(57)【要約】      （修正有）【課題】高い糖転移活性を有するα−グルコシダーゼの製造方法を提供する。【解決手段】特定な配列のアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼＢ、該α−グルコシダーゼＢをコードするα−グルコシダーゼＢ遺伝子、特定な配列の塩基配列を有するα−グルコシダーゼＢ遺伝子、該α−グルコシダーゼＢ遺伝子を含むベクター、該ベクターを組み込んだ形質転換体、該形質転換体を培養してα−グルコシダーゼを得るα−グルコシダーゼの製造方法。本発明のα−グルコシダーゼＢは、特に菌体外酵素として得られることが好ましい。【選択図】図１
2008072956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼＢ。
【請求項２】
請求項１に記載のα−グルコシダーゼＢをコードするα−グルコシダーゼＢ遺伝子。
【請求項３】
配列番号２の塩基配列を有するα-グルコシダーゼＢ遺伝子。
【請求項４】
請求項２または３に記載のα−グルコシダーゼＢ遺伝子を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターが組み込まれ、アスペルギルス・オリゼーＭＩＢＡ  １００２（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−２１４）である、形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物からα−グルコシダーゼＢを採取する採取工程と、
を含む、α−グルコシダーゼＢの製造方法。
【請求項７】
前記採取工程において、前記α−グルコシダーゼＢが少なくとも菌体外酵素として採取される、請求項６に記載のα-グルコシダーゼＢの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い糖転移活性を有するα−グルコシダーゼＢ、該α−グルコシダーゼＢをコードするα−グルコシダーゼＢ遺伝子、該α−グルコシダーゼＢ遺伝子を含むベクター、該ベクターを組み込んだ形質転換体、および該形質転換体を培養してα−グルコシダーゼＢを得るα−グルコシダーゼＢの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、α−グルコシダーゼは、マルトースおよびオリゴ糖の非還元末端のグルコシル基をグルコースまたはオリゴ糖の６位または３位の水酸基に転移する活性（糖転移活性）を持つ酵素であり、動物、植物および微生物に広く分布する。澱粉工業において製造されるイソマルトオリゴ糖は、清酒、味噌、醤油等に少量含まれ、旨味を与える天然の食品成分として知られ、また人体の腸内に常在するビフィズス菌等の有用細菌に対する増殖促進効果や、歯に対する抗う蝕効果等の機能を有する非常に重要な糖類である。イソマルトオリゴ糖は、α−グルコシダーゼの作用により製造される。
【０００３】
特許文献１には、α−グルコシダーゼを高生産する能力を有するアスペルギルス・オリゼーの育種を目的とし、特定の制限酵素切断地図で規定されるアスペルギルス・オリゼーから単離したα−グルコシダーゼ遺伝子、およびこれを含むアスペルギルス・オリゼーのベクター、該ベクターをアスペルギルス・オリゼーに移入して得られる形質転換体、該形質転換体を培養するα−グルコシダーゼの製造法が提案されている。
【０００４】
特許文献２には、アスペルギルス・オリゼーのα−グルコシダーゼ遺伝子（ａｇｄＡ）のプロモーターの転写活性の増大および炭素源に対する依存性の排除が可能なエンハンサーＤＮＡ塩基配列として、配列−ＣＧＧＮＮＡＴＴＴＡ−を含有するエンハンサーＤＮＡ塩基配列が提案されている。
【０００５】
特許文献３には、目的のタンパク質をコードする遺伝子を導入した際に当該遺伝子の発現を効率的に高めることが可能な宿主微生物の提供を目的とし、真菌類に属しかつ主たるイソマルトース生成酵素の遺伝子を欠損した微生物、さらに、α−グルコシダーゼＢ遺伝子が欠損したアスペルギルス・ニードランスが提案されている。
【０００６】
特許文献４には、アスペルギルス属糸状菌セルフクローニング株の効率的な生産方法の提供を目的として、ｎｉａＤ、ａｒｇＢ、ｓＣ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧ、ａｍｄＳ、オーレオバシジン耐性遺伝子、ベノミル耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群より選ばれるアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来のマーカー遺伝子と、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）の目的遺伝子発現カセットとを含む環状ヌクレオチドおよびこれを用いたアスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株の製造方法が提案されている。
【０００７】
また、非特許文献１には、アスペルギルス・ニードランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｎｉｄｕｌａｎｓ）から得られ、高い糖転移活性を有するα−グルコシダーゼＢ（ａｇｄＢ）の存在が報告されている。
【０００８】
アスペルギルス・オリゼーはタンパク質生産能に優れ、アスペルギルス・オリゼーの生産するα−グルコシダーゼは、イソマルトース、イソマルトトリオース、コウジビオース、パノース等のオリゴ糖を生成するため、該α−グルコシダーゼの利用は産業界において重要であり、さらに高い糖転移活性を有するα−グルコシダーゼの探索、検討が行なわれているが、満足できるレベルの高い糖転移活性を有するα−グルコシダーゼは得られていないのが現状である。
【特許文献１】特開平６−６２８６８号公報
【特許文献２】特開平９−９９６８号公報
【特許文献３】特開２００４−１４１０２９号公報
【特許文献４】特開２００４−３２９１４３号公報
【非特許文献１】”Ｎｏｖｅｌ  α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ”（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｒ．２００２，ｐ．１２５０−１２５６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、高い糖転移活性を有するα−グルコシダーゼ、該α−グルコシダーゼをコードするα−グルコシダーゼ遺伝子、該α−グルコシダーゼ遺伝子を含むベクター、該ベクターを組み込んだ形質転換体、該形質転換体を培養してα−グルコシダーゼを得るα−グルコシダーゼの製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼＢに関する。
本発明はまた、上記のα−グルコシダーゼＢをコードするα−グルコシダーゼＢ遺伝子に関する。
【００１１】
本発明はまた、配列番号２の塩基配列を有するα-グルコシダーゼＢ遺伝子に関する。
本発明はまた、上記のα−グルコシダーゼＢ遺伝子を含む、ベクターに関する。
【００１２】
本発明はまた、上記のベクターが組み込まれ、アスペルギルス・オリゼーＭＩＢＡ１００２（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−２１４）である、形質転換体に関する。
【００１３】
本発明はまた、上記の形質転換体を培養する培養工程と、該培養工程で得られた培養物からα−グルコシダーゼＢを採取する採取工程とを含む、α−グルコシダーゼＢの製造方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、上記の採取工程において、α−グルコシダーゼＢが少なくとも菌体外酵素として採取される、α-グルコシダーゼＢの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、α−グルコシダーゼとして特に高い糖転移活性を有するα−グルコシダーゼＢ、該α−グルコシダーゼＢをコードするα−グルコシダーゼＢ遺伝子、該α−グルコシダーゼＢ遺伝子を含むベクター、該ベクターを組み込んだ形質転換体、および該形質転換体を培養してα−グルコシダーゼＢを得るα−グルコシダーゼＢの製造方法を提供することができる。また、本発明の形質転換体によれば、高い糖転移活性を有するα−グルコシダーゼＢを特に菌体外酵素として多量に生産することができるため、生産されたα−グルコシダーゼＢをより効率良く利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
＜α−グルコシダーゼＢ＞
本発明の発明者らは、特定のアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼＢが、α−グルコシダーゼとして極めて高い糖転移活性を有することを見出し、本発明を完成した。本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼＢに関する。
【００１７】
配列番号１のアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼＢは、α−グルコシダーゼとして極めて高い糖転移活性を有する。
【００１８】
本発明における「糖転移活性」とは、マルトースおよびオリゴ糖の非還元末端のグルコシル基をグルコースまたはオリゴ糖の６位または３位の水酸基に転移する活性を意味する。このような糖転移活性は、たとえば、糖化力分別定量キット（たとえばキッコーマン製）を用い、基質である４−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコシドに粗酵素液を添加して３７℃で反応させた後、Ｎａ2ＣＯ3を加えることにより反応を停止させ、反応中に遊離してくる４−ニトロフェノールを４００ｎｍの吸光度の上昇により測定される値を指標として評価することができる。
【００１９】
より具体的には、たとえば上記の糖化力分別定量キットを用いた測定における活性または比活性の値を指標として糖転移活性を評価することができる。ここで、活性の値は、上記の測定において１分間に１μｍｏｌの基質を糖転移させる酵素量を１Ｕ（ユニット）としたときの、粗酵素液１ｍｌ当たりの酵素量（単位：Ｕ／ｍｌ）として与えられ、上記の「比活性」の値は、上記の測定において１分間に１μｍｏｌの基質を糖転移させる酵素量を１Ｕ（ユニット）としたときの、タンパク質１ｍｇ当たりの酵素量（単位：Ｕ／ｍｇ）として与えられる。
【００２０】
本発明に係るα−グルコシダーゼＢは、上記の方法で測定される活性として０．０１２Ｕ／ｍｌ以上、さらに０．０８０Ｕ／ｍｌ以上の活性を有することが好ましい。該活性が０．０１２Ｕ／ｍｌ以上、特に０．０８０Ｕ／ｍｌ以上である場合、α−グルコシダーゼＢは高い糖転移活性を有し、該α−グルコシダーゼＢを用いることによって、たとえばイソマルトオリゴ糖等を効率的に生産することができる。α−グルコシダーゼＢの活性は高いほど好ましいが、たとえば０．２００Ｕ／ｍｌ程度であれば十分に高い糖転移活性を有する。
【００２１】
本発明のα−グルコシダーゼＢは、微生物由来でも人工的な合成により得られたものでも良い。目的のアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼＢが簡便に得られる点では、アスペルギルス・オリゼー由来であることが好ましい。配列番号１のアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼＢは、当業者であれば、公知の方法にて、過度な試行錯誤や複雑高度な実験を行なうことなく、人工的に合成することが可能である。
【００２２】
＜α−グルコシダーゼＢ遺伝子＞
本発明はまた、本発明のα−グルコシダーゼＢをコードする、α−グルコシダーゼＢ遺伝子に関する。本発明のα−グルコシダーゼＢ遺伝子は、一本鎖、二本鎖のいずれであってもよく、またＤＮＡ、ＲＮＡのいずれであってもよい。α−グルコシダーゼＢ遺伝子がＤＮＡである場合、本発明のα−グルコシダーゼＢをコードする構造遺伝子を含んでいることが好ましい。またこの場合、上記構造遺伝子はエキソンとして含まれ、上記構造遺伝子以外の塩基配列がイントロンとして含まれていても良い。
【００２３】
本発明のα−グルコシダーゼＢ遺伝子は、微生物由来でも人工的な合成により得られたものでも良い。目的の塩基配列を有するα−グルコシダーゼＢ遺伝子が簡便に得られる点では、アスペルギルス・オリゼー由来であることが好ましい。本発明のα−グルコシダーゼＢ遺伝子は、当業者であれば、たとえばＤＮＡ合成機を用いて、公知の方法にて過度な試行錯誤や複雑高度な実験を行なうことなく、人工的に合成することが可能である。
【００２４】
本発明のα−グルコシダーゼＢ遺伝子は、特に配列番号２の塩基配列を有するα−グルコシダーゼＢ遺伝子であることができる。配列番号２の塩基配列を有するα−グルコシダーゼＢ遺伝子は配列番号１のアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼＢをコードする。
【００２５】
また、配列番号２の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列であって、かつ、同一条件下でこれらの配列がコードするα−グルコシダーゼＢと同等の糖転移活性のα−グルコシダーゼＢをコードする機能を有する塩基配列も本発明の範囲内に含まれる。ここでストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件が挙げられ、たとえば、一次洗浄バッファー（０．５×ＳＳＣ、０．４％ＳＤＳ）中、５５℃で１０分間振とうし、新しい該一次洗浄バッファー中で再び５５℃で１０分間振とうした後、二次洗浄バッファー（２×ＳＳＣ）中、室温で５分間振とうし、新しい該二次洗浄バッファー中で再び室温で５分間振とうする条件が挙げられる。
【００２６】
以下に、本発明のα−グルコシダーゼＢ遺伝子の作製法として、配列番号２の塩基配列を有するα−グルコシダーゼＢ遺伝子を得るための具体的な手順の一例を説明する。上述したように本発明のα−グルコシダーゼＢ遺伝子は、微生物由来でも人工的な合成により得られたものでも良いが、以下では、供与体としてアスペルギルス・オリゼーを用いる場合について説明する。なお、以下に示した手順において特に言及しない操作については、適宜常法が適用され得る。また、適宜常法にて追加または代替の手順が採用され得る。
【００２７】
（１）染色体ＤＮＡの抽出
供与体として用いるアスペルギルス・オリゼー菌株としては、たとえばＲＩＢ４０等が例示できる。
【００２８】
菌株からの染色体ＤＮＡの抽出はたとえば下記のような方法で行なうことができる。アスペルギルス・オリゼーの分生胞子１白金耳を、たとえばデキストリン・ペプトン培地に接種して振とう培養した後、得られた菌体をガラスフィルターで集め、滅菌水で洗浄する。次にこの菌体の水分をろ紙等により除去した後、あらかじめ冷却した乳鉢を用いて液体窒素中ですりつぶす方法等により菌体を破砕する。得られた菌体破砕物を、たとえばＴＥ溶液に懸濁させた後、溶菌溶液を加えて緩やかに撹拌した後、３７℃程度で３０分間程度放置する。得られた溶菌液を冷却遠心分離等により遠心分離した後、上清を回収する。
【００２９】
この上清をたとえば等量のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール混合液で２回処理する方法によって、夾雑するタンパク質を除去した後、冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させる。得られた沈殿物をＲＮアーゼを含むＴＥ溶液に緩やかに溶解させて、たとえば３７℃で３０分間程度反応させる。
【００３０】
反応後の溶液をたとえばフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール処理した後、冷エタノールを添加し、生じた染色体ＤＮＡをパスツールピペットで巻き取る。巻き取った染色体ＤＮＡを乾燥した後、ＴＥ溶液に溶解させ、染色体ＤＮＡ溶液を調製する。
【００３１】
（２）染色体ジーンライブラリーの作製
上記のような方法で抽出した染色体ＤＮＡから、アスペルギルス・オリゼーの染色体ジーンライブラリーを作製する。
【００３２】
上記で得られた染色体ＤＮＡからの染色体ジーンライブラリーの作製は常法により行なうことができる。たとえば、染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ  Ｉで処理することによって部分分解して得た染色体ゲノムをアガロース電気泳動で分離した後、約５．５ｋｂｐ付近のゲルを切り出し、ＤＮＡ断片を得る。このＤＮＡ断片をファージλに挿入して染色体ジーンライブラリーを作製することができる。
【００３３】
（３）クローニング
上記の染色体ジーンライブラリーに保存されたファージのプラークを形成した後、プラークハイブリダイゼーションによりα−グルコシダーゼＢ遺伝子を含むクローンを選択する。用いるプローブは、α−グルコシダーゼＢ遺伝子の一部についてＰＣＲ増幅を行なうことで取得できる。
【００３４】
アスペルギルス・ニードランスの前述の非特許文献１に記載される共通保存配列（アミノ酸配列）を参考に、揺らぎの少ない部分にて縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーを作製し、アスペルギルス・オリゼーの染色体ゲノムを鋳型にネストＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）を行ない、約９００ｂｐのＰＣＲ断片を取得し、プローブとすることができる。
【００３５】
このような縮重プライマーとしては、たとえば、プライマーＳＰ１（５‘−ＴＧＧＡＴＨＧＡＹＡＴＧＡＡＹＧＡＲＣＣ−３’）（配列番号３）、プライマーＡＳＰ２（５‘−ＴＧＲＴＣＮＣＫＲＡＡＲＡＡＮＧＴＲＴＡ−３’）（配列番号４）、およびプライマーＡＳＰ３（５‘−ＣＣＮＣＣＲＡＡＮＣＣＲＣＡＮＡＣＲＴＣ−３’）（配列番号５）を設計できる。
【００３６】
なお上記の配列において、ＨはＡ，Ｃ，Ｔのいずれかを、ＹはＣまたはＴを、ＲはＡまたはＧを、ＫはＧまたはＴを、ＮはＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔのいずれかを、それぞれ表す。
【００３７】
上記で得た染色体ライブラリーからのα−グルコシダーゼＢ遺伝子の単離は、たとえば以下のように行なうことができる。ハイブリダイゼーションによって得られたプラーク中に挿入されているアスペルギルス・オリゼー由来のＤＮＡを含む断片をＰＣＲ増幅により得る。プラークベクター内のマルチクローニングサイトの両隣に存在するＴ７およびＴ３のプロモーター配列と、プローブの３’末端側の配列とを用い増幅する。
【００３８】
ＰＣＲ産物についてシーケンスを行ない、得られた結果につきＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ検索を行なう。これにより、本発明のα−グルコシダーゼＢ遺伝子の全長を決定することができる。
【００３９】
＜ベクター＞
本発明は、上述した本発明のα−グルコシダーゼＢ遺伝子を含むベクターも提供する。本発明のベクターは、これを導入した形質転換体においてα−グルコシダーゼＢを産生させ得るものであれば特に制限されるものではない。たとえば染色体、エピソーム、ウイルスに由来するベクター（たとえば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクターなど）、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、およびこれらの組合せに由来するベクター（コスミドベクターなど）に、従来公知の遺伝子工学的手法にて上述した本発明のα−グルコシダーゼＢ遺伝子を組み込んだベクターを挙げることができる。
【００４０】
本発明のベクターは、通常、組み込んだα−グルコシダーゼＢ遺伝子の上流側に、プロモータ配列を有するものを用いる。プロモータ配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、β−アクチンプロモータ、メタロチオネインＩＩＡプロモータ、ＳＶ４０Ｅプロモータ、ＳＲαプロモータ、麹菌のエノラーゼ遺伝子の改良型プロモータ、などが挙げられるが、本発明のα−グルコシダーゼＢがアスペルギルス・オリゼー由来である場合にはセルフクローニングが可能である点で麹菌のエノラーゼ遺伝子の改良型プロモータを用いることが好ましい。本発明のベクターは、所望のプロモータ配列が予め組み込まれたものを用いてもよいし、従来公知の遺伝子工学的手法にてα−グルコシダーゼＢ遺伝子の上流側に組み込んでもよい。
【００４１】
本発明のベクターの好適な具体例としては、ｎｉａＤ遺伝子をマーカーに持つｐＮＥＮ１４２の他、ａｒｇＢマーカー、ｐｉｒＧマーカー、ピリジアミノマーカーなどを持つベクターに該α−グルコシダーゼＢ遺伝子を挿入することによって得られたベクターを挙げることができる。たとえば図１は、ｐＮＥＮ１４２の制限酵素切断地図を示す図であり、図２は、本発明のベクターの例としてのｐＮＥＮ−ａｇｄＢの制限酵素切断地図を示す図である。図２は、一例として、３ｋｂｐのａｇｄＢ−ＯＲＦ（α−グルコシダーゼＢ遺伝子のオープンリーディングフォーム）が挿入された１２．３ｋｂｐのベクターｐＮＥＮ−ａｇｄＢの例について示しているが、本発明のベクターはこれに限定されるものではない。
【００４２】
＜形質転換体＞
本発明はまた、上述した本発明のベクターが組み込まれた形質転換体も提供する。本発明の形質転換体は、本発明のベクターを適切な宿主に常法にて組み込むことにより得ることができる。ベクターを組み込む宿主は限定されるものではなく、たとえばアルペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・カウチ、アスペルギルス・ソヤなどを挙げることができる。中でも、α−グルコシダーゼＢ産生能、特に菌体外酵素としてのα−グルコシダーゼＢ産生能が高い点でアスペルギルス・オリゼーが好ましく用いられる。宿主のアスペルギルス・オリゼーとしては、通常のアスペルギルス・オリゼー（ピリジアミンマーカー優性）、アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０等のｎｉａＤ欠損株、が好ましく用いられる。
【００４３】
上述したα−グルコシダーゼＢ産生能を有する形質転換体としては、たとえば本発明者が作製し、アスペルギルス・オリゼーＭＩＢＡ  １００２（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＭＩＢＡ  １００２）と命名された形質転換体を挙げることができる。かかる形質転換体アスペルギルス・オリゼーＭＩＢＡ  １００２は新規なものであるため、微生物工業技術研究所に寄託した（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−２１４）。
【００４４】
＜α−グルコシダーゼＢの製造方法＞
本発明においては、上記で得られた形質転換体を培養する培養工程と、該培養工程で得られた培養物からα−グルコシダーゼＢを採取する採取工程と、を含む方法によりα−グルコシダーゼＢを製造することができる。典型的には、まず、培養工程において、本発明の形質転換体を、たとえばデキストリンを炭素源とする培地等の培地中で、たとえば３〜８日間程度培養し、育成された菌株を培養物として回収する。次に、採取工程において該培養物のろ過、破砕等を行なうことにより、α−グルコシダーゼＢを採取する。この場合、培養物をろ過して得たろ液を、菌体外酵素を含む菌体外粗酵素液として回収し、ろ過後の残渣をさらに破砕して、菌体内酵素を含む菌体内粗酵素液として回収する方法等が好ましく採用され得る。
【００４５】
特に、アスペルギルス・オリゼーを宿主とする本発明の形質転換体を用いる場合には、α−グルコシダーゼＢを多量の菌体外酵素として採取できる点で好ましい。この場合、上記の採取工程において、たとえば培養物をろ過して得たろ液を菌体外粗酵素液として回収する方法等によって、α−グルコシダーゼＢを少なくとも菌体外酵素として回収することができる。α−グルコシダーゼＢを菌体外酵素として得ることにより、たとえば食品用途においてオリゴ糖を生成させる際等、本発明の種々の適用態様において、生産されたα−グルコシダーゼＢを効率的に利用することが可能である。
【００４６】
なお、本発明のα−グルコシダーゼＢの製造方法のその他の工程については従来公知の手法を適宜好ましく採用することができる。
【００４７】
［実施例］
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお以下の「％」の記載は特記がない限り質量％を意味する。
【００４８】
＜実施例１＞
（染色体ジーンライブラリーの作製）
アスペルギルス・オリゼー菌株から、下記の手順で染色体ＤＮＡを抽出した。すなわち、アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株の分生胞子１白金耳をデキストリン・ペプトン培地（２％デキストリン、１％ペプトン、０．５％ＫＨ2ＰＯ4、０．１％ＮａＮＯ3、０．０５％ＭｇＳＯ4、７Ｈ2Ｏ）１００ｍｌに接種し、３０℃で２日間振とう培養し、得られた菌体を３Ｇ１ガラスフィルターに集め、滅菌水で洗浄した。
【００４９】
次に、この菌体の水分を濾紙により除去した後、あらかじめ−８０℃に冷却した乳鉢を用いて液体窒素中ですりつぶした。この菌体粉砕物をＴＥ溶液（１０ｍＭ、トリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁させた後、溶菌溶液（０．５％ＳＤＳ、５０ｍＭＥＤＴＡ）を等量加えて緩やかに撹拌した後、３７℃で３０分間放置した。得られた溶菌液を３０００ｒｐｍで１０分間冷却遠心分離した後、上清を取得した。その上清を等量のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール混合液で２回処理して、夾雑するタンパク質を除去した後、２．５倍容の冷エタノールを加え、ＤＮＡを沈殿させた。得られた沈殿物を０．１ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼを含むＴＥ溶液に緩やかに溶解して、３７℃で３０分間反応させた。反応後の溶液をフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール処理した後、２．５倍容の冷アルコールを添加し、生じた染色体ＤＮＡをパスツールピペットで巻き取った。巻き取ったＤＮＡを乾燥した後、ＴＥ溶液に溶解し、染色体ＤＮＡ溶液を調製した。
【００５０】
上記で得たアスペルギルス・オリゼーの染色体ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨ  Ｉを用い、３７℃で２時間反応させて消化した。アガロース電気泳動で分離した後、サザンハイブリダイゼーションを行なった。なおサザンハイブリダイゼーションには、アマシャムバイオサイエンス（株）製のキット「ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ」を用い、一連の操作は、該キットに付属するプロトコールに従って常法にて行なった。パーオキシダーゼが触媒するルミノールの酸化反応によるケミルミネセンスを検出するという原理を応用したアマシャムバイオサイエンス（株）のＥＣＬ検出システムにより、バンドの検出を行なった。
【００５１】
用いたプローブは、下記に示すネストＰＣＲにより得た。アスペルギルス・オリゼーと同属であるアスペルギルス・ニードランスの、前述の非特許文献１に記載される共通保存配列（アミノ酸配列）を参考に、揺らぎの少ない部分にて、縮重プライマーＳＰ１（５‘−ＴＧＧＡＴＨＧＡＹＡＴＧＡＡＹＧＡＲＣＣ−３’）（配列番号３）、プライマーＡＳＰ２（５‘−ＴＧＲＴＣＮＣＫＲＡＡＲＡＡＮＧＴＲＴＡ−３’）（配列番号４）、およびプライマーＡＳＰ３（５‘−ＣＣＮＣＣＲＡＡＮＣＣＲＣＡＮＡＣＲＴＣ−３’）（配列番号５）を設計した。
【００５２】
なお上記の配列において、ＨはＡ，Ｃ，Ｔのいずれかを、ＹはＣまたはＴを、ＲはＡまたはＧを、ＮはＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔのいずれかを、それぞれ表す。
【００５３】
上記のアスペルギルス・オリゼーの染色体ＤＮＡとプライマーＳＰ１、およびプライマーＡＳＰ３、さらに、得たＰＣＲ産物とプライマーＳＰ１およびプライマーＡＳＰ２とでネストＰＣＲを行ない、プローブとなる約８００ｂｐのＰＣＲ断片を取得した。
【００５４】
サザンハイブリダイゼーションの検出結果としては、約５．５ｋｂｐのサイズのバンドが検出された。
【００５５】
アスペルギルス・オリゼーの染色体ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨ  Ｉで再度消化し、アガロース電気泳動で分離した後、約５．５ｋｂｐ付近のゲルを切り出し、断片を回収した。
【００５６】
回収した断片をファージλＤＡＳＨ  ＩＩのＢａｍＨ  Ｉ部位にＴ４リガーゼを用いて連結し、得られたファージＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージングキット（ギガパックゴールド（東洋紡績（株）製））を用いてパッケージングした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２にトランスフェクションし、染色体ＤＮＡのジーンライブラリーを作製した。
【００５７】
（クローニング）
上記で作製した染色体ＤＮＡのジーンライブラリーに保存されたファージのプラークを形成した後、プラークハイブリダイゼーションにより、α−グルコシダーゼＢ遺伝子を含むクローンの選択を行なった。なおプラークハイブリダイゼーションにはアマシャムバイオサイエンス（株）製のキット「ＥＣＬ  Ｄｉｒｅｃｔ」を用い、一連の操作は、該キットに付属するプロトコールに準じて常法にて行なった。なお、プローブ濃度は１０ｎｇ／ｍｌ、ハイブリダイゼーション時間は４時間、フィルムへの露光時間は１時間にそれぞれ設定し、培地にはプロトコールに記載されるクロラムフェニコールに代えてアンピシリンを添加し、培養およびリンスを行なった後のディスクの乾燥条件としてはプロトコールに記載される風乾に代えて８０℃でインキュベートにて乾燥する条件を採用した。プラークハイブリダイゼーションに用いたプローブとしては前述の染色体ジーンライブラリーの作製において用いたのと同じものを用いた。その結果、数個のプラークが検出できた。
【００５８】
（α−グルコシダーゼＢ遺伝子の塩基配列の決定）
上記で得られたプラークの中に挿入されているアスペルギルス・オリゼー由来のＤＮＡを含む断片を下記のようにＰＣＲにて増幅させた。プラークベクター内のクローニングサイトの隣に存在するＴ７およびＴ３のプロモーター配列と、プローブの３’末端側、５‘末端側、の配列とを用いてＰＣＲを行なった。
【００５９】
増幅したＰＣＲ断片について、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いてシーケンスを行ない、ベクターに挿入されている塩基配列を決定したところ、配列表に記載された配列番号２の塩基配列が得られた。また、配列番号２の塩基配列によってコードされるα−グルコシダーゼＢのアミノ酸配列として、配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列が決定された。
【００６０】
上記の塩基配列についてホモロジー検索をした結果、アスペルギルス・ニードランス由来のα−グルコシダーゼＢ遺伝子とのホモロジーは、ＮＣＢＩのＦＡＳＴによる塩基配列の検索で８１％、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴによるアミノ酸配列の検索で８０％の相同性が認められた。これより、アスペルギルス・ニードランスのα−グルコシダーゼＢ遺伝子と同様の遺伝子がアルペルギルス・オリゼーにも存在することが分かった。また、ベクターに挿入されているＤＮＡ断片は、α−グルコシダーゼＢ遺伝子全長を含んでいることが分かった。
【００６１】
＜実施例２＞
（活性アスペルギルス・オリゼーのα−グルコシダーゼＢを分泌産生するためのアスペルギルス・オリゼーで機能するベクターの構築）
α−グルコシダーゼＢ遺伝子の構造遺伝子部分は下記の方法で取得した。
【００６２】
上記で得たＤＮＡ断片を含むプラークより、スタートコドンおよびＮｏｔ  Ｉ配列を含むプライマーと、ストップコドンおよびＸｂａ  Ｉ配列を含むプライマーとを用いてＰＣＲを行ない、構造遺伝子をＰＣＲ断片として取得した。
【００６３】
得られたＰＣＲ断片を、Ｍｉｎｅｔｏｋｉ．ｔ  ”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｏｒ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ”  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，３（３）８９−９６（２００３）に記載される、アスペルギルス・オリゼーで複製可能なベクターｐＮＥＮ１４２により、以下の方法で連結した。用いたｐＮＥＮ１４２の制限酵素切断地図は図１に示す通りである。
【００６４】
まず、上記のＰＣＲ断片の１０μｇを、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ制限酵素で二重消化した後、０．８％アガロース電気泳動にかけて分離した３ｋｂｐの断片をゲルから切り取り、そのゲル片からジーンクリーンキット（バイオ１０１社製）を用いてＴＥ溶液（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に回収した。
【００６５】
一方、ｐＮＥＮ１４２をＮｏｔ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ制限酵素で二重消化した後、小牛腸のアルカリフォスファターゼ（ＣＩＡＰ）で処理し、５‘末端のリン酸基を除去して、ｐＮＥＮ１４２の自己連結を防ぎながら上記の５．５ｋｂｐのＤＮＡ断片とＴ４リガーゼを用いて連結してベクターｐＮＥＮ１４２−ａｇｄＢを作製した。得られたベクターｐＮＥＮ１４２−ａｇｄＢの制限酵素切断地図は図２に示す通りである。
【００６６】
＜実施例３＞
（活性アスペルギルス・オリゼーのα−グルコシダーゼＢを多量に分泌生産するアスペルギルス・オリゼー形質転換体の作製）
上記で得たベクターｐＮＥＮ１４２−ａｇｄＢに挿入されている３ｋｂｐのアスペルギルス・オリゼー由来のＤＮＡ断片には、α−グルコシダーゼＢを発現分泌生産するのに必要な情報が含まれていると予想される。そこで、次のようにｐＮＥＮ１４２−ａｇｄＢのアスペルギルス・オリゼーへの移入を行なった。
【００６７】
アスペルギルス・オリゼーの硝酸還元酵素遺伝子欠損株（ｎｉａＤ-株）をデキストリン・ペプトン培地（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．５％ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）にて、３０℃で２日間振とう培養した後、得られた菌糸を無菌水で洗浄した。
【００６８】
この菌糸を、細胞壁溶解液（１０ｍＭリン酸緩衝液、０．８ＭＮａＣｌ、２０ｍｇ／ｍｌヤタラーゼ（宝酒造（株）製））に懸濁し、３０℃で３時間振とうすることによりプロトプラスト化を図った。
【００６９】
得られたプロトプラストをガラスフィルター３Ｇ３でろ過することにより、残存する菌糸を除去した。
【００７０】
次に、このプロトプラストを、０．８ＭＮａＣｌで２回洗浄した後、形質転換溶液１（０．８ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ2、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））に、２．５×１０6個／ｍｌになるように懸濁させ、懸濁液を調製した。この懸濁液に、１／４容の形質転換溶液２（４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール４０００、５０ｍＭＣａＣｌ2、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））、１／１００容のジメチルスルホキシドを添加してコンピテントセルを調製した。
【００７１】
上記で得たコンピテントセル０．１ｍｌ（２．０×１０7個）に、ｐＮＥＮ１４２−ａｇｄＢ１０μｇを加え、氷中で３０分間放置した後、１ｍｌの形質転換溶液２を加えよく混合した後、室温で２０分間放置した。これを１０ｍｌの形質転換溶液１で洗浄した後、０．８ＭＮａＣｌを含むデキストリン・ツァペック・ドックス培地（２％デキストリン、０．３％ＮａＮＯ3、２％ＫＣｌ、０．１％ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００２％ＦｅＳＯ4、ｐＨ５．５）の平板上に塗布し、その上に０．８ＭＮａＣｌを含む０．６％寒天を重層して３０℃で培養した。ｐＮＥＮ１４２−ａｇｄＢは、硝酸還元酵素遺伝子（ｎｉａＤ）を含んでおり、最小培地（デキストリン・ツァペック・ドックス培地）で生育可能な形質転換体を取得した。
【００７２】
該形質転換体は、アスペルギルス・オリゼーＭＩＢＡ１００２（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＭＩＢＡ１００２）と命名し、微生物工業技術研究所に寄託した。受託番号は、「ＮＩＴＥ  Ｐ−２１４」である。
【００７３】
得られた形質転換体のα−グルコシダーゼＢの活性および比活性を、後述の実施例４において記載する方法により測定した。結果についても後述する。
【００７４】
＜実施例４＞
（アスペルギルス・オリゼーの形質転換体を用いた液体培養によるα−グルコシダーゼＢの生産）
実施例３で得た形質転換体の分生胞子を、１００ｍｌの培地（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．１％ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ｐＨ５．５）に、２．５×１０6個接種し、３０℃で１〜９日間振とう培養した。得られた培養物は、３ＧＩガラスフィルターでろ過し、ろ液は菌体外粗酵素液として、また菌体は超純水で洗浄し、バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％  Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）中で、ホモジナイザーで破砕、遠心分離した上清を菌体内粗酵素液とした。下記の方法で糖転移活性およびＳＤＳ−ＰＡＧＥの評価を行なった。
【００７５】
（糖転移活性の評価）
上記の１〜９日培養後のそれぞれの培養物から得た菌体内粗酵素液および菌体外粗酵素液の各粗酵素液につき、α−グルコシダーゼＢの糖転移活性を測定した。
【００７６】
測定は、糖化力分別定量キット（キッコーマン）を用いて行なった。基質である４−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコシドに上記の各粗酵素液を添加して３７℃で反応させた後、Ｎａ2ＣＯ3を加えることにより反応を停止させ、反応中に遊離してくる４−ニトロフェノールを４００ｎｍの吸光度の上昇により測定し、α−グルコシダーゼＢの活性（Ｕ／ｍｌ）を測定した。また、３日培養後および８日培養後の培養物については、比活性（Ｕ／ｍｇ）も測定した。なお、１分間に１μｍｏｌの基質を糖転移させる酵素量を１Ｕ（ユニット）とした。上記の活性の値は、粗酵素液１ｍｌ当たりの酵素量（Ｕ／ｍｌ）として与えられ、上記の比活性の値は、タンパク質１ｍｇ当たりの酵素量（Ｕ／ｍｇ）として与えられる。
【００７７】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の評価）
上記の８日培養後の培養物から得た菌体外粗酵素液につき、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの評価を行なった。
【００７８】
評価は、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法（”Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅａｄ  ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４”Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２２７，６８０（１９７０））で行ない、電気泳動後のゲルはクマシーブリリアントブルーＲ２５０を用いて染色した。これを、粗酵素液セントリカットＵ−２０（倉敷紡績（株）製）を用いて濃縮した。
【００７９】
＜比較例１＞
実施例３の形質転換体に代えて親株であるアスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０を用いた他は実施例４と同様の方法で菌体を培養した。実施例４と同様の方法で１〜９日培養後のそれぞれの培養物から菌体内粗酵素液および菌体外粗酵素液を調製した。
【００８０】
上記の菌体内粗酵素液および菌体外粗酵素液について糖転移活性の測定を行ない、８日培養後の培養物から得た菌体外粗酵素液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥの評価を行なった。
【００８１】
実施例４および比較例１における、１〜９日培養後の菌体内酵素の活性を表１に、１〜９日培養後の菌体外酵素の活性を表２に、３日培養後の菌体内酵素の糖転移活性を表３に、８日培養後の菌体内酵素および菌体外酵素の糖転移活性を表４に、それぞれ示す。
【００８２】
【表１】
2008072956.tif 000003
【００８３】
【表２】
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【００８４】
【表３】
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【００８５】
【表４】
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【００８６】
表１および表２に示す結果から、本発明の形質転換体のα−グルコシダーゼＢの生産性は、親株に比べて顕著に向上していることが分かる。特に、表３に示す結果から、培養３日後において、本発明の形質転換体の菌体内酵素としてのα−グルコシダーゼＢの生産性は、活性、比活性ともに、親株の約１１倍に増加したことが分かる。また、表４に示す結果から、培養８日後において、本発明の形質転換体の菌体内酵素としてのα−グルコシダーゼＢの生産性は、活性で親株の７.５倍、比活性で親株の６.８倍に増加したことが分かり、さらに、菌体外酵素としてのα−グルコシダーゼＢの生産性は、親株と比較して、活性が４.２倍、比活性が約２．４倍に増加したことが分かる。また、表４に示す結果から、実施例４における１ｇ菌体当りの酵素量に占める菌体外酵素の割合は６８.４５％であり、本発明の形質転換体を用いた液体培養において多量の菌体外酵素を得ることが可能であることが分かる。
【００８７】
図３は、実施例４および比較例１における８日培養後の菌体外酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。図３中、（１）は実施例４の結果、（２）は比較例１の結果を示している。図３に示すように、実施例４においては、分子量７８，０００付近および分子量６３，０００付近の比較例１にはないタンパク質が出現していた。図３に示す結果から、実施例４においては、α−グルコシダーゼＢに相当する分子量のタンパク質が多量に分泌生産され、なおかつ、夾雑酵素も少なく高純度であることが分かる。
【００８８】
これらの結果から、本発明のα−グルコシダーゼＢ遺伝子を含むベクターを移入した形質転換体を用いることにより、高い糖転移活性を有するα−グルコシダーゼＢを多量かつ高純度で生産することが可能であり、特に、α−グルコシダーゼＢを菌体外酵素として多量に得ることが可能であることが分かる。
【００８９】
＜実施例５＞
（アスペルギルス・オリゼーの形質転換体のふすま培養によるα−グルコシダーゼＢの生産）
前述したように、本発明のα−グルコシダーゼＢ遺伝子を含むベクターを移入した形質転換体の液体培養において菌体外酵素を多量に得ることができることが確認できたため、より良い培養条件を検討するため、該形質転換体のふすま培養を行なった。
【００９０】
実施例３で得た形質転換体の分生胞子を、ふすま培地（小麦ふすま５ｇ、Ｈ2Ｏ５ｍｌ）に２．５×１０6個接種し、３０℃で５日間静置培養した。培養物１ｇに対し、１０ｍｌの酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で、３時間抽出した。
【００９１】
抽出後、３Ｇ１ガラスフィルターでろ過し、ろ液は菌体外粗酵素液として、また菌体は、超純水で洗浄した後、バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％  Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）中でホモジナイザーで破砕、遠心分離し、上清を菌体内粗酵素液とした。糖転移活性の測定は、実施例４と同様に行なった。結果を表５に示す。
【００９２】
【表５】
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【００９３】
表５に示すように、ふすま培養における菌体内酵素、菌体外酵素の糖転移活性の比較を行なった結果、ふすま１ｇ当りの酵素量に占める菌体外酵素の割合は約８６％（０．５８７Ｕ／ｇ）であった。表５に示す結果から、本発明のα−グルコシダーゼＢ遺伝子を含むベクターを移入した形質転換体を用いることにより、ふすま培養によってもα−グルコシダーゼＢを多量に生産でき、特に菌体外酵素として多量のα−グルコシダーゼＢが得られることが分かる。
【００９４】
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明において生産されるα−グルコシダーゼＢを用いて、たとえば、イソマルトオリゴ糖を効率的に生産し、清酒、味噌、醤油等の旨味成分として利用できる他、ビフィズス菌の増殖、抗う蝕等の用途にも利用できる。さらに、本発明のα−グルコシダーゼＢ遺伝子が組み込まれた組換え体ＤＮＡを含むアスペルギルス・オリゼーの形質転換体は、多量のα−グルコシダーゼＢを特に菌体外酵素として生産できるため、該形質転換体を用いて製麹した麹を利用することによって、イソマルトース、イソマルトトリオース、コウジビオース等のオリゴ糖を効率良く生成することができ、該オリゴ糖は、食品や化粧品等に対して好適に適用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ｐＮＥＮ１４２の制限酵素切断地図を示す図である。
【図２】本発明のベクターの例としてのｐＮＥＮ−ａｇｄＢの制限酵素切断地図を示す図である。
【図３】実施例４および比較例１における８日培養後の菌体外酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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