(57)【要約】【課題】遺伝子分析を利用して、固体又は液体の試料からの微生物を検出するシステムを提供する。【解決手段】本発明の微生物検出システムは分析チップと分析装置を有する。分析チップには予め必要な試薬が保管されている。分析チップに試料を注入し、それを分析装置に装着する。分析装置には、分析チップに加圧気体を供給する加圧源と分析チップからの気体を排気する低圧源とを有する。分析チップには試料溜めが設けられ、試料溜めにはフィルタが設けられている。フィルタによって試料に含まれる破砕物質が除去される。分析チップには、更に、試料溜めの上流側の流路と下流側の流路にバルブが設けられている。バルブは、流路に充填されたポリマーを有する。ポリマーは、加熱することにより溶解し、バルブは開通する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析チップと分析装置とを有する細菌検出システムにおいて、
上記分析装置は、上記分析チップを保持する分析チップ装着系と、上記分析チップの温度を所定の温度に保持する温度調節系と、上記分析チップに加圧気体を供給する加圧源と上記分析チップからの気体を排気する低圧源とを有する加圧気体供給系と、上記分析チップにて生成された遺伝子を光学的に検出する光検出系と、を有し、
上記分析チップは、
試料を保持する試料溜めと、流路によって上記試料溜めに接続され試料中の遺伝子を捕獲する遺伝子結合担体を保持する遺伝子抽出エリアと、流路によって上記遺伝子抽出エリアに接続され遺伝子を増殖させる反応槽と、流路によって上記反応槽に接続され廃液を貯蔵する廃液槽と、流路によって上記液試料溜め、上記遺伝子抽出エリア、及び、上記反応槽に接続され試薬を保持する試薬保管槽と、上記加圧源に接続された加圧ポートと、上記低圧源に接続された排気ポートと、を有し、上記加圧ポートからの加圧気体を上記排気ポートに排出することによって上流側から下流側に液を移動させるように構成され、
上記試料溜めには、上記試料溜めに注入された試料より所定の大きさの破砕物質を除去するためのフィルタが設けられていることを特徴とする細菌検出システム。
【請求項２】
請求項１記載の細菌検出システムにおいて、上記フィルタは20μｍ上の物質を除去することを特徴とする細菌検出システム。
【請求項３】
請求項１記載の細菌検出システムにおいて、
上記試料溜めの上流側に接続された流路と上記試料溜めの下流側に接続された流路に、それぞれ、バルブが設けられ、該バルブは流路と該流路に充填されたポリマーを有し、該ポリマーは、室温にて固化し、室温より高温であり且つ１００℃以下の温度で溶解することを特徴とする細菌検出システム。
【請求項４】
請求項１記載の細菌検出システムにおいて、
上記分析装置の分析チップ装着系は、上記分析チップの加圧ポート及び排気ポートに接続される複数の流路が形成された基板と、該基板上に配置された分析チップを押えるチップホルダとを有することを特徴とする細菌検出システム。
【請求項５】
請求項１記載の細菌検出システムにおいて、
上記分析チップは、上記分析装置において直立した状態で保持されていることを特徴とする細菌検出システム。
【請求項６】
試料を保持する試料溜めと、流路によって上記試料溜めに接続され試料中の遺伝子を捕獲する遺伝子結合担体を保持する遺伝子抽出エリアと、流路によって上記遺伝子抽出エリアに接続され遺伝子を増殖させる反応槽と、流路によって上記反応槽に接続され廃液を貯蔵する廃液槽と、流路によって上記液試料溜め、上記遺伝子抽出エリア、及び、上記反応槽に接続され試薬を保持する試薬保管槽と、加圧源に接続された加圧ポートと、低圧源に接続された排気ポートと、を有し、上記加圧ポートからの加圧気体を上記排気ポートに排出することによって上流側から下流側に液を移動させるように構成された分析チップにおいて、
上記試料溜めには、上記試料溜めに注入された試料より所定の大きさの破砕物質を除去するためのフィルタが設けられていることを特徴とする分析チップ。
【請求項７】
請求項６記載の分析チップにおいて、
上記試料溜めの上流側に接続された流路と上記試料溜めの下流側に接続された流路にバルブが設けられ、該バルブは流路と該流路に充填されたポリマーを有し、該ポリマーは、室温にて固化し、室温より高温であり且つ１００℃以下の温度で溶解することを特徴とする分析チップ。
【請求項８】
請求項６記載の分析チップにおいて、上記液移動機構は、加圧源に接続された加圧ポートと、低圧源に接続された排気ポートと、を有し、上記加圧ポートからの加圧気体を上記排気ポートに排出することによって上流側から下流側に液を移動させるように構成された分析チップ。
【請求項９】
請求項６記載の分析チップにおいて、上記反応槽の底部に、圧電素子が設けられ、該圧電素子の発振周波数の変化を検出することにより、上記反応槽に生成した遺伝子量を測定することを特徴とする分析チップ。
【請求項１０】
試料を保持する試料溜めと、流路によって上記試料溜めに接続され試料中の遺伝子を捕獲する遺伝子結合担体を保持する遺伝子抽出エリアと、流路によって上記遺伝子抽出エリアに接続され遺伝子を増殖させる反応槽と、流路によって上記反応槽に接続され廃液を貯蔵する廃液槽と、流路によって上記液試料溜め、上記遺伝子抽出エリア、及び、上記反応槽に接続され試薬を保持する試薬保管槽と、を有する分析チップと、該分析チップを保持する分析装置を用いた細菌検出方法において、
試料と蒸留水を袋に入れ、該袋を叩いて袋の中にて上記試料に含まれる細菌の懸濁液を生成することと、
上記袋の中から所定量の試料を採取し、上記分析チップの試料溜めに注入し、該試料溜めを密閉することと、
上記試料溜めの上流側に高圧源を接続し、上記試料溜めの下流側に低圧源を接続することによって、上記試料を上記試料溜めのフィルタを通過させて濾過することと、
培養液が保管された上記試料保管槽の上流側に高圧源を接続し、上記試料溜めの下流側に低圧源を接続することによって、上記試薬保管槽に保管された培養液を上記試料溜めに導入することと、
カオトロピックイオンを含む溶液が保管された上記試料保管槽の上流側に高圧源を接続し、上記試料溜めの下流側に低圧源を接続することによって、上記試薬保管槽に保管されたカオトロピックイオンを含む溶液を上記試料溜めに導入することと、
上記試料溜めの上流側に高圧源を接続し、上記遺伝子抽出エリアの下流側に低圧源を接続することによって、上記試料留めにて細胞膜が破壊された細菌を含む試料を上記遺伝子抽出エリアに導き、上記遺伝子結合担体に遺伝子を結合させることと、
洗浄液が保管された上記試料保管槽の上流側に高圧源を接続し、上記遺伝子抽出エリアの下流側の上記廃液層に低圧源を接続することによって、上記遺伝子抽出エリアに洗浄液を導入し、該洗浄液の廃液を上記廃液槽に導入することと、
溶離液が保管された上記試料保管槽の上流側に高圧源を接続し、上記遺伝子抽出エリアの下流側の反応槽に低圧源を接続することによって、上記遺伝子抽出エリアの上記遺伝子結合担体に結合した遺伝子を溶離し、該溶離した遺伝子を含む液を上記反応槽に導入することと、
遺伝子増幅液が保管された上記試料保管槽の上流側に高圧源を接続し、上記反応槽に低圧源を接続することによって、上記試料保管槽に保管されている遺伝子増幅液を上記反応槽に導入することと、
上記反応槽にて増殖した遺伝子を検出することと、
を含む細菌検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の微生物を検出する微生物検出システムに関し、特に、遺伝子分析を利用して間接的に微生物を検出する微生物検出システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、微生物の検出方法として、微生物を直接検出する代わりに、微生物の遺伝子を増幅し、増殖した遺伝子を分析することによって、微生物の存在を検出する方法が開発されている。このような微生物検出方法は、直接微生物を検出する方法と比較して、操作及び処理が簡単で且つ安価である利点を有する。また、このような方法は、微生物の遺伝子分析が最終目的である場合、微生物の検出から遺伝子分析の結果を得るまでの処理を自動的に且つ効率的に行うことができる。
【０００３】
特許文献１には、大気中に浮遊する微生物を捕集し、捕集した微生物の遺伝子を抽出し、増殖し、分析することによって、微生物を検出するシステムが記載されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−６５６０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載されているシステムは、大気中に浮遊する微生物を捕集するためのものであり、固体又は液体中の微生物を検出するものではない。
【０００６】
近年、食品等の個体又は液体に含まれる微生物を検出する必要性が高まっている。しかしながら、従来、遺伝子分析を利用して固体又は液体中の微生物を検出する方法又はシステムは開発されていない。
【０００７】
本発明の目的は、遺伝子分析を利用して、固体又は液体の試料からの微生物を検出するシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の微生物検出システムは分析チップと分析装置を有する。分析チップには予め必要な試薬が保管されている。分析チップに試料を注入し、それを分析装置に装着する。分析装置には、分析チップに加圧気体を供給する加圧源と分析チップからの気体を排気する低圧源とを有する。
【０００９】
分析装置には、分析チップの反応槽における遺伝子を検出するための光検出部が設けられている。
【００１０】
分析チップには試料溜めが設けられ、試料溜めにはフィルタが設けられている。フィルタによって試料に含まれる破砕物質が除去される。分析チップには、更に、試料溜めの上流側の流路と下流側の流路にバルブが設けられている。バルブは、流路に充填されたポリマーを有する。ポリマーは、加熱することにより溶解し、バルブは開通する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、遺伝子分析を利用して、固体又は液体の試料からの微生物を検出するシステムを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明は、各実施形態に開示した形態に限られるものではなく、公知技術などに基づく変更を許容するものである。
【００１３】
図１を参照して本発明による微生物検出システムの概要を説明する。本例の微生物検出システムは、分析チップ１００と分析装置３００を有する。分析チップ１００の詳細は、以下に、図３を参照して説明する。分析装置３００の詳細は、以下に、図８及び図９を参照して説明する。
【００１４】
本発明による細菌の検出方法では、一般的に知られる固相抽出法により遺伝子の抽出を行う。固相抽出法とは、固体表面に遺伝子を特異的に結合させ、次に他物質と区別して遺伝子のみを水溶液に溶離させることで抽出する方法である。更に、本発明では、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、遺伝子を増幅する。
【００１５】
図示のように、破砕袋４００に適当な大きさの固形試料と蒸留水を入れる。破砕袋４００に、適当な力の衝撃を与える。それによって、試料は破砕し、試料の懸濁液が生成される。破砕袋４００から試料液を採取し、分析チップ１００に注入する。
【００１６】
この分析チップ１００を分析装置３００にセットする。分析装置３００によって、試料に含まれる細菌が検出される。細菌の検出が終了すると、分析装置３００から分析チップ１００を取り出し、廃棄する。
【００１７】
試料を分析チップ１００に注入すると、分析チップ１００内の試料は、それ以後、分析チップの外部に取り出されることはない。従って、オペレータは、分析中、及び、分析後、試料に触れることはない。試料中に危険な細菌が含まれる場合であっても、安全である。
【００１８】
分析チップ１００の中には、細菌の前処理から検出に至るまでの工程に必要な全ての試薬が予め収容されている。従って、煩雑な試薬の分注操作を省略することができる。
【００１９】
本例では、廃棄物は分析チップ１００のみである。分析チップ１００は、焼却可能な材料によって製造される。分析チップ１００を、焼却処分することによって、二次汚染の危険性を低減することができる。分析チップ１００は使い捨てである。しかしながら、分析チップ１００には、１検査分の試薬のみが収容されているから、試薬の無駄を防止することができる。本例の微生物遺伝子分析システムは、屋内又は屋外の何処でも、簡便に遺伝子レベルの高精度な細菌検査を行うことができる。
【００２０】
本例の分析装置３００は、分析チップ１００を立てた状態で保持する。即ち、縦置き型である。しかしながら、分析装置３００は、分析チップ１００を横に倒した状態で保持する横置き型も可能である。以下に、特に断らない限り、本例の分析装置３００は、縦置き型であるとして説明する。
【００２１】
図２を参照して本発明による微生物検出方法の例を説明する。ステップＳ１０１は、試料の破砕及び懸濁液の生成である。固形試料の場合、まず試料を数センチ角にカットして、破砕袋に入れる。この袋に蒸留水を加え、５〜10分間ほど袋を手動ないし装置を用いて叩く。これにより、袋の中の試料は破砕され、１ｍｍ以下の破片となる。試料に含まれる細菌は水に懸濁される。ストマッキング袋を使用すると、100μｍ以上の寸法の破砕物質はストマッキング袋のフィルタによって濾過されるため、好適である。液状試料の場合、破砕処理を省略してよい。
【００２２】
ステップＳ１０２は、試料の採取である。袋の中から所定量の試料を採取する。ステップＳ１０３は、破砕物質の除去である。固形試料由来の破砕物質が残存すると、破砕物質中のタンパク質が細菌遺伝子の増幅反応を阻害する。そのため、細菌の大きさ以上の物質（20μｍ以上）の除去を行う。
【００２３】
ステップＳ１０４は、細菌の培養である。培養によって細菌の個数を増やすことにより、数個オーダーの細菌を検出することができる。危険な菌の場合、細菌の個数が数個でも致死量となる場合がある。通常の培養では、一日かけて細菌がコロニーを形成するまで細菌数を増やす。しかしながら、ここでは、細菌数が１００個程度まで増殖させる短時間の培養を行う。便中の大腸菌のように、分析対象菌の数が十分多いことが予め判っている場合には、この細菌の培養工程は省略してもよい。
【００２４】
ステップＳ１０５は、細菌の溶解である。試料にカオトロピックイオンを含む溶液を混合する。カオトロピックイオンは、分子の直径が大きい−1価の陰イオンである。カオトロピックイオンの働きにより、細菌の細胞膜が破壊する。カオトロピックイオンは、試料中に含まれる多くの蛋白質を変性し、ヌクレアーゼ（核酸を分解する酵素）の働きを阻害する機能を有する。
【００２５】
ステップＳ１０６は、遺伝子の捕獲である。遺伝子の捕獲には、遺伝子結合担体が用いられる。遺伝子結合担体として、石英ウール、ガラスウール、ガラスファイバー、ガラスビーズ、ガラスフィルタ等が用いられる。溶解した細菌を含む試料を遺伝子結合担体に接触させる。カオトロピックイオンの働きにより、遺伝子は遺伝子結合担体に特異的に結合する。一般的には試料を、遺伝子結合担体に通過させる。
【００２６】
ステップＳ１０７は、遺伝子の洗浄である。遺伝子結合担体及び遺伝子に付着している蛋白質、カオトロピックイオン等を洗浄する。洗浄液として、高濃度のエタノールを用いる。遺伝子結合担体に結合している遺伝子は、洗浄工程では溶離しない。
【００２７】
ステップＳ１０８は、遺伝子の溶離である。溶離液を用いて、遺伝子を、遺伝子結合担体から溶離させる。溶離液として、水又は低塩濃度の溶液が用いられる。
【００２８】
ステップＳ１０９は、遺伝子の増殖及び検出である。ポリメラーゼ連鎖反応によって遺伝子を増殖する。溶離した遺伝子にプライマ（目的とするＤＮＡ領域の両末端の約２０塩基と同一の塩基配列を有する一本鎖DNA）、DNA合成酵素（ポリメラーゼ）、四種類の基質（ｄＮＴＰ）等を加え、温度サイクルを印加する。それによって、熱変性−アニーリング−相補鎖の合成が起きる。
【００２９】
温度サイクルを印加しながら、遺伝子を検出する。試料に励起光を照射する。遺伝子は、予め蛍光標識が付されている。蛍光を検出することにより、遺伝子を検出することができる。
【００３０】
ステップＳ１１０は、分析チップ１００の廃棄である。分析チップ１００を分析装置３００から取り出し、廃棄する。
【００３１】
図３から図７を参照して本発明による分析チップ１００の例を具体的に説明する。先ず、図３を参照して、説明する。本例の分析チップ１００は、４つの試薬保管槽１２０、１３０、１４０、１５０と、試料溜め１１０と、４つの試薬保管槽１６０、１７０、１８０、１９０と、遺伝子抽出エリア２１０と、廃液槽２２０と、反応槽２３０と、２つの試薬保管槽２４０、２５０と、を有する。これらの要素は流路によって互いに接続されている。
【００３２】
４つの試薬保管槽１２０、１３０、１４０、１５０と試料溜め１１０の間の流路には、吸入側バルブ１１３が設けられている。試料溜め１１０と４つの試薬保管槽１６０、１７０、１８０、１９０の間の流路には、排出側バルブ１１４が設けられている。
【００３３】
４つの試薬保管槽１２０、１３０、１４０、１５０には、それぞれ、加圧ポート１２１、１３１、１４１、１５１が接続されている。
【００３４】
吸入側バルブ１１３と試料溜め１１０の間の流路は、加圧ポート１１５が接続されている。試料溜め１１０には、試料注入口１１１が設けられている。試料溜め１１０には、排気ポート１１６が接続されている。
【００３５】
４つの試薬保管槽１６０、１７０、１８０、１９０には、それぞれ、加圧ポート１６１、１７１、１８１、１９１が接続されている。廃液槽２２０と反応槽２３０には、それぞれ、加圧排気ポート２２１、２３１が接続されている。試薬保管槽２４０、２５０には、それぞれ、加圧ポート２４１、２５１が接続されている。
【００３６】
ここで、試料溜め１１０に対して、試薬保管槽１２０、１３０、１４０、１５０のある側を上流側、廃液槽２２０と反応槽２３０のある側を、下流側と称することとする。
【００３７】
本例の分析チップでは、加圧気体を用いて、液を上流側から下流側に移動させる。液の上流側の加圧ポートに分析装置の加圧源を接続し、液の下流側の排気ポートに分析装置の低圧源を接続する。加圧ポートからの加圧気体は、液を押し出す。加圧気体は、液を押し出し、排気ポートから排出される。
【００３８】
加圧気体は、所定の圧力の乾燥した不活性ガス、例えば、窒素、ヘリウム、アルゴン等である。酸素は試薬を酸化させ、二酸化炭素は試薬のｐＨを変化させる可能性があるから、使用しない。分析装置の低圧源は大気圧であってよい。
【００３９】
吸入側バルブ１１３と排出側バルブ１１４の構造を説明する。吸入側バルブ１１３と排出側バルブ１１４は、流路に充填されたポリマーを有する。ポリマーは、１００℃以下で溶解し、室温で固化し、且つ、生体試料と相性が良いものが選ばれる。このようなポリマーとして、アガロースゲルがある。特に、６５℃付近で溶解し、室温で固化する低融点アガロースがよい。
【００４０】
吸入側バルブ１１３と排出側バルブ１１４を製造する場合、流路に、溶融したポリマーを充填し、室温まで冷却する。それによってポリマーは固化し、流路は閉鎖される。流路を開通させる場合には、局所的にバルブを加熱し、ポリマーを溶解させる。溶解したポリマーは、流路の内壁に沿って流動する。流路が開通したら、ポリマーを室温まで冷却する。それによって、ポリマーは、流路の内壁に付着した状態で固化する。本例の、バルブは、一度、開いたら再び閉じることはない非可逆的な動作を行う。
【００４１】
図４を参照して、試料溜め１１０の構造の例を説明する。試料溜め１１０の内部には、フィルタ１１２が設けられている。フィルタ１１２は、細菌より大きい破砕物質を除去する。例えば、細菌の寸法を20μｍと仮定すると、フィルタ１１２の目開きは、20μｍ以上であることが望ましい。
【００４２】
フィルタ１１２の上側には、試料注入口１１１が設けられ、フィルタ１１２の下側には、排気ポート１１６が設けられている。試料溜め１１０の底面１１７はテーパが形成されている。このテーパによって、試料溜め１１０の底面１１７に試料が残存することが防止される。
【００４３】
再び、図３を参照して説明する。遺伝子抽出エリア２１０には、遺伝子結合担体が充填されている。遺伝子結合担体として、例えば、石英ウール、ガラスウール、ガラスファイバー、ガラスビーズ等が用いられる。ガラスビーズを用いる場合、接触面積を大きくするためにビーズ径を５０μｍ以下とするのが好ましい。ビーズ径が小さすぎると、遺伝子抽出エリア２１０から流路へ流出する可能性がある。そこで、ビーズ径は、２０〜３０μｍが最適である。
【００４４】
図６を参照して、遺伝子抽出エリア２１０の構造の例を説明する。遺伝子抽出エリア２１０には、遺伝子保持担体が流路に流出しないように、堰２１１が設けられている。堰２１１は遺伝子抽出エリア２１０に形成された複数の柱状体を含む。柱状体の間の隙間、及び、柱状体と内壁の間の隙間によって、流路が形成される。この流路の幅は、ビーズ径より小さい。流路の幅が１０μｍ未満であると、流体抵抗が大きく、試料をスムーズに流すことが困難になる。従って、堰２１１によって形成される流路幅は１５〜５０μｍが好適である。
【００４５】
次に、分析チップ１００の材料及び製造方法を説明する。分析チップは、２枚の基板を張り合わせて形成される薄い矩形のディスク形状である。第１の基板には、流路、試薬保管槽、試料溜め１１０、遺伝子抽出エリア２１０等を構成する溝が形成され、第２の基板には、ポートを構成する孔が形成される。第１の基板の溝は、光造形法によって作成した樹脂の型を転写して作成する。光造形法によって作成する樹脂の型は滑らかな曲線とならない。そのため、型は、基本的には、矩形構造を有する。従って、第１の基板に形成される溝の断面は矩形である。矩形断面の流路に試薬を流すと、流路の四隅に試薬が付着して、残存する。流路に残存した試薬が次に流れてきた試薬と混合するキャリーオーバーが起きる。流路壁面への試薬の付着を抑制するためには、流路の断面を小さくすればよい。本例では、試薬のキャリーオーバーを防止するため、流路の断面を、横０．５ｍｍ、縦０．５ｍｍとした。
【００４６】
第２の基板は、板材に孔を形成することにより作成される。第１の基板上に第２の基板を張り合わせることによって、分析チップ１００は製造される。
【００４７】
基板の材料として、ガラス、樹脂等の透明な材料が用いられる。ガラスは、加工費用が高く、また割れ易い。樹脂は、加工性及び廃棄処理性に優れる。従って、基板の材料には樹脂が好ましい。樹脂の種類は特に限定されるものではないが、以下の特性を備えることが好ましい。
（１）生体適合性が良好である。通常のシリコンゴムは生理的に不活性である。
（２）サブミクロンの精度で型の転写が可能である。硬化前は低粘度で流動性に富み、型の複雑な形状の細部まで良好に浸透することができることが好ましい。
（３）低コストである。例えば、８円／１グラム程度であることが好ましい。従来の汎用マイクロデバイス材料であるパイレックスガラスは1ｋ円／１グラムである。従って、パイレックスガラスの価格の１／１００以下であることが好ましい。
（４）焼却により容易に廃棄可能である。ガラスは焼却不可であり、好ましくない。
【００４８】
このような特性を有する材料に、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：ダウコーニングアジア社製、シルポット184）がある。
【００４９】
再度、図３を参照して説明する。本例の分析チップを用いて固形試料に含まれる微生物を検出する場合を説明する。試薬保管槽１２０、１３０、１４０、１５０には、それぞれ、培養液、細胞壁溶解液である第１の酵素、第２の酵素、及び、カオトロピックイオン液が収容されている。従って、これらの試薬槽を、以下に、それぞれ、培養液保管槽１２０、第１の酵素保管槽１３０、第２の酵素保管槽１４０、及び、カオトロピック保管槽１５０と称する。試薬保管槽１６０、１７０、１８０、１９０には、それぞれ、第１、第２、及び、第３の洗浄液及び遺伝子溶離液が収容されている。従って、これらの試薬槽を、以下に、それぞれ、第１、第２、及び、第３の洗浄液保管槽１６０、１７０、１８０、及び、溶離液保管槽１９０と称する。試薬保管槽２４０、２５０には、それぞれ、第１及び第２の遺伝子増幅試薬が収容されている。従って、これらの試薬槽を、以下に、それぞれ、第１、第２の遺伝子増幅試薬保管槽２４０、２５０と称する。
【００５０】
本例では、培養液保管槽１２０の体積は２０〜１００μＬ、第１の酵素保管槽１３０の体積は２０〜１００μＬ、第２の酵素保管槽１４０の体積は５〜２０μＬ、カオトロピック保管槽１５０の体積は４００〜８００μＬが好ましい。また第１の洗浄液保管槽１６０の体積は２００〜３００μＬ、第２の洗浄液保管槽１７０の体積は５０〜１５０μＬ、第３の洗浄液保管槽１８０の体積は５０〜１００μＬ、溶離液保管槽１９０の体積は１０〜２０μＬ、第１の遺伝子増幅試薬保管槽２４０の体積は２０〜４０μＬ、第２の遺伝子増幅試薬保管槽２５０の体積は１０〜２０μＬが好ましい。
【００５１】
これらの試薬保管槽は、細長い流路形状に形成される。試薬保管槽内の試薬を送液するためには、試薬保管槽の背後から加圧気体を試薬保管槽に送る。試薬保管槽が細長い流路形状でない場合、気体が通り抜け易い部位のみにて試薬が押し出され、その他の部位の試薬が試薬保管槽に残る。消費する試薬の量を減らすために、試薬保管槽を流路形状にするのが効果的である。
【００５２】
これらの試薬保管槽の断面形状は、横／縦＝１０以下が好ましい。横／縦が１０以上となると、流路天井部の樹脂が撓み、流路の矩形構造が崩れる可能性がある。それによって流路断面が狭まり、送液が困難となる。本実施例における試薬保管槽の断面形状は、横１ｍｍ、縦２〜３ｍｍである。試薬保管槽に接続された流路の断面は、試薬保管槽よりも小さい。例えば、流路の断面積は、試薬保管槽の断面積の１／４以下が好ましい。
【００５３】
溶離液に試料及び第１の洗浄液が混入すると遺伝子の検出が困難となる。そこで、溶離液保管槽１９０は、試料溜め１１０及び第１の洗浄液保管槽１６０から離れた位置に配置することが好ましい。
【００５４】
本例では、分析チップ１００を冷蔵した状態又は冷凍した状態でユーザに提供する。分析チップ１００を４℃で冷蔵保存することにより、試薬の活性を１ヶ月保持することができる。分析チップ１００を−２０℃で凍結保存することにより、試薬の活性を、半年以上を保持することが可能である。
【００５５】
分析チップ１００には１検査分のみの試薬が収容されている。分析チップ１００は、１検査用の使い捨てである。したがって、試薬の無駄がなく、経済性が向上する。またユーザは試薬を各試薬保存槽に分注する手間を省くことができ、時間が短縮されるだけでなく、汚染を防ぐこともできる。
【００５６】
本例では、各分析チップ１００には、１０種類の試薬の１検査分が収容されている。即ち、培養液、第１及び第２の細胞壁溶解液、カオトロピックイオン、第１、第２、及び、第３の洗浄液、遺伝子溶離液、第１、及び、第２の遺伝子増幅試薬が、それぞれ、培養液保管槽１２０、第１の酵素保管槽１３０、第２の酵素保管槽１４０、カオトロピック保管槽１５０、第１の洗浄液保管槽１６０、第２の洗浄液保管槽１７０、第３の洗浄液保管槽１８０、溶離液保管槽１９０、第１の遺伝子増幅試薬保管槽２４０、第２の遺伝子増幅試薬保管槽２５０に収容されている。
【００５７】
培養液として、アラニン、アデノシン、グルコース等を含むブイヨンが好ましい。特にＬ-アラニンを1ｍＭ〜１０ｍＭ含有するブイヨンが最適である。第１の細胞壁溶解液、即ち、第１の酵素として、リゾチーム又はアクロモペプチダーゼが好適である。第２の細胞壁溶解液、即ち、第２の酵素として、プロテアーゼKが好適である。
【００５８】
カオトロピックイオンとして、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム等が挙げられる。グアニジン塩酸は、冷蔵又は冷凍保存による組成の変化が極めて少ないため、好適である。またカオトロピックイオンに界面活性剤又は緩衝剤を含有させることが好ましい。界面活性剤として特に限定はされないが、ツイーン−２０、トリトンＸ−１００等が挙げられる。緩衝剤として特に限定はされないが、トリス−塩酸塩、リン酸２水素カリウム−４ホウ酸ナトリウム等が挙げられる。カオトロピックイオンを添加することにより、細菌の細胞膜はより完全に破壊される。またカオトロピックイオンは、試料中に含まれる多くの蛋白質を変性し、ヌクレアーゼ（核酸を分解する酵素）の働きを阻害する。
【００５９】
第１の洗浄液としては、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩化水素、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム等のカオトロピックイオンが好ましい。第２の洗浄液としては、５０％以上の高濃度エタノール又は酢酸カリウム溶液が好ましい。第３の洗浄液としては、第２の洗浄液を２倍以上に希釈した液（エタノールや酢酸カリウム溶液の希釈液）又は滅菌蒸留水が好ましい。
【００６０】
溶離液としては、滅菌蒸留水、ＴＲＩＳ−ＥＤＴＡ、ＴＲＩＳ−アセテート等のバッファ溶液が使用可能である。第１の遺伝子増幅試薬は、4種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、バッファ（ＴＲＩＳ塩酸、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２など）、プライマ等から構成される。第２の遺伝子増幅試薬は、ＤＮＡ合成酵素（TaqＤＮＡポリメラーゼ、TthＤＮＡポリメラーゼ、VentＤＮＡポリメラーゼ、サーモシーケナーゼなど）、蛍光色素（エチジウムブロマイド、SYBR  GREEN（Molecular  Probe製）、ＦＡＭ、ＲＯＸなど）等から構成される。
【００６１】
次に、分析対象の細菌の有無を検出する処理を説明する。ユーザは、先ず、冷蔵保存しておいた分析チップ１００を室温に戻す、又は、冷凍保存しておいた分析チップ１００を室温で解凍する。
【００６２】
ステップＳ１０１の試料の破砕及び懸濁液の生成処理を行う。上述のように、試料を適当な大きさにカットし、破砕袋に入れる。この袋に水を加え、試料を破砕する。それによって試料の懸濁液が生成される。
【００６３】
ステップＳ１０２の試料の採取を行う。図５Ａに示すように、懸濁液の一部を分析チップ１００の試料注入口１１１を介して試料溜め１１０に注入する。試料４０１の量は、約１００μＬである。カバー１１１Ａによって試料注入口１１１を閉じ、試料溜め１１０を密閉する。カバー１１１Ａは、分析チップ１００と同一の材料からなる薄いシートが好ましい。基板とシートが同一の樹脂によって形成されているため、両者は、密着し、容易に、試料溜め１１０を密閉することができる。試料注入口１１１をカバーする処理は、手動で行ってもよいが、分析装置３００に、試料注入口１１１にカバーを覆う機構が備わっているとより好ましい。なお、このときに、全てのポート及びバルブ１１３、１１４は閉じている。
【００６４】
ステップＳ１０３の破砕物質の除去工程を行う。図５Ａに示すように、試料４０１の懸濁液は、液試料溜め１１０内のフィルタ１１２の上側に注入される。図５Ｂに示すように、試料溜め１１０に接続された排気ポート１１６を低圧源に接続し、試料溜め１１０の上流側の加圧ポート１１５を加圧源に接続する。２つのポート１１５、１１６以外の他の全てのポートは閉じられている。加圧ポート１１５から試料溜め１１０に、加圧気体が導入される。それによって、試料４０１は、フィルタ１１２を通過して試料溜め１１０の底部に溜まる。フィルタ１１２によって、細菌の寸法より大きい破砕物質が除去される。例えば、細菌の寸法を20μｍと仮定すると、寸法が20μｍ以上の物質が除去される。
【００６５】
次に、ステップＳ１０４の細菌の培養工程を行う。試料溜め１１０の加圧ポート１１５を閉じる。吸入側バルブ１１３を局所的に加熱し、吸入側バルブ１１３内の充填物質を溶解させる。それによって、図５Ｃに示すように、吸入側バルブ１１３を開通させる。
【００６６】
培養液保管槽１２０に接続された加圧ポート１２１を加圧源に接続し、試料溜め１１０に接続された排気ポート１１６を低圧源に接続する。２つのポート１２１、１１６以外の全てのポートは閉じられている。
【００６７】
加圧ポート１２１からの加圧気体は、培養液保管槽１２０に収容されている１００μＬの培養液を押し出す。加圧空気によって押し出された培養液は、試料溜め１１０に到達する。加圧空気は、排気ポート１１６の低圧源に排出される。培養液は、フィルタ１１２を通過して試料溜め１１０の底部に到達する。そこで、培養液は試料と混合する。
【００６８】
培養液によって試料中の細菌の培養が行われる。培養液は、上述のように、Ｌ-アラニンを1ｍＭ〜１０ｍＭ含有するブイヨンが最適である。培養時間は３０分以上が好ましく、対象細菌により、３〜４時間の培養がより好ましい。培養温度として好ましいのは３５〜４０℃であり、最も好ましいのは３５〜３７℃である。
【００６９】
次に、ステップＳ１０５の細菌の溶解工程を行う。培養液保管槽１２０の加圧ポート１２１を閉じ、第１の酵素保管槽１３０に接続された加圧ポート１３１を加圧源に接続する。試料溜め１１０の排気ポート１１６は低圧源に接続されている。２つのポート１３１、１１６以外の全てのポートは閉じられている。
【００７０】
加圧ポート１３１からの加圧気体は、第１の酵素保管槽１３０に収容されている１００μＬの第１の酵素を押し出す。加圧空気によって押し出されたの第１の酵素は、試料溜め１１０に到達する。加圧空気は、排気ポート１１６の低圧源に排出される。第１の酵素は、フィルタ１１２を通過して試料溜め１１０の底部に到達する。そこで、第１の酵素は試料と混合する。
【００７１】
第１の酵素による酵素処理が行われる。第１の酵素は、上述のように、リゾチーム又はアクロモペプチダーゼが好適である。第１の酵素よって、細菌の外側の部分にある細胞壁が溶解される。酵素処理の時間は１０分以上が望ましい。酵素処理の至適温度は３７℃である。
【００７２】
次に、第１の酵素保管槽１３０の加圧ポート１３１を閉じ、第２の酵素保管槽１４０に接続された加圧ポート１４１を加圧源に接続する。試料溜め１１０の排気ポート１１６は低圧源に接続されている。２つのポート１４１、１１６以外の全てのポートは閉じられている。
【００７３】
加圧ポート１４１からの加圧気体は、第２の酵素保管槽１４０に収容されている２０μＬの第２の酵素を押し出す。加圧空気によって押し出された第２の酵素は、試料溜め１１０に到達する。加圧空気は、排気ポート１１６の低圧源に排出される。第２の酵素は、フィルタ１１２を通過して試料溜め１１０の底部に到達する。そこで、第２の酵素は試料と混合する。
【００７４】
第２の酵素による酵素処理が行われる。第２の酵素は、上述のように、プロテアーゼKが好適である。第２の酵素よって、細菌の細胞壁の内側にある細胞膜が溶解され、細菌の遺伝子が細胞外部に放出される。酵素処理の時間は１０分以上が望ましい。酵素処理の至適温度は３７〜６０℃である。
【００７５】
次に、第２の酵素保管槽１４０の加圧ポート１４１を閉じ、カオトロピック保管槽１５０に接続された加圧ポート１５１を加圧源に接続する。試料溜め１１０の排気ポート１１６は低圧源に接続されている。２つのポート１５１、１１６以外の全てのポートは閉じられている。
【００７６】
加圧ポート１５１からの加圧気体は、カオトロピック保管槽１５０に収容されている８００μＬのカオトロピックイオン液を押し出す。加圧空気によって押し出されたカオトロピックイオン液は、試料溜め１１０に到達する。加圧空気は、排気ポート１１６の低圧源に排出される。カオトロピックイオン液は、フィルタ１１２を通過して試料溜め１１０の底部に到達する。そこで、カオトロピックイオン液は試料と混合する。
【００７７】
カオトロピックイオン液は、上述のように、グアニジン塩酸が好適である。カオトロピックイオンの添加により、細菌の細胞膜はより完全に破壊される。
【００７８】
次に、ステップＳ１０６の遺伝子の捕獲工程を行う。廃液槽２２０に接続された加圧排気ポート２２１を低圧源に接続する。反応槽２３０に接続された加圧排気ポート２３１に背圧を印加する。背圧は、高圧源の圧力より小さく低圧源の圧力より大きい。排出側バルブ１１４を局所的に加熱し、排出側バルブ１１４内の充填物質を溶解させる。それによって、図５Ｄに示すように、排出側バルブ１１４を開通させる。試料溜め１１０の排気ポート１１６を閉じる。カオトロピック保管槽１５０の加圧ポート１５１は高圧源に接続されている。３つのポート２２１、２３１、１５１以外の全てのポートは閉じられている。
【００７９】
加圧ポート１５１からの加圧気体は、試料溜め１１０のフィルタ１１２を経由して、試料溜め１１０の底部に到達する。加圧空気は、試料溜め１１０の底部に溜まっている試料を押し出す。加圧空気は、加圧排気ポート２２１の低圧源に排出される。加圧空気によって押し出された試料は、遺伝子抽出エリア２１０に到達する。
【００８０】
試料中の細菌の遺伝子は、試料中のカオトロピックイオンの働きにより、遺伝子抽出エリア２１０に充填された遺伝子結合担体に結合する。細菌遺伝子と遺伝子結合担体との結合を促進するために、試料が遺伝子抽出エリア２１０を通過する時間は１０分以上が好ましい。
【００８１】
試料を、遺伝子結合担体の微細な流路を１０分以上の時間をかけて移動させるためには、高度な送液制御が必要である。従って、試料を、間欠的に送液してもよい。
【００８２】
遺伝子抽出エリア２１０を通過した試料は廃液槽２２０に貯まる。反応槽２３０の加圧排気ポート２３１には背圧が印加されているから、試料が反応槽２３０に進入することはない。
【００８３】
次に、ステップＳ１０７の遺伝子の洗浄工程を行う。先ず、第１の洗浄液による洗浄を行う。カオトロピック保管槽１５０の加圧ポート１５１を閉じ、第１の洗浄液保管槽１６０に接続された加圧ポート１６１を加圧源に接続する。廃液槽２２０の加圧排気ポート２２１は低圧源に接続され、反応槽２３０の加圧排気ポート２３１には、背圧が印加されている。３つのポート１６１、２２１、２３１以外の全てのポートは閉じられている。
【００８４】
加圧ポート１６１からの加圧気体は、第１の洗浄液保管槽１６０に収容されている２００μＬの第１の洗浄液を押し出す。加圧空気は、加圧排気ポート２２１の低圧源に排出される。加圧空気によって押し出された第１の洗浄液は、遺伝子抽出エリア２１０を通過する。それによって、遺伝子抽出エリア２１０に残留する蛋白質が除去される。第１の洗浄液は、洗浄後、廃液槽２２０に収容される。反応槽２３０の加圧排気ポート２３１には背圧が印加されているから、第１の洗浄液が反応槽２３０に進入することはない。
【００８５】
次に、第２の洗浄液による洗浄を行う。第１の洗浄液保管槽１６０の加圧ポート１６１を閉じ、第２の洗浄液保管槽１７０に接続された加圧ポート１７１を加圧源に接続する。廃液槽２２０の加圧排気ポート２２１は低圧源に接続され、反応槽２３０の加圧排気ポート２３１には、背圧が印加されている。３つのポート１７１、２２１、２３１以外の全てのポートは閉じられている。
【００８６】
加圧ポート１７１からの加圧気体は、第２の洗浄液保管槽１７０に収容されている１５０μＬの第２の洗浄液を押し出す。加圧空気は、加圧排気ポート２２１の低圧源に排出される。加圧空気によって押し出された第２の洗浄液は、遺伝子抽出エリア２１０を通過する。それによって、遺伝子抽出エリア２１０に残留するカオトロピックイオンが除去される。第２の洗浄液は、洗浄後、廃液槽２２０に収容される。反応槽２３０の加圧排気ポート２３１には背圧が印加されているから、第２の洗浄液が反応槽２３０に進入することはない。
【００８７】
最後に、第３の洗浄液による洗浄を行う。第２の洗浄液保管槽１７０の加圧ポート１７１を閉じ、第３の洗浄液保管槽１８０に接続された加圧ポート１８１を加圧源に接続する。廃液槽２２０の加圧排気ポート２２１は低圧源に接続され、反応槽２３０の加圧排気ポート２３１には、背圧が印加されている。３つのポート１８１、２２１、２３１以外の全てのポートは閉じられている。
【００８８】
加圧ポート１８１からの加圧気体は、第３の洗浄液保管槽１８０に収容されている１００μＬの第３の洗浄液を押し出す。加圧空気は、加圧排気ポート２２１の低圧源に排出される。加圧空気によって押し出された第３の洗浄液は、遺伝子抽出エリア２１０を通過する。それによって、遺伝子抽出エリア２１０に残留する第２の洗浄液が除去される。第３の洗浄液は、洗浄後、廃液槽２２０に収容される。反応槽２３０の加圧排気ポート２３１には背圧が印加されているから、第３の洗浄液が反応槽２３０に進入することはない。
【００８９】
次に、ステップＳ１０８の遺伝子の溶離工程を行う。第３の洗浄液保管槽１８０の加圧ポート１８１を閉じ、溶離液保管槽１９０に接続された加圧ポート１９１を加圧源に接続する。反応槽２３０の加圧排気ポート２３１を低圧源に接続し、廃液槽２２０の加圧排気ポート２２１に背圧を印加する。背圧は、高圧源の圧力より小さく低圧源の圧力より大きい。３つのポート１９１、２２１、２３１以外の全てのポートは閉じられている。
【００９０】
加圧ポート１９１からの加圧気体は、溶離液保管槽１９０に収容されている溶離液を押し出す。加圧空気は、加圧排気ポート２３１の低圧源に排出される。加圧空気によって押し出された溶離液は、遺伝子抽出エリア２１０を通過する。それによって、遺伝子結合担体に結合している遺伝子が溶離される。遺伝子は溶離液と共に反応槽２３０に収容される。廃液槽２２０の加圧排気ポート２２１には背圧が印加されているから、溶離液が廃液槽２２０に進入することはない。
【００９１】
ステップＳ１０９の遺伝子の増殖及び検出工程を行う。先ず、試料に第１の遺伝子増幅試薬を添加する。溶離液保管槽１９０の加圧ポート１９１、及び、廃液槽２２０の加圧排気ポート２２１を閉じる。反応槽２３０の加圧排気ポート２３１を低圧源に接続する。第１の遺伝子増幅試薬保管槽２４０に接続された加圧ポート２４１に加圧源を接続する。２つのポート２３１、２４１以外の全てのポートは閉じられている。
【００９２】
加圧ポート２４１からの加圧気体は、第１の遺伝子増幅試薬保管槽２４０に収容されている４０μＬの第１の遺伝子増幅試薬を押し出す。加圧空気は、加圧排気ポート２３１の低圧源に排出される。加圧空気によって押し出された第１の遺伝子増幅試薬は、反応槽２３０に移動する。そこで、第１の遺伝子増幅試薬は遺伝子と混合する。
【００９３】
次に、試料に第２の遺伝子増幅試薬を添加する。第１の遺伝子増幅試薬保管槽２４０の加圧ポート２４１を閉じ、第２の遺伝子増幅試薬保管槽２５０の加圧ポート２５１に加圧源を接続する。反応槽２３０の加圧排気ポート２３１には低圧源が接続されている。２つのポート２３１、２５１以外の全てのポートは閉じられている。
【００９４】
加圧ポート２５１からの加圧気体は、第２の遺伝子増幅試薬保管槽２５０に収容されている２０μＬの第２の遺伝子増幅試薬を押し出す。加圧空気は、加圧排気ポート２３１の低圧源に排出される。加圧空気によって押し出された第２の遺伝子増幅試薬は、反応槽２３０に移動する。そこで、第２の遺伝子増幅試薬は遺伝子と混合する。
【００９５】
反応槽２３０内にて、遺伝子を増幅させ、それを検出するために、反応槽２３０の温度を周期的に変化させる温度サイクルをかける。
【００９６】
温度サイクルの例としては、「90〜95℃10〜30秒」及び「65〜70℃10〜30秒」を交互に３０〜４５回繰り返す方法がある。温度サイクルの好ましい例として、「94℃30秒」及び「68℃30秒」を交互に４５回繰り返す方法がある。
【００９７】
温度サイクルを実行しながら、反応槽２３０に励起光を照射する。遺伝子は、２本鎖の内部にインターカレートした蛍光色素を有すると、吸収した光エネルギーを蛍光色素に移転する。その結果、蛍光色素は励起されて蛍光を発する。試料中の目的遺伝子が増幅すると、蛍光量が増加する。従って、温度サイクルの間、反応槽２３０からの蛍光量を検出することにより、目的遺伝子の有無をリアルタイムにて知ることができる。
【００９８】
なお、分析チップ１００は、分析装置３００にて、立てた状態で、保持されている。従って、温度サイクル中に反応物質の一部が蒸発すると、蒸気が反応槽２３０上部に滞留する。そのため、反応槽２３０の側面は蒸気によって曇ることはない。従って、遺伝子の検出感度が低下することはない。これは、縦型の長所である。
遺伝子の検出が終わると、ステップＳ１１０の分析チップの廃棄を行う。
【００９９】
図７を参照して説明する。上述のように、本例の分析装置では、分析チップは立てた状態で保持される。この場合、試薬保管槽１２０内の試薬４０３が自重で自然に流出しないように、試薬保管槽１２０に接続された流路１２２をＵの字形に形成する。好ましくは、この流路１２２に堰１２３を設ける。これにより、各試薬保管槽の保管される試薬の流出をより確実に防止することができる。
【０１００】
図８及び、図９を参照して分析装置３００を説明する。図８は、分析装置３００の外観を示し、図９は、分析装置３００の内部の構造を示す。分析装置３００は、分析チップ装着系、温度調節系、加圧気体供給系、及び、光学検出系を含む。
【０１０１】
分析チップ装着系を説明する。分析チップ装着系は、前蓋３０１、基板３１０、チップホルダ３２０及びチップストッパ３２２を有する。分析チップ１００を分析装置３００に装着する場合には、前蓋３０１を開け、前蓋３０１に設けられたチップガイドに沿って分析チップ１００を挿入する。分析チップ１００の下端がチップストッパ３２２に当接すると、前蓋３０１を閉じる。分析チップ１００は、立てた状態で、基板３１０とチップホルダ３２０の間に挟まれて保持される。
【０１０２】
基板３１０には複数の管３１２が形成されている。これらの管３１２は、分析チップ１００の加圧ポート、排気ポート、及び、加圧排気ポートに接続される。
【０１０３】
温度調節系を説明する。温度調節系は、基板３１０に設けられた温度調節部３１１と、チップホルダ３２０に設けられたヒータ３２１を有する。温度調節部３１１は、分析チップ１００を所定の温度に保持する。即ち、試料溜め、及び、反応槽を所定の温度にて保持するように機能する。ヒータ３２１は、吸入側バルブ１１３及び排気側バルブ１１４を開通させるために用いる。ヒータ３２１によってバルブを局所的に加熱し、充填物質を溶解させる。
【０１０４】
温度制御機構３１１およびヒータ３２１の構造は、特に限定されるものでないが、印加電流の向きを変えるだけで昇温及び冷却を簡便に行うことができるペルチェがより好適である。
【０１０５】
加圧気体供給系を説明する。加圧気体供給系は、切り替えバルブ３３０、バルブ制御部３３１、加圧ポンプ３４０、及び、ポンプ制御部３４１を有する。基板３１０の管３１２と切り替えバルブの各ポートは管３０２によって接続されている。加圧ポンプ３４０は、液を押し出すための加圧気体を供給する機能さえあれば十分であり、高精度の流量を提供する必要はない。また、加圧ポンプ３４０は、加圧気体又は背圧を供給するだけで、吸引を行わない。従って、加圧ポンプ３４０は、簡素且つ小型であってよい。
【０１０６】
ポンプ制御部３４１からの制御信号によって、ポンプ３４０は高圧源を供給する高圧運転モード、背圧を供給する背圧運転モードにて運転する。バルブ制御部３３１からの制御信号によって、切り替えバルブ３３０の各ポートは、閉鎖されるか、大気に開放されるか、又は、ポンプに接続される。
【０１０７】
分析チップのポートを閉じるには、そのポートに接続されている切り替えバルブ３３０のポートを閉鎖すればよい。分析チップのポートを低圧源に接続するには、そのポートに接続されている切り替えバルブ３３０のポートを大気に開放すればよい。分析チップのポートを高圧源に接続するには、そのポートに接続されている切り替えバルブ３３０のポートを、高圧運転モードにて運転されているポンプに接続すればよい。分析チップのポートを背圧に接続するには、そのポートに接続されている切り替えバルブ３３０のポートを、背圧運転モードにて運転されているポンプに接続すればよい。
【０１０８】
光検出系は、光源３５０、光源制御部３５１、励起フィルタ３５５、ミラー３６０、フィルタ３７５、光検出器３７０、光検出器制御部３７１、及び、光信号変換器３８０を有する。光源３５０は、波長領域の広いキセノンランプがよいが、特定の波長が必要な場合には、発光ダイオードLEDであってもよい。光検出器３７０は、ＣＣＤカメラ、光電子倍増管、フォトダイオード等であってよいが、小型であるフォトダイオードが好ましい。
【０１０９】
光源３５０からの励起光は励起フィルタ３５５を通過することによって、特定の波長領域の励起光が生成される。励起光は、分析チップの反応槽内の遺伝子に照射される。遺伝子は予め蛍光標識されている。遺伝子からの蛍光は、ミラー３６０を反射し、光路を変更して、フィルタ３７５に入射される。フィルタ３７０によって不要な波長成分が除去された蛍光は、光検出器３７０によって検出される。光検出器３７０からの検出信号は、光信号変換器３８０によってデジタル信号に変換される。こうして、分析チップの反応槽内の微生物の量は、ディスプレイ３９０に表示される。
【０１１０】
分析装置３００は更に、前面に設けられたディスプレイ３９０、背面付近に設けられた電源装置３０５、及び、図示しない制御装置を有する。制御装置から、温度調節部３１５、バルブ制御部３３１、ポンプ制御部３４１、光源制御部３５１、及び、光検出器制御部３７１に信号が供給される。
【０１１１】
図１０は、分析装置の基板３１０の例を示す。基板３１０には複数の流路が設けられている。これらの流路は、分析チップのポートの位置に対応して設けられている。基板３１０に予め多数の流路３１２を設けることにより、分析チップ１００の形式が変化しても、分析装置に装着することができる。即ち、分析装置３００は、ポートの位置が異なる多様な分析チップ１００を用いることができる。即ち、多様な分析チップ１００のプラットフォームとなり得る。
【０１１２】
図３に示した分析チップ１００では、１個の反応槽２３０が設けられている。しかしながら、複数の細菌を同時に検出する場合には、複数個の反応槽２３０を設けてもよい。この場合、検出対象の細菌に対応したプライマが必要となる。そのため、第１及び第２の遺伝子増幅試薬保管槽も、それぞれ複数個必要となる。さらに、複数の反応槽に励起光を順次照射する光学系が必要となる。しかしながら、１枚の分析チップ上で複数の細菌を同時に検査できる長所を有する。
【０１１３】
本例の微生物検出システムでは、加圧気体供給系の切り替えバルブ３３０を分析チップ１００の内部ではなく、分析装置３００に設ける。これにより、分析チップ１００には機械部品が含まれない。そのため、小型化、低価格化、及びディスポーザブル化を実現することができる。
【０１１４】
機械部品を含まない分析チップを保持する基板と光検出器を組み合わせるだけで、小型で可搬の分析装置を提供することができる。
【０１１５】
また、微細加工によって、試薬保管槽、反応槽、及び、流路を微細化することができる。それによって、試薬、及び、試料の微量化を達成し、低コスト化が可能となる。更に、温度制御が迅速、混合が迅速、反応が均一といった長所が得られる。
【０１１６】
本例の微生物検出システムでは、分析チップ１００と分析装置３００を組み合わせて使用する。そのため、試料の濾過、細菌培養、細菌の溶解、遺伝子抽出、遺伝子の増殖及び検出を、小型の分析チップ内で且つ自動的に行うことができる。分析チップに試料を注入した後は、全ての処理は、分析装置によって自動的に行われる。従って、誰でも安全に細菌の検出を行うことができる。
【０１１７】
さらにディスポーザブルなチップに予め１検査分のみの試薬を収容し、チップを冷蔵又は冷凍した状態でユーザに提供する。それにより、極めて簡便且つ迅速な遺伝子及び細菌の検出が可能となる。更に、遺伝子を分析した後に、試料を廃棄物としてい試薬と共に処分することができる。
【０１１８】
次に、本発明の分析チップの第２の例を説明する。本例の分析チップは、基本的には、図３を参照して説明した第１の例と同様な構造を有するが、ここでは、異なる点のみを説明する。本例では、分析チップ１００の反応槽２３０の底部に、水晶振動子、表面弾性波素子等の圧電素子を設置する。圧電素子の発振周波数は、その電極上に付着した重さによって変化する。従って、圧電素子の発振周波数の変化を検出することにより、電極に付着した物質の量を検出することができる。圧電素子は、微量な質量変化を反応雰囲気下で連続的に測定できる。
【０１１９】
反応槽２３０の底部に配置された圧電素子に、既知の塩基配列を有するヌクレオチドを固定する。固定方法は次のようにするとよい、先ず、圧電素子の電極上にスパッタリング、蒸着等の方法によって、ガラス薄膜を形成する。ガラスは、電極素材であるクロムやチタンと最も接着性のよいSiO2を主成分としたものが好ましい。このガラス薄膜にアミノプロピルトリメトキシシラン（APS）を添加し、１２０〜１６０℃程度でベークすると、ガラス薄膜の表面にアミノ基が固定される。ここで、電極とガラス薄膜の厚みがそれぞれ0.1〜1μｍであることが好ましい。双方の厚みが1μｍを超えると、圧電素子の周波数応答が悪くなるためである。さらに、アミノ基がコーティングされたガラス薄膜にヌクレオチドを塗布し、恒温恒湿槽内で３７℃、湿度９０％で１時間保温する。その後、UVクロスリンカーを用いて６０mJ/cm2の紫外線を圧電素子に照射することで、ヌクレオチドは圧電素子に強固に固定される。
【０１２０】
ステップＳ１０１の試料の破砕及び懸濁液の生成工程からステップＳ１０８の遺伝子の溶離工程までは、上述の第１の例と同様である。ステップＳ１０９の遺伝子の増殖及び検出工程が、第１の例とは異なる。
【０１２１】
ステップＳ１０９の遺伝子の増殖及び検出工程を簡単に説明する。反応槽２３０に、遺伝子が移送されると、温度制御機構３１３によって反応槽２３０の温度を、９４℃付近まで昇温する。それによって、遺伝子は熱変性して一本鎖となる。この一本鎖遺伝子と反応槽の底部に固定されたヌクレオチドが結合する。それによって、圧電素子の発振周波数が変化する。周波数変化を測定することにより、ヌクレオチドと相補的な遺伝子の配列を読み取ることができる。
【０１２２】
圧電素子の周波数特性は温度によって変化する。反応槽２３０にて圧電素子を使用する場合、液温が１℃変化すると周波数は15〜30Hz変化する。従って、反応槽２３０内の液温の正確な制御が必須となる。しかしながら、本例では、遺伝子増幅試薬が不要となり、また温度サイクルを行う必要がない。そのため、検出時間が短くなる長所がある。
【０１２３】
以上、本発明の例を説明したが、本発明は上述の例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲にて様々な変更が可能であることは当業者にとって容易に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】本発明による細菌検出システムの構成を示す図である。
【図２】本発明の細菌検出システムによる細菌検出の手順を示す図である。
【図３】本発明の分析チップの構成を示す図である。
【図４】本発明の分析チップの試料溜めの断面構成を示す図である。
【図５】本発明の分析チップの試料溜めの動作を説明する図である。
【図６】本発明の分析チップの遺伝子抽出エリアの堰を示す図である。
【図７】本発明の分析チップの試薬保管槽の構成を示す図である。
【図８】本発明の分析装置の外観を示す図である。
【図９】本発明の分析装置の構成を示す図である。
【図１０】本発明の分析装置の基板の構成を示す図である。
【符号の説明】
【０１２５】
１００…分析チップ、１１０…試料溜め、１１１…試料注入口、１１２…フィルタ、１１３、１１４…バルブ、１２０…培養液保管槽（試薬保管槽）、１３０…第１の酵素保管槽（試薬保管槽）、１４０…第２の酵素保管槽（試薬保管槽）、１５０…カオトロピック保管槽（試薬保管槽）、１６０…第１の洗浄液保管槽（試薬保管槽）、１７０…第２の洗浄液保管槽（試薬保管槽）、１８０…第３の洗浄液保管槽（試薬保管槽）、１９０…溶離液保管槽（試薬保管槽）、２１０…遺伝子抽出エリア、２２０…廃液槽、２３０…反応槽、２４０…第１の遺伝子増幅試薬保管槽（試薬保管槽）、２５０…第２の遺伝子増幅試薬保管槽（試薬保管槽）、３００…分析装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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