(57)【要約】【課題】いくつかの種類の癌を同時に検出することができ、また、早期の癌を検出することのできる腫瘍マーカーを提供する。【解決手段】本発明者は、抗ｈｎＲＮＰ抗体と抗メチル化アミノ酸残基に結合する抗体とを用い、癌患者の血液中のメチル化ｈｎＲＮＰ群を分析したところ、メチル化ｈｎＲＮＰ群が大腸癌患者の血液中においても増加していることを見出した。更に、大腸癌以外の癌である肺癌及び乳癌の患者の血液中においても、健常人と比較してメチル化ｈｎＲＮＰ群が増加していることがわかった。このことより、メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を用いるメチル化ｈｎＲＮＰの免疫学的分析方法により、大腸癌、肺癌及び乳癌などの癌を検出することが可能であり、進行癌や末期癌の患者だけでなく、症状が見られないステージＩの早期癌の患者の血液中でも高い比率で癌を検出することが可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を用いることを特徴とする、被検試料中のメチル化ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインの免疫学的分析方法。
【請求項２】
前記メチル化アミノ酸残基が、メチル化アルギニン又はメチルリジンである請求項１に記載の免疫学的分析方法。
【請求項３】
前記メチル化ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインが、ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテイン２つ以上を含む複合体を形成している、請求項１又は２に記載の免疫学的分析方法。
【請求項４】
ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインに結合する抗体を、更に用いる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫学的分析方法。
【請求項５】
前記ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインに結合する抗体が、Ｃｏｌｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｈｎＲＮＰ  Ｃ−ｌｉｋｅ  １、ｈｎＲＮＰ  Ｈ、ｈｎＲＮＰ  Ｈ‘、ｈｎＲＮＰ  Ｈ３、ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰ  Ｄ０、ｈｎＲＮＰ  Ｆ、ｈｎＲＮＰ  Ｇ、ｈｎＲＮＰ  Ｋ、ｈｎＲＮＰ  Ｌ、ｈｎＲＮＰ  Ｍ、ｈｎＲＮＰ  Ｑ、ｈｎＲＮＰ  Ｒ、ｈｎＲＮＰ  Ｕ、ｈｎＲＮＰ  Ｅ１、ｈｎＲＮＰ  Ｅ２、ｈｎＲＮＰ  Ｉ、ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒａｌｙ、ｈｎＲＮＰ  Ａ０、ｈｎＲＮＰ  Ａ１、ｈｎＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１、ｈｎＲＮＰ  Ａ３、ｈｎＲＮＰ  Ａ／Ｂ、及びｈｎＲＮＰ  ＪＫＴＢＰからなる群から選択されるヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインに結合する少なくとも１つの抗体である、請求項４に記載の免疫学的分析方法。
【請求項６】
前記ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインに結合する抗体が、ｈｎＲＮＰ  Ｋに結合する抗体である、請求項４に記載の免疫学的分析方法。
【請求項７】
前記被検試料が、血液由来の試料である、請求項１〜６のいずれか一項に記載免疫学的分析方法。
【請求項８】
メチルリジンを含むヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテイン。
【請求項９】
前記ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインが、ｈｎＲＮＰ  Ａ１、ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰ  Ｆ、ｈｎＲＮＰ  Ｈ、又はｈｎＲＮＰ  Ｋである、請求項８に記載のヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテイン。
【請求項１０】
被検試料中のメチル化ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインを免疫学的に分析することを特徴とする、癌を検出する方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫学的分析方法により、被検試料中のメチル化ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインを免疫学的に分析することを特徴とする、癌を検出する方法。
【請求項１２】
前記癌が、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病、又は脳腫瘍である、請求項１０又は１１に記載の癌を検出する方法。
【請求項１３】
ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインに結合する抗体と、メチルリジンに結合する抗体を含む、癌の診断試薬。
【請求項１４】
ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインに結合する抗体と、アシンメトリックジメチルアルギニンに結合する抗体を含む、癌の診断試薬。
【請求項１５】
ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインに結合する抗体と、メチルリジンに結合する抗体を含む、癌の診断キット。
【請求項１６】
ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインに結合する抗体と、アシンメトリックジメチルアルギニンに結合する抗体を含む、癌の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチル化ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインの免疫学的分析方法及び免疫学的分析試薬、並びに癌を検出する方法に関する。本発明は、癌の早期発見及び治療後のモニタリングに有用である。
【背景技術】
【０００２】
医療技術の進歩にもかかわらず、癌は依然として世界レベルでの主要な死亡原因となっている。多くの癌は、その進行度によってステージＩ、ステージII、ステージIII及びステージIVの４つの病期（ステージ）に分けられている。これらのうち、ステージＩやステージIIの比較的早期の癌は、一般に小さく、転移も少ない。そのため、治療、例えば、外科的切除、放射線治療、又は化学治療等によって長期治癒を得ることが可能である。しかしながら、早期癌は基本的には無症状であり、早期癌を発見するためには、無症状の被験者を対象とする健康診断や人間ドックなどにおいて、癌を発見する必要がある。このような無症状の多くの被験者を対象とする検査は、スクリーニング検査と呼ばれているが、一般に検査対象の数が極端に多い。そのため、多くの検査対象者を検査するために、検査法は簡便で、かつ経済的でなければならない。また、一回の検査でいくつかの種類の癌、例えば、胃癌、肝癌、膵癌、大腸癌、肺癌などを発見できるような検査であることが望ましい。現在、癌を発見するために使用されている腫瘍マーカー（癌マーカー）検査は、患者への侵襲が少なく好適な検査法であるが、比較的ステージの進んだ進行癌、末期癌での検出率が高く、現時点では、腫瘍マーカーの測定により早期の癌を検出することは困難だと考えられている。また、特定の癌を特異的に検出する腫瘍マーカーが多く、いくつかの腫瘍マーカーを組合わせて用いる必要がある。
【０００３】
腫瘍マーカーの候補として、多くのタンパク質やペプチドが報告されている。例えば、ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテイン（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ：以下、ｈｎＲＮＰと称する）も、その一つである。ｈｎＲＮＰは、ｍＲＮＡ前駆体のプロセッシングにかかわっていると言われている分子群で、ｈｎＲＮＰファミリーには、１０以上の分子（例えば、Ｃｏｌｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｈｎＲＮＰ  Ｃ−ｌｉｋｅ  １、ｈｎＲＮＰ  Ｈ、ｈｎＲＮＰ  Ｈ‘、ｈｎＲＮＰ  Ｈ３、ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰ  Ｄ０、ｈｎＲＮＰ  Ｆ、ｈｎＲＮＰ  Ｇ、ｈｎＲＮＰ  Ｋ、ｈｎＲＮＰ  Ｌ、ｈｎＲＮＰ  Ｍ、ｈｎＲＮＰ  Ｑ、ｈｎＲＮＰ  Ｒ、ｈｎＲＮＰ  Ｕ、ｈｎＲＮＰ  Ｅ１、ｈｎＲＮＰ  Ｅ２、ｈｎＲＮＰ  Ｉ、ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒａｌｙ、ｈｎＲＮＰ  Ａ０、ｈｎＲＮＰ  Ａ１、ｈｎＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１、ｈｎＲＮＰ  Ａ３、ｈｎＲＮＰ  Ａ／Ｂ、ｈｎＲＮＰ  ＪＫＴＢＰ）が含まれ、細胞内では、複数のｈｎＲＮＰ分子を含むｈｎＲＮＰ複合体を形成していると考えられている。核内でＤＮＡから転写されたヘテロ核ＲＮＡは、ｈｎＲＮＰ複合体に結合し、その後にスプライシングが起こり、ｍＲＮＡが形成された後に、核外に輸送される。核外への輸送にも特定のｈｎＲＮＰがかかわっており（非特許文献１）、また、ｈｎＲＮＰは核内及び細胞質内にのみ存在するわけではなく、培養細胞の細胞膜画分には、ｈｎＲＮＰ類のうち、ｈｎＲＮＰ  Ａ１、Ａ２／Ｂ１、Ａ３、Ｃ１が存在することが報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
前記のｈｎＲＮＰ群のうち、痰中のｈｎＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１は初期肺癌の良いマーカーとなるという報告がある（非特許文献３）。また、肺癌組織中のｈｎＲＮＰ  Ｂ１の発現が亢進しているという報告（非特許文献４）、及び大腸癌においてｈｎＲＮＰ  Ｋの発現が亢進しているという報告もある（非特許文献５）。また、血中のｈｎＲＮＰ  Ｂ１  ｍＲＮＡが肺癌のマーカーとなるという報告がなされている（非特許文献６）。しかしながら、これらの報告は、いずれも組織レベルのｈｎＲＮＰ発現及びｍＲＮＡの検出についての報告であり、健康診断等において組織におけるｈｎＲＮＰの発現やｍＲＮＡの発現を検査することは、現実的ではなく、一般的な腫瘍マーカーとして使用することのできるものではなかった。
【０００５】
【非特許文献１】「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（米国）、２００１年、第２１巻、ｐ．７３０７−
【非特許文献２】「バイオケミカル・ファーマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」（米国）、２００４年、第６７巻、ｐ．６５５−
【非特許文献３】「クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｃｈ）」（米国）、１９９７年、第３巻、ｐ．２２３７−
【非特許文献４】「キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｃｈ）」（米国  ）、１９９９年、第５９巻、ｐ．１４０４−
【非特許文献５】「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）」（英国）、２００６年、第９５巻、ｐ．９２１−
【非特許文献６】「ラング・キャンサー（Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ）」（米国）２００５年、第４８巻、ｐ．７７−
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、いくつかの種類の癌を同時に検出することができ、また、早期の癌を検出することのできる腫瘍マーカーについて鋭意研究したところ、同一人のヒト大腸癌組織サンプルと正常組織サンプルとにおけるタンパク質メチル化レベル（リジンメチル化、及びアルギニンメチル化）を比較することにより、癌部において、特定の分子のリジンメチル化及び全体的なアルギニンメチル化が亢進していることを見出した。つまり、癌化に伴いタンパク質のメチル化の亢進が特定のタンパク質で起こり、そのようなメチル化タンパク質の検出が、癌のマーカーとなる可能性が考えられた。また、前記大腸癌組織と正常組織の比較において、癌組織においてアルギニンをメチル化するプロテイン・アルギニン・メチルトランスフェラーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：以下、ＰＲＭＴと称する）の１つであるＰＲＭＴ１の発現がタンパク質レベルで亢進していることを見出した。
本発明者らは、更に、大腸癌組織においてメチル化されているタンパク質について鋭意研究を進めたところ、抗ｈｎＲＮＰ抗体を用いてその複合体を免疫沈降し、抗メチルリジン（Ｍｅｔｈｙｌｌｙｓｉｎｅ：以下、ＭｅＫと称することがある）抗体、又は抗メチルアルギニン（ｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ：以下、ＭｅＲと称することがある）抗体でウェスタンブロッティングを行うことにより、複数のｈｎＲＮＰが細胞内で分子複合体として存在しており、ＭｅＲ化されたタンパク質及びＭｅＫ化された複数のタンパク質がｈｎＲＮＰであることを見出した。
また、本発明者は、抗ｈｎＲＮＰ抗体と抗ＭｅＫ抗体、又は抗ｈｎＲＮＰ抗体と抗ＭｅＲ抗体とを用い、癌患者の血液中のメチル化ｈｎＲＮＰ類を分析したところ、メチル化ｈｎＲＮＰ類が大腸癌患者の血液中においても増加していることを見出した。更に、驚くべきことに、大腸癌以外の癌である肺癌及び乳癌の患者の血液中においても、健常人と比較してメチル化ｈｎＲＮＰ類が増加していることがわかった。また、メチル化ｈｎＲＮＰは、進行癌や末期癌の患者だけでなく、症状が見られないステージＩの早期癌の患者の血液中でも高い比率で検出されることがわかった。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明は、メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を用いることを特徴とする、被検試料中のメチル化ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインの免疫学的分析方法に関する。
本発明による免疫測定方法の好ましい態様においては、前記メチル化アミノ酸残基が、メチル化アルギニン又はメチルリジンである。
本発明による免疫測定方法の別の好ましい態様においては、前記メチル化ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインが、ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテイン２つ以上を含む複合体を形成している。
本発明による免疫測定方法の別の好ましい態様においては、更に、ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインに結合する抗体を用い、特には、前記ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインに結合する抗体が、Ｃｏｌｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｈｎＲＮＰ  Ｃ−ｌｉｋｅ  １、ｈｎＲＮＰ  Ｈ、ｈｎＲＮＰ  Ｈ‘、ｈｎＲＮＰ  Ｈ３、ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰ  Ｄ０、ｈｎＲＮＰ  Ｆ、ｈｎＲＮＰ  Ｇ、ｈｎＲＮＰ  Ｋ、ｈｎＲＮＰ  Ｌ、ｈｎＲＮＰ  Ｍ、ｈｎＲＮＰ  Ｑ、ｈｎＲＮＰ  Ｒ、ｈｎＲＮＰ  Ｕ、ｈｎＲＮＰ  Ｅ１、ｈｎＲＮＰ  Ｅ２、ｈｎＲＮＰ  Ｉ、ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒａｌｙ、ｈｎＲＮＰ  Ａ０、ｈｎＲＮＰ  Ａ１、ｈｎＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１、ｈｎＲＮＰ  Ａ３、ｈｎＲＮＰ  Ａ／Ｂ、及びｈｎＲＮＰ  ＪＫＴＢＰからなる群から選択されるヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインに結合する少なくとも１つの抗体である。
本発明による免疫測定方法の好ましい態様においては、前記被検試料が、血液由来の試料である。
【０００８】
また本発明は、メチルリジンを含むヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインにも関する。
本発明によるメチルリジンを含むヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインの好ましい態様においては、前記ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインが、ｈｎＲＮＰ  Ａ１、ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰ  Ｆ、ｈｎＲＮＰ  Ｈ、又はｈｎＲＮＰ  Ｋである。
【０００９】
また本発明は、被検試料中のメチル化ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインを免疫学的に分析することを特徴とする、癌を検出する方法にも関する。
本発明による癌を検出する方法の好ましい態様においては、前記癌が、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病、又は脳腫瘍である。
【００１０】
また本発明は、ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインに結合する抗体と、メチルリジンに結合する抗体を含む、癌の診断試薬、又はヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインに結合する抗体と、アシンメトリックジメチルアルギニンに結合する抗体を含む、癌の診断試薬にも関する。
また本発明は、ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインに結合する抗体と、メチルリジンに結合する抗体を含む、癌の診断キット、又はヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインに結合する抗体と、アシンメトリックジメチルアルギニンに結合する抗体を含む、癌の診断キットにも関する。
なお、本明細書における「分析」には、分析対象化合物の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象化合物の存在量を決定する「定量」との両方が含まれる。
また本明細書において、「ｈｎＲＮＰ」は、特に断らない限り、不特定の１種のｈｎＲＮＰを意味し、「ｈｎＲＮＰ類」は不特定の複数のｈｎＲＮＰを意味する。そして、特定のｈｎＲＮＰについては、例えば、「ｈｎＲＮＰ  Ｋ」と示す。また、「ｈｎＲＮＰファミリー」は、ｈｎＲＮＰに分類される全てのｈｎＲＮＰを含むことを意味し、「ｈｎＲＮＰ複合体」は、複数のｈｎＲＮＰが結合した複合体を意味する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、組織や血液中のメチル化ｈｎＲＮＰ類を分析することにより、癌を検出することが可能である。また、早期癌の患者の血清においても、メチル化ｈｎＲＮＰ類を検出することが可能であり、癌の早期発見が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の分析方法によって分析することのできるｈｎＲＮＰ類のメチル化されているアミノ酸残基は、アルギニン及び／又はリジンである。すなわち、メチル化ｈｎＲＮＰ類は、メチル化アルギニン及び／又はメチル化リジンを含む。メチル化ｈｎＲＮＰ類としては、例えば、メチル化されたＣｏｌｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｈｎＲＮＰ  Ｃ−ｌｉｋｅ  １、ｈｎＲＮＰ  Ｈ、ｈｎＲＮＰ  Ｈ‘、ｈｎＲＮＰ  Ｈ３、ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰ  Ｄ０、ｈｎＲＮＰ  Ｆ、ｈｎＲＮＰ  Ｇ、ｈｎＲＮＰ  Ｋ、ｈｎＲＮＰ  Ｌ、ｈｎＲＮＰ  Ｍ、ｈｎＲＮＰ  Ｑ、ｈｎＲＮＰ  Ｒ、ｈｎＲＮＰ  Ｕ、ｈｎＲＮＰ  Ｅ１、ｈｎＲＮＰ  Ｅ２、ｈｎＲＮＰ  Ｉ、ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒａｌｙ、ｈｎＲＮＰ  Ａ０、ｈｎＲＮＰ  Ａ１、ｈｎＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１、ｈｎＲＮＰ  Ａ３、ｈｎＲＮＰ  Ａ／Ｂ、又はｈｎＲＮＰ  ＪＫＴＢＰを挙げることができ、好ましくは、ｈｎＲＮＰ  Ａ１、ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰ  Ｆ、ｈｎＲＮＰ  Ｈ、ｈｎＲＮＰ  Ｋ、又はｈｎＲＮＰ  Ｍである。
【００１３】
前記のように、タンパク質に含まれるアミノ酸残基のうち、メチル化されるアミノ酸残基としては、アルギニン又はリジンが知られている。タンパク質のメチル化は一群のメチルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素により担われており、アルギニン残基をメチル化する酵素として、８種類のタンパク質アルギニンメチル化酵素（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；以下、ＰＲＭＴと称することがある）が報告されている。中でも幅広い分子量に亘ってアルギニンメチル化を起こす酵素として、ＰＲＭＴ１が知られており、この分子の基質としていくつかのｈｎＲＮＰ類が報告されている。しかしながら、ｈｎＲＮＰ類のアルギニンメチル化の生理学的な意義、又は疾患との関係は明らかではなかった。
【００１４】
本発明者は、大腸癌患者の癌組織と正常組織とにおいて、ＰＲＭＴ１の発現（タンパク質）を調べたところ、癌組織においてＰＲＭＴ１の発現が亢進していることを見出した。また、大腸癌細胞株、肺腺癌細胞株、肺扁平上皮癌細胞株、乳癌細胞株、肝癌細胞株、神経芽細胞種細胞株、横紋筋肉種細胞株、などの癌細胞株において、８種類のＰＲＭＴのｍＲＮＡの発現を調べたところ、多くの細胞で何種類かのＰＲＭＴのｍＲＮＡの発現が亢進していることを見出した。従って、被検試料中のＰＲＭＴを分析することによって、癌を検出することが可能である。好ましくは、ＰＲＭＴ１を分析することによって癌を検出することが可能である。
【００１５】
一方、ｈｎＲＮＰファミリーにおいては、リジン残基のメチル化は報告されておらず、リジン残基をメチル化するメチルトランスフェラーゼについての報告もなされていなかった。本発明者は、ｈｎＲＮＰ類に含まれるリジン残基がメチル化されていることを見出し、特に、癌患者においてメチル化されたｈｎＲＮＰ類が増加していることがわかった。後述する抗ｈｎＲＮＰ抗体又はメチルリジンに結合する抗体を用いることにより、細胞や組織、特には癌細胞や癌組織からメチルリジンを含むｈｎＲＮＰを分離及び精製することが可能である。本発明のメチルリジンを含むｈｎＲＮＰ類には、前記メチル化ｈｎＲＮＰが含まれるが、好ましくは、メチルリジンを含むｈｎＲＮＰ  Ａ１、ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰ  Ｆ、ｈｎＲＮＰ  Ｈ、ｈｎＲＮＰ  Ｋ、又はｈｎＲＮＰ  Ｍである。
【００１６】
本発明の分析方法によって分析されるメチル化ｈｎＲＮＰ類は、少なくとも１つ以上のメチル化アミノ酸残基を含む。メチル化アミノ酸残基は、前記のメチル化リジン又はメチル化アルギニンである。
【００１７】
メチル化リジン（ＭｅＫ）には、モノメチルリジン、ジメチルリジン及びトリメチルリジンが含まれる。モノメチルリジンは、一般式（１）：
【化１】
2008164517.tif 000002
で表され、リジンの側鎖のアミノ基の水素原子１つがメチル基で置換されたリジンである。ジメチルリジンは、一般式（２）：
【化２】
2008164517.tif 000003
で表され、リジンの側鎖のアミノ基の水素原子の２つがメチル基で置換されたリジンである。トリメチルリジンは、一般式（３）：
【化３】
2008164517.tif 000004
で表され、リジンの側鎖のアミノ基の水素原子の２つがメチル基で置換され、更にもう一つのメチル基が窒素原子に付加した構造を有するリジンである。
【００１８】
リジンメチル化ｈｎＲＮＰに含まれるメチル化リジンは、特に限定されず、前記モノメチルリジン、ジメチルリジン、又はトリメチルリジンのうちのいずれか１つ以上であればよく、２種類以上のメチル化リジンを含んでいてもよい。また、メチル化ｈｎＲＮＰ類におけるメチル化リジンの位置及び数は、特に限定されない。すなわち、メチル化ｈｎＲＮＰ類において、１つ以上のリジンがメチル化されていればよく、従って、メチル化ｈｎＲＮＰ類は、メチル化されていないリジンを含むことができる。
【００１９】
メチル化アルギニン（ＭｅＲ）には、アシンメトリックジメチルアルギニン（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ：以下、ＡＤＭＡと称することがある）、シンメトリックジメチルアルギニン（以下、ＳＤＭＡと称することがある）、モノメチルアルギニン（以下、ＭＭＡと称することがある）が含まれる。ＡＤＭＡとは、一般式（４）：
【化４】
2008164517.tif 000005
で表される、アルギニンの側鎖のアミノ基の水素原子２つが、メチル基で置換されたアルギニンである。本発明の抗体が反応しない、ＳＤＭＡとは、一般式（５）：
【化５】
2008164517.tif 000006
で表されるアルギニンの側鎖のアミノ基の水素原子及びイミノ基の水素原子がメチル基に置換されたアルギニンである。ＭＭＡとは、一般式（６）：
【化６】
2008164517.tif 000007
で表される、アルギニンの側鎖のアミノ基の水素原子１つがメチル基に置換されたアルギニンである。
【００２０】
アルギニンメチル化ｈｎＲＮＰに含まれるメチル化アルギニンは、特に限定されず、前記アシンメトリックジメチルアルギニン、シンメトリックジメチルアルギニン、モノメチルアルギニンのうちのいずれか１つ以上であればよく、２種類以上のメチル化アルギニンを含んでいてもよい。また、メチル化ｈｎＲＮＰ類におけるメチル化アルギニンの位置及び数は、特に限定されない。すなわち、メチル化ｈｎＲＮＰ類において、１つ以上のアルギニンがメチル化されていればよく、従って、メチル化ｈｎＲＮＰ類は、メチル化されていないアルギニンを含むことができる。
【００２１】
また、本発明の免疫学的分析方法によって、分析できるメチル化ｈｎＲＮＰは、リジンのみがメチル化されているもの、アルギニンのみがメチル化されているもの、又はリジン及びアルギニンがメチル化されているものでもよい。
【００２２】
本発明者は、メチル化リジン及び／又はメチル化アルギニンを含む複数のメチル化ｈｎＲＮＰが、癌細胞中において、複合体を形成していることを見出した。また、癌患者の血液中においても、メチル化リジン又はメチル化アルギニンを含む複数のメチル化ｈｎＲＮＰが、複合体を形成していることを見出した。本発明による免疫学的分析方法によれば、単独のメチル化ｈｎＲＮＰを分析することもできるが、メチル化ｈｎＲＮＰ複合体を分析することも可能である。メチル化ｈｎＲＮＰ複合体は、少なくとも２つ以上の前記メチル化ｈｎＲＮＰを含むが、好ましくはメチル化リジン及び／又はメチル化アルギニンを含むｈｎＲＮＰ  Ａ１、ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰ  Ｆ、ｈｎＲＮＰ  Ｈ、ｈｎＲＮＰ  Ｋ、又はｈｎＲＮＰ  Ｍを含むことができる。
【００２３】
本発明のメチル化ｈｎＲＮＰの免疫学的分析方法によれば、癌を検出することが可能である。本発明の癌を検出する方法は、複数の種類の癌を同時に、そして高感度に検出することができる。癌の種類は、特に限定されることはないが、例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病及び脳腫瘍を挙げることができる。特には、大腸癌、肺癌及び乳癌を高率に検出することができる。多くの癌は、その進行度によって４つの病期（ステージ）ステージＩ、ステージII、ステージIII及びステージIVに分けることができる。ステージＩやステージIIのような早期のステージの癌患者の検体において、多くの腫瘍マーカーは、検出されない。本発明の癌を検出する方法によれば、癌のステージに関係なく、癌を高感度に検出することが可能であり、特に、早期の癌であるステージＩの癌も検出することができる。
【００２４】
本発明方法においては、任意の哺乳動物（特にはヒト）の任意の試料を被検試料として、用いることができる。被検試料としては、例えば、臓器、組織、細胞などの固体の試料の細胞ライセート（Ｌｙｓａｔｅ）、又は体液試料を用いることができる。体液試料としては、血液、血漿、血清などの血液由来の試料、及び尿などを挙げることができ、特には血漿又は血清が好ましい。
【００２５】
本発明者は、後述する実施例に示すとおり、癌患者においては、健常人と比較して、試料中に含まれているメチル化ｈｎＲＮＰの濃度が統計学的に有意に高くなることを見出した。具体的には、抗ｈｎＲＮＰ抗体及び抗ＡＤＭＡ抗体を用いる免疫学的分析法（以下、ＡＤＭＡ−ｈｎＲＮＰ法と称することがある）によって、健常人、大腸癌、肺癌及び乳癌において、それぞれ６、４８、８０、５０％が陽性であり、抗ｈｎＲＮＰ抗体及び抗メチルリジン抗体を用いる免疫学的分析法（以下、ＭｅＫ−ｈｎＲＮＰ法と称することがある）によって、それぞれ６、５７、８０、７８％が陽性であった。これらの値は、従来の腫瘍マーカーよりも高い陽性率を示した。このように、本発明の癌を検出する方法においては、検査対象者から採取した被検試料中に含まれているメチル化ｈｎＲＮＰを分析することによって、癌を検出することができる。メチル化ｈｎＲＮＰの分析は、免疫学的分析方法に基づいて行うことができる。
【００２６】
本発明のメチル化ｈｎＲＮＰの免疫学的分析方法に使用することのできる抗ＭｅＫ抗体は、前記モノメチルリジン、ジメチルリジン又はトリメチルリジンに結合することができ、リジンに結合しない抗体であれば限定されず、モノメチルリジン、ジメチルリジン及びトリメチルリジンのうちの１つに特異的に結合する抗体でもよく、２つ以上に結合する抗体でもよい。例えば、モノメチルリジン及びジメチルリジンに結合することができ、リジンに結合しない抗体として、国際公開第２００５／０５４２９６号パンフレットに記載のモノメチルリジン及びジメチルリジンに結合する抗体を挙げることができる。具体的には、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５９５号であるハイブリドーマＭＥＫ３Ｄ７から産生されるＭＥＫ３Ｄ７抗体、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５９６号であるハイブリドーマＭＥＫ４Ｅ１０から産生されるＭＥＫ４Ｅ１０抗体、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５９７号であるハイブリドーマＭＥＫ５Ｆ７から産生されるＭＥＫ５Ｆ７抗体、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５９３号であるハイブリドーマＭＥＫ２−５Ａ１１から産生されるＭＥＫ５Ａ１１抗体、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５９４号であるハイブリドーマＭＥＫ２−５Ｂ１１から産生されるＭＥＫ２−５Ｂ１１抗体を挙げることができる。
【００２７】
本発明のメチル化ｈｎＲＮＰの免疫学的分析方法に使用することのできる抗ＭｅＲ抗体は、前記ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、又はＭＭＡに結合することができ、アルギニンに結合しない抗体であれば限定されないが、ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、又はＭＭＡのうちの１つに特異的に結合する抗体を用いることもでき、２つ以上に結合することのできる抗体を用いることもできる。例えば、ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、又はＭＭＡのうちの１つに特異的に結合する抗体としては、ＡＤＭＡに結合し、ＳＤＭＡ、ＭＭＡ及びリジンに結合しない抗体が挙げられ、具体的には、特願２００５−３７８９６５に記載の受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４５８号であるハイブリドーマＡＤＭＡ２−２Ｈ５から産生されるモノクローナル抗体を挙げることができる。
【００２８】
本発明のメチル化ｈｎＲＮＰの免疫学的分析方法に使用することのできる抗ｈｎＲＮＰ抗体は、ｈｎＲＮＰ群のいずれかのｈｎＲＮＰに結合することのできる抗体であれば、特に限定されるものではないが、例えば、抗Ｃｏｌｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、抗ｈｎＲＮＰ  Ｃ−ｌｉｋｅ  １抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｈ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｈ‘抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｈ３抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｄ０抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｆ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｇ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｋ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｌ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｍ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｑ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｒ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｕ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｅ１抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｅ２抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｉ抗体、抗ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒａｌｙ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ０抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ１抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ／Ｂ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  ＪＫＴＢＰ抗体、又はこれらの抗体の２種以上の混合物を挙げることができる。また、ｈｎＲＮＰ類は、スプライシングの違いにより異なるタンパク質となるｈｎＲＮＰも含まれ、部分的に同一のアミノ酸配列を有するｈｎＲＮＰが存在する。そのため、２種類以上のｈｎＲＮＰに結合することのできる抗体があり、そのような抗体も、本発明の分析方法に使用することが可能である。好ましくは、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ０抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ１抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｃ１＋Ｃ２抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｆ／Ｈ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｇ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｋ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｍ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｑ抗体、又はこれらの抗体の混合物を使用することができ、より好ましくは、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ１抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｃ１＋Ｃ２抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｆ／Ｈ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｋ抗体、抗ｈｎＲＮＰ  Ｍ、又は抗ｈｎＲＮＰ  Ｑ抗体を使用することができる。
【００２９】
抗体の種類は、特に限定されないが、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、又はそれらの抗体の抗体フラグメントなどを挙げることができるが、好ましくはモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、又はＦｖ等を挙げることができる。これらの抗体フラグメントは、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化し、続いて、常法のタンパク質の分離精製の方法により精製することで、得ることができる。
【００３０】
前記のメチル化アミノ酸残基に結合する抗体を用いる本発明の免疫学的分析方法には、固相酵素免疫測定法（以下、ＥＬＩＳＡ法と称する）などの酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡ法と称する）、放射性免疫測定法（以下、ＲＩＡ法と称する）、蛍光標識免疫測定法（以下、ＦＩＡと称する）、凝集法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノブロット法、又は各種の免疫組織染色法などが含まれる。
【００３１】
本発明の（Ａ）メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を用いる免疫学的分析方法は、
（Ａ−１）メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を被検試料と接触させる工程、及び
（Ａ−２）メチル化ｈｎＲＮＰと前記抗体との免疫複合体を検出する工程
を含む。メチル化アミノ酸残基に結合する抗体は、免疫複合体を検出するために標識抗体であることが好ましい。
【００３２】
前記免疫学的分析方法（Ａ）は、具体的には、被検試料中のメチル化ｈｎＲＮＰを１次元の電気泳動又は２次元の電気泳動により分離し、次にウエスタンブロット法により、工程（Ａ−１）及び工程（Ａ−２）を行うことにより、メチル化ｈｎＲＮＰを分析することが可能である。また、ＦＩＡ法、免疫組織染色法、イムノブロット法などにより、前記工程（Ａ−１）及び工程（Ａ−２）を行うこともできる。
【００３３】
本発明の免疫学的分析方法では、更に、前記抗ｈｎＲＮＰ抗体を用いることができる。（Ｂ）メチル化アミノ酸残基に結合する抗体及び抗ｈｎＲＮＰ抗体を用いる免疫学的分析方法は、
（Ｂ−１）ｈｎＲＮＰに結合する抗体を被検試料と接触させる工程、
（Ｂ−２）メチル化ｈｎＲＮＰ、又はメチル化ｈｎＲＮＰと前記ｈｎＲＮＰに結合する抗体との免疫複合体に、メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を接触させる工程、及び
（Ｂ−３）メチル化ｈｎＲＮＰとメチル化アミノ酸残基に結合する抗体とからなる免疫複合体、又はメチル化ｈｎＲＮＰと前記ｈｎＲＮＰに結合する抗体とメチル化アミノ酸残基に結合する抗体とからなる免疫複合体を検出する工程
を含むことができる。
【００３４】
工程（Ｂ−１）においては、被検試料に含まれているメチル化ｈｎＲＮＰとｈｎＲＮＰに結合する抗体とを結合させる。ｈｎＲＮＰに結合する抗体は、単独の抗ｈｎＲＮＰ抗体を用いてもよいが、複数の抗体を組合わせて使用してもよい。ＥＬＩＳＡ法では、抗ｈｎＲＮＰ抗体を不溶性の担体に固相化して用いることもできる。また、工程（Ｂ−１）を免疫沈降などによって行う場合は、抗ｈｎＲＮＰ抗体は、液相で使用することができる。この工程において、メチル化ｈｎＲＮＰとｈｎＲＮＰに結合する抗体との免疫複合体が形成させる。
【００３５】
工程（Ｂ−２）においては、得られた免疫複合体、又は免疫複合体から分離したメチル化ｈｎＲＮＰとメチル化アミノ酸残基に結合する抗体とを結合させる。具体的には、メチル化ｈｎＲＮＰのメチル化アミノ酸残基に抗体が結合する。それにより、メチル化ｈｎＲＮＰ、ｈｎＲＮＰに結合する抗体及びメチル化アミノ酸残基に結合する抗体からなる免疫複合体、又はメチル化ｈｎＲＮＰとメチル化アミノ酸残基に結合する抗体とからなる免疫複合体が形成される。メチル化アミノ酸残基に結合する抗体は、前記のモノメチルリジン、ジメチルリジン、あるいはトリメチルリジンに結合する抗体、又はＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、又はＭＭＡに結合する抗体を用いることができる。これの抗体は単独で使用してもよいが、何種類かの抗体を組合わせて使用してもよい。この工程において用いる抗体は、工程（Ｂ−３）において、免疫複合体からのシグナルを検出するために標識抗体であることが好ましい。ＥＬＩＳＡ法では、メチル化アミノ酸残基に結合する抗体は、メチル化ｈｎＲＮＰと前記ｈｎＲＮＰに結合する抗体との免疫複合体に液相で反応させることができる。また、工程（Ｂ−２）をウエスタンブロット法などによって行う場合は、ブロット膜などに結合したメチル化ｈｎＲＮＰに、メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を液相で結合させる。
【００３６】
工程（Ｂ−３）においては、メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を含む免疫複合体を、シグナルとして検出する。具体的には、標識されたメチル化アミノ酸残基の酵素などを基質と反応させ、発色又は発光などによって検出する。また、標識物質である蛍光物質やラジオアイソトープなどを直接検出することもできる。
前期工程（Ｂ−１）及び工程（Ｂ−２）は、工程（Ｂ−１）を行い、次に工程（Ｂ−２）行うこともできるが、同時に行うことも可能である。例えば、ＥＬＩＳＡ法では、工程（Ｂ−１）及び工程（Ｂ−２）を同時に行うことにより、メチル化ｈｎＲＮＰ、ｈｎＲＮＰに結合する抗体、及びメチル化アミノ酸残基に結合する抗体からなる免疫複合体が形成される。
【００３７】
更に、工程（Ｂ−１）で使用するｈｎＲＮＰに結合する抗体の代わりにメチル化アミノ酸残基に結合する抗体を用い、工程（Ｂ−２）で使用するメチル化アミノ酸残基に結合する抗体の代わりにｈｎＲＮＰに結合する抗体を用いることもできる。この場合、工程（Ｂ−２）で使用する抗体は、免疫複合体を検出するため、標識抗体であることが好ましい。
【００３８】
前記（Ｂ）の免疫学的分析方法は、具体的には、免疫沈降とウエスタンブロット法を組み合わせて行うことができる。例えば、ｈｎＲＮＰに結合する抗体を被検試料に添加し、ｈｎＲＮＰと抗体の免疫複合体を形成させる。これに、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇなどの結合したゲルなどを添加し、免疫複合体をゲルに結合させる。遠心分離などでゲルを回収し、加熱、界面活性剤、及び／又は高塩濃度による処理などによって免疫複合体を分離させる。得られたｈｎＲＮＰを電気泳動し、ＰＶＤＦ膜などのブロット膜に転写する。ブロット膜を、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）でブロッキングする。その後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素で標識したメチル化アミノ酸残基に結合する抗体を接触させ、メチル化ｈｎＲＮＰに結合させる。ブロット膜を洗浄し、酵素に対する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。
【００３９】
また、前記（Ｂ）の免疫学的分析方法は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を利用して行うこともできる。例えば、まず、マイクロプレートやビーズなどの不溶性担体に、ｈｎＲＮＰに結合する抗体（捕捉抗体、又は一次抗体）を固相化する。次に、捕捉抗体や不溶性担体への非特異的な吸着を防ぐために、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で不溶性担体のブロッキングを行う。捕捉抗体が固相化されたプレートやビーズに、メチル化ｈｎＲＮＰが含まれる被検試料を一次反応液と一緒に加え、捕捉抗体とメチル化ｈｎＲＮＰを接触させ、結合させる（一次反応工程）。この後、捕捉抗体に結合しなかった抗原や夾雑物を適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液）で洗浄する。次に、捕捉されたメチル化ｈｎＲＮＰと結合するメチル化アミノ酸残基に結合する抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素とが結合した標識抗体（２次抗体）を添加し、捕捉された抗原に標識抗体を結合させる（二次反応工程）。この反応により、捕捉抗体−メチル化ｈｎＲＮＰ−標識抗体の免疫複合体がマイクロプレート等の担体上に形成される。結合しなかった標識抗体を洗浄液で洗浄し、標識抗体の酵素に対する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。
【００４０】
本発明のメチル化ｈｎＲＮＰの分析方法において使用する捕捉抗体とは、被検試料中のメチル化ｈｎＲＮＰを捕捉する抗体であるが、前記の不溶性担体を用いたサンドイッチ法では、不溶性担体に固相化される固相抗体である。また、本発明のメチル化ｈｎＲＮＰの分析方法において使用する検出抗体とは、捕捉抗体によって捕捉された被検試料中のメチル化ｈｎＲＮＰを検出する抗体であるが、前記の不溶性担体を用いたサンドイッチ法では、酵素などによって標識された標識抗体である。前記の説明では、抗ｈｎＲＮＰ抗体を捕捉抗体として、メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を検出抗体として用いた場合について説明しているが、メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を捕捉抗体として、抗ｈｎＲＮＰ抗体を検出抗体として用いることも可能である。
【００４１】
抗体を標識する酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼなどを挙げることができる。また酵素以外にも、標識物質として、アクリジニウム誘導体などの発光物質、ユーロピウムなどの蛍光物質、Ｉ１２５などの放射性物質などを使用することができる。また、標識物質に会わせて基質や発光誘導物質を適宜選択することができる。更に、本発明における標識抗体は、検出マーカーとしてハプテンや低分子量のペプチド、レクチンなどの抗原抗体反応のシグナルの検出に利用できる物質を結合させた抗体も含む。ハプテンにはビオチン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、ＦＩＴＣなどが含まれる。例えばビオチンを抗体に結合させ、プローブ複合体を作成した場合、ビオチンに親和性のあるアビジンにＨＲＰなどの酵素、フルオレセインなどの蛍光物質、又はアクリニジウム誘導体などの発光物質を標識し、プローブ複合体と反応させ発色、蛍光、発光などによりシグナルを検出することができる。
【００４２】
本発明の癌の診断用である免疫学的分析用試薬には、前記メチル化アミノ酸残基に結合する抗体及びｈｎＲＮＰに結合する抗体を含むことができる。癌の診断用である免疫学的分析用試薬は、メチル化ｈｎＲＮＰと抗体を接触させる抗原抗体反応時に用いる試薬であれば特に限定されない。例えば、前記の免疫沈降及びウエスタンブロットに用いる試薬でもよく、サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる試薬でもよい。試薬はメチル化アミノ酸残基に結合する抗体及び／又はｈｎＲＮＰに結合する抗体を単独で含んでもよく、両方の抗体を含んでもよい。免疫学的分析用試薬に用いる緩衝液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液又はヘペス緩衝液など、従来公知の緩衝液から適宜選択することができる。また、免疫学的分析用試薬には、その他の成分、例えば、抗原や抗体を安定化させるための、ウシ血清アルブミンなどのキャリアータンパク質、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、また非特異反応を抑えるための界面活性剤などを含有させることもできる。
【００４３】
本発明の癌診断用免疫学的分析キットは、ｈｎＲＮＰに結合する抗体が固相化された不溶性担体（例えば、９６ウェルプレート又はビーズ）、及び前記メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を検出プローブとして含む癌診断用の免疫学的分析試薬を含むことができる。癌診断用の免疫学的分析試薬は溶液の状態で提供されてよいが、凍結乾燥されて粉末状態で提供されてもよい。本発明の癌診断用免疫学的分析キットは、メチル化ｈｎＲＮＰ、及び使用説明書などを含むことができる。
【００４４】
《作用》
多くの癌において、血液中にメチル化アミノ酸残基を含むｈｎＲＮＰ類が増加する理由は、完全に解明されているわけではないが、以下のように推論することができる。しかしながら、本発明は以下の説明によって限定されるものではない。癌組織中の癌細胞においては、ＰＲＭＴ１などのタンパク質アルギニンメチル化酵素、及びｈｎＲＮＰ類のリジン残基をメチル化するメチルトランスフェラーゼの発現が亢進しているものと考えられる。癌細胞においては、これらのメチル化酵素により、ｈｎＲＮＰ類のアルギニン及び／又はリジンがメチル化され、更に、血液中にメチル化されたｈｎＲＮＰが単独で、又はｈｎＲＮＰ複合体として、分泌されているものと考えられる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４６】
《実施例１：大腸癌組織及び正常組織におけるタンパク質メチル化レベルの比較》
（Ａ）大腸癌患者１２人の癌部の組織及び非癌部の組織を分析に用いた。凍結されたサンプルの一部を切除後、重量を測定し、組織重量１ｇ当り４ｍＬのサンプル処理バッファー（９．８Ｍ  Ｕｒｅａ，０．５％ＣＨＡＰＳ，１０ｍＭ  ＤＴＴ）を加えた。バッファー中で、鋏を用いて細かく切り刻んだ後、チップ式の超音波破砕機で組織懸濁液を調製した。組織懸濁液を１００００ｒｐｍで５分遠心後、上清をサンプルとして使用した。得られた上清を、２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，４％ＳＤＳ，１４％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，８０ｍＭ  ＤＴＴ，０．０１％ＢＰＢ）で１：１に希釈し、３７℃で３０分インキュベートした。
（Ｂ）サンプルのタンパク質の分解をチェックするために、１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて、１０μｇのタンパク量を電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗βアクチン抗体（Ａｂｃａｍ社）ａｂ６２７６を反応させた。二次抗体としてはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を反応させ、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ社）を用い、シグナルを検出した。図１に示される様に、いずれの検体もほぼ等しい量のβアクチンを発現していることが確認でき、保存されていた癌組織のタンパク質は劣化していないことがわかった。
（Ｃ）前記工程（Ａ）で調整したサンプルを用いて、タンパク質メチル化レベルの測定を行った。抗βアクチン抗体（Ａｂｃａｍ社）ＡＣ−１５の代わりに、ＨＲＰ標識した抗メチルリジン抗体ＭＥＫ３Ｄ７（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５，４６５３，２００５；特許国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７９５９）、又は抗ＡＤＭＡ抗体ＡＤＭＡ２−２Ｈ５（特願２００５−３７８９６３）を用いたこと、及び二次抗体であるＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体使用しなかったこと以外は、前記工程（Ｂ）の操作を繰り返した。ＨＲＰ標識は、Ｐｉｅｒｃｅ社のＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｐｌｕｓ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを用いて行った。結果を図２（メチルリジン）及び図３（ＡＤＭＡ）に示した。抗メチルリジン抗体を用いてメチル化タンパク質を検出した場合、約４５ｋ、４０ｋ、２５ｋ、２２ｋ、１５ｋ程度の分子量を有するタンパク質を含む複数のタンパク質が、非癌部（Ｎ）よりも癌部（Ｔ）において濃く染まっており、これらのメチル化タンパク質の増加が認められた。一方、抗ＡＤＭＡ抗体を用いてメチル化タンパク質を検出した場合、７０ｋ、４０Ｋ、２２ｋ程度の分子量を有するタンパク質が、特に顕著に検出されたが、基本的には全分子量領域のタンパク質が、非癌部よりも癌部において強く染色され、メチル化が亢進していた。
【００４７】
《実施例２：大腸癌組織及び正常組織におけるタンパク質アルギニンメチル化酵素発現レベルのタンパク質レベルでの比較》
実施例１の工程（Ａ）で得られたサンプルのタンパク質アルギニンメチル化酵素ＰＲＭＴ１の発現レベルを、ウェスタンブロッティングで検出した。抗βアクチン抗体（Ａｂｃａｍ社）ａｂ６２７６の代わりに、抗ＰＲＭＴ１抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ７０２７）を用いた以外は、前記実施例１の工程（Ｂ）の操作を繰り返した。結果を図４に示す。前記実施例１で示された抗ＡＤＭＡ抗体を使用したウェスタンブロッティングにおける、全体的なタンパク質の染色の濃淡とほぼ一致して、ＰＲＭＴ１の発現量が変動していることが分かった。このことは、図３において見られた全体的なタンパク質アルギニンメチル化の亢進が、ＰＲＭＴ１分子の発現亢進により担われている可能性を示唆している。
【００４８】
《実施例３：癌細胞及び正常細胞におけるタンパク質アルギニンメチル化酵素発現レベルのｍＲＮＡレベルでの比較》
タンパク質アルギニンメチル化酵素は、これまで８種類が同定されクローニングされている。これら全てのＰＲＭＴについて、正常細胞及び癌細胞における発現レベルの比較をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて実施した。
ヒト培養癌細胞株として、大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣより入手）、ＲＫＯ（ＡＴＣＣより入手）、肺腺癌細胞ＡＢＣ−１（ＪＣＲＢより入手）、ＬＣ−ＭＳ（ＪＣＲＢより入手）、肺扁平上皮癌細胞Ｈ５２０（ＡＴＣＣより入手）、ＥＢＣ−１（東北大学加齢研より入手）、乳癌細胞ＭＣＦ−７（東北大学加齢研より入手）、Ｔ４７Ｄ（大日本製薬より入手）、肝癌細胞株ＨｅｐＧ２（大日本製薬より入手）、Ｈｕｈ−７（ＪＣＲＢより入手）、神経芽細胞種細胞ＩＭＲ３２（大日本製薬より入手）、及び横紋筋肉種細胞Ａ６７３（大日本製薬より入手）の１２株を用いた。ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ−７は、ＤＭＥＭ培地を用い、それ以外の細胞株は、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて培養した。正常ヒト肝細胞は、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＮＪ，ＵＳＡ）で製造され、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＭＡ，ＵＳＡ）から供給されているものを、株式会社ケー・エー・シー（栗東市、滋賀県）より購入して用いた。本研究で用いた正常ヒト肝細胞は、ＰＣＲ分析についてはＳｅｒｉａｌ  Ｎｏ．ＨＨ−１３４及びＨＨ−１５７の細胞を用い、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析においては、これらに加えＨＨ−１１６、ＨＨ１８４、及びＨＨ−１８９の細胞を使用した。肝細胞からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出は、ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを用いて行った。
各ＰＲＭＴアイソザイムのｍＲＮＡを検出するためのプライマーは、ｗｅｂ上で公開されているＰｒｉｍｅｒ３  ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）を用いて設計した。各アイソザイムのｃＤＮＡ配列は、Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔに登録されている配列情報を用いた。Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｉｚｅを３００−４００に設定、Ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｙをｈｕｍａｎに設定した上で、他はｄｅｆａｕｌｔのままで検索を行った。Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ上で複数情報間の不一致が報告されている時は、その領域を含まないｃＤＮＡ配列を検索に用いた。上記方法により設計したプライマー配列及び予想されるＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｉｚｅは表１に示す通りである。
【００４９】
【表１】
2008164517.tif 000008
【００５０】
ＲＴ−ＰＣＲは、基本的には２００ｎｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡのテンプレートを用いて行った。ランダムプライマーを用い、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをテンプレートとして用い、それぞれのＰＲＭＴのプライマーペアを用いてＰＣＲ反応を実施した。
まず、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２００ｎｇを全量１０μＬのＤＥＰＣ処理水に溶解し、ｒａｎｄｏｍ  ６−ｍｅｒ溶液（５０μＭ）を２μＬ加え、６５℃で１０分インキュベートした後、氷冷した。そこに、ｘ５  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ  １μＬ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  １μＬ、２０ｍＭｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ０．５μＬ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  III  ＲＴａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬ、及びＤＥＰＣ処理水１．５μＬを加え、４３℃で３０分反応させた後、９５℃で５分処理し酵素を失活させた（ＲＴ  ｐｒｏｄｕｃｔ）。
ＰＣＲ反応は、ＲＴ  ｐｒｏｄｕｃｔ１μＬに、ｘ１０ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、２０ｍＭｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２５μＬ、Ｆｏｒｗａｒｄ及びＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（５０μＭ）を各０．４μＬ、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ０．２５μＬ、Ｄ．Ｗ．３３μＬを加え、９４℃−５ｍｉｎ加熱した。その後、９４℃−３０ｓｅｃ、６０℃−３０ｓｅｃ、７２℃−２ｍｉｎのサイクルを３０ｃｙｃｌｅｓ繰り返し、７２℃−７ｍｉｎの温度サイクル条件でＰＣＲを実施した。反応産物は、臭化エチジウム入りの２％アガロースゲルで泳動し、紫外光照射により可視化した。
結果を図５に示した。以下、ＰＲＭＴアイソザイムごとに結果の概略をまとめる。
（ＰＲＭＴ１）ヒト正常肝細胞ＨＨ−１５７で特に発現が低く、次いでＨＨ−１３４で低いが、それ以外の癌細胞株では高発現である。
（ＰＲＭＴ２）ヒト正常肝細胞ＨＨ−１５７では、今回の分析条件ではバンドは認められない。ＨＨ−１３４ではごくわずかに検出される。癌細胞株では基本的には発現しているが、一部の細胞（ＲＫＯ、ＡＢＣ−１、ＨｅｐＧ２、ＨＴ−２９、ＬＣ−ＭＳ）でやや低い発現となっている。癌の種類としては、大腸癌及び肺腺癌で低めである。
（ＰＲＭＴ３）これも基本的にＰＲＭＴ−１と同じパターンを示した。但し、大腸癌及び肺腺癌でやや低値である。
（ＰＲＭＴ４）ＰＲＭＴ３と同じ傾向であるが、ＨＨ−１３４においてもほとんどバンドは検出されない。
（ＰＲＭＴ５）これもＰＲＭＴ１と似たパターンであるが、ＲＫＯ及びＬＣ−ＭＳで低値である。
（ＰＲＭＴ６）乳癌細胞の二つ、神経芽細胞種ＩＭＲ３２、及び骨格筋肉腫Ａ６７３以外は非常に低値である。
（ＰＲＭＴ７）ＰＲＭＴ５とほぼ同じパターンで発現している。すなわち、正常組織及び細胞で非常に低く、それ以外はＨＴ−２９及びＡＢＣ−１で低値である。
（ＰＲＭＴ８）予想されるｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｉｚｅの位置に、全くバンドは見出されなかった。このプライマー以外にも２通りのプライマーを設計して検討したが（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）、やはり全く発現は検出されなかった。
【００５１】
癌細胞におけるタンパク質の全体的なＡＤＭＡ化を担っている可能性がある酵素は、ＰＲＭＴ−１、３、又は４であると考えられ、特に、ＰＲＭＴ１は、今回の実験で示した発現パターンからも、大腸癌組織のタンパク質のアルギニンのメチル化の原因酵素となっている可能性が最も高いと思われる。
【００５２】
《実施例４：抗ｈｎＲＮＰ抗体による細胞ｌｙｓａｔｅからの免疫沈降》
大腸癌組織でメチル化されているタンパク質の探索のために、大腸癌細胞ＲＫＯのタンパク質の解析を行った。
（Ａ）５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１２０ｍＭＮａＣｌ、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０に、ＲｏｃｈｅのＣｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ  ｆｒｅｅを加えた緩衝液を用いて、大腸癌細胞ＲＫＯのｌｙｓａｔｅを調製した。得られた細胞ｌｙｓａｔｅを、タンパク質濃度１．１ｍｇ／ｍＬに調整し、各種抗ｈｎＲＮＰ抗体を用いて免疫沈降した。免疫沈降に用いた抗体は、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ０（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、ｓｃ−１６５０９、ヤギポリクローナル抗体）、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ１（Ａｂｃａｍ社、ａｂ５８３２、マウスモノクローナル抗体）、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１（Ａｂｃａｍ社、ａｂ６１０２、マウスモノクローナル抗体）、抗ｈｎＲＮＰ  Ｃ１＋Ｃ２（Ａｂｃａｍ社、ａｂ１０２９４、マウスモノクローナル抗体）、抗ｈｎＲＮＰ  Ｆ／Ｈ（Ａｂｃａｍ社、ａｂ１０６８９、マウスモノクローナル抗体）、抗ｈｎＲＮＰ  Ｇ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、ｓｃ−１４５８１、ヤギポリクローナル抗体）、抗ｈｎＲＮＰ  Ｋ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、ｓｃ−２８３８０、マウスモノクローナル抗体）、抗ｈｎＲＮＰ  Ｍ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、ｓｃ−２０００２、マウスモノクローナル抗体）、及び抗ｈｎＲＮＰ  Ｑ（Ａｂｃａｍ社、ａｂ１０６８７、マウスモノクローナル抗体）である。更に、ＡＤＭＡ化が知られているｈｎＲＮＰ以外の二種のタンパク質に対する抗体、抗ＰＡＢＰ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、ｓｃ−３２３１８、マウスモノクローナル抗体）、及び抗Ｓａｍ６８（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、ｓｃ−１２３８、マウスモノクローナル抗体）を用いた。ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ５００μＬに、抗体１μｇを添加し、４℃で一晩ローテートした後に、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦを２０μＬ添加し、更に４℃で４時間ローテートした。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０で洗浄後、２ｘ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを加え、５分間ボイルしてサンプルを調製した。
（Ｂ）サンプルとして免疫沈降によって得られたサンプルを用いたこと、及び抗βアクチン抗体（Ａｂｃａｍ社）ａｂ６２７６の代わりに、前記各種抗ｈｎＲＮＰ抗体を用いたこと以外は、前記実施例１の工程（Ｂ）の操作を繰り返した。但し、一次抗体としてヤギで作製されたものを用いた場合は、ＨＲＰ標識された抗ヤギＩｇＧ抗体を二次抗体として用いた。結果を図６−８に示した。抗ｈｎＲＮＰ  Ａ１、抗ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、抗ｈｎＲＮＰ  Ｆ／Ｈ、抗ｈｎＲＮＰ  Ｋ、抗ｈｎＲＮＰ  Ｍ、抗ｈｎＲＮＰ  Ｑ、抗ＰＡＢＰ、及び抗Ｓａｍ６８を用いた場合に、特に、多くのタンパク質が免疫沈降された。
【００５３】
《実施例５：抗ｈｎＲＮＰ抗体による免疫沈降と抗メチルリジン抗体及び抗ＡＤＭＡ抗体による検出》
実施例４の工程（Ａ）で得られたサンプルを、抗メチルリジン抗体及び抗ＡＤＭＡ抗体で検出した。抗ｈｎＲＮＰ抗体の代わりに、抗メチルリジン抗体又は抗ＡＤＭＡ抗体を用いたこと以外は、実施例４の工程（Ｂ）を繰り返した。結果を図９に示した。抗ＡＤＭＡ抗体による検出において、ｈｎＲＮＰ  Ａ１による免疫沈降物中からはほぼｈｎＲＮＰ  Ａ１の分子量に相当する位置にバンドが検出された。また、ＰＡＢＰ、Ｓａｍ６８に対する抗体での免疫沈降物においても、基本的には、それぞれＰＡＢＰ、及びＳａｍ６８の分子量に相当する位置にメインのバンドが見られた。それに対して、ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰ  Ｆ／Ｈ、ｈｎＲＮＰ  Ｋ、ｈｎＲＮＰ  Ｍに対する抗体で免疫沈降したサンプルにおいては、それぞれ用いた抗体に対応する分子の位置だけでなく、広い分子量領域に亘って種々のバンドが検出されることが分かった。この結果は、これらの抗体が種々のｈｎＲＮＰを含む分子複合体を免疫沈降する能力があることを示している。
一方、抗ＭｅＫ抗体による検出において、基本的は抗ＡＤＭＡ抗体で検出した際と類似の染色パターンを示したが、抗ＡＤＭＡ抗体では染まらなかったバンドも染色されることが分かった。ここで染色されているタンパク質の多くはｈｎＲＮＰ群のタンパク質である可能性が高いので、この結果は、ｈｎＲＮＰの中にはアルギニンメチル化だけでなく、リジンメチル化も生じている可能性を強く示唆する。
これまで、ｈｎＲＮＰ複合体の検出は、細胞を放射ラベルした後に免疫沈降物をオートラジオグラフィーで検出する手法が主に取られており、今回の様な感度で非ＲＩの条件で複合体を一括して検出できたのは、初めてのことである。
【００５４】
《実施例６：ｈｎＲＮＰ複合体が形成されていることの確認》
実施例５の検討で、いくつかの抗ｈｎＲＮＰ抗体による免疫沈降物には、免疫沈降に用いた抗体が反応する以外のｈｎＲＮＰタンパク質も含まれていることが示唆された。そのことを確かめるために、実施例４の工程（Ａ）で得られた抗ｈｎＲＮＰ  Ａ１、抗ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２、抗ｈｎＲＮＰＦ／Ｈ、及び抗ｈｎＲＮＰＫ抗体で免疫沈降したサンプルを、これら４種の抗体を用いて検出した。抗ｈｎＲＮＰ抗体の代わりに、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ１、抗ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２、抗ｈｎＲＮＰＦ／Ｈ、及び抗ｈｎＲＮＰＫ抗体を用いたこと以外は、実施例４の工程（Ｂ）を繰り返した。結果を図１０に示した。抗ｈｎＲＮＰ  Ａ１抗体で免疫沈降したサンプルはｈｎＲＮＰ  Ａ１抗体でのみ検出されたことから、この抗体はｈｎＲＮＰ複合体を免疫沈降する能力は低いものと思われる。この結果は、実施例５での染色パターンと一致する。一方、抗ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、抗ｈｎＲＮＰ  Ｆ／Ｈ、及び抗ｈｎＲＮＰ  Ｋ抗体で免疫沈降したサンプルを検出すると、それぞれの抗体のみではなく、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ１、抗ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、抗ｈｎＲＮＰ  Ｆ／Ｈ、及び抗ｈｎＲＮＰ  Ｋの全ての抗体で検出された。従って、少なくともこれら４種の抗体で検出されるｈｎＲＮＰは複合体を形成しており、その複合体は抗ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、抗ｈｎＲＮＰ  Ｆ／Ｈ、及び抗ｈｎＲＮＰ  Ｋ抗体により免疫沈降されることが分かった。
【００５５】
《実施例７：メチル化ｈｎＲＮＰ複合体のサンドイッチＥＬＩＳＡによる検出》
メチル化ｈｎＲＮＰ及び／又はメチル化ｈｎＲＮＰ複合体を検出するために、サンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築した。市販の抗ｈｎＲＮＰ抗体（抗ｈｎＲＮＰ  Ａ１、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１、抗ｈｎＲＮＰ  Ｍ、抗ｈｎＲＮＰ  Ｑ、及び抗ｈｎＲＮＰ  Ｋ）を１μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳで希釈し、ＥＬＩＳＡ用のＢｌａｃｋ  ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに室温、３時間で固相化した。１％  ＢＳＡでブロッキングした後に、メチル化ｈｎＲＮＰが含まれているＨｅｐＧ２細胞ｌｙｓａｔｅを０．５％  ＢＳＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００入りのＰＢＳで種々の希釈倍率で添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄液（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００入りＰＢＳ）で洗浄後、標識抗体希釈液（０．５％  ＢＳＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００入りのＰＢＳ）で１μｇ／ｍＬに調製したＡＤＭＡ２−２Ｈ５−ＨＲＰ又はＭＥＫ３Ｄ７−ＨＲＰを添加して、室温で１時間インキュベートした。その後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてシグナルを検出した。その結果、抗ｈｎＲＮＰ  Ｑ抗体及び抗ｈｎＲＮＰ  Ｋ抗体を用いて固相化した条件で高い反応性が見られ、特に抗ｈｎＲＮＰ  Ｋ抗体を用いた時が最も強い反応性を示した。
【００５６】
《実施例８：メチル化ｈｎＲＮＰ複合体のサンドイッチＥＬＩＳＡによる癌患者血清の測定》
大腸癌患者、肺癌患者、乳癌患者の血清中のメチル化ｈｎＲＮＰを、ＥＬＩＳＡ法によって分析した。抗ｈｎＲＮＰ  Ｋ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  ｓｃ−２８３８０）を、ＰＢＳで１  μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、室温、３時間で、ＥＬＩＳＡ用ｂｌａｃｋ  ｐｌａｔｅに固相化した。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ、２％Ｓｕｃｒｏｓｅ  ｉｎ  ＰＢＳを用いて、室温で２．５時間ブロッキングした。０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００入りＰＢＳで洗浄後、３％ＢＳＡ、０．１％Ｔｘ１００、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ）／ＰＢＳで３倍に希釈した検体を添加した。室温で１時間反応後、洗浄液で洗浄し、標識抗体希釈液で、１μｇ／ｍＬの濃度に希釈したＨＲＰ標識抗メチルリジン抗体（ＭＥＫ３Ｄ７−ＨＲＰ）又はＨＲＰ標識抗ＡＤＭＡ抗体−ＨＲＰ（ＡＤＭＡ２−２Ｈ５−ＨＲＰ）を添加し、室温で１時間反応させた。（以下、それぞれ、ＭＥＫ−ｈｎＲＮＰ法及びＡＤＭＡ−ｈｎＲＮＰ法と称することがある）洗浄液で洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて検出した。メチル化ｈｎＲＮＰを含む標準物質としては、ＨｅｐＧ２細胞ｌｓｙａｔｅを３％  ＢＳＡ、０．１％Ｔｘ１００、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ）／ＰＢＳで希釈したものを用いた。ＨｅｐＧ２細胞ｌｙｓａｔｅを３倍希釈した時の測定値で全ての測定値を除し、更に１００倍した暫定的な相対値を用いて結果を評価した。
健常人血清１８名、大腸癌患者血清２３名、肺癌血清１５名、乳癌血清５０名分について、測定値をグラフにプロットした結果を図１１に示した。健常人における値の平均値＋２ＳＤを仮のカットオフ値として設定して、陽性率を判定すると、ＡＤＭＡ−ｈｎＲＮＰ法で検出した場合に、健常人、大腸癌、肺癌、及び乳癌のそれぞれにおいて、６、４８、８０、５０％、ＭＥＫ−ｈｎＲＮＰ法で検出した場合に、それぞれ、６、５７、８０、７８％の陽性率の値を示し、高感度で癌患者血清を検出できることが分かった。特にＭＥＫ−ｈｎＲＮＰ法はダイナミックレンジが広かった。
【００５７】
また、今回の検出結果を従来の腫瘍マーカーでの検出率と比較するために、全ての検体でＣＥＡ及びＢＦＰを、大腸癌に関しては更にＣＡ１９−９を、肺癌に関しては更にＣＹＦＲＡを、乳癌に関しては更にＣＡ１５−３及びＢＣＡ２２５を市販のキットを用いて測定した。使用したキットは、それぞれ、ＣＥＡ（ＣＥＡ，ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ，Ｈｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＴＭ−２０１）、ＢＦＰ（カイノス、ラナザイムＢＦＰプレート）、ＣＡ１９−９（Ｐａｎｏｍｉｃｓ  ＢＣ１０１７）、ＣＹＦＲＡ（ＣＹＦＲＡ２１−１，ＥＬＩＳＡ，ＤＲＧ  ＥＩＡ−３９４３）、ＣＡ１５−３（Ｐａｎｏｍｉｃｓ  ＢＣ１０１５）、ＢＣＡ２２５（ＫアッセイＩＩ  ＢＣＡ２２５，ＭＢＬ７７２１）である。また、初期癌の検出感度を評価するために、各癌患者検体の中からＳｔａｇｅ−１の検体について解析した。結果を表２に示す。大腸癌においては、市販のいずれの腫瘍マーカー（ＣＥＡ、ＢＦＰ、ＣＡ１９−９）よりも、本発明の方法が高い陽性率を示していた。大腸癌のＳｔａｇｅ−１の検体は２例であったが、ＭＥＫ−ｈｎＲＮＰ法及びＡＤＭＡ−ｈｎＲＮＰ法のいずれの測定においても陽性であった。市販の腫瘍マーカーではＢＦＰのみが、これらの検体で陽性を示していた。肺癌においては、ＣＥＡ、ＢＦＰ、ＣＹＦＲＡのいずれの陽性率よりも、本発明の方法が高い陽性率を示していた。Ｓｔａｇｅ−１の検体についても６７％と高い陽性率を示した。乳癌においても、従来のいずれの腫瘍マーカー（ＣＥＡ、ＢＦＰ、ＣＡ１５−３、ＢＣＡ２２５）よりも本発明の方法が高い陽性率を示しており、特にＭＥＫ−ｈｎＲＮＰ法における陽性率が高かった。Ｓｔａｇｅ−１のサンプルにおいても８０％と高い陽性率をしめしており、この値は従来の腫瘍マーカーよりも高値であった。
以上の結果は、血清中のメチル化ｈｎＲＮＰを測定することにより高感度で腫瘍患者を識別できることを示すものである。
【００５８】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明による免疫学的分析方法により、メチル化ｈｎＲＮＰを分析することができる。提供される免疫学的分析方法を用いて、癌患者及び健常人の血清中のｈｎＲＮＰ複合体中のメチル化タンパク質レベルを測定すると、明らかに癌患者血清中で高値を示し、本発明の分析方法が癌の検出に有用であることが示された。また、ｈｎＲＮＰ複合体中のメチル化タンパク質レベルは、初期癌血清においても有意に高値を示したことから、癌の早期発見にも有用な方法である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】１２人の大腸がん患者検体におけるβアクチンの発現を示すウエスタンブロットの写真である。
【図２】１２人の大腸がん患者検体におけるＭｅＫ含有タンパク質の発現を示すウエスタンブロットの写真である。
【図３】１２人の大腸がん患者検体におけるＡＤＭＡ含有タンパク質の発現を示すウエスタンブロットの写真である。
【図４】１２人の大腸がん患者検体におけるＰＲＭＴ１の発現を示すウエスタンブロットの写真である。
【図５】人正常肝細胞、肝癌細胞、大腸癌細胞、肺癌細胞、肺扁平上皮癌細胞、乳癌細胞、神経芽細胞腫細胞及び横紋筋肉腫細胞におけるＰＲＭＴ１〜ＰＲＭＴ８のｍＲＮＡの発現を示すＲＴ−ＰＣＲの写真である。
【図６】大腸癌細胞ＲＫＯの細胞Ｌｙｓａｔｅを抗ｈｎＲＮＰ抗体（ｈｎＲＮＰ  Ａ０、ｈｎＲＮＰ  Ａ１、ｈｎＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１、及びｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２）を用いて免疫沈降し、同じ抗体でウエスタンブロットを行った写真である。
【図７】大腸癌細胞ＲＫＯの細胞Ｌｙｓａｔｅを抗ｈｎＲＮＰ抗体（ｈｎＲＮＰ  Ｆ／Ｈ、ｈｎＲＮＰ  Ｇ、ｈｎＲＮＰ  Ｉ、及びｈｎＲＮＰ  Ｋ）を用いて免疫沈降し、同じ抗体でウエスタンブロットを行った写真である。
【図８】大腸癌細胞ＲＫＯの細胞Ｌｙｓａｔｅを抗ｈｎＲＮＰ抗体（ｈｎＲＮＰ  Ｍ、ｈｎＲＮＰ  Ｑ、ｈｎＲＮＰ  ＰＡＢＰ、及びｈｎＲＮＰ  Ｓａｍ６８）を用いて免疫沈降し、同じ抗体でウエスタンブロットを行った写真である。
【図９】大腸癌細胞ＲＫＯの細胞Ｌｙｓａｔｅを１２種類の抗ｈｎＲＮＰ抗体を用いて免疫沈降し、抗ＡＤＭＡ抗体（Ａ）及び抗ＭｅＫ抗体（Ｂ）でウエスタンブロットを行った写真である。
【図１０】大腸癌細胞ＲＫＯの細胞Ｌｙｓａｔｅを４種類の抗ｈｎＲＮＰ抗体（ｈｎＲＮＰ  Ａ１、ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰ  Ｆ／Ｈ、及びｈｎＲＮＰ  Ｋ）を用いて免疫沈降し、同じ４種の抗体でウエスタンブロットを行い、ｈｎＲＮＰ複合体を確認した写真である。
【図１１】抗ｈｎＲＮＰ  Ｋ抗体と抗ＡＤＭＡ抗体（Ａ）、又は抗ｈｎＲＮＰ  Ｋ抗体と抗ＡＤＭＡ抗体（Ｂ）を用いたＥＬＩＳＡ法により、大腸癌、肺癌、乳癌の患者血清中のメチル化ｈｎＲＮＰを測定したプロット図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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