(57)【要約】【課題】ラクトン型及び酸型の混合物として得られていた従来のソホロースリピッド発酵生産法に対して、化学的に安定である酸型ソホロースリピッドのみを一段階で選択的に生産する発酵生産方法の提供を目的とする。【解決手段】酸型ソホロースリピッドのみを選択的に生産する微生物であるキャンディダ・フロリコーラ（Candida floricola）を液体培養し、酸型ソホロースリピッドを回収する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示す塩基配列と９５％以上相同な塩基配列を含むリボソームＲＮＡ遺伝子の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２領域を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物を液体培地で培養することを特徴とする、次の式（１）で表される酸型ソホロースリピッドを選択的に生産する方法：
【化１】
2008247845.tif 000015
（１）
（式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して水素（−Ｈ）又はアセチル基（-ＣＯＣＨ3）であり、ｎは９〜２０の数であり、
2008247845.tif 000016
で表される基は、飽和脂肪族炭化水素鎖又は二重結合を少なくとも１個有する不飽和脂肪族炭化水素鎖である。）
【請求項２】
生産される酸型ソホロースリピッドが、以下の式（２）で表される６’，６’’−ジアセチル化物を９０質量％以上含有することを特徴とする、請求項１に記載の方法：
【化２】
2008247845.tif 000017
（２）
（式中、ｎは９〜２０の数であり、
2008247845.tif 000018
で表される基は飽和脂肪族炭化水素鎖又は二重結合を少なくとも１個有する不飽和脂肪族炭化水素鎖である。）
【請求項３】
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物がキャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）に属する微生物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物がキャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）ＺＭ−１５０２株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１１３３）、ＺＭ−１５１７株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１１５３）、ＺＭ−０１３２株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１１５２）のいずれかである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
グリセロールを含有する液体培地を用いて該微生物を培養することを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記グリセロールが、植物油の分解又はエステル交換の際の副生成物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
以下の構造を有する酸型のソホロースリピッドを９０質量％以上含有する、酸型ソホロースリピッド：
【化３】
2008247845.tif 000019
（２）
（式中、ｎは９〜２０の数であり、
2008247845.tif 000020
で表される基は飽和脂肪族炭化水素鎖又は二重結合を少なくとも１個有する不飽和脂肪族炭化水素鎖である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオサーファクタントの一種であるソホロースリピッドのうち、酸型ソホロースリピッドのみを選択的に生産する製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質は、脂質に１〜１０数個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系・免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていること等が明らかにされつつある。一方で、糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する物質は界面活性物質と呼ばれている。
一部の微生物はこれらの界面活性物質を効率良く生産することが知られており、この生物由来界面活性剤（バイオサーファクタント）は、安全性が高く、環境に対する負荷が少ない生分解性に優れた環境先進型界面活性剤として研究が進められている。現在、微生物が生産する界面活性物質としては、糖脂質系、アシルペプチド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子化合物系の５つに分類されているが、特にこの内の糖脂質系の界面活性剤については、最もよく研究され、細菌及び酵母によって生産された多くの種類の物質が報告されている。
【０００３】
これらの糖脂質等のバイオサーファクタントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。このことから、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等にこれらのバイオサーファクタントを幅広く適用することは、持続可能社会の実現と高機能製品の提供という、両面を兼ね備えており極めて有意義である。
その中でも、ソホロースリピッド（Ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ  ｌｉｐｉｄｓ；「ソホロリピッド」とも言われる；以下、ＳＬと表記する場合にはソホロースリピッドを意味するものとする）は、比較的安価な原料から高い生産量で得られるため、現在商業利用されている代表的なバイオサーファクタントの一種である。ＳＬは、Ｐ．Ａ．ＧｏｒｉｎらによってＣａｎｄｉｄａ（以前はＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ） ｂｏｍｂｉｃｏｌａ（キャンデダ ボンビコーラ）の培養液から発見され（非特許文献１参照）、その後、その他の酵母菌、例えば、キャンディダ・ボゴリエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）、キャンディダ・グロペンギッセリ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｒｏｐｅｎｇｉｓｓｅｒｉ）、キャンディダ・アピコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｐｉｃｏｌａ）によってもその培養液中に比較的多量に生産されることが報告されている（非特許文献２参照）。現在では、３００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献３及び４参照）。
【０００４】
ＳＬは、ソホロースあるいはヒドロキシル基が一部アセチル化したソホロースと、ヒドロキシ脂肪酸とからなる糖脂質である。ソホロースとは、β１→２結合した２分子のブドウ糖からなる糖であり、ヒドロキシ脂肪酸は、構造中にヒドロキシル基を有する脂肪酸である。ＳＬはまた、ヒドロキシ脂肪酸のカルボキシル基が遊離した酸型と分子内のソホロースと結合したラクトン型とに大別される（式３）。発酵生産によって得られるＳＬは、一般的にラクトン型と酸型の混合物として得られ、通常、ラクトン型を５０％以上含む。
【化１】
2008247845.tif 000002
酸型                      ラクトン型
【０００５】
現在ＳＬは、洗剤、化粧品、食品等幅広い分野で工業利用が進められており、ＳＬ誘導体の化粧品の湿潤剤（非特許文献５参照）およびゲル化剤（特許文献１参照)としての利用、および小麦製品の品質改良における混合物の形態のＳＬの利用（特許文献２参照）、ＳＬを配合した洗浄剤（特許文献３及び４参照）、漂白剤（特許文献５参照）等の報告がある。これらは全て、発酵生産によって得られたＳＬ混合物をそのまま利用したものである。
一方、ラクトン型を含むＳＬは、ラクトン部分が化学的に不安定であることから、他の化学物質と混合して利用する場合、性能の低下を誘引する恐れがある。例えば、液体のアルカリ洗浄剤としてＳＬ混合物を配合する場合、ラクトン部分の加水分解が起こる。また、ＳＬ以外の洗浄補助成分を配合する場合も、ラクトン部分の反応によって安定的な性能の維持が困難となり、その用途が大きく制限される。
そこで、これらの解決策の一つとして、化学的に安定な酸型ＳＬを製造し、これを高純度で利用する方法が採られている。具体的な利用方法として、発酵生産によって得られたＳＬ混合物のラクトン部分及びソホロースのアセチル基を加水分解し、生成した高純度な酸型ＳＬを配合した洗浄剤に関する報告がある（特許文献６参照）。
【０００６】
発酵生産によって得られるＳＬの主成分はラクトン型であるため、酸型ＳＬを高純度で多量に得る有効な方法は、現在のところＳＬ混合物のアルカリ加水分解による方法しかない。しかしこの場合、微生物発酵によってＳＬを生産、分離した後、再度アルカリ処理を行う工程が必要であり、使用済みアルカリの後処理も必要となる。またソホロースのアセチル基の加水分解も同時に起こるため、酢酸誘導体の生成について考慮する必要が生じる。
以上の理由から、ＳＬの工業利用は一部の用途に制限されているが、酸型ＳＬのみを一段階で生産できる方法が開発されれば、ＳＬの用途拡大に多大な影響を与え、ひいてはバイオサーファクタントの普及拡大に繋がるものと期待される。
【０００７】
【特許文献１】特公平７−１７６６８号公報
【特許文献２】特開昭６１−２０５４４９号公報
【特許文献３】特開２００３−１３０９３号公報
【特許文献４】特開２００６−８３２３８号公報
【特許文献５】特開２００６−２７４２３３号公報
【特許文献６】特開２００６−７０２３１号公報
【非特許文献１】ピー．エー．ゴーリン（Ｐ．Ａ．Ｇｏｒｉｎ），ジェイ．エフ．ティ．スペンサー（Ｊ．Ｆ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ），エー．ピー．ツロテェ（Ａ．Ｐ．Ｔｕｌｌｏｃｈ），「カナデアン ジャーナル オブ ケミストリー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．）」，３９巻，ｐ８４６−８５５（１９６１）．
【非特許文献２】アール．ホメル（Ｒ．Ｈｏｍｍｅｌ），「バイオデグラデーション（Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）」，１巻，ｐ１０７−１１９（１９９０）．
【非特許文献３】エー．エム．ダビラ（Ａ．Ｍ．Ｄａｖｉｌａ），アール．マークバル（Ｒ．Ｍａｒｃｂａｌ），ジェイ．ピー．バンデカテーレ（Ｊ．−Ｐ．Ｖａｎｄｅｃａｔｅｅｌｅ），「アプライド マイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，４７巻，ｐ４９６−５０１（１９９７）．
【非特許文献４】エイチ．ジェイ．ダニエル（Ｈ．−Ｊ．Ｄａｎｉｅｌ），エム．リュッシ（Ｍ．Ｒｅｕｓｓ），シー．シィルダック（Ｃ．Ｓｙｌｄａｔｋ），「バイテクノロジー レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，２０巻，ｐ１１５３−１１５６（１９９８）．
【非特許文献５】木村  義晴，「油化学」，３６，ｐ７４８−７５３（１９８７）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上の事情を鑑みて、本発明では、ラクトン型及び酸型の混合物として得られていた従来のＳＬ発酵生産法に対して、一段階で選択的に酸型ＳＬのみを生産する発酵生産方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、キャンディダ属酵母の一種であるキャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）に属する微生物を培養することにより、酸型ＳＬを効率よく製造することが可能であることを見出し、本発明をなすに至ったものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔７〕に示される。
〔１〕配列番号１に示す塩基配列と９５％以上相同な塩基配列を含むリボソームＲＮＡ遺伝子の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２領域を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物を液体培地で培養することを特徴とする、次の式（１）で表される酸型ＳＬを選択的に生産する方法：
【化２】
2008247845.tif 000003
（１）
（式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して水素（−Ｈ）又はアセチル基（−ＣＯＣＨ3）であり、ｎは９〜２０の数であり、
2008247845.tif 000004
で表される基は、飽和脂肪族炭化水素鎖又は二重結合を少なくとも１個有する不飽和脂肪族炭化水素鎖である。）
〔２〕生産される酸型ＳＬが、以下の式（２）で表される６’，６’’−ジアセチル化物を９０質量％以上含有することを特徴とする、〔１〕に記載の方法：
【化３】
2008247845.tif 000005
（２）
（式中、ｎは９〜２０の数であり、
2008247845.tif 000006
で表される基は飽和脂肪族炭化水素鎖又は二重結合を少なくとも１個有する不飽和脂肪族炭化水素鎖である。）
〔３〕キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物がキャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）に属する微生物である、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物がキャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）ＺＭ−１５０２株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１１３３）、ＺＭ−１５１７株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１１５３）、ＺＭ−０１３２株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１１５２）のいずれかである、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕グリセロールを含有する液体培地を用いて該微生物を培養することを特徴とする、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕前記グリセロールが、植物油の分解又はエステル交換の際の副生成物である、〔５〕に記載の方法。
〔７〕以下の構造を有する酸型のＳＬを９０質量％以上含有する、酸型ＳＬ：
【化４】
2008247845.tif 000007
（２）
（式中、ｎは９〜２０の数であり、
2008247845.tif 000008
で表される基は飽和脂肪族炭化水素鎖又は二重結合を少なくとも１個有する不飽和脂肪族炭化水素鎖である。）
【発明の効果】
【００１１】
ＳＬの発酵生産について、従来の方法ではラクトン型と酸型を作り分けることができず、生成物は両者の混合物として得られていたが、本発明により、一段階で酸型ＳＬのみを生産することが可能となる。
化学的に不安定で、用途が著しく制限されていたラクトン型ＳＬとの混合物に対して、単品としての酸型ＳＬには、液体中で化学的に安定である、高極性で水への溶解性が高い、カルボキシル基の反応性を利用した誘導化が容易等の特徴があり、また１０数種類の構造類縁体が存在していた混合物と比較すると、構造、物性のバラつきが少なく、目的の用途に応じた性能の調整が容易である。
これまで酸型ＳＬは、混合物からの精密な分離・精製、ラクトン型ＳＬのアルカリ加水分解、または化学合成による極めて難解な全合成でしか得られなかったが、一段階の発酵生産によって高純度で容易に回収できることは、ＳＬの用途拡大に向けて極めて有効な手段となり得る。
【００１２】
特に、本発明の生産方法によって、得られる酸型ＳＬの９０質量％以上が６’、６”−ジアセチル化物で構成されているＳＬを得ることができる。ラクトン型ＳＬのアルカリ加水分解による既存の酸型ＳＬの製造方法では、アセチル基についてもそのほとんどが同時に加水分解を受けてしまうことから、本化合物を多量に製造するのは通常の化学合成法では極めて困難である。従来の脱アセチル化された酸型ＳＬと比較して、本発明で得られるジアセチル化物である酸型ＳＬは臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）が低く、使用量が少量でも同等の性能が見込まれるほか、アセチル基の有無により異なる生理活性の発現が期待される。
さらに、バイオディーゼル等を生産する際に、エステル交換反応で副生成するグリセロールは、現在余剰バイオマスとして利用されておらず、その利用方法及び用途開拓が課題とされていたが、本発明の生産方法においては、グリセロール、特に植物油の分解又はエステル交換の際に生じる副生成物としてのグリセロールから酸型ＳＬを生産できるため、余剰グリセロールの有効利用が期待できる。
以上のように本発明を利用することで、洗浄剤用途をはじめ、水溶液中で安定な性能の維持が求められる医薬、食品、化粧品分野等へのＳＬの利用拡大が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に本発明の内容を詳細に説明する。以下、特に記載のない場合においてｇ／ｌは、培地１Ｌ中に含まれる物質の質量を意味するものとする。
〈酸型ＳＬの生産方法〉
使用する微生物
本発明の微生物は、配列番号１に示す塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上相同な塩基配列を含むリボソームＲＮＡ遺伝子を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物である。
このような微生物の例としては、本発明者らが、岡山県で採取した植物（葉）サンプルから分離したＺＭ−１５０２株を挙げることができる。本菌株は、ＹＭ寒天培地上にて２５℃２日間培養で、直径が２〜３ｍｍ程度のコロニーを形成する（形：円形、隆起状態：クッション形、周縁：全縁、表面の形状：平滑、色調：白色からクリーム状、光沢および性状：バター様で湿性）。また、有性生殖器官および偽菌糸の形成は認められない。
【００１４】
ＺＭ−１５０２株は、リボソームＲＮＡ遺伝子の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２領域の塩基配列（ｒＤＮＡ配列）を決定し、ＤＮＡデータベース(ＤＤＢＪ)にアクセスし、ＦＡＳＴＡプログラム (ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ｆａｓｔａ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いて相同性検索を行ったところ、キャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）のｒＤＮＡ配列と１００％一致した。ＺＭ−１５０２株の生理性状試験の結果、本菌株をキャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）ＺＭ−１５０２株と命名した。生理性状試験の結果は、表１に示す通りである。本菌株は、平成18（2006）年12月13日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）（茨城県つくば市東１−１−３）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１３３として寄託されている。
【００１５】
【表１】
2008247845.tif 000009
表中の「＋」は反応が陽性、「−」は反応が陰性、「Ｗ (weak)」は弱い陽性反応、
「S (slow)」は試験開始後２週間から３週間にかけて徐々に陽性反応が認められたこと、「Ｌ (latent)」は試験開始後２週間以降に急速に陽性反応が認められたことを示す。
【００１６】
本発明の微生物には、上記のＺＭ−１５０２株のほか、その類縁微生物も含まれる。ＺＭ−１５０２株の類縁微生物としては、例えば、配列番号１の塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上相同な塩基配列を含むリボソームＲＮＡ遺伝子を有する微生物をいう。前記類縁微生物としては、例えばキャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）ＺＭ−１５１７株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１１５３）、ＺＭ−０１３２株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１１５２）等が該当する。ここで、酸型ＳＬは、前記式（１）で表される構造を有するＳＬである。
また、本発明においては、上記微生物のうち、酸型ＳＬ高生産能を有する微生物を使用することが好ましい。ここで「酸型ＳＬ高生産能」とは、前記酸型ＳＬのみを選択的かつ効率良く生産する能力、具体的には、１００ｇ/Ｌのグルコース、５０ｇ/Lのオレイン酸、５０g/Lの大豆油、１ｇ/Lの酵母エキス（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ製））、３ｇ/Lの尿素、１ｇ/Lのリン酸二水素カリウム、及び１ｇ/Lの硫酸マグネシウム、０．４ｇ/Ｌの硫酸ナトリウムを含む培地において微生物を２８℃で７日間培養した場合において、ＳＬを１ｇ／ｌ以上、好ましくは２ｇ／ｌ以上生産し、かつ生産されるＳＬの９０質量％以上、好ましくは９５質量％以上が酸型のＳＬであることをいう。このような性能を有する菌としては、前記キャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）、ＺＭ−１５０２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１３３）、ＺＭ−１５１７株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１１５３）、ＺＭ−０１３２株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１１５２）等が該当する。
【００１７】
ＺＭ−１５０２株の類縁微生物は、配列番号１に記載の塩基配列を指標として単離することができる。自然界から採取したサンプル（例えば、土壌、河川・湖沼の水、樹液、花、葉、果実など）を、微生物が生育可能な培地にて２６〜３０℃にて３〜７日間培養し、培養液をＧＣ／ＭＳ分析して酸型ＳＬの生産が認められたサンプルを選抜する（一次スクリーニング）。次に、選抜したサンプルの培養液をプレート上で培養し、コロニーを形成させて微生物を単離し、さらに単離した微生物を微生物が生育可能な培地にて培養し、ＧＣ／ＭＳ分析して酸型ＳＬ生産が認められた微生物を選択し（二次スクリーニング）、この微生物菌株のリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＤＤＢＪのＦＡＳＴＡプログラム （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ｆａｓｔａ−ｊ．ｈｔｍｌ）の塩基配列データベースに対して相同性検索を行う。
上記のスクリーニングに用いる培地としては、例えば、２００ｇ/Ｌのグリセロールと酵母エキス１ｇ/Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ/Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ/Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ/Ｌの組成の液体培地が挙げられる。
【００１８】
本発明においては、前記のような微生物を用いて酸型のＳＬを生産することができるが、中でもＺＭ−１５０２、ＺＭ−１５１７及びＺＭ−０１３２株は、酸型のＳＬ、特に全酸型ＳＬの９０質量％以上、好ましくは９５質量％以上、さらに好ましくは９７質量％以上の前記式（２）のジアセチル化物を含む酸型ＳＬを生産できるため、特に好ましく使用することができる。
【００１９】
培地の組成
上記培養に用いる培地には、特に制限はなく、微生物（特に酵母）に対して一般に用いられる培地、例えばＹＰＤ培地（イーストエキストラクト１０ｇ、ポリペプトン２０ｇ、及びグルコース２０ｇ）を使用することができる。
培地に添加する成分としては、当該技術分野で通常用いられる炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要な栄養源等を単独で、又は組み合わせて用いることができる。炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、炭水化物（グルコース、マンノース、グリセロール、マンニトール等の単糖、ショ糖、麦芽糖、乳糖等のオリゴ糖、デンプン等）、有機酸（酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、オレイン酸等）、アルコール類（エタノール、プロパノール等）、中鎖脂肪属炭化水素（ヘキサデカン、テトラデカン等）が用いられる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、又は尿素、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、コーンスチープリカー、カザミノ酸等の含窒素化合物が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、リン酸二水素カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００２０】
特に、本発明の微生物を用いて、効率よく酸型ＳＬを生産するためには、炭素源として油脂、例えば大豆油、菜種油、綿実油、ひまわり油、カポック油、ごま油、コーン油、米油、落花生油、ベニバナ油、オリーブ油、アマニ油、キリ油、ひまし油、パーム油、パーム核油、ヤシ油等を、単独又はこれらの２以上を組み合わせて使用することができる。また、さらに生産効率を向上させるためには、前記油脂と共に有機酸を併用することが好ましく、このような有機酸は、例えばカプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、トウハク酸、リンデル酸、ツズ酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、ソルビン酸、リノール酸、リノエライジン酸、γ−リノレン酸、リノレン酸及びアラキドン酸を、単独又はこれらの２以上を組み合わせて使用することができる。上記油脂と有機酸を併用する場合には、油脂１００質量部に対して、有機酸を０〜５００質量、好ましくは５０〜１００質量部使用することが好ましい。培地中における油脂の濃度は、０ｇ／ｌ〜４００ｇ／ｌ、好ましくは１０ｇ／ｌ〜２００ｇ／ｌ、さらに好ましくは５０〜１００ｇ／ｌであることが好ましい。また、培地中における有機酸の濃度は、０〜４００ｇ／ｌ、好ましくは１０〜２００ｇ／ｌ、さらに好ましくは５０〜１００ｇ／ｌであることが好ましい。上記油脂及び有機酸は、上記他の炭素源と共に、又は他の炭素源に変えて使用することができ、さらに前記窒素源、無機塩と適宜組み合わせて使用することが可能である。
【００２１】
本発明における酸型ＳＬの生産方法において、より効率よく酸型ＳＬを、特に上記式（２）に表されるジアセチル化物としての酸型ＳＬを効率よく生産するためには、例えば上記炭素源のうち炭水化物を０〜４００ｇ／ｌ、好ましくは５０〜２００ｇ／ｌ、有機酸を０〜４００ｇ／ｌ、好ましくは２０〜１００ｇ／ｌ、油脂を０〜４００ｇ／ｌ、好ましくは２０〜１００ｇ／ｌ、窒素源を０．５〜１００ｇ／ｌ、好ましくは１〜５ｇ／ｌ、及び無機塩類を０〜１００ｇ／ｌ、好ましくは０．５〜５ｇ／ｌ含有する培地を用いることがより好ましい。
【００２２】
本発明の酸型ＳＬは種々の炭素源から生産できるが、前記炭素源の代わりに、又はこれと併用してグリセロール、特に植物油の分解又はエステル交換の際の副生成物であるグリセロールを用いても生産することができる。その際、副生成物であるグリセロールを活性炭処理して培養に用いる事が、酸型ＳＬの生産性の観点から好ましい。当該活性炭処理は、例えば、前記副生成物としてのグリセロール１Ｌ（水、不純物等を含む）に対して、活性炭を１０〜３００ｇ添加し、これを１〜１２時間攪拌し、攪拌終了後に当該活性炭を除去することにより行うことができる。前記活性炭処理により、副生成物であるグリセロール中に含まれる、微生物の成育を阻害する物質を取り除き、酸型ＳＬの生産性を向上させることができると考えられる。上記グリセロールを炭素源として用いる場合には、グリセロールの純分として、１０〜５００ｇ／ｌ、好ましくは５０〜３００ｇ／ｌ、さらに好ましくは１００〜２５０ｇ／ｌ培地中に含有することが好ましい。
【００２３】
生産のための培養条件
本発明における酸型ＳＬの生産は、前記培地を用いて前記微生物を培養することにより行える。
一般的な培養条件は、以下の通りである。培養温度は、２０〜３０℃、好ましくは２６〜３０℃である。培養日数としては、酸型ＳＬ生産量に応じて適宜設定すればよいが、例えば３〜２０日間が好ましい。培養方法としては、振盪培養、通気撹拌培養等の公知の一般的な微生物の培養方法を適用することができる。良好な微生物の生育及び酸型ＳＬの生産のためには、培養液に酸素を供給することが好ましく、そのためには、ジャーファメンターを用いる場合では、空気を通気しながら撹拌するか、振とう培養を行えばよい。
【００２４】
上記微生物を用いて酸型ＳＬを選択的に生産する場合、増殖能の高い菌株を用いた方が、単位培養液及び単位時間当たりの酸型ＳＬ生産量が高くなるため、まず前培養によって菌体を活性化させ、これを本培養の培地に接種して培養を行うことが好ましい。例えば、種培養、本培養及び酸型ＳＬ生産培養の順にスケールアップしていくことが好ましい。これらの培養における、具体的な培地組成、培養条件を例示すると以下のとおりである。
【００２５】
グルコース５〜２０ｇ／Ｌ，酵母エキス０．１〜２ｇ／Ｌ，硝酸ナトリウム０．１〜５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．１〜２ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．１〜１ｇ／Ｌの組成の液体培地４ｍＬが入った試験管に、保存菌株を１白金耳接種し、２６〜３０℃で１〜３日振とう培養を行う（種培養）。次に、２０〜３００ｇ／Ｌ、好ましくは４０〜１００ｇ／Ｌの植物油脂等の油脂類を加えた上記と同じ組成の液体培地５０〜１００ｍＬの入った坂口フラスコに上記の種培養を行った培養液を接種して、２６〜３０℃で１〜７日間振とう培養を行う（本培養）。さらに、上記の本培養と同じ組成の液体培地１〜２Ｌが入ったジャーファメンターに上記の本培養を行った培養液を接種して、２６〜３０℃で１〜２Ｌ／分の通気速度と６００〜１０００ｒｐｍの撹拌速度で培養する(酸型ＳＬ生産培養)。このときの培養温度は２０〜３０℃、好ましくは２６〜３０℃であり、培養時間は、３〜２０日間が好ましい。
微生物菌株の酸型ＳＬ生産培養に用いる培地への接種は、例えば、種培養液又は本培養液を、酸型ＳＬ生産培養に用いる培地１Ｌ中に、１００〜２００ｍｌ、好ましくは５０〜１００ｍｌ含む量となるように添加することで行える。
【００２６】
本発明における培養は、培養液中の所望の酸型ＳＬ生成量が最高に達した時点で終了させることができるように、培養液中の酸型ＳＬを高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の周知の方法により測定しながら行うことが好ましい。
上記培養において、微生物の形態は、特に限定されず、微生物の菌体、菌体処理物（例えば、菌体破砕物）などをいう。
微生物の菌体または菌体処理物は固定化して用いることもできる。固定化法としては、従来公知の担体結合法、架橋化法、包括法などの方法が挙げられる。担体結合法では、担体に菌体を固定化させるが、固定化は物理的吸着、イオン結合、共有結合のいずれであってもよい。担体としては多糖（アセチルセルロース、アガロース）、無機物質（多孔質ガラス、金属酸化物）、合成高分子（ポリアクリルアミド、ポリスチレン）等が用いられる。架橋化法では、グルタルアルデヒド等の二官能性試薬を用いて菌体同士を架橋、結合させることによって固定化する。また、包括法では、多糖（アルギン酸、カラギーナン）、ポリアクリルアミド、コラーゲン、ポリウレタン等の高分子ゲルの格子や半透膜カプセルに菌体を包み込むことによって固定化する。
【００２７】
培養液中に蓄積された酸型ＳＬは、培養終了後、培養液を抽出することによって取得できる。抽出は、酢酸エチル等の有機溶媒を用いて行う。抽出は当該分野において通常行われる方法に従って行えばよく、例えば、培養液１Ｌあたり０．５〜１．５Ｌ程度の有機溶媒を用いて１〜数回抽出操作を行い、有機溶媒相を合わせて溶媒を留去し、脂質成分を得る。得られた脂質成分を、以下のように処理して酸型のＳＬを回収・精製する。
【００２８】
〈酸型ＳＬ組成物の回収・精製〉
培養終了後、得られた脂質成分を精製して酸型ＳＬを得る。精製方法は、公知の精製方法が特に制限なく使用できるが、本発明では、例えば以下の方法を用いることができる。酢酸エチルに溶解した脂質成分をシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム：アセトン（１０：０、９：１、８：２、５：５、２：８、１：９、０：１０）の順で溶出させる。各溶液を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートにチャージし、クロロホルム：メタノール＝８：２（容積比）で展開する。展開終了後、アンスロン硫酸試薬で糖脂質の存在を確認する。糖脂質の含まれる溶出液を集め、溶媒を留去して糖脂質成分を得る。このうち、酸型ＳＬは極性の高い成分のため、クロロホルム：アセトン＝２：８溶出液中に多量に含まれることから、これらを回収しさらに精製することで単一成分を回収できる。
【００２９】
〈酸型ＳＬ組成物の構造決定〉
上記により得られる糖脂質成分の構造決定は、以下のようにして行う（キャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）ＺＭ−１５０２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１３３）を、グルコース、オレイン酸、大豆油を炭素源として培養することで得られる酸型ＳＬの構造決定手法を例にして以下説明する）。
単離した糖脂質成分は、ＴＬＣプレート上で、アンスロン硫酸試薬で青緑色に呈色することにより糖脂質成分であると判断できる。この糖脂質について、1Ｈ、13Ｃ、二次元ＮＭＲ解析を行い、得られたスペクトルと、構造既知である酸型ＳＬ化合物群のデータ（K. S. Bishtら，J. Org. Chem., 64巻, p780-789 (1999)、S. K. Singhら，J. Org. Chem., 68巻, p5466-5477 (2003)等）とを比較することで、構造解析を行う。
【００３０】
１）糖組成の解析
糖組成の解析はＮＭＲスペクトル法では困難なため、高速液体クロマトグラフィー分析（ＨＰＬＣ）により決定する。糖脂質を酸で単糖と脂質部分に加水分解した後、単糖が含まれる水相から精製して得られる単糖溶液を、カルバモイル基の結合したシリカゲルを充填剤とするカラムを用いた順相ＨＰＬＣ法によって分析する。標準サンプルの溶出時間と比較することで、単糖溶液中に含まれる糖成分を決定できる。
【００３１】
２）脂質組成の解析
一方、脂質部分の組成は、得られた糖脂質を塩酸メタノールでメタノリシスし、ヘキサンで抽出して得られた脂肪酸メチルエステルのＧＣ／ＭＳで分析することにより決定する。
【００３２】
３）構造解析
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは、一般に糖アルコール上の還元末端以外のプロトンは３．５ｐｐｍ前後にまとまって検出されるが、水酸基の水素がアシル基とエステル結合すると、そのα−プロトンのシグナルは低磁場にシフトすることが知られている。本糖脂質の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、既知の酸型ＳＬのものと比較し、各プロトンに由来するピークの化学シフトを帰属する。また、２．１ｐｐｍ付近に観測されるアセチル基（−ＣＯＣＨ3）由来のシグナルを確認し、どの水酸基に何分子アセチル基が結合しているかが類推される。
また、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて、１７０ｐｐｍ付近に観測されるアシル基のカルボニル炭素（Ｃ＝Ｏ）由来のシグナル、２０ｐｐｍ付近に観測されるアセチル基炭素（−ＣＯＣＨ3）由来のシグナルを確認することでも、分子中のアセチル基の存在を確認できる。
【００３３】
次に、1Ｈ−1Ｈ ＣＯＳＹ（Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ＨＭＱＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）、ＨＭＢＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂｏｎｄ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）スペクトル解析を行い、上記の1Ｈ、13Ｃ−ＮＭＲ解析の結果を基にして糖骨格の完全帰属を行う。ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣスペクトルによって、炭素、水素の化学シフトがそれぞれ完全帰属される。また、ＨＭＢＣスペクトルにおいて、どの水酸基にアセチル基が存在しているかが証明できる。
得られた糖脂質は脂質部分の脂肪酸鎖長が異なる成分の混合物として回収されるが、さらにこれは逆相カラム（ＯＤＳカラム）を用いたＨＰＬＣ分析を行うことで、単一の脂肪酸を有する化合物を容易に分離できる。分離した各ピーク化合物についてＭＳ分析を行うことで主成分の構造を決定する。
さらに、これらの菌体が生産する化合物群には、ＴＬＣ上で他にもいくつかの微量スポットが検出されており、糖骨格上のアセチル基の数とその結合位置の異なる成分等も存在していることが認められる。
【００３４】
〈本発明で得られるＳＬ〉
上記のような本発明の生産方法を実施することにより得られる酸型ＳＬは、以下の式（１）で表され、従来の方法ではラクトン型との混合物としてしか生産されなかったＳＬの酸型が、微生物を培養する工程のみで選択的に生産されるところが大きな特徴である。
【化５】
2008247845.tif 000010
（１）
（式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して水素（−Ｈ）又はアセチル基（−ＣＯＣＨ3）であり、ｎは一般に９〜２０、より通常には１１〜１７、さらにより通常には１３〜１５の数であり、
2008247845.tif 000011
基は飽和脂肪族炭化水素鎖または二重結合を少なくとも１個有する不飽和脂肪族炭化水素鎖である。）
【００３５】
特に、本発明においては、式（２）で表される６’、６”−ジアセチル化物を９０質量％以上、好ましくは９５質量％以上、さらに好ましくは９７質量％以上含有する酸型ＳＬを得ることができる。
【化６】
2008247845.tif 000012
（２）
（式中、ｎは一般に９〜２０、より通常には１１〜１７、さらにより通常には１３〜１５であり、
2008247845.tif 000013
基は飽和脂肪族炭化水素鎖または二重結合を少なくとも１個有する不飽和脂肪族炭化水素鎖である。）
【００３６】
一般的に酸型ＳＬを大量に得るには、一度発酵生産法によってラクトン型・酸型ＳＬ混合物を生産し、その後、酸またはアルカリによってエステル結合の加水分解を行う方法が採られている。その際、前記式（２）中のＲ1およびＲ2に存在するアセチル基も加水分解を受けるため、得られる酸型ＳＬのほとんどは脱アセチル化された化合物となる。したがって、６’、６”−ジアセチル化酸型ＳＬ組成物は、本発明の発酵生産法によってのみ選択的に生産される。
【００３７】
本発明を実施することにより得られる上記酸型ＳＬは、１ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは０．３ｍｇ／ｍｌ以下の臨界ミセル濃度を有している。よって、従来の微生物を用いて得られるラクトン型と酸型のＳＬ混合物、及びアセチル基が脱落した酸型ＳＬと比較して、低濃度で界面活性効果を発現することが可能である。従って、本発明の酸型ＳＬは、洗剤、化粧品及び食品等の幅広い分野で好適に使用することができる。
【実施例】
【００３８】
実施例１
（ＺＭ−１５０２株の単離と同定）
岡山県で採取した植物（葉）サンプルから分離したＺＭ−１５０２株のリボソームＲＮＡ遺伝子の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２領域の塩基配列（ｒＤＮＡ配列）による相同性検索を以下のようにして行った。ゲノムの抽出には、ＧｅｎＴＬＥ (ＴａＫａＲａ社製)を使用し、操作はＴａＫａＲａ社のプロトコールに従った。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、リボゾームＲＮＡ遺伝子 (ｒＤＮＡ)に特異的なプライマーＡ（５’−ｇｃａｔａｔｃａａｔａａｇｃｇｇａｇｇａａａｇ−３’:配列番号２）及びプライマーＢ（５’−ｇｇｔｃｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇａｃｇｇ−３’:配列番号３）を用いて、ＰＣＲにより２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２領域の塩基配列を増幅した。その後、増幅された前記領域の塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号１に示す。得られたｒＤＮＡ配列について、ＤＮＡデータベース(ＤＤＢＪ)にアクセスし、ＦＡＳＴＡプログラム (ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ｆａｓｔａ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いて相同性検索を行ったところ、キャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）の対応する前記領域のｒＤＮＡ配列と１００％一致した。また、ＤＮＡデータベース上より入手したキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属および代表的な酵母種のリボソームＲＮＡ遺伝子の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２領域の塩基配列を多重整列後、ＮＪ法により分子系統解析を行った結果、本菌株の分子系統樹の位置はキャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）と一致した（図１）。さらに、表１に記載の生理性状試験の結果を合わせた結果、ＺＭ−１５０２株は、キャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）に分類された。ＺＭ−１５０２株は、平成18（2006）年12月13日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）（茨城県つくば市東１−１−３）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１３３として寄託されている。
【００３９】
実施例２
（酸型ＳＬの生産）
（１）キャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）ＺＭ−１５０２株の培養
（a）種培養
保存培地（麦芽エキス３ｇ/Ｌ（Ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ （Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ製)）、酵母エキス３ｇ/Ｌ（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ製））、ペプトン５ｇ/Ｌ、グルコース１０ｇ/Ｌ、寒天３０ｇ/Ｌ）に保存しておいた上記のキャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）ＺＭ−１５０２株を、グルコース２０ｇ/Ｌ、酵母エキス１ｇ/Ｌ（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ製））、硝酸ナトリウム１ｇ/Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ/Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ/Ｌの組成の液体培地２ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し２６℃で振とう培養を１日間行った。
（b）酸型ＳＬ生産培養
（a）で得られた菌体培養液を、１００ｇ/Ｌのグルコース、５０ｇ/Lのオレイン酸、５０g/Lの大豆油、１ｇ/Lの酵母エキス（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ製））、３ ｇ/Lの尿素、１ｇ/Lのリン酸二水素カリウム、及び１ｇ/Lの硫酸マグネシウム、０．４ｇ/Ｌの硫酸ナトリウムの組成の液体培地３０ｍＬが入った三角フラスコに２ｍｌ接種し、振とう培養を２８℃にて７日間行った。
【００４０】
（２）ＺＭ−１５０２株の酸型ＳＬ生産能の確認
上記（１）の培養終了後の培養液を採取し、これを用いてＺＭ−１５０２株の酸型ＳＬ生産能を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で確認した（図２、レーンＡ）。ＳＬの標準として、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ  １０２４３Ｔ株を上記と同じ条件で培養し、酢酸エチル抽出画分を用いた（図２、レーンＢ）。さらに、これをアルカリ加水分解することで得られる従来型の酸型ＳＬ（脱アセチル化物）もスポットした（図２、レーンＣ）。なお、薄層クロマトグラフィーは、Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０Ｆ（Ｗａｋｏ社製）を用い、展開溶媒はクロロホルム：メタノール＝８:２とした。検出は、展開後のプレートにアンスロン試薬（０．２％アンスロン/７５％硫酸水溶液）を吹き付け、１１０℃で５分間加熱した。
【００４１】
図２に示すように、ラクトン型が主成分であるＣ．  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ菌株を用いた従来法によって得られたＳＬ標準（レーンＢ）に対して、ＺＭ−１５０２株が主に生産している糖脂質は、ラクトン型よりも極性の高い酸型ＳＬであり、ラクトン型のＳＬが存在しないことが確認できた（レーンＡ）。また、そのスポット数も少なく、混合物の種類が少ないことが予想された。さらに、脱アセチル化された従来の酸型ＳＬ（レーンＣ）と比較して、疎水性の高い糖脂質が主成分であることが大きな特徴であった。
【００４２】
実施例３
（酸型ＳＬの単離・精製）
実施例２で得られたＳＬの精製を、既知の精製手法によって分離した。すなわち、上記酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムに供し、クロロホルムとアセトンの混合液を展開溶媒とするカラムクロマトグラフィー法によって精製した。クロロホルムとアセトンの割合が２：８の画分で酸型ＳＬを分離回収し、続いてアセトンでさらに極性の高い成分を分離回収した。そして、それぞれの回収した画分を上記ＴＬＣに供した（図３）。これによれば、主成分（a）及び微量成分（b）が存在することが分かった。さらにこれらの精製を繰り返すことで、単一成分を得た。
【００４３】
実施例４
（酸型ＳＬの構造解析）
１）糖組成の解析
実施例３で得られた酸型ＳＬ（a）１０ｍｇに３N塩酸を１ｍL加え、９０℃で３時間加熱し、脂質部分と糖に完全に分解した。脂質部分を２ｍLのヘキサンに抽出して除去し、水溶液部分について脱塩用樹脂(アンバーライトＩＲＡ−４１０)で脱塩した後、高速液体クロマトグラフィーで（ＨＰＬＣ）分析した。ＨＰＬＣ分析のカラムには、Ａｍｉｄｅ８０カラム（東ソー株式会社製）を用い、アセトン：水=８５：１５を溶離液とし、検出は蒸発光散乱検出器を用いた。ＨＰＬＣのチャートを図４に示す。ＨＰＬＣの溶出時間を標準物質の溶出時間と比較した結果、実施例３で得られた酸型ＳＬ（a）の糖部分は、全てグルコースで構成されていることが示された。
【００４４】
２）脂質組成の解析
実施例３で得られた酸型ＳＬ（a）の脂質部分の組成は、塩酸メタノール加水分解物からヘキサンで抽出して得られた脂肪酸メチルエステルのＧＣ／ＭＳ分析により行った。分析結果を表２に示す。本糖脂質では、分子構造中に水酸基を一つ有する中鎖の直鎖飽和及び不飽和ヒドロキシ脂肪酸（Ｃ１６〜Ｃ１８）が検出され、特にＣ１８の不飽和ヒドロキシ脂肪酸が主成分であることが示された。また、不飽和脂肪酸は全体の２分の１程度含まれていることが示された。
【表２】
2008247845.tif 000014
【００４５】
３）糖骨格の完全帰属
実施例３で得られた酸型ＳＬ（a）について、重水素化メタノール（ＣＤ3ＯＤ）を溶媒とするＮＭＲ解析により構造の同定を行った。1Ｈ、13Ｃ、1Ｈ−1Ｈ  ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣの各ＮＭＲスペクトル解析を行うことで、本糖脂質の構造を完全帰属した。本糖脂質の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図５に示す。これによれば、本糖脂質では、アシル基とエステル結合したことで低磁場シフトしたα−プロトンのシグナルが２つ４．２ｐｐｍ及び４．３５ｐｐｍ付近に観測され、これはそれぞれソホロース上６’及び６”位の区別されるプロトン（６’−ａ、６”−ａ、及び６’−ｂ、６”−ｂ）であることが確認された。また、２．０４６ｐｐｍ及び２．０５８ｐｐｍにアセチル基（−ＣＯＣＨ3）のメチルプロトンのシグナルが２本検出された。
さらに、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて、アセチル基由来のピークが各２本ずつ（カルボニル基炭素（Ｃ＝Ｏ）由来のシグナルが１７１．４６ｐｐｍ及び１７１．４８ｐｐｍに、メチル炭素（−ＣＯＣＨ3）由来のシグナルが１９．５８ｐｐｍ及び１９．７５ｐｐｍに見られたことからも確認された。
以上の結果は、本発明で得られた酸型ＳＬは、ソホロースの６’及び６”位にアセチル基が２個エステル結合したジアセチル化物であることを示している。
【００４６】
次に、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣスペクトル測定を行い、得られたスペクトルから糖骨格、及びエーテル結合によって結合したヒドロキシ脂肪酸の炭素、水素の化学シフトがそれぞれ完全帰属され、本発明で得られる酸型ＳＬが６’、６”−ジアセチル化酸型ＳＬであることが証明された。アセチル基のカルボニル炭素と糖骨格との相関を示すＨＭＢＣスペクトルの拡大図を示す（図６）。また、化学シフトを以下にまとめて示す。
1H NMR (CD3OD, δ): 1.20 (d, CH3 (H-18)), 1.26-1.44 (br, CH2 (H-4〜7, 12〜15)), 1.55-1.64 (m, CH2 (H-3, 16)), 2.0-2.08 (m, -CH2CH=CH- (H-8, 11)), 2.046, 2.048 (Ac×2), 2.27 (t, -CH2COOH (H-2)), 3.2-3.7 (m, CHOH (H-2'〜5', 2”〜5”)), 3.75 (m, CH (H-17)), 4.20 (dd, CH (H-6'a, 6”a)), 4.36 (dd, CH (H-6'b, 6”b)), 4.45 (d, CH (H-1')), 4.55 (d, CH (H-1”)), 5.35 (m, -CH=CH- (H-9, 10))
13C NMR (CD3OD, δ): 19.58, 19.75 (CH3×2 (Ac)), 20.67 (CH3 (C-18)), 23.05, 25.0, 29.0-29.8 (CH2 (C-4〜7, 12〜15)), 24.92 (CH2 (C-3, 16)), 26.99 (CH2 (C-8, 11)), 33.77 (-CH2COOH (C-2)), 63.57, 63.74 (C-6', 6”), 70.2, 70.3 (C-4', 4”), 73.68 (C-5'), 74.39 (C-2”), 74.90 (C-5”), 76.34, 76.63 (C-3', 3”), 77.37 (CH (C-17)), 82.60 (C-2'), 101.40 (C-1'), 104.48 (C-1”), 129.6 (CH=CH (C-9, 10)), 171.48 (C=O (Ac)), 176.5 (COOH (C-1))
【００４７】
さらに、本酸型ＳＬはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析において、擬似分子イオン［Ｍ＋Ｎａ］+ ｍ／ｚ  ７３０．０、及び７０４．０が検出された（図７）。したがって本酸型ＳＬは、Ｃ１８で不飽和二重結合が一つ存在する直鎖不飽和ヒドロキシ脂肪酸が結合している６’、６”−ジアセチル化酸型ＳＬが主成分であり、続いてＣ１６の直鎖飽和ヒドロキシ脂肪酸が結合している６’、６”−ジアセチル化された酸型ＳＬが多く含まれていると考えられる。さらにそれらに次いで、Ｃ１８の飽和及びＣ１６の不飽和ヒドロキシ脂肪酸が結合した化合物６’、６”−ジアセチル化された酸型ＳＬのピークも検出された。これらの結果は脂肪酸組成分析の結果（表２）ともよく一致している。尚、前記式（１）又は（２）において、Ｃ１６とはｎ＝１３の構造に該当し、Ｃ１８とはｎ＝１５の構造に該当する。
また、実施例３で分離された他の成分（b）について同様の解析を行った結果、ソホロース上の６’位、あるいは６”位の一方のアセチル基が欠落したモノアセチル化酸型ＳＬであることが確認された。よって、成分（ａ）及び（ｂ）の分析により、本発明の方法により生産されたＳＬは、ラクトン型を含まない、換言すれば生産されるＳＬの１００質量％が酸型であることが明らかとなった。
【００４８】
実施例５
（ＨＰＬＣ分析によるＺＭ−１５０２株のＳＬ生産量の決定）
実施例２で得られたＺＭ−１５０２株の培養液、及び比較として実施例２と同じ条件で培養したＣａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ  １０２４３Ｔ株の培養液の酢酸エチル抽出画分について、シリカゲルカラム（イナートシルＳｉｌ−１００Ａ）を接続したＨＰＬＣを用い、生成物の成分分析を行った。溶離液にはクロロホルム／メタノール混合溶媒を用い、流速１ｍＬ／ｍｉｎで混合比が１０：０から０：１０まで変化するように設定したグラジエントシステムにより溶出した。検出は蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ−ＬＴ、島津製作所製）を用いた。各サンプルの測定の結果（図８）、ＺＭ−１５０２株からはほぼ単一ピークの生成物が得られた（図８a）。実施例３と同様の方法で精製した各種ＳＬフラクションについて、濃度を変えて測定を行うことで検量線を作成した結果、ＺＭ−１５０２株から得られる単一ピークの生成物はジアセチル化酸型ＳＬに相当し、その生産量は４２ ｇ/Ｌであった。さらに、ＺＭ−１５０２株が生産する酸型ＳＬの組成比はピーク面積から算出した結果、ジアセチル化酸型ＳＬが９８質量％以上、モノアセチル化酸型ＳＬが２質量％未満であった。一方、Ｃ．  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ  １０２４３Ｔ株からは複数の成分が生産されており、ラクトン型が主成分であることが確認された（図８b）。Ｃ．  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ  １０２４３Ｔ株の全ＳＬの生産量は５６ｇ／Ｌ、そのうちラクトン型ＳＬが６６質量％、酸型が３４質量％であり、及び酸型ＳＬのうちの５０質量％がジアセチル化物の酸型ＳＬであった。上記の結果は実施例２における図２のＴＬＣ分析の結果とよく一致するものであった。
【００４９】
実施例６
（グリセロールを原料に用いる酸型ＳＬの生産）
１）グリセロールの活性炭処理
植物油脂のエステル交換反応で副生成するグリセロール水溶液５０質量％１Ｌに対し、活性炭を５０ｇ添加し、１時間攪拌した。その溶液をＮｏ．５のろ紙でろ過し、活性炭を取り除いた。ろ液を活性炭処理グリセロールとした。
【００５０】
２）活性炭処理グリセロールを炭素源とした酸型ＳＬの生産  
ＺＭ−１５０２株を活性炭処理済みグリセロールを２００ｇ/Ｌ（グリセロール純分）、酵母エキスを１ｇ/L、尿素を３ ｇ/L、リン酸２水素カリウムを１ｇ/L、及び硫酸マグネシウムを１ｇ/L含む組成の液体培地３０ｍＬが入った三角フラスコに接種し、振とう培養を２８℃にて７日間行った。なお、対照実験として、前記活性炭処理済みグリセロールの代わりに活性炭処理をしない副生成物としてのグリセロールを２００ｇ／Ｌ（グリセロール純分）含む培地、及び前記活性炭処理済グリセロールの代わりに０．４ｇ/Ｌの硫酸ナトリウム及び試薬グレードのグリセロール２００ｇ/Ｌ（グリセロール純分）を含む培地を用いて、同条件でＺＭ−１５０２株を培養した。
【００５１】
３)酸型ＳＬの生産量
酸型ＳＬの生産量は前述のシリカゲルカラムと蒸発光散乱検出器を用いたＨＰＬＣによって行った。活性炭処理を行ったグリセロールでは４．６ｇ/Ｌの酸型ＳＬを生産した。一方、活性炭処理しないグリセロールを含んだ培地では１．９ｇ/Ｌの酸型ＳＬを、０．４ｇ/Ｌの硫酸ナトリウム及び試薬グレードのグリセロール２００ｇ/Ｌを含んだ培地では３．５ｇ/Ｌの酸型ＳＬを生産した。
【００５２】
実施例７
（ＺＭ−１５１７株及びＺＭ−０１３２株を用いる酸型ＳＬの生産）  
ＺＭ−１５１７株、ＺＭ−０１３２株を用い、実施例６と同様の方法（活性炭処理済のグリセロールを含んだ培地を用いて培養する方法）で培養を行った。培養終了後の培養液を採取し、これを用いて上記２株の糖脂質生産能を薄層クロマトグラフィーで確認した結果（図９）、ＺＭ−１５０２株と同様に、上記２株は酸型ＳＬのみを選択的に生産することが確認された。薄層クロマトグラフィーのスポットから、ＺＭ−１５０２株、ＺＭ−１５１７株及びＺＭ−０１３２株の酸型ＳＬの生産量は、ほぼ同等であると判断される。
【００５３】
実施例８
（Ｃａｎｄｉｄａ属酵母菌株間での酸型ＳＬ生産能の比較）  
ＺＭ−１５０２株に対して、酵母菌近縁種であるＣａｎｄｉｄａ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ１０７００Ｔ株（配列番号１に示す塩基配列との相同性：９９％＜）、及び既存のＳＬ生産菌株であるＣａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ  １０２４３Ｔ株を用い、実施例６と同様の方法（活性炭処理済のグリセロールを含んだ培地を用いて培養する方法）で培養を行った。培養終了後の培養液を採取し、これを用いて上記２株の糖脂質生産能を薄層クロマトグラフィーで確認した結果（図１０）、ＺＭ−１５０２株と同様に、Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ１０７００Ｔ株でも酸型ＳＬのみを選択的に生産することが確認された。一方、ラクトン型を主生成物とするＳＬ混合物を生産する既存のＣａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ  １０２４３Ｔ株ではラクトン型を主に生産することが確認された。ＳＬの生産量については、ＴＬＣのスポットから、ＺＭ−１５０２株とＣａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ  １０２４３Ｔ株の生産量はほぼ同程度であるが、Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ１０７００Ｔ株の生産量は、ＺＭ−１５０２株と比較して少量であることが確認された。
【００５４】
実施例９
（酸型SLの界面活性能）
次に、実施例２で生産し、実施例３の精製過程で原料油分等のみを除去した「成分（ａ）＋（ｂ）」に該当する酸型ＳＬの界面活性能について検討した。図１１には種々の濃度の酸型SL水溶液の表面張力を協和界面科学社製のｄｒｏｐ  ｍａｓｔｅｒ  ＤＭ５００を用いて測定した結果を示す。図より明らかなように、表面張力値は、界面活性剤濃度の増加とともに、減少し、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に達するとやがて一定となった。図より明らかなように酸型ＳＬのＣＭＣは０．２ｍｇ／ｍｌであり、ｒＣＭＣは３８．９２ｍＮ／ｍとなり、極めて低濃度から優れた界面活性能を示すことが判明した。なお、従来の脱アセチル化された酸型ＳＬのＣＭＣは０．３０ｍｇ／ｍｌであり、ｒＣＭＣは３５．３３ｍＮ／ｍであり、本発明の酸型ＳＬの方が低濃度から界面活性を発現することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】キャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）ＺＭ−１５０２株から得られた塩基配列をもとに作成した分子系統樹を示す。
【図２】キャンディダ・フロリコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）ＺＭ−１５０２株の培養液の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による分析結果を示す。（レーンＡ： ＺＭ−１５０２株培養液、Ｂ：  Ｃ．  ｂｏｂｍｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ  １０２４３Ｔ株培養液、Ｃ： レーンＢのアルカリ加水分解によって得られる既存の酸型ＳＬ）
【図３】実施例３において、分離生成した酸型ＳＬのＴＬＣチャートを示す。
【図４】実施例４において、酸型ＳＬ（a）の糖組成の分析を行ったＨＰＬＣチャートを示す。
【図５】実施例４において、酸型ＳＬ（a）の構造解析を行った1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】実施例４において、酸型ＳＬ（a）の構造の完全帰属を行う際に、アセチル基の結合位置の決定に利用したＨＭＢＣスペクトルについて、カルボニル炭素と糖骨格との相関を示す拡大図を示す。
【図７】実施例４において、酸型ＳＬ（a）の分子量測定を行ったＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルを示す。
【図８】実施例５において、ＺＭ−１５０２株及びＣａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ  １０２４３Ｔ株の各培養液の酢酸エチル抽出画分を分析したＨＰＬＣチャートを示す。
【図９】実施例７において、グリセロールを炭素源とする培養によって得られた各種菌株培養液のＴＬＣチャートを示す。（レーン１： ＺＭ−１５０２株培養液、２： ＺＭ−１５１７株培養液、３： ＺＭ−０１３２株培養液）
【図１０】実施例８において、グリセロールを炭素源とする培養によって得られた各種菌株培養液のＴＬＣチャートを示す。（レーン１： ＺＭ−１５０２株培養液、２： Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ１０７００Ｔ株培養液、３： Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ  １０２４３Ｔ株培養液）
【図１１】実施例９において、酸型ＳＬ（a）＋（b）の界面活性能の測定結果から得られた濃度と表面張力値との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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