(57)【要約】【課題】堅牢で、電気浸透流が制御可能な内壁修飾キャピラリを提供する。【解決手段】シリカ液作製液２０とポリマー２２を混合する手順と、混合液をキャピラリ１０内に注入する手順と、注入液をキャピラリ１０内で重合する手順とを含む製造方法により、内壁のシラノール基と共有結合したシリカ膜２４と、該シリカ膜２４に巻き込まれた状態で固定されたポリマー２２と、を有する内壁修飾キャピラリを製造する。この際、重合終了前に、注入液の一部をキャピラリ１０から流出させて、キャピラリ１０を中空化することができる。前記ポリマー２２は、正電荷を有するポリマーと、負電荷を有するポリマーの両者を含むことができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
内壁のシラノール基と共有結合したシリカ膜と、
該シリカ膜に巻き込まれた状態で固定されたポリマーと、
を有することを特徴とする内壁修飾キャピラリ。
【請求項２】
前記ポリマーが、正電荷を有するポリマーと、負電荷を有するポリマーの両者を含むことを特徴とする請求項１に記載の内壁修飾キャピラリ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の内壁修飾キャピラリの製造方法であって、
シリカ膜作製液とポリマーを混合する手順と、
混合液をキャピラリ内に注入する手順と、
注入液をキャピラリ内で重合させる手順と、
を含むことを特徴とする内壁修飾キャピラリの製造方法。
【請求項４】
重合終了前に、注入液の一部をキャピラリから流出させて、キャピラリを中空化することを特徴とする請求項３に記載の内壁修飾キャピラリの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内壁修飾キャピラリ、及び、その製造方法に関する。特に、キャピラリ電気泳動法等で用いられる毛細管の内壁に種々の高分子を不可逆的にしかも堅牢に固定化された内壁修飾キャピラリ、及び、その製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キャピラリ電気泳動（以下ＣＥ）は、内径１００μｍ以下の毛細管の中で行う電気泳動の総称であり、超高分離能、高速性、微小規模等の特徴を有することから、ＤＮＡの塩基配列を決定するＤＮＡシークエンシング、食品・薬品分析をはじめ、多くの分野で使われている。最近では、特許文献１のように、質量分析（以下ＭＳ）と直結させたＣＥ−ＭＳが、メタボローム分析システムに使われる等の更なる応用研究も行われている。
【０００３】
分離に用いられる毛細管は、通常溶融石英ガラスが用いられており、中性条件下では、シラノール基の乖離により電気浸透流が発生する。この電気浸透流自体がＣＥにおける分離そのものを調節する重要なパラメータであるが、これを完全に制御できる手段は、今のところ存在しない。
【０００４】
今までに種々の内壁修飾（コーティングとも称する）キャピラリが開発され、市販されている。親水性ポリマーを共有結合させた物や、物理的に吸着させた物がある。例えば、特許文献２には、内壁部に高密度電荷（正電荷又は負電荷）ゲルを化学結合で固定したフューズドシリカキャピラリを電気浸透流ポンプに用いることが記載され、特許文献３には、コーティングしていないシリカキャピラリに、荷電していない水溶性シリカ吸着ポリマーを吸着させて、電気浸透流を動的に抑制し、キャピラリ中の電気泳動による生体分子の分離の精度を高めることが記載されている。
【０００５】
一方、今回の発明者の一人が共同発明者である特許文献４や５で提案した、再現性の乏しい化学反応による被覆を避け、正負電荷を有するポリマーを交互に吸着させ、いわゆるＳＭＩＬＥコートキャピラリ（以下、単にＳＭＩＬＥキャピラリと称する）は、正電荷を有するポリマーを被覆した唯一の市販キャピラリであることから、ＣＥ−ＭＳを用いたメタボローム分析（アニオン分析）に必須のツールとなっている。
【０００６】
一方、本発明に関連する技術として、ケイ酸とホルムアミドの混合物を用いてクロマトグラフィ用充填カラムのフリットを作製することが非特許文献１に記載され、ケイ酸とホルムアミドの混合物を用いてシリカを作製する技術が特許文献６に記載されている。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−３５６９８号公報
【特許文献２】特開２００３−２７９５３６号公報
【特許文献３】特表平９−５０４３７５号公報
【特許文献４】特開平１０−２２１３０５号公報
【特許文献５】ＷＯ９８／２５１３７号公報
【特許文献６】米国特許第４０５９６５８号明細書
【非特許文献１】H.J.Cortes,C.D.Pfeiffer,B.E.Richter and T.S.Stevens,J.High Resolut.Chromatogr.Chromatogr. Commun.,10(1987)446.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来の内壁修飾キャピラリは、いずれも安定性に乏しく、又、ロット差が有る等、多くの問題を抱えており、価格の面からも実分析に耐えられるものではない。
【０００９】
ＳＭＩＬＥキャピラリは、その当時で最高の安定性・耐久性を実現したが、ポリマーの性質によっては、数十回の分析しか行うことができない場合が有るという問題点を有していた。
【００１０】
本発明は、前記従来の問題点を解消するべくなされたもので、堅牢で、電気浸透流が制御可能な内壁修飾キャピラリを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ケイ酸は、ある種の条件下で重合し、シリカゲルになることは古くから知られており、接着剤としても工業的に使われている。分離分析の分野でも、ケイ酸とホルムアミドの混合物を用いてクロマトグラフィ用充填カラムのフリットが作製されている（非特許文献１）。発明者は、そこに着目し、キャピラリ内にケイ酸とホルムアミド混合液を注入すれば、内壁のシラノール基と共有結合したシリカ膜を作製できると考えた。更に、ケイ酸−ホルムアミド混合液に正電荷を有するポリマーを混合しておけば、シリカ膜に巻き込まれた状態でポリマーを固定化できると考えた。実際、ポリブレンやＤＥＡＥデキストランをケイ酸−ホルムアミド混合液と混合してキャピラリ内で重合したところ、カソードからアノードへ電気浸透流を反転させたキャピラリを作製することができた。又、耐久性についても、弱アルカリ性下で数百回の分析に供することが可能となった。
【００１２】
本発明は、このような研究結果に基づいてなされたもので、内壁のシラノール基と共有結合したシリカ膜と、該シリカ膜に巻き込まれた状態で固定されたポリマーと、を有することを特徴とする内壁修飾キャピラリにより、前記課題を解決したものである。
【００１３】
前記ポリマーは、正電荷を有するポリマーと、負電荷を有するポリマーの両者を含むことができる。
【００１４】
本発明は、又、前記の内壁修飾キャピラリの製造方法であって、シリカ膜作製液とポリマーを混合する手順と、混合液をキャピラリ内に注入する手順と、注入液をキャピラリ内で重合させる手順と、を含むことにより、前記課題を解決したものである。
【００１５】
ここで、重合終了前に、注入液の一部をキャピラリから流出させ、キャピラリを中空化することができる。なお、二次元ネットワーク状の骨格と、その空隙（流路、マクロポア、スルーポア等と表現される）が一体となった構造を持つモノリス型シリカカラムのように、用途によっては、必ずしも中空化する必要はない。
【発明の効果】
【００１６】
本発明において、混合するポリマーはどのようなものでも可能であり、又、複数のポリマーを色々な割合で混ぜることも可能であるので、キャピラリ内壁の電荷密度を自由に変化させることが可能となる。即ち、電気浸透量を自由に設計できるようになる。従って、電気浸透量の微妙な調整によってのみ分離できていた分析も、高い再現性で実現可能となる。又、被覆が非常に堅牢であることから、例えばＣＥ−ＭＳによるアニオン分析の精度が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００１８】
本実施形態は、本発明をケイ酸−ポリマー被覆キャピラリの調製に適用したもので、以下、図１を参照して、その手順を説明する。
【００１９】
（１）図２（Ａ）に示すような断面構成のフューズドシリカキャピラリ（単にキャピラリとも称する）１０を適当な長さに切断する（ステップＳ１）。
【００２０】
（２）例えばシリンジポンプを用いて前記キャピラリを、例えば流速０．５０ｍｌ／時の、１Ｍ  ＮａＯＨ（例えば３０分）と蒸留水（例えば１５分）で順に洗浄する（ステップＳ２）。その後、例えば３０分放置する。
【００２１】
（３）キャピラリ内面を、例えば窒素ガスを用いて、例えば５分間乾燥させる（ステップＳ３）。
【００２２】
（４）シリカ膜作製液としての、リン酸カリウム溶液１００μｌ、蒸留水１００μｌ、ホルムアミド２０μｌに、ポリマーとして１０％ポリマー溶液４０μｌ（ポリブレン、ＤＥＡＥ−デキストラン）を混合したコート溶液を調製し、３分間撹拌する（ステップＳ４）。
【００２３】
（５）ポリマー２２を含むシリカ膜作製液２０でなる前記コート溶液を、図２（Ｂ）に示す如く、乾燥させたキャピラリ１０に注入する（ステップＳ５）。例えば５０ｃｍ長のキャピラリには１０分、１２０ｃｍ長のキャピラリには２０分間、一定流速（例えば０．５０ｍｌ／時）で流し続ける。
【００２４】
（６）３０分間放置して、キャピラリ１０内で重合させる（ステップＳ６）。
【００２５】
（７）余分なコート溶液を、例えばシリンジに詰めた空気で押し出して、図２（Ｃ）に示す如く、中空化する（ステップＳ７）。図において、２４はシリカ膜である。
【００２６】
（８）室温で一終夜乾燥させる（ステップＳ８）。
【００２７】
なお、モノリス型シリカカラムの場合には、（７）の工程（ステップＳ７）は省略できる。
【００２８】
ここで、ケイ酸をゲル化するためのシリカ膜作製液２０としては、例えば次の物を用いることができる。
【００２９】
Ａ．ケイ酸塩溶液（カリウム塩、ナトリウム塩等）＋酸（リン酸、硫酸水素ナトリウム、炭酸、トリフルオロ酢酸等）
【００３０】
Ｂ．ケイ酸塩溶液（カリウム塩、ナトリウム塩等）＋アルカリ土類金属塩やアルミニウム塩（塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸アルミニウム等）
【００３１】
Ｃ．ケイ酸塩溶液（カリウム塩、ナトリウム塩等）＋有機化合物（グルオキサル、酢酸エステル、アミド類（ホルムアミド等））
【００３２】
Ｄ．上記３つの組み合せ（例えば、ケイ酸塩＋塩化物イオン＋アミド類や、ケイ酸塩＋アルミニウム塩＋アミド類）等
【００３３】
本発明に係るケイ酸−ポリブレンコートキャピラリと従来のＳＭＩＬＥキャピラリ（ナカライテスク社製）の安定性を比較した結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
2008032397.tif 000003
【００３５】
分析条件は、キャピラリの全長Ｌ＝３８．５ｃｍ、有効長ｌ＝３０ｃｍ、分離溶液は、ｐＨ８．５の５０ｍＭ酢酸アンモニウム、印加電圧は−１５ｋＶ、検出は２００ｎｍ、電気浸透流マーカーはホルムアミドであり、分析と分析の間では３分間９３０ｍｂａｒで分離溶液を用いて洗浄した。
【００３６】
ここで、電気浸透流（ＥＯＦ）の速度は、ｌＬ／Ｖｔ（ここでｔは移動時間）である。
【００３７】
又、劣化率は、次式による。
【００３８】
劣化率＝((EOF(初期値）-  EOF(X回目の分析）)／EOF(初期値））×100%・・・(１)
【００３９】
ケイ酸−１．５％ポリブレン被覆キャピラリを用いたＣＥ−ＭＳによるリン酸化合物の分離例を図３に示す。
【００４０】
分析条件は、キャピラリの全長が１００ｃｍ、分離溶液はｐＨ８．５の５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ＣＥ印加電圧は−３０ｋＶ、ＥＳＩ印加電圧は−３．５ｋＶ、シース溶液は５０％メタノール水溶液中の５ｍＭ酢酸アンモニウム、シース液の流速は１０μｌ／分である。
【００４１】
図３から十分分離されていることがわかる。
【００４２】
なお、濃度や電圧、時間等の数値は、前記実施形態に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明に係る内壁修飾キャピラリの製造方法の実施形態の手順を示す流れ図
【図２】製造過程の内壁修飾キャピラリを示す断面図
【図３】ケイ酸−ポリブレン被覆キャピラリを用いたＣＥ-ＭＳによるリン酸化合物の分離例を示す図
【符号の説明】
【００４４】
１０…フューズドシリカキャピラリ
２０…シリカ膜作製液
２２…ポリマー
２４…シリカ膜
【図１】
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【図２】
2008032397.tif 000005
【図３】
2008032397.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月14日(2007.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内壁のシラノール基と共有結合したシリカ膜と、
該シリカ膜に巻き込まれた状態で固定されたポリマーと、
を有することを特徴とする内壁修飾キャピラリ。
【請求項２】
前記ポリマーが、正電荷を有するポリマーと、負電荷を有するポリマーの両者を含むことを特徴とする請求項１に記載の内壁修飾キャピラリ。
【請求項３】
内壁のシラノール基と共有結合したシリカ膜と、
該シリカ膜に巻き込まれた状態で固定されたポリマーと、
を有する内壁修飾キャピラリの製造方法であって、
シリカ膜作製液とポリマーを混合する手順と、
混合液をキャピラリ内に注入する手順と、
注入液をキャピラリ内で重合させる手順と、
を含むことを特徴とする内壁修飾キャピラリの製造方法。
【請求項４】
重合終了前に、注入液の一部をキャピラリから流出させて、キャピラリを中空化することを特徴とする請求項３に記載の内壁修飾キャピラリの製造方法。
【請求項５】
前記ポリマーが、正電荷を有するポリマーと、負電荷を有するポリマーの両者を含むことを特徴とする請求項３又は４に記載の内壁修飾キャピラリの製造方法。
【請求項６】
前記ポリマーが、ポリブレンとＤＥＡＥ−デキストランを含むことを特徴とする請求項５に記載の内壁修飾キャピラリの製造方法。
【請求項７】
前記シリカ膜作製液が、ケイ酸塩溶液と酸を含むことを特徴とする請求項３乃至６のいずれかに記載の内壁修飾キャピラリの製造方法。
【請求項８】
前記シリカ膜作製液が、ケイ酸塩溶液とアルカリ土類金属塩やアルミニウム塩を含むことを特徴とする請求項３乃至６のいずれかに記載の内壁修飾キャピラリの製造方法。
【請求項９】
前記シリカ膜作製液が、ケイ酸塩溶液と有機化合物を含むことを特徴とする請求項３乃至６のいずれかに記載の内壁修飾キャピラリの製造方法。
【請求項１０】
前記シリカ膜作製液が、ケイ酸塩と塩化物イオンとアミド類や、ケイ酸塩とアルミニウム塩とアミド類を含むことを特徴とする請求項３乃至６のいずれかに記載の内壁修飾キャピラリの製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2008032397.tif 000007