(57)【要約】      （修正有）【課題】異種植物由来の染色体を有し、この染色体の担う形質を発現し、かつ核相が３倍体を示す植物を提供する。【解決手段】異種同士の掛け合わせと染色体の倍加、その戻し交配を経て作出され、異種染色体を１本または複数本有する異種染色体添加２倍体植物の染色体を倍加させた異種染色体添加４倍体植物と、通常の染色体構成を有する２倍体植物とを掛け合わせて得られる、異種染色体添加３倍体植物。好適には、前記２倍体植物はユリ科ネギ属であり、前記異種染色体はシャロット由来である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１本の異種染色体が添加され、核相が３倍性であることを特徴とする異種染色体添加３倍体植物。
【請求項２】
少なくとも１本の異種染色体が添加された２倍体植物の染色体を倍加して得られた異種染色体添加４倍体植物と、前記２倍体植物とを交配することによって得られることを特徴とする、請求項１に記載の異種染色体添加３倍体植物。
【請求項３】
前記２倍体植物がユリ科植物であることを特徴とする、請求項２に記載の異種染色体添加３倍体植物。
【請求項４】
前記２倍体植物がネギ属植物であることを特徴とする、請求項３に記載の異種染色体添加３倍体植物。
【請求項５】
前記２倍体植物がネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）であって、添加された前記異種染色体がシャロット（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）由来の染色体であることを特徴とする、請求項４に記載の異種染色体添加３倍体植物。
【請求項６】
添加された前記シャロット由来の染色体が、シャロット第一染色体であることを特徴とする、請求項５に記載の異種染色体添加３倍体植物。
【請求項７】
異種染色体添加４倍体植物を種子親とし、２倍体植物を花粉親として交配することを特徴とする、請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加３倍体植物の作出方法。
【請求項８】
異種染色体添加４倍体植物を花粉親とし、２倍体植物を種子親として交配することを特徴とする、請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加３倍体植物の作出方法。
【請求項９】
請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加３倍体植物に由来することを特徴とする、異種染色体添加３倍体植物細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の異種染色体添加３倍体植物細胞を培養して得られることを特徴とする、異種染色体添加３倍体植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、育種分野において種々の有用な形質を示すことが知られる３倍体植物及びその細胞、さらにはその３倍体植物の作出方法に関し、より詳しくは、通常の染色体構成を有する２倍体植物と、異種由来の染色体を添加した前記２倍体植物の染色体倍加によって得られた４倍体植物との掛け合わせによって得られる、異種染色体添加３倍体植物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
果物や野菜など有用植物の倍数体、特に通常の２倍体植物と染色体を倍加した４倍体植物との掛け合わせで生じる３倍体植物は、農業分野、特に育種分野において、種なしスイカや種なしブドウなど数多くの有用品種を産み出すために用いられてきた。植物種によって作出の効率に差異があり、これまでにベンジルアデニンやコルヒチンで染色体を倍加させた４倍体に２倍体を掛け合わせることによって種々の植物から３倍体を作出するという通常の方法のほか、混数性（１個体に２以上の倍数性が存在する現象）を利用して２倍体植物から発生する４倍体の不定芽を育成し、これと２倍体とを掛け合わせる方法などが開示されている（特許文献１−３）。
【０００３】
しかしながらこれらの方法はいずれも、通常の染色体セットを有する２倍体植物を倍加して４倍体を得、さらにこれと２倍体を掛け合わせるという基本的構成に差は無く、３倍体化することによって得られる効果も、その植物が本来持っている性質を増強する以上のものではなかった。一方で植物に新規な形質を付与する手法としては遺伝子組み換え技術がよく知られるが、食用作物に適用するには社会的な抵抗感も根強いため、遺伝子組み換えなどの手法に頼らず、かつ新しい有用な形質が付与された３倍体植物の開発が待たれていた。
【特許文献１】特開２００５−２８７４２３  混数性を利用した倍数体植物の作出方法
【特許文献２】特開平６−２５３６９８  シクラメン３倍体の作出方法
【特許文献３】特許第２７４８１４１号  ステビア３倍体の育成方法
【非特許文献１】Ｓｈｉｇｙｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）：Ｇｅｎｅｓ  Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｓｔ．７１：３６３−３７１．
【非特許文献２】Ｍａｓｕｚａｋｉ  Ｓ．，Ｓｈｉｇｙｏ  Ｍ．＆Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ｎ．（２００６）：Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１２：６０７−６１７．
【非特許文献３】Ｓｈｉｇｙｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）：Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．７０：３９９−４０７．
【非特許文献４】Ｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９４８）：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７４：２０１−２０８．
【非特許文献５】五訂増補  食品成分表２００６  香川芳子監修  女子栄養大学出版部（２００５．１０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述の現状に鑑み、本発明者は、これまでに育種分野で用いられてきた伝統的な掛け合わせ手法に基づく染色体レベルでの品種改良に取り組み、特にネギを材料として、異種由来の染色体を１本または複数本有する「異種染色体添加２倍体植物」の開発に成功した（非特許文献１，２）。異種染色体添加植物では、添加された染色体の発現する有用な形質が確認されたため、本発明者らはこの異種染色体添加２倍体植物を出発点とし、異種染色体を安定に有した３倍体植物の作出のため検討を重ね、これに成功して本発明を完成させた。
本発明は、異種生物由来の染色体を有し、この染色体の担う形質を発現し、かつ核相が３倍体を示す植物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち本発明の第１の態様は、少なくとも１本の異種染色体が添加され、核相が３倍性であることを特徴とする異種染色体添加３倍体植物である。
【０００６】
本発明の第２の態様は、少なくとも１本の異種染色体が添加された２倍体植物の染色体を倍加して得られた異種染色体添加４倍体植物と、前記２倍体植物とを交配することによって得られることを特徴とする、請求項１に記載の異種染色体添加３倍体植物である。
【０００７】
本発明の第３の態様は、前記２倍体植物がユリ科植物であることを特徴とする、請求項２に記載の異種染色体添加３倍体植物である。
【０００８】
本発明の第４の態様は、前記２倍体植物がネギ属植物であることを特徴とする、請求項３に記載の異種染色体添加３倍体植物である。
【０００９】
本発明の第５の態様は、前記２倍体植物がネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）であって、添加された前記異種染色体がシャロット（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）由来の染色体であることを特徴とする、請求項４に記載の異種染色体添加３倍体植物である。
【００１０】
本発明の第６の態様は、添加された前記シャロット由来の染色体が、シャロット第一染色体であることを特徴とする、請求項５に記載の異種染色体添加３倍体植物である。
【００１１】
本発明の第７の態様は、異種染色体添加４倍体植物を種子親とし、２倍体植物を花粉親として交配することを特徴とする、請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加３倍体植物の作出方法である。
【００１２】
本発明の第８の態様は、異種染色体添加４倍体植物を花粉親とし、２倍体植物を種子親として交配することを特徴とする、請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加３倍体植物の作出方法である。
【００１３】
本発明の第９の態様は、請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加３倍体植物に由来することを特徴とする、異種染色体添加３倍体植物細胞である。
【００１４】
本発明の第１０の態様は、請求項９に記載の異種染色体添加３倍体植物細胞を培養して得られることを特徴とする、異種染色体添加３倍体植物である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明を利用することにより、異種植物から導入された染色体を安定に保有し、この染色体が示す種々の有用形質が付加された、新規な３倍体植物を提供することが可能となる。すなわち本発明によれば、本来その植物が有する性質とは異なる優れた性質、例えばアスコルビン酸等の有用成分を多く含有する、病原菌耐性を獲得する、あるいは大果（可食部が多い）・豊産（生産性向上）など多くの優れた性質を有し、かつ不稔性であるため農業用作物として極めて効果の高い植物が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に本発明を実施するための最良の形態を示す。本発明の第１の実施の形態は、少なくとも１本の異種染色体を有し、核相が３倍性であることを特徴とする植物を提供する。３倍体植物はこれまでに多くの作物で作出されてきたが、これらのいずれも染色体の倍加による４倍体作出と、この４倍体と２倍体との掛け合わせにより３倍体を作出するというものであり、その植物が本来持っている形質を増強するのにすぎなかった。本発明はこれに対し、異種染色体を添加した４倍体植物を用い、これを２倍体植物に掛け合わせることによって、異種染色体を導入した３倍体植物の作出を可能とした点が極めて新規である。これまでに多くの３倍体植物の作出方法が提案されてきているが、これらの方法のどれを採用した場合においても、３倍体植物に直接異種の染色体を導入することは技術的には不可能に近いほど困難であり、その点において本発明の実施の形態に係る異種染色体添加３倍体植物は極めて高い利用価値を有すると考えられる（本発明の第２の実施の形態）。
【００１７】
本発明の実施の形態に係る異種染色体添加３倍体植物は、原理的には異種染色体を添加した２倍体植物があればどの様な植物にも適用可能であり、植物の種類が発明を限定することは無いが、好ましくは食用作物、花卉類などの品種向上に利用可能であり、更に好ましくはユリ科の作物（第３の実施の形態）、例えばチューリップ属やユリ属など園芸植物を含むユリ亜科、スズラン属やアスパラガス属を含むキジカクシ亜科、ネギやニラなど多くの食用作物を含むネギ亜科などの植物が適している。この中でも特にネギ属の作物（第４の実施の形態）、好ましくはネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、ニラ（Ａｌｌｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ラッキョウ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｈｉｎｅｓｅ）、チャイブ（Ａｌｌｉｕｍ  ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ）、アサツキ（Ａｌｌｉｕｍ  ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ  ｖａｒ．ｆｏｌｉｏｓｕｍ）、ノビル（Ａｌｌｉｕｍ  ｇｒａｙｉ）、ギョウジャニンニク（Ａｌｌｉｕｍ  ｖｉｃｔｏｒａｌｉｓ）、リーキ（Ａｌｌｉｕｍ  ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ）などから選択される食用作物や、花ネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、コワニー（Ａｌｌｉｕｍ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎｕｍ）、アリウム・アズレウム（Ａｌｌｉｕｍ  ａｚｕｒｅｕｍ）、アリウム・ロゼウム（Ａｌｌｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、アリウム・スファエロセファルム（Ａｌｌｉｕｍ  ｓｐｈａｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｍ）、アリウム・トリクエトルム（Ａｌｌｉｕｍ  ｔｒｉｑｕｅｔｒｕｍ）、アリウム・ディッキンソニイ（Ａｌｌｉｕｍ  ｄｉｃｋｉｎｓｏｎｉｉ）、アリウム・アフラチュネンセ（Ａｌｌｉｕｍ  ａｆｌａｔｕｎｅｎｓｅ）、アリウム・ディクラミディウム（Ａｌｌｉｕｍ  ｄｉｃｈｌａｍｙｄｅｕｍ）、アリウム・モンゴリクム（Ａｌｌｉｕｍ  ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ）などから選択される園芸品種に適用可能である。下記実施例では、ネギ（Ａｌｌｕｉｉｕｍ  ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）にシャロット（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）由来の染色体を添加した異種染色体添加４倍体ネギと、２倍体ネギとの掛け合わせによって、異種染色体を有する３倍体植物を作出している（第５の実施の形態）。シャロット染色体添加ネギにおいて、本発明者らは特に第１染色体添加系統がアスコルビン酸高生産などの有用な形質を示すことを見いだしており、シャロット第１染色体を有する３倍体ネギは好ましい例である（第６の実施の形態）。
【００１８】
４倍体植物と２倍体植物との掛け合わせにおいては、種子親、花粉親の組み合わせで２通りの方法がある。４倍体植物を種子親に、２倍体植物を花粉親にする組み合わせは、例えば作出した４倍体植物の花粉稔性が低く、雄性不稔を示す場合などに適用可能であり、また４倍体植物の胚珠由来の果実などが良い形質を示す場合にも、この組み合わせを採用すれば良い（第７の実施の形態）。反対に、４倍体植物を花粉親に、２倍体植物を種子親にする組み合わせは、２倍体植物胚珠由来の果実の方が良い形質を示す場合、異種染色体添加４倍体植物が高い花粉稔性を示す場合、などに適用すれば良い（第８の実施の形態）。異種染色体添加４倍体植物と２倍体植物を掛け合わせて異種染色体を１本または複数本有する３倍体植物を作出するという本質に違いは無いが、どちらを種子親／花粉親にするかによって生じる子孫株の形質に差が出たり、子孫を形成する効率に差が出る可能性があるため、花粉、種子それぞれの形質を考慮に入れつつ育種上有効な組み合わせを採るのが望ましい。本発明の実施の形態はこの両方を包含するものである。
【００１９】
本発明の実施の形態が提供する３倍体植物は掛け合わせによって得られるものであるが、その植物に由来する器官または組織あるいは細胞も利用可能である（第９の実施の形態）。３倍体植物はほとんどの場合稔性が無いため、自家受精などによって次世代を得ることが極めて困難であることから、３倍体植物の一部を接ぎ木や挿し木、取り木、むかご、分球等の形で栄養繁殖させたり、組織あるいは細胞を単離して培養し、培養細胞塊（カルス）に発芽誘導、発根誘導をかけて新たな植物体を得たりすることで異種染色体添加３倍体植物を大量に増やすことが可能となる（第１０の実施の形態）。栄養繁殖や組織培養、細胞培養などの手法は育種分野等で通常用いられている手法の中から適宜選択すればよく、本発明を限定するものではない。以下に本発明の実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものでは無い。
【実施例】
【００２０】
（単一異種染色体添加ネギ系統の作出）本発明に係る単一異種染色体添加ネギ系統は、非特許文献１に記載の方法で作出した（Ｓｈｉｇｙｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。作出方法の概要を表１、表２に示す。２倍体のネギ（ゲノム記号ＦＦ，２ｎ＝１６）とシャロット（ゲノム記号ＡＡ，２ｎ＝１６）を掛け合わせ、雑種第一代（ＡＦ，ｎ＋ｎ＝１６）を得た。染色体の倍加によりＡｍｐｈｉｄｉｐｌｏｉｄ（４倍体ＡＡＦＦ，２ｎ＝３２）を得、これに２倍体のネギ（ＦＦ）を掛け合わせて次代（ＡＦＦ，２ｎ＋ｎ＝２４）を得た。更にこれに２倍体のネギ（ＦＦ）を掛け合わせると、減数分裂時にシャロットゲノムＡに由来する染色体の不均等分配がおこり、この中から染色体１本を含む子孫の系統（Ａｌｉｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｍｉｃ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｌｉｎｅ）をそれぞれの染色体（第１〜第８）について作出した（表１）。本実施例ではこのうち、アスコルビン酸含有量の向上、及びネギさび病への抵抗性など有用な形質が見られた第１染色体添加系統について、更なる解析を行った。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
【表２】
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【００２３】
（４倍体植物の作出）本発明の実施例として、前述の方法で作出したシャロット第１染色体を１本持つネギ系統（ＦＦ＋１Ａ，２ｎ＝１６＋１）を材料に用いた。前記植物体の１ないし２枚の葉原基を含む茎頂部成長点（１ｍｍ以下）を切り出し、０．０５％（ｗ／ｖ）コルヒチン、２％（ｗ／ｖ）ジメチルスルホキシド、３％ショ糖（ｗ／ｖ）を含むＭＳ固形培地（ジェランガムまたは寒天で固化）に置床して、２５℃、暗条件で４日間培養した（染色体倍加処理）。その後、培養した前記組織をホルモンフリーショ糖３％（ｗ／ｖ）ＭＳ寒天培地上に無菌的に移し、２５℃、１６時間日長で３ヶ月間培養して、シャロット第１染色体を１対有する４倍体のネギ単一染色体添加植物細胞（ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａ，２ｎ＝３４）に由来する植物体（再生植物体）を得た。
【００２４】
（３倍体植物の作出）シャロットの第１染色体を一対添加した四倍体ネギ（２ｎ＝３４，ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａ）に２倍体ネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ  Ｌ．’九条細’  ２ｎ＝１６）を戻し交雑して、戻し交雑第一代（ＢＣ１）を得た。交配は、自家受粉を防ぐために４倍体ネギの葯を裂開前に取り除いて、ネギの花粉を４倍体ネギの雌蕊に人工的に受粉させて行った。得られたＢＣ１は染色体１Ａに特異的なアイソザイムマーカー（ロイシナミノペプチナーゼ，ＬＡＰ）により１Ａの伝達を推定した後、染色体数を調査した。分析方法はＷｅｎｄｅｌ（１９８３）、Ｇｅｙｔ，Ｓｍｅｄ（１９８４）、及びＳｈｉｇｙｏ（１９９５）らの方法（非特許文献３）に従った。得られた果実から成熟し黒化した種子を摘出して、０．４％（ｗ／ｖ）ゲランガムを含むホルモンフリーショ糖３％（ｗ／ｖ）ＭＳ固形培地に無菌的に播種し、２５℃、暗黒下で発芽させた。発芽後は２５℃、８時間日長条件下で育成し、播種３ヶ月後に一週間かけて順化させた。その後、０．１％（ｗ／ｖ）オーソサイドに５分間浸けて殺菌処理を行い、培養土に移植してガラス温室内で栽培した。
【００２５】
（染色体調査）５〜１０ｍｍに伸長した二次根を採取し、０．０５％（ｗ／ｖ）コルヒチン溶液に入れて２０℃で約２時間半処理した。その後、処理した根を酢酸とエタノールの混合液（酢酸：エタノール＝３：１）に入れ、４℃で一晩放置して固定した。次に、固定した根を１基底の塩酸で６０℃、６分間処理して解離・加水分解させた後、塩基性フクシンによるホイルゲン染色−押しつぶし法により染色し、顕微鏡下で根端細胞の染色体数を調査した。
【００２６】
（シャロット第１染色体を有する３倍体ネギ）３９２個のＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａの小花を用いて交配を行った結果、２５６粒の種子が得られ、種子形成胚珠率は１０．９％であった。最終的に得られた２５個体のＢＣ１についてＬＡＰアイソザイム分析を行ったところ、全ての個体がシャロット第１染色体（１Ａ）をもつことが推定された。また、染色体数の調査を行ったところ、２ｎ＝２４が１個体、２５が１７個体、２６が７個体であった。これらの結果より、４倍体ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａと２倍体ネギの交配により得られた後代は、全てが添加染色体である１Ａをもつ３倍性ネギ（ＦＦＦ＋１Ａ）である事が示された。図１は３倍体ネギ（ＦＦＦ＋１Ａ，３ｎ＝２４＋１）の根端細胞における細胞分裂中期の顕微鏡像の一例を示す。異種染色体添加４倍体ネギ（ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａ）と２倍体ネギとの交配により得られた、染色体数２５本を示すＢＣ１の根端細胞における体細胞分裂中期の染色体像であり、ネギとシャロットでは、シャロットの方が染色体が大きいため、見分けが容易である。この図の場合、矢頭（Δ）で示してある一番大きい染色体が１Ａであり、３つの矢印で示してあるのがネギの第６染色体である。これは、ネギの３倍体のバックグラウンドに染色体１Ａが存在することを示している。
【００２７】
（アスコルビン酸量の測定）本発明で得られたシャロット第１染色体を有する３倍体ネギの有用成分として、葉身に含まれるアスコルビン酸（ビタミンＣ）量に着目し、３０ｃｍ長まで生育した異種染色体を１本有する３倍体ネギ（ＦＦＦ＋１Ａ）の葉身を採集してアスコルビン酸含有量を測定し、この含有量を一般的な２倍体ネギとの間で比較した。アスコルビン酸量の測定はＲｏｅらの方法（非特許文献４）に従い、葉身１００ｇ（湿重量）あたりに含まれるアスコルビン酸の重量（＝ｍｇ／１００ｇ  Ｆｒｅｓｈ  Ｗｅｉｇｈｔ（ＦＷ））として算出した。
シャロット第１染色体を有する３倍体ネギのアスコルビン酸量の測定値は、１６個体の平均値で９１．３ｍｇ／１００ｇＦＷであった。一般的な２倍体ネギに含まれるアスコルビン酸量は、いわゆる長ネギで１１ｍｇ／１００ｇＦＷ、葉ネギで３１ｍｇ／１００ｇＦＷであり、本発明の提供するシャロット第１染色体を１本有する３倍体ネギは、一般的なネギの約３倍〜８倍ものアスコルビン酸を含有するという予測し得ない優良な性質を持っていることが示された。なお、一般的な２倍体ネギのアスコルビン酸量は、「５訂増補  食品成分表２００６（非特許文献５）」を参照・引用した。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】３倍体ネギ（ＦＦＦ＋１Ａ，３ｎ＝２４＋１）の根端細胞における細胞分裂中期の像を示す写真である。前記３倍体ネギは、異種染色体添加４倍体ネギ（ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａ）と２倍体ネギ（ＦＦ）との交配により得られた、染色体数２５本を示すＢＣ１であり、体細胞分裂中期の根端細胞を染色した。
【図１】
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