(57)【要約】【課題】肝内胆管癌（ICC）の鑑別診断に有用なマーカー遺伝子及び該マーカー遺伝子を用いた肝内胆管癌（ICC）の鑑別診断方法の提供。【解決手段】以下の４種類の遺伝子からなる群から選択されるClaudin4を除く１つの遺伝子、又は少なくとも２つの遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを含む肝内胆管癌を検出するための試薬；（１）insulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)、（２）Claudin4(CLDN4)、（３）PDZ and LIM domain 7(PDLIM7)、及び（４）Biglycan(BGN)。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の４種類のヒト遺伝子からなる群から選択されるClaudin4を除く１つの遺伝子、又は少なくとも２つの遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを含む肝内胆管癌を検出するための試薬；
（１）insulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)、
（２）Claudin4(CLDN4)、
（３）PDZ and LIM domain 7(PDLIM7)、及び
（４）Biglycan(BGN)。
【請求項２】
請求項１に記載の４種類の遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを含む、請求項１記載の肝内胆管癌を検出するための試薬。
【請求項３】
遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドが基板に結合しているDNAマイクロアレイを含む、請求項１又は２に記載の肝内胆管癌を検出するための試薬。
【請求項４】
肝内胆管癌と肝細胞癌及び転移性肝癌とを鑑別することができる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の肝内胆管癌を検出するための試薬。
【請求項５】
以下の４種類のヒト遺伝子の翻訳産物に対する４種類の抗体のうちのClaudin4の翻訳産物に対する抗体を除く１つの抗体又は少なくとも２つの抗体を含む肝内胆管癌を検出するための試薬；
（１）insulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)、
（２）Claudin4(CLDN4)、
（３）PDZ and LIM domain 7(PDLIM7)、及び
（４）Biglycan(BGN)。
【請求項６】
請求項５に記載の４種類のヒト遺伝子の翻訳産物に対する４種類の抗体を含む肝内胆管癌を検出するための試薬。
【請求項７】
肝内胆管癌と肝細胞癌及び転移性肝癌とを鑑別することができる、請求項５又は６に記載の肝内胆管癌を検出するための試薬。
【請求項８】
被験体における以下の４種類のヒト遺伝子からなる群から選択されるClaudin4を除く１つの遺伝子、又は少なくとも２つの遺伝子の発現レベルをin vitroで測定し、該発現レベルに基づいて肝内胆管癌を検出する方法；
（１）insulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)、
（２）Claudin4(CLDN4)、
（３）PDZ and LIM domain 7(PDLIM7)、及び
（４）Biglycan(BGN)。
【請求項９】
被験体の遺伝子の発現レベルが、被験体の肝臓組織のmRNAを用いて得られる請求項８に記載の肝内胆管癌を検出する方法。
【請求項１０】
遺伝子の発現レベルを、請求項８に記載の４種類の遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを固相化したマイクロアレイを用いて測定する、請求項８又は９に記載の肝内胆管癌を検出する方法。
【請求項１１】
遺伝子の発現レベルを、請求項８に記載の４種類の遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドをターゲットとした定量的PCRにより測定する、請求項８又は９に記載の肝内胆管癌を検出する方法。
【請求項１２】
遺伝子の発現レベルを、請求項８に記載の４種類の遺伝子の翻訳産物に対する抗体を用いて肝臓組織中の遺伝子発現産物を検出することにより測定する、請求項８又は９に記載の肝内胆管癌を検出する方法。
【請求項１３】
免疫組織染色により、遺伝子の発現レベルを測定する請求項１２記載の肝内胆管癌を検出する方法。
【請求項１４】
以下の判別式を用いて癌を検出する請求項８〜１２のいずれか１項に記載の肝内胆管癌を検出する方法であって、Zが０より大きい場合に肝内胆管癌であると判定し得る方法；
Z＝ａ1（IGFBP5)＋ａ2（CLDN4）＋ａ3（PDLIM7）＋ａ4（BGN)＋ａ5
[（IGFBP5)、（CLDN4)、（PDLIM7）及び（BGN)は、それぞれIGFB5、CLDN4、PDLIM7及びBGNの発現レベルを表す値であり、ａ1が0.175〜0.185、ａ2が-0.001〜-0.005、ａ3が0.500〜0.510、ａ4が０、ａ5が-2.175〜-2.185）。
【請求項１５】
以下の判別式を用いて癌を検出する請求項８〜１２のいずれか１項に記載の肝内胆管癌を検出する方法であって、Zが０より大きい場合に肝内胆管癌であると判定し得る方法；
Z＝ａ1（IGFBP5)＋ａ2（CLDN4）＋ａ3（PDLIM7）＋ａ4（BGN)＋ａ5
[（IGFBP5)、（CLDN4)、（PDLIM7）及び（BGN)は、それぞれIGFB5、CLDN4、PDLIM7及びBGNの発現レベルを表す値であり、ａ1が0.215〜0.225、ａ2が-0.001〜-0.005、ａ3が0.540〜0.550、ａ4が-0.205〜-0.215、ａ5が-2.065〜2.075]。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胆管癌患者において発現が増大する遺伝子をマーカーとして用いた肝内胆管癌の検出診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarinoma, ICC)は、原発性肝癌の約３％を占める癌である。外科的切除後５年生存率は15〜35％と低く、化学療法なども試みられているが有効な治療がなく、早期発見が困難であり予後不良とされている。
【０００３】
肝内胆管癌は、CTスキャン等の画像診断により検出し得るが、肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)との鑑別は画像上可能な場合が多いものの、苦慮する場合があり、更に転移性肝癌、特に線癌との鑑別が困難な場合がある。CEA、CA19-9等が腫瘍マーカーとして用いられているが、これらのマーカーは膵癌や肺癌、卵巣癌などでも高値を呈し、特異性が低い。
【０００４】
従って、胆管癌の早期発見や鑑別診断に有用な腫瘍マーカーが望まれていた。
【０００５】
胆管癌で発現が亢進する遺伝子として、ケラチン(Keratin)17及び19が報告され、組織免疫染色の手法でマーカーとして用いられている（非特許文献１〜４を参照）。
また、胆管癌とClaudin-4の関係についても報告されている（非特許文献５を参照）。
【０００６】
【非特許文献１】Johnson DE et al., Am J Surg Pathol 1988;12:187-197.
【非特許文献２】Lai YS et al., Arch Pathol Lab Med 1989;113:134-138.
【非特許文献３】Maeda T et al., Hum Pathol 1995;26:956-964.
【非特許文献４】Altmannsberger M et al., Lab Invest 1982;46:520-526.
【非特許文献５】Csaba Lodi et al., Modern Pathology(2006)19, 460-469
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、肝内胆管癌（ICC）の鑑別診断に有用なマーカー遺伝子を含む肝内胆管癌検出用試薬及び該マーカー遺伝子を用いた肝内胆管癌（ICC）の鑑別診断方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、肝内胆管癌（ICC）の鑑別診断に有用なマーカー遺伝子候補を包括的な遺伝子発現解析を用いて同定することを試みた。
【０００９】
肝内胆管癌（ICC）患者一例及び肝細胞癌（HCC）３例について、SAGEを用い、遺伝子発現解析を行い、ICC患者において発現している遺伝子として約15,000個、HCC患者において特異的に発現が増大している遺伝子として約17,000個の遺伝子を選択した。
【００１０】
このうちICC患者と特に関連していると考えられる１６個の遺伝子について正常肝、慢性肝炎患者、HCC患者、他臓器癌由来の市販されているトータルRNA及びICC患者から採取した組織を用いてReal-time PCR解析を行った。
【００１１】
その結果、ICC患者において特異的に発現が増大し、ICCとHCC及び転移性肝癌を鑑別して検出し得る遺伝子として、insulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)、Claudin4(CLDN4)、PDZ and LIM domain 7(PDLIM7)及びBiglycan(BGN)の４種類の遺伝子を見出し、これらの遺伝子をマーカーとして用いて肝内胆管癌を検出・診断する本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]  以下の４種類のヒト遺伝子からなる群から選択されるClaudin4を除く１つの遺伝子、又は少なくとも２つの遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを含む肝内胆管癌を検出するための試薬；
（１）insulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)、
（２）Claudin4(CLDN4)、
（３）PDZ and LIM domain 7(PDLIM7)、及び
（４）Biglycan(BGN)。
【００１３】
[２]  [１]の４種類の遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを含む、[１]の肝内胆管癌を検出するための試薬。
[３]  遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドが基板に結合しているDNAマイクロアレイを含む、[１]又は[２]の肝内胆管癌を検出するための試薬。
【００１４】
[４]  肝内胆管癌と肝細胞癌、転移性肝癌を鑑別することができる、[１]〜[３]のいずれかの肝内胆管癌を検出するための試薬。
[５]  以下の４種類のヒト遺伝子の翻訳産物に対する４種類の抗体のうちのClaudin4の翻訳産物に対する抗体を除く１つの抗体、又は少なくとも２つの抗体を含む肝内胆管癌を検出するための試薬；
（１）insulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)、
（２）Claudin4(CLDN4)、
（３）PDZ and LIM domain 7(PDLIM7)、及び
（４）Biglycan(BGN)。
【００１５】
[６]  [５]の４種類のヒト遺伝子の翻訳産物に対する４種類の抗体を含む肝内胆管癌を検出するための試薬。
[７]  肝内胆管癌と肝細胞癌及び転移性肝癌とを鑑別することができる、[５]又は[６]の肝内胆管癌を検出するための試薬。
【００１６】
[８]  被験体における以下の４種類のヒト遺伝子からなる群から選択されるClaudin4を除く１つの遺伝子、又は少なくとも２つの遺伝子の発現レベルをin vitroで測定し、該発現レベルに基づいて肝内胆管癌を検出する方法；
（１）insulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)、
（２）Claudin4(CLDN4)、
（３）PDZ and LIM domain 7(PDLIM7)、及び
（４）Biglycan(BGN)。
【００１７】
[９]  被験体の遺伝子の発現レベルが、被験体の肝臓組織のmRNAを用いて得られる[８]の肝内胆管癌を検出する方法。
[１０]  遺伝子の発現レベルを、[８]の４種類の遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを固相化したマイクロアレイを用いて測定する、[８]又は[９]の肝内胆管癌を検出する方法。
【００１８】
[１１]  遺伝子の発現レベルを、[８]の４種類の遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドをターゲットとした定量的PCRにより測定する、[８]又は[９]の肝内胆管癌を検出する方法。
[１２]  遺伝子の発現レベルを、[８]の４種類の遺伝子の翻訳産物に対する抗体を用いて肝臓組織中の遺伝子発現産物を検出することにより測定する、[８]又は[９]の肝内胆管癌を検出する方法。
【００１９】
[１３]  免疫組織染色により、遺伝子の発現レベルを測定する[１２]の肝内胆管癌を検出する方法。
[１４]  以下の判別式を用いて癌を検出する[８]〜[１２]のいずれかの肝内胆管癌を検出する方法であって、Zが０より大きい場合に肝内胆管癌であると判定し得る方法；
Z＝ａ1（IGFBP5)＋ａ2（CLDN4）＋ａ3（PDLIM7）＋ａ4（BGN)＋ａ5
[（IGFBP5)、（CLDN4)、（PDLIM7）及び（BGN)は、それぞれIGFB5、CLDN4、PDLIM7及びBGNの発現レベルを表す値であり、ａ1が0.175〜0.185、ａ2が-0.001〜-0.005、ａ3が0.500〜0.510、ａ4が０、ａ5が-2.175〜-2.185]。
【００２０】
[１５]  以下の判別式を用いて癌を検出する[８]〜[１２]のいずれかの肝内胆管癌を検出する方法であって、Zが０より大きい場合に肝内胆管癌であると判定し得る方法；
Z＝ａ1（IGFBP5)＋ａ2（CLDN4）＋ａ3（PDLIM7）＋ａ4（BGN)＋ａ5
[（IGFBP5)、（CLDN4)、（PDLIM7）及び（BGN)は、それぞれIGFB5、CLDN4、PDLIM7及びBGNの発現レベルを表す値であり、ａ1が0.215〜0.225、ａ2が-0.001〜-0.005、ａ3が0.540〜0.550、ａ4が-0.205〜-0.215、ａ5が-2.065〜2.075]。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の４種類の遺伝子は、肝内胆管癌（ICC)に罹患した場合に発現が変動し、特に肝細胞癌（HCC)及び転移性肝癌患者との間で、発現が変動する。本発明の４種類の遺伝子の発現を解析することにより、肝内胆管癌を検出することができ、さらに肝内胆管癌と肝細胞癌及び転移性肝癌を鑑別診断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の方法で用いる遺伝子は、肝内胆管癌（ICC)で発現レベルが変動する４種類の遺伝子である。これらの４種類の遺伝子の発現を解析することにより肝内胆管癌を検出することができる。
【００２３】
本発明の方法で用いる遺伝子は、以下に述べる方法で選択することができる。
肝内胆管癌及び肝細胞癌患者から肝臓組織を生検により採取し、肝臓組織中で発現している遺伝子を解析する。この際、SAGE（Serial Analysis of Gene Expression）法（Velculescu, V.E. et al., Science, 270: 484-487, 1995)により発現遺伝子を解析し、肝内胆管癌患者と肝細胞癌患者の２群で発現程度が異なっている遺伝子を選択する。
【００２４】
選択した遺伝子について、肝内胆管癌及び肝細胞癌患者の他、正常肝、肝硬変患者、肝臓以外の組織癌、例えば乳癌、結腸癌、胃癌、肺癌、卵巣癌を原発性とする転移性肝癌患者における発現を解析する。解析は各群の患者から肝臓組織を生検により採取し、mRNAを単離し、Real-time PCRにより発現レベルを測定することにより行なうことができる。
【００２５】
SAGEにより選択した遺伝子の中から、肝内胆管癌患者で発現が増大しており、肝細胞癌患者、正常肝、肝硬変患者、及び肝臓以外の組織癌を原発性とする転移性肝癌患者では発現が増大していない遺伝子、肝内胆管癌を特異的に鑑別・検出し得る遺伝子として選択することができる。
【００２６】
本発明で用いる肝内胆管癌患者で発現が特異的に変動する遺伝子は以下に示す４種類の遺伝子である。
（１）insulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)、
GenBank登録番号：NM_000599、配列番号１
（２）Claudin4(CLDN4)、
GenBank登録番号：NM_001305、配列番号２
（３）PDZ and LIM domain 7(PDLIM7)
GenBank登録番号：NM_00542、配列番号３
その他、transcript variant として、登録番号NM_203352、NM_2136361の遺伝子が存在する。
（４）Biglycan(BGN)
GenBank登録番号：NM_001711、配列番号４
上記４種類の遺伝子（１）〜（４）の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１〜４に示す。
【００２７】
本発明で用いるヌクレオチドは上記配列を含むヌクレオチド及びその断片配列からなるヌクレオチドを含む。また、本発明に用いるヌクレオチドは、上記配列番号で示される塩基配列を有するヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド及びその断片配列からなるヌクレオチドも含まれる。このようなヌクレオチドとしては、例えば、上記塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で約80％以上、好ましくは約90％以上、より好ましくは約95％以上である塩基配列を含有するヌクレオチド等を挙げることが出来る。ハイブリダイゼーションは、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１XSSC、0.1％  SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5XSSC、0.1％SDS、42℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2XSSC、0.1％  SDS、65℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するヌクレオチドを単離し得る。ただし、上記のSSC、SDS及びに温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記もしくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。さらに、これらの遺伝子はバリアントを有する場合もあり、本発明で用いる遺伝子には上記遺伝子のバリアントも含まれる。バリアントの塩基配列は遺伝子データベースにアクセスすることにより得ることができる。本発明のヌクレオチドは該バリアントの塩基配列を含むヌクレオチド又はその断片配列からなるヌクレオチドも含む。
【００２８】
また、本発明で用いるヌクレオチドは、上記遺伝子のセンス鎖よりなるヌクレオチド、アンチセンス鎖よりなるヌクレオチドのいずれをも用いることができる。
【００２９】
本発明において、遺伝子の発現レベルとは、遺伝子の発現量、発現強度又は発現頻度をいい、通常、遺伝子に対応する転写産物の産生量、又はその翻訳産物の産生量、活性等により解析することができる。遺伝子の発現レベルは、絶対値で表してもよく、また相対値で表してもよい。
【００３０】
本発明の方法において、被験体における上記４種類の遺伝子の少なくとも一つ、すなわち１種類、２種類、３種類又は４種類の発現レベルを測定する。この際、Claudin4（CLDN4)単独での利用を除く。好ましくは３種類又は４種類の遺伝子の発現レベルを測定する。発現レベルの測定は、遺伝子の転写産物、すなわちmRNAの測定により行ってもよいし、遺伝子の翻訳産物、すなわちタンパク質の測定により行ってもよい。好ましくは、遺伝子の転写産物の測定により行なう。遺伝子の転写産物には、mRNAから逆転写されて得られたcDNAも含まれる。
【００３１】
遺伝子の転写産物の測定は、上記の遺伝子の塩基配列の全部又は一部を含むヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして用いて遺伝子発現の程度を測定すればよい。遺伝子発現の程度は、マイクロアレイ（マイクロチップ）を用いた方法、ノーザンブロット法、定量しようとする遺伝子又はその断片をターゲットとした定量的PCR法等で測定することが可能である。定量的PCR法としては、アガロースゲル電気泳動法、蛍光プローブ法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、ATAC-PCR法(Kato,K.et al.,Nucl.Acids Res.,25,4694-4696,1997)、Taqman PCR法（SYBR（登録商標）グリーン法）（Schmittgen TD,Methods25,383-385,2001）、Body Map法(Gene,174,151-158(1996))、Serial analysis of gene expression(SAGE)法（米国特許第527,154号、第544,861号、欧州特許公開第0761822号）、MAGE法(Micro-analysis of Gene Expression)（特開2000-232888号）等がある。ここに挙げた方法はいずれも公知の方法で行うことができる。これらの方法を用いて、上記遺伝子の全部又は一部から転写されたメッセンジャーRNA（mRNA）の量を測定すればよく、該mRNAにハイブリダイズするヌクレオチドプローブ又はプライマーの使用により測定することができる。測定に用いるプローブ又はプライマーの塩基長は、10〜50bp、好ましくは15〜25bpである。
【００３２】
DNAマイクロアレイ（DNAチップ）は、前記遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを適当な基板上に固定化することにより作製することができる。
【００３３】
固定基板としては、ガラス板、石英板、シリコンウェハーなどが挙げられる。基板の大きさとしては、例えば3.5mm×5.5mm、18mm×18mm、22mm×75mmなどが挙げられるが、これは基板上のプローブのスポット数やそのスポットの大きさなどに応じて様々に設定することができる。ポリヌクレオチド又はその断片の固定化方法としては、ヌクレオチドの荷電を利用して、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミンなどのポリ陽イオンで表面処理した固相担体に静電結合させたり、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などの官能基を導入した固相表面に、アミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチンなどの官能基を導入したヌクレオチドを共有結合により結合させることもできる。固定化は、アレイ機を用いて行えばよい。上記１１の遺伝子の少なくとも１個の遺伝子又はその断片を基板に固相化してDNAマイクロアレイを作製し、該DNAマイクロアレイと蛍光物質で標識した被験体由来のmRNAまたはcDNAを接触させ、ハイブリダイズさせ、DNAマイクロアレイ上の蛍光強度を測定することにより、mRNAの種類と量を決定することができる。その結果、被験体において発現が変動している遺伝子の発現レベルがわかる。被験体由来のmRNAを標識する蛍光物質は、限定されず、市販の蛍光物質を用いることができる。例えば、Cy3、Cy5等を用いればよい。mRNAの標識は公知の方法で行うことができる。
【００３４】
遺伝子の翻訳産物の測定は、翻訳されたタンパク質を定量するか、又はタンパク質の活性を測定すればよい。タンパク質の定量は上記４種類の遺伝子産物に対する抗体を用いたELISA等の免疫測定法により行うことができる。抗体は公知の方法により、作製することができる。
【００３５】
遺伝子の転写産物を測定する場合の試料は、被験体の肝臓生検組織の細胞を用い、細胞からmRNAを抽出単離すればよい。また、蛍光色素等で標識した遺伝子断片を用いた組織化学染色により測定することもできる。さらに、上記４種類の遺伝子産物に対する抗体を用いた組織免疫染色により測定することもできる。
【００３６】
本発明の方法により、被検体が肝内胆管癌を検出することができる。上記４種類の少なくとも１種類の遺伝子の発現が増大している場合に、肝内胆管癌に罹患していると診断することができる。遺伝子の発現が増大しているかどうかは、正常肝と比較すればよい。例えば、予め正常肝における上記４種類の遺伝子の発現レベルを測定しておき、発現レベルについての正常肝と肝内胆管癌患者を区別するためのカットオフ値を設定しておけばよい。
【００３７】
また、既に肝癌に罹患していることがわかっているが、癌種が特定できていない患者において、癌が肝内胆管であるかどうかを、肝細胞癌、転移性肝癌と鑑別して検出・診断することができる。
【００３８】
さらに、被検体において、肝内胆管癌に罹患するリスクや手術後の予後を評価判定することもできる。
【００３９】
また、本発明の方法において、あらかじめ胆管癌に罹患しているか否か等の病態を検出し、又は病態予測若しくは予後予測を評価判定するための判別分析モデルを構築し、該判別分析モデルに被験体から得られた４種類の遺伝子の発現レベルに関するデータを入力し、胆管癌に罹患しているか否か、又は病態予測若しくは予後予測を行うこともできる。例えば、判別分析により判別式を得て、発現レベルと病態、病態予測又は予後予測を関連付け、判別式に被験体の発現レベルを代入することにより、病態、病態予測又は予後予測を評価判定することができる。発現レベルを示す数値としては、例えば、蛍光強度を用いてもよいし、被検体の状態に関らず普遍的に一定レベルで発現している遺伝子の発現レベルに対する相対値を用いてもよい。普遍的に一定レベルで発現している遺伝子として、例えば、グリセロアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）が挙げられ、同一サンプルにおいて、各遺伝子の発現レベルの測定と同時にGAPDHの発現レベルを測定し、各遺伝子の発現レベルをGAPDHの発現レベルに対する相対値で表せばよい。例えば、各遺伝子の発現レベルが蛍光強度で表される場合、各遺伝子の蛍光強度をGAPDHの蛍光強度で除すればよい。
【００４０】
判別分析は、２群以上の母集団から抽出した標本データを得て、どの母集団に属するか不明のサンプルデータがある場合に、このサンプルデータがどの母集団に属するか調べる方法であり、本発明においては４種類の遺伝子のうちの少なくとも１種類の遺伝子の発現レベルに関する数値からなる多変量データ（x1、x2、・・・xn）を説明変数として用いる。
【００４１】
このような判別分析の手法は公知であり、最も代表的な判別分析に線形判別関数による判別がある。これは市販の統計解析ソフトウェアを用いて行うことができる。
【００４２】
判別分析により、目的変数を判別することのできる境界線として、判別式（判別関数） Ｚ＝ａ1・x1＋ａ2・x2＋・・・＋ａn・xn＋ａ0を得ることができる。この式は判別したい2つのエリアの境界線であるため、この境界線上ではZ=0となる。また、境界線上にない分析値を判別式に代入すると、0>Z、もしくは0<Zの値を得る。被検体における遺伝子の発現レベルに関する数値を代入したときに、Zが正、負どちらの値をとるかにより、所属するエリアを予測できる。なお、Zの値の絶対値が大きいほど、そのエリアに属する可能性が高いことを示している。判別式の評価は、判別的中率により評価することができる。本発明の判別式において、判別的中率は80％以上、好ましくは85％以上である。判別率が低い場合は、判別に寄与していない遺伝子を取り除く、判別に使用している遺伝子が相互作用している場合どちらかの遺伝子を判別分析に利用しない、異常値を取り除く、などを行うことにより判別的中率を上げることができる。
【００４３】
例えば、
Z＝ａ1（IGFBP5)＋ａ2（CLDN4）＋ａ3（PDLIM7）＋ａ4（BGN)＋ａ5
[（IGFBP5)、（CLDN4)、（PDLIM7）及び（BGN)は、それぞれIGFB5、CLDN4、PDLIM7及びBGNの発現レベルを表す値であり、例えば、同一サンプルにおける各遺伝子の発現レベルのGAPDHに対する相対値を示す。]
で示される判別式において、以下の判別式が挙げられる。
（１）  ａ1が0.175〜0.185、ａ2が-0.001〜-0.005、ａ3が0.500〜0.510、ａ4が０、ａ5が-2.175〜-2.185
例えば、Z=0.182（IGFBP5)-0.003（CLDN4）+0.503（PDLIM7）-2.178
（２）  ａ1が0.215〜0.225、ａ2が-0.001〜-0.005、ａ3が0.540〜0.550、ａ4が-0.205〜-0.215、ａ5が-2.065〜2.075
例えば、Z=0.221（IGFBP5)-0.002（CLDN4）+0.546（PDLIM7）-0.212(BGN)-2.069
【００４４】
これらの判別式において、Zが０より大きい場合、例えば０〜１、好ましくは１以上、さらに好ましくは２以上、特に好ましくは３以上のとき、陽性と判断することができ、被験体が胆管癌に罹患していると検出・診断することができ、また、被検体が胆管癌に罹患するリスクが高いと評価・判定することができる。すなわち、判別式を用いた胆管癌の判別基準としてもZのカットオフ値の一例は、０〜１である。
【００４５】
本発明は、本発明の遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを含む肝内胆管癌を検出するための試薬又はキットを包含する。該試薬は、前記遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして含む試薬であり、また前記遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを固相化したマイクロアレイ等の基板である。
【００４６】
この試薬又はキットは、上記４種類の遺伝子の少なくとも一つ、すなわち１種類、２種類、３種類又は４種類を含む。
【００４７】
さらに、本発明は上記遺伝子翻訳産物であるタンパク質に対する抗体を含む肝内胆管癌を検出するための試薬又はキットを包含する。該キットは、４種類の遺伝子翻訳産物に対する４種類の抗体の少なくとも一つ、すなわち１種類、２種類、３種類又は４種類を含む。
【実施例】
【００４８】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
用いた材料及び方法
【００４９】
サンプル
肝内胆管癌（ICC)サンプルは肝臓内の組織病理学的に中分化胆管細胞癌と診断された孤立性癌領域の外科的切除により得た。肝細胞癌（HCC)サンプルは組織病理学的に高分化肝細胞癌と診断された３例の外科的に切除した癌領域から得た。上記４つのサンプルを用いてSAGE分析を行なった。
【００５０】
また、４例の正常肝、８例の慢性B型肝炎患者、１２例の慢性C型肝炎患者、８例のB型肝炎ウイルス関連HCC患者、１２例のC型肝炎ウイルス関連HCC患者から外科的切除によりサンプルを得た。SAGE分析に用いた上記のICCサンプルに加えて、６例のICC患者から生検によりICCサンプルを得た。これらのすべてのサンプルについて、Real-time PCRを行なった。
【００５１】
肝臓以外の器官の癌サンプルとして、ヒト各種癌由来の腺癌のBD Premium Total RNA（商標）サンプル（BD Biosciences Clontech社）を用いた。癌種は、乳癌（カタログ番号636635）、結腸癌（カタログ番号636634）、胃癌（カタログ番号636629）、子宮癌（カタログ番号636628）及び肺癌（カタログ番号636633)であった。
【００５２】
SAGE
それぞれの組織サンプルを液体窒素中でホモジナイズし、トータルRNAをToTALLY RNA(商標）キット（Ambicon, Inc.)を用いて抽出し、ポリアデニル化RNA（PolyA-RNA)をMicroPoly(A)Pure（商標）キット（Ambicon, Inc.)を用いて精製した。それぞれのICC及びHCC組織サンプル由来のPolyA-RNA  ３μgをSAGE解析に用いた。SAGEは文献（Velculescu VE et al., Science 1995;270:484-487; Yamashita T et al., Biochem Biophys Res Commun 2000;269:110-116; Yamashita T et al., Biochem Biophys Res Commun 2001;282:647-654)の記載に従って行なった。
【００５３】
Real-time 定量的RT-PCR
トータルRNAは、ToTALLY RNA(商標）キット（Ambicon, Inc.)またはISOGEN（Nippon Gene Co., Ltd)を用いてそれぞれのサンプルから抽出した。鋳型となるcDNAは１μgの各々のトータルRNAからSuperScript（商標）II RT(Invtrogen)を用いて合成した。鋳型となるcDNAは計200μlに希釈して用いた。Real-time定量的RT-PCRはTaqMan（登録商標）Gene Expression Assays(Applied Biosystems)及びGeneAmp 7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems)を用いて行なった。増幅プロトコールは、50℃２分間のアニーリングサイクル１回、95℃10分間の変性サイクル１回、95℃15秒の変性サイクル40回、並びに60℃１分間のアニーリング及び伸張で行なった。それぞれのmRNA量を標準化するため、グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH)mRNAをそれぞれのサンプルごとに増幅した。すべてのプライマーはTaqMan（登録商標）Gene Expression Assays(Applied Biosystems)に含まれているものを用いた。用いたものを以下に記す。GAPDH (Hs99999905), Cbp/p300-interacting transactivator with Glu/Asp-rich carboxy-terminal domain 4 (CITED4) (Hs00388363), glutathione S-transferase P1 (GSTP1) (Hs00168310), biglycan (BGN) (Hs00156076), insulin-like growth factor-binding protein 5 (IGFBP5) (Hs00181213), claudin 4 (CLDN4) (Hs00533616), phosphofructokinase platelet type (PFKP) (Hs00242993), transmembrane 4 superfamily member 1 (TM4SF1) (Hs00371997), calpain 1 (mu/l) large subunit (CAPN1) (Hs00559804), claudin 10 (CLDN10) (Hs00199599), PDZ and LIM domain 7 (PDLIM7) (Hs00193775), tubulin alpha 3 (TUBA3) (Hs00362387), signal sequence receptor beta (SSR2) (Hs00162346), EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 (EFEMP1) (Hs244575), peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase (PAM) (Hs00168596), syntaxin 10 (STX10) (Hs00186826), 及びsuperoxide dismutase 3 extracellular (SOD3) (Hs 00162090)。統計的解析にはMann-Whitney Uテスト及びFisher's exactテストを利用した。0.05以下のP値を統計的に有意差があるとした。
【００５４】
免疫組織化学検討
抗Claudin4（C-18）抗体（santa cruz biotechnology, inc.)を用いて、免疫組織化学検討をCLDN4について行なった。
【００５５】
結果
SAGE解析の結果、16遺伝子が肝内胆管癌患者において、発現が変動していることがわかった。16遺伝子のリストを図１に示す。
これらの16遺伝子についてReal-time 定量的RT-PCRを行なった。
【００５６】
図２に、最初に選別した16遺伝子についての肝細胞癌（HCC)患者、慢性肝炎（CH)患者及び正常肝との遺伝子発現の有意差をP値で示した。図に示すように、16遺伝子のうち、insulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)、Claudin4(CLDN4)、PDZ and LIM domain 7(PDLIM7)及びBiglycan(BGN)の４遺伝子が、肝内胆管癌患者で発現が増大していることがわかった。
【００５７】
insulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)についてのReal-time 定量的RT-PCRの結果を図３及び４に示す。Claudin4(CLDN4)についてのReal-time 定量的RT-PCRの結果を図５及び６に示す、PDZ and LIM domain 7(PDLIM7)についてのReal-time 定量的RT-PCRの結果を図７及び８に示す及びBiglycan(BGN)についてのReal-time 定量的RT-PCRの結果を図９及び１０に示す。
【００５８】
Real-time 定量的RT-PCRの結果を示すグラフは各遺伝子ごとに２つずつある。1つ目のグラフは他臓器癌を含まず、２つ目は含んだグラフである。１つ目のグラフは原発性肝癌及び背景肝との有意差を示し、２つ目のグラフで更に他臓器癌との違いを示す。
【００５９】
図１１に、Claudin4(CLDN4)についての免疫組織化学染色の結果を示す。対照として肝細胞癌（HCC)組織の染色を示す。図に示すように、肝内胆管癌組織のみで染色が認められた。
Real-time定量的RT-PCRの結果に基づいて、Dr SPSSII for Windowsを用いて、判別式を作成した。
【００６０】
insulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)、Claudin4(CLDN4)及びPDZ and LIM domain 7(PDLIM7)の３種類の遺伝子の発現レベルに基づいて以下の判別式が構築された。図１２及び１３に判別式による解析の結果を示す。図１２及び１３において、Training groupは、判別式を作成するために用いた検体群であり、Test groupは作成した判別式が有効かどうか検証するために用いた検体群である。
Z=0.182（IGFBP5)-0.003（CLDN4）+0.503（PDLIM7）-2.178
【００６１】
また、insulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)、Claudin4(CLDN4)、PDZ and LIM domain 7(PDLIM7)及びBiglycan(BGN)の４種類の遺伝子の発現レベルに基づいて以下の判別式が構築された。図１４及び１５に判別式による解析の結果を示す。図１４及び１５において、Training groupは、判別式を作成するために用いた検体群であり、Test groupは作成した判別式が有効かどうか検証するために用いた検体群である。
Z=0.221（IGFBP5)-0.002（CLDN4）+0.546（PDLIM7）-0.212(BGN)-2.069
【００６２】
上記の２つの式中、（IGFBP5)、（CLDN4）、（PDLIM7）及び（BGN)は、それぞれinsulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)、Claudin4(CLDN4)、PDZ and LIM domain 7(PDLIM7)及びBiglycan(BGN)の発現レベルを、GAPDHの発現レベルに対する相対値で表した値（比）であり、図３〜１０のグラフの縦軸の値である。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は、肝内胆管癌の検出を可能にするとともに、肝内胆管癌と肝細胞癌及び転移性肝癌との鑑別診断を可能にするため、医療産業上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】SAGE解析で選択した１６個の遺伝子を示す図である。
【図２】16遺伝子についての肝細胞癌（HCC)患者、慢性肝炎（CH)患者及び正常肝との遺伝子発現の有意差を示す図である。
【図３】insulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)についてのReal-time 定量的RT-PCRの結果を示す図である。
【図４】insulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)についてのReal-time 定量的RT-PCRの結果を示す図である。
【図５】Claudin4(CLDN4)についてのReal-time 定量的RT-PCRの結果を示す図である。
【図６】Claudin4(CLDN4)についてのReal-time 定量的RT-PCRの結果を示す図である。
【図７】PDZ and LIM domain 7(PDLIM7)についてのReal-time 定量的RT-PCRの結果を示す図である。
【図８】PDZ and LIM domain 7(PDLIM7)についてのReal-time 定量的RT-PCRの結果を示す図である。
【図９】Biglycan(BGN)についてのReal-time 定量的RT-PCRの結果を示す図である。
【図１０】Biglycan(BGN)についてのReal-time 定量的RT-PCRの結果を示す図である。
【図１１】Claudin4(CLDN4)についての免疫組織化学染色の結果を示す図である。
【図１２】IGFBP5、CLDN4及びPDLIM7の３種類の遺伝子の発現レベルに基づく判別式による解析の結果を示す図である。
【図１３】IGFBP5、CLDN4及びPDLIM7の３種類の遺伝子の発現レベルに基づく判別式による解析の結果を示す図である。
【図１４】IGFBP5、CLDN4、PDLIM7及びBGNの４種類の遺伝子の発現レベルに基づく判別式による解析の結果を示す図である。
【図１５】IGFBP5、CLDN4、PDLIM7及びBGNの４種類の遺伝子の発現レベルに基づく判別式による解析の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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