(57)【要約】【課題】従来に比べ感度の高い酵素免疫測定が可能な酵素免疫測定用素子、及び、これを備えた抗原抗体リアクターを提供する。【解決手段】流路を内部に有する孔が多数穿設されたものであって、前記流路同士が内部において交差している。そして、前記流路の内壁表面に、所定の抗体又は抗原を固定させることによって、酵素免疫測定用素子となる。また、抗原抗体リアクターは、前記酵素免疫測定用素子を平面上に複数配列してなる。この抗原抗体リアクターにおいては、酵素免疫測定用素子ごとに、固定される抗体又は抗原が異なるものとしてもよい。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路を内部に有する孔が多数穿設された酵素免疫測定用素子であって、
前記流路同士が内部において交差しているとともに、前記流路の内壁表面に所定の抗体又は抗原が固定されていることを特徴とする酵素免疫測定用素子。
【請求項２】
前記流路の内壁表面がニッケル又は白金の薄膜で被覆形成されたものであり、
前記薄膜の表面に前記抗体又は前記抗原が固定されていることを特徴とする請求項１に記載の酵素免疫測定用素子。
【請求項３】
請求項１に記載の酵素免疫測定用素子を平面上に複数配列してなり、
前記酵素免疫測定用素子ごとに種類の異なる抗体又は抗原が固定されていることを特徴とする多成分分析用の抗原抗体リアクター。
【請求項４】
前記酵素免疫測定用素子の流路表面が絶縁膜で被覆形成されたものであり、
前記絶縁膜における前記流路内側と反対側に、流路に沿って形成されている導電部と、
前記流路内を流れる液体があった際、前記導電部と前記液体とを電気的に接続自在な配線及びスイッチと、
前記スイッチと前記導電部との間の配線、又は、前記スイッチと前記液体との間の配線に設けられた電源とをさらに備えていることを特徴とする請求項３に記載の抗原抗体リアクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療、製薬分野における生化学分析や環境保全、食品・生物の検疫分野における分析方法のうち、簡便かつ局感度な方法として知られる酵素免疫測定法（ELISA法）に用いる酵素免疫測定用素子及び抗原抗体リアクターであって、特にミクロンレベルのマイクロ空間における抗原抗体反応とその前後の連続的な単位化学操作を利用したものに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、上記ELISA法に用いることができる酵素免疫測定用素子は公知である。例えば、下記特許文献１に開示されているプラスチックフィルターがある。
【０００３】
【特許文献１】特開平８−７５７４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、近年では、上記特許文献１に開示されているような素子（プラスチックフィルター）を用いた酵素免疫測定よりもさらに感度の高くかつ高速で行えるものが要求されている。
【０００５】
そこで、本発明の目的は、従来に比べ感度の高い酵素免疫測定が可能な酵素免疫測定用素子、及び、これを備えた抗原抗体リアクターを提供することである。
【課題を解決するための手段及び効果】
【０００６】
（１）  本発明は、流路を内部に有する孔が多数穿設された酵素免疫測定用素子であって、前記流路同士が内部において交差しているとともに、前記流路の内壁表面に所定の抗体又は抗原が固定されているものである。これにより、流路の表面積を従来よりも大幅に向上させると共に、液体が通過する際に発生するミキシング（混合）効果を奏することができる。その結果として、従来に比べ感度の高くかつ高速で行える酵素免疫測定が可能な酵素免疫測定用素子を提供できる。
【０００７】
（２）  上記（１）の酵素免疫測定用素子においては、前記流路の内壁表面がニッケル又は白金の薄膜で被覆形成されたものであり、前記薄膜の表面に前記抗体又は前記抗原が固定されていることが好ましい。これにより、流路表面に、所定の抗体又は抗原が高密度に安定して固定されるので、さらに酵素免疫測定における感度を向上できる。
【０００８】
（３）  本発明の抗原抗体リアクターにおいては、上記（１）の酵素免疫測定用素子を平面上に複数配列してなり、前記酵素免疫測定用素子ごとに種類の異なる抗体又は抗原が固定されている。これにより、多成分分析と多検体（多項目）の分析とを一度にすることができる。
【０００９】
（４）  上記（３）の抗原抗体リアクターにおいては、前記酵素免疫測定用素子の流路表面が絶縁膜で被覆形成されたものであり、前記絶縁膜における前記流路内側と反対側に、流路に沿って形成されている導電部と、前記流路内を流れる液体があった際、前記導電部と前記液体とを電気的に接続自在な配線及びスイッチと、前記スイッチと前記導電部との間の配線、又は、前記スイッチと前記液体との間の配線に設けられた電源とをさらに備えていることが好ましい。
【００１０】
上記（４）の構成により、複数の酵素免疫測定用素子の各流路においてエレクトロウェッティング現象を発生させて、所定の液体を酵素免疫測定用素子ごとに制御して流すことができる。その結果として、酵素免疫測定用素子ごとの酵素免疫測定の制御が可能な抗原抗体リアクターを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明の実施形態に係る酵素免疫測定用素子及び抗原抗体リアクターについて説明する。
【００１２】
＜第１実施形態（酵素免疫測定用素子）＞
図１は、本発明の実施形態に係る酵素免疫測定用素子の本体の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ写真）であって、（ａ）が斜視写真、（ｂ）が断面写真である。図２は、図１に示した酵素免疫測定用素子の本体の製造工程を順に示す図である。
【００１３】
図１（ａ）、図１（ｂ）に示すように、本実施形態に係る酵素免疫測定用素子の本体は、流路を内部に有する孔（５０μｍ以下の径）が多数穿設されたものであって、前記流路同士が内部において交差している。そして、図示しないが、この流路の内壁表面に、所定の抗体又は抗原を固定させることによって、本実施形態に係る酵素免疫測定用素子となる。この所定の抗体又は抗原の固定には、公知の手法（例えば、上記特許文献１の［００１０］に記載されているような手法）を用いることができるが、これらに限られない。
【００１４】
本実施形態に係る酵素免疫測定用素子の本体は、ポリメタクリル酸メチル、エポキシ系感光性樹脂、ポリテトラフルオロエチレン等の感光性樹脂を用いて形成されている。
【００１５】
本実施形態で用いられる抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。抗原としては、ノニルフェノール、ダイオキシン等の低分子化合物、腫瘍マーカーなどのタンパク質、ウィルス粒子、細胞などが挙げられる。
【００１６】
次に、図２を用いて、本実施形態に係る酵素免疫測定用素子の本体の製造方法を説明する。なお、ここでは、８０ｅＶ以上の光子エネルギーを有する軟Ｘ線もしくは硬Ｘ線を用いた感光性樹脂のリソグラフィー加工技術を用いる。
【００１７】
まず、所定数の孔が形成されているＸ線マスク１を、感光性樹脂２のＸ線３照射側表面に設置する。続いて、Ｘ線３照射方向に対し、Ｘ線マスク１及び感光性樹脂２を所定角度傾斜させてから、Ｘ線３をＸ線マスク１に向けて照射し、感光性樹脂２の所定部分を感光させ、感光部２ａを形成する（図２（ａ）参照）。次に、一旦、Ｘ線３の照射を止めてから、Ｘ線マスク１及び感光性樹脂２を逆に所定角度傾斜させ、再度、Ｘ線３をＸ線マスク１に向けて照射し、感光性樹脂２の所定部分を感光させ、感光部２ｂを形成する（図２（ｂ）参照）。そして、現像液を用いて、感光部２ａ、２ｂを溶解させ、交差する流路４を成形（現像）することによって、本実施形態に係る酵素免疫測定用素子の本体が完成する（図２（ｃ）参照）。また、この酵素免疫測定用素子の本体に、所定の抗体又は抗原を固定させることによって、本実施形態に係る酵素免疫測定用素子が完成する。
【００１８】
なお、上記製造方法では、単に１つの本体を製造する場合について説明したが、大量生産する場合は以下の方法を用いることができる。すなわち、まず、上記製造方法で図２（ａ）まで行った後、現像液を用いて、感光部２ａを溶解させる。そして、これに電鋳を行って、感光部２ａと同形状である突起部を有した酵素免疫測定用素子の本体製造用の金型を作製する。この金型を用いて、一度樹脂を斜めに打ち抜いて感光部２ａと同形状の孔を形成した後、この孔に再度挿し込んで、図２（ｂ）の感光部２ｂと同形状の孔を形成するように、再度樹脂を斜めに打ち抜くことによって、図２（ｃ）に表した酵素免疫測定用素子の本体を製造することができる（いわゆるエンボス加工）。したがって、上記金型により、酵素免疫測定用素子の本体を大量生産することができる。なお、金型の材料としては、ニッケル、金、白金、銅、モリブデン、タングステン、コバルト、及びこれらの合金等の金属が挙げられる。
【００１９】
次に、本実施形態に係る酵素免疫測定用素子の使用方法について説明する。酵素免疫測定用素子の孔の中へ「抗原となる被検物質と、当該被検物質と酵素もしくは蛍光標識された抗体を結合した複合体」を混合した溶液を導入し、酵素免疫測定用素子の流路中で保持させながら競合的に抗原抗体反応を行うことにより、被検物質の同定と濃度を測定する。なお、被検物質の同定と濃度の測定は、本実施形態に係る酵素免疫測定用素子の流路外に上記複合体を溶出させ、酵素反応による吸光度変化もしくは上記複合体からの蛍光を分光し、得られたスペクトルのピーク位置及び強度を測定することによって行う。ここで、「抗原となる被検物質と、当該被検物質と酵素もしくは蛍光標識された抗体を結合した複合体」の例としては、上述した抗原とパーオキシダーゼとの複合体、上述した抗体とパーオキシダーゼとの複合体などが挙げられる。また、パーオキシダーゼの代わりに、ホスファターゼ、βガラクトシダーゼなどのように反応産物が蛍光または吸光により検出可能な酵素、又は、ルシフェラーゼのように発光反応を触媒する酵素のいずれかを適用した複合体であってもよい。他の例としては、蛍光を発する低分子化合物と抗原（または抗体）との複合体が挙げられる。また、溶液の溶媒には、水又は／及び有機溶媒を用いる。
【００２０】
上記構成の本実施形態によれば、流路の表面積を従来よりも大幅に向上させると共に、液体が通過する際に発生するミキシング効果を奏することができる。その結果として、従来に比べ感度の高くかつ高速で行える酵素免疫測定が可能な酵素免疫測定用素子を提供できる。
【００２１】
なお、一変形例として、流路の内壁表面は、ニッケル又は白金の薄膜で被覆形成されたものであってもよく、この薄膜の表面に所定の抗体又は抗原が固定されていてもよい。これにより、流路表面に、所定の抗体又は抗原が高密度に安定して固定されるので、さらに酵素免疫測定における感度を向上できるとともに、高速で行うことができる。
【００２２】
＜第２実施形態（抗原抗体リアクター）＞
次に、本発明の実施形態に係る抗原抗体リアクターについて説明する。図３は、本発明の実施形態に係る抗原抗体リアクターの斜視図である。図４は、図３に示した抗原抗体リアクターの酵素免疫測定用素子における動作原理を説明するための断面図である。
【００２３】
抗原抗体リアクター１０は、複数の酵素免疫測定用素子１１が形成されている導電性材料からなるプレート１２と、１つの酵素免疫測定用素子１１につき１本接続された配線１３と、配線１３とプレート１２と直列に接続自在なスイッチ１５及び電源１６（図４参照）を備えている。なお、図３においては、スイッチ１５及び電源１６を図示していないが、スイッチ１５を制御できるコンピュータ装置１９の中にスイッチ１５及び電源１６の役目を果たす回路が組み込まれている。また、図３においては、「抗原となる被検物質と、当該被検物質と酵素もしくは蛍光標識された抗体を結合した複合体」である液状の検体１４が、それぞれの酵素免疫測定用素子１１の上に滴下されている状態を示している。
【００２４】
酵素免疫測定用素子１１は、上記第１実施形態とほぼ同構成のものであるが、図４に示すように、流路表面が絶縁膜（誘電体膜を含む）１７で被覆形成されている点が異なっている。また、それぞれの酵素免疫測定用素子１１の流路１８表面（絶縁膜１７）には、図示していないが、同一の所定の抗体又は抗原、若しくは、種類の異なる抗体又は抗原が固定されている。種類の異なる抗体又は抗原が固定されている場合には、多成分分析と多検体（多項目）の分析とを一度にすることができる。
【００２５】
なお、プレート１２に上述したエンボス加工を施すことによって、複数の酵素免疫測定用素子１１は形成される。ここで、一変形例として、１つ１つ酵素免疫測定用素子１１をエンボス加工で製造した後に集積して、抗原抗体リアクター１０を形成してもよい。
【００２６】
次に、抗原抗体リアクター１０の使用方法について説明する。まず、図３及び図４（ａ）に示すように、それぞれの酵素免疫測定用素子１１の上に、検体１４を滴下する。この状態（スイッチ１５がオフ）においては、検体１４は、酵素免疫測定用素子１１の流路１８の毛管力により保持されることになる。しかし、コンピュータ装置１９の命令によって、図４（ｂ）に示すように、電圧を印加（スイッチ１５がオン）して、酵素免疫測定用素子１１の流路１８の表面（絶縁膜１７）を親水化させることにより、検体１４と酵素免疫測定用素子１１表面と間の親和力が変化し、接触角に変化が現れ、流路１８内に検体１４を導くことができる。
【００２７】
本実施形態によれば、上記第１実施形態の酵素免疫測定用素子の効果を奏することができる。また、複数の酵素免疫測定用素子の各流路においてエレクトロウェッティング現象を発生させて、所定の液体を酵素免疫測定用素子ごとに制御して流すことができる。その結果として、酵素免疫測定用素子ごとの酵素免疫測定の制御が可能な抗原抗体リアクターを提供できる。
【００２８】
なお、本発明は、特許請求の範囲を逸脱しない範囲で設計変更できるものであり、上記実施形態に限定されるものではない。例えば、第２実施形態においては、エレクトロウェッティング現象を発生させて、検体を酵素免疫測定用素子ごとに制御して流す構成を示したが、これを用いずに、酵素免疫測定用素子ごとに検体の上から圧力をかけて、酵素免疫測定用素子の流路内に流す構成としてもよい。圧力のかけ方としては、例えば、酵素免疫測定用素子のそれぞれの上に、注入機構（注射筒とピストンとからなるもの）を１つずつ形成し、これを利用する方法が挙げられる。また、エレクトロウェッティング現象を起こしている際、同時に、注入機構を用いて酵素免疫測定用素子に圧力をかけてもよい。
【００２９】
また、上記第２実施形態においては、コンピュータ装置１９を用いて、スイッチ１５の制御を行ったがこれに限られず、手動でスイッチ１５の切り替えを行ってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の実施形態に係る酵素免疫測定用素子の本体の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ写真）であって、（ａ）が斜視写真、（ｂ）が断面写真である。
【図２】図１に示した酵素免疫測定用素子の本体の製造工程を順に示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る抗原抗体リアクターの斜視図である。
【図４】図３に示した抗原抗体リアクターの酵素免疫測定用素子における動作原理を説明するための断面図である。
【符号の説明】
【００３１】
１    Ｘ線マスク
２    感光性樹脂
２ａ、２ｂ    感光部
３    Ｘ線
４、１８    流路
１０    抗原抗体リアクター
１１    酵素免疫測定用素子
１２    プレート
１３    配線
１４    検体
１５    スイッチ
１６    電源
１７    絶縁膜
１９    コンピュータ装置
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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