(57)【要約】【課題】少なくとも２つの、ヘテロ型の多型部位を有する標的核酸のハプロタイプを同時に判定する方法及びそれに用いるプライマーセットを提供すること。【解決手段】２つの対立遺伝子を含む部位を増幅する上で一方の対立遺伝子の多型を一つの増幅プライマーの３'末端もしくはその近傍に配置し変異型ヌクレオチドか野生型ヌクレオチドかどちらか一方のプライマーからしか伸長しないようにする。他方のプライマーは対立遺伝子に影響受けないが、他方の対立遺伝子を増幅物に含むような位置にあって、第１の対立遺伝子について一方のアレルだけの対象ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅する。その増幅物の第２の対立遺伝子についてそのアレルを、両アレル（メジャー／マイナー）を判別する相補の配列のプローブを用いて判定すれば、第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子のハプロタイプを識別できることを利用する。【選択図】図１
2008136419.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３’側にヘテロ型の第１の多型部位を有し、５’側にヘテロ型の第２の多型部位を有する標的核酸のハプロタイプを決定する方法であって、
（ｉ）（ａ−１）以下の順方向プライマーのいずれか１つと、
（ａ−１−１）前記第１の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第１の多型部位が変異型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第１の多型部位が野生型である標的核酸は伸長しない順方向プライマー、および
（ａ−１−２）前記第１の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第１の多型部位が野生型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第１の多型部位が変異型である標的核酸は伸長しない順方向プライマー、
（ｂ−１）該標的核酸の相補鎖の、該第２の多型部位よりも３’側の、該第２の多型部位を含まない所定の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を用いて該標的核酸のＰＣＲ反応を行う工程と、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）の結果として得られる産物を、該第２の多型部位の野生型ヌクレオチドを含む該標的核酸の所定の塩基配列部分と同じ塩基配列を有する第１のプローブ、及び該第２の多型部位の変異型ヌクレオチドを含む該標的核酸の所定の塩基配列部分と同じ塩基配列を有する第２のプローブとハイブリダイゼーション反応させ、該第１および第２のプローブとのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程とを有することを特徴とするハプロタイプの決定方法。
【請求項２】
前記工程（ｉｉ）が、該第１のプローブおよび第２のプローブが固定されたプローブ担体を前記工程（ｉ）の結果として得られる産物とハイブリダイゼーション反応させる工程を含む請求項１に記載のハプロタイプの決定方法。
【請求項３】
前記（ａ−１−１）における順方向プライマーが、その３´末端またはその近傍に、変異型ヌクレオチドである前記第１の多型部位に相補的なヌクレオチドを有しており、
前記（ａ−１−２）における順方向プライマーが、その３´末端またはその近傍に、野生型ヌクレオチドである前記第１の多型部位に相補的なヌクレオチドを有している請求項１または２に記載のハプロタイプの決定方法。
【請求項４】
３’側に第１の多型部位を有し、５’側に第２の多型部位を有する標的核酸のハプロタイプを決定するためのプライマーセットであって、
前記第１の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第１の多型部位が変異型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第１の多型部位が野生型である標的核酸は伸長しない順方向プライマー、および
前記第１の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第１の多型部位が野生型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第１の多型部位が変異型である標的核酸は伸長しない順方向プライマー、
の何れかと、
該標的核酸の相補鎖の、該第２の多型部位よりも３’側の、該第２の多型部位を含まない所定の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する逆方向プライマーと、を含むことを特徴とするプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも２つの、ヘテロ型の多型部位を有する標的核酸のハプロタイプの決定方法及びそれに用いるプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ハプロタイプは単一の染色体に位置する２つまたはそれ以上の多型部位のシス配置である。ハプロタイプ情報は特定の疾患や異常と関連していたり、特定の薬剤感受性と関連していたりと非常に有用な情報だと考えられている。従来、ハプロタイプの解析は家系の多世代にわたる多型部位の遺伝情報の追跡調査や、計算機における推定アルゴリズムを必要とした。一方、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技術の進歩により分子レベルでＤＮＡを直接分析できるようになり、その分析結果をハプロタイプの決定に利用する方法が提案されている。しかし、ＰＣＲを利用してハプロタイプを決定するためには、対立遺伝子に特異的なプライマーの組合せを複数用意し多数回のＰＣＲを実施する必要があった。また、２つの対立遺伝子に限定すれば２つのプライマーペアを多型部位に配し、その増幅の有無によってハプロタイプを決定しようとする試みもある。これは、単一試験管アッセイ形式のハプロタイプ決定方法（特許文献１参照）で提案されている。具体的に示すと、第一の多型部位を含む順方向プライマーは、5’末端にアレルによって異なるシグナルを与える標識が修飾されている。また第二の多型部位を含む逆方向プライマーにおいては、5’末端にターゲット配列には含まれないフラップ配列をつけて、アレルによって異なる長さになるように設計されている。これらのプライマーを用いて両方向でアレル特異的にPCRを行う。PCR増幅産物中の蛍光標識と増幅産物長を検出することによって、どのプライマー対により増幅されたかが分かり、ハプロタイプを決定することが可能となる。
【特許文献１】特開２００２−２７２４８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、上記の従来方法においては、プライマーに多型配列部位が含まれることが必須である。そのため、プライマーの塩基配列における選択の自由度が制限を受ける。ここで、アレル特異的なPCRを行なう為には、PCRに用いるプライマー間でTmを揃えることが必要となるが、上記にあるように、プライマーの塩基配列の選定に制約があると、プライマー間でTmを揃えることが困難となる場合が想定される。言い換えると、上記特許文献１の方法によって精度よくハプロタイプを検出できるのはTｍが揃ったプライマーを設定可能な位置に多型部位が存在している場合に限定されてしまう可能性がある。また、上記検出法では、両方向のプライマーの配列位置をずらすことが困難なため、順方向のプライマーと逆方向のプライマー間でプライマーダイマーを形成した場合には、ハプロタイプを検出できなくなる。
【０００４】
そこで、本発明の目的は、多型部位の位置に因らず、ハプロタイプをより正確に検出することができるハプロタイプの検出方法を提供することにある。特に、少なくとも２つの、ヘテロ型の多型部位を有する標的核酸のハプロタイプを同時に判定する方法及びそれに用いるプライマーセットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のハプロタイプの決定方法は、３'側にヘテロ型の第１の多型部位を有し、５'側にヘテロ型の第２の多型部位を有する標的核酸のハプロタイプを決定する方法であって、
（ｉ）（ａ−１）以下の順方向プライマーのいずれか１つと、
（ａ−１−１）前記第１の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第１の多型部位が変異型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第１の多型部位が野生型である標的核酸は伸長しない順方向プライマー、および
（ａ−１−２）前記第１の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第１の多型部位が野生型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第１の多型部位が変異型である標的核酸は伸長しない順方向プライマー、
（ｂ−１）該標的核酸の相補鎖の、該第２の多型部位よりも３’側の、該第２の多型部位を含まない所定の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を用いて該標的核酸のＰＣＲ反応を行う工程と、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）の結果として得られる産物を、該第２の多型部位の野生型ヌクレオチドを含む該標的核酸の所定の塩基配列部分と同じ塩基配列を有する第１のプローブ、及び該第２の多型部位の変異型ヌクレオチドを含む該標的核酸の所定の塩基配列部分と同じ塩基配列を有する第２のプローブとハイブリダイゼーション反応させ、該第１および第２のプローブとのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程とを有することを特徴とするハプロタイプの決定方法である。
【０００６】
また、本発明にかかるハプロタイプの決定に用いるプライマーセットは、
３’側に第１の多型部位を有し、５’側に第２の多型部位を有する標的核酸のハプロタイプを決定するためのプライマーセットであって、
前記第１の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第１の多型部位が変異型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第１の多型部位が野生型である標的核酸は伸長しない順方向プライマーおよび
前記第１の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第１の多型部位が野生型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第１の多型部位が変異型である標的核酸は伸長しない順方向プライマー
の何れかと、
該標的核酸の相補鎖の、該第２の多型部位よりも３’側の、該第２の多型部位を含まない所定の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する逆方向プライマーと、を含むことを特徴とするプライマーセットである。
【発明の効果】
【０００７】
以上説明したように本発明によれば、複数のヘテロ接合体があったときに網羅的にその
ハプロタイプを同時に決定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、マイクロアレイでハプロタイプを決定する上で標的となるゲノムＤＮＡの対象となる多型について対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応増幅プロトコルを用いる。第１の対立遺伝子において一方のアレルに特異的でかつ第２の対立遺伝子を含む増幅産物を産生し、第２の対立遺伝子において一方のアレルに特異的なオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションすることで第２の対立遺伝子のアレルを判別する。これは、第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子がハプロタイプである場合にその分子レベルの有力な検出方法になり得る。第２の対立遺伝子がメジャーアレルである場合にＤＮＡハイブリッドを構成する相補鎖プローブとマイナーアレルである場合にＤＮＡハイブリッドを構成する相補鎖プローブとを例えばマイクロアレイをはじめとする固体支持体上に固定されているものを用意する。どちらのプローブにハイブリダイゼーションされたかを標識で確認することによりそのハプロタイプを決定することができる。対立遺伝子の候補が複数対あって、そのN通りのハプロタイプをN×２本のプローブを搭載した固体支持体とハイブリダイゼーションすることですべてのハプロタイプを網羅的に解析ができる。第１の対立遺伝子は予め選別されたヘテロ型であればハプロタイプを識別する専用の固体支持体を構成することができる。増幅プライマーの一方は、第１、第２の対立遺伝子のうちどちらか一方のアレルに特異的になるように設計してもよく他方は、必ず異なる対立遺伝子を含むように設計する。標識は、例えば蛍光標識をプライマーが保持しているものとし、アレル特異的な増幅に成功した場合にのみ異なる対立遺伝子とハイブリッドを形成したプローブにその蛍光を検出できる構成とする。
【０００９】
本発明においては、第１の対立遺伝子において一方のアレルに特異的である部分を増幅産物中に得るために、以下の順方向プライマーのいずれか１つが用いられる。
【００１０】
（ａ−１−１）前記第１の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第１の多型部位が変異型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第１の多型部位が野生型である標的核酸は伸長しない順方向プライマー。
【００１１】
（ａ−１−２）前記第１の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第１の多型部位が野生型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第１の多型部位が変異型である標的核酸は伸長しない順方向プライマー。
【００１２】
なお、この順方向プライマーは、標的核酸のタイピングに基づく既知の第１の多型部位を含む部分の配列を基礎として、この部分がＰＣＲ増幅産物中に得られるように、順方向プライマーの塩基配列（配列長）を常法により設定可能である。
【００１３】
なお、多型部位は、変異型または野生型から選択可能である。
【００１４】
第２の多型部位を含む部分を増幅産物中に得るための逆方向プライマーは、標的核酸の相補鎖の、第２の多型部位よりも３’側の、第２の多型部位を含まない所定の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するように設計される。逆方向プライマーは、標的核酸のタイピングに基づく既知の第２の多型部位を含む部分の配列を基礎として、この部分がＰＣＲ増幅産物中に得られるように、逆方向プライマーの塩基配列（配列長）
を常法により設定可能である。
【００１５】
第２の多型部位を含む部分の検出に用いるプローブも、第２の多型部位を含む部分が標的核酸のタイピングによって既知であるので、この部分に特異的な配列を選択してこれを検出可能なプローブの塩基配列（配列長）を常法により設定可能である。
【００１６】
以下に本発明の実施態様について説明する。
〔第１の実施態様〕
第１の実施態様を、図１を用いて、以下に説明する。本実施態様は、ゲノムＤＮＡ上にある複数の対立遺伝子のアレルタイプを決定する手法に関し、特に２つもしくは２つ以上の対立遺伝子のハプロタイプを決定する手続きを以下に順に追って説明する。
【００１７】
本実施態様では、ゲノムＤＮＡ上の２つの対立遺伝子はヘテロ型であり、そのハプロタイプを決定する。２つの対立遺伝子間距離は数〜数十塩基長程度から数百〜数千塩基長離れている場合もあり、両対立遺伝子を含む増幅産物を生成する必要がある。２つの対立遺伝子を５’サイドから第１の対立遺伝子、第２の対立遺伝子と定義する。第１の対立遺伝子のメジャーアレルはＧ、マイナーアレルはＣ、第２の対立遺伝子のメジャーアレルはＧ、マイナーアレルはＴである。
【００１８】
本実施態様では、そのハプロタイプを決定するために第１の対立遺伝子をメジャー／マイナーアレルのどちらか一方を選択的に増幅するように、プライマーの３’末端をアレル位置に符合させる。例えば、３’末端に第１対立遺伝子のマイナーアレルと相補になるような第１のプライマー（順方向プライマー）を設計し、第１の対立遺伝子がマイナーアレルであれば伸長するがメジャーアレルであれば伸長がストップするようにする。他方、反対鎖の第２のプライマー（逆方向プライマー）は、第１のプライマーの結合位置を基準として第２の対立遺伝子を、挟むように設計し、第２のプライマーはアレルの種別には依存しない。この構成では、第１の対立遺伝子がマイナーアレルの場合に大量の増幅産物を生成するため、第１の対立遺伝子がマイナーアレルであり第２の対立遺伝子を含んだ増幅産物を優先的に増産する。そのため、増幅産物において第２の対立遺伝子のアレルタイプを決定すれば、第１、第２の対立遺伝子のハプロタイプを決定できる。
【００１９】
本発明に係るハプロタイプの決定方法は、下記１）及び２）のステップを有する。
１）第１の対立遺伝子をどちらか一方のアレルを選択し、第２の対立遺伝子を含む増幅産物だけを生成するステップ；
２）第２の対立遺伝子のアレルに特異的な相補的プローブとハイブリダイゼーション反応させ、その結果から第２の対立遺伝子のアレルを決定するステップ。
【００２０】
図１は、上記のステップをフローチャートにしたもので、Ｓ−１は、第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子がともにヘテロ型であることを確認するステップで、個々の対立遺伝子についてタイピングする方法は問わない。第一の対立遺伝子と第二の対立遺伝子のうち少なくとも一方がホモ型であれば、両対立遺伝子のハプロタイプの組は既知であり本発明を適用する必要性はない。
【００２１】
本実施態様では、個々の遺伝子型をタイピングしてヘテロ型を確認した組だけを対象とする。Ｓ−２は、第１の対立遺伝子のマイナーアレルに特異的な第１のプライマーと第２の対立遺伝子を含むような反対鎖の第２のプライマーをペアとする増幅産物を対象ゲノムから得るステップである。第１の対立遺伝子のマイナーアレルに特異的な第１のプライマーとは、相補になるように変異部位を３’末端に位置したプライマーで、対象ゲノム配列がメジャーアレルである場合には伸長しない。ここでは、第１の対立遺伝子はヘテロ型であるため、マイナーアレルのゲノムと第１のプライマーとがアニールした場合にのみ伸長反応は進む。すなわち、増幅産物としては、第１の対立遺伝子がマイナーアレルにのみ限定される。第２のプライマーは対象ゲノムを限定するものではなくその配置から第２の対立遺伝子を含む増幅産物を生成する。この場合、第１の対立遺伝子がマイナーアレルであり対応する第２の対立遺伝子を含む増幅産物が生成する。第２の対立遺伝子はマイナーアレル、メジャーアレルのどちらであっても影響はしないが第１の対立遺伝子とハプロタイプを決定する場合には第２の対立遺伝子のアレルに特異的なプローブとハイブリすることで判定することができる。第１のプライマーは、上記とは逆にメジャーアレルに特異的になるように設計されても本発明の本質は同じである。
【００２２】
更に、第２の対立遺伝子を決定する上で、標識する必要があるが、第１、第２のプライマーのどちらを標識してもよく、また、伸長反応により、標識化されたヌクレオチドを増幅産物中に取り入れるようにしてもよい。標識は、蛍光物質、化学発光物質、放射線同位体、どれであってもよいが、本実施態様ではCｙ３を使った蛍光色素標識を用いた。Ｓ−３は、第２の対立遺伝子に特異的なプローブを固定した固体支持体と、増幅産物をハイブリダイゼーションさせるステップである。プローブは、各々、マイナーアレル、メジャーアレルに特異的なものを用意する。当該プローブは、固体支持体に固定されていてもよく、また液相反応でＦＲＥＴを起こすような構成としたものであってもよい。本実施態様では、固体支持体を使って第２対立遺伝子を決定した。つまり、第２の対立遺伝子のマイナーアレルに特異的なプローブが配置されている固体支持体上の特定位置だけが蛍光を示せば、第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子は、マイナー／マイナーでハプロタイプを形成していることを意味する。これと同時にメジャー／メジャーでハプロタイプを形成していることも確定する。他方、第２の対立遺伝子のメジャーアレルに特異的なプローブが配置されている固体支持体上の特定位置が蛍光を示せば、第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子は、マイナー／メジャーでハプロタイプを形成していることを意味する。これと同時にメジャー／マイナーでハプロタイプを形成していることも確定する。更に、第２の対立遺伝子のメジャーアレル、マイナーアレルに特異的な両プローブが配置されている固体支持体上の両者位置が蛍光を示せば第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子はハプロタイプの関係は薄いと解析することができる。このように、Ｓ−４は、この第２の対立遺伝子のアレル、第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子のハプロタイプを判定するステップになる。
【００２３】
図２は、前記の第１の対立遺伝子２０１、第２の対立遺伝子２０２の対象ゲノム上の位
置関係を示した配置図である。第１のプライマー２０３、第２のプライマー２０４と、その増幅産物２０５をもこれに示される。前記の通り、第１のプライマー２０３の３’末端部は第１の対立遺伝子２０１の変異部位にあたり、第２のプライマー２０４は、第２の対立遺伝子２０２を含むその下流域に位置する。第１のプライマー２０３によって、第１の対立遺伝子２０１の一方のアレルを含む伸長産物の産生量（上図）は他方のアレルを含む伸長産物の産生量（下図）よりも多くなる。すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応により、第１の対立遺伝子２０１の一方のアレルを含んだ一方の対象ゲノムに対してのみその増幅量を増やしていくため、第２の対立遺伝子２０２もまた、その対象ゲノムに対応するアレルだけを含むことになる。また、配置図上にある第２の対立遺伝子２０２のアレルを含むプローブを設計する。
【００２４】
表１は、本実施態様に関連する増幅プライマー一対とその増幅産物及び、第２の対立遺伝子に対応するプローブの配列を示す。太字は、5'側から順に第１の対立遺伝子のアレル位置（変異型ヌクレオチドC）、第２の対立遺伝子のアレル位置（変異型ヌクレオチドT）に対応する。順方向プライマー（FP）には、変異型ヌクレオチドCを選択する。
【００２５】
【表１】
2008136419.tif 000003
【００２６】
〔第２の実施態様〕
第２実施態様を、図５を用いて以下に説明する。各対立遺伝子の多型の位置は×で表示し第N番目、第N+１番目、第N＋２番目の多型のみ表示しているが、他は省略しているだけで多型数を限定しているものではない。ここでは、順方向プライマーにＣｙ３標識をしているが、いうまでもなく逆方向プライマーに標識しても、伸長するヌクレオチド自体に標識していても本発明の骨子が変わるものではない。
【００２７】
本実施態様では、複対立遺伝子のハプロタイプを決定する一般化された手法を提供する。ここではN通りのヘテロ型を示す多型をテストする。図５に見られるようにN番目の多型に対して順方向のプライマーFP（N）と反対方向の逆方向プライマーRP（N）を定義する。N+１番目以降も同様に順方向プライマーはFP（N＋１）、FP（N+２）、・・・、逆方向プライマーはRP（N+１）、RP（N＋２）、・・・、と定義できる。ここで、N番目の多型とN+１番目の多型を含むＰＣＲ増幅産物を産生するために、順方向プライマーFP（N）と逆方向プライマーRP（N＋１）を設計する。FP（N）は、第N番目の多型を３'末端に含むように設計されどちらか一方のアレルに選択される。RP（N＋１）は、第N＋１番目の多型をＰＣＲ増幅産物に含むように第N番目の多型と反対側に設計される。FP（N）とRP（N+１）のプライマーペアは、第N番目の多型で一方のアレルに一致した場合にのみ第N番目の多型と第N＋１番目の多型を含むＰＣＲ増幅産物を得るプライマーペアとなる。これをN＝１、２、３、・・・、ｍの場合のｍ通りのＰＣＲ増幅反応から反応物を取得し、FP（N）により選択された第Nの対立遺伝子に対する第N+１の対立遺伝子を決定するプローブとハイブリダイゼーションする。上記の場合では、２×ｍ本の各アレルに対応したプローブを設計しマイクロアレイの所望の位置に固定する。
【００２８】
ｍ通りのＰＣＲ増幅反応で得られた増幅産物を混合し、第１の実施態様にあるプロトコルにしたがってマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイゼーションする。これにより、複対立遺伝子のハプロタイプの組合せを単一標識だけで網羅的に決定することができる。また、本発明のように一方の対立遺伝子について２つのアレルに対応した配列をもつプローブとハイブリッド体を形成するのはどちらなのかを判定しそのアレルを決定する手法は、ハプロタイプの判定精度を高めることになる。
【００２９】
ここでは、ヘテロ型の対立遺伝子に限定したが、第１の対立遺伝子の両アレルに関して個々に特異的なプライマーを２セット用意し別箇にハイブリダイゼーションして決定しても構わない。
【実施例】
【００３０】
実施例１
上記第１の実施態様にかかる実施例を以下に記載する。
I．検体の調製と特定遺伝子部位の抽出
使用したテンプレートDNAは、日本人由来のB細胞株から抽出されたゲノムＤＮＡから代謝酵素遺伝子であるＣＹＰ２Ｄ６の領域５ｋｂｐに限定して増幅し、予め増幅産物を８ｎｇ／μＬに超純水で稀釈したものである。これは、擬似遺伝子であるＣＹＰ２Ｄ７、ＣＹＰ２Ｄ８等の重複配列部分を除外し、ＣＹＰ２Ｄ６部位だけに純化する目的で処理されている。詳細には、使用したプライマーは、一般的に広く用いられている表２のものを使用した。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
また、ＰＣＲ溶液の調整法は表３のとおりに、ＰＣＲサイクルは図３のとおりに実施し、その結果増幅されたＣＹＰ２Ｄ６遺伝子領域の産物（５０７９ｂｐ）を得た。
反応プロセスには、変性、アニール、伸長の３ステップサイクルを３５回繰り返し、冷却後、精製プロセスにより増幅産物の純化を行った。
【００３３】
ＰＣＲ増幅産物は精製用カラム（Qiagen QIAquick PCR Purification Kit）を用いて精製し、ＰＣＲ増幅産物溶液の液量は、５０μLとなるように調製した。得られた精製済ＰＣＲ増幅産物溶液の一部を取り、定法に従って電気泳動を行い、生成物のサイズから目的のＰＣＲ産物が合成されていることを確認した。更に、生成物は、純水により８ｎｇ／μＬに稀釈調製した。
【００３４】
【表３】
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【００３５】
II．ＰＣＲ増幅反応
プライマーの設計およびＰＣＲ増幅産物の純化
表４は、増幅反応に使われる試薬類とその配合比率を示す。ＰＣＲ用バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ、各ヌクレオチド、各プライマー、テンプレートＤＮＡの濃度とその投入量もここに記す。ここではＣｙ３で標識化されたプライマーを使用する。
【００３６】
【表４】
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【００３７】
図４は、増幅反応に適用するプロトコルを示す。反応プロセスには、変性、アニール、伸長の３ステップサイクルを３５回繰り返し、冷却後、精製プロセスにより増幅産物の純化を行う。
【００３８】
ＰＣＲ増幅産物は精製用カラム（Qiagen QIAquick PCR Purification Kit）を用いて精製した。精製後、ＰＣＲ増幅産物溶液の液量は、５０μLとなるよう調製した。得られた精製済ＰＣＲ増幅産物溶液の一部を取り、定法に従って電気泳動を行い、生成物のサイズから目的のＰＣＲ産物が合成されていることを確認した。なお、各プライマー及び増幅産物の配列は先に表１に示したとおりである。
【００３９】
III．マイクロアレイの作製
（１）プローブの設計
上記、ＰＣＲ産物に対して２種のプローブを設計した。設計はプライマーの設計と同様、各プローブが設計した第２の対立遺伝子のアレル塩基配列を特異的に認識できるように充分配慮して設計を行った。このプローブ設計においては、プローブとハイブリダイゼーションし、プローブとハイブリッド体を形成するのは、順方向プライマーFPから伸長したＤＮＡ鎖である。各プローブの配列はハイブリッド体の安定性に考慮し、塩基長を調整するなどして充分配慮して設計を行った。設計された２本のプローブの配列は表１に示される通りである。
（２）プローブの合成及びマイクロアレイの作製
プローブの合成およびマイクロアレイの作製は、キヤノン社から開示されているＤＮＡマイクロアレイの作製法（特開平１１−１８７９００号公報）に従って行った。すなわち、基板プロセスに関しては、石英ガラスにシランカップリング剤処理及びＥＭＣＳを結合し、それにより表面にマレイミド基を導入した。またプローブ合成に関しては、５’末端にチオール基が導入されたプローブを合成しＨＰＬＣ精製した。ＤＮＡマイクロアレイ作製には、インクジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０  キヤノン社製）の改造機を使用し、ガラス基板上に、各プローブをスポットして、ＤＮＡマイクロアレイを得た。なお、ガラス基板のサイズ（Ｗ×Ｌ×Ｔ）は、２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍとした。
【００４０】
IV．ハイブリダイゼーション
IIIで作製したＤＮＡマイクロアレイと、サンプル核酸検体としてIIで作製したＰＣＲ増幅産物を用いて、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションを行った。
（１）ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング
ＢＳＡ（牛血清アルブミンＦｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ：Ｓｉｇｍａ社製）を１重量％となるように、１００ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  リン酸バッファーに溶解した。この溶液にIIで作製したＤＮＡマイクロアレイを室温で２時間浸し、ガラス基板面のブロッキングを行った。ブロッキング終了後、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２×ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｉｈｙｄｒａｔｅ，Ｃ6Ｈ5Ｎａ3・２Ｈ2Ｏ）  ３０ｍＭ、ｐＨ７．０）で洗浄を行った。その後、純水でリンスした。更にその後、スピン・ドライ装置でＤＮＡマイクロアレイの水切りを行った。
（２）ハイブリダイゼーション溶液の調製
各ＰＣＲ産物は互いに等モルとなるよう調製したうえで、ＰＣＲ増幅産物溶液２マイクロリットルを用いて最終濃度が下記の構成となるよう、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
ハイブリダイゼーション溶液の組成は以下のとおりである。
【００４１】
６×ＳＳＰＥ／ １０％  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ／ ＰＣＲ増幅産物溶液
（６×ＳＳＰＥ：  ＮａＣｌ  ９００ｍＭ、ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ  ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ６ｍＭ、ｐＨ７．４）
（３）ハイブリダイゼーション
水切りしたＤＮＡチップを、ハイブリダイゼーション装置（Genomic Solutions Inc. Hybridization Station）にセットした。そして、上記組成のハイブリダイゼーション溶液を用いて、下記手順および条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００４２】
ハイブリダイゼーション条件・手順は以下のとおりである。
【００４３】
上記ハイブリダイゼーション溶液を、６５℃に加温し３分間保持したあと、さらに９２℃で２分間、続いて５０℃で４時間保持した。そのあと、その後、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて、４０℃で洗浄をした。さらに２×ＳＳＣを用いて２５℃で洗浄を行い、必要に応じて通常のマニュアルに従い純水でリンスして、最後にスピン・ドライ装置で水切りを行い乾燥させた。
（４）蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応終了後、スピン・ドライ乾燥したＤＮＡチップについて、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、Ｇｅｎｅｐｉｘ  ４０００Ｂ）を用いで、ハイブリッド体に由来する蛍光測定を行った。各プローブについて測定した結果下記表５の通りになった。
【００４４】
【表５】
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【００４５】
輝度の算出にあたっては、ＤＮＡチップ上、プローブＤＮＡのスポットの無い部分において観測される蛍光強度をバックグランド値として、各スポットからの見掛けの蛍光強度より、バックグランド値を差し引いた値を、蛍光強度の実測値とした。また測定は２回実施し、その平均値を示す。
【００４６】
この結果から、第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子についてハプロタイプはＣ／Ｔ（マイナー／マイナー）に決まる。また、両対立遺伝子がヘテロ型であることからそのディプロタイプはＧ／Ｇ（メジャー／メジャー）になる。ここでは、ヘテロ型の対立遺伝子に限定したが、第１の対立遺伝子の両アレルに関して個々に特異的なプライマーを２セット用意し別箇にハイブリダイゼーションして決定しても構わない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の第１の実施態様における２つの対立遺伝子のハプロタイプを決定するフローチャートである。
【図２】本発明の第１の実施態様における２つの対立遺伝子の配置図である。
【図３】本発明の第１の実施態様における特定遺伝子部位抽出のためのＰＣＲ増幅反応に適用するプロトコルを示す図である。
【図４】本発明の第１の実施態様におけるＰＣＲ増幅反応に適用するプロトコルを示す図である。
【図５】本発明の第２の実施態様における2つ以上の複対立遺伝子の配置図
【符号の説明】
【００４８】
２０１  ：第１の対立遺伝子
２０２  ：第２の対立遺伝子
２０３  ：第１のプライマー
２０４  ：第２のプライマー
２０５  ：ＰＣＲ増幅産物
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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