(57)【要約】【課題】簡易な構成により、単離された単一細胞若しくは数個の細胞について、捕捉、放出、破砕するといった複数の機能を実現することができる細胞捕捉部材を提供する。【解決手段】  少なくとも２つの並走する主流路を配置した細胞捕捉部材であって、当該主流路間に、捕捉する物体の断面積の最大値に比して小さい断面積を有する通過路、流速の異なる液体を当該２つの主流路に流すことにより、通過路入口部位で負圧もしくは加圧が生じさせることができ、これにより主流路を流れる細胞を通過路入口部位で捕捉及び放出できることを特徴とする。【選択図】図２
2008136475.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
層流を生じせしめる程度の微小な並走する主流路を少なくとも２つ使用し、当該主流路の流速を異なる流速とすることによって細胞を捕捉する方法。
【請求項２】
少なくとも２つの並走する主流路の間を繋ぐことができる、単一細胞の断面線分の最大値と同一若しくはそれ以下の長さの断面線分を有する流体の通過路を設けた細胞捕捉部材を利用した請求項１記載の細胞捕捉方法。
【請求項３】
少なくとも２つの並走する主流路の１又は２以上特定の部位において、その幅が異なることを特徴とする前記細胞捕捉部材を利用した請求項１又は２に記載の細胞捕捉方法。
【請求項４】
請求項１乃至３に記載の方法を用いて捕捉した細胞を、当該細胞捕捉部材で培養する方法。
【請求項５】
層流を生じせしめる程度に微小である、少なくとも２つの並走する主流路の流速を変化させることによって、請求項２又は３に記載した細胞捕捉部材を利用して細胞を捕捉し培養する方法。
【請求項６】
少なくとも２つの並走する主流路の流速を変化させることによって、前記細胞捕捉部材内に補足した細胞を放出または解放し、細胞を回収する方法。
【請求項７】
前記細胞捕捉部材の少なくとも２つの並走する主流路の流速を変化させることによって細胞を破砕する方法。
【請求項８】
通過路を共有した他方の主流路に比して、流速の速い主流路を流れる細胞を前記通過路入口部位で捕捉するとともに、細胞を流した主流路の流速を当該細胞が破砕される程度まで速くすることにより、細胞が前記主流路を繋ぐ通過路で破砕され、その内容物が当該通過路を介して、流速の遅い他方の主流路を移動することを特徴とする細胞破砕方法。
【請求項９】
密着した複数の細胞からなる細胞塊を単一細胞若しくは数個の細胞群とするように分離処理して、当該単一細胞若しくは数個の細胞群がそれぞれ捕捉される前記細胞捕捉部材の任意の部位に捕捉され、全部若しくは一部の単一細胞又は数個の細胞群に対して、任意の処理をすることにより、当該単一細胞若しくは数個の細胞群について前記細胞捕捉部材を用いて当該単一細胞若しくは数個の細胞群を試験する方法。
【請求項１０】
少なくとも２つの並走する主流路を配置した細胞捕捉部材であって、当該主流路間に、単一細胞の断面線分の最大値と同一若しくはそれ以下の長さの断面線分を有する通過路を有し、流速の異なる液体を当該２つの主流路に流すことにより、主流路を流れる細胞を通過路入口部位で捕捉及び放出できることを特徴とする細胞捕捉部材。
【請求項１１】
前記通過路と主流路の接続部位において、曲面を有する細胞捕捉領域を設け、当該細胞捕捉領域の開口部は主流路に接し、当該開口部の断面積は前記通過路の断面積よりも大きいことを特徴とする請求項１０に記載の細胞捕捉部材。
【請求項１２】
前記主流路に流路内壁を修飾する分子を流して、少なくとも２つの並走する主流路の流速を変化させることによって、前記主流路および通過路の全部または一部を物理的または化学的に修飾する方法。
【請求項１３】
前記方法で、細胞が接着しやすいまたは接着しにくいように流路内壁の全部または一部を修飾した前記細胞補足部材。
【請求項１４】
前記細胞捕捉部材で、流路の任意の部位で細胞を培養する方法。
【請求項１５】
前記細胞捕捉部材に、流速の異なる液体を当該２つの主流路に流す液体搬送手段を連結させ、主流路を流れる細胞を通過路入口部位で捕捉及び放出できることを特徴とする細胞捕捉装置。
【請求項１６】
前記流速の異なる液体を当該２つの主流路に流す液体搬送手段は、液体搬送ポンプを用いて、流路の幅の異なる少なくとも２つの主流路に同時に液体に挿入することを特徴とする細胞捕捉装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の集団から分離された細胞の捕捉、放出、破砕、さらには培養を可能とする細胞捕捉装置及びそれを用いた細胞捕捉、放出、破砕、培養の方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
組織や培養細胞を用いて、再生医療、分子医療、ゲノム創薬を行う場合に、細胞の観察や実験は不可欠である。細胞の集団としての効果より綿密に解析する場合には、細胞塊ではなく、単一の細胞をそれぞれ単離し、若しくは数個の細胞群を空間的に分離した状態での観察・実験をすることが必要となる。さらに、集団としての機能が確立される組織においても、それを構成する細胞等をより詳しく調べることで、各細胞の分化の違いなどを明らかにすることが出来る。特に、細胞一個の内容物を調べることによって、特定のタンパク質やDNAの発現経路がより詳しくわかり、また同じ細胞であっても周囲の環境の違いや概日リズム等における時間的な違いによって、遺伝子やタンパク質の発現パターンが揺らぐもしくは異なる現象を詳しく理解することも可能となる。
【０００３】
これらの再生医療、ゲノム創薬を含む現代の先端的な医療分野や生物学において、集団の中の細胞一個の役割を調べる技術やそれを用いて得られる知見は、その全体としての生化学的機能の優れた組織を再生する上で有用である。また、細胞の集団や組織の中での細胞一個の役割を理解することにより、極めて微量な試料で遺伝性の病気や後天的な疾患を調べることが可能になる。これらの技術は、受精卵もしくは分化の進む前の細胞に適用し、早期の診断に用いることもできる。さらに、特定のタンパク質の生産力が高い大腸菌などの微生物を構築するなど、バイオテクノロジーへの応用も期待できる。
【０００４】
単一の細胞に対して、なんらかの処置を行おうとする試みは例えば、特許文献１に見られるように、細胞の大きさよりも小さい開口を区画する通路と、通路に接続され、通路内に負圧を発生させる負圧発生手段と、通路に接続され、通路内の負圧を調整する負圧制御手段とを備えることを特徴とし、安定した細胞捕捉のための装置が開示されている。負圧発生手段として、真空ポンプが開示されている。
【０００５】
また、特許文献２では、細胞の捕獲機構は、ウエル（窪み）を設け、その大きさは単一の細胞のみを保持する大きさ及び形状にすることを特徴として、細胞は重力によってウエル内部に保持されると開示されている。また、ウエルに保持された細胞を放出させる手法として、ウエルの下に設置されたチャンバーに泡核生成を引き起こし、チャンバー内側に容積膨張を作り出し、ウエルとチャンバーの間のチャネルを通じて、流体の噴出により、細胞をウエル外に排出されることを開示している。
【特許文献１】特開２００６−１９７８８０ 細胞捕捉装置及び細胞捕捉方法
【特許文献２】特表２００３−５１４２３６ 細胞を操作するための細胞分析及び選別装置
【０００６】
また、細胞を捕獲することによって、生じる効果として、従来の方法は捕獲した細胞にマイクロインジェクションなどの外的な操作を加え、その効果を調べるものを目的としたものであるが、本発明は、外的な操作を流路の内部で行うことが可能であり、外部環境に晒されにくく、より精密に細胞一個の形態や操作、分析を可能とするものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の技術や装置はこの用途に一致しているものはない。例えば、特許文献１の発明のような安定した細胞の捕捉に関する発明は、負圧発生手段や負圧制御手段として、真空ポンプや電空レギュレータを必要として、大掛かりな装置を必要としてしまう。また、特許文献２の発明は、細胞を保持する手法として、重力を利用しているので、効率的な細胞の捕捉が難しい。また、細胞の放出方法は泡核生成としているので、装置の構成が複雑なものとなる。
【０００８】
そこで、本発明は、細胞の捕捉、放出、破砕、培養する方法において、単純な流路と流体を組み合わせることによって、単純な構造でありながら、細胞の捕捉、放出、破砕、培養に係る小さい動力で可能とする細胞一個の捕捉、放出、破砕、培養の方法及び装置の開発を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意工夫を重ねた結果、異なる流速で液体が流れることができる２以上の主流路とその主流路間に通過路を設けることで、異なる流速を発生させることによる当該通過路部位での流速の差を利用した細胞の捕捉、放出、破砕できることを見出し、本発明を完成するに至った。また、同時に捕捉した細胞を個別に培養することが可能であることも発見した。
【００１０】
本発明は、層流を生じせしめる程度の微小な並走する主流路を少なくとも２つ使用して当該主流路の流速を異なる流速とさせることによって細胞を捕捉する方法を提供するものである。ここで、上記主流路の直径幅が層流を生じしめる程度の１００マイクロメートル以下であるようなマイクロチャンネルであってもよい。また、上記主流路の高さが細胞一個の大きさ以上であるようなマイクロチャンネルであってもよい。本発明において、細胞とは、単一細胞、複数の単一細胞が結合した細胞群、又は、同細胞群が複数集まった細胞群が挙げられ、また、細胞は培養細胞でもよく、任意の組織から単一細胞若しくは数個の細胞群を分離したものであってもよい。また、細胞は、生体組織若しくは培養された一つの細胞集団から浮遊化されたもの、若しくは生来浮遊化しているものであってもよい。
【００１１】
また、本発明は、少なくとも２つの並走する主流路の間を繋ぐことができる、単一細胞の断面線分の最大値と同一若しくはそれ以下の長さの断面線分を有する流体の通過路を設けた細胞捕捉部材を利用することが挙げられる。また、少なくとも２つの並走する主流路の１又は２以上の特定の部位において、その幅が異なることを特徴とする前記部材を利用してもよい。上記の細胞の断面線分とは、細胞膜上の任意の2点を結んだ線分を意味する。
【００１２】
ここで、単一細胞の断面線分の最大値と同一若しくはそれ以下の長さの断面線分を有する流体の通過路としたのは、細胞が通過路を通過できない大きさとすることで、通過路入口部位で捕捉できるようにしたものである。ここでは、細胞を流速の速い主流路を流れるものとして、並行する他方の流路は流速の遅い液体を流すことで、この２つの主流路間の通過路において、圧力差が生じて通過路入口部位で細胞を捕捉することができる。２つの主流路の流速の調整は、通過路入口部位で細胞の形状が変化するなどストレスを与えない程度で捕捉できるものとするように行うことが望ましい。
【００１３】
さらに、別の態様として、小さい断面積の流路を利用することによって、それぞれの細胞が捕捉された後、それぞれに加える圧力、流れが作りだす圧力の違い、細胞が通過路に押し込まれて受ける圧力を利用して細胞を破砕できる。
【００１４】
また、主流路の配置方法は、例えば、中央とその両側に主流路を設けて、中央の流路には単離された細胞を含んだ液体を流し、その両側の流路には、流速の遅い液体を流して、中央の流路の側面にある通過路入口で捕捉してもよい。逆に、両側の主流路に単離された細胞を含んだ液体を流し、中央の流路に流速の遅い液体を流して、両側の主流路の側面にある通過路入口で捕捉してもよい。通過路は２つの主流路の間に、複数路を配置してもよい。また、通過路は、主流路に対して垂直、若しくは、細胞の流れる向きに対して、１８０度以内の斜め方向に配置してもよい。
【００１５】
また、本発明は、請求項１の方法または本発明の細胞捕捉部材を用いて捕捉した細胞を、当該部材で培養する方法を提供するものである。さらに、層流を生じせしめる程度に微小である、少なくとも２つの並走する主流路の流速を変化させることによって、前記細胞捕捉部材を利用して細胞を捕捉し培養する方法としてもよい。本発明の特徴として、本発明の細胞捕捉部材は、細胞を捕捉するとともに、当該部材で培養することができる。細胞が捕捉された流路に、細胞培養液を流すことができ、また、主流路に細胞培養液を流しつづけ、長時間の安定した培養を可能とすることが挙げられる。さらに、温度調整は、細胞捕捉部材を置くステージ等に加熱装置を設置することや、細胞捕捉部材若しくはその周辺機器をも、温度調節可能なインキュベーターのなかに入れることが挙げられる。また、捕捉した一個の細胞について細胞培養液を別個に一つの流路を用いて与えることを可能としてもよい。
【００１６】
本発明は、上述の物体捕捉装置を用いて単離された単一細胞若しくは数個の細胞群を培養する方法であって、細胞を通過路入口部位で捕捉するとともに、その部位にある細胞に細胞培養液を連続的に与えることができることを特徴とする細胞の培養方法を提供するものである。ここで、細胞は捕捉した後は、主流路の流れを止め、そのまま培養すること、または、流れを止めずに、かつ細胞の破砕等の変化が生じない条件で細胞を捕捉し続けて培養することが挙げられる。
【００１７】
細胞を培養するにあたっては、細胞の効果的な接着を促すために、流路内を細胞外基質のタンパク質やペプチドもしくは合成高分子を含む試薬で修飾してもよい。これらの修飾分子は、少なくとも２つの主流路の流速を制御することにより、流路の全部もしくは特異的な一部を修飾するようにしてもよい。また、修飾は物理的な吸着もしくは化学結合を利用してもよい。
【００１８】
ここで、流路の全部もしくは特異的な一部を化学結合で修飾するために、適当な試薬を流して表面を予め化学的に修飾してもよい。また、細胞を接着しやすくするのと同様の方法を用いて、細胞を接着しにくくする試薬を用いて、流路を修飾してもよい。
【００１９】
また、本発明は、少なくとも２つの並走する主流路の流速を変化させることによって、前記細胞捕捉部材内に補足した細胞を放出または解放する方法、さらに、その放出または解放した細胞を回収する方法を提供する。さらに、少なくとも前記細胞捕捉部材の少なくとも２つの並走する主流路の流速を変化させることによって細胞を破砕する方法を提供するものである。ここで、主流路の構成等、若しくは利用する細胞捕捉部材については、上述した細胞を捕捉する方法で利用する細胞捕捉部材と同様である。
【００２０】
また、本発明は、上述の細胞捕捉方法で捕捉した細胞を放出させる方法であって、通過路入口部位に捕捉された細胞がある主流路を流れる液体の流速を、通過路を共有した他方の主流路を流れる液体の流速に比して遅くすることを特徴とする細胞放出方法を提供する。ここでは、上記の捕捉方法における２つの主流路の流速を逆転させる。これにより、細胞の無い主流路を流れる液体が、圧力差により通過路を介して、もう片方の主流路の通過路入口部位を塞ぐように捕捉されている細胞を押し出し、細胞を放出させることができる。放出された細胞は主流路より回収し、他の培養器材で再び培養することも可能である。
【００２１】
また、本発明は、通過路を共有した他方の主流路に比して、流速の速い主流路を流れる細胞を前記通過路入口部位で捕捉するとともに、細胞を流した主流路の流速を当該細胞が前記主流路を繋ぐ通過路に押し込まれる程度まで速くすることにより、細胞が同通過路で破砕され、その内容物が当該通過路を介して、流速の遅い他方の主流路を移動することを特徴とする細胞破砕方法を提供する。ここで、細胞が破砕するメカニズムとして、圧力差により、細胞がその大きさよりも狭い通過路に押し込まれることにより、細胞が破裂する。
【００２２】
本発明は、密着した複数の細胞からなる細胞塊を単一細胞若しくは数個の細胞群とするように分離処理して、当該単一細胞若しくは数個の細胞群がそれぞれ捕捉される前記細胞捕捉部材の任意の部位に捕捉され、全部若しくは一部の単一細胞又は数個の細胞群に対して、任意の処理をすることにより、当該単一細胞若しくは数個の細胞群を前記細胞捕捉部材を用いて試験する方法を提供する。
【００２３】
ここで、密着した複数の細胞からなる細胞塊とは、培養細胞の細胞塊や動物の組織などが挙げられる。分離処理とは、カルシウムイオンのキレート剤などの化学処理や物理的な分離処理がある。また、全部若しくは一部の単一細胞又は数個の細胞群に対して、任意の処理ができるのは、主流路に流れる液体を異なるものとすることで、任意の主流路の部位に捕捉されている細胞のみに特定の試薬などを処理させることができることが挙げられる。なお、細胞の試験とは、細胞にある処理をすることで、分化誘導を生じさせて観察することも含まれる。
【００２４】
また、本発明は、少なくとも２つの並走する主流路を配置した細胞捕捉部材であって、当該主流路間に、単一細胞の断面線分の最大値と同一若しくはそれ以下の長さの断面線分を有する通過路を有し、流速の異なる液体を当該２つの主流路に流すことにより、主流路を流れる細胞を通過路入口部位で捕捉及び放出できることを特徴とする細胞捕捉部材を提供するものである。また、前記通過路と主流路の接続部位において、曲面を有する細胞捕捉領域を設け、当該細胞捕捉領域の開口部は主流路に接し、当該開口部の断面積は前記通過路の断面積よりも大きいことを特徴とさせてもよい。ここで、曲面を有する細胞保持領域とは、半円形の形状などが挙げられる。
【００２５】
また、本発明は、前記細胞捕捉部材の主流路に流路内壁を修飾する分子を流して、少なくとも２つの並走する主流路の流速を変化させることによって、前記主流路および通過路の全部または一部を物理的または化学的に修飾する方法を提供する。ここで、前記主流路および通過路の全部または一部を物理的または化学的に修飾することは、主流路の液体が流れる流速を異なるものとすることで、可能となる。２つの主流路の一方のみを分子で流路内壁を修飾させるためには、その一方の主流路を流れる液体の流速を、他方の主流路に比して、速くすること等により実現できる。また、前記分子は、細胞が接着しやすいまたは接着しにくいものであってもよい。また、当該細胞捕捉部材の流路の任意の部位で細胞を培養してもよい。ここで、細胞を接着させやすい分子とは、フィブロネクチンなどがあり、逆に、細胞を接着させにくい分子とは、PEGによる修飾等がある。
【００２６】
また、本発明は、前記細胞捕捉部材に、流速の異なる液体を当該２つの主流路に流す液体搬送手段を連結させ、主流路を流れる細胞を通過路入口部位で捕捉及び放出できることを特徴とする細胞捕捉装置を提供するものである。前記液体搬送手段は、液体搬送ポンプを用いて、流路の幅の異なる少なくとも２つの主流路に同時に液体に挿入することとしても良い。
【００２７】
ここで、液体搬送手段とは、それぞれの主流路の液体搬送口に、ペリスタポンプやプランジャポンプ等のポンプ装置、手動シリンジに続くチューブを接続させ、２つの主流路に流速の異なる液体をそれぞれ搬送することが挙げられる。
【００２８】
また、これらの流速の違いを生み出す方法として、流路の幅を違えることによって、すなわち、一つの流路の幅をその流路の方向に対して太くしたり、あるいは細くすることによって、流体の動力源（ペリスタポンプやプランジャポンプ等のポンプ装置など）により流量を変化させることなく流速の違いを効果的に発生させることができる。
【００２９】
また、前記流速の異なる液体を当該２つの主流路に流す液体搬送手段は、１つの液体搬送ポンプを用いて、流路の幅の異なる２つの主流路に同時に液体に挿入することを特徴としてもよい。ここで、装置を簡略化するために、１つの液体搬送ポンプに続くチューブが、途中で、複数本のチューブに分かれる構成、また、２つの主流路の上流について、１つの流路として、途中で複数の流路に分かれる構成としてもよい。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、液体が異なる流速で流れる並走する主流路とそれを連結させる通過路の間に生じる圧力差を利用して、細胞を捕捉、放出、破砕、及び培養する構成としているため、複数の機能を同じ部材、装置で実現できるという簡易な構成でよい。また、圧力差の調整は、主流路の流速を異なるものとするだけで調節が可能となる。
【００３１】
また、本発明では、捕捉した細胞に対して連続して特定の液体で浸すことができるため、本発明の部材の中で、細胞を培養することができ、また、任意の薬物等を細胞培養用培地液に添加することで、その影響を観察することができる。さらに、本部材の全部若しくは一部を透明のガラスやプラスチックもしくは樹脂やゴムで構成することもでき、細胞を顕微鏡で観察しながら、それらの処理ができる。
【００３２】
また、本発明の細胞捕捉部材には、任意のタンパク質や試薬を流して本部材の全部若しくは一部の流路壁面を物理吸着または化学結合的に修飾することもでき、本部材が透明のガラスやプラスチックで構成することで、これらの修飾分子を蛍光染色などの手法により解析することができる。これにより、細胞の特定の極性、もしくは細胞の特定の領域にのみに、任意のタンパク質や試薬を処理することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、添付図面を参照にしつつ、本発明の一実施形態を説明する。本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
（細胞捕捉部材の構成及び製造方法）
本発明に係る細胞捕捉部材の構成を説明する。図１は、細胞捕捉部材（１１）の上面を示したものである。基板のうえに、凹部状の３本の並行する独立した主流路（１２、１３、１４）が設けられており、図示しないが、基板上に、基板と同じ大きさのカバーを載せる。細胞が流れる主流路は、両側の主流路（12、14）であり、圧力差を生じさせるための流路は中央の主流路（13）である。主流路の幅は、５０μｍである。また、本発明の係る細胞捕捉部材の製造方法は、polydimethylsiloxane  （PDMS）を用いたsoft-lithographyの手法により作製される。また図２は本発明の細胞捕捉部材の走査電子顕微鏡像である。
【００３５】
また、図１に示す細胞捕捉部材では、両側の主流路に６つ（合計１２）の半円状の細胞捕捉領域（１５）を基板の中心側に向かって設けている。この半円状の細胞捕捉領域の大きさは、半径10-50μｍとしている。また、細胞捕捉領域（１５）の半円状の頂点部分には、主流路（12、14）と中央の主流路（13）の間を繋ぐ、幅３〜５μｍの通過路（１６）を設けている。図１に示す細胞捕捉部材では、半円状の細胞捕捉領域（１５）及び通過路（１６）の大きさをそれぞれ異なるものとしている。
【００３６】
細胞捕捉部材の主流路（１２、１３、１４）の入口部位（１７）に、図示しない任意のポンプ等のチューブを連結、若しくは配置させ、チューブ等から液体を搬送させることができる。主流路を流れた液体は、主流路（１２、１３、１４）の出口部位（１８）から排出されることになる。液体の円滑な排出のために、出口部位（１８）に図示しない任意のポンプ等のチューブを連結、若しくは配置させ、チューブ等から液体を吸引して搬送させることができる。チューブ等を配置させる場合には、当該配置部位にはカバーされないカバー形状としてもよい。
【実施例２】
【００３７】
（単一細胞の捕捉）
図３は、上記の細胞捕捉部材を用いて、実際に細胞を捕捉したことを示す顕微鏡写真である。ここで、細胞は、NIH3T3細胞を用いて、細胞を流す主流路（１２、１４）の流量を、０．５μL/min、圧力差を生じさせるための主流路（１３）の流量を、０．２μL/minとした。図３では、主流路間の流量の違いにより生じる水圧により、単一細胞（１９）が細胞捕捉領域（１５）の通過路を塞ぐように捕捉される。他の態様として、通過路に捕捉された細胞について、細胞捕捉部材の温度を調整すること、また、培養液を流し続けることなどにより、培養することができるものとすることが挙げられる。矢印は、水流及び細胞の流れる方向を示している。
【実施例３】
【００３８】
（捕捉された単一細胞の放出）
図４は、上記の細胞捕捉部材を用いて、実際に、捕捉された細胞を放出させたことを示
す顕微鏡写真である。細胞を流す主流路（１２、１４）の流量を、０μL/min、圧力差を
生じさせるための主流路（１３）の流量を、３０μL/minとした。図３では、圧力差を与えるための主流路からの液体が通過路に流れ、その水圧により、細胞捕捉領域の通過路に補足された細胞（１９）が放出されて、流速の遅い主流路に向かって流れる。
【実施例４】
【００３９】
（単一細胞の破砕）
図５は、上記の細胞捕捉部材を用いて、実際に、捕捉された細胞を破砕することを示す顕微鏡写真である。細胞を流す主流路（１２、１４）の流速を、２．０μL/min、圧力差を生じさせるための主流路（１３）の流量を、０．２μL/minとした。図３では、細胞を流れる主流路の液体が通過路を介して、細胞を流れる主流路と比して高い水圧で他の主流路に流れることで、単一細胞が細胞捕捉領域（１５）の通過路に詰るように捕捉される。続いて、図２の場合と異なり、圧力差の程度を強力なものとすることで、通過路入口に捕捉された細胞が通過路の中に押し込まれて形状を維持することができず、破砕される。細胞が破砕されることで細胞内にあった内容物は、通過路を介して、流速の遅い主流路に向かって流れる。他の態様として、流速の遅い主流路の出口にドレインを結合させることで、破砕された内容物を回収することができる。図５に示す矢印で、細胞及び細胞が破砕され流出した内容物を示しているが、（a）から（ｃ）に経時的に細胞が、主流路（１２）から流れてきた細胞が、通過路（１６）部分で破砕されて、その内容物が主流路（１３）に流れ出ることが示されている。
【実施例５】
【００４０】
（細胞捕捉領域及び通過路の流れの解析）
図６は、上記の細胞捕捉部材の細胞捕捉領域及び通過路に係る流速シミュレーションを示したものである。上図は、図の上方にある主流路の流量を、1.0μL/min、として、圧力差を生じさせる主流路の流量を、0μL/minとした。下図は、図の上方にある主流路の流量を、1.0μL/min、として、圧力差を生じさせる主流路の流量を、０.０5μL/minとした。シミュレーションは、Coventor  Ware社のFEM/CFDsimulation  を用いた。矢印の向きは液体の流れる方向を示し、矢印の長さは、流速の速さを示している。流速が速いほど、長く表現している。シミュレーションにおいても、液体の流れる方向は、実験結果と一致し、また、２つの主流路間の流速の差分が大きいほど、通過路および細胞捕捉領域の液体の流れる流速、水圧も大きくなることが示されている。
【実施例６】
【００４１】
（通過路を斜めに配置した細胞捕捉部材と細胞の連続捕獲）
図７は、通過路を主流路に対して斜め方向に配置した細胞捕捉部材を示す。この説明図のように、細胞の流れる向きに対して、180度以内の斜め方向、ここでは、４５度程度にしたものである。さらに、通過路の位置は、細胞捕捉領域の中心ではなく、細胞を捕捉し易いように、中心点と主流路の間に配置することが示されている。図７の下側の細胞捕捉領域の通過路には、細胞が捕捉されていることが示されている。これらの細胞は、図中右側の通過路から順に捕捉されたものである。この経時的な様子を図８に示す。図８a,b,cの順で、図中左側から流れる液体とともに、細胞が右側の細胞捕捉領域から順に捕捉されていることが示される。
【実施例７】
【００４２】
（様々な細胞の捕獲）
図９（a）は、通過路が主流路の直行方向からおよそ４５度斜めに傾いた形状をもつ細胞捕捉部材で、PC12、NIH3T3、アストロサイトの各単一細胞を捕捉した顕微鏡像である。主流路を流れる流体の流量は、細胞が流れる主流路は0.5μL/minとその他の主流路は、0.2 μL/minである(図９（ｂ）)。
【実施例８】
【００４３】
（細胞捕捉部材のガラス底面の局所的なフィブロネクチン修飾）
図１０は、ガラス底面を局所的にフィブロネクチンでコーティングした実施例である。（a）に示すように、フィブロネクチンを含むPBS溶液を中央の主流路に流量0.03μL/minで流し、図中下側の主流路にはPBSのみを同じく流量0.03 μL/minで流した。このため2つの流路間の通過路には圧力差が生じず、下側の主流路には中央流路からのフィブロネクチンの流入が起こらない。一方、図中上側の主流路にはPBSのみを流量0.02μL/minで流すと、中央流路よりも僅かに流速が小さいため、通過路を通って中央流路からのフィブロネクチンの流入が起こる。ただし、流速比が小さいため、2つの流路間の圧力差は僅かであると考えられ、上側主流路の層流に遮られてフィブロネクチンの流入は通過路出口の近傍に限られる。（b）は両側の主流路に設けた細胞捕捉部位でNIH3T3細胞の捕捉と培養を行った顕微鏡像である。フィブロネクチンがコーティングされた上側の流路では、細胞の顕著な接着・伸展が観察される。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の細胞捕捉部材によれば、異なる流速で液体が流れる並走する主流路とそれを連結させる通過路の間に生じる圧力差を利用して、細胞を捕捉、放出、破砕する構成としているため、簡単な構成で複数の機能を実現することができ、研究機器として提供することができる。
【００４５】
また、本発明の細胞捕捉部材では、捕捉した細胞に対して連続して特定の液体で浸すことができるため、部材の中で、細胞を培養することができ、また、任意の薬物等を細胞培養用培地液に添加することで、その影響を観察することができる。さらに、本部材の全部若しくは一部を透明のガラスやプラスチックで構成することもでき、細胞を顕微鏡で観察しながら、それらの処理ができる。単一細胞若しくは数個の細胞についての培養装置、観察装置として提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】細胞捕捉部材の構成を示す図
【図２】細胞捕捉部材を示す走査電子顕微鏡像
【図３】細胞捕捉領域の通過路で捕捉される細胞を示す顕微鏡写真
【図４】細胞捕捉領域の通過路で捕捉された細胞が主流路に放出されたこと示す顕微鏡写真
【図５】細胞捕捉領域の通過路で破砕される細胞を示す顕微鏡写真
【図６】細胞捕捉領域の流れの状態を示すシミュレーション
【図７】通過路が主流路に対して斜め方向に設けられた細胞捕捉部材を示す説明図
【図８】細胞捕捉領域に経時的に細胞が捕捉されていることを示す顕微鏡写真
【図９】(a)異なる種類の細胞が、細胞捕捉領域に捕捉されていることを示す顕微鏡写真            (b)各主流路に流れる液体の流量を説明する説明図
【図１０】(a)各主流路に流れる液体の流量と液体の種類を説明する説明図              (b)一方の主流路にフィブロネクチンが処理され、細胞接着の様子を示す顕微鏡写真
【符号の説明】
【００４７】
11    細胞捕捉部材
12・14    細胞を流す主流路
13    圧力差を生じさせるための主流路
15    細胞捕捉領域
16    通過路
17    入口部位
18    出口部位
19    細胞捕捉領域に捕捉された単一細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2008136475.tif 000006
【図５】
2008136475.tif 000007
【図６】
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【図７】
2008136475.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年3月13日(2007.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
組織や培養細胞を用いて、再生医療、分子医療、ゲノム創薬を行う場合に、細胞の観察や実験は不可欠である。細胞の集団としての効果をより綿密に解析する場合には、細胞塊ではなく、単一の細胞をそれぞれ単離し、若しくは数個の細胞群を空間的に分離した状態での観察・実験をすることが必要となる。さらに、集団としての機能が確立される組織においても、それを構成する細胞等をより詳しく調べることで、各細胞の分化の違いなどを明らかにすることが出来る。特に、細胞一個の内容物を調べることによって、特定のタンパク質やDNAの発現経路がより詳しくわかり、また同じ細胞であっても周囲の環境の違いや概日リズム等における時間的な違いによって、遺伝子やタンパク質の発現パターンが揺らぐもしくは異なる現象を詳しく理解することも可能となる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
また、本発明は、通過路を共有した他方の主流路に比して、流速の速い主流路を流れる細胞を前記通過路入口部位で捕捉するとともに、細胞を流した主流路の流速を当該細胞が前記主流路を繋ぐ通過路に押し込まれる程度まで速くすることにより、細胞が同通過路で破砕され、その内容物が当該通過路を介して、流速の遅い他方の主流路を移動することを特徴とする細胞破砕方法を提供する。ここで、細胞が破砕するメカニズムとして、圧力差により、細胞がその大きさよりも狭い通過路に押し込まれることにより、細胞が破砕する
。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
（単一細胞の破砕）
図５は、上記の細胞捕捉部材を用いて、実際に、捕捉された細胞を破砕することを示す顕微鏡写真である。細胞を流す主流路（１２、１４）の流量を、２．０μL/min、圧力差を生じさせるための主流路（１３）の流量を、０．２μL/minとした。図３では、細胞を
流れる主流路の液体が通過路を介して、細胞を流れる主流路と比して高い水圧で他の主流路に流れることで、単一細胞が細胞捕捉領域（１５）の通過路に詰るように捕捉される。続いて、図２の場合と異なり、圧力差の程度を強力なものとすることで、通過路入口に捕捉された細胞が通過路の中に押し込まれて形状を維持することができず、破砕される。細胞が破砕されることで細胞内にあった内容物は、通過路を介して、流速の遅い主流路に向かって流れる。他の態様として、流速の遅い主流路の出口にドレインを結合させることで、破砕された内容物を回収することができる。図５に示す矢印で、細胞及び細胞が破砕され流出した内容物を示しているが、（a）から（ｃ）に経時的に細胞が、主流路（１２）から流れてきた細胞が、通過路（１６）部分で破砕されて、その内容物が主流路（１３）に流れ出ることが示されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
（細胞捕捉領域及び通過路の流れの解析）
図６は、上記の細胞捕捉部材の細胞捕捉領域及び通過路に係る流速シミュレーションを示したものである。上図は、図の上方にある主流路の流量を、1.0μL/min、として、圧力差を生じさせる主流路の流量を、0μL/minとした。下図は、図の上方にある主流路の流量を、1.0μL/min、として、圧力差を生じさせる主流路の流量を、０.０5μL/minとした。シミュレーションは、Coventor  Ware社のFEM/CFD  simulation  を用いた。矢印の向きは液体の流れる方向を示し、矢印の長さは、流速の速さを示している。流速が速いほど、長く表現している。シミュレーションにおいても、液体の流れる方向は、実験結果と一致し、また、２つの主流路間の流速の差分が大きいほど、通過路および細胞捕捉領域の液体の流れる流速、水圧も大きくなることが示されている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
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