(57)【要約】      （修正有）【課題】メナキノンの新規生合成経路を用いるメナキノンの製造方法、および新規生合成経路を利用したメナキノンの生合成阻害剤の探索方法の提供。【解決手段】特定の塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードし、または該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。上記ＤＮＡによりコードされるタンパク質。上記ＤＮＡを含む形質転換体を培養し、該培養物からメナキノンを採取する、メナキノンの製造方法。阻害剤候補化合物およびメナキノンを含有する培地、および、当該阻害剤候補化合物を含有するがメナキノンは含有しない培地において、上記ＤＮＡから選ばれた２種以上のＤＮＡを有する菌株の生育状況を調べ、メナキノンの新規生合成経路に特異的な阻害剤を同定することを特徴とする、阻害剤の探索方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のＡ〜Ｇのいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ。
Ａ．下記（Ａ１）〜（Ａ３）のいずれかを有する塩基配列；
（Ａ１）配列番号１の塩基配列 (オープン・リーディング・フレームSCO 4506)
（Ａ２）配列番号１において１〜数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されている塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
（Ａ３）配列番号１の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
Ｂ．下記（Ｂ１）〜（Ｂ３）のいずれかを有する塩基配列；
（Ｂ１）配列番号２の塩基配列 (オープン・リーディング・フレームSCO 4327)
（Ｂ２）配列番号２において１〜数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されている塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
（Ｂ３）配列番号２の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
Ｃ．下記（Ｃ１）〜（Ｃ３）のいずれかを有する塩基配列；
（Ｃ１）配列番号３の塩基配列 (オープン・リーディング・フレームSCO 4550)
（Ｃ２）配列番号３において１〜数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されている塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
（Ｃ３）配列番号３の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
Ｄ．下記（Ｄ１）〜（Ｄ３）のいずれかを有する塩基配列；
（Ｄ１）配列番号４の塩基配列 (オープン・リーディング・フレームSCO 4326)
（Ｄ２）配列番号４において１〜数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されている塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
（Ｄ３）配列番号４の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
Ｅ．下記（Ｅ１）〜（Ｅ３）のいずれかを有する塩基配列；
（Ｅ１）配列番号５の塩基配列 (オープン・リーディング・フレームSCO 4490)
（Ｅ２）配列番号５において１〜数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されている塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
（Ｅ３）配列番号５の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
Ｆ．下記（Ｆ１）〜（Ｆ３）のいずれかを有する塩基配列；
（Ｆ１）配列番号６の塩基配列 (オープン・リーディング・フレームSCO 4492)
（Ｆ２）配列番号６において１〜数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されている塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
（Ｆ３）配列番号６の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
Ｇ．下記（Ｇ１）〜（Ｇ３）のいずれかを有する塩基配列；
（Ｇ１）配列番号７の塩基配列 (オープン・リーディング・フレームSCO 4494)
（Ｇ２）配列番号７において１〜数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されている塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
（Ｇ３）配列番号７の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
【請求項３】
下記（イ）〜（ト）のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（イ）配列番号８のアミノ酸配列、または、配列番号８において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されているアミノ酸配列であって、配列番号８のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（ロ）配列番号９のアミノ酸配列、または、配列番号９において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されているアミノ酸配列であって、配列番号９のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（ハ）配列番号１０のアミノ酸配列、または、配列番号１０において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されているアミノ酸配列であって、配列番号１０のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（ニ）配列番号１１のアミノ酸配列、または、配列番号１１において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されているアミノ酸配列であって、配列番号１１のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（ホ）配列番号１２のアミノ酸配列、または、配列番号１２において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されているアミノ酸配列であって、配列番号１２のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（ヘ）配列番号１３のアミノ酸配列、または、配列番号１３において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されているアミノ酸配列であって、配列番号１３のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（ト）配列番号１４のアミノ酸配列、または、配列番号１４において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されているアミノ酸配列であって、配列番号１４のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡの少なくとも一種以上を含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを少なくとも一種以上有する形質転換体。
【請求項６】
メナキノン非生産菌、大腸菌または放線菌である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項１に記載のＤＮＡを宿主に形質転換して作製した形質転換体を培養して培養物中にメナキノンを生成させる工程、および該培養物からメナキノンを採取する工程を含む、メナキノンの製造方法。
【請求項８】
メナキノンの新規生合成経路に特異的な阻害剤の探索方法であって、阻害剤候補化合物およびメナキノンを含有する培地、および、当該阻害剤候補化合物を含有するがメナキノンは含有しない培地において、それぞれ、請求項１に記載のＤＮＡから選ばれた２種以上のＤＮＡを有する菌株の生育状況を調べ、当該菌株が、当該阻害剤候補化合物およびメナキノンを含有する培地では生育できるが、当該阻害剤候補化合物を含有するがメナキノンは含有しない培地では生育できないことを確認し、当該生育状況に該当する阻害剤候補化合物を、メナキノンの新規生合成経路に特異的な阻害剤と同定することを特徴とする、メナキノンの新規生合成経路に特異的な阻害剤の探索方法。
【請求項９】
請求項８で使用する菌株が放線菌である、請求項８に記載のメナキノンの新規生合成経路に特異的な阻害剤の探索方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メナキノンの新規生合成経路を構成する遺伝子群、それらがコードする酵素タンパク質群、メナキノン新規生合成経路を利用したメナキノンの製造方法、および新規生合成経路を利用したメナキノンの生合成阻害剤の探索方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メナキノン（構造式を下記に示す）は、ビタミンＫ２とも呼ばれ、プレニル側鎖の長さおよび二重結合の飽和度の違いによりくつかの同族体が知られている。例えば納豆にはビタミンＫ２が豊富に含まれることが知られているが、これはメナキノン７（下記構造式中ｎ＝６）である。メナキノンは、微生物の細胞内（おそらく細胞膜) に存在し、ユビキノンと同様にエネルギー産生の最終段階である電子伝達系に関与していると考えられる。メナキノンの生理作用としては、血液の凝固促進作用が知られ、抗出血性ビタミンとして医薬品等で実用化している。さらに、哺乳類の骨の形成には、カルシウムを骨に接着させるタンパク質（オステオカルシン）の合成にメナキノン７が必須であることが明らかとなっている。
【０００３】
【化１】
2008011854.tif 000002
【０００４】
電子伝達系で微生物が利用している物質は、メナキノンのみ、ユビキノンのみ、ユビキノンとメナキノンの両方の三種類に分類されるが、遺伝子欠損等の特殊な微生物でない限りメナキノンまたはユビキノンのいずれかまたは両方を利用していると考えられ、これらは一次代謝の維持に必須の重要な生体物質である。なお、大腸菌等の多くの微生物が両方のキノンを生産することが知られており（非特許文献１参照）、好気的な場合は、ユビキノン、嫌気的な場合はメナキノンの生産性が高くなると考えられる。
【０００５】
メナキノンの生合成は、大腸菌や枯草菌では芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンの生合成経路（シキミ酸経路) の中間体であるコリスミ酸を出発物質としてo-succinylbenzoateを経由する７段階の反応により生成することが知られている（〔化２〕参照）。これらの反応は、〔化２〕に示すように men遺伝子群 (MenF、MenD、MenC、MenE、MenB、MenA、MenG) の産物である酵素タンパク質（それぞれコリスミ酸異性化酵素、２−サクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−１−カルボキシレート合成酵素、オルトサクシニル安息香酸合成酵素、オルトサクシニル安息香酸ＣｏＡ合成酵素、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート合成酵素、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエートプレニル転移酵素、２−デメチルメナキノンメチル基転移酵素）の触媒作用により、生成すると考えられている。
【０００６】
【化２】
2008011854.tif 000003
【０００７】
これまでメナキノンを利用することが知られている微生物としては、大腸菌(Escherichia coli) 、Bacillus属、Salmonella属、Mycobacterium 属、Staphylococcus属、Flavobacterium属、Vibrio属、Anabaena属、Chlorobium属、Haemophilus 属、Halobacterium 属、Pasteurella 属、Streptomyces属、Helicobacter属、Wolinella 属、Campylobacter 属、Geobacter 属、Desulfovibrio 属等があげられる。一方ユビキノンを利用することが知られている微生物としては、Pseudomonas属、Mesorhizobium 属、Neisseria 属、Xanthomonas 属、Sinorhizobium 属、Agrobacterium 属、Brucella属等があげられる。
【０００８】
メナキノン発酵については、バクテリアや放線菌による菌体内生産が知られ、特にFlavobacterium属の細菌で生産性が高いことが報告されている（非特許文献２参照）。Flavobacterium属の生産するメナキノンは、メナキノン６（前記構造式中ｎ＝５）であるが、界面活性剤を添加して培養することでメナキノン４（前記構造式中ｎ＝３）を菌体外生産させることも可能であり、その場合の全メナキノンの生産性は２８０ｍｇ／Ｌと報告されており（非特許文献３参照）、安価に供給するためには大幅な生産性改良が必須である。
【０００９】
メナキノンはBacillus属も生産することから、Bacillus属に属する納豆菌による発酵食品である納豆中に含まれ、納豆を常時摂取していればメナキノン即ちビタミンＫ欠乏症にはならないとされている。しかし、食の多様化が進んでおり、納豆は特徴的な風味・食感やネバがあることから、嗜好として容認できない場合や、食文化として積極的に摂取したくないケースも考えられる。また、欧米では納豆そのものやメナキノン生産菌を利用した発酵食品が存在しないと考えられ、腸内細菌による生産だけでは不足するケースも知られており、積極的に摂取するためにはメナキノンそのものの安価な提供が望まれている。
また、これらのメナキノン生産菌の中には胃潰瘍の原因菌であるHelicobacter属や食中毒の原因菌であるCampylobacter 属が含まれる。これらの菌に対して抗菌作用を示す薬剤はマクロライド系のクラリスロマイシンやセファム系のアモキシシリン等いくつか知られているが、抗菌スペクトルが広くほとんどの微生物に対して作用を示し有用な腸内細菌まで死滅させることから、選択性の高い薬剤が望まれている。
【００１０】
【非特許文献１】Microbiol. Rev., 45, 316-354, 1981
【非特許文献２】Y. Tani et al, J. Ferment. Technol., 62, 321 (1984)
【非特許文献３】H. Taguchi et al, Agric. Biol. Chem., 53, 3017 (1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明の目的は、メナキノンの新規生合成経路を構成する遺伝子群、それらがコードする酵素タンパク質群、これらの遺伝子の形質転換体を培養することを特徴とするメナキノンの製造方法、および新規生合成経路を利用したメナキノンの生合成阻害剤の探索方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、メナキノンを生産しているにも関わらず従来知られているメナキノン生合成遺伝子を持っていない微生物群が存在することを見いだし検討を進めた結果、従来知られている生合成経路（既知経路）ではなく新規な生合成経路を見いだし本発明に至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、下記のＡ〜Ｇのいずれかの塩基配列を含むＤＮＡを提供するものである。
Ａ．下記（Ａ１）〜（Ａ３）のいずれかを有する塩基配列；
（Ａ１）配列番号１の塩基配列 (オープン・リーディング・フレームSCO 4506)
（Ａ２）配列番号１において１〜数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されている塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
（Ａ３）配列番号１の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
Ｂ．下記（Ｂ１）〜（Ｂ３）のいずれかを有する塩基配列；
（Ｂ１）配列番号２の塩基配列 (オープン・リーディング・フレームSCO 4327)
（Ｂ２）配列番号２において１〜数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されている塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
（Ｂ３）配列番号２の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
Ｃ．下記（Ｃ１）〜（Ｃ３）のいずれかを有する塩基配列；
（Ｃ１）配列番号３の塩基配列 (オープン・リーディング・フレームSCO 4550)
（Ｃ２）配列番号３において１〜数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されている塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
（Ｃ３）配列番号３の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
Ｄ．下記（Ｄ１）〜（Ｄ３）のいずれかを有する塩基配列；
（Ｄ１）配列番号４の塩基配列 (オープン・リーディング・フレームSCO 4326)
（Ｄ２）配列番号４において１〜数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されている塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
（Ｄ３）配列番号４の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
Ｅ．下記（Ｅ１）〜（Ｅ３）のいずれかを有する塩基配列；
（Ｅ１）配列番号５の塩基配列 (オープン・リーディング・フレームSCO 4490)
（Ｅ２）配列番号５において１〜数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されている塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
（Ｅ３）配列番号５の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
Ｆ．下記（Ｆ１）〜（Ｆ３）のいずれかを有する塩基配列；
（Ｆ１）配列番号６の塩基配列 (オープン・リーディング・フレームSCO 4492)
（Ｆ２）配列番号６において１〜数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されている塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
（Ｆ３）配列番号６の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
Ｇ．下記（Ｇ１）〜（Ｇ３）のいずれかを有する塩基配列；
（Ｇ１）配列番号７の塩基配列 (オープン・リーディング・フレームSCO 4494)
（Ｇ２）配列番号７において１〜数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されている塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
（Ｇ３）配列番号７の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、メナキノン生合成経路を機能させるのに必要な酵素をコードする塩基配列
【００１４】
また、本発明は、上記ＤＮＡによりコードされるタンパク質を提供するものである。
【００１５】
また、本発明は、下記（イ）〜（ト）のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質を提供するものである。
（イ）配列番号８のアミノ酸配列、または、配列番号８において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されているアミノ酸配列であって、配列番号８のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（ロ）配列番号９のアミノ酸配列、または、配列番号９において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されているアミノ酸配列であって、配列番号９のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（ハ）配列番号１０のアミノ酸配列、または、配列番号１０において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されているアミノ酸配列であって、配列番号１０のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（ニ）配列番号１１のアミノ酸配列、または、配列番号１１において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されているアミノ酸配列であって、配列番号１１のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（ホ）配列番号１２のアミノ酸配列、または、配列番号１２において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されているアミノ酸配列であって、配列番号１２のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（ヘ）配列番号１３のアミノ酸配列、または、配列番号１３において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されているアミノ酸配列であって、配列番号１３のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（ト）配列番号１４のアミノ酸配列、または、配列番号１４において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されているアミノ酸配列であって、配列番号１４のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
【００１６】
また、本発明は、上記ＤＮＡの少なくとも一種以上を含むベクターを提供するものである。
【００１７】
また、本発明は、上記ベクターを少なくとも一種以上有する形質転換体を提供するものである。
【００１８】
また、本発明は、上記ＤＮＡを宿主に形質転換して作製した形質転換体を培養して培養物中にメナキノンを生成させる工程、および該培養物からメナキノンを採取する工程を含む、メナキノンの製造方法を提供するものである。
【００１９】
また、本発明は、メナキノンの新規生合成経路に特異的な阻害剤の探索方法であって、阻害剤候補化合物およびメナキノンを含有する培地、および、当該阻害剤候補化合物を含有するがメナキノンは含有しない培地において、それぞれ、上記ＤＮＡから選ばれた２種以上のＤＮＡを有する菌株の生育状況を調べ、当該菌株が、当該阻害剤候補化合物およびメナキノンを含有する培地では生育できるが、当該阻害剤候補化合物を含有するがメナキノンは含有しない培地では生育できないことを確認し、当該生育状況に該当する阻害剤候補化合物を、メナキノンの新規生合成経路に特異的な阻害剤と同定することを特徴とする、メナキノンの新規生合成経路に特異的な阻害剤の探索方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の遺伝子は新規遺伝子である。本発明の遺伝子を宿主に導入した形質転換体を培養することにより、メナキノンを大量生産可能である。さらに、本発明の生合成経路に特異的な阻害剤を探す方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本明細書において「１〜数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されている」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されていることを意味する。
このような塩基配列とは、例えば、同一のアミノ酸を示す他の塩基コドンや、類似の物性を示すアミノ酸グループ内（酸性アミノ酸間、塩基性アミノ酸間、疎水性アミノ酸間、アロマティックアミノ酸間等）での他のアミノ酸を示す他の塩基コドンなどであり、欠失、置換、付加および／または挿入の結果、配列番号１〜７の塩基配列等と少なくとも６０％以上の相同性となる塩基配列である。
【００２２】
本明細書において「１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されている］とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の下記のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されていることを意味する。
このようなアミノ酸とは、酸性アミノ酸(Asp,Glu) 、塩基性アミノ酸(Lys,Arg) 、疎水性アミノ酸(Val,Leu,Ile) 、酸と酸アミド(Glu,GlnまたはAsp,Asn)、水酸基を持つアミノ酸(Ser,Thr) 、アロマティックアミノ酸(Trp,Tyr,Phe) 、酸アミドアミノ酸(Asn,Gln) 等、物性の類似しているアミノ酸のグループ間の他のアミノ酸である。
【００２３】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第二版等に記載されている方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、相同性は、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、もっとも好ましくは９８％以上である。
【００２４】
次に本発明のＤＮＡの取得方法および利用方法について説明する。
本発明は、A)メナキノンの新規生合成経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子の同定と、それら遺伝子ＤＮＡの取得、B)メナキノン新規生合成経路のタンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体の作成および上記タンパク質の発現、C)メナキノン生産、D)メナキノンの新規生合成経路に特異的な阻害剤の探索方法、より構成される。以下、放線菌を例示して詳述するが、放線菌に限定するものではない。他の微生物を試料とする場合は順次読み替えてもよい。
【００２５】
まず、A)メナキノンの新規生合成経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子の同定と、それら遺伝子ＤＮＡの取得について詳述する。なお、A)は(1) 目的の候補ＤＮＡの抽出、(2) 候補遺伝子の破壊実験による証明、(3) 変異剤を用いたメナキノン新規経路遺
伝子欠損株の取得、（4)メナキノン新規経路遺伝子ＤＮＡの取得、（5)変異処理で得たメナキノン新規経路欠損株を相補するＤＮＡの取得、の５段階より構成される。
【００２６】
（１）目的の候補ＤＮＡの抽出
基本的な方針としては、メナキノンを生合成しているにも関わらず既存のメナキノン生合成遺伝子群(Men遺伝子群) を持たない微生物に共通して存在する遺伝子の検索を、遺伝情報データベースを活用して進める(in silico) 。使用可能な遺伝情報データベースはどのようなものでも構わないが、含まれる遺伝情報が多く、出来るだけ最新の結果が反映されているものが好ましい。また、検索速度が速くなるような処理がなされている方が好ましい。このようなデータベースとしてKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (http://www.genome.ad.jp/kegg/）、The Institute for Genomic Research (TIGR、http://www.tigr.org/) 、The Joint Genome Institute（JGI 、http://genome.jgi-psf.org/mic ＿home.html)、The Sanger Institute（http://www.sanger.ac.uk/）、Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC 、http://www.jamstec.go.jp/jamstec-j/XBR/db/exbase/exbase.html) 、The Institut Pasteur（http://www.pasteur.fr/english.html）、The Kitasato Institute for Life Sciences（http://genome.ls.kitasato-u.ac.jp/index ＿j.html）、Real Environmental Genomix (Max Planck Institute、http://www.regx.de/m＿home.php) 、Gottingen Genomics Laboratory, Institute of Microbiology and Genetics, Georg August University（http://www.g2l.bio.uni-goettingen.de/index.html)、National Institute of Technology and Evaluation (NITE 、http://www.bio.nite.go.jp/dogan/Top)、等があげられる。検索は遺伝子同士の相同性を数値化できるものであればどのようなものでも良いが、例えばダイナミックプログラミングアルゴリズム、FASTA アルゴリズム、BLAST アルゴリズム等を利用した汎用のソフトウエアを使用してもよい。このようなソフトウエアとしてはSSearch 3.4 、FASTA 3.4 、NCBI-BLAST 2.2. 等があげられる。また、検索は通常データベースを保有ないし直接アクセス可能なホストコンピュータ上で行うが、ホストコンピュータとのコミュニケーションおよび、目的の配列が限定した条件下（例えば菌株の限定等）での詳細な相同性の検索はパーソナルコンピュータを使用する。パーソナルコンピュータのハードウエアやプラットホームは使用するソフトウエアが実行可能であればどのようなものでも構わないが、実行速度が速い方が好ましい。
【００２７】
以上の方法を用いて、ゲノム解析が終了しており、かつメナキノンを生合成することが確認されている微生物の中から、既知メナキノン生合成経路遺伝子群、すなわちmenF、menD、menC、menE、menBを持っている微生物と持っていない微生物をNational Center for Biotechnology Information のデータベースPubMed（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed ）から、Search for Nucleotide for menFとして検索を実行する。その結果、Escherichia coli、Salmonella typhimurium、Haemophilus influenzae、Bacillus subtilis 、Corynebacterium glutamicum、 Mycobacterium tuberculosis などの微生物が当該遺伝子を持つ菌株として検索される（以下、これらの菌株を旧経路菌株と呼ぶ）。同様に、順次、menD、menC、menE、menB遺伝子をキーワードに用いることによっても、旧経路菌株の微生物が当該遺伝子を持つ菌株として検索される。さらに、詳細な解析が行われている大腸菌のmenF、menD、menC、menE、menB産物のアミノ酸配列を問い合わせ配列として、DNA Data Bank of Japan（日本DNA データバンク、http://www.ddbj.nig.ac.jp/searches-j.html)の検索・解析サービスを用いてSSearch 、FASTA 、Blast 検索を行うと、旧経路菌株に個々の遺伝子のオーソログが探索できる。したがって、これら微生物では既知経路（旧経路）が作動していることが確認できる。他方、Streptomyces coelicolor 、Streptomyces avermitilis、Geobacter metallireducens 、Helicobacter pylori 、Campylobacter jejuni、Archaeoglobus fulgidus、Aquifex aeolicusなどの微生物では（以下、これらの菌株を新経路菌株と呼ぶ）、メナキノンを生合成することが確認されているにもかかわらず、上記、National Center for Biotechnology Information のデータベースPubMedを用いた探索においても、日本DNA データバンクを利用したSSearch 、FASTA 、Blast 検索においても、menF、menD、menC、menE、menBのオーソログの存在を検出することはできない。
【００２８】
そこで、新経路菌株としてStreptomyces coelicolor 、Streptomyces avermitilis、Geobacter metallireducens 、Helicobacter pylori の４株を選択し、これら４株が共通に持つオーソログを全遺伝子産物（ＯＲＦ）の総当りBLAST 検索することにより抽出する。また、旧経路菌株としてEscherichia coli、Bacillus subtilis 、Mycobacterium tuberculosis、Corynebacterium glutamicumの４株を選択し、同様にこれら４株が共通に持つオーソログも全遺伝子産物（ＯＲＦ）の総当りBLAST 検索することにより抽出できる。最終的に、新経路菌株特異的オーソログの中から、旧経路菌株特異的オーソログを除いて遺伝子群を絞り込むことにより、例えばStreptomyces coelicolor を例に取ると、配列番号１〜７に記載したＤＮＡ、および配列番号８〜１４に記載したタンパク質を選択できる。
【００２９】
（２）候補遺伝子の破壊実験による証明
（１）で絞り込んだ遺伝子が実際にメナキノン新規生合成経路に関与することを遺伝子破壊により実証できる。以下、SCO 4506遺伝子の破壊株の取得を例示しながら説明するが、他の遺伝子破壊株でも同様に実施可能である。
Streptomyces coelicolor A3(2) 株用に用いられるプラスミドベクターpIJ702をBclI切断し、チオストレプトン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を得る。本断片を大腸菌用のプラスミドベクターpUC19 のBamHI サイトにクローン化し、pUC19-tsr を得る。Streptomyces coelicolor A3(2) 株をYEME液体培地に植菌し、適当な条件で培養した後、常法に従い染色体ＤＮＡを単離・精製する。次いで、このＤＮＡを鋳型に用い、in silico で絞り込んだSCO 4506の翻訳開始コドン上流3Kb のＤＮＡ領域を一対のプライマーを用いてPCR で増幅する。また、SCO 4506翻訳終止コドン下流域のＤＮＡも一対のプライマーを用いてPCR で増幅する。PCR には、TaKaRa LA-PCR TM Kit Ver.2 (宝酒造社製) またはExpandTM High-Fidelity PCR System(ベーリンガー・マンハイム社製) 等を用い、ＤＮＡ Thermal Cycler(パーキンエルマージャパン社製) を用いる。なお、後のクローニング操作を容易にするために、プライマーには適当な制限酵素部位を付加させておくことが好ましい。
【００３０】
増幅したSCO 4506翻訳領域の上流と下流を含む２つのＤＮＡ断片を定法によりサブクローン化した後、PCR による複製エラーが無いことを塩基配列解析により確認する。SCO 4506翻訳領域の上流を含むＤＮＡ断片をpUC19-tsr のチオストレプトン耐性遺伝子の上流に、またSCO 4506翻訳領域の下流を含むＤＮＡ断片をpUC19-tsr のチオストレプトン耐性遺伝子下流に位置するように挿入し、SCO 4506遺伝子がチオストレプトン耐性遺伝子と入れ替わっていることを除き、SCO 4506遺伝子周辺の染色体領域がクローンニングされた、SCO 4506破壊用プラスミドpUC-4506-Disruptを得る。
【００３１】
次いで、本プラスミドからSCO 4506の翻訳開始コドン上流域のＤＮＡ、チオストレプトン耐性遺伝子、SCO 4506翻訳終止コドン下流域のＤＮＡを含むＤＮＡ断片を調製し、定法に従いポリエチレングリコールを用いてStreptomyces coelicolor A3(2) 株のプロトプラストに導入し、市販されているメナキノン４含有Ｒ５再生培地に塗布する。１６時間後に、チオストレプトンを含む軟寒天培地を重層して培養することでチオストレプトン耐性株を得る。目的遺伝子が破壊されていることは、チオストレプトン耐性遺伝子特異的ＤＮＡ断片を用いたサザンハイブリダイゼーション、あるいは、チオストレプトン耐性遺伝子特異的ＤＮＡ塩基配列に基づいて設計されたプライマーを用いるPCR により確認できる。これら破壊株は、メナキノン４を含むＲ５寒天培地やYEME液体培地で生育できるが、メナキノン４を含まない培地では生育できないことから、SCO 4506はメナキノンの新規生合成経路に関与することは明らかである。さらに、本破壊株をメナキノン４含有YEME液体培地で生育させ、菌体から全メナキノンを抽出し、HPLCでメナキノンの種類を同定すると、本来Streptomyces coelicolor A3(2) 株が持つイソプレン側鎖が８であるメナキノン８ではなく、培地に添加したイソプレン側鎖が４のメナキノン４のみを検出できることから、SCO 4506破壊株は、メナキノンの新規合成ができず、培地に添加したメナキノン４に依存して生育することが確認できる。
【００３２】
（３）変異剤を用いたメナキノン新規経路遺伝子欠損株の取得
上記in silico による新規経路に関与する遺伝子群の探索と遺伝子破壊実験による実証では、検索条件（検索に用いる母集団の数、オーソログ判定のための期待値の設定など）により、新規経路遺伝子（産物）を見逃す可能性がある。そこで、確実に全経路遺伝子の取得が可能な変異剤を用いたメナキノン要求性変異株の取得も行うことができる。放線菌Streptomyces coelicolor A3(2) 株を通常の変異処理を行い、メナキノン要求性変異株を取得する。この時に使用する変異処理は特に限定しないが、効率的に変異株が得られる方法が好ましい。このような方法としては、紫外線や放射線を照射する方法、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ニトロソグアニジン；NTG)等のＤＮＡのメチル化剤、等の変異源を有する薬剤と接触処理する方法、遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発方法等があげられる。変異処理により得られた菌株は、培地中にメナキノンを添加した場合のみに増殖する菌株を選抜することで目的の変異株を得ることができる。変異株を培養するために使用する培地としては菌が増殖可能であればどのようなものでも構わないが、メナキノンの添加効果が現れやすい培地が好ましい。このような培地としては、合成培地のＭ９などがあげられる。培養条件は特に限定しないが、適当な温度（例えば３０℃）で数日間培養する。また、培地に添加するメナキノンはプレニル側鎖の長さの違いによりいくつか存在するが、前記構造中ｎ＝１〜７のものが好ましく、放線菌S. coelicolor A3(2) 株が細胞内で生産する長さ（ｎ＝７）がもっとも添加効果が得られやすい。ただし、経済性を配慮して安価に入手可能なメナキノン４｛長さ（ｎ＝３）｝がもっとも好ましい。メナキノンの添加濃度は、０．１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１００μｇ／ｍｌ、もっとも好ましくは、２〜５０μｇ／ｍｌが良い。
【００３３】
好適な例としては、次のような手順を実施可能である。即ち、変異処理したStreptomyces coelicolor A3(2) の胞子（１×１０10個）をメナキノン４（１００μｇ／ｍｌ）含有ATCC5 培地（スターチ0.2 ％、Difco yeast extract 0.1 ％、Difco Bacto beef extract0.1％、 FeSO4・7H2O 0.01 ％、寒天 2％、pH 7.5）に塗布する。３０℃で４日間培養した後、個々のコロニーを爪楊枝を用いて、メナキノン４（１００μｇ／ｍｌ）含有ATCC5 培地とメナキノン４を含まないATCC5 培地の２つのプレートにレプリカする。３０℃で４日間培養した後、メナキノン４（１００μｇ／ｍｌ）含有ATCC5 培地でのみ生育した株を選択することにより新規メナキノン経路欠損株を得る。
【００３４】
（４）メナキノン新規経路遺伝子ＤＮＡの取得
前記（１）および（２）で実証できるメナキノン新規生合成経路に関与する遺伝子を取得できる。以下、SCO 4506遺伝子の取得を例示しながら具体的に説明するが、他の遺伝子の取得に関しても同様に実施可能である。
PCR 法により配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを取得するためには、Streptomyces coelicolor A3(2) 株の染色体ＤＮＡを鋳型として使用し、ゲノム情報に基づき設計した１対のプライマーＤＮＡを使用して、TaKaRa LA-PCR TM Kit Ver.2 (宝酒造社製) またはExpandTM High-Fidelity PCR System(ベーリンガー・マンハイム社製) 等を用い、ＤＮＡThermal Cycler (パーキンエルマージャパン社製) でＰＣＲを行う。なお、後のクローニング操作を容易にするために、プライマーには適当な制限酵素部位を付加させておくことが好ましい。
【００３５】
ＰＣＲの条件の実施可能な一例として、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長) からなる反応工程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件をあげることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。クローニングは、常法、例えば、モレキュラー・クローニング第二版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)(以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995) 等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばSuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（ライフ・テクノロジーズ社製）やZAP-cDNA Synthesis Kit〔ストラタジーン（Staratagene)社製〕を用いて行うことができる。
【００３６】
クローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自律複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる、大腸菌の発現用ベクターをクローニングベクターとして用いてもよい。具体的には、ZAP Express 〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔Nucleic Acids Research,17, 9494 (1989)〕、Lambda ZAP II （ストラタジーン社製）、λgt10、λgt11〔DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985) 〕、λTriplEx （クローンテック社製）、λExCell（ファルマシア社製）、pT7T318U（ファルマシア社製）、pcD2〔H. Okayama and P. Berg；Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983) 〕、pMW218（和光純薬社製）、pUC118（宝酒造社製）、pEG400〔J. Bac.,172, 2392 (1990)〕、pQE-30（QIAGEN社製）等をあげることができる。
【００３７】
得られた形質転換株より、目的とするＤＮＡを含有したプラスミドを常法、例えば、モレキュラー・クローニング第二版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997) 、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法により取得することができる。上記方法により、配列番号１を有するＤＮＡを取得することができる。
【００３８】
また、配列番号１において、１〜数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入されている塩基配列であって、SC O 4506産物をコードする塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、SCO 4506産物が持つ酵素活性を有する酵素蛋白質をコードする塩基配列も本発明の範囲内である。
例えば、配列番号１の塩基配列を有する放線菌由来のＤＮＡ断片の塩基配列を利用し、他の微生物等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。あるいは、上記したように変異ＤＮＡは化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者が既知の任意の方法で作製することもできる。具体的には配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異ＤＮＡを取得することができる。
例えば、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異源となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発方法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Nucleic Acids Research,12,9441(1984)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Nucleic Acids Research,13,8749(1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,79,6409(1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82,488(1985) 、Gene,102,67(1991) 等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００３９】
（５）変異処理で得たメナキノン新規経路欠損株を相補するＤＮＡの取得
前記（３）の方法で得ることができるメナキノン新規経路欠損株を相補する遺伝子を取得することにより、メナキノン新規経路遺伝子ＤＮＡを取得できる。放線菌S. coelicolor A3(2) 株の染色体ＤＮＡのプラスミドライブラリを調製し、このライブラリィから挿入配列の中に前記（３）で得たメナキノン新規経路欠損株を相補する遺伝子を取得することができる。染色体ＤＮＡの調製は、放線菌S. coelicolor A3(2) 株を適当な培地、例えばDifco yeast extract 3g, Difco Bacto-peptone 5g, oxoid malt extract 3g, glucose 10g, sucrose 340g, 5 mM MgCl2・6H2Oより成るYEME培地で適当な温度（例えば３０℃) で数日間培養する。培養後、得られた培養液より遠心分離により菌体を取得し、菌体より公知の方法(Practical Streptomyces Genetics, T. Kieser et al., The John Innes Foundation, Norwich) に従い染色体ＤＮＡを単離精製する。得られた染色体ＤＮＡは公知の方法、例えば適当な制限酵素による切断と適当なプラスミド、例えばpIJ702とのリガ−ゼを用いた連結により、メナキノン要求性変異株に導入する。プラスミドＤＮＡのメナキノン要求性変異株への導入は公知の方法、例えば、Practical Streptomyces Genetics, T. Kieser et al., The John Innes Foundation, Norwich に記載されているプロトプラスト・ポリエチレングリコール法で行うことができる。このようにして得られる形質転換株の中から、培地中にメナキノン類を添加することなく生育可能となった株を選抜できる。これらの株が持つプラスミドに挿入されているＤＮＡを回収し、挿入されている配列の両端について塩基配列を決定することで挿入配列が染色体のどの部分のオペロンかを正確に知ることができる。なお、挿入配列の塩基配列の決定は公知の方法により決定できる。このように、オペロンによる相補性およびメナキノン要求性を確認することで、メナキノンの新規生合成経路を構成するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。
【００４０】
以上の手順により配列番号１〜７の塩基配列を有するＤＮＡを取得できる。また、明らかになった塩基配列を基に、PCR により目的の塩基配列を取得することも可能である。
以上より得られた配列番号１〜７の塩基配列を用いて、遺伝情報データベースに対して再度これらのORF 配列を持っている生物を検索し生物中での分布を調べ、表１のように分布していることを確認した。即ちヘリコバクター、カンピロバクター、クラミジア等一部の病原性や食中毒原因菌を含むことから、当該新規生合成経路をターゲットとする薬剤を開発することで、選択性の高い薬剤を得ることができる。
【００４１】
【表１】
2008011854.tif 000004
【００４２】
次に、Ｂ）放線菌のメナキノン新規生合成経路のタンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体の作成および上記タンパク質の発現ついて詳述する。以下では、放線菌を例に示しながら説明するが、本発明は該菌株由来の酵素遺伝子以外でも、放線菌や微生物、動物細胞、植物細胞由来等メナキノンの新規生合成経路を持つ生物由来の酵素遺伝子を形質転換してよい。
【００４３】
本発明で形質転換に使用するＤＮＡは、いかなる生物由来であっても構わないが、宿主細胞中でＤＮＡから産生されるタンパク質の発現効率が高いことが好ましい。また発現したタンパク質の酵素活性が高い触媒機能を発現できる細胞との組合せが好ましい。
得られたORF を含むＤＮＡ断片を宿主細胞中で発現させるためにはまず目的とする該ＤＮＡ断片を制限酵素あるいはＤＮＡ分解酵素で該遺伝子を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後、発現ベクター中においてプロモーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
【００４４】
本発明で使用する宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等に属する細菌、クルイベロミセス属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母、動物細胞、昆虫細胞等を上げることができる。なお、本発明のＤＮＡはメナキノンの新規な生合成経路に関与する酵素タンパク質をコードするものであるが、宿主細胞としては新規経路を本来有しない細菌や動物細胞、昆虫細胞等でも、新規経路を有する細菌のいずれでも構わない。
【００４５】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、上記目的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。細菌等を宿主細胞として用いる場合は、上記ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは該微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４６】
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、pKK233-2（Pharmacia 社製）、pSE280（Invitrogen社製）、pGEMEX-1（Promega 社製）、pQE-8 (QIAGEN社製）、pQE-30（QIAGEN社製）、pKYP10（特開昭58-110600 ）、pKYP200 〔Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984) 〕、pLSA1 〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985) 〕、pBluescriptII SK+ 、pBluescriptII SK(-) （Stratagene社製）、pTrS30(FERMBP-5407) 、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX（Pharmacia 社製）、pET-3 （Novagen 社製）、pTe rm2(US4686191、US4939094 、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18 〔gene, 33, 103 (1985)〕、pUC19 〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pSTV28( 宝酒造社製) 、pSTV29（宝酒造社製）、pUC118（宝酒造社製）、pPA1（特開昭63-233798 号公報）、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392(1990)〕、pQE-30（QIAGEN社製）等を例示することができる。
【００４７】
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trp プロモーター（Ｐtrp ）、lac プロモーター（Ｐlac ）、P L プロモーター、ＰR プロモーター、ＰSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またＰtrp を２つ直列させたプロモーター（Ｐtrp ｘ２）、tac プロモーター、letIプロモーター、lacT7 プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００４８】
リボソーム結合配列としては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミッドを用いることが好ましい。目的とするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００４９】
宿主細胞としては、Escherichia 属、Corynebacterium 属、Brevibacterium属、Bacillus属、Microbacterium属、Serratia属、Pseudomonas属、Agrobacterium 属、Alicyclobacillus属、Anabaena属、Anacystis 属、Arthrobacter属、Chromatium属、Erwinia 属、Methylobacterium属、Phormidium属、Rhodobacter 属、Rhodopseudomonas属、Rhodospirillum属、Scenedesmun 属、Streptomyces属、Synnecoccus 属、Zymomonas 属等に属する微生物をあげることができ、好ましくは、Escherichia 属、Corynebacterium 属、Brevibacterium属、Bacillus属、Pseudomonas属、Agrobacterium 属、Alicyclobacillus属、Anabaena属、Anacystis 属、Arthrobacter属、Chromatium属、Erwinia 属、Methylobacterium属、Phormidium属、Rhodobacter 属、Rhodopseudomonas属、Rhodospirillum属、Scenedesmun 属、Streptomyces属、Synnecoccus 属、Zymomonas 属に属する微生物をあげることができる。
【００５０】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972) 〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942号公報）、またはGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979) に記載の方法等をあげることができる。
【００５１】
酵母を宿主細胞として使用する場合は、発現ベクターとして、例えば、YEp13(ATCC37115)、Yep24(ATCC37051)、pHS19 、pHS15 等を例示することができる。プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいかなるものでも良く、例えば、PH05プロモーター、PGK プロモーター、GAP プロモーター、ADH プロモーター、gal1プロモーター、gal10 プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1 プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としてはSaccharomyces cerevisae 、Schizosaccharomyces probe 、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius 等をあげることができる。
組み換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Methods. Enzymol, 194, 182(1990)］、 スフェロプラスト法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929(1978)]、 酢酸リチウム法[J. Bacteriol., 153, 163(1983)]、あるいはProc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929(1978)に記載の方法等をあげることができる。
【００５２】
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8(フナコシ社より市販) 、pAGE107 ［特開平3-22979 ：Cytotecnology, 3, 133(1990) ］、pAS3-3( 特開平2-227075) 、pCDM8 ［Nature, 329, 840(1987)］、pcDNAI/AmP(Invitrogen 社製) 、pREP4(Invitrogen社製),pAGE103 ［J. Biochem., 101, 1307(1987)］、pAGE210 等を例示することができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトCMV)のIE(immediate early) 遺伝子のプロモーター,SV40 の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMV のIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターとともに用いても良い。宿主細胞としては、ナマルバ細胞、HBT5637(特開昭63-299号公報) 、COS1細胞、COS7細胞、CHO 細胞等をあげることができる。
動物細胞への組み換えベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法でもよいが、例えば、エレクトロポレーション法(Cytotecnology, 3, 133(1990)) 、リン酸カルシウム法( 特開平2-227075) 、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)]、virology, 52, 456(1973) に記載の方法等を用いることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平2-227075号公報あるいは特開平2-257891号公報に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００５３】
昆虫細胞を宿主として用いる場合は、例えば、バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ・ア・ラボラトリー・マニュアル(Baculovirus expression Vectors, A Laboratory Manual) 、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・ バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988) 等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。即ち、組み換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組み換えウイルスを得た後、さらに組み換えウイルスを昆虫に感染させ、タンパク質を発現させることができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターは、例えば、pVL1392 、pVL1393 、pBlueBacIII(ともにインビトロジェン社製) 等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用いることができる。昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperda の卵巣細胞であるSf9 、Sf21［バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company) 、ニューヨーク(New York)、(1992)］、Trichoplusia ni の卵巣細胞であるHigh5(インビトロジェン社製) 等を用いることができる。
組み換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組み換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075号公報) 、リポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)］等をあげることができる。遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合、糖あるいは糖鎖が付加されたタンパク質を得ることができる。
【００５４】
上記ＤＮＡを組込んだ組み換えＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中にメナキノンの新規生合成経路に関与する酵素を生成蓄積させ、該培養物より該タンパク質を採取することによりメナキノンの新規生合成経路に関与する酵素タンパク質を製造することができる。かくして製造されるタンパク質（放線菌のメナキノンの新規生合成経路に関与する酵素タンパク質) も本発明の範囲内である。
【００５５】
本発明のＤＮＡを保有する形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。本発明の形質転換体が大腸菌、放線菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００５６】
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
【００５７】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
【００５８】
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００５９】
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン、チオストレプトン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６０】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lac プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trp プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００６１】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPM11640培地［The Journal of the American Medical Association, 199, 519(1967) ］、Eagle のMEM 培地［Science, 122, 501(1952) ］、199 培地［Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ2 存在等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加しても良い。昆虫細胞を宿主細胞として得られた、形質転換体を培養する培地としては、一般に用いられているTNM-FH培地(Pharmingen 社製) 、Sf-900 II SFM 培地（ギブコBRL 社製）、ExCell400 、ExCell405(いずれもJRH Biosciences 社製) 、Graces Insert Medium［Grace, T. C. C., Nature, 195, 788(1962) ］等を用いることができる。培養は通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で１〜５日間行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してよい。
【００６２】
本発明の形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質（メナキノンの新規生合成経路に関与する酵素タンパク質) を単離精製するためには、通常のタンパク質の単離・精製法を用いればよい。例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合は、培養終了後、細胞を遠心分離や濾過により回収し緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫酸アンモニウム等による塩析法、半透膜による脱塩法、有機溶剤による沈殿法、ジアミノエチル(DEAE)セファロース（ファルマシア社製) 、DIAION HPA-75(三菱化学社製) 等の樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-セファロース FF(ファルマシア社製) 等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の調製電気泳動法、等の手法を単独あるいは組み合わせて用いることで、精製することができる。
【００６３】
また、該タンパク質が細胞内に不溶性の封入体を形成して発現した場合は、可溶性の場合と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分から該タンパク質を回収後、該タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤を用いて可溶化する。該可溶化溶液をタンパク質変性剤を含まない溶液、あるいはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質を変性させない程度に希薄な溶液に希釈あるいは透析し、該タンパク質を正常な立体構造に再構成させた後、上記と同様の単離精製法の組み合わせにより、精製することができる。
【００６４】
本発明のタンパク質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合は、培養上清に該タンパク質あるいはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様に遠心分離あるいは濾過等の処理により可溶性画分を含む培養ろ液を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製することができる。このようにして取得したタンパク質として、例えば配列番号８〜１４のアミノ酸配列を有するタンパク質をあげることができる。
【００６５】
また、上記方法により発現させたタンパク質を、fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法),tBoc法(t- ブチルオキシカルボニル法) 等の化学合成法によって製造することもできる。また、桑和貿易（米国Advanced Chem. Tech 社製) 、パーキンエルマージャパン( 米国Perkin-Elmer社製) 、ファルマシアバイオテック（スウェーデンPharmacia Biotech 社製) 、アロカ（米国Protein Technology Insturment 社製) 、クラボウ（米国Synthecell-Vega 社製) 、日本パーセプティブ・リミッテド（米国PerSeptive社製) 、島津製作所等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。
【００６６】
次に、Ｃ）メナキノン生産について詳述する。
上記Ｂ）で取得した形質転換体を、上記Ｂ）の方法に準じて培養し、培養物中にメナキノンを生成蓄積させ、該培養物からメナキノンを採取することにより、メナキノンを製造あるいは通常細胞内に存在するよりも大量に製造することができる。該培養により例えば、Escherichia 属に属する微生物を形質転換体としてメナキノンの製造や、Streptomyces属に属する微生物を形質転換体としてメナキノンの製造をあげることができる。培養終了後、培養物に適当な有機溶媒を加えてメナキノンを抽出し、遠心分離や濾過等で沈殿物を除去した後、各種クロマトグラフィーを行うことによりメナキノンを単離・精製することができる。
【００６７】
最後に、Ｄ）メナキノンの新規生合成経路に特異的な阻害剤の探索方法について詳述する。
本発明のメナキノンの新規な生合成経路は表１のような微生物に分布している。表１の微生物には、胃潰瘍の原因菌とされる、ヘリコバクター属の微生物や、食中毒の原因菌のひとつであるカンピロバクター属、性器クラミジア感染症の原因菌であるクラミジア属、等の微生物が多く含まれる。このため、本発明のメナキノンの新規な生合成経路に特異的な薬剤は選択性の高い薬剤であると期待できる。また、メナキノンの新規な生合成経路はヒトを含む哺乳類には全く存在しないことから、安全性が高いことも期待できる。
【００６８】
本発明のメナキノンの新規な生合成経路に特異的な薬剤のスクリーニングは、スクリーニング系にメナキノンを添加することで成育が回復することを指標に実施できる。このスクリーニングに使用する試験菌は、ヘリコバクター属やカンピロバクター属、クラミジア属等の標的菌を直接用いても構わないが、メカニズムが明確であることから同じメナキノンの新規な生合成経路を持っている放線菌を使用することが、扱いやすさや安全な研究環境という点から好ましい。このような視点から、例えば、S. coelicolor A3(2) があげられる。増殖の回復を確認するために使用するメナキノンは、試験菌が生合成するタイプのメナキノンの使用が感度良く評価でき好ましいが、試験の効率および経済性を考慮すると容易に入手可能なメナキノン４（前記構造式中ｎ＝３）が好ましい。このようにして見いだした薬剤は作用機作が当初より明確であるため、抗菌剤や抗生物質としての開発が容易に開始可能であり、メカニズムを明らかにするためのコストを低減化することもできる。さらに、得られた薬剤は各段階の酵素タンパク質の阻害活性を調べることにより、本発明の６種類の酵素タンパク質のどの段階を阻害するかを明確にすることも容易に可能であり、研究用試薬としての利用もできる。ただし、現時点ではこれら６種の酵素タンパク質と相同性の高いタンパク質は全て機能未知である。しかし、本発明はメナキノンの生合成の既存の経路とは全く異なる新規な生合成経路に関するものであり、既存の経路の情報だけでは実施不可能でかつ有用性の高い薬剤の探索ができる。
【実施例】
【００６９】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例で示した遺伝子組み換え実験は、特に言及しない限りモレキュラー・クローニング第２版に記載の方法、およびPractical Streptomyces Genetics, T. Kieser et al., The John Innes Foundation, Norwich （以下、常法と呼ぶ）を用いて行った。
【００７０】
実施例１：in silico によるStreptomyces coelicolor A3(2) 株のメナキノン新規生合成経路に関与する遺伝子の同定とＤＮＡの取得、及び組み換え蛋白質の調製
（１）in silico による候補ＤＮＡの推定
ゲノム解析が終了しており、かつメナキノンを生合成することが確認されている微生物の中から、既知メナキノン生合成経路遺伝子群、すなわちmenF、menD、menC、menE、menBを持っている微生物と持っていない微生物をin silico により探索した。具体的には、National Center for Biotechnology Information のデータベースPubMed（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed ）から、Search for Nucleotide for menFとして検索を行うと、Escherichia coli、Salmonella typhimurium、Haemophilus influenzae、Bacillus subtilis 、Corynebacterium glutamicum、 Mycobacterium tuberculosis 等の微生物が当該遺伝子を持つ菌株として検索された（旧経路菌株）。同様に、順次、menD、menC、menE、menB遺伝子をキーワードに用いることによっても、旧経路菌株の微生物が当該遺伝子を持つ菌株として検索された。さらに、詳細な解析が行われている大腸菌のmenF、menD、menC、menE、menB産物のアミノ酸配列を問い合わせ配列として、DNA Data Bank of Japan（日本DNA データバンク、http://www.ddbj.nig.ac.jp/searches-j.html ）の検索・解析サービスを用いてSSearch 、FASTA 、Blast 検索を行うと、旧経路菌株に個々の遺伝子のオーソログが探索できた。したがって、これら微生物では既知経路（旧経路）が作動していることが確認できた。他方、Streptomyces coelicolor 、Streptomyces avermitilis、Geobacter metallireducens 、Helicobacter pylori 、Campylobacter jejuni、Archaeoglobus fulgidus、Aquifex aeolicusなどの微生物では（新経路菌株）、メナキノンを生合成することが確認されているにもかかわらず、上記、National Center for Biotechnology Information のデータベースPubMedを用いた探索においても、日本DNA データバンクを利用したSSearch 、FAS TA 、Blast 検索においても、menF、menD、menC、menE、menBのオーソログの存在を検出できなかった。
【００７１】
以上の結果は、新経路菌株では既知経路とは全く異なる経路でメナキノンが生合成されるか、あるいは経路は同じであるが、アミノ酸配列の全く異なる酵素群により生合成される可能性の何れかであると考えられた。そこで今回見出したメナキノンの新規生合成経路に関して、[13C-U6]グルコースを使用した標識実験を行った結果、〔化３〕に示すように太線部分に13C-13C スピン結合が認められ、既知経路とは異なる標識パターンを示したことから（＊を付した炭素には[6-13C] グルコースが取り込まれた。また、既知経路では、上下対称な中間体を経由するため、〔化３〕に示すように２種類の標識パタ−ンが得られる）、新経路菌株では、全く新規な経路が作動していることを証明できた。
【００７２】
【化３】
2008011854.tif 000005
【００７３】
そこで、新規経路に関与する遺伝子群をin silico により探索した。すなわち、旧経路菌株には存在せず、新経路菌株に特異的に存在する遺伝子（産物）を探索した。具体的には、旧経路菌株としてEscherichia coli、Bacillus subtilis 、Mycobacterium tuberculosis、Corynebacterium glutamicumの４株を選択し、新経路菌株としてStreptomyces coelicolor 、Streptomyces avermitilis、Geobacter metallireducens 、Helicobacter pylori の４株を選択し、以下の条件でFASTA 検索とBLAST 検索を行った。
１）上記８つの微生物が持つ個々の遺伝子産物に対して、期待値（Ｅ値、Ｅスコア、e-value とも言う）が−１０以下のものをオーソログとみなす。
２）旧経路菌株４株の内、少なくとも３株に共通に存在するオーソログを旧経路菌株特異的オーソログとみなす。
３）同様に、新経路菌株４株の内、少なくとも３株に共通に存在するオーソログを新経路菌株特異的オーソログとみなす。
４）最終的に、新経路菌株特異的オーソログの中から、旧経路菌株特異的オーソログを除く。
以上の条件で新規経路に関与すると予想される遺伝子群を絞り込んだ後、転写調節因子、物質輸送に関与する膜タンパクなど、明らかに新規経路に関与していないと推定された遺伝子群を除外することにより、Streptomyces coelicolor については、配列番号１〜７に記載したＤＮＡ、および配列番号８〜１４に記載したタンパク質を選択できた。
【００７４】
（２）候補遺伝子破壊株の取得
（２）−１、SCO 4506の破壊
Streptomyces coelicolor A3(2) 株用に用いられるプラスミドベクターpIJ702をBclI切断後、アガロースゲル電気泳動し、チオストレプトン耐性遺伝子を含む約８００ｂp のＤＮＡ断片を取得した。上記で取得したＤＮＡ断片をpUC19 （ニッポンジーン社製）と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli （東洋紡より購入）DH５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。該方法により単離したプラスミド中に目的のチオストレプトン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されていることを確認し、本プラスミドをpUC19-tsr と命名した。次いで、Streptomyces coelicolor A3(2) 株を１白金耳、１００ｍｌのYEME液体培地（Difco yeast extract 3g, Difco Bacto-peptone 5g, oxoid malt extract 3g, glucose 10g, sucrose 340g, 5mM MgCl2・6H2O）に植菌し、３０℃で３日間培養した後、常法に従い染色体ＤＮＡを単離・精製した。次いで、in silico で絞り込んだ候補遺伝子の翻訳開始コドン上流3Kb のＤＮＡ領域と翻訳終止コドン下流3Kb のＤＮＡ領域をPCR により増幅した。具体的には、SCO 4506の翻訳開始コドン上流3Kb のＤＮＡ領域の増幅には、下記の配列2-1-a および配列2-1-b の２つのプライマーを用いた。なお、各々のプライマーには、サブクローニングしやすいようにEcoRI 部位とSacI部位を導入した（下線部）。また、翻訳終止コドン下流3Kb のＤＮＡ領域の増幅には、下記の配列2-1-c および配列2-1-d の２つのプライマーを用いた。これらプライマーにも各々制限酵素部位（XbaIとHindIII ）を導入した（下線部）。染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマーと、TaKaRa LA-PCR TM Kit Ver.2( 宝酒造社製) 、ExpandTM High-Fidelity PCR System(ロシュ社製) またはTaq DNA polymerase（Promega 社製）を用い、ＤＮＡ増幅装置 (MJ Research 社製) でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。ＰＣＲ終了後、各々の反応液をアガロースゲル電気泳動し、約3KｂのＤＮＡ断片を取得した。次いで、上記と同じ方法で、各々の断片をｐUC19にサブクローン化した。得られたプラスミドの塩基配列を決定することにより、目的のSCO 4506の翻訳領域上流3Kb 、および翻訳領域下流3Kb の領域を含むＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認し、本プラスミドをp4506-UPとｐ4506-DOWN と命名した。次いで、p4506-UPからSCO 4506の翻訳領域上流3Kb 領域を含むEcoRI-SacI断片を、また、ｐ4506-DOWN からSCO 4506翻訳領域の下流を含むXbaI-HindIII断片を調製し、上記と同様の方法で、pUC19-tsr の対応する各々の制限酵素部位に導入し、SCO 4506破壊用プラスミドpUC-4506-Disrpt を得た。次いで、本プラスミドをEcoRI-HindIII 切断し、SCO 4506の翻訳領域のみがチオストレプトン耐性遺伝子で置き換えられているＤＮＡ断片を上記と���じ方法で得た。
【００７５】
このＤＮＡ断片をPractical Streptomyces Genetics (ISBN 0-7084-0623-8)に記載の方法を用いてStreptomyces coelicolor A3(2) 株のプロトプラストに導入し、市販されているメナキノン４（１００μｇ／ｍｌ）含有Ｒ５再生培地に塗布した。１６時間後に、チオストレプトン（最終濃度２５μｇ／ｍｌ）を含む軟寒天培地を重層した後、３０℃で３日間培養し、チオストレプトン耐性株を得た。目的遺伝子が破壊されていることは、チオストレプトン耐性遺伝子特異的ＤＮＡ断片を用いたサザンハイブリダイゼーションで確認した。これら破壊株は、メナキノン４を含むＲ５寒天培地やYEME液体培地で生育できたが、メナキノン４を含まない培地では生育できなかったことから、SCO 4506はメナキノンの新規生合成経路に関与することを実証した。
【００７６】
翻訳開始コドン上流3Kb のＤＮＡ領域用プライマー
配列2-1-a ；  5'-CCGGAATTCGCCGGAGGGCGACTGGTCCGA-3'
配列2-1-b ；  5'-GGCGAGCTCATCGCGAGGCTAGCCCTCCCC-3'
翻訳終止コドン下流3Kb のＤＮＡ領域用プライマー
配列2-1-c ；  5'-TGCTCTAGACACGGCCGGGGCGTCGCCGCG-3'
配列2-1-d ；  5'-CCCAAGCTTGACCGCTGGGAGGGGTGGGTG-3'
【００７７】
（２）−２、SCO 4326の破壊
基本的にSCO 4506の破壊と同様の方法でSCO 4326がメナキノンの新規生合成経路に関与することを実証した。SCO 4326の翻訳開始コドン上流3Kb のＤＮＡ領域をプライマー（下記の配列2-2-a および配列2-2-b のプライマー）を用いてPCR で増幅した。PCR による複製エラーが無いことを塩基配列解析により確認した後、ｐUC19のSacI-BamHI部位に挿入した。次いで、本プラスミドのBamHI 部位にpIJ702から調製したチオストレプトン耐性遺伝子を含むBclI断片を挿入した。さらに、本プラスミドにプライマー（下記の配列2-2-c および配列2-2-d のプライマー）で増幅、塩基配列確認したSCO 4326の翻訳終止コドン下流3Kb のＤＮＡ領域を含むPstI-HindIII断片を挿入した。本プラスミドを用いて、上記（２）−１同様の手法でSCO 4326を破壊し、SCO 4326もメナキノンの新規生合成経路に関与することを実証した。
【００７８】
翻訳開始コドン上流3Kb のＤＮＡ領域用プライマー
配列2-2-a ；  5'-GGCGAGCTCCATACGCCGTCTCACGAGTGC-3'
配列2-2-b ；  5'-GGGGGATCCTCAGCGCTCATGCGGTTTCCA-3'
翻訳終止コドン下流3Kb のＤＮＡ領域用プライマー
配列2-2-c ；  5'-AAACTGCAGGACGGCCGGGGCGAGGAGATC-3'
配列2-2-d ；  5'-CCCAAGCTTAGGTCGTCTTCGAGTATCTGA-3'
【００７９】
（２）−３、SCO 4327の破壊
SCO 4327については基本的にSCO 4506の破壊と同様の方法でSCO 4327がメナキノンの新規生合成経路に関与することを実証した。なお、以下のプライマーを用いてPCR で増幅した。
翻訳開始コドン上流3Kb のＤＮＡ領域用プライマー
配列2-3-a ；  5'-GCGGAATTCGGGCCGTAGCCCTCCTCCCAG-3'
配列2-3-b ；  5'-GCGGGTACCCTCCGTGCCCGGCGCGGGGAA-3'
翻訳終止コドン下流3Kb のＤＮＡ領域用プライマー
配列2-3-c ；  5'-GAGTCTAGACACCCTGCAGATCGCGTACTC-3'
配列2-3-d ；  5'-GTGAAGCTTCACCGAGGGCCGCTGGGGCGA-3'
【００８０】
（２）−４、SCO 4550の破壊
SCO 4550については基本的にSCO 4506の破壊と同様の方法でSCO 4550がメナキノンの新規生合成経路に関与することを実証した。なお、以下のプライマーを用いてPCR で増幅した。
翻訳開始コドン上流3Kb のＤＮＡ領域用プライマー
配列2-4-a ；  5'-CCCAAGCTTGCTGGTCGAGATGCCCGACGA-3'
配列2-4-b ；  5'-TGCTCTAGACGGCGTCCCTTTCGCAAGGTT-3'
翻訳終止コドン下流3Kb のＤＮＡ領域用プライマー
配列2-4-c ；  5'-CGGGGTACCGGCCGCCGTGCTGAGGATCCA-3'
配列2-4-d ；  5'-CCGGAATTCGACGGCGGGCCGTTTCCAGTC-3'
【００８１】
（２）−５、SCO 4490の破壊
SCO 4490については基本的にSCO 4506の破壊と同様の方法でSCO 4490がメナキノンの新規生合成経路に関与することを実証した。なお、以下のプライマーを用いてPCR で増幅した。
翻訳開始コドン上流3Kb のＤＮＡ領域用プライマー
配列2-5-a ；  5'-CCGGAATTCGCCCGGTCGGACTCTGGCCCC-3'
配列2-5-b ；  5'-GGGGGTACCGCCGTCCAGTATCCCCGAGCG-3'
翻訳終止コドン下流3Kb のＤＮＡ領域用プライマー
配列2-5-c ；  5'-TGCTCTAGACGTCGGCTTCCGCCGCCCTGC-3'
配列2-5-d ；  5'-CCCAAGCTTCCATCTGCGTCCGCGCCTGGA-3'
【００８２】
（２）−６、SCO 4492の破壊
SCO 4492については基本的にSCO 4506の破壊と同様の方法でSCO 4492がメナキノンの新規生合成経路に関与することを実証した。なお、以下のプライマーを用いてPCR で増幅した。
翻訳開始コドン上流3Kb のＤＮＡ領域用プライマー
配列2-6-a ；  5'-CCGGAATTCAGGAGCGCGAACGCCTGGCTC-3'
配列2-6-b ；  5'-CGGGGTACCGCGCTGCGTCTGTCCTGGCTT-3'
翻訳終止コドン下流3Kb のＤＮＡ領域用プライマー
配列2-6-c ；  5'-TGCTCTAGAGCACCGACTCCCCCCACACGT-3'
配列2-6-d ；  5'-CCCAAGCTTTGAGGCGTATCGCCTCGATGC-3'
【００８３】
（２）−７、SCO 4494の破壊
SCO 4494については基本的にSCO 4506の破壊と同様の方法でSCO 4494がメナキノンの新規生合成経路に関与することを実証した。なお、以下のプライマーを用いてPCR で増幅した。
翻訳開始コドン上流3Kb のＤＮＡ領域用プライマー
配列2-7-a ；  5'-GGAAGATCTCACTACCAGGTCGCCGCCCGC-3'
配列2-7-b ；  5'-CCGCTCGAGTTACTGGACCTCTTCGGGCAG-3'
翻訳終止コドン下流3Kb のＤＮＡ領域用プライマー
配列2-7-c ；  5'-CCCAAGCTTGTTTCGCGGTAGTTCTCCGCC-3'
配列2-7-d ；  5'-GGCGAGCTCGCTCGGTGACCTTCTGGGTCA-3'
【００８４】
（３）変異剤を用いたメナキノン新規経路遺伝子欠損株の取得
上記（１）、（２）で記載したin silico による新規経路に関与する遺伝子群の探索と遺伝子破壊実験による実証では、検索条件｛検索に用いる母集団の数、オーソログ判定のための期待値の設定、新（旧）経路特異的オーソログを設定する際、母集団中、幾つの微生物が持てば新（旧）経路特異的オーソログとみなすかの設定など｝により、新規経路遺伝子（産物）を見逃す可能性がある。そこで、確実に全経路遺伝子の取得が可能な変異原を用いたメナキノン要求性変異株の取得を行った。具体的には、病原性が無いStreptomyces coelicolor の胞子（１×１０10個）を常法により、N-methyl-N-nitro-N- nitrosoguanidineを用いて変異処理を行い、市販のメナキノンのプレニル側鎖が４であるメナキノン４（１００μｇ／ｍｌ）含有ATCC5 培地（スターチ0.2 ％、Difco yeast extract 0.1 ％、Difco Bacto beef extract 0.1％、 FeSO4・7H2O 0.01 ％、寒天 2％、pH 7.5）に塗布した。３０℃で４日間培養した後、個々のコロニーを爪楊枝を用いて、メナキノン４（１００μｇ／ｍｌ）含有ATCC5 培地とメナキノン４を含まないATCC5 培地の２つのプレートにレプリカした。３０℃で４日間培養した後、メナキノン４（１００μｇ／ｍｌ）含有ATCC5 培地でのみ生育した株を新規メナキノン経路欠損株とした。
【００８５】
（４）メナキノン新規経路遺伝子ＤＮＡの取得
実施例１の（１）と（２）で同定できたメナキノン新規生合成路に関与する各遺伝子群をPCR により増幅した。Streptomyces coelicolor A3(2) 株のゲノム情報に基づき、SCO 4506遺伝子の５'側のプライマーとして、下記の配列4-a を、３'側のプライマーとして、下記の配列4-b を作成した。Streptomyces coelicolor A3(2) 株の染色体ＤＮＡを上記の方法で調製した後、このＤＮＡを鋳型として、上記プライマーと、TaKaRa LA-PCR TM Kit Ver.2（宝酒造社製) 、ExpandTM High-Fidelity PCR System(ロシュ社製) またはTaq DNA polymerase（Promega 社製）を用い、ＤＮＡ増幅装置 (MJ Research 社製) でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。ＰＣＲ終了後、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約850 ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。上記で取得したＤＮＡ断片をpGEM-T Easy ベクター（Promega 社製）と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli （東洋紡より購入）DH５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、さらに塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
同様の方法で、SCO 4326は、下記の配列4-c と配列4-d をプライマーに用いて、SCO 4327は、下記の配列4-e と配列4-f をプライマーに用いて、SCO 4550は下記の配列4-g と配列4-h をプライマーに用いて、SCO 4490は、下記の配列4-i と配列4-j をプライマーに用いて、SCO4492は、下記の配列4-k と配列4-l をプライマーに用いて、SCO 4494は、下記の配列4-m と配列4-n をプライマーに用いて、目的遺伝子を各々取得した。
【００８６】
遺伝子増幅用プライマー (SCO 4506遺伝子５'側)
配列4-a ；  5'-GTGGACAATTCTCGCACCCGGCCGCGTGTC-3'
遺伝子増幅用プライマー (SCO 4506遺伝子３'側)
配列4-b ；  5'-TCAGGGCTTGAGCAGCTCGACCTTCACGTC-3'
遺伝子増幅用プライマー (SCO 4326遺伝子５'側)
配列4-c ；  5'-ATGAGCGCTGACACCCTGCAGATCGCGTAC-3'
遺伝子増幅用プライマー (SCO 4326遺伝子３'側)
配列4-d ；  5'-CTACGGGAACGCCAGCGCGTCCGGGCCGAG-3'
遺伝子増幅用プライマー (SCO 4327遺伝子５'側)
配列4-e ；  5'-GTGTCCCGCCCCGGGATCACCCTCCACCGG-3'
遺伝子増幅用プライマー (SCO 4327遺伝子３'側)
配列4-f ；  5'-TCAGCGCTCATGCGGTTTCCAACTCTCAAG-3'
遺伝子増幅用プライマー (SCO 4550遺伝子５'側)
配列4-g ；  5'-GTGACCGAGAAGGCCGACCTTCAGCCCATC-3'
遺伝子増幅用プライマー (SCO 4550遺伝子３'側)
配列4-h ；  5'-TCAGTTGGGGCGAGCAGCTTCAGCTCGGGG -3'
遺伝子増幅用プライマー (SCO 4490遺伝子５'側)
配列4-i ；  5'-ATGGCTTACGACGATCTTCGCTCCCTGCTC-3'
遺伝子増幅用プライマー (SCO 4490遺伝子３'側)
配列4-j ；  5'-TCACAGTCCGTACTCCTTCCAGCGGCGGTC-3'
遺伝子増幅用プライマー (SCO 4492遺伝子５'側)
配列4-k ；  5'-GTGCCTTGGATCGTGGGGGTGTCCGGGGCC-3'
遺伝子増幅用プライマー (SCO 4492遺伝子３'側)
配列4-l ；  5'-TCAGCCGGTGGGGCGGGCCCCGCCGAGGTC-3'
遺伝子増幅用プライマー (SCO 4494遺伝子５'側)
配列4-m ；  5'-ATGGACGCCGGGCTCAAGCGCGAGCTGGAG-3'
遺伝子増幅用プライマー (SCO 4494遺伝子３'側)
配列4-n ；  5'-TCACACCCGCATCGGCTGCGGCGACTCCCG-3'
【００８７】
（５）変異処理で得たメナキノン新規経路欠損株を相補するＤＮＡの取得
Streptomyces coelicolor A3(2) 株を１白金耳、１００ｍｌのYEME液体培地（Difco yeast extract 3g, Difco Bacto-peptone 5g, oxoid malt extract 3g, glucose 10g, sucrose 340g, 5 mM MgCl2・6H2O）に植菌し、３０℃で３日間培養した。常法に従い染色体ＤＮＡを単離・精製した後、制限酵素Sau 3 AIによる部分分解を行った。Sau 3 AI部分分解溶液２００〜４００μｌ（１００〜２００μｇ）を１０〜４０％ショ糖密度勾配に重層し、28,000rpm 、２０℃で１６時間遠心した（ローター; SW41TI、BECKMAN ）。５００μｌずつ分画し、一部（１０μｌ）を０．７％ Agarose電気泳動にかけ、１０ Kbp程度の画分を１つにまとめ回収した。TE緩衝液で１０倍希釈し、イソプロピルアルコール沈殿、７０％エタノール洗浄後、適当量のTE緩衝液で溶解した。プラスミドベクターpIJ702を制限酵素BglII で切断後、bacterial Alkaline Phosphatase (BAP)による切断末端の脱リン酸化を行い、上記分画したＤＮＡとT4 ligase によって連結した。このＤＮＡをPractical Streptomyces Genetics (ISBN 0-7084-0623-8)に記載の方法を用いて、上記（３）で得たメナキノン新規経路遺伝子欠損株のプロトプラストに導入し、メナキノン類を含まないＲ５再生培地に塗布した。１６時間後に、チオストレプトン（最終濃度２５μｇ／ｍｌ）を含む軟寒天培地を重層した後、３０℃で３日間培養し、チオストレプトン耐性株を得た。これら形質転換株は、メナキノン４を含まないＲ５寒天培地やYEME液体培地で生育可能になったこと、また形質転換株から、全メナキノンを抽出し、HPLCでメナキノンの種類を同定すると、本来Streptomyces coelicolor A3(2) 株が持つイソプレン側鎖が８であるメナキノン８が検出できたことから、形質転換株が持つプラスミドに挿入されているＤＮＡ断片中には、メナキノン新規経路に関与する遺伝子が含まれていることが確認できた。
【００８８】
次いで、これら形質転換株をYEME液体培地で培養し、形質転換株が持つプラスミドをPractical Streptomyces Genetics (ISBN 0-7084-0623-8)に記載の方法を用いて回収した。これらプラスミドに挿入されているＤＮＡを回収し、挿入されている配列の両端について塩基配列を決定することで挿入配列が染色体のどの部分のオペロンかを正確に決定した。以上の操作を、変異処理で得たメナキノン新規経路欠損株３０種類について同様に行った結果、配列番号１〜７の塩基配列を有するＤＮＡをオペロンとして取得できた。また、3-dehydroquinate synthase をコードするSCO 1494、shikimate kinase IをコードするSCO 1495、chorismate synthase をコードするSCO 1496遺伝子群もこれらの相補実験でオペロンとして得られたことから、新規経路は、既知経路同様、コリスミ酸から分岐して生合成されることも分かった。
【００８９】
（６）ＰＣＲによるメナキノン新規生合成経路にかかわるＤＮＡの蛋白質発現プラスミドの構築およびこれらを用いた蛋白質の取得
実施例１の（４）で実施したのと同じ方法で、S. coelicolor A3(2) 株のゲノム情報に基づき、SCO 4506遺伝子の５'側のプライマーとして、下記の配列6-a を、３'側のプライマーとして、下記の配列6-b を作成した。S. coelicolor A3(2) 株の染色体ＤＮＡを上記の方法で調製した後、このＤＮＡを鋳型として、上記プライマーと、TaKaRa LA-PCR TM Kit Ver.2（宝酒造社製) 、ExpandTM High-Fidelity PCR System(ロシュ社製) またはTaq DNA polymerase（Promega 社製）を用い、ＤＮＡ増幅装置 (MJ Research 社製) でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。ＰＣＲ終了後、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約1150ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。上記で取得したＤＮＡ断片をpGEM-T Easy ベクター（Promega 社製）と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli （東洋紡より購入）DH５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃１６時間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、さらに塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
SCO 4326、SCO 4327、SCO 4550、SCO 4490、SCO4492、SCO4494はそれぞれ下記の配列のプライマーを使用する以外はSCO4506と同様に操作することでプラスミドを単離し、さらに塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
【００９０】
DNA配列                                                        制限酵素部位
蛋白質発現用プライマー (SCO 4506遺伝子５'側)
配列6-a ；  5'- ACATGCATGCGACAATTCTCGCACCCGGCC-3'    SphI
蛋白質発現用プライマー (SCO 4506遺伝子３'側)
配列6-b ；  5'- ACCAAGCTTTCAGGGCTTGAGCAGCTCGAC-3'    HindIII
蛋白質発現用プライマー (SCO 4326遺伝子５'側)
配列6-c ；  5'- GGGGGATCCAGCGCTGACACCCTGCAGATC-3'    BamHI
蛋白質発現用プライマー (SCO 4326遺伝子３'側)
配列6-d ；  5'- ACCAAGCTTCTACGGGAACGCCAGCGCGTC-3'    HindIII
蛋白質発現用プライマー (SCO 4327遺伝子５'側)
配列6-e ；  5'- GGGGGATCCTCCCGCCCCGGGATCACCCTC-3'    BamHI
蛋白質発現用プライマー (SCO 4327遺伝子３'側)
配列6-f ；  5'- ACCAAGCTTTCAGCGCTCATGCGGTTTCCA-3'    HindIII
蛋白質発現用プライマー (SCO 4550遺伝子５'側)
配列6-g ；  5'- GGGGGATCCACCGAGAAGGCCGACCTTCAG-3'    BamHI
蛋白質発現用プライマー (SCO 4550遺伝子３'側)
配列6-h ；  5'- ACCAAGCTTTCAGTTGGGGGCGAGCAGCTT-3'    HindIII
蛋白質発現用プライマー (SCO 4490遺伝子５'側)
配列6-i ；  5'- CCCGAGCTCGCTTACGACGATCTTCGCTCC-3'    SacI
蛋白質発現用プライマー (SCO 4490遺伝子３'側)
配列6-j ；  5'- ACCAAGCTTTCACAGTCCGTACTCCTTCCA-3'    HindIII
蛋白質発現用プライマー (SCO 4492遺伝子５'側)
配列6-k ；  5'- GGGGGATCCCCTTGGATCGTGGGGGTGTCC-3'    BamHI
蛋白質発現用プライマー (SCO 4492遺伝子３'側)
配列6-l ；  5'- ACCAAGCTTTCAGCCGGTGGGGCGGGCCCC-3'    HindIII
蛋白質発現用プライマー (SCO 4494遺伝子５'側)
配列6-m ；  5'- GGGGGATCCGACGCCGGGCTCAAGCGCGAG-3'    BamHI
蛋白質発現用プライマー (SCO 4494遺伝子３'側)
配列6-n ；  5'- ACCAAGCTTTCACACCCGCATCGGCTGCGG -3'    HindIII
【００９１】
得られたプラスミドベクターに挿入された目的の遺伝子断片を、SCO4506はSphI-HindIIIで切断後、SCO4326はBamHI-HindIIIで切断後、SCO4327はBamHI-HindIIIで切断後、SCO4550はBamHI-HindIIIで切断後、SCO4490はSacI-HindIIIで切断後、SCO4492はBamHI-HindIIIで切断後、N-末 His-tag融合タンパク質発現ベクターであるｐQE30（QIAGEN社製）の対応する制限酵素部位に挿入した。SCO4494の場合はBamHI-HindIIIで切断後、N-末calmodulin-binding peptide融合タンパク質発現ベクターであるpCAL-n-FLAG（Stratagene社製）の対応する制限酵素部位に挿入した。これら発現ベクターを各ベクターに推奨されている大腸菌に導入し、それぞれSCO4506、SCO 4326、SCO 4327、SCO 4550、SCO 4490、SCO4492、SCO4494遺伝子の産物である酵素蛋白質の精製品（P-SCO4506、P-SCO4326、P-SCO4327、P-SCO4550、P-SCO4490、P-SCO4492、P-SCO4494）を得た。これらの蛋白質のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を〔図１〕に示す。
【００９２】
実施例２： PCRによるThermus thermophilus HB8株からのメナキノン新規生合成経路にかかわるＤＮＡ(TTHA1092、TTHA0803、TTHA0804)およびこれらから翻訳される蛋白質の取得
実施例１の（４）で実施したのと同じ方法で、メナキノン新規生合成路に関与する各遺伝子群を持つ表１に記載した菌株の中からThermus thermophilus HB8株を選択し、SCO 4550のオーソログ遺伝子（TTHA1092）(実施例２−１)、SCO 4506のオーソログ遺伝子（TTHA0803）(実施例２−２)、SCO 4494のオーソログ遺伝子（TTHA0804）(実施例２−３)を取得した。
まず実施例２−１について以下に示す。
Thermus thermophilus HB8 株のゲノム情報に基づき、TTHA1092遺伝子の５'側のプライマー（下記の配列TTHA-aのプライマー) および３側のプライマー（下記の配列TTHA-bのプライマー）を作成した。市販のThermus thermophilus HB8株染色体ＤＮＡ（宝酒造社製、Code 3071 ）を鋳型として、これらプライマーと、TaKaRa LA-PCR TM Kit Ver.2（宝酒造社製) 、ExpandTM High-Fidelity PCR System(ロシュ社製) またはTaq DNA polymerase（Promega 社製）を用い、ＤＮＡ増幅装置 (MJResearch 社製) でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。ＰＣＲ終了後、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約1150ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。上記で取得したＤＮＡ断片をpGEM-T Easy ベクター（Promega 社製）と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli （東洋紡より購入）DH５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃１６時間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、さらに塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。実施例２−２〜２−４については、SCO 4506のオーソログ遺伝子（TTHA0803）(実施例２−２)およびSCO 4494のオーソログ遺伝子（TTHA0804）(実施例２−３)は下記の配列のプライマー（それぞれ下記の配列TTHA-cから配列TTHA-fのプライマー）を使用する以外は実施例２−１と同様に操作することでプラスミドを単離し、さらに塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
【００９３】
DNA配列                                                        制限酵素部位
TTHA1092遺伝子の５'側のプライマー
配列TTHA-a; 5'-ACATGCATGCAAGGGCATGGACGTCCTGGAGAAGG-3'    SphI
TTHA1092遺伝子の３'側のプライマー
配列TTHA-b; 5'-ACCAAGCTTTTAGGCGAGGGGGAGCTCCACGGGCT-3'  HindIII
TTHA0803遺伝子の５'側のプライマー
配列TTHA-c; 5'-GGGGGATCCAGGCCCTACGTCCTGGGCCTTCCCCG-3'  BamHI
TTH0803遺伝子の３'側のプライマー
配列TTHA-d; 5'-ACCAAGCTTCTACTCAGGATAGAACATAGGGGCGA-3'  HindIII
TTHA0804遺伝子の５'側のプライマー
配列TTHA-e; 5'-CGGGGTACCAGAGGCATCCGGGACCCCCGCCTCAT-3'    KpnI
TTHA0804遺伝子の３'側のプライマー
配列TTHA-f; 5'-ACCAAGCTTTCACGCCTCCACCCGGTCCCAGACCC-3'  HindIII
【００９４】
得られたプラスミドベクターに挿入された目的の遺伝子断片を、TTHA804はKpnI-HindIIIで切断後、TTHA1092はSphI-HindIIIで切断後、N-末 His-tag融合タンパク質発現ベクターであるｐQE30（QIAGEN社製）の対応する制限酵素部位に挿入した。TTHA803の場合は、BamHI-HindIII切断後、N-末calmodulin-binding peptide融合タンパク質発現ベクターであるpCAL-n-FLAG（Stratagene社製）の対応する制限酵素部位に挿入した。これら発現ベクターを各ベクターに推奨されている大腸菌に導入し、それぞれTTHA1092、TTHA0803、TTHA0804遺伝子の産物である酵素蛋白質の精製品（P-TTHA1092、P-TTHA0803、P-TTHA0804）を得た（実施例２−４）。これらの蛋白質のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を〔図２〕に示す。
【００９５】
実施例３〜６：形質転換体の作成
実施例１の（５）で得たメナキノン新規経路欠損株を相補するＤＮＡの中から、SCO 4327とSCO 4326を含むオペロンを持つプラスミド（pMK4326-7)（実施例３）、SCO 4490、SCO 4491、SCO 4492を含むオペロンを持つプラスミド（pMK4490-2)（実施例４）、SCO 4506を含むオペロンを持つプラスミド（pMK4506)（実施例５）、SCO 4550を含むオペロンを持つプラスミド（pMK4550)（実施例６）を保持する形質転換株を、各々チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌのYEME液体培地で３０℃、３日間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体よりPractical Streptomyces Genetics (ISBN 0-7084-0623-8)に記載の方法を用いてプラスミドを単離した。各々の得られたプラスミドを用いて、Streptomyces coelicolor A3(2) 株を、Practical Streptomyces Genetics (ISBN 0-7084-0623-8)に記載のプロトプラスト、ポリエチレングリコール法で形質転換し、４種類の形質転換株｛S. coelicolor A3(2)/pMK4326-7 、S. coelicolor A3(2)/ｐMK4490-2、S. coelicolor A3(2)/pMK4506 、S. coelicolor A3(2)/pMK4550 ｝を得た。
【００９６】
実施例７〜１０および比較例１：形質転換体によるメナキノン生産
（１）形質転換体の培養
実施例３〜６で作成した４種類の形質転換株（実施例７〜１０）および未処理株｛S. coelicolor A3(2)/pIJ702  比較例１｝を、各々チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含むSK No.2 （可溶性でんぷん２％、グルコース０．５％、酵母エキス０．５％、Bacto TM  Peptone ０．３％、肉エキス０．３％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．０２％、ＭｇＳＯ4 ０．００６％）培地５ｍｌに植菌し、３０℃で４日間培養した。本培養として前培養液全量をSK No.2 培地３０ｍｌに植菌し、３０℃で５日間培養した。培養後、遠心分離(3,600rpm, 10min, R.T.) により菌体を１５ｍｌファルコンチューブに回収、滅菌水で洗浄した後再度遠心分離により菌体を回収して−８０℃で冷凍、凍結乾燥を行った。得られた乾燥菌体は重量を測った後に、１５ｍｌファルコンチューブ内でミクロスパーテルを用いて十分に破砕した。乾燥重量０．１ｇにつき２ｍｌ程度のchloroform-methanol (2:1) を加え３０℃で終夜振盪した。濾過により菌体を除き、エバポレーターにより溶媒を除去してオイル状の抽出物を得た。次に前操作で加えたchloroform-methanol (2:1) と等量のacetone を加えVortexにより激しく攪拌し、前操作と同様に濾過により沈殿を除き、溶媒の除去を行った。菌体抽出物にacetone ２００μｌを加え再溶解させ、Cosmonice Filter S（溶媒系）（Millipore ）を通し、それぞれ油状物質を得た。
【００９７】
（２）HPLCによるメナキノン分析
得られた油状物質のメナキノン含量を以下のHPLC測定により定量した結果、乾燥菌体１ｇ当たりのメナキノン含量はそれぞれ２２５μｇ（実施例７）、１２０μｇ（実施例８）、２６３μｇ（実施例９）、２７５μｇ（実施例１０）、７２μｇ（比較例１）であり、比較例１に比べて実施例７〜１０の生産性が高いことが明確であった。
カラム ：Mightysil RP-18GP 250-4.6 (5μm) (関東化学株式会社製)
溶媒 ：2-propanol : methanol = ２：１
流速 ：１ｍｌ／min
温度 ：３０℃
検出波長 ：２１０ｎｍ，２７０ｎｍ
Inject volume ：２０μｌ
【００９８】
実施例１１：蛋白質P-TTHA1092と蛋白質P-TTHA0804との相互作用の確認
実施例２−４で調製した蛋白質の1時間静置後の相互作用を確認するために、Native-PAGE(アトー株式会社製、PAGEL  型式NPU-R12.5L、コード2331468)による分析を行った。その結果、〔図３〕（４℃）及び〔図４〕（５０℃）の泳動写真に示すように、蛋白質P-TTHA1092および蛋白質P-TTHA0804は、単独では4℃及び50℃共に電気泳動パターンに変化はないが、蛋白質P-TTHA1092および蛋白質P-TTHA0804を混合した場合では、泳動パターンが4℃に比べて50℃で泳動パターンがクリアになり分子量も大きくなっており、相互作用を証明できた(実施例１１)。すなわち、これらの蛋白質をコードする遺伝子TTHA1092、TTHA0804、およびこれらのS. coelicolor A3(2)株のオーソログ遺伝子SCO4550、SCO4494は、メナキノンの新規生合成経路に関する遺伝子であることが明確であり、これらの遺伝子を宿主に組み込むことでメナキノンの増産が可能である。また、蛋白質P-TTHA0803と蛋白質P-TTHA0804の間には相互は、見られなかった。
なお、〔図３〕及び〔図４〕において、レーン１〜レーン７は以下に示す通りである。
レーン1：第一化学 タンパク質分子量マーカー 「第一」・Ｉ
レーン2：蛋白質P-TTHA0804
レーン3：蛋白質P-TTHA0803
レーン4：蛋白質P-TTHA0804  ＋  蛋白質P-TTHA0803(参考例1)
レーン5：蛋白質P-TTHA1092
レーン6：蛋白質P-TTHA1092  ＋  蛋白質P-TTHA0804(実施例12)
レーン7：第一化学 タンパク質分子量マーカー 「第一」・Ｉ
【００９９】
実施例１２：放線菌S. coelicolor A3(2) を用いたメナキノン新規生合成経路の阻害剤の探索系
実施例１の（２）と（３）で記載したように、メナキノン新規生合成経路欠損株は、メナキノン４存在下で生育できるが、メナキノン４が無い条件下では生育できない。そこで、メナキノン４入りのATCC5 寒天培地と、メナキノン４を含まないATCC5 寒天培地の２つの固形培地に試験する各種薬剤として、土壌から分離した放線菌の培養液の酢酸エチル抽出物へ培養液１０μＬ相当を添加後、Streptomyces coelicolor A3(2) 株を塗布し、３０℃で３日間培養した。メナキノン４入りのATCC5 寒天培地では生育可能であるが、メナキノン４を含まないATCC5 寒天培地では生育できない放線菌培養抽出物の探索を行うという手順により、各種薬剤を評価することで、メナキノンの新規な生合成経路に特異的な阻害剤のスクリーニングを実施した。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、実施例１で得られた蛋白質のSDS-PAGE解析図である。
【図２】図２は、実施例２で得られた蛋白質のSDS-PAGE解析図である。
【図３】図３は、実施例２−４で得られた蛋白質の４℃におけるNative-PAGE解析図である。
【図４】図３は、実施例２−４で得られた蛋白質の５０℃におけるNative-PAGE解析図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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