(57)【要約】      （修正有）【課題】新たな角結膜障害の予防または治療剤の提供。【解決手段】Ｎｒｆ２（ＮＦ−Ｅ２ ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２）は、親電子性物質を直接解毒する異物代謝系第２相酵素およびヘムオキシゲナーゼといった抗酸化酵素等の遺伝子発現を誘導制御している転写因子であり、該Ｎｒｆ２の活性化物質を有効成分とする角結膜障害の予防または治療剤。該Ｎｒｆ２活性化物質としては、マイケル反応アクセプター、ｔ−ブチルハイドロキノン、クルクミンまたは下式で示される化合物が好ましい。2008110962.tif 000011【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｒｆ２活性化物質を有効成分として含む角結膜障害の予防または治療剤。
【請求項２】
Ｎｒｆ２活性化物質が、マイケル反応アクセプター、ジフェノール類、キノン類、ブチル化ヒドロキシアニソール類、ブチル化ヒドロキシトルエン類、イソチオシアネート類、ヒドロペルオキシド、メルカプタン類、１，２−ジチオール−チオン類、チオカーバメート類、ヒ素化合物、重金属、ジアリールスルフィド、インドール−３−カルビノール、エピガロカテキンガレート、エラグ酸、エトキシキン、カロテノイド類、共役系ポリエン類、４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，２−ベンゾセレナジン、イソフムロン酸および異性化ホップエキスからなる群より選択される請求項１記載の予防または治療剤。
【請求項３】
マイケル反応アクセプターが、マレイン酸ジエチル、マレイン酸ジメチル、１−ニトロ−１−シクロヘキセン、２−メチレン−４−ブチロールアセトン、１５−デオキシ−△１２，１４−プロスタグランジンＪ２、７（Ｅ）−［６−（４−メチルフェニル）ヘキシル］−５−オキソー３−シクロペンテン−１−イリデン］ヘプタン酸メチル、３−ヒドロキシクマリン、クルクミン、ビス（２−ヒドロキシベンジリデン）アセトンおよび下記一般式（Ｉ）で表される化合物からなる群より選択され、および／または、
ジフェノール類が、カテコール、クエルセチン、カルノソール、ロスマノール、エピロスマノール、カルノジン酸およびレスベラトロールからなる群より選択され、および／または、
キノン類がヒドロキノンおよびｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンからなる群より選択され、および／または、
イソチオシアネート類が、１−イソチオシアネート−４−（メチルスルフィニル）ブタン、６−（メチルスルフィニル）ヘキシルイソチオシアネート、フェネチルイソチオシアネート、グルコシノレートおよびグルコラファニンからなる群より選択され、および／または、
１，２−ジチオール−チオン類が、４−メチル−５−ピラジニル−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオンおよび１，２−ジチオール−チオン、アネトールトリチオンからなる群より選択される請求項２記載の予防または治療剤。
【化１】
2008110962.tif 000010
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は同一かまたは異なって水素原子またはアルキル基を示し、
Ｘは水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アルデヒド基またはカルボキシル基を示し、
Ｙはシアノ基または−ＣＯ−Ｚを示し、
Ｚは水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルコキシ基、アミノ基またはイミダゾール環、トリアゾール環およびベンゾイミダゾール環からなる群より選択される芳香族複素環を示す。
上記で規定した芳香族複素環はハロゲン原子、アルキル基またはフェニル基で置換されていてもよい。］
【請求項４】
Ｎｒｆ２活性化物質が、ｔｅｒｔ‐ブチルヒドロキノン、４−メチル−５−ピラジニル−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン、４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，２−ベンゾセレナジン、１−イソチオシアネート−４−（メチルスルフィニル）ブタン、カルノジン酸、カルノソール、クルクミンおよび一般式［Ｉ］で表される化合物ならびにこれらの塩類からなる群より選択される請求項３記載の予防または治療剤。
【請求項５】
一般式［Ｉ］で表される化合物が２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９（１１）−ジエン−２８−オイック酸、２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９（１１）−ジエン−２８−オイック酸メチルエステルまたは１−［２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９（１１）−ジエン−２８−オイル］イミダゾールである請求項４記載の予防または治療剤。
【請求項６】
角結膜障害がドライアイである請求項４記載の予防または治療剤。
【請求項７】
角結膜障害が、点状表層角膜症、角膜上皮欠損、角膜びらん、角膜潰瘍、結膜上皮欠損、乾性角結膜炎、上輪部角結膜炎、糸状角結膜炎、感染性角膜炎、非感染性角膜炎、感染性結膜炎または非感染性結膜炎である請求項４記載の予防または治療剤。
【請求項８】
投与形態が点眼投与または経口投与である請求項４記載の予防または治療剤。
【請求項９】
剤型が、点眼剤、眼軟膏、錠剤、細粒剤またはカプセル剤である請求項４記載の予防または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎｒｆ２活性化物質を有効成分として含むドライアイ、点状表層角膜症、角膜上皮欠損、角膜びらん、角膜潰瘍、結膜上皮欠損、乾性角結膜炎、上輪部角結膜炎、糸状角結膜炎、感染性角膜炎、非感染性角膜炎、感染性結膜炎、非感染性結膜炎などの角結膜障害の予防または治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は、酸化−抗酸化のバランスを調節し、細胞内酸化還元状態を一定に維持して機能している。この酸化−抗酸化のバランスが酸化方向に傾いた状態を酸化ストレスという。酸化ストレスは、脂質、ＤＮＡ、タンパク質などの生体高分子に修飾や障害を与え、細胞機能障害や細胞死を引き起こし、発癌、高血圧、動脈硬化、脳神経変性疾患、炎症、喘息、皮膚疾患、加齢黄斑変性、白内障といった加齢に伴う慢性疾患の発症や進行に深く関与していることが知られている。そのため、酸化−抗酸化のバランスを一定に維持する防御機構は生体にとって必須の生体防御システムであり、酸化ストレスからの防御能を高めることは、これらの疾患の予防や治療に有用であると考えられている（非特許文献１）。
【０００３】
近年、Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２システムが、哺乳類の酸化ストレス防御機構において中心的な役割を果たすことが明らかになってきた。Ｎｒｆ２（ＮＦ−Ｅ２ ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２）は、親電子性物質を直接解毒するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、キノンオキシドレダクターゼといった異物代謝系第２相酵素およびヘムオキシゲナーゼ、ペルオキシレドキシンといった抗酸化酵素等の遺伝子発現を誘導制御している転写因子である。Ｎｒｆ２は、定常状態（未刺激の状態）では、細胞質中でＫｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ−ｌｉｋｅ ＥＣＨ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）と複合体を形成し不活性状態にあるが、親電子性物質や活性酸素種といった酸化ストレスに暴露されると、Ｋｅａｐ１との相互作用が減弱し（解離が促進されて）核へ移行する。核に移行したＮｒｆ２は、小Ｍａｆ（Ｍｕｓｃｕｌｏａｐｏｎｅｕｒｏｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ）群因子とヘテロニ量体を形成し、標的配列である抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ：ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）と呼ばれるプロモーター配列に結合して、上述した酵素群の遺伝子発現を誘導する。このように、Ｎｒｆ２は、生体の酸化ストレスからの防御や生体異物の解毒排泄を統一的に制御していることが知られている（非特許文献２）。
【０００４】
また、Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２システムが破綻したマウス（Ｎｒｆ２遺伝子欠損マウス）では、細胞内の酸化−抗酸化のバランスが崩れて、易発ガン性（ベンツピレンによる前胃部発ガン、ニトロサミンによる膀胱発ガン等）、外来異物／酸化ストレスに対する感受性亢進（アセトアミノフェンによる肝障害、高酸素暴露による肺障害等）、炎症・免疫系の異常（糸球体腎炎、全身性自己免疫疾患、タバコ誘導性肺気腫等）を示すことが報告されている。このように、Ｎｒｆ２の機能欠損は酸化ストレスを引き起こし、癌、高血圧、脳神経変性疾患、炎症といった疾患を誘発することが示唆されている（非特許文献３）。
【０００５】
このような知見から、Ｎｒｆ２の活性化は、酸化ストレスが関連する疾患の予防、改善に非常に有効であると考えられている。たとえば、Ｎｒｆ２を活性化する物質として知られるオルチプラズやスルフォラファンがベンツピレンによる前胃部発ガンを抑制すること、Ｎｒｆ２を活性化する物質であるオルチプラズがニトロサミンによる膀胱発ガンを抑制することが報告されている（非特許文献３）。
【０００６】
また、酸化ストレスが関連する眼科疾患である加齢黄斑変性や白内障に対するＮｒｆ２活性化物質の有用性を示した報告として、非特許文献４〜５および特許文献１〜３がある。加齢黄斑変性は、黄斑の加齢変化に伴う変性症で、紫外線暴露により蓄積されるレチンアルデヒド（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎａｌｄｅｈｙｄｅ）といった酸化ストレスが網膜色素細胞を障害することが知られているが、非特許文献４および特許文献１には、Ｎｒｆ２活性化物質であるスルフォラファンやビス−２−ヒドロキシベンジリデンアセトンがこの細胞障害を抑制することが報告されている。非特許文献５には、Ｎｒｆ２活性化物質であるクルクミンがガラクトース誘発白内障を抑制することが報告されている。特許文献２および３には、Ｎｒｆ２活性化物質を用いた加齢黄斑変性のドルーセン形成、糖尿病性網膜症および緑内障に伴う網膜症・視神経症の治療方法が記載されている。
【０００７】
しかしながら、Ｎｒｆ２活性化物質について、ドライアイ、角膜潰瘍、角膜炎、結膜炎等といった角結膜障害に対する薬理作用を検討する報告はない。特に、Ｎｒｆ２活性化物質のドライアイに対する予防、改善効果について検討する報告はない。
【特許文献１】国際公開０３／５１３１３号パンフレット
【特許文献２】国際公開２００５／０６３２４９号パンフレット
【特許文献３】国際公開２００５／０６３２９５号パンフレット
【非特許文献１】Biomed. Pharmacother. 57, 251-60（2003）
【非特許文献２】J. Biol. Chem., 278, 14, 12029-38（2003）
【非特許文献３】別冊「医学のあゆみ」レドックス−ストレス防御の医学, 46-9（2005）
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci., 101, 10446-51（2004）
【非特許文献５】Mol. Vis., 9, 223-30（2003）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、Ｎｒｆ２活性化物質に関して、新たな医薬用途を探索することは興味深い課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、Ｎｒｆ２活性化物質の新たな医薬用途を探索すべく鋭意研究を行ったところ、Ｎｒｆ２活性化能を有することが報告されている化合物等が、ヒト角膜上皮細胞においても異物代謝系第２相酵素および抗酸化酵素の遺伝子発現を誘導制御することを見出した。さらに、Ｎｒｆ２活性化物質が、角膜障害モデルを用いた角膜障害治癒効力試験において、角膜障害に対して優れた予防および改善効果を発揮することを見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、Ｎｒｆ２活性化物質を有効成分とするドライアイ、点状表層角膜症、角膜上皮欠損、角膜びらん、角膜潰瘍、結膜上皮欠損、乾性角結膜炎、上輪部角結膜炎、糸状角結膜炎、感染性角膜炎、非感染性角膜炎、感染性結膜炎、非感染性結膜炎などの角結膜障害の予防または治療剤である。
【００１１】
本発明のＮｒｆ２活性化物質とは、転写因子であるＮｒｆ２を活性化させる作用を有する化合物をいい、Ｎｒｆ２の活性化とは、Ｎｒｆ２と複合体を形成することで細胞質にトラップしているＫｅａｐ１から解離させることをいう。また、この解離の結果、Ｎｒｆ２は核へ移行して、異物代謝系第２相酵素や抗酸化酵素等の遺伝子発現を誘導するので、Ｎｒｆ２活性化物質はＮｒｆ２の核への移行を促進する作用も有する。
【００１２】
本発明のＮｒｆ２活性化物質は、例えば、（１）マイケル反応アクセプター、（２）ジフェノール類、キノン類、ブチル化ヒドロキシアニソール類、ブチル化ヒドロキシトルエン類、（３）イソチオシアネート類、（４）ヒドロペルオキシド、（５）メルカプタン類、特に、２つのチオール基が隣接しているビシナルジチオール類、（６）１，２−ジチオール−チオン類、（７）チオカーバメート類、（８）ヒ素化合物、（９）重金属、（１０）ジアリールスルフィド、インドール−３−カルビノール、エピガロカテキンガレート、エラグ酸、エトキシキン、カロテノイド類、共役系ポリエン類、４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，２−ベンゾセレナジン、イソフムロン酸、異性化ホップエキス（ＷＯ２００６／０４３６７１）、これらの塩等が挙げられる（生化学，７６（４），Ｐ．３３９−４８（２００４）、PNAS 98, 6, 3404-9（2001）、蛋白質  核酸  酵素，４４（１５），Ｐ．２３９０−５（１９９９）、ＷＯ２００５／０６３２４９、ＷＯ２００５／０６３２９５）。
【００１３】
マイケル反応アクセプターの例として、カルボニル基、二トリル基、ニトロ基などの電子求引基と結合した炭素−炭素二重結合をもつ化合物（α、β−不飽和カルボニル化合物等）が挙げられ、具体的には、マレイン酸誘導体（マレイン酸ジエチル、マレイン酸ジメチル等）、フマル酸誘導体、１−ニトロ−１−シクロヘキセン、２−メチレン−４−ブチロールアセトン、１５−デオキシ−△１２，１４−プロスタグランジンＪ２、７（Ｅ）−［６−（４−メチルフェニル）ヘキシル］−５−オキソー３−シクロペンテン−１−イリデン］ヘプタン酸メチル（PNAS 103, 3, 768-73（2006））、クマリン類（３−ヒドロキシクマリン等）、クルクミン、ビス（２−ヒドロキシベンジリデン）アセトン、下記一般式（Ｉ）で表される化合物（Cancer Res. 65, 11, 4789-98（2005））等が挙げられる。
【化１】
2008110962.tif 000002
【００１４】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は同一かまたは異なって水素原子またはアルキル基を示し、
Ｘは水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アルデヒド基またはカルボキシル基を示し、
Ｙはシアノ基または−ＣＯ−Ｚを示し、
Ｚは水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルコキシ基、アミノ基またはイミダゾール環、トリアゾール環およびベンゾイミダゾール環からなる群より選択される芳香族複素環を示す。
【００１５】
上記で規定した芳香族複素環はハロゲン原子、アルキル基またはフェニル基で置換されていてもよい。］
ジフェノール類、キノン類、ブチル化ヒドロキシアニソール類およびブチル化ヒドロキシトルエン類の例として、カテコール、クエルセチン、カルノソール、ロスマノール、エピロスマノール、カルノジン酸等の１，４−または１，２−の位置に水酸基が入った構造をもち、酸化されてキノンになりうるジフェノール類、レスベラトロール、ヒドロキノン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、２−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキシアニソール、３−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキシアニソール、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキシトルエン等が挙げられる。イソチオシアネート類は、イソチオシアネート（Ｓ＝Ｃ＝Ｎ−）基を含有する化合物をいい、植物とその種子に広く存在している。イソチオシアネート類の例として、１−イソチオシアネート−４−（メチルスルフィニル）ブタン（以下、「スルフォラファン」ともいう）、６−（メチルスルフィニル）ヘキシルイソチオシアネート、フェネチルイソチオシアネート等が挙げられ、また、イソチオシアネート類の前駆体であるグルコシノレート、グルコラファニン（スルフォラファンの前駆体）等もこれに含まれる。ヒドロペルオキシドの例として、クメンヒドロペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド等が挙げられる。メルカプタン類の例として、２，３−ジメルカプトプロパノール、１，２−エタンジチオール等といった２つのチオール基が隣接しているビシナルジチオール類等が挙げられる。１，２−ジチオール−チオン類の例として、４−メチル−５−ピラジニル−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン（以下、「オルチプラズ」ともいう）、１，２−ジチオール−チオン、アネトールトリチオン等が挙げられる。チオカーバメート類の例として、ピロリジンジチオカーバメート等が挙げられる。ヒ素化合物の例として、亜ヒ酸（ＮａＡｓＯ２）など３価のヒ素化合物で近接した２個のチオール基に結合する性質をもつ化合物が挙げられる。重金属の例として、ＨｇＣｌ２（Ｈｇ２＋）、ＣｄＣｌ２（Ｃｄ２＋）、ＺｎＣｌ２（Ｚｎ２＋）などでチオール基と反応する重金属が挙げられる。
【００１６】
好ましくは、ｔｅｒｔ‐ブチルヒドロキノン、オルチプラズ、４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，２−ベンゾセレナジン、スルフォラファン、カルノジン酸、カルノソール、クルクミン、下記一般式［Ｉ］で表される化合物が挙げられる。
【００１７】
一般式［Ｉ］で表される化合物の好ましい例としては、下記式［ＩＩ］で示される２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９（１１）−ジエン−２８−オイック酸（以下。「ＣＤＤＯ」ともいう）、下記式［ＩＩＩ］で示される２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９（１１）−ジエン−２８−オイック酸メチルエステル（以下、「ＣＤＤＯ−Ｍｅ」ともいう）、または、下記式［ＩＶ］で示される１−［２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９（１１）−ジエン−２８−オイル］イミダゾール（以下、「ＣＤＤＯ−Ｉｍ」ともいう）が挙げられる。
【化２】
2008110962.tif 000003
【化３】
2008110962.tif 000004
【化４】
2008110962.tif 000005
【００１８】
上述のように、本発明のＮｒｆ２活性化物質は、多様な化学構造のものが挙げられ、化学構造には共通点は見出せない。しかし、その一方で、これらの構造の異なる多様な物質にほぼ共通している性質として、ＳＨ（チオール）基に反応性があることが挙げられる。この事実は、Ｎｒｆ２の活性化が、化学物質の三次元立体構造を認識しているのではなく、その反応性（親電子性）を認識していることを示唆している。
【００１９】
実際に、Ｎｒｆ２活性化の分子メカニズムとして以下のような仮説が立てられている。Ｎｒｆ２は、定常状態においてはＫｅａｐ１のＫｅｌｃｈドメインと相互作用することで細胞質にトラップされ不活性な状態にある。Ｋｅａｐ１はＩＶＲと呼ばれる領域を有しており、この領域に親電子性物質が作用することでＫｅｌｃｈドメインのコンフォメーション変化を促し、Ｎｒｆ２との相互作用を減弱させることで、Ｎｒｆ２は解離されると考えられている。より具体的には、ＩＶＲは反応性の高いシステイン残基が存在しており、このシステイン残基と親電子性物質が共有結合することによりＫｅｌｃｈドメインのコンフォメーション変化を促していると考えられている（生化学，７６（４），Ｐ．３３９−４８（２００４））。
【００２０】
すなわち、本発明のＮｒｆ２活性化物質は、広義には、ＳＨ基と反応性を有する親電子性の化合物をいう。
【００２１】
なお、Ｎｒｆ２活性化物質であるか否かは、後述の試験方法（実施例１）のように、核のＮｒｆ２量を指標に調べることもできる。
【００２２】
一般式［Ｉ］で表される化合物は、有機合成化学の分野における通常の方法に従って製造でき、特表２００２−５３０２７２およびＷＯ２００４／０６４７２３に記載された方法に基づいても製造することができる。
【００２３】
ここで、本明細書中で規定した各基および文言について以下に示す。「アルキル」とは炭素原子数１〜８個の直鎖または分枝のアルキルを示し、好ましくは炭素原子数１〜６個の直鎖または分枝のアルキルを示す。具体例としてメチル、エチル、ｎ‐プロピル、ｎ‐ブチル、ｎ‐ペンチル、ｎ‐ヘキシル、イソプロピル、イソブチル、イソペンチル、イソヘキシル、ｓｅｃ‐ブチル、ｔ‐ブチル等が挙げられる。「アルコキシ」とは炭素数１〜８個の直鎖または分枝のアルコキシを示し、好ましくは炭素原子数１〜６個の直鎖または分枝のアルコキシを示す。具体例としてメトキシ、エトキシ、ｎ‐プロポキシ、ｎ‐ブトキシ、ｎ‐ペントキシ、ｎ‐ヘキシルオキシ、イソプロポキシ、イソブトキシ、イソペントキシ、イソヘキシルオキシ、ｓｅｃ‐ブトキシ、ｔ‐ブトキシ等が挙げられる。ハロゲン原子とはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素を示す。
【００２４】
本化合物の塩類は、医薬として許容される塩類であれば特に制限されず、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、鉄塩、マンガン塩をはじめ、塩酸、硝酸、硫酸等の無機酸との塩、酢酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸等の有機酸との塩などが挙げられ、第四級アンモニウム塩も本発明における塩類に包含される。本化合物は、水和物および溶媒和物の形態をとっていてもよい。また、本化合物の光学異性体、幾何異性体、互変異性体、多形体など本発明の範囲に含まれる。
【００２５】
本発明において、角結膜障害とは、涙液異常、代謝異常、外的傷害等といった種々の要因により角膜や結膜が障害を受けた状態にあるものをいい、例えばドライアイ、点状表層角膜症、角膜上皮欠損、角膜びらん、角膜潰瘍、結膜上皮欠損、乾性角結膜炎、上輪部角結膜炎、糸状角結膜炎、感染性角膜炎、非感染性角膜炎、感染性結膜炎、非感染性結膜炎などが挙げられる。また、本発明において、ドライアイとは、涙液減少症、眼乾燥症、乏涙症、シェーグレン症候群、乾性角結膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、涙腺機能不全、マイボーム腺機能不全、眼瞼炎、ＶＤＴ（Ｖｉｓｕａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ）作業、手術、薬剤、外傷、コンタクトレンズ装用等に伴う角結膜障害、または当該角結膜障害を伴う症状をいう。
【００２６】
本発明の角結膜障害の予防または治療剤は、経口でも、非経口（点眼、経皮等）でも投与することができる。投与剤型としては、点眼剤、眼軟膏、ゲル、皮膚軟膏、注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等が挙げられる。これらは汎用されている技術を用いて製剤化することができる。例えば、点眼剤であれば、塩化ナトリウム、濃グリセリン等の等張化剤、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等の緩衝化剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレ−ト、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤、クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム等の安定化剤、塩化ベンザルコニウム、パラベン等の防腐剤等を必要に応じて用い製剤化することができる。ｐＨは眼科製剤に許容される範囲内にあればよいが、４〜８の範囲が好ましい。
【００２７】
眼軟膏であれば、白色ワセリン、流動パラフィン等の汎用される基剤を用いて調製することができる。また、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤であれば、乳糖、結晶セルロ−ス、デンプン、植物油等の増量剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロ−ス、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロ−ス  カルシウム、低置換ヒドロキシプロピルメチルセルロ−ス等の崩壊剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロ−ス、マクロゴ−ル、シリコン樹脂等のコ−ティング剤、ゼラチン皮膜等の皮膜剤などを必要に応じて加えればよい。
【００２８】
本発明のＮｒｆ２活性化物質の投与量は、剤型、投与すべき患者の症状の軽重、年令、体重、医師の判断等に応じて適宜変えることができるが、経口剤の場合、一般には、成人に対し１日あたり０．０１〜５０００ｍｇ、好ましくは０．１〜２５００ｍｇ、より好ましくは０．５〜１０００ｍｇを１回又は数回に分けて投与することができる。また、点眼剤又は挿入剤の場合には、０．０００００１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００００１〜１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０００１〜０．１％（ｗ／ｖ）の有効成分濃度のものを１日１回又は数回投与することができる。
【発明の効果】
【００２９】
後述の試験を実施したところ、Ｎｒｆ２活性化能を有することが報告されているｔｅｒｔ‐ブチルヒドロキノン、オルチプラズ、スルフォラファン、カルノジン酸、カルノソール、クルクミン、ＣＤＤＯ、ＣＤＤＯ−ＭｅおよびＣＤＤＯ−Ｉｍが、ヒト角膜上皮細胞において、Ｎｒｆ２によって発現制御されている標的遺伝子グルタミン酸システインリガーゼ調節サブユニット（Glutamate-cysteine ligase, modifier subunit：以下、「ＧＣＬＭ」ともいう）、チオレドキシンレダクターゼ（Thioredoxin Reductase：以下、「ＴＲｘＲ」ともいう）、ヘムオキシゲナーゼ１（Heme oxigenase 1：以下、「ＨＯ１」ともいう）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノン酸化還元酵素（NAD(P)H quinone oxidoreductase 1：以下、「ＮＱＯ１」ともいう）の発現量を増加させることを示した。すなわち、Ｎｒｆ２活性化物質は、ヒト角膜上皮細胞においても異物代謝系第２相酵素（例えば、ＮＱＯ１）および抗酸化酵素（例えば、ＨＯ１）の遺伝子発現を誘導制御する。同様に、４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，２−ベンゾセレナジンが、ヒト角膜上皮細胞において、Ｎｒｆ２によって発現制御されている標的遺伝子ＧＣＬＭ、ＴＲｘＲ、ＨＯ１およびＮＱＯ１の発現量を増加させることを示した。すなわち、４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，２−ベンゾセレナジンはＮｒｆ２活性化能を有し、ヒト角膜上皮細胞において異物代謝系第２相酵素および抗酸化酵素の遺伝子発現を誘導制御する。
【００３０】
また、下記の薬理試験を実施したところ、Ｎｒｆ２活性化物質であるｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、オルチプラズ、スルフォラファン、カルノソール、クルクミン、４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，２−ベンゾセレナジン、ＣＤＤＯ、ＣＤＤＯ−ＭｅおよびＣＤＤＯ−Ｉｍが、角膜障害モデルにおいて優れた改善効果を示した。すなわち、Ｎｒｆ２活性化物質は、ドライアイ、点状表層角膜症、角膜上皮欠損、角膜びらん、角膜潰瘍、結膜上皮欠損、乾性角結膜炎、上輪部角結膜炎、糸状角結膜炎、感染性角膜炎、非感染性角膜炎、感染性結膜炎、非感染性結膜炎などの角結膜障害の予防または治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下に、実施例および製剤例の結果を示すが、これらの例は本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３２】
［実施例１］
Ｎｒｆ２活性化物質の検査方法
核のＮｒｆ２量を指標にしてＮｒｆ２活性化能を有するか否かを調べることができる。
【００３３】
肝癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）を用いて、ある化合物がＮｒｆ２の活性化能を有しているか否か評価できる。例えば、単層ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むアルファＭＥＭ培地中で培養し、サブコンフルエントに達した時点で被験化合物を含有する培地に交換する。２４時間培養後、Abhinav K. Jainらの方法（J. Biol. Chem., 280, 32, 29158-29168（2005））に記載されるように核抽出物を採取し、イムノブロッティングにてＮｒｆ２の量を定量する。被験化合物なしの対照細胞と比較して、被験化合物を処置した細胞の核抽出物中のＮｒｆ２量が増加すれば、当該化合物はＮｒｆ２活性化能を有していると判断できる。
【００３４】
［実施例２］
Ｎｒｆ２活性化能を有することが報告されている化合物および４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，２−ベンゾセレナジンのヒト角膜上皮細胞における異物代謝系第２相酵素および抗酸化酵素の遺伝子発現誘導能を調べた。
【００３５】
Ｎｒｆ２により発現制御される遺伝子の発現解析
ヒト角膜上皮細胞を用い、Ｎｒｆ２の活性化によって発現増加することが知られている標的遺伝子の発現への影響を調べた。
【００３６】
（実験方法）
細胞は理化学研究所・バイオリソースセンターより入手したＳＶ４０不死化ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥ−Ｔ）を用いた。６ウェルプレートに１×１０５個のＨＣＥ−Ｔを播種して、３７℃、５％ＣＯ２条件下、３日間培養した。培養液は１５%牛胎児血清（ＩＣＮ）と４０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（ナカライテスク）を用いた。培養液を除去し、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（１００μＭ）、オルチプラズ（１００μＭ）、４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，２−ベンゾセレナジン（１５μＭ）、スルフォラファン（１５μＭ）、カルノジン酸（１５μＭ）、カルノソール（１５μＭ）、クルクミン（１５μＭ）、ＣＤＤＯ（１００ｎＭ）、ＣＤＤＯ−Ｍｅ（１００ｎＭ）またはＣＤＤＯ−Ｉｍ（１０ｎＭ）を含有する培養液に交換し、３７℃、５％CO２条件下、１２時間培養した。各化合物はＤＭＳＯに溶解し、培養液で１０００倍希釈することにより上記濃度に調整した。また、ＤＭＳＯのみを含有する培養液を基剤培養液とした。
【００３７】
培養１２時間後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびＭ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型とし、下記配列のプライマーおよびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（商標）  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（商標）  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）にて各種遺伝子発現量を測定した。ハウスキーピング遺伝子のグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase：以下、「ＧＡＰＤＨ」という）を内部標準として用い、遺伝子発現量を補正した。
【００３８】
ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（以下、「ｔＢＨＱ」ともいう）およびオルチプラズの遺伝子発現解析においては、表１に示すＤＮＡプライマーを使用した。
【表１】
2008110962.tif 000006
【００３９】
４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，２−ベンゾセレナジン（以下、「ＢＸＴ−５１０７２」ともいう）、スルフォラファン、カルノジン酸、カルノソール、クルクミン、ＣＤＤＯ、ＣＤＤＯ−ＭｅおよびＣＤＤＯ−Ｉｍの遺伝子発現解析においては、表２に示すＤＮＡプライマーを使用した。
【表２】
2008110962.tif 000007
【００４０】
（結果）
基剤培養液の発現量を１として、各７化合物の遺伝子発現量（例数３の平均）を表３に示す。
【表３】
2008110962.tif 000008
【００４１】
（考察）
表３から明らかなように、本試験で用いた全ての化合物において、Ｎｒｆ２によって誘導制御されている標的遺伝子ＧＣＬＭ、ＴＲｘＲ、ＮＱＯ１およびＨＯ１の発現量の増加が認められた。ｔＢＨＱ、オルチプラズ、スルフォラファン、カルノジン酸、カルノソール、クルクミン、ＣＤＤＯ、ＣＤＤＯ−ＭｅおよびＣＤＤＯ−Ｉｍといった化合物は、種々の細胞において、Ｎｒｆ２を活性化することが報告されているが、これらのＮｒｆ２活性化物質が、ヒト角膜上皮細胞においても、異物代謝系第２相酵素および抗酸化酵素の遺伝子発現を誘導制御することが示された。また、上記のＮｒｆ２活性化物質と同様に、ヒト角膜上皮細胞において、ＢＸＴ−５１０７２が異物代謝系第２相酵素および抗酸化酵素の遺伝子発現を誘導制御することが示された。従って、ＢＸＴ−５１０７２がＮｒｆ２活性化能を有することが示唆された。以上の結果から、クルクミン、ＣＤＤＯ、ＣＤＤＯ−ＭｅおよびＣＤＤＯ−Ｉｍに代表されるマイケル反応アクセプター、カルノジン酸およびカルノソールに代表されるジフェノール類、ｔＢＨＱに代表されるキノン類、スルフォラファンに代表されるイソチオシアネート類、オルチプラズに代表される１，２−ジチオール−チオン類およびＢＸＴ−５１０７２といったＮｒｆ２活性化物質が、ヒト角膜上皮細胞においても、異物代謝系第２相酵素および抗酸化酵素の遺伝子発現を誘導制御することが示された。
【００４２】
［実施例３］
角膜障害モデルを用いて、Ｎｒｆ２活性化物質の角膜障害の改善効果を調べた。
【００４３】
角膜障害の治癒効力試験
雄性SDラットを用い、Fujiharaらの方法（Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 42(1) 96-100 (2001)）に準じ、角膜障害モデルを作製した。角膜障害モデル作成後、宮田らの方法（眼科臨床医報, 48(2), 183-188 (1994)）に修飾を加えた手法（あたらしい眼科, 21(1), 87-90 (2004)）で、角膜障害の改善率を求めた。
【００４４】
（実験方法）
雄SDラットを用い、ネンブタ−ルを投与して全身麻酔を施した後、眼窩外涙腺を摘出し、２ヶ月かけて角膜障害を誘発させた。
【００４５】
つぎに、Ｎｒｆ２活性化物質であるｔＢＨＱ、オルチプラズ、ＢＸＴ−５１０７２、スルフォラファン、カルノソールおよびクルクミンを以下のように投与した。
【００４６】
ｔＢＨＱ点眼群：
ｔＢＨＱ（６２５μＭ）を含む生理食塩水溶液を両眼に１日６回、１４日間点眼した（一群４匹８眼）。
【００４７】
オルチプラズ点眼群：
オルチプラズ（５００μＭ）を含む生理食塩水溶液を両眼に１日６回、１４日間点眼した（一群４匹８眼）。
【００４８】
ＢＸＴ−５１０７２点眼群：
ＢＸＴ−５１０７２（２５μＭ）を含む生理食塩水溶液を両眼に１日６回、１４日間点眼した（一群４匹８眼）。
【００４９】
スルフォラファン点眼群：
スルフォラファン（２５μＭ）を含む生理食塩水溶液を両眼に１日６回、１４日間点眼した（一群４匹８眼）。
【００５０】
カルノソール点眼群：
カルノソール（２５μＭ）を含む生理食塩水溶液を両眼に１日６回、１４日間点眼した（一群４匹８眼）。
【００５１】
クルクミン点眼群：
クルクミン（２５μＭ）を含む生理食塩水溶液を両眼に１日６回、１４日間点眼した（一群４匹８眼）。
【００５２】
ＣＤＤＯ点眼群：
ＣＤＤＯ（１μＭ）を含む生理食塩水溶液を両眼に１日６回、７日間点眼した（一群４匹８眼）。
【００５３】
ＣＤＤＯ−Ｍｅ点眼群：
ＣＤＤＯ−Ｍｅ（０．１μＭ）を含む生理食塩水溶液を両眼に１日６回、７日間点眼した（一群４匹８眼）。
【００５４】
ＣＤＤＯ−Ｉｍ点眼群：
ＣＤＤＯ−Ｍｅ（０．１μＭ）を含む生理食塩水溶液を両眼に１日６回、７日間点眼した（一群４匹８眼）。
【００５５】
なお、コントロール群として、生理食塩水を両眼に１日６回、７日間（ＣＤＤＯ、ＣＤＤＯ−ＭｅおよびＣＤＤＯ−Ｉｍの対照）あるいは１４日間（ｔＢＨＱ、オルチプラズ、、ＢＸＴ−５１０７２、スルフォラファン、カルノソールおよびクルクミンの対照）点眼した（一群４匹８眼）。
【００５６】
点眼開始７日後あるいは１４日後、角膜の障害部分をフルオレセインにて染色した。角膜の上部、中間部および下部のそれぞれについて、フルオレセインによる染色の程度を下記の基準に従ってスコア判定し、上記各部におけるスコアの合計の平均値から角膜障害の改善率を算出した。正常眼についても上記各部におけるスコアの合計の平均値を求めた。
【００５７】
（判定基準）
０：染色されていない。
【００５８】
１：染色が疎であり、各点状の染色部分は離れている。
【００５９】
２：染色が中程度であり、点状の染色部分の一部が隣接している。
【００６０】
３：染色が密であり、各点状の染色部分は隣接している。
【００６１】
（結果）
コントロ−ル群（生理食塩水）のスコア平均値を基準（改善率：０％）にして下記計算式より算出した、ｔＢＨＱ、オルチプラズ、ＢＸＴ−５１０７２、スルフォラファン、カルノソール、クルクミン、ＣＤＤＯ、ＣＤＤＯ−ＭｅおよびＣＤＤＯ−Ｉｍの各改善率を表４に示す。なお、スコアの平均値は各８例の平均である。
【００６２】
改善率（％）＝｛（コントロ−ル）−（被験化合物）｝/ 障害度×１００
障害度＝｛（コントロ−ル）−（正常眼）｝
【表４】
2008110962.tif 000009
【００６３】
（考察）
上記のラットを用いた角膜障害の治癒効力試験の結果から明らかなように、ｔＢＨＱ、オルチプラズ、ＢＸＴ−５１０７２、スルフォラファン、カルノソール、クルクミン、ＣＤＤＯ、ＣＤＤＯ−ＭｅおよびＣＤＤＯ−Ｉｍは角膜障害を顕著に改善した。すなわち、クルクミン、ＣＤＤＯ、ＣＤＤＯ−ＭｅおよびＣＤＤＯ−Ｉｍに代表されるマイケル反応アクセプター、カルノソールに代表されるジフェノール類、ｔＢＨＱに代表されるキノン類、スルフォラファンに代表されるイソチオシアネート類、オルチプラズに代表される１，２−ジチオール−チオン類およびＢＸＴ−５１０７２といったＮｒｆ２活性化物質が、角膜障害に対して改善効果を有することが示された。
【００６４】
［製剤例］
製剤例を挙げて本発明の薬剤をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの製剤例にのみ限定されるものではない。
【００６５】
処方例１  点眼剤
１００ｍｌ中
カルノソール                                      １０ｍｇ
塩化ナトリウム                                    ９００ｍｇ
滅菌精製水                                        適量
カルノソールの添加量を変えることにより、濃度が０．００１％（ｗ／ｖ）、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）の点眼剤を調製できる。
【００６６】
処方例２  点眼剤
１００ｍｌ中
オルチプラズ                                      １００ｍｇ
塩化ナトリウム                                    ８００ｍｇ
リン酸水素二ナトリウム                            １００ｍｇ
リン酸二水素ナトリウム                            適量
滅菌精製水                                        適量
オルチプラズの添加量を変えることにより、濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）の点眼剤を調製できる。
【００６７】
処方例３  眼軟膏
１００ｇ中
スルフォラファン                                  ０．３ｇ
流動パラフィン                                    １０．０ｇ
白色ワセリン                                      適量
スルフォラファンの添加量を変えることにより、濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｗ）の眼軟膏を調製できる。
【００６８】
処方例４  錠剤
１００ｍｇ中
クルクミン                                          １ｍｇ
乳糖                                                ６６．４ｍｇ
トウモロコシデンプン                                ２０ｍｇ
カルボキシメチルセルロースカルシウム                ６ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース                        ６ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                            ０．６ｍｇ
クルクミン、乳糖を混合機中で混合し、その混合物にカルボキシメチルセルロースカルシウム及びヒドロキシプロピルセルロースを加えて造粒し、得られた顆粒を乾燥後整粒し、その整粒顆粒にステアリン酸マグネシウムを加えて混合し、打錠機で打錠する。また、クルクミンの添加量を変えることにより、１００ｍｇ中の含有量が０．１ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇの錠剤を調製できる。