(57)【要約】【課題】工業的にかつ高収率に２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを微生物学的に製造する方法を提供する。【解決手段】一般式（１）：2008136450.tif 000007（式中、Ｒはカルバモイル基又はヒドロキシイミノメチル基を示す。）で表される４−置換ピリジンに、その２位にヒドロキシル基を導入する能力を有するクレブトレラ属の微生物又はその処理物を作用させ、対応する２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
2008136450.tif 000005
（式中、Ｒはカルバモイル基又はヒドロキシイミノメチル基を示す。）
で表される４−置換ピリジンに、その２位にヒドロキシル基を導入する能力を有するクレブトレラ属の微生物又はその処理物を作用させることを特徴とする、一般式（２）：
【化２】
2008136450.tif 000006
（式中、Ｒはカルバモイル基又はヒドロキシイミノメチル基を示す。）
で表される２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを製造する方法。
【請求項２】
前記微生物がクラブトレラ・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ４４３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９３９）である、請求項１記載の２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンの製造方法。
【請求項３】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９３９である、クラブトレラ・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ４４３。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンの製造方法及び２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを製造することのできる微生物に関する。２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンは、医農薬中間体を始め、各種ファインケミカルの中間体として用いられ、産業上有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
微生物学的手法により２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを製造する方法としては、デルフティア・スピーシーズ（Ｄｅｌｆｔｉａ  ｓｐ．）ＹＧＫ−Ａ６４９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８９）、デルフティア・スピーシーズ（Ｄｅｌｆｔｉａ  ｓｐ．）ＹＧＫ−Ｃ２１７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８８）、又はアシドボラックス・スピーシーズ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｓｐ．）ＹＧＫ−Ａ８５４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８７）により、イソニコチン酸アミド又は４−ピリジンアルドキシムを対応する２−ヒドロキシイソニコチン酸アミド又は２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシムへそれぞれ変換する方法（特許文献１）が知られている。しかしながら、特許文献１の実施例に開示されている２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドと２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシムの蓄積濃度をそれぞれ計算すると、ＹＧＫ−Ａ６４９株が０．２６％と０．２４％、ＹＧＫ−Ｃ２１７株が０．２１％と０．４５％、ＹＧＫ−Ａ８５４株が０．３１％と０．５７％であり、生産効率が低く、工業的生産方法として必ずしも満足できるものではなかった。
【特許文献１】国際公開２００６／０３０９０９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンが蓄積反応液中で飽和した状態においても、持続的に一定の反応速度で４−置換ピリジンから対応する２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンに変換する能力を有する微生物を用い、反応を進行させることにより、高効率な２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンの蓄積反応ができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
従って、本発明は、一般式（１）：
【化１】
2008136450.tif 000002
（式中、Ｒはカルバモイル基又はヒドロキシイミノメチル基を示す。）
で表される４−置換ピリジンに、その２位にヒドロキシル基を導入する能力を有するクレブトレラ属の微生物又はその処理物を作用させることを特徴とする、一般式（２）：
【化２】
2008136450.tif 000003
（式中、Ｒはカルバモイル基又はヒドロキシイミノメチル基を示す。）
で表される２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを製造する方法に関する。
【０００５】
本発明方法の好ましい態様においては、前記微生物がクラブトレラ・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ４４３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９３９）である。
【０００６】
また、本発明は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９３９である、クラブトレラ・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ４４３にも関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンの反応系への蓄積速度を一定に保って長時間反応が可能となり、高濃度の２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンの蓄積反応をすることで、２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを工業的にかつ高収率に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明方法において出発原料として用いる４−置換ピリジンとしては、イソニコチン酸アミド〔Ｒ＝カルバモイル基〕と４−ピリジンアルドキシム〔Ｒ＝ヒドロキシイミノメチル基〕を挙げることができる。
【０００９】
本発明方法で使用することのできる微生物は、４−置換ピリジンから対応する２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを著量生成し、蓄積する能力を有する微生物であればその起源は限定されない。
【００１０】
４−置換ピリジンから対応する２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを著量生成し、蓄積する能力を有する微生物は、例えば、クラブトレラ属に属する微生物が好ましく、更に具体的には、クラブトレラ・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ４４３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９３９）を挙げることができる。クラブトレラ・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ４４３は平成１８年６月２１日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に上記受託番号で国内寄託されている。
【００１１】
本発明方法において使用することのできるクラブトレラ・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ４４３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９３９）の菌学的性質は次のとおりである。
１．形態的・培養的性質（＋は陽性、−は陰性を表す。）
（１）細胞形態：桿菌
（２）幅：０．７〜０．８μｍ
（３）長さ：１．５〜２．０μｍ
（４）胞子形成：−
（５）運動性：＋
（６）コロニー形態：円形、周縁全縁、隆起状態レンズ状、表面形状スムーズ、不透明、クリーム色
【００１２】
２．生理学的性質（＋は陽性、−は陰性を表す。）
（１）グラム染色：−
（２）各培養温度での生育：３７℃  ＋、４５℃  −
（３）カタラーゼ：＋
（４）オキシダーゼ：＋
（５）酸／ガス産生（グルコース）：−／−
（６）Ｏ／Ｆテスト（グルコース）：＋／−
（７）硝酸塩還元：＋
（８）インドール産生：−
（９）ブドウ糖  酸性化：−
（10）アルギニンジヒドロラーゼ：−
（11）ウレアーゼ：−
（12）エスクリン加水分解：＋
（13）ゼラチン加水分解：−
（14）β−ガラクトシダーゼ：＋
（15）各種化合物の資化性
ブドウ糖：＋
Ｌ−アラビノース：＋
Ｄ−マンノース：＋
Ｄ−マンニトール：＋
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：＋
マルトース：＋
グルコン酸カリウム：−
ｎ−カプリン酸：−
アジピン酸：−
ｄｌ−リンゴ酸：−
クエン酸ナトリウム：−
酢酸フェニル：−
（16）チトクロームオキシダーゼ：＋
【００１３】
３．化学分類学的性質
本菌株よりゲノムＤＮＡを抽出し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）の配列を解析した。決定された塩基配列を配列表の配列番号１に示す。こうして得られた本菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１）を用いて、ＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対して相同性を検索し、近縁菌群と系統樹を作製した結果、本菌株はクラブトレラ属に属すると推定された。最も近縁であった基準株はクラブトレラ・サッカロフィラ（Ｃｒａｂｔｒｅｅｌｌａ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）  ＩＡＭ１２６６９［Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．２３８７８９］であり、相同率は９９．０％であった。
【００１４】
以上の結果より、本菌株をクラブトレラ・スピーシーズであると判定した。従って、本発明は、この新規菌株にも関する。
【００１５】
次に、本発明において使用することができるクラブトレラ属に属する微生物の培養方法を、クラブトレラ・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ４４３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９３９）の培養方法をもって説明するが、以下の方法は、ＹＧＫ−Ａ４４３の培養に限定されるものではなく、培養方法も本発明方法に使用することのできる微生物が増殖する限り、以下の方法に限定されるものではない。
蓄積反応に用いる前記微生物の培養液の調整方法としては、（ア）炭素源及び窒素源を適宜添加した培地に微生物の菌体を接種して同一の該培地中で増殖させて培養液を得る方法、（イ）培養を段階的に行なって培養液を得る方法、すなわち、前培養と本培養を組み合わせて培養液を得る方法が挙げられるが、好ましくは（イ）の方法である。（イ）の方法は、まず、前培養として、炭素源及び窒素源を適宜添加した培地に前記微生物の菌株を接種して微生物を増殖させて、本培養で使用する微生物の確保を目的として第一段階の培養液（以下、前培養液という。）を得た後、次に、本培養として、容量を増大させた培地に前培養液を加えて、炭素源及び窒素源を適宜添加して微生物を培養することで蓄積反応に十分な酵素の産生を目的として第二段階の培養液（以下、本培養液という。）を得る方法である。
【００１６】
前記微生物を培養するための培地は、通常これらの微生物が生育可能な培地であれば特に制限はなく、一般的な微生物用の任意の公知培地を用いることができる。培地の炭素源及び窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸、有機酸、糖類、及び／又はイソニコチン酸などを使用することができる。また、必要に応じて、微量金属塩、ビタミン類、核酸関連物質、及び／又は無機塩類などを添加することもできる。
【００１７】
炭素源及び窒素源の供給方法としては、（１）培地作成時にあらかじめ添加しておく方法、（２）微生物の増殖にあわせて、炭素源及び窒素源を連続又は間欠的に供給していく方法が挙げられるが、好ましくは（２）の方法である。前記（２）の方法は、微生物の増殖により消費した炭素源及び窒素源を追加していくため、微生物の濃度を高くすることができる利点がある。前記（２）の方法を更に具体的に説明すると、微生物が炭素源及び窒素源を消費する速度に合わせて炭素源及び窒素源を添加する方法などがある。例えば、微生物が生育するとともにｐＨが上昇し、かつ、炭素源及び窒素源を含む水溶液が酸性である場合、ｐＨコントローラーを用いて、培養液のｐＨが一定になるように、炭素源及び窒素源を含む酸性の水溶液を添加すると、微生物の増殖の進行とともに、炭素源及び窒素源を少しずつ添加する方法を用いることができる。
【００１８】
更に、培養の際に、前記微生物が有する、４−置換ピリジンから対応する２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを生成する能力を最大限に引き出すために、必要に応じて４−置換ピリジン、又はイソニコチン酸を培地に添加して培養することもできる。その場合、４−置換ピリジン、又はイソニコチン酸の添加量は、培地及び培養液に対して０．０１〜３．０ｗ／ｖ％であり、好ましくは０．３〜２．０ｗ／ｖ％である。以下、本明細書において特に断りのない限り、％は、重量／容量％（ｗ／ｖ％）を意味する。
【００１９】
前記微生物の培養温度は、好ましくは１０〜３７℃、より好ましくは２３〜３２℃である。培養時の培地のｐＨは、好ましくは６．０〜１０．０であり、より好ましくはｐＨ６．５〜９．０である。培養は、好気的条件下で行うことが好ましく、液体培養時には通気及び撹拌を行うことが望ましい。培養時間は、好ましくは１０時間〜１週間であり、より好ましくは１〜５日間であり、最も好ましくは、２〜４日である。
【００２０】
以上のようにして、前記の微生物の培養菌体を培養液中に蓄積させ、以下の２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンの蓄積反応に用いることができる。
［ｉ］得られた培養液はそのまま以下に述べる蓄積反応に使用してもよいし、
［ii］微生物を培養液から回収して反応に使用したり、更に
［iii］回収した微生物の処理物、例えば、破砕物、粗酵素、精製酵素などを反応に使用することもできる。
【００２１】
続いて、前記の微生物又はその処理物により、４−置換ピリジンから対応する２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを生成する反応を実施する。この反応は、バッチ式でも、また、バイオリアクターなどを用いた連続式でも可能である。バッチ式反応の場合には、数時間から２週間で行うことができる。
【００２２】
上述の［ｉ］の場合を具体的に説明すると、上記の方法で増殖させた前記微生物を含む培養液に、直接、４−置換ピリジンを加え、対応する２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを反応系内に蓄積させる反応を開始させることができる。蓄積反応のｐＨは、好ましくはｐＨ６．０〜１０．０であり、より好ましくはｐＨ６．０〜９．０である。反応温度は、好ましくは１０〜４０℃であり、より好ましくは１０〜３５℃である。前記４−置換ピリジンの添加量は、培養液に対して０．１〜５．０％であり、より好ましくは０．２〜３．０％である。４−置換ピリジンの添加は一度に行ってもよいが、高濃度の４−置換ピリジンによる反応阻害が見られる場合には分割して添加してもよい。
【００２３】
対応する２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンの蓄積反応は、前記微生物が十分に増殖して、変換能力が十分となった時点から開始することができるが、前記微生物の増殖が十分でない培養初期段階でも、生育阻害が起こらない濃度範囲で培養液に４−置換ピリジンを添加して、微生物の増殖と対応する２−ヒドロキシ−４−置換ピリジン蓄積反応を同時に行うことができる。
【００２４】
４−置換ピリジンから対応する２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを蓄積する反応に関しては、上記の条件で蓄積反応を行った場合、２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンの蓄積濃度が０．１〜０．２％に達した時点で、２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンが反応液中に析出し、その後も一定の反応速度を保って４−置換ピリジンから対応する２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを生成し、蓄積することができる。
【００２５】
また、上述の［ii］の場合には、上記の培養方法で増殖させた微生物を、ろ過又は遠心分離により培養液から回収して蓄積反応に使用することができる。すなわち、得られた微生物は４−置換ピリジンを含む生理食塩水、又は緩衝液などの水性溶媒に懸濁して反応に使用することができる。反応条件（ｐＨ、温度、４−置換ピリジンの添加量）は［ｉ］の場合と同じである。
【００２６】
更に、上述の［iii］の場合には、前記培養方法で増殖させ、回収した微生物の処理物（例えば、破砕物、粗酵素、精製酵素）は、４−置換ピリジンを含む水性溶媒に懸濁して反応に使用することができる。あるいは、微生物又はその処理物を公知の方法で適当な担体に固定化し、その固定化物を水性溶媒と接触させて反応に使用してもよい。前記微生物又はその処理物を使用した蓄積反応に用いる水性溶媒としては、生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液などを挙げることができる。反応条件は、［ｉ］の場合と同様である。
【００２７】
以上のようにして得られた蓄積反応後の反応液から、必要に応じて、ろ過、遠心分離などにより微生物を除去した後、必要に応じて塩酸や硫酸などの酸溶液を加えて２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを沈殿させて、あるいは溶媒で２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを抽出して、２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを回収することができる。粗酵素、精製酵素などの処理物を使用した場合には菌体除去操作を省略することができる。また、クロマトグラフィーなどの公知の精製方法により２−ヒドロキシ−４−置換ピリジンを回収することもできる。
【実施例】
【００２８】
以下に代表的な実施例を示し、本発明の具体的な説明を行うが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。実施例において使用する培地を以下記載する。
（１）培地［Ａ］
脱塩水１．０Ｌ中に、酵母エキス１．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物４．３ｇ、リン酸二水素カリウム４．２ｇ、硫酸鉄（II）七水和物０．３ｇ、モリブデン（VI）酸二ナトリウム二水和物０．３ｇ、塩化マンガン（II）四水和物０．３ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５ｇ及びイソニコチン酸３．０ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを７．５に調整した培地。
【００２９】
《実施例１：クラブトレラ・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ４４３の培養液を用いた２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドの高濃度蓄積反応》
（１）前培養
培地［Ａ］１００ｍＬを５００ｍＬ容の三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した後、フィルター滅菌したスクロース１０％溶液２．５ｍＬを添加した。この三角フラスコに、栄養寒天培地に維持したクラブトレラ・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ４４３の菌体を１白金耳接種し、２７℃で２７時間振とう培養して、前培養液を得た。
【００３０】
（２）本培養
一方、撹拌、通気、温度及びｐＨ調整が可能な２Ｌ容のジャーファーメンターに培地［Ａ］１Ｌを入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した後、フィルター滅菌したスクロース１０％溶液２５ｍＬを添加した。このジャーファーメンターに、上述の前培養液２０ｍＬを加え、撹拌及び通気を実施しながら２７℃及びｐＨ７．５で１９時間培養を行った。
【００３１】
その後、炭素源及び窒素源であるスクロース７．５％とイソニコチン酸１０％を含む酸性の水溶液を、ｐＨコントローラーを用いて培養液に添加することで、培養液がｐＨ７．２になるように、炭素源及び窒素源を少しずつ添加し、培養を継続した。本培養を開始してから４６時間目で、スクロース７．５％とイソニコチン酸１０％を含む水溶液の添加総量が３８０ｍＬになり、培養を終了し、本培養液を得た。
【００３２】
（３）蓄積反応
得られた本培養液１Ｌ（菌体濃度：濁度（６６０ｎｍ）＝２４）に、２５℃で撹拌及び通気を実施しながら、培養液中のイソニコチン酸アミド濃度が０．２〜１．０％の範囲に保たれるようにイソニコチン酸アミドを固体で適宜添加し、２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドの蓄積反応を行ったところ、ほぼ一定の速度で２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドが蓄積した。２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドの濃度が約０．１％に達した時点で、２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドが析出した。
【００３３】
反応液中のイソニコチン酸アミドの基質濃度及び２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドの生成濃度の経過を図１に示す。図中におけるＩＮＡＡはイソニコチン酸アミドを、２ＨＩＮＡＡは２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドを示す。
【００３４】
反応１０１時間目で反応液を下記の条件でＨＰＬＣ分析したところ、２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドの蓄積重量は１９２．７ｇ（１．４０モル）、２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドの蓄積濃度は１９．９％（蓄積重量１９２．７ｇ／最終反応液量９７０ｍＬ）であった。前記蓄積反応中に消費したイソニコチン酸アミドの合計量１７９．７ｇ（１．４７モル）に対して、２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドのモル変換率は９５％に相当した。
【００３５】
上記で得られた反応液（定量値で２−ヒドロキシイソニコチン酸アミド１９２．７ｇを含む）について、菌体を遠心ろ過機で除去して、析出した２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドの結晶を得た。得られた２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドを、水酸化ナトリウム水溶液で中和し、溶解させた後、ろ過することで、微生物由来の不溶物を除去した後、中和して２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドを析出させ、白色結晶を得た。得られた結晶は、乾燥重量で１８８．７ｇ（１．３７モル）、ＨＰＬＣ分析の面比は９９．４％であった。得られた化合物は、ＨＰＬＣ−ＭＳ、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及びＩＲ分析により、２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドと同定された。
【００３６】
［ＨＰＬＣの分析条件］
カラム；CAPCELL PAK C18 MGII (SHISEIDO)  ４．６×２５０ｍｍ
移動相；５ｖ／ｖ％アセトニトリル（８５％リン酸を加えてｐＨを２．５に調整）
流速；１ｍＬ／分
カラム温度；４０℃
検出波長；２１０ｎｍ
保持時間；イソニコチン酸アミド＝２．７分、２−ヒドロキシイソニコチン酸アミド＝３．７分
【００３７】
《実施例２：クラブトレラ・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ４４３の培養液を用いた２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドの長時間蓄積反応》
実施例１の（１）及び（２）と同様の方法でクラブトレラ・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ４４３を培養して、得られた本培養液１Ｌ（菌体濃度：濁度（６６０ｎｍ）＝１９）に、２５℃で撹拌及び通気を実施しながら、培養液中のイソニコチン酸アミド濃度が０．２〜１．０％の範囲に保たれるようにイソニコチン酸アミドを固体又は５％水溶液で適宜添加して、２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドの蓄積反応を１０日間（２４０時間）行った。２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドの濃度が約０．１％に達した時点で、２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドが析出した。反応液に含まれる２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドを実施例１記載の条件でＨＰＬＣ分析して、２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドの蓄積速度（１時間当たりの２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドの蓄積濃度の増加量）を求めたところ、１０日間ほぼ一定であり、イソニコチン酸アミドを２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドに変換する酵素が長時間安定であることを確認した。
【００３８】
表１は、反応時間が４８時間、１４５時間及び２４０時間における反応液量、並びに２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドの蓄積濃度、蓄積重量及び蓄積速度を示している。なお、１時間当たりの２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドの蓄積重量の増加量を蓄積速度として求めた（例えば、反応２４０時間における蓄積速度は、蓄積重量（４３８−２７８）／反応時間（２４０−１４５）＝１．７）。表中における２ＨＩＮＡＡは２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドを示す。
【表１】
2008136450.tif 000004
【００３９】
《実施例３：クラブトレラ・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ４４３の静止菌体を用いた２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシムの蓄積反応》
実施例１の（１）及び（２）と同様の方法でクラブトレラ・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ４４３を培養して得られた本培養液１０ｍＬ（菌体濃度：濁度（６６０ｎｍ）＝２８．５）を遠心分離により集菌し、静止菌体を得た。これに、４−ピリジンアルドキシム０．５％を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を１０ｍＬ加え、懸濁した。この懸濁液を５０ｍＬ三角フラスコに入れ、撹拌を行いながら、２７℃にて反応を開始した。その後、懸濁液の４−ピリジンアルドキシム濃度が０．２〜０．６％の範囲に保たれるように４−ピリジンアルドキシムを適宜添加し、２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシムの蓄積反応を行った。２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシムの濃度が約０．２％に達した時点で、２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシムが析出した。反応９５時間目で懸濁液を下記の条件でＨＰＬＣ分析したところ、２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシムの蓄積濃度は２．３％となり、前記蓄積反応中に消費した４−ピリジンアルドキシムに対して、２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシムのモル変換率は１００％に相当した。反応生成物は、ＨＰＬＣ−ＭＳ、１Ｈ−ＮＭＲ、及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析により確認した。
【００４０】
［ＨＰＬＣの分析条件］
カラム；CAPCELL PAK C18 MGII (SHISEIDO)  ４．６×２５０ｍｍ
移動相；５ｖ／ｖ％アセトニトリル（８５％リン酸を加えてｐＨを２．５に調整）
流速；１ｍＬ／分
カラム温度；４０℃
検出波長；２１０ｎｍ
保持時間；４−ピリジンアルドキシム＝２．７分、２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシム＝６．６分
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】実施例１の反応経過を反応時間における各成分の基質濃度又は生成濃度で示したグラフである。
【図１】
2008136450.tif 000008
【配列表】
2008136450000001.app