(57)【要約】【課題】細菌の共凝集能を客観的且つ容易に評価することができる細菌の共凝集能の評価方法を提供すること。【解決手段】本発明の細菌の共凝集能の評価方法は、評価対象となる二種以上の細菌を含む液中観察用カプセル１１に外力を加え、外力を加える前と加えた後の前記細菌の共凝集状態を走査型電子顕微鏡により観察し、その観察結果に基づいて前記細菌の共凝集能を評価する。前記走査型電子顕微鏡内で前記液中観察用カプセルに外力を加えることが好ましく、前記液中観察用カプセルを振動させて外力を加えることが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
評価対象となる二種以上の細菌を含む液中観察用カプセルに外力を加え、外力を加える前と加えた後の前記細菌の共凝集状態を走査型電子顕微鏡により観察し、その観察結果に基づいて前記細菌の共凝集能を評価する細菌の共凝集能の評価方法。
【請求項２】
前記走査型電子顕微鏡内で前記液中観察用カプセルに外力を加える請求項１に記載の細菌の共凝集能の評価方法。
【請求項３】
外力を加える前に前記液中観察用カプセルを一旦前記走査型電子顕微鏡外に取り出して該液中観察用カプセルに外力を加えた後、該液中観察用カプセルを再度該走査型電子顕微鏡内に配して観察する請求項１に記載の細菌の共凝集能の評価方法。
【請求項４】
前記液中観察用カプセルを振動させて外力を加える請求項１〜３の何れかに記載の細菌の共凝集能の評価方法。
【請求項５】
前記細菌が口腔内細菌である請求項１〜４の何れかに記載の細菌の共凝集能の評価方法。
【請求項６】
請求項２に記載の細菌の共凝集能の評価方法に使用される液中観察用カプセルの外力印加装置であって、走査型電子顕微鏡の観察用ステージに取り付けられ前記液中観察用カプセルが収容されて固定される固定用ホルダーと、該固定用ホルダーを振動させる振動源とを備えている液中観察用カプセルの外力印加装置。
【請求項７】
請求項３に記載の細菌の共凝集能の評価方法に使用される液中観察用カプセルを収容して固定する固定用ホルダーであって、走査型電子顕微鏡の観察用ステージに取り付けられて使用され、前記液中観察用カプセルの形態に応じて該液中観察用カプセルを前記固定用ホルダーの所定位置に位置決めする位置決め手段を備えている液中観察用カプセルの固定用ホルダー。
【請求項８】
請求項１に記載の細菌の共凝集能の評価方法を使用した共凝集塊の分散剤の評価方法であって、
前記液中観察用カプセルに前記細菌とともに分散剤を含ませておき、該液中観察用カプセルに外力を加え、外力を加える前と加えた後の前記細菌の共凝集状態を走査型電子顕微鏡により観察し、その観察結果に基づいて前記分散剤の効能を評価する共凝集塊の分散剤の評価方法。
【請求項９】
前記共凝集塊の分散剤が口腔用組成物に配合可能な成分である請求項８に記載の共凝集塊の分散剤の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌、特に口腔内に存在する口腔細菌の共凝集能を評価する方法、それに使用される液中観察用カプセルの外力印加装置、液中観察用カプセルの固定用ホルダー及び効能剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
口臭や歯周病、むし歯などの口腔疾患を予防する目的で、口腔内の歯垢や舌苔の洗浄を行う各種の口腔用組成物が提供されている。これらの口腔用組成物は、洗口剤のように適量を口に含んで含嗽するものや、歯磨剤のように歯ブラシ等の補助的な道具を用いて口腔内を洗浄するもの、義歯洗浄剤のように脱着後に口腔外にて洗浄を行うものなどが挙げられる。
【０００３】
近年、歯垢や舌苔の発生の一機序として、口腔内に存在する一般細菌、病原菌、Fusobacterium菌等の細菌同士が共凝集して凝集塊を形成し、該共凝集塊が口腔組織に付着・増殖することに起因していることがわかってきている。このため、このような細菌の共凝集能の評価を的確に行うことは、組織表面や唾液中における口腔細菌の共凝集塊を分散させたり、付着後の細菌の増殖を抑える口腔用組成物の開発にとって重要である。
【０００４】
従来、このような細菌の共凝集能を把握する場合、底部に試料台を入れた試験管内で共凝集反応を起こさせ、生成した共凝集塊を該試料台上に沈降させ、該試料台に付着した共凝集塊をレーザー共焦点顕微鏡等を用いて観察することで行われていた。このため、光学的な分解能でしか共凝集塊を観察できず、その微細な形状等に基づいて共凝集能を把握することができなかった。
【０００５】
一方、湿潤状態や液状の試料の電子顕微鏡観察を可能とする技術が提供されている（下記特許文献１参照）。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６９９２３００号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上述の課題に鑑みてなされたものであり、細菌の共凝集能を的確で客観的且つ容易に行うことができる細菌の共凝集能の評価方法、それに使用される液中観察用カプセルの外力印加装置、液中観察用カプセルの固定用ホルダー及び共凝集塊の分散剤の評価方法を提供するものである。
【０００８】
本発明者は、上述の技術を利用すれば、細菌の共凝集能の把握が客観的且つ容易に行えるのではないかと考え、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、評価対象となる二種以上からなる細菌を含む液中観察用カプセルに外力を加え、外力を加える前と加えた後の前記細菌の共凝集状態を走査型電子顕微鏡により観察し、その観察結果に基づいて前記細菌の共凝集能を評価する細菌の共凝集能の評価方法を提供することにより、前記目的を達成したものである。
【００１０】
また、本発明は、上記本発明の細菌の共凝集能の評価方法に使用される液中観察用カプセルの外力印加装置であって、走査型電子顕微鏡の観察用ステージに取り付けられ前記液中観察用カプセルが収容されて固定される固定用ホルダーと、該固定用ホルダーを振動させる振動源とを具えている液中観察用カプセルの外力印加装置を提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、上記本発明の細菌の共凝集能の評価方法に使用される液中観察用カプセルを収容して固定する固定用ホルダーであって、走査型電子顕微鏡の観察用ステージに取り付けられて使用され、前記液中観察用カプセルの形態に応じて該液中観察用カプセルを前記固定用ホルダーの所定位置に位置決めする位置決め手段を備えている液中観察用カプセルの固定用ホルダーを提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、上記本発明の細菌の共凝集能の評価方法を使用した効能剤の評価方法であって、前記液中観察用カプセルに前記細菌とともに共凝集塊の分散剤を含ませておき、該液中観察用カプセルに外力を加え、外力を加える前と加えた後の前記細菌の共凝集状態を走査型電子顕微鏡により観察し、その観察結果に基づいて前記分散剤の効能を評価する共凝集塊の分散剤の評価方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、細菌の共凝集能を的確で客観的且つ容易に評価することができる細菌の共凝集能の評価方法、それに使用される液中観察用カプセルの外力印加装置、液中観察用カプセルの固定用ホルダー及び共凝集塊の分散剤の評価方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下本発明を、その好ましい実施形態に基づいて説明する。
【００１５】
先ず、本発明の細菌の共凝集能の評価方法に使用される液中観察用カプセル（以下、カプセルともいう。）の外力印加装置（以下、外力印加装置ともいう。）について説明する。
【００１６】
図１は、本発明の外力印加装置の一実施形態を示した模式図である。
図１に示すように、外力印加装置１は、後述する本発明の細菌の共凝集能の評価方法に使用されるカプセル１１の外力印加装置であり、カプセル１１が収容されて固定される固定用ホルダー２と、固定用ホルダー２を振動させる振動源３とを具備している。本実施形態では、固定用ホルダー２は、震動源３の振動を伝える振動伝搬板３１を介して走査型電子顕微鏡の観察用ステージ１０に取り付けられている。
【００１７】
図２に示すように、カプセル１１は、評価対象となる細菌を含む試料を収容する器具であり、上筒１２と上筒１２の上端開口部を塞ぐ極薄膜１３と、上筒１２内を上下に仕切り試料封入部を形成するシール材１４と、下筒１５とを備えている。上筒１２の内周面の下方部及び下筒１５の外周面の上方部には互いに螺着する螺旋(図示せず)が設けられており、上筒１２及び下筒１５を互いに螺着させることで、試料を封止できるようになっている。上筒１２及び下筒１５の外周面部には、外側に張り出す一対の突片１２０、１５０が設けられている。下筒１５の底面部の中央には下方に向けて突出する突起１５１が設けられている。カプセル１１としては、具体的には、イスラエル国クウォントミクス社のウェットＳＥＭカプセル（商品名ＱＸ−ｃａｐｓｕｌｅ）が好ましく使用される。
【００１８】
固定用ホルダー２は、カプセル１１を収容し固定する治具であり、有底筒状の形態を有している。固定用ホルダー２は、カプセル１１の形態に応じてカプセル１１を固定用ホルダー２の所定位置に位置決めする位置決め手段を備えている。本実施形態では、位置決め手段は、固定用ホルダー２の上端にカプセル１１の突片１２０、１５０に対応して設けられた凹部２１で構成されている。この凹部２１に突片１２０、１５０をはめ込むことで、固定用ホルダー２に対してカプセル１１の位置決めを正確に行え、カプセル１１を一旦固定用ホルダー２から取り外し、再度収容する場合にも、同じ位置決め状態で収容することできる。固定用ホルダー２の内底部の中央にはカプセル１１の下筒１５の突起１５１が嵌合される嵌合穴２２が設けられている。また固定用ホルダーの下面部には、螺旋穴２３が設けられている。
【００１９】
固定用ホルダー２は、カプセル１１の冷却手段としても機能するよう設けられているホルダーである。即ち、固定用ホルダー２は、観察用ステージ１０に固定されたペルチェ素子からなる冷却装置４の雄螺旋４０に螺旋穴２３を螺着させることによって固定されている。このとき、振動伝搬板３１の挿通穴３２に雄螺旋４０を挿通させ、固定用ホルダー２と冷却装置４との間に振動伝搬板３１を介在させる。このような構成とすることで、電子ビームの照射に伴うカプセル１１内の温度上昇を抑えるとともにカプセル１１に振動源３からの振動を伝えるようにしている。固定ホルダー２はアルミ合金製であり、振動伝搬板３１は非磁性ステンレス合金製である。
【００２０】
振動源３は、振動伝搬板３１、固定用ホルダー２を介してカプセル１１に振動を加えることができる出力を有するものであればよい。振動源３としては、超音波振動子、ピエゾ素子等を使用することができる。震動源の振動の周波数は、超音波振動子の共振周波数を考慮すると３０ｋＨｚ〜５５ｋＨｚが好ましい。
【００２１】
次に、本発明の細菌の共凝集能の評価方法を、口腔細菌の共凝集能の評価に適用した好ましい実施形態に基づいて説明する。
【００２２】
先ず、走査型電子顕微鏡（図示せず）に前記外力印加装置１をセットする。即ち、走査型電子顕微鏡の本体から観察用ステージを取り外し、取り外した観察用ステージ（図示せず）に前記振動伝搬板３１を介して前記固定用ホルダー２を取り付けるとともに、振動伝搬板３１に振動源３を取り付け、振動源３の振動が振動伝搬板３１を介して固定用ホルダー２に伝搬できるようにする。
【００２３】
次に、前記カプセル１１内に評価対象となる細菌である口腔細菌を含む試料を封入する。ここで、口腔細菌を含む試料としてはFusobacterium属、Streptcoccus属、Actinomyces属、Porphyromonas属、Prevotella属などに属する標準菌株や臨床分離菌株より選ばれる２種以上の菌株が用いられるが、その他に歯垢、舌苔などの生体試料などを用いても良い。試料の封入は、上筒１２を上下反転させ試料を極薄膜１３に付着させたのち、菌体の数の制御として６００ｎｍの波長における光学的濃度（O.D.：Optical Density）を測定し、O.D.＝０．０５〜０．５となるように菌体濃度を調節する。菌体濃度の調整に用いる希釈液としては、上記クウォントミクス社から提供されているサンプルイメージング緩衝液の他、生理的食塩水、生理的食塩加リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、生理的食塩加トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）などを用いることができる。共凝集反応は２価の陽イオンにおいて促進されるため、０．１ｍＭのカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含有する、生理的食塩水や生理的食塩加トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）が特に好ましい。コントラスト良く観察する上では、酢酸ウラニル、酢酸鉛、リンタングステン酸など一般的な電子染色剤を用いることもできる。この場合、電子染色剤を水溶液濃度で０．１〜２ｗｔ％で使用することが好ましい。
【００２４】
次に、試料を封入したカプセル１１を固定用ホルダー２に収容する。このとき、前記突起１５１を嵌合穴２２に嵌合させ、前記突片１２０、１５０を凹部２１にはめ込んで位置決めする。
【００２５】
次に、観察用ステージを走査型電子顕微鏡の本体に取り付け、前記試料に含まれる細菌の共凝集塊の状態を当該走査型電子顕微鏡で観察し、特定の観察視野における細菌の共凝集状態を撮影する。観察の際の加速電圧は１−３０ｋＶとし、検出モードは、反射電子検出モードあるいは２次電子検出モードとすることが好ましい。
【００２６】
次に、前記外力印加装置１を作動させ、振動源３の振動を、振動伝搬板３１、固定用ホルダー２を介してカプセル１１に伝え、当該カプセル１１に外力を加える。カプセル１１に振動によって外力を加える時間は、評価する細菌、外力印加装置の構成等に応じて設定する。本実施形態の場合には、振動源３が、振動伝搬板３１、固定用ホルダー２を介してカプセル１１に振動を加えることを考慮すると、振動させる時間は１０秒から５分が好ましく、３０秒から２分がより好ましい。
【００２７】
次に、振動による外力の印加を停止し、外力を加えた後の前記細菌の共凝集状態を、外力を加える前と同じ観察視野で観察し、該細菌の共凝集状態を撮像する。
【００２８】
そして、この観察結果（観察像）に基づいて、振動によって外力を加える前と後の前記細菌の共凝集能力を評価する。具体的には、共凝集塊を形成している菌体の数を数えることを行い、前後で数に変化がない場合には、共凝集塊を形成している細菌間の結合力あるいは付着している膜と細菌との間の接着力が強力であると評価し、数が減っている場合には、共凝集塊を形成している細菌間の結合力あるいは付着している膜と細菌との間の接着力が弱いと評価する。菌体の数を数える代わりに観察結果を画像解析装置等で二値化処理などによって解析し、その結果に基づいて同様に評価することもできる。
【００２９】
このように、本実施形態の外力印加装置１を使用した細菌の共凝集能の評価方法によれば、外力を加える前と加えた後の細菌の共凝集状態を同じ観察視野において観察することができるので、細菌の共凝集能の評価を的確で客観的且つ容易に行える。
【００３０】
次に、本発明の共凝集塊の分散剤の評価方法を、前記細菌の共凝集能の評価方法を使用した口腔用組成物の評価に適用した好ましい実施形態に基づいて説明する。
【００３１】
本実施形態の共凝集塊の分散剤の評価方法は、試料に分散剤を添加する以外は、前記実施形態の細菌の共凝集能の評価方法と同様の方法で行われる。
【００３２】
共凝集塊の分散剤としては、以下に示す口腔用組成物に含まれるベヒクル成分などの分散材が挙げられる。具体的には、ガラクトース、Ｎ-アセチルガラクトサミン、ラクトースなどの糖類、ラクチトール、マルチトール、パラチニット、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトールなどの糖アルコール類等やラウリル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、ラウロイルメチルタウリンナトリウム、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ラルリルグリコシド、ラウロイルグルタミン酸などが挙げられる。分散剤の濃度は、分散剤の種類、効能を評価したい分散剤の濃度等に応じて設定される。本発明に適用される分散材は、これらの分散剤に限定されるものではなく、他の分散剤も広く適用することができる。
【００３３】
本実施形態の共凝集塊の分散剤の評価方法によれば、外力を加える前と加えた後の細菌の共凝集状態を同じ観察視野において観察することができるので、口腔細菌の共凝集塊に対する分散剤の効能を的確で客観的且つ容易に行える。
【００３４】
本発明は、前記実施形態に制限されない。
前記実施形態の細菌の共凝集能の評価方法では、電子顕微鏡内で液中観察用カプセルに外力を加えたが、外力を加える前に前記液中観察用カプセルを一旦前記走査型電子顕微鏡外に取り出して該液中観察用カプセルに外力を加えた後、該液中観察用カプセルを再度該走査型電子顕微鏡内に配して観察することによって、細菌の共凝集能の評価を行うこともできる。この場合、前記実施形態の液中観察用カプセルの固定用ホルダーのように、当該液中観察用カプセルを固定用ホルダーに一意的に固定できる位置決め手段を備えているので、外力を加える前と加えた後の細菌の共凝集状態を同じ観察視野で観察することができる。
【００３５】
また、前記実施形態の細菌の共凝集能の評価方法では、評価する細菌、外力印加装置の構成等に応じて外力を加える時間を設定したが、時間の代わりに外力を加える時間を短くし回数で加えた外力を制御してもよい。さらに、外力を加える度に撮影を行い、必要数（たとえば１０〜５００回）の撮影を行い、それらを連続的（動画的）に再生することによって細菌の凝集能を動的に評価することが可能となる。その評価の中には時間的概念が含まれるため、外力を加えることによって変化する過程も評価が可能となる。
【００３６】
本発明は、前記実施形態のように、口腔細菌の共凝集能の評価に好適であるが、これ以外にも、湿潤環境で形成される一般細菌やカビなどによる複合バイオフィルム形成時の共凝集能の評価にも適用することができる。
【００３７】
また、本発明は、前記実施形態のように、口腔用組成物に含まれる共凝集塊の分散剤の効能の評価に好適であるが、これ以外にも、湿潤環境で用いられる洗浄剤、除菌剤等の効能にも適用することができる。
【実施例】
【００３８】
以下実施例により本発明を更に詳細に説明する。本発明の範囲は斯かる実施例に制限されるものではない。
【００３９】
〔実施例１〕
下記電子顕微鏡、液中観察用カプセル、外力印加装置を使用し、下記口腔細菌を含む下記試料について、外力を加える前と後の細菌の共凝集状態を観察し、その観察結果に基づいてその共凝集能（抗分散能）を下記のように評価した。電子顕微鏡写真を図２（ａ）及び（ｂ）に示す。
【００４０】
走査型電子顕微鏡：日立製作所製、S-4300SE/N
液中観察用カプセル：クウォントミクス社製、QX-capsule QX-102
外力印加装置：振動源（超音波振動子、最大出力100Ｗ、共振周波数45KＨｚ）、アルミ合金製固定用ホルダー
【００４１】
＜試料＞
口腔細菌：Fusobacterium nucleatum ssp. polymorphum ATCC10953株、Streptococcus sobrinus B13株
分散媒：０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム加トリス塩酸緩衝液
電子染色剤：０．３５ｗｔ％の水溶液濃度の酢酸ウラニル
【００４２】
＜観察条件＞
電子顕微鏡の加速電圧を１５ｋＶ、反射電子検出器で観察した。
【００４３】
＜外力印加条件＞
上記外力印加装置にて、４５ｋＨｚの振動を１分間印加した。
【００４４】
＜共凝集能の評価＞
外力を加える前と後の細菌の共凝集状態の観察結果に基づいて、それぞれに観察される菌体の数を数えることで、共凝集能を評価した。
【００４５】
図２（ａ）及び（ｂ）に示すように、評価に供した口腔細菌の共凝集能は、加えた外力ではほとんど観察される菌体の数に変化がないため十分強固についていることがわかった。
【００４６】
〔実施例２〕
試料に凝集塊の分散剤としてガラクトースを１質量％添加した以外は、実施例１と同様にして、分散剤の効能を下記のように評価した。その観察結果を図３（ａ）及び（ｂ）に示す。
【００４７】
＜効能剤の効能の評価＞
外力を加える前と後の細菌の共凝集状態の観察結果に基づいて、分散剤がない場合（図１）と比較して、観察される菌体の数が明らかに減少していることで効能剤の効能を評価した。
【００４８】
図３（ａ）及び（ｂ）に示すように、ガラクトースによって菌体の数が減少していることが明らかとなり、細菌の共凝集能を減退させる能力、あるいは細菌を分散させる能力があることがわかった。
【００４９】
〔実施例３〕
試料に分散剤としてエリスリトールを１質量％添加した以外は、実施例１と同様にして、分散剤の効能を評価した。その観察結果を図４（ａ）及び（ｂ）に示す。
【００５０】
図４（ａ）及び（ｂ）に示すように、エリスリトールによって菌体の数が減少していることが明らかとなり、さらに、ガラクトースと比較してより減少していることが見て取れる。よって、エリスリトールのほうが細菌の共凝集能を減退させる能力、あるいは細菌を分散させる能力があることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の細菌の共凝集能の評価方法において使用される外力印加装置の一実施形態を一部を断面視して示す模式図である。
【図２】本発明の細菌の共凝集能の評価方法の実施例による観察結果を示す走査型電子顕微鏡写真を示す図であり、（ａ）は外力を加える前、（ｂ）は外力を加えた後の観察結果を示す写真である。
【図３】本発明の共凝集塊の分散剤の評価方法の実施例による観察結果を示す走査型電子顕微鏡写真を示す図であり、（ａ）は外力を加える前、（ｂ）は外力を加えた後の観察結果を示す写真である。
【図４】本発明の共凝集塊の分散剤の評価方法の実施例による観察結果を示す走査型電子顕微鏡写真を示す図であり、（ａ）は外力を加える前、（ｂ）は外力を加えた後の観察結果を示す写真である。
【符号の説明】
【００５２】
１  液中観察用カプセルの外力印加装置
２  液中観察用カプセルの固定用ホルダー
３  振動源
１０  観察用ステージ
１１  液中観察用カプセル
【図１】
2008032531.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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