(57)【要約】【課題】  本発明は、農薬や抗真菌剤など対象とする植物体の外部から与えることが可能な殺生物剤の成分として、新規なβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子、その遺伝子のコードするタンパク質、並びにβ−１，３−グルカナーゼの生産方法を提供することを課題とする。【解決手段】  上記課題の解決のため、本発明は、寒さや病気に強いことが知られているセイヨウシバ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ）に由来する新規なβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子、その遺伝子のコードするタンパク質、並びにβ−１，３−グルカナーゼの生産方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セイヨウシバ由来のβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子に係る配列番号１で示される塩基配列、または該塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる事を特徴とする、β−１，３−グルカナーゼ遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子を組み込んだベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターを含んだ形質転換細胞。
【請求項４】
宿主がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項３に記載の形質転換細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の遺伝子がコードする、セイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼ。
【請求項６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列、または配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項７】
請求項３または請求項４に記載の形質転換細胞を用いた、β−１，３−グルカナーゼの生産方法。
【請求項８】
請求項５または請求項６に記載のタンパク質を有効成分とする殺生物剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、工業用、農業用として有用な酵素であるβ−１，３−グルカナーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼをコードした遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルカナーゼは、グルコースなどの単糖が多数結合した多糖類の一種グルカンの加水分解反応を触媒する酵素である。グルカンにはその構造からβ−１，４−グルカン（セルロース）やβ−１，３−グルカン（酵母、カビ、キノコなどの微生物の細胞壁骨格を構成）など幾つかの種類が知られ、近年のバイオマス利用意識の高まりや抗菌物質としての酵素の働きへの注目から、微生物の持つグルカナーゼをセルロース分解や口腔衛生などに利用する試みがなされている（特許文献１，２）。
【０００３】
またβ−１，３−グルカンは、細菌や菌類などの細胞壁構成成分であることから、β−１，３−グルカナーゼ遺伝子を組み込んだトランスジェニック植物の形での利用が提示されている（特許文献３−９）。これらの試みは、植物とは他種の生物、例えば真菌類などから単離したβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子を植物細胞に導入し、遺伝子組み換え植物体内でβ−１，３−グルカナーゼを発現させることで、病原性微生物への抵抗性を付与しようとするものであった。しかしながら、遺伝子組み換え植物に対する社会的不安感は根強いものがあり、容易に受け入れられるものではなかった。そこで、対象となる生物自体への遺伝子の組み込みなど細胞の形質転換を伴わない、しかもヒトをはじめとする哺乳動物に無害でかつ効果の高い殺生物剤（殺菌・殺虫剤等）の開発が待たれていた。
【特許文献１】特開２００５−２８７４４０  エンド−１，４−βグルカナーゼ
【特許文献２】特開２００６−１３６２８３  α−１，３−グルカナーゼ
【特許文献３】特開平６−１９７６５１  耐病原体性トランスジェニック植物およびその生物を作製するのに用いるＤＮＡトランスファベクターならびにその生物を作製する方法
【特許文献４】特開平８−２８０２８３  菌類耐性植物、該菌類耐性植物の製造方法および該方法で使用する組換えポリヌクレオチド
【特許文献５】特表平９−５０１３２２  キチナーゼ、キチナーゼをコードするＤＮＡおよびそのＤＮＡを含有する植物
【特許文献６】特表２００３−５０４０３０  新規抗真菌剤および殺菌剤、その製造及び使用法
【特許文献７】特開平９−１２１７０５  耐病性ゾイシア属植物
【特許文献８】特開平７−２７４２５２  病害抵抗性イネ科植物およびその作出方法
【特許文献９】特表２００４−５２００４８  真菌耐性トランスジェニック植物
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の現状に鑑み、本発明者らは、いわゆる農薬や抗真菌剤などとして植物の外部から与えることが可能な殺生物剤の検討を行った。本発明者らはまず、殺生物剤として一般に用いられている化学物質ではなく、植物が本来持っている防御機構に着目し、植物自身が生産する酵素そのものを殺生物剤の成分として利用するという観点から研究を進め、これまでにカビなどの細胞壁成分であるキチンを分解する酵素キチナーゼにより、キチン質を有するカビなどの駆除に良好な効果を見いだしている。しかしキチナーゼのみでは効果は十分ではなく、更に効果の高い殺生物剤の開発のためには細菌や害虫の外皮等に含まれるグルカン類が有効であるとの推測から、上述のβ−１，３−グルカナーゼに着目した。本発明者らは種々の植物においてβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子を検討し、その結果寒さや病気に強いセイヨウシバ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ）から得られるβ−１，３−グルカナーゼが、殺生物剤として極めて有効であることを見いだし、本発明を完成した。
従来、セイヨウシバのβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子は全く知られておらず、本発明者らによって初めて解明された新規な遺伝子である。それ故、本発明は、新規なβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子、その遺伝子のコードするタンパク質すなわちβ−１，３−グルカナーゼ、並びに該β−１，３−グルカナーゼの生産方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち本発明の第１の態様は、セイヨウシバ由来のβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子に係る配列番号１で示される塩基配列、または該塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる事を特徴とする、β−１，３−グルカナーゼ遺伝子を提供する。
【０００６】
本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の遺伝子を組み込んだベクターを提供する。
【０００７】
本発明の第３の態様は、第２の態様に記載のベクターを含んだ形質転換細胞を提供する。
【０００８】
本発明の第４の態様は、宿主がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、第３の態様に記載の形質転換細胞を提供する。
【０００９】
本発明の第５の態様は、第１の態様に記載の遺伝子がコードする、セイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼを提供する。
【００１０】
本発明の第６の態様は、配列番号２で示されるアミノ酸配列、または配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質を提供する。
【００１１】
本発明の第７の態様は、第３または第４の態様に記載の形質転換細胞を用いた、β−１，３−グルカナーゼの生産方法を提供する。
【００１２】
本発明の第８の態様は、第５または第６の態様に記載のタンパク質を有効成分とする殺生物剤を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の提供する新規β−１，３−グルカナーゼ遺伝子、その遺伝子を含むベクターやベクターを導入した形質転換細胞、並びに新規β−１，３−グルカナーゼ遺伝子がコードするタンパク質を用いることにより、作物の病原性微生物に対する新規な殺生物剤として利用可能な新規β１，３−グルカン加水分解酵素を製造することが可能となる。本発明が提供するタンパク質は、菌類の細胞壁を特異的に分解可能な酵素であり、これまで用いられてきた化学農薬に替わりうる新たな殺生物剤として利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に本発明を利用するための最良の形態を述べる。本発明の第１の態様は、配列番号１で示される塩基配列、または配列番号１で示される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる事を特徴とする、セイヨウシバ由来のβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子を提供する。本発明は寒さや病害虫に強いことで知られるセイヨウシバ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ）が持つ生体防御機構、特に病原性の菌類などへの抵抗手段として用いられる酵素の一種β−１，３−グルカナーゼに着目し、このタンパク質をコードする遺伝子をクローニングして利用可能としたものである。β−１，３−グルカンは菌類に特徴的な細胞壁構成多糖の一種であり、加水分解によってこれを選択的に切断するβ−１，３−グルカナーゼは他種生物に害を与えることなく、標的とする病原性微生物、例えばうどん粉病菌などを選択的に除去可能な新規殺生物剤の成分として利用可能な酵素である。塩基配列には個体差もあり、配列番号１で示した配列において１または数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されることも考えられるが、これらの場合にあってもコドンの読み枠をずらさない変異（置換）であって、更にアミノ酸配列の置換につながらない変異、あるいはアミノ酸配列が置換されても酵素活性に影響を与えない変異であれば、β−１，３−グルカナーゼをコードする遺伝子としての利用には問題なく、またコドンの読み枠をずらす変異（欠失、付加）であってもそのコードするタンパク質が酵素活性を保持していれば上記同様問題なく利用することが可能である。おおよその目安として、配列番号１の塩基配列と８０％以上の相同性を有する遺伝子であれば、本発明の目的に利用可能である。
【００１５】
本発明の実施の態様としては、上述の遺伝子を適当なベクターに組み込んで、更にこのベクターを宿主となる細胞に導入して形質転換細胞を作成し、この形質転換細胞に遺伝子のコードするタンパク質を発現させて利用することが好ましい。この場合においてベクターとはプラスミドベクターやウィルスベクターなど、遺伝子導入のために分子生物学において用いられているものであれば特にその種類は問わず、何ら本発明を限定するものでは無いが、例えば複製起点と抗生物質耐性遺伝子とインサートチェック（Ｂｌｕｅ／Ｗｈｉｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）のためのＬａｃＺ遺伝子と、インサート切り出しのための複数制限酵素サイトを有したベクターであれば良く、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどはその一例である。また形質転換に用いる細胞も、分子生物学で通常用いられているものであればどの様なものでも良く、特に本発明を限定するものでは無いが、例としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｂｉｓｉａｅ）、昆虫細胞−バキュロウィルス系、メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの系が利用可である。また本発明の遺伝子は、大量発現させて産物そのものを殺生物剤の有効成分として利用しようとするものであるが、勿論植物細胞に導入し、いわゆる遺伝子組み換えによって「病気に強い植物」を作出するためにも利用可能であり、その場合は宿主となる植物の細胞を培養してこれに分子生物学で通常用いられている手法により遺伝子を導入し、導入細胞から植物体を形成させれば良い。
【００１６】
本発明の遺伝子がコードするタンパク質、好適には配列番号２で示したアミノ酸配列、または配列番号２で示したアミノ酸配列と８０％以上の相同性を持つタンパク質も、本発明に含まれるべきものである。遺伝子に変異がある場合と同様に、配列番号２に記載のアミノ酸配列に１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは挿入されたものも、本発明の範囲内である。実質的に酵素活性を保持しているならば、アミノ酸変異の数や場所は問わず、本発明を限定するものではない。上述の形質転換細胞を大量培養し、全タンパク質中から本発明のβ−１，３−グルカナーゼを精製し、これを適切な緩衝液や展着剤などと混合することによって、うどん粉病など病原性微生物に効果のある殺生物剤を製造することも可能となる。タンパク質の精製については、分子生物学で通常用いられている手法の中から適宜選択すれば良く、殺生物剤における緩衝液や展着剤などの補助成分についても目的に合わせて適宜組み合わせれば良く、どちらも本発明を限定するものではない。以下、本発明を実施例により更に詳しく述べるが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
（材料及びグルカナーゼの誘導）  セイヨウシバ（Ｆｉｎｅ  ｂｅｎｔｇｒａｓｓ，学名Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ）からβ−１，３−グルカナーゼの遺伝子を単離するために、細胞培養で得られたカルスを用い、Ｍｏｎｏ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ６（ＭＡＣＯ６）処理によってβ−１，３−グルカナーゼを誘導した。セイヨウシバのカルス０．３ｇに対して０．３％のＭＡＣＯ６溶液を５０μｌ投与し、１２時間ごとにサンプリングしつつ４８時間まで誘導を行った。サンプリング時には液体窒素によりカルスを凍結させ、−８０℃で保存した。各時間におけるサンプルから粗酵素液を抽出してポリアクリルアミドゲルで電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）を行い、グリコール化水溶性カードラン（Ｃｕｒｄｌａｎ）を基質としてβ−１，３−グルカナーゼの活性染色を行ってその酵素活性の強さを確認した。結果を図１に示す。図中各レーンはサンプリング時間（上段の数字）を示し、矢印で示した部分がβ−１，３−グルカナーゼの活性（染色の強さが活性の強さを表す）を示す。３６時間におけるサンプルで最も活性が強かったため、この時点のサンプルから遺伝子クローニングのためＲＮＡを抽出した。
【００１８】
（セイヨウシバカルスからのＲＮＡ抽出）  上述のＭＡＣＯ６誘導後３６時間のサンプル（液体窒素で凍結）を乳鉢で粉砕し、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。以後の操作はこのＲＮＡを鋳型とした。
【００１９】
（３’−ＲＡＣＥによるｃＤＮＡの塩基配列決定）  前述の全ＲＮＡを鋳型とし、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて３’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）を行った。操作の概要を図２に示す。ｍＲＮＡにおけるＰｏｌｙ  Ａ  ｔａｉｌのプライマーとしてＯｌｉｇｏ−ｄＴにアダプター配列を付加したものをプライマーとし、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いて３７℃、６０分インキュベートしてＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した（図２）。図中ＢＲＬはアダプターの配列を示し、黒塗りのバーはｍＲＮＡを、白抜きのバーは合成されたｃＤＮＡをそれぞれ示す。更にこのｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号３で示した５’プライマー（Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙに解読した部分配列から作成）と配列番号４で示すアダプター配列に対応する３’プライマーを用いてＰＣＲ（２．５ｕｎｉｔｓ  ＴＡＫＡＲＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ  ＫＣｌ，０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ，４μＭ  ｅａｃｈ  ｐｒｉｍｅｒ）を行い、３’側の配列を増幅した（図２）。ＰＣＲ産物はＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を用いて精製し、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてサブクローニングを行った上、塩基配列を決定した。
【００２０】
（５’−ＲＡＣＥによるｃＤＮＡの塩基配列決定）  β−１，３−グルカナーゼｍＲＮＡの５’側の塩基配列を明らかにするために、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて５’−ＲＡＣＥを行った。前述の３’−ＲＡＣＥで明らかになった配列を基に逆転写プライマー（配列番号５）を設計して、３’−ＲＡＣＥと同条件でｃＤＮＡを合成した。更に５’−ＲＡＣＥにおいては、反応後にＴｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを用いてＯｌｉｇｏ−ｄＣを付加し、末端標識とした。こうして得られたｃＤＮＡを鋳型として、配列番号６，７で示すプライマー（配列６＝ＢＲＬ配列＋Ｏｌｉｇｏ−ｄＧ，配列７＝３’−ＲＡＣＥの結果から設計）でＰＣＲを行った。３’−ＲＡＣＥと同様、ＰＣＲ産物をクローニングして塩基配列を決定した。概要を図３に示す。図中の記号などは図２と同様である。
【００２１】
（セイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子の全長配列決定）  ３’−ＲＡＣＥ，５’−ＲＡＣＥで明らかになった部分配列から全長配列を決定するために、配列番号８，９（上記で明らかになった配列を基に設計）で示した２つのプライマーを用い、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型にして、信頼性の高いポリメラーゼであるＥｌｏｎｇａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲを行った。模式図を図４に、結果を図５に示す。図中レーンＭは分子量マーカー（φ×１７４  ＨａｅＩＩＩ／λ−ＨｉｎｄＩＩＩ）、レーンＧｌｕはＰＣＲ産物を表し、矢印で示した１４９０ｂｐ付近にシングルバンドが得られた。このＰＣＲ産物を前述の方法でクローニングし、シークエンスを行ってセイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子の全塩基配列を決定した。配列番号１に全塩基配列を、配列番号２に塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。この結果から、セイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子のＯＲＦは１３１４ｂｐ（３３番目のＡＴＧ−１３２８番目のＴＴＡまで）で、４３８個のアミノ酸からなり、分子量３８．５ｋＤａ，ｐＩは６．４４と推定された。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明の提供する新規β−１，３−グルカナーゼ遺伝子及びこの遺伝子がコードするタンパク質は、菌類に対して特異的に作用する殺生物剤の製造を可能にするものであり、農業分野においてこれまでの化学農薬に替わる新たな農薬の有効成分として利用可能である。また本発明の遺伝子は、遺伝子組み換えによって植物に菌類に対する抵抗性を付与するのにも利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＭＡＣＯ６で誘導したセイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼの、活性染色の結果を示す。図中各レーンは誘導開始からの時間（サンプリングした時点）における酵素活性を示し、活性の強さは反応の強さで表されている（矢印部分）。誘導開始から３６時間において、最も強い酵素の活性が見られた。
【図２】セイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子のクローニング過程を模式的に示す。本図は３’−ＲＡＣＥの過程を表し、黒塗りのバーはＲＮＡを、白抜きのバーはｃＤＮＡを示す。ＢＲＬはキット付属のアダプター配列、ＢＲＬ’はアダプター配列に対応するプライマーをそれぞれ表す。
【図３】セイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子のクローニング過程における、５’−ＲＡＣＥの過程を示す。黒塗りのバーはＲＮＡを、白抜きのバーはｃＤＮＡを示す。ＢＲＬはキット付属のアダプター配列、ＢＲＬ’はアダプター配列に対応するプライマーをそれぞれ表す。
【図４】セイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子のクローニング過程における、全長配列のクローニング過程を示す。
【図５】セイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子の全長を、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型にして両端のプライマーで増幅させた結果を示す。レーンＭは分子量マーカーを、レーンＧｌｕはＰＣＲ産物を表し、１４９０ｂｐ付近にシングルバンドが確認された。分子量マーカーはφ×１７４  ＨａｅＩＩＩ／λ−ＨｉｎｄＩＩＩを用いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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