(57)【要約】【課題】ｃ−ｋｉｔレセプターに対するＳＣＦの結合を阻害し、医薬品又は飲食品に有用なＳＣＦ結合阻害剤の提供。【解決手段】Ｄ−グルタミン酸、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、プロトポルフィリンＩＸ、グリセロリン脂質及び２，３−ジヒドロキシ安息香酸から選ばれる化合物若しくはその塩を有効成分とするＳＣＦ結合阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−グルタミン酸、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、プロトポルフィリンＩＸ、グリセロリン脂質及び２，３−ジヒドロキシ安息香酸から選ばれる化合物若しくはその塩を有効成分とするＳＣＦ結合阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステムセルファクター（Stem cell factor、以下「ＳＣＦ」という）結合阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＣＦは、癌遺伝子ｃ−ｋｉｔに対するリガンドとしてクローニングされ、造血幹細胞の表面に発現しているｃ−ｋｉｔレセプターのリガンドであり、造血細胞の増殖・分化を促す膜結合型の増殖因子として知られている。また、ｃ−ｋｉｔレセプターは肥満細胞の表面にも発現しており（非特許文献１）、該ｃ−kitレセプターにＳＣＦが結合すると、肥満細胞（マスト細胞）の増殖・活性化させることが報告されている（非特許文献２）。
【０００３】
かようなことから、ｃ−ｋｉｔレセプターとＳＣＦとの結合を阻害することにより、ｃ−ｋｉｔの発現する肥満細胞の増殖・分化を抑制することができ、アレルギー症状を予防又は改善できると考えられる。また、アレルギー疾患の予防又は治療剤としては長期間投与しても安全性に優れている医薬品、化粧品及び食品素材等が望まれている。
【０００４】
Ｄ−グルタミン酸は、ヒトの毛穴収縮や不全角化抑制に作用に関与する細胞の受容体のアゴニストやアンタゴニスト作用（特許文献１）又は非ヒト動物に対する行動抑制や殺傷作用（特許文献２）があることが知られている。
【０００５】
Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンは、イソプロテレノールのようなカテコールアミン類の気管支弛緩作用や心刺激作用の増強作用（非特許文献３）、腎毒性の軽減や抗腫瘍効果の増強作用（特許文献３）、一時的な局在性虚血により惹起される再灌流障害の低減作用（特許文献４）、及び癌転移の抑制作用（特許文献５）があることが知られている。
【０００６】
プロトポルフィリンＩＸは、生体内でのヘムやクロロフィル合成代謝経路の中間体として知られており、光増感性を生かし、悪性腫瘍等に対する光化学治療に用いることができること（特許文献６及び７）が知られている。
【０００７】
グリセロリン脂質は、メラニン生成抑制作用（特許文献８及び９）、ＮＧＦ（Nerve growth factor）産生促進活性作用（特許文献１０）及びＴリンパ球増殖反応の低下作用（特許文献１１）、また、焼き菓子や揚げ菓子の食感向上作用（特許文献１２及び１３）があることが知られている。
【０００８】
２，３−ジヒドロキシ安息香酸は、感光の現像剤の添加物（特許文献１４）として利用されており、また当該化合物を含有するウンカリア・トメントーサ樹皮抽出物にアルツハイマー病のアミロイド阻害作用（特許文献１５）があることが知られている。
【０００９】
しかしながら、これらの化合物にＳＣＦ結合阻害作用があることは知られていない。
【特許文献１】特開２００３−３４２１９５号公報
【特許文献２】特開２００６−２８０９７号公報
【特許文献３】特開平６−１９２１０９号公報
【特許文献４】ＷＯ９６／０２２５２パンフレット
【特許文献５】特開平７−６９８７６号公報
【特許文献６】特開２００５−２４６０１３号公報
【特許文献７】特開２００６−５６８０７号公報
【特許文献８】特開２００４−２３１５４４号公報
【特許文献９】特開２０００−８６４２５号公報
【特許文献１０】特開平６−１５７３３８号公報
【特許文献１１】特開２００１−８９３６０号公報
【特許文献１２】特開２０００−２７０７５９号公報
【特許文献１３】特開２０００−２４５３８３号公報
【特許文献１４】特開平６−３３２１５５号公報
【特許文献１５】特表２００２−５０８７５２号公報
【非特許文献１】J.Exp.Med.,183,2681-2686,1996
【非特許文献２】Blood., 87(6):2262-2268. 1996
【非特許文献３】Hirata,F.,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,368,1979
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ｃ−ｋｉｔレセプターに対するＳＣＦの結合を阻害し、アレルギー症状を予防又は改善する医薬品又は飲食品として有用なＳＣＦ結合阻害剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、細胞表面上のｃ−ｋｉｔレセプターに対するＳＣＦの結合を特異的に阻害する成分を探索したところ、枯草菌の代謝物中に存在する特定の物質にｃ−ｋｉｔとＳＣＦとの結合阻害活性があることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、Ｄ−グルタミン酸、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、プロトポルフィリンＩＸ、グリセロリン脂質及び２，３−ジヒドロキシ安息香酸から選ばれる化合物若しくはその塩を有効成分とするＳＣＦ結合阻害剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＳＣＦ結合阻害剤によれば、細胞表面上のｃ−ｋｉｔとＳＣＦとの結合が阻害され、各種アレルギー症状等を予防又は改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のＳＣＦ結合阻害剤とは、細胞表面上のｃ−ｋｉｔレセプターに対するＳＣＦの結合を特異的に阻害し、アレルギー症状の予防又は改善効果等を有するものをいう。
【００１５】
本発明の化合物は、下記に示す、Ｄ−グルタミン酸（化合物１）、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（化合物２）、プロトポルフィリンＩＸ（化合物３）、グリセロリン脂質（化合物４）及び２，３−ジヒドロキシ安息香酸（化合物５）である。
【００１６】
【化１】
2008031096.tif 000002
【００１７】
ここで、一般式（４）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ共に又は独立して高級飽和又は不飽和炭化水素、Ｒ3は、−Ｈ、−ＣＨ2ＣＨ2Ｎ+（ＣＨ3）3、−ＣＨ2ＣＨ2Ｎ+Ｈ3、−ＣＨ2ＣＨ（Ｎ+Ｈ3）ＣＯＯ-、−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2ＯＨを意味する。グリセロリン脂質としては、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、ホスファチジルセリン（セファリン）、ホスファジルイノシトール、ホスファジルグリセロールが挙げられ、好ましくはホスファチジン酸である。
【００１８】
化合物１〜５の塩としては、医薬品若しくは飲食品上許容し得る塩であればよい。例えば、塩基性塩としてリチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩類、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属類、１〜３級アミン類、４級アンモニウム塩類やアルギニン、リジン等のアミノ酸類が挙げられる。また、例えば、酸性塩として、塩酸、ヨウ素酸、硫酸等の鉱酸塩、酢酸、クエン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸塩等が挙げられる。
【００１９】
斯かるＤ−グルタミン酸、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、プロトポルフィリンＩＸ、グリセロリン脂質及び２，３−ジヒドロキシ安息香酸（化合物１〜５）は、市販品を用いてもよく、公知の有機化合物合成法により得てもよい。また、天然物や微生物代謝物、例えば枯草菌代謝物から公知の抽出方法により得てもよい。
【００２０】
具体的には、Ｄ−グルタミン酸は（化合物１）は、グルタミン酸ラセマーゼ発現遺伝子を組み込んだエシェリヒア属菌（特開２００３−３４２１９５号公報）、グルタミン酸ラセマーゼ（Ashiuchi M, Soda K, Misono H. Biosci Biotechnol Biochem. 1999 May;63(5):792-8, Characterization of yrpC gene product of Bacillus subtilis IFO 3336 as glutamate racemase isozym）次いでＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（特開２００１−２５３９８号公報）等を用いて製造することができる。
【００２１】
また、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（化合物２）は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン合成酵素（Yocum RR, Perkins JB, Howitt CL, Pero J. J Bacteriol. 1996 Aug;178(15):4604-4610, Cloning and characterization of the metE gene encoding S-adenosylmethionine synthetase from Bacillus subtilis.）、サッカロマイセス属の食用酵母（特開２００５−２２９８１２号公報）を用いて製造することができる。
【００２２】
また、プロトポルフィリンＩＸ（化合物３）は、動物体内でのヘムやクロロフィル合成代謝経路から得ることやプロトヘムＩＸ合成酵素遺伝子（Hansson M, Hederstedt L. J Bacteriol. 1992 Dec;174(24):8081-8093., Cloning and characterization of the Bacillus subtilis hemEHY gene cluster, which encodes protoheme IX biosynthetic enzymes.）を用いて製造することができる。
【００２３】
また、グリセロリン脂質（化合物４）は、ホスホリパーゼ等の酵素や微生物例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ subtilis and its closest relatives. (ASM press)）を用いて製造することができる（特表２００４−５３２８５７号公報）。
【００２４】
また、２，３−ジヒドロキシ安息香酸（化合物５）は、カテコールのジナトリウム塩から有機合成（特開２００１−３９９１９号公報）を用いて製造することができる。
【００２５】
この際用いられる分離・精製手段としては、例えば、活性炭処理、液液分配、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ゲル濾過、精密蒸留等を挙げることができる。
【００２６】
本発明のＤ−グルタミン酸、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、プロトポルフィリンＩＸ、グリセロリン脂質及び２，３−ジヒドロキシ安息香酸（化合物１〜５）は、後記実施例に示すように、ｃ−ｋｉｔへのＳＣＦの結合阻害活性を有し、例えば肥満細胞上のｃ−Ｋｉｔの活性化によって引き起こされるアレルギー機構の作用を抑制することができると考えられる（Eur J Pharmacol. 2006 Mar 8;533(1-3):327-40. Epub 2006 Feb 17.）。従って、本発明の化合物１〜５は、これを有効成分とするＳＣＦ結合阻害剤として使用することができ、また、ＳＣＦ結合阻害剤を製造するために使用することができる。当該ＳＣＦ結合阻害剤は、アレルギー症状の予防又は改善等の効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品等として使用可能である。また、前記、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品の製造のために使用可能である。例えば、アレルギー症状の予防又は改善等をコンセプトとし、必要に応じてその旨の表示を付した飲食品、例えば、病者用飲食品、特定保健用食品、美容食品等の機能性食品や化粧品として使用可能である。
【００２７】
ここで、アレルギー症状とは、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、アナフィラキシー症候群、蕁麻疹、血管浮腫、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、結節性紅斑、多形性紅斑、皮膚壊死性静脈炎等のアレルギー疾患によって呈される諸症状をいう。
【００２８】
本発明のＳＣＦ結合阻害剤を医薬品として用いる場合の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、外用剤、坐剤、経皮吸収剤等による非経口投与のいずれでもよい。当該医薬製剤を調製するには、本発明の植物又はその抽出物を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００２９】
また、本発明のＳＣＦ結合阻害剤を医薬部外品や化粧料として用いる場合は、皮膚外用剤、洗浄剤、メイクアップ化粧料とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の医薬部外品や化粧料は、本発明の化合物１〜５を単独で、又は医薬部外品、皮膚化粧料及び洗浄料に配合される、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、樹脂、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせることにより調製することができる。尚、薬効成分としては、スプロピオン酸クロベタゾール、吉草酸ジフルコルトロン、酢酸ヒドロコルチゾン等のステロイド剤等が挙げられる。
【００３０】
本発明のＳＣＦ結合阻害剤を食品として用いる場合は、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料、ガム、キャンデー、クッキー、パン、米飯、麺類等あらゆる飲食品の形態とすることができる。このような種々の飲食品は、本発明の化合物１〜５を単独で、又は飲料、食品に配合される酸化防止剤、香料、無機酸類、無機酸塩類、無機塩類、色素類、乳化剤、保存料、調味料、甘味料、酸味料、果汁エキス類、野菜エキス類、花蜜エキス類、乳酸菌、ｐＨ調整剤、品質安定剤等を適宜組み合わせることにより調製することができる。
【００３１】
本発明のＳＣＦ結合阻害剤の化合物１〜５の含有量は、乾燥固形成分として０．１〜２０質量％、特に０．５〜１０質量％とすることが好ましく、化合物１〜５の含有量としては、固形分換算で０．０００１〜１０質量％、特に０．００１〜５質量％含有することが好ましい。
また、本発明のＳＣＦ結合阻害剤の成人１人当たりの１日の投与（摂取）量は、本発明の化合物１〜５（乾燥固形分換算）として、例えば0.001〜1000ｍｇ、特に0.01〜100ｍｇであることが好ましい。
【実施例】
【００３２】
化合物１溶液は、Ｄ−グルタミン酸（シグマ  Ｇ１００１）を蒸留水で１ｍＭとなるように溶解した。化合物２溶液は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（Ｆｌｕｋａ  ０２０９５）を蒸留水で１ｍＭとなるように溶解した。化合物３溶液は、プロトポルフィリンＩＸ（Ｗａｋｏ  ５９９−１０２９１）をＤＭＳＯで１ｍＭとなるように溶解した。化合物４溶液は、グリセロリン脂質（レシチン由来、シグマ  Ｐ９５１１）を蒸留水に０．１％（Ｗ／Ｖ）となるように溶解した。化合物５溶液は、２，３−ジヒドロキシ安息香酸（シグマ（ＡＬＤＲＩＣＨ）  １２６２０９）を蒸留水で１ｍＭとなるように溶解した。
【００３３】
実施例１  ＳＣＦ結合阻害活性
ＰＢＳで２００μｇ／ｍＬに溶解したRecombinant human c-kit (Soluble c-kit ; s-kit（R&D systems社）)を９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルとなるように添加し、４℃で一晩放置した。翌日ウェルをＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＢＳＡ（Bovine Serum Albumin；和光純薬工業株式会社）−ＰＢＳＴ（0.1% Tween20-PBS）をウェルが満杯になるまで添加し、室温で１時間以上放置した。ウェルをＰＢＳＴで２回洗浄後、評価サンプル（各化合物１〜５溶液：終濃度５％（ｖ／ｖ））、終濃度１００ｐＭのＳＣＦ（「Recombinant Human SCF」（Peprotech社））、終濃度０．５％のＢＳＡ、ＰＢＳを加え計１００μＬ／ウェルを添加し、室温で２時間以上振とうさせた。ウェルをＰＢＳＴで５回洗浄した後、終濃度０．５μｇ／ｍＬの抗ＳＣＦ抗体（「Rabbit polyclonal to SCF」（abcam社））、終濃度０．５％のＢＳＡ、ＰＢＳを加え計１００μＬ／ウェルを添加し、室温で２時間以上振とうまたは、４℃で一晩放置した。ウェルをＰＢＳＴで５回洗浄した後、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ECL Anti-rabbit IgG（Amersham Biosciences社））を１００μＬ／ウェル添加し、室温で２時間以上振とうさせた。ウェルをＰＢＳＴで１０回洗浄した後、ＴＭＢ基質液（「TMB Microwell Peroxidase Substrate System」（KPL社））を１００μＬ／ウェル添加し、遮光して室温で１０℃、２０分放置した。さらにＴＭＢ反応停止液（「TMB Stop Solution」（KPL社））を１００μＬ／ウェル添加し反応を停止させ、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定しｓ−ｋｉｔに結合したＳＣＦ量を計測した。
なおコントロールとして、評価サンプルの代わりにその溶媒を同量添加したウェルを作製した。また、ｓ−ｋｉｔを固相化せずに、評価サンプルの代わりにその溶媒を添加したウェルを作製し、この吸光度をブランク（非特異的結合量）とした。得られた吸光度はブランクの値を差し引くことで特異的結合量を求め、コントロールの値を１００とした相対値で表した。
【００３４】
【表１】
2008031096.tif 000003
【００３５】
表１に示したとおり、本発明の化合物１〜５は、ｃ−ｋｉｔに対するＳＣＦの結合阻害活性を有することが認められた。