(57)【要約】【課題】静電引力を利用することなしに基板表面に生理活性物質の失活を防ぎ、及び／又は生理活性物質を高濃度に固定化することができる、生理活性物質固定基板の製造方法及び該方法により得られた基板を提供する。【解決手段】本発明の生理活性物質固定基板の製造方法においては、生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板に、該生理活性物質を固定するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布する工程、及びその後に乾燥する工程を含み、生理活性物質は、アビジン類であり、乾燥する工程により生理活性物質を固定化するための層上に１ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２．５ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下の密度で固定化される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板に、該生理活性物質を固定するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布する工程、及びその後に乾燥する工程を含み、
前記生理活性物質は、アビジン類であり、前記乾燥する工程により前記生理活性物質を固定化するための層上に１ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２．５ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下の密度で固定化されることを特徴とする生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項２】
前記生理活性物質を固定化するための層上に固定化されたアビジン類に、アビジン結合性蛋白であるビオチン化された高分子蛋白質を結合させる工程を更に含み、
該アビジン類と、該結合されたビオチン化された高分子蛋白質と、のモル比が０．１７以上０．６９以下であることを特徴とする請求項１に記載の生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項３】
前記高分子蛋白質の重量平均分子量が１０００００以上２０００００以下であることを特徴とする請求項２に記載の生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項４】
前記アビジン類は、前記乾燥する工程により前記生理活性物質を固定化するための層に１．０７ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２．４８ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下の密度で固定化されることを特徴とする請求項１〜請求項３の何れか１項に記載の生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項５】
前記アビジン類と、前記結合されたビオチン化された高分子蛋白質と、のモル比が０．３５以上０．５５以下であることを特徴とする請求項２〜請求項４の何れか１項に記載の生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項６】
前記アビジン類が、ストレプトアビジンであることを特徴とする請求項１〜請求項５の何れか１項に記載の生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項７】
生理活性物質の固定量の変動係数（ＣＶ値）が１５％以下であることを特徴とする請求項１〜請求項６の何れか１項に記載の生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項８】
前記生理活性物質を固定化するための層が、親水性ポリマー層、疎水性ポリマー層、及び自己酸化膜から選択される少なくとも１つからなることを特徴とする請求項１〜請求項７の何れか１項に記載の生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項９】
前記生理活性物質を固定化するための層が、少なくとも親水性ポリマー層を含むことを特徴とする請求項８に記載の生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項１０】
前記親水性ポリマーを活性化することによって前記生理活性物質と共有結合させることを特徴とする請求項９に記載の生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項１１】
前記親水性ポリマー層は、自己酸化膜を介して前記金属基板に固定されていることを特徴とする請求項８〜請求項１０の何れか１項に記載の生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項１２】
前記親水性ポリマー層が多糖類からなり、自己酸化膜を介して前記金属基板に固定されていることを特徴とする請求項１１に記載の生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項１３】
前記多糖類の重量平均分子量が１０００００〜２０００００であることを特徴とする請求項１１に記載の生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項１４】
前記乾燥する工程において、前記塗布する工程によって塗布した前記生理活性物質を含む溶液を、乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上で乾燥することを特徴とする請求項１〜請求項１３の何れか１項に記載の生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項１５】
前記塗布する工程において、乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の乾燥環境下において前記金属基板に前記生理活性物質を含む溶液を塗布することを特徴とする請求項１〜請求項１４の何れか１項に記載の生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項１６】
前記乾燥する工程において、前記生理活性物質を含む溶液の乾燥時間が１０分以下であることを特徴とする請求項１〜請求項１５の何れか１項に記載の生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜請求項１６の何れか１項の生理活性物質固定基板の製造方法により得られた基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質固定基板の製造方法及び基板に関する。より詳細には、本発明は、表面プラズモン共鳴分析などで使用するための、生理活性物質固定基板の製造方法及び基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
生理活性物質を基板に共有結合で固定化する方法としては、基板の電荷と反対の電荷を生理活性物質を持たせて、静電引力を利用して基板近傍に生理活性物質を高濃度に局在させて結合させる方法が用いられてきた。この方法によれば、センサー用基板に、高濃度かつ均一に生理活性物質を固定することができるが、多量の溶液を使用する必要があり、溶液のｐＨは荷電濃縮が可能な範囲に限定され、生理活性物質が失活する懸念があった。
【０００６】
また、特許文献１及び非特許文献１には、基板への生理活性物質の固定について記載されているが、いずれも溶液中で固定を行っている。生理活性物質を乾燥させること、スピンコーターやディスペンサーにより溶液を塗布することは公知であるが、これまで、基板上に共有結合によって固定した生理活性物質は、共有結合によって失活しやすくなっているため、少量塗布することにより、乾燥しやすい状態におくことや、自発的に乾燥させることが懸念されていた。特許文献１では、生理活性物質の固定は流路中で行われるため、乾燥させたり、少量塗布することは適用できない。非特許文献１では、生理活性物質の固定方法が共有結合ではないため、乾燥させたり塗布を行ったとしても、洗浄の工程で結合が外れる可能性が高い。
また、固定化する生理活性物質が低分子蛋白質ではない場合には、失活を抑制しつつ且つ基板への固定化量の調整を行うことは困難な場合があった。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，４３６，１６１号明細書
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９（２００３）  １３−２６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、静電引力を利用することなしに基板表面に生理活性物質の失活を防ぎ、及び／又は生理活性物質を高濃度に固定化することができる、生理活性物質固定基板の製造方法及び基板を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、生理活性物質を含む溶液の薄膜を金属基板上に形成し、さらに乾燥濃縮することにより静電引力を利用することなしに基板表面に生理活性物質を高濃度に固定できることを見出した。さらに、本発明者らは、生理活性物質を含む溶液の薄膜を形成し、乾燥時間を短くすることによって、均一に生理活性物質を固定できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明は、
＜１＞  生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板に、該生理活性物質を固定するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布する工程、及びその後に乾燥する工程を含み、前記生理活性物質は、アビジン類であり、前記乾燥する工程により前記生理活性物質を固定化するための層上に１ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２．５ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下の密度で固定化されることを特徴とする生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００１１】
＜２＞  前記生理活性物質を固定化するための層上に固定化されたアビジン類に、アビジン結合性蛋白であるビオチン化された高分子蛋白質を結合させる工程を更に含み、該アビジン類と、該結合されたビオチン化された高分子蛋白質と、のモル比が０．１７以上０．６９以下であることを特徴とする上記＜１＞に記載の生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００１２】
＜３＞  前記高分子蛋白質の重量平均分子量が１０００００以上２０００００以下であることを特徴とする上記＜２＞に記載の生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００１３】
＜４＞  前記アビジン類は、前記乾燥する工程により前記生理活性物質を固定化するための層に１．０７ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２．４８ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下の密度で固定化されることを特徴とする上記＜１＞〜＜３＞の何れか１つに記載の生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００１４】
＜５＞  前記アビジン類と、前記結合されたビオチン化された高分子蛋白質と、のモル比が０．３５以上０．５５以下であることを特徴とする上記＜２＞〜＜４＞の何れか１つに記載の生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００１５】
＜６＞  前記アビジン類が、ストレプトアビジンであることを特徴とする上記＜１＞〜上記＜５＞の何れか１つに記載の生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００１６】
＜７＞  生理活性物質の固定量の変動係数（ＣＶ値）が１５％以下であることを特徴とする上記＜１＞〜上記＜６＞の何れか１つに記載の生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００１７】
＜８＞  前記生理活性物質を固定化するための層が、親水性ポリマー層、疎水性ポリマー層、及び自己酸化膜から選択される少なくとも１つからなることを特徴とする上記＜１＞〜上記＜７＞の何れか１つに記載の生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００１８】
＜９＞  前記生理活性物質を固定化するための層が、少なくとも親水性ポリマー層を含むことを特徴とする上記＜８＞に記載の生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００１９】
＜１０＞  前記親水性ポリマーを活性化することによって前記生理活性物質と共有結合させることを特徴とする上記＜９＞に記載の生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００２０】
＜１１＞  前記親水性ポリマー層は、自己酸化膜を介して前記金属基板に固定されていることを特徴とする上記＜８＞〜上記＜１０＞の何れか１つに記載の生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００２１】
＜１２＞  前記親水性ポリマー層が多糖類からなり、自己酸化膜を介して前記金属基板に固定されていることを特徴とする上記＜１１＞に記載の生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００２２】
＜１３＞  前記多糖類の重量平均分子量が１０００００〜２０００００であることを特徴とする上記＜１１＞に記載の生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００２３】
＜１４＞  前記乾燥する工程において、前記塗布する工程によって塗布した前記生理活性物質を含む溶液を、乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上で乾燥することを特徴とする上記＜１＞〜上記＜１３＞の何れか１つに記載の生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００２４】
＜１５＞  前記塗布する工程において、乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の乾燥環境下において前記金属基板に前記生理活性物質を含む溶液を塗布することを特徴とする上記＜１＞〜上記＜１４＞の何れか１つに記載の生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００２５】
＜１６＞  前記乾燥する工程において、前記生理活性物質を含む溶液の乾燥時間が１０分以下であることを特徴とする上記＜１＞〜上記＜１５＞の何れか１つに記載の生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００２６】
＜１７＞  上記＜１＞〜上記＜１６＞の何れか１つの生理活性物質固定基板の製造方法により得られた基板である。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、静電引力を利用することなしに基板表面に生理活性物質の失活を防ぎ、及び／又は生理活性物質を高濃度に固定化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。本発明による生理活性物質固定基板の製造方法は、生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板に、該生理活性物質を固定するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布する工程、及びその後に乾燥する工程を含み、前記生理活性物質は、アビジン類であり、前記乾燥する工程により前記金属基板上に前記アビジン類が１ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２．５ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下の密度で固定化されることを特徴とする生理活性物質固定基板の製造方法である。
【００２９】
本発明の方法では、基板上に共有結合で固定した生理活性物質を乾燥させても失活することがなく、また、生理活性物質は共有結合により基板表面に固定化されるため、洗浄工程で生理活性物質が外れることもない。さらに、生理活性物質を溶液中で固定する場合にはｐＨをコントロールしなければ固定することはできないが、本発明による方法（乾燥法）では、生理活性物質に好ましいｐＨで固定することができる。また、生理活性物質を含む溶液のｐＨをコントロールする必要がないため、生理活性物質が失活しない。さらに、本発明の方法によれば、生理活性物質を少量塗布することにより固定化することができ、溶液の使用量を減らすことができるためコストを削減することができる。従来、生理活性物質は乾燥させると失活すると考えられていたが、乾燥させても失活はしなかった。また、本発明の方法では、生理活性物質の膜が均一であるため、定量的かつ速度論的評価の誤差を最小限に抑えることができる。
【００３０】
また、生理活性物質として、アビジン類を用い、上記塗布及び乾燥する工程によって金属基板上にアビジン類を固定化すると、このアビジン類は、共有結合によって金属基板上に固定化される。上記塗布及び乾燥工程によって固定化されることで、このアビジン類による膜は上述のように均一な膜となる。そして、このアビジン類を１ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２．５ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下の密度で固定化すると、ビオチン化された高分子蛋白質は、このアビジン類にアビジン−ビオチン結合によって高濃度に固定化される。具体的には、アビジン類と、該アビジン類を介して金属基板に固定化されたビオチン化された高分子蛋白質と、のモル比が０．１７以上０．６９以下となるように固定化される。さらに、ビオチン化された高分子蛋白質は、アビジン類を介して金属基板に固定化されるため、失活が抑制される。
【００３１】
本発明の方法で製造される生理活性物質固定基板は、バイオセンサー用基板として用いることができる。本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。以下、本発明による生理活性物質固定基板の製造方法について具体的に説明する。
【００３２】
（１）本発明では、生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板の、該生理活性物質を固定化するための層上に、生理活性物質を塗布する。本発明では、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００３３】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００３４】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００３５】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００３６】
上記の基板は、測定ユニットの誘電ブロックに固定され、一体化されて測定チップを構成しており、この測定チップが交換可能に形成されていてもよい。以下にその例を示す。
【００３７】
図１は、ＳＰＲを利用した測定に用いられるセンサユニット１０の分解斜視図である。センサユニット１０は、透明な誘電体である全反射プリズム（光学ブロック）２０と、この全反射プリズム２０の上に取り付けられる流路部材３０とで構成される。流路部材３０は、図中奥側に位置する第１流路３１と、図中手前側に位置する第２流路３２との２種類の流路を有している。詳細は後述するが、センサユニット１０を用いて測定を行う際には、これら２つの流路３１、３２を１組として、１つの試料の測定が行われる。流路部材３０には、各流路３１、３２が、それぞれ長手方向に６つずつ設けられており、１つのセンサユニット１０で６つの試料を測定できるようにしている。なお、各流路３１、３２の数は、６つに限ることなく、５つ以下でもよいし７つ以上でもよい。
【００３８】
全反射プリズム２０は、長尺な台形柱状に形成されたプリズム本体２１と、このプリズム本体２１の一端に設けられた把持部２２と、プリズム本体２１の他端に設けられた突出部２３とからなる。この全反射プリズム２０は、例えば、押し出し法などによって型成形されるものであり、プリズム本体２１、把持部２２、突出部２３の各部は、一体に成形されている。
【００３９】
プリズム本体２１は、下底よりも上底の方が長い略台形の縦断面を有しており、底面側面から照射された光を上面２１ａに集光する。プリズム本体２１の上面２１ａには、ＳＰＲを励起するための金属膜（薄膜層）２５が設けられている。金属膜２５は、流路部材３０の各流路３１、３２と対面するように、長方形状をなしており、例えば、蒸着法などによって成形される。この金属膜２５としては、例えば、金や銀などが使用され、その膜厚は、例えば、５０ｎｍである。なお、金属膜２５の膜厚は、金属膜２５の素材や測定時に照射される光の波長などに応じて適宜選択される。
【００４０】
金属膜２５の上には、生理活性物質を固定化するための層２６が設けられている。生理活性物質を固定化するための層２６は、生理活性物質を固定させるための結合基を有するものであり、この生理活性物質を固定化するための層２６を介して金属膜２５上に生理活性物質が固定される。
【００４１】
（２）生理活性物質を固定化するための層
金属基板には、生理活性物質を固定化するための層が設けられている。生理活性物質を固定化するための層は、自己組織化膜、親水性ポリマー層、疎水性ポリマー層、から選択される少なくとも１つの層からなるが、少なくとも親水性ポリマー層を含んだ層であることが好ましい。生理活性物質を固定化するための層の、特に好ましい態様は、自己組織化膜と親水性ポリマー層の組み合わせである。
【００４２】
（２−１）自己組織化膜
本発明で言う自己組織化膜とは、外からの細かい制御を加えていない状態で、膜材料そのものがもつ機構によって形成される一定の秩序をもつ組織をもった単分子膜やＬＢ膜などの超薄膜のことを言う。この自己組織化により、非平衡な状況で長距離にわたって秩序がある構造やパターンが形成される。
【００４３】
自己組織化膜（ＳＡＭｓ）を用いた金属膜の被覆法は、ハーバード大のＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ教授らにより精力的に展開されており、その詳細は例えばＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ，１０５，１１０３−１１６９（２００５）に報告されている。金属として金を用いた場合、有機層形成化合物として一般式Ａ−１（一般式Ａ−１において、ｎは３から２０の整数を示し、Ｘは官能基を示す）に示すアルカンチオール誘導体を用いることにより、Ａｕ−Ｓ結合とアルキル鎖同士のｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ力に基づき、配向性を持つ単分子膜が自己組織的に形成される。自己組織化膜は、アルカンチオール誘導体の溶液中に金基板を浸漬するという極めて簡便な手法で作成される。具体的には、例えば、一般式Ａ−１においてＸ＝ＮＨ２である化合物を用いて自己組織化膜を形成させることで、アミノ基を有する有機層で金表面を被覆することが可能となる。
【００４４】
【化１】
2008286775.tif 000002
【００４５】
上記一般式Ａ−１においてＸがＮＨ２である末端にアミノ基を有するアルカンチオールとしては、アルキル鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物であってもよく、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−３、Ａ−４）と大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させた化合物であってもよい。上記末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールと大過剰のヒドラジドまたはジアミンとの反応は、溶液状態で行ってもよく、また、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールを基板表面に結合した後、大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させてもよい。
【００４６】
【化２】
2008286775.tif 000003
【００４７】
なお、上記一般式Ａ−２において、アルキル基の繰り返し数ｎは３から２０の整数を示し、３〜１６の整数がさらに好ましく、４〜８の整数が特に好ましい。また、上記一般式Ａ−３においてアルキル基の繰り返し数ｎは３〜２０の整数を示し、３〜１６の整数がさらに好ましく、４〜８の整数が特に好ましい。また、上記一般式Ａ−４においてアルキル基の繰り返し数ｎは、それぞれ独立に１から２０の整数を示し、３〜２０の整数が好ましく、３〜１６の整数がさらに好ましく、４〜８の整数が最も好ましい。
アルカンチオール誘導体のアルキル鎖が短いと自己組織化膜を形成しにくく、アルキル鎖が長いと水溶性が低下し、ハンドリングが困難になる。
また、上記一般式Ａ−４において、エチレンオキシド基の繰り返し数ｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示し、３〜２０の整数が好ましく、３〜１６の整数がさらに好ましく、４〜８の整数が最も好ましい。
【００４８】
上記末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−３、Ａ−４）と反応させる大過剰のジアミンとしては、任意の化合物を用いることが可能であるが、バイオセンサー表面に用いる場合、水溶性ジアミンが好ましい。水溶性ジアミンとしては具体的には、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ピペラジン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ジヘキサメチレントリアミン、１，４−ジアミノシクロヘキサン等の脂肪族ジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、パラキシリレンジアミン、メタキシリレンジアミン、４，４’−ジアモノビフェニル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルケトン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン酸等の芳香族ジアミンが挙げられる。バイオセンサー表面の親水性を向上させるという観点から、２つのアミノ基をエチレングリコールユニットで連結した化合物（一般式Ａ−５）を用いることも可能である。本発明に用いるジアミンとしては、好ましくはエチレンジアミンまたは一般式Ａ−５（一般式Ａ−５において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）で表される化合物であり、より好ましくは、エチレンジアミンまたは１，２−ビス（アミノエトキシ）エタン（一般式Ａ−５において、ｎ＝２，ｍ＝１）である。
【００４９】
【化３】
2008286775.tif 000004
【００５０】
上記アミノ基を有するアルカンチオールは、単独で自己組織化膜を形成することも可能であり、また、他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成することも可能である。バイオセンサー表面に用いる場合、他のアルカンチオールとしては、生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な化合物を用いることが好ましい。生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な自己組織化膜に関しては、前述のＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ教授らにより詳細に検討されており、親水性基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化膜が非特異吸着抑制に有効であることが報告されている（Ｌａｎｇｍｕｉｒ１７，２８４１−２８５０，５６０５−５６２０，６３３６−６３４３（２００１））。本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールは、前記論文に記載された化合物を好ましく用いることが可能である。非特異吸着抑制能に優れ、入手が容易であることから、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールとしては、水酸基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−６）あるいはエチレングルコールユニットを有するアルカンチオール（一般式Ａ−７）（一般式Ａ−６において、ｎは３から２０の整数を示し、一般式Ａ−７において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）を用いることが好ましい。好ましくは、一般式Ａ−６において、ｎは５以上の整数であり、１０以上の整数であることがさらに好ましく、１０〜２０の整数がさらに好ましく、最も好ましくは６〜１６の整数である。
【００５１】
【化４】
2008286775.tif 000005
【００５２】
なお、アミノ基を有するアルカンチオールを他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成する場合には、一般式Ａ−２〜一般式Ａ−４のアルキル基の繰返し数ｎは、４以上２０以下の整数であり、４以上１６以下の整数が好ましく、４以上１０以下の整数が最も好ましい。
また同様に、アミノ基を有するアルカンチオールを他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成する場合には、一般式Ａ−６及び一般式Ａ−７のアルキル基の繰返し数ｎは、３以上１６以下の整数であり、３以上１２以下の整数が好ましく、３以上８以下の整数が最も好ましい。
【００５３】
本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールは、任意の割合で混合することが可能であるが、アミノ基を有するアルカンチオールの割合が、少ない場合には活性エステル化されたカルボキシル基含有ポリマーの結合量が低下し、親水性基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には非特異吸着抑制能が減少する。それゆえ、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールの混合比は、１／１〜１／１，０００，０００の範囲であることが好ましく、１〜１／１，０００の範囲であることがより好ましく、１〜１／１０の範囲であることがさらに好ましい。活性エステル化されたカルボキシル基を含有するポリマーと反応する場合の立体障害低減の観点から、アミノ基を有するアルカンチオールの分子長は、親水性基を有するアルカンチオールの分子長よりも長いことが好ましい。
【００５４】
本発明で用いるアルカンチオールは、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ大学のＧｒｚｙｂｏｗｓｋｉ教授らによる総説（Ｃｕｒｒ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，８，１７６３−１７９７（２００４）．）およびその引用文献に基づいて合成された化合物を用いても良く、また市販の化合物を用いてもよい。これらの化合物は、同仁化学（株）、Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＳｅｎｓｏＰａｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．社等から購入可能である。本発明においてアルカンチオールの酸化生成物であるジスルフィド化合物は、アルカンチオールと同様に用いることが可能である。
【００５５】
（２−２）親水性ポリマーについて
本発明で用いることができる親水性ポリマーとしては、ゼラチン、アガロース、キトサン、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、澱粉、セルロース、又はこれらの誘導体、例えばカルボキシメチル誘導体、又は水膨潤性有機ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール又はこれらの誘導体などを挙げることができる。
【００５６】
本発明で用いる親水性ポリマーとしてはさらに、カルボキシル基含有合成ポリマーおよびカルボキシル基含有多糖類を用いることが可能である。カルボキシル基含有合成ポリマーとしては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、およびこれらの共重合体、例えば、特開昭５９−５３８３６号３頁右上２行目〜６頁左下９行目、特開昭５９−７１０４８号３頁左下１行目〜５頁左上３行目に記載されているようなメタクリル酸共重合体、アクリル酸共重合体、イタコン酸共重合体、クロトン酸共重合体、マレイン酸共重合体、部分エステル化マレイン酸共重合、水酸基を有するポリマーに酸無水物を付加させたものなどが挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、天然植物からの抽出物、微生物発酵の生産物、酵素による合成物、または化学合成物の何れであってもよく、具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、セロウロン酸、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン等が挙げられる。
【００５７】
カルボキシル基含有多糖類は、市販の化合物を用いることが可能であり、具体的には、重量平均分子量が１０００００〜２０００００の範囲である、ＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン）、ＣＭＤ−Ｌ、ＣＭＤ−Ｄ４０（名糖産業社製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、等を挙げることができる。
【００５８】
本発明で用いる親水性ポリマーの重量平均分子量は特に制限されないが、重量平均分子量が１０００〜５００００００であることが好ましく、重量平均分子量が１００００〜２００００００であることがより好ましく、重量平均分子量が１０００００〜１００００００であることがさらに好ましい。
【００５９】
上記したような親水性ポリマーは、本明細書中以下に説明するような自己組織化膜又は疎水性ポリマーを介して基板に固定してもよいし、あるいはモノマーを含む溶液から直接基板上に形成させることもできる。さらに、上記した親水性ポリマーは架橋することもできる。親水性ポリマーの架橋は当業者に自明である。
【００６０】
センサー表面に固定する親水性ポリマーは、水溶液中の膜厚が１ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることが好ましい。膜厚が薄いと生理活性物質固定量が減少し、またセンサー表面の水和層が薄くなるため生理活性物質自身の変性で被検体物質との相互作用が検出しにくくなる。膜厚が厚いと被検体物質が膜内に拡散する障害となり、また特にセンサー基板の親水性ポリマー固定面の反対側から相互作用を検出する場合は検出表面から相互作用形成部までの距離が長くなり、検出感度が低くなる。水溶液中の親水性ポリマー層厚はＡＦＭ、エリプソメトリーなどで評価することができる。
【００６１】
また、本発明では、センサー表面に固定する親水性ポリマーの固定量は、３ｎｇ／ｍｍ２以上３０ｎｇ／ｍｍ２以下（３×１０−６ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上３０×１０−６ｐｍｏｌ／ｍｍ３）以下であることが好ましく、３ｎｇ／ｍｍ２以上２０ｎｇ／ｍｍ２以下（３×１０−６ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２０×１０−６ｐｍｏｌ／ｍｍ３）が更に好ましく、３ｎｇ／ｍｍ２以上１５ｎｇ／ｍｍ２以下（３×１０−６ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上１５×１０−６ｐｍｏｌ／ｍｍ３）が最も好ましい。又は、親水性ポリマーの膜厚として、３ｎｍ以上３０ｎｍ以下であることが好ましく、３ｎｍ以上２０ｎｍ以下が更に好ましく、３ｎｍ以上１５ｎｍ以下が最も好ましい。
【００６２】
親水性ポリマーの固定量は、種々の膜厚測定方法・重量測定方法などで検出した値を使用することができる。膜厚測定方法の例としては、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）などの走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）などの電子顕微鏡、エリプソメトリー法などの方法が挙げられる。
【００６３】
膜厚測定方法の具体的な算出法としては、例えばＳＰＭでは、基板上の親水性ポリマーが固定されているエリアと固定されていないエリアとの表面凹凸の差から膜厚を算出でき、電子顕微鏡の場合は親水性ポリマーが固定された基板の切片観察から膜厚を算出できる。分光エリプソメトリー（ファイブラボ社製）を用いて、まず親水性ポリマー層の膜厚を求める場合、親水性ポリマー固定前・後の基板を乾燥状態で測定することにより、夫々の光学定数を算出する。基板表面が多層構成の場合は、各層を設置する毎にエリプソメトリー測定することで、各層の光学定数を順次算出でき、２層程度までは１層とみなして算出することも可能である。算出した各層の光学定数をパラメータとして使用し、単色エリプソメトリー（Ｈｅ−Ｎｅレーザー、ファイブラボ社製）によって、親水性ポリマー固定前の基板と、親水性ポリマー固定後の乾燥基板との膜厚を測定し、その差を親水性ポリマー層の膜厚として求めることができる。
【００６４】
重量測定方法の具体的な算出方法としては、水晶発振子マイクロバランス法（ＱＣＭ）、全反射測定法（ＡＴＲ）、外部反射法などの赤外分光法などが挙げられる。重量測定方法の具体的な算出法としては、例えば、赤外分光法では親水性ポリマーに帰属される吸収強度の検量線から親水性ポリマーの固定量（重量）を定量できる。ＱＣＭ（ユーエスアイシステム社製）を用いて親水性ポリマーの固定量を求める場合、親水性ポリマー固定前・後の基板の振動数を乾燥状態で測定し、その差を親水性ポリマーの固定量として求めることができる。
【００６５】
ここで、＜乾燥状態＞とは親水性ポリマーの含水率が３０重量％以下であることをいう。具体的には気温５℃から３０℃、湿度０％ＲＨ以上９０％ＲＨ以下、好ましくは湿度０％ＲＨ以上７０％ＲＨ以下で、５分以上静置することによって上記の乾燥状態を得ることができる。
また、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）では、溶液中の基板上の親水性ポリマーの固定前・後の共鳴シグナルの変化量を、親水性ポリマーの固定量として算出することができる。
【００６６】
（２−３）親水性ポリマーの活性化
親水性ポリマーとしてカルボキシル基を含有するポリマーを使用する場合、カルボキシル基を活性化することによって、自己組織化膜で被覆された基板に固定化することができる。カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法としては、公知の手法、例えば、水溶性カルボジイミドである１−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−３ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）とＮ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）により活性化する方法、又はＥＤＣ単独により活性化する方法を好ましく用いることができる。この手法で活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーを、アミノ基を有する基板と反応させることで、本発明のバイオセンサーを製造することが可能となる。
【００６７】
また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として含窒素化合物を用いる方法があり、具体的には、下記一般式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）［式中、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して置換基を有しても良いカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表し、Ｒ１及びＲ２は結合により５〜６員環を形成しても良く、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（ｎ−１）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す］に示される含窒素化合物を用いることもできる。
【００６８】
【化５】
2008286775.tif 000006
【００６９】
ここで、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して置換基を有しても良いカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表すが、好ましくはＲ１及びＲ２は結合により５〜６員環を形成する。特に好ましくは、ヒドロキシコハク酸、ヒドロキシフタル酸、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３、４−ジヒドロキシ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１、２、３−ベンゾトリアジン、及びその誘導体が提供される。
【００７０】
また、好ましくは下記化合物Ｉｃ〜Ｉｅで示される含窒素化合物を用いることもできる。
【００７１】
【化６】
2008286775.tif 000007
【００７２】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（ＩＩ）［式中、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表す］で表される化合物を用いることもできる。
【００７３】
【化７】
2008286775.tif 000008
【００７４】
また、上記一般式（ＩＩ）で示される含窒素化合物としては、具体的には、下記の化合物（ＩＩ―１）〜（ＩＩ―３）などを用いることができる。
【００７５】
【化８】
2008286775.tif 000009
【００７６】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記の化合物（ＩＩ―４）を用いることもできる。
【００７７】
【化９】
2008286775.tif 000010
【００７８】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（ＩＩＩ）［式中、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表し、Ｍは（ｎ−１）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す］を用いることもできる。
【００７９】
【化１０】
2008286775.tif 000011
【００８０】
ここで、Ａで表される炭素原子またはリン原子の置換基としては、置換基を有するアミノ基が好ましく、ジメチルアミノ基やピロリジノ基の様なジアルキルアミノ基が好ましい。Ｍで表される（ｎ−１）価の元素は、リン原子、ホウ素原子、ヒ素原子などが挙げられるが、好ましくはリン原子があげられる。Ｘで表されるハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、好ましくはフッ素原子が挙げられる。
【００８１】
また一般式（ＩＩＩ）で表される含窒素化合物の具体例としては、下記の化合物（ＩＩＩ―１）〜（ＩＩＩ―６）などが挙げられる。
【００８２】
【化１１】
2008286775.tif 000012
【００８３】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（ＩＶ）［式中、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（ｎ−１）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す］を用いることもできる。
【００８４】
【化１２】
2008286775.tif 000013
【００８５】
具体的には、下記の化合物（ＩＶ−１）などを用いることができる。
【００８６】
【化１３】
2008286775.tif 000014
【００８７】
また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として、電子吸引性基を有するフェノール誘導体を使用することも好ましく、更に電子吸引性基のσ値が０．３以上であることが好ましい。具体的には、下記化合物（Ｖ−１）〜（Ｖ−４）などを用いることができる。なお、下記一般式（Ｖ−４）中、Ｘ−は、アニオンを示す。
【００８８】
【化１４】
2008286775.tif 000015
【００８９】
更に、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法では、別にカルボジイミド誘導体物を併用することができ、好ましくは、水溶性カルボジイミド誘導体を併用する事ができ、更に好ましくは下記の化合物（Ｉ−１）、（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）〜（Ｉ−３）の何れか１種を併用することができる。
【００９０】
【化１５】
2008286775.tif 000016
【００９１】
上記のカルボジイミド誘導体及び、含窒素化合物、またはフェノール誘導体は併用して使用するだけではなく、所望により、夫々、単独で用いることもできる。好ましくはカルボジイミド誘導体と含窒素化合物との併用である。
【００９２】
また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として、下記化合物（Ｖ−６）を用いることもできる。該化合物は単独で用いることもできるが、カルボジイミド誘導体、含窒素化合物、フェノール誘導体と併用してもよい。
【００９３】
【化１６】
2008286775.tif 000017
【００９４】
さらに、カルボキシル基を含有するポリマーにおけるカルボン酸を活性化する手法としては、特開２００６−５８０７１号公報  段落番号「００１１」〜「００２２」に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いて活性化することによりカルボン酸アミド基を形成する方法）、並びに特開２００６−９０７８１号公報  段落番号「００１１」〜「００１９」に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物でエステルとした後に、アミンと反応させることによりカルボン酸アミド基を形成する方法）を好ましく用いることもできる。
【００９５】
なお、上記した特開２００６−５８０７１号公報における特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体とは、下記一般式（１）で表されるウロニウム塩、下記一般式（２）で表されるホスホニウム塩、又は下記一般式（３）で表されるトリアジン誘導体を示す。
【００９６】
【化１７】
2008286775.tif 000018
【００９７】
（一般式（１）〜（３）において、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は結合により炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ３は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ−はアニオンを示す。一般式（２）において、Ｒ４とＲ５はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は結合により炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ６は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ−はアニオンを示す。一般式（３）において、Ｒ７はオニウム基を示し、Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に電子供与基を示す。）
本発明において、親水性ポリマーの活性化量の調整には、親水性ポリマーを活性化するために用いる上記ＥＤＣや、ＮＨＳ等の親水性ポリマーへの添加量を調整すればよい。具体的には、親水性ポリマー１μｍｏｌに対するＥＤＣやＮＨＳ等の活性化剤の添加量を２．４ｍｍｏｌ以下の範囲内の調整をすればよく、好ましくは２．０ｍｍｏｌ以下、さらに好ましくは０．０４ｍｍｏｌ〜１．５ｍｍｏｌ、最も好ましくは０．０４ｍｍｏｌ〜０．３ｍｍｏｌの範囲内に調整すればよい。
また、親水性ポリマーの基板への固定化量の調整には、上記塗布工程において用いるポリマー溶液中の親水性ポリマーの溶液濃度を調整すればよい。具体的には、ポリマー溶液中の親水性ポリマーの溶液濃度を０．００５重量％〜５重量％の範囲内、好ましくは０．０５重量％〜３重量％の範囲内、特に好ましくは０．１重量％〜２重量％の範囲内に調整すればよい。
【００９８】
（２−４）親水性ポリマーの基板への塗布
本発明において活性エステル化されたカルボキシル基を含有するポリマーは、溶液として基板と反応させてもよく、また、スピンコート等の手法を用いて基板上の薄膜を形成させた状態で反応させてもよい。好ましくは、薄膜を形成させた状態での反応である。
【００９９】
上記の通り、本発明において活性エステル化されたカルボキシル基を含有するポリマーは、薄膜状態で基板と反応させることが好ましい。基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。これらの薄膜形成法については、「コーティング技術の進歩」原崎勇次著、総合技術センター（１９８８）、「コーティング技術」技術情報協会（１９９９）、「水性コーティングの技術」シーエムシー（２００１）、「進化する有機薄膜  成膜編」住べテクノリサーチ（２００４）、「高分子表面加工学」岩森暁著、技報堂出版（２００５）、等に説明されている。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。
【０１００】
スプレーコート法とは、微細化されたポリマー溶液を基板に吹きつけた状態で、基板を移動させることで、基板上にポリマー溶液を均一塗布する方法である。スプレーガンの引き金を引くと空気バルブとニードルバルブが同時に開き、ノズルからポリマー溶液が霧状に噴出し、ノズル先端にある空気キャップから噴出する空気で霧状のポリマー溶液がさらに微細化される。微細化されたポリマー溶液による塗布膜を基板表面に形成させた後、溶媒を蒸発させることで、膜厚の制御されたポリマーフイルムが容易に作成される。ポリマー溶液濃度、基板の移動速度等により、ポリマー薄膜の膜厚制御が可能となる。
【０１０１】
スピンコート法とは、水平に設置した基板上にポリマー溶液を滴下した後に高速回転させ、遠心力によって基板全体にポリマー溶液を均一塗布する方法である。遠心力によるポリマー溶液の飛散と溶媒の蒸発に伴い、膜厚の制御されたポリマーフイルムが容易に作成される。回転数、ポリマー溶液濃度、溶剤の蒸気圧等により、ポリマー薄膜の膜厚制御が可能となる。本発明においてスピンコート時の回転数は特に制限されないが、回転数が低すぎる場合には基板上に溶液が残存し、回転数が高すぎる場合には使用可能な装置が制限されてしまう。
【０１０２】
ディスペンス法とは、塗布液を定量吐出するディスペンサーを使用して基板上にポリマー溶液を均一塗布する方法である。シリンジポンプなどの吐出装置からポリマー溶液を吐出しながら、吐出口を基板上で一定速度で動作させることで基板上の任意の場所に均一塗布することが可能である。また、吐出口を固定し、基板を一定速度で動作させることで塗布を行っても良い。基板と吐出口の間隔を一定に保つことで塗布量を均一にすることが可能で、さらに間隔を極力狭くすることで塗布液の厚みを薄くすることで塗布液使用量の削減、乾燥速度の向上が可能で好ましい。
【０１０３】
（２−５）疎水性ポリマー
本発明で用いることができる疎水性ポリマーは、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０質量％以下、より好ましくは１質量％以下、最も好ましくは０．１質量％以下である。
【０１０４】
疎水性ポリマーを形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性ポリマーとしては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【０１０５】
本発明で好ましく用いられる疎水性ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【０１０６】
疎水性ポリマーの基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【０１０７】
疎水性ポリマーのコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、特に好ましくは１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。疎水性ポリマーの重量平均分子量は特に限定されないが、好ましい範囲は１万から５０００万である。
【０１０８】
（３）生理活性物質を固定化するための層への生理活性物質の固定
上記した生理活性物質を固定化するための層は、生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。
例えば、生理活性物質を固定化するための層が、カルボキシル基を有する親水性ポリマーから構成されている場合は、このカルボキシル基を活性化した後に、アミノ基を有する生理活性物質を反応させることによって、当該生理活性物質を親水性ポリマーに固定化することができる。生理活性物質を固定化するための層に、該生理活性物質を固定化する際におけるカルボキシル基の活性化は、本明細書中上記（２−３）親水性ポリマーの活性化において記載した方法と同様の方法により行うことができる。
【０１０９】
本発明では、生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板の表面（該生理活性物質を固定化するための層）上に、該生理活性物質を固定化するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布し、乾燥させることによって基板表面上に均一な膜を形成する。この際、生理活性物質は、生理活性物質を固定化するための層を構成する分子と共有結合することによって、金属基板の表面に固定化される。
【０１１０】
本発明において、生理活性物質を固定化することができる官能基として、カルボキシル基やアミノ基などの官能基の他に、アルカンを導入すれば、脂質などの膜構造を有した生理活性物質を固定することが可能になる。また、用途に応じて、ポリマー鎖の長さ、ポリマーの厚み、ポリマーの密度、あるいは、ポリマーに導入する反応基の量を調整することにより、多様な蛋白に対応することが可能になる。またポリマーに固定基として、ＮＴＡ（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）等などを導入すれば、金属キレートを介してＨｉｓ−ｔａｇリガンドの付いた生理活性物質等を固定することができる。
【０１１１】
（４）本発明で用いることができる生理活性物質
本発明で用いることができる生理活性物質としては、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン類（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン）、抗原、抗体（例えば、抗ＧＳＴ抗体等の公知のｔａｇ抗体）などを挙げることができる。これらの生理活性物質を使用すると、これらの生理活性物質の上にさらに蛋白などを結合させることができる。例えば、アビジン類を生理活性物質として用いた場合、アビジン−ビオチン結合により、ビオチン化された蛋白を固定化でき、抗体を生理活性物質として用いた場合は、抗原を固定化することが可能である。
本発明において、生理活性物質はアビジン類を使用することが好ましく、ストレプトアビジンを使用することがより好ましい。
【０１１２】
生理活性物質を含む溶液（塗布液）の濃度は、基板表面に固定する生理活性物質の濃度が高い方が好ましい。生理活性物質により異なるが、０．１ｍｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬで使用することが好ましく、さらに好ましくは１ｍｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬである。
【０１１３】
（５）生理活性物質の塗布及び乾燥
本発明においては、生理活性物質を含む溶液を塗布した後に静置することで乾燥させる。
【０１１４】
生理活性物質を含む溶液の乾燥過程において、生理活性物質は塗布した溶液の外周部または、塗布液が乾固直前まで液が残った部分に析出する傾向がある。これにより基板表面に固定される生理活性物質の量に分布が発生し好ましくない。基板表面の生理活性物質固定量を均一にするため、塗布液の粘度は生理活性物質の基板表面への結合を阻害しない範囲で高くすることが好ましい。塗布液粘度を高くすることで、乾燥過程における塗布液中の生理活性物質の基板表面に対して水平方向の移動が抑えられ、結果として生理活性物質固定量のばらつきを抑えられる。乾燥工程における塗布液の粘度は０．９ｃＰ以上に保つことが好ましい。
【０１１５】
本発明において、生理活性物質を含む溶液を乾燥する工程とは、生理活性物質を含む溶液の基板への塗布後、その溶液を、静置することによる自然乾燥や、静置しながら、加熱や送風などによって溶液が乾燥する速度を上げ、意図的に乾燥させる工程をいう。生理活性物質を含む溶液（塗布液）の乾燥速度を上げることは生理活性物質固定量のばらつきを抑えることに効果がある。
【０１１６】
乾燥速度を上げ、生理活性物質の水平方向の移動速度に対して、十分早く乾燥を終了させることで、生理活性物質が実質的に移動する前に乾燥が終了し、ばらつきを抑えることが可能となる。乾燥速度を上げる方法は特に限定されないが、塗布液温度、乾燥環境温度を上げる、赤外線、レーザーなどの照射で蒸発エネルギーを加える、送風などで乾燥時の溶媒蒸気圧を下げる、溶液を薄層塗布して塗布量に対する蒸発面積を大きくするなどの方法が挙げられる。特に、塗布液が水を含む場合、乾球温度と湿球温度差の大きい環境で乾燥させることで乾燥速度は早くなる。乾燥方法としては、エアナイフ法を用いても良い。
【０１１７】
乾燥する工程は、塗布工程後、温度・湿度を一定に保った条件下で乾燥させることが好ましい。この乾燥工程において、乾球温度と湿球温度との温度差は、７℃以上の乾燥環境下で乾燥させることが好ましく、さらに好ましくは１０℃以上、さらに好ましくは１３．５℃以上である。また、製造工程上、乾燥時間としては０．１秒以上１０分以内が好ましく、より好ましくは１秒以上５分以内、特に好ましくは１秒以上１分以内である。
【０１１８】
乾燥する工程における乾球温度と湿球温度との温度差が７℃未満であると、生理活性物質の固定量にばらつきが生じるという問題が生じる場合がある。
【０１１９】
生理活性物質を含む溶液を塗布する方法としては、特に塗布液を定量吐出するディスペンサーを使用する方法が挙げられる。ディスペンサーは、シリンジに溶液を溜めてこれを吐出しても良く、ピペットを用いて吐出しても良い。特にピペトを用いることが、生理活性物質のディスペンサー内の残留量を削減することができ好ましい。ディスペンサーの吐出口を基板上で一定速度、一定間隔で動作させることで基板上の任意の場所に均一塗布することが可能である。ディスペンサーで塗布する場合、基板と吐出口の間隔を極力狭くし、塗布液厚みを薄くすることで生理活性物質の厚みを均一にすることができ、また乾燥速度を上げることができ、好ましい。また生理活性物質を含む溶液を塗布する好ましい方法として、スピンコートも挙げられる。この方法は、特に塗布膜厚を薄くする場合に好ましい。均一厚みの溶液を形成した後に乾燥させるため、スピンコーターは回転中の溶媒の蒸発を防ぐことが好ましい。このため、回転時に基板を密閉容器に入れておくなどの方法で、基板周辺の溶媒濃度が高い環境に保つことで、回転中の薄膜形成と薄膜形成後の乾燥速度を制御できるため、特に好ましい。
【０１２０】
上記塗布工程では、上記乾燥工程と同じ環境条件下で静置することが好ましい。
【０１２１】
上記溶液を塗布する工程及び乾燥工程は、これらの２工程の内の少なくとも１つの工程を上記乾燥環境下（乾球温度と湿球温度との差が７℃以上）で行うが、好ましくは、これら２つの工程すべてを乾燥環境下で行う事が生理活性物質上に固定化されるビオチン化蛋白の固定量を増大させることができることから好ましい。
【０１２２】
生理活性物質と被検体物質との相互作用を検出する場合、センサー表面の生理活性物質の固定量の変動は相互作用の定量的、速度論的評価の誤差の原因となる。この誤差を最小限に抑える目的で、生理活性物質の固定量を均一にすることが好ましい。相互作用の検出に使用される基板表面の生理活性物質の固定量のばらつきがＣＶ値（変動係数）（標準偏差／平均値）で１５％以下が好ましく、さらに好ましくは１０％以下である。ＣＶ値は、基板表面の少なくとも２点以上、好ましくは１０点以上、さらに好ましくは１００点以上の固定量から算出することができる。均一性は、生理活性物質を固定する前後のセンサー基板上の物質の量を定量することでも評価可能であるが、生理活性物質と結合することが知られている物質を蛍光標識して、この標識物質をセンサー基板に固定した後に蛍光顕微鏡などを用いて蛍光強度を測定することでも可能である。また、ＳＰＲイメージャー、エリプソメーター、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ、ＡＴＲ−ＩＲ装置などで生理活性物質の定量も可能である。これらの測定を行う場合、装置の特性にもよるが、乾燥状態で測定することが好ましい。ここでいう、＜乾燥状態＞とは、本明細書段落番号［００６５］に記載の、親水性ポリマー固定量を測定した際の乾燥状態と同様の条件のことをいう。
【０１２３】
上記塗布及び乾燥する工程によって、生理活性物質を固定化するための層へ固定化する生理活性物質が、ＩｇＧ（免疫グロブリン）ＣＲＰ（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）等の分子量１０５ｋＤａ以上１５０ｋＤａ以下の高分子蛋白質である場合には、上記塗布及び乾燥する工程等によって、生理活性物質であるアビジン類を固定化した後にアビジン−ビオチン結合の相互作用を利用してビオチン化された高分子蛋白質を結合する方法もあげられる。しかしながら、この場合には、アビジン類による立体障害によって結果的に好適な量の高分子蛋白質が固定化されない場合がある。
【０１２４】
そこで、本発明では、上記塗布及び乾燥工程によって生理活性物質を固定化するための層へ固定化されるアビジンの密度を、密度１ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２．５ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下となるように調製する。
【０１２５】
本発明において、固定化されるアビジン類の密度の調整方法としては、上記段落番号［００９８］に記載した条件によって、親水性ポリマーの基板への固定化量を調整することにより、アビジン類の密度を調整することが出来る。また、本手法以外に、生理活性物質（アビジン類）を固定化する際の親水性ポリマーの活性化量を減らすことによっても、本発明におけるアビジン類の密度を調整することが出来る。
【０１２６】
生理活性物質を固定するための層に固定されるアビジン類の密度を上記範囲となるように調整することによって、ビオチン化された高分子蛋白質が高濃度の固定化される。また、ビオチン化された高分子蛋白質は、アビジン類に結合することによって固定化されるため、失活を抑制される。
【０１２７】
上記塗布工程及び乾燥工程によって、上記生理活性物質を固定化するための層の表面へ固定化されるアビジン類の密度は、上述のように密度１ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２．５ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下であるが、密度１．０７ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２．４８ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下であることが好ましく、密度１．５８ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２．２８ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下であることが更に好ましい。
【０１２８】
生理活性物質を固定化するための層へ固定化されるアビジン類の密度が１ｐｍｏｌ／ｍｍ３未満であると、ビオチン化された高分子蛋白質の固定量が下がると言う問題が生じる場合があり、２．５ｐｍｏｌ／ｍｍ３を超えると、ビオチン化された高分子蛋白質の固定化がアビジン類による立体障害により阻害されて高濃度の固定化が達成されない場合がある。
【０１２９】
この生理活性物質を固定化するための層の表面へ固定化されたアビジン類の密度は、上記生理活性物質の固定量の算出方法と同様にして求めればよい。
【０１３０】
生理活性物質を固定化するための層へ上記所定の密度で固定化されたアビジン類に、ビオチン化された高分子蛋白質を結合させるには、ビオチン化された高分子蛋白質を含む溶液中に、アビジン類が固定化された基板を接触させればよい。また、接触させる際、中性条件下にすることが好ましい。
【０１３１】
上述のように、金属基板へ固定化されるアビジン類の密度を１ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２．５ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下となるように調整し、このアビジン類にビオチン化された高分子蛋白質を結合させることによって、上述のように高濃度のビオチン化された高分子蛋白質が固定化されるが、この高濃度に固定化されたビオチン化された高分子蛋白質の固定量とは、具体的には、０．４１ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上０．８７ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下である。また、このとき、この生理活性物質を固定化するための層に固定化されているアビジン類と、ビオチン化された高分子蛋白質と、のモル比は、０．１７以上０．６９以下の範囲内となる。
【０１３２】
生理活性物質を固定化するための層に固定化されているアビジン類と、ビオチン化された高分子蛋白質と、のモル比は、上述のように０．１７以上０．６９以下であり、０．３５以上０．５５以下であることが好ましい。
【０１３３】
アビジン類とビオチン化された高分子蛋白質とのモル比が０．１７未満であると、ビオチン化された高分子蛋白質の固定量が少ないという問題が生じる場合がある。
なお、この生理活性物質を固定化するための層へ固定化されたアビジン類と、ビオチン化された高分子蛋白質と、のモル比を上記０．１７以上０．６９以下となるように調製するためには、固定化されるアビジン類の密度を、上記１ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２．５ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下の範囲となるように調製すればよい。
【０１３４】
また、この生理活性物質を固定化するための層へ固定化されたアビジン類と、ビオチン化された高分子蛋白質と、のモル比を上記好ましい範囲である０．３５以上０．５５以下となるように調製するためには、固定化されるアビジン類の密度を、１．５８ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２．２８ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下の範囲となるように調製すればよい。
【０１３５】
なお、上記アビジン類と、ビオチン化された高分子蛋白質のモル比は、下記式（１）によって求められる。
【０１３６】
（ビオチン化された高分子蛋白質の固定量（ＲＵ）／固定化されているビオチン化された高分子蛋白質の重量平均分子量）／（アビジン類の固定量（ＲＵ）／固定化されているアビジン類の重量平均分子量）    ・・・式（１）
【０１３７】
式（１）中、ＲＵ（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）は、ＳＰＲイメージャー（ＣＷＧ社製  ＳＰＲイメージャー）を用いて、基板上を０．２５ｍｍ間隔で１２０点測定し、各測定点における測定対象物の固定化されていない状態における共鳴シグナルを示す基準点に対する、測定対象物を固定化した後に求められる共鳴シグナルの変化量を固定量（ＲＵ）として測定し、その平均値を求めることによって得られる。なお、１ＲＵは、１ｐｇ／ｍｍ２の固定量に相当する。
【０１３８】
（６）ビオチン化された高分子蛋白質
本発明においてビオチン化された高分子蛋白質とは、下記＜１＞〜＜５＞に示す、蛋白質・核酸などのうち、アビジン類と結合可能なビオチンを付与し、さらに、重量平均分子量１０００００以上２０００００以下であるものをいう。例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどのうち、重量平均分子量１０００００以上２０００００以下であり、さらに、ビオチン化されているものが挙げられる。ここで、ビオチン化とは、公知の方法を用いることができる。
【０１３９】
＜１＞  免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原２６、８６、５５、１１１、１５７  などに対する抗体等を使用することができる。
【０１４０】
＜２＞  酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク）等の酵素を使用することができる。
【０１４１】
＜３＞  微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
【０１４２】
＜４＞  核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
【０１４３】
＜５＞  糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【０１４４】
上記ビオチン化された高分子蛋白質の内、免疫蛋白質または酵素を用いることが好ましく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、及びＣＲＰを用いることがより好ましい。
【０１４５】
（７）本発明の基板の使用方法
上記のようにして生理活性物質を固定化した本発明の基板は、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。また、この検出及び／又は測定において、生理活性物質と相互作用する物質は特に限定されず、低分子化合物から蛋白質などの高分子化合物までの検出及び／又は測定が可能である。ここで、「低分子化合物」とは重量平均分子量１０００未満の化合物のことをいい、「高分子化合物」とは重量平均分子量１０００以上の化合物のことをいう。
【０１４６】
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【０１４７】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の方法で製造される基板は、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【０１４８】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【０１４９】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【０１５０】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【０１５１】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを、入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【０１５２】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【０１５３】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【０１５４】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【０１５５】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻  第１号（１９９８）の第２１頁〜２３頁および第２６頁〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【０１５６】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【０１５７】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【０１５８】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【０１５９】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩｇＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【０１６０】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【０１６１】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【０１６２】
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
【０１６３】
また、本発明のバイオセンサーは、例えば基板表面に導波路構造を保持した、屈折率変化を、導波路を用いて検出するバイオセンサーとして用いることができる。この場合、基板表面の導波構造物は、回折格子と場合によっては付加層とを有している、この導波構造物は、薄い誘電層からなる平面的な導波体から成る。導波体に集光された光線は全反射によりこの薄い層内に導かれる。この導かれる光波（以降モードと呼ぶ）の伝播速度は、Ｃ／Ｎの値をとる。ここでＣは、真空中での光速であり、Ｎは導波体内を導かれるモードの有効屈折率である。有効屈折率Ｎは、一面では導波体の構成により、他面では薄い導波層に隣接する媒体の屈折率により決まる。光波の伝導は、薄い平面層内のみでなく、別の導波構造物、特にストリップ状の導波体によっても行われる。その場合は、導波構造物はストリップ状のフイルムの形状にされる。有効屈折率Ｎの変化は、導波層に隣接する媒体の変化と導波層自身もしくは導波層に隣接する付加層の屈折率および厚さの変化とにより生じることがバイオセンサーにとって重要な要素である。
【０１６４】
この方式のバイオセンサーの構成については、例えば特公平６−２７７０３号公報４ページ４８行目から１４ページ１５行目および第１図から第８図、米国特許第  ６，８２９，０７３号のｃｏｌｕｍｎ６の３１行目からｃｏｌｕｍｎ７の４７行目および第９図Ａ，Ｂに記載されている。
【０１６５】
例えば、一つの実施形態として、薄層が平面状の導波路層が基材（たとえばパイレックス（登録商標）・ガラス）上に設けられている構造がある。導波路層と基材とは、一緒にいわゆる導波体を形成する。導波路層は、たとえば酸化物層（ＳｉＯ２，ＳｎＯ２，Ｔａ２Ｏ５，ＴｉＯ２，ＴｉＯ２−ＳｉＯ２，ＨｆＯ２，ＺｒＯ２，Ａｌ２Ｏ３，Ｓｉ３Ｎ４，ＨｆＯＮ，ＳｉＯＮ，酸化スカンジウムまたはこれらの混合物）、プラスチック層（例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネートなど）、など多層の積層体が可能である。光線が全反射により導波路層内を伝播するには、導波路層の屈折率が隣接媒体（たとえば基材や後述の付加層）の屈折率より大でなければならない。基材もしくは測定物質に向いた導波路層表面もしくは導波路層体積内には、回折格子が配置されている。回折格子は、型押し、ホログラフィまたはその他の方法によって基板内に形成することができる。次いでより高い屈折率を有する薄い導波路膜を回折格子の上表面に被覆する。回折格子は導波路層への入射光線を集束したり、既に導波路層内を導かれているモードを放出したり、そのモードの一部を進行方向へ透過させ、一部を反射させたりする機能を持つ。導波路層は、格子域を付加層でカバーしておく。付加層は必要に応じて多層膜とすることができる。この付加層は、測定物質に含まれている物質の選択的検知を可能にする機能を持たせることができる。好ましい態様として付加層の最表面に、検知機能を持つ層を設けることができる。このような検知機能を持つ層として、生理活性物質を固定化し得る層を用いることができる。
【０１６６】
別の実施形態として、回折格子導波路のアレイがマイクロプレートのウェル内に組み込まれる形態も可能である（特表２００７−５０１４３２）。すなわち回折格子導波路がマイクロプレートのウェル底面にアレイ状に配列されていれば、スループットの高い薬物または化学物質のスクリーニングを可能にすることができる。
【０１６７】
回折格子導波路は、回折格子導波路の上層（検知領域）上の生理活性物質検出を可能にするために、入射光線、および反射光を検出して屈折特性の変化を検出する。この目的のため、１つまたはそれより多くの光源（例えば、レーザ、ダイオード）及び１つまたはそれより多くの検出器（例えば、分光計、ＣＣＤカメラまたはその他の光検出器）を用いることができる。屈折率変化を測定するための方法として、２つの異なる動作モード−分光法、及び角度法がある。分光法においては、入射光として広帯域ビームが回折格子導波路に送られ、反射光が集められて、例えば分光計で測定される。共鳴波長（ピーク）のスペクトル位置を観測することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。また、角度法においては、公称上単一波長の光がある範囲の照射角を生じるように集束されて、回折格子導波路内に向けられる。反射光がＣＣＤカメラまたはその他の光検出器によって測定される。回折格子導波路によって反射された共鳴角の位置を測定することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。
【０１６８】
本発明の基板を用いた、生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定方法は、フラグメントアッセイ（生理活性物質と相互作用する物質として、低分子化合物の検出を行う方法）として、使用することが可能である。フラグメントアッセイは創薬手法の効率化に寄与することができ、薬剤の基となる化合物の探索として本発明の上記の検出及び／又は検出方法を使用することにより、生理活性物質の立体構造との活性相関のある低分子化合物を検出し、さらに活性の強い化合物をデザインすることで、創薬手法の効率化を図ることができる。本発明の基板を用いた、生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定方法を使用したフラグメントアッセイでは、重量平均分子量１００から５００程度の低分子化合物の測定が可能である。
【０１６９】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【０１７０】
以下、本実施例では、アビジン類が表面に固定化された層を有する金属基板の表面への、ビオチン化された高分子蛋白質の固定能を評価した。
【０１７１】
（実施例１）
（１）基板の作成
６−Ａｍｉｎｏ−１−ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ，  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（同仁化学社製）の１ｍＭ水溶液を作成した。この溶液をＡ液と呼ぶ。
【０１７２】
次に、ゼオネックス（日本ゼオン社製）のペレットを２４０℃で溶解し、この溶融物を射出成型器で縦８ｍｍ×横１２０ｍｍ×１．５ｍｍのプラスチックプリズム基板を成型した。この基板に平行平板型６インチ用スパッタ装置（ＳＨ−５５０、アルバック（株）社製）の基板ホルダにプリズムを取付け、真空（ベースプレッシャー１×１０−３Ｐａ以下）に引いてからＡｒガスを導入し（１Ｐａ）、基板ホルダを回転（２０ｒｐｍ）させながら、基板ホルダにＲＦパワー（高周波数の電気信号）（０．５ｋＷ）を約９分間印加して上記プラスチックプリズム表面をプラズマ処理する。次に、Ａｒガスを止めて真空に引き、Ａｒガスを再び導入し（０．５Ｐａ）、基板ホルダを回転（１０ｒｐｍ〜４０ｒｐｍ）させながら、８ｉｎｃｈのＣｒターゲットにＤＣパワー（ＤＣ電圧）（０．２ｋＷ）を約３０秒間印加して２ｎｍのＣｒ薄膜を成膜する。次に。Ａｒガスを止めて再び真空に引き、Ａｒガスを再び導入し、（０．５Ｐａ）、基板ホルダを回転（２０ｒｐｍ）させながら、８ｉｎｃｈのＡｕターゲットにＤＣパワー（１ｋＷ）を約５０秒間印加して５０ｎｍ程度のＡｕ薄膜を成膜した。
【０１７３】
上記で得られたＡｕ薄膜を成膜したプラスチックプリズムを、上記Ａ液に４０℃１時間浸漬し、超純水で５回洗浄した。
【０１７４】
（２）ＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン）の活性エステル化
１重量％のＣＭＤ（名糖産業製：重量平均分子量１００万、糖１ユニットあたりのカルボキシメチル基置換度０．６７）溶液２０ｇを調製した後、ＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を濃度１５ｍＭの水溶液を２０ｍｌ加え、室温で１時間攪拌した。
【０１７５】
（３）ＣＭＤの基板への結合反応
上記（１）で作成された基板（Ａｕ薄膜を成膜したプラスチックプリズム）の上に、上記（２）で作成されたＣＭＤとＥＤＣの混合溶液を１．５ｍｌ滴下し、１５００ｒｐｍで４５秒間スピンコートし、室温で１５分間静置させて反応させることで、アミノ基を有する基板上にカルボキシメチルデキストラン薄膜を固定させた。次に、１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液に３０分浸漬し、超純水で５回洗浄することで、ＣＭＤ膜を成膜した。
【０１７６】
（４）センサースティックの作製
（４−１）
上記（３）で作製されたＣＭＤ膜上に０．２Ｍ  ＥＤＣ／５０ｍＭ  ＮＨＳ（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）の混合水溶液を１ｍｌ滴下し、７分間静置させた。同表面上を純水で５回洗浄した。洗浄液を表面から窒素ガンを用いて十分に取り除いた後、２３℃１０％環境下でスピンコートにセットし、５ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン（和光純薬製）  Ｂｏｒａｔｅバッファー（ｐＨ８．５）を１００ｕｌキャストし、１分静置後に５００ｒｐｍで４５秒間スピンコート）を３回繰り返した後に、１５分間静置することにより乾燥を行った。
（４−２）ブロッキング処理
該１５分の静置の後、１Ｍ  ２−Ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｏｌ（和光純薬製）  ｐＨ８．５をキャストして７分間静置、Ｂｏｒａｔｅバッファーで洗浄後１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液に１５分間浸漬、Ｂｏｒａｔｅバッファーで洗浄を順次行うことによって、ストレプトアビジンが固定されたアビジン修飾基板２を得た。
【０１７７】
（４−３）
上記（４−１）及び（４−２）の処理により作製したアビジン修飾基板を、表面プラズモン共鳴装置へセットした。
ＰＢＳバッファーを注入し、ベースラインを確認した後（この時の共鳴角を基準点とする）、０．５ｍｇ／ｍｌのビオチン化ＩｇＧ溶液（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製、ＣＲＰ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ＰＢＳバッファーｐＨ７．４、ビオチン化蛋白質の分子量１５０ｋＤａ）を注入し３０分攪拌した。
次にＰＢＳバッファーを注入し１分間静置し、次に０．２ｍｇ／ｍｌのＤ−Ｂｉｏｔｉｎ溶液を注入し１分静置、最後にＰＢＳバッファーを注入し１分静置を２回行うことによって、ビオチン化されたＩｇＧがアジビンを介して固定化されたセンサースティック２を得た。
【０１７８】
（実施例２）
上記実施例１の（２）の工程において、ＥＤＣの濃度を１０ｍＭとした以外は、上記実施例１と同様にして、アビジンの固定されたアビジン修飾基板３を得た後に、ビオチン化されたＩｇＧがアジビンを介して固定化されたセンサースティック３を得た。
【０１７９】
（実施例３）
上記実施例１の（２）の工程において、ＥＤＣの濃度を６ｍＭとした以外は、上記実施例１と同様にして、アビジンの固定されたアビジン修飾基板４を得た後に、ビオチン化されたＩｇＧがアジビンを介して固定化されたセンサースティック４を得た。
【０１８０】
（実施例４）
上記実施例１の（２）の工程において、ＥＤＣの濃度を３ｍＭとした以外は、上記実施例１と同様にして、アビジンの固定されたアビジン修飾基板５を得た後に、ビオチン化されたＩｇＧがアジビンを介して固定化されたセンサースティック５を得た。
【０１８１】
（実施例５）
上記実施例１の（２）の工程において、ＥＤＣの濃度を１ｍＭとした以外は、上記実施例１と同様にして、アビジンの固定されたアビジン修飾基板６を得た後に、ビオチン化されたＩｇＧがアジビンを介して固定化されたセンサースティック６を得た。
【０１８２】
（実施例６）
上記実施例１の（２）の工程において、ＥＤＣの濃度を０．４ｍＭとした以外は、上記実施例１と同様にして、アビジンの固定されたアビジン修飾基板７を得た後に、ビオチン化されたＩｇＧがアジビンを介して固定化されたセンサースティック７を得た。
【０１８３】
（比較例１）
上記実施例１の（２）の工程において、ＥＤＣの濃度を２５ｍＭとした以外は、上記実施例１と同様にして、アビジンの固定されたアビジン修飾基板１を得た後に、ビオチン化されたＩｇＧがアジビンを介して固定化されたセンサースティック１を得た。
【０１８４】
（比較例２）
上記実施例１の（２）の工程において、ＥＤＣの濃度を１０ｍＭとすると共に、該実施例１の（３）の工程で得られたアビジンを固定していないＣＭＤ膜に対し、表面プラズモン共鳴装置内で、上記０．２Ｍ  ＥＤＣ／５０ｍＭ  ＮＨＳ混合水溶液を用いて７分間活性化した後、に５ｍｇ／ｍｌのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（和光純薬製）  Ｂｏｒａｔｅバッファー（ｐＨ８．５）を加えて３０分攪拌した後に、上記実施例１の（４―２）〜（４−３）の工程を行うことによって、アビジンが固定されたアビジン修飾基板８を得た後に、ビオチン化されたＩｇＧがアジビンを介して固定化されたセンサースティック８を得た。
【０１８５】
（比較例３）
上記実施例１の（２）の工程において、ＥＤＣの濃度を３ｍＭとすると共に、該実施例１の（３）の工程で得られたアビジンを固定していないＣＭＤ膜に対し、表面プラズモン共鳴装置内で、上記０．２Ｍ  ＥＤＣ／５０ｍＭ  ＮＨＳ混合水溶液を用いて７分間活性化した後、５ｍｇ／ｍｌのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（和光純薬製）  Ｂｏｒａｔｅバッファー（ｐＨ８．５）を加えて３０分攪拌した後に、上記実施例１の（４―２）〜（４−３）の工程を行うことによって、アビジンが固定されたアビジン修飾基板９を得た後にビオチン化されたＩｇＧがアジビンを介して固定化されたセンサースティック９を得た。
【０１８６】
（比較例４）
上記実施例１の（２）の工程において、ＥＤＣの濃度を３ｍＭとすると共に、該実施例１の（３）の工程で得られたアビジンを固定していないＣＭＤ膜に対し、表面プラズモン共鳴装置内で、上記０．２Ｍ  ＥＤＣ／５０ｍＭ  ＮＨＳ混合水溶液を用いて７分間活性化した後、０．５ｍｇ／ｍｌのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（和光純薬製）酢酸バッファー（ｐＨ４．５）を加えて３０分攪拌した後に、上記実施例１の（４―２）〜（４−３）の工程を行うことによって、アビジンが固定されたアビジン修飾基板１０を得た後に、ビオチン化されたＩｇＧがアジビンを介して固定化されたセンサースティック１０を得た。
【０１８７】
上記実施例１〜実施例６、及び比較例１〜比較例４で調整した、アビジン類の固定されたアビジン修飾基板１〜１０の各々について、固定化されているアビジンの密度（ｐｍｏｌ／ｍｍ３）を測定した。測定結果を表１に示した。
【０１８８】
さらに、上記実施例１〜実施例６、及び比較例１〜比較例６で調整した、アビジンを介してビオチン化された高分子蛋白質の固定化された各センサースティック１〜１０の各々について、固定化されている各ビオチン化された高分子蛋白質の固定量（ｐｍｏｌ／ｍｍ３）を測定した。測定結果を表１に示した。
【０１８９】
なお、固定化されているアビジンの密度、及びビオチン化された高分子蛋白質の固定量は、上記センサースティックの調整工程（上記（４−３）の工程）において、共鳴角と原点の共鳴角の差を、ビオチン化された高分子蛋白質の固定量として測定した。なお、共鳴角はＤＭＳＯ溶液で較正し、ＰＢＳバッファーと１０％ＤＭＳＯを含むＰＢＳバッファーとの共鳴角変化を１５００ｐｇ／ｍｍ２ビオチン化された高分子蛋白質の固定量として比例計算した。
また、アビジン類の固定量についても同様に、上記作製したアビジン修飾基板を固定前後の共鳴角変化からその固定量を算出した。
【０１９０】
さらに、上記実施例１〜実施例６、及び比較例１〜比較例４で調整された各センサースティック１〜１０の各々に固定化されたアビジン類と、ビオチン化された高分子蛋白質と、のモル比を求めた。結果を表１に示した。
【０１９１】
なお、このモル比は、下記式（２）により求めた。
【０１９２】
（ビオチン化された高分子蛋白質の固定量（ＲＵ）／固定されているビオチン化された高分子蛋白質の重量平均分子量）／（アビジン類の固定量（ＲＵ）／固定されているアビジン類の重量平均分子量）    ・・・式（２）
【０１９３】
【表１】
2008286775.tif 000019
【０１９４】
表１に示されるように、塗布及び乾燥工程によって基板上にアビジン類を固定化し、且つこのアビジンを密度１ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２．５ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下の密度となるように固定化した場合には、ビオチン化された高分子蛋白質を結合させることによって得られたセンサースティックにおける、アビジン類と、ビオチン化された高分子蛋白質と、のモル比は０．１７以上０．６９以下の範囲内であり、またビオチン化された高分子蛋白質の固定量は０．４１ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上０．８７ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下の範囲内となった。このため、実施例１〜６においては、ビオチン化された高分子蛋白質の好適な量の固定化が見られた。
一方、比較例１〜比較例４で調整したセンサースティック１、８〜１０においては、ビオチン化された高分子蛋白質の固定量は、実施例に比べて少なく、良好な固定化量は得られなかったといえる。
【０１９５】
このため、アビジン類を塗布及び乾燥工程によって基板上に固定化すると共に、アビジン類の固定化量を密度１ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２．５ｐｍｏｌ／ｍｍ３以下となるように調整すれば、このアビジン類を介して、ビオチン化された高分子蛋白質を好適な量固定化することができたといえる。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】センサユニットの概略構成を示す分解斜視図である。
【符号の説明】
【０１９７】
２５  金属膜（薄膜層）
２６  生理活性物質を固定化するための層
【図１】
2008286775.tif 000020