(57)【要約】【課題】リンパ節にどの程度のがん細胞が転移しているかを客観的に判定することのできる方法を提供すること。【解決手段】がん細胞の転移が疑われるリンパ節から調製された検出用試料中の腫瘍マーカーｍＲＮＡを定量する工程、及び前記ｍＲＮＡの定量結果に基づいて前記リンパ節における転移巣の大きさを判定する工程を含むがん転移の判定方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん細胞の転移が疑われるリンパ節から調製された検出用試料中の腫瘍マーカーｍＲＮＡを定量する工程、及び
前記ｍＲＮＡの定量結果に基づいて前記リンパ節における転移巣の大きさを判定する工程を含む、がん転移の判定方法。
【請求項２】
がん細胞の転移が疑われるリンパ節から調製された検出用試料中の腫瘍マーカーｍＲＮＡを定量する工程、及び
前記ｍＲＮＡの定量結果に基づいて前記リンパ節における転移巣の大きさ又は転移巣に含まれるがん細胞数を定量する工程を含む、がん転移の判定方法。
【請求項３】
前記転移巣の大きさ又は転移巣に含まれるがん細胞数を定量する工程において、
前記ｍＲＮＡの定量結果を、前記ｍＲＮＡの定量結果に対応する第１の閾値と比較し、前記ｍＲＮＡの定量結果が前記第１の閾値未満である場合は前記リンパ節ががん転移陰性であると判定し、前記定量結果が前記第１の閾値以上である場合は、前記転移巣を定量する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
がん細胞の転移が疑われるリンパ節から調製された検出用試料中の腫瘍マーカーｍＲＮＡを定量する工程、及び
前記ｍＲＮＡの定量結果を、前記定量結果に対応する第１の閾値及び前記第１の閾値より高値である第２の閾値と比較することにより、前記リンパ節ががん転移陰性、がん転移弱陽性、及びがん転移強陽性の何れであるかを判定する工程を含む、がん転移の判定方法。
【請求項５】
前記ｍＲＮＡの定量結果が、前記検出用試料中の前記ｍＲＮＡの絶対量である、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍マーカーがサイトケラチン１９である、請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
前記第１の閾値が５０〜３０００コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅに設定される、請求項３又は４記載の方法。
【請求項８】
前記第１の閾値が２００〜３００コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅに設定される、請求項３又は４記載の方法。
【請求項９】
前記第２の閾値が２０００〜２００００コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅに設定される、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
がん細胞の転移が疑われるリンパ節から調製された検出用試料中の腫瘍マーカーｍＲＮＡを定量する定量手段、及び
前記ｍＲＮＡの定量結果を、前記定量結果に対応する第１の閾値及び前記第１の閾値より高値である第２の閾値と比較することにより、前記リンパ節ががん転移陰性、がん転移弱陽性、及びがん転移強陽性の何れであるかを判定する判定手段を含む、がん転移の判定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ節に含まれるがん転移を判定する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、リンパ節組織にどの程度がんが転移しているかを判定するため、組織診が一般的に行われる。組織診では、リンパ節組織を薄くスライスして切片を作製し、がん細胞に特異的に結合する標識抗体を用いて切片中のがん細胞を染色し、これを検鏡することによりがん転移の程度が測定される。しかしながら、検査には熟練を要するために検査者の技能に依るところが大きく、客観的な判定結果を得難い。
【０００３】
がん細胞のリンパ節転移を判定する方法として、例えば特許文献１記載の方法が知られている。特許文献１には、肺腺癌のリンパ節転移を診断する方法について記載されており、具体的には、リンパ節転移のある患者の肺の組織片と、リンパ節転移のない患者の肺の組織片を試料とし、様々な分子の発現量を測定することによって転移診断マーカーとして有用な分子を同定している。また、この分子を用いることにより、肺腺癌患者における肺がんのリンパ節転移を診断することが可能であるとの開示がある。しかしながら、この技術では、どの程度リンパ節にがんが転移しているかを判定することはできない。
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−５３１１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、リンパ節にどの程度のがん細胞が転移しているかを客観的に判定することのできる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、がん細胞の転移が疑われるリンパ節から調製された検出用試料中の腫瘍マーカーｍＲＮＡを定量する工程、及び前記ｍＲＮＡの定量結果に基づいて前記リンパ節における転移巣の大きさを判定する工程を含むがん転移の判定方法を提供する。
【０００７】
また、本発明は、がん細胞の転移が疑われるリンパ節から調製された検出用試料中の腫瘍マーカーｍＲＮＡを定量する定量手段、及び前記ｍＲＮＡの定量結果を、前記定量結果に対応する第１の閾値及び前記第１の閾値より高値である第２の閾値と比較することにより、前記リンパ節ががん転移陰性、がん転移弱陽性、及びがん転移強陽性の何れであるかを判定する判定手段を含む、がん転移の判定装置を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、リンパ節にどの程度がん細胞が転移しているかを判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の一実施形態は、生体から採取されたリンパ節に含まれるがん転移を判定する方法である。この方法によると、リンパ節におけるがんの転移巣（以下、単に転移巣ともいう）の大きさを判定することができる。例えば、転移巣の定量的な測定や、陰性、弱陽性、強陽性などの転移巣の大きさに基づいた段階的な転移巣の測定を行うことができる。なお、転移巣の定量的な測定とは、リンパ節から組織切片を作製した際に観察される転移巣の長径や面積、この長径から算出される転移巣の体積、転移巣の質量、転移巣に含まれるがん細胞の数などを定量的に測定することである。
【００１０】
本明細書におけるがんとは、悪性化した腫瘍のことであり、悪性腫瘍と同義である。がんには、癌腫、肉腫、造血器由来のがんなどが含まれる。癌腫としては、乳がん、胃がん、大腸がん、前立腺がん、子宮頸部がん、子宮体部がんなどの上皮細胞由来のがんが例示される。肉腫としては、骨肉腫、軟部肉腫などが例示される。造血器由来のがんとしては、白血病や悪性リンパ腫などが例示される。
【００１１】
転移巣の測定するため、先ずリンパ節に含まれる腫瘍マーカーｍＲＮＡ（以下、単にｍＲＮＡともいう）を定量する。腫瘍マーカーｍＲＮＡとは、腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡのことである。腫瘍マーカー遺伝子とは、上述したようにがん細胞における発現量と正常細胞における発現量が有意に異なる遺伝子を指す。腫瘍マーカー遺伝子の例としては、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＣＫ２０などのＣＫ (サイトケラチン)、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＭＵＣ１、ＭＭＧ (マンマグロビン)、ＰＳＡ（前立腺特異抗原：Prostate specific antigen）、ＣＡ１５−３、ＥｐＣＡＭ（Epithelial cellular adhesion molecule）等をコードする遺伝子が挙げられる。
【００１２】
ｍＲＮＡの定量に際しては、上記のリンパ節から検出用試料を調製し、この検出用試料に含まれるｍＲＮＡを定量することが好ましい。例えばリンパ節と緩衝液とを混合し、緩衝液中の細胞に対して化学的及び／又は物理的処理を行うことによって細胞中のＲＮＡを液中に移行（可溶化）させ、このＲＮＡを含む溶液を検出用試料とすることができる。
【００１３】
ＲＮＡの分解を抑制するために緩衝液は強酸性であることが好ましい。ｐＨの好ましい範囲は２．５〜５．０であり、より好ましくは３．０〜４．０である。ｐＨをこの範囲に保つために、公知の緩衝剤を用いることができる。
【００１４】
また、緩衝液には界面活性剤を含有させることが好ましい。界面活性剤によって細胞膜や核膜が損傷するため、この損傷を通して細胞中の核酸が溶液中に移行しやすくなる。このような作用を有するものであれば界面活性剤の種類は特に限定されないが、非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤がよりこのましい。特に、次のような一般式：
Ｒ１−Ｒ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ
（ここで、Ｒ１は炭素数１０〜２２のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、イソオクチル基；Ｒ２は−Ｏ−又は−（Ｃ６Ｈ６）−Ｏ−；ｎは８〜１２０の整数）
で表されるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が好適であり、例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテルなどが挙げられる。具体的には、Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル)などが好適である。緩衝液中の界面活性剤の濃度は０．１〜６％（ｖ／ｖ）が好ましく、より好ましくは１〜５％（ｖ／ｖ）である。
【００１５】
また、ｍＲＮＡの定量を後述の核酸増幅により行う場合は、緩衝液にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有させることが好ましい。リンパ節には、核酸増幅における酵素反応を阻害する物質（阻害物質）が含まれていることがあるが、ＤＭＳＯの作用によってこの阻害物質の影響を効果的に低減することができる。また、ＤＭＳＯには核酸増幅酵素の活性の低下を抑制する効果もある。処理液中のＤＭＳＯの濃度としては、１〜５０％（ｖ／ｖ）が好ましく、５〜３０％（ｖ／ｖ）がより好ましく、１０〜２５％（ｖ／ｖ）が最も好ましい。
【００１６】
検出用試料調製の際には、リンパ節に対してホモジナイズ等の物理的処理を施すことが好ましい。これにより、リンパ節の細胞の細胞膜や核膜が物理的に破砕され、細胞内の核酸が溶液中に移行しやすくなる。ホモジナイズは、ペッスルなどによって手動で行われてもよいし、市販の電動ホモジナイザを用いて行われてもよい。得られたホモジネートを数秒〜数分間遠心分離することによってホモジネート中に浮遊していた細胞の破片等を沈殿させることができる。これにより、ＲＮＡ等を含む上清（ライセート）を検出用試料とすることができる。
【００１７】
ｍＲＮＡの定量は、核酸増幅やＤＮＡチップ等を用いて公知の方法により行うことができる。核酸増幅法を用いる場合は、核酸増幅反応の前に逆転写反応を含むＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription PCR）法やＲＴ−ＬＡＭＰ(Reverse Transcription LAMP：LAMP法については米国特許６４１０２７８号公報参照)法などが好適に用いられる。特に、定量的核酸増幅法としては、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法やＴａｑＭａｎ（ロシュダイアグノスティクス社の登録商標）法（Linda G. Lee, 1993, Nucleic Acids Research, vol.21, p3761-3766等参照）などの公知の方法を用いることができる。
【００１８】
ｍＲＮＡの定量に用いることのできるＤＮＡチップとしては、上記の腫瘍マーカー遺伝子のｃＤＮＡとハイブリダイズ可能なＤＮＡのポリヌクレオチド及び／又はその断片を固定化した基盤を用いることができる。ＤＮＡチップを用いたＲＮＡの検出は、一般的に用いられる公知の方法により行うことができる。例えば、以下のようにして行うことができる。先ず、検出用試料中のｍＲＮＡの３’末端に存在するポリＡ配列を利用して逆転写反応を行う。逆転写反応の際に例えばＣｙ３やＣｙ５などの蛍光物質で標識されたヌクレオチドを用いることにより、蛍光標識されたｃＤＮＡが合成される。これを上記のポリヌクレオチドを固定化した基盤と接触させると、このポリヌクレオチドと標識されたｃＤＮＡとが二本鎖を形成する。二本鎖を形成させた後、ｃＤＮＡの蛍光を測定することにより、ｍＲＮＡを定量することができる。
【００１９】
上述の方法によって測定されたｍＲＮＡの定量結果は、単位体積当たりのｍＲＮＡの物質量、ｍＲＮＡ質量、コピー数などであってもよいし、反応液の蛍光強度、濁度、透過光強度などが所定の値となるまでの時間、サイクル数（ＰＣＲを用いた場合）などであってもよい。
【００２０】
通常は、腫瘍マーカーｍＲＮＡの定量と共に、どのような細胞でも一定量恒常的に発現していると考えられている遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子等：以下、標準化遺伝子とする）のｍＲＮＡを定量し、腫瘍マーカーｍＲＮＡの定量値を標準化遺伝子等のｍＲＮＡの定量値で除する（標準化する）ことにより、標準化遺伝子のｍＲＮＡ当たりの腫瘍マーカーｍＲＮＡ発現量に換算することが行われる（例えば、M. Inokuchi et al., British Journal of Cancer (2003) 89, 1750-1756参照）。しかしながら、リンパ節にがん細胞だけでなく正常なリンパ節細胞も多く含まれる場合は、測定結果が正常細胞の数により左右されるため正確にがん病巣の測定を行えないことがある。従って、本実施形態では腫瘍マーカーｍＲＮＡ定量値に対して標準化を行わず、定量値（絶対量）をそのままがん病巣の測定に用いることが好ましい。
【００２１】
ｍＲＮＡの定量結果は転移巣の大きさや転移巣に含まれるがん細胞数に相関しているため、上記したようにｍＲＮＡの定量結果に基づいてリンパ節における転移巣の定量的な測定や段階的な測定を行うことができる。段階的な測定を行う場合は、ｍＲＮＡの定量結果と、複数の閾値とが比較される。この場合、少なくとも１つ（第１の閾値）は、がん陰性およびがん陽性を識別可能に設定されることが好ましい。これらの閾値は、がんや腫瘍マーカーの種類に応じて適宜設定される。また、転移巣を定量的に測定する場合でも、この第１の閾値を用いて陰性と陽性とを識別し、転移陽性のものに関してがん病巣の定量的測定を行うことが好ましい。
【００２２】
第１の閾値は、がん細胞の存在が確認されたリンパ節(陽性検体)に含まれるｍＲＮＡの定量値以下であって、がん細胞が存在しないことが確認されたリンパ節(陰性検体)に含まれるｍＮＲＡの定量値よりも高い値に設定することができる。複数の陽性検体のｍＲＮＡ定量値と複数の陰性検体のｍＲＮＡ定量値とを予め測定し、最も高確率に陽性検体と陰性検体とを区別できる値を閾値として設定することが好ましい。
【００２３】
上記のような段階的な情報を得る場合は、第１の閾値の他にさらに第２の閾値が用いられる。即ち、上記第１の閾値と、弱陽性と強陽性とを識別可能な第２の閾値とを用いることにより、ｍＲＮＡの定量結果が第１の閾値未満であった場合は実質的にがん病巣が存在しない（即ち、がん陰性）と判定し、ｍＲＮＡの定量結果が第１の閾値以上第２の閾値未満であった場合はサイズの比較的小さいがん病巣が存在する（がん弱陽性）と判定し、ｍＲＮＡの定量結果が第２の閾値以上であった場合はサイズの比較的大きいがん病巣が存在する（がん強陽性）と判定することができる。
【００２４】
リンパ節における転移巣は、大きさに基づいてマイクロメタスタシス（微小転移）とマクロメタスタシスに分類される。リンパ節組織から作製した組織切片において、転移巣が確認され、且つ転移巣が長径２ｍｍ未満の転移はマイクロメタスタシス（Micro metastasis：微小転移）と呼ばれ、転移巣が長径２ｍｍ以上の転移はマクロメタスタシス（Macro metastasis）と呼ばれる。上記の第２の閾値は、マイクロメタスタシスとマクロメタスタシスとを識別可能な値に設定することができる。また、第２の閾値以外にも転移巣の大きさに応じて複数の閾値を設定してもよい。
【００２５】
がん病巣の定量的な情報を取得する場合、ｍＲＮＡの発現量からリンパ節中のがん細胞の数やがん病巣のサイズ（面積、体積、質量等）を測定することができる。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、上述の方法を実施するためのがん病巣の測定装置である。この装置を用いると、リンパ節における転移巣の大きさを段階的に測定することが可能である。以下、図面に基づき、この装置について説明する。
【００２７】
図１は、本発明の一実施形態による装置１の全体構成を示した斜視図である。この装置１は、核酸定量部１０１と、核酸定量部１０１と有線通信ができるように接続されたパーソナルコンピュータ(ＰＣ)１０２とにより構成される。パーソナルコンピュータ１０２は、図１に示すように、キーボードからなる入力部１０２ａと、モニタからなる表示部１０２ｃと、測定結果を分析する制御部１０２ｄとを含む。
【００２８】
以下、図２及び図３を用いて、装置１の核酸定量部１０１について説明する。図２は、核酸定量部１０１の全体構成を示した斜視図である。図３は、図２の核酸定量部１０１の概略平面図である。
【００２９】
核酸定量部１０１は、図２に示すように分注機構部１０と、試料セット部２０と、チップセット部３０と、チップ廃棄部４０と、５つの反応検出ブロック５０ａからなる反応検出部５０と、分注機構部１０をＸ軸方向及びＹ軸方向に移送するための移送部６０とを含んでいる。
【００３０】
また、分注機構部１０は、図２に示すように、移送部６０によりＸ軸方向及びＹ軸方向（水平方向）に移動されるアーム部１１と、アーム部１１に対してそれぞれ独立してＺ軸方向（垂直方向）に移動可能な２連（２本）のシリンジ部１２とを含んでいる。
【００３１】
また、図２及び図３に示すように、試料セット部２０には、装置の手前から順番に、１０個の試料容器セット孔２１ａ〜２１ｊと、１つの酵素試薬容器セット孔２１ｋ及び１つのプライマ試薬容器セット孔２１ｌとが設けられている。また、１０個の試料容器セット孔２１ａ〜２１ｊは、５行２列に配列するように設けられている。そして、試料容器セット孔２１ｃ及び２１ｄと、試料容器セット孔２１ｅ及び２１ｆと、試料容器セット孔２１ｇ及び２１ｈと、試料容器セット孔２１ｉ及び２１ｊとは、それぞれ、装置の奥側から順に、試料セット位置１、試料セット位置２、試料セット位置３及び試料セット位置４に設けられている。
【００３２】
また、本実施形態では、正面左側の試料容器セット孔２１ｃ、２１ｅ、２１ｇ及び２１ｉには、予め切除生体組織を上述の処理（ホモジナイズ、ろ過など）を施して調製されたライセート（検出用試料）が収容された試料容器２２がセットされるとともに、正面右側の試料容器セット孔２１ｄ、２１ｆ、２１ｈ及び２１ｊには、上記した試料を１０倍に希釈した希釈試料が収容された試料容器２３がセットされる。
【００３３】
また、試料容器セット孔２１ａには、増幅するべき核酸が正常に増幅することを確認するための陽性コントロール（ＩｎＣｔ）が収容された容器２４が載置されるとともに、試料容器セット孔２１ｂには、増幅するべきでない核酸が正常に増幅しないことを確認するための陰性コントロールを収容した容器２５がセットされる。
【００３４】
また、酵素試薬容器セット孔２１ｋ及びプライマ試薬容器セット孔２１ｌには、それぞれ、ＣＫ１９のｍＲＮＡ（腫瘍マーカーｍＲＮＡ：以下、ＣＫ１９ｍＲＮＡともいう）に対応するｃＤＮＡ（以下、ＣＫ１９ｃＤＮＡともいう）を増幅するための核酸増幅酵素試薬が収容された酵素試薬容器２６と、ＣＫ１９ｃＤＮＡにハイブリダイズ可能なプライマを含む試薬（以下、プライマ試薬とする）が収容されたプライマ試薬容器２７とがセットされている。
【００３５】
また、反応検出部５０の各反応検出ブロック５０ａは、図２及び図３に示すように、反応部５１と、２つの濁度検出部５２と、蓋閉機構部５３（図３参照）とから構成されている。各反応検出ブロック５０ａに設けられる反応部５１には、図３に示すように、検出セル５４をセットするための２つの検出セルセット孔５１ａが設けられている。各反応検出ブロック５０ａは、装置の奥側から順に、セルセット位置１、セルセット位置２、セルセット位置３、セルセット位置４及びセルセット位置５に配置されている。
【００３６】
また、濁度検出部５２は、反応部５１の一方の側面側に配置された基板５５ａに取り付けられた４６５ｎｍの波長を有する青色ＬＥＤからなるＬＥＤ光源部５２ａと、反応部５１の他方の側面側に配置された基板５５ｂに取り付けられたフォトダイオード受光部５２ｂとによって構成されている。各反応検出ブロック５０ａには、１つのＬＥＤ光源部５２ａと１つのフォトダイオード受光部５２ｂとからなる１組の濁度検出部５２が２組ずつ配置されている。
【００３７】
また、検出セル５４は、試料を収容するため２つのセル部５４ａと、２つのセル部５４ａを塞ぐ２つの蓋部５４ｂとを有している。
【００３８】
また、移送部６０は、図２に示すように、分注機構部１０をＹ軸方向に移送するための直動ガイド６１及びボールネジ６２と、ボールネジ６２を駆動するためのステッピングモータ６３と、分注機構部１０をＸ軸方向に移送するための直動ガイド６４及びボールネジ６５と、ボールネジ６５を駆動するためのステッピングモータ６６とを含んでいる。なお、分注機構部１０のＸ軸方向及びＹ軸方向への移送は、ステッピングモータ６３及び６６により、それぞれ、ボールネジ６２及び６５を回転させることにより行う。
【００３９】
次に、図１〜図３を参照して、本実施形態による核酸定量部１０１の動作について説明する。この実施形態では、上記したように、手術によって切除されたリンパ節組織中のＣＫ１９ｍＲＮＡ（腫瘍マーカー）に対応するｃＤＮＡをＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いて増幅させ、増幅に伴い発生するピロリン酸マグネシウムの白濁による濁度の変化を測定する。濁度が所定の値に達するまでの時間（増幅立ち上がり時間）に基づいて、ＣＫ１９ｍＲＮＡの量（コピー数／μＬ・ｌｙｓａｔｅ）を測定し、これを閾値と比較する。
【００４０】
まず、図２及び図３に示すように、予め切除組織を処理（ホモジナイズ、ろ過など）して作製された検出用試料が収容された試料容器２２を試料容器セット孔２１ｃ〜２１ｊにセットする。また、陽性コントロールが収容された容器２４及び陰性コントロールが収容された容器２５を、それぞれ、試料容器セット孔２１ａ及び２１ｂ（図３参照）にセットする。また、酵素試薬容器セット孔２１ｋ（図３参照）及びプライマ試薬容器セット孔２１ｌに、それぞれ、ＣＫ１９ｃＤＮＡの増幅のための核酸増幅酵素試薬が収容された酵素試薬容器２６と、ＣＫ１９ｃＤＮＡの増幅のためのプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器２７とをセットする。また、チップセット部３０に、それぞれ３６本の使い捨て用のピペットチップ３１が収納された２つのラック３２を設置する。
【００４１】
核酸定量部１０１の動作がスタートすると、まず、図２に示した移送部６０により分注機構部１０のアーム部１１が初期位置からチップセット部３０に移動された後、チップセット部３０において、分注機構部１０の２つのシリンジ部１２が下方向に移動される。これにより、２つのシリンジ部１２のノズル部の先端が２つのピペットチップ３１の上部開口部内に圧入されるので、２つのシリンジ部１２のノズル部の先端にピペットチップ３１が自動的に装着される。そして、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、プライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器２７の上方に向かってＸ軸方向に移動される。そして、プライマ試薬容器２７の上方に位置する一方のシリンジ部１２が下方向に移動されてプライマ試薬が吸引された後、その一方のシリンジ部１２が上方向に移動される。その後、他方のシリンジ部１２が同じプライマ試薬容器２７の上方に位置するように、移送部６０により分注機構部１０のアーム部１１がＹ軸方向に移動される。そして、他方のシリンジ部１２が下方向に移動されて同じプライマ試薬容器２７からプライマ試薬が吸引された後、その他方のシリンジ部１２が上方向に移動される。このようにして、シリンジ部１２に装着される２つのピペットチップ３１によりプライマ試薬容器２７内のプライマ試薬が吸引される。
【００４２】
プライマ試薬の吸引後、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、移送部６０により最も奥側（装置正面奥側）であるセルセット位置１に位置する反応検出ブロック５０ａの上方に移動される。そして、最も奥側の反応検出ブロック５０ａにおいて、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、２つのシリンジ部１２に装着された２つのピペットチップ３１が、それぞれ、検出セル５４の２つのセル部５４ａ内に挿入される。そして、シリンジ部１２を用いて、プライマ試薬がそれぞれ２つのセル部５４ａに吐出される。
【００４３】
プライマ試薬の吐出後、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、移送部６０によりチップ廃棄部４０の上方に向かってＸ軸方向に移動される。そして、チップ廃棄部４０において、ピペットチップ３１の廃棄が行われる。具体的には、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、チップ廃棄部４０の２つのチップ廃棄孔４０ａ（図３参照）内にピペットチップ３１が挿入される。この状態で、分注機構部１０のアーム部１１が移送部６０によりＹ軸方向に移動されることにより、ピペットチップ３１が溝部４０ｂの下に移動される。そして、２つのシリンジ部１２が上方向に移動されることにより、ピペットチップ３１の上面のつば部は、溝部４０ｂの両側の下面に当接してその下面から下方向の力を受けるので、ピペットチップ３１が２つのシリンジ部１２のノズル部から自動的に脱離される。これにより、ピペットチップ３１がチップ廃棄部４０に廃棄される。
【００４４】
次に、同様の動作により、酵素試薬容器２６から酵素試薬が上記のセル部５４ａに吐出され、さらに同様の動作により、試料容器２２及び試料容器２３から試料が上記のセル部５４ａに吐出される。
【００４５】
そして、上記のセル部５４ａ内へのプライマ試薬、酵素試薬、試料の吐出が行われた後、検出セル５４の蓋部５４ｂの蓋閉め動作が行われる。この蓋閉め動作が完了した後、検出セル５４内の液温を約２０℃から約６５℃に加温することにより、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応によりＣＫ１９ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを増幅する。そして、増幅に伴い生成されるピロリン酸マグネシウムによる白濁を比濁法により検出する。具体的には、図３に示したＬＥＤ光源部５２ａ及びフォトダイオード受光部５２ｂを用いて、増幅反応時の検出セル５４内の濁度を検出（モニタリング）することによって、濁度の検出を行う。
【００４６】
試料の濁度データは、核酸定量部１０１からパーソナルコンピュータ１０２の制御部１０２ｄへリアルタイムに送信される。
【００４７】
図４は、制御部１０２ｄの構成を示すブロック図である。この制御部１０２ｄは、ＣＰＵ６ａと、ＲＯＭ６ｂと、ＲＡＭ６ｃと、ハードディスク６ｄと、入出力インタフェース６eと、画像出力インタフェース６ｆと、通信インタフェース６ｇとから主として構成されており、ＣＰＵ６a、ＲＯＭ６ｂ、ＲＡＭ６ｃ、ハードディスク６ｄ、入出力インタフェース６e、画像出力インタフェース６ｆ、および通信インタフェース６ｇは、バス６ｈによってデータ通信可能に接続されている。
【００４８】
ＣＰＵ６ａは、ＲＯＭ６ｂ及びハードディスク６ｄに記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ６ｃに読み出されたコンピュータプログラムを実行することが可能である。
【００４９】
ＲＯＭ６ｂは、ＣＰＵ６aに実行させるためのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータ等を記憶している。
【００５０】
ＲＡＭ６ｃは、ＲＯＭ６ｂ及びハードディスク６ｄに記憶されているコンピュータプログラムの読み出し、及びコンピュータプログラムを実行するときのＣＰＵ６aの作業領域に用いられる。
【００５１】
ハードディスク６ｄは、ＣＰＵ６aに実行させるためのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータを記憶している。このコンピュータプログラムは、核酸定量部１０１より送信された濁度情報を分析し、分析結果を出力するための機能を果たす。
【００５２】
入出力インタフェース６eには、キーボードからなる入力部１０２ａが接続されている。入力部１０２ａは、出力画面上における操作等のために設けられている。画像出力インタフェース６ｆは、表示部１０２ｃに接続されている。表示部１０２ｃは、核酸定量部１０１から送信されてくる濁度をリアルタイムで表示したり、分析結果を出力する等のために設けられている。通信インタフェース６ｇは核酸定量部１０１に接続されており、濁度情報を受信するための機能を果たす。
【００５３】
次に、図５に基づき、制御部１０２ｄによる処理フローについて説明する。制御部１０２ｄは、核酸定量部１０１から濁度データをリアルタイムで受信する（ステップＳ１）。反応液の濁度が所定の値に達した時間から、ｍＲＮＡのコピー数（コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅ）を算出し（ステップＳ２）、これを予め決められた閾値（第１の閾値及び第２の閾値）と比較することにより、がん病巣のサイズ判定を行う（ステップＳ３）。具体的には、ｍＲＮＡコピー数が２５０コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅ（第１の閾値）未満である場合は、がん陰性であると判定し、２５０コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅ（第１の閾値）以上５０００コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅ（第２の閾値）未満である場合は、がん弱陽性（＋）であると判定し、１００００コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅ（第２の閾値）以上である場合はがん強陽性（＋＋）と判定する。次に、制御部１０２ｄは、これらの判定結果をパーソナルコンピュータ１０２の表示部１０２ｃに出力し（ステップＳ４）、表示させる。
【００５４】
なお、「コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅ」とは、直径約６ｍｍのリンパ節組織、緩衝液(ｐＨ３．４：２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、５％  Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル、シグマ社製)及び２０％  ＤＭＳＯ(和光純薬)を含む）４ｍＬ中で可溶化させ、さらにこれを１０倍希釈することにより得られるライセート１μＬ中のｍＲＮＡコピー数を示す。
【００５５】
上記の実施形態において第１の閾値は５０〜３０００コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅの間で設定することが好ましく、より好ましくは１００〜１０００コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅ、さらに好ましくは２００〜３００コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅの間で設定される。また、第２の閾値は、２０００〜２００００コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅの間で設定することが好ましく、さらに好ましくは、４０００〜１００００コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅの間で設定される。
【００５６】
次に、図６に基づき、表示部１０２ｃにおける判定結果の表示画面の一例について説明する。欄２００には、ＣＫ１９ｍＲＮＡの増幅立ち上がり時間が表示され、欄２０５には、陽性コントロールの増幅立ち上がり時間が表示される。これに基づいてＣＰＵ６ａによって算出されたＣＫ１９ｍＲＮＡ発現量（コピー／μＬ）は、欄２０１に表示される。この発現量を第１の閾値及び第２の閾値と比較することによって得られた転移巣のサイズに関する情報は欄２０２に表示される。図６では、＋＋、即ちがん強陽性であることが示されている。また、ＣＫ１９ｍＲＮＡの増幅を行った反応液の濁度のリアルタイム曲線は欄２０３に、陽性コントロールの増幅を行った反応液の濁度のリアルタイム曲線は欄２０５に表示される。
【００５７】
なお、上記実施形態の装置は、リンパ節中の転移巣サイズの段階的な測定を行ったが、上述のように、転移巣の面積や、転移巣に含まれる細胞数など、転移巣の定量的な測定を行ってもよい。
【００５８】
（実施例１）
（１）免疫組織化学染色
乳がん患者から切除したリンパ節組織１１個と、大腸がん患者から切除したリンパ節７個を用いて、免疫組織化学染色による転移巣サイズの測定を行った。
【００５９】
これらのリンパ節(約５０〜６００ｍｇ／個)の中央部の付近で厚さ約１０μｍの切片（以下、セクションともいう）を切り出し、スライドガラスに載置した。この切片に対して、抗ＣＫ１９抗体及びEnvision Kit（何れもＤＡＫＯ社）を用いてがん細胞の染色を行った。GS-710 Calibrated Densitometer（バイオラッド社）を用いてこの切片のがん細胞の転移巣サイズの測定を行った。転移巣の測定結果（ｍｍ２）を下記表１に示す。
【００６０】
（２）ＣＫ１９ｍＲＮＡ定量
上記で切り取った切片に隣接する切片（厚さ約１０μｍ）を切り取り、RNeasy Mini Kit（キアゲン社）を用いてＲＮＡ抽出を行い、ＲＮＡ試料を調製した。このＲＮＡ試料を用い、以下の組成の反応液を調製してＴａｑＭａｎ法によってＣＫ１９ｍＲＮＡのコピー数を算出した。なお、ＴａｑＭａｎ法による測定は、TaqMan One-step RT-PCR Master Mix及びPrism 7700 Realtime PCR system（何れもアプライドバイオシステムズ社）を用いて添付の使用説明書に従って行われた。
【００６１】
反応液（５０μＬ）組成
精製水  ２０．１０μＬ
ＲＮＡ試料  ２μＬ
TaqMan 2X Universal PCR Master Mix  ２５μＬ
40X MultiScribe and RNase Inhibitor Mix  １．２５μＬ
１００μＭ  フォワードプライマ  ０．１５μＬ
１００μＭ  リバースプライマ  ０．１５μＬ
７．４ｐｍｏｌ／μＬ（終濃度２００ｎｍ）  TaqManプローブ  １．３５μＬ
【００６２】
また、ＣＫ１９ｍＲＮＡ検出のためのプライマ配列及びTaqManプローブの配列は以下の通りである。
フォワードプライマ：５’-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-３’（配列番号１）
リバースプライマ：５’-CTTGGCCCCTCAGCGTACT-３’（配列番号２）
TaqManプローブ：５’-GCCTACCTGAAGAAGAACCATGAGGAGGAA-３’（配列番号３）
【００６３】
なお、このTaqManプローブは、５’末端には６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、３’末端には６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）を有する。
【００６４】
ｍＲＮＡの定量値（コピー／セクション）を下記表１に示す。また、乳がんの転移巣サイズとＣＫ１９ｍＲＮＡ定量結果との関係を図７に、大腸がんの転移巣サイズとＣＫ１９ｍＲＮＡ定量結果との関係を図８に示す。
【００６５】
【表１】
2008011728.tif 000002
【００６６】
表１、図７及び８より、大腸がん及び乳がんの何れであっても、ＣＫ１９ｍＲＮＡの定量結果と転移巣のサイズ（ｍｍ２）に相関関係が認められた。従って、ＣＫ１９ｍＲＮＡを定量することにより、転移巣のサイズ（ｍｍ２）を予測できることが確認された。
【００６７】
（実施例２）
乳頭腺管癌に由来するがん細胞が転移したリンパ節１個から、一定の間隔を置いて厚さ約１０μｍの切片を３５枚切り出した。この３５枚の切片に対して実施例１（１）と同様にして免疫組織化学染色を行い、がん細胞の数（個／セクション）を計数した。
免疫組織化学染色に用いた切片をｍＲＮＡの定量に用いることはできないため、この切片に隣接する切片（厚さ約１０μＬ）のｍＲＮＡ発現量（コピー／セクション）を実施例１と同様にして測定し、この定量結果を免疫組織化学染色によるがん細胞数と対応させた。ｍＲＮＡ発現量とがん細胞数の関係を図９に示す。
【００６８】
充実腺管癌に由来するがん細胞が転移したリンパ節１個から、一定の間隔で厚さ約１０μｍの切片を３０枚切り出した。この３０枚の切片に対して実施例１（１）と同様にして免疫組織化学染色を行い、がん細胞の数（個／セクション）を計数した。次に、各切片に隣接する切片を用い、実施例１（２）と同様にしてｍＲＮＡ発現量（コピー／セクション）を測定した。
実施例２と同様にして、がん細胞計数に供した所定の切片におけるｍＲＮＡ発現量を、隣接する切片のｍＲＮＡ発現量とし、ｍＲＮＡ発現量とがん細胞数の関係を図１０に示す。
【００６９】
図９及び１０からわかるように、ＣＫ１９ｍＲＮＡの発現量とがん細胞数とは良好な相関関係を示した。従って、ＣＫ１９ｍＲＮＡを定量することにより、転移巣におけるがん細胞の数を予測できることが確認された。
【００７０】
（実施例３）
がん転移が認められないリンパ節１１個（陰性検体）を用い、実施例１（２）と同様にして検出用試料を作製してそれぞれの検体におけるＣＫ１９ｍＲＮＡ発現量（バックグラウンドの値）を測定した。
また、表１に示す乳がんのデータを基に、各切片において転移巣が一辺１ｍｍの立方体（体積１ｍｍ３）であると仮定した場合のＣＫ１９ｍＲＮＡ発現量と、一辺２ｍｍの立方体（体積８ｍｍ３）であると仮定したときのＣＫ１９ｍＲＮＡ発現量とを算出した。
さらに、転移巣が１ｍｍ３であった場合のＣＫ１９ｍＲＮＡ発現量及び８ｍｍ３であった場合のＣＫ１９ｍＲＮＡ発現量に、バックグラウンド値である陰性検体のＣＫ１９ｍＲＮＡ発現量をそれぞれ加算した。即ち、これらの値は、転移巣を有さないリンパ節一個のＣＫ１９ｍＲＮＡ発現量（バックグラウンド）、１ｍｍ３の転移巣を有するリンパ節一個のＣＫ１９ｍＲＮＡ発現量の推定値、及び８ｍｍ３の転移巣を有するリンパ節一個のＣＫ１９ｍＲＮＡ発現量の推定値である。これらの値を図１１に示す。
【００７１】
図１１より、１．０Ｅ＋０７コピーに第１の閾値を設定することにより、上記の検体を陰性と陽性とに分けることができた。即ち、リンパ節から測定したＣＫ１９ｍＲＮＡ発現量が、第１の閾値未満である場合はこのリンパ節へがん細胞が転移していないと予測することができ、第１の閾値以上である場合はこのリンパ節へがん細胞が転移していると予測することができる。
本実施例では、第１の閾値は、バックグラウンドの最高値である３．０Ｅ＋０６コピー以上に設定することができる。
【００７２】
また、組織診において転移巣の長径が２ｍｍである場合はマクロメタスタシスと呼ばれ、２ｍｍ未満である場合はマイクロメタスタシスと呼ばれる。従って、図１１より、一辺２ｍｍの立方体と仮定されたＣＫ１９ｍＲＮＡ発現量の最低値が約２．０Ｅ＋８．０コピーであるため、これを第２の閾値として設定することにより、転移巣がマイクロメタスタシスかマクロメタスタシスかを予測することも可能である。
【００７３】
（実施例４）
乳がん患者から採取されたリンパ節６４個（陰性検体４２個、陽性検体２２個）、及び大腸がん患者から採取されたリンパ節６９個（陰性検体３３個、陽性検体３６個）(直径約６ｍｍ／個)に、それぞれ、ｐＨ３．４の緩衝液(２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、５％  Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル、シグマ社製)及び２０％  ＤＭＳＯ(和光純薬)を含む）４ｍＬを添加し、ブレンダーでホモジナイズした。１００００×ｇで１分間遠心し、上清を採取した。この上清を上記緩衝液で１０倍に希釈し、検出用試料（ｌｙｓａｔｅ）２μＬを採取した。
【００７４】
核酸増幅装置「ＧＤ−１００」（シスメックス製）にこの検出用試料と核酸増幅用試薬「サイトケラチン試薬」（シスメックス製）とをセットし、検出用試料中のＣＫ１９ｍＲＮＡ（コピー数／μＬ・ｌｙｓａｔｅ）を定量した。
【００７５】
乳がん患者から採取されたリンパ節を用いた場合のＣＫ１９ｍＲＮＡ定量結果を図１２に、大腸がん患者から採取されたリンパ節を用いた場合のＣＫ１９ｍＲＮＡ定量結果を図１３に示す。
【００７６】
本実施例で用いた検出用試料は、実施例３で用いた検出用試料に比べて４万倍に希釈しているため、図１２及び１３において、第１の閾値を２５０コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅに、第２の閾値を５０００コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅに設定した。
【００７７】
図１２より、ＣＫ１９ｍＲＮＡの発現量（コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅ）と第１の閾値とを比較することにより、全ての陰性検体を陰性と判定し、全ての陽性検体を陽性と判定することができた。即ち、１００％の確率で乳がんのリンパ節転移が陰性か陽性かを判定できることが確認された。なお、本実施例では、第１の閾値を２００〜１０００コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅの間で設定することにより、上記と同様の結果を得ることができる。
また、図１２においてＣＫ１９ｍＲＮＡの発現量（コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅ）が第２の閾値以上であった検体は乳がんのマクロメタスタシスを含むことが予想され、第１の閾値以上第２の閾値未満であった検体は乳がんのマイクロメタスタシスを含むことが予想される。
【００７８】
図１３より、ＣＫ１９ｍＲＮＡの発現量（コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅ）と第１の閾値（２５０コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅ）とを比較することにより、全ての陰性検体を陰性と判定し、３６個の陽性検体のうち３５個を陽性と判定することができた。即ち約９９％の高確率で大腸がんのリンパ節転移が陰性か陽性かを判定できることが確認された。なお、本実施例では、第１の閾値を１００〜３００コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅの間で設定することにより、上記と同様の結果を得ることができる。
また、図１３においてＣＫ１９ｍＲＮＡの発現量（コピー／μＬ・ｌｙｓａｔｅ）が第２の閾値以上であった検体は乳がんのマクロメタスタシスを含むことが予想され、第１の閾値以上第２の閾値未満であった検体は乳がんのマイクロメタスタシスを含むことが予想される。
【００７９】
本実施例の結果より、乳がんにおいても大腸がんにおいても同じ閾値（第１の閾値及び第２の閾値）を用いることによってリンパ節中の転移巣の測定を行えることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】本発明の一実施形態による装置１の全体構成を示した斜視図である。
【図２】核酸定量部１０１の全体構成を示した斜視図である。
【図３】核酸定量部１０１の概略平面図である。
【図４】制御部１０２ｄの構成を示すブロック図である。
【図５】制御部１０２ｄによる処理フローである。
【図６】表示部１０２ｃにおける判定結果の表示画面の一例である。
【図７】乳がんの転移巣サイズとＣＫ１９ｍＲＮＡ定量結果との関係を示すグラフである。
【図８】大腸がんの転移巣サイズとＣＫ１９ｍＲＮＡ定量結果との関係を示すグラフである。
【図９】乳頭腺管癌に由来するがん細胞が転移したリンパ節中のｍＲＮＡ発現量と転移巣に含まれるがん細胞数の関係を示すグラフである。
【図１０】充実腺管癌に由来するがん細胞が転移したリンパ節中のｍＲＮＡ発現量と転移巣に含まれるがん細胞数の関係を示すグラフである。
【図１１】特定の大きさの転移巣を有するリンパ節中のＣＫ１９ｍＲＮＡ発現量の推定値である。
【図１２】乳がん患者から採取されたリンパ節を用いた場合のＣＫ１９ｍＲＮＡ定量結果を示すグラフである。
【図１３】大腸がん患者から採取されたリンパ節を用いた場合のＣＫ１９ｍＲＮＡ定量結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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