(57)【要約】【課題】ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供する。【解決手段】電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、内面が親水性ポリマーでコーティングされ、かつ、内部にイオン交換体を充填された泳動路を用いるヘモグロビン類の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、内面が親水性ポリマーでコーティングされ、かつ、内部にイオン交換体が充填された泳動路を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
【請求項２】
更に、アニオン性基を有する水溶性ポリマーを含有する緩衝液を用いることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビンの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビン（Ｈｂ）類、特に糖化ヘモグロビン類の一種であるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）は、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。
従来、ＨｂＡ１ｃの測定方法としては、ＨＰＬＣ法、免疫法、電気泳動法等が用いられている。このうち、臨床検査分野で多く用いられているＨＰＬＣ法では、１試料当たり１〜２分での測定が可能であり、また、同時再現性試験のＣＶ値が１．０％程度の測定精度が実現されている。糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための測定方法としては、このレベルの性能が必要とされている。
【０００３】
一方、電気泳動法は、装置構成が簡便なため、マイクロチップ電気泳動のような安価で小型なシステムを作製することが可能な技術であり、電気泳動法におけるＨｂＡ１ｃの高精度測定技術の臨床検査への適用は、コスト面において非常に有益な効果が期待できる。
電気泳動法によるＨｂ類の測定は、通常とは異なるアミノ酸配列を有する異常Ｈｂ類の分離方法として古くから用いられているが、ＨｂＡ１ｃの分離は非常に困難であり、ゲル電気泳動の手法では３０分以上の時間が必要であった。このように電気泳動法は、臨床検査分野に応用した場合、測定時間及び測定精度の点で問題があるため、現在では糖尿病診断への応用はほとんど行われていなかった。
【０００４】
これに対して、１９９０年頃に登場したキャピラリー電気泳動法は、一般的に高分離・高精度測定が可能とされており、例えば、特許文献１には、キャピラリー電気泳動法によってＨｂＡ１ｃを分離する方法が開示されている。
しかしながら、特許文献１に開示された方法を用いた場合、測定時間が長いという問題点は解消されず、加えて、使用する緩衝液のｐＨが９〜１２と高く、Ｈｂが変性してしまう可能性があることから、この方法を臨床検査に適用することは困難であった。
【０００５】
また、特許文献２には、キャピラリー電気泳動法において、キャピラリーにカチオン性ポリマーを通液することによって、キャピラリー内面にカチオン性ポリマーを動的にコーティングし、硫酸化多糖類を含む緩衝液を用いる方法が開示されている。この方法によれば、１０分間程度で測定することができ、ゲル電気泳動法と比較して短時間で測定することが可能となる。
【０００６】
しかしながら、糖尿病診断を行う場合は、ＨｂＡ１ｃのなかでも糖尿病の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃを分離して、不安定型ＨｂＡ１ｃ、カルバミル化Ｈｂ、アセチル化Ｈｂ等の修飾Ｈｂ類の影響を排除しなければならない。しかしながら、特許文献１及び２に開示された方法によって得られるエレクトロフェログラムでは、分離性能及び測定精度が不充分であり、これらの方法に記載の技術範囲では安定型ＨｂＡ１ｃを分離することは困難であった。
【０００７】
一方、例えば、特許文献３には、キャピラリー内部に液体クロマトグラフィー用充填剤等を充填して電気泳動を行う電気クロマトグラフィーと呼ばれる方法が開示されている。この方法によれば、単純な電気泳動法では分離しにくい測定物質を分離する際に、当該試料と充填剤との相互作用を利用して、電気泳動とクロマトグラフィーとの２つの作用により分離をすることが可能となる。
しかしながら、特許文献３に開示された電気クロマトグラフィーによる方法では、ヘモグロビン類のような蛋白質類が泳動路に非特異吸着するため、ヘモグロビン類の各成分を分離することは困難であった。特に、短時間内に高精度な分離能が要求されるヘモグロビン類の測定においては、特許文献３をはじめとした電気クロマトグラフィーに関する開示技術の条件設定範囲では、安定型ＨｂＡ１ｃを分離することは困難であり、糖尿病患者の血糖値を管理できるレベルの分離性能及び測定精度が得られていなかった。
【特許文献１】特表平０９−５１０７９２号公報
【特許文献２】特開平０９−１０５７３９号公報
【特許文献３】特開２００６−１５９１４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、内面が親水性ポリマーでコーティングされ、かつ、内部にイオン交換体を充填された泳動路を用いるヘモグロビン類の測定方法である。
以下に本発明を詳述する。
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討した結果、内面が親水性ポリマーでコーティングされ、かつ、内部にイオン交換体を充填した泳動路を用いて電気泳動を行うことによって、従来測定が困難であった安定型ＨｂＡ１ｃについて、低コストで、高精度の測定を短時間に行うことが可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
本発明のヘモグロビン類の測定方法において用いる電気泳動法としては特に限定されず、例えば、キャピラリー電気泳動法、マイクロチップ電気泳動法等が挙げられる。
【００１２】
図１に、本発明のヘモグロビン類の測定方法に用いるキャピラリー電気泳動装置の一例を示す。図１に示すように、キャピラリー電気泳動装置１１は、陽極槽１２、陰極槽１３、キャピラリー１４、高圧電源１５、検出器１６、及び、一対の電極１７、１８からなる。キャピラリー１４の両端は陽極槽１２内、及び、陰極槽１３内の緩衝液に浸され、管状のキャピラリー１４の内部は緩衝液で満たされている。また、電極１７及び１８は高圧電源１５と電気的に接続されている。
本発明のヘモグロビン類の測定方法では、泳動路であるキャピラリー１４の内部にイオン交換体が充填されている。
そして、ヘモグロビン類を測定する際には、キャピラリー１４の一方より試料を注入して、高圧電源１５から所定の電圧を印加することにより、キャピラリー１４内を移動する目的成分を検出器１６によって測定する。
【００１３】
本発明のヘモグロビン類の測定方法は、内面が親水性ポリマーでコーティングされ、かつ、内部にイオン交換体を充填された泳動路を用いる。
このような泳動路を用いることによって、ヘモグロビン類、特に従来分離することが困難であった安定型ＨｂＡ１ｃを短時間に高精度で測定することが可能となる。
【００１４】
上記泳動路とは、電気泳動が行われる際に、試料が移動及び／又は分離する部位（注入された部位から検出される部位まで）のことをいう。具体的には、例えば、キャピラリー電気泳動法の場合は、キャピラリー内の試料が注入された部位から検出器により検出される部位までのことをいい、マイクロチップ型電気泳動法の場合は、マイクロチップ型電気泳動装置におけるマイクロチップ溝内の試料が注入された部位から検出器により検出される部位までのことをいう。
上記泳動路の内面とは、具体的には、例えば、キャピラリー電気泳動法の場合は、キャピラリーの泳動路内面のことをいい、マイクロチップ型電気泳動法の場合は、マイクロチップ型電気泳動装置におけるマイクロチップ溝の泳動路内面のことをいう。
【００１５】
上記泳動路を構成する素材としては特に限定されず、例えば、ガラス、金属、樹脂等が挙げられる。
【００１６】
上記泳動路の長さの好ましい下限は１０ｍｍ、好ましい上限は３００ｍｍである。１０ｍｍ未満であると、充分に試料が分離されないため、正確な測定をすることができないことがある。３００ｍｍを超えると、測定時間の延長や得られるエレクトロフェログラムにおいてピーク形状の変形が生じることによって、正確な測定をすることができないことがある。
【００１７】
上記泳動路の直径の好ましい下限は１μｍ、好ましい上限は１００μｍである。１μｍ未満であると、検出器により検出するための光路長が小さく、測定精度が低下することがある。１００μｍを越えると、泳動路内で試料が拡散することにより得られるエレクトロフェログラムにおいてピークがブロードになり、測定精度が低下することがある。
【００１８】
本発明に用いられる上記泳動路の内面は、親水性ポリマーによってコーティングされている。
上記泳動路内面に形成されるコーティング層は、単層であってもよく、同一又は異なる材料からなる多層であってもよい。
【００１９】
このように親水性ポリマーを用いてコーティングすることによって、泳動路の内面に親水性を付与し、泳動路の内部を通過する試料であるヒト血液中の蛋白質、脂質等の各成分の非特異吸着を抑制し、測定対象であるヘモグロビン類を充分に分離測定することが可能となる。親水性が不充分であると、試料中の各成分が上記泳動路の内面に非特異吸着を起こし、各成分の分離に悪影響を及ぼすことがある。
本明細書において、親水性ポリマーとは親水性の官能基を有するポリマーをいう。
【００２０】
上記親水性ポリマーとしては特に限定されないが、例えば、イオン性又は非イオン性のポリマーが挙げられる。具体的には例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等の非イオン性ポリマー；２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート（アクリレート又はメタクリレートは、以下（メタ）アクリレートともいう）、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート；グリシジル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート等の非イオン性モノマーを重合して得られる非イオン性ポリマー；デンプン、デキストラン、アガロース、マンナン等の非イオン性多糖類等が挙げられる。
【００２１】
上記イオン性ポリマーとしては特に限定されず、例えば、キチン、キトサン、アミノセルロース、Ｎ−メチルアミノセルロース等のＮ−置換セルロース等のカチオン性基を含むイオン性多糖類；デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、フコイダン、アルギン酸、ペクチン酸等のアニオン性基を含むイオン性多糖類；アルブミン類、ラクトフェリン、スキムミルク等蛋白質類等、又は、これらの物質の塩類又は誘導体類等が挙げられる。
【００２２】
他の上記イオン性ポリマーとしては特に限定されず、例えば、ポリエチレンイミン、ポリブレン、ポリ（２−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート）等のカチオン性基含有ポリマー及びこれらのポリマーを含む共重合物；ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸）、リン酸基含有（メタ）アクリル酸エステル重合体、スルホン酸基含有（メタ）アクリル酸重合体等のアニオン性基含有ポリマー、及び、これらのポリマーを含む共重合物等が挙げられる。
【００２３】
上記親水性ポリマーは、複数種が混合されて、あるいは他のモノマーとの共重合体とされて用いられてもよい。
上記親水性ポリマーの重量平均分子量の好ましい下限は５００である。５００未満であると、泳動路の内面を充分に被覆することが困難となり、ヘモグロビン類の分離性能が不充分となることがある。
【００２４】
上記親水性ポリマーを泳動路にコーティングする方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができ、例えば、上記親水性ポリマーを含有する溶液を上記泳動路の内部に通液することによってコーティングする動的コーティング法；上記親水性ポリマーを泳動路の内面に接触させて疎水性的又は静電気的な相互作用等を利用して物理的に吸着・固定化させる固定化コーティング法、泳動路の内面及び親水性ポリマーをそれぞれの物質が有する官能基や他の物質等を介して共有結合により結合・固定化させる固定化コーティング法等が挙げられる。上記固定化コーティング法を用いる場合、更に、加熱工程、乾燥工程等を経ることにより、コーティング層が剥離することがないため、繰り返し測定が可能となる。上記固定化コーティング法としては、具体的には例えば、上記泳動路内部に上記親水性ポリマーを含有する溶液を通液し、該泳動路に空気を注入することによって該溶液を追い出した後、乾燥することを繰り返す方法等が挙げられる。
【００２５】
上記コーティング法のうち、特に固定化コーティング法が好ましい。固定化コーティング法を用いることによって、いったんコーティングすれば剥離することがなく、測定毎に再びコーティングを行う必要がない。そのため、連続測定等の際には、測定時間の短縮を図ることができる。
【００２６】
上記泳動路に上記親水性ポリマーを固定化する際、上記泳動路内面と上記親水性ポリマーからなる層との間に、別種の層を形成してもよい。上記別種の層が形成される場合、上記親水性ポリマーからなる層は、上記泳動路最内面に形成されていればよい。
【００２７】
上記泳動路に上記親水性ポリマーをコーティングする際、上記親水性ポリマーは、その種類やコーティングの方法にもよるが、上記親水性ポリマーを含む溶液としてコーティングに供されることが好ましい。
上記親水性ポリマー溶液の濃度としては、好ましい下限が０．０１％、好ましい上限が２０％である。０．０１％未満であると、固定化が不充分となることがある。２０％を超えると、上記親水性ポリマーからなる層を均一に形成することができず、ヘモグロビン類の測定途中に剥離し、再現性低下の原因となることがある。
【００２８】
上記泳動路は、内面に上記親水性ポリマーがコーティングされていることに加え、内部にイオン交換体が充填されている。本明細書において、イオン交換体とは、イオン交換基を有する不溶性担体をいう。
【００２９】
上記イオン交換体は、上記泳動路の内部全体に充填されていてもよく、上記泳動路の内部の一部にのみ充填されていてもよい。
試料中のヘモグロビン類は、イオン交換体が充填された泳動路に導入された後、電気泳動によって移動しながら該イオン交換体と接触することによって、各成分に分離される。そのため、分離された各成分を検出器によって検出することが可能となる。
【００３０】
上記イオン交換体としては特に限定されず、例えば、イオン交換性の官能基を有する不溶性の高分子が挙げられる。
上記イオン交換性の官能基としては特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等のカチオン交換基；アミノ基等のアニオン交換基が挙げられる。
【００３１】
上記イオン交換性の官能基を有する高分子の骨格としては特に限定されず、例えば、有機合成高分子、多糖類等の有機系高分子；シリカ系、セラミック系等の無機系高分子等が挙げられる。
これらのイオン交換体は、電気泳動時に不溶性の粒子であればよく、架橋体であってもよく、非架橋体であってもよい。
これらのイオン交換体は、上記イオン交換性の官能基を有するモノマーを重合することによって得られた高分子であってもよく、高分子を調製した後、上記イオン交換性の官能基を導入したものであってもよい。
本発明のヘモグロビン類の測定方法では、血液を試料とするため、試料中の成分の上記イオン交換体への非特異吸着を抑制する必要があることから、これらのイオン交換体は、親水性を有することが好ましい。具体的には例えば、親水性素材からなるイオン交換体、又は、親水化処理を施した多糖類、有機合成高分子、シリカ等からなるイオン交換体が好ましく、親水性の有機合成高分子がより好ましい。
【００３２】
上記多糖類としては特に限定されず、例えば、キチン、キトサン等のキトサン誘導体類、及び、その塩類；アミノセルロース、Ｎ−メチルアミノセルロース等のＮ−置換セルロースの誘導体類、及び、その塩類；デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類、及び、その誘導体類へのアミノ基導入化物、及び、その塩類等、カチオン性基含有多糖類等の不溶化物が挙げられる。また、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、フコイダン等のスルホン酸基含有多糖類、及び、その塩類；アルギン酸、ペクチン酸等のカルボキシル基含有多糖類、及び、その塩類；セルロース、デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類、及び、その誘導体へのアニオン性基導入化物、及び、その塩類等の公知のアニオン性基含有多糖類等の不溶化物が挙げられる。
上記イオン交換性を有する多糖類と、デンプン、デキストラン、アガロース、マンナン等の中性多糖類とを混合物や結合物として用いてもよい。
【００３３】
上記有機合成高分子としては特に限定されないが、例えば、イオン交換基を有するモノマーを単独で重合すること、又は他のイオン交換基を有しない親水性モノマーと共重合することにより得られるもの等が挙げられる。例えば、アクリル系モノマーより重合されて得られるアクリル系高分子が好ましい。
【００３４】
上記イオン交換基を有するモノマーとしては特に限定されず、例えば、カルボキシル基を有する（メタ）アクリル酸、スルホン酸基を有する２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、アミノ基を有する２−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレートを重合した後、グリシジル基をカルボキシル基、スルホン酸基等に置換したもの等が挙げられる。また、アミノ基を有するポリエチレンイミン、ポリブレンの不溶化物等も用いることもできる。
【００３５】
上記イオン交換基を有しない親水性モノマーとしては特に限定されず、例えば、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリメチロールアルカンポリ（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、グリシジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。また、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等の不溶化物等も用いることができる。
【００３６】
上記イオン交換体の形状としては特に限定されず、例えば、球形、破砕形等が挙げられる。なかでも、球形が好ましく、真球又は真球に近い形状がより好ましい。
【００３７】
上記イオン交換体の大きさとしては、上記泳動路に充填可能な大きさであれば特に限定されないが、直径の好ましい下限が０．１μｍ、好ましい上限が３０μｍである。０．１μｍ未満であると、空隙が小さ過ぎて試料が移動しにくいため、充分な泳動ができなくなることがある。３０μｍを超えると、空隙が大き過ぎて、試料とイオン交換体との相互採用が不充分となるため、分離性能が低下することがある。
より好ましい下限は１μｍ、より好ましい上限は２０μｍである。
【００３８】
本発明のヘモグロビン類の測定方法は、上記内面がコーティングされ、かつ、内部にイオン交換体が充填された泳動路を用い、該泳動路に緩衝液を満たして電気泳動を行う。
上記緩衝液としては、緩衝能を有する従来公知の緩衝液組成物を含有する溶液であれば特に限定されず、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸、及び、その塩類等を含有する溶液等；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸、及び、その塩類等を含有する溶液等が挙げられる。
上記緩衝液には、カオトロピック化合物、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等、一般的に用いられる添加剤を適宜添加してもよい。
【００３９】
上記緩衝液に含有させる各種ポリマーとしては特に限定されないが、例えば、イオン性基を有する水溶性ポリマーが好ましい。イオン性基を有する水溶性ポリマーとしては、分子内にイオン性の官能基を有するポリマーであり、イオン性の種類により、アニオン性基を有するポリマーと、カチオン性基を有するポリマーとに大別される。なかでも、アニオン性基を有する水溶性ポリマーが好ましい。
【００４０】
上記アニオン性基としては特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等の従来公知のアニオン性を有する官能基である。なかでも、スルホン酸基を有することが好ましい。上記アニオン性基を有する水溶性ポリマーは、分子中に、上記アニオン性基を複数有していてもよく、異なる種類の上記アニオン性基を有していてもよい。上記アニオン性基を有する水溶性ポリマーは、使用時に上記緩衝液に完全に溶解した状態であればよいが、水に対する溶解度の好ましい下限が１ｇ／Ｌである。１ｇ／Ｌ未満であると、アニオン性基を有する水溶性ポリマーを低濃度でしか用いることができないため効果が現れにくく、測定精度が不十分となることがある。より好ましい下限が５ｇ／Ｌである。
【００４１】
上記アニオン性基を有する水溶性ポリマーとしては特に限定されず、公知のポリマーを用いることができるが、例えば、アニオン性基を有する多糖類、及び、アニオン性基を有する水溶性の有機合成ポリマーが好ましい。
【００４２】
上記アニオン性基を有する多糖類としては特に限定されず、例えば、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、フコイダン等のスルホン酸基含有多糖類、及び、その塩類；アルギン酸、ペクチン酸等のカルボキシル基含有多糖類、及び、その塩類；セルロース、デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類、その誘導体へのアニオン性基導入化物、及び、その塩類等の公知のアニオン性基を有する多糖類等が挙げられる。
【００４３】
上記アニオン性基を有する有機合成ポリマーとしては、例えば、アニオン性の官能基を含有する水溶性の公知の有機合成ポリマーが挙げられるが、特にアクリル系ポリマー；すなわち、アクリル酸又はメタクリル酸及びその誘導体類及びエステル類等を主成分とするポリマー等が好ましい。
具体的には例えば、（メタ）アクリル酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸等のカルボキシル基を有するモノマーを重合して得られるアクリル系ポリマー、（（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェート等のリン酸基を有するモノマーを重合して得られるアクリル系ポリマー、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、（メタ）アクリルアミドプロパンスルホン酸、スルホプロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルオキシナフタレンスルホン酸等のスルホン酸基を有するモノマーを重合して得られるアクリル系ポリマー等が挙げられる。
【００４４】
上記アクリル系ポリマーは、アニオン性基を有する（メタ）アクリルモノマーと、アニオン性基を有しない（メタ）アクリルモノマーとの共重合体であってもよい。
上記アニオン性基を有しない（メタ）アクリルモノマーとしては、上記アニオン性基を有する（メタ）アクリルモノマーと共重合が可能な（メタ）アクリルモノマーであれば特に限定されないが、例えば、非イオン性の親水性である（メタ）アクリル酸エステル類であることが好ましい。具体的には、例えば、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート；グリシジル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００４５】
上記アニオン性基を有しない（メタ）アクリルモノマーの添加量としては、得られる共重合体が水溶性であれば特に限定されないが、上記アニオン性基を有する（メタ）アクリルモノマー１００重量部に対して、好ましい上限が１０００重量部である。１０００重量部を超えると、得られる共重合体が水溶性とならないことがある。
【００４６】
上記緩衝液の上記アニオン性基を有する水溶性ポリマーの含有量の好ましい下限は０．０１重量％、好ましい上限は１０重量％である。０．０１重量％未満であると、水溶性ポリマーを添加することによる効果が発現しにくく、ヘモグロビン類の測定において、分離等が不充分となることがある。１０重量％を超えると、測定時間の延長や分離不良を引き起こすことがある。
【００４７】
本発明のヘモグロビン類の測定方法において、測定対象となるヘモグロビン類としては特に限定されず、例えば、従来公知のヘモグロビン類が挙げられる。具体的には例えば、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２；アセチル化Ｈｂ、カルバミル化Ｈｂ等の修飾ヘモグロビン；ＨｂＳ、ＨｂＣ等の異常ヘモグロビン等が挙げられる。なかでも、安定型ＨｂＡ１ｃを好適に測定することが可能である。
【発明の効果】
【００４８】
本発明によれば、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法に関する。具体的には、電気泳動法という簡易かつ低コストな方法を用いながら、特に安定型ＨｂＡ１ｃの測定において、１試料当たり数分という短時間に、同時再現性を示すＣＶ値が１．０％程度という高精度で測定することができる。そのため、電気泳動法によって糖尿病患者のＨｂＡ１ｃの数値の管理を好適に行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００５０】
（実施例１）
（１）イオン交換体の調製
３％のポリビニルアルコール水溶液２．０Ｌに、トリエチレングリコールジメタクリレート（非イオン性モノマー：新中村化学社製）３００ｇ、ジエチルアミノエチルメタクリレート（アミノ基を有するモノマー：和光純薬社製）１００ｇ、及び、過酸化ベンゾイル（重合開始剤：ナカライテスク社製）１．０ｇの混合物を添加して、攪拌しながら、窒素雰囲気下で８０℃に昇温して、１２時間重合を行った。得られた重合物を洗浄して回収し、アミノ基を有するイオン交換体を得た。
【００５１】
（２）泳動路の調製
フューズドシリカキャピラリー（内径１００μｍ×全長３００ｍｍ：ＧＬサイエンス製）を０．２Ｎ−ＮａＯＨ、イオン交換水、０．５Ｎ−ＨＣｌの順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、０．５％ポリメタクリル酸水溶液（親水性ポリマー）を２０分間通液した。その後、空気をキャピラリー内に注入してポリビニルアルコー水溶液を追い出した後、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させた。その後、再び、ポリビニルアルコール水溶液の注入、空気の注入、及び、乾燥からなる一連の工程を５回繰り返して、内部にポリメタクリル酸をコーティングしたキャピラリーを得た。得られたキャピラリーに、上述の（１）イオン交換体の調製で得られたアミノ基を有するイオン交換体を充填したうえで、キャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製  ＰＡＣ／Ｅ  ＭＤＱ）にセットした。
【００５２】
（３）健常人血の測定
試料として健常人血よりヘパリン採血した血液を用い、該健常人全血７０μＬに０．０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（界面活性剤：和光純薬社製）を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ６．２）２００μＬを添加して溶血希釈したものを用いた。
キャピラリー及び該キャピラリー両端の電極槽に、リン酸緩衝液（ｐＨ７．６）を満たし、キャピラリーの一方より試料を注入し、キャピラリーの両端の緩衝液に２０ｋＶの電圧をかけて電気泳動を行い、４１５ｎｍの可視光における吸光度変化を測定することにより、健常人血中の安定型ＨｂＡ１ｃのキャピラリー電気泳動法による測定を行った。
図２は、健常人血の測定によって得られたエレクトロフェログラムを示す模式図である。図２中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０を示す。なお、安定型ＨｂＡ１ｃの分離は、約６０秒の電気泳動時間で行うことができた。
【００５３】
（４）修飾Ｈｂを含む試料の測定
ヘパリン採血した健常人全血に、グルコースを２５００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、修飾Ｈｂの一種である不安定型ＨｂＡ１ｃを多量に含む試料を人為的に調製した。
キャピラリーの一方から試料を注入し、上述の（３）健常人血の測定と同様の条件を用いて修飾Ｈｂ含有試料中の安定型ＨｂＡ１ｃのキャピラリー電気泳動法による測定を行った。
図３は、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムを示す模式図である。
図３中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０、ピーク３は修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を示す。図３に示すように、安定型ＨｂＡ１ｃと修飾Ｈｂである不安定型ＨｂＡ１ｃとが良好に分離された。
【００５４】
（実施例２）
（１）イオン交換体の調製
４％ポリビニルアルコール水溶液２．０Ｌに、テトラエチレングリコールジメタクリレート（非イオン性モノマー：新中村化学社製）３００ｇ、テトラメチロールエタントリアクリレート５０ｇ（非イオン性モノマー：新中村化学社製）、及び、過酸化ベンゾイル１．０ｇの混合物を添加し、攪拌しながら、窒素雰囲気下で８０℃に昇温して１時間重合を行った。この重合系に、５０％の２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（スルホン酸基を有するモノマー：東亞合成化学社製）水溶液２００mＬを添加し、更に２時間重合を行った。得られた重合物を洗浄して回収し、スルホン酸基を有するイオン交換体を得た。
【００５５】
（２）泳動路の調製
キトサン（キトサン−１００：和光純薬社製）を０．５重量％含有する０．５Ｎ塩酸溶液を用いた以外は、実施例１と同様の方法によって、泳動路のコーティングを行った。得られた内面コーティングキャピラリーに、上述の（１）イオン交換体の調製で得られたスルホン酸基を有するイオン交換体を充填したうえで、キャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製  ＰＡＣ／Ｅ  ＭＤＱ）にセットした。
【００５６】
（３）健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定
緩衝液としてクエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）を用いた以外は、実施例１と同様の方法によって、健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。
図４は、健常人血の測定によって得られたエレクトロフェログラムを示す模式図である。図４中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０を示す。
図５は、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムを示す模式図である。
図５中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０、ピーク３は修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を示す。図５に示すように、安定型ＨｂＡ１ｃと修飾Ｈｂである不安定型ＨｂＡ１ｃとが良好に分離された。
【００５７】
（実施例３）
（１）イオン交換体の調製
４％ポリビニルアルコール水溶液２．０Ｌに、テトラエチレングリコールジメタクリレート（非イオン性モノマー：新中村化学社製）３００ｇ、２−ヒドロキシメチルメタクリレート５０ｇ（非イオン性モノマー：新中村化学社製）、ジエチルアミノエチルメタクリレート（アミノ基を有するモノマー：和光純薬社製）１００ｇ及び過酸化ベンゾイル１．０ｇの混合物を添加し、攪拌しながら、窒素雰囲気下で８０℃に昇温して１０時間重合を行った。得られた重合物を洗浄して回収し、アミノ基を有するイオン交換体を得た。
【００５８】
（２）泳動路の調製
ポリジメチルシロキサンからなる電気泳動用マイクロチップ（５０ｍｍ×１００ｍｍ）に、クロス十字型の溝を形成することによって、幅１００μｍ×長さ７０ｍｍの泳動路とした。形成した泳動路内に、実施例２と同様の方法によって、キトサン溶液によるコーティングを行い、更に、上述の（１）イオン交換体の調製で得られたアミノ基を有するイオン交換体を充填した。
【００５９】
（３）健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定
緩衝液として２．０重量％のコンドロイチン硫酸を含むクエン酸緩衝液（ｐH４．７）を用い、１０００Ｖの電圧で電気泳動を行った以外は、実施例１と同様の方法によって、健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。
健常人血の測定では、図４と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Ｈｂを含む試料の測定では、図５と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
【００６０】
（比較例１）
フューズドシリカからなるキャピラリー（ＧＬサイエンス社製：内径２５μｍ×全長３０ｃｍ）に、０．２Ｎ−ＮａＯＨ、イオン交換水、０．５Ｎ−ＨＣｌを、この順で通液してキャピラリー内部を洗浄した後、ＢＳＡ（カチオン性ポリマー：牛血清アルブミン：和光純薬社製）の０．５重量％を含むリンゴ酸緩衝液を１分間通液することによって、キャピラリー内面を動的にコーティングした。引き続き、キャピラリー内に充填剤を充填することなく０．２重量％のコンドロイチン硫酸（和光純薬社製：アニオン性基を有するポリマー）を含有するリンゴ酸緩衝液（ｐＨ４．７）を上述のキャピラリーの両端にセットし、キャピラリー内部に満たした後、実施例１と同様の方法によって、修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。
【００６１】
図６は、比較例１において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
図６中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０、ピーク３は修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を示す。図７に示すように、安定型ＨｂＡ１ｃを示すピーク１は修飾Ｈｂを示すピーク３に重なっている。
【００６２】
（評価）
実施例１〜３及び比較例１で得られた試料について、以下の評価を行った。
【００６３】
（１）修飾Ｈｂの分離性能試験
実施例１〜３及び比較例１について、健常人血試料と、該健常人血試料と同一の健常人血を元に調製した修飾Ｈｂ含有試料、すなわち、実施例１（４）修飾Ｈｂを含む試料の測定において調製した健常人血にグルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加して得られた不安定型ＨｂＡ１ｃ含有試料と、更に、他の修飾Ｈｂ含有試料、すなわち、健常人血にアセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加して得られたアセチル化Ｈｂ含有試料と、シアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加して得られたカルバミル化Ｈｂ含有試料とを調製し、各試料における安定型ＨｂＡ１ｃ値を求めた。
なお、各試料の安定型ＨｂＡ１ｃ値は、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）を求めることにより算出した。
得られた修飾Ｈｂ含有試料の安定型ＨｂＡ１ｃ値から、得られた健常人血試料の安定型ＨｂＡ１ｃ値を差し引いた値を求めた。
結果を表１に示した。
【００６４】
【表１】
2008164500.tif 000002
【００６５】
実施例１〜３の測定条件においては、修飾Ｈｂ含有試料と修飾Ｈｂを含まない健常人血試料の安定型ＨｂＡ１ｃの測定値の差はほとんどなく、測定値差は０．２％以下であり、修飾Ｈｂ類の存在下においても、安定型ＨｂＡ１ｃが正確に測定できることがわかった。一方、比較例１の測定条件では、修飾Ｈｂ類と安定型ＨｂＡ１ｃの分離が不十分なため、安定型ＨｂＡ１ｃ値が大きく変動し、正確な測定ができないことがわかった。
【００６６】
（２）同時再現性試験
実施例１〜３及び比較例１の測定条件を用いて、健常人血試料の同一試料を１０回連続して得られた安定型ＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値を算出した。
なお、ＣＶ値は（標準偏差／平均値）を算出することにより求めた。
また、比較例１では、１回の測定が終了した時点で、０．２Ｎ−ＮａＯＨ、イオン交換水、０．５Ｎ−ＨＣｌを、この順で通液してキャピラリー内部を洗浄した後、ＢＳＡ（カチオン性ポリマー：牛血清アルブミン：和光純薬社製）の０．５重量％リンゴ酸緩衝液を１分間送液して動的コーティングを施した後、次試料を測定することによって、測定を繰り返し行うことによって同時再現性試験を行った。
結果を表２に示した。
【００６７】
（３）耐久性試験
実施例１〜３及び比較例２の測定条件を用いて、健常人血試料の同一試料を１００回連続して測定して得られた安定型ＨｂＡ１ｃ値の最大値と最小値との差（Ｒ値）を算出した。
結果を表２に示した。
【００６８】
【表２】
2008164500.tif 000003
【００６９】
表２に示すように、実施例１〜３では、同時再現性試験において、バラツキ度合いを示すＣＶ値が１％前後であり良好な結果であった。また、耐久性試験における連続１００試料測定時のバラツキ幅についても、０．２％程度と非常に小さく、大量試料の連続測定においても精度良く安定型ＨｂＡ１ｃを測定できることがわかった。
一方、比較例２については、同時再現性試験におけるＣＶ値が３％以上と大きく、また、耐久性試験時のバラツキ幅も最大１．２％程度であり、糖尿病患者のＨｂＡ１ｃ値を管理するうえで全く不充分な値となっていた。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明によれば、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明のヘモグロビン類の測定方法を用いた電気泳動装置の一例を示す模式図である。
【図２】実施例１において、健常人血の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
【図３】実施例１において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
【図４】実施例２及び３において、健常人血の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
【図５】実施例２及び３において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
【図６】比較例１において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
【符号の説明】
【００７２】
１  安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
２  ＨｂＡ０のピーク
３  修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）のピーク
【図１】
2008164500.tif 000004
【図２】
2008164500.tif 000005
【図３】
2008164500.tif 000006
【図４】
2008164500.tif 000007
【図５】
2008164500.tif 000008
【図６】
2008164500.tif 000009