(57)【要約】【課題】  迅速かつ簡便な検出が可能な核酸の検出方法を提供する。【解決手段】  検体液中の標的核酸を検出する核酸検出方法であって、  標的核酸と会合する核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブと、検体液と、核酸凝集剤とを混合させた混合液を作製する工程と、  前記混合液における前記微小担体の凝集の有無もしくは程度を検知する工程と、を有することを特徴とする核酸検出方法。【選択図】  図１
2008104455.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体液中の標的核酸を検出する核酸検出方法であって、
標的核酸と会合する核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブと、検体液と、核酸凝集剤とを混合させた混合液を作製する工程と、
前記混合液における前記微小担体の凝集の有無もしくは程度を検知する工程と、
を有することを特徴とする核酸検出方法。
【請求項２】
前記標的核酸と会合する核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブと、検体液と、核酸凝集剤とを混合させた混合液を作製する工程が、
前記標識核酸プローブと前記検体液とを混合させた後に前記核酸凝集剤を添加して混合液を作製する工程であることを特徴とする請求項１に記載の核酸検出方法。
【請求項３】
前記標的核酸と会合する核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブと、検体液と、核酸凝集剤とを混合させた混合液を作製する工程が、
前記標識核酸プローブと、前記検体液と、核酸凝集剤とを同時に混合させる工程であることを特徴とする請求項１に記載の核酸検出方法。
【請求項４】
前記核酸プローブがペプチド核酸であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項５】
前記微小担体の凝集の有無もしくは程度を検知する工程が、前記混合液の色の変化を測定することによって行う工程であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項６】
前記核酸凝集剤は、前記核酸プローブそのものとは結合せず、前記標的核酸と前記標識核酸プローブとの会合体とは結合する物質であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項７】
検体液中の標的核酸を検出するための検査キットであって、
前記検査キットが、少なくとも一つの検査試薬を備え、
前記一つの検査試薬には、核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブが含まれていることを特徴とする標的核酸の検査キット。
【請求項８】
核酸凝集剤を含む検査試薬をさらに有することを特徴とする請求項７に記載の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の検出方法及び検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトをはじめとするさまざまな生物のゲノム等の塩基配列解析が精力的に進められ、その結果として、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、標的核酸の検出を通して、遺伝病、癌、感染症、生活習慣病等の診断、治療方針の決定、治療後の管理、予後予想等が行われるようになってきた。
【０００３】
標的遺伝子の検出に使用される技術として、ラテックス微粒子や金属コロイド粒子とＤＮＡとの複合体の凝集を用いる遺伝子診断が注目されている。
【０００４】
特許文献１では、核酸にインターカレートする性質と銀コロイドなどを凝集させる性質とを併せ持つ物質（遺伝子結合性凝集促進性物質）を用いて、分析対象試料中の標的核酸の有無を検出している。例えば、予めＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）法などによって標的核酸のみを増幅する処理を施した試料中に、遺伝子結合性凝集促進性物質と銀コロイド粒子とを添加する。試料中に標的核酸が存在する場合にはＰＣＲにより標的核酸が増幅され、遺伝子結合性凝集促進性物質のほぼ全てが標的核酸に結合する。その結果、銀コロイドは凝集しない。一方、試料中に標的核酸が存在しない場合には、試料中の核酸は増幅されず、遺伝子結合性凝集促進性物質のほとんどは試料中の核酸には結合しないことになる。その結果、銀コロイドが凝集する。特許文献１では、このような銀コロイドの凝集の有無を目視等で確認することによって、試料中に標的核酸が存在するか否かを判定することができる。
【０００５】
また、特許文献２では、金コロイドに固定化した一本鎖ＤＮＡプローブと標的ＤＮＡとが会合反応により相補鎖を形成した際に、金コロイドが凝集する性質を利用して、標的遺伝子の有無の検出を行っている。
【特許文献１】特開平１０−１１７７９８
【特許文献２】特開２００４−２７５１８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に記載の発明で使用される遺伝子結合性凝集促進性物質は、核酸特異的に結合する性質、例えば一本鎖または二本鎖の核酸を識別する性質を有しているが、核酸の塩基配列を認識して結合させることができない。それゆえ、配列特異的に標的核酸を検出するためには、予めＰＣＲ法等の遺伝子増幅法により標的核酸のみを増幅させておく必要がある。このように遺伝子増幅法を用いざるを得ないことから、特許文献１に記載の発明を、複数の遺伝子を検出する場合や標的核酸以外の遺伝子が多く含まれている試料中の標的核酸を検出する場合に応用することは難しい。
【０００７】
一方、特許文献２に記載の発明では、金コロイドが凝集するのは、標的ＤＮＡとＤＮＡプローブのＤＮＡとが同一の長さであって完全相補鎖である場合と、標的ＤＮＡとＤＮＡプローブの核酸とが同一の長さであって標的ＤＮＡに内側欠損がある場合である。したがって、標的ＤＮＡと非標的ＤＮＡを凝集により識別するためには、ＤＮＡプローブの自由末端側に塩基の置換がくるようにＤＮＡプローブの配列を設計する必要がある（特許文献２の表１参照）。さらに、特許文献２に記載の発明では、試料中の標的ＤＮＡの長さを調整する必要があるために、遺伝子増幅反応後の増幅産物の精製やプライマー伸張反応、第二の核酸プローブの会合反応等、多くの準備が必要であり、煩雑である。
【０００８】
本発明は、上記課題点を克服するものであり、微小担体を用いた標的核酸の簡便な検出方法と検査キットを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は、
検体液中の標的核酸を検出する核酸検出方法であって、
標的核酸と会合する核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブと、検体液とを混合させた混合液を作製する工程と、
前記混合液に核酸凝集剤を添加する工程と、
前記混合液における前記微小担体の凝集の有無もしくは程度を検知する工程と、
を有することを特徴とする核酸検出方法である。
【００１０】
前記標的核酸と会合する核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブと、検体液と、核酸凝集剤とを混合させた混合液を作製する工程が、
前記標識核酸プローブと前記検体液とを混合させた後に前記核酸凝集剤を添加して混合液を作製する工程であることが好ましい。
【００１１】
前記標的核酸と会合する核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブと、検体液と、核酸凝集剤とを混合させた混合液を作製する工程が、
前記標識核酸プローブと、前記検体液と、核酸凝集剤とを同時に混合させる工程であることが好ましい。
前記核酸プローブがペプチド核酸であることが好ましい。
【００１２】
前記微小担体の凝集の有無もしくは程度を検知する工程が、前記混合液の色の変化を測定することによって行う工程であることが好ましい。
【００１３】
前記核酸凝集剤は、前記核酸プローブそのものとは結合せず、前記標的核酸と前記標識核酸プローブとの会合体とは結合する物質であることが好ましい。
【００１４】
また、別の本発明は、
試料中の標的核酸を検出するための検査キットであって、
前記検査キットが、少なくとも一つの検査試薬を備え、
前記一つの検査試薬には、核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブが含まれていることが好ましい。
【００１５】
前記検査キットが、核酸凝集剤を含む検査試薬をさらに有することが好ましい。
【００１６】
また、別の本発明は、
試料中の標的核酸を検出する核酸検出方法であって、
核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブと前記標的核酸との会合体を形成する工程と、
前記会合体と核酸凝集剤とを反応させる工程と、
前記微小担体の凝集状態を検出する工程と、
を有することを特徴とする核酸検出方法である。
【００１７】
前記核酸プローブとしてはペプチド核酸が好適に用いられる。
【００１８】
前記微小担体の凝集状態は、溶液の色の変化を測定することによって検査することが好ましい。
【００１９】
前記核酸凝集剤としては、前記核酸プローブそのものとは結合せず前記会合体とは結合する物質を好適に用いることができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の検出方法及び検査キットを用いることによって、簡便な標的核酸の調整、および目視を含む簡易な検出方法によって、配列特異的に標的核酸の検出を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、
検体液中の標的核酸を検出する核酸検出方法であって、
標的核酸と会合する核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブと、検体液と、核酸凝集剤とを混合させた混合液を作製する工程と、
前記混合液における前記微小担体の凝集の有無もしくは程度を検知する工程と、
を有することを特徴とする核酸検出方法。
【００２２】
微小担体が凝集したことが検知された場合には、検体液中に標的核酸が存在するということになり、試料中に標的核酸が存在するということになる。
【００２３】
これらの工程は、通常溶液中で行われる。一般的には、試料溶液と標識核酸プローブ含有溶液とを混合して混合液を形成した後に、この混合液中に核酸凝集剤を添加する又は核酸凝集剤を含む溶液を添加するという順序で行われる。
【００２４】
なお、後述する例のように、核酸凝集剤と、前記標的核酸と前記標識核酸プローブからなる会合体との反応に比べて、核酸凝集剤と核酸との反応が著しく早い場合には、核酸プローブと検体液とを混合させて、核酸プローブと標的核酸との会合が十分に進んだ後にこれらの会合体を含有する溶液に核酸凝集剤を添加すべきである。一方、これらの反応の速度に大きな差がないような場合など会合していない標的核酸と凝集剤との反応を問題にしなくてよいような場合には、試料中に標識核酸プローブと核酸凝集剤とを同時又はほぼ同時に添加するような手法を採ることも考えられる。
【００２５】
本発明に係る測定方法の一実施形態の概略を、図を用いて説明する。なお、本実施形態は、以下の手順に従って検出を実施することができるが、この手順に限定されるものではない。
【００２６】
図１は、本実施形態における検出方法を示すものである。この図の左側には、核酸プローブ３と相補的な配列を持つ核酸（標的核酸１）を用いた検出例を、右側には、核酸プローブ３と相補的な配列を持たない核酸（非標的核酸２）を用いた検出例を、それぞれ示す。
【００２７】
まず、図１（ａ）に示すように、標的核酸１を含む検体液と非標的核酸２を含み標的核酸１を含まない検体液を用意する。次に、図１（ｂ）に示すように、遺伝子増幅反応やプライマー伸張反応、ディネーチャー反応等を利用し、それぞれの核酸（標的核酸１あるいは非標的核酸２）の１本鎖核酸を形成する。その後、核酸プローブ３を微小担体９に固定させたもの（以下、「標識核酸プローブ１０」と呼ぶ）をそれぞれの検体液に加えて混合液を作製し、会合反応を行う。図１（ｃ）に示すように、前記会合反応により核酸プローブ３と相補的な配列を持つ標的核酸１は会合して会合状態４を形成、即ち会合体を形成するが、前記核酸プローブ３と相補的な配列を持たない非標的核酸２は会合しない（非会合状態５）。その後、それぞれの溶液に核酸凝集剤６を添加し、混合液を作製する。核酸凝集剤６は、検体液の１本鎖および２本鎖核酸と結合し、核酸を凝集させる性質を有している。それゆえ、前記会合状態４が形成された溶液に核酸凝集剤６を添加した場合、標的核酸同士が標識核酸プローブ１０を含んだ状態で凝集するが（標識核酸プローブの凝集７）、前記非会合状態５の混合液に核酸凝集剤６を添加した場合、非標的核酸２のみが核酸凝集剤６により凝集し、標識核酸プローブ１０は凝集しない（標識核酸プローブの非凝集８）。ここで、本発明において、「会合」とは、同種の分子が分子間力や水素結合などの比較的弱い力で数個結合して会合体を形成し、一つの分子のようにふるまうことである。また、「凝集」とは、多数の分子などが、互いの間の引力によって集合し、大きな集合体となる現象である。
【００２８】
つまり、本実施形態では、試料中に標的核酸１が含まれている場合（言い換えれば、検体液中に標的核酸１が含まれている場合）、微小担体９は凝集し、含まれていない場合、微小担体９は凝集しない。そして、微小担体９の凝集の有無もしくは凝集の程度（言い換えれば凝集状態）は、肉眼による目視や吸光度測定器などの凝集状態検出器等で容易に検知できる。
【００２９】
前記微小担体の凝集の有無もしくは程度を検知する工程において、前記微小担体の凝集の有無を検知する場合は、目視による測定で行うことが簡便で望ましい。一方、凝集の程度を検知する場合は、混合液の色の変化を分光光度計による吸光度の測定により行う方法や、静置下で沈殿した凝集体の大きさまたは空隙の密度もしくは大きさを凝集状態検知器によって検知する方法を用いることもできる。このような手法により、検出対象溶液中の標的核酸濃度の正確な測定が可能となる。なお、凝集の有無もしくは程度は、顕微鏡観察、粒子からの散乱光の検知、電気化学的検出、表面プラズモン共鳴、磁気測定、または水晶振動子マイクロバランスなどの凝集状態検知方法によって検知することもできる。
【００３０】
＜核酸の種類＞
本発明の検出方法を適用することのできる標的核酸は、遺伝子増幅反応用のプライマーを設計することができ、そのプライマーを用いて遺伝子増幅反応を実施可能な塩基配列を有する核酸である限り、特に限定されるものではない。また、そのような核酸であれば、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれも利用でき、更に一本鎖および二本鎖のいずれの核酸も利用できる。そのような核酸が有する塩基配列としては検出対象である遺伝子配列の少なくとも一部を含むものが好適に適用できる。そのような配列を含む核酸の有無あるいは量を検出することにより、当該遺伝子の有無あるいはコピー数を調べることができる。核酸の由来は問わない。すなわち、天然の核酸（例えば、動物、植物、微生物、ウイルスに由来する核酸）、人工的に合成した核酸（例えば、化学的に合成した核酸、あるいは、遺伝子工学的に合成した核酸）のいずれも、標的核酸として利用することができる。なお、本明細書中では、何かしらの機能を発現するための塩基配列を遺伝子と呼んでいる。したがって、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）と遺伝子とは必ずしも上位概念・下位概念の関係にはない。
【００３１】
また、本発明の検出方法を適用することのできる試料は、標的となる核酸を含む可能性がある限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料あるいは、環境由来の試料を挙げることができる。生物学的試料としては、例えば、動物の体液（例えば、血液、血清、血漿、ずい液、汗、唾液、尿、精液など）もしくは、毛髪、排泄物、臓器、組織、または動植物それ自体もしくは、それらの乾燥体などを挙げることができる。環境由来の試料としては、例えば、河川水、湖沼水、もしくは海水、土壌などを挙げることができる。また、これらの試料が液体である場合には、これらの試料を検体液として用いることができるが、必要に応じて試料溶液の希釈、分離、精製を施してもよい。また、これらの試料が固体である場合には、試料を溶出したものを検体液として用いることができるが、必要に応じて試料溶液の希釈、分離、精製を施してもよい。
【００３２】
＜核酸プローブ＞
本発明に用いられる核酸プローブとしては、配列特異的に核酸と会合し、核酸凝集剤とは結合をしない物質であれば何でも良い。好ましい核酸プローブとしてはペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。合成の容易性の観点からは、核酸プローブの鎖長は１８ｍｅｒ以内であることが好ましい。また、核酸プローブの配列は、標的核酸の配列に応じて適宜決定することができる。なお、ペプチド核酸は、その構造中にリン酸ジエステル結合を有しないものである。すなわち、ペプチド核酸は、その名称中に「核酸」という文言を有してはいるものの、「核酸」の一種というわけではない。
【００３３】
また、標識核酸プローブの核酸としてペプチド核酸を用いる場合、標的核酸の１塩基変異を検出することもできる。これは、ペプチド核酸の認識能が高いことによるものである。ペプチド核酸の認識能が高いため、標的核酸に一塩基変異がある場合、標的核酸と標識核酸プローブは会合体を形成しない。したがって、そのような場合には、凝集が生じない。一方、標的核酸に変異がない場合は、前述したように、会合体を形成するため凝集する。よって標的核酸に変異がない場合と、標的核酸に一塩基変異が存在する場合を区別することができる（すなわち一塩基変異を検出することができる）。なお、このような１塩基変異は、塩基の置換、挿入または欠損など、いずれであっても検出することができる。なお、ここで、「標的核酸の１塩基変異」とは、標的核酸が有する塩基のうちの一つの塩基が置換もしくは欠損していること、または、標的核酸が有する塩基のうち塩基に一つの塩基が挿入（付加）されたことを指す。
【００３４】
＜微小担体＞
本発明に用いられる微小担体は、核酸プローブに固定できる微小物質であり、本手法の凝集反応の妨げにならない物質であれば何でもよく、例えば、金コロイド、銀コロイド、金や銀からなるナノロッドなどの微小金属構造体、磁気ビーズ、ポリスチレンビーズ、ガラスビーズ等があげられる。また、本発明に係る微小担体の大きさは、本手法の凝集反応の妨げにならない大きさであればどのようなものでも利用できるが、その平均径が５ｎｍ〜５０００ｎｍの範囲内にあることが好ましい。
【００３５】
微小担体表面への核酸プローブの固定は、既知のオリゴヌクレオチドの固定化方法等を利用することができる。例えば、微小担体に金コロイドを用いた場合、硫黄原子を持つ有機物中の硫黄原子が金などの金属の表面に共有結合することを利用する方法が挙げられる。この場合、予めチオール基を導入しておいた核酸プローブと金コロイドとを混合することで、金コロイドに核酸プローブを固定することができる。また、予め微小担体表面をシラン剤等でアミノ化、カルボキシル化、チオール化させておくことで、微小担体表面に核酸プローブを吸着法、カップリング反応等により固定することもできる。さらに、予めストレプトアビジンを微小担体に吸着させ、ビオチン修飾核酸プローブをストレプトアビジンに選択的に結合させて固定化する方法等も用いることもできる。
【００３６】
＜核酸凝集剤＞
本発明に用いられる核酸凝集剤は、核酸が１本鎖であるか、２本鎖であるかを問わず核酸に結合し、凝集する性質を有する物質である限り、特に限定されるものではない。核酸凝集剤の例としては、ヘキスト３３２５８［（Ｈｏｅｃｈｓｔ社）；２’−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２，５’−ビ−１Ｈ−ベンズイミダゾール（２’−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）−２，５’−ｂｉ−１Ｈ−ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ）］、ヘキスト３３３４２［（Ｈｏｅｃｈｓｔ社）；２’−（４−エトキシフェニル）−５−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２，５’−ビ−１Ｈ−ベンズイミダゾール（２’−（４−ｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）−２，５’−ｂｉ−１Ｈ−ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ）］、
ヌクレアイエロー［（ｎｕｃｌｅａｒ  ｙｅｌｌｏｗ；ＳＩＧＭＡ社）；４−［５−（４−メチル−１−ピペラジニル）［２，５’−ビ−１Ｈ−ベンズイミダゾール］−２’−イル］−ベンゼンスルホンアミド（４−［５−（４−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）［２，５’−ｂｉ−１Ｈ−ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ］−２’−ｙｌ］−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）］、ミトキサントロン［（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ；ＳＩＧＭＡ社）；１，４−ジヒドロキシ−５，８−ビス｛２−［（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］エチル｝アミノアントラセン−９，１０−ジオン（１，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−５，８−ｂｉｓ｛２−［（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ｝ａｍｉｎｏａｎｔｈｒａｃｅｎｅ−９，１０−ｄｉｏｎｅ）］を挙げることができる。これらは、リン酸ジエステル結合を持たないＰＮＡとは結合しない。
【００３７】
より、一般的には、核酸凝集剤として好適な物質は、標的核酸と核酸プローブとの会合体とは結合する一方で核酸プローブそのものとは結合しない（核酸と結合しない状態で存在する核酸プローブとは結合しない）物質である。すなわち、このような条件を満たす限り、核酸プローブと核酸凝集剤との組み合わせは任意に選択することができる。
【００３８】
＜検査キット＞
次に本発明の検査キットの好適な実施形態例について説明する。
【００３９】
本発明の検査キットは、検査試薬を少なくとも備えている。本発明の検査キットは、単数もしくは複数の検査試薬のみから構成されていても良いし、検査試薬以外に検査用の容器等を備えていても良い。検査試薬は、少なくとも核酸プローブ１と微小担体９とからなる標識核酸プローブ１０を有している。
【００４０】
本発明の検査キットの好適な実施形態例に備わる検査試薬は、核酸プローブ１と微小担体９とからなる標識核酸プローブ１０そのものあるいはこれを有する試薬と、核酸凝集剤６そのものあるいはこれを有する試薬とからなる。また、これらの試薬は、乾燥状態であっても、溶液状態であってもよく、反応促進試薬、界面活性化剤等が添加されていても構わない。
【００４１】
本実施形態例の検査キットは、検体液に前記検査試薬（標識核酸プローブ１０そのものあるいはこれを有する試薬および核酸凝集剤６そのものあるいはこれを有する試薬）をこの順序で添加して混合液を作製し、混合液中の標的核酸の有無によって生じる微小担体の凝集程度を測定すればよい。この順序で試薬を添加するのは、核酸凝集剤と会合体との反応と比べて核酸凝集剤と核酸との反応が著しく早いからである。仮に、これらの反応の速度に大きな差がないような場合など会合していない標的核酸と凝集剤との反応を問題にしなくてよいような場合には検体液に標識核酸プローブと核酸凝集剤とを同時添加することが可能である。このような場合には、標識核酸プローブと核酸凝集剤との双方を有する試薬を用意してそれを添加することも考えられる。
【００４２】
このキットを用いれば、迅速かつ簡便な標的核酸の検出が可能となる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明の実施例を説明する。
【００４４】
（実施例１）
＜標識核酸プローブ溶液の調整＞
冷蔵状態にある、微小担体としての直径１５ｎｍの金コロイドが分散された金コロイド溶液を冷蔵状態から室温に戻し、その溶液（ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）０．９ｍｌと５０ｍＭ−ＫＨ２ＰＯ４０．１ｍｌとを混合して金コロイド溶液ａを用意する。
【００４５】
次に、３ｎｍｏｌのＮ末端にシステインを持つペプチド核酸（ＮＨ２−Ｃｙｓ−Ｏ−Ｏ−ＣＴＣＣＴＣＴＴＧＡＣＣＴＧＣ−Ｈ）（グライナージャパン製）と前記金コロイド溶液ａを混合し、室温で一晩反応させ混合液ｂを得る。次に、前記混合液ｂを１４０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離し、上清を取り除き、新たに５０ｍＭ−ＫＨ２ＰＯ４を１ｍｌ加える。再度、同じ条件で遠心分離操作を行い、この沈殿物を標識核酸プローブ溶液とする。
【００４６】
＜検出反応＞
調整した標識核酸プローブ溶液５μｌに、標的核酸（５’−ＡＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡ−３’）溶液（グナイナージャパン製）１０μｌを加えて、会合させる。次に、核酸凝集剤としての４００μＭ−Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（和光純薬製）５μｌを加えて、凝集を促す。
【００４７】
標的核酸を加えていない核酸プローブにＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８を加える場合、溶液は色の変化を示さない。一方、標的核酸を加え、核酸プローブと会合させると、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８の凝集作用により溶液は紫色に変化する。この色の変化は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８が標的核酸に結合し凝集する際、標的核酸に会合している核酸プローブに結合した金コロイドをも凝集させるために引き起こされる。それゆえ本実施例によれば、標的核酸の有無を簡便に検出することができる。
【００４８】
（実施例２）
＜標的核酸の準備＞
検査試料として、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）を用いてＰＣＲを行う。また標的核酸としては、Ｈｕｍａｎ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅをコードする遺伝子を選択する。
【００４９】
ＰＣＲはＰＣＲ増幅キット（ＴｏＹｏＢｏ製）を用いて、下記の条件にて行う。Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ：０．５μｌ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ：２．５μｌ、２ｍＭｄＮＴＰ：２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４：１．５μｌ、ＫＯＤ：０．５μｌ、Ｆ−Ｐｒｉｍｅｒ：１．５μｌ、Ｒ−Ｐｒｉｍｅｒ：１．５μｌ、Ｈ２Ｏ：１４．５μｌを混合し、９５℃：１５秒−６８℃：１５秒の温度サイクルを３５回繰り返す。
【００５０】
その後、アシンメトリックＰＣＲにより１本鎖核酸を増幅し、このＰＣＲ産物を検査試料とする。
【００５１】
＜核酸プローブの調整＞
ペプチド核酸の塩基配列を表１に示すものとした点を除いては実施例１と同様の方法により、表１に示す核酸プローブを有する標識核酸プローブの溶液を調整する。
【００５２】
【表１】
2008104455.tif 000003
【００５３】
これらの核酸プローブは、それぞれ以下のようなものである。
【００５４】
１１２ＴＧＣは、１１２番目のアミノ酸がシステインであるＨｕｍａｎ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅをコードする遺伝子の一部と相補的なペプチド核酸である。
【００５５】
１１２ＣＧＣは、１１２番目のアミノ酸がアルギニンであるＨｕｍａｎ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅをコードする遺伝子の一部と相補的なペプチド核酸である。
【００５６】
１５８ＴＧＣは、１５８番目のアミノ酸がシステインであるＨｕｍａｎ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅをコードする遺伝子の一部と相補的なペプチド核酸である。
【００５７】
１５８ＣＧＣは、１５８番目のアミノ酸がアルギニンであるＨｕｍａｎ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅをコードする遺伝子の一部と相補的なペプチド核酸である。
【００５８】
＜検出反応＞
表１に示す各核酸プローブを有する標識核酸プローブ溶液５μｌのそれぞれに、調整した前記ＰＣＲ産物（標的核酸）の溶液を１０μｌずつ加えて、会合反応を行う。次に、それぞれの溶液に核酸凝集剤としての４００μＭ−Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（和光純薬）を５μｌずつ加えて、凝集反応の有無を調べる。
【００５９】
表１に示すように、１１２ＴＧＣを有する標識核酸プローブ溶液および１５８ＣＧＣを有する標識核酸プローブ溶液は溶液の色変化を示すが、１１２ＣＧＣを有する標識核酸プローブ溶液および１５８ＴＧＣを有する標識核酸プローブ溶液は溶液の色変化を示さない。
【００６０】
つまり、試料中の標的核酸は、Ｈｕｍａｎ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅをコードする遺伝子のうち、アミノ酸配列１１２番目に相当する１塩基置換部位の塩基がＴ、１５８番目に相当する１塩基置換部位の塩基がＣであることを意味し、これは１１２番目がシステイン、１５８番目がアルギニンであると分かる。なお、この組み合わせはε３型と呼ばれ、Ｈｕｍａｎ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ３をコードする型である。また、アルツハイマー病及び心血管疾患の非常に強い危険因子であることが知られているε４は、１１２番目、１５８番目が共にアルギニンとなっている。
【００６１】
このように、本実施例によれば、１塩基置換の有無も簡便に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】（ａ）〜（ｄ）は、本発明の一実施形態にかかる検査方法を示す工程図である。
【符号の説明】
【００６３】
１  標的核酸
２  非標的核酸
３  核酸プローブ
４  会合状態
５  非会合状態
６  核酸凝集剤
７  標識核酸プローブの凝集
８  標識核酸プローブの非凝集
９  微小担体
１０  標識核酸プローブ
【図１】
2008104455.tif 000004
【配列表】
2008104455000001.app