(57)【要約】【課題】低侵襲で生存率が高く維持しつつ、導入効率も高い遺伝子導入装置及び方法を提供すること。【解決手段】細胞７０へ遺伝子を導入する遺伝子導入装置１０は、導入される遺伝子が分散されたＤＮＡ分散溶液６６中で培養される細胞７０の細胞膜７２を穿孔する導入針４４と、該導入針４４を駆動し、上記細胞膜７２の少なくとも２箇所に穿孔させる駆動ユニット４８及びＺ軸アクチュエータ５６と、を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞へ遺伝子を導入する遺伝子導入装置において、
導入される遺伝子が分散された培養液中で培養される細胞の細胞膜を穿孔する穿孔手段と、
前記穿孔手段を駆動し、前記細胞膜の少なくとも２箇所に穿孔させる駆動手段と、
を具備することを特徴とする遺伝子導入装置。
【請求項２】
前記穿孔手段は、前記細胞内に挿入される微細針と、当該微細針を支持する支持部と、を有する針部であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子導入装置。
【請求項３】
前記微細針は、前記細胞を貫通して前記細胞膜を穿孔することを特徴とする請求項２に記載の遺伝子導入装置。
【請求項４】
前記駆動部は、前記細胞を保持する基板に前記微細針の先端が接触した位置よりも、さらに前記微細針を当該基板方向に移動させることを特徴とする請求項３に記載の遺伝子導入装置。
【請求項５】
前記駆動部は、前記細胞を保持する基板に前記微細針の先端が接触した位置で、前記微細針を当該基板と水平な方向に移動させることを特徴とする請求項３に記載の遺伝子導入装置。
【請求項６】
前記微細針は、前記細胞の外部から少なくとも２箇所前記細胞膜を穿孔することを特徴とする請求項２に記載の遺伝子導入装置。
【請求項７】
前記微細針は、少なくとも２回前記細胞膜を穿孔することを特徴とする請求項６に記載の遺伝子導入装置。
【請求項８】
前記穿孔手段は、前記針部を少なくとも２つ有し、
前記針部の前記微細針は、それぞれ同一の細胞の前記細胞膜を穿孔することを特徴とする請求項６に記載の遺伝子導入装置。
【請求項９】
前記穿孔手段は、レーザ光を前記細胞に貫通させ、焦点位置を前記細胞膜の２箇所に合わせて当該細胞膜を穿孔するレーザであることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子導入装置。
【請求項１０】
遺伝子を導入しようとする細胞を選定する工程と、
前記細胞の細胞膜の少なくとも２箇所を穿孔する工程と、
を有することを特徴とする遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞へ遺伝子を導入する遺伝子導入装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、微細針先端に遺伝子等の導入物質を電気的に吸着させ、この微細針を細胞内に侵入させて、この微細針にパルス電圧を印加することにより、細胞内に導入物質を導入するマイクロインジェクション方法及び装置が開示されている。ここで、微細針の侵入は、微細針と同軸に伸縮する圧電素子を用いて微動することにより行うようになっている。
【特許文献１】ＷＯ０４／０９２３６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記特許文献１は、微細針先端部に遺伝子を保持する方式であり、細胞に対して低侵襲で遺伝子を導入することが可能で、高い生存率を得ることができる。
【０００４】
しかしながら、遺伝子を保持する表面積が微小であるため遺伝子の保持量が非常に少なく、有効な量の遺伝子を細胞内に導入することが難しい。このため、高い導入効率が得られにくいことが課題となっている。
【０００５】
本発明は、上記の点に鑑みてなされたもので、低侵襲で生存率を高く維持したまま、導入効率も高い遺伝子導入装置及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の遺伝子導入装置の一態様は、細胞へ遺伝子を導入する遺伝子導入装置において、
導入される遺伝子が分散された培養液中で培養される細胞の細胞膜を穿孔する穿孔手段と、
上記穿孔手段を駆動し、上記細胞膜の少なくとも２箇所に穿孔させる駆動手段と、
を具備することを特徴とする。
【０００７】
また、本発明の遺伝子導入方法の一態様は、
遺伝子を導入しようとする細胞を選定する工程と、
上記細胞の細胞膜の少なくとも２箇所を穿孔する工程と、
を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、細胞外の溶液中に遺伝子を分散させ、細胞膜の少なくとも２箇所に孔を形成することにより、細胞内に溶液を流通させ遺伝子を導入することで、低侵襲で、生存率が高く、導入効率も高い遺伝子導入装置及び方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を実施するための最良の形態を図面を参照して説明する。
【００１０】
［第１実施形態］
まず、本発明の第１実施形態に係る遺伝子導入装置及び遺伝子導入方法について、図１乃至図３（Ｃ）を参照して説明する。
【００１１】
本実施形態に係る遺伝子導入装置１０は、図１に示すように、細胞を観察するための倒立型顕微鏡１２に備えられる。
【００１２】
倒立型顕微鏡１２は、細胞を収容したワーク１４を載置するワークホルダ１６と、該ワークホルダ１６上の細胞を照明する照明装置１８と、細胞において反射あるいは透過した光、あるいは細胞から発生した蛍光を観察する観察装置２０と、上記ワークホルダ１６をＸ方向及びＹ方向に移動する顕微鏡ＸＹステージ２２と、該顕微鏡ＸＹステージ２２を駆動制御する顕微鏡ＸＹステージコントローラ２４と、上記照明装置１８及び観察装置２０を制御する顕微鏡コントローラ２６と、上記観察装置２０により得られた画像を処理する画像処理装置２８と、該画像処理装置２８により処理された画像を表示するモニタ３０を備え、上記遺伝子導入装置１０及び該倒立型顕微鏡１２の全体を制御する制御コンピュータ３２と、を備えている。
【００１３】
また、上記照明装置１８には、細胞に対して、上記観察装置２０とは反対側から照明光を照射する透過照明光源３４と、該透過照明光源３４から発せられた照明光を細胞に集光するコンデンサレンズ３６と、細胞に対して上記観察装置２０と同一方向から照明光を照射する落射照明光源３８とが備えられている。
【００１４】
一方、上記観察装置２０には、図示しない対物レンズを含む観察光学系と、該観察光学系を介した細胞からの光を撮像して画像を取得するＣＣＤカメラ４０と、細胞からの光を直接観察する接眼レンズ４２とが備えられている。
【００１５】
そして、本実施形態に係る遺伝子導入装置１０は、上記倒立型顕微鏡１２のワークホルダ１６近傍に配置され、細胞に対して挿入される導入針４４と、該導入針４４を保持する導入針保持具４６と、該導入針保持具４６を移動させることで上記導入針４４を移動させる駆動ユニット４８と、該遺伝子導入装置１０を制御するコントロールボックス５０と、を備えている。ここで、駆動ユニット４８は、Ｘ，Ｙ，Ｚ方向に導入針４４を移動させる、例えば、３軸の直線移動機構を備えている。
【００１６】
上記導入針４４は、図２（Ａ）に示すように、カンチレバー５２の自由端側に、該カンチレバー５２の長手方向に対して交差する方向に延びるように設けられている。カンチレバー５２は取付部材５４に固定され、該取付部材５４は、Ｚ軸アクチュエータ５６を介して導入針保持具４６のアーム４６Ａに固定されている。これにより、カンチレバー５２は斜め下向きに保持され、導入針４４はカンチレバー５２の自由端において、先端を鉛直下方に向けて保持されている。
【００１７】
カンチレバー５２は、図２（Ｂ）に示すように、可撓性を持つシリコンベース部５８と、先端に微細な導入針４４が形成されたレバー部６０とから構成されており、上記取付部材５４に対して交換可能に固定される。従って、このカンチレバー５２を交換することで、コンタミネーションのおそれなく、該遺伝子導入装置１０を繰り返し使用することができる。
【００１８】
上記取付部材５４と導入針保持具４６との間に配置されたＺ軸アクチュエータ５６は、例えば、積層された圧電素子により構成され、その印加電圧に応じて伸縮する。図２（Ａ）に示すようにＺ軸アクチュエータ５６は取付部材５４と導入針保持具４６との間に垂直方向に配置されているので、印加電圧を調整することにより導入針保持具４６に対して取付部材５４を垂直方向に微小変位させ、該取付部材５４に鉛直下向きに取り付けられている導入針４４の先端を垂直方向に微小距離、移動させることができるようになっている。
【００１９】
上記コントロールボックス５０は、駆動ユニット４８を制御する駆動ユニット制御回路６２と、Ｚ軸アクチュエータ５６を制御するアクチュエータ制御回路６４とを備えている。
【００２０】
このように構成された本実施形態に係る遺伝子導入装置１０を用いた遺伝子導入方法について以下に説明する。
【００２１】
本実施形態に係る遺伝子導入装置１０を用いて、ワーク１４内の培養液中で培養される細胞に遺伝子を導入するには、まず、細胞培養液中に、遺伝子導入物質を分散させる。そして、顕微鏡ＸＹステージコントローラ２４及び顕微鏡コントローラ２６を作動させ、顕微鏡ＸＹステージ２２の作動により観察したい細胞を顕微鏡観察下に配置する（詳細は後述する第３実施形態において説明する）。その後、駆動ユニット制御回路６２の作動により駆動ユニット４８を作動させ、カンチレバー５２の導入針４４を細胞の上方から細胞に近接させる。ワーク１４の基板６８上に播種された細胞は、２μｍ〜１０μｍ程度の厚みしかないため、この近接した位置からの微細な下降は、アクチュエータ制御回路６４の作動によりＺ軸アクチュエータ５６を作動させることにより行う。
【００２２】
Ｚ軸アクチュエータ５６を作動させることにより、図３（Ａ）に示すように、導入針４４を下降させ基板６８へ近づけていく。これにより、導入針４４の先端が下降していく途中において、ワーク１４内の遺伝子が分散された培養液（以下、ＤＮＡ分散溶液６６）内に進入し、ワーク１４の基板６８上に播種された細胞７０に接触する。ここで、更に導入針４４を下降させていき、細胞膜７２及び核７４に穿孔する。
【００２３】
そして、図３（Ｂ）に示すように、導入針４４の先端が基板６８面と接触する位置まで導入針４４を下降させたならば、基板６８面との接触位置よりも更に導入針４４を降下させる。これにより、図３（Ｃ）に示すように、導入針４４の先端は基板６８面に対して摺動し、この摺動により、底面側も破断し、細胞膜７２の上面側及び底面側の２箇所の破断箇所７６間を貫通する孔が空けられる。
【００２４】
こうして形成された貫通する孔をＤＮＡ分散溶液６６が流通することにより、ＤＮＡ分散溶液６６中に分散した遺伝子が細胞７０内に流入する。
【００２５】
なお、導入針４４を上昇させて導入針４４を細胞７０から引き抜いた後は、ある一定時間が経過すると、細胞膜７２は自己修復により回復し、細胞７０内に遺伝子が取り込まれた状態となる。
【００２６】
このようにして、従来と同様に低侵襲で生存率は高いまま、本実施形態では、更に、遺伝子を細胞７０内に確実且つ高い導入効率で導入することができる。
【００２７】
なお、導入針４４の摺動方法は、上記のように基板６８面との接触位置よりも更に導入針４４を降下させることにより行う手法に限定されるものではなく、例えば、導入針保持具４６のアーム４６Ａも上記Ｚ軸アクチュエータ５６と同様に積層された圧電素子により構成し、該アーム４６Ａを伸縮させることで、導入針４４の先端が基板６８と接触した状態で導入針４４を水平移動させることにより行うこともできる。
【００２８】
勿論、駆動ユニット４８で微細なＸＹＺ方向の調整が可能な場合には、そのようなＺ軸アクチュエータ５６やアーム４６Ａを圧電素子で構成することは不要となる。
【００２９】
［実施例１］
図４（Ａ）は、ＨｅｌａＳ３細胞を蛍光色素溶液中に浸漬し、レーザ走査型顕微鏡で観察した例であり、細胞が接着している基板面より、２〜３μｍ上方の細胞の水平断面像となる。蛍光色素はスルホローダミンを用いている。レーザ走査型顕微鏡では、この蛍光像を観察するため、細胞周辺の溶液部が観察されている。
【００３０】
本実施例１では、この細胞に対して、導入針４４を下降させ細胞内に進入した後、導入針４４先端部が基板６８面と接触した位置から、さらに下降させた。これにより導入針４４先端部を基板６８面上で３μｍほど摺動させ、細胞膜に２箇所の孔を空け、色素溶液を細胞内に導入することを試みている。図４（Ｂ）は、この結果を示す図である。孔を空けた細胞には、細胞周辺の色素溶液が流入するため、細胞内の蛍光強度が大きくなり、細胞内に取り込まれたことが確認できる。
【００３１】
［実施例２］
実施例１と同様に、ＨｅｌａＳ３細胞を遺伝子溶液中に浸漬し、導入を試みた例を示す。導入した遺伝子は、ＧＦＰ蛍光タンパク質を発現する遺伝子であり、導入の正否は蛍光観察により確認することができる。
【００３２】
図５（Ａ）は、遺伝子導入直後の導入を試みた細胞の顕微鏡観察像を示す。観察画像中の複数の細胞を選定し導入を試みている。図５（Ｂ）及び（Ｃ）は、導入２４時間経過後に導入の成否を確認した顕微鏡観察像である。図５（Ｂ）は、位相差観察像であり、２４時間経過後の細胞の状態を示している。図５（Ｃ）は、この細胞を蛍光観察により観察したものであり、導入が成功した細胞では、遺伝子が発現し強い蛍光強度が得られている。この結果より、非常に効率良く、細胞に遺伝子が導入されていることが確認できる。
【００３３】
［第２実施形態］
次に、本発明の第２実施形態に係る遺伝子導入装置及び遺伝子導入方法について、図６乃至図８を参照して説明する。
【００３４】
本実施形態では、図６に示すようなカンチレバー５２を用いるものである。即ち、本実施形態におけるカンチレバー５２は、可撓性を持つシリコンベース部５８と、先端に微細な導入針４４１が形成されたレバー部６０１と、同じく先端に微細な導入針４４２が形成されたレバー部６０２とから構成されている（なお、図６は、導入針４４１，４４２をレバー部６０１，６０２に対して水平な方向に引き延ばして示しているが、実際には、上記第１実施形態の導入針４４及びレバー部６０のように、導入針４４１，４４２はレバー部６０１，６０２の延在方向に対して交差する方向に延びるように設けられている）。
【００３５】
このように構成された本実施形態に係る遺伝子導入装置１０を用いた遺伝子導入方法について以下に説明する。
【００３６】
本実施形態に係る遺伝子導入装置１０を用いて、ワーク１４内の培養液中で培養される細胞７０に遺伝子を導入するには、まず、細胞培養液中に、遺伝子導入物質を分散させる。そして、顕微鏡ＸＹステージコントローラ２４及び顕微鏡コントローラ２６を作動させ、顕微鏡ＸＹステージ２２の作動により観察したい細胞を顕微鏡観察下に配置する。その後、駆動ユニット制御回路６２の作動により駆動ユニット４８を作動させ、カンチレバー５２の導入針４４１，４４２を細胞の上方から細胞に近接させる。
【００３７】
このとき、アクチュエータ制御回路６４の作動によりＺ軸アクチュエータ５６を作動させることにより、導入針４４を下降させていく。これにより、導入針４４１，４４２の先端が下降していく途中において、ワーク１４内のＤＮＡ分散溶液６６内に進入し、ワーク１４の基板６８上に播種された細胞７０に接触する。ここで、図７に示すように、更に導入針４４１，４４２を下降させていき、細胞膜７２及び核７４に穿孔する。
【００３８】
これにより、図８に示すように、細胞７０の外部から２本の導入針４４１，４４２によって細胞７０の上面の細胞膜７２に２箇所の穿孔７８を同時に行うことができる。こうして形成された貫通する孔をＤＮＡ分散溶液６６が流通することにより、該ＤＮＡ分散溶液６６中に分散した遺伝子が細胞７０内に流入する。
【００３９】
なお、導入針４４１，４４２を上昇させて導入針４４１，４４２を細胞７０から引き抜いた後は、ある一定時間が経過すると、細胞膜７２は自己修復により回復し、細胞７０内に遺伝子が取り込まれた状態となる。
【００４０】
以上説明したような本第２実施形態によれば、基板６８との接着力の弱い細胞であっても、微細な導入針が基板６８に対して摺動することにより細胞７０が基板６８から剥離するおそれがなく、遺伝子を確実に導入することが可能である。
【００４１】
また、細胞７０が積層した状態であっても、上側にある細胞のみ選択して遺伝子を導入することが可能である。
【００４２】
なお、上記第１実施形態で説明したような１本の導入針４４を用いたカンチレバー５２を使用して細胞膜７２を２回穿孔することによって、細胞膜７２が自己修復される前に２箇所の穿孔７８を行っても良いことは勿論である。
【００４３】
［第３実施形態］
次に、本発明の第３実施形態に係る遺伝子導入装置及び遺伝子導入方法について、図９乃至図１１を参照して説明する。
【００４４】
倒立型顕微鏡１２の架台８０（図１参照）内には、図９に示すように、弱出力のレーザ光を出射するレーザポインタ８２と、該レーザポインタ８２から出射されたレーザ光を図中上方へ向けて反射するハーフミラー８４と、該ハーフミラー８４で反射されたレーザ光を図中右方向へ反射するハーフミラー８６と、該ハーフミラー８６で反射されたレーザ光を図中上方へ向けて反射するミラー８８と、該ミラー８８で反射されたレーザ光を集光する対物レンズ９０と、該対物レンズ９０の焦点位置を調整するためのアクチュエータ９２とが設けられている。なお、上記ワーク１４の基板６８は、ガラス等の透明な部材で形成されている。また、レーザポインタ８２及びアクチュエータ９２の駆動は、特に図示はしていないが、それぞれ対応するコントローラを介して制御コンピュータ３２によって制御される。
【００４５】
この構成により、細胞７０位置にスポット光が形成され、その像を上記対物レンズ９０、ミラー８８、及びハーフミラー８６を介して上記ＣＣＤカメラ４０で撮像することで、モニタ３０には、図１０に示すような細胞７０とスポット位置９４とが表示される。上記第１及び第２実施形態では、顕微鏡ＸＹステージコントローラ２４及び顕微鏡コントローラ２６を作動させ、顕微鏡ＸＹステージ２２の作動により、このスポット位置９４に遺伝子導入対象として選定された細胞７０を合わせることにより、当該細胞７０の細胞膜７２の２箇所を導入針４４又は４４１，４４２にて穿孔させるようになっている。
【００４６】
これに対して、本第３実施形態に係る遺伝子導入装置１０は、上記第１及び第２実施形態のような導入針４４の代わりに、図９に示すように、高出力のレーザ光源９６とミラー９８とを備え、レーザ光源９６からのレーザ光をミラー９８にて上記ハーフミラー８４方向へ反射させ、上記ハーフミラー８４及び８６、ミラー８８を介して対物レンズ９０により集光して細胞７０に照射するよう構成されている。なお、レーザポインタ８２によるレーザ光とレーザ光源９６によるレーザ光とは、互いのレーザ光軸が一致するように予め校正されている。また、レーザ光源９６の駆動は、特に図示はしていないが、対応するコントローラを介して制御コンピュータ３２によって制御される。
【００４７】
このように構成された本実施形態に係る遺伝子導入装置１０を用いた遺伝子導入方法について、図１１のフローチャートを用いて以下に説明する。
【００４８】
本実施形態に係る遺伝子導入装置１０を用いて、ワーク１４内の培養液中で培養される細胞７０に遺伝子を導入するには、まず、細胞培養液中に、遺伝子導入物質を分散させる。そして、遺伝子を導入しようとする細胞７０を選定し（ステップＳ１０）、その選定した細胞７０をスポット位置９４に移動させる（ステップＳ１２）。
【００４９】
その後、アクチュエータ９２により、図９に矢印で示すように、細胞７０の上下方向に対物レンズ９０を振動する（ステップＳ１４）。このときの振動の振幅は、既知の平均的な細胞７０の高さよりも十分な高さとなるようにする。即ち、焦点位置が細胞７０の底面及び上面を貫通する位置で振動させる。例えば、顕微鏡観察下で上面側で細胞７０がボケ像となる位置である。
【００５０】
そして、細胞膜７２に孔が形成される時間、レーザ光源９６よりレーザ光を照射して、細胞膜７２の少なくとも２箇所を穿孔する（ステップＳ１６）。その後、アクチュエータ９２の駆動を停止して（ステップＳ１８）、終了する。
【００５１】
このようにして、細胞膜７２の上面及び底面を貫通してレーザ光が照射され、両側の細胞膜７２が穿孔されて、貫通孔が形成される。こうして形成された貫通孔をＤＮＡ分散溶液６６が流通することにより、該ＤＮＡ分散溶液６６中に分散した遺伝子が細胞７０内に流入する。細胞膜７２は、自己修復により回復し、細胞７０内に遺伝子が取り込まれた状態となる。
【００５２】
以上のように、本第３実施形態によれば、レーザ光により穿孔するため、高速に穿孔が可能である。特に、高速に対物レンズ９０を振動させながらレーザ光を照射するため、細胞膜７２の上面及び底面に均一にレーザ光を照射することができ、短時間、即ち、低侵襲で細胞７０を貫通する穿孔を形成できる。
【００５３】
また、細胞７０に接触する導入針の交換、滅菌等のメンテナンスが不要であるため、性能の維持が容易である。
【００５４】
なお、レーザ光源９６からのレーザ光の照射は、上記アクチュエータ９２の動作に連動させて間欠的に行うことで、細胞膜７２の上面及び底面の２箇所のみに穿孔を行うようにしても構わない。
【００５５】
更には、上記アクチュエータ９２によりレーザ光の焦点位置を細胞膜７２の上面に合わせて細胞膜７２の上面を穿孔した後、レーザ光の焦点位置を細胞膜７２の底面に合わせて細胞膜７２の底面を穿孔するというように、時系列に穿孔を行っても良い。
【００５６】
以上実施形態に基づいて本発明を説明したが、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で種々の変形や応用が可能なことは勿論である。
【００５７】
例えば、細胞内に導入する物質は、遺伝子に限らず、色素、量子ドットなどの蛍光試薬、イオン、ペプチド、タンパク質、多糖類、等、溶液中に混濁できるものであれば良い。
【００５８】
また、上記実施形態は、細胞の２箇所を穿孔するものとしたが、それ以上の箇所を穿孔しても良いことは勿論である。
【００５９】
（付記）
前記の具体的実施形態から、以下のような構成の発明を抽出することができる。
【００６０】
（１）  細胞へ遺伝子を導入する遺伝子導入装置において、
導入される遺伝子が分散された培養液中で培養される細胞の細胞膜を穿孔する穿孔手段と、
上記穿孔手段を駆動し、上記細胞膜の少なくとも２箇所に穿孔させる駆動手段と、
を具備することを特徴とする遺伝子導入装置。
【００６１】
（対応する実施形態）
この（１）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第１乃至第３実施形態が対応する。それらの実施形態において、細胞７０が上記細胞に、遺伝子導入装置１０が上記遺伝子導入装置に、ＤＮＡ分散溶液６６が上記導入される遺伝子が分散された培養液に、細胞膜７２が上記細胞膜に、カンチレバー５２に設けられた導入針４４又は４４１，４４２、又はレーザ光源９６及び対物レンズ９０が上記穿孔手段に、駆動ユニット４８及びＺ軸アクチュエータ５６、又はアクチュエータ９２が上記駆動手段に、それぞれ対応する。
【００６２】
（作用効果）
この（１）に記載の遺伝子導入装置によれば、細胞に２箇所の孔が形成されるため細胞外の溶液が容易に細胞内を通過するので、溶液が効率良く細胞内に取り込まれる。遺伝子は細胞外の溶液中に分散しているため、細胞内で発現するために十分な量が細胞内に確保され、高い導入効率が得られる。
【００６３】
（２）  上記穿孔手段は、上記細胞内に挿入される微細針と、当該微細針を支持する支持部と、を有する針部であることを特徴とする（１）に記載の遺伝子導入装置。
【００６４】
（対応する実施形態）
この（２）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第１及び第２実施形態が対応する。それらの実施形態において、導入針４４又は４４１，４４２が上記微細針に、シリコンベース部５８が上記支持部に、カンチレバー５２が上記針部に、それぞれ対応する。
【００６５】
（作用効果）
この（２）に記載の遺伝子導入装置によれば、微細針を用いるので、細胞に対するダメージを抑え、狙いとする細胞に対して遺伝子が導入できる。
【００６６】
（３）  上記微細針は、上記細胞を貫通して上記細胞膜を穿孔することを特徴とする（２）に記載の遺伝子導入装置。
【００６７】
（対応する実施形態）
この（３）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第１実施形態が対応する。
【００６８】
（作用効果）
この（３）に記載の遺伝子導入装置によれば、孔が細胞の核内を貫通して形成されるため、遺伝子が核内を流通し、効率良く核内に取り込まれる。
【００６９】
（４）  上記駆動部は、上記細胞を保持する基板に上記微細針の先端が接触した位置よりも、さらに上記微細針を当該基板方向に移動させることを特徴とする（３）に記載の遺伝子導入装置。
【００７０】
（対応する実施形態）
この（４）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第１実施形態が対応する。その実施形態において、ワーク１４の基板６８が上記基板に対応する。
【００７１】
（作用効果）
この（４）に記載の遺伝子導入装置によれば、基板との接触位置よりも更に微細針を降下させることにより、微細針を基板面に対して摺動させることができ、この摺動により細胞膜の上面側及び底面側の２箇所を確実に破断できる。
【００７２】
（５）  上記駆動部は、上記細胞を保持する基板に上記微細針の先端が接触した位置で、上記微細針を当該基板と水平な方向に移動させることを特徴とする（３）に記載の遺伝子導入装置。
【００７３】
（対応する実施形態）
この（５）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第１実施形態が対応する。
【００７４】
（作用効果）
この（５）に記載の遺伝子導入装置によれば、微細針が基板と接触した状態で水平移動させることにより、微細針を基板面に対して摺動させることができ、この摺動により細胞膜の上面側及び底面側の２箇所を確実に破断できる。
【００７５】
（６）  上記微細針は、上記細胞の外部から少なくとも２箇所上記細胞膜を穿孔することを特徴とする（２）に記載の遺伝子導入装置。
【００７６】
（対応する実施形態）
この（６）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第２実施形態が対応する。
【００７７】
（作用効果）
この（６）に記載の遺伝子導入装置によれば、基板との接着力の弱い細胞であっても、遺伝子を確実に導入することが可能である。また、細胞が積層した状態であっても、上側にある細胞のみ選択して遺伝子を導入することが可能である。
【００７８】
（７）  上記微細針は、少なくとも２回上記細胞膜を穿孔することを特徴とする（６）に記載の遺伝子導入装置。
【００７９】
（対応する実施形態）
この（７）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第２実施形態が対応する。
【００８０】
（作用効果）
この（７）に記載の遺伝子導入装置によれば、１本の微細針により少なくとも２箇所の穿孔が行える。
【００８１】
（８）  上記穿孔手段は、上記針部を少なくとも２つ有し、
上記針部の上記微細針は、それぞれ同一の細胞の上記細胞膜を穿孔することを特徴とする（６）に記載の遺伝子導入装置。
【００８２】
（対応する実施形態）
この（８）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第２実施形態が対応する。
【００８３】
（作用効果）
この（８）に記載の遺伝子導入装置によれば、１回の動作で少なくとも２箇所の穿孔が行える。
【００８４】
（９）  上記穿孔手段は、レーザ光を上記細胞に貫通させ、焦点位置を上記細胞膜の２箇所に合わせて当該細胞膜を穿孔するレーザであることを特徴とする（１）に記載の遺伝子導入装置。
【００８５】
（対応する実施形態）
この（９）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第３実施形態が対応する。その実施形態において、レーザ光源９６が上記レーザに対応する。
【００８６】
（作用効果）
この（９）に記載の遺伝子導入装置によれば、レーザ光により穿孔するため、低侵襲で細胞を貫通する穿孔を形成できる。また、細胞に接触する微細針の交換、滅菌等のメンテナンスが不要であるため、性能の維持が容易である。
【００８７】
（１０）  遺伝子を導入しようとする細胞を選定する工程と、
上記細胞の細胞膜の少なくとも２箇所を穿孔する工程と、
を有することを特徴とする遺伝子導入方法。
【００８８】
（対応する実施形態）
この（１０）に記載の遺伝子導入方法に関する実施形態は、第１乃至第３実施形態が対応する。
【００８９】
（作用効果）
この（１０）に記載の遺伝子導入方法によれば、細胞に２箇所の孔が形成されるため細胞外の溶液が容易に細胞内を通過するので、溶液が効率良く細胞内に取り込まれる。遺伝子は細胞外の溶液中に分散しているため、細胞内で発現するために十分な量が細胞内に確保され、高い導入効率が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、本発明の第１実施形態に係る遺伝子導入装置を示す全体構成図である。
【図２】図２（Ａ）は、カンチレバー近傍の構造を示す拡大図であり、図２（Ｂ）は、カンチレバーの構造を示す拡大図である。
【図３】図３（Ａ）乃至（Ｃ）はそれぞれ、本発明の第１実施形態に係る遺伝子導入方法を説明するための、カンチレバーに設けた導入針の一連の状態を示す図である。
【図４】図４（Ａ）は、ＨｅｌａＳ３細胞を蛍光色素溶液中に浸漬し、レーザ走査型顕微鏡で観察した顕微鏡画像を示す図であり、図４（Ｂ）は、第１実施形態に係る遺伝子導入装置及び方法によって色素溶液を細胞内に導入した結果の顕微鏡画像を示す図である。
【図５】図５（Ａ）は、第１実施形態に係る遺伝子導入装置及び方法によってＨｅｌａＳ３細胞にＧＦＰ蛍光タンパク質を発現する遺伝子を導入した直後の顕微鏡画像を示す図であり、図５（Ｂ）及び（Ｃ）はそれぞれ２４時間経過後の位相差観察顕微鏡画像及び蛍光観察による顕微鏡画像を示す図である。
【図６】図６は、本発明の第２実施形態に係る遺伝子導入装置におけるカンチレバーの構造を示す拡大図である。
【図７】図７は、本発明の第２実施形態に係る遺伝子導入方法を説明するための、カンチレバーに設けた導入針の細胞への挿入状態を示す図である。
【図８】図８は、細胞の上面の細胞膜に形成された２箇所の穿孔を示す図である。
【図９】図９は、本発明の第３実施形態に係る遺伝子導入装置の要部を示す構成図である。
【図１０】図１０は、細胞とスポット位置との表示例を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明の第３実施形態に係る遺伝子導入装置を用いた遺伝子導入方法の手順を表すフローチャートを示す図である。
【符号の説明】
【００９１】
１０…遺伝子導入装置、  １２…倒立型顕微鏡、  １４…ワーク、  １６…ワークホルダ、  １８…照明装置、  ２０…観察装置、  ２２…顕微鏡ＸＹステージ、  ２４…顕微鏡ＸＹステージコントローラ、  ２６…顕微鏡コントローラ、  ２８…画像処理装置、  ３０…モニタ、  ３２…制御コンピュータ、  ３４…透過照明光源、  ３６…コンデンサレンズ、  ３８…落射照明光源、  ４０…ＣＣＤカメラ、  ４２…接眼レンズ、  ４４，４４１，４４２…導入針、  ４６…導入針保持具、  ４６Ａ…アーム、  ４８…駆動ユニット、  ５０…コントロールボックス、  ５２…カンチレバー、  ５４…取付部材、  ５６…Ｚ軸アクチュエータ、  ５８…シリコンベース部、  ６０，６０１，６０２…レバー部、  ６２…駆動ユニット制御回路、  ６４…アクチュエータ制御回路、  ６６…ＤＮＡ分散溶液、  ６８…基板、  ７０…細胞、  ７２…細胞膜、  ７４…核、  ７６…破断箇所、  ７８…穿孔、  ８０…架台、  ８２…レーザポインタ、  ８４，８６…ハーフミラー、  ８８，９８…ミラー、  ９０…対物レンズ、  ９２…アクチュエータ、  ９４…スポット位置、  ９６…レーザ光源。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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