(57)【要約】【課題】効果が優れ、しかも安全性の高いＣ型慢性肝炎の治療または予防を提供する。【解決手段】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製を抑制するマイクロＲＮＡを含む、Ｃ型慢性肝炎の治療または予防用医薬組成物。特に、ｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１３６、あるいはその変異体を含む、Ｃ型慢性肝炎の治療または予防用医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製を抑制するマイクロＲＮＡを含む、Ｃ型慢性肝炎の治療または予防用医薬組成物。
【請求項２】
マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１３６、ならびにそれらの変異体からなる群から選択される１種またはそれ以上のものである、請求項１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型慢性肝炎の治療または予防に関する。詳細には、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製を抑制するマイクロＲＮＡを用いるＣ型慢性肝炎の治療または予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型慢性肝炎の治療はインターフェロンとリバビリン併用療法が標準的であるが、日本人に多く見られるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の遺伝子型１ｂの高ウイルス量である患者ではこの治療の奏効率は３０−４０％程度に落ち込むため、再発や長期にわたる炎症の結果発癌するなどの問題が発生している。またインターフェロンは多様な副作用があり、６５歳以上の高齢者に投与する場合には注意が必要となっている。そのためＣ型慢性肝炎の治療に現在タンパク分解酵素阻害剤や免疫抑制剤などが新たな治療法として候補に挙がっているが臨床治験の段階であり、予想される効果からこれらの薬剤単独で使用されず、インターフェロンと併用になる。そのため副作用の少ない薬剤の開発が望まれている。
【０００３】
近年、ＲＮＡ干渉の技術を利用してＨＣＶに相補的な塩基配列を持ったｓｉＲＮＡを作成し、これを用いてＨＣＶの複製の抑制が試みられている（非特許文献１等参照）。しかしながらｓｉＲＮＡは外来遺伝子であるため、治療に利用した場合の安全性に問題がある。
【非特許文献１】Wang Y et al. GASTROENTEROLOGY 2006; 130:883-892
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
効果が優れ、しかも安全性の高いＣ型慢性肝炎の治療または予防を提供することが本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、ＨＣＶをターゲットとするマイクロＲＮＡを用いることにより、効率的にＨＣＶの複製を抑制でき、さらにＨＣＶ感染も抑制できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）Ｃ型肝炎ウイルスの複製を抑制するマイクロＲＮＡを含む、Ｃ型慢性肝炎の治療または予防用医薬組成物；ならびに
（２）マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１３６、ならびにそれらの変異体からなる群から選択される１種またはそれ以上のものである、（１）記載の医薬組成物
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、マイクロＲＮＡを用いて効率的にＨＣＶの複製を抑制でき、さらにＨＣＶ感染も抑制できるので、効果が優れ、しかも安全性の高いＣ型慢性肝炎の治療または予防を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
マイクロＲＮＡはｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡ干渉の機構により作用するものである。しかし、ｓｉＲＮＡは外来遺伝子であるため、安全性に問題が残る。一方、マイクロＲＮＡは内因性であるため、それが由来する生物に投与した場合に安全性が高いと考えられる。種々の疾病の原因となる遺伝子に対して、アンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡを用いてその複製を抑制することにより、疾病を治療または予防する試みは多くある。しかしながら、マイクロＲＮＡを用いてＨＣＶの複製を抑制することにより、Ｃ型慢性肝炎を治療または予防することは、本発明により初めてなされたことである。
【０００９】
付言するが、マイクロＲＮＡのＨＣＶに対する作用としては、本発明のマイクロＲＮＡのＨＣＶ以外のものについてＨＣＶ増殖促進作用が知られていたが（ＷＯ２００５／１０７８１６；Science, 309, 1577 (2005)）、マイクロＲＮＡのＨＣＶ複製抑制作用については全く知られていなかった。
【００１０】
かくして、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの複製を抑制するマイクロＲＮＡを含む、Ｃ型慢性肝炎の治療または予防用医薬組成物を提供するものである。
【００１１】
本発明の医薬組成物により治療または予防可能なＨＣＶはヒトＨＣＶ（本明細書において、単に「ＨＣＶ」という）であり、その遺伝子型は、マイクロＲＮＡがターゲットとする配列が類似のものであれば、いずれの遺伝子型であってもよい。好ましい遺伝子型は１ｂおよび２ａである。
【００１２】
本発明の医薬組成物の有効成分として用いられるマイクロＲＮＡは、ＨＣＶ中のヌクレオチド配列をターゲットとし、ＨＣＶの複製を抑制するものであればいずれのマイクロＲＮＡであってもよい。本発明者らは、かかるマイクロＲＮＡのうち好ましいものとしてｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１３６を見出した。
【００１３】
ｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１８２、およびｍｉＲ−１３６のヌクレオチド配列は公知であり、それぞれ、ＵＡＣＡＧＵＡＧＵＣＵＧＣＡＣＡＵＵＧＧＵＵ（配列番号：１）、ＵＵＵＧＧＣＡＡＵＧＧＵＡＧＡＡＣＵＣＡＣＡ（配列番号：２）、およびＡＣＵＣＣＡＵＵＵＧＵＵＵＵＧＡＵＧＡＵＧＧＡ（配列番号：３）である。
【００１４】
参考のため、これら３つのマイクロＲＮＡのＨＣＶ中のターゲット部位を図１に示す。後述する実施例では、ＨＣＶの複製を観察できるレプリコン細胞としてＨＣＶの遺伝子型１ｂ型のＣｏｎ１、ならびに遺伝子型２ａ型のＪＦＨ１を用いた。Ｃｏｎ１では、そのinternal ribosomal entry site (IRES)領域の５’ＵＴＲ中、ＮＳ５領域中およびＮＳ３領域中にそれぞれｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１３６のターゲット部位があり、ＪＦＨ１においても同様である。
【００１５】
さらに本発明者らは、これらのマイクロＲＮＡの変異体についてもＨＣＶ複製抑制効果を認めた。したがって、本発明の医薬組成物において、有効成分たるマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１３６、ならびにそれらの変異体のいずれかであってもよい。本発明の医薬組成物において、ＨＣＶの複製を抑制するマイクロＲＮＡまたはその変異体を１種だけ用いてもよく、２種以上用いてもよい。
【００１６】
本発明のマイクロＲＮＡの変異体とは、本来のマイクロＲＮＡと比較して、数個まで、例えば７個まで、６個まで、好ましくは５個まで、４個まで、さらに好ましくは３個まで、２個まで、あるいは１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加されたＲＮＡであって、ＨＣＶ複製抑制作用のあるものをいう。
【００１７】
本発明の医薬組成物は、通常の製薬に用いられる方法により、種々の剤形として製造することができる。本発明の医薬組成物の好ましい剤形は液体であり、注射または輸液可能な剤形が特に好ましい。液体の本発明の医薬組成物を製造するには、担体として、例えば注射用水、生理食塩水、リンゲル液などの公知の液体担体を用いることができる。マイクロＲＮＡをそのまま、あるいは適当なベクターに挿入したものを、液体担体に溶解あるいは懸濁することにより液体の本発明の医薬組成物を得ることができるが、これらの担体に限定されない。マイクロＲＮＡを挿入することのできるベクターとしては、pSilencer H1-puro（applied biosystem社）、BLOCK-iTTMPol II miR RNAi Expression Vector（Invitrogen社）などが挙げられるが、これらのベクターに限定されない。マイクロＲＮＡをベクターに挿入して細胞や組織に導入する方法は当業者に公知である。また例えば、肝細胞特異的に発現しているタンパクのレセプターを利用して臓器特異的に投与することもできる。具体的には、あるタンパクの抗原提示部分をマイクロＲＮＡに付加しておき、レセプターがそのタンパクを細胞に取り込むことを利用して、肝細胞特異的にマイクロＲＮＡを投与することができる。しかし、マイクロＲＮＡの投与方法はこれらの方法に限定されない。本発明の医薬組成物を投与するには、上記のような方法のほか、肝臓付近への注射、静脈注射、輸液などにより行うことができるが、これらの方法に限定されない。マイクロＲＮＡの投与量は、治療あるいは予防すべきＣ型慢性肝炎の重さ、ＨＣＶの種類（遺伝子型など）、対象の健康状態、年齢、体重などの種々の要因に応じて調節することができる。投与頻度も上記のごとき種々の要因に応じて変更することができ、例えば、１日１回〜数回、あるいは数日に１回投与してもよい。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、インターフェロンやリバビリンなどの他のＨＣＶ治療剤とともに用いられてもよい。
【００１９】
さらに本発明は、Ｃ型慢性肝炎の治療または予防方法であって、ＨＣＶの複製を抑制するマイクロＲＮＡまたはその変異体を対象に投与することを特徴とする方法を提供する。ＨＣＶの複製を抑制するマイクロＲＮＡまたはその変異体、ならびに投与量などについては上述のとおりである。
【００２０】
さらに本発明は、Ｃ型慢性肝炎の治療または予防のための医薬を製造するための、ＨＣＶの複製を抑制するマイクロＲＮＡまたはその変異体の使用を提供する。
【００２１】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２２】
遺伝子型１ｂのＨＣＶの複製を観察できるレプリコン細胞Ｃｏｎ１、および遺伝子型２ａのＨＣＶの複製を観察できるレプリコン細胞ＪＦＨ１に、それぞれのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１９９ａ＊）を発現ベクター（pSilencer H1-puro）を用いて過剰発現させ、マイクロＲＮＡの発現を変化させないコントロールベクターを導入したものとＨＣＶ  ＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲを用いて比較した。結果を図２に示す。いずれの遺伝子型でも、マイクロＲＮＡを過剰発現させるとレプリコンの量が減少し、ｍｉＲ−１３６およびｍｉＲ−１９９ａ＊を用いた場合にレプリコンの量の減少が顕著であった。これらの結果より、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１９９ａ＊はＨＣＶの複製を抑制することがわかった。
【実施例２】
【００２３】
マイクロＲＮＡの機能を特異的に抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いて、レプリコンの減少がマイクロＲＮＡの発現に起因しているかどうかを検証した。図３に結果を示す。ｍｉＲ−１９９ａ＊を特異的に機能抑制するＡＳＯ  ｍｉＲ−１９９ａ＊（ＡＡＣＣＡＡＵＧＵＧＣＡＧＡＣＵＡＣＵＧＵＡ、配列番号：４、すべての塩基の２’−Ｏをメチル化）、およびｍｉＲ−１３６を特異的に機能抑制するＡＳＯ  ｍｉＲ−１３６（ＵＣＣＡＵＣＡＵＣＡＡＡＡＣＡＡＡＵＧＧＡＧＵ、配列番号：５、すべての塩基の２’−Ｏをメチル化）を導入すると、遺伝子型１ｂの細胞ではレプリコンは減少しなかった。遺伝子型２ａの細胞にＡＳＯ  ｍｉＲ−１９９ａ＊を導入した場合にはレプリコンの減少が若干抑制された。これらの結果から、レプリコンの減少がマイクロＲＮＡの発現に起因していることがわかった。
【実施例３】
【００２４】
マイクロＲＮＡは単一のマイクロＲＮＡで多数の遺伝子を制御する可能性がある。今回のレプリコンが減少した事はマイクロＲＮＡが直接レプリコンと結合してレプリコンを減少させたものか、別の遺伝子を活性化しその結果レプリコンを減少させたのかを検証するために、レプリコンの塩基配列に変異を作成しマイクロＲＮＡがレプリコン上のターゲット配列を認識できなくするようにし、それをルシフェラーゼに結合させたものを作成した。図４に示すようにＨＣＶのｍｉＲ−１９９ａ＊のターゲット領域のセンス鎖の３’側を２個または４個変異させた（上段の配列の−で示す部分）。変異配列（４１）の場合には野生型３’末端のｇｔをａｃに変異させ、変異配列（５１）の場合には野生型３’末端のｃｔｇｔをｔｇａｃに変異させた。
【００２５】
結果を図４に示す。野生株の場合ｍｉＲ−１９９ａ＊を過剰発現するとレプリコン上のターゲット配列を認識しレプリコンの活性が低下し、その結果ルシフェラーゼ活性がコントロールベクターを導入したものに比較して低下した。ターゲット領域を変異させたものはマイクロＲＮＡがターゲット領域を認識しないためにルシフェラーゼ活性は低下しないか、少ししか低下しなかった。したがって、個々のマイクロＲＮＡは直接レプリコンと結合してレプリコンを減少させたことがわかった。
【実施例４】
【００２６】
本発明のマイクロＲＮＡの変異体（図５）を作成し、それらがＨＣＶの複製を抑制するかどうかを調べた。ｍｉＲ−１３６の変異体は３塩基変異のｍｉＲ−１３６  ｍ１（ＡＧＡＧＧＵＵＵＵＧＵＵＵＵＧＡＵＧＡＴＴ、配列番号：６）および５塩基変異のｍｉＲ−１３６  ｍ２（ＡＧＡＧＣＡＵＵＵＧＵＵＵＵＧＡＵＧＡＴＴ、配列番号：７）であり、ｍｉＲ−１９９ａ＊の変異体は３塩基変異のｍｉＲ−１９９ａ＊  ｍ１（ＵＵＧＵＣＡＡＧＵＣＵＧＣＡＣＡＵＵＧＴＴ、配列番号：８）および５塩基変異のｍｉＲ−１９９ａ＊  ｍ２（ＵＵＧＵＧＵＡＧＵＣＵＧＣＡＣＡＵＵＧＴＴ、配列番号：９）であった。これらの変異体の末尾にＴＴが付加されているが、塩基の安定性を考慮したものである。
【００２７】
結果を図６に示す。ｍｉＲ−１３６  ｍ１およびｍｉＲ−１３６  ｍ２は、いずれの遺伝子型のＨＣＶにおいてもその複製を抑制した。ｍｉＲ−１９９ａ＊  ｍ１およびｍｉＲ−１９９ａ＊  ｍ２は遺伝子型２ａのＨＣＶにおいてその複製を抑制したが、遺伝子型１ｂのＨＣＶにおいては複製を有意に抑制しなかった。またこれらの領域はウイルスの複製に重要で遺伝子型を超えて保存されている部位なため、この領域を標的として遺伝子療法を行った場合、耐性株が発生する可能性は低いと予想される。
【００２８】
不死化した肝細胞ＨｕＳ／Ｅ２（Hussein H. Aly., et al. Journal of Hepatology (2007) Vol 46, 26-36参照）を用いて、ＨＣＶを含んだヒト血清を用いて感染実験を行なった。非特異的マイクロＲＮＡとしてはapplied biosystemsのSilencer（登録商標）Negative Control #1 siRNA No.4611を用いた。あらかじめｍｉＲ−１９９ａ＊を過剰発現させておくと遺伝子型１ｂ、２ａ両者とも感染抑制効果が得られた。あらかじめｍｉＲ−１３６を過剰発現させておいた場合にも、遺伝子型１ｂ、２ａ両者とも感染抑制効果が得られた。結果を図７に示す。これらの結果から、ｍｉＲ−１９９ａ＊にはＨＣＶ感染予防効果があることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明は、医薬品の分野、特にＣ型慢性肝炎の治療または予防用の医薬品の分野、ならびに医学・薬学の研究分野等に幅広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＨＣＶの複製を観察できるレプリコン細胞の構造と、レプリコン細胞の塩基配列のマイクロＲＮＡのターゲット領域を示す図である。
【図２】図２は、遺伝子型１ｂおよび２ａのＨＣＶに対するｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１９９ａ＊の複製抑制効果を調べた結果を示す図である。
【図３】図３は、マイクロＲＮＡの機能を特異的に抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いて、レプリコンの減少がマイクロＲＮＡの発現に起因しているかどうかを調べた結果を示す図である。
【図４】図４は、ｍｉＲ−１９９ａ＊が直接ターゲット領域に作用してＨＣＶの複製を抑制するかどうかを調べた結果を示す図である。４１および５１は変異させたターゲット領域を示す。
【図５】図５は、本発明の変異マイクロＲＮＡの配列を示す図である。
【図６】図６は、本発明の変異マイクロＲＮＡのＨＣＶ複製抑制効果を調べた結果を示す図である。
【図７】図７は、不死化肝細胞における本発明のマイクロＲＮＡのｄｅ  ｎｏｖｏ感染抑制効果を調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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