(57)【要約】【課題】本発明は、細胞中にポリヌクレオチドを導入する新規の方法を提供する。【解決手段】上記課題は、標的細胞中にポリヌクレオチドを導入する方法であって、光生成タンパク質コード配列を使用する核酸配列を使用する方法を提供することによって、解決された。本発明の方法の重要な利点は、薬物耐性標的細胞または有用な栄養素要求性マーカーを有さない標的細胞が、有効に形質転換され得ることである。本発明はまた、本明細書中に記載される方法により生成される形質転換細胞を包含する。また、光生成タンパク質コード配列の改変、種々のベクター、および本発明の形質転換細胞を使用する方法が、記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中にポリヌクレオチドを導入する方法であって、該方法は、
細胞の集団を提供する工程；
ポリヌクレオチドを用いて、該細胞の少なくとも部分集団による該ポリヌクレオチドの取り込みを促進する条件下で、該細胞の集団を処理する工程であって、該ポリヌクレオチドは、光生成タンパク質コード配列を含む、工程；
該細胞の集団を、光を生成する細胞についてスクリーニングする工程；および
光を生成する細胞を単離する工程であって、該光を生成する能力がある細胞は、該ポリヌクレオチドが導入された細胞である、工程；
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、選択マーカーの必要性なくして外因性核酸で形質転換された任意の標的細胞または生物を検出するために有用な組成物および方法に関する。これらの組成物および方法は、任意の形質転換可能な細胞タイプ中へのＤＮＡの導入、および薬物またはその他の化合物の高スループットスクリーニングのための、このような細胞の次の使用を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
外因性ＤＮＡで首尾良く形質転換された細胞を迅速かつ効率的に同定するアッセイは、例えば、細胞株および／またはトランスジェニック生物を同定すること、および高スループット薬物スクリーニングを行うことを含む、広範な種類の適用で有用である。実際、外因性ＤＮＡの挿入が一度だけ確認されると、薬物発見、生化学的経路の解明、毒性研究などの動物モデルとしてその細胞株またはトランスジェニック生物が用いられ得る。
【０００３】
外因性核酸が標的細胞中に導入されたか否かを決定するために最も普通に用いられる方法は、導入されたＤＮＡにより相補される栄養欠損によるか、または薬物耐性によるかのいずれかの選択による。栄養要求性変異体の相補には、レシピエント細胞は、その遺伝子機能において欠損していなければならない。薬物耐性には、細胞はその薬物に対して感受性でなければならない。不運なことには、多くの細胞（例えば、病原体）は、薬物選択技法に耐性である。例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓは、ヒグロマシイン、ベノミル、シクロヘキシイミド、マイトマイシンＣおよびツニカマイシンに対する耐性を示す。同様に、その他の病原体生物（例えば、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、およびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのいくつかの改変体）は、これらの慣用的に用いられる抗生物質の多くに対する耐性を発現する。従って、これらの細胞を形質転換し、そして成功した組み込み事象を検出することは非常に困難であることが証明されている。
【０００４】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）のメチシリン耐性株は、世界で最も一般的な院内感染体である。ＭＲＳＡは、大きな合衆国の大学附属病院における病院で生まれる４０％を超えるスタフィロコッカス感染の原因である。それらは、より小さな病院（２００〜５００ベッドをもつ病院で２０％の発生率）で、そして養護施設（非特許文献１）で蔓延するようになった。ＭＲＳＡ株の通常でない性質は、さらなる耐性因子を釣り上げ、化学療法的に有用な抗生物質に対するこれらの株の感受性をほとんどなくするか、またはなくするそれらの能力である。このような細菌の多剤耐性株は、今や世界的に蔓延し、そしてこれらの最悪の病原体は、１つ（バンコマシイン）を除くすべての使用可能な抗細菌剤に対する耐性を保持している（Ｂｌｕｍｂｅｒｇら、１９９１、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓｅａｓｅ（６３：１２７９−１２８５））。
【０００５】
別の院内感染体であるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍは、バンコマイシン耐性のようなプラスミドが担う耐性因子を、１つの細胞から別の細胞に移入するその能力について知られている。耐性因子の移入のためのこのような機構は、細菌をますます公知の抗生物質に対して耐性に導く。高レベルのバンコマイシン耐性Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ株は、１９８６年に英国で最初に単離された。１９９０年代には、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）は、全世界にわたり拡散していると報告された。高濃度のアンピシリンまたはゲンタマイシン、またはバンコマイシンに耐性である多剤耐性株の同定は、重篤な治療的ジレンマを導入する。さらに、抗生物質に対する感受性がないことは、特に、大部分の細
菌形質転換ベクターが抗生物質耐性選択に依存しているという事実を考慮すれば、これらの生物を操作する能力を多いに妨害する。抗生物質耐性の基礎および耐性株の出現のより完全な説明は、文献中に見出され得る（例えば、米国特許第６，１３６，５８７号、Ｔｏｍａｓｚら、２０００年１０月２４日；Ｏｈｎｏ，Ａ．ら、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ（２００１）５９（４）：６７３−６８０）。
【０００６】
特定の生物における効率的なスクリーニング系の欠如は、候補薬物をスクリーニングする努力を深刻に損傷し得る。免疫寛容患者の増加する数に一部起因して、薬物耐性生物での感染、および通常良性の生物での全身的真菌感染が生じており、例えば、多くのこのような感染は、通常のヒト菌叢Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓに起因する。Ｃａｎｄｉｄａ種は、今や、院内血流感染の第４の最も一般的な原因である（Ｅｄｍｏｎｄら、（１９９９）Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２９（２）：２３９−４４）。重篤なＣａｎｄｉｄａ感染にかかる人々の数の増加と釣り合って、抗真菌化合物に耐性である株の発生率の増加がある（Ｗｈｉｔｅ、Ｍａｒｒら（１９９８）Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ１１（２）：３８２−４０２）。これを妨げるために、新たなクラスの抗真菌化合物およびそれらの可能な標的が調査されなければならない。
【０００７】
遺伝子的アプローチを用いる、抗真菌攻撃を受けやすい新たな標的のＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓにおける研究は、いくつかの因子により妨げられている。第１に、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓで用いられるプラスミドは、通常、細胞中にタンデムコピーとして存在し、そして選択圧なくして急速に失われる（Ｃａｎｎｏｎら（１９９２）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．２３５（２−３）：４５３−４５７；Ｋｕｒｔｚら（１９８７）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７（１）：２０９−１７；Ｐｌａら（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６５（１）：１１５−２０）。さらに、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとは異なり、クローン化されたセントロメア配列または自己複製配列はなく、これは、任意の選択なくしてエピソーム性プラスミドを操作することを可能にし得る。
【０００８】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの研究および有効な治療の生成を妨げている別の因子は、この生物が、その生活環を通じて二倍体であると考えられていたからである。ほんの最近、このＣａｎｄｉｄａが強制的に接合され得ることが示され（Ｍａｇｅｅ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９（５４７７）；３１０−３１３；Ｈｕｌｌら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２８９（５４７７）：３０７−３１０）、おそらくは四倍体状態になっている。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの接合型対立遺伝子に類似の遺伝子エレメントの存在は、減数分裂が一倍体細胞を誘導し得ることを示唆する。しかし、このような一倍体単離体はまだ観察されていない。従って、新たな抗真菌標的を研究するために、候補遺伝子の両方の染色体コピーを不活性化し、細胞に対するその影響を観察しなければならない。両方のコピーをノックアウトするために、「ｕｒａ  ｂｌａｓｔｅｒ」と呼ばれる構築物が開発された（Ａｌａｎｉ（１９８７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１７（１）：５−１２；Ｆｏｎｚｉら（１９９３）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３４（３）：７１７−２８）。細胞は、ＵＲＡ３について栄養要求性とされなければならず、そして、通常、毒性を有意に低減するか、または全くなくした臨床分離体から栄養要求性株を創出する（Ｌａｙら（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６６（１１）：５３０１−６；Ｋｉｒｓｃｈら（１９９１）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．５９（９）：３２９７−３００；Ｐｏｌａｋ（１９９２）Ｍｙｃｏｓｅｓ  ３５（１−２）：９−１６；Ｃｏｌｅら（１９９５）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１２６（２）：１７７−８０）。毒性株においてさえ、ＵＲＡ３機能の回復は、毒性を野生型のレベルまで必ずしも回復させ得ないことを研究は示している（Ｌａｙら（１９９８）、前述）。
【０００９】
第３の論点は、その異常なコドン使用法に起因して、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ中で発現された異種遺伝子はほとんどないことである（ロイシンの代わりにセリンをコードするＣＴ
Ｇ）（Ｌｅｕｋｅｒ（１９９４）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．２４５（２）：２１２−７）。異種遺伝子がＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ中で機能的に発現されるために、遺伝子中のすべてのＣＴＧコドンは、他のロイシンコドンに変異されなければならない（Ｍｏｒｓｃｈｈａｕｓｅｒら（１９９８）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．２５７（４）：４１２−２０）。従って、これらの困難性およびその他の困難性が、Ｃａｎｄｉｄａ遺伝子の研究を、ＵＲＡ３または別の栄養マーカーがノックアウトされた株に制限している。多くのレポーター遺伝子は、発現のためにそれらを変異誘発する必要の努力に起因して用いられていない。
【００１０】
米国特許第５，６５０，１３５号に記載される方法は、動物を解剖またはそうでなければ切開することなくして生存動物中の生物発光細菌の検出を可能にする（「インビボモニタリング」）−光は、高感度カメラを用いて、筋肉、皮膚、毛皮およびその他の伝統的に「不透明な」組織を通じて検出される。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ中で発現されたが（Ｃｏｒｍａｃｋ、Ｂｅｒｔｒａｍら、（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３（Ｐｔ２）：３０３−１１：Ｍｏｒｓｃｈｈａｕｓｅｒ、Ｍｉｃｈｅｌら（１９９８）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２５７（４）：４１２−２０）、ＧＦＰ産生Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞は、生存動物内でまだ造影されていない。Ｓｒｉｋａｎｔｈａら（（１９９６）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８（１）：１２１−９）は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ中で海パンジーＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼの発現を報告したが、基質であるコエレントラジンのコストが、生存動物における使用について、それを実施不能にしている。
【００１１】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに加え、多くの他の病原体生物が、大部分またはすべての抗生物質に耐性となり、それ故、薬物耐性遺伝子を含むＤＮＡを導入する工程、および形質転換のためにこのＤＮＡにより付与される薬物耐性について選択する工程の古典的方法によるこれら成分の形質転換を、不可能ではないにしても困難にしている。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。 
【非特許文献１】Ｗｅｎｚｅｌら、１９９２、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．９１（補遺３Ｂ）：２２１−２２７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、標的細胞の形質転換を検出する方法、特に、選択マーカーを含まない方法に対する必要性が残っている。本発明は、とりわけ、このような方法、発現カセット、トランスポゾンカセット、および光生成生物、例えば、インビトロおよび動物全体中で感染および／または病原体に関する研究に適切である病原体生物（ＭＲＳＡ、抗生物質耐性細菌、およびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓなど）を生成するために有用なツールを提供する。
従って、本発明は、以下を提供する： 
（項目１）    細胞中にポリヌクレオチドを導入する方法であって、該方法は、
細胞の集団を提供する工程；
ポリヌクレオチドを用いて、該細胞の少なくとも部分集団による該ポリヌクレオチドの取り込みを促進する条件下で、該細胞の集団を処理する工程であって、該ポリヌクレオチドは、光生成タンパク質コード配列を含む、工程；
該細胞の集団を、光を生成する細胞についてスクリーニングする工程；および
光を生成する細胞を単離する工程であって、該光を生成する能力がある細胞は、該ポリヌクレオチドが導入された細胞である、工程；
を包含する、方法。
（項目２）    項目１に記載の方法であって、前記光生成タンパク質が、生物発光タンパク質または蛍光タンパク質である、方法。
（項目３）    項目２に記載の方法であって、前記生物発光タンパク質が、ルシフェラーゼである、方法。
（項目４）    項目１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、前記細胞の集団が、原核生物細胞の集団である、方法。
（項目５）    項目４に記載の方法であって、前記原核生物細胞が、抗生物質耐性細菌である、方法。
（項目６）    項目４に記載の方法であって、前記原核生物細胞が、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌である、方法。
（項目７）    項目６に記載の方法であって、前記原核生物細胞が、グラム陽性細菌である、方法。
（項目８）    項目７に記載の方法であって、前記グラム陽性細菌が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種である、方法。
（項目９）    項目１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、前記細胞の集団が、真核生物細胞の集団である、方法。
（項目１０）    項目９に記載の方法であって、前記細胞の集団が、酵母である、方法。
（項目１１）    項目１０に記載の方法であって、前記酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓである、方法。
（項目１２）    項目９に記載の方法であって、前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、方法。
（項目１３）    項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、前記ポリヌクレオチドが、光生成タンパク質をコードする、プロモーターのないポリヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目１４）    項目１３に記載の方法であって、前記ポリヌクレオチドが、組み込みベクターを含む、方法。
（項目１５）    項目１３に記載の方法であって、前記ポリヌクレオチドが、転移性遺伝因子または可動性遺伝因子を含み、該転移性遺伝因子または可動性遺伝因子は、前記光生成タンパク質
コード配列を含む、方法。
（項目１６）    項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、前記ポリヌクレオチドが、前記光生成タンパク質コード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、方法。
（項目１７）    項目１６に記載の方法であって、前記ポリヌクレオチドが、組み込みベクターを含む、方法。
（項目１８）    項目１６に記載の方法であって、前記ポリヌクレオチドが、転移性遺伝因子または可動性遺伝因子を含み、該転移性遺伝因子または可動性遺伝因子は、前記光生成タンパク質コード配列に作動可能に連結された前記プロモーターを含む、方法。
（項目１９）    項目１６に記載の方法であって、前記ポリヌクレオチドが、環状プラスミドを含む、方法。
（項目２０）    項目１９に記載の方法であって、前記プラスミドが、前記細胞において機能性である複製起点をさらに含む、方法。
（項目２１）    項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法であって、前記ポリヌクレオチドが、第１の目的コード配列をさらに含む、方法。
（項目２２）    項目２１に記載の方法であって、前記第１の目的コード配列が、前記細胞において機能性であるプロモーターに作動可能に連結されている、方法。
（項目２３）    項目１〜２２のいずれか１項に記載の方法であって、前記スクリーニング工程が、固体培地プレート上で行われ、
そして前記単離する工程が、
該固体培地プレートのうちの、光を生成する細胞を含む領域から細胞サンプルを採集する工程、
該サンプルを液体培養中に接種する工程、
該細胞を液体培養中で増殖させる工程、
各液体培養物のアリコートを光生成について評価する工程、
光を生成する細胞を含む液体培養物を同定する工程、
液体培養物を希釈およびプレーティングして、光を生成する単離された個々の細胞を得る工程、ならびに
光を生成する個々の細胞に由来するシングルコロニーを同定する工程、
を包含する、方法。
（項目２４）    細胞の集団において形質転換細胞についてスクリーニングする方法であって、該方法は、
細胞の集団を提供する工程であって、該細胞は、光を生成する能力がない、工程；
ポリヌクレオチドを用いて、該細胞の少なくとも部分集団による該ポリヌクレオチドの取り込みを促進する条件下で、該細胞の集団を処理する工程であって、該ポリヌクレオチドは、光生成タンパク質コード配列を含む、工程；および
該処理した細胞の集団を、光を生成する細胞についてスクリーニングする工程であって、該光を生成する細胞は、形質転換された細胞である、工程；
を包含する、方法。
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、目的のポリヌクレオチドを細胞中に導入する方法に関し、ここで、選択マーカーは用いられず、むしろ、光生成のスクリーニングを用い、目的のポリヌクレオチドを含む細胞を同定する。本発明はまた、本発明の方法により生成された細胞、およびそのような細胞の使用に関する。本発明の１つの実施形態では、細胞は、本発明の方法により形質転換される、抗生物質耐性細菌（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性株、およびバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）株）である。
【００１４】
本発明の１つの局面は、ポリヌクレオチドを細胞中に導入する方法、すなわち、標的細胞を形質転換する方法である。この方法では、細胞の集団が提供される。細胞のこの集団は、目的のポリヌクレオチドで、少なくとも細胞の部分集団によるこのポリヌクレオチドの取り込みを促進する条件下で処理される。目的のポリヌクレオチドは、光生成タンパク質コード配列を含む。好適な実施形態では、この光生成タンパク質コード配列は、生物発光タンパク質、例えば、ルシフェラーゼをコードする。ポリヌクレオチドを標的細胞中に
導入するための多くの方法が採用され得、限定されないで以下を含む：脂質媒介移入（例えば、中性およびカチオン性脂質を含むリポソームを用いる）、直接注入（例えば、マイクロインジェクション）、細胞融合、微粒子銃（例えば、ＤＮＡ粒子ボンバードのような微粒子銃法）、共沈殿（例えば、リン酸カルシウム、または酢酸リチウムを用いる）、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移入またはポリエチレングリコール媒介移入、およびウイルスベクター媒介移入。次いで、細胞の集団は、目的のポリヌクレオチドを取り込んだ細胞の部分集団についてスクリーニングされる。これらの細胞は、目的のポリヌクレオチドを含み、光生成タンパク質コード配列を発現するそれらの能力により識別される。光生成細胞が単離される。これらの光生成細胞は、上記ポリヌクレオチドがその中に導入された細胞、すなわち、形質転換された細胞である。このような光生成細胞は、次いで、例えば、シングルコロニーについて希釈または画線培養により単離されて、光生成細胞の実質的に純粋なコロニー（すなわちクローン）を提供する。
【００１５】
本発明の形質転換方法で用いられるポリヌクレオチドは、光生成タンパク質のコード配列を含む。このような光生成タンパク質は、例えば、生物発光または蛍光タンパク質であり得る。本発明の１つの実施形態では、この生物発光タンパク質はルシフェラーゼ（例えば、ｌｕｃまたはｌｕｘ配列によりコードされる）である。
【００１６】
任意の形質転換可能な細胞が本発明の実施に用いられ得る。代表的には、このような細胞は形質転換前に光を発しないが、細胞が既に所定の波長の光を生成する場合、そのときは、異なる、識別可能な波長の光を生成するタンパク質を生成する光生成タンパク質コード配列を用いて、このような細胞を形質転換する。本発明の方法で採用され得る細胞は、制限されないで、原核生物細胞（例えば、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、およびその他の原核生物）、および真核生物細胞（例えば、ＣａｎｄｉｄａまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのような酵母；植物細胞；動物細胞；腫瘍細胞；組織特異的細胞）を含む。昆虫細胞もまた、本発明の方法において用いられ得る。本発明の１つの局面では、細胞の集団は、抗生物質耐性細菌、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性株、およびバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）株を含む。標的細胞は、上記ポリヌクレオチドを用い、このポリヌクレオチドの取り込みを容易にする条件下での処理の後、細胞型、および細胞が光の生成についてスクリーニングされる培地の種類（例えば、液体または固体）に基づき、適切なスクリーニング密度でプレートに播かれる。
【００１７】
本発明の１つの実施形態では、細胞中に導入されるポリヌクレオチドは、光生成タンパク質をコードする、プロモーターのないポリヌクレオチド配列を含む。代表的には、このようなポリヌクレオチド配列は、標的生物のゲノム中に、例えば、標的生物のゲノム中内因性プロモーターに隣接して組み込まれた後に発現される。多くのベクターが、このようなポリヌクレオチドを含み得、制限されないで、組込みベクター、トランスポゾン（または、ＴＹまたはマリナーのようなその他の移動可能な遺伝子エレメント）を含む。
【００１８】
別の局面では、標的細胞中に導入されるポリヌクレオチドは、光生成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。多くのプロモーターが、このようなプロモーター含有ポリヌクレオチド配列を含み得、制限されないで、組込みベクター、トランスポゾン（または、ＴＹまたはマリナーのようなその他の移動可能な遺伝子エレメント）、複製プラスミド、非複製プラスミドなどを含む。プラスミドは、例えば、標的細胞の形質転換において用いられ得る十分な量のポリヌクレオチドを調製するために、ある細胞型における継代を可能にするシャトルベクター配列を含み得る。このような構築物中で用いられるプロモーターは、標的細胞中で機能的である。
【００１９】
光生成タンパク質コード配列を用いて、形質転換された細胞をスクリーニングし得、そしてそれ故、目的のその他の配列が、（例えば、同じベクター構築物中で）この光生成タ
ンパク質コード配列と会合し得る。この目的の他の配列は、光生成タンパク質を発現するめたに用いられる、同じセットの制御エレメントと会合し得るか、あるいは、目的のこのような配列の発現は、目的の配列（単数または複数）と会合する独立の制御エレメントにより媒介され得る。例えば、光生成タンパク質コード配列の発現は、第１のプロモーターにより媒介され得、そして目的のさらなる配列の発現は、少なくとも第２のプロモーターにより媒介され得る。
【００２０】
本発明の１つの局面では、酵母が、本明細書に記載の方法により形質転換される。酵母、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ細胞の形質転換は、光生成を増大する培地のプレートに播かれ得、例えば、細胞の形質転換された集団のスクリーニングは、細胞を、ＹＰＤプレートよりもむしろＳＤ上に播くことにより実施され得る（例えば、６００μｇ／ｍｌのルシフェリンを含み、５０μｇ／ｍｌウリジンを補充したＳＤ−ｕｒａプレート）。酵母細胞、およびその他の型の細胞は、初期スクリーニングのために種々の密度、例えば、約２．５×１０５細胞／１４０ｍｍプレートの密度で播かれ得る。本発明の１つの実施形態では、スクリーニングは、固体培地のプレート上で行われる。形質転換された細胞の単離は、多くの方法で実施され得、これには、固体培地プレートのうちの、光を生成する細胞を含む領域から細胞のサンプルを採集すること、このサンプルを液体培養中に接種すること、この細胞を液体培地中で増殖させること、光生成について各液体培養のアリコートを評価すること、光を生成する細胞を含む液体培養を同定すること、液体培養を希釈し、そしてプレートに播き。光を生成する単離された個々の細胞を得ること、および光を生成する個々の細胞に由来するシングルコロニーを同定することを包含する。
【００２１】
従って、本発明は、細胞の集団中の形質転換された細胞をスクリーニングする方法を提供し、ここで、この方法は、例えば、細胞の集団を提供する工程（ここで、この細胞は光を生成する能力がない）、この細胞の集団を、光生成タンパク質コード配列を含むポリヌクレオチドで形質転換する工程、および光を生成する細胞について細胞の形質転換された集団をスクリーニングする工程（ここで、光を生成する上記細胞は、形質転換された細胞である）を包含する。本発明はまた、本発明の方法により生成された形質転換された細胞およびその使用を含む。
【００２２】
本発明のこれらの実施形態およびその他の実施形態は、本明細書の開示を考慮すれば、当業者に容易に想定される。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他の様に示されない限り、当業者の範囲内にある、従来の化学技術、生化学技術、分子生物学技術、微生物学技術、細胞生物学技術、および組換えＤＮＡ技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ，ＰＡ（１９９５））；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ  ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５）ならびにＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）を参照のこと。
【００２４】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の処方物または処理パラメーターに限定されず、これらは、当然変動し得ることが、理解されるべきである。本明細書中で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を記載するためだけのものであり、限定するものであることは、意図されないこともまた、理解されるべきである。
【００２５】
（定義）
本発明を記載するにあたり、以下の用語が使用され、そして下記に示されるように定義されることが意図される。他の様に示されない限り、本明細書中に使用されるすべての用語は、本発明の当業者に対して有するのと同じ意味を有する。
【００２６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その文脈が明確に他のように示さない限り、複数形を包含する。従って、例えば、「抗原」に対する言及は、そのような抗原２つ以上の混合物を包含する。
【００２７】
用語「形質転換」、「形質転換法」および「細胞を形質転換する方法」とは、核酸分子（例えば、ベクター構築物）を標的細胞中に、その標的細胞が形質転換後にその核酸分子を含むように移入または導入することを指す。代表的には、形質転換法は、最終的にはその細胞の部分集団がその核酸分子を含む、細胞の集団に適用される。導入された核酸分子を含むその部分集団の細胞は、代表的には、例えば、選択（例えば、選択培地上で増殖する能力）またはスクリーニング（例えば、導入された核酸を含まない細胞に対して、導入された核酸を含む細胞の同定を可能にする表現型の発現）によって同定される。「形質転換体」は、形質転換により生成された、細胞（例えば、「形質転換細胞」）または生物である。細胞中への核酸分子のそのような導入は、「細胞形質転換」と区別するために「遺伝子形質転換」と呼ばれ得る。細胞形質転換とは、異なる種類のオンコジーンの制御下での事象の結果として代表的には生じる、正常細胞から新生物細胞または腫瘍細胞への転換を指す。特に他の様に示されない限り、用語「形質転換」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子形質転換（すなわち、標的細胞中への核酸分子の導入）を指す。
【００２８】
用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらのアナログのいずれか）を指すために互換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、そして既知または未知の、任意の機能を行い得る。ポリヌクレオチドの非限定的例としては、遺伝子、遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離された任意配列のＤＮＡ、単離された任意配列のＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが、挙げられる。
【００２９】
ポリヌクレオチドは、代表的には、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）（そのポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、チミン（Ｔ）に代わってウラシル（Ｕ））の特定の配列から構成される。従って、用語、ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示は、中央処理装置を備えるコンピューターにおいてデータベース中に入力され得、そしてバイオインフォマティクス適用（例えば、機能的ゲノミクスおよびホモロジー検索）のために使用され得る。
【００３０】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、宿主系において適切な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下に配置された場合に転写（ＤＮＡの場合）およびポリペプチドへと翻訳（ｍＲＮＡの場合）される、核酸分子である。そのコード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’末端（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード配列としては、ウイルスｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡもしくは真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、原核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列もしく
は真核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえ挙げられ得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、そのコード配列の３’側に位置し得る。
【００３１】
代表的な「制御エレメント」としては、転写調節因子（例えば、プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、およびポリアデニル化配列）；および翻訳調節因子（例えば、翻訳開始の最適化のために配列（例えば、シャイン−ダルガーノ（リボソーム結合部位））配列、および翻訳終結配列）が挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターは、誘導性プロモーター（そのプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、抑制可能プロモーター（そのプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などによって抑制される）および構成的プロモーターを包含し得る。
【００３２】
二本鎖ＤＮＡ分子は、「対向する方向」を有するＤＮＡの二本鎖を包含し、その二本鎖のうちの一つの鎖は、５’から３’へと示される；第２の鎖は、その相補体である。従って、第１鎖中の第１コード配列および相補鎖中の第２コード配列は、互いに対して「対向する」方向を有する。すなわち、その第１コード配列および第２コード配列は、互いに対して対向する方向にある。
【００３３】
「単離されたポリヌクレオチド」分子は、その分子が天然で見出される生物全体から分離し別個である、核酸分子である。そのような単離されたポリヌクレオチドは、天然にその分子と通常は結合している配列を、すべてまたは一部欠き得る。
【００３４】
「ポリペプチド」は、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、または他のペプチド模倣物の化合物を指すために、最も広い意味で使用される。そのサブユニットは、ペプチド結合または他の結合（例えば、エステル結合、エーテル結合など）により連結され得る。本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」とは、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸もしくは合成アミノ酸（グリシン、およびＤ光学異性体もしくはＬ光学異性体を含む）およびアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を指す。
【００３５】
「作動可能に連結された」とは、そのように記載される成分が、その有用な機能を行うように構成されている、エレメントの配置を指す。従って、コード配列（例えば、レポーター遺伝子）に作動可能に連結されている所定のプロモーターは、その適切な酵素が存在する場合に、そのコード配列の発現をもたらす能力を有する。そのプロモーターまたは他の制御エレメントは、それらがそのコード配列の発現を指示するように機能する限り、そのコード配列と連続している必要はない。例えば、翻訳されないが転写される介在配列が、そのプロモーター配列とそのコード配列との間に存在し得、そしてそのプロモーター配列は、そのコード配列となお「作動可能に連結されている」と見なされ得る。
【００３６】
本明細書中で使用される「組換えポリヌクレオチド」は、分子生物学技術（例えば、クローニング、ＰＣＲ増幅、プラスミド単離、発現系の使用など）を使用して得られる、核酸分子を記載する。用語「組換え体」とは、タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、組換えポリヌクレオチドの発現により生成されるポリペプチドを意味する。
【００３７】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、および原核微生物または単細胞実態として培養される真核細胞株を示すそのような他の用語は、互換可能に使用され、そして組換えベクターまたは他の移入ＤＮＡのレシピエントとして使用され得るかもしくは使用された、細胞を指し、そして形質転換されたもとの細胞の子孫を包含する。単一の親細胞の子孫が、偶発的変異または意図的変異に起因して、形態またはゲノムＤＮＡ相補体もしくは全ＤＮＡ相補対が、もとの親と必ずしも完全には同一で
はないかもしれないことが、理解される。適切な特性（例えば、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親と十分に類似する親細胞の子孫が、この定義により意図される子孫に含められ、そして上記の用語により包含される。
【００３８】
核酸およびアミノ酸の「配列同一性」を決定するための技術はまた、当該分野で公知である。代表的には、このような技術としては、遺伝子についてのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定することおよび／またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第２のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較することが挙げられる。一般に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれ、ヌクレオチド間またはアミノ酸間の正確な対応をいう。２以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）が、それらの「同一性％」を決定することにより比較され得る。２つの配列の同一性％は、核酸配列またはアミノ酸配列に拘わらず、２つの整列させた配列間の正確なマッチを、より短い配列の長さで除して、１００をかけた数である。核酸配列についての適切な整列は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編，５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡにより開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により正規化されたスコアリングマトリクスを使用することによってアミノ酸配列に適用され得る。配列の同一性％を決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティーアプリケーションにおけるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により提供される。この方法のデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  ＰｒｏＧｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）において記載される。本発明の状況において同一性％を確立する好ましい方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有し、Ｊｏｈｎ  Ｆ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｎｅ
Ｓ．  Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により配布されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この統合ソフトウェアから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムは、デフォルトパラメーターがスコアリング表のために使用される場合（例えば、１２のギャップオープンペナルティー、１のギャップ伸長ペナルティー、および６のギャップ）に使用され得る。「マッチ」値から生成されたデータから、「配列同一性」を反映させる。配列間の同一性％または類似性％を計算するための他の適切なプログラムは、一般に、当該分野で公知であり、例えば、別のアルゴリズムプログラムは、ＢＬＡＳＴであり、デフォルトパラメーターとともに使用される。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーター：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０配列；ソート＝ハイスコア；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを用いて使用され得る。これらプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴにて見出され得る。
【００３９】
「遺伝子」とは、特定の生成物（例えば、ポリペプチド、タンパク質またはＲＮＡ）をコードし得る少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドをいう。代表的には、用語「遺伝子」は、その生成物の発現に関連する制御配列を含む。用
語「遺伝子座」とは、ゲノムまたは生物中の遺伝子の物理的位置をいう。本明細書中に記載される任意のポリヌクレオチド配列は、関連する遺伝子のより大きなフラグメントまたは全長コード配列を同定するために使用され得る。より大きなフラグメント配列を単離する方法は、当業者に公知である。
【００４０】
２つの核酸分子の間の配列関連性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および長さに影響を及ぼす。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列が標的分子にハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと））を使用して評価され得る。このようなアッセイは、種々の程度の選択性を使用して（例えば、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーまで変化する条件を使用して）行われ得る。低ストリンジェンシーの条件が使用される場合、非特異的結合がないことが、部分的な配列同一性の程度すら欠く第２のプローブ（例えば、標的分子との配列同一性が約３０％より低いプローブ）を使用して評価され得る。その結果、非特異的結合事象がない場合、第２のプローブは、その標的にハイブリダイズしない。
【００４１】
ハイブリダイゼーションベースの検出系を利用する場合、標的核酸配列に相補的な核酸プローブが選択され、次いで、プローブおよび標的配列が互いに「選択的にハイブリダイズする」または結合して、ハイブリッド分子を形成する適切な条件が選択される。「中程度にストリンジェントな」条件下で標的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％を超える配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ／標的のハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、プローブおよび標的が配列同一性の特定の程度を有する場合に、当該分野で公知のように決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，編者Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００４２】
ハイブリダイゼーションについてのストリンジェンシー条件に関して、多くの等価な条件が、例えば、以下の因子：プローブおよび標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング薬剤（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、およびポリエチレングリコール）の存在または非存在、ハイブリダイゼーション反応温度および時間のパラメーター、ならびに種々の洗浄条件、を変化させることにより特定のストリンジェンシーを確立するために使用され得ることが当該分野で周知である。ハイブリダイゼーション条件の特定のセットの選択は、当該分野で標準的な方法により選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
【００４３】
連続した核酸の規定された配列を含む核酸は、対応するポリペプチドまたはＲＮＡ生成物を「コードする」。例えば、オープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列は、その配列がオープンリーディングフレームに対応するポリペプチドをコードする。別の例としては、ＤＮＡ配列は、対応するｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｍＲＮＡの配列をコードし得る
。
【００４４】
「精製（された（る））ポリヌクレオチド」とは、そのポリヌクレオチドが天然に関連するタンパク質の約５０％未満、好ましくは、約７０％未満、より好ましくは、約９０％未満が実質的にない（すなわち含まない）目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをいう。目的のポリヌクレオチドを精製するための技術は、当該分野で周知であり、これらの技術としては、例えば、ポリヌクレオチドを含む細胞の、カオトロピック薬剤を用いた破壊、ならびにイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度に従う沈降によるポリヌクレオチドとタンパク質の分離が挙げられる。
【００４５】
「ベクター」は、標的細胞に遺伝子配列を移入し得る（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子状キャリア、およびリポソーム）。代表的には、「ベクター構築物」とは、標的細胞に目的の配列を移入し得る核酸ベクターをいう。核酸ベクターは、標的細胞中で一過性に存在するかまたは複製し得る。一過性ベクターは、代表的には、標的細胞中で機能し得る複製起点も、標的細胞中の特定の条件下で機能しない複製起点（「条件的」複製起点）も有さない。
【００４６】
「核酸発現ベクター」とは、目的の配列または遺伝子の発現を方向付け得るアセンブリをいう。この核酸発現ベクターは、目的の配列または遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。他の制御因子もまた存在し得る。例えば、発現カセットの成分に加えて、プラスミド構築物はまた、１以上の細菌性複製起点、１以上の選択マーカー、一本鎖ＤＮＡ（例えば、Ｍ１３複製起点）としてプラスミド構築物が存在するシグナル、マルチクローニング部位、および「哺乳動物」の複製起点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの複製起点）を含み得る。
【００４７】
「発現カセット」は、細胞中で発現され得るポリヌクレオチド遺伝子または配列を含む任意の核酸構築物を含む。発現カセットは、目的のポリヌクレオチド遺伝子または配列に加えて、さらなる転写因子、翻訳因子または他の調節因子もしくは制御因子を含み得る。このようなカセットは、代表的には、標的細胞に発現カセットを移入するために、「ベクター」、「ベクター構築物」または「発現ベクター」（すなわち、「核酸発現ベクター」）へと構築される。
【００４８】
「トランスポゾン」は、本明細書中で使用される場合、１つの遺伝子座から別の遺伝子座へ（例えば、ある染色体の地点から別の染色体の地点へ、またはあるエピソームの地点からある染色体の地点へ）移動可能な反復因子（すなわち、トランスポゾン）を含むポリヌクレオチドを規定し、これは、可動性遺伝因子である。本発明の好ましい実施形態において、「トランスポゾンカセット」は、転移に必要な最小限のユニット（例えば、第１および第２のトランスポゾン逆方向反復（これは、上記のトランスポゾン逆方向反復により媒介される転移を誘導し得る少なくとも１つのトランスポザーゼを含む内部ポリヌクレオチド配列に隣接する））を含む。あるいは、トランスポゾンカセットは、第１および第２のトランスポゾン逆方向反復配列（これは、内部ポリヌクレオチド配列に隣接する）であり得る。ここで、このトランスポザーゼの機能は、トランスにて提供されるか、またはトランスポゾンカセットに対して外部（すなわち、内部ポリヌクレオチド配列に隣接する２つのトランスポゾン逆方向反復の外側）でコードされる。本明細書中で使用される場合、トランスポゾンカセットは、内部領域に隣接する、少なくとも２つの逆方向反復配列を含む。この内部領域は、トランスポザーゼコード配列および／または目的の他の配列を含み得る。トランスポゾンカセットの模式的代表例は、以下のとおりである：ＩＲ−逆方向内部領域−ＩＲ（ここで、ＩＲ反復は、逆方向反復を示す）。別の実施形態において、代表例は、以下のとおりである：ＩＲ−ｔｎｐ−ＩＲ（ここで、ｔｎｐは、トランスポザーゼ遺伝子を示す）。さらに、ＩＲ−目的の配列−ｔｎｐ−ＩＲは、ＩＲ配列により媒介され
る転移を誘導し得るなお別の実施形態を示す。示される場合、さらなる配列である、逆方向反復の５’および３’が、トランスポゾンカセットに含まれ得る。宿主生物にて「機能的」なトランスポゾンカセットは、その生物において転移を経験し得るトランスポゾンカセットである。用語「転移体（ｔｒａｎｓｐｏｓａｎｔ）」とは、代表的には、トランスポゾンが細胞のゲノムへ組み込まれた細胞をいう。
【００４９】
「光生成タンパク質（ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「発光タンパク質（ｌｉｇｈｔ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、代表的には、２００ｎｍ〜１１００ｎｍ、好ましくは、可視スペクトル（すなわち、約４００ｎｍ〜７５０ｎｍ）の範囲において発光し得る生物発光タンパク質または蛍光タンパク質である。生物発光タンパク質は、（代表的には、基質、エネルギー供給源および酸素を必要とする）化学反応を介して発光する。蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）は、放射線の吸収および再放射を介して発光する。生物発光タンパク質の例としては、別段述べられなければ、以下の「ルシフェラーゼ」が挙げられるが、これらに限定されない。このルシフェラーゼとしては、原核生物ルシフェラーゼ（例えば、細菌性ｌｕｘがコードする）および真核生物ルシフェラーゼ（例えば、ホタルのｌｕｃがコードする、またはＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼ）、ならびに変化したまたは改変した至適特性を有する改変体（例えば、異なる色の光を発するルシフェラーゼ（例えば、Ｋａｊｉｙａｍａ，Ｎ．，およびＮａｋａｎｏ，Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４（６）：６９１−６９３（１９９１））；ならびに例えば、「「発光タンパク質（ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）」、カルシウム活性化発光タンパク質（例えば、Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｊ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３６６（６７）：７６０−７６８（２０００））が挙げられる。蛍光タンパク質の例としては、緑色、黄色、シアン、青色、および赤色の蛍光タンパク質（例えば、Ｈａｄｊａｎｔｏｎａｋｉｓ，Ａ．Ｋ．ら，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１５（１）：４９−５８（２００１））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
「光生成タンパク質基質」または「発光タンパク質基質」は、エネルギー的に減衰した基質（例えば、ルシフェリン）および代表的には、エネルギー供給源（例えば、ＡＴＰまたはＦＭＮＨ２、および酸素）の添加による光子（ｐｈｏｔｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇｈｔ）を生成する光生成タンパク質の基質（例えば、ルシフェラーゼ酵素）を記載する。このような基質の例としては、細菌性ｌｕｘ系におけるデカナール、ホタルルシフェラーゼ（ｌｕｃ）系における４，５−ジヒドロ−２−（６−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾリル）−４−チアゾールカルボン酸（または単にルシフェリンといわれる）、生物発光真菌Ｐａｎｅｌｌｕｓ  ｓｔｉｐｔｉｃｕｓ系における「パナール（ｐａｎａｌ）」（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４４：１５９７−１６０２，１９８８）およびミミズ（ｅａｒｔｈ  ｗｏｒｍ）Ｄｉｐｌｏｃａｒｄｉａ  ｌｏｎｇａ系におけるＮ−イソ−バレリル−３−アミノプロパノール（Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５：１００１−１００４，１９７６）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に記載されるように、いくつかの系において、アルデヒドが、光生成タンパク質の基質として使用され得る。
【００５１】
他に記載されない限り、本明細書中において「光」とは、約２００ｎｍ（例えば、ＵＶ−Ｃに対して）と約１１００ｎｍ（例えば、赤外に対して）との間の波長を有する電磁放射として規定される。可視光の波長は、約４００ｎｍと約７５０ｎｍとの間（すなわち、約４，０００Åと７，５００Åとの間）に分布している。
【００５２】
「動物」とは、代表的には、非ヒト動物をいい、限定することなしに以下が挙げられる：家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）；家畜化された哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）；クロアシイタチ、ノウサギおよびウサギ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミおよびモルモット）を含む実験動物；チンパン
ジーを含む非ヒト霊長類。用語「動物」としてはまた、限定することなしに以下が挙げられる：家畜化された鳥、野鳥および狩猟鳥（例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他のキジ類の鳥、アヒル、ガチョウなど）、ならびに両生類、魚類、昆虫類、爬虫類など。この用語は、特定の年齢を意味しない。従って、成熟個体、胚性個体、胎仔性個体、および新生仔個体が、包含されるように意図される。
【００５３】
「トランスジェニック動物」とは、遺伝的に操作された動物または遺伝的に操作された動物の子孫をいう。トランスジェニック動物は、通常、例えば、ウイルス、微生物、植物または他の動物由来の少なくとも１つの無関連な生物由来の物質を含む。用語「キメラ動物」とは、異種遺伝子が、見出されるか、または異種遺伝子が、動物の全ての細胞ではなく一部の細胞において発現される、動物について言及するために使用される。
【００５４】
用語「選択マーカー」とは、本明細書中において使用される場合、選択マーカーコード配列で形質転換された生物に非形質転換生物と比較して培地上での増殖の有利性を与えるコード配列についていう。選択マーカーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）機能的遺伝子（例えば、相補性ｕｒａ３変異体に対するＵＲＡ３遺伝子の使用のような栄養要求性変異の相補性）による変異遺伝子の相補性（このような変異体は、ウリジンまたはウラシルの非存在下で増殖することができない）、（ｉｉ）優性な選択可能な表現型を提供するコード配列（例えば、薬物耐性リボソームタンパク質をコードする配列）の細胞への導入、および（ｉｉｉ）培地へ添加される薬物への耐性を付与するコード配列（例えば、アンピシリンを含む培地において細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖を可能にするβ−ラクタマーゼ遺伝子）の細胞への導入。選択マーカーは、非増殖関連アッセイ（例えば、光を生成する能力）によってスコアリングされねばならない表現型を付与するマーカーを含まない。本明細書中において使用される場合、コロニーは、光を生成するそれらの能力について「スクリーニング」される。
【００５５】
「分析物（ａｎａｌｙｔｅ）」とは、本明細書中において使用される場合、任意の化合物または物質をいい、分析物の効果（例えば、特定のプロモーターの誘導または後退）は、本発明の試験動物および方法を用いて評価され得る。このような分析物としては、化学物質、薬学的化合物、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチドアナログが挙げられるが、これらに限定されない。多数の機関（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、製薬会社および化学会社）は、天然プロセスもしくは合成プロセス、または発酵のブロスもしくは抽出物由来の化学物質または生物学的化合物の大きなライブラリーを有する。このような化合物／分析物は、本発明の実施において使用され得る。
【００５６】
（発明を実施する様式）
本発明を詳細に説明する前に、本発明が、特定の処方物またはプロセスパラメーターに限定されず、これらが、当然、変動し得ることは、理解されるべきである。本明細書中において使用される用語法が、本発明の特定の実施形態を説明する目的のみに対してであり、限定することを意図しないこともまた理解されるべきである。
【００５７】
本明細書中において記載される方法および物質と類似または等価な多数の方法および物質は、本発明の実施において使用され得るが、好ましい物質および方法は、本明細書中において記載される。
【００５８】
（発明の一般的な概要）
本発明の組成物および方法は、生物または選択された細胞に光生成特性を付与する能力を容易にする。さらに、本発明の組成物および方法は、このような標的細胞または生物の形質転換体を同定するためのスクリーニング可能マーカーとして光生成タンパク質コード
配列を使用して、標的細胞または生物中に目的の任意のポリヌクレオチドの導入を可能にする。目的のポリヌクレオチドを用いる細胞の形質転換に対するスクリーンとして、光生成タンパク質を使用する能力は、例えば、細胞または生物を形質転換するのが困難な場合において、選択マーカーについての必要性を排除する。光生成タンパク質コード配列は、任意の目的の異種遺伝子と作動可能に連結され得、従って光生成は、目的の異種遺伝子を用いた細胞の成功した形質転換についてのレポーターとして役立ち得る。
【００５９】
本発明の１つの局面は、細胞中にポリヌクレオチドを導入する方法、すなわち、標的細胞を形質転換する方法を包含する。この方法において細胞の集団が提供される。細胞の集団は、細胞の少なくとも１つの部分集団によってポリヌクレオチドの取り込みを容易にする条件下で、目的のポリヌクレオチドで処理される。目的のポリヌクレオチドは、光生成コード配列を含む。１つの実施形態において、光生成タンパク質コード配列は、生物発光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする。標的細胞中へポリヌクレオチドを導入するための多数の方法が、使用され得、それらの方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：脂質媒介移入（例えば、中性脂質およびカチオン性脂質を含むリポソームの使用）、直接注入（例えば、微量注入）、細胞融合、微粒子ボンバードメント（例えば、ＤＮＡ粒子ボンバードメントのような微粒子銃法）、共沈（例えば、リン酸カルシウムまたは酢酸リチウムの使用）、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移入またはポリエチレングリコール媒介移入、およびウイルス性ベクター媒介移入。次いで、細胞の集団は、目的のポリヌクレオチドを取り込んだ細胞の部分集団についてスクリーニングされる。これらの細胞は、目的のポリヌクレオチドを含む光生成タンパク質コード配列を発現する細胞の能力によって同定される。光生成細胞は、単離される。これらの光生成細胞は、ポリヌクレオチドが導入された細胞、すなわち、形質転換細胞である。次いで、このような光生成細胞は、単離されて、例えば、シングルコロニーに対する希釈またはストリーキングによって、光生成細胞の実質的に純粋なコロニー（すなわち、クローン）を提供する。
【００６０】
さらに、このような光生成タンパク質コード配列を有する生物は、例えば、種々の感染のモデルをインビボでモニタリングすることを伴うか、または例えば、食品産業において感染および／もしくは病原性の追跡に使用され得る。特に、任意の利用可能な選択方法に耐性である生物に対してこのような光生成特性を付与することは、望ましい。例えば、特定の遍在する病原体（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのいくつかの種）は、抗生物質または他の一般の選択マーカーに対して耐性である。他の生物、操作が困難であり、そして薬学的介入についてこれまでに受け入れられていない生物（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、および他の生物）に対して光生成特性を付与することも、望ましい。
【００６１】
本発明は、プラスミドおよび発現カセット（例えば、改変ルシフェラーゼオペロンおよびトランスポゾンカセット（Ｔｎ４００１、Ｔｎ９１７などを含む））の使用を教示して、目的の生物の遺伝的操作を容易にする。目的の生物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：グラム陰性細菌（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉなどを含む）、グラム陽性細菌（ＣｈｌａｍｙｄｉａおよびＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍのような関連生物を含む）および真核生物（例えば、酵母（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓなどを含む））。
【００６２】
１つの局面において、本発明は、ルシフェラーゼ遺伝子を含む構築物に関する。特に、本発明は、真核生物ルシフェラーゼ（例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼ）を再操作することを含む。これらのルシフェラーゼオペロンの再操作は、例えば、コドン使用頻度を変更（例えば、最適化）する部位特異的変異誘発を含む。選択された光生成タンパク質コード配列をコードする核酸は、本発明の教示を考慮して当該
分野において公知の方法によって、標的生物における発現について最適化され得る。
【００６３】
例示の目的で、ほとんどの真核生物においてＣＴＧは、アミノ酸ロイシンをコードするが、ＣａｎｄｉｄａにおいてＣＴＧは、アミノ酸セリンをコードすることが公知である。異種遺伝子をＣａｎｄｉｄａにおいて発現させるためには、真核生物ルシフェラーゼにおけるＣＴＧコドンが、ロイシンコード配列（例えば、ＴＴＧ）に変異されなければならないようである。従って、再操作されたルシフェラーゼオペロンは、以下のルシフェラーゼコード配列に作動可能に連結された１つ以上を含むベクター中に挿入され得る：（１）標的細胞において活性または高度に転写されるプロモーター（例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓエノラーゼ（ＥＮＯ１）プロモーター）；（２）ポリアデニル化シグナル（例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓアクチン（ＡＣＴ１）ポリアデニル化シグナル）；および（３）目的の異種遺伝子。特定の実施形態において、プロモーターおよび／またはポリアデニル化シグナルは、ルシフェラーゼオペロンに隣接している。
【００６４】
別の局面において、本発明は、トランスポゾンを使用してこれらの生物のゲノムにカセットを組込むことによって、目的の生物体を光生成表現型に形質転換するための、プロモーターのないルシフェラーゼカセットの使用に関し、ここで、この組込みは、標的生物内の内生プロモーターの近傍で起こる。例えば、プロモーターのないルシフェラーゼ（例えば、ｌｕｘ）カセットをＴｎ４００１トランスポゾンに挿入し、次いで、目的の細胞を、Ｔｎ４００１ルシフェラーゼ構築物を有するシャトルベクターで形質転換した。形質転換に続く転位事象は、宿主生物のゲノムへのルシフェラーゼカセットの組込みを生じ、この生物に光を生成する能力を生じた；そうでなければ、活性なプロモーター配列の後へのプロモーターのないカセットの組込みによって、光生成表現型を有する宿主生物をもたらした。このアプローチを使用して、グラム陽性細菌のいくつかの異なる属は、構成的または誘導的のいずれかで、明らかな光生成性になった。
【００６５】
本明細書に記載される構築物（例えば、改変されたルシフェラーゼプラスミドおよびトランスポゾン構築物）を、適切な骨格（例えば、シャトルベクター）に挿入し得、それによって、宿主細胞ゲノムにおける活性なプロモーター領域の後への、目的のコード配列（例えば、光生成タンパク質コードカセット）の組込みに基づいて、（光生成タンパク質の場合にはまた、細胞または動物に光を生成する能力を付与する）目的のコード配列の産物を産出する能力が付与される。１つの局面において、本明細書中に記載される構築物は、光生成生物（例えば、グラム陽性細菌）の産生および動物モデルにおけるこれら生物の使用を可能にする。
【００６６】
多くの型の光生成タンパク質配列は、本発明の実施において有用であり、代表的には、標的生物での発現に対して最適化される。
【００６７】
従って、選択マーカーを必要とせずに、標的細胞への核酸（例えば、目的の異種遺伝子）の導入についてスクリーニングする方法が、本明細書中で提供される。この方法は、カンジダ属または耐性細菌のような病原性株において、特に有用であり、ここで、入手可能な選択マーカーは存在しない。標的宿主細胞を、本明細書中で記載される構築物で形質転換し、続く核酸の組込みの機会を提供する。得られた光生成表現型は、トランスポゾンカセットが後に存在するプロモーター領域の特徴に依存して、構成性で、誘導性でまたは抑制性であり得、従って、この得られた光生成表現型は、好結果の形質転換を検出するために使用され得る。
【００６８】
次いで、そのような形質転換された細胞を使用して、例えば、インビトロおよび動物モデルにおいて、候補エフェクター分子をスクリーニングし得る。感染によって誘導されるプロモーターの活性に起因し得る、光生成を示す細胞（またはコロニー）を使用して、有
効な薬学的薬剤を同定し得る。例えば、光生成を示す細胞を使用して、実験動物およびコントロール動物を感染する。次いで、実験動物を目的の薬学的薬剤で処置する。実験動物およびコントロールの両方を、光生成についてモニターし、有効な薬剤を、例えば、光を生成する能力を消す薬剤として同定する。
【００６９】
本発明の利点としては、（ｉ）グラム陽性細菌、抗生物質耐性生物、およびカンジダ属などを含む、種々の生物を形質転換すること；（ｉｉ）これらの形質転換された生物における高レベルの光生成タンパク質の発現を得、ここで、例えば、インビトロおよびインビボの両方で、生成された光をより敏感に検出することを可能にすること；（ｉｉｉ）このカセットを宿主染色体に組込むことであって、その結果、光生成タンパク質をコードする配列が、宿主細胞プロモーターに作動可能に連結されるようになり、この光生成タンパク質は、例えば、病理に関連するプロモーターの同定を可能にすること；および、生理学的温度（例えば、３７℃〜４２℃）での、そのような生物体からの、安定な光生成、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明の方法および構築物の特定の局面は、以下に議論される。
【００７１】
（１．光生成タンパク質）
本発明の実施によって、代表的に、光生成タンパク質をコードするヌクレオチド配列が使用される。本明細書中に記載される光生成レポータータンパク質を使用する場合、発現を、以前に記載され（例えば、Ｃｏｎｔａｇ，Ｐ．Ｒ．ら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：２４５−７；Ｃｏｎｔａｇ，Ｃ．Ｈ．ら、（１９９７）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ
Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．６６：５２３−３１；Ｃｏｎｔａｇ，Ｃ．Ｈ．ら、（１９９５）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：５９３−６０３を参照のこと）かつ本明細書に記載されるように、正確にかつ非侵襲的に評価し得る。
【００７２】
本発明の１つの局面において、光生成タンパク質は、ルシフェラーゼである。生物発光は、生物感染の研究に対する強力なレポーター系を提供する（例えば、米国特許第５，６５０，１３５号）。ルシフェラーゼは、基質（例えば、ルシフェリン、長鎖アルデヒドまたはコレントラジン）、エネルギー源（例えば、ＡＴＰまたはＦＭＮＨ２）および酸素を提供された場合、光を生成する性質を有する多様な酵素のファミリーのメンバーに適用される用語である。ルシフェラーゼは、広くは、（ｌｕｃ遺伝子によってコードされる）真核生物ルシフェラーゼおよび（ｌｕｘ遺伝子によってコードされる）原核生物ルシフェラーゼに分類され得る。真核生物ルシフェラーゼ（「ｌｕｃ」）は、代表的には、単一の遺伝子によってコードされる（例えば、ｄｅ  Ｗｅｔ，Ｊ．Ｒ．ら、（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：７８７０−７８７３；ｄｅ  Ｗｅｔ，Ｊ．Ｒら、（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７を参照のこと）。
【００７３】
細菌性ルシフェラーゼ（「ｌｕｘ」）は、代表的には、ｌｕｘオペロン上の２つの異なる遺伝子（ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ）によってコードされる２つのサブユニット（αおよびβ）からなる。オペロン上の３つの他の遺伝子（ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥ）は、アルデヒド基質の生合成に必要な酵素をコードする。細菌性ｌｕｘは、特定の生物発光性グラム陰性細菌（例えば、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）に存在し、野生型オペロンは、ＣＤＡＢＥで配列される。
【００７４】
さらに、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ株Ｙ−１から単離された別の細菌性遺伝子（ｌｕｘＹ）は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をコードする（ルシフェラーゼ酵素が作用する場合、λｍａｘが５４５ｎｍの黄色光を放出する基質）。Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｔ．Ｏ．ら、（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２９：５５０９−５５１５を参照のこと。
【００７５】
本発明の別の局面において、光生成タンパク質は、蛍光タンパク質（例えば、青色、シアン色、緑色、黄色、および赤色蛍光タンパク質）である。
【００７６】
いくつかの光生成タンパク質コード配列は、市販されている（以下が挙げられるがこれらに限定されない）。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）は、ルシフェラーゼのコード配列および、青色、シアン色、緑色、黄色、および赤色蛍光タンパク質を含む、種々の蛍光タンパク質を提供する。強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）改変体は、哺乳動物系で良好に発現され、野生型ＧＦＰより明るい蛍光を示す傾向がある。強化蛍光タンパク質としては、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化シアン色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、および強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）が挙げられる。さらに、Ｃｌｏｎｔｅｃｈは、迅速な回転速度を特色にする不安定化強化蛍光タンパク質（ｄＥＦＰ）改変体を提供する。ｄＥＦＰ改変体のより短い半減期によって、反応速度論研究においておよび定量的なレポーターとして、強化蛍光タンパク質が有用になる。ＤｓＲｅｄコード配列は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｉｎｆｏ／ｖｅｃｔｏｒｓ／ｖｅｃｔｏｒｓＤ／ｔｅｘｔ／ｐＤｓＲｅｄ．ｔｘｔ）。ＤｓＲｅｄは、発現の研究において有用な赤色蛍光タンパク質である。さらに、Ｆｒａｄｋｏｖ，Ａ．Ｆ．らは、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｃｏｒａｌ由来の新規蛍光タンパク質および特有の赤外蛍光を有するその変異体記載した（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４７９（３），１２７−１３０（２０００））（ｍＲＮＡ配列，ＧＥＮＢＡＮＫ  受託番号第ＡＦ２７２７１１，タンパク質配列，ＧＥＮＢＡＮＫ  受託番号第ＡＡＧ１６２２４）。プロメガ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）はまた、ホタルルシフェラーゼのコード配列を（例えば、ｐＧＬ３ベクターに含まれる形態で）提供する。さらに、多くの蛍光タンパク質のコード配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（例えば、受託番号ＡＹ０１５９９５，ＡＦ３２２２２１，ＡＦ０８０４３１，ＡＦ２９２５６０，ＡＦ２９２５５９，ＡＦ２９２５５８，ＡＦ２９２５５７，ＡＦ１３９６４５，Ｕ４７２９８，Ｕ４７２９７，ＡＹ０１５９８８，ＡＹ０１５９９４，およびＡＦ２９２５５６）から入手可能である。
【００７７】
さらに、さらなる光生成系が、例えば、細胞内での発現を評価する場合に使用され得る。そのような系としては、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００７８】
（１Ａ．Ｌｕｘコードカセット）
本発明の１つの局面において、ｌｕｘ構造遺伝子産物および基質コードｌｕｘ遺伝子産物の両方をコードするポリヌクレオチドを含む、遺伝子カセットが提供される。本発明に支持されて実行される実験によって、（例えば、野生型ＣＡＢＤＥからＡＢＣＤＥへの）ｌｕｘ遺伝子の再配置および発現が所望される標的生物に基づいて選択された、転写制御配列および／または翻訳制御配列の、１つ以上のｌｕｘ遺伝子の前への挿入によって、光を生成する能力が強化されたルシフェラーゼが与えられる。例えば、グラム陽性細菌の形質転換で使用される場合、グラム陽性シャイン−ダルガーノ配列が、コード配列の上流に挿入される。他の生物の形質転換で使用される場合、適切な転写強化配列および／または翻訳強化配列（例えば、真核生物細胞におけるＫｏｚａｋ配列、グラム陰性生物に対するグラム陰性シャイン−ダルガーノ配列）が使用され得る。いくつかの生物、例えば真核生物において、各ｌｕｘ遺伝子は、別々のプロモーターの転写制御下に置かれ得る。このｌｕｘ  ＡＢＣＤＥカセットは、ルシフェラーゼだけでなく、ｌｕｘルシフェラーゼの基質（アルデヒド）の合成に必要な生合成酵素もまた発現する。従って、酸素は、そのようなカセットが使用される場合に、生物発光に関して唯一の外的条件である。
【００７９】
本発明の別の局面において、ｌｕｘＹは、光生成タンパク質コード配列を含むカセット
に加えられ得る。例えば、ｌｕｘＹ遺伝子をｌｕｘ  ＡＢＣＤＥ遺伝子カセットに加えることによって、生物発光の間発光される光の波長領域の、可視光スペクトルの赤色端への広幅化が生じる。従って、より長波長の光が、より短波長の光に比べて生物組織をより容易に貫通する場合、本発明のｌｕｘ  ＡＢＣＤＥ遺伝子カセットの、選択される実施形態は、レポーターの手段として生物発光を使用する適用の感度を増加する手段として、ｌｕｘＹコード配列をさらに含む。
【００８０】
１つの局面において、ｌｕｘＡＢ遺伝子カセットが、提供される。グラム陽性生物の形質転換に使用される場合、ｌｕｘＡＢカセットは、代表的には、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢをコードする各ポリヌクレオチドの上流に作動可能に連結される（「シャイン−ダルガーノ」配列としても参照される）グラム陽性リボソーム結合部位を含む。他の生物の形質転換で使用される場合、適切な転写強化配列および／または翻訳強化配列（例えば、プロモーター配列、真核生物細胞におけるＫｏｚａｋ配列、グラム陰性生物に対するグラム陰性シャイン−ダルガーノ配列）が使用され得る。ｌｕｘＡＢカセットを保持する宿主生物は、外性アルデヒド基質が提供される場合、生物発光を示す。ｌｕｘＡＢカセットは、特に、ＳｔａｐｈｏｌｏｃｏｃｃｕｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのようなグラム陽性細菌で発現される場合、以前に知られている構築物で見られるより高いレベルのルシフェラーゼ活性を与える。
【００８１】
ｌｕｘをコードする配列のコード配列は、標的生物での発現に対して最適化され得る。例えば、ｌｕｘ遺伝子のポリペプチド生成物の配列が提供される場合、ポリペプチドをコードするための適切なコドンが選択され得、ここで、そのようなコドンは、標的生物において好ましいコドン使用頻度に基づいて選択される。
【００８２】
改変されたｌｕｘコード配列はまた記載されている（例えば、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって２００１年３月１５日に公表された、ＷＯ  ０１／１８１９５）。
【００８３】
代替的な実施形態において、２つ以上の波長で発光を生成する、２つ以上の光生成ポリペプチドを産出する配列は、別々のトランスポゾンカセットにおける第１の目的配列として提供され得；このトランスポゾンカセットはまた、単一のベクター骨格または複数のベクター骨格のいずれかで提供され得る。そのような構築物は、例えば、本発明の複数のトランスポゾンカセットを有する単一の微生物を産生するために使用され得、ここで、このトランスポゾンカセットは、異なる波長の光を放出する、各光生成ポリペプチドをコードし得る。
【００８４】
（１Ｂ．Ｌｕｃコードカセット）
本発明はまた、標的細胞中での真核生物ルシフェラーゼの発現を可能にする遺伝子カセットを包含する。上記のように、種々の真核生物ルシフェラーゼが同定されており、そして市販されており、例えば、プラスミドｐＧＬ２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）は、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼを含む。
【００８５】
種々のルシフェラーゼコード遺伝子が同定されており、これらとしては以下が挙げられるが以下には限定されない：Ｂ．Ａ．ＳｈｅｒｆおよびＫ．Ｖ．Ｗｏｏｄ，米国特許第５，６７０，３５６号（１９９７年９月２３日発行）；Ｋａｚａｍｉ，Ｊ．ら，米国特許第５，６０４，１２３号（１９９７年２月１８日発行）；Ｓ．Ｚｅｎｎｏら，米国特許第５，６１８，７２２号；Ｋ．Ｖ．Ｗｏｏｄ，米国特許第５，６５０，２８９号（１９９７年７月２２日発行）；Ｋ．Ｖ．Ｗｏｏｄ，米国特許第５，６４１，６４１号（１９９７年６月２４日発行）；Ｎ．ＫａｊｉｙａｍａおよびＥ．Ｎａｋａｎｏ，米国特許第５，２２９，２８５号（１９９３年７月２０日発行）；Ｍ．Ｊ．ＣｏｒｍｉｅｒおよびＷ．Ｗ．Ｌｏ
ｒｅｎｚ，米国特許第５，２９２，６５８号（１９９４年３月８日発行）；Ｍ．Ｊ．ＣｏｒｍｉｅｒおよびＷ．Ｗ．Ｌｏｒｅｎｚ，米国特許第５，４１８，１５５号（１９９５年５月２３日発行）；ｄｅ  Ｗｅｔ，Ｊ．Ｒ．ら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７，１９８７；Ｔａｔｓｕｍｉ，Ｈ．Ｎ．ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１３１：１６１−１６５，１９９２；ならびにＷｏｏｄ，Ｋ．Ｖ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７００−７０２，１９８９。別の群の生物発光タンパク質としては、エクオリンファミリーの光生成タンパク質（Ｐｒａｓｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：１３２６−１３３２（１９８７））が挙げられる。ルシフェラーゼ、ならびにエクオリン様分子は、エネルギー源（例えば、ＡＴＰ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈなど）および基質（例えば、ルシフェリンまたはコエレントリジン（ｃｏｅｌｅｎｔｒｉｚｉｎｅ）および酸素）を必要とする。
【００８６】
野生型ホタルルシフェラーゼは、代表的に、約５５０ｍｎに最大発光を有する。別個の最大発光を有する多数の改変体もまた研究されている。例えば、ＫａｊｉｙａｍａおよびＮａｋａｎｏ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（６）：６９１−６９３，１９９１；米国特許第５．３３０，９０６号（１９９４年７月１９日発行））は、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａルシフェラーゼコード配列への１アミノ酸変化によって作製された、５つの改変体ホタルルシフェラーゼを教示する。これらの改変体は、５５８ｎｍ、５９５ｎｍ、６０７ｎｍ、６０９ｎｍおよび６１２ｎｍの発光ピークを有する。約５４０ｎｍの発光ピークを有する黄緑色ルシフェラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩからｐＧＬ３の名称で市販されている。約６１０ｎｍの発光ピークを有する赤色ルシフェラーゼは、例えば、Ｃｏｎｔａｇら（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２４５−２４７およびＫａｊｉｙａｍａら（１９９１）Ｐｏｒｔ．Ｅｎｇ．４：６９１−６９３に記載されている。Ｒｅｎｉｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ由来のルシフェラーゼのコード配列もまた記載されている（ｍＲＮＡ、ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＹ０１５９８８、タンパク質登録番号ＡＡＧ５４０９４）。
【００８７】
本明細書中に記載される構築物および方法では、真核生物ルシフェラーゼは、好ましくは、コドン使用頻度が、標的細胞においてより頻繁に使用されるコドンを反映するように改変される。コドンの改変は、例えば、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂにおいてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／にて利用可能なＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅを利用することによって達成され得る。例えば、Ｃａｎｄｉｄａでは、コドンＣＴＧはセリン残基として発現され、一方、多くの他の真核生物（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓを含む）では、ＣＴＧはロイシン残基として発現される。従って、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓにおけるＣＴＧコドンは、ＴＴＧ（またはＣａｎｄｉｄａにおいてロイシンとして発現される任意の他のコドン）に改変されることが好ましい
ルシフェラーゼオペロンの好ましい部位特異的変異方法は、ＰＣＲを用いることによる。ＰＣＲに関する一般的手順は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ら，ＰＣＲ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１））に教示される。各適用反応に関するＰＣＲ条件は、経験的に決定され得る。多数のパラメーターが、反応の成功に影響を与える。これらのパラメーターの中には、アニーリング温度およびアニーリング時間、伸長時間、Ｍｇ２＋濃度およびＡＴＰ濃度、ｐＨ、ならびにプライマーと、テンプレートとデオキシリボヌクレオチドとの相対濃度がある。例示的なプライマー（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー）は、以下の実施例に記載される。増幅後、得られるフラグメントは、アガロースゲル電気泳動、続いて臭化エチジウムおよび紫外線照射を用いた可視化によって検出され得る。部位特異的変異誘発もまた、以下の実施例に記載され、そして図１は、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓの部位特異的変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチド対を示す。好ましくは、これらの変化は、得られるタンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない。
【００８８】
改変ルシフェラーゼを得るための別の方法は、アミノ酸をランダムに変更するためのランダム変異誘発、続いて効率的な発光を示すクローンについてのスクリーニングである。ランダム変異誘発は、例えば、標的ＤＮＡ配列をランダムに変更するためのオリゴヌクレオチドを作製することによって実施され得る。
【００８９】
（２．ベクター）
次いで、光生成タンパク質をコードする配列を用いて、標的細胞の形質転換において使用するためのベクターを構築し得る。いくつかのこのような構築物は、実施例に記載される。本発明において使用するためのベクターは一般に、２つの群（プロモーターのない構築物およびプロモーター含有構築物）に分けられ得る。
【００９０】
特定の実施形態では、この構築物は、プロモーターがない（例えば、以下に詳述するトランスポゾンシャトルベクター）。しかし、他の実施形態では、この構築物は、ルシフェラーゼ配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。好ましくは、そのプロモーターは、標的細胞中で活性がある。標的生物中で機能的なプロモーターは、その標的生物に関連した先行技術を調べることによって同定され得る（例えば、Ｃａｎｄｉｄａに関して以下に例示した通り）。同様に、さらなる転写制御エレメントおよび／または翻訳制御エレメントは好ましくは、その標的生物に由来する。
【００９１】
光生成タンパク質コード配列に結合した、プロモーターを含まない構築物は、その標的生物のゲノムへの組み込みが所望される場合、形質転換ベクターに有用である。この状況では、光生成タンパク質の発現およびその後の光生成は、内因性の活性なプロモーターに近接した光生成タンパク質コード配列の組み込みに依存する。このような、プロモーターのない光生成タンパク質コード配列を含むベクター構築物は、直鎖状または環状であり得る。これらとしては、特定のゲノム位置での標的組込みのための配列が挙げられ得、このような組み込みは、部位特異的組込み（例えば、環状ベクター中の相同配列との１つの交叉事象；または２つの交叉事象が生じてゲノムセグメントを本質的に置換する相同組換え）によって媒介され得る。あるいは、そのゲノムにランダムに組み込まれる、直鎖状または環状のポリヌクレオチドが、導入され得る。このような、プロモーターのない構築物は、以下に記載されるエレメントを含むがこれらに限定されない、さらなるエレメントを含み得る。
【００９２】
別の実施形態では、本発明は、光生成タンパク質コード配列が、選択されたプロモーターの転写制御下にあるベクター構築物（すなわち、プロモーター含有構築物）を用いる。プロモーターのない構築物について上記した通り、プロモーター含有構築物は、直鎖状または環状であり得、そしてこれらは、１以上の部位への組込みを指示するエレメントを含み得るか、またはこれらのベクターは、標的細胞に導入され、ランダム組込みが利用されて、形質転換体が獲得され得る。
【００９３】
従って、本明細書中に記載される光生成タンパク質コード配列は、以下のうちの１以上をさらに含む、プロモーターのないベクターまたはプロモーター含有ベクターへと導入され得る：（１）１以上のポリアデニル化シグナル、（２）１以上の組込み標的化配列、（３）１以上の複製起点、（４）１以上の転写終結エレメント、および（５）１以上の目的のコード配列。目的のコード配列は、代表的に、それら自体の転写制御エレメントおよび／または翻訳制御エレメントを含む。例えば、プロモーターのない光生成タンパク質構築物を用い、そしてその標的生物において機能的なプロモーターを目的のコード配列に作動可能に連結した場合、このベクターは、目的のコード配列に結合したこの転写制御エレメントからのこの光生成タンパク質コード配列の読み通し転写を防止するために、転写終結配列をさらに含み得る。別の例示的な実施形態では、例えば、グラム陽性細菌を形質転換する場合、プロモーターのない目的のコード配列は、プロモーターのない光生成タンパク
質コード配列とタンデムであり得、ここで、目的のコード配列は、本質的に、ポリシストロン性のメッセージを提供する配列を提供するために、作動可能に連結されたグラム陽性シャイン−ダルガーノ配列を含む。
【００９４】
本発明の１つの局面では、このプロモーターのない構築物は、転移性遺伝因子または可動性遺伝因子を含む。
【００９５】
（２Ａ．転移性遺伝因子または可動性遺伝因子）
１つの局面では、本発明の実施は、転移性遺伝因子または可動性遺伝因子の使用を用いる。特定の転移性因子または可動性因子は、その標的生物に基づいて選択される。例示的な標的生物および関連の転移性因子または可動性因子としては、以下が挙げられるが以下に限定されない：細菌（例えば、グラム陽性、グラム陰性）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔｙ因子，Ｂｏｅｋｅ，Ｇａｒｆｉｎｋｅｌら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４０（３）：４９１−５００）、植物（例えば、トウモロコシ）、および昆虫（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるｍａｒｉｎｅｒ）。本発明において使用するために、このトランスポゾンまたはこの可動性遺伝因子は、プロモーターのない光生成タンパク質構築物またはプロモーター含有光生成タンパク質構築物のいずれかを含むように改変される。このトランスポゾンまたはこの可動性遺伝因子は、他のエレメント（例えば、目的のさらなるポリヌクレオチド配列）をさらに含むように改変され得る。代表的に、このトランスポゾンまたはこの可動性遺伝因子に付加される全ての構成要素は、このトランスポゾンまたはこの可動性遺伝因子が再配置された場合に、これらの付加された構成要素が、このトランスポゾンまたはこの可動性遺伝因子と一緒に移動するように、機能的トランスポゾンまたは可動性遺伝因子の境界（例えば、逆方向反復）の間に含まれる。
【００９６】
本発明において使用するための１つの例示的なトランスポゾンは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓから元々単離されたクラスＩ複合型トランスポゾンである、Ｔｎ４００１である（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号Ｍ１８０８６、この配列の塩基対１〜１，３２４；Ｂｙｒｎｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ａ．，およびＳｋｕｒｒａｙ，Ｒ．Ａ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８１：３６１−３６７を参照のこと）。この因子は、グラム陽性生物の細菌染色体中に高度の無作為で挿入し得る。本発明を支持して実施される実験は、このトランスポゾンが、グラム陰性宿主細胞においても機能することを示す。
【００９７】
Ｔｎ４００１トランスポゾンの構成要素としては、以下が挙げられる：（１）逆方向配列（ＩＲ）の間の挿入配列を規定する逆方向反復として存在する、２つの同一コピーのＩＳ２５６挿入配列、および（２）この逆方向反復内に位置するトランスポザーゼ遺伝子（これは、挿入を規定する）。一般に、このトランスポゾンに言及する場合、これらの逆方向反復は、機能的トランスポゾン単位の境界であると考えられる。この基本的構造は、さらに改変されて、以下に考察するような種々のベクター骨格内に配置され得る。
【００９８】
例えば、目的のさらなる配列ならびに光生成タンパク質コード配列は、この逆方向反復の間に挿入され得る（例えば、５’−ＩＲ−光生成タンパク質コード配列−−目的の配列−ＩＲ  ３’）。１つの実施形態では、この目的のさらなる配列は、関連のプロモーター領域を欠く。この場合、転写増強配列が、各タンパク質コード配列の間に付加され得る（すなわち、ポリシストロン性メッセージを作製するために）。代替の実施形態では、この標的生物において機能的なプロモーターは、この目的の配列に作動的に連結される。
【００９９】
この光生成タンパク質コード配列を含む、プロモーターのない構築物を用いる場合、この光生成タンパク質コード配列および任意のさらなる目的の配列は、好ましくは、このＴｎ４００１トランスポゾン内に導入され、その結果、この挿入された配列についての転写
方向が、このトランスポザーゼコード配列の転写方向とは逆になり、それゆえ、トランスポザーゼプロモーターの影響下にはない。それゆえ、この配列は、この挿入配列が、活性なプロモーター領域または活性化可能なプロモーター領域の後ろに組み込まれなければ、そして組み込まれるまでは、転写されない。その結果として、このことは、この目的の配列およびこのトランスポザーゼについてのオープンリーディングフレームのコード配列は、このＤＮＡにおいて逆方向にあることを意味する。あるいは、このトランスポザーゼ配列は、この目的の配列と同じ方向で存在し得るが、ただし、このトランスポザーゼ配列は、この内因性トランスポザーゼプロモーターからの読み通しおよび組み込み前のこの光生成タンパク質遺伝子産物の発現を回避するために、目的の配列の下流に位置する。
【０１００】
プロモーターのない構築物が本発明の実施において使用される場合、光生成タンパク質配列は代表的に転移性因子内に含まれるプロモーターの非存在下で使用される。すなわち、プロモーター配列が、代表的に、光生成タンパク質の転写を媒介し得るトランスポゾン内に存在しない。好ましい実施形態において、光生成タンパク質配列は、５’逆方向反復配列（例えば、５’−ＩＲ−光生成配列−ＩＲ−３’）の３’末端に隣接してか、または非常に近接して挿入される。さらに、この配列は、トランスポゾン配列の向きとは反対の向きで挿入され、その結果、トランスポゾン配列の転写がされても、活性な宿主プロモーター領域に隣接する目的の生物のゲノム中への統合の前に、目的の配列（例えば、光生成ポリペプチドコード配列）の転写は存在しない。
【０１０１】
トランスポゾンカセットは代表的に、ベクターＤＮＡの操作を簡単にするために、そして多量に単離するために、シャトルベクター中にクローニングされる。このようなシャトルベクターの多くが一般的に利用可能である。例えば、ｐＡＵＬ−Ａ（Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙら、（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：５６８−５７４）；ｐＥ１９４（Ｓｏｚｈａｍａｎｎａｎ，ｓ．ら、（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：４５４３−４５４８；このベクターのマップについてはｈｔｔｐ：／／ｐｈａｓｅ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｖｅｃｔｏｒｓ／ｇｉｆｓ／６８３５９．ｇｉｆを参照のこと；完全な配列についてはｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｖｅｃｔｏｒ＿ｓｅｑｓ／ｐＥ１９４．ｈｔｍｌを参照のこと；ｐＭＫ４（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｍ．ら、（１９８４）Ｇｅｎｅ  ２９：２１−２６）、ｐＤＬ２８９（Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｎ．ら、（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７７：５０２８−５０３４）、ｐＳＫ＋ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）；およびｐＳＵＭシリーズミコバクテリアシャトルベクター（Ａｉｎｓａ，Ｊ．Ａ．ら、（１９９６）Ｇｅｎｅ  １７６：２３−２６）。類似のベクター骨格が、トランスポゾンまたは可動性遺伝因子が導入される宿主（すなわち、標的）細胞に基づく任意の所定のトランスポゾンまたは可動性遺伝因子について選択され得る。
【０１０２】
ＴＮ４００１について、このようなベクター骨格は、（１）グラム陰性の複製起点（例えば、温度感受性に条件付けされ得る）、（２）グラム陽性の複製起点（例えば、温度感受性に条件付けされ得る）、（３）ポリリンカー領域、および（４）転写終結領域を含み得る。
【０１０３】
実施例１は、本発明の例示的な転写性因子の構築を記載し、トランスポゾンはプロモーターのない光生成タンパク質コード配列を含む。実施例２は、多数の異なる細菌中にトランスポゾンを導入するのに有用な多数のベクターへの、トランスポゾンの導入を記載する。実施例３は、形質転換した生物発光コロニーを獲得するためのベクター／トランスポゾン構築物の１つの使用を記載する。本発明の方法によって形質転換された細胞は、光学的検出および手動の単離を用いて、固体培地上に高密度でプレートしたコロニーのうちから単離された。
【０１０４】
本発明の１つの局面において、ベクター骨格は、宿主生物のＤＮＡ中へのカセットの統合前に光生成ポリペプチドの発現を防ぐことを目的として、トランスポゾンまたは可動性遺伝因子の一方の側または両側に隣接して転写終結配列を含む。このような領域は当該分野で公知である。例えば、Ｈｅｎｋｉｎ，Ｔ．Ｍ．（１９９６）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ３０：３５−３７；ＭａｃＤｏｎａｌｄ  Ｌ．Ｅ．ら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３２：１０３０−１０３７；Ｊｅｎｇ，Ｓ．Ｔ．ら、（１９９７）Ｃａｎ  Ｊ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４３：１１４７−１１５６を参照のこと。
【０１０５】
好ましい実施形態（複製起点がグラム陰性生物およびグラム陽性生物の両方において機能する場合）においては、グラム陰性の複製起点の存在が、グラム陰性生物におけるベクターの複製を可能にし、それによって、挿入された配列の操作を容易にするが、グラム陽性宿主生物の制限エンドヌクレアーゼシステムを回避し、そして大量のベクター構築物ＤＮＡの単離を可能にする。この場合において、選択マーカーは、グラム陰性生物内における通過を容易にするためにベクター内に含まれ得、ここで、生じるＤＮＡが、グラム陽性生物の形質転換のために使用されるべきである。選択マーカーは、大量のＤＮＡを得るために、宿主生物にベクターが通過するように使用される。本発明のこの局面では、選択マーカーが、トランスポゾン転移体（ｔｒａｎｓｐｏｓａｎｔ）を同定するために使用されるのではなく、むしろ、光生成タンパク質配列の標的細胞における発現が、トランスポゾン挿入体を同定するために使用されるスクリーニングである。
【０１０６】
あるいは、グラム陽性生物およびグラム陰性生物の両方において機能する複製起点が、使用され得る（例えば、特定のストレプトミセス属プラスミド（例えば、ｐＣＫ１）に存在する複製起点）。
【０１０７】
トランスポゾンまたは可動性遺伝因子を有するベクターにおける複製起点は、連続的に活性であり得るか、またはｐＡＵＬ−Ａシャトルベクターにおいて見出されるように、その代わりに条件的（例えば、ｐＥ１９４由来の温度感受性起点）であり得る。本発明のベクター構築物において条件的な複製起点を含むことの利点は、このような因子が、許容条件下で増殖した目的の宿主生物においてベクター構築物を安定化することを可能にするが、限定条件（例えば、転移が生じた後に非許容レベルにまで上昇した温度）下で増殖する場合、この宿主生物はベクターを「矯正する（ｃｕｒｅ）」ことを可能にすることである。
【０１０８】
従って、トランスポゾンまたは可動性遺伝因子を含むベクター（これは、プロモーター含有光生成タンパク質コード配列またはプロモーターのない光生成タンパク質コード配列のいずれかを含む）で標的生物を形質転換した後、形質転換体は、それらが光を生成する能力により同定される。代表的には、形質転換プロトコルの後、細胞がプレーティングされ、そしてそのプレートのうちの光生成細胞を含む領域が、同定される。その後、これらの領域が継代されて、光生成タンパク質コード配列を発現する形質転換細胞の、より純粋な培養物が提供される。そのような操作は、例えば、マイクロタイタープレートを使用して、液体培養材料または半固体培養材料においても実行され得る。
【０１０９】
（２Ｂ．ベクターおよびプラスミド）
本発明の方法は、選択された発現制御エレメントを含む適切な発現ベクターを使用する、種々の細胞型の形質転換のために使用され得る。所定の任意の細胞型のために適切なベクターおよび制御エレメントは、本明細書の教示および発現ベクターの分野で公知の情報を考慮して、当業者によって選択され得る。
【０１１０】
例えば、光生成タンパク質コード配列が、そのコード配列に作動可能に連結された制御エレメントを含むベクター（これは、選択された細胞型におけるその遺伝子の発現を可能
にする）中に挿入され得る。哺乳動物細胞発現における使用のための例示的プロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＩＶ−ＬＴＲ、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター（ＭＭＬＶ−ＬＴＲ）、ＦＩＶ−ＬＴＲ、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の非ウイルスプロモーター（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター）もまた、哺乳動物発現のために使用され得る。代表的には、転写終結配列およびポリアデニル化配列もまた、翻訳終止コドンの３’側に位置して存在する。好ましくは、そのコード配列の５’側に位置して、翻訳開始を最適化するための配列もまた、存在する。転写終結因子／ポリアデニル化シグナルの例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるようなＳＶ４０由来の転写終結因子／ポリアデニル化シグナル、ならびにウシ成長ホルモン終結因子配列が挙げられる。スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む、イントロンもまた、本発明とともに使用するために構築物中に設計され得る（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）。
【０１１１】
エンハンサーエレメントは、哺乳動物ベクター構築物の発現レベルを増加するために使用され得る。例示的エンハンサーとしては、Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載されるような、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー；Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載されるような、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター；およびＢｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載されるような、ヒトＣＭＶ由来のエレメント（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
適切な原核生物ベクターとしては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて複製能力を有するプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ＰＡＣＹＣ  １８４、ｉｔＶＸ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）など）が挙げられる。このようなプラスミドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）を参照のこと）により開示されており、そして多くのこのようなベクターが、市販されている。Ｂａｃｉｌｌｕｓプラスミドとしては、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７などが挙げられ、そしてＧｒｙｃｚａｎ（Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８２）ｐｐ．３０７−３２９）に開示される。適切なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドとしては、ｐｌｉ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３，１９８７）およびストレプトマイセスバクテリオファージ（例えば、□Ｃ３１（Ｃｈａｔｅｒら、Ｓｉｘｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ  Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ（１９８６）ｐｐ．４５−５４）が挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラスミドは、Ｊｏｈｎら（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４，１９８６）およびＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２，１９７８）により概説される。
【０１１３】
適切な真核生物プラスミドとしては、例えば、ＢＰＶ、ＥＢＶ、ワクシニア、ＳＶ４０、２−ミクロン環、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＳ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＭＴ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ（Ｓｐｌ）、ｐＶｇＲＸＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など、またはそれらの誘導体が挙げられる。そのようなプラスミドは、当該分野で周知である（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｍｉａｍｉ  Ｗｎｔｒ．ＳｙＴｎｐ．１９：２６５−２７４，１９８
２；Ｂｒｏａｃｈ「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ  Ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、ｐｐ．４４５−４７０，１９８１；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ  ２８：２０３−２０４，１９８２；Ｄｉｌｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３９−４８，１９８０；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ。５６３−６０８，１９８０）。
【０１１４】
光生成タンパク質コード配列は、適切な宿主系における形質転換マーカーとして使用するためにその光生成ポリペプチドの発現を生じるように、多数の市販のベクター中にクローニングされ得る。これらの系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：バキュロウイルス形質転換のためのベクター，Ｒｅｉｌｌｙ，Ｐ．Ｒ．ら、ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（１９９２），Ｂｅａｍｅｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：３７８（１９９１），Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）；細菌形質転換のためのベクター，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ  ＰＡ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；酵母形質転換のためのベクター，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．およびＴｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．，米国特許ＲＥ３５，７４９（１９９８年３月１７日発行），Ｓｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，米国特許第５，６２９，２０３号（１９９７年５月１３日発行），Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．ら，Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，６２（１−２）：７９−９３（１９９２），Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．ら，Ｙｅａｓｔ  ８（６）：４２３−４８８（１９９２），Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（１９９０），Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｃ．，およびＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４（１９９１）；哺乳動物細胞形質転換のためのベクター，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１１：６８７−７０６（１９８３），Ｌａｕ，Ｙ．Ｆ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４６９−１４７５（１９８４），Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８５，ｐｐ５３７−５６６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（１９９１）；ならびに植物細胞形質転換のためのベクター，植物クローニングベクター，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，およびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｔｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，Ｈｏｏｄ，Ｅ．ら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１２９１−１３０１（１９８６），Ｎａｇｅｌ，Ｒ．．ら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．６７：３２５（１９９０），Ａｎら「Ｂｉｎａｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」など、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ａ３：１−１９（１９８８），Ｍｉｋｉ，Ｂ．Ｌ．Ａ．ら，ｐｐ．２４９−２６５など、Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｈｏｈｎ，Ｔ．ら編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｉ��ｎ，Ａｕｓｔｒｉａ，（１９８７），Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐ．Ｇ．ＪｏｎｅｓおよびＪ．Ｍ．Ｓｕｔｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，１９９７，Ｍｉｇｌａｎｉ，Ｇｕｒｂａｃｈａｎ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８，Ｈｅｎｒｙ，
Ｒ．Ｊ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，１９９７。
【０１１５】
光生成タンパク質コード配列を含むベクターはまた、標的生物のゲノムへの単一部位組換えを容易にする配列（例えば、組み込みを容易にするのに使用される標的ゲノム中の１つ以上の部位に相同な単一ＤＮＡ配列）または相同組換えを容易にする配列（例えば、標的ゲノム中の遺伝子座に相同な２つの配列であって、ここで、この２つの配列は、光生成タンパク質コード配列に隣接する）（ならびに任意の関連制御因子またはさらなる目的配列）を含み得る。いったん同定されれば、標的化配列は、例えば、プライマーを設計し、そしてＰＣＲにより配列を増幅することにより、容易に単離され得る。この増幅産物は、次いで、光生成タンパク質コード配列含有構築物（例えば、挿入されることが所望される配列に隣接して）に挿入され得る。組み込みベクターは、環状または線状であり得る。さらに、本発明の方法を用いて、光生成タンパク質コード配列（および関連制御因子およびさらなる目的配列）を保有するベクターが細胞に導入され得、そしてランダム組み込み事象が、標的細胞の形質転換および形質転換体の同定によって検出され得る。
【０１１６】
実施例４は、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓについての組み込みゲノム標的化ベクター（ここで、標的化ベクターは、プロモーター含有光生成タンパク質コード配列を含む）の構築を記載する。さらに、実施例４は、このベクターを用いて実施される形質転換実験を記載する。実施例４に示す結果は、光生成タンパク質コード配列含有構築物が、選択マーカーに適合されない細胞においてレポーター構築物として使用され得ることを示す。実施例４に記載の方法は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓにおけるその発現を可能にするように改変したホタルＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼ遺伝子を用いる。形質転換Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ細胞は、いかなる栄養要求性または薬物ベースの選択も使用することなく光生成についてスクリーニングすることにより単離された。
【０１１７】
本明細書中に記載の高密度スクリーニングは、選択を包含せず、形質転換体を得るために効率的な方法を提供した。首尾よい形質転換は、約５×１０−５〜１０−６の頻度で生じた（５〜１０生物発光コロニー／２０プレート；実施例４）。大過剰数の非形質転換細胞からの形質転換体（すなわち、光生成細胞）の同定は、簡単であり、かつ反復可能であった。本明細書中に示した首尾よい形質転換は、ＡＴＣＣからのいくつかのビルレント株を用いて反復されている。本発明の１つの実施形態では、形質転換ミックスを、ルシフェリンを含む非選択培地上にプレートした。細胞のローン（ｌａｗｎ）を増殖させた。このローンを光生成について画像化し（例えば、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＩＶＩＳＴＭ  画像化システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を用いて）、光生成タンパク質コード配列（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）を含み、発現する細胞の領域を同定した。プレート上の各々の明るい領域から４〜８の小さなサンプルを採集し、そしてこれを用いて終夜液体培養物に接種した。次いで、この終夜培養物の少量アリコートをマイクロタイタープレートのウェル中でルシフェリンと混合し、そして各アリコートを光生成について評価した。光生成タンパク質コード配列含有／発現細胞を含む終夜培養物を希釈し、そしてシングルコロニーについてプレートし、シングルコロニー単離物を得た。
【０１１８】
従って、これらの結果は、光生成タンパク質コード配列含有構築物が高密度スクリーニングのために用いられて、形質転換事象を検出し得、そしてさらには動物全体における観察を可能にし得ることを示す。
【０１１９】
光生成タンパク質コード配列を含む、本発明のベクターは、キットに処方され得る。このようなキットのコンポーネントとしては、容器、説明書、溶液、緩衝液、使い捨て物、
およびハードウェアが挙げられ得るが、これらに限定されない。代表的なハードウェアとしては、増強光子係数カメラ（ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ  ｐｈｏｔｏｎ−ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｃａｍｅｒａ）または冷却統合カメラ（ｃｏｏｌｅｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｃａｍｅｒａ）が挙げられ得る。
【０１２０】
従って、形質転換細胞中のベクターの存在を決定するために従来の選択またはスクリーニング方法を使用する代わりに、光ベースのスクリーニング方法が用いられ得る。１つの実施形態（すなわち、プロモーター含有構築物）では、光生成ポリペプチドコード配列は、目的の生物において活性なプロモーターの制御下に置かれる。このような制御因子は、恒常的または条件付きであり得る。例えば、目的の標的生物において機能的であるプロモーター配列に作動可能に連結されたｌｕｘＡＢＣＤＥカセットが、適切なベクターに導入され得る。次いで、この目的の生物は形質転換され、そして得られた生物は、それらが光を生成する能力についてスクリーニングされる。この方法において、光の生成は、目的の形質転換体を同定するために使用される。光生成コロニー（または細菌斑）は、代表的には、標準的な方法（例えば、希釈プレーティング（例えば、マイクロタイターウェルを用いる）、またはシングルコロニーについてのストリーキング）によってクローン化される（すなわち、物理的に単離される）。本発明の１つの局面は、目的の標的生物において機能的であるプロモーター配列に作動可能に連結された光生成ポリペプチド配列を含むベクターを提供する。このようなベクターの使用は、選択マーカー（例えば、薬物耐性マーカー）が利用可能ではない生物の形質転換のための手段を提供する。
【０１２１】
（２Ｃ．光生成タンパク質構築物の作製方法）
本明細書中に記載の光生成タンパク質カセット、トランスポゾンカセットおよびシャトルベクター構築物は、本明細書の教示を考慮して、分子生物学の分野において公知の方法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ，ＰＡ（１９９５）、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、を参照のこと）を用いて組み立てられ得る。代表的には、光生成ポリペプチドをコードする配列を含む遺伝子カセットが組み立てられる。プロモーター、制御因子、および／または他のヌクレオチド配列もまた、適切な位置で構築物中に導入され得る。
【０１２２】
ポリヌクレオチド、適切な調節配列、および短いランダムヌクレオチド配列を得るための好ましい方法は、ＰＣＲである。ＰＣＲについての一般的な手順は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＰＣＲ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９１））により教示される。各増幅反応についてのＰＣＲ条件は、経験的に決定され得る。多数のパラメーターが反応の成功に影響する。これらのパラメーターの中には、アニーリング温度および時間、伸長時間、Ｍｇ２＋およびＡＴＰ濃度、ｐＨ、ならびにプライマー、鋳型、およびデオキシリボヌクレオチドの相対濃度がある。代表的なプライマーは、実施例にて以下に記載される。増幅後、得られるフラグメントは、アガロースゲル電気泳動、次いで臭化エチジウム染色および紫外線照射による可視化によって検出され得る。ポリヌクレオチドを得るための別の方法は、例えば、酵素消化による。所望のベクターの構成要素は、任意の適切な方向および／または配置で編成され得る。
【０１２３】
（２Ｄ．標的細胞に核酸を導入する方法）
核酸を細胞（または細胞のプロトプラスト（例えば、酵母または植物細胞壁の弱化または除去後））に導入するための方法は当業者に公知であり、そして以下を含むがこれらに限定されない：脂質媒介移入（例えば、リポソーム（中性脂質およびカチオン性脂質を含む）を用いる）、直接注入（例えば、マイクロインジェクション）、細胞融合、マイクロプロジェクタイルボンバードメント（例えば、微粒子銃法（例えば、ＤＮＡ粒子ボンバー
ドメント））、共沈殿（例えば、リン酸カルシウムと、または酢酸リチウムと）、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移入もしくはポリエチレングリコール媒介移入、およびウイルスベクター媒介移入。
【０１２４】
形質転換方法は、代表的には、細胞型および本方法において利用可能な核酸の量に依存して選択される。形質転換後、細胞は、光生成についてのスクリーニングを容易にする密度でプレートされ得る。細胞は、例えば、形質転換細胞集団の一連の希釈を調製することによって、多数の密度でプレートされ得る。細胞プレーティング密度は、細胞型によって異なる；しかし、初期スクリーニングについて高密度プレーティングであることは、形質転換方法によって処理される細胞の集団において形質転換細胞を検出する可能性を増大するために一般に好ましい。
【０１２５】
当業者は、本明細書中に提示した指針と合わせて、基本的に任意の選択された形質転換方法を用いて、本発明の光ベースのスクリーニング方法を適用し得る。
【０１２６】
（３．細胞培養物における光生成ポリペプチド配列の評価）
光生成タンパク質コード配列構築物（例えば、上記および実施例に記載のもの）は、種々の宿主細胞を形質転換し、首尾よい形質転換事象をアッセイするために使用され得る。適切な宿主細胞としては、真核生物（例えば、酵母（例えばＣａｎｄｉｄａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））；植物細胞；哺乳動物細胞（例えば、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、またはＣＨＯ細胞）；組織特異的細胞；腫瘍細胞；昆虫細胞；原核細胞（例えば、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌および上記の分類のいずれにも含まれない他の属（例えば、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．；Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ  ｓｐｐ，；Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ（梅毒を引き起こす生物）を含む）；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．、およびＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
グラム陰性宿主細胞に関して、本発明の構築物は、以下を含むがこれらに限定されない生物を形質転換するために使用され得る：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．，Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．，Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．，Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．，Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．，Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．，Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．，Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．，およびＹｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．。
【０１２８】
グラム陽性宿主細胞に関しては、本発明の構築物は、以下を含むがこれらに限定されない生物を形質転換するために使用され得る：
以下のグラム陽性球菌科のメンバー：Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，Ｓｔｏｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐｐ．，およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．），Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．），および以下を含む他の球菌属の種：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ（例えば、化膿性溶血性（ｐｙｏｇｅｎｉｃ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ）ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  ｓｐｐ．，口腔ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  ｓｐｐ．，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ  ｓｐｐ．，乳酸ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  ｓｐｐ．，嫌気性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  ｓｐｐ．，および他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ種）；Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐｐ．，Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，Ｇｅｍｅｌｌａ  ｓｐｐ．，Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  
ｓｐｐ．，Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，およびＳａｒｃｉｎａ属の種。
【０１２９】
内生胞子形成グラム陽性桿菌および球菌（以下を含む：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．，Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｓｐｐ．，Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ  ｓｐｐ．，およびＯｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ属の種）。
【０１３０】
規則的非胞子形成グラム陽性桿菌（ｒｅｇｕｌａｒ，ｎｏｎｓｐｏｒｉｎｇ，Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｏｄｓ）（以下を含む：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．，Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．（食糧中、飲料水中、および食用調製物表面上に汚染物として見出される病原種Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含む）、属Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｓｐｐ．，Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ  ｓｐｐ．，Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｋｕｒｔｈｉａ  ｓｐｐ．，およびＣａｒｙｏｐｈａｎｏｎ属の種）。
【０１３１】
不規則的非胞子形成グラム陽性桿菌（ｉｒｒｅｇｕｌａｒ，ｎｏｎｓｐｏｒｉｎｇ，Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｏｄｓ）（以下を含む：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの植物病原種を含む），Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．，Ａｒｃａｎａｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．，Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｃｕｒｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｃａｓｅａｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．，Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ａｕｒｅａｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．，Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．，Ａｒａｃｈｎｉａ  ｓｐｐ．，Ｒｏｔｈｉａ  ｓｐｐ．，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．，Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．，Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．，Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．，およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の種）。
【０１３２】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の生物（すなわち、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｐｐ）。
【０１３３】
ノカルジア状生物（以下を含む：Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｐ．，Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．，Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｐ．，Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ  ｓｐｐ．，Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．，Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．，Ｐｒｏｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ
ｓｐｐ．，およびＩｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ属の種）。
【０１３４】
特別な目的の生物としては、以下が挙げられる：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．，Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．，Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．，Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．，Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．，Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．，Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．，Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．，およびＹｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．。
【０１３５】
原核生物細胞および真核生物細胞の両方についての形質転換方法が当該分野で公知であり（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら）、そしてこのような方法としては、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。適切な調節因子および多重クローン化部位を含むベクターは広範に市販され（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ；Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ）、そして光生成タンパク質コード配列を有するバックボーンベクターとして使用され得る。
【０１３６】
上述のように、本明細書中に記載の特定の発現カセットは、光の生成について外因性基質の添加を必要とする（例えば、ｌｕｃおよびｌｕｘＡＢ発現カセット）。本発明の１つの実施形態では、基質はアルデヒドである。細胞に投与される場合、アルデヒドは、蒸気として培養培地の周囲の雰囲気中で、または、液体もしくは固形として培養培地に直接に適用され得る。
【０１３７】
光生成の検出および定量は、例えば、増強光子計数カメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｍｏｄｅｌ  ２４００−３２）を用いて達成される。本発明の方法によって生成される形質転換体をスクリーニングするために特に有用である１つのシステムは、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）から入手可能なＩＶＩＳＴＭ画像化システムである。ＩＶＩＳＴＭ  画像化システムは、高感度カメラ（例えば、冷却統合カメラ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｏｄｅｌ  ＬＮ／ＣＣＤ
１３００−ＥＢ／１；Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｍｏｄｅｌ  ６２０冷却ＣＣＤカメラ、Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａから入手可能）、特殊設計画像化チャンバー、およびそれを全て実行するためのソフトウェアを備える。さらに、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅＴＭソフトウェアは、データを解析、編成、および保存する。システムのコンポーネントについての代表的な仕様は、表１に以下に示すとおりである。
【０１３８】
【表１】
2008148715.tif 000002
複数の光生成タンパク質コード配列が、本明細書中に記載の構築物および方法を用いて単一生物に取り込まれ得る。１つの実施形態では、各カセットは、互いに対して異なる特徴的な波長で発光する光生成ポリペプチドをコードし得る。あるいは、特徴的な波長で発光する光生成ポリペプチドを保有するいくつかのカセットが用いられ得る。異なる特徴的な波長で発光する光生成ポリペプチドの種々のこのような混合物を有する、光生成タンパク質コード配列を含む、カセットの組み合わせが、本明細書中の教示を考慮して構築され得る。
【０１３９】
（４．動物におけるルシフェラーゼ発現ベクターの評価）
選択される細胞または細胞型の形質転換において使用するための、本発明の構築物および方法に加えて、光生成タンパク質をコードする配列を含む構築物を有する微生物は、動物全体における非侵襲的造影に有用である。動物全体における非侵襲的造影は、共有に係る米国特許第５，６５０，１３５号（Ｃｏｎｔａｇ，ｅｔ  ａｌ．）において記載される（以下もまた参照のこと：Ｃｏｎｔａｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４（２）：２４５−２４７；Ｃｏｎｔａｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）ＯＳＡ  Ｔｏｐｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ３：２２０−２２４；Ｃｏｎｔａｇ，ｅｔ
ａｌ．，（１９９７）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，６６（４）：５２３−５３１；およびＣｏｎｔａｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：５９３−６０３）。
【０１４０】
造影方法において、その結合体は、生体適合性実体（例えば、本発明の構築物がそのゲノムに組み込まれた、形質転換された細菌）および光生成部分（例えば、ルシフェラーゼ酵素）を含む。光放出結合体は、代表的に、種々の方法のいずれかによって被検体に投与され、その被検体内に配置され、そして造影される。造影すなわちその被検体からの光子放出の測定は、数十分までかかり得ることから、その被検体は、代表的に、造影プロセスの間固定されるが、必ずしも必要ではない。
【０１４１】
光放出実体の画像は、非常に低レベルの光（代表的に、単一の光子事象）を検出し得る光検出器の使用、および画像が構築され得るまで光子放出を積分する工程を包含する。そのような感度のよい光検出器の例としては、その事象がカメラによって検出されるまで単一の光子事象を強化するデバイス、および検出系において固有のバックグラウンドノイズに対して単一の光子を検出し得るカメラ（例えば、液体窒素によって冷却される）が挙げられる。
【０１４２】
いったん光子放出画像が生成されると、代表的に、その画像は、被検体の「写真」が反映された光画像に重ねられた擬色画像として表現され、放出された光子の供給源に対して参照のフレームを提供する（すなわち、その被検体に対して光放出する結合体を局在化する）。次いで、そのような「複合」画像は、被検体におけるレポーター遺伝子の発現の位置および／またはレベルを決定するために分析される。
【０１４３】
（４Ａ．動物の感染）
本明細書において記載されるカセットは、動物における種々の原核生物および真核生物の細胞を評価するために有用である。例えば、記載されるカセットは、病原体生物（例えば、カンジダ、グラム陽性細菌など）のゲノムに組み込まれ得、次いで動物全体に導入され得る。次いで、この動物を用いて感染プロセスをインビボにおいて追跡し得、そして新たな抗生物質のような可能な抗感染薬物を、感染を阻害するにおけるその効力について評価し得る。したがって、１つの局面において、本明細書において記載される発現カセットは、（例えば、ルシフェラーゼ発現カセットを有する細菌または真菌の細胞に感染した）哺乳動物被検体における光放出結合体の非侵襲性の造影および／または検出において有用である。形質転換された細胞は、試験被検体にそれらが細胞または組織の型に局在化されるように投与され得る。あるいは、形質転換された細胞は、それらがその被検体において均一に分配されるように投与され得る。
【０１４４】
（４Ｂ．基質の投与）
上記のように、本明細書において記載される特定の発現カセットは、光の生成のために外来の基質（例えば、ルシフェリン）の添加を必要とする（例えば、ｌｕｃおよびｌｕｘ
ＡＢの発現カセット）。本発明の１つの実施形態において、この基質はアルデヒドである。この基質はまた、動物全体に投与され得る。基質について適切な濃度は、構築された試験動物の各々の系統について経験的に決定され得る。基質（代表的に、ルシフェリン）は、目的分析物の投与の前、同時または後に投与され得る。基質の投与経路は、分析物について記載されるとおりであり得る。基質について好ましい投与経路は、静脈投与または局所投与、あるいは例えば蒸気として雰囲気中で基質を提供することによるものが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１４５】
（５．本発明の構築物の使用）
１つの局面において、本発明は、種々の細胞型について形質転換ベクターとして使用される、プロモーターを含有するか、またはプロモーターのない、光生成タンパク質コード配列構築物に関する。本発明は、本発明の構築物が首尾よく導入された細胞の同定を可能にする。形質転換のレポーターとして光生成を用いる本明細書において記載されるこの方法は、例えば、抗生物質抵抗性細菌、自己栄養性マーカーのない酵母のような、使用され得る選択可能なマーカーが知られていない細胞型の形質転換のために特に有用である。本発明の形質転換方法は、以下の工程を包含する。第一に、所望の標的細胞の細胞集団が調製され、次いで、光生成タンパク質コード配列構築物を使用して当該分野において公知の形質転換方法（例えば、（カルシウム沈降；ポリエチレングリコール沈降；酢酸リチウム／ポリエチレングリコール形質転換、Ｂｒａｕｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  （１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７（５３２２）：１０５−９；およびエレクトロポレーション、Ｄｅ  Ｂａｃｋｅｒ，Ｍａｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｙｅａｓｔ  １５（１５）：１６０９−１８）を用いてその細胞を形質転換する。光生成タンパク質コード配列構築物を取り込み、そして光生成タンパク質を発現する細胞は、例えば、画像系を用いて同定される。形質転換された細胞は、代表的に、単一のコロニーについて、例えば希釈プレーティングまたはストリーキングによって、さらに精製されて形質転換された細胞の本質的に純粋な培養物を生成する。
【０１４６】
本発明の１つの局面において、プロモーターのない光生成タンパク質コード配列構築物が使用される。この場合、光生成タンパク質コード配列の発現は、代表的に、その標的細胞のゲノムへの組み込みに依存する。最も一般には、組み込み事象は、その標的細胞における隣接する活性転写制御エレメントである。
【０１４７】
本発明の別の局面において、プロモーターを含む光生成タンパク質コード配列構築物が使用される。この場合、その光生成タンパク質コード配列は、その標的細胞のゲノムに組み込まれてもよく、あるいはプラスミド（または、他のエピソーム性もしくは染色体外のベクター）上に有され得る。
【０１４８】
本発明のカセットは、広汎な種々の適用において有用である。例えば、これらのカセットは、目的の遺伝子または核酸配列と組み合わせて用いられて、その標的細胞がその目的の遺伝子または核酸配列で形質転換されたか否かをアッセイすることができる。換言すれば、光は、例えば、エレクトロポレーションまたはファージ媒介性の形質導入または接合を介した、標的細胞（例えば、病原性生物）の首尾よい形質転換を示すレポーターとして供される。このことは、形質転換事象についてアッセイするために代表的に使用される、選択マーカー（例えば、薬物抵抗性）を利用することができない細胞において特に有用である。
【０１４９】
形質転換体はまた、有効な薬学的因子を決定し、そしてその作用点を決定するために用いられ得る。首尾よく形質転換された標的細胞を同定した後、次いでその標的細胞を使用して実験動物の複数の群に感染させる。この群は各々、目的の遺伝子もしくは核酸配列および／または活性プロモーターを１つ以上含む。次いで、この群を目的の薬学的因子で処
置し、次いで実験動物および感染され処置されていないコントロール動物の両方を、光生成についてモニターする。転写および／または翻訳を抑制するにおいて有用な（直接または間接のいずれかで）、または形質転換された細胞が正常に機能する能力を阻害する因子は、処置された実験動物において光生成を抑制し、他方、光生成は、対応する感染され処置されていないコントロール動物において観察される。あるいは、光生成を増強する化合物もまた同定され得る。
【０１５０】
本発明によって教示されるような、光を生成するように改変された生物を使用して、例えば、感染、食糧、飲用水および食物調製物の表面における微生物の存在をモニターすることができる。
【０１５１】
特に、本発明の方法は、核酸（例えば、ＤＮＡ）を細胞に導入するために有用であり、ここで、形質転換体（例えば、病原性真核生物の生物（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ））および抗生物質抵抗性細菌（以下を含むがそれらに限定されない：院内感染病原体（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのメチシリン抵抗性株、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍおよび他の抗生物質抵抗性腸菌））を選択することが困難である。
【０１５２】
以下は本発明を実施するための、特定の実施形態の例である。この例は、例示の目的のみに提供され、そして本発明の範囲をいかなる様式においても限定することを意図しない。
【０１５３】
（材料および方法）                   
そうではないと指示しない場合、細胞、タンパク質および核酸（例えば、ＤＮＡ）の操作は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ，ＰＡ  （１９９５）に記載されるような標準的な方法を用いて実施した。そうではないと指示しない場合、制限酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。修飾酵素は、ＰｒｏｍｅｇａまたはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手した。そして、他の実験室用化学物質は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０１５４】
使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証するための努力がなされたが、いくつかの実験誤差および偏差は、当然に許容されるべきである。
【０１５５】
（Ａ．外因性アルデヒドの存在下でのインビトロスクリーニング）
外因性アルデヒド基質を、ｌｕｘＣＤＥ遺伝子を含まない細菌のプレートまたは培養物を造影する前に加えた。造影プレートについて、ｎ−デシルアルデヒド（デカナール；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を、造影されるべき細菌を含むプレートを覆う蓋の内表面内に広げた（「アルデヒド蒸発造影」）、次いでこのプレートを、本質的に米国特許第５，６５０，１３５号に記載されるようにＣＣＤ増感カメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  ｍｏｄｅｌ  ２４００−３２）を用いて造影した。液体培養物を造影するために、１μｇの１％デカナール溶液（５０％エタノール中）を、１ｍｌの適切な１０倍培養物希釈液に加えた。
【０１５６】
（Ｂ．ＤＮＡの調製およびクローニング）
そうではないと指示しない場合、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いた消化後に、ＤＮＡサンプルを８５℃で１５分間加熱して制限酵素を不活化した。ライゲーションを、１６℃で一晩行った。
【０１５７】
（Ｃ．細菌細胞の形質転換）
コンピテント細胞の調製。そうではないと指示しない場合、細菌細胞を、以下のように形質転換した。細菌培養物を、ＬＢ中で一晩増殖させた。５ｍｌの各々の培養物を用いて新鮮な５００ｍｌ容量のＬＢに播種した。これらの培養物を３７℃で、約０．６のＯ．Ｄ．（６００ｎｍ）が達成されるまで振盪した。次いで、この細胞を、氷上で３０分間冷却し、その後３，０００×ｇにて１０分間４℃で遠心分離することによって採集した。この細胞を冷０．５Ｍスクロース（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはｄｄＨ２Ｏ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のいずれかの５０ｍｌ中に再懸濁し、その後再遠心分離し、そして冷０．５Ｍスクロース（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはｄｄＨ２Ｏ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のいずれかの５ｍｌ中に再懸濁した。この段階において、その細胞を、氷上で３０分間にわたって保持し、次いで再遠心分離し、そして５ｍｌの冷１０％グリセロール中に再懸濁した。各々の細胞型のアリコートを凍結し、そして−８０℃で保存した。
【０１５８】
エレクトロポレーション。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎカラムを用いて精製し、透析し、そして「ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ」（ＢｉｏＲａｄ）を用いてコンピレント細胞にエレクトロポレーションした。設定は、２５μＦ、２．５ｋＶおよびＳ．ａｕｒｅｕｓについて１００Ω抵抗またはＥ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについて４００Ω抵抗のいずれかであった。この細胞を、１ｍｌの培養培地中に回収して３７℃で２時間保持し、その後必要な選択抗生物質を含む適切な寒天上にプレーティングした。
【０１５９】
（Ｄ．サンプルの画像化）
サンプルを、以下に記載のようにわずかに改変して、Ｃｏｎｔａｇら，米国特許第５，６５０，１３５号に本質的に記載されるように画像化した。
【０１６０】
本発明（以下に記載される）を支持して行われる実験において、サンプルが発した光の量を、増強光子計数カメラ（ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ  ｐｈｏｔｏｎ−ｃｏｕｎｔｉｎｇ
ｃａｍｅｒａ）（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｍｏｄｅｌ  ２４００−３２）または冷却集積カメラ（ｃｏｏｌｅｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｃａｍｅｒａ）のいずれかを用いて定量した。冷却集積型のカメラに関して、使用される特定の機器を、３つの製造業者／モデルの中から選択した：（１）Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏｄｅｌ  ＬＮ／ＣＣＤ  １３４０−１３００−ＥＢ／１；（２）Ｒｏｐｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ＬＮ−１３００ＥＢ  ｃｏｏｌｅｄ  ＣＣＤ  ｃａｍｅｒａ  （Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａから入手可能）；および（３）Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｍｏｄｅｌ  ６００またはｍｏｄｅｌ  ６２０  ｃｏｏｌｅｄ  ＣＣＤ  ｃａｍｅｒａ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａから入手可能）。好ましい装置は、それぞれ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  ｃａｍｅｒａ  ｎｕｍｂｅｒ  ＸＥＮ−３およびＰｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｃａｍｅｒａ  ｎｕｍｂｅｒ  ＸＥＮ−５（ともに、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａにある）であった。両方の型のカメラは、電荷結合デバイスアレイ（ＣＣＤアレイ）を使用して、面積あたりに選択された光子数に比例したシグナルを生成する。選択された単位面積は、１つのＣＣＤピクセルにより検出される面積と同程度に小さいものであり得るか、またはビンニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）が使用される場合は、任意の選択された群のピクセルにより検出される面積と同程度に小さいものであり得る。このシグナルは、必要に応じて、画像プロセッサ（例えば、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓから入手可能なＡｒｇｕｓ）を介して指令され得、次いで、コンピューター（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＮＴ（Ｄｅｌｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を走らせているＰＣまたは画像処理ソフトウェアアプリケーション（例えば、「Ｌｉｖｉ
ｎｇＩｍａｇｅ」（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を走らせているＭａｃｉｎｔｏｓｈ（Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）のいずれか）に送られる。このソフトウェアおよび／または画像プロセッサは、コンピューターデータファイルとして保存された画像を獲得するために使用される。このデータは、概して、（ｘ、ｙ、ｚ）値の形態で得る。ここで、ｘおよびｙは、シグナルが収集された点または面積の空間座標を示し、ｚは、「相対光単位（ＲＬＵ）」として表されるその点または領域にてシグナルの量を表す。
【０１６１】
実行を容易にするために、データは、代表的には、「偽カラー」画像としディスプレイされ、ここで、カラースペクトルは、特定の点におけるｚ値（シグナルの量）を示すために使用される。さらに、この偽カラーシグナル画像は、代表的には、反映された光または「写真」画像の上に重ね合わせられて、準拠座標系が提供される。
【０１６２】
シグナルが、安定な光電子放出標準（例えば、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）を使用して較正されたカメラで獲得される場合、任意のカメラからのＲＬＵシグナル値が、同じ光電子放出標準を使用して較正された任意の他のカメラからのＲＬＵと比較され得ることが認識される。さらに、光電子放出標準を、絶対光子フラックス（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｆｌｕｘ）（ある時間単位における単位面積から放出された光子）について較正した後、当業者は、このようなカメラから光子フラックス値へとＲＬＵ値を変換し得る。次いで、光子フラックス値は、単位時間あたりのサンプル中の形質転換細胞により放出された光子の数の予測を可能にする。
【０１６３】
（Ｅ．９６ウェルマイクロタイタープレートを使用して産出された光の定量）
溶液中の細胞により生成される光の量を、９６ウェルプレートのウェルへ溶液の希釈物をプレートし、Ｘｅｎ−３カメラにおいて上記のようにプレートを画像化することにより定量した。次いで、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアを使用して、特定のウェルからの光に対応するシグナルを示す画像の各面積の周りに規定された境界を重ね合わせた。次いで、これらの面積の各々からのシグナルを定量し、各ウェルについての単一ＲＬＵ値として表した。これらのＲＬＵを、以下に記載した研究（実施例１３、１４および１５を含む）のいくつかに使用した。
【実施例】
【０１６４】
（実施例１：グラム陽性ｌｕｘトランスポゾン：Ｔｎ４００１  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲの構築）
ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲカセットを以下のように構築した：ｐＤＬ２８９（Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｎ．Ｄ．ら（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：５０２８−５０３４）からのグラム陽性カナマイシンカセットを、プライマーＫａｎＦ２
【０１６５】
【化１】
2008148715.tif 000003
；配列番号１；太字は、ＸｈｏＩ部位を示す）およびＫａｎＲ２
【０１６６】
【化２】
2008148715.tif 000004
；配列番号２；太字は、ＳａｌＩ部位を示す）を使用してＰＣＲ増幅した。９５℃で１５秒、５０℃で３０秒、および７２℃で２分の３０回の加熱／冷却サイクルで増幅を行った
。
【０１６７】
得られた増幅産物は、プロモーターなしのｋｍＲ抗生物質耐性遺伝子を提供した。次いで、増幅産物を、ＸｈｏＩ／ＳａｌＩで切断し、ｌｕｘＡＢＣＤＥカセットのすぐ下流にあるｐＳＫ−ｌｕｘＡＢＣＤＥプラスミド構築物（プラスミド構築についてのさらなる詳細に関しては、同時係属中の共有に係る米国特許出願第０９／６５７，２８９号を参照のこと）のＳａｌＩ部位に連結した。
【０１６８】
ｐＳＫ  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲプラスミド構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞にエレクトロポレーションし、形質転換細菌を、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢプレートにプレートした。３７℃で一晩インキュベートした後、得られた形質転換体を、光子計数ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｓｈｉｚｕｏｋａ  Ｐｒｅｆ．，Ｊａｐａｎ；ｍｏｄｅｌ  ２４００−３２）を使用して、発光についてスクリーニングした（材料および方法を参照のこと）。Ｅ．ｃｏｌｉ（グラム陰性）におけるカナマイシン耐性および生物発光両方の発現は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋またはＳＫベクター骨格において見出されたｌａｃＺプロモーターにより媒介された。ＤＮＡを、生物発光コロニーから調製した。ｌｕｘＡＢＣＤＥコード配列に対するカナマイシンカセット（すなわち、コード配列）の正しい方向を、ＳａｌＩでのＤＮＡの制限消化および得られた制限パターンの分析により確認した。
【０１６９】
ｌｕｘ遺伝子およびｋｍＲ遺伝子を含むＴｎ４００１カセットを構築するために、ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲカセットを、ｐＳＫ  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲ構築物から切断し、ＳｐｅＩ／ＳａｌＩを使用して上記のように調製した。フラグメントの末端を、ヌクレオチドで埋めて、平滑末端化分子を生成した。これらの分子を、プラスミドｐＭＧＣ５７（Ｌｙｏｎら（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：６２６３−６２７５）のＥｃｏＲＶ部位に連結し、この構築物を、ＤＨ５α細胞にエレクトロポレーションした。形質転換細菌を、１５μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを含有するＬＢ培地にプレートした。得られた形質転換体を、発光、クロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）およびカナマイシン耐性（ＫａｎＲ）についてスクリーニングした。ＤＮＡを、発光コロニー、ＣｍＲコロニー、ＫａｎＲコロニーから調製した。ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲカセットの正しい方向（すなわち、Ｔｎ４００１トランスポゾンの５’末端に対するｌｕｘＡ配列の５’末端の位置）を、制限消化（ＸｈｏＩ／ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶ）および制限パターン分析、ならびにＤＮＡのＰＣＲ分析により確認した。ＰＣＲを、上記の条件下でプライマーＭＧＣ−ＣＡＴ−Ｆ１（５’−ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＡＣＣ  Ｇ−３’，配列番号３）およびＬｕｘＡ−Ｒｅｖ（５’−ＣＣＡ  ＣＡＣ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＣＧ−３’，配列番号４）を使用して行った。フラグメントサイズにより正しい方向を同定した。
【０１７０】
（実施例２：Ｔｎ４００１  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲシャトルベクター構築物の構築）
（Ａ．ｐＡＵＬ−Ａ  Ｔｎ４００１  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲシャトルベクターの構築）
ｌｕｘ遺伝子およびｋｍＲ遺伝子（ＩＲ  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲ  ｔｎｐ  ＩＲといわれ、ここでＩＲは、逆方向反復を示し、ｔｎｐは、Ｔｎ４００１トランスポザーゼをコードする遺伝子を示す）を含むＴｎ４００１カセットを、グラム陰性複製起点およびグラム陽性複製起点（構成性または条件性（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ）（例えば、温度感受性）のいずれか）を有する広範囲のシャトルベクターに挿入した。このようなシャトルベクターの１つの例は、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌両方において機能するエリスロマイシン耐性遺伝子を含むｐＡＵＬ−Ａベクター（Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙら（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：５６８−５７４）である。このベクターは、グラ
ム陽性複製起点および温度感受性ｐＥ１９４グラム陽性複製起点の両方を含む。
【０１７１】
本明細書中で、本発明のトランスポゾンカセットを、以下のように模式的に示す。逆方向反復（ＩＲ）は、一般に、転移可能因子の末端を示す。従って、トランスポゾンについての１つの設計は、ＩＲ−ｔｎｐ−ＩＲであり、ここでｔｎｐは、トランスポザーゼをコードする遺伝子を示す。さらに、因子は、トランスポゾンに付加され得、同様に示され、例えば、ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲカセットの付加が、ＩＲ  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲ
ｔｎｐ  ＩＲとして模式的に与えられる。
【０１７２】
ＩＲ  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲ  ｔｎｐ  ＩＲカセットを、酵素ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩを使用してｐＭＧＣ５７から切断し、ｐＡＵＬ−ＡシャトルベクターのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位に連結して、シャトルベクター構築物ｐＡＵＬ−Ａ  Ｔｎ４００１  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲを得た。
【０１７３】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＤＨα５）を、エレクトロポレーションによりシャトルベクター構築物で形質転換し、１５０μｇ／ｍｌの濃度にてエリスロマイシンを含有するＬＢプレートにプレートし、３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体を、発光、エリスロマイシン耐性（ＥｍＲ）およびカナマイシン耐性（ＫａｎＲ）についてスクリーニングした。次いで、プラスミドＤＮＡを、発光コロニー、ＥｒＲコロニー、ＫａｎＲコロニーから単離した。
【０１７４】
（Ｂ．ｐＳＫ  Ｔｎ４００１  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲ  ｐＥ１９４シャトルベクターの構築）
Ｔｎ４００１  ｌｕｘＡＢＣＤＥ構築物についての送達系としてｐＡＵＬ−Ａを使用することに代えて、プラスミドｐＳＫおよびｐＥ１９４を組み合わせて使用した。
【０１７５】
Ｔｎ４００１カセットを、以下のように、ｐＭＧＣ５７からｐＳＫへと動かした：Ｔｎ４００１カセットを、ＸｈｏＩ／ＰｓｔＩを使用してｐＭＧＣ５７から切断し、同様に切断したｐＳＫと連結した。この連結物を、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αにエレクトロポレーションし、形質転換体を、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌを含有するＬＢ上で選択した。白色コロニーを、Ｔｎ４００１トランスポザーゼ遺伝子由来の配列を含むプライマーを用いて、ＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲによりポジティブであることが示されたコロニーは、準備された（ｐｒｅｐｐｅｄ）プラスミドであり、これらのＤＮＡをＸｈｏＩ／ＰｓｔＩで切断して、それが正確なサイズのフラグメントを含むことを確認した。
【０１７６】
次いで、ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲカセットを、２つのＩＲ配列との間にあるようにｐＳＫ  Ｔｎ４００１に動かした。最初に、アンピシリンカセットを、（ｌｕｘカセットのｐＳＫ  Ｔｎ４００１への引き続くクローニングを補助するために）酵素ＡｈｄＩ／ＫｐｎＩを用いてｐＳＫからｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲを除去した。次いで、ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲカセットを、アンピシリン欠失ｐＳＫ骨格からＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩを使用して切り出した。次いで、ｐＳＫ  Ｔｎ４００１  ＤＮＡを、ＥｃｏＲＶで切断し、平滑末端化したｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲカセットと連結した。
【０１７７】
連結物を、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αにエレクトロポレーションし、形質転換体を、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含有するＬＢ上で選択した。光形質転換体を、クロラムフェニコールまたはカナマイシンのいずれかに当てた（ｐａｔｃｈ）。陽性のクローンの正確な方向を、プライマーＭ１３ＦおよびＬｕｘＡ−Ｒを使用してＰＣＲにより確認した。
【０１７８】
次に、ｐＳＫ  Ｔｎ４００１  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲを、ＳａｃＩで直鎖状にし、平滑末端化した。最後に、このＤＮＡを、続いて平滑末端化したＣｌａＩ切断したｐＥ１９４と連結し、ｐＳＫ  Ｔｎ４００ｌ  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲ  ｐＥ１９４シャトルベクター構築物を得た。
【０１７９】
この構築物を、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αにエレクトロポレーションした。形質転換体を、１５０μｇ／ｍｌ  エリスロマイシンを含有するＬＢ上で選択した。次いで、得られた光コロニーを、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含有するＬＢ、および５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンまたは１５μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールのいずれかを含有するＬＢ上に当てた。
【０１８０】
（Ｃ．ｐＥ１９４  Ｔｎ４００１  ｐＳＫ  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲシャトルベクターの構築）
Ｔｎ４００１  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍＲシャトルベクターを構築した。ここで、グラム陰性起点を、２つのＩＲ配列の中に配置した。最初に、グラム陰性Ｔｎ４００１含有プラスミドｐＭＧＣ５７を、グラム陽性エリスロマイシン耐性プラスミドｐＥ１９４と融合した。ｐＭＧＣ５７を、ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩで切断し、平滑末端化した。同時に、ｐＥ１９４を、ＣｌａＩで切断し、平滑末端化した。次いで、これら２つの直鎖状にしたプラスミドを連結し、この混合物を、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αにエレクトロポレーションし、形質転換体を、１５０μｇ／ｍｌ  エリスロマイシンを含有するＬＢ上で選択した。
【０１８１】
第２に、クロラムフェニコール耐性カセットおよびグラム陰性起点を、ｐＭＧＣ５７／ｐＥ１９４複合物から取り出した。多くの上記のエリスロマイシン耐性コロニーから精製したプラスミドＤＮＡを、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ（クロラムフェニコール耐性カセットおよびグラム陰性起点に隣接する部位）で切断し、各消化物の一部を、アガロースゲル上で電気泳動して、正確なサイズのプラスミドを同定した。次いで、正確なサイズであるようであるプラスミド消化物の残りを、平滑末端化し、連結した。この連結物を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０にエレクトロポレーションし、０．３μｇ／ｍｌ  エリスロマイシンを含有するチョコレート寒天上にプレートした。
【０１８２】
最後に、ｐＳＫ  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍプラスミドを、Ｔｎ４００１のＩＲ内に導入した。ｐＭＧＣ５７／ｐＥ１９４  ｏｒｉ  ｃｍＲ  Ｓ．ａｕｒｅｕｓクローンのうち１０個から精製したプラスミドＤＮＡを、ＥｃｏＲＶで切断し、各消化物の一部を、アガロースゲル上で電気泳動して、正確なサイズのプラスミドを同定した。次いで、正しいサイズ（約６ｋｂ）を示すプラスミド消化物の残りを、平滑末端化したＢａｍＨＩ切断ｐＳＫ
ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍ  ＤＮＡと連結した。この連結物を、ＤＨ５αにエレクトロポレーションし、形質転換体を、１５０μｇ／ｍｌ  エリスロマイシンを含有するＬＢ上で選択した。次いで、生物発光コロニーを、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンまたは１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンのいずれかを含有するＬＢプレート上で２連にて当てて、後者の抗生物質カセットの活性を確認した。正確な方向における前者のプラスミドへのｐＳＫ  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  ｋｍ連結の可能性は約５０％であるはずなので、このような改変体が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおける表現型（転移の際に生物発光を付与する、正確な方向にてｌｕｘを有するプラスミドのみ）により同定され得ることを決定した。
【０１８３】
（実施例３：生物発光転移体の高密度スクリーニング）
選択培地を使用する代わりに、生物発光コロニーを、光検出および目視単離を使用して、固体培地上に高密度でプレートされたコロニーの中から単離した。
【０１８４】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ８３２５−４細胞を、ｐＥ１９４  Ｔｎ４０００１  ｌｕｘＡＢＣ
ＤＥで形質転換し、１０４〜１０５個の細胞／プレートの密度にて固体の非選択培地プレートにプレートし、３７℃にて一晩増殖した。強い生物発光シングルコロニーを、ＩＣＣＤカメラを使用して検出し、それらのコロニーを、使い捨てマイクロピペットチップを使用して採取し；所望のコロニーの発光表現型を、カメラを使用して確認した。このコロニーを使用して、ある容積の液体増殖培地を接種した。これを、次いで、新たな培地プレートに画線した。このプレートを、３７℃にて一晩インキュベートした。画線プレート上の１コロニーの中から、本質的に均一な光強度の観察により、純粋なコロニーの単離が確認されるまで、このプロセスを繰り返した。
【０１８５】
前述は、本発明のトランスポゾンカセットで形質転換された目的の生物を単離する手段として、抗生物質選択の必要性を避ける方法を示す。
【０１８６】
（実施例４：Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓに組み込み可能なゲノム標的化ベクターの構築、Ｃ．ａｌｂｏｃａｎｓの形質転換およびスクリーニング、ならびに形質転換した株の使用）
（Ａ．ベクター構築）
Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓにルシフェラーゼを発現するために、ルシフェラーゼ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中のＣＴＧコドンを、以下のように変更した。第一に、ｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ中のルシフェラーゼ遺伝子を、９つのＣＴＧコドン全てをＴＴＧコドンに変異誘発させることを容易にするために２つに分けた。１つのフラグメントは、４つのＣＴＧコドンおよび他の５つのＣＴＧコドンを含んだ。これらを、別々にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）にクローニングした。これらのコドンを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して変更した。各変異誘発工程後に、産物を配列決定して、所望の変異が組み込まれていることを確認した。
【０１８７】
簡単には、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで制限し、ルシフェラーゼオープンリーディングフレーム中に４つのＣＴＧコドンを含む５４０ｂｐフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。第二に、他の５つのＣＴＧコドンを含む７５１ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）に別々にクローニングした。これら９つのＣＴＧコドンを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によってＴＴＧに変異させた。相補的プライマー対を、部位特異的変異誘発キットとともに使用するために、構築した。図１は、ルシフェラーゼの部位特異的変異誘発に使用した相補的オリゴヌクレオチド対を示す。これらのオリゴヌクレオチドを使用して、部位特異的変異誘発によって、サイレント突然変異をｐＧＬ２  ＢａｓｉｃのＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ遺伝子に組み込んだ。太字で強調したヌクレオチドは、ＣＴＧからＴＴＧに変える必要のある変化である。下線を付したヌクレオチドは、プライマー安定性に必要な塩基変化である。これらの変化は、タンパク質のアミノ酸配列に影響しない。さらに、プライマーＲＲ４５ＴおよびプライマーＲＲ４５Ｂについて、ＣＴＧからＴＴＧへの２つの変異は、１つの反応でこれらの両方を組み込むのに十分近くであった。
【０１８８】
９つのコドン全ての変異誘発後、これらの変異を含むＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントおよびＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）から切り出して、ｐＧＬ−Ｂａｓｉｃに再クローニングしてｐＬｕｃＴ９を生成した。
【０１８９】
ルシフェラーゼコドンの改変に加えて、これらの構築物をまた、プロモーターおよびポ
リアデニル化シグナル（両方ともＣａｎｄｉｄａ由来である）を含むように作製した。このために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）を、ＮｏｔＩで切断し、この末端を平滑化し、そしてリン酸化ＡｓｃＩリンカー（５’−ＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴ−３’；配列番号２１）を、平滑末端部位に連結してｐＢＳ−ＡＳＣを作製した。９つのＴＴＧコドンを含むルシフェラーゼオープンリーディングフレームを、プライマーＬＵＣＢおよびプライマーＬＵＣＰ（図２Ａ）を用いてｐＬｕｃＴ９からＰＣＲすることにより増幅し、ＢａｍＨＩ部位およびＰｓｔＩ部位に直接隣接する改変ルシフェラーゼオープンリーディングフレームを含む産物を作製した。この増幅産物を、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで制限し、ｐＢＳ−ＡＳＣにクローニングして、プラスミドｐＢＳ−Ｌを生成した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓアクチン（ＡＣＴ１）遺伝子（ＤｅｌｂｒｕｃｋおよびＥｍｓｔ（１９９３）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０（４）：８５９−６６）の転写終止領域を、プライマーＡＣＴ−ＴＰおよびプライマーＡＣＴ−ＴＨ（図２Ａ）を用いてＣＡＩ４ゲノムＤＮＡからＰＣＲすることにより増幅し、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてｐＢＳ−Ｌに連結してｐＢＳ−ＬＡを生成した。
【０１９０】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓエノラーゼ遺伝子（ＥＮＯ１）のプロモーター（ＳｕｎｄｓｔｒｏｍおよびＡｌｉａｇａ（１９９２）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７４（２１）：６７８９−９９）を、プライマーＥＮＯＡおよびプライマーＥＮＯＢ（図２Ａ）を用いてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ株ＣＡＩ４  ＤＮＡからＰＣＲすることにより増幅した。ＥＮＯ１プロモーターを、選択した。なぜなら、これは、調節されていない構成的な発現を有することが示されたからである（ＰｏｓｔｌｅｔｈｗａｉｔおよびＳｕｎｄｓｔｒｏｍ（１９９５）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７７（７）：１７７２−９）。
【０１９１】
増幅したＰＣＲ産物を、ＡｓｃＩおよびＢａｍＨＩで切断し、その同一の制限酵素で切断したｐＢＳ−ＬＡにクローニングして、ｐＢＳ−ＥＬＡを生成した。よって、ＥＮＯ１プロモーターを、ルシフェラーゼ開始コドンのすぐ上流に挿入したＢａｍＨＩ部位を介して、変更したルシフェラーゼオープンリーディングフレームに融合した。ＰｓｔＩ部位を、ルシフェラーゼ遺伝子の終止コドンの直後に配置した。
【０１９２】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）のマルチクローニング部位（ＮｏｔＩ部位からＸｈｏＩ部位まで）を、制限酵素部位ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＦｓｅＩ、ＳｂｆＩおよびＸｈｏＩを含む合成リンカー（図２Ａ；合成リンカーＡ、配列番号３４；合成リンカーＢ、配列番号３５；そして図２Ｃは、これら２つの合成リンカーの相補対を示す）で置換し、ｐＢＳ−ＮＸを生成した。プロモーター−ルシフェラーゼターミネーターカセットを、ＡｓｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでｐＢＳ−ＥＬＡから切り出し、ｐＢＳ−ＮＸにクローニングしてｐＮＸ−ＥＬＡを生成した。ＵＲＡ３遺伝子を、プライマーＵＲＡＨおよびプライマーＵＲＡＦ（図２Ａ）を用いるＰＣＲにより、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ−Ｅ．ｃｏｌｉシャトルプラスミドｐＲＣ２３１２（Ｃａｎｎｏｎ（１９９２）、上述）から増幅した。この増幅産物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＦｓｅＩで切断し、ｐＮＸ−ＥＬＡに連結してｐＮＸ−ＥＬＡＵを生成した。
【０１９３】
ｕｒａ３：：ｉｍｍ４３４／ｕｒａ３：：ｉｍｍ４３４  ＣＡＩ４株におけるパイロット実験について、標的化ベクターは、完全なＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＵＲＡ３遺伝子を含み、これは、細胞にウラシル栄養性を回復させた。高密度スクリーニング（以下を参照のこと）において、ＵＲＡ３機能についての選択は、臨床的単離物ＡＴＣＣ  ３２０３２、ＡＴＣＣ  １０２６１およびＡＴＣＣ  ９０２３４を用いて行われなかった。
【０１９４】
全てのプラスミド単離および酵素反応を、標準的条件下（Ａｕｓｕｂｅｌ、上述；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上述）または製造業者の手引きに従って、行った。全ての連結を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＤＨ５α（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ）にエレクトロポレーションし、１００μｇアンピシリン／ｍｌを含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で増殖させた。ＰＣＲを、Ｇｅｎｅａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｅｔｅｍ  ９７００自動化サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。反応を、細壁の（ｔｈｉｎ  ｗａｌｌｅｄ）２００μｌ  ＰＣＲチューブ中で、２５ピコモルの各オリゴヌクレオチドプライマー（Ｏｐｅｒｏｎ）、５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに同梱される）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）、１ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１ｎｇのテンプレートＤＮＡを含有する５０μｌ容量にて行った。増幅を、以下の条件下で行った：９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１〜２分間を４０サイクル（予想される産物のサイズに依存する）、および７２℃で５分間の最終伸長工程。ＰＣＲ産物の制限の前に、反応混合物を、スピンカラム（ＰＣＲ増幅キット；Ｑｉａｇｅｎ）に通した。
【０１９５】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ標的化配列をまた選択して、ベクターに挿入した。この標的化ベクターの構築の際に、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓゲノムＤＮＡを含む６つのコスミドの配列を、ＧｅｎＢａｎｋからダウンロードした（登録番号：ＡＬ０３３５０１、ＡＬ０３３４９７、ＡＬ０３３５０３、ＡＬ０３３５０２、ＡＬ０３３３９６およびＡＬ０３３３９１）。配列データ注釈から推定されるオープンリーディングフレームを、ＤＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ２ＴＭ（Ｔｅｘｔｃｏ，Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）を使用してマッピングした。推定のオープンリーディングフレームをいずれも含まない約３ｋｂのいくつかの領域を、反復Ｃａｎｄｉｄａ配列（Ｃｈｉｂａｎａ，Ｍａｇｅｅ，ら（１９９８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４９（４）：１７３９−５２）または可能な他のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対する相同性について試験した。推定のオープンリーディングフレームをいずれも含まない大きな領域（約３ｋｂ）を、５００ｂｐ部分に分け、そして各々を、当時公知であったＣａｎｄｉｄａ配列の全てのｂｌａｓｔ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５（３）：４０３−１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２）において使用した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｃａｎｄｉｄａでのＳｔａｎｆｏｒｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒウェブサイト）。
【０１９６】
公知の遺伝子または反復配列に対して顕著な相同性を有する領域を、考慮から除いた。コスミドＣＡ４１Ｃ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０３３５０１）中の、ヌクレオチド２３５６〜５８５８の領域を、選択した。この３５０２ｂｐの領域において、最初の１０００ｂｐおよび最後の１０００ｂｐを、隣接するオープンリーディングフレームから、存在し得る任意のプロモーターを含まないようにするために、考慮から除いた。このベクターの５’標的化領域および３’標的化領域について選択されたフラグメントを、Ｃａｎｄｉｄａゲノムにおいて１２５ｂｐで分離した。使用したこの株のゲノム標的化領域を、ゲノムＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物より分離した。公開されたコスミド配列における領域とＡＴＣＣ３２０３２とは、ＡＴＣＣ３２０２がヌクレオチド４７４５でのグアニン残基の代わりにアデニン残基を有したことを除いて同一であった。他の３つの株は、ヌクレオチド３９４２でグアニンを、ヌクレオチド４６４５でチミジンを、そしてヌクレオチド４００７〜４１３１のタンデム重複を有した。
【０１９７】
選択された標的化領域を、ルシフェラーゼ発現カセットおよびＵＲＡ３遺伝子に隣接して、標的化ベクター中にクローニングした。特に、ＣＡ４１Ｃ１０のヌクレオチド３８５２〜４３０７を、プライマーＴＡＲ５ＮおよびプライマーＴＡＲ５Ａ（図２Ｂ）により、
ＣＡＩ４  ＤＮＡからのＰＣＲによって増幅した。増幅した産物を、ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩで切断し、ｐＮＸ−ＥＬＡＵにクローニングしてｐＮＸ−５ＥＬＡＵを生成した。別の領域（ヌクレオチド４４３６〜４７８９）を、プライマーＴＡＲ３ＦおよびプライマーＴＡＲ３Ｓ（図２Ｂ）により、ＣＡＩ４  ＤＮＡからのＰＣＲによって増幅した。増幅産物を、ＦｓｅＩおよびＳｂｆＩで切断し、ｐＮＸ−５ＥＬＡＵにクローニングしてｐＧＴＶ−Ｅｎｏを生成した。ＫｐｎＩ部位は、これらの標的化領域の各々の外側端近傍に位置させる。この構築物を、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換に使用する前に、ＫｐｎＩで切断した。
【０１９８】
ｐＧＴＶ−ＥＮＯの構築物は、図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃに図示的に示される。
【０１９９】
（Ｂ．Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ株の形質転換）
次いで、ＢｒａｕｎおよびＪｏｈｎｓｏｎの方法（ＢｒａｕｎおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７（５３２２）：１０５−９）の改変を用いて、標的化構築物を使用して、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓを形質転換した。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｃｓ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅ／ＪｏｈｎｓｏｎＬａｂ／ｂｕｒｋ／ｂｕｒｋ．ｈｔｍｌ）を、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ形質転換全てに使用した。１００ｍｌ培養物を、５０ｍｇ／ｍｌウリジン（Ｓｉｇｍａ）で補充したＹＰＤ中で、３０℃で一晩増殖させた。一晩の細胞培養物を、同一の培地中に希釈して、ＯＤ６００が１〜１．５まで増殖させた。細胞を、５分間４０００ｒｐｍでペレット化し、２０ｍｌのＬＡＴＥ緩衝液（１００ｍＭ  酢酸リチウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。細胞を、再度ペレット化し、そして１ｍｌのＬＡＴＥ緩衝液中に再懸濁した。１００μｌの細胞を、１０ｍｇ／ｍｌの変性した剪断サケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）および１〜１０μｇのＫｐｎＩ消化プラスミドＤＮＡ  １０μｌと混合した。７００μｌのＰＬＡＴＥ（ＬＡＴＥ緩衝液中４０％ポリエチレングリコール３３５０）を添加し、そしてマイクロピペッターで穏やかに混合した。形質転換反応物を、３０℃で３ｈインキュベートし、４２℃で４５分間熱ショックを与えた。細胞をペレット化し、４００μｌのＹＰＤ中に再懸濁し、そしてルシフェリンを含有する非選択培地上にプレートした。
【０２００】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＣＡＩ４（ｕｒａ３：：ｉｍｍ４３４／ｕｒａ３：：ｉｍｍ４３４）（ＦｏｎｚｉおよびＩｒｗｉｎ（１９９３）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３４（３）：７１７−２８）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡのＪｕｄｉｔｈ  Ｂｅｒｍａｎ博士より親切にも提供された。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ株ＡＴＣＣ３２０３２、１０２６１および９０２３４を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より得た。ＹＰＤ培地（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、２％（ｗ／ｖ）ペプトン、１％（ｗ／ｖ）酵母抽出物および２％（ｗ／ｖ）グルコースを含有する。合成的に規定された（ＳＤ）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）培地は、０．１７％（ｗ／ｖ）酵母窒素ベース（アミノ酸を含まず）、０．５％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、２％（ｗ／ｖ）デキストロース（グルコース）および０．０７７％（ｗ／ｖ）完全補充混合物（ウラシルを含まず）（ＣＳＭ−ｕｒａ）を含む。ＣＳＭ−ｕｒａについての形質転換は、以下のようである（成分をｍｇ／Ｌで表す）：アデニン  １０；Ｌ−アルギニン  ５０；Ｌ−アスパラギン酸  ８０；Ｌ−ヒスチジン−ＨＣｌ  ２０；Ｌ−イソロイシン  ５０；Ｌ−ロイシン  １００；Ｌ−リジン  ５０；Ｌ−メチオニン  ２０；Ｌ−フェニルアラニン  ５０；Ｌ−トレオニン  １００；Ｌ−トリプトファン  ５０；Ｌ−チロシン  ５０；およびバリン  １４０；合計７７０ｍｇ。この粉末７７０ｍｇ（０．７７ｇ）を、１ＬのＳＤに添加してＳＤ−ｕｒａを作製する。プレート上での増殖について、アガー（Ｄｉｆｃｏ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を１．５％（ｗ／ｖ）まで添加した。
【０２０１】
（Ｃ．高密度スクリーニング）
高密度スクリーニングについて、形質転換した細胞を、線状化したｐＧＴＶ−Ｅｎｏ構築物で形質転換し、形質転換した細胞を１ｍｌ  ＹＰＤ中に再懸濁し、５０μｇ／ｍｌウリジンを補充した、６００μｇ／ｍｌルシフェリン（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を含有する１４０ｍｍ  ＳＤ−ｕｒａプレート  ２０枚に（約２．５×１０５細胞／プレートの密度で）プレートし、３０℃で一晩増殖させた。この培地上でのプレーティングは、（ＹＰＤ培地上への細胞のプレーティングと比較して）良好な軽度の産生を提供した。使用した培地は、非形質転換細胞および形質転換細胞の同様な増殖を可能にし、よって、選択圧を与えなかった。従って、細胞の叢が各プレートに増殖する。
【０２０２】
翌朝、プレートを、ＩＶＩＳＴＭ画像化システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を５分間使用して、ＩＶＩＳＴＭ画像化システム上で画像化した。ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅＴＭソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を使用して、この画像を取得および分析した。特定の場合において、液体培養物およびプレートを、光子計数増感電荷結合デバイス（ＩＣＣＤ）カメラ（モデル２４００−３２、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）を使用して、画像化した。
【０２０３】
生物発光する少数の形質転換細胞を、多くの非形質転換細胞の黒バックグラウンドに対して検出し得る。高密度でのプレーティングでは、生物発光細胞の純粋なコロニーを拾い上げることは困難である。よって、細胞を、生物発光コロニーの位置で、およびその周囲で、プレートから拾い上げ、１．５ｍｌの微量遠心分離チューブに移し、そして５０μｇ／ｍｌウリジンを補充したＳＤ−ｕｒａ中で３０℃で一晩増殖させた。各チューブからのアリコートを、６００μｇ／ｍｌのルシフェリンを含有するＳＤ−ｕｒａとともに、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル中に置いた。プレートを５分間画像化し、生物発光細胞を含有する培養物を希釈して、単一コロニー単離のために５０μｇ／ｍｌウリジンを補充したＳＤ−ｕｒａプレート上に広げた。得られた生物発光細胞は、繰り返し継代され、そしてシグナルを消失することなく安定であった。さらに、標的化領域で組み込まれた構築物を含むＣａｎｄｉｄａの増殖速度は、親細胞と同一である。
【０２０４】
（Ｄ．サザンブロッティング）
臨床的酵母株ＡＴＣＣ３２０３２、１０２６１および９０２３４の形質転換体由来のゲノムＤＮＡを、ＦｕｊｉｍｕｒａおよびＳａｋｕｍａ（ＦｕｊｉｍｕｒａおよびＳａｋｕｍａ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４（４）：５３８−４０）に従って、単離した。このゲノムＤＮＡをサザンブロットし、そしてゲノム標的化領域にわたるフラグメントでプローブした。３つの形質転換株全てにおいて、この構築物は、ゲノム中の正確な位置で組み込まれていた。
【０２０５】
（Ｅ．膣内感染）
６週齢を超える雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。偽発情を誘導するために、１００μｌの吉草酸エストラジオールを、ゴマ油中に２ｍｇ／ｍｌで溶解し、そして感染の７２〜９６時間前およびその後毎週、腹膜内で注入した。５０ｍｌのＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ株の培養物を、３０℃で一晩増殖させた。細胞を、１０分間４，０００ｒｐｍでペレット化し、２５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、１０ｍｌ
ＰＢＳ中で２度繰り返した。次いで、細胞を、血球計算板で計数し、感染に適切な密度にＰＢＳに希釈した。２０μｌの摂取物（５×１０４細胞を含む）を、ピペットから膣内腔に投与した。この動物を、播種後１分間逆位で保持した（Ｒｏｍａｎｉ（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：１９．６．１−１９．６．１６）。この播種物を、最初の画像を取得するまで６時間置いたままにした。
【０２０６】
例えば、感染させたマウスを、Ｃａｎｄｉｄａの光生成株での感染の１日後、２日後、３日後、５日後、６日後、７日後、９日後、１３日後、１５日後および２１日後に画像化した（画像化を、マウスを固定した後、本明細書中上記の手順（物質の投与を含む）に従って、行った）。全てのマウスの画像のインビボでの時系列は、光生成Ｃａｎｄｉｄａのモニタリングによって鮮明に画像化した感染の進行性の経過を示した。２１日目に、動物を安楽死させ、そして膣組織を取り出し、試験した。この組織を画像化し、そして光生成Ｃａｎｄｉｄａである感染性因子の存在を、鮮明に示した。
【０２０７】
画像化の直前、マウスをイソフルランで５分間麻酔した。上記の全身画像化に加えて、休眠時に、各マウスを、逆位で保持し、そして１６．６ｍｇ／ｍｌ  ルシフェリンおよび１６．６ｍＭ  ＡＴＰを含有するＰＢＳ  １００μｌで洗浄した。ピペットチップを、膣内腔に挿入し、洗浄液を追い出した。この洗浄液を上下に吸引し、腔壁をリンスした。洗浄に続いて、ほとんどのルシフェリン溶液を取り出し、微小遠心分離チューブ中に保存し、腔内に約１０〜２０μｌを残したままにした。３匹のマウスの各群由来の洗浄液をプールしそして画像化した。ＰＢＳでの連続希釈（１０×、１００×および１０００×）を、５０ｍｇ／ｍｌウリジンおよび１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＹＰＤ培地上にプレートした。プレートを、３０℃で２４〜４８時間増殖させて、そして計数した。洗浄液から得られた細胞の細胞形態の光学顕微鏡による試験は、Ｃａｎｄｉｄａ細胞の毒性の（ｖｉｒｕｌｅｎｔ）菌糸形態の存在を示した。
【０２０８】
従って、これらの結果は、ルシフェラーゼ含有構築物を、選択マーカーに感受性ではないレポーター構築物として細胞中で使用し得ることを示した。さらに、これらの結果は、ルシフェラーゼ含有構築物を高密度スクリーニングに使用して形質転換事象を検出し得、さらに動物全体での観察を可能にし得ることを示した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでのその発現を可能にするように変更した発光性飛翔昆虫Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼ遺伝子を使用することによって、形質転換したＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ細胞を、光生成についてスクリーニングすることにより、遺伝的選択（すなわち、選択マーカーの使用）を用いることなく単離した。形質転換細胞の検出についての典型的な例は、導入したＤＮＡによって置換した栄養性の欠損、または薬物耐性のいずれかによる選択を使用する。栄養要求性変異体の置換について、レシピエント細胞は、その遺伝子の欠損を有する。薬物耐性について、細胞は、その薬物に対する感受性を有する。しかし、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓは、ハイグロマイシン、ベノミル、シクロヘキシミド、マイトマイシンＣおよびツニカマイシンに対して耐性である（Ｂｅｃｋｅｒｍａｎ，Ｃｈｉｂａｎａら（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６９（１）：１０８−１１４）。本明細書中に記載される高密度スクリーニングは、遺伝的選択に関与せず、そして形質転換体を取得するために効率よい方法を提供する。首尾よい形質転換は、約５×１０−５〜１０−６（５〜１０生物発光コロニー／切断ＤＮＡ５μｇ）の頻度で生じ、そして大過剰の非形質転換細胞の中で形質転換体（すなわち、光生成細胞）を検出する際に問題はなかった。本明細書中で示される首尾よい形質転換を、ＡＴＣＣ由来の他のいくつかの毒性株をもちいて反復した。
【０２０９】
現在のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ感染の動物モデルの全てが、終了点での動物の死または屠殺、組織の収集、細胞数のためのホモジネートのプレーティング、および／または組織学のための組織の切片化を含む。このようなアプローチは、一般に、疾患進行における単回の遅い時点で調べられ、そして単一の動物での感染経過の追跡を可能にしない。本発明は、生物発光細胞を提供し、次いで生きた感染した動物において画像化し得る方法を記載する。これは、他の方法を伴っても可能である、感染の多くの一時的な局面および空間的局面の試験を可能にする。
【０２１０】
本発明の好ましい実施形態がいくらか詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲
に規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく明らかな変更がなされ得ることが、理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】図１は、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓにおいてそのコード配列の発現のためのルシフェラーゼの部位特異的変異誘発のために使用される、相補的オリゴヌクレオチド対を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換において使用するためのルシフェラーゼ発現ベクターを作製するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換において使用するためのルシフェラーゼ発現ベクターを作製するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、合成リンカーＡおよび合成リンカーＢのアライメントを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ｐＧＴＶ−ＥＮＯプラスミドベクターの構築を図示する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｐＧＴＶ−ＥＮＯプラスミドベクターの構築を図示する。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ｐＧＴＶ−ＥＮＯプラスミドベクターの構築を図示する。
【図１】
2008148715.tif 000005
【図２Ａ】
2008148715.tif 000006
【図２Ｂ】
2008148715.tif 000007
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2008148715.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月3日(2008.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008148715000001.app