(57)【要約】【課題】  マウスまたはラットにおける前癌病変または癌病変を確実に検出する検出方法と、物質に起因する発癌性を予測するスクリーニング方法とを提供する【解決手段】  本発明のラットまたはマウスの前癌病変または癌病変の検出方法は、ラットまたはマウス細胞に特異的に発現するサイトケラチン８の遺伝子の発現を検出することにより行う。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラットまたはマウスの前癌病変または癌病変に特異的に発現するサイトケラチン８の遺伝子の発現を検出する、
ラットまたはマウスの前癌病変または癌病変の検出方法。
【請求項２】
前記サイトケラチン８の遺伝子の発現の検出が、サイトケラチン８のタンパク質を検出する、請求項１に記載のラットまたはマウスの前癌病変または癌病変の検出方法。
【請求項３】
前記前癌病変または癌病変が、ラットまたはマウスの肝前癌病変または肝癌病変である、請求項１に記載のラットまたはマウスの前癌病変または癌病変の検出方法。
【請求項４】
被験物質と、ラットまたはマウスの細胞とを接触させ、
ラットまたはマウスの前癌病変または癌病変に特異的に発現するサイトケラチン８の遺伝子の発現を検出する、
物質の発癌性のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記サイトケラチン８の遺伝子の発現の検出が、サイトケラチン８のタンパク質を検出する、請求項４に記載の物質の発癌性のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記ラットまたはマウス細胞が肝細胞である、請求項４に記載の物質の発癌性のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラットまたはマウスの前癌病変または癌病変の検出方法および物質の発癌性のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、多数の化学物質が、環境下に存在している。これらの化学物質が発癌性を有するかどうかを確認することは重要である。従来、化学物質の発癌性を検定する代表的な方法としては、種々の脊椎動物（例えばラット）を用いた安全性試験において腫瘍マーカを指標として用いることにより、発癌性の有無を評価する方法が知られている。
【０００３】
例えば、ラットでは、胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ酵素（以下、「ＧＳＴ−Ｐ」という場合がある）という肝臓前癌病変マーカが存在する。このマーカを用いれば、８週齢のラットにおける前癌病変を効率よく計測できる。また、この結果は、３０週齢のラットにおける発癌性の結果と相関していることが知られている（非特許文献１、２参照）。
【非特許文献１】鰐渕  英機（Ｈｉｄｅｋｉ  Ｗａｎｉｂｕｃｈｉ）、他９名、「ジメチルアルシン酸によるラット肝細胞癌の発生の促進：肝臓内でのオルニチンデカルボキシラーゼ活性の上昇と８−ヒドロキシデオキシグアノシンの形成との関係（Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｔ  Ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ａｃｉｄ：Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ８−Ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ）」、ジャパニーズ  ジャーナル  オブ  キャンサー  リサーチ、日本、財団法人日本癌学会、１９９７年１２月、第８８号、ｐ．１１４９−１１５４
【非特許文献２】エヌ  イトウ（Ｉｔｏ，Ｎ）、他１３名、「ラットの前癌胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの陽性巣形成の誘発における種々の肝癌細胞誘発物質による増加効果−新規な中期バイオアッセイシステムへのアプローチ（Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ  ｏｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｆｏｒｍ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｆｏｃｉ  ｉｎ  ｒａｔ−ａｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｄｉｕｍ−ｔｅｒｍ  ｂｉｏａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ）」，カルチノジェネシス（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）、イギリス、オクスフォード  ユニバーシティ  プレス、１９８８、９、ｐ．３８７−３９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣において、前癌病変細胞巣で実際に発現しているタンパク質がわかると好ましい。特に、前癌病変細胞巣と癌性病変のいずれにも発現するものが検出できると好ましい。
【０００５】
また、マウスにおいては、ラットのＧＰＳ−Ｐのような前癌病変を検出できるマーカは知られていない。そのため、マウスにおいても、前癌病変を検出できるマーカの開発が望まれる。
【０００６】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、マウスまたはラットにおける前癌病変または癌病変を確実に検出する検出方法と、物質に起因する発癌性を予測するスクリーニング方法とを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ラットの前癌病変であるＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣に特異的に発現するタンパク質を、プロテオーム解析を用いて解析し、サイトケラチン８であることを見出した。また、サイトケラチン８は、ラットの前癌病変であるＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣のみならず、マウスの前癌病変である好塩基性細胞巣においても特異的に発現することを見出した。さらに、ラットおよびマウスの癌病変おいても、サイトケラチン８は特異的に発現していた。これにより、サイトケラチン８は、マウスまたはラットにおける前癌病変を確実に検出するとともに、サイトケラチン８をマーカとして用いれば、物質に起因する発癌性を予測することが可能になる。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【０００８】
本発明のラットまたはマウスの前癌または癌病変の検出方法は、ラットまたはマウス細胞に特異的に発現するサイトケラチン８の遺伝子の発現を検出することにより行う。前記サイトケラチン８の遺伝子の発現の検出が、サイトケラチン８のタンパク質を検出すると好ましい。また、前記前癌病変または癌病変が、ラットまたはマウスの肝前癌病変または癌病変であると好ましい。
【０００９】
本発明の物質の発癌性のスクリーニング方法は、被験物質と、ラットまたはマウスの細胞とを接触させ、ラットまたはマウスの前癌病変または癌病変に特異的に発現するサイトケラチン８の遺伝子の発現を検出するものである。前記サイトケラチン８の遺伝子の発現の検出が、サイトケラチン８のタンパク質を検出すると好ましい。また、前記ラットまたはマウス細胞は、肝細胞であると好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明では、マウスまたはラットの細胞における前癌病変または癌病変に特異的に発現するサイトケラチン８をマーカに用いることで、マウスまたはラットにおける前癌病変または癌病変を確実に検出する検出方法と、物質に起因する発癌性を予測するスクリーニング方法とを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
［サイトケラチン８］
サイトケラチン８は、単一上皮細胞の細胞骨格を構成するケラチン繊維タンパク質であり、サイトケラチンの１９種の亜分画の一つである。サイトケラチン８は、タイプＩとタイプＩＩの２種類のケラチンのヘテロ四量体であり、通常は細胞質基質や核質に存在する。サイトケラチン８は、ヒト、ラット、マウスにおける一部の癌細胞で検出されている。例えば、肺癌、乳癌、マウス肝芽腫などで、過度に発現する。また、ヒトでは、肺癌、乳癌、子宮頸癌などでの腫瘍マーカとして使用されている。サイトケラチン８は、腫瘍性形質変化に伴い、セリン残基がリン酸化することも知られている。
【００１２】
［ラットまたはマウス細胞］
本発明においてラットまたはマウス細胞とは、例えばラットまたはマウスから採取された組織あるいはこれらの組織から分離された細胞、またはその培養細胞等を挙げることができる。これらの試料はそのまま検体として用いてもよく、また、かかる試料から分離、分画、固定化等の種々の操作により調製された試料を検体として用いてもよい。好ましい組織は、肝臓組織である。
【００１３】
本発明のラットまたはマウスの前癌病変または癌病変の検出方法または物質の発癌性のスクリーニング方法においては、まず、ラットまたはマウスの細胞と被験物質とを接触させる。例えば、ラットまたはマウスから採取された組織内に存在している状態にある細胞、あるいは、当該組織から分離された細胞又はその培養細胞等があげられる。
【００１４】
本発明のラットまたはマウスの前癌病変または癌病変の検出方法または物質の発癌性のスクリーニング方法において、肝細胞と被験物質との接触は、例えば、ラットまたはマウスに被験物質を投与することにより、行ってもよい。ラットまたはマウスは、天然の動物のほか、トランスジェニック動物、遺伝子ノックアウト動物等であってもよい。ラットまたはマウスへの被験物質の投与方法としては、例えば、経口（強制又は飲料水や餌に混じ）、筋肉内、静脈内、皮下、腹腔内、経気道等により行うことができる。投与量、投与回数及び投与期間は、例えば、全身状態、全身諸器官組織等に重篤な影響を及ぼさない範囲内（例えば投与量は、最大耐量）とすればよい。
【００１５】
本発明のラットまたはマウスの前癌病変または癌病変の検出方法または物質の発癌性のスクリーニング方法において、サイトケラチン８の遺伝子の発現レベルを測定するものであってもよい。発現レベルの測定は、例えば、単位量の検体あたりの本遺伝子の転写物量を測定する方法、単位量の検体あたりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができる。
【００１６】
本発明のラットまたはマウスの前癌病変または癌病変の検出方法または物質の発癌性のスクリーニング方法において、単位量の検体あたりの本遺伝子の翻訳産物量を測定するには、例えば、当該タンパク質に対する特異抗体を用いた免疫学的測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、免疫組織化学的検査等）、二次元電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー等により実施することができる。具体的には、サイトケラチン８の遺伝子の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質に対する特異抗体は、常法に準じて、本遺伝子の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質を免疫抗原として調製することができる。
【００１７】
本発明のラットまたはマウスの前癌病変の検出方法または物質の発癌性のスクリーニング方法において、免疫組織化学的検査を行う場合には、サイトケラチン８を認識する抗体（抗サイトケラチン８抗体）に対して反応するラットまたはマウスの細胞の有無あるいはその発生程度を評価する。
【００１８】
遺伝子の転写物量を測定するには、例えば、サイトケラチン８の遺伝子の転写物であるｍＲＮＡ量を測定する。特定の遺伝子のｍＲＮＡ量の測定は、具体的には、例えば、定量的リアルタイム−ポリメラーゼチェイン反応（以下、定量的ＲＴ−ＰＣＲと記す。）、ノーザンハイブリダイゼーション法［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年］、ＤＮＡアレイ法、インサイチューハイブリダイゼーション法等により実施することができる。
【００１９】
サイトケラチン８の発現を遺伝子レベルで評価する場合には、遺伝子の発現レベルの測定値に基づいて評価する。
【００２０】
本発明のラットまたはマウスの前癌病変または癌病変の検出方法または物質の発癌性のスクリーニング方法を用いれば、ラットまたはマウスに対して発癌活性を有する物質の探索等に利用することができる。具体的には、本発明の物質の発癌性のスクリーニング方法により評価されたラットまたはマウスに対する発癌活性の有無又はその量に基づきラットまたはマウスに対して発癌活性を有する物質を選抜することによって、ラットまたはマウスに対して発癌活性物質を探索することができる。選抜されたラット発癌活性物質を用いると、例えば、癌モデル哺乳動物の作製等が行える。
【００２１】
また、サイトケラチン８は、ラットまたはマウスの発癌性マーカとなる。特に、マウスにおいて、有効なマーカである。
【実施例１】
【００２２】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【００２３】
［実施例１］
（サイトケラチン８の検索）
６週齢の雄性Ｆ３３ラットにジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）を１００ｍｇ／ｋｇを腹腔内に単回投与し、フェノバルビタール（ＰＢ）をそれぞれ０、５００ｐｐｍの用量で混餌投与した。実験開始後１０週でこのラットを屠殺し、肝臓を採取した。
【００２４】
採取した肝臓から組織を適度な大きさに切り出した後、ＯＣＴコンパウンドにこれを包埋し、液体窒素にて冷却したイソペンタン中で凍結させた。これを−２０℃に冷却したクリオスタット中で約５μｍの厚さに薄切し、スライドグラスに載せ、乾燥させた。
【００２５】
上記作製した薄切切片を７０％エタノ−ルで１分間固定した後、ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ（組成：１０  ｍＭ  リン酸ナトリウム  ［ｐＨ７．４］，  １００ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄してＯＣＴコンパウンドを落とし、０．３％過酸化水素水で５分間処理した。ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで５分間×３回洗浄し、正常血清で室温２０分間処理した。次いで、ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで適度に希釈したＧＳＴ−Ｐ抗体（一次抗体）（コードＮｏ．３１１、メディカル  アンド  バイオロジカル  ラボラトリー（株）製）で室温６０分間処理した。反応後、ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで５分間×３回洗浄し、ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで適度に希釈した一次抗体と同じ免疫動物のＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ／ＡＢＣ試薬（フナコシ）で室温３０分間処理した。更に、ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで５分間×３回洗浄した後、３，３'−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ナカライ）を用いて発色させた。
【００２６】
次に、得られた標本から、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）法（ＰＡＬＭ社製）を用いて、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣と周辺の正常組織とを切り出した。これを用いて、以下のようにプロテオーム解析をした（ＰＣＳ４０００シリーズ、サイファージェン・バイオシステムズ（株）製）。
【００２７】
ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の抽出液を、陽イオン型、陰イオン型、金属イン型のプロテインチップ（サイファージェン・バイオシステムズ（株）製）に固定させた。プロテインチップ（サイファージェン・バイオシステムズ（株）製）をインキュベートした後、水を用いてチップ表面を洗浄した。次にチップ上にエネルギー吸収分子を加えて乾燥させた。次に、プロテインチップに捕捉されたタンパク質の分子量を飛行時間型質量分析計により測定した。ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣からは５４０ｋＤａの質量のタンパク質が検出されたが、周辺の正常組織からは検出されなかった。
【００２８】
次に、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣抽出液を結合させたプロテインチップをマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）（ダルトニクス社製）を用いて分析した。この分析データに基づいてペプチドマスフィンガープリンティング法により、タンパク質を同定したところ、５４０ｋＤａの質量のタンパク質がサイトケラチン８であることを見出した。
【００２９】
（ラットおよびマウスの前癌病変および癌病変組織におけるサイトケラチン８の確認）
ラットおよびマウスから採取した肝臓から組織を取り出し、上記と同様に凍結標本を取り出した。これらから、ラットの肝細胞癌細胞、肝腺腫およびこれらの前癌病変であるＧＳＴ−Ｐ細胞、およびマウスの肝細胞癌細胞、肝腺腫およびこれらの前癌病変である抗塩基性細胞巣を、抗サイトケラチン８抗体（サイトケラチン８／１８ポリクローナル、ＧＰ１１、プローゲン  バイオテクニック  ゲーエムベーハー製）で免疫化学染色をし、光学顕微鏡で観察した。サイトケラチン８は、前癌病変および癌病変組織のいずれにおいても発現されていることがわかる。また、サイトケラチン８は、ラットのみならず、マウスにおいても発現しており、ラットおよびマウスの発癌マーカとして利用できることがわかった。図１は、マウスの前癌病変である抗塩基性細胞巣をヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色したもの（上図）、免疫化学染色をしたもの（下図）、図２は、マウスの肝細胞癌細胞巣をヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色したもの（上図）、免疫化学染色をしたもの（下図）、図３は、マウスの肝腺腫細胞巣をヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色したもの（上図）、免疫化学染色をしたもの（下図）である。また、図４は、ラットにＤＥＮとＰＢとを処理して発生したラットの前癌病変であるＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣と肝細胞癌巣とを免疫化学染色をしたものである。
【００３０】
図１から、図中で丸で囲ったマウスの前癌病変である抗塩基性細胞巣は、サイトケラチン８が発現していることがわかる（下図）。図２から、図中で丸で囲ったマウスの癌細胞巣は、サイトケラチン８が発現していることがわかる（下図）。図３から、図中で丸で囲ったマウスの肝腺腫細胞巣は、サイトケラチン８が発現していることがわかる（下図）。図４から、図中で丸で囲ったラットの前癌病変である抗塩基性細胞巣は、サイトケラチン８が発現しており（左上図）、この図を拡大した図から、複数の細胞巣にサイトケラチン８が発現していることがわかる（右上図）。また、ラットの肝腺腫細胞巣は、図中で丸で囲ったサイトケラチン８が発現しており（左下図）、この図を拡大した図から、多くの細胞巣にサイトケラチン８が発現していることがわかる（右下図）。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、マウスの前癌病変である抗塩基性細胞巣をヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色したもの（上図）、免疫化学染色をしたもの（下図）を示す写真である。
【図２】図２は、マウスの肝細胞癌細胞巣をヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色したもの（上図）、免疫化学染色をしたもの（下図）を示す写真である。
【図３】図３は、マウスの肝腺腫細胞巣をヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色したもの（上図）、免疫化学染色をしたもの（下図）を示す図である。
【図４】図４は、ラットにＤＥＮとＰＢとを処理して発生したラットの前癌病変であるＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣と肝細胞癌巣とを免疫化学染色をしたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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