(57)【要約】      （修正有）【課題】ｃ−ｋｉｔレセプターに対するＳＣＦの結合を阻害し、医薬又は化粧料として有用なＳＣＦ結合阻害剤及び美白剤の提供。【解決手段】下記（１）〜（３）で表される化合物及びリン酸化マンナンオリゴ糖（Ｙ１８９２由来）、リン酸化ガラクタン（Ｙ６４９３由来）及びリン酸化ガラクタン（Ｙ６５０２由来）などのリン酸化多糖類から選ばれる化合物又はその塩を有効成分とするＳＣＦ結合阻害剤及び美白剤。（１）７，８−ジヒドロ葉酸（１ａ）及び７，８−ジヒドロプロテイル酸（１ｂ）（２）ｄＧＭＰ（２ａ）及び１−（５’−ホスホリボシル）−５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミド（２ｂ）（３）ホスホエノールピルビン酸（３ａ）、２−イソプロピルリンゴ酸（３ｂ）及び２−オキソ酪酸（３ｃ）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）〜（３）で表される化合物及びリン酸化多糖類から選ばれる化合物又はその塩を有効成分とするＳＣＦ結合阻害剤。
【化１】
2008031094.tif 000005
【請求項２】
下記一般式（１）〜（３）で表される化合物及びリン酸化多糖類から選ばれる化合物又はその塩を有効成分とする美白剤。
【化２】
2008031094.tif 000006
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステムセルファクター（Stem cell factor、以下「ＳＣＦ」という）結合阻害剤及び美白剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
日焼け後の色素沈着やシミ・ソバカスは、一般に皮膚の紫外線暴露による刺激やホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）が活性化されメラニン産生が亢進した結果生じるものと考えられている。
【０００３】
ＳＣＦは、造血幹細胞の表面に発現しているｃ−ｋｉｔレセプターのリガンドであり、造血細胞の増殖・分化を促す膜結合型の増殖因子として知られているが、近年、ｃ−ｋｉｔが造血細胞の他に、肥満細胞、メラノサイト及び生殖細胞の表面にも発現していることが明らかになり（非特許文献１）、即時型アレルギーへの関与を始めとして、ＳＣＦの生体内作用に関する研究が進められている。最近では、皮膚にのみＳＣＦを発現させるトンラスジェニックマウスにおいて、肥満細胞の誘導とメラノサイトの増殖により、メラニン合成が増強されること（非特許文献２）、メラノサイト上のｃ−ｋｉｔのリン酸化によって、メラノジェネシスが亢進することが報告され（非特許文献３）、メラニンの過剰生産にＳＣＦが深く関与すると考えられている。
【０００４】
従って、メラノサイト上のｃ−ｋｉｔレセプターとＳＣＦとの結合を特異的に阻害することができれば、メラニンの過剰産生応を抑制することができ、皮膚の褐色化、シミ・ソバカスの発生を予防又は改善することが可能となる。
【０００５】
一方、７，８−ジヒドロ葉酸は葉酸生合成系における最初の生成物として知られ（非特許文献４）、７，８−ジヒドロプテロイル酸は生体内でジヒドロプテロイン酸ピロホスホリラーゼにより合成されることが知られ（非特許文献５）、ｄＧＭＰはＤＮＡの構成デオキシヌクレオチドとして知られ（非特許文献６）、１−（５′−ホスホリボシル）−５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミドにはＡＭＰＫ活性化作用があることが知られ（非特許文献７）、ホスホエノールピルビン酸には育毛作用があることが知られ（特許文献１）、２−イソプロピルリンゴ酸はロイシン生合成の中間体として知られ（非特許文献８）、２−オキソ酪酸は生体内でトレオニンがデヒドラターゼ反応を受けて生成されることが知られ（非特許文献９）、リン酸化多糖類にはタンパク質吸着抑制作用があることが報告されているが（特許文献２）、これらの化合物にＳＣＦ結合阻害作用があることは全く知られていない。
【特許文献１】特開２００４−１６８７２８号公報
【特許文献２】特開２００２−２９９４８号公報
【非特許文献１】J.Exp.Med.,183,2681-2686,1996
【非特許文献２】J.Exp.Med.,187,1565-1573,1998
【非特許文献３】Molecular Bioloy of the Cell  3, 197-209 1992
【非特許文献４】化学大辞典 1989 株式会社東京化学同人
【非特許文献５】生化学辞典（第２版） 1990 株式会社東京化学同人
【非特許文献６】化学大辞典 1989 株式会社東京化学同人
【非特許文献７】肥満研究 11, 79-81, 2005
【非特許文献８】生化学辞典（第２版） 1990 株式会社東京化学同人
【非特許文献９】生化学辞典（第２版） 1990 株式会社東京化学同人
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ｃ−ｋｉｔレセプターに対するＳＣＦの結合を阻害し、医薬又は化粧料として有用なＳＣＦ結合阻害剤及び美白剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、細胞表面上のｃ−ｋｉｔレセプターに対するＳＣＦの結合を特異的に阻害する化合物を探索したところ、下記に示す特定の葉酸類（１）、プリン関連物質（２）、Ｃ３−Ｃ４ユニット（３）及びリン酸化多糖類にＳＣＦ結合阻害活性があり、メラニンの過剰産生に起因する色素沈着やシミ・ソバカスの予防又は改善に有効であることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記一般式（１）〜（３）で表される化合物及びリン酸化多糖類から選ばれる化合物又はその塩を有効成分とするＳＣＦ結合阻害剤及び美白剤に係るものである。
【０００９】
【化１】
2008031094.tif 000002
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＳＣＦ結合阻害剤又は美白剤によれば、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制でき、日焼け後の色素沈着やシミ・ソバカスを予防又は改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のＳＣＦ結合阻害剤とは、細胞表面、特にメラノサイト表面上のｃ−ｋｉｔレセプターに対するＳＣＦの結合を特異的に阻害し、メラニンの過剰生成に伴う皮膚の褐色化やシミ・ソバカスの発生の予防又は改善効果を有するものをいう。
【００１２】
本発明において、一般式（１）で表される化合物は、以下に示すとおり、７，８−ジヒドロ葉酸（１ａ）及び７，８−ジヒドロプテロイル酸（１ｂ）であり、一般式（１）で表される化合物は、ｄＧＭＰ（２ａ）及び１−（５'−ホスホリボシル）−５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミド（２ｂ）であり、一般式（３）で表される化合物は、ホスホエノールピルビン酸（３ａ）、２−イソプロピルリンゴ酸（３ｂ）及び２−オキソ酪酸（３ｃ）である。
【００１３】
【化２】
2008031094.tif 000003
【００１４】
これらの化合物の塩としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩類、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属類、１〜３級アミン類、４級アンモニウム塩類、アルギニン、リジン等のアミノ酸類等との塩基性塩、塩酸、ヨウ素酸、硫酸等の鉱酸、酢酸、クエン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸等との酸性塩が挙げられる。
【００１５】
上記化合物は、いずれも既知化合物であり、公知の有機化学合成、或いはこれらの化合物を含有する天然物や微生物代謝産物（例えば枯草菌代謝物）から周知の手法を用いて得ることができる。また、いずれも市販品が存在し、これらを用いることができる。  斯かる市販品としては、例えば、７，８−ジヒドロ葉酸（Schircks Laboratories 16.206  ）、７，８−ジヒドロプテロイル酸（Schircks Laboratories 16.114）、ｄＧＭＰ（SIGMA D-9625）、１−（５'−ホスホリボシル）−５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミド（SIGMA A-1393）、ホスホエノールピルビン酸（Wako 325-20641）、２−イソプロピルリンゴ酸（ALDRICH 333115）、２−オキソ酪酸（ALDRICH K401）等が挙げられる。
【００１６】
本発明のリン酸化多糖類としては、分子内に少なくとも１個、好ましくは２個以上のリン酸基を有する多糖類（オリゴ糖を含む）をいい、その構成多糖としては、例えば、マンナン、ガラクタン等が挙げられ、好ましくは、植物由来マンナン、植物由来ガラクタン、微生物由来マンナン、微生物由来ガラクタンが挙げられる。このうち、酵母由来リン酸化多糖が好ましく、特にH.capsulata NRRL Y-1842由来のリン酸化マンナンオリゴ糖、Sporobolomyces NRRL Y-6493由来のリン酸化ガラクタン、Sporobolomyces NRRL Y-6502由来のリン酸化ガラクタンが好ましい。
また、これらの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００１７】
これらのリン酸化多糖類は、例えばSlodki ME et al., J.Bacteriol,82;269-274(1961)に記載の方法により、当該微生物の培養液より得ることができる。
【００１８】
本発明の化合物又はその塩は、後記実施例に示すように、ｃ−ｋｉｔへのＳＣＦの結合阻害活性を有することから、メラノサイト上のｃ−Ｋｉｔの活性化によって引き起こされるメラニンの過剰産生応を抑制することができると考えられる（文献：The Journal of Biological Chemistry 275, 33321-33328, 2000）。従って、本発明の化合物又はその塩は、ＳＣＦ結合阻害剤或いは美白剤として使用でき、またＳＣＦ結合阻害剤或いは美白剤を製造するために使用できる。当該ＳＣＦ結合阻害剤及び美白剤は、皮膚の褐色化、シミ・ソバカスの発生を予防又は改善するための医薬品、医薬部外品、化粧品等として使用できる。また、当該ＳＣＦ結合阻害剤或いは美白剤は、ＳＣＦ結合阻害或いは美白をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した医薬部外品、化粧品として使用することもできる。
【００１９】
本発明のＳＣＦ結合阻害剤又は美白剤を医薬品として用いる場合の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、外用剤、坐剤、経皮吸収剤等による非経口投与のいずれでもよい。当該医薬製剤を調製するには、本発明の植物又はその抽出物を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。該製剤中の本発明化合物又はその塩の含有量は、０．１〜２０質量％、特に０．５〜１０質量％含有することが好ましい。尚、本発明のＳＣＦ結合阻害剤又は美白剤を医薬品として使用する場合、成人１人当たりの１日の投与量は、本発明の化合物又はその塩として、例えば０．００１〜１０００ｍｇ、特に０．０１〜１００ｍｇであることが好ましい。
【００２０】
また、本発明のＳＣＦ結合阻害剤又は美白剤を医薬部外品や化粧料として用いる場合は、皮膚外用剤、洗浄剤、メイクアップ化粧料とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の医薬部外品や化粧料は、本発明の植物又はその抽出物を単独で、又は医薬部外品、皮膚化粧料及び洗浄料に配合される、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、樹脂、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせることにより調製することができる。尚、薬効成分としては、ホルモン剤やコウジ酸、アルブチン、プラセンタエキス、カミツレエキス、ルシノール等の他の美白成分が挙げられる。
当該医薬部外品、化粧料中の本発明化合物の含有量は、０．０１〜１００質量％とすることが好ましく、特に０．０５〜７０質量％とすることが好ましい。
【実施例】
【００２１】
＜評価サンプルの調製＞
各サンプルは、７，８−ジヒドロ葉酸（Schircks Laboratories 16.206）、７，８−ジヒドロプテロイル酸（Schircks Laboratories 16.114）、ｄＧＭＰ（SIGMA D-9625）、１−（５'−ホスホリボシル）−５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミド（SIGMA A-1393）、ホスホエノールピルビン酸（Wako 325-20641）、２−イソプロピルリンゴ酸（ALDRICH 333115）、２−オキソ酪酸（ALDRICH K401）、H.capsulata NRRL Y1842由来リン酸化マンナンオリゴ糖、Sporobolomyces NRRL Y6493由来リン酸化ガラクタン、Sporobolomyces NRRL Y6502由来リン酸化ガラクタンを、それぞれ蒸留水に１ｍＭとなるように溶解して調製した。
【００２２】
実施例１  ＳＣＦ結合阻害活性
ＰＢＳで２００μｇ／ｍｌに溶解したRecombinant human c-kit (Soluble c-kit ; s-kit（R&D systems社）)を９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェルとなるように添加し、４℃で一晩放置した。翌日ウェルをＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＢＳＡ（Bovine Serum Albumin；和光純薬工業株式会社）−ＰＢＳＴ（0.1% Tween20-PBS）をウェルが満杯になるまで添加し、室温で１時間以上放置した。ウェルをＰＢＳＴで２回洗浄後、評価サンプル（終濃度５％（ｖ／ｖ））、終濃度１００ｐＭのＳＣＦ（「Recombinant Human SCF」（Peprotech社））、終濃度０．５％のＢＳＡ、ＰＢＳを加え計１００μｌ／ウェルを添加し、室温で２時間以上振とうさせた。ウェルをＰＢＳＴで５回洗浄した後、終濃度０．５μｇ／ｍｌの抗ＳＣＦ抗体（「Rabbit polyclonal to SCF」（abcam社））、終濃度０．５％のＢＳＡ、ＰＢＳを加え計１００μｌ／ウェルを添加し、室温で２時間以上振とうまたは、４℃で一晩放置した。ウェルをＰＢＳＴで５回洗浄した後、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ECL Anti-rabbit IgG（Amersham Biosciences社））を１００μｌ／ウェル添加し、室温で２時間以上振とうさせた。ウェルをＰＢＳＴで１０回洗浄した後、ＴＭＢ基質液（「TMB Microwell Peroxidase Substrate System」（KPL社））を１００μｌ／ウェル添加し、遮光して室温で１０℃、２０分放置した。さらにＴＭＢ反応停止液（「TMB Stop Solution」（KPL社））を１００μｌ／ウェル添加し反応を停止させ、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定しｓ−ｋｉｔに結合したＳＣＦ量を計測した。なおコントロールとして、評価サンプルの代わりにその溶媒を同量添加したウェルを作製した。また、ｓ−ｋｉｔを固相化せずに、評価サンプルの代わりにその溶媒を添加したウェルを作製し、この吸光度をブランク（非特異的結合量）とした。得られた吸光度はブランクの値を差し引くことで特異的結合量を求め、コントロールの値を１００とした相対値で表した。
【００２３】
【表１】
2008031094.tif 000004
【００２４】
表１に示したとおり、本発明の化合物は、ｃ−ｋｉｔに対するＳＣＦの結合阻害活性を有することが認められた。