(57)【要約】【課題】原核微生物であるオエルスコヴィア属の微生物からイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素を生産し、その酵素学的特徴を明らかにし、さらにその遺伝子を取り出し、さらにその遺伝子を用いて遺伝子工学的手法により上記酵素を製造する方法を提供する【解決手段】自然界よりオリゴキシログルカンを炭素源として生育できる原核微生物のスクリーニングを行い、さらに分離微生物がイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素を生産するか検討した。その結果、放線菌の一種である、オエルスコヴィア属の一菌株（オエルスコヴィア（Oerskovia）属菌Y1株）が該酵素を生産することを見出し、該酵素を精製しアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列を解明した。そして、この遺伝子を用いて大量の組換え酵素の製造法を確立し、本発明を完成するに至った。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オエルスコヴィア属に属する微生物由来の蛋白質であって、オリゴキシログルカンの非還元末端のグルコース残基のβ-１，４-グルコシド結合を切断し、イソプリメベロースを産生する作用を有する、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素。
【請求項２】
配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するポリぺプチド、若しくは該ポリペプチドにおける１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換されたアミノ酸配列を有し、かつイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
Ｎ末端にメチオニンが付加された請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
シグナル配列が付加された請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号８中に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、若しくは該ポリペプチドにおける１個又は数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチドの前駆体となるポリペプチド。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号９に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、若しくは該ポリヌクレオチドにおける１個又は数個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列を有するものであって、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチドを発現するポリヌクレオチド。
【請求項８】
開始コドンが付加された請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
シグナルペプチド配列に対応する塩基配列が付加された請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号７に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、若しくは該ポリヌクレオチドにおける１個又は数個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチドの前駆体を発現するポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれかに記載のポリヌクレオチドに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチドに相同性を有するポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項７〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチドに縮重するポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項６〜１３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の形質転換体を培養し、培養物から、組み換えられたポリヌクレオチドに対応するポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１７】
ポリペプチドが、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するものである請求項１６に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１８】
オエルスコヴィア属に属する微生物を培地に培養し、培養物から、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素を採取することを特徴とする、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素の製造方法。
【請求項１９】
オエルスコヴィア属に属する微生物がオエルスコヴィア・エスピー（Oerskovia sp.）Y1株（FERM P-21157）である、請求項１８に記載のイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素の製造方法。
【請求項２０】
オエルスコヴィア・エスピー（Oerskovia sp.）Y1株（FERM P-21157）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有する特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換された形質転換体、および該形質転換体を培養して上記ポリペプチドを製造する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
キシログルカンは、グルコース、キシロース、ガラクトース、フコース、アラビノースなどを構成単糖とするヘテロ多糖であるが、グルコースがβ-１，４-グルコシド結合で多数結合した主鎖に対して、キシロースがα-１，６キシロシド結合で高頻度に分岐結合した構造を基本とすることから、キシログルカンと呼称されている。このキシログルカンは、植物の一次細胞壁の構成成分として、またタマリンド豆に代表される熱帯産マメ科植物の種子貯蔵多糖として重要な役割を担っており、その構造や機能が注目されている。特に、植物の一次細胞壁中におけるキシログルカンは、セルロースと密接に関わって存在していると考えられており、セルロースとの相対的な存在形態が、植物細胞の伸長や形態分化に重要な役割を担っているものと考えられている。このようなキシログルカンの役割を解明するために種々の手法が用いられているが、中でもキシログルカンを分解することのできる各種グリコシダーゼは、重要で強力な分析手段を提供する。
【０００３】
上述のようにキシログルカンはグルコース、キシロース、ガラクトース、フコース、アラビノースなどを構成単糖とし、かつ主鎖の構造がセルロースと同様なものであることから、これを分解できるグリコシダーゼとして、エンド-１，４-β-D-グルカナーゼ、β-ガラクトシダーゼ、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素、α-キシロシダーゼ、β-グルコシダーゼ、α-フコシダーゼなどが知られており、キシログルカンの構造や機能の解明に、各種起源のこれら酵素が用いられてきた。
【０００４】
そのうちイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素は、オリゴキシログルカンの非還元末端のグルコース残基のβ-１，４-グルコシド結合を切断し、イソプリメベロースを産生する作用を有している。該酵素の報告例は極めて少なく、真核微生物由来のものが報告されているだけである（非特許文献１）。また、遺伝子については全くわかっていない。
【０００５】
【非特許文献１】Yoji Kato et. al.  Journal of Biochemistry (1985) 97, 801-810
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、原核微生物であるオエルスコヴィア属の微生物からイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素を生産し、その酵素学的特徴を明らかにし、さらにその遺伝子を取り出し、さらにその遺伝子を用いて遺伝子工学的手法により上記酵素を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、自然界よりオリゴキシログルカンを炭素源として生育できる原核微生物のスクリーニングを行い、さらに分離微生物のイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素生産能について検討した。その結果、放線菌の一種である、オエルスコヴィア属の一菌株（オエルスコヴィア（Oerskovia）属菌Y1株）が該酵素を生産することを見出し、該酵素を精製しアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列を解明した。そして、この遺伝子を用いて大量の組換え酵素の製造法を確立し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１９）に係るものである。
（１）オエルスコヴィア属に属する微生物由来の蛋白質であって、オリゴキシログルカンの非還元末端のグルコース残基のβ-１，４-グルコシド結合を切断し、イソプリメベロースを産生する作用を有する、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素。
（２）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するポリぺプチド、若しくは該ポリペプチドにおける１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換されたアミノ酸配列を有し、かつイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチド。
（３）Ｎ末端にメチオニンが付加された上記（２）に記載のポリペプチド。
（４）シグナル配列が付加された上記（２）に記載のポリペプチド。
（５）配列番号８中に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、若しくは該ポリペプチドにおける１個又は数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチドの前駆体となるポリペプチド。
（６）上記（２）〜（５）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（７）配列番号９に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、若しくは該ポリヌクレオチドにおける１個又は数個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列を有するものであって、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチドを発現するポリヌクレオチド。
（８）開始コドンが付加された上記（７）に記載のポリヌクレオチド。
（９）シグナルペプチド配列に対応する塩基配列が付加された上記（７）に記載のポリヌクレオチド。
（１０）配列番号７に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、若しくは該ポリヌクレオチドにおける１個又は数個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチドの前駆体を発現するポリヌクレオチド。
（１１）上記（７）〜（１０）のいずれかに記載のポリヌクレオチドに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（１２）上記（７）〜（１１）のいずれかに記載のポリヌクレオチドに相同性を有するポリヌクレオチド。
（１３）上記（７）〜（１１）のいずれかに記載のポリヌクレオチドに縮重するポリヌクレオチド。
（１４） 上記（６）〜（１３）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター。
（１５）上記（１４）に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
（１６）上記（１５）に記載の形質転換体を培養し、培養物から、組み換えられたポリヌクレオチドに対応するポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
（１７）ポリペプチドが、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するものである上記（１６）に記載のポリペプチドの製造方法。
（１８）オエルスコヴィア属に属する微生物を培地に培養し、培養物から、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素を採取することを特徴とする、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素の製造方法。
（１９）オエルスコヴィア属に属する微生物がオエルスコヴィア・エスピー（Oerskovia sp.）Y1株（FERM P-21157）である、上記（１８）に記載のイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素の製造方法。
（２０）オエルスコヴィア・エスピー（Oerskovia sp.）Y1株（FERM P-21157）。
【０００９】
なお、本発明においては、「アミノ酸配列を有するポリペプチド」あるいは「塩基配列を有するポリヌクレオチド」というとき、該記載において指摘するアミノ酸配列または塩基配列からなるもののみではなく、これら配列をその部分として含有するポリペプチド、ポリヌクレオチドも包含する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、新規かつ有用な真核微生物由来のイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素が提供でき、そのアミノ酸配列、その遺伝子の構造が明らかとなった。そして、この遺伝子を用いて大量の組換え酵素を製造することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明におけるイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素は、オエルスコヴィア（Oerskovia）属に属する微生物由来の酵素あって、オリゴキシログルカンの非還元末端のグルコース残基のβ-１，４-グルコシド結合を切断し、イソプリメベロースを産生する作用を有する。
この酵素は、より具体的には、オエルスコヴィア（Oerskovia）属菌Y1株により生産され、オエルスコヴィア（Oerskovia）属菌Y1株は、オエルスコヴィア・エスピー  （Oerskovia sp.）Y1株、FERM P-21157として産業技術総合研究所、特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００１２】
上記オルスコヴィア（Oerskovia）属に属する微生物より、本発明の酵素を生産するためには、通常、オリゴキシログルカンを炭素源とし、これに窒素源として、硝酸塩、アンモニウム塩或いはペプトン、酵母エキスのような無機または有機の窒素源と少量の金属塩を含む液体または固体培地を用い、２０〜３０℃で、４〜１０日程度、好気的に培養される。本発明の酵素は、菌体外に生産される酵素であるため、液体培地の場合は培養後、濾過或いは遠心分離した上澄液を、そして固体培養の場合は培養後、水または適当な無機塩類で抽出した液を、粗酵素液とすることができる。粗酵素液中には、本発明の酵素以外にキシログルカンを分解する種々の酵素活性が含まれるため、これを除去する必要があるが、公知のクロマトグラフィーにより、本発明の酵素以外の共存するグリコシダーゼ活性を除去することができる。
【００１３】
上記のようにして得られた本発明の酵素（精製物）は、以下のような性質を有している。
【００１４】
（１）分子量；精製された本発明の酵素は、分子量が約１０５,０００である。
【００１５】
（２）作用；本発明の酵素は、オリゴキシログルカンの非還元末端のグルコース残基のβ-グルコシド結合を分解し、イソプリメベロースが生産される。
【００１６】
（３）至適作用ｐＨ；オリゴキシログルカンを分解基質としたとき、本発明の酵素の至適ｐＨは、ｐＨ４〜５付近である。
【００１７】
（４）安定ｐＨ範囲；本発明の酵素をクエン酸-リン酸塩緩衝液中で、３５℃，２０分放置してその残存活性からみた安定ｐＨ範囲は約ｐＨ３．５〜７．５である。
【００１８】
（５）至適作用温度；オリゴキシログルカンを分解基質としたとき、本発明の酵素の至適作用温度は５５℃である。
【００１９】
（６）熱安定性；本発明の酵素を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）のもとで、各温度で２０分間加熱処理した残存活性は４５℃までは殆ど失活しない。
【００２０】
（７）精製法；本発明の酵素は、培養上清を限外濾過により濃縮・脱塩した後、陰イオン交換カラムHiPrep DEAE、HiPrep QおよびResourceQ、陽イオン交換カラムResourceS、疎水カラムResource PHE（いずれもGEヘルスケア  バイオサイエンス社製）を用いたクロマトグラフィーを繰り返し行い、活性を保持している画分を濃縮して、さらにHiLoad Superdex 200 pgカラム（GEヘルスケア  バイオサイエンス社製）によるゲル濾過を行うことで、ＳＤＳ電気泳動的に均一なまで分離精製することができた。
【００２１】
（８）活性測定法；本発明の酵素は、オリゴキシログルカンを特異的に分解することから、オリゴキシログルカン７糖（東京化成工業）を水酸化ホウ素ナトリウム処理で還元したものを基質として活性測定を行った。この基質０．１％水溶液（ｐＨ４．５）に対して、適量の酵素を添加して５０℃で１０分間反応させ、生成する還元糖をビシンコニン酸法により測定し、活性を求めた。この条件で、１分間に１マイクロモルのグルコースに相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。
【００２２】
本発明の新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素は、分泌蛋白であり、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有し、該配列中、残基１〜２８はシグナル配列と推定される。本酵素の成熟体蛋白は、この残基１〜２８の配列が除かれたものであると予想され、このアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
【００２３】
したがって、本発明のポリペプチドとして好適なものは、少なくともこの配列番号１０のアミノ酸配列を有するものであるが、また、このポリペプチドと１個又は数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換によりアミノ酸配列が異なるものであっても、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有する限り本発明に含まれる。
また、本発明のポリペプチドとしては、配列番号８で示されるような、上記シグナル配列を有する前駆体ポリペプチド、あるいは、該ポリペプチドと１個又は数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換によりアミノ酸配列が異なるものであっても、スプライシングによりイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチドを産生可能なものも挙げることができる。
【００２４】
さらに、本発明のポリペプチドは、遺伝子組換え手段を用いて製造することができる。この場合、例えば、上記配列番号１０に示されるアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン由来のメチオニンが付加したものであってもよく、例えば、配列番号１４に示されるポリペプチドについて、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有することが確認されている。
【００２５】
本発明のイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子としては、該酵素を産生する微生物から該遺伝子のクローニングによって取得することができる遺伝子や該遺伝子に相同性を有する遺伝子があげられる。相同性としては、少なくとも６０％以上の相同性を有する遺伝子、好ましくは８０％以上の相同性を有する遺伝子、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する遺伝子が挙げられる。
本発明のイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子としては、例えば以下のようなポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が好ましい。
【００２６】
（１）配列番号９に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド、あるいは該ポリペプチドの１個又は数個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（２）上記（１）のポリヌクレオチドに開始コドンが付加されているポリヌクレオチド。
（３）上記（１）に示されるポリヌクレオチドにシグナル配列に対応する塩基配列が付加されたポリヌクレオチド、あるいは該ポリヌクレオチドにおける１個又は数個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列を有し、かつスプライシングにより成熟体を発現可能なポリヌクレオチドであって、具体的には配列番号７に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【００２７】
さらに、このほか上記（１）〜（３）のポリヌクレオチドに対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、該ポリヌクレオチドに相同性を有するポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドに縮重するポリヌクレオチドもそれらがコードするポリペプチドがイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有する限り本発明に含まれる。
なお、ここでいう「ストリンジェントな条件下」とは、例えば以下の条件をいう。すなわち0.5％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Denhartz's、0.１％ウシ血清アルブミン（BSA ）、0.１％ポリビニルピロリドン、0.１％フィコール400 〕および100μg/mlサケ精子DNAを含む６×SSC （１×SSCは、0.15 mol/l NaCl 、0.015mol/lクエン酸ナトリウム、pH7.0 ）中で、50℃〜65℃で４時間〜一晩保温する条件をいう。
【００２８】
本発明のイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上述したイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素を産生する微生物から、例えば以下に記載するような方法で該遺伝子のクローニングを行うことによって取得することができる。まず、新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素を産生する微生物から上述の方法によって本発明の新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素を単離、精製し、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。
【００２９】
部分アミノ酸配列決定方法としては、例えば、精製された本酵素蛋白質を直接エドマン分解法によりアミノ酸配列分析に供してもよいし、あるいはタンパク質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を分離精製し、得られた精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが効果的である。
【００３０】
こうして得られる部分アミノ酸配列の情報を基に、新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素遺伝子をクローニングする。一般的に、 PCRを用いる方法あるいはハイブリダイゼーション法を利用してクローニングを行うことができる。
【００３１】
ハイブリダイゼーション法を利用する場合、例えば、Sambrook and Russell，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Third edition, Cold Spring Habor Laboratory Press（2001）に記載の方法を用いることができる。
【００３２】
また、 PCR法を利用する場合、以下のような方法を用いることができる。まず、新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素を産生する微生物のゲノムDNAあるいはcDNAを鋳型とし、部分アミノ酸配列の情報を基にデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR反応を行い、目的の遺伝子断片を得る。
【００３３】
PCR法は、PCRテクノロジー〔PCR Technology、エルリッヒ（Erlich）HA編集、ストックトンプレス社（Stocktonpress）、1989年発行〕に記載の方法に準じて行う。更に、この増幅ＤＮＡ断片について通常用いられる方法、例えば、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定すると、決定された配列中に合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列以外に新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素の部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目的の酵素遺伝子の一部を取得することができる。さらに、得られた遺伝子断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法、ＲＡＣＥ(Rapid Amplification of cDNA ends)法、インバースPCR法等を行うことによって、新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素全長をコードする遺伝子をクローニングすることができる。
【００３４】
本発明者は、オエルスコヴィア・エスピー（Oerskovia sp.）Y1株を用い、PCR法を利用して、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素をコードする遺伝子の全塩基配列を決定した。この塩基配列は配列番号７に示される。
これによってコードされるアミノ酸配列を配列番号８に記載した。このアミノ酸配列のうち、Ｎ末端１〜２８のアミノ酸残基はシグナル配列と推定され、成熟体のポリペプチドは、２９番目のアラニンから始まるアミノ酸配列を有し（配列番号１０）、該成熟体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は配列番号９に示すとおりである。
なお、配列番号８あるいは１０に記載したアミノ酸配列に対応する塩基配列は、配列番号７あるいは９に記載したポリヌクレオチドのみではないことは自明であり、上記したとおり、本発明においては、配列番号８，１０に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子であればこれらを含む。
【００３５】
また、配列番号８あるいは１０に記載のアミノ酸配列や配列番号７あるいは９に記載の塩基配列の情報を元にして、化学合成によって目的とする遺伝子ポリヌクレオチドを得ることもできる(参考文献：Gene,60(1), 115-127 (1987))。
【００３６】
さらに、オエルスコヴィア・エスピーY1株を用いて全塩基配列が明らかにされた新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素遺伝子の全体あるいは一部分をハイブリダイゼーション用のプローブとして用いて、他のイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素を産生する微生物のゲノムDNAライブラリーあるいはcDNAライブラリーから、配列表の配列番号７に示される新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素遺伝子と相同性の高いDNAを選別することができる。
【００３７】
ハイブリダイゼーションは、上記に示したストリンジェントな条件下で行うことができる。例えば、新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素を産生する微生物から得たゲノムDNAライブラリーあるいはcDNAライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×SSC 、 0.5％SDS 、５×デンハルツ、100 μg/mlサケ精子DNAを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、65℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、65℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×SSC中、室温で10分間、0.１％ SDSを含む２×SSC中、室温で10分間、0.１％ SDSを含む0.２×SSC中、45℃で30分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズするDNAを検出することができる。また、洗いなどの条件を変えることによって様々な相同性を示す遺伝子を得ることができる。
【００３８】
一方、本発明の遺伝子の塩基配列からPCR反応用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを用いてPCR反応を行うことによって、本発明の遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出したり、更にはその遺伝子全体を得ることもできる。
【００３９】
得られた遺伝子が目的のイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうかを確認するには、決定された塩基配列を本発明の新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素の塩基配列又はアミノ酸配列と比較し、その遺伝子構造および相同性から推定することもできる。また、得られた遺伝子のポリペプチドを製造し、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を測定することにより、目的の酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうか確認することができる。
【００４０】
本発明のイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素遺伝子を用いて、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチドを生産するには以下の方法が便宜である。まず、目的の酵素遺伝子により発現ベクターを組み換え、該遺伝子を含む組換えベクターを用いて宿主の形質転換を行い、次いで該形質転換体の培養を通常用いられる条件で行うことによって、新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチドを生産させる。この際、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有する成熟体ポリペプチドを得るには、該ポリペプチドのＮ末端にメチオニン残基が付いていないため、該成熟体ポリペプチドに対応する塩基配列において開始コドン（atg）を付加し、さらに、必要に応じ終止コドンを付加する(taa/tag/tga)。
【００４１】
また、宿主としては微生物、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。微生物としては、大腸菌、Bacillus属、Streptomyces属、Lactococcus属等の細菌、Saccharomyces属、Pichia属、Kluyveromyces属等の酵母、Aspergillus属、Penicillium属、Trichoderma属等の糸状菌が挙げられる.動物細胞としては、バキュロウイルスの系統が挙げられる。
【００４２】
発現の確認や発現産物の確認は、新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素に対する抗体を用いて行うことが簡便であるが、酵素活性を測定することにより発現の確認を行うこともできる。
【００４３】
形質転換体の培養物から新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチドを精製するには上述のように、遠心分離、UF濃縮、塩析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーを適宜組み合わせて行うことができる。
【００４４】
一方、本発明によりイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素の一次構造および遺伝子構造が明らかとなったことにより、本発明の遺伝子を用いて、ランダム変異あるいは部位特異的変異を導入し、天然のイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素のアミノ酸配列中に、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされている遺伝子を得ることが可能である。これにより、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するが、至適温度、安定温度、至適pH、安定pH、基質特異性等の性質が少しづつ異なったイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素をコードする遺伝子を得ることが可能であり、遺伝子工学的にこれら酵素活性を有するポリペプチドを製造することが可能となる。
【００４５】
ランダム変異を導入する方法としては、例えば、 DNAを化学的に処理する方法として、亜硫酸水素ナトリウムを作用させシトシン塩基をウラシル塩基に変換するトランジション変異を起こさせる方法〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイエンシーズ オブ ザUSA、第79巻、第1408〜1412頁（1982）〕、生化学的方法として、〔α-S〕dNTP存在下、二本鎖を合成する過程で塩基置換を生じさせる方法〔ジーン（Gene）、第64巻、第313〜319頁（1988）〕、 PCRを用いる方法として、反応系にマンガンを加えてPCRを行い、ヌクレオチドの取込みの正確さを低くする方法〔アナリティカル バイオケミストリー（Analytical Biochemistry ）、第224巻、第347〜353頁（1995）〕等を用いることができる。
【００４６】
部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法〔ギャップド デュプレックス（gapped duplex ）法、ヌクレイックアシッズ リサーチ（Nucleic Acids Research）、第12巻、第24号、第9441〜9456頁（1984）〕、制限酵素の認識部位を利用する方法〔アナリティカル バイオケミストリー、第200巻、第81〜88頁（1992）、ジーン、第102巻、第67〜70頁（1991）〕、dut （dUTPase ）とung （ウラシルDNAグリコシラーゼ）変異を利用する方法〔クンケル（Kunkel）法、プロシーディングズ オブ ザ ナショナル オブ サイエンシーズ オブ ザUSA、第82巻、第488〜492頁（1985）〕、 DNAポリメラーゼおよびDNAリガーゼを用いたアンバー変異を利用する方法〔オリゴヌクレオチド-ダイレクティッド デュアル アンバー（Oligonucleotide-directed Dual Amber ：ODA）法、ジーン、第152巻、第271〜275頁（1995）、特開平7-289262号公報〕、 DNAの修復系を誘導させた宿主を利用する方法（特開平8-70874号公報）、 DNA鎖交換反応を触媒するタンパク質を利用する方法（特開平8-140685号公報）、制限酵素の認識部位を付加した２種類の変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法（USP5,512,463）、不活化薬剤耐性遺伝子を有する二本鎖DNAベクターと２種類のプライマーを用いたPCRによる方法〔ジーン、第103巻、第73〜77頁（1991）〕、アンバー変異を利用したPCRによる方法〔国際公開WO98/02535号公報〕等を用いることができる。
【００４７】
また、市販されているキットを使用することにより、部位特異的変異を容易に導入することができる。市販のキットとしては、例えば、ギャップドデュプレックス法を用いたMutan（登録商標）-G（タカラバイオ社製）、クンケル法を用いたMutan（登録商標）-K（タカラバイオ社製）、ODA法を用いたMutan （登録商標）-Express Km （タカラバイオ社製）、変異導入用プライマーとピロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来DNAポリメラーゼを用いたQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit〔ストラタジーン（STRATAGENE）社製〕等を用いることができ、また、 PCR法を利用するキットとして、TaKaRa LA PCR in vitro Mutagenesis Kit（タカラバイオ社製）、Mutan （登録商標）-Super Express Km （タカラバイオ社製）等を用いることができる。
【００４８】
このように、本発明により、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素の一次構造および遺伝子構造が提供されたことにより、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素活性を有するポリペプチドの安価で高純度な遺伝子工学的な製造が可能となる。なお、本明細書では種々の文献等を引用したが、これらはすべて参考として本明細書に組み込まれるものである。以下、本発明について実施例を用いて詳述するが本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に明記しない限り、本明細書において％はW/V％で示した。
【実施例】
【００４９】
実施例１  
オリゴキシログルカン７糖（東京化成工業社製）０．５％とペプトン０．８％と硫酸マグネシウム０．０５％とリン酸一カリウム０．２％と酵母エキス０．０５％とを含む培地２ｌを常法により殺菌した後、オエルスコヴィア・エスピー（Oerskovia sp.）Y1株（FERM P-21157）を接種し、３０℃で7日間通気培養した。その後、遠心分離により培養上清を得た。培養上清を限外濾過により濃縮・脱塩した後、陰イオン交換カラムHiPrep DEAE、HiPrep Q、ResourceQ、陽イオン交換カラムResourceS、疎水カラムResource PHE（いずれもGEヘルスケア  バイオサイエンス社製）を用いたクロマトグラフィーを繰り返し行い、活性を保持している画分を濃縮して、さらにHiLoad Superdex 200 pgカラム（GEヘルスケア  バイオサイエンス社製）によるゲル濾過を行った。精製酵素はＳＤＳ電気泳動的に均一であった（図１）。
オリゴキシログルカン７糖（東京化成工業）を水酸化ホウ素ナトリウム処理で還元したものを基質として、上記精製酵素の活性測定を行った。この基質０．１％水溶液（ｐＨ４．５）１０μｌに対して、３０ｎｇの精製酵素を添加して５０℃で１０分間反応させ、生成する還元糖をビシンコニン酸法により測定し、活性を求めた。この条件で、１分間に１マイクロモルのグルコースに相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。
精製酵素蛋白質１ｍｇ当たりの活性は、８５単位であった。
【００５０】
実施例２
〈オエルスコヴィア・エスピー（Oerskovia sp.）Y1株由来の新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素をコードする遺伝子の単離〉
【００５１】
本明細書においては、遺伝子操作手法は特に記載しない限り成書（例えばSambrook and Russell，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Third edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, 2001）に従って行った。
【００５２】
〔部分アミノ酸配列の決定〕
実施例１で得られたイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素の精製標品を、リシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）による分解を行った。得られた分解物を逆相液体クロマトグラフィーに供し、分離されたペプチド画分のうち二つをプロテイン・シークエンサーに供し、配列番号１および２に示す内部アミノ酸配列を決定した。
【００５３】
ゲノムＤＮＡの調製  実施例1と同様に培養を行い、常法によりゲノムＤＮＡ単離キット（FastDNA Kit、BIO 101社製）を用いて、添付の説明書に従ってゲノムＤＮＡを調整した。
【００５４】
ＰＣＲによる増幅  配列番号１および２の内部アミノ酸配列をもとに、配列番号３および４に示すセンス・プライマーと配列番号５および６に示すアンチセンス・プライマーの４種の混合オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕により合成し、ＰＣＲプライマーとした。
【００５５】
配列番号３に示すセンス・プライマーと配列番号５に示すアンチセンス・プライマーを用いて、オエルスコヴィア・エスピー（Oerskovia sp.）Y1株のゲノムＤＮＡを鋳型として、以下の条件下、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕を用いてＰＣＲ反応を行なった。
【００５６】
＜ＰＣＲ反応液＞ １０×ＰＣＲ反応緩衝液 (タカラバイオ社製)１０μl 、ｄＮＴＰ混合液 (それぞれ２．５ｍｍｏｌ/ｌ、タカラバイオ社製) 8 μ、 １００μｍｏｌ/ｌセンス・プライマー５μl 、１００μｍｏｌ/ｌアンチセンス・プライマー５μl 、蒸留水７１μl、ゲノムＤＮＡ溶液（１００μg/ｍｌ）０．５μl 、ＥＸ-Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ (タカラバイオ社製)０．５μl
【００５７】
＜ＰＣＲ反応条件＞ ステージ１： 変性（９４℃、２分） １サイクル 
ステージ２： 変性（９４℃、３０秒）アニール（４８℃、３０秒）伸長（７２℃、３０秒）４５サイクル
ステージ３： 伸長（７２℃、２分）１サイクル
【００５８】
PCR反応後の反応溶液を鋳型として、配列番号４に示すセンス・プライマーと配列番号６に示すアンチセンス・プライマーを用いて、以下の条件下、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕を用いてＰＣＲ反応を行なった。
【００５９】
＜ＰＣＲ反応液＞ １０×ＰＣＲ反応緩衝液 (タカラバイオ社製)１０μl 、ｄＮＴＰ混合液 (それぞれ２．５ｍｍｏｌ/ｌ、タカラバイオ社製) 8 μ、 １００μｍｏｌ/ｌセンス・プライマー５μl 、１００μｍｏｌ/ｌアンチセンス・プライマー５μl 、蒸留水７１μl、PCR反応後の反応溶液０．５μl 、ＥＸ-Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ (タカラバイオ社製)０．５μl
【００６０】
＜ＰＣＲ反応条件＞ ステージ１： 変性（９４℃、２分） １サイクル 
ステージ２： 変性（９４℃、３０秒）アニール（５２℃、３０秒）伸長（７２℃、３０秒）４０サイクル
ステージ３： 伸長（７２℃、２分）１サイクル
【００６１】
得られた約５００ｂｐのＤＮＡ断片をpGEM-T Easy〔プロメガ（Promega）社製〕にクローニング後、塩基配列を決定した。
【００６２】
〔イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素の完全長遺伝子配列の決定〕
前記ＤＮＡの塩基配列をもとにして、インバースＰＣＲ法を行うことによって５′側および３‘側の遺伝子断片を増幅し、その塩基配列を決定し、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素遺伝子の全塩基配列を決定した。インバースＰＣＲ法については「細胞工学別冊  ＰＣＲ  Ｔｉｐｓ  （秀潤社）」第１章「ベーシックス」１-８「Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ」６１-６４項に記載されている。
【００６３】
決定されたイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号７に示す。得られたＤＮＡは全長３０５４塩基対からなり、１０１８アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。このアミノ酸配列中には、内部アミノ酸配列（配列番号１および２）が見出された。１番目から２８番目のアミノ酸までの配列は、シグナル配列であると推測され、本発明の酵素が分泌蛋白であることを示唆している。
２９番目のアミノ酸残基から始まると推測される成熟体蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１０に、該成熟体蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号９に示す。
【００６４】
本発明はイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有する前記の配列のポリペプチドやそれをコードするヌクレオチドに特に限定されるものではなく、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有するポリペプチドからなる更に長いポリペプチドやそれをコードするヌクレオチドを含むものである。
【００６５】
実施例３
〈新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素の大腸菌での発現プラスミドの構築〉
成熟体のＮ末端領域アミノ酸配列およびＣ末端領域アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列をもとに、配列番号１１に示すセンス・プライマーと配列番号１２に示すアンチセンス・プライマーを作製した。この際、Ｎ末端領域側のセンス・プライマーの５’側には、制限酵素Nde I認識配列（catatg）を、Ｃ末端領域側のアンチセンス・プライマーの５’側には制限酵素EcoRI認識配列（gaattc）を付加した。制限酵素認識配列のさらに５’側に付加されている複数の塩基は、制限酵素の切断効率を増加させるためのものである。
【００６６】
これらのプライマーとオエルスコヴィア・エスピー（Oerskovia sp.）Y1株のゲノムＤＮＡを鋳型として、以下の条件下、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕を用いてＰＣＲ反応を行なった。
【００６７】
＜ＰＣＲ反応液＞５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ(タカラバイオ社製)１０μl 、ｄＮＴＰ混合液 (それぞれ２．５ｍｍｏｌ/ｌ、タカラバイオ社製) ４ μ、１０μｍｏｌ/ｌセンス・プライマー１μl 、１０μｍｏｌ/ｌアンチセンス・プライマー１μl 、蒸留水３３μl、ゲノムＤＮＡ溶液（１００μg/ｍｌ）０．５μl 、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ (タカラバイオ社製)０．５μl
【００６８】
＜ＰＣＲ反応条件＞ ステージ１： 変性（９８℃、１分） １サイクル 
ステージ２： 変性（９８℃、１０秒）アニール（５５℃、５秒）伸長（７２℃、３分）３０サイクル
ステージ３： 伸長（７２℃、１０分）１サイクル
【００６９】
得られた約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素Nde I及びEcoRIで切断し、制限酵素Nde I及びEcoRIで切断したpET29a(+)〔ノバジェン（Novagen）社製〕にクローニングした。塩基配列が正しいことを確認した後、大腸菌BL21-CodonPlus (DE3)-RP〔ストラタジーン（STRATAGENE）社製〕に導入した。得られた形質転換体を３０μｇ／ｍｌのカナマイシンと５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むLB培地で３７℃で振盪培養した。培地にイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシドを添加して生産誘導すると、目的の遺伝子産物は、蛋白質封入体として菌体内に蓄積した。
【００７０】
実施例４
〈タンパク質封入体の単離・可溶化・巻き戻し〉
上述のようにして培養した菌体を集菌後、蛋白質抽出キット〔バグバスター（BugBuster）、ノバジェン（Novagen）社製〕を用いて細胞の破砕および蛋白質封入体の精製を行った。精製された蛋白質封入体を、８Ｍ尿素-５０ｍＭトリス・塩酸-１ｍＭエチレンジアミン四酢酸溶液（ｐＨ８．０）に、タンパク質濃度が約１ｍｇ／ｍｌになるよう溶解した。
【００７１】
可溶化上清を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に透析し、尿素を除去することによって巻き戻しを行った。
【００７２】
得られたポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１４に示し、また、該アミノ酸配列に対応する塩基配列を配列番号１３に示す。該ポリペプチドは、配列番号１０に記載の成熟体ポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドン由来のメチオニンが付加されているものである。該ポリペプチドのキシログルカンオリゴ糖分解活性について、オリゴキシログルカン７糖を基質として、実施例１と同様に測定した。その結果、蛋白質１ｍｇ当たりの活性は３２単位であり、その活性様式はオエルスコヴィア・エスピー（Oerskovia sp.）Y1株から得られた酵素と同じであった。すなわち、この組み換え酵素は、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解活性を有していた。
【００７３】
これらの結果より、本発明で得られた新規なイソプリメベロース生成オリゴキシログルカン加水分解酵素遺伝子を用いて、組換え酵素を大腸菌を用いて製造出来ることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】実施例１において得られた精製酵素タンパク質についてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果を示す写真である。
【図１】
2008199977.tif 000002
【配列表】
2008199977000001.app