(57)【要約】【課題】本発明は、付着性細胞の冷蔵保存方法を提供することを課題とする。より詳しくは、冷蔵保存を可能とすることで、凍結細胞保存から通常の細胞培養条件に移す際に、必要としていた凍結保存剤を除去する必要なく、効果的に保存可能な付着性細胞の冷蔵保存方法を提供することを課題とする。【解決手段】培養用基材上で増殖した付着性細胞を、細胞剥離液を用いて該培養用基材から剥離したものを、還元糖を含む細胞保存液に懸濁して、冷蔵条件にて保存することによる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養用基材上で増殖した付着性細胞を、細胞剥離液を用いて該培養用基材から剥離し、該剥離した付着性細胞を、還元糖を含む細胞保存液に懸濁し、冷蔵条件にて保存することを特徴とする付着性細胞の保存方法。
【請求項２】
細胞保存液に含まれる還元糖が、グルコース又はマルトースからなる群より選ばれるいずれか１種又は複数種であることを特徴とする請求項１に記載の付着性細胞の保存方法。
【請求項３】
細胞保存液が、さらに炭酸水素イオン及び／又は炭酸イオンを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の付着性細胞の保存方法。
【請求項４】
細胞保存液に含まれる炭酸水素イオン及び／又は炭酸イオンの含有量が、1 〜 75 mMであることを特徴とする請求項３に記載の付着性細胞の保存方法。
【請求項５】
細胞保存液が、さらにカルシウムイオン、マグネシウムイオン、塩化物イオン、リン酸イオン、硫酸イオン及び乳酸イオンからなる群より選ばれるいずれか１種又は複数種のイオンを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の付着性細胞の保存方法。
【請求項６】
1,000 mlの水溶液中、以下の組成を含む細胞保存液を用いて、付着性細胞を冷蔵条件にて保存することを特徴とする請求項１に記載の付着性細胞の保存方法。
還元糖                                 0 〜 150 mM
ナトリウムイオン                      20 〜 260 mM
カリウムイオン                         3 〜 125 mM
炭酸水素イオン及び／又は炭酸イオン     1 〜  75 mM
カルシウムイオン                       1 〜   4 mM
マグネシウムイオン                     0 〜   1 mM
塩化物イオン                          75 〜 245 mM
リン酸イオン                         0.5 〜  65 mM
硫酸イオン                             0 〜   1 mM
乳酸イオン                             0 〜  20 mM
【請求項７】
冷蔵条件が、０〜２５℃である請求項１〜６のいずれか１項に記載の付着性細胞の保存方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の付着性細胞の保存方法により保存した後の付着性細胞を、細胞保存液を洗浄除去する工程を経ないで、細胞増殖用培地に播種することによる付着性細胞の培養方法。
【請求項９】
付着性細胞保存用の還元糖を含む細胞保存液、及び細胞剥離液を含む付着性細胞保存用キット。
【請求項１０】
細胞保存液が、請求項１〜８のいずれか１項に記載の付着性細胞の保存方法に用いられる細胞保存液である請求項９に記載の付着性細胞保存用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冷蔵条件にて保存することを特徴とする付着性細胞の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生細胞は、生理機能や生物学的活性を有しており、多方面で利用価値がある。しかしながら、温度の高い条件下に放置すると代謝により細胞が変性するため、細胞の生理機能や生物学的活性が低下若しくは消失してしまう。そこで、細胞を凍結して保存することが必要となる。細胞の凍結保存には従来から細胞膜透過型凍結保存剤としてＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）、エチレングリコール、グリセロールなどが用いられ、細胞膜非透過型凍結保存剤としてはポリビニルピロリドン等が用いられてきた。また、精製アルブミンとＤＭＳＯとを含有する細胞保存液を用いれば、−８０℃で、短期間であれば−４℃程度でも細胞を保存できることが開示されている（特許文献１）。
【０００３】
しかしながら、一般にこれらの凍結保存剤は高濃度にすると細胞に対して毒性を示すという問題がある。また凍結保存された細胞を培養などに用いる場合には、予め細胞から凍結保存剤を除去しておくことが必要となり、その作業は煩雑である。また、凍結保存は、例えば−８０℃といった非常に低い温度条件で行われるが、これは専門の高価な冷凍装置を必要とするという問題を有する。また、凍結・融解という工程は、細胞に著しい損傷を与える可能性があるため、生存率を低下させてしまう。さらに、細胞種によっては、凍結保存できないものもある。
【０００４】
凍結保存用の、ＤＭＳＯ等の毒性を示す可能性のある物質を含まないような細胞・組織等の保存液として、多糖類のレバン又はレバンオリゴ糖を含有する保存液（特許文献２）、フラクオリゴ糖の一種である1-ケストースを有効成分として含有する保存液（特許文献３）等が開示されている。
【０００５】
一方、トレハロースとマトリクス蛋白質充填剤と単糖とを緩衝液に含有させた組成物（特許文献４）や、抗酸化作用をもつポリフェノールを含有させた保存液（特許文献５）、また、水に混和可能なアルコールにキレート剤等を加えた溶液などが開示されている（特許文献６）。
【０００６】
上述の溶液以外に、従来から用いられている細胞・組織保存液としては、ユーロ−コリンズ液（Euro-Collins液）（非特許文献１）、ＵＷ液（University of Wisconsin液）（非特許文献２）、ET-Kyoto液（特許文献７）及びユーロ−コリンズ液やＵＷ液に有効成分として緑茶カテキンのエピガロカテキンガレードを添加した溶液（特許文献８）などが開示されている。
【特許文献１】特開2002-233356号公報
【特許文献２】特開平9-255501号公報
【特許文献３】特開平5-38284号公報
【特許文献４】特表2003-505024号公報
【特許文献５】国際公開WO02/017952号公報
【特許文献６】特開2002-168858号公報
【特許文献７】特開平6-40801号公報
【特許文献８】特開2003-267801号公報
【非特許文献１】Squifflet, J. P., et al., Transplant Proc., 13, 693, 1981
【非特許文献２】Wahlberg, J. A., et al., Transplantation, 43, pp. 5-8, 1987
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、付着性細胞の冷蔵保存方法を提供することを課題とする。より詳しくは、凍結細胞保存から細胞増殖用培地を用いる細胞培養条件に移す際に、必要としていた凍結保存剤を除去する必要がないように、凍結保存剤を用いずに効果的に保存可能な付着性細胞の冷蔵保存方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を進めた結果、培養用基材上で増殖した付着性細胞を、細胞剥離液を用いて該培養用基材から剥離したものを還元糖を含む細胞保存液に懸濁することで、付着性細胞を冷蔵条件にて保存可能なことを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は以下よりなる。
１．培養用基材上で増殖した付着性細胞を、細胞剥離液を用いて該培養用基材から剥離し、該剥離した付着性細胞を、還元糖を含む細胞保存液に懸濁し、冷蔵条件にて保存することを特徴とする付着性細胞の保存方法。
２．細胞保存液に含まれる還元糖が、グルコース又はマルトースからなる群より選ばれるいずれか１種又は複数種であることを特徴とする前項１に記載の付着性細胞の保存方法。
３．細胞保存液が、さらに炭酸水素イオン及び／又は炭酸イオンを含むことを特徴とする前項１又は２に記載の付着性細胞の保存方法。
４．細胞保存液に含まれる炭酸水素イオン及び／又は炭酸イオンの含有量が、1 〜 75 mMであることを特徴とする前項３に記載の付着性細胞の保存方法。
５．細胞保存液が、さらにカルシウムイオン、マグネシウムイオン、塩化物イオン、リン酸イオン、硫酸イオン及び乳酸イオンからなる群より選ばれるいずれか１種又は複数種のイオンを含むことを特徴とする前項１〜４のいずれか１項に記載の付着性細胞の保存方法。
６．1,000 mlの水溶液中、以下の組成を含む細胞保存液を用いて、付着性細胞を冷蔵条件にて保存することを特徴とする前項１に記載の付着性細胞の保存方法。
還元糖                                 0 〜 150 mM
ナトリウムイオン                      20 〜 260 mM
カリウムイオン                         3 〜 125 mM
炭酸水素イオン及び／又は炭酸イオン     1 〜  75 mM
カルシウムイオン                       1 〜   4 mM
マグネシウムイオン                     0 〜   1 mM
塩化物イオン                          75 〜 245 mM
リン酸イオン                         0.5 〜  65 mM
硫酸イオン                             0 〜   1 mM
乳酸イオン                             0 〜  20 mM
７．冷蔵条件が、０〜２５℃である前項１〜６のいずれか１項に記載の付着性細胞の保存方法。
８．前項１〜７のいずれか１項に記載の付着性細胞の保存方法により保存した後の付着性細胞を、細胞保存液を洗浄除去する工程を経ないで、細胞増殖用培地に播種することによる付着性細胞の培養方法。
９．付着性細胞保存用の還元糖を含む細胞保存液、及び細胞剥離液を含む付着性細胞保存用キット。
１０．細胞保存液が、前項１〜８のいずれか１項に記載の付着性細胞の保存方法に用いられる細胞保存液である前項９に記載の付着性細胞保存用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の付着性細胞の保存方法によると、付着性細胞を凍結保存している状態から培養状態に移す場合に、通常必要とされる遠心分離等による凍結保存剤を除去するための洗浄工程を経ずに、細胞を細胞保存液に懸濁したまま培地に播種して細胞を培養することを可能とする。本発明の付着性細胞を冷蔵保存するために用られる細胞保存液は、少なくとも還元糖を含み、かかる細胞保存液を用いて細胞を保存すると、細胞の生存率の上昇及び細胞の生理機能の維持をもたらし、細胞保存性能を高い状態で維持することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の付着精細胞の保存方法は、通常の細胞増殖用培地を用いて培養用基材上に培養した付着性細胞を、例えばトリプシン及び／又はＥＤＴＡ等を含む自体公知の細胞剥離液を用いて剥離し、細胞保存液に上記濃度に懸濁し、浮遊させることによって、冷蔵保存する保存方法に関する。ここにおいて、通常の細胞増殖用培地とは、細胞の種類や使用目的によっても異なるが、市販の培地に、ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum; 以下「ＦＢＳ」という。）などを適宜必要な量加えたものなどをいい、自体公知の細胞増殖用培地を例示することができる。
【００１２】
本発明において、細胞培養基材とは、細胞培養用シャーレや細胞培養用フラスコなど、いわゆる当業者が細胞培養に用いる基材をいい、特に限定されない。細胞培養用基材の素材として、細胞培養することができればよく、特に限定されないが、例えばプラスチック板のほか、繊維、織布、不織布、スポンジ、綿、フィルムなどを例示することができる。
【００１３】
本発明の保存方法により保存することのできる付着性細胞としては、例えば、ヒトを含む哺乳動物から単離した種々の細胞、例えば骨膜細胞、間葉系幹細胞、神経細胞、肝細胞、腎細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞及びＥＳ細胞等を挙げることができる。付着性細胞は、株化された付着性細胞であってもよい。株化された付着性細胞として、例えば３Ｔ３細胞（マウス繊維芽細胞由来）、正常ヒト繊維芽細胞、Ａ５４９細胞（ヒト肺上皮細胞由来）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞由来）などが挙げられる。
【００１４】
本発明の付着性細胞の保存方法によると、細胞の保存は冷蔵条件において行われる。冷蔵条件とは、溶液が凍結しない条件であって、低温であれば特に限定されるものではないが、好ましくは、０〜２５℃、より好ましくは０〜１０℃、特に好ましくは４〜６℃の範囲である。細胞保存器は、上記のような冷蔵条件を達成しうるものであれば良く、特に限定されないが、例えばインキュベーターや冷蔵庫を挙げることができる。
【００１５】
本発明の付着性細胞の保存方法に使用される細胞保存用容器は、細胞保存器、細胞種、保存温度、保存期間、保存後の細胞の用途等を考慮して、公知の容器から適宜選択して用いることができる。例えば、冷蔵庫で細胞を保存する場合には、密閉系の容器を用いることが好ましい。
【００１６】
また、本発明の細胞保存方法による細胞の保存期間は、細胞種、保存温度等の条件に依存するため一律には規定しがたいが、目安としては４〜１２日程度まで、好ましくは４〜６日程度まで可能である。具体的な使用態様としては、例えば、付着性細胞を受託培養施設から患者の元に輸送する際の保存方法として用いることができる。このような短期間の保存の場合、冷蔵条件下で保存できるという点で、本発明の保存方法には利点がある。
【００１７】
本発明の細胞の保存方法による保存は、付着性細胞であっても、細胞を保存液中に浮遊させて行うことができる。保存の際に、細胞保存液に浮遊させる細胞濃度は、細胞種、細胞の大きさ、保存期間等の条件に依存し、当業者により適宜決定されるものであり、特に限定されるものではないが、例えば、１×１０４〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度である。
【００１８】
本発明の付着性細胞の保存方法は、通常の細胞増殖用培地を用いて培養用基材上に培養した付着性細胞を、例えばトリプシン及び／又はＥＤＴＡ等を含む自体公知の細胞剥離液を用いて剥離し、以下に示す細胞保存液に上記濃度に懸濁し、浮遊させることによって、達成される。上記濃度となるように細胞保存液に浮遊させるために、剥離した細胞を細胞保存液又はその他の溶液に浮遊させ、遠心分離により細胞剥離液を除去した後に、上記濃度になるように細胞保存液に細胞を浮遊させても良い。
【００１９】
本発明の付着性細胞の保存方法に使用される細胞保存液は、少なくとも還元糖を含むことを特徴とする。ここで使用される還元糖とは、アルドースの１位、又はケトースの２位、すなわちアノマー炭素原子が置換を受けていない単糖及びオリゴ糖をいい、例えばグルコース又はマルトース等が挙げられる。これらの糖は１種又は複数種を組み合わせて用いてもよい。なかでもグルコースが好適である。これらの糖類は、市販のものを用いることができる。 細胞保存液における糖類の含有量は、0.5 〜 150 mM、好ましくは0.5 〜 100 mM、さらに好ましくは0.5 〜 50 mMである。糖類の含有量が150 mMを超えると、細胞の保存時に細胞が凝集し、塊を形成することがあり、該塊をほぐすのに煩雑な作業を要する。
【００２０】
本発明において使用される細胞保存液は、さらに炭酸水素イオン及び／又は炭酸イオンを含ませることが好ましい。ここで炭酸水素イオンとはHCO3-を示し、炭酸イオンとはCO32-を示す。これらのイオンは溶液中では平衡状態にあり、pH等の条件により変化しうる。炭酸水素イオン及び／又は炭酸イオンは、種々の炭酸塩、炭酸水素塩を細胞保存液に添加することによって、当該保存液に含ませることができる。このような化合物の例としては、炭酸水素ナトリウム（重曹）、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、重炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等が挙げられる。特に重曹が経済性・扱い易さの点で好適であるが、本発明はこれに限定されるものではない。重曹は市販のものを用いることができる（下記の実施例では和光純薬工業株式会社製を使用）。細胞保存液における炭酸水素イオン及び／又は炭酸イオンの含有量は、1〜75 mM、好ましくは10〜50 mM、さらに好ましくは20〜30 mMから選択することができるが、特に限定されるものではない。
【００２１】
本発明において使用される細胞保存液では、細胞及び組織が保存中に膨張又は収縮するのを防ぐこと等によって、細胞の生存率を向上させることが好ましい。このため該細胞保存液の浸透圧は、200〜500 mOsm/kgに調整され、好ましくは200〜400 mOsm/kg、より好ましくは250〜350 mOsm/kgに調整される。保存液の浸透圧は、該保存液に含有されるイオンを含む全物質の濃度により定まる。保存液の浸透圧は、糖類、炭酸水素イオン及び／又は炭酸イオン、その他の保存液に含まれるイオンの含有量を変化させることにより、適宜調整することができ、あるいはヒドロキシエチル澱粉等の無害な浸透圧調整剤を添加してもよい。
また本発明において使用される細胞保存液は、pHが5.0〜8.5、好ましくは6.0〜8.5、より好ましくは7.0〜8.0に調整される。pHは、上述した有機酸のナトリウム塩若しくはカリウム塩等の電解質を添加することにより調整することができるが、これに限定されるものではない。
【００２２】
本発明において使用される細胞保存液は、さらにカルシウムイオン、マグネシウムイオン等の金属イオン、塩化物イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、及び乳酸イオン等を含んでいてもよい。これらのイオンは１種又は複数種を組み合わせて用いてもよく、特に限定されるものではない。これらのイオンの濃度は、保存液の浸透圧、pH、及び保存液における他の物質の含有量等に依存するため、当業者が適宜設定できるものであり、特に限定されるものではないが、例えばマグネシウムイオンが0.0 〜 1 mM、好ましくは0.2 〜 0.8 mM、カルシウムイオンが1 〜 4 mM、好ましくは1.5 〜 3.5、塩化物イオンが75 〜 245 mM、好ましくは100 〜 150 mM、リン酸イオンが0.5 〜 65 mM、好ましくは0.5 〜 2 mM、硫酸イオンが0 〜 1 mM、好ましくは0.5 〜 1 mM、乳酸イオンが0 〜 20 mM、好ましくは0 〜 15 mMから選択することができる。
【００２３】
本発明において使用される細胞保存液には、従来の保存液における他の成分、例えば抗生物質、抗菌剤、抗酸化剤、血清、ビタミン、タンパク質、アミノ酸、pH指示薬、キレート剤等を適宜含有させることもできる。
【００２４】
また、本発明のにおいて使用される細胞保存液は、日本薬局方リンゲル液及び日本薬局方炭酸水素ナトリウム溶液に、市販の輸液製剤である脱水補給液を必要な成分が必要濃度含まれるように、無菌条件下で混合する方法により調製することができる。その他の方法として、例えば必要な成分を各々必要量秤量し、純水に混合し、混合した溶液を除菌ろ過することにより調製してもよい。
市販の輸液製剤である脱水補給液として、例えば総合電解質輸液、輸液用電解質液として販売されている薬剤を使用することができる。より具体的には、以下の１）又は２）の組成を有する注射液が挙げられる。
【００２５】
１）1,000 mlの水溶液中に以下の成分を含有する注射液
塩化ナトリウム            1.92 g
塩化カリウム              1.00 g
乳酸ナトリウム            2.80 g
塩化マグネシウム          0.10 g
リン酸一ナトリウム        0.14 g
リン酸ニカリウム          1.00 g
ブドウ糖                 23.5 g
【００２６】
２）以下の組成からなる注射液
塩化ナトリウム            0.270 w/v%
塩化カリウム              0.149 w/v%
乳酸ナトリウム            0.224 w/v%
リン酸ニ水素ナトリウム    0.031 w/v%
リン酸一水素ナトリウム    0.287 w/v%
ブドウ糖                  3.2 w/v%
L-乳酸                      8 mEq/L
【００２７】
上記日本薬局方リンゲル液、日本薬局方炭酸水素ナトリウム溶液及び市販の輸液製剤は、体積比８０：３：２０〜５０の割合で混合することにより、本発明の細胞保存液を調製することができる。具体的には、例えば日本薬局方リンゲル液８００ｍｌ、日本薬局方炭酸水素ナトリウム溶液３０ｍｌに上記１）の注射液を２５０〜３００ｍｌ混合して調製することができる。さらに別の方法として例えば日本薬局方リンゲル液８００ｍｌ、日本薬局方炭酸水素３０ｍｌに上記２）の注射液を４００〜４５０ｍｌ混合して調製することができる。
【００２８】
上記により一定時間冷蔵保存により保存した細胞は、遠心分離などによって細胞保存液を除去した後、通常の細胞増殖用培地に播種して培養してもよいが、細胞保存液で保存した後の細胞を、通常の細胞増殖用培地にそのまま播種することで、通常の培養を行うことができる。培養を再開するための細胞の濃度は、細胞の種類によっても異なるが、例えば細胞継代時の細胞濃度とすることができる。本発明は、細胞保存液で保存した後の細胞を用いて、通常の細胞増殖用培地を用いた細胞培養を行う方法にも及ぶ。
【００２９】
本発明は、細胞保存液及び細胞剥離液を含む付着性細胞保存用キットにも及ぶ。
【実施例】
【００３０】
以下に、参考例、実施例、実験例等を示して、本発明の付着性細胞の保存方法に使用しうる保存液、細胞保存方法及びこれらによる細胞生存率を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【００３１】
（参考例１）グルコース及び重曹を含有した細胞保存液
以下の成分を純水に溶解することにより細胞保存液を調製した。浸透圧は約283.5 mOsm/kgであった。浸透圧はOSMOMETER OM 802-D (VOGEL社製)を用いて測定した。
グルコース（和光純薬工業株式会社製）1,000 mg
塩化ナトリウム                    6,976.8 mg
塩化カリウム                          400 mg
塩化カルシウム                        200 mg
炭酸水素ナトリウム                  2,000 mg
リン酸水素ナトリウム・水和物          140 mg
硫酸マグネシウム                       98 mg
１Ｎ塩酸                              2.8 ml
純水
合計                                1,000 ml
【００３２】
したがって、イオン組成は以下のとおりである。
グルコース                           5.5 mM
ナトリウムイオン                   143.8 mM
カリウムイオン                       5.4 mM
炭酸水素イオン及び／又は炭酸イオン  23.7 mM
カルシウムイオン                     1.8 mM
マグネシウムイオン                   0.8 mM
塩化物イオン                       130.8 mM
リン酸イオン                         1.0 mM
硫酸イオン                           0.8 mM
純水
合計                               1,000 ml
【００３３】
（参考例２）市販のＭＥＭ培地からなる細胞保存液
細胞保存液として市販のＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）を用いた。以下の組成からなる。
グルコース                           5.6 mM
ナトリウムイオン                   145.3 mM
カリウムイオン                       5.4 mM
炭酸水素イオン及び／又は炭酸イオン  23.7 mM
カルシウムイオン                     1.8 mM
マグネシウムイオン                   0.8 mM
塩化物イオン                       132.4 mM
リン酸イオン                         1.0 mM
硫酸イオン                           0.8 mM
純水
合計                               1,000 ml
【００３４】
したがって、イオン組成は以下のとおりである。
ナトリウムイオン                   143.8 mM
カリウムイオン                       5.4 mM
炭酸水素イオン及び／又は炭酸イオン  23.7 mM
カルシウムイオン                     1.8 mM
マグネシウムイオン                   0.8 mM
塩化物イオン                       130.8 mM
リン酸イオン                         1.0 mM
硫酸イオン                           0.8 mM
純水
合計                               1,000 ml
【００３５】
（参考例３）市販のＭＥＭ培地にＦＢＳを添加した細胞保存液
参考例２におけるＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳを添加したものを細胞保存液とした。
【００３６】
（参考例４）マルトース及び重曹を含有した細胞保存液
参考例１におけるグルコースを、マルトース（和光純薬工業株式会社製）に置き換えた以外は参考例１と同様の細胞保存液を調製した。ちなみに、マルトースの含量は、参考例１のグルコースの含量と同じである。
【００３７】
（参考例５）マンニトール及び重曹を含有した細胞保存液
参考例１におけるグルコースを、マンニトール（和光純薬工業株式会社製）に置き換えた以外は参考例１と同様の細胞保存液を調製した。ちなみに、マンニトールの含量は、参考例１のグルコースの含量と同じである。
【００３８】
（参考例６）スクロース及び重曹を含有した細胞保存液
参考例１におけるグルコースを、スクロース（シグマ社製）に置き換えた以外は参考例１と同様の細胞保存液を調製した。ちなみに、スクロースの含量は、参考例１のグルコースの含量と同じである。
【００３９】
（参考例７）トレハロース及び重曹を含有した細胞保存液
参考例１におけるグルコースを、トレハロース（和光純薬工業株式会社製）に置き換えた以外は参考例１と同様の細胞保存液を調製した。ちなみに、トレハロースの含量は、参考例１のグルコースの含量と同じである。
【００４０】
（参考例８）糖類を含有しない細胞保存液
グルコースを含まないこと以外は参考例１と同様の細胞保存液を調製した。したがって、以下の組成からなる。
グルコース（和光純薬工業株式会社製）    0 mg
塩化ナトリウム                    6,976.8 mg
塩化カリウム                          400 mg
塩化カルシウム                        200 mg
炭酸水素ナトリウム                  2,000 mg
リン酸水素ナトリウム・水和物          140 mg
硫酸マグネシウム                       98 mg
１Ｎ塩酸                              2.8 ml
純水
合計                                1,000 ml
【００４１】
したがって、イオン組成は以下のとおりである。
ナトリウムイオン                   143.8 mM
カリウムイオン                       5.4 mM
炭酸水素イオン及び／又は炭酸イオン  23.7 mM
カルシウムイオン                     1.8 mM
マグネシウムイオン                   0.8 mM
塩化物イオン                       130.8 mM
リン酸イオン                         1.0 mM
硫酸イオン                           0.8 mM
純水
合計                               1,000 ml
【００４２】
（参考例９）リン酸緩衝液
リン酸緩衝液を細胞保存液とした。
【００４３】
（実施例１）参考例１の細胞保存液による３Ｔ３細胞の冷蔵保存
まず、３Ｔ３細胞（独立行政法人理化学研究所提供）の細胞懸濁液を調製した。分散媒として、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）を用い、濃度を約１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとした。次に、１０ｃｍポリスチレンシャーレ上にこの細胞懸濁液を１０ｍｌ展開して播種した。そして、５％ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター内で培養を行った。
【００４４】
培養細胞がコンフルエントになった状態で、培地を吸引除去した。次に、０．００１％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液３ｍｌを上記ポリスチレンシャーレに添加した。顕微鏡で観察しながら細胞が剥離する手前で、トリプシン及びＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液を吸引除去した。５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地を添加して３Ｔ３細胞をシャーレから剥離したのち、遠心分離管（グライナー社製）に移した。３００×ｇで遠心分離をした後、上清を取り除いた。そして、ＦＢＳを洗浄するために、リン酸緩衝液にて遠心分離・上清を取り除く作業を２回繰り返した。以上の作業により遠心分離管の底に細胞ペレットが形成された。参考例１の細胞保存液１ｍｌを細胞ペレットに添加することにより、約２２０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。遠心分離管を密閉することにより、細胞保存液に懸濁した前記細胞懸濁液を、６℃の環境下で保存した。
【００４５】
（実施例２）参考例２の細胞保存液による３Ｔ３細胞の冷蔵保存
実施例１で使用した参考例１の細胞保存液の代わりに参考例２の細胞保存液を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００４６】
（実施例３）参考例３の細胞保存液による３Ｔ３細胞の冷蔵保存
実施例１で使用した参考例１の細胞保存液の代わりに参考例３の細胞保存液を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００４７】
（実施例４）参考例４の細胞保存液による３Ｔ３細胞の冷蔵保存
実施例１で使用した参考例１の細胞保存液の代わりに参考例４の細胞保存液を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００４８】
（実施例５）参考例１の細胞保存液による正常ヒト繊維芽細胞の冷蔵保存
実施例１で用いた３Ｔ３細胞の代わりに正常ヒト繊維芽細胞（独立行政法人理化学研究所提供）を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００４９】
（実施例６）参考例２の細胞保存液による正常ヒト繊維芽細胞の冷蔵保存
実施例２で用いた３Ｔ３細胞の代わりに正常ヒト繊維芽細胞を用いたこと以外は、実施例２と同様に行った。
【００５０】
（実施例７）参考例３の細胞保存液による正常ヒト繊維芽細胞の冷蔵保存
実施例３で用いた３Ｔ３細胞の代わりに正常ヒト繊維芽細胞を用いたこと以外は、実施例３と同様に行った。
【００５１】
（実施例８）参考例１の細胞保存液によるＡ５４９細胞の冷蔵保存
実施例１で用いた３Ｔ３細胞の代わりにＡ５４９細胞（独立行政法人理化学研究所提供）を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００５２】
（実施例９）参考例２の細胞保存液によるＡ５４９細胞の冷蔵保存
実施例２で用いた３Ｔ３細胞の代わりにＡ５４９細胞を用いたこと以外は、実施例２と同様に行った。
【００５３】
（実施例１０）参考例３の細胞保存液によるＡ５４９細胞の冷蔵保存
実施例３で用いた３Ｔ３細胞の代わりにＡ５４９細胞を用いたこと以外は、実施例３と同様に行った。
【００５４】
（実施例１１）参考例１の細胞保存液によるＨｅｐＧ２細胞の冷蔵保存
実施例１で用いた３Ｔ３細胞の代わりにＨｅｐＧ２細胞（独立行政法人理化学研究所提供）を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００５５】
（実施例１２）参考例２の細胞保存液によるＨｅｐＧ２細胞の冷蔵保存
実施例２で用いた３Ｔ３細胞の代わりにＨｅｐＧ２細胞を用いたこと以外は、実施例２と同様に行った。
【００５６】
（実施例１３）参考例３の細胞保存液によるＨｅｐＧ２細胞の冷蔵保存
実施例３で用いた３Ｔ３細胞の代わりにＨｅｐＧ２細胞を用いたこと以外は、実施例３と同様に行った。
【００５７】
（実施例１４）参考例１の細胞保存液によるＶｅｒｏ細胞の冷蔵保存
実施例１で用いた３Ｔ３細胞の代わりにＶｅｒｏ細胞（独立行政法人理化学研究所提供）を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００５８】
（実施例１５）参考例２の細胞保存液によるＶｅｒｏ細胞の冷蔵保存
実施例２で用いた３Ｔ３細胞の代わりにＶｅｒｏ細胞を用いたこと以外は、実施例２と同様に行った。
【００５９】
（実施例１６）参考例３の細胞保存液によるＶｅｒｏ細胞の冷蔵保存
実施例３で用いた３Ｔ３細胞の代わりにＶｅｒｏ細胞を用いたこと以外は、実施例３と同様に行った。
【００６０】
（比較例１）３Ｔ３細胞の凍結保存
まず、３Ｔ３細胞（独立行政法人理化学研究所提供）の細胞懸濁液を調製した。分散媒は、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）を用い、濃度を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとした。次に、１０ｃｍポリスチレンシャーレ上にこの細胞液を１０ｍｌ展開して播種した。そして、５％ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター内で培養を行った。
【００６１】
培養細胞がコンフルエントになった状態で、培地を吸引除去した。そして実施例１と同様の方法にてトリプシン及びＥＤＴＡ処理により細胞を剥離し、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭにて３Ｔ３細胞を回収した。次にリン酸緩衝液を用いて遠心分離を２回行い、ＦＢＳを洗浄した。その後、遠心分離管の底に形成された細胞ペレットに１０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯ含有ＭＥＭを添加し、８３０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度の細胞懸濁液を調製した。そして、凍結保存チューブに加えた細胞懸濁液を−８０℃フリーザーにて緩速凍結させた。−８０℃まで温度を低下させた後、液体窒素内に移した。
【００６２】
（比較例２）参考例５の細胞保存液による３Ｔ３細胞の冷蔵保存
実施例１で使用した参考例１の細胞保存液の代わりに参考例５の細胞保存液を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００６３】
（比較例３）参考例６の細胞保存液による３Ｔ３細胞の冷蔵保存
実施例１で使用した参考例１の細胞保存液の代わりに参考例６の細胞保存液を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００６４】
（比較例４）参考例７の細胞保存液による３Ｔ３細胞の冷蔵保存
実施例１で使用した参考例１の細胞保存液の代わりに参考例７の細胞保存液を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００６５】
（比較例５）参考例８の細胞保存液による３Ｔ３細胞の冷蔵保存
実施例１で使用した参考例１の細胞保存液の代わりに参考例８の細胞保存液を用いたこと以外は、実施例１と同様に３Ｔ３細胞を保存した。
【００６６】
（比較例６）参考例９の細胞保存液による３Ｔ３細胞の冷蔵保存
実施例１で使用した参考例１の細胞保存液の代わりに参考例９の細胞保存液を用いたこと以外は、実施例１と同様に３Ｔ３細胞を保存した。
【００６７】
（比較例７）参考例９の細胞保存液による正常ヒト繊維芽細胞の冷蔵保存
比較例３で用いた３Ｔ３細胞の代わりに正常ヒト繊維芽細胞を用いたこと以外は、比較例３と同様に行った。
【００６８】
（比較例８）参考例９の細胞保存液によるＡ５４９細胞の冷蔵保存
比較例６で用いた３Ｔ３細胞の代わりにＡ５４９細胞を用いたこと以外は、比較例６と同様に行った。
【００６９】
（比較例９）参考例９の細胞保存液によるＨｅｐＧ２細胞の冷蔵保存
比較例６で用いた３Ｔ３細胞の代わりにＨｅｐＧ２細胞を用いたこと以外は、比較例６と同様に行った。
【００７０】
（比較例１０）参考例９の細胞保存液によるＶｅｒｏ細胞の冷蔵保存
比較例６で用いた３Ｔ３細胞の代わりにＶｅｒｏ細胞を用いたこと以外は、比較例６と同様に行った。
【００７１】
（比較例１１）剥離しない状態での３Ｔ３細胞の冷蔵保存
まず、３Ｔ３細胞（独立行政法人理化学研究所提供）の細胞懸濁液を調製した。分散媒は、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）を用い、濃度を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとした。次に、１０ｃｍポリスチレンシャーレ上にこの細胞液を２ｍｌ展開して播種した。そして、５％ ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター内で培養を行った。
【００７２】
培養細胞がコンフルエントになった状態で、培地を吸引除去した。そして、参考例１の細胞保存液２ｍｌを添加し、６℃の環境下で保存した。
【００７３】
（比較例１２）剥離しない状態でのＨｅｐＧ２細胞の冷蔵保存
比較例１１で用いた３Ｔ３細胞の代わりにＨｅｐＧ２細胞を用いたこと以外は、比較例１１と同様に行った。
【００７４】
（実験例１）
実施例１〜３（細胞保存液：参考例１〜３）、比較例１（凍結保存）の保存条件において、３Ｔ３細胞を保存したときの保存日数に対する細胞生存率を検討した。その結果を図１に示す。細胞生存率はトリパンブルー染色による生死判定にて測定した。この結果から、本発明の細胞保存方法は、１０日以内の保存であれば凍結保存と同等レベルの生存率で細胞を保存できることが示された。
【００７５】
（実験例２）
実施例１（細胞保存液：参考例１）、実施例４（細胞保存液：参考例４）及び比較例２〜６（細胞保存液：参考例５〜９）の保存条件において、３Ｔ３細胞を保存したときの保存日数に対する細胞生存率を検討した。その結果を図２に示す。なお、細胞生存率の測定については実験例１と同様に行った。還元糖を含有しない細胞保存液（比較例２〜６）では３日で細胞はほぼ死滅したが、還元糖を含有する細胞保存液では６日経過しても細胞は生存していた。特に、実施例１のグルコースを含有する細胞保存液及び実施例４のマルトースを含有する細胞保存液による保存結果は、より優れた結果となった。
【００７６】
（実験例３）
実施例５〜７（細胞保存液：参考例１〜３）及び比較例７（細胞保存液：参考例９）の保存条件において、正常ヒト繊維芽細胞を保存したときの保存日数に対する細胞生存率を検討した。その結果を図３に示す。なお、細胞生存率の測定については実験例１と同様に行った。
【００７７】
（実験例４）
実施例８〜１０（細胞保存液：参考例１〜３）及び比較例８（細胞保存液：参考例９）の保存条件において、Ａ５４９細胞を保存したときの保存日数に対する細胞生存率を検討した。その結果を図４に示す。なお、細胞生存率の測定については実験例１と同様に行った。
【００７８】
（実験例５）
実施例１１〜１３（細胞保存液：参考例１〜３）及び比較例９（細胞保存液：参考例９）の保存条件において、ＨｅｐＧ２細胞を保存したときの保存日数に対する細胞生存率を検討した。その結果を図５に示す。なお、細胞生存率の測定については実験例１と同様に行った。
【００７９】
（実験例６）
実施例１４〜１６（細胞保存液：参考例１〜３）及び比較例１０（細胞保存液：参考例９）の保存条件において、Ｖｅｒｏ細胞を保存したときの保存日数に対する細胞生存率を検討した。その結果を図６に示す。尚、細胞生存率の測定については実験例１と同様に行った。
【００８０】
以上の実験例１、３〜６の結果から、本発明の細胞保存方法は、３Ｔ３細胞だけでなく、正常ヒト繊維芽細胞、Ａ５４９細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｖｅｒｏ細胞などの付着性細胞の保存についても格別な効果を奏することが明らかであった。
【００８１】
（比較実験例１）
３Ｔ３細胞及びＨｅｐＧ２細胞について、剥離しない状態での保存（比較例１１及び１２）において、保存日数に対する細胞生存率を検討した。細胞生存率の測定は、トリパンブルー染色により行った。具体的には、参考例１の細胞保存液を除去した後、０．００１％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液を適当量添加することで、細胞を剥離させ、残細胞を回収した。そして、トリパンブルー染色にて生死判定を行った。その結果、いずれの細胞も保存３日目には全て死滅していた。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
以上説明した通り、本発明の付着性細胞の保存方法により、冷蔵条件下でも細胞保存性能を向上させて、細胞生存率の増加が可能になる。また、本発明によれば冷蔵条件での細胞保存方法を提供するため、これまで保存が困難であった細胞種を保存することも可能となる。また、凍結保存に必要であったプログラミングフリーザー等の高価な装置・設備が準備できないような場合でも、細胞を保存することが可能となる。さらに本発明の細胞保存液を用いれば、凍結保存時に通常使用していた凍結保護剤などについて、洗浄等の工程を経ずに、細胞を保存液に懸濁したまま培地に播種して細胞を培養することが可能となるため、簡便に細胞培養を行うことできる。例えば、本発明の細胞保存液は、付着性細胞を受託培養施設から患者の元へ輸送する際に使用することができる。
これにより、細胞生存率の低下を抑制して細胞の品質を保持し、最終的には治療への活用にも役立つものと考えられる。
【００８３】
細胞の培養は常に培養の様子を観察しなければならないため、急用などにより一定期間培養を観察できない場合は、煩雑な作業で細胞を凍結保存しなければならない。このような場合でも、煩雑な作業をする必要のない細胞保存液の提供が求められる。本発明の付着性細胞の保存方法は、細胞保存管理者が例えば１週間程度の急な出張を要するなどの場合が生じうる試験研究機関などでの有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】３Ｔ３の浮遊保存及び凍結保存による生存率を示す図である。（実験例１）
【図２】細胞保存液に添加する糖類を変えたときの生存率を示す図である。（実験例２）
【図３】正常ヒト繊維芽細胞の浮遊保存による生存率を示す図である。（実験例３）
【図４】Ａ５４９の浮遊保存による生存率を示す図である。（実験例４）
【図５】ＨｅｐＧ２の浮遊保存による生存率を示す図である。（実験例５）
【図６】Ｖｅｒｏの浮遊保存による生存率を示す図である。（実験例６）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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