(57)【要約】【課題】量的制限や時間的制限を受けることが少ない、迅速である、生体間での保存性による限界を回避できる等の特徴のいずれかを備えた、膜タンパク質に特異的に結合する機能性分子の作製方法、製造方法およびそのような膜タンパク質に特異的に結合する機能性分子を提供する。【解決手段】ヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは整数を表す）をランダムに重合させて得た修飾オリゴヌクレオチド配列を含んでなる機能性分子の候補のプールを、膜タンパク質と接触せしめ、その後、膜タンパク質をプロテアーゼで処理して、膜タンパク質に結合していた機能性分子を分離する。更に、この機能性分子から対応する非修飾分子を増幅し、増幅した対応非修飾分子の配列を解読し、解読結果を分離された機能性分子の配列に翻訳する。この翻訳を元に機能性分子を製造できる。【選択図】図４
2008199969.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜タンパク質に特異的に結合する機能性分子の作製方法であって、
ヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは整数を表す）をランダムに重合させて得た修飾オリゴヌクレオチド配列を含んでなる機能性分子の候補のプールを、当該膜タンパク質と接触せしめ、
その後、当該膜タンパク質をプロテアーゼで処理して、当該膜タンパク質に結合していた機能性分子を分離する、
ことを含む、機能性分子の作製方法。
【請求項２】
前記膜タンパク質が単一種のタンパク質である、請求項１に記載の機能性分子の作製方法。
【請求項３】
前記膜タンパク質が細胞膜を複数回貫通する膜タンパク質である、請求項１または２に記載の機能性分子の作製方法。
【請求項４】
前記膜タンパク質を細胞膜中に存在した状態で使用する、請求項１〜３のいずれかに記載の機能性分子の作製方法。
【請求項５】
前記ｎが２または３である、請求項１〜４のいずれかに記載の機能性分子の作製方法。
【請求項６】
前記修飾オリゴヌクレオチド配列がデオキキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはその両者を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の機能性分子の作製方法。
【請求項７】
前記置換基が、ヌクレオシドにおけるピリミジン塩基の５位に導入されたものである、請求項１〜６のいずれかに記載の機能性分子の作製方法。
【請求項８】
請求項１〜８のいずれかに記載の機能性分子の作製方法により作製された機能性分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の機能性分子の作製方法によって作製された機能性分子から対応する非修飾分子を増幅し、
当該増幅した対応非修飾分子の配列を解読し、
当該解読結果を当該機能性分子の配列に翻訳することを含む、
機能性分子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜タンパク質に特異的に結合する機能性分子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
膜タンパク質は創薬ターゲットとして注目されており、特に現在臨床的に用いられている薬の半数がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のような多数回膜貫通タンパク質に働くといわれている。
【特許文献１】特開２００４−３３７０２２号公報（特許請求の範囲）
【特許文献２】特願２００３−５７６６１７公報（特許請求の範囲）
【特許文献３】特開平１−３１４９６５号公報（特許請求の範囲）
【特許文献４】特開平１−２５２３００号公報（特許請求の範囲）
【特許文献５】特願２００７−５７６号（特許請求の範囲）
【非特許文献１】実験医学、羊土社、８，Ｎｏ．９（１９９０）、ＰＣＲテクノロジー・ストックトン・プレス（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ ｐｒｅｓｓ）、１９８９年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これまで、膜タンパク質を含むタンパク質に対する抗体は古典的な抗体生産法あるいはマウスハイブリドーマを利用した方法によって作成されてきた。古典的な抗体生産法とは、ウサギにアジュバントと混合した抗原を接種し、これを２〜３週間おきに３ヶ月〜半年間繰り返した後、全血を採取し、ポリクローナル抗体を得る方法である。マウスハイブリドーマを利用する方法とは、マウスにアジュバントと混合した抗原を接種し、これを２〜３週間おきに１ヶ月〜半年間繰り返した後、脾細胞を取得し、ミエローマ細胞を作用させて、細胞融合した抗体産生細胞を選択し、この抗体産生細胞をクローン化して得た細胞をマウスに注射して、その腹水を採取し、カラム精製してモノクローナル抗体を得る方法である。
【０００４】
しかしながら、これらの方法には次のような問題点があった。すなわち、
１．ウサギなどを利用する場合は、抗原タンパク質を多く必要とする（５〜１０ｍｇタンパク質）。マウス利用の場合は、抗原タンパク質量は少なくても済むが（０．２５〜２．５ｍｇタンパク質）、得られる血清量が少ない。また、抗原となるタンパク質を調製してから抗体を得るまでに、３ヶ月程度の期間を要する。
【０００５】
２．抗原が膜タンパク質である場合には、その精製が非常に難しく、抗原として動物個体へ接種できるだけのタンパク量を確保することが非常に困難であることが多い。また、使用する膜タンパク質は可溶化することが必要であり、また、可溶化できた膜タンパク質でも数日後には不溶化してしまうこともあるため、抗体力価向上のための追加免疫が行いにくい。
【０００６】
３．ハイブリドーマ系を確立してモノクローナル抗体を得る場合には、全工程で半年程度の期間が必要である。
【０００７】
４．膜タンパク質には、生体間での保存性が高く、抗ヒト抗体を得ようとした場合に動物へ感作すると免疫寛容により抗体が得られない場合が多い。
【０００８】
本発明は、これらの問題を解決し、量的制限や時間的制限を受けることが少ない、迅速である、生体間での保存性による限界を回避できる等の特徴を備えた、膜タンパク質に特異的に結合する機能性分子の作製方法およびそのような膜タンパク質に特異的に結合する機能性分子を提供することを目的とする。本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様によれば、
膜タンパク質に特異的に結合する機能性分子の作製方法であって、
ヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは整数を表す）をランダムに重合させて得た修飾オリゴヌクレオチド配列を含んでなる機能性分子の候補のプールを、当該膜タンパク質と接触せしめ、
その後、当該膜タンパク質をプロテアーゼで処理して、当該膜タンパク質に結合していた機能性分子を分離する
ことを含む、機能性分子の作製方法が提供される。
【００１０】
本発明態様により、量的制限や時間的制限を受けることが少ない、迅速である、生体間での保存性による限界を回避できる等の特徴のいずれかを備えた、膜タンパク質に特異的に結合する機能性分子の作製方法を実現することができる。
【００１１】
前記膜タンパク質が単一種のタンパク質であること、前記膜タンパク質が細胞膜を複数回貫通する膜タンパク質であること、前記膜タンパク質を細胞膜中に存在した状態で使用すること、前記ｎが２または３であること、前記修飾オリゴヌクレオチド配列がデオキキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはその両者を含むこと、前記置換基が、ヌクレオシドにおけるピリミジン塩基の５位に導入されたものであること、前記置換基が、下記構造式（Ｉ）で表される基から選択されたものであること、
【００１２】
【化１】
2008199969.tif 000003
｛ここで、構造式（Ｉ）中、Ｒは、天然又は非天然のアミノ酸、金属錯体、蛍光色素、酸化還元色素、スピンラベル体、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、及び下記式（１）〜（１０）から選ばれるいずれかの基を表す。Ｐは、ピリミジン塩基を表す。｝。
【００１３】
【化２】
2008199969.tif 000004
ヌクレオチドランダム配列に対しヌクレオチドモノマーをアニーリングさせ、当該ヌクレオチドモノマーをＤＮＡリガーゼ及びＲＮＡリガーゼの少なくともいずれかにより連結させて前記修飾オリゴヌクレオチド配列を合成することを含むこと、および、前記機能分子候補のプールに含まれる修飾オリゴヌクレオチド配列が、両端に固定オリゴヌクレオチド配列を有すること、が好ましい。
【００１４】
本発明の他の一態様によれば、上記の機能性分子の作製方法によって作製された機能性分子から対応する非修飾分子を増幅し、
当該増幅した対応非修飾分子の配列を解読し、
当該解読結果を当該機能性分子の配列に翻訳することを含む、
機能性分子の製造方法が提供される。
【００１５】
前記増幅を、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、３ＳＲ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法及びＬＡＭＰ法から選択されるいずれかの方法により行い、クローニングにより塩基配列を決定すること、前記製造方法が、塩基配列を決定した対応非修飾分子の配列を、修飾されていないヌクレオチドｎ量体と修飾されたヌクレオチドｎ量体とを、ヌクレオシドのｎ個の塩基配列で表して１：１に対応させた対応表に基づき機能性分子の配列に翻訳することを含むこと、前記翻訳を、前記塩基配列を決定した対応非修飾分子の配列における５’末端側からｎ塩基ずつ、この対応表に基づいて行うこと、前記修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド２量体であること、および、前記修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド３量体であること、が好ましい。
【００１６】
本発明態様により、量的制限や時間的制限を受けることが少ない、迅速である、生体間での保存性による限界を回避できる等の特徴のいずれかを備えた、膜タンパク質に特異的に結合する機能性分子の作製方法を実現することができる。
【００１７】
本発明の更に他の態様によれば、上記の機能性分子の作製方法により作製された機能性分子および、上記の機能性分子の製造方法によって製造された機能性分子が提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、量的制限や時間的制限を受けることが少ない、迅速である、生体間での保存性による限界を回避できる等の特徴のいずれかを備えた、膜タンパク質に特異的に結合する機能性分子の作製方法、製造方法およびそのような膜タンパク質に特異的に結合する機能性分子が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本発明の実施の形態を図、表、実施例等を使用して説明する。なお、これらの図、表、実施例等及び説明は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の趣旨に合致する限り他の実施の形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。
【００２０】
本発明に係る膜タンパク質に特異的に結合する機能性分子（「膜タンパク質に特異的に結合する機能性分子」を、以下、単に「機能性分子」ともいう。）は、ヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは整数を表す）をランダムに重合させて得た修飾オリゴヌクレオチド配列を含んでなるものである。すなわち、ヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは整数を表す）をランダムに重合させて得た修飾オリゴヌクレオチド配列またはその修飾オリゴヌクレオチド配列が更に他の構造部分（たとえば他のヌクレオチド配列）を有するものである。この「他のヌクレオチド配列」として構造の判明しているものを使用すると、後述するように、効率よく増幅（複製）することができる点で好ましい場合がある。この「他のヌクレオチド配列」は修飾ヌクレオチドｎ量体の端に付加されていても、修飾ヌクレオチドｎ量体の中間に付加されていてもよい。
【００２１】
本発明に係る機能性分子の作製には、ヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは整数を表す）をランダムに重合させて得た修飾オリゴヌクレオチド配列を含んでなる機能性分子の候補のプールを膜タンパク質と接触せしめ、その後、当該膜タンパク質をプロテアーゼで処理して、当該膜タンパク質に結合していた機能性分子を分離することが含まれる。
【００２２】
本発明に係る膜タンパク質は、細胞膜に埋め込まれたタンパク質またはその細胞膜から取り出されたタンパク質であればどのようなものでもよい。膜タンパク質は、図３に模式的に示すように、親水性部５２と疎水性部５３とからなる脂質５４の二重膜である細胞膜５１中に、膜タンパク質５５が、氷山のように親水部２からなる頭を少し出して浮かんでいる構造を取っていると考えることができる。膜タンパク質は膜タンパク質５５で表されているように膜を貫通しているものが多い。この膜貫通型の膜タンパク質の中には図４に示すように、親水性部を膜外に出して疎水性部が細胞膜を複数回貫通している膜タンパク質も存在する。本発明に係る膜タンパク質は、細胞膜を複数回貫通する膜タンパク質であることが、プロテアーゼ処理の点で好ましい。なお、本発明に係る膜タンパク質は、特定の目的の人工抗体を得易い点からは、単一種のタンパク質であることが好ましいが、複数種のタンパク質であっても差し支えない場合も多い。
【００２３】
本発明に係る機能性分子における「機能性」とは、膜タンパク質と接触せしめたときに膜タンパク質と特異的に結合し得ることを意味する。本発明に係る機能性分子は、人工物であるので、膜タンパク質と特異的に結合し得ることと人工物であることとから、人工抗体と呼ぶことも可能である。
【００２４】
本発明に係る機能性分子の候補（すなわち、機能性分子候補）は、ヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは整数を表す）をランダムに重合させて得た修飾オリゴヌクレオチド配列を含んでなるものであればどのようなものでもよい。この「機能性分子候補」における「機能性」は上記と同様の意味を有するが、「候補」と定義されているのは、膜タンパク質と接触せしめたときに、膜タンパク質と特異的に結合しないものも含まれ、また、必ずしも膜タンパク質と特異的に結合するものではないからである。
【００２５】
ただし、本発明に係る機能性分子候補は、ヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは整数を表す）をランダムに重合させて得た修飾オリゴヌクレオチド配列を含んでなるものであり、これらを混合物のまま（すなわちプールとして）用いるため、多種多様の構造を含み得、また、経験等により、膜タンパク質と特異的に結合する可能性の大きい構造のものを選択し得るので、機能性分子を含んでいる可能性は大きい。
【００２６】
本発明に係る機能性分子候補のプールを膜タンパク質と接触せしめると、この膜タンパク質と特異的に結合する修飾オリゴヌクレオチド配列を含んでなる機能性分子がそのプール中に含まれていれば、この機能性分子がこの膜タンパク質と特異的に結合する。
【００２７】
この様子を、細胞膜を複数回貫通する膜タンパク質（以下、「細胞膜を複数回貫通する膜タンパク質」を「複数回貫通膜タンパク質」と呼称する。）の例で説明すると図４のようになる。図４は本発明に係る機能性分子候補のプールを複数回貫通膜タンパク質６１に接触させ、その後、複数回貫通膜タンパク質６１をプロテアーゼで処理して、複数回貫通膜タンパク質６１に結合していた機能性分子を分離する過程等を模式的に表したものである。棒状の折り畳まれた構造部分が疎水性部分６２であり、ループ状の部分（親水性部分）６３がこの折り畳み構造を繋いでいる。細胞膜中にある場合は、疎水性部分６２が細胞膜の内部（疎水性部分）にあり、ループ状の部分６３が細胞膜外に露出しているものと考えられる。
【００２８】
このような構造の膜タンパク質に本発明に係る機能性分子候補のプールを接触させると、機能性分子候補中に含まれる機能性分子６４が複数回貫通膜タンパク質６１と結合する。
【００２９】
その後、必要であれば、結合しなかった機能性分子候補や余った機能性分子を洗浄により除去する。この洗浄は、複数回貫通膜タンパク質が細胞膜中にある等の理由により固定されたものである場合には、適当なバッファー溶液を流すことによって行うことができる。複数回貫通膜タンパク質が固定されていない場合には、透析膜を用いて結合しなかった機能性分子候補や余った機能性分子を膜外に取り出すことにより洗浄することができる。
【００３０】
このようにして得た複数回貫通膜タンパク質６１をプロテアーゼで処理すると、ループ状の部分６３が優先的に切断されるので、これをゲル濾過、限外濾過、透析膜等で処理して機能性分子を分離回収することができる。
【００３１】
このようにして機能性分子を作製することができる。また、分離により得られた機能性分子に対応する非修飾分子を何らかの方法で増幅し、その配列を解読し、この解読結果をこの機能性分子の配列に翻訳すれば、機能性分子を製造することもできる。なお、本発明に係る「機能性分子に対応する非修飾分子」とは機能性分子からその修飾基が取り外された状態の分子を意味する。
【００３２】
なお、本発明に係る「作製」は、このように、機能性分子候補のプールを、当該膜タンパク質と接触せしめ、その後、当該膜タンパク質をプロテアーゼで処理して、当該膜タンパク質に結合していた機能性分子を分離することにより得ることを意味する。機能性分子と共にあるループ部分（特許文献５参照）は、アルカリ処理等の後処理で容易に取り除くことができるが、用途によってはそのまま機能性分子に結合させたままであってもよい。
【００３３】
また、本発明に係る「製造」は、本発明により「作製」された機能性分子から翻訳された配列に従って機能性分子を別途造ることを意味する。この場合に、別途造る方法については制限はなく、公知の技術を適用することができる。
【００３４】
本発明に係る修飾ヌクレオチドｎ量体を使用することにより、機能性分子候補のプール中に含まれる機能性分子候補の数を非常に大きく取ることができる。このことは、修飾されていないヌクレオチドｎ量体を考えると容易に理解できる。
【００３５】
修飾されていないヌクレオチドは、それがＤＮＡのようにデオキキシリボヌクレオチドからなる場合には、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）の４種の塩基のみが含まれ、ＲＮＡのようにリボヌクレオチドからなる場合には、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）及びシトシン（Ｃ）の４種の塩基のみが含まれることになる（なお、チミンは５−メチルウラシルである。）。従って、それらの組合せはそれぞれ１６種類に限定される。しかしながら、例えばデオキキシリボヌクレオチドのＵ塩基部分とＣ塩基部分とを修飾したものを何種類か導入すれば、塩基の組合せを大幅に増大させることができる。
【００３６】
そのような、修飾されていないヌクレオチドｎ量体と修飾されたヌクレオチドｎ量体とを、ヌクレオシドのｎ個の塩基配列で表して１：１に対応させた対応表の例を表１を用いて説明する。この対応表は、たとえばＡＣの組合せの代わりにＡＣ１の組合せを作製し、ＣＡの組合せの２量体の代わりにＣ２Ａの組合せの２量体を作製すること意味している。なお、この対応表の５’は５’塩基を意味し、３’は３’塩基を意味している。
【００３７】
【表１】
2008199969.tif 000005
このような組合せは、Ｃ塩基部分として６種の修飾基を導入したヌクレオチドモノマー（Ｃ１〜Ｃ６）と、Ｕ塩基部分として６種の修飾基を導入したヌクレオチドモノマー（Ｕ１〜Ｕ６）とを、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣの塩基部分を持つヌクレオチドモノマーと反応させて得ることができる。従って、このような組合せを使用すれば、１２×１２種類の相異なる組合せを得ることができるのである。なお、この対応表については、後で更に詳細に説明する。
【００３８】
本発明で、必要とされる膜タンパク質は、その後の分離と増幅に必要な量だけあれば十分であるので、従来のような多量の膜タンパク質を必要とすることはない。たとえば０．１〜０．５ｍｇで十分であり得る。また、長期間の抗原接種がなくなるため、作製期間を大幅に短縮できる。
【００３９】
人工抗体としての機能を発揮するためには、通常、機能性分子が膜タンパク質の親水性部分と結合することが重要であるので、対象となる膜タンパク質は必ずしも細胞膜から取り出され可溶化されている必要はない。しかしながら、可溶化されている場合には、膜タンパク質を高濃度にできたり、機能性分子の結合がより迅速に行われる場合もあり得るので有利な場合もある。この場合でも、長期間の抗原接種が必要でないため、不溶化の心配をする必要がなくなる。
【００４０】
さらに、免疫動物に頼らず、上記のように多種多様の機能性分子候補を用い、全く生物の関与しない反応により機能性分子を選び出すので、膜タンパク質には、生体間での保存性が高く、抗ヒト抗体を得ようとした場合に動物へ感作すると免疫寛容により抗体が得られない場合が多いという問題を回避することができる。
【００４１】
ヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは整数を表す）におけるｎとしては、２以上が好ましく、２〜１０がより好ましく、２〜３が特に好ましい。
【００４２】
ｎが２未満であると、修飾ヌクレオチドの種類が核酸を構成する４種類のヌクレオチドと差がなく、標的に対する認識力を向上させることができなくなることがある。なお、ｎが４以上であると、増幅過程に起こる可能性のある１塩基欠損や１塩基付加を塩基配列類似性から判別し難くなり、ｎが３であっても最大６４種類もの異なる側鎖を導入することができるので、アミノ酸２０種類から多種多様なタンパク質ができていることを考慮すると、ｎが３でも十分であり、ｎが４以上であってもそれに見合う効果が十分には期待できない一方、合成の負荷の増大が懸念される。
【００４３】
本発明に係る修飾オリゴヌクレオチド配列はデオキキシリボヌクレオチドでもリボヌクレオチドでもよく、これらの混合物であってもよい。また、この場合、一本鎖であってもよいし二本鎖であってもよい。
【００４４】
本発明に係る修飾ヌクレオシドにおいて置換基が導入される位置には特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ピリミジンにおける５位、プリンにおける７位、プリンにおける８位、環外アミンの置換、４−チオウリジンの置換、５−ブロモの置換、５−ヨード−ウラシルの置換などが挙げられる。これらの中でも、増幅（複製）の際の酵素反応を阻害し難い点で、ピリミジンにおける５位、プリンにおける７位などが好ましく、合成の容易さの点で、ピリミジンにおける５位がより好ましい。
【００４５】
このヌクレオシドに置換基を導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記式で示されるヌクレオシドのピリミジン塩基における５位に置換基Ｒを導入する方法などが好適に挙げられる。
【００４６】
【化３】
2008199969.tif 000006
上記の右端の構造のものは、より一般的には、下式｛構造式（１）｝のように表すことができる。構造式（１）においてＰはピリミジン基を表す。
【００４７】
【化４】
2008199969.tif 000007
なお、前記置換基Ｒとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、天然又は非天然のアミノ酸、金属錯体、蛍光色素、酸化還元色素、スピンラベル体、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、下記式（１）〜（１０）で表される基などが挙げられる。
【００４８】
【化５】
2008199969.tif 000008
前記天然又は非天然のアミノ酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、アルギニン、グルタミン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、システイン、スレオニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グリシン、セリンなどが挙げられる。
【００４９】
前記金属錯体としては、金属イオンに配位子が配位した化合物であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｒｕビピリジル錯体、フェロセン錯体、ニッケルイミダゾール錯体などが挙げられる。
【００５０】
前記蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン系列、ローダミン系列、エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光色素などが挙げられる。
【００５１】
前記酸化還元色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ロイコアニリン、ロイコアントシアニン等のロイコ色素などが挙げられる。
【００５２】
前記スピンラベル体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、鉄Ｎ−（ジチオカルボキシ）サルコシン（ｓａｒｃｏｓｉｎｅ）、ＴＥＭＰＯ（テトラメチルピペリジン）誘導体などが挙げられる。
前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基などが挙げられる。
【００５３】
これらは、置換基で更に置換されていてもよい。
【００５４】
前記修飾ヌクレオチド２量体を合成する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジエステル法、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファイト法などが挙げられる。これらの中でも、ホスホロアミダイト法が好適である。
【００５５】
ホスホロアミダイト法は、一般的には、テトラゾールを促進剤としたヌクレオシドホスホロアミダイトとヌクレオシドとの縮合反応を鍵反応として用いる。この反応は、通常、糖部分の水酸基とヌクレオシド塩基部のアミノ基との両方に競合的に起こるが、所望のヌクレオチド合成のためには、糖部分の水酸基にのみ選択的に反応を起こさせる。したがって、アミノ基への副反応を防止するため、保護基で修飾する。例えば、修飾ヌクレオチド２量体（ＡＵ１）は、下記式で示したように、デオキシアデノシンと修飾デオキシウリジンとから合成することができる。
【００５６】
【化６】
2008199969.tif 000009
但し、前記式において、ＤＭＴｒは、ジメトキシトリチル基を表す。
【００５７】
なお、前述した表１に示す、修飾ヌクレオチド２量体（ＡＣ１、Ｃ２Ａ、Ｃ３Ｃ、Ｃ４Ｇ、Ｃ５Ｔ、ＧＣ６、ＡＵ１、ＧＵ２、Ｕ３Ａ、Ｕ４Ｃ、Ｕ５Ｇ、Ｕ６Ｔ）についても同様の方法により合成することができる。
【００５８】
ここで、前記合成した修飾ヌクレオチド２量体を、修飾されていないヌクレオチド２量体と１対１に対応付け（関係付け）する。
【００５９】
前記修飾ヌクレオチド２量体の種類が、５未満であると、核酸を構成する４種のヌクレオチドと大差がなく、標的に対する認識力を十分に向上させることができないことがある。
【００６０】
このような対応表としては、例えば、前述した表１が挙げられる。表１は、横方向（５’側）にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの順に４種のヌクレオシドの塩基を配置し、一方、縦方向（３’側）にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの順に４種のヌクレオシドの塩基を配置し、これら塩基がそれぞれ１対１に対応した１２個のパターン（マス）が形成されている。
【００６１】
また、前記修飾ヌクレオチド２量体の場合と同様に、修飾ヌクレオチド３量体を用いることもでき、この場合における前記対応表としては、例えば表２に示すものが挙げられる。表２には、５６種の修飾ヌクレオチド３量体のパターンが形成されている。なお、前記修飾ヌクレオチド２量体や前記修飾ヌクレオチド３量体の場合と同様に、修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは整数を表す）を用いることもでき、この場合における前記対応表には、例えば、４ｎ個のパターン（４ｎ種の修飾ヌクレオチドｎ量体）を形成しておくことができる。
【００６２】
【表２】
2008199969.tif 000010
表１においては、下記に示すように１２種の修飾ヌクレオチド２量体が条件付けられている。
【００６３】
具体的には、塩基配列は、５’側から３’側方向に読み取り、塩基配列ＡＣには修飾ヌクレオチド２量体ＡＣ１が対応する。配列ＡＴには修飾ヌクレオチド２量体ＡＵ１が対応する。塩基配列ＣＡには修飾ヌクレオチド２量体Ｃ２Ａが対応する。塩基配列ＣＣには修飾ヌクレオチド２量体Ｃ３Ｃが対応する。塩基配列ＣＧには修飾ヌクレオチド２量体Ｃ４Ｇが対応する。塩基配列ＣＴには修飾ヌクレオチド２量体Ｃ２Ａが対応する。塩基配列ＧＣには修飾ヌクレオチド２量体ＧＣ６が対応する。塩基配列ＧＴには修飾ヌクレオチド２量体ＧＵ２が対応する。塩基配列ＴＡには修飾ヌクレオチド２量体Ｕ３Ａが対応する。塩基配列ＴＣには修飾ヌクレオチド２量体Ｕ４Ｃが対応する。塩基配列ＴＧには修飾ヌクレオチド２量体Ｕ５Ｇが対応する。塩基配列ＴＴには修飾ヌクレオチド２量体Ｕ６Ｔが対応する。
【００６４】
なお、対応表（表１）における、塩基配列と修飾ヌクレオチド２量体との条件付けとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、表１はあくまでもその一例である。また、修飾ヌクレオチド２量体を１２種作製することが困難であれば、一部が重複してもよいが、その分、標的に対する認識力は低下することがある。
【００６５】
前記表１において、プリン塩基同士の組合せであるＡＡ、ＡＧ、ＧＡ、ＧＧについては、プリン塩基が修飾に用いる酵素の反応が低いため、修飾ヌクレオチド２量体を作製していないが、これは、プリン塩基同士の修飾ヌクレオチド２量体が作製することができないことを意味するものではない。
【００６６】
前記表１に基づいて、１２種の２量体修飾ヌクレオシドを対応付けることにより、従来の核酸では４種でしかなかったものが、一挙に１２種にまで拡がり、その結果、数多くの種の標的に対して識別力を発揮し得る。
【００６７】
本発明に係る機能性分子候補のプールを構成する修飾オリゴヌクレオチド配列は、図１に示す修飾オリゴヌクレオチド配列１０のように、その両端に固定オリゴヌクレオチド配列２０，２０を有するものであることが、後述する配列解読工程においてＰＣＲ法を行う際に固定オリゴヌクレオチド配列にプライマーを結合させて、効率よく増幅（複製）することができる点で好ましい。なお、修飾オリゴヌクレオチド配列１０と両端の固定オリゴヌクレオチド配列２０，２０とを含めて、本発明に係る修飾オリゴヌクレオチド配列と考えてもよい。また、機能性分子候補は固定オリゴヌクレオチド配列を含み、これに対し、作製され、または製造される機能性分子が固定オリゴヌクレオチド配列を含まないものであることも本発明の範疇に属する。
【００６８】
前記修飾オリゴヌクレオチド配列のヌクレオチド数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０〜１００個が好ましく、１０〜５０個がより好ましい。また、前記固定オリゴヌクレオチド配列のヌクレオチド数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、通常１５個以上が好ましく、２０〜４０個がより好ましい。
【００６９】
本発明に係る機能分子候補のプールを作製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡシンセサイザー（ＤＮＡ自動合成機）を用いる方法などが好適である。
【００７０】
ＤＮＡシンセサイザー（ＤＮＡ自動合成機）を用いる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、図２に示すようなＤＮＡシンセサイザー（ＤＮＡ自動合成機）を用い、合成した修飾ヌクレオチド２量体を複数種混合したもの（図２に示す例では１２種であり、図２中「Ｘ」で表される）を試薬とし、この試薬をコントローラーによる制御の下、ノズル１５により吸い上げて重合させることにより、ランダムであらゆる配列順序の修飾オリゴヌクレオチド配列を有する前記機能分子候補のプールを作製する方法などが好ましい。この方法は、前記機能分子候補のプールを効率よく作製することができる点で有利である。
【００７１】
なお、前記固定ヌクレオチド配列を合成する場合には、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）の４種により同様に合成することができる。
【００７２】
前記機能分子候補のプールを作製する方法としては、また、予め作製しておいたオリゴヌクレオチドランダム配列に対しモノマーブロックを並べてアニーリングし、ＤＮＡリガーゼ又はＲＮＡリガーゼを働かせて結合させることにより機能分子候補のプールを作製する方法なども挙げられる。この方法の場合も、ランダムであらゆる配列順序の修飾オリゴヌクレオチド配列を含む前記機能分子候補のプールを作製することができる。
【００７３】
ＤＮＡリガーゼは、隣接したヌクレオチドの５’リン酸基と３’水酸基の間の、共有結合の形成を触媒する酵素である。これに対し、ＲＮＡリガーゼは、ＲＮＡリガーゼともいい、５’リン酸基末端のポリヌクレオチドと３’水酸基末端のポリヌクレオチドとを連結させる酵素である。ＲＮＡリガーゼの基質は本来はＲＮＡであるが、５’リン酸基末端のポリデオキシリボヌクレオチドと３’端のみがリボヌクレオチドであるポリデオキシリボヌクレオチドも効率的に連結する。
【００７４】
なお、前記機能分子候補のプールは、前記修飾オリゴヌクレオチド配列を含むが、更に必要に応じて、置換基で修飾していないＤＮＡ若しくはＲＮＡのモノマー又はオリゴマーをランダムに重合させた配列を含んでいてもよい。
【００７５】
本発明に係る機能性分子候補のプールを膜タンパク質と接触せしめる方法については特に制限はなく、液状の機能性分子候補のプールに膜タンパク質または膜タンパク質を含む液体を加え、あるいはその逆を行い、適当な温度条件でインキュベートする方法を例示することができる。液状の機能性分子候補のプールの組成、膜タンパク質を含む液体の組成、温度条件等のインキュベーション条件、インキュベーション時間等についても特に制限はないが、膜タンパク質が安定に存在しえる公知の条件から適宜選択することができる。たとえば、ヒスタミンH1-レセプターの場合では、75mM Tris-HCl(pH7.4)、12.5mM MgCl2、1mM EDTAの溶液中で、37℃あるいはまた25℃などで30分から24時間のインキュベーション条件で行うことができる。
【００７６】
インキュベーション後、膜タンパク質に結合しなかった機能性分子候補を除去する。除去される機能性分子候補には、膜タンパク質に結合しない修飾オリゴヌクレオチド配列の他に、膜タンパク質に結合する能力を有するが、その機会がなかった機能性分子も含まれ得る。
【００７７】
その後、前記膜タンパク質をプロテアーゼで処理して、当該膜タンパク質に結合していた機能性分子を分離するが、この処理方法では、単に膜タンパク質を含む液体中にプロテアーゼまたはプロテアーゼの溶液を加え、あるいはこの逆を行い、、膜タンパク質に結合していた機能性分子を分離する。この処理では、たとえば図４のループ状の部分（親水性部分）６３が分解され、機能性分子が分離されてくる。
【００７８】
使用するプロテアーゼについては特に制限はなく、公知のどのようなものを使用してもよい。トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、ズブチリシン等を例示できる。プロテアーゼの溶液のその他の組成については特に制限はなく、プロテアーゼはそれぞれ公知の至適ｐH域にあわせて、例えばトリプシンではpH7から９、キモトリプシンではpH7.5から8.5の範囲であれば公知の組成から選択することができる。例えば、PBS（リン酸緩衝食塩水）やTBS（Tris緩衝食塩水）などの溶液組成でｐHを利用するプロテアーゼの至適pHに調製したものが一般的に用いられる。トリプシンを利用する場合においては、公知のとおり２０ｍM CaCl2を反応溶液に加えることで自己消化を緩和でき、安定に制限消化を行える。
【００７９】
前記分解経過は、可能ならばどのような方法でモニターしてもよい。たとえば、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＡＳＳ（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ−Ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  ＭＡＳＳ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間形質量分析計）などの方法やゲルマトリックスなどを利用した電気泳動あるいは液体クロマトグラフィーを例示することができる。
【００８０】
分解を確認した後、分解に利用したプロテアーゼに対する阻害剤を加えることで、反応を停止させることができる。たとえば、トリプシンを分解に利用した場合にはｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）あるいは４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）などのセリンプロテアーゼ阻害剤を加えることにより、分解反応を停止させる。ただし、分解反応を停止させずに次の工程に移ってもよい場合もある。
【００８１】
その後、膜タンパク質から分離した機能性分子を取り出す。この方法についても特に制限はなく、公知の方法を利用し得る。たとえば、限外ろ過膜あるいはゲルろ過法などを用いて、機能性分子を取り出すことができる。
【００８２】
取り出した機能性分子は、その配列を解読することにより、その製造や機能解析等に役立てることができる。このためには、通常、分離された機能性分子から対応する非修飾分子を増幅し、この増幅した対応非修飾分子の配列を解読し、ついで、この解読結果を分離された機能性分子の配列に翻訳することが必要である。
【００８３】
増幅の方法としては、特に制限はなく、本技術分野において公知の方法の中から適宜選択することができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法などが挙げられる。これらは、１種単独で行ってもよいし、２種以上を行ってもよい。増幅は、機能性分子を元に行ってもよいが、機能性分子から、一旦、その修飾基（置換基）のすべてまたは一部を外してから行ってもよい。修飾基（置換基）の取り外しには、アルカリ処理等公知の方法を採用することができる。
【００８４】
ＰＣＲ法は、ポリメラーゼ連鎖反応法を意味し、ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ合成反応の試験管内での繰り返しにより、その特定のオリゴヌクレオチド領域を数１０万倍に増幅可能な方法である。ＰＣＲ法においては、使用するプライマーの伸長反応は、４種又は５種のヌクレオチド三リン酸｛デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸、及びチミジン三リン酸あるいはデオキシウリジン三リン酸（これらの混合物をｄＮＴＰということもある）｝を基質としてプライマーに取り込ませることにより行われる。
【００８５】
この伸長反応を行う場合、通常核酸鎖を増幅するために単位核酸及び核酸伸長酵素を含む増幅反応試薬が用いられる。この場合、核酸伸長酵素としてはＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ等の任意のＤＮＡポリメラーゼを用いることができるが、特にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましく、これによりサイクル毎に新たな酵素の添加の必要性がなくなり、自動的にサイクルを繰り返すことが可能になり、更にアニーリング温度を５０〜６０℃に設定することが可能なためプライマーによる標的塩基配列認識の特異性を高めることができ、迅速かつ特異的に遺伝子増幅反応を行うことができる（特許文献３，４参照。）。
【００８６】
また、この反応を行う際、反応溶液の水分の蒸発を防止するためにオイルを添加することができる。この場合、オイルは水と分配可能で、かつ水より比重の軽いものであればよく、具体的にはシリコーンオイル、ミネラルオイル等が例示される。また、遺伝子増幅装置によってはこのような媒体を必要としないものもあり、このような遺伝子増幅装置を用いてプライマーの伸長反応を行うこともできる。
【００８７】
このように、前記プライマーを用いて伸長反応を繰り返すことにより、目的とするオリゴヌクレオチドを効率的に遺伝子増幅させることができオリゴヌクレオチドを大量に作製することができる。なお、この遺伝子増幅反応を行う条件等の具体的な方法については、非特許文献１等の文献に記載された公知の方法が挙げられる。
【００８８】
なお、ＰＣＲ法を行うことにより、前記修飾オリゴヌクレオチド配列は、置換基の修飾のないオリゴヌクレオチド配列に置換される。本発明において、「分離された機能性分子から対応する非修飾分子を増幅」すると言うのは、このように、置換基の修飾のないオリゴヌクレオチド配列として増幅されることを意味する。
【００８９】
また、前記修飾オリゴヌクレオチド配列が、デオキキシリボヌクレオチドではなくリボヌクレオチドからなる場合、逆転写反応を行うことによりデオキキシリボヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチド配列を合成することができる。前記逆転写反応とは、リボヌクレオチドを鋳型としてデオキキシリボヌクレオチドを合成する方法であり、対象となるリボヌクレオチドにより、逆転写反応の反応液や反応条件は異なる。例えば、リボヌクレオチド溶液にＲＮａｓｅフリーの滅菌蒸留水と３’−プライマーを添加し、インキュベートした後、冷却して、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２などを含む逆転写緩衝液、ＤＴＴ、ｄＮＴＰｓを加え、逆転写酵素を添加した後インキュベートすること等により行うことができる。該逆転写反応の停止は、インキュベートの条件を調整して行うことができる。なお、このような逆転写反応は、逆転写ＰＣＲによっても行うことができる。
【００９０】
この増幅した対応非修飾分子の配列の解読方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、遺伝子クローニングによる方法、チェーンターミネーター法、サンガー法、ジデオキシ法等によるＤＮＡシーケンサー（ＤＮＡ塩基配列自動決定装置）などが挙げられる。これらは、１種単独で行ってもよいし、２種以上を行ってもよい。
【００９１】
前記遺伝子クローニングでは、増幅したオリゴヌクレオチド配列を組み込んだ発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、この形質転換体を培養すること等により製造することができる。
【００９２】
前記発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、プラスミドとファージとのキメラベクターなどが挙げられる。
【００９３】
前記宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核微生物、酵母菌等の真核微生物、動物細胞などが挙げられる。
【００９４】
上記解読結果を上記分離された機能性分子の配列に翻訳する翻訳工程は、塩基配列を決定した前記対応非修飾分子の配列を、修飾されていないヌクレオチドｎ量体と修飾されたヌクレオチドｎ量体とを、ヌクレオシドのｎ個の塩基配列で表して１：１に対応させた対応表に基づき翻訳する工程である。
【００９５】
この翻訳は、塩基配列を決定した対応非修飾分子の配列における５’末端側からｎ塩基ずつ対応表に基づいて行われることが好ましい。例えば、修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド２量体である場合、非修飾オリゴヌクレオチド配列の５’末端側から２塩基ずつ対応表に基づいて翻訳することができる。具体的には、表１で表される対応表に基づいて翻訳される。例えば、決定された修飾オリゴヌクレオチド配列が“ＡＴＧＣＴＣＴＡＧＣＣＣＣＴ”である場合には、対応表に基づき翻訳すると“ＡＵ１ＧＣ６Ｕ４ＣＵ３ＡＧＣ６Ｃ３ＣＣ５Ｔ”という配列であることが確認され、前記機能性分子の配列を求めることができる。なお、配列中に、定期的にブロックを規定する既知の固定塩基を入れることが好ましい場合も多い。
【００９６】
前記修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド３量体である場合、塩基配列が決定された非修飾オリゴヌクレオチド配列の５’末端側から３塩基ずつ対応表に基づいて翻訳することができる。具体的には、下記表２で表される対応表を用いて翻訳される。
【００９７】
なお、修飾ヌクレオチド３量体を超える場合（ｎ≧４）にも上記同様に、修飾されていないヌクレオチドｎ量体と修飾されたヌクレオチドｎ量体とを、ヌクレオシドのｎ個の塩基配列で表して１：１に対応させた対応表に基づいて翻訳することができる。
【００９８】
このような翻訳により、本発明に係る機能性分子の配列を解読し得る。従って、この解読をベースに、本発明に係る機能性分子を製造することができる。この場合の製造方法については特に制限はなく、公知の方法を使用することができる。例としてホスホロアミダイト法を挙げることができる。
【００９９】
本発明の機能性分子の作製方法および製造方法は、量的制限や時間的制限を受けることが少ない。具体的には、抗原となる膜タンパク質を少量準備するだけで済む。上述のごとくたとえば０．１〜０．５ｍｇで十分であり得る。作製期間を大幅に短縮できる。膜タンパク質が膜に埋もれた状態、可溶化水溶液の状態に関わらず使用でき、必ずしも可溶化する必要がないため、膜タンパク質でも数日後には不溶化してしまうといった心配も解消される。従って、追加免疫操作などは不要なため不溶化しやすい膜タンパク質でも抗体を得ることが可能となる。また、たとえば長期間の抗原接種がなくなるため迅速である。さらに、上記のように多種多様の機能性分子候補を用い、全く生物の関与しない反応により機能性分子を選び出すので、膜タンパク質には、生体間での保存性が高く、抗ヒト抗体を得ようとした場合に動物へ感作すると免疫寛容により抗体が得られない場合が多いという問題を回避することができる。上述の増幅、解読および翻訳を行えば、その後公知の技術を使用して、大量かつ安価に機能性分子を製造することも可能となる。
【０１００】
本発明の機能性分子の作製または製造により得られる本発明の機能性分子は、抗体に匹敵する親和性及び特異性を有し得、各種分野に幅広く好適に使用可能である。例えば、特定の膜タンパク質に親和性を有する機能性分子として確認され、本発明の機能性分子の作製方法または製造方法により得られた本発明の機能性分子は、薬品、ドラッグデリバリーの分野に好適に使用可能である。
【実施例】
【０１０１】
次に本発明の実施例を詳述する。
【０１０２】
図４は、本発明の一実施例の構成図である。精製された膜タンパク質と塩を含むトリス緩衝溶液とからなる溶液に、人工抗体溶液（すなわち、本発明に係る機能性分子候補のプール）を加え、たとえば室温でインキュベートする。結合できなかった人工抗体を溶液から排除するため、バッファーで洗う。
【０１０３】
溶液にトリプシンを加え、インキュベートし膜タンパク質のループ部分を分解する。なお、分解酵素はトリプシンに限定されるものではない。分解の経過は適時ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＡＳＳなどの方法でモニターする。
【０１０４】
分解を確認した後に、分解に利用したプロテアーゼに対する阻害剤を加えることで、反応を停止させる。たとえば、トリプシンを分解に利用した場合にはｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）あるいは４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）などのセリンプロテアーゼ阻害剤を加えることにより、分解反応を停止させる。
【０１０５】
この後、限外ろ過膜あるいはゲルろ過法などを用いて、抗体とタンパク質とを分離する。分離された抗体は、特許文献１、特許文献２に記載されている方法により暗号解読を行い、得られた抗体を同定することができる。
なお、上記に開示した内容から、下記の付記に示した発明が導き出せる。
【０１０６】
（付記１）
膜タンパク質に特異的に結合する機能性分子の作製方法であって、
ヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは整数を表す）をランダムに重合させて得た修飾オリゴヌクレオチド配列を含んでなる機能性分子の候補のプールを、当該膜タンパク質と接触せしめ、
その後、当該膜タンパク質をプロテアーゼで処理して、当該膜タンパク質に結合していた機能性分子を分離する
ことを含む、機能性分子の作製方法。
【０１０７】
（付記２）
前記膜タンパク質が単一種のタンパク質である、付記１に記載の機能性分子の作製方法。
【０１０８】
（付記３）
前記膜タンパク質が細胞膜を複数回貫通する膜タンパク質である、付記１または２に記載の機能性分子の作製方法。
【０１０９】
（付記４）
前記膜タンパク質を細胞膜中に存在した状態で使用する、付記１〜３のいずれかに記載の機能性分子の作製方法。
【０１１０】
（付記５）
前記ｎが２または３である、付記１〜４のいずれかに記載の機能性分子の作製方法。
【０１１１】
（付記６）
前記修飾オリゴヌクレオチド配列がデオキキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはその両者を含む、付記１〜５のいずれかに記載の機能性分子の作製方法。
【０１１２】
（付記７）
前記置換基が、ヌクレオシドにおけるピリミジン塩基の５位に導入されたものである、付記１〜６のいずれかに記載の機能性分子の作製方法。
【０１１３】
（付記８）
前記置換基が、下記構造式（Ｉ）で表される基から選択されたものである、付記１〜７のいずれかに記載の機能性分子の作製方法。
【０１１４】
【化７】
2008199969.tif 000011
｛ここで、構造式（Ｉ）中、Ｒは、天然又は非天然のアミノ酸、金属錯体、蛍光色素、酸化還元色素、スピンラベル体、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、及び下記式（１）〜（１０）から選ばれるいずれかの基を表す。Ｐは、ピリミジン塩基を表す。｝。
【０１１５】
【化８】
2008199969.tif 000012
（付記９）
ヌクレオチドランダム配列に対しヌクレオチドモノマーをアニーリングさせ、当該ヌクレオチドモノマーをＤＮＡリガーゼ及びＲＮＡリガーゼの少なくともいずれかにより連結させて前記修飾オリゴヌクレオチド配列を合成することを含む、付記１〜８のいずれかに記載の機能性分子の作製方法。
【０１１６】
（付記１０）
前記機能分子候補のプールに含まれる修飾オリゴヌクレオチド配列が、両端に固定オリゴヌクレオチド配列を有する、付記１〜９のいずれかに記載の機能性分子の作製方法。
【０１１７】
（付記１１）
付記１〜１０のいずれかに記載の機能性分子の作製方法によって作製された機能性分子から対応する非修飾分子を増幅し、
当該増幅した対応非修飾分子の配列を解読し、
当該解読結果を当該機能性分子の配列に翻訳することを含む、
機能性分子の製造方法。
【０１１８】
（付記１２）
前記増幅を、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、３ＳＲ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法及びＬＡＭＰ法から選択されるいずれかの方法により行う、付記１１に記載の機能性分子の製造方法。
【０１１９】
（付記１３）
塩基配列を決定した対応非修飾分子の配列を、修飾されていないヌクレオチドｎ量体と修飾されたヌクレオチドｎ量体とを、ヌクレオシドのｎ個の塩基配列で表して１：１に対応させた対応表に基づき翻訳することを含む、付記１１または１２に記載の機能性分子の製造方法。
【０１２０】
（付記１４）
前記翻訳を、前記塩基配列を決定した対応非修飾分子の配列における５’末端側からｎ塩基ずつ、前記対応表に基づいて行う、付記１３に記載の機能性分子の製造方法。
【０１２１】
（付記１５）
前記修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド２量体である、付記１４に記載の機能性分子の製造方法。
【０１２２】
（付記１６）
前記修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド３量体である、付記１４に記載の機能性分子の製造方法。
【０１２３】
（付記１７）
付記１１〜１６のいずれかに記載の機能性分子の製造方法によって製造された機能性分子。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】両端に固定オリゴヌクレオチド配列を有する修飾オリゴヌクレオチド配列を示す模式図である。
【図２】ＤＮＡシンセサイザーによる修飾ヌクレオチド２量体の合成を示す模式図である。
【図３】細胞膜の模式的断面図である。
【図４】複数回貫通膜タンパク質を用いて本発明に係る機能性分子を作製する過程を示す模式図である。
【符号の説明】
【０１２５】
１０  修飾オリゴヌクレオチド配列
１５  ノズル
２０  固定オリゴヌクレオチド配列
５２  親水性部
５３  疎水性部
５４  脂質
５１  細胞膜
５５  膜タンパク質
６１  複数回貫通膜タンパク質
６２  疎水性部分
６３  ループ状の部分
６４  機能性分子
【図１】
2008199969.tif 000013
【図２】
2008199969.tif 000014
【図３】
2008199969.tif 000015
【図４】
2008199969.tif 000016