(57)【要約】【課題】癌の治療又は予防に有用な癌の治療及び／又は予防剤を提供すること。【解決手段】イヌ精巣由来ｃＤＮＡライブラリーと担癌犬の血清を用いたSEREX法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得し、そのｃＤＮＡを基にして、特定の新規なアミノ酸配列を有するポリペプチドを作製した。該ポリペプチドは、生体に投与すると既に生じている腫瘍を退縮させることができるため、癌の治療及び／又は予防に有用である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)ないし(c)のいずれかのポリペプチドであって、抗癌活性を有するポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該ポリペプチドを生体内で発現可能な組換えベクターを有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤。
(a)  配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド。
(b)  (a)のポリペプチドと８０％以上の相同性を有し、７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド。
(c)  (a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド、又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドである、請求項１記載の癌の治療及び／又は予防剤。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸から成るポリペプチドである請求項２記載の癌の治療及び／又は予防剤。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項３記載の癌の治療及び／又は予防剤。
【請求項５】
イヌ又はネコ用である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の癌の治療及び／又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な癌の治療及び／又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩で癌に反応する細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原や癌抗原をコードする遺伝子が同定されてき、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている（非特許文献１を参照）。免疫療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチド又はタンパクは、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが必要とされる。１９９１年、ベルギーLudwig研究所のBoonらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献２を参照）。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する、SEREX(serological identifications of antigens by recombinant expression cloning)法が報告され（非特許文献３；特許文献１）、各種癌抗原が単離されてきた（非特許文献４−９を参照）。その一部をターゲットにして癌免疫療法の臨床試験も開始されている。
【０００３】
一方、ヒトと同様、イヌやネコにも乳腺腫瘍、扁平上皮癌など多数の腫瘍が知られており、イヌやネコの疾病統計でも上位にランクされている。しかしながらイヌやネコの癌に対する有効な治療薬、予防薬および診断薬は現在のところ存在しない。大部分のイヌやネコの腫瘍は、進行して腫瘤が大きくなってから飼い主が気付くケースがほとんで、来院して外科的手術により切除したり、人体薬（抗癌剤など）を投与しても、すでに手遅れで処置後まもなく死亡することが多い。このような現状の中で、イヌやネコに有効な癌の治療薬、予防薬および診断薬が入手可能になれば、イヌの癌に対する用途が開かれると期待される。
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５６９８３９６号
【非特許文献１】秋吉毅，「癌と化学療法」、１９９７年、第２４巻、ｐ551-519
【非特許文献２】Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647(1991)
【非特許文献３】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813(1995)
【非特許文献４】Int.J.Cancer,72:965-971(1997)
【非特許文献５】Cancer Res., 58:1034-1041(1998)
【非特許文献６】Int.J.Cancer,29:652-658(1998)
【非特許文献７】Int.J.Oncol.,14:703-708(1999)
【非特許文献８】Cancer Res., 56:4766-4772(1996)
【非特許文献９】Hum. Mol. Genet６：33-39, 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、癌の治療又は予防に有用な癌の治療及び／又は予防剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、イヌ精巣由来cDNAライブラリーと担癌犬の血清を用いたSEREX法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするcDNAを取得し、そのｃＤＮＡを基にして、該タンパク質のアミノ酸配列を同定した。そして、該アミノ酸配列を基に作製された組換えポリペプチドが生体内で抗体を誘導できること、該組換えポリペプチドを生体に投与することにより、既に生じている腫瘍を退縮させることができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の(a)ないし(c)のいずれかのポリペプチドであって、抗癌活性を有するポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該ポリペプチドを生体内で発現可能な組換えベクターを有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤を提供する：(a)  配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド、(b)  (a)のポリペプチドと８０％以上の相同性を有し、７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド、(c)  (a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、癌の治療及び／又は予防に有用な新規癌の治療及び／又は予防剤が提供された。下記実施例において具体的に示されるように、本発明で用いられるポリペプチドを担癌イヌに投与すると、既に生じている腫瘍を退縮させることができるので、本発明の癌の治療及び／又は予防剤は癌の治療や予防に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の癌の治療及び／又は予防剤に有効成分として含まれるポリペプチドとしては、以下のものが挙げられる。なお、本発明において、「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が多いポリペプチド分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）や、全長タンパク質も包含され、本発明では配列番号２の全長から成るタンパク質も包含される。
(a)  配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸から成り、抗癌活性を有するポリペプチド。
(b)  (a)のポリペプチドと８０％以上の相同性を有し、７個以上のアミノ酸から成る、抗癌活性を有するポリペプチド。
(c)  (a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含み、抗癌活性を有するポリペプチド。
【００１０】
なお、本発明において、「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、配列番号２に示されるMet Lys Ile Ser・・(中略)・・His Phe Tyr Hisのアミノ酸配列を持つ、７９５アミノ酸残基のサイズのポリペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」を「配列番号２のポリペプチド」と略記することがある。「塩基配列を有する」という表現についても同様である。
【００１１】
ここで、「抗癌活性」とは、配列番号２のポリペプチドを発現する癌細胞の増殖を抑制し又は癌組織（腫瘍）を縮小若しくは消滅させる能力を意味する。下記実施例に具体的に記載される通り、配列番号２に示されるアミノ酸配列を基に作製されたポリペプチドは、担癌イヌに投与すると、腫瘍を退縮させることができる。ポリペプチドが抗癌活性を有するか否かは、下記実施例に具体的に記載するように、実際に担癌生体に投与して腫瘍が縮小等されるか否かを調べることよって確認することができる。
【００１２】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列とは、イヌ精巣由来cDNAライブラリーと担癌犬の血清を用いたSEREX法により、担癌イヌ由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチドとして単離された、新規なポリペプチドのアミノ酸配列である(参考例１参照)。
【００１３】
上記(a)のポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上、好ましくは連続する１０個以上のアミノ酸から成るポリペプチドであって、抗癌活性を有するものである。特に好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する。なお、この分野で公知の通り、約７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば抗原性を発揮できる。従って、配列番号２のアミノ酸配列中の連続する７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば、抗癌活性を有し得るので、本発明の癌の治療及び／又は予防剤の調製に用いることができる。ただし、生体中で抗原物質に対して生産される抗体がポリクローナル抗体であることに鑑みれば、アミノ酸残基の数が多い方が、抗原物質上の種々の部位を認識する、より多くの種類の抗体を誘導できるので、ひいては抗癌活性を高めることができると考えられる。従って、抗癌活性を高めるために、アミノ酸残基の数を好ましくは３０以上、さらに好ましくは１００以上、さらに好ましくは３００以上、さらに好ましくは６００以上、さらに好ましくは７５０以上としてもよい。
【００１４】
また、癌抗原ポリペプチドを投与することによる免疫誘導の原理として、ポリペプチドが体内でペプチダーゼによる分解を受けてより小さな断片となり、その断片が抗原提示細胞に取り込まれてその表面上に提示され、それを細胞障害性Ｔ細胞等が認識し、その抗原を提示している細胞を選択的に殺していくということが知られている。この場合、抗原提示細胞に取り込まれるポリペプチドのサイズは比較的小さく、アミノ酸数で７〜３０程度であるので、配列番号２で示されるアミノ酸配列中の連続する７〜３０程度、好ましくは１０〜３０程度のアミノ酸から成るポリペプチドが有効である。もっとも、ポリペプチドのサイズがアミノ酸数で３０よりも大きな場合でも、生体内のペプチダーゼにより、ランダムな位置で切断を受けて種々のポリペプチド断片が生じ、これらのポリペプチド断片が抗原提示細胞に取り込まれるので、上記したように、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するもののように大きなサイズのポリペプチドを投与すれば、その生体内での分解によって、抗原提示細胞を介する免疫誘導に有効なポリペプチド断片が必然的に生じる。従って、抗原提示細胞を介する免疫誘導にとっても、サイズの大きなポリペプチドは好ましく、上記と同様、アミノ酸数を３０以上、さらに好ましくは１００以上、さらに好ましくは３００以上、さらに好ましくは６００以上、さらに好ましくは７５０以上としてもよい。
【００１５】
上記(b)のポリペプチドは、上記(a)のポリペプチドのうちの１個ないし数個のアミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入されたポリペプチドであって、元の配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつ、抗癌活性を有するポリペプチドである。一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換され、欠失され又は挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、上記(b)のポリペプチドも抗癌活性を発揮し得るので、本発明の癌の治療及び／又は予防剤の調製に用いることができる。ここで、アミノ酸配列の「相同性」とは、両者のアミノ酸配列残基ができるだけ多く一致するように（必要ならばギャップを挿入する）両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を、全アミノ酸残基数（両者の配列で全アミノ酸残基数が異なる場合には短い方の配列の全アミノ酸残基数）で除したものを百分率で表したものであり、BLASTのような周知のソフトを用いて容易に算出することができる。なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、本発明で用いられる上記(a)のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、抗癌活性を維持できる可能性が高くなる。また、上記(b)のポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、１個ないし数個のアミノ酸が置換し及び／若しくは欠失し、並びに／又は該アミノ酸配列に１個ないし数個のアミノ酸が挿入されたポリペプチドであることも好ましい。
【００１６】
上記(c)のポリペプチドは、上記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含み、抗癌活性を有するポリペプチドである。すなわち、(a)又は(b)のポリペプチドの一端又は両端に他のアミノ酸又はポリペプチドが付加されたものであって、抗癌活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドも、本発明の癌の治療及び／又は予防剤の調製に用いることができる。
【００１７】
上記した本発明で用いられるポリペプチドは、例えば、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t―ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて容易に調製することができる。例えば、配列番号２のポリペプチドをコードする遺伝子を発現している組織から抽出したＲＮＡから、該遺伝子のcDNAをＲＴ−ＰＣＲにより調製し、該cDNAの全長又は所望の一部を発現ベクターに組み込んで、宿主細胞中に導入し、目的とするポリペプチドを得ることができる。ＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲ、ベクターへのcDNAの組み込み、ベクターの宿主細胞への導入は、例えば以下に記載するとおり、周知の方法により行なうことができる。また、用いるベクターや宿主細胞も周知であり、種々のものが市販されている。
【００１８】
本発明で用いられるポリペプチドをコードするDNAは、具体的には例えば以下のようにして調製することができる。配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡは、イヌ染色体DNA又はcDNAライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてPCRを行うことにより調製することができる。PCRの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応行程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。また、本明細書中の配列表の配列番号１および配列番号２に記載した塩基配列およびアミノ酸配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてイヌなどのcDNAライブラリーをスクリーニングする事により、該DNAを単離することができる。cDNAライブラリーは、該DNAを発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。上記したプローブ又はプライマーの調製、cDNAライブラリーの構築、cDNAライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークロニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラバイオロジー等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られた配列番号１の塩基配列を有するDNAから、上記(a)のポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。また、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列は容易に特定することができる。従って、上記した(b)のポリペプチドや(c)のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列も容易に特定することができるので、そのようなＤＮＡは、市販の核酸合成機を用いて常法により容易に合成することができる。
【００１９】
上記宿主細胞としては、本発明で用いられるポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞COS 1、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO等の哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられる。
【００２０】
宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、pUC系、pBluescriptII、pET発現システム、pGEX発現システムなどが例示できる。本発明で用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記DNAがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。
【００２１】
宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（A）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2等が例示できる。上記と同様に、本発明で用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記DNAがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてpIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1等を用いた場合には、Hisタグ、FLAGタグ、mycタグ、HAタグ、GFPなど各種タグを付加した融合タンパク質として、該ポリペプチドを発現させることができる。
【００２２】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法等の周知の方法を用いることができる。
【００２３】
宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等が挙げられる。
【００２４】
以上の方法によって得られるポリペプチドには、他の任意のタンパク質との融合タンパク質の形態にあるものも含まれる。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）やHisタグとの融合タンパク質などが例示できる。このような融合タンパク質の形態のポリペプチドも、上記した(c)のポリペプチドに含まれ、本発明の癌の治療及び／又は予防剤の調製に用いることができる。さらに、形質転換細胞で発現されたポリペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。このような翻訳後修飾されたポリペプチドも、抗癌活性を有する限り、本発明の範囲に含まれる。この様な翻訳修飾としては、N末端メチオニンの脱離、N末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
【００２５】
本発明の癌の治療及び／又は予防剤の対象となる癌としては、配列番号２のポリペプチドをコードする遺伝子を発現している癌であり、脳腫瘍、頭、首、肺、子宮又は食道の扁平上皮癌、メラノーマ、肺、乳または子宮の腺癌、腎癌等を挙げることができるがこれらに限定されない。また、対象となる動物は、哺乳動物であり、特にイヌやネコが好ましい。
【００２６】
本発明の癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。抗癌作用を高めるため、下記実施例に記載するように、治療対象となる腫瘍の近傍の所属リンパ節や腫瘍近傍の皮下に投与することもできる。投与量は、癌の治療及び／又は予防に有効な量であればよく、腫瘍の大きさや症状等に応じて適宜選択されるが、通常、対象動物に対し１日当りの有効量として0.0001μｇ〜1000μｇ、好ましくは0.001μｇ〜1000μｇであり、１回又は数回に分けて投与することができる。好ましくは、数回に分け、数日ないし数月おきに投与する。下記実施例に具体的に示されるとおり、本発明の癌の治療及び／又は予防剤は、既に形成されている腫瘍を退縮させることができる。従って、発生初期の少数の癌細胞にも抗癌作用を発揮し得るので、癌の発症前や癌の治療後に用いれば、癌の発症や再発を防止することができる。すなわち、本発明の癌の治療及び／又は予防剤は、癌の治療と予防の双方に有用である。
【００２７】
本発明の癌の治療及び／又は予防剤は、ポリペプチドのみ又は抗体若しくは抗原結合性断片のみから成っていてもよいし、各投与形態に適した、薬理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤を適宜混合させて製剤することもできる。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。添加剤の具体例としては、生理緩衝液のような希釈剤；砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等のような賦形剤；シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等のような結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等の滑沢剤等が挙げられるが、これらに限定されない。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。
【００２８】
特に、上記ポリペプチドを有効成分とする本発明の癌の治療及び／又は予防剤は、該有効成分に加えてさらにアジュバントを含むことが好ましい。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外またはマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得るので、本発明の癌の治療及び／又は予防剤の抗癌作用を高めることができる。多数の種類のアジュバントが、当業界で周知である。具体例としては、ＭＰＬ（SmithKline Beecham）、サルモネラ属のSalmonella minnesota Re 595リポ多糖類の精製および酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（SmithKline Beecham）、Quillja saponaria抽出物から精製される純ＱＡ−２１サポニン；ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３３７３９（SmithKline Beecham）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８およびＱＳ−Ｌ１（ソ（So）、外１０名、「モレキュルズ・アンド・セル（Molecules and cells）」、１９９７年、第７巻、ｐ．１７８−１８６）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、クレイグ（Kreig）、外７名、「ネイチャー（Nature）」、第３７４巻、ｐ．５４６−５４９）を参照）；ポリＩＣ；ポリＩＣＬＣ；ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。特に好ましい製剤例として、本発明の癌の治療及び／又は予防剤は、有効成分として含有されるポリペプチドと、ＤＱＳ２１／ＭＰＬの組合せとを含んだ形態で投与される。ＤＱＳ２１対ＭＰＬの比は、典型的には約１：１０〜１０：１，好ましくは約１：５〜５：１、さらに好ましくは約１：１である。典型的には、ヒト投与に関しては、ＤＱＳ２１およびＭＰＬは、約１μｇ〜約１００μｇの範囲で処方物中に存在する。その他のアジュバントが当業界で既知であり、本発明に用いられ得る（例えば、ゴッディング（Goding）著,「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプル・アンド・プラクティス（Monoclonal Antibodies:Principles and Practice）」、第２版、１９８６年を参照）。ポリペプチドおよびアジュバントの混合物またはエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。
【００２９】
対象動物(患者)の免疫応答を刺激するその他の因子も、本発明の癌の治療及び／又は予防剤と共に患者に投与され得る。例えばサイトカインは、リンパ球刺激特性の結果として、免疫学的応答の強化に有用である。このような目的のために有用な多数のサイトカインは当業者に既知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターフェロン、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８およびＦｌｔ３リガンドが挙げられる。このような因子は、本発明の癌の治療及び／又は予防剤に含まれていてもよいし、別個の組成物として本発明の癌の治療及び／又は予防剤と併用して患者に投与してもよい。
【００３０】
また、本発明で用いられるポリペプチドと、抗原提示細胞とをインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、上記した(a)ないし(c)のポリペプチドは、抗原提示細胞の処理剤として利用し得る。この場合、ポリペプチドは、特に限定されないが、好ましくは約３０アミノ酸残基以下、より好ましくは１０〜３０アミノ酸残基のサイズで用いる。ここで、抗原提示細胞としては、ＭＨＣクラスI分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞を好ましく用いることができる。ヒトにおいては、種々のＭＨＣクラスI分子が同定されており、周知である。ヒトにおけるＭＨＣ分子はＨＬＡと呼ぶ。ＨＬＡクラスI分子としては、HLA-A、HLA-B、HLA-Cを挙げることができ、より具体的には、HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602などを挙げることができる。
【００３１】
ＭＨＣクラスI分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）とIL-3（あるいはIL-4）を用いて樹状細胞を誘導することにより得ることができる。上記樹状細胞又はＢ細胞を得るための試料としては、健康な生体から提供された骨髄や臍帯血、患者自身の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者自身の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血または骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やＣＤ４陽性細胞等が含まれているので、末梢血の全血を培養することによって上記樹状細胞又はＢ細胞を得ることもできるが、白血球成分だけを分離して培養する方が効率的で好ましい。さらに、白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で10〜1000ng/mL程度が好ましく、さらに好ましくは20〜500ng/mL程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒト等の哺乳動物の体温である37℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、5％ＣＯ２を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常3日〜2週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。
【００３２】
本発明で用いられる上記ポリペプチドと抗原提示細胞をインビトロで接触させる方法自体は、周知の方法により行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を、上記ポリペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地中のポリペプチド濃度は、特に限定されないが、通常、１μg/mlないし100μg/ml程度、好ましくは5μg/mlないし20μg/ml程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常、10３細胞/mlから107細胞/ml程度、好ましくは5x10４細胞/mlから５x106細胞/ml程度である。培養は、常法に従い、３７℃、５％CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。なお、抗原提示細胞が表面上に提示できるポリペプチドの長さは、通常、最大で３０アミノ酸残基程度である。従って、特に限定されないが、抗原提示細胞とポリペプチドをインビトロで接触させる場合、該ポリペプチドをおよそ３０アミノ酸残基以下の長さに調製してもよい。
【００３３】
上記したポリペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、ポリペプチドが抗原提示細胞のMHC分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞を調製することができる。このような抗原提示細胞は、生体内又はインビトロにおいて、Ｔ細胞に対して該ポリペプチドを提示し、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。
【００３４】
上記のようにして調製される、上記ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体とを含む抗原提示細胞を、Ｔ細胞とインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とＴ細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにＴ細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とＴ細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で１：１〜１：１００程度、好ましくは１：５〜１：２０程度である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、１００〜１０００万細胞/ml程度、好ましくは１００００〜１００万細胞/ml程度である。共存培養は、常法に従い、３７℃、５％CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、通常、２日〜３週間、好ましくは４日〜２週間程度である。また、共存培養は、IL-2、IL-6、IL-7及びIL-12のようなインターロイキンの１種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、IL-2及びIL-7の濃度は、通常、5U/mlから20U/ml程度、IL-6の濃度は通常、500U/mlから2000U/ml程度、IL-12の濃度は通常、5ng/mlから20ng/ml程度であるが、これらに限定されるものではない。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して１回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、１回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。
【００３５】
上記の共存培養により、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞が誘導され、増殖される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞を調製することができる。
【００３６】
下記実施例に記載される通り、配列番号２に示されるアミノ酸配列から調製されたポリペプチドは、生体内で抗体の生産を誘導し、癌組織を退縮させることができる。従って、上記のようにして調製した細胞障害性Ｔ細胞を生体内に投与することによっても、癌細胞を障害し、癌組織を退縮させることができる。また、また、上記ポリペプチドを提示する抗原提示細胞は、生体内においても該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができるので、該抗原提示細胞を生体内に投与することによっても、癌細胞を障害することができる。
【００３７】
上記した単離抗原提示細胞や単離Ｔ細胞を生体に投与する場合には、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はＴ細胞を、上記のように上記(a)ないし(c)のポリペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。
【００３８】
抗原提示細胞又はＴ細胞を有効成分として含む癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常1個〜10兆個、好ましくは100万個〜10億個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の１又は２以上の添加剤を添加することもできる。
【００３９】
また、上記(a)ないし(c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象動物の体内で発現させることによっても、該生体内で抗体生産や細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができるので、これにより癌の治療及び／又は予防をすることもできる。すなわち、本発明で用いられる上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子ワクチンとしても有用である。この場合、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、対象動物細胞内(好ましくは哺乳動物細胞内)で発現可能なベクターに組み込んで用いられる。そのようなベクターとしては、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、遺伝子ワクチンの分野で公知のいかなるベクターを用いてもよい。なお、上記ポリペプチドをコードするDNA等のポリヌクレオチドは、上述した通り、常法により容易に調製することができる。
【００４０】
上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、所望のベクターに組み込むことにより、遺伝子ワクチンを得ることができる。ベクターへの組み込みは当業者に周知の方法を用いて行なうことができる。
【００４１】
遺伝子ワクチンの投与方法は、遺伝子ワクチン分野で公知のいずれの方法であってもよく、特に限定されないが、例えば、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。投与量は、抗原の種類や症状等に応じて適宜選択されるが、通常、対象動物の体重１ｋｇ当り、遺伝子ワクチンの重量で0.1μｇ〜100mg程度、好ましくは1μg〜10mg程度である。
【００４２】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡ ウイルスまたはＤＮＡ ウイルスに本発明のＤＮＡ を組み込んで対象動物に感染させる方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
【００４３】
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００４４】
本発明で用いられる上記ポリペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するin vivo方法、および対象動物からある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo方法がある（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０−４５、月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３−４８、実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号、およびこれらの引用文献等）。in vivo方法がより好ましい。
【００４５】
in vivo方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することが出来る。in vivo方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明で用いられる上記ペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００４６】
なお、本発明において、「配列番号１に示される塩基配列」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列の他、これと相補的な配列も包含する。従って、「配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、その相補的な塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、及びこれらから成る二本鎖ポリヌクレオチドが包含される。本発明に用いられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する場合には、適宜いずれかの塩基配列を選択することとなるが、当業者であれば容易にその選択をすることができる。
【００４７】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
【実施例】
【００４８】
参考例１：ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの取得
（１）ｃＤＮＡライブラリの作製
健常な犬の精巣組織から酸−グアニジウム−フェノール−クロロフォルム法（Acid guanidium-Phenol-Chloroform法）により全ＲＮＡを抽出し、Oligotex-dT30 mRNA purification Kit（宝酒造社製）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリA RNAを精製した。
【００４９】
この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリの作製にはcDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit（STRATAGENE社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリのサイズは１．３×１０６ｐｆｕ／ｍｌであった。
【００５０】
（２）血清によるｃＤＮＡライブラリのスクリーニング
上記作製したイヌ精巣由来ｃＤＮＡファージライブラリを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに２３４０クローンとなるように宿主大腸菌（XL1-Blue MRF'）に感染させ、４２℃、３〜４時間培養し、溶菌班（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−D−チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Hybond C Extra: GE Healthecare Bio-Science社製）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（10mM Tris-HCl,150mM NaCl pH7.5）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを２５０倍希釈した患犬血清と室温で２〜３時間反応させた。
【００５１】
上記患犬血清としては、扁平上皮癌の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は−８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ ZAP Expressファージを宿主大腸菌（XL1-BLue MRF'）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次いで0.5M NaClを含む0.2M NaHCO3 pH8.3のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をNHS-column（GE Healthecare Bio-Science社製）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌およびファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ−Ｔ（0.05% Tween20/TBS）にて２５０倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。
【００５２】
かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをＴＢＳＴ（0.05% Tween20/TBS）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて３０００倍希釈を行った抗イヌＩｇＧ（Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories社製）を、室温1時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Roche社製）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５mmのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（100mM NaCl、10mM MgClSO4、50mM Tris-HCl、0.01%ゼラチン pH7.5）５００μlに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のIgGと反応する３５３６０個のファージクローンをスクリーニングして、７個の陽性クローンを単離した。
【００５３】
（３）単離抗原遺伝子の相同性検索
上記方法により単離した７個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、それぞれのクローンについて、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（XL1-Blue MRF’）を吸光度OD600が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液１００μlさらにExAssist helper phage （STRATAGENE社製）１μlを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を４ｍｌ添加し３７℃で２〜３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、5000rpm、２０分間遠心を行い上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（SOLR）を吸光度OD600が１．０となるよう調製した溶液１００μlと、精製したファージ溶液１００μlを混合した後３７℃で１５分間反応させ、１００μlをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたSOLRのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、PureLink Quick plasmid Miniprep Kit（invitrogen社製）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。
【００５４】
精製した各プラスミドは、配列番号３に記載のＴ３プライマーと配列番号４に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により取得した塩基配列およびアミノ酸配列を用いて、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を行い既知遺伝子との相同性検索を行った結果、７個の陽性クローンは５個の遺伝子であることが確認された。その内の１つは新規遺伝子であり、７９５アミノ酸をコードする遺伝子であることが判明した。この遺伝子のcDNA塩基配列を配列番号１に記載した。
【００５５】
（４）各組織での発現解析
上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ正常組織および各種癌細胞株における発現をＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription-PCR）法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織５０−１００ｍｇおよび各細胞株５−１０×１０６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（invitrogen社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてSuperscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR（invitrogen社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（配列番号５および６に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μl、上記プライマーを各２μM、０．２mM各dNTP, ０．６５UのExTaqポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μlとし、Thermal Cyclerを用いて、９４℃―３０秒、５５℃―３０秒、７２℃―１分のサイクルを３０回繰り返した。なお、上記の遺伝子特異的プライマーは、配列番号１中の１８３３番塩基〜２３５０番塩基の領域を増幅するものであった。比較対照のため、GAPDH特異的なプライマー（配列番号７および８に記載）も同時に用いた。その結果、図１に示すように、健常なイヌ組織では精巣特異的に強く発現しており、癌細胞株では乳癌細胞株で強い発現が確認された。取得した遺伝子の相同因子の発現を併せて確認したところ、各種癌細胞株で強い発現が検出された。
【００５６】
なお、図１中、縦軸の参照番号１は、本発明において取得した新規遺伝子の発現パターンを、参照番号２は、比較対照であるGAPDH遺伝子の発現パターンを示す。
【００５７】
実施例１：組換えタンパク質の調製及び抗腫瘍効果の確認
（１）組換えタンパク質の作製
参考例１で取得した遺伝子を基にした組換えタンパク質を以下の方法にて作製した。PCRは、参考例１で得られたファージミド溶液より調製し、配列解析に供したベクターを１μl、それぞれ２種類のプライマー（配列番号９および配列番号１０に記載）を各１μM, 0.2mM各dNTP, １mM MgSO4, 1UのKODポリメラーゼとなるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Thermal Cyclerを用いて、９４℃―３０秒、５５℃―３０秒、６８℃―３分のサイクルを１５回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号１に示す塩基配列のコード領域の全長を含む領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたDNAを１％アガロースゲルにて電気泳動し、PureLink Quick Gel Extraction Kit(invitrogen Carlsbad,CA 92008 USA)を用いて約2.4KbpのＤＮＡ断片を精製・調製した。
【００５８】
調製したDNA断片をpET100/D-TOPO（invitrogen Carlsbad,CA 92008 USA ）とでTOPO反応を行い、大腸菌用発現ベクターを作製した。宿主として大腸菌BL21（Star）（invitrogen Carlsbad,CA 92008 USA ）を使用した。トランスフォームしたBL21のシングルコロニーをアンピシリン（終濃度100μg/ml）含有LB培地でOD600が約0.5になるまで３７℃で培養後、終濃度1mMになるようにIPTGを添加してさらに２０℃で２０時間培養した。培養後、大腸菌を5,000xgで4℃、30分間遠心し、沈殿物を0.１% CHAPSとプロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma社製）の存在下で超音波にて破砕した。その後、16,000xgで4℃、30分間、遠心し、得られた上清を可溶性画分、沈殿物を不溶性画分とした。
【００５９】
組換えタンパク質の産生はウェスタンブロットにより以下の方法で確認した。回収した培養上清に等量の２×泳動バッファー（0.125M Tris-HCl pH6.8,10% 2ME,4% SDS,10%スクロース, 0.01% BPB）を添加し、９５℃で５分間熱処理を行った。その後、サンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写した。タンパクが転写されたPVDF膜を１０％ブロックエース（雪印社製）を含むPBSで４℃、一晩、ブロッキングし、その後、抗His-Tagに対する抗体(Anti-His Antibody Selector Kit QIAGEN社製)を室温で2-3時間反応させた。PBSTで３回洗浄し、SuperSignal WestFemto（ピアス社製）に反応させ、X線フィルムに感光することで、組換えタンパク質の発現を確認した。なお、当該組換えタンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列の全長を含むものであった。
【００６０】
上記方法により得られた可溶性画分を5mlのHis-Trapカラム(Amersham Biosciences社製)に通液した後、未吸着画分をPBSにて洗浄後、直ちに10mMイミダゾールを含む50mM Tris-HCl pH8.0の緩衝液にてカラム容量の１０倍洗浄を行った後、100mMイミダゾールを含む50mM Tris-HCl pH8.0の緩衝液にて溶出を行い精製画分とした。
【００６１】
上記方法によって得られた精製標品のうち1.5mlを、限外ろ過NANOSEP 10K OMEGA（PALL社製）を用いて、生理用リン酸緩衝液（日水製薬社製）置換した後、HTタフリンアクロディスク０．２２μｍ（PALL社製）にて無菌ろ過を行い、これを、以下の実験に用いた。
【００６２】
（２）組換えタンパク質の犬生体内での免疫誘導能の評価
上記（１）で得られた精製標品１ｍlと等量の不完全フロイントアジュバント（和光純薬社製）を混合し、これを健常犬の皮下に投与した。比較対照となる犬においては生理用リン酸緩衝液（PBS）１ｍlと等量の不完全フロイントアジュバント（和光純薬社製）を混合調製したものを投与した。一週間経過した時点で前肢より採血した後、血清を分離し、組換えタンパク質を固相化したイムノプレートを用いて、投与した組換えタンパク質に対する該血清中の抗体価の測定を行い、免疫誘導能を評価した。
【００６３】
抗体価の測定は、具体的には以下のとおりの方法で行なった。すなわち、上記（１）の方法で精製した組換えタンパク質をNunc社製９６穴イムノプレートに固相化後、余剰官能基をブロックするため0.5% BSA-50mM NaHCO3 pH8.3の緩衝液にて室温１時間反応させた後、各種血清を0.5% BSA-50mM NaHCO3 pH8.3の緩衝液にて２５０倍に希釈を行い反応させた。その後、PBS-T(0.05% Tween 20を含むPBS)にて洗浄した後、HRP結合ヤギ抗イヌIgG抗体と基質であるO-フェニレンジアミンを加えて吸光度計を用いて吸光度を測定した。
【００６４】
その結果、図２に示すように、比較対照となるPBSを投与したコントロールの犬に対して、組換えタンパク質を投与した犬では、有意に高い組換えタンパクに対する抗体価が検出され、該組換えタンパク質が高い抗原性を持つことが示された。なお、図２中、参照番号３，５，７は、それぞれ組換えタンパク質を投与後０日、４日、７日後に採取した血清を用いた結果であり、参照番号４，６，８は、それぞれPBSを投与後０日、４日、７日後に採取した血清を用いた結果である。
【００６５】
（３）組換えタンパク質の担癌患犬に対する抗腫瘍効果
表皮に腫瘤を持つ担癌患犬２頭（肛門周囲腺腫１頭、乳腺腫瘍１頭）に対して、上記組換えタンパクの抗腫瘍効果の評価を行った。投与を行う前に、まず上記（２）に記載した方法により、各患犬の血清中の組換えタンパク質に対する抗体価を測定したところ、健常犬と比較して高い抗体価が検出された（図３）。このことからこれら担癌患犬の生体中の腫瘍組織には、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が癌抗原として発現していることが示唆された。
【００６６】
上記（１）の通り精製した組換えタンパク質２ｍｌと等量の不完全フロイントアジュバント（和光純薬社製）を混合して癌治療剤とし、これを一週間毎に腫瘍近傍の所属リンパ節に計３回投与を行った。その結果、癌治療剤投与時点で、それぞれ大きさが約７５ｍｍ３及び１２０ｍｍ３であった腫瘤が、癌治療剤投与からそれぞれ１５日後及び２４日後には、完全に退縮した。
【００６７】
また、肛門周囲に発生した腺癌および肥満細胞腫の各患犬に対して、上記の通り精製した組換えタンパク質１０μｇ（０．５ｍｌ）に等量のMONTANIDE ISA51（SEPPIC社製）を混合して癌治療剤とし、これを一週間毎に腫瘍近傍の皮下に計４回投与した。その結果、癌治療剤投与時点で、それぞれ癌の大きさが約58ｍｍ３及び112ｍｍ３であった腫瘤が、癌治療剤投与からそれぞれ４０日後及び５９日後には、完全に退縮した。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】参考例１で同定した新規遺伝子の、イヌ正常組織および腫瘍細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号１は新規遺伝子の発現、参照番号２はGAPDH遺伝子の発現を示す。
【図２】組換えタンパク質を投与した健常犬から採取した血清中の、組換えタンパク質に対する抗体価を示す図である。参照番号３、５及び７は、それぞれ組換えタンパク質を投与後０日、４日及び７日に採取した血清についての結果を示し、参照番号４、６及び８は、それぞれPBSを投与後０日、４日及び７日に採取した血清についての結果を示す。
【図３】実施例で調製した組換えタンパク質に対する、担癌犬由来血清中の抗体の反応性を示す図である。参照番号９ないし１１は健常犬由来の血清の結果、参照番号１２及び１３は担癌患犬（１２；肛門周囲腺腫、１３；乳腺腫瘍）由来の血清の結果を示す。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【配列表】
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