(57)【要約】【課題】精製収率が高く、高純度で取得可能なネコエリスロポエチンの製造方法を得ることを目的とする。【解決手段】本発明は、動物細胞CHO細胞により生産したネコエリスロポエチンを含む細胞培養上清を、銅キレートカラムにを用いて精製する工程を含むネコエリスロポエチンの製造方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞を培養して培養上清中にネコエリスロポエチンを発現させる工程、及び発現させたネコエリスロポエチンを銅キレート担体を用いて精製する工程とを含むネコエリスロポエチンの製造方法。
【請求項２】
ネコエリスロポエチンを陰イオン交換担体を用いて精製する工程を含む請求項１に記載のネコエリスロポエチンの製造方法。
【請求項３】
陰イオン交換担体がジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交換担体である請求項２に記載のネコエリスロポエチンの製造方法。
【請求項４】
動物細胞がＣＨＯ細胞である請求項１〜３のいずれかに記載のネコエリスロポエチンの製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法により製造されたネコエリスロポエチン。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法により製造されたネコエリスロポエチンを含む動物用医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞を用いて発現させ、カラムクロマトグラフィーにより精製するネコエリスロポエチンの製造方法、及び該製造方法で製造されたネコエリスロポエチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチン（以下、本明細書において「ＥＰＯ」と記載することがある。）は、赤血球産生を促進するホルモンで、主に腎臓において生産される。ヒトＥＰＯは192残基のアミノ酸で構成されており、その内27残基がシグナルペプチド、165残基が成熟タンパク質のアミノ酸配列からなり、Ｎ型結合糖鎖およびＯ型結合糖鎖修飾を受けた分子量約34,000Daの糖タンパク質である。ＥＰＯは、組織が低酸素ストレスを受けた際に骨髄中の原始前駆細胞が前赤芽球に変換されるのを促進し、もって赤血球の産生を増大させる作用を有する。ＥＰＯ  cDNAクローニングは、ヒト以外にも、マウス、ラット、イヌ、ネコなどで行われている（非特許文献１）。
【０００３】
ヒトで報告のある慢性腎不全、化学療法剤又は外科手術によって引き起こされる貧血は、コンパニオンアニマルであるイヌおよびネコにおいても見られ、これらの動物の死亡および能力障害の主な原因となっている。現在、イヌやネコの輸血などに際して、さらにほとんどのネコの慢性腎疾患および感染症(FeLV感染)による貧血症状に対して、利用可能な唯一の方法は、組換えヒトエリスロポエチンの投与である。この動物種が異なるヒトＥＰＯの投薬は、イヌ、ネコの生活の質を改善するものの、２つの欠点を有するとされている。まず第一の欠点は、ネコに対するヒトＥＰＯの活性は、ネコＥＰＯに比べて低下することが予想され、目的の治療効果を得るためには大量の投与を余儀なくされることである。第二の欠点は、ヒト由来ＥＰＯを投与されたイヌ、ネコは、その投与によって中和抗体が発現し、この抗体により投与したＥＰＯの有効性が減弱し、またイヌ、ネコ本来のＥＰＯと交叉反応して貧血を悪化させる（非特許文献１）。これらの問題を解決する手段として、イヌ、ネコのＥＰＯ製剤が得られれば、これらの免疫学的な問題は克服され、ヒトＥＰＯ製剤投与による諸問題は解決される可能性がある。
【０００４】
現在、ネコの慢性腎疾患や感染症による貧血治療に対して使用されている組換えヒトＥＰＯ製剤は、動物細胞（ＣＨＯ細胞）で製造されている。一般に、培養上清中からのタンパク質の回収には、クロマトグラフィー技術が用いられる。従来一般に用いられているものとしては、イオン交換クロマトグラフィー、キレートクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどが挙げられる。イオン交換クロマトグラフィーは、異なった電荷を有するタンパク質からなる溶液が、異なったイオン強度の溶出液による溶出によって分離される方法である。キレートクロマトグラフィーは、固定化金属イオンアフィニティー担体とタンパク質がキレート形成により固定化された金属イオンに対する親和性を利用して分離する方法である。タンパク質のヒスチジンやシステインはキレートを形成している金属と複合体を形成し、カラムに吸着する。ヒトＥＰＯは、陰イオン交換担体および逆相クロマトグラフィー（HPLC）の組合わせにより精製されているが、精製収率は30-50%である（特許文献１、特許文献２）。また、他の報告として、ヒト尿から、イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈殿、ゲル濾過、ハイドロキシアパタイト等の７つのステップからなる方法により、精製収率２１％でヒトＥＰＯを精製する方法が報告されている（非特許文献２）。しかし、ネコＥＰＯについては、これまでに精製・単離に関する報告はない。
【特許文献１】特公平７−７２９２３号公報
【特許文献２】特公平６−９８０１８号公報
【非特許文献１】ヴェンら：「ブラッド（Blood）」、８２巻、ｐ１５０７（１９９３）
【非特許文献２】ミヤケら：「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Ｂ.Ｃ）」、２５２巻，ｐ５５５８（１９７７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、ネコでは慢性腎疾患や感染症により貧血症例が多いのにも関わらず、その治療には組換えヒトＥＰＯ製剤が使用されており、異種タンパク質投与による中和抗体出現のための作用減弱などの諸問題がある。組換えヒトＥＰＯ製剤に代わり、ネコＥＰＯ製剤があれば、費用の面・薬効の面でも飼い主の負担は軽減されるともに、投薬されたネコのＱＯＬも向上する可能性がある。そこで、動物細胞、中でもＣＨＯ細胞を用いて生産された組換えネコＥＰＯの製造方法として、報告されているヒトＥＰＯの精製法を用いて、CHO細胞で生産された組換え型ネコＥＰＯの精製を検討したが、精製収率が低いという結果であった。本発明は、精製収率が高く、高純度ネコＥＰＯを取得可能な製造方法を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、動物細胞を培養することにより得られたネコＥＰＯを、ヒトＥＰＯの精製において報告のある方法を一切使用することなく、銅キレート担体を用いて精製することにより、不純物の除去効率が大幅に改善し、高純度な組換え型ネコＥＰＯを得られることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
〔１〕動物細胞を培養して培養上清中にネコエリスロポエチンを発現させる工程、及び発現させたネコエリスロポエチンを銅キレート担体を用いて精製する工程とを含むネコエリスロポエチンの製造方法。
〔２〕ネコエリスロポエチンを陰イオン交換担体を用いて精製する工程を含む〔１〕に記載のネコエリスロポエチンの製造方法。
〔３〕陰イオン交換担体がジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交換担体である〔２〕に記載のネコエリスロポエチンの製造方法。
〔４〕動物細胞がＣＨＯ細胞である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のネコエリスロポエチンの製造方法。
〔５〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法により製造されたネコエリスロポエチン。
〔６〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法により製造されたネコエリスロポエチンを含む動物用医薬。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、組換え型の高純度なネコエリスロポエチンを得ることが可能になる。本発明により得られるネコエリスロポエチンは、動物用医薬品、例えばネコの慢性腎不全、化学療法剤又は外科手術によって引き起こされる貧血に対する治療薬として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、動物細胞を培養して培養上清中にネコエリスロポエチンを発現させる工程、及び発現させたネコエリスロポエチンを銅キレート担体を用いて精製する工程とを含むネコエリスロポエチンの製造方法である。
【００１０】
本発明のネコエリスロポエチンの製造方法において、動物細胞を培養して培養上清中へネコエリスロポエチンを発現させることは、以下のように行うことができる、
ネコＥＰＯをコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドは、例えば次のようにして製造することができる。すなわち、ネコの虚血状態のネコ腎臓を処理して得られる細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、ネコＥＰＯをコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによって、ネコＥＰＯをコードする遺伝子を得ることができる。
【００１１】
上記ネコの細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（チルインら：バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１８、５２９４（１９７９））バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法、グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。
【００１２】
また、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロース法などによりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（ガブラーら：ジーン（Ｇｅｎｅ）．２５，２３６−２６９（１９８３））、Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（オカヤマら：モレキュラーセルバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ），２，１６１，（１９８２）＆３，２８０，（１９８３））などによりネコＥＰＯｃＤＮＡを合成することができる。ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、例えばトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いる方法のほか、一部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてもよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。
【００１３】
以上のようにして得られたｃＤＮＡを鋳型として、ネコＥＰＯをコードする遺伝子の塩基配列を基にし、かつベクターに組込みが可能なように適切な制限酵素サイトを付加したプライマーを設計し、ＰＣＲを行うことによって、ネコＥＰＯをコードするＤＮＡを得ることができる。次に、後述するように、調製したネコＥＰＯｃＤＮＡを適当な発現ベクターに組込み、これを用いて動物細胞に形質転換し、形質転換体をスクリーニング、培養することによりネコＥＰＯを生産することが可能である。
【００１４】
動物細胞に導入したネコＥＰＯ遺伝子を増幅するために、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素(mdhfr)をコードする遺伝子を同時に導入する方法を用いることができる。ネコＥＰＯ遺伝子とマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素遺伝子の両遺伝子が導入された動物細胞の培養液中にメトトレキセート(MTX)を段階的に添加していくことで、動物細胞内のmdhfrの発現量が向上するとともに、目的の遺伝子であるネコＥＰＯ遺伝子が増幅され、結果的にネコＥＰＯ発現量が向上する。
【００１５】
ここで用いるマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素(mdhfr)をコードしている遺伝子は、例えば次のようにして製造することができる。すなわち、マウス細胞、たとえばマウスＴＫ細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、mdhfrをコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによって、mdhfrをコードする遺伝子を得ることができる。上記マウス細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（チルインら：バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１８、５２９４（１９７９））バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法、グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。
【００１６】
さらに、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロース法などによりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば  Ｇｕｂｌｅｒらの方法（ガブラーら：ジーン（Ｇｅｎｅ）．２５，２３６−２６９（１９８３））、Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（オカヤマら：モレキュラーセルバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ），２，１６１，（１９８２）＆３，２８０，（１９８３））などによりｃＤＮＡを合成する。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いるほか一部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。このｃＤＮＡを鋳型としてmdhfrをコードする遺伝子の塩基配列を基にし、かつベクターに組込みが可能なように適切な制限酵素サイトを付加したプライマーを設計してＰＣＲを行うことによってmdhfrをコードするＤＮＡを得ることができる。次に、調製したmdhfrｃＤＮＡを適当な発現ベクターに組込むかまたはネコＥＰＯｃＤＮＡを含むベクター内に導入し、これを用いて動物細胞に形質転換し、形質転換体のスクリーニングに使用し、培養することによりネコＥＰＯの高生産が可能になる。
【００１７】
本発明において、ネコＥＰＯを発現させる動物細胞としては、ほ乳類細胞、例えばCHO細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、COS細胞、ミエローマ細胞、BHK細胞、HeLa細胞、Vero細胞などが挙げられる。これらのうち、CHO細胞が好ましく用いられる。CHO細胞としては、DHFR遺伝子を欠損したCHO細胞であるCHO/dhfr-細胞やCHO K-1細胞を好適に使用することができる。具体的には、ネコＥＰＯのタンパク質の発現はチャイニーズハムスター卵巣細胞のDHFR-(CHO/dhfr-)株を用いることができる。ＣＨＯ／dhfr−細胞は、構造遺伝子の突然変異によりジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素（DHFR）を欠如しており、このため培地中にグリシン、ヒポキサンチン、チミジンの存在を要求する（ウルラシブら：プロシーディング・オブ・ナショナルアカデミー・オブ・サインス．７７，４４６１−４４６９（１９８０））。
【００１８】
本発明において、動物細胞を培養に用いる培地としては、各種血清（例えばウシ胎児血清）を加えたHamF10培地、Ham F12培地、ダルベッコMEM培地、RPMI-1640培地、MEM-α培地（以上  インビトロジェン社製）およびこれらの混合培地が用いられる。培地には必要によりグルタミン0.5〜5mM、抗生物質（ペニシリン(25U/mL)、ストレプトマイシン(25μg/mL),G418(0.3mg/mL)）などを適宜加える。
【００１９】
動物細胞の培養には、種々の培養ビン、ディッシュ、ローラーボトル、スピナーフラスコ、ジャーファーメンターなどを用いることができる。通常種細胞濃度5×104〜１×106cells/mLとし、培養温度30〜40度で、２〜10日間培養を行うと、各細胞濃度に応じ、ネコエリスロポエチンが主に細胞外に分泌される。
【００２０】
本発明において、ネコＥＰＯを発現させるために用いる発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルスベクターなどを用いることができる。発現ベクターに組込まれるプロモーターは、宿主である動物細胞により、SV40初期、後期、hCMVなど最終的に活性型のネコＥＰＯを得られるものであればよい。マーカー遺伝子は、アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子やジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)遺伝子などが用いられる。選択用添加物質として、G-418,メトトレキセートが例示される。
【００２１】
動物細胞への形質転換は、公知の方法、例えばリン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、リポフェクチン法などの沈殿法、プロトプラストポリエチレン法、エレクトロポレーション法などが利用できる。
【００２２】
本発明のネコエリスロポエチンの製造方法において、上記のようにして動物細胞を培養して培養上清中に得られたネコエリスロポエチンは、銅キレート担体を用いて精製される。
【００２３】
銅キレート担体は、銅キレートを形成するのに適当なリガンドが結合されているセファロースなどの担体に銅イオンを接触させて調製された、銅イオンをキレート結合させた担体である。タンパク質を構成するアミノ酸は、キレート形成している銅イオンと複合体を形成するため、銅キレート担体にタンパク質を接触させることにより担体に吸着する。しかし、この担体への吸着はpHに依存し、またキレート形成するアミノ酸（主にヒスチジン、システイン）が糖鎖などでマスクされると銅キレート担体に結合しない場合もある。この性質を利用し、目的タンパク質を含む動物細胞の培養液や精製された溶液中の不純物すべてを銅キレートに吸着させ、特別な塩溶液を通液することなく、目的タンパク質の高純度化が可能になる。逆に、予め目的タンパク質のみを銅キレートに吸着させ、塩の使用により、イオン強度を上げることで、溶出させ高純度化することも可能である。
【００２４】
本発明においてネコエリスロポエチンの精製に使用される銅キレート担体としては、アガロース、セルロース、セファロース、合成ポリマーゲルなどに、銅キレートを形成するリガンド、例えばイミノジ酢酸などを親水性のスペーサーを介して、導入したものが挙げられる。好ましくは、イミノジ酢酸を導入したハイトラップキレーティング（アマシャム社製）やキレーティングセファロースファーストフロー（アマシャム社製）などが用いられる。
【００２５】
銅キレート担体は、例えば次のようにして作製することができる。まず、上述した担体を精製水で予め平衡化しておき、0.1M硫酸銅水溶液を通液させる。その後に再度精製水を通液して余分な銅を除去し、精製に使用する平衡化緩衝液を通液する。以上のようにして作製した銅キレート担体を、本発明のネコＥＰＯの精製に用いることができる。
【００２６】
本発明の製造方法では、ネコエリスロポエチンを含む溶液（培養上清）を銅キレート担体に接触させ、ネコエリスロポエチンはフロースルー画分で回収する方法が好ましく採用される。
【００２７】
銅キレート担体を用いた精製操作における、溶出剤の組成、液量などは特に限定されるものではなく、最適な分離条件は存在する夾雑タンパク質、ネコエリスロポエチン各成分の量、およびカラムの寸法などに応じて適宜決定される。好ましくは、次の条件を適用することができる。すなわち、20〜100mLの銅キレート担体を用い、これを100〜500mLの10mM Tris緩衝液で平衡化する。次に、ネコＥＰＯを含む溶液を通液した後、再度40〜125mLの10mM Tris緩衝液を通液することで、ネコＥＰＯを精製することができる。
【００２８】
本発明のネコエリスロポエチンの製造方法においては、銅キレート担体を用いる精製工程に加えて、陰イオン交換担体（アニオン交換担体）を用いる精製工程を組合わせることで、目的のネコエリスロポエチンをさらに高純度化することが可能になる。
【００２９】
陰イオン交換担体としては、アガロース、セルロース、セファロース、合成ポリマーゲルなどに、親水性のスペーサーを介して、化学的に安定なエーテル結合によってジエチルアミノエチル基やクオータナリーアンモニウム基を導入したものが挙げられる。好ましくは、ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン（アニオン）交換担体、例えばDEAEセファロース（登録商標）（アマシャム社製）などが用いられる。本発明の方法では、ネコエリスロポエチンを含む溶液を陰イオン交換担体であるDEAEセファロースに接触させ、担体への吸着物を溶出剤で溶出させる方法が好ましく採用される。
【００３０】
陰イオン交換担体としてDEAEセファロースを用いた精製は、まずpHを下げてネコＥＰＯの等電点に近づることで不純物を効果的に除去し、次にイオン強度を上げること、すなわち塩などの溶出剤による溶出を行うことで、純度の高いネコエリスロポエチンを含む画分を溶出させることが好ましい。溶出剤としては、例えば塩化ナトリウムや塩化カルシウムなどが挙げられる。目的のネコＥＰＯの溶出は、溶出剤の濃度に依存し、溶出剤の濃度を変化させることにより、DEAEセファロースに吸着したタンパク質を個々に分離・分画することができる。
【００３１】
陰イオン交換担体を用いた精製操作における、溶出剤の組成、液量などは特に限定されるものではなく、最適な分離条件は存在する夾雑タンパク質、ネコＥＰＯタンパク質の量、およびカラムの寸法などに応じて適宜決定される。好ましくは、次の条件を適用することができる。すなわち、5mL〜20mLのDEAEセファロースを用い、これを50mL〜200mLの10mM Tris緩衝液で平衡化する。次に、ネコＥＰＯを含む溶液を通液し、再度50mL〜200mLの10mM Tris緩衝液で平衡化する。次に、0.5M NaClを含む10mM Tris緩衝液を溶出剤として、塩濃度を段階的に上げて担体に吸着したネコＥＰＯを溶出させる。溶出剤は、20mL〜100mLを通液する。
【００３２】
また、陰イオン交換担体による精製は、銅キレート担体による精製工程の後に実施しても、前に実施してもよいが、銅キレート担体による精製工程の後に実施することが好ましい。
【００３３】
上記の銅キレート担体を用いて精製する工程、陰イオン交換担体を用いて精製する工程を含め、本発明のネコエリスロポエチンを精製する工程においては、ネコエリスロポエチンを含む溶液（培養上清）やカラムクロマトで使用する溶出液に、界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤としては、ラウロイルザルコシン酸ナトリウム等のイオン系界面活性剤又はHCO60、Tween80等の非イオン系界面活性剤が挙げられ、これらの中でもTween80等の非イオン系界面活性剤が好ましい。また、界面活性剤の添加量としては、ネコＥＰＯ上清液中又は溶出液中に0.005重量％〜１重量％の範囲とすることが可能である。具体的には、界面活性剤としてTween80を用い、添加量0.01重量％の濃度とすることが好ましい。
【００３４】
本発明のネコエリスロポエチンの製造方法においては、さらにタンデンシャルウルトラフィルトレーションの工程を加えてもよく、これにより目的のネコＥＰＯタンパク質のさらなる高純度化が可能になる。タンデンシャルウルトラフィルトレーションは、主に限外ろか膜（UF膜）を用いたタンパク質の濃縮やバッファー交換を行う工程をさし、膜表面に対し溶液を平行に流すことによってファルリング（膜の目詰まり）を抑制し、安定で短時間での濾過工程を可能にする。UF膜としては、材質がポリエーテルスルホンや再生セルロースなどの膜を用いることができる。また、UF膜の分子量サイズは、目的となるタンパク質の分子量サイズに合わせて選択することができ、本発明のネコＥＰＯタンパク質の場合は1000-100000が好ましい。UF膜としては、具体的にはYM-10(ミリポア社製)などが好ましいものとして挙げられる。
【００３５】
本発明において、精製されたネコＥＰＯの純度の確認は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により行うことができる。例えば、精製により得られたネコＥＰＯを含む溶液10〜100μg をHPLCに導入したとき、得られた検量線から全てのピークの面積値におけるネコＥＰＯ以外の不純物のピーク面積値の割合を算出し、純度100%から不純物の割合を差し引いた値をネコＥＰＯの純度とすることができる。具体的には、以下のようにして純度を確認することができる。すなわち、ネコＥＰＯを含む溶液をC4樹脂カラム（VYDAC社製）を用いたHPLCに供し担体に接触させる。HPLCの測定条件は、流速1mL/min で通液し、０〜80%エタノール/10mMTris-HCl(pH7)のグラジエント溶出を行い、230nmのUVで吸光度測定を行う。この条件において、ネコＥＰＯのピークはリテンションタイム50-60min、エタノール濃度約66-80%に見られる。なお、HPLC操作における、溶出剤の組成、液量などは特に限定されるものではなく、最適な分離条件は存在する夾雑タンパク質、ネコエリスロポエチン各成分の量、およびカラムの寸法などに応じて適宜決定される。
【００３６】
本発明により得られたネコＥＰＯの分子量は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定することができる。還元条件下、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定すると、本発明により得られたネコＥＰＯの分子量が約30〜35ｋＤであることを確認することができる。
【００３７】
ネコＥＰＯの比活性は、本発明によって得られたネコＥＰＯの比活性は、例えば以下のように算出することができる。すなわち、ヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（R & D system社製）に添付の方法に従い、キット中のヒトＥＰＯ国際標準品をスタンダードとして用いて、溶液中のネコＥＰＯの活性値(U/mL)を算出する。次に、ネコＥＰＯ溶液のタンパク質の定量をBCA protein assay(PIERCE社製)を用いて行い、ネコＥＰＯタンパク質濃度（mg/L）の算出を行う。得られた活性値（U/mL）をネコＥＰＯタンパク質濃度（mg/L）で除した数値の商を比活性値とすることができる。すなわち、比活性値は、溶液あたりのネコＥＰＯの活性値（U/mL）を、溶液あたりのネコＥＰＯタンパク質濃度(mg/L)で除した値として求められる。
【００３８】
ここで、ネコＥＰＯタンパク質の比活性は、ネコＥＰＯタンパク質１ｍｇあたりの生理活性の強さを意味する。比活性は、タンパク質の精製の度合い、すなわちネコＥＰＯタンパク質の純度の指標となりうる。ネコＥＰＯの比活性を求めるために用いられる生理活性としては、in vitroにおけるヒトTF細胞による細胞増殖活性や赤血球前駆細胞の細胞増殖活性を用いることができる。例えば、ヒトTF細胞による細胞増殖活性は、「J.Cell.Physiol 1989 140 pp323-334」に記載の方法を適用することができる。
【実施例】
【００３９】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
【００４０】
参考例１  ネコＥＰＯ遺伝子の取得
（１）ネコｃＤＮＡの調製
一過性に低酸素状態にしたネコから腎臓を抽出し、メスにて適切な大きさ（直径2cm2程度）に切開し、10%FBSを含むMEM培地（インビトロジェン社製）を含む容器に入れ、同じ培地にて３回洗浄を行った。皮膚組織など不要な部分をさらに取り除き、ハサミで細かくし、滅菌三角フラスコに入れ0.1%コラゲナーゼtypeＩ溶液（シグマ社）を細切組織が完全に浸かる程度加え、さらに0.001%DNase（宝酒造（株）製）を添加し、37℃で２時間ゆっくり撹拌した。次に、ステンレス製細胞コレクターを通し、組織片を取り除いた。コレクターのメッシュを通過した細胞浮遊液を900rpm,５分間遠心して上清を取り除き、１０％FBSを含むMEM培地で懸濁し、ピペッティングを行い、再度遠心し、細胞の沈殿とした。この操作を３回繰り返し、ネコ腎臓細胞とした。得られたネコ腎臓細胞をＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、「ＴＥ」と略することがある。）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。０．５Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％  ＳＤＳを含む２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ  ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２ を２μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍ  ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００４１】
（２）ネコＥＰＯ遺伝子の取得
ネコＥＰＯのＮ末端およびＣ末端の塩基配列をもとに、配列番号２及び配列番号３の塩基配列で表される２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のネコ腎臓細胞より得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分とする各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社製のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約550ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００４２】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）製のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次に、このプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社製のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片が、ネコEPOをコードする配列番号１に示す塩基配列であることを確認した。
【００４３】
参考例２  マウスdhfr遺伝子の取得
（１）マウスｃＤＮＡの調製
マウスTK細胞を10%FBSを含むRPMI1640(インビトロジェン社製)を用いて、３７℃で５％CO2存在下培養し、２×106cellsに調製した。次にこの細胞ををＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。０．５Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％  ＳＤＳを含む２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ  ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２ を２μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍ  ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００４４】
（２）マウスdhfr遺伝子の取得
マウスdhfrのＮ末端およびＣ末端の塩基配列をもとに、配列番号４及び配列番号５の塩基配列で表される２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のネコ腎臓細胞より得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分とする各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社製のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約550ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００４５】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）製のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社製のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片がマウスdhfrをコードする配列番号６に示す塩基配列であることを確認した。
【００４６】
実施例１  CHO細胞によるネコEPOの発現
（１）発現用遺伝子ベクターへのネコEPO遺伝子の組込み
配列番号１に示すネコEPOをコードする塩基配列のＮ末側およびＣ末端の塩基配列をもとに、配列番号７及び配列番号８の塩基配列で表される２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。参考例１（２）で得られたネコEPOcDNAを鋳型とし、PCRによる遺伝子の増幅を行った。すなわち、０．５ｍｌのミクロ遠心チューブにネコEPOcDNA２μｌを添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分とする各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社製のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約550ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００４７】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）製のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次に、このプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社製のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片がネコEPOをコードする配列であることを確認した。
【００４８】
動物細胞発現用遺伝子ベクターpcDNA3.1(インビトロジェン社製)及び上記で調製したネコEPO遺伝子をEcoRＩ、Xho I処理した。次に、１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、常法により目的の遺伝子の切り出しを行った。得られた遺伝子断片をgeneclean II kit（フナコシ社製）により抽出し、DNA ligation kit ver II（宝酒造（株）社製）により16℃、30分の条件下pcDNA3.1とネコEPO遺伝子の連結を行った。次に、連結した遺伝子をDH5αコンピテントセル(TOYOBO社製)に常法により形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりネコEPO遺伝子断片を含む動物細胞発現用遺伝子ベクターDNAを調製した。
【００４９】
（２）発現用遺伝子ベクターへのマウスdhfr遺伝子の組込み
配列番号６に示したマウスdhfrをコードする塩基配列のＮ末側およびＣ末端の塩基配列をもとに、配列番号９及び配列番号１０の塩基配列で表される２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。参考例１（２）で得られたマウスdhfr cDNAを鋳型とし、PCRによる遺伝子の増幅を行った。すなわち、０．５ｍｌのミクロ遠心チューブにマウスdhfr cDNA２μｌを添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分とする各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社製のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約550ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００５０】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）製のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社製のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片がマウスdhfrをコードする配列であることを確認した。
【００５１】
動物細胞発現用遺伝子ベクターpSV40neo(ATCC製)及び上記で調製したマウスdhfr遺伝子をHind III、Bgl II処理した。次に、１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、常法により目的の遺伝子の切り出しを行った。得られた遺伝子断片をgeneclean II kit（フナコシ社製）により抽出し、DNA ligation kit ver II（宝酒造（株）社製）により16℃、30分の条件下pSV40neoとマウスdhfr遺伝子の連結を行った。次に、連結した遺伝子をDH5αコンピテントセル(TOYOBO社製)に常法により形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりマウスdhfr遺伝子断片を含む動物細胞発現用遺伝子ベクターDNAを調製した。
【００５２】
（３）CHO細胞へのネコEPO遺伝子およびマウスdhfr遺伝子のトランスフェクション
ネコＥＰＯ遺伝子およびマウスdhfr遺伝子をそれぞれ含む発現用遺伝子ベクターDNAをそれぞれ100μg,10μgを調製し、CHO/dhfr-細胞１×107cells/750μL DMEM/F12培地を調製したものと混合した。室温で３０分静置し、エレクトロポレーション装置（バイオラッド社製）に設置し、330μF,400Vで通電した。５分間静置後、氷上でさらに１０分静置し、10%FBS、ヒポキサンチン、チミジンを含むIMDM培地（インビトロジェン社製）１０ｃｃに懸濁し、１０ｃｍシャーレにまいた。３７℃、５％CO2条件下２日間培養し、細胞を遠心操作により回収し、10%FBS、0.3mg/mLG-418を含むIMDM培地（インビトロジェン社製）１０ｃｃに懸濁し、100μL/wellの割合で９６穴プレートに処理した。３日毎に10%FBS、0.3mg/mL G-418を含むIMDM培地で交換し、１５日間培養を行った。１５日後、顕微鏡観察を行い、生存している細胞を選択し、コロニー単離を行った。
【００５３】
（４）メトトレキセートによる遺伝子増幅
上記（３）で得られたクローンを10%FBS、0.3mg/mLG-418を含むIMDM培地（インビトロジェン社製）で増殖させ、2×105cells/10cc/10cmシャーレを準備し、最終濃度5nMメトトレキセート（MTX）を添加した。３日毎に5nM MTXを含む上記培地と交換し、10-15日間培養を継続し、細胞が生存していてコロニーを形成しているものについて、細胞を回収し、2×105cells/10cc/10cmシャーレを準備し、最終濃度50nMメトトレキセート（MTX）を添加した。同様の方法で、500n MMTXまで処理を行い、細胞の生存が確認できる２クローンを選別した。
【００５４】
ここで作製したネコＥＰＯをコードするＤＮＡ及びマウスdhfrをコードするＤＮＡを含む組換えCHO細胞を、それぞれ「rFeEPO/CHO1」および「rFeEPO/CHO2」とした。
【００５５】
（５）陽性クローンの遺伝子挿入確認
上記（４）で得られたクローンを10%FBS、0.3mg/mLG-418を含むIMDM培地（インビトロジェン社製）で増殖させ、1×106cellsに調製した。次に、この細胞ををＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（ＴＥ）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。０．５Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％  ＳＤＳを含む２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ  ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を２μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍ  ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００５６】
（６）ネコＥＰＯ遺伝子の確認
配列番号２及び配列番号３の塩基配列で表される２種類のプライマーを用いて、上記（５）のＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２ 、２５ｍＭ  ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分とするの各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社製のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約550ｂｐであることを確認し、そのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００５７】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）製のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次に、このプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社製のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片がネコEPOをコードする配列であることを確認した。
【００５８】
（７）マウスdhfr遺伝子の確認
配列番号４及び配列番号５の塩基配列で表される２種類のプライマーを用いて、上記（５）のｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分とする各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社製のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約550ｂｐであることを確認し、そのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００５９】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）製のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社製のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片がマウスdhfrをコードする配列であることを確認した。
【００６０】
（８）rFeEPO/CHO1およびrFeEPO/CHO2のネコＥＰＯの生産
rFeEPO/CHO1またはrFeEPO/CHO2を150cm2フラスコにて10%FBS、0.3mg/mL G-418を含むIMDM培地（インビトロジェン社製）で増殖させトリプシン処理により細胞を回収し、三角フラスコに接種した。10%FBS,Ｌ−グルタミンを含むMEMおよびHam’sF12の50-50混合液（インビトロジェン社製）下で、37℃、5%CO2条件下、100rpmで５日間培養した。次に、培養した細胞を回収し、遠心操作により培養液を除いた。無血清培地CHO-SFM培地（インビトロジェン社製）で２〜３回懸濁し、三角フラスコで培養した細胞を無血清培地CHO-SFM培地（インビトロジェン社製）100mLを添加し、5%CO2存在下、100rpmで７日間培養した。７日間培養し得られた培養上清を回収した。
【００６１】
実施例２  ネコＥＰＯの検出
実施例１で得られた培養上清中のネコＥＰＯをウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー（株）製のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー（株）製のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗ヒトＥＰＯポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬（株）製）溶液に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット（株）製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ（株）製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、rFeEPO/CHO1およびrFeEPO/CHO2ともに約30〜35ｋＤのバンドを検出した。
【００６２】
ヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（R & D system社製）を用いて、培養液中のネコＥＰＯの定量を行った。その結果、ネコＥＰＯの生産速度は800〜1200U/106 cells/48hであった。ネコEPOの推定分子量がおよそ30〜35kDaであり、ヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔによる測定の結果、ＥＰＯの定量が可能であったことから、実施例１の培養上清中にネコEPOが発現したものと考えられる。
【００６３】
実施例３  CHO細胞生産ネコEPOの精製
１．限外濾過法による濃縮・バッファー交換
実施例１で得られたネコEPOを含む細胞培養上清を、限外ろ過装置（ミリポア社製）により、分子量10000以下の物質の除去およびHCO60を含む10mM Tris緩衝液(pH7)にバッファー置換を行い、30倍濃縮を行った。限外ろかに使用した膜は、ＹＭ10（ミリポア社製、分子量10000カット）を使用した。
【００６４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、図１（左）のレーン１，２に示すようにイムノブロッティングにおいて、ネコＥＰＯのバンドを確認できた。
【００６５】
２．陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
次に、HCO60を含む10mMTris緩衝液(pH7)で平衡化した陰イオン（アニオン）交換担体であるDEAEセファロース（アマシャム社製）を用意し、濃縮したネコＥＰＯを含む溶液を導入した。十分にカラムの洗浄を行った後、HCO60を含む10mM Tris-AcOH緩衝液(pH6)、HCO60を含む10mM Tris-AcOH緩衝液(pH5)を通液し、カラム内のpHを低下させて不純物を除去した。次に、pH5に達したところで、50mM NaCl/10mM Tris-AcOH(pH5)/0.01%HCO60、100mM NaCl/10mM Tris-AcOH(pH5)/0.01%HCO60、200mM NaCl/10mM Tris-HCl(pH5)/0.01%HCO60、500mM NaCl/10mM Tris-AcOH(pH5)/0.01%HCO60 で段階的に溶出させ、200mM NaCl/10mM Tris-AcOH(pH5)/0.01%HCO60の画分を次の銅キレートカラムクロマトグラフィーに供した。
【００６６】
本操作における活性回収率をヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔによる測定した結果、約50-70%であった。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、図１のレーン３に示すようにイムノブロッティング・銀染色において、ネコＥＰＯのバンドを確認できた。
【００６７】
３．銅キレートカラムクロマトグラフィー
次に、上記２の精製フラクションを、銅イオンをキレート結合させた銅キレーティングセファロースファーストフロー（アマシャム社製）を予めHCO60を含む10mMTris緩衝液(pH5)で平衡化させた後、通液した。さらにHCO60を含む10mM Tris-AcOH緩衝液(pH5)でカラムに通液したところ、ネコＥＰＯ以外の高分子量不純物が除去され、これらのフロースルーを回収した。
【００６８】
本操作における活性回収率をヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔによる測定した結果、70-80%であった。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、図１のレーン４に示すようにイムノブロッティング・銀染色において、ネコＥＰＯのバンドを確認できた。
【００６９】
４．ゲル濾過
最後に、上記３の精製フラクションを、セファクリルS-200(アマシャム社製)のカラムに導入し脱塩操作を行った。このカラムは、pH6.8〜7.0の20mMクエン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム/0.01%HCO60で展開した。
【００７０】
５．得られたネコＥＰＯの純度、精製収率および比活性
上記１〜４の操作の結果得られたネコＥＰＯサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、図１のレーン５に示すように銀染色によるゲル染色において、ネコＥＰＯの単一化を確認した。また、イメージアナライザー（Bio-Rad社製）により染色したゲルを用いた純度検定を行った結果、９０％の純度を確認することができた。さらに、得られたネコＥＰＯサンプルをC4樹脂カラム（VYDAC社製）に供した。測定条件は、流速1mL/minで通液し、０〜80%エタノール/10mM Tris-HCl(pH7)のグラジエント溶出を行い、230nmのUV吸光度測定を行った。その結果、リテンションタイム50-60min、約66-80%エタノールの画分に溶出が見られ、得られたネコＥＰＯの純度は約90%であった。
【００７１】
さらに、上記１〜４の操作の結果得られたネコＥＰＯの最終的な精製収率をヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔによる測定した結果、35-50%であった。また、ゲル濾過精製溶液のタンパク定量をBCA protein assay(PIERCE社製)を用いて定量した結果、比活性は約100000U/mgであった。また、エンドトキシン含量は0.9ng/mg蛋白量であった。
【００７２】
以上、本実施例３によって得られたネコＥＰＯの純度、精製収率および比活性を、後述する比較例１と比較すると、純度は同等であったものの、精製収率は35-50%、比活性は約100000U/mgであり、比較例１の精製収率10-20%、比活性値50000-60000U/mgと比べて、顕著に向上した。
【００７３】
実施例４  CHO細胞生産ネコEPOの精製
１．限外濾過法による濃縮・バッファー交換
実施例１で得られたネコEPOを含む細胞培養上清を、限外ろ過装置（ミリポア社製）により、分子量10000以下の物質の除去およびHCO60を含む10mM Tris緩衝液(pH５)にバッファー置換を行い、30倍濃縮を行った。限外ろかに使用した膜は、ＹＭ10（ミリポア社製、分子量10000カット）を使用した。
【００７４】
２．銅キレートカラムクロマトグラフィー
銅イオンをキレート結合させた銅キレーティングセファロースファーストフロー（アマシャム社製）を予めHCO60を含む10mM Tris緩衝液(pH5)で平衡化させた後、上記１の溶液を通液した。さらにHCO60を含む10mM Tris-AcOH緩衝液(pH5)でカラムに通液したところ、ネコＥＰＯを含むフロースルーを回収した。
【００７５】
本操作における活性回収率をヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔによる測定した結果、70-80%であった。
【００７６】
３．陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
次に、HCO60を含む10mM Tris緩衝液(pH7)で平衡化した陰イオン（アニオン）交換担体であるDEAEセファロース（アマシャム社製）を用意し、上記２のネコＥＰＯを含む溶液を導入した。十分にカラムの洗浄を行った後、HCO60を含む10mM Tris-AcOH緩衝液(pH6)、HCO60を含む10mM Tris-AcOH緩衝液(pH5)を通液し、カラム内のpHを低下させて不純物を除去した。次にpH5に達したところで、50mM NaCl/10mM Tris-AcOH(pH5)/0.01%HCO60、100mM NaCl/10mM Tris-AcOH(pH5)/0.01%HCO60、200mM NaCl/10mM Tris-HCl(pH5)/0.01%HCO60、500mM NaCl/10mM Tris-AcOH(pH5)/0.01%HCO60で段階的に溶出させ、200mM NaCl/10mM Tris-AcOH(pH5)/0.01%HCO60の画分を次のゲル濾過に供した。
【００７７】
本操作における活性回収率をヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔによる測定した結果、約50-70%であった。
【００７８】
４．ゲル濾過
最後に、上記３の精製フラクションを、セファクリルS-200(アマシャム社製)のカラムに導入し脱塩操作を行った。このカラムは、pH6.8〜7.0の20mMクエン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム/0.01%HCO60で展開した。
【００７９】
５．得られたネコＥＰＯの純度、精製収率および比活性
上記１〜４の操作の結果得られたネコＥＰＯサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色によるゲル染色を行い、ネコＥＰＯの単一化を確認した。また、イメージアナライザー（Bio-Rad社製）により染色したゲルを用いた純度検定を行った結果、９０％の純度を確認することができた。さらに、得られたネコＥＰＯサンプルをC4樹脂カラム（VYDAC社製）に供した。測定条件は、流速1mL/minで通液し、０〜80%エタノール/10mM Tris-HCl(pH7)のグラジエント溶出を行い、230nmのUV吸光度測定を行った。その結果、リテンションタイム50-60min、約66〜80%エタノールの画分に溶出が見られ、得られたネコＥＰＯの純度は約90%であった。
【００８０】
さらに、上記１〜４の操作の結果得られたネコＥＰＯの最終的な精製収率をヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔによる測定した結果、35-50%であった。また、ゲル濾過精製溶液のタンパク定量をBCA protein assay(PIERCE社製)を用いて定量した結果、比活性は約100000U/mgであった。また、エンドトキシン含量は0.9ng/mg蛋白量であった。
【００８１】
以上、本実施例４によって得られたネコＥＰＯの純度、精製収率および比活性について、後で述べる比較例１と比較すると、純度は同等であったものの、精製収率は35-50%、比活性は約100000U/mgであり、比較例１の精製収率10-20%、比活性値50000-60000U/mgと比べて、顕著に向上した。
【００８２】
実施例５  ネコＥＰＯの活性測定
実施例３または４で製造されたネコＥＰＯの活性測定は、ヒトＥＰＯの活性測定法を適応し、ＴＦ−１細胞（ATCCより入手）を用いて以下のようにして行った。
【００８３】
ＴＦ−１細胞をRPMI1640/10%FBS培地に懸濁し、2×105cells/mLに調製し、96穴microplateに100μL添加した。さらに標準品として、ヒトＥＰＯの10U、5U、1U、0.5U、0.1U、0Uをそれぞれ10μL、実施例３または４で得られたネコＥＰＯ精製サンプルの原液、１０倍希釈液、１００倍希釈液、１０００倍希釈液それぞれを10μL添加し、５％CO2、37℃条件下、24時間培養し、cell counting kit-8を用いて細胞増殖の程度を測定した。すなわち、kitのWST-8を各穴10μＬずつ添加し、1時間培養後、ELISA Plate reader(アマシャム社製)により吸光度A450を測定した。
【００８４】
標準品として用いたヒトＥＰＯの各添加量（10U、5U、1U、0.5U、0.1U、0U）における吸光度A450をプロットしたグラフを検量用に用いて、実施例３または４で得られたネコＥＰＯ精製液×1000、×100希釈液の吸光度から、各ネコＥＰＯ精製液中のネコＥＰＯ含有量を定量した。その結果、実施例３または実施例４で得られたネコＥＰＯ精製液中のネコＥＰＯの含有量は、いずれも2000〜3000U/mLであった。また、濃度依存的なTF-1細胞の増殖が確認できた。すなわち、ネコＥＰＯの活性が確認できた。
【００８５】
比較例１  CHO細胞生産ヒトEPO精製方法における陰イオン交換カラムクロマトグラフィー法の適応
本比較例では、実施例３で得られたネコEPOを含む細胞培養上清を、銅キレート担体を用いる精製工程（実施例３の３．、実施例４の２．）を行わずに、限外ろ過、陰イオン交換担体及び逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて精製した。
【００８６】
実施例３で得られたネコEPOを含む細胞培養上清を、限外ろ過装置（ミリポア社製）により、分子量10000以下の物質の除去およびHCO60を含む10mMTris緩衝液(pH7)にバッファー置換を行い、30倍濃縮を行った。限外ろかに使用した膜は、ＹＭ10（ミリポア社製、分子量10000カット）を使用した。
【００８７】
次に、HCO60を含む10mMTris緩衝液(pH7)で平衡化した陰イオン（アニオン）交換担体であるDEAEセファロース（アマシャム社製）を用意し、濃縮したネコＥＰＯを含む溶液を導入した。十分にカラムの洗浄を行った後、5mM酢酸/１mMグリシン/6M尿素を含む緩衝液（pH4.5）で４倍洗浄した。さらに、25mM NaCl/10mM Tris/0.01%HCO60を含む溶液により洗浄し、100mM NaCl/10mM Tris(pH7)/0.01%HCO60、200mM NaCl/10mM Tris-HCl(pH7)/0.01%HCO60、400mM NaCl/10mM Tris-HCl(pH7)/0.01%HCO60、500mM NaCl/10mM Tris-HCl(pH7)/0.01%HCO60で段階的に溶出させ、抗ヒトEPO抗体を用いたイムノブロッティングを行ったところ、200〜500mM NaCl画分にバンドが見られ、本操作による活性回収率は20-30%であった。
【００８８】
次に、得られた精製フラクションを逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に適用し、C4基質（VYDAC 214TP-B）で充填して密閉したカラムにロードした。0.45×10mmのカラムで、流速1mL/minの条件下、10mM Tris(pH7)から80%エタノール/10mM Tris(pH7)までの直線勾配で溶出した。UV230nmで測定し、溶出液を用いて抗ヒトEPO抗体を用いたイムノブロッティングを行ったところ、約66〜80%エタノールの溶出画分でネコEPOバンドを検出し、純度は約90%であった。また、培養液から上記の操作の結果得られたネコＥＰＯの最終的な精製収率をヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔによる測定した結果、10-20%であった。さらに、得られた精製品のタンパク定量をBCA protein assay(PIERCE社製)を用いて定量した結果、比活性は約50000-60000U/mgであった。また、エンドトキシン含量は0.9ng/mg蛋白量であった。本操作による活性回収率は50-60%であった。なお、ヒトＥＰＯ（フナコシ社製）を上記と同様HPLCに導入し、エタノール勾配による溶出を行ったところ、50-65%エタノールで溶出された。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、実施例３の各カラムクロマト工程における精製液をSDS-PAGEによる電気泳動を行い、イムノブロッティング（左）及び銀染色法（右）により染色した結果を示す図である。
【図１】
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【配列表】
2008266268000001.app