(57)【要約】【課題】  安定性に問題のあるグルコースオキシダーゼなどの酵素を用いず、また、長時間を要するHPLC法を用いずに、再現性に優れ、且つ簡易・迅速な操作にて、糖類などのシス−ジオール基を持つ化合物を選択的に検出可能な検出方法を提供する。【解決手段】  シス−ジオール基と結合能を有するボロン酸化合物と、カチオン基を有するモノマーとを架橋剤の存在下に重合反応させて得られたポリマー生成物に、該カチオン基と静電的に結合するアニオン性色素を結合させた構造の色素結合ポリマーを用い、水性溶液中で、シス−ジオール基含有化合物と反応させ、アニオン性色素を水性溶液中に放出せしめ、水性溶液の着色を検出することを特徴とするシス−ジオール基含有化合物の検出方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シス−ジオール基と結合能を有するボロン酸化合物と、カチオン基を有するモノマーとを架橋剤の存在下に重合反応させて得られたポリマー生成物に、該カチオン基と静電的に結合するアニオン性色素を結合させた構造の色素結合ポリマーを用い、水性溶液中で、シス−ジオール基含有化合物と反応させ、アニオン性色素を水性溶液中に放出せしめ、水性溶液の着色を、又は該色素結合ポリマーの変色を検出することを特徴とするシス−ジオール基含有化合物の検出方法。
【請求項２】
前記シス−ジオール基含有化合物が、単糖類、ポリフェノール類、糖アルコール類であることを特徴とする請求項１に記載したシス−ジオール基含有化合物の検出方法。
【請求項３】
該アニオン性色素を複数種用いることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載したシス−ジオール基含有化合物の検出方法。
【請求項４】
単糖類が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、リボース、ポリフェノール類が、カテコール、ピロガロール、エピカテキン、デルフィニジン、糖アルコール類がソルビトール、マンニトールから選ばれる1種であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかひとつに記載したシス−ジオール基含有化合物の検出方法。
【請求項５】
前記アニオン性色素として、Indigo carmine、Chrysophenine、Brilliant yellowから選ばれる多価アニオン性色素を用いる請求項１〜４のいずれかひとつに記載したシス−ジオール基含有化合物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明は、血液、尿等の生体試料、食品工業における原料、製品など、さらに果汁などの試料中に含まれるシス−ジオール基を有する化合物のセンシングに関するものである。シス−ジオール基を有する主な化合物としては、グルコースやフルクトースなどの糖類があげられる。
【従来の技術】
【０００２】
これまで、グルコースやフルクトースなどの糖類の分析法として、施光度計法、比色法、還元滴定法および各種クロマトグラフィーを用いた方法などが開発されている。しかし、これらの方法はいずれも、糖類に対する特異性が低く精度が不十分である。例えば、上記施光度計法は、その操作は簡便ではあるが、操作時の温度の影響を大きく受けることが知られている。グルコースに対して選択性のある分析法としては、グルコースオキシダーゼによりグルコースのみを特異的に酸化し、同時に発生する過酸化水素を白金電極で酸化したときに流れる電流を測定することにより、元のグルコース濃度を測定するセンサ（グルコースセンサ）法、または生じた過酸化水素を、ペルオキシダーゼを触媒としてルミノールと反応させて、そのときの化学発光強度を測定することにより元のグルコース濃度を測定する方法（例えば、特許文献1）、あるいは生じた過酸化水素と色素との呈色反応を利用した比色法、いわゆる試験紙法（例えば、特許文献２）などが知られている。
また、ボロン酸を用いる方法としては、ボロン酸アフィニティーカラムを用いるHPLC法が知られている。この方法は、ボロン酸が弱アルカリ条件下でシス−ジオール基を持つ化合物と可逆的な結合体を作ることを利用した方法であり、例えば、クロマトグラフィー用の充填剤としてアミノフェニルボロン酸をセルロースやポリアクリルアミド樹脂に結合させた例が報告されている。ボロン酸アフィニティーカラムを用いるHPLC法によるグリコアルブミンの測定は、特許文献３に記載されている。しかしながら、HPLC法による測定は１検体当たりの測定時間が長く、同時に多数検体の測定ができないという問題がある。
【０００３】
【特許文献１】特開２００２−１６２３５３号公報
【特許文献２】特開２０００−０４６８３４号公報
【特許文献３】特開平２−９６６５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
グルコースオキシダーゼは酵素タンパク質であり、タンパク変性および活性低下などが避けられず、最長でも約6ケ月しか維持できないという保存上の問題がある。また、酵素活性の経時変化による再現性の低さが問題となっている。さらに、酵素反応系は反応が複雑であり、反応条件の詳細な設定が要求されるという問題がある。ボロン酸アフィニティーカラムを用いるHPLC法による測定は１検体当たりの測定時間が長いため、同時に多数検体の測定ができないという問題がある。
本発明の課題は、安定性に問題のあるグルコースオキシダーゼなどの酵素を用いず、また、長時間を要するHPLC法を用いずに、再現性に優れ、且つ簡易・迅速な操作にて、糖類などのシス−ジオール基を持つ化合物を選択的に検出可能な材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、シス−ジオール基と結合能を有するボロン酸化合物と、カチオン基を有するモノマーとを架橋剤の存在下に重合反応させて得られたポリマー生成物に、カチオン基と静電的に結合するアニオン性色素を結合させた色素結合ポリマーを合成した。この色素結合ポリマーは、糖類などのシス−ジオール基と反応するとボロン酸が中性からアニオン性となるため、アニオン性色素を溶液中に放出する能力を有しており、目視又は吸光光度計によってシス−ジオール基を持つ化合物濃度を検知することができる。
すなわち、本発明はシス−ジオール基と結合能を有するボロン酸化合物と、カチオン基を有するモノマーとを架橋剤の存在下に重合反応させて得られたポリマー生成物に、該カチオン基と静電的に結合するアニオン性色素を結合させた構造の色素結合ポリマーを用い、水性溶液中で、シス−ジオール基含有化合物と反応させ、アニオン性色素を水性溶液中に放出せしめ、水性溶液の着色、又は該色素結合ポリマーの変色を検出することを特徴とするシス−ジオール基含有化合物の検出方法である。
また、本発明は、前記シス−ジオール基含有化合物が、単糖類、ポリフェノール類、糖アルコール類とすることができる。
さらに本発明は、該アニオン性色素を複数種用いることができる。複数種も用いることにより、色の濃淡だけでなく、変色の度合いを併用し、鋭敏に検出することができる。
また、本発明は、単糖類が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、リボース、ポリフェノール類が、カテコール、ピロガロール、エピカテキン、デルフィニジン、糖アルコール類がソルビトール、マンニトールから選ばれる1種とすることができる。
さらに、本発明においては、アニオン性色素として、Indigo carmine、Chrysophenine、Brilliant yellowから選ばれる多価アニオン性色素を用いることができる。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、酵素を用いることなく、安定性、再現性に優れ、且つ簡易・迅速な操作にて、糖類などのシス−ジオール基を持つ化合物の選択的センシングを可能とするポリマー材料を提供することが可能となった。さらに、本発明によれば、糖類濃度の変化を、色の濃さの変化、或いは色調の変化としてとらえることができるため、高度な分析装置を用いることなく、目視で濃度を知ることも可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明を、図１を参照して説明する。
本発明においては、溶液中の糖類濃度に応答して色素を放出する機能性ポリマーを得るための手段として、シス−ジオール基と結合能を有するボロン酸化合物と、カチオン基を有するモノマーとを架橋剤の存在下に重合反応させて得られたポリマー生成物（図１のA）に、このカチオン基と静電的に結合するアニオン性色素（図１のB）を結合させた色素結合ポリマー（図１のC）を合成した。なお、図１ではアニオン性色素として２価のアニオン生成色素を用いる場合を示したが、アニオン性色素としては２価のアニオン性色素に限らず、１価アニオン、或いは３価以上の多価アニオンを用いることもできる。ボロン酸は、グルコースやフルクトースのようなシス−ジオール部位を有する化合物（図１のD）と、水溶液中においてエステルを形成し、中性付近のpH条件下では、このエステル形成反応に伴い、ボロン酸上に負電荷を生成する（図１のEの状態）。従って、この色素結合ポリマーを糖類含有水溶液に投入すると、糖類との結合に伴いボロン酸上に生成した負電荷によって、ポリマー中のカチオン基と静電的に相互作用していたアニオン性色素が置換され、ポリマー外に放出される（図１のFの状態）。ポリマーから溶液へ放出される量は糖類濃度に応じて増大するため、水溶液の色は濃くなり、逆にポリマーの色は薄くなるなどの変化が現れる。この可視吸収スペクトルの変化を、目視又は吸光光度計により検出することにより、糖類濃度を測定できる。さらに、アニオン性色素の放出量と糖類濃度との関係は、アニオン性色素の価数や疎水性の違いによって放出特性が大きく異なるため、色（可視吸収スペクトル）と放出特性の両方が異なる複数種のアニオン性色素を同時にポリマーに結合させたポリマーを合成し、これを用いると、この複数種のアニオン性色素が結合したポリマーからは、異なる色素が逐次放出されるため、糖類濃度に応じて色の濃さだけでなく、色調も変化する。一般に色調の変化は、色の濃さの変化に比べて、目視でも検出が容易であるため、吸光光度計等の機器を用いずとも測定が可能となる。なお、測定しようとする溶液自体に色が付いている場合は、1種類の色素を用いても色調の変化として観測される。また、測定しようとする溶液自体の色が非常に濃く、溶液の色の変化が観測されづらい場合は、ポリマーを取り出して、ポリマーの色の濃さ、又は色調変化から、糖類濃度を測定することも可能である。
【０００８】
本発明に用いるボロン酸化合物としては、シス−ジオール基と結合する−B(OH)2基を有し、且つ重合するためのビニル基を有するものであれば、如何なるものも使用可能である。なかでも、ビニル基を持つフェニルボロン酸誘導体、具体的には、3-アクリルアミドフェニルボロン酸、3-メタクリルアミドフェニルボロン酸、4-ビニルフェニルボロン酸などを用いることが好ましい。
【０００９】
本発明に用いるカチオン基を有するモノマーとしては、一価あるいは多価の正電荷を有し、且つ重合するためのビニル基を有するものであれば、如何なるものも使用可能であって、なかでも、ビニル基を持つ三級アミン誘導体、具体的には、N-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]メタクリルアミド、N-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]アクリルアミド、2-(ジメチルアミノ)エチルアクリレート等を用いることが好ましい。
【００１０】
本発明に用いる架橋剤としては、分子内に２つ以上のビニル基を有する従来公知のモノマーが用いられるが、好ましくはN,N’-メチレンビスアクリルアミドが用いられる。また、重合開始剤としては、ビニル重合に用いられている慣用のものであれば如何なるものも使用可能であるが、通常、ペルオキソ二硫酸カリウムなどの過硫酸塩や、2,2’‐アゾビス(2-アミジノプロパン)二塩酸塩などのアゾ化合物が好ましい。
【００１１】
本発明に用いるアニオン性色素としては、一価あるいは多価の負電荷を有し、且つ可視光線を吸収する特性を有するものであれば、如何なるものも使用可能であって、なかでも、Indigo carmine、Chrysophenine、Brilliant yellow等の多価アニオン系色素はポリマー生成物（図１のA）との結合力が強いため、これを用いることが好ましい。
【００１２】
さらに、上記の色素結合ポリマーを常法によって薄膜化することにより、pH試験紙と同様の使い方ができる、糖類の試験紙とすることも可能となる。すなわち、薄膜化することにより、糖類とボロン酸の反応速度、及び色素の放出速度が格段に速くなるため、糖類含有試料溶液にこの試験紙を短時間浸すだけで、試験溶液又は試験紙の色の変化として検知することが可能となる。
本発明で用いるカチオン基と静電的に結合するアニオン性色素を結合させた構造の色素結合ポリマーを用いれば、シス−ジオール基含有化合物ならどのようなものでも検出できる。代表的には、単糖類としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、リボース、ポリフェノール類としては、カテコール、ピロガロール、糖アルコール類としてはソルビトール、マンニトール、カテキン類としては、エピカテキン、アントシアニジン類としては、デルフィニジン等を挙げることができる。
【実施例１】
【００１３】
以下、本発明を実施例などにより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
＜製造例１：色素結合ポリマーの合成（図２の1と3の色素結合ポリマーの場合）＞
ボロン酸化合物（3-アクリルアミドフェニルボロン酸（図２の4に示す化合物））38 mg（200 μmol）、カチオン基を有するモノマー（N-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]メタクリルアミド（図２の5に示す化合物））34 mg（200 μmol）、架橋剤（N,N’-メチレンビスアクリルアミド（図２の6に示す化合物））8 mg（50 μmol）、およびアクリルアミド（図２の7に示す化合物）43 mg（(600 μmol）をDMSO 0.9 ml / 水 0.1 mlに溶解し、凍結−溶解法により脱気後、重合開始剤であるペルオキソ二硫酸カリウム 2.7 mg（10 μmol）を添加し、25℃で12時間放置した。
なお、アクリルアミドは、ボロン酸基とカチオン基の密度を調整するために用いるモノマーであるが、電荷を持たず、ビニル基を有し、且つ水溶性のものであれば、アクリルアミド以外のモノマーを使用することができる。以上のようにして生成したゲルを水中に一昼夜浸漬して未反応のモノマー等を除去し、凍結乾燥により白色スポンジ状の固体を得た（収率：〜81 %）。この白色スポンジ状ポリマー約4.0 mgを色素水溶液20 ml（図２の1に示す色素を0.1 mMと3に示す色素を0.05 mM含み、5 mM HEPESでpH7.4に調整した溶液HEPESは2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piper azinyl]ethanesulfonic acidの略称）に浸漬し、25℃において12時間穏やかに撹拌し、色素を結合させた。ポリマーに結合した色素量は、攪拌後の上澄み溶液の吸収スペクトルを測定することにより求めた。
【００１４】
＜グルコース濃度に応答した色素の放出（図２の1、2、3の色素のうち1種類を結合したポリマーの場合）＞
製造例１で示した方法と同様の方法により得られた色素結合ポリマー（但し、色素としては図２の1、2、3のうち1種類の色素を結合）を水で洗浄した後、5 mM のHEPESを含む水溶液20 mlに3時間浸漬し、上澄み液を除いた後、ポリマーを水で洗浄した。この操作によって5 mM のHEPESのみでも放出される色素をできるだけ除く。このポリマーに、種々の濃度のグルコースを含む水溶液20 ml（5 mM HEPES でpH 7.4に調整した溶液）を添加し、一定時間穏やかに撹拌した後、上澄み液の吸収スペクトルから放出した色素を定量した。以上の実験は、すべて25℃において行った。このとき得られるグルコース濃度と色素放出量の割合（%）の関係を図３（ａ）に示す。また、グルコース濃度と水溶液の色の変化を図３（ｂ）〜（ｄ）に示す。グルコース濃度に応じて色素放出量の割合（%）が変化しており、水溶液の色の濃さも濃度が高くなるにつれて濃くなることが目視でも十分検知できる。ここでpHを7.4とした理由は血液などの体液のpHと同一にするためであるが、食品など他の媒体中の糖類濃度の検出においては、各々の媒体に最適なpHに設定できることは勿論である。
【実施例２】
【００１５】
＜グルコース濃度に応答した色素の放出（図２の1と2の両方を結合した色素結合ポリマーの場合）＞
製造例１で示した方法と同様の方法に得られた色素結合ポリマー（但し、色素としては図２の1と2を結合）を水で洗浄した後、5 mM のHEPESを含む水溶液20 mlに3時間浸漬し、上澄み液を除いた後、ポリマーを水で洗浄した。この操作によって5 mM のHEPESのみでも放出される色素をできるだけ除く。このポリマーに、種々の濃度のグルコースを含む水溶液20 ml（5 mM HEPES でpH 7.4に調整した溶液）を添加し、一定時間穏やかに撹拌した後、上澄み液の吸収スペクトルから放出した色素を定量した。以上の実験は、すべて25℃において行った。このとき得られるグルコース濃度と吸光度比（394 nmでの吸光度／612 nmでの吸光度）の関係を図４（ａ）に示す。また、グルコース濃度と水溶液の色の変化を図４（ｂ）に示す。グルコース濃度に応じて、吸光度比が変化しており、水溶液の色も0〜100 mMは青色の濃さの変化として、また100〜1000 mMは青〜緑の色調の変化として、目視でも十分検知することが可能である。
【実施例３】
【００１６】
＜グルコース濃度に応答した色素の放出（図２の1と3の両方を結合した色素結合ポリマーの場合）＞
製造例１で得られた色素結合ポリマーを水で洗浄した後、5 mM のHEPESを含む水溶液20 mlに3時間浸漬し、上澄み液を除いた後、ポリマーを水で洗浄した。この操作によって5 mM のHEPESのみでも放出される色素をできるだけ除く。このポリマーに、種々の濃度のグルコースを含む水溶液20 ml（5 mM HEPES でpH 7.4に調整した溶液）を添加し、一定時間穏やかに撹拌した後、上澄み液の吸収スペクトルから放出した色素を定量した。以上の実験は、すべて25℃において行った。このとき得られるグルコース濃度と吸光度比（405 nmでの吸光度／612 nmでの吸光度）の関係を図５（ａ）に示す。また、グルコース濃度と水溶液の色の変化を図５（ｂ）に示す。グルコース濃度に応じて、吸光度比が変化しており、水溶液の色も0〜10 mMは青色の濃さの変化として、また10〜1000 mMは青〜緑の色調の変化として、目視でも十分検知することが可能である。
【実施例４】
【００１７】
＜フルクトース濃度に応答した色素の放出（図２の1と2の両方を結合した色素結合ポリマーの場合）＞
実施例２で示した色素結合ポリマーに、種々の濃度のフルクトースを含む水溶液20 ml（5 mM HEPES でpH 7.4に調整した溶液）を添加し、一定時間穏やかに撹拌した後、上澄み液の吸収スペクトルから放出した色素を定量した。以上の実験は、すべて25℃において行った。このとき得られるフルクトース濃度と吸光度比（394 nmでの吸光度／612 nmでの吸光度）の関係を図６（ａ）に示す。また、フルクトース濃度と水溶液の色の変化を図６（ｂ）に示す。フルクトース濃度に応じて、吸光度比が変化しており、水溶液の色も0〜10 mMは青色の濃さの変化として、また10〜100 mMは青〜緑の色調の変化として、目視でも十分検知することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】シスージオール基を有する化合物に応答して色素を放出するメカニズムを示す図
【図２】（１）アニオン性色素の一例（Indigo carmine）  （２）アニオン性色素の一例（Chrysophenine）  （３）アニオン性色素の一例（Brilliant yellow）  （４）ボロン酸化合物の一例（3-アクリルアミドフェニルボロン酸）  （５）カチオン基を有するモノマーの一例（N-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]メタクリルアミド）  （６）架橋剤の一例（N,N’-メチレンビスアクリルアミド）  （７）アクリルアミド
【図３】（ａ）グルコース濃度に応答した色素の放出量の割合。  なお、図中の◆印は図２の色素1を結合させたポリマー、■印は図２の色素2を結合させたポリマー、▲印は図２の色素3を結合させたポリマーに対応する。  （ｂ）図２の色素1を結合させたポリマーを種々の濃度のグルコース水溶液に添加したときの色の変化を示す図。左から0 mM、1 mM、10 mM、100 mM、1000 mMに対応する。  （ｃ）図２の色素2を結合させたポリマーを種々の濃度のグルコース水溶液に添加したときの色の変化を示す図。左から0 mM、1 mM、10 mM、100 mM、1000 mMに対応する。  （ｄ）図２の色素3を結合させたポリマーを種々の濃度のグルコース水溶液に添加したときの色の変化を示す図。左から0 mM、1 mM、10 mM、100 mM、1000 mMに対応する。
【図４】（ａ）グルコース濃度に応答した色素の放出量の割合及び吸光度比の変化（色素として図２の1と2の両方を結合したポリマーを用いた場合）。  なお、図中の●印は波長394 nmと612 nmにおける吸光度の比を示す。  （ｂ）本ポリマーを種々の濃度のグルコース水溶液に添加したときの色の変化を示す図。左から0 mM、1 mM、10 mM、100 mM、1000 mMに対応する。
【図５】（ａ）グルコース濃度に応答した色素の放出量の割合及び吸光度比の変化（色素として図２の1と3の両方を結合したポリマーを用いた場合）。  なお、図中の●印は波長405 nmと612 nmにおける吸光度の比を示す。  （ｂ）本ポリマーを種々の濃度のグルコース水溶液に添加したときの色の変化を示す図。左から0 mM、1 mM、10 mM、100 mM、1000 mMに対応する。
【図６】（ａ）フルクトース濃度に応答した色素の放出量の割合及び吸光度比の変化（色素として図２の1と2の両方を結合したポリマーを用いた場合）。  なお、図中の●印は波長394 nmと612 nmにおける吸光度の比を示す。  （ｂ）本ポリマーを種々の濃度のフルクトース水溶液に添加したときの色の変化を示す図。左から0 mM、1 mM、10 mM、100 mMに対応する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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