(57)【要約】【課  題】肝腫瘍のみならず種々の目的組織の腫瘍に対して適用できる実用的なＭＲＩ造影剤、及びそれに用いることができる微粒子を提供する。【解決手段】磁性酸化鉄粒子の表面に複数の金微粒子を備えた金酸化鉄粒子の、金微粒子の全部又は一部に、硫黄を介して、ポリアルキレングリコールが結合した複合粒子。【選択図】図３
2008266214.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性酸化鉄粒子の表面に複数の金微粒子を備えた金酸化鉄粒子の、金微粒子の全部又は一部に、硫黄を介して、ポリアルキレングリコールが結合したことを特徴とする複合粒子。
【請求項２】
磁性酸化鉄が、Ｆｅ３Ｏ４、γ-Ｆｅ２Ｏ３、フェライトからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の複合粒子。
【請求項３】
金酸化鉄粒子の一次粒子の平均粒径が５〜２００ｎｍである請求項１または２に記載の複合粒子。
【請求項４】
金酸化鉄粒子の二次粒子の平均粒径が１００〜１０００ｎｍである請求項１〜３のいずれかに記載の複合粒子。
【請求項５】
複合粒子における磁性酸化鉄粒子に対する金微粒子の重量比が、１０：１〜１：１（金微粒子：磁性酸化鉄粒子）である請求項１〜４のいずれかに記載の複合粒子。
【請求項６】
金微粒子の平均粒径が１〜２０ｎｍである請求項１〜５のいずれかに記載の複合粒子。
【請求項７】
磁性酸化鉄粒子の全表面が実質的に金微粒子で覆われた請求項１〜６のいずれかに記載の複合粒子。
【請求項８】
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項１〜７のいずれかに記載の複合粒子。
【請求項９】
ポリアルキレングリコールの分子量が２０００〜３０万である請求項１〜８のいずれかに記載の複合粒子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の複合粒子を含むＭＲＩ造影剤。
【請求項１１】
組織非特異的ＭＲＩ造影剤である請求項１０に記載のＭＲＩ造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金酸化鉄粒子を利用した複合粒子および該複合粒子を含むＭＲＩ造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、がん病変の診断ならびに治療方針の決定に必要な情報を視覚的に読み取ることが可能な画像診断技術としてエックス線を利用したＣＴ（コンピュータ断層撮影）法、磁気共鳴現象を利用したＭＲＩ（磁気共鳴画像）法が一般的に知られている。特にＭＲＩ法は、従来までの血清生化学的または組織学的ながん診断と比べると、より微小ながんをも発見できる上に、エックス線を利用しないため放射線被爆の恐れがなく小児や健常者も安心して検査を受けられるという利点がある。
【０００３】
ＭＲＩ法は、人体構成物質の大部分を占める水素原子核（proton）の核磁気共鳴（ＮＭＲ）現象を利用して、その状態の差異および分布を濃淡として画像化する技術である。これは、従来のエックス線を利用するＣＴ法が基本的に解剖学的所見を得るだけのものであったのに対し、矢状断面像、横断面像、冠状断面像など任意方向の断面像が撮像できること、軟部組織のコントラストが良いなどの特徴を有し、３次元画像処理技術の進展に伴い臨床用にも広く応用されるに至っている。
【０００４】
ＭＲＩ法においては、がんをはじめとする特定の組織をより鮮明に造影するために、造影剤が使用されることが多い。造影剤とは診断に当たって正常組織と目的組織の画像コントラストを増強するための検査用の医薬品であって、通常、静脈注射で使用される。ＭＲＩ用の造影剤は、ＣＴ法などのエックス線画像診断とは造影機構が原理的に異なるため、バリウムやヨウ素のようなエックス線吸収性物質ではなく、通常、核磁気共鳴に影響を与える磁性物質が用いられ、例えばガドリニウム製剤や鉄製剤が市販されている。具体的には（Fe2O3）m（FeO）ｎ（但し、０＜ｎ／ｍ＜１）を原料とするフェリデックス（栄研化学株式会社製造、田辺製薬株式会社販売）が挙げられる。
【０００５】
しかし、市販のＭＲI用造影剤は肝集積性が高く血中安定性が乏しいため、生理学的、および物理的特徴から使用用途が肝腫瘍造影に限定されているという問題点がある。したがって、ＭＲＩ法による腫瘍造影法をより組織的に汎用性の高いがん診断技術として発展させるためには、肝腫瘍のみならず種々の目的組織に対して適用できるＭＲＩ造影剤の開発が望まれていた。
【０００６】
ここで、特許文献１には金酸化鉄粒子の製造方法が開示されている。同文献には、この金酸化鉄粒子が造影剤として利用できる可能性があることが記載されているが、ＭＲＩ造影剤としての実用性については不明である。
【０００７】
また、非特許文献１には高分子被膜で被覆した鉄微粒子の表面にＰＥＧを担持させた微粒子がＭＲＩ造影剤として使用できることが記載されている。しかし、微粒子の作成方法が再現可能な程度には十分開示されておらず、ＭＲＩ造影剤としての実用性に欠けている。
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００４/０８３１２４号公報
【非特許文献１】J.AM.CHEM.SOC.2006,128,7383-7389
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、肝腫瘍のみならず種々の目的組織の腫瘍に対して適用できる実用的なＭＲＩ造影剤、及びそれに用いることができる微粒子を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、磁性酸化鉄粒子の表面に複数の金微粒子を備えた金酸化鉄粒子の金微粒子の全部又は一部に、硫黄を介してポリアルキレングリコールが結合した複合粒子がＭＲＩ造影剤として肝腫瘍のみならず種々の目的組織の腫瘍に対して適用できることを見出した。
【００１１】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の各項の新規な複合粒子および該複合粒子を含むＭＲＩ造影剤を提供する。
項１．磁性酸化鉄粒子の表面に複数の金微粒子を備えた金酸化鉄粒子の、金微粒子の全部又は一部に、硫黄を介して、ポリアルキレングリコールが結合した複合粒子。
項２．磁性酸化鉄が、Ｆｅ３Ｏ４、γ-Ｆｅ２Ｏ３、フェライトからなる群より選ばれる少なくとも１種である項１に記載の複合粒子。
項３．金酸化鉄粒子の一次粒子の平均粒径が５〜２００ｎｍである項１または２に記載の複合粒子。
項４．金酸化鉄粒子の二次粒子の平均粒径が１００〜１０００ｎｍである項１〜３のいずれかに記載の複合粒子。
項５．複合粒子における磁性酸化鉄粒子に対する金微粒子の重量比が、１０：１〜１：１（金微粒子：磁性酸化鉄粒子）である項１〜４のいずれかに記載の複合粒子。
項６．金微粒子の平均粒径が１〜２０ｎｍである項１〜５のいずれかに記載の複合粒子。
項７．磁性酸化鉄粒子の全表面が実質的に金微粒子で覆われた項１〜６のいずれかに記載の複合粒子。
項８．ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である項１〜７のいずれかに記載の複合粒子。
項９．ポリアルキレングリコールの分子量が２０００〜３０万である項１〜８のいずれかに記載の複合粒子。
項１０．項１〜９のいずれかに記載の複合粒子を含むＭＲＩ造影剤
項１１．組織非特異的ＭＲＩ造影剤である項１０に記載のＭＲＩ造影剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の複合粒子は、肝腫瘍のみならず種々の目的組織の腫瘍に対して組織非特異的に適用できるＭＲＩ造影剤として使用できることを特徴としている。
従来のＭＲＩ造影剤は点滴などによって静脈内投与後、腫瘍組織には殆ど取り込まれず、投与後わずか数分で正常肝細胞（主にクッパー細胞）に投与粒子中のおよそ８０％が取り込まれる。このような機構で正常肝組織のみに集積した造影剤は、電磁波を照射した際に正常肝細胞内でのみ局所磁場の撹乱を引き起こすため、結果として肝腫瘍−肝正常組織間のＭＲＩ信号コントラストを増強し肝腫瘍の高感度造影を可能としている。しかし一方で、他の目的組織ではこのような生物学的現象が起こらないため従来のＭＲＩ造影剤の用途は肝腫瘍造影に限定されるという問題点があった。
【００１３】
この点、本発明の複合粒子を利用したＭＲＩ造影剤は磁性酸化鉄粒子の表面の金微粒子に硫黄を介してポリアルキレングリコールを結合させることにより、腫瘍組織に特異的に集積されるという特徴を有し、その結果、用途を肝腫瘍造影に限定しない組織非特異的な汎用性の高いＭＲＩ造影剤となっている。
また、本発明の複合粒子は、金酸化鉄粒子における金微粒子の担持量(数及び大きさ)を調節することにより、ポリアルキレングリコールの担持量を任意に調節することができ、複合粒子の体内動態などを容易に制御することができる。
また、本発明の複合粒子は、硫黄を介してポリアルキレングリコールが金酸化鉄粒子に結合しているため、投与後にポリアルキレングリコールが金酸化鉄粒子から脱離することがなく、ＭＲＩ造影剤として実用性が高いものである。
また、本発明の複合粒子は、例えば、金酸化鉄粒子とチオール基を有するポリアルキレングリコールとを混合するという簡単な方法で製造することができる。また、後述するように、金酸化鉄粒子が滅菌状態で得られるため、別途滅菌しておいたチオール基を有するポリアルキレングリコールを用いて滅菌状態の複合粒子を簡単に得ることができ、医薬品として使用し易い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の複合粒子は、磁性酸化鉄粒子の表面に複数の金微粒子を備えた金酸化鉄粒子の金微粒子の全部又は一部に、硫黄を介して、ポリアルキレングリコールが結合した複合粒子であることを特徴とする。
【００１５】
以下、複合粒子の製造方法について詳細を説明した後で、該複合粒子について説明する。
金酸化鉄粒子の製造方法
金酸化鉄粒子は、金イオンまたは金錯体を含有する液に磁性酸化鉄粒子を分散させ、ガンマ線、電子線、または超音波を照射することによって得られる。具体的には、特許文献１に記載の方法で製造できる。
【００１６】
＜磁性酸化鉄粒子＞
本発明に用いる磁性酸化鉄粒子は磁性を有する酸化鉄の微粒子であり、酸化鉄としては例えば磁鉱、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、ガンマヘマタイト、フェライトを挙げることができる。中でも生体への毒性が低いことにより、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、ガンマヘマタイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）の微粒子が好ましい。
磁性酸化鉄粒子は、一次粒子の平均粒径が１０ｎｍ程度のものを用いればよい。ここで平均粒子径は電子顕微鏡観察により２０個の粒子の粒径を測定し、平均した値である。
また、上記磁性酸化鉄粒子およびその製造方法は周知である。例えばＰＶＳ（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｖａｐｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）法（Ｃ．Ｊ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ｎ．Ａｌｉ，Ｂ．Ｂ．Ｌｙｍｐａｎｙ，ＵＳ公開特許第５５１４３４９Ａ参照）などにより製造することができる。さらに磁性酸化鉄粒子は、既に市販されているため、本発明ではこのような市販品、例えばフェリデックス（栄研化学株式会社製造、田辺製薬株式会社販売）を利用することもできる。
【００１７】
＜金微粒子の担持＞
金微粒子は金イオンまたは金錯体含有液に上記の磁性酸化鉄粒子を添加し、ガンマ線、電子線または超音波を照射することによって磁性酸化鉄粒子の表面に設けることができる。
金イオン含有液は金イオンを含む水溶液またはアルコール溶液で、その調製は金イオンを与える適当な化合物を水、含水アルコールもしくはアルコール（メタノール、エタノール、ｎ-プロパノール等）、または塩酸、硫酸、硝酸などの酸（アルコールなどの有機物を含んでいてもよい）に溶解させることにより行い得る。適当な化合物としては、金の硝酸塩、塩化物、酢酸塩、クエン酸塩などを挙げることができる。中でもＨＡｕＣｌ4が好ましい。
金錯体を含有する液体としては、上記金イオンに適当な配位子が配位した化合物の水溶液、含水アルコールもしくはアルコール溶液を挙げることができる。配位子は、非共有電子対もしくは負電荷を持っている限り特に限定されず、公知のものから制限なく選択することができる。具体的には、例えば単座配位子としての、ハロゲン化物イオン、シアン化物イオン、アンモニア、ピリジンなど；二座配位子としてのエチレンジアミン、アセチルアセトンイオンなど；六座配位子としてのエチレンジアミンテトラ酢酸イオンなどを挙げることができる。
金イオン含有液及び金錯体含有液中の金濃度は、１μＭ〜１Ｍ程度とすればよい。金イオン含有液及び金錯体含有液中への磁性酸化鉄粒子の添加量は、０．００１〜５０重量％程度とすればよい。
【００１８】
＜ガンマ線、電子線、または超音波照射＞
ガンマ線は一般的なガンマ線を使用できるが、コバルト６０によるガンマ線が好ましい。照射量と照射時間は通常３ｋＧｙ／ｈで３時間程度の照射とすればよい。
電子線は、一般的な電子線を使用できるが、直線加速器による電子線が好ましい。照射量と照射時間は電子線加速器による電子線（エネルギー１０ＭｅＶ）を、通常１ＭＧｙ／ｈで２０秒程度の照射とすればよい。
超音波は、一般的な超音波を使用できるが、２００ｋＨｚ程度の超音波が好ましい。照射量と照射時間は通常２００Ｗで３０分程度の照射とすればよい。
上記方法によって、本発明の複合粒子の製造に適した金酸化鉄粒子が得られる。
【００１９】
＜ポリアルキレングリコールの結合＞
本発明の複合粒子は、上記方法で得られた金酸化鉄粒子を含む溶液に、硫黄原子を有するポリアルキレングリコールを、金酸化鉄粒子に対して過剰量添加し、室温で１時間程度インキュベーションすることにより得られる。上記の溶液から金酸化鉄粒子を分離して、蒸留水などの溶液に懸濁させた状態で、硫黄原子を有するポリアルキレングリコールと反応させてもよい。インキュベーションの温度と時間は、１６〜２５℃程度で１時間程度が好ましい。上記範囲であれば反応が十分に進行し目的の複合粒子の収量も十分となる。
【００２０】
＜ポリアルキレングリコール＞
本発明の複合粒子の製造に使用するポリアルキレングリコールは分子の末端、または分子中に硫黄原子を有している。これは金酸化鉄粒子とポリアルキレングリコールとを結合するのに硫黄原子を利用するためである。硫黄原子は、例えばチオール基（−ＳＨ基）として含まれていればよい。ポリアルキレングリコール分子中に含まれる硫黄原子の部位や数は特に制限されない。硫黄原子は、ポリアルキレングリコール分子の末端又は内部に結合していればよい。中でも末端に結合していることが好ましい。ポリアルキレングリコール分子の内部に１個以上結合している場合は、ポリアルキレングリコール分子が折れ曲がって金酸化鉄粒子に結合するため、金酸化鉄粒子から伸びるポリアルキレングリコール鎖の本数が多くなる。
本発明に用いるポリアルキレングリコールは公知のポリアルキレングリコールを制限なく使用できる。公知のポリアルキレングリコールとしてはポリメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなどが挙げられるが、生体適合性が良い点でポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」ということもある）が好ましい。
ポリアルキレングリコールの分子量は通常、２０００〜３０万程度、好ましくは２０００〜２０万程度、より好ましくは５０００〜１５万程度とすればよい。上記範囲であれば血中滞留性が高く、かつ肝集積性が低い組織非特異的な造影剤が得られる。
かくして、磁性酸化鉄微粒子の表面に複数の金微粒子を備え、金微粒子に硫黄原子を介してポリアルキレングリコールが結合した本発明の複合粒子が得られる。
【００２１】
本発明の複合粒子
本発明の複合粒子においてＰＥＧは硫黄原子を介して（Ａｕ−Ｓ結合を介して）金微粒子と結合している。具体的には−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−などの結合様式が挙げられる。また硫黄に加えて硫黄以外の原子が介在する場合も本発明の範囲に含まれる。
本発明の複合粒子において、磁性酸化鉄粒子に担持される金微粒子の平均粒径は通常、１〜２０ｎｍ程度、好ましくは１〜１０ｎｍ程度、より好ましくは１〜５ｎｍ程度とすればよい。上記範囲であれば表面積を活用してＰＥＧを高い効率で結合させることができる。また上記範囲であれば金微粒子が磁性酸化鉄表面で安定に存在し、かつ複合粒子の良好な分散性を維持できる。
また、金酸化鉄粒子の一次粒子の平均粒径は、５〜２００ｎｍ程度が好ましく、３０〜１００ｎｍ程度がより好ましく、５０〜１００ｎｍ程度がさらにより好ましい。また、金酸化鉄粒子は凝集していることがあるが、二次粒子の平均粒子径は、１００〜１０００ｎｍ程度が好ましく、１００〜８００ｎｍ程度がより好ましく、１００〜５００ｎｍ程度がさらにより好ましい。ここでいう一次粒子とは磁性酸化鉄の表面に金微粒子が担持された粒子のことを意味し、二次粒子とは該一次粒子が複数個、凝集したものを意味する。上記範囲であれば、腫瘍組織内の血管壁を通過し易く、有効に腫瘍組織に集積させることができる。原料となる磁性酸化鉄粒子の大きさを調整することにより、金酸化鉄粒子の平均粒子径を上記範囲に調整することができる。金酸化鉄粒子の１次粒子径は動的光散乱法あるいは電子顕微鏡観察により測定した値であり、２次粒径は動的光散乱法の方法により測定した値である。
また、金酸化鉄粒子における金微粒子の担持量は、磁性酸化鉄粒子に対する金微粒子の重量比（金微粒子：磁性酸化鉄粒子）が、１〜１０：１程度であることが好ましく、１〜２：１程度であることがより好ましい。上記範囲であれば、十分にポリアルキレングリコールを担持でき、かつ、実用的な造影効果が得られる。
金イオン又は金錯体含有液中の金イオン又は金錯体の濃度や、これに添加する磁性酸化鉄微粒子の量を上記範囲で調整することにより、金微粒子の担持量をこの範囲に調整することができる。また、磁性酸化鉄粒子の表面は金で実質的に覆われていることが好ましく、これにより、ポリアルキレングルコールの結合量を多くすることができる。金酸化鉄粒子へのポリアルキレングリコールの担持量は、磁性酸化鉄粒子への金微粒子の担持量、及びポリアルキレングリコール分子中の硫黄原子の数と位置等により定まる。ポリアルキレングリコールの担持量が多いほど、血中滞留性が向上する。
＜本発明の複合粒子の用途＞
本発明の複合粒子は、製造されたままの分散液として各種用途に利用することができる。また、適当な溶液に懸濁させた状態、又は乾燥させた状態で製品にすることもできる。本発明の複合粒子は磁性を帯びているため、その磁性を利用して磁石などを用いて磁気分離することにより、別の溶液に懸濁させたり、溶液から分離することができる。また、本発明の複合粒子は、磁性を帯びていることにより外部磁場を利用して目的組織への誘導も可能である。
本発明の複合粒子はＭＲＩ造影剤の有効成分として好適に使用できる。この場合の製剤の形態は、従来のＭＲＩ造影剤と同様にすればよい。代表的には、生理食塩水のような溶液に本発明の複合粒子を懸濁させた製剤が挙げられる。溶液中の複合粒子の濃度は、例えば１〜５０重量％程度とすればよい。本発明の複合粒子にはポリアルキレングリコールが結合しているため、製剤は分散剤を含まないこともでき、安全性の高い製剤とすることができる。
実際にＭＲＩ造影剤として人体へ使用する場合には、従来のＭＲＩ造影剤の投与方法と同様に、そのまま、又はブドウ糖注射液などに用時混合して静脈注射できる塩濃度に調整した上で静脈注射や点滴などにより投与することができる。また投与量も市販鉄製ＭＲＩ用造影剤と同程度とすればよい。
本発明の複合粒子を利用したＭＲＩ造影剤はポリアルキレングリコールを担持することで組織非特異性を有し、造影部位を肝腫瘍に限定しないという特徴がある。
【実施例】
【００２２】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
（１）本発明複合粒子の調整のための磁性酸化鉄粒子の調整
磁性酸化鉄粒子として市販品（一般名：フェルモキシデス、分子式（Ｆｅ２Ｏ３）ｍ（ＦｅＯ）ｎ：但し０＜n/m＜１、商品名：フェリデックス（登録商標）、栄研化学株式会社製、田辺製薬株式会社販売）を利用した。フェリデックスの平均一次粒子径は１０ｎｍ、平均二次粒子径は８０ｎｍである。
【００２４】
（２）本発明複合粒子の調整のための金イオン含有液の調整
ＨＡｕＣｌ４を金イオンが０．５ｍＭ含まれるように純水に溶解させた。さらにこの溶液に対して、ポリビニルアルコール（平均分子量２２０００）を１０グラム/リットルの濃度になるように、また２−プロパノールを１０ミリリットル/リットルの濃度になるよう添加した。試薬はすべて和光純薬工業株式会社より購入した。
【００２５】
（３）本発明複合粒子の調整のための金酸化鉄粒子の調整
上記、磁性酸化鉄粒子５ mgと金イオン含有液（金イオン０．５ ｍＭ、５０ ｍｌ）を１００ｍｌ容ビーカーに混合し、直線加速器による電子線（エネルギー１０ＭｅＶ）を、線量率１ＭＧｙ／ｈで２０秒照射した。
上記方法により、磁性酸化鉄粒子の表面に金微粒子が担持され、本発明の複合粒子を調製するための金酸化鉄粒子が得られた。得られた金酸化鉄粒子に担持された金微粒子の平均粒径は６ｎｍで、金酸化鉄粒子の二次粒径は２５０ｎｍだった。また、金酸化鉄粒子における金微粒子の担持量は１：１（磁性酸化鉄：金微粒子）だった。
【００２６】
（４）本発明複合粒子の調整のためのポリアルキレングリコールの調整
市販のＰＥＧ−ＳＨ（日本油脂社製、商品名ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＳＨ Ｓｅｒｉｅｓ、分子量５０００）を利用した。
【００２７】
（５）本発明複合粒子の調製
上記の金酸化鉄粒子を遠心分離によって終濃度２０ mg/mlに精製または濃縮し、さらに１０ mM ＰＥＧ−ＳＨを４０μl加え、室温（２２℃）にて１時間インキュベートした。これにより金酸化鉄粒子の表面に硫黄原子を介してＰＥＧが結合した複合粒子が生成した。この溶液を遠心分離して複合粒子を沈殿させ、蒸留水に再懸濁した。この洗浄操作を３回繰り返すことにより精製した複合粒子を以下の実験に使用した。
【００２８】
（６）金酸化鉄粒子にＰＥＧが結合していることの証明実験
ポリビニルアルコール（以下、「ＰＶＡ」という）の存在下では、ＰＥＧがＰＶＡと水素結合することにより、ＰＶＡが架橋剤として働きＰＥＧが担持された金酸化鉄粒子は凝集および沈殿を起こす。この現象を利用して本発明の複合粒子にＰＥＧが実際に担持されていることを証明した。具体的には上記（５）にて作製した複合粒子に対して終濃度が０．２〜０．３（ｇ／ｍｌ）となるようにＰＶＡ溶液を添加した後に室温で３時間インキュベートし、粒子の凝集の有無を目視により確認した。
結果
結果を図１に示す。金酸化鉄粒子単独ではＰＶＡの添加による凝集が生じなかったのに対して、ＰＥＧ−ＳＨを結合させた複合粒子では、ＰＶＡとＰＥＧとの架橋によって粒子の沈殿が観察された。このことから、ＰＥＧ−ＳＨを用いることによって金磁性酸化鉄をＰＥＧで修飾可能であることが分かった。
【００２９】
（７）金酸化鉄粒子にＰＥＧが硫黄原子によって結合していることの証明実験
−Ｓ−結合によるＰＥＧの存在下で過剰量のシステインを添加し、室温で一時間程度インキュベートを行うと、システイン中の−ＳＨ基がＰＥＧの−Ｓ−結合と競合反応を起こしＰＥＧとシステインの置換が起こる。精製後、さらにＰＶＡを添加するとＰＥＧがシステインに置き換わった懸濁液では、前述のＰＥＧとＰＶＡの水素結合による凝集および沈殿が見られない。この現象を利用して金酸化鉄粒子にＰＥＧが硫黄原子によって結合していることを証明した。具体的には上記の（５）で作製した本発明の複合粒子に対して１０ mMのシステイン溶液を添加した後に、（６）で説明した上記ＰＶＡ定性反応を行った。
結果
結果を図２に示す。本発明の複合粒子では、ＰＶＡ依存的な粒子の凝集または沈殿が認められたのに対して、本発明の複合粒子と過剰量のシステインを混合した後に、ＰＶＡを添加した群では、粒子の凝集がまったく認められなかった。以上の結果は、ＰＥＧ−ＳＨが硫黄原子を介して粒子表面に結合していることを裏付けるものである。
【００３０】
（８）本発明の複合粒子のＭＲＩ造影剤としての適性実験
（５）で得られた本発明の複合粒子がＭＲＩ造影剤として有効に機能するためには、十分な水分子緩和時間の短縮能を有している必要がある。そこで、Ｆｅｒｉｄｅｘ、金酸化鉄粒子、および（５）で得られた本発明の複合粒子を種々の濃度で蒸留水に懸濁し、ＮＭＲ測定装置（Varian社製：Varian Unity INOVA 400WB high resolusion NMR spectrometer）を用いてＴ１、Ｔ２、Ｔ２*値を測定した。
結果
各粒子のＴ１、Ｔ２、Ｔ２*の測定結果を表１に示す。Ｈ−ＮＭＲのスペクトル解析の結果、（５）で得られた本発明の複合粒子は水分子の緩和時間（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ２*）を短縮する性質を有することが明らかとなった。この結果より、本発明の複合粒子がＭＲＩ造影剤としての性質を保持していることが示された。
【００３１】
【表１】
2008266214.tif 000003
※Ｔ１「ｓ」、Ｔ２「ｓ」、Ｔ２*「ｓ」…水の緩和時間の指標。これらの値が小さい方が水が緩和されている。
【００３２】
（９）本発明の複合粒子を用いた造影実験
（５）で得られた本発明の複合粒子を用いて実際に造影を行なった。Ｆｅｒｉｄｅｘ、金酸化鉄粒子、および本発明の複合粒子を１０ mg/マウスで尾静脈内より投与した後に、ＮＭＲ測定装置を用いてマウスの全身ＭＲＩ像を撮影することにより、本発明の複合粒子のＭＲＩ造影剤としての適性を評価した。具体的にはマウス（Ｂａｌｂ／ｃ，６週齢）の腹部皮膚組織下に腫瘍細胞（Ｍｅｔｈ−Ａ繊維芽肉腫）を移植して、腫瘍の長径が１５〜２０ｍｍ程度の担癌マウスを作成した。該担癌マウスに（５）で得られた本発明の複合粒子またはＦｅｒｉｄｅｘを１ｍｇ／１００μｌ（蒸留水）／マウスで尾静脈内より投与し、４〜７時間後に全身および腫瘍断面のＭＲＩ造影を実施した。
結果
撮影した結果を図３に示す。上段のFeridexを投与したマウスでは腹部に移植した腫瘍が白く写り造影されていないのに対して、下段の複合粒子を投与したマウスの腫瘍は黒く鮮明に造影されている。この結果より、本発明の複合粒子はがん組織への集積性を有し、かつ肝臓以外の臓器への適用が可能なＭＲＩ造影剤として十分、実用的に機能することが確認された。
【００３３】
（１０）本発明の複合粒子の腫瘍集積性評価実験
本発明の複合粒子が肝臓以外の組織の腫瘍細胞に集積していることを確認した。具体的にはマウス（Ｂａｌｂ／ｃ，６週齢）の腹部皮膚組織下に腫瘍細胞（Ｍｅｔｈ−Ａ繊維芽肉腫）を移植して、腫瘍の長径が１５〜２０ｍｍ程度の担癌マウスを作成した。該担癌マウスに（５）で得られた本発明の複合粒子を利用したＭＲＩ造影剤、および（３）で得られたＰＥＧ修飾を施していない金酸化鉄粒子を尾静脈注射（１ｍｇ／１００μｌ（蒸留水）／マウス）し、注射後２４時間経過した時点で腫瘍組織を回収、ベルリンブルー染色を行った。具体的には、回収した組織をリン酸緩衝生理食塩水で希釈した４%ホルマリンにて固定し（室温、２４時間）、さらに０．３（ｇ／ｍｌ）スクロース溶液に浸漬した。２４〜７２時間浸漬した組織から凍結組織切片（３ μm）を作成し、０．０１（ｇ／ｍｌ）フェロシアン化カリウム、０．０１（ｇ／ｍｌ）塩酸を含むベルリンブルー溶液にて３０分間反応させた。発色後の標本を顕微鏡下で観察することにより、青色に発色した酸化鉄粒子の局在を解析した。
結果
結果を図４に示す。ＰＥＧ修飾を施していない金酸化鉄粒子を投与した群では、腫瘍組織内に酸化鉄由来の青色のスポットが全く観察されなかった。それに対して本発明の複合粒子を投与したマウスの腫瘍組織内には酸化鉄粒子由来の青色の染色像が認められたことから、金酸化鉄粒子をＰＥＧ修飾することによってＭＲＩ造影剤の腫瘍組織集積性を向上できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の複合粒子を利用したＭＲＩ造影剤は、肝腫瘍に限定されず組織非特異的に使用が可能であるため、より汎用性の広いＭＲＩによる画像診断を可能としている。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】金酸化鉄粒子および金酸化鉄粒子にＰＥＧを担持させた複合粒子の懸濁液にＰＶＡを添加したものを示す図である。
【図２】システイン処理した複合粒子とシステイン処理をしていない複合粒子の懸濁液にＰＶＡを添加した図である。
【図３】フェリデックスを投与したマウスと、本発明の複合粒子からなるＭＲＩ造影剤を投与したマウスのＭＲＩ造影画像である。
【図４】マウスの腫瘍組織をベルリンブルー染色したものを示す図である。
【図１】
2008266214.tif 000004
【図２】
2008266214.tif 000005
【図３】
2008266214.tif 000006
【図４】
2008266214.tif 000007