(57)【要約】【課題】新規カチオン脂質複合体の提供。【解決手段】誘導体化された第四アンモニウムヘッドグループを有し、より高い細胞標的能力およびマイナスに帯電するマクロ分子に対するより強いトランスフェクション効率を提供する、カチオン脂質。本脂質は、さらに医薬品、細胞レセプターリガンドまたは他の生物活性を有する薬剤を連結するための部位を提供する官能基を有するリンカーを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式で示される化合物：
【化１】
2008247906.tif 000042
［式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ，０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アシル、アルキレンまたは、ヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基で、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、また、前記置換基は、−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2より選択される（但し、前記置換基のアルキル基は、０〜２のヘテロ原子を含み、Ｋは０〜４である）。
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アルキレンまたはヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であり、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、また、前記置換基は、−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2から選択され（但し、前記置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４であり）、
Ｒ５は、ＨまたはＮＨ−Ｒ６−Ｒ７であり、ここで、Ｒ６、またはＲ７とともにＲ６は、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４について定義されるグループから選択され、また、任意でさらに化学的に結合したアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、または、他の生物活性を有する薬剤もしくは医薬用の薬剤を含み、
ｎは１〜６であり、
ｍは１〜１０であり、および
Ｙは薬学的に許容されるアニオンである。
（ここで、ｎが１であり、ｍが２〜６であり、かつＲ１およびＲ２が別々にまたは共にＣ1−Ｃ23アルキルまたはＣ（Ｏ）−Ｃ1−Ｃ23であり、さらにＲ３およびＲ４が別々にまたは共にＨまたは直鎖アルキルＣ1−Ｃ6であり、およびＲ５がＮＨ−Ｒ６−Ｒ７である場合、
Ｒ６−Ｒ７は、（ＣＨ2）zＮＨ２（但し、ｚは２〜６である）、または−（ＣＨ2）3−ＮＨ−（ＣＨ2）4−ＮＨ2、または−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−（ＣＨ2）4−ＮＨ（ＣＨ2）3−ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）−フルオレセイン、または下記構造で示される基ではない：
【化２】
2008247906.tif 000043
または
【化３】
2008247906.tif 000044
または
【化４】
2008247906.tif 000045
（式中においてｐは２〜５であり、ＺはＨまたはアミドまたはアルキルアミノ基により結合される他の基である。）］。
【請求項２】
ジアルキル−ローゼンタールインヒビターエーテルまたはジアルケニル−ローゼンタールインヒビターエーテルに化学的に結合し、非極性、極性で非荷電、および生理学的ｐＨにおいてマイナスに帯電する基からなるグループから選択されるアミノ酸またはペプチドからなるグループより選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
生物活性部分と両機能性リンカーを介して共有結合するジアルキル−ローゼンタールインヒビターエーテルおよびジアルケニル−ローゼンタールインヒビターエーテルからなるグループから選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ５がグリシンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
下記構造を有する化合物：
【化５】
2008247906.tif 000046
［式中において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ，０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アシル、アルキレンまたは、ヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基あり、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、また、前記置換基は、−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ−（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2より選択される（但し、前記置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４である）、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アルキレンまたはヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であり、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、また、前記置換基は、−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2から選択され（但し、前記置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４である）、
Ｒ５は、Ｒ１〜Ｒ４について定義されるグループより選択され、
ここで、Ｒ６は、Ｒ３およびＲ４について定義されるグループから選択され、また、任意でさらに化学的に結合したアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、または、他の生物活性を有する薬剤もしくは医薬用の薬剤を含み、
Ｚは、ＮＨまたはＳであり、
ｎは１〜６であり、および
Ｙは薬学的に許容されるアニオンである。
（ここで、ＺがＮＨであり、Ｒ５が（ＣＨ２）mであり、かつｍが２〜６であり、また、ｎが１であり、さらにＲ１およびＲ２が別々にまたは共にＣ1−Ｃ23アルキルまたはＣ（Ｏ）−Ｃ1−Ｃ23であり、かつＲ３およびＲ４が別々にまたは共にＨまたは側鎖のないアルキルＣ1−Ｃ6である場合、
Ｒ６は、（ＣＨ2）ｚＮＨ２（但し、ｚは２〜６である）、または−（ＣＨ2）3−ＮＨ−（ＣＨ2）4−ＮＨ2、または−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−（ＣＨ2）4−ＮＨ（ＣＨ2）3−ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）−フルオレセイン、または下記構造で示される基ではない：
【化６】
2008247906.tif 000047
または
【化７】
2008247906.tif 000048
または
【化８】
2008247906.tif 000049
（式中においてｐは２〜５であり、ＺはＨまたはアミドまたはアルキルアミノ基により結合される他の基である。））］。
【請求項６】
Ｒ５がヘテロエチレン基であり、Ｚが０であって、かつＲ７とともにＲ６がヘテロエチレン基に化学的に結合したアミノ酸またはペプチドである請求の範囲第５項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その中で、生物のシステムにより認識される生物活性を有する薬剤がローゼンタールインヒビターの核構造とアルキル連結グループを介して連結される、両親和性脂質複合体を含むチトフェクチンに関する。カルボキシ−、カルバミル−、ウレイル−、チオウレイル−、およびグアニジル−チトフェクチンを含む、いくつかのアルキル連結グループが開示されている。
本発明の第二の態様は、第四窒素の８炭素以内に第一アミンを有するチトフェクチンに関する。
【０００２】
本発明の第三の態様は、生物学的に活性な部分が、非極性、極性で非荷電、および生理学的ｐＨにおいてマイナスに荷電する部分から選択されるアミノ酸またはペプチドである、チトフェクチンに関する。
本発明の第四の態様は、生物学的に活性な部分が、天然の生物中では一般に見出されない代替アミノ酸を含有するチトフェクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
カチオン脂質とは、一般に一つまたは複数の炭化水素またはアルキルグループを含む脂質親和性領域と、少なくとも一つのプラスに帯電した極性ヘッドグループを含む親水性領域を有する両親和性分子である。カチオン脂質は、総荷電としてプラスに帯電する複合体を形成することにより、巨大分子が細胞の原形質膜を通過して細胞質に入りやすくする上で有用である。インビトロおよびインビボにおいて行うことのできるこのプロセスは、トランスフェクションとして知られ、このような技法において使用されるカチオン脂質は、チトフェクチンとして知られている。
【０００４】
裸のＤＮＡの場合と比べて３倍しかトランスフェクション効率を増大しないチトフェクチンでも有用であるが、好ましくはトランスフェクション効率は５−１０倍、さらに好ましくはトランスフェクション効率は、１０倍を越えて増大される。
【０００５】
典型的には、チトフェクチンは、ホスホリピッドなどの中性の両性イオン脂質と組み合わされる。二種類の両親和性の脂質は、組み合わされて、チトフェクチン単独でのトランスフェクションよりも有効な整列した脂質二重相を含む小胞を形成できることが分かっているからである。これらの小胞、またはリポソームは、表面に多数のプラス荷電を有し、この荷電荷より、これらがポリヌクレオチドまたはマイナスに帯電したたんぱく質などの他のアニオン分子と複合体を形成できる。ポリヌクレオチド／チトフェクチン／中性脂質複合体の表面上の残りの総力チオン荷電により、細胞膜表面の主にマイナスの電荷と強い相互反応を起こすことが可能である。
【０００６】
両親和性の特徴と極性ヘッドグループの基本的な特性はさておき、チトフェクチンは、親脂質性および親水性領域において、かなりの構造的な多様性がある。多くの異なる種類のチトフェクチンが、トランスフェクションに使用するために合成されており、現在市販されている。このようなチトフェクチンには、例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ  ＡＣＥTM、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥTM、ＴｒａｎｓｆｅａｃｔａｍTMおよびＤＯＴＡＰTMがある。有効なチトフェクチンの構造上の多様性は、チトフェクチンの構造−機能−認識的側面が、細胞におけるそれぞれの用途に関して異なるという観察を、一部において、反映するものである。
【０００７】
ＤＯＴＭＡ化合物に構造の類似するチトフェクチンでの経験から、トランスフェクション活性は、一部、トランスフェクトされる細胞のタイプに依存することが示される（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．８４：７４１３−７４１７，１９８７；Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（刊行物））。特にアンモニウム基にスペルミン弛緩を有するカチオン脂質が、ある細胞株のトランスフェクションにおいて、ＤＯＴＭＡよりも有効であることが判明した。この現象は、有効なトランスフェクションは、原形質膜の構造脂質二重膜とカチオン脂質複合体との受動的融合のみではなく、特定の細胞の特性および細胞成分と個々のカチオン脂質種の相互作用によることを示唆するものである。
【０００８】
チトフェクチン種間の構造上の変種は、したがって、チトフェクチンと細胞の多重かつ複雑な相互作用のより高度な理解、およびこれらの相互作用の一つまたは複数を利用とする一部の研究者の努力を表すものである。
【０００９】
Ｅｐｓｔｅｉｎの米国特許第５，０４９，３８６号中で開示される、ＤＯＴＭＡ，Ｎ−〔１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムは、当初に開発されたカチオン脂質のひとつで、このグループの脂質は新たな構造上変種の開発においてチトフェクチン力価を比較評価する参照化合物となった。ＤＯＴＭＡ脂質は、分子にカチオン部位を与える、第四窒素を有するプロパナミニウム基、および分子のプロピルバックボーンにエーテル結合する一対のＣ18炭化水素により特徴付けられる。第四窒素は、メチル基などの比較的短鎖のアルキル鎖で三置換されている。構造上類似のカチオン脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、エーテル結合したアルキル基ではなく、アシルを含み、標的細胞によってより容易に代謝されると考えられている。
【００１０】
ある種類のカチオン脂質、例えば、アルキルまたはアシル基で直接置換されたアンモニウム塩は、主に経済上の目的のために開発された（Ｒｏｓｅに対する米国特許第５，２７９，８３３号）。より毒性作用の低いものを提供する目的で開発されたものもある。例えば、ホスファチジルコリンとスフィンゴミエリンから作成された生体適合性の高いチトフェクチン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．Ａｌａｇｂａｓｔｅｒ，  ＡＬ，Ｃａｔ．Ｎｏｓ．８９０７００−７０６）である。
Ｆｅｌｇｎｅｒ他の米国特許第５，２６４，６１８号、およびＷＯ９１／１７４２４は、ホスホリパーゼＡのローゼンタールインヒビター（ＲＩ）（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３５：２２０２−２２０６，１９６０）およびこのジアシル−またはアルキル／アシル−種に構造的に類似するチトフェクチンを開示している。ＲＩを基にする一連の化合物は、パターン：ＤＯＲＩＥ（Ｃ18）；ＤＰＲＩＥ（Ｃ16）；およびＤＭＲＩＥ（Ｃ14）を有する頭文字により知られている。これらの頭文字は、共通の基本的な化学構造を示唆し、例えば、ＤＭＲＩＥは、１−プロパナミニウム、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−、ブロミド、（±）・（ＣＡＳレジストリー：１４６６５９）であり、その他は置換アルキル基が異なる。第四アンモニウム基上に極性ヒドロキシエチル置換基を有するこれらのチトフェクチンは、多くの場合ＤＯＴＭＡタイプの化合物よりもより有効なトランスフェクションを与える。ヒドロキシアルキル部分の様々な置換基および、アルキル鎖長の変化の、ＲＩチトフェクチンのトランスフェクション有効性への影響についての研究が、Ｆｅｌｇｎｅｒ他によって提示された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０−２５６１，１９９４）。ここでも、研究により、最適なヒドロキシルアルキル鎖長は、細胞のタイプによって異なることが示された。
【００１１】
ＤＭＲＩＥからβＡＥ−ＤＭＲＩＥへの変換が（Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（刊行物））、チトフェクチン活性に重要な作用を与えることが示された。第一アルコールに隣接する第四窒素を有し、これによりｐＨに依存しないプラス荷電を与えられているＤＭＲＩＥは、現在知られている最も活性なチトフェクチンのひとつである。
【００１２】
しかしながら、ＤＭＲＩＥ上のアルコールを第一アミン基に置換してβＡＥ−ＤＭＲＩＥを得ると、ＤＭＲＩＥのものと構造的に明らかに異なるＤＮＡ複合体が形成されることが判明しており、βＡＥ−ＤＭＲＩＥはヘルパー補助脂質がなくとも有効に多くの細胞株にトランスフェクトすることができる。チトフェクチン骨格の一か所の置換により、トランスフェクションの性質を著しく変化させることができるというこの観察は、他の修飾でも遺伝子の送達において同様の改良を行える可能性を示唆するものである。
トランスフェクション事象の継続的な研究は、カチオン脂質が、機能性分子の細胞の細胞質内への進入を助けるだけでなく、例えば機能性分子のリソゾームによる分解を防止する、核コンパートメントへの進入を助ける、または細胞質酵素によるＲＮＡ転写産物の分解の防止など、さらなる有用な能力を提供する可能性を示している。これらのカチオン分子の機能は、特異的な構造特性に関連するものと考えられている。このように、特定のタイプの細胞内への外来分子のトランスフェクションに特に適当なチトフェクチンが必要とされている。また、特定の細胞内機能を行うことのできるチトフェクチンの開発も必要とされている。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
本発明は、代謝系により認識される生物活性を有する薬剤とローゼンタールインヒビターの核構造を有するチトフェクチンとをカップリングさせるいくつかのリンケージグループに関する。
本発明の第二の態様は、第四窒素の８炭素以内に第一アミンを有するチトフェクチンに関する。
【００１４】
本発明の第三の態様は、非極性、極性かつ非荷電、および生理学的ｐＨにおいてマイナスに荷電する部分から選択されるアミノ酸またはペプチドと結合したチトフェクチンに関する。極性で非荷電のアミノ酸の例は、セリンおよびスレオニンなどのような極性部分を有する側鎖を有するアミノ酸である。非極性アミノ酸の例は、直鎖のアルキルまたは環状アルキルまたはへテロアルキル側鎖を有する、グリシン、バリン、フェニルアラニン、およびロイシンである。マイナスに荷電したアミノ酸の例は、マイナスに荷電した酸性の側鎖を有するグルタミン酸またはアスパラギン酸などのアミノ酸である。
本発明の第四の態様は、天然の生物内には一般に見出されない代替アミノ酸を含有するアミノ酸またはペプチドと結合したチトフェクチンに関する。このようなアミノ酸には、これに限定されるものではないが、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ§１．８２２に掲載される修飾された通常にはないアミノ酸が含まれる。さらにこのようなアミノ酸は、天然には見出されない合成アミノ酸であってもよい。
本発明のある実施態様は、
【００１５】
第四窒素基を含むローゼンタールインヒビター核構造；
カルボキシ、カルバミル、ウレイル、チオウレイル、またはグアニジル基を含む、第四窒素に結合するアルキルリンカー；および
リンカーに結合した代謝系により認識される生物活性を有する薬剤；
を含むカチオン両親和性脂質である。
【００１６】
本発明の他の実施態様は、下記式の化合物である。
【化１】
2008247906.tif 000002
［式中において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ，０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アシル、アルキレン、ヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であり、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、前記置換基は−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2であり（但し、置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４である）、
【００１７】
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アルキレンまたはヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であり、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、前記置換基は−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2であり（但し、置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４である）、
【００１８】
Ｒ５は、下記構造を有し：
【化２】
2008247906.tif 000003
（式中、ＺはＯ，Ｓ，Ｎ，Ｓｅ，Ｃからなるグループより選択され、Ｒ６は不在であるか、またはＲ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４について定義されるグループから選択される）、
Ｙは薬学的に許容されるアニオンであり、
ｎは１〜６であり、
ｍは２〜１０である。］
【００１９】
また好ましくは、上記の構造中、ＺはＮであり、かつＲ５は下記構造を有し：
【化３】
2008247906.tif 000004
（式中、Ｒ７およびＲ８はそれぞれ独立して、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３、およびＲ４について定義されるグループから選択され、また任意でさらに化学的に結合したアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、または、他の生物活性を有するもしくは医薬用の薬剤を含む）、
ｎは１〜６であり、
ｍは１〜１０であり、および
【００２０】
Ｙは、薬学的に許容されるアニオンである。
さらに有効には、ＺはＣであり、かつＲ５は下記構造を有し：
【化４】
2008247906.tif 000005
（式中、Ｒ７，Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立してＲ１，Ｒ２，Ｒ３、およびＲ４について定義されるグループから選択され、また任意でさらに化学的に結合したアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、または、他の生物活性を有するもしくは医薬用の薬剤を含む）、
ｎは１〜６であり、
ｍは２〜１０であり、および
Ｙは、薬学的に許容されるアニオンである。
【００２１】
この好ましい実施態様の別の態様によれば、Ｒ１およびＲ２は、Ｃ8からＣ20アルキルまたはアルケニル基、ＺはＯ、並びにＲ６は化学的に結合したアミノ酸またはペプチドである。
本発明はまた、下記式の化合物を提供する。
【化５】
2008247906.tif 000006
［式中において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ，０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アシル、アルキレンまたはヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であり、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、さらに、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＨであってもよく、また、前記置換基は、−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2より選択され（但し、前記置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４である）、
【００２２】
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アルキレンまたはヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であり、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、さらに、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＨであってもよく、また、前記置換基は、−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2から選択され（但し、前記置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４である）、
【００２３】
Ｒ５は、Ｎ−Ｃ（Ｏ）−またはＲ５は下記構造を有し：
【化６】
2008247906.tif 000007
（式中、Ｒ６、またはＲ７とともにＲ６は、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４について定義されるグループから選択され、また任意でさらに化学的に結合したアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、または、他の生物活性を有するもしくは医薬用の薬剤を含み、
【００２４】
Ｒ８は不在か、またはＨもしくはＲ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４からなるグループより選択されるアルキル基であり、また、Ｒ８は環を形成するようにＲ６またはＲ７と結合していてもよく、
Ｗは、Ｏ，Ｎ，ＮＨ，Ｓ，Ｓｅ，Ｃ，ＣＨ、またはＣＲ1Ｒ2である（但し、Ｒ1およびＲ2は上記に定義されるとおりである））、
ｎは、１〜６であり、
ｍは、２〜１０であり、および
Ｙは薬学的に許容されるアニオンである。］
【００２５】
本発明の別の実施態様は、下記式の化合物である。
【化７】
2008247906.tif 000008
［式中において、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ，０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アシル、アルキレンまたはヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であり、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、また、前記置換基は、−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2から選択され（但し、置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４である）、
【００２６】
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、またはヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であり、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、また前記置換基は、−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2から選択され（但し、前記置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４である）、
【００２７】
また式中、Ｒ５は下記構造を有し：
【化８】
2008247906.tif 000009
（式中、Ｒ６、または、Ｒ７とともにＲ６は、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４について定義されるグループから選択され、また任意でさらに化学的に結合したアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、または、他の生物活性を有するもしくは医薬用の薬剤を含み、
Ｗは、Ｏ，Ｎ，ＮＨ，Ｓ，Ｓｅ，Ｃ，ＣＨ、またはＣＲ1Ｒ2である）、
ｎは１〜６であり、
ｍは２〜１０であり、および
Ｙは薬学的に許容されるアニオンである。］
【００２８】
本発明のさらに別の実施態様は、下記式を有する化合物である。
【化９】
2008247906.tif 000010
［式中において、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ，０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アシル、アルキレンまたはヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であり、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、また、前記置換基は、−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2より選択され（但し、前記置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４である）、
【００２９】
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキルまたはヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であり、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、また、前記置換基は、−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2から選択され（但し、前記置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４である）、
【００３０】
また、式中Ｒ５は、下記構造を有し：
【化１０】
2008247906.tif 000011
（式中、Ｒ６または、Ｒ７とともにＲ６は、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４について定義されるグループから選択され、また、任意でさらに化学的に結合したアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、または、他の生物活性を有するもしくは医薬用の薬剤を含み、
Ｗは、Ｏ，Ｎ，ＮＨ，Ｓ，Ｓｅ，Ｃ，ＣＨ、またはＣＲ1Ｒ2である）、
ｎは、１〜６であり、
ｍは、２〜１０であり、および
Ｙは薬学的に許容されるアニオンである。］
【００３１】
本発明はまた、下記式の化合物を提供する。
【化１１】
2008247906.tif 000012
［式中において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ，０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アシル、アルキレンまたはヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であり、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、また、前記置換基は、−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2から選択され（但し、前記置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４である）、
【００３２】
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキルまたはヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であり、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、また、前記置換基は、−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2から選択され（但し、前記置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４である）、
【００３３】
式中、Ｒ５は不在であるか、または−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７または、−ＮＨ−Ｒ６−Ｒ７であり（但し、式中、Ｒ６、またはＲ７をともなうＲ６は、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４について定義されるグループより選択され、また任意でさらに化学的に結合したアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、または、他の生物活性を有するもしくは医薬用の薬剤を含む）、
ｎは、１〜６であり、
ｍは、２〜１０であり、および
Ｙは薬学的に許容されるアニオンである。］
【００３４】
好ましくは、この化合物は、ジアルキル−ローゼンタールインヒビターエステルおよびジアルケニル−ローゼンタールインヒビターエステルと化学的に結合したアミノ酸またはペプチドからなるグループより選択され、最も好ましくは、化合物は両機能性リンカーを介して生物活性を有する部分と共有結合しているジアルキル−およびジアルケニル−ローゼンタールインヒビターエステルからなるグループから選択される。有効には、Ｒ５は−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７−であり、かつＲ６はアミノ酸またはポリペプチドである。別の好ましい実施態様において、Ｒ５はグリシンである。
【００３５】
本発明は、Ｒ１がＨ、またはＣ１−Ｃ２４アルキルまたはアルケニルであって、Ｒ２がＣ１からＣ２４アルキルまたはアルケニルであり、かつＲ３とＲ４が同じかまたは異なるＣ１−Ｃ２４アルキルもしくはＨであり、Ｒ５がＯ−Ｒ６−Ｒ７であり、さらにＲ６が不在あるいは、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）p−ＮＨ；アルキル、アリール、もしくはアラルキルのジアミノカルボキシレートエステル基；またはジアミノカルボキシレートエステル基に結合した−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）p−ＮＨ（但し、ｐは１〜１８である）であり、かつＲ７がＨ、スペルミン、スペルミジン、ヒストン、ＤＮＡ結合特異性を有するたんぱく質であるか、またはＲ７部分のアミン基がＨまたはＣ1からＣ24の直鎖もしくは分岐アルキル鎖によって第四化合物化されている先述の基である化合物、または、
【００３６】
側鎖にプラスに帯電した基を有するＬ−またはＤ−アルファアミノ酸であって、該アミノ酸がアルギニン、ヒスチジン、リジンもしくはオルニチンまたはこれらのアナログを含むか、またはＲ７部分のアミンがＨまたはＣ1からＣ24の直鎖もしくは分岐アルキル鎖によって第四化合物化されているＬ−またはＤ−アルファアミノ酸、または
Ｌ−またはＤ−アルファアミノ酸からなるグループから選択されるポリペプチドで、アミノ酸残基の少なくともひとつがアルギニン、ヒスチジン、リジンまたはオルニチンもしくはこれらのアナログを含むポリペプチド、を含まない。
【００３７】
本発明に含まれないさらなる化合物は、ｎが１であり、かつｍが２〜６であり、さらにＲ１およびＲ２が別々にまたは共にＣ1〜Ｃ23アルキルまたはＣ（Ｏ）−Ｃ1−Ｃ23であり、またＲ３およびＲ４が別々にまたは共にＨまたは側鎖のないアルキルＣ1〜Ｃ6であり、およびＲ５がＮＨ−Ｒ６−Ｒ７であって、さらにＲ６−Ｒ７が、−（ＣＨ2）zＮＨ２（式中ｚは２〜６）、または−（ＣＨ2）3−ＮＨ−（ＣＨ2）4−ＮＨ2、または−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−（ＣＨ2）4−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）−フルオレセイン、または
【化１２】
2008247906.tif 000013
または
【化１３】
2008247906.tif 000014
または
【化１４】
2008247906.tif 000015
（式中、ｐは２〜５であり、ＺはＨまたはアミドまたはアルキルアミノ基によって結合する他の基である）である化合物である。
【００３８】
本発明の別の実施態様は、下記構造を有する化合物である。
【化１５】
2008247906.tif 000016
［式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ，０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アシル、アルキレンまたはヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であり、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、また、前記置換基は、−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2から選択され（但し、前記置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４である）、
【００３９】
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキルまたはヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であり、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、また、前記置換基は、−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2から選択され（但し、前記置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４である）、
【００４０】
式中、Ｒ５は不在であるか、または−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７もしくは、−ＮＨ−Ｒ６−Ｒ７であり（式中、Ｒ６、またはＲ７をともなうＲ６は、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４について定義されるグループより選択され、また任意でさらに化学的に結合したアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、または、他の生物活性を有するもしくは医薬用の薬剤を含む）、
ｎは、１〜６であり、
ｍは、２〜１０であり、および
Ｙは薬学的に許容されるアニオンであり、さらに
【００４１】
Ｚは、Ｏ，ＮＨ、またはＳである。］
好ましくは、Ｒ５はヘテロエチレン基で、ＸはＯであり、かつＲ７をともなうＲ６がエステル結合を介してヘテロエチレン基と結合したアミノ酸またはペプチドである。
【００４２】
本発明は、上記の構造にあたるある特定の化合物を含まない。例えば、ＺがＯであり、Ｒ１がＨか、またはＣ１−Ｃ２４アルキルまたはアルケニルであり、かつＲ２がＣ１からＣ２４アルキルまたはアルケニルであり、さらにＲ３とＲ４が同じかまたは異なるＣ１−Ｃ２４アルキルまたはＨであり、Ｒ６が不在あるいは、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）p−ＮＨ：アルキル、アリール、もしくはアラルキルであるジアミノカルボキシレートエステル基；またはジアミノカルボキシレートエステル基に結合する−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）p−ＮＨ（但し、ｐは１〜１８である）であり、かつＲ７がＨ、スペルミン、スペルミジン、ヒストン、ＤＮＡ結合能を有するたんぱく質であるか、またはＲ７部分のアミン基がＨもしくはＣ1からＣ24の直鎖または分岐アルキル鎖で第四化合物化された先述の基である場合、または側鎖にプラスに帯電した基を有するＬ−またはＤ−アルファアミノ酸であって、該アミノ酸がアルギニン、ヒスチジン、リジンもしくはオルニチンまたはこれらのアナログを含むか、または、Ｒ７部分のアミンがＨまたはＣ1からＣ24の直鎖もしくは分岐アルキル鎖によって第四化合物化されているＬ−またはＤ−アルファアミノ酸である場合、または
【００４３】
Ｌ−またはＤ−アルファアミノ酸からなるグループから選択されるポリペプチドで、アミノ酸残基の少なくともひとつがアルギニン、ヒスチジン、リジンまたはオルニチンもしくはこれらのアナログを含むポリペプチドである場合。
【００４４】
本発明に含まれないさらなる化合物は、ＺがＮＨであり、ｎが１であり、かつｍが２〜６であり、さらにＲ１およびＲ２が別々にまたは共にＣ1〜Ｃ23アルキルまたはＣ（Ｏ）−Ｃ1〜Ｃ23であり、またはＲ３およびＲ４が別々にまたは共にＨまたは側鎖のないアルキルＣ1〜Ｃ6であり、およびＲ５がＮＨ−Ｒ６−Ｒ７であって、さらにＲ６−Ｒ７が、−（ＣＨ2）zＮＨ２（但し、式中、ｚは２〜６である）、または−（ＣＨ2）3−ＮＨ−（ＣＨ2）4−ＮＨ2、または−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−（ＣＨ2）4−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）−フルオレセイン、または
【化１６】
2008247906.tif 000017
または
【化１７】
2008247906.tif 000018
または
【化１８】
2008247906.tif 000019
（式中、ｐは２〜５であり、ＺはＨまたはアミドまたはアルキルアミノ基によって結合する他の基である）である化合物である。
【００４５】
本発明は、また、下記式の化合物を提供する。
【化１９】
2008247906.tif 000020
［式中において、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して、０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アシル、アルキレンまたはヘテロアルキル基、またはサイクリックもしくはアリール基であり（該サイクリックもしくはアリール基は５個までのヘテロ原子を含み、また、前記置換基は、−Ｏ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライド）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2からなるグループから選択される（式中ｋは０〜４であり、該置換基のアルキル基は０〜２個のヘテロ原子を含む））、およびＲ1またはＲ2はＨであってもよく：Ｒ3およびＲ4は、Ｒ3またはＲ4がＨではないということを除いて、Ｒ1およびＲ2と同様に定義され：Ｒ5は不在であるか、Ｈ、またはＲ1およびＲ2の定義と同じアルキル基であり：Ｒ５からＲ１０はそれぞれ独立して、または組合わさって不在であるか、Ｈ、またはＲ1およびＲ2について定義されるアルキル基であって、また、任意でさらに化学的に結合したアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、または、他の生物活性を有するもしくは医薬用の薬剤を含み；Ｇは不在であるか、Ｏ，Ｎ，ＳまたはＳｅであり；ＺはＯ，Ｎ，Ｓ，ＳｅまたはＣであり、ＡはＯ，Ｎ，Ｓ，ＳｅまたはＣであり；ｎは１〜６であり；ｍは２〜１０であり；およびＹは薬学的に許容されるアニオンである。］
【００４６】
本発明は、ＧがＮであり、ＺがＯであり、かつＡがＣである式１の化合物、または、ＧがＯであり、ＺがＯであり、かつＡがＣである式１の化合物を含まない。
本発明はまた、上記のカチオン脂質のいずれか、および適当な担体溶液中に含有される中性脂質、ホスホリピッド、およびコレステロールからなるグループから選択される補助脂質を含むチトフェクチン製剤を提供するものである。
【００４７】
本発明のさらに別の実施態様は、アニオン分子を細胞内に送達する下記工程を含む方法であって、これにより生物学的に有効な量のアニオン分子を細胞中に導入する方法である：
（ａ）アニオン分子を上記カチオン脂質のいずれかの有効量を含む製剤を接触させて脂質との複合体を作製するステップ；及び
（ｂ）ステップ（ａ）で作製した脂質複合体と細胞を接触させるステップ。
好ましくは、該細胞はインビトロであり、最も好ましくは、該細胞はインビボである。本発明の別の態様は、細胞に生物活性を有する薬剤を導入するための組成物に、上記の式１の化合物を使用することである。好ましくは、細胞はインビボである。ある実施態様において、細胞はインビトロである。
【００４８】
使用の一つの実施態様において、生物活性を有する薬剤はアニオンで、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。
様々な化合物の活性は、例えば、インビトロ細胞培養アッセイ、げっ歯類肺トランスフェクション、げっ歯類腹腔内腫瘍、および、げっ歯類筋肉内およびブタまたはウサギ動脈内アッセイなどのアッセイで示すことができる。このようなアッセイは、特許を請求する化合物のスクリーニング技法として本発明明細書中に説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
反応スキームの簡単な説明
明細書の本文に続いて、いくつかの代表的な反応スキームが示される。これら番号付与された反応スキームは、以下を説明するものである。
スキームＩは、本発明のチトフェクチンの基本骨格の合成経路を説明するものである。
【００５０】
スキームIIは、本発明のチトフェクチンの合成における市販の出発材料からの中間体の作成経路を説明するものである。
スキームIIIは、中間化合物からのカルボキシチトフェクチンの合成経路を説明するものである。
スキームIVは、中間化合物からのカルバミルチトフェクチンの合成経路を説明するものである。
スキームＶは、中間化合物からの尿素様官能基を有するチトフェクチンの合成経路を説明するものである。
【００５１】
発明の詳細な説明
ローゼンタールインヒビター（ＲＩ）系列が実例であるようなチトフェクチンの第四アンモニウムクラスの両親和性脂質を、誘導体化することにより、より高い特異性で細胞膜と相互反応し、より高いレベルのトランスフェクションを行うことのできるより有効性の高いトランスフェクション剤を作成できることが見出された。これらは、標的とするキーレセプターおよび細胞表面酵素に適応できる構造を提供し、これにより、分子認識における重要な要素を発見及び利用するのに適当である。これらのカチオン脂質の一部は、細胞内に送達される物質に結合して特定の生物学的目的を達成することができる。
【００５２】
本発明のカチオン脂質は、先に記載される通り、ＤＯＴＭＡまたはＲＩ特性を含む可学構造を有するが、リンキングスペーサーを介して、たとえばケトン、エステル、ウレイル、またはカルバミル部分などの官能基を有利に有する構造と結合されている。これらの官能基は、（１）細胞標的部分に結合する、または（２）治療用分子をチトフェクチンに結合させるために使用することができる。付加的に、または代替的に、官能基は、チトフェクチンの極性荷電密度を増大する基と結合し、これによりトランスフェクションを促進するためのリンカーとして使用することができる。例えば、第四窒素の８炭素以内に第一アミン基が存在すると、トランスフェクション効率が増大することを見出した。第四窒素の８炭素以内に第一アミンを有する有効なチトフェクチンの例は、実施例７および９、および図２，３，４、および５に示される結果において開示される。
【００５３】
プラスに帯電するアミノ酸またはペプチドのみがチトフェクチンの有効性を増大できるとした最初の予想に反して（米国特許第５，２６４，６１８号参照）、非極性、極性で非荷電、または生理学的ｐＨにおいてマイナスに帯電するペプチドまたはアミノ酸をローゼンタールインヒビター骨格に結合することによっても、トランスフェクション効率を増大することができる。例えば、非荷電のアミノ酸であるグリシンは、ＤＬＲＩＥと結合すると、荷電アミノ酸リジンの場合よりもトランスフェクション活性をより増大させる。
【００５４】
用語
本発明のチトフェクチンは、ＲＩ，ＤＬ−２，３−ジアシルオキシプロピル（ジメチル）−β−ヒドロキシエチルアンモニウムの核構造を有するカチオン脂質類である。
【化２０】
2008247906.tif 000021
チトフェクチンのＲＩクラスの頭文字の例は、次の通りである。
ＤＯＲＩ：ジオレイルローゼンタールインヒビター（ＤｉＯｌｅｙｌＲｏｓｅｎｔｈａｌＩｎｈｉｂｉｔｏｒ）
Ｒ＝ＣＯ（ＣＨ2）7〔ｚ〕ＣＨ＝（ＣＨ2）7ＣＨ3
ＤＯＲＩＥ：ジオレイルローゼンタールインヒビターエーテル
（ＤｉＯｌｅｙｌＲｏｓｅｎｔｈａｌＩｎｈｉｂｉｔｏｒＥｔｈｅｒ）Ｒ＝（ＣＨ2）8〔ｚ〕ＣＨ＝（ＣＨ2）7ＣＨ3
ＤＤＲＩＥ：ジデシルローゼンタールインヒビターエーテル
（ＤｉＤｅｃｙｌＲｏｓｅｎｔｈａｌＩｎｈｉｂｉｔｏｒＥｔｈｅｒ）Ｒ＝（ＣＨ）9ＣＨ3
ＤＬＲＩＥ：ジラウリルローゼンタールインヒビターエーテル
（ＤｉＬａｕｒｙｌＲｏｓｅｎｔｈａｌＩｎｈｉｂｉｔｏｒＥｔｈｅｒ）Ｒ＝（ＣＨ2）11ＣＨ3
ＤＭＲＩＥ：ジミリスチルローゼンタールインヒビターエーテル
（ＤｉＭｙｒｉｓｔｙｌＲｏｓｅｎｔｈａｌＩｎｈｉｂｉｔｏｒＥｔｈｅｒ）Ｒ＝（ＣＨ2）13ＣＨ3
ＤＰＲＩＥ：ジパルミチルローゼンタールインヒビターエーテル
（ＤｉＰａｌｍｉｔｙｌＲｏｓｅｎｔｈａｌＩｎｈｉｂｉｔｏｒＥｔｈｅｒ）Ｒ＝（ＣＨ2）15ＣＨ3
ＤＳＲＩＥ：ジステアリルローゼンタールインヒビターエーテル
（ＤｉＳｔｅａｒｙｌＲｏｓｅｎｔｈａｌＩｎｈｉｂｉｔｏｒＥｔｈｅｒ）Ｒ＝（ＣＨ2）17ＣＨ3
βＡＥ−ＤＭＲＩＥ：β−アミノエチルジミリスチルローゼンタールインヒビターエーテル
（β−ＡｍｉｎｏＥｈｙｌＤｉＭｙｒｉｓｔｙｌＲｏｓｅｎｔｈａｌＩｎｈｉｂｉｔｏｒＥｔｈｅｒ）
ＤＭＲＩＥ−Ｏｘ：ジミリスチルローゼンタールインヒビターエーテルカルボキシレート
（ＤｉＭｙｒｉｓｔｙｌＲｏｓｅｎｔｈａｌＩｎｈｉｂｉｔｏｒＥｔｈｅｒＣａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、
また、例えば、ＤＯＰＥ：ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤｉＯｌｅｏｙｌＰｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）など、類似の頭文字でリポソーム製剤中に含まれる中性脂質を表す。
【００５５】
本発明のチトフェクチン：構造
一実施態様において、本発明の脂質は、以下の一般式を有する。
【化２１】
2008247906.tif 000022
［式中において、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して、０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アシル、アルキレンまたはヘテロアルキル基、またはサイクリックもしくはアリール基であり（該サイクリックもしくはアリール基は５個までのヘテロ原子を含み、また、前記置換基は、−Ｏ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライド）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2からなるグループから選択される
【００５６】
（式中、該置換基のアルキル基は０〜２個のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４である））、およびＲ1またはＲ2はＨであってもよく：Ｒ3およびＲ4は、Ｒ3またはＲ4がＨではないということを除いて、Ｒ1およびＲ2と同様に定義され：Ｒ5は不在であるか、Ｈ、またはＲ1およびＲ2の定義と同じアルキル基であり；Ｒ５からＲ１０はそれぞれ独立して、または組合わさって不在であるか、Ｈ、またはＲ1およびＲ2について定義されるアルキル基であって、また、任意でさらに、これらに化学的に結合したアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、または、他の生物活性を有するもしくは医薬用の薬剤を含み；Ｇは不在であるか、Ｏ，Ｎ，ＳまたはＳｅであり；ＺはＯ，Ｎ，Ｓ，ＳｅまたはＣであり、ＡはＯ，Ｎ，Ｓ，ＳｅまたはＣであり；ｎは１〜６であり；ｍは２〜１０であり；およびＹは薬学的に許容されるアニオンである。］
【００５７】
本発明は、ＧがＮであり、ＺがＯであり、かつＡがＣである式１の化合物、または、ＧがＯであり、ＺがＯであり、かつＡがＣである式１の化合物、または、Ｇ，ＺおよびＡがＣである化合物を含まない。
この構造の好ましい実施態様において、ｎ＝１〜２である。別の好ましい実施態様においては、ｍ＝２〜４である。更に好ましい実施態様においては、ｋ＝０〜４である。好ましくは、Ｒ３−１０、アルキルの場合は、Ｃ１０−１５である。
【００５８】
好ましい実施態様において、本発明のチトフェクチンは、以下の式を有する。
【化２２】
2008247906.tif 000023
［式中において、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アシル、アルキレンまたはヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であって、０〜５個のへテロ原子を含み、前記置換基は、−Ｏ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中においてＸはハライド）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2から選択され（式中においてアルキル基は０〜２個のヘテロ原子を含む）；ｎは１〜６であり；ｍは２〜１０であり；また、Ｒ５は式２の種を定義する官能基を有する化学構造である。］
Ｒ５は、好ましくはこれもまたヘテロ原子を含有すルアルキルリンカーを介してアンモニウム窒素と結合している。
【００５９】
本発明のカチオン脂質は、生理学的に許容される非毒製アニオン、Ｙを伴う。製薬に一般に使用されるアニオンは、Ｂｅｒｇｅらによって開示されている（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９，１９７７）。
好ましい実施態様において、ｎは１であり、かつｍは２〜４であって、本発明の好ましいチトフェクチン種は、したがってキーとなる以下の中間体、式１−３中に示されるＲＩ骨格を有する。本発明の他のチトフェクチン種は、ＲＩを基にするグループと相同であり、これらのチトフェクチンは同じ一般式１を有するが、しかし、ｎは３〜６であり、ｍは２〜１０である。
【００６０】
本発明のチトフェクチンは、下記Ａ〜Ｅを含むモジュラーアレンジメント中の機能性パーツのアッセンブリと見なすことができる。
Ａ．脂肪族鎖の間でなくその中にサイクリック構造を含有することのできる脂肪族鎖であり得る、疎水性構造
Ｂ．ジアルコキシ、ジアシルオキシ、およびアルキル基で置換された第４Ｎ原子を含み、式１中において上および下に付加された基を含む環の一部でもあり得る、分子の最も特徴的な部分
Ｃ．通常は脂肪族鎖であるが、ひとつまたは複数のヘテロ原子を含有してもよい、スペーサー、（ＣＨ2）n
Ｄ．しばしば、通常は酸素と二重結合した中央炭素原子を有する３つの原子のバックボーンであるリンカー基（リンカー基は、カルボキシ、カルバミル、ウレイル、またはグアニジルであり、以下で考察されるように、共通のキーとなる合成中間体を有する場合もある。本発明の分子において、この基がシンメトリカルでない場合は、その左右を反転することができる。）
Ｅ．アミノ酸、ペプチド、たんぱく質、炭水化物、核酸、薬剤、リガンド、または細胞成分と反応して所望の反応を引き起こすことのできる全ての他の分子種を含む、分子の“カーゴ”部分（これらの分子は、両機能性スペーサーにより分子のリンカー基に結合することができる。）
【００６１】
上記のクラスの化合物は、多様な化学的部分、特に生理学的に活性と考えられるものを有する基本的なジオキシプロパニミニウム骨格の有効な誘導体を与えるように設計された。このクラスの各チトフェクチンは、本明細書に開示される合成方法を使用した多様な化学的な機能性の一般的な導入の模範例として作成された。“リンカー”として本明細書に記載されるユニークな官能基もまた、本発明のチトフェクチンの有効性および／または特異性という特性を増大させるものである。
【００６２】
それぞれ尿素およびチオ尿素中に導入された特定の生物活性ペプチドおよびサッカライドは、レセプターの介在するプロセスによる標的の選択またはインターナリゼーションの増大を可能とするであろう。尿素グループの導入は、チトフェクチンとＤＮＡのリン酸バックボーンとの相互作用を増大し、これによりトランスフェクションをより有効にするであろう。開示された方法を一般化する能力により、より簡単に、チトフェクチン基本骨格に当業者に既知である多様な生物活性分子で機能を付与できるようになる。
本発明のチトフェクチンの種は、以下のように、一般式１における特徴的なＲ５置換に基づいて分類される。
【００６３】
１．カルボキシチトフェクチン
本発明のカチオン脂質の種類の一つは、式１のアンモニウム基上の置換リンカー基中にカルボキシ基があることを特徴とする。このクラスの化合物は、式１の一般構造を有するが、カルボキシ種Ｒ５は、下記構造を有するものである。
【化２３】
2008247906.tif 000024
［式中において、ＺはＯ，Ｎ，Ｓ，Ｓｅ，ＣまたはＨであり、Ｒ６はＲ１，Ｒ２，Ｒ３またはＲ４について定義される基である。］
【００６４】
ＺがＮの場合、Ｒ５は下記構造を有し、
【化２４】
2008247906.tif 000025
またＺがＣの場合、Ｒ５は下記構造を有する。
【化２５】
2008247906.tif 000026
［式中、Ｒ７，Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立して、Ｈであるか、またはＲ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４について定義される基より選択される。］
この種の全ての化合物において、Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８、およびＲ９は、任意でさらに、化学的に結合したアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、または、他の生物活性を有するもしくは医療用の薬剤を含む。
【００６５】
２．カルバミルチトフェクチン
本発明の別の種のカチオン脂質は、式１のアンモニウム基上の置換基のひとつにカルバミル基があることを特徴とし、このクラスの化合物は、下記一般構造を有する。
【化２６】
2008247906.tif 000027
［式中において、Ｒ５は下記構造を有する：
【化２７】
2008247906.tif 000028
（式中、ＷはＯ，Ｎ，ＮＨ，Ｓ，Ｓｅ，Ｃ，ＣＨ，ＣＲ１またはＣＲ１Ｒ２であり、Ｒ６およびＲ７は上記に定義される通りである）。］
本発明のカルボニルカチオン脂質には、また、Ｒ５が下記構造を有するイソメリックなカルバミル構造を有するものが含まれる。
【化２８】
2008247906.tif 000029
［式中Ｗは、上記に定義される通りであり、Ｒ６はカルボキシ種について定義される通りであり、また、Ｒ７は不在であるか、またはＨもしくはカルボキシ種について定義されるようなアルキル基である。］
【００６６】
カルバメイトチトフェクチンの好ましい実施態様には、アルキルリンカー（ＣＨ2）m（式中において、ｍは２〜４である）、を介して脂質と結合したメチルカルバメイト基を含む。
カルバメイト構造により、末端基におけるアミン−アルコールリガンドカップリングが容易に起こる。
【００６７】
３．尿素様の結合基を有するチトフェクチン
本発明の別のカチオン脂質は、式１のアンモニウム基上の置換基中に尿素様の基があることを特徴とし、このクラスの化合物は下記一般構造を有する。
【化２９】
2008247906.tif 000030
［式中において、Ｒ５は下記構造を有する：
【化３０】
2008247906.tif 000031
（式中、ＷはＯ，Ｎ，ＮＨ，Ｓ，Ｓｅ，Ｃ，ＣＲ１またはＣＲ１Ｒ２であり；Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立して、上記のカルボキシ種について定義される通りであり；Ｒ８は不在であるか、またはＨもしくは式１について上記で定義されるようなアルキル基Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３、またはＲ４であり；また、Ｒ６，Ｒ７およびＲ８がＨでない場合、これらは任意でさらに、化学的に結合したアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、または、他の生物活性を有するもしくは医療用の薬剤を含む）。］
【００６８】
（ａ）ウレイルチトフェクチン
このクラスの本発明のカチオン脂質の一種は、このように式１の一般構造を有し、式１のアンモニウム窒素上の置換基中にウレイル基があることを特徴とする。この種においては、Ｒ５は上記で定義され、その構造式中のＷが酸素であるような構造を有する。
【００６９】
（ｂ）グアニジルチトフェクチン
このクラスによる本発明の別の種のカチオン脂質は、式１のアンモニウム窒素上の置換基中にグアニジル基があることを特徴とし、Ｒ５が上記で定義され、その構造式中のＷがＮまたはＮＨであるような構造を有する式１の一般構造を有する。
【００７０】
（ｃ）チオ尿素およびセレノウレアチトフェクチン
本発明のカチオン脂質には、また、Ｒ５が上記で定義され、その構造式中のＷがＳまたはＳｅであるような構造を有する式１の一般構造を有する化合物を含む。
【００７１】
（ｄ）他の尿素関連チトフェクチン
本発明のカチオン脂質には、また、Ｒ５が上記で定義される通りで、その構造式中、ＷがＣ，ＣＨ，ＣＲ１、またはＣＲ１Ｒ２であり（Ｒ１およびＲ２は式１について定義される通りである）、Ｒ６，Ｒ７およびＲ８がＲ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４について定義されるグループより選択されるところの、式１の一般構造を有する化合物が含まれる。
尿素／チオ尿素合成は、アミン−アミンリガンドカップリングを容易に形成させ、サッカライドおよびアミノ酸の誘導体を調製する手段を提供するものである。チオ尿素結合を通じて調製することのできる好ましいサッカライド誘導体には、グルコース、ガラクトース、ラクトース、およびアラビノース種が含まれる。
【００７２】
４．Ｎ-ヘテロエチレン置換チトフェクチン
本発明はまた、カチオン脂質のＲＩ種に特徴的なβ−ヒドロキシエチレン置換を含むプロパミニウムグループの第四アンモニウム上のヘテロエチレン置換、およびＷｈｅｅｌｅｒらによって、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（刊行物）に開示されたアミン誘導体を含むカチオン脂質の別の主要な種を含む。このグループの化合物は、下記一般構造を有する。
【化３１】
2008247906.tif 000032
［式中において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ，０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アシル、アルキレンまたはヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であり、前記基は０〜５のヘテロ原子を含み、また、前記置換基は、−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2より選択され（但し、前記置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４である）；ｎは１〜６であり；およびｍは２〜１０である。
【００７３】
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、０〜６個の不飽和部位を有する直鎖または分岐、非置換または置換基を有するＣ1-23アルキル、アルキレンまたはヘテロアルキル基、サイクリックおよびアリール基であり、該基は０〜５のヘテロ原子を含み、また、前記置換基は、−０−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、−Ｓ−（ＣＨ2）k−ＣＨ3、Ｘ−（ＣＨ2）k−（式中において、Ｘはハライドである）、および−Ｎ（（ＣＨ2）k−ＣＨ3）2から選択され（但し、該置換基のアルキル基は０〜２のヘテロ原子を含み、ｋは０〜４であり）；
【００７４】
式中、Ｒ５はＨであるか、または−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７もしくは、−ＮＨ−Ｒ６−Ｒ７であり、式中においてＲ６，Ｒ７をともなうＲ６は、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４について定義される基から選択され、また、任意でさらに、化学的に結合したアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、または、他の生物活性を有するもしくは医薬用の薬剤を含み；
【００７５】
さらに、Ｙは薬学的に許容されるアニオンである。］
本発明は、上記の一般構造にあたる当業において既知である化合物を包含しない。例えば、本発明は、Ｒ５が−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７であり、Ｒ１がＨであるか、またはＣ１−Ｃ２４アルキルもしくはアルケニルであり、またＲ２がＣ１からＣ２４アルキルもしくはアルケニルであり、さらにＲ３およびＲ４は同じまたは異なりかつＣ１−Ｃ２４アルキルまたはＨであって、Ｒ６が不在であるか、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）p−ＮＨ、アルキル、アリールもしくはアラルキルであるジアミノカルボキシレートエステル基、またはジアミノカルボキシレートエステル基に結合した−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）p−ＮＨ（但し、ｐは１〜１８である）であり、かつＲ７がＨ、スペルミン、スペルミジン、ヒストン、ＤＮＡ結合特異性を有するたんぱく質、または、Ｒ７部分のアミン基がＨもしくはＣ1からＣ24の直鎖または分岐アルキル鎖で第四化合物化されている先述の基である化合物、または
【００７６】
側鎖にプラスに帯電した基を有するＬ−またはＤ−アルファアミノ酸であって、該アミノ酸がアルギニン、ヒスチジン、リジンもしくはオルニチンまたはこれらのアナログを含むか、またはＲ７部分のアミンがＨまたはＣ1からＣ24の直鎖もしくは分岐アルキル鎖によって第四化合物化されているＬ−またはＤ−アルファアミノ酸、または
Ｌ−またはＤ−アルファアミノ酸からなるグループから選択されるポリペプチドで、アミノ酸残基の少なくともひとつがアルギニン、ヒスチジン、リジンまたはオルニチンもしくはこれらのアナログを含むポリペプチド、を含有しない。
【００７７】
本発明に含まれないさらなる化合物は、ｎが１であり、かつｍが２〜６であり、さらにＲ１およびＲ２が別々にまたは共にＣ1〜Ｃ23アルキルまたはＣ（Ｏ）−Ｃ1〜Ｃ23であり、またＲ３およびＲ４が別々にまたは共にＨまたは側鎖のないアルキルＣ1〜Ｃ6であり、およびＲ５がＮＨ−Ｒ６−Ｒ７であって、さらにＲ６−Ｒ７が、−（ＣＨ2）zＮＨ２（式中ｚは２〜６）、または−（ＣＨ2）3−ＮＨ−（ＣＨ2）4−ＮＨ2、または−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−（ＣＨ2）4−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）−フルオレセイン、または
【化３２】
2008247906.tif 000033
または
【化３３】
2008247906.tif 000034
または
【化３４】
2008247906.tif 000035
（式中、ｐは２〜５であり、ＺはＨまたはアミドまたはアルキルアミノ基によって結合する他の基である）である化合物である。
【００７８】
好ましい実施態様において、ＲＩ脂質部分は、アルキルリンカーを介してアミノ酸またはポリペプチドに結合している。代替的に、チトフェクチンは両機能性リンカー、例えばヒドロキシサクシニル−ＤＯＲＩＥ−プロピルアミドを含んでもよい。
【００７９】
チトフェクチンの生物活性を有するヘッドグループ
（ａ）標的種
本発明によるチトフェクチンは、末端基として生物学的な細胞標的活性を有する分子種を含む。このクラスに属するのは、細胞レセプター特異的分子を含むチトフェクチンである。レセプター特異的ペプチドまたはアミノ酸は、典型的には、ＤＭＲＩＥ−ＯＸおよびγＡＰ−ＤＭＲＩＥを介するアミドとして結合する。このタイプの好ましい種の例は、走化性ペプチドを含む、ＤＭＲＩＥをカルボキシレート（メチオニン−ロイシン−フェニルアラニンメチルエステル）アミド（ＤＯｘ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ）、およびｐＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−γ−ＤＭＲＩＥである。本発明のチトフェクチンに結合する他の細胞表面レセプターへのリガンドは、ペプチド様アナログ、多くのウイルスアタッチメントおよびインターナリゼーションペプチド、ラクトースおよび他のジサッカライドおよびポリサッカライド、アセチルコリンアナログ、および葉酸誘導体を含む。
【００８０】
（ｂ）治療薬
本発明によるチトフェクチンは、末端基として、生物活性分子種を含むことができる。このタイプの好ましい種の例は、チロトロピン放出ホルモンを含む、ｐグルタメイト−ヒスチジン−プロリン−γ−ＤＭＲＩＥアミドである。
【００８１】
（ｃ）細胞および細胞内標的
本発明によるチトフェクチンは、細胞膜または細胞内標的に特異的に結合して所望の生理学的反応を与えるリガンドを有する末端基を含むことができる。適当なリガンドには、ウイルスエピトープであるペプチド、ホルモン、酵素基質、モノサッカライド、ジサッカライド、オリゴサッカライド、炭水化物、補助因子、薬剤、レクチン、オリゴヌクレオチド、および核酸を含む。これらのグループのうち、好ましい種は、クロロキンおよび他の向リソソーム剤、該局在性ペプチド、コルチコステロイドおよびウイルスペプチドまたはたんぱく質を含むチトフェクチンである。
【００８２】
トランスフェクション効率に影響を与える基
本発明のチトフェクチンは、そのトランスフェクション効率に影響を与える基に結合することができる。このような基は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリッカライドである。さらに、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、または、たんぱく質は、生物中には一般に見られない通常にはないまたは修飾されたアミノ酸を含んでもよい。このような通常にはないまたは修飾されたアミノ酸には、これに限定されないが、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に掲載される修飾された通常にないアミノ酸が含まれる。さらに、このようなアミノ酸は、天然には見られない合成アミノ酸であってもよい。
【００８３】
トランスフェクション効率
ＤＭＲＩＥ系化合物における各クラスの代表的な化合物およびそのＤＭＲＩＥ相対のチトフェクチン活性の測定値を表１に一覧する。表１は、明らかに、本発明の結合基のいくつかを有するＤＭＲＩＥ誘導体が有効なレベルのトランスフェクションを与えることを示している。
【００８４】
Ｉ：チトフェクチンヘッドグループの変更と活性の概要
官能基 アルキル結合 名称 Ｃｏｓ７ Ｃ２Ｃ１２
メチル尿素            エチル（Ｃ２）      ＢＭＵ         ≧              ≦
プロピル（Ｃ３）    ＧＭＵ         ≧              ＝
ブチル（Ｃ４）      ＤＭＵ         》              ≧
メチルカルバメート    エチル（Ｃ２）      βＭＣ        ＝               ＝
プロピルＣ３）      γＭＣ        ＝               ＝
ブチル（Ｃ４）      δＭＣ        ＝               ＝
糖−チオ尿素
グルコース            プロピル（Ｃ３）    Glc-TU-DMRIE  ≧               ≦
アラビノース          プロピル（Ｃ３）    Ara-TU-DMRIE  ＝               ＜
ガラクトース          プロピル（Ｃ３）    Gal-TU-DMRIE  ≧               ＝
ラクトース            プロピル（Ｃ３）    Lac-TU-DMRIE  検出せず        検出せず
単一アミノ酸
セリン                ブチル（Ｃ４）      δ-ser-DMRIE  ＝               ＝
メチオニン            メチレン（Ｃ１）    DOx-Met-OMe   《               ＜
ペプチド
Met-Leu-Phe           メチレン（Ｃ１）    DOX-MLF-OMe    ＝              ＜
pGlu-His-Pro          プロピル（Ｃ３）    TRH-γ-DMRIE    ＝             《
【００８５】
反応スキームおよび作成方法
Ａ．チトフェクチンの合成
本発明の化合物は、いずれかの適当なプロセスにより作製することができる。便宜上、スキームIIのキー中間体からの本発明のチトフェクチンの合成を可能とするために、これらの誘導体を合成する一般的な方法をダイアグラムを使用して特定の例について提示する。様々なカルボキシチトフェクチン、カルバミルチトフェクチン種および尿素様の官能基を有するチトフェクチンを、スキームIII，IV、およびＶにそれぞれ概略させる合成方法により作製することができる。
本発明のチトフェクチンは、下記一般式を有するキー中間体の相同体より適宜作製される。
【化３５】
2008247906.tif 000036
ｎが１およびｍが２であるい場合の好ましいチトフェクチンは、式中においてｎが１であるようなスキームＩの化合物Ｉ−３から作製される。化合物Ｉ−３は、Ｉ−１からジアルキルアミノプロパンジオールのヒドロキシルをアルキル化してＩ−２を作製し、次いで示されるようにＮをＲ−置換エチル基でアルキル化することにより作製される。
【００８６】
スキームIIは、ｎ＝１〜６である種についてのスキームＩの出発化合物を合成する一般的な方法を説明するものである。例えば、ヒドロキシ−オレフィンII−３またはブロモ−オレフィンII−４などのような合成経路に沿った様々な化合物が市販されている。ｎ＝５であるチトフェクチン種のみが、酸II−１より出発する必要がある。ｎが１およびｍが２である場合の好ましい種を作製するための、最終ジメチルアミノプロパンジオールが市販されている（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１，０２１−８、アルドリッチケミカル社、セントルイス、ミズーリー州）。
【００８７】
本発明のチトフェクチンは、反応性の官能基を有する様々な既知の分子をキー中間体の骨格構造に適切な順番で付加することによって作製される。様々な既知の化合物、例えば、置換アルキルアミン、糖、尿素、チオ尿素、アミノ酸、およびペプチドが市販され入手可能である。様々な官能基をキー中間体にカップリングする方法は、当業者によく知られており、例えば学術論文集、Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｖｏｌ．１−１６、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹなどの文献において詳細に記載されている。
【００８８】
合成トランスフォーメーションの概要
本出願中において特許請求の範囲にあるタイプのチトフェクチンは、従来の合成化学を使用して作製することもできる。本明細書に開示されるチトフェクチンの全てについての合成方法は、本質的に同一であるが、出発材料として異なるアミノ−アルコールを使用する。骨格は、スキームＩに説明されるように、ジヒドロキシ−ジアルキルアミン化合物を作製することにより形成される。導入したい特定の置換基によって決まる試薬および条件を使用して、ヒドロキシル官能基を疎水性アルキル鎖に結合する。例えば、単純なｎ−アルキル鎖には、塩基性触媒を使用して必要なアルキルメタンスルホネートをアルコールとカップリングすることにより、適切に導入することができる。第三アミンを、次いで、官能基を有する、適切に保護されたアルキル化剤で処理して、窒素を第四化合物化する。第四窒素を介して付加された特異的な官能基は、次いで、スキームIII，IV，およびＶに示されるように、カルボキシ−チトフェクチン、カルバミル−チトフェクチン、および尿素−チトフェクチンと呼ばれる様々な機能クラスへと変換される。米国特許第５，３３４，７６１号に開示されるような一般的な合成方法を、本発明において、有効に使用することができる。
【００８９】
スキームIIIに従ってカルボキシチトフェクチンを作製するために、第四窒素（III−１）に結合した一級アルコール部分を酸化して相当するカルボン酸にする（III−２）。多くの試薬が、このトランスフォーメーションを起こすが、我々は標準的に、修飾されたクロミニウムトリオキシド酸化を使用する。チトフェクチンカルボキシレートは、様々なアルコール、チオール、およびアミンとカップリングして相当するエステル、チオエステル、およびアミドをそれぞれ与えることができるという点において典型的である。このようにして、適当な求核性を有するいかなる材料も、「塩基性」のカルボキシチトフェクチン骨格に結合して、III−３およびIII−４のような化合物を生成することができる。例えば、ＤＭＲＩＥカルボキシレートプロピルアミドは、プロピルアミンとＤＭＲＩＥカルボキシレートとのＤＣＣ−触媒カップリングにより製造した。相当するアミノ酸およびペプチド誘導体が、同様の技術を使用して作製され、このタイプの合成経路および生物学的に活性な部分の導入における応用についてのさらに特定の説明を提供する。
【００９０】
カルバミルチトフェクチンを作製する場合、二種類の「適応」が可能で、双方の適応の合成経路をスキームＩＶにおいて説明する。第四窒素に結合したアルコール部分（ＩＶＡ−１）は、適当なイソシアネートによる処理など、幾つかの方法により、相当するカルバメイト（ＩＶＡ−２）に変換することができる。第四窒素に結合するアミン置換基（ＩＶＢ−１）もまた、典型的に異なる試薬の使用が必要であるが、類似の方法により、相当するカルバメイト（ＩＶＢ−２）に変換することができる。例えば、ＤＭＲＩＥのメチルカバメートの作製では、親チトフェクチンアルコールとメチルイソシアネートのカップリングを使用した。
【００９１】
尿素チトフェクチン（Ｖ−２）は、第一または第二アミン官能基（ａｍｉｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を有するチトフェクチン（Ｖ−１）からスキームＶによって作製できる。これは、数種類の方法により行うことができる。例えば、様々なイソシアネートを使用する一段階の変換および、ホスゲンによる第一処理とこれに続くアミンとのカップリングからなる二段階の変換の双方を我々は使用している。あらゆる与えられた化合物についての好ましい方法は、出発チトフェクチン内、およびアミン置換基上の官能基によって決まる。例えば、γ−アミノプロピルＤＭＲＩＥをメチルイソシアネートで処理して、一段階で相当するメチル尿素を得ることができる。また、γ−アミノプロピルＤＭＲＩＥアルギニンメチルエステル尿素を作製するために、二段階の変換法を使用した。
これらの一般化された方法に従って作製、およびそのトランスフェクション活性が検査されたものに、以下のチトフェクチンがある。
【００９２】
１．ＲＩチトフェクチン
セリン−δ−ＤＭＲＩＥアミド
アスパルテート−γ−ＤＭＲＩＥアミド
ｐグルタメート−ヒスチジン−プロリン−γ−ＤＭＲＩＥアミド
（チロトロピン放出ホルモン誘導体）
ヒドロキシサクシニル−ＤＯＲＩＥプロピルアミド
２．カルボキシチトフェクチン
ＤＯＲＩＥカルボキシレート（Ｃ１８：１アルケニル側鎖）
ＤＭＲＩＥカルボキシレート（Ｃ１４アルキル側鎖）
ＤＭＲＩＥカルボキシレートプロピルアミド
ＤＭＲＩＥカルボキシレート（メチオニン−メチルエステル）アミド
ＤＭＲＩＥカルボキシレート（メチオニン−ロイシン−メチルエステル）アミド
ＤＭＲＩＥカルボキシレート（メチオニン−ロイシン−フェニルアラニンメチルエステル）アミド〔走化性ペプチド誘導体〕
３．カルバミルチトフェクチン
ＤＭＲＩＥメチルカルバメート
ヒドロキシプロピルＤＭＲＩＥメチルカルバメート
ヒドロキシブチルＤＭＲＩＥメチルカルバメート
【００９３】
４．尿素様チトフェクチン
尿素
β−アミノエチル−ＤＭＲＩＥ、メチル尿素
γ−アミノプロピル−ＤＭＲＩＥ、メチル尿素
δ−アミノブチル−ＤＭＲＩＥ、メチル尿素
γ−アミノプロピル−ＤＭＲＩＥ、アルギニン−メチルエステル尿素
γ−アミノプロピル−ＤＭＲＩＥ、リジンメチルエステル尿素
γ−アミノプロピル−ＤＭＲＩＥ、リジン内部塩尿素
チオ尿素
γ−アミノプロピル−ＤＭＲＩＥ、α−グルコシルチオ尿素
γ−アミノプロピル−ＤＭＲＩＥ、α−ガラクトシルチオ尿素
γ−アミノプロピル−ＤＭＲＩＥ、α−アラボニシルチオ尿素
γ−アミノプロピル−ＤＭＲＩＥ、α−ラクトシルチオ尿素
ＤＭＲＩＥ−γ−チオ尿素
【００９４】
上記の方法は、適当な時間内にスクリーニング用の多数のチトフェクチンを作製するのに使用される。スクリーニングを組み合わせて行う合成は、特定の適用に最も有効なチトフェクチンを効率よく選択するために使用することができる。
複数の官能基を有する分子の場合、特定のカップリング反応の対象ではないこれらのひとつまたは複数の基をブロックまたはマスキングする必要があることは、当業者において一般に知られている。
【００９５】
製薬
本発明の化合物は、インビトロおよびインビボの双方において、哺乳類細胞にトランスフェクションするために、製剤中において使用することができる。トランスフェクションのための製剤は、当業者においては既知で、その製造法と一緒に、例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒの米国特許第５，２６４，６１８号、Ｇｅｂｅｙｅｈｕ他の米国特許第５，３３４，７６１号およびＦｅｌｇｎｅｒ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０−２５６１，１９９４）において開示されている。本発明のカチオン脂質は、ホスホリピッドなどの両親和性脂質やリポソーム、単ラメラ胞、ミセル、または単純フィルムなどである脂質小胞を形成するコレステロールなどの中性脂質と組み合わせることができる。
本発明のカチオン脂質は、Ｎａｂｌｅらにより報告された臨床試験（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：３９９−４１０，１９９２）に開示されるように、特に遺伝子療法において有用である。カチオン脂質の使用は、ポリヌクレオチド、マクロ分子、および小分子の血管細胞、全身循環、肺上皮細胞、脳組織およびカエルの胚（Ｘｅｎｏｐｕｓ）への侵入を容易にする上で有用であることが知られている。
【００９６】
本発明のチトフェクチンはまた、インビトロにおける細胞のトランスフェクションにおいて有用であることも、特記される。本発明の範囲にある様々な化合物は、ある程度、インビボにおいて組織特異性を有するが、その大半または全てが、インビトロにおける培養細胞のトランスフェクションに有用である。本発明のチトフェクチンの全ての特定の候補に対して、そのインビトロおよびインビボの様々な組織における相対的トランスフェクション効率は、実施例８−１２に開示されるようなスクリーニングアッセイを使用して容易に確認することができる。
【００９７】
実験方法
下記の化学反応は、本発明のカチオン脂質の作製のための一般的使用という面において開示されている。時として、反応が開示された範囲内の各分子種に対して、記載されるように適用できない場合もある。このことが起こる化合物は、当業者によって簡単に認識されるであろう。このようなすべてのケースにおいて、当業者の知る従来の修飾、すなわち従来の代替的な試薬への変更、または反応条件のルーチン修飾、によりどの反応も適宜行われる。
本発明は、以下の実施例を使用することにより以下に詳細に説明されるが、開示される方法は、本発明の請求の範囲により網羅されるすべてのカチオン脂質の作製に使用でき、実施例に限定されるものではない。実施例中において示される全ての温度は摂氏で補正されていない。
【実施例】
【００９８】
実施例１
カルボキシチトフェクチン：ＤＭＲＩＥ−Ｏｘの作製
ＤＭＲＩＥ  Ｂｒ（１．１４ｇ）を１８ミリリットルのジメチルホルムアミドに、緩やかに撹拌しながら溶解し、２．７１ｇのピリジニウムジクロメートを添加し、反応容器をアルゴンで完全にパージし、しっかりと栓をする。１８時間後、溶媒を減圧で除去する。残渣をエチルエーテルおよび０．２Ｎ水酸化ナトリウム間で分配する。有機層を回収し、水層を繰り返しエーテルで抽出する。合わせた有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、その後濾過して蒸発させ、粗精製物を得る。ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＮＨ4ＯＨ：Ｈ2Ｏ（９０：１０：０．２５：０．２５）を使用したシリカゲルでのクロマトグラフィーにより、精製物を得る。
実施例１Ａ：ＤＰＲＩＥカルボキシレート、および実施例１Ｂ：ＤＯＲＩＥカルボキシレートは、実施例１に記載される方法に従って、それぞれＤＰＲＩＥ  ＢｒおよびＤＯＲＩＥ  ＢｒをＤＭＲＩＥ  Ｂｒの代わりに出発物質として用いて、作製された。
【００９９】
実施例２
カルボキシチトフェクチンエステル：ＤＭＲＩＥ−Ｏｘエチルエステルの作製
実施例１のカルボキシチトフェクチン生成物、ＤＭＲＩＥ−Ｏｘ（３００ｍｇ）を７ミリリットルのクロロホルムに溶解して、３ミリリットルの１Ｎ  ＨＣｌで洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、反応容器中に濾過して入れた。無水エタノール（１００マイクロリットル）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ジクロロメタン中の０．５Ｍ溶液を１．３ミリリットル）を添加し、フラスコに栓をして、室温で一晩撹拌した。反応液を媒体ガラスフリットで濾過して、固体の副生成物を全て除去し、その後蒸発を行った。蒸発残渣の、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＮＨ4ＯＨ：Ｈ2Ｏ（９０：１０：０．２５：０．２５）とシリカゲルを使用したクロマトグラフィーにより、精製物を得た。
【０１００】
実施例３
カルボキシチトフェクチンアミド：ＤＭＲＩＥ−Ｏｘプロピルアミドの作製
ＤＭＲＩＥ−Ｏｘ（３００ｍｇ）を７ミリリットルのクロロホルムに溶解して、３ミリリットルの１Ｎ  ＨＣｌで洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、反応容器中に濾過して入れた。溶液は、氷水浴中におかれ、Ｎ−ヒドロサクシンイド（８２ｍｇ）、ついで、ジシクロへキシルカルボジイミド（ジクロロメタン中の０．５Ｍ溶液を１．３ミリリットル）を添加し、８時間温めながら撹拌して反応させた。この時点で、プロピルアミン（４０ｍｇ）をニート液（ｎｅａｔ  ｌｉｑｕｉｄ）として添加し、室温で一晩反応させた。反応液を、濾過し、その後蒸発を行った。濾過残渣のＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＮＨ4ＯＨ：Ｈ2Ｏ（９０：１０：０．２５：０．２５）とシリカゲルを使用したクロマトグラフィーにより、精製産物を得た。
実施例３Ａ：ＤＭＲＩＥカルボキシレート（メチオニン−メチルエステル）アミド、実施例３Ｂ：ＤＭＲＩＥカルボキシレート（メチオニン−ロイシン−メチルエステル）アミド、および実施例３Ｃ：ＤＭＲＩＥカルボキシレート（メチオニン−ロイシン−フェニルアラニン−メチルエステル）アミドを、実施例３のプロトコール中のプロピルアミンに相当するアミンを置き換えることにより、同様の方法により作製した。
【０１０１】
実施例４
チトフェクチン尿素：ＤＭＲＩＥ−β−メチル尿素の作製
βＡＥ−ＤＭＲＩＥ（１ｇ）を撹拌しながら、２０ミリリットルの無水のクロロホルム中に溶解し、メチルイソシアネート（１００ｍｇ）をニート液として添加した。反応液は、一晩撹拌され、その後溶媒および過剰のイソシアネートを蒸発により除去した。残渣を、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＮＨ4ＯＨ：Ｈ2Ｏとシリカゲルを使用してクロマトグラフ処理して、精製物を得た。
実施例４Ａ：γ−アミノプロピル−ＤＭＲＩＥ、メチル尿素、および実施例４Ｂ：γ−アミノブチル−ＤＭＲＩＥ、メチル尿素を、それぞれ出発物質をγ−アミノプロピル−ＤＭＲＩＥおよびγ−アミノブチル−ＤＭＲＩＥと置き換えて同様にして作製した。
【０１０２】
実施例５
チトフェクチンカルバメート：ＤＭＲＩＥ−β−メチルカルバメートの作製
ＤＭＲＩＥ（１ｍｇ）を、１５ミリリットルの無水クロロホルムに撹拌して溶解し、次いで、トリエチルアミン（１．３ミリリットル）を加えた。メチルイソシアネート（１００ｍｇ）を次いでニート液として加え、反応溶液を一晩撹拌した。反応は、２０ミリリットルのクロロホルムおよび２０ミリリットルの０．２Ｎ  ＨＣｌを順番に加えることにより終了させた。二相の混合物を約１時間撹拌し、その後、分液ロートに移して有機相を回収した。溶液は、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過、濃縮を行い、次いで高真空で処理され、泡として粗精製物を得た。この物質をＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＮＨ4ＯＨ：Ｈ2Ｏ（９０：１０：０．２５：０．２５）を使用して溶出を行うシリカゲルによるクロマトグラフで処理して、精製物を得た。
【０１０３】
実施例５Ａ：ヒドロキシプロピルＤＭＲＩＥメチルカルバメートおよび実施例５Ｂ：ヒドロキシブチルＤＭＲＩＥメチルカルバメートを、替わりの出発材料としてそれぞれヒドロキシプロピルＤＭＲＩＥとヒドロキシブチルＤＭＲＩＥを用いて同様の方法により作製した。
【０１０４】
実施例６
尿素様アミノ酸についての一般スキーム
ＤＭＲＩＥ−γＵ−Ａｒｇ（ＮＯ2）−ＯＭｅの作製：
マグネッティクスターラーを入れた乾いた反応容器をアルゴン雰囲気下に維持し、ついで１２ミリリットルの無水クロロホルムおよび３．２ミリリットルのホスゲンの１．９３Ｍトルエン溶液を入れる。撹拌しながらフラスコを氷／水浴で冷し、そこに１２ミリリットルの無水クロロホルム中に１．４０ｇのγＡＰ  ＤＭＲＩＥおよび１．２ミリリットルのトリエチルアミンを含む溶液を約５分かけて滴下する。反応液は、氷／水温度で１時間撹拌され、次いで冷浴を取り除き、２．５時間にわたり室温で反応させる。この時点で、温水浴を使用して反応液を緩やかに温める一方、乾燥アルゴン流で約１時間処理して、過剰の試薬および溶媒を蒸発させて除去した。残渣は、２０ミリリットルのクロロホルム中に再度溶解され、これに７ミリリットルのジメチルホルムアミドと１０ミリリットルのクロロホルム中に１．２０ｇのＨ−Ａｒｇ（ＮＯ2）−ＯＭｅ−ＨＣｌと０．６ミリリットルのトリエチルアミンを含有する溶液を、５分間かけて室温で撹拌しながら滴下添加し、さらにアルゴン雰囲気下において一晩、撹拌して反応させた。溶媒を蒸発により除去し、次いでクロロホルム：メタノール：アンモニア水溶媒系を使用したシリカゲルでのクロマトグラフィーにより、適当なＮＭＲ，ＩＲ，ＵＶおよび解析力の高いマススペクトルにより検証された、１．４７ｇのＴＬＣで均一な生成物が得られた。
実施例６Ａ：γ−アミノプロピル−ＤＭＲＩＥ、リジンメチルエステル尿素、および実施例６Ｂ：γ−アミノプロピル−ＤＭＲＩＥ，リジン内部塩尿素が、替わりの出発材料として、それぞれＤＭＲＩＥ−γＵ−Ｌｙｓ（ＮＯ2）−ＯＭｅおよびＤＭＲＩＥ−γＵ−Ｌｙｓ（ＮＯ2）を用いて同様に作製された。
【０１０５】
実施例７
肺内トランスフェクションアッセイ
成熟（４〜１６週）メスＢＡＬＢ／ｃマウスをメトフェンで浅く麻酔し、１００マイクロリットルＵＳＰ生理食塩水または水中の１３２μｇクロラムフェニコールアエチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ＤＮＡ±カチオン脂質を、小さなプラスチック製のカテーテルのついたディスポーザブルの滅菌プラスチック製インシュリンシリンジを使用して、経鼻的に送達した。全ての液体およびシリンジは、室温に平衡化し、１回１００マイクロリットルの容積はＤＮＡの送達が、１分未満に必要である。送達から２〜３日後、マウスはペントバルビツール酸ナトリウムの過剰投与により屠殺され、肺を以下の通りに摘出した。
【０１０６】
肺は、即座に冷凍して−７８℃で保存した。冷凍した肺は、リバーシブルドリルおよび試験管内にちょうど合う大きさのビットを使用して、１．５ミリリットルの試験管中に入れた０．４ミリリットルの凍結した溶解バッファですり合わせて、それぞれ、細かい粉末に粉砕し、粉末は抽出するまで同じ試験管内で、−７８℃において保存した。凍結された粉末を融解し、それぞれに１００マイクロリットルのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製のレポーターライシスバッファー（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ：カタログ番号Ｅ３９７Ａ）を添加した。サンプルは、１５分間ボルテックス処理し、液体窒素および室温の水浴を交互に使用して、凍結−融解を３回繰り返し、さらに１０，０００ｘｇにおいて３分間遠心分離した。別の１．５ミリリットルの試験管に上清を移し、沈殿にさらに５００マイクロリットルの溶解バッファを添加した後、抽出プロセスを（凍結−融解を行わない）繰り返した。二回目の上清を始めの上清と合わせて、−７８℃で保存した。
【０１０７】
使用したカチオン脂質は、１０，１２または１４炭素原子のいずれかのアルキル鎖を有するＤＬＲＩＥ系（ｎ＝２〜６）およびＤＯＡＰ系のものであった。ＤＯＡＰ系は、Ｒ１＝Ｒ２＝側鎖のないアルキル鎖、ｎ＝１，Ｒ３＝Ｒ４＝ＣＨ3，ｍ＝３，Ｇ＝ＮおよびＲ５＝Ｈの式２に相当する。
ＣＡＴアッセイは、Ｓａｎｋａｒａｎ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００：１８０−１８６，１９９２）の放射活性分配法またはＣＡＴ  ＥＬＩＳＡキット（ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して行われた。簡単には、ＣＡＴ組織ホモジネートを、エタノール／ドライアイス浴中にて凍結−融解を３回繰り返すことによって破壊した。細胞の破片を遠心分離で取り除き、たんぱく質抽出物を14Ｃ−クロラムフェニコールおよびアセチルＣｏＡとともにインキュベートした。クロラムフェニコールをエチルアセテートで抽出し、薄層クロマトグラフィーを行って、抽出細胞たんぱく質により変換された14Ｃ−クロラムフェニコールのパーセントを測定した。細胞抽出物は、２０分間インキュベートした２μｇたんぱく質に標準化した。組織抽出物は、４時間インキュベートした２００μｇたんぱく質に標準化した。
【０１０８】
標準曲線は、肺抽出物中に加えた精製酵素（シグマ社、セントルイス、ミズーリー州）または、ＥＬＩＳＡキットに添付の酵素を使用して作成した。二種類のＣＡＴアッセイ法は、同じ組の抽出物から得たサンプル当たり、同一のｐｇＣＡＴを与えた。図２および３に結果をまとめる。ＤＬＲＩＥ系については、一級アミンをいれる最も有効な第四窒素からの距離は、４炭素（ｎ＝４）であった（図２）。図３は、ＤＯＡＰ系についてのトランスフェクション効率に与えるアルキル鎖長の影響を調べたもので、肺ＤＮＡトランスフェクションを媒介するにあたり、Ｃ１０またはＣ１４化合物に比べてＣ１２化合物が有意に有効であることを示している。図４は、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥに対して、アミノ酸結合化合物Ｇｌｙ−Ｇ−ＤＬＲＩＥおよびＬｙｓ−Ｇ−ＤＬＲＩＥの活性を比較したものである。Ｇｌｙ−Ｇ−ＤＬＲＩＥは、げっ歯類肺システムにおいて、特に有効であった。図４は、グリシンのような非荷電、非極性アミノ酸の結合は、チトフェクチン核構造に対して、リジンのような荷電、極性アミノ酸により得られるよりも高いレベルのトランスフェクション効率を与える可能性を示している。
【０１０９】
ここで報告されるテストは、本発明の化合物がトランスフェクションにおいて活性であることを示すのみならず、特定の組織のトランスフェクションに対して、チトフェクチンを選択、最適化する方法を示すものである。このアッセイに対して特に最適な構造は、容易に分かるが、これらの結果は組織に対して特異的であること、すなわち、このアッセイにおいては最適でなかったチトフェクチンでも、インビトロトランスフェクションおよび腹腔内トランスフェクションなどの別のアッセイにおいては有効な活性を有することが理解されよう。
【０１１０】
実施例８
インビトロトランスフェクションにおける配合の効果：
ＧＭＵ−ＤＭＲＩＥとＤＭＲＩＥの比較
チトフェクチン：ＤＭＲＩＥまたはＧＭＵ−ＤＭＲＩＥのクロロホルム溶液を、重量対容積（ｗ／ｖ）ベースで作製した。１ミリリットルの水性ビヒクルで還元した際に所望の脂質の相対および絶対濃度を与えるように計算された量のカチオン脂質および中性脂質（使用する場合には）を、無菌的に滅菌バイアルに入れた。大半のクロロホルムを乾燥窒素流により除去し、バイアルを高真空で一晩処理して残存する溶媒を全て除去した。
ＤＮＡ−脂質複合体：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、５ｍｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡおよび乾燥され配合されたチトフェクチン−中性脂質配合混合物をＯＰＴＩＭＥＭTM（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中に懸濁して、表中に示される通り、９６穴プレート中において所望の質量／分子比率で混合した。ＤＮＡ−脂質複合体は、混合後２時間以内に細胞に添加された。
【０１１１】
トランスフェクション
細胞株：使用された細胞株は、以下の通りで、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド州）から入手した：ＣＯＳ７サル腎臓細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、およびＣ２Ｃ１２マウス筋芽筋肉細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７７２）。
全ての細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびダルベコの改良イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）中で１：５から１：１０で継代された。全ての細胞を、受け取った後、１０倍加継代を経して増殖させ、一部を凍結保存した。再度増殖させた後、全ての細胞は、さらに１０継代する前にトランスフェクションの研究に使用された。
【０１１２】
トランスフェクションアッセイ：０日目に、１０％ＦＥＢＳ／９０％ＤＭＥＭ１００マイクロリットル中の２０，０００個の細胞を、９６穴培養プレート（Ｎｕｎｃ）の各ウエルに植えつけ、５％ＣＯ2インキュベーター中３７℃で一晩培養した。１日目に、細胞を吸い込まないように気をつけて培地を吸い上げ、１００マイクロリットルの、血清を含有しないＯＰＴＩＭＥＭTM（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中のＧＭＵ−ＤＭＲＩＥ／ｐＲＳＶ  ｌａｃＺ／ＤＯＰＥを添加した。ＤＭＲＩＥは、参照用の標準として使用した。ｌａｃＺ遺伝子は、酵素βガラクトシダーゼをコードし、比色分析でアッセイできる。カチオン脂質：ＤＯＰＥ比は、各ウエルによって異なった。培養４時間後、５０マイクロリットルの３０％ＦＢＳ／７０％ＯＰＴＩＭＥＭTMを各ウエルに添加した。２日目、各ウエルに１００マイクロリットルの１０％ＦＥＢＳ／９０％ＯＰＴＩＭＥＭTMを入れた。３日目に、培地を除去し、５０マイクロリットルの溶解バッファ（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，ｐＨ８．０）を添加し、プレートを７０℃で少なくとも２０時間保存した。融解後、β−ガラクトシダーゼ酵素活性の内容について、ウエルの培地をＦｅｌｇｎｅｒ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０−２５６１，１９９４）によってアッセイした。
【０１１３】
結果（図１ａ−１ｄ）は、ＣＯＳ７細胞およびＣ２Ｃ１２細胞におけるβ−ｇａｌの総発現は、どちらの細胞株においても、ＧＭＵ−ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ比が５０：５０であるときに最適であったことを示している。さらに、ＣＯＳ７細胞において、ＧＭＵ−ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ比が７５：２５である場合も非常に有効であった。β−ｇａｌ発現のピークは、ＣＯＳ７細胞において、ＧＭＵ−ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ比が７５：２５または５０：５０のときに起こった。Ｃ２Ｃ１２細胞においては、同程度のＧＭＵ−ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ比において、β−ｇａｌ活性のピークが得られた。ＧＭＵ−ＤＭＲＩＥのみの比率を使用すると、いずれの細胞株においても、総β−ｇａｌ発現は有意に低下した。ＧＭＵ−ＤＭＲＩＥは、ＣＯＳ７細胞において、ＤＭＲＩＥによるよりもより高いレベルの活性を与えた。Ｃ２Ｃ１２細胞において、ＧＭＵ−ＤＭＲＩＥは、ＤＭＲＩＥによりも有意に高いレベルの総活性を与えた。これらのテストにおいて使用されたスクリーニングアッセイは、トランスフェクション活性を示したり、チトフェクチン／補助脂質の比率を最適化するのに有用である。
【０１１４】
実施例９
腹腔内腫瘍アッセイ
５００マイクロリットルのＲＰＭＩ中、２００，０００個のげっ歯類Ｂ１６腫瘍細胞を、０日目にＣ５７／Ｂ１６マウスの腹腔内に注射した。７から１４日目において、マウスに１０：１のチトフェクチン、ＤＮＡモル比でチトフェクチンを含有する１．５ミリリットル生理食塩水中の０．５ｍｇのＣＡＴ  ＤＮＡの腹腔内注射を行った。使用されたカチオン脂質はＤＭＲＩＥ，ＧＡＰ−ＤＭＲＩＥ，ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ、およびＧＭＵ−ＤＬＲＩＥであった。二日後に、腫瘍を回収し、抽出して実施例７に記載されるとおりにＣＡＴ活性を計測した。図５では、チトフェクチン配合で見られたＣＡＴ活性を、ＤＮＡ単独を投与した対照と比較している。各カチオン脂質は、腫瘍細胞中において有意にＣＡＴ発現を与え、細胞内におけるＣＡＴ  ＤＮＡの侵入と機能発現を示した。ＣＡＴ活性は、ＤＭＲＩＥでトランスフェクションされた細胞において最大であった。ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥは、ＤＭＲＩＥとほぼ同じ効力を示し、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥおよびＧＡＰ−ＤＭＲＩＥも有意な活性を示した。
図５は、第四窒素の３炭素以内に第一アミンを有するチトフェクチンは、腹腔内腫瘍アッセイにおいて有効なＤＮＡトランスフェクションを与えることを示している。
【０１１５】
実施例１０
筋肉内アッセイ
大腿四頭筋を固定された意識のあるマウスに、５０マイクロリットルＵＳＰ生理食塩水中の５０μｇのルシフェラーゼまたはＣＡＴ  ＤＮＡ±チトフェクチンを、２８Ｇ  １／２針（ベックマン−ディキンソン）および黄色いエッペンドルフマイクロピペットのチップから切断したプラスチックカラーを付けたディスポーザブルのプラスチック製インシュリンシリンジを使用して注射する。カラーの長さは、針のオリフィスの侵入が、直径３ｍｍの大腿直筋の中央部分内におよそ２ｍｍの距離までに制限されるように調整する。注射液およびシリンジは、室温に平衡化し、１回５０マイクロリットルの量の生理食塩水−ＤＮＡの注射に数秒をかける。注射後、様々な時間において、完全な大腿四頭筋グループ（湿重量で１４０〜１８０ｍｇ）を各マウスの足から採取する。筋肉は、冷凍し、実施例７に記載されるように溶解される。
ルシフェラーゼ活性は、自動マイクロプレートルミノメーター（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ＭＬ２２５０）を使用して測定した。１００マイクロリットルのルシフェラーゼ基質が、ルミノメーターのインジェクションシステムによって２０マイクロリットルの抽出物に添加され、サンプル光単位が記録される。サンプルのルシフェラーゼ含有量は、注射を受けない筋肉抽出物の存在下で実施された精製ホタルルシフェラーゼの標準曲線を使用した相対光単位から計算された。注射をした筋肉の抽出物に存在するルシフェラーゼ活性は、注射をしない筋肉の抽出物における活性よりはるかに高い。
このアッセイは、特定の組織中において使用するための特定のチトフェクチンの構造を最適化するための別のスクリーニングアッセイを説明するものである。
【０１１６】
実施例１１
ブタ動脈中およびアテローム硬化ウサギ動脈中への遺伝子移入
ブタ動脈のリポロームトランスフェクションが、文献に記される通りに、麻酔、挿管、および腸骨大腿骨動脈の無菌的暴露により行われた（Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１２８５−１２８８、１９９０）。ダブルバルーンカテーテルを腸骨大腿骨動脈に挿入し、基部バルーンを５分間にわたり５００ｍｍＨｇまで膨らませる。バルーンをしぼませて、基部および遠位末端バルーンの間の中央スペースがヘパリン含有生理食塩水で満たされるようにカテーテルを進める。ＣＡＴ  ＤＮＡ溶液（ＣＡＴ  ＤＮＡ±チトフェクチン）を、カテーテルの中央スペースに２０分間注入する。カテーテルを除去し、反勾配の血流が復活される。動脈は、組換えＣＡＴ発現について、二日後に分析される。カチオン脂質存在下でＣＡＴ  ＤＮＡによるトランスフェクションを受けた動脈は、ＤＮＡのみと接触した動脈に比較してＣＡＴ遺伝子発現が有意に増大している。
【０１１７】
アテローム硬化ウサギ腸骨動脈のインビボ遺伝子移入は、Ｆａｘｏｎ他の記載する（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，４：１８９−１９５，１９８４）ダブルインジャリーモデルを使用して行われる。二回目の血管形成損傷を行った後、カテーテルのエンドホールドインフュージョンポートが損傷の基部末端にくるように、血管形成バルーンをすこし引く。損傷の遠位末端に結紮を作り、損傷部分をヘパリン含有生理食塩水で洗い流し、ＣＡＴ  ＤＮＡ±カチオン脂質リポソーム溶液を単離された損傷部分中に２０分間注入する。カテーテルを抜き、反勾配の血流が復活される。動脈は、組換えＣＡＴ発現について、二日後に分析される。カチオン脂質存在下でＣＡＴ  ＤＮＡによるトランスフェクションを受けた動脈は、ＤＮＡのみと接触した動脈に比較してＣＡＴ遺伝子発現が有意に増大している。
【０１１８】
さらに労力を要することなく、当業者は、先の記録を使用して、本発明を最大限度に利用することができるものと考えられる。本発明は、本質的な特徴の精神から逸脱することなく、他の特定の形態で実施することができる。記載された実施例は、全ての面において、限定的なものではなく、説明するためだけのものであるとみなされ、したがって本発明の範囲は前述の記載によってではなく、添付の請求の範囲により示されるものである。請求の範囲の意味および法律上同等である範囲内にある全ての変更は、その範囲内に含まれるものである。
【０１１９】
【化３６】
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【０１２０】
【化３７】
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【０１２１】
【化３８】
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【０１２２】
【化３９】
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【０１２３】
【化４０】
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【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１Ａ】図１Ａは、ＣＯＳ７細胞において、異なるＧＭＵ−ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥ比率により得られた総β−ｇａｌ発現レベルを示すグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣＯＳ７細胞において、異なるＧＭＵ−ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥ比率により得られたピークβ−ｇａｌ発現を示すグラフである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ｃ２Ｃ１２細胞において、異なるＧＭＵ−ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥ比率により得られた総β−ｇａｌ発現を示すグラフである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、Ｃ２Ｃ１２細胞において、異なるＧＭＵ−ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥ比率により得られたピークβ−ｇａｌ発現を示すグラフである。
【図２】図２は、トランスフェクションが、異なる鎖長のアルキルアミン部分を有するチトフェクチンに介在された場合の、マウス肺でのＣＡＴの肺発現に関するグラフである。
【図３】図３は、トランスフェクションが、Ｃ10-14のアルキル鎖を有するチトフェクチンに介在された場合の、マウス肺でのＣＡＴの肺発現に関するグラフである。
【図４】図４は、げっ歯類肺アッセイにおける、アミノ酸の結合した化合物Ｇｌｙ−Ｇ−ＤＬＲＩＥおよびＬｙｓ−Ｇ−ＤＬＲＩＥのＧＡＰ−ＤＬＲＩＥに相対的な活性を示す。
【図５】図５は、マウス腫瘍モデルにおける三種類のチトフェクチンの腹腔内トランスフェクション活性を比較するグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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