスにおける肝組織幹細胞の標識を示した写真である。
【図７】肝組織幹細胞の単離を示す写真である。SYTO GREENnegativeの細胞はコロニー形成を認めなかったのに対し、SYTO GREENhighの細胞群では、コロニーの形成を認めた。
【図８】単離肝組織幹細胞による肝細胞索様構築を示した写真である。
【図９】癌細胞株培養過程における癌性幹細胞の標識を示した写真である。
【図１０】癌細胞株からの癌性幹細胞の単離を示した図である。
【図１１】本発明の原理を表す模式図である。
【図１２】生存マウスにおける肝癌性幹細胞の標識を示した写真である。
【図１３】癌細胞株からの癌性幹細胞の単離を示した図および写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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