(57)【要約】【課題】  高い特異性・多様性を有する情報インプット様式のみならず、インプット情報の記憶を可能にする分子メモリ及び分子論理回路を提供する。【解決手段】  分子中に第１のアミノ酸残基と第２のアミノ酸残基とフォトクロミック化合物とを結合してなるペプチド誘導体と、上記第１及び第２のアミノ酸残基に共有結合して電荷の変化をもたらす化合物の供給源となる物質と、静電的相互作用によりペプチド誘導体との複合体を形成すると上記フォトクロミック化合物の異性化を抑制するイオン性物質と、を溶液に含有する。【選択図】  図２
2008031105.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液からなる分子メモリであって、
分子中にアミノ酸残基を結合してなるペプチド誘導体と、
上記アミノ酸残基に共有結合して電荷の変化をもたらす化合物の供給源となる物質と、を上記溶液に含有し、
上記アミノ酸残基に上記化合物を共有結合させる活性を有する酵素が上記溶液に添加されることにより情報が入力され、上記化合物を上記アミノ酸残基に共有結合させて情報を記録することを特徴とする分子メモリ。
【請求項２】
上記ペプチド誘導体は分子中にアミノ酸残基とフォトクロミック化合物とを結合してなり、
静電的相互作用によりペプチド誘導体との複合体を形成すると上記フォトクロミック化合物の異性化を抑制するイオン性物質を上記溶液に含有し、
情報として記録した上記ペプチド誘導体の総電荷量を上記ペプチド誘導体と上記イオン性物質との静電的相互作用による複合体の形成量に反映させ、上記複合体の形成量を上記フォトクロミック化合物の異性化を抑制する程度に反映させて上記フォトクロミック化合物の光学的特性として情報を出力することを特徴とする請求項１に記載の分子メモリ。
【請求項３】
上記アミノ酸残基はセリン、チロシン、及びトレオニンのうち少なくとも１つを含み、上記化合物の供給源となる物質はアデノシントリフォスフェートであることを特徴とする請求項１に記載の分子メモリ。
【請求項４】
上記アミノ酸残基はセリン、チロシン、及びトレオニンのうち少なくとも１つを含み、上記化合物の供給源となる物質はアデノシントリフォスフェートであり、上記フォトクロミック化合物はスピロピランであり、上記イオン性物質はポリアスパラギン酸又はポリリシンであることを特徴とする請求項２に記載の分子メモリ。
【請求項５】
溶液からなる分子論理回路であって、
分子中に第１のアミノ酸残基と第２のアミノ酸残基とフォトクロミック化合物とを結合してなるペプチド誘導体と、
上記第１及び第２のアミノ酸残基に共有結合して電荷の変化をもたらす化合物の供給源となる物質と、
静電的相互作用によりペプチド誘導体との複合体を形成すると上記フォトクロミック化合物の異性化を抑制するイオン性物質と、を上記溶液に含有し、
上記第１のアミノ酸残基に上記化合物を共有結合させる活性を有する第１の酵素と上記第２のアミノ酸残基に上記化合物を共有結合させる活性を有する第２の酵素とが上記溶液に選択されて添加されることにより情報が入力され、上記化合物を上記アミノ酸残基に共有結合させて情報を記録し、情報として記録した上記ペプチド誘導体の総電荷量を上記ペプチド誘導体と上記イオン性物質との静電的相互作用による複合体の形成量に反映させ、上記複合体の形成量を上記フォトクロミック化合物の異性化を抑制する程度に反映させて、上記第１及び第２の酵素の添加による情報の入力があった場合、上記第１又は第２の酵素の添加による情報の入力あった場合、又は、上記第１又は第２の酵素の無添加による情報の入力がなかった場合の上記フォトクロミック化合物の光学的特性として情報を出力することを特徴とする分子論理回路。
【請求項６】
上記フォトクロミック化合物の光学的特性の変化が第１の閾値により判別され、上記第１及び第２の酵素の添加による情報の入力があった場合、及び、上記第１又は第２の酵素の添加による情報の入力あった場合の上記フォトクロミック化合物の光学的特性として出力した情報は１として読み出され、上記第１又は第２の酵素の無添加による情報の入力がなかった場合の上記フォトクロミック化合物の光学的特性として出力した情報は０として読み出されることを特徴とする請求項５に記載の分子論理回路。
【請求項７】
上記フォトクロミック化合物の光学的特性の変化が第２の閾値により判別され、上記第１及び第２の酵素の添加による情報の入力があった場合の上記フォトクロミック化合物の光学的特性として出力した情報は１として読み出され、上記第１又は第２の酵素の添加による情報の入力あった場合、及び、上記第１又は第２の酵素の無添加による情報の入力がなかった場合の上記フォトクロミック化合物の光学的特性として出力した情報は０として読み出されることを特徴とする請求項５に記載の分子論理回路。
【請求項８】
上記フォトクロミック化合物の光学的特性の変化が第３の閾値により判別され、上記第１及び第２の酵素の添加による情報の入力があった場合、及び、上記第１又は第２の酵素の添加による情報の入力あった場合の上記フォトクロミック化合物の光学的特性として出力した情報は０として読み出され、上記第１又は第２の酵素の無添加による情報の入力がなかった場合の上記フォトクロミック化合物の光学的特性として出力した情報は１として読み出されることを特徴とする請求項５に記載の分子論理回路。
【請求項９】
上記フォトクロミック化合物の光学的特性の変化が第４の閾値により判別され、上記第１及び第２の酵素の添加による情報の入力があった場合の上記フォトクロミック化合物の光学的特性として出力した情報は０として読み出され、上記第１又は第２の酵素の添加による情報の入力あった場合、及び、上記第１又は第２の酵素の無添加による情報の入力がなかった場合の上記フォトクロミック化合物の光学的特性として出力した情報は１として読み出されることを特徴とする請求項５に記載の分子論理回路。
【請求項１０】
上記第１及び第２のアミノ酸残基はセリン、チロシン、及びトレオニンのうち何れか２つであり、上記化合物の供給源となる物質はアデノシントリフォスフェートであり、上記フォトクロミック化合物はスピロピランであり、上記イオン性物質はポリアスパラギン酸であることを特徴とする請求項６又は請求項７に記載の分子論理回路。
【請求項１１】
上記第１及び第２のアミノ酸残基はセリン、チロシン、及びトレオニンのうち何れか２つであり、上記化合物の供給源となる物質はアデノシントリフォスフェートであり、上記フォトクロミック化合物はスピロピランであり、上記イオン性物質はポリリシンであることを特徴とする請求項８又は請求項９に記載の分子論理回路。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い特異性・多様性を有する情報インプット様式のみならず、インプット情報の記憶を可能にする分子メモリ及び分子論理回路に関する。
【背景技術】
【０００２】
２０世紀はコンピュータの普及が著しい時代であった。コンピュータが行う様々な計算や判断及び記憶は、「論理回路」によって実行されている。現在汎用されているシリコン型コンピュータの高密度集積化微細加工技術開発（トップダウンアプローチ）の物理的限界はそう遠くないと考えられている。
【０００３】
一方、ナノメートルスケールの分子を自己組織化的に基板上に配置することで、従来のものより微小化及び省エネルギ化が可能な分子デバイスの構築（ボトムアップアプローチ）が盛んに行われている。
【０００４】
開発対象となる基本的な論理回路には以下の３つが挙げられる。図１３の真偽表のように演算を行う、１つ目は、「ＡかつＢ」を表す「ＡＮＤゲート」、２つ目は、「Ａ又はＢ」を表す「ＯＲゲート」、３つ目は「Ａでない」を表す「ＮＯＴゲート」である。これらの組合せによって複雑な演算や判断を行うことができる。
【０００５】
これまで、蛍光色素にプロトン（水素イオン）受容体分子やナトリウムイオン、亜鉛イオン、銅イオン、ニッケルイオンなど金属イオン受容体分子を複数種組み合わせて連結することで、それぞれの受容体が特定のリガンドと結合したときのみ強い蛍光シグナルが得られる分子論理回路が報告されている（非特許文献１−９）。
【０００６】
図１４〜１６に従来の化学インプットによるＡＮＤ型分子論理回路構築例を示す。図１４は蛍光基−アクセプタ複合化による基本的な分子論理回路の模式図である。中心のＦｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ（蛍光物質）にはアントラセンが用いられている。ｒｅｃｅｐｔｏｒ（受容体）−１にはベンゾクラウンエーテルが用いられ、ナトリウムイオンなどを選択的に結合する。ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２には第三級アミンが用いられ、プロトンを選択的に結合してアンモニウムになる。２つのｒｅｃｅｐｔｏｒにナトリウムイオンとプロトンとが結合していない状態では蛍光強度は弱いかほとんど検出されないことが必須である。
【０００７】
図１５はナトリウムイオンとプロトンの共存によって蛍光強度が増大するＡＮＤ型論理回路の模式図である。第三級アミンを例に挙げると、第三級アミンの不対電子が移動してアントラセンの励起状態を解消させるため、第三級アミンとプロトンとが結合することで、不対電子の移動によるアントラセンの消光を解消するようになっている。
【０００８】
図１６はナトリウムイオン、プロトン及び亜鉛イオンの共存によって蛍光強度が増大するＡＮＤ型論理回路の模式図である。３つのｒｅｃｅｐｔｏｒにナトリウムイオン、プロトン及び亜鉛イオンが結合することで、アントラセンの消光を解消するようになっている。
【０００９】
【非特許文献１】Raymo, F. M. Adv. Mater. 2002, 14, 401.
【非特許文献２】De Silva, A. P.; McClenaghan, N. D. Chem. Eur. J. 2004, 10, 574.
【非特許文献３】Uchiyama, S.; Kawai, N.; de Silva, A. P.; Iwai, K. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 3032.
【非特許文献４】Okamoto, A.; Tanaka, K.; Saito, I. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 9458.
【非特許文献５】Margulies, D.; Melman, G.; Felder, C. E.; Arad-Yellin, R.; Shanzer, A. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15400.
【非特許文献６】Margulies, D.; Melman, G.; Shanzer, A. Nat. Mater. 2005, 4, 768.
【非特許文献７】Uchiyama, S.; McClean, G. D.; Iwai, K.; de Silva, A. P. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 8920.
【非特許文献８】Szacilowski, K.; Macyk, W.; Stochel, G. J. Am. Chem. Soc. 2006, 10.1021/ja060694.
【非特許文献９】Magri, D. C.; Brown, G. J.; McClean, G. D.; de Silva, A. P. J. Am. Chem. Soc. 2006, 10.1021/ja058295.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、これら従来の分子論理回路システムは比較的性質の近い金属イオンを選択的に認識する受容体分子の開発が不可欠であることや、分子論理回路上に書き込まれたインプット情報の記憶が困難であるという問題があった。
【００１１】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、高い特異性・多様性を有する情報インプット様式のみならず、インプット情報の記憶を可能にする分子メモリと、その分子メモリをロジックゲートに発展させた分子論理回路を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本件発明者らは、上述した目的を達成するために、様々な観点から鋭意研究を重ねてきた。その結果、酵素が生体システム中で高い特異性と多様性を発揮し、円滑な情報伝達を行っていることに着目し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明に係る分子メモリは、上記の課題を解決するために、溶液からなる分子メモリであって、分子中にアミノ酸残基を結合してなるペプチド誘導体と、上記アミノ酸残基に共有結合して電荷の変化をもたらす化合物の供給源となる物質と、を上記溶液に含有し、上記アミノ酸残基に上記化合物を共有結合させる活性を有する酵素が上記溶液に添加されることにより情報が入力され、上記化合物を上記アミノ酸残基に共有結合させて情報を記録することを特徴とする。
【００１４】
また、本発明に係る分子論理回路は、上記の課題を解決するために、溶液からなる分子論理回路であって、分子中に第１のアミノ酸残基と第２のアミノ酸残基とフォトクロミック化合物とを結合してなるペプチド誘導体と、上記第１及び第２のアミノ酸残基に共有結合して電荷の変化をもたらす化合物の供給源となる物質と、静電的相互作用によりペプチド誘導体との複合体を形成すると上記フォトクロミック化合物の異性化を抑制するイオン性物質と、を上記溶液に含有し、上記第１のアミノ酸残基に上記化合物を共有結合させる活性を有する第１の酵素と上記第２のアミノ酸残基に上記化合物を共有結合させる活性を有する第２の酵素とが上記溶液に選択されて添加されることにより情報が入力され、上記化合物を上記アミノ酸残基に共有結合させて情報を記録し、情報として記録した上記ペプチド誘導体の総電荷量を上記ペプチド誘導体と上記イオン性物質との静電的相互作用による複合体の形成量に反映させ、上記複合体の形成量を上記フォトクロミック化合物の異性化を抑制する程度に反映させて、上記第１及び第２の酵素の添加による情報の入力があった場合、上記第１又は第２の酵素の添加による情報の入力あった場合、又は、上記第１又は第２の酵素の無添加による情報の入力がなかった場合の上記フォトクロミック化合物の光学的特性として情報を出力することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、高い特異性・多様性を有する情報インプット様式のみならず、インプット情報の記憶を可能にする分子メモリと、その分子メモリをロジックゲートに発展させた分子論理回路を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を適用した実施の形態について、具体的な実験結果を参照しながら詳細に説明する。
【００１７】
本件発明者らは酵素が生体システム中で高い特異性と多様性を発揮し、円滑な情報伝達を行っていることに着目した。特に、図１（Ａ）（Ｂ）に示すようなキナーゼやフォスファターゼによる基質のリン酸化・脱リン酸化サイクル及びヒストンアセチルトランスフェラーゼやヒストンデアセチラーゼによるリシン側鎖のアセチル化・脱アセチル化サイクルなどのタンパク質翻訳後修飾酵素群は、高い特異性と多様性を有し、インプット情報として利用可能である。
【００１８】
また、酵素基質中のアミノ酸側鎖に付加したリン酸基やアセチル基は、低温にて安定に保存（情報記憶）可能であり、付加した色素分子の蛍光強度変化を用いて自在に側鎖修飾情報を読み出すことができる。
【００１９】
さらに、酵素反応は触媒反応なので、基質に対して酵素の化学量論比を抑制することが可能である。
【００２０】
以上３点は、酵素を分子論理回路への情報インプットとするシステムが従来のシステムと比較して有利な点である。すなわち、色素分子に複数種の酵素基質を連結することで、標的とする酵素が特定の濃度以上で時空間的に共存するときのみ強いシグナルが観測されるシステム構築が期待される。具体的には、図２に示すように、基質特異性の高いｃ−Ｓｒｃ（ＳｒｃＮ１）基質とプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）基質を直鎖状に連結し、Ｎ末端にシグナル発生のためのフォトクロミック色素を結合したフォトクロミックペプチド基質を設計合成することで、２カ所のリン酸化部位を情報インプット部位として利用する図３に示すような「ＡＮＤ」、「ＯＲ」及び「ＮＯＲ（NotOR）」に対応するデータ出力がプログラム可能な分子論理回路の構築が可能である。
【００２１】
「フォトクロミズム」とは、「単一の化学種が二つの異なった状態間を吸収スペクトルの大きな変化を伴って可逆的に往復し、少なくとも一方の変換が光照射により引き起こされる現象」をいう。フォトクロミック化合物の代表としては、フルギド類、ジアリルエテン類、スピロピラン類、及びスピロオキサジン類が知られている。これらの異性化反応は分子構造の大幅な再構築を伴うので、異性化速度定数は、フォトクロミック分子周囲の微小環境変化に依存すると考えられる。本発明では、無色と桃色の２状態を有するスピロピラン誘導体を色素分子として用いた。
【００２２】
図４に示すように、スピロピラン誘導体には光異性体としてスピロピラン型とメロシアニン型が存在する。メロシアニン体は、可視領域（５００−６００ｎｍ）に吸収を持ち尚かつ６００ｎｍ付近に蛍光を発する。スピロピラン体は、４００ｎｍ以下の光を吸収するが蛍光を発しないという特徴をもつ。
【００２３】
そこで、キナーゼが触媒するリン酸化反応が無色のスピロピラン型から桃色蛍光性のメロシアニン型への異性化速度に影響を及ぼすと期待される。すなわち、異性化速度の変化をアミノ酸側鎖修飾の結果生じる色素分子周辺環境変化と捉えることができる。
【００２４】
スピロピラン誘導体は、中性水溶液中では無色のスピロピラン（ＳＰ）型と桃色蛍光性のメロシアニン（ＭＣ）型の平衡状態にあり、ＳＰ→ＭＣは暗所インキュベーションにより、またＭＣ→ＳＰは可視光照射により誘導できる。また、メロシアニン型からの蛍光の増加を評価するので、みかけの蛍光強度に影響されることなく再現性よく測定できる。
【００２５】
そこで、リン酸化反応に伴う無色のスピロピラン型から桃色蛍光性のメロシアニン型へ熱平衡状態へと緩和する過程における着色量をメロシアニン型が発する蛍光強度を指標として追跡することで（文献「Tomizaki, K.-Y.; Mihara, H. J. Mater. Chem. 2005, 15, 2732.」を参照）、ＳｒｃＮ１とＰＫＡをインプットとする、このフォトクロミックタンデムキナーゼ基質ペプチドの分子論理回路としての性能評価を行った。
【００２６】
＜スピロピラン含有タンデムキナーゼペプチド基質の設計合成＞
チロシン側鎖水酸基をリン酸化するＳｒｃ  ｋｉｎａｓｅ（ＳｒｃＮ１）基質配列と、セリン側鎖水酸基をリン酸化するｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ（ＰＫＡ）基質を選択・連結し、Ｎ末端にフォトクロミック化合物であるスピロピラン誘導体を導入したペプチド基質を設計した（ＳＰ−ＹＳ、図２を参照）。
【００２７】
また、あらかじめチロシン又はセリンが水酸化されたリン酸化ペプチド（ＳＰ−ＹｐＳ，ＳＰ−ｐＹＳ、図２を参照）及び両水酸基がリン酸化された二リン酸化ペプチド（ＳＰ−ｐＹｐＳ、図２を参照）も合わせて設計した。
【００２８】
ここで、設計合成したスピロピラン含有ペプチドの総電荷は、
ＳＰ−ＹＳ：＋４
ＳＰ−ＹｐＳ：＋２
ＳＰ−ｐＹＳ：＋２
ＳＰ−ｐＹｐＳ：０
である。
【００２９】
なお、ＳＰ、ｐＴｙｒ、ｐＳｅｒ、Ａｈａは、
ＳＰ：１−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｌｉｎｏ−６’−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｐｙｒｙｌｏｓｐｉｒａｎ（ｓｐｉｒｏｐｙｒａｎ）ｍｏｉｅｔｙ
ｐＴｙｒ：ｐｈｏｓｐｈｏ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ
ｐＳｅｒ：ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｅｒｉｎｅ
Ａｈａ：６−ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ
を意味する。
【００３０】
図５に示すように、ペプチドは、Ｆｍｏｃ固相合成法によりＣ末端側より伸長し（文献「Chen, W. C.; White, P. D. Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, New York, 2000.」を参照）、樹脂上でスピロピラン分子を選択的に導入した（文献「Tomizaki, K.-Y.; Mihara, H. J. Mater. Chem. 2005, 15, 2732.」を参照）。
【００３１】
保護基の除去及び樹脂からの脱離の後、得られた粗ペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で精製し、飛行時間型質量分析装置（MALDI-TOFMS）にて同定した。
【００３２】
＜合成方法の詳細＞
ペプチドＳＰ−ＹＳの合成
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄ  ＭＢＨＡ樹脂（０．４０ｍｍｏｌ／ｇ，５０μｍｏｌスケール）、Ｎ末端保護アミノ酸Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ（３ｅｑ）、カップリング試薬はＨＢＴＵ（３ｅｑ）、ＨＯＢｔ（３ｅｑ）、ＤＩＥＡ（６ｅｑ）及びＳＰ−ＯＮｐ（３ｅｑ）、ＤＩＥＡ（３ｅｑ）を用い、Ｆｍｏｃ固相法の定法に従ってＳＰ−Ａｈａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（tBu）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（OtBu）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Boc）−Ｌｙｓ（Boc）−Ｌｙｓ（Boc）−Ａｈａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Pbf）−Ａｒｇ（Pbf）−Ａｌａ−Ｓｅｒ（tBu）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ｒｅｓｉｎペプチド付き樹脂を調製した。
【００３３】
乾燥後ｍ−ｃｒｅｓｏｌ／ｅｔｈａｎｄｉｔｈｉｏｌ／ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ／ＴＦＡ（２．５／７．５／７．５／１００）の混合溶液（２．０ｍＬ）を加え室温で１時間攪拌し脱保護を行った。
【００３４】
濃縮後、エーテル沈殿、デカントを繰り返し、ＳＰ−ＹＳ粗ペプチドを得た（１１７ｍｇ，９９％）。この内、６１ｍｇを逆相ＨＰＬＣで精製後凍結乾燥し、目的物ＳＰ−ＹＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ｏｂｓｄ：２３７２［Ｍ＋Ｈ］＋；ｃａｌｃｄ：２３７１）、１２ｍｇ，２２％）を得た。
【００３５】
ペプチドＳＰ−ＹｐＳの合成
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄ  ＭＢＨＡ樹脂（０．４０ｍｍｏｌ／ｇ，５０μｍｏｌスケール）、Ｎ末端保護アミノ酸Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ（３ｅｑ）、カップリング試薬はＨＢＴＵ（３ｅｑ）、ＨＯＢｔ（３ｅｑ）、ＤＩＥＡ（６ｅｑ）及びＳＰ−ＯＮｐ（３ｅｑ）、ＤＩＥＡ（３ｅｑ）を用い、Ｆｍｏｃ固相法の定法に従ってＳＰ−Ａｈａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（tBu）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（OtBu）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Boc）−Ｌｙｓ（Boc）−Ｌｙｓ（Boc）−Ａｈａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Pbf）−Ａｒｇ（Pbf）−Ａｌａ−Ｓｅｒ（P(O)(OBzl)(OH)）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ｒｅｓｉｎペプチド付き樹脂を調製した。
【００３６】
乾燥後ｍ−ｃｒｅｓｏｌ／ｅｔｈａｎｄｉｔｈｉｏｌ／ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ／ＴＦＡ（２．５／７．５／７．５／１００）の混合溶液（２．０ｍＬ）を加え室温で１時間攪拌し脱保護を行った。
【００３７】
濃縮後、エーテル沈殿、デカントを繰り返し、ＳＰ−ＹｐＳ粗ペプチドを得た（１０６ｍｇ，８７％）。この内、４４ｍｇを逆相ＨＰＬＣで精製後凍結乾燥し、目的物ＳＰ−ＹｐＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ｏｂｓｄ：２４５２［Ｍ＋Ｈ］＋；ｃａｌｃｄ：２４５０）、２０ｍｇ，３９％）を得た。
【００３８】
ペプチドＳＰ−ｐＹＳの合成
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄ  ＭＢＨＡ樹脂（０．４０ｍｍｏｌ／ｇ，５０μｍｏｌスケール）、Ｎ末端保護アミノ酸Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ（３ｅｑ）、カップリング試薬はＨＢＴＵ（３ｅｑ）、ＨＯＢｔ（３ｅｑ）、ＤＩＥＡ（６ｅｑ）及びＳＰ−ＯＮｐ（３ｅｑ）、ＤＩＥＡ（３ｅｑ）を用い、Ｆｍｏｃ固相法の定法に従ってＳＰ−Ａｈａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（P(O)(OBzl)(OH)）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（OtBu）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Boc）−Ｌｙｓ（Boc）−Ｌｙｓ（Boc）−Ａｈａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Pbf）−Ａｒｇ（Pbf）−Ａｌａ−Ｓｅｒ（tBu）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ｒｅｓｉｎペプチド付き樹脂を調製した。
【００３９】
乾燥後ｍ−ｃｒｅｓｏｌ／ｅｔｈａｎｄｉｔｈｉｏｌ／ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ／ＴＦＡ（２．５／７．５／７．５／１００）の混合溶液（２．０ｍＬ）を加え室温で１時間攪拌し脱保護を行った。
【００４０】
濃縮後、エーテル沈殿、デカントを繰り返し、ＳＰ−ｐＹＳ粗ペプチドを得た（１０８ｍｇ，８８％）。この内、５５ｍｇを逆相ＨＰＬＣで精製後凍結乾燥し、目的物ＳＰ−ｐＹＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ｏｂｓｄ：２４５１［Ｍ＋Ｈ］＋；ｃａｌｃｄ：２４５０）、７．４ｍｇ，１２％）を得た。
【００４１】
ペプチドＳＰ−ｐＹｐＳの合成
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄ  ＭＢＨＡ樹脂（０．４０ｍｍｏｌ／ｇ，５０μｍｏｌスケール）、Ｎ末端保護アミノ酸Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ（３ｅｑ）、カップリング試薬はＨＢＴＵ（３ｅｑ）、ＨＯＢｔ（３ｅｑ）、ＤＩＥＡ（６ｅｑ）及びＳＰ−ＯＮｐ（３ｅｑ）、ＤＩＥＡ（３ｅｑ）を用い、Ｆｍｏｃ固相法の定法に従ってＳＰ−Ａｈａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（P(O)(OBzl)(OH)）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（OtBu）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Boc）−Ｌｙｓ（Boc）−Ｌｙｓ（Boc）−Ａｈａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Pbf）−Ａｒｇ（Pbf）−Ａｌａ−Ｓｅｒ（P(O)(OBzl)(OH)）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ｒｅｓｉｎペプチド付き樹脂を調製した。
【００４２】
乾燥後ｍ−ｃｒｅｓｏｌ／ｅｔｈａｎｄｉｔｈｉｏｌ／ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ／ＴＦＡ（２．５／７．５／７．５／１００）の混合溶液（２．０ｍＬ）を加え室温で１時間攪拌し脱保護を行った。濃縮後、エーテル沈殿、デカントを繰り返し、ＳＰ−ｐＹｐＳ粗ペプチドを得た（８５ｍｇ，６７％）。これを逆相ＨＰＬＣで精製後凍結乾燥し、目的物ＳＰ−ｐＹｐＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ｏｂｓｄ：２５３２［Ｍ＋Ｈ］＋；ｃａｌｃｄ：２５３０）、１２ｍｇ，９．１％）を得た。
【００４３】
＜ペプチド側鎖のリン酸化状態に依存する着色反応の検討＞
まず、ペプチド側鎖のリン酸化状態に依存して無色のスピロピラン型から桃色蛍光性のメロシアニン型への着色反応がどのように変化するかをリン酸化モデルペプチドを用いて調べた。
【００４４】
着色反応は、図６に従って行った（文献「Tomizaki, K.-Y.; Xu, J.; Mihara, H. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 1731.」、「Tomizaki, K.-Y.; Mihara, H. Mol. BioSyst. submitted.」を参照）。図６に示すように、反応チューブにペプチド基質（５０μＭ）、ｃＡＭＰ（１ｍＭ）及びＡＴＰ（１ｍＭ）を溶解した緩衝溶液（１００μＬ，１００ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０，５ｍＭＭｇＣｌ２）を加え、ここに必要量の酵素を添加して、３０℃で１時間インキュベーションを行った。
【００４５】
反応液を光照射により無色のスピロピラン型に変換し、反応液（１０μＬ）、イオン性ポリマー（２μＬ、終濃度１０μＭ）と緩衝液（８８μＬ，２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）を混合し、９６穴マイクロプレート上にて無色のスピロピラン型から桃色蛍光性のメロシアニン型へ６０分間着色反応を行った。
【００４６】
蛍光強度測定はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製１４２０Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  ＡＲＶＯ  ＭＸ（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ＝Ｆ４８５，Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ＝５８０±０）で行った。ペプチド側鎖のリン酸化状態はイオン性ポリマー（ＰＬＸ）を添加した反応液の蛍光強度（着色量ＦＰＬＸ）をイオン性ポリマー無添加反応液の蛍光強度（着色量ＦＮｏｎｅ）と比較するＦＰＬＸ／ＦＮｏｎｅを指標として評価した。
【００４７】
図７に各ペプチドの着色量のポリアスパラギン酸依存性を、図８にポリリシン依存性の結果を示す。図７において、すべてリン酸化されたＳＰ−ｐＹｐＳの値は、０．８９倍であった。これは、モノリン酸化ペプチド、ＳＰ−ＹｐＳ（０．２０倍）、ＳＰ−ｐＹＳ（０．２３倍）、及び非リン酸化ペプチドＳＰ−ＹＳ（−０．２２倍）と比較し強いシグナルであった。
【００４８】
一方、図８のポリリシン依存性検討では、非リン酸化ペプチドＳＰ−ＹＳ（２．０９倍）が最も強いシグナルを与え、モノリン酸化ペプチドＳＰ−ＹｐＳ（１．４４倍）、ＳＰ−ｐＹＳ（１．２０倍）、二リン酸化ペプチドＳＰ−ｐＹｐＳ（０．８３倍）の順にシグナルが弱くなった。
【００４９】
これらのイオン性ポリマー添加効果は、リン酸基付加によるペプチド総電荷の変化を反映していると考えられる。図９に示すように、非リン酸化状態のペプチドＳＰ−ＹＳの総電荷は、＋４であるが、どちらか一カ所がリン酸化を受けると＋２となり、全てがリン酸化を受けると総電荷は中性となる。
【００５０】
これらリン酸化に伴うペプチドの総電荷の変化を、添加したイオン性ポリマーが静電的相互作用により認識して複合体を形成すると、ポリマーマトリックス中のスピロピラン分子の運動性が低下し、結果的に無色のスピロピラン型から桃色蛍光性のメロシアニン型への着色反応が抑制される。
【００５１】
つまり、ポリアスパラギン酸を添加することによって、非リン酸化ペプチドの着色は抑制されるが、リン酸化ペプチドの場合は電荷反発のためポリアスパラギン酸との複合体形成が不利となり、着色速度の抑制効果は低下する。よって、ＡＮＤ型論理回路として機能すると考えられる。
【００５２】
また、どちらか一方がリン酸化されたペプチドの総電荷は、＋２なのでポリアスパラギン酸と弱く結合する。その結果、両キナーゼ存在時と比べると弱いシグナルが確認できることから、シグナル敷居値を下げることで少なくともキナーゼのどちらかが存在するとシグナルが得られるＯＲ型論理回路機能を発現できる。
【００５３】
一方、カチオン性ポリマーであるポリリシンを添加すると、非リン酸化ペプチド（総電荷＋４）との静電反発によって複合体が不利となり、逆に対イオン効果によりメロシアニン型の安定化に寄与し着色量が増加したと考えられる。どちらか一方がリン酸化されたペプチド（総電荷＋２）では着色量微増、また全てリン酸化されたペプチド（総電荷中性）では着色量が若干減少した。よって、非リン酸化状態のみ他と比べて強いシグナルを与えるＮＯＲ型論理回路として機能すると考えられる。
【００５４】
＜フォトクロミックタンデムキナーゼ基質を用いるＡＮＤ／ＯＲ型論理回路性能評価＞
ＳｒｃＮ１基質とＰＫＡ基質を連結したフォトクロミックペプチド基質（ＳＰ−ＹＳ）をＡＴＰ及びｃＡＭＰ存在下、十分量のＳｒｃＮ１（６ｎｇ／μＬ）とＰＫＡ（１０ｎｇ／μＬ）、ＳｒｃＮ１（６ｎｇ／μＬ）のみ、ＰＫＡ（１０ｎｇ／μＬ）のみ、及びキナーゼ無しの４条件にてリン酸化反応による情報インプットを行った（図１０を参照）。
【００５５】
反応チューブにペプチド基質（５０μＭ）、ｃＡＭＰ（１ｍＭ）及びＡＴＰ（１ｍＭ）を溶解した緩衝溶液（１００μＬ，１００ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０，５ｍＭＭｇＣｌ２）を加え、ここに必要量の酵素を添加して、３０℃で１時間インキュベーションを行った。
【００５６】
反応液を光照射により無色のスピロピラン型に変換し、反応液（１０μＬ）、イオン性ポリマー（２μＬ、終濃度１０μＭ）と緩衝液（８８μＬ，２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）を混合し、９６穴マイクロプレート上にて無色のスピロピラン型から桃色蛍光性のメロシアニン型へ６０分間着色反応を行った。
【００５７】
蛍光強度測定は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製１４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  ＡＲＶＯ  ＭＸ（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ＝Ｆ４８５，Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ＝５８０±０）にて行った。ＡＮＤ／ＯＲ型論理回路機能発現のために、ここではプログラミングインプットとしてポリアスパラギン酸を用いた。
【００５８】
ペプチド側鎖のリン酸化状態はポリアスパラギン酸を添加した反応液の蛍光強度（着色量ＦＰＬＤ）をイオン性ポリマー無添加反応液の蛍光強度（着色量ＦＮｏｎｅ）と比較するＦＰＬＤ／ＦＮｏｎｅを指標として評価した。
【００５９】
ＳｒｃＮ１とＰＫＡが共存するときの値は、０．５７倍であった。これは他の条件、ＳｒｃＮ１のみ（０．１７倍）、ＰＫＡのみ（０．２３倍）、及びキナーゼ無し（−０．２２倍）と比較し明らかに強いシグナルであり、閾値をＦＰＬＤ／ＦＮｏｎｅ＝０．４に設定することでＡＮＤ論理回路として機能することが示された。また、敷居値をＦＰＬＤ／ＦＮｏｎｅ＝０．１に設定することで少なくともどちらか一方のキナーゼが存在するときシグナルを与えるＯＲ論理回路として機能することも示唆された。
【００６０】
＜フォトクロミックタンデムキナーゼ基質を用いるＮＯＲ型論理回路性能評価＞
上記と同様に、リン酸化反応液にプログラミングインプットとしてカチオン性ポリマーであるポリリシンを添加して着色反応を行ったところ、非リン酸化状態のペプチドが２．１０倍の強いシグナルを与えた（図１１を参照）。
【００６１】
一方、ＳｒｃＮ１とＰＫＡの両方あるいはどちらか一方が存在するとき１．１−１．４倍の比較的弱いシグナルを与えた。このことは、ポリリシン添加時における無色のスピロピラン型から桃色蛍光性のメロシアニン型への着色反応の敷居値を１．６に設定することで、ＮＯＲ論理回路機能が発現可能であることが分かった。
【００６２】
図１２に真偽表を示す。２種類のキナーゼによるインプット情報をプログラミングインプットによってＡＮＤ／ＯＲ／ＮＯＲへのデータ変換行うことが可能であった。これらの論理回路は、分子コンピュティングにおける技術基盤の一つであり、分子デバイスなどへの応用が期待される。
【００６３】
このように２種の特異的キナーゼ基質を連結したフォトクロミックペプチド基質を合成し、キナーゼリン酸化活性を情報インプットとする分子論理回路は、スピロピラン分子のメロシアニン型が発する蛍光を用いて情報の読み出しが可能であった。
【００６４】
また、キナーゼあるいはフォスファターゼにより修飾を受けたペプチドは、それらの反応溶液を低温保存することで、インプット情報をペプチド側鎖に記録したまま保存と情報読み出し（記憶と読み出し）が可能である。
【００６５】
本発明に係る分子メモリ及び分子論理回路では、基質総電荷が変化する触媒活性が利用可能である。したがって、キナーゼ活性以外の触媒活性、例えばヒストンアセチルトランスフェラーゼ・ヒストンデアセチラーゼが触媒するリシン側鎖アミノ基のアセチル化・脱アセチル化反応サイクルなどは、本発明において利用することができる。なお、本発明に係る分子論理回路では、基質総電荷に応じた着色を可視的に区別して、「０」「１」と明確に判別するためには、総電荷が正電荷を持った状態（＋）から最終的にニュートラル（０）へ変化するようにするのが好ましい。
【００６６】
本実施例においては、インプットは二種類のキナーゼのみを示したが、種々のキナーゼやフォスファターゼ及びヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどの特異的基質を設計・連結することで、さらに複雑で多様な分子論理回路構築が期待できる。例えば、トレオニンはセリンと類似するアミノ酸であり、セリン及びトレオニンのどちらのアミノ酸もプロテインキナーゼＣ−ａｌｐｈａによりリン酸化される。したがって、キナーゼ基質中のリン酸化を受けるアミノ酸として、セリン、トレオニン及びチロシンを組み合わせてフォトクロミックペプチド基質を設計合成しても、本実施例と同様に分子論理回路を構築することができる。
【００６７】
なお、本発明は上述した実施の形態のみに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】タンパク質翻訳後修飾酵素の反応サイクルであって、（Ａ）キナーゼとフォスファターゼによる基質のリン酸化及び脱リン酸化反応サイクルを示す模式図、（Ｂ）ヒストンアセチルトランスフェラーゼとヒストンデアセチラーゼによる基質のアセチル化及び脱アセチル化反応サイクルを示す模式図である。
【図２】設計合成したスピロピラン含有ペプチドのアミノ酸配列を示す模式図である。
【図３】本発明の一実施形態における分子論理回路の模式図である。
【図４】スピロピラン誘導体の中性水溶液中における異性化反応を示す模式図である。
【図５】スピロピラン含有ペプチドの合成スキームを示す図である。
【図６】キナーゼによる情報インプットとスピロピラン誘導体のフォトクロミズムを利用した情報読み出し操作概略を示す図である。
【図７】アニオン性ポリマーであるポリアスパラギン酸（ＰＬＤ）存在下における無色スピロピラン型から桃色メロシアニン型への着色反応のペプチド側鎖リン酸化状態依存性を示す図である。
【図８】カチオン性ポリマーであるポリリシン（ＰＬＫ）存在下における無色スピロピラン型から桃色メロシアニン型への着色反応のペプチド側鎖リン酸化状態依存性を示す図である。
【図９】リン酸化反応にともなうペプチド基質総電荷の変化と無色スピロピラン型から桃色メロシアニン型への着色反応性の関係を示す図である。
【図１０】プログラミングインプットとしてアニオン性ポリマーであるポリアスパラギン酸（ＰＬＤ）を添加するＡＮＤ／ＯＲ型論理回路機能発現を示す図である。
【図１１】プログラミングインプットとしてカチオン性ポリマーであるポリリシン（ＰＬＫ）を添加するＮＯＲ型論理回路機能発現を示す図である。
【図１２】２種類のキナーゼを情報インプットとする分子論理回路の真偽表である。
【図１３】コンピュティングのために基本となるＡＮＤ／ＯＲ／ＮＯＴ型論理回路の真偽表である。
【図１４】化学インプットによるＡＮＤ型分子論理回路の模式図である。
【図１５】ナトリウムイオンとプロトンの共存によって蛍光強度が増大するＡＮＤ型論理回路の模式図である。
【図１６】ナトリウムイオン、プロトン及び亜鉛イオンの共存によって蛍光強度が増大するＡＮＤ型論理回路の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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