(57)【要約】【課題】簡便且つ高い感度や定量性をもつ測定方法の提供。【解決手段】標的物質を含む被験試料液に下記競合物質を混合した混合液を、下記競合的捕捉物質、下記判定物質の順に接触させる免疫反応工程と、前記競合的捕捉物質及び前記判定物質のうちの少なくとも一方に前記競合物質が備える酵素の基質を接触させて反応物を得る酵素反応工程と、前記反応物の量を測定して前記標的物質の量を算出する算出工程と、を有することを特徴とする。つまり、イムノクロマトグラフィーにおいて標的物質の濃度を定量するために酵素を結合させて、標的物質に相当する濃度を増幅することで検出感度を向上できた。なお、本測定方法は低分子量の標的物質に好適に適用することができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質を含む被験試料液に下記競合物質を混合した混合液を、下記競合的捕捉物質、下記判定物質の順に接触させる免疫反応工程と、
前記競合的捕捉物質及び前記判定物質のうちの少なくとも一方に前記競合物質が備える酵素の基質を接触させて反応物を得る酵素反応工程と、
前記反応物の量を測定して前記標的物質の量を算出する算出工程と、
を有することを特徴とする標的物質の測定方法。
競合物質：前記標的物質に結合しうる抗体、及び、前記標的物質若しくは類似する物質のうちの一方に、所定の基質反応を促進する酵素を結合した物質。
競合的捕捉物質：前記標的物質に結合しうる抗体、及び、前記標的物質若しくは類似する物質のうちの他方であり且つ接触させた前記混合液から分離可能な物質。
判定物質：前記競合物質に結合しうる抗体であり且つ接触させた前記混合液から分離可能な物質。
【請求項２】
前記標的物質及び前記判定物質の免疫反応におけるモル比（標的物質の検出感度）：（判定物質）は、１：１〜１：０．０１である請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記標的物質及び前記競合物質の免疫反応におけるモル比（標的物質の検出感度）：（競合物質）は、１：１〜１：０．００１であり、
前記標的物質及び前記競合的捕捉物質の免疫反応におけるモル比（標的物質の検出感度）：（競合的捕捉物質）は、１：１〜１：０．０１である請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記競合的捕捉物質及び前記判定物質は、固体担体上に固定化されている請求項１〜３のいずれかに記載の測定方法。
【請求項５】
標的物質を含む被験試料液に混合する下記競合物質と、
前記被験試料液及び前記競合物質の混合液を接触させる下記競合的捕捉物質と、
前記混合液を前記競合的捕捉物質の後に接触させる下記判定物質と、
前記競合的捕捉物質及び前記判定物質のうちの少なくとも一方に接触させる前記競合物質が備える酵素の基質を含む後処理液と、
を有することを特徴とする測定用キット。
競合物質：前記標的物質に結合しうる抗体、及び、前記標的物質若しくは類似する物質のうちの一方に、所定の基質反応を促進する酵素を結合した物質。
競合的捕捉物質：前記標的物質に結合しうる抗体、及び、前記標的物質若しくは類似する物質のうちの他方であり且つ接触させた前記混合液から分離可能な物質。
判定物質：前記競合物質に結合しうる抗体であり且つ接触させた前記混合液から分離可能な物質。
【請求項６】
前記標的物質及び前記判定物質の免疫反応におけるモル比（標的物質の検出感度）：（判定物質）は、１：１〜１：０．０１である請求項５に記載の測定用キット。
【請求項７】
前記標的物質及び前記競合物質の免疫反応におけるモル比（標的物質の検出感度）：（競合物質）は、１：１〜１：０．００１であり、
前記標的物質及び前記競合的捕捉物質の免疫反応におけるモル比（標的物質の検出感度）：（競合的捕捉物質）は、１：１〜１：０．０１である請求項５又は６に記載の測定用キット。
【請求項８】
前記競合的捕捉物質及び前記判定物質は、固体担体上に固定化されている請求項５〜７のいずれかに記載の測定用キット。
【請求項９】
前記競合的捕捉物質及び前記判定物質が固定された前記固体担体は同一の薄膜上に列設されている請求項８に記載の測定用キット。
【請求項１０】
標的物質を含む被験試料液に下記競合物質を混合した混合液を、免疫反応におけるモル濃度がそれぞれ異なる複数の下記競合的捕捉物質にそれぞれ独立して接触させた後に、それぞれ下記判定物質に接触させる免疫反応工程と、
前記競合的捕捉物質及び前記判定物質のそれぞれの組のうちの少なくとも一方に結合した前記競合物質の量を測定して前記標的物質の量を算出する算出工程と、
を有することを特徴とする標的物質の測定方法。
競合物質：前記標的物質に結合しうる抗体、及び、前記標的物質若しくは類似する物質のうちの一方。
競合的捕捉物質：前記標的物質に結合しうる抗体、及び、前記標的物質若しくは類似する物質のうちの他方であり且つ接触させた前記混合液から分離可能な物質。
判定物質：前記競合物質に結合しうる抗体であり且つ接触させた前記混合液から分離可能な物質。
【請求項１１】
標的物質を含む被験試料液に混合する下記競合物質と、
前記混合液をそれぞれ独立して接触させる物質であり且つ免疫反応におけるモル濃度がそれぞれ異なる複数の下記競合的捕捉物質と、
前記複数の競合的捕捉物質に接触させた前記混合液をそれぞれ独立して接触させる下記判定物質と、
を有することを特徴とする測定用キット。
競合物質：前記標的物質に結合しうる抗体、及び、前記標的物質若しくは類似する物質のうちの一方。
競合的捕捉物質：前記標的物質に結合しうる抗体、及び、前記標的物質若しくは類似する物質のうちの他方であり且つ接触させた前記混合液から分離可能な物質。
判定物質：前記競合物質に結合しうる抗体であり且つ接触させた前記混合液から分離可能な物質。
【請求項１２】
前記競合的捕捉物質及び前記判定物質は固体担体に固定化されており、
前記競合的捕捉物質及び前記判定物質はそれぞれ異なるモル濃度毎に並んで列設されている請求項１１に記載の測定用キット。
【請求項１３】
標的物質を含む被験試料液に混合する下記競合物質と、
前記混合液を一方から展開させて接触させる物質であり且つ混合する競合物質に対する免疫反応におけるモル当量よりも過剰量で且つ薄膜状に固定化されている下記競合的捕捉物質と、
を有することを特徴とする測定用キット。
競合物質：前記標的物質に結合しうる抗体、及び、前記標的物質若しくは類似する物質のうちの一方。
競合的捕捉物質：前記標的物質に結合しうる抗体、及び、前記標的物質若しくは類似する物質のうちの他方であり且つ接触させた前記混合液から分離可能な物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質を高感度且つ簡便な操作にて測定できる免疫測定方法及び測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、微量物質の測定方法として、様々な原理を利用した方法が開発されている（例えば、特許文献１及び２）。そのなかで近年、高感度測定法の１つとして免疫反応を応用した方法、例えば、イムノクロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡ法が開発されている。また、機器分析を用いた分析方法も提案されている。特にイムノクロマトグラフィーは操作が簡便な上、検出までの時間が短いことから様々な検査分野で利用されている。
【０００３】
イムノクロマトグラフィーは、サンプルとして調製されたクロマトチップや培地にサンプル溶液を浸すだけという簡便さが特長になっている。反応液が毛細管現象でメンブレン中を進み、メンブレンに埋没されている金コロイド標識抗体と結合して、更に下流の検出部でトラップ抗体と結合して、目的物質の存在有無を発現させる。
【０００４】
ここで、イムノクロマトグラフィーの特徴としては、金コロイド粒子の発色による検出が一般的であるので、検出下限がｐｐｍオーダー程度である。しかしながら、簡便性に優れるものの目視による定性検出が主であり定量性が乏しい。
【０００５】
ＥＬＩＳＡ法の特長としては、検出感度も概ね良好で、試験群にコントロールを加えることで定量が可能である点である。しかしながら、操作が煩雑であり、測定者の熟練度による誤差・ばらつきが大きい欠点がある。また、作業時間が数時間と長く使用する反応試薬や溶液量が多く必要である。
【０００６】
機器分析の特長としては、現行の技術の中では最も高い感度が期待できる点である。その反面、高額な設備が必要であり且つ高い専門知識を持つ技術者も必要である。また、検出感度が高いことから微量の不純物の影響を受けやすく、試験試料に煩雑な前処理を行う必要がある。
【特許文献１】特許第３００５３０３号公報
【特許文献２】特開２００４−１３８５５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記実情に鑑み完成されたものであり、イムノクロマトグラフィーの簡便さの上で、ＥＬＩＳＡ法や機器分析法のような高い感度や定量性をもつ測定方法や、その測定原理を応用した測定用キットを提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段及び発明の効果】
【０００８】
（１）上記課題を解決する本発明の測定方法は、標的物質を含む被験試料液に下記競合物質を混合した混合液を、下記競合的捕捉物質、下記判定物質の順に接触させる免疫反応工程と、
前記競合的捕捉物質及び前記判定物質のうちの少なくとも一方に前記競合物質が備える酵素の基質を接触させて反応物を得る酵素反応工程と、
前記反応物の量を測定して前記標的物質の量を算出する算出工程と、
を有することを特徴とする。
【０００９】
また、上記課題を解決する本発明の測定用キットは、低分子量の標的物質を含む被験試料液に混合する下記競合物質と、前記被験試料液及び前記競合物質の混合液を接触させる下記競合的捕捉物質と、前記混合液を前記競合的捕捉物質の後に接触させる下記判定物質と、前記競合的捕捉物質及び前記判定物質のうちの少なくとも一方に接触させる前記競合物質が備える酵素の基質を含む後処理液と、を有することを特徴とする。
【００１０】
ここで、競合物質、競合的捕捉物質及び判定物質は以下の通りである。
競合物質：前記標的物質に結合しうる抗体、及び、前記標的物質若しくは類似する物質のうちの一方に、所定の基質反応を促進する酵素を結合した物質。
競合的捕捉物質：前記標的物質に結合しうる抗体、及び、前記標的物質若しくは類似する物質のうちの他方であり且つ接触させた前記混合液から分離可能な物質。
判定物質：前記競合物質に結合しうる抗体であり且つ接触させた前記混合液から分離可能な物質。
【００１１】
つまり、イムノクロマトグラフィーにおいて標的物質の濃度を定量するために信号の化学的増幅が可能な酵素を結合させて、標的物質に相当する濃度を増幅することで検出感度を向上できた。なお、本発明方法のように競合反応を利用した測定方法は低分子量の標的物質に好適に適用することができる。ここで挙げた「低分子量」とは免疫反応において汎用されているサンドイッチ法が適用できない程度の分子量であるとの意味である。本発明の測定方法及び測定用キットにて採用したいわゆる競合法においては化学的な増幅が困難であると考えられていた。また、ここでいう「競合反応（競合法）」は、競合物質と標的物質とが可逆的に反応する狭義の競合反応（競合法）を含むのはもちろん、競合物質と標的物質とが結合してしまう阻害反応（阻害法）をも含む、広義の競合反応（競合法）のことである。
【００１２】
ここで、競合物質と競合的捕捉物質の存在比を測定対象である標的物質の想定される検出範囲を考慮して調節することで高い検出感度を実現することができる。
【００１３】
すなわち、前記標的物質及び前記判定物質の免疫反応におけるモル比（標的物質の検出感度）：（判定物質）は、１：１〜１：０．０１であることが望ましい。
【００１４】
また、前記標的物質及び前記競合物質の免疫反応におけるモル比（標的物質の検出感度）：（競合物質）は、１：１〜１：０．００１であり、
前記標的物質及び前記競合的捕捉物質の免疫反応におけるモル比（標的物質の検出感度）：（競合的捕捉物質）は、１：１〜１：０．０１であることが望ましい。ここで、標的物質の検出感度とは測定できる検出限界のモル数又はモル濃度である。
【００１５】
つまり、本発明方法のように競合反応を利用する測定方法では、標的物質及び競合物質と競合物質及び競合的捕捉物質との間、又は、標的物質及び競合的捕捉物質と競合物質及び競合的捕捉物質との間において、競合的に免疫反応が進行して標的物質の量に応じて競合物質が競合的捕捉物質に捕捉されている。このときに競合物質が競合的捕捉物質に捕捉された量を直接的乃至間接的に測定することで競合する標的物質の定量を行っている。従って、標的物質と競合物質と競合的捕捉物質との間には前述したような望ましい存在比が設定できる。
【００１６】
ここで、前記競合的捕捉物質及び前記判定物質は、固体担体上に固定化されていることが望ましい。固体担体の形態は限定されず、微粒子状、繊維状のものなどがある。特に、前記競合的捕捉物質及び前記判定物質が固定された前記固体担体は同一の薄膜上に列設されていることが望ましい。競合物質と混合した被験試料液をその薄膜上の競合的捕捉物質側から展開するだけで容易に標的物質の定量を行うことができる。なお、競合物質についても予め薄膜上に配置することもできる。
【００１７】
（２）上記課題を解決する本発明の測定方法は、低分子量の標的物質を含む被験試料液に下記競合物質を混合した混合液を、免疫反応におけるモル濃度がそれぞれ異なる複数の下記競合的捕捉物質にそれぞれ独立して接触させた後に、それぞれ下記判定物質に接触させる免疫反応工程と、
前記競合的捕捉物質及び前記判定物質のそれぞれの組のうちの少なくとも一方に結合した前記競合物質の量を測定して前記標的物質の量を算出する算出工程と、
を有することを特徴とする。
【００１８】
また、上記課題を解決する本発明の測定用キットは、低分子量の標的物質を含む被験試料液に混合する下記競合物質と、前記混合液をそれぞれ独立して接触させる物質であり且つ免疫反応におけるモル濃度がそれぞれ異なる複数の下記競合的捕捉物質と、前記複数の競合的捕捉物質に接触させた前記混合液をそれぞれ独立して接触させる下記判定物質と、を有することを特徴とする。
【００１９】
ここで、競合物質としては前記標的物質に結合しうる抗体、及び、前記標的物質若しくは類似する物質のうちの一方。競合的捕捉物質としては、前記標的物質に結合しうる抗体、及び、前記標的物質若しくは類似する物質のうちの他方であり且つ接触させた前記混合液から分離可能な物質。判定物質としては、前記競合物質に結合しうる抗体であり且つ接触させた前記混合液から分離可能な物質。
【００２０】
濃度を変化させた競合的捕捉物質を複数採用することで、標的物質に反応する濃度のダイナミックレンジが拡がることになる。特に、競合反応を利用する本発明方法においては標的物質の濃度が所定濃度以上になると競合物質が流れ出して判定物質に結合するようになる。その所定濃度は競合的捕捉物質の濃度に応じて決定されるので、競合的捕捉物質の濃度を複数採用することで、標的物質の濃度が推察できるようになる。すなわち、それら競合的捕捉物質の濃度に応じた標的物質の濃度を境にしてそれぞれの判定物質や競合的捕捉物質に結合する競合物質の量が大きく変化するので、標的物質の濃度を簡単に測定することができる。
【００２１】
ここで、前記競合的捕捉物質及び前記判定物質は固体担体に固定化されており、前記競合的捕捉物質及び前記判定物質はそれぞれ異なるモル濃度毎に並んで列設されていることが望ましい。
【００２２】
（３）上記課題を解決する本発明の測定用キットは、標的物質を含む被験試料液に混合する下記競合物質と、前記混合液を一方から展開させて接触させる物質であり且つ混合する競合物質に対する免疫反応におけるモル当量よりも過剰量で且つ薄膜上に固定化されている下記競合的捕捉物質と、を有することを特徴とする。
【００２３】
ここで、競合物質は前記標的物質に結合しうる抗体、及び、前記標的物質若しくは類似する物質のうちの一方であり、競合的捕捉物質は前記標的物質に結合しうる抗体、及び、前記標的物質若しくは類似する物質のうちの他方であり且つ接触させた前記混合液から分離可能な物質である。
【００２４】
つまり、競合物質に対して過剰量の競合的捕捉物質を薄膜状に固定化したものの一方から被験試料液及び競合物質の混合液を展開すると、標的物質の量が多いほど、展開を開始した側から離れた側に競合物質が結合・捕捉されることになるので、結合・捕捉された位置を測定することで標的物質の量を算出することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下に本発明の測定方法及び測定用キットについて詳細に説明する。本発明の測定方法及び測定用キットが測定対象とする標的物質は被験試料液中に含有されている。被験試料液は特に限定しないが適正な緩衝液にて調製されていることが望ましい。被験試料液としては免疫反応並びに検出・定量反応に影響を与えないようなものであれば含有していても構わないので精製の工程を簡略化することができる。標的物質としては特に限定しないが、低分子量化合物に対して好適に適用できる。
【００２６】
（第１実施形態：測定方法及び測定用キット）
本実施形態の測定方法は免疫反応工程と酵素反応工程と算出工程とを有する。免疫反応工程では被験試料液に競合物質を混合した混合液を競合的捕捉物質、判定物質の順に接触させる工程である。
【００２７】
競合物質は標的物質に結合しうる抗体、及び、標的物質若しくは類似する物質のうちの一方に、所定の基質反応を促進する酵素を結合した物質である。ここで、結合する酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの公知の酵素を採用することができる。競合物質は被験試料液に混合する形態の他、何らかの固体担体上に担持させることもできる。ここで、酵素は競合物質の量を酵素反応により定量する目的で競合物質に導入されているので、酵素反応工程時において競合物質に結合していれば充分である。つまり、当初（免疫反応工程以前）から共有結合などにより酵素を結合しておくことができるのはもちろん、アビジン−ビオチンの反応のように競合物質に対して特異的に酵素を結合させることが可能な反応を用いて、免疫反応工程より後で酵素反応工程より前に酵素を結合させる工程（例えば、酵素を導入できる試薬を用意し、その試薬を接触させ、必要に応じて競合物質に導入できなかった酵素を除去乃至失活させることで実現できる）を設けて後に結合させることもできる。
【００２８】
競合的捕捉物質は標的物質に結合しうる抗体、及び、標的物質若しくは類似する物質のうちの他方である。つまり、競合物質が標的物質に結合しうる抗体である場合には標的物質若しくは類似する物質であり、競合物質が標的物質若しくは類似する物質である場合には標的物質に結合しうる抗体である。この物質は混合液から分離可能な物質である。例えば、不溶性の固体担体上に固定化されることで分離可能にできる。固体担体としては特に限定しないが、シリカゲル、セルロースやそれらの誘導体などの微粉末や繊維状のものが例示できる。
【００２９】
判定物質は競合物質に結合しうる抗体である。例えば、競合物質が備える酵素に特異的に結合する抗体が挙げられる。判定物質も競合的捕捉物質と同様に混合液から分離可能な物質である。例えば、不溶性の固体担体上に固定化されることで分離可能にすることができる。
【００３０】
ここで、競合物質及び競合的捕捉物質の量としては特に限定しないが、標的物質の検出感度を基準として好適な範囲を設定することができる。具体的には標的物質及び競合物質の免疫反応におけるモル比（標的物質の検出感度）：（競合物質）は、１：１〜１：０．００１が好ましく、１：１〜１：０．０１がより好ましい。そして、標的物質及び競合的捕捉物質の免疫反応におけるモル比（標的物質の検出感度）：（競合的捕捉物質）は、１：１０〜１：０．０１が好ましく、１：１〜１：０．１がより好ましい。
【００３１】
競合的捕捉物質及び判定物質は固体担体上に固定化した上で薄膜上やキャピラリー内やカラム内などに列設することが望ましい。そして、混合液を競合的捕捉物質を配設した側から展開することで競合的捕捉物質、判定物質の順に混合液を接触させることができる。このような構成を採用する場合には競合物質についても競合的捕捉物質に至る前の部分に担持させておくことが望ましい。
【００３２】
被験試料液と競合物質との混合液は競合的捕捉物質に接触する際に被験試料液中に含まれる標的物質の量に応じて内部に含まれる競合物質が競合的捕捉物質に結合・捕捉される。すなわち、競合物質は標的物質が存在しない状態では競合的捕捉物質に結合・捕捉され、標的物質の量が増えるにつれて競合物質は競合的捕捉物質に結合せずに判定物質に流れていく。判定物質では競合的捕捉物質にて結合・捕捉されなかった競合物質が結合・捕捉される。
【００３３】
酵素反応工程は競合的捕捉物質及び判定物質のうちの少なくとも一方に基質（競合物質が備える酵素に対応するもの）を接触させて反応物を得る工程である。
【００３４】
算出工程は生成した反応物の量を測定することで標的物質の量を算出する工程である。反応物の量を測定する方法としては特に限定しない。例えば、吸光度や、蛍光の変化を測定することが挙げられる。吸光度や蛍光の測定方法としては画像解析による方法が例示される。反応物の量を定量した結果から標的物質の量を算出する。例えば、標的物質の算出は予め作成した検量線により行うことができる。
【００３５】
（第２実施形態：測定方法及び測定用キット）
本実施形態の測定方法は第１実施形態に記載した測定方法と概ね同じ方法であるが、以下の点で異なる。すなわち、競合的捕捉物質と判定物質とを、競合的捕捉物質の濃度を変化させて複数組、並列に有している点、競合物質として必ずしも酵素を結合していることが必須でない点、そして酵素反応工程が必須でない点の３点である。
【００３６】
つまり、異なる濃度をもつ競合的捕捉物質を並列に配置し、混合液を順次、反応させることで、競合的捕捉物質が飽和する濃度を変化させている。その結果、競合的捕捉物質の濃度に応じ、競合的捕捉物質から判定物質に競合物質が移動する際の被験試料液に含まれる標的物質の量がそれぞれ異なるものになり、標的物質の量の判断が簡単になる。
【００３７】
以下に、より具体的に説明する。本発明の測定方法は、競合物質（又は競合的捕捉物質）に対して、標的物質と競合的捕捉物質と（又は、競合物質と標的物質と）を競合して結合させ、競合的捕捉物質に結合できなかった競合物質の量を測定することで間接的に標的物質の量を測定するものである。従って、競合的捕捉物質の濃度を小さくすると、競合物質の量（濃度）及び標的物質の量（濃度）は変化しないので、標的物質の量が相対的に少なくても多くの競合物質が判定物質に流れて結合・捕捉されることになる。反対に、競合的捕捉物質の濃度を大きくすると、標的物質の量が相対的に少なくなるので判定物質に流れていく競合物質の量が少なくなる。つまり、競合的捕捉物質の濃度を大きくすると、標的物質の検出限界が大きくなった場合と同様に扱うことができるので、適正な段階で標的物質の量が検出できるように競合的捕捉物質の濃度を段階的に変化させることで、判定物質における競合物質の量を定量しなくても標的物質の量を判定することができる。
【００３８】
本実施形態では競合物質について酵素の存在を必須としないので、酵素を含有させて酵素増幅を行わないときには金コロイドなどの従来の構成をそのまま採用することができる。なお、望ましい形態として挙げられるのは、第１実施形態と同様に競合物質に酵素を結合させると共に、酵素反応工程を設ける形態である。
【００３９】
（第３実施形態：測定方法及び測定用キット）
本実施形態の測定用キットは競合物質と競合的捕捉物質とを有する。競合物質は第１実施形態や第２実施形態にて説明したものと同様の構成が採用できる。
【００４０】
競合的捕捉物質としては含有する化合物としては第１実施形態及び第２実施形態で説明したものと同様であるが、その配設する形態及び配設する量が異なっている。すなわち、競合的捕捉物質の量としては競合物質の量よりも過剰量としている。ここで、過剰量か否かの判断は免疫反応におけるモル比に基づいて決定する。過剰量としては、例えば、免疫反応におけるモル比に基づき、１倍超、１．５倍超、２倍超、２．５倍超、３倍超が挙げられる。このモル比は実験的にも算出することができる。
【００４１】
過剰量の競合的捕捉物質を薄膜状に固定化している。ここで、競合的捕捉物質は薄膜上に一様な濃度で固定化されていることが望ましい。
【００４２】
以上の構成をもつことから本発明の測定方法及び測定用キットは、標的物質の量が多くなるにつれて、競合物質が結合・捕捉される位置が変化していくことになり、その位置を測定することで標的物質の量を簡便に定量することができる。
【実施例１】
【００４３】
（標的物質としてのＰＣＢの検出）
・抗体−酵素複合体（競合物質）の調製
コプラナＰＣＢ抗体２ｍｇ／ＰＢＳに、０．１ｍｏｌ／Ｌのβ−メルカプトエチルアミンを５０μＬ加えて３７℃で９０分間静置した。その後、リン酸緩衝液（ｐＨ６、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いたゲルろ過にて抗体還元体を単離した。
【００４４】
アルカリフォスフォターゼを１ｍｇにＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを３０μＬ加えて１時間静置した。その後、脱塩カラムにて残存Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを除去し、マレイミド標識アルカリフォスフォターゼを得た。
【００４５】
抗体還元体とマレイミド標識アルカリフォスフォターゼとを等量混合することで両者は反応してアルカリフォスフォターゼ標識コプラナＰＣＢ抗体（ＡＰ標識コプラナＰＣＢ抗体）が得られた。
【００４６】
・競合的捕捉物質及び判定物質の薄膜上への固定化
競合的捕捉物質としてのジクロロベンゼン−ストレプトアビジン０．１μｇを滴下乾燥法により、薄膜上に固定化した（図１：Ｔ２）。そして、判定物質としてのanti-mouse抗体１μｇを滴下乾燥法により、薄膜上に所定間隔を空けて列設・固定化し（Ｔ１）、イムノクロマトデバイス（測定用キットの一部）とした。図１では薄膜にカバーが形成されているが、薄膜自身は方形である。カバーに形成された窓部１０から被験試料液などを滴下する。
【００４７】
・測定
既知濃度のＰＣＢ（ＫＣ−５００）をＤＭＳＯにて種々の濃度に希釈したものを被験試料液とした。ＡＰ標識コプラナＰＣＢ抗体を希釈緩衝液（１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％カゼイン）にて希釈し、１／１０量の被験試料液を添加した。室温にて３０分間反応を進行させた後に、イムノクロマトデバイスの競合的捕捉物質側に形成された窓部１０に７５μＬ滴下して展開時間として２０分間放置した（免疫反応工程）。その後、基質としてのＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ナカライテスク製）を付属の希釈緩衝液にて１／１００に希釈したものを後処理液として７５μＬ、被験試料液と同じように窓部１０に滴下した（酵素反応工程）。
【００４８】
判定物質における発色の程度をアイシン精機株式会社製のイムノサーバー（型番：ＡＩＳ−ＧＰ１００）にて測定し、ＰＣＢに対する検量線を作成した。発色の測定は波長５００ｎｍ〜６００ｎｍのフィルタを介して照射する緑色ＬＥＤを斜め４５°方向から２つ配置して光源として用い、サンプルの上方に配置されたフォトダイオードにて検知して行った。
【００４９】
・比較例（特許文献２参照）
酵素を結合させる代わりに、金コロイド粒子（平均粒径４０ｎｍ、ＢＢＩｎｔｅｒｅｎｅｔｉｏｎａｌ）を結合させた。結合方法はＢＢＩｎｔｅｒｅｎｅｔｉｏｎａｌのプロトコールに従い行った。得られた金コロイド粒子標識コプラナＰＣＢ抗体を競合物質に代えて採用して実施例１と同様にＰＣＢに対する検量線を作成した。
【００５０】
結果を図２に示す。図２より明らかなように、実施例１と比較例との間で２桁程度の感度の差が認められた。
【実施例２】
【００５１】
（標的物質としてのビオチンの検出）
・競合的捕捉物質及び判定物質の薄膜上への固定化
競合的捕捉物質としてのビオチン−ＢＳＡを３×１０-5ｍｏｌ、３×１０-6ｍｏｌ、そして３×１０-7ｍｏｌの３種類の量にてニトロセルロース製の薄膜上に固定化した。そして、判定物質としてのanti-Rabbit抗体を１ｍｇ／ｍＬの濃度で、ビオチン−ＢＳＡ抗体が固定化された薄膜上に所定間隔を空けて固定化してイムノクロマトデバイス（測定用キットの一部）とした。競合的捕捉物質及び判定物質の固定化はそれぞれを薄膜上に滴下した後、５０℃で１時間乾燥させることで行った。
【００５２】
・測定
・既知濃度のビオチン（標的物質）をＰＢＳ緩衝液により種々の濃度に希釈して被験試料液とした。競合物質としてのアルカリフォスフォターゼ標識抗ビオチン抗体（Rabbit由来：ＡＰ標識抗ビオチン抗体）を前述の希釈緩衝液により希釈を行った後に所定の量になるように（１０-11ｍｏｌ〜１０-5ｍｏｌ）、１／１０量の被験試料液を添加し、室温にて３０分間反応させた。
【００５３】
その後、イムノクロマトデバイスの競合的捕捉物質側に７５μＬ滴下して展開時間として２０分間放置した（免疫反応工程）。そして、基質としてのＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ナカライテスク製）を添付の希釈緩衝液にて１／１００に希釈したもの７５μＬを被験試料液と同じ場所に滴下した（酵素反応工程）。
【００５４】
判定物質における発色の程度を前述したアイシン精機株式会社製のイムノサーバーにて実施例１と同様の方法にて測定した。
【００５５】
結果を図３に示す。図３より明らかなように、競合的捕捉物質としてのビオチン−ＢＳＡの濃度が３×１０-5〜３×１０-7ｍｏｌの範囲内では低いほど望ましいことが分かった。そして、競合物質としてのＡＰ標識抗ビオチン抗体の濃度としては１０-10〜１０-7ｍｏｌ程度とすることが望ましく、１０-10〜１０-8ｍｏｌ程度とすることが更に望ましいことが分かった。
【００５６】
また、競合的捕捉物質としてビオチン−ＢＳＡを薄膜に固定する代わりに、抗ＢＳＡ抗体を固定し、競合反応として、ビオチン、ビオチン−ＢＳＡ、抗ビオチン抗体（ＡＰ標識）の３者を混ぜても良い。
【実施例３】
【００５７】
実施例１とほぼ同様の方法にて図４に示すようなイムノデバイスを調製した。具体的には実施例１におけるＴ２の位置に、競合的捕捉物質の量を変化させて固定化した（Ｔ２’）。そして濃度を変化させた競合的捕捉物質の下流側に量を変化させた判定物質をそれぞれ固定化した（Ｔ１’）。それぞれ３種類の競合的捕捉物質及び判定物質の組はそれぞれ独立して被験試料液が展開されるように間を区切り区画した。
【００５８】
・測定
マイクロチューブ内にてＡＰ標識ＰＣＢ抗体（競合的捕捉物質：１ｎｇ／ｍＬ）／ＰＢＳを１００μＬとＰＣＢが０．５ｐｐｍ、５ｐｐｍ、そして５０ｐｐｍ含有するＤＭＳＯ溶液（被験試料液）を１０μＬとを混合して１０分間静置した。その後、図４に示す窓部１１に全量滴下し、１０分間放置した。
【００５９】
続いて、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液１００μをＬ窓部１１から滴下し３０分間放置した。その結果、ＡＰ標識ＰＣＢ抗体が結合・捕捉されている部分が発色した。結果を図４（ａ）〜（ｃ）に併せて示す。図４（ａ）〜（ｃ）から明らかなように、競合的捕捉物質などを固定化した量が少ない部分が、より低い濃度の標的物質に反応してＴ１’の部分が発色した。順次、標的物質の濃度が上がるにつれて、競合的捕捉物質の濃度が高い部分に対応するＴ２’の部分が発色した。従って、目的とする範囲内且つ目的とする濃度にて発色が進行するように競合的捕捉物質などの濃度を設定することで機器などで発色の程度を測定しなくても目視にて速やかに被験試料液中に含まれる標的物質の量を測定できることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】実施例１及び２にて用いた測定用キットにおけるイムノデバイスの概略である。
【図２】実施例１と比較例との検量線を示すグラフである。
【図３】実施例２において測定した検出限界を示すグラフである。
【図４】実施例３にて用いた測定用キットのイムノデバイスの概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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