(57)【要約】【課題】ピルビン酸とインドール−３−ピルビン酸との交差アルドール反応において４位鏡像体を選択的に製造する方法を提供すること。【解決手段】ピルビン酸とインドール−３−ピルビン酸との交差アルドール反応をする際に、２級アミン含有光学活性α−アミノ酸と金属イオンを共存させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表されるピルビン酸と下記式（２）で表されるインドール−３−ピルビン酸とを、２級アミン含有光学活性α−アミノ酸、および金属イオンの共存下にて反応させる工程を含有することを特徴とする、下記式（３）で表される光学活性化合物（塩の形態も含む）の製造方法。
【化１】
2008214345.tif 000021
【化２】
2008214345.tif 000022
【化３】
2008214345.tif 000023
（但し、式（３）中における＊は不斉炭素を示す。）
【請求項２】
請求項１記載の製造方法で得られた光学活性化合物、に更に下記一般式（４）で示されるアミン誘導体またはその塩を作用させる工程を含有することを特徴とする、下記一般式（５）で表される光学活性化合物（塩の形態も含む）の製造方法。
【化４】
2008214345.tif 000024
【化５】
2008214345.tif 000025
（但し、式（５）中における＊は不斉炭素を示し、Ｒは水素原子若しくはメチル基を示す。）
【請求項３】
２級アミン含有光学活性α−アミノ酸が、ヒドロキシプロリン、およびプロリンから選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、請求項１記載の光学活性化合物（塩の形態も含む）の製造方法。
【請求項４】
２級アミン含有光学活性α−アミノ酸が、下記一般式（６）で表されることを特徴とする、請求項１記載の光学活性化合物（塩の形態も含む）の製造方法。
【化６】
2008214345.tif 000026
（但し、Ｒ１は炭素数１〜３のアルキル基を示し、Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基、または炭素数７〜１０のアラルキル基を示し、当該アルキル基乃至はアラルキル基は少なくとも１つの水酸基又はアミノ基で置換されていても良い。）
【請求項５】
金属イオンが、マグネシウム（II）イオン、亜鉛（II）イオン、コバルト（II）乃至は（III）イオン、ニッケル（II）イオンから選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、請求項１記載の光学活性化合物（塩の形態も含む）の製造方法。
【請求項６】
反応中、反応溶液のｐＨが７〜１２であることを特徴とする、請求項１記載の光学活性化合物（塩の形態も含む）の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の光学活性化合物（塩の形態も含む）の製造方法を含有するモナティンまたはその塩の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法で得られた光学活性化合物に対して、更にトランスアミナーゼとアミノ供与体とを作用させる工程を含有することを特徴とする、モナティンまたはその塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光学活性化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
下記構造式（７）で示される３−（１−アミノ−１，３−ジカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブタン−４−イル）−インドール（以下、「モナティン」と称する。）については、植物シュレロチトン  イリシホリアス（Schlerochiton ilicifolius）の根に含有し、ショ糖の数百倍の甘味を有していることから、低カロリー甘味料として期待される化合物である（特開昭６４−２５７５７号公報参照。）。
【０００３】
【化１】
2008214345.tif 000002
【０００４】
尚、本件明細書中、「モナティン」との用語は、（２Ｓ、４Ｓ）体に限定することなく、４種の立体異性の総称として使用する。従って、「モナティン」と称する場合、特定の異性体に限定して使用した場合を除いて、（２Ｓ、４Ｓ）体、（２Ｓ、４Ｒ）体、（２Ｒ、４Ｓ）体及び（２Ｒ、４Ｒ）体モナティンの少なくとも１種を意味する。
【０００５】
モナティンの合成法は、過去に９例の報告が為されている。
（１）オーガニック  レターズ（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）２０００年２巻１９号２９６７〜２９７０頁記載の方法。［非特許文献１］
（２）米国特許第５９９４５５９号記載の方法。［特許文献１］
（３）シンセティック  コミュニケーション（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）１９９４年２４巻２２号３１９７〜３２１１頁記載の方法。［非特許文献２］
（４）シンセティック  コミュニケーション（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）１９９３年２３巻１８号２５１１〜２５２６頁記載の方法。［非特許文献３］
（５）テトラヘドロン  レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）２００１年４２巻３９号６７９３〜６７９６頁記載の方法。［非特許文献４］
（６）特開２００２−０６０３８２号公報記載の方法。［特許文献２］
（７）特開２００４−３３１６５０号公報記載の方法。［特許文献３］
（８）ＷＯ２００４／０６７４９４記載の手法。［特許文献４］
（９）ＷＯ２００３／０５９８６５記載の方法。［特許文献５］
【０００６】
特にＷＯ２００３／０５９８６５記載の手法は、光学活性モナティンをピルビン酸及びインドール−３−ピルビン酸より短工程で製造できるため、工業的に非常に優れた方法である［特許文献５］。
【０００７】
しかし、製造中間体である４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸が4位ラセミ体として得られるために当該中間体を光学分割しなければならず、結果として不要な４位鏡像体をリサイクルする必要があった。そのため、更なる改善が求められていた。
【０００８】
改善例として、酵素（アルドラーゼ）を利用した不斉交差アルドール反応が報告されている。例えばＷＯ２００３／０５６０２６記載の方法である。これらの酵素的手法によれば、ピルビン酸とインドール−３−ピルビン酸より低収率ながら４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸を高い光学純度で合成できる［特許文献６］。
【０００９】
現在までに、α−ケト酸エステルをドナー及びアクセプターとして用いた不斉交差アルドール反応において、鏡像体選択性の発現に成功した例が３例報告されている。即ち、下記文献記載の手法である。
（１）オーガニック  アンド  バイオモレキュラーケミストリー（Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２００４年２巻１０７７〜１０８５頁記載の手法。［非特許文献５］
（２）ケミカル  コミュニケーションズ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）２０００年２２１１〜２２１２頁記載の手法。［非特許文献６］
（３）オーガニック  レターズ（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）２００５年７巻２１号４６５７〜４６６０頁記載の手法。［非特許文献７］
【００１０】
しかしながら、上記記載文献（１）〜（３）の公知文献は何れもα−ケト酸エステルをドナーとして用いたものであり、フリーのα−ケト酸であるピルビン酸をドナーとするモナティンの製造には応用出来ない。特に、文献（２）及び（３）記載の手法は、ピルビン酸エチルの２量化のみ言及されており、モナティンの製造における異なるピルビン酸をドナー及びアクセプターとして用いる不斉交差アルドール反応について何ら触れられていない。文献（１）には、異なるピルビン酸エステルを用いた不斉交差アルドール反応が記載されている。しかし、トリフルオロピルビン酸エチルという活性水素が存在しないα−ケト酸エステルをアクセプターとして用いているため、活性水素を有するインドール−３−ピルビン酸をアクセプターとして用いるモナティンの製造には応用できない。
【００１１】
このように、モナティン製造に必要とされるピルビン酸及びインドール−３−ピルビン酸をそれぞれドナー及びアクセプターとして識別可能な不斉触媒に関しては全く報告が無く、現在の技術水準からしても困難であった。これは、何れの原料もカルボニルのα位に活性水素を有するため、何れもドナー乃至はアクセプターとして働きうるために反応位置の制御が難しいためである。この困難性は当業者間で容易に理解される事項である。
【００１２】
ピルビン酸とインドール−３−ピルビン酸との交差アルドール反応において４位鏡像体を選択的に製造する方法が切に求められていた。
【特許文献１】米国特許第５９９４５５９号
【特許文献２】特開２００２−０６０３８２号公報
【特許文献３】特開２００４−３３１６５０号公報
【特許文献４】ＷＯ２００４／０６７４９４
【特許文献５】ＷＯ２００３／０５９８６５
【特許文献６】ＷＯ２００３／０５６０２６
【非特許文献１】オーガニック  レターズ（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）２０００年２巻１９号２９６７〜２９７０頁
【非特許文献２】シンセティック  コミュニケーション（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）１９９４年２４巻２２号３１９７〜３２１１頁
【非特許文献３】シンセティック  コミュニケーション（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）１９９３年２３巻１８号２５１１〜２５２６頁
【非特許文献４】テトラヘドロン  レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）２００１年４２巻３９号６７９３〜６７９６頁
【非特許文献５】オーガニック  アンド  バイオモレキュラーケミストリー（Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２００４年２巻１０７７〜１０８５頁
【非特許文献６】ケミカル  コミュニケーションズ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）２０００年２２１１〜２２１２頁
【非特許文献７】オーガニック  レターズ（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）２００５年７巻２１号４６５７〜４６６０頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明が解決しようとする課題はピルビン酸とインドール−３−ピルビン酸との交差アルドール反応において４位鏡像体を選択的に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等はピルビン酸とインドール−３−ピルビン酸との交差アルドール反応を行う際、２級アミン含有光学活性α−アミノ酸と金属イオンを共存させることにより上記課題が解決することを見出し、発明を完成させた。
【００１５】
即ち、本発明は下記態様を含む。
〔１〕下記式（１）で表されるピルビン酸と下記式（２）で表されるインドール−３−ピルビン酸とを、２級アミン含有光学活性α−アミノ酸、および金属イオンの共存下にて反応させる工程を含有することを特徴とする、下記一般式（３）で表される光学活性化合物（塩の形態も含む）の製造方法。
【００１６】
【化２】
2008214345.tif 000003
【００１７】
【化３】
2008214345.tif 000004
【００１８】
【化４】
2008214345.tif 000005
（但し、式（３）中における＊は不斉炭素を示す。）
【００１９】
〔２〕〔１〕記載の製造方法で得られた光学活性化合物、に更に下記一般式（４）で示されるアミン誘導体またはその塩を作用させる工程を含有することを特徴とする、下記一般式（５）で表される光学活性化合物（塩の形態も含む）の製造方法。
【００２０】
【化５】
2008214345.tif 000006
【００２１】
【化６】
2008214345.tif 000007
（但し、式（５）中における＊は不斉炭素を示し、Ｒは水素原子若しくはメチル基を示す。）
【００２２】
〔３〕２級アミン含有光学活性α−アミノ酸が、ヒドロキシプロリン、およびプロリンから選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、〔１〕記載の光学活性化合物（塩の形態も含む）の製造方法。
【００２３】
〔４〕２級アミン含有光学活性α−アミノ酸が、下記一般式（６）で表されることを特徴とする、〔１〕記載の光学活性化合物（塩の形態も含む）の製造方法。
【００２４】
【化７】
2008214345.tif 000008
（但し、Ｒ１は炭素数１〜３のアルキル基を示し、Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基、または炭素数７〜１０のアラルキル基を示し、当該アルキル基乃至はアラルキル基は少なくとも１つの水酸基又はアミノ基で置換されていても良い。）
【００２５】
〔５〕金属イオンが、マグネシウム（II）イオン、亜鉛（II）イオン、コバルト（II）乃至は（III）イオン、ニッケル（II）イオンから選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、〔１〕記載の光学活性化合物（塩の形態も含む）の製造方法。
【００２６】
〔６〕反応中、反応溶液のｐＨが７〜１２であることを特徴とする、〔１〕記載の光学活性化合物（塩の形態も含む）の製造方法。
【００２７】
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の光学活性化合物（塩の形態も含む）の製造方法を含有するモナティンまたはその塩の製造方法。
【００２８】
〔８〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の製造方法で得られた光学活性化合物に対して、更にトランスアミナーゼとアミノ供与体とを作用させる工程を含有することを特徴とする、モナティンまたはその塩の製造方法。
【発明の効果】
【００２９】
本発明は、効率的な不斉交差アルドール反応の新手法を提供するものである。甘味料として知られる光学活性モナティン他、光学活性化合物の調製に応用が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００３１】
本発明によれば、下記式（１）で表されるピルビン酸（塩の形態を含む）と下記式（２）で表されるインドール−３−ピルビン酸（塩の形態を含む）を、2級アミン含有光学活性α−アミノ酸及び金属イオン共存下にて反応させることで、下記式（３）で表される４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸の４位に不斉が誘起される。
【００３２】
【化８】
2008214345.tif 000009
【００３３】
【化９】
2008214345.tif 000010
【００３４】
【化１０】
2008214345.tif 000011
（但し、式（３）中における＊は４位不斉炭素を示す。）
【００３５】
本発明の反応に用いられる２級アミン含有光学活性α−アミノ酸としては、カルボン酸と２級アミノ基を有している、光学活性のαアミノ酸であれば良い。鎖状でも環状でも、塩の状態でもフリーの状態でも、また、光学活性としては、Ｌ体でもＤ体でも、場合によってはＬ体あるいはＤ体が過剰なものを用いても構わない。具体的には、Ｎ−モノアルキルアラニン、Ｎ−モノアルキルセリン、Ｎ−モノアルキルグルタミン酸、Ｎ−モノアルキルアスパラギン酸、Ｎ−モノアルキルスレオニン、Ｎ―モノアルキルリジン、Ｎ、Ｓ−ジアルキルシステイン（環状化合物を含む）等で代表されるＮ−モノアルキルアミノ酸（アルキル基は炭素数１〜３）又は、プロリン、ヒドロキシプロリン、ピペコリン酸等が挙げられ、入手容易ながら、鏡像体選択性が高いという観点で、下記一般式（６）の構造が好ましく、２級アミノ基含有環状光学活性α−アミノ酸がより好ましく、プロリン又はヒドロキシプロリンが更に好ましい。
【００３６】
【化１１】
2008214345.tif 000012
（但し、Ｒ１は炭素数１〜３のアルキル基を示し、Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基、または炭素数７〜１０のアラルキル基を示し、当該アルキル基乃至はアラルキル基は少なくとも１つの水酸基又はアミノ基で置換されていても良い。）
【００３７】
本発明の反応に用いられる金属イオンとしては、２級アミン含有光学活性α−アミノ酸と良好な錯体を形成し、且つ当該錯体が反応液に溶解する限りにおいて特に制限は無い。具体的には、マグネシウム（II）イオン、アルミニウム（III）イオン、ホウ素イオン、亜鉛（II）イオン、銅（I）または（II）イオン、ニッケル（II）イオン、コバルト（II）または（III）イオン、鉄（II）または（III）イオン、マンガン（II）または（III）イオン、パラジウム（I）または（II）イオン、プラチナ（IV）イオン等が挙げられ、入手容易で期待され不斉誘起効果が高いという観点からアルミニウム（III）イオン、ホウ素イオン、マグネシウム（II）イオン、亜鉛（II）イオン、コバルト（II）または（III）イオン、ニッケル（II）イオン、パラジウム（I）または（II）イオン、プラチナ（IV）イオンが好ましく、マグネシウム（II）イオン、亜鉛（II）イオン、コバルト（II）または（III）イオン、ニッケル（II）イオン、プラチナ（IV）イオン、パラジウム（I）または（II）イオンがより好ましく、マグネシウム（II）イオン、亜鉛（II）イオン、ニッケル（II）イオン、コバルト（II）または（III）イオン、が更に好ましく、亜鉛（II）イオン、ニッケル（II）イオンが特に好ましい。
【００３８】
本発明の反応に用いられる金属イオンに対する2級アミン含有光学活性α−アミノ酸のモル比については、反応が進行しさえすれば特に制限はないが、大きすぎると収率が低下し、また比が小さすぎると鏡像体選択性が低下するので、好ましくは１−１０倍モルであり更に好ましくは２−８倍モルである。
【００３９】
インドール−３−ピルビン酸に対するピルビン酸の使用量は反応が進行しさえすれば特に制限は無いが、反応が良好な収率で完結しうるという観点で、好ましくは０．５〜１０倍モルであり、更に好ましくは１〜５倍モルである。
【００４０】
インドール−３−ピルビン酸に対する２級アミン含有光学活性α−アミノ酸のモル比について反応が進行しさえすれば特に制限はないが、大きすぎると経済上好ましくなく、また小さすぎると収率および鏡像体選択性が低下するので、好ましくは０．０１〜２倍モルであり、更に好ましくは０．０５〜０．５倍モルである。
【００４１】
反応溶剤は反応が進行しさえすれば特に制限はないが、好ましくは、水、メタノール、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒又はそれらの混合物を挙げることができる。
【００４２】
反応溶媒中のインドール−３−ピルビン酸の濃度は、反応が進行しさえすれば特に制限はないが、余りにも高濃度であると操作性が悪化し、また低濃度であると経済上好ましくないので、好ましくは０．０１〜２．０ｍｏｌ／Ｌであり、更に好ましくは０．０５〜１．５ｍｏｌ／Ｌである。
【００４３】
特に、溶剤として水または含水有機溶剤を用いた場合の溶液のｐＨは、反応が進行しさえすれば特に制限はないが、余りに高いとアルドール反応が自発的に進行し、また低すぎると生成物の分解反応が進行することから、好ましくは５〜１３であり更に好ましくは７〜１２である。
【００４４】
使用する塩基は反応が進行しさえすれば制限は無いが、無機塩基乃至は有機アミン化合物が好適に用いられる。経済上の理由から、更に好ましくは水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、トリエチルアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、アンモニア等である。
【００４５】
反応温度としては、反応が進行しさえすれば特に限定されるものではないが、好ましくは−４０℃〜１００℃、より好ましくは−２０〜５０℃を採用することができる。
【００４６】
本発明の形態の１つとして、本発明により得られるアルドール反応液は４位に不斉の誘起された４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸を含有する。公知文献ＷＯ２００３／０５９８６５記載の〔実施例２〕によれば、当該化合物はそのままの形で単離精製することも可能である。その場合、反応で使用された塩基の種類または処理・精製工程で使用する塩基の種類によって各種塩の形態をとりうる。例えば、アンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等が経済的見地から好ましいが、これらに本発明は限定されない。
【００４７】
本発明の形態の一つとして、本発明により得られる４位に不斉の誘起された４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸を含むアルドール反応液に対し、トランスアミナーゼと適当なアミノ供与体（Ｌ―またはＤ−アラニン、トリプトファン等）を作用させることで、直接モナティンへと酵素的に変換することも可能である。この際、酵素は本発明の交差アルドール反応の初期段階で加えてもよく、このような実施形態も当然本発明に含まれる。
【００４８】
上記トランスアミナーゼとしては、アミノ供与体のアミノ基を４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸に転移することができるものであれば特に限定されない。前述のトランスアミナーゼは、当該酵素を生産する微生物を培養することによっても調製することができる。このような微生物としては、例えばバチルス(Bacillus)属、パエニバチルス(Paenibacillus)属に属する微生物を挙げることができる。
【００４９】
これらの微生物として、具体的には、次のものが例として挙げられる。Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ生産菌としては下記の例を挙げることができる。
・バチルス  スフェリカス  Bacillus sphaericus ＡＴＣＣ１０２０８
・バチルス  プルビファシエンス  Bacillus pulvifaciens ＡＪ１３２７
・パエニバチルス  ラバエ  サブスピシーズ  プルビファシエンス  Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens ＡＴＣＣ １３５３７
・バチルス  マセランス  Bacillus macerans ＡＪ１６１７
・パエニバチルス  マセランス  Paenibacillus macerans ＡＴＣＣ ８２４４
・バチルス  レンタス  Bacillus lentus ＡＪ１２６９９
・バチルス  レンタス  Bacillus lentus ＡＴＣＣ １０８４０
【００５０】
この中で、本発明において用いることの出来るトランスアミナーゼの１例として、バチルス・マセランス由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ（配列番号２）を挙げることができる。なお、上記バチルス・マセランス由来のＤ−アミノトランスフェラーゼおよびその変異体酵素については、本願出願人による国際出願ＷＯ２００４／０５３１２５号公報に詳細に記載されており、その内容は引用により本願に組み込まれるものとする。簡単に説明すると、配列番号２に示したアミノ酸配列を有するタンパク質は、バチルス  マセランス(Bacillus macerans)ＡＪ１６１７由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列である。バチルス  マセランス  ＡＪ１６１７については、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に、平成１３年１２月１３日付けで寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４３である（尚、本菌株は、平成１３年１２月１３日に寄託されたＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５３より平成１４年１１月２２日に国際寄託へ移管された）。配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１８２番目のアラニンがセリンへ、かつ２４３番目のセリンがアスパラギンへ置換された変異体酵素（Ｓ２４３Ｎ／Ａ１８２Ｓ）は、基質である４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸の４位Ｒ体に対する立体選択性が高いためさらに好ましい。
【００５１】
本発明に用いられるアミノ供与体としては、トランスアミナーゼによるアミノ交換反応においてアミノ基を供与しうる能力を有するアミノ基含有化合物でありさえすれば、特に制限はなく、微生物または単離された酵素毎に簡単な予備試験により判定されうる。この場合、アミノ酸が使用されることが多い。アミノ酸は、天然由来、非天然由来のいずれでも使用することができ、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸のいずれでも使用することができる。また、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、ＤＬ−アミノ酸のいずれでも使用することができる。具体的には、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、バリン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、オルニチン、セリン、システイン、ヒスチジン、リジン等のα−アミノ酸が好ましく、甘味倍率の高い（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを製造しうるという観点で、Ｄ−アミノ酸がより好ましい。これらは１種または２種以上を混合使用しても構わない。
【００５２】
また、アミノ供与体としてのＤ−アミノ酸は、対応するＬ−アミノ酸及び／又はＤＬ−アミノ酸と対応するラセミ化酵素とを併用することにより代用することが可能である。この目的に使用されるラセミ化酵素としては、アラニンラセマーゼ、グルタミン酸ラセマーゼ、アスパラギン酸ラセマーゼ、フェニルアラニンラセマーゼ等のラセマーゼを使用することができる。具体的には、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、或いは前記Ｌ−アミノ酸のラセミ混合物をモナティンの生成中に反応溶液に添加することができる。
【００５３】
アミノ化の後にアルドール反応の原料であるピルビン酸及びインドール−３−ピルビン酸が再生されるという観点で、アラニン、トリプトファンが好ましく、アラニンがより好ましい。甘味倍率の高い（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを製造しうるという観点で、Ｄ−アラニン、Ｄ−トリプトファンが好ましく、Ｄ−アラニンが更に好ましく、高価なＤ体を使用しないで安価原料からｉｎ−ｓｉｔｕにアミノ供与体を供給できるという観点で、Ｌ−アラニン及び／又はＤＬ−アラニンとアラニンラセマーゼの併用が特に好ましい。
【００５４】
本発明の一つの好ましい様態において、前記トランスアミナーゼをコードする遺伝子を微生物細胞中に組み込むこともできる。尚、組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。組み込まれる遺伝子としては、Ｌ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子やＤ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子が挙げられる。一例を挙げると、Bacillus sphaericusやBacillus maceransからのＤ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子が微生物に導入され得る。
【００５５】
Bacillus sphaericus由来Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子については、欧州特許出願公開０７３６６０４、及び、Taylor et al.、ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（Journal of Bacteriol.）、１９９８年、１８０巻、１６号、４３１９頁に報告がある。また、Bacillus macerans由来Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子としては、配列表配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを用いることができる。配列表配列番号１に記載のＤ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子ＤＮＡを用いた場合、配列表配列番号２に記載のＤ−アミノ酸トランスアミナーゼが得られる。Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子の由来はこれに限定されるものではなく、目的とするＤ−グルタミン酸誘導体を生成するようなＤ−アミノ酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子であればよい。
【００５６】
組み換えＤＮＡ技術を用いてタンパク質を大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができる。このうち、組換えＤＮＡ操作について知見のある微生物としてはBacillus、Pseudonomas、Brevibacterium、Corynebacterium、Streptomyces、及びEscherichia coli等が挙げられる。一般には、大腸菌を用いてタンパク質を大量生産する技術について数多くの知見があるため、大腸菌、好ましくはEshelichia coliが用いられる。
【００５７】
これら微生物へは、目的とするトランスアミナーゼ遺伝子を塔載したプラスミド、ファージ等のベクターを用いて導入してもよいし、相同組換えによって該細胞の染色体上に目的遺伝子を組み込んでもよい。好ましくは、いわゆるマルチコピー型のプラスミドベクターが挙げられ、例えばEscherichia coliへのベクターとしてはＣｏｌ Ｅ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミド、或いはその誘導体が挙げられる。これらベクターには目的とするトランスアミナーゼ遺伝子を発現させるプロモーターとして、通常大腸菌においてタンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター等の強力なプロモーターが挙げられる。また、生産量を増大させるためには、タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。また、形質転換体を選別するために、該ベクターはアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましく、このようなプラスミドとして、例えば、ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）等のように強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている。
【００５８】
アミノ化反応に使用する酵素を産生する微生物の培養方法としては、通常この分野において用いられる培地、即ち炭素源、窒素源、無機塩類、微量金属塩類、ビタミン類等を含む培地を用いて行うことができる。また、微生物の種類或いは培養条件によっては、培地中に０.１〜１.０ｇ／ｄｌ程度のアミノ酸等のアミノ化合物を添加することによって、アミノ基転移反応活性を促進することもできる。
【００５９】
遺伝子組換え細胞を培養する場合は、ベクターの選択マーカーに対応してアンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール等の薬剤を適宜添加することもできる。また、ベクターに塔載されているプロモーターに合わせて、誘導剤を適量添加することによって該組換え遺伝子の発現量を上げることもできる。一例を挙げると、ｌａｃプロモーターの下流に目的とする遺伝子を連結してベクターを構築した場合は、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲で適宜添加することも可能であり、また、この代りとしてガラクトースを終濃度０.１〜５ｇ／ｄｌ望ましくは０.５ｇ／ｄｌ〜２ｇ／ｄｌ適宜添加することもできる。
上記培地成分として用いる具体的物質として、例えば、炭素源としては、利用する微生物が利用可能であれば制限は無く、例えばグルコース、シュークロース、フルクトース、グリセロール、酢酸等、又はこれらの混合物を使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物等、或いはこれらの混合物を使用することができる。具体的な培地組成として、例えばフマル酸  ０.５ｇ／ｄｌ、酵母エキス  １ｇ／ｄｌ、ペプトン  １ｇ／ｄｌ、硫安  ０．３ｇ／ｄｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．３ｇ／ｄｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１ｇ／ｄｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／ｄｌ、及びＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／ｄｌ（ｐＨ７．０）を含む培地等が挙げられる。
【００６０】
培養温度は、通常、利用する微生物が生育する範囲内、即ち１０〜４５℃で行われるが、好ましくは２０℃〜４０℃、更に好ましくは２５〜３７℃の範囲である。また、培地のｐＨ値については、好ましくは２〜１２、より好ましくは３〜１０、更に好ましくは４〜８の範囲で調節される。通気条件については、利用する微生物の生育に適した条件に設定されるが、好気条件が好ましい。培養時間については、通常１２〜１２０時間、好ましくは２４〜９６時間程度である。
【００６１】
アミノ化反応において、「酵素の存在下で」とは本発明におけるケト酸誘導体をグルタミン酸誘導体に変換できる限りはいかなる形態で酵素を反応系に存在させてもよく、例えば、酵素を単体で反応系に添加してもよいし、当該酵素活性を有する微生物（酵素産生菌、組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞）、該微生物の培養物（液体培養、固体培養等）、培地（培養物から菌体を除去したもの）、該培養物の処理物を反応系に添加してもよい。微生物の培養物を用いる場合は、微生物を培養させながら同時にアミノ化反応を進行させてもよいし、予め酵素を得るために培養された培養物を用いてアミノ化反応を行っても良い。また、ここでの「処理」とは、菌体内の酵素を取り出すことを目的として行う処理を意味し、例えば超音波、ガラスビーズ、フレンチプレス、凍結乾燥処理や溶菌酵素、有機溶剤、界面活性剤等による処理等が挙げられる。また、これ等の処理を行った処理物を、定法（液体クロマトグラフィーや硫安分画等）によって調製した粗分画酵素や精製酵素であって、必要とする能力を有するものであれば、これを用いてもよい。
【００６２】
更に、上記培養物或いはその処理物の利用の際、これ等をカラギーナンゲルやポリアクリルアミドに包括、或いはポリエーテルスルホンや再生セルロース等の膜に固定化して使用することも可能である。
【００６３】
反応系に、反応促進物質として、補酵素、界面活性剤、有機溶剤等を含有させてもよい。例えば、基質となる置換α−ケト酸の菌体内への透過性を高めるために、トライトン  Ｘ（Triton X）やトゥイーン（Tween）等の界面活性剤やトルエン、キシレン等の有機溶媒を利用することもできる。また、ピリドキサール−５−リン酸等の補酵素類を上記培地に添加してもよい。
【００６４】
また、酵素を生産させるための培養とアミノ化反応を分割して順次行わせる場合は、後者のアミノ化反応の工程では必ずしも好気的雰囲気下で反応を行う必要はなく、むしろ嫌気的雰囲気下で、更には窒素ガス置換、アルゴンガス置換、亜硫酸ソーダ添加等によって反応液中の溶存酸素を除いた系で反応を行わせることも可能である。反応温度については、通常、利用する酵素が活性を有する範囲内、即ち好ましくは１０〜５０℃で行われるが、より好ましくは２０〜４０℃、更に好ましくは２５〜３７℃の範囲で行われる。反応溶液のｐＨ値については、通常、２〜１２、好ましくは６〜１１、更に好ましくは７〜９の範囲で調節される。反応時間については、通常１〜１２０時間程度、好ましくは１〜７２時間程度、更に好ましくは１〜２４時間程度が選択される。
【００６５】
また、本発明において４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸を生成するアルドール縮合反応とトランスアミナーゼによってモナティンへの変換する反応は、同時に行ってよいし、順に分けて実施しても良い。
【００６６】
本発明の一つの形態として、下記式（３）で表される４位に不斉の誘起された４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸を含有するアルドール反応液に対し、下記一般式（４）で示されるアミン誘導体乃至はその塩を作用させることより、下記式（５）で示される４位に不斉の誘起された４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸乃至はその塩として導くことができ、更には単離することも出来る。
【００６７】
【化１２】
2008214345.tif 000013
（但し、式（３）中における＊は４位不斉炭素を示す。）
【００６８】
【化１３】
2008214345.tif 000014
【００６９】
【化１４】
2008214345.tif 000015
（但し、式（５）中における＊は４位不斉炭素を示す。）
【００７０】
本発明におけるアミン誘導体は、一般式（４）の構造を有する。
【００７１】
【化１５】
2008214345.tif 000016
【００７２】
一般式（４）中の置換基Ｒとしては、モナティンへと変換される際に還元条件下にて除去されるため、反応が進行しさえすれば特に制限はなく、商業的に入手容易なことから、例えば水素原子、メチル、エチル、ベンジル基等が挙げられる。系外除去が容易で経済的という観点で、水素原子乃至はメチル基が好適である。
【００７３】
インドール−３−ピルビン酸に対するアミン誘導体のモル比については、反応が進行しさえすれば特に制限はないが、大きいと経済上好ましくなく、また少ないと反応が完結しないので、好ましくは１〜１０倍モルであり、更に好ましくは２〜５倍モルである。
【００７４】
本発明によって得られる４位に不斉の誘起された４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸とアミン誘導体とを反応させる方法は、前者を単離して、別途前者で使用しうる反応溶媒中にアミン誘導体を反応させても良いし、前者を含むアルドール反応液に直接投入しても良いが、４位に不斉の誘起された４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸の分解が最小限に抑制されるという観点で、前者を含むアルドール反応液に直接投入する方法が、簡便かつ工業的に望ましい。
【００７５】
アミン誘導体を作用させる際の反応液のｐＨは、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸が安定に存在するｐＨ領域で行う必要があり、好ましくは４〜１３であり、更に好ましくは７〜１０である。
【００７６】
アミン誘導体を加える際、ｐＨが７〜１０のアミン誘導体の溶液を予め調製しておき、そのものを４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸を含む溶液に加えても良いし、アミン誘導体を加えた後に、直ちにｐＨ調整しても構わない。急激なｐＨ変動を防止でき、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸の分解抑制と収率向上を期待できるという観点で、ｐＨが７〜１０のアミン誘導体の溶液を予め調製しておき、そのものを４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸を含む溶液に加える方法が好ましい。
【００７７】
得られた４位に不斉の誘起された４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸は、各種塩の形態として単離することができる。例えば、アンモニウム塩、Ｒ−（＋）−又はＳ−（−）−１−フェネチルアミン等のキラルアミン、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等が経済的見地から好ましいが、これらに本発明は限定されない。これは更に一般的な再結晶法により光学純度を高めることが可能である。例えば公知文献ＷＯ２００３／０５９８６５記載〔実施例２０〕、〔実施例２３〕のように、Ｒ−（＋）−又はＳ−（−）−１−フェネチルアミンとの塩として再結晶することで、効率的に光学純度を高めることが出来る。
【００７８】
再結晶に使用される溶媒は特に制限はないが、アンモニア水、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、ペンタン、ヘキサン、ジエチルエーテル、トルエン等、またはこれらの２種以上の混合溶媒が挙げられる。好ましくは、アンモニア水、水、メタノール、エタノール、プロパノール、またはこれらの２種以上の混合溶媒であり、更に好ましくは水、アンモニア水、エタノール、またはこれらの２種以上の混合溶媒である。
【００７９】
得られた光学的に純粋な４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸は、公知文献ＷＯ２００３／０５９８６５記載〔実施例８〕に従い接触水素添加反応に供することでモナティンに変換することができる。
【００８０】
本発明の方法を実施又は経由して得られるモナティン及びその類縁体については、各立体異性体（光学異性体）の形で得られる場合もあり、また、光学的に複数の混合物の形で得られる。光学的に混合物の形で得られてもそのまま甘味成分として使用することもできるし、既知の光学分割法により更に光学純度を高めたり、精製を行うこともできる。このように更に精製されて得られるモナティンまたはその塩やその類縁体についても、本発明の方法を経由して製造される限り、本発明方法により製造された物に該当する。
【００８１】
本発明の方法により、式（１）のピルビン酸と式（２）のインドール−３−ピルビン酸とを、２級アミン含有光学活性α−アミノ酸、および金属イオンの存在下にて反応させることにより得られる式（３）の光学活性化合物は、好ましくは少なくとも１０％の鏡像体過剰率を有し、より好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも４０％、さらになお好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも９０％以上の鏡像体過剰率を有する。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は当該実施例に何等限定されるものではない。
【００８３】
以下、反応溶液から分析試料調製方法（１〜３）、収率決定方法（４〜５）、鏡像体過剰率決定方法（６）を順次説明する。
【００８４】
〔分析試料調製方法〕
１）４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸を含むアルドール反応液に過剰量（インドール−３−ピルビン酸仕込みモル数の約４倍モル）のヒドキシアミンを加え、溶液のｐＨ値が７．０〜１０．０になるように２規定水酸化ナトリウム水溶液または１規定塩酸を加えて調節した。
２）室温にて終夜撹拌することで４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸に変換した。
３）得られた反応液の一部をメスフラスコに計り取り、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の濃度が１００〜１５０ｐｐｍになるように反応液を純水で希釈し、分析用サンプルを調製した。
【００８５】
〔収率決定方法〕
４）上記３）の分析用サンプルを下記高速液体クロマトグラフィー条件にかけ、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の標品溶液との面積百分率比較により生成量を計算し、使用したインドール−３−ピルビン酸に対する収率（％）を算出した。
【００８６】
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件（グラジエント）＞
カラム；ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８（ＭＧII）５μｍ  ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ
カラム温度；２５℃
検出波長；２１０ｎｍ
流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ
移動液組成；
Ａ液  ＫＨ２ＰＯ４（２０ｍＭ）＋Ｋ２ＨＰＯ４（２０ｍＭ）水溶液／アセトニトリル
＝１００／５
Ｂ液  ＫＨ２ＰＯ４（２０ｍＭ）＋Ｋ２ＨＰＯ４（２０ｍＭ）水溶液／アセトニトリル
＝１／１
サンプル注入量；１０μＬ
保持時間；１１分（４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸）
【００８７】
〔鏡像体過剰率決定方法〕
５）上記３）の分析用サンプルを、下記の高速液体クロマトグラフィー条件にかけ、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の４位鏡像体に由来するピーク積分値を基に、下記手法により４位鏡像体選択性および４位鏡像体過剰率（％ｅｅ）を下式により求めた。
【００８８】
４位鏡像体過剰率＝（４Ｓ体ピーク面積−４Ｒ体ピーク面積）／（４Ｓ体ピーク面積＋４Ｒ体ピーク面積）＊１００
（符号＋の場合は％ｅｅ４Ｓとし、符合−の場合は％ｅｅ４Ｒとする）  
【００８９】
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件（グラジエント）＞
カラム；ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ７１００  ４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ
カラム温度；１０℃
検出波長；２１０ｎｍ
流速；０．５ｍｌ／ｍｉｎ
移動液組成；
Ａ液  ＫＨ２ＰＯ４（２０ｍＭ）＋Ｋ２ＨＰＯ４（２０ｍＭ）水溶液／アセトニトリル
＝１００／５
Ｂ液  ＫＨ２ＰＯ４（２０ｍＭ）＋Ｋ２ＨＰＯ４（２０ｍＭ）水溶液／アセトニトリル
＝１／１
注入量；１０μL
保持時間；４Ｒ体  １９分、４Ｓ体  ２１分
【００９０】
以下に示す方法により錯体溶液を調製し、アルドール反応をそれぞれのｐＨで行い、反応液中の４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の含有量を基に、収率、鏡像体選択性および鏡像体過剰率決定を行った。
【００９１】
〔調製例１〕錯体水溶液の調製
酢酸亜鉛０．３６ｇ（２．０ミリモル）とトランス−Ｌ−ヒドロキシプロリン１．０７ｇ（８．２ミリモル）を水２５ミリリットルに溶解し、２規定水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを８．３に調節することで、トランス−Ｌ−ヒドロキシプロリン／亜鉛（ＩＩ）錯体水溶液を調製した。
【００９２】
〔調製例２〜１５〕
調製例１と同様にして、表１に示す金属塩と各種光学活性２級アミン含有アミノ酸を用いて、錯体水溶液を調製した。結果を表１に示した。
【００９３】
【表１】
2008214345.tif 000017
【００９４】
〔実施例１〕不斉交差アルドール反応
アルゴン気流下にて、インドール−３−ピルビン酸０．２１ｇを水５．０ｍｌにけん濁した後に、２規定水酸化ナトリウム水溶液を加えて溶解し、溶液のｐＨを１２に調節した。続いて、１規定塩酸を加えて水溶液のｐＨを７〜１０に調製した後に、ピルビン酸ナトリウム（０．３４ｇ）および、調製例１の溶液１．０ｍｌを加えた。ここで再度溶液のｐＨをｐＨメーターを用いて確認し、必要に応じて２規定水酸化ナトリウム水溶液または１規定塩酸を加え、所定のｐＨに調整した。室温にて５時間撹拌した後に、反応液中の４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の収率及び鏡像体過剰率を決定した。
【００９５】
〔実施例２〜１２及び比較例１〜６〕
実施例１と同様にして、表２に示す反応ｐＨ、錯体溶液、反応時間により、得られた反応液中の４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の収率及び鏡像体過剰率を決定した。結果を表２に示した。
【００９６】
【表２】
2008214345.tif 000018
【００９７】
亜鉛錯体を用いた場合には、４Ｒ体が選択的に生成していることが分かった（実施例１〜３、５）。一方、ニッケル錯体を用いた場合には、４Ｓ体の選択性が高いことが分かった（実施例４、６〜１２）。また、２級アミン含有光学活性α―アミノ酸と金属塩との関係は、１：１程度では鏡像体選択性は乏しく、２：１、３：１、４：１と徐々に鏡像体選択性改善が見られ、１０：１の大過剰にもなると収率阻害の傾向も見受けられた（実施例６〜１１）。２級アミン含有光学活性α―アミノ酸は、プロリンやトランス−Ｌ−ヒドロキシプロリンのように環状を形成している方が、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニンに代表される直鎖状のものに較べて、鏡像体選択性が高い傾向が見られた（実施例４、９、１２）。１級アミン含有光学活性α−アミノ酸の場合には、いずれも鏡像体選択性が発現せず、収率も非常に低かった（比較例１〜３）。同様に、金属イオンと良好な錯体を形成することで知られるＬ−酒石酸を用いた場合にも、鏡像体選択性は発現しなかった（比較例４）。以上、比較例１〜４より、鏡像体選択性の発現のみならず反応の進行においても、２級アミンが分子の構造として必須なことが理解される。更に、比較例５〜６より、ニッケル（II）イオンのみ、またはＬ−プロリンのみでは鏡像体選択性は発現しないことから、金属イオンと２級アミン含有光学活性アミノ酸の両者が反応液中に共存することが、鏡像体選択性の発現に必須であることが理解される。
【００９８】
〔実施例１３〕溶媒効果
溶媒として水の代わりにメタノール５ｍｌを使用する以外は、〔実施例２〕と同様に実験を行った。反応液を分析したところ、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸は１９％（鏡像体過剰率１９％：選択性４−Ｒ体）であった。これにより溶媒としては、メタノールよりも水の方が収率および鏡像率過剰率のいずれも良好であることが分かった（実施例２、１３）。
【００９９】
〔実施例１４〕塩基の検討
アルゴン気流下にて、インドール−３−ピルビン酸１．００ｇを水１５．０ｍｌにけん濁した後に、モルホリンを１．７２ｍｌ（インドール−３−ピルビン酸に対し４倍モル）加えた。続いて、ピルビン酸１．０３ｍｌおよび、調製例１の溶液６．０ｍｌを加えた。ここでの反応液ｐＨは７．１であった。室温にて５時間撹拌した後に、反応液中の４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の収率及び鏡像体過剰率を決定した。
【０１００】
〔実施例１５及び比較例７〕
実施例１４と同様にして、表３に示す反応ｐＨ、塩基、錯体溶液、反応時間により、得られた反応液中の４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の収率及び鏡像体過剰率を決定した。結果を表３に示した。
【０１０１】
【表３】
2008214345.tif 000019
【０１０２】
塩基として水酸化ナトリウムの代わりにモルホリン又はピロリジンを用いると、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の収率は同等であったものの４位鏡像体選択性は低下することが判明した。また、比較例７において錯体溶液を加えなかった場合、目的の反応は全く進行しなかったことから、錯体溶液が反応の進行に必須であることが分かった。
【０１０３】
〔実施例１６〕アミン誘導体による晶析精製
上記〔実施例２〕を２４倍にスケールアップして、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸を含有するアルドール反応液を調製した。得られたアルドール反応液に１２規定塩酸を加えてｐＨを１．２に調節し、酢酸エチルで２回（１００ミリリットルｘ２）抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、硫酸マグネシウムを濾別後に、エバポレーターを用いて濃縮して残渣を得た。２８％アンモニア水を２０ミリリットル加えた後に、エタノール２００ミリリットルを加え、５℃にて３日間保存した。析出した結晶を濾別後に減圧下で乾燥し、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸ジアンモニウム塩を２．２グラム（純度８８％、収率２３％）。鏡像体選択性は４４％ｅｅであり、選択性は４Ｒ体であった。
【０１０４】
（NMRスペクトル）
1HNMR (DMSO-d6) d : 2.66 (s, 2H) , 2.89 (d, J= 14.4 Hz, 1H), 3.04 (d, J= 14.4 Hz, 1H) , 6.89‐6.94 (m, 1H), 6.97‐7.03 (m, 1H), 7.11 (d, J= 2.8Hz, 1H) , 7.27 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 7.53 (d, J= 7.8Hz, 1H), 10.71(br s, 1H)。
（質量分析）
ESI-MS  計算値 C14H14N2O6 = 306.28, 分析値 305.17 (MH-)。
【０１０５】
〔実施例１７〕モナティンへの酵素的変換
酢酸亜鉛０．３６ｇ（２．０ミリモル）とトランス−Ｌ−ヒドロキシプロリン１．０７ｇ（８．２ミリモル）を水２０ミリリットルに溶解し、２規定水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを８．３に調節することで、トランス−Ｌ−ヒドロキシプロリン／亜鉛（ＩＩ）錯体水溶液を調製した。
【０１０６】
インドール−３−ピルビン酸５．０ｇを水１００ｍｌに懸濁した後に、２規定水酸化ナトリウム水溶液を加えて溶解し、溶液のｐＨを１２に調節した。続いて、１規定塩酸を加えて水溶液のｐＨを９に調整した後に、ピルビン酸ナトリウム（８．１２ｇ）および、前述のトランス−Ｌ−ヒドロキシプロリン／亜鉛（ＩＩ）錯体水溶液２２ｍｌを加え、ｐＨ８．６に調整した。室温にて４時間撹拌し、交差アルドール反応を行った。得られたアルドール反応液２５ｍｌに対して、Ｄ−Ａｌａ（１．８ｇ）およびピリドキサール−５’−リン酸（１ｍｇ）を添加した後に、ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉあるいはＳ２４３Ｎ／Ａ１８２Ｓ変異型ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉをそれぞれ０．５ｇ懸濁し、３３℃で２４時間振とうさせてアミノ化反応を実施した。反応液中を適宜希釈してＨＰＬＣ分析に供したところ、表４に示す通り、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンあるいは（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンの生成が確認された。なお、上記アミノ化反応に用いたＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ２４３Ｎ／Ａ１８２Ｓ変異型ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉは、以下の参考例１に記載の方法により調製した。
【０１０７】
【表４】
2008214345.tif 000020
ＩＰＡ：インドール−３−ピルビン酸
【０１０８】
〔参考例１〕Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７株由来Ｄ−ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＢＭＤＡＴ）発現Ｅ．ｃｏｌｉの調製
（１）ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉの調製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７株由来ｄａｔ遺伝子（ｂｍｄａｔ遺伝子）をｐＵＣ１８のｌａｃプロモーター下流に連結した発現プラスミドｐＵＣＢＭＤＡＴは、 国際公開ＷＯ２００４／０５３１２５パンフレット（国際公開日２００３年１２月９日）記載の方法に従って構築した。
【０１０９】
すなわち、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７株の染色体ＤＮＡ３０μｇに制限酵素ＥｃｏＲＩを１Ｕ添加し、３７℃にて３時間反応させて部分消化した。次にこのＤＮＡからアガロースゲル電気泳動にて３〜６ｋｂｐの断片を回収し、プラスミド ｐＵＣ１８ｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ切断物（ＢＡＰ処理済み・タカラバイオ）１μｇにライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性を指標として目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＵＣＢＭＤＡＴとした。尚、ｂｍｄａｔ遺伝子のＯＲＦは約８５０ｂｐであり、配列番号１記載の塩基配列のうち塩基番号６３０番から１４８１番に対応する。
【０１１０】
ｐＵＣＢＭＤＡＴを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌ  アンピシリン、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む５０ｍｌのカザミノ酸培地（０．５ｇ／ｄｌ  硫酸アンモニウム、０．１４ｇ／ｄｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．２３ｇ／ｄｌ  クエン酸・２Ｎａ・３Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ｄｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｍｇ／ｄｌ  ＦｅＳＯ４、２ｍｇ／ｄｌ  ＭｎＳＯ４、２ｍｇ／ｄｌ  塩酸ピリドキシン、０．１ｍｇ／ｄｌ  ｔｈｉａｍｉｎｅ、１ｇ／ｄｌ  カザミノ酸、０．３ｇ／ｄｌ  グリセロール、ｐＨ７．５）に接種し、３７℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液より集菌、洗浄し、ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを調製した。
【０１１１】
（２）変異型ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉの調製
Ｓ２４３Ｎ／Ａ１８２Ｓ部位特異的変異（Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）による変異型ＢＭＤＡＴ発現プラスミドを、前記（１）で得たプラスミドｐＵＣＢＭＤＡＴから、 国際公開ＷＯ２００４／０５３１２５号パンフレット記載の方法に従い、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用して作製した。
【０１１２】
すなわち、変異導入用に以下のオリゴＤＮＡプライマーＳ２４３Ｎ−Ｓ（配列番号３）およびＳ２４３Ｎ−ＡＳ（配列番号４）、ならびにＡ１８２Ｓ−Ｓ（配列番号５）およびＡ１８２Ｓ−ＡＳ（配列番号６）を設計し合成した。
Ｓ２４３Ｎ−Ｓ（配列番号３）： gaaatcattg tgtcgtctgt aaattctgag gttacgccag
Ｓ２４３Ｎ−ＡＳ（配列番号４） ctggcgtaac ctcagaattt acagacgaca caatgatttc
Ａ１８２Ｓ−Ｓ（配列番号５） gtgacagaat gctcttcatc taatgtttac ggaattaaag
Ａ１８２Ｓ−ＡＳ（配列番号６） ctttaattcc gtaaacatta gatgaagagc attctgtcac
【０１１３】
まず、Ｓ２４３Ｎの変異を導入した。すなわち、該キットの方法に従い、上記（１）にて採取した野生型ＢＭＤＡＴ発現プラスミドｐＵＣＢＭＡＤＴを鋳型として、プライマーＳ２４３Ｎ−Ｓ，Ｓ２４３Ｎ−ＡＳを用いて、以下の条件で変異型ＢＭＤＡＴ発現プラスミドを増幅し、プラスミドｐＳ２４３Ｎを得た。
９５℃  ３０秒
５５℃  １分
６８℃  ８分×１８サイクル
【０１１４】
続いて、Ａ１８２Ｓの変異を導入した。すなわち、上記ｐＳ２４３Ｎを鋳型としかつプライマーＡ１８２Ｓ−ＳおよびＡ１８２Ｓ−ＡＳを用いたほかは、上記Ｓ２４３Ｎの導入と同様の処理を行った。このようにして作成したプラスミドｐＳ２４３Ｎ／Ａ１８２Ｓを（１）と同様の方法でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、Ｓ２４３Ｎ／Ａ１８２Ｓ変異型ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを調製した。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明の交差アルドール反応の鏡像体選択性を発現させる製造方法により、甘味料として知られるモナティンの重要中間体を効率良く工業的に製造できるようになったことは、極めて意義深い。
【配列表】
2008214345000001.app