(57)【要約】      （修正有）【課題】腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）群の細菌中に存在するプラスミド起源の核酸配列、ＥＨＥＣ、特にエンテロヘモリシンおよびインチミンビルレンス因子をコードする遺伝子を有するものの探索のための、より詳細にはＯ１５７：Ｈ７血清型の特異的検出のためのこの配列の使用、この配列を使用する方法およびこの配列を含む検出キットの提供。【解決手段】食物、臨床的、獣医学的または環境試料中のＥＨＥＣの特異的検出のために使用できる、特定の核酸配列、その相補配列、それに由来する配列およびそのフラグメント。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる単離された核酸：
ａ）配列番号２の配列；
ｂ）配列番号２の相補配列；
ｃ）配列番号２の少なくとも１４個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド鎖を含む配列番号２の配列のフラグメント、または該フラグメントの相補配列；
ｄ）配列番号２と１若しくは数個の塩基の欠失および／または置換で異なる配列番号２に由来する配列であって、該由来する配列が配列番号２の配列またはその相補配列と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、ここで該由来する配列が配列番号２の少なくとも１４個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド鎖を含み、そして該由来する配列が腸管出血性大腸菌の特異的検出のために使用される、配列；あるいは
ｅ）以下の配列から選択される配列：配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７。
【請求項２】
腸管出血性大腸菌の検出のために使用される、各々が配列番号２の配列またはその相補配列のフラグメントからなる単離された核酸の対であって、
一方の核酸の配列が以下の核酸配列から選択され：配列番号２１および配列番号２３、そして
他方の核酸の配列が以下の核酸配列から選択される：配列番号２２および配列番号２４、単離された核酸の対。
【請求項３】
核酸の対が以下の配列の以下の対：
配列番号２１と配列番号２２および
配列番号２３と配列番号２４、
から選択される、請求項２記載の単離された核酸の対。
【請求項４】
プローブとして使用される請求項１記載の単離された核酸。
【請求項５】
標識されていることを特徴とする請求項４記載の単離された核酸。
【請求項６】
１９９８年３月２６日に番号Ｉ−２０００のもとにコレクション・ナショナル・ドゥ・クルチュル・ドゥ・ミクロオルガニスムに寄託されたプラスミドｐＤＦ４。
【請求項７】
請求項６記載のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項８】
以下の工程：
（ａ）試料を、オリゴヌクレオチドプライマーの対と接触させる工程であって、ここで各オリゴヌクレオチドプライマーは配列番号２ｎｏ核酸配列から選択される少なくとも１４個の連続したヌクレオチドまたはその相補配列からなり；試料中に含まれる核酸は、適切な場合、試験される標的においてプライマーに接近可能にされている工程、
（ｂ）選択したプライマーの対が隣接する核酸配列を増幅する工程、
（ｃ）増幅産物に特異的な少なくとも１個のプローブを使用することによって増幅産物の存在を確認する工程、
を包含する試料中の腸管出血性大腸菌の検出法。
【請求項９】
工程（ｃ）が以下の下位工程：
（ｃ1）増幅核酸を物理的または化学的手段によって変性する工程、
（ｃ2）工程（ｃ1）の変性した増幅核酸を含有する溶液を、一方で少なくとも１個の捕獲プローブと、他方で標識されていてもよい少なくとも１個の検出プローブと接触させる工程であって、捕獲および検出プローブは配列番号２の核酸配列またはその相補配列において選択されるプライマーの対が隣接する領域から選択される、少なくとも１４個の連続したヌクレオチドの配列を有し、増幅核酸と同じ鎖とハイブリダイズでき、接触がハイブリダイゼーション反応をさせるために十分な時間実施される工程、
（ｃ3）少なくとも１回洗浄して未反応核酸を除去する工程、
（ｃ4）増幅核酸とハイブリダイズした検出プローブを可視化する工程、
を含む請求項８記載の方法。
【請求項１０】
捕獲プローブがマイクロタイトレーションプレートの壁の表面に結合されている請求項９記載の方法。
【請求項１１】
検出プローブがペルオキシダーゼで標識されている請求項９記載の方法。
【請求項１２】
反応した検出プローブに結合したペルオキシダーゼの活性の検出が、色素原性基質の存在下での比色反応によって以下の工程：
−  反応混合物を含むウェルへ色素原性基質を添加する工程、
−  発色に十分な時間暗所でインキュベートする工程、
−  ブロッキング溶液の添加によって反応をブロックする工程、
−  適切な波長で光学密度を測定する工程、
を使用して実施される請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
色素原性基質がテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
以下のオリゴヌクレオチド：
−  増幅用プライマーとしての配列番号２１および配列番号２２の配列からなるオリゴヌクレオチド、
−  捕獲プローブとしての配列番号２５の配列からなるオリゴヌクレオチド、
−  検出プローブとしての配列番号２７の配列からなるオリゴヌクレオチド、
を使用する請求項８〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
試薬の中に、プライマーの対として使用される少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含む腸管出血性大腸菌検出用キットであって、各オリゴヌクレオチドは配列番号２の核酸配列から選択される少なくとも１４個の連続したヌクレオチドまたはその相補配列からなる、キット。
【請求項１６】
増幅産物の検出用の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、ここでオリゴヌクレオチドプローブが配列番号２の核酸配列またはその相補配列において選択される少なくとも２個のオリゴヌクレオチドが隣接する領域から選択される少なくとも１４個の連続したヌクレオチドの配列からなる、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
試薬の中に以下：
−  プライマーの対としての配列番号２１および配列番号２２の配列からなる２つのオリゴヌクレオチド、
−  増幅産物の検出用の配列番号２５および配列番号２７の配列からなる２つのオリゴヌクレオチド、
を含む請求項１６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）群の細菌中に存在するプラスミド起源の２つの核酸配列、ＥＨＥＣ、特にビルレンス因子であるエンテロヘモリシン（enterohemolysine）およびインチミン（intimine）をコードする遺伝子を有するものの同定のための、より詳細にはＯ１５７：Ｈ７血清型の特異的検出のためのこの配列の使用に関する。本発明はまた、この配列を使用する方法およびこの配列を含む検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＨＥＣ群の細菌は、その結果としてヒトにおいて致死的となり得る下痢性症候群の原因となるベロ毒素生産エシェリキア・コリ（Escherichia coli）またはＶＴＥＣファミリーに属する。特に、ＥＨＥＣは出血性大腸炎（ＨＣ）およびおそらく溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）または血栓症血小板減少性紫斑病のような主要な合併症の出現を引き起こし得る（Griffin et Tauxe, Epidemiol. Rev. 13, 1991, 60-98（非特許文献１））。
【０００３】
従って、これらの感染によって、特に流行の場合、公衆衛生が食材および迅速な検出手段の監視を増加させるといった影響がある。
【０００４】
以下のようなＥＨＥＣ群に属するいくつかの血清型が同定されており、種々の流行性病巣の原因であるとされている：Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ２６：Ｈ１１、Ｏ１１１：ＮＭ、Ｏ１０３：Ｈ２、Ｏ１４５：ＮＭなど（Acheson et Keush, ASM News 62, 1996, 302-306（非特許文献２））。しかし、最も頻繁に単離されているのはＯ１５７：Ｈ７血清型である。
【０００５】
従来の検出法は、細菌の同定または細菌によって分泌される毒素の検出からなっている。イー・コリ（E. coli）Ｏ１５７：Ｈ７の検出は主に、代謝特性についての試験（ソルビトール発酵の不在および／またはβ−グルクロニダーゼ活性の不在を含む）と組合せた、血清型決定に基いて実施される。さらに、ＥＨＥＣの検出に特異的な細菌学的方法は存在しないが、診断の方向付けを可能にする試験は存在する。特に、血液または洗浄赤血球を補充した寒天を使用することにより、ＥＨＥＣ中に一般的に存在する腸管溶血特性を示すことができる。
【０００６】
一般に、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の検出に関する細菌学的および免疫学的方法は長く、退屈で、比較的高価であり、血清学的確認を必要とする。さらに、これらの方法は、他の細菌属および種との交差反応（これ解釈を困難にするが）のために、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の同定を確立することができない。
【０００７】
それゆえ、核酸プローブの使用がこれらの従来法の代替として出現した。高感度かつ特異的に、ＥＨＥＣ型イー・コリ細菌（ＨＣおよび／またはＨＵＳ症例に関与し、その最も広まった原型がイー・コリＯ１５７：Ｈ７である）を検出できるプローブを開発するために多大な努力がなされている。
【０００８】
特に、イー・コリのビルレンスの原因遺伝子（ビルレンス因子とも呼ばれる）の検出を可能にするプローブまたはフラグメントが公開されている。しかし、現在知られているビルレンス因子のいずれによってもイー・コリＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣの病原性株を単独で同定することはできない。
【０００９】
従って、多くの研究グループによって記載されたベロ毒素をコードする遺伝子（ｖｔ１またはｓｔ１、ｖｔ２またはｓｔ２）の検出のための核酸プローブまたはフラグメントの使用によって（Karch et Meyer, J. Clin. Microbiol. 27, 1989, 2751-2757（非特許文献３）; Gannon et al., Appl. Env. Microbiol. 58, 1992, 3809-3815（非特許文献４）; Begum et al., J. Clin. Microbiol. 31, 1993, 3153-3156（非特許文献５）; Witham et al., Appl. Env. Microbiol. 62, 1996, 1347-1353（非特許文献６））、ベロ毒素をコードする遺伝子は病原性細菌株イー・コリＯ１５７：Ｈ７および他のＥＨＥＣに関連するが、非病原性イー・コリ株またはおそらく他の細菌型（例えば、シゲラ・ジセンテリエ（Shigella dysenteriae）、シトロバクター・フレンディ（Citrobacter freundii）など）にも存在し得ることが示された。
【００１０】
同様に、インチミンと呼ばれる接着タンパク質もＥＨＥＣ型細菌のビルレンスに関与している。特に、プローブが対応する遺伝子（ｅａｅ）上で選択されている（Gannon et al., J. Clin. Microbiol. 31, 1993, 1268-1274（非特許文献７）, Louie et al., Epidemiol. Infect. 112, 1994, 449-461（非特許文献８）およびMeng et al., Int. J. Food Microbiol. 32, 1996, 103-113（非特許文献９））。しかし、このビルレンス因子はＥＨＥＣ群に密接に関連しているが、血清型Ｏ５５：Ｈ７を含む腸病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）にも見出される。
【００１１】
最後に、とりわけ、多くのＥＨＥＣにも存在するビルレンス因子であるエンテロヘモリシンをコードする６０ＭＤａのプラスミド上でプローブが選択されている（Levine et al., J. Infect. Dis. 156, 1987, 175-182（非特許文献１０）; Schmidt et al., Infect. Immun. 63, 1995, 1055-1061（非特許文献１１））。米国特許第5,475,098号（特許文献１）はｈｌｙＡおよびｈｌｙＢ遺伝子ならびにｈｌｙＡ−ｈｌｙＢ遺伝子間領域に対応するエンテロヘモリシンオペロンに含まれる核酸配列に関する。請求されるオリゴヌクレオチド配列によってＥＨＥＣの特異的検出が可能になるが、この発明によってイー・コリＯ１５７：Ｈ７を他のＥＨＥＣから区別することはできない。さらに、米国特許第5,652,102号（特許文献２）は６０ＭＤａのプラスミドに由来する制限フラグメントに位置する核酸配列を記載している。しかし、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてこの配列に由来するオリゴヌクレオチドを使用しても、単独でＯ１５７：Ｈ７血清型を特異的に検出することはできず、その結果ベロ毒素およびインチミンをコードする遺伝子を増幅するプライマーの併用が必要となる。
【００１２】
臨床試料から得られたイー・コリＯ１５７：Ｈ７株から単離されたプラスミドｐＯ１５７の全体が最近記載された（Makino et al., DNA Research 5, 1998, 1-9（非特許文献１２））。プラスミドのゲノム上の異なる遺伝子の順序を表すプラスミドのマッピングによって、１８６個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の存在が示されている。しかし、核酸配列についてのデータがないので（文献の公開時にデータは利用可能でなかった）、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の特異的検出について診断上関心のある領域を同定することはできない。
【００１３】
最近では、特許出願WO 97/32045（特許文献３）はＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）法によって得られた染色体配列から選択されたオリゴヌクレオチドに関し、これによって約９９．５％のイー・コリＯ１５７：Ｈ７が検出されるが、請求される核酸配列はほぼ３％の非ＥＨＥＣイー・コリも検出し、特に農食材分野において特異性の点で満足なものではない。
【００１４】
それゆえ、全てのこれらの検出系の主な不利益は、そのいずれもがイー・コリＯ１５７：Ｈ７血清型の同定を明確に確立しかつ単純化することができないという事実にある。結果を正確にするためには、実際、頻繁にいくつかの増幅および／または検出系を組合せる必要がある。使用するプロトコルは実施が困難になり（複数の同時の増幅）、得られる結果は、感度および特異性に関して、使用する核酸標的のみならず操作条件にもおおいに依存する。
【００１５】
しかし、上記で示したように、この血清型は死に至る可能性がある重篤な症候群を引き起こし得、このことは、特に流行の場合に、迅速かつ信頼性のある検出手段の必要性を意味する。
【特許文献１】米国特許第5,475,098号
【特許文献２】米国特許第5,652,102号
【特許文献３】WO 97/32045
【非特許文献１】Griffin et Tauxe, Epidemiol. Rev. 13, 1991, 60-98
【非特許文献２】Acheson et Keush, ASM News 62, 1996, 302-306
【非特許文献３】Karch et Meyer, J. Clin. Microbiol. 27, 1989, 2751-2757
【非特許文献４】Gannon et al., Appl. Env. Microbiol. 58, 1992, 3809-3815
【非特許文献５】Begum et al., J. Clin. Microbiol. 31, 1993, 3153-3156
【非特許文献６】Witham et al., Appl. Env. Microbiol. 62, 1996, 1347-1353
【非特許文献７】Gannon et al., J. Clin. Microbiol. 31, 1993, 1268-1274
【非特許文献８】Louie et al., Epidemiol. Infect. 112, 1994, 449-461
【非特許文献９】Meng et al., Int. J. Food Microbiol. 32, 1996, 103-113
【非特許文献１０】Levine et al., J. Infect. Dis. 156, 1987, 175-182
【非特許文献１１】Schmidt et al., Infect. Immun. 63, 1995, 1055-1061
【非特許文献１２】Makino et al., DNA Research 5, 1998, 1-9
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明者による作業は、イー・コリＯ１５７：Ｈ７ゲノムライブラリー由来の特異的配列について試験し、ヒトに対して病原性である主要なイー・コリ血清型、より詳細にはＯ１５７：Ｈ７の認識を可能にすることからなる。ライブラリーを腸病原性大腸菌Ｏ５５：Ｈ７に対してスクリーニングした。Ｏ５５：Ｈ７は血清型Ｏ１５７：Ｈ７の祖先であると推定されており、T. Whittam et al., Infect. Immun. 61, 1993, 1619-1629によって実施された多型分析によれば２つのゲノムは非常に近縁である。
【００１７】
この作業によって、ＥＨＥＣの検出、より詳細にはイー・コリＯ１５７：Ｈ７の検出用の２つの目的の核酸フラグメントを単離することができた。これらは６０ＭＤａの腸溶血性プラスミド上に位置する配列番号１および配列番号２の核酸配列を含む。これらの配列を含む対応するクローンｐＤＦ３およびｐＤＦ４は、１９９８年３月２６日にそれぞれ番号Ｉ−１９９９およびＩ−２０００のもとにコレクション・ナショナル・ドゥ・クルチュル・ドゥ・ミクロオルガニスム（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes）に寄託された
【００１８】
驚くべきことに、挿入配列ＩＳ９１の一部とイー・コリＯ１５７：Ｈ７  ｋａｔＰ遺伝子由来の配列またはその一部の安定な組合せを含む第１の配列（配列番号１）が同定された。それから生じる核酸鎖は他所で記載されたことはなく、イー・コリＯ１５７：Ｈ７において特異的に見出される。
【００１９】
カタラーゼ−ペルオキシダーゼをコードするｋａｔＰ遺伝子はイー・コリＯ１５７：Ｈ７および多数のＥＨＥＣの腸溶血性プラスミド上に存在する（Brunder et al., Microbiol. 142, 1996, 3305-3315）し、イー・コリのα−溶血性プラスミド上で同定された挿入配列ＩＳ９１（Zabala et al., J. Bacteriol. 151, 1982, 472-476）は未だにイー・コリＯ１５７：Ｈ７型腸溶血性株において記載されていない。
【００２０】
短縮された挿入配列がＩＳ９１−ｋａｔＰ連結（ＩＳ９１の左逆方向反復配列（ＩＲＬ）が存在しない）のレベルで同定されたことはまた、ＩＳ９１のイー・コリＯ１５７：Ｈ７ゲノムのこの部分への安定な組込みを示唆する。
【００２１】
種々の起源の多数のＯ１５７：Ｈ７株の増幅産物の分析は、このヌクレオチド鎖がＯ１５７：Ｈ７血清型内で保存されていることを示す。
【００２２】
実際、それぞれＩＳ９１およびｋａｔＰの配列中に位置する配列番号３および配列番号４のプライマーを用いて、試験した全ての株（５５個のイー・コリＯ１５７：Ｈ７および１個のイー・コリＯ１５７：Ｈ−）において６７０塩基対の増幅産物が観察された。
【００２３】
さらに、異なる起源の５個のＯ１５７：Ｈ７株の増幅産物について作成したＡｌｕＩおよびＲｓａＩ制限プロフィールから得られたデータならびに３個の株（米国（１９９３年）および日本（１９９６）の流行から単離された２個を含む）について実施した配列分析によって、分析した配列部分（配列番号１、２７２〜６２４位（ｎｔ））における完全な保存、すなわち１００％の相同性が示された。
【００２４】
さらに、安定な、保存されたヌクレオチド鎖はおそらく、進化の間にイー・コリＯ１５７：Ｈ７において生じた比較的古い組換え事象である。なぜなら、異なる場所および時期に単離された株がこの同じ特性を示すからである。
【００２５】
それゆえ、この配列は、血清型Ｏ１５７：Ｈ７の特異的検出に好ましい標的を表す。
【００２６】
第２の配列はビルレンス因子エンテロヘモリシン（ｅｈｌｙ）およびインチミン（ｅａｅ）の存在に関連した同じプラスミド上に特徴付けられた（配列番号２）。これらの特性は血清型Ｏ１５７：Ｈ７を含む腸管出血性大腸菌株に特異的である。この点で、このフラグメントには疫学的興味がある。なぜなら、いくつかの分子系の使用を必要とする既に公知の方法とは異なり（Paton and Paton, J. Clin. Microbiol. 36, 1998, 598-602）、診断適用のためにこの配列を使用することによって、使用が簡略化され、結果がより迅速に解釈されるからである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
それゆえ、本発明は、食物、臨床的、獣医学的または環境試料中のＥＨＥＣの特異的検出のために使用できる、配列番号１および配列番号２の核酸配列、その相補配列、それに由来する配列およびそのフラグメントに関する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明は腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）群の細菌中に存在するプラスミド起源の２つの核酸配列、ＥＨＥＣ、特にビルレンス因子であるエンテロヘモリシン（enterohemolysine）およびインチミン（intimine）をコードする遺伝子を有するものの同定のための、より詳細にはＯ１５７：Ｈ７血清型の特異的検出のためのこの配列の使用に関する。本発明はまた、この配列を使用する方法およびこの配列を含む検出キットに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明は、より詳細には、配列番号１の配列、この配列のフラグメントまたはそれに由来する配列を含む、血清型イー・コリＯ１５７：Ｈ７の検出用の特異的配列に関する。
【００３０】
本発明によれば、配列番号１の配列は、ｋａｔＰ遺伝子の配列またはその一部と短縮された挿入配列ＩＳ９１との間の安定な組換え事象から生じたヌクレオチド鎖を含む。
【００３１】
本発明によれば、核酸配列なる表現は、ＤＮＡもしくは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列、または対応するＲＮＡ配列のいずれかを意味すると理解される。
【００３２】
本発明はまた、配列番号１または配列番号２に由来する核酸配列、すなわち、１個以上の塩基の変異、挿入、欠失および／または置換で異なるが、それにもかからわず上記の配列の１つと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列に関する。
【００３３】
本発明によれば、高ストリンジェンシーなる表現は、２つの相補的な核酸フラグメント間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にし、非特異的結合を制限するような温度およびイオン強度条件を意味すると理解される（Sambrook et al., Molecular Cloning, Second Edition (1989), 9.47-9.62）。ハイブリッド配列の一方が短い場合（約２０ヌクレオチド）、温度条件は一般に（Ｔｍ−５℃）〜（Ｔｍ−１０℃）である。Ｔｍは、理論的融点であり、対合した鎖の５０％が分離する温度であると定義される。
【００３４】
配列番号１に由来する核酸配列なる表現はまた、本発明によれば、後者と１個以上の塩基の変異、挿入、欠失および／または置換で異なり、ｋａｔＰ遺伝子と短縮された挿入配列ＩＳ９１との間の安定な組換えの鎖を含むいずれかの配列を意味すると理解される。
【００３５】
より詳細には、核酸配列は、図１の鎖の少なくとも８個、好ましくは１０個、さらに好ましくは１４個の連続したヌクレオチドを含み、４００〜４０７位のヌクレオチドを含む。
【００３６】
本発明はまた、ＥＨＥＣに特異的な第２の配列（配列番号２）、その相補配列、そのフラグメントおよびそれに由来する配列に関する。これらの配列はＥＨＥＣ、特にエンテロヘモリシン（ｅｈｌｙ）およびインチミン（ｅａｅ）をコードする遺伝子を連結して有するＥＨＥＣにおいて常に検出される；この配列番号２の配列を図２に示す。
【００３７】
本発明はまた、配列番号１および配列番号２の配列に由来するオリゴヌクレオチドに関する。これは増幅手順におけるプライマーとしてまたは検出法の使用に関してプローブとして使用することができ、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド鎖の少なくとも８個、有利には少なくとも１０個、より有利には１４個、好ましくは３０個までの連続したヌクレオチドを含む。このプライマーは前記配列に上記で規定したような高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる。
【００３８】
本発明のプライマーまたはプローブはまた、いくつかのヌクレオチドの置換および／または付加および／または抑制によって、あるいは末端（一般にプライマーについては５’；プローブについては３’または５’）の一方での所望の配列にとって外来の核酸配列または標識分子の付加によって改変され得るオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドはそれにもかかわらずイー・コリＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣ中に存在する相補的核酸配列と高ストリンジェンシー条件下でハハイブリダイズすることができる。
【００３９】
本発明の好ましい実施態様によれば、オリゴヌクレオチドを遺伝子増幅手順におけるプライマーとして使用してもよい。これによって配列番号１のフラグメントまたは配列番号２のフラグメントの大量のコピーが生産され、それぞれイー・コリＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣの特異的検出が可能になる。
【００４０】
増幅工程を、特に、Kwoh et al., PNAS, 86, 1989, 1173-1177によって提唱されるＴＡＳ（Transcription-based Amplification System）技術、Fahy et al., PCR Meth. Appl. 1, 1991, 25-33に記載の３ＳＲ（Self-Sustained Sequence Replication）技術、特許EP 329 822に記載のＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）技術、またはWalker et al., P.N.A.S., 89, 1992, 392-396に記載のＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）技術、あるいは有利には、特にCetusの欧州特許EP 200 362およびEP 201 184に記載のＰＣＲ技術、あるいは後者に由来する技術およびインビトロにおける核酸配列の増幅に所望されるいずれかの他の方法のようなＤＮＡまたはＲＮＡの酵素的増幅の従来法を使用するいずれの方法によって実施してもよい。
【００４１】
本発明の好ましい実施態様において、配列番号１および配列番号２の配列に由来するオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおいて使用する。
【００４２】
増幅産物の検出を、その中で増幅を実施した反応媒質の全部または一部の、特にアガロースまたはポリアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動によって、あるいはキャピラリー電気泳動またはクロマトグラフィーによって実施してもよい。ゲルの特定の点に局在化された核酸フラグメントのバンドの可視化によって、大きさを評価することができる。このバンドの強度を試料中の検出しようとする標的の最初のコピー数におおまかに相関させることが可能である。
【００４３】
本発明の別の実施態様によれば、上記で規定するようなオリゴヌクレオチドを、標的核酸配列の直接検出のために、または、増幅後に増幅産物の検出のためにハイブリダイゼーション手順においてプローブとして使用してもよい。
【００４４】
例として、ヌクレオチドフラグメントを放射性元素（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１２５Ｉ）または非放射性分子（特にビオチン、アセチルアミノフルオレン、蛍光色素、ジゴキシゲニン）または酵素分子またはハプテンで標識してもよい。プローブの非放射性標識の例は、例えば、P. Kourilsky、フランス特許第78.10975号、またはM.S. Urdea et al., Nucleic Acids Symp. Ser., 24, 1991, 197-200、あるいはR. Sanchez-Pescador, J. Clin. Microbiol. 26, 1988, 1934-1938に記載されている。
【００４５】
最も一般的なハイブリダイゼーション法は、分析しようとする試料から抽出した核酸を支持体（ニトロセルロース、ナイロン、ポリスチレンなど）上に固定化し、固定化した核酸をプローブとともに規定された温度およびイオン強度の条件下でインキュベートすることからなる。ハイブリダイゼーション後、過剰のプローブを除去し、形成されたハイブリダイズした分子を、適切な方法によって検出する（プローブに結合した放射能、蛍光または酵素活性の測定）。
【００４６】
形成されたハイブリッド分子を「結合」相および「非結合」相の分離の必要なしに検出してもよい。これは、検出を均質相で実施するという。これらの方法（T. Walker et al., Clin. Chemistry 42, 1996, 9-13およびL. Morrison (Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, 1992, 312-352)に記載される）は特に蛍光分極に関する。ここで、プローブをフルオレセインで標識し、ハイブリダイゼーションによって蛍光の修飾またはエネルギーの移行が引き起こされる。後者の場合、検出は２つのマーカーの分子間または分子内相互作用に基く。「ドナー」と呼ばれる第１のマーカーは特定の波長の光の吸収によって励起される。エネルギーは「アクセプター」と呼ばれる第２のマーカーに移行される。これは次に励起されエネルギーを発する。
【００４７】
オリゴヌクレオチドプローブを、オリゴヌクレオチドのアレイ配列を含む検出デバイスにおいて使用してもよい。このアレイ配列において、所定の長さのオリゴヌクレオチドが事前に決定された順序で支持体に結合させられ、互いに１以上の塩基が重複しており；各オリゴヌクレオチドは検出しようとする標的配列のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的である。標的配列（これは有利には標識されている）を、アレイデバイスと接触させ、支持体に結合したプローブとハイブリダイズさせることができる。次いで、酵素処理によって不完全なハイブリッドを除去することができる。アレイの決定された位置におけるプローブの配列がわかっており、分析した標的配列のヌクレオチド配列を推定すること、生じた可能な変異を推定することができる。
【００４８】
ハイブリッドが形成されるアレイの位置において例えば電子供与体として作用できる材料（金のような）の支持体に結合させたプローブとの標的配列のハイブリダイゼーションの「バイオエレクトロニクス」的検出を可能にする支持体を使用して、標識配列の使用の代替としてもよい。次いで、標的核酸配列の検出を、電子デバイスによって測定する。バイオセンサーの例示的な実施態様は、Affymax Technologiesの特許出願EP-0721 016に記載されている。
【００４９】
単純かつ有利な実施態様によれば、核酸プローブを捕獲プローブとして使用してもよい。この場合、「捕獲プローブ」と称するプローブを支持体上に固定化し、これは特異的ハイブリダイゼーションによって、試験しようとする試料から標的核酸を捕獲するように作用する。必要であれば、固体支持体を試料から分離し、捕獲プローブと標的核酸配列との間に形成された二重鎖を「検出プローブ」と称する検出可能な要素で標識した第２のプローブによって検出する。有利には、捕獲プローブおよび検出プローブは、検出しようとする標的配列（増幅されたかまたはそうではない）内部の２つの異なる領域に相補的である。
【００５０】
固体支持体への捕獲プローブの結合を、当業者に周知の方法に従って、特に受動的吸着または共有結合によって行ってもよい（Cook et al., Nucleic Acids Res. 16, 1988, 4077-4095; Nagata et al., FEBS Lett. 183, 1985, 379-382; M. Longlaru et al., EP 420 260 A2; T. Gingeras et al., EP 276 302; E Hornes and L.M. Kornes, EP 446 260）。
【００５１】
捕獲プローブおよび検出プローブのハイブリダイゼーションは別々に（２段階で）または同時に、特にLanghale and Malcolm, Gene 36, 1985, 201-210、Ranki et al. Gene 21, 1993, 77-85、Dunn and Hassel, Cell, 12, 1977, 23-36またはRanki and Soderlund, 米国特許第4,486,539号および同第4,563,419号によって記載される方法の１つに従って生じ得る。
【００５２】
それゆえ、本願はまた、配列番号１または配列番号２に由来する、プライマーまたはプローブとして選択された、ストリンジェントな条件下で、イー・コリＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣに特異的な、試験試料中に含まれる標的核酸配列とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドに関する。
【００５３】
標的核酸配列なる表現は、本発明によるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできるいずれかのＤＮＡまたはｃＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味すると理解される。
【００５４】
その配列が添付物に記載されている好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の表に報告される配列番号１および配列番号２の配列の位置に対応する：
配列                配列番号１における位置
配列番号  ３            ９  −      ３０
配列番号  ４        ６７９  −    ６５８
配列番号  ５            ６  −      ３０
配列番号  ６        ６８２  −    ６５８
配列番号  ７        ２４１  −    ２６３
配列番号  ８          ４７  −      ６９
配列番号  ９        ２５１  −    ２７４
配列番号１０        ４２６  −    ４０１
配列番号１１        ４２７  −    ４０２
配列番号１２        ３９１  −    ４２１
配列番号１３        ３８７  −    ４１７
配列番号１４        ２９１  −    ３２１
配列番号１５        ５１０  −    ５４０
配列番号１６        ３３１  −    ３５０
配列番号１７          ６８  −      ８７
配列番号１８        ３９７  −    ４１０
配列番号１９        ３９６  −    ４１１
配列番号２０        ３９５  −    ４１２
配列番号２１        ７１８  −    ７３９
配列番号２２      １０９９  −  １０７８
配列番号２３          ４１  −      ６０
配列番号２４        ８８４  −    ８６３
配列番号２５        ９２８  −    ９５８
配列番号２６        ９７０  −  １０００
配列番号２７        ８８３  −    ９０３
【００５５】
本発明はまた、上記のようなオリゴヌクレオチド対に関し、これは、イー・コリＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣのゲノムに含まれる配列番号１または配列番号２に対応する標的核酸配列の増幅用のプライマーとして使用することができる。
【００５６】
好ましいプライマーの対は以下のとおりである：
・イー・コリＯ１５７：Ｈ７の増幅用
−  配列番号３と配列番号４
−  配列番号５と配列番号６
−  配列番号６と配列番号７
−  配列番号６と配列番号８
−  配列番号６と配列番号９
・ＥＨＥＣの増幅用
−  配列番号２１と配列番号２２
−  配列番号２３と配列番号２４
【００５７】
配列番号５および配列番号６のプライマーの対をイー・コリＯ１５７：Ｈ７の核酸の増幅を実施するために使用することによって、イー・コリＯ１５７：Ｈ７株に特徴的な６７６  ｂｐの核酸フラグメントが増幅される。適切な場合、このフラグメントの特異性を、配列番号１８のプローブを使用することによって管理してもよい。
【００５８】
同様に、配列番号２１および配列番号２２のプライマーの対を使用することによって、ＥＨＥＣ（エンテロヘモリシンおよびインチミンの特性も有する）中に存在する３８２  ｂｐの核酸配列が特異的に増幅される。他の大腸菌群に属する細菌（例えば、ＥＴＥＣ（エンテロトキシン産生大腸菌）、ＥＰＥＣなど）は検出されない。増幅産物の特異性を増幅フラグメント内部のオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、配列番号２７）によってさらに確認することができる。
【００５９】
本発明はまた、随意に増幅されたヌクレオチド配列の検出用のプローブとして使用できる上記のようなオリゴヌクレオチドに関する。例えば、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１８のオリゴヌクレオチド配列を、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の特異的検出のために使用してもよい。同様に、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７の配列を使用することによって、Ｏ１５７：Ｈ７を含むＥＨＥＣの検出が可能になる。
【００６０】
本発明はまた、上記の配列番号１および配列番号２の配列を含むプラスミドならびにそれらを含む宿主細胞に関する。
【００６１】
本発明はまた、試料中のイー・コリＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣのインビトロ検出法に関する。この方法は以下の工程を包含することを特徴とする：
１．試料を、上記のプライマーの対の１つと接触させる工程であって、試料中に含まれる核酸配列は、適切な場合、試験される標的の核酸とのプライマーのハイブリダイゼーションに接近可能にされている工程、
２．選択したプライマーの対が隣接する核酸配列を増幅する工程、
３．上記のような当業者に公知の方法に従って増幅産物の存在の可能性を確認することができる。
【００６２】
有利な実施態様によれば、増幅されたフラグメントをいわゆる「サンドイッチ」法の原理に従って検出してもよい。
【００６３】
以下の工程を包含することを特徴とする、支持体（例えば、マイクロタイタープレート）上での検出による、イー・コリＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣに特異的な以前に増幅されたヌクレオチド配列のインビトロ検出のための方法も本発明の範囲内に入る：
−  物理的または化学的手段によるイー・コリＯ１５７：Ｈ７および／またはＥＨＥＣの増幅配列の変性。２００ｍＭ  ＮａＯＨ、４０ｍＭ  ＥＤＴＡから構成される変性溶液の添加が好ましい、
−  変性した増幅フラグメントの、適切なハイブリダイゼーション緩衝液中での、一方で支持体に結合した少なくとも１つの捕獲プローブとの、他方でハイブリダイゼーション緩衝液中の少なくとも１つの遊離検出核酸プローブとの接触。検出プローブは所望により標識されており、捕獲プローブとハイブリダイズするのと同じ増幅フラグメントの鎖と、捕獲プローブとハイブリダイズするのとは異なる領域でハイブリダイズでき；このハイブリダイゼーション溶液を、有利には５倍濃度のＳＳＰＥ（Sodium Saline Phosphate EDTA; Molecular Cloning, A practical guide, Sambrook et al., Vol. 3, 1989, annexe B13）、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．０１％  メルチオレート（Merthiolate）とすることができる、
−  ハイブリダイゼーションを可能にするに十分長い時間の反応混合物のインキュベーション；このインキュベーションを、例えば、有利には３７℃で約１時間実施することができる、
−  全ての未反応核酸配列を除去するための前記混合物の１回以上の洗浄；この洗浄を、例えば、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４を含有する溶液を用いて実施することができる、
−  増幅した核酸配列とハイブリダイズした検出プローブの可視化。
【００６４】
本発明の有利な実施態様によれば、検出プローブをペルオキシダーゼで標識し、ハイブリダイズした検出プローブに結合したペルオキシダーゼの活性を、以下の工程に従って、色素原性基質の存在下での比色読み取りによって可視化する：
−  反応混合物を含有する各ウェルにおける色素原性基質（例えば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））を含有する溶液の沈着、およびマイクロプレートの暗所での十分な時間（一般に２０〜３０分間）のインキュベーション。次いで、反応をブロッキング溶液（有利にはこの溶液は最終濃度０．５Ｎで使用するＨ２ＳＯ４溶液である）を添加することによって停止する、
−  光学密度の測定。ＴＭＢを色素原性基質として使用する場合、この測定を４５０  ｎｍ（参照６２０  ｎｍ）の波長で実施する。
【００６５】
特に有利な実施態様によれば、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の検出に使用する捕獲プローブは配列番号１５であってもよく、検出プローブは配列番号１８のオリゴヌクレオチドである。同様に、ＥＨＥＣ細菌の検出に使用する捕獲プローブは配列番号２５であってもよく、検出プローブは配列番号２７のオリゴヌクレオチドである。
【００６６】
本発明はまた、試料中に含まれるイー・コリＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣの同定用の検出キットに関する。このキットは試薬の中に以下を含む：
−  イー・コリＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣ群の細菌の増幅用のプライマーとして使用される上記で規定するような少なくとも２個のオリゴヌクレオチド、
−  所望により、増幅フラグメントの配列の確認用の成分、より詳細には上記で規定するような核酸プローブ。
【００６７】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００６８】
実施例１
配列番号１および配列番号２の配列の特徴付け
１）イー・コリＯ１５７：Ｈ７ゲノムライブラリーの構築：
出血性大腸炎に罹患し、１型および２型ベロ毒素を産生している患者の糞便から単離されたイー・コリＯ１５７：Ｈ７株のゲノムＤＮＡを、３７℃で１時間緩衝化媒質中で１μｇのＤＮＡあたり０．０３酵素単位を作用させることによってエンドヌクレアーゼＰｓｔＩ（Boehringer Mannheim, Ref. 621625）で部分消化した。このようにしてゲノムＤＮＡを消化することによって３５〜４５ｋｂのフラグメントを生成することができた。コスミドｐＨＣ７９（Hohn and Murray, Proc. Natl. Acad, Sci 74, 1977, 3259-3263）を同様に消化し、自己連結を回避するように脱リン酸化した。
【００６９】
９００ｎｇのベクターと２．６μｇの３５〜４５ｋｂのＤＮＡフラグメント（すなわち、ベクター／インサートモル比２）を混合することによって連結を実施した。２単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Boehringer Mannheim; Ref. 481220）を補充した後、反応媒質を１４℃で１８時間放置した。組換えコスミドをインビトロで包膜化し、これを用いてイー・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲ細菌（Stratagene; Ref. 200300）を形質転換した。形質転換した細菌を１時間３７℃でＬＢ培地（Luria-Bertani, Molecular Cloning, A practical guide, Sambrook et al., Vol. 3, 1989, annexe A1）中でインキュベートした。３５〜４５ｋｂのＤＮＡフラグメントを、アンピシリン耐性部位をなくし、テトラサイクリン耐性部位を保存するようにベクターｐＨＣ７９に挿入し、次いで細菌を１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する選択寒天培地にプレーティングした。
【００７０】
コスミドＤＮＡのミニ調製物をQuiagen（reference 26171）によって供給されるＲＥＡＬ  Ｐｒｅｐ９６  Ｋｉｔを使用してテトラサイクリン上で単離した最初の３６０個のコロニーから作製した。
【００７１】
次いで、これらの調製物のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ（Boehringer Mannheim, Ref. 621625、703737および567663）で消化し、１．２％アガロースゲルでの電気泳動によって分析し、次いでＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋ナイロンフィルター（Amersham, Ref. RPN 303B）に移した。ＵＶに５分間曝露することによってＤＮＡを不可逆的に固定した。
【００７２】
２）ライブラリーのスクリーニング：
イー・コリＯ１５７：Ｈ７株（コレクション・ドゥ・ランスティトゥ・パストゥール（Collection de l'Institut Pasteur）No. 103571）から得た同種ＤＮＡプローブおよび８個のイー・コリＯ５５：Ｈ７株（コレクション・ドゥ・ランスティトゥ・パストゥール、No. 105215, 105216, 105217, 105228, 105239, 105240, 105241, 105242）から得たＤＮＡの「プール」からなる異種ＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションを実施した。
【００７３】
種々のフィルターを、６倍濃度のＳＳＣ緩衝液（Sodium Saline Citrate; Molecular Cloning, A practical guide, Sambrook et al., Vol. 3, 1989, annexe B13）、５倍濃度のデンハルト溶液（Molecular Cloning, Vol. 3, 1989, annexe B15）、１０％デキストラン硫酸（Pharmacia Biotech, Ref. 17-0340-02）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  １本鎖サケ精子ＤＮＡおよび関連ＤＮＡ（Ｏ１５７：Ｈ７）を含有する溶液中で１６〜１８時間６５℃でハイブリダイズさせた。
【００７４】
ハイブリダイゼーション後、フィルターを１０分間２倍濃度のＳＳＣ緩衝液中で６５℃で２回、３０分間２倍濃度のＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する緩衝液中で６５℃で１回、次いで１０分間１／１０希釈したＳＳＣ中で６５℃で１回洗浄した。濡れたままのフィルターを増感スクリーンとともに２４〜４８時間−８０℃でカセット中で露光した。
【００７５】
必要な露光時間の後、フィルムを現像し、次いでナイロンメンブレンを、撹拌しながら４５℃で４〜５サイクルの水浴を実施することによって脱ハイブリダイズした。各サイクルについて、３０分間の０．５Ｎ  ＮａＯＨ溶液および次いで３０分間の１／１０希釈したＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する緩衝液中での２回の連続した水浴を実施した。メンブレンを最後に２倍濃度のＳＳＣ中で洗浄し、カセットに入れて、ハイブリダイゼーションの痕跡が残存していないことを確認した。脱ハイブリダイゼーション後、フィルターを上記と同様に非関連ＤＮＡ（Ｏ５５：Ｈ７）のプールとハイブリダイズさせた。
【００７６】
３）配列番号１および配列番号２のフラグメントの単離およびクローニング
これらのハイブリダイゼーションの結果、２つのコスミドクローンを同定することができ、それぞれから同種プローブとはハイブリダイズするが異種プローブとはハイブリダイズしない約１〜２ｋｂのフラグメント１つが単離された。「ドットブロット」ハイブリダイゼーションによって種々のＯ１５７：Ｈ７株においてそれらが保存されていることを確認した後、これらのフラグメントをベクターｐＵＣ１８（Oncor Appligene Ref. 161131）中にクローン化し、次いで大量に調製した。組換えプラスミドはｐＤＦ３およびｐＤＦ４と称し、それぞれ配列番号１および配列番号２の配列に対応する。
【００７７】
４）配列番号１および配列番号２の配列の決定
Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 1977, 5463に記載されるSanger et al.の方法に従って、プラスミドｐＵＣ１８の「ユニバーサルプライマー」および「リバースプライマー」ならびに配列の内部のオリゴヌクレオチドを使用してフラグメントの配列決定をした。
【００７８】
１４８９ｂｐを含む配列番号１の配列（図１）は、４０７〜１４８９の領域においてイー・コリＯ１５７：Ｈ７のｋａｔＰ遺伝子との９９．９％の相同性および１〜４０６の領域においてイー・コリのＩＳ９１との９５．８％の相同性を示す。
【００７９】
１１８１ｂｐを含む配列番号２の配列（図２）の解析によっては、腸溶血性プラスミドの既知の配列は示されない。２３７〜５７０の部分がシゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）ビルレンスタンパク質をコードするｖｉｒＫプラスミド遺伝子と６８％の相同性を示すのみである。
【００８０】
実施例２
イー・コリＯ１５７：Ｈ７の特異的検出
異なる血清型の１００個のイー・コリ株および４２個の非イー・コリ株（とりわけ、イー・コリＯ１５７：Ｈ７と交差反応し得る細菌（例えば、サルモネラ（Salmonella）、シゲラ・ジセンテリエ、シトロバクター・フレンディ、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、エシェリキア・ヘルマニ（Escherichia hermanii））を含む）について特異性の研究を実施した。
【００８１】
１）ＤＮＡの抽出：
ＤＮＡ配列を、Chelex（InstaGeneTM Matrix, Biorad）の存在下での煮沸法によって得た。試料を以下のプロトコルに従って調製した：
細菌懸濁物を、滅菌超純水中に、Tryptone-Caseine-Soja寒天（Sanofi Diagnostics Pasteur, Ref. 53455）上で単離したいくつかの細菌コロニーから作製し、１０，０００〜１２，０００回転／分で２〜３分間遠心分離し、上清を慎重に除去する。細菌ペレットを２００μｌの溶解試薬中に再懸濁し、ホモジナイズし、次いでヒートブロックで１００℃で１０〜１５分間インキュベートする。試料を再度ホモジナイズし、次いで１０，０００〜１２，０００回転／分で２〜３分間遠心分離する。このＤＮＡを直接増幅するか、または−２０℃で貯蔵できる。
【００８２】
２）ＰＣＲによる増幅：
増幅反応を５０ｍＭ  ＫＣｌ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３；０．０１％ゼラチン；３ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．２５μＭの配列番号５および配列番号６の各プライマー；１００μＭ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）；４００μＭ  ｄＵＴＰ；０．５単位のウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＤＧ; BRL Life Technologies）；１単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（BRL Life Technologies）およびパラグラフ１に示すように調製したＤＮＡ  ５μｌを含有する総量１５μｌで実施する。
【００８３】
５０℃で２分間、次いで９５℃で５分間インキュベートした後、試料を３５回の増幅サイクル（１５秒９５℃、１５秒６５℃、１５秒７２℃から構成される）に供する。プレートを除くまでチューブを７２℃に維持する。
【００８４】
温度サイクルを「Perkin-Elmer 9600」サーモサイクラー中で実施する。
【００８５】
各実験はポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを含む。
【００８６】
３）増幅産物の可視化：
増幅反応物をアガロースゲル上で可視化するかまたはマイクロプレート上で検出する。
【００８７】
３−１）アガロースゲル：
増幅後、１５μｌのクロロホルムを各試料に添加して、ＵＤＧを不活化し、次いで１アリコートの各反応物をサイズマーカーの存在下で臭化エチジウムで染色した１．２％アガロースゲルでの電気泳動によって分析する。６７６ｂｐのＤＮＡフラグメントの可視化によって、試験試料中のイー・コリＯ１５７：Ｈ７の存在が示される。
【００８８】
３−２）マイクロプレート中でのハイブリダイゼーション：
増幅産物を、２００ｍＭ  ＮａＯＨ、４０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する溶液を等量添加することによって変性する。ウェルの表面を配列番号１５の捕獲プローブでコートしたマイクロプレートを、５倍濃度のＳＳＰＥ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０および０．０１％メルチオレートを含有するハイブリダイゼーション緩衝液中でプレハイブリダイズする。次に、マイクロプレートをからにし、各ウェルに、変性した増幅フラグメントおよび配列番号１８の表示用プローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液２００μｌを入れる。インキュベーションを３７℃で撹拌しながら１時間実施する。
【００８９】
次いで、ウェルを、４００μｌの溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４；３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で６回洗浄し、次いでプローブに結合したペルオキシダーゼの活性を、色素原テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含有する検出溶液２００μｌを各ウェルに添加することによって検出する。マイクロプレートを３７℃で暗所で３０分間インキュベートし、次いで１００μｌの１．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４溶液を添加して、反応をブロックする。光学密度値を６２０ｎｍの参照に対して４５０ｎｍで測定する。
【００９０】
４）特異性の研究：
総数１４２個の細菌株に対して、ＰＣＲ増幅工程用の配列番号５および配列番号６のプライマーの対、配列番号１５の捕獲プローブおよびマイクロプレートでのハイブリダイゼーション工程用の配列番号１８の検出プローブを使用して試験を実施した。
【００９１】
イー・コリ株および非イー・コリ株（異なる属および種の細菌）を用いてマイクロプレート上で得られた結果をそれぞれ以下の表Ｉおよび表ＩＩに示す
【００９２】
【表１】
2008148697.tif 000002
（＋）の結果はＯＤ450＞２．５に対応する。
（＋）の結果はＯＤ450＜０．０５に対応する。
【００９３】
【表２】
2008148697.tif 000003
（＋）の結果はＯＤ450＞２．５に対応する。
（＋）の結果はＯＤ450＜０．０５に対応する。
【００９４】
結論として、Ｏ１５７：Ｈ７および１５７：Ｈ−株のみが上記の系を用いてマイクロプレート上で検出される。
【００９５】
実施例３
ＥＨＥＣの特異的検出
種々の血清型のイー・コリおよびＥＨＥＣの検出を妨害し得る他の細菌種を含む総数１４２個の細菌株について特異性を試験した。
【００９６】
ＤＮＡを実施例２の第１パラグラフに記載したプロトコルに従って抽出した。
【００９７】
増幅条件は以下のとおりである：反応を、５０ｍＭ  ＫＣｌ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；それぞれ０．５μＭの配列番号２１および配列番号２２のプライマー；２００μＭ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）；１単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（BRL Life Technologies）および実施例２のパラグラフ１で示したように調製したＤＮＡ  ５μｌを含有する総容量５０μｌで実施する。
【００９８】
温度サイクルを「Perkin-Elmer 9600」サーモサイクラー中で実施する。
【００９９】
各実験はポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを含む。
【０１００】
増幅産物をＥｔＢｒで染色したアガロースゲル上で可視化した。３８２ｂｐのバンドの存在は試験試料中のＥＨＥＣの存在を示す。
【０１０１】
結果を表ＩＩＩに示す。
ヒト感染から単離された株に頻繁に関連するビルレンス因子であるｅｈｌｙおよびｅａｅ特性を示す株のみが、配列番号２１および配列番号２２のプライマーの対を用いるＰＣＲによって検出される。
【０１０２】
さらに、このプライマーの対を使用することによっても、特に単一の増幅反応によって、腸管出血性大腸菌に特徴的な遺伝子型（ｖｔ＋、ｅａｅ＋、ｅｈｌｙ＋）を有するイー・コリ株を検出することが可能となる。
【０１０３】
【表３】
2008148697.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明は腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）群の細菌中に存在するプラスミド起源の２つの核酸配列、ＥＨＥＣ、特にビルレンス因子であるエンテロヘモリシン（enterohemolysine）およびインチミン（intimine）をコードする遺伝子を有するものの同定のための、より詳細にはＯ１５７：Ｈ７血清型の特異的検出のためのこの配列の使用に関する。本発明はまた、この配列を使用する方法およびこの配列を含む検出キットに関する。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】配列番号１の配列を示す図である。
【図２】配列番号２の配列を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０６】
SEQ ID NO:3: Synthetic oligonucleotide
SEQ ID NO:4: Synthetic oligonucleotide
SEQ ID NO:5: Synthetic oligonucleotide
SEQ ID NO:6: Synthetic oligonucleotide
SEQ ID NO:7: Synthetic oligonucleotide
SEQ ID NO:8: Synthetic oligonucleotide
SEQ ID NO:9: Synthetic oligonucleotide
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SEQ ID NO:24: Synthetic oligonucleotide
SEQ ID NO:25: Synthetic oligonucleotide
SEQ ID NO:26: Synthetic oligonucleotide
SEQ ID NO:27: Synthetic oligonucleotide
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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