(57)【要約】【課題】  経口摂取した被検物質が線虫に与える影響を評価できる被検物質評価方法を提供する。【解決手段】  本発明は、被検物質を封入したマイクロカプセルを含有する培地中で線虫を飼育することで、経口摂取した被検物質の生物機能に対する効果を評価する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質を封入したマイクロカプセルを含有する培地中で線虫を飼育し、経口摂取した被検物質の生物機能に対する効果を評価する被検物質評価方法。
【請求項２】
前記線虫がシノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）である請求項1に記載の被検物質評価方法。
【請求項３】
被検物質の生物機能に対する効果を、線虫の寿命の長短により評価する請求項1または2に記載の被検物質評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線虫を用いた被検物質評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日莫大な数の化学物質が存在する。これらの化学物質の中には、農薬、生理活性物質、重金属、大気汚染ガスなどの毒性物質や、薬剤、栄養補助食品などの有用物質がある。
【０００３】
化学物質の効果を評価するには、マウス、ラット、イヌ、サルなどの高等動物が用いられている。しかし、高等動物を用いると、多大な労力と時間と費用を要する。一方、バクテリアを用いると、形体形成、器官形成などの高次の生命現象が見られず、代謝系も多細胞生物とのギャップが大きい。
【０００４】
このため、高等動物より簡易に試験が行え、ヒトのような動物の神経系、生殖器官を有し、しかもヒトとの類似度性がある動物を用いることが要求されている。このような動物として、線虫のシノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）を用いる毒性試験方法が提案されている（例えば、特許文献１、２参照）。
【特許文献１】特開昭５５−１５３５９９号公報
【特許文献２】特開２００５−１０１１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
薬剤、栄養補助食品などの物質の場合、経口摂取による影響を正確に評価することが重要である。しかし、上記文献に記載の方法では、いずれも培地に被検物質を加え、それが線虫に与える影響を評価する。このため、物質が線虫に影響を与えたのが、経口摂取によるものか、経皮摂取によるものか区別できない。また、培地全体に溶け込ませる方法の場合、多量の被験物質を確保する必要がある。しかし、試験的に得られた天然抽出物などでは極めて少ない量の被験物質で試験を行う必要があり、経口的に確実に摂取させるほうが望ましい。さらに、培地に被検物質を加える方法では、被験物質の分子量や化学的性質により、線虫の体表面から吸収される量が異なると推察され、体内移行量を把握することは容易ではない。また、薬剤、栄養補助食品などの被検物質を摂取させた後に、病原菌などを摂取させることで、薬剤、栄養補助食品などの免疫力賦活効果を評価することができる。
【０００６】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、経口摂取した被検物質が線虫に与える影響を評価できる被検物質評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、被検物質を封入したマイクロカプセルを含有する培地中で線虫を飼育することで、経口摂取した被検物質の生物機能に対する効果が評価できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
上記線虫は、シノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）であればよい。
【０００９】
被検物質の生物機能に対する効果は、線虫の寿命の長短により評価することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の被検物質評価方法を用いると、被検物質が経皮吸収される影響を排除して、経口摂取した被検物質が線虫に与える影響を評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
［線虫］
本発明の被検物質評価方法に用いる線虫（シノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ））は、１５００種程度知られている中から選択された体長約１ｍｍの土壌線虫の一種である。この線虫は、飼育が容易で体細胞数が約１０００個と少なく、雌雄同体が自家受精で増殖することができるものである。線虫は神経系、筋肉、消化器官、生殖器官等および表皮をもち、動物としての基本的体制をもっており、その遺伝子もヒトに近く、また、ヒトと同じ真正後生動物に属する。この線虫は、老化の分子生物学研究の実験動物や、病原微生物の感染モデルとして用いられている。
【００１３】
このような線虫として、例えば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｂｒｉｏｓｔｏｌ株Ｎ２雌雄同体型が挙げられる。この線虫は、例えばＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、Ｓｔ  Ｐａｕｌ、ＭＮ、ＵＳＡ．）より入手することができる。本発明において、被検物質の評価は、線虫の寿命の長短により行う。通常、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｂｒｉｏｓｔｏｌ株Ｎ２雌雄同体型の寿命は、２５日程度である。線虫は毎日観察し、線虫を器具で軽く触れて動かなかった固体を死亡したものとして、評価した。なお、本明細書中において、２５℃の温度条件下で飼育した場合に、線虫の幼虫期とは孵化後０〜３日齢を、成虫期とは４日齢以降をいう。
【００１４】
線虫の飼育は、「Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ」、「線虫ラボマニュアル」記載の方法を一部変更して行う。
【００１５】
［被検物質］
本発明で評価することができる被検物質は、経口摂取してその効果を評価するものであれば特に制限はない。本発明の方法は、薬剤や栄養補助食品などのように経被吸収の影響を排除して評価する必要があるものに用いることができる。
【００１６】
［マイクロカプセル］
本発明で用いることのできるマイクロカプセルとしては、特に制限はなく、公知のマイクロカプセルが使用できる。マイクロカプセルは、相分離法、液中乾燥法、融解分散冷却法、スプレードライング法、パンコーティング法、界面重合法、ｉｎ  ｓｉｔｕ重合法、液中硬化被覆法などの公知の方法を用いて、形成することができる。
【００１７】
マイクロカプセルの壁材、分散層は、封入する被検物質の性状（親油性、親水性など）種類によって、適宜選択することができる。壁材としては、特に制限はなく、アラビアガム、ゼラチン、ポリ乳酸、リン脂質などの公知の材料が使用できる。マイクロカプセルの壁剤の材質としては、線虫が忌避反応を起こさないものを選べばよい。また、被検物質が親油性の物である場合にはアラビアガムを用い、被検物質が親水性の物である場合にはフォスファチジルコリンなどのリン脂質を用いてリポゾームに封入すると、好ましい。また、親油性物質の場合であっても、水と混和する有機溶媒（例えば、ジメチルスルフォサイド、エタノールなど）に溶解させたものを水に混合させる、あるいは界面活性剤を用いて水と混和したものであれば、リン脂質を用いて、マイクロカプセル（リポゾーム）を作ることができる。
【００１８】
本発明では、マイクロカプセルの粒径の大きさが重要である。線虫は、通常大腸菌を餌として飼育される。また、酵母サイズ（５μｍより大きく、１０μｍより小さいサイズ）の大きさのものは、線虫が摂取しにくい。したがって、マイクロカプセルの粒径が、大腸菌の大きさと同じ程度（例えば、２μｍ〜５μｍ程度）であると好ましい。
【００１９】
［評価方法］
被検物質は、マイクロカプセルに封入し、緩衝液に分散したものを、線虫育成用寒天平板に塗布する。この状態でしばらく置くと、緩衝液が寒天に吸収され、マイクロカプセルが線虫育成用寒天平板上に残る。この寒天平板上で所定期間線虫を飼育する。線虫の寿命を観察することで、経口摂取した被検物質の生物機能に対する効果を評価する。また、薬剤、栄養補助食品などの被検物質を摂取させた後に、病原菌などを摂取させることで、薬剤、栄養補助食品などの効果を評価する。
【００２０】
また、本発明の評価方法では、マイクロカプセルが存在する線虫育成用寒天平板で線虫を飼育する期間を変えることで、摂食した被検物質が線虫に影響を与える時期を正確に評価できる。例えば、ビタミンＥでは、幼虫期のみの投与で、寿命を延長させることができる。
【００２１】
［摂取量の測定方法］
本発明で用いるマイクロカプセルに、蛍光物質や抗原を被検物質とともに封入しておくと、線虫が被検物質をどの程度の量を摂取したかを容易に測定できる。すなわち、蛍光物質や抗原が封入されたマイクロカプセルを線虫に摂食させる。一定時間経過した後、線虫体内の蛍光物質の分布を蛍光顕微鏡で観察する。あるいは、虫体から回収される抗原量を酵素抗体法で測定する。これにより、単位時間当たりのマイクロカプセル摂取量を算定する。これからマイクロカプセルおよび包含される被検物質の経口摂取量を求めることができる。また、マイクロカプセルに封入する被検物質の濃度を調整することで、投与量を調整することも容易である。
【００２２】
本発明の方法によれば、被検物質が経皮吸収される影響を排除して、経口摂取した被検物質の生物機能に対する効果を直接評価できる。特に、経口摂取量を正確に測定でき、その効果を評価できる。この結果、薬剤、栄養補助食品などの経口摂取による物質の影響を正確に評価することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【００２４】
以下の実施例において、線虫、試薬、培養液は以下のものを用いた。
線虫：Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｂｒｉｏｓｔｏｌ株Ｎ２雌雄同体型(線虫)を用いた。
線虫育成用寒天平板（Ｎｅｍａｔｏｄｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＮＧＭ  ｐｌａｔｅ）：
ＮａＣｌ（和光純薬工業）１．５ｇ、Ａｇａｒ（和光純薬工業）８．５ｇを４８５ｍｌの蒸留水に混合し、オートクレーブ（１２１℃、１５ｍｉｎ）滅菌し、６０℃のウォーターバス内で１ｈｒ冷却した後、１Ｍ  ＣａＣｌ２を５００μｌ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４を５００μｌ、エタノール（和光純薬工業）で５ｍｇ／ｍｌに調整したコレステロール（和光純薬工業）を５００ｍｇ／ｍｌ、１Ｍ  ＫＰＯ４を１２．５ml混合し、直径６０ｍｍのシャーレ（Ｋｏｒｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｒａｍｐｔｏｍ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）に１２ｍｌずつ分注したものを用いた。
【００２５】
ＴＲＹＰＴＯＮＥ  ＳＯＹＡ寒天平板（ＴＳＡ）：
ＴＲＹＰＴＯＮＥ  ＳＯＹＡ  ＡＧＡＲ（Ｏｘｏｉｄ）２０ｇを５００ｍｌの蒸留水に混合し、オートクレーブ（１２１℃、１５ｍｉｎ）で滅菌して冷却後、９０ｍｍシャーレ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）に約２０mlずつ分注したものを用いた。
【００２６】
Ｍ９  ｂｕｆｆｅｒ：
ＫＨ２ＰＯ４（和光純薬工業）１．５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４（和光純薬工業）３ｇ、ＮａＣｌ（和光純薬工業）２．５ｇを蒸留水５００ｍｌに混合し、オートクレーブ（１２１℃、１５ｍｉｎ）で滅菌して冷却後１Ｍ  ＭｇＳＯ４  ５００μｌを加えて混合したものを用いた。
【００２７】
１Ｍアジ化ナトリウム−Ｍ９溶液：
アジ化ナトリウム（和光純薬工業）０．６５ｇを１０ｍｌのＭ９  ｂｕｆｆｅｒに加えて溶解させ、１Ｍアジ化ナトリウム−Ｍ９溶液を作製した。これを母液として、Ｍ９  ｂｕｆｆｅｒでそれぞれ希釈を行い、５０ｍＭアジ化ナトリウム−Ｍ９溶液と１０ｍＭアジ化ナトリウム−Ｍ９溶液を作製した。
【００２８】
（親油性物質の取り込み）
（実施例１）
（マイクロカプセルの取り込みの確認）
蛍光マイクロカプセルの作成
オートクレーブ（１２１℃、１５ｍｉｎ）により滅菌した蒸留水３．５ｇとアラビアガム０．７５ｇを遠心チューブに入れ、よく撹拌し、溶解させた。そこに、孔径０．４５μｍのディスクフィルター（東洋濾紙、東京）で濾過滅菌した、蛍光物質３、３’−Ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ（ＤｉＯ、Ｓｉｇｍａ、  Ｄ４２９２）２．５ｍｇを大豆油（和光純薬工業）１．０ｇに溶解した液０．７５ｇを加え、氷上にて超音波分散機（ＵＨ−５０、エスエムテー）の最大出力で2分間処理して、粒経1〜５μｍのマイクロカプセルを作成した。
【００２９】
蛍光物質含有マイクロカプセルの線虫への投与
ＴＳＡで一晩培養した餌となるＯＰ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＯＰ５０（以下「ＯＰ」という））をＭ９  ｂｕｆｆｅｒで２００ｍｇ／ｍｌに調整したもの５０μｌと蛍光物質含有マイクロカプセル５０μｌを撹拌混合した後、ＮＧＭ  ｐｌａｔｅに塗布した。その上に線虫を数匹ワームピッカーを用いて移し、一日間餌を自由摂食させた。
【００３０】
蛍光物質含有マイクロカプセルの線虫への取り込みの確認
１５ｍｌ容量のチューブに、３ｍｌの１０ｍＭアジ化ナトリウム−Ｍ９溶液と０．１５ｇのＡｇａｒ（和光純薬工業）を入れ、撹拌した後、チューブのふたを緩めて電子レンジに数十秒かけて溶かし、５％寒天溶液を作った。５％寒天溶液は、固まらないうちに手早くスライドグラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ）の上に滴下し、すぐに上からもう一枚スライドグラスをかぶせて平らなアガーパッドを作製した。アガーパッドが固まったら、上に重ねているスライドグラスをゆっくりと取り外し、アガーパッドの上に５０ｍＭアジ化ナトリウム−Ｍ９溶液を数滴のせて、その中に、ワームピッカーですくった線虫を載せた。その上に円形マイクロカバーガラス（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を被せて、顕微鏡観察用の線虫試料とした。
【００３１】
結果
上記線虫試料を蛍光顕微鏡で観察した。図１は、線虫試料を蛍光顕微鏡で観察した写真である。図１から、線虫は、マイクロカプセルを摂取していることがわかる。
【００３２】
（実施例２）
［ビタミンＥを加えた培地上で飼育する線虫の寿命の評価］
本実施例では、以下の培地を用いた以外は、実施例１と同じものを用いた。
ビタミンＥ添加寒天培地（ＶＥ寒天）：
α−トコフェロール（和光純薬工業）２００ｍｇをエタノール（和光純薬工業）１ｍｌに溶解させ調整した２００ｍｇ／ｍｌのα−トコフェロール溶液１００μｌをシャーレに分注する上記液状のＮＧＭ１００ｍｌによく撹拌しながら添加し、２００μｇ／ｍｌビタミンE添加ＮＧＭを作製し、直径６０ｍｍのシャーレ（Ｋｏｒｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｒａｍｐｔｏｍ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）に１２ｍｌずつ分注したものを用いた。
【００３３】
０．１％エタノール添加寒天培地（対照用寒天）：
シャーレに分注する前の液状のＮＧＭ５００ｍｌに、エタノール（和光純薬工業）５００μｌをよく撹拌しながら添加し、０．１％エタノール添加ＮＧＭを作製した。これを、直径６０ｍｍのシャーレ（Ｋｏｒｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｒａｍｐｔｏｍ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）に１２ｍｌずつ分注したものを用いた。
【００３４】
また、以下の実施例においては、観察により得られた結果は、４  Ｓｔｅｐｓ  エクセル統計  第２版付属の統計ソフトＳｔａｔｃｅｌ  ２（２０）を用い、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により生存率を計算後、Ｌｏｇｒａｎｋ  ｔｅｓｔにより各群間の生存率の差を比較した。
【００３５】
０．１％エタノール加寒天上での飼育が線虫の寿命に与える影響
３日齢まで成長した線虫を、ＯＰを１０ｍｇ／ｐｌａｔｅとなるように塗布したＮＧＭ ｐｌａｔｅ上および０．１％エタノール加寒天上にそれぞれワームピッカーを用いて移した。その後、１日おきに新しくＯＰを塗布したｐｌａｔｅに移しながら、毎日観察し、ピッカーで軽く触れて動かなかった個体を死亡とした。このとき、０．１％エタノール添加群の線虫は全飼育期間をエタノール加寒天上で飼育し、対照群の線虫は全飼育期間をＮＧＭ  ｐｌａｔｅ上で飼育した。また、観察期間中にシャーレの壁に登ったものや、寒天中にもぐりこんだものは試験個体数から省いた。
【００３６】
ＮＧＭ  ｐｌａｔｅ上で飼育した対照群と、ＮＧＭに０．１％エタノールを添加した培地上で飼育した０．１％エタノール添加群との間に、寿命の差はみられなかった。なお、本実施例では、０．１％エタノール添加群をビタミンE群に対する対照群として用いた。
【００３７】
VE寒天上で全期間飼育することが線虫の寿命に与える実験
産卵期にある線虫から卵を回収し、２５℃のインキュベーター内で１日培養した。予め、ＴＳＡで３７℃一晩培養したＯＰをＶＥ寒天上および対照用の０．１％エタノール加寒天上に１０ｍｇ／ｐｌａｔｅとなるように塗布した後、回収した虫卵を滴下した。３日齢まで飼育した後、ＯＰを１０ｍｇ／ｐｌａｔｅとなるように塗布したＶＥ寒天上および対照用寒天上にそれぞれワームピッカーを用いて移し、その後、1日おきに新しくＯＰを塗布したｐｌａｔｅに移しながら、毎日観察し、ピッカーで軽く触れて動かなかった個体を死亡とした。このとき、ビタミンＥ群の線虫は、全飼育期間をＶＥ寒天上で飼育し、対照群の線虫は、全飼育期間を対照用寒天上で飼育した。また、観察期間中にシャーレの壁に登ったものや、寒天中にもぐりこんだものは試験個体数から省いた。
【００３８】
全期間ＶＥ寒天上で飼育した群と、対照群との間に、寿命の差はみられなかった。このことから、全期間ＶＥ寒天上で線虫を飼育することは、線虫の寿命に対して、影響を及ぼさないと考えられた。
【００３９】
幼虫期にのみＶＥ寒天上で飼育することが線虫の寿命に与える影響
産卵期にある線虫から卵を回収し、２５℃のインキュベーター内で１日培養した。この後、ＴＳＡで３７℃一晩培養したＯＰを１０ｍｇ／ｐｌａｔｅとなるように塗布したＶＥ寒天上および対照用寒天上にそれぞれ滴下した。3日齢まで飼育した後、ＯＰを１０ｍｇ／ｐｌａｔｅとなるように塗布した対照用寒天上にワームピッカーを用いて移し、その後、1日おきに新しくＯＰを塗布したｐｌａｔｅに移しながら、毎日観察し、ピッカーで軽く触れて動かなかった個体を死亡とした。このとき、ビタミンＥ群の線虫は、孵化後０〜３日間の幼虫期のみをＶＥ寒天上で飼育し、その後３日齢以降は、対照用寒天上で飼育し、対照群の線虫は、全飼育期間を対照用寒天上で飼育した。また、観察期間中にシャーレの壁に登ったものや、寒天中にもぐりこんだものは試験個体数から省いた。
【００４０】
幼虫期のみVE寒天上で飼育した群と、対照群との間に、寿命の差はみられなかった。このことから、幼虫期にＶＥ寒天上で線虫を飼育することは、線虫の寿命に対して、影響を及ぼさないと考えられた。
【００４１】
成虫期にのみＶＥ寒天上で飼育することが線虫の寿命に与える影響
産卵期にある線虫より卵を回収し、２５℃のインキュベーター内で１日培養した。この後、ＴＳＡで３７℃一晩培養したＯＰを１０ｍｇ／ｐｌａｔｅとなるように塗布した対照用寒天上に滴下した。3日齢まで飼育した後、ＯＰを１０ｍｇ／ｐｌａｔｅとなるように塗布したＶＥ寒天上および対照用寒天上にそれぞれワームピッカーを用いて移した。その後、１日おきに新しくＯＰを塗布したｐｌａｔｅに移しながら、毎日観察し、ピッカーで軽く触れて動かなかった個体を死亡とした。このとき、ビタミンＥ群の線虫は、孵化後０〜３日間の幼虫期は対照用寒天上で飼育し、その後３日齢以降は、ＶＥ寒天上で飼育し、対照群の線虫は、全飼育期間を対照用寒天上で飼育した．また、観察期間中にシャーレの壁に登ったものや、寒天中にもぐりこんだものは試験個体数から省いた。
【００４２】
成虫期のみVE寒天上で飼育した群と、対照群との間に、寿命の差はみられなかった。このことから、全期間ＶＥ寒天上で線虫を飼育することは、線虫の寿命に対して、影響を及ぼさないと考えられた。
【００４３】
以上の結果から、ＶＥ寒天上飼育は線虫の寿命に対して影響を及ぼさないことがわかった。
【００４４】
（実施例３）
［ビタミンＥ経口摂取が線虫の寿命に与える効果の評価］
以下のマイクロカプセルを作成して本実施例で用いた。
ビタミンＥ含有マイクロカプセル  ［ＭＣ（Ｅ）］：
α−トコフェロール（和光純薬工業）１．０ｇとトコフェロール除去コーン油（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ、ＵＳＡ）０．６ｇとを混合した。次に、オートクレーブ（１２１℃、１５ｍｉｎ）により滅菌した蒸留水７．０ｇとアラビアガム１．５ｇを遠心チューブに入れ、よく撹拌し溶解させた。そこによく混合しておいたα−トコフェロールとトコフェロール除去コーン油を加えて、氷上にて超音波分散機（UH-50、エスエムテー）の最大出力で2分間処理して、ＭＣ（Ｅ）を作成した。
【００４５】
対照用マイクロカプセル  ［ＭＣ（−）］：
オートクレーブ（１２１℃、１５ｍｉｎ）により滅菌した蒸留水７．０ｇとアラビアガム１．５ｇを遠心チューブに入れ、よく撹拌し溶解させた。そこに、トコフェロール除去コーン油（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ、ＵＳＡ）１．６ｇを加えて、氷上にて超音波分散機（ＵＨ−５０、エスエムテー）の最大出力で2分間処理し、ＭＣ（−）を作成した。
【００４６】
ＭＣ（Ｅ）を全期間投与することが線虫の寿命に与える影響
産卵期にある線虫から卵を回収し、２５℃のインキュベーター内で１日培養した。ＴＳＡで３７℃一晩培養したＯＰとＭＣ（Ｅ）、またはＯＰとＭＣ（−）とをボルテックスで混合したものを塗布したＮＧＭ  ｐｌａｔｅに回収した虫卵を滴下した。このとき、ＯＰは１０ｍｇ／ｐｌａｔｅ、ＭＣ（Ｅ）およびＭＣ（−）は５０μｌ／ｍｌとなるように各プレートに塗布した。３日齢まで飼育した後、ＯＰを１０ｍｇ／ｐｌａｔｅ、ＭＣ（Ｅ）またはＭＣ（−）を５０μｌ／ｍｌとなるようにＯＰとＭＣ（Ｅ）またはＯＰとＭＣ（−）との混合物を塗布したＮＧＭ  ｐｌａｔｅ上に、ワームピッカーを用いて線虫を移した。その後、1日おきに新しくＯＰとＭＣとの混合物を塗布したＮＧＭ  ｐｌａｔｅに移しながら、毎日観察し、ピッカーで軽く触れて動かなかった個体を死亡とした．このとき、ＭＣ（Ｅ）群の線虫は、全飼育期間ＯＰとＭＣ（Ｅ）の混合物を与えて飼育し、ＭＣ（−）群の線虫は、全飼育期間ＯＰとＭＣ（−）の混合物を与えて飼育した。また、観察期間中にシャーレの壁に登ったものや、寒天中にもぐりこんだものは試験個体数から省いた。
【００４７】
図２は、全期間ビタミンＥを経口投与したＭＣ（Ｅ）群と、対照となるＭＣ（−）群との、寿命の差を比較したグラフである。横軸は、観察期間（ｄａｙ）を、縦軸は生存率（％）を示す。全期間ビタミンＥを経口投与したＭＣ（Ｅ）群（図２中、■で示す）と、対照となるＭＣ（−）群（図２中、◆で示す）との間に、寿命の差はみられなかった（図２）。このことから、全期間ＭＣ（Ｅ）を経口投与して線虫を飼育することは、線虫の寿命に対して、影響を及ぼさないと考えられた。
【００４８】
幼虫期にのみＭＣ（Ｅ）を投与することが線虫の寿命に与える影響
産卵期にある線虫より卵を回収し、２５℃のインキュベーター内で1日培養した後、ＴＳＡで３７℃、一晩培養したＯＰとＭＣ（Ｅ）またはＯＰとＭＣ（−）とをボルテックスで混合したものを塗布したＮＧＭ  ｐｌａｔｅにそれぞれ滴下した。このとき、ＯＰは１０ｍｇ／ｐｌａｔｅ、ＭＣ（Ｅ）およびＭＣ（−）は５０μｌ／ｍｌとなるように各プレートに塗布した。３日齢まで飼育した後、ＯＰを１０ｍｇ／ｐｌａｔｅとなるように塗布したＮＧＭ  ｐｌａｔｅ上にワームピッカーを用いて移し、その後、1日おきに新しくＯＰを塗布したＮＧＭ  ｐｌａｔｅに移しながら、毎日観察し、ピッカーで軽く触れて動かなかった個体を死亡とした。このとき、ＭＣ（Ｅ）群の線虫は、孵化後０〜３日間の幼虫期はＯＰとＭＣ（Ｅ）の混合物を与えて飼育し、その後３日齢以降はＯＰを与えて飼育した。ＭＣ（−）群の線虫は、孵化後０〜３日間の幼虫期はＯＰとＭＣ（−）の混合物を与えて飼育し、その後３日齢以降はＯＰを与えて飼育した。また、観察期間中にシャーレの壁に登ったものや、寒天中にもぐりこんだものは試験個体数から省いた。
【００４９】
図３は、幼虫期のみビタミンＥを経口投与したＭＣ（Ｅ）群と、対照となるＭＣ（−）群との、寿命の差を比較したグラフである。横軸は、観察期間（ｄａｙ）を、縦軸は生存率（％）を示す。幼虫期のみビタミンＥを経口投与したＭＣ（Ｅ）群（図３中、■で示す）と、対照となるＭＣ（−）群（図３中、◆で示す）との間に、寿命の差がみられた（図３）。この結果から、幼虫期のみＭＣ（Ｅ）を経口投与することが、線虫に対して寿命延長効果をもたらすことがわかった。
【００５０】
成虫期にのみＭＣ（Ｅ）を投与することが線虫の寿命に与える影響
産卵期にある線虫より卵を回収し、２５℃のインキュベーター内で１日培養した後、ＴＳＡで３７℃、一晩培養したＯＰを１０ｍｇ／ｐｌａｔｅとなるように塗布したＮＧＭ  ｐｌａｔｅ上に滴下した。３日齢まで飼育した後、ＯＰとＭＣ（Ｅ）またはＯＰとＭＣ（−）とをボルテックスで混合したものを塗布したＮＧＭ  ｐｌａｔｅ上にワームピッカーを用いて線虫を移した。このとき、ＯＰは１０ｍｇ／ｐｌａｔｅ、ＭＣ（Ｅ）およびＭＣ（−）は５０μｌ／ｍｌとなるように各プレートに塗布した。その後、1日おきに新しくＯＰとＭＣとの混合物を塗布したｐｌａｔｅに移しながら、毎日観察し、ピッカーで軽く触れて動かなかった個体を死亡とした。このとき、ＭＣ（Ｅ）群の線虫は、孵化後０〜３日間の幼虫期はＯＰを与えて飼育し、その後３日齢以降は、ＯＰとＭＣ（Ｅ）の混合物を与えて飼育した。ＭＣ（−）群の線虫は、孵化後０〜３日間の幼虫期はＯＰを与えて飼育し、その後３日齢以降は、ＯＰとＭＣ（−）の混合物を与えて飼育した。また、観察期間中にシャーレの壁に登ったものや、寒天中にもぐりこんだものは試験個体数から省いた。
【００５１】
図４は、成虫期のみビタミンＥを経口投与したＭＣ（Ｅ）群と、対照となるＭＣ（−）群との、寿命の差を比較したグラフである。横軸は、観察期間（ｄａｙ）を、縦軸は生存率（％）を示す。成虫期のみビタミンＥを経口投与したＭＣ（Ｅ）群（図４中、■で示す）と、対照となるＭＣ（−）群（図４中、◆で示す）との間に、寿命の差はみられなかった（図４）。このことから、成虫期のみＭＣ（Ｅ）を経口投与して線虫を飼育することは、線虫の寿命に対して、影響を及ぼさないと考えられた。
【００５２】
以上から、ビタミンＥをマイクロカプセルにより経口投与する場合、幼虫期にのみ投与することで、線虫に寿命延長効果をもたらすことがわかった。
【００５３】
（実施例４）
［ビタミンＥ含有カプセル投与が線虫の感染抵抗性に与える影響の評価］
産卵期にある線虫より卵を回収し、２５℃のインキュベーター内で１日培養した後、ＴＳＡで３７℃、一晩培養したＯＰとＭＣ（Ｅ）またはＯＰとＭＣ（−）とをボルテックスで混合したものを塗布したＮＧＭ  ｐｌａｔｅにそれぞれ滴下した。このとき、ＯＰは１０ｍｇ／ｐｌａｔｅ、ＭＣ（Ｅ）およびＭＣ（−）は５０μｌ／ｍｌとなるように各プレートに塗布した。３日齢まで飼育した後、ＳＥを１０ｍｇ／ｐｌａｔｅとなるように塗布したＮＧＭ  ｐｌａｔｅ上にワームピッカーを用いて移し、その後、1日おきに新しくＳＥを塗布したＮＧＭ  ｐｌａｔｅに移しながら、毎日観察し、ピッカーで軽く触れて動かなかった個体を死亡とした。このとき、ＭＣ（Ｅ）群の線虫は、孵化後０〜３日間の幼虫期はＯＰとＭＣ（Ｅ）の混合物を与えて飼育し、その後３日齢以降はＳＥのみを与えた。対照群の線虫は、孵化後０〜３日間の幼虫期はＯＰとＭＣ（−）の混合物を与えて飼育し、その後３日齢以降はＳＥのみを与えて飼育した。また、観察期間中にシャーレの壁に登ったものや、寒天中にもぐりこんだものは試験個体数から省いた。
【００５４】
図５は、幼虫期のみビタミンＥを経口投与したＭＣ（Ｅ）群と、対照となるＭＣ（−）群との、サルモネラ菌感染における感染抵抗性を比較したグラフである。横軸は、観察期間（ｄａｙ）を、縦軸は生存率（％）を示す。幼虫期においてビタミンＥを経口投与した後、成虫期からサルモネラに感染させたＭＣ（Ｅ）群（図５中、■で示す）では、対照となるＭＣ（−）群（図５中、◆で示す）との間に生存率の差はみられず、両群ともにサルモネラ感染によって、通常よりも早期に生存率が低下していく様子が観察された(図５)。
【００５５】
以上の結果から、被検物質を封入したマイクロカプセルを線虫に経口投与し、線虫の寿命の長短を評価することで、経口摂取した被検物質の生物機能に対する効果を評価できることがわかった。また、被検物質を封入したマイクロカプセルを線虫に経口投与する時期を変えることにより、投与時期の差による経口摂取した被検物質の生物機能に対する効果を評価できることもわかった。
【００５６】
（親水性物質の取り込み）
（実施例５）
（マイクロカプセルの取り込みの確認）
蛍光マイクロカプセルの作成
蛍光物質フルオレセインナトリウム（以下、「ウラニン」という）の水溶液（２ｍｇ／ｍｌ）にＬ−α−ホスファチジルコリンなどのリン脂質を４０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。この溶液を攪拌、凍結、溶解を繰り返したものを試料液とした。孔径０．１μｍ、１μｍ、および５μｍのワットマン社Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ  ｔｒａｃｋ−ｅｔｃｈｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅを装着したリポゾーム作製装置用シリンジ（Ｍｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄ  Ｉｎｃ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．６１００００）に、試料液を取り、６５℃に加温したヒートブロック上でメンブレンを通過させて反対側にセットしたシリンジへ移動させた。この操作を繰り返すことで孔径と同じ（０．１μｍ、１μｍ、５μｍ）直径のウラニン水溶液を含むリポゾームを作製した。
【００５７】
使用した線虫
線虫Ｂｒｉｓｔｏｌ株Ｎ２の雌雄同体を実験に供した。線虫飼育用の餌として非病原性の大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＯＰ５０株（ＯＰ）を用いた。湿重量１０ｍｇのＯＰを２５μｌ  のＭ９  ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、ペプトン未添加の線虫育成用寒天培地（ＮＧＭ）に塗布した。虫卵をＮＧＭに散布し、２５℃のふ卵器内で３日齢まで飼育したものを用いた。
【００５８】
蛍光物質含有マイクロカプセルの線虫への投与
表１に示す６種の条件で、ウラニンを添加したプレートを作成した。ウラニンをＮＧＭに添加・塗布する場合（表１中、Ｉ−１、Ｉ−２、ＩＩ）のウラニン濃度は、２ｍｇ／ｍｌである。また、表１に示すように、各条件において、１プレートあたりのウラニン量は、Ｉ−１が２５ｍｇであるのに対し、他の条件（Ｉ−１、Ｉ−２、ＩＩ、ＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２、ＩＩＩ−３）では、５０μｇであった。上記した３日齢の線虫を各プレートに５０匹加え、３時間自由に摂食させた。
【表１】
2008170427.tif 000002
【００５９】
蛍光物質含有マイクロカプセルの線虫への取り込みの確認
１５ｍｌ容量のチューブに、３ｍｌの１０ｍＭアジ化ナトリウム−Ｍ９溶液と０．１５ｇのＡｇａｒ（和光純薬工業）を入れ、撹拌した後、チューブのふたを緩めて電子レンジに数十秒かけて溶かし、５％寒天溶液を作った。５％寒天溶液は、固まらないうちに手早くスライドグラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ）の上に滴下し、すぐに上からもう一枚スライドグラスをかぶせて平らなアガーパッドを作製した。アガーパッドが固まったら、上に重ねているスライドグラスをゆっくりと取り外し、アガーパッドの上に５０ｍＭアジ化ナトリウム−Ｍ９溶液を数滴のせて、その中に、ワームピッカーですくった線虫を載せた。その上に円形マイクロカバーガラス（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を被せて、顕微鏡観察用の線虫試料とした。
【００６０】
結果
上記線虫試料を蛍光顕微鏡で観察した。図６は、線虫試料を蛍光顕微鏡で観察した写真である。図６中、虫体の中に白く見える部分がウラニンである。図６から、高濃度のウラニンを添加したプレート（Ｉ−１）で飼育した線虫では、ウラニンが取り込まれていることがわかる。しかし、この場合に、経口摂取以外に経皮摂取によるウラニンの摂取も含まれている。低濃度のウラニンを添加したプレート（Ｉ−２）で飼育した線虫、低濃度のウラニンを培地表面に塗布したプレート（ＩＩ）で飼育した線虫では、ウラニンを摂取していないことがわかる。一方、ウラニンを封入した直径１μｍのリポソームを表面に含むプレート（ＩＩＩ−２）で飼育した線虫では、ウラニンの摂取が認められた。
【００６１】
蛍光物質含有マイクロカプセルの線虫への取り込み量の測定
上記各条件で３時間飼育した線虫各５０匹を回収し、洗浄した。これをペッスルを用いて、物理的に粉砕した。この粉砕液の蛍光強度を測定し、あらかじめ既知の濃度ウラニンを溶解した複数のウラニン溶液の蛍光強度を測定して得た検量線から、線虫１匹あたりのウラニンの取り込み量を逆算して求めた。蛍光強度が、１０００以下は不検出（ＮＤ）とした。蛍光強度は、蛍光マイクロプレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ社製，１４２０ＡＲＶＯ  ＳＸ）を用いて、励起波長４８５ｎｍ・蛍光波長５３５ｎｍで１０秒間、測定した。結果を、図７に示す。図７は、各飼育条件における線虫１匹あたりのウラニンの取り込み量（ｎｇ）を示すグラフである。
【００６２】
図７から、高濃度のウラニンを添加したプレート（Ｉ−１）で飼育した線虫では、約０．１２（ｎｇ）のウラニンが取り込まれていることがわかる。また、低濃度のウラニンを添加したプレート（Ｉ−２）で飼育した線虫、低濃度のウラニンを培地表面に塗布したプレート（ＩＩ）で飼育した線虫では、ウラニンの摂取が認められなかった。一方、ウラニンを封入した直径１μｍのリポソームを表面に含むプレート（ＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２、ＩＩＩ−３）で飼育した線虫では、ウラニンの摂取（それぞれ約０．０２（ｎｇ）前後）が認められた。また、リポソームの径が大きくなるほど摂取量が増加している。
【００６３】
以上の結果から、本発明にかかるマイクロカプセルを用いると、少量の被験物質（５０μｇ）を使用する場合は、リポゾームを用いた投与が、最も効率的に線虫に被験物質を取り込ませることができることがわかった。ウラニンを封入した直径１μｍのリポソームを表面に含むプレート（ＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２、ＩＩＩ−３）では、１プレートあたりの使用ウラニン量は５０μｇであり、寒天平板に溶解させる方法（Ｉ−１）が２５ｍｇを要したのに比べると、１/５００の使用量であったが、線虫体内へのウラニン取り込み量は１/５に低下するにとどまった。このことから、経口摂取による被検物質の評価をするには、本発明にかかるマイクロカプセルを用いる方法が優れていることがわかる。
【００６４】
以上から、被検物質が親水性の物質の場合には、その水溶液をリン脂質を用いたマイクロカプセルに被検物質を封入することで、線虫の経口摂取による被検物質の評価をすることができることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、線虫試料を蛍光顕微鏡で観察した写真である。
【図２】図２は、全期間ビタミンＥを経口投与したＭＣ（Ｅ）群と、対照となるＭＣ（−）群との、寿命の差を比較したグラフである。
【図３】図３は、幼虫期のみビタミンＥを経口投与したＭＣ（Ｅ）群と、対照となるＭＣ（−）群との、寿命の差を比較したグラフである。
【図４】図４は、成虫期のみビタミンＥを経口投与したＭＣ（Ｅ）群と、対照となるＭＣ（−）群との、寿命の差を比較したグラフである。
【図５】図５は、幼虫期のみビタミンＥを経口投与したＭＣ（Ｅ）群と、対照となるＭＣ（−）群との、サルモネラ菌感染における感染抵抗性を比較したグラフである。
【図６】図６は、線虫試料を蛍光顕微鏡で観察した写真である。
【図７】図７は、各飼育条件における線虫１匹あたりのウラニンの取り込み量（ｎｇ）を示すグラフである。
【図２】
2008170427.tif 000003
【図３】
2008170427.tif 000004
【図４】
2008170427.tif 000005
【図５】
2008170427.tif 000006
【図６】
2008170427.tif 000007
【図７】
2008170427.tif 000008
【図１】
2008170427.tif 000009