(57)【要約】【課題】  フィトフトラ属に属する微生物に起因する植物疫病を、簡便な操作により、経験と勘を必要とせず、効果的に防除する、微生物農薬を用いた新規な植物疫病の防除剤、それを用いた植物疫病の防除法及び植物疫病抵抗性植物を提供する。【解決手段】  キュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを含む植物疫病の防除剤を、予め植物苗に接種することによって、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属に属する微生物による植物疫病を防除する。また、植物疫病抵抗性植物、例えば植物疫病抵抗性唐辛子苗を得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィトフトラ属に属する微生物に起因する植物疫病の防除剤であって、キュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを含むことを特徴とする植物疫病の防除剤。
【請求項２】
キュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスが、サテライトＲＮＡを含有するキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスである請求項１に記載の植物疫病の防除剤。
【請求項３】
サテライトＲＮＡが、配列番号１記載のサテライトＲＮＡである請求項２に記載の植物疫病の防除剤。
【請求項４】
微生物が、フィトフトラカプシシレオニアンである請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物疫病の防除剤。
【請求項５】
弱毒ウイルスの粒子が５０〜５００μｇ／ｍｌの濃度で含まれる請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物疫病の防除剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物疫病の防除剤を植物苗に接種することを特徴とする植物疫病の防除法。
【請求項７】
植物が唐辛子である請求項６に記載の植物疫病の防除法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物疫病の防除剤を植物苗に接種して得られる植物疫病抵抗性植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、唐辛子、トマト等に生じる植物疫病菌であるフィトフトラカプシシレオニアン（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉ  Ｌｅｏｎｉａｎ）等のフィトフトラ属に属する微生物に起因する植物疫病の防除剤、それを使用した植物疫病の防除法及び植物疫病抵抗性植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物疫病菌は、植物疫病の病原菌であり、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属の菌類の総称である。この植物疫病菌の分類学的位置は、藻菌綱（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、卵菌亜綱（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、べと病菌目（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｌｅｓ）、ピチウム菌科（Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ）、病原菌属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、疫病菌属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）である。その菌体は、通常、無隔菌糸体、分生子柄、分生胞子（遊走子のう）、卵胞子からなる。このなかで分生柄及び分生胞子が患部の外表部に現れて植物疫病の標兆となる。植物疫病菌の種類としては、例えば、トウガラシ疫病やトマト灰色疫病、ナス褐色腐敗病、キュウリ灰色疫病、スイカ褐色腐敗病及びカボチャ疫病を起こすフィトフトラカプシシレオニアン（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉ  Ｌｅｏｎｉａｎ）やジャガイモやトマトの疫病を起こすフィトフトラインフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、リンゴや枇杷その他の樹木類の疫病を起こすフィトフトラカクトラム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｃｔｏｒｕｍ）、パイナップルの疫病を起こすフィトフトラシナモミ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｉ）、ウリ類の疫病を起こすフィトフトラメロニス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｌｏｎｉｓ）、タバコの疫病を起こすフィトフトラバルニコチアナエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｖａｒ．  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、及び花卉類の疫病を起こすフィトフトラバルパラシチカ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｖａｒ．  ｐａｒａｓｔｉｃａ）等が挙げられる。
【０００３】
上記したように唐辛子、トマトの植物疫病をはじめとする植物疫病は、フィトフトラ属に属する微生物により起こされる病気である。代表的な植物疫病菌としてはフィトフトラカプシシレオニアンが挙げられ、主な宿主作物としては、ナス科植物（唐辛子、ナス、トマト等）、ウリ科植物（キュウリ、カボチャ、スイカ、マクワウリ、シロウリ等）が挙げられる。
この植物疫病菌は、圃場に残された作物の被害茎葉上や土中で越冬して、伝染源となることが知られている。そして、病斑上の分生胞子は、風雨によって飛散し、葉に達すると水滴の中で発芽して菌糸によって葉の気孔から進入することになる。この植物疫病菌の発生は気温が４〜２６℃の条件でみられ、２０℃以下の低温の場合には、分生胞子のほとんどが、「遊走子のう」となって多数の遊走子を生ずる。そして、この「遊走子のう」が活動する適温は、１２〜１３℃であるため、２０℃以下の低温でも植物疫病が蔓延することになる。この遊走子は水の中を泳いで気孔に達するため、多湿条件では、遊走子の遊泳、発芽、侵入が容易になる。
植物疫病は、日本では、低温多湿となる梅雨時期又は秋雨時期に多発することが知られている。この植物疫病を防除する技術としては、抵抗性品種が存在しないことから、施設栽培では低温多湿をできる限り避けることが重要となり、その他に薬剤散布に頼らざるを得ないのが現状である。この植物疫病に対する効果的な薬剤は存在するが、いずれも人体に対する安全性が高いとは言えず、農産物における残留や環境影響が懸念され、薬剤を代替あるいは補完する微生物農薬を用いた病害制御技術の確立や普及が求められている。
【０００４】
従来、微生物農薬を用いた植物疫病の防除に関する研究としては、植物内生型相利共生細菌であるシュードモナス・フルオレッセンスＦＰＴ−９６０１菌株とシュードモナス属ＦＰＨ９６０１菌株を含有する育苗培土に関する報告（特許文献１参照）及び、フィトフトラ属に属する微生物に対して拮抗作用を有するバチルス属細菌の菌体又は培養物を含む植物疫病の防除剤に関する報告（特許文献２参照）がわずかに知られているに過ぎない。
しかしながら、前者の共生細菌を使用する方法は、共生細菌の圃場への定着に時間がかかること、その処理が複雑で手間がかかる等の問題点があり、より簡便で且つ効果的な植物疫病に対する防除法が望まれている。
また、後者のバチルス属細菌を含む植物疫病の防除剤を使用する方法は、該細菌を植物の葉面や茎へ噴霧、散布し、該植物体の表面に定着させる方法であるため、操作が煩雑で、経験と勘を必要とする問題点を有する。
【０００５】
このように、微生物農薬を用いた植物疫病の防除に関する研究としては、あまり知られておらず、弱毒ウイルスを含む疫病防除剤については全く知られていない。
【０００６】
一方、弱毒ウイルスを予め植物（野菜、花卉、タバコ、豆類、果樹等）の幼苗に接種することにより、キュウリモザイクウイルスを防除する方法が知られている（例えば、特許文献３、特許文献４参照）。
この方法は、植物には既に感染しているウイルス病と同じウイルス又は極めて近縁なウイルスには感染しにくいという現象（これを干渉作用という）を利用するもので、具体的には植物に容易に感染して、その体内で盛んに増殖しても植物そのものの生育にほとんど影響を及ぼさない程度の弱い病原性のウイルス（これを弱毒ウイルスという）を、無病の植物に予め感染させ、強毒ウイルスの感染や被害を防ぐこと（これを防除という）を可能としたものである。
【０００７】
しかし、この方法は、専ら弱毒ウイルスの干渉作用によって、同種の強毒キュウリモザイクウイルスがもたらす病害を防除するもので、植物疫病菌がもたらす病害すなわち植物疫病を防除するものではない。
【特許文献１】特許第２８３５５９８号公報
【特許文献２】特開２００１−２０６８１１号公報
【特許文献３】特許第２９７５７３９号公報
【特許文献４】特許第３７２８３８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、微生物農薬を用いた新規な植物疫病の防除剤、すなわちフィトフトラ属に属する微生物に起因する植物疫病を、簡便な操作により、経験と勘を必要とせず、効果的に防除する植物疫病の防除剤を提供すること、また、それを用いた植物疫病の防除法及び植物疫病抵抗性植物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討したところ、キュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス、及びサテライトＲＮＡを含有するキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスが、フィトフトラ属に属する微生物に対して、拮抗作用を有することを見出し、更にこのサテライトＲＮＡを分析したところ、配列番号１に記載のサテライトＲＮＡを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下に示す植物疫病の防除剤、防除法及び植物疫病抵抗性植物である。
（１）フィトフトラ属に属する微生物に起因する植物疫病の防除剤であって、キュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを含むことを特徴とする植物疫病の防除剤。
（２）キュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスが、サテライトＲＮＡを含有するキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスである上記（１）の植物疫病の防除剤。
（３）サテライトＲＮＡが、配列番号１記載のサテライトＲＮＡである上記（２）の植物疫病の防除剤。
（４）微生物が、フィトフトラカプシシレオニアンである上記（１）〜（３）の植物疫病の防除剤。
（５）弱毒ウイルスの粒子が５０〜５００μｇ／ｍｌの濃度で含まれる上記（１）〜（４）のいずれかの植物疫病の防除剤。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかの植物疫病の防除剤を植物苗に接種する植物疫病の防除法。
（７）植物が唐辛子である上記（６）の植物疫病の防除法。
（８）上記（１）〜（５）のいずれかの植物疫病の防除剤を植物苗に接種して得られる植物疫病抵抗性植物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の植物疫病の防除法によれば、弱毒ウイルスの接種という簡便な操作により、植物疫病の防除剤を植物体の組織内に定着させ、一回の操作にて植物疫病を持続的に防除することが可能となる。また、本発明の植物疫病の防除剤は、施用する場合に、特別な経験と勘を必要としない利点を有する。また、本発明の防除剤は、唐辛子や、トマトの植物疫病に対する防除効果が優れており、高品質の唐辛子やトマトを収量よく収穫できる効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下本発明を詳細に説明する。
（１）弱毒ＣＭＶの単離
本発明のキュウリモザイクウイルス（以下、ＣＭＶという）の弱毒ウイルス（以下、弱毒ＣＭＶということがある）は、以下のようにして単離する。
唐辛子圃場やトマト圃場等より、ウイルス症状を持つ約６００枚の唐辛子葉又はトマト葉を採集し、これらの葉に１０倍量のリン酸緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えて磨砕し、その液をトマト苗（例えば、日本デルモンテ社製、トマト苗ＴＭＫ１４３）に接種する。
一週間後、各々のエライザー検定を行い、いくつかの系統についてＣＭＶの感染を確認する。
これらの中から弱毒ＣＭＶを選抜すべく、トマトの感染葉をそれぞれトマト苗（ＴＭＫ１４３）１０株ずつに接種し、一週間後、ＴＮＡ法（Ｔｏｔａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｋａｐｅｒ，Ｊ．Ｍ．１９８９，Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｓａｔｅｌｉｔｅ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｐｌａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｍｐｌｅｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３，Ｐ８３〜９４参照）によって、リボ核酸（ＲＮＡ）分析を行う。
そして、サテライトＲＮＡを有するＣＭＶを、前述の系統の中から取得する。そして、取得した系統についてトマト苗におけるウイルス症状調査を行い、ネクロシス、モザイクが発病した系統や感染力を有しない系統を取り除き、ウイルス症状が軽微でウイルス増殖量の多い弱毒ＣＭＶを選抜する。この選抜した弱毒ＣＭＶは遺伝的に均一ではなく、ウイルス症状が異なっている場合が多いので、トマト苗１００株にこれら弱毒ＣＭＶを接種し、弱いウイルス症状が揃っている株だけを選抜する。さらにサテライトＲＮＡの存在が継続されている株だけを取得して、ウイルス接種液の調製を行い、再度トマト苗に接種し、同じ選抜操作をしてウイルス接種液を調製する作業を５回繰り返し、トマトで継代接種を行う。そして、サテライトＲＮＡを安定して含む弱毒ＣＭＶ（例えばＮＤＭ０５−２）を単離する。
【００１３】
（２）サテライトＲＮＡの単離
サテライトＲＮＡを含む弱毒ＣＭＶをトマト苗の子葉に接種、感染させ、１〜４週間程度ウイルスを増殖させる。
次いで、トマト本葉を採取し超低温（例えば、−８０℃）にて凍結する。
そしてこの感染葉を粉砕し、２倍量の ０．１％チオグリコール酸を含む ０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）と同量のクロロホルムを加え、ワーリングブレンダーで破砕する。
この破砕液を９，５００Ｘｇ、１０分間遠心分離処理し、上層（水層）の１０％に当たる重量のポリエチレングリコールを加え溶解させた後、４０分間静置する。この溶液を９，５００Ｘｇ、２０分間遠心分離処理し、得られた沈殿に２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０） を加え懸濁均一化する。この粗精製品を１２，０００Ｘｇで遠心分離し得られた上清を２４０，０００Ｘｇ、４５分間遠心分離処理し、沈殿を回収し、これを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁する。これら溶液に最終濃度で１％になるように１０％ＳＤＳを加え、さらに溶液と等量のフェノールを加えた後１２，０００Ｘｇ、１５分間遠心分離処理する。この上層（水層）を回収し、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返してＲＮＡを単離、精製する。
この方法で感染葉１００ｇより、約１００μｇのＲＮＡを得る。
上記の方法で得られたＲＮＡを水にそれぞれ溶解し、１０〜４０％ショ糖密度勾配により超遠心分離（１７５，０００Ｘｇ、１６時間）して得られたサテライトＲＮＡのバンドを採取し、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返して、サテライトＲＮＡを単離精製する。
また精製が不十分な場合は６Ｍ尿素を含む９％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、臭化エチジウムの溶液で染色し、サテライトＲＮＡのバンドの部分をカミソリなどで切り取る。
サテライトＲＮＡのバンドを含むゲル断片を透析チューブに入れＥＤＴＡを含むトリス−酢酸緩衝液中で電気泳動による溶出を行ってサテライトＲＮＡを回収した後、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返してサテライトＲＮＡを単離精製する。
この電気泳動によるサテライトＲＮＡの単離精製の詳細はＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）］に従って行う。
【００１４】
（３）サテライトＲＮＡのクローニングとシークエンス
単離精製したサテライトＲＮＡからマイナス鎖ｃＤＮＡを合成するために、サテライトＲＮＡ（約３μｇ）と３’末端塩基配列に相補的なＤＮＡプライマー（８塩基、１μＭ）を９５℃で熱処理した後、徐冷してアニーリングする。このマイナス鎖ｃＤＮＡ合成反応はＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、３７℃、６０分の条件で行う。
次に、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させる。すなわち、プラス鎖サテライトＲＮＡの５’末端に相同的なＤＮＡプライマーと３’末端塩基配列に相補的なＤＮＡプライマーを用い、９４℃１分間、３７℃１分間、７２℃２分間の反応を４５回繰り返すことによってＰＣＲ反応を行う［ＰＣＲ反応液；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２００μＭ  ｄＮＴＰ、２．５ｕｎｉｔｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）］。
【００１５】
このｃＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離させた後、ゲルより切り出し、ＤＮＡ回収キットＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて精製する。得られたｃＤＮＡをＴＡクローニング用ベクターｐＧＥＭ  Ｔ  Ｅａｓｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングする。このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲ１で切断することによって、サテライトＲＮＡ由来のｃＤＮＡを確認する。
【００１６】
このサテライトＲＮＡの塩基配列をＴｈｅｒｏｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）とＤＮＡシーケンサＤＳＱ−１０００Ｌ（島津製作所社製）を用いて決定する。このようにして、例えば、３４０塩基からなる塩基配列（配列番号１に示す）を有する、弱毒ＣＭＶに由来するサテライトＲＮＡを得る。
【００１７】
（４）植物疫病の防除剤の調製（弱毒ＣＭＶの接種源作製）
弱毒ＣＭＶが感染したトマト葉１ｇに、緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えて、１０ｍｌに調整した磨砕液をトマト１００株の子葉又は本葉に接種し、１〜２週間程度、弱毒ＣＭＶを増殖させた後、トマト感染葉１５０ｇを採取し、超低音（例えば、−８０℃）で凍結する。
この感染葉を粉砕した後、０．１％チオグリコール酸を含む０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３００ｍｌと同量のクロロホルムを加え、ワーリングブレンダーで磨砕して、弱毒ＣＭＶ粒子を含む磨砕液を得る。
この磨砕液を２，０００Ｘｇ、１０分間遠心し、上層（水層）１２０ｍｌを回収して、これに１０重量％の粉末ポリエチレングリコール１２ｇを加えて溶解させた後、４０分静置して、析出させ、沈殿し易くする。
この溶液を９，５００Ｘｇ、２０分間遠心分離処理し、得られた沈殿（弱毒ＣＭＶ粒子）を回収して、これに２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を洗浄のため加えて溶解する。
これを１２，０００Ｘｇで遠心分離処理し、弱毒ＣＭＶ粒子を含む上澄を分取して、２４０，０００Ｘｇ、４５分間遠心分離処理し、得られた沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁して、弱毒ウイルスのＣＭＶ粒子を約１０ｍｇ抽出し、接種源を得る。
【００１８】
（５）植物疫病の防除剤の植物への施用（弱毒ＣＭＶの植物への接種）
本発明の弱毒ＣＭＶを唐辛子に接種する方法は、純化した弱毒ＣＭＶのＮＤＭ０５−２の粒子を５０〜５００μｇ／ｍｌになるようにリン酸緩衝液に懸濁し、公知の方法により接種すればよく、例えば、噴霧ローラー法（特許第２９０８５９４号参照）やブラシ法（特許第３７５９５６０号参照）で行うことが好ましい。
これらの方法は、少量の弱毒ＣＭＶ液で、迅速、簡便、かつ高い感染率で接種することができる特徴を有する。
【００１９】
（６）植物疫病抵抗性植物の作製
このようにして、唐辛子の苗に弱毒ＣＭＶを接種すると、容易に弱毒ＣＭＶが全身に感染した唐辛子の苗が得られる。
したがって、この唐辛子苗を適当な大きさに切断した後、挿し木、接ぎ木などの栄養繁殖手段を採用して、通常の育苗管理をすると、容易に弱毒ＣＭＶが全身に感染した、植物疫病抵抗性唐辛子苗が得られる。
【００２０】
また、この弱毒ＣＭＶを接種した唐辛子苗を適当な大きさに切断した後、これを穂木として、弱毒ＣＭＶの接種していない他の台木に接ぎ木したり、また逆に弱毒ＣＭＶを接種した他の植物を台木にしたりして、弱毒ＣＭＶを接種していない唐辛子を接木して、通常の育苗管理をしても、容易に弱毒ＣＭＶが全身に感染した、疫病抵抗性の唐辛子苗が得られる。
【００２１】
また、弱毒ＣＭＶ接種唐辛子苗からその一部（例えば側芽）を採り、消毒した後、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に挿し芽し、外界と隔離された室内で、至適な温度、照度条件下で育成し、幼苗（例えば本葉の十分展開した幼苗）を得、この葉片を適当な大きさに切断したあと、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に２〜４回移植し、通常の植物体の組織培養法と同様に操作して、葉片から直接誘導させた不定芽から個体の再生を行い、弱毒ＣＭＶを保有する唐辛子苗を大量に得ることができる。
また、この弱毒ＣＭＶ接種唐辛子苗から一部を採り、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に２〜４回移植し、カルスから誘導させた不定芽から個体の再生を行い、所望の、弱毒ＣＭＶを保有する植物疫病抵抗性唐辛子苗を大量に得ることができる。
以下、実施例を示して、本発明を具体的に説明する。
【実施例１】
【００２２】
（１）弱毒ＣＭＶの単離
トマト圃場より、ウイルス症状を持つ約６００枚のトマト葉を採集し、これらの葉に１０倍量のリン酸緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えて磨砕し、その液をトマト苗ＴＭＫ１４３（日本デルモンテ社製）に接種した。
一週間後、各々のエライザー検定を行い、いくつかの系統（４１２系統）についてキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の感染を確認した。
これらの中から弱毒ＣＭＶを選抜すべく、４１２系統のトマトの感染葉をそれぞれトマト苗（ＴＭＫ１４３）１０株ずつに接種し、一週間後、リボ核酸（ＲＮＡ）分析をＴＮＡ法（Ｔｏｔａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｋａｐｅｒ，Ｊ．Ｍ．１９８９，Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｓａｔｅｌｉｔｅ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｐｌａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｍｐｌｅｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３，Ｐ８３〜９４参照）により行った。
そして、サテライトＲＮＡを有するＣＭＶを、前述の系統の中から取得した。そして、これらの系統について該トマト苗におけるウイルス症状調査を行い、ネクロシス、モザイクが発病した系統や感染力を有しない系統を取り除き、ウイルス症状が軽微でウイルス増殖量の多い弱毒ＣＭＶを選抜した。この選抜した弱毒ＣＭＶは遺伝的に均一ではなく、ウイルス症状が異なっているので、該トマト苗１００株にこれら弱毒ＣＭＶを接種し、弱いウイルス症状が揃っている株だけを選抜した。さらにサテライトＲＮＡの存在が継続されている株だけを取得して、弱毒ＣＭＶ接種液の調製を行い、再度トマト苗に接種し、同じ選抜操作をして弱毒ＣＭＶ接種液の調製する作業を５回繰り返し、トマトで継代接種を行った。そして、サテライトＲＮＡを安定して含む弱毒ＣＭＶ（ＮＤＭ０５−２）を単離した。
【００２３】
（２）サテライトＲＮＡの単離
サテライトＲＮＡを含む弱毒ＣＭＶ（ＮＤＭ０５−２）をトマト苗（ＴＭＫ１４３）の子葉に接種、感染させ、１〜４週間程度弱毒ＣＭＶを増殖させた。
次いで、トマト本葉を採取し−８０℃にて凍結した。
この感染葉を粉砕し、２倍量の ０．１％チオグリコール酸を含む ０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）と同量のクロロホルムを加え、ワーリングブレンダーで破砕した。
この破砕液を９，５００Ｘｇ、１０分間遠心分離処理し、上層（水層）の１０％に当たる重量のポリエチレングリコールを加え溶解させた後、４０分間静置した。
この溶液を９，５００Ｘｇ、２０分間遠心分離処理し、得られた沈殿に２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０） を加え懸濁均一化した。
この粗精製品を１２，０００Ｘｇで遠心分離し得られた上清を２４０，０００Ｘｇ、４５分間遠心分離処理し、沈殿を回収し、これを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。
これら溶液に最終濃度で１％になるように１０％ＳＤＳを加え、さらに溶液と等量のフェノールを加えた後１２，０００Ｘｇ、１５分間遠心分離処理した。
この上層（水層）を回収し、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返してＲＮＡを単離、精製した。
この方法で感染葉１００ｇより、約１００μｇのＲＮＡを得た。
上記の方法で得られたＲＮＡを水にそれぞれ溶解し、１０〜４０％ショ糖密度勾配により超遠心分離（１７５，０００Ｘｇ、１６時間）して得られたサテライトＲＮＡのバンドを採取し、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返して、サテライトＲＮＡを単離精製した。
次いで６Ｍ尿素を含む９％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、臭化エチジウムの溶液で染色し、サテライトＲＮＡのバンドの部分をカミソリで切り取った。
サテライトＲＮＡのバンドを含むゲル断片を透析チューブに入れ、ＥＤＴＡを含むトリス−酢酸緩衝液中で電気泳動による溶出を行ってサテライトＲＮＡを回収した後、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返してサテライトＲＮＡを単離精製した。
この電気泳動によるサテライトＲＮＡの溶出の詳細はＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）］に従って行った。
【００２４】
（３）サテライトＲＮＡのクローニングとシークエンス
単離精製したサテライトＲＮＡからマイナス鎖ｃＤＮＡを合成するために、サテライトＲＮＡ（約３μｇ）と３’末端塩基配列に相補的なＤＮＡプライマー（８塩基、１μＭ）を９５℃で熱処理した後、徐冷してアニーリングした。
このマイナス鎖ｃＤＮＡ合成反応はＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、３７℃、６０分の条件で行った。
次に、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させた。
すなわち、プラス鎖サテライトＲＮＡの５’末端に相同的なＤＮＡプライマーと３’末端塩基配列に相補的なＤＮＡプライマーを用い、９４℃１分間、３７℃１分間、７２℃２分間の反応を４５回繰り返すことによってＰＣＲ反応を行った［ＰＣＲ反応液；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２００μＭ  ｄＮＴＰ、２．５ｕｎｉｔｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）］。
【００２５】
このｃＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離させた後、ゲルより切り出し、ＤＮＡ回収キットＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて精製した。
得られたｃＤＮＡをＴ−Ａクローニング用ベクターｐＧＥＭ  Ｔ  Ｅａｓｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてクローニングした。
このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲ１で切断することによって、ＮＤＭ０５−２のサテライトＲＮＡ由来のｃＤＮＡを確認した。
【００２６】
このサテライトＲＮＡの塩基配列をＴｈｅｒｏｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）とＤＮＡシーケンサＤＳＱ−１０００Ｌ（島津製作所社製）を用いて決定した。
このようにして、３４０塩基から成る塩基配列（配列番号１に示す）を有する、ＮＤＭ０５−２に由来するサテライトＲＮＡを得た。
【００２７】
（４）植物疫病の防除剤の調製（弱毒ＣＭＶの接種源作製）
弱毒ＣＭＶが感染したトマト葉１ｇに、緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えて、１０ｍｌに調整後磨砕した磨砕液をトマト１００株の子葉及び本葉に接種し、１〜２週間程度、弱毒ＣＭＶを増殖させた後、トマト感染葉１５０ｇを採取し、−８０℃で凍結した。
この感染葉を粉砕した後、０．１％チオグリコール酸を含む０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３００ｍｌと同量のクロロホルムを加え、ワーリングブレンダーで磨砕して、弱毒ＣＭＶ粒子を含む磨砕液を得た。
この磨砕液を２，０００Ｘｇ、１０分間遠心し、上層（水層）１２０ｍｌを回収して、これに１０重量％の粉末ポリエチレングリコール１２ｇを加えて溶解させた後、４０分静置して、析出させ、沈殿し易くした。
この溶液を９，５００Ｘｇ、２０分間遠心分離処理し、得られた沈殿（弱毒ＣＭＶ粒子）を回収して、これに２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を洗浄のため加えて溶解した。
これを１２，０００Ｘｇで遠心分離処理し、弱毒ＣＭＶ粒子を含む上澄を分取して、２４０，０００Ｘｇ、４５分間遠心分離処理し、得られた沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁して、弱毒ＣＭＶ粒子を約１０ｍｇ抽出し、接種源を得た。
【００２８】
（５）植物疫病の防除剤の植物への施用（弱毒ＣＭＶの植物への接種）
本発明の弱毒ＣＭＶを唐辛子に接種する方法は、ＮＤＭ０５−２由来の純化した弱毒ＣＭＶ粒子を４００μｇ／ｍｌになるようにリン酸緩衝液に懸濁し、公知の方法により接種した。すなわち、ブラシ法（特許第３７５９５６０号参照）で行った。
【００２９】
（６）植物疫病抵抗性植物の作製
このようにして、唐辛子の苗に弱毒ＣＭＶを接種し、弱毒ＣＭＶが全身に感染した唐辛子の苗を得た。
【００３０】
（７）圃場における植物疫病に対する防除効果試験
韓国唐辛子品種のチャナトイル（天下統一、セミニス・コリア社製、韓国ソウル市）の種子約２５０粒を培養土に温室内で播種し、本葉１〜２枚期の当該唐辛子品種の幼苗に、調製した弱毒ＣＭＶ・ＮＤＭ０５−２（本発明区１）を４００μｇ／ｍｌの接種濃度で１００株に接種し、接種１０日後に苗の全核酸分析を行い、２本鎖サテライトＲＮＡのバンドの有無を電気泳動法で確認した。全核酸（ＲＮＡ）分析は、ＴＮＡ法（Ｔｏｔａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｋａｐｅｒ，Ｊ．Ｍ．１９８９，Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｓａｔｅｌｉｔｅ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｐｌａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｍｐｌｅｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３，Ｐ８３〜９４参照）により行った。
その後、温室で４５日間育苗し圃場に定植した。
比較のため、同様に育苗し、無接種のものも定植した。
圃場試験は乱塊法の３反復試験区で行った。
その結果を表１と表２に示す。
さらに、当該植物疫病被害株の病患部である根と茎葉をそれぞれ採取し、水道水で表面部を洗い、滅菌水を入れたペトリ皿に入れた。
その中に健全な唐辛子苗を入れて、３〜５日後に当該健全苗に、被害株と同様な症状が現れるのを確認した後、該健全株の病患部をＶ-８ジュース培地上に置いた。
Ｖ-８ジュース培地は、トマト、ニンジン、セロリ、ビート、パセリ、レタス、ミズガラシ、ホウレンソウの８種類の野菜の混合ジュースに香辛料と食塩を添加混合し、得られた飲料用のジュース２００ｍｌに、ＣａＣＯ３３ｇ、寒天２０ｇ、水８００ｍｌを添加溶解し、ｐＨ７．２に調整した。
その結果、当該培地状にフィトフトラカプシシレオニアン（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉ  Ｌｅｏｎｉａｎ）（植物疫病菌）を確認し（植物の疫病  理論と実際、Ｐ４７〜Ｐ５５、誠文堂新光社、１９７１年、参照）、該植物疫病被害株の全株から植物疫病菌の感染を確認した。
表１は、ＮＤＭ０５−２の弱毒ＣＭＶ接種唐辛子と無接種唐辛子における植物疫病発生株の比較を示す。
表２は、ＮＤＭ０５−２の弱毒ＣＭＶ接種唐辛子と無接種唐辛子における植物疫病発生指数の比較を示す。
【００３１】
【表１】
2008266195.tif 000002
【００３２】
表１の結果から、いずれの反復処理区においても、本発明のＮＤＭ０５−２の弱毒ＣＭＶ処理区は、無接種区と比較して植物疫病の発生株数が少なく、発生株数の頻度は無接種区の約１／３であることが判る。
すなわち、配列番号１記載のサテライトＲＮＡを含有する弱毒ＣＭＶを予め植物苗に接種すると、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属に属する微生物による植物疫病を効率良く防除できることが判る。
【００３３】
【表２】
2008266195.tif 000003
【００３４】
表２の結果から、植物疫病の発生指数は、本発明のＮＤＭ０５−２の弱毒ＣＭＶ接種区は、無接種区と比較して、いずれの反復処理区でも低い値を示し、無接種区の約１／４であることが判る。
すなわち、配列番号１記載のサテライトＲＮＡを含有する弱毒ＣＭＶを予め植物苗に接種すると、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属に属する微生物による植物疫病を効果的に防除できることが判る。
【配列表】
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