(57)【要約】【課題】マイクロアレイ等のプローブ固定担体のプローブとして、より一層特異性の高いプローブを選択する方法を提供すること。【解決手段】バイオインフォマティクスの観点から設計されたプローブについてハイブリダイゼーション温度及びハイブリダイゼーション時間を各々別個に変化させて標的遺伝子配列を含む核酸とハイブリダイゼーション反応させ、ハイブリッド体の形成を示すシグナル強度について、ハイブリダイゼーション温度の上昇に対する第１の変化プロファイルと、ハイブリダイゼーション時間の延長に対する第２の変化プロファイルとを作成し、第１のプロファイルが極大値を示し、且つ該第２のプロファイルが単純増加を示すハイブリッド体を構成しているプローブを標的核酸との特異性の高いプローブと判定する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子配列の少なくとも一部に相補的な配列を有し、該標的遺伝子とハイブリッド体を形成するプローブの選択方法であって、
（ｉ）ＧＣ％に基づくＴｍ値及び他の遺伝子配列との相同性検索により複数の候補プローブを選択する工程と；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で選択された候補プローブから、前記標的遺伝子との特異性の高いプローブを選択する工程と、を有し、
前記工程（ｉｉ）は、
（ｉｉ−１）前記候補プローブの各々と前記標的遺伝子を含む検体とを、ハイブリダイゼーション温度及びハイブリダイゼーション時間を各々別個に変化させてハイブリダイゼーション反応させる工程と、
（ｉｉ−２）前記候補プローブと前記標的遺伝子とのハイブリッド体の形成を示すシグナル強度を検出する工程と、
（ｉｉ−３）（ｉｉ−２）の工程に基づいて前記各候補プローブについて、
ハイブリダイゼーション時間一定下における複数の前記ハイブリダイゼーション温度での前記シグナル強度について、該ハイブリダイゼーション温度の上昇に対する該シグナル強度の変化を示す第１の変化プロファイルと、
ハイブリダイゼーション温度一定下における複数の前記ハイブリダイゼーション時間での前記シグナル強度について、該ハイブリダイゼーション時間の延長に対する該シグナル強度の変化を示す第２の変化プロファイルとを作成する工程と、
（ｉｉ−４）前記第１のプロファイルが１つの極大点を有し、且つ前記第２のプロファイルが単純増加を示す前記ハイブリッド体を構成している候補プローブを前記標的核酸との特異性の高いプローブと判定する工程、
を有することを特徴とするプローブの選択方法。
【請求項２】
標的遺伝子に対してハイブリダイズするプローブが固相上に配置されているプローブ担体において、
該プローブは、ハイブリダイゼーション温度及びハイブリダイゼーション時間を各々別個に変化させて行う前記標的遺伝子とのハイブリダイゼーション反応で検出される該標的遺伝子とのハイブリッド体の形成を示すシグナル強度についての前記第１の変化プロファイルが１つの極大点を有し、且つ前記第２のプロファイルが単純増加を示すことを特徴とするプローブ担体。
【請求項３】
標的遺伝子に対してハイブリダイズするプローブであって、
ハイブリダイゼーション温度及びハイブリダイゼーション時間を各々別個に変化させて行う前記標的遺伝子とのハイブリダイゼーション反応で検出される該標的遺伝子とのハイブリッド体の形成を示すシグナル強度についての前記第１の変化プロファイルが１つの極大点を有し、且つ前記第２のプロファイルが単純増加を示すことを特徴とするプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブの選択方法、プローブ担体及びプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年遺伝子の網羅的な解析を行うツールとして、マイクロアレイが広く用いられている。マイクロアレイの固相上にはＤＮＡ断片（プローブ）が共有結合または吸着しており、ターゲットとなる遺伝子配列と相補的な塩基配列を有するプローブのみがハイブリッド体を形成する。そのハイブリッド体が示すシグナルを解析することにより、遺伝子の解析を行うことが可能である。マイクロアレイの固相上に配置されるプローブの長さは数十ｂａｓｅから数千ｂａｓｅに及び、解析の目的によって使い分けられている。中でも、ターゲット遺伝子に特有な塩基配列から選択された数十ｂａｓｅのオリゴヌクレオチドをプローブとして配置したマイクロアレイは、特定遺伝子の発現状態の解析に用いられることが多い。
【０００３】
遺伝子の発現を解析するマイクロアレイにおいて、プローブの塩基配列は各遺伝子に特有の配列を用いる必要がある。仮に複数の遺伝子に共通するような塩基配列をプローブとして設定した場合、所望外の遺伝子配列ともハイブリダイゼーションし、正確な測定結果が得られなくなってしまうからである。測定精度が高いマイクロアレイを作製するためには、ターゲット遺伝子に特有の塩基配列、つまり特異性の高い塩基配列をプローブとして設計、選択することが必須と言える。
【０００４】
特異性の高いプローブを設計するため、バイオインフォマティクスの観点からコンピュータ上でプローブを設計する手法が数多く開発されている。特許文献１には、対象遺伝子の塩基配列データを取得した後、部分塩基配列をツリー状に分類し、融解温度（Ｔｍ）やエントロピーの変化からプローブとして適切であるか評価する方法が開示されている。また、特許文献２には、遺伝子配列間のマッチング数や融解温度（Ｔｍ）によるハイブリダイゼーション強度をモデリングし、プローブ配列の相同性や特異性を解析、選別する方法が開示されている。
【特許文献１】特開２００３−０００２８０号公報
【特許文献２】特許第０３０５５９４２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし本発明者の検討によれば、上記した従来の技術に基づき、様々なパラメータを用いて設計したプローブが、必ずしも良好な実験結果を示すとは限らなかった。これは、例えば遺伝子配列間のマッチング数によってはターゲット遺伝子以外ともハイブリダイゼーションする可能性があり、実験で得られたシグナル強度がターゲット遺伝子のみとのハイブリダイゼーションによるものとは言い切れない場合もあると考えられる。
【０００６】
またプローブの塩基配列が特異的であっても、プローブが分子内で２本鎖を形成し、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションしない場合も考え得る。
【０００７】
従って、コンピュータ上で設計、選別されたプローブであっても、それらの中から、より特異性の高いプローブを選択することが標的核酸をより一層高精度に検出する上で必要であるとの認識を得るに至った。
【０００８】
よって、本発明の目的は、標的核酸に対して、より一層特異性の高いプローブを選択する方法を提供すること、及び標的核酸の特異的検出能に優れたプローブ及びプローブ担体を提供する点にある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の目的を達成すべく、バイオインフォマティクス等の従来法によって設計された複数種のオリゴプローブをターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションさせ、反応条件の変化に伴うシグナル強度の変化のパターンを観察した。具体的には、ハイブリダイゼーションによって形成される標識化ハイブリッドからのシグナル強度の、ハイブリダイゼーション時間およびハイブリダイゼーション温度の変化に対する変化のプロファイルを観察した。その結果、当該複数種のオリゴプローブ由来のハイブリッド体の各々が示すプロファイルと、それら複数種のオリゴプローブのターゲット遺伝子に対する特異性との間に相関があることを見出した。本発明は、係る知見に基づきなされたものである。
【００１０】
本発明に係る一態様によれば、標的遺伝子配列の少なくとも一部に相補的な配列を有し、該標的遺伝子とハイブリッド体を形成するプローブの選択方法であって、
（ｉ）ＧＣ％に基づくＴｍ値及び他の遺伝子配列との相同性検索により複数の候補プローブを選択する工程と；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で選択された候補プローブから、前記標的遺伝子との特異性の高いプローブを選択する工程と、を有し、
前記工程（ｉｉ）は、（ｉｉ−１）前記候補プローブの各々と前記標的遺伝子とを、ハイブリダイゼーション温度及びハイブリダイゼーション時間を各々別個に変化させてハイブリダイゼーション反応させる工程と、
（ｉｉ−２）前記候補プローブの各々と前記標的遺伝子とのハイブリッド体の形成を示すシグナル強度を検出する工程と、
（ｉｉ−３）前記工程（ｉｉ−２）に基づいて、ハイブリダイゼーション時間一定下における複数の前記ハイブリダイゼーション温度での前記シグナル強度について、該ハイブリダイゼーション温度の上昇に対する該シグナル強度の変化を示した第１の変化プロファイルと、ハイブリダイゼーション温度一定下における複数の前記ハイブリダイゼーション時間での前記シグナル強度について、該ハイブリダイゼーション時間の延長に対する該シグナル強度の変化を示した第２の変化プロファイルとを作成する工程と、
（ｉｉ−４）前記第１のプロファイルが１つの極大点を有し、且つ前記第２のプロファイルが単純増加を示す前記ハイブリッド体を構成している候補プローブを前記標的核酸との特異性の高いプローブと判定する工程、を有することを特徴とするプローブの選択方法が提供される。
【００１１】
本発明の他の態様によれば、標的遺伝子に対してハイブリダイズするプローブが固相上に配置されているプローブ担体において、
該プローブは、ハイブリダイゼーション温度及びハイブリダイゼーション時間を各々別個に変化させて行う前記標的遺伝子とのハイブリダイゼーション反応で検出される該標的遺伝子とのハイブリッド体の形成を示すシグナル強度についての前記第１の変化プロファイルが１つの極大点を有し、且つ前記第２のプロファイルが単純増加を示すことを特徴とするプローブ担体が提供される。
【００１２】
本発明の更に他の態様によれば、標的遺伝子に対してハイブリダイズするプローブであって、
ハイブリダイゼーション温度及びハイブリダイゼーション時間を各々別個に変化させて行う前記標的遺伝子とのハイブリダイゼーション反応で検出される該標的遺伝子とのハイブリッド体の形成を示すシグナル強度についての前記第１の変化プロファイルが１つの極大点を有し、且つ前記第２のプロファイルが単純増加を示すことを特徴とするプローブが提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、プローブ固定担体用に設計された標的遺伝子配列と相補的な配列からなるプローブ群から、標的遺伝子以外の遺伝子とも干渉してシグナルを生じるプローブを除き、標的遺伝子のみを特異的に検出するプローブを選択する方法を提供する。
【００１４】
本発明の選択方法により選択された標的遺伝子のみを特異的に高精度に検出できるプローブ、およびプローブ固定担体を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１６】
本発明に係るプローブの選択方法は、バイオインフォマティクスの観点から設計された標的オリゴプローブ（候補プローブ）を更に選別するための方法である。この方法は候補プローブと標的核酸との標識化ハイブリッド体が示すシグナル強度のハイブリダイゼーション時間及び温度に対する特徴的な変化を選択指標とする。この選択指標によって一種類のハイブリダイゼーション条件下では不可能であった、標的遺伝子発現状況のみを反映するプローブの選択を可能とする。
【００１７】
標的遺伝子配列とは、検査対象となる遺伝子（標的遺伝子）をコードする領域全体を対象として、その領域の少なくとも一部を含む配列である。ゆえにＤＮＡにあっては構造遺伝子以外の配列であっても、その遺伝子を特定することができる配列であれば、いわゆる調節領域やイントロンに含まれる配列も含まれる。標的遺伝子配列を有する核酸（以下、標的核酸ともいう）は天然に存在する核酸（例えば動物、植物、微生物、ウイルス等の試料に由来する核酸）、人工的に合成した核酸（例えば化学的または遺伝子工学的に合成した核酸）のいずれも利用することができる。検体に含まれる標的核酸は、各試料からの検体の調製方法によってゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡまたはｃＤＮＡなどの各種形態を利用することができる。よって、標的遺伝子配列と相補的な配列は、標的核酸の形態によって標的遺伝子配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖のどちらに相補的であるかを考慮して選ばれる。また、標的遺伝子とハイブリッド体を形成するとは、標的核酸と候補プローブ（および選択プローブ）とが相補的な領域でハイブリッド体を形成することをいう。
【００１８】
標的遺伝子の候補プローブを設計するため、まず始めに標的遺伝子の塩基配列を取得する。この際、塩基配列は公共のデータベースから取得された配列、またはシーケンサーによって解読された塩基配列を用いてよい。
【００１９】
この標的遺伝子の候補プローブは、標的遺伝子配列の少なくとも一部に相補的な配列からなる核酸プローブとしてバイオインフォマティクスの観点から設計される。この塩基配列中に候補プローブを設計する際、バイオインフォマティクスの観点に基づいた設計方法としては、例えば以下の工程が挙げられる。
（１）所望の長さの部分配列を、標的遺伝子の塩基配列の５’末端に設定する。５’末端から３’末端に向かって１塩基ずつずらしていき、３’末端に達するまで多数の部分配列を設定する。
（２）（１）で設定された部分配列また、これと相補的な配列のうち、検出対象のゲノムや遺伝子が有するＧＣ％に応じた値、またはその他所望のＧＣ％を示す配列を選択する。
（３）ＧまたはＣが４個以上連続する配列を除く。
（４）最近接法により算出された融解温度（Ｔｍ）が所望の数値を示す配列を選択する。
（５）（１）〜（４）により選択されたプローブについて、他の遺伝子との相同性または相補性を確認し、所望の遺伝子配列のみと一致する、または相補的である部分配列を選択する。
【００２０】
上記（１）から（５）の選別を行うため、（１）から（５）をまとめておこなう一つのプログラムを作成しても良いし、上記工程を分割して行う複数のプログラムを作成しても良い。上記工程を経て選別された候補プローブは、ＴｍやＧＣ％などのパラメータが同程度の範囲に収まっている。しかし、これらの候補プローブを、実際にマイクロアレイ上に配置した際、どのプローブも標的核酸を特異的に検出できるとは限らず、これらの候補プローブから、より好適なプローブを選別する必要がある。そこで、これらのプローブを標的核酸に反応させて、プローブ−標的核酸の標識化ハイブリッド体を形成する。そして、該ハイブリッド体が示すシグナル強度の挙動を更なる選択指標とする。
【００２１】
即ち、ハイブリダイゼーション時間一定下での複数のハイブリダイゼーション温度（測定温度条件）においてハイブリッド体を形成させ、温度を上昇させたときの該ハイブリッド体から観察されるシグナル強度の変化プロファイル（第１の変化プロファイル）を作成する。
【００２２】
同様に、ハイブリダイゼーション温度一定下での複数のハイブリダイゼーション時間（測定時間条件）においてハイブリッド体を形成させ、時間を長くしたときの該ハイブリッド体から観察されるシグナル強度の変化プロファイル（第２の変化プロファイル）を作成する。
【００２３】
そして、第１の変化プロファイルが１つの極大点を有し、かつ第２の変化プロファイルが単純増加を示したハイブリッド体を構成している候補プローブを標的核酸に対する特異性の高いプローブと判定するものである。ここで、第１の変化プロファイルが１つの極大点を有するとは、ある１点の測定温度においてのみシグナル強度が極大となることをいう。つまり、第１の変化プロファイルが１つの測定温度でのみ、その測定温度より１条件低い測定温度および１条件高い測定温度のいずれのシグナル強度よりも高いシグナル強度を有していることをいう。また第２の変化プロファイルが単純増加を示すとは、第２の変化プロファイルの各々の測定時間条件におけるシグナル強度が、１条件短い測定時間でのシグナル強度とくらべて高いこと（増減がない場合を含んでもよい）をいう。さらに単純減少を示すとは、各々の測定時間条件におけるシグナル強度が、１条件短い測定時間でのシグナル強度とくらべて低いこと（増減がない場合を含んでもよい）をいう。
【００２４】
より具体的には、上記（１）から（５）の工程を経て選別された候補プローブを基板上に共有結合、または吸着させてマイクロアレイを作製する。プローブの標的となる核酸を含む、多種類の核酸を当該マイクロアレイにハイブリダイゼーションさせる。この際、反応温度と反応時間を別個に変化させた複数の条件下でハイブリダイゼーションを行う。ただしこれらのハイブリダイゼーション反応について、反応温度と時間以外の条件はすべて同様に行うものとする。所望の条件によるハイブリダイゼーションが終了した後、プローブ−標的核酸のハイブリッド体が示すシグナル強度を検出する。プローブ−標的核酸が示すシグナルは、蛍光、化学発光、吸光度、電圧のいずれでも良い。シグナルとして蛍光、化学発光、吸光度などを用いる場合には、ハイブリッド体が標識化されている必要がある。標識化ハイブリッド体の形成は、プローブ及び標的核酸の何れか一方を予め標識化しておいても良く、或いはハイブリッド体を形成後に標識を付しても良い。
【００２５】
ハイブリダイゼーション条件によってそれぞれのシグナル強度は異なる。すなわち、プローブの特異性が高くターゲットの配列と完全に一致している場合は、ハイブリダイゼーション時間の延長に応じてシグナル強度が増加し、ハイブリダイゼーション温度の上昇によってシグナル強度は１点で極大値を示す。一方、プローブの特異性が低く、所望でないターゲットと部分的にハイブリダイゼーションしている場合、ハイブリダイゼーション時間の延長によってシグナル強度は低下し、ハイブリダイゼーション温度を変化させてもシグナル強度は極大値を示さない。
【００２６】
すなわち、ハイブリダイゼーション時間の延長によってシグナル強度が増大し、かつ温度変化によって極大値を示すハイブリッド体を構成しているプローブが標的核酸に対して、より特異性の高いプローブであると判定することが可能となる。
【００２７】
こうして選択されたプローブは、単独で、或いは固相上に配置してプローブ担体として、標的核酸の検出に供することで、より一層高精度な特異的検出に用いることができる。
【００２８】
ハイブリダイゼーション温度は、候補プローブのＴｍ値に応じて設定し、少なくとも３点以上必要である。候補プローブのＴｍ値より低い温度範囲での測定であって、Ｔｍより４０℃以下から１０℃以下で５℃間隔で測定することで設定可能である。また、この場合、ハイブリダイゼーション時間は同じ長さに設定するが、ハイブリダイゼーション反応が進行するのに十分な時間であればよく、当業者であれば設定可能であるが、例えば１６時間以上に設定することができる。また、周知慣用方法にもとづいて１６時間で行うこともできる。一方、ハイブリダイゼーション時間の設定は、測定箇所は少なくとも３点以上必要である。ハイブリッド体の形成の始まりから、十分に反応が進行するまでの時点を含むことが望ましいが、より簡易な条件とするため、反応開始から４時間から１６時間の間で、２時間ごとの経過時点で測定する設定が好適に利用できる。さらに条件を少なくして、開始から４時間、８時間、１６時間の３点で測定することもできる。この場合、ハイブリダイゼーション温度は、前記で設定された複数の温度条件を用いることができる。さらに条件を少なくして、前記で設定された温度条件のうち、極大点を示す温度だけで測定することもできる。
【実施例】
【００２９】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜実施例１＞
ヒトのトータルＲＮＡと細菌のＲＮＡを用いて、プローブのターゲットとなる核酸を以下の手順により調製した。
【００３０】
Ｉ．リニア増幅法による検体調製
（１）逆転写によるｃＤＮＡの合成、精製
ユニバーサル  ヒトトータルＲＮＡ（ベクトンデッキンソン社製）５μｇとＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｐｏｌｙ−Ａ  ＲＮＡ  （アフィメトリックス社製）０．１５μｇとを、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ（商品名：ＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ；ＭＯＢＩＯ社製）に、全量が１１μｌとなるように溶解した。次いで、これにＴ−７−（ｄＴ）  ２４  Ｐｒｉｍｅｒ（タカラバイオ社）１μｌを加えた後、７０℃で１０分間インキュベートした。その後表１の試薬を表記順に加え、４２℃で１時間インキュベートし、逆転写反応を行った。
【００３１】
【表１】
2008136425.tif 000002
【００３２】
さらに表２の試薬を表記順に加え、１６℃で２時間インキュベートし、２本鎖ＤＮＡを合成した。
【００３３】
【表２】
2008136425.tif 000003
【００３４】
最後にＴ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｅｍｅｒａｓｅ  （インビトロジェン社製）  ２μｌを加えて１６℃で５分間インキュベートし、両端の一本鎖の部分を二本鎖に調製した。続いてＤＮＡ精製用のゲル（商品名：Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ；エッペンドルフ社製）を用いてＤＮＡを精製し、５０μｌのＤＮＡ溶液を得た(手順は表３参照)。
【００３５】
【表３】
2008136425.tif 000004
【００３６】
（２）標識ｃＲＮＡの合成、精製
ｃＲＮＡの合成には、ｃＲＮＡ合成キット（商品名：Ｔ７  ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｋｉｔ  ；アンビオン社製）を用いた。表４の順に以下の試薬を加え、３７℃で４時間インキュベートした。ｃＲＮＡの合成後、ＲＮＡ精製キット（商品名：Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；キアゲン社製)を用いて精製し、１００μｌのｃＲＮＡ溶液を得た（手順は表５を参照）。ナノドロップ分光光度計（ナノドロップテクノロジー社製）を用いてこのｃＲＮＡ溶液の吸光度を測定し濃度を求めたところ、３６５．２ｎｇ／ｕｌだった。
【００３７】
【表４】
2008136425.tif 000005
【００３８】
【表５】
2008136425.tif 000006
【００３９】
ＩＩ．ＤＮＡマイクロアレイの作製
（１）２５ｍｅｒプローブの設定Ｉで合成されたｃＲＮＡ中における、ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｔｈｒ）を検出するため、各種の２５ｍｅｒプローブを設定した。ｔｈｒを特異的に検出するコントロールプローブとして、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社から開示されている一部の配列を用いた。また、コントロールプローブ配列のうち、１塩基だけ異なる配列を設定し、特異性の異なるミスマッチプローブとして用いた。その他ネガティブコントロールとして、プラスミドベクターであるｐＵＣ１１８に含まれる遺伝子配列と完全な相補性を有するプローブを設計した。ｐｕＣ１１８のプローブを設計する際、ＧＣ％は５０±２％、融解温度（Ｔｍ値）は７０±２℃（ＮｅａｒｅｓｔＮｅｉｇｈｂｏｒ法により計算、［Ｎａ+］＝９００ｍＭ）となる配列をまず選択した。さらに米国のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが構築した相同性検索プログラム（ＢＬＡＳＴ；Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）にて検索を行い、他の遺伝子とクロスハイブリダイゼーションしない配列をプローブとして設定した。
【００４０】
設定されたプローブの塩基配列およびＴｍ値を表６に示す。なお、表６に示されているＴｍ値は塩濃度が［Ｎａ＋］＝９００ｍＭの場合の値とする。
【００４１】
【表６】
2008136425.tif 000007
【００４２】
（２）ガラス基板の洗浄
ホウ珪酸のガラス基板（サイズ（Ｗ×Ｌ×Ｔ）：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリ性のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩、洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて、ガラス基板を取り出し、軽く純水で漱いだ後、超純水中で２０分超音波洗浄を行った。次に、８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間、ガラス基板を浸した。再び、純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の洗浄済ガラス基板を用意した。
【００４３】
（３）表面処理
シランカップリング剤（商品名：ＫＢＭ−６０３；信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、洗浄済ホウ珪酸ガラス基板を、このシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、ガラス基板の表面に窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。次に、窒素ブロー乾燥したガラス基板を、１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させた。このカップリング剤処理により、ガラス基板表面に、シランカップリング剤由来のアミノ基が導入された。
【００４４】
一方、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）；以下、ＥＭＣＳと略す）（同仁化学研究所社製）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ベーク終了後、カップリング剤処理済ガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この浸漬処理間に、カップリング処理済ガラス基板の表面に導入されているアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基とが反応し、ガラス基板表面にＥＭＣＳ由来のマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のジメチルスルホキシドとエタノールの混合溶媒を用いて洗浄し、さらに、エタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００４５】
（４）プローブ用ＤＮＡの合成
上記（１）で設計したプローブを合成した。プローブＤＮＡは、上記の表面にマレイミド基が導入されガラス基板に対して共有結合させるため、定法に従って、５’末端にチオール化処理を施した。その後、ＤＮＡ合成時における副反応を避けるために、保護基を脱保護し、さらにＨＰＬＣ精製および脱塩処理を施した。
【００４６】
得られたプローブＤＮＡは、純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【００４７】
（５）ＢＪプリンターによるプローブＤＮＡ吐出、および基板表面への結合
グリセリン７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、分注したプローブＤＮＡを上記の混合溶媒に規定濃度（１０μＭ）となるように溶解した。得られたプローブＤＮＡ溶液を、バブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０、キヤノン（株）社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００４８】
なお、前記バブルジェットプリンターは、平板へのインクジェット印刷が可能なように改造を施したものである。また、該改造バブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ｐｌのＤＮＡ溶液液滴を、約１２０μｍピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【００４９】
続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、ガラス基板表面にプローブＤＮＡ溶液のスポッティング操作を行った。ＤＮＡマイクロアレイ１枚あたり、プローブ毎に１６スポットの吐出が行われるよう印字のパターンを予め作製し、インクジェット印字した。目的のパターンにＤＮＡ溶液のスポッティングが確実に行われていることを拡大鏡等により確認した後、３０分間常温で加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基とプローブＤＮＡ５’末端のスルファニル基（−ＳＨ）とを反応させた。
【００５０】
（６）洗浄
加湿チャンバー内における３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により、ガラス基板表面に残った未反応のプローブＤＮＡを洗い流した。ガラス基板表面に、各ＤＮＡチップ当たり１６スポットに所定の一本鎖プローブＤＮＡが、それぞれ固定された、ＤＮＡマイクロアレイ型ＤＮＡチップを得た。
【００５１】
上記（１）〜（６）の手順に従って、合計７枚のＤＮＡチップを用意した。
【００５２】
ＩＩＩ．ハイブリダイゼーション反応
ＩＩで作製した７枚のＤＮＡチップの各々と、サンプル核酸検体としてＩで調製した標識ｃＲＮＡを用いて、ハイブリダイゼーション反応を行った。
【００５３】
（１）ハイブリダイゼーション溶液の調製
上記Ｉ（２）で調製したｃＲＮＡに対しハイブリダイゼーション溶液を調製した。
【００５４】
【表７】
2008136425.tif 000008
【００５５】
６×ＳＳＰＥ：ＮａＣｌ  ９００ｍＭ、ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ  ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ６ｍＭ、ｐＨ  ７．４
ＳＤＳ：Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ,  ＢＳＡ：Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ウシ血清アルブミン）
（２）ハイブリダイゼーション
水切りした７枚のＤＮＡチップを、ハイブリダイゼーション装置(ゲノミックソリューション．インク ハイブリダイゼーションステーション)にセットした。上記組成のハイブリダイゼーション溶液を用いて、下記表８に示す手順と表９に示す条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００５６】
【表８】
2008136425.tif 000009
【００５７】
【表９】
2008136425.tif 000010
【００５８】
（３)蛍光染色
ハイブリダイゼーション反応終了後、下記表１０の通り調製した蛍光試薬を基板のアレイ上に添加し、室温で３０分間遮光して反応させた。
【００５９】
【表１０】
2008136425.tif 000011
【００６０】
反応後、２×ＳＳＣに５分間浸し、０．１×ＳＳＣでリンスしてスピン・ドライ乾燥した。
【００６１】
（４）蛍光測定
蛍光染色反応後、各々のＤＮＡチップについて、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（商品名：Ｇｅｎｅｐｉｘ  ４０００Ｂ；アキソン社製）を用いて、ハイブリッド体に由来する蛍光測定を行った。
【００６２】
輝度の算出にあたっては、ＤＮＡチップ上、プローブＤＮＡのスポットのない部分において観測される蛍光輝度をバックグラウンド値として、各スポットからの見掛けの蛍光強度より、バックグラウンド値を差し引いた値を、蛍光強度の実測値とした。
【００６３】
（５）結果
以下図１に実験１におけるプローブの蛍光強度の実測値変化、図２に実験２におけるプローブの蛍光強度の実測値変化を示す。
【００６４】
図１の結果から２５ｍｅｒプローブにおいて、ポジティブコントロールのようにターゲットとの特異性が高いプローブはハイブリダイゼーション時の温度変化によって蛍光強度に極大値が現れることが示された。またミスマッチプローブのように特異性が低いプローブは同様の条件でも極大値が現れないことが同様に示された。また図２の結果から、特異性の高いプローブはハイブリダイゼーション時間の延長によって蛍光強度が増加し、特異性の低いプローブは同様の条件において蛍光強度が低下することが示された。一方、ターゲットの配列と一致しないネガティブプローブはハイブリダイゼーション条件の変化によらず、蛍光強度を示さなかった。
＜実施例２＞
胃癌標準細胞ＫＡＴＯＩＩＩ、及び正常ヒト繊維芽細胞Ｆｉｂｌｏｂｌａｓｔから抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡとＤＮＡアレイを用いて、６０ｍｅｒフルマッチプローブ−ターゲットのハイブリッド体が示すシグナル強度の挙動を検出した。
【００６５】
Ｉ．細胞からトータルＲＮＡの抽出
胃癌標準細胞ＫＡＴＯＩＩＩ（大日本製薬社）の懸濁液に、ＲＮＡ抽出キット（商品名：Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ；キアゲン社製）とＲＮＡ精製キット（商品名：Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；キアゲン社製）を用いて以下の方法により、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出、精製した。
【００６６】
まず、細胞懸濁液（１×１０6個／１００μｌ）にβメルカプトエタノールを含むＲＬＴ緩衝液を６００μｌ加え、混合液をＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒに添加した。１５，０００ｒｐｍで１分間遠心後、抽出液に７０％エタノールを３５０μｌ加えて、Ｒｎｅａｓｙのカラムに添加した。１２，０００ｒｐｍで１５秒間遠心後、廃液を捨ててからカラムにＲＷ１緩衝液を７００μｌ添加した。１２，０００ｒｐｍで１５秒間遠心後、新しいチューブにカラムをセットし、ＲＰＥ緩衝液を５００μｌ添加した。１２，０００ｒｐｍで２分間遠心後廃液を捨て、何も添加せずに１５，０００ｒｐｍで１分間遠心した。新しいチューブにカラムをセットし、Ｒｎａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを５０μｌ加えて１分間静置後、１２，０００ｒｐｍで１分間遠心してｔｏｔａｌ  ＲＮＡを溶出した。
【００６７】
上記と同様の方法で、正常ヒト繊維芽細胞Ｆｉｂｌｏｂｌａｓｔ（倉敷紡績株式会社）の懸濁液からもｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出、精製した。
【００６８】
なお、東京大学が構築した網羅的な遺伝子発現データベース  ＲｅｆＥＸＡ（東京大学ＲＣＡＳＴシステム生物医学ラボラトリーデータベース）によると、ＴＡＣＳＴＤ１はＫＡＴＯＩＩＩにおいては高発現だが、Ｆｏｂｌｏｂｌａｓｔではほとんど発現していない。
【００６９】
ＩＩ．リニア増幅法による検体調製
上記Ｉ．で抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡについて、実施例１−Ｉに記載の方法に従って検体調製を行った。ナノドロップ分光光度計（ナノドロップテクノロジー社製）を用いてこれらの標識ｃＲＮＡ溶液の吸光度を測定し濃度を求めたところ、ＫＡＴＯＩＩＩでは３９５．７ｎｇ／ｕｌ、Ｆｉｂｌｏｂｌａｓｔでは３８７．５ｎｇ／ｕｌだった。
【００７０】
ＩＩＩ．ＤＮＡチップの作製
（１）プローブの設計および合成
ＩＩで合成された標識ｃＲＮＡ中の特定遺伝子（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  １（ＴＡＣＳＴＤ１）））の有無を検出するため、２種類のフルマッチプローブを設定した。各プローブを設定する際、まずＧＣ％は４１±２％、融解温度（Ｔｍ値）は８８±２℃（ＮｅａｒｅｓｔＮｅｉｇｈｂｏｒ法により計算、［Ｎａ+］＝９００ｍＭ）となる配列をまず選択した。さらに米国のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが構築した相同性検索プログラム（ＢＬＡＳＴ；Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）にて検索を行い、他の遺伝子とクロスハイブリダイゼーションしない配列をプローブとして設定した。設定されたプローブの塩基配列およびＴｍ値を表１１に示す。なお、表１１に示されているＴｍ値は塩濃度が［Ｎａ＋］＝９００ｍＭの場合の値とする。
【００７１】
【表１１】
2008136425.tif 000012
【００７２】
（２）ＤＮＡチップの作製
ホウ珪酸ガラスを用いたＤＮＡチップの作製方法は実施例１−ＩＩに従った。
合計６枚のＤＮＡチップを用意した。
【００７３】
ＩＶ．ハイブリダイゼーション反応
ＩＩＩで作製したＤＮＡチップと、サンプル核酸検体としてＩで調製した標識ｃＲＮＡを用いて、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションを行った。
【００７４】
（１）ハイブリダイゼーション溶液の調製
上記Ｉ（２）で調製した２種類の標識ｃＲＮＡ（ＫＡＴＯＩＩＩ由来の標識ｃＲＮＡ、ＦＩｂｒｏｂｌａｓｔ由来の標識ｃＲＮＡ）に対し、表１２の通りに各々のハイブリダイゼーション溶液を調製した。
【００７５】
【表１２】
2008136425.tif 000013
【００７６】
（２）ハイブリダイゼーション
実施例１と同様にして、水切りしたＤＮＡチップを、ハイブリダイゼーション装置（商品名：ハイブリダイゼーションステーション；ゲノミックソリューション・インク社製）にセットした。上記組成の各ハイブリダイゼーション溶液を用いて、下記表１３に示す手順と表１４に示す条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００７７】
【表１３】
2008136425.tif 000014
【００７８】
【表１４】
2008136425.tif 000015
【００７９】
（３）蛍光染色、蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応終了後、実施例１に倣って蛍光染色、蛍光測定を行った。
【００８０】
（４）結果
図３に、ＫＡＴＯＩＩＩ由来の標識ｃＲＮＡを用いて行った実験１から得られた、配列番号４及び５に係る各プローブ由来のハイブリッド体からのシグナル強度のハイブリダイゼーション温度の上昇に対する変化プロファイルを示す。図４にＫＡＴＯＩＩＩ由来の標識ｃＲＮＡを用いて行った実験２から得られた、配列番号４及び５に係る各プローブ由来のハイブリッド体からのシグナル強度のハイブリダイゼーション時間の延長に対する変化プロファイルを示す。
また図５に、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ由来の標識ｃＲＮＡを用いて行った実験１から得られた、配列番号４及び５に係る各プローブ由来のハイブリッド体からのシグナル強度のハイブリダイゼーション温度の上昇に対する変化プロファイルを示す。更に図６にＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ由来の標識ｃＲＮＡを用いて行った実験２から得られた、配列番号４及び５に係る各プローブ由来のハイブリッド体からのシグナル強度のハイブリダイゼーション時間の延長に対する変化プロファイルを示す。
【００８１】
なお、東京大学のデータベース  ＲｅｆＥＸＡ（東京大学ＲＣＡＳＴシステム生物医学ラボラトリーデータベース）によると、ＴＡＣＳＴＤ１はＫＡＴＯＩＩＩにおいては高発現だが、Ｆｉｂｌｏｂｌａｓｔではほとんど発現していない。
【００８２】
図３及び図４から明らかな様に、配列番号５に係るプローブ由来のハイブリッド体からの蛍光強度は、配列番号４に係るプローブ由来のハイブリッド体からの蛍光強度よりも強い。このことから、ＴＡＣＳＴＤ１検出用のプローブとしては、配列番号５に係るプローブが、配列番号４に係るプローブよりも適しているかのように見える。
【００８３】
しかし、前記したように、Ｆｉｂｌｏｂｌａｓｔでは、ＴＡＣＳＴＤ１は、殆ど発現していない。それにも関わらず、図５及び図６から明らかなように、配列番号５に係るプローブ由来のハイブリッド体からの蛍光が観察されている。これは、配列番号５に係るプローブが、ＴＡＣＳＴＤ１に対して結合する一方で、他の遺伝子に対しても結合すること、即ち、ＴＡＣＳＴＤ１に対する特異性が低いプローブであることを示している。一方、配列番号４に係るプローブは、図５及び図６から明らかな様に、Ｆｉｂｌｏｂｌａｓｔ由来のｃＲＮＡとのハイブリッド体の形成を示す蛍光は全く観察されていない。即ち、このことは、配列番号４に係るプローブは、ＴＡＣＳＴＤ１に対する特異性が高いプローブであることを示している。
【００８４】
ここで、図３に示した各プローブ由来のハイブリッド体からのシグナル強度の、ハイブリダイゼーション温度の上昇に対する変化プロファイルから次のことがわかる。ＴＡＣＳＴＤ１に対する特異性の認められない配列番号５に係るプローブ由来のハイブリッド体のそれは、ハイブリダイゼーション温度が高くなるにつれて単純減少している。それに対して、配列番号４に係るプローブ由来のハイブリッド体のそれは、ハイブリダイゼーション温度の上昇に対して極大を示している。これらのプロファイルのパターンは、図１に示した、実施例１に係るミスマッチプローブ由来のハイブリッド体が示した蛍光強度の変化パターン及びポジティブプローブ由来のハイブリッド体が示した蛍光強度の変化パターンと同様である。
【００８５】
また、図４は、各プローブ由来のハイブリッド体からのシグナル強度の、ハイブリダイゼーション時間の延長に対する変化プロファイルを示している。このプロファイルより、配列番号５に係る当該シグナル強度は、ハイブリダイゼーション時間が長くなるにつれて単純減少しているのに対して、配列番号４に係る当該シグナル強度は、ハイブリダイゼーション時間の延長に対して単純増加を示していることがわかる。
【００８６】
これらのプロファイルのパターンも、図２に示した、実施例１に係るミスマッチプローブ由来のハイブリッド体が示した蛍光強度の変化パターン及びポジティブプローブ由来のハイブリッド体が示した蛍光強度の変化パターンと同様である。
【００８７】
つまり、配列番号５に係るプローブは、ＫＡＴＯＩＩＩ由来の標識ｃＲＮＡとの反応により、所望外のｃＲＮＡとも非特異的にハイブリダイゼーションしたことが推測できる。また、配列番号４に係るプローブは、ＴＡＣＴＤ１と完全マッチのハイブリッド体を形成したことが推測できるものである。
【００８８】
更に、上記実施例１及び２の結果から、第１のプロファイルにおいてハイブリダイゼーション時の温度上昇によって１点で極大値を示し、第２のプロファイルにおいて時間延長によって輝度が上昇するという基準を満たすプローブは標的核酸に対する特異性が高いと言える。
【００８９】
これより、検出対象配列と完全マッチのプローブ配列の中から、非特異的にハイブリダイゼーションするプローブを除き、検出対象配列と特異的なハイブリッドを形成するものを選択することが可能となる。よって、バイオインフォマティクスの観点から設計された候補プローブから、上記の基準を満たすものを選択し、標的核酸の検出に用いることで、より高精度な標的核酸の検出を行い得ると考えられる。
【００９０】
＜実施例３＞
胃癌標準細胞ＫＡＴＯＩＩＩから抽出したトータルＲＮＡとＤＮＡアレイを用いて、発現解析に適した６０ｍｅｒプローブの選択を行った。
【００９１】
Ｉ．細胞からトータルＲＮＡの抽出およびリニア増幅
実施例２に従って胃癌標準細胞ＫＡＴＯＩＩＩからトータルＲＮＡを抽出した後、リニア増幅を行った。ナノドロップ分光光度計（ナノドロップテクノロジー社製）を用いてこのｃＲＮＡ溶液の吸光度を測定し濃度を求めたところ、４００．８ｎｇ／ｕｌだった。
【００９２】
ＩＩ．ＤＮＡマイクロアレイの作製
（１）６０ｍｅｒプローブの設計および合成
Ｉで合成されたｃＲＮＡ中における、ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ５  （ＣＥＡ）、ＡＴＰａｓｅ，  ＮＡ＋／Ｋ＋  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｂｅｔａ  １  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＡＴＰ１Ｂ１）、ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＡＰ）、ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  １（ＢＣＡＳ１）とを検出するため、これらの遺伝子配列と完全相補的（フルマッチ）である６０ｍｅｒプローブを設定した。各プローブを設定する際、配列、ＧＣ％、融解温度（Ｔｍ値）に十分配慮して設計を行った。
【００９３】
設定されたプローブの塩基配列およびＴｍ値を表１５に示す。なお、表１５に示されているＴｍ値は塩濃度が［Ｎａ＋］＝９００ｍＭの場合の値とする。
【００９４】
【表１５】
2008136425.tif 000016
【００９５】
（２）ＤＮＡチップの作製
ホウ珪酸ガラスを用いたＤＮＡチップの作製方法は実施例１−ＩＩに従った。
合計６枚のＤＮＡチップを用意した。
【００９６】
ＩＩＩ．ハイブリダイゼーション反応
ＩＩで作製したＤＮＡマイクロアレイと、サンプル核酸検体としてＩで調製したリニア増幅産物（ｃＲＮＡ）を用いて、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションを行った。
【００９７】
（１）ハイブリダイゼーション溶液の調製
上記Ｉで調製したｃＲＮＡに対しハイブリダイゼーション溶液を調製した（表１６）。
【００９８】
【表１６】
2008136425.tif 000017
【００９９】
（２）ハイブリダイゼーション
実施例１に倣い、水切りしたＤＮＡチップを、ハイブリダイゼーション装置（ゲノミックソリューション．インク  ハイブリダイゼーションステーション）にセットした。上記組成のハイブリダイゼーション溶液を用いて、表１３に示す手順と表１４に示す実験１と実験２の各条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
【０１００】
（３）蛍光染色、蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応終了後、実施例１に倣って蛍光染色、蛍光測定を行った。
【０１０１】
（４）結果
図７に実験１におけるプローブの蛍光強度の実測値、図８に実験２におけるプローブの蛍光強度の実測値を示す。
【０１０２】
全８種類のプローブの中で、ハイブリダイゼーション温度の変化によって蛍光強度が極大値を示し、反応時間の延長によって蛍光強度が増大したものはＣＥＡ（配列番号６）とＡＴＰ１Ｂ１（配列番号９）の２種類だった。
【０１０３】
ＣＥＡ（配列番号７）、ＡＴＰ１Ｂ１（配列番号８）、ＰＡＰ（配列番号１４）、ＢＣＡＳ（配列番号１２）はハイブリダイゼーション温度の上昇、反応時間延長によって蛍光強度が低下した。
【０１０４】
ＰＡＰ（配列番号１１）とＢＣＡＳ（配列番号１３）はハイブリダイゼーション条件の変化によらず、蛍光強度をほとんど示さなかった。
【０１０５】
つまり実験１と実験２の結果から、ＣＥＡ（配列番号６）とＡＴＰ１Ｂ１（配列番号９）は特異性の高いプローブと考えられる。
【０１０６】
また同様に、ＣＥＡ（配列番号７）、ＡＴＰ１Ｂ１（配列番号８）、ＰＡＰ（配列番号１０）、ＢＣＡＳ（配列番号１２）は特異性が低いプローブと言える。
【０１０７】
一方、ＰＡＰ（配列番号１１）とＢＣＡＳ（配列番号１３）の特異性については不明である。
【０１０８】
そこで各プローブが各遺伝子の発現状況を反映しているか確認するため、ＫＡＴＯＩＩＩにおける遺伝子の発現状態をデータベースによって検索した（参照：東京大学ＲＣＡＳＴシステム生物医学ラボラトリー  ＲｅｆＥＸＡ）。その結果、ＫＡＴＯＩＩＩにおいてＣＥＡとＡＴＰ１Ｂ１は中〜高発現、ＰＡＰとＢＣＡＳ１はほとんど発現していないことが確認された。
【０１０９】
このことから、ほとんど蛍光を示さないＰＡＰ（配列番号１１）とＢＣＡＳ（配列番号１３）は各遺伝子の発現状況を反映していたことが示された。実験結果とデータベースの内容を照らし合わせると、遺伝子の発現状況を反映しているプローブはＣＥＡ（配列番号６）、ＡＴＰ１Ｂ１（配列番号９）、ＰＡＰ（配列番号１１）、ＢＣＡＳ（配列番号１３）であった。ＣＥＡ（配列番号６）とＡＴＰ１Ｂ１（配列番号９）はハイブリダイゼーション温度の変化によって蛍光強度が極大値を示し、反応時間の延長によって蛍光強度が増大することから、本発明に係る特異性の高いプローブの基準を満たしている。一方、ＰＡＰ（配列番号１１）、ＢＣＡＳ（配列番号１３）は特異性の低いプローブの条件（ハイブリダイゼーション温度の上昇、反応時間延長によって蛍光強度が低下する）には当てはまらなかった。
【０１１０】
ハイブリダイゼーション条件が一種類のみの場合、ＰＡＰやＢＣＡＳのプローブのように、蛍光を示すものと示さないものがある。また蛍光を示していても、ＣＥＡ（配列番号７）、ＡＴＰ１Ｂ１（配列番号８）のように、非特異的な結合による場合がある。つまり、バイオインフォマティクスの観点から選択されたプローブであっても、一種類のハイブリダイゼーション条件下ではどのプローブが正しい遺伝子発現状況を反映しているか判断することはできない。ハイブリダイゼーション条件を変化させた場合の蛍光強度の挙動を参考にプローブを選択すれば、より特異性の高いプローブを得ることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】実施例１に係る３種のプローブ由来のハイブリッド体の蛍光強度の、ハイブリダイゼーション温度の上昇に対する変化プロファイルを示すグラフである。
【図２】実施例１に係る３種のプローブ由来のハイブリッド体の蛍光強度の、ハイブリダイゼーション時間の延長に対する変化プロファイルを示すグラブである。
【図３】実施例２に係る２種のプローブとＫＡＴＯＩＩＩ由来のｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応の結果得られたハイブリッド体の蛍光強度の、ハイブリダイゼーション温度の上昇に対する変化プロファイルを示すグラフである。
【図４】実施例２に係る２種のプローブＫＡＴＯＩＩＩ由来のｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応の結果得られたハイブリッド体の蛍光強度の、ハイブリダイゼーション時間の延長に対する変化プロファイルを示すグラフである。
【図５】実施例２に係る２種のプローブとＦｉｂｌｏｂｌａｓｔ由来のｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応の結果得られたハイブリッド体の蛍光強度の、ハイブリダイゼーション温度の上昇に対する変化プロファイルを示すグラフである。
【図６】実施例２に係る２種のプローブとＦｉｂｌｏｂｌａｓｔ由来のｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応の結果得られたハイブリッド体の蛍光強度の、ハイブリダイゼーション時間の延長に対する変化プロファイルを示すグラブである。
【図７】実施例３に係る８種のプローブとＫＡＴＯＩＩＩ由来のｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応の結果得られたハイブリッド体の蛍光強度の、ハイブリダイゼーション温度の上昇に対する変化プロファイルを示すグラフである。
【図８】実施例３に係る８種のプローブとＫＡＴＯＩＩＩ由来のｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応の結果得られたハイブリッド体の蛍光強度の、ハイブリダイゼーション時間の延長に対する変化プロファイルを示すグラブである。
【図１】
2008136425.tif 000018
【図２】
2008136425.tif 000019
【図３】
2008136425.tif 000020
【図４】
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【図５】
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【図６】
2008136425.tif 000023
【図７】
2008136425.tif 000024
【図８】
2008136425.tif 000025
【配列表】
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