(57)【要約】【課題】  海洋細菌アグロバクテリウム属細菌Ｎ−８１１０６株（例えば、特許第３５７０７４１号公報参照）の変異株であるＴＳＵＧ１Ｃ１１（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）、（例えば、特開２００５−０５８２１６号公報参照）、菌株ＴＳＮ１８Ｅ７（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）、（例えば、特開２００５−０５８２１６号公報参照）等の培養液より得られる安定性に優れたカロテノイドを含有する粉体およびその製造方法を提供する。【解決の手段】  カロテノイド生産性海洋細菌の菌体懸濁液に水溶性抗酸化剤を添加し乾燥して得られるカロテノイド含有粉体およびその製造方法を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロテノイド生産性海洋細菌の菌体懸濁液に水溶性抗酸化剤を添加し乾燥して得られるカロテノイド含有粉体。
【請求項２】
請求項１に記載の水溶性抗酸化剤がアスコルビン酸、クエン酸又はそれらの塩であるカロテノイド含有粉体。
【請求項３】
アスコルビン酸、クエン酸又はそれらの塩を、粉体重量当り０．１〜１０重量％含有する請求項２に記載のカロテノイド含有粉体。
【請求項４】
カロテノイド生産性海洋細菌が、Ｎ−８１１０６株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）の変異育種によって得られた菌株又はそれらの遺伝子組換え株である請求項１〜３のいずれかに記載のカロテノイド含有粉体。
【請求項５】
カロテノイド生産性海洋細菌を培養して得られる培養液中の固形分に対し、アスコルビン酸、クエン酸又はそれらの塩を添加した後に乾燥することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のカロテノイド含有粉体の製造方法。
【請求項６】
アスコルビン酸、クエン酸又はそれらの塩の添加量がカロテノイド生産性海洋細菌を培養して得られる培養液中の固形分に対し０．１〜１０重量％である請求項５に記載のカロテノイド含有粉体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の培養により得られる、脂溶性色素である天然アスタキサンチンを含有する粉体に関するものである。アスタキサンチンは養殖サケ・マス・マダイの色揚げ剤や鶏卵の色調改善剤、健康補助食品、医薬品として有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
β‐カロテンやリコペンなどに代表されるカロテノイド類の化合物のうち、アスタキサンチン（以下Ａｘと略記する。）は、オキアミ、カニ、エビなどの甲殻類やマダイ、サケ、マスなどの魚類、フラミンゴなどの鳥類、藻類や微生物等に広く分布する天然の化合物である。近年はサケやマス、マダイ等の養殖魚の色揚げ剤や鶏卵の色調改善剤としてＡｘの需要が増加している。またＡｘには抗酸化活性や抗癌活性などの様々な生理的作用が確認され、医薬品や健康補助食品としての利用も注目されている。
【０００３】
Ａｘの製造方法としては、化学合成法、天然物からの抽出法、微生物による発酵生産法などがあるが、現在は主に価格等の要因から化学合成法による製品が広く流通している。しかし、化学合成法では原料に臭素および塩素を含むハロゲン系化合物や重金属類を使用するため安全性に懸念があり（例えば、特許文献１参照）、消費者の自然、天然志向にともない天然物由来のＡｘへの要求が強くなっている。
【０００４】
天然物からの抽出法としてはオキアミ等からの抽出法があるが、これらは含量が低く、採取、抽出、精製などに多大な労力を要し、コスト的に問題があった。
【０００５】
微生物を利用した製法としては、酵母ではファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（例えば、非特許文献１参照）、藻類ではヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）（非特許文献２）の報告がある。しかしながらファフィア酵母は増殖速度が遅いため培養日数が長く、細胞壁が強固なために抽出効率が低く、含量が少ないためコスト高である。またヘマトコッカス藻類は増殖速度が非常に遅いために培養日数が長く、光を必要とするため立地条件や設備などに制約がある他、クロロフィルなどの夾雑物の除去が必要になりコスト高である。
【０００６】
これらの問題を解決する方法として海洋性アグロバクテリウム属細菌Ｎ−８１１０６株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）の培養により得る方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。当該発明によれば、藻類や酵母に比べて細菌は増殖が速く、また細胞壁が脆弱であり、藻類と異なりクロロフィルなどのカロテノイド以外の色素を含まず、酵母のように副生成物の多糖類を生産しないという利点がある。当該発明によればＡｘを含有した菌体が迅速に得られ、さらに菌体を回収した後、アセトンなどの有機溶媒と菌体を混和・攪拌するだけで容易にＡｘを抽出できるという利点がある。なお、この微生物は後に１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子の配列解析が行われた結果、パラコッカス属細菌と再同定された。海洋バイオテクノロジー研究所においてＭＢＩＣ０１１４３としても管理され、その諸性質に関する情報の概略は国立遺伝学研究所日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）や米国ＮＩＨのデーターベース（ＮＣＢＩ）に公開されている（例えば、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５参照）。また該微生物を用いて変異育種を行ない、Ａｘの生産能が向上したＴＳＵＧ１Ｃ１１株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）、ＴＳＮ１８Ｅ７株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）の取得例（例えば、特許文献３参照）、ＴＳＴＴ００１株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−０２６７０）、ＴＳＴＴ０３１株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−０２６８９）及びＴＳＴＴ０５２株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−０２６９０）の取得例が報告されている（例えば、特許文献４参照）。
【０００７】
上記Ｎ−８１１０６株は細胞中にＡｘを主なカロテノイドとして蓄積するが、その他にβ−カロテン、エキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、カンタキサンチン、３’−ヒドロキシエキネノン、シス−アドニキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチンなどの多様なカロテノイドを蓄積し、これらの生成比率は培養条件により変化することも知られている（例えば、非特許文献６参照）。
【０００８】
当該微生物のＡｘの生合成経路は三澤らにより解明されている（例えば、非特許文献７参照）。彼らはβ−カロテンからＡｘを合成する酵素の遺伝子であるｃｒｔＷおよびｃｒｔＺを見出し、大腸菌にクローニングして製造した両酵素の性質を解析した。その結果によれば、これらはそれぞれβ−カロテンの３および３’位にケト基を導入する酵素、および４および４’位に水酸基を導入する酵素である。この発見に基づき、Ａｘの生合成経路として1）β−カロテンにｃｒｔＺが優先して作用してβ−クリプトキサンチンを経てゼアキサンチンが第一に生産され、次いでｃｒｔＷが作用してアドニキサンチン（４−ケトゼアキサンチンとも称される）を経てＡｘが生産される経路と、２）ｃｒｔＷが優先して作用してエキネノンを経てカンタキサンチンが第一に生産され、次いでｃｒｔＺが作用してフェニコキサンチンを経てＡｘに至る経路の、二つの経路が存在することが解明された。
【０００９】
当該微生物、すなわち海洋細菌Ｎ−８１１０６株（例えば、特許文献２参照）の変異株であるＴＳＵＧ１Ｃ１１（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）、（例えば、特許文献３参照）又は菌株ＴＳＮ１８Ｅ７（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６号）、（例えば、特許文献３参照）により魚類を色揚げした例は、例えば特許文献５に報告されている。当該文献によれば、これらの細菌の培養液から固形分を回収し、これを乾燥することにより得られた乾燥物を各種飼料原料と混合してマダイを飼育することにより、同じ飼料原料を用いたが当該乾燥物を混合しなかった場合に比較して、有意に体表の赤色が強く、かつ表皮中のカロテノイド含量の高いマダイが得られることが報告されている。しかしながら当該文献では固形分の回収方法として凍結乾燥を行った例が開示されるのみであり、工業的に有利な乾燥法である噴霧乾燥法等で粉体を調製した例は報告されていなかった。
【００１０】
カロテノイドは不安定な化合物であり、酸化分解しやすく、特に噴霧乾燥などの際に加熱することで分解が促進することが知られていた。その解決として、例えばファフィア酵母に由来するカロテノイドの回収においてエトキシキンを添加することや（例えば特許文献６参照）、２つ以上のカルボキシル基を有する有機酸、グリシン、アスコルビン酸、若しくはこれらの塩類を添加すること（例えば、特許文献７参照）により、カロテノイドを安定化する方法が知られていた。しかしながら海洋細菌により生産されるカロテノイドに対するこれらの抗酸化剤の添加効果は全く知られていなかった。
【００１１】
類似した細菌により得られたカロテノイドによる色揚げの例としては、フラボバクテリウム属細菌Ｎ−８１１０６株より抽出精製された４−ケトゼアキサンチンを用いてワキンを飼育した例が知られている（例えば、特許文献８参照）。この例においては精製した４−ケトゼアキサンチンのアセトン溶液を市販の飼料に噴霧した後に乾燥した飼料を用いて飼育することにより、視認により赤色の良好なワキンが得られることが述べられている。しかしながら当該文献においては、カロテノイド類の安定性については全く触れられていない。
【００１２】
またその他の細菌によるものとして土壌細菌であるＥ−３９６株またはＡ−５８１−１株を培養し、遠心分離により得られた菌体をスプレードライヤーにより乾燥して得た乾燥菌体を用いて白色レグホンおよびマダイを飼育した例が知られている（例えば、特許文献９参照）。しかしながら、本公報においてもカロテノイドの安定性については触れられていなかった。
【００１３】
【特許文献１】米国特許第４２８３５５９号明細書
【特許文献２】特許第３５７０７４１号公報
【特許文献３】特開２００５−０５８２１６号公報
【特許文献４】特願２００５−３５０２２５号
【特許文献５】特願２００６−０６７８６５号
【特許文献６】特表平８−５０８８８５号公報
【特許文献７】特開平６−２６４０５５号公報
【特許文献８】特開平６−１６５６８４号公報
【特許文献９】特許第３２７８５７４号公報
【非特許文献１】Ａｎｄｒｅｗｅｓ，Ａ．Ｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １５，  １００３，  １９７６年
【非特許文献２】Ｒｅｎｓｔｒｏｍ，Ｂ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０，  ２５６１，  １９８１年
【非特許文献３】インターネット（海洋バイオテクノロジー研究所ホームページ）、株式会社  海洋バイオテクノロジー研究所、ＭＢＩＣ（菌株コレクションデータベース）、［ｏｎｌｉｎｅ］、掲載年月日不明、９ページ目の「ｃａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」、「ｓｔｒａｉｎ  ｎａｍｅ」及び「１６ｓ」の項、  ［平成１７年６月８日検索］、インターネット：＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｃｏｄ．ｍｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｍｂｉｈｐ／ｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献４】インターネット（国立遺伝学研究所ホームページ）大学共同利用機関法人  情報・システム研究機構  国立遺伝学研究所  日本ＤＮＡデータバンク、”ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ”、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００２年１０月８日、３ページ目の「ＯＲＩＧＩＮ」の項、［平成１７年６月８日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献５】インターネット（米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈホームページ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００２年１０月８日、４頁目の「Ｓｏｕｒｃｅ  ｏｒｉｇｉｎｅ」および「Ｆｅａｔｕｒｅｓ」の項、［２００５年１０月１８日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／＞
【非特許文献６】Ａ．Ｙｏｋｏｙａｍａ  ＆  Ｗ．Ｍｉｋｉ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｏｒｉｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２８，１３９，１９９５年
【非特許文献７】Ｆｒａｓｅｒ  Ｐ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，６１２８，１９９７年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、海洋細菌アグロバクテリウム属細菌Ｎ−８１１０６株（例えば、特許第３５７０７４１号公報参照）の変異株であるＴＳＵＧ１Ｃ１１（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）、（例えば、特開２００５−０５８２１６号公報参照）、菌株ＴＳＮ１８Ｅ７（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）、（例えば、特開２００５−０５８２１６号公報参照）等の培養液より得られる安定性に優れたカロテノイドを含有する粉体およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
すなわち本発明は、カロテノイド生産性海洋細菌Ｎ−８１１０６株（特許生物寄託センターへの受託番号：ＦＥＲＭ−１４０２３）またはその育種によって得られた菌株であるＴＳＵＧ１Ｃ１１（特許生物寄託センターへの受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）又はＴＳＮ１８Ｅ７（特許生物寄託センターへの受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）又はＴＳＴＴ００１株（特許生物寄託センターへの受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６７０）又はＴＳＴＴ０３１株（特許生物寄託センターへの受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６８９）又はＴＳＴＴ０５２株（特許生物寄託センターへの受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６９０）を培養し、その培養液又はそこから回収された固形分に対し、水溶性抗酸化剤を添加して乾燥して得られるカロテノイド含有粉体に関するものである。
【００１６】
また本発明は、上記の水溶性抗酸化剤がアスコルビン酸、クエン酸又はそれらの塩であるカロテノイド含有粉体である。
【００１７】
また本発明は、アスコルビン酸、クエン酸又はそれらの塩を、粉体重量当り０．１〜１０重量％含有する上記カロテノイド含有粉体である。
【００１８】
また本発明は、カロテノイド生産性海洋細菌がＮ−８１１０６株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３号）の変異育種によって得られた菌株又はそれらに遺伝子組換え株である上記カロテノイド含有粉体である。
【００１９】
また本発明は、カロテノイド生産性海洋細菌Ｎ−８１１０６株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）の変異育種によって得られた菌株がＴＳＵＧ１Ｃ１１（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）、ＴＳＮ１８Ｅ７（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）、ＴＳＴＴ００１株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６７０）、ＴＳＴＴ０３１株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６８９）又はＴＳＴＴ０５２株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６９０）である上記カロテノイド含有粉体に関するものである。
【００２０】
また本発明は、カロテノイド生産性海洋細菌を培養して得られる培養液中の固形分に対し、アスコルビン酸、クエン酸又はそれらの塩を添加した後に乾燥することを特徴とする上記カロテノイド含有粉体の製造方法である。
【００２１】
また本発明は、上記のアスコルビン酸、クエン酸又はそれらの塩の添加量がカロテノイド生産性海洋細菌を培養して得られる培養液中の固形分に対し０．１〜１０重量％である上記のカロテノイド含有粉体の製造方法である。
【００２２】
本発明に用いる細菌Ｎ−８１１０６株、またはその変異株であるＴＳＵＧ１Ｃ１１株やＴＳＮ１８Ｅ７株の性質については特許第３５７０７４１号公報、特開２００５−０５８２１６号公報および特願２００５−３５０２２５号に示されている。
【００２３】
これらの細菌の培養方法に特に限定はないが、振とう培養や通気撹拌培養等の好気的な条件が好ましく、培養時間としては２４時間〜２００時間程度、培養温度としては１０〜４０℃付近が好ましく、ｐＨは６〜８が好ましい。
【００２４】
用いられる培地としては、細菌が増殖しカロテノイドを生産しうるものであればいずれを使用してもよく、炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源にはコーンスチープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、又はアンモニア水や、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、ビタミン類としては酵母エキスやビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。
【００２５】
培養後、培養液に水溶性抗酸化剤としてアスコルビン酸、クエン酸又はそれらの塩を添加するが、より好ましくは培養液から固形分を回収したのち、固形分に対して添加することが好ましい。
【００２６】
回収の方法に限定はなく、遠心分離法やろ過法等の一般的な方法を適用できる。この際、固形分が回収できる条件であれば、その条件に特に限定は無いが、カロテノイドは熱安定性が低いため低温であることが好ましく、しかし溶液が凍結する温度では固形分の回収が不可能になるため、凍結しない温度であることが好ましい。その様な温度として、−５℃〜１００℃の温度領域が挙げられるが、より好ましくは０〜８０℃である。
【００２７】
得られた固形分にそのまま水溶性抗酸化剤を添加することもできるが、より好ましくは純水を添加して懸濁液とした後に加える。これにより水溶性抗酸化剤を均一に分散させることが容易になる。純水の添加量に特に制限はないが、過剰に加えた場合は乾燥するためにより多くのエネルギーと時間を必要するため好ましくない。また少量である場合は懸濁液の流動性が悪く、均一に乾燥させることが困難になるため好ましくない。例えば噴霧乾燥を行う場合は、１００ｃｐ程度の粘性に調整して乾燥することが好ましく、その様な懸濁液を得るために必要な水の量は、固形分に対して２倍量〜２０倍量、より好ましくは３倍量から１０倍量の間で任意に設定される。その他の乾燥法による場合は適宜適切な量に調整して行うことができる。
【００２８】
乾燥方法には特に限定はなく、凍結乾燥法、噴霧乾燥法、真空乾燥法等の通常の方法が用いられる。この際の条件は、カロテノイド類がほとんど分解しない条件であれば特に限定は無く、その様な条件は乾燥方法ごとに異なるため、適用する方法に従って、随時実験的に設定される。例えば噴霧乾燥においては、入口温度１２０℃、出口温度６０℃で噴霧乾燥を行うことにより、約９０％の回収率で目的物が回収される。
【００２９】
このようにして得られた固形分は単独でもちいることもできるが、その目的により様々な他の成分と混合しても用いられる。例えば養殖用の飼料に用いる場合、フィッシュミール、大豆ミール、小麦粉、デンプン、大豆油、肝油などの魚類の生育に好ましい成分を自由に混合することができる。
【００３０】
粉体中のカロテノイド類の定量法に特に限定はないが、カロテノイド類を抽出した後に、比色法やクロマトグラフィー等の既存の方法で定量すればよい。例えば抽出溶媒としてメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド、酢酸エチル等が用いられる。
【００３１】
比色法の場合は抽出液から、遠心分離やろ過などの方法で不溶性物質を除去した後、４００〜６００ｎｍの吸光度、好ましくは４５０〜５００ｎｍの吸光度、さらに好ましくは、アスタキサンチン等の赤色カロテノイドの定量として４８０ｎｍの吸光度、そしてゼアキサンチン等の黄色カロテノイドの定量として４６０ｎｍの吸光度を測定することが好ましい。ＨＰＬＣによる場合は比色法の場合と同様に試料を調製した後、逆相法や順相法など既存の方法で行うことができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、カロテノイド生産性海洋細菌Ｎ−８１１０６株（ＦＥＲＭ−１４０２３号）の変異育種によって得られた菌株を培養し、その培養液、又はその培養液から回収した固形分に、アスコルビン酸、クエン酸又はそれらの塩等の水溶性抗酸化剤を添加し、さらに乾燥することでカロテノイドの安定性に優れた粉末が得られる。この粉体は魚類の色調改善剤等として用いることができる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例で説明するが、本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることは言うまでもない。
【００３４】
（カロテノイドの抽出と定量法）
適量の菌体懸濁液を１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブを用いて、１５，０００回転、５分間遠心分離を行ない菌体を得た。この菌体に２０μｌの純水に懸濁し、次いで２４０μｌのジメチルホルムアミドおよび２４０μｌのアセトンを加え約１時間振とうし、カロテノイドを抽出した。この抽出液を１５，０００回転、５分間遠心分離により残渣を除去後、ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭカラム（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略記する）でアスタキサンチンを定量した。なおＡｘの分離はＡ液として純水とメチルアルコールの５対９５の混合溶媒、Ｂ液としてメチルアルコールとテトラヒドロフランの７対３の混合溶媒を用い、１ｍｌ／ｍｉｎの流速でＡ液を５分間カラムに通過させた後、同じ流速Ａ液からＢ液へ５分間の直線濃度勾配を行ない、さらにＢ液を５分間通過させることにより行なった。Ａｘ濃度は４７０ｎｍの吸光度をモニターし、既知濃度のＡｘ試薬（シグマ製）で作成した検量線より濃度を算出した。
【００３５】
（実施例１）菌体懸濁液の調製
表１に示した組成の培地３００ｍｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃、２０分間で滅菌後、Ｎ−８１１０６株の変異株の一つであるＴＳＴＴ００１株を植菌し、２５℃で１日間、毎分１００回転の振とう速度で前々培養を行なった。
【００３６】
次いで表２に示した組成の培地１００ｍｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃、２０分間で滅菌し、上記培養液５ｍｌを植菌して２５℃で約１８時間、毎分１００回転の振とう速度で前培養した。
【００３７】
さらに、表３に示す組成の培地約１４Ｌを３０Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、２０分間で滅菌後、得られた上記培養液７００ｍｌと金属塩を添加し本培養を開始した。培養にはエイブル社の３０Ｌ自動滅菌培養装置を使用し、排ガス分析装置としてエイブル社のＤＥＸ−２５６２を使用した。培養温度は２２℃、ｐＨは７．０〜７．４とした。培養時のｐＨは２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液と２Ｎの塩酸水溶液の自動添加で制御した。また培養中２０Ｌ／ｍｉｎの速度で空気を供給し、毎分４００回転の回転速度で撹拌した。
【００３８】
約１１６時間培養を行ったのち、ＣＥＰＡ社製４１Ｇ型連続遠心分離機を用いて湿菌体を回収した。遠心分離の回転速度は２００００ｒｐｍ、送液速度は１０Ｌ／ｈとした。
【００３９】
回収した湿菌体の一部を正確に秤量し、１０５℃の恒温槽中で恒量になるまで加熱をおこなうことで湿菌体中の固形分を測定したところ、４５重量％が固形分だった。また湿菌体の粘度は約７００００ｃｐだった。この湿菌体２Ｋｇに対し１．６Ｋｇの純水を添加し、固形分濃度２６％としたところ、粘度１００ｃｐの菌体懸濁液が得られた。
【００４０】
その一部を回収してカロテノイドを抽出し、ＨＰＬＣで組成を分析したところ、固形分１ｋｇ当り１．７５ｇのアスタキサンチン、０．５９ｇのアドニキサンチン、１．７１ｇのフェニコキサンチン、１．５ｇのカンタキサンチン、２．４６ｇのエキネノン、０．３６ｇのβ−カロテンが検出された。
【００４１】
【表１】
2008011825.tif 000002
【００４２】
【表２】
2008011825.tif 000003
【００４３】
【表３】
2008011825.tif 000004
（実施例２）アスコルビン酸の影響
実施例１の菌体懸濁液に１Ｌあたり８ｇの、水溶性抗酸化剤であるアスコルビン酸を添加し（対固形分３．０重量％）した。この溶液１０ｍｌを密栓した容器中、８０℃で加熱し、一日ごとにその０．５ｍｌを回収してカロテノイドの残存量を測定した。加熱によるアスタキサンチン量の推移を図１に、総カロテノイド量（アスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、及びβ−カロテンの総量）を図２に示した。加熱開始時のスラリー１Ｌ当りのアスタキサンチンおよび総カロテノイド量を１００％とした場合の３日間加熱後のアスタキサンチン残存量は８７％、総カロテノイド量は９１％だった。
【００４４】
（実施例３）クエン酸３ナトリウムの影響
実施例１の菌体懸濁液に１Ｌあたり２６ｇの、水溶性抗酸化剤であるクエン酸３ナトリウムを添加し（対固形分１０重量％）した。この溶液１０ｍｌを密栓した容器中、８０℃で加熱し、一日ごとにその０．５ｍｌを回収してカロテノイドの残存量を測定した。加熱によるアスタキサンチン量の推移を図１に、総カロテノイド量（アスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、及びβ−カロテンの総量）を図２に示した。加熱開始時のスラリー１Ｌ当りのアスタキサンチンおよび総カロテノイド量を１００％とした場合の３日間加熱後のアスタキサンチン残存量は８６％、総カロテノイド量は８９％だった。
【００４５】
（比較例１）無添加での安定性
実施例１の菌体懸濁液１０ｍｌを密栓した容器中、８０℃で加熱し、一日ごとにその０．５ｍｌを回収してカロテノイドの残存量を測定した。加熱によるアスタキサンチン量の推移を図１に、総カロテノイド量（アスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、及びβ−カロテンの和）を図２に示した。加熱開始時のスラリー１Ｌ当りのアスタキサンチンおよび総カロテノイド量を１００％とした場合の３日間加熱後のアスタキサンチン残存量は８０％、総カロテノイド量は８３％だった。すなわち、抗酸化剤を添加せずに過熱した場合のアスタキサンチン残存量は、アスコルビン酸を添加した実施例１およびクエン酸３ナトリウムを添加した実施例２に比較しそれぞれ７％および６％低く、総カロテノイド残存量はそれぞれ８％及び６％低いものであり、アスコルビン酸やクエン酸３ナトリウムの添加によるカロテノイドの安定化効果が確認された。
【００４６】
（比較例２）エトキシキンの影響
実施例１の菌体懸濁液に、脂溶性抗酸化剤であるエトキシキンのエタノール溶液（６９ｇ／Ｌ）を１Ｌあたり１０ｍｌ添加し（対固形分約０．３重量％）した。この溶液１０ｍｌを密栓した容器中、８０℃で加熱し、一日ごとにその０．５ｍｌを回収してカロテノイドの残存量を測定した。加熱によるアスタキサンチン量の推移を図１に、総カロテノイド量（アスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、及びβ−カロテンの和）を図２に示した。加熱開始時のスラリー１Ｌ当りのアスタキサンチンおよび総カロテノイド量を１００％とした場合の３日間加熱後のアスタキサンチン残存量は８２％、総カロテノイド量は８９％だった。総カロテノイドの残存量は実施例１や実施例２と同等だったが、アスタキサンチン残存量ではアスコルビン酸を添加した実施例１およびクエン酸３ナトリウムを添加した実施例２に比較しそれぞれ５％および４％低いものだった。
【００４７】
（比較例３）α−トコフェロールの影響
実施例１の菌体懸濁液に１Ｌあたり２６ｇの、脂溶性抗酸化剤であるα−トコフェロールを添加し（対固形分１０重量％）した。この溶液１０ｍｌを密栓した容器中、８０℃で加熱し、一日ごとにその０．５ｍｌを回収してカロテノイドの残存量を測定した。加熱によるアスタキサンチン量の推移を図１に、総カロテノイド量（アスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、及びβ−カロテンの和）を図２に示した。加熱開始時のスラリー１Ｌ当りのアスタキサンチンおよび総カロテノイド量を１００％とした場合の３日間加熱後のアスタキサンチン残存量は７６％、総カロテノイド量は８４％だった。すなわち、抗酸化剤を添加せずに過熱した場合のアスタキサンチン残存量は、アスコルビン酸を添加した実施例１およびクエン酸３ナトリウムを添加した実施例２に比較しそれぞれ１１％および１０％低く、総カロテノイド残存量はそれぞれ７％及び５％低いものであり、α−トコフェロールにはこの菌体懸濁液中のカロテノイドに対する安定化効果がないことが確認された。
【００４８】
（実施例４）アスコルビン酸添加量の影響
アスコルビン酸の添加量を固形分に対して０〜３重量％の間で段階的に変えた他、実施例２と同様の実験を行った。その結果を、アスコルビン酸存在下、６７時間加熱後のカロテノイド残存量として、表４に示した。アスコルビン酸添加量が０．１重量％ではアスタキサンチン残存量および総カロテノイド残存量ともに無添加の場合と同等だったが、０．３％添加することで無添加に対してアスタキサンチン残存量および総カロテノイド残存量ともに約５％向上した。すなわちアスコルビン酸によるこの菌体懸濁液中のカロテノイドの安定化には固形分当り０．３重量％の添加が必要であることが判明した。
【００４９】
【表４】
2008011825.tif 000005
（実施例５）クエン酸３ナトリウム添加量の影響
クエン酸３ナトリウムの添加量を固形分に対して０〜１０重量％の間で段階的に変えた他、実施例３と同様の実験を行った。その結果を、クエン酸３ナトリウム存在下、６７時間加熱後のカロテノイド残存量として、表５に示した。アスコルビン酸添加量が０．１重量％ではアスタキサンチン残存量および総カロテノイド残存量ともに無添加の場合と同等だったが、０．３％添加することで無添加に対して総カロテノイド残存量は約８％向上した。また１％の添加でアスタキサンチン残存量は５％向上した。すなわちクエン酸３ナトリウムによるこの菌体懸濁液中のカロテノイドの安定化には固形分当り０．３〜１重量％の添加が必要であることが判明した。
【００５０】
【表５】
2008011825.tif 000006
（実施例６）  粉体の調製
実施例１の湿菌体１ｋｇに純水１．５ｋｇを加えて菌体スラリーを調製した。この菌体懸濁液の固形分含量は１８重量％だった。この懸濁液の１Ｌにアスコルビン酸１０．４ｇおよびクエン酸３ナトリウム１８ｇを添加してよく撹拌した。
【００５１】
この菌体懸濁液１１００ｍｌを大川原製作所製ＬＴ−８型スプレードライヤーを用いて、入口温度１２０℃、出口温度７５〜８０℃、送液速度３４ｍｌ／ｍｉｎで噴霧乾燥し、２３０ｇの粉体を回収した。即ち、懸濁液１Ｌ当り２１０ｇの粉体が回収された。粉体１ｇ中のカロテノイド組成は表６に示した。
【００５２】
比較のため同じ懸濁液１００ｍｌを東京理科器械株式会社製ＥＹＥＬＡ  ＦＥ−８１型凍結乾燥機により凍結乾燥したところ、２３ｇの粉体を回収した。すなわち、懸濁液１Ｌ当り２３０ｇの粉体が回収された。噴霧乾燥では凍結乾燥に比較して粉体の回収量が約１割低いものだったが、これは噴霧乾燥の際、装置内壁に粉体の一部が吸着したことによるものだった。凍結乾燥粉体１ｇ中のカロテノイド組成も同様に表６に示した。凍結乾燥、噴霧乾燥とも粉体当りのカロテノイド含量及び組成は同等のものであった。すなわち、アスコルビン酸とクエン酸３ナトリウムの添加により噴霧乾燥でも凍結乾燥と同様にカロテノイドを分解することなく回収できることが確認された。
【００５３】
（比較例４）  水溶性抗酸化剤無添加での粉体の調製
アスコルビン酸とクエン酸３ナトリウムを添加しなかったことをのぞき、実施例６と同様に噴霧乾燥と凍結乾燥を行った。凍結乾燥による粉体の回収量は１Ｌの懸濁液当り１８０ｇであるのに対し、噴霧乾燥による粉体の回収量は１６０ｇだった。噴霧乾燥での粉体回収量の低下は実施例６と同様に装置内壁への粉体の吸着によるものだった。回収した粉体中のカロテノイドの組成を、粉体中のカロテノイド含量として、表６に示した。表中の略号は、Ａｘがアスタキサンチンを、Ａｄがアドニキサンチンを、Ｐｘがフェニコキサンチンを、Ｃｘがカンタキサンチンを、Ｅｃがエキネノンを、βがβ−カロテンを、示す。その結果から、凍結乾燥では組成比、カロテノイド含量ともに実施例６と同様の結果だったが、噴霧乾燥ではいずれのカロテノイドとも、凍結乾燥粉末よりも低い含量となっていた。すなわち、アスコルビン酸とクエン酸３ナトリウムを添加しないことで、噴霧乾燥による加熱によりカロテノイドが分解して含量が低下することが確認された。
【００５４】
【表６】
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（実施例７）  粉体の安定性
実施例６で調製した噴霧乾燥粉体を８０℃で過熱し、一日おきにその一定量を回収してカロテノイドを抽出し、ＨＰＬＣでその含有量を測定することにより、加熱による残存カロテノイド量の経時変化を追跡した。加熱開始時のアスタキサンチン含量または総カロテノイド含量を１００％としたときの、アスタキサンチン残存量を図３に、総カロテノイド残存量を図４に示した。後述する比較例４で調製した粉体を同様に加熱した場合よりもアスタキサンチン、総カロテノイドともに残存量が高く、アスコルビン酸とクエン酸３ナトリウムを添加することで、粉体中のカロテノイドが加熱分解に対して安定化されることが確認された。
【００５５】
（比較例５）
比較例４で調製した噴霧乾燥粉体を実施例７と同様に過熱して、残存カロテノイド量の経時変化を追跡した。アスタキサンチン残存量を図３に、総カロテノイド残存量を図４に示したが、実施例７に比較して残存カロテノイドの減少が早く、カロテノイドが不安定であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】８０℃において菌体懸濁液を加熱した場合のアスタキサンチン残存量の経時変化の説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は加熱時間（単位は時間（ｈ））を示し、Ｙ軸（縦軸）はアスタキサンチン残存量（単位は％）であり、図中の記号は、無添加（○）、アスコルビン酸添加（●）、クエン酸３ナトリウム添加（▲）、エトキシキン添加（◇）α−トコフェロール添加（△）を示す。
【図２】８０℃において菌体懸濁液を加熱した場合の総カロテノイド残存量の経時変化の説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は加熱時間（単位は時間（ｈ））を示し、Ｙ軸（縦軸）は総カロテノイド残存量（単位は％）であり、図中の記号は、無添加（○）、アスコルビン酸添加（●）、クエン酸３ナトリウム添加（▲）、エトキシキン添加（◇）α−トコフェロール添加（△）を示す。
【図３】８０℃において菌体懸濁液を加熱した場合の総カロテノイド残存量の経時変化の説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は加熱時間（単位は時間（ｈ））を示し、Ｙ軸（縦軸）はアスタキサンチン残存量（単位は％）であり、図中の記号は、無添加（○）、アスコルビン酸およびクエン酸３ナトリウム添加（●）を示す。
【図４】８０℃において菌体懸濁液を加熱した場合の総カロテノイド残存量の経時変化の説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は加熱時間（単位は時間（ｈ））を示し、Ｙ軸（縦軸）は総カロテノイド残存量（単位は％）であり、図中の記号は、無添加（○）、アスコルビン酸およびクエン酸３ナトリウム添加（●）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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