(57)【要約】【課題】安全性が高く、かつ抗腫瘍効果に優れた新規ウイルス及びその利用法を提供すること。【解決手段】単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)株の組換え体ウイルスであって、下記構造（１）及び（２）を備えたウイルスゲノムを有するウイルス：（１）TRL領域において、神経毒性遺伝子γ134.5の一部が欠失し、かつ当該欠失部位にLacZ遺伝子が挿入されている；（２）US領域において、HSV-1 HF株由来のUS4、US5、US6、US7及びUS8からなる群から選ばれる少なくとも１つのUS遺伝子を含む。【選択図】図５
2008247861.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)株の組換え体ウイルスであって、
下記構造（１）及び（２）を備えたウイルスゲノムを有するウイルス：
（１）TRL領域において、神経毒性遺伝子γ134.5の一部が欠失し、かつ当該欠失部位にLacZ遺伝子が挿入されている；
（２）US領域において、HSV-1 HF株由来のUS4、US5、US6、US7及びUS8からなる群から選ばれる少なくとも１つのUS遺伝子を含む。
【請求項２】
ウイルスゲノムが更に下記構造（３−ａ）を備えている請求項１記載のウイルス：
（３−ａ）UL 領域において、UL56遺伝子が欠損している。
【請求項３】
ウイルスゲノムが更に下記構造（４）を備えている請求項１記載のウイルス：
（４）IRL領域において、神経毒性遺伝子γ134.5の一部が欠失し、かつ当該欠失部位にLacZ遺伝子が挿入されている。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のウイルスからなる癌治療剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のウイルスを含む癌治療用組成物。
【請求項６】
HSV-1アンプリコン及びそのヘルパーウイルスを含んでおり、
前記ヘルパーウイルスが請求項１〜３のいずれかに記載のウイルスである
請求項５に記載の癌治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単純ヘルペスウイルス１型（以下、HSV-1ともいう）株の組換え体ウイルスであって、抗腫瘍効果を奏するウイルス及び当該ウイルスを用いる癌治療剤及び癌治療用組成物に主に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療技術の進歩にも拘わらず、進行癌において十分な治療成績の向上はみられていない。そのため、新しい治療法の出現が待望されている。このような中、遺伝子組換えウイルスを癌治療に応用するウイルス療法が注目を集めており、特に、単純ヘルペスウイルスＩ型（HSV-1）を用いた療法について、多くの研究が進められている。
【０００３】
HSV-1を用いたウイルス療法は、複製可能型HSV-1を腫瘍に感染させ、ウイルスの細胞変性効果によって腫瘍を融解し、破壊する治療法である。
【０００４】
これまでも、このような腫瘍融解療法に利用可能なウイルスについて種々の報告がなされてきた。例えば、神経毒性遺伝子γ134.5遺伝子を欠失させたHSV-1 R849はヒト神経膠腫細胞に対する抗腫瘍効果を奏することが報告されている(非特許文献１参照)。
【０００５】
また、HSV-1 HF株を親株とするHSV-1 HF10が知られている（非特許文献２参照）。HF10は、乳癌に対する臨床応用の検討段階にある（非特許文献３参照）。
【非特許文献１】Cancer Res., 57, 1502, 1997
【非特許文献２】Arch Virol 148,813, 2003
【非特許文献３】J.Surg.Oncol.,Vol.85(1),42-7,2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、安全性が高く、かつ抗腫瘍効果に優れた組換え体ウイルス及びその利用法を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決することを主な目的として鋭意検討を重ねた結果、二種の単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)株の組み合わせにより優れた抗腫瘍効果が奏され得ることを見出し、更に検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、下記組換え体ウイルス、癌治療剤、及び癌治療用組成物に関する。
【０００９】
項１：単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)株の組換え体ウイルスであって、
ウイルスゲノムにおいて、
（１）TRL領域における神経毒性遺伝子γ134.5の一部が欠失し、かつ当該欠失部位にLacZ遺伝子が挿入されており、
（２）US領域において、HSV-1 HF株由来のUS4、US5、US6、US7及びUS8からなる群から選ばれる少なくとも１つのUs遺伝子を含んでいる
ウイルス。
【００１０】
項２：ウイルスゲノムが更に下記構造（３−ａ）を備えている項１記載のウイルス：
（３―ａ）UL 領域において、UL56遺伝子が欠損している。
好ましくは、（３−ａ1）UL 領域において、UL56遺伝子が欠損し、かつ、HSV-1 HF株由来のUL53遺伝子を有する項２に記載のウイルス。
また、好ましくは、（３−ａ2）UL 領域において、UL56遺伝子が欠損し、かつ、UL領域ならびにTRL領域にHSV-1 HF株由来のUL53遺伝子を有する項２に記載のウイルス。
好ましくは、下記に記載の遺伝子地図を有する項２に記載のウイルス。
【００１１】
2008247861.tif 000003
【００１２】
好ましくは、HSV-1 RH1株である項２に記載のウイルス。
【００１３】
項３：ウイルスゲノムが更に下記構造（４）を備えている項１記載のウイルス：
（４）IRL領域において、神経毒性遺伝子γ134.5の一部が欠失し、かつ当該欠失部位にLacZ遺伝子が挿入されている。
好ましくはウイルスゲノムが更に下記構造（３―ｂ）を備えている項３に記載のウイルス：
（３―ｂ）UL 領域において、HSV-1 F株又はHSV-1 R849株由来のUL53遺伝子を有する。
好ましくは下記に記載の遺伝子地図を有する項３に記載のウイルス。
【００１４】
2008247861.tif 000004
【００１５】
好ましくは、HSV-1 RH2株である項３に記載のウイルス。
【００１６】
項４：項１〜３のいずれかに記載のウイルスからなる癌治療剤。
【００１７】
項５：項１〜３のいずれかに記載のウイルスを含む癌治療用組成物。
【００１８】
項６：HSV-1アンプリコン及びそのヘルパーウイルスを含んでおり、
前記ヘルパーウイルスが請求項１〜３のいずれかに記載のウイルスである
項５に記載の癌治療用組成物。
【００１９】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
【００２０】
１．組換え体ウイルス
本発明の組換え体ウイルス（recombinant virus）は、単純ヘルペスウイルス１型（以下「HSV-1」ともいう。）株の組換え体であり、HSV-1ウイルスゲノムを有している。
【００２１】
HSV-1ウイルスゲノムには、L（Long）領域とS（Short）領域が存在し、またLとS各々の両端に逆向き反復配列（Inverted  Repeat Sequence、R）が存在する。
【００２２】
ゲノムの両端及びL-S結合部には、a、b又はc配列と呼ばれる配列又はその逆向き配列a’、b’又はc’配列が１〜数コピー存在してもよい。
【００２３】
Lの両端の逆向き反復配列はRLとも称され、ゲノム端部に存在するRLはTRL （the terminal repeat sequences of the L component）、ゲノム内部に存在するRLはIRL （the internal repeat sequences of the L component）と称される。
【００２４】
また、Sの両端の逆向き反復配列はRSと称され、ゲノム末端に存在するRSはTRS（the terminal repeat of the S component）、ゲノム内部に存在するRSはIRS（the internal repeat sequences of the S component）と称される。
【００２５】
また両端を逆向き反復配列に挟まれた部分はユニーク配列（Unique Sequence、U）と称され、L領域のユニーク配列はUL（the unique sequence of the long component )、S領域のユニーク配列はUS（the unique sequence of the short component )と称される。
【００２６】
本発明のHSV-1株の組換え体ウイルスは、当該HSV-1ウイルスゲノムにおいて、
下記構造（１）及び（２）を備えている。
（１）TRL領域において、神経毒性遺伝子γ134.5の一部が欠失し、かつ当該欠失部位にLacZ遺伝子が挿入されている；
（２）US領域において、HSV-1 HF株由来のUS4、US5、US6、US7及びUS8からなる群から選ばれる少なくとも１つのUS遺伝子を含む。
【００２７】
（１）TRL領域（神経毒性遺伝子）
正常細胞は、ウイルスが感染した場合、二本鎖RNA依存性のプロテインキナーゼ（double-stranded RNA-dependent protein kinase:PKR）が活性化し、translation initiation factor 2a (eIF-2a)をリン酸化して、細胞のタンパク質合成自体を阻害することで、ウイルスを増殖できなくする。
【００２８】
しかし、野生型HSV-1ウイルスは、TRL領域とIRL領域に各１コピー、計２コピーのγ134.5遺伝子を備え、γ134.5遺伝子産物がprotein phosphatase 1 aと結合してPKRによってリン酸化されたeIF-2aを脱リン酸化して、増殖する。
【００２９】
これに対し、本発明の組換え体ウイルスは、少なくともTRL領域におけるγ134.5遺伝子の一部が欠失している。そのため、ウイルスの増殖能が抑制され、弱毒化されている。
【００３０】
また、本発明のウイルスにおいては、当該γ134.5の一部の欠失部位に、LacZ遺伝子が挿入されている。
【００３１】
LacZ遺伝子は、X-gal染色で容易に検出可能であるため、当該遺伝子が組み込まれていることにより、組み換え体の形成や存在を容易に検出できる。また組換え体からLacZ遺伝子の喪失が生じた場合も容易に把握できる。
【００３２】
また、LacZ遺伝子を指標とすることにより、投与した腫瘍内でのウイルスの波及程度を容易に判断できる。例えば、生体にすでに潜伏感染していたHSV-1が活性化して組み換え体ウイルスと共に増殖する状況が生じた場合にも、LacZを指標として検出することができる。
【００３３】
（２）Us領域
本発明の組換え体ウイルスは、
US領域において、HSV-1 HF株由来のUS4、US5、US6、US7及びUS8からなる群から選ばれる少なくとも１つのUs遺伝子を含む。
【００３４】
US4、US5、US6、US7及びUS8からなる群から選ばれる少なくとも１つのUs遺伝子を含むとは、US4、US5、US6、US7及びUS8のいずれか１つのUs遺伝子を含んでいてもよく、２以上を固まりとして含んでいてもよい。好ましい例としては、US6、US7及びUS8を含む場合、更にはUS4、US5、US6、US7及びUS8を含む場合が挙げられる。
【００３５】
また、HSV-1 HF株由来のUS4、US5、US6、US7及びUS8からなる群から選ばれる少なくとも１つのUS遺伝子を含むとは、HSV-1 HF株が有するそれらのUS遺伝子の一部が本発明の細胞融合能の効果を奏する範囲内で変異している場合を含む。
【００３６】
このような構造は、優れた細胞融合能を奏するために重要と考えられる。
【００３７】
より具体的な態様としては、本発明の組み換え体ウイルスのUs領域がHSV-1 HF株又はHSV-1 HF10株のUS領域と同一である場合が含まれる。
【００３８】
このような構造から、本発明の組換え体ウイルスは、HSV-1 KOS株のEcoRI切断片であってUS領域の中央部をカバーするH断片(プラスミド名:pSG25)をプローブに用いてストリンジェントな条件下でハイブリダイズを行った場合、HSV-1 HF株と共通するパターンを示す。
【００３９】
尚、本明細書においてストリンジェントな条件とは、通常42℃、2×SSC、0.1％ SDSの条件であり、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％ SDSの条件であり、さらに好ましくは、65℃、0.1×SSCおよび0.1％ SDSの条件を指す。
【００４０】
（３）UL領域
UL領域の構造は、本発明の組み換え体ウイルスの効果を奏する範囲内であれば、特に限定されないが、例えば、以下の（３−ａ）の構造を有する場合が含まれる：
（３−ａ）UL領域において、UL56遺伝子が欠損している。この場合、好ましくは、更にUL 領域において、HSV-1 HF株由来のUL53遺伝子を有する。具体的な態様としては、UL 領域がHSV-1 HF株のUL領域と同一である場合が含まれる。
【００４１】
また、以下の（３−ｂ）の構造を有する場合が含まれる：
（３―ｂ）UL 領域においてHSV-1 F株又はHSV-1 R849株由来のUL53遺伝子を有する。この場合、好ましくは、UL領域において、HSV-1 F株又はHSV-1 R849株由来のUL52、UL53、UL54及びUL55遺伝子を有する場合が含まれる。具体的な態様としては、UL 領域がHSV-1 F株又はHSV-1 R849株のUL領域と同一である場合が含まれる。
【００４２】
（４）態様
上記のような特徴を有する本発明の組換え体ウイルスの具体例としては、以下の態様が含まれる。
【００４３】
態様１
本発明の組み換え体ウイルスの１態様は、次のウイルスを含む。
単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)株の組換え体ウイルスであって、下記構造（１）、（２）及び（３−ａ）を備えたウイルスゲノムを有するウイルス：
（１）TRL領域において、神経毒性遺伝子γ134.5の一部が欠失し、かつ当該欠失部位にLacZ遺伝子が挿入されている；
（２）US領域において、HSV-1 HF株由来のUS4、US5、US6、US7及びUS8からなる群から選ばれる少なくとも１つのUs遺伝子を含む；かつ、
（３−ａ）UL領域において、UL56遺伝子が欠損している。
【００４４】
当該態様１には、以下のウイルスが含まれる。
単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)株の組換え体ウイルスであって下記構造（１）、（２）及び（３−ａ１）を備えたウイルスゲノムを有するウイルス：
（１）TRL領域において、神経毒性遺伝子γ134.5の一部が欠失し、かつ当該欠失部位にLacZ遺伝子が挿入されている；
（２）US領域において、HSV-1 HF株由来のUS4、US5、US6、US7及びUS8からなる群から選ばれる少なくとも１つのUs遺伝子を含む；
（３−ａ１）UL領域において、UL56遺伝子が欠損しており、かつ、UL 領域において、HSV-1 HF株由来のUL53遺伝子を有する。
【００４５】
また、当該態様１には、以下のウイルスが含まれる。
単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)株の組換え体ウイルスであって、下記構造（１）、（２）及び（３−ａ２）を備えたウイルスゲノムを有するウイルス：
（１）TRL領域において、神経毒性遺伝子γ134.5の一部が欠失し、かつ当該欠失部位にLacZ遺伝子が挿入されている；
（２）US領域において、HSV-1 HF株由来のUS4、US5、US6、US7及びUS8からなる群から選ばれる少なくとも１つのUs遺伝子を含む；かつ、
（３−ａ２）UL領域において、UL56遺伝子が欠損しており、かつ、UL 領域及びTRL 領域において、HSV-1 HF株由来のUL53遺伝子を有している。
【００４６】
態様１のウイルスの具体例としては、下記に記載の遺伝子地図で表されるウイルスゲノムを有するウイルスが含まれる。
【００４７】
2008247861.tif 000005
【００４８】
このような組換え体ウイルスとしては、具体的には、HSV-1 RH1株が挙げられる。
【００４９】
尚、HSV-1 RH1は、大阪大学大学院歯学研究科顎口腔病因病態制御学講座口腔外科学第ニ教室にておいて必要な場合に試料の分譲ができるように保管管理されている。即ち特許法施行規則第２７条の３第１項第１号〜第３号に掲げた分譲を出願人において保証するものである。
【００５０】
態様２
本発明の組み換え体ウイルスの他の１態様は、次のウイルスを含む。
単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)株の組換え体ウイルスであって、下記構造（１）、（２）及び（４）を備えたウイルスゲノムを有するウイルス：
（１）TRL領域において、神経毒性遺伝子γ134.5の一部が欠失し、かつ当該欠失部位にLacZ遺伝子が挿入されている；
（２）US領域において、HSV-1 HF株由来のUs4、Us5、Us6、Us7及びUs8からなる群から選ばれる少なくとも１つのUS遺伝子を含む；かつ、
（４）IRL領域において、神経毒性遺伝子γ134.5の一部が欠失し、かつ当該欠失部位にLacZ遺伝子が挿入されている。
【００５１】
当該態様２には、以下のウイルスが含まれる。
単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)株の組換え体ウイルスであって、下記構造（１）、（２）、（３−ｂ）及び（４）を備えたウイルスゲノムを有するウイルス：
（１）TRL領域において、神経毒性遺伝子γ134.5の一部が欠失し、かつ当該欠失部位にLacZ遺伝子が挿入されている；
（２）US領域において、HSV-1 HF株由来のUs4、Us5、Us6、Us7及びUs8からなる群から選ばれる少なくとも１つのUs遺伝子を含む；
（３―ｂ）UL 領域においてHSV-1 F株又はHSV-1 R849株由来のUL53遺伝子を有する；かつ
（４）IRL領域において、神経毒性遺伝子γ134.5の一部が欠失し、かつ当該欠失部位にLacZ遺伝子が挿入されている。
【００５２】
態様２のウイルスの具体例としては、下記に記載の遺伝子地図で表されるウイルスゲノムを有するウイルスが含まれる。
【００５３】
2008247861.tif 000006
【００５４】
このような組換え体ウイルスとしては、具体的には、HSV-1 RH2株が挙げられる。
【００５５】
尚、HSV-1 RH2も、大阪大学大学院歯学研究科顎口腔病因病態制御学講座口腔外科学第ニ教室において、必要な場合に試料の分譲ができるように保管管理されている。即ち特許法施行規則第２７条の３第１項第１号〜第３号に掲げた分譲を出願人において保証するものである。
【００５６】
（５）作製方法
本発明のウイルスは、HSV-1 R849及びHSV-1 HFを用いて公知の方法に従って作製することができ、例えば、以下のように作製することができる。
【００５７】
先ず、HSV-1 R849及びHSV-1 HFを、宿主細胞に、共感染させる。
【００５８】
宿主細胞としては、R849及びHFが感染し、増殖することが可能なものであれば特に限定されないが、例えば、PKR活性が低いVero細胞や、R849の増殖が可能な口腔扁平上皮癌細胞などを用いることができる。
【００５９】
共感染における感染多重度(multiplicity of infection:MOI)は、常法に従って適宜設定し得るが、好ましくは、R849は0.01〜0.05、HFは0.01〜0.1である。
【００６０】
次いで、R849とHFの共感染した細胞を培養し、細胞変性が細胞層全体に拡大した時点で感染細胞を回収する。好ましくは、共感染後48 〜72時間程度培養を行い、細胞変性が細胞層全体に拡大した時点で回収する。
【００６１】
次いで、候補となるウイルス株を選択し、必要に応じ、純化し、更に継体した後、目的とする性質を獲得したウイルスを単離する。
【００６２】
ウイルス株の選択方法としては、位相差顕微鏡を用いた細胞形態観察や、X-gal染色によるLacZ遺伝子の検出などが挙げられる。例えば、細胞融合能を有することにより、感染細胞どうしあるいは感染細胞と非感染細胞が融合して、しだいに核を多く持つ多核巨細胞が形成される。また、LacZ遺伝子が組み込まれることにより、X-gal染色で陽性となる。従って、培養液にX-gal染色液を添加し培養を継続しながら位相差顕微鏡で細胞を観察し、青色に染色された時点でこのX-gal陽性の多核巨細胞を採取することにより、適当なウイルス株を選択することができる。
【００６３】
また、純化や継体は、公知の方法に従って適宜実施することができる。
より具体的には、本発明のウイルスは、実施例に記載の方法に従って得ることができる。
【００６４】
（６）他の構造
本発明のウイルスは、本発明の効果を奏する範囲内であれば、野生型への復帰を防止するための付加的な変異を更に含んでいてもよい。
【００６５】
また、本発明のウイルスは、本発明の効果を奏する範囲内で、異種遺伝子産物をコードする配列を含んでいてもよい。異種遺伝子産物としては、例えば、抗腫瘍及び／又は免疫に関するものが挙げられ、具体的には、ワクチン抗原または免疫調整タンパク質などが挙げられる。
【００６６】
（７）特性
本発明の組換え体ウイルスは、次のような利点を有する。
【００６７】
本発明のウイルスにおいては、PKRの活性化によるタンパク質合成停止を解除する上で重要なγ134.5遺伝子が少なくとも1部欠失しており、弱毒化され、安全性に優れる。例えば、HSV-1 RH１は、γ134.5遺伝子の一方が欠損して神経毒性が半減しており、かつUL56欠損によって病原性が低下している。また、HSV-1 RH2は、γ134.5遺伝子が２コピーとも欠失し、正常細胞での増殖が阻止され、脳炎などの重篤な病変を惹起する恐れが少ない。
【００６８】
一方で本発明のウイルスは、増殖活性が旺盛で抗PKR活性を示す腫瘍細胞で複製することができる。このため、腫瘍の選択的な傷害が可能となっている。
【００６９】
特に、本発明のウイルスは、野生型HSV-1でみられるような感染細胞の円形化をきたすのではなく、感染細胞どうしあるいは感染細胞と非感染細胞との高い細胞融合（cell fusion）能を示す。このため、細胞と細胞の接触面を介してウイルス感染が直接拡大する特徴をもつ。このため、血中のHSV-1中和抗体によるウイルス中和作用を受けることなく、腫瘍組織内を伝播し、固形腫瘍に対する優れた破壊又は破壊促進作用を示し得る。
【００７０】
また、ウイルスの複製にともなってLacZ遺伝子が発現するため、投与した腫瘍組織や周囲正常組織、遠隔臓器へのウイルスの拡散をX-gal染色で容易に検出可能である。
【００７１】
また、本発明のウイルスは、HSV-1R849に匹敵するウイルス産生量を有し、高濃度の粒子を含むウイルス液を容易に調製することができ、高力価のウイルスが得られる。
【００７２】
このように、本発明の組換え体ウイルスは、安全性に優れるだけでなく、抗腫瘍効果にも優れ、産生量も優れるという特性を有している。
【００７３】
２．癌治療剤
本発明の癌治療剤は、上記本発明のウイルスからなり、ウイルス自体からなるものであってもよく、公知の方法に従って適宜製剤化したものであってもよい。
【００７４】
本発明の癌治療剤は、腫瘍、特に固形癌をターゲットとする抗腫瘍療法において薬剤又は治療用組成物などにおける有効成分として用いることができる。
【００７５】
固形癌としては、口腔癌、肺癌、乳癌、胃癌、結腸・直腸癌、膵癌、骨肉腫、悪性リンパ腫以外に脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、肝癌、腎癌、子宮癌、前立腺癌、皮膚癌又は悪性黒色腫などが挙げられる。例えば、本発明の癌治療剤は、口腔癌治療剤として好適に使用し得る。
【００７６】
また、本発明の癌治療剤は、乳癌患者のリンパ節転移で報告されているような、多発性のリンパ節転移に直接投与することもできる。表在性で多発性のリンパ節転移を制御することは、粒子線治療や超選択的動注化学療法といった最新の方法でも極めて難しく、このような利用は、本願発明を用いた療法の利点といえる。
【００７７】
本発明の癌治療剤は、上記組み換え体ウイルスを用いるものであり、安全性が高く、抗腫瘍効果に優れる。
【００７８】
３．癌治療用組成物
本発明の癌治療用組成物は、上記本発明のウイルスを含んでなる。
【００７９】
本発明の癌治療用組成物は、常法に従って、上記本発明のウイルスと、他の薬学的に許容し得る成分を用いて調製することにより得ることができる。
【００８０】
薬学的に許容し得る成分としては、薬学的に使用可能な担体や、他の薬学的活性成分、添加剤、アジュバント等を挙げることができる。添加剤としては、例えば、安定化剤、保存剤などを挙げることができる。
【００８１】
他の成分の配合量は、本発明の効果を損なわないことを限度として、適宜設定することができる。
【００８２】
本発明の癌治療用組成物は、目的に応じて製剤化することができ、例えば注射剤として調製することができる。
【００８３】
投与方法も、本発明の効果を奏する範囲内であれば、公知の方法に従って設定することができ、例えば動脈内注入法などを用いることができる。
【００８４】
癌治療用組成物における上記組み換え体ウイルスの割合は、投与対象、剤型、投与方法等によって異なり、一律に規定することはできないが、例えば、組成物全体に対し、ウイルスが80 〜90%程度となることをもたらすような量で設定される。
【００８５】
本発明の組成物は、各種癌、特に固形癌をターゲットとする抗腫瘍療法に用いることができる。固形癌としては、口腔癌、肺癌、乳癌、胃癌、結腸・直腸癌、膵癌、骨肉腫、悪性リンパ腫以外に脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、肝癌、腎癌、子宮癌、前立腺癌、皮膚癌又は悪性黒色腫などが挙げられる。例えば、本発明の癌治療用組成物は、口腔癌治療用組成物として好適に使用できる。
【００８６】
また、本発明の癌治療用組成物は、乳癌患者のリンパ節転移で報告されているような、多発性のリンパ節転移にも有効と考えられる。
【００８７】
本発明の癌治療用組成物は、上記本発明のウイルスを有効成分として含むものであり、安全性が高く、抗腫瘍効果に優れる。
【００８８】
また、本発明のウイルスは、更に、ヘルパーウイルスとしても利用することができる。
【００８９】
例えば、HSV-1アンプリコン及び当該アンプリコンのヘルパーウイルスを含む癌治療用組成物であってヘルパーウイルスが本発明組換え体ウイルスである組成物が挙げられる。
【００９０】
HSV-1アンプリコンは、HSV-1のDNA複製開始起点とDNA切断・パッケージング配列を持つ環状DNAを含むベクターであって、本発明の組み換え体ウイルスと共感染することで増殖可能となるものであれば、特に限定されない。通常、当該HSV-1アンプリコンは本発明の組換え体ウイルスと共通する増殖機構を有している。
【００９１】
当該HSV-1アンプリコンには、適当な外来遺伝子を含めてもよい。
【００９２】
HSV-1アンプリコンとヘルパーウイルスとなる本発明のウイルスの混在割合は、所望の効果を奏することを目的に適宜設定することができる。
【００９３】
本発明の癌治療剤又は癌治療用組成物において、本発明のウイルスは、ウイルスストック等に調製したものとして用いてもよい。ウイルスストックの形態としては、例えば、液状、その凍結物、凍結乾燥により得られる粉体などが挙げられる。
【００９４】
また、本発明の組み換え体ウイルス、癌治療剤及び癌治療用組成物は、HSV-1又はその組換え体、及びそれを用いた細胞融解療法に関する公知の技術を必要に応じて付加し得るものである。
【発明の効果】
【００９５】
本発明の組み換え体ウイルスは、弱毒化されており、神経節での潜伏感染を生じる恐れが少なく、安全性が高い。
【００９６】
また、LacZ遺伝子が挿入されており、検出が容易である。
【００９７】
また、本発明の組み換え体ウイルスは、細胞融合能に優れ、高い伝播能を有しており、細胞障害性に優れ、腫瘍細胞の破壊又は破壊促進効果に優れる。
【００９８】
また本発明のウイルスは、産生量が大きく、高力価のウイルス液やウイルスストックを容易に調製できる。
【００９９】
そして、このような特徴を有するウイルスを用いて得られる癌治療剤または癌治療用組成物は、抗腫瘍効果に優れ、安全性も高く、また高力価のウイルスを容易に入手し得ることから有用性にも優れる。
【０１００】
このように、本発明は、ウイルスを用いた癌治療法乃至細胞融解療法、更にはその応用開発のための有用な技術を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０１】
以下、実施例等を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されることはない。
【０１０２】
尚、以下ではHSV-1 R849を「R849」、HSV-1 HFを「HF」、HSV-1 Fを「F」、HSV-1 HF10を「HF10」と略して称する場合もある。
【０１０３】
材料と方法
HSV-1 R849
R849は米国シカゴ大学のRoizman博士から分与されたものを使用した。
【０１０４】
尚、R849は、γ134.5欠損ウイルスで、1997年に、シカゴ大学のRoizmanのグループ
により開発されたものである(Cancer Res 57, 1502, 1997：参考として本明細書に含まれる)。このウイルスの親株となるのは野生型HSV-1F株（ATCC受託番号VR-733）で1968年にその性状が報告されている(Ejercito et al., J Gen Virol 2, 357, 1968)。
【０１０５】
R849作成ではtk insertion-deletion technique が使われている(Post & Roizman, Cell 25, 227, 1981)。まず、R849 に先行するR4002が作製されている。R4002はHSV-1F株のγ134.5遺伝子の5’末端にHSV-1 tk遺伝子を挿入したもので、本来のUL23の部位にあるべきtk遺伝子は欠損させてある(Chou et al., Science 250, 1262, 1990)。一方で、HSV-1F株のγ134.5遺伝子部分を含むDNA断片を調製しプラスミドに組み込み、次にこの間に存在する制限酵素切断部位BstEIIとSalI部位間の1000塩基を欠失させてここにLacZを挿入しておく。R4002とこのプラスミドを143tk-細胞にトランスフェクションしてbromouracildeoxyriboside存在下に増殖させる。この条件下では、tk遺伝子をもつR4002は増殖できず、相同組換えでγ134.5遺伝子にLacZを挿入された部位を獲得したtk-のウイルスだけが増殖できる。これを回収し、本来存在すべきであるtk遺伝子をUL23の部位に、相同組換えで戻すことで、R849が完成する。
【０１０６】
HSV-1 HF株
HSV-1 HF株は、徳島大学名誉教授佐藤光信氏から提供されたものを使用した。
【０１０７】
HSV-1 F株
HSV-1 F株は、Spear教授（Department of Microbiology-Immunology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 320 East Superior Street, Chicago, IL 60611, USA）より分与されたものを使用した。
【０１０８】
実施例
1.組換え体ウイルスの単離及び精製
Vero細胞上で、R849とHFのMOIをそれぞれ変化させて感染し、以下のようにして組
換え体の単離を試みた。
【０１０９】
Vero細胞（Japanese Collection of Research Bioresouces, Tokyo）を100 mm径の培養皿に1x106個播種し、イーグルの最小必須培地に2mMグルタミン、5%仔牛血清を添加したものを培養液として、5%CO2存在下に37℃で培養した。
【０１１０】
細胞がセミコンフルエントになった状態で、R849とHFのMOIの比率を12通り変化させて感染を行った。すなわち、R849のMOIを0.01から0.05、HFのMOIを0.01から0.1の範囲で変化させ共感染を行った。
【０１１１】
感染細胞を位相差顕微鏡下に観察し、細胞融合が進行し多核巨細胞が非感染細胞と区別できるようになった時点で非固定下のX-gal染色を行った。R849感染による細胞変性で円形化した細胞集団を避けて、融合して多核巨細胞した細胞集団より構成されるプラークを、顕微鏡観察下で30個採取し、-80℃で凍結保存した。
【０１１２】
凍結保存した感染細胞を融解し、低速遠心にて細胞破片を除去しその上清を培養皿で増殖させたVero細胞に感染させた。Vero細胞で細胞融合を示すものを採取して-80℃で凍結保存した。
【０１１３】
増殖させたウイルスをダルベッコのリン酸緩衝液(PBS)にて10倍段階希釈し、Vero細胞に感染させた。十分希釈され、細胞融合ししかもX-gal陽性となる感染細胞を単離できる条件下で感染細胞を採取した。
【０１１４】
このクローニングを繰り返し、ウイルスを純化した。
【０１１５】
純化したウイルスを10代まで継代し、獲得した性質が安定したものであるかを確認した。最終的に6種類のウイルスが得られた。
【０１１６】
獲得したウイルスがLacZ遺伝子を保有することを確認するため、LacZ遺伝子を増幅するプライマーを設定し、PCRを行った。
【０１１７】
Forwardプライマーとしては
（配列番号１） 5’-GCGTTACCCAACTTAATCG -3’を用いた。
【０１１８】
またReverseプライマーとしては  
（配列番号２）5’-TGTGAGCGAGTAACAACC -3’を用いた。
これを検出できなかった1種類は破棄した。
【０１１９】
得られた5種類のうち、2種類のウイルスHSV-1 RH1及びHSV-1 RH2について、更に解析を行った。
【０１２０】
2.  ゲノム構造解析
1．で得られたRH1及びRH2のゲノムについて、LacZ遺伝子についてのPCR解析、及びサザンブロット解析により、以下のように検討を行った。
【０１２１】
2-1．LacZ遺伝子の検出
ウイルスゲノムにおけるLacZ遺伝子の存在を確認するため、下記２種類のプライマーを用いて、PCR法で解析した。
【０１２２】
LacZのForwardプライマー及びReverseプライマーとしては、上記1．と同様に配列番号１及び２に示す配列を用いた
PCRの条件は、変性が94°C で40秒、アニーリングが60°C で 30秒、伸長が72°C で90秒とし、この反応を35サイクル行った。 
【０１２３】
LacZ遺伝子の検出結果を図１の左に示す。
【０１２４】
その結果、R849と組換え体RH1、RH2においては、320bpの位置に増幅産物のバンドが形成され、LacZ遺伝子の発現が認められた
これらの結果から、RH1及びRH2のいずれもγ134.5遺伝子部位に挿入されたLacZを持つ構造をしていると考えられた。但し、RH1については、バンドの濃度が1/2程度に減弱していることから、TRLとIRLに存在する2コピーのうちいずれか1コピーがないものと考えられた。
【０１２５】
2-2．サザンブロット解析
UL領域及びUS領域の構造について、以下の方法で、サザンブロットにより解析した。
【０１２６】
ウイルス粒子から調整したDNAをBamHIで切断したのち、2%アガローズゲル電気泳動を行い、切断されたDNA断片を分子量の大きさで分離した。泳動後のゲルの下にろ紙を敷きこれがDNA転写用緩衝液に浸潤する状態とした。ゲルの上にはニトロセルロース膜を密着させ、その上からろ紙を重ね、重しを置いて全体を密着させた。この状態で一夜静置し、緩衝液が毛細管現象で上方へ移動することでゲル内のDNAがニトロセルロース膜に転写するようにした。膜を回収し、このDNA が移行した面にペルオキシダーゼで標識したDNAプローブを重層して、DNA-DNAのハイブリダイゼーションを行った。反応後、洗浄し未反応のプローブを除去し、ペルオキシダーゼを検出する試薬を更に反応させ、標識されたDNAプローブをEnhanced chemilumescence（ECL）キットを用いて検出した。ハイブリダイゼーションは、42℃、2×SSC、0.1％ SDSの条件で行った。
【０１２７】
（LacZ遺伝子）
LacZ遺伝子については、R849をテンプレートとしたPCR増幅産物をアガロースゲルから切り出し、シーケンシングで確認したのち、プローブとして用いた。LacZ遺伝子について、サザンブロットにより解析した結果を図１の右に示す。その結果、上記PCRによる結果と同様に、R849、RH1、RH2では、LacZが検出されたが、HFでは検出されなかった。但し、RH1については、バンドの濃度が1/2程度に減弱していることから、TRLとIRLに存在する2コピーのうちいずれか1コピーがないものと考えられた。
【０１２８】
（UL領域、US領域の構造の比較）
プローブとして、プラスミドに組み込んだHSV-1 KOS株のEcoRI切断片のうち、UL領域のA断片(プラスミッド名：pSG124)、US領域のH断片(プラスミッド名:pSG25)(Goldin et al., J Virol, 38, 50, 1981)を用いた。これらを用いて、サザンブロットによりUL領域及びUS領域解析した結果を図２に示す。
【０１２９】
pSG124はULの中央部に存在する領域をカバーするプローブで、この場合、すべてのウイルスで差がなかった。
【０１３０】
一方、pSG25はUSの中央部をカバーするプローブで、F とR849は同じパターンであったが、HF、RH1、RH2はこれと異なるが共通のパターンを示した。このことから、RH1及びRH2のUS領域はHFに由来すると考えられた。
【０１３１】
（UL53遺伝子）
UL53遺伝子について、HSV-1 FをテンプレートとしたPCR増幅産物をシーケンシングで確認したのち、プローブとして用いた。
【０１３２】
UL53の増幅においては、文献（Dolter et al., J Virology 1994年 pp.8277-8282）に従い、Forwardプライマーとして
（配列番号３） 5’- cgccaaatgcgacagcaacc -3’
Reverseプライマーとして
（配列番号４）: 5’- cagtttgcatatgccgttcc -3’
を用いた。
【０１３３】
UL53遺伝子及びその周辺について、サザンブロットにより解析した結果を図３に示す。
【０１３４】
その結果、HFとRH1は共通のパターンを示し、R849とRH2はこれと異なるパターンを示した。このことから、RH1のUL53はHFに由来し、RH2のUL53はR849に由来すると考えられた。
【０１３５】
3.ゲノム構造
上記ゲノム構造の解析結果から考えられるRH1及びRH2のゲノム構造の模式図を図４に示す。また文献（Andreansky et al., Cancer Res. 57, 1502, 1997）に基づくF、R849の構造、及び文献（Takakuwa et al., Arch Virol 148,813, 2003）に基づくHF10の構造を図４に合わせて示す。
【０１３６】
尚、HFに関する文献（Umene et al., Arch Virol 80, 275, 1984) 及び(Nishiyama et al., J Virol 65, 4520, 1991)とHF10に関する文献 (Takakuwa et al., Arch Virol 148,813, 2003)における制限酵素切断パターンの比較から、HFとHF10は同様の構造であろうと推定される。
【０１３７】
相同組換えの位置関係から、RH1は、HFからUSとIRLのa’を得ており、IRL領域の部位のLacZは持たないものと考えられる。そして、TRL領域のaはR849に由来し、この部位のγ134.5の一部が欠失し、当該部位にLacZ遺伝子が挿入されていると考えられる。更に、US領域において、HSV-1 HF株由来のUs遺伝子を含むと考えられる。更に、UL 領域において、UL56遺伝子が欠損し、かつ、UL領域においてHF株由来のUL53遺伝子を有すると考えられる。
【０１３８】
一方、RH2はR849と同等にLacZをa領域とa’領域で保有し、Us領域はHFに由来すると考えられる。換言すると、TRL領域及びIRL領域において、γ134.5の一部が欠失し、当該欠失部位にLacZ遺伝子が挿入されていると考えられる。また、US領域において、HF株由来のUs遺伝子を含むと考えられる。また、UL領域においてHSV-1 F株又はHSV-1 R849株由来のUL53遺伝子を有すると考えられる。
【０１３９】
4.効果確認
4−1細胞傷害性に関する試験
HSV-1感染によるヒト口腔扁平上皮癌細胞に対する細胞傷害性を明らかにするため、MTT（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide )アッセイを行った。
【０１４０】
具体的に、産生された子孫ウイルス粒子が培養液中に放出され、離れた非感染細胞に吸着し新たな感染細胞の集団(プラーク)を形成することを避けるために、感染後の培養液中にメチルセルロースを添加する条件で、細胞傷害性の検討を行った。
【０１４１】
生細胞数の測定には、MTT proliferation assay kit( CHEMICON INTERNATIONAL)を用いた。 
【０１４２】
まず、口腔扁平上皮癌細胞SAS（Japanese Collection of Research Resources, Tokyo）1×10４個を96ウェルプレートに植え込み、10%の牛胎児血清を含むDulbecco’s変法Eagle培地(DMEM)を用いて37℃で24時間培養した。次いで、各HSV-1をMOI=0.01で感染させた。
【０１４３】
ウイルス溶液を単層に増殖した細胞層で覆い、1時間ウイルスの吸着を行った。次に、細胞層にPBSを加えて除去した後、SASの培養液に0.3%(W/V)の濃度でメチルセルロースを溶解させたものを加えて培養した。
【０１４４】
経時的にMTTアッセイ溶液を加え 4時間培養したのち発光溶液を加え、570nmと630nmの波長でプレートリーダーにて吸光度値を測定し、非感染対象細胞の吸光度値と比較した。
【０１４５】
更に、R849感染24時間後にR849又はHFを同じMOIで感染させて重複感染させる以外は、同様にして試験を行い、吸光度を測定した。
【０１４６】
試験結果を図５に示す。
【０１４７】
図５の縦軸は非感染細胞と比較した感染細胞の570nm波長に対する吸光度の比率（Cell viability (% of control)、感染細胞の吸光度 / 非感染細胞の吸光度×１００）を示す。縦軸中の100%は非感染細胞と同じ生細胞数を示す。
【０１４８】
図５の横軸は、細胞に感染させた時点を0とし、そこからの経過時間（Time after initial infection）を示す。重複感染の場合は、24時間後に新たなウイルスを感染させた。図中の矢印は感染させたことを示す。即ち、「R849 + R849」はR849感染24時間後にR849を重複感染させたことを示す。また「R849 + HF」はR849感染24時間後にHFを重複感染させたことを示す。
【０１４９】
その結果、RH1、RH2は、重複感染した場合よりもMTT値が低下し強い細胞傷害性を示すことが明らかとなった。組換え体ウイルスは細胞間を伝播してより広範囲に腫瘍融解作用を及ぼすことができるためと考えられる。
【０１５０】
4-2.ウイルス産生量に関する試験
口腔扁平上皮癌細胞SASを24穴プレートに2.0×10５cells/well播種し, 2日間培養後にウイルス液を一定の多重感染度 (multiplicity of infection ; MOI )で接種し, 1時間の吸着を行った。Ca+とMg2+を含まないPBSにて洗浄したのち,メチルセルロースを含有する培養液を重層し, 37 ℃で培養した。経時的に培養液を回収し、細胞にはPBSを加えて、いずれも-80℃で凍結した。細胞と培養液を更に2回凍結融解して遠心で細胞残渣を除去し、その上清に含まれるウイルスをVero細胞でのプラックアッセイにて測定した。すなわち、10倍段階希釈したウイルス液をVero単層細胞に感染させ、メチルセルロースを含有する培養液を重層して培養し、細胞変性が明瞭となった時点で細胞をエタノールで固定し, 1 ％クリスタルバイオレットにて染色して細胞変性部位に一致して形成されるプラック数を算定し、希釈倍率から感染力価plaque forming unit ( PFU )/ml を算定した。
【０１５１】
その結果、SASでのウイルス産生量は、R849が3.7 x 107 plaque forming units (PFU)/ml、HFが3.9 x 106 PFU/ml、RH1が6.3 x 106PFU/ml、RH2が3.1 x 107 PFU/mlであった。
【０１５２】
またSAS細胞に代えてHSC-3細胞を用いる以外は同様にして、感染後、48時間培養したのちにウイルス産生量を測定した。
【０１５３】
その結果、HSC-3細胞の場合には、R849が7.5 x 107 PFU/ml、HFが2.8 x 106 PFU/ml、RH1が5.6 x 107 PFU/ml、RH2が6.2 x 107 PFU/mlであった。
【０１５４】
これらの結果から、RH1及びRH2は、口腔扁平上皮癌細胞の増殖能がHFよりも大きくなっていることが明らかとなった。
【０１５５】
4-3.細胞融合能に関する試験
ウイルスの細胞融合能を確認するため、細胞変性により形成されるプラックの径を測定した。SAS細胞にR849, HF, RH2, RH1を感染させ、メチルセルロースを含む培養液を用いて培養した。感染48時間後に細胞をメタノールで固定しクリスタルバイレットで染色し、それぞれ、100個のプラックの直径を計測し、平均値を求めた。
【０１５６】
図６に結果を示す。
【０１５７】
その結果、RH1、RH2はいずれもHFと同様の融合型の細胞変性によるプラックを形成し、HFよりもその直径の平均値は増加した。
【０１５８】
このことから、本発明の組換え体RH1、RH2はいずれも細胞癒合にて癌細胞間を伝播して感染を広げる能力を有すると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】LacZ遺伝子のPCR及びサザンブロットによる解析結果を示す図面である。LacZのバンドを矢印で示す。
【図２】サザンブロット法によりウイルスのゲノム構造を解析した結果を示す図面である。左図にpSG124による解析結果、右図にpSG25による解析結果を示す。また株間で異なるDNA断片のバンドを矢印で示す。
【図３】サザンブロット法によりウイルスのゲノム構造を解析した結果を示す図面である。UL53遺伝子周囲の構造を比較して解析した結果を示す。また株間で異なるDNA断片のバンドを矢印で示す。
【図４】各HSV-1株のゲノムの構造模式図を示す図面である。
【０１６０】
上から、HSV-1 F、HSV-1 R849、HSV-1 HF10、HSV-1 RH1及びHSV-1 RH2のゲノムの構造模式図を示す。
【図５】MTTアッセイによりウイルスの細胞傷害性について試験した結果を示す図面である。
【０１６１】
縦軸は非感染細胞と比較した感染細胞の570nm波長に対する吸光度の比率（Cell viability (% of control)）を示す。縦軸中の100%は非感染細胞と同じ生細胞数を示す。
【０１６２】
横軸は、細胞に感染させた時点を0とし、そこからの経過時間（Time after initial infection）を示す。R849+R849とR849+HFは重複感染の場合で、R849感染24時間後にR849あるいはHFをそれぞれ同じMOIで重複感染したことを示す。図中の矢印はHSV-1を感染させたことを示す。
【図６】ウイルスの細胞変性により形成されるプラックの径を測定した結果を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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