(57)【要約】 【課題】  生細胞における過酸化水素を選択的かつ高感度に検出することのできる新しいインディケーターを提供する。【解決手段】  酵母タンパク質Glutathione peroxidase 3（Gpx3）、酵母タンパク質Yeast activator protein 1（Yap1）および蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を生じさせる蛍光タンパク質XおよびYを含み、過酸化水素によるYap1の立体構造変化によって蛍光タンパク質XおよびYがFRETシグナルを発生させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母タンパク質Glutathione peroxidase 3（Gpx3）、酵母タンパク質Yeast activator protein 1（Yap1）および蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を生じさせる蛍光タンパク質XおよびYを含み、過酸化水素によるYap1の立体構造変化によって蛍光タンパク質XおよびYがFRETシグナルを発生させることを特徴とする過酸化水素インディケーター。
【請求項２】
さらに、細胞内局在化ペプチドを含む請求項１の過酸化水素インディケーター。
【請求項３】
Yap1部分が、Yap1のN末端側システイン-リッチドメイン（n-CRD）とC末端側システイン-リッチドメイン（c-CRD）をフレキシブルリンカーで連結したものである請求項１の過酸化水素インディケーター。
【請求項４】
N末端から、Gpx3、リンカー、蛍光タンパク質X、n-CRD、フレキシブルリンカー、c-CRD、蛍光タンパク質Yの順番で直鎖状に連結されている請求項３の過酸化水素インディケーター。
【請求項５】
請求項１から４記載のいずれかのインディケーターを生細胞で発現することのできる発現ベクター。
【請求項６】
請求項１から４記載のいずれかのインディケーターを生細胞内に導入し、FRETシグナルを指標として生細胞内の過酸化水素を検出することを特徴とする過酸化水素検出方法。
【請求項７】
請求項５記載の発現ベクターを生細胞内に導入することによってインディケーターを生細胞内に導入する請求項６の過酸化水素検出方法。
【請求項８】
生細胞内において過酸化水素を発生させる条件をスクリーニングする方法であって、請求項１から４記載のいずれかのインディケーターを導入した細胞に候補条件を処置し、FRETシグナルが観察された場合に、候補条件が目的条件であると判定することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項５記載の発現ベクターを生細胞で発現させることによってインディケーターを生細胞に導入する請求項８のスクリーニング方法。
【請求項１０】
生細胞において発生した過酸化水素を消失または減少させる条件をスクリーニングする方法であって、過酸化水素を発生する生細胞に請求項１から４記載のいずれかのインディケーターを導入し、次いでこの細胞を候補条件で処置し、FRETシグナルが減少または消失した場合に、候補条件が目的条件であると判定することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項５記載の発現ベクターを生細胞で発現させることによってインディケーターを生細胞に導入する請求項１０のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生細胞内の過酸化水素を高感度で検出することのできるインディケーターに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
過酸化水素（H2O2）、スーパーオキシドアニオン（O2-）、ヒドロキシルラジカル（・OH）などは活性酸素種と総称され、その反応性の高さゆえに、生体内で産生されると遺伝子の変異やタンパク質の変性などを引き起こし、正常な生命活動を損なわせる。そのため、癌や動脈硬化、アルツハイマー病を始めとする約95%の疾病発症に関係することが知られている。
【０００３】
一方で、H2O2は活性酸素種の中でも比較的反応性が低く、低濃度では細胞内の特定のアミノ酸しか酸化できないため、上述の病理的因子としてのみならず、シグナル伝達物質として生理的な細胞機能の制御にも利用されていることが明らかになっている。病理的因子および生理的因子としてのH2O2の機能を理解するためには、生細胞においてH2O2を選択的かつ高感度に検出する手段が必要である。
【０００４】
しかしながら、従来のH2O2検出は、例えば、体液中のH2O2を有機蛍光色素によって標識測定するものであるが（例えば、特許文献１）、有機蛍光色素は検出感度、選択性において限界が指摘されている。
【０００５】
なお、本願発明者らは、生体内の様々な微量分子等を高感度で検出するためのプローブやインディケーターを発明しており、特に蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を利用したものとして、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（特許文献２）、蛋白質リン酸化・脱リン酸化可視化プローブ（特許文献３）、核内レセプターのアゴニスト・アンタゴニスト検出用プローブ（特許文献４）、イノシトール-1,4,5-三リン酸検出・定量用プローブ（特許文献５）を特許出願している。
【特許文献１】特開2004-81138号公報
【特許文献２】特開2004-325253号公報
【特許文献３】再表02/077623号公報
【特許文献４】国際公開WO2005/078119号パンフレット
【特許文献５】国際公開WO2005/113792号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記のとおり、病理的因子および生理的因子としてのH2O2の機能を解明するためには、生細胞におけるH2O2を選択的かつ高感度に検出する必要があり、またそのような検出によって、生細胞におけるH2O2の発生条件や抑制条件を正確に特定することも可能となる。
【０００７】
本願発明は、生細胞におけるH2O2を選択的かつ高感度に検出するための新しい手段を提供することを課題としている。
【０００８】
以上のとおりの課題を解決するための第1の発明は、酵母タンパク質Glutathione peroxidase 3（Gpx3）、酵母タンパク質Yeast activator protein 1（Yap1）および蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を生じさせる蛍光タンパク質XおよびYを含み、H2O2によるYap1の立体構造変化によって蛍光タンパク質XおよびYがFRETシグナルを発生させることを特徴とするH2O2インディケーターである。
【０００９】
すなわち、酵母タンパク質Yap1はH2O2に応答して特定の遺伝子発現を調節する酸化ストレスセンサータンパク質であり、酵母タンパク質Gpx3がYap1と共存すると、このGpx3がH2O2によって最初に酸化され、続いてYap1の分子内でジスルフィド結合が形成され、Yap1が折り畳むようにして大きく構造変化する。そして、このYap1の構造変化に伴って蛍光タンパク質XおよびYの距離が変化し、FRETシグナルを生じる。
【００１０】
なお、前記発明において、「酵母タンパク質Yap1」および「酵母タンパク質Gpx3」はそれぞれの実施的な全長タンパク質であってもよく、あるいはそれぞれの部分ペプチドであってもよい。例えば、Gpx3は、H2O2によって酸化されるシステイン残基を含むGpx3部分ペプチドであってもよい。またYap1は、その２つの部分ペプチド断片をフレキシブルリンカーで連結したキメラペプチドであって、両ペプチド断片のシステイン残基がジスルフィド結合することによってキメラペプチド全体の構造変化を生じさせるようにしたものであってもよい。
【００１１】
また前記発明において、「生細胞」とは、それ本来の機能の少なくとも一部を保持した状態で人工的な環境下に置かれた細胞（例えば培養細胞）、あるいは多細胞生物個体（例えば動物個体）を構成し、かつ本来の機能の少なくとも一部を保持している細胞を意味する。後者において、インディケーターが導入された生細胞は、多細胞生物個体の一部又は全部を構成してもよい。
【００１２】
このH2O2インディケーターの好ましい態様の一つは、前記の構成要素に加え、さらに細胞内局在化ペプチドを含むことである。
【００１３】
このH2O2インディケーターのさらに別の好ましい態様は、Yap1部分が、Yap1のN末端側システイン-リッチドメイン（n-CRD）とC末端側システイン-リッチドメイン（c-CRD）をフレキシブルリンカーで連結したものであり、より具体的には、N末端から、Gpx3、リンカー、蛍光タンパク質X、n-CRD、フレキシブルリンカー、c-CRD、蛍光タンパク質Yの順番で直鎖状に連結されているインディケーターである。
【００１４】
第2の発明は、前記第1発明のH2O2インディケーターを生細胞で発現することのできる発現ベクターである。
【００１５】
第3の発明は、前記第1発明のH2O2インディケーターを生細胞内に導入し、FRETシグナルを指標として生細胞内の過酸化水素を検出することを特徴とするH2O2検出方法である。
【００１６】
第4発明は、生細胞内においてH2O2を発生させる条件をスクリーニングする方法であって、前記第1発明のインディケーターを導入した細胞に候補条件を処置し、FRETシグナルが観察された場合に、候補条件が目的条件であると判定することを特徴とするスクリーニング方法である。
【００１７】
第5発明は、生細胞において発生したH2O2を消失または減少させる条件をスクリーニングする方法であって、H2O2を発生する生細胞に前記第1発明のインディケーターを導入し、次いでこの細胞を候補条件で処置し、FRETシグナルが減少または消失した場合に、候補条件が目的条件であると判定することを特徴とするスクリーニング方法である。
【００１８】
前記第3―5発明における好ましい態様は、前記第2発明の発現ベクターを生細胞内に導入することによってインディケーターを生細胞内に導入することである。
【００１９】
なお本発明は、蛍光タンパク質XおよびYによるFRET現象に基づく特許文献2-5の開示内容を含むものである。
【００２０】
本発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA技術）」、東京化学同人 (1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種蛋白質やペプチド、あるいはそれらをコードするDNAについては、既存のデータベース（URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等）から入手することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によって、生細胞におけるH2O2を選択的かつ高感度に検出することが可能となる。これによって、病理的因子および生理的因子としてのH2O2の機能を解明することが可能となるばかりか、生体内で生じたH2O2による各種疾患の診断等が可能となる。また生細胞におけるH2O2の発生条件や抑制条件を正確に特定することも可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明のインディケーターは、基本的には、酵母タンパク質Gpx3、酵母タンパク質Yap1、蛍光タンパク質XおよびYによって構成される。蛍光タンパク質XおよびYは、例えば、GFP、CFP、YFP、RFPやそれらの変異体等から適宜の組合せを選択することができる。
【００２３】
そしてこれらの各構成要素は、H2O2によるGpx3の酸化に引き続くYap1の立体構造変化に伴って、蛍光タンパク質XおよびYの距離が変化し、FRETシグナルを生させるような状態で直鎖状に連結される。
【００２４】
図１aは、インディケーターの好ましい構成例である。この図１aの例では、インディケーターはN末端から順にGpx3、リンカー、シアン色蛍光タンパク質（CFP）、Yap1のn-CRD、Yap1のc-CRD、黄色蛍光タンパク質（YFP）からなる。H2O2によってインディケーター内のGpx3のシステイン残基が酸化されると、Gpx3はc-CRDとジスルフィド結合を形成する（図1b）。続いて、そのジスルフィド結合がn-CRDとc-CRDとの間のジスルフィド結合へと転移され、図1cのようにインディケーターの立体構造が変化する。そしてこの立体構造の変化に伴って、CFPからYFPへFRETが生起し、CFPを励起した時にYFPからの蛍光が観察されることになる。従って、CFPとYFPの蛍光強度比をモニターすることにより、細胞内のH2O2を可視化計測が可能となる。
【００２５】
また、前記のインディケーターにさらに、細胞内局在化ペプチドを連結することによって、細胞内でのH2O2の局所濃度を検出することも可能となる。
【００２６】
以上のようなインディケーターを作成する場合には、各要素（タンパク質またはペプチド）を、例えば適当なリンカー配列を介してペプチド結合により連結させる。各要素は、基本的に公知のタンパク質またはペプチドであり（例えば、Gpx3はGenBank/U22446；Yap1はGenBank/X58693、CFPはGenBank/EF212307、YFPはGenBank/AY391252）、これらの配列情報に基づいて公知のペプチド合成法（Merrifield, R.B. J. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963； Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W.C. and White, P.D., Oxford University Press, 2000等）に準じて作成することが出来る。あるいは、既知の塩基配列情報に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプローブやプライマーを用いてプローブハイブリダイゼーションやRT-PCR法により取得したそれぞれのコード配列を、in vitro転写翻訳や宿主−ベクター系において発現させる遺伝子組み換え技術によって取得することもできる。
【００２７】
インディケーターはまた、第２発明の発現ベクターを用いて遺伝子工学的に作成してもよい。インディケーターを遺伝子工学的に作成するための発現ベクターは、インディケーターの発現形態等に応じて公知のベクターを適宜に選択して構築することができる。例えば、in vitro転写翻訳によりインディケーターを作成する場合には、RNAポリメラーゼプロモーターを含むpKA1、pCDM8、pT3／T718、pT7／319、pBluescriptIIなどを基に発現ベクターを構築できる。微生物（大腸菌等）を宿主とする場合には、pUC系、pBluescriptII、pETベクターシリーズ、pGEXベクターシリーズ等を使用する。真核細胞を宿主とする場合には、例えば、pKA1、pCDM8、pSVK3、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pYE82などのベクターが使用可能である。
【００２８】
発現ベクターを宿主細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポゾーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。また、宿主細胞で発現させたインディケーターは、公知の分離操作を組み合わせて単離精製することができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS−PAGE,等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（タグ配列を利用した方法など）である。
【００２９】
またこの発現ベクターには、インディケーターの各要素のコード配列が所定の順番で組込まれているが、これらのコード配列は、リンカーペプチドをコードするヌクレオチド鎖によって連結されてもよい。このようなリンカーヌクレオチド鎖は、例えば文献（Carruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90; Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することができる。
【００３０】
第２発明の発現ベクターは、また、インディケーターを生細胞内に導入するためのウイルスベクターとして構築することができる。例えば、哺乳動物細胞や哺乳動物個体への遺伝子導入に適したレトロウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）をベースとするベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどである（例えば、Miller et al. BioTechniques 7:980-990, 1992； Anderson et al., Nature 392:25-30 Suppl., 1998； Verma and Somia, Nature 389:239-242, 1997；Wilson, New Engl. J. Med. 334:1185-1187, 1996等を参照）。
【００３１】
以上のとおりのリン酸化インディケーターは、例えば、第３−５発明の方法に使用される。
【００３２】
第3の発明は、前記第1発明のH2O2インディケーターを生細胞内に導入し、FRETシグナルを指標として生細胞内の過酸化水素を検出することを特徴とするH2O2検出方法である。生細胞がH2O2を発生している場合には、インディケーターは図1b、cに例示したように、システイン残基が酸化されたGpx3はc-CRDとジスルフィド結合を形成し、次いでそのジスルフィド結合がn-CRDとc-CRDとの間のジスルフィド結合へと転移され、インディケーターの立体構造が変化する。そしてこの立体構造の変化に伴って、CFPからYFPへFRETが生起し、CFPを励起した時にYFPからの蛍光が観察されることになる。従って、CFPとYFPの蛍光強度比をモニターすることにより、細胞内のH2O2を可視化して検出する。
【００３３】
インディケーターを生細胞内に導入するためには、例えば、脂質（BioPORTER（Gene Therapy Systems社、米国）、Chariot（Active Motif社、米国）等）による細胞内導入法を採用することができる。あるいはまた、前記第２発明の発現ベクターを生細胞内にトランスフェクトすることによってインディケーターを生細胞内に導入することである。例えば、前記のウイルス性発現ベクターを有するウイルスを生細胞に感染させることによって、インディケーターを生細胞内で発現させることができる。また、例えば、発現ベクターをマイクロインジェクション法によって生細胞に導入する方法や、生体認識分子を提示した中空ナノ粒子に発現ベクターを封入して生細胞に発現ベクターを導入することもできる。
【００３４】
第4発明は、生細胞内においてH2O2を発生させる条件をスクリーニングする方法であって、前記第1発明のインディケーターを導入した細胞に候補条件を処置し、FRETシグナルが観察された場合に、候補条件が目的条件であると判定することを特徴とするスクリーニング方法である。H2O2を発生させる可能性のある候補条件は、例えば動物の生活環境条件、摂食節水物質、除草剤、感染症治療薬、抗ガン剤など各種化合物等から任意に選択される。インディケーターを導入した培養細胞や動物個体をこれらの条件に暴露し、インディケーターからのFRETシグナルを測定することによって、生細胞内におけるH2O2発生条件を特定することができる。また、この発明のインディケーターは、H2O2の有無によって可逆的にFRETシグナルを生じる。従って、インディケーターを導入した生細胞を、繰り返し別条件に暴露することによって、他種類の候補条件をスクリーニングすることもできる。
【００３５】
第5発明は、生細胞において発生したH2O2を消失または減少させる条件をスクリーニングする方法であって、H2O2を発生する生細胞に前記第1発明のインディケーターを導入し、次いでこの細胞を候補条件で処置し、FRETシグナルが減少または消失した場合に、候補条件が目的条件であると判定することを特徴とするスクリーニング方法である。このH2O2を消失または減少させる条件としては、例えば、有機または無機の化合物（特に低分子量の化合物）、タンパク質、ペプチド等を培養細胞や動物個体に接触させるなどの条件である。これらの物質は、機能や構造が既知のものであっても未知のものであってもよい。また、「コンビナトリアルケミカルライブラリー」は、目的物質を効率的に特定するための被験物質群として有効な手段である。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第6,004,617号；5,985,365号を参照）。さらには、市販のライブラリー（例えば、米国ComGenex社製、ロシアAsinex社製、米国Tripos, Inc.社製、ロシアChemStar, Ltd社製、米国3D Pharmaceuticals社製、Martek Biosciences社製などのライブラリー）を使用することもできる。また、コンビナトリアルケミカルライブラリーを、インディケーター導入細胞の集団に適用することによって、いわゆる「ハイスループットスクリーニング」を実施することもできる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例１
図1aの構成からなるインディケーターをコードするキメラDNAを作製し、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO-K1細胞）に発現させた。この細胞にH2O2を添加し、蛍光強度比（YFP/CFP）を測定した。100 μM H2O2を添加すると蛍光強度比が増大し、一定値に達した後にH2O2を除去すると蛍光強度比が減少した（図２）。これより、本発明のインディケーターはH2O2に対し可逆的に応答することが確認された。また、H2O2に対する検出下限は1μM程度であり、極めて高感度のH2O2検出が可能であることが確認された。
【００３７】
次に、本インディケーターの選択性を調べるために、アフィニティクロマトグラフィにより精製したインディケーターにH2O2、ONOO-、OCl-、NO、酸化型グルタチオン(GSSG)をそれぞれ添加して蛍光強度比の変化を調べた。その結果、H2O2以外の活性酸素種では応答がみられなかった（表1）。この結果から、本インディケーターはH2O2に対して極めて高い選択性を有することが確認された。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
実施例２
実施例１と同様のインディケーターを用いて、細胞が病理的状態に陥った時に発生するH2O2の検出を試みた。
【００４０】
本インディケーターを発現させたCHO-K1細胞に小胞体ストレスを引き起こすThapsigarginを加えると、数分後にインディケーターからのFRETシグナルが観察された。この結果は、小胞体ストレス下においてH2O2が生成していることを示している。小胞体ストレスとは、タンパク質合成の場である小胞体内腔において、正しく折り畳まれなかったタンパク質が蓄積することである。小胞体ストレスは細胞死（アポトーシス）を引き起こすことが知られているが、H2O2はアポトーシスを引き起こす因子であることも知られており、小胞体ストレスによるアポトーシスの誘導にH2O2が介在していることが示唆されていた。しかしながら，従来法の低い選択性とH2O2に対する高い検出下限が制限となり、小胞体ストレス下でのH2O2生成を示す直接的な証拠は提出されていなかった。本発明のインディケーターは、前記のとおり、H2O2に対する検出感度及び選択性において従来法を凌駕しており、本インディケーターの高性能化が、小胞体ストレス下におけるH2O2生成の検出を可能とした。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明インディケーターの構成例と、このインディケーターによるH2O2の検出原理を示した模式図である。
【図２】実施例１において、インディケーターを発現するCHO-K1細胞にH2O2を添加し、蛍光強度比（YFP/CFP）を測定した結果である。
【図１】
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【図２】
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