(57)【要約】【課題】酵素タンパク質の複数の特性を同時に改良した酵素変異体を提供する。【解決手段】酵素タンパク質のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の変異により生ずる特性変化の曖昧な相加性を利用し、複数の特性を指標とした変異・選抜を繰り返すことにより、タンパク質の複数の特性を同時に改良した酵素変異体を得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性、プロトカテキン酸を基質としたときのみかけの活性、プロトカテキン酸に対する相対活性、又は熱処理後の残存活性のうち、少なくとも２つの特性が改良されたパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素変異体。
【請求項２】
プロトカテキン酸に対する相対活性が２％以下に改良された、請求項１に記載のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素変異体。
【請求項３】
パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素のアミノ酸配列中、52位がグルタミン、211位がイソロイシン、213位がグリシン、及び276位がグルタミンに変異した、請求項２に記載のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素変異体。
【請求項４】
パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素のアミノ酸配列中、52位がグルタミン、211位がイソロイシン、213位がグリシン、及び332位がアラニンに変異した、請求項２に記載のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の複数の特性を同時に効率良く改良する方法、及び当該方法により得られたタンパク質変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は一般的に20種類のアミノ酸の結合により構成されており、アミノ酸配列の配列制御によりタンパク質の様々な特性が制御されている。従って、タンパク質のアミノ酸配列を変えることにより、タンパク質の特性を改良することが可能になるものと考えられている。以下、タンパク質の特性改良技術として、酵素の改良例について説明する。
【０００３】
酵素は触媒活性を有するタンパク質の総称であり、様々な特性を持つ。改良が望まれる酵素の特性には、結合特性、反応特異性・比活性、活性の強弱、作用・pH・温度等に対する反応の平衡、熱・溶液・pH・有機溶剤を含む化学変性剤等に対する安定性等が挙げられる。
【０００４】
酵素の他分子との結合特性は、化学構造論的に厳密な基質特異性、あるいは反応そのものに対する厳密な特異性であり、前者を酵素の基質特異性、後者を酵素の反応特異性と別称する。
【０００５】
酵素の基質特異性を利用し、ヒトの体液（血液、血漿、血清、尿等）の生体成分を測定する方法は、臨床診断及び臨床検査薬分野において広く行われている。酵素を利用した生体成分の測定は、疾病の進行度合いの推定による治療効果の確認や、生体成分中のリスク因子（予防医学及び疫学上、重要な因子）の同定において重要である。従って、酵素を利用した分析素子を作製し、様々な物質が混在する試料中の特定物質を同定・定量する方法には、酵素の基質特異性の高さ及び測定値の精度管理が強く要求される。
【０００６】
このような酵素を利用した生体成分の測定における従来の実用化例として、以下の（１）〜（３）のものを挙げることができるが、それぞれ酵素特性に起因する問題を有している。
(1)  血清アミノトランスフェラーゼ：血清アミノトランスフェラーゼ活性の測定は、肝疾患の臨床検査において広く行われている。
しかし、生体成分中の血清トランスアミナーゼ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）やアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の測定のときには、生体成分中の乳酸デヒドロゲナーゼやリンゴ酸デヒドロゲナーゼに起因する副反応が観察される。この副反応は試薬ブランクとなり、測定値の精度管理において問題となることが指摘されている（非特許文献１参照）。
(2)  コレステロールデヒドロゲナーゼ：コレステロールデヒドロゲナーゼ活性の測定は、血清コレステロールの定量において広く行われている。しかし、コレステロールデヒドロゲナーゼによる反応生成物（コレステ−４−エン−３−オン）による反応阻害に起因する測定感度の低下現象が知られている。現在はヒドラジン化合物により、反応生成物を酵素との親和性を持たない化合物に変換する等の工夫がなされている。（非特許文献２参照）。しかし、ジアゾ化合物は人体への危害の可能性が指摘されており、取り扱い上問題が多い。例えばヒドラジン一水和物は、和光純薬工業試薬カタログ2000年版において「毒性および腐食性を有する劇物III類ならびに危険物4-3-III類の化合物」に分類されている。
(3)  パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素：パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素、パラヒドロキシ安息香酸及びその誘導体を用いた方法は、血清コリンエステラーゼ活性の測定に広く用いられている。パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素（p-Hydroxybenzoate hydroxylase: PHBH）の反応様式には２つの反応、主反応（反応(a)）及び副反応（反応(b)）が存在することが知られている。
(a)  パラヒドロキシ安息香酸 ＋ O2 ＋ NADPH → プロトカテキン酸 ＋ H2O ＋ NADP+（主反応）
(b)  O2 ＋ NADPH → H2O ＋ NADP+（副反応）
上記主反応生成物のプロトカテキン酸がPHBHに活性化因子的に作用し、補酵素の酸化という副反応を促進する問題がある（非特許文献３参照）。上記の血清コリンエステラーゼの測定のためには、パラヒドロキシ安息香酸の濃度とNADP+生成量を化学量論的に一致させることが重要である。従って、現在はプロトカテキン酸を分解するためのプロトカテキン酸ジオキシゲナーゼを添加することにより、上記の問題を解決している。しかし、プロトカテキン酸ジオキシゲナーゼの添加は、臨床検査薬のコスト面や検査試薬の溶液安定性の面で多くの問題が残る（非特許文献４参照）。
【０００７】
また、酵素反応を利用し、有用な物質を製造する方法は産業的に広く行われている。ただし、通常の酵素反応は可逆的な反応様式をとる場合が多い。すなわち、酵素(E)は出発物質(A)に反応して生成物(B)の生成を促進する機能を持つが、基質濃度、pH、温度等の反応条件により、生成物(B)にも反応して出発物質(A)の生成を促進することも少なくない。すなわち、生成物(B)を効率良く得るには、酵素Ｅの反応特異性をA→Bの方向のみの不可逆的な反応様式に改良することが求められる。
【０００８】
一方、酵素反応を利用し、産業廃物等を分解する例も知られており、このような酵素は環境浄化酵素として、近年着目されている。環境浄化酵素は一群の対象物質と反応し分解する等、広範な基質との反応性を持つことが望まれている。すなわち、環境浄化酵素は酵素の基質特異性が低いことが重要となる。
【０００９】
環境浄化酵素として、洗剤等に利用されるリパーゼやプロテアーゼ等が例に挙げられる。リパーゼは脂肪酸エステルの炭素鎖数や不飽和度に依存しないような特性が望まれている。プロテアーゼはペプチド鎖のアミノ酸残基数に依存せず、任意のアミノ酸残基のところで加水分解できるような特性が望まれている。
【非特許文献１】「臨床化学」2000年、第29巻補冊2号、99a-115a
【非特許文献２】Kayamori, Y. et al." Endpoint colorimetric method for assaying total cholesterol in serum with cholesterol dehydrogenase. "「Clin. Chem. 」1999 December 45 (12): 2158-2163
【非特許文献３】丸尾文治、田宮信雄監修「酵素ハンドブック」1982年、朝倉書店発行、179頁）
【非特許文献４】「臨床検査法提要」金原出版、 平成10年、第31版、 632-633頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のように、特性、コスト、あるいは安全性等の面で、満足のゆくような高い基質性を持つ酵素変異体や広範な反応性を持つ酵素変異体は必ずしも得られていない。したがって、酵素をはじめとする種々のタンパク質の様々な特性を効率的に改良するための方法の発明が望まれている。しかし、その必要性にも関わらず、タンパク質一般に適用し得る、タンパク質の複数の特性を同時に効率よく改良するための方法は未だ開発されていなかった。
そこで、本発明はタンパク質の複数の特性を同時に効率良く改良するための方法であり、タンパク質一般に適用できる方法を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意研究し、タンパク質のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の変異により生ずる特性変化の曖昧な相加性を利用し、タンパク質変異体の作製及選抜を繰り返すことによりタンパク質の複数の特性を同時に効率良く改良できることを見いだし、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の１．〜１１．の構成を伴う。
１．タンパク質の複数の特性が改良されたタンパク質変異体を効率良く製造する方法であって、タンパク質のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の変異により生ずる特性変化の曖昧な相加性を利用し、複数の特性を指標とした変異・選抜を繰り返すことにより、タンパク質の複数の特性を同時に効率良く改良する手法を含む前記方法。
２．タンパク質の複数の特性が改良されたタンパク質変異体を効率良く製造する方法であって、少なくとも以下の工程を含む方法。
(1)  変異アミノ酸残基を有する一群のタンパク質変異体を作製する工程。
(2)  該タンパク質変異体の複数の特性変化を測定する工程。
(3)  該測定結果に基づき、変異アミノ酸残基を組み合わせて、より高次の多重変異体を複数を作製する工程。
(4)  各多重変異体の複数の特性変化を各々測定する工程。
(5)  該測定結果に基づき、複数の特性が同時に改良された多重変異体を選抜して得る工程。
３．上記２．の方法において、さらに（３）、（４）の工程を繰り返しながら、複数の特性が同時に改良されたタンパク質変異体を選抜して得ることを特徴とする、タンパク質の複数の特性を同時に改良されたタンパク質を製造する方法。
４．タンパク質の複数の特性が改良されたタンパク質変異体を効率良く製造する方法であり、少なくとも以下の工程を含む方法。
(1)  タンパク質のアミノ酸配列中の複数箇所において、アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に変異し、一群の一アミノ酸変異体を作製する工程。
(2)  各一アミノ酸変異体の特性変化を測定し、変異アミノ酸残基と複数の特性を対応させた１次データベースを作製する工程。
(3)  該一次データベースに基づき、変異アミノ酸残基を少なくとも２つ選抜し、選抜した変異アミノ酸残基の組み合わせを有する一群の２重変異体を作製する工程。
(4)  各２重変異体の特性変化を測定し、複数の特性が同時に改良された２重変異体を選抜する工程。
５．上記４．に記載のタンパク質変異体を製造する方法において、さらに、以下の工程を含む方法。
(5)  請求項２の上記（１）〜（３）の工程により作製された各２重変異体の特性変化を測定し、変異アミノ酸残基の組み合わせと複数の特性を対応させた２次データベースを作製する工程。
(6)  該２次データベースに基づき、変異アミノ酸残基の組み合わせを少なくとも２つ選抜し、選抜した変異アミノ酸残基の組み合わせを有する一群の３重変異体あるいは４重変異体を作製する工程。
(7)  各３重変異体あるいは４重変異体の特性変化を測定し、複数の特性が同時に改良された３重変異体あるいは４重変異体を選抜する工程。
６．タンパク質の変異されるアミノ酸残基が含硫アミノ酸残基（システイン残基あるいはメチオニン残基）である、上記２．〜５．のいずれかに記載のタンパク質変異体の製造方法。
７．改良されるタンパク質がパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素である、上記２．〜６．のいずれかに記載のタンパク質変異体の製造方法。
８．改良されるタンパク質の複数の特性が、パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素のパラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性、プロトカテキン酸を基質としたときのみかけの活性、プロトカテキン酸に対する相対活性、又は熱処理後の残存活性のうち、少なくとも２つである、上記２．〜７．のいずれかに記載のタンパク質変異体の製造方法。
９．パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性、プロトカテキン酸を基質としたときのみかけの活性、プロトカテキン酸に対する相対活性、又は熱処理後の残存活性のうち、少なくとも２つの特性が改良されたパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素変異体。
１０．プロトカテキン酸に対する相対活性が２％以下に改良された、上記９に記載のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素変異体。
１１．パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素のアミノ酸配列中、52位がグルタミン、211位がイソロイシン、213位がグリシン、及び276位がグルタミンに変異した、上記１０に記載のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素変異体。
１２．パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素のアミノ酸配列中、52位がグルタミン、211位がイソロイシン、213位がグリシン、及び332位がアラニンに変異した、上記１０に記載のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素変異体。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、複数の特性の好ましい変化を示したタンパク質変異体における変異アミノ酸残基あるいはその組み合わせを選抜の幅を持たせて選抜し、より高次の多重変異体を作製することにより、複数の特性が同時に改良されたタンパク質変異体を効率良く得る方法である。
タンパク質のアミノ酸配列中の複数のアミノ酸残基を一度に他のアミノ酸残基に変異させるという従来法に比べて、作製及び特性の測定が必要な多重変異体の数が少なくすみ、複数の特性が改良されたタンパク質変異体を効率良く得ることが可能になる。従って、本発明により実用化が可能な高性能タンパク質変異体が得られる確率が高くなるという効果を持つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
タンパク質のアミノ酸配列中のあるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に変異させることにより、タンパク質の特性を変化させることができる。この場合、タンパク質のある特性は向上しても、他の特性は劣ったものになる場合が多く、２つの特性を同時に向上させることには多くの困難が伴う。
タンパク質のアミノ酸配列中の複数の箇所において、複数の特性を指標として、各箇所において最も良好な特性変化を生じた変異アミノ酸残基同士を組み合わせても、得られたタンパク質変異体が複数の特性の改良において最も良好なものであるとは限らず、むしろこの手法によって良好なものが得られる確率は低い。
【００１５】
本発明の方法は、タンパク質のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の変異により生ずる特性変化の曖昧な相加性を利用し、複数の特性を指標とした変異・選抜を繰り返すことにより、タンパク質の複数の特性を同時に効率良く改良する方法である。
具体的には、本発明のタンパク質の改良法は、少なくとも以下の工程を含む。
(1)  変異アミノ酸残基を有する一群のタンパク質変異体を作製する工程。
(2)  該タンパク質変異体の複数の特性変化を測定する工程。
(3)  該測定結果に基づき、変異アミノ酸残基を組み合わせて、より高次の多重変異体を複数作製する工程。
(4)  上記各多重変異体の複数の特性変化を各々測定する工程。
(5)  該測定結果に基づき、複数の特性が同時に改良された多重変異体を選抜して得る工程。
また、上記（５）の工程後、必要に応じて、さらに、（３）、（４）の工程を繰り返し、段階的に、より高次の多重変異体群を作製しつつ、複数の特性が同時に改良されたタンパク質変異体を選抜して得るものである。
すなわち、本発明においては、一アミノ酸変異体群の作製及び選抜、２重変異体群の作製及び選抜、更には３重変異体群や４重変異体群等の高次多重変異体群の作製及び選抜を段階的に行う。各段階において、好ましい特性変化をもたらす変異アミノ酸残基あるいは変異アミノ酸残基の組み合せを選抜の幅を持たせて、少なくとも２つのタンパク質変異体を選抜する。選抜した変異アミノ酸残基の組み合わせを有する一群のタンパク質変異体を作製し、複数の特性を指標にした選抜を行う。これを繰り返すことにより、タンパク質の複数の特性を同時に効率良く改良することが可能になる。
【００１６】
本明細書にいう「曖昧な相加性」中、「曖昧」とは上記アミノ酸残基の選抜において、選抜の幅を持たせる、すなわち複数のタンパク質変異体を選抜することをいう。また、「曖昧な相加性」とは、選抜の幅を持たせて選抜したタンパク質変異体のアミノ酸配列中の変異アミノ酸残基を組み合わせ、新たなタンパク質変異体を作製することをいう。
従って、本発明の方法は、タンパク質のアミノ酸配列中の複数の箇所において、複数の特性を指標とし、各箇所において最も良好な特性変化を生ずる変異アミノ酸残基同士を組み合わせる方法ではない。
【００１７】
本発明の方法を以下さらに詳細に説明する。
本発明における、タンパク質の複数の特性を同時に効率良く改良するための方法は少なくとも以下の工程を含む。
(1)  タンパク質のアミノ酸配列中の複数箇所のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に変異し、一群の一アミノ酸変異体を作製する工程（工程１）。
(2)  各一アミノ酸変異体の特性変化を測定し、変異アミノ酸残基と複数の特性を対応させた一次データベースを作製する工程（工程２）。
(3)  該一次データベースに基づき、変異アミノ酸残基を少なくとも２つ選抜し、選抜した変異アミノ酸残基の組み合わせを有する一群の２重変異体を作製する工程（工程３）。
(4)  各２重変異体について特性変化を測定し、複数の特性が同時に改良された２重変異体を選抜する工程（工程４その１）。
【００１８】
本発明は、必要に応じ、以下の工程を更に加えることができる。
(5)  上記工程３で作製された各２重変異体の特性変化を測定し、変異アミノ酸残基の組み合わせと複数の特性を対応させた２次データベースを作製する工程（工程４その２）。
(6)  該２次データベースに基づき、変異アミノ酸残基の組み合わせを少なくとも２つ選抜し、選抜した変異アミノ酸残基の組み合わせを有する一群の３重変異体あるいは４重変異体を作製する工程（工程５）。
(7)  各３重変異体あるいは４重変異体の特性変化を測定し、複数の特性が同時に改良された３重変異体もしくは４重変異体を選抜する工程（工程６の１）。
(8)  あるいは、さらに、必要に応じて、変異アミノ酸残基の組み合わせと複数の特性を対応させた３次データベースを作製する工程（工程６の２）。
(9)  該３次データベースに基づき、変異アミノ酸残基の組み合わせを少なくとも２つ選抜し、選抜した変異アミノ酸残基の組み合わせを有する一群の高次多重変異体を作製する工程（工程７）。
(10)  各高次多重変異体の特性変化を測定し、複数の特性が同時に改良された高次多重変異体を選抜する工程（工程８の１）。
(11)  ｌあるいは、さらに、必要に応じて、変異アミノ酸残基の組み合わせと複数の特性を対応させた高次データベースを作製し、上記工程９、１０と同様の工程を段階的に繰り返し行う工程（工程８の２）。
【００１９】
以下、各工程について説明する。
工程１においては、野生型タンパク質のアミノ酸配列中の複数の箇所（任意の３箇所あるいはそれ以上の箇所のアミノ酸残基）の一アミノ酸変異体群を作製する。着目する任意の３箇所あるいはそれ以上の箇所は特に限定されない。タンパク質の全てのアミノ酸残基について、野生型と異なるアミノ酸残基に変異させた一アミノ酸変異体群を作製してもよい。
【００２０】
また、含硫アミノ酸残基（Cys残基及びMet残基）等、特定のアミノ酸残基、あるいは既知の基質結合領域等、特定の領域におけるアミノ酸残基に着目しても良い。
一般にタンパク質を構成するアミノ酸は20種類存在する。従って一アミノ酸変異体は各箇所ごとに最大19種類作製できる。しかし全ての種類の一アミノ酸変異体を作製する必要はない。例えば、含硫アミノ酸残基（システイン算残基あるいはメチオニン残基）に着目した場合、含硫アミノ酸（システインあるいはメチオニン）以外の18種類のアミノ酸に変異した18種類の一アミノ酸変異体の作製を行えば十分である。
【００２１】
本発明において、タンパク質のアミノ酸配列中の特定の箇所の変異は、任意の箇所の変異ができる方法であれば、当業者に既知の任意の方法等、どのような方法でも適用可能である。一例として、合成DNAを用いた部位特異的変異法が挙げられる。部位特異的変異法は、本明細書の実施例で用いたPCRを利用した方法の他、多くの方法が公知である。
【００２２】
工程２においては、一アミノ酸変異体群の複数の特性を測定し、タンパク質のアミノ酸配列中の変異箇所ごとに、変異アミノ酸残基と複数の特性を対応させた一次データーベースを作製する。
【００２３】
工程３においては、上記工程２で作製した１次データベースに基づき、好ましい特性変化が生じた箇所の変異アミノ酸残基を少なくとも２つ選抜する。
変異アミノ酸残基を選抜するタンパク質のアミノ酸配列中の箇所は、一次データベースにおける箇所のうち任意の箇所でよい。ただし、好ましい特性変化が生じた変異箇所すべてを選抜してもよい。工程２において、例えば、a、b、c及びｄの４箇所について、それぞれ１次データベースを作製した場合、工程３では、a、b、cおよびdのうち、aとc、あるいはbとcというように、任意の２箇所の選抜を行うことができる。全ての特性が好ましい方向に変化したものがあれば、それを選抜するが、各特性ごとに好ましい変化を示したものを選抜してもよい。各箇所ごとに選抜する変異アミノ酸残基の数は２つ以上であればよい。
次いで、選抜した複数の箇所（任意の３箇所あるいはそれ以上の箇所における変異アミノ酸残基）のうち、任意の２箇所を変異させた一群の２重変異体を作製する。この２重変異体の作製は、上記の公知の部位特異的変異法により可能である。
【００２４】
工程４その１においては、２重変異体群の複数の特性を測定し、複数の特性が改良された２重変異体を選抜する。
【００２５】
工程４その１において、２重変異体群の複数の特性に満足できない場合は、工程４その２及び工程５において、複数の特性が同時に改良された２重変異体を選抜し、３重変異体あるいは４重変異体を作製する。
すなわち、工程４は得られた２重変異体群の特性変化を測定し、２重変異体における変異アミノ酸残基の組み合わせと複数の特性を対応させた２次データベースを作製する工程である。
【００２６】
工程５においては、２次データベースから、好ましい特性変化が生じた変異アミノ酸残基の組み合わせを少なくとも２つ選抜する。この場合、全ての特性が好ましい方向に変化したものがあれば、それを選抜するが、各特性ごとに好ましい変化を示したものを選抜してもよい。次いで、選抜した変異アミノ酸残基の組み合わせを有する、一群の3重変異体あるいは4重変異体等の多重変異体を作製する。
【００２７】
工程６の１においては、３重変異体群あるいは４重変異体群の複数の特性を測定し、複数の特性が改良された３重変異体あるいは４重変異体を選抜する。
【００２８】
工程６の１において、３重変異体もしくは４重変異体に満足できない場合は、工程６の２、工程７、及び工程８を順次行い、得られた３重変異体群あるいは４重変異体群と複数の特性を対応させた３次データベースを作製し、複数の特性の好ましい変化を生じた変異アミノ酸残基の組み合わせを有する、一群の高次多重変異体を更に作製し、複数の特性が改良された高次多重変異体を選抜してもよい。
また、さらにその特性に満足できない場合は、上記と同様の工程を順次段階的に行う（工程８の２）。
【００２９】
本発明の方法は、上記のようにタンパク質のアミノ酸配列中の複数箇所のアミノ酸残基の変異・選抜を繰り返して多重変異体を作製し、複数の特性変化を調べて好ましいものを段階的に選抜していく方法である。すなわち、多重変異体の作製の全ての工程において、１箇所のアミノ酸残基ごとに変異・選抜を行わなくてもよいという点で効率的である。
【００３０】
本発明の方法により、タンパク質の複数の特性を同時に効率良く改良することができる。本発明において改良される蛋白質としては、酵素タンパク質、ペプチドホルモンなどの生理活性タンパク質、ペプチド性酵素阻害剤、抗体タンパク質、結合タンパク質、受容体タンパク質、転写制御因子等が挙げられる。改良すべき特性として、結合特性、反応特異性・比活性、活性の強弱、作用・pH・温度等に対する反応の平衡、熱・溶液・pH・有機溶剤を含む化学変性剤等に対する安定性等が挙げられる。しかし、これらは本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【００３１】
本明細書において、タンパク質の複数の特性の改良は、該特性を向上させる場合だけではなく、低下させる場合も含む。
例えば、複数の特性の一部として、酵素の基質特異性の改良を目的とする場合、（１）野生型酵素の副反応が抑制されるように基質特異性を改良する場合（２）野生型酵素では反応しない基質アナログにまで反応し、産業的に広範に使用できるように野生型酵素を改良する場合も含む。
（１）の場合は基質特異性および／または反応特異性を高めるための特性の改良である。例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素等、高い基質特異性が望まれるタンパク質の改良に利用できる。
（２）の場合は反応特異性および／または基質特異性を低下させ、反応する化合物の範囲を広めるための改良である。例えば、洗剤などに使用されるリパーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ等、低い基質特異性が望まれるタンパク質の改良に利用できる。
【００３２】
作製された一群の酵素変異体における基質特異性の測定方法は、対象とするタンパク質に応じて、当業者は任意に選択可能である。酵素の基質特異性は、通常基質の化学構造と類似する化合物（アナログ）との交差反応性の程度を測定することにより求めることができる。例えば、デヒドロゲナーゼは補酵素の酸化還元反応の程度として分光光学的に求めることができる。
酵素変異体が生体試料の中に含まれる特定の生体成分を測定する臨床検査薬として利用される場合、試料の代わりに生理食塩水や精製水を対照試料として測定する場合が一般的である。対照試料の測定の時に生じる試薬ブランク反応を、測定に用いた各酵素のブランク反応という。ブランク反応では、通常の酵素学的な測定方法では検出できないような副反応まで問題となる場合がある。その場合は、所定の測定試薬組成ならびに所定の測定条件下での本反応とブランク反応の程度を比例化し、実質的な基質特異性を判定することができる。
【００３３】
本発明は、改良するタンパク質の種類を限定するものではない。対象とするタンパク質及びタンパク質の複数の特性の例を以下に示す。
糖分解酵素、タンパク質分解酵素、核酸分解酵素、芳香族化合物分会酵素等における分解速度（すなわち酵素活性）、安定性、有機溶媒耐性及び基質特異性等、酸素原子添加酵素（オキシゲナーゼ）、酸化酵素（オキシダーゼ）を含む酸化還元酵素類における基質特異性、補酵素特異性、反応特異性、安定性、有機溶媒耐性等、特定分子との結合性能を有する結合タンパク質類における、結合定数、分子認識の特異性、安定性、pH応答性等、色素タンパク質における吸収特性、安定性、蛍光特性、pH応答性等が挙げられる。
【００３４】
本発明に対する一層の理解のため、タンパク質の活性及び熱安定性を、改良するタンパク質の複数の特性の例として挙げ、以下に説明する。
本発明により、タンパク質のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の変異により生ずる特性変化の曖昧な相加性を利用し、活性及び熱安定性の２種類の特性を指標とした変異・選抜を繰り返して、２種類の特性を同時に効率良く改良することができる。
【００３５】
任意の野生型タンパク質のアミノ酸配列において、あるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に変異することにより、活性及び熱に対する安定性の２種類の特性が同時に変化する場合がある。野生型タンパク質のアミノ酸配列中、活性や熱安定性に対する影響があると推定される複数箇所のアミノ酸残基を選抜し、この標的アミノ酸残基の一アミノ酸変異体群及び多重変異体群を作製する。一アミノ酸変異体群及び多重変異体群の特性変化を測定し、変異アミノ酸残基あるいは変異アミノ酸残基の組み合せと複数の特性変化を対応させたデータベースを作製する。データベースに基づき、変異アミノ酸残基を組み合わせた多重変異体の作製及び選抜を繰り返す。
変異アミノ酸残基あるいは変異アミノ酸残基の組み合せの選抜は、データベース上で目的とする活性及び熱安定性の向上が認められた上位（少なくとも３種）の一アミノ酸変異体あるいは多重変異体を集団として選抜し、この集団同士の組み合わせの中から好ましいものを選抜する。
【００３６】
本発明の特徴は、上記のように候補集団同士の組み合わせにより変異及び選抜を段階的に行い、その中から予期せぬものまでデータベース化していく点にある。従って、本発明は効果のあった異なる変異体同士を同時に組み合わせて優れた効能を期待する方法ではない。
【００３７】
含硫アミノ酸残基（システイン残基及びメチオニン残基）ｎ個を含む野生型タンパク質において、含硫アミノ酸残基を変異させて活性及び熱安定性を向上させる場合を以下に示す。この場合、アミノ酸配列中の各含硫アミノ酸残基の箇所をi（i = 1ないしn）とする。
(1)  各含硫アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に変異させる場合、各箇所の含硫アミノ酸残基ごとに最大18種類、計18×n個の変異体が作製される。（工程１）
(2)  各一アミノ酸変異体の活性及び熱安定性について測定し、各箇所の変異アミノ酸残基と２種類の特性を対応させた一次データベースを作製する（工程２）。
(3)  一次データベースに基づき、活性及び熱安定性が同時に改良された一アミノ酸変異体のうち上位n個、例えば次の６個を選抜する（1U, 2V, 3W, 4X, 5Y, 6Z：U, V, W, X，Y，Zは含硫アミノ酸残基以外のアミノ酸残基を示し、数字はアミノ酸配列中の変異箇所を示す）。これらを組み合わせて２重変異体を作製する。（工程３）
(4)  得られた２重変異体の活性及び熱安定性を測定する。２重変異体における変異アミノ酸残基の組み合わせと２種類の特性を対応させた２次データベースを作製する。この場合、得られるデータは合計15個の変異アミノ酸残基の組み合わせについてのデータとなる（1U2V, 1U3W, 1U4X, 1U5Y, 1U6Z, 2V3W, 2V4X, 2V5Y, 2V6Z, 3W4X, 3W5Y, 3W6Z, 4X5Y, 4X6Z, 5Y6Z）（工程４）。
(5)  ２次データベースに基づき、活性及び熱に対する安定性が同時に向上した２重変異体のうち上位ｎ個、例えば次の３個を選抜する（1U2V, 3W4X, 5Y6Z）。これらを組み合わせて４重変異体を作製する。（工程５）。
(6)  得られた４重変異体の活性及び熱安定性を測定する。４重変異体における変異アミノ酸残基の組み合わせと２種類の特性を対応させた3次データベースを作製する。この場合、得られるデータは合計３個の４重変異体のデータとなる（1U2V3W4U, 1U2V5Y6Z, 3W4X5Y6Z）（工程６）。
(7)  3次データベースに基づき、活性及び熱安定性が同時に向上した４重変異体のうち上位ｎ個（例えば2個）を選抜する。以下同様にして、満足する特性になるまで多重変異変異体の作製を続ける。この場合、最大６重変異体まで作製可能である（工程７及び工程８）
(8)  ２次データベースより選抜した３個の2重変異体が共通するアミノ酸変異（変異箇所及び変異アミノ酸残基）を含む場合（例えば1U2V, 1U3W, 1U4X）、これらを組み合わせて３重変異体を作製する（工程５）。得られた３重変異体の活性及び熱安定性を測定し、３重変異体と２種類の特性を対応させた3次データベースを作製する。この場合、得られるデータは合計3個の３重変異体のデータとなる（1U2V3W, 1U2V4X, 1U3W4X）（工程６）。3次データベースに基づき、活性及び熱安定性が同時に向上した３重変異体のうち上位ｎ個（例えば2個）を選抜する。以下同様にして、満足する特性を有する高次多重変異体が得られるまで、多重変異体の作製を続ける。この場合、最大4重変異体まで作製可能である（工程７及び工程８）。
(9)  ２次データベースより選抜した３個の2重変異体のうち、２個が共通するアミノ酸変異（変異箇所及び変異アミノ酸残基）を含む場合（例えば1U2V, 1U3W, 4X5Y）、これらを組み合わせて３重変異体及び４重変異体を作製する（工程５）。得られた３重変異体及び４重変異体の活性及び熱安定性を測定し、３重変異体及び４重変異体と２種類の特性を対応させた3次データベースを作製する。この場合、得られるデータは１個の３重変異体及び２個の４重変異体のデータとなる（1U2V3W, 1U2V4X5Y, 1U3W4X5Y）（工程６）。3次データベースに基づき、活性及び熱安定性が同時に向上した３重変異体あるいは４重変異体のうち上位ｎ個（例えば2個）を選抜する。以下同様にして、満足する特性になるまで多重変異体の作製を続ける。この場合、最大5重変異体まで作製可能である（工程７及び工程８）。
【００３８】
本発明の方法により、上記のように活性及び熱安定性が野生型よりも有意に向上した４重変異体が得られた場合、上記工程１〜工程６において、最大18×n個（一アミノ酸変異体）、15個（2重変異体）、３個（４重変異体）を作製して活性及び熱安定性を測定することになる。含硫アミノ酸残基が10箇所の場合、上記工程１〜工程６において、180+15+3=198個のタンパク質変異体の作製及び特性の測定で足りる。
一方、従来の方法においては、全ての含硫アミノ酸残基n個に同時に変異を施す場合、18のn乗個の組み合わせが可能である。含硫アミノ酸残基のが10個の場合、18の10乗個、すなわち3570億個ものタンパク質変異体の作製及び特性の測定が必要になる。
以上、n個の含硫アミノ酸残基の多重変異を例に挙げて、本発明の効果を説明した。本発明は、上記のように作製及び特性の測定に必要なタンパク質変異体の数を減らし、タンパク質の複数の特性を同時に効率良く改良することを可能にする。従って、本発明の方法は、着目するアミノ酸残基の数が多いほど効率的になり、従来の方法に比べて有利になる。
【００３９】
本発明の方法をパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素（p-Hydroxybenzoate hydroxylase: PHBH）に適用した。
その結果、複数の特性が同時に改良されたPHBH多重変異体、すなわちパラヒドロキシ安息香酸に対する活性が向上するのと同時に、プロトカテキン酸に対するみかけの活性が低下し、その結果プロトカテキン酸に対する相対活性が向上したのに加えて、熱処理後の残存活性も向上したPHBH多重変異体を効率良く得ることができた。
一例としてPHBH４重変異体[M52Q/C211I/M213G/M276Q]及びPHBH４重変異体[M52Q/C211I/M213G/C332A]が挙げられる。かっこ内のアルファベットはアミノ酸残基の１文字略号を示し、数字はPHBHのアミノ酸配列中の箇所を示す。例えばM52Qは、野生型のPHBHのアミノ酸配列中52番目のメチオニン残基がグルタミン残基に変異していることを示す。
【００４０】
以下に示す実施例では、PHBHのパラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性、プロトカテキン酸を基質としたときのみかけの活性、プロトカテキン酸に対する相対活性、及び熱処理後の残存活性の改良を行った。しかし、これらは本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００４１】
(1)システイン残基あるいはメチオニン残基を変異させたPHBHをコードする遺伝子（pobA）の構築及び一アミノ酸変異体群の作製
（a）システイン残基あるいはメチオニン残基を変異させたpobA遺伝子の構築
Pseudomonas fluorescens IFO14160由来のPHBHをコードする遺伝子（pobA）の塩基配列及びコードされるPHBHのアミノ酸配列を、後述する配列表の配列番号27及び28にそれぞれ記載する。PHBHのN末端Met残基は配列番号27の塩基番号1−3によってコードされる。
野生型pobAを鋳型にしたPCR法により、野生型pobA配列上に存在するシステイン（Cys）残基及びメチオニン（Met）残基を他のアミノ酸残基に変異させた一アミノ酸変異体の遺伝子ライブラリーを構築した。すなわち、野生型PHBHの152番目、158番目、211番目及び332番目のCys残基及び52番目、65番目、98番目、110番目、213番目、276番目、346番目及び349番目のMet残基を、それぞれ他のアミノ酸残基に変異させた。
【００４２】
まず、２種類のPCR反応溶液（反応溶液（1）及び反応溶液（2））を準備した。
(1)  SacI/H3-Nプライマー（配列番号1）とプライマー2（配列番号4）を含むPCR反応溶液。
(2)  プライマー1（配列番号3）KpnI-Cプライマー（配列番号2）を含むPCR反応溶液。
上記の152番目のCys残基の変異に用いた4種類のプライマーの塩基配列を以下に示す。配列中、NはA, T, G, Cを，KはGあるいはTを、MはAあるいはCを示す。
(a)SacI/H3-Nプライマー
5’-AGGGAGCTCAAAGGAGGAACTTCCATGCATCACCATATGAAAACGCTAAAAACCCAAGTC-3’
（配列番号1）
(b)KpnI-Cプライマー
5’-AGGGTACCTTACTCGATAGCTTCGTAAGGAAGCCCGACGTA-3’（配列番号2）
(c)プライマー1  5’-GCTTTTCGCCTGGAGNNKGACTACATCGCGGGC-3’（配列番号3）
(d)プライマー2  5’-GCCCGCGATGTAGTCMNNCTCCAGGCGAAAAGC-3’（配列番号4）
【００４３】
反応溶液（１）及び反応溶液（２）のPCRを別個に行い、前者より配列断片Ａ、後者より配列断片Ｂを得た。PCRは、変性（95℃、30秒）、アニーリング（55℃、30秒）、伸長（72℃、1分）からなるサイクルを30サイクル繰り返した。以下、PCRにおける変性、アニーリング、伸長反応はすべて同条件で行った。
【００４４】
配列断片Ａ及び配列断片Ｂを混合し、5サイクルのPCRを行った。その結果、配列断片Ａと配列断片Ｂが重複する36bpの部分配列に基づくアニーリング及び伸長を行うことにより、152番目の残基を他のアミノ酸に変異させた配列のみを有する改変pobA全長遺伝子を構築することができた。
さらにSacI/H3-NプライマーとKpnI-Cプライマーを添加し、30サイクルのPCRを行った。その結果、Cys152番目のみを任意のアミノ酸に変異した配列のみを有する改変pobA全長遺伝子をPCR産物として得た。
【００４５】
上記配列（a）〜（d）のうち、152番目のCys残基以外の含硫アミノ酸残基変異の場合も、（a）SacI/H3-Nプライマーと（b）KpnI-Cプライマーは共通に用い、（c）プライマー1と（d）プライマー2は各Cys残基あるいはMet残基の変異に固有のものとした。
158番目、211番目、332番目のCys残基、及び52番目、65番目、98番目、110番目、213番目、276番目、346番目、349番目のMet残基の変異に用いたプライマー１及びプライマー２の配列を以下に示す。
158番目のCys残基変異の場合
（c）プライマー1  5’-GACTACATCGCGGGCNNKGATGGTTTTCACGGT-3’（配列番号5）
（d）プライマー2  5’-ACCGTGAAAACCATCMNNGCCCGCGATGTAGTC-3’（配列番号6）
211番目のCys残基変異の場合
（c）プライマー1  5’-CGTGGCTTTGCCCTGNNKAGCATGCGCTCGCCG-3’（配列番号7）
（d）プライマー2  5’-CGGCGAGCGCATGCTMNNCAGGGCAAAGCCACG-3’（配列番号8）
332番目のCys残基変異の場合
（c）プライマー1  5’-CAGTACTCAGCGATCNNKTTGCGCCGCGTATGG-3’（配列番号9）
（d）プライマー2  5’-CCATACGCGGCGCAAMNNGATCGCTGAGTACTG-3’（配列番号10）
52番目のMet残基変異の場合
（c）プライマー1  5’-GTGCTGGAGCAAGGCNNKGTCGACCTGCTGCGC-3’（配列番号11）
（d）プライマー2  5’-GCGCAGCAGGTCGACMNNGCCTTGCTCCAGCAC-3’（配列番号12）
65番目のMet残基変異の場合
（c）プライマー1  5’-GGCGTCAGCCGACGCNNKGACGCCGAGGGCCTT-3’（配列番号13）
（d）プライマー2  5’-AAGGCCCTCGGCGTCMNNGCGTCGGCTGACGCC-3’（配列番号14）
98番目のMet残基変異の場合
（c）プライマー1  5’-GGCGGCCAGTCGGTGNNKATCTACGGCCAGACC-3’（配列番号15）
（d）プライマー2  5’-GGTCTGGCCGTAGATMNNCACCGACTGGCCGCC-3’（配列番号16）
110番目のMet残基変異の場合
（c）プライマー1  5’-GTCACCCGTGACTTGNNKGCCGCCCGCGAAGCG-3’（配列番号17）
（d）プライマー2  5’-CGCTTCGCGGGCGGCMNNCAAGTCACGGGTGAC-3’（配列番号18）
213番目のMet残基変異の場合
（c）プライマー1  5’-TTTGCCCTGTGCAGCNNKCGCTCGCCGACCCGC-3’（配列番号19）
（d）プライマー2  5’-GCGGGTCGGCGAGCGMNNGCTGCACAGGGCAAA-3’（配列番号20）
276番目のMet残基変異の場合
（c）プライマー1  5’-TTTGTGGTCGAGCCGNNKCAATACGGGCGCCTG-3’（配列番号21）
（d）プライマー2  5’-CAGGCGCCCGTATTGMNNCGGCTCGACCACAAA-3’（配列番号22）
346番目のMet残基変異の場合
（c）プライマー1  5’-CGGTTTTCCTGGTGGNNKACTTCGATGTTGCAC-3’（配列番号23）
（d）プライマー2  5’-GTGCAACATCGAAGTMNNCCACCAGGAAAACCG-3’（配列番号24）
349番目のMet残基変異の場合
（c）プライマー1  5’-TGGTGGATGACTTCGNNKTTGCACCAGTTTCCG-3’（配列番号25）
（d）プライマー2  5’-CGGAAACTGGTGCAAMNNCGAAGTCATCCACCA-3’（配列番号26）
【００４６】
上記工程により、PHBHの152番目、158番目、211番目及び332番目のCys残基及び52番目、65番目、98番目、110番目、213番目、276番目、346番目、349番目のMet残基をコードする部分をそれぞれ他のアミノ酸残基をコードするように変異させた配列のみを有する改変pobA全長遺伝子を構築した。
【００４７】
（b）一アミノ酸変異体群の作成
Cys残基及びMet残基の一アミノ酸変異体ライブラリーの構築で得られた大腸菌形質転換体よりプラスミドを抽出し、一アミノ酸変異体の様相を塩基配列より決定した。当該遺伝子を挿入したプラスミドについては、次の論文に詳述されている（Suemori, A. et al. Engineering of histidine tail in the N-terminal region of p-hydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas fluorescens. Biotech. Lett. 23, 489-495 (2001)）。
その結果、152番目、158番目、211番目、332番目のCys残基及び52番目、65番目、98番目、110番目、213番目、276番目、346番目、349番目のMet残基が他のアミノ酸残基に変異された一アミノ酸変異体が13種類、9種類、11種類、11種類、16種類、12種類、15種類、15種類、14種類、19種類、15種類及び16種類得られた。
【００４８】
得られた一アミノ酸変異体群について、変異体のN末端に付与したヒスチジン残基配列を利用して精製を行った。精製した一アミノ酸変異体の３種類の特性、すなわちパラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性（Uphb: U/mg）、プロトカテキン酸を基質としたときの見かけの活性（Upro: U/mg）、熱処理後の残存活性（R.A.: %）を測定した。３種類の特性の測定法方については、次の論文に詳述されている（Suemori, A. et al. Engineering of histidine tail in the N-terminal region of p-hydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas fluorescens. Biotech. Lett. 23, 489-495 (2001)）。
更にプロトカテキン酸に対する相対活性（Rpro: %)を計算した。プロトカテキン酸に対する相対活性は、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性に対するプロトカテキン酸を基質としたときの見かけの活性の比として求めた。以下の表において、プロトカテキン酸に対する相対活性が低いほど、PHBHのパラヒドロキシ安息香酸に対する基質特異性が高くなるものと判断した。
【００４９】
各一アミノ酸変異体と４つの特性を対応させた一次データベースを作製した。結果を以下の表1〜表12に示す。表1〜表12において、各一アミノ酸変異体は、Cys残基あるいはMet残基が他のアミノ酸に変異された形の一文字略記で示す。なお、表中の空白部分は当該箇所において所定アミノ酸残基に変異させたとき、活性を有する一アミノ酸変異体が得られなかったことを意味する。
【表１】
2008148713.tif 000002
【表２】
2008148713.tif 000003
【表３】
2008148713.tif 000004
【表４】
2008148713.tif 000005
【表５】
2008148713.tif 000006
【表６】
2008148713.tif 000007
【表７】
2008148713.tif 000008
【表８】
2008148713.tif 000009
【表９】
2008148713.tif 000010
【表１０】
2008148713.tif 000011
【表１１】
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【表１２】
2008148713.tif 000013
【００５０】
(2)一アミノ酸変異体群より選抜した変異アミノ酸残基の組み合わせによる２重変異酵素ライブラリーの構築と諸特性  
表１〜表12に基づき、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性が野生型より向上するのと同時に、熱処理後の残存活性も野生型より向上した一アミノ酸変異変異体を11個選抜した（M65S, M65D, M98V, M110S, M110N, M213C, M276Q, M346G, M346A, M346I, M346E）。
次いで、選抜した一アミノ酸変異体の変異アミノ酸残基を組み合わせた（47種類）。組み合せにより理論上得られる２重変異体を以下の表13に示す。２重変異体の作製は、上記（１）の工程に記載した塩基置換を含む核酸増幅用プライマーを用いたPCRによる変異導入の工程を繰り返すことによって行われた。以下、多重変異体の作製は同様に行った。
【表１３】
2008148713.tif 000014
その結果、活性を示す２重変異体が28個得られた。得られた２重変異体群について、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性、プロトカテキン酸を基質としたときのみかけの活性、熱処理後の残存活性を測定し、プロトカテキン酸に対する相対活性を計算した。結果を以下の表14に示す。
【表１４】
2008148713.tif 000015
【００５１】
(3)２重変異体群より選抜した変異アミノ酸残基の組み合わせによる3重変異酵素ライブラリーの構築と諸特性
上記表14に基づき、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性が高い順に２重変異体を3個選抜した（M110S/M346G, M65S/M346E, M98V/M346E）。更に、熱処理後の残存活性が高い順に２重変異体を３個選抜した（M110S/M346I, M65D/M346I, M110N/M346A）。
次いで、選抜した計6個の２重変異体の変異アミノ酸残基を組み合わせた（計17種類）。組み合せにより理論上得られる3重変異体を以下の表15に示す。
【表１５】
2008148713.tif 000016
＊重複
その結果、活性を示す3重変異体酵素が６個得られた。得られた3重変異体群について、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性、プロトカテキン酸を基質としたときのみかけの活性、熱処理後の残存活性を測定し、プロトカテキン酸に対する相対活性を計算した。結果を以下の表16に示す。
【表１６】
2008148713.tif 000017
【００５２】
(4)3重変異体群より選抜した変異アミノ酸残基の組み合わせによる４重変異酵素ライブラリーの構築と諸特性
表16に基づき、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性が高い順に３重変異体を２個選抜した（M65D/M98V/M346I, M65S/M110S/M346E）。更に熱処理後の残存活性が高い順に３重変異体を２個選抜した（M65S/M110S/M346E, M98V/M110S/M346E）但し、M65S/M110S/M346Eは両方の選抜群に含まていた。
次いで、選抜した計３個の3重変異体の変異アミノ酸残基を組み合わせた（４種類）。組み合せにより理論上得られる4重変異体を以下の表17に示す。
【表１７】
2008148713.tif 000018
＊重複
その結果、活性を示す4重変異体酵素が４個得られた。得られた４重変異体群について、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性、プロトカテキン酸を基質としたときのみかけの活性、熱処理後の残存活性を測定し、プロトカテキン酸に対する相対活性を計算した。結果を以下の表18に示す。
【表１８】
2008148713.tif 000019
【実施例２】
【００５３】
(1)得られた一アミノ酸置換変異体群より選抜した変異アミノ酸残基の組み合わせによる２重変異酵素ライブラリーの作成
実施例１の表1〜表12に基づき、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性が野生型より向上するのと同時に、プロトカテキン酸を基質としたときの見かけの活性が野生型よりも低下した一アミノ酸変異体を10個選抜した（C152V, C211I, C332A, M52Q, M52V, M110L, M110I, M213G, M276Q, M349A）。
次いで、選抜した一アミノ酸変異体の変異アミノ酸残基を組み合わせた（43種類）。組み合せにより理論上得られる2重変異体を以下の表19に示す。
【表１９】
2008148713.tif 000020
その結果、活性を示す２重変異体が18個得られた。得られた２重変異体群について、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性、プロトカテキン酸を基質としたときのみかけの活性、熱処理後の残存活性を測定し、プロトカテキン酸に対する相対活性を計算した。結果を以下の表20に示す。
【表２０】
2008148713.tif 000021
【００５４】
(2)２重変異体群より選抜した変異アミノ酸残基の組み合わせによる４重変異酵素ライブラリーの構築と諸特性（その１）
表20に基づき、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性が野生型より向上するのと同時に、プロトカテキン酸を基質としたときの見かけの活性が野生型よりも低下した２重変異体群の中から、プロトカテキン酸に対する相対活性が低い順に3個選抜した（M52Q/C211I, M110L/M276Q, C152V/M213G）。
次いで、選抜した２重変異体の変異アミノ酸残基を組み合わせた（３種類）。組み合せにより理論上得られる４重変異体を以下の表21に示す。
【表２１】
2008148713.tif 000022
その結果、活性を示す４重変異体酵素が３個得られた。得られた４重変異体群について、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性、プロトカテキン酸を基質としたときのみかけの活性、熱処理後の残存活性を測定し、プロトカテキン酸に対する相対活性を計算し、データベース化した。結果を以下の表22に示す。
【表２２】
2008148713.tif 000023
【００５５】
(3)２重変異体群より選抜した変異アミノ酸残基の組み合わせによる3重変異体及び4重変異酵素ライブラリーの構築と諸特性（その２）
表20に基づき、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性が野生型より向上するのと同時に、プロトカテキン酸を基質としたときの見かけの活性が野生型よりも低下した２重変異体群の中より、プロトカテキン酸に対する相対活性が低い順に3個選抜した（M52Q/C211I, M110L/M276Q, C152V/M213G）。更に熱処理後の残存活性が高い順に４個選抜した（M52Q/C152V, M110L/M276Q, M213G/M276Q, M213G/M332A）但し，M110L/M276Qは両方の選抜群に含まれていた。
次いで、選抜した計６個の２重変異体の変異アミノ酸残基を組み合わせた（15種類）。組み合せにより理論上得られる3重変異体及び４重変異体を以下の表23に示す。
【表２３】
2008148713.tif 000024
その結果、活性を示す3重変異体が６個、活性を示す4重変異体が９個得られた。得られた３重変異体群及び４重変異体群について、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性、プロトカテキン酸を基質としたときのみかけの活性、熱処理後の残存活性を測定し、プロトカテキン酸に対する相対活性を計算した。結果を以下の表24に示す。
【表２４】
2008148713.tif 000025
【００５６】
表24に示すように、PHBH４重変異体[M52Q/C211I/M213G/M276Q]は、野生型と比較してパラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性が15.9 (U/mg)から21.3 (U/mg)に向上すると共に、プロトカテキン酸を基質としたときのみかけの活性が0.747 (U/mg)から0.405 (U/mg)に低下した。その結果、プロトカテキン酸に対する相対活性が4.7％から1.9％に有意に減少した。熱処理後の残存活性は31%から39%に有意に向上した。
【００５７】
また、表24に示すように、PHBH４重変異体[M52Q/C211I/M213G/C332A]は、野生型と比較してパラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性が15.9 (U/mg)から20.8 (U/mg)に向上すると共に、プロトカテキン酸を基質としたときのみかけの活性が0.747 (U/mg)から0.405 (U/mg)に低下した。その結果、プロトカテキン酸に対する相対活性は4.7％から1.9％に有意に減少した。熱処理後の残存活性は野生型の31%から53%に有意に向上した。
【００５８】
実施例１及び実施例２に示したように、本発明のタンパク質改良方法は、複数の特性を指標とした変異・選抜を繰り返すことにより、タンパク質の複数の特性を同時に効率良く改良していく方法である。
表14、表16及び表18の結果は、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性及び熱処理後の残存活性を指標とし、２重変異、３重変異及び４重変異と好ましい変異を加えることにより、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性の向上及び熱処理後の残存活性の向上を同時に効率良く行うことができたことを示している。これは該酵素の２種類の特性の改良を同時に効率良く行うことができたことを示す。
【００５９】
表20及び表22の結果は、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性、プロトカテキン酸を基質としたときのみかけの活性及びプロトカテキン酸に対する相対活性を指標とし、２重変異及び４重変異と好ましい変異を加えることにより、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性の向上及びプロトカテキン酸を基質としたときのみかけの活性の低下という、相反性の高い２種類の特性の改良を同時に行い、その結果、プロトカテキン酸に対する相対活性が野生型よりも有意に減少した多重変異体を効率良く得ることができたことを示している。これは該酵素の３種類の特性の改良を同時に効率良く行うことができたことを示す。
【００６０】
表20及び表24の結果は、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性、プロトカテキン酸を基質としたときのみかけの活性及びプロトカテキン酸に対する相対活性に加えて、熱処理後の残存活性も指標とし、２重変異、３重変異及び４重変異と好ましい変異を加えることにより、パラヒドロキシ安息香酸を基質としたときの活性の向上及びプロトカテキン酸を基質としたときのみかけの活性の低下に伴うプロトカテキン酸に対する相対活性の有意な減少のみならず熱処理後の残存活性の向上も行うことができたことを示している。これは該酵素の４種類の特性の改良を同時に効率良く行うことができたことを示す。
【配列表】
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