(57)【要約】【課題】非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質や、それをコードする遺伝子ＤＮＡや、細菌性伝染病に対する宿主免疫細胞の応答性を調べる上で有用な実験モデル動物を提供すること。【解決手段】非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡを、ＢＬＡＳＴサーチによりスクリーニングし、各種ＴＬＲと高い相似性を有する多くのＥＳＴクローンをスクリーニングし、これらをプローブにして、マウス・マクロファージｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡの塩基配列を解析してＬＲＲ及びＴＩＲ領域などの保存領域が存在するＴＬＲ９であることを確認した後、ノックアウトマウスを作製し、ＴＬＲ９が細菌ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧ配列を含むオリゴヌクレオチドの受容体タンパク質であることを確認した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡからなるリガンドに対する、以下の(ａ)又は(ｂ)に記載のタンパク質の受容体としての使用方法。
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質；
【請求項２】
タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡにコードされることを特徴とする請求項１記載の使用方法。
【請求項３】
タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列の相補的配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされることを特徴とする請求項１記載の使用方法。
【請求項４】
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡからなるリガンドに対する、以下の(ａ)又は(ｂ)に記載のタンパク質の受容体としての使用方法。
(ａ)配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ)配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質；
【請求項５】
タンパク質が、配列番号３に示される塩基配列を含むＤＮＡにコードされることを特徴とする請求項４記載の使用方法。
【請求項６】
タンパク質が、配列番号３に示される塩基配列の相補的配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされることを特徴とする請求項４記載の使用方法。
【請求項７】
タンパク質が、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識することができるＴＬＲ９タンパク質であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の使用方法。
【請求項８】
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡが、ＴＬＲ９タンパク質を介して免疫細胞を活性化し、免疫応答を誘導することができる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の使用方法。
【請求項９】
以下の(ａ)又は(ｂ)に記載の受容体タンパク質に対する、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡのリガンドとしての使用方法。
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質；
【請求項１０】
タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡにコードされることを特徴とする請求項９記載の使用方法。
【請求項１１】
タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列の相補的配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされることを特徴とする請求項９記載の使用方法。
【請求項１２】
以下の(ａ)又は(ｂ)に記載の受容体タンパク質に対する、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡのリガンドとしての使用方法。
(ａ)配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ)配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質；
【請求項１３】
タンパク質が、配列番号３に示される塩基配列を含むＤＮＡにコードされることを特徴とする請求項１２記載の使用方法。
【請求項１４】
タンパク質が、配列番号３に示される塩基配列の相補的配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされることを特徴とする請求項１２記載の使用方法。
【請求項１５】
タンパク質が、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識することができるＴＬＲ９タンパク質であることを特徴とする請求項９〜１４のいずれか記載の使用方法。
【請求項１６】
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡが、ＴＬＲ９タンパク質を介して免疫細胞を活性化し、免疫応答を誘導することができる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡであることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか記載の使用方法。
【請求項１７】
ＴＬＲ９タンパク質を介して免疫細胞を活性化する免疫応答刺激性組成物であって、ＴＬＲ９タンパク質のリガンドである非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるマウスＴＬＲ９タンパク質を介してマウスの免疫応答を刺激する方法であって、前記マウスＴＬＲ９タンパク質に、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを接触させることを特徴とする方法。
【請求項１９】
免疫応答刺激性物質のスクリーニング方法であって、ＴＬＲ９タンパク質に対する被検物質の親和性を、免疫応答刺激性の指標とすることを特徴とする方法。
【請求項２０】
ＴＬＲ９タンパク質をコードする遺伝子の全部又は一部が遺伝子変異により破壊され、ＴＬＲ９を発現する機能を喪失したことを特徴とする非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して不反応性のモデル非ヒト動物。
【請求項２１】
マウスであることを特徴とする請求項２１記載の非ヒト動物。
【請求項２２】
請求項２０又は２１記載のモデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞に、
（ａ）被検物質の存在下又は非存在下で、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを接触させ、
（ｂ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞とにおける免疫細胞活性の程度を測定し、
（ｃ）野生型動物由来の免疫細胞における上記活性の程度が、被検物質の存在により上昇し、モデル非ヒト動物由来の免疫細胞における上記活性の程度が被検物質の存在による影響を受けないとき、
（ｄ）前記被検物質を非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の促進物質と評価することを特徴とする、
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の促進物質のスクリーニング方法。
【請求項２３】
請求項２０又は２１記載のモデル非ヒト動物と、同種の野生型動物に、
（ａ）被検物質を投与した後に、免疫細胞を採取し、
（ｂ）インビトロで非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを接触させ、
（ｃ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞とにおける免疫細胞活性の程度を測定し、
（ｄ）被検物質を投与した野生型動物由来免疫細胞の上記活性の程度は、投与しない野生型動物由来免疫細胞の程度より高く、被検物質を投与したモデル非ヒト動物由来免疫細胞の上記活性の程度は、投与しないモデル非ヒト動物由来免疫細胞の程度と変わらないとき、
（ｅ）前記被検物質を非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の促進物質と評価することを特徴とする、
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の促進物質のスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項２０又は２１記載のモデル非ヒト動物と、同種の野生型動物に、
（ａ）細菌を感染させた後に、免疫細胞を採取し、
（ｂ）被検物質の存在／非存在下でインビトロ培養し、
（ｃ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞とにおける免疫細胞活性の程度を測定し、
（ｄ）被検物質を投与した野生型動物由来免疫細胞の上記活性の程度は、投与しない野生型動物由来免疫細胞の程度より高く、被検物質を投与したモデル非ヒト動物由来免疫細胞の上記活性の程度は、投与しないモデル非ヒト動物由来免疫細胞の程度と変わらないとき、
（ｅ）前記被検物質を非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の促進物質と評価することを特徴とする、
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の促進物質のスクリーニング方法。
【請求項２５】
請求項２０又は２１記載のモデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞に、
（ａ）被検物質の存在下又は非存在下で、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを接触させ、
（ｂ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞とにおける免疫細胞活性の程度を測定し、
（ｃ）野生型動物由来の免疫細胞における上記活性の程度が、被検物質の存在により低下し、モデル非ヒト動物由来の免疫細胞における上記活性の程度が被検物質の存在による影響を受けないとき、
（ｄ）前記被検物質を非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の抑制物質と評価することを特徴とする、
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項２６】
請求項２０又は２１記載のモデル非ヒト動物と、同種の野生型動物に、
（ａ）被検物質を投与した後に、免疫細胞を採取し、
（ｂ）インビトロで非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを接触させ、
（ｃ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞とにおける免疫細胞活性の程度を測定し、
（ｄ）被検物質を投与した野生型動物由来免疫細胞の上記活性の程度は、投与しない野生型動物由来免疫細胞の程度より低く、被検物質を投与したモデル非ヒト動物由来免疫細胞の上記活性の程度は、投与しないモデル非ヒト動物由来免疫細胞の程度と変わらないとき、
（ｅ）前記被検物質を非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の抑制物質と評価することを特徴とする、
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の促進物質のスクリーニング方法。
【請求項２７】
請求項２０又は２１記載のモデル非ヒト動物と、同種の野生型動物に、
（ａ）細菌を感染させた後に、免疫細胞を採取し、
（ｂ）被検物質の存在／非存在下でインビトロ培養し、
（ｃ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞とにおける免疫細胞活性の程度を測定し、
（ｄ）被検物質を投与した野生型動物由来免疫細胞の上記活性の程度は、投与しない野生型動物由来免疫細胞の程度より低く、被検物質を投与したモデル非ヒト動物由来免疫細胞の上記活性の程度は、投与しないモデル非ヒト動物由来免疫細胞の程度と変わらないとき、
（ｅ）前記被検物質を非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の抑制物質と評価することを特徴とする、
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項２８】
請求項２０又は２１記載のモデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞に、
（ａ）被検物質を接触させ、
（ｂ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞における免疫細胞活性の程度を測定し、
（ｃ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞における上記活性の程度が被検物質の接触による影響を受けないが、野生型動物由来の免疫細胞における上記活性の程度が被検物質の接触により増加したとき、
（ｄ）前記被検物質をＴＬＲ９のアゴニストと評価することを特徴とする、
ＴＬＲ９のアゴニストのスクリーニング方法。
【請求項２９】
請求項２０又は２１記載のモデル非ヒト動物と、同種の野生型動物に、
（ａ）被検物質を投与した後に、免疫細胞を採取し、
（ｂ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞とにおける免疫細胞活性の程度を測定し、
（ｃ）被検物質を投与した野生型動物由来免疫細胞の上記活性の程度が、投与しない野生型動物由来免疫細胞の程度より高く、被検物質を投与したモデル非ヒト動物由来免疫細胞の上記活性の程度が、投与しないモデル非ヒト動物由来免疫細胞の程度と変わらないとき、
（ｄ）前記被検物質をＴＬＲ９のアゴニストと評価することを特徴とする、
ＴＬＲ９のアゴニストのスクリーニング方法。
【請求項３０】
請求項２０又は２１記載のモデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞に、
（ａ）被検物質の存在下又は非存在下で、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを接触させ、
（ｂ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞とにおける免疫細胞活性の程度を測定し、
（ｃ）野生型動物由来の免疫細胞における上記活性の程度が、被検物質の存在により低下し、モデル非ヒト動物由来の免疫細胞における上記活性の程度が被検物質の存在による影響を受けないとき、
（ｄ）前記被検物質をＴＬＲ９のアンタゴニストと評価することを特徴とする、
ＴＬＲ９のアンタゴニストのスクリーニング方法。
【請求項３１】
免疫細胞活性の程度が、ＴＬＲ９のシグナル伝達機能の活性の程度であることを特徴とする請求項２２〜３０いずれか記載の方法。
【請求項３２】
ＴＬＲ９のシグナル伝達機能が、サイトカインを産生させる機能、細胞を増殖させる機能、細胞表面分子を発現させる機能、及び細胞内シグナル伝達分子を活性化させる機能から選択される１又は２以上の機能であることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
サイトカインが、ＴＮＦα、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２から選択される１又は２以上のサイトカインであることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
細胞表面分子が、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６及び腫瘍組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩから選択される１又は２以上の細胞表面分子であることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
細胞内シグナル伝達分子が、ＮＦ−κＢ活性、ＪＮＫ活性、及びＩＲＡＫ活性から選択される１又は２以上の細胞内シグナル伝達分子であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
免疫細胞が、腹腔マクロファージであることを特徴とする請求項２２〜３５いずれか記載の方法。
【請求項３７】
ＴＬＲ９タンパク質をコードする遺伝子の全部又は一部が遺伝子変異により破壊され、ＴＬＲ９を発現する機能を喪失した非ヒト動物を、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して不反応性のモデル動物として使用する方法。
【請求項３８】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質、該受容体タンパク質の遺伝子及びそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
トール（Ｔｏｌｌ）遺伝子は、ショウジョウバエの胚発生中の背腹軸の決定（非特許文献１及び２参照）、また成体における抗真菌性免疫応答に必要であることが知られている（非特許文献３参照）。かかるＴｏｌｌは、細胞外領域にロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を有するＩ型膜貫通受容体であり、この細胞質内領域は、哺乳類インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）の細胞質内領域と相同性が高いことが明らかとなっている（非特許文献４、５、及び６参照）。
【０００３】
近年、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）と呼ばれるＴｏｌｌの哺乳類のホモログが同定され、ＴＬＲ２やＴＬＲ４など現在までに６つのファミリーが報告されている（非特許文献７、８、９、及び１０参照）。このＴＬＲファミリーは、上記ＩＬ−１Ｒと同様にアダプタータンパク質であるＭｙＤ８８を介し、ＩＬ−１Ｒ結合キナーゼ（ＩＲＡＫ）をリクルートし、ＴＲＡＦ６を活性化し、下流のＮＦ−κＢを活性化することが知られている（非特許文献１１、１２、及び１３参照）。また、哺乳類におけるＴＬＲファミリーの役割は、細菌の共通構造を認識するパターン認識受容体（ＰＲＲ：pattern recognition receptor）として、先天的な免疫認識に関わっているとも考えられている（非特許文献１４参照）。
【０００４】
上記ＰＲＲにより認識される病原体会合分子パターン（ＰＡＭＰ：pathogen-associated molecular pattern）の一つは、グラム陰性菌の外膜の主成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）であって（非特許文献１４参照）、かかるＬＰＳが宿主細胞を刺激して宿主細胞にＴＮＦα、ＩＬ−１及びＩＬ−６等の各種炎症性サイトカインを産生させること（非特許文献１５及び１６参照）や、ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ：LPS-binding protein）により捕獲されたＬＰＳが細胞表面上のＣＤ１４に引き渡されることが知られている（非特許文献１６及び１７参照）。本発明者らは、ＴＬＲ４のノックアウトマウスを作製し、ＴＬＲ４ノックアウトウスが上記グラム陰性菌の外膜の主成分であるＬＰＳに不応答性であること（非特許文献１８参照）や、ＴＬＲ２ノックアウトマウスを作製し、ＴＬＲ２ノックアウトマウスのマクロファージがグラム陽性菌細胞壁やその構成成分であるペプチドグリカンに対する反応性が低下すること（非特許文献１９参照）を報告している。
【０００５】
他方、細菌ＤＮＡ（バクテリア由来ＤＮＡ）や非メチル化ＣｐＧ配列を含むオリゴヌクレオチドが、マウス及びヒトの免疫細胞を刺激すること（非特許文献２０及び２１参照）や、ＩＬ−１２及びＩＦＮγの放出に支配されるＴヘルパー１細胞（Ｔｈ１）様炎症性応答を刺激すること（非特許文献２２、２３、及び２４参照）から、ＣｐＧ配列を含むオリゴヌクレオチドは、癌、アレルギー及び伝染病のワクチンを含むワクチン戦略のアジュバントとしての使用可能性が提唱されている（非特許文献２５、２６、及び２７参照）。このように臨床実用において効果が期待されるにも関わらず、非メチル化ＣｐＧ配列を含む細菌ＤＮＡが免疫細胞を活性化する分子メカニズムはよくわかっていない。
【０００６】
【非特許文献１】Cell 52, 269-279, 1988
【非特許文献２】Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996
【非特許文献３】Cell 86, 973-983, 1996
【非特許文献４】Nature 351, 355-356, 1991
【非特許文献５】Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996
【非特許文献６】J. Leukoc. Biol. 63, 650-657, 1998
【非特許文献７】Nature 388, 394-397, 1997
【非特許文献８】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 588-593, 1998
【非特許文献９】Blood 91, 4020-4027, 1998
【非特許文献１０】Gene 231, 59-65, 1999
【非特許文献１１】J. Exp. Med. 187, 2097-2101, 1998
【非特許文献１２】Mol. Cell 2, 253-258, 1998
【非特許文献１３】Immunity 11, 115-122, 1999
【非特許文献１４】Cell 91, 295-298, 1997
【非特許文献１５】Adv. Immunol. 28, 293-450, 1979
【非特許文献１６】Annu. Rev. Immunol. 13, 437-457, 1995
【非特許文献１７】Science 249, 1431-1433, 1990
【非特許文献１８】J. Immunol. 162, 3749-3752, 1999
【非特許文献１９】Immunity 11, 443-451, 1999
【非特許文献２０】Trends Microbiol. 4, 73-76, 1996
【非特許文献２１】Trends Microbiol. 6, 496-500, 1998
【非特許文献２２】EMBO J. 18, 6973-6982, 1999
【非特許文献２３】J. Immunol. 161, 3042-3049, 1998
【非特許文献２４】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9305-9310, 1999
【非特許文献２５】Adv. Immunol. 73, 329-368, 1999
【非特許文献２６】Curr. Opin. Immunol. 12, 35-43, 2000
【非特許文献２７】Immunity 11, 123-129, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、メチル化されていないＣｐＧモチーフを含有するバクテリア由来ＤＮＡは免疫細胞を非常に活性化し、Ｔｈ１の応答を誘導するが、その分子レベルでの活動はあまり理解されていない。本発明の課題は、細菌ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧ配列を含むオリゴヌクレオチドの分子レベルでの作用を明らかにすることができる、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識するＴＬＲファミリーのメンバー受容体タンパク質ＴＬＲ９や、それをコードするＤＮＡや、細菌性伝染病に対する宿主免疫細胞の応答性を調べる上で有用な実験モデル動物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
細菌の共通構造を認識するパターン認識受容体として、先天的な免疫認識に関わっている哺乳類におけるＴＬＲファミリーは、現在までに６つのメンバー（ＴＬＲ１−６）が公表されており（Nature 388, 394-397, 1997、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 588-593, 1998、Gene 231, 59-65, 1999）、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８の新たな２つのメンバーがGenBankに登録されている（登録番号ＡＦ２４０４６７及びＡＦ２４６９７１）。また、ＴＬＲ９についても完全長ｃＤＮＡが見い出されGenBankに登録されている（登録番号ＡＦ２４５７０４）が、その機能については知られていなかった。
【０００９】
本発明者らは、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識するＴＬＲファミリーのメンバー受容体タンパク質をコードするＤＮＡを、ＢＬＡＳＴサーチによりスクリーニングし、既に同定されている各種ＴＬＲと高い相似性を有する多くのシークエンス・タグ（ＥＳＴ）クローンをスクリーニングし、これらの遺伝子フラグメントをプローブにして、マウス・マクロファージｃＤＮＡライブラリーから完全な長さを有するｃＤＮＡを単離し、これを用いてヒトｃＤＮＡも単離した。次に、これらｃＤＮＡの塩基配列を解析し、このＴＬＲファミリーにＬＲＲ及びＴＩＲ領域などの保存領域が存在するＴＬＲ９であることを確認した。そこで、このＴＬＲ９ノックアウトマウスを作製し、ＴＬＲ９が細菌ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧ配列を含むオリゴヌクレオチドの受容体タンパク質であることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、
（１）非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡからなるリガンドに対する、(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＴＬＲ９タンパク質、又は(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質の受容体としての使用方法や、
（２）タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡにコードされることを特徴とする前記（１）記載の使用方法や、
（３）タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列の相補的配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされることを特徴とする前記（１）記載の使用方法に関する。
【００１１】
また本発明は、
（４）非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡからなるリガンドに対する、(ａ)配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＴＬＲ９タンパク質、又は(ｂ)配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質の受容体としての使用方法や、
（５）タンパク質が、配列番号３に示される塩基配列を含むＤＮＡにコードされることを特徴とする前記（４）記載の使用方法や、
（６）タンパク質が、配列番号３に示される塩基配列の相補的配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされることを特徴とする前記（４）記載の使用方法や、
（７）タンパク質が、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識することができるＴＬＲ９タンパク質であることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の使用方法や、
（８）非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡが、ＴＬＲ９タンパク質を介して免疫細胞を活性化し、免疫応答を誘導することができる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡであることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれか記載の使用方法に関する。
【００１２】
また本発明は、
（９）(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＴＬＲ９タンパク質、又は(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質に対する、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡのリガンドとしての使用方法や、
（１０）タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡにコードされることを特徴とする前記（９）記載の使用方法や、
（１１）タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列の相補的配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされることを特徴とする前記（９）記載の使用方法や、
（１２）(ａ)配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＴＬＲ９タンパク質、又は(ｂ)配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質に対する、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡのリガンドとしての使用方法や、
（１３）タンパク質が、配列番号３に示される塩基配列を含むＤＮＡにコードされることを特徴とする前記（１２）記載の使用方法や、
（１４）タンパク質が、配列番号３に示される塩基配列の相補的配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされることを特徴とする前記（１２）記載の使用方法や、
（１５）タンパク質が、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識することができるＴＬＲ９タンパク質であることを特徴とする前記（９）〜（１４）のいずれか記載の使用方法や、
（１６）非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡが、ＴＬＲ９タンパク質を介して免疫細胞を活性化し、免疫応答を誘導することができる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡであることを特徴とする前記（９）〜（１５）のいずれか記載の使用方法に関する。
【００１３】
さらに本発明は、
（１７）ＴＬＲ９タンパク質を介して免疫細胞を活性化する免疫応答刺激性組成物であって、ＴＬＲ９タンパク質のリガンドである非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを含むことを特徴とする組成物や、
（１８）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるマウスＴＬＲ９タンパク質を介してマウスの免疫応答を刺激する方法であって、前記マウスＴＬＲ９タンパク質に、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを接触させることを特徴とする方法や、
（１９）免疫応答刺激性物質のスクリーニング方法であって、ＴＬＲ９タンパク質に対する被検物質の親和性を、免疫応答刺激性の指標とすることを特徴とする方法や、
（２０）ＴＬＲ９タンパク質をコードする遺伝子の全部又は一部が遺伝子変異により破壊され、ＴＬＲ９を発現する機能を喪失したことを特徴とする非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して不反応性のモデル非ヒト動物や、
（２１）マウスであることを特徴とする前記（２１）記載の非ヒト動物に関する。
【００１４】
また本発明は、
（２２）前記（２０）又は（２１）記載のモデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞に、（ａ）被検物質の存在下又は非存在下で、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを接触させ、（ｂ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞とにおける免疫細胞活性の程度を測定し、（ｃ）野生型動物由来の免疫細胞における前記活性の程度が、被検物質の存在により上昇し、モデル非ヒト動物由来の免疫細胞における前記活性の程度が被検物質の存在による影響を受けないとき、（ｄ）前記被検物質を非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の促進物質と評価することを特徴とする、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の促進物質のスクリーニング方法や、
（２３）前記（２０）又は（２１）記載のモデル非ヒト動物と、同種の野生型動物に、（ａ）被検物質を投与した後に、免疫細胞を採取し、（ｂ）インビトロで非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを接触させ、（ｃ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞とにおける免疫細胞活性の程度を測定し、（ｄ）被検物質を投与した野生型動物由来免疫細胞の前記活性の程度は、投与しない野生型動物由来免疫細胞の程度より高く、被検物質を投与したモデル非ヒト動物由来免疫細胞の前記活性の程度は、投与しないモデル非ヒト動物由来免疫細胞の程度と変わらないとき、（ｅ）前記被検物質を非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の促進物質と評価することを特徴とする、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の促進物質のスクリーニング方法や、
（２４）前記（２０）又は（２１）記載のモデル非ヒト動物と、同種の野生型動物に、（ａ）細菌を感染させた後に、免疫細胞を採取し、（ｂ）被検物質の存在／非存在下でインビトロ培養し、（ｃ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞とにおける免疫細胞活性の程度を測定し、（ｄ）被検物質を投与した野生型動物由来免疫細胞の前記活性の程度は、投与しない野生型動物由来免疫細胞の程度より高く、被検物質を投与したモデル非ヒト動物由来免疫細胞の前記活性の程度は、投与しないモデル非ヒト動物由来免疫細胞の程度と変わらないとき、（ｅ）前記被検物質を非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の促進物質と評価することを特徴とする、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の促進物質のスクリーニング方法や、
（２５）前記（２０）又は（２１）記載のモデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞に、（ａ）被検物質の存在下又は非存在下で、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを接触させ、（ｂ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞とにおける免疫細胞活性の程度を測定し、（ｃ）野生型動物由来の免疫細胞における前記活性の程度が、被検物質の存在により低下し、モデル非ヒト動物由来の免疫細胞における前記活性の程度が被検物質の存在による影響を受けないとき、（ｄ）前記被検物質を非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の抑制物質と評価することを特徴とする、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の抑制物質のスクリーニング方法に関する。
【００１５】
また本発明は、
（２６）前記（２０）又は（２１）記載のモデル非ヒト動物と、同種の野生型動物に、（ａ）被検物質を投与した後に、免疫細胞を採取し、（ｂ）インビトロで非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを接触させ、（ｃ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞とにおける免疫細胞活性の程度を測定し、（ｄ）被検物質を投与した野生型動物由来免疫細胞の前記活性の程度は、投与しない野生型動物由来免疫細胞の程度より低く、被検物質を投与したモデル非ヒト動物由来免疫細胞の前記活性の程度は、投与しないモデル非ヒト動物由来免疫細胞の程度と変わらないとき、（ｅ）前記被検物質を非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の抑制物質と評価することを特徴とする、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の促進物質のスクリーニング方法や、
（２７）前記（２０）又は（２１）記載のモデル非ヒト動物と、同種の野生型動物に、（ａ）細菌を感染させた後に、免疫細胞を採取し、（ｂ）被検物質の存在／非存在下でインビトロ培養し、（ｃ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞とにおける免疫細胞活性の程度を測定し、（ｄ）被検物質を投与した野生型動物由来免疫細胞の前記活性の程度は、投与しない野生型動物由来免疫細胞の程度より低く、被検物質を投与したモデル非ヒト動物由来免疫細胞の前記活性の程度は、投与しないモデル非ヒト動物由来免疫細胞の程度と変わらないとき、（ｅ）前記被検物質を非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の抑制物質と評価することを特徴とする、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の抑制物質のスクリーニング方法や、
（２８）前記（２０）又は（２１）記載のモデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞に、（ａ）被検物質を接触させ、（ｂ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞における免疫細胞活性の程度を測定し、（ｃ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞における前記活性の程度が被検物質の接触による影響を受けないが、野生型動物由来の免疫細胞における前記活性の程度が被検物質の接触により増加したとき、（ｄ）前記被検物質をＴＬＲ９のアゴニストと評価することを特徴とする、ＴＬＲ９のアゴニストのスクリーニング方法に関する。
【００１６】
本発明はまた、
（２９）前記（２０）又は（２１）記載のモデル非ヒト動物と、同種の野生型動物に、（ａ）被検物質を投与した後に、免疫細胞を採取し、（ｂ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞とにおける免疫細胞活性の程度を測定し、（ｃ）被検物質を投与した野生型動物由来免疫細胞の前記活性の程度が、投与しない野生型動物由来免疫細胞の程度より高く、被検物質を投与したモデル非ヒト動物由来免疫細胞の前記活性の程度が、投与しないモデル非ヒト動物由来免疫細胞の程度と変わらないとき、（ｄ）前記被検物質をＴＬＲ９のアゴニストと評価することを特徴とする、ＴＬＲ９のアゴニストのスクリーニング方法や、
（３０）請求項２０又は２１記載のモデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞に、（ａ）被検物質の存在下又は非存在下で、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを接触させ、（ｂ）モデル非ヒト動物由来の免疫細胞と、同種の野生型動物由来の免疫細胞とにおける免疫細胞活性の程度を測定し、（ｃ）野生型動物由来の免疫細胞における前記活性の程度が、被検物質の存在により低下し、モデル非ヒト動物由来の免疫細胞における前記活性の程度が被検物質の存在による影響を受けないとき、（ｄ）前記被検物質をＴＬＲ９のアンタゴニストと評価することを特徴とする、ＴＬＲ９のアンタゴニストのスクリーニング方法に関する。
【００１７】
さらに本発明は、
（３１）免疫細胞活性の程度が、ＴＬＲ９のシグナル伝達機能の活性の程度であることを特徴とする前記（２２）〜（３０）いずれか記載の方法や、
（３２）ＴＬＲ９のシグナル伝達機能が、サイトカインを産生させる機能、細胞を増殖させる機能、細胞表面分子を発現させる機能、及び細胞内シグナル伝達分子を活性化させる機能から選択される１又は２以上の機能であることを特徴とする前記（３１）記載の方法や、
（３３）サイトカインが、ＴＮＦα、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２から選択される１又は２以上のサイトカインであることを特徴とする前記（３２）記載の方法。
（３４）細胞表面分子が、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６及び腫瘍組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩから選択される１又は２以上の細胞表面分子であることを特徴とする前記（３３）記載の方法や、
（３５）細胞内シグナル伝達分子が、ＮＦ−κＢ活性、ＪＮＫ活性、及びＩＲＡＫ活性から選択される１又は２以上の細胞内シグナル伝達分子であることを特徴とする前記（３２）記載の方法や、
（３６）免疫細胞が、腹腔マクロファージであることを特徴とする前記（２２）〜（３５）いずれか記載の方法や、
（３７）ＴＬＲ９タンパク質をコードする遺伝子の全部又は一部が遺伝子変異により破壊され、ＴＬＲ９を発現する機能を喪失した非ヒト動物を、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して不反応性のモデル動物として使用する方法や、
（３８）非ヒト動物がマウスであることを特徴とする前記（３７）記載の方法に関する。
【００１８】
さらに本発明は、
［１］（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＴＬＲ９タンパク質、又は（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫細胞を活性化し、免疫応答を誘導することができる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、前記受容体タンパク質を介して、免疫細胞を活性化し、免疫応答を誘導することができる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡや、
［２］配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の全部を含むことを特徴とする前記［１］の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡや、
［３］配列番号１に示される塩基配列の相補的配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする前記［１］の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡや、
［４］（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＴＬＲ９タンパク質、又は（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫細胞を活性化し、免疫応答を誘導することができる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質であって、前記受容体タンパク質を介して、免疫細胞を活性化し、免疫応答を誘導することができる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に関することもできる。
【００１９】
また本発明は、
［５］以下の（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＴＬＲ９タンパク質、又は（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、前記受容体タンパク質を介して、免疫細胞を活性化し、免疫応答を誘導することができる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡや、
［６］配列番号３に示される塩基配列を含むことを特徴とする前記［５］の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡや、
［７］配列番号３に示される塩基配列の相補的配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする前記［５］の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡや、
［８］（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＴＬＲ９タンパク質、又は（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有する受容体タンパク質であって、前記受容体タンパク質を介して、免疫細胞を活性化し、免疫応答を誘導することができる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に関することもできる。
【００２０】
また本発明は、［９］ＴＬＲ９タンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質や、［１０］ＴＬＲ９タンパク質と特異的に結合するモノクローナル抗体等の抗体や、［１１］ＴＬＲ９タンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞や、［１２］ＴＬＲ９タンパク質をコードする遺伝子が過剰発現することを特徴とする非ヒト動物に関してもよい。
【００２１】
さらに本発明は、［１３］ＴＬＲ９受容体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞に、ＴＬＲ９をコードするＤＮＡを導入することを特徴とする非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質を発現する細胞の調製方法や、［１４］非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を発現する細胞の調製方法により得られることを特徴とする非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を発現する細胞に関することもできる。
【発明の効果】
【００２２】
メチル化されていないＣｐＧモチーフを含有するバクテリア由来ＤＮＡは免疫細胞を非常に活性化し、Ｔｈ１の応答を誘導するが、そのバクテリア由来ＤＮＡを認識する受容体は知られていなかった。本発明により、細菌ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧ配列を含むオリゴヌクレオチドの受容体が明らかとなったことから、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識するＴＬＲファミリーのメンバー受容体タンパク質ＴＬＲ９や、それをコードする遺伝子ＤＮＡ等は、細菌性疾病等の診断や、治療に用いることができ、またＴＬＲ９ノックアウト動物を用いると、バクテリア由来ＤＮＡの分子レベルにおける作用機作を明らかにすることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質としては、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識することができるタンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、配列表の配列番号２で示されるヒト由来のＴＬＲ９や、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識することができるタンパク質や、これらの組換えタンパク質を具体的に挙げることができる。かかる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質は、そのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製でき、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡをリガンドとして特異的に認識する受容体として使用することができる。
【００２４】
本発明における非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡとしては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞等の免疫細胞を活性化し、免疫応答を誘導することができる、メチル化されていないＣｐＧモチーフを有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）等のバクテリアに由来するＤＮＡであって、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡをリガンドとして特異的に認識する受容体のリガンドとして使用できるＤＮＡであればどのようなものでもよく、エセリシア・コリ、クレブシェラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノサ、サルモネラ・チフィムリウム、セラチア・マルセッセンス、フレクスナー赤痢菌、ビブリオ・コレレェ、サルモネラ・ミネソタ、ポルフィロモナス・ジンジバリス、スタフィロコッカス・アウレウス、コリネバクテリウム・ジフテリア、ノカルジア・コエリアカ、ストレプトコッカス・ニューモニアなどのバクテリア由来のＤＮＡを具体的に挙げることができる。
【００２５】
また、本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列表の配列番号２で示されるヒト由来のＴＬＲ９をコードするＤＮＡ、例えば配列番号１で示されるものや、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識することができるタンパク質をコードするＤＮＡや、これらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識することができるタンパク質をコードするＤＮＡも包含され、これらはそのＤＮＡ配列情報等に基づき、例えばマウス由来のＴＬＲ９においてはマウスＲＡＷ２６４．７ｃＤＮＡライブラリーや１２９／ＳｖＪマウス遺伝子ライブラリーなどから公知の方法により調製することができる。
【００２６】
また、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、マウス由来のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、受容体タンパク質ＴＬＲ９と同効な目的とする免疫誘導非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２７】
本発明の融合タンパク質とは、マウス、ヒト等の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグを結合させたものをいい、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であればどのようなものでもよく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質の精製や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質の検出や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００２８】
本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に特異的に結合する抗体は、例えば、ＴＬＲ９の変異又は欠失に起因する疾病の診断やＴＬＲ９の制御分子機構を明らかにする上で有用である。
【００２９】
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質若しくはエピトープを含む断片、又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。以下に非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質として、マウス由来のＴＬＲ９を例に挙げてマウス由来のＴＬＲ９に対して特異的に結合するモノクローナル抗体、すなわち抗ｍＴＬＲ９モノクローナル抗体の作製方法を説明する。
【００３０】
上記抗ｍＴＬＲ９モノクローナル抗体は、抗ｍＴＬＲ９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。
【００３１】
抗ｍＴＬＲ９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、マウス等から得られた受容体タンパク質ＴＬＲ９を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免役し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスＮＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１８）とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗ｍＴＬＲ９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。
【００３２】
また、本発明の上記非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、その非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に対する抗体は、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質の分子機構を明らかにする上で有用である。
【００３３】
また上記抗ｍＴＬＲ９モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、125Ｉ、32Ｐ、35Ｓ又は3Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質の機能解析を行うことができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００３４】
本発明はまた、上記非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に関する。かかる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子の宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（transvection）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（scrape loading）、弾丸導入（ballistic introduction）、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞などを挙げることができる。
【００３５】
また、発現系としては、上記非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００３６】
上記発現系を含んでなる宿主細胞やかかる細胞の細胞膜、またかかる細胞を培養して得られる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識するタンパク質は、後述するように本発明のスクリーニング方法に、受容体として使用することができる。例えば、細胞膜を得る方法としては、F. Pietri-Rouxel（Eur. J. Biochem., 247, 1174-1179, 1997）らの方法などを用いることができ、また、かかる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、抗ＴＬＲ９モノクローナル抗体等の抗非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質抗体を結合させたカラムや、上記ＴＬＲ９等の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらの非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を得ることができる。
【００３７】
本発明において、上記非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識するＴＬＲ９タンパク質をコードする遺伝子が過剰発現する非ヒト動物とは、野生型非ヒト動物に比べてかかる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を大量に産生する非ヒト動物をいい、また、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識するＴＬＲ９タンパク質をコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識するＴＬＲ９タンパク質を発現する機能を失った非ヒト動物をいう。そして、本発明における非ヒト動物としては、ウサギや、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。上記ＴＬＲ９タンパク質を発現する機能を失った非ヒト動物は、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して不反応性のモデル動物として使用することができる。
【００３８】
また、本発明において非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して不反応性とは、細菌ＤＮＡによる刺激に対する生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下しているか、あるいはほぼ失われていることを意味する。したがって、本発明において非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して不反応性の非ヒト動物とは、細菌ＤＮＡによる刺激に対して、生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下しているか、あるいはほぼ失われているマウス、ラット、ウサギ等のヒト以外の動物をいう。また、細菌ＤＮＡによる刺激としては、細菌ＤＮＡを生体に投与するインビボでの刺激や、生体から分離された細胞に細菌ＤＮＡを接触させるインビトロでの刺激等を挙げることができ、具体的には、ＴＬＲ９ノックアウトマウス等のＴＬＲ９遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を挙げることができる。
【００３９】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を、例えば下記に記載する本発明のスクリーニングに際して併用することが好ましい。かかる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質のノックアウトマウスやトランスジェニックマウスを例にとって以下説明する。
【００４０】
例えば、ＴＬＲ９等の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわち非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、上記非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされた非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子をウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクローンの非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。
【００４１】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質ノックアウトマウスを作製することができる。また、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質ノックアウトマウスが生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスの発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００４２】
また、作出されたＴＬＲ９ノックアウトマウスが非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して不応答性であることは、例えば、ＣｐＧ  ＯＤＮをＴＬＲ９ノックアウトマウスのマクロファージ、単核細胞、樹状細胞などの免疫細胞にインビトロ又はインビボで接触せしめ、かかる細胞におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ等の産生量や、脾臓Ｂ細胞の増殖応答や、脾臓Ｂ細胞表面でのＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスII等の抗原の発現量や、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ＩＲＡＫ等のＴＬＲ９のシグナル伝達経路における分子の活性化を測定することにより確認することができる。そして、本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウスは、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡ等の作用機序の解明や細菌感染に対するワクチン開発に有用なモデルとすることができる。
【００４３】
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質のトランスジェニックマウスは、ＴＬＲ９等の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡにチキンβ−アクチン、マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することによりかかるトランスジェニックマウスを創製することができる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入した非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００４４】
また、本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡの全部あるいは一部を用いると、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質の欠失又は異常に起因する疾病等の遺伝子治療に有効な細胞を調製することができる。本発明におけるこれら細胞の調製方法としては、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞に、上記本発明のＤＮＡの全部あるいは一部をトランスフェクション等により導入し、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を発現する細胞を得る方法を挙げることができ、特に、かかる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を発現する細胞としては、上記ＤＮＡ等が染色体にインテグレイトされ、ステイブルにＴＬＲ９活性を示す細胞を用いることが好ましい。
【００４５】
そしてまた、上記非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡ、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に対する抗体、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子が過剰発現する非ヒト動物、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を発現する細胞等を用いると、本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質のアゴニスト又はアンタゴニストや、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対する反応性の抑制物質又は促進物質をスクリーニングすることができる。これらのスクリーニングにより得られたものは、細菌感染症に対する抑制物質又は促進物質や、アレルギー性疾患若しくは癌に対する抑制剤、予防剤又は治療薬や、遺伝子治療等において副作用を抑制剤又は阻害剤や、ＴＬＲ９活性の欠失又は異常に起因する疾病等の診断・治療に有用な物質である可能性がある。
【００４６】
上記ＴＬＲ９活性とは、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡと特異的に反応し、細胞内にシグナルを伝達する機能をいい、シグナル伝達機能としては、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ等のサイトカインを産生する機能や、亜硝酸イオンを産生する機能や、細胞を増殖する機能や、細胞表面においてＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスII等の抗原を発現する機能や、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ＩＲＡＫ等のＴＬＲ９のシグナル伝達経路における分子を活性化させる機能などを具体的に例示することができる。
【００４７】
本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質ＴＬＲ９のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法としては、被検物質の存在下、マクロファージ、脾臓細胞又は樹状細胞などの免疫細胞、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を発現している細胞、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を発現する細胞等の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質を発現している細胞をインビトロで培養し、ＴＬＲ９活性を測定・評価する方法や、野生型非ヒト動物、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物、又は、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子が過剰発現した非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物から得られるマクロファージ、脾臓細胞、又は樹状細胞などの免疫細胞のＴＬＲ９活性を測定・評価する方法等を具体的に挙げることができる。
【００４８】
また、マクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価するに際し、対照として野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物の測定値と比較・評価することが個体差によるバラツキをなくすることができるので好ましい。このことは、以下に示す非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対する反応性の抑制物質又は促進物質のスクリーニングや、ＴＬＲ９のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングにおいても同様である。例えば、野生型非ヒト動物の免疫細胞とＴＬＲ９がノックアウトされたモデル非ヒト動物由来の免疫細胞に被検物質を接触させて免疫細胞活性の程度を測定し、野生型動物由来の免疫細胞における活性が増加してモデル動物由来の免疫細胞における活性が変わらないときは前記被検物質はＴＬＲ９のアゴニストと評価することができ、野生型非ヒト動物の免疫細胞とＴＬＲ９がノックアウトされたモデル非ヒト動物由来の免疫細胞に非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡの存在下に被検物質を接触させて免疫細胞活性の程度を測定し、野生型動物由来の免疫細胞における活性が低下してモデル動物由来の免疫細胞における活性が変わらないとき前記被検物質はＴＬＲ９のアンタゴニストと評価することができる。
【００４９】
また、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識するタンパク質に対する被験物質の親和性を指標とする、免疫応答反応性の抑制物質又は刺激／促進物質のスクリーニング方法としては、被検物質と非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡとの存在下／又は非存在下で、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質、又は該タンパク質を発現している細胞膜をインビトロでインキュベーションし、該タンパク質との反応性を測定・評価する方法や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞と被検物質とをあらかじめインビトロで接触せしめた後、該マクロファージ又は脾臓細胞を非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡの存在下で培養し、該マクロファージ若しくは脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価する方法や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞と非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡとをあらかじめインビトロで接触せしめた後、該マクロファージ又は脾臓細胞を被検物質の存在下で培養し、該マクロファージ若しくは脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価する方法や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞を非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡの存在下で培養し、該マクロファージ若しくは脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価する方法や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物を細菌により感染させ、該非ヒト動物から得られるマクロファージ若しくは脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価する方法や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞を被検物質の存在下で培養し、該マクロファージ若しくは脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価する方法や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物から得られるマクロファージ若しくは脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価する方法や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物を細菌により感染させ、該非ヒト動物におけるマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価する方法や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物におけるマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価する方法などを具体的に挙げることができる。また、これらのスクリーニング方法に用いる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡとしては、ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＴＣＣ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＴＴＣ−ＣＴＧ−ＡＴＧ−ＣＴ：配列番号５）を用いることが好ましいが、これに限定されるのもではない。
【００５０】
本発明はまた、検体中の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列と比較することからなる、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質の活性又は発現と関連する疾病の診断に用いられる診断キットに関する。非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡの変異型の検出は、遺伝子に変異がある個体をＤＮＡレベルで見い出すことにより行うことができ、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質の過少発現、過剰発現又は変異発現により生ずる疾病の診断に有効である。かかる検出に用いられる検体としては、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織等の生検から得ることができるゲノムＤＮＡや、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではなく、かかる検体を使用する場合、ＰＣＲ等により増幅したものを用いることもできる。そして、塩基配列の欠失や挿入変異は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化により検出でき、また点突然変異は増幅ＤＮＡを標識非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子とハイブリダイズさせることで同定することができる。このように、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子の変異を検出することで、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質の活性又は発現と関連する疾病の診断又は判定をすることができる。
【００５１】
本発明はまた、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部からなる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質の活性又は発現と関連する疾患の診断用プローブ、及び当該プローブ及び／又は本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に特異的に結合する抗体を含有してなる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質の活性又は発現と関連する疾患の診断キットに関する。前記診断用プローブとしては、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（ｃＲＮＡ）のアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有するものであれば特に制限されるものではない。かかるプローブ及び／又は本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に特異的に結合する抗体を細菌感染症等のような症状の疾患の診断薬の有効成分とするためには、プローブが分解されないような適当なバッファー類や滅菌水に溶解することが好ましい。また、これらの診断薬を用いた、免疫染色法（Dev.Biol. 170, 207-222, 1995、J. Neurobiol. 29, 1-17, 1996）や、In situハイブリダイゼーション法（J. Neurobiol. 29, 1-17, 1996）や、in situ PCR法等の方法により細菌感染症等のような症状の疾患を診断することもできる。
【００５２】
本発明の医薬組成物としては、ＴＬＲ９等の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質の全部又はその一部や、上記受容体タンパク質のアゴニストやアンタゴニストを含むものであれば、どのようなものでもよい。具体的には、細菌感染症に対するワクチンや、癌に対するワクチンや、気管支喘息をはじめとするアレルギー疾患の治療薬や、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた治療や遺伝子治療において障害となるＣｐＧモチーフの存在による副作用の克服剤・抑制剤・阻害剤などを挙げることができる。
【００５３】
前記のように、本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列の欠失、置換及び／又は付加に関連する疾病の診断キットとしては、ＴＬＲ９をコードするＤＮＡを含むものであればどのようなものでもよく、かかるＴＬＲ９をコードするＤＮＡと検体中の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡとの塩基配列を比較することにより、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列の欠失、置換及び／又は付加に関連する疾病、例えば、癌、アレルギー、伝染病等の診断が可能となる。
【実施例】
【００５４】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれら実施例により限定されるものではない。
実施例１（ＴＬＲ９のクローニング）
ヒトＴＬＲ４のＤＮＡ配列情報を用いて、GenBankをサーチした結果、相同性がきわめて高いマウスＥＳＴ（登録番号ＡＡ２７３７３１；マウス）を見い出した。このマウスＥＳＴのＰＣＲ増幅産物をプローブとして、マウスＲＡＷ２６４．７ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、完全なＴＬＲ９オープンリーディングフレームを含む配列番号３に示される完全長のｃＤＮＡクローンを単離した。このマウスＴＬＲ９のＤＮＡ配列情報を用いてGenBankをサーチし、高い相同性を有するヒトゲノム配列を見い出した。このヒトゲノム配列に基づいて、ｃＤＮＡ端部を増幅し、Ｕ９３７細胞（J. Immunol. 163, 5039-5048, 1999）から、配列番号１に示される塩基配列を有する完全長のヒトＴＬＲ９のｃＤＮＡを単離した。
【００５５】
実施例２（ＴＬＲ９ノックアウトマウスの作製）
１２９／ＳｖＪマウス遺伝子ライブラリー（ストラタジーン社製）からＴＬＲ９ゲノムＤＮＡを単離し、pBluescript II SK(+)ベクター（ストラタジーン社製）中でサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定により特定した。ターゲッティングベクターは、ＬＲＲ（ロイシンリッチリピート）領域の一部分をコードする１．０ｋｂのフラグメントを、ネオマイシン耐性遺伝子カセット（pMC1-neo；ストラタジーン社製）に置換し、負の選択マーカーとして単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を挿入することにより構築した（図１）。このターゲッティングベクターを線状化し、胎生１４．１日目の胚幹細胞（ＥＳ細胞）にエレクトポレーションし、Ｇ４１８及びガンシクロビアに抵抗性を示す２９２個のクローンを選択し、ＰＣＲ法及びサザンブロット法により１４個のクローンをスクリーニングした。
【００５６】
突然変異ＴＬＲ９対立遺伝子を含有していた３個の標的ＥＳクローンを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製した。この雄のキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６雌マウスと交配させ、ヘテロ接合体Ｆ１マウスを作製し、かかるヘテロ接合体Ｆ１マウスをインタークロスすることによってホモ接合体マウス（ＴＬＲ９ノックアウトマウス：ＴＬＲ９-/-）を得た（図２）。なお、ホモ接合体マウスの確認は、マウスの尾から抽出した各ゲノムＤＮＡをＳｃａＩでダイジェストし、図１に示すプローブを用いたサザンブロット法により行った。本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウス（ＴＬＲ９-/-）はメンデルの法則に従い作製することができ、１２週目までは顕著な異常を示さなかった。
【００５７】
突然変異によりＴＬＲ９遺伝子の不活性化が生起していることを確認するため、野生型マウス（＋／＋）及びＴＬＲ９ノックアウトマウス（−／−）の脾臓細胞から抽出した全ＲＮＡ（１０μｇ）を電気泳動にかけナイロン膜に移して、［32Ｐ］で標識したＴＬＲ９のＣ−末端フラグメント若しくはＮ−末端フラグメント、又はβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）に特異的なｃＤＮＡを用いてノーザンブロット分析を行った（図３）。これらの結果から、ＴＬＲ９ｍＲＮＡのＮ−末端フラグメントはＴＬＲ９ノックアウトマウスの脾臓細胞からは検出されなかった。また、Ｃ−末端フラグメントをプローブとした場合、変異マウス由来のＴｌｒ９の転写は野生型マウス由来のものとほぼ同じサイズのものが検出されたが、生産量においては少ないことがわかった。そこで、変異マウスから得られた脾臓細胞のｍＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、得られた生成物の配列分析を行った。この結果、転写されたＴｌｒ９遺伝子にはｎｅｏ遺伝子が含まれており、このｎｅｏの挿入によって、ＴＬＲ９のＮ−末端部位にストップコドンが出現し、変異マウスにおいて機能的なＴＬＲ９タンパク質が発現しないことがわかった（図４）。なお、ＴＬＲ９ノックアウトマウスのリンパ細胞をフローサイトメトリーで測定した結果、異常成分は見られなかった。
【００５８】
実施例３（腹腔マクロファージの調製）
野生型マウス（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）及びＴＬＲ９ノックアウトマウス（ＴＬＲ９-/-）のそれぞれの腹腔内に４％のチオグリコール酸培地（ＤＩＦＣＯ社製）を２ｍｌずつ注入し、３日後に各マウスの腹腔内から腹膜滲出細胞を単離し、これらの細胞を１０％のウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）中で３７℃にて２時間培養し、氷温のハンクス緩衝液（Hank's buffered salt solution：ＨＢＳＳ；ＧＩＢＣＯ社製）で洗浄することにより非付着細胞を取り除き、付着細胞を腹膜マクロファージとして以下の実験に使用した。
【００５９】
実施例４（ＴＬＲ９ノックアウトマウスの非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対する応答性）
最近、ＣｐＧ  ＯＤＮ（oligodeoxynucleotide）の応答性は、ＴＬＲを介するシグナル伝達経路の中のアダプタータンパク質であるＭｙＤ８８に依存していることが明らかになった。このＭｙＤ８８ノックアウトマウスはＣｐＧ  ＯＤＮに対して応答しないが、ＴＬＲ２ノックアウトマウスやＴＬＲ４ノックアウトマウスは正常にＣｐＧ  ＯＤＮに対して応答する。これらのことは、ＣｐＧ  ＯＤＮがＴＬＲ２及びＴＬＲ４以外のＴＬＲによって認識されることを示している。そこで、ＴＬＲ９ノックアウトマウスのＣｐＧ  ＯＤＮに対する応答性を調べてみた。まず、腹腔マクロファージにおける炎症性サイトカインの産生量を以下のように測定した。
【００６０】
実施例３により調製した各腹膜マクロファージをＩＮＦγ（３０ｕｎｉｔ／ｍｌ）の存在下又は非存在下において、図５に示された各種濃度のＣｐＧ  ＯＤＮ（０．１又は１．０μＭ；TIB MOLBIOL社製；ＴＣＣ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＴＴＣ−ＣＴＧ−ＡＴＧ−ＣＴ）、ＰＧＮ（１０μｇ／ｍｌ；Sigma and Fluka社製；スタフィロコッカス・アウレウス由来）、ＬＰＳ（１．０μｇ／ｍｌ；Sigma社製；サルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５由来）といっしょに２４時間培養した。培養後、培養上清中のＴＮＦα、ＩＬ−６及びＩＬ−１２  ｐ４０の各濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。この結果を図５に示す。これらの結果から、野生型マウス（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）のマクロファージはＣｐＧ  ＯＤＮに応答してＴＮＦα、ＩＬ−６及びＩＬ−１２を産生し、さらにＩＦＮγ及びＣｐＧ  ＯＤＮで刺激すると、ＴＮＦα、ＩＬ−６及びＩＬ−１２の産生量が増加することがわかった。しかし、ＴＬＲ９ノックアウトマウス（ＴＬＲ９-/-）由来のマクロファージは、ＩＦＮγの存在下でさえ、ＣｐＧ  ＯＤＮに対する応答において検出可能なレベルの炎症性サイトカインを産生していなかった。また、野生型マウス及びＴＬＲ９ノックアウトマウス由来のマクロファージは、ＬＰＳ又はＰＧＮに対する応答によりＴＮＦα、ＩＬ−６及びＩＬ−１２をほぼ同程度産生することがわかった（図５）。なお、それぞれの実験結果はｎ＝３の平均値を示す。図中のＮ．Ｄ．は検出できなかったことを示す。
【００６１】
また、ＣｐＧ  ＯＤＮ又はＬＰＳに対する野生型マウス（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）及びＴＬＲ９ノックアウトマウス（ＴＬＲ９-/-）の脾臓細胞の応答性について調べてみた。それぞれのマウスの脾臓細胞（１×１０5）を単離し、図６に示す各種濃度のＣｐＧ  ＯＤＮ又はＬＰＳにより９６ウェルプレート内で培養して脾臓細胞を刺激した。培養から４０時間後に１μＣｉの［3Ｈ］−チミジン（デュポント社製）を添加して更に８時間培養し、［3Ｈ］の摂取量をβシンチレーションカウンター（パッカード社製）で測定した（図６）。この結果から、野生型マウスの脾臓細胞では、ＣｐＧ  ＯＤＮやＬＰＳの投与量に依存して細胞増殖反応を促進していたが、ＴＬＲ９ノックアウトマウスの脾臓細胞では、いかなる濃度のＣｐＧ  ＯＤＮ刺激においてもＣｐＧ  ＯＤＮによる細胞増殖反応は見られなかった。また、ＣｐＧ  ＯＤＮに応答して、野生型マウス由来のＢ細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスIIの発現が増加した。しかし、ＴＬＲ９ノックアウトマウス由来のＢ細胞ではＣｐＧ  ＯＤＮに誘導されたＭＨＣクラスIIの発現の増加は見られなかった。以上のことから、ＴＬＲ９ノックアウトマウスのマクロファージやＢ細胞は、ＣｐＧ  ＯＤＮに対する応答性を特異的に欠如していることがわかった。
【００６２】
次に、ＣｐＧ  ＯＤＮを含有するバクテリア由来ＤＮＡは樹状細胞を潜在的に刺激し、Ｔｈ１細胞の発達をサポートすることが知られている（EMBO J. 18, 6973-6982, 1999、J. Immunol. 161, 3042-3049, 1998、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9305-9310, 1999）。そこでＣｐＧ  ＯＤＮ誘導サイトカインの産生と、骨髄由来の樹状細胞の表面分子のアップレギュレーションを分析した。野生型マウス（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）又はＴＬＲ９ノックアウトマウス（ＴＬＲ９-/-）の骨髄細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのマウス顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（Peprotech社製）を含む１０％のウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養し（J. Exp. Med. 176, 1693-1702, 1992）、培養後６日目に未成熟の樹状細胞を回収し、０．１μＭのＣｐＧ  ＯＤＮ又は０．１μｇ／ｍｌのＬＰＳの存在下若しくは非存在下において、１０％のウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で２日間培養した。培養後、上清中のＩＬ−１２  ｐ４０の濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した（図７）。この結果から、野生型マウス由来の樹状細胞はＣｐＧ  ＯＤＮに応答してＩＬ−１２を産生したが、ＴＬＲ９ノックアウトマウス由来の樹状細胞においては、ＣｐＧ  ＯＤＮはＩＬ−１２の産生を誘導しなかった。
【００６３】
上記１０ｎｇ／ｍｌのマウス顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（Peprotech社製）を含む１０％のウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、６日目に回収された樹状細胞を、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＭＨＣクラスIIに対する、それぞれのビオチン化抗体により染色し、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：ＰＥ；ファーミンジェン社製）で標識したストレプトアビジンで発展させ、これらの細胞をセルクエストソフトウェア（ベクトンディッキンソン社製）により蛍光活性化セルソーターキャリバー（FACS Calibur）で分析した（図８）。この結果から、ＣｐＧ  ＯＤＮで刺激すると、野生型マウス由来の樹状細胞表面においては、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＭＨＣクラスIIの発現を促進していたが、ＴＬＲ９ノックアウトマウス由来の樹状細胞表面では、ＣｐＧ  ＯＤＮに対する応答によりこれらの分子の発現を促進しなかった（図８）。ＬＰＳによる刺激では、野生型マウス由来の樹状細胞もＴＬＲ９ノックアウトマウス由来の樹状細胞も同様の応答がみられた。以上の結果から、ＴＬＲ９はＣｐＧＯＤＮの細胞応答に不可欠な受容体であることがわかった。
【００６４】
実施例５（ＴＬＲ９ノックアウトマウス由来のマクロファージのＣｐＧ  ＯＤＮに対する応答によるＮＦ−κＢ、ＪＮＫ及びＩＲＡＫの活性化）
ＴＬＲのシグナルは、アダプター分子であるＭｙＤ８８を介してセリン／トレオニンキナーゼであるＩＲＡＫを活性化し、次いでＭＡＰキナーゼ及びＮＦ−κＢを活性化することが知られている（Immunity 11, 115-122, 1999）。そこでＣｐＧ  ＯＤＮが、かかる細胞内シグナル伝達分子を活性化するかどうかを調べてみた。実施例３により調製した野生型マウス及びＴＬＲ９ノックアウトマウスの腹腔マクロファージ（１×１０6cells）を、１．０μＭのＣｐＧ  ＯＤＮ又は１．０μｇ／ｍｌのサルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５のＬＰＳで図９に示された時間刺激し、各マウスのマクロファージから核蛋白質を抽出し、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合部位を含む特異的プローブといっしょにインキュベートし、電気泳動を行い、オートラジオグラフィーにより視覚化した（図９）。
【００６５】
この結果から、ＣｐＧ  ＯＤＮで刺激すると、野生型マウス由来のマクロファージではＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性が増加するのに対し、ＴＬＲ９ノックアウトマウス由来のマクロファージではＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性は増加しなかった。ＴＬＲ９ノックアウトマウス由来のマクロファージをＬＰＳで刺激したものは、野生型マウス由来のマクロファージをＬＰＳで刺激したものと同様のＮＦ−κＢの活性化が見られた。以上の結果から、ＣｐＧ  ＯＤＮの誘導によるＮＦ−κＢの活性がＴＬＲ９ノックアウトマウス由来のマクロファージにおいて特異的に欠損していることがわかる。なお、図中の矢印はＮＦ−κＢと特異的プローブとの複合物の位置を示し、矢頭は特異的プローブのみの位置を示している。
【００６６】
上記と同様に図１０又は図１１で示された時間、ＣｐＧ  ＯＤＮ又はＬＰＳで刺激した野生型マウス及びＴＬＲ９ノックアウトマウスのマクロファージを、溶解緩衝液（最終濃度で１．０％のトリトンＸ−１００、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール、１ｍＭのＰＭＳＦ、２０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのＮａ3ＶＯ4及び１０ｍＭのβ−グリセロリン酸を含有する緩衝液；ｐＨ８．０）中にて溶解し、この細胞溶解物を抗ＪＮＫ抗体（サンタクルス社製）又は抗ＩＲＡＫ抗体（林原生化学研究所株式会社製）で免疫沈降して、文献（Immunity 11, 115-122, 1999）記載のように、インビトロキナーゼアッセイを行い、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ溶解蛋白質（ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ）を基質としたＪＮＫ活性及びＩＲＡＫの活性を測定した（図１０，１１における上段；ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ，Ａｕｔｏ）。
【００６７】
また、上記細胞溶解物を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離させ、ニトロセルロース膜に移し、この膜を抗ＪＮＫ抗体（サンタクルス社製）又は抗ＩＲＡＫ抗体（Transduction Laboratories社製）でブロットして、エンハンスド・ケミルミネッセンス装置（デュポント社製）を使用して視覚化した（図１０，１１における下段；ＷＢ）。以上の結果から、ＣｐＧ  ＯＤＮは野生型マウス由来のマクロファージのＪＮＫ及びＩＲＡＫを活性化するが、ＴＬＲ９ノックアウトマウス由来のマクロファージでは全く活性化しないことがわかった（図１０，１１）。したがって、ＣｐＧ  ＯＤＮを介する情報伝達はＴＬＲ９に依存していることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウスと野生型マウスの遺伝子地図を示す図である。
【図２】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウスのサザンブロット分析の結果を示す図である。
【図３】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウスの脾臓細胞におけるノーザンブロット分析の結果を示す図である。
【図４】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウスと野生型マウスのアミノ酸配列の比較結果を示す図である。
【図５】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウス及び野生型マウスにおけるＣｐＧ  ＯＤＮ、ＰＧＮ又はＬＰＳ誘導によるＴＮＦα、ＩＬ−６又はＩＬ１２の産生量の結果を示す図である。
【図６】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウス及び野生型マウスにおけるＣｐＧ  ＯＤＮ又はＬＰＳ誘導による細胞増殖応答の結果を示す図である。
【図７】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウス及び野生型マウスにおけるＣｐＧ  ＯＤＮ又はＬＰＳ誘導によるＩＬ−１２の産生量の結果を示す図である。
【図８】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウス及び野生型マウスにおけるＣｐＧ  ＯＤＮ又はＬＰＳ誘導によるＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＭＨＣクラスIIの発現量の結果を示す図である。
【図９】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウス及び野生型マウスにおけるＣｐＧ  ＯＤＮ又はＬＰＳ誘導によるＮＦ−κＢの活性化の結果を示す図である。
【図１０】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウス及び野生型マウスにおけるＣｐＧ  ＯＤＮ又はＬＰＳ誘導によるＪＮＫの活性化の結果を示す図である。
【図１１】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウス及び野生型マウスにおけるＣｐＧ  ＯＤＮ又はＬＰＳ誘導によるＩＲＡＫの活性化の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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