(57)【要約】【課題】迅速且つ簡便であり、高選択・高感度を有するセンサー及び／又はアッセイ法の提供。センサー以外にも用いることができる、分子などの被捕捉物質を認識する装置、該装置の製造方法の提供。【解決手段】イ）細孔を有する多孔性基材であって外部環境変化により実質的に変化しない多孔性基材；ロ）細孔中に配置されるポリマーであって外部環境変化に応答するポリマー；及びハ）ポリマーと結合するように配置される捕捉物質であって被捕捉物質を特異的に捕捉する捕捉物質；を有する被捕捉物質認識装置であって、被捕捉物質が捕捉物質に特異的に捕捉されると共に該被捕捉物質と捕捉物質との結合を介してポリマーの少なくとも一部が架橋され、該架橋に伴って前記細孔内のポリマーの挙動が変化し、且つ外部環境変化に伴って細孔内のポリマーの細孔閉塞状態が変化することを特徴とする、被捕捉物質認識装置により、上記課題を解決する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イ）細孔を有する多孔性基材であって外部環境変化により実質的に変化しない多孔性基材；
ロ）前記細孔中に配置されるポリマーであって外部環境変化に応答するポリマー；及び
ハ）前記ポリマーと結合するように配置される捕捉物質であって被捕捉物質を特異的に捕捉する捕捉物質；
を有する被捕捉物質認識装置であって、
被捕捉物質が捕捉物質に特異的に捕捉されると共に該被捕捉物質と捕捉物質との結合を介して前記細孔内のポリマーの少なくとも一部が架橋され、
該架橋に伴って前記ポリマーの挙動が変化し、且つ
外部環境変化に伴って前記細孔内のポリマーの細孔閉塞状態が変化することを特徴とする、被捕捉物質認識装置。
【請求項２】
前記被捕捉物質は、前記捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有する請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記被捕捉物質は、前記捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有し、該少なくとも２箇所の部位のうちの一方の部位が前記ポリマーのうちの第１のポリマーの第１の捕捉物質に捕捉され、他方の部位が前記ポリマーのうちの第２のポリマーの第２の捕捉物質に捕捉され、第１のポリマーと第２のポリマーとが、第１及び第２の捕捉物質並びに被捕捉物質を介して架橋する請求項１記載の装置。
【請求項４】
前記ポリマーの一部又は全部は、その一端が前記細孔の表面に化学的又は物理的に結合する請求項１〜３のいずれか１項記載の装置。
【請求項５】
前記外部環境変化は、外部環境である溶液のｐＨの変化、外部環境である溶液のイオン強度の変化、外部環境である溶液の特定物質の濃度変化、外部環境である光の変化、外部環境である磁場の変化、外部環境である温度の変化、外部環境である電界の変化、及び外部環境である溶媒組成の変化からなる群から選ばれる少なくとも１種の変化である請求項１〜４のいずれか１項記載の装置。
【請求項６】
前記ポリマーが、アクリルアミド系モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、アクリル酸モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、もしくはこれら双方のモノマーを繰返単位として含むコポリマーである請求項１〜５のいずれか１項記載の装置。
【請求項７】
前記細孔は、その孔径が被捕捉物質の粒径の１倍〜１万倍である請求項１〜６のいずれか１項記載の装置。
【請求項８】
前記被捕捉物質が、細胞、タンパク質、核酸、糖及び／又は糖鎖、脂質、並びにこれらの複合体、抗原、ウイルス、細菌、ホルモン、並びにこれらの断片からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１〜７のいずれか１項記載の装置。
【請求項９】
前記捕捉物質がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１〜８のいずれか１項記載の装置。
【請求項１０】
被捕捉物質認識装置及び該装置によって認識される被捕捉物質を定性的又は定量的に検出する検出部を有する被捕捉物質アッセイ装置であって、
前記被捕捉物質認識装置は、
イ）細孔を有する多孔性基材であって外部環境変化により実質的に変化しない多孔性基材；
ロ）前記細孔中に配置されるポリマーであって外部環境変化に応答するポリマー；及び
ハ）前記ポリマーと結合するように配置される捕捉物質であって被捕捉物質を特異的に捕捉する捕捉物質；
を有し、被捕捉物質が捕捉物質に特異的に捕捉されると共に該被捕捉物質と捕捉物質との結合を介して前記ポリマーの少なくとも一部が架橋され、
アッセイ装置は、前記架橋の後に、前記ポリマーの外部環境を変化させる外部環境変化手段をさらに有し、該手段により前記ポリマーの外部環境を変化させてポリマーを収縮させるポリマー収縮状態又はポリマーを膨潤させるポリマー膨潤状態を形成させ、
前記検出部は、前記ポリマー収縮状態又は該収縮状態から解放した状態で、前記ポリマーの架橋の有無、又は架橋の有無と架橋の度合いを検出することを特徴とする、前記被捕捉物質アッセイ装置。
【請求項１１】
前記検出部は、前記認識装置の一方の面と該一方の面に対向する他方の面とに液を接触させ、且つ一方の面に接触させる第１の液と他方の面に接触させる第２の液とに溶質濃度差が生じるように配置し、架橋の有無又は架橋の度合いにより第１の液と第２の液との間に浸透圧が生じ、該浸透圧を検出する請求項１０記載のアッセイ装置。
【請求項１２】
前記検出部は、前記認識装置の一方の面と該一方の面に対向する他方の面とに液を接触させ、且つ一方の面に接触させる第１の液と他方の面に接触させる第２の液とに溶質濃度差が生じるように配置し、第１の液及び／又は第２の液の溶質濃度変化を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知する請求項１０又は１１記載のアッセイ装置。
【請求項１３】
前記検出部は、前記認識装置の一方の面に第１の液を接触させ、該第１の液に等圧を掛けて、前記認識装置を透過する第１の液の前記認識装置透過速度を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知する請求項１０〜１２のいずれか１項記載のアッセイ装置。
【請求項１４】
前記検出部は、前記認識装置の一方の面に第１の液を接触させ、該第１の液を前記認識装置側に対して等速で付して、前記第１の液の圧力を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知する請求項１０〜１３のいずれか１項記載のアッセイ装置。
【請求項１５】
前記外部環境変化手段が、外部環境である溶液のｐＨの変化、外部環境である溶液のイオン強度の変化、外部環境である溶液の特定物質の濃度変化、外部環境である光の変化、外部環境である磁場の変化、外部環境である温度の変化、外部環境である電界の変化、及び外部環境である溶媒組成の変化からなる群から選ばれる少なくとも１種の変化を生じさせる請求項１０〜１４のいずれか１項記載のアッセイ装置。
【請求項１６】
前記被捕捉物質は、前記捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有する請求項１０〜１５のいずれか１項記載のアッセイ装置。
【請求項１７】
前記被捕捉物質は、前記捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有し、該少なくとも２箇所の部位のうちの一方の部位が前記ポリマーのうちの第１のポリマーの第１の捕捉物質に捕捉され、他方の部位が前記ポリマーのうちの第２のポリマーの第２の捕捉物質に捕捉され、第１のポリマーと第２のポリマーとが、第１及び第２の捕捉物質並びに被捕捉物質を介して架橋する請求項１０〜１５のいずれか１項記載のアッセイ装置。
【請求項１８】
前記ポリマーの一部又は全部は、その一端が前記細孔の表面に化学的又は物理的に結合する請求項１０〜１７のいずれか１項記載のアッセイ装置。
【請求項１９】
前記ポリマーがアクリルアミド系モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、アクリル酸モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、もしくはこれら双方のモノマーを繰返単位として含むコポリマーである請求項１０〜１８のいずれか１項記載のアッセイ装置。
【請求項２０】
前記細孔は、その孔径が被捕捉物質の粒径の１倍〜１万倍である請求項１０〜１９のいずれか１項記載のアッセイ装置。
【請求項２１】
前記被捕捉物質が、細胞、タンパク質、核酸、糖及び／又は糖鎖、脂質、並びにこれらの複合体、抗原、ウイルス、細菌、ホルモン、並びにこれらの断片からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１０〜２０のいずれか１項記載のアッセイ装置。
【請求項２２】
前記捕捉物質がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１０〜２１のいずれか１項記載のアッセイ装置。
【請求項２３】
検体試料中の被捕捉物質のアッセイ法であって、
ａ）細孔を有する多孔性基材細孔を有する多孔性基材であって外部環境変化により実質的に変化しない多孔性基材；前記細孔中に配置されるポリマーであって外部環境変化に応答するポリマー；及び前記ポリマーと結合するように配置され、被捕捉物質を特異的に捕捉する捕捉物質；を有する被捕捉物質認識装置を準備する工程；
ｂ）検体試料と被捕捉物質認識装置とを接触させて、前記検体試料中に存在する被捕捉物質を捕捉物質に特異的に捕捉させ、且つ被捕捉物質と捕捉物質との結合を介して前記ポリマーの少なくとも一部が架橋される工程；
ｃ）前記ポリマーが収縮する外部環境に前記装置を配置する工程；
ｄ）前記架橋の有無、又は架橋の有無と架橋の度合いとを検出する工程；
を有し、
前記ｄ）工程の結果により、検体試料中の被捕捉物質を定性的又は定量的にアッセイする、上記アッセイ法。
【請求項２４】
前記ｄ）工程は、前記認識装置の一方の面と該一方の面に対向する他方の面とに液を接触させ、且つ一方の面に接触させる第１の液と他方の面に接触させる第２の液とに溶質濃度差が生じるように配置し、架橋の有無又は架橋の度合いにより第１の液と第２の液との間に浸透圧が生じ、該浸透圧を検出する請求項２３記載のアッセイ法。
【請求項２５】
前記ｄ）工程は、前記認識装置の一方の面と該一方の面に対向する他方の面とに液を接触させ、且つ一方の面に接触させる第１の液と他方の面に接触させる第２の液とに溶質濃度差が生じるように配置し、第１の液及び／又は第２の液の溶質濃度変化を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知する請求項２３又は２４記載のアッセイ法。
【請求項２６】
前記ｄ）工程は、前記認識装置の一方の面に第１の液を接触させ、該第１の液に等圧を掛けて、前記認識装置を透過する第１の液の前記認識装置透過速度を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知する請求項２３〜２５のいずれか１項記載のアッセイ法。
【請求項２７】
前記ｄ）工程は、前記認識装置の一方の面に第１の液を接触させ、該第１の液を前記認識装置側に対して等速で付して、前記第１の液の圧力を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知する請求項２３〜２６のいずれか１項記載のアッセイ法。
【請求項２８】
前記外部環境が、溶液のｐＨの変化、溶液のイオン強度の変化、溶液の特定物質の濃度変化、光の変化、磁場の変化、温度の変化、電界の変化、及び溶媒組成の変化からなる群から選ばれる少なくとも１種の変化である請求項２３〜２７のいずれか１項記載のアッセイ法。
【請求項２９】
前記被捕捉物質は、前記捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有する請求項２３〜２８のいずれか１項記載のアッセイ法。
【請求項３０】
前記被捕捉物質は、前記捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有し、該少なくとも２箇所の部位のうちの一方の部位が前記ポリマーのうちの第１のポリマーの第１の捕捉物質に捕捉され、他方の部位が前記ポリマーのうちの第２のポリマーの第２の捕捉物質に捕捉され、第１のポリマーと第２のポリマーとが、第１及び第２の捕捉物質並びに被捕捉物質を介して架橋する請求項２３〜２９のいずれか１項記載のアッセイ法。
【請求項３１】
前記ポリマーの一部又は全部は、その一端が前記細孔の表面に化学的又は物理的に結合する請求項２３〜３０のいずれか１項記載のアッセイ法。
【請求項３２】
前記ポリマーが、アクリルアミド系モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、アクリル酸モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、もしくはこれら双方のモノマーを繰返単位として含むコポリマーである請求項２３〜３１のいずれか１項記載のアッセイ法。
【請求項３３】
前記細孔は、その孔径が被捕捉物質の粒径の１倍〜１万倍である請求項２３〜３２のいずれか１項記載のアッセイ法。
【請求項３４】
前記被捕捉物質が、細胞、タンパク質、核酸、糖及び／又は糖鎖、脂質、並びにこれらの複合体、抗原、ウイルス、細菌、ホルモン、並びにこれらの断片からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２３〜３３のいずれか１項記載のアッセイ法。
【請求項３５】
前記捕捉物質がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２３〜３４のいずれか１項記載のアッセイ法。
【請求項３６】
被捕捉物質を認識する被捕捉物質認識装置の製造方法であって、
ｉ）細孔を有する多孔性基材であって外部環境変化により実質的に変化しない多孔性基材の該細孔に、官能基を有するポリマーであって外部環境変化に応答するポリマーを充填する工程；及び
ｉｉ）捕捉物質又はその誘導体を前記細孔に導入し、前記ポリマーと前記捕捉物質又はその誘導体とを結合させる工程；
を有する、上記方法。
【請求項３７】
前記ｉ）工程の官能基を有するポリマーは、
Ｌ−１）モノマーを充填した後、該モノマーからポリマーを調製するか、又は
Ｌ−２）ポリマーを充填し、
その後に、ポリマーに官能基を導入する工程；もしくは
Ｍ）官能基を有するモノマー又は官能基を有するプレポリマーを充填した後、該モノマー又はプレポリマーからポリマーを調製する工程；
により得る請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記ｉ）工程において、ポリマーの一端と細孔の表面とを化学的又は物理的に結合させる工程をさらに有する請求項３６又は３７記載の方法。
【請求項３９】
前記被捕捉物質は、前記捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有する請求項３６〜３８のいずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
前記被捕捉物質は、前記捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有し、該少なくとも２箇所の部位のうちの一方の部位が前記ポリマーのうちの第１のポリマーの第１の捕捉物質に捕捉され、他方の部位が前記ポリマーのうちの第２のポリマーの第２の捕捉物質に捕捉され、第１のポリマーと第２のポリマーとが、第１及び第２の捕捉物質並びに被捕捉物質を介して架橋する請求項３６〜３９のいずれか１項記載の方法。
【請求項４１】
前記外部環境変化は、外部環境である溶液のｐＨの変化、外部環境である溶液のイオン強度の変化、外部環境である溶液の特定物質の濃度変化、外部環境である光の変化、外部環境である磁場の変化、外部環境である温度の変化、外部環境である電界の変化、及び外部環境である溶媒組成の変化からなる群から選ばれる少なくとも１種の変化である請求項３６〜４０のいずれか１項記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリマーが、アクリルアミド系モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、アクリル酸モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、もしくはこれら双方のモノマーを繰返単位として含むコポリマーである請求項３６〜４１のいずれか１項記載の方法。
【請求項４３】
前記細孔は、その孔径が被捕捉物質の粒径の１倍〜１万倍である請求項３６〜４２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４４】
前記被捕捉物質が、細胞、タンパク質、核酸、糖及び／又は糖鎖、脂質、並びにこれらの複合体、抗原、ウイルス、細菌、ホルモン、並びにこれらの断片からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項３６〜４３のいずれか１項記載の方法。
【請求項４５】
前記捕捉物質がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項３６〜４４のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被捕捉物質認識装置及び該装置の製造方法、該装置を備える被捕捉物質アッセイ装置、該装置を用いる被捕捉物質アッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体が有している高度な機能を模倣し、高い分子認識能力をセンサーとして応用したバイオセンサーが開発されている。
例えば、抗原抗体結合において標識を用いて抗原量を検出するバイオセンサー、標識以外のものを用いるイムノクロマト法など、様々な方法及び該方法を具現化したセンサーなどが、種々研究されている。
より具体的には、特許文献１は、特定分子を鋳型とする分子インプリント法を用いる方法又は用いない方法を開示する。
また、特許文献２は、刺激応答性高分子ゲルを用いるセンサー材料を開示する。
【特許文献１】ＷＯ２００２／０９０９９０号公報。
【特許文献２】特開２００２−１７４５９７号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、バイオセンサー又は該センサーを用いるアッセイ法として、コスト、検査時間、操作性、検査設備など、改善されるべき点は多々残されている。
特に、これらのセンサー及び／又はアッセイ法として、迅速且つ簡便であり、高選択・高感度を有するもののニーズが依然として存在する。
【０００４】
そこで、本発明の目的は、上記ニーズに応えることにある。即ち、本発明の目的は、迅速且つ簡便であり、高選択・高感度を有するセンサー及び／又はアッセイ法を提供することにある。
特に、本発明の目的は、コスト性、迅速性及び簡便性を有し、定性及び定量を行えるアッセイ法、及び該アッセイに用いる装置を提供することにある。
また、本発明の目的は、上記目的と共に、又は上記目的以外に、センサー以外にも用いることができる、分子などの被捕捉物質を認識する装置、該装置の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、以下の発明により、上記目的を達成できることを見出した。
＜１＞  イ）細孔を有する多孔性基材であって外部環境変化により実質的に変化しない多孔性基材；
ロ）前記細孔中に配置されるポリマーであって外部環境変化に応答するポリマー；及び
ハ）前記ポリマーと結合するように配置される捕捉物質であって被捕捉物質を特異的に捕捉する捕捉物質；
を有する被捕捉物質認識装置であって、
被捕捉物質が捕捉物質に特異的に捕捉されると共に該被捕捉物質と捕捉物質との結合を介してポリマーの少なくとも一部が架橋され、
該架橋に伴って前記細孔内のポリマーの挙動が変化し、且つ
外部環境変化に伴って細孔内のポリマーの細孔閉塞状態が変化することを特徴とする、被捕捉物質認識装置。
【０００６】
＜２＞  上記＜１＞において、被捕捉物質は、捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有するのがよい。
＜３＞  上記＜１＞において、被捕捉物質は、捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有し、該少なくとも２箇所の部位のうちの一方の部位がポリマーのうちの第１のポリマーの第１の捕捉物質に捕捉され、他方の部位がポリマーのうちの第２のポリマーの第２の捕捉物質に捕捉され、第１のポリマーと第２のポリマーとが、第１及び第２の捕捉物質並びに被捕捉物質を介して架橋するのがよい。
なお、第１のポリマーと第２のポリマーとは同じポリマーであっても、異なるポリマーであってもよい。第１及び第２の捕捉物質とは同じであっても、異なってもよい。
【０００７】
＜４＞  上記＜１＞〜＜３＞のいずれかにおいて、ポリマーの一部又は全部は、その一端が細孔の表面に化学的又は物理的に、特に化学的に結合するのがよい。
＜５＞  上記＜１＞〜＜４＞のいずれかにおいて、外部環境変化は、外部環境である溶液のｐＨの変化、外部環境である溶液のイオン強度の変化、外部環境である溶液の特定物質の濃度変化、外部環境である光の変化、外部環境である磁場の変化、外部環境である温度の変化、外部環境である電界の変化、及び外部環境である溶媒組成の変化からなる群から選ばれる少なくとも１種の変化であるのがよい。
【０００８】
＜６＞  上記＜１＞〜＜５＞のいずれかにおいて、ポリマーがアクリルアミド系モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、アクリル酸モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、もしくはこれら双方のモノマーを繰返単位として含むコポリマーであるのがよい。
＜７＞  上記＜１＞〜＜６＞のいずれかにおいて、細孔は、その孔径が被捕捉物質の粒径の１倍〜１万倍、好ましくは１０倍〜１万倍、より好ましくは１０倍〜１０００倍であるのがよい。例えば、孔径が１０ｎｍ〜１ｍｍであるのがよい。
【０００９】
＜８＞  上記＜１＞〜＜７＞のいずれかにおいて、被捕捉物質が、細胞、タンパク質、核酸、糖及び／又は糖鎖、脂質、並びにこれらの複合体、抗原、ウイルス、細菌、ホルモン、並びにこれらの断片からなる群から選ばれる少なくとも１種であるのがよい。
＜９＞  上記＜１＞〜＜８＞のいずれかにおいて、捕捉物質がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原からなる群から選ばれる少なくとも１種であるのがよく、特にポリクローナル抗体であるのがよい。
【００１０】
＜１０＞  被捕捉物質認識装置及び該装置によって認識される被捕捉物質を定性的又は定量的に検出する検出部を有する被捕捉物質アッセイ装置であって、
前記被捕捉物質認識装置は、
イ）細孔を有する多孔性基材であって外部環境変化により実質的に変化しない多孔性基材；
ロ）前記細孔中に配置されるポリマーであって外部環境変化に応答するポリマー；及び
ハ）前記ポリマーと結合するように配置される捕捉物質であって被捕捉物質を特異的に捕捉する捕捉物質；
を有し、被捕捉物質が捕捉物質に特異的に捕捉されると共に該被捕捉物質と捕捉物質との結合を介して前記ポリマーの少なくとも一部が架橋され、
アッセイ装置は、前記架橋の後に、前記ポリマーの外部環境を変化させる外部環境変化手段をさらに有し、該手段により前記ポリマーの外部環境を変化させてポリマーを収縮させるポリマー収縮状態又はポリマーを膨潤させるポリマー膨潤状態を形成させ、
前記検出部は、前記ポリマー収縮状態又は該収縮状態から解放した状態で、好ましくは前記ポリマー収縮状態で、前記ポリマーの架橋の有無、又は架橋の有無と架橋の度合いを検出することを特徴とする、前記被捕捉物質アッセイ装置。
【００１１】
＜１１＞  上記＜１０＞において、検出部は、認識装置の一方の面と該一方の面に対向する他方の面とに液を接触させ、且つ一方の面に接触させる第１の液と他方の面に接触させる第２の液とに溶質濃度差が生じるように配置し、架橋の有無又は架橋の度合いにより第１の液と第２の液との間に浸透圧が生じ、該浸透圧を検出するのがよい。
＜１２＞  上記＜１０＞又は＜１１＞において、検出部は、認識装置の一方の面と該一方の面に対向する他方の面とに液を接触させ、且つ一方の面に接触させる第１の液と他方の面に接触させる第２の液とに溶質濃度差が生じるように配置し、第１の液及び／又は第２の液の溶質濃度変化を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知するのがよい。
＜１３＞  上記＜１０＞〜＜１２＞のいずれかにおいて、検出部は、認識装置の一方の面に第１の液を接触させ、該第１の液に等圧を掛けて、前記認識装置を透過する第１の液の前記認識装置透過速度を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知するのがよい。
【００１２】
＜１４＞  上記＜１０＞〜＜１３＞のいずれかにおいて、検出部は、認識装置の一方の面に第１の液を接触させ、該第１の液を前記認識装置側に対して等速で付して、前記第１の液の圧力を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知するのがよい。
＜１５＞  上記＜１０＞〜＜１４＞のいずれかにおいて、外部環境変化手段が、外部環境である溶液のｐＨの変化、外部環境である溶液のイオン強度の変化、外部環境である溶液の特定物質の濃度変化、外部環境である光の変化、外部環境である磁場の変化、外部環境である温度の変化、外部環境である電界の変化、及び外部環境である溶媒組成の変化からなる群から選ばれる少なくとも１種の変化を生じさせるのがよい。
【００１３】
＜１６＞  上記＜１０＞〜＜１５＞のいずれかにおいて、被捕捉物質は、捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有するのがよい。
＜１７＞  上記＜１０＞〜＜１５＞のいずれかにおいて、被捕捉物質は、捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有し、該少なくとも２箇所の部位のうちの一方の部位がポリマーのうちの第１のポリマーの第１の捕捉物質に捕捉され、他方の部位がポリマーのうちの第２のポリマーの第２の捕捉物質に捕捉され、第１のポリマーと第２のポリマーとが、第１及び第２の捕捉物質並びに被捕捉物質を介して架橋するのがよい。
なお、第１のポリマーと第２のポリマーとは同じポリマーであっても、異なるポリマーであってもよい。第１及び第２の捕捉物質とは同じであっても、異なってもよい。
【００１４】
＜１８＞  上記＜１０＞〜＜１７＞のいずれかにおいて、ポリマーの一部又は全部は、その一端が細孔の表面に化学的又は物理的に、特に化学的に結合するのがよい。
＜１９＞  上記＜１０＞〜＜１８＞のいずれかにおいて、ポリマーが、アクリルアミド系モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、アクリル酸モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、もしくはこれら双方のモノマーを繰返単位として含むコポリマーであるのがよい。
【００１５】
＜２０＞  上記＜１０＞〜＜１９＞のいずれかにおいて、細孔は、その孔径が被捕捉物質の粒径の１倍〜１万倍、好ましくは１０倍〜１万倍、より好ましくは１０倍〜１０００倍であるのがよい。例えば、孔径が１０ｎｍ〜１ｍｍであるのがよい。
＜２１＞  上記＜１０＞〜＜２０＞のいずれかにおいて、被捕捉物質が、細胞、タンパク質、核酸、糖及び／又は糖鎖、脂質、並びにこれらの複合体、抗原、ウイルス、細菌、ホルモン、並びにこれらの断片からなる群から選ばれる少なくとも１種であるのがよい。
＜２２＞  上記＜１０＞〜＜２１＞のいずれかにおいて、捕捉物質がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原からなる群から選ばれる少なくとも１種であるのがよく、特にポリクローナル抗体であるのがよい。
【００１６】
＜２３＞  試料中の被捕捉物質のアッセイ法であって、
ａ）細孔を有する多孔性基材細孔を有する多孔性基材であって外部環境変化により実質的に変化しない多孔性基材；前記細孔中に配置されるポリマーであって外部環境変化に応答するポリマー；及び前記ポリマーと結合するように配置され、被捕捉物質を特異的に捕捉する捕捉物質；を有する被捕捉物質認識装置を準備する工程；
ｂ）検体試料と被捕捉物質認識装置とを接触させて、前記検体試料中に存在する被捕捉物質を捕捉物質に特異的に捕捉させ、且つ被捕捉物質と捕捉物質との結合を介して前記ポリマーの少なくとも一部が架橋される工程；
ｃ）前記ポリマーが収縮する外部環境に前記装置を配置する工程；
ｄ）前記架橋の有無、又は架橋の有無と架橋の度合いとを検出する工程；
を有し、
前記ｄ）工程の結果により、検体試料中の被捕捉物質を定性的又は定量的にアッセイする、上記アッセイ法。
【００１７】
＜２４＞  上記＜２３＞において、ｄ）工程は、認識装置の一方の面と該一方の面に対向する他方の面とに液を接触させ、且つ一方の面に接触させる第１の液と他方の面に接触させる第２の液とに溶質濃度差が生じるように配置し、架橋の有無又は架橋の度合いにより第１の液と第２の液との間に浸透圧が生じ、該浸透圧を検出するのがよい。
＜２５＞  上記＜２３＞又は＜２４＞において、ｄ）工程は、認識装置の一方の面と該一方の面に対向する他方の面とに液を接触させ、且つ一方の面に接触させる第１の液と他方の面に接触させる第２の液とに溶質濃度差が生じるように配置し、第１の液及び／又は第２の液の溶質濃度変化を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知するのがよい。
＜２６＞  上記＜２３＞〜＜２５＞のいずれかにおいて、ｄ）工程は、認識装置の一方の面に第１の液を接触させ、該第１の液に等圧を掛けて、前記認識装置を透過する第１の液の前記認識装置透過速度を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知するのがよい。
【００１８】
＜２７＞  上記＜２３＞〜＜２６＞のいずれかにおいて、ｄ）工程は、認識装置の一方の面に第１の液を接触させ、該第１の液を前記認識装置側に対して等速で付して、前記第１の液の圧力を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知するのがよい。
＜２８＞  上記＜２３＞〜＜２７＞のいずれかにおいて、外部環境が、溶液のｐＨの変化、溶液のイオン強度の変化、溶液の特定物質の濃度変化、光の変化、磁場の変化、温度の変化、電界の変化、及び溶媒組成の変化からなる群から選ばれる少なくとも１種の変化であるのがよい。
【００１９】
＜２９＞  上記＜２３＞〜＜２８＞のいずれかにおいて、被捕捉物質は、捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有するのがよい。
＜３０＞  上記＜２３＞〜＜２９＞のいずれかにおいて、被捕捉物質は、捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有し、該少なくとも２箇所の部位のうちの一方の部位が前記ポリマーのうちの第１のポリマーの第１の捕捉物質に捕捉され、他方の部位が前記ポリマーのうちの第２のポリマーの第２の捕捉物質に捕捉され、第１のポリマーと第２のポリマーとが、第１及び第２の捕捉物質並びに被捕捉物質を介して架橋するのがよい。なお、第１のポリマーと第２のポリマーとは同じポリマーであっても、異なるポリマーであってもよい。第１及び第２の捕捉物質とは同じであっても、異なってもよい。
【００２０】
＜３１＞  上記＜２３＞〜＜３０＞のいずれかにおいて、ポリマーの一部又は全部は、その一端が細孔の表面に化学的又は物理的に、特に化学的に結合するのがよい。
＜３２＞  上記＜２３＞〜＜３１＞のいずれかにおいて、ポリマーが、アクリルアミド系モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、アクリル酸モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、もしくはこれら双方のモノマーを繰返単位として含むコポリマーであるのがよい。
【００２１】
＜３３＞  上記＜２３＞〜＜３２＞のいずれかにおいて、細孔は、その孔径が被捕捉物質の粒径の１倍〜１万倍、好ましくは１０倍〜１万倍、より好ましくは１０倍〜１０００倍であるのがよい。例えば、孔径が１０ｎｍ〜１ｍｍであるのがよい。
＜３４＞  上記＜２３＞〜＜３３＞のいずれかにおいて、被捕捉物質が、細胞、タンパク質、核酸、糖及び／又は糖鎖、脂質、並びにこれらの複合体、抗原、ウイルス、細菌、ホルモン、並びにこれらの断片からなる群から選ばれる少なくとも１種であるのがよい。
＜３５＞  上記＜２３＞〜＜３４＞のいずれかにおいて、捕捉物質がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原からなる群から選ばれる少なくとも１種であるのがよく、特にポリクローナル抗体であるのがよい。
【００２２】
＜３６＞  被捕捉物質を認識する被捕捉物質認識装置の製造方法であって、
ｉ）細孔を有する多孔性基材であって外部環境変化により実質的に変化しない多孔性基材の該細孔に、官能基を有するポリマーであって外部環境変化に応答するポリマーを充填する工程；及び
ｉｉ）捕捉物質又はその誘導体を前記細孔に導入し、前記ポリマーと前記捕捉物質又はその誘導体とを結合させる工程；
を有する、上記方法。
【００２３】
＜３７＞  上記＜３６＞において、ｉ）工程の官能基を有するポリマーは、
Ｌ−１）モノマーを充填した後、該モノマーからポリマーを調製するか、又は
Ｌ−２）ポリマーを充填し、
その後に、ポリマーに官能基を導入する工程；もしくは
Ｍ）官能基を有するモノマー又は官能基を有するプレポリマーを充填した後、該モノマー又はプレポリマーからポリマーを調製する工程；
により得るのがよい。
＜３８＞  上記＜３６＞又は＜３７＞のいずれかにおいて、ｉ）工程において、ポリマーの一端と細孔の表面とを化学的又は物理的に、特に化学的に結合させる工程をさらに有するのがよい。
【００２４】
＜３９＞  上記＜３６＞〜＜３８＞のいずれかにおいて、被捕捉物質は、捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有するのがよい。
＜４０＞  上記＜３６＞〜＜３８＞のいずれかにおいて、被捕捉物質は、捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有し、該少なくとも２箇所の部位のうちの一方の部位が前記ポリマーのうちの第１のポリマーの第１の捕捉物質に捕捉され、他方の部位が前記ポリマーのうちの第２のポリマーの第２の捕捉物質に捕捉され、第１のポリマーと第２のポリマーとが、第１及び第２の捕捉物質並びに被捕捉物質を介して架橋するのがよい。
なお、第１のポリマーと第２のポリマーとは同じポリマーであっても、異なるポリマーであってもよい。第１及び第２の捕捉物質とは同じであっても、異なってもよい。
【００２５】
＜４１＞  上記＜３６＞〜＜４０＞のいずれかにおいて、外部環境変化は、外部環境である溶液のｐＨの変化、外部環境である溶液のイオン強度の変化、外部環境である溶液の特定物質の濃度変化、外部環境である光の変化、外部環境である磁場の変化、外部環境である温度の変化、外部環境である電界の変化、及び外部環境である溶媒組成の変化からなる群から選ばれる少なくとも１種の変化であるのがよい。
＜４２＞  上記＜３６＞〜＜４１＞のいずれかにおいて、ポリマーが、アクリルアミド系モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、アクリル酸モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、もしくはこれら双方のモノマーを繰返単位として含むコポリマーであるのがよい。
【００２６】
＜４３＞  上記＜３６＞〜＜４２＞のいずれかにおいて、細孔は、その孔径が被捕捉物質の粒径の１倍〜１万倍、好ましくは１０倍〜１万倍、より好ましくは１０倍〜１０００倍であるのがよい。例えば、孔径が１０ｎｍ〜１ｍｍであるのがよい。
【００２７】
＜４４＞  上記＜３６＞〜＜４３＞のいずれかにおいて、被捕捉物質が、細胞、タンパク質、核酸、糖及び／又は糖鎖、脂質、並びにこれらの複合体、抗原、ウイルス、細菌、ホルモン、並びにこれらの断片からなる群から選ばれる少なくとも１種であるのがよい。
＜４５＞  上記＜３６＞〜＜４４＞のいずれかにおいて、捕捉物質がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原からなる群から選ばれる少なくとも１種であるのがよく、特にポリクローナル抗体であるのがよい。
【発明の効果】
【００２８】
本発明により、迅速且つ簡便であり、高選択・高感度を有するセンサー及び／又はアッセイ法を提供することができる。
また、本発明により、コスト性、迅速性及び簡便性を有し、定性及び定量を行えるアッセイ法、及び該アッセイに用いる装置を提供することができる。
さらに、本発明により、上記効果と共に、又は上記効果以外に、センサー以外にも用いることができる、分子などの被捕捉物質を認識する装置、該装置の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、被捕捉物質認識装置及び該装置の製造方法を提供する。また、本発明は、該装置を備える被捕捉物質アッセイ装置、該装置を用いる被捕捉物質アッセイ法を提供する。
【００３０】
＜被捕捉物質認識装置＞
まず、被捕捉物質認識装置について説明する。
本発明の被捕捉物質認識装置は、イ）細孔を有する多孔性基材であって外部環境変化により実質的に変化しない多孔性基材；ロ）細孔中に配置されるポリマーであって外部環境変化に応答するポリマー；及びハ）ポリマーと結合するように配置される捕捉物質であって被捕捉物質を特異的に捕捉する捕捉物質；を有する。
この装置を、被捕捉物質が存在する系内に配置することにより、被捕捉物質が捕捉物質に特異的に捕捉されると共に該被捕捉物質と捕捉物質との結合を介してポリマーの少なくとも一部が架橋される。また、本発明の被捕捉物質認識装置は、該架橋に伴って細孔内のポリマーの挙動が変化し、且つ外部環境変化に伴って細孔内のポリマーの細孔閉塞状態が変化することを特徴とする。
【００３１】
即ち、本発明の被捕捉物質認識装置は、上述の架橋と細孔閉塞状態変化により、被捕捉物質が捕捉物質によって捕捉されたことを認識する。より具体的な作用を、図１を参照しつつ説明する。
図１は、捕捉物質と被捕捉物質との組合せとして、抗体と抗原を用いた被捕捉物質認識装置１を例示する本発明の一態様を示す図である。
図１のｘ）の被捕捉物質認識装置１において、多孔性基材２の細孔４内であって、細孔の表面に一端が結合するように外部環境応答性ポリマー６が配置される。また、ポリマー６の他端には捕捉物質（抗体）８が配置される。
【００３２】
この被捕捉物質認識装置１が、捕捉物質（抗体）８と特異的に結合する被捕捉物質（抗原）１０の存在下に配置されると、図１のａ）で示すように、該被捕捉物質（抗原）１０及び捕捉物質（抗体）８を介して、ポリマー６同士が架橋される。
一方、捕捉物質（抗体）８と非特異的に結合する被捕捉物質（抗原）１１の存在下に、被捕捉物質認識装置１を配置すると、図１のｂ）で示すように、上述のような架橋は形成されない。特に、外部環境応答性ポリマー６が収縮するような環境に、被捕捉物質認識装置１を配置すると、上述のような架橋は形成されず、図１のｂ）で示すように、外部環境応答性ポリマー６は、収縮し細孔壁近傍に存在することとなる。
【００３３】
図１のａ）とｂ）との状態は、次のように簡易に検出することができる。例えば、図１は、浸透圧により検出する方法を例示する。即ち、多孔性基材２の細孔４の一方の開口部に第１の液１３を接触させ、他方の開口部に第２の液１４を接触させる。第１の液１３と第２の液１４とは、同じ溶媒を用い、溶質の濃度差を付与する。特に、第１の液１３の濃度を高くし、第２の液１４の濃度を低くする。この場合、ａ）においては、ポリマー６同士の架橋の有無及び／又は度合いにより、第１の液と第２の液との間で浸透圧が生じる。一方、ｂ）においては、ポリマー同士の架橋がないため、浸透圧が生じない。したがって、この浸透圧により、被捕捉物質認識装置１は、被捕捉物質（抗原）１０の存在及びその量を認識することができる。
上記図１は、捕捉物質と被捕捉物質との組合せとして、抗体と抗原を用い、認識の検出として浸透圧を用いたものを例示したが、本発明の被捕捉物質認識装置は、これに限定されない。
【００３４】
＜＜被捕捉物質＞＞
被捕捉物質は、捕捉物質と特異的に捕捉される部位を少なくとも２箇所有するのがよい。また、該少なくとも２箇所の部位のうちの一方の部位がポリマーのうちの第１のポリマーの第１の捕捉物質に捕捉され、他方の部位がポリマーのうちの第２のポリマーの第２の捕捉物質に捕捉され、第１のポリマーと第２のポリマーとが、第１及び第２の捕捉物質並びに被捕捉物質を介して架橋するのがよい。なお、第１のポリマーと第２のポリマーとは同じポリマーであっても、異なるポリマーであってもよい。第１及び第２の捕捉物質とは同じであっても、異なってもよい。
【００３５】
＜＜ポリマー＞＞
ポリマーは、外部環境変化に応答するポリマーである。該ポリマーの一部又は全部は、その一端が細孔の表面に化学的又は物理的に、特に化学的に結合するのがよい。
外部環境変化は、外部環境である溶液のｐＨの変化、外部環境である溶液のイオン強度の変化、外部環境である溶液の特定物質の濃度変化、外部環境である光の変化、外部環境である磁場の変化、外部環境である温度の変化、外部環境である電界の変化、及び外部環境である溶媒組成の変化からなる群から選ばれる少なくとも１種の変化であるのがよい。
ポリマーは、アクリルアミド系モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、アクリル酸モノマー由来のホモポリマー又はコポリマー、もしくはこれら双方のモノマーを繰返単位として含むコポリマーであるのがよい。アクリルアミド系モノマーとして、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド及びＮ−アクリルピロリジンなど；並びにこれらの修飾物を挙げることができるが、これらに限定されない。また、アクリルアミド系モノマー由来のコポリマーは、外部環境により変化を生じる官能基を有してもよい。アクリル酸モノマーとして、アクリル酸、メタクリル酸及びこれらの修飾物を挙げることができるがこれらに限定されない。アクリル酸モノマー由来のコポリマーは、外部環境により変化を生じる官能基を有してもよい。これら双方のモノマー、即ちモノマーアクリルアミド系モノマーとアクリル酸モノマーとを繰返単位として含むコポリマーは、該２つのモノマー以外のモノマーを繰返単位として含んでもよい。このコポリマーも、この場合、外部環境により変化を生じる官能基を有してもよい。
【００３６】
＜＜多孔性基材＞＞
多孔性基材は、外部環境変化により実質的に変化しないものであれば、材質は限定されない。即ち、多孔性基材の細孔中に配置するポリマーが、外部環境変化に応答し変化するのに対して、多孔性基材は実質的に変更しない。よって、多孔性基材及びポリマーは、外部環境変化に依存するか、又は外部環境変化は、多孔性基材及びポリマーに依存して、選択される。
例えば、多孔性基材の材質として、有機物、無機物、有機−無機ハイブリッド材料を挙げることができる。より具体的には、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリシクロキサン、ポリカーボナートなどのポリマー材料；多孔性ガラス、多孔性セラミックスなどの無機材料などを挙げることができるがこれに限定されない。なお、多孔性基材の形状も、被捕捉物質認識装置の形状も、特に限定されない。
細孔は、被捕捉物質及び／又は捕捉物質の大きさなどに依存するが、その孔径が被捕捉物質の粒径の１倍〜１万倍、好ましくは１０倍〜１万倍、より好ましくは１０倍〜１０００倍であるのがよい。例えば、孔径が１０ｎｍ〜１ｍｍであるのがよい。
【００３７】
＜＜被捕捉物質と捕捉物質＞＞
捕捉物質と被捕捉物質とは、その結合が特異的となる組合せであるのがよい。
被捕捉物質は、細胞、タンパク質、核酸、糖及び／又は糖鎖、脂質、並びにこれらの複合体、抗原、ウイルス、細菌、ホルモン、並びにこれらの断片からなる群から選ばれる少なくとも１種であるのがよい。
また、捕捉物質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗原からなる群から選ばれる少なくとも１種であるのがよく、特にポリクローナル抗体であるのがよい。特に、本発明において、ポリクローナル抗体を用いることにより架橋度を高めることができる。したがって、モノクローナル抗体を用いなくてもよいため、低コスト化を図ることができる。
【００３８】
本発明の被捕捉物質認識装置は、後述の被捕捉物質のアッセイ装置、アッセイ法に用いることができるが、これに限定されない。
例えば、本発明の被捕捉物質認識装置は、マイクロバルブ、人工臓器、触媒反応システム、ドラッグデリバリーシステム、ティシュエンジニアリングなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３９】
＜被捕捉物質認識装置の製造方法＞
上述の被捕捉物質認識装置は、次のような方法により製造することができる。
即ち、ｉ）細孔を有する多孔性基材であって外部環境変化により実質的に変化しない多孔性基材の該細孔に、官能基を有するポリマーであって外部環境変化に応答するポリマーを充填する工程；及び
ｉｉ）捕捉物質又はその誘導体を前記細孔に導入し、前記ポリマーと前記捕捉物質又はその誘導体とを結合させる工程；
を有することにより、製造することができる。
なお、「多孔性基材」、「ポリマー」、「捕捉物質」、「被捕捉物質」として、上述したものを用いることができる。
【００４０】
ここで、ｉ）工程の官能基を有するポリマーは、
Ｌ−１）モノマーを充填した後、該モノマーからポリマーを調製するか、又は
Ｌ−２）ポリマーを充填し、
その後に、ポリマーに官能基を導入する工程；もしくは
Ｍ）官能基を有するモノマー又は官能基を有するプレポリマーを充填した後、該モノマー又はプレポリマーからポリマーを調製する工程；
により得るのがよい。
【００４１】
本発明の方法において、官能基は、導入する捕捉物質に依存して、選択することができる。例えば、後述するアミノ基（−ＮＨ２基）を有する抗体などを捕捉物質として導入する場合、官能基として、N-アクリルオキシスクシンイミドなどの活性エステル基とすることができる。
【００４２】
ｉ）工程において、特にＬ−１）工程において、ポリマーの一端と細孔の表面とを化学的又は物理的に、特に化学的に結合させる工程をさらに有するのがよい。化学的に結合させる工程として、プラズマグラフト重合法、光重合法、ＵＶグラフト重合法、電子線グラフト重合法、放射線グラフト重合法、一般的な化学結合（重合）法（例えば、ポリマーの一端に第１の官能基を有し且つ細孔の表面に第２の官能基を有し該第１及び第２の官能基同士の反応による結合法）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４３】
より具体的には、本発明の製造法は、次のように行うことができる。なお、図２を参照しつつ説明する。
上述の多孔性基材を準備する。
次いで、N-イソプロピルアクリルアミド（以下、「ＮＩＰＡＭ」と略記する場合がある）、及びアクリル酸（以下、「ＡＡｃ」と略記する場合がある）を、前述の多孔性基材の細孔中でプラズマグラフト重合法により細孔表面に固定化する（図２のａ）の左辺側）。
固定化されたアクリル酸を足場にN-ヒドロキシスクシンイミド（以下、「ＮＨＳ」と略記する場合がある）及び水溶性カルボジイミドを用いて、溶媒下、例えばジメチルホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」と略記する場合がある）下で反応させ、アクリル酸をN-アクリルオキシスクシンイミド（以下、「ＮＡＳ」と略記する場合がある）化する（図２のａ）工程）。
さらに、リン酸緩衝液中でＮＡＳの活性エステル基と抗体のアミノ基とを反応させ、抗体固定グラフトポリマーを膜細孔中に導入する（図２のｂ）工程）。
最後に、残ったＮＡＳの活性エステル基を不活化するために、イソプロピルアミンと反応させ、N-イソプロピルアクリルアミド化し、ＮＡＳと抗体との反応を完全に停止させる（図２のｃ）工程）。
なお、図２は、捕捉物質として「抗体」を用いるものを例示したが、これに限定されない。
【００４４】
＜被捕捉物質アッセイ装置＞
本発明は、上述の被捕捉物質認識装置及び該装置によって認識される被捕捉物質を定性的又は定量的に検出する検出部を有する被捕捉物質アッセイ装置を提供する。
被捕捉物質認識装置は、上述した通りである。
【００４５】
＜＜外部環境変化手段＞＞
本発明のアッセイ装置は、被捕捉物質を捕捉した際に形成される架橋後に、ポリマーの外部環境を変化させる外部環境変化手段をさらに有する。
この手段により、ポリマーの外部環境を変化させてポリマーを収縮させるポリマー収縮状態又はポリマーを膨潤させるポリマー膨潤状態を形成する。
なお、外部環境変化については、上述の通りである。
上述のように、ポリマーを収縮させることにより、非特異結合による対象とする被捕捉物質以外の物質が、検出されないこととなる。したがって、この手段を有することにより、検出感度、検出精度を上げることができる。
【００４６】
＜＜検出部＞＞
本発明のアッセイ装置は、ポリマー収縮状態又は該収縮状態から解放した状態で、好ましくはポリマー収縮状態で、ポリマーの架橋の有無、又は架橋の有無と架橋の度合いを検出する検出部を有する。
検出部は、上述の浸透圧を検出するものに限定されず、種々の検出部を備えることができる。
浸透圧を検出する検出部は、認識装置の一方の面と該一方の面に対向する他方の面とに液を接触させ、且つ一方の面に接触させる第１の液と他方の面に接触させる第２の液とに溶質濃度差が生じるように配置し、架橋の有無又は架橋の度合いにより第１の液と第２の液との間に浸透圧が生じ、該浸透圧を検出するのがよい。
また、検出部は、認識装置の一方の面と該一方の面に対向する他方の面とに液を接触させ、且つ一方の面に接触させる第１の液と他方の面に接触させる第２の液とに溶質濃度差が生じるように配置し、第１の液及び／又は第２の液の溶質濃度変化を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知するのがよい。
さらに、検出部は、認識装置の一方の面に第１の液を接触させ、該第１の液に等圧を掛けて、前記認識装置を透過する第１の液の前記認識装置透過速度を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知するのがよい。
また、検出部は、認識装置の一方の面に第１の液を接触させ、該第１の液を前記認識装置側に対して等速で付して、前記第１の液の圧力を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知するのがよい。
これらの検出部は、上記の２つ以上を組み合わせて備えるものであってもよい。
【００４７】
＜アッセイ法＞
また、本発明は、上述の被捕捉物質認識装置を用いる、試料中の被捕捉物質のアッセイ法を提供する。
即ち、本発明のアッセイ法は、
ａ）細孔を有する多孔性基材細孔を有する多孔性基材であって外部環境変化により実質的に変化しない多孔性基材；前記細孔中に配置されるポリマーであって外部環境変化に応答するポリマー；及び前記ポリマーと結合するように配置され、被捕捉物質を特異的に捕捉する捕捉物質；を有する被捕捉物質認識装置を準備する工程；
ｂ）検体試料と被捕捉物質認識装置とを接触させて、前記検体試料中に存在する被捕捉物質を捕捉物質に特異的に捕捉させ、且つ被捕捉物質と捕捉物質との結合を介して前記ポリマーの少なくとも一部が架橋される工程；
ｃ）前記ポリマーが収縮する外部環境に前記装置を配置する工程；
ｄ）前記架橋の有無、又は架橋の有無と架橋の度合いとを検出する工程；
を有し、
前記ｄ）工程の結果により、検体試料中の被捕捉物質を定性的又は定量的にアッセイする。
なお、「多孔性基材」、「ポリマー」、「捕捉物質」、「被捕捉物質」、「外部環境」として、上述したものを用いることができる。
【００４８】
ｄ）工程は、架橋の有無、又は架橋の有無と架橋の度合いとを検出する工程であれば、特に限定されない。
例えば、上述のように、浸透圧を検出する工程の場合、ｄ）工程は、認識装置の一方の面と該一方の面に対向する他方の面とに液を接触させ、且つ一方の面に接触させる第１の液と他方の面に接触させる第２の液とに溶質濃度差が生じるように配置し、架橋の有無又は架橋の度合いにより第１の液と第２の液との間に浸透圧が生じ、該浸透圧を検出するのがよい。
また、ｄ）工程は、認識装置の一方の面と該一方の面に対向する他方の面とに液を接触させ、且つ一方の面に接触させる第１の液と他方の面に接触させる第２の液とに溶質濃度差が生じるように配置し、第１の液及び／又は第２の液の溶質濃度変化を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知するのがよい。
さらに、ｄ）工程は、認識装置の一方の面に第１の液を接触させ、該第１の液に等圧を掛けて、前記認識装置を透過する第１の液の前記認識装置透過速度を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知するのがよい。
また、ｄ）工程は、認識装置の一方の面に第１の液を接触させ、該第１の液を前記認識装置側に対して等速で付して、前記第１の液の圧力を検出して、架橋の有無又は架橋の度合いを検知するのがよい。
これらの検出工程は、上記の２つ以上を組み合わせて有してもよい。
【００４９】
以下、実施例に基づいて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５０】
＜抗原認識ゲート膜の作製＞
基材として旭化成社製多孔高密度ポリエチレン（膜厚２７μｍ、公称径１５０ｎｍ、空孔率５０％）を用いた。
溶媒を水としてN-イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）−アクリル酸（ＡＡｃ）（ＮＩＰＡＭ：ＡＡｃ（ｍｏｌ％）＝７０：３０）モノマー濃度１〜３ｗｔ％、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）界面活性剤濃度３ｗｔ％を用い、遊離ラジカル法によりプラズマグラフト重合を行った。プラズマ照射条件はＡｒ  １０Ｐａの雰囲気下で照射強度３０Ｗ、照射時間６０秒で行った。また重合は６０℃、１０〜６０分間振とうすることにより行った。多孔質細孔へ導入したＮＩＰＡＭ−ＡＡｃは、重量変化およびＦＴ−ＩＲ（Ｎｉｃｏｌｅｔ、ＵＳＡ、Ｍｏｄｅｌ  ＭＡＧＮＡ５５０）により評価した。
続いてＮＩＰＡＭ−ＡＡｃ導入膜のカルボキシル基とN-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、縮合剤である水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）をＤＭＦ中で３０℃、２４時間反応させ、アクリル酸をN-アクリルオキシスクシンイミド（ＮＡＳ）に変換した。反応はアクリル酸に対し、ＮＨＳとＷＳＣともにモル数で１００倍以上導入し行った。変換されたＮＡＳ量は０．１Ｎアンモニア水と３０℃、１時間反応させ、脱離したＮＨＳ量を２６０ｎｍのＵＶ測定により評価した。
ＮＡＳ導入後の膜を用い、ｐＨ７．４の０．０２Ｍリン酸緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５ｍｌ／Ｌ界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を含む）中でＮＡＳの活性エステル基と抗体のアミノ基を３０℃、２時間反応させた。抗体としては抗アルブミンポリクローナル抗体を用いた。最後に残った活性エステル基を不活性化するためにイソプロピルアミンと３０℃、２時間反応させ、ＮＩＰＡＭとすることでＮＡＳと抗体の反応を完全に停止させた。
【００５１】
プラズマグラフト重合により反応時間、モノマー濃度を制御することでグラフト率２〜４８％のＮＩＰＡＭ−ＡＡｃ膜を作製することに成功した（グラフト率は基材の空孔体積をグラフトポリマー（密度１ｇ／ｃｍ３）が占有する割合と定義する）。
また、上記のＮＡＳ導入反応によるＮＩＰＡＭ−ＡＡｃ膜のアクリル酸からＮＡＳへの置換率は約１０％程度であることが分かった。多孔質膜細孔中に空間的に導入できる抗体量を見積もり、今回導入したＮＡＳ量と照らし合わせるとＮＡＳの活性エステル基は充分量で導入できたと考えられた。
【００５２】
＜透過実験＞
循環型の透過装置（図３）を用い、ＮＩＰＡＭ−ＡＡｃ膜に関してｐＨの変化による透過流束を観察した。膜は基材と重合量４．２％と１２．９％のものを用いた。なお、図３において、３０１はポンプ、３０２は圧力ゲージ、３０３は温度計、３０４は試験セル、３０５は透過液、３０６は流量計、３０７は圧力バルブ、３０８は供給タンク、３０９はサーモスタット、３１０は攪拌機であった。
透過液としては０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０、５．０）、または０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。透過液は３７℃で一定とし、ポンプにより循環され膜面が加圧される。透過圧力は０．５ｋｇｆ／ｃｍ２〜１．０ｋｇｆ／ｃｍ２の間で行い、透過流量は５００ｍｌ／分とした。膜透過してきた透過流束を測定し、２０℃の粘度を基準にして温度補正し、１．０ｋｇｆ／ｃｍ２で加圧した時の透過係数Ｌｐ［ｍ３ｍ−２ｓ−１（ｋｇｆ／ｃｍ２）−１］に換算した。
【００５３】
基材またはＮＩＰＡＭ−ＡＡｃ膜（グラフト率：４．２％、１２．９％）を用いて透過試験を行った結果を図４に示す。図４からアクリル酸のｐＫａ付近（ｐＨ４〜５）において透過流束が劇的に変化していることが観察され、細孔径も大幅に変化していると考えられた。
【００５４】
＜浸透圧測定実験＞
測定装置は、２チャンバーの密閉系浸透圧測定装置（図５）を用い、ＮＩＰＡＭ−ＡＡｃ膜に関してｐＨの変化により発生する浸透圧を評価した。膜は重合量１２．９％のものを用いた。密閉された溶液チャンバー側に圧力センサーを取り付けており、経時的に浸透圧を測定した。溶液チャンバー側の溶質としてポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、Ｍｗ＝４０，０００）を用い溶質濃度は１０ｗｔ％とした。溶媒は０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）、または０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用い、チャンバーは攪拌を行い、37℃で温度一定とした。
【００５５】
グラフト率１２．９％のＮＩＰＡＭ−ＡＡｃ膜を用いてｐＨの変化による浸透圧測定試験を行った。図６に示すようにｐＨ７．４ではグラフトポリマーが膨潤し、細孔が閉塞した状態で完全な阻止が起こり、溶質濃度勾配が保たれ、分画分子量１４，０００の再生セルロース透析膜を用いた浸透圧測定結果と最大浸透圧がほぼ一致した。また、ｐＨ４．０ではグラフトポリマーが収縮し細孔は開いており浸透圧はほぼ発生しなかった。ｐＨの変化による細孔の開閉で浸透圧発生の制御が可能であることが示された。
以上のことから、さらに抗原抗体結合の架橋を組み合わせて細孔の開閉、そして浸透圧発生を制御することも可能であると考えられ、高感度・高選択性を有したバイオセンサーが期待できると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の被捕捉物質認識装置の一態様を示す図である。
【図２】本発明の被捕捉物質認識装置の製法の一態様を示す図である。
【図３】実施例１に用いる循環型透過装置を示す図である。
【図４】透過試験の結果を示すグラフである。
【図５】実施例１に用いる密閉系浸透圧測定装置を示す図である。
【図６】浸透圧測定試験結果を示すグラフである。
【図１】
2008002918.tif 000002
【図２】
2008002918.tif 000003
【図３】
2008002918.tif 000004
【図４】
2008002918.tif 000005
【図５】
2008002918.tif 000006
【図６】
2008002918.tif 000007