(57)【要約】【課題】電気泳動等の処理を必要とせずに、増幅反応後、反応チューブ内で直ちに増幅の有無を検出することのできる、ＤＮＡ増幅検出法を提供する。【解決手段】ＤＮＡ増幅反応の温度よりも融点が高いパラフィンワックスにＤＮＡと特異的に反応する染料水溶液を内包させたマイクロカプセルを用い、このマイクロカプセルの存在下において、ＤＮＡ増幅反応を進行させ、ＤＮＡ増幅反応後に反応液を加熱してマイクロカプセルからＤＮＡと特異的に反応する染料水溶液を放出させ、反応液の色の変化に基づきＤＮＡ増幅の有無又は程度を検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ溶液にＤＮＡと特異的に反応する染料を添加し、ＤＮＡ溶液の色の変化に基づきＤＮＡ濃度を推定することを特徴とするＤＮＡ濃度推定法。
【請求項２】
ＤＮＡ増幅反応後の反応液にＤＮＡと特異的に反応する染料を添加し、反応液の色の変化に基づきＤＮＡ増幅の有無又は程度を検出することを特徴とするＤＮＡ増幅検出法。
【請求項３】
ＤＮＡ増幅反応の温度よりも融点が高いパラフィンワックスにＤＮＡと特異的に反応する染料水溶液を内包させたマイクロカプセルを用い、このマイクロカプセルの存在下において、ＤＮＡ増幅反応を進行させ、ＤＮＡ増幅反応後に反応液を加熱してマイクロカプセルからＤＮＡと特異的に反応する染料水溶液を放出させ、反応液の色の変化に基づきＤＮＡ増幅の有無又は程度を検出することを特徴とするＤＮＡ増幅検出法。
【請求項４】
前記マイクロカプセルは、ＤＮＡと特異的に反応する染料と水溶性界面活性剤とを溶解した水溶液を溶融した融点が７０〜８５℃のパラフィンワックスに分散させてＷ／Ｏ分散系を調製し、油溶性界面活性剤を含むシリコーン油と前記Ｗ／Ｏ分散系を混合して（Ｗ／Ｏ）／Ｏ分散系を調整し、その後、前記（Ｗ／Ｏ）／Ｏ分散系を冷却してパラフィンワックスを固化させることで製造されたことを特徴とする請求項３記載のＤＮＡ増幅検出法。
【請求項５】
前記水溶液中の水溶性界面活性剤の含有量が、９〜１１質量％であること特徴とする請求項４記載のＤＮＡ増幅検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ濃度推定方法及びＤＮＡ増幅検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ（polymerase chain reaction）やＬＡＭＰ（Loop mediated isothermal amplification）等は生物の遺伝子情報（ＤＮＡ）の一部分を特異的に数万倍以上に増幅する（ＤＮＡ増幅）ことにより、サンプル中に標的生物が存在するかどうかを視認できる。これらは、他の方法と比較して高感度かつ短時間で検出が可能となるため、様々な分野で普及している（例えば、特許文献１を参照）。
【特許文献１】特開２００１−２４２１６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
以上の技術は通常、増幅の有無を視認するために電気泳動等の処理を行うが、１つ以上の専用の検出装置と３０分〜２時間程度の操作時間を必要とするという問題があった。また、この操作の際に反応産物が飛散して未反応のサンプルに混入し、本来、陰性反応となるべきサンプルが陽性と判定されてしまうことが起こりうるという問題があった。
【０００４】
そこで、本発明は、電気泳動等の処理を必要とせずに、増幅反応後、反応チューブ内で直ちに増幅の有無を検出することのできる、ＤＮＡ増幅検出法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の請求項１記載のＤＮＡ濃度推定法は、ＤＮＡ溶液にＤＮＡと特異的に反応する染料を添加し、ＤＮＡ溶液の色の変化に基づきＤＮＡ濃度を推定することを特徴とする。
【０００６】
本発明の請求項２記載のＤＮＡ増幅検出法は、ＤＮＡ増幅反応後の反応液にＤＮＡと特異的に反応する染料を添加し、反応液の色の変化に基づきＤＮＡ増幅の有無又は程度を検出することを特徴とする。
【０００７】
本発明の請求項３記載のＤＮＡ増幅検出法はＤＮＡ増幅反応の温度よりも融点が高いパラフィンワックスにＤＮＡと特異的に反応する染料水溶液を内包させたマイクロカプセルを用い、このマイクロカプセルの存在下において、ＤＮＡ増幅反応を進行させ、ＤＮＡ増幅反応後に反応液を加熱してマイクロカプセルからＤＮＡと特異的に反応する染料水溶液を放出させ、反応液の色の変化に基づきＤＮＡ増幅の有無又は程度を検出することを特徴とする。
【０００８】
本発明の請求項４記載のＤＮＡ増幅検出法は、請求項３において、前記マイクロカプセルは、ＤＮＡと特異的に反応する染料と水溶性界面活性剤とを溶解した水溶液を溶融した融点が７０〜８５℃のパラフィンワックスに分散させてＷ／Ｏ分散系を調製し、油溶性界面活性剤を含むシリコーン油と前記Ｗ／Ｏ分散系を混合して（Ｗ／Ｏ）／Ｏ分散系を調整し、その後、前記（Ｗ／Ｏ）／Ｏ分散系を冷却してパラフィンワックスを固化させることで製造されたことを特徴とする。
【０００９】
本発明の請求項５記載のＤＮＡ増幅検出法は、請求項４において、前記水溶液中の水溶性界面活性剤の含有量が、９〜１１質量％であること特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の請求項１記載のＤＮＡ濃度推定法によれば、極めて簡単な操作でＤＮＡ濃度を推定することができる。
【００１１】
本発明の請求項２記載のＤＮＡ増幅検出法によれば、電気泳動等の処理を必要とせずに、増幅反応後、反応チューブ内で直ちに増幅の有無を検出することができる。
【００１２】
本発明の請求項３記載のＤＮＡ増幅検出法によれば、反応後、チューブを開ける必要がないため、開封操作による反応産物の混入を防ぐことができる。
【００１３】
本発明の請求項４記載のＤＮＡ増幅検出法によれば、マイクロカプセルは、常温において内包した染料水溶液の漏洩が全くなく、かつ、ＤＮＡ増幅反応に適した温度よりも高い温度である７０〜８５℃において確実に溶融してＤＮＡと特異的に反応する染料水溶液を放出するので、ＤＮＡ増幅の検出をより確実なものとすることができる。
【００１４】
本発明の請求項５記載のＤＮＡ増幅検出法によれば、マイクロカプセルからの染料水溶液の漏洩をより確実に防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明のＤＮＡ濃度推定方法及びＤＮＡ増幅検出法について説明する。
【００１６】
ＤＮＡと特異的に反応する染料であるアズールＢ、クリスタルバイオレッド、ニュートラルレッド、ナイルブルー、メチレンブルー等を適当な濃度の水溶液に調製した後、適量をＤＮＡ溶液に混合すると一定濃度以上のＤＮＡが溶液に含まれていた場合、混合液の色が変化する。
【００１７】
この変化はＤＮＡと特異的に反応する染料の添加後、直ちに起こり、溶液の混合以外の処理を一切必要としない。また、この反応は溶液中のＤＮＡ濃度と染料の濃度に相関するため、反応の有無または程度によりＤＮＡ濃度の推定が可能となる。したがって、ＤＮＡと特異的に反応する染料の濃度と添加量を加減することで、様々なＤＮＡ濃度の推定が可能となる。
【００１８】
以上のＤＮＡと特異的に反応する染料を用いたＤＮＡ濃度の推定方法を利用し、ＤＮＡ増幅反応後の反応液にＤＮＡと特異的に反応する染料を添加することによって、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法等のＤＮＡ増幅反応によるＤＮＡの増幅の有無又は程度を検出することができる。
【００１９】
一例を挙げると、反応液に対して体積にして１０分の１の量の０．１質量％アズールＢ水溶液を添加すると、ＤＮＡ濃度が２０ｎｇ／μｌ以下なら溶液の色は変化しないが、３０ｎｇ／μｌ以上の場合、溶液の色が２０ｎｇ／μｌ以下の場合と区別ができる。このように、ＤＮＡと特異的に反応する染料の添加量を加減することで、ＤＮＡの濃度の推定が可能となる。
【００２０】
なお、一般に、ＰＣＲやＬＡＭＰに鋳型として用いるＤＮＡの量は１０ｎｇ／μｌ以下であり、また増幅反応はＤＮＡを１億倍以上に増幅するため、増幅後の溶液中のＤＮＡ濃度は１００ｎｇ／μｌを下回ることはない。したがって、本発明のＤＮＡ増幅検出法によれば、確実にＤＮＡの増幅の有無又は程度を検出することができる。
【００２１】
このように、目視により染料の色の変化を観察することによって溶液中のＤＮＡ濃度を推定することができるため、電気泳動等の処理を行うための特別な装置を用いる必要がない。したがって、ＤＮＡの増幅の有無又は程度の検出にかかる費用及び時間を削減できる。
【００２２】
また、本発明のＤＮＡ増幅検出法は、ＤＮＡ増幅反応の温度よりも融点が高いパラフィンワックスにＤＮＡと特異的に反応する染料水溶液を内包させたマイクロカプセルを用い、このマイクロカプセルの存在下において、ＤＮＡ増幅反応を進行させ、ＤＮＡ増幅反応後に反応液を加熱してマイクロカプセルからＤＮＡと特異的に反応する染料水溶液を放出させ、反応液の色の変化に基づきＤＮＡ増幅の有無又は程度を検出するものである。
【００２３】
このように、温度条件により非接触で崩壊する機能を有するマイクロカプセルを用いることによって、ＤＮＡ増幅反応後、操作の途中で染料水溶液を添加する必要がなくなる。したがって、操作中の不純物混入を確実に防止することができるとともに、ＤＮＡ増幅検知のための操作を簡略化することができる。
【００２４】
また、ＤＮＡと特異的に反応する染料は、サンプル中の生物由来のＤＮＡとも反応し、ＤＮＡ増幅反応を阻害するという問題があるが、この方法によれば、増幅反応中は染料を反応液と隔離しておき、反応後に染料を反応液と混合することが可能となり、その問題を解決することができる。
【００２５】
ここで用いられるマイクロカプセルは、ＤＮＡと特異的に反応しＤＮＡ増幅の検出に用いられる染料、例えば、アズールＢやメチルオレンジ、又はクリスタルバイオレッド、ニュートラルレッド、ナイルブルー、メチレンブルーなどの水溶液を内包したものである。シェル材としては、例えば、融点がＤＮＡ増幅反応に適した温度である６５℃よりも高い７０〜８５℃の範囲内にあるパラフィンワックス、例えば、融点が７５℃のパラフィンワックスが用いられている。パラフィンは固有の融点を持ち、一定温度以下では固体、一定温度以上では液体であるため、パラフィンをシェル材とすることにより、反応液の温度を制御して、ＤＮＡと特異的に反応する染料を反応液中に放出させることが可能となる。
【００２６】
上記のマイクロカプセルは、例えば、以下のように製造することができる。
【００２７】
まず、ＤＮＡと特異的に反応する染料と水溶性界面活性剤とを溶解した水溶液を溶融した融点が７０〜８５℃のパラフィンワックスに分散させてＷ／Ｏ分散系を調製する。
【００２８】
ここで、前記水溶液中の水溶性界面活性剤の含有量は、８〜１２質量％とするのが好ましい。そうすることによって、染料の仕込み量に対するマイクロカプセルに包含される染料の割合、すなわち染料包含率が最大になり、かつ、マイクロカプセルからの染料の漏洩率が最低になる。
【００２９】
つぎに、油溶性界面活性剤を含むシリコーン油と前記Ｗ／Ｏ分散系を混合して（Ｗ／Ｏ）／Ｏ分散系を調整する。その後、前記（Ｗ／Ｏ）／Ｏ分散系を冷却してパラフィンワックスを固化させる。
【００３０】
このように製造することによって、パラフィンワックスの融点よりも低い温度では、内包した水溶液の漏洩が全くなく、用いたパラフィンワックスの融点において確実に溶融、崩壊して、芯物質の染料水溶液を放出することのできるマイクロカプセルを得ることができる。
【００３１】
以下、具体的な実施例について説明する。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内で変形実施可能である。
【実施例１】
【００３２】
ＤＮＡと特異的に反応する染料を用いたＤＮＡ濃度の推定
ＤＮＡと特異的に反応する染料であるアズールＢ、クリスタルバイオレッド、メチレンブルーを種々の濃度の水溶液に調製した。そして、種々の濃度のＤＮＡ溶液に対して体積にして１０分の１の量の染料水溶液をそれぞれ混合して、混合液の色を目視観察した。その結果を図１に示す。
【００３３】
なお、図１において、アズールＢを「ＡｚｕｒＢ」、クリスタルバイオレッドを「ＣＶ」、メチレンブルーを「ＭＢ」と表記し、百分率はそれぞれの水溶液中の質量％を表示している。また、１，５，１０，・・・，５００の数字は、ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μｌ）を示す。
【００３４】
例えば、０．１質量％アズールＢ水溶液を混合した場合、ＤＮＡ濃度が２０ｎｇ／μｌ以下なら溶液の色は変化しないが、３０ｎｇ／μｌ以上の場合、溶液の色が２０ｎｇ／μｌ以下の場合と区別ができた。したがって、０．１質量％アズールＢ水溶液を用いて溶液の色が変化した場合には、ＤＮＡ濃度が３０ｎｇ／μｌ以上であると推定できることが確認された。
【００３５】
そして、ＤＮＡと特異的に反応する染料の濃度と添加量を加減することで、様々なＤＮＡ濃度の推定が可能となることがわかった。
【実施例２】
【００３６】
ＤＮＡと特異的に反応する染料を用いたＤＮＡ増幅の検出
反応チューブにＬＡＭＰ反応試薬、鋳型となるＤＮＡ及び鋳型となるＤＮＡの一部を増幅するように設計されたプライマーを添加し、６５℃で３０分間反応させたところ、電気泳動法によりＤＮＡの増幅が確認された。比較のために、増幅領域が含まれない鋳型ＤＮＡを用いたものと、鋳型ＤＮＡを加えなかったもので同様に反応させた場合は、増幅は確認されなかった。
【００３７】
反応液に対して体積にして１０分の１の量の０．１質量％アズールＢ水溶液を添加すると、増幅が起きた反応液のみ反応液の色が明るい青に変化し、増幅が起きなかった反応液と容易に区別することができた。反応液の色を観察することにより、極めて短時間でＤＮＡ増幅の有無を検出可能であることが確認された。
【実施例３】
【００３８】
マイクロカプセルの調製
融点７５℃のパラフィンワックス（Ｏ相）２０ｇ中に、濃度１．０質量％のアズールＢ水溶液１０ｍｌを添加混合し、毎分５０００回転で１０分間撹拌することにより、Ｗ／Ｏ分散系を調製し、これを分散相とした。なお、アズールＢ水溶液は、水溶性界面活性剤の添加量の影響を調べるために、水溶性界面活性剤（Poem PR-100）を０、２．０、５．０、７．５、１０、１２質量％の濃度で含有するものを用いて、それぞれ同様の条件で分散相を調製した。
【００３９】
一方、２．０質量％の油溶性界面活性剤（Poem Joo21）を溶解したシリコーン油を連続相とした。
【００４０】
そして、上記の分散相を、それぞれ、３００ｇの連続相中に添加混合し、８５℃に保温しながら毎分２００回転で５分間撹拌することにより、（Ｗ／Ｏ）／Ｏ分散系を調製した。その後、この分散系を毎分２００回転で撹拌しながら冷却して、パラフィンワックスを固化させることにより、染料水溶液を包含したマイクロカプセルを調製した。
【００４１】
染料含有量の界面活性剤濃度への依存性
図２に、染料含有量の界面活性剤濃度への依存性を示す。濃度が増加するとともに含有量は増加し、７．５、１０質量％の濃度で仕込み量基準の含有量となり、染料包含率が１００％となった。これは、界面活性剤は濃度の増加とともに分子集合体としてのミセルや第３相を形成するようになり、ここに染料水溶液が可溶化されたことによると思われる。さらに、濃度を増加させると１２質量％では含有量が低下した。これは、１２質量％以上の高濃度では、パラフィンワックス内での分子集合体や第３相の割合が増加し、（Ｗ／Ｏ）滴としての安定性が低下したことによるものと思われる。したがって、水溶性界面活性剤（Poem PR-100）の濃度には最適値があることが分かった。
【００４２】
また、連続相として疎水性の強いシリコーン油を採用することにより、マイクロカプセル調製工程における芯物質の染料水溶液の漏洩が防止されるものと思われる。
【００４３】
マイクロカプセル径の界面活性剤濃度への依存性
図３に、マイクロカプセル径の界面活性剤濃度への依存性を示す。マイクロカプセル径は濃度によらず、平均粒径２５０μｍでほぼ一定となっている。これは、パラフィンワックス内では分子集合体や第３相を形成しているので、油相と水相との界面への界面活性剤の吸着量が飽和になっていることによる。
【００４４】
マイクロカプセルからの染料の漏洩
図４に、調製したマイクロカプセルからの染料の漏洩を測定した結果を示す。界面活性剤の濃度が増加するにつれて漏洩が抑制されていること、濃度１０質量％では全く漏洩しないこと、さらに高濃度の１２質量％では漏洩することが分かった。
【００４５】
これらの結果は、図２の結果とよく対応しており、界面活性剤により、染料水溶液の可溶化、安定化が促進されることが確認された。
【００４６】
マイクロカプセルの温度応答性
図５に、マイクロカプセルの温度応答性の測定結果を示す。マイクロカプセルを添加した連続水相の温度が７５℃以下では、マイクロカプセルが溶融しないため染料の放出は観測されないが、７５℃以上になるとマイクロカプセルは溶融崩壊して染料が放出された。
【００４７】
このことから、マイクロカプセルの温度応答性が確認された。
【００４８】
マイクロカプセルの光学顕微鏡写真
図６に、調製したマイクロカプセルの光学顕微鏡写真を示す。青色の染料水溶液が包含されている良好なマイクロカプセルが得られたことが確認された。
【実施例４】
【００４９】
マイクロカプセルを用いたＤＮＡ増幅の検出
反応チューブにＬＡＭＰ反応試薬、鋳型となるＤＮＡ、鋳型となるＤＮＡの一部を増幅するように設計されたプライマー及び実施例３で調製した１質量％のアズールＢ水溶液を内包する熱応答カプセルを添加し、６５℃で３０分間反応させた。なお、この反応はマイクロカプセルの崩壊温度以下で進行させたため、マイクロカプセルは崩壊しなかった。
【００５０】
反応後、７５℃以上に５分間保温したところ、マイクロカプセルが崩壊してアズールＢ水溶液が放出された。反応液の色は明るい青となり、ＤＮＡが増幅されたことが確認された。
【００５１】
また、比較のために、増幅領域が含まれない鋳型ＤＮＡを用いたものと、鋳型ＤＮＡを加えなかったものについて上記と同様に操作を行った場合は、反応液の色に変化は見られなかった。
【００５２】
以上のように、反応液の色を観察することによって、反応チューブを開封することなく、増幅の有無を目視で容易に区別することができた。
【００５３】
なお、本実施例ではマイクロカプセルを溶液内に添加したが、チューブ壁面又は蓋など、反応チューブ内のいずれかの部位に固定してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】種々の濃度のＤＮＡ溶液に対して種々の濃度の染料水溶液を混合したときの色の変化を示す表である。
【図２】染料含有量の界面活性剤濃度への依存性を示すグラフである。
【図３】マイクロカプセル径の界面活性剤濃度への依存性を示すグラフである。
【図４】調製したマイクロカプセルからの染料の漏洩を測定した結果を示すグラフである。
【図５】マイクロカプセルの温度応答性の測定結果を示すグラフである。
【図６】調製したマイクロカプセルの光学顕微鏡写真である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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