(57)【要約】【課題】簡便な操作で高効率でグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を細胞内へ導入する試薬及び方法を提供する。【解決手段】ポリエチレンイミンまたはその化学修飾誘導体とグルタチオンとの結合体、及び結合体を用いてタンパク質を細胞内に輸送するタンパク質の細胞内導入方法。【選択図】図１
2008115150.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレンイミンまたはその化学修飾誘導体とグルタチオンとの結合体。
【請求項２】
ポリエチレンイミンの数平均分子量が１００〜１００，０００の範囲である、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
ポリエチレンイミンが分岐状構造を有する、請求項１または２に記載の結合体。
【請求項４】
化学修飾誘導体が、ポリエチレンイミンのＮ−アルキル誘導体、Ｎ−アシル誘導体、Ｎ−スルホニル誘導体またはシッフ塩基誘導体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項５】
グルタチオンが還元型グルタチオンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項６】
ポリエチレンイミンとグルタチオンがジスルフィド結合を介して結合した、請求項１〜５のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合体とグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質との複合体。
【請求項８】
結合体とグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質が、モル比で１：１０〜１００：１で結合した、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
ポリエチレンイミンまたはその化学修飾誘導体と２，２−ジピリジルジスルフィドを、ポリエチレンイミンまたはその化学修飾誘導体のアミノ基と反応してチオール基を露出させる試薬の存在下で反応させ、得られた生成物に還元型グルタチオンを接触させる工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合体を製造する方法。
【請求項１０】
試薬が、γ−チオブチロラクトン、メチル ４−メルカプトアルカンイミデート、２−イミノチオランまたはＮ-アセチルホモシステインチオラクトンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
化学修飾誘導体が、ポリエチレンイミンのＮ−アルキル誘導体、Ｎ−アシル誘導体、Ｎ−スルホニル誘導体またはシッフ塩基誘導体である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合体とグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を混合して、それらの複合体を形成することを含む、請求項７または８に記載の複合体を製造する方法。
【請求項１３】
結合体とグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を、モル比で１：１〜１００：１で混合することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
グルタチオンＳトランスフェラーゼをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子を融合して融合遺伝子を作製し、該融合遺伝子を大腸菌で発現させてグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を得る工程をさらに含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合体を用いて目的タンパク質を細胞内に輸送することを含む、タンパク質の細胞内導入方法。
【請求項１６】
結合体とグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を混合して、それらの複合体を形成することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
結合体とグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質の混合比が、モル比で１：１〜１００：１である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項７または８に記載の複合体を用いてタンパク質を細胞内に輸送することを含む、目的タンパク質の細胞内導入方法。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合体を含む、タンパク質の細胞内導入剤。
【請求項２０】
請求項７または８に記載の複合体を含む、タンパク質の細胞内導入剤。
【請求項２１】
請求項１９に記載のタンパク質の細胞内導入剤を含む、タンパク質の細胞内導入キット。
【請求項２２】
請求項２０に記載のタンパク質の細胞内導入剤を含む、タンパク質の細胞内導入キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエチレンイミンまたはその化学修飾誘導体とグルタチオンとの新規な結合体、及び該結合体を用いてタンパク質を細胞内に導入する導入剤およびその方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内で任意のタンパク質を生物学的に機能させたい場合、タンパク質そのものを細胞内に導入することが好ましいが、細胞膜は脂質二重膜から構成されており、タンパク質のような大きな外来分子を外から細胞の中へと透過させることは容易でない。
【０００３】
本発明者らは、以前、タンパク質を生細胞内に導入する方法として、タンパク質をカチオン化することで負電荷を帯びている生細胞表面への静電気的な吸着を介して導入する方法を開発した。その方法は、抗体−ＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇやビオチン−アビジンといった特異的な結合を活用した方法（特許文献１）、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いたタンパク質またはペプチドの細胞内導入方法（特許文献２）であり、これらの方法により、細胞外であらかじめ調製した各種のタンパク質を簡便に生細胞内に導入することが可能になった。
【０００４】
上記ポリエチレンイミンを用いたタンパク質またはペプチドの細胞内導入方法は、具体的には、タンパク質またはペプチドとポリエチレンイミンとを、例えばＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、２−イミノチオラン、ＧＭＢＳ（Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）などを用いて共有結合させて複合体を作製し、タンパク質を導入しようとする細胞を含む培地中に、該複合体を添加して培養すると、複合体が細胞内に取り込まれる、という方法である（特許文献２）。
【０００５】
しかし、このポリエチレンイミンを用いたタンパク質またはペプチドの細胞内導入方法では、目的のタンパク質またはペプチドとポリエチレンイミンとを、上記ＥＤＣなどの試薬を用いて共有結合させなければならない。
【０００６】
また、従来から用いられているタンパク質を細胞内に導入する方法に、塩基性ペプチドを融合する方法（非特許文献１）、及び上記カチオン化アビジンと複合体を形成させて導入する方法（特許文献１）があるが、これらの手法は簡便性に劣る。また、カチオン性脂質をベースとした各種のタンパク質導入試薬（ＣｈａｒｉｏｔＴＭ、ＢｉｏｐｏｒｔｅｒＴＭなど）も市販されているが、必ずしも導入効率が良いとはいえない。
【０００７】
一方、組換えタンパク質として大腸菌での可溶性発現および簡便なアフィニティー精製が可能な、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質は、１９９０年代から世界中で多用され、基礎研究分野で大きく活用されている。最近、このＧＳＴ融合タンパク質そのものが細胞内によく取り込まれるとの報告（非特許文献２）がなされたが、本発明者らの追試結果では、導入効率は非常に低かった。
【０００８】
【特許文献１】特願２００２−３４２４８６号明細書
【特許文献２】特開２００４−４９２１４号公報
【非特許文献１】Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ＳＲ，Ｈｏ  Ａ，Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉ  Ａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｄｙ  ＳＦ．，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５（５４３３），１５６９−１５７２，１９９９．
【非特許文献２】Ｎａｍｉｋｉ  Ｓ，Ｔｏｍｉｄａ  Ｔ，Ｔａｎａｂｅ  Ｍ，Ｉｉｎｏ  Ｍ  ａｎｄ  Ｈｉｒｏｓｅ  Ｋ，Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，３０５（３），５９２−５９７，２００３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、簡便な操作で高効率でグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を細胞内へ導入する試薬及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、グルタチオンＳトランスフェラーゼと目的タンパク質との融合タンパク質（以下、単に「グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質」という）を効率良く細胞内へ導入できるように、ポリエチレンイミンまたはその化学修飾誘導体を用いたカチオン化法をグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質に適用した。本発明者らは、この適用において使用するためのポリエチレンイミンまたはその化学修飾誘導体とグルタチオンとの新規な結合体を合成することに成功した。この結合体を用いることにより、簡便な操作で効率よくタンパク質を細胞内に導入できることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
本発明の特徴は、要約すると以下の通りである。
（１）ポリエチレンイミンまたはその化学修飾誘導体とグルタチオンとの結合体。好ましくは、ポリエチレンイミンとグルタチオンが、モル比で１：１〜１：２０、より好ましくは１：１〜１：１０、更に好ましくは１：１〜１：５、特に好ましくは１：１〜１：３で結合した結合体。
（２）ポリエチレンイミンの数平均分子量が１００〜１００，０００の範囲である、（１）に記載の結合体。
（３）ポリエチレンイミンが分岐状構造を有する、（１）または（２）に記載の結合体。
（４）化学修飾誘導体が、ポリエチレンイミンのＮ−アルキル誘導体、Ｎ−アシル誘導体、Ｎ−スルホニル誘導体またはシッフ塩基誘導体である、（１）〜（３）のいずれかに記載の結合体。
（５）グルタチオンが還元型グルタチオンである、（１）〜（４）のいずれかに記載の結合体。
【００１２】
（６）ポリエチレンイミンとグルタチオンがジスルフィド結合を介して結合した、（１）〜（５）のいずれかに記載の結合体。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の結合体とグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質との複合体。
（８）結合体とグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質が、モル比で１：１０〜１００：１で結合した、（７）に記載の複合体。
（９）ポリエチレンイミンまたはその化学修飾誘導体と２，２−ジピリジルジスルフィドを、ポリエチレンイミンまたはその化学修飾誘導体のアミノ基と反応してチオール基を露出させる試薬の存在下で反応させ、得られた生成物に還元型グルタチオンを接触させる工程を含む、（１）〜（６）のいずれかに記載の結合体を製造する方法。
（１０）試薬が、γ−チオブチロラクトン、メチル ４−メルカプトアルカンイミデート、２−イミノチオランまたはＮ-アセチルホモシステインチオラクトンである、（９）に記載の方法。
【００１３】
（１１）化学修飾誘導体が、ポリエチレンイミンのＮ−アルキル誘導体、Ｎ−アシル誘導体、Ｎ−スルホニル誘導体またはシッフ塩基誘導体である、（９）または（１０）に記載の方法。
（１２）（１）〜（６）のいずれかに記載の結合体とグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を混合して、それらの複合体を形成することを含む、（７）または（８）に記載の複合体を製造する方法。
（１３）結合体とグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を、モル比で１：１〜１００：１で混合することを含む、（１２）に記載の方法。
（１４）グルタチオンＳトランスフェラーゼをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子を融合して融合遺伝子を作製し、該融合遺伝子を大腸菌で発現させてグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を得る工程をさらに含む、（１２）または（１３）に記載の方法。
（１５）（１）〜（６）のいずれかに記載の結合体を用いて目的タンパク質を細胞内に輸送することを含む、タンパク質の細胞内導入方法。
【００１４】
（１６）結合体とグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を混合して、それらの複合体を形成することを含む、（１５）に記載の方法。
（１７）結合体とグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質の混合比が、モル比で１：１〜１００：１である、（１６）に記載の方法。
（１８）（７）または（８）に記載の複合体を用いてタンパク質を細胞内に輸送することを含む、目的タンパク質の細胞内導入方法。
（１９）（１）〜（６）のいずれかに記載の結合体を含む、タンパク質の細胞内導入剤。
（２０）（７）または（８）に記載の複合体を含む、タンパク質の細胞内導入剤。
（２１）（１９）に記載のタンパク質の細胞内導入剤を含む、タンパク質の細胞内導入キット。
（２２）（２０）に記載のタンパク質の細胞内導入剤を含む、タンパク質の細胞内導入キット。
【００１５】
以下、本明細書において、ポリエチレンイミンはＰＥＩと、グルタチオンはＧＳＨと、グルタチオンＳトランスフェラーゼはＧＳＴと表すことがある。
【００１６】
また、結合体、複合体の表記は、結合体または複合体の構成要素を「−」でつなげ、つないだ順番で構成要素同士が結合していることを示す。例えば、「ＰＥＩ−ＧＳＨ−ＧＳＴ融合タンパク質」複合体は、ポリエチレンイミン、グルタチオン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質で構成され、この順番で結合している複合体を示す。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、ポリエチレンイミンまたはその化学修飾誘導体とグルタチオンとの結合体を用いることによってグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を簡便に高効率で細胞内に導入することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の結合体は、ポリエチレンイミンまたはその化学修飾誘導体とグルタチオンとの結合生成物である。
【００１９】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、直鎖状または分岐鎖状構造のいずれでもよく、分岐鎖状構造には橋かけ構造も含まれる。分岐鎖状ＰＥＩは、例えば下記式で表される。
【００２０】
【化１】
2008115150.tif 000003
（式中、ｘ及びｙはそれぞれ１以上の整数である。）
【００２１】
また、上記式中、分岐鎖末端のアミノ部分は、遊離アミノ基でもよいし、あるいはエチレンイミンの更なる重合鎖を表す。
【００２２】
ＰＥＩは、大きな正の電荷密度を有する水溶性ポリマーである。なお、ＰＥＩはかまぼこの沈殿剤などの食品添加物としても利用されており、生体に対する安全性が確認されている。
【００２３】
ＰＥＩは、分岐鎖状構造を有するものが好ましく、例えば下記式
【００２４】
【化２】
2008115150.tif 000004
【００２５】
で例示されるような枝分かれ構造を有するＰＥＩが、より正電荷密度が高いことから好ましい。また、分子量は、細胞導入効率、取扱い性などを考慮すると、分子量が１００〜１００，０００の範囲のＰＥＩが好ましく、１００〜１０，０００のＰＥＩがより好ましく、２００〜３，０００のＰＥＩが更に好ましく、５００〜１，８００の低分子量のＰＥＩが特に好ましい。
【００２６】
ＰＥＩは市販されており、例えば（株）日本触媒のエポミン（商標）が好適に用いられる。
【００２７】
また、ＰＥＩの化学修飾誘導体は、ＰＥＩのアミノ基（好ましくは１級アミノ基）と、それと反応しうるすべての化学修飾剤とから形成することができる。化学修飾剤の例は、置換されたまたは未置換の、飽和または不飽和の、脂肪族、芳香族、脂環式および複素環式の、アルキル化剤、アシル化剤、スルホニル化剤などを含む。
【００２８】
本明細書中で使用される「脂肪族」は、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を指し、好ましくは炭素数１〜６（Ｃ１〜Ｃ６）、より好ましくは炭素数１〜４（Ｃ１〜Ｃ４）の炭化水素基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチルなどである。
【００２９】
本明細書中で使用される「芳香族」は、ベンゼン核を含む炭化水素基を指し、例えばフェニル基、フェニレン基などが挙げられる。
【００３０】
本明細書中で使用される「脂環式」は、飽和単環水素基あるいは１または２個の二重結合を含む不飽和単環炭化水素基を指し、例えばシクロペンチル基、シクロへキシル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
【００３１】
本明細書中で使用される「複素環式」は、飽和または不飽和の環に１または複数のヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、Ｓなど）を含む単環または縮合環式炭化水素基を指し、例えばピロリジル、ピリジル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリノ、インドリル、イミダゾリル、チオフェニルなどが挙げられる。
【００３２】
置換基として、例えばハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）、フェニル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボニル、アルコキシカルボニルなどが挙げられる。
【００３３】
アルキル化剤の例は、ハロゲン化アルキル、エポキシドなどである。
アシル化剤の例は、エステル、酸ハロゲン化物、酸無水物などである。
スルホニル化剤の例は、ハロゲン化アルキルスルホニルなどである。
【００３４】
その他の例は、アルデヒドであり、アミノ基との反応によってシッフ（Ｓｃｈｉｆｆ）塩基が形成される。
【００３５】
具体的なアルキル化剤の例として、スチレンオキサイド、エポキシブテン、ハロゲン化Ｃ１〜Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、プロペニル、ブテニルなどが挙げられる。
【００３６】
具体的なアシル化剤の例として、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイルハライド、好ましくはＣ１〜Ｃ４アルカノイルハライド、例えば塩化アセチル、塩化プロピオニル、塩化ブチリル、などが挙げられる。
【００３７】
具体的なスルホニル化剤の例として、Ｃ１〜Ｃ６アルカンスルホニルハライド、好ましくはＣ１〜Ｃ４アルカンスルホニルハライド、例えば塩化メタンスルホニル、塩化エタンスルホニルなどが挙げられる。
【００３８】
従って、本発明において、ＰＥＩの化学修飾誘導体には、例えばＮ−アルキル誘導体、Ｎ−アシル誘導体、Ｎ−スルホニル誘導体、シッフ塩基誘導体などが含まれる。
グルタチオン（ＧＳＨ）は下記式で表される。
【００３９】
【化３】
2008115150.tif 000005
【００４０】
グルタチオンは、グルタミン酸、システイン、グリシンがこの順番でペプチド結合したトリペプチドである。ただしグルタミン酸とシステインの結合はグルタミン酸側鎖のγ−カルボキシ基とシステイン主鎖のα−アミノ酸からなるγ−グルタミル結合であるため、ほとんどのプロテアーゼに対して耐性であり分解されず、α−グルタミルトランスペプチターゼなどのごく限られた酵素のみが分解できる。
【００４１】
グルタチオンは、多様な生物種の細胞に濃度０．５〜１０ｍＭで存在し、ラジカルの捕捉、酸化還元による細胞機能の調節を行い、各種酵素のＳＨ供与体でもある。また、抗酸化成分としても知られ、グルタチオンを含有したサプリメントなどが市販されている。
【００４２】
グルタチオンには、還元型（ＧＳＨ）と酸化型（ＧＳＳＧ）があり、酸化型は、２分子の還元型グルタチオンがジスルフィド結合で結合した分子である。細胞内のグルタチオンは、ほとんどが還元型である。本発明では還元型グルタチオンを使用することが好ましい。本明細書において、特に明記がない限り、グルタチオンは還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を示す。
【００４３】
グルタチオンは市販されており、例えばナカライテスク（株）のＧＳＨやＲｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社のＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｒｅｄｕｃｅｄ  （ＧＳＨ）などが好適に用いられる。
【００４４】
本発明の結合体は、ＰＥＩとＧＳＨがジスルフィド結合を介して結合しており、モル比で好ましくは１：１〜１：２０、より好ましくは１：１〜１：１０、更に好ましくは１：１〜１：５、特に好ましくは１：１〜１：３で結合している。
【００４５】
また本発明のＰＥＩ−ＧＳＨ結合体に、更にグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質(ＧＳＴ融合タンパク質)が結合できる。
【００４６】
ＧＳＴ融合タンパク質は、上記ＧＳＴと細胞に導入したい目的タンパク質との融合体である。ＧＳＴは、多様な生物種に広く存在し、薬物などの種々の化合物にグルタチオンを転移し、グルタチオン抱合体を産生する酵素である。目的タンパク質は、特に限定されず、ペプチド、酵素、その他機能性（生理活性または生物活性）を有するタンパク質などの任意のタンパク質を含む。また糖鎖、脂質、リン酸基などの化学修飾基が結合したタンパク質も含む。さらにタンパク質は天然状態でも変性状態であってもよい。目的タンパク質として、例えばｐ５３やＣａｓｐａｓｅ、ＰＰＡＲγ、あるいは人工的に修飾したタンパク質などが挙げられる。
【００４７】
本発明の結合体とＧＳＴ融合タンパク質は、好ましくはモル比で、約１：１０〜１００：１、より好ましくは１：５〜１０：１、更に好ましくは１：２〜２：１で結合している。ＧＳＴとグルタチオンの結合様式については、Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｍ，Ｈａｒａｄａ  Ｓ，Ｎｏｇｕｃｈｉ  Ｓ，Ｓａｔｏｗ  Ｙ，Ｉｎｏｕｅ  Ｈ  ａｎｄ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ．，Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ：ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｙｓ１０  ａｎｄ  Ｈｉｓ１０６．，Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，２８１（１），１３５−１４７，１９９８における複合体のＸ線結晶構造解析の結果からも明らかなとおり、１分子のＧＳＴタンパク質に１分子のグルタチオン分子が結合する。
【００４８】
以下、本発明の結合体の製造方法を説明する。
本発明の結合体の製造方法は、ＰＥＩまたはその化学修飾誘導体と２，２−ジピリジルジスルフィドを、ＰＥＩまたはその化学修飾誘導体のアミノ基と反応してチオール基を露出させる試薬の存在下で反応させ、得られた生成物に還元型グルタチオンを接触させる工程を含む。
【００４９】
ポリエチレンイミンは、例えば数平均分子量１００〜１００，０００のものを好適に用いることができ、例えば上記（株）日本触媒のエポミン（数平均分子量３００、６００、１，２００、１，８００、１０，０００、７０，０００）を用いることができる。
２，２−ジピリジルジスルフィドは、下記式で表される。
【００５０】
【化４】
2008115150.tif 000006
【００５１】
２，２−ジピリジルジスルフィドは、例えばＳｉｇｍａ社のアルドリチオール（商標）やＤＯＪＩＮＤＯ社の２−ＰＤＳなどを好適に用いることができる。
【００５２】
ポリエチレンイミンまたはその化学修飾誘導体のアミノ基と反応してチオール基を露出させる試薬は、例えばγ−チオブチロラクトン、メチル ４−メルカプトアルカンイミデート、２−イミノチオランまたはＮ-アセチルホモシステインチオラクトンが挙げられる。特にγ−チオブチロラクトンが好適であり、γ−チオブチロラクトンは下記式で表される。
【００５３】
【化５】
2008115150.tif 000007
【００５４】
γ−チオブチロラクトンとしては、例えばＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＬＩＣＨ社のγ−チオブチロラクトンを好適に用いることができる。
【００５５】
本発明のＰＥＩ−ＧＳＨ結合体は、例えば図１のスキームに従って合成することができる。具体的には、例えば以下の手順で合成することができる。
【００５６】
まず、ＰＥＩをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの溶媒に溶解し、これにアルドリチオールを溶解する。ここに攪拌下でγ−チオブチロラクトンを添加し、約５０℃で数時間攪拌した後、２層に分離した上澄みをロータリーエバポレーターにより濃縮する。これを超純水で再溶解し、ヘキサンを用いて洗浄した後、反応に用いたアルドリチオールに対する約０．９倍モル相当量の還元型グルタチオンを添加し、ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体を取得する。
【００５７】
また、ＰＥＩを上記のように化学修飾して、修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体を合成することもできる。例えば、ＰＥＩを適当な溶媒に溶解し、ＰＥＩのアミノ基と反応する化学修飾剤を添加し、必要に応じてアミンなどの塩基の存在下で、約０〜数十℃で数時間反応させて、修飾を行う。得られた修飾ＰＥＩとＧＳＨを用いて、上記合成手順と同様にして修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体を合成する。
【００５８】
上記のようにして合成したＰＥＩ−ＧＳＨ結合体または修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体に、ＧＳＴ融合タンパク質を接触させる工程を更に含めることができる。この工程により、ＧＳＨとＧＳＴが特異的に結合し、ＰＥＩ−ＧＳＨ−ＧＳＴ融合タンパク質または修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ−ＧＳＴ融合タンパク質の複合体が形成される。接触させる際のＰＥＩ−ＧＳＨ結合体または修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体とＧＳＴ融合タンパク質のモル比は、好ましくは１：１〜１００：１、より好ましくは１：１〜２０：１、最も好ましくは１：１〜１０：１である。
【００５９】
上記ＧＳＴ融合タンパク質は、例えば、ＧＳＴをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子を融合して融合遺伝子を作製し、適当な発現ベクターに組込んだのち、この融合遺伝子を大腸菌などの細菌、酵母、動物細胞などの宿主細胞で発現させることにより得られる。好ましくは、組換えタンパク質の有効な発現方法の１つとして多用されているＧＳＴ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍが用いられる。このシステムの優位性は、可溶性としてタンパク質を発現させやすい点や、ＧＳＴ部分を利用したアフィニティークロマトグラフィーの手法を用いて、簡便に精製することが可能な点が挙げられ、世界中で多用されている手法である。ここで得られたＧＳＴ融合タンパク質は、主に試験管内（生細胞外）で様々な生化学的な実験に用いられている。
【００６０】
ＧＳＴ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍに用いられる発現ベクターはキットとして市販されており、例えばｐＧＥＸシリーズ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社、アマシャムファルマシア社）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）がある。以下、例としてｐＧＥＸベクターを使用した場合のＧＳＴ融合タンパク質の製造方法について説明する。
【００６１】
ｐＧＥＸベクターは、ＧＳＴ遺伝子の配列の下流にプロテアーゼ認識部位とマルチクローニングサイトを配置したベクターである。目的タンパク質の遺伝子をベクター上のＧＳＴ遺伝子（例えば住血吸虫由来）の下流にフレームを合わせて組み込み、大腸菌菌体内で融合タンパク質として大量発現することができる。また、ｐＧＥＸベクターは、ｌａｃ  Ｉｑ遺伝子を有しており、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−ガラクトシド）添加によりタンパク質の発現を誘導することができ、種々の大腸菌を宿主として使用することができる。例えば、ＢＬ２１、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＴＧ１、ＸＬ１  Ｂｌｕｅなどの大腸菌を好適に使用できる。目的タンパク質のｃＤＮＡを鋳型にして制限酵素（例えばＥｃｏ  ＲＩ、Ｘｈｏｌ、ＳａｃＩ、ＳｍａＩ、Ｂａｍ  ＨＩ、ＡｃｃＩ、ＰｓｔＩ、Ｈｉｎ  ｄＩＩＩなど）の認識配列を付加させたＰＣＲ増幅断片をｐＧＥＸに連結し、発現ベクターを作製する。これを上記大腸菌に形質転換し、例えばアンピシリンを含む培地（ＬＢ（Ａｍｐ＋）など）で３７℃で培養する。Ｏ．Ｄ．６００＝０．６〜０．８になったら、ＩＰＴＧを終濃度が例えば０．１〜１ｍＭになるように加え、例えば３０℃で２〜５時間培養する。なお、ＩＰＴＧ濃度、培養温度、培養時間は目的タンパク質により最適条件が異なるので事前に検討することが好ましい。遠心分離により集菌し、バッファー（ＰＢＳ、ＧＳＴバッファーなど）に懸濁して、例えばソニケーターで菌体を破壊する。遠心分離して上清を菌体タンパク質として回収する。例えば平衡化したグルタチオン−セファロース４Ｂを少量加え、３０分間〜２時間、４℃で緩やかに振る。４℃で遠心して上清を捨て、グルタチオン−セファロース４Ｂを回収する。グルタチオン−セファロース４Ｂをバッファーで繰返し洗浄する。ここで、精製サンプル、ソニケーション後の可溶性画分、不溶性画分、吸着後のグルタチオン−セファロース上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動して、精製の確認を行う。
【００６２】
精製確認後、グルタチオン−セファロース４Ｂをアフィニティービーズとして溶出を行うことができる。グルタチオン−セファロース４Ｂを遠心して上清を除去し、レジンと等量の溶出バッファーを加え、例えば４℃で５〜１０分緩やかに攪拌し、遠心して上清を回収する、というサイクルを数回繰り返し、ＧＳＴ融合タンパク質を回収する。
【００６３】
以下、本発明のタンパク質細胞内導入方法について説明する。
本発明のタンパク質細胞内導入方法は、ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体または修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体を用いる。上記製造方法で得られたＰＥＩ−ＧＳＨ結合体または修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体とＧＳＴ融合タンパク質を、例えば試験管内であらかじめ混合すると、ＧＳＨとＧＳＴが特異的に結合して、ＰＥＩ−ＧＳＨ−ＧＳＴ融合タンパク質複合体または修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ−ＧＳＴ融合タンパク質複合体を形成する。これを細胞の培養上清に添加するだけでタンパク質を細胞内に導入でき、非常に簡便である。複合体のＰＥＩ−ＧＳＨ結合体（修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体）：ＧＳＴ融合タンパク質のモル比は、好ましくは１：１〜１００：１、より好ましくは１：１〜２０：１、更に好ましくは１：１〜１０：１、最も好ましくは１０：１である。図２に、ＰＥＩ−ＧＳＨ−ＧＳＴ融合タンパク質が生細胞内に導入される様子を模式的に示す。
【００６４】
本発明は、ＧＳＴとＧＳＨの特異的な結合を利用しており、様々な混合液中に存在するＧＳＴ融合タンパク質のみを細胞内に導入できることから、以下の様な取り扱いも可能である。すなわち、細胞内のタンパク質はリン酸化等の翻訳後修飾を介して生理活性を調節していることが知られている。これらを検証する目的で、試験管内のＧＳＴ融合タンパク質を、ある種の酵素や組織・細胞抽出液、化合物、化学反応誘導剤で処理することで翻訳後修飾様の化学修飾を施したＧＳＴ融合タンパク質を作製し、さらにこの混合液中にＰＥＩ−ＧＳＨ結合体または修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体を添加することで、目的のＧＳＴ融合タンパク質とＰＥＩ−ＧＳＨ結合体または修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体との複合体が形成され、結果として、混合液中に存在するＧＳＴ融合タンパク質のみが細胞内へ導入できる。従って、特別な精製作業を経ずにこの様な実験を行うことが原理的に可能である。
【００６５】
本発明のＰＥＩ−ＧＳＨ結合体（修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体）またはＰＥＩ−ＧＳＨ−ＧＳＴ融合タンパク質複合体（修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ−ＧＳＴ融合タンパク質複合体）は、上述のようにタンパク質の細胞内導入剤として用いることができる。研究用試薬として使用できるほか、医薬品、診断薬等としても使用できる。具体的には、シグナル伝達に影響を及ぼすタンパク質や遺伝子発現に関与するタンパク質等を導入することによる細胞機能解析、また、細胞増殖を促進させるタンパク質を導入することによる皮膚や肝臓等の再生医療や細胞増殖を抑制したりアポトーシスを誘導するタンパク質を導入することによるがん治療等に使用できる。
【００６６】
また、ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体（修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体）またはＰＥＩ−ＧＳＨ−ＧＳＴ融合タンパク質複合体（修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ−ＧＳＴ融合タンパク質複合体）をタンパク質の細胞内導入剤として含めた、タンパク質の細胞内導入キットを作製することも可能である。具体的には、例えば、シグナル伝達に影響を及ぼすタンパク質や遺伝子発現に関与するタンパク質等を導入することによる細胞機能解析用キット、細胞増殖を促進させるタンパク質を導入することによる皮膚や肝臓等の再生医療や細胞増殖を抑制したりアポトーシスを誘導するタンパク質を導入することによるがん治療用キット等が挙げられる。
【００６７】
なお、タンパク質の細胞内導入技術は種々の手法があるが、グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質に特化した例は本発明が初めてである。
【００６８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００６９】
ＧＳＴ及びＧＳＴ融合タンパク質の精製
日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）由来のＧＳＴ及びそのＧＳＴ融合タンパク質は、ｐＧＥＸベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主として１００μｇ／ｍＬ  ａｍｐｉｓｉｌｉｎ含有ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）中で発現させた。菌体内で発現させたＧＳＴ及びそのＧＳＴ融合タンパク質は、菌体を超音波破砕器（ＢＲＡＮＳＯＮ社、ＳＯＮＩＦＩＥＲ  ２５０）を用いて破壊後にグルタチオンセファロースゲル（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）にアプライし、ＰＢＳＴ（１０％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ）、ＰＢＳで洗浄後、１０ｍＭ  ＧＳＨ含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で溶出させた。
【実施例２】
【００７０】
ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体の合成
ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体は、図１のスキームに従って合成を行った。まず、５．０ｇの平均分子量６００のポリエチレンイミン（（株）日本触媒、エポミン（商標）ＳＰ−００６）を２０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解し、これに５．４９ｇのアルドリチオール（Ｓｉｇｍａ、化学名：２，２−ジピリジルジスルフィド）を溶解した。ここに攪拌下で２．５４ｇのγ−チオブチロラクトン（Ｓｉｇｍａ）を添加し、５０℃で２時間攪拌した後、２層に分離した上澄みをロータリーエバポレーターにより濃縮した。これを超純水で再溶解し、ヘキサンを用いて洗浄した後、反応に用いたアルドリチオールに対する０．９倍モル相当量（６．８９ｇ）の還元型グルタチオンを添加し、ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体を取得した。
【実施例３】
【００７１】
ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体を用いたＧＳＴの細胞内導入
実施例２で作製したＰＥＩ６００−ＧＳＨ結合体を用いて、ＧＳＴの細胞内導入を定量的に確認した。具体的には、タンパク質を導入する細胞としてチャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ細胞）を用い、ＧＳＴとＰＥＩ６００−ＧＳＨ結合体の細胞内導入に適した混合比の検討と、ＰＥＩ６００−ＧＳＨ−ＧＳＴ複合体の時間依存及び濃度依存的な取り込みを、抗ＧＳＴ抗体を用いたウエスタンブロッティング法で定量・検証した（図３）。具体的には、細胞を播種し１２〜１５時間培養し、７０〜８０％コンフルエントになった状態でＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）に培地を交換し、３０分培養した後、ＰＥＩ６００−ＧＳＨとＧＳＴの混合液を添加し、更に１時間培養した。その後、細胞を回収し、得られたｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅを５〜２０％のグラジエントアガロースゲルで電気泳動し、泳動後ニトロセルロースメンブレンに転写した。転写後、ブロッキングをおこない、ヤギ抗ＧＳＴ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）と反応させた。さらにアルカリフォスファターゼ融合抗ヤギＩｇＧ抗体（ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と反応させ、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ．）を用いて発光させ、フィルムに感光させて検出した。
【００７２】
この結果、単独のＧＳＴではほとんど細胞内に取り込まれることはなかったが、ＧＳＴ：ＰＥＩ６００−ＧＳＨ結合体の混合比がモル比で１：１０のとき、最も効率的に細胞内へ取り込まれることが判明した（図３のＡ（１００ｎＭのＧＳＴと、０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭの各ＰＥＩ６００−ＧＳＨ結合体を混合し、ＣＨＯ細胞の培養上清に添加し、１時間後に細胞を回収し、上記抗ＧＳＴ抗体によるウエスタンブロティングにより定量した。））。
【００７３】
また、ＧＳＴとＰＥＩ６００−ＧＳＨ結合体の複合体（混合比１：１０）は、速やかに細胞に取り込まれ、添加３０分後にはほぼ飽和したように観察された。これは細胞表面への結合量が３０分以内に完了することが示唆される（図３のＢ（１００ｎＭのＧＳＴと１μＭのＰＥＩ６００−ＧＳＨ結合体を混合し（モル比で１：１０）、ＣＨＯ細胞の培養上清に添加し、０分、１０分、３０分、６０分の各時間経過後に細胞を回収し、上記抗ＧＳＴ抗体によるウエスタンブロッティングにより定量した。））。
【００７４】
さらに、ＰＥＩ−ＧＳＨ−ＧＳＴ複合体（混合比１：１０）は培養上清に添加する濃度に依存して増加することが確認された（図３のＣ（ＧＳＴとＰＥＩ６００−ＧＳＨ結合体の混合比を１：１０（モル比）に固定し、０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭの各濃度の複合体をＣＨＯ細胞の培養上清に添加し、１時間経過後に細胞を回収し、上記抗ＧＳＴ抗体によるウエスタンブロッティングにより定量した。））。
【００７５】
なお、ウエスタンブロッティング法を用いたこの定量系では細胞表面に結合したままのＧＳＴと、細胞内に取り込まれたＧＳＴは区別されない。しかし、ＰＥＩでカチオン化されたタンパク質の細胞内への導入効率は、細胞表面に結合した量に比例することが他の実験から確認されているため（Ｍｕｒａｔａ  Ｈ，Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｆｕｔａｍｉ  Ｊ，Ｋｉｔａｚｏｅ  Ｍ，Ｍａｅｄａ  Ｔ，Ｄｏｕｒａ  Ｈ，Ｋｏｓａｋａ  Ｍ，Ｔａｄａ  Ｈ，Ｓｅｎｏ  Ｍ，Ｈｕｈ  ＮＨ  ａｎｄ  Ｙａｍａｄａ  Ｈ．，Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ｃａｔｉｏｎｉｚｅｄ  ｐ５３  ｒｅａｄｉｌｙ  ｅｎｔｅｒｓ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｆｏｌｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｓ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５（１９），６１２４−６１３２，２００６．）、本手法でもこれに準拠するものと仮定し、定量した。
【実施例４】
【００７６】
ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体を用いたＧＳＴ−ｅＧＦＰ融合タンパク質の細胞内導入
実施例２で作製したＰＥＩ６００−ＧＳＨ結合体を用いて、ＧＳＴ融合タンパク質が細胞内に取り込まれることを可視化するため、ＧＳＴを融合させた緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をモデルタンパク質として実施例１と同様に作製し、各種の細胞への取り込みを共焦点レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社／ＬＳＭ  ５１０  ｖｅｒ．３．０）を用いて蛍光を観察した。具体的には、滅菌したカバーガラスを装填した１２  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに細胞を播種し、１２〜１４時間培養した。７０〜８０％程度のコンフルエントになった状態で培地をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）に交換し、３０分培養した。その後、５００ｎＭのＰＥＩ６００−ＧＳＨ結合体と５００ｎＭのＧＳＴ融合タンパク質の混合液を添加し、更に２時間培養した。その後、細胞表面を２０ｍＭ  ＤＴＴで洗浄し、細胞表面に結合しただけのＧＳＴ−ｅＧＦＰを除去した。洗浄後、カバーガラスを取り出し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光を観察した。
【００７７】
この結果、結合体を添加した２時間後には、評価に使用した４種の細胞（ＣＨＯ細胞、Ｂａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞、Ｃｏｓ７細胞）全てにおいて、均一かつ効率的なＧＳＴ−ｅＧＦＰタンパク質の取り込みが観察された（図４のＡ〜Ｆ）。
【実施例５】
【００７８】
ＧＳＴ−ＮＬＳ−Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅの細胞内導入による機能発現の確認
ＰＥＩ６００−ＧＳＨ結合体を用いてＧＳＴ融合タンパク質を細胞内に導入した後、主に図２で示した経路で細胞質内に到達したＧＳＴ融合タンパク質がその生理機能を発現していることを確認するモデル実験を行った。この評価系では、Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを細胞内に導入するタンパク質とし、図５のＡに示すＣｒｅ／ＬｏｘＰシステムを用いたレポーター遺伝子をＣＨＯ細胞に安定的に組み込んだ評価系細胞を用いた。また、このレポーター遺伝子は細胞の核内に存在し、細胞質内に取り込まれたタンパク質をさらに核内へと移行させる必要があるため、核移行シグナル（ＮＬＳ）とＣｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを融合させたＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−ＮＬＳ−Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）を細胞内へ導入することとした。１００ｎＭのＧＳＴ−ＮＬＳ−Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを評価用の細胞に添加し、４８時間後に観察したところ、全く変化は確認されなかった（図５のＢ）。一方、１μＭのＰＥＩ６００−ＧＳＨ結合体と１００ｎＭのＧＳＴ−ＮＬＳ−Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを混合して形成された複合体を添加したところ、４８時間後に細胞内（核内）でＣｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅの活性が発現した細胞（赤色蛍光）が確認された（図５のＣ）。
【００７９】
以上の結果から、ＰＥＩ６００−ＧＳＨ結合体を介して細胞質内に取り込まれたＧＳＴ融合タンパク質は、細胞内でその機能を発現していることが確認された。
【実施例６】
【００８０】
ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体の混合比率（結合比率）の検討
ＰＥＩとＧＳＨを１：１、１：２、１：３の混合比率にした以外は、実施例２と同様にしてＰＥＩ−ＧＳＨ結合体を作製した。
【００８１】
次に、実施例４と同様にして、作製した結合体を用いてＧＳＴ−ｅＧＦＰ融合タンパク質の細胞内導入を行った。この結果、１：３の混合比率(結合比率)のＰＥＩ−ＧＳＨ結合体が最も導入効率が高いことが分かった（図６、ＧＳＴ−ｅＧＦＰ単独の場合、１：１のＰＥＩ−ＧＳＨ結合体を用いてＧＳＴ−ｅＧＦＰを導入した場合、１：３のＰＥＩ−ＧＳＨ結合体を用いてＧＳＴ−ｅＧＦＰを導入した場合を示す）。
【００８２】
また、平均分子量１８００のＰＥＩを用いて、ＰＥＩとＧＳＨを１：１、１：２、１：３、１：４の混合比率にした以外は、実施例２と同様にしてＰＥＩ−ＧＳＨ結合体を作製し、実施例４と同様にして、ＧＳＴ−ｅＧＦＰ融合タンパク質の細胞内導入を行ったところ、平均分子量６００のＰＥＩを用いた結合体の方が、融合タンパク質の導入能がより高いことがわかった（図７）。
【００８３】
このことから、平均分子量６００のＰＥＩの表面に３つほどグルタチオンが結合した密集度・疎水度が、平均分子量１８００のＰＥＩのものと比べて、ＰＥＩ−ＧＳＨとＧＳＴの結合力および細胞表面への結合力に寄与していると考えられる。
【実施例７】
【００８４】
修飾ＰＥＩの合成
（１）ＧＸ−１の合成
平均分子量６００のポリエチレンイミン（（株）日本触媒、エポミン（商標）ＳＰ−００６）を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、塩化ヘキシルを添加して反応させた。得られた反応溶液をエバポレーターで濃縮し、目的化合物を得て、該目的化合物をＧＸ−１とした。
（２）ＧＸ−４の合成
平均分子量６００のポリエチレンイミン５ｇを、１５．３ｇのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、１，３−ブタジエンモノエポキシド（東京化成社製）１．７５ｇを添加し、５０℃で５時間反応させた。得られた反応溶液をエバポレーターで濃縮し、目的化合物６．８ｇを得て、該目的化合物をＧＸ−４とした。
（３）ＧＸ−５の合成
平均分子量６００のポリエチレンイミンを、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、スチレンオキシドを添加して反応させた。得られた反応溶液をエバポレーターで濃縮し、目的化合物を得て、該目的化合物をＧＸ−５とした。
【実施例８】
【００８５】
修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体による融合タンパク質の細胞内導入
（１）修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体の合成
実施例７で合成したＧＸ−４：γ−チオブチロラクトン：アルドリチオール＝１：３：３．１のモル比で、以下のように修飾ＰＥＩ−ＧＳＨ結合体を合成した。
【００８６】
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５ｍｌを入れた３０ｍｌナス型フラスコにＧＸ−４  ０．２ｇ（０．３×１０−３ｍｏｌ）を加えた。攪拌下、アルドリチオール０．２４ｇ（１．１×１０−３ｍｏｌ）とγ−チオブチロラクトン０．１ｇ（１×１０−３ｍｏｌ）を加え、５０℃で１時間反応を行った。ＴＨＦをエバポレーターを用いて除去した後、反応物に超純水を２ｍｌ加え、５０℃で溶解させた。室温でしばらくおくと２層分離が起こったので、遠心を１２，０００ｒｐｍ、５分の条件で行い、下層部分５００μｌを回収した。還元型グルタチオン（ＧＳＨ）７４ｍｇ（０．２３×１０−３ｍｏｌ、γ−チオブチロラクトンの×０．９ｍｏｌ）を加え、１つのＧＸ−４に対して３つのＧＳＨを反応させたＧＸ−４−ＧＳＨ３（ＧＸ−４の濃度で１５０ｍＭ）を合成し、以下の実験に用いた。
【００８７】
また、ＧＸ−１、ＧＸ−５についても修飾ＰＥＩ：ＧＳＨの混合比（結合比）が１：２になるように、ＧＸ−１の場合はＧＸ−１  ０．２ｇ（０．３×１０−３ｍｏｌ）、アルドリチオール０．１４ｇ（０．６３×１０−３ｍｏｌ）、γ−チオブチロラクトン０．０６３ｇ（０．６×１０−３ｍｏｌ）およびＧＳＨ  ４２ｍｇ（０．１４×１０−３ｍｏｌ）の割合、ＧＸ−５の場合はＧＸ−５  ０．２ｇ（０．３×１０−３ｍｏｌ）、アルドリチオール０．１４ｇ（０．６３×１０−３ｍｏｌ）、γ−チオブチロラクトン０．０６３ｇ（０．６×１０−３ｍｏｌ）およびＧＳＨ１６．６ｍｇ（０．０５４×１０−３ｍｏｌ）の割合で上記と同様にして、ＧＸ−１−ＧＳＨ２結合体、ＧＸ−５−ＧＳＨ２結合体を合成した。
【００８８】
（２）修飾ＰＥＩ−ＧＳＨを用いたＧＳＴ−ｅＧＦＰの細胞導入
ＰＥＩ６００（未修飾）−ＧＳＨ３と上記（１）で合成したＧＸ−４−ＧＳＨ３によるＧＳＴ融合タンパク質の細胞導入能を比較するために、ＧＳＴ−ｅＧＦＰを用いた細胞の可視化実験を行った。
【００８９】
マウス線維芽細胞株Ｂａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３  Ａ３１Ｈクローンを５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件でφ１８ｍｍのカバーガラスを入れた１２ｗｅｌｌプレートにまいた。１２時間培養後、培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ５００μｌに置換した。培地中での最終濃度が５００ｎＭとなる条件で、ＧＳＴ−ｅＧＦＰとＰＥＩ６００−ＧＳＨ３またはＧＸ−４−ＧＳＨ３を１：１で混合し、室温で５分反応後、培地中に添加した。細胞を３７℃で２時間培養後、２０ｍＭ  ＤＴＴを加えたＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で１０分間培養を行い、細胞表面に残ったタンパク質の除去を行った。ＰＢＳで洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞内の蛍光局在を観察した。
【００９０】
ＧＳＴ−ｅＧＦＰの導入を行った細胞の様子を図８に示す。
ＧＳＴ−ｅＧＦＰ単独で添加を行った場合、ｅＧＦＰの蛍光は細胞内で観察されなかった（図８のＡ）。ＰＥＩ６００−ＧＳＨ３を用いてＧＳＴ−ｅＧＦＰを導入した場合、粒上の蛍光が細胞内で観察された（図８のＢ）。これはエンドサイトーシスで取り込まれたタンパク質がエンドソーム内に留まっている様子を示していると考えられる。一方でＧＸ４−ＧＳＨ３を用いた場合、粒状の蛍光を示す細胞のほかに、細胞質内にｅＧＦＰの蛍光が均一に広がった細胞を確認することができた（図８のＣ）。その出現頻度は全体の細胞のうちの１０％程度であった。
【００９１】
また、ＧＸ−１−ＧＳＨ２結合体、ＧＸ−５−ＧＳＨ２結合体についても、上記と同様にしてＧＳＴ−ｅＧＦＰ導入細胞の可視化実験を行った。
【００９２】
ＧＸ−１−ＧＳＨ２結合体、ＧＸ−４−ＧＳＨ３結合体、ＧＸ−５−ＧＳＨ２結合体のＧＳＴ−ｅＧＦＰ導入細胞の可視化実験の結果を図９に示す。ＧＸ−４−ＧＳＨ３結合体が特に優れた導入能を示した（細胞質への放出が顕著に見られる細胞が数％検出できる）。
【００９３】
次に、ＧＳＴ−ｅＧＦＰを導入した細胞の生死を判断するために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色実験を行った。
【００９４】
ＧＳＴ−ｅＧＦＰ導入後の細胞を１μｇ／ｍｌのＰＩを含む培地中で２０分間培養を行い、ＰＢＳで洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察を行った。対照実験として、固定化細胞のＰＩ染色を行った。ＧＳＴ−ｅＧＦＰ導入後の細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液で３０分間反応させ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ中で１０分間透過処理を行った。１μｇ／ｍｌのＰＩを含む培地中で２０分間反応を行い、ＰＢＳで洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察を行った（図１０のＡ〜Ｄ）。
【００９５】
観察を行った細胞にＰＩを添加した場合、ｅＧＦＰの蛍光が粒状の観察される細胞、蛍光が均一に広がっている細胞のどちらにおいてもＰＩの取り込みは観察できなかった（図１０のＢ）。一方で、固定化処理を行った細胞ではＰＩの取り込みを観察することができた（図１０のＤ）。
【００９６】
以上の結果より、ＧＸ−４−ＧＳＨ３結合体はエンドサイトーシスで取り込まれたＧＳＴ融合タンパク質を積極的に細胞質内に放出する能力を持ち、細胞に対してダメージを与えない有用なキャリアーであることが判明した。
【実施例９】
【００９７】
ＧＳＴ−ＣＡ−ＭＥＫ１による試験管内でのＭＡＰＫカスケード反応の確認
恒常的に活性を持つＭＥＫ１（ＣＡ−ＭＥＫ１）がコードされているプラスミドＤＮＡ（ｐＦＣ−ＭＥＫ１、ストラタジーン社）を用いる以外は、実施例１と同様にしてＧＳＴ−ＣＡ−ＭＥＫ１融合タンパク質を作製した。なお、ＣＡ−ＭＥＫ１は、Ｌｅｕ３３〜Ａｌａ５２残基が欠損し、Ｓｅｒ２１７がＧｌｕ２１７に置換、Ｓｅｒ２２１がＧｌｕ２２１に置換されている。
【００９８】
ＧＳＴ融合タンパク質として発現させたＣＡ−ＭＥＫ１、ＥＲＫ１の両方あるいは一方をＭＢＰおよびＡＴＰ等と試験管内で混合する。ＣＡ−ＭＥＫ１によりＥＲＫ１が活性化された場合、それに続いてＭＢＰがリン酸化される。そして、リン酸化されたＭＢＰをａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ  ＭＢＰ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（抗ｐ−ＭＢＰ抗体）を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により検出した。その結果、ＣＡ−ＭＥＫ１およびＥＲＫ１両方を混合したサンプルのみでリン酸化ＭＢＰが観察された（図１１）。
【実施例１０】
【００９９】
ＧＳＴ−ＣＡ−ＭＥＫ１による細胞レベルのＭＡＰＫカスケード反応の確認
細胞内のＥＲＫの活性化レベルをルシフェラーゼ活性で評価できる細胞ＨＬＲ−Ｅｌｋ１細胞／ストラタジーン社）に、３００ｎＭのＰＥＩ６００−ＧＳＨ３結合体を用いて３００ｎＭのＧＳＴ−ＣＡ−ＭＥＫ１融合タンパク質を導入した。細胞内に導入したＧＳＴ−ＣＡ−ＭＥＫ１が内在性のＥＲＫを活性化し、それに続き、予め細胞内で発現しているＧＡＬ４ＢＤ−Ｅｌｋ１を活性化する。活性化されたＧＡＬ４ＢＤ−Ｅｌｋ１はゲノム上に組み込まれたレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）の発現を誘導する。その結果、ルシフェラーゼ活性を定量することで、ＰＥＩ６００−ＧＳＨ３を用いたＧＳＴ−ＣＡ−ＭＥＫ１の導入を確認することができた。ここで得られたルシフェラーゼ活性の上昇は、ＥＧＦ刺激時と同程度の活性上昇であることが確認されたが、無処理あるいはＧＳＴのみをＰＥＩ６００−ＧＳＨ３で導入した細胞ではこのような活性上昇は確認されなかった（図１２）。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明の結合体は、ＧＳＴ融合タンパク質と容易に結合し、簡便な操作で目的タンパク質を細胞に導入することができる。このため、世界中で汎用的に使用されているＧＳＴ融合タンパク質を研究資産としてより一層活用することができる。本発明の結合体を用いることにより、グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を生細胞内で使用できるようになることから、様々なアプリケーションの創出が期待される。また、タンパク質の翻訳後修飾などの研究分野に多大な貢献をしうる研究用試薬として期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明の結合体の合成スキームを示す。
【図２】ＰＥＩ−ＧＳＨ−ＧＳＴ融合タンパク質が細胞に導入される様子を模式的に示す。
【図３】ウエスタンブロットによるＰＥＩ−ＧＳＨ−ＧＳＴの細胞内導入を示す。Ａ：ＧＳＴとＰＥＩ６００−ＧＳＨ結合体の混合比の最適化を示す。Ｂ：ＧＳＴとＰＥＩ６００−ＧＳＨ結合体（混合比（モル比）１：１０）の細胞内導入の経時変化を示す。Ｃ：ＧＳＴとＰＥＩ６００−ＧＳＨ結合体（混合比(モル比)１：１０）の濃度依存的な細胞内導入を示す。
【図４】共焦点レーザー顕微鏡によるＧＳＴ−ｅＧＦＰ融合タンパク質の細胞内への取り込みを示す。
【図５】Ｃｒｅ／ＬｏｘＰシステム及び蛍光顕微鏡で観察した細胞を示す。Ａ：ＧＳＴ−Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅの細胞内での活性発現を確認するためのレポーター遺伝子を示す。Ｂ：Ａのレポーター遺伝子を組み込んだＣＨＯ細胞（安定発現株）を示す。Ｃ：Ｂの細胞にＧＳＴ−Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ＋ＰＥＩ６００−ＧＳＨを添加した２日後の細胞を示す。
【図６】ＰＥＩ６００−ＧＳＨによるＧＳＴ−ｅＧＦＰの細胞内導入を示す。
【図７】ＰＥＩ１８００−ＧＳＨとＰＥＩ６００−ＧＳＨによるＧＳＴ−ｅＧＦＰの細胞内導入を示す。
【図８】ＧＳＴ−ｅＧＦＰ融合タンパク質の細胞内導入を示す。Ａ：ＧＳＴ−ｅＧＦＰ単独で添加を行った場合を示す。Ｂ：ＰＥＩ６００−ＧＳＨ３を用いてＧＳＴ−ｅＧＦＰを導入した場合を示す。Ｃ：ＧＸ−４−ＧＳＨ３を用いてＧＳＴ−ｅＧＦＰを導入した場合を示す。
【図９】修飾ＰＥＩ−ＧＳＨを用いたＧＳＴ−ｅＧＦＰ融合タンパク質の細胞内導入を示す。
【図１０】ＧＳＴ−ｅＧＦＰ導入細胞のＰＩ染色を示す。Ａ：生細胞におけるｅＧＦＰの蛍光を示す。Ｂ：生細胞におけるＰＩ染色を示す。Ｃ：固定化細胞におけるｅＧＦＰの蛍光を示す。Ｄ：固定化細胞におけるＰＩ染色を示す。
【図１１】試験管内でのＭＡＰＫカスケード反応の確認を示す。
【図１２】ＨＬＲ−ＥＬＫ細胞へのＧＳＴ−ＣＡ−ＭＥＫ１の導入を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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