(57)【要約】【課題】DNAナノエレクトロニクスにより、核酸の塩基配列などの情報を取り出す。【解決手段】一端に電荷ドナー、他端に接続性末端を有する電荷注入ブロック、二本鎖ポリヌクレオチドの一端に電荷アクセプター、他端に接続性末端を有する電荷検出ブロックを有し、前記電荷注入ブロックは二本鎖ポリヌクレオチドあるいは二本鎖ポリヌクレオチドを構成可能な２以上の相補鎖から構成され、前記電荷検出ブロックは二本鎖ポリヌクレオチドあるいは二本鎖ポリヌクレオチドを構成可能な２以上の相補鎖から構成され、電荷注入ブロックと電荷検出ブロックの接続性末端は同一であっても異なっていてもよい、核酸ブロックコンビネーション。【選択図】図３
2008104422.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一端に電荷ドナー、他端に接続性末端を有する電荷注入ブロック、二本鎖ポリヌクレオチドの一端に電荷アクセプター、他端に接続性末端を有する電荷検出ブロックを有し、前記電荷注入ブロックは二本鎖ポリヌクレオチドあるいは二本鎖ポリヌクレオチドを構成可能な２以上の相補鎖から構成され、前記電荷検出ブロックは二本鎖ポリヌクレオチドあるいは二本鎖ポリヌクレオチドを構成可能な２以上の相補鎖から構成され、電荷注入ブロックと電荷検出ブロックの接続性末端は同一であっても異なっていてもよい、核酸ブロックコンビネーション。
【請求項２】
同一または異なる２以上の接続性末端を有する少なくとも１つのリンカーブロックをさらに有し、前記リンカーブロックは二本鎖ポリヌクレオチドあるいは二本鎖ポリヌクレオチドを構成可能な２以上の相補鎖から構成される、請求項１に記載の核酸ブロックコンビネーション。
【請求項３】
一端に電荷ドナー、他端に接続性末端を有する電荷注入ブロック、二本鎖ポリヌクレオチドの一端に電荷アクセプター、他端に接続性末端を有する電荷検出ブロックを有し、前記電荷注入ブロックは二本鎖ポリヌクレオチドあるいは二本鎖ポリヌクレオチドを構成可能な２以上の相補鎖から構成され、前記電荷検出ブロックは二本鎖ポリヌクレオチドあるいは二本鎖ポリヌクレオチドを構成可能な２以上の相補鎖から構成され、電荷注入ブロックと電荷検出ブロックの接続性末端は同一であっても異なっていてもよい、生物サンプルの核酸情報検出用キット。
【請求項４】
以下の工程を有する生物サンプル中の核酸情報を検出する方法:
（１）生物サンプル中の核酸を少なくとも１種の制限酵素で切断する工程
（２）請求項１または２に記載の核酸ブロックコンビネーションまたは請求項３に記載のキットを加えて、電荷注入ブロックと電荷検出ブロックが両端にあり、内部に生物サンプル由来の核酸断片を有する複合核酸ブロックを形成させる工程
（３）前記工程(２)で得られた複合核酸ブロックに光照射し、前記光増感基から前記電荷アクセプターへの電荷移動時間を検出する工程。
【請求項５】
前記核酸情報が、１塩基多型（ＳＮＰ）、核酸の挿入、欠失、点突然変異などの突然変異、反復配列の数を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
以下の工程を有する生物の遺伝子診断法:
（１）生物サンプル中の核酸を少なくとも１種の制限酵素で切断する工程
（２）請求項１または２に記載の核酸ブロックコンビネーションまたは請求項３に記載のキットを加えて、電荷注入ブロックと電荷検出ブロックが両端にあり、内部に生物サンプル由来の核酸断片を有する複合核酸ブロックを形成させる工程
（３）前記工程(２)で得られた複合核酸ブロックに光照射し、前記光増感基から前記電荷アクセプターへの電荷移動時間を検出する工程。
【請求項７】
前記生物がヒトである、請求項６に記載の遺伝子診断法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物サンプルの核酸情報を検出することができる核酸ブロックコンビネーションおよび核酸情報検出用キット、並びに生物サンプル中の核酸情報を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ナノテクノロジーの研究分野において、DNAを分子ワイヤなどのデバイスの構成要素として用いる試みが盛んである。DNAは、その自己組織化能を利用することで、ナノスケールでの構造を制御することが可能であり、次世代のデバイスへ応用する試みが多岐に渡って研究されている。その一つがDNAを分子ワイヤとして利用するDNAナノエレクトロニクスの創製である。そのためには、DNA中の電荷移動について明らかにすることが重要であり、これまで様々な研究が行われてきた。その結果、DNAを構成する核酸塩基の配列によって、DNA中の電荷移動を制御できることがわかってきた。つまり、DNAを分子ワイヤとして利用する可能性が示されてきた(非特許文献１)。
【非特許文献１】”Direct Observation of Hole Transfer through double helical DNA over 100 A”, T. Takada, K. Kawai, M. Fujitsuka, and T. Majima, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101(39), 14002-14006.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
DNAナノエレクトロニクスの実現のためには、様々な伝導性をもつDNAナノブロックをプログラム化して集積させることによってDNAナノ構造体を形成することである。ナノサイズのDNAナノブロックを、各DNAナノブロックの末端に配置された、スティッキーエンドと呼ばれる１本鎖DNA同士の相互作用により集積化させることで、様々なDNAナノ構造体を作り出されている。例えば、ロッド状、テープ状、立方体、多面体、タイルなど様々なDNAナノ構造体が創製されている。
【０００４】
しかしながら、このような複数のDNAナノブロックよりなるDNAナノ構造体をDNAナノエレクトロニクスへと応用した試みはこれまで全く報告例がない。その理由は、このようなDNAナノ構造体での伝導性を測定することができなかったからである。
【０００５】
本発明は、DNAナノエレクトロニクスにより、核酸の塩基配列などの情報を取り出すことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明においては、DNAナノ構造体におけるDNAナノブロック内およびDNAナノブロック同士の接続性末端の電荷移動を明らかにすることに初めて成功し、このことから、DNAナノブロックを利用したDNAナノエレクトロニクスが現実のものとなることを見出した。
【０００７】
本発明は、以下の生物サンプルの核酸情報を検出することができる核酸ブロックコンビネーションおよび核酸情報検出用キット、並びに生物サンプル中の核酸情報を検出する方法を提供するものである。
１.  一端に電荷ドナー、他端に接続性末端を有する電荷注入ブロック、二本鎖ポリヌクレオチドの一端に電荷アクセプター、他端に接続性末端を有する電荷検出ブロックを有し、前記電荷注入ブロックは二本鎖ポリヌクレオチドあるいは二本鎖ポリヌクレオチドを構成可能な２以上の相補鎖から構成され、前記電荷検出ブロックは二本鎖ポリヌクレオチドあるいは二本鎖ポリヌクレオチドを構成可能な２以上の相補鎖から構成され、電荷注入ブロックと電荷検出ブロックの接続性末端は同一であっても異なっていてもよい、核酸ブロックコンビネーション。
２.  同一または異なる２以上の接続性末端を有する少なくとも１つのリンカーブロックをさらに有し、前記リンカーブロックは二本鎖ポリヌクレオチドあるいは二本鎖ポリヌクレオチドを構成可能な２以上の相補鎖から構成される、項１に記載の核酸ブロックコンビネーション。
３.  一端に電荷ドナー、他端に接続性末端を有する電荷注入ブロック、二本鎖ポリヌクレオチドの一端に電荷アクセプター、他端に接続性末端を有する電荷検出ブロックを有し、前記電荷注入ブロックは二本鎖ポリヌクレオチドあるいは二本鎖ポリヌクレオチドを構成可能な２以上の相補鎖から構成され、前記電荷検出ブロックは二本鎖ポリヌクレオチドあるいは二本鎖ポリヌクレオチドを構成可能な２以上の相補鎖から構成され、電荷注入ブロックと電荷検出ブロックの接続性末端は同一であっても異なっていてもよい、生物サンプルの核酸情報検出用キット。
４.  以下の工程を有する生物サンプル中の核酸情報を検出する方法:
（１）生物サンプル中の核酸を少なくとも１種の制限酵素で切断する工程
（２）項１または２に記載の核酸ブロックコンビネーションまたは項３に記載のキットを加えて、電荷注入ブロックと電荷検出ブロックが両端にあり、内部に生物サンプル由来の核酸断片を有する複合核酸ブロックを形成させる工程
（３）前記工程(２)で得られた複合核酸ブロックに光照射し、前記光増感基から前記電荷アクセプターへの電荷移動時間を検出する工程。
５.  前記核酸情報が、１塩基多型（ＳＮＰ）、核酸の挿入、欠失、点突然変異などの突然変異、反復配列の数を含む、項４に記載の方法。
６.  以下の工程を有する生物の遺伝子診断法:
（１）生物サンプル中の核酸を少なくとも１種の制限酵素で切断する工程
（２）項１または２に記載の核酸ブロックコンビネーションまたは項３に記載のキットを加えて、電荷注入ブロックと電荷検出ブロックが両端にあり、内部に生物サンプル由来の核酸断片を有する複合核酸ブロックを形成させる工程
（３）前記工程(２)で得られた複合核酸ブロックに光照射し、前記光増感基から前記電荷アクセプターへの電荷移動時間を検出する工程。
７.  前記生物がヒトである、項６に記載の遺伝子診断法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、核酸内の電荷輸送が配列に大きく依存することに基づき、核酸ナノブロックを混合するだけで、接続性末端のプログラミング化によって核酸を集積化させて核酸ナノ構造体を形成させ、その核酸ナノブロックの電気伝導性に基づき核酸情報(例えば遺伝情報)を速度として読み出すことができる。電荷注入ブロックと電荷検出ブロック、さらに情報インプットブロック(たとえば生物由来のDNA断片)とを混合させ、核酸ナノ構造体を形成させる。例えば、電荷ドナーとして、UV光により電荷を発生する光増感剤を使用した場合、UV光を照射すると電荷注入ブロックにおいて核酸内に電荷を発生させることができる。発生した電荷は、核酸ナノ構造体中を移動する。電荷検出ブロックへの電荷到達速度をモニターすることで、インプットしたブロックの情報を速度として読み出すことができる。この核酸微小構造体を利用することによって、核酸ナノエレクトロニクスを実現することが可能である。
【０００９】
核酸をナノエレクトロニクスへ応用するには、簡便な微小構造体の形成が必要不可欠であり、長い核酸鎖を用いるのは、比較的困難である。したがって、短い核酸を混合させただけでブロックを形成し、その核酸微小ブロックをプログラミングして集積化させて核酸微小構造体による核酸ナノエレクトロニクスシステムを構築することは必要不可欠な技術である。また、その核酸微小構造体の電気伝導性に関する速度を測定し、核酸微小ワイヤとしての機能を実証することが必要である。その結果、電荷移動速度から核酸微小ブロックおよび核酸微小構造体内の核酸塩基の配列情報を読み出すシステムを確立することができれば、次世代のナノエレクトロニクスの基盤技術として非常に重要な位置を占めることになる。
【００１０】
さらに本発明によれば、電荷の移動時間を測定するだけで多数の核酸の情報(特に配列情報)を得ることができ、ヒトに応用した場合、各個人の遺伝情報のパターンを複数の核酸断片の電荷移動時間の情報に変換することができ、体質、疾患或いは疾患のなりやすさなどの遺伝情報を短時間で得ることができ、病気の予防・治療などに役立てることができる。
【００１１】
また、ヒト以外の哺乳動物を含む動物、植物、微生物などにおいても、同様に遺伝情報のパターンを検出することができ、各遺伝情報と生物の特有の性質の関係を調べるために本発明は非常に有用なツールを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において、「ナノエレクトロニクス」とは、微小な核酸の情報をエレクトロニクスにより検出することを意味しており、測定対象の核酸がナノサイズであることは必ずしも必要ない。本発明で測定の対象となる核酸のサイズは、塩基数として20個〜10万個程度、好ましくは25個〜5万個程度、より好ましくは30個〜1万個程度、特に40個〜5000個程度である。
【００１３】
本発明の検出対象である複合核酸ブロックでは、電荷注入ブロックと電荷検出ブロックの間に少なくとも1つのインプットブロック(測定対象の核酸)を有するので、これら3つ以上のブロックを合計すると塩基数としては、20個程度以上になる。一方、核酸があまりにも長いと複合ブロックの形成と電荷移動の測定が困難になるため、塩基数の上限は10万個程度以下になる。
【００１４】
本明細書において「核酸」としては、DNA、RNA、或いはDNA-RNAハイブリッドが挙げられるが、好ましくはDNAである。核酸としては、各ブロックの接続性末端を制限酵素により形成することができるものが好ましい。
【００１５】
以下においては、核酸としてDNAを用いた場合について説明するが、RNAの配列情報も同様の手法により得ることができる。
【００１６】
本明細書において、電荷ドナーとしては、外部からの刺激により電荷を発生することができるものであれば特に限定されない。外部からの刺激としては、光(紫外線、可視光、Ｘ線、ガンマ線、レーザー光)、熱、化学物質などが挙げられ、好ましくは光が挙げられる。別個の刺激(波長の異なる光により選択的に電荷を発生させ得るケースを含む)により電荷を発生させることが可能な２種以上の電荷ドナーと異なる２種以上の接続性末端を組み合わせることで、より詳細な遺伝情報を得ることが可能になる。電荷ドナーは、アデニン(Ａ)に結合されるのが好ましいが、グアニン（Ｇ）に結合されてもよい。
【００１７】
なお、電荷ドナーは、二本鎖である電荷注入ブロックの末端の片側の相補鎖（例えば5’末端）に1個結合させてもよく電荷注入ブロックの末端の2本の相補鎖に各々(合計2個)結合させてもよい。
【００１８】
光照射により電荷を発生させ得る電荷ドナーとしては、光増感剤が挙げられる。
【００１９】
光増感剤として使用できる化合物は、光励起によってその化合物の光励起状態がアデニンを酸化できるものであれば特に限定はない。具体的には、還元されやすい芳香族化合物であり、紫外から紫外可視領域（350 nmより長波長）に吸収をもち、比較的大きい一重項エネルギーを有する光増感剤が好ましい。例えば、ナフタルイミド、ナフタルジイミド（NI）、ジフェニルアセチレン、フラビン、アントラキノン、ベンゾフェノン、ベンゾイン、キサントン、アクリジン等が挙げられる。これらの化合物は、1以上の置換基により置換されていてもよい。特に、電子移動理論から、再結合が遅く電荷分離効率が向上するので、電流検出感度が上昇するナフタルイミド、ジフェニルアセチレンが光増感剤として好ましい。
【００２０】
光増感剤において電荷を発生させるための光源としては、キセノンランプ、高圧水銀ランプ、低圧水銀ランプ、或いはNd:YAGレーザーなどのレーザー光等の通常の光源が使用できる。
【００２１】
電荷アクセプターによる電荷捕捉の検出は、例えば特定波長の過渡吸収を検出することにより行うことができる。該検出は、DNAのサンプル中の夾雑物質、未反応の電荷注入ブロック、未反応の電荷検出ブロックなどの共存下においてもほとんど影響なしに行うことができる。
【００２２】
電荷アクセプターとして使用できる化合物としては、4つの核酸塩基よりも一電子酸化されやすい（酸化電位が低い）こと、正電荷によって一電子酸化されて（正電荷を捕捉することで）ラジカルカチオンとなったときに可視光領域に明瞭な強い吸収を持つこと、その化合物のラジカルカチオンが少なくとも100マイクロ秒以上安定に存在すること、などの条件を備えている分子が好ましい。電荷アクセプターとしてはフェノチアジン(PTZ)またはその誘導体が最も優れている。
【００２３】
本明細書において、接続性末端としては、２つの接続性末端が連結できるものであればよく、スティッキーエンド(付着末端、sticky end)、平滑末端（blunt end)が挙げられ、スティッキーエンドが好ましい。相互に相補的なスティッキーエンドを有するDNAブロックは、溶液中で混合するだけで、２つのブロックを連結することができる。また、平滑末端を有するDNAは、DNAリガーゼを作用させることにより、連結することができる。スティッキーエンドを形成する制限酵素としては、公知の制限酵素が広く使用でき、例えばEcoRI、BamHI、NotI、BstEII、PstI、HindIII、XhoI、SacI、PvuI、KpnI、BglI、AatIIなどが挙げられ、平滑末端を形成する制限酵素としては、公知の制限酵素が広く使用でき、例えばAluI、BalI、DraI、EcoRV、HaeIII、HpaI、NaeI、SmaIなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
電荷ドナーと接続性末端の間の塩基配列、電荷アクセプターと接続性末端の間の塩基配列は、任意の配列でよく、塩基の数としては、通常3個以上、好ましくは5個以上である。塩基数の上限は、特に限定されないが、通常１万程度以下、好ましくは５０００程度以下、より好ましくは１０００程度以下、さらに好ましくは３００程度以下、特に好ましくは５０程度以下、特に３０程度以下である。これらの電荷ドナー/電荷アクセプターと接続性末端の間の塩基配列は、電荷の移動を実現できる限りにおいて特に限定されず、どのような配列でもよい。本発明における電荷移動は、マイクロ秒からナノ秒のレベルであるので、塩基数が多くても、電荷移動時間の測定は可能である。
【００２５】
これらの塩基配列は、Ａホッピング及び/又はＧホッピングで高速に電荷移動を行うことができる配列を有することが望ましい。
【００２６】
本発明で電荷移動を測定する、複数のブロックが連結された複合核酸ブロックは、２本鎖DNAが対象となる。従って、電荷注入ブロックと電荷検出ブロックは、２本鎖DNAを使用することができるが、２本鎖DNAの各相補鎖を分離しておき、複合核酸ブロックを形成する際に二本鎖電荷注入ブロックと二本鎖電荷検出ブロックを同時に形成させてもよい。なお、各ブロック及びそれらブロックが連結された複合核酸ブロックは、切れ目(nick)を有していてもよく、電荷注入ブロックと電荷検出ブロックの各相補鎖は、２以上の鎖で構成されていてもよい。切れ目(nick)は、電荷移動検出の妨げとならないため複合核酸ブロックに含まれていてもよいが、DNAリガーゼで結合させて切れ目(nick)をなくしてもよい。
【００２７】
また、本発明の複合核酸ブロックは、２重らせんを形成することが電荷移動の条件になり、一方の鎖において１塩基または連続する２塩基の欠失があったとしてもそのギャップの間を他方の鎖において電荷移動が起こる場合には、１塩基または連続する２塩基までの欠失は、許容され得る。但し、３塩基以上の欠失は、通常電荷移動をストップすることになるので好ましくない。
【００２８】
また、本発明の電荷注入ブロックと電荷検出ブロックは、通常１つの接続性末端を有するが、２個の接続性末端を有していてもよい。２個の接続性末端ＩA、IIAを有する電荷注入ブロックは、例えば以下の３本の一本鎖Ａ，Ｂ，Ｃから構成される：
一本鎖Ａ：一端(5’末端)に電荷ドナーを有し、他端が接続性末端ＩAに関与する。
一本鎖Ｂ：一端(3’末端)を電荷ドナーに近接し、他端が接続性末端IIAに関与する。
一本鎖Ｃ：一端(5’末端) が接続性末端ＩAに関与し、他端が接続性末端IIAに関与する。
また、接続性末端を二つ有する二本鎖の中央部に電荷ドナーを導入してもよい。
電荷ドナーにおいて発生した電荷は、5’→3’方向と、3’→5’方向のいずれにも移動し得る。
【００２９】
２個の接続性末端ＩB、IIBを有する電荷検出ブロックは、例えば以下の３本の一本鎖Ｘ，Ｙ，Ｚから構成される：
一本鎖Ｘ：一端(5’末端)に電荷アクセプターを有し、他端が接続性末端ＩBに関与する。
一本鎖Ｙ：一端(3’末端)を電荷アクセプターに近接し、他端が接続性末端IIBに関与する。
一本鎖Ｚ：一端(5’末端) が接続性末端Ｉに関与し、他端が接続性末端IIに関与する。
また、接続性末端を二つ有する二本鎖の中央部に電荷アクセプターを導入してもよい。
【００３０】
電荷注入ブロック、インプットブロック、電荷検出ブロックを接続するブロックとして３本の１本鎖DNAによりなる３つの接続性末端を有するブロック、および４本の１本鎖DNAによりなる４つの接続性末端を有するブロックを用いることにより、２次元、３次元構造へと発展することができる。
【００３１】
本明細書において、インプットブロックとしては、測定対象の2本鎖DNAが挙げられる。
【００３２】
このインプットブロックは、両端に接続性末端を有し、電荷注入ブロックと電荷検出ブロックを混合することにより、少なくとも１つのインプットブロックが電荷注入ブロックと電荷検出ブロックで挟まれた複合核酸ブロックを得ることができる。
【００３３】
例えば生物サンプルを２つの異なる接続性末端を残す複数の制限酵素で切断後、一方の接続性末端を有する電荷注入ブロックと他方の接続性末端を有する電荷検出ブロックを混合することで、複合核酸ブロックを得ることができる。
【００３４】
生物サンプルのDNA量が少なすぎる場合には、PCRなどの常法に従いDNAを増幅後、制限酵素で切断し、電荷注入ブロックと電荷検出ブロックを作用させて、測定対象となる複合核酸ブロックを形成させてもよい。なお、生物サンプルとしては、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、イノシシ、イヌ、ネコなどの哺乳動物、ニワトリ、アヒル、カモ、七面鳥などの鳥類、爬虫類、両生類、魚類を含む動物、樹木、花卉、野菜、果物、穀物などを得るための植物、酵母、細菌、真菌などの微生物が挙げられる。動物のサンプルは、ヒトを含む哺乳動物の場合、血液、血清、血漿あるいは生検サンプルなどからＤＮＡを抽出し、必要に応じて増幅して用いてもよく、臓器ないし組織からDNAを分離して用いてもよい。DNAは、制限酵素により断片化されるが、DNAライブラリー、cDNAライブラリーなどが入手できる場合には、それらを直接用いてもよい。制限酵素は、1種のみを用いてもよいが、2種以上を組み合わせて使用することもできる。制限酵素を1種のみ使用した場合には、該制限酵素により形成される末端と連結可能な接続性末端を有する電荷注入ブロックと電荷検出ブロックを使用し、2種以上の制限酵素を組み合わせた場合には、これらの制限酵素で形成され得るDNA断片(インプットブロック)と連結可能な少なくとも2種の電荷注入ブロックと少なくとも2種の電荷検出ブロックを組み合わせて使用することができる。
【００３５】
本発明において、電荷注入ブロックは、電荷ドナー、接続性末端あるいは、電荷ドナーと接続性末端に挟まれる任意のDNA配列のいずれか(特に電荷ドナーと接続性末端のいずれか)が異なる２種以上電荷注入ブロックを組み合わせて使用してもよい。同様に、本発明において、電荷検出ブロックは、電荷アクセプター、接続性末端あるいは、電荷アクセプターと接続性末端に挟まれる任意のDNA配列のいずれか(特に電荷アクセプターと接続性末端のいずれか)が異なる２種以上電荷検出ブロックを組み合わせて使用してもよい。このように、２種以上の電荷注入ブロックと２種以上の電荷検出ブロックを組み合わせて使用することで、複数のDNAの情報を１回の操作で検出することができる。
【００３６】
本発明の電荷移動は、Ａホッピング機構、Ｇホッピング機構、Ａ→Ｇ(発熱反応)、Ｇ→Ａ（吸熱反応）のいずれかのメカニズムで起こる。4種の核酸塩基(A,T,G,C)において、アデニン間（A→A）の電荷移動（Ａホッピング）が最も速く起こり、グアニン間（G→G）の電荷移動（Ｇホッピング）がやや速度が低下するが起こる。アデニンからグアニンへの電荷移動は、発熱反応であるので、速やかに起こる。グアニンからアデニンへの電荷移動は、やや吸熱反応になるため電荷移動速度はかなり低下するが、室温以上の温度では十分に起こる。電荷移動は、電荷のある鎖(センス鎖)またはその相補鎖(アンチセンス鎖)の隣の塩基に対しては、ＧホッピングまたはＡホッピングにより高速の電荷移動が起こる。Ｇ→Ｃ、Ｇ→Ｔ、Ａ→Ｃ、Ａ→Ｔの電荷移動は、大きな吸熱反応となるため実質的に起こらない。なお、Ｇホッピング機構は、図5aと5bの両方を包含し、Ａホッピングについても同様にセンス鎖における電荷移動と、センス鎖とアンチセンス鎖を電荷が移動する機構の両方を含む。
【００３７】
電荷移動の例を以下のスキーム１に示す。
【００３８】
スキーム１において、光により電荷を発生する電荷ドナーであるNI(1,8-ナフタルイミド)を使用した場合、NIに発生した電荷は、隣接するＡに速やかに転移し、最後に電荷アクセプターであるPTZ(フェノチアジン)に移動する。なお電荷移動は可逆反応であり、最終的に電荷アクセプターに電荷が移動した段階で終結する。具体的には、NIとPTZとを修飾したDNA中のNIを光励起すると、NI励起一重項状態が生成し、近接するAとの間で電荷分離が起こり、NIのラジカルアニオンとAのラジカルカチオンが生成する。A連続配列中では正電荷はAホッピング機構で高速に移動し、Gの領域ではGホッピング機構にμs-100μsの時間領域で正電荷の移動が起こり、最終的に酸化電位の低いPTZに捕捉される。したがって、PTZラジカルカチオンの生成の時間挙動から、ホール移動の速度を直接観測することができる。
【００３９】
＜スキーム１＞
【００４０】
【化１】
2008104422.tif 000003
【００４１】
上記のように、A→A、G→G、A→Gは起こりやすく、G→Aは起こりにくいので、電荷ドナーはアデニン(A)に連結され、電荷アクセプターはグアニン(G)に連結されるのが特に好ましい。
【００４２】
以下、図面を参照して、本発明をさらに詳しく説明する。
【００４３】
まず、DNA微小ブロックの一つの電荷移動速度を測定した。9-15塩基からなるDNAの両端にアデニン酸化が起こる光増感剤として1,8-ナフタルイミド(NI)を、正電荷アクセプターとしてフェノチアジン(PTZ)を修飾した。1,8-ナフタルイミドの光励起によってDNA内に電荷が注入され、DNA内のアデニンおよびグアニン-ホールホッピング機構による電荷移動を経て、酸化電位の最も低いフェノチアジンに正電荷が捕捉される。フェノチアジンラジカルカチオンの過渡吸収を時間分解して測定することによって、フェノチアジン上へ正電荷が捕捉される速度（核酸塩基間のホールホッピングによる電荷移動速度）を直接測定することができる。図１に示すように、電荷移動速度はDNAの塩基配列に著しく依存し、GCの連続したDNAでの電荷輸送を調べると、黒：DNA1、緑：DNA2、空色：DNA3、青：DNA4となり、GCの連続したDNAではGCの連続数が少ないほど電荷分離寿命が長くなることが明らかである。また、GCの連続したDNA (DNA4)での電荷輸送の温度効果について調べたところ、ピンク：10 ℃、空色：28 ℃、青：44 ℃であった（図２）。
【００４４】
次に、DNA微小ブロックを用いたDNA微小複合体における電荷移動の観測について、以下に記す。
【００４５】
図３に本発明のストラテジーを示した。電荷注入ブロック、電荷検出ブロックと情報を取り出したいインプットブロックを混合することで、微小複合体を形成させた。具体的には、電荷注入ブロックとして、光増感剤として1,8-ナフタルイミドを修飾したDNAを用いた。ここで、光増感剤はUV光励起によってDNA内に電荷を発生させるために修飾してある。電荷検出ブロックとして、正電荷アクセプターとしてフェノチアジンを修飾したDNAを用いた。ここで、電荷アクセプターは電荷が移動したかどうかを速度の情報で判断するために修飾してある。電荷注入ブロック、検出ブロックと情報を取り出したいインプットブロックとを混合し、ハイブリダイズさせてDNA微小複合体を形成させた。UV光照射によって生じた電荷は、スティッキーエンドのハイブリダイズによってブロック同士が接着し、その接着面を介して電荷アクセプターまで到達する。正電荷が電荷アクセプターまで到達したときには、電荷アクセプターラジカルカチオンの特徴的吸収が観測される。したがって、電荷アクセプターラジカルカチオンの吸収の時間変化から、正電荷の移動速度を直接観測することが出来る。この電荷の移動速度はインプットしたブロックの種類に大きく依存することから、電荷移動速度を観測することで、ブロックの核酸塩基の配列情報を読み出すことが可能となる。
【００４６】
DNAブロックに用いたDNA配列は図３中の通りである。図４に、正電荷アクセプター（フェノチアジン）のラジカルカチオンの吸収の時間変化を示した。この吸収の時間変化は、電荷が正電荷アクセプターまで到達する過程を示している。インプットとして用いるブロックの配列によって、電荷の到達する速度は、大きく異なった。この結果は、DNA微小ブロックを混合することにより形成されたDNA微小複合体内で、電荷移動が起こっていることを示す。また電荷移動速度は、インプットしたDNA微小ブロックに依存して変化した。これは、インプットしたDNA微小ブロックの識別が可能であることを示す。また、インプットしたDNA微小ブロックに一塩基のミスマッチがある場合、電荷移動速度は大きく減少し、SNPs検出が可能であることがわかった。すなわち、この発明によれば、電荷注入ブロック、電荷検出ブロックと、インプットブロックを混合することだけで、DNA微小複合体を形成させ、インプットしたDNA微小ブロックの識別ばかりでなく、インプットしたDNA微小ブロックSNPs検出を実現できることがわかった。
【００４７】
また、本実施例のように、DNAのハイブリダイズの性質を利用し、様々な伝導性を示すDNA微小ブロックをプログラム化して自由自在に組み合わせることによって、伝導性を自由自在に制御した多次元DNA微小配線や、多次元DNA微小複合体からなるDNAエレクトロニクスシステムを作成することは容易なので、伝導性を制御した微小分子ワイヤを創製できる。
【００４８】
本発明により、SNPなどの１塩基の相違を検出することができ、同様に核酸の挿入、欠失、点突然変異などの突然変異、反復配列の数などを容易に検出することができる。これらの情報は、遺伝子診断、あるいは遺伝情報に基づくテーラーメード医療などに有用であり、本発明により、大量の遺伝情報を容易に得ることができる。
【００４９】
また、ヒトなどの哺乳動物以外であっても、遺伝情報により有用な形質(例えば家畜であれば肉や乳の品質や太りやすさ、健康状態など、植物では花の色や大きさ、有用物質の収量、味、環境ストレスに対する抵抗性、微生物や酵母では有用物質の産生能、無病原性など)を迅速に評価することができる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
【００５１】
実施例１
GCの連続したDNAに対し、DNA内の電荷移動速度がどのような配列依存性を示すかについて検討した。
【００５２】
具体的には、光増感剤としてナフタルジイミド(NI)、及び正電荷のプローブ分子としてフェノチアジン(PTZ)をDNAの末端に結合させた、４種類の二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（二本鎖DNA配列１〜４、スキーム1を参照）を合成し、その水溶液中のナノ秒レーザーフラッシュホトリシスについて検討した。
【００５３】
具体的には、Q-switched Nd:YAG laser からの第3高調波 (355 nm, 4 ns, 20 mJ) レーザーパルスを照射し、レーザーパルスに同期させたキセノンフラッシュ光 (Osram社, XBO-450) を使用しモニター光として使用し、モニター光に対してレーザーパルスを垂直方向から入射した。過渡吸収の時間プロファイルは、モニター光をレンズを用いてモノクロメータ (Nikon社, G250 monochromator) に集光させ、光電子増倍管(Hamamatsu Photonics社, R928) とデジタルオシロスコープ (Tektronics社, TDS-380P) によって分析した。レーザーパルスを照射する前にサンプルを通過する分析光強度をI0、励起光照射時の分析光強度をIとした時のlog (I0 / I) をDO.D.とした。
【００５４】
ナノ秒パルスレーザー（波長355 nm）照射によってNI部位を光励起すると、NIの励起状態が生成し、近傍の核酸塩基との間での電荷分離反応が起こり、さらにＤＮＡ鎖内での正電荷の移動反応が生じた。これらの電荷移動速度を、時間分解過渡吸収測定法によって決定した。
【００５５】
その結果、GCの連続したDNAではGCの連続数が少ないほど、PTZへ電荷の到達する速度が速くなることが見出された。また、その電荷輸送効率は、これまでで最も電荷移動速度が速いとされてきたGAG配列の1.8-2.3倍であることが分かった。また、GCの連続したDNA (DNA4)での電荷輸送の温度効果について調べたところ、その活性化エネルギーは、GAG配列に比べ高いことが見出された。
【００５６】
実施例２
電荷注入ブロック、検出ブロックと情報を取り出したいインプットブロックを混合することで、微小複合体を形成させた(図３参照)。これらの電荷移動速度を、時間分解過渡吸収測定法によって決定した。
【００５７】
具体的には、電荷注入ブロックとして、光増感剤としてＮＩを修飾したDNAを、さらに電荷検出ブロックとして、正電荷アクセプターとしてＰＴＺを修飾したDNAを用いた。電荷注入ブロック、検出ブロックと情報を取り出したいインプットブロックとを混合し、PCR装置を用い、80°Cで10分間アニ−リングを行った後、16時間かけて冷却することで、ハイブリダイズさせてDNA微小複合体を形成させた。その水溶液中のナノ秒レーザーフラッシュホトリシスについて検討した。
【００５８】
この電荷の移動速度はインプットしたブロックの種類に大きく依存した (図１を参照)。即ち、DNA微小ブロックを混合することにより形成されたDNA微小複合体内で、電荷移動が起こり、さらにブロックの核酸塩基の配列情報を読み出すことが可能であることが示された。
実施例３
微小複合体における正電荷移動速度の温度依存性を測定した。
【００５９】
具体的には、GCの連続した配列をもつDNA 4の水溶液中のナノ秒レーザーフラッシュホトリシスにおいて観測された波長520 nmの過渡吸収（PTZラジカルカチオンに帰属される）の時間変化に及ぼす温度効果を調べた。この電荷の移動速度は温度に大きく依存した (図２を参照、ピンク：10 ℃、空色：28 ℃、青：44 ℃)。即ち、温度が低いほどPTZラジカルカチオンの生成は速く、DNA中の電荷輸送が速く進行することを示す。PTZラジカルカチオンの過渡吸収の生成挙動から、ホール移動速度が求まる。このホール移動過程は、G間のホール移動（Gホールホッピング機構）とPTZへのホールの捕捉によって説明できる(図５を参照)。考えられるホール移動の機構としては、a: 鎖間のGホールホッピング機構と、b: 鎖内のG間のGホールホッピング機構（GとGとの間にはCが介在している）である。二つの反応機構において数値計算を行うと、それぞれ、a: 鎖間のGホールホッピング速度、b: 鎖内のG間のGホールホッピング速度を算出することができる。このようにして得たホール移動速度と温度とのアレニウスプロットを図６に示す。○はa機構, ●はb機構。いずれの場合も直線関係を示していることから、DNA 4内のホール移動速度がそれぞれa, bの機構で進行していることを示す。すなわち、DNA微小ブロックの接続による微小複合体においても、継ぎ目の部分は通常のDNAと同様の性質を示し、DNA内のホール移動が確実に起こっていることを示す。
【００６０】
実施例4
図３に示した電荷注入ブロック、検出ブロックを一定にし、情報を取り出したいインプットブロックをDNA5 ,6, 7の3種類を混合することで、それぞれ微小複合体を形成させた。このとき、インプットブロックの変化による電荷移動速度を、時間分解過渡吸収測定法によって決定した。図４に示すように、インプットブロックを緑：DNA5、青：DNA6、空色：DNA7と変化させると、PTZラジカルカチオンの過渡吸収の生成速度（ホール移動速度）は変化した。すなわち、フルマッチにGTミスマッチが一つあると電荷移動速度は遅くなった。GとGとの間の塩基がTよりAの場合が、電荷移動速度は速くなった。この結果から、インプットブロックの配列情報を電荷移動速度によって読み出すことが可能であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】電荷輸送の距離依存性。GCの連続した配列をもつDNA 1-4のレーザーフラッシュホトリシスにおいて観測された波長520 nmの過渡吸収の時間変化。NIの光励起によって隣のAとの間で電荷分離が起こり、A上に生成した正電荷がDNA中を移動してPTZラジカルカチオンが生成する。図のPTZラジカルカチオンの生成は電荷がDNA中を移動する速度を示している。黒：DNA1、緑：DNA2、空色：DNA3、青：DNA4。DNAが長くなると、正電荷がDNA中を移動する時間が長くかかることを示す。DNA1では電荷移動はほぼレーザーパルス内に終了しているので、100 ns領域のPTZラジカルカチオンの生成が観測されない。
【図２】電荷輸送の温度効果。GCの連続した配列をもつDNA 4のレーザーフラッシュホトリシスにおいて観測された波長520 nmの過渡吸収の時間変化に及ぼす温度効果。ピンク：10 ℃、空色：28 ℃、青：44 ℃。温度が低いほどPTZラジカルカチオンの生成は速く、DNA中の電荷輸送が速く進行することを示す。
【図３】本発明のストラテジーを示す模式図。電荷注入・電荷検出・インプットDNAブロックを混合することでDNA微小構造体を容易に形成できる。
【図４】本発明の具体例。図３に示したDNA微小構造体での電荷移動速度の観測。インプットブロックの変化による電荷移動速度の変化。緑：DNA5、青：DNA6、空色：DNA7。フルマッチにGTミスマッチが一つあると電荷移動速度は遅くなる。GとGとの間の塩基がTよりAの場合が、電荷移動速度は速い。これは、インプットブロックの配列情報が電荷移動速度による読み出しが可能なことを示す。
【図５】G間のホール移動（Gホールホッピング機構）とPTZへのホールの捕捉示す模式図。a: 鎖間のGホールホッピング機構。b: 鎖内のG間のGホールホッピング機構。GとGとの間にはCが介在している。
【図６】電荷輸送の温度効果のアレニウスプロット。○はa機構, ●はb機構。いずれの場合も直線関係を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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