(57)【要約】【課題】  液体クロマトグラフからの溶離液を直接ＭＡＬＤＩレーザー脱離イオン化飛行時間質量分析計で連続的に行う。【解決手段】  液体クロマトグラフ溶離液とイオン化支援薬剤を中空円錐キャピラー管内臓中空２重管によりサンプルプレート上のメッシュ枠内に同時に滴下する機構により、溶離液を連続的にＭＡＬＤＩレーザー脱離イオン化飛行時間質量分析することを可能とした。また飛行時間質量分析計のレーザー照射部にイオン引き出し・アインシェルパイプレンズ内臓対物レンズを用い、サンプルプレート上にレーザー光を数１０μｍに絞って照射することが可能で、これにより、溶離液スポット相互間の干渉を防止した。また本発明によれば液体クロマトグラフからの溶離液をほぼ全量分析に使うことができ、従来の液体クロマトグラフ質量分析装置に比べ著しく高感度を向上させる効果がある。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフからの溶離液をレーザー光でのイオン化を支援する薬剤を用いて行うＭＡＬＤＩレーザー脱離イオン化飛行時間質量分析装置において、アインシェルレンズシステムを内蔵した光学穴あきレンズまたは穴あき光学顕微鏡対物レンズを用い液体クロマトグラフからの溶離液とイオン化支援薬剤は中空円錐管内臓の中空２重管を用い、メッシュ板を搭載したサンプルプレート上に同時に移行して測定することを特徴とする液体クロマトグラフ・レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析計
【請求項２】
請求項１記載の液体クロマトグラフ・レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析計において液体クロマトグラフからの溶離液とイオン化支援薬剤滴下時は中空円錐管内臓の中空２重管をサンプルプレートに近接して行う機能付加したこととメッシュ板搭載プレートを２次元（平面内）または３次元駆動ステージ上に搭載することを特徴とする液体クロマトグラフ・レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析計。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、液体クロマトグラフなどの分離手段とレーザー光でのイオン化支援する薬剤（ＭＡＬＤＩ）を用いて行う飛行時間質量分析計とを組み合わせて生体高分子、有機高分子化合物などを分析する方法およびそのシステムに関し、さらに詳細には、プロテオーム、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、脂質、糖などの各種の高分子質量分析において従来と比較して分析の効率を著しく向上することに有効な液体クロマトグラフ・レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析装置およびそのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、レーザー脱離質量分析法は化学、物理学、生化学の分野から薬学、医学等のライフサイエンスの分野へ急速に広がってきている。特にプロテーム、蛋白質、多糖質のなどの生体高分子の分子量解析とかアミノ酸配列解析の手段としてその有効性が認められ始めている。【０００３】  こうした生体高分子は難揮発性であることが多く、気体分子としてイオン化することが困難であった。  １９８０年代以降になって高速原子衝撃イオン化法
（ｆａｓｔ  ａｔｏｍ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ；ＦＡＢ）、エレクトロスプレーイオン化法
（Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ；ＥＳＩ）
マトリックスアシステッドレーザ脱離イオン化（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ；ＭＡＬＤＩ）などのソフトイオン化が実用化され、近年になってタンパク質とか核酸などの生体高分子の解析に広く用いられてきた。【０００４】  しかし、多種多様な多くの化学成分からなる生体高分子（蛋白質、多糖質など）、有機高分子化合物のような物質を一度に質量分析計で分析することは、装置に大きな負荷をかけるだけでなく、得られるデータも非常に複雑なもので、解析が非常に困難であり、液体クロマトグラフなどの成分分離手段を行った後に質量分析を行うか、これらを結合した装置が使われている。【０００５】  質量分析装置では分離した成分を様々な方法でイオン化し、そこで得られたイオン粒子を質量／電荷に従って分離し、各質量数／電荷毎のイオンの強度（個数）を計測するものである。【０００６】  ところで、該分離手段に連結して使われる質量分析計は電場や、磁場を走査してイオン粒子を質量検出方向に誘導するとか選択誘導する方法用いられている。【０００７】  前述したレーザー脱利イオン化飛行時間質量分析は該分離手段と直接結合して用いられることはなく、該分離手段からフラクショウンコレクタなどの分取手段を用いて各成分毎に採取して行われる。採取した試料にイオン化支援物質を加え混合した後、試料プレート上に滴下し、溶媒を蒸発させる。レーザー支援物質は分取した成分（生体高分子）を抱合しながら結晶化する。このようにして作成した試料プレートを分析計に設置して測定する。【０００８】  通常、窒素ガスレーザーが用いられ、イオン化支援物質（マトリックス）はレーザー光を吸収して励起状態になる特性の例えば、２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＨＢ  Ｍｗ２２４．０７）、α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＣＡ  Ｍｗ１８９．０４）、Ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  （ＳＡ  Ｍｗ２２４．０７）などの様なものである。
レーザー光を受けて支援物質は励起状態になり、そのエネルギーにより生体高分子（試料）は気化するとともに、最終的にはプロトン移動が生じイオン化する。イオン化した生体高分子粒子は高電場により高速に加速され、高真空中を検出器に向かって飛行し始める。そして検出器には質量数／電荷の小さい順に到達し、大きい質量数／電荷の粒子は後から到着することで分離される。従って、検出器までの時間とイオンの数を計測することで、質量巣スペクトル（マススペクトル）が得られる。より精密な高分解能質量分析を行う目的で、リフレクトロンが用いられる。
ところで、従来のレーザー脱離飛行時間質量分析計は、レーザー光を試料に照射するレンズ光学部、そこで生成したイオン粒子を加速領域するイオン光学部（共にイオン源を構成する）とイオン粒子の自由飛行空間（ドリフト領域）と検出器からなり、これらを直線的に配置したリニヤータイプのものと、高分解能の質量スペクトルを得る目的で高電圧の井戸の様なイオン反射場を持つリフレクトロンタイプがある。従来技術は多くに文献に記載されている。たとえば特開２００２−１４１０６  アンドリーウ・アール・ボードラーにある。【０００９】  エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法が開発される前は液体クロマトグラフから溶出液を長尺金属帯状板に滴下して連続スポットを形成し、それを高速原子衝撃イオン化法（ｆａｓｔ  ａｔｏｍ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ；ＦＡＢ）などで、イオン化して質量分析する方法が行われていた。スポットの大きさは１ｍｍ程度で相互の干渉を防ぐには数ミリ程度間隔をあける必要があり、金属帯の長さは数十ｃｍから１ｍ近くあり、外部より高真空イオン化室により送り込む必要があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  磁場または電場でマススペクトルを測定するには、特定質量数に限定して測定する場合を除いて特定幅の質量数領域を走査して順次検出器に到達させて測定する。従って、到達する前後のイオン粒子は検出器に使われなく、無駄の多い測定法である欠点がある。【００１１】  この点、電場走査のない飛行時間質量分析法形成されたイオン粒子の無駄の少ない測定法であるが、質量数分解能の高い測定のためにはレーザー光の発行時間が数ｎ秒（ナノ秒）と常に短いものを使う必要があり、繰り返し発光回数も毎秒１００回程度である。従って、イオン化には支援物質と混合するなどの前処理が必要であるが、これを解決したとしても、液体クロマトグラフから連続的に排出される成分を分析するには非常に効率の悪い測定法である。しかし、スポット的に測定する方法としては磁場または電場を走査して測定分析計に比べ効率の高い測定方法である。【００１２】  ところで、生体高分子を分析する際の液体クロマトグラフ溶離液は１０μＬ／ｍｉｎ程度で行われる。これは１秒間当たり数１００ｎＬ／ｍｉｎで、１秒間に１０回サンプリングして質量分析すると、１回の液量は数１０ｎＬ、である。この液量は直径数１０μｍ球の大きさである。最近では分離キャピラーカラムの径が細くなり、溶離液の流速も１０〜１００ｎＬ／ｍｉｎと低流速になってきており、測定に使える１回の液量１００ｐＬと微量でその体積は球に換算すると数μｍ程度の大きさである。これらを試料プレート滴下してレーザー脱離イオン化飛行時間質量分析計で測定することになる。【００１３】  とことで、従来のレーザー脱離イオン化飛行時間質量分析計はレーザー光を斜め上からレンズで集光してサンプルプレートに照射する。レンズはイオン引き出し電極などが障害になり遠くに配置する必要があり、焦点距離の短いレンズは使うことができない。このためレーザースポットは試料プレート上に長円形に形成される。またレーザー光は厳密には平行光でなく数ミリラジアン（ｍｒａｄ）程度の発散角度があるので、従来装置では試料プレート上にできるレーザー光の大きさは長円方向の長さは５００μｍ以上で、前述のように１回の質量分析に使う液体クロマトグラムからの溶離液で形成する体積（球の直径）に比べ著しく大きく、隣のスポットと干渉して適切なレーザー照射強度密度を得る事が困難である。【００１４】  従って、これらの解決には試料プレート上に数１０μｍていどの小さいスポットになるように集光する必要がある。【００１５】  また、液体クロマトグラムからの溶離液をＭＡＬＤＩレーザー脱離イオン化飛行時間質量分析計で測定するにはレーザー脱離イオン化支援物質を液体クロマトグラフからの溶離液と同時に試料プレート上に滴下する方法を考案する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】  焦点距離の短いレンズはレーザースポットを小さく絞る事ができ、顕微鏡に使用される対物レンズ用いるとサンプルプレート上に数μｍから数１０μｍ以下のスポット径にレーザー光を絞ることは容易にできる。  サンプルプレート上にレーザーが集光してできるスポットの大きさ（ｓ）とレーザーの発散角度（θ）、レンズの焦点距離（ｆ）との間にはｓ＝２ｆＸθの関係が成りたつ。前に記載した窒素レーザーの発散角度は０．７ｍｒａｄで、焦点距離が１５ｍｍのレンズを用いることでレーザーのスポットを３０μｍ程度に小さくすることが可能である。【００１７】  光学レンズは光を通すことができるがイオン粒子は通さない。そのためにレンズのセンターに穴を開けてイオン粒子を通すことにした。【００１８】  この穴の図２に示したイオン引き出し電極機能を備え、レーザーでイオン化した粒子を集束し、平行イオン光束となってイオン検出器に向かって飛行させる機能付与したアインシェル静電パイプ状レンズを内蔵した対物光学レンズを用いることにした。この詳細は特開平９−３０４３４３号、特開昭６３−１４６３３９号などに記載されている。【００１９】  液体クロマトグラフからの溶離液は００１３項で記載したように１００ｐＬから１０ｎＬと微量で、イオ化支援物質溶液と共にレーザー脱離飛行時間質量分析計のサンプルプレートの上に滴下できるように、図３に示した様に中にイオン化支援物質溶液を送り込む管の中に液体クロマトグラムからの溶離液を送り込む中空円錐管内に入れた二重管の構造とした。【００２０】  サンプルプレートは金めっき板を使いその上にステンレスメッシュ板を載せメッシュのグリッド（枠）で中空円錐管内臓の中空２重管から滴下された液体が広がらない様に工夫した。【００２１】  また、中空円錐管内臓の中空２重管から滴下された液体のサンプルプレート上への移行を確実にするため、中空円錐管内臓の中空２重管を上下に駆動機構をつけるか、あるいはサンプルプレート搭載したＸＹＺ駆動ステージを操作し液体滴下時は中空円錐管内臓の中空２重管の先端をサンプルプレートに数十μｍ以下に近接することにした。
【発明の効果】
【００２２】  以上のように本発明によれば、液体クロマトグラフからの溶離液を直接ＭＡＬＤＩレーザー脱離イオン化飛行時間質量分析行ことが可能で。また、液体クロマトグラフがらの溶離液をほぼ全量分析に使うことができるので、従来装置である液体クロマドグラフ四重極質量分析装置に比べ著しく高感度な装置を提供できる。また、液体クロマトグラフからの溶離液を分取するなどの複雑な操作が必要でなく、直接レーザー脱離イオン化支援（ＭＡＬＤＩ）飛行時間質量分析を行うことができので、プロテオームなどの蛋白質の高度解析に効果を発揮する。
【発明の実施するための最良の形態】
【００２３】  以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
図１は、本発明の一実施形態に基づくレーザー脱離イオン化液体クロマトグラフ飛行時間質量分析装置の概略構成図である。大きく分けてサンプルの調整を行うサンプル調整部１、サンプルをそれぞれの成分毎に分離を行う分離カラム２、溶離液３を分離カラム２送り送り込むためのポンプ４などからなる液体クロマトグラフ部、イオン化支援物質溶液を送り込むためのポンプ６とそのイオン化支援物質溶液６、液体クロマトグラフからの溶離液とを同時に受けるサンプルプレート７、このサンプルプレート上の試料に照射するレーザー、およびイオン化した粒子の質量を測定する飛行時間質量分析部９からなり、サンプルステージはＸＹＺ駆動ステージ１０に上に乗せてある。ＸＹＺステージ１０の駆動およびレーザー８発信パルスのタイミングなどの制御などをコントロールするシステム制御コントロール部１２、液体クロマトグラフおよび飛行時間質量分析装置から得られるデータを処理とか演算を行うデータ処理部１３からなる。
【００２４】  試料調整部１で調整された試料は液体クロマトグラフで成分に単離され、その単離された成分を含む溶離液はレーザーイオン化支援物質に包まれる様に、真空室内のＸＹＺ駆動ステージ１０に搭載した付サンプルプレート３５上のメッシュ３６枠内に滴下する。そしてイオン引き出し・アインシェルパイプレンズ内臓対物レンズ１４の真下まで移動させる。その間で溶媒は飛散、乾燥する。その後レーザーを照射してその質量を測定する。
【００２５】  液体クロマトグラフからの溶離液は毎分５０μＬ／分の流速で流し、サンプルプレート上への滴下移行は０．５から１秒間隔で行った。またレーザー８のパルス幅は２ｎｓで、１秒間に２回から１０回繰り返し照射して行った。
【００２６】  図２は本発明の実施形態１のレーザー脱離イオン化飛行時間質量分析装置構成を示したものである。７はサンプルプレート、１４はイオン引き出し電極１５およびアインシェルパイプレンズを内蔵した光学対物レンズである。１７はイオン粒子貫通穴付きの反射鏡、レーザー光源２１からの光を拡大するためのエキスパンダー１８で、１９の反射鏡、２０の半透鏡、２２のキセノンランプ、２２のＣＣＤはサンプルプレート７上の試料の上体を観察するためのものである。２３，２４はイオンをリフテクトロン２５、およびＭＣＴイオン検出器に正確誘導するためのイオンの飛行方向を制御するための偏向電極である。
すなわち、レーザー光源２１から出たレーザー光貫通穴付き鏡６により反射し、アインシェルパイプレンズの周囲を通り、対物レンズ１４により数μから数１０μｍの大きさのレーザースポット形成サンプルプレート上に形成する。イオン粒子の質量数はレーザー発振からイオンが検出器１０に到達するまでの時間を測定し、この時間をもとに質量を求めた。
【００２７】  図３は本発明の実施形態である中空円錐管内臓の中空２重管（中空円錐キャピラリーパイプ内蔵２重管）３４を示したもので、液体クロマトグラフからの溶離液とイオン化支援物質溶液をサンプルプレート７上に同時に滴下することができる。２８は先端の外径７５μｍ、内径２０μｍで出口側の外径３００μｍ内径１００μｍの中空円錐状のパイプである。２９は先端の内径１００μｍ、外径１５０μｍ出口側の外形１．５ｍｍ内径２００μｍのパイプで、内管２８を液体クロマトグラフからの溶離液が通り、外管と中管の間をイオン化支援物質溶液が通る。３０、３１はパイプの支持体で、３２，３３は連結のためのパイプ連結金具である。多層積層圧電素子３９は中空円錐管内臓の中空２重管をサンプルプレートに数１０μｍ以下近接させるものである。液体クロマトグラフからの溶離液とイオン化支援物質溶液滴下時は下げて、次のメッシュへの移行時は５０μｍ以上先端を上げて操作した。
【００２８】  図４はサンプルプレートの一部を拡大して示したものである。３５はグラファイトカーボンの板で、その上グリッドの線幅が５０μｍで暑さが５０μｍの３００μｍの矩形の穴を有するステンレスメッシュ板であり、これにより液体が広がるのを防いだ。メッシュ板の大きさは５０ｍｍＸ７５ｍｍで、メッシュ枠の数は３３３８４個ある。０．５秒間隔で測定すると、１８時間連続して測定できる。
【００２９】  図５はサンプルプレート７、中空円錐管内臓の中空２重管３４、アインシェルパイプレンズ内臓対物レンズ１４などをイオン化室に設置した状態を示したものである。中空円錐管内臓の中空２重管３４先端とアインシェルパイプレンズ内臓対物レンズ１４焦点の感覚は３５ｍｍでメッシュ枠の数にして１０個で、０．５秒の滴下移行間隔での測定ではこの間のＸＹＺステージの駆動時間は５秒である。溶媒の乾燥が十分出ない時は中空円錐管内臓の中空２重管３４の設置場所を移して時間を調整した。
【００３０】  溶離液をほぼ全量使って分析するため従来装置である液体クロマドグラフ四重極質量分析装置に比べ著しく高感度な装置が提供できる。また、液体クロマトグラフからの溶離液を分取するなどの複雑な操作が必要でなく、簡便にプロテオームなどの蛋白質の高度解析に効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の概略構成図
【図２】レーザー脱離イオン化質量分析装置概略図
【図３】溶離液とイオン化支援物質溶液同時滴下キャピラリー管内蔵２重管
【図４】メッシュ装着グラファイトサンプルプレート
【図５】イオン化室構成図
【符号の説明】
【００３２】１・・・試料調整部
２・・・液体クロマトグラフ分離カラム部
３・・・溶離液
４・・・溶離液ポンプ
５・・・イオン化支援液ポンプポンプ
６・・・イオン化支援液
７・・・サンプルプレート
８・・・レーザー
９・・・ＴＯＦ／ＭＳ
１０・・・ＸＹＺ駆動ステージ
１１・・・レーザーパルス制御部
１２・・・システムコントロール
１３・・・データ処理部
１４・・・イオン引き出し・アインシェルパイプレンズ内臓対物レンズ
１５・・・引き出し電極
１６・・・アインシェルパイプレンズ
１７・・・貫通穴付き鏡
１８・・・レーザエキスパンダー
１９・・・抜き差し可動反射鏡
２０・・・半透明反射鏡
２１・・・レーザー装置
２２−１・・・観察用キセノンランプ
２２−２・・・観察用ＣＣＤカメラ
２３・・・イオン偏向電極Ｉ
２４・・・イオン偏向電極ＩＩ
２５・・・リフレクトロン
２６・・・ＭＣＰイオン検出器Ｉ
２７・・・ＭＣＰイオン検出器ＩＩ
２８・・・中空円錐パイプ
２９・・・中空外装パイプ
３０・・・中空外装パイプ支持体
３１・・・中空円錐パイプ支持体
３２・・・パイプ連結
３３・・・パイプ連結
３４・・・中空円錐パイプ内蔵２重管
３５・・・グラファイトサンプルステージ
３６・・・ステンレスメッシュ
３７・・・イオン化支援液用管
３８・・・溶離液用管
３９・・・多層積層圧電素子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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