(57)【要約】【課題】    クッパー細胞の活性化状態を簡便な方法で判定する方法の提供する。【解決手段】サンプル中のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）濃度を測定し、得られたＯＴＣ濃度又は当該ＯＣＴ濃度と他の肝臓特異的細胞障害マーカー濃度との比を指標にクッパー細胞の活性化状態を判定する。  たとえば、サンプル中のＯＣＴ濃度が健常者サンプル中のＯＴＣ濃度より低い場合、あるいはサンプル中のＯＣＴ濃度と他の肝臓特異的細胞障害マーカーから得られた比が、健常者サンプル中の対応する比より高い場合、クッパー細胞が活性化状態にあると判定し、サンプル中のＯＣＴ濃度と他の肝臓特異的細胞障害マーカーから得られた比が、健常者サンプル中の対応する比より低い場合、クッパー細胞が不活性化状態にあると判定する。  本発明方法は、このような極めて簡便な方法でクッパー細胞の活性化状態を知ることができるため、臨床上極めて有用な方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）濃度を測定し、得られたＯＴＣ濃度又は当該ＯＣＴ濃度と他の肝臓特異的細胞障害マーカー濃度との比を指標にクッパー細胞の活性化状態を判定する方法。
【請求項２】
ＯＣＴとアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）との比を指標とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＯＣＴとグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）との比を指標とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
サンプル中のＯＣＴ濃度が健常者サンプル中のＯＴＣ濃度より低い場合、クッパー細胞が活性化状態にあると判定する請求項１記載の方法。
【請求項５】
サンプル中のＯＣＴ濃度と他の肝臓特異的細胞障害マーカーから得られた比が、健常者サンプル中の対応する比より低い場合、クッパー細胞が活性化状態にあると判定する請求項１記載の方法。
【請求項６】
サンプル中のＯＣＴ濃度と他の肝臓特異的細胞障害マーカーから得られた比が、健常者サンプル中の対応する比より高い場合、クッパー細胞が不活性化状態にあると判定する請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）の濃度を測定することによりクッパー細胞（kupffer cell）の活性化状態を判定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
クッパー細胞は肝臓に存在するマクロファージであり、肝臓障害の発症または抑制において重要な働きをすると考えられている。その機能は、病原体や古くなった細胞の貪食作用、サイトカイン産生など多岐にわたる。クッパー細胞が正常に機能するためには、活性な状態を維持することが重要であるが、過度の活性化は肝炎などの肝臓障害をはじめ、様々な疾患の原因となると考えられている。
【０００３】
また、クッパー細胞の不活性化によりその機能が低下すると、病原体排除や全身の免疫機能の調節などに影響を及ぼすと考えられる。そのため、クッパー細胞の活性化状態を知ることは、肝臓機能および免疫機能の状態を把握する上で、極めて重要であると考えられる。
【０００４】
従来、クッパー細胞の活性化状態を判定するための方法としては、たとえばクッパー細胞に集積する網内系造影剤を使用する方法がある（非特許文献１−３）。すなわち、粒子状の造影剤をクッパー細胞に取り込ませて、ＭＲＩなどの画像診断機器により検出する方法であり、肝細胞癌などの腫瘍組織内にはクッパー細胞が存在しないことから、肝臓における腫瘍の検出に利用されている。しかしながら、この方法は、造影剤の投与が必須であるため、その検出に時間と費用がかかり、かつ同時に複数の患者を検査することができない等の欠点があり、大量のサンプルを処理する方法としては不適な方法であった。
【０００５】
また、血液などのサンプルを用いてクッパー細胞の機能を判定する方法としては、たとえばクッパー細胞の産生するサイトカインなどの血中濃度を測定する方法が報告されている（非特許文献４、５）。しかしながら、クッパー細胞が産生するサイトカインは他のマクロファージなどの免疫細胞からも産生されるため、クッパー細胞に特異的なものではないという問題点が指摘されていた。
【０００６】
さらに、炎症性サイトカインなどにより肝細胞から誘導される急性期蛋白と呼ばれる蛋白質の血中濃度を測定する方法も報告されている（非特許文献６）。しかし、これら急性期蛋白の血中濃度は肝臓以外の臓器における炎症においても上昇するため、クッパー細胞の活性化状態を示す指標としては用いられてこなかった。
【０００７】
さらにまた、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）などの肝臓特異的な細胞障害マーカーの血中濃度を測定し、肝臓障害を検出する方法も知られているが、これらのマーカーは、細胞の障害により血中に逸脱し、必ずしもクッパー細胞の活性化状態を反映しているわけではないため、クッパー細胞の活性化状態を表す指標としては適切なものではなかった。
【０００８】
【非特許文献１】Diangostic and Interventional Radiology 2006;12:22-30
【非特許文献２】Radiology 2001;218:27-38
【非特許文献３】Research in Experimental Medicine (Berl) 1994;194:237-246
【非特許文献４】Journal of Immunological Methods 1991;138:47-56
【非特許文献５】Journal of Immunological Methods 1994;177:191-198
【非特許文献６】Immunology Today 1994;15:81-88
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このように、クッパー細胞の活性化状態を知ることは臨床上重要であるものの、クッパー細胞の活性化状態を簡便な方法で、かつ特異的に測定する方法は存在しなかった。したがって、本願発明は、クッパー細胞の活性化状態を簡便な方法で判定する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上述の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、（１）クッパー細胞の活性化により、肝細胞から血中へのＯＣＴの逸脱が抑制されてＯＣＴの血中濃度が低くなること、（２）クッパー細胞の不活性化により、血中からのＯＣＴの排除が阻害されてＯＣＴの血中半減期が長くなることを見出し、これを基に本発明を完成させた。したがって、本発明は以下の通りである。
【００１１】
〔１〕サンプル中のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）濃度を測定し、得られたＯＣＴ濃度又は当該ＯＣＴ濃度と他の肝臓特異的細胞障害マーカー濃度との比を指標にクッパー細胞の活性化状態を判定する方法。
〔２〕ＯＣＴとアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）との比を指標とする上記〔１〕記載の方法。
〔３〕ＯＣＴとグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）との比を指標とする上記〔１〕記載の方法。
〔４〕サンプル中のＯＣＴ濃度が健常者サンプル中のＯＴＣ濃度より低い場合、クッパー細胞が活性化状態にあると判定する上記〔１〕記載の方法。
〔５〕サンプル中のＯＣＴ濃度と他の肝臓特異的細胞障害マーカーから得られた比が、健常者サンプル中の対応する比より低い場合、クッパー細胞が活性化状態にあると判定する上記〔１〕記載の方法。
〔６〕サンプル中のＯＣＴ濃度と他の肝臓特異的細胞障害マーカーから得られた比が、健常者サンプル中の対応する比より高い場合、クッパー細胞が不活性化状態にあると判定する上記〔１〕記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法は、実施例からも明らかなように、ＯＣＴの血中濃度または当該ＯＣＴと他の肝臓特異的細胞障害マーカーとの比を求めることによりクッパー細胞の活性化状態を知ることができ、このような極めて簡便な方法でクッパー細胞の活性化状態を知ることができるため、臨床上極めて有用な方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本明細書において、「クッパー細胞」とは、肝臓に常在するマクロファージで、肝臓障害の発症または抑制において重要な働きをすると考えられている細胞のことを意味する。
【００１４】
「活性化状態」とは、クッパー細胞が他の細胞より放出されたサイトカインや腸管バクテリア由来のリポポリサッカライドなどにより刺激され、炎症性サイトカインや活性酸素を多量に放出したり、貪食作用が通常よりも亢進している状態を指す。クッパー細胞が過度に活性化され、炎症性サイトカインや活性酸素などを放出すると、類同内皮細胞や肝細胞が障害され肝障害が誘発される。
【００１５】
「不活性化状態」とは、クッパー細胞が他の細胞より放出された抑制性のサイトカインなどの影響により、その機能が通常より低下している状態を指す。クッパー細胞が不活性化しているということは、免疫機能が低下し、癌や病原体などに対する生体防衛が不十分となる恐れがある。
【００１６】
本発明方法は、サンプル中のＯＣＴ濃度を測定し、得られたＯＣＴ濃度又は当該ＯＣＴ濃度と他の肝臓特異的細胞障害マーカー濃度との比を指標にクッパー細胞の活性化状態を判定する方法に関するものである。
【００１７】
測定対象の被検サンプルとしては、血液、血清、血漿などの血液由来サンプルであれば特に限定されない。
【００１８】
サンプル中のＯＣＴの測定法としては、従来公知の方法を採用すればよく、測定法の原理も特に制限されない。たとえば、酵素法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、化学発光法、ラテックス凝集法などが一般的であるが、その他の測定法であってもよい。
【００１９】
ＯＣＴとの比を算出するために用いる肝臓特異的細胞障害マーカーとしては、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＤＨ、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、グアナーゼ（ＧＵ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼなどがあげられ、ＡＬＴ、ＡＳＴ，ＧＤＨが好ましい。
【００２０】
活性化状態の判定は、たとえば、サンプル中のＯＣＴ濃度が健常者サンプル中のＯＣＴ濃度より低い場合、あるいはサンプル中のＯＣＴ濃度と他の肝臓特異的細胞障害マーカーから得られた比が健常者サンプル中の対応する比より低い場合、クッパー細胞が活性化状態にあると判定し、サンプル中のＯＣＴ濃度と他の肝臓特異的細胞障害マーカーから得られた比が健常者サンプル中の対応する比より高い場合、クッパー細胞が不活性化状態にあると判定する。
【００２１】
クッパー細胞が活性化状態にある場合、肝臓またはそれ以外の部位において炎症が存在し、例えば劇症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎の急性増悪、エンドトキシン血症、その他の感染症、アルコール性肝障害、薬剤性肝障害、組織損傷などの可能性があり、一方、クッパー細胞が不活性化状態にある場合、肝臓又はそれ以外の部位において免疫機能が低下し、感染症などに罹りやすくなるほか、発癌、癌の進行、再発および転移が促進される恐れがある。免疫抑制状態にあると例えば癌の免疫療法が効きづらいなどの弊害を起こす可能性があり、いずれの場合に置いてもより精密診断を行う必要がある。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。なお、ＯＣＴの測定はＥＬＩＳＡ法（Clinica Chimica Acta 2006;368:125-130）にて、ＡＬＴ及びＧＤＨは酵素法（トランスアミナーゼC-IIテストワコー、和光純薬工業、European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry 1992;30:493-502）にてそれぞれ測定した。
【００２３】
実施例１：リポポリサッカライド投与による正常ラットおける血中ＯＣＴ濃度の変動
雄のウィスターラット９週齢６匹に大腸菌O128:B12株由来リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を５ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与してクッパー細胞を活性化し、ＯＣＴ、ＡＬＴのコントロール値の変動を検討した。
【００２４】
その結果、表１に示すように、投与後４８時間で投与前と比べＯＣＴの血中濃度は１／６０に低下した。また、ＡＬＴも有意に低下したが、その程度はＯＣＴより少なく、ＯＣＴ／ＡＬＴは有意に低下した。このことから、クッパー細胞が活性化した状態においては、血中ＯＣＴ濃度は顕著に低下することが明らかとなった。
【００２５】
【表１】
2008043271.tif 000002
＊：ｐ＜０．０５
【００２６】
実施例２：塩化ガドリニウム投与による慢性肝障害モデルラットの血中ＯＣＴ濃度の変動
雄のウィスターラット９週齢８匹に、チオアセトアミド（ＴＡＡ）を４ヶ月間連日投与し、その後２ヶ月間おいて、慢性肝障害モデルを作成した。次ぎに、塩化ガドリニウム（ＧＤ）を７ｍｇ／ｋｇ静脈投与し、ＯＣＴ、ＡＬＴ値の変動を検討した。
【００２７】
その結果、表２に示すように、クッパー細胞を不活性化するＧＤ投与により、ＯＣＴ値は上昇したが、ＡＬＴ値に変動はみられなかった。このことから、血中ＯＣＴ値はクッパー細胞が不活性化した状態においては相対的に高値になり、クッパー細胞をはじめとする免疫機能が低下していることを反映することが示唆された。
【００２８】
【表２】
2008043271.tif 000003
＊：ｐ＜０．０５  
【００２９】
実施例３：ＬＰＳおよびＧＤの前投与による急性肝障害時の血中ＯＣＴ上昇に及ぼす影響
雄のＳＤラット９週齢にＬＰＳ（５ｍｇ／ｋｇ，ｉｐ）またはＧＤ（７ｍｇ／ｋｇ，ｉｖ）を投与し、４８時間後（ＧＤは２４時間後）にＴＡＡ（２００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、急性肝障害モデルラットを作成した。ＴＡＡ投与２４時間後、血中のＯＣＴとＡＬＴ濃度の上昇の程度を調べた。また、肝臓を摘出し、１０％中性ホルマリンにより固定し、病理検査に供した。
【００３０】
その結果、表３に示すように、ＬＰＳ前投与によりＴＡＡ急性肝障害時におけるＯＣＴ値の上昇は有意に抑制されたが、ＡＬＴの低下は有意ではなかった。また、ＬＰＳ投与群ではＯＣＴ／ＡＬＴも有意に低かった。一方、ＧＤ前投与による影響はみられなかった。また、病理検査の結果、前投与の有無にかかわらず、ＴＡＡによる肝障害の程度は同程度であった。これらの結果から、クッパー細胞が活性化した状態においては、血中へのＯＣＴの漏出が抑制されることが示唆され、ＯＣＴと他の障害マーカーとの比などによりクッパー細胞の活性化状態を検出することができることが示された。
【００３１】
【表３】
2008043271.tif 000004
＊：ｐ＜０．０５  
【００３２】
実施例４：ＬＰＳ、ＧＤ投与によるＯＣＴ血中半減期への影響
ラット肝臓ミトコンドリアよりＯＣＴを部分精製した。精製ＯＣＴをラットに注入し、経時的に採血してＯＣＴの消失を測定し、血中半減期を求めた。あらかじめＬＰＳ、ＧＣ投与によりクッパー細胞の活性化状態を調整後、同様にインジェクション実験を行い血中半減期への影響を検討した。ＡＬＴ、ＧＤＨについても同様に検討した。
【００３３】
その結果、表４に示すように、ＯＣＴの血中半減期は約１時間であった。ＧＤ投与により血中半減期は約２時間となり、有意に延長された。ＬＰＳ投与による影響はみられなかった。ＡＬＴ、ＧＤＨの血中半減期はそれぞれ１０時間、８時間であった。これらの酵素の血中半減期はＧＤ、ＬＰＳ投与により影響を受けなかった。これらのことから、ＯＣＴの血中半減期はクッパー細胞の活性化状態を反映して変動することが明らかとなり、ＯＣＴと他の障害マーカーとの比などによりクッパー細胞をはじめとする免疫機能の状態を検出できる可能性が示唆された。
【００３４】
【表４】
2008043271.tif 000005
＊：ｐ＜０．０５