(57)【要約】【課題】血液中のグルコースなどの測定対象成分の濃度測定を迅速に行え、かつ製造時の取り扱いの問題を解決した乾式分析要素およびその製造方法を提供すること。【解決手段】液体試料中の測定対象成分を測定又は検出するための乾式分析要素において、測定対象成分を測定又は検出するための試薬を含む非繊維質多孔性担体からなる試薬層が、微貫通空隙構造の接着剤層を介して、光透過性・水不透過性支持体に接着して一体化されていることを特徴とする乾式分析要素。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中の測定対象成分を測定又は検出するための乾式分析要素において、測定対象成分を測定又は検出するための試薬を含む非繊維質多孔性担体からなる試薬層が、微貫通空隙構造の接着剤層を介して、光透過性・水不透過性支持体に接着して一体化されていることを特徴とする乾式分析要素。
【請求項２】
測定対象成分がグルコースである、請求項１に記載の乾式分析要素。
【請求項３】
測定対象成分を測定又は検出するための試薬が、グルコースと反応して呈色する試薬である、請求項２に記載の乾式分析要素。
【請求項４】
測定対象成分を測定又は検出するための試薬が、グルコースオキシターゼ、ペルオキシターゼ、及びロイコ色素である、請求項２又は３に記載の乾式分析要素。
【請求項５】
光透過性・水不透過性支持体の表面に、ホットメルト型接着剤を、グラビア印刷法によりグラビアローラーからの転写により、点状に付着させることによって、微貫通空隙構造の接着剤層が設けられている、請求項１から４の何れかに記載の乾式分析要素。
【請求項６】
光透過性・水不透過性支持体の表面に微貫通空隙構造の接着剤層を設ける工程、及び接着剤層が設けられた光透過性・水不透過性支持体の表面に、非繊維質多孔性担体からなる試薬層を設ける工程、を含む、請求項１から５の何れかに記載の乾式分析要素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液等の液体中に含まれるグルコースなどの測定対象成分の定量分析において、過酸化水素を生成するオキシダーゼ反応系を利用する乾式分析要素およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中のグルコース濃度を試験するのに、酵素系組成物を含む乾式分析要素が診療所、医院、病院及び家庭で広く使用されている。実際に、乾式分析要素は糖尿病患者の多くにとって日常必需品となっている。糖尿病患者は血糖濃度を1日に複数回測定し、その結果に応じて、例えば食事制限及び／又はインスリン注射の実施を行わなければならず、測定の迅速化は非常に重要な課題となっている。この課題に対して、例えば、特許第２５４５２５０号、特開平９−１２１８９４号、特開平１１−１８３４７４号に記載のグルコースオキシダーゼ法を用いて、グルコース濃度に依存した色変化を生ずるような試薬を含む乾式分析要素が提案されている。しかしながら、グルコースオキシダーゼが有効に働くためには、空気中の酸素の十分な供給が必要不可欠であるために、試薬の担持を強度が弱いまたは伸縮しやすい多孔質膜のみに行わなければならず、製造時の取り扱いにおいて、問題が生じる場合があり、安定した製造を実施することが困難である。  一方で、例えば特開２０００−１４６９６０号に記載の支持体に多孔性素材をゼラチン等で完全に接着した多層分析要素では、製造時の取り扱いの問題が解決されているが、空気中の酸素の十分な供給ができなくなり、測定の迅速化が達成できなくなる。
【０００３】
そこで、迅速な測定が可能で、かつ製造時の取り扱いの問題が解決された血液中のグルコース濃度測定用の乾式分析要素の開発が求められている。
【０００４】
【特許文献１】特許第２５４５２５０号
【特許文献２】特開平９−１２１８９４号
【特許文献３】特開平１１−１８３４７４号
【特許文献４】特開２０００−１４６９６０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、血液中のグルコースなどの測定対象成分の濃度測定を迅速に行え、かつ製造時の取り扱いの問題を解決した乾式分析要素およびその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記問題点を解決するべく鋭意検討の結果、光透過性・水不透過性支持体に接着剤を介して、反応試薬を含有した非繊維質多孔性担体を多孔性接着することによって、酸化反応に必要な酸素の大気中からの供給を十分に保ちながら、かつ製造時の取り扱いの問題が格段に改善されることを見出して本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明によれば、液体試料中の測定対象成分を測定又は検出するための乾式分析要素において、測定対象成分を測定又は検出するための試薬を含む非繊維質多孔性担体からなる試薬層が、微貫通空隙構造の接着剤層を介して、光透過性・水不透過性支持体に接着して一体化されていることを特徴とする乾式分析要素が提供される。
【０００８】
好ましくは、測定対象成分はグルコースである。
好ましくは、測定対象成分を測定又は検出するための試薬は、グルコースと反応して呈色する試薬である。
好ましくは、測定対象成分を測定又は検出するための試薬は、グルコースオキシターゼ、ペルオキシターゼ、及びロイコ色素である。
好ましくは、光透過性・水不透過性支持体の表面に、ホットメルト型接着剤を、グラビア印刷法によりグラビアローラーからの転写により、点状に付着させることによって、微貫通空隙構造の接着剤層が設けられている。
【０００９】
本発明の別の側面によれば、光透過性・水不透過性支持体の表面に微貫通空隙構造の接着剤層を設ける工程、及び接着剤層が設けられた光透過性・水不透過性支持体の表面に、非繊維質多孔性担体からなる試薬層を設ける工程、を含む、上記した本発明の乾式分析要素の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明においては、光透過性・水不透過性支持体に接着剤を介して、反応試薬を含有した非繊維質多孔性担体を多孔性接着することによって、酸化発色反応に必要な大気中の酸素供給を十分に行うことで迅速測定が可能になり、また製造時の取り扱いの問題が格段に改善される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の乾式分析要素は、液体試料中の測定対象成分を測定又は検出するための乾式分析要素であって、測定対象成分を測定又は検出するための試薬を含む非繊維質多孔性担体からなる試薬層が、微貫通空隙構造（または微貫通孔構造）の接着剤層を介して、光透過性・水不透過性支持体に実質的に密着して接着して一体化されていることを特徴とする乾式分析要素である。ここで、試薬層の、微貫通空隙構造（または微貫通孔構造）の接着剤層を介した光透過性・水不透過性支持体への接着は、多孔性接着又は微多孔性接着とも称する。
【００１２】
上記の通り、本発明の乾式分析要素は、非繊維質多孔性担体からなる試薬層と、微貫通空隙構造の接着剤層と、光透過性・水不透過性支持体とから構成されるものである。
【００１３】
本発明の乾式分析要素の構成を図1に示す。本発明の乾式分析要素は、図１に示すように、液体中の成分を検出するための試薬成分が担持する非繊維質多孔性担体１と光透過性・水不透過性支持体３は、微貫通空隙構造の接着剤層２により接着して一体化されている。
【００１４】
本発明では、非繊維質多孔性担体として小さい孔径の開孔部を備えた平面（以下密面と呼称する）と大きい孔径の開孔部を備えた平面（以下粗面と呼称する）とを有する高度に非対称性の形状を備え、かつ両開孔部は連通しているものが利用される。このような非繊維質多孔性担体は、具体的には、例えば、ニトロセルロース、ポリビニルジフロライド、セルロースアセテート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリアミド、ポリイミド、ポリカーボネート等が挙げられる。特に富士写真フイルム（株）社から販売されているＳＥシリーズフィルターは、密面における平均開孔径が０．５３〜３．０μｍ、粗面における平均開孔径が１．０〜５．０μｍと非対称性を有するポリスルホン製多孔性担体であり、本発明による乾式分析要素の好適な素材となる。
【００１５】
また、上記非繊維質多孔性担体は、親水性を有する材質から構成される、または親水化剤を担持させる、もしくは親水化処理を行うことが、検体の供給、展開に要する時間を短縮することができるという理由から好ましい。上記親水化剤としては、例えば、トライトンＸ−１００（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ社製）等の界面活性剤、水溶性シリコン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。また親水化処理としては、例えば、プラズマ処理、グロー放電、コロナ放電、紫外線照射等の処理方法が好適に例示される。
【００１６】
光透過性・水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル（例、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネート等）等のポリマーからなる厚さ約５０μｍから約１ｍｍ、好ましくは約８０μｍから約３００μｍの範囲のフイルムもしくはシート状の透明支持体を挙げることができる。
【００１７】
本発明における微貫通空隙構造の接着剤層としては、例えば印刷における網点と同じように円、方形、星形、不定型等のドット状の接着剤が整然と配列されたもの、平行状細線(波型または直線)形、交叉細線（波型または直線）形に配列されたもの（この場合、微貫通孔構造接着剤層になる）、スクリーンレスドット（砂目状パターン）のように微視的にはドットの形、大きさ、配列はランダムであるが巨視的には均一性が感じられるように配列されたもの等の部分的配列のいずれかになるように配置された接着剤層が用いられる。単位面積当りの接着剤のドットや線が占める総面積の比率、すなわち接着剤面積率は、印刷における網点面積率（日本印刷学会編「印刷工学便覧」１９８３年発行，２６２〜２６３頁）と同様の定義により、約８０％以下、好ましくは約５０％以下、最も好ましくは約５％から約２０％の範囲である。接着剤のドット径または線の太さは、約５０μｍから約３ｍｍの範囲で接着される対向２表面の間に毛細間隙ができない範囲で実験により決めることができる。
【００１８】
接着剤としては液状接着剤、非ニュートン粘性の液体接着剤、ホットメルト型(熱融解型)接着剤等を用いることができる。液状接着剤としては粘度約１０００ｃｐｓ以上で延糸性の少ない接着剤が多孔性シートの表面に局在し、多孔性シートの内部方向への侵入の少ない点で好ましい。その具体例としてポリビニルアルコール水溶液、デキストリン水溶液、カルボキシメチルセルロース水溶液がある。非ニュートン粘性の液体接着剤としては固体微粒子等を適宜混合して非ニュートン粘性を付与された液体接着剤が好ましい。その具体例として澱粉糊、メチルセルロース添加澱粉糊、酢酸ビニル−ブチルアクリレートコポリマー水性エマルジョンがある。ホットメルト型接着剤としては温度約５５℃以下で固体状の接着剤が好ましい。その具体例としてエチレン−酢酸ビニルコポリマー、エチレン−イソブチルアクリレートコポリマー、スチレン−ブタジエンブロックコポリマーがある。ホットメルト型接着剤は糸状、細毛糸状、顆粒状、微粒子状、粉状等のものを適宜選択して用いることができる。
【００１９】
接着剤の部分的存在パターンを形成する好ましい方法として印刷方式による方法がある。印刷方式として、凹版またはグラビア版により直接表面に接着剤パターンを形成する方法、オフセット印刷方式で一度ゴムローラー、離型紙等の上に接着剤パターンを移し取り、さらにこの接着剤パターンを接着する表面に移す方法、ポリエチレンテレフタレート紗スクリーンまたはメタルスクリーンを通してスクリーン印刷方式により直接またはオフセット方式で接着する表面に接着剤パターンを形成する方法等がある。ホットメルト型接着剤を用いる場合にはこれらの方法は接着剤の融解温度より高い温度で実施することができる。
【００２０】
接着剤の部分的存在パターンを形成する他の方法として、仮支持体の表面に固体微粒子等を適宜混合して非ニュートン粘性を付与された液体接着剤の薄層を塗布形成し、その上に例えばメンブランフィルタまたは抄造紙を一様に重ねた後すぐにこれを剥離することによりメンブランフィルタまたは抄造紙の表面に印刷におけるスクリーンレスドット状の接着剤パターンを形成する方法がある。
【００２１】
このようにして支持体表面に接着剤の部分的存在パターンが形成された支持体を非繊維質多孔性担体（表面に接着剤パターンが形成されていない）に重ねあわせ（ホットメルト型接着剤を用いる場合には接着剤の融解温度より高い温度で）実質的に一様な軽い圧力を加えることにより非繊維質多孔性担体と支持体は相互に微貫通空隙構造（または微貫通孔構造）の接着剤層により実質的に密着して接着され一体化する。
【００２２】
このようにできた支持体のある非繊維質多孔性担体に、液体中の特定成分を検出するための発色試薬を塗布し、乾燥させて、多孔性乾式分析要素を形成する。この乾式分析要素は非繊維質多孔性担体が微貫通空隙構造の接着剤層により支持体と接着されているので、酸化発色反応に必要な大気中の酸素がこの微貫通空隙構造によってできた空間から十分に供給されるという特徴を有する。さらに、強度が弱い非繊維質多孔性担体が支持体と一体化されるため、塗布、加工など製造時の取り扱いの問題が大幅に改善されるというメリットもある。
【００２３】
本発明における試薬成分としては、従来種々のタイプの試験片に応用された試薬系と同じものを利用し得る。具体的には、例えば、血糖値測定用の場合、グルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）と、ペルオキシターゼ（ＰＯＤ）と、ロイコ色素或いは、４−アミノアンチピリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンのような発色剤（発色試薬）とが挙げられる。
【００２４】
また、本発明の乾式分析要素は液体中のグルコース測定に限定されるものではなく、液体中のその他の成分の測定にも利用できる。例えば、前記グルコース測定試薬の中に含まれるグルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）に代わり、コレステロールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼからなる群より選ばれる酸化酵素を用いることで、液体中のコレステロール、乳酸、アルコール、を測定することもできる。
【００２５】
グルコースオキシダーゼとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ等由来のものを用いることが好ましい。
【００２６】
コレステロールオキシダーゼとしては、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｒｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、スエヒロタケ等から得られたものを用いることが好ましい。
【００２７】
乳酸オキシダーゼとしては、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ等から得られたものを用いることが好ましい。
【００２８】
アルコールオキシダーゼとしては、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ、H.ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及びＫｌｏｅｃｋｅｒａ  ｓｐ．等から得られたものを用いることが好ましい。
【００２９】
ペルオキシダーゼとしては、植物起源あるいは動物起源のペルオキシダーゼ、微生物起源のペルオキシダーゼを用いることができる。植物起源あるいは微生物起源の非特異的ペルオキシダーゼを用いることが好ましい。西洋わさびもしくは大根から抽出したペルオキシダーゼ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属もしくはＣｕｒｖｕｌａｒｉａ属の微生物から抽出したペルオキシダーを用いることがさらに好ましい。
【００３０】
イミダゾールロイコ色素は、過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼ等の酸化作用を有する物質が触媒として働くことにより呈色する発色体である。ロイコ色素としては、例えば、特開昭５９−１９３３５２号公報の明細書に記載のロイコ色素を使用することができる。該公報に記載のロイコ色素は、６００以上、好ましくは６００〜７００ｎｍの波長の範囲に吸収ピークを有し、青色に発色する。その中でも２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−フェネチルイミダゾール、もしくは２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−ベンジルイミダゾールを用いることが好ましい。
【００３１】
本発明の乾式分析要素に適用される液体試料の種類は特に限定されず、任意の液体試料（例えば、全血、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、髄液、膣液などの体液；あるいは飲料水、酒類、河川水、工場廃水等）中の測定対象成分を分析することができる。
【００３２】
本発明の乾式分析要素は一辺約10mmから約30mmの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭５７−２８３３１（対応米国特許４，１６９，７５１）、実開昭５６−１４２４５４（対応米国特許４，３８７，９９０）、特開昭５７−６３４５２、実開昭５８−３２３５０、特表昭５８−５０１１４４（対応国際公開ＷＯ８３／００３９１）等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドとして用いることが、製造，包装，輸送，保存，測定操作等の観点で好ましい。使用目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収めて用いたり、又は小片を開口のあるカードに貼付または収めて用いたり、あるいは裁断した小片をそのまま用いることなどもできる。こうして、１枚または２枚以上の小片を収めた容器は、項目名やロット番号、キャリブレーションなどの情報を有することができる。これらの情報は、例えば、ＩＣ、磁気やバーコードなどを用いることができ、ハードウェア上で簡便に読み取り、自動化に有用である。
【００３３】
本発明の乾式分析要素は、例えば約０．５μＬ〜約３０μＬ、好ましくは１μＬ〜１０μＬの範囲の液体試料を、試薬層に点着する。点着した乾式分析要素を約２０℃〜約４５℃の範囲の一定温度で、好ましくは約３０℃〜約４０℃の範囲内の一定温度で１〜１０分間インキュベーションする。乾式分析要素内の発色又は変色を支持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により液体試料中の測定対象成分の量を求めることができる。
【００３４】
測定操作は特開昭６０−１２５５４３号公報、特開昭６０−２２０８６２号公報、特開昭６１−２９４３６７号公報、特開昭５８−１６１８６７号公報（対応米国特許４，４２４，１９１）などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精度によっては目視により発色の度合いを判定して、半定量的な測定を行ってもよい。
【００３５】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
実施例１：グルコース定量用乾式分析要素１の作製
（１）非繊維質多孔性担体と支持体の接着
厚さ１８０μｍで平滑な表面の無色透明ＰＥＴシート（支持体）を温度８０℃に予熱した表面に、温度１３０℃に加熱して溶融させたスチレン−ブタジエンブロックコポリマー系ホットメルト型接着剤を、グラビア印刷法を利用してグラビアローラーからの転写により、点状に付着させた。グラビアローラーは、円型のドットの直径０．３ｍｍ、ドット中心間距離０．６ｍｍ、ドット面積率約２０％のものを用いた。付着した固形成分の量は約３ｇ／ｍ2であった。接着剤が転写された直後の高温の支持体の表面に、粗面平均孔径１．０μｍ、密面平均孔径０．５μｍ、厚さ１３０μｍ、空隙体積約８０％のポリスルホンメンブランフィルター（富士写真フイルム(株)製ミクロフィルターＳＥ−１０）の密面と向かい合わせてラミネートローラーの間を通し、両者をラミネート（接着一体化）した。
【００３７】
（２）グルコース定量用乾式分析要素１の作製
こうして完成した支持体と多孔性接着したポリスルホンメンブランフィルター（ＳＥ−１０）に下記の表１に記載の発色試薬組成物溶液を１ｍ2当たりの１１０．３ｍＬの割合で塗布し、乾燥させて、１２×１３ｍｍの長方形チップに裁断し、特開昭５７−６３４５２号公報に記載のスライド枠に収めてグルコース定量用乾式分析要素１を作製した。
【００３８】
【表１】
2008148657.tif 000002
【００３９】
比較例１：グルコース定量用乾式分析要素２の作製
比較のために、支持体を接着していない、非繊維質多孔性担体（富士写真フイルム(株)製ミクロフィルターＳＥ−１０）を実施例１と同様な発色試薬組成物溶液に30秒を含浸し、乾燥させて、グルコース定量用乾式分析要素２を作製した。
【００４０】
比較例２：グルコース定量用乾式分析要素３の作製
比較のために、特開２０００−１４６９６０の実施例により、全血中のグルコース量を測定することできるグルコース定量用乾式分析要素３を作製した。
【００４１】
測定例１：
実施例１及び比較例１及び２で作製したグルコース定量用乾式分析要素１〜３について、全血中のグルコース量を測定する場合の反応速度について比較検討した。
【００４２】
ヒト全血に、グルコースの生食水溶液を添加して、グルコース濃度がそれぞれ１００、３００、５００ｍｇ／ｄＬの試料を調製した。上記のグルコース定量用乾式分析要素１、２、３にそれぞれの試料３μＬを点着し、点着後の経過時間に対応する乾式分析要素内の発色濃度を６５０ｎｍにて瞬間光学反射測定装置ＭＣＰＤ３０００（大塚電子株式会社製）によって測定した。測定結果をそれぞれ図２、３、及び４に示す。
【００４３】
図２〜４より、支持体と展開層がゼラチンバインダーで完全に接着されているグルコース定量用乾式分析要素３を用いた場合は、上記全血試料を点着後、反応の終結までに約８０秒を要するが、本発明の多孔性接着された乾式分析要素であるグルコース定量用乾式分析要素１を用いた場合には、約１０秒後には反応が完結していることが分かった。さらにグルコース定量用乾式分析要素１は多孔性接着されていないグルコース定量用乾式分析要素２（非繊維質多孔性担体のみ）を用いた場合と同程度の反応性を持っていることも同時に確認された。
【００４４】
以上の結果より、本発明の多孔性接着された乾式分析要素は血液中のグルコース濃度測定を迅速に行え、かつ製造時の取り扱い性を容易にできることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、本発明の乾式分析要素の断面図を示す。１は、膜（試薬層）を示し、２は接着剤層を示し、３は透明支持体を示す。
【図２】図２は、本発明の乾式分析要素を用いた場合の各グルコース濃度におけるタイムコースを示す。
【図３】図３は、支持体無し（膜のみ）の乾式分析要素を用いた場合の各グルコース濃度におけるタイムコースを示す。
【図４】図４は、支持体を有し、無孔性の乾式分析要素を用いた場合の各グルコース濃度におけるタイムコースを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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