(57)【要約】【課題】  外傷性神経障害および／または運動機能障害を処置するための医薬、特に、脊髄損傷による外傷性神経障害および／または運動機能障害を処置するための医薬を提供することを目的とする。【解決手段】  ヒアルロナンが脊髄損傷による外傷性神経障害および／または運動機能障害に対し改善効果を有し、外傷性神経障害および／または運動機能障害を処置するための医薬として有用であることが見出された。すなわち、本発明によると、有効量のヒアルロナンを含む、外傷性神経障害および／または運動機能障害を処置するための医薬が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外傷性神経障害を処置するための経鼻投与用医薬であって、有効量のヒアルロナンを含む医薬。
【請求項２】
運動機能障害を処置するための経鼻投与用医薬であって、有効量のヒアルロナンを含む医薬。
【請求項３】
運動機能障害が神経障害によるものである、請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
神経障害が中枢神経の外傷によるものである、請求項１または３に記載の医薬。
【請求項５】
神経障害が脊髄損傷によるものである、請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
前記ヒアルロナンが、交互にグリコシド結合したＤ−グルクロン酸とＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンとを含む多糖、もしくはその誘導体、または薬学的に許容されるその塩である、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬。
【請求項７】
Ｄ−グルクロン酸の１位とＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンの３位との結合が、存在する場合、β１−３結合であり、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンの１位とＤ−グルクロン酸の４位との結合が、存在する場合、β１−４結合である、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
前記ヒアルロナンが２〜６０糖である、請求項１〜７のいずれかに記載の医薬。
【請求項９】
前記ヒアルロナンが４糖である、請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
前記ヒアルロナンが、Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、もしくはその誘導体、または薬学的に許容されるその塩である、請求項１〜９に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外傷性神経障害および／または運動機能障害を処置するための医薬、特に、中枢神経における外傷性神経障害および／または運動機能障害を処置するための経鼻投与用医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊髄損傷は交通事故、銃創、背部への強い物理的圧力等が原因で起こる、不可逆的な傷害である。現在国内において５，０００人が脊髄損傷を罹患しており、脊髄損傷患者は年々増加する傾向にある（非特許文献１:日本せきずい基金ホームページ参照）。
【０００３】
脊髄損傷患者の多くは、罹患後４０年以上もの間その傷害による麻痺と共に生存する。このため、脊髄損傷患者に対する社会保障のコストが大きく、社会的問題となっている。さらに、神経が遮断される事から起こる運動および歩行困難、排尿困難、感覚の鈍化等により、脊髄損傷患者の生活の質が損なわれることや、就職機会が失われることも問題となっている。このため、脊髄損傷を治療し、ひいては麻痺から回復させることは、患者のためのみならず社会的にも極めて貢献が高いものといえる。
【０００４】
現在行われている脊髄損傷の治療は、外科的処置、ステロイドの投与、残存神経の保護が主である。中でもステロイドの投与は静脈内投与であり、かつその副作用が少なくないため、患者の生活の質を損なうことが問題となっている。
【０００５】
ヒアルロナンは、Ｄ−グルクロン酸とＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンとの２糖繰り返し単位から構成されている多糖であり、長鎖の多糖のものばかりでなく、オリゴ糖のものも知られている。ヒアルロナンは、鶏冠、さい体、皮膚、関節液などの生体組織からの抽出液から、またはストレプトコッカス属等の細菌を用いる発酵法などにより製造することができる。ヒアルロナンは、毒性学的および免疫学的作用を示さず、医薬や化粧品として利用されている。例えば、ヒアルロナンを関節内に注射することにより関節炎を治療できることがよく知られている。以下、４糖のヒアルロナンをＨＡ４と記載する。
【０００６】
ＨＡ４が、臓器保存剤として利用できることや、肝障害および胃潰瘍に対する治療、抑制効果を有することが報告されている（特許文献１:WO 2002/004471参照）。また、ＨＡ４が、ストレスタンパク発現増強作用および細胞死抑制作用を有することが知られている（非特許文献２：Xu H et al.参照）。
【０００７】
同様に、ラット脊髄損傷モデルにおいて、ＨＡ４を髄腔内投与することで、運動機能が回復することが知られている（特許文献２：WO2004/084912参照）。また、ＨＡ４が自己免疫性疾患の一つである多発性硬化症のモデル動物において症状を抑える事が知られている（特許文献３：特開2006-327958参照）。
【０００８】
【特許文献１】国際公開第WO2002/004471号パンフレット
【特許文献２】国際公開第WO2004/084912号パンフレット
【特許文献３】特開2006-327958号公報
【非特許文献１】日本せきずい基金, [online], [平成19年1月5日検索], インターネット <URL:http://www.jscf.org/jscf/GAIYOU.htm>
【非特許文献２】Xu H, Ito T, Tawada A, Maeda H, Yamanokuchi H, Ishihara K, Yoshida K, Uchiyama Y, Asari A., "Effect of Hyaluronan Oligosaccharides on the Expression of Heat Shock Protein 72.", J Biol. Chem. 2002 May 10;277(19):17308-17314.
【非特許文献３】Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC. "A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats.", J Neurotrauma. 1995 Feb;12(1):1-21.
【非特許文献４】Masaki M, Ikeda A, Shiraki E, Oka S, Kawasaki T.   Mixed lineage kinase LZK and antioxidant protein-1 activate NF-kappaB synergistically.  Eur J Biochem. 2-3 Jan;270(1):76-83.
【非特許文献５】Ikeda A, Sakuma H, Masaki M, Kozutsumi Y,Oka S, Inazawa J,Kawasaki T.  Genomic organization and fine-mapping of the human leucine zipper-bearing kinase(LZK)gene.  J Biochem Mol Biol Biophys.  2002 Apr;6(2):113-7
【非特許文献６】Ikeda A, Hasegawa K, Masaki M, Moriguchi T, Nishida E, Kozutsumi Y, Oka S, Kawasaki T.  Mixed lineage kinase LZK forms a functional signaling complex with JIP-1, a scaffold protein of the c-Jun NH(2)-terminal kinase pathway
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、髄腔内投与（脊髄内注射）法は痛みを伴う方法であり、また患者自身で行うことができない煩わしさを伴う。そこで、本発明は、より侵襲性が低く、患者自身が行うことができる手段により、外傷性神経障害および／または運動機能障害、特に、脊髄損傷による外傷性神経障害および／または運動機能障害を処置するための医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一の側面によると、外傷性神経障害を処置するための経鼻投与用医薬であって、有効量のヒアルロナンを含む医薬が提供される。また、本発明の他の側面によると、運動機能障害を処置するための経鼻投与用医薬であって、有効量のヒアルロナンを含む医薬が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明者等は、ラット脊髄損傷モデルを用いて、ヒアルロナンの脊髄損傷に対する作用を検討した。この結果、驚くべきことに、以下に詳細に説明するように、経鼻投与によってもヒアルロナンが脊髄損傷による運動機能障害に対し改善効果を有し、外傷性神経障害および／または運動機能障害を処置するための医薬として有用であることが見出された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態を説明する。もっとも、以下の記載は、本発明を具体的に説明するためのものであって、本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。
【００１３】
上記したように、本発明の一の側面によると、外傷性神経障害および／または運動機能障害を処置するための経鼻投与用医薬であって、有効量のヒアルロナンを含む医薬が提供される。
【００１４】
本発明において、ヒアルロナンは、交互にグリコシド結合したＤ−グルクロン酸とＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンとを含む多糖、もしくはその誘導体、または薬学的に許容されるその塩である。特に、ヒアルロナンは、Ｄ−グルクロン酸の１位とＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンの３位との結合が、存在する場合、β１−３結合であり、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンの１位とＤ−グルクロン酸の４位との結合が、存在する場合、β１−４結合であることが好ましい。
【００１５】
また、上記誘導体には、構成要素中のＤ−グルクロン酸および／またはＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンの少なくとも１つが、これらの不飽和糖であるものが含まれる。特に、上記誘導体には、構成要素中の非還元末端糖が、その不飽和糖であるものが含まれる。特に、上記誘導体には、非還元末端に位置するＤ−グルクロン酸が、その４，５位炭素間が不飽和である不飽和糖であるものが含まれる。また、上記誘導体には、構成要素中の少なくとも１つの水酸基が保護基により保護されているものが含まれる。保護基は、加水分解性であることが好ましく、例えばアシル基（ＲＣＯ−（式中、Ｒは、低級アルキル、好ましくはＣ1〜Ｃ6アルキルを示す。）であってもよい。
【００１６】
また、本発明においては、ヒアルロナンは、薬学的に許容される塩であってもよい。具体的には、薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリ（ｎ−ブチル）アミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、アミノ酸塩等のアミン塩などが含まれる。
【００１７】
また、本発明において、ヒアルロナンは２糖以上の多糖である。すなわち、本発明に用いることができるヒアルロナンは、２糖程度の低分子のヒアルロナンから、重量平均分子量４００万程度の高分子量のヒアルロナンまで含む。特に、組織における浸透性などの点で優れるため、ヒアルロナンは、重量平均分子量３８０程度〜９００，０００程度のものが好ましい。特に、ヒアルロナンは２〜６０糖であることが好ましく、４〜２０糖であることが好ましく、４糖であることが最も好ましい。なお、本明細書において、重量平均分子量は、ＧＰＣ法によるポリスチレン換算値をいうものとする。
【００１８】
特に、ヒアルロナンは、（１）Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、（２）Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−Ｄ−グルクロン酸、もしくはこれらの誘導体、または薬学的に許容されるこれらの塩であることが好ましい。
【００１９】
本発明にかかる医薬は、単一の種類のヒアルロナンのみを含んでもよく、また複数種類のヒアルロナンを含んでもよい。
【００２０】
なお、これらの種々のヒアルロナンは、特許文献１(WO2002/004471)において、その物性および調製方法が詳細に示されている。
【００２１】
ヒアルロナンは、特許文献１(WO2002/004471)に記載の方法を含め、公知の種々の方法により調製することができる。例えば、ヒアルロナンは、動物等の天然物や培養された微生物から抽出することができ、また、化学的または酵素的に合成することができる（Glycoconjugate J., (1993) p435-439、WO93/20827）。より具体的には、ヒアルロナンは、鶏冠、さい体、皮膚、関節液などの生体組織から公知の方法で抽出、精製することができる。また、ヒアルロナンは、ストレプトコッカス属等の細菌等を用いた発酵法によって製造することができる。
【００２２】
特に、分子量の低いヒアルロナンは、酵素分解法（例えばTawada A, Masa T, Oonuki Y, Watanabe A, Matsuzaki Y, Asari A, "Large-scale preparation, purification, and characterization of hyaluronan oligosaccharides from 4-mers to 52-mers.", Glycobiology, (2002) 12(7):421-6参照）、酸加水分解法、アルカリ分解法、加熱処理法、超音波処理法（Biochem., 33 (1994) p6503-6507）等の公知の方法によってより高分子のヒアルロナンを低分子化することで調製することができる。また、分子量の低いヒアルロナンは、化学的または酵素的に合成することでも調製することができる。
【００２３】
例えば、酵素分解法としては、ヒアルロナン分解酵素（ヒアルロニダーゼ（睾丸由来）、ヒアルロニダーゼ（Streptomyces由来）、ヒアルロニダーゼＳＤなど）、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣなどのヒアルロナンを分解する酵素をヒアルロナンに作用させてヒアルロナンオリゴ糖を生成する方法（新生化学実験講座「糖質ＩＩ−プロテオグリカンとグリコサミノグリカン−」p244-248、1991年発行、東京化学同人参照）などが挙げられる。また、アルカリ分解法としては、例えばヒアルロナンの溶液に１Ｎ程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加え、数時間加温して低分子化させた後、塩酸等の酸を加えて中和して、低分子量のヒアルロナンを得る方法などが挙げられる。
【００２４】
本発明にかかる医薬の有効成分であるヒアルロナンは、医薬として使用出来る程度に精製され、医薬として混入が許されない物質を含まないものであることが好ましい。
【００２５】
本発明にかかる医薬は、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、マウス、ラット等の哺乳動物における外傷性神経障害および／または運動機能障害を処置（例えば治療、進行抑制または予防）するのに有効である。特に、本発明にかかる医薬は、運動機能障害が神経障害によるものである場合に好適である。特に、本発明にかかる医薬は、神経障害が中枢神経の外傷によるものである場合に好適である。さらに、本発明にかかる医薬は、神経障害が脊髄損傷によるものである場合に好適である。脊髄損傷としては、外傷性脊髄損傷（椎体関節の脱臼または亜脱臼、脊椎骨折（線状骨折、圧迫骨折、圧挫骨折、完全横断損傷、不完全横断損傷、Brown-Sequard型損傷、急性脊髄前半部損傷、急性脊髄中心部損傷、高位頚髄損傷等）、脊椎変性疾患（脊椎症等）、脊椎炎症性疾患（脊椎炎、慢性関節リウマチ等）、腫瘍（脊髄腫瘍、脊椎腫瘍等）、血管性疾患（脊髄出血、隋外血管障害による脊髄麻痺等）、脊髄炎（クモ膜炎、ウイルス性脊髄炎、細菌性脊髄炎等）、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症等が挙げられる。脊髄損傷による神経障害としては、下半身の運動機能障害、半身不随、下半身麻痺、知覚障害、自律神経機能障害、反射の喪失、性機能の低下等が挙げられる。神経障害による運動機能障害としては、神経障害に基づいて起こるショック、呼吸麻痺、知覚麻痺、運動麻痺、反射の消失、自律神経麻痺等が挙げられる。なお、本発明にかかる医薬は、純然とした治療目的のみならず、疾患の予防、維持（悪化防止）、軽減（症状の改善）等を目的として適用することができる。
【００２６】
以下に詳細に説明するように、本発明者らによると、驚くべきことに、ヒアルロナンが、経鼻投与によっても、神経学的にラット脊髄損傷モデルにおいて治療効果を有することが見出された。経鼻投与実験に使用したラットモデルは、ピンセットによる脊髄の挫滅後、後肢感覚障害および運動機能障害を呈する。脊髄損傷直後にＨＡ４を経鼻投与することにより処置した場合、試験終了時（脊髄損傷後９日）において、Basso-Beeattie-Bresnahan（ＢＢＢ）スコア（非特許文献３:Basso DM et al参照）は、対照群と比較して、ＨＡ４  １０および２０ｍｇ／ｋｇ群で有意な高値、５ｍｇ／ｋｇ群では高値傾向が認められた。対照群と比較して、明らかな後肢運動機能の改善が認められた（実験例１、図２および３参照）。従って、ヒアルロナンは、経鼻投与によっても、外傷性神経障害および／または運動機能障害等の上記疾患の予防や症状改善に有効と考えられる。
【００２７】
また、ヒアルロナンは、炎症性サイトカインの発現抑制作用（実験例４参照）、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ発現増強作用（実験例５参照）が認められていることから、ヒアルロナンは、経鼻投与によっても、上記の炎症疾患の症状改善に有効であると考えられる。サイトカインは、細胞から放出され、免疫、炎症反応の制御作用、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、細胞増殖・分化の調節作用といった細胞間相互作用を媒介する蛋白性因子（多くは糖タンパク質）を総称した呼称である。サイトカインとしては、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子(TNF)等が知られている。一方、MAPキナーゼキナーゼキナーゼ(以下、MAPKKKと称する)は、MAPキナーゼシグナル伝達において、MAPキナーゼキナーゼ（以下、MAPKKと称する）をリン酸化する活性を有する。MAPKKKの中でもMAPKKK13は、ストレス応答性ＭＡＰキナーゼ(Stress responsive MAP kinase)（以下、SAPKと称する）経路に関与しており、ロイシンジッパー保有キナーゼ(Leucine zipper-bearing kinase)（以下、LZKと称する）とも呼ばれるキナーゼである。SAPKシグナル伝達経路は細胞外からの刺激を核に伝達し、遺伝子発現を調節することでストレス適応、アポトーシス、細胞増殖、癌化、分化、免疫応答などを制御することが知られている（非特許文献４〜６参照）。LZKは、混合系統キナーゼ(MLK: Mixed-lineage kinase)ファミリー(セリン/スレオニンキナーゼとチロシンキナーゼのハイブリッド型の触媒領域と、２つの隣接したロイシンジッパー構造によって特徴付けられる)に属するプロテインキナーゼである。LZKはセリン／スレオニンキナーゼ活性を有し、MAPKKであるMKK7を活性化するMAPKKKでありJNK/SPAK経路を特異的に活性化する。この経路においてスカフォールドタンパク質JIP-1と結合する（非特許文献４〜６参照）。LZKは膵臓ランゲルハンス島および脳に強く発現している（非特許文献４〜６参照）。さらにヒアルロナンにはシナプス伝達促進作用（実験例２参照）が認められていることから、ヒアルロナンは、経鼻投与によっても、上記の外傷性神経疾患および／または運動機能障害の予防や症状改善に有効であると考えられる。これらのことから、ヒアルロナンは脊髄損傷における損傷部位での神経細胞及び神経膠細胞の細胞死よりも、損傷部位近傍で起きうる２次的な損傷による炎症反応、それに伴うアポトーシスの誘導を阻害し、神経活動および細胞の活動を活発化させることにより脊髄損傷における治療を行うものであると考えられる。
【００２８】
本発明にかかる医薬は、処置に有効な量のヒアルロナンを含む。有効量は、対象とする疾患、被検体、患者の年令、健康状態、体重等に応じて適宜決定することができる。一般には、有効量は、０．０５〜５０ｍｇ／ｋｇ／日とすることができる。なお、本発明にかかる医薬は、１日１回または複数回に分けて投与することができる。なお、ヒアルロナンは、処置に有効な量において、ほとんどまたは全く細胞毒性を示さなかった。
【００２９】
本発明にかかる医薬は、経鼻投与用である。本発明者らにより、驚くべきことに、髄腔内投与のみならず、経鼻投与によっても、ヒアルロナンが上記処置に有効であることが見出された。これまでにヒアルロナンの経鼻投与による神経疾患等の処置を目的とした報告例（実験例）はみられない。また、以下のように、経鼻投与は他の投与経路と比較して利点が多いと考えられる。すなわち、経鼻投与によると、患者自身や救命救急の現場においての投与が可能である。また、経鼻投与は、抵抗感も少ないと考えられ、場所を選ばずに投与が可能である。さらに、経鼻投与は、侵襲性が現存の薬剤による投与経路と比較して極端に低く、痛みがないことから患者への肉体的な負担が大変軽い。代表的な現存の第一選択薬であるステロイドはその効果が疑問視されており、また副作用が強い事が知られている。また、侵襲性も高い。したがって、ヒアルロナンの経鼻投与用医薬は患者に対し、扱いやすい医薬となる。なおかつ、例えば脊髄損傷の第一の原因である交通事故において、種々問題はあるが救急車内および事故現場での投与が可能となれば、他の投与形態では早期処置が不可能であったが、本発明によるヒアルロナンの経鼻投与では早期処置が可能となる。このように、ヒアルロナンの経鼻投与は、急性期患者への初期治療として大変効果的であり、患者のＱＯＬ向上に大きく貢献するものである。ヒアルロナンが安価であることも併せると、本発明により、現存の医薬に比べて経済的な負担が非常に低く、医療経済的にも大変有用な医薬が提供されると考えられる。
【００３０】
本発明にかかる医薬は、経鼻投与に適した任意の剤型に製剤化することができる。例えば、経鼻投与に適した剤型は、液性製剤、固形製剤、エアゾール製剤等を含む。液性製剤は、溶液剤、懸濁液剤、乳液剤等を含む。溶液剤は、活性物質を溶媒に溶解させたものをいう。懸濁液剤は、必要に応じて懸濁化剤その他の適当な添加剤と共に、固形活性物質を溶媒中に分散させた液剤をいう。乳液剤は、溶解した活性物質を含む溶媒を、他の溶媒中に分散させた液剤をいい、油中水型、水中油型、水中油中水型、油中水中油型等いずれの型のものも含む。固形製剤は、粉末剤、顆粒剤等を含む。粉末剤は、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤またはその他の適当な添加剤と共に、活性物質を粉末状としたものである。顆粒剤は、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤またはその他の適当な添加剤と共に、活性物質を粒状としたものである。エアゾール製剤は、溶解した活性物質を含む溶媒または固体活性物質を、気体中に分散させるよう製剤化されたものをいい、例えば、活性物質を含む溶液、懸濁液などを、これと同一または別の容器に充填した液化ガスまたは圧縮ガスの圧力により、用時噴出して用いるよう製剤化されたものである。また、本発明にかかる医薬は、用時溶解型製剤とすることができる。より具体的には、例えば、本発明にかかる医薬は、活性物質を凍結乾燥物、真空乾燥物等とし、用時に、これを適切な溶解液により溶解して用いることができる。これらの各剤形への製剤化は、公知の種々の方法により行うことができる。
【００３１】
本発明にかかる医薬は、必要に応じて、担体、賦形剤その他の添加物をさらに含むことができる。その他の添加物には、例えば、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、増粘剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、安定化剤、保存剤（防腐剤）、ｐＨ調整剤、清涼化剤、抗酸化剤、湿潤化剤、粘着剤等が含まれる。当業者であれば、目的とする医薬用途や剤型に応じて、これらの添加物を適宜選択することができる。より具体的には、例えば、等張化剤には、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グリセリン、ソルビトールマンニトール、グルコース、ほう酸、白糖、ポリエチレングリコール、ツイーン８０、リン酸−水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどが含まれる。また、緩衝剤には、クエン酸ナトリウム、ほう酸、ほう砂、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどが含まれる。また、保存剤には、メチルパラベン等のパラベン類、塩化ベンザルコニウム等の逆性石けん類、ベンジルアルコール等のアルコール誘導体、ソルビン酸等の有機酸およびその塩類、フェノール等の保存剤などが含まれる。また、安定化剤には、システイン、チオソルビトール、酒石酸、クエン酸、炭酸ナトリウム、アスコルビン酸、グリシン、亜硫酸ナトリウムなどが含まれる。また、造粘剤には、グリセリン、ポリエチレングリコール、ソルビトール、マンニトール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース ナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニールアルコール、ポリビニールピロリドンなどが含まれる。また、懸濁剤には、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリエチレングリコール、ツイーン８０などが含まれる。
【００３２】
本発明にかかる医薬は、任意の経鼻投与用器具を用いて投与することができる。例えば、吸入器具や粉末噴霧器を用いることで、１回投与分の固形製剤を収容したカプセルに孔を開け、吸入により、あるいは噴霧器により空気を導入することにより、経鼻投与することができる。また、スプレーを用いることで、液性製剤を経鼻投与することができる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明の実施例を、添付図面を参照しながら説明する。もっとも、以下の記載は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。
【００３４】
［実験例１：経鼻投与によるＨＡ４の脊髄損傷への効果］
〔脊髄損傷モデル作製〕
ラット脊髄損傷モデルは、Wistarラット（入荷時１１週齢、使用時１２週齢）を以下のように処置することで作製した。まず、ラットをペントバルビタール麻酔下に、頸部から胸部にかけて電気バリカンで剪毛し、７０％アルコールおよびイソジン（明治製菓株式会社製）で剪毛部位を清拭した。次に、背部皮膚を切開し、第５から第１０胸椎を露出後、第６胸椎を半椎弓切除した。次に、硬膜に小切開を加え、キシロカインで局所麻酔後、マイクロフォーセップ（先端を０．３ｍｍに加工）の先端を脊髄後索の幅（約１．５ｍｍ）で腹部側椎体にマイクロフォーセップの先端が接触するまで刺入し、マイクロフォーセップを１０秒間抓み、脊髄を挫滅した。挫滅処理の終了後、損傷部と周囲組織の隔離のために、ゼラチンスポンジ（Gelform、ファルマシア社製）を置き、創部を縫合した。
【００３５】
〔被験物質投与〕
本実験例では、１２５ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬおよび５００ｍｇ／ｍＬの濃度となるように２０％マンニトールに溶解したＨＡ４を用いた。これらのＨＡ４は、Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンの２Ｎａ塩である。図１に、本実験例で用いたＨＡ４のＥＳＩ−ＭＳ(Electoron Spray Ionization-Mass Spectorometory)による測定結果を示す。図１中、ｍ／ｚが７７５のピークがＨＡ４の塩でない状態のもの、７９７のピークがＨＡ４の１Ｎａ塩を表す。なお、対照として、２０％マンニトールを用いた。脊髄損傷直後にイトーマイクロシリンジ（５０μＬ）を用いて、鼻腔内に２回／日（午前・午後）投与した。投与液量は、１０μＬ／headを設定した。
【００３６】
〔行動学的評価〕
脊髄損傷後、９日間毎日、後肢運動機能検査を行った。Bassoらの方法に準じ、Basso-Beeattie-Bresnahan（ＢＢＢ）スケールを用いて、２人の試験者が盲目的に独立して評価を行い、その平均点を最終評点とした。なお、ＢＢＢスケールとは、２１段階に細分化された評点を用い、動物をオープンフィールド内で自由に歩行させ、後肢運動機能の回復を計測する評価方法である。後肢の自発的運動が全くみられない場合、評点は０となり、正常な後肢の運動がみられる場合は、評点は２１となる。
【００３７】
〔統計学的評価〕
ＢＢＢスコアにはノンパラメトリックDunnett'sの多重比較検定を用いた。
【００３８】
［結果および考察］
ＢＢＢスケールを用いた後肢運動機能検査においても、２０％マンニトール投与群と比較して、脊髄損傷後９日に、ＨＡ４の１０ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．００１）および２０ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．０５）での投与で有意な後肢運動機能の回復が認められた（図２、３）。また、ＨＡ４各群は順調な体重増加を示したが、２０％マンニトール群は体重増加抑制傾向が認められた（図４）。従って、ＨＡ４は経鼻投与においても、脊髄損傷により誘発される運動機能障害に対し改善効果を有するものと考えられる。
【００３９】
［実験例２：ＨＡ４のシナプス伝達促進作用］
本実験例では、ラット脊髄損傷モデルに、生理食塩液（生食群）またはＨＡ４を含む生理食塩液（ＨＡ４群）を髄腔内持続投与後、脊髄組織を採取し、抗Ｈｓｐ７２抗体および／または抗シナプトフィジン抗体にて免疫染色した。また、本実験例では、偽手術（Sham-operation）を施したラットを非損傷の対照とした（偽手術群）。
【００４０】
ラット脊髄損傷モデルは、Wistarラット（入荷時１１週齢、使用時１２週齢）を以下のように処置することで作製した。まず、ラットをペントバルビタール麻酔下に、頸部から臀部にかけて電気バリカンで剪毛し、７０％アルコールおよびイソジンで剪毛部位を清拭した。次に、背部皮膚を切開し、第５から第１０胸椎を露出後、第６胸椎を半椎弓切除した。次に、硬膜に小切開を加え、キシロカインで局所麻酔後、マイクロフォーセップ（先端を０．３ｍｍに加工）の先端を脊髄後索の幅（約１．５ｍｍ）で腹部側椎体にマイクロフォーセップの先端が接触するまで刺入し、マイクロフォーセップを１０秒間抓み、脊髄を挫滅した（以下、１次損傷部位と称す）。なお、ラット脊髄損傷モデルにおいては、１次損傷部位から、軸索の変性や細胞死などが伝播し、広がってできた損傷部位として定義される２次損傷部位が形成される。なお、２次損傷部位は、１次損傷部位に浸潤してきた炎症性細胞の作用も関与していると考えられている。
【００４１】
脊髄挫滅後、直ちにチューブの先端（ＯＤ：０．２５４ｍｍ）を損傷部頭側に留置後、浸透圧ポンプ（AlzetポンプModel 2004（Alza Corporation））を接続し、設定した投与期間で硬膜内持続投与を行った。損傷部と周囲組織の隔離のために、ゼラチンスポンジ（Gelform、ファルマシア）を置き、創部を縫合後、飼育ケージに戻した。
【００４２】
なお、偽手術群のラットは、硬膜切開し、その後、縫合することで作製した。
【００４３】
以上のように作製した偽手術群のラットを１群とした。また、ラット脊髄損傷モデルのラットのうち、生理食塩液を髄腔内持続投与したものを２群とした。さらに、ラット脊髄損傷モデルのラットのうち、ＨＡ４を含む生理食塩液を髄腔内持続投与したものを３群とした。これら群の構成を表６に示す。
【００４４】
【表１】
2008214216.tif 000002
【００４５】
なお、３群に投与したＨＡ４を含む生理食塩液は、上記Tawadaらの方法(Tawada A, et al. 2002)により調製した。
【００４６】
これら各群のラットを用いて、１次損傷部位および２次損傷部位の横断面の組織切片を作製し、ホルマリン固定後、通常の方法にて免疫染色を行った。Ｈｓｐ７２については、１次抗体として抗Ｈｓｐ７２抗体（アマシャム社製）を使用し、２重染色の場合には２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Texas Red標識抗ウサギＩｇＧ抗体）を使用した。また、シナプトフィジンについては、１次抗体として抗シナプトフィジン抗体（フナコシ社製）を使用し、２重染色の場合には２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体）を使用した。
【００４７】
〔結果〕
１次損傷部位および２次損傷部位におけるＨｓｐ７２の免疫染色試験の結果を、それぞれ図５および図６に示す。図５および図６において、ａ）は各群における組織切片の写真であり、ｂ）はＮＩＨイメージにより測定した各群の光強度を示す特性図である。図５および図６に示すように、Ｈｓｐ７２は、１群ではほとんど認められず、２群において軽度の染色性が認められ、３群ではさらに強い染色性が認められた。これら染色性については、１次損傷部位と２次損傷部位とで違いが認められなかった。
【００４８】
１次損傷部位および２次損傷部位におけるシナプトフィジンの免疫染色試験の結果を、それぞれ図７および図８に示す。図７および図８において、ａ）は各群における組織切片の写真であり、ｂ）はＮＩＨイメージにより測定した各群の光強度を示す特性図である。図７および図８に示すように、シナプトフィジンは、１群では強い発現が灰白質に中等度発現が白質に認められたが、２群ではその発現がほとんど認められなかった。これに対して３群では、１群に近い発現が認められた。この染色性については、１次損傷部位と２次損傷部位とで違いが認められなかった。
【００４９】
また、３群のラットについて、Ｈｓｐ７２およびシナプトアィジンの２重染色した結果を図９および図１０に示す。図９は、灰白質および白質の写真である。図１０の右側はＨｓｐ７２を赤色として示す写真（灰白質）であり、左側はシナプトフィジンを緑色として示す写真（灰白質）であり、中央は右側写真と左側写真を重ねた写真（灰白質）である。なお図１０の中央の写真において、Ｈｓｐ７２とシナプトフィジンが共に発現している場合には黄色となっている。図９に示すように、３群において、Ｈｓｐ７２はユビキタスな染色性を示した。一方で、図１０に示すように、Ｈｓｐ７２とシナプトフィジンとは一致した局在性を示した。
【００５０】
〔考察〕
ＨＡ４投与により脊髄損傷部位においてＨｓｐ７２発現が増強した。この場合、Ｈｓｐ７２は、ユビキタスに存在したが、シナプトフィジンと局在性を同じにしたことは特筆に値する。すなわち、シナプトフィジンは、シナプス小胞に存在しシナプス伝達に関与する。したがって、ＨＡ４は、シナプス小胞におけるＨｓｐ７２の発現増強を介して、シナプス小胞およびシナプトフィジンを保護することが考えられる（図１１における左側）。海馬シナプスにおける伝達効率の長期増強はスコポラミン(scopolamine)により抑制されるが、あらかじめ海馬を熱処理してＨｓｐ７０を誘導させておくとその抑制が起きないことが知られている(Lin YW, Yang HW, Min MY, Chiu TH. "Heat-shock pretreatment prevents suppression of long-term potentiation induced by scopolamine in rat Hippocampal CA1 synapses. Brain Res. 2004; 5; 999(2): 222-6.)。ＨＡ４によって発現増強されたＨｓｐ７２（Ｈｓｐ７０ファミリーのひとつ）も、シャペロンとしてシナプス伝達にかかわるタンパク質機能を介添えし、その機能を促進および回復させると考えられる。なお、シナプス小胞においてＨｓｐ７２発現を増強させる薬剤は現在まで報告が無い。本実験例によって、ＨＡ４が、シナプス小胞においてＨｓｐ７２発現を増強させる作用を有することが分かる。
【００５１】
［実験例３：［3Ｈ］標識ＨＡ４糖をサルに鼻腔内投与したときの頭部オートラジオルミノグラフィー］
ＨＡ４糖の鼻腔内投与時における薬効のメカニズムを推定することを目的に、［3Ｈ］標識ＨＡ４糖（3Ｈ−ＨＡ４糖）を腔内投与したサルの頭部オートラジオルミノグラム（ＡＲＬＧＭ）を作成した。
【００５２】
〔材料および方法〕
＜被験物質：放射性同位元素標識体＞
株式会社糖質科学研究所提供のＨＡ４を標識した［3Ｈ］標識ＨＡ４糖（パーキンエルマー製）を用いた（比放射能２６．６ＧＢｑ／ｍｍｏｌ（１．２ｍＣｉ／１．６７μｍｏｌ／ｍＬ＝４４．４ＭＢｑ／ｍＬ）、分子量８２０（Ｎａフォーム）、２％エタノール溶液）。
【００５３】
＜試験動物＞
株式会社新日本科学  安全性研究所（ＳＮＢＬ  ＤＳＲ）から入手した１匹のカニクイザル（雄性、３歳）を試験に供した。試験動物の体重は、２．５２ｋｇ（投与日投与前）であった。
【００５４】
＜投与液の調製法＞
［3Ｈ］標識ＨＡ４糖の２％エタノール溶液４ｍＬを分取し、減圧気流下で溶媒を留去した。得られた残留物を注射用水０．４ｍＬに溶解し、１０．７ｍｇ／３４４ＭＢｑ／ｍＬ（実測値）の投与液を調製した。
【００５５】
＜被験物質の投与＞
投与量および容量は１．０７ｍｇ／３４．４ＭＢｑ／０．１ｍＬ／ｂｏｄｙとし、単回鼻腔内投与を行った。フォーレン（イソフルラン）で麻酔した動物を仰臥位に寝かせ、鼻孔が天井を向くように頭部を保定した。カテーテルおよび注射筒を用いて、投与液１００μＬ／ｈｅａｄを左鼻腔内に投与した。投与後も保定および麻酔を維持した。また、投与後、一般状態を観察するとともにくしゃみをしないか観察した。
【００５６】
＜血漿中放射能濃度測定＞
（採血および血漿分離）
被験物質を投与後１５および３０分に、１０００ｕｎｉｔ／ｍＬのヘパリンナトリウムで内壁を処理したディスポーザブル注射筒および注射針を用いて、左又は右の大腿静脈から各時点約０．５ｍＬの血液を採取した。血液から血漿を遠心分離（設定：約９０００Ｘｇ，１分，４℃）した。
【００５７】
（測定用試料の調製方法）
血漿１００μＬをＰＥバイアルに分取し（ｎ＝１）、ハイオニックフロー約１０ｍＬを加え、総放射能濃度測定用試料とした。また、血漿１００μＬをＰＥバイアルに分取し（ｎ＝１）、窒素気流下で濃縮乾固した。乾固した血漿を超純水５００μＬに再溶解し、ハイオニックフロー約１０ｍＬを加え、不揮発性放射能濃度測定用試料とした。
【００５８】
＜脳脊髄液中放射能濃度測定＞
（採取）
被験物質を投与後３０分の採血後に、注射針を用いて、動物の頸背部から約０．８ｍＬの脳脊髄液を採取した。
【００５９】
（測定用試料の調製方法）
脳脊髄液１００μＬをＰＥバイアルに分取し（ｎ＝１）、ハイオニックフロー約１０ｍＬを加え、総放射能濃度測定用試料とした。また、脳脊髄液１００μＬをＰＥバイアルに分取し（ｎ＝１）、窒素気流下で濃縮乾固した。乾固した脳脊髄液を超純水５００μＬに再溶解し、ハイオニックフロー約１０ｍＬを加え、不揮発性放射能濃度測定用試料とした。
【００６０】
＜頭部オートラジオルミノグラフィー＞
（動物の処置）
投与後３０分の採血後に過用量のペントバルビタールナトリウム水溶液（６４．８ｍｇ／ｍＬ，２ｍＬ／ｋｇ）を橈側皮静脈から静脈内投与した。過麻酔死後、バリカンで除毛して、５ｗ／ｖ％  カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ  Ｎａ）水溶液を口腔および耳孔につめ、鼻孔に塗布した後、頭部にゴム手袋を被せ、ドライアイス・ヘキサン浴中で全身を凍結した。凍結時間は約３０分間とした。凍結後は乾燥を防ぐためアルミ箔およびプラスチックフィルムを巻き，ポリ袋に入れて冷凍（実測値：−２４．４〜−１７．８℃）で２４時間以上保存して凍結固定した。
【００６１】
（凍結ブロックの作製）
凍結固定した動物の首および耳介をバンドソー（２５０型、近江屋製作所）で切断した。頭部の表面に３ｗ／ｖ％  ＣＭＣ  Ｎａ水溶液を塗布した。次いで、５％  ＣＭＣ  Ｎａ水溶液に包埋してドライアイス・ヘキサン浴中で凍結させ、凍結ブロックを作製した。凍結ブロックは、切片採取時まで冷凍（実測値：−２３．６〜−２０．３℃）で保存した。
【００６２】
（凍結切片の採取および露出）
クライオミクロトーム（Leica CM3600、Leica Instruments GmbH、庫内温度設定値：−２０℃）を用いて、各凍結ブロックから厚さ４０μｍの頭部凍結切片を得た。得られた切片をクライオミクロトーム庫内（庫内温度設定値：−２０℃）で凍結乾燥させた。乾燥切片を台紙に貼り、イメージングプレート（ＩＰ）に密着させ、２４または４８時間露出させた。露出終了後、直ちにバイオイメージングアナライザー（BAS-2500、富士写真フイルム株式会社）で読み取りを行い、ＡＲＬＧＭを作製した。データ処理ソフトとして、Image Reader Version 2.2およびImage Gauge Version 4.0（富士写真フイルム株式会社）を用いた。
【００６３】
＜放射能の測定および結果の表示＞
（液体シンチレーションアナライザーによる放射能の測定）
試料中およびＢＫＧの放射能を液体シンチレーションアナライザー（TRI-CARB 2700TR、株式会社パーキンエルマージャパン）で測定した。測定時間は２分間とした。ＢＫＧ試料は、ハイオニックフロー約１０ｍＬをＰＥバイアルに分取したもの（ｎ＝３）とした。外部標準線源法により計数効率を補正した。
【００６４】
（投与液中放射能濃度）
投与液中放射能濃度は、測定値からＢＫＧを差し引いた後、放射能濃度（ＭＢｑ／ｍＬ）を求め、投与液中放射能濃度とした。
【００６５】
（血漿および脳脊髄液中放射能濃度）
血漿、脳脊髄液中放射能濃度は測定値からＢＫＧを差し引いた後、投与液の比放射能から未変化体に換算（ｎｇ  ｅｑ．／ｍＬ）した。
【００６６】
〔結果および考察〕
サルに［3Ｈ］標識ＨＡ４糖を約１．０７ｍｇ／ｂｏｄｙの用量で鼻腔内投与し、ＨＡ４糖の吸収について検討を行った。まず、サルに［3Ｈ］標識ＨＡ４糖を投与後１５および３０分の血漿および投与後３０分の脳脊髄液を採取し、血漿および脳脊髄液中放射能濃度を測定した。なお、本試験で使用した［3Ｈ］標識ＨＡ４糖は3Ｈ−Ｈ交換により3Ｈ標識しており、生体内でトリチウム水が生成する可能性が考えられることから、各試料中の放射能濃度は、総放射能濃度およびトリチウム水を除いた不揮発性放射能濃度を測定した。
【００６７】
表２および３に、3Ｈ−ＨＡオリゴ糖をカニクイザルに単回鼻腔内投与した後の血漿および脳脊髄液における放射能濃度を示す。
【表２】
2008214216.tif 000003
【表３】
2008214216.tif 000004
【００６８】
表２および３に示すように、投与後１５および３０分の血漿中総放射能濃度はそれぞれ８６．０および７９．９ｎｇ  ｅｑ．／ｍＬならびに不揮発性放射能濃度はそれぞれ７５．６および６７．９ｎｇ  ｅｑ．／ｍＬと血漿中放射能濃度はほぼ同じであり、約１０ｎｇ  ｅｑ．／ｍＬ相当の放射能がトリチウム水に置換されていることが確認された。投与後３０分の脳脊髄液中総放射能濃度は２０．８ｎｇ  ｅｑ．／ｍＬおよび不揮発性放射能濃度は７．０９ｎｇ  ｅｑ．／ｍＬであった。
【００６９】
図１２に、サルに［3Ｈ］標識ＨＡ４糖を鼻腔内投与後３０分の頭部ＡＲＬＧＭを示す。投与部位である嗅粘膜と嗅球に多量の放射能が分布し、背矢状静脈洞に僅かながら放射能の分布が見られた。
【００７０】
以上の結果、ＨＡ４糖は鼻腔内投与することにより脳内へ取り込まれることが明らかとなり、脳脊髄液内濃度は血漿中濃度の約１／１０になるものと推察された。このように、驚くべきことに、経鼻投与したＨＡ４は血液のみならず脳脊髄液に移行し、これにより、ＨＡ４が、経鼻投与した場合であっても髄腔内投与した場合と同様に脊髄損傷の治療に有効であることが分かる。
【００７１】
［実験例４：ＨＡ４の炎症性サイトカイン発現抑制作用］
本実験例では、ＨＡ４によるサイトカイン関連遺伝子およびケモカイン関連遺伝子の発現抑制作用を、遺伝子の発現促進および抑制をモニターすることができるＤＮＡチップを用いて評価した。
【００７２】
〔実験方法〕
まず、１、２群に分けてＫ５６２をＲＰＭＩ培地で培養した。両群は、４２℃で２０分、次いで３７℃で３０分の培養条件でインキュベートした。なお、２群の培地には、ＨＡ４を終濃度１０ｎｇ／ｍＬで添加した。
【００７３】
培養の後、１０００ｒｐｍで遠心分離して、培養液から培地を除去した。得られた細胞を−６０℃ディープフリーザーにて保存した。保存した細胞から、定法に従ってＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡチップにより遺伝子発現を解析した。ＤＮＡチップによる遺伝子発現解析はＤＮＡチップ研究所に外注した。詳細には、ＤＮＡチップ研究所製、商品名：AceGene Human Oligo Chip 30K l Chip Versionを使用した。
【００７４】
〔結果〕
ＤＮＡチップによる発現解析の結果、ＨＡ４を含む培地で培養した細胞においては、表４にあげる、細胞の賦活に関する多くの遺伝子の発現プロファイルに有意な変化が観察された。
【００７５】
【表４】
2008214216.tif 000005
【００７６】
表４に示すように、ＨＡ４処理によって、複数のサイトカイン関連遺伝子およびケモカイン関連遺伝子の発現が抑制されていることが明らかになった。表４に示したサイトカイン関連遺伝子およびケモカイン関連遺伝子のなかで、ＩＦＮ−γ遺伝子については、Schroder K, Hertzog PJ, Ravasi T, Hume DA, Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions. J Leukoc Biol. 2004 75(2):163-89.を参照することができる。また、Ｍｉｇ（ＣＸＣＬ９）遺伝子については、Farber JM, Mig and IP-10: CXC chemokines that target lymphocytes. J Leukoc Biol. 1997 61(3): 246-57.を参照することができる。また、ＩＬ−５遺伝子については、Adachi T, Alam R. The mechanism of IL-5 signal transduction. Am J Physiol. 1998 275(3 Pt 1):C623-33.を参照することができる。さらに、ＩＬ一１７ｂについては、LI H, Chen J, Huang A, Stinson J, Heldens S, foster J, Dowd P, Gurney AL, Wood WI, Cloning and characterization of IL-17B and IL-17C, two new members of the IL-17 cytokine family. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 18 97(2):773-8.を参照することができる。さらにまた、ＩＬ−１８ＲＡＰについては、Cheung H, Chen NJ, Cao Z, Ono N, Ohashi PS, Yeh WC, Accessory protein-like is essential for IL-18-mediated signaling. J Immunol. 2005 174(9): 5351-7.を参照することができる。さらにまた、ＣＣＬ２８については、Wang W, Soto H, Oldham ER, Buchanan ME, Homey B, Catron D, Jenkins N, Copeland NG, Gilbert DJ, Nguyen N, Abrams J, Kershenovich D, Smith K, McClanahan T, Vicari AP, Zlotnik A, Identification of a novel chemokine (CCL28), which binds CCR10 (GPR2). J Biol Chem. 2000 275(29): 22313-23.を参照することができる。さらにまた、ＩＬ−１βについては、Okamura H, IL-1 family (IL-1alpha/beta, IL-1Ra, IL-18), IL-16, IL-17, Nippon Rinsho, 2005 63 Suppl 4:226-33.を参照することができる。さらにまた、ＩＦＮ−ω１については、Bekisz J, Schmeisser H, Hernandez J, Goldman ND, Zoon KC, Human interferons alpha, beta and omega, Growth Factors, 2004 22(4):243-51.およびAdolf GR, Maurer-Fogy I, Kalsner I, Cantell K, Purification and characterization of natural human interferon omega 1. Two alternative cleavage sites for the signal peptidase. J Biol Chem. 1990 265(16):9290-5.を参照することができる。
【００７７】
〔考察〕
本実験例において、ＨＡ４の添加により、サイトカイン関連遺伝子およびケモカイン関連遺伝子の発現抑制が認められた。本実験例で使用したＫ５６２細胞は、白血球系の細胞であることから、本来的にサイトカイン関連遺伝子およびケモカイン関連遺伝子の発現がある。ＨＡ４はＨｓｐ７２発現を増強させる（非特許文献２:Xu H et al.）ことから、In vivoでは、そのＨｓｐ７２がγδＴ細胞に認識されてＩＬ−１０産生がおこり、そのＩＬ−１０が各種炎症性サイトカインやケモカイン産生を抑制することが考えられる。しかし、本実験例においては、γδＴ細胞を含まないことから、炎症や自己免疫疾患に関与するサイトカイン関連遺伝子およびケモカイン関連遺伝子の発現がＨＡ４により、直接抑制されたことが分かる。よって、ヒアルロナンが、脊髄損傷に伴う損傷部位及び近傍部における炎症反応を抑制し、２次的な損傷部位の拡大を抑制することが推察される。
【００７８】
［実験例５：ＨＡ４のＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ発現増強作用］
本実験例では、ＨＡ４によるＭＡＰＫＫＫ遺伝子の発現増強作用を、遺伝子の発現増強および抑制をモニターすることができるＤＮＡチップを用いて評価した。
【００７９】
〔実験方法〕
まず、１、２群に分けてＫ５６２をＲＰＲＩ培地で培養した。両群は、４２℃で２０分、次いで３７℃で３０分の培養条件でインキュベートした。なお、２群の培地には、ＨＡ４を終濃度１０ｎｇ／ｍＬで添加した。
【００８０】
培養の後、１０００ｒｐｍで遠心分離して、培養液から培地を除去した。得られた細胞を−６０℃ディープフリーザーにて保存した。保存した細胞から、定法に従ってＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを用いて、ＭＡＰＫＫＫ１３遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが固定化されたＤＮＡチップにより遺伝子発現を解析した。ＤＮＡチップによる遺伝子発現解析はＤＮＡチップ研究所に外注した。詳細には、ＤＮＡチップ研究所製、商品名：AceGene Human Oligo Chip 30K 1 Chip Versionを使用した。
【００８１】
〔結果〕
ＤＮＡチップを用いたＭＡＰＫＫＫ１３遺伝子の発現解析の結果として、１群における発現強度と２群における発現強度との比（〔２群の発現強度〕／〔１群の発現強度〕）を算出した。ＭＡＰＫＫＫ１３遺伝子について発現強度比は１１．４３であった。
【００８２】
〔考察〕
本実験例において、ＨＡ４の添加により、ＭＡＰＫＫＫ１３遺伝子の発現増強が認められた。本実験例では、Ｋ５６２以外の細胞が入っていないので、他の種類の細胞による影響は排除される。また、本実験例では、２０分の４２℃の熱ショック終了後、３７℃３０分のインキュベートの時点では、新規ｍＲＮＡ発現はあるものの、新規のタンパク質発現はほとんど起きていないと考えられる。例えば、Ｈｓｐ７２についてはｍＲＮＡ発現増強はあっても、タンパク質レベルでは変化がないと言える。したがって、本実験例で示したＭＡＰＫＫＫ１３遺伝子のｍＲＮＡ発現増強は、ＨＡ４による直接的な影響であり、他の因子を介した２次的現象ではないと言える。以上の結果からＨＡ４が、ＭＡＰＫＫＫ１３遺伝子に対して発現増強作用を有することが分かる。ＭＡＰＫＫＫ１３遺伝子は、SAPKシグナル伝達経路に関与するLZKである。SAPKシグナル伝達経路は、細胞外からの刺激を核に伝達することによってストレス適応、アポトーシス、細胞増殖、癌化、分化、免疫応答などを制御することが知られている。よって本実験例で得られた結果から、ヒアルロナンが、脊髄損傷に伴う２次損傷による神経細胞及び神経膠細胞の細胞死を抑制、制御することが推察される。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】実験例１〜５で用いたＨＡ４（実験例３については標識前のもの）のＥＳＩ−ＭＳ(Electoron Spray Ionization-Mass Spectorometory)による測定結果を示すグラフである。
【図２】脊髄損傷モデル動物において、損傷直後から９日間、ＨＡ４を経鼻投与した群および対照群におけるＢＢＢスコアの評価値（平均値）の推移を示すグラフである。損傷実施を１日目とする経過日数を横軸に、上述したＢＢＢスコアの評価値の平均値を縦軸に示す。Ｐ値は対照群（２０％マンニトール）に対するもので、ノンパラメトリックDunnett's法によった。
【図３】脊髄損傷モデル動物において、損傷直後から９日目の、ＨＡ４を経鼻投与した群および対照群におけるＢＢＢスコアの評価値（平均値）を示すグラフである。損傷実施から９日目における、上述したＢＢＢスコアの評価値の平均値を縦軸に示す。Ｐ値は対照群（２０％マンニトール）に対するもので、ノンパラメトリックDunnett's法によった。
【図４】脊髄損傷モデル動物において、損傷直後から９日間、ＨＡ４を経鼻投与した群および対照群における動物体重の測定値（平均値）の推移を示すグラフである。損傷実施を１日目とする経過日数を横軸に、動物体重の測定値の平均値を縦軸に示す。Ｐ値は対照群（２０％マンニトール）に対するもので、パラメトリックDunnett's法によった。
【図５】１次損傷部位におけるＨｓｐ７２の免疫染色の結果を示す図であり、（ａ）は染色後における各群の切片を撮像した写真であり、（ｂ）はＨｓｐ７２の免疫染色の光強度を測定した結果を示す特性図である。
【図６】２次損傷部位におけるＨｓｐ７２の免疫染色の結果を示す図であり、（ａ）は染色後における各群の切片を撮像した写真であり、（ｂ）はＨｓｐ７２の免疫染色の光強度を測定した結果を示す特性図である。
【図７】１次損傷部位におけるシナプトフィジンの免疫染色の結果を示す図であり、（ａ）は染色後における各群の切片を撮像した写真であり、（ｂ）はシナプトフィジンの免疫染色の光強度を測定した結果を示す特性図である。
【図８】２次損傷部位におけるシナプトフィジンの免疫染色の結果を示す図であり、（ａ）は染色後における各群の切片を撮像した写真であり、（ｂ）はシナプトフィジンの免疫染色の光強度を測定した結果を示す特性図である。
【図９】Ｈｓｐ７２およびシナプトフィジンの２重染色後の灰白質および白質を撮像した写真である。
【図１０】Ｈｓｐ７２およびシナプトフィジンの２重染色後の灰白質を撮像した写真であり、右側はＨｓｐ７２を赤色として示す写真であり、左側はシナプトフィジンを緑色として示す写真であり、中央は右側写真と左側写真を重ねた写真である。
【図１１】シナプスにおけるＨｓｐ７２の機能を説明するための模式図であって、左側は障害のあるシナプスを示し、右側はＨｓｐ７２により保護されたシナプスを示す。
【図１２】サルに［3Ｈ］標識ＨＡ４糖を鼻腔内投与後３０分の頭部ＡＲＬＧＭを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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