(57)【要約】【課題】本発明は、第二相解毒酵素誘導剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、２−プロペニルチオ硫酸又はその医薬上許容される塩を有効成分として含有する、第二相解毒酵素誘導剤に関する。誘導される第二相解毒酵素としては特にキノンリダクターゼ又はエポキシドヒドロラーゼが挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−プロペニルチオ硫酸又はその医薬上許容される塩を有効成分として含有する、第二相解毒酵素誘導剤。
【請求項２】
誘導される第二相解毒酵素がキノンリダクターゼ又はエポキシドヒドロラーゼである、請求項１記載の第二相解毒酵素誘導剤。
【請求項３】
２−プロペニルチオ硫酸又はその医薬上許容される塩を有効成分として含有するガンの予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第二相解毒酵素誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機チオ硫酸化合物であるｎ−プロピルチオ硫酸ナトリウム（ＮＰＴＳ）及び２−プロペニルチオ硫酸ナトリウム（２ＰＴＳ）は、犬のハインツ小体性溶血性貧血の原因物質として、Ａｌｌｉｕｍ属植物であるタマネギおよびニンニクからそれぞれ同定された化合物である（非特許文献１および２）。これまでに、これらの有機チオ硫酸化合物が、好中球の活性酸素生成刺激効果（免疫増強）（非特許文献３）、血小板凝集阻害効果（抗血栓症）（非特許文献４）、およびガン細胞に対するアポトーシス誘導効果（抗ガン）（非特許文献５）など、多くの機能性を有していることが証明されてきた。
【０００３】
一方、第二相解毒酵素は生体内においてある種の化学物質を解毒する活性を有することが知られている。第二相解毒酵素による解毒がなければ、化学物質により正常細胞の突然変異が誘発され、正常細胞がガン化する可能性がある。従って、第二相解毒酵素の発現を誘導することにより、ガンを未然に防ぐことができると考えられている（例えば非特許文献６）。また近年、タマネギ又はニンニク並びにそれらに含有される化合物の経口摂取によって、実験動物の組織中の第二相解毒酵素活性が増加し、腫瘍の発生が抑制されるとする研究成果が報告されている（例えば非特許文献７、８）。
【０００４】
しかしながら、有機チオ硫酸化合物が第二相解毒酵素を誘導する効果を有するか否かに関する報告はなされていない。
【０００５】
【非特許文献１】Yamato, O., Yoshihara, T., Ichihara, A., Maede, Y. Novel Heinz body hemolysis factors in onion (Allium cepa). Biosci. Biotechnol. Biochem. 58, 221-222, 1994.
【非特許文献２】Yamato, O., Sugiyama, Y., Matsuura, H., Lee, K. W., Goto, K., Hossain, M. A., Maede, Y., Yoshihara, T. Isolation and identification of sodium 2-propenyl thiosulfate from boiled garlic (Allium sativum) that oxidizes canine erythrocytes. Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, 1594-1596, 2003.
【非特許文献３】Chang, H. S., Yamato, O., Sakai, Y., Yamasaki, M., Maede, Y. Acceleration of superoxide generation in polymorphonuclear leukocytes and inhibition of platelet aggregation by alk(en)yl thiosulfates derived from onion and garlic in dogs and humans. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 70, 77-83, 2004.
【非特許文献４】Chang, H. S., Yamato, O., Yamasaki, M., Maede, Y. Modulatory influence of sodium 2-propenyl thiosulfate from garlic on cyclooxygenase activity in canine platelets: Possible mechanism for the anti-aggregatory effect. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 72, 351-355, 2005.
【非特許文献５】Chang, H. S., Yamato, O., Yamasaki, M., Ko, M., Maede, Y. Growth inhibitory effect of alk(en)yl thiosulfates derived from onion and garlic in human immortalized and tumor cell lines. Cancer Lett. 223, 47-55, 2005.
【非特許文献６】Talalay, P. et al. Chemoprotection against cancer by Phase 2 enxyme induction. Toxicol. Lett. 82/83, 173-179, 1995.
【非特許文献７】Teyssier, C. et al. Effect of onion consumption by rats on hepatic drug-metabolizing enzymes. Food Chem. Toxicol. 39, 981-987, 2001.
【非特許文献８】Guyonnet, D. et al. Antimutagenic activity of organosulfur compounds from Allium is associated with phase II enzyme induction. Mutat. Res. 495, 135-145, 2001.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、第二相解毒酵素を誘導するための有効成分を提供することを目的とする。このような活性成分はガンの予防の目的で特に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の発明を包含する。
（１）２−プロペニルチオ硫酸又はその医薬上許容される塩を有効成分として含有する、第二相解毒酵素誘導剤。
（２）誘導される第二相解毒酵素がキノンリダクターゼ又はエポキシドヒドロラーゼである、（１）記載の第二相解毒酵素誘導剤。
（３）２−プロペニルチオ硫酸又はその医薬上許容される塩を有効成分として含有するガンの予防又は治療剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、第二相解毒酵素を誘導するための有効成分が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（有効成分）
２−プロペニルチオ硫酸は次の構造を有する化合物である。
【００１０】
【化１】
2008115090.tif 000002
【００１１】
本発明の用途では２−プロペニルチオ硫酸は医薬上許容される塩の形態であることが好ましく、具体的にはナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ又はアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、メチルアンモニウム塩、ジメチルアンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩等のアンモニウム塩等の形態であることが好ましい。
【００１２】
２−プロペニルチオ硫酸又はその塩は、水和物や、低級アルコール等との溶媒和物の形態であってよい。本発明において２−プロペニルチオ硫酸又はその塩の範囲内には、それらの水和物又は溶媒和物の形態も包含される。
【００１３】
２−プロペニルチオ硫酸又はその塩の入手方法は特に限定されない。例えば、市販品を使用してもよいし、公知の合成方法（例えば非特許文献２）に従って合成されたものを使用してもよいし、ニンニク、タマネギ等の植物から単離されたものを使用してもよい。
【００１４】
（２−プロペニルチオ硫酸又はその塩の活性）
２−プロペニルチオ硫酸又はその塩は、第二相解毒酵素を誘導する活性を有する。ここで「第二相解毒酵素を誘導する」とは第二相解毒酵素群に属する酵素のメッセンジャーＲＮＡ発現量を増大させ、それにより当該酵素タンパク質の合成を増大させて、その結果として当該酵素活性を高めることを指す。
【００１５】
本発明に係る「第二相解毒酵素誘導剤」はこの活性を有する物質（組成物を含む）を指す。
【００１６】
第二相解毒酵素群に属する酵素のうち、２−プロペニルチオ硫酸又はその塩の投与により特に発現又は活性が増大される酵素としてはキノンリダクターゼ（ＱＲ）又はエポキシドヒドロラーゼ（ＥＨ）が挙げられる。
【００１７】
２−プロペニルチオ硫酸又はその塩は、第二相解毒酵素を誘導する活性を有することからガンの予防又は治療、特にガンの予防、のために有効である。
【００１８】
また、本発明の第二相解毒酵素誘導剤は化学物質で起こる様々な身体的トラブル、すなわち、シックハウス症候群、化学物質過敏症、アレルギー、環境化学物質で起こる内分泌異常などの治療又は予防の用途にも使用できる。
【００１９】
本発明の薬剤の投与を受ける対象としては例えばヒト、家畜（ウシ、ウマ等）、愛玩動物（イヌ、ネコ等）、実験動物（マウス、ラット、ハムスター等）等の哺乳動物が挙げられ、なかでもヒトが好ましい。
【００２０】
（製剤及び使用方法）
本発明は２−プロペニルチオ硫酸又はその塩を有効成分として含有する第二相解毒酵素誘導剤及びガンの予防又は治療剤に関する。２−プロペニルチオ硫酸又はその塩単独で使用されてもよく、他の成分と組み合わされた組成物として使用されてもよい。
【００２１】
２−プロペニルチオ硫酸又はその塩は、第二相解毒酵素誘導活性を有する、ガン予防又は治療、特にガン予防、に有効な食品の形態で提供されてもよい。かかる食品は、その本体、包装、説明書、宣伝物又は宣伝用電子的情報に効能の表示、例えば、第二相解毒酵素誘導活性を有する旨の表示、ガンの予防に有効である旨の表示、ガンの治療に有効である旨の表示等が付されたものであってもよい。２−プロペニルチオ硫酸又はその塩を含む食品は、固形、半固形、液体等の種々の形態のものであってよい。食品の範囲にはタブレット状や粉末形状のいわゆるサプリメント食品も包含される。これらの食品はいわゆる特定保健用食品とすることもできる。
【００２２】
食品中における２−プロペニルチオ硫酸又はその塩の含有量は、所望の作用が奏される含有量である限り特に限定されない。２−プロペニルチオ硫酸又はその塩を含む食品には、必要に応じて常法に従って、安定化剤、ｐＨ調整剤、糖類、甘味料、各種ビタミン類、ミネラル類、抗酸化剤、賦形剤、可溶化剤、結合剤、滑沢剤、懸濁剤、湿潤剤、皮膜形成物質、矯味剤、矯臭剤、着色剤、香料、保存料等を添加することができる。
【００２３】
２−プロペニルチオ硫酸又はその塩は、第二相解毒酵素誘導活性を有する、ガン予防又は治療、特にガン予防、に有効な食品又は医薬品として、投与（摂取）形態に応じて種々の形態に製剤化できる。例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドライシロップ剤、シロップ剤、注射剤等の形態に製剤化できる。なかでも経口投与（経口摂取）用の形態に製剤化することが好ましい。このような食品又は医薬品は、食品又は医薬品として許容される担体又は賦形剤、或いは他の添加物を含んでもよい。
【００２４】
経口用固形製剤とする場合は、２−プロペニルチオ硫酸又はその塩に必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。経口用液体製剤とする場合は、２−プロペニルチオ硫酸又はその塩に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。注射剤とする場合は、２−プロペニルチオ硫酸又はその塩に必要に応じてpH調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。これらの製剤に使用する添加剤としては、当該分野で一般的に使用されている添加剤を使用できる。
【００２５】
上記の各形態の製剤中に配合される有効成分の量は所望の活性を奏する上で有効な量である限り、これを投与又は摂取する対象者の症状に応じて、あるいはその剤形等に応じて適宜決定することができる。
【実施例】
【００２６】
本実験では試験化合物の存在可でH4IIE細胞（ラット肝癌由来細胞）の培養を行い、4種類の第二相解毒酵素の総活性又はmRNA量を評価した。
【００２７】
試験化合物としてはn-プロピルチオ硫酸ナトリウム（NPTS）、又は2-プロペニルチオ硫酸ナトリウム（2PTS）を使用した。また、第二相解毒酵素群を誘導することで知られるジアリルトリスルフィド（DATS）、又はtert-ブチルヒドロキノン（TBHQ）を使用した。
【００２８】
n-プロピルチオ硫酸ナトリウム（NPTS）を、市販の1-プロピルクロリドとチオ硫酸ナトリウムとを出発物質として非特許文献1に記載されている手順に従って合成し、本実験に使用した。2-プロペニルチオ硫酸ナトリウム（2PTS）を市販の2-プロペニルクロリドとチオ硫酸ナトリウムとを出発物質として非特許文献2に記載されている手順に従って合成し、本実験に使用した。
【００２９】
第二相解毒酵素群として、キノンリダクターゼ（QR）及びグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）の活性を測定した。また、QR、GSTのアイソザイムであるGSTA5、エポキシドヒドロラーゼ（EH）のアイソザイムであるEH1、及びUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ（UDPGT）分子種であるUDPGT1A1のmRNA量も定量した。
【００３０】
H4IIE細胞の培養条件は次の通りであった。H4IIE細胞を37℃、5% CO2、100% 湿度の条件下で培養した。培養液には、10% ウシ胎仔血清、100 units/mlペニシリンおよび100 μg/ml硫酸ストレプトマイシンを添加したDMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）を用いた。細胞が単層でコンフルエントに達したとき、培養液を取り除き、0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4）（PBS）で洗浄した後、0.25%トリプシン-0.02%エチレンジアミン四酢酸溶液を加え、細胞がフラスコの表面から剥がれるまで37℃で静置した。剥がれた細胞を回収し、110×gで3分間遠心した後、上清を除去して、この細胞を培養液に再浮遊した。細胞浮遊液の細胞数を算定して、7×105個ずつ25 cm2のフラスコに播いた。これを24時間培養した後、超純水に溶解したNPTSおよび2PTS、ならびにジメチルスルホキシドに溶解したDATSおよびTBHQをさらに超純水で段階希釈して、各フラスコに添加し、48時間培養した。添加した化合物の培養液中の最終濃度は、1, 10, 50, 100 μＭであった。化合物は加えないで培養したものを陰性対照とした。
【００３１】
酵素活性の測定のために、培養後の細胞からS9分画を調整した。各化合物とともに培養した細胞をPBSで2回洗浄した後、PBSで溶解した1 mM phenylmethylsulfonyl fluorideを200 μl添加し、セルスクレイパーで細胞を掻き取り、掻き取った細胞を氷中でホモゲナイズした。このホモジネートを4℃、9,000×gで20分間遠心し、この上清（S9分画）を測定まで-80℃で保存した。S9分画の蛋白濃度は、牛血清アルブミンを標準試料として、Lowry法で測定した。
【００３２】
QR活性の測定には96ウェルのプレートを使用し、1ウェルに、0.1 M リン酸カリウム緩衝液（pH 7.4）(KPB) 43 μl、10 mM 2,6-dichloroindophenol sodium salt hydrate (DCPIP) 1 μl、10 mM nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, reduced form（NADPH）1 μl、KPBで蛋白濃度を0.6 mg/mlに調製したS9分画 5 μlを添加し、測定波長650 nmで5分間吸光度を測定した。次に、１ウェルにKPB 42 μl、10 mM DCPIP 1 μl、10 mM NADPH 1 μl、QR活性特異的阻害剤である1 mM dicumarol 1 μl、KPBで蛋白濃度を0.6 mg/mlに調製したS9分画 5 μlを添加し、同様に測定した。前者の吸光度から後者の吸光度を差し引いたものをQR活性による吸光度変化とした。酵素活性は、生成する抱合体の分子吸光係数（ε）を15 mM-1cm-1をとして計算し、陰性対照として培養した細胞の活性を100%として表した。
【００３３】
GST活性の測定は次のように行った。氷上で、KPB 85 μl、5 mM 還元型グルタチオン 10 μl、蛋白濃度が0.2 mg/mlになるようにKPBで調製したS9分画 5 μlを混和した。この反応混合溶液を37℃、3分間プレインキュベーションした後、ジメチルスルホキシドで溶解した37.5 mM 1-chloro-2,4-dinitrobenzene （CDNB）を最終濃度0.5 mMとなるように2 μl添加し、37℃で1分間インキュベーションした。33% トリクロロ酢酸を10 μl添加して反応を停止し、800×gで5分間遠心し、その上清について測定波長340 nmでの吸光度を測定した。酵素活性は、生成する抱合体の分子吸光係数（ε）を9.6 mM-1cm-1をとして計算し、コントロールとして培養した細胞の活性を100%として表した。
【００３４】
QR、GSTA5、EH1及びUDPGT1A1について、それぞれのmRNA量をリアルタイムPCRを用いて測定した。培養後の細胞から、TRI Reagentを用いて総RNAを抽出し、それぞれ3.5 μgのRNAから逆転写酵素を用いてcDNAに変換した。これを鋳型とし、それぞれmRNAの定量を行った。測定に用いたキットであるTaqMan Gene Expression Assay Mixは、Applied Biosystemsから購入した。それぞれのカタログ番号は、Rn00566528_m1（QR）、Rn00580416_m1（GSTA5）、Rn00563349_m1（EH1）、Rn00754947_m1（UDPGT1A1）であった。
【００３５】
また、内在性コントロールとして、Glucuronidase（カタログ番号 Rn00566655_m1）を使用した。TaqMan Gene Expression Assay Mix 1 μl、TaqMan Universal PCR Master Mix 10 μl、超純水で50倍希釈したcDNA 9 μlを混和し、95℃15秒、60℃1分を40サイクルでリアルタイム PCRを行った。測定には、ABI PRISM7700（Applied Biosystems、Foster City、CA、USA）を使用し、比較Ct法で定量した。各実験区のmRNA量は陰性対照の値を1として表した。
【００３６】
H4IIE細胞を2PTS存在下で培養すると、QR活性が濃度依存性に増加し、10 μM以上の濃度においては、陰性対照の値と比較して有意に高値を示した（図1）。しかし、NPTSによるQR活性の変化は観察されなかった。DATSおよびTBHQは、50 μMおよび100 μMの濃度で、QR活性を増加させる傾向がみられたが、有意な増加ではなかった。化合物間で比較すると、2PTSは10 μMの濃度で他の化合物に比較して有意に高値であった。また、2PTSは50 μMの濃度ではNPTSに比較して、100 μMの濃度ではNPTSおよびTBHQに比較して有意に高値であった。
【００３７】
また、2PTS存在下ではQRのmRNA発現量が濃度依存性に増加し、50 μMおよび100 μMの濃度で、陰性対照の値と比較して有意に高値を示した（図2）。NPTSは10 μM以上の濃度で、QRのmRNA発現量を増加させる傾向を示したが、いずれも有意な増加ではなかった。2PTSおよびNPTS が100 μMの濃度では、両化合物の間に有意差が認められた。DATSは50 μMおよび100 μMの濃度で、QRのmRNA発現量を有意に増加させた。その100 μMでのmRNA発現量は、NPTSの値に比較して有意に高値であった。TBHQは100 μMで、mRNA発現量を有意に増加させたが、その効果は比較的弱く、50 μMでの発現量は2PTSに比較して有意に低値であった。
H4IIE細胞のGST活性は、いずれの化合物を添加しても変化しなかった（図3）。
【００３８】
2PTSは50 μM以上の濃度で、GSTA5のmRNA発現量を増加させる傾向を示したが、有意な増加ではなかった（図4）。NPTSによる発現量の変化は観察されなかった。DATSおよびTBHQは、100 μMの濃度で陰性対照と比較して、GSTA5のmRNA発現量を有意に増加させた。その両化合物の100 μMでの発現量は、NPTSに比較して有意に高値であった。
【００３９】
2PTS、DATSおよびTBHQは、100 μMの濃度で、EH1のmRNA発現量を陰性対照と比較して有意に増加させた（図5）。また、これらの三種の化合物の50 μMおよび100 μMの濃度での発現量は、NPTSに比較して有意に高値であった。NPTSによるEH1の発現量の変化は観察されなかった。
【００４０】
すべての化合物において、UDPGT1A1のmRNA発現量はほとんど変化しなかった（図6）。しかし、TBHQの値は他の化合物に比較してわずかに高い傾向を示し、1 μMの濃度での発現量が2PTSに比較して、100 μMでの発現量がNPTSおよび2PTSに比較して、ともに有意に高値であった。
【００４１】
総合すると、2PTSはQR活性、QRのmRNA量およびEH1のmRNA量を有意に増加させたことから、第二相解毒酵素群を誘導する効果が証明された。しかし、GST活性、GSTA5のmRNA量およびUDPGT1A1のmRNA量には影響を与えなかった。NPTSには、第二相解毒酵素群を誘導する効果が認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】各試験化合物がQR活性に及ぼす効果を示す図である。表記は平均値±標準偏差（5回の実験）。分散分析を用いた統計解析による有意差は、*P＜0.05、**P＜0.01および†P＜0.005で表した。陰性対照との有意差をカラムの上に表示し、化合物間の有意差をカラム間に線を引いて表示した。
【図２】各試験化合物がQRのmRNA量に及ぼす効果を示す図である。表記は平均値±標準偏差（5回の実験）。分散分析を用いた統計解析による有意差は、*P＜0.05および††P＜0.001で表した。陰性対照との有意差をカラムの上に表示し、化合物間の値の有意差をカラム間に線を引いて表示した。
【図３】各試験化合物がGST活性に及ぼす効果を示す図である。表記は平均値±標準偏差（5回の実験）。
【図４】各試験化合物がGSTA5のmRNA量に及ぼす効果を示す図である。表記は平均値±標準偏差（5回の実験）。分散分析を用いた統計解析による有意差は*P＜0.05、**P＜0.01および†P＜0.005で表した。陰性対照との有意差をカラムの上に表示し、化合物間の有意差をカラム間に線を引いて表示した。
【図５】各試験化合物がEH1のmRNA量に及ぼす効果を示す図である。表記は平均値±標準偏差（5回の実験）。分散分析を用いた統計解析による有意差は*P＜0.05、**P＜0.01、†P＜0.005および††P＜0.001で表した。陰性対照との有意差をカラムの上に表示し、化合物間の有意差をカラム間に線を引いて表示した。
【図６】各試験化合物がUDPGT1A1のmRNA量に及ぼす効果を示す図である。表記は平均値±標準偏差（5回の実験）。分散分析を用いた統計解析による有意差は*P＜0.05および**P＜0.01で表した。陰性対照との有意差をカラムの上に表示し、化合物間の有意差をカラム間に線を引いて表示した。
【図１】
2008115090.tif 000003
【図２】
2008115090.tif 000004
【図３】
2008115090.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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