(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトにおける卒中および他の神経学的疾患の治療または予防方法ならびに前記方法において用いるための抗体を提供する。【解決手段】有効量のミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）アンタゴニストまたは抗ＭＡＧ抗体を投与することを含む、ヒトにおける卒中および他の神経学的疾患の治療または予防方法、および前記方法に使用される改変型抗体およびそれらの機能的フラグメント。好ましくは前記抗体はヒト化されたモノクローナル抗体である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける卒中および他の神経学的疾患の治療または予防方法であって、それらを必要とする該ヒトに、有効量のＭＡＧアンタゴニストまたは抗ＭＡＧ抗体（改変型抗体またはその機能的フラグメントを含む）を投与することを含む、上記方法。
【請求項２】
卒中および他の神経学的疾患の治療または予防のための医薬の製造における、ＭＡＧアンタゴニストまたは抗ＭＡＧ抗体（改変型抗体またはその機能的フラグメントを含む）の使用。
【請求項３】
卒中または他の神経学的疾患を患うかまたはそれを発症する危険性のあるヒト患者における、神経変性の阻害および／または機能回復の促進方法であって、それらを必要とする該ヒトに、有効量のＭＡＧアンタゴニストまたは抗ＭＡＧ抗体（改変型抗体またはその機能的フラグメントを含む）を投与することを含む、上記方法。
【請求項４】
卒中および他の神経学的疾患を患うかまたはそれを発症する危険性のあるヒト患者における神経変性の阻害および／または機能回復の促進のための医薬の製造における、ＭＡＧアンタゴニストまたは抗ＭＡＧ抗体（改変型抗体またはその機能的フラグメントを含む）の使用。
【請求項５】
改変型抗ＭＡＧ抗体およびその機能的フラグメント。
【請求項６】
以下の（ａ）および／または（ｂ）を含む改変型抗ＭＡＧ抗体およびその機能的フラグメント。
ａ）ＭＡＧに特異的に結合する非ヒトドナーモノクローナル抗体のＬ鎖の抗原結合ドメインのＣＤＲと置換されている抗原結合ドメインのＣＤＲを少なくとも１つ有するアクセプターモノクローナル抗体のＬ鎖を含む抗体Ｌ鎖可変ドメイン、および／または
ｂ）ＭＡＧに特異的に結合する非ヒトドナーモノクローナル抗体のＨ鎖の抗原結合ドメインのＣＤＲと置換されている抗原結合ドメインのＣＤＲを少なくとも１つ有するアクセプターモノクローナル抗体のＨ鎖を含む抗体Ｈ鎖可変ドメイン
【請求項７】
以下のＣＤＲの１つ以上を含む改変型抗体またはその機能的フラグメント。
【表１】
2008291031.tif 000007
【請求項８】
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３から選択される１つ以上のＣＤＲを含むＨ鎖可変ドメイン、ならびに／または、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３から選択される１つ以上のＣＤＲを含むＬ鎖可変ドメインを含む、請求項７に記載の改変型抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項９】
超可変領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を順に含むＨ鎖可変ドメイン（ＶＨ）
ならびに／または
超可変領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を順に含むＬ鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
を含む、請求項８に記載の改変型抗ＭＡＧ抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項１０】
モノクローナルである請求項７記載の抗体。
【請求項１１】
ヒト化されたものである請求項７または８記載の抗体。
【請求項１２】
請求項５〜１２のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的フラグメントと薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
ヒトにおける卒中および他の神経学的疾患の治療または予防方法であって、それらを必要とする該ヒトに、有効量の請求項５〜１２に記載の抗ＭＡＧ抗体（改変またはその機能的フラグメントを含む）を投与することを含む、上記方法。
【請求項１４】
卒中および他の神経学的疾患の治療または予防のための医薬の製造における、請求項５〜１２に記載の抗ＭＡＧ抗体またはその機能的フラグメントの使用。
【請求項１５】
卒中または他の神経学的疾患を患うかまたはそれを発症する危険性のあるヒト患者における神経変性の阻害および／または機能回復の促進方法であって、それらを必要とする該ヒトに、有効量の請求項５−１２に記載の抗ＭＡＧ抗体またはその機能的フラグメントを投与することを含む、上記方法。
【請求項１６】
卒中および他の神経学的疾患を患うか、またはそれを発症する危険性のあるヒト患者における神経変性の阻害および／または機能回復の促進のための医薬の製造における、請求項５〜１２に記載の抗ＭＡＧ抗体またはその機能的フラグメントの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経学的疾患の治療方法およびかかる方法において用いるための抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
卒中は、西側世界における死亡および障害の主要原因である。卒中を治療するための認可治療はｔ−ＰＡ以外になく、これは、出血を排除するためにＣＴスキャンに続いて発症の３時間以内に投与しなければならない。現在まで、急性卒中の治療（すなわち、神経保護）に関する治療薬のほとんどは、主として、急性細胞死に関与することが知られるグルタミン酸受容体およびそれらの下流シグナル伝達経路の標的化を行うものである。しかしながら、現在まで、これらの方策は臨床試験において不成功であることが立証されており、しばしば、用量限定的な副作用を伴う（Hill & Hachinski, The Lancet, 352: (suppl III) 10-14 (1998)）。したがって、血流の停止に続く細胞死の改善に対する新規アプローチの必要性が存在する。
【０００３】
卒中の発症に続いて、多くの患者においてはある程度の自発的機能回復が観察されているが、これは脳が（限定的ではあるが）損傷の後に修復および／または再造形する能力を有することを示唆する。したがって、この回復を強化する潜在能力を有する作用物質は脳虚血の発症のかなり後に（数日の可能性がある）なされる処置を可能にし得る。急性の神経保護および強化された機能回復の両者を付与することができる作用物質は、現在の潜在的神経保護策を上回る著しい利点を提供し得る。
【０００４】
機能回復の基礎をなす機構は現時点では不明である。損傷または非損傷軸索の出芽が可能性のある機構の１つとして提唱されている。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究によって、脊髄損傷または卒中の神経栄養性因子での治療が機能回復およびある程度の軸索出芽を増強することが示されてはいるものの、これらは軸索出芽の程度と機能回復の程度との直接的な関連を立証してはいない（Jakeman, et al. 1998, Exp. Neurol. 154: 170-184, Kawamata et al.1997, Proc Natl Acad. Sci. USA., 94: 8179-8184, Ribotta, et al. 2000, J Neurosci. 20: 5144-5152）。さらに、軸索出芽は生存可能なニューロンを必要とする。したがって、広範な細胞死を伴う卒中のような疾患において、卒中後に所定の作用物質によって付与される機能回復の強化は軸索出芽以外の機構、例えば、内在性幹細胞の分化、重複経路の活性化、受容体分布またはニューロンもしくはグリアの興奮性の変化によるものであり得る（Fawcett & Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391, Horner & Gage, 2000, Nature 407 963-970）。
【０００５】
次の損傷を修復する中枢神経系（ＣＮＳ）の限られた能力は、部分的には、軸索出芽（神経突起成長）に対する阻害効果を有するＣＮＳ環境内の分子のためであると考えられる。ＣＮＳミエリンは阻害性分子を含むものと考えられる（Schwab ME and Caroni P (1998) J. Neurosci. 8, 2381-2193）。２種類のミエリンタンパク質、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）およびノゴ（Ｎｏｇｏ）がクローン化され、神経突起成長の推定阻害因子と同定されている（Sato S. et al (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163, 1473-1480; McKerracher L et al (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G et al (1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K and Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer et al (1996) Neuron 16, 1107-1113; WO9522344; WO9701352; Prinjha R et al (2000) Nature 403, 383-384; Chen MS et al (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T et al (2000) Nature 403, 439-444; US005250414A; WO200005364A1; WO0031235）。
【０００６】
ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）は、５つの細胞外免疫グロブリンドメイン、１つの膜貫通ドメインおよび１つの細胞内ドメインからなる、ミエリンの表面上に発現する細胞表面膜貫通分子である。ＭＡＧ発現はＣＮＳおよび末梢神経系（ＰＮＳ）内のミエリン化グリアに制限される。ＭＡＧは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの神経フィラメントリン酸化および神経突起成長の阻害を含むニューロン細胞骨格に対するの作用を媒介するニューロン受容体（１つもしくは複数）と相互作用するものと考えられる。ＭＡＧのアンタゴニストが損傷後の軸索出芽の促進に有用であるものと推定されているが（ＷＯ９５２２３４４号、ＷＯ９７０１３５２号およびＷＯ９７０７８１０号）、これらの請求の範囲はｉｎ  ｖｉｖｏデータによって支持されてはいない。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＮＳニューロンからの軸索出芽の阻害因子としてのＭＡＧの役割は立証されていない（Li CM et al (1994) Nature 369, 747-750; Montag, D et al (1994) Neuron 13, 229-246; Lassmann H et al (1997) GLIA 19, 104-110; Li C et al (1998) J. Neuro. Res. 51, 210-217; Yin X et al (1998) J. Neurosci. 18, 1953-1962; Bartsch U et al (1995) Neuron 15 1375-1381; Li M et al (1996) 46, 404-414）。
【０００７】
今や、抗ＭＡＧモノクローナル抗体は、ラット（卒中のモデル）において局所的脳虚血の後に脳内に直接または静脈内投与されたときに、神経保護をもたらし、かつ機能回復を強化することが見出されている。したがって、抗ＭＡＧ抗体またはＭＡＧアンタゴニストは、急性神経保護に加えて卒中後の機能回復促進の両者の潜在的治療薬を提供する。ＭＡＧとそのニューロン受容体との相互作用を破壊する他の作用物質（例えば、受容体アンタゴニストまたはＭＡＧ受容体（１つもしくは複数）を認識する抗体）もこの治療上の利益を提供し得る。
【０００８】
神経変性のプロセスは、急性疾患、例えば、卒中、外傷性脳損傷および脊髄損傷に加えて、アルツハイマー病、前頭−側頭痴呆（タウパシー）、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病および多発性硬化症を含む慢性疾患を含む多くの神経学的疾患の基礎をなす。したがって、抗ＭＡＧ  ｍａｂまたはＭＡＧアンタゴニストは、これらの障害に関連する細胞死の緩和および機能回復の促進の両者により、これらの疾患の治療において有用であり得る。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、一態様において、ヒトにおける卒中および他の神経学的疾患の治療または予防方法であって、それらを必要とする該ヒトに有効量のＭＡＧアンタゴニストまたは、抗ＭＡＧ抗体（改変型抗体もしくはその機能的フラグメントを含む）を投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、卒中および他の神経学的疾患の治療または予防のための医薬の製造における、ＭＡＧアンタゴニストまたは、改変型抗体もしくはその機能的フラグメントを含む、抗ＭＡＧ抗体の使用を提供する。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、卒中または他の神経学的疾患を患うかまたはそれを発症する危険性のあるヒト患者における神経変性の阻害および／または機能回復の促進方法であって、それらを必要とする該ヒトに有効量のＭＡＧアンタゴニストまたは抗ＭＡＧ抗体（改変型抗体もしくはその機能的フラグメントを含む）を投与することを含む方法を提供する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、卒中および他の神経学的疾患を患うかまたはそれを発症する危険性のあるヒト患者における神経変性の阻害および／または機能回復の促進のための医薬の製造における、ＭＡＧアンタゴニストまたは抗ＭＡＧ抗体（改変型抗体もしくはその機能的フラグメントを含む）の使用を提供する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は改変型抗ＭＡＧ抗体およびその機能的フラグメントを提供する。この抗Ｍａｇ  ｍＡＢは本発明の方法において有用であり得る。
【００１４】
したがって、本発明は、以下の（ａ）および／または（ｂ）を含む改変型抗体またはその機能的フラグメントを提供する：
ａ）ＭＡＧに特異的に結合する非ヒトドナーモノクローナル抗体のＬ鎖の抗原結合ドメインのＣＤＲと置換されている抗原結合ドメインのＣＤＲを少なくとも１つ有するアクセプターモノクローナル抗体のＬ鎖を含む、抗体Ｌ鎖可変ドメインおよび／または
ｂ）ＭＡＧに特異的に結合する非ヒトドナーモノクローナル抗体のＨ鎖の抗原結合ドメインのＣＤＲと置換されている抗原結合ドメインのＣＤＲを少なくとも１つ有するアクセプターモノクローナル抗体のＨ鎖を含む、抗体Ｈ鎖可変ドメイン。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、１つ（もしくはより多くの）改変型抗ＭＡＧ抗体および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、以下のＣＤＲの１つ以上を含む改変型抗体またはその機能的フラグメントを提供する。これらのＣＤＲは、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋによって記述される通りに特定される（Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest; Fifth Edition; US Department of Health and Human Services; NIH publication No 91-3242, Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883）。ＣＤＲは、好ましくは、Ｋａｂａｔによって定義される通りであるが、ＣｈｏｔｈｉおよびＬｅｓｋによって定義されるようなタンパク質構造および折り畳みの原理に従い、さらなる残基も抗原結合領域の一部であると考えることでき、したがって、本発明に包含されることは理解されるであろう。
【表１】
2008291031.tif 000002
さらなる態様において、本発明は、（Ｋａｂａｔならびに／またはＣｈｏｔｉａおよびＬｅｓｋにより定義される）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３から選択される１つ以上のＣＤＲを含むＨ鎖可変ドメイン、ならびに／または、（Ｋａｂａｔならびに／またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋにより定義される）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３から選択される１つ以上のＣＤＲを含むＬ鎖可変ドメインを含む、改変型抗体またはその機能的フラグメントを提供する。
【００１７】
本発明は、さらに、
ａ）超可変領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を順に含むＨ鎖可変領域（ＶＨ）、
ならびに／または
ｂ）超可変領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を順に含むＬ鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む、改変型抗ＭＡＧ抗体またはその機能的フラグメントを提供する。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、改変型抗ＭＡＧ抗体またはその機能的フラグメントを薬学的に許容し得る希釈剤または担体と共に含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明の他の態様および利点は、詳細な説明およびそれらの好ましい態様においてさらに説明する。
【００２０】
発明の詳細な説明
ＭＡＧアンタゴニスト
「ＭＡＧアンタゴニスト」とは、ニューロンへの結合および神経突起成長の阻害などのＭＡＧの機能を阻害する化合物を指す。アンタゴニストの適切なアッセイおよびアンタゴニストの例は、ＷＯ９５２２３４４号、ＷＯ９７０１３５２号およびＷＯ９７０７８１０号に開示されており、これには：
改変された生物学的活性を特徴とする改変型または突然変異型のＭＡＧ；
シアル酸担持糖；
糖に結合するシアル酸の修飾誘導体；
タンパク質または脂質キャリア分子に結合するシアル酸担持糖；
タンパク質または脂質キャリア分子に結合する修飾シアル酸担持糖；および
ＰＮＳまたはＣＮＳにおけるニューロン表面へのＭＡＧ結合を媒介するＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−ＧａｌＮＡｃ構造を有するシアル酸残基を改変または除去することができる酵素、
が含まれる。
【００２１】
改変型ＭＡＧの例は、ヒト免疫グロブリン分子のＦｃドメインに結合したＭＡＧの細胞外Ｉｇ様ドメイン１〜３または１〜５を含む可溶性キメラタンパク質、例えば、ＷＯ９７０１３５２号に記載されるＩｇＧ（ＭＡＧ［ｄ１−３］−ＦｃまたはＭＡＧ［１−５］−Ｆｃ）である。
【００２２】
遊離シアル酸担持糖の例は、シアロ２，３−α−ラクトースまたは２，３−ジデオキシシアル酸である。
【００２３】
酵素の例は、シアリダーゼまたはシアリルトランスフェラーゼである。
【００２４】
抗ＭＡＧ抗体
抗体は、好ましくはヒトＭＡＧに対して生じたものであり、かつ、好ましくはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）または改変型抗体（好ましくはヒト化もしくは再構成されたもの）である。
【００２５】
好ましい態様において、ｍＡｂまたは改変型抗体はＩｇＧクラスである。
【００２６】
さらなる好ましい態様において、抗体は中和抗体である。
【００２７】
したがって、本発明は、ＭＡＧに特異的に結合する少なくとも１つのＣＤＲを含む改変型抗ＭＡＧ抗体をさらに提供する。好ましくは、この抗体はヒト化抗体である。
【００２８】
したがって、本発明は、以下の（ｃ）および／または（ｄ）を含む改変型抗体またはその機能的フラグメントを提供する：
ｃ）ＭＡＧに特異的に結合する非ヒトドナーモノクローナル抗体のＬ鎖の抗原結合ドメインのＣＤＲと置換されている抗原結合ドメインのＣＤＲを少なくとも１つ有するアクセプターモノクローナル抗体のＬ鎖を含む抗体Ｌ鎖可変ドメイン、および／または
ｄ）ＭＡＧに特異的に結合する非ヒトドナーモノクローナル抗体のＨ鎖の抗原結合ドメインのＣＤＲと置換されている抗原結合ドメインのＣＤＲを少なくとも１つ有するアクセプターモノクローナル抗体のＨ鎖を含む抗体Ｈ鎖可変ドメイン。
【００２９】
より好ましい態様においては、アクセプター抗体のＬ鎖および／またはＨ鎖ＣＤＲの３つ全てがドナー抗体のＣＤＲと置換されている。好ましくは、アクセプター抗体はヒト抗体である。
【００３０】
「中和」とは、ニューロンへの結合および神経突起成長の阻害などのＭＡＧ機能の実質的な阻害を指す。
【００３１】
「実質的な阻害」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において測定される場合に、７５％、より好ましくは８５％、最も好ましくは９５％の阻害を指す。
【００３２】
「改変型抗体」とは、選択された宿主細胞における発現によって得ることができる、改変型免疫グロブリンコード領域によってコードされるタンパク質を指す。そのような改変型抗体には、操作された抗体（例えば、キメラ、再構成、ヒト化もしくはベクター化抗体）または免疫グロブリン定常領域の全てもしくは一部を欠く抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、もしくはＦ（ａｂ）２等が含まれる。
【００３３】
「改変型免疫グロブリンコード領域」とは、改変型抗体をコードする核酸配列を指す。改変型抗体がＣＤＲグラフト化もしくはヒト化抗体であるときには、非ヒト免疫グロブリンに由来する相同性決定領域（ＣＤＲ）をコードする配列がヒト可変フレームワーク配列を含む第１免疫グロブリンパートナーに挿入される。任意により、この第１免疫グロブリンパートナーは第２免疫グロブリンパートナーと機能可能なように連結される。
【００３４】
「第１免疫グロブリンパートナー」とは、非改変（もしくは天然）ＣＤＲコード領域がドナー抗体のＣＤＲコード領域と置換されている、ヒトフレームワークまたはヒト免疫グロブリン可変領域をコードする核酸配列を指す。このヒト可変領域は、免疫グロブリンＨ鎖、Ｌ鎖（もしくは両鎖）、それらの類似体または機能的フラグメントであり得る。抗体（免疫グロブリン）の可変領域内に位置するそのようなＣＤＲ領域は、当該技術分野において公知の方法によって決定することができる。例えば、Kabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S.Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)）は、ＣＤＲの位置決定のための規則を開示する。加えて、ＣＤＲ領域／構造を同定するのに有用であるコンピュータプログラムが公知である。
【００３５】
「第２免疫グロブリンパートナー」とは、第１免疫グロブリンパートナーが、フレームを合わせてまたは任意の通常リンカー配列を用いて融合される（すなわち、機能可能なように連結する）、タンパク質またはペプチドをコードする別のヌクレオチド配列を指す。好ましくは、それは免疫グロブリン遺伝子である。第２免疫グロブリンパートナーには、その同じ定常領域全体をコードする核酸配列（すなわち、相同−第１および第２改変型抗体が同じ供与源から誘導される）または別の（すなわち、異種）目的の抗体が含まれる。それは免疫グロブリンＨ鎖であってもＬ鎖であってもよい（または、単一ポリペプチドの一部としての両鎖であってもよい）。第２免疫グロブリンパートナーは特定の免疫グロブリンクラスまたはアイソタイプに限定されない。加えて、第２免疫グロブリンパートナーは、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２に見出されるもののような免疫グロブリン定常領域の一部（すなわち、適切なヒト定常領域またはフレームワーク領域の別の部分）を含むことができる。そのような第２免疫グロブリンパートナーは、宿主細胞の外表面上に、例えばファージ呈示ライブラリの一部として、露出される完全な膜タンパク質をコードする配列、または分析もしくは診断検出のためのタンパク質、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等をコードする配列を含んでもよい。
【００３６】
Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ）２という用語は、それらの標準的な意味で用いられる（例えば、Harlow et al., Antibodies A Labortory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)を参照）。
【００３７】
ここで用いられる場合、「操作された抗体」とは、選択されたアクセプター抗体のＬ鎖および／またはＨ鎖可変ドメインの一部が、選択されたエピトープに対する特異性を有する１以上のドナー抗体に由来する類似部分と置換されている、特定のタイプの改変型抗体、すなわち、全長合成抗体（例えば、抗体フラグメントとは対称的に、キメラ、再構成またはヒト化抗体）を説明する。例えば、そのような分子には、非修飾Ｌ鎖（もしくはキメラＬ鎖）を伴うヒト化Ｈ鎖、またはその逆を特徴とする抗体が含まれる。操作された抗体は、ドナー抗体の結合特異性を保持するため、アクセプター抗体のＬ鎖および／またはＨ鎖可変ドメインフレームワークをコードする核酸配列の改変を特徴とすることもできる。これらの抗体は、アクセプター抗体に由来する１以上のＣＤＲ（好ましくは全てのＣＤＲ）の、本明細書で説明されるドナー抗体に由来するＣＤＲとの置換を含むことができる。
【００３８】
「キメラ抗体」とは、アクセプター抗体から誘導されるＬ鎖およびＨ鎖定常領域と会合した、ドナー抗体から誘導される天然可変領域（Ｌ鎖およびＨ鎖）を含む操作された抗体の１タイプを指す。
【００３９】
「ヒト化抗体」とは、非ヒトドナー免疫グロブリンから誘導されるＣＤＲを有し、その分子の残りの免疫グロブリン誘導部分は１つ（もしくはより多くの）ヒト免疫グロブリン（１つもしくは複数）から誘導されている、操作された抗体の１タイプを指す。加えて、フレームワーク支持残基が結合親和性を保存するように改変されていてもよい（例えば、Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86: 10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9: 421 (1991)を参照）。
【００４０】
「再構成ヒト抗体」とは、最小限、第１ヒトモノクローナルドナー抗体に由来する少なくとも１つのＣＤＲが第２ヒトアクセプター抗体のＣＤＲの代わりに用いられる改変型抗体を指す。好ましくは、６つのＣＤＲ全てが置換される。より好ましくは、第１ヒトドナーモノクローナル抗体に由来する抗原結合領域（例えば、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２）全体が第２ヒトアクセプターモノクローナル抗体における対応領域の代わりに用いられる。最も好ましくは、第１ヒトドナーに由来するＦａｂ領域が第２ヒトアクセプター抗体の適切な定常領域と機能可能なように連結して全長モノクローナル抗体を形成する。
【００４１】
「ベクター化抗体」とは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する輸送を改善するため、作用物質が結合している抗体を指す。その結合は化学的であってもよく、またはその代わりに、その部分が抗体内に操作されて入れられていてもよい。一例は、脳毛細管内皮細胞受容体に向けられた抗体、例えば、抗インシュリン受容体抗体または抗トランスフェリン受容体抗体とのキメラを作製することである（Saito et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 10227-31; Pardridge et al (1995) Pharm. Res. 12 807-816; Broadwell et al (1996) Exp. Neurol. 142 47-65; Bickel et al (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90, 2618-2622; Friden et al (1996) J. Pharm. Exp. Ther. 278 1491-1498, 米国特許第5182107号, 米国特許第5154924号 米国特許第5833988号, 米国特許第5527527号）。受容体に結合した後、その二特異的抗体の両方の構成要素が経細胞輸送のプロセスによってＢＢＢを横切って通過する。あるいは、作用物質はそのような細胞表面受容体と結合するリガンド、例えば、インシュリン、トランスフェリンまたは低密度リポタンパク質であってもよい（Descamps et al (1996) Am. J. Physiol. 270 H1149-H1158; Duffy et al (1987) Brain Res. 420 32-38; Dehouck et al (1997) J. Cell Biol. 1997 877-889）。ＢＢＢを横切る輸送を改善することが知られる天然ペプチド、例えば、ペネトラチン並びにＳｙｎＢ１およびＳｙｎＢ３を用いることもできる（Rouselle et al (2000) Mol. Pharm. 57, 679-686およびRouselle et al (2001) Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 296, 124-131）。
【００４２】
「ドナー抗体」という用語は、改変型免疫グロブリンコード領域を提供し、かつそのドナー抗体に特徴的な抗原特異性および中和活性を有する発現された改変型抗体を生じるように、その可変領域、ＣＤＲ、またはそれらの他の機能的フラグメントもしくは類似体の核酸配列を第１免疫グロブリンパートナーに付与する抗体（モノクローナルもしくは組換え）を指す。
【００４３】
「アクセプター抗体」という用語は、そのＨ鎖および／もしくはＬ鎖フレームワーク領域、ならびに／またはそのＨ鎖および／もしくはＬ鎖定常領域をコードする核酸配列の全て（または任意の部分であるが、好ましくは全て）を第１免疫グロブリンパートナーに与える、ドナー抗体とは異種の抗体（モノクローナルもしくは組換え）を指す。好ましくは、ヒト抗体がアクセプター抗体である。
【００４４】
「ＣＤＲ」は、免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列と定義される。例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照のこと。免疫グロブリンの可変部分には３つのＨ鎖および３つのＬ鎖ＣＤＲ（もしくはＣＤＲ領域）が存在する。したがって、「ＣＤＲ」は、本明細書で用いられる場合、３つのＨ鎖ＣＤＲ全てもしくは３つのＬ鎖ＣＤＲ全て（または、適切であるならば、全てのＨ鎖ＣＤＲおよび全てのＬ鎖ＣＤＲの両者）を指す。抗体の構造およびタンパク質折り畳みは他の残基が抗原結合領域の一部と考えられることを意味することがあるが、当業者であればそのように理解するであろう。例えば、Chothia et al., (1989) Coformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883を参照のこと。
【００４５】
ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合するための接触残基の大部分を提供する。本発明における目的のＣＤＲはドナー抗体可変Ｈ鎖およびＬ鎖配列から誘導され、かつ天然ＣＤＲの類似体を含み、その類似体もまた、それらが誘導されるドナー抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能力を共有または保持する。
【００４６】
「機能的フラグメント」は、そのフラグメントが誘導される抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能力を保持する、部分的Ｈ鎖またはＬ鎖可変配列（例えば、免疫グロブリン可変領域のアミノまたはカルボキシ末端での僅かな欠失）である。
【００４７】
「類似体」は、少なくとも１つのアミノ酸で修飾されたアミノ酸配列であり、その修飾は化学的であるか、または数個のアミノ酸（すなわち、１０以下）の置換もしくは再配列であってもよく、その修飾はそのアミノ酸配列に非修飾配列の生物学的特徴（例えば、抗原特異性および高親和性）を保持させる。例えば、特定のエンドヌクレアーゼ制限部位がＣＤＲコード領域内またはその周囲に作製されるとき、置換により（サイレント）突然変異を構築することができる。本発明では、本発明の抗体の類似体の使用を含む。アミノ酸または核酸配列における僅かな変化によって、例えば、実質的に類似する特性を保持する元のタンパク質の対立遺伝子形態となり得る。したがって、本発明の抗体の類似体には、Ｈ鎖およびＬ鎖の超可変領域におけるＣＤＲがＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と定義されるＣＤＲと少なくとも８０％相同、好ましくは少なくとも９０％相同、より好ましくは少なくとも９５％相同であり、かつＭＡＧ中和活性を有するものが含まれる。アミノ酸配列は、配列が最適に整列されたときにそれらが同様の位置に８０％の同一のアミノ酸残基を有する場合（ギャップまたは挿入は非同一残基とカウントされる）に、少なくとも８０％相同である。
【００４８】
類似体はまた対立遺伝子変異体として生じてもよい。「対立遺伝子変異体または修飾」は核酸配列における変化である。そのような変異体または修飾は、遺伝暗号の縮重によるものであっても、または望ましい特徴をもたらすように慎重に操作されたものであってもよい。これらの変異または修飾は、任意のコードされたアミノ酸配列に変化を生じても生じなくてもよい。
【００４９】
「エフェクタ剤」という用語は、改変型抗体、および／あるいはドナー抗体の天然もしくは合成Ｌ鎖もしくはＨ鎖またはドナー抗体の他のフラグメントが通常の手段によって会合することができる非タンパク質キャリア分子を指す。そのような非タンパク質キャリアには、診断分野において用いられる通常のキャリア、例えば、ポリスチレンもしくは他のプラスチックビーズ、例えばＢＩＡｃｏｒｅ［Ｐｈａｒｍａｃｉａ］系において用いられるような多糖、または医療分野において有用であり、かつヒトおよび動物への投与に安全な他の非タンパク質物質が含まれ得る。他のエフェクタ剤には、重金属分子をキレート化するためのマクロサイクル、または放射性同位体が含まれ得る。そのようなエフェクタ剤、例えばポリエチレングリコール、は改変型抗体の半減期を増加させるのに有用でもあり得る。
【００５０】
ＭＡＧに特異的な中和抗体は記載されており（Poltorak et al (1987) Journal of Cell Biology 105, 1893-1899, DeBellard et al (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang et al (1997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K and Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262）、かつ商業的に入手可能である（ＭＡＢ１５６７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））。
【００５１】
この抗体は配列決定されており、したがって、本発明の好ましい態様においては、以下のＣＤＲの１つ以上を含む改変型抗体またはその機能的フラグメントを含む改変型抗ＭＡＧ抗体またはその機能的フラグメントが提供される。これらのＣＤＲはKabatまたはChotia and Leskによって記述されるように同定される。（Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest; Fifth Edition; US Department of Health and Human Services; NIH publication No 91-3242, Chotia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883）。両文献は本発明に包含される。
【表２】
2008291031.tif 000003
【００５２】
さらなる態様において、本発明は、（Ｋａｂａｔおよび／またはＣｈｏｔｉａおよびＬｅｓｋによる定義で）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３から選択される１つ以上のＣＤＲを含むＨ鎖可変ドメイン、ならびに／または（Ｋａｂａｔおよび／またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋによる定義で）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３から選択される１つ以上のＣＤＲを含むＬ鎖可変ドメインを含む、改変型抗体またはその機能的フラグメントを提供する。
【００５３】
本発明は、さらに、
ｃ）超可変領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を順に含むＨ鎖可変領域（ＶＨ）、
ならびに／または
ｄ）超可変領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を順に含むＬ鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む、改変型抗ＭＡＧ抗体またはその機能的フラグメントを提供する。
【００５４】
さらなる態様において、本発明は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３をコードするポリヌクレオチドを提供する。好ましいポリヌクレオチド配列は図４および５において下線が付されている。
【００５５】
本発明のさらなる態様においては、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含み、より好ましくは３つのＣＤＲ全てを順に含む改変型抗ＭＡＧ抗体のＬ鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００５６】
本発明のさらなる態様においては、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含み、より好ましくは３つのＣＤＲ全てを順に含む改変型抗ＭＡＧ抗体のＨ鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００５７】
本発明のさらなる態様は、改変型抗ＭＡＧ抗体またはその機能的フラグメントを薬学的に許容し得る希釈剤または担体と共に含む医薬組成物を提供する。この改変型抗体は、好ましくはモノクローナル抗体、好ましくはヒト化抗体である。
【００５８】
あるいは、非ヒト種（例えば、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリ、齧歯類（例えば、マウスおよびラット）等）を免役し、ヒトＭＡＧと交差反応する抗体を産生することができるあらゆる種、例えば、ヒト又はニワトリに由来する非改変ＭＡＧを呈示することで望ましい免疫グロブリンを産生することにより、抗体、改変型抗体およびフラグメントを構築することができる。通常のハイブリドーマ技術を用いて、ＭＡＧに対する非ヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞株を提供する。そのようなハイブリドーマを、次に、ストレプトアビジン被覆プレートに結合させたビオチニル化ＭＡＧを用いて、またはビオチニル化ＭＡＧを用いる同種ユーロピニウム−ＡＰＣ連結イムノアッセイにおいて、３８４もしくは９６ウェルプレートに被覆させたＭＡＧを用いる結合についてスクリーニングする。
【００５９】
非改変ヒト抗体は、ヒト抗体マウス、例えば、マウス免疫グロブリン遺伝子が除去され、かつヒト免疫グロブリンをコードする遺伝子がマウス染色体に挿入されている「ゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）」（Ａｂｇｅｎｉｘ）において産生させることができる。これらのマウスを通常通り免役し、ヒト遺伝子から誘導される抗体応答を発生させる。そのようにしてマウスがヒト抗体を産生し、これは陽性ハイブリドーマを選択した後にヒト化する必要性がなくなる（Green L.L., J Immunol Methods 1999 Dec 10; 231(1-2): 11-23）。
【００６０】
本発明は、ＭＡＧに対するｍＡｂから誘導されるＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ'）２フラグメントの使用も含む。これらのフラグメントは、ｉｎ  ｖｉｖｏで保護的である作用物質として有用である。ＦａｂフラグメントはＬ鎖全体およびＨ鎖のアミノ末端部分を含み；Ｆ（ａｂ'）２フラグメントはジスルフィド結合によって結合する２つのＦａｂフラグメントにより形成されるフラグメントである。ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ'）２フラグメントは通常の手段、例えば、適切なタンパク分解酵素（パパインおよび／またはペプシン）でのｍＡｂの開裂によって、または組換え法によって得ることができる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ'）２フラグメントは、それら自体、治療薬または予防薬として、並びにここで説明される組換えまたはヒト化抗体の形成において有用な可変領域およびＣＤＲ配列を含む配列のドナーとして有用である。
【００６１】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ'）２フラグメントは組合せファージライブラリによって（例えば、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)を参照）、または免疫グロブリン鎖シャッフリングによって（例えば、Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)を参照）によって構築することもでき、これら文献はいずれも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００６２】
したがって、ヒト抗体フラグメントファージ呈示ライブラリを用いて、ＭＡＧに特異的なヒト抗体フラグメント（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）を単離することができる。ヒト抗体フラグメントタンパク質を呈示するバクテリオファージ粒子のライブラリをＭＡＧタンパク質に対してパニングすることができる。ＭＡＧと結合する抗体フラグメントを呈示するファージをライブラリから保持し、クローン的に増幅させる。次に、ヒト抗体遺伝子を特定のバクテリオファージから切り出し、ヒトＩｇＧ定常領域を含むヒトＩｇＧ発現構築体に挿入して、ＭＡＧに特異的な単離バクテリオファージに由来する可変領域を有する未変性ヒトＩｇＧ分子を形成する。
【００６３】
ドナー抗体は、そのドナー抗体の抗原結合特性を特徴とする様々な改変型抗体の設計および獲得において有用である配列、例えば、可変Ｈ鎖および／またはＬ鎖ペプチド配列、フレームワーク配列、ＣＤＲ配列、機能的フラグメント、およびそれらの類似体、並びにそれらをコードする核酸配列を導くことができる。
【００６４】
遺伝暗号の縮重を考慮して、可変Ｈ鎖およびＬ鎖アミノ酸配列並びにＣＤＲ配列に加えて、ドナー抗体の抗原特異性を共有する機能的フラグメントおよびそれらの類似体をコードする様々なコード配列を構築することができる。可変鎖ペプチド配列またはＣＤＲをコードする単離核酸配列またはそれらのフラグメントを、改変型抗体、例えば、キメラもしくはヒト化抗体、または、第２免疫グロブリンパートナーと機能可能なように組み合わせた場合には、他の操作された抗体の産生に用いることができる。
【００６５】
改変型免疫グロブリン分子は、操作された抗体、例えば、キメラ抗体およびヒト化抗体を含む改変型抗体をコードすることができる。望ましい改変型免疫グロブリンコード領域は、抗ＭＡＧ抗体、好ましくは、高親和性抗体の抗原特異性を有するペプチドをコードする、第１免疫グロブリンパートナー（ヒトフレームワークまたはヒト免疫グロブリン可変領域）に挿入されたＣＤＲエンコード領域を含む。
【００６６】
好ましくは、第１免疫グロブリンパートナーは、第２免疫グロブリンパートナーと機能可能なように連結する。第２免疫グロブリンパートナーは上に定義され、目的第２抗体領域、例えば、Ｆｃ領域をコードする配列を含むことができる。第２免疫グロブリンパートナーは、Ｌ鎖またはＨ鎖定常領域が、フレームを合わせてまたはリンカー配列を介して融合する別の免疫グロブリンをコードする配列を含むこともできる。ＭＡＧの機能的フラグメントまたは類似体に対する操作された抗体は強化された結合を誘発するように設計することができる。
【００６７】
第２免疫グロブリンパートナーは、第２免疫グロブリンパートナーが通常の手段によって機能可能なように連結することができる、非タンパク質キャリア分子を含む、上で定義されるエフェクタ剤と会合することもできる。
【００６８】
第２免疫グロブリンパートナー（例えば抗体配列）とエフェクタ剤との融合または連結は、あらゆる適切な手段によるもの、例えば、通常の共有もしくはイオン結合、タンパク質融合、またはヘテロ二官能性交差リンカー（例えば、カルボジイミド、グルタルアルデヒド）等によるものであり得る。そのような技術は当該技術分野において公知であり、通常の化学および生化学のテキストにおいて容易に説明される。
【００６９】
加えて、第２免疫グロブリンパートナーとエフェクタ剤との間の望ましい程度の空間を単に提供する通常のリンカー配列を改変型免疫グロブリンコード領域内に構築することもできる。そのようなリンカーの設計は当業者に公知である。
【００７０】
さらなる態様において、本発明の抗体はそれに結合するさらなる作用物質を有することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術の手順を用いて、完全抗体分子のＦｃフラグメントまたはＣＨ２−ＣＨ３ドメインが酵素または他の検出可能な分子（すなわち、ポリペプチドエフェクタまたは受容体分子）と置換されている本発明の操作された抗体を作製することができる。
【００７１】
第２免疫グロブリンパートナーは、抗ＭＡＧ抗体の抗原特異性を有するＣＤＲ含有配列とは異種の非免疫グロブリンペプチド、タンパク質またはそれらのフラグメントと機能可能なように連結することもできる。生じるタンパク質は、発現時に、抗ＭＡＧ抗原特異性および非免疫グロブリンの特徴の両者を示し得る。その融合パートナーの特徴は、例えば、機能的特徴、例えば、結合もしくは受容体ドメイン、または、その融合パートナー自体が治療用タンパク質である場合には、治療上の特徴、またはさらなる抗原の特徴であり得る。
【００７２】
本発明の別の望ましいタンパク質は、全長Ｈ鎖およびＬ鎖、またはそれらの任意の別個のフラグメント、例えばＦａｂもしくはＦ（ａｂ'）２フラグメント、Ｈ鎖二量体、またはそれらのあらゆる最小組換えフラグメント、例えばＦｖを有する完全抗体分子、または選択されたドナーｍＡｂと同じ特異性を有する一本鎖抗体（ＳＣＡ）、あるいは他の任意の分子を含むことができる。そのようなタンパク質は改変型抗体の形態で用いることができ、またはその非融合形態で用いることができる。
【００７３】
第２免疫グロブリンパートナーがドナー抗体とは異なる抗体、例えば、任意のアイソタイプもしくはクラスの免疫グロブリンフレームワークまたは定常領域から誘導される場合には常に、操作された抗体が得られる。操作された抗体は、１つの供与源、例えば、アクセプター抗体に由来する免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域および可変フレームワーク領域、並びにドナー抗体に由来する１以上の（好ましくは全ての）ＣＤＲを含むことができる。加えて、ドナー抗体の抗原結合特異性を保持するために、アクセプターｍＡｂＬ鎖および／またはＨ鎖可変ドメインフレームワーク領域の、核酸もしくはアミノ酸レベルでの、またはドナーＣＤＲ領域の改変、例えば、欠失、置換、または付加をなすことができる。
【００７４】
そのような操作された抗体は、抗ＭＡＧ  ｍＡｂの可変Ｈ鎖および／もしくはＬ鎖の１つ（または両者）または１つ以上のＨ鎖もしくはＬ鎖ＣＤＲを用いるように設計される。操作された抗体は、上で定義される、中和抗体であり得る。
【００７５】
そのような操作された抗体には、選択されたヒト免疫グロブリンもしくはサブタイプのフレームワーク領域を含むヒト化抗体、または抗ＭＡＧ抗体機能的フラグメントに融合するヒトＨ鎖およびＬ鎖定常領域を含むキメラ抗体が含まれ得る。適切なヒト（または他の哺乳動物）アクセプター抗体は、通常のデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴＲデータベース、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓデータベース、およびＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースから、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に対する相同性によって選択されるものであり得る。ドナー抗体のフレームワーク領域に対する（アミノ酸ベースでの）相同性を特徴とするヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のためのＨ鎖定常領域および／またはＨ鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適するものであり得る。Ｌ鎖定常または可変フレームワーク領域を提供することが可能である適切なアクセプター抗体は同様の方法で選択することができる。アクセプター抗体Ｈ鎖およびＬ鎖は同じアクセプター抗体に由来する必要はないことに注意すべきである。
【００７６】
望ましくは、異種フレームワークおよび定常領域はヒト免疫グロブリンクラスおよびアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（サブタイプ１ないし４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥから選択される。しかしながら、アクセプター抗体はヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む必要はない。例えば、ヒト免疫グロブリン鎖の一部をコードするＤＮＡ配列が非免疫グロブリンアミノ酸配列、例えば、ポリペプチドエフェクタまたは受容体分子をコードするＤＮＡ配列に融合する遺伝子を構築することができる。
【００７７】
好ましくは、ヒト化抗体において、Ｈ鎖およびＬ鎖の両者における可変ドメインが１以上のＣＤＲ置換によって操作されている。６つ全てのＣＤＲ、または６つ未満のＣＤＲの様々な組合せを用いることができる。好ましくは、６つ全てのＣＤＲが置換される。ヒトアクセプター抗体に由来する非修飾Ｌ鎖をＬ鎖として用いて、ヒトＨ鎖におけるＣＤＲのみを置換することができる。あるいは、通常の抗体データベースを利用することにより、適合するＬ鎖を別のヒト抗体から選択することができる。操作された抗体の残りは、あらゆる適切なアクセプターヒト免疫グロブリンから誘導することができる。
【００７８】
したがって、操作されたヒト化抗体は、好ましくは、天然ヒト抗体またはそれらのフラグメントの構造を有し、かつ有効な治療上の使用に必要な特性の組合せを有する。
【００７９】
当業者であれば、可変ドメインのアミノ酸における変化により、必ずしもドナー抗体（すなわち、類似体）の特異性および高親和性に影響を及ぼすことなしに、操作された抗体をさらに修飾することができることが理解できるであろう。可変ドメインフレームワークもしくはＣＤＲのいずれか、またはその両者において、Ｈ鎖およびＬ鎖アミノ酸を他のアミノ酸と置換できることが予期される。
【００８０】
加えて、定常領域を改変して本発明の分子の選択特性を強化または減少させることができる。例えば、二量体化、Ｆｃ受容体への結合、または相補体に結合して活性化する能力（例えば、Angal et al., Mol. Immunol, 30: 105-108 (1993), Xu et al., J. Biol. Chem, 269: 3469-3474 (1994), Winter et al., EP 307,434号Bを参照）。
【００８１】
キメラ抗体である改変型抗体は、両鎖についてヒト免疫グロブリン定常領域を伴う、フレームワーク領域を含む非ヒトドナー抗体Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域全体を提供することにより、上記ヒト化抗体とは異なる。
【００８２】
好ましくは、適切なドナーｍＡｂの可変Ｌ鎖および／またはＨ鎖配列、およびＣＤＲ、並びにそれらをコードする核酸配列は、以下の方法に従って本発明の改変型抗体、好ましくはヒト化抗体の構築において用いられる。同じまたは類似の技術を本発明の他の態様の生成に用いることもできる。
【００８３】
選択されたドナーｍＡｂを産生するハイブリドーマを通常通りにクローン化し、そのＨ鎖およびＬ鎖可変領域のＤＮＡを当業者に公知の技術、例えば、Sambrookら（Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)）に記載される技術によって得る。少なくともＣＤＲコード領域およびドナーｍＡｂ結合特異性を保持するために必要なアクセプターｍＡｂＬ鎖および／またはＨ鎖可変ドメインフレームワーク領域に加えて、ヒト免疫グロブリンから誘導される抗体鎖の残りの免疫グロブリン誘導部分を含む可変Ｈ鎖およびＬ鎖領域を、ポリヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素を用いて得る。ＣＤＲコード領域は、公知データベースを用い、他の抗体と比較することよって同定される。
【００８４】
次に、マウス／ヒトキメラ抗体を調製し、結合能力についてアッセイする。そのようなキメラ抗体は、両鎖についてヒトＩｇ定常領域を伴う、非ヒトドナー抗体ＶＨおよびＶＬ領域全体を含む。
【００８５】
ヒト抗体に由来するＨ鎖可変領域の相同フレームワーク領域は、コンピュータ化データベース、例えば、ＫＡＢＡＴＲを用いて同定することができ、ドナー抗体との相同性を有するヒト抗体がアクセプター抗体として選択される。適切なＬ鎖可変フレームワーク領域を同様の方法で設計することができる。
【００８６】
ヒト化抗体はキメラ抗体から誘導することができ、または好ましくは、Ｈ鎖およびＬ鎖からのドナーｍＡｂ  ＣＤＲコード領域を選択されたＨ鎖およびＬ鎖フレームワーク内に適切に挿入することにより、合成により作製することができる。あるいは、ヒト化抗体は、標準的な突然変異誘発技術を用いて作製することができる。したがって、得られるヒト化抗体は、ヒトフレームワーク領域およびドナーｍＡｂ  ＣＤＲコード領域を含む。続いて、フレームワーク残基を操作することができる。得られるヒト化抗体は、組換え宿主細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯまたはミエローマ細胞において発現させることができる。
【００８７】
これらの抗体のコード配列を、宿主細胞における複製および発現ならびに／またはそこからの分泌の制御が可能な通常の調節制御配列と機能的に連結して配置することにより、通常の発現ベクターまたは組換えプラスミドを作製する。調節配列には、他の公知抗体から誘導することができる、プロモーター配列、例えば、ＣＭＶプロモーター、およびシグナル配列が含まれる。同様に、相補的抗体Ｌ鎖またはＨ鎖をコードするＤＮＡ配列を有する第２発現ベクターを作製することができる。好ましくは、この第２発現ベクターは、各々のポリペプチド鎖が機能的に発現することを可能な限り確実なものとするため、コード配列および選択可能なマーカーが関与する範囲を除いて、第１のものと同一である。あるいは、改変型抗体のＨ鎖およびＬ鎖コード配列を単一のベクターに配置することができる。
【００８８】
選択された宿主細胞に、通常の技術により、第１および第２ベクターの両者を共トランスフェクトし（または単一ベクターによって単純にトランスフェクトし）、組換えまたは合成Ｌ鎖およびＨ鎖の両者を含む本発明のトランスフェクト宿主細胞を作出する。次に、このトランスフェクト細胞を通常の技術によって培養し、本発明の操作された抗体を産生させる。組換えＨ鎖および／またはＬ鎖の両者の会合を含むこのヒト化抗体を、適切なアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより、培養物からスクリーニングする。同様の通常の技術を他の改変型抗体および分子の構築に用いることができる。
【００８９】
本発明の方法および組成物の構築において用いられるクローニングおよびサブクローニング工程に適するベクターは当業者が選択することができる。例えば、通常のｐＵＣシリーズのクローン化ベクターを用いることができる。１つのベクターであるｐＵＣ１９は卸売商、例えば、Amersham（Buckinghamshire、英国）またはPharmacia（Uppsala、スウェーデン）から商業的に入手可能である。さらに、容易に複製可能であり、多数のクローニング部位および選択可能な遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有し、かつ容易に操作されるあらゆるベクターをクローニングに用いることができる。したがって、クローニングベクターの選択は本発明における限定要素ではない。
【００９０】
同様に、抗体の発現に用いられるベクターは、当業者があらゆる通常のベクターから選択することができる。これらのベクターは、選択された宿主細胞における異種ＤＮＡ配列の複製および発現を指令する選択された調節配列（例えば、ＣＭＶプロモーター）も含む。これらのベクターは、抗体をコードする上述のＤＮＡ配列または改変型免疫グロブリンコード領域を含む。加えて、これらのベクターは、即時操作のための所望の制限部位の挿入によって修飾された、選択された免疫グロブリン配列を組み込んでいてもよい。
【００９１】
発現ベクターは、異種ＤＮＡ配列、例えば、哺乳動物ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）の発現を増幅させるのに適する遺伝子を特徴としてもよい。他の好ましいベクター配列には、例えばウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）に由来する、ポリＡシグナル配列およびβグロブリンプロモーター配列（ｂｅｔａｇｌｏｐｒｏ）が含まれる。ここで有用な発現ベクターは、当業者に公知の技術によって合成することができる。
【００９２】
そのようなベクターの構成要素、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列等は、市販または天然資源から得ることができ、または選択された宿主における組換えＤＮＡの産生物の発現および／または分泌の指令において用いるための公知手順によって合成することができる。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母、および真菌の発現用に多くのタイプが当該技術分野において公知である、他の適切な発現ベクターをこの目的で選択することもできる。
【００９３】
本発明は、抗体またはそれらの改変型免疫グロブリン分子のコード配列を含む組換えプラスミドをトランスフェクトした細胞株も包含する。クローニングおよびこれらのクローニングベクターの他の操作に有用な宿主細胞も通常のものである。しかしながら、最も望ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の様々な株からの細胞を、クローニングベクターの複製および本発明の改変型抗体の構築における他の工程に用いる。
【００９４】
本発明の抗体の発現に適する宿主細胞または細胞株は、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ、ＣＯＳ、線維芽細胞（例えば、３Ｔ３）、および骨髄細胞、より好ましくは、ＣＨＯまたは骨髄細胞である。ヒト細胞を用いることができ、それにより、分子をヒトの糖鎖付加パターンで修飾することが可能となる。あるいは、他の真核細胞株を用いることができる。適切な哺乳動物宿主細胞並びに形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび産生物の産生および精製の方法の選択は当該技術分野において公知である。例えば、上に引用されるSambrookらを参照のこと。
【００９５】
細菌細胞は、本発明の組換えＦａｂの発現に適する宿主細胞として有用であることが判明し得る（例えば、Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130: 151-188 (1992)を参照）。しかしながら、細菌細胞において発現したタンパク質は折り畳まれていないかもしくは不正に折り畳まれた形態または糖鎖が付加していない形態となる傾向があるため、細菌細胞において産生されたあらゆる組換えＦａｂは抗原結合能力についてスクリーニングしなければならない。細菌細胞によって発現した分子が適正に折り畳まれた形態で産生された場合、その細菌細胞は望ましい宿主である。例えば、発現に用いられる大腸菌の様々な株がバイオテクノロジーに分野において宿主細胞として公知である。Ｂ．ズブチリス、ストレプトマイセス、他の桿菌等もこの方法において用いることができる。
【００９６】
所望であれば、当該技術分野において公知の酵母細胞の株も、昆虫細胞（例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）並びにウイルス発現系に加えて、宿主細胞として利用可能である。例えば、Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298, Plenum Press (1986)およびそこで引用される参考文献を参照のこと。
【００９７】
ベクターを構築することができる一般的な方法、本発明の宿主細胞を産生するのに必要なトランスフェクション方法、およびそのような宿主細胞から本発明の改変型抗体を産生するのに必要な培養方法は全て通常の技術である。同様に、ひとたび産生されると、本発明の抗体は、その産生後、細胞培養内容物から、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む当該技術分野の標準手順に従って精製することができる。そのような技術は当該技術分野の技術の範囲内であり、本発明を限定するものではない。
【００９８】
さらに別の抗体の発現方法は、米国特許第４，８７３，３１６号に記載されるもののようなトランスジェニック動物における発現を用いることができる。これは、哺乳動物に遺伝子導入で組み込まれるときにメスに所望の組換えタンパク質をその乳中に産生させる、動物のカゼインプロモーターを用いる発現系に関する。
【００９９】
望ましい方法によって発現させた後、次にその抗体を、適切なアッセイを用いることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性について調べる。現時点で通常のＥＬＩＳＡアッセイ形式は、ＭＡＧへの抗体の結合を定性的および定量的に評価するのに用いられる。加えて、他のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを、通常のクリアランス機構にもかかわらず体内での抗体の持続性を評価するために実施される次のヒト臨床研究の前に、中和効力の検証に用いることができる。
【０１００】
本発明の治療薬は、予防として、もしくは傷害後に、または他の点で必要なときに投与することができる。治療の用量および持続期間はヒト循環における本発明の分子の相対持続期間に関連し、治療する状態および患者の一般的な健康に応じて当業者が調整することができる。
【０１０１】
本発明の治療薬の投与形式は薬剤を宿主に送達するあらゆる適切な経路であり得る。本発明のアンタゴニストおよび抗体、並びに医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、静脈内、または鼻内投与に特に有用である。
【０１０２】
本発明の治療薬は、有効量の本発明のアンタゴニストまたは抗体を有効成分として薬学的に許容し得る担体中に含む医薬組成物として調製することができる。本発明の予防薬においては、即時注射可能な状態にある、好ましくは生理学的ｐＨで緩衝されている、操作された抗体を含有する水性懸濁液または溶液が好ましい。非経口投与用の組成物は、通常、薬学的に許容し得る担体、好ましくは水性担体中に溶解した本発明のアンタゴニストもしくは抗体またはそれらの混合物の溶液を含む。様々な水性担体、例えば、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン等を用いることができる。これらの溶液は無菌であり、かつ一般に、粒状物質を含まない。これらの溶液は、通常の公知滅菌技術（例えば、濾過）によって無菌化することができる。これらの組成物は、生理学的状態に近づけるのに必要である薬学的に許容し得る補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤等を含むことができる。そのような医薬配合物における本発明のアンタゴニストまたは抗体の濃度は、広範に、すなわち、約０．５％未満、通常は約１％もしくは少なくとも約１％から１５もしくは２０重量％までも変化することができ、かつ主として流体容積、粘度等に基づき、選択された投与形式に従って選択される。
【０１０３】
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬ無菌緩衝水、および約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、またはより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のアンタゴニストまたは抗体を含むように調製することができる。同様に、静脈内輸液用の本発明の医薬組成物は、２５０ｍｌの無菌リンゲル液、および約１〜約３０、好ましくは５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の操作された抗体を含むように作製することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、公知であるか、または当業者に明かであり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaに詳細に記載されている。
【０１０４】
本発明の治療薬は、医薬調製品の状態にあるとき、単位投与剤形で存在することが好ましい。適切な治療上有効な用量は当業者が容易に決定することができる。ヒトにおける卒中および他の神経学的疾患を有効に治療するには、体重７０ｋｇ当たり本発明のアンタゴニストまたは抗体の７００ｍｇまでの１回用量を、非経口、好ましくは、静脈内（ｉ．ｖ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）投与するべきである。そのような用量は、必要であれば、医師が適切に選択した適切な間隔で反復投与することができる。
【０１０５】
本明細書で説明される抗体は、保存のために凍結乾燥し、使用前に適切な担体で戻すことができる。この技術は通常の免疫グロブリンで有効であることが示されており、当該技術分野において公知の凍結乾燥および戻し技術を用いることができる。
【０１０６】
別の態様において、本発明は、ＭＡＧアンタゴニストまたは抗ＭＡＧ抗体（改変型抗体もしくはその機能的フラグメントを含む）および薬学的に許容し得る担体を含む、卒中および他の神経学的疾患の治療または予防のための医薬組成物を提供する。
【０１０７】
さらなる態様において、本発明は、ＭＡＧアンタゴニストまたは抗ＭＡＧ抗体（改変型抗体もしくはその機能的フラグメントを含む）および薬学的に許容し得る担体を含む、卒中または他の神経学的疾患を患うかまたはその発症の危険性があるヒト患者における神経変性の阻害および／または機能回復の促進のための医薬組成物を提供する。
【実施例】
【０１０８】
以下の例は本発明を説明するものである。
【０１０９】
材料および方法
抗ＭＡＧモノクローナル抗体
抗ＭＡＧモノクローナル抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎから入手したマウス抗ニワトリＭＡＧ抗体ＭＡＢ１５６７であった。この抗体は以下の特徴を有する：
抗原：ミエローマ関連糖タンパク質（ヒト、マウス、ラット、ウシ、ニワトリ、カエル）
アイソタイプ：ＩｇＧ１
中和能力：DeBellard et al (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang et al (1997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K and Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262を参照。
【０１１０】
対照ＩｇＧ１  ｍａｂはＲ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【０１１１】
この抗体を配列決定し、それらの結果を図１および２に示す。図１は、Ｌ鎖の可変鎖（配列番号７）および定常鎖（配列番号８）の配列を示す。図２は、Ｈ鎖の可変鎖（配列番号９）および定常鎖（配列番号１０）の配列を示す。
【０１１２】
脳室内カニューレ挿入（研究１に対してのみ）
ハロタン麻酔の下で、脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）カニューレを左側脳室内に配置した（座標：正中線から１．６ｍｍ、十字縫合から０．８ｍｍ後側、頭蓋表面から４．１ｍｍ、切歯バーゼロの下−３．２ｍｍ、Paxinos and Watso、1986による）。全てのラットは１匹づつ収容してガイドまたはダミーカニューレに対する損傷を回避した。術後７日間、アンギオテンシンＩＩ（１００ｎｇ、Simpsonら、1978）に対する強い飲応答によって正しいカニューレ配置を確認した。９日後、動物に脳虚血を施した。
【０１１３】
一時的限局的脳虚血
各々３００−３５０ｇの体重のオスＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおいて一時的（９０分）限局的脳虚血を誘導した。これらの動物を最初に５％ハロタン、６０％一酸化窒素および３０％酸素の混合物で麻酔し、フェースマスクを装着し、続いて１．５％ハロタンで麻酔を維持した。従来記載される腔内スレッド技術を用いて中大脳動脈閉鎖（ＭＣＡＯ）を行った（Zea Longa, et al., 1989）。術中、動物を正常温に維持し、インキュベーター内で１時間回復させた後、１匹づつ収容した。閉鎖後１時間で神経学的評点３の動物のみを研究に含めた（５点採点システムを用いる評価：０、欠損なし；１、対側反射；２、握力の弱化；３、旋回；４、不動；５、死亡）。動物を１週間まで維持し、その時点で０．９％生理食塩水、次いで１００ｍＭリン酸バッファー中の４％パラホルムアルデヒドの経心臓灌流によって動物を殺した。脳を４％パラホルムアルデヒド中、４℃で４８時間、後固定（ｐｏｓｔ−ｆｉｘ）し、その時点でそれらを頭蓋から取り出し、ラット脳マトリックスを用いて２ｍｍブロックに切断した。次に、Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｃｉｔａｄｅｌ  １０００組織プロセッサを用いてこの２ｍｍ切片をパラフィン包埋し、ミクロトームを用いて６μｍ切片に切断してポリ−Ｌ−リジン被覆スライド上にマウントした。続いて、切片をＣｒｅｓｙｌ  Ｆａｓｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＦＶ）染色で処理した。
【０１１４】
投薬手法
抗ＭＡＧモノクローナル抗体およびマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を無菌０．９％塩化ナトリウムに対して一晩透析し、適切に濃縮した。
【０１１５】
研究１：ＭＣＡＯの１、２４および７２時間後に２．５μｇの抗ＭＡＧｍａｂまたは２．５μｇのマウスＩｇＧを動物にｉ．ｃ．ｖ．投与した（投与当たり５μｌ）
研究２：ＭＣＡＯの１および２４時間後に２００μｇの抗ＭＡＧ  ｍａｂまたは２００μｇのマウスＩｇＧを動物にｉ．ｖ．投与した
研究者は各々の投薬溶液の内容がわからない盲目試験とした。
【０１１６】
神経学的評価
脳虚血を誘導する前に、研究１のラットにビーム歩行（ｂｅａｍ  ｗａｌｋｉｎｇ）および粘着ラベル試験の訓練を施した。両試験において基準に到達しない動物はさらなる研究から除外した。訓練に続いて、残りの動物を、成績に従い、２つの均衡のとれた群に階層化した。神経学的評価を通じて、研究者は動物の処置群がわからない盲目試験とした。
【０１１７】
両側粘着ラベル試験
両側粘着ラベル試験（Schallert et al., Pharmacology Biochemistry and Behaviour 16: 455-462, (1983)）を用いて対側無視／同側偏向を評価した。これはヒト卒中患者において観察される触覚消滅を模倣する（Rose, et al. 1994）。この試験は従来詳細に記載されている（Hunter, et al., Neuropharmacology 39: 806-816 (2000); Virley et al Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 20: 563-582 (2000)）。簡潔に述べると、丸い粘着紙ラベルを前肢の無毛領域周辺に、均等の圧力で、配置の順序は無作為に（左、右）、しっかりと配置した。ＭＣＡＯの前に訓練セッションを６日間行い、第６日のデータを術前ベースラインとして用いた（第０日）。ＭＣＡＯの２４および７日後に２回の試験を動物に施した。データは２回の試験の平均を表す。ラベルの接触および除去の反応時間を記録し、ログランク検定を用いて分析した（Cox, J. Royal Statistical Society B34: 187-220 (1972)）。
【０１１８】
ビーム歩行
従来詳細に記載されるように（Virley et al Journal of Cereberal Blood Flow & Metabolism, 20:563-582 (2000)）、ビーム歩行は、上昇する１００ｃｍビーム（直径２．３ｃｍ、床からの高さ４８ｃｍ）を移動する距離により、後肢および前肢協調の尺度として用いた。ラットはビームを出発点から終着点まで横断するように訓練した。試験のため、ＭＣＡＯの２４時間および７日後に２回の試験を各々のラットに施した。データは２回の試験の平均を表す。統計解析はＡＮＯＶＡ、次いでスチューデントのｔ検定であった。
【０１１９】
２７点神経学的採点（研究−１）
この研究は、従来記載される（Hunter, et al. Neuropharmacology 39: 806-816 (2000)）、足の配置、視覚的前肢到達、平行棒、対側回転、傾斜平面、正向反射、対側反射、運動性および一般的な状態に握力測定（良好な右前肢握力について評点２、弱い握力ついて１）を加えたものを含む神経学的状態を評価する一連の試験からなる。合計評点は正常動物について２７である。
【０１２０】
研究２については、この試験をさらに修正した：握力−正常評点３、良好−２、弱い−１、非常に弱い−０；運動性−正常評点４、優秀−３、非常に良好−２、良好−１、平均−０；一般的な状態−正常評点４、優秀−３、非常に良好−２、良好−１、平均−０；旋回−なし評点５、一方の側を好む評点４、大円−３、中円−２、小円−１、回転−０。合計評点は正常動物について３２である。
【０１２１】
両研究において、ＭＣＡＯの１、２４、４８時間および７日後に試験し、健常正常動物の評点はそれぞれ２７または３２であった。データは平均値として示す。統計解析はＫｒｕｓｋｉｌ  Ｗａｌｌｉｓ  ＡＮＯＶＡであった。
【０１２２】
病変評価
研究１−各々の動物について、病変面積を脳内の３つの所定レベルからの切片において評価した（それぞれ、十字縫合から０、−２．０、−６．０ｍｍ）。クレシルバイオレット染色を用いてニューロン損傷を評価し、Ｏｐｔｉｍａｓ  ６．１画像処理パッケージを用いて損傷の面積を測定した。データは平均面積（ｍｍ２）±標準誤差として表す。
【０１２３】
研究２−各々の動物について、病変面積を脳内の７つの所定レベルからの切片において評価した（＋３ｍｍ〜−８ｍｍ  ｗ．ｒ．ｔ．  十字縫合）。クレシルバイオレット染色を用いてニューロン損傷を評価し、Ｏｐｔｉｍａｓ  ６．１画像処理パッケージを用いて損傷の面積を測定した。データは平均面積（ｍｍ２）±標準誤差として表す。
【０１２４】
結果
研究１−抗ＭＡＧ  ｍａｂの脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）投与
神経学的評点
ＭＣＡＯの１時間後、両処置群の動物は神経学的評点の顕著な減少を示した（各々の群において平均評点１２）。この時点で群間に有意の差はなかった。しかしながら、ＭＣＡＯの２４（ｐ＝０．０２）、４８（ｐ＝０．００５）時間および７日（ｐ＝０．００６）後、抗ＭＡＧ  ｍａｂ（２．５μｇ、ＭＣＡＯ後１、２４および７２時間）で処置した動物は、対照ＩｇＧで処置したものと比較して、合計神経学的評点の有意の改善を示した。ＩｇＧ１処置群におけるＭＣＡＯ後２４、４８時間および７日後の平均神経学的評点は、抗ＭＡＧ  ｍａｂ処置動物における１９．５、２１．５および２２と比較して、それぞれ１５、１４および１８であった。合計評点を含む個々の挙動のさらなる分析で、この有意の改善は主として以下の試験における成績の改善に起因するものであった：足の位置（２４時間、ｐ＝０．００４５；４８時間、ｐ＝０．０１６；７日、ｐ＝０．００８）、握力（２４時間、ｐ＝０．０４９  ４８時間、ｐ＝０．０４９５；７日、ｐ＝０．２４３）、運動性（２４時間、ｐ＝０．１９９；４８時間、ｐ＝０．０１２；７日、ｐ＝０．０６７）、平行棒（２４時間、ｐ＝０．０６５；４８時間、ｐ＝０．００５；７日、ｐ＝０．０１６）、傾斜平面（２４時間、ｐ＝０．００６；４８時間、０．００６；７日、ｐ＝０．１６９）、視覚的前肢到達（４８時間、ｐ＝０．０４９、７日、ｐ＝０．０４９）および旋回の程度（２４時間、ｐ＝０．４１７；４８時間、ｐ＝０．０３４；７日、ｐ＝０．１８３）。
【０１２５】
ビーム歩行
手術に先立ち、ビーム（１００ｃｍ）を横断するように全ての動物を訓練した。手術の２４時間後、術前値と比較して、抗ＭＡＧ（５０±１８ｃｍ）およびＩｇＧ１（２２±１４ｃｍ）処置動物の両者においてビーム上を移動する距離の有意の減少が存在した。有意ではないが、抗ＭＡＧ処置動物はＩｇＧ１処置動物を上回る顕著な改善を示し、それらはｔＭＣＡＯの２４時間後にＩｇＧ１処置動物の距離の２倍を移動した。しかしながら、手術の７日後、両群は時間に基づく顕著な改善を示したものの、ＩｇＧで処置した動物の成績はベースライン（５５±１５ｃｍ；ｐ＝０．００５）と比較して大きく損なわれたままであった。しかしながら、対照的に、ＭＣＡＯの７日後、抗ＭＡＧ  ｍａｂ（２．５μｇ  ＭＣＡＯの１、２４および７２時間後  ｉ．ｃ．ｖ．）で処置した動物の成績はベースライン（７５±１５ｃｍ；ｐ＝０．０７）から大きく異なってはいなかった。このデータは、抗ＭＡＧ  ｍａｂ処置がマウスＩｇＧ１処置対照と比較してこのビーム歩行作業の回復を促進したことを示す。
【０１２６】
粘着ラベル
手術に先立ち、各々の処置群の動物の各々の前肢にラベルを迅速に接触させ、かつ除去したところ、処置前に群における有意の差はなかった（表１）。ＭＣＡＯの２４時間および７日後、各々の治療群における左肢の接触に対する反応時間は比較的変化しないままであり、それに対して右のものは顕著に増加した。しかしながら、抗ＭＡＧおよびＩｇＧ１処置動物における除去時間の間には有意の差が存在しなかった。加えて、ＭＣＡＯの２４時間後、左および右肢の両者からの除去に対する反応時間はベースラインと比較して両処置群において有意に増加したが、抗ＭＡＧ処置動物における左肢からの除去に対する反応時間はＩｇＧ１処置動物よりも有意に短かった（ｐ＝０．０３）。抗ＭＡＧ処置動物における右肢からの除去に対する反応時間がＩｇＧ１で処置したものよりも短い傾向も存在した（ｐ＝０．０８）（表１）。７日で、ＩｇＧ１処置動物においてはある程度の回復が存在し、各々の前肢の除去時間に対する反応時間が２４時間のものと比較して減少した（表１）。このデータは、抗ＭＡＧ  ｍａｂでのラットの処理がｔＭＣＡＯ後の粘着ラベル試験における回復を促進することを示唆する。
【表３】
2008291031.tif 000004
【０１２７】
病変面積測定
抗ＭＡＧ  ｍａｂのｉ．ｃ．ｖ．投与は、ｔＭＡＣＯの７日後に検査したとき、等量のマウスＩｇＧ１で処置した動物と比較して、検査した３つの脳レベルのうちの２つにおいて病変面積を有意に減少させた（表２）。
【表４】
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【０１２８】
研究２−静脈内（ｉ．ｖ．）投与
神経学的評点
ＭＣＡＯの１および２４時間後、両群の動物は神経学的評点の顕著な減少を示した。この時点で群間に有意の差はなく、抗ＭＡＧ  ｍａｂおよびＩｇＧ１処置の２４時間後の平均評点はそれぞれ２０および１８であった（ｐ＝０．５）。ＭＣＡＯの４８時間後、抗ＭＡＧ  ｍａｂ（２００μｇ、ＭＣＡＯの１および２４時間後ｉ．ｖ．）で処置した動物は足の配置（ｐ＝０．０４８）および握力（ｐ＝０．０３３）において有意の改善を示した。脳虚血発症の７日後、抗ＭＡＧ  ｍａｂで処置した動物は改善が継続し（足の配置ｐ＝０．０４１；握力、ｐ＝０．０４８；運動性、ｐ＝０．０５）、マウスＩｇＧ１で処置したもの（平均評点２３、ｐ＝０．０４７）と比較して合計神経学的評点における有意の改善を示した（平均評点２５）。
【０１２９】
病変面積測定
抗ＭＡＧ抗体は、ｉ．ｖ．  ＭＣＡＯ投与した場合に、アイソタイプ対照と比較して、ＭＣＡＯの７日後に検査したとき、７つの所定の脳レベルのうちの５つで病変面積を有意に減少させた（＋３〜−８ｍｍ  ｗ．ｒ．ｔ．  十字縫合）。
【表５】
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【０１３０】
結論
ラットにおいて中大脳動脈閉鎖の後にＣＳＦに直接投与または静脈内に投与された抗ＭＡＧモノクローナル抗体は、対照処置動物と比較して、両者とも細胞死の面積を減少させ、かつ機能回復を改善した。これらの研究に見られる神経保護の程度は、この効果がニューロン回避（sparing）を生じないため、軸索出芽に起因するものではあり得ないことを示唆する。ＭＣＡＯの２４および４８時間後に見られる機能回復の改善は、おそらくは、対照処置動物と比較したこの抗体によって付与される神経保護の程度を反映する。しかしながら、経時的にこれらの動物はさらに改善されるように思われ、これはＭＡＧ活性の遮断も機能回復を経時的に強化し得ることを示唆する。
【０１３１】
呈示されるこれらの研究は、ＭＡＧの作用の遮断が卒中のラットモデルにおいて神経保護および機能回復の強化の両者を提供し、したがって、抗ＭＡＧ抗体またはＭＡＧアンタゴニストが卒中後の急性神経保護および／または機能回復の促進のための潜在的治療薬を提供する証拠を提供する。抗ＭＡＧ抗体またはＭＡＧアンタゴニストには、細胞および神経線維の変性が明白である他の神経学的傷害、例えば、脊髄損傷、外傷性脳損傷、末梢神経障害、アルツハイマー病、前頭−側頭痴呆（タウパシー）、パーキンソン病、ハンチントン病および多発性硬化症の治療における潜在的用途もある。
【０１３２】
実施例２−キメラ抗体
改変型抗体には、ある種から誘導される可変領域とこれに連結した別の種に由来する定常領域を含むキメラ抗体が含まれる。本発明のマウス−ヒトキメラ抗ＭＡＧ抗体の一例が図５および６に示される。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域を用いるマウス−ヒトキメラを、マウス可変領域に非ヒト種に由来するＨ鎖またはＬ鎖定常領域を有するキメラ抗体が産生できるのと同様に、産生させることができる。
【０１３３】
図５は、マウス抗ＭＡＧ可変領域が、機能的免疫グロブリン分泌シグナル配列、並びにＦｃγＲＩおよび相補体タンパク質Ｃ１ｑに結合するエフェクタ機能を不能とするためにＫａｂａｔ残基２４８および２５０がアラニンに変異されているヒトＩｇＧ１定常領域の改変形態を有する、キメラ免疫グロブリンＨ鎖のアミノ酸配列を示す（Duncan, A.R. and Winter, G. Localization of the C1q binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A.R., Woolf, J.M., Partridge, L.J., Burton, D.R. and Winter, G. Localization of the binding site for human FcR1 on IgG. Nature 332, 563-564, 1988）。そのような突然変異は、溶解エフェクタ機構を活性化することなしに特定の治療効果−例えば、抗原への結合およびその機能のブロッキングが達成されるように改変型抗体の特性をもたらすように任意に行われる。本発明の他の改変型抗体は、そのような不能化突然変異のないヒト定常領域を用いる。
【０１３４】
図６は、マウス抗ＭＡＧ可変領域が機能的免疫グロブリン分泌シグナル配列およびヒトカッパ定常領域を有するキメラ免疫グロブリンＬ鎖のアミノ酸配列を示す。
【０１３５】
図５および６に示される情報から、当業者に公知の標準分子生物学技術により、これらのキメラ鎖をコードするｃＤＮＡインサートを調製することができる。簡潔に述べると、遺伝暗号を用いて所望のアミノ酸をコードするヌクレオチドコドンを同定し、キメラタンパク質をコードする仮想ｃＤＮＡ配列を作製る。このｃＤＮＡインサートを特定の生物において発現させようとする場合、公知のコドン用法の偏向に従って特に好まれるコドンを選択することができる。次に、コンティグとして所望の配列を表す重複する合成オリゴヌクレオチドを含むテンプレートのＰＣＲ増幅により、所望のヌクレオチド配列を合成する。生じる産生物をＰＣＲまたは突然変異誘発により制限部位を結合するように改変することによって、発現またはさらなる操作のためのプラスミドへのクローニングを容易にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎからのマウス抗ニワトリＭＡＧ抗体１５６７のＬ鎖の配列を示す。
【図２】図２は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎからのマウス抗ニワトリＭＡＧ抗体１５６７のＨ鎖の配列を示す。
【図３】図３は、Ｌ鎖可変領域の核酸配列を示す。ＫａｂａｔによるＣＤＲ領域が強調表示されている。
【図４】図４は、Ｈ鎖可変領域の核酸配列を示す。ＫａｂａｔによるＣＤＲ領域が強調表示されている。
【図５】図５は、マウス／ヒトキメラ抗ＭＡＧ抗体Ｈ鎖の配列を示す。
【図６】図６は、マウス／ヒトキメラ抗ＭＡＧ抗体Ｌ鎖の配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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