(57)【要約】      （修正有）【課題】豚痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスの提供。【解決手段】豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindIIIN断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞中で発現することができる組み換え豚痘ウイルス。更に、相同性ベクター、ワクチン、および免疫感作方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindIII N断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞中で発現することができる組み換え豚痘ウイルス。
【請求項２】
請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII N断片における略２.０ＫｂのHindIII〜BamHI亜断片内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。
【請求項３】
請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII N断片における略1.2ｋＢのBamHI〜 HindIII亜断片内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。
【請求項４】
請求項２に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindIII N断片の略2.0ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片内のオープンリーディングフレーム中に挿入される組み換え豚痘ウイルス。
【請求項５】
請求項４に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記オープンリーディングフレームは、Ｉ７Ｌ遺伝子をコードする組み換え豚痘ウイルス。
【請求項６】
請求項２に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略2.0ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片内におけるEcoRV制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。
【請求項７】
請求項２に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略2.0ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片内におけるSnaBI制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。
【請求項８】
請求項３に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII N断片における略1.2ｋＢのBamHI〜 HindIII亜断片内のオープンリーディングフレーム中に挿入される組み換え豚痘ウイルス。
【請求項９】
請求項８に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記オープンリーディングフレームは、Ｉ４Ｌ遺伝子をコードする組み換え豚痘ウイルス。
【請求項１０】
請求項３に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記略1.2ｋＢのBamHI〜 HindIII亜断片内のBglII制限エンドヌクレアーゼ内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。
【請求項１１】
組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０６０と命名された組み換え豚痘ウイルス。
【請求項１２】
組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０６１と命名された組み換え豚痘ウイルス。
【請求項１３】
組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０６２と命名された組み換え豚痘ウイルス。
【請求項１４】
二本鎖ＤＮＡ分子を含む豚痘ウイルスのウイルスゲノム中に外来ＤＮＡを挿入することにより組み換え豚痘ウイルスを製造するための相同性ベクターであって、
（ａ）通常は豚痘ウイルスゲノム内に存在しない二本鎖の外来ＤＮＡと；
（ｂ）前記外来ＤＮＡの一端に存在する、前記豚痘ウイルスゲノムのコーディング領域の HindIII Ｎ断片の一方の側に位置する前記ウイルスゲノムに対して相同性である二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡと；および、
（ｃ）前記外来ＤＮＡの他端に存在する、前記豚痘ウイルスゲノムのコーディング領域の HindIII Ｎ断片の他方の側に位置する前記ウイルスゲノムに対して相同性である二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡと；
からなる相同性ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の相同性ベクターであって、前記外来ＤＮＡ配列がサイトカインをコードする相同性ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の相同性ベクターであって、前記サイトカインがニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）またはニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）である相同性ベクター。
【請求項１７】
請求項１４に記載の相同性ベクターであって、前記外来ＤＮＡ配列がポリペプチドをコードする相同性ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の相同性ベクターであって、前記ポリペプチドは抗原性である相同性ベクター。
【請求項１９】
請求項１４に記載の相同性ベクターであって、前記外来ＤＮＡ配列がプロモータの制御下にある相同性ベクター。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本出願は、1995年６月７日に提出された合衆国特許出願第08/480,640号、1995年６月７日に提出された合衆国特許出願第08/488,237号、1995年６月７日に提出された合衆国特許出願第08/472,679号および1995年１月１９日に提出された合衆国特許出願第08/375,992号の一部継続出願の一部継続出願である。これら親出願の内容は、本明細書の一部をなす参照文献として本願に組み込まれる。
【０００２】
本願の中には、括弧内のアラビア数字によって、幾つかの出版物が参照される。これら文献の完全な書誌的引用は明細書の最後、即ち、請求の範囲の直前に見られる。これらの文献の開示は、本明細書の一部をなす参照として本願に組み込まれる。
【発明の背景】
【０００３】
豚痘ウイルス（ＳＰＶ）はポックスウイルス族（Poxviridae）に属している。このグループに属しているウイルスは、宿主細胞中の細胞質中で特徴的に発育する大型の二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＳＰＶは、スイポックスウイルス（Suipoxvirus）属の唯一のメンバーである。ＳＰＶは、幾つかの特徴によって、他のポリウイルスから区別される。ワクシニア等の他のポックスウイルスが宿主範囲が広いのに比較して、ＳＰＶは種特異性を示す（１８）。組識培養細胞系にＳＰＶを感染させたものと、他のポックスウイルスを感染させたものとでは劇的に異なる（２４）。ＳＰＶは、ワクシニア・ウイルスと抗原交叉反応を示さず、またオルソ、レポリ、アヴィ、昆虫ポックスグループとＤＮＡレベルで、検出可能な総体的相同性を示さない（２４）。従って、従来技術において、他のポックスウイルスに関して知られ、記載されていることは、豚痘ウイルスの先行技術とはならない。ＳＰＶは、肌および局部的リンパ節においてのみ検出される病巣を持った自己規制感染を特徴とする、唯一穏やかな病原菌である。ＳＰＶの感染は非常に制限されているけれども、ＳＰＶから回復したブタは、ＳＰＶの感作に対して免疫性があり、活性免疫が発生したことがわかる（１８）。
【０００４】
本発明は、ワクチン抗原およびブタに対する治療剤のデリバー用ベクターとしてＳＰＶを使用することに関する。この原理は、ＳＰＶの下記特質によって支持される。ＳＰＶは、ブタにおいて唯一穏やかな病原菌であり、種特異的あり、防御免疫反応を誘導する。よって、ＳＰＶは、ベクターのワクチンおよび治療的特質によって与えられるその有益性とバランスさせなくてはならない本質的危険が少ない、ウイルス性ベクターデリバリーシステムの優れた候補である。
【０００５】
本発明の従来技術としては、バクテリア性プラスミド中でのＤＮＡクローン化および分析の技術がまずあげられる。利用される技術は、マニアチス等１９８３年の大部分およびサンブロック等１９８９年に詳述されている。これらの文献には、一般的組替えＤＮＡ技法の従来技術の状態が教示されている。
【０００６】
ポックスウイルスの中から５つ（ワクシニア、家禽ポックス、カナリアポックス、鳩およびアライグマポックス）が、本開示の前に、外来ＤＮＡ配列を含む様に加工された。ワクシニアウイルスは、外来遺伝子のベクターとして広範に使用されてきており（２５）、これは合衆国特許4,603, 112および4,722,848の主題である。同様に、家禽ポックスが外来遺伝子のベクターとして使用されており、これは幾つかの特許出願、ＥＰＡ0 284 416、PCT WO89/03429、およびPCT WO 89/12684の主題である。アライグマ・ポックス（１０）およびカナリアポックス（３１）は、狂犬病ウイルス起源の抗原を発現するために使用されてきた。ポックスウイルス中へ挿入する外来遺伝子挿入物の例としては、スイポックスウイルス属由来の例は含まれない。このように、豚痘ウイルスを遺伝子工学的に加工する方法、即ち、どこに挿入するか、又どのようにブタポックス中の発現物を得るかという方法は教示されていない。
【０００７】
抗原のデリバリーシステムとして生ウイルスを使用するアイデアは、最初の生ウイルスワクチンまで立ち戻ると、大変長い歴史を有している。デリバーされた抗原は、外来性でなく、生ウイルスによってワクチン中に自然に発現されものであった。外来抗原をデリバーするにウイルスを使用することについては、組替えワクシニアウイルスの研究によって、現在では容易になってきた。ワクシニアウイルスはベクターであり、伝染性を引き起こす他の疾患起源の様々な抗原は外来抗原であり、該ワクチンは遺伝子工学によって作成される。これらの開示によってこれらの概念が明らかになる一方、明らかにならなかったのは、何によって最良のウイルスベクター候補が作られるかというより実践的疑問に対する答えであった。この質問に答えるにあたっては、ウイルスの病原性の詳細、複製部位、それが誘導する免疫反応の種類、ウイルスが外来抗原を発現する可能性、遺伝子工学の適合性、規制当局によって認可される可能性など、選択にあたっての全ての因子である。これらの実用上の問題については、先行技術は何等教示していない。
【０００８】
治療剤をデリバーするためにポックスウイルスを使用することに関わる先行技術としては、インターロイキン２（１２）をデリバリーするワクシニア・ウイルスの使用があげられる。この場合、インターロイキン２は、ワクシニア・ウイルス上で弱毒性効果を示したけれども、宿主における治療剤効果は実証されなかった。
【０００９】
本発明のウイルス性ベクターによってデリバーされる治療剤は、生物学的分子すなわち、ブタウイルス複製の副産物でなくてはならない。これによって、治療剤はまず、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白に限られる。これらの化合物クラスに由来する治療剤の例として、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ（１６）、リボソーム（３４）、サプレサーｔＲＮＡｓ（２）、インタフェロンに誘発される二本鎖ＲＮＡの形があげられ、また、インシュリン等のホルモンから、インターフェロンおよびインターロイキン等のリンホカイン、天然麻酔剤までの数多くの蛋白質治療剤の例があげられる。これらの治療剤の発見およびその構造および作用の解明によって、ウイルスベクターデリバリーシステムにおけるそれを使用する技量が容易になることはない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入される外来ＤＮＡ配列を含む組替え豚痘ウイルスであって、該外来ＤＮＡは、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHind III N断片内に挿入され、またブタウイルスに感染した宿主細胞中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。
【００１１】
本発明は、更に相同性ベクター、ワクチンおよび免疫感作の方法を提供する。
【００１２】
図面の簡単な説明
図１Ａ−１Ｂ：
特徴的な長いターミナル・リピート（ＴＲ）領域を含むＳＰＶゲノムＤＮＡ（kasza株）の詳細な図が示される。酵素Hind IIIが制限マップが示される（２３）。断片は、サイズの減っていく順番に文字で表示される。ターミナル・リピートのサイズは、2.1 Kbより大きいが、9.7Kbより小さい。
【００１３】
図２Ａ−２Ｂ：
相同性ベクター515-85.1起源のＤＮＡ配列が示される。相同性ベクター515-85.1の二つの領域の配列が示される。第一の領域（図２Ａ）（配列認識番号１）は、５９９塩基対配列にわたり、ユニークなＡｃｃＩ部位が図３Ａ−３Ｃに示したように、側面に置（フランク）かれる。１１５のアミノ酸のＯＲＦの始めと終わりは、ＤＮＡ配列の下のアミノ酸の翻訳ＭetとＶａｌによって示されている。第二領域（図２Ｂ）（配列認識番号３）は、図３Ａ−３Ｃに示すように、特徴的なHIind III部位の上流８９９塩基対にわたる。２２０アミノ酸ＯＲＦの始めと終わりは、ＤＮＡ配列の下のアミノ酸の翻訳ＡｓｐとＩｌｅによって示される。
【００１４】
図３Ａ−３Ｃ：
515-85.1  ORFと、ワクシニア・ウイルス０１ＬＯＲＦの間の相同関係を示す。図３Ａには、二つのマップが示されている。図３Ａの第一のラインは、ＳＰＶHind III M断片の制限マップであり、第二のラインは、プラスミド515-85.１中のＤＮＡ挿入物の制限マップである。515-85.1[VV 01L様]ORFの位置もまた、該マップ中に示されている。図３Ｂおよび３Ｃに示されたＤＮＡ配列の位置は、図３Ａでは地図の下に太棒で示されている。図３Ｂは、その夫々のＮ末端におけるＶＶ０１ＬＯＲＦ(配列認識番号５)と515-85.1ORF(配列認識番号６)の間にある相同関係を示す。図３Ｃは、その夫々のＣ末端におけるＶＶ０１ＬＯＲＦ(配列認識番号７)と515-85.1ORF(配列認識番号８)の間にある相同関係を示す。
４Ａ−４Ｄ
相同性ベクター520-17.5におけるＤＮＡ挿入物が記載されている。図４Ａは、プラスミド520-17.5に会合するＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図４Ｂには、断片の間にある連結部ＡおよびＢの各々に位置する配列が示される。図４Ｃには、連結部ＣおよびＤ（配列認識番号９、１０、１３および１６）に位置する配列が示される。図４Ｂおよび４Ｃには更に、各断片を生成する制限部位が記載されているのみならず断片を繋ぎ合せるために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。合成リンカー配列には、太棒で下線が施されている。幾つかの遺伝子をコードしている配列の位置、調整要素もまた提示されている。下記二つの取り決めが使用された。括弧（  )中の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、初期プロモーター（ＥＰ１）、後期プロモーター（ＬＰ２）、ラクトースオペロンＺ遺伝子（lacＺ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）。
【００１５】
図５Ａ−５Ｄ
相同性ベクター中538-46.16におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図５Ａには、プラスミド538-46.16に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図５Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図５Ｃには、連結部Ｃに位置する配列が示され、および図５Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列（配列認識番号１７、１８、２１、２６および２８）が示される。図５Ｂから５Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、  各連結部について記載されている。該合成リインカー配列には、太棒で下線が施されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病ウイルス（ＰＲＶ），ｇ５０（ｇＤ）、糖蛋白  ６３（ｇ６３），初期プロモーター（ＥＰ１）、後期プロモーター１（ＬＰ１）（配列認識番号４６）、後期プロモーター２（ＬＰ２）、ラクトースオペロンＺ遺伝子（lacZ）、および大腸菌（Ｅ．coli）。
【００１６】
図  ６
組替えＳＰＶに感染した細胞の溶融物の、ＰＲＶに対する抗血清によるウエスタンブロット。  レーン（Ａ）未感染ベロ細胞溶融物、（Ｂ）Ｓ−ＰＲＶ−０００（擬狂犬病ウイルスＳ６２／２６）に感染した細胞の溶融物、  （Ｃ）既染色分子量マーカー、（Ｄ）未感染ＥＭＳＫ細胞溶融物、（Ｅ）Ｓ−ＳＰＶ−０００に感染した細胞の溶融物、（Ｆ）Ｓ−ＳＰＶ−００３に感染した細胞の溶融物、（Ｇ）Ｓ−ＳＰＶ−００８に感染した細胞の溶融物。細胞溶融物は、”感染細胞溶融物の調製”に記載されたように調製された。全溶融物サンプルの約１／５を、各レーンに搭載した。
【００１７】
図  ７：
ＮＤＶ血球凝集素ノイラミダーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（ＨＮ）（配列認識番号２９）。ＮＤＶ  ＨＮ  ｃＤＮＡクーロンの１９０７塩基対の配列が示される。ＨＮ遺伝子の翻訳開始停止は、ＤＮＡ配列の下のアミノ酸翻訳によって示される。
図８Ａ−８Ｄ
相同性ベクター538-46.26におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図５Ａには、プラスミド538-46.26に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図8Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図8Ｃには、連結部ＣおよびＤに位置する配列が示され、および図８Ｄには、連結部Ｅに位置する配列（配列認識番号３１、３２、３４、３７および４０）が示される。図８Ｂおよび８Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。該合成リインカー配列には、太棒で下線が施されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。  下記の略字が使用されている：  豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ），血球凝結素ノイラミダーゼ（ＨＮ）、初期プロモーター（ＥＰ１）、後期プロモーター１（ＬＰ１）、後期プロモーター２（ＬＰ２）、ラクトースオペロンＺ遺伝子（lacZ）、および大腸菌（Ｅ．coli）。
【００１８】
図９Ａ−９Ｃ
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１０および相同性ベクター561-36.26におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図９Ａには、プラスミド561-36.26に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図9Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図9Ｃには、連結部ＣおよびＤに位置する配列(配列認識番号４７、４８、４９、５０）が示される。図９Ｂおよび９Ｃには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、  各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。  下記の略字が使用されている：  豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、大腸菌（Ｅ．coli）、チミンキナーゼ（ＴＫ）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），塩基対（ＢＰ）。
【００１９】
図１０Ａ−１０Ｄ
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１１および相同性ベクター570-91.21におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図10Aには、プラスミド570-91.21に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図10Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図10Cには、連結部Ｃに位置する配列がおよび図１０Ｄには、連結部１０Ｄおよび１０Ｅに位置する配列（配列認識番号５１、５２、５３、５４、５５）が示される。
図１０Ｂから１０Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。  下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成初期プロモータ２（ＥＰ２）（配列認識番号４５），ｇＩＩＩ（ｇＣ）、塩基対（ＢＰ）。
【００２０】
図１１Ａ−１１Ｄ
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１２および相同性ベクター570-91.41におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図11Aには、プラスミド570-91.41に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図11Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図11Cには、連結部Ｃに位置する配列がおよび図11Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列（配列認識番号５6、５7、５8、５9、  ６０）が示される。
図１１Ｂから１１Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。  下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）（配列認識番号４３），ｇＩＩＩ（ｇＣ）、塩基対（ＢＰ）。
【００２１】
図１２Ａ−１２Ｄ：
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１３および同ベクター570-91.64におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図12Aには、プラスミド570-91.64に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図12Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図12Cには、連結部Ｃに位置する配列が、および図1２Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列（配列認識番号６１、６２、６３、６４、６５）が示される。１２Ｂから１２Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。  下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモーター２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）(配列認識番号４４），ｇＩＩＩ（ｇＣ）、塩基対（ＢＰ）。
【００２２】
図１３Ａ−１３Ｄ：
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１４および同ベクター599-65.25におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図13Aには、プラスミド599-65.25に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図13Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図13Cには、連結部Ｃに位置する配列が、および図13Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列（配列認識番号６６、６７、６８、６９、７０）が示される。１３Ｂから１３Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。  下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、伝染性咽喉気管炎ウイルス（ＩＬＴ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、糖蛋白Ｇ（ｇＧ）、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。
【００２３】
図１４Ａ−１４Ｄ
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１６および同ベクター624-20.1CにおけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図14Aには、プラスミド624-20.1Cに会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図14Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図14Cには、連結部Ｃに位置する配列が、および図14Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列（配列認識番号71.、72、73, 74および75）が示される。１４Ｂから１４Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。  下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、伝染性咽喉気管炎ウイルス（ＩＬＴ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、糖蛋白Ｉ（ｇＩ）、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。  
図１５Ａ−１５Ｄ
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１７および相同性ベクター614-83.18におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図15Aには、プラスミド614--83.18に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図15Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図15Cには、連結部Ｃに位置する配列が、および図15Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列が示される。１５Ｂから１５Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。  下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、伝染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、糖蛋白Ｇ（ｇＧ）、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。
【００２４】
図１６
組替えＳＰＶに感染した細胞の溶融物のポリクローナル・ゴート抗ＰＲＶｇIII（ｇＣ）によるウエスタンブロット。レーン（Ａ）Ｓ−ＰＲＶ−００２（合衆国特許第4,877,737,  1989年10月31日提出）に感染した細胞の溶融物、（Ｂ）既染色分子量マーカー、（Ｃ）偽感染ＥＭＳＫ細胞溶融物、（Ｄ）Ｓ−ＳＰＶ−００３に感染した細胞の溶融物、（Ｅ）Ｓ−ＳＰＶ−００８に感染した細胞の溶融物、（Ｆ）Ｓ−ＳＰＶ−０１１感染した細胞の溶融物、（Ｇ）Ｓ−ＳＰＶ−０１２に感染した細胞の溶融物、（Ｈ）Ｓ−ＳＰＶ−０１３に感染した細胞の溶融物。細胞溶融物は、”感染細胞溶融物の調製”に記載されたように調製された。全溶融物サンプルの約１／５を、各レーンに搭載した。
【００２５】
図１７：
5.6キロ塩基対Ｈind III  M豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ断片を示すマップ。  オープンリーデイングフレーム（ＯＲＦ）は、各オープンリーデイングフレームにおけるアミノ酸コードの数と共に示される。豚痘ウイルスのＯＲＦｓは、ワクシニアウイルスＯＲＦｓと著しい配列の同一性を示し、ワクシニアウイルスの命名法(５６および５８)によってラベルされている。Ｉ４ＬＯＲＦ(配列認識番号１９６)は、リボヌクレオチド・リダクターゼの大型ユニット（５７）とアミノ酸配列相同性を示し、また０１ＬＯＲＦ（配列認識番号１９３）は、ある真核生物の翻訳調節蛋白（１３）に特徴的なロイシン・ジッパー・モチーフに対するアミノ酸配列相同性を示す。Ｉ４ＬＯＲＦ中のＢｇｌII部位および０１ＬＯＲＦ中のＡｃｃＩ部位は、ブタポックスゲノムの非必須領域中ヘの外来ＤＮＡの挿入部位である。相同性ベクター738-94.4は、ヌクレオチド１６７９から２４５２(配列番号１８９)のＳＰＶ ＤＮＡの欠損を含む。底部の黒棒は、ＤＮＡ配列が既知である領域を示し、配列番号１８９および１９５を示す。制限部位ＡｃｃＩ，ＢｇｌII , およびHind IIIの位置が示されている。Ｉ３ＬＯＲＦ（配列認識番号１９０）、Ｉ２ＬＯＲＦ(配列認識番号１９１)、Ｅ１ＯＲ ＯＲＦ（配列認識番号１９４）が示される。配列認識番号２２１は、Hind III M断片の完全な５７８５塩基対配列を含んでいる。ＳＰＶHindIII M断片内のオープンリーデイングフレームは、部分的なＩ４ＬＯＲＦ（４４５ＡＡ；ヌクレオチド２から１３３６）；Ｉ３ＬＯＲＦ（２７５ＡＡ；ヌクレオチド１３８７から２２１１）；Ｉ２ＬＯＲＦ（７５ＡＡ；ヌクレオチド２２１５から２４３９）；Ｉ１ＬＯＲＦ（３１３ＡＡ；ヌクレオチド２４４３から３３８１）；０１ＬＯＲＦ（６７７ＡＡ；ヌクレオチド３５２０から５５５０）；部分的Ｅ１ＯＲ ＯＲＦ（６４ＡＡ；ヌクレオチド５７８７−５５９６）。
【００２６】
図１８Ａ−１８Ｄ： 
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３４および相同性ベクター723-59A9.22におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図18Aには、プラスミド723-59A9.22に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図18Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示され、図18Cには、連結部Ｃに位置する配列が、および図18Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列が示される。１８Ｂから１８Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。  下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、馬インフルエンザウイルス（ＥＩＶ）．大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ノイラミダーゼ（ＮＡ）、プラハ（ＰＲ），ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。
【００２７】
図１９Ａ−１９Ｄ： 
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１５および相同性ベクター727-54.60におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図19Aには、プラスミド727-54.60に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図19Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示され、図19Cには、連結部Ｃに位置する配列が、および図19Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列が示される。１9Ｂから１9Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。  下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、糖蛋白Ｂ（ｇＢ）、塩基対（ＢＰ）。
【００２８】
図２０Ａ−２０Ｄ：
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３１および相同性ベクター727-67.18におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図20Aには、プラスミド727-67.18に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図20Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示され、図20Cには、連結部Ｃに位置する配列が、および図20Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列が示される。20Ｂから20Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。  下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成初期プロモータ1後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、抗原（Ａｇ）塩基対（ＢＰ）。
【００２９】
図２１Ａ−２１Ｄ： 
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３３および相同性ベクター732-18.4におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図21Aには、プラスミド732-18.4に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図２１Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示され、図２１Cには、連結部Ｃに位置する配列が、および図２１Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列が示される。２１Ｂから２１Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。  下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、馬インフルエンザウイルス（ＥＩＶ），ノイラミダーゼ（ＮＡ），アラスカ（ＡＫ）ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。
【００３０】
図２２Ａ−２２Ｃ： 
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３６および相同性ベクター741-80.3におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図22Aには、プラスミド741-80.3に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図22Ｂには、断片間の連結部Ａ, BおよびＣに位置する配列が示され、図22Cには、連結部Ｄ，Ｅ，およびＦに位置する配列が示される。22Ｂおよび22Ｃには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。  下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）．大腸菌（Ｅ．coli）、ヒトサイトメガロウイルス即時初期（ＨＣＭＶＩＥ）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポリアデニレーション部位、塩基対（ＢＰ）。
【００３１】
図２３Ａ−２３Ｄ： 
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３５および相同性ベクター741-84.14おけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図23Aには、プラスミド741-84.14に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図23Ｂには、断片間の連結部Ａ,およびＢにおける配列が示され、図23Cには、連結部Ｃに位置する配列が示され、また図23Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列が示される。23Ｂから23Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず、該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。  下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）．大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、インターロイキンー２（ＩＬ−２）、糖蛋白Ｘ（ｇＸ）ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、配列（ｓｅｑ）、塩基対（ＢＰ）。
【００３２】
図２４Ａ−２４Ｄ： 
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３８および相同性ベクター744-34.おけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図2４Aには、プラスミド744-34に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図2４Ｂには、断片間の連結部Ａ,およびＢにおける配列が示され、図2４Cには、連結部Ｃに位置する配列が示され、また図2４Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列が示される。２４Ｂおよび２４Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。  下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、馬ヘルペスウイルス・タイプ１（ＥＨＶ−１）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、糖蛋白Ｂ（ｇＢ）、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。
【００３３】
図２５Ａ−２５Ｄ： 
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３９および相同性ベクター744-38におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図２５Aには、プラスミド744-38に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図２５Ｂには、断片間の連結部Ａ,およびＢにおける配列が示され、図２５Cには、連結部Ｃに位置する配列が示され、また図2５Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列が示される。２５Ｂから２５Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、馬ヘルペスウイルス・タイプ１（ＥＨＶ−１）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、糖蛋白Ｄ（ｇＤ），ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。
【００３４】
図２６Ａ−２６Ｄ： 
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４２および相同性ベクター751-07A1におけるＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図には751-07A1に会合したＤＮＡ断片の配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示されている。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。図２６Ａから２６Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識番号１９７)、（配列認識番号１９８）Ｃ（配列認識番号１９９）、Ｄ(配列認識番号２００)およびＥ(配列認識番号２０１)に位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、チキン・インターフェロン（ｃＩＦＮ），大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。
【００３５】
図２７Ａ−２７Ｄ：
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４３よび相同性ベクター751-56A1におけるＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド751-56A1に会合したＤＮＡ断片の配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示されている。図２７Ａから２７Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識番号202)、（配列認識番号203）Ｃ（配列認識番号204）、Ｄ(配列認識番号205)およびＥ(配列認識番号206)に位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず幾つかの遺伝子コード領域を結合するために使用される合成リンカー配列、および調節要素もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、チキン・骨髄単球性成長ファクター（ｃＭＧＦ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰＥ２ＥＰ２）、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。
【００３６】
図２８Ａ−２８Ｄ： 
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４３よび相同性ベクター752-22.1におけるＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド752-22.1に会合したＤＮＡ断片の配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示されている。図２８Ａから２８Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識番号207)、（配列認識番号208）Ｃ（配列認識番号209）、およびＤ(配列認識番号210)位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。
【００３７】
図２９Ａ−２９Ｂ：
図２９Ａ：  ＳＰＶ ＨｉｎｄIII N断片およびＳＰＶ ＨｉｎｄIIIＭ断片の一部における制限エンドヌークレアーゼマップおよびオープンリーデイングフレーム。  豚痘ウイルスHind III N  およびHind III MゲノムＤＮＡの非必須部位への外来遺伝子の挿入物には、EcoR V部位 (S-SPV-060)、SnaBI部位 (S-SPV-061)、Hind III N(S-SPV-062)におけるBgl II部位、Hind III M ( S-SPV-047)におけるBgl II部位がある。Ｉ７ＬＯＲＦ(配列認識番号２３０)およびＩ４ＬＯＲＦ（配列認識番号２３１）ヘの外来遺伝子の挿入物によって、全オープンリーデングフレームは、豚痘ウイルスの複製に非必須であること、および外来遺伝子の挿入に最適である事が示唆される。外来遺伝子のその他の挿入部位には、二つのHind III部位およびAvaIおよびBamHIがあるがこれに限定されない。
【００３８】
図２９Ｂ：ＳＰＶ ＨｉｎｄIIIＫ断片における制限エンドヌークレアーゼマップおよびオープンリーデイングフレーム。  豚痘ウイルスHind IIIＫ  ゲノムＤＮＡの非必須部位に挿入された外来遺伝子の挿入物には、EcoRＩ部位 (S-SPV-059)があるがこれには限定されない。 ＳＰＶHind IIIＫ断片の3.2kB領域内では、３つのオープンリーデイングフレームが確認されている。Ｂ１８ＲＯＲＦ(配列認識番号２２８)への外来遺伝子の挿入によって、全オープンリーデングフレームは、豚痘ウイルスの複製に非必須であること、および外来遺伝子の挿入に最適である事が示唆される。また、Ｂ４ＲＯＲＦ（配列認識番号２２９）が外来遺伝子の挿入部位として確認された。ＳＰＶＢ１８ＲＯＲＦは、ワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｂ１８ＲＯＲＦと相同性である。ＳＰＶＢ１８ＲＯＲＦは、ラビット繊維腫ウイルス（ＲＦＶ）の７７.2kd蛋白よりも相同性である。ＳＰＶＢ４ＲＯＲＦは、ワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｂ４ＲＯＲＦと相同性である。ＳＰＶＢ４ＲＯＲＦは、ラビット繊維腫ウイルス（ＲＦＶ）のＴ５蛋白とより相同性である。確認されたオープンリーデイングフレームは、ＳＰＶＨｉｎｄIII K断片の約３２００塩基対の内にある。ＳＰＶHind III K断片の残りの約３５００塩基対は、先にシークエンスされている（Ｒ．Ｆ．Massung et al. Virology 197, 511-528 (1993)）。
図３０Ａ−３０Ｃ:
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４７および相同性ベクター779-94.31におけるＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド779-94.31に会合したＤＮＡ断片の配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示されている。図30Ａから30Ｃには、断片間の連結部Ａ(配列認識番号：)、（配列認識番号：）Ｃ（配列認識番号：）、Ｄ(配列認識番号：)およびＥ（配列認識番号：）に位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポックス合成後期プロモータ  １（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）。
【００３９】
図３１Ａ−３１Ｄ:
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５２および相同性ベクター789-41.7におけるＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド789-41.7に会合したＤＮＡ断片の配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示されている。図３１Ａ−３１Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識番号：)、（配列認識番号：）Ｃ（配列認識番号：）、Ｄ(配列認識番号：)、Ｅ（配列認識番号：）およびＦ（配列認識番号：）に位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、ポックス合成後期プロモータ  １（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）。
【００４０】
図３２Ａ−３２Ｄ:
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５３および相同性ベクター789-41.27におけるＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド789-41.27に会合したＤＮＡ断片の配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示されている。図３２Ａ−３２Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識番号：)、（配列認識番号：）Ｃ（配列認識番号：）、Ｄ(配列認識番号：)、Ｅ（配列認識番号：）, Ｆ（配列認識番号：）およびＧ（配列認識番号：）に位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、ポックス合成後期プロモータ  １（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）。
【００４１】
図３３Ａ−３３Ｄ:
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５４および相同性ベクター789-41.47におけるＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド789-41.47に会合したＤＮＡ断片の配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示されている。図３３Ａ−３３Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識番号：)、（配列認識番号：）Ｃ（配列認識番号：）、Ｄ(配列認識番号：)、Ｅ（配列認識番号：）, Ｆ（配列認識番号：）およびＧ（配列認識番号：）に位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、ポックス合成後期プロモータ  １（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）。
【００４２】
図３４Ａ−３４Ｅ:
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５5および相同性ベクター789-41.73におけるＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド789-41.73に会合したＤＮＡ断片の配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示されている。図３4Ａ−３4Ｅは、断片間の連結部Ａ(配列認識番号：)、（配列認識番号：）Ｃ（配列認識番号：）、Ｄ(配列認識番号：)、Ｅ（配列認識番号：）, Ｆ（配列認識番号：）、Ｇ（配列認識番号：）およびＨ（配列認識番号：）に位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。(  )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、ポックス合成後期プロモータ  １（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）。
【発明の詳細な説明】
【００４３】
本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindIIIＫ断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。
【００４４】
一態様において、この組み換え豚痘ウイルスは、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII Ｎ断片における略２ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片内に挿入された前記外来ＤＮＡを含んでいる。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindIII N断片における略２ＫｂのHindIII〜BamHI亜断片内のオープンリーディングフレーム内に挿入される。他の態様において、該オープンリーディングフレームはＩ７Ｌ遺伝子をコードする。
【００４５】
他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略２ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片内におけるEcoRV制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略2.0ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片内におけるSnaBI制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。
【００４６】
他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII N断片における略1.2ＫｂのBamHI 〜HindIII亜断片内に挿入される。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindIII N断片の略1.2ｋＢのBamHI〜HindIII亜断片内のオープンリーディングフレーム中に挿入される。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、Ｉ４Ｌ遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム中に挿入される。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記略1.2ｋＢのBamHI〜HindIII亜断片内のBglII制限エンドヌクレアーゼ内に挿入される。
【００４７】
本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindIII M断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。
【００４８】
一態様において、この組み換え豚痘ウイルスは、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII M断片における略２ＫｂのBglII 〜HindIII亜断片内に挿入された前記外来ＤＮＡ配列を有する。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII M断片の略２ＫｂのBglII 〜HindIII亜断片内のオープンリーディングフレーム中に挿入される。他の態様において、該オープンリーディングフレームは、Ｏ１Ｌ遺伝子をコードする。好ましい態様において、前記外来遺伝子は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略２ｋＢのBglII〜HindIII亜断片内におけるBglII制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。
【００４９】
他の態様において、前記組み換え豚痘ウイルスは、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIIIＭ断片における略3.6ｋＢの大きい方のHindIII〜BglII亜断片内に挿入される。他の態様において、前記外来配列は、略3.6ｋＢの大きい方のHindIII〜BglII亜断片内のオープンリーディングフレーム中に挿入される。他の態様において、このオープンリーディングフレームは、Ｉ４Ｌ遺伝子をコードする。
【００５０】
一つの態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、前記HindIIIＭ断片の非必須のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に挿入される。ＯＲＦの例には、Ｉ４Ｌ、Ｉ２Ｌ、Ｏ１ＬおよびＥ１０Ｌが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
他の態様において、前記組み換え豚痘ウイルスの外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII M断片における略２ＫｂのHindIII〜BglII亜断片内に挿入される。好ましい態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記略２ＫｂのHindIII〜BglII亜断片内に位置するBglII部位内に挿入される。
【００５２】
他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII M断片における大きい方の HindIII〜BglII亜断片内に挿入される。好ましい態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記大きい方のHindIII〜BglII亜断片内に位置する AccI部位内に挿入される。
【００５３】
他の態様において、前記組み換え豚痘ウイルスは、更に、豚痘ウイルスチミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフレーム中に挿入された外来ＤＮＡ配列を具備する。一つの態様において、この外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスチミジンキナーゼをコードしているオープンリーディングフレーム内に位置したＮｄｅＩ部位中に挿入される。
【００５４】
本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindIIIＫ断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスと提供する。
【００５５】
一つの態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII K断片における略3.2Ｋｂの亜断片内に挿入される。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII K断片における略3.2Ｋｂの亜断片内のオープンリーディングフレーム中に挿入される。他の態様において、該オープンリーディングフレームはＢ１８Ｒ遺伝子をコードする。他の態様において、該オープンリーディングフレームはＢ４Ｒ遺伝子をコードする。
【００５６】
本発明の目的において、「複製できる組み換え豚痘ウイルス」とは、当業者に周知の組み換え法、例えば、＜材料および方法＞の項の組み換えＳＰＶを作成するための相同組み換え法に記載した方法によって作成され、組み換え豚痘ウイルスの複製に不可欠の遺伝子物質を欠失されていない生の豚痘ウイルスである。
【００５７】
本発明の目的において、「豚痘ウイルスの複製に不可欠でない挿入部位」とは、ＤＮＡの配列がウイルスの複製のために必要とされない豚痘ウイルスゲノムにおける位置、例えば、複合タンパク結合配列、逆転写酵素または必須糖タンパクをコードする配列、パッケージングに必要なＤＮＡ配列等である。
【００５８】
本発明の目的において、「プロモータ」とは、外来ＲＮＡポリメラーゼが付着し、そこで外来ＲＮＡの複製が開始されるＤＮＡ分子上の特定のＤＮＡ配列である。
【００５９】
本発明の目的において、「オープンリーディングフレーム」とは、ＲＮＡに転写されてアミノ酸配列に翻訳されるコドンを含み、且つ終始コドンを含まないＤＮＡ切片である。
【００６０】
加えて、本発明は、当該組み換え豚痘ウイルスが導入される動物中で複製できる組み換え豚痘ウイルス（ＳＰＶ）であって、豚痘ウイルスＤＮＡと、前記組み換え豚痘ウイルスが導入される動物には本来存在しないＲＮＡをコードする外来ＤＮＡとを具備し、該外来ＤＮＡは、豚痘ウイルスの複製に不可欠ではない部位で豚痘ウイルスＤＮＡ中に挿入されており、且つプロモータの制御下にある組み換え豚痘ウイルスを提供する。
【００６１】
本発明は更に、ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ配列または外来ＲＮＡを提供する。好ましくは、このポリペプチドは動物において抗原性である。好ましくは、この抗原性ポリペプチドは、10個を越えるアミノ酸がペプチド結合によって結合された線形ポリマーであり、動物を刺激して抗体を産生させる。
【００６２】
本発明は更に、検出マーカーであるポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。好ましくは、この検出マーカーはポリペプチドである大腸菌βガラクトシダーゼまたは大腸菌βグルクロニダーゼである。好ましくは、大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡの挿入部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIIIＭ断片内に位置するAccI制限エンドヌクレアーゼである。好ましくは、この組み換え豚痘ウイルスは、Ｓ−ＳＰＶ−００３（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2335）と称するものである。このＳ−ＳＰＶ−００３豚痘ウイルスは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2335の下に、アメリカ合衆国郵便番号20852メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション特許カルチャー寄託施設に寄託されている。
【００６３】
本発明の目的において、「検出マーカーであるポリペプチド」には、ポリペプチドの形の二量体、三量体および四量体が含まれる。大腸菌βガラクトシダーゼは、四つのポリペプチドまた亜はモノマーサブユニットで構成される四両体である。
【００６４】
本発明は更に、複製可能な組み換え豚痘ウイルスであって、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパク５０（ｇＤ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇII（ｇＢ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇIII（ｇＣ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパクＨ、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパクＥ、遺伝性胃腸炎（ＴＧＥ）糖タンパク１９５、遺伝性胃腸炎（ＴＧＥ）マトリックスタンパク、豚ロタウイルス糖タンパク３８、豚パルボウイルスキャプシドタンパク、サープリナ・ヒドジセンテリエ(Serpulina hydodysenteriae)防御抗原、ウシ・ウイルス性下痢（ＢＶＤ）糖タンパク５５、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ、豚ｆｌｕ赤血球凝集素、もしくは豚ｆｌｕノイラミニダーゼである抗原性ポリペプチド、またはこれらに由来する抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含んだ組み換え豚痘ウイルスを提供する。好ましくは、該抗原性ポリペプチドは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパク５０（ｇＤ）である。好ましくは、該抗原性ポリペプチドは、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）赤血球凝集素−ノイラミニダーゼである。
【００６５】
本発明は更に、複製可能な組み換え豚痘ウイルスであって、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＤ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスは、大腸菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むように、更に加工することができる。ＰＲＶｇ５０（ｇＤ）および大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚痘ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIIIＭ断片内のAccI部位である。好ましくは、この組み換え豚痘ウイルスは、Ｓ−ＳＰＶ−００８（ＡＴＣＣ受付番号2339）と称するものである。このＳ−ＳＰＶ−００８豚痘ウイルスは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2339の下に、アメリカ合衆国郵便番号20852メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション特許カルチャー寄託施設に寄託されている。
【００６６】
本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩＩ（ｇＣ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスは、大腸菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むように、更に加工することができる。ＰＲＶ  Ｃおよび大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚痘ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIIIＭ断片内のAccI部位である。好ましくは、この組み換え豚痘ウイルスは、Ｓ−ＳＰＶ−０１１、Ｓ−ＳＰＶ−０１２、または Ｓ−ＳＰＶ−０１３と命名されたものである。Ｓ−ＳＰＶ−０１３と命名された豚痘ウイルスは、1993年６月16日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2418の下に、アメリカ合衆国郵便番号20852メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション特許カルチャー寄託施設に寄託された。
【００６７】
本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇＢ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスは、大腸菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むように、更に加工することができる。ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）および大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚痘ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIIIＭ断片内のAccI部位である。好ましくは、この組み換え豚痘ウイルスはＳ−ＳＰＶ−０１５（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2466）と命名されたものである。このＳ−ＳＰＶ−０１５豚痘ウイルスは、1994年７月22日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2466の下に、アメリカ合衆国郵便番号20852メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション特許カルチャー寄託施設に寄託された。
【００６８】
本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＤ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩＩ（ｇＣ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスもまた、大腸菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むように、更に加工することができる。ＰＲＶｇ５０（ｇＤ）、ＰＲＶｇＩＩＩ（ｇＣ）および大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚痘ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIIIＭ断片内のAccI部位である。
【００６９】
本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＤ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇＢ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスもまた、大腸菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むように、更に加工することができる。ＰＲＶｇ５０（ｇＤ）、ＰＲＶｇＩＩ（ｇＢ）および大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚痘ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIIIＭ断片内のAccI部位である
本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＣ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇＢ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスもまた、大腸菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むように、更に加工することができる。ＰＲＶｇＩＩＩ（ｇＣ）、ＰＲＶｇＩＩ（ｇＢ）および大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚痘ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIIIＭ断片内のAccI部位である
本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＤ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩＩ（ｇＣ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇＢ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスもまた、大腸菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むように、更に加工することができる。
【００７０】
ＰＲＶｇ５０（ｇＤ）、ＰＲＶｇＩＩＩ（ｇＣ）、ＰＲＶｇＩＩ（ｇＢ）および大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚痘ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIIIＭ断片内のAccI部位である
本発明は更に、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）赤血球凝集素-ノイラミニダーゼをコードするＲＮＡをコードする外来ＤＮＡを含み、更に検出マーカーであるポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含む、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスはＳ−ＳＰＶ−００９（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2344）と命名されたものである。このＳ−ＳＰＶ−００９豚痘ウイルスは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2344の下に、アメリカ合衆国郵便番号20852メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション特許カルチャー寄託施設に寄託されている。
【００７１】
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主子中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。このような抗原性ポリペプチドの例は、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルス糖タンパクＥおよび糖タンパクＧである。本発明の好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０１７およびＳ−ＳＰＶ−０１９と称する組み換え豚痘ウイルスである。
【００７２】
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、感染性咽頭気管炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主子中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。このような抗原性ポリペプチドの例は、感染性咽頭気管支炎ウイルス糖タンパクＧおよび糖タンパクＩである。本発明の好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０１４およびＳ−ＳＰＶ−０１６と称する組み換え豚痘ウイルスである。
【００７３】
上記組み換え豚痘ウイルスの一つの態様において、前記外来ＤＮＡ配列はサイトカインである。他の態様において、該サイトカインはニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）またはニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）である。サイトカインには下記のものが含まれるが、これらに限定されるものではない：即ち、形質転換増殖因子ベータ、繊維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、血管内皮増殖因子、インターロイキン１、ＩＬ−１受容体拮抗剤、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、ＩＬ−６可溶性受容体、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、アンジオジェニン、ケモカイネス(chemokines)、コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン、インターフェロンガンマ、ｃ−ｋｉｔリガンド、白血球阻害因子、オンコスタチンＭ(oncostatin M)、プライオトロピン(pleiotrophin)、分泌性は血球プロテアーゼ阻害剤、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、および可溶性ＴＮＦ受容体である。これらのサイトカイン類はヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタまたは鳥類に由来するものである。このような組み換えウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０４２およびＳ−ＳＰＶ−０４３である。
【００７４】
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ヒト病原体由来の抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主子中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。
【００７５】
サイトカイン類を発現する組み換えＳＰＶは、単独で、もしくは疾病を起こす微生物のサイトカイン類または抗原遺伝子を含むワクチンと組み合わせて、免疫応答性を高めるために用いられる。
【００７６】
ヒトヘルペスウイルスから誘導されるヒト病原体の抗原性ポリペプチドには、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス表面およびコア抗原、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペスウイルス−２、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン-バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス−６、ヒト・ヘルペスウイルス−７、ヒト・インフルエンザ、麻疹ウイルス、ハンターンウイルス(Hantaan virus)、肺炎ウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ヒト呼吸器シンシチアウイルス、レトロウイルス、ヒトＴ細胞白血球ウイルス、狂犬病ウイルス、ムンプスウイルス、マラリア(Plasmodium falciparum)、百日咳菌、ジフテリア菌、発疹チフスリケッチア、ボレリア・ベルフドルフェリ(Borrelia berfdorferi)、破傷風トキソイド、悪性腫瘍抗原が含まれるが、こられに限定されるものではない。
【００７７】
本発明の一態様において、組み換え豚痘ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパクをコードする外来ＤＮＡ配列を含んでいる。好ましくは、このような組み換えウイルスはＳ−ＳＰＶ−０３１と命名されたものである。
【００７８】
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主子において免疫を刺激することができるサイトカインをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。
【００７９】
本発明の一つの態様において、組み換え豚痘ウイルスは、ヒト・インターロイキン−２をコードする外来ＤＮＡ配列を含む。好ましくは、このような組み換えウイルスはＳ−ＳＰＶ−０３５と命名されたものである。
【００８０】
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ウマ病原体から誘導された抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。
【００８１】
ウマ病原体の抗原性ポリペプチドは、ウマインフルエンザウイルスまたはウマヘルペスウイルスから誘導することができる。一態様において、この抗原性ポリペプチドは、ウマインフルエンザ・ノイラミニダーゼまたは赤血球凝集素である。このような抗原性ポリペプチドの例は、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／プラーク５６ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー９２ノイラミニダーゼ、ウマ・ヘルペスイウルス１型糖タンパクＢ、ウマ・ヘルペスイウルス１型糖タンパクＤ、ストレプトコッカス・エクイ(Streptocoddus equi)、ウマ感染性貧血ウイルス、ウマ脳炎ウイルス、ウマ・ライノウイルス、およびウマ・ロタウイルスである。このような組み換え豚痘ウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０３３、Ｓ−ＳＰＶ−０３４、Ｓ−ＳＰＶ−０３８、Ｓ−ＳＰＶ−０３９およびＳ−ＳＰＶ−０４１と命名されたものである。
【００８２】
更に、本発明は抗原性ポリペプチドを提供する。該抗原性ポリペプチドには豚コレラウイルスｇＥ１、豚コレラウイルスｇＥ２、豚インフルエンザウイルス赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、マトリックスおよび核タンパク、仮性狂犬病ウイルスｇＢ、ｇＣおよびｇＤ、並びにＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７からなる群から誘導される組み換え豚痘ウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ウシ呼吸器シンシチアウイルスまたはウシ・パラインフルエンザウイルスから誘導された抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。
【００８４】
例えば、上記の抗原性ポリペプチドは、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルスｇＥ、ウシ呼吸器シンシチアウイルス、ウマ病原体、ウマインフルエンザウイルス、齲歯呼吸器シンシチアウイルス付着タンパク（ＢＲＳＶ  Ｇ）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス融合タンパク（ＢＲＳＶ  Ｆ）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス核キャプシドタンパク（ＢＲＳＶ  Ｎ）、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型融合タンパクおよびウシ・パラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイラミニダーゼから誘導することができる。好ましい態様において、この組み換え豚痘ウイルスはＳ−ＳＰＶ−０４５と命名されたものである。
【００８５】
ウシ呼吸器シンシチアウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含む組み換えウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０２０、Ｓ−ＳＰＶ−０２９、およびＳ−ＳＰＶ−０３０と命名されたものである。また、ウシ・パラインフルエンザウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含む組み換えウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０２８と命名されたものである。
【００８６】
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ウシ・ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）糖タンパク４８または糖タンパク５３をコードし、また前記外来ＤＮＡ配列は、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。このようなウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０３２、Ｓ−ＳＰＶ−０４０、Ｓ−ＳＰＶ−０４９、およびＳ−ＳＰＶ−０５０と命名されたものである。
【００８７】
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、感染性嚢症ウイルスから誘導される抗原性ポリペプチドをコードし、また前記外来ＤＮＡ配列は、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。このような抗原性ポリペプチドの例は、感染性嚢症ウイルスポリタンパクおよびＶＰ２である。このようなウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０２６、およびＳ−ＳＰＶ−０２７と命名されたものである。
【００８８】
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が抗原性ポリペプチドをコードする組み換え豚痘ウイルスを提供する。該抗原性ポリペプチドには下記のものが含まれるが、これらに限定されることはない：  即ち、ＭＤＶ  ｇＡ、ＭＤＶ  ｇＢ、ＭＤＶ  Ｄ、ＮＤＶ  ＨＮ、ＮＤＶ  Ｆ、ＩＬＴ  ｇＢ、
ＩＬＴ  ｇＩ、ＩＬＴ  ｇＤ、ＩＢＤＶ  ＶＰ２、ＩＢＤＶ  ＶＰ３、
ＩＢＤＶ  ＶＰ４、ＩＢＤＶポリタンパク、ＩＢＶスパイク、ＩＢＶマトリックス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、鳥類パラミクソウイルス、鳥類ロタウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、サルモネラｓｐｐ．、大腸菌、パスツレラｓｐｐ．、百日咳菌ｓｐｐ．(Bordetella spp.)、エイメリアｓｐｐ．(Eimeria  spp.)、ヒストモナスｓｓｐ．、トリコモナスｓｓｐ．、家禽線虫、条虫、吸虫、鳥類ダニ／シラミ、鳥類原生動物である。
【００８９】
本発明は更に、前記挿入された外来ＤＮＡ配列がプロモータの制御下にある組み換え豚痘ウイルスを提供する。一態様において、該プロモータは豚痘ウイルスプロモータである。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、内因性の上流豚痘ウイルスプロモータの制御下にある。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、異種上流プロモータの制御下にある。
【００９０】
本発明の目的において、前記プロモータには、合成豚痘ウイルスプロモータ、ポックス合成後期プロモータ１、ポックス合成後期プロモータ２、初期プロモータ２、ポックス０１Ｌプロモータ、ポックスＩ４Ｌプロモータ、ポックスＩ３Ｌプロモータ、ポックスＩ２Ｌプロモータ、ポックスＩ１Ｌプロモータ、ポックスＥ１０Ｒプロモータ、ＰＲＶ  ｇＸ、ＨＳＶ−１アルファ４、ＨＣＭＶ即時型初期、ＭＤＶ  ｇＡ、ＭＤＶ  ｇＢ、ＭＤＶ  ｇＤ、ＩＬＴ  ｇＢ、ＢＨＶ−1.1  ＶＰ８およびＩＬＴ  ｇＤが含まれるが、これらに限定されるものではない。別のプロモータは、当業者に周知の方法、例えば、材料と方法の項における「合成ポックスウィルスプロモーターの構築のための基本的手法」に記載した方法によって作成される。
【００９１】
本発明は、豚痘ウイルスのゲノムＤＮＡ中に外来ＤＮＡを挿入することにより組み換え豚痘ウイルスを製造するための、相同性ベクターを提供する。
【００９２】
この相同性ベクターは、当該組み換え豚痘ウイルスが導入される動物には本来的に存在しない実質的に二本鎖の外来ＤＮ（ＲＮＡ）配列からなる二本鎖ＤＮＡ分子を具備し、該外来二本鎖ＤＮＡの一端には、豚痘ウイルスの複製に不可欠でないゲノムＤＮＡの一方の側に位置する前記ウイルスゲノムに対して相同性である二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡを有し、前記外来ＤＮＡの他端には、前記豚痘ウイルスゲノムの他方の側に位置する前記ウイルスゲノムに対して相同性である二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡを有する。好ましくは、前記ＲＮＡはポリペプチドをコードする。
【００９３】
本発明の他の態様において、上記相同性ベクターの二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、HindIIIＭ断片内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。他の対応において、上記相同性ベクターの二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、略２ｋＢのHindIII〜BglII亜断片内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。好ましい態様において、前記二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、このHindIII〜BglII亜断片の中に位置したBglII部位内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。
【００９４】
他の態様において、この二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、大きい方のHindIII〜BglII亜断片に含まれたオープンリーディングフレーム内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。好ましくは、該二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、大きい方のHindIII〜BglII亜断片に位置したAccI制限エンドヌクレアーゼ部位内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。
【００９５】
好ましい態様において、当該相同性ベクターは、752-29.33、751-07.A1、751-56.A1、751-22.1、746-94.1、767-67.3、738-94.4、および771-55.11と命名されたものである。
【００９６】
一つの態様において、前記ポリペプチドは検出マーカーである。好ましくは、検出マーカであるポリペプチドは、大腸菌βガラクトシダーゼである。
【００９７】
一つの態様において、前記ポリペプチドは動物において抗原性である。好ましくは、該抗原性ポリペプチドは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパク５０（ｇＤ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇII（ｇＢ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇIII（ｇＣ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパクＨ、遺伝性胃腸炎（ＴＧＥ）糖タンパク１９５、遺伝性胃腸炎（ＴＧＥ）マトリックスタンパク、豚ロタウイルス糖タンパク３８、豚パルボウイルスキャプシドタンパク、サープリナ・ヒドジセンテリエ(Serpulina hydodysenteriae)防御抗原、ウシ・ウイルス性下痢（ＢＶＤ）糖タンパク５５およびｇ４８、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ、豚ｆｌｕ赤血球凝集素、もしくは豚ｆｌｕノイラミニダーゼ、またはこれらに由来する。好ましくは、該抗原性ポリペプチドは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパク５０（ｇＤ）である。好ましくは、該抗原性ポリペプチドは、セルプリナ・ヒオディセンテリエ（Serpulina Hyodysenteriae)、口蹄疫ウイルス、豚これらウイルスｇＥ１およびｇＥ２、豚インフルエンザウイルス、アフリカ豚熱ウイルスまたはマイコプラズマ・ハイポニュモニエ、豚インフルエンザウイルス赤血球凝集素、ノイラミニダーゼおよびマトリックスおよび核タンパク、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７、およびＢ型肝炎ウイルス核タンパク、またはこれらから誘導されたものである。
【００９８】
本発明の一つの態様において、相同性ベクター中の二本鎖外来ＤＮＡ配列は、ヒト病原体から誘導された抗原性ポリペプチドをコードする。
【００９９】
例えば、ヒト病原体の抗原性ポリペプチドは、ヒト・ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペスウイルス−２、ヒト・サイトメガロウイルス、エプスタイン-バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス−６、ヒト・ヘルペスウイルス−７、ヒト・インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスからなる群から誘導される。更に、ヒト病原体の抗原性ポリペプチドは、
プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum)、ボルデテリア・ペルトゥスシス（Bordetelia pertussis）および悪性腫瘍からなる群から選択される、マラリアまたは悪性腫瘍に関連していてもよい。
【０１００】
本発明の一態様において、前記相同性ベクターにおける二本鎖外来ＤＮＡ配列は、ヒト免疫応答を刺激することができるサイトカインをコードする。一つの態様において、このサイトカインは、ニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）またはニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）である。例えば、該サイトカインはインターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン−１２、インターフェロン、顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子、およびインターロイキン受容体であることができるが、これに限定されるものではない。
【０１０１】
本発明の一態様において、相同性ベクターにおける前記二本鎖外来ＤＮＡ配列は、ウマ病原体から誘導された抗原性ポリペプチドをコードする。
【０１０２】
ウマ病原体の抗原性ポリペプチドは、ウマ・インフルエンザウイルスまたはウマ・ヘルペスウイルスから誘導することができる。このような抗原性ポリペプチドの例は、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／プラーク５６ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼ、ウマ・ヘルペスウイルス１型糖タンパクＢ、およびウマ・ヘルペスウイルス１型糖タンパクＤからなる群から選択される組み換え豚痘ウイルスである。
【０１０３】
本発明の一態様において、前記相同性ベクターの二本鎖外来ＤＮＡ配列は、ウシ呼吸器シンシチアウイルスまたはウシ・パラインフルエンザウイルスをコードする。
【０１０４】
例えば、該抗原性ポリペプチドは、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルスｇＥ、ウシ呼吸器シンシチアウイルス付着タンパク（ＢＲＳＶ Ｇ）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス融合タンパク（ＢＲＳＶ Ｆ）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス核キャプシドタンパク（ＢＲＳＶ  Ｎ）、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型融合タンパク、およびウシ・パラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイラミニダーゼから誘導される。
【０１０５】
本発明の一態様において、前記相同性ベクターの前記二本鎖外来ＤＮＡ配列は、感染性嚢症ウイルスから誘導される。このような抗原性ポリペプチドの例は、感染性嚢症ウイルスポリペプチドおよび感染性嚢症ウイルスＶＰ２、ＶＰ３またはＶＰ４である。
【０１０６】
本発明の目的において、「相同性ベクター」とは、豚痘ウイルスゲノムの特定の部位に外来ＤＮＡを挿入するために構築されたプラスミドである。
【０１０７】
本発明の一つの態様において、上記で述べた相同性ベクターの二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、豚痘チミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフレーム内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。好ましくは、該二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、豚痘チミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフレーム中に位置するNdeI制限エンドヌクレアーゼ内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。
【０１０８】
本発明は更に、上記の相同性ベクターであって、その外来ＤＮＡ配列が、前記外来ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモータの制御下にある相同性ベクターを提供する。該プロモータは、内因性豚痘ウイルスプロモータまたは外因性プロモータであることができる。プロモータには、合成ポックスウイルスプロモータ、ポックス合成後期プロモータ１、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２、ポックス０１Ｌプロモータ、ポックスＩ４Ｌプロモータ、ポックスＩ３Ｌプロモータ、ポックスＩ２Ｌプロモータ、ポックスＩ１ＬプロモータおよびポックスＥ１０Ｒプロモータ、ＰＲＶ  ｇＸ、ＨＳＶ−１・アルファ４、ＨＣＭＶ即時型初期、ＢＨＶ−１．１  ＶＰ８、感染性咽頭気管炎ウイルス糖タンパクＢ、感染性咽頭気管炎ウイルスｇＤ、マレック病ウイルス糖タンパクＡ、マレック病ウイルス糖タンパクＢ、マレック病ウイルス糖タンパクＤが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０９】
本発明は、Ｓ−ＳＰＶ−０４４、Ｓ−ＳＰＶ−０４６、Ｓ−ＳＰＶ−０４７、Ｓ−ＳＰＶ−０４８、Ｓ−ＳＰＶ−０５２、Ｓ−ＳＰＶ−０５１、Ｓ−ＳＰＶ−０５３、Ｓ−ＳＰＶ−０５４、Ｓ−ＳＰＶ−０５５、Ｓ−ＳＰＶ−０５６、Ｓ−ＳＰＶ−０５７、Ｓ−ＳＰＶ−０５８、Ｓ−ＳＰＶ−０５９、Ｓ−ＳＰＶ−０６０、Ｓ−ＳＰＶ−０６１、Ｓ−ＳＰＶ−０６２と命名された組み換え豚痘ウイルスを提供する。
【０１１０】
本発明は更に、有効免疫量の本発明の組み換え豚痘ウイルスと、適切なキャリアとを含有するワクチンを提供する。
【０１１１】
豚痘ウイルスのための適切なキャリアは当該技術において周知であり、タンパク、糖などが含まれる。このような適切なキャリアの一例は、安定化された加水分解タンパク、ラクトース等のような１以上の安定家財を含有する、生理学的にバランスされた培養培地である。
【０１１２】
本発明の目的において、「有効免疫量」の本発明の組み換え豚痘ウイルスは、１０３〜１０９ＰＦＵ／投与量の範囲である。
【０１１３】
本発明はまた、動物を免疫化する方法であって、該動物がヒト、豚、牛、ウマヤギ(caprine)またはヒツジ(ovine)である方法を提供する。本発明の目的において、この方法には、疾患を生じるウイルス（類）に対して動物を免疫化することが含まれ、これらウイルス（類）には、仮性狂犬病ういるす、遺伝性胃腸炎（ＴＧＥ）ウイルス、豚ロタウイルス、豚パルボウイルス、サープリナ・ヒドジセンテリエ(Serpulina hydodysenteriae)、ウシ・ウイルス性下痢（ＢＶＤ）ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、豚インフルエンザウイルス、ＰＲＲＳ、ウシ呼吸器シンシチアウイルス、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型、口蹄病ウイルス、豚コレラウイルス、アフリカ豚熱ウイルスまたはマイコプラズマ・ハイポニュモニエが含まれる。本発明の目的において、この免疫化方法にはまた、ヒト病原体、ウシ病原体、ウマ病原体、鳥類病原体に対して動物を免疫化することが含まれる。
【０１１４】
この方法には、動物に対して、有効免疫投与量の本発明のワクチンを投与することが含まれる。このワクチンは、当業者に周知の何れかの方法、例えば筋肉内注射、皮下注射、副空内注射または静脈内注射によって投与すればよい。或いは、このワクチンは、鼻腔内または経口的に投与してもよい。
【０１１５】
本発明はまた、豚が本発明のワクチン、特に組み換え豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−００８（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2339）を含有する実施例で予防接種されているかどうか、または天然に存在する野生型の仮性狂犬病ウイルスに感染しているかどうかを決定するために、豚を試験する方法を提供する。この方法は、試験すべき豚から適切な体液のサンプルを取得することと、該サンプル中において仮性狂犬病ウイルスに対する抗体の存在を検出する（このような抗体が存在しないことによって、前記豚が予防接種も感染もされていないことが示される）ことと、仮性狂犬病ウイルスに対する抗体が存在する豚について、前記サンプル中において、天然に存在する仮性狂犬病ウイルスに感染した豚の体液中には通常存在するが、予防接種された豚には存在しない仮性狂犬病ウイルス抗原に対する抗体が存在していないことを検出することにより、該豚が予防接種されていることまたは感染していないことが示されることとを具備する。
【０１１６】
本発明は、外来ＤＮＡ配列または遺伝子と共に挿入されると、診断試験として用い得る組み換えＳＰＶを提供する。一つの態様においては、ＦＩＶｅｎｖおよびｇａｇ遺伝子類、並びにＤ．イミティス(immitis)ｐ３９および２２ｋｄが、ＦＩＶによって起こされたネコ免疫不全を検出し、またＤ．イミティスによって起こされたイヌ糸状虫を検出するための診断試験に用いられる。
【０１１７】
本発明はまた、複製できる組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主細胞を提供する。一つの実施例において、宿主細胞は哺乳類細胞である。好ましくは、この哺乳類細胞はベロ細胞(Vero cell)である。好ましくは、前記哺乳類細胞はＥＳＫ−４細胞、ＰＫ−１５細胞またはＥＭＳＫ細胞である。
【０１１８】
本発明の目的において、「宿主細胞」とは、ベクターおよびその挿入物を増殖させるために用いられる細胞である。害細胞の感染は、当業者に周知の方法、例えば、＜材料と方法＞の項における「感染−トランスフェクション法」に記載した方法によって達成された。
【０１１９】
上記の組み換え豚痘ウイルスを構築し、選択し、精製するための方法は、下記の＜材料と方法＞の項で詳述する。
【実験の詳細】
【０１２０】
＜材料と方法＞
豚痘ウィルスストック試料の調製
豚痘ウィルス(SPV)試料はイスコーブの改良ダルベッコ培地(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) (IMDM)と2  mM のグルタミン,  100  units/mlの ペニシリン,  100 units/mlのストレプトマイシンを含むRPMI 1640 培地の1:1 混合溶液中(これらの構成成分はシグマ社もしくは相当の供給元から得られ，そしてこれ以後EMSK陰性培地(negative medium)と呼ぶ)でブタ胎児腎臓(EMSK)細胞， ESK-4細胞, PK-15細胞もしくはベロ細胞を，0.01 PFU/細胞の感染多重度で感染させることにより調製された。感染に先立ち，細胞単層は微量のウシ胎児血清を除去するためEMSK陰性培地を用いて１回洗浄された。その後，最初の接種原(10 cmのプレートに対しては0.5 ml； T175 cmのフラスコに対しては10ml)に含まれるSPVは，30分間ごとに繰り返し拡散させつつ(redistributed)，2時間細胞単層中へ吸収させられた。この期間の後，最初の接種原は規定の(recommended)容量まで完全EMSK培地(5 %のウシ胎児血清を加えたEMSK陰性培地)を加えられた。プレートは細胞変性の効果が完全となるまで，5% CO2中37 ℃でインキュベートされた。培地と細胞は回収され，50 mlのスクリューキャプ付き円錐管(conical screw cap tube)中で-70℃で凍結された。37℃で解凍されるとすぐに，ウィルスストックは1.0 ml バイアルに分注され，-70℃にて再凍結された。力価は通常約106  PFU/mlであった。
【０１２１】
SPV DNAの調製
豚痘ウィルスDNAを単離するために，T175 cm2 フラスコ中の集密的EMSK細胞単層は多重度0.1で感染させられ，細胞が100 %細胞変性の効果を示すまで4から6時間インキュベートされた。感染細胞はその後，培地中に細胞をこすり落とされ，臨床的な遠心分離(clinical centrifuge)にて300 rpm で５分間遠心分離することにより回収された。培地は別の容器に移され，細胞ペレットはリン酸緩衝溶液1.0ml(PBS: 水1L中に1.5 g のリン酸二ナトリウム,  0.2g の リン酸二水素カリウム, 0.8g の塩化ナトリウム 及び 0.2g の塩化カリウムを含む )(T175あたり)中で穏やかに再懸濁され，連続2回の凍結−解凍処理(-70℃から37℃まで)を受けた．最後の解凍の際，細胞(氷上で)は30秒間2回の超音波処理を施され，１回目と2回目の間には45秒間の冷却時間をおいた．その後，細胞の残骸はHB4ローターで4℃下，3000 rpm, 5分間の遠心分離(ソーヴァル  RC-5B 超高速遠心機)(Sorvall RC-5B superspeed centrifuge)により取り除かれた。上清中に存在するSPV ウィルス粒子(virions)は，その後SS34ローター(ソーヴァル)(Sorvall)で４℃下，15,000 rpm ，20分間の遠心分離によりペレット化され，10 mM のトリス（pH 7.5)中に再懸濁された。その後，この画分は36 %ショ糖の密度勾配(10mM トリス pH 7.5中でのw/v )中へ層状化され，SW41ローター(ベックマン) で4℃下，18,000 rpm, 60分間遠心分離(ベックマンL8-70M 超遠心機)(Beckman L8-70M ultracentrifuge)された。ウィルス粒子ペレットは10 mM のトリス緩衝溶液 pH7.5 中に再懸濁され，氷上で30秒間超音波処理を施された。この画分は20%から50%の連続的ショ糖密度勾配(continuous sucrose gradient)で層状化され，SW41ローターで4℃下，16,000 rpm, 60分間遠心分離された。その勾配の下方約4分の3に位置するSPVウィルス粒子のバンドが回収され，20%ショ糖溶液で希釈され，SW41ローター で4℃下，18,000 rpm, 60分間の遠心分離によりペレット化された。生成されたペレットは，その後微量のショ糖を除去するために10 mM のトリス緩衝溶液pH 7.5を用いて１回洗浄され，最終的に10 mM のトリス緩衝溶液pH 7.5中で再懸濁された。その後，EDTA, SDS及びプロテイナーゼ Kをそれぞれ20 mM, 0.5%及び0.5 mg/ml の最終濃度になるように添加して誘導された溶解(lysis)(60℃，4時間)により精製されたウィルス粒子から，SPV DNA が抽出された。消化(digestion)の後，フェノール:クロロホルム  (1:1)抽出が3回実施され，2倍量の100%エタノールの添加と-20 ℃，30分間のインキュベートにより試料は沈殿させられた。その後，試料はエッペンドルフミニフュージ(eppendorf minifuge)にて5分間，最高速度(full speed)で遠心分離された。上清は他の容器に移され，ペレットは風乾され， 4℃にて1mM EDTA を含む0.01 M のトリス緩衝溶液 pH 7.5中で再水和された。
【０１２２】
感染細胞溶解物(infected cell lysates)の調製
細胞溶解物の調製用に，血清を含まない培地が用いられた。25 cm2 フラスコまたは60  mmペトリ皿中で集密的細胞単層(SPVに対しEMSK, ESK-4, PK-15またはVero，またはPRVに対してVERO )は100 μlのウィルス試料で感染させられた。細胞変性の効果が完全となった後，培地と細胞は回収され，細胞は3000rpm, 5分間の臨床的な遠心分離(clinical centrifuge)でペレット化された。細胞ペレットは250μlの破壊緩衝液(disruption buffer)(2% のドデシル硫酸ナトリウム, 2%のβ-メルカプトエタノール)中に再懸濁された。試料は氷上で30秒間の超音波処理を施され，-20℃で保存された。
【０１２３】
ウェスタンブロッティング法
細胞溶解物試料と標準タンパク質はラエムンリ(Laemnli) (1970)の方法に従ってポリアクリルアミドゲル上で泳動された。ゲル電気泳動後，タンパク質は変性され，サムブルックら(Sambrook et al.)(1982)の方法に従って処理された。１次抗体はトリスナトリウム塩化物及びアジ化ナトリウム(TSA: 水1L中に 6.61g のトリス塩酸, 0.97g のトリス塩基, 9.0g の塩化ナトリウム及び2.0g のアジ化ナトリウムを含む)中にて5%の無脂肪乾燥ミルクで1:100の割合に希釈されたブタ抗PRV血清(Shope strain; lot370, PDV8201, NVSL, Ames, IA)であった。２次抗体はTSAで1:1000の割合に希釈されたヤギ抗ブタアルカリ性フォスファターゼ抱合体(goat anti-swine alkaline phosphatase conjugate)であった。
【０１２４】
分子生物学的手法
制限エンドヌクレアーゼを用いた消化，ゲル電気泳動，ゲルからのDNAの抽出，ライゲーション，キナーゼを用いたリン酸化，ホスファターゼを用いた処理，細菌培養の成長，DNAを用いた細菌の形質転換法などを含む，細菌とDNAの操作に関する技術及びその他の分子生物学的方法はマニアティスら(Maniatis et al.)(1982)及びサムブルックら（Sambrook et al.）(1989)により示されている。例外として，これらの方法には若干の修正が加えられた。
【０１２５】
DNAシークエンシング
シークエンシングはUSBシークエナーゼキット( USB Sequenase Kit)と35S-dATP (NEN)を用いて行われた。圧縮された領域(areas of compression)を解明するためdGTP混合物とdITP混合物の両方を用いる反応が実行された。あるいは，圧縮された領域(compressed areas)はフォルムアミドゲルで解析された。テンプレートにはダブルストランドのプラスミドサブクローンもしくはシングルストランドM13サブクローンを用い，プライマーはシークエンスされるべき挿入断片のすぐ外側のベクターに対して，あるいは以前に得られた配列に対して作成された。得られた配列は編集され，ドナスターソフトウエアー(Dnastar software)を用いて比較された。得られた配列の取り扱いや比較はコラルソフトウェア(Coral Software)のスーパークローンTM(SupercloneTM)とスーパーシーTMプログラム(SuperseeTM programs)を用いて行れた。
【０１２６】
複製連鎖反応(Polymerase Chain Reaction)を用いたクローニング
種々のDNAの繰作に都合のよい制限（酵素）部位を導入するために複製連鎖反応(Polymerase Chain Reaction)(PCR)が用いられた。用いられた方法はインニスら(Innis, et al. )  (1990)により示されている。一般に，増幅された断片はサイズ的には500塩基対より小さく，増幅された断片の臨界領域(critical region)はDNAシークエンシングにより確かめられる。それぞれの場合において用いられたプライマーは，以下に示す相同性ベクターの構築についての記述で詳しく述べられている。
【０１２７】
組み換えSPV生成のための相同的組み換え法(Homologous Recombination Prodecure)
この方法は，豚痘ウィルスDNAとトランスフェクションされたプラスミド相同性ベクターの両方を含む組織培養細胞中に生じた，豚痘ウィルスDNAとプラスミド相同性ベクターDNA間の相同的組み換えに依拠する。相同的組み換えを生じさせるために，EMSK 細胞単層はこれらの細胞中へのSPVの複製(すなわちDNA合成)を誘導するべく，感染多重度  0.01 PFU/細胞でS-SPV-001(カスザ  SPV株, 17) (Kasza SPV strain, 17)に感染させられる。その後,プラスミド相同性ベクターDNAは感染−トランスフェクション法(Infection - Transfected Procedure)に従い，これらの細胞にトランスフェクションされる。本方法で用いた相同性ベクターの構築は以下に示される。
【０１２８】
感染−トランスフェクション法
EMSK細胞の6 cm プレート(集密度約80%)はEMSK陰性培地中にて感染多重度 0.01 PFU/細胞でS-SPV-001 に感染させられ，CO2濃度5%の加湿された環境下で37℃にて5時間インキュベートされた。用いられたトランスフェクション法は基本的にはリポフェクチンTM試薬(LipofectinTM Reagent)(BRL)の使用説明書に示された方法である。簡単に説明すると，6 cmプレートのそれぞれにつき，15 μgのプラスミドDNAが水で100 μlまで希釈された。これとは別に50 μgのリポフェクチン試薬が水で100 μlまで希釈された。その後，ポリスチレン製の5 mlのスナップキャップ付き試験管中の希釈されたプラスミドDNAに，希釈されたリポフェクチン試薬100μlが滴下的に加えられ，穏やかに混合された。その後，混合物は室温にて15から20分間インキュベートされた。この間に，ウィルスの接種原は6 cmプレートから除去され，細胞単層はEMSK陰性培地を用いて１回洗浄された。その後，3 mlのEMSK陰性培地がプラスミドDNA/リポフェクチン混合物に加えられ，その内容物は細胞単層上にピペットで移された。細胞は一晩(約16時間)，CO2濃度5%の加湿された環境下で37℃にてインキュベートされた。翌日，3 mlのEMSK陰性培地は取り除かれ，5 ml のEMSK完全培地に置き換えられた。細胞はウィルスによる細胞変性の効果が80%から100%になるまで， CO2濃度5%下37℃で3日間から7日間インキュベートされた。ウィルスはウィルスストックの調製で上記したようにして回収された。このストックはトランスフェクションストック(transfection stock)と呼ばれ，引き続いて組み換え豚痘ウィルス検出用のブルオガルスクリーン(Bluogal Screen)もしくは組み換え豚痘ウィルス検出用CPRGスクリーン(CPRG Screen)により，組み換えウィルスの検出がなされた。
【０１２９】
β−ガラクトシダーゼを発現している組み換えSPVの検出(Screen)
(ブルオガル(Bluogal)及びCPRG分析)  
組み換えウィルスに大腸菌(E. coli)のβ−ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子が組み込まれた場合，組み換え体を含んでいるプラークは，２つの簡単な方法のうちのどちらか１つによって視覚化された。１番目の方法では，プラーク分析の間ブルオガル(BluogalTM)試薬 (ベテスダ研究所)(Bethesda Research Labs)がアガロース上層(agarose overlay)に組み込まれ(200 μg/ml)，β−ガラクトシダーゼ活性を発現しているプラークは青になる。青いプラークはその後，新しい細胞(EMSK)上に選び取られ，青いプラークのさらなる単離により精製された。２番目の方法では，プラーク分析の間CPRG(ベーリンガー  マンハイム)(Boehringer Mannheim)がアガロース上層(agarose overlay)に組み込まれ（400 μg/ml），β−ガラクトシダーゼ活性を発現しているプラークは赤になる。赤いプラークはその後，新しい細胞(EMSK)上に選び取られ，赤いプラークのさらなる単離により精製された。どちらの場合においてもウィルスは，典型的には，３回のプラーク精製で精製された。
【０１３０】
ブラックプラーク分析(Black Plaque Assays)を用いた
組み換えSPV中における外来遺伝子発現の検出(screen)
組み換え豚痘ウィルスにより発現した外来抗原の発現を分析するために，EMSK細胞単層は組み換えSPVで感染させられ，アガロース栄養培地に重層され(overlayed)，プラーク成長(plaque development)が生じるまで37℃で6日間から7日間インキュベートされた。その後，アガロース上層(overlay)はペトリ皿から除かれ，細胞は100%メタノールによりで室温で10分間固定され，風乾された。細胞の固定により表面抗原と同様に細胞質抗原も検出されるようになるが，未固定の細胞を用いることにより特異的な表面抗原の発現が検出可能である。その後，１次抗体はPBSを用いて適当な希釈倍率まで希釈され，細胞単層上に室温で２時間インキュベートされた。S-SPV-008由来のPRV g50 (gD)の発現を検出するために，ブタ抗PRV血清(ショープ株; ロット370, PDV8201, NVSL, エームズ, IA)(shope strain; lot370, PDV8201, NVSL, Ames, IA)が用いられた(1:100希釈)。S-SPV-009由来のNDV HN の発現を検出するために，HNタンパク質に特異的なウサギ抗血清(rabbit anti-NDV#2)が用いられた(1:1000希釈)。その後結合していない抗体は，PBSを用いて室温下で細胞を３回洗浄することにより除かれた。2次抗体としては，ヤギ抗ブタ(PRV g50 (gD); S-SPV-008)もしくはヤギ 抗ウサギ (NDV HN; S-SPV-009)のいずれかと西洋ワサビパーオキシダーゼの抱合体がPBSを用いて1:250に希釈され，室温下で2時間，細胞とともにインキュベートされた。その後，結合していない2次抗体は，PBSを用いて室温下で細胞を３回洗浄することにより除去された。その後，細胞は新しく調製された基質溶液(substrate solution)(PBS中に100 μg/ml の4クロロ-1-ナフトール(4-chloro-1-naphthol), 0.003% の過酸化水素を含む)とともに室温で15分間から30分間インキュベートされた。正しい抗原性を発現するプラークは黒く染色される。
【０１３１】
診断法として使用されるためのウィルス性糖タンパク質の精製に関する方法
ウィルス性糖タンパク質は抗体アフィニティカラムを用いて精製される。モノクローナル抗体を生成するために，8週から10週齢のBALB/c 雌マウスはS-SPV-009, -014,-016, -017, -018もしくは-019の107  PFUを2週から4週間隔で７回，腹膜内にワクチン接種(vaccinated)される。最後のワクチン接種から3週間後，マウスは相応のウィルス性糖タンパク質40 mgを腹膜内に注射される。最後の抗原投与から3日後に脾臓が取り出される。
【０１３２】
オイとハーゼンバーグ(Oi and Herzenberg)(41)の手法を改良した方法により，脾細胞はマウス NS1/Ag4 プラスマ細胞腫細胞と融合される。脾細胞とプラスマ細胞腫細胞は10分間300 x gの遠心分離 で一緒にペレット化される。ポリエチレングリコール(分子量1300から1600)の50%溶液１mlが，1分間攪拌されながら細胞ペレットに加えられる。ダルベッコ改良イーグル培地(Dulbecco's modified Eagles's Medium)(5ml)が3分間にわたり細胞に加えられる。細胞は300 x g，10分間の遠心分離 によりペレット化され，10%のウシ胎児血清と100mM ヒポキサンチン, 0.4 mMアミノプテリン及び16 mM  チミジンを含む培地(HAT)中に再懸濁される。100mlの標準の脾臓支持細胞層細胞(normal spleen feeder layer cells)を含有する8から10個の96穴の組織培養プレートに細胞(100ml)が加えられ，37℃でインキュベートされる。細胞には3日間から4日間ごとに新しいHAT培地が供給される。
【０１３３】
ハイブリドーマ培養上清は，100 ngのウィルス性糖タンパク質がコートされた96穴マイクロタイタープレート(96-well microtiter plates)中でのエリサ(ELIZA) 分析により検査される。活性ハイブリドーマ由来の上清はさらにブラックプラーク分析(black -plaque assay)とウェスタンブロット(Western Blot)により解析される。選抜されたハイブリドーマは限界希釈(limiting dilution)により二度クローニングされる。プリスタン処理されたBALB/ｃ マウスに5x106ハイブリドーマ細胞を腹膜内注射することにより腹水液(ascetic fluid)が生成される。
【０１３４】
S-SPV-009, -014, -016, -017, -018もしくは-019由来の細胞溶解物は感染細胞溶解物の調製で示されたようにして得られる。糖タンパク質を含む細胞溶解物(100 mls)は，2mlのアガロース親和性樹脂を通される。製造元(AFC培地，ニューブランズウィックサイエンティフィック,  エディソン, ニュージャージー)(AFC Medium, New Brunswick Scientific, Edison, N.J.)の使用説明に従うと，そのカラムでは20 mgの糖タンパク質モノクローナル抗体が固定化されている。カラムは非特異的に結合した物質を除くために，0.1%のノニデット P-40(Ｎｏｎｉｄｅｔ P-40)を含むリン酸緩衝溶液(PBS)100mlを用いて洗浄された。結合した糖タンパク質は100mM  炭酸緩衝液(carbonate buffer), pH 10.6 (40)で溶出される。溶出前後の画分(pre-posteluted fractions)は，エリサ(ELISA)システム中でのSPVモノクローナル抗体に対する活性により純度(purity)がモニターされる。
【０１３５】
エリサ検定（ELISA ASSAY）
ワクチン接種と抗原投与に引き続いておこる畜牛の免疫状態を測定するために，標準的な酵素結合免疫吸着剤検定法(ELISA)の手順が用いられる。
【０１３６】
糖タンパク質抗原溶液(PBS中にng/mlにて100ml)(100 ml at ng/ml in PBS)はマイクロタイター皿の穴に4℃下18時間吸着させられる。コートされた穴はPBSを用いて１回リンスされる。穴は1%のBSA (シグマ)(Sigma)を含むPBSを250 ml加えることによりブロックされ，37℃で1時間インキュベートされる。ブロックされた穴は0.02%のツィーン 20(Tween20)を含むPBSで１回リンスされる。50 mlの供試血清(前もって1% BSAを含むPBS中で1:2に希釈された)が穴に添加され，37℃で1時間インキュベートされる。抗血清は除去され，穴は0.02%のツィーン 20(Tween20)を含むPBSで3回洗浄される。特異的な抗原に対する抗体を含んでいる穴を視覚化するために，西洋ワサビパーオキシダーゼ(1% BSAを含むPBS中で1:500に希釈されたもの，キッケガードとペリー研究所 社(Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.))に結合した 抗ウシIgGを含む50 mlの溶液が添加される。溶液は37℃で1時間インキュベートされ，その後溶液は除去され，0.02%のツィーン 20(Tween20)を含むPBSで3回洗浄される。それぞれの穴に100 mlの基質溶液(ATBS, キッケガードとペリー研究所 社)(ATBS, Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.)が加えられ，15分間発色させられ．反応は0.1 Mのシュウ酸の添加により終止させられた。色は自動プレート読みとり機(automatic plate reader)にて吸光度410nmで読みとられた。
【０１３７】
合成ポックスウィルスプロモーターの構築のための基本的手法
組み換え豚痘ベクターに関して，合成痘プロモーター(synthetic pox promoters)は，外来遺伝子発現の強度とタイミングを制御する能力を含むいくつかの利点を供する。ワクシニアウィルス(1,7及び8)中で決定されたプロモーターに基づいた３つのプロモーターカセットLP1, EP1及びLP2が設計された。それぞれのカセットはワクシニア中で決定されたDNA配列に制限酵素部位を配したものを含むように設計された。この制限酵素部位により，カセットはいかなる順番にでも，いかなる組み合わせにでも結合させて利用できるようになる。EcoRIもしくはBamHIサイトでフレーム内融合(inframe fusion)ができるように，イニシエーターメチオニンもそれぞれのカセット中に設計された。３つのリーディングフレームすべてに含まれる一連の翻訳終了コドンと初期(early)転写終止シグナル(early transcriptional termination signal) (9)もフレーム内融合(inframe fusion)サイトの下流に組み込まれた。それぞれのカセットをコードするDNAは標準的な手法に従って合成され，適当な相同性ベクターへクローニングされた(図4,5及び8参照)。
【０１３８】
仮性狂犬病(Pseudorabies)ウィルス糖タンパク質遺伝子を含む
組み換え豚痘ウィルスを用いたブタにおけるワクチン接種実験：
仮性狂犬病(Pseudorabies)非感染群からの離乳した幼ブタが，１つまたはそれ以上の仮性狂犬病(Pseudorabies)ウィルス糖タンパク質遺伝子(SPV/PRV)を有する組み換え豚痘ウィルスの効力を検査するために用いられる。約103から107 プラーク形成単位(PFU)の組み換えSPV/PRVウィルスが筋肉内，皮下，あるいは経口的に幼ブタに接種される。
【０１３９】
免疫性はPRV血清抗体のレベルを測定することと，ワクチン接種されたブタに仮性狂犬病(Pseudorabies)ウィルスの病原性株を抗原投与(challenge)することにより決定される。ワクチン接種の3から4週間後，ブタの接種したグループと接種していないグループはともに仮性狂犬病(Pseudorabies)ウィルスの病原性株(VDL4892)を抗原投与(challenge)される。抗原投与(challenge)後，ブタは14日間毎日，仮性狂犬病(Pseudorabies)の臨床的兆候を観察される。
【０１４０】
ワクチン接種した時点，抗原投与の時点，及び接種後2から3週の間１週おきに血清試料が得られ，血清中和抗体を検査された。
【０１４１】
ウマインフルエンザウィルス赤血球凝集素とノイラミニダーゼ遺伝子のクローニング
カッツら(Katz et al. )(42)がヒトインフルエンザウィルスのHA遺伝子に関して示したのと基本的に同様の手法により，ウマインフルエンザウィルス赤血球凝集素(HA)とノイラミニダーゼ(NA)遺伝子がクローニングされた。ウィルスRNAはMDBK細胞(インフルエンザ A/ウマ/アラスカ/91とインフルエンザ A/ウマ/マイアミ/63に関して)またはMDCK細胞(インフルエンザ A/ウマ/プラハ/56とインフルエンザ A/ウマ/ケンタッキー/81に関して)内で成長したウィルスから調製され，最初に標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用してcDNAに変えられた。cDNAは標的とした遺伝子領域のPCRクローニング(51)のためのテンプレートとして用いられた。PCRプライマーは，EHV内での発現のための適当なシグナルを含むベクター中に，増幅したコード領域のクローニングを可能とする制限酵素サイトを組み込むように設計された。コードする領域のそれぞれにつき１対のオリゴヌクレオチドプライマーが必要であった。抗原型2  (H3)ウィルス(インフルエンザA/ウマ/マイアミ/63， インフルエンザA/ ウマ/ケンタッキー/81, 及びインフルエンザA/ウマ/アラスカ/91)由来のHA遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプライマー5'-GGAGGCCTTCATGACAGACAACCATTATTTTGATACTACTGA-3' (SEQ ID NO:120)を用いてクローニングされ，PCRのために5'-GAAGGCCTTCTCAAATGCAAATGTTGCATCTGATGTTGCC-3' (SEQ ID NO:121)と結合させられた。抗原型1  (H7) ウィルス(インフルエンザA/ウマ/プラハ/56)由来のHA遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプライマー
5'-GGGATCCATGAACACTCAAATTCTAATATTAG-3' (SEQ ID NO:122)
を用いてクローニングされ，PCRのために
5'-GGGATCCTTATATACAAATAGTGCACCGCA-3' (SEQ ID NO:123)
と結合させられた。抗原型2  (N8) ウィルス(インフルエンザA/ウマ/マイアミ/63， インフルエンザA/ ウマ/ケンタッキー/81, 及びインフルエンザA/ウマ/アラスカ/91)由来のNA遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(priming)ため以下のプライマー
5'-GGGTCGACATGAATCCAAATCAAAAGATAA-3' (SEQ ID NO:124)
を用いてクローニングされ，PCRのために
5'-GGGTCGACTTACATCTTATCGATGTCAAA-3' (SEQ ID NO:125)
と結合させられた。抗原型1  (N7) ウィルス(インフルエンザA/ウマ/プラハ/56)由来のNA遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプライマー5'-GGGATCCATGAATCCTAATCAAAAACTCTTT-3' (SEQ ID NO:118)を用いてクローニングされ，PCRのために
5'-GGGATCCTTACGAAAAGTATTTAATTTGTGC-3' (SEQ ID NO:119)
と結合させられた。この一般的な手法は，ウマ インフルエンザA ウィルスの他の株からHA遺伝子とNA遺伝子をコードする領域をクローンするために用いられたことに留意されたい。EIV HA 遺伝子または NA遺伝子はブラントエンド処理されたsalIまたはBamHI断片として，SPV相同性ベクターのLP2EP2プロモーターの下流のブラントエンド処理されたEcoRIサイトにクローニングされた。
【０１４２】
パラインフルエンザ-3  ウィルス融合 (parainfluenza-3 virus fusion )と赤血球凝集素遺伝子のクローニング
カッツら(Katz et al. )(42)がヒトインフルエンザウィルスのHA遺伝子に関して示したのと基本的に同様のPCRクローニング法により，パラインフルエンザ-3  ウィルス融合 (F) (parainfluenza-3 virus fusion (F))と赤血球凝集素(HN)遺伝子がクローニングされた。マーデン-ダービイ(Madin-Darby) ウシ腎臓(MDBK)細胞中で成長させたウシPI-3ウィルスから調製されたウィルスRNAは最初に，標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用してcDNAに変えられた。その後，cDNAは標的とされる領域の複製連鎖反応(PCR)クローニング(15)のためのテンプレートとして用いられた。PCRプライマーは，SPV内での発現のための適当なシグナルを含むベクター中に，増幅したコード領域のクローニングを可能とする制限酵素サイトを組み込むように設計された。コードする領域のそれぞれにつき１対のオリゴヌクレオチドプライマーが必要であった。PI-3株 SF-4 (VR-281)由来のＦ遺伝子をコードする領域は，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプライマー：
5'-TTATGGATCCTGCTGCTGTGTTGAACAACTTTGT-3'
(SEQID NO:130)
を用いてクローニングされ，PCRのために
5'-CCGCGGATCCCATGACCATCACAACCATAATCATAGCC-3' 
(SEQ ID NO:131)
と結合させられた。PI-3株 SF-4  (VR-281)由来のHN遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプライマー：
5'-CGTCGGATCCCTTAGCTGCAGTTTTTTGGAACTTCTGTTTTGA-3' 
(SEQ ID NO:132)
を用いてクローニングされ，PCRのために
5'-CATAGGATCCCATGGAATATTGGAAACACACAAACAGCAC-3' 
(SEQ ID NO:133)
と結合させられた。この一般的な手法は，PI-3の他の株からF遺伝子とHN遺伝子をコードする領域をクローンするために用いられたことに留意されたい。PI-3 HN (遺伝子)または F(遺伝子)に対応するDNA断片は，それぞれ1730 bpもしくは1620 bpの断片を得るためにBamHIを用いて消化された。PI-3 HN断片は，SPV相同性ベクターのLP2EP2プロモーターに隣接するBamHIサイトにクローニングされた。PI-3 F断片は相同性ベクター713-55.10.を得るために，SPV相同性ベクターのLP2EP2プロモーターに隣接するBamHIサイトにクローニングされた。
【０１４３】
ウシウィルス性下痢ウィルス(Bovine Viral Diarrhea Virus) g48 と g53 遺伝子のクローニング
カッツら(Katz et al.) (42)がヒトインフルエンザウィルスのHA遺伝子に関して示したのと基本的に同様のPCRクローニング手法により，ウシウィルス性下痢ウィルス g48 と g53 遺伝子はクローニングされた。マーデン-ダービイ(Madin-Darby) ウシ腎臓(MDBK)細胞中で成長したBVD ウィルスシンガー株(BVD Virus Singer strain)から調製されたウィルスRNAは最初に，標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用してcDNAに変えられた。その後，cDNAは複製連鎖反応(PCR)クローニング(15)のためのテンプレートとして用いられた。PCRプライマーは，SPV内での発現のための適当なシグナルを含むベクター中に，増幅したコード領域のクローニングを可能とする制限酵素サイトを組み込むように設計された。コードする領域のそれぞれにつき１対のオリゴヌクレオチドプライマーが必要であった。BVDV シンガー株(BVDV  Singer strain)(49) 由来のg48 遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプライマー：
5'-ACGTCGGATCCCTTACCAAACCACGTCTTACTCTTGTTTTCC-3' 
(SEQ ID NO:134)
を用いてクローニングされ，PCRのために
5'-ACATAGGATCCCATGGGAGAAAACATAACACAGTGGAACC-3'
(SEQ ID NO:135)
と結合させられた。BVDV ウィルスシンガー株(BVDV  Singer strain)  (49) 由来のg53 遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプライマー:
5'-CGTGGATCCTCAATTACAAGAGGTATCGTCTAC-3' (SEQ ID NO:136)を用いてクローニングされ，PCRのために
5'-CATAGATCTTGTGGTGCTGTCCGACTTCGCA-3' (SEQ ID NO:137)
と結合させられた。この一般的な手法は，BVDVの他の株からg48 遺伝子とg53 遺伝子をコードする領域をクローンするために用いられたことに留意されたい。BVDV  g48に対応するDNA断片は，678bpの断片を得るためにBamHIで消化された。BVDV g53 に対応するDNA断片は，1187 bpの断片を得るためにBglIIとBamHIを用いて消化された。BVDV g48とg53 DNA断片は，それぞれ相同性ベクター727-78.1と738-96を得るために，SPV相同性ベクターのLP2EP2プロモーターに隣接するBamHIサイトにクローニングされた。
【０１４４】
ウシ呼吸器合胞体ウィルス融合(Bovine Respiratory Syncytial Virus Fusion)，ヌクレオカプシド(Nucleocapsid)及び糖タンパク質遺伝子のクローニング
カッツら(Katz et al.) (42)がヒトインフルエンザウィルスのHA遺伝子に関して示したのと基本的に同様のPCRクローニング手法により，ウシ呼吸器合胞体ウィルス融合(Bovine respiratory syncytial virus fusion)  (F)，ヌクレオカプシド(Nucleocapsid)(N)及び糖タンパク質(G)遺伝子がクローニングされた。ウシ鼻甲介(nasal turbinate)(BT)細胞中で成長させたBRSV から調製されたウィルスRNAは最初に，標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用してcDNAに変えられた。その後，cDNAは複製連鎖反応(PCR)クローニング(15)のためのテンプレートとして用いられた。PCRプライマーは，SPV内での発現のための適当なシグナル含むベクター中に，増幅したコード領域のクローニングを可能とする制限酵素サイトを組み込むように設計された。コードする領域のそれぞれにつき１対のオリゴヌクレオチドプライマーが必要であった。BRSV 株375 (VR-1339) 由来のF遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプライマー：
5'-TGCAGGATCCTCATTTACTAAAGGAAAGATTGTTGAT-3'
(SEQ ID NO:138)
を用いてクローニングされ，PCRのために
5'-CTCTGGATCCTACAGCCATGAGGATGATCATCAGC-3' 
(SEQ ID NO:139)
と結合させられた。BRSV 株375 (VR-1339)由来の領域をコードしているN 遺伝子は，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプライマー：
5'-CGTCGGATCCCTCACAGTTCCACATCATTGTCTTTGGGAT-3' 
(SEQ ID NO:140)
を用いてクローニングされ，PCRのために
5'-CTTAGGATCCCATGGCTCTTAGCAAGGTCAAACTAAATGAC-3' 
(SEQ ID NO:141)
と結合させられた。BRSV 株375 (VR-1339)由来のG遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプライマー:
5'-CGTTGGATCCCTAGATCTGTGTAGTTGATTGATTTGTGTGA-3' 
(SEQ ID NO:142)
を用いてクローニングされ，PCRのために
5'-CTCTGGATCCTCATACCCATCATCTTAAATTCAAGACATTA-3' 
(SEQ ID NO:143)
と結合させられた。この一般的な手法は,BRSVの他の株からF遺伝子，N遺伝子及びG 遺伝子をコードする領域をクローンするために用いられたことに留意されたい。BRSVのF,N 及びGに対応するDNA断片は，それぞれ1722bp, 1173bp及び771bpの断片を得るためにBamHIで消化された。BRSV のF, N,及びGのDNA断片は，相同性ベクター727-20.10,  713-55.37,   及び727-20.5を得られようにSPV相同性ベクターのLP2EP2プロモーターに隣接するBamHIサイトにそれぞれクローニングされた。
【０１４５】
コンカナバリン A(Concanavalin A)で処理されたニワトリ脾臓細胞から単離されたRNA
ニワトリ脾臓は3週齢のSPAFAS孵化ヒナから解剖して取り出され，洗浄され，細胞を解離するために注射筒/針を通して粉砕された。細胞質と残渣が除かれた後，細胞はペレット化され，PBSで二回洗浄された。細胞ペレットは赤血球細胞を溶血させるために低張性溶解緩衝液で処理され，脾細胞は回収され，PBSで二回洗浄された。脾細胞は5%  FBSと5μg/mlのコンカナバリン A(concanavalin A)を含むRPMI中に5x106  細胞/ ml にて再懸濁され，39℃下で, 48時間インキュベートされた。総RNAはグアニジンイソチオネート溶解剤(guanidine isothionate lysis reagents)とプロメガRNA単離キット(プロメガ社 RNA isolation Kit) (プロメガ社  マディソン  ウィスコンシン)(プロメガ社 Corporation, Madison WI)による手順を用いて細胞から単離された。4μgの総RNAが，適当なアンチセンスプライマーとAMV 逆転写酵素(プロメガ社  マディソン ウィスコンシン)(プロメガ社 Corporation, Madison WI)を含むそれぞれの第一鎖(1st strand)反応に用いられた。逆転写酵素反応に続いてcDNA合成が同じ試験管内で，適当なセンスプライマー(sense primers)とVentR DNA ポリメラーゼ（ライフテクノロジーズ社, ベテスダ,  メリーランド）(Life technologies, Inc. Bethesda, MD)を用いて行われた。
【０１４６】
酵素のマーカー遺伝子を発現させる組み換えヘルペスウィルスの検出(Screen)
大腸菌β−ガラクトシダーゼ  (uidA)マーカー遺伝子が組み換えウィルスに組み込まれた時，組み換え体を含むプラークは簡単な分析により視覚化された。プラーク分析の間，アガロース上層(agarose overlay)に酵素基質が組み入れられた(300μg/ml)．uidAマーカー遺伝子に関しては，基質 X-グルクロChx(X-GlucuroChx) (5-ブロモ-4クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニック酸シクロヘキシルアンモニウム塩, バイオシンス AG )(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid Cyclohexylammonium salt, Biosynth AG)が用いられた。 マーカー酵素活性を示したプラークは青に変わった。その後，青いプラークは新しいESK-4細胞上に選び取られ，青いプラークをさらに単離することにより精製された。酵素マーカー遺伝子が除去された場合の組み換えウィルス手法では分析に際し，親（世代）の青いプラークのバックグランドから白いプラークを精製したものが用いられた。どちらの場合においても，典型的には，３回のプラーク精製によりウィルスは精製された。
【０１４７】
相同性ベクター515-85.1
プラスミド515-85.1は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。このプラスミドは外来DNAが挿入されうる特異なAccI制限酵素サイトを含んでいる。AccIサイトに外来DNA挿入（断片）を有しているプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来DNAを有するウィルスが生じるだろう。相同性ベクター515-85.1内のDNA挿入（断片）の制限酵素地図を図4A-4Dに示す。このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用い(22と29)，以下に示す供給源からの２つ制限酵素（切断）断片を結合させることで構築される。１つめの断片はpSP64(プロメガ) (プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972 塩基対の制限酵素切断断片である。２番目の断片はSPV HindIII消化断片 M (23)のHindIIIからBglIIまでの約3628塩基対の亜断片(sub-fragment)である。
【０１４８】
相同性ベクター520-17.5
プラスミド520-17.5は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。このプラスミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子をもつ．マーカー遺伝子の上流はSPV DNAの約2149塩基対断片である。マーカー遺伝子の下流はSPV DNAの約1484塩基対断片である。このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，マーカー遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう。β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子は合成初期/後期(early/late) 痘プロモーターの制御下にあることに留意されたい。プラスミドの詳細を図4A-4Dに示す。このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。この配列を図4A-4Dに示す。このプラスミドベクターはpSP64 (プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。断片１はSPV HindIII消化断片 M (23)のHindIIIからAccIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片２はプラスミドpJF751 (11) のBamHIからPvuIIまでの約3006塩基対の制限酵素断片である。断片3はSPV HindIII消化断片 M (23)のAccIからBglIIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である。
【０１４９】
相同性ベクター538-46.16
プラスミド538-46.16は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。このプラスミドはSPV DNAに隣接して，大腸菌β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子とPRV g50 (gD)遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約2149塩基対断片である。外来遺伝子の下流はSPV DNAの約1484塩基対断片である。このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう。β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子は合成後期(late) 痘プロモーター(LP1)の制御下に，g50 (gD)遺伝子は合成初期/後期(early/late) 痘プロモーター(EP1Lp1)の制御下にあることに留意されたい。プラスミドの詳細を図5A-5Dに示す。このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。この配列を図5A-5Dに示す。このプラスミドベクターはpSP64 (プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。断片１はSPV HindIII消化断片 M (23)のHindIIIからAccIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片２はプラスミドpJF751 (11) のBamHIからPvuIIまでの約3006塩基対の制限酵素断片である。断片3はPRV BamHI消化断片 7 (21)のEcoRIからStuIまでの約1571塩基対の亜断片(sub-fragment)である。EcoRIサイトはPCRクローニングによりこの断片に導入されたことに留意されたい。この手法において，以下に示されたプライマーはpSP64にサブクローニングしたPRV BamHI #7断片からなるテンプレートとともに用いられた。１つめのプライマー87.03 (5'-CGCGAATTCGCTCGCAGCGCTATTGGC-3') (SEQ ID NO: 41)は，PRV g50 (gD)配列(26)上で，遺伝子の3'末端方向にプライミング(priming)しながら略アミノ酸3の位置にバインド(sit down)する。２つめのプライマー87.06 (5'-GTAGGAGTGGCTGCTGAAG-3') (SEQ ID NO: 42)は，逆鎖上で，遺伝子の5'末端方向にプライミング(priming)しながら略アミノ酸174の位置にバインド(sit down)する。PCR産物は，約509塩基対の断片を得るために，EcoRIとSalIで消化されてもよい。PRV BamHI #7のSalIからStuIまでの約1049塩基対の亜断片(sub-fragment)はその後，EcoRIからStuIまでの約1558塩基対の断片3を得るために約509塩基対のEcoRIからSalIまでの断片にライゲーションされてもよい。断片4はSPV HindIII消化断片 M (23)のAccIからBglIIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である。
【０１５０】
相同性ベクター570-91.21
プラスミド570-91.21は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。プラスミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子とPRV gIII (gC)遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約1484塩基対断片である。外来遺伝子の下流はSPV DNAの約2149塩基対断片である。このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう。β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子は合成後期(late) 痘プロモーター(LP1)の制御下に，gIII (gC)遺伝子は合成初期(early) 痘プロモーター(EP2)の制御下にあることに留意されたい。プラスミドの詳細を図10A-10Dに示す。このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。この配列を図10A-10Dに示す。このプラスミドベクターはpSP64 (プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。断片１はSPV HindIII消化断片 M (23)のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片2はプラスミドpJF751 (11) のBamHIからPvuIIまでの約3002塩基対の制限酵素断片である。断片3はPRV BamHI  #2 と#9の亜断片(sub-fragment)である，プラスミド251-41.AのNcoIからNcoIまでの約2378塩基対の断片である。この断片の末端のNcoIサイトとNcoIサイトはEcoRIリンカーにより置換された。断片4はSPV HindIII消化断片 M (23)のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片1と断片4中のAccIサイトは合成DNAリンカーを用いてPstIに転換された。
【０１５１】
相同性ベクター570-91.41
プラスミド570-91.41は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。プラスミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子とPRV gIII (gC)遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約2149塩基対断片である。外来遺伝子の下流はSPV DNAの約1484塩基対断片である。このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう。β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子は合成後期(late) 痘プロモーター(LP1)の制御下に，gIII (gC)遺伝子は合成初期後期(early late) 痘プロモーター(EP1LP2)の制御下にあることに留意されたい。プラスミドの詳細を図11A-11Dに示す。このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。この配列を図11A-11Dに示す。このプラスミドベクターはpSP64 (プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。断片１はSPV HindIII消化断片 M (23)のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片2はプラスミドpJF751 (11) のBamHIからPvuIIまでの約3002塩基対の制限酵素断片である。断片3はPRV BamHI  #2 と#9の亜断片(sub-fragment)である，プラスミド251-41.AのNcoIからNcoIまでの約2378塩基対の断片である。この断片の末端のNcoIサイトとNcoIサイトはEcoRIリンカーにより置換された。断片4はSPV HindIII消化断片 M (23)のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片1と断片4中のAccIサイトは合成DNAリンカーを用いてPstIに転換された。
【０１５２】
相同性ベクター570-91.64
プラスミド570-91.64は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。プラスミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子とPRV gIII (gC)遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約1484塩基対断片である。外来遺伝子の下流はSPV DNAの約2149塩基対断片である。このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう。β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子は合成後期(late) 痘プロモーター(LP1)の制御下に，gIII(gC)遺伝子は合成後期初期(late early ) 痘プロモーター(Lp2EP2)の制御下にあることに留意されたい。プラスミドの詳細を図12A-12Dに示す。このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。この配列を図12A-12Dに示す。このプラスミドベクターはpSP64 (プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。断片１はSPV HindIII消化断片 M (23)のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片2はプラスミドpJF751 (11) のBamHIからPvuIIまでの約3002塩基対の制限酵素断片である。断片3はPRV BamHI  #2 と#9の亜断片(sub-fragment)である，プラスミド251-41.AのNcoIからNcoIまでの約2378塩基対の断片である。この断片の末端のNcoIサイトとNcoIサイトはEcoRIリンカーにより置換された。断片4はSPV HindIII消化断片 M (23)のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片1と断片4中のAccIサイトは合成DNAリンカーを用いてPstIに転換された。
【０１５３】
相同性ベクター538-46.26
プラスミド538-46.26は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。プラスミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子とニューカッスル病ウィルス (NDV) 赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ (HN)遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約2149塩基対断片である。外来遺伝子の下流はSPV DNAの約1484塩基対断片である。このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう。β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子は合成後期(late) 痘プロモーター(LP1)の制御下に，HN遺伝子は合成初期/後期(early/late) 痘プロモーター(EP1Lp2)の制御下にあることに留意されたい。プラスミドの詳細を図8A-8Dに示す。このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。この配列を図8A-8Dに示す。このプラスミドベクターはpSP64 (プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。断片１はSPV HindIII消化断片 M (23)のHindIIIからAccIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片2はNDV HN cDNAクローンのAvaIIからNaeIまでの約1810塩基対の制限酵素断片である。HN cDNAクローンの配列を図7に示す。cDNAクローンは標準的なcDNAクローニング技術 (14)を用いてNDVのB1株から集められた。断片3はプラスミドpJF751 (11) のBamHIからPvuIIまでの約3006塩基対の制限酵素断片である。断片4はSPV HindIII消化断片 M (23)のAccIからBglIIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である。
【０１５４】
相同性ベクター599-65.25
プラスミド599-65.25は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。プラスミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子とILT gG遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約1484塩基対断片である。外来遺伝子の下流はSPV DNAの約2149塩基対断片である。このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう。β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子は合成後期(late) 痘プロモーター(LP1)の制御下に，ILT gG遺伝子は合成初期/後期(early/late) 痘プロモーター(EP1LP2)の制御下にあることに留意されたい。プラスミドの詳細を図13A-13Dに示す。このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。この配列を図13A-13Dに示す。このプラスミドベクターはpSP64 (プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。断片１はSPV HindIII消化断片 M (23)のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片2はEcoRIからMboIまでの約1073塩基対の断片である。EcoRIサイトはPCRクローニングにより導入されたことに留意されたい。この手法において，以下に示されたプライマーはILTウィルスゲノムの5.1 KbのAsp718I断片のSst IからAsp718Iまでの2.6 kbの亜断片(sub-fragment)からなるテンプレートとともに用いられた。１つめのプライマー91.13 (5'-CCGAATTCCGGCTTCAGTAACATAGGATCG-3') (SEQ ID NO: 81)は，ILT gG配列上で，アミノ酸2の位置にバインド(sit down)する。本プライマーはさらにアミノ酸1とアミノ酸2の間にアスパラギン残基を付加し，またEcoRI制限酵素サイトを導入する。２つめのプライマー91.14 (5'-GTACCCATACTGGTCGTGGC-3') (SEQ ID NO: 82)は，逆鎖上で，遺伝子の5'末端方向にプライミング(priming)しながら，おおよそアミノ酸196の位置にバインド(sit down)する。PCR産物は．約454 塩基対の断片を得るためにEcoRIとBamHIで消化される。ILT Asp718I (5.1 Kb)断片の約485塩基対のMboIの亜断片(sub-fragment)は，長さ約939塩基対(293アミノ酸)であるEcoRIからMboIまでの（断片）から断片2を得るために，約454塩基対のEcoRIからBamHIまでの断片にライゲーションされる。 断片3はプラスミドpJF751 (11) のBamHIからPvuIIまでの約3002塩基対の制限酵素断片である。断片4はSPV HindIII消化断片 M のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片1と断片4中のAccIサイトは合成DNAリンカーを用いてPstIに転換された。
【０１５５】
相同性ベクター624.20.1C
プラスミド624.20.1Cは，外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。プラスミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子とILT gI遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約1484塩基対断片である。外来遺伝子の下流はSPV DNAの約2149塩基対断片である。このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう。β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子は合成後期(late) 痘プロモーター(LP1)の制御下に，ILT gI遺伝子は合成後期/初期( late/early) 痘プロモーター(LP2EP2)の制御下にあることに留意されたい。プラスミドの詳細を図14A-14Dに示す。このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。この配列を図14A-14Dに示す。このプラスミドベクターはpSP64 (プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。断片１はSPV HindIII消化断片 M (23)のBgl IIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片2はPCRクローニングにより合成された末端にEcoRIとBamHIサイトをもつ約1090塩基対の断片であり，ILT gI遺伝子の全てのアミノ酸をコードする配列を含んでいる。ILT gI 遺伝子は２つの別個のPCR反応により合成された。この手法において，以下に示されたプライマーが8kbのILT Asp 718I 断片からなる テンプレート共に用いられた。１つめのプライマー103.6 (5'-CCGGAATTCGCTACTT  GGAACTCTGG-3') (SEQ ID NO: 83)は，ILT gI 配列上で，アミノ酸2の位置にバインド(sit down)し，ILT gI 遺伝子の5'末端にEcoRIサイトを導入する。２つめのプライマー103.3 (5'-CATTGTCCCGAGACGGACAG-3') (SEQ ID NO: 84)は，プライマー103.6に対する逆鎖上の，ILT gI配列上のおおよそアミノ酸269の位置にバインド(sit down)し，遺伝子の5'末端方向へ向けてプライミング(priming)する。PCR産物はILT gI 遺伝子の5'末端側に相当する長さ625塩基対の断片を得るために，EcoRIとBglI(BglIはプライマー2に対して5'末端側の179塩基対である，約アミノ酸209の位置にある)で消化される。３つめのプライマー103.4は(5'-CGCGATCCAACTATCGGTG-3') (SEQ ID NO:85)はILT gI 遺伝子上で，遺伝子の3'末端方向にプライミング(priming)しながら，略アミノ酸153の位置にバインド(sit down)する。４つ目のプライマー103.5 (5'-GCGGATCCACATTCAG  ACTTAATCAC-3') (SEQ ID NO:86)はILT gI遺伝子の3'末端側のUGA終始コドンから14塩基対先の位置にバインドし(sit down)，BamHIの制限酵素サイトと遺伝子の5'末端側方向へのプライミング(priming)を誘導する。PCR産物はILT gI 遺伝子の3'末端側に相当する長さ476塩基対の断片を得るために，Bgl I(209アミノ酸 の位置にある)とBamHIを用いて消化される。断片2は長さ約1101塩基対(361個のアミノ酸)のEcoRIからBamHIまでの断片であるILT gI 遺伝子を得るために，一緒にライゲーションされた2つのPCR反応産物からなる。断片3はプラスミドpJF751 (11) のBamHIからPvuIIまでの約3002塩基対の制限酵素断片である。断片4はSPV HindIII消化断片 M のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片1と断片4中のAccIサイトはNotIリンカーを用いて特異なNotIサイトに転換された。
【０１５６】
相同性ベクター614-83.18
プラスミド 614-83.18は， 外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。プラスミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子とIBR gG遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約1484塩基対断片である。外来遺伝子の下流はSPV DNAの約2149塩基対断片である。このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう。β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子は合成後期(late) 痘プロモーター(LP1)の制御下に，IBR gG 遺伝子は合成後期/初期(late/early) 痘プロモーター(LP2EP2)の制御下にあることに留意されたい。プラスミドの詳細を図15A-15Dに示す。このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。この配列を図15A-15Dに示す。このプラスミドベクターはpSP64 (プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。断片１はSPV HindIII消化断片 M (23)のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片2は末端にEcoRIとBamHIサイトをもつ，PCRクローニングにより合成された約1085塩基対の断片であり，IBR gG遺伝子のアミノ酸2からアミノ酸362由来のアミノ酸をコードする配列を含んでいる。PCRクローニング手法において，以下に示されたプライマーはIBR-000ウィルス(クーパー株)(Cooper Strain)からなるテンプレートと共に用いられた。１つめのプライマー106.9
(5'-ATGAATTCCCCTGCCGCCCGGACCGGCACC-3') (SEQ ID NO: 87)
は，IBR gG配列上で，アミノ酸1の位置にバインド(sit down)し，IBR gG 遺伝子の5'末端にEcoRIサイトを，アミノ酸1とアミノ酸2の間に２つのアミノ酸を付加させる。２つめのプライマー106.8
(5'-CATGGATCCCGCTCGAGGCGAGCGGGCTCC-3') (SEQ ID NO: 88)
は，プライマー1に対する逆鎖上の，IBR gG配列上のおおよそアミノ酸362の位置にバインド(sit down)し，IBR gG遺伝子の5'末端方向への合成をプライミング(priming)する。断片2はIBR gG 遺伝子のアミノ末端側の362アミノ酸(約80%)に相当する長さ1085塩基対の断片を得るために，PCR産物をEcoRIとBamHIを用いて消化することにより生成された。断片3はプラスミドpJF751 (11) のBamHIからPvuIIまでの約3002塩基対の制限酵素断片である。断片4はSPV HindIII消化断片 M のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片1と断片4中のAccIサイトはNotIリンカーを用いて特異なNotIサイトに転換された。
【０１５７】
S-SPV-019を構築するための相同性ベクター 
(LacZ/ IBR gE 相同性ベクター)：
この LacZ/ IBR gE 相同性ベクターは外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。プラスミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子とIBR gE 遺伝子をもつ．このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう。β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子は合成後期(late) 痘プロモーターの制御下に， gE遺伝子は合成後期/初期(late/early) 痘プロモーターの制御下にあることに留意されたい。相同性ベクターは標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下に示す適当な合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。このプラスミドベクターはpSP64 (プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。SPVホモロジーの上流はSPV HindIII消化断片 M (23)の約1146塩基対のBglIIIからAccIまでの制限酵素切断亜断片(sub-fragment)である。IBR gE遺伝子は，EcoRIとBamHIの制限酵素サイト末端をもつ，PCRクローニングにより合成された約1888塩基対の断片である。PCRクローニング手法において，以下に示されたプライマーはIBR-000 ウィルス(クーパー株)(Cooper Strain)からなる テンプレートとともに用いられた。１つめのプライマー4/93.17DR
(5'-CTGGTTCGGCCCAGAATTCTATGGGTCTCGCGCGGCTCGTGG-3') 
(SEQ ID NO: 89)
は，IBR gE 遺伝子上で，アミノ酸1の位置にバインド(sit down)し，IBR gE遺伝子の5'末端にEcoRIサイトを導入し，タンパク質のアミノ末端に２つのアミノ酸を付加をした．２つめのプライマー4/93.18DR
(5'-CTCGCTCGCCCAGGATCCCTAGCGGAGGATGGACTTGAGTCG-3') 
(SEQ ID NO: 90)
は，プライマー1に対する逆鎖上の，IBR gE配列上のおおよそアミノ酸648の位置にバインド(sit down)し，IBR gE 遺伝子の5'末端方向への合成をプライミング(priming)する。lacZプロモーターとマーカー遺伝子はプラスミド520-17.5で用いられたものと同一である。SPVホモロジー下流は，SPV HindIII消化断片 M (23)の約2156塩基対のAccIからHindIIIまでの制限酵素切断亜断片(sub-fragment)である。SPV相同性ベクター中のAccIサイトは特異なXbaIサイトに転換された。
【０１５８】
S -SPV-018を構築するための相同性ベクター  
(LacZ/ PRV gE 相同性ベクター) ：
相同性ベクター は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。プラスミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子とPRV gE遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約1484塩基対断片である。外来遺伝子の下流はSPV DNAの約2149塩基対断片である。このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じる。β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子は合成後期(late) 痘プロモーター(LP1)の制御下に，PRV gE 遺伝子は合成初期/後期(early/ late) 痘プロモーター(EP1LP2)の制御下にあることに留意されたい。この相同性ベクターは標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下に示す合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。このプラスミドベクターはpSP64 (プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。断片１はSPV HindIII消化断片 M (23)のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片2はプラスミド520-17.5で用いられたものと同一のLacZプロモーターとマーカー遺伝子である。断片3はPRV BamHI #7  DNA断片に由来するPRVの，DraIからMluIまでの約2484塩基対の亜断片(sub-fragment)である。DraIサイトは合成DNAリンカーを用いてEcoRIサイトに転換された。DraIは本来のgE 開始コドンの45 bp上流に位置し，タンパク質のアミノ末端側のオープンリーディングフレームを15アミノ酸伸長する。合成痘プロモーター/EcoRI  DNAリンカーはさらに４つのアミノ酸を付加した．結局，付加された19個のアミノ酸を含む合成されたgE 遺伝子がgEのアミノ末端に融合された。19個のアミノ酸とはMet-Asn-Ser-Gly-Asn-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Ser-Leu-Ala-His-Thr-Gly-Val-Glu-Thrである。断片4は，SPV HindIII消化断片 M (23)のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片1と断片4中のAccIサイトは合成DNAリンカーを用いてPstIサイトに転換された。
【０１５９】
相同性ベクター520-90.15
プラスミド520-90.15は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。このプラスミドは外来DNAが挿入されうる特異なNdeI制限酵素サイトを含んでいる。NdeIサイトに外来DNA挿入（断片）を有しているプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来DNAを有するウィルスが生じるだろう。プラスミド520-90.15は標準的な組み換えDNA技術を用い(22と30)，以下に示す供給源からの２つ制限酵素（切断）断片を結合させることで構築される。１つめの断片はpSP64(プロメガ) (プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972 塩基対の制限酵素切断断片である。２番目の断片はSPV HindIII消化断片 G (23)のHindIIIからBamHIまでの約1700塩基対の亜断片(sub-fragment)である。
【０１６０】
相同性ベクター 708-78.9
プラスミド 708-78.9は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。プラスミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子と感染性ウシ鼻気管炎ウィルス(IBRV) gE 遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約1484塩基対断片である。外来遺伝子の下流はSPV DNAの約2149塩基対断片である。このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう。β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子は合成後期(late) 痘プロモーター(LP1)の制御下に，  IBRV gE遺伝子は合成後期/初期(late/early) 痘プロモーター(LP2EP2)の制御下にあることに留意されたい。相同性ベクターは標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下に示す供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。このプラスミドベクターはpSP64 (プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。断片１はSPV HindIII消化断片 M (23)のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片2は末端にEcoRIとBamHIサイトをもつ約475塩基対の断片である。EcoRIサイトとBamHIサイトはPCRクローニングにより合成された。PCR産物には全アミノ酸をコードしているIBRV gE遺伝子の配列を含む．PCRクローニング手法において，以下に示されたプライマーはIBR-000ウィルス(クーパー株)(Cooper Strain) (44) からなる テンプレートとともに用いられた。１つめのプライマー2/94.5DR
(5'-CTGGTTCGGCCCAGAATTCGATGCAACCCACCGCGCCGCCCCG-3') 
(SEQ ID NO: 116)
は，IBR gE  遺伝子上で，アミノ酸1の位置にバインド(sit down)し，IBRV gE 遺伝子の5'末端にEcoRIサイトを，タンパク質のアミノ末端に２つのアミノ酸付加を導入する。２つめのプライマー4/93.18DR
(5'-CTCGCTCGCCCAGGATCCCTAGCGGAGGATGGACTTGAGTCG-3') 
(SEQ ID NO: 117)
は，プライマー1に対する逆鎖上の，IBRV gE配列 (44)上の略アミノ酸648の位置にバインド(sit down)し，IBRV gE遺伝子の5'末端方向に合成をプライミング(priming)する。PCR産物はIBRV gE 遺伝子に相当する長さ約1950塩基対の断片を得るために，EcoRIとBamHIを用いて消化された。断片3はプラスミドpJF751 (11) のBamHIからPvuIIまでの約3002塩基対の制限酵素断片である。断片4はSPV HindIII消化断片 M のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片1と断片4中のAccIサイトはNotIリンカーを用いて特異なNotIサイトに転換された。
【０１６１】
相同性ベクター 723-59A9.22
プラスミド723-59A9.22は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。プラスミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子とウマインフルエンザウィルス NA PR/56 遺伝子をもつ．このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると， 外来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じる。β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子は合成後期(late) 痘プロモーター(LP1)の制御下に，EIV PR/56 NA遺伝子は合成後期/初期(late/early) 痘プロモーター(LP2EP2)の制御下にあることに留意されたい。プラスミドの詳細を図18A-18Dに示す。相同性ベクターは標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下に示す適当な合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。このプラスミドベクターはpSP64 (プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。断片１はSPV HindIII消化断片 M (23)のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である。断片2はウマインフルエンザA/プラハ/56 (血清型 1 (N7) ウィルス)由来のNA遺伝子をコードしている領域であり，cDNAのプライミング(priming)のために以下のプライマー
5'-GGGATCCATGAATCCTAATCAAAAACTCTTT-3' (SEQ ID NO:118)
を用い，大きさ約1450塩基対のBamHI断片としてクローニングされたものである。そしてそれはPCRのため
5'-GGGATCCTTACGAAAAGTATTTAATTTGTGC-3' (SEQ ID NO:119)
と結合させられた。(「ウマインフルエンザウィルス赤血球凝集素とノイラミニダーゼ(Neuraminidase)遺伝子のクローニング」参照)．断片3はプラスミドpJF751 (11) のBamHIからPvuIIまでの約3010塩基対の制限酵素断片である。断片4はSPV HindIII消化断片 M (23) のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)である。SPV 相同性ベクター中のAccIサイトは特異なNotIサイトに転換された。
【０１６２】
相同性ベクター７２７−５４．６０
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために、プラスミド７２７−５４．６０を構築した。これにより、ＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇII（ｇＢ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより、上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第１９Ａ−１９Ｄ図に示されている。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、第１９Ａ−１９Ｄ図に示す合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記の起源に由来する制限断片を相互に結合させることにより構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）から入手可能な略２９７２塩基対のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対のＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ゲノムＰＲＶ  ＤＮＡのＫｐｎＩ  Ｃ断片（２１）内にあるＰＲＶ  ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略３５００塩基対断片である。断片２は、ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２１）とを含有する。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【０１６３】
相同性ベクター７２７−６７．１８
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７２７−６７．１８を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したＢ型肝炎ウイウスコア抗原遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第２０Ａ−２０Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、第２０Ａ−２０Ｄ図に示す合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片３は、末端にＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ制限部位を有する略５８９塩基対断片である。本断片はＢ型肝炎コア抗原をコードする塩基配列（アミノ酸２５−２１２）（４５、５０参照）を含有する。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡｃｃＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【０１６４】
相同性ベクター７３２−１８．４
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７３２−１８．４を用いた。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したウマインフルエンザウイルスＡＫ／９１ＮＡ遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ウマインフルエンザウイルスＡＫ／９１ＮＡ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第２１Ａ−２１Ｄ図に示す。本相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、適切な合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ｃＤＮＡプライミング用の５’−ＧＧＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＡ−３’（配列番号：１２４）にＰＣＲ用５’−ＧＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＡＴＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＡＡＡ−３’（配列番号：１２５）を結合したプライマーを用いて略１４５０塩基対ＳａｌＩ断片としてクローニングを行ったウマインフルエンザＡ／アラスカ／９１（抗原型２（Ｎ８）ウイルス）由来のＮＡ遺伝子をコードする領域である（「ウマインフルエンザウイルス血球凝集素及びノイラミニダーゼ遺伝子のクローニング」参照）。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜制限断片である。本ＳＰＶ相同性ベクターのＡｃｃＩ部位は、非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【０１６５】
相同性ベクター７４１−８０．３
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７４１−８０．３を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子はヒトサイトメガロウイルス即時早期（ＨＣＭＶ  ＩＥ）プロモーターの制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第２２Ａ−２２Ｃ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、第２２Ａ−２２Ｃ図に示す合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーター（４６）を含有するＨＣＭＶ  ２．１ｋｂ  ＰｓｔＩ断片から誘導した１１５４塩基対ＰｓｔＩ−ＡｖａII断片である。断片３は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導した３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片である。断片４は、ＰＲＶ  ｇＸ遺伝子のポリアデニル化シグナルとカルボキシ末端の１９個のアミノ酸とを含有するＰＲＶ  ＢａｍＨＩ  ＃７から誘導した略７５０塩基対ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片である。断片５は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片５のＡｃｃＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【０１６６】
相同性ベクター７４１−８４．１４
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７４１−８４．１４を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ヒトＩＬ−２遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。ヒトＩＬ−２タンパク質をコードする配列は、そのアミノ末端で膜輸送用ＰＲＶ  ｇＸシグナル配列に融合する。本プラスミドの詳細は第２３Ａ−２３Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、第２３Ａ−２３Ｄ図に示す合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、末端にＥｃｏＲＩとＢｇｌII制限部位を有する略４７５塩基対断片である。ＥｃｏＲＩ部位はＰＣＲクローニングにより合成され、ＢｇｌII部位はヒトＩＬ−２ｃＤＮＡ（４３、４７）の３’末端に位置する。ＰＣＲ生産物は、ＰＲＶ  ｇＸシグナル配列−ヒトＩＬ−２遺伝子の全アミノ酸コード配列を含有する。本法では、ＰＲＶ  ｇＸシグナル配列−ヒトＩＬ−２のｃＤＮＡ（４３）から成る鋳型を用いて下記プライマーを適用した。第１プライマー５／９４．２３（５’−ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＧＣ−３’）（配列番号：１２６）は、ＰＲＶ  ｇＸシグナル配列上の第１番目アミノ酸の位置に坐し、上記遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。第２プライマー５／９４．２４（５’−ＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡ−３’）（配列番号：１２７）は、ヒトＩＬ−２遺伝子配列上のプライマー５／９４．２３の反対鎖上の３’非翻訳領域内に坐し、上記遺伝子の５’末端方向にプライミングを行う。ＰＣＲ生産物をＥｃｏＲＩとＢｇｌII（ＢｇｌIIはヒトＩＬ−２遺伝子のための停止コドンを略３個のヌクレオチド分越えたところに位置する）を用いて消化して長さにおいてＰＲＶ  ｇＸシグナル配列−ヒトＩＬ−２遺伝子に対応する４７５塩基対断片を生成した。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡｃｃＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【０１６７】
相同性ベクター７４４−３４
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７４４−３４を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したウマヘルペスウイルス１型ｇＢ遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第２４Ａ−２４Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、第２４Ａ−２４Ｄ図に示す合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、末端にＥｃｏＲＩとＰｍｅＩ制限部位を有する略２９４１塩基対断片である。断片２は、略２９４１塩基対ＥｃｏＲＩ−ＰｍｅＩ断片である。断片２は、５’末端にＥＨＶ−１ゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ“ａ”断片内の自然ＢａｍＨＩ部位と合成ＥｃｏＲＩ部位を有する略４２９塩基対ＰＣＲ断片並にＥＨＶ−１ゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ“ｉ”断片内のＢａｍＨＩ−ＰｍｅＩを３’末端に有する略２５１２塩基対制限断片（４８）として合成された。５’末端ＰＣＲ断片を製造する際、ＥＨＶ−１  ＢａｍＨＩ“ａ”並に“ｉ”断片から成る鋳型を用いて下記プライマーを適用した。第１プライマー５／９４．３（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＧＧＴＴＧＣＣＧＴ−３’）（配列番号：１２８）は、ＥＨＶ−１  ｇＢ配列上の第２番目アミノ酸の位置に座し、上記ＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入しさらにＡＴＧ開始コドンを導入する。第２プライマー５／９４．４（５’−ＧＡＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＧＧＣＧＧＴ−３’）（配列番号：１２９）は、ＥＨＶ−１  ｇＢ配列上のプライマー５／９４．３の反対鎖上の略１４４番目アミノ酸の位置に座し、上記遺伝子の５’末端方向にプライミングを行う。ＰＣＲ生産物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを用いて消化して鎖長においてＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子の５’末端に対応する４２９塩基対断片を生成した。断片２は、ＰＣＲ反応生成物（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）と制限断片（ＢａｍＨＩ−ＰｍｅＩ）を連結して鎖長略２９４１塩基対（９７９個のアミノ酸）のＥｃｏＲＩ−ＰｍｅＩ断片であるＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子を生成したものである。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡｃｃＩ部位は、ＮｏｔＩリン���ーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【０１６８】
相同性ベクター７４４−３８
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７４４−３８を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したウマヘルペスウイルス１型ｇＤ遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＥＨＶ−１  ｇＤ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第２５Ａ−２５Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、第２５Ａ−２５Ｄ図に示す合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＥＨＶ−１のＢａｍＨＩ“ｄ”断片（４８）内の略１２４０塩基対ＨｉｎｄIII断片である。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡｃｃＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【０１６９】
相同性ベクター６８９−５０．４
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド６８９−５０．４を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した伝染性嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）ポリプロテイン遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＩＢＤＶポリプロテイン遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、プラスミド２−８４／２−４０（５１）由来の末端にＳｍａＩとＨｐａＩ制限部位を有する略３４００塩基対断片である。この断片は、ＩＢＤＶポリプロテインをコードする配列を含有する。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII断片である。断片１と断片４のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【０１７０】
相同性ベクター６８９−５０．７
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド６８９−５０．７を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した伝染性嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、両末端にＢｃｌＩとＢａｍＨＩ制限部位を有する略１０８１塩基対断片である。本断片は、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードしており、全鎖長ＩＢＤＶ  ｃＤＮＡクローン（５１）から誘導される。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【０１７１】
相同性ベクター７５１−０７．Ａ１
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７５１−０７．Ａ１を用いた。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ｃＩＦＮ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、適切な合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１１４６塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、コンカナバリンＡ刺激ニワトリ脾臓細胞から分離されたＲＮＡの逆転写並にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）より誘導されたｃＩＦＮ遺伝子（５４）をコードする略５７７塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩ断片である。逆転写とＰＣＲのために用いたアンチセンスプライマー（６／９４．１３）は５’−ＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＧＴＴＴＧＧＧＧＣＴＡＡＧＴＧＣ−３’（配列番号：２１１）であった。ＰＣＲのため用いたセンスプライマー（６／９４．１２）は５’−ＣＣＡＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＣＧＣＧＡＧＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴ−３’（配列番号：２１２）であった。逆転写とＰＣＲにより得られたＢａｍＨＩ断片はゲル精製され、５’末端に非反復ＥｃｏＲＩ部位を導入し３’末端に非反復ＢｇｌII部位を導入するための第２ＰＣＲ反応用鋳型として用いられた。第２ＰＣＲ反応では５’末端でプライマー６／９４．２２（５’−ＣＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧー３’、配列番号：２１３）を用い、３’末端でプライマー６／９４．３４（５’−ＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＴＧＣＧＴＴＴＧＧＧＧＣＴＡＡＧＴＧＣ−３’、配列番号：２１４）を用いて略５７７塩基対断片を産生した。このＤＮＡ断片は、ニワトリインターフェロンをコードする成熟タンパク質の１６２個アミノ酸とアミノ末端の３１個アミノ酸シグナル配列とを含んでなるニワトリインターフェロンタンパク質（５４）の第１番目アミノ酸から第１９３番目アミノ酸までをコードする配列を含有する。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）の略２１５６塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII制限亜断片である。本ＳＰＶ相同性ベクターのＡＣＣＩ部位は、非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【０１７２】
相同性ベクター７５１−５６．Ａ１
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７５１−５６．Ａ１を用いた。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ｃＭＧＦ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、適切な合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１１４６塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、コンカナバリンＡ刺激ニワトリ脾臓細胞から分離されたＲＮＡの逆転写並にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）より誘導されたｃＭＧＦ遺伝子（５５）をコードする略６４０塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片である。逆転写とＰＣＲのために用いたアンチセンスプライマー（６／９４．２０）は５’−ＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧ−３’（配列番号：２１５）であった。ＰＣＲのため用いたセンスプライマー（６／９４．５）は５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号：２１６）であった。ＰＣＲより誘導されたＢａｍＨＩ断片はサブクローニングを行ってプラスミドとし、第２ＰＣＲ反応用鋳型として用いた。第２ＰＣＲ反応では５’末端でプライマー６／９４．１６（５’−ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＣＣＴＧＴＧ−３’、配列番号：２１７）を用い、３’末端でプライマー６／９４．２０（５’−ＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧ−３’、配列番号：２１８）を用いて略６４０塩基対断片を産生した。このＤＮＡ断片は、ｃＭＧＦをコードする成熟タンパク質の１７８個アミノ酸とアミノ末端の２３個アミノ酸シグナル配列とを含んでなるｃＭＧＦタンパク質（５５）の第１番目アミノ酸から第２０１番目アミノ酸までをコードする配列を含有する。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）の略２１５６塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII制限亜断片である。本ＳＰＶ相同性ベクターのＡｃｃＩ部位は、非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【０１７３】
相同性ベクター７５２−２２．１
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７５２−２２．１を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略８５５塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１１１３塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあることが注目される。本相同性ベクターはまた第２の外来遺伝子が非反復ＢａｍＨＩあるいはＥｃｏＲＩ部位に挿入された合成後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）を含有する。本プラスミドの詳細は第２８Ａ−２８Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、第２８Ａ−２８Ｄ図に示す合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６５（プロメガ社）の略２５１９塩基対ＨｉｎｄIII−ＳｐｈＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略８５５塩基対亜断片である。すなわちＤＮＡプライマーである５’−ＧＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡＴＡ−３’（配列番号：１８５）と５’−ＣＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：１８６）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行いＳｐｈＩ並にＢｇｌII末端を有する８５５塩基対断片を合成した。断片２は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含むプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導された３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１１１３塩基対亜断片である。即ち、ＤＮＡプライマーである５’−ＣＣＧＴＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴ−３’（配列番号：１８７）と５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＴ−３’（配列番号：１８８）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行いＳａｌＩ並にＨｉｎｄIII末端を有する１１１３塩基対断片を合成した。
【０１７４】
相同ベクター７５２−２９．３３
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７５２−２９．３３を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したウマヘルペスウイルス１型ｇＢ遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略８５５塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１１３塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。ＬＰ２ＥＰ２プロモーター／ＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子カセットは同族ベクター７３８−９４．４のＮｏｔＩ部位へ挿入された。同族ベクター７５２−２９．３３は、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６５（プロメガ社）の略２５１９塩基対ＨｉｎｄIII−ＳｐｈＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略８５５塩基対亜断片である。すなわち、ＤＮＡプライマーである５’−ＧＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡＴＡ−３’（配列番号：１８５）と５’−ＣＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：１８６）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行いＳｐｈＩ並にＢｇｌII末端を有する８５５塩基対断片を合成した。断片２は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含むプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導された３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片である。断片３は、ＰＣＲ反応生成物（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）と制限断片（ＢａｍＨＩ−ＰｍｅＩ）を連結して鎖長略２９４１塩基対（９７９個のアミノ酸）のＥｃｏＲＩ−ＰｍｅＩ断片であるＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子を生成したものである。上記ＰＣＲ断片は、ＥＨＶ−１ゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ“ａ”断片内の３’末端に自然ＢａｍＨＩ部位を有しこの遺伝子の５’末端に合成ＥｃｏＲＩ部位を有する略４２９塩基対断片である。上記制限断片は、ＥＨＶ−１ゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ“Ｉ”断片内のＢａｍＨＩからＰｍｅＩに至る略２５１２塩基対断片である。５’末端ＰＣＲ断片を製造する際、ＥＨＶ−１  ＢａｍＨＩ“ａ”並に“ｉ”断片から成る鋳型を用いて下記プライマーを適用した。第１プライマー５／９４．３（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＧＧＴＴＣＧＣＣＧＴ−３’）（配列番号：１２８）は、ＥＨＶ−１  ｇＢ配列上の第２番目アミノ酸の位置に座し、上記ＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入しさらにＡＴＧ開始コドンを導入する。第２プライマー５／９４．４（５’−ＧＡＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＧＧＣＧＧＴ−３’）（配列番号：１２９）は、ＥＨＶ−１  ｇＢ配列上のプライマー５／９４．３の反対鎖上の略１４４番目アミノ酸の位置に座し、上記遺伝子の５’末端方向にプライミングを行う。ＰＣＲ生産物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを用いて消化して鎖長においてＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子の５’末端に対応する４２９塩基対断片を生成した。上記のように、断片３は、ＰＣＲ反応生成物（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）と制限断片（ＢａｍＨＩ-ＰｍｅＩ）を連結して鎖長略２９４１塩基対（９７９個のアミノ酸）のＥｃｏＲＩ−ＰｍｅＩ断片であるＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子を生成したものである。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１１１３塩基対亜断片である。即ち、ＤＮＡプライマーである５’−ＣＣＧＴＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴ−３’（配列番号：１８７）と５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＴ−３’（配列番号：１８８）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行いＳａｌＩ並にＨｉｎｄIII末端を有する１１１３塩基対断片を合成した。
【０１７５】
相同性ベクター７４６−９４．１
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７４６−９４．１を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した伝染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略８５５塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１１１３塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＩＢＲＶ  ｇＥ遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。ＩＢＲＶ  ｇＥ遺伝子（カルボキシ末端膜内外領域のアミノ酸１５８個が欠如）の第１番目アミノ酸から第４１７番目アミノ酸をコードする１２５０塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を相同性ベクター７５２−２２．１（第２８Ａ−２８Ｄ図）の非反復ＥｃｏＲＩ並にＢａｍＨＩ部位に挿入した。上記１２５０塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片は、ＩＢＲＶ（Ｃｏｏｐｅｒ）ゲノムＤＮＡを鋳型として用い、プライマー１０／９４．２３（５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＧＣＡＡＣＣＣＡＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＣ−３’；配列番号：２１９）をＩＢＲＶ  ｇＥ遺伝子の５’末端（第１番目アミノ酸）で且つプライマー１０／９４．２２（５’−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＴＣＧＣＴ−３’；配列番号：２２０）をＩＢＲＶ  ｇＥ遺伝子の第４１７番目アミノ酸で用いてポリメラーゼ連鎖反応（１５）を行い合成した。
【０１７６】
相同性ベクター７６７−６７．３
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７６７−６７．３を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したウシウイルス性下痢症ウイルス糖タンパク質５３（ＢＶＤＶ  ｇｐ５３）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略８５５塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１１１３塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＢＶＤＶ  ｇｐ５３遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。ＢＶＤＶ  ｇｐ５３をコードする１１８７塩基対ＢａｍＨＩ断片を相同性ベクター７５２−２２．１（第２８Ａ−２８Ｄ図）の各非反復ＢａｍＨＩ部位に挿入した。上記１１８７塩基対ＢａｍＨＩ断片は、「ウシウイルス性下痢症ウイルスｇｐ４８並にｇｐ５３遺伝子のクローニング」に記載のポリメラーゼ連鎖反応（１５）により合成した。
【０１７７】
相同性ベクター７７１−５５．１１
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７７１−５５．１１を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したウシウイルス性下痢症ウイルス糖タンパク質４８（ＢＶＤＶ  ｇｐ４８）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略８５５塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１１１３塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＢＶＤＶ  ｇｐ４８遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。ＢＶＤＶ  ｇｐ４８をコードする６７８塩基対ＢａｍＨＩ断片を相同ベクター７５２−２２．１（第２８Ａ−２８Ｄ図）の各非反復ＢａｍＨＩ部位に挿入した。上記６７８塩基対ＢａｍＨＩ断片は、「ウシウイルス性下痢症ウイルスｇｐ４８並にｇｐ５３遺伝子のクローニング」に記載のポリメラーゼ連鎖反応（１５）により合成した。
【０１７８】
相同性ベクター５５１−４７．２３
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド５５１−４７．２３を構築した。本プラスミドには大腸菌β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕ）標識遺伝子が後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下に取込まれる。上記標識遺伝子をＳＰＶゲノムの部位に挿入し組換え豚痘ウイルスを産生することは有用である。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い下記源由来の制限断片を結合して構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６５（プロメガ社）の略３００５塩基対ＨｉｎｄIII制限断片から誘導した。断片１は、プラスミドｐＲＡＪ２６０（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）の略１８２３塩基対ＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ断片である。ＥｃｏＲＩとＳｍａＩ部位はＰＣＲクローニングにより導入されたものであることが注目される。プラスミド５５１−４７．２３を用いて組換え豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５９，Ｓ−ＳＰＶ−０６０，Ｓ−ＳＰＶ−０６１並にＳ−ＳＰＶ−０６２を産生した。
【０１７９】
相同性ベクター７７９−９４．３１
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７７９−９４．３１を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢ（ｇII）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略５３８塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１１８０塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第３０Ａ−３０Ｅ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９８６塩基対ＨｉｎｄIII−ＰｓｔＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略５４２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢｇｌII制限亜断片である。断片２は、ゲノムＰＲＶ  ＤＮＡのＫｐｎＩ  Ｃ断片（２１）内のＰＲＶ  ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略３５００塩基対断片である。断片２は、ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２１）とを含有する。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１１８０塩基対ＢｇｌII−ＰｓｔＩ亜断片である。断片１と断片４のＢｇｌII部位は、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位へ変換した。
【０１８０】
相同性ベクター７８９−４１．７
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８９−４１．７を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢ（ｇII）遺伝子とＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）遺伝子並に大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１５６０塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子は合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第３１Ａ−３１Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子の第３番目アミノ酸から第２７９番目アミノ酸をコードする配列を含有するＰＲＶ  ＢａｍＨＩ  ＃７断片の略１５５２塩基対亜断片である。ＥｃｏＲＩ部位とＡＴＧ翻訳開始コドンはＥｃｏＲＩ部位を有する５’プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応から誘導される。３’末端のＳｔｕＩ部位は通常、ＰＲＶ  ｇＩ遺伝子３’−ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子内にある。ＥｃｏＲＩ部位に始まる全オープンリーディングフレームは４０５個アミノ酸をコードする。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII  Ｍ断片の略４８塩基対ＡｃｃＩ−ＮｄｅＩ亜断片である。断片４は、ゲノムＰＲＶ  ＤＮＡ（２１）のＫｐｎＩ  Ｃ断片内のＰＲＶ  ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略３５００塩基対断片である。断片４は、ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２１）とを含有する。断片５は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片６は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１５６０塩基対ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片３のＡｃｃＩ部位は、ＰｓｔＩリンカーを用いて非反復ＰｓｔＩ部位へ変換した。断片３と断片６のＮｄｅＩ部位は、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位へ変換した。ＳＰＶ断片３と６に広がる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIIIＭ断片の略５４５塩基対ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩ亜断片（ヌクレオチド番号１５６０乃至２１０４；配列番号：  ）が欠失していた。
【０１８１】
相同性ベクター７８９−４１．２７
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８９−４１．２７を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢ（ｇII）遺伝子とＰＲＶ  ｇＣ（ｇIII）遺伝子並に大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１５６０塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＣ遺伝子は合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第３２Ａ−３２Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、図示合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１５６０塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限亜断片である。断片２は、ゲノムＰＲＶ  ＤＮＡのＫｐｎＩ  Ｃ断片（２１）内のＰＲＶ  ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略３５００塩基対断片である。断片２は、ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２１）とを含有する。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIIIＭ断片の略４８塩基対ＡｃｃＩ−ＮｄｅＩ亜断片である。断片５は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ  ＃２並に＃９の亜断片であるプラスミド２５１−４１．Ａの略２３７８塩基対ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ断片である。本断片末端のＮｃｏＩ部位をＥｃｏＲＩリンカーにより置換した。断片６は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＡｃｃＩ−ＢｇｌII制限亜断片である。断片１と断片４のＮｄｅＩ部位は、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位へ変換した。断片４と断片６のＡｃｃＩ部位は、ＰｓｔＩリンカーを用いて非反復ＰｓｔＩ部位へ変換した。ＳＰＶ断片４と６に広がる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIIIＭ断片の略５４５塩基対ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩ亜断片（ヌクレオチド番号１５６０乃至２１０４；配列番号：  ）が欠失していた。
【０１８２】
相同性ベクター７８９−４１．４７
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８９−４１．４７を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＣ（ｇIII）遺伝子とＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）遺伝子並に大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１５６０塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＣ遺伝子は合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子も合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第３３Ａ−３３Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子の第３番目アミノ酸から第２７９番目アミノ酸をコードする配列を含有するＰＲＶ  ＢａｍＨＩ  ＃７断片の略１５５２塩基対亜断片である。ＥｃｏＲＩ部位とＡＴＧ翻訳開始コドンはＥｃｏＲＩ部位を有する５’プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応から誘導される。３’末端のＳｔｕＩ部位は通常、ＰＲＶ  ｇＩ遺伝子３’−ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子内にある。ＥｃｏＲＩ部位に始まる全オープンリーディングフレームは４０５個アミノ酸をコードする。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII  Ｍ断片の略４８塩基対ＡｃｃＩ−ＮｄｅＩ亜断片である。断片４は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片５は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ＃２並に＃９の亜断片であるプラスミド２５１−４１．Ａの略２３７８塩基対ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ断片である。本断片末端のＮｃｏＩ部位をＥｃｏＲＩリンカーにより置換した。断片６は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１５６０塩基対ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片３のＡｃｃＩ部位は、ＰｓｔＩリンカーを用いて非反復ＰｓｔＩ部位へ変換した。断片３と断片６のＮｄｅＩ部位は、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位へ変換した。ＳＰＶ断片３と６に広がる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIIIＭ断片の略５４５塩基対ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩ亜断片（ヌクレオチド番号１５６０乃至２１０４；配列番号：  ）が欠失していた。
【０１８３】
相同性ベクター７８９−４１．７３
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８９−４１．７３を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢ（ｇII）遺伝子とＰＲＶ  ｇＣ（ｇIII）遺伝子とＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）遺伝子並に大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１５６０塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＣ遺伝子は合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第３４Ａ−３４Ｅ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子の第３番目アミノ酸から第２７９番目アミノ酸をコードする配列を含有するＰＲＶ  ＢａｍＨＩ  ＃７断片の略１５５２塩基対亜断片である。ＥｃｏＲＩ部位とＡＴＧ翻訳開始コドンはＥｃｏＲＩ部位を有する５’プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応から誘導される。３’末端のＳｔｕＩ部位は通常、ＰＲＶ  ｇＩ遺伝子３’−ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子内にある。ＥｃｏＲＩ部位に始まる全オープンリーディングフレームは４０５個アミノ酸をコードする。断片３は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ  ＃２並に＃９の亜断片であるプラスミド２５１−４１．Ａの略２３７８塩基対ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ断片である。本断片末端のＮｃｏＩ部位をＥｃｏＲＩリンカーにより置換した。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII  Ｍ断片の略４８塩基対ＡｃｃＩ−ＮｄｅＩ亜断片である。断片５は、ゲノムＰＲＶ  ＤＮＡ（２１）のＫｐｎＩ  Ｃ断片内のＰＲＶ  ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略３５００塩基対断片である。断片５は、ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２１）とを含有する。断片６は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片７は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１５６０塩基対ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片３のＡｃｃＩ部位は、ＰｓｔＩリンカーを用いて非反復ＰｓｔＩ部位へ変換した。断片３と断片６のＮｄｅＩ部位は、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位へ変��した。ＳＰＶ断片３と６に広がる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII  Ｍ断片の略５４５塩基対ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩ亜断片（ヌクレオチド番号１５６０乃至２１０４；配列番号：  ）が欠失していた。
【０１８４】
相同性ベクター７９１−６３．１９
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７９１−６３．１９を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片３のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【０１８５】
相同性ベクター７９１−６３．４１
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７９１−６３．４１を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片３のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【０１８６】
相同性ベクター７９６−１８．９
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７９６−１８．９を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成早期痘プロモーター（ＥＰ１）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片３のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【０１８７】
相同性ベクター７８３−３９．２
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８３−３９．２を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したウシウイルス性下痢症ウイルス糖タンパク質５３（ＢＶＤＶ  ｇｐ５３）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＢＶＤＶ  ｇｐ５３遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させ構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＢＶＤＶ  ｇｐ５３をコードする略１１８７塩基対ＢａｍＨＩ断片である。この１１８７塩基対ＢａｍＨＩ断片は「ウシウイルス性下痢症ウイルスｇｐ４８並にｇｐ５３遺伝子のクローニング」に記載のポリメラーゼ連鎖反応（１５）により合成した。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡｃｃＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【０１８８】
相同性ベクター７４９−７５．７８
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７４９−７５．７８を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した伝染性嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）ポリメラーゼ遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子は合成後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＩＢＤＶ  ＲＮＡ鋳型からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とｃＤＮＡクローニングにより合成した略２７００塩基対ＥｃｏＲＩ−ＡｓｃＩ制限断片である。ｃＤＮＡとＰＣＲプライマー（５’−ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣ−３’；１２／９３．４）（配列番号：）並に（５’−ＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＧＣＣＡＧＧ−３’；９／９３．２８）（配列番号：）を用いてＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子の５’末端に略１４００塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩ断片を合成した。また、ｃＤＮＡとＰＣＲプライマー（５’−ＡＣＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＣＣＡＴ−３’；１２／９３．２）（配列番号：）並に（５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＡＡＧＧＣＣＧＧＧＧＡＴＡＣＧＧ−３’；１２／９３．３）（配列番号：）を用いてＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子の３’末端に略１８００塩基対ＢｃｌＩ−ＡｓｃＩ断片を合成した。これらの二個の断片をＢｃｌＩ部位で連結して略２７００塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩ断片を産生した。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡｃｃＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【０１８９】
相同性ベクター７６１−７５．Ｂ１８
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７６１−７５．Ｂ１８を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）プロテアーゼ（ｇａｇ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略８５５塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１１１３塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘ウイルスＯｌＬ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＦＩＶ  ｇａｇ遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２５１９塩基対ＨｉｎｄIII−ＳｐｈＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略８５５塩基対亜断片である。すなわち、ＤＮＡプライマーである５’−ＧＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡＴＡ−３’（配列番号：１８５）と５’−ＣＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：１８６）を用いるポリメラーゼ連鎖反応を行いＳｐｈＩ並にＢｇｌII末端を有する８５５塩基対断片を合成した。断片２は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導された３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片である。断片３は、ＦＩＶ（ＰＰＲ株）（６１）由来のｃＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成した略１８７８塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌII制限断片である。プライマー（５’−ＧＣＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＡＡＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＧＡＧＡＴ−３’；１１／９４．９）（配列番号：）はＦＩＶ  ｇａｇ遺伝子の５’末端から合成され、この遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を更にＡＴＧ開始コドンを導入する。プライマー（５’−ＧＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＣＣ−３’；１１／９４．１０）（配列番号：）は、ＦＩＶ  ｇａｇ遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産生物は、ＥｃｏＲＩとＢｇｌIIで消化してＦＩＶ  ｇａｇ遺伝子に対応する鎖長の１８７８塩基対断片を生成した。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１１１３塩基対亜断片である。すなわち、ＤＮＡプライマーである５’−ＣＣＧＴＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴ−３’（配列番号：１８７）と５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＴ−３’（配列番号：１８８）を用いるポリメラーゼ連鎖反応を行いＳａｌＩとＨｉｎｄIII末端を有する１１１３塩基対断片を合成した。
【０１９０】
相同性ベクター７８１−８４．Ｃ１１
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８１−８４．Ｃ１１を用いた。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）エンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＦＩＶ  ｅｎｖ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、適切な合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片３は、「ポリメラーゼ連鎖反応によるクローニング」に従い合成したＦＩＶ  ｅｎｖ遺伝子（６１）の略２５６４塩基対ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片である。このＰＣＲ反応のための鋳型としてＦＩＶ  ＰＰＲ株ゲノムｃＤＮＡ（６１）を用いた。ＦＩＶ  ＰＰＲ株ゲノムｃＤＮＡの６２６３番目ヌクレオチドに始まるＦＩＶ  ｅｎｖ遺伝子の５’末端に対応する上流プライマー１０／９３．２１（５’−ＧＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＴＴＴＧＣＡＧＣ−３’；配列番号：）を合成した。本法では５’末端にＢａｍＨＩ部位が導入された。このＢａｍＨＩ部位は、ＰＣＲ断片のクローニングの際破壊された。ＦＩＶ  ＰＰＲゲノムｃＤＮＡの８８２７番目ヌクレオチドに始まるＦＩＶ  ｅｎｖ遺伝子の３’末端に対応する下流プライマー１０／９３．２０（５’−ＣＣＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＣ−３’；配列番号：）を合成した。本法では３’末端にＢａｍＨＩ部位が導入された。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII制限亜断片である。本ＳＰＶ相同性ベクターのＡｃｃＩ部位は、非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
【実施例】
【０１９１】
実施例１
相同性ベクター５１５−８５．１
相同性ベクター５１５−８５．１は外来性ＤＮＡのＳＰＶへの挿入に有用なプラスミドである。プラスミド５１５−８５．１は、それに外来性ＤＮＡをクローン化し得る唯一のＡｃｃＩ制限部位を含有する。かかる外来性ＤＮＡインサートを含有するプラスミドを「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従って用いて、外来性ＤＮＡを含有するＳＰＶを得ることができる。この方法を首尾よく行うためには、挿入部位（ＡｃｃＩ）がＳＰＶの複製に必須ではない領域にあって、該部位に、ウイルスとプラスミドＤＮＡとの間の相同組換えを媒介するのに適した豚痘ウイルスＤＮＡがその端部に隣接することが重要である。相同性ベクター５１５−８５．１におけるＡｃｃＩ部位を用いて、外来性ＤＮＡを少なくとも３つの組換えＳＰＶに挿入する（実施例２−４参照）。
【０１９２】
適当な挿入部位を規定するために、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片のライブラリーを創製した。これらの制限断片のうちいつくかを（ＨｉｎｄIII断片Ｇ、ＪおよびＭ、図１Ａ−１Ｂ参照）制限マッピング解析に付した。可能な挿入部位として２つの制限部位が各断片で同定された。これらの部位は断片ＧにおけるＮｒｕＩ、断片ＪにおけるＢａｌＩおよびＸｂａＩ、および断片ＭにおけるＡｃｃＩおよびＰｓｔＩを含むものであった。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を可能な部位の各々に挿入した。得られたプラスミドを「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」で利用した。組換えウイルスの創製は「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶをスクリーニングするアッセイ」によって判断した。６つの部位のうち４つは組換えウイルスを生じることが判明したが、これらの各ウイルスが親ＳＰＶから精製除去される能力は大きく変動した。１つの場合において、ウイルスを１％のレベルを超えて精製できず、もう１つの場合において、ウイルスを５０％のレベルを超えて精製できが、および第３の場合において、ウイルスを９０％のレベルを超えて精製できなかった。これらのウイルスを精製できないことは、挿入部位における不安定性を示す。これは対応する部位を外来性ＤＮＡの挿入に不適当とする。しかしながら、１の部位（相同性ベクター５１５−８５．１のＡｃｃＩ部位）における挿入の結果、容易に１００％まで精製できたウイルスが得られ（実施例２参照）、これは外来性ＤＮＡの挿入のための適当な部位を規定する。
【０１９３】
相同性ベクター５１５−８５．１をＤＮＡ配列解析によってさらに特徴付けた。相同性ベクターの２つの領域を配列決定した。第１の領域は、唯一のＡｃｃＩ部位に隣接する５９９塩基対配列をカバーする（図２Ａおよび２Ｂ参照）。第２の領域は唯一のＨｉｎｄIII部位の上流の８９９塩基対をカバーする（図２Ａおよび２Ｂ参照）。第１の領域の配列はGoebelら,1990によって同定されたワクシニアウイルス（ＶＶ）ＯＩＬオープンリーディングフレームのアミノ酸１ないし１１５に対して相同性を示すオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする（図３Ａ−３Ｃ参照）。第２の領域の配列は同ワクシニアウイルスＯＩＬオープンリーディングフレームのアミノ酸５６８ないし６６６に対して相同性を示すオープンリーディングフレームをコードする（図３Ａ−３Ｃ参照）。これらのデータは、ＡｃｃＩ部位はほぼアミノ酸４１において推定ＶＶ  ＯＩＬ−様ＯＲＦを中断することを示し、これは、このＯＲＦがＳＰＶ複製につき必須でない遺伝子をコードすることを示唆する。Goebelらは、ＶＶ  ＯＩＬ  ＯＲＦはある種の真核生物転写調節蛋白質に特徴的なロイシンジッパー・モチーフを含有することを提案しているが、彼らはこの遺伝子がウイルス複製に必須か否かは知られていないことを示している。ＶＶ  ＯＩＬ−様ＯＲＦの上流に位置するＤＮＡ配列（図２Ａ参照）は豚痘ウイルスのプロモーターを含有することが予測されるであろう。この豚痘ウイルスのプロモーターは豚痘ゲノムに導入された外来性ＤＮＡ対照要素として有用であろう。
【０１９４】
実施例２
Ｓ−ＳＰＶ−００３
Ｓ−ＳＰＶ−００３は外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリ（E. coli)β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子）をＳＰＶ  ５１５−８５．１ ＯＲＦに導入した。外来性遺伝子（ｌａｃＺ）は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
【０１９５】
Ｓ−ＳＰＶ−００３はＳ−ＳＰＶ−１００（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５２０−１７．５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−００３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現していたことを示す。ここに記載するアッセイはＶＥＲＯ細胞ならびにＥＭＳＫ細胞で行い、これはＶＥＲＯ細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産のための適当な基礎となろうことを示す。Ｓ−ＳＰＶ−００３は受託番号２３３５の下でＡＴＣＣに寄託された。
【０１９６】
実施例３
Ｓ−ＳＰＶ−００８
Ｓ−ＳＰＶ−００８は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＤ）（２６）についての遺伝子をＳＰＶ  ５１５−８５．１ ＯＲＦに挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｇ５０（ｇＤ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
【０１９７】
Ｓ−ＳＰＶ−００８はＳ−ＳＰＶ−１００（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５３８−４６．１６（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−００８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０１９８】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−００８を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＰＲＶ血清はＳ−ＳＰＶ−００８プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００９陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−００８で観察されたプラークはブタ抗血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。また、黒色プラーク・アッセイを固定されていない単層で行った。固定されていない単層上のＳＰＶプラークもブタ抗−ＰＲＶ血清との特異的反応性を呈し、これはＰＲＶ抗原が感染細胞表面で発現されることを示す。
【０１９９】
ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶで感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶ血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。図６に示すごとく、Ｓ−ＳＰＶ−００８感染細胞からの溶解物はほぼ４８ｋｄの特異的バンド、ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）（３５）の報告されたサイズを示す。
【０２００】
ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）はＨＳＶ−１（２６）のｇ５０（ｇＤ）同族体である。幾人かの研究者は、ＨＳＶ−１ ｇ５０（ｇＤ）を発現するＶＶはマウスをＨＳＶ−１での攻撃から保護することを示している（６および３４）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−００８はブタをＰＲＶ病から保護するためのワクチンとして価値があるはずである。
【０２０１】
いくつかの他のＰＲＶ糖蛋白質がＰＲＶ病から保護するための組換え豚痘ワクチンの創製で有用であろうことが予想される。これらのＰＲＶ糖蛋白質はｇＩＩ（２８）、ｇＩＩＩ（２７）、およびｇＨ（１９）を含む。ＰＲＶ  ｇＩＩＩ暗号領域はいくつかの合成ｐｏｘプロモーターの後に作成された。Ｓ−ＳＰＶ−００８の創製で利用した技術は、全ての４つのこれらのＰＲＶ糖蛋白質遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスを創製するのに使用されるであろう。かかる組換え豚痘ウイルスはＰＲＶ病に対するワクチンとして有用であろう。ここに記載するＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらは、ワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋR，ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋRおよびＣｌｉｎＥａｓｅR）と適合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−００８は受託番号ＶＲ２３３９の下でＡＴＣＣに寄託された。
【０２０２】
実施例４
Ｓ−ＳＰＶ−０１１
Ｓ−ＳＰＶ−０１１は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルスｇＩＩＩ（ｇＣ）についての遺伝子を相同性ベクター５７０−３３．３２の唯一のＰｓｔＩ制限部位（唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
【０２０３】
Ｓ−ＳＰＶ−００１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５７９−９１．２１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０１１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２０４】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０１１を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ヤギ抗−ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）ポリクローナル抗体はＳ−ＳＰＶ−０１１プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０１１で観察されたプラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＭＳＫ細胞で行い、ＥＭＳＫ細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した基礎となろうことが示される。
【０２０５】
ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶで感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ヤギ抗−ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）ポリクローナル抗体を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。図１６に示すごとく、Ｓ−ＳＰＶ−０１１感染細胞からの溶解物はほぼ９２ｋｄの特異的バンド、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）（３７）の報告されたサイズを示す。
【０２０６】
組換体で発現されたＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）はマウスおよびブタにおいて有意な免疫応答を誘導することが示された（３７、３８）。さらにｇＩＩＩ（ｇＣ）をｇＩＩ（ｇＢ）またはｇ５０（ｇＤ）と共に発現させた場合、ビルレントＰＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（３９）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０１１はブタをＰＲＶ病から保護するためのワクチンとして価値があるはずである。ここに記載するＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらは、ワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋR，ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋRおよびＣｌｉｎＥａｓｅR）と適合するであろう。
【０２０７】
実施例５
Ｓ−ＳＰＶ−０１２
Ｓ−ＳＰＶ−０１２は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルスｇＩＩＩ（ｇＣ）についての遺伝子を相同性ベクター５７０−３３．３２の唯一のＰｓｔＩ制限部位（唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成初期後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
【０２０８】
Ｓ−ＳＰＶ−０１２はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５７０−９１．４１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０１２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２０９】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０１２を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ヤギ抗−ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）ポリクローナル抗体はＳ−ＳＰＶ−０１２プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０１２で観察されたプラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＭＳＫ細胞およびＶＥＲＯ細胞で行い、ＥＭＳＫ細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した基礎となろうことが示される。
【０２１０】
ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳ−ＳＰＶ−０１２で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ヤギ抗−ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）ポリクローナル抗体を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。図１６に示すごとく、Ｓ−ＳＰＶ−０１２感染細胞からの溶解物は、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）（３７）の報告されたサイズである２つの特異的バンド−９２ｋｄ成熟形態および７４ｋｄプレ−ゴルジ形態を示す。
【０２１１】
組換体で発現されたＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）はマウスおよびブタにおいて有意な免疫応答を誘導することが示された（３７、３８）。さらにｇＩＩＩ（ｇＣ）をｇＩＩ（ｇＢ）またはｇ５０（ｇＤ）と共に発現させた場合、ビルレントＰＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（３９）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０１２はブタをＰＲＶ病から保護するためのワクチンとして価値があるはずである。ここに記載するＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらは、ワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋR，ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋRおよびＣｌｉｎＥａｓｅR）と適合するであろう。
【０２１２】
実施例６
Ｓ−ＳＰＶ−０１３
Ｓ−ＳＰＶ−０１３は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルスｇＩＩＩ（ｇＣ）についての遺伝子を相同性ベクター５７０−３３．３２の唯一のＰｓｔＩ制限部位（唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成後期初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０２１３】
Ｓ−ＳＰＶ−０１３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５７０−９１．６４（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０１３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２１４】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０１３を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ヤギ抗−ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）ポリクローナル抗体はＳ−ＳＰＶ−０１３プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０１２で観察されたプラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＭＳＫ細胞およびＶＥＲＯ細胞で行い、ＥＭＳＫ細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した基礎となろうことが示される。
【０２１５】
ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶで感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ヤギ抗−ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）ポリクローナル抗体を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。図１６に示すごとく、Ｓ−ＳＰＶ−０１３感染細胞からの溶解物は、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）（３７）の報告されたサイズである２つの特異的バンド−９２ｋｄ成熟形態および７４ｋｄプレ−ゴルジ形態を示す。
【０２１６】
組換体で発現されたＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）はマウスおよびブタにおいて有意な免疫応答を誘導することが示された（３７、３８）。さらにｇＩＩＩ（ｇＣ）をｇＩＩ（ｇＢ）またはｇ５０（ｇＤ）と共に発現させた場合、ビルレントＰＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（３９）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０１３はブタをＰＲＶ病から保護するためのワクチンとして価値があるはずである。ここに記載するＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらは、ワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋR，ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋRおよびＣｌｉｎＥａｓｅR）と適合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−０１３は受託番号２４１８の下でＡＴＣＣに寄託された。
【０２１７】
組換え豚痘ウイルスワクチンＳ−ＳＰＶ−００８およびＳ−ＳＰＶ−０１３を用いるアウエスキー病に対する保護
Ｓ−ＳＰＶ−００８およびＳ−ＳＰＶ−０１３を含有するワクチン（１×１０６ＰＦＵ／ｍｌ）（２種のウイルスの１：１混合物の２ｍｌ）を皮内接種または経口／咽頭スプレイによって、２群のブタ（群当たり５匹ブタ）に投与した。５匹ブタの対照群には皮内および経口／咽頭接種によってＳ−ＳＰＶ−００１を摂取させた。ワクチン接種から３週間後に、鼻孔内接種によってビルレントＰＲＶ株４９８２でブタを攻撃した。表は臨床的応答の要約を与える。該データは、Ｓ−ＳＰＶ−００１ワクチン接種対照と比較したＳ−ＳＰＶ−００８／Ｓ−ＳＰＶ−０１３ワクチン接種体におけるアウエスキー病からの保護の増加を支持する。
【０２１８】
ワクチン          接種経路    攻撃後の      攻撃後の      攻撃後の
呼吸系徴候    ＣＮＳ徴候    群平均
（徴候数／    （徴候数／  （臨床徴候
合計数）       合計数）     の日数）
S-SPV-008  ＋      皮内        ３／５        ０／５        ２.６
S-SPV-013 
S-SPV-008  ＋      経口／      ３／５        ０／５        ２.２
S-SPV-013          咽頭
S-SPV-001          皮内  ＋    ５／５        ２／５        ７.８
（対照）           蛍光／
咽頭
実施例７
Ｓ−ＳＰＶ−０１５
Ｓ−ＳＰＶ−０１５は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇＢ）についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦ（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｃｏｔＩ制限部位で置き換えた）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０２１９】
Ｓ−ＳＰＶ−０１５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７２７−５４．６０（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０１５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２２０】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０１５を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０１５プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０１５で観察されたプラークは該抗血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した基礎となろうことが示される。
【０２２１】
ＰＲＶ ｇＩＩ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０１５で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０１５感染細胞からの溶解物は、ＰＲＶ ｇＩＩ糖蛋白質の予測されたサイズである、１２０ｋｄ、６７ｋｄおよび５８ｋｄに対応するバンドを呈した。
【０２２２】
Ｓ−ＳＰＶ−０１５はブタにおいて仮性狂犬病ウイルスに対するワクチンとして有用である。優れたワクチンは、ブタにおいて仮性狂犬病に対する保護のためにＳ−ＳＰＶ−００８（ＰＲＶ  ｇ５０）、Ｓ−ＳＰＶ−０１３（ＰＲＶ  ｇＩＩＩ）と戦うことによって処方される。
【０２２３】
従って、Ｓ−ＳＰＶ−０１５はブタをＰＲＶ病から保護するためのワクチンとして価値があるはずである。ここに記載するＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらは、ワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋR，ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋRおよびＣｌｉｎＥａｓｅR）と適合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−０１５は受託番号２４６６の下でＡＴＣＣに寄託された。
【０２２４】
実施例８
ＰＲＶ糖蛋白質の１種のみを発現する組換え豚痘ウイルスを用いることによって得ることができるものよりもＰＲＶ感染に対して保護する増強された能力を持つ組換え豚痘ウイルスを得るために、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）に対する中和抗体の産生を誘導できる、１種を超える仮性狂犬病糖蛋白質を発現する組換え豚痘ウイルスを構築する。
【０２２５】
１種を超えるＰＲＶ糖蛋白質を発現するかかる組換え豚痘ウイルスのいくつかの例がある：ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）およびｇＩＩＩ（ｇＤ）を発現する組換え豚痘ウイルス、ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）およびｇＩＩ（ｇＢ）を発現する組換え豚痘ウイルス；ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）およびｇＩＩＩ（ｇＣ）を発現する組換え豚痘ウイルス；およびｇ５０（ｇＤ）、ｇＩＩＩ（ｇＣ）およびｇＩＩ（ｇＢ）を発現する組換え豚痘ウイルスを発現する組換え豚痘ウイルス。前記引用ウイルスの各々は、組換え豚痘ウイルスのクローニングを容易とするであろうイー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を含有させ発現させるようにも設計される。
【０２２６】
以下にリストするのは、ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）、ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）およびイー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）を発現する組換え豚痘ウイルスの３つの例である。
【０２２７】
ａ）ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）遺伝子、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子、ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含有する豚痘ウイルス。全ての４種の遺伝子は、豚痘ウイルスゲノムのＨｉｎｄIII  Ｍ断片内の唯一のＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、およびｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。
【０２２８】
ｂ）ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）遺伝子、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子、ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含有する豚痘ウイルス。全ての４種の遺伝子は、豚痘ウイルスゲノムのＨｉｎｄIII  Ｍ断片内の唯一のＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、およびｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。
【０２２９】
ｃ）ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）遺伝子、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子、ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含有する豚痘ウイルス。全ての４種の遺伝子は、豚痘ウイルスゲノムのＨｉｎｄIII  Ｍ断片内の唯一のＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＥＰ２ＬＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、およびｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。
【０２３０】
組換え豚痘ウイルスワクチンＳ−ＳＰＶ−００８、Ｓ−ＳＰＶ−０１３およびＳ−ＳＰＶ−０１５を用いるアウエスキー病に対する保護
Ｓ−ＳＰＶ−００８、Ｓ−ＳＰＶ−０１３、またはＳ−ＳＰＶ−０１５を含有するワクチン（１×１０７ＰＦＵ／ｍｌウイルスの２ｍｌ）またはＳ−ＳＰＶ−００８、Ｓ−ＳＰＶ−０１３、およびＳ−ＳＰＶ−０１５の混合物（３種ウイルスの１：１：１混合物の２ｍｌ；１×１０７ＰＦＵ／ｍｌ）を筋肉内接種によって、４群のブタ（群当たり５匹ブタ）に投与した。５匹ブタの対照群には筋肉内接種によってＳ−ＳＰＶ−００１を摂取させた。ワクチン接種から４週間後に、鼻孔内接種によってビルレントＰＲＶ株４９８２でブタを攻撃した。仮性狂犬病の臨床的徴候につき１４日間毎日ブタを観察し、表は臨床的応答の要約を与える。該データは、Ｓ−ＳＰＶ−００８、Ｓ−ＳＰＶ−０１３、またはＳ−ＳＰＶ−０１５でワクチン接種したブタは、Ｓ−ＳＰＶ−００１ワクチン接種対照と比較して、仮性狂犬病ウイルスによって引き起こされたアウエスキー病に対する部分的保護を有し、組合せワクチンＳ−ＳＰＶ−００８／Ｓ−ＳＰＶ−０１３／Ｓ−ＳＰＶ−０１５でワクチン接種したブタは完全な保護を有したことを示す。
【０２３１】
ワクチン          接種経路    攻撃後の      攻撃後の      攻撃後の
呼吸系徴候    ＣＮＳ徴候    群平均
（徴候数／    （徴候数／  （臨床徴候
合計数）       合計数）     の日数）
S-SPV-008          筋肉内      ２／５        ２／５        ２.０
S-SPV-013          筋肉内      １／５        ０／５        ０.４
S-SPV-015          筋肉内      ３／５        ０／５        １.０
S-SPV-008  ＋      筋肉内      ０／５        ０／５        ０.０
S-SPV-013  ＋
S-SPV-015
S-SPV-001          筋肉内      ５／５        ２／５        ３.６
（対照）
実施例９
Ｓ−ＳＰＶ−００９
Ｓ−ＳＰＶ−００９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子）およびニューカッスル病ウイルス血球凝集素についての遺伝子（ＨＮ遺伝子）をＳＰＶ  ５１５−８５．１  ＯＲＦに挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＨＮ遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
【０２３２】
Ｓ−ＳＰＶ−００９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５３８−４６．２６（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−００９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２３３】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−００９を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ウサギ抗−ＮＤＶ  ＨＮ抗血清はＳ−ＳＰＶ−００９プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００８陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−００９で観察されたプラークはブタ抗血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。Ｓ−ＳＰＶ−００９は受託番号ＶＲ２３４４の下でＡＴＣＣに寄託された。
【０２３４】
ＮＤＶ  ＨＮ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶで感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ウサギ抗−ＮＤＶ  ＨＮ血清を用いてＨＮ蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−００９感染細胞からの溶解物は、ほぼ７４ｋｄの特異的バンド、ＮＤＶ  ＨＮの報告されたサイズ（２９）を呈した。
【０２３５】
実施例１０
Ｓ−ＳＰＶ−０１４
Ｓ−ＳＰＶ−０１４は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および感染性喉頭気管炎ウイルス糖蛋白質Ｇについての遺伝子（ＩＬＴ  ｇＧ）をＳＰＶ  ５７０−３３．３２  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ部位は唯一のＰｓｔＩ部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＬＴ  ｇＧ遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
【０２３６】
Ｓ−ＳＰＶ−０１４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５９９−６５．２５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０１４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞において行い、これはＥＳＫ−４細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産についての適当な基礎となろうことを示す。
【０２３７】
ＩＬＴ  ｇＧ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０１４で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ＩＬＴ  ｇＧに対するペプチド抗血清を用いてＩＬＴ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０１４感染細胞からの溶解物は、ＩＬＴ  ｇＧ蛋白質の予測されたサイズである４３ｋｄにおけるバンドおよびＩＬＴ  ｇＧについての欠失突然変異体には存在しない蛋白質の糖鎖付加形態を表す高分子量のさらなるバンドを呈した。
【０２３８】
このウイルスをＩＬＴ糖蛋白質Ｇ（ｇＧ）を発現させるための発現ベクターとして用いる。かかるＩＬＴ  ｇＧを抗原として用いて、ｇＧ欠失ＩＬＴウイルスに対して向けられた抗体とは反対に、野生型ＩＬＴウイルスに対して向けられた抗体を同定する。このウイルスはＩＬＴ  ｇＧ特異的モノクローナル抗体の産生のための抗原としても用いられる。かかる抗体はＩＬＴ  ｇＧ蛋白質につき特異的な診断テストの開発で有用である。モノクローナル抗体は、「診断剤として使用されるウイルス糖蛋白質の精製手法」（材料および方法）に従って、このウイルスを利用してマウスにおいて創製される。
【０２３９】
実施例１１
Ｓ−ＳＰＶ−０１６
Ｓ−ＳＰＶ−０１６は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および感染性喉頭気管炎ウイルス糖蛋白質Ｉについての遺伝子（ＩＬＴ  ｇＩ）をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＬＴ  ｇＩ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０２４０】
Ｓ−ＳＰＶ−０１６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター６２４−２０．１Ｃ（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０１６と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２４１】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０１６を、ＩＬＴ  ｇＩ−およびβ−ガラクトシダーゼ−特異的抗原の発現につきアッセイした。ニワトリ抗−ＩＬＴポリクローナル抗体はＳ−ＳＰＶ−０１６プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−０１７陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０１６で観察されたプラークはニワトリ抗血清と反応し、これは該ウイルスがＩＬＴ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞において行い、これはＥＳＫ−４細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産についての適当な基礎となろうことを示す。
【０２４２】
ＩＬＴ  ｇＩ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０１６で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ニワトリ抗−ＩＬＴポリクローナル抗体を用いてＩＬＴ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０１６感染細胞からの溶解物は４０ないし２００ｋｄの抗−ＩＬＴ抗体に対して反応性であるバンドの範囲を呈し、これはＩＬＴ  ｇＩがかなり修飾されたらしいことを示す。
【０２４３】
このウイルスをＩＬＴ糖蛋白質Ｉ（ｇＩ）を発現させるための発現ベクターとして用いる。かかるＩＬＴ  ｇＩを抗原として用いて、ｇＩ欠失ＩＬＴウイルスに対して向けられた抗体とは反対に、野生型ＩＬＴウイルスに対して向けられた抗体を同定する。このウイルスはＩＬＴ  ｇＩ特異的モノクローナル抗体の産生のための抗原としても用いられる。かかる抗体はＩＬＴ  ｇＩ蛋白質につき特異的な診断テストの開発で有用である。モノクローナル抗体は、「診断剤として使用されるウイルス糖蛋白質の精製手法」（材料および方法）に従って、このウイルスを利用してマウスにおいて創製される。
【０２４４】
実施例１２
Ｓ−ＳＰＶ−０１７
Ｓ−ＳＰＶ−０１７は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および感染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖蛋白質Ｇについての遺伝子（ＩＢＲ  ｇＧ）をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＲ  ｇＧ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０２４５】
Ｓ−ＳＰＶ−０１７はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター６１４−８３．１８（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０１７と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２４６】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０１７を、ＩＢＲ−特異的抗原の発現につきアッセイした。ＩＢＲ  ｇＧに対するモノクローナル抗体およびペプチド抗血清はＳ−ＳＰＶ−０１７プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−０１６陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０１７で観察されたプラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＩＢＲ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞において行い、これはＥＳＫ−４細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産についての適当な基礎となろうことを示す。
【０２４７】
ＩＢＲ  ｇＧ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０１７で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ＩＢＲ  ｇＧに対する抗血清を用いてＩＢＲ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０１７感染細胞からの溶解物は、ＩＢＲ  ｇＧ蛋白質の予測されたサイズである４３ｋｄにおけるバンドおよびＩＢＲ  ｇＧについての欠失突然変異体に存在しない蛋白質の糖鎖付加形態を表す高分子量のさらなるバンドを呈した。
【０２４８】
このウイルスをＩＢＲ糖蛋白質Ｉ（ｇＧ）を発現させるための発現ベクターとして用いる。かかるＩＢＲ  ｇＧを抗原として用いて、ｇＧ欠失ＩＢＲウイルスに対して向けられた抗体とは反対に、野生型ＩＢＲウイルスに対して向けられた抗体を同定する。このウイルスはＩＢＲ  ｇＧ特異的モノクローナル抗体の産生のための抗原としても用いられる。かかる抗体はＩＢＲ  ｇＧ蛋白質につき特異的な診断テストの開発で有用である。モノクローナル抗体は、「診断剤として使用されるウイルス糖蛋白質の精製手法」（材料および方法）に従って、このウイルスを利用してマウスにおいて創製される。
【０２４９】
実施例１３
Ｓ−ＳＰＶ−０１９
Ｓ−ＳＰＶ−０１９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）ｇＥについての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＲＶ  ｇＥ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０２５０】
Ｓ−ＳＰＶ−０１９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７０８−７８．９（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０１９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２５１】
このウイルスをＩＢＲ糖蛋白質Ｅ（ｇＥ）を発現させるための発現ベクターとして用いる。かかるＩＢＲ  ｇＥを抗原として用いて、ｇＥ欠失ＩＢＲウイルスに対して向けられた抗体とは反対に、野生型ＩＢＲウイルスに対して向けられた抗体を同定する。このウイルスはＩＢＲ  ｇＥ特異的モノクローナル抗体の産生のための抗原としても用いられる。かかる抗体はＩＢＲ  ｇＥ蛋白質につき特異的な診断テストの開発で有用である。モノクローナル抗体は、「診断剤として使用されるウイルス糖蛋白質の精製手法」（材料および方法）に従って、このウイルスを利用してマウスにおいて創製される。
【０２５２】
実施例１４
Ｓ−ＳＰＶ−０１８
Ｓ−ＳＰＶ−０１８は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルス糖蛋白質Ｅ（ＰＲＶ  ｇＥ）についての遺伝子をＳＰＶ  ５７０−３３．３２  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ部位は唯一のＰｓｔＩ部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＥ遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
【０２５３】
Ｓ−ＳＰＶ−０１８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において最終相同性ベクターおよびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングされる。組換えウイルスの赤色プラーク精製はＳ−ＳＰＶ−０１８と命名される。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイする。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２５４】
このウイルスをＰＲＶ糖蛋白質Ｅ（ｇＥ）を発現させるための発現ベクターとして用いる。かかるＰＲＶ  ｇＥを抗原として用いて、ｇＥ欠失ＰＲＶウイルスに対して向けられた抗体とは反対に、野生型ＰＲＶウイルスに対して向けられた抗体を同定する。このウイルスはＰＲＶ  ｇＥ特異的モノクローナル抗体の産生のための抗原としても用いられる。かかる抗体はＰＲＶ  ｇＥ蛋白質につき特異的な診断テストの開発で有用である。モノクローナル抗体は、「診断剤として使用されるウイルス糖蛋白質の精製手法」（材料および方法）に従って、このウイルスを利用してマウスにおいて創製される。
【０２５５】
実施例１５
相同性ベクター５２０−９０．１５
相同性ベクター５２０−９０．１５は外来性ＤＮＡのＳＰＶへの挿入に有用なプラスミドである。プラスミド５２０−９０．１５は、それに外来性ＤＮＡをクローン化し得る唯一のＮｄｅＩ制限部位を含有する。かかる外来性ＤＮＡインサートを含有するプラスミドを「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従って用いて、外来性ＤＮＡを含有するＳＰＶを得る。この方法を首尾よく行うためには、挿入部位がＳＰＶの複製に必須ではない領域にあって、該部位に、ウイルスとプラスミドＤＮＡとの間の相同組換えを媒介するのに適した豚痘ウイルスＤＮＡがその端部に隣接することが重要である。プラスミド５２０−９０．１５における唯一のＮｄｅＩ制限部位はＳＰＶチミジンキナーゼ遺伝子（３２）の暗号領域内に位置する。従って、豚痘ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子はＤＮＡ複製に必須ではなく、適当な挿入部位であることが示された。
【０２５６】
実施例１６
Ｓ−ＰＲＶ−０１０
Ｓ−ＳＰＶ−０１０は外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子をチミジンキナーゼ遺伝子内の唯一のＮｄｅＩ制限部位に挿入する。外来性遺伝子（ｌａｃＺ）は合成後期プロモーター、ＬＰ１の制御下にある。かくして、豚痘ウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子は該ウイルスの複製に必須でない領域であり、適当な沿うに結う部位であることが示された。
【０２５７】
ＨｉｎｄIII  Ｇ断片からサブクローン化された１７３９塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片は豚痘ウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子を含有し、命名された相同性ベクター５２０−９０．１５である。該相同性ベクター５２０−９０．１５をＮｄｅＩで消化し、ＡｓｃＩリンカーを該チミジンキナーゼ遺伝子内のこの唯一の部位に挿入した。ＡｓｃＩリンカーを持つＬＰ１プロモーター−ｌａｃＺカセットをチミジンキナーゼ遺伝子内のＡｓｃＩ部位に結んだ。組換え相同性ベクター５６１−３６．２６を、「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」によってウイルスＳ−ＳＰＶ−００１で共トランスフェクトし、β−ガラクトシダーゼを発現するウイルス・プラークを「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によって選択した。青色および赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ１−０１０と命名された組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞において行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０２５８】
実施例１７
種々の病気を引き起こす微生物からの抗原を発現させるための豚痘ウイルスを利用するワクチンの開発を企画することができる。
【０２５９】
伝染性胃腸炎ウイルス
豚痘ウイルスベクターで使用する、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥ）の主要中和抗原、糖蛋白質１９５をクローン化した。該中和抗原のクローンは１９８７年７月２７日に出願された米国特許出願第０７８,５１９号に開示されている。ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された、および本明細書に開示した手法はＴＧＥに適用できると考えられる。
【０２６０】
ブタ・パルボウイルス
ブタ・パルボウイルス（ＰＰＶ）の主要キャプシド蛋白質を豚痘ウイルスベクターで使用するためにクローン化した。該キャプシド蛋白質は１９９１年１１月２６日に発行された米国特許第５,０６８,１９２号に開示されている。ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された、および本明細書に開示した手法はＰＰＶに適用できると考えられる。
【０２６１】
ブタ・ロタウイルス
ブタ・ロタウイルスの主要中和抗原、糖蛋白質３８を豚痘ウイルスベクターで使用するためにクローン化した。糖蛋白質３８のクローンは１９９１年１１月２６日に発行された米国特許第５,０６８,１９２号に開示されている。ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された、および本明細書に開示した手法はＳＲＶに適用できると考えられる。
【０２６２】
ブタ・コレラウイルス
ウシ・ウイルス性下痢（ＢＶＤ）ウイルスの主要中和抗原を、１９８８年７月２７日に出願された米国特許出願第２２５，０３２号に開示されているごとくにクローン化した。ＢＶＤおよびブタ・コレラウイルスは交差保護性であるので（３１）、ＢＶＤウイルス抗原は豚痘ウイルスベクターで使用するために標的化されている。ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された、および本明細書に開示した手法はＢＶＤに適用できると考えられる。
【０２６３】
セルプリナ・ヒオディセンテリエ（Serpulina Hyodysenteriae)
豚痘ウイルスベクターで使用するためのSerpulina Hyodysenteriae（３）の保護抗原はクローン化されている。ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された、および本明細書に開示した手法はSerpulina Hyodysenteriaeに適用できると考えられる。
【０２６４】
以下の微生物からの抗原も動物ワクチンを開発するのに利用できる：ブタ・インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、ブタ・コレラウイルス、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Mycoplasma hyopneumoniae)、ブタ生殖系および呼吸器系症候群／ブタ不妊症および呼吸器系症候群（ＰＲＲＳ／ＳＩＲＳ）。
【０２６５】
以下の微生物からの抗原も動物ワクチンで利用できる：イヌ−ヘルペスウイルス、イヌ・ジステンパー、イヌ・アデノウイルス１型（肝炎）、アデノウイルス２型（呼吸器系病）、パラインフルエンザ、レプトスピラ・カニコラ（Leptospira canicola)、イクテロヘモラジア（icterohemorragia)、パルボウイルス、コロナウイルス、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi)、イヌ・ヘルペスウイルス、ボルデテラ・ブロンキセプティカ（Bordetella bronshiseptica)、ディロフィラエ・イミティス（Dirofilaria immitis)（イヌ糸状虫）および狂犬病ウイルス、２）ネコ−Ｆｉｖ  ｇａｇおよびｅｎｖ、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ・ヘルペスウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、イヌ・ヘルペスウイルス、イヌ・コロナウイルス、イヌ・パルボウイルス、（イヌおよびネコにおけるDirofilaria  immitisを含めた)動物における寄生虫病、ウマ感染性貧血、ストレプトコッカス・エキィ（Streptococcus equi)、球虫類亜綱（coccidia)、エメリア（emeria)、ニワトリ貧血ウイルス、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi)、ウシ・コロナウイルス、パステレラ・ヘマリティカ（Pasteurella haemolytica)。
【０２６６】
実施例１７Ａ
ブタ・コレラウイルス、ブタ・インフルエンザウイルスおよび（ブタ生殖系および呼吸器系症候群）ＰＲＲＳウイルスからの抗原を発現する組換え豚痘ウイルスを含有するワクチン
ブタ・コレラウイルス、ブタ・インフルエンザウイルスおよびＰＲＲＳウイルスに対する中和抗原についての遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスはブタにおける病気を予防するのに有用である。組換えＳＰＶで発現された遺伝子は、限定されるものではないが、ブタ・コレラウイルスｇＥ１およびｇＥ２遺伝子、ブタ・インフルエンザウイルス血球凝集素、ノイラミニダーゼ、マトリックスおよび核蛋白質、およびＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７を含む。
【０２６７】
実施例１８
組換え豚痘ウイルスは、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／プラグ５６、ウマ・ヘルペスウイルス１型ｇＢ、またはウマ・ヘルペスウイルス１型ｇＤ遺伝子を発現する。Ｓ−ＳＰＶ−０３３およびＳ−ＳＰＶ−０３４はウマ・インフルエンザ感染に対するワクチンとして有用であり、Ｓ−ＳＰＶ−０３８およびＳ−ＳＰＶ−０３９はウマ鼻気管炎およびウマ流産を引き起こすウマ・ヘルペスウイルス感染に対するワクチンとして有用である。これらのウマ・インフルエンザおよびウマ・ヘルペスウイルス抗原は動物において保護免疫応答を生起させるのに鍵となる。組換えウイルスは単独でまたは効果的なワクチンとして組合せにおいて有用である。豚痘ウイルスは、（ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／マイアミ／６３およびウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキィー／８１を含めた）ウマ・インフルエンザウイルスの他のサブタイプをクローニングして、この病気における変異体の急速な進化に対して保護するのに有用である。また、Ｓ−ＳＰＶ−０３３、Ｓ−ＳＰＶ−０３４、Ｓ−ＳＰＶ−０３８、およびＳ−ＳＰＶ−０３９はウマ・インフルエンザまたはウマ・ヘルペスウイルス抗原を発現させるための発現ベクターとして有用である。かかるウマ・インフルエンザまたはウマ・ヘルペスウイルス抗原は野生型ウマ・インフルエンザウイルスまたはウマ・ヘルペスウイルスに対して向けられた抗体を同定するのに有用である。また、該ウイルスは単一特異性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の産生のための抗原を生産するにおいて有用である。かかる抗体はウイルス蛋白質に特異的な診断テストの開発で有用である。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断剤として用いられるウイルス糖蛋白質の精製法」（材料および方法）に従って、これらのウイルスを利用してマウスにおいて創製される。
【０２６８】
実施例１８Ａ
Ｓ−ＳＰＶ−０３３：
Ｓ−ＳＰＶ−０３３は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウマ・インフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼについての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＥＩＶ  Ａｋ／９１  ＮＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０２６９】
Ｓ−ＳＰＶ−０３３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７３２−１８．４（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０３３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２７０】
実施例１８Ｂ
Ｓ−ＳＰＶ−０３４：
Ｓ−ＳＰＶ−０３４は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウマ・インフルエンザウイルスＡ型／プラグ５６ノイラミニダーゼについての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＥＩＶ  ＰＲ／５６  ＮＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０２７１】
Ｓ−ＳＰＶ−０３４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７３２−５９Ａ９．２２（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０３４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２７２】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０３４を、ＥＩＶ−特異的抗原の発現につきアッセイした。ＥＩＶ  ＰＲ／５６ ＮＡに対する単一特異性ポリクローナル抗体はＳ−ＳＰＶ−０３４プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−０３４陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０３４で観察されたプラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＥＩＶ  ＰＲ／５６ ＮＡ性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞において行い、これによりＥＳＫ−４細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産についての適当な基礎となろうことが示された。
【０２７３】
実施例１８Ｃ
Ｓ−ＳＰＶ−０３８：
Ｓ−ＳＰＶ−０３８は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウマ・ヘルペスウイルス１型糖蛋白質Ｂについての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＥＨＶ−１  ｇＧ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０２７４】
Ｓ−ＳＰＶ−０３８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７４４−３４（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０３８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２７５】
実施例１８Ｄ
Ｓ−ＳＰＶ−０３９：
Ｓ−ＳＰＶ−０３９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウマ・ヘルペスウイルス１型糖蛋白質Ｄについての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＥＨＶ−１  ｇＤ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０２７６】
Ｓ−ＳＰＶ−０３９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７４４−３８（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０３９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２７７】
実施例１９
組換え豚痘ウイルスは、ウシ・呼吸器系シンシチウムウイルス付着蛋白質（ＢＲＳＶ  Ｇ）、ＢＲＳＶ融合蛋白質（ＢＲＳＶ  Ｆ）、ＢＲＳＶヌクレオキャプシド蛋白質（ＢＲＳＶ  Ｎ）、ウシ・ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）ｇ４８、ＢＶＤＶｇ５３、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩ−３）Ｆ、またはＢＰＩ−３  ＨＮを発現する。Ｓ−ＳＰＶ−０２０、Ｓ−ＳＰＶ−０２９、Ｓ−ＳＰＶ−０３０およびＳ−ＳＰＶ−０３２、Ｓ−ＳＰＶ−０２８はウシの病気に対するワクチンとして有用である。これらのＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ、およびＢＰＩ−３抗原は動物において保護免疫応答を生起させるのに鍵となる。組換えウイルスは単独でまたは効果的なワクチンとして組合せにおいて有用である。豚痘ウイルスは、ＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ、およびＢＰＩ−３の他のサブタイプをクローニングして、この病気における変異体の急速な進化に対して保護するのに有用である。また、Ｓ−ＳＰＶ−０２０、Ｓ−ＳＰＶ−０２９、Ｓ−ＳＰＶ−０３０、およびＳ−ＳＰＶ−０３２、Ｓ−ＳＰＶ−０２８はＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ、およびＢＰＩ−３抗原を発現させるための発現ベクターとして有用である。かかるＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ、およびＢＰＩ−３抗原は野生型ＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ、およびＢＰＩ−３に対して向けられた抗体を同定するのに有用である。また、該ウイルスは単一特異性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の産生のための抗原としても有用である。かかる抗体はウイルス蛋白質に特異的な診断テストの開発で有用である。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断剤として用いられるウイルス糖蛋白質の精製法」（材料および方法）に従って、これらのウイルスを利用してマウスにおいて創製される。
【０２７８】
実施例１９Ａ
Ｓ−ＳＰＶ−０２０
Ｓ−ＳＰＶ−０２０は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウシ呼吸器系シンシチウムウイルス（ＢＲＳＶ）Ｇについての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＢＲＳＶ  Ｇ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０２７９】
Ｓ−ＳＰＶ−０２０はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７２７−２０．５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０２０と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２８０】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０２０を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ウシ抗−ＢＲＳＶ  ＦＩＴＣ（Accurate Chemicals）はＳ−ＳＰＶ−０２０プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００３陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０２０で観察されたプラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０２８１】
ＢＲＳＶ  Ｇ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０２０で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ウシ抗−ＢＲＳＶ  ＦＩＴＣ（Accurate Chemicals）を用いてＢＲＳＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０２０感染細胞からの溶解物は、ＢＲＳＶ  Ｇ蛋白質の非糖鎖付加形態の予測されるサイズである３６ｋｄにおけるバンドおよびＢＲＳＶ  Ｇ蛋白質の糖鎖付加形態の予測それるサイズである５３ないし４５ｋｄおよび８０ないし９０ｋｄにおけるバンドを呈した。
【０２８２】
実施例１９Ｂ
Ｓ−ＳＰＶ−０２９：
Ｓ−ＳＰＶ−０２９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウシ呼吸器系シンシチウムウイルス（ＢＲＳＶ）Ｆについての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＢＲＳＶ  Ｆ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０２８３】
Ｓ−ＳＰＶ−０２９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７２７−２０．１０（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０２９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２８４】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０２９を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ウシ抗−ＢＲＳＶ  ＦＩＴＣ（Accurate Chemicals）はＳ−ＳＰＶ−０２９プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００３陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０２９で観察されたプラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０２８５】
実施例１９Ｃ
Ｓ−ＳＰＶ−０３０：
Ｓ−ＳＰＶ−０３０は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウシ呼吸器系シンシチウムウイルス（ＢＲＳＶ）Ｎについての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＢＲＳＶ  Ｎ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０２８６】
Ｓ−ＳＰＶ−０３０はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７１３−５５．３７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０３０と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２８７】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０３０を、ＢＲＳＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ウシ抗−ＢＲＳＶ  ＦＩＴＣ（Accurate Chemicals）はＳ−ＳＰＶ−０３０プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００３陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０３０で観察されたプラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０２８８】
ＢＲＳＶ  Ｎ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０３０で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ウシ抗−ＢＲＳＶ  ＦＩＴＣ（Accurate Chemicals）を用いてＢＲＳＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０３０感染細胞からの溶解物は、ＢＲＳＶ  Ｎ蛋白質の予測されるサイズである４３ｋｄにおけるバンドを呈した。
【０２８９】
実施例１９Ｄ
Ｓ−ＳＰＶ−０２８：
Ｓ−ＳＰＶ−０２８は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウシ・パラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩ−３）Ｆについての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＢＰＩ−３  Ｆ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０２９０】
Ｓ−ＳＰＶ−０２８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７１３−５５．１０（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０２８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２９１】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０２８を、ＢＰＩ−３−特異的抗原の発現につきアッセイした。ウシ抗−ＢＰＩ−３  ＦＩＴＣ（Accurate Chemicals）はＳ−ＳＰＶ−０２８プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００３陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０２８で観察されたプラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＢＰＩ−３外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０２９２】
ＢＰＩ−３  Ｆ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０２８で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ウシ抗−ＢＰＩ−３  ＦＩＴＣ（Accurate Chemicals）を用いてＢＰＩ−３特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０２８感染細胞からの溶解物は、ＢＰＩ−３  Ｆ蛋白質の予測されるサイズである４３ｋｄ、および７０ｋｄにおけるバンドを呈した。
【０２９３】
実施例１９Ｅ
Ｓ−ＳＰＶ−０３２：
Ｓ−ＳＰＶ−０３２は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウシ・ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）ｇ４８についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＢＶＤＶ  ｇ４８遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０２９４】
Ｓ−ＳＰＶ−０３２はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７２７−７８．１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０３２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２９５】
実施例１９Ｆ
Ｓ−ＳＰＶ−０４０：
Ｓ−ＳＰＶ−０４０は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウシ・ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）ｇ５３についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＢＶＤＶ  ｇ４８遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０２９６】
Ｓ−ＳＰＶ−０４０はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７３８−９６（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４０と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０２９７】
実施例１９Ｇ
船積熱ワクチン
船積熱またはウシ呼吸器系病（ＢＲＤ）合併症はウシの感染性病気およびさらなるストレス関連因子（５２）の組合せの結果として発現される。ストレスの病理生理学的効果によって増大される呼吸器系ウイルス感染は多数のメカニズムによるパスツレラ属生物に対するウシの罹患性を改変する。ＢＲＤを開始させるウイルス感染の制御は該病気症候群（５３）を防止するのに必須である。
【０２９８】
ＢＲＤに寄与する主要感染性病気の病原体は、限定されるものではないが、鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）、パラインフルエンザウイルス３型（ＰＩ−３）、ウシ呼吸器系シンシチウムウイルス（ＢＲＳＶ）、およびパスツレラ・ヘモリティカ（Paeteurella haemolytica)（５３）を含む。ＢＲＤを引き起こす生物に対する保護抗原を発現する組換え豚痘ウイルスはワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０２０、Ｓ−ＳＰＶ−０２９、Ｓ−ＳＰＶ−０３０、およびＳ−ＳＰＶ−０２８はかかるワクチンの有用な成分である。
【０２９９】
実施例２０
組換え豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３１およびＳ−ＳＰＶ−０３５はヒトの病気に対するワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０３１はＢ型肝炎ウイルスのコア抗原を発現する。Ｓ−ＳＰＶ−０３１はヒトにおいてＢ型肝炎感染に対して有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０３５はサイトカイン、インターロイキン−２を発現し、ヒトにおいて免疫応答を増強させるための免疫モジュレーターとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０３１およびＳ−ＳＰＶ−０３５を組み合わせると、Ｂ型肝炎に対して優れたワクチンが生産される。
【０３００】
実施例２０Ａ
Ｓ−ＳＰＶ−０３１：
Ｓ−ＳＰＶ−０３１は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびＢ型肝炎コア抗原についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、Ｂ型肝炎コア抗原遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
【０３０１】
Ｓ−ＳＰＶ−０３１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７２７−６７．１８（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０３１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３０２】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０３１を、Ｂ型肝炎コア抗原−特異的抗原の発現につきアッセイした。Ｂ型肝炎コア抗原に対するウサギ抗血清はＳ−ＳＰＶ−０３１プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０３１で観察されたプラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＢ型肝炎コア抗原遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０３０３】
Ｂ型肝炎コア抗原遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０３１で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。Ｂ型肝炎コア抗原に対するウサギ抗血清を用いてＢ型肝炎特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０３１感染細胞からの溶解物は、Ｂ型肝炎コア抗原の予測されるサイズである２１ｋｄにおけるバンドを呈した。
【０３０４】
実施例２０Ｂ：
Ｓ−ＳＰＶ−０３５：
Ｓ−ＳＰＶ−０３５は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびヒトＩＬ−２についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ヒトＩＬ−２遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０３０５】
Ｓ−ＳＰＶ−０３５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７４１−８４．１４（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０３５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３０６】
実施例２１
組換え豚痘ウイルスをベクターとして用いるヒト・ワクチン
組換え豚痘ウイルスはヒトの病気に対するワクチンとして有用である。例えば、ヒト・インフルエンザウイルスは、その中和ウイルス・エピトープが急速に変化する、急速に進化するウイルスである。有用な組換え豚痘ワクチンは、該インフルエンザウイルス中和エピトープがインフルエンザウイルスの新しい株に対して保護するための組換えＤＮＡ技術によって迅速に適合されるものである。ヒト・インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＮ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子は、「ウマ・インフルエンザウイルス血球凝集素およびノイラミニダーゼ遺伝子のクローニング」（材料および方法および実施例１７参照）に記載されているように豚痘ウイルスにクローン化される。
【０３０７】
組換え豚痘ウイルスは、以下の病気類または病気微生物からの外来性抗原が豚痘ウイルスベクターで発現されると、他のヒトの病気に対するワクチンとして有用である：Ｂ方肝炎ウイルス表面およびコア抗原、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス、単純疱疹ウイルス−１、単純疱疹ウイルス−２、ヒト・サイトメガロウイルス、エプスタンバールウイルス、バリセラ−ゾスター（Varicella-Zoster）ウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス−６、ヒト・ヘルペスウイルス−７、ヒト・インフルエンザ、麻疹ウイルス、ハンターン（hantaan）ウイルス、肺炎ウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ヒト呼吸器系シンシチウムウイルス、レトロウイルス、ヒトＴ−細胞白血病ウイルス、狂犬病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、マラリア（プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum))、ボルデテリア・ペルトゥスシス（Bordetelia pertussis）、ジフテリア、リケッチア・プロワゼッキィー（Rickettsia prowazekki)、ボレリア・ベルグドルフェリ（Borrelia bergdorferi）、破傷風トキソイド、悪性腫瘍抗原。
【０３０８】
さらに、Ｓ−ＳＰＶ−０３５（実施例２０）は、豚痘ウイルス・インターロイキン−２と組み合わせると、ヒトにおいて免疫応答を増強するのに有用である。限定されるものではないが、ヒトおよび他の動物からのインターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン−１２、インターフェロン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン受容体を含めたさらなるサイトカインは、豚痘ウイルス・ゲノム中の非必須部位にベクターにより入れられ、引き続いて発現されると、免疫刺激効果を有する。
【０３０９】
組換え豚痘ウイルスはヒト細胞系で外来性遺伝子を発現する。Ｓ−ＳＰＶ−００３（ｌａｃＺ遺伝子を発現するＥＰ１ＬＰ２プロモーター）は、β−ガラクトシダーゼ活性を測定することによると、ＴＨＰヒト単球細胞系においてｌａｃＺ遺伝子を発現した。豚痘ウイルスの細胞障害効果がＴＨＰヒト単球細胞で観察され、これは組換え豚痘ウイルスはヒト細胞系で外来性遺伝子を発現するが、ヒト細胞系において再現性よく感染したり複製されないことを示す。豚痘ウイルスはＥＳＫ−４細胞（胚性ブタ腎臓）でよく複製されることが示され、これはＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことを示す。
【０３１０】
実施例２２
組換え豚痘ウイルスをベクターとして用いる鳥類ワクチン
実施例２２Ａ
Ｓ−ＳＰＶ−０２６
Ｓ−ＳＰＶ−０２６は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および感染性包病ウイルス（ＩＢＤＶ）ポリプロテインについての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＤＶポリプロテイン遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
【０３１１】
Ｓ−ＳＰＶ−０２６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター６８９−５０．４（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０２６と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３１２】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０２６を、ＩＢＤＶポリプロテイン−特異的抗原の発現につきアッセイした。ＩＢＤＶポリプロテインに対するラット抗血清はＳ−ＳＰＶ−０２６プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０２６で観察されたプラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＩＢＤＶポリプロテイン遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０３１３】
ＩＢＤＶポリプロテイン遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０２６で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ＩＢＤＶプロテインＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ４に対するラット抗血清ならびにＩＢＤＶ  ＶＰ２に対するモノクローナル抗体を用いてＩＢＤＶプロテインの発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０２６感染細胞からの溶解物は、ＩＢＤＶプロテインの予測されるサイズである３２ないし４０ｋｄにおけるバンドを呈した。
【０３１４】
実施例２２Ｂ
Ｓ−ＳＰＶ−０２７
Ｓ−ＳＰＶ−０２７は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および感染性包病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２（４０ｋｄ）についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
【０３１５】
Ｓ−ＳＰＶ−０２７はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター６８９−５０．７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０２７と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３１６】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０２７を、ＩＢＤＶ  ＶＰ２−特異的抗原の発現につきアッセイした。ＩＢＤＶプロテインに対するラット抗血清はＳ−ＳＰＶ−０２７プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０２７で観察されたプラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０３１７】
ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０２７で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ＩＢＤＶプロテインに対するラット抗血清ならびにＩＢＤＶ  ＶＰ２に対するモノクローナル抗体Ｒ６３を用いてＩＢＤＶ  ＶＰ２プロテインの発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０２７感染細胞からの溶解物は、ＩＢＤＶ  ＶＰ２プロテインの予測されるサイズである４０ｋｄにおけるバンドを呈した。
【０３１８】
Ｓ−ＳＰＶ−０２６およびＳ−ＳＰＶ−０２７はニワトリにおける感染性包病に対するワクチンとして、およびＩＢＤＶプロテインについての発現ベクターとしても有用である。組換え豚痘ウイルスは、以下の病気類または病気微生物からの外来性抗原が豚痘ウイルスベクターで発現されると、他の鳥類病に対するワクチンとして有用である：マレク病ウイルス、感染性咽頭気管炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、およびニワトリ貧血ウイルス、ひよこ貧血ウイルス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、鳥類パラミキソウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、鳥類アデノウイルス、鶏痘ウイルス、鳥類コロナウイルス、鳥類ロタウイルス、サルモネラ（Salmonella)種イー・コリ、パスツレラ（Pasteurella）種、ヘモフィラス（Haemophilus）種、クラミジア（Chlamydia)種、マイコプラズマ（Mycoplasma）種、カンピロバクター（Campylobacter）種、ボルデテラ（Bordetella)種、家禽線虫、条虫、吸虫、家禽ダニ／シラミ、家禽原虫（エイメリア（Eimeria)種、ヒストモナス（Histomona)種、トリコモナス（Trichomonas）種）。
【０３１９】
実施例２３
ＳＰＶ−０３６
Ｓ−ＳＰＶ−０３６は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子はヒト・サイトメガロウイルス即時型（ＨＣＭＶ  ＩＥ）プロモーターの制御下にある。
【０３２０】
Ｓ−ＳＰＶ−０３６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７４１−８０．３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０３６と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３２１】
ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターからのｌａｃＺの発現は豚痘における外来性遺伝子の発現のための強力なプロモーターを提供する。Ｓ−ＳＰＶ−０３６はポックスウイルスにおいて外来性遺伝子の発現を駆動するヘルペスウイルス・プロモーターの新規で予期せぬ証明である。Ｓ−ＳＰＶ−０３６はヒト・ワクチンを処方するのに有用であり、組換え豚痘ウイルスはヒト病原体からの抗原の中和の発現で有用である。組換え豚痘ウイルスは、ＴＨＰヒト単球細胞系においてＳ−ＳＰＶ−００３（ｌａｃＺ遺伝子を発現するプロモーター（ＥＰ１ＬＰ２））がβ−ガラクトシダーゼを発現したことから示されるように、ヒト細胞系で外来性遺伝子を発現した。ＴＨＰヒト単球細胞に対する豚痘ウイルスの細胞障害効果は観察されず、これは組換え豚痘ウイルスがヒト細胞系で外来性遺伝子を発現できるが、ヒト細胞系において再現性よく感染せず複製されないことを示す。
【０３２２】
実施例２４
相同性ベクター７３８−９４．４
相同性ベクター７３８−９４．４は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスベクターである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）についての遺伝子をＯ１Ｌオープンリーディングフレーム（配列番号：１１５）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子はＯ１Ｌプロモーターの制御下にある。該相同性ベクター７３８−９４．４は、Ｏ１Ｌ  ＯＲＦの一部を示すヌクレオチド１６７９ないし２４５２（配列番号：１８９；図１７）からのＳＰＶ  ＤＮＡの欠失を含む。
【０３２３】
ＤＮＡプライマー５’−ＧＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡＴＡ−３’（配列番号：１８５）および５’−ＣＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：１８６）を用いるポリメラーゼ鎖反応によって上流ＳＰＶ配列を合成してＢｇｌIIおよびＳｐｈＩ末端をもつ８５５塩基対断片を得た。Ｏ１Ｌプロモーターはこの断片上に存在する。ＤＮＡプライマー５’−ＣＣＧＴＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴ−３’（配列番号：１８７）および５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＴ−３’（配列番号：１８８）を用いるポリメラーゼ鎖反応によって下流ＳＰＶ配列を合成してＳａｌＩおよびＨｉｎＩＩＩ末端を持つ１１１３塩基対断片を得た。組換え豚痘ウイルスは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７３８−９４．４およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１（Kansza株）を利用して誘導した。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は該組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。相同性ベクター７３８−９４．４から誘導された組換え豚痘ウイルスは、外来性抗原を発現させるための発現ベクターとして、および組換え豚痘ウイルスによって発現された外来性遺伝子に対して動物で保護免疫応答を生起させるためのワクチンとして利用される。Ｏ１Ｌプロモーターに加えて、ＬＰ１、ＥＰ１ＬＰ２、ＬＰ２ＥＰ２、ＨＣＭＶ即時型を含めた他のプロモーターが欠失領域に挿入され、１以上の外来性遺伝子がこれらのプロモーターから発現される。
【０３２４】
実施例２４Ｂ
相同性ベクター７５２−２２．１は２つの外来性遺伝子を発現させるのに利用される豚痘ウイルスベクターである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）についての遺伝子をＯ１Ｌオープンリーディングフレーム（配列番号：１１５）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子はＯ１Ｌプロモーターの制御下にある。第２の外来性遺伝子は、ＬＰ２ＥＰ２プロモーター配列に従ってＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩ部位に挿入されたＬＰ２ＥＰ２プロモーターから発現される。相同性ベクター７５２−２２．１は、Ｏ１Ｌ  ＯＲＦの一部を欠失するヌクレオチド１６７９ないし２４５２（配列番号：１８９；図１７）からのＳＰＶ  ＤＮＡの欠失を含む。相同性ベクター７５２−２２．１はＬＰ２ＥＰ２プロモーター断片の挿入によって相同性ベクター７３８−９４．４から誘導された（材料および方法参照）。相同性ベクター７５２−２２．１は、合成ＬＰ１プロモーターの制御下にあるｌａｃＺ遺伝子を入れることによってさらに改良される。該ＬＰ１プロモーターの結果、ＳＰＶ  Ｏ１Ｌプロモーターと比較してより高いレベルのｌａｃＺ発現となる。
【０３２５】
実施例２５
Ｓ−ＳＰＶ−０４１：
Ｓ−ＳＰＶ−０４１は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウマ・ヘルペスウイルス１型糖蛋白質Ｂ（ｇＢ）についての遺伝子を７３８−９４．４ＯＲＦ（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１６７９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０３２６】
Ｓ−ＳＰＶ−０４１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７５２−２９．３３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３２７】
Ｓ−ＳＰＶ−０４１はウマにおいてＥＨＶ−１感染に対するワクチンとして有用であって、ＥＨＶ−１糖蛋白質Ｂの発現に有用である。
【０３２８】
Ｓ−ＳＰＶ−０４５：
Ｓ−ＳＰＶ−０４５は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および感染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖蛋白質Ｅ（ｇＥ）についての遺伝子を７３８−９４．４ＯＲＦ（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１６７９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＩＢＲＶ  ｇＥ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０３２９】
Ｓ−ＳＰＶ−０４５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７４６−９４．１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３３０】
Ｓ−ＳＰＶ−０４５はＩＢＲＶ糖蛋白質Ｅの発現に有用である。
【０３３１】
Ｓ−ＳＰＶ−０４９：
Ｓ−ＳＰＶ−０４９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウシ・ウイルス性下痢ウイルス糖蛋白質４８（ｇｐ４８）についての遺伝子を７３８−９４．４  ＯＲＦ（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１６７９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＢＶＤＶ  ｇｐ４８遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０３３２】
Ｓ−ＳＰＶ−０４９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７７１−５５．１１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３３３】
Ｓ−ＳＰＶ−０４９はウシにおいてＢＶＤＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＢＶＤＶ糖蛋白質４８の発現に有用である。
【０３３４】
Ｓ−ＳＰＶ−０５０：
Ｓ−ＳＰＶ−０５０は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウシ・ウイルス性下痢ウイルス糖蛋白質５３（ｇｐ５３）についての遺伝子を７３８−９４．４  ＯＲＦ（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１６７９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＢＶＤＶ  ｇＥ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０３３５】
Ｓ−ＳＰＶ−０５０はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７６７−６７．３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０５０と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３３６】
Ｓ−ＳＰＶ−０５０はウシにおいてＢＶＤＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＢＶＤＶ糖蛋白質５３の発現に有用である。
【０３３７】
実施例２６
各々ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）またはニワトリ骨髄単球成長因子（ｃＭＧＦ）を発現する組換え豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４２またはＳ−ＳＰＶ−０４３は、家禽の病気に対するワクチンに添加すると、免疫応答を増強するのに有用である。ニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）は哺乳動物インターロイキン−６蛋白質と相同であり、ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）は哺乳動物インターフェロンと相同である。特異的鳥類病に対するワクチンと組み合わせて用いると、Ｓ−ＳＰＶ−０４２およびＳ−ＳＰＶ−０４３は、限定されるものではないが、マレク病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、感染性咽頭気管炎ウイルス、感染性気管支炎、感染性包病ウイルスを含めた鳥類を引き起こすウイルスに対して増強された粘液性、体液性、または細胞媒介免疫を供する。
【０３３８】
実施例２６Ａ
Ｓ−ＳＰＶ−０４２：
Ｓ−ＳＰＶ−０４２は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）についての遺伝子をＳＰＶ６１７−４８．１  ＯＲＦ（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｃｏＩ制限部位で置き換えた）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後記プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｃＩＦＮ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０３３９】
Ｓ−ＳＰＶ−０４２はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７５１−０７．Ａ１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３４０】
Ｓ−ＳＰＶ−０４２は細胞培養においてインターフェロン活性を有する。Ｓ−ＳＰＶ−０４２条件培地のニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）細胞培養への添加は、水泡性口内炎ウイルスによる、またはシチメンチョウのヘルペスウイルスによるＣＥＦ細胞の感染を阻害する。Ｓ−ＳＰＶ−０４２は家禽の病気に対するワクチンに添加すると、免疫応答を増強するのに有用である。
【０３４１】
実施例２６Ｂ
Ｓ−ＳＰＶ−０４３：
Ｓ−ＳＰＶ−０４３は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）についての遺伝子をＳＰＶ６１７−４８．１  ＯＲＦ（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｃｏＩ制限部位で置き換えた）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後記プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｃＭＧＦ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０３４２】
Ｓ−ＳＰＶ−０４３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７５１−５６．Ａ１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３４３】
Ｓ−ＳＰＶ−０４３は家禽の病気に対するワクチンに添加すると、免疫応答を増強させるのに有用である。
【０３４４】
実施例２７
非必須部位の、豚痘ウイルスＨｉｎｄIII  Ｍ断片の
２．０ｋｂＨｉｎｄIIIないしＢｇｌII領域への挿入
豚痘ウイルスＨｉｎｄIII  Ｍ断片の２．０ｋｂ  ＨｉｎｄIIIないしＢｇｌII領域は外来性ＤＮＡのＳＰＶへの挿入で有用である。外来性ＤＮＡは該領域における唯一のＢｇｌII制限部位に挿入される（図１７；配列番号：１９５のヌクレオチド５４０）。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従って、外来性ＤＮＡインサートを含有するプラスミドを用いて外来性ＤＮＡを含有するＳＰＶを得る。この手法が首尾よく行われるためには、挿入部位がＳＰＶの複製に必須でない領域にあって、該部位に、ウイルスとプラスミドＤＮＡとの間の相同組換えを媒介するのに適した豚痘ウイルスＤＮＡがその端部に隣接することが重要である。豚痘ウイルスＨｉｎｄIII  Ｍ断片の２．０ｋｂ  ＨｉｎｄIIIないしＢｇｌII領域における唯一のＢｇｌII制限部位はＳＰＶ  Ｉ４Ｌオーブンリーディングフレームの暗号領域内に位置する。該Ｉ４Ｌ  ＯＲＦはワクシニアウイルスおよび天然痘ウイルス・リボヌクレオチド・レダクターゼ（大サブユニット）遺伝子（５６−５８）に対して配列同様性を有する。該リボヌクレオチド・レダクターゼ（大サブユニット）遺伝子はワクシニアウイルスのＤＮＡ複製に非必須であって、豚痘ウイルスにおける適当な挿入部位である。
【０３４５】
実施例２８
Ｓ−ＳＰＶ−０４７
Ｓ−ＳＰＶ−０４７は２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルスｇＢ（ｇＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄIII部位（ＨｉｎｄIII  Ｍ断片の２．０ｋｂ  ＢｇｌIIないしＨｉｎｄIIIサブ断片内にあるＢｇｌII制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入されたＨｉｎｄIIIリンカー）に挿入した。該ＢｇｌII挿入部位は、ワクシニアウイルス・リボヌクレオシド二リン酸レダクターゼ遺伝子に対して有意な相同性を有するＳＰＶ  １４Ｌオープンリーディングフレーム内にある。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＢ（ｇＩＩ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０３４６】
Ｓ−ＳＰＶ−０４７はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９９−９４．３１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４７と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３４７】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０４７を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０４７プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０４７で観察されたプラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０３４８】
ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０４７で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０４７感染細胞からの溶解物は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｂの予測されるサイズである１２０ｋＤ、６７ｋＤおよび５８ｋＤに対応するバンドを呈した。
【０３４９】
ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ ｇＢはブタにおいて有意な免疫応答を刺激することが示されている（３７、３８；実施例８参照）。さらに、ＰＲＶ ｇＢを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（実施例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０４７はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。ここに記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ  ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらはワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋＲ、ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋＲおよびＣｌｉｎＥａｓｅＲ）と適合するであろう。
【０３５０】
Ｓ−ＳＰＶ−０５２
Ｓ−ＳＰＶ−０５２は３つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルスｇＢ（ｇＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄIII制限部位（ＳＰＶ  ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＮｄｅＩ部位に挿入されたＨｉｎｄIIIリンカー；ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII  Ｍ断片のほぼ５４５塩基対ＮｄｅＩないしＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０ないし２１０４；配列番号）が欠失されている）に挿入した。ＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）についての遺伝子を唯一のＰｓｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＢ（ｇＩＩ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあって、ＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
【０３５１】
Ｓ−ＳＰＶ−０５２はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８９−４１．７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０５２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３５２】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５２を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０５２プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５２で観察されたプラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０３５３】
ＰＲＶ  ｇＢおよびｇＤ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０５２で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５２感染細胞からの溶解物および上清は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｂの予測されるサイズである１２０ｋＤ、６７ｋＤおよび５８ｋＤに対応するバンド、およびＰＲＶ糖蛋白質Ｄの予測されるサイズである４８ｋＤに対応するバンドを呈した。
【０３５４】
ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ ｇＢおよびｇＤはブタにおいて有意な免疫応答を刺激することが示されている（３７、３８；実施例８参照）。さらに、ＰＲＶ ｇＢおよびｇＤを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（実施例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０５２はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。ここに記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ  ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらはワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋR、ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋRおよびＣｌｉｎＥａｓｅR）と適合するであろう。
【０３５５】
Ｓ−ＳＰＶ−０５３
Ｓ−ＳＰＶ−０５３は３つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルスｇＢ（ｇＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄIII制限部位（ＳＰＶ  ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＮｅＩ部位に挿入されたＨｉｎｄIIIリンカー；ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII  Ｍ断片のほぼ５４５塩基対ＮｄｅＩないしＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０ないし２１０４；配列番号）が欠失されている）に挿入した。ＰＲＶ  ｇＣ（ｇＩＩＩ）についての遺伝子を唯一のＰｓｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＢ（ｇＩＩ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあって、ＰＲＶ  ｇＣ（ｇＩＩＩ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
【０３５６】
Ｓ−ＳＰＶ−０５３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８９−４１．２７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０５３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３５７】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５３を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０５３プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５３で観察されたプラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０３５８】
ＰＲＶ  ｇＢおよびｇＣ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０５３で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５３感染細胞からの溶解物および上清は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｂの予測されるサイズである１２０ｋＤ、６７ｋＤおよび５８ｋＤに対応するバンド、およびＰＲＶ糖蛋白質Ｃの予測されるサイズである９２ｋＤに対応するバンドを呈した。
【０３５９】
ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ ｇＢおよびｇＣはブタにおいて有意な免疫応答を刺激することが示されている（３７、３８；実施例８参照）。さらに、ＰＲＶ ｇＢおよびｇＣを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（実施例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０５３はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。ここに記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ  ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらはワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋR、ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋRおよびＣｌｉｎＥａｓｅR）と適合するであろう。
【０３６０】
Ｓ−ＳＰＶ−０５４
Ｓ−ＳＰＶ−０５４は３つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルスｇＣ（ｇＩＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄIII制限部位（ＳＰＶ  ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＮｅＩ部位に挿入されたＨｉｎｄIIIリンカー；ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII  Ｍ断片のほぼ５４５塩基対ＮｄｅＩないしＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０ないし２１０４；配列番号）が欠失されている）に挿入した。ＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）についての遺伝子を唯一のＰｓｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＣ（ｇＩＩＩ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあって、ＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
【０３６１】
Ｓ−ＳＰＶ−０５４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８９−４１．２７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０５４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３６２】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５４を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０５４プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５４で観察されたプラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０３６３】
ＰＲＶ  ｇＣおよびｇＤ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０５４で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５４感染細胞からの溶解物および上清は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｃの予測されるサイズである９２ｋＤに対応するバンド、およびＰＲＶ糖蛋白質Ｄの予測されるサイズである４８ｋＤに対応するバンドを呈した。
【０３６４】
ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ ｇＣおよびｇＤはブタにおいて有意な免疫応答を刺激することが示されている（３７、３８；実施例８参照）。さらに、ＰＲＶ ｇＣおよびｇＤを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（実施例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０５４はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。ここに記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ  ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらはワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋR、ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋRおよびＣｌｉｎＥａｓｅR）と適合するであろう。
【０３６５】
Ｓ−ＳＰＶ−０５５
Ｓ−ＳＰＶ−０５５は４つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルスｇＢ（ｇＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄIII制限部位（ＳＰＶ  ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＮｅＩ部位に挿入されたＨｉｎｄIIIリンカー；ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII  Ｍ断片のほぼ５４５塩基対ＮｄｅＩないしＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０ないし２１０４；配列番号）が欠失されている）に挿入した。ＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）およびＰＲＶ  ｇＣ（ｇＩＩＩ）についての遺伝子を唯一のＰｓｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＢ（ｇＩＩ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあって、ＰＲＶ  ｇＣ（ｇＩＩＩ）遺伝子は合成初期／後記プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
【０３６６】
Ｓ−ＳＰＶ−０５５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８９−４１．７３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０５５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３６７】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５５を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０５５プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５５で観察されたプラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０３６８】
ＰＲＶ  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０５５で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５５感染細胞からの溶解物および上清は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｂの予測されるサイズである１２０ｋＤ、６７ｋＤおよび５８ｋＤに対応するバンド；ＰＲＶ糖蛋白質Ｃの予測されるサイズである９２ｋＤに対応するバンド；およびＰＲＶ糖蛋白質Ｄの予測されるサイズである４８ｋＤに対応するバンドを呈した。
【０３６９】
ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤはブタにおいて有意な免疫応答を誘発することが示されている（３７、３８；実施例８参照）。さらに、ＰＲＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（実施例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０５５はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。ここに記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ  ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらはワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋR、ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋRおよびＣｌｉｎＥａｓｅR）と適合するであろう。
【０３７０】
実施例２９
ＳＰＶ−０５９
Ｓ−ＳＰＶ−０５９は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−グルクロニダーゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ）をＳＰＶ  ＨｉｎｄIII  Ｋゲノム断片内にあるＳＰＶ  Ｂ１８Ｒオープンリーディングフレーム中の唯一のＥｃｏＲＩ制限部位に挿入した。該ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＳＰＶ  ６．５ｋｂ  ＨｉｎｄIII  Ｋ断片（配列番号）の３．２ｋｂ領域からの部分配列は、３つの可能なオープンリーディングフレームを示す。ＳＰＶ  Ｂ１８Ｒ  ＯＲＦはワクシニアウイルスＢ１８Ｒ遺伝子、ウサギ線維腫ウイルスからの７７．２Ｋ蛋白質、ワクシニアウイルスＣ１９Ｌ／Ｂ２５Ｒ  ＯＲＦおよびヒト脳変異体からのアンキリン反復領域に相同な配列を示す。該Ｂ１８Ｒ遺伝子は高親和性および広い特異性を持つ可溶性インターフェロン受容体をコードする。ＳＰＶ  Ｂ４Ｒオープンリーディングフレームはウサギ線維腫ウイルスのＴ５蛋白質に相同の配列を示す。
【０３７１】
Ｓ−ＳＰＶ−０５９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６−５０．３１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性ベクター７９６−５０．３１はプラスミド５５１−４７．２３（材料および方法参照）からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡカセットを含有する平滑末端化されたＮｃｏＩ断片の、ＳＰＶ６．５ｋｂ  ＨｉｎｄIII  Ｋ断片中の唯一のＥｃｏＲＩ部位（平滑末端化）への挿入によって創製された。「酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニング」によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０５９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３７２】
Ｓ−ＳＰＶ−０５９を精製し、これは外来性遺伝子、イー・コリｕｉｄＡを発現し、これは７．５ｋｂ  ＨｉｎｄIII  Ｋ断片内のＥｃｏＲＩ部位が外来性遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換え豚痘ウイルスは外来性遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または発現された外来性遺伝子に対する抗体を生起させるための発現ベクターとして有用である。
【０３７３】
ＳＰＶ−０６０
Ｓ−ＳＰＶ−０６０は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−グルクロニダーゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ）をＳＰＶ  ＨｉｎｄIII  Ｎゲノム断片内にある唯一のＥｃｏＲＶ制限部位に挿入した。該ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＳＰＶ  ３．２ｋｂ  ＨｉｎｄIII  Ｎ断片（配列番号）の部分配列は、２つの可能なオープンリーディングフレームを示す。ＳＰＶ  Ｉ７Ｌ  ＯＲＦはワクシニアウイルスの蛋白質Ｉ７に相同な配列を示す。該ＳＰＶ  Ｉ４Ｌオープンリーディングフレームは、ワクシニアウイルスのリボヌクレオシド二リン酸レダクターゼ遺伝子に相同の配列を示す。Ｉ４Ｌ  ＯＲＦおよびＩ７Ｌ  ＯＲＦの間の、２つの可能なオープンリーディングフレームＩ５ＬおよびＩ６Ｌは機能が未知である。
【０３７４】
Ｓ−ＳＰＶ−０６０はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６−７１．３１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性ベクター７９６−７１．３１はプラスミド５５１−４７．２３（材料および方法参照）からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡカセットを含有する平滑末端化されたＮｃｏＩ断片の、ＳＰＶ３．２ｋｂ  ＨｉｎｄIII  Ｎ断片（図２９Ａ）中の唯一のＥｃｏＲＶ部位への挿入によって創製された。「酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニング」によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６０と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３７５】
Ｓ−ＳＰＶ−０６０を精製し、これは外来性遺伝子、イー・コリｕｉｄＡを発現し、これは３．２ｋｂ  ＨｉｎｄIII  Ｎ断片内のＥｃｏＲＩ部位が外来性遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換え豚痘ウイルスは外来性遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または発現された外来性遺伝子に対する抗体を生起させるための発現ベクターとして有用である。
【０３７６】
Ｓ−ＳＰＶ−０６１
Ｓ−ＳＰＶ−０６１は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−グルクロニダーゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ）をＳＰＶ  ＨｉｎｄIII  Ｎゲノム断片内にある唯一のＳｎａＢＩ制限部位に挿入した。該ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＳＰＶ  ３．２ｋｂ  ＨｉｎｄIII  Ｎ断片（配列番号）の部分配列は、２つの可能なオープンリーディングフレームを示す。ＳＰＶ  Ｉ７Ｌ  ＯＲＦはワクシニアウイルスの蛋白質Ｉ７に相同な配列を示す。該ＳＰＶ  Ｉ４Ｌオープンリーディングフレームは、ワクシニアウイルスのリボヌクレオシド二リン酸レダクターゼ遺伝子に相同の配列を示す。Ｉ４Ｌ  ＯＲＦおよびＩ７Ｌ  ＯＲＦの間の、２つの可能なオープンリーディングフレームＩ５ＬおよびＩ６Ｌは機能が未知である。
【０３７７】
Ｓ−ＳＰＶ−０６１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６−７１．４１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性ベクター７９６−７１．４１はプラスミド５５１−４７．２３（材料および方法参照）からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡカセットを含有する平滑末端化されたＮｃｏＩ断片の、ＳＰＶ３．２ｋｂ  ＨｉｎｄIII  Ｎ断片中の唯一のＳｎａＢＩ部位への挿入によって創製された。「酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニング」によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３７８】
Ｓ−ＳＰＶ−０６１を精製し、これは外来性遺伝子、イー・コリｕｉｄＡを発現し、これは３．２ｋｂ  ＨｉｎｄIII  Ｎ断片内のＳｎａＢＩ部位が外来性遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換え豚痘ウイルスは外来性遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または発現された外来性遺伝子に対する抗体を生起させるための発現ベクターとして有用である。
【０３７９】
Ｓ−ＳＰＶ−０６２
Ｓ−ＳＰＶ−０６２は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−グルクロニダーゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ）をＳＰＶ  ＨｉｎｄIII  Ｎゲノム断片内にある唯一のＢｇｌII制限部位に挿入した。該ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＳＰＶ  ３．２ｋｂ  ＨｉｎｄIII  Ｎ断片（配列番号）の部分配列は、２つの可能なオープンリーディングフレームを示す。ＳＰＶ  Ｉ７Ｌ  ＯＲＦはワクシニアウイルスの蛋白質Ｉ７に相同な配列を示す。該ＳＰＶ  Ｉ４Ｌオープンリーディングフレームは、ワクシニアウイルスのリボヌクレオシド二リン酸レダクターゼ遺伝子に相同の配列を示す。Ｉ４Ｌ  ＯＲＦおよびＩ７Ｌ  ＯＲＦの間の、２つの可能なオープンリーディングフレームＩ５ＬおよびＩ６Ｌは機能が未知である。
【０３８０】
Ｓ−ＳＰＶ−０６２はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６−７１．５１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性ベクター７９６−７１．５１はプラスミド５５１−４７．２３（材料および方法参照）からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡカセットを含有する平滑末端化されたＮｃｏＩ断片の、ＳＰＶ３．２ｋｂ  ＨｉｎｄIII  Ｎ断片中の唯一のＢｇｌII部位への挿入によって創製された。「酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニング」によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３８１】
Ｓ−ＳＰＶ−０６２を精製し、これは外来性遺伝子、イー・コリｕｉｄＡを発現し、これは３．２ｋｂ  ＨｉｎｄIII  Ｎ断片内のＢｇｌII部位が外来性遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換え豚痘ウイルスは外来性遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または発現された外来性遺伝子に対する抗体を生起させるための発現ベクターとして有用である。
【０３８２】
実施例３０：
合成初期または合成痘プロモーターの制御下にあるイー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）を発現する組換え豚痘ウイルス
各々、合成痘プロモーターＬＰ１、ＬＰ２、およびＥＰ１の制御下にあるイー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）を発現する３つの組換え豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５６、Ｓ−ＳＰＶ−０５７、およびＳ−ＳＰＶ−０５８を構築した。
【０３８３】
Ｓ−ＳＰＶ−０５６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９１−６３．１９（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。Ｓ−ＳＰＶ−０５７はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９１−６３．４１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。Ｓ−ＳＰＶ−０５８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６−１８．９（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０５６、Ｓ−ＳＰＶ−０５７およびＳ−ＳＰＶ−０５８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３８４】
組換え豚痘ウイルスはヒト細胞系においてイー・コリβ−ガラクトシダーゼのごとき外来性遺伝子を発現するが、ヒト細胞系において複製しない。外来性遺伝子の発現を最適化するために、Ｓ−ＳＰＶ−０５６、Ｓ−ＳＰＶ−０５７およびＳ−ＳＰＶ−０５８を用いて、初期または後期合成ポックスウイルス・プロモーターの制御下にあるイー・コリβ−ガラクトシダーゼの最適発現レベルを比較する。組換え豚痘ウイルスの発現が欠失されているヒト細胞系は、限定されるものではないが、１４３Ｂ（骨肉腫）、Ａ４３１（類表皮癌）、Ａ５４９（肺癌）、Ｃａｐａｎ−１（肝臓癌）、ＣＦ５００（包皮繊維芽細胞）、Ｃｈａｎｇ  Ｌｉｖｅｒ（肝臓）、Ｄｅｔｒｏｉｔ（ダウン包皮繊維芽細胞）、ＨＥＬ−１９９（胚性肺）、ＨｅＬａ（子宮頸部癌）、ＨＥｐ−２（表皮咽頭癌）、ＨＩＳＭ（腸平滑筋）、ＨＮＫ（新生児腎臓）、ＭＲＣ−５（胚性肺）、ＮＣＩ−Ｈ２９２（肺粘膜表皮癌）、ＯＶＣＡＲ−３（卵巣癌）、ＲＤ（横紋筋肉腫）、ＴＨＦ（単球白血球）、ＷＩＬ２−ＮＳ（Ｂリンパ球系、非分泌）、ＷＩＳＨ（羊膜）を含む。
【０３８５】
実施例３１
Ｓ−ＳＰＶ−０５１
Ｓ−ＳＰＶ−０５１は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウシ・ウイルス性下痢ウイルス糖蛋白質５３（ｇ５３）についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＢＶＤＶ  ｇ５３遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０３８６】
Ｓ−ＳＰＶ−０５１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８３−３９．２（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０５１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３８７】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５１を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ＢＶＤＶ  ｇ５３に対するマウス・モノクローナル抗体はＳ−ＳＰＶ−０５１プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５１で観察されたプラークはＢＶＤＶ  ｇ５３に対するモノクローナル抗体と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０３８８】
ＢＶＤＶ  ｇ５３遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０５１で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ＢＶＤＶ  ｇ５３に対するモノクローナル抗体を用いてＢＶＤＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５１感染細胞からの溶解物および上清は、ＢＶＤＶ  ｇ５３蛋白質の糖鎖付加および非糖鎖付加形態を示す５３ｋｄおよびそれを超えるバンドを呈した。
【０３８９】
Ｓ−ＳＰＶ−０５１はウシにおいてＢＶＤＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＢＶＤＶ糖蛋白質５３の発現に有用である。
【０３９０】
実施例３２：
Ｓ−ＳＰＶ−０４４：
Ｓ−ＳＰＶ−０４４は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および感染性包病ウイルス（ＩＢＤＶ）ポリメラーゼ蛋白質についての遺伝子を６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０３９１】
Ｓ−ＳＰＶ−０４４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７４９−７５．７８（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３９２】
Ｓ−ＳＰＶ−０４４はＩＢＤＶポリメラーゼ蛋白質の発現に有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０４４は組換えＩＢＤＶ弱毒化ワクチンに対するイン・ビトロのアプローチで有用である。Ｔ３またはＴ７プロモーター（pBlueScriptプラスミド；Stratagene, Inc.）を用いて弱毒化ＩＢＤＶ株からのＲＮＡ鎖を細菌発現系で合成して、ＩＢＤＶゲノムの二本鎖短鎖および長鎖セグメントを合成する。豚痘ウイルスはＩＢＤＶポリメラーゼを発現するが、ＣＥＦ細胞中で複製しない。Ｓ−ＳＰＶ−０４４から産生されたＩＢＤＶポリメラーゼは、二本鎖ＲＮＡゲノム鋳型から感染性弱毒化ＩＢＤＶウイルスを合成する。得られた弱毒化ＩＢＤＶウイルスはニワトリにおいて感染性包病に対するワクチンとして有用である。
【０３９３】
実施例３３：
Ｓ−ＳＰＶ−０４６
Ｓ−ＳＰＶ−０４６は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｇａｇプロテアーゼ（ｇａｇ）についての遺伝子を７３８−９４．４  ＯＲＦ（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＦＩＶ  ｇａｇ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０３９４】
Ｓ−ＳＰＶ−０４６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７６１−７５．Ｂ１８（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４６と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３９５】
ＦＩＶ  ｇａｇ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０４６で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ネコ抗−ＦＩＶ（ＰＰＲ株）血清を用いてＦＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０４６感染細胞からの溶解物および上清は、ＦＩＶ  ｇａｇ蛋白質の予測されたサイズである２６ｋｄおよび１７ｋｄにおけるバンドを呈した。組換え豚痘ウイルスにより発現されたＦＩＶ  ｇａｇ蛋白質は適当に加工され、培地に分泌された。
【０３９６】
Ｓ−ＳＰＶ−０４８
Ｓ−ＳＰＶ−０４８は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）エンベロープ（ｅｎｖ）についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｃｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＦＩＶ  ｅｎｖ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０３９７】
Ｓ−ＳＰＶ−０４８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８１−８４．Ｃ１１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０３９８】
Ｓ−ＳＰＶ−０４６およびＳ−ＳＰＶ−０４８は単独でまたはネコにおけるＦＩＶ感染に対するワクチンとしての組合せにおいて有用であって、ＦＩＶ  ｅｎｖおよびｇａｇ蛋白質の発現に有用である。ＦＩＶ  ｅｎｖおよびｇａｇ蛋白質双方を発現する組換え豚痘ウイルスはネコにおいてＦＩＶ感染に対するワクチンとして有用である。
【０３９９】
ヒト呼吸器系シンシチウムウイルスＦおよびＧ蛋白質を発現する組換え豚痘ウイルスはヒトの病気に対するワクチンとして有用である。
【０４００】
実施例３４
組換えポックスウイルスで発現されたニワトリＩＦＮのイン・ビトロ特性
細胞培養における組換えウイルスの増殖特性。野生型豚痘ウイルスと比較して、Ｓ−ＳＰＶ−０４２は胚性ブタ腎臓細胞（ＥＳＫ−４）において増殖しなかった。
【０４０１】
ＳＰＶ／ｃＩＦＮ組換えウイルスで感染させた細胞からの上清につきウェスタンブロット分析を行った。ウサギおよびマウス抗血清を、濃縮ＳＰＶ／ｃＩＦＮ感染不和済みからのｃＩＦＮに対して生起させ、ウェスタン分析用の調製において、野生型ＳＰＶで感染させたＥＳＫ−４細胞に対して予め清澄化させた。ウサギおよびマウス抗−ｃＩＦＮ抗血清は、組換えＳＰＶ／ｃＩＦＮおよびＳＰＶ野生型ウイルス感染上清からのニトロセルロース上の変性蛋白質と反応した。１７−２０キロダルトンの推定分子量サイズ範囲を持つ反応性バンドがＳＰＶ／ｃＩＦＮレーンに存在し、ＳＰＶ野生型対照レーンでは存在しなかった。
【０４０２】
水泡性口内炎ウイルスの増殖に対するＳＰＶ／ｃＩＦＮ（Ｓ−ＳＰＶ−０４２）、ＦＰＶ／ｃＩＦＮ、およびＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ＮＤＶ感染細胞からの上清で発現されたｃＩＦＮの効果
ＳＰＶ／ｃＩＦＮ、ＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ｃＩＦＮ感染細胞からのビリオン清澄化上清をウイルス阻害活性の存在につきテストし、結果を表１に示す。略言すれば、ＣＥＦ細胞を系列希釈したウイルス上清と共にインキュベートした。引き続いて、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の４０,０００プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ウェルを添加し、４８時間後にＶＳＶ細胞障害効果（ＣＰＥ）につきウェルをスコア取りした。ｃＩＦＮを含有する組換えウイルス上清はＶＳＶ誘導ＣＰＥを阻害することが示され、他方、対照ウイルス上清は阻害しなかった。ＶＳＶ誘導細胞障害効果はウサギ抗−ｃＩＦＮ血清の存在下では逆になったであろう。
【表１】
2008148712.tif 000002
【０４０３】
シチメンチョウのヘルペスウイルスに対するＳＰＶ／ｃＩＦＮ感染細胞の上清から発現されたｃＩＦＮの効果
ＳＰＶ／ｃＩＦＮウイルスで感染したＥＳＫ−４細胞からの組換えｃＩＦＮを含有する上清を、ＣＥＦ細胞におけるシチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶＴ）の増殖を阻害するその活性につきテストし、結果を表２に示す。略言すれば、系列希釈上清をＣＥＦ細胞と共にインキュベートし、次いで、１００ｐｆｕ／ウェルの野生型ＨＶＴで感染させた。４８時間後に全てのウェルでプラークを計数した。１０−１００単位のｃＩＦＮ活性はＨＶＴ（１００ｐｆｕ／ウェル）のプラーク形成を阻害した。野生型ＳＰＶからの上清はＨＶＴプラーク形成を阻害しなかった。
【表２】
2008148712.tif 000003
【０４０４】
ＳＰＶ／ｃＩＦＮ感染細胞からの上清で発現されたｃＩＦＮでの処理の後におけるニワトリ・マクロファージによるＮＯの誘導
ＨＤ１１細胞または骨髄接着性細胞をＳＰＶ／ｃＩＦＮ上清からの１０００単位／ｍｌのｃＩＦＮ、リポ多糖（ＬＰＳ）（９ｎｇ／ｍｌ）またはｃＩＦＮおよびＬＰＳ双方と共にインキュベートし、結果を表３に示す。２４時間後、上清流体を収集し、亜硝酸塩レベルを測定した。これらのデータは、ＳＰＶ／ｃＩＦＮ上清から発現されたｃＩＦＮがＬＰＳの存在下でニワトリ・マクロファージを活性化する能力を有することを示す。
【表３】
2008148712.tif 000004
【０４０５】
結論：
１．組換え豚痘ウイルスは、ＶＳＶ感染からのＣＥＦ細胞の保護によって測定して、生物学的に活性なニワトリ・インターフェロンを感染細胞の上清中に発現する。
【０４０６】
２．組換えＳＰＶ／ｃＩＦＮ感染細胞からの上清で発現されたニワトリ・インターフェロンは用量依存的にＨＶＴでの感染に対してＣＥＦ細胞を保護することが示された。
【０４０７】
３．ＳＰＶ／ｃＩＦＮから発現されたニワトリ・インターフェロンはＰＬＳと相乗的に作用して、一酸化窒素誘導によって検出して、ニワトリ・マクロファージを活性化する。
【０４０８】
４．前記データは、ニワトリＩＦＮを発現する組換え豚痘ウイルスがイン・ビトロ、イン・ビボおよびイン・オボにおいて免疫変調剤として遊離な適用を有し得ることを示す。
【０４０９】
実施例３５
ウイルスベクターによる送達系および／またはサブユニット・アプローチを用いるＩＢＤワクチンの構築の別法として、ＩＢＤウイルスＲＮＡを直接操作して、大（セグメントＡ）および小（セグメントＢ）二本鎖ＲＮＡサブユニット双方を表すｃＤＮＡクローンから誘導された全長ＲＮＡを用いてウイルスを再構築する。ＩＢＤウイルスの生成はこのようにして最初の２つのアプローチよりも優れたいくつかの利点を与える。まず、もしＩＢＤウイルスをＲＮＡ鋳型を用いて再度生成すれば、転写（ＲＭＡの生成）に先立ってウイルス・ゲノムのクローン化ｃＤＮＡコピーを操作することができる。このアプローチを用い、ビルレントＩＢＤ株を弱毒化するか、あるいは弱毒化ワクチン骨格のＶ２可変領域をビルレント株のそれで置き換えることができる。そうする場合において、本発明は、ワクチン株の安全性および効率を供しつつ、ビルレントＩＢＤ株に対する保護を提供する。さらに、このアプローチを用い、本発明により、関連ビルナウイルス感染性膵臓壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）から誘導されたＲＮＡポリメラーゼおよびＩＰＮＶから誘導されたポリプロテインを用いて生成した温度感受性ＩＢＤウイルスが構築されテストされる。ＩＰＮＶポリメラーゼはＩＢＤＶのそれよりも低い温度で最適活性を有する。もしＩＰＮＶポリメラーゼがＩＢＤＶ上に存在する調節シグナルを認識すれば、ハイブリッド・ウイルスはニワトリに存在する高温で弱毒化されることが期待される。別法として、ＩＢＤＶ血清型２ウイルスから誘導されたＲＮＡポリメラーゼおよびＩＢＤＶ血清型１ウイルスから誘導されたポリプロテインを用いて生成されたＩＢＤウイルスを構築しテストできる。
【０４１０】
最初にBursaVacワクチン株（Sterwin Labs)を用いて、ＩＢＤＶの完全なゲノム（二本鎖ＲＮＡセグメントＡおよびＢ）を表すｃＤＮＡクローンを構築する。一旦セグメントＡおよびＢの全長コピーを表すｃＤＮＡクローンが構築されたならば、鋳型ＲＮＡが調製される。ＩＢＤＶは二セグメント化二本鎖ＲＮＡウイルスとして存在するので、pBlueScriptプラスミド（Stratagene, Inc.)を用いて、各セグメントのセンスおよびアンチセンス両ＲＮＡ鎖を得る。これらのベクターは、イン・ビトロで実質量のＲＮＡを得るために高度に特異的なファージ・プロモーターを利用する。唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位を３’ＰＣＲプライマーに作成して、転写の間にラン−オフ転写体の生成のためにＤＮＡを線状化する。
【０４１１】
精製されたＲＮＡ転写体（４鎖）をニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）にトランスフェクトして該ＲＮＡが感染性であるか否かを判断する。ＩＢＤＶ特異的Ｍａｂｓを用いる黒色プラーク・アッセイによって判断してもしＩＢＤウイルスが生成すれば、さらなる操作は必要ではなく、ワクチン株の作成を開始できる。この方法の利点は、このようにして作成されたＩＢＤウイルスは純粋でほとんど／全く精製を要せず、新しいワクチンを創製するのに要する時間を大幅に減少させるということである。もし精製されたＲＮＡを用いて陰性結果が得られれば、ヘルパーウイルスの使用による機能的ウイルスＲＮＡポリメラーゼが必要である。ビルナウイルスは鎖置き換え（半保存的）メカニズムによってその核酸を複製し、ＲＮＡポリメラーゼは二本鎖ＲＮＡ分子の末端に結合し、環化された環構造を形成する（Muller & Nitschke, Virology 159, 174-177, 1987)。豚痘ウイルスにおける約８７８アミノ酸のＲＮＡポリメラーゼ・オープンリーディングフレームを発現させ、この組換えウイルス（Ｓ−ＳＰＶ−０４４）を用いて、イン・トラントにて機能的ＩＢＤＶ  ＲＮＡを得る。ウイルス・ベクターの生成的複製の徴候がない場合、豚痘ウイルスは免疫学的に認識可能な外来性抗原を鳥類細胞（ＣＥＦ細胞）にて発現した。本発明においては、ＳＰＶ複製で細胞を汚染することくなく、豚痘ベクターを用いてＩＢＤＶポリメラーゼ蛋白質をトリンスフェクトしたＲＮＡとして同一細胞内で発現させる。
【０４１２】
ゲノムＲＮＡを用いてＩＢＤウイルスはイン・ビトロで生成されるということが証明されれば、感染性包病に対する改良された弱毒化ウイルス生ワクチンが開発される。生成するＩＢＤウイルスの新しく規定された系と共に組換えＤＮＡ技術を用いて、弱毒化ウイルスの構築を容易とするウイルス・ゲノム内の特異的欠失が作成される。この技術を用い、病原性の原因となるＩＢＤＶの領域および弱毒化された免疫原性ＩＢＤＶワクチンが同定される。本発明はビルレントＩＢＤ株または弱毒化ワクチン骨格のＶＰ２可変領域のビルレント株のそれでの置き換えを提供し、かくして、ワクチン株の安全性および効果を供しつつ、ビルレント株に対して保護する。
【０４１３】
実施例３６
シチメンチョウのヘルペスウイルスの増殖に対するウサギ抗−ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）抗体の効果
ＳＰＶ／ｃＩＰＮ（ＳＰＶ０４１）感染ＥＳＫ−４細胞からの上清を感染４８時間後に収穫し、次いで、Centricon 10 カラム（Amicon）によって５−１０倍濃縮した。１ｍｌの濃縮上清をウサギに３週間間隔で３回注射し、次いで、血液採取した。次いで、このウサギ抗血清を培養で用いて、ＨＶＴの増殖に対するインターフェロンの効果を調べた。抗−ｃＩＦＮはプラーク・アッセイにおいてｃＩＦＮの添加によって誘導されたＨＶＴ（１：２００）およびＶＳＶ（１：８０）に対するブロックを逆行させることが示された。さらに、ＨＶＴウイルスＤＮＡのサブ−プラーキング・レベルで一時的にトランスフェクトしたＣＥＦの培地中への抗−ｃＩＦＮの添加（１：１００）は、ＨＶＴプラークの形成（２００プラーク／ウェル）を増強させることが示された。抗−ｃＩＦＮの不存在下でＨＶＴ  ＤＮＡでトランスフェクトしたＣＥＦはプラークを生じなかった。
【０４１４】
ＨＶＴはＣＥＦから産生されたインターフェロンに高度に感受性であって、ｃＩＦＮをブロックした場合、ＨＶＴ増殖が増強された。
【０４１５】
出願人は、（１）ワクチン・ストックにおいてＨＶＴ力価を増加させるための添加剤としてのｃＩＦＮに対する抗体の使用；（２）コスミド再構築を介する新しい組換えＨＶＴウイルスの形成を容易とするための添加剤としてのｃＩＦＮに対する抗体の使用を含める。
【０４１６】
実施例３７
Ｓ−ＳＰＶ−０６３
Ｓ−ＳＰＶ−０６３は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＮＰ（Ｈ１Ｎ１）についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＮＰ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０４１７】
Ｓ−ＳＰＶ−０６３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０７−４１．３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０４１８】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０６３を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＮＰポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０６３プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０６３で観察されたプラークはブタ抗−ＳＩＶ血清またはヤギ抗−ＮＰ血清と反応し、これは該ウイルスがＳＩＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０４１９】
ＳＩＶ  ＮＰ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０６３で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＮＰポリクローナル血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０６３感染細胞からの溶解物および上清は、ＳＩＶ  ＮＰ蛋白質の予測されるサイズである５６ｋｄに対応するバンドを呈した。
【０４２０】
Ｓ−ＳＰＶ−０６３はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＳＩＶ  ＮＰの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６３はＮＡを発現するＳ−ＳＰＶ−０６６およびＳＩＶ  ＨＡを発現するＳ−ＳＰＶ−０６５と組み合わせたワクチンとして有用である。
【０４２１】
Ｓ−ＳＰＶ−０６４
Ｓ−ＳＰＶ−０６４は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）についての遺伝子を６．９ｋｂ  ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII  Ｊゲノム断片内の唯一のＸｈｏＩ制限部位に挿入した。該ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＨｉｎｄIII  Ｊゲノム断片はＡ５０Ｒ  ＯＲＦの一部（ａａ２２７ないし５５２）を含有する。唯一のＸｈｏＩ部位はＡ５０Ｒ  ＯＲＦ内にはない。ＸｈｏＩ部位は豚痘ウイルス・ゲノムの３’末端から２５ｋｂにある。
【０４２２】
Ｓ−ＳＰＶ−０６４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０７−４２．２８およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性ベクター８０７−４２．２８は、プラスミド５５１−４７．２３からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡ遺伝子カセットを含有するＮｏｔＩ断片（材料および方法参照）の、６．９ｋｂ  ＨｉｎｄIII  Ｊ断片中のＮｏｔＩ部位（ＤＮＡリンカーによって唯一のＸｈｏＩ部位はＮｏｔＩに変換した）への挿入によって生成した。「酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニングスクリーニング」によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０４２３】
Ｓ−ＳＰＶ−０６４を精製し、これは外来性遺伝子、イー・コリｕｉｄＡを発現し、これは６．９ｋｂ  ＨｉｎｄIII  Ｊ断片内のＸｈｏＩ部位がウイルス増殖に必須でない部位であって外来性遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換え豚痘ウイルスは外来性遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または発現された外来性遺伝子に対して抗体を生起させるための発現ベクターとして有用である。
【０４２４】
Ｓ−ＳＰＶ−０６５
Ｓ−ＳＰＶ−０６５は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＨＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０４２５】
Ｓ−ＳＰＶ−０６５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０７−８４．３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０４２６】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０６５を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＨＡポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０６５プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０６５で観察されたプラークはブタ抗−ＳＩＶ血清と反応した。ＳＩＶ外来性遺伝子。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０４２７】
ＳＩＶ  ＮＰ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０６５で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＨＡポリクローナル血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０６５感染細胞からの細胞溶解物および上清は、ＳＩＶ  ＨＡ蛋白質の予測されるサイズである６４ｋｄに対応するバンドを呈した。
【０４２８】
Ｓ−ＳＰＶ−０６５はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＳＩＶ  ＮＰの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６５はＮＡを発現するＳ−ＳＰＶ−０６６およびＳＩＶ  ＮＰを発現するＳ−ＳＰＶ−０６３と組み合わせたワクチンとして有用である。
【０４２９】
Ｓ−ＳＰＶ−０６６
Ｓ−ＳＰＶ−０６６は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＮＡ（Ｈ１Ｎ１）についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＮＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０４３０】
Ｓ−ＳＰＶ−０６６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０７−８４．３５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６６と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０４３１】
ＳＩＶ  ＮＡ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０６６で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＮＡポリクローナル血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０６６感染細胞からの細胞溶解物および上清は、ＳＩＶ  ＨＡ蛋白質の予測されるサイズである６４ｋｄに対応するバンドを呈した。
【０４３２】
Ｓ−ＳＰＶ−０６６はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＳＩＶ  ＮＡの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６６はＨＡを発現するＳ−ＳＰＶ−０６５およびＳＩＶ  ＮＰを発現するＳ−ＳＰＶ−０６３と組み合わせたワクチンとして有用である。
【０４３３】
Ｓ−ＳＰＶ−０７１
Ｓ−ＳＰＶ−０７１は少なくとも４つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）およびＮＡ（Ｈ１Ｎ１）についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＨＡ、およびＮＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０４３４】
Ｓ−ＳＰＶ−０７１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８１７−８６．３５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０７１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０４３５】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０７１を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ヤギ抗−ＨＡポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０７１プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０７１で観察されたプラークはヤギ抗−ＨＡ血清と反応し、これはウイルスがＳＩＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０４３６】
ＳＩＶ  ＨＡおよびＮＡ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０７１で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＨＡポリクローナル血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０７１感染細胞からの細胞溶解物および上清は、ＳＩＶ  ＨＡおよびＮＡ蛋白質の予測されるサイズである６４ｋｄおよび５２ｋｄに対応するバンドを呈した。
【０４３７】
Ｓ−ＳＰＶ−０７１はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＳＩＶ  ＨＡおよびＮＡの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０７１はＳＩＶ  ＮＰを発現するＳ−ＳＰＶ−０６３と組み合わせたワクチンとして有用である。
【０４３８】
Ｓ−ＳＰＶ−０７４
Ｓ−ＳＰＶ−０７４は少なくとも４つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）についての遺伝子およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）およびＮＡ（Ｈ１Ｎ１）についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＨＡおよびＮＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０４３９】
Ｓ−ＳＰＶ−０７４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８１７−１４．２（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０７４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０４４０】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０７４を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＳＩＶ血清はＳ−ＳＰＶ−０７４プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０７４で観察されたプラークはヤギ抗−ＨＡ血清と反応し、これはウイルスがＳＩＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０４４１】
Ｓ−ＳＰＶ−０７４はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＳＩＶ  ＨＡおよびＮＡの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０７４はＳＩＶ  ＮＰを発現するＳ−ＳＰＶ−０６３と組み合わせたワクチンとして有用である。
【０４４２】
Ｓ−ＳＰＶ−０６９
Ｓ−ＳＰＶ−０６９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＲＳＶ）融合（Ｆ）蛋白質についての遺伝子をＳＰＶ  ７２８−９４．４  ＯＲＦ（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０４４３】
Ｓ−ＳＰＶ−０６９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８１０−２１９．Ａ１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０４４４】
「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０６９を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ＨＲＳＶ  Ｆに対するモノクローナル抗体６２１（Biodesign, Inc.)はＳ−ＳＰＶ−０６９プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０６９で観察されたプラークはモノクローナル抗体６２１と反応し、これはウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
【０４４５】
Ｓ−ＳＰＶ−０７８
Ｓ−ＳＰＶ−０７８は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＲＳＶ）付着（Ｇ）蛋白質についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＨＲＳＶ  Ｇ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０４４６】
Ｓ−ＳＰＶ−０７８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８２２−５２Ｇ．７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０７８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０４４７】
Ｓ−ＳＰＶ−０６９およびＳ−ＳＰＶ−０７８はブタにおいてヒト呼吸器系シンシチウムウイルス感染に対するワクチンとして個々にまたは組み合わせて有用であって、ＨＲＳＶ  ＦおよびＧ遺伝子の発現に有用である。
【０４４８】
相同性ベクター８１０−２９．Ａ２
プラスミド８１０−２９．Ａ２は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入する目的で構築した。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＲＳＶ）融合（Ｆ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。外来性遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡのほぼ８５５塩基対断片がある。外来性遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡのほぼ１１１３塩基対断片がある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従って該プラスミドを用いる場合、外来性遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られるであろう。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は豚痘ウイルス０１Ｌマーカー遺伝子プロモーターの制御下にあり、ＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子は後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を合成ＤＮＡ配列に連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６５（プロメガ社）のほぼ２５１９塩基対ＨｉｎｄIIIないしＳｐｈＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳｐｈＩおよびＢｇｌII末端をもつ８５５塩基対断片を得るための、ＤＮＡプライマー５’−ＧＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡＴＡ−３’（配列番号：１８５）および５’−ＣＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：１８６）を用いるポリメラーゼ鎖反応によって合成したＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）のほぼ８５５塩基対サブ断片である。断片２はイー・コリｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導した３００２塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ断片である。断片３は、ＨＲＳＶ株Ａ２（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３０２）からのＲＮＡを用い、逆転写酵素およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したほぼ１７２８塩基対ＥｃｏＲＩ制限断片である。プライマー（５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＡＴＣＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＴＧＣＡＡＴ−３’；４／９５．２３）（配列番号）はＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端のＥｃｏＲＩ部位およびＡＴＧ開始コドンを導入する。プライマー（５’−ＧＧＴＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＴＡＣＴＡＡＡＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＴ−３’；４／９５．２４）（配列番号）はＦ遺伝子の３’末端から合成し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化して、ＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子に対応する長さの断片１７２８塩基対を得た。断片４は、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄIII末端をもつ１１１３塩基対断片を得るための、プライマー５’−ＣＣＧＴＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴ−３’（配列番号：１８７）および５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＴ−３’（配列番号：１８８）を用いるポリメラーゼ鎖反応によって合成したＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍのほぼ１１１３塩基対サブ断片である。
【０４４９】
相同性ベクター８２２−５２Ｇ．７．
プラスミド８２２−５２Ｇ．７は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入する目的で構築した。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＲＳＶ）付着（Ｇ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。外来性遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡのほぼ１４８４塩基対断片がある。外来性遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡのほぼ２１４９塩基対断片がある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従って該プラスミドを用いる場合、外来性遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られるであろう。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＨＲＳＶ  Ｇ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。それは、以下の源からの制限断片を連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６５（プロメガ社）のほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄIIIないしＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＡｃｃＩないしＢｇｌII制限亜断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほぼ３００６塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＨＲＳＶ株Ａ２（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３０２）からのＲＮＡを用い、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したほぼ８９９塩基対ＥｃｏＲＩ制限断片である。プライマー（５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＡＣＧＣＡＣ−３’；４／９５．２５）（配列番号）はＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端のＥｃｏＲＩ部位およびＡＴＧ停止コドンを導入する。プライマー（５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＣＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＴＴＧ−３’；４／９５．２６）（配列番号）はＨＲＳＶ  Ｇ遺伝子の３’末端から合成し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化して、ＨＲＳＶ  Ｇ遺伝子に対応する長さの断片８９９塩基対を得た。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）のほぼ２１４９塩基対ＨｉｎｄIIIないしＡｃｃＩ制限部位亜断片である。
【０４５０】
相同性ベクター８０７−４１．３
プラスミド８０７−４１．３は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入する目的で構築した。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）核蛋白質（ＮＰ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従って該プラスミドを用いる場合、外来性遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られるであろう。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＮＰ遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄIIIないしＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＢｇｌIIないしＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ  ＨＩＮ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ  ＮＰ遺伝子のほぼ１５０１塩基対ＥｃｏＲＩないしＥｃｏＲＩ断片である。プライマー（５’−ＣＡＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＣ−３’；６／９５．１３）（配列番号）はＳＩＶ  ＮＰ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで臭化してＳＩＶ  ＮＰ遺伝子に対応する長さの断片１５０１塩基対を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほぼ３０１０塩基対ＢａｍＨＩないしＰｕｖＩＩ制限断片である。断片４はＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｎ（２３）のほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩないしＨｉｎｄIII制限亜断片である。
【０４５１】
相同性ベクター８０７−８４．８
プラスミド８０７−８４．８は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用いた。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）血球凝集素（ＨＡ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従って該プラスミドを用いる場合、外来性遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＨＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄIIIないしＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＢｇｌIIないしＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ  ＨＩＮ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ  ＨＡ遺伝子のほぼ１７２１塩基対ＢａｍＨＩないしＢａｍＨＩ断片である。プライマー（５’−ＣＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＴＡＣＴＡＴＴＡＧＴＣＴＴＧＣＴＡＴＧＴＡＣＡＴ−３’；６／９５．５）（配列番号）はＳＩＶ  ＨＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＣＴＣＴＧＧＡＣＣＴＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＣＡＴＡＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＴＳ−３’；６／９５．６）（配列番号：）はＳＩＶ  ＨＡ遺伝子の３’末端から合成し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ  ＨＡ遺伝子に対応する長さの断片１７２１塩基を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほぼ３０１０塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片４はほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩないし断片Ｍ（２３）である。
【０４５２】
相同性ベクター８０７−８４．３５
プラスミド８０７−８４．３５は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用いた。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。「組換えＳＰＶを創製するための手法」に従ってこのプラスミドを用いる場合、外来性遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＮＡ遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄIIIないしＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＢｇｌIIないしＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ  ＨＩＮ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ  ＮＡ遺伝子のほぼ１４１４塩基対ＥｃｏＲＩないしＢｇｌII断片である。プライマー（５’−ＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＴ−３’；６／９５．１２）（配列番号；）はＳＩＶ  ＮＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＨＨＴＨＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＣＡＧ−３’；６／９５．１３）（配列番号；）はＳＩＶ  ＮＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢｇｌII部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ  ＮＡ遺伝子に対応する長さの断片１４１４塩基を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほぼ３０１０塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）のほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩないしＨｉｎｄIII制限亜断片である。
【０４５３】
相同性ベクター８０７−８６，３５
プラスミド８０７−８６．３５は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用いた。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）血球凝集素（ＨＡ）遺伝子およびノイラミラダーゼ（ＮＡ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従ってこのプラスミドを用いる場合、外来性遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＮＡおよびＨＡ遺伝子は、各々、合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄIIIないしＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＢｇｌIIないしＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ  ＨＩＮ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ  ＨＡ遺伝子のほぼ１７２１塩基対ＢａｍＨＩないしＢａｍＨＩ断片である。プライマー（５’−ＣＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＴＡＣＴＡＴＴＡＧＴＣＴＴＧＣＴＡＴＧＴＡＣＡＴ−３’；６／９５．５）（配列番号：）はＳＩＶ  ＨＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴＡＡＡＴＡＣＡＴＡＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＴＡ−３’；６／９５．６）（配列番号：）はＳＩＶ  ＨＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ  ＨＡ遺伝子に対応する長さの断片１７２１塩基を得た。断片３は、ＳＩＶ  Ｈ１Ｎ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ  ＮＡ遺伝子のほぼ１４１４塩基対ＥｃｏＲＩないしＢｇｌII断片である。プライマー（５’−ＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＴ−３’；６／９５．１２）（配列番号：）はＳＩＶ  ＮＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＣＡＧ−３’；６／９５．１３）（配列番号：）はＳＩＶ  ＮＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢｇｌII部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ  ＮＡ遺伝子に対応する長さの断片１４１４塩基対を得た。断片４はプラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほぼ３０１０塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片５はＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）のほぼ２１４９塩���対ＡｃｃＩないしＨｉｎｄIII制限亜断片である。
【０４５４】
相同性ベクター８１７−１４．２
プラスミド８１７−１４．２は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用いた。それには、イー・コリβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミラダーゼ（ＮＡ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従ってこのプラスミドを用いる場合、外来性遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。βグルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＮＡおよびＨＡ遺伝子は、各々、合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列に連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄIIIないしＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＢｇｌIIないしＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ  ＨＩＮ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ  ＨＡ遺伝子のほぼ１７２１塩基対ＢａｍＨＩないしＢａｍＨＩ断片である。プライマー（５’−ＣＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＴＡＣＴＡＴＴＡＧＴＣＴＴＧＣＴＡＴＧＴＡＣＡＴ−３’；６／９５．５）（配列番号：）はＳＩＶ  ＨＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴＡＡＡＴＡＣＡＴＡＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＴＡ−３’；６／９５．６）（配列番号：）はＳＩＶ  ＨＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ  ＨＡ遺伝子に対応する長さの断片１７２１塩基を得た。断片３は、ＳＩＶ  Ｈ１Ｎ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ  ＮＡ遺伝子のほぼ１４１４塩基対ＥｃｏＲＩないしＢｇｌII断片である。プライマー（５’−ＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＴ−３’；６／９５．１２）（配列番号：）はＳＩＶ  ＮＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＣＡＧ−３’；６／９５．１３）（配列番号：）はＳＩＶ  ＮＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢｇｌII部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ  ＮＡ遺伝子に対応する長さの断片１４１４塩基対を得た。断片４はプラスミドｐＲＡＪ２６０（Clonetech)のほぼ１８２３塩基対ＮｃｏＩ制限断片である。断片５はＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）のほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩないしＨｉｎｄIII制限亜断片である。
【０４５５】
単一または複数のＰＲＲＳ遺伝子（ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、またはＯＲＦ７を含有するＰＲＲＳ相同性ベクター
ＰＲＲＳ相同性ベクターは外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用いた。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、またはＯＲＦ７遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。外来性遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡのほぼ８５５塩基対断片がある。外来性遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡのほぼ１１１３塩基対断片がある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従ってこのプラスミドを用いる場合、外来性遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は豚痘ウイルスＯｌＬ遺伝子プロモーターの制御下にあり、ＰＲＲＳ遺伝子は後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列に連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２５１９塩基対ＨｉｎｄIIIないしＳｐｈＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳｐｈＩおよびＢｇｌII末端を持つ８５５塩基対断片を生じさせるための、ＤＮＡプライマー５’−ＧＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡＴＡ−３’（配列番号：１８５）および５’−ＣＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：１８６）を用いるポリマラーゼ鎖反応によって合成したＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）のほぼ８５５塩基対サブ−断片である。断片２は、イー・コリｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導した３００２塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ断片である。断片３は、ＮＶＳＬ（参照株）から得られたＰＲＲＳのＵ．Ｓ．単離体からのゲノムＲＮＡを用いて逆転写およびポリマラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって合成したＥｃｏＲＩないしＢａｍＨＩ制限断片である。各相同性ベクターは１または複数のＰＲＲＳウイルスＯＲＦ２ないし７を含有する。ＰＲＲＳ  ＯＲＦ２を合成するために、プライマー（５’−ＡＡＴＧＡＡＴＴＣＧＡＡＡＴＧＧＧＧＴＣＣＡＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＴＴＴＴＧ−３’；１／９６．１５）（配列番号：）はＰＲＲＳ  ＯＲＦ２遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＣＣＧＴＧＴＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＧＡＧＴＴＣＧ−３’；１／９６．１６）（配列番号）を逆転写およびＰＣＲのために使用し、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ２遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化してＰＲＲＳ  ＯＲＦ２遺伝子に対応する長さの断片７７１塩基対を得た。ＯＲＦ３を合成するために、プライマー（ＴＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＴＡＡＴＡＧＣＴＧＴＡＣＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＡＴＴＴ−３’；１／９６．７）（配列番号）はＰＲＲＳ  ＯＲＦ３遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＣＧＣＣＧＴＡＣＧＧＣＡＣＴＧＡＧＧＧ−３’；１／９６．８）（配列番号：）を逆転写およびＰＣＲのために用い、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ３遺伝子の３’末端から合成する。ＰＲＲＳ  ＯＲＦ４を合成するために、プライマー（５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＴＣＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＣＡＴＧＧ−３’；１／９６．１１）（配列番号：）はＰＲＲＳ  ＯＲＦ４遺伝子の５’末端から合成し、５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＡＡＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＴＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡＣ−３’；１／９６．１２）（配列番号：）を逆転写およびＰＣＲのために用い、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ４遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＮａｍＨＩで消化してＰＲＲＳ  ＯＲＦ４遺伝子に対応する長さの断片５３７塩基対を得る。ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５を合成するために、プライマー（５’−ＴＴＧＡＡＴＴＣＧＴＴＧＧＡＧＡＡＡＴＧＣＴＴＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣ−３’；１／９６．１３）（配列番号：）はＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＡＡＧＧＡＴＣＣＴＡＡＧＧＡＣＧＡＣＣＣＣＡＴＴＧＴＴＣＣＧＣＴＧ−３’；１／９６．１４）（配列番号：）を逆転写およびＰＣＲのために用い、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化してＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子に対応する長さの断片６０３塩基対を得る。ＰＲＲＳ  ＯＲＦ６を合成するために、プライマー（５’−ＣＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＴＣＧＴＣＣＴＴＡＧＡＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＣ−３’；１／９６．１７）（配列番号：）はＰＲＲＳ  ＯＲＦ６遺伝子を５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＧＴＴＡＴＧＴＧＧＣＡＴＡＴＴＴＧＡＣＡＡＧＧＴＴＴＡＣ−３’；１／９６．１８）（配列番号：）を逆転写およびＰＣＲのために用い、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ６遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化してＰＲＲＳ  ＯＲＦ６に対応する長さの５２５塩基対を得る。ＰＲＲＳ  ＯＲＦ７を合成するために、プライマー（５’−ＧＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＡＡＴＡＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧ−３’：１／９６．１９）（配列番号：）はＰＲＲＳ  ＯＲＦ７の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡＴＧＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＴＧ−３’；１／９６．２０）（配列番号：）を逆転写およびＰＣＲのために合成し、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ７遺伝子の３’末端から合成する。断片４は、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄIII末端を持つ１１１３塩基対を生じさせるための、ＤＮＡプライマー５’−ＣＣＧＴＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴ−３’（配列番号：１８７）および５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＴ−３’）（配列番号：１８８）を用いるポリメラーゼ鎖反応によって合成したＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍのほぼ１１１３塩基対サブ��片である。
【０４５６】
仮性狂犬病遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルス
Ｓ−ＳＰＶ−０８６は少なくとも３つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＤおよびｇＩについての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−６８．１ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＤおよびｇＩ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０４５７】
Ｓ−ＳＰＶ−０７７は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩについての遺伝子をＳＰＶ  ６１７  ４８．１ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０４５８】
Ｓ−ＳＰＶ−０７９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢについての遺伝子をＳＰＶ  ６１７  ４８．１ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０４５９】
Ｓ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７７、およびＳ−ＳＰＶ−０７９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクターおよびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７７、およびＳ−ＳＰＶ−０７９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０４６０】
Ｓ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７７、およびＳ−ＳＰＶ−０７９はＰＲＶ糖蛋白質の発現につき「黒色プラーク・アッセイ」および「ウェスタンブロット」によってテストした。
【０４６１】
Ｓ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７７、およびＳ−ＳＰＶ−０７９はブタにおいてＰＲＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＰＲＶ  ｇＤ、ｇＩまたはｇＢの発現に有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０７１はＳ−ＳＰＶ−０１１、Ｓ−ＳＰＶ−０１２、またはＳ−ＳＰＶ−０１３のごときＰＲＶ  ｇＣを発現とする組換え豚痘ウイルスと組み合わせたワクチンとして有用である。
【０４６２】
１４３Ｂ                  骨肉腫＊
Ａ４３１                  類表皮癌＊
Ａ５４９                  肺癌＊
Ｃａｐａｎ−１            肝臓癌＊
ＣＦ５００                包皮繊維芽細胞
Ｃｈａｎｇ肝臓            肝臓
Ｄｅｔｒｏｉｔ            ダウン包皮繊維芽細胞
ＨＥＬ−１９８            胚性肺
ＨｅＬａ                  子宮頸部癌＊
Ｈｅｐ−２                表皮咽頭癌＊
ＨＩＳＭ                  腸平滑筋
ＨＮＫ                    新生児腎臓
ＭＲＣ−５                胚性肺
ＮＣＩ−Ｈ２９２          肺粘液性類表皮癌＋
ＯＶＣＡＲ−３            卵巣癌＊
ＲＤ                      横紋筋肉腫＋
ＴＨＰ                    単球（白血病）＊
ＷＩＬ２−ＮＳ            Ｂリンパ球系、非分泌
ＷＩＳＨ                  羊膜
ＰＢＬ                    末梢血液リンパ球
実施例３８
ＰＲＲＳ遺伝子ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、およびＯＲＦ６を発現する組換え豚痘ウイルス
Ｓ−ＳＰＶ−０８０少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ２についての遺伝子をＳＰＶ  ７３８−９４．４  ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ  ＯＲＦ２遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０４６３】
Ｓ−ＳＰＶ−０８１は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ３についての遺伝子をＳＰＶ  ７３８−９４．４  ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ  ＯＲＦ３遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０４６４】
Ｓ−ＳＰＶ−０８２は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ４についての遺伝子をＳＰＶ  ７３８−９４．４  ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ  ＯＲＦ４遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０４６５】
Ｓ−ＳＰＶ−０８３は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５についての遺伝子をＳＰＶ  ７３８−９４．４  ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ  ＯＲＦ５遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０４６６】
Ｓ−ＳＰＶ−０８４は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ６についての遺伝子をＳＰＶ  ７３８−９４．４  ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ  ＯＲＦ６遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０４６７】
Ｓ−ＳＰＶ−０８５は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ７についての遺伝子をＳＰＶ  ７３８−９４．４  ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ  ＯＲＦ７遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
【０４６８】
Ｓ−ＳＰＶ−０８０、Ｓ−ＳＰＶ−０８１、Ｓ−ＳＰＶ−０８３、Ｓ−ＳＰＶ−０８４およびＳ−ＳＰＶ−０８５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター材料および方法（ＰＲＲＳ相同性ベクター）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０８０、Ｓ−ＳＰＶ−０８１、Ｓ−ＳＰＶ−０８３、Ｓ−ＳＰＶ−０８４およびＳ−ＳＰＶ−０８５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。
【０４６９】
Ｓ−ＳＰＶ−０８０、Ｓ−ＳＰＶ−０８１、Ｓ−ＳＰＶ−０８３、Ｓ−ＳＰＶ−０８４およびＳ−ＳＰＶ−０８５はブタにおいてＰＲＲＳ感染に対するワクチンとして個々にまたは組み合わせて有用であって、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６およびＯＲＦ７の発現で有用である。
【０４７０】
実施例３９
以下の実験を行って、培養においてヒト細胞に感染する、およびｌａｃＺのごとき外来性ＤＮＡを発現する豚痘ウイルスの能力を測定した。
【０４７１】
Ｓ−ＳＰＶ−００３をＭＯＩ＝０．１にて後記標記にリストしたヒト細胞系に２ないし３時間吸着させた。細胞をＰＢＳで３回すすぎ、増殖培地を添加し、細胞を３７℃で４日間インキュベートした。細胞を収穫し、３回の凍結／解凍によって２００マイクロリットルのＰＢＳ中に溶解物を調製した。細胞夾雑物をペレット化し、１０マイクロリットルの上清をＯＮＰＧアッセイによって、３７℃にて、ガラクトシダーゼ活性につき１／２時間アッセイした。表はＳ−ＳＰＶ−００３での種々のヒト細胞系の感染および細胞障害効果の相対的レベルおよびｌａｃＺの発現の結果を示す。
【０４７２】
結果は、種々の細胞系はＳ−ＳＰＶ−００３を摂取し、ｌａｃＺを発現する能力が変化することを示す。ＣＰＥは全ての場合において最小であって、ウイルス複製の結果とはならなかった。１つの例外はＡ５４９細胞であり、これは、１つの例で、数ラウンドの細胞周期およびプレートからの剥がれを示さず、もう１つの例は継代の間の力価の１０倍増加であり、これは限定的ウイルス複製を示唆した。いくつかの細胞系は、細胞障害効果を持たない有意なｌａｃＺ活性を示す。
【０４７３】
異なる痘プロモーターは、多数のヒト細胞系で組換え豚痘ウイルスからのｌａｃＺを発現する。ＥＰ１、ＬＰ１、ＬＰ２、ＥＰ１ＬＰ２、ＬＰ２ＥＰ２、またはＳＰＶ  ＰＯｌＬプロモーターからのｌａｃＺを発現した６種の異なる豚痘ウイルスを構築した。ウイルスを各々用いて、Ａ５４９、Ｃｈａｎｇ肝臓、または１４３Ｂ細胞を０．１ｍｏｉにて感染させ、細胞を２および３時間後にすすぎ、次いで、３７℃で４日間インキュベートした。各細胞系はプロモーター活性の異なる階層を維持し、これは以下の実験で再現性があった。例えば、ＥＰ１、ＬＰ２ＥＰ２、およびＰＯｌＬプロモーターは１４３Ｂ細胞で最大の発現を与え、他方、ＬＰ２はＣｈａｎｇ肝臓細胞で最も強力であり、ＥＰ１ＬＰ２はＡ５４９で最も強力であった。Ｃｈａｎｇ肝臓およびＡ５４９細胞において、ＰＯｌＬプロモーターからの発現は最も貧弱であり、他方、１４３Ｂにおいては、ＬＰ２からの発現が貧弱であった。従って、異なるヒト細胞系は異なる方法で痘プロモーターを利用する。これは、異なる細胞系で複製経路に沿ってどれ位遠くまで豚痘ウイルスが進行できるかを反映し得る。
【０４７４】
これらの初期および後期プロモーターは、組換え豚痘ウイルスによって感染されたヒト細胞型に応じてより低いまたはより高いｌａｃＺ活性を呈した。異なる標的組織に対して異なるプロモーターを選択することによって、豚痘ウイルスから標的組織に送達される外来性遺伝子産物の量を調節することができる。
【０４７５】
組換え豚痘ウイルスはヒト感染性病気に対するワクチンとして、および治療剤をヒトに送達するのに有用である。組換え豚痘ウイルスはヒトにおいてウイルスまたは細菌感染に対するワクチンとして、および抗生物質、腫瘍抗原、細胞表面リガンドおよび受容体、サイトカインのごとき免疫変調分子を送達するための癌または遺伝病のための治療剤として有用である。
【０４７６】
実施例４０
ヒト細胞系におけるｌａｃＺのＳ−ＳＰＶ−００３発現
細胞障害効果およびｌａｃＺ発現の測定
細胞型                  細胞障害効果＊    ｌａｃＺ発現＊＊
Ａ４３１                        −                −
類表皮癌＊
Ａ５４９                        ＋＋            ＋＋＋
肺癌＊
Ｃａｐａｎ−１                  −                −
肺癌＊  
ＣＦ５００                      ＋                ＋
包皮繊維芽細胞
Ｃｈａｎｇ肝臓                  ＋              ＋＋＋
Ｄｅｔｒｏｉｔ                  ＋／−            −
ガウン包皮繊維芽細胞
ＨＥＬ−１９９                  ＋／−          ＋＋＋
胚性肺
ＨＥｐ−２                      −                ＋
表皮咽頭癌＊
ＨＩＳＮ                        ＋                ＋
腸平滑筋
ＨＮＫ                          −                ＋＋
新生児腎臓
ＭＲＣ−５                      ＋／−            ＋
胚性肺
ＮＣＩ−Ｈ２９２                −              ＋＋＋
肺粘液性類表皮癌＊
ＯＶＣＡＲ−３                  −              ＋＋＋
卵巣癌＊
ＲＤ                            −                ＋
横紋筋肉腫＋
ＴＨＰ                          −                ＋
単球（白血病）＊
ＷＩＬ２−ＮＳ                  −              −−−−
Ｂリンパ球系、非分泌
ＷＩＳＨ                        ＋／−
羊膜
ＨｅＬａ                        −              ＋＋＋
ＰＢＬ                          −                −
末梢血液リンパ球
＊ヒト細胞をＳＰＶで感染させた場合、細胞障害効果が時々観察される。ほとんどの細胞系において、この細胞障害効果は細胞の出現の変化によって示され、細胞は薄くなり、エッジに沿ってより凸凹になり；細胞は緊張しているように見える。この現象は以下のごとくに評価される。
【０４７７】
−は感染および非感染細胞の間に差異のないことを示す。
【０４７８】
＋／−は、ほとんどの細胞が正常に見えるにも拘わらず、単層が非感染のものと視覚的に異なることを示す。
【０４７９】
＋は、単層が明らかに侵されており、ほとんどの細胞が緊張して見えることを示す。系列的継代後に力価が得られたある種の細胞（ＨｅＬａ、ＣＦ５００、１４３Ｂ）においては、１つの例外を除き、ＳＰＶの複製の証拠がなかったことに注意すべきである。
【０４８０】
Ａ５４９は、細胞が感染の間に丸くなってプレートから剥がれた場合に、１つの例において細胞障害効果につき＋＋を与えたが、この観察は反復されなかった。また、Ａ５４９は継代の間に１０倍増加の力価の証拠をもう１つの例で示し、これは限定的ウイルス複製を支持し得ることを示す。
【０４８１】
＊＊  ３５ｍｍ皿の１／２０からの細胞溶解物当たりのＡ２６０単位で表したβ−ガラクトシダーゼ活性
−  活性無し
＋  ０．２−０．９Ａ２６０単位
＋＋  ０．９−１．６Ａ２６０単位
＋＋＋  １．６Ａ２６０単位より大
【参考文献】
【０４８２】
2008148712.tif 000005
2008148712.tif 000006
2008148712.tif 000007
2008148712.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０４８３】
【図１Ａ】特徴的な長いターミナル・リピート（ＴＲ）領域を含むＳＰＶゲノムＤＮＡ（kasza株）の詳細な図
【図１Ｂ】特徴的な長いターミナル・リピート（ＴＲ）領域を含むＳＰＶゲノムＤＮＡ（kasza株）の詳細な図
【図２Ａ】相同性ベクター515-85.1起源のＤＮＡ配列
【図２Ｂ】相同性ベクター515-85.1起源のＤＮＡ配列
【図３Ａ】515-85.1  ORFと、ワクシニア・ウイルス０１ＬＯＲＦの間の相同関係
【図３Ｂ】515-85.1  ORFと、ワクシニア・ウイルス０１ＬＯＲＦの間の相同関係
【図３Ｃ】515-85.1  ORFと、ワクシニア・ウイルス０１ＬＯＲＦの間の相同関係
【図４Ａ】相同性ベクター520-17.5におけるＤＮＡ挿入物
【図４Ｂ】相同性ベクター520-17.5におけるＤＮＡ挿入物
【図４Ｃ】相同性ベクター520-17.5におけるＤＮＡ挿入物
【図５Ａ】相同性ベクター中538-46.16におけるＤＮＡ挿入物
【図５Ｂ】相同性ベクター中538-46.16におけるＤＮＡ挿入物
【図５Ｃ】相同性ベクター中538-46.16におけるＤＮＡ挿入物
【図５Ｄ】相同性ベクター中538-46.16におけるＤＮＡ挿入物
【図６】組替えＳＰＶに感染した細胞の溶融物の、ＰＲＶに対する抗血清によるウエスタンブロット
【図７】ＮＤＶ血球凝集素ノイラミダーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（ＨＮ）
【図８Ａ】相同性ベクター538-46.26におけるＤＮＡ挿入物
【図８Ｂ】相同性ベクター538-46.26におけるＤＮＡ挿入物
【図８Ｃ】相同性ベクター538-46.26におけるＤＮＡ挿入物
【図８Ｄ】相同性ベクター538-46.26におけるＤＮＡ挿入物
【図９Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１０および相同性ベクター561-36.26におけるＤＮＡ挿入物
【図９Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１０および相同性ベクター561-36.26におけるＤＮＡ挿入物
【図９Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１０および相同性ベクター561-36.26におけるＤＮＡ挿入物
【図１０Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１１および相同性ベクター570-91.21におけるＤＮＡ挿入物
【図１０Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１１および相同性ベクター570-91.21におけるＤＮＡ挿入物
【図１０Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１１および相同性ベクター570-91.21におけるＤＮＡ挿入物
【図１０Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１１および相同性ベクター570-91.21におけるＤＮＡ挿入物
【図１１Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１２および相同性ベクター570-91.41におけるＤＮＡ挿入物
【図１１Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１２および相同性ベクター570-91.41におけるＤＮＡ挿入物
【図１１Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１２および相同性ベクター570-91.41におけるＤＮＡ挿入物
【図１１Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１２および相同性ベクター570-91.41におけるＤＮＡ挿入物
【図１２Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１３および同ベクター570-91.64におけるＤＮＡ挿入物
【図１２Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１３および同ベクター570-91.64におけるＤＮＡ挿入物
【図１２Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１３および同ベクター570-91.64におけるＤＮＡ挿入物
【図１２Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１３および同ベクター570-91.64におけるＤＮＡ挿入物
【図１３Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１４および同ベクター599-65.25におけるＤＮＡ挿入物
【図１３Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１４および同ベクター599-65.25におけるＤＮＡ挿入物
【図１３Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１４および同ベクター599-65.25におけるＤＮＡ挿入物
【図１３Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１４および同ベクター599-65.25におけるＤＮＡ挿入物
【図１４Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１６および同ベクター624-20.1CにおけるＤＮＡ挿入物
【図１４Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１６および同ベクター624-20.1CにおけるＤＮＡ挿入物
【図１４Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１６および同ベクター624-20.1CにおけるＤＮＡ挿入物
【図１４Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１６および同ベクター624-20.1CにおけるＤＮＡ挿入物
【図１５Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１７および相同性ベクター614-83.18におけるＤＮＡ挿入物
【図１５Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１７および相同性ベクター614-83.18におけるＤＮＡ挿入物
【図１５Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１７および相同性ベクター614-83.18におけるＤＮＡ挿入物
【図１５Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１７および相同性ベクター614-83.18におけるＤＮＡ挿入物
【図１６】組替えＳＰＶに感染した細胞の溶融物のポリクローナル・ゴート抗ＰＲＶｇIII（ｇＣ）によるウエスタンブロット
【図１７】5.6キロ塩基対Ｈind III  M豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ断片を示すマップ
【図１８Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３４および相同性ベクター723-59A9.22におけるＤＮＡ挿入物
【図１８Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３４および相同性ベクター723-59A9.22におけるＤＮＡ挿入物
【図１８Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３４および相同性ベクター723-59A9.22におけるＤＮＡ挿入物
【図１８Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３４および相同性ベクター723-59A9.22におけるＤＮＡ挿入物
【図１９Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１５および相同性ベクター727-54.60におけるＤＮＡ挿入物
【図１９Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１５および相同性ベクター727-54.60におけるＤＮＡ挿入物
【図１９Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１５および相同性ベクター727-54.60におけるＤＮＡ挿入物
【図１９Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１５および相同性ベクター727-54.60におけるＤＮＡ挿入物
【図２０Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３１および相同性ベクター727-67.18におけるＤＮＡ挿入物
【図２０Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３１および相同性ベクター727-67.18におけるＤＮＡ挿入物
【図２０Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３１および相同性ベクター727-67.18におけるＤＮＡ挿入物
【図２０Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３１および相同性ベクター727-67.18におけるＤＮＡ挿入物
【図２１Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３３および相同性ベクター732-18.4におけるＤＮＡ挿入物
【図２１Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３３および相同性ベクター732-18.4におけるＤＮＡ挿入物
【図２１Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３３および相同性ベクター732-18.4におけるＤＮＡ挿入物
【図２１Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３３および相同性ベクター732-18.4におけるＤＮＡ挿入物
【図２２Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３６および相同性ベクター741-80.3におけるＤＮＡ挿入物
【図２２Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３６および相同性ベクター741-80.3におけるＤＮＡ挿入物
【図２２Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３６および相同性ベクター741-80.3におけるＤＮＡ挿入物
【図２３Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３５および相同性ベクター741-84.14おけるＤＮＡ挿入物
【図２３Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３５および相同性ベクター741-84.14おけるＤＮＡ挿入物
【図２３Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３５および相同性ベクター741-84.14おけるＤＮＡ挿入物
【図２３Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３５および相同性ベクター741-84.14おけるＤＮＡ挿入物
【図２４Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３８および相同性ベクター744-34.おけるＤＮＡ挿入物
【図２４Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３８および相同性ベクター744-34.おけるＤＮＡ挿入物
【図２４Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３８および相同性ベクター744-34.おけるＤＮＡ挿入物
【図２４Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３８および相同性ベクター744-34.おけるＤＮＡ挿入物
【図２５Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３９および相同性ベクター744-38におけるＤＮＡ挿入物
【図２５Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３９および相同性ベクター744-38におけるＤＮＡ挿入物
【図２５Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３９および相同性ベクター744-38におけるＤＮＡ挿入物
【図２５Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３９および相同性ベクター744-38におけるＤＮＡ挿入物
【図２６Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４２および相同性ベクター751-07A1におけるＤＮＡ挿入物
【図２６Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４２および相同性ベクター751-07A1におけるＤＮＡ挿入物
【図２６Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４２および相同性ベクター751-07A1におけるＤＮＡ挿入物
【図２６Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４２および相同性ベクター751-07A1におけるＤＮＡ挿入物
【図２７Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４３よび相同性ベクター751-56A1におけるＤＮＡ挿入物
【図２７Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４３よび相同性ベクター751-56A1におけるＤＮＡ挿入物
【図２７Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４３よび相同性ベクター751-56A1におけるＤＮＡ挿入物
【図２７Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４３よび相同性ベクター751-56A1におけるＤＮＡ挿入物
【図２８Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４３よび相同性ベクター752-22.1におけるＤＮＡ挿入物
【図２８Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４３よび相同性ベクター752-22.1におけるＤＮＡ挿入物
【図２８Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４３よび相同性ベクター752-22.1におけるＤＮＡ挿入物
【図２８Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４３よび相同性ベクター752-22.1におけるＤＮＡ挿入物
【図２９Ａ】ＳＰＶ ＨｉｎｄIII N断片およびＳＰＶ ＨｉｎｄIIIＭ断片の一部における制限エンドヌークレアーゼマップおよびオープンリーデイングフレーム
【図２９Ｂ】ＳＰＶ ＨｉｎｄIII N断片およびＳＰＶ ＨｉｎｄIIIＭ断片の一部における制限エンドヌークレアーゼマップおよびオープンリーデイングフレーム
【図３０Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４７および相同性ベクター779-94.31におけるＤＮＡ挿入物
【図３０Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４７および相同性ベクター779-94.31におけるＤＮＡ挿入物
【図３０Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４７および相同性ベクター779-94.31におけるＤＮＡ挿入物
【図３１Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５２および相同性ベクター789-41.7におけるＤＮＡ挿入物
【図３１Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５２および相同性ベクター789-41.7におけるＤＮＡ挿入物
【図３１Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５２および相同性ベクター789-41.7におけるＤＮＡ挿入物
【図３１Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５２および相同性ベクター789-41.7におけるＤＮＡ挿入物
【図３２Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５３および相同性ベクター789-41.27におけるＤＮＡ挿入物
【図３２Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５３および相同性ベクター789-41.27におけるＤＮＡ挿入物
【図３２Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５３および相同性ベクター789-41.27におけるＤＮＡ挿入物
【図３２Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５３および相同性ベクター789-41.27におけるＤＮＡ挿入物
【図３３Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５４および相同性ベクター789-41.47におけるＤＮＡ挿入物
【図３３Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５４および相同性ベクター789-41.47におけるＤＮＡ挿入物
【図３３Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５４および相同性ベクター789-41.47におけるＤＮＡ挿入物
【図３３Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５４および相同性ベクター789-41.47におけるＤＮＡ挿入物
【図３４Ａ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５5および相同性ベクター789-41.73におけるＤＮＡ挿入物
【図３４Ｂ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５5および相同性ベクター789-41.73におけるＤＮＡ挿入物
【図３４Ｃ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５5および相同性ベクター789-41.73におけるＤＮＡ挿入物
【図３４Ｄ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５5および相同性ベクター789-41.73におけるＤＮＡ挿入物
【図３４Ｅ】豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５5および相同性ベクター789-41.73におけるＤＮＡ挿入物
【図１Ａ】
2008148712.tif 000009
【図１Ｂ】
2008148712.tif 000010
【図２Ａ】
2008148712.tif 000011
【図２Ｂ】
2008148712.tif 000012
【図３Ａ】
2008148712.tif 000013
【図３Ｂ】
2008148712.tif 000014
【図３Ｃ】
2008148712.tif 000015
【図４Ａ】
2008148712.tif 000016
【図４Ｂ】
2008148712.tif 000017
【図４Ｃ】
2008148712.tif 000018
【図５Ａ】
2008148712.tif 000019
【図５Ｂ】
2008148712.tif 000020
【図５Ｃ】
2008148712.tif 000021
【図５Ｄ】
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【図６】
2008148712.tif 000023
【図７】
2008148712.tif 000024
【図８Ａ】
2008148712.tif 000025
【図８Ｂ】
2008148712.tif 000026
【図８Ｃ】
2008148712.tif 000027
【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
2008148712.tif 000029
【図９Ｂ】
2008148712.tif 000030
【図９Ｃ】
2008148712.tif 000031
【図１０Ａ】
2008148712.tif 000032
【図１０Ｂ】
2008148712.tif 000033
【図１０Ｃ】
2008148712.tif 000034
【図１０Ｄ】
2008148712.tif 000035
【図１１Ａ】
2008148712.tif 000036
【図１１Ｂ】
2008148712.tif 000037
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
2008148712.tif 000040
【図１２Ｂ】
2008148712.tif 000041
【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
2008148712.tif 000043
【図１３Ａ】
2008148712.tif 000044
【図１３Ｂ】
2008148712.tif 000045
【図１３Ｃ】
2008148712.tif 000046
【図１３Ｄ】
2008148712.tif 000047
【図１４Ａ】
2008148712.tif 000048
【図１４Ｂ】
2008148712.tif 000049
【図１４Ｃ】
2008148712.tif 000050
【図１４Ｄ】
2008148712.tif 000051
【図１５Ａ】
2008148712.tif 000052
【図１５Ｂ】
2008148712.tif 000053
【図１５Ｃ】
2008148712.tif 000054
【図１５Ｄ】
2008148712.tif 000055
【図１６】
2008148712.tif 000056
【図１７】
2008148712.tif 000057
【図１８Ａ】
2008148712.tif 000058
【図１８Ｂ】
2008148712.tif 000059
【図１８Ｃ】
2008148712.tif 000060
【図１８Ｄ】
2008148712.tif 000061
【図１９Ａ】
2008148712.tif 000062
【図１９Ｂ】
2008148712.tif 000063
【図１９Ｃ】
2008148712.tif 000064
【図１９Ｄ】
2008148712.tif 000065
【図２０Ａ】
2008148712.tif 000066
【図２０Ｂ】
2008148712.tif 000067
【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
2008148712.tif 000069
【図２１Ａ】
2008148712.tif 000070
【図２１Ｂ】
2008148712.tif 000071
【図２１Ｃ】
2008148712.tif 000072
【図２１Ｄ】
2008148712.tif 000073
【図２２Ａ】
2008148712.tif 000074
【図２２Ｂ】
2008148712.tif 000075
【図２２Ｃ】
2008148712.tif 000076
【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
2008148712.tif 000078
【図２３Ｃ】
2008148712.tif 000079
【図２３Ｄ】
2008148712.tif 000080
【図２４Ａ】
2008148712.tif 000081
【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
2008148712.tif 000083
【図２４Ｄ】
2008148712.tif 000084
【図２５Ａ】
2008148712.tif 000085
【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
2008148712.tif 000089
【図２６Ｂ】
2008148712.tif 000090
【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
2008148712.tif 000094
【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
2008148712.tif 000096
【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２９Ａ】
2008148712.tif 000101
【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３４Ａ】
2008148712.tif 000118
【図３４Ｂ】
2008148712.tif 000119
【図３４Ｃ】
2008148712.tif 000120
【図３４Ｄ】
2008148712.tif 000121
【図３４Ｅ】
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【配列表】
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