(57)【要約】【課題】溶液中の分析物を高密度に集積し、簡便かつ高感度で検出し得る方法、および装置を提供する。【解決手段】目的の分析物を、支持層とこの支持層上に配置された塑性変形層と前記支持層上に固定された核酸プローブとを備えた基板の、前記核酸プローブに捕獲する工程、前記基板上の領域にエネルギーを与え、前記分析物が捕獲された領域の前記塑性変形層を改変し、前記基板に凹凸形状を形成する工程、およびこの凹凸形状を走査型プローブ顕微鏡で検出し、それによって該分析物の存在を検出する工程、を包含する、分析物測定方法であり、溶液中の分析物を高密度に集積し、簡便かつ高感度で検出し得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の分析物を、支持層とこの支持層上に配置された塑性変形層と前記支持層上に固定された核酸プローブとを備えた基板の、前記核酸プローブに捕獲する工程、
前記基板上の領域にエネルギーを与え、前記分析物が捕獲された領域の前記塑性変形層を改変し、前記基板に凹凸形状を形成する工程、および
この凹凸形状を走査型プローブ顕微鏡で検出し、それによって該分析物の存在を検出する工程、を包含する、分析物測定方法。
【請求項２】
前記分析物が核酸である、請求項１に記載の分析物測定方法。
【請求項３】
前記エネルギーは、前記走査型プローブ顕微鏡のプローブまたは探針の熱である請求項１に記載の分析物測定方法。
【請求項４】
遺伝子を検出するための自動遺伝子検出装置であって、
支持層と、この支持層上に配置された塑性変形層と、前記支持層上に固定化された核酸プローブとを有する基板と、
該基板を移動する手段と、
分析物を含有するサンプル溶液および該基板を収容する反応槽と、
該基板を洗浄する手段と、
該基板上の領域にエネルギーを付与する手段と、
該基板の凹凸形状変化を検出する走査型プローブ顕微鏡を備える、自動遺伝子検出装置。
【請求項５】
前記走査型プローブ顕微鏡が、走査型トンネル顕微鏡、原子間力顕微鏡、摩擦力顕微鏡、マクスウエル応力顕微鏡、磁気力顕微鏡、フォトン走査型トンネル顕微鏡、走査型近接視野光学顕微鏡、または走査型近接場音響顕微鏡である、請求項４に記載の自動遺伝子検出装置。
【請求項６】
前記走査型プローブ顕微鏡が、プローブまたは探針と前記基板との間に電圧を印加する手段を有する請求項４に記載の自動遺伝子検出装置。
【請求項７】
前記走査型プローブ顕微鏡のプローブまたは探針が振動する機構を有する、請求項４に記載の自動遺伝子検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中の分析物を簡便かつ高感度で検出する方法および装置に関する。より詳細には、本発明は、溶液中に目的の核酸が存在するか否かを特異的に検出する方法および遺伝子検出装置に関する。本発明の方法およびデバイスは高密度の集積化が可能であって、治療薬などの薬剤のスクリーニング、遺伝子のフィンガープリンティング、ハイブリダイゼーションによる遺伝子の塩基配列の決定（ＳＢＨ：Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｙ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に適用可能である。
【背景技術】
【０００２】
生物中に存在する全遺伝子の数は、酵母で約６，０００個、ヒトで約１００，０００個といわれている。ヒトの遺伝子の配列決定はほぼ終了しており、また、ヒト遺伝子の８０％以上は、ＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ：ｃＤＮＡの末端から２００〜３００塩基の配列を読んだもの）として、それらの一部配列が既に公表されているといわれている。
【０００３】
一般に、細胞または組織ごとの遺伝型の解析、遺伝子発現パターンの比較、遺伝子変異多型のマッピング（診断）、ゲノムに存在する機能的塩基配列の解析などの遺伝子検出法では、一本鎖に変性した遺伝子サンプルに特異的にハイブリダイズした核酸プローブを検出することによって目的遺伝子の存在が確認される。最近、このような遺伝子検出法では、ＤＮＡチップが採用されている。例えば、Ｈｙｓｅｑ社は、ＤＮＡチップを用いた塩基配列解析法を開示する（特許文献１を参照のこと）。
【０００４】
ＤＮＡチップは、生体に含まれる全遺伝子を、１〜２日間程度で解析可能といわれており、簡便で迅速な塩基配列の解析が可能であることから、ＤＮＡチップの利用技術開発は急速に進んでいる。しかし、ＤＮＡチップを用いて、未知の配列の決定を行う場合の問題点として、ＤＮＡチップが、遺伝子と核酸プローブとの間のいくつかの末端ミスマッチに対して完全マッチと同等のシグナルを与えることが指摘されている。それ故、この末端ミスマッチと完全マッチとの識別を正確に行う方法について技術的な検討が必要である。
【０００５】
ＤＮＡチップを含む従来技術の代表的な遺伝子分析法について説明する。まず、生物試料から遺伝子を抽出し、必要であれば適切な制限酵素で切断した後、電気泳動およびサザンブロットを行なう。次に、目的とする遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する核酸プローブを放射性同位元素または蛍光色素などで標識し、ブロットされた遺伝子とハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズした核酸を、低温でＸ線フィルムに感光させた後ＲＩスキャナーを用いるか、レーザを照射して発生する蛍光放射を蛍光スキャナーを用いるか、または高感度ＣＣＤカメラなどの光検出器や光電子倍増管を用いて蛍光標識した物質を検出することで、ハイブリダイズした核酸プローブを検出し、それによって目的とする遺伝子の存在を確認する。
【０００６】
しかし、上記放射性同位元素を用いた検出法は、放射性同位元素を使用するため診断場所が限定され、試薬の取扱いにも十分注意しなければならない。また、遺伝子検出までに長時間を要し、測定操作もかなり繁雑かつ複雑であるという問題がある。その操作も資格を有するオペレ−タが行なわなければならない。これに加えて廃棄物の処理などにも注意を必要とする。
【０００７】
この点を改善するために、放射性同位元素に代わる安全なラベル剤の開発が進められており、例えば、アビジン−ビオチン結合を利用する方法、酵素や蛍光物質を使用する方法など、いくつかのプローブ検出方法が既に提案されている。このような検出方法で用いられるスキャナーは、数十ミクロン程度のサイズを検出し得る性能を有し、間隔が１００ミクロン程度のスポットを定量的に識別することができる。しかし、２波長、多いもので５波長のレーザを用いる場合など、多数の標識には十分対応できず、そして広範囲を高速でスキャンできない。例えば、共焦点レーザを用いたスキャナーは、５〜５０μｍの比較的低い解像度しか有さず、上記のようなプローブ検出方法の高密度集積化の障害となっている。また、本当にターゲットの配列と合致した結合により蛍光を発しているのか、またはミスマッチのまま結合が起こって生じる非特異的な擬陽性の信号であるのかを評価することができないという課題を有している。
【０００８】
その他の検出法として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ）を用いた質量分析検出法がある（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社のＤＮＡ  ＭａｓｓＡｒｒａｙ）。このＴＯＦ質量分析器は、サンプルをイオン化し、磁場型または、４重極型の装置により質量／電化比に従ってサンプル分子を分離し、発生したイオンが検出器を１周するのに要する時間を測定する。ＴＯＦ質量分析器を用いれば、例えば、ＤＮＡチップに結合した目的の遺伝子のフラグメントをプライマー伸張反応することによって、結合した相補的なＤＮＡ配列のラダーを生じさせ、１〜２ダルトンの精度でその質量を検出できる。しかし、その原理上、実際の分析時間は非常に短いにもかかわらず、一方で、生物学的サンプルを質量分析するまでには複雑なサンプル準備作業を行う必要があり、結果として測定に非常に時間がかかる。また、現在投入されているシステムが大掛かりであり、装置の準備等にも時間がかかる。
【０００９】
また、特許文献２は、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応を無標識で検出する方法および装置を開示している。この装置は、ＤＮＡ分離抽出モジュール、増幅モジュール、および検出モジュールを備え、チップ上のプローブと、検体中の変性一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって生じる２本鎖形成にともなう位相差の変化を検出する。
【００１０】
近年、極微細探針を用いた走査トンネル顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＴＭ）に代表される走査型プローブ顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＰＭ）が開発され、これを用い、原子オーダーあるいは、ナノメートルオーダーの表面観察、原子操作や表面改質が盛んに行われるようになった。特にデータストレージ応用の観点から、記憶媒体の表面修飾や表面改質が行われ、ナノメートルサイズの凹凸構造が作製されている。走査型プローブ顕微鏡を用いれば、サンプル表面の幾何学的形状だけでなく、サンプルの磁気力分布、表面電位、光学情報などの物理特性をナノメートルオーダーの分解能で制御することが可能である。これは、探針とサンプル間に印加する電圧、これに伴う電子注入、熱、微小力などの作用をナノメートル領域で制御することで達成される。
【００１１】
中でも、１９８９年スタンフォード大のＣ．Ｆ．Ｏｕａｔｅ教授らのグループはＳＴＭによる電流加熱によりグラファイト表面にナノメートルオーダーのピット構造を形成し、超高密度記録の可能性を示した。これを契機に、現在、世界的にこのような微細加工技術を将来のストレージ技術に応用しようとする研究が盛んに行われている。例えば、１９９０年ＭａｍｉｎらはＳＴＭを用い、金の電界蒸発によるドット記録技術を示し、また、Ｂｅｔｚｉｇらも１９９２年近接場光顕微鏡ＳＮＯＭによる光磁気記録を示し、日本国内でもＳａｔｏらがＳＴＭによる相変化記録を示し、Ｈｏｓｏｋｉらが原子操作によるアトミックストレージの可能性の検証を行った。
【００１２】
また、Ｍ．Ｄｅｓｐｏｎｄらは、非特許文献１において、ＳＰＭプローブ（探針）先端の耐摩耗性の向上、探針の加熱機構の搭載などによって、たわみ検出センサを搭載したＡＦＭ探針を、同一平面で３２×３２のマトリクス状に配列し、加熱した探針をＰＭＭＡ樹脂製の記録媒体に押し付けることで窪みを形成し、凹凸を検出することでデータを記録および再生するデータストレージ装置のプロトタイプを示した。この方式によって記録されたデータマークサイズは約４０ｎｍであり、４００ＧＢ／ｉｎｃｈ2の記録密度に相当する。
【００１３】
その他には、非特許文献２、非特許文献３などがある。しかし、本発明者らの知る限り、走査型プローブ顕微鏡をＤＮＡチップと組み合わせ、遺伝子分析法に適用した先行技術は存在していない。
【特許文献１】米国特許第５，５２５，４６４号明細書
【特許文献２】特開平１０−２３９００号公報
【特許文献３】特開平０２−２４２１４４号公報（特に第２図およびその説明）
【非特許文献１】Ｍ．Ｄｅｓｐｏｎｄら、「ＶＬＳＩ−ＮＥＭＳ  Ｃｈｉｐ  ｆｏｒ  ＡＦＭ  Ｄａｔａ  Ｓｔｏｒａｇｅ」、ＩＥＥＥ  Ｍｉｃｒｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｄｉｇｅｓｔ  １９９９、ｐｐ５６４−５６９
【非特許文献２】Ｖｅｔｔｉｇｅｒ、Ｐ．；Ｄｅｓｐｏｎｔ、Ｍ．；Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒ、Ｕ．；Ｄｕｒｉｇ、Ｕ．；Ｈａｂｅｒｌｅ、Ｗ．；Ｌｕｔｗｙｃｈｅ、Ｍ．Ｉ．；Ｒｏｔｈｕｉｚｅｎ、Ｈ．Ｅ．；Ｓｔｕｔｚ、Ｒ．；Ｗｉｄｍｅｒ、Ｒ．；Ｂｉｎｎｉｇ、Ｇ．Ｋ．「Ｍｉｌｌｉｐｅｄｅ」  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ  ｔｈｏｕｓａｎｄ  ｔｉｐｓ  ｆｏｒ  ｆｕｔｕｒｅ  ＡＦＭ  ｄａｔａ  ｓｔｏｒａｇｅ
【非特許文献３】ＩＢＭ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｖｏｌ．４４・Ｉｓｓｕｅ  ３  ３２３−３４０、２０００
【非特許文献４】Ｃ．Ａ．Ｊ．Ｐｕｔｍａｎ  ｅｔ．  ａｌ．「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」  ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １４：３５６−３６１（１９９３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は上記従来技術の課題を解決し、溶液中の分析物を高密度に集積し、簡便かつ高感度で検出し得る方法および装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は分析物測定方法に関し、この方法は、目的の分析物を基板上の少なくとも１つの領域に捕獲する工程、上記分析物が捕獲された領域の幾何学的形状を改変する工程、および改変された幾何学的形状を検出し、それによって上記分析物の存在を検出する工程を包含する。
【００１６】
好ましくは、上記幾何学的形状を改変する工程は、上記領域にエネルギーを与えることによって行われる。
【００１７】
好ましくは、上記幾何学的形状を改変する工程は、基板に捕獲された分析物に特異的に結合する標識物質の存在下で行われる。
【００１８】
好ましくは、上記分析物は標識物質を有する。
【００１９】
好ましくは、上記標識物質は遮光物質である。
【００２０】
好ましくは、上記標識物質は光硬化性樹脂である。
【００２１】
好ましくは、上記分析物は核酸であり得る。
【００２２】
好ましくは、上記エネルギーは、可視光、紫外線光、赤外光、Ｘ線、および電子線からなる群から選択される。
【００２３】
好ましくは、上記方法は、上記改変された幾何学的形状を固定処理する工程をさらに包含する。
【００２４】
本発明は、１つの局面で、分析物が捕獲されることによって幾何学的に形状変化し得るセンサ基板に関し、この基板は、支持層、およびこの支持層の上に配置された形状変化する層を備える。
【００２５】
好ましくは、上記形状変化する層は、フォトレジスト樹脂を含む。
【００２６】
好ましくは、上記形状変化する層は、塑性変形する材料または非弾性変化する材料を含む。
【００２７】
本発明はまた、１つの局面で、分析物が捕獲されることによって形状変化した基板に関し、この基板は、支持層、およびこの支持層の上に配置された形状変化した層を備える。
【００２８】
好ましくは、上記形状変化した層は、固定処理されている。
【００２９】
好ましくは、上記分析物は特定の塩基配列を有する遺伝子であり、上記支持層にこの遺伝子の核酸プローブが固定化されている。
【００３０】
本発明はまた、１つの局面で、遺伝子を検出するための自動遺伝子検出装置に関し、この装置は、上記基板、この基板を移動する手段、分析物を含有するサンプル溶液および該基板を収容する反応槽、上記基板を洗浄する手段、この基板上の領域にエネルギーを付与する手段、およびこの基板の幾何学的形状変化を検出する手段を備える。
【００３１】
好ましくは、この装置は、上記基板に捕獲された分析物に特異的に結合する標識物質を収容する貯留槽をさらに備える。
【００３２】
好ましくは、上記幾何学的形状変化を検出する手段は、触針式表面粗さ計である。
【００３３】
好ましくは、上記触針式表面粗さ計は、振動型触針式表面粗さ計である。
【００３４】
好ましくは、上記振動型触針式表面粗さ計は、音叉型水晶振動子、電子回路用マイクロフォーク、圧電材料、または圧電性を有するセラミックを備える。
【００３５】
好ましくは、上記幾何学的形状変化を検出する手段は、光学式表面形状測定器である。
【００３６】
好ましくは、上記幾何学的形状変化を検出する手段は、走査型プローブ顕微鏡である。
【００３７】
好ましくは、上記走査型プローブ顕微鏡は、走査型トンネル顕微鏡、原子間力顕微鏡、摩擦力顕微鏡、マクスウエル応力顕微鏡、磁気力顕微鏡、フォトン走査型トンネル顕微鏡、走査型近接視野光学顕微鏡、または走査型近接場音響顕微鏡である。
【００３８】
好ましくは、上記走査型プローブ顕微鏡は、プローブまたは探針と該遺伝子センサ基板の間に電圧を印加する手段を有する。
【００３９】
好ましくは、上記プローブまたは探針は、振動する機構を有する。
【発明の効果】
【００４０】
溶液中の分析物を高密度に集積し、簡便かつ高感度で検出し得る方法および装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下では、目的の分析物が核酸、特にＤＮＡである場合の本発明の実施の形態について説明するが、これらは本発明の例示であって、限定するものではない。
【００４２】
（実施の形態１）
本実施の形態では、表面にフォトレジストを塗布した基板を遺伝子センサとして用いる。フォトレジストとしては、光曝露で溶けるポジ型フォトレジストまたは光曝露で重合するネガ型フォトレジストを用い得る。
【００４３】
図１に、ポジ型フォトレジストを用いる本実施の形態の概略、およびこれに用いる遺伝子センサの概略を示す。図示されるように、基板１０１は、支持層１０６およびポジ型フォトレジスト層１０５を備える。支持層１０６として、単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表される半導体材料；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、セラミクスなどの無機材料；およびポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステ
ル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料を用い得る。好ましくは、アモルファスシリコン、またはガラスが支持層１０６として用いられる。
【００４４】
ポジ型フォトレジスト層１０５として、ノボラック樹脂をベース樹脂とするノボラック樹脂−ジアゾナフトキノン（ＤＮＱ）系レジスト、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）およびＰＭＭＡとの共重合体、ポリメチレンスルホン、ポリヘキサフルオロブチルメタクリレート、ポリメチルイソプロペニルケトン（ＰＭＩＰＫ）、放射線分解型ポリマーレジスト＝臭化ポリ１−トリメチルシリルプロピンなど、溶解抑制剤系レジスト＝コール酸−０−ニトロベンジルエステルなどの材料が用いられ得る。好ましくは、ノボラック樹脂−ジアゾナフトキノン（ＤＮＱ）系レジストが用いられる。
【００４５】
測定に際しては、基板１０１の支持層１０６上に、一本鎖に変性された核酸プローブ１０２が所定の間隔でシランカップリングなどの方法により固定化される。核酸プローブの固定化は当業者に公知の任意の方法を用いて行われ得る。なお、本明細書で用いる用語「遺伝子センサ」は、核酸プローブが固定化された基板をいうために用いる。図１の左上では、分析物核酸１０３に、標識物質として、遮光物質１０４が結合されて示される。遮光物質１０４として、チタン白、カーボン黒、亜鉛華、湯煙、黄鉛、トルイジンブルーなどの有色顔料などの無機材料、または、鉄、コバルト、亜鉛、チタン、錫、アルミ、ニッケル、およびマンガンから選ばれる金属の混合物、およびこれら金属の錯体などを用い得る。遮光物質１０４は、当業者に公知の任意の方法を用いて分析物核酸１０３に結合し得る。あるいは、図１の右上に示すように、分析物核酸１０３と一本鎖核酸プローブ
１０２とのハイブリダイゼーションの際に、光を遮蔽する遮光基をもった二本鎖だけに特異的に挿入される挿入剤１０８を存在させ、形成される二本鎖に導入してもよい。このような挿入剤として、例えば、フェニル基などの平板状挿入基を有する二本鎖挿入剤がある。例として、ビピリジンプラチナ錯体、タ−ピリジンプラチナ錯体などのプラチナ錯体、クロム錯体、亜鉛錯体、コバルト錯体などがあげられる。核酸プローブと分析物核酸とのハイブリダイゼーションの条件は、当業者に公知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂａｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂａｒ（１９８２）などの成書に記載されている。
【００４６】
ハイブリダイゼーションの後、光源１０９により基板の表面領域に紫外線光を照射する。紫外線光への曝露によりポジ型フォトレジスト層１０５は溶解する。その一方、遮光修飾物質１０４もしくは遮光挿入剤１０８が存在する領域、つまり形成された二本鎖が捕捉された基板上の領域（以下二本鎖形成領域）は遮光されるため、ポジ型フォトレジスト層１０５は、図１の下に示されるように溶解せずに残る。
【００４７】
ここで、ＡＦＭ探針１１３などにより、支持層１０６の表面上に残ったポジ型フォトレジスト層により形成される凹凸形状を、ＡＦＭ駆動装置１１２により走査する。ＡＦＭ（Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：原子間力顕微鏡）は、ＳＴＭで絶縁体の表面形状を測定するために、ＳＴＭを発明したビニッヒ博士が、米国スタンフォード大学のクウェート教授と共同で考案した装置である。ＡＦＭでは、ＳＴＭ探針と絶縁体試料表面の間に小さな柔らかいテコが挿入されている。ここで、レーザ光源１０９からレーザをＡＦＭ探針１０７背面に斜めから入射し、探針の変位によるレーザ光の反射角度の変化を位置解析装置１１１を用いて読み取り、支持層１０６の表面凹凸形状を知ることにより、核酸プローブと分析物核酸とのハイブリダイゼーションを検出し得る。
【００４８】
なお、このような、凹凸形状が刻印された基板１０１は、例えば、１２０℃で１０分間ベイクすることにより、その形状を半永久的に保存し得、必要に応じて、随時、被験試料のデータベースとして用い得る。
【００４９】
図２に、ポジ型レジストをマスクとして用い、図１に示す実施の形態に加え、さらに支持層をエッチングする本発明の改変例の概略を示す。
【００５０】
基板の構成は図１に示す例と同じである。ハイブリダイゼーションの後、光源１０９から基板１０１表面に紫外線を照射することによって形成された、二本鎖形成領域２１３のみを、ポジ型フォトレジスト１０５を用いてマスクをパターニングする。その後、支持層１０６をエッチングなどによりさらに加工することで、図２の下に示される支持層形状１１４に見られるように、支持層１０６において、二本鎖形成領域の凹凸形状が拡大される。
【００５１】
このようなエッチングする工程をさらに行うことで、ｉ）二本鎖形成領域の凹凸形状が拡大されて、形状測定の感度が増大する、そしてｉｉ）支持層を加工することにより、被験試料のデータベースとして基板の保存性が高められる、という効果が得られる。
【００５２】
エッチングは、当業者に公知の任意の方法によって行われ、これには、ドライエッチング、またはウェットエッチングのいずれをも適用され得る。支持層を腐食させるエッチャントは、必要に応じて、等方性のエッチャント、または異方性のエッチャントが選択され得る。等方性のウェットエッチャントとして、例えば、単結晶シリコン（Ｓｉ）を熱酸化することにより得られたシリコン酸化膜（ＳｉＯ2）を支持層１０６として用いる場合、フッ酸（ＨＦ）とフッ化アンモニウム（ＮＨ4Ｆ）が知られる。等方性のドライエッチャントとして、例えば、ポリシリコン（ｐ−Ｓｉ）を支持層１０６として用いる場合、ＣＦ4ガスが知られる。異方性のウェットエッチャントとして、単結晶シリコンを支持層１０６として用いる場合、水酸化カリウム、ヒドラジン、ＥＰＷ（エレチンジアミン−ピロカテコール−水）、ＴＭＡＨ（水酸化テトラメチルアンモニウム）など知られる。いずれも結晶面に対するエッチング速度の違いを利用して異方性を実現するが、ＴＭＡＨが好適に用いられる。異方性のドライエッチャントとして、ＣＦ4ガスを主成分とするその他の成分との混合ガスで異方性エッチングを実現することが知られている。
【００５３】
図３に、等方性エッチングを施したときに得られる基板支持層の形状１１５、および異方性エッチングを施したときに得られる基板支持層の形状１１６を示す。図３に示されるように、異方性エッチングでは、支持層は、その結晶面に沿って加工されるため、二本鎖形成領域は、拡大された凸形状（底面積が大きい台地状形状）として拡大される。
【００５４】
次に、ネガ型フォトレジストを用いる例について説明する。
【００５５】
図４は、ネガ型フォトレジストを用いる本発明の方法の概略、およびこれに用いる遺伝子センサの概略である。上記のポジ型フォトレジストを用いる場合と比べ、フォトレジスト層がネガ型フォトレジスト層４１７であることを除いて基板の構成は同じである。ネガ型フォトレジスト層４１７の材料として、ＵＶレジストである環化ポリイソプレン−芳香族ビスアジド系レジスト、フェノール樹脂−芳香族アジド化合物系レジスト、ポリビニルフエノール−３、３'−ジアジドジ
フェニルスルホン、ポリメタクリ酸グリシジルなどを用い得る。環化ポリイソプレンをベースポリマーとするアジド化合物、例えば、２−６−ジ（４−ジドベザール）−４−メチルシクロヘキサノンなどが好適に用いられる。
【００５６】
この例では、ハイブリダイゼーションの後、光源１０９（図示せず）からの紫外線光の照射によってネガ型フォトレジスト層４１７は光重合する。その一方、遮光修飾物質１０４または遮光挿入剤１０８が存在する領域は遮光されるため、ネガ型フォトレジスト層４１７は光重合せずに溶解する。
【００５７】
ネガ型フォトレジスト層を用いる場合においても、支持層をさらにエッチングすることにより二本鎖形成領域の形状を拡大し得る。これは、ネガ型レジストをマスクとして支持層をエッチングすることにより達成される。二本鎖形成領域のみを選択的に、ネガ型フォトレジスト４１７を用いてマスクをパターニングする。その後、支持層１０６をエッチングにより加工することで、図４の下に示す支持層形状４１８に見られるように、支持層１０６には、二本鎖形成領域に形成された凹部の深さが拡大される。
【００５８】
このようなエッチングする工程をさらに行うことで、ネガ型フォトレジストを用いた場合にも、ｉ）二本鎖形成領域の凹凸形状が拡大されて、形状測定の感度が増大する、そしてｉｉ）支持層を加工することにより、被験試料のデータベースとして基板の保存性が高められる、という効果が得られる。
【００５９】
図５に、等方性エッチングを施したときの基板支持層の形状５１９、および異方性エッチングを施したときの基板支持層の形状５２０を示す。図５に示されるように、等方性エッチングでは、支持層は、その結晶面に沿って加工され、二本鎖形成領域は凹形状として拡大される。
【００６０】
（遺伝子センサの製造例と使用）
基板１０１の支持層１０６として単結晶シリコンを用いた。最初に、単結晶シリコンを含む支持層１０６をクリーンオーブン内で２０分間ベイクした。支持層１０６の表面を脱水した後、スピナーを用いて、フォトレジストを３５００ｒｐｍで３０秒間スピンコートして成膜し、９０℃で１０分間ベイクした。
【００６１】
得られた基板１０１を、ＮａＯＨ＋９５％エタノールに室温で２時間ゆっくりと振盪しながら浸漬した。次いで、蒸留水で３回リンスした後、基板１０１を、ポリＬリシン（Ｐ８９２０、シグマ社製）希釈液に１時間浸漬した。基板１０１をこの希釈液から取り出し、マイクロタイタープレート用遠心機を用いて５００ｒｐｍで１分間遠心し、残存するポリＬリシン希釈液を除いた後、吸引式恒温機に入れ、４０℃で５分間乾燥させた。
【００６２】
得られた基板１０１の表面に、核酸プローブとして、１０μＭのＫ−ｒａｓＤＮＡ  ｌｉｇａｎｄ（５’−ＣＣＡ−ＣＣＡ−ＧＣＴ−ＣＣＧ−５’）／ＴＥバッファー溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、1ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸））を1０μｌスポットし、風乾することによりこの一本鎖ＤＮＡを基板表面に固定した。なお、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃは、それぞれＤＮＡ核酸の塩基配列を示す。
【００６３】
次いで、基板を純水で洗浄した後、分析物核酸として１０μＭ Ｋ−ｒａｓＤＮＡ  ｌｉｇａｎｄ（５’−ＣＣＡ−ＣＣＡ−ＧＣＴ−ＣＣＧ−５’）／ＴＥバッファー溶液を５０μｌ加えて、６５℃恒温槽中で１０時間ハイブリダイゼーション反応をおこなった。そのまま基板を０．０３％ＳＤＳ、ＳＳＣ（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム）中に静かに入れ、軽く洗浄後、取り出し、マイクロタイタープレート用遠心機を用いて５００ｒｐｍ、１分間遠心分離し、水分を飛ばした。次いで、４秒間露光し、そして７０秒間現像した。得られた基板を純水で３０秒リンスした後、１２０℃で１０分間ベイクした。ＡＦＭ探針７０７を用い、得られた基板上の２μｍ×２μｍの領域を走査し、表面形状を測定した。
【００６４】
（実施の形態２）
本実施の形態では、光硬化性樹脂を用い、遺伝子センサの二本鎖形成領域に光硬化性樹脂を凝集させて基板上に凸部を形成する。
【００６５】
図６に、本実施の形態、およびこれに用いる基板の概略を示す。基板６０１は支持層６０６からなる。支持層６０６として用いられる材料として、単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表される半導体材料；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、セラミクスなどの無機材料；およびポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料が用いられ得る。好ましくは、基板材料として石英ガラスが用いられる。
【００６６】
測定に際しては、上記実施の形態１と同様に、支持層６０６上に一本鎖に変性された核酸プローブ１０２を所定の間隔でシランカップリングなどにより固定化する。ここで、分析物核酸１０３には、あらかじめ光硬化性樹脂６０４が結合されている（図６の上の左に示される）。あるいは、分析物核酸１０３と、一本鎖核酸プローブ１０２とがハイブリダイズするときに、光硬化を起こす官能基をもつ、二本鎖だけに特異的に挿入される挿入剤６０５を存在させ形成される二本鎖に挿入してもよい（図６の上の右に示される）。いずれの場合も、光に暴露されると硬化する光硬化性の性質を持つ材料が、二本鎖形成位置にだけ特異的に存在することになる。光硬化性樹脂６０４として、ベンゾフェノンまたはその置換誘導体、ベンゾインまたはその置換誘導体、アセトフェノンまたはその置換誘導体、ベンジルオキシムなどのオキシム系化合物などから選択される１つ以上の光重合開始剤を約２〜１０重量％含有する、ポリエステルアクリレート、エポキシアクリレート、ウレタンアクリレートなどが好適に用いられ得る。その他、必要に応じ、光硬化性樹脂６０４は、増感剤、充填剤、不活性有機ポリマー、レベリング剤、チキソトロープ性付与剤、熱重合禁止剤などの助触媒的な役割を持つ化学物質を適宜含み得る。
【００６７】
ハイブリダイゼーション反応の後、光源６０９によって基板に光を照射する。用いられる光硬化性樹脂に依存して、２００ｎｍ〜８００ｎｍの波長を有する光を基板に照射する。紫外線光が好適に用いられる。光の照射によって硬化した樹脂は、基板６０１上の二本鎖形成領域で凝集し、凸形状の凝集体６１３を形成する。
【００６８】
ここで、ＡＦＭ探針１１３などにより、支持層６０１の表面上に形成された凝集体の形状を、ＡＦＭ駆動装置１１２により走査する。ここで、ＡＦＭ探針の背面１０７にレーザ光源１０９からレーザを照射し、ＡＦＭ探針１１３を追従するレーザ光源１０９の位置を解析装置１１１を用いて読み取ることにより、プローブと分析物核酸とのハイブリダイゼーションを検出し得る。
【００６９】
このような、凝集体６１３を有する基板もまた、例えば、１２０℃で１０分間ベイクすることにより、半永久的に保存し得、必要に応じて、随時、被験試料のデータベースとして用い得る。
【００７０】
（遺伝子センサの製造例および使用）
支持層６０６として、スライドガラス（Ｇｏｌｄ  Ｓｅａｌ  Ｂｒａｎｄ社製３０１０スライドガラス）を用いた。スライドガラスをＮａＯＨ＋９５％エタノール溶液に室温で２時間浸漬した後、蒸留水で３回リンスした。次いでスライドガラスをポリＬリシン（Ｐ８９２０シグマ社製）希釈液に１時間浸漬した。ポリＬリシン希釈液からスライドガラスを取り出し、マイクロタイタープレート用遠心機にて５００ｒｐｍで１分間遠心分離して過剰のポリＬリシン希釈液を取り除いた後、吸引式恒温機に入れ、４０℃で５分間乾燥させた。
【００７１】
紫外線硬化樹脂ＥＨＡ（２−エチルヘキシルアクリレート、ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯＣＨ2ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）Ｃ4Ｈ9）の末端にアクリロイル基（ＣＨ2＝ＣＨＣＯ−）を導入し、１０μＭ ５’アミノ化Ｋ−ｒａｓＤＮＡ（５’−Ｈ2Ｎ−Ｃ6Ｈ12−ＣＧＧ−ＡＧＣ−ＴＧＧ−ＴＧＧ−３’）（Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣはＤＮＡの塩基配列を示す）を標識するために用いた。光重合モノマー（ＥＨＡ）標識Ｋ−ｒａｓＤＮＡ／ＴＥバッファー溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸））を、乾燥したスライドガラスの基板上に１０μｌスポットし、一本鎖ＤＮＡを基板表面に固定化した（遺伝子センサ）。さらにこの遺伝子センサを純水で洗浄した後、１０μＭ Ｋ−ｒａｓＤＮＡｌｉｇａｎｄ（５’−ＣＣＡ−ＣＣＡ−ＧＣＴ−ＣＣＧ−３’）／ＴＥバッファー溶液を５０μｌ加え１０時間浸漬してハイブリダイゼーションを行い、遺伝子センサ表面に、二本鎖ＤＮＡを形成させた。
【００７２】
次いで、遺伝子センサを紫外線に曝した（露光時間：４秒×２回）。そして７０秒間現像を行った後、純水で３０秒間リンスした。洗浄した遺伝子センサを１２０℃で１０分間ベイクした後。ＡＦＭ探針およびＡＦＭ駆動装置を用い、支持層の表面上に形成された凝集体の形状を走査した。
【００７３】
なお、上記実施の形態１および２においては、フォトレジストとして、光露光用フォトレジストである環化ゴム、ポリけい皮酸およびノボラック樹脂などを主原料とするもの、遠紫外用フォトレジストである環化ゴム、フェノール樹脂、ポリメチルイソプロペニルケトン（ΡＭΙＰＫ）およびポリメチルメタクリレート（ΡＭＭΑ）などを主原料とするもの、Ｘ線用フォトレジストであるＣＯΡおよびメタルアクリレートを主原料とするもの、または、薄膜ハンドブック（日本学術振興会薄膜第１３１委員会編、第１版、昭和５８年１２月１０日、オーム社）に記載されたもの電子線用レジストであるΡＭＭΑをはじめとする、上記ハンドブックに記載された任意のフォトレジストを目的に応じて選択し用いることができる。
【００７４】
（実施の形態３）
本実施の形態では、ＡＦＭ探針（ＡＭＦカンチレバー）を用い、これに電荷を印加してタッピングすることによって基板上に配置した塑性変形層の二本鎖形成領域をへこませて窪みを形成し、その形状変化を測定する。
【００７５】
図７に、本実施の形態に用いるデバイスの概略を示す。図７に示されるように、ＡＦＭ探針７０６の基部は、圧電素子７０７に接合されており、圧電素子７０７に電源７０８から電圧を印加することにより、ＡＦＭ探針７０６を振動させることができる。印加する電圧は、通常、０．１ｍＶ〜１００Ｖの範囲の電圧であ
る。また、ＡＦＭ探針７０６が振動する振幅は、通常、１０ｎｍ〜１００μｍの範囲である。圧電素子７０７は、当業者に公知の、単層型、バイモルフ型、積層型のいずれの圧電素子も用いることができ、特にバイモルフ型の圧電素子が好適に用いられる。基板７０１は、支持層７０４および塑性変形層７０５を備える。
【００７６】
支持層７０４として、単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表される半導体材料；およびガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、セラミクスなどの無機材料が用いられ得る。
【００７７】
塑性変形層７０５として、ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料が好適に用いられる。より好ましくは、ポリカーボネート、またはＰＭＭＡ樹脂を塗布したポリカーボネートが塑性変形層７０５として用いられる。
【００７８】
この塑性変形層７０５に、核酸プローブを固定化する。ハイブリダイゼーションの後、基板を乾燥し、ＡＦＭ探針７０６をサンプル表面にソフトコンタクトさせる。コンタクト圧力は、０．１ｎＮから１ｍＮの範囲で調整するが、約１００ｎＮのコンタクト圧力が好適に用いられる。必要に応じて、二本鎖形成位置でＡＦＭ探針の裏面にレーザ光を照射し、探針を加熱する。あるいは、レーザ光源７０９により印加されるレーザ光は、ＡＦＭ探針７０６の先端面に直接照射し得る。レーザとして、固体半導体レーザ、ＣＯ2レーザ、ＹＡＧレーザ、エキシマレ
ーザなどを用い得る。波長２００ｎｍ付近のエキシマレーザが好適に用いられ得る。
【００７９】
加熱された探針の熱は、遺伝子センサ表面に伝達され、二本鎖形成領域では、二本鎖を解離するためのエネルギーとして用いられるため、二本鎖形成領域以外の領域に比べ、サンプルの塑性変形降伏点が大きくなることに起因して、二本鎖形成領域に加熱により形成される凹構造（ナノメートルサイズ）は、一本鎖のプローブ核酸が固定化された領域で加熱により形成される基板表面の凹構造より小さくなる。図８にその概略を示す。このようにして形成された基板表面上の凹凸構造を読み取ることで、二本鎖形成反応を検出することができる。このような基板表面上の凹凸構造を読み取るとき、ＡＦＭ探針７０６の裏面に、出力の弱いレーザ光をレーザ光源７０９から照射し、反射したレーザ光をフォトマル７１１で信号を増幅して位置検出器７１２に伝えて検出する（光てこ検出法）。なお、常温時の塑性変形材料の塑性変形降伏点は大きいため、基板表面は塑性変形を起こさない。
【００８０】
（遺伝子センサの製造例および使用例）
支持層７０４として、３０ｍｍ角、厚さ５２５μｍの単結晶シリコン小片を用いた。この単結晶シリコン小片を６００℃で熱酸化し、最表面にＳｉＯ2層を形成してセンサ基板を得た。その後、ＰＭＭＡ（メチルメタクリレート）樹脂を厚さ２μｍ堆積させた。ＴＥバッファー溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、1ｍＭ  ＥＤ
ＴＡ（エチレンジアミン四酢酸））1００μｌ中に、Ｋ−ｒａｓＤＮＡｌｉｇａ
ｎｄ（５’−ＣＣＡ−ＣＣＡ−ＧＣＴ−ＣＣＧ−５’）を溶かして終濃度１０μＭとした。次いで、アミノプロピルトリエトキシシランを用いて基板上のＰＭＭＡ樹脂の側鎖を活性化し、Ｋ−ｒａｓＤＮＡｌｉｇａｎｄを２箇所に架橋した。なお、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣはＤＮＡの塩基配列を示す。
【００８１】
このＤＮＡｌｉｇａｎｄを架橋した基板を純水で洗浄した後、上記２箇所の内の１箇所に１０μＭ  Ｋ−ｒａｓＤＮＡｌｉｇａｎｄ（５’−ＣＣＡ−ＣＣＡ−ＧＣＴ−ＣＣＧ−５’）／ＴＥバッファー溶液を５０μｌ加え、１０時間浸漬し、ハイブリダイゼーションを行って、基板表面に二本鎖ＤＮＡを形成させた。
【００８２】
この基板に、ＡＦＭ探針を圧力１００ｎＮで接触させ、ＡＦＭ探針の背面にスポット径１μm半導体レーザ光を照射し、そして圧電素子に５０Ｖ印加してＡＦＭ探針を振動させながら、基板上の二本鎖形成領域、一本鎖Ｋ−ｒａｓＤＮＡｌｉｇａｎｄ固定化領域、およびＰＭＭＡ樹脂表面の合計３箇所、それぞれについて２μｍ×２μmの領域を走査した。その後、レーザ照射をやめ、接触圧力１０
ｎＮで走査し、基板上の同じ３箇所の２μｍ×２μmの範囲の表面凹凸形状を測
定した。
【００８３】
測定の結果、二本鎖形成領域に形成された凹部の開口部の直径は１００ｎｍであった。その一方、一本鎖Ｋ−ｒａｓＤＮＡｌｉｇａｎｄ固定化領域の凹部の開口部の直径はやや小さかった。ＡＦＭ探針の接触圧力が一定なため、凹部深さは、凹部の開口部の直径に比例する。凹部の開口部の直径が１００ｎｍであったので、基板上に、固定ピッチ２００ｎｍで遺伝子を固定化すれば、１．５×１０8
サンプル／ｃｍ2の高密度で遺伝子検出が可能である。
【００８４】
（実施の形態４）
本実施の形態では、導電層をもつＡＦＭ探針（ＡＦＭカンチレバー）を用い、これに電荷を印加して遺伝子センサの二本鎖形成領域を引っ掻いて熱膨張させて凸構造を形成する。
【００８５】
図９に本実施の形態、および遺伝子センサの概略を示す。図９に示すように、ＡＦＭカンチレバー９０７は導電層９０８を備え、従って、探針は導電特性をもつ。導電層９０８の製作方法としては、例えば、ＡＦＭカンチレバー９０７の基部に金属を成膜して形成され得る。成膜方法としては、蒸着、スパッタ、ＣＶＤなどを用い得、好ましくは真空蒸着法が用いられる。あるいは、半導体探針にボロンなどをドープして導電性を持たせてもよい。
【００８６】
基板９０１は支持層９０４と導電層９０５と塑性変形層９０６を備える。支持層９０４は、上記と同様に、単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表される半導体材料；およびガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、セラミクスなどの無機材料であり得る。
【００８７】
導電層９０５として、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンなどの貴金属を含む電極が好適に用いられ、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カ−ボンペ−スト、カ−ボンファイバ−に代表される炭素電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガンなどの酸化物電極を用い得る。
【００８８】
塑性変形層９０６には、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料が好適に用いられる。より好ましくは、塑性変形層９０６としてポリスチレンが用いられる。
【００８９】
この塑性変形層９０６に核酸プローブ１０２を上記と同様に固定化する。ハイブリダイゼーションの後、ＡＦＭ探針９０７をサンプル表面にソフトコンタクトさせながら走査する。コンタクト圧力は、０．１ｎＮから１ｍＮの範囲で調整するが、約６０ｎＮのコンタクト圧力が好適である。ＡＦＭ探針を接触させ走査することで、塑性変形層はスクラッチ（削られる）される。その際に、基板９０１の導電層９０５と、ＡＦＭ探針９０７の導電層９０８の間に、電圧印加装置９１３によって高周波電圧を印加することで探針付近の熱により、塑性変形層のポリマーが塑性変形を起こして隆起する。この電圧は、基板９０１の導電層９０５と、ＡＦＭ探針９０７の導電層９０８との間に電圧印加装置９１３により印加される。通常、０．１ｍＶ〜１００Ｖの範囲の、１ＫＨｚ〜１００ＭＨｚの電圧が印加される。好ましくは、５０ＭＨｚ付近の高周波電圧が印加される。
【００９０】
一般に、上記の隆起高さは、ポリマーの誘電体損失量に依存する。核酸自身は不導体であるため、一本鎖の核酸プローブ固定領域に比べ、二本鎖形成領域では、探針と基板との間の誘電率は高くなり、誘電体損失量は大きくなる。つまり、二本鎖形成領域に形成されるサンプル表面の凸構造（ナノメートルサイズ）は、一本鎖の核酸プローブ固定化領域に形成される凸構造より大きくかつ高くなる。
【００９１】
このように形成された、基板表面上の凹凸構造を読み取り、二本鎖形成反応を検出することができる。
【００９２】
なお、基板表面の凹凸構造を読み取る際には、図１０に示すように、ＡＦＭ探針９０７の裏面にはレーザ光源９０９から出力の弱いレーザ光９０９を照射し、フォトマル９１１で信号を増幅し位置検出器９１２に伝える。読み取りは上記のように、光てこ検出法によるのが望ましい。
【００９３】
（遺伝子センサの製造例および使用）
基板９０１の支持層９０４として石英ガラスを用いた。支持層９０４上に、真空蒸着により銀を蒸着し導電層９０５として成膜した。次いで、その上にポリスチレンのベンゼン溶液をスピンコートし、９５℃で２０時間アニーリングし塑性変形層９０６を作製した。実施の形態１および２の（遺伝子センサの製造例および使用）と同様に、核酸プローブの固定およびハイブリダイゼーション反応を行った後、ボロンをドープし導電性を持たせた銀を含む導電層をもつＡＦＭ探針を、６０ｎＮのコンタクト圧力で接触させ、２μｍ×２μｍの領域を、５０ＭＨｚで印加しながら走査した。印加電圧８Ｖのとき、約１０μmの隆起が観察された
。
【００９４】
（実施の形態５）
図１１は本発明の自動遺伝子検出装置の概略を示す図である。図１１に示すように、本発明の遺伝子検出用測定装置は、核酸プローブが固定化された遺伝子センサ３３、この遺伝子センサを移動する手段４３、一本鎖に変性した遺伝子核酸サンプルを含有するサンプル溶液を貯留するリザーバ３１、遺伝子核酸サンプルと遺伝子センサ上の核酸プロ−ブとのハイブリダイゼ−ションを行う反応槽３２、サンプル溶液の温度を制御する温度制御装置３４、ハイブリダイゼ−ション反応の後、遺伝子センサを洗浄して未反応のサンプル溶液を除去するための洗浄手段２９、遺伝子センサ３３上の領域にエネルギーを付与する手段３８（露光装置、電圧印加装置など）、および遺伝子センサの幾何学的形状変化の測定する装置３７を備える。エネルギー付与手段３８は、例えば、計算機４１で生成される信号に従って、制御装置３９によって制御され得る。参照番号３６は、必要に応じて配置される遺伝子センサ３３を走査するためのカンチレバーである。
【００９５】
さらに、本発明の自動遺伝子検出装置は、標識物質を含有する溶液を貯留し、標識物質と、核酸プローブと遺伝子核酸サンプルとのハイブリダイゼーション反応の際、または遺伝子センサ表面上に形成された二本鎖核酸とを反応させることにより標識物質を二本鎖核酸に結合するように貯蔵する、標識物質リザーバ４２を備え得る。上記標識物質リザーバ４２は、図１１に参照番号３０で概略的に示す部材は、必要に応じて設置される核酸解離装置であって、遺伝子センサ上に形成された二本鎖を乖離するための部材であって、遺伝子センサの再利用を可能にするための部材である。また参照番号３５は、遺伝子センサを移動するための移動ステージであって、遺伝子センサを、上記のそれぞれ、洗浄手段２９、サンプル溶液リザーバ３１、反応槽３２、および核酸解離装置３０に移動させる。
【００９６】
上記遺伝子センサの幾何学的形状変化を測定する装置３７として、例えば、触針式表面粗さ計が採用され得る。この触針式表面粗さ計は、探針３６が、音叉型水晶振動子、電子回路用マイクロフォーク、もしくはＰＺＴに代表される圧電材料または圧電性を有するセラミックから構成される。あるいは振動する機構をもつタッピングスタイラス（振動型触針式表面粗さ計）であってもよい。
【００９７】
あるいは、上記遺伝子センサの幾何学的形状変化を測定する装置３７として、光学式表面形状測定器、特に走査型プローブ顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＳＰＭ）が好適に用いられる。
【００９８】
本明細書で用いる用語「走査型プローブ顕微鏡」は、原子レベルでの観察が可能な走査型顕微鏡の総称である。より詳細には、走査型トンネル顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＳＴＭ）、原子間力顕微鏡（ａｔｏｍｉｃ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＡＦＭ）、摩擦力顕微鏡、マクスウエル応力顕微鏡、磁気力顕微鏡、フォトン走査型トンネル顕微鏡、走査型近接視野光学顕微鏡（ｎｅａｒ−ｆｉｅｌｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＮＯＭ）、走査型近接場音響顕微鏡などが挙げられる。  ＡＦＭは斥力型、引力型およびタッピング型（「タッピング型」は、アメリカ合衆国カリホルニア州サンタバーバラに所在するデジタルインスツルメント社の登録商標）などに大別され、この分野における研究の進展は著しく、摩擦力顕微鏡、マクスウエル応力顕微鏡、磁気力顕微鏡、フォトン走査型トンネル顕微鏡、フォトン走査型トンネル顕微鏡、走査型近接視野光学顕微鏡（ｎｅａｒ−ｆｉｅｌｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＮＯＭ）などの新しい顕微鏡が開発されている。本発明の自動遺伝子検出装置には、いずれの走査型プローブ顕微鏡も適用可能である。
【００９９】
ＳＴＭに関する技術は、例えば文献（Ｇ．Ｂｉｎｎｉｎｇら、ＩＢＭ  Ｊ．ＲＥＳ．ＤＥＶＥＬＯＰ．、３０（４）：３５５−３６９、１９８６；Ｃｏｎｒａｄ  Ｓｃｈｎｅｉｋｅｒら、Ｊ．ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、１５２（２）：５８５−５９６、１９８８；Ｈ．Ｋａｉｓｕｋａ、Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．、６０（１０）：３１１９−３１２２、１９８９）を参考にすることができる。
【０１００】
また、ＡＦＭに関する技術は、文献（Ｇ．Ｂｉｎｎｉｇら、Ｐｈｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５６（９）：９３０−９３３、１９８６；Ｔ．Ｒ．Ａｌｂｒｅｃｈｔら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．、６２（７）：２５９９−２６０２、１９８７；Ａ．Ｌ．Ｗｅｉｓｅｎｈｏｒｎら、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．、５４（２６）：２６５１−２６５３、１９８９；Ｔ．Ｒ．Ａｌｂｌｅｃｈｔら、Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、  Ａ８（４）：３３８６−３３９６、１９９０；Ｒ．Ｃ．Ｂａｒｒｅｔｔら、Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．、６２（６）、１９９１  ）を参考にすることができる。
【０１０１】
ＳＮＯＭに関する技術は、例えば文献（Ｐｏｈｌら．、Ｊ．ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、１５２（３）：８５３−８６１、１９８８；Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ａ．Ｊ．Ｐｕｔｍａｎら、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．、６４（１８）：２４５４−２４５６、１９９４；Ｎ．Ｆ．ｖａｎ  Ｈｕｌｓｔ、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．、６２（５）：４６１−４６３、１９９３）を参考にすることができる。
【０１０２】
また、これらＳＰＭの技術により、生物学的材料を測定し画像化する参考技術は、文献（Ｚａｓａｄｚｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１０１３−１０１５、１９８８；Ｅｍｃｈら．、Ｊ．ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、１５２（１）：８５−９２、１９８８；Ｍａｒｔｉら、Ｊ．ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、１５２（３）：８０３−８０９、１９８８；Ｄｒａｋｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：１５８６−１５８９、１９８９；Ｇｏｕｌｄら、Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、８（１）：３６９−３７３、１９９０；Ｊｅｒｉｃｈｏら、Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、８（１）：６６１−６６６、１９９０；Ｃｏｒａｇｔｇｅｒら、Ｍｉｃｒｏｎ、２５（４）：３７１−３８５、１９９４；Ｙｏｕら、Ｍｉｃｒｏｎ、２６（４）：３１１−３１５、１９９５）に記載されている。
【０１０３】
さらに、核酸分子をＳＰＭの技術により測定するための参考技術は、文献（Ｆｅｎｇら、Ｊ．ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、１５２（３）：８１１−８１６、１９８８；Ｄｒｉｓｃｏｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ、３４６：２９４−２９６、１９９０；ＦｉｒｔｅｌおよびＢｅｖｅｒｉｄｇｅ、Ｍｉｃｒｏｎ、２６（４）、３４７−３６２、１９９５；ＹａｎｇおよびＳｈａｏ、Ｍｉｃｒｏｎ、２６（１）：３５−４９、１９９５；Ｒｉｖｅｔｔｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６４：９１９−９３２、１９９６）に記載されている。
【０１０４】
本発明の方法に適用されるＳＰＭの詳細な操作技術は、以上の文献から適宜参照できる。本発明の自動遺伝子検出装置に用いる走査型プローブ顕微鏡において、プローブまたは探針と、遺伝子センサ基板との間に電圧を印加する手段、またはＰＺＴに代表される圧電材料もしくは圧電性を有するセラミックから構成される、探針を振動させる機構を有してもよい。あるいは、探針の先端近傍に遺伝子センサの表面または裏面のいずれか一方にレーザ光を照射する手段を備えていてもよい。
【０１０５】
代表的には、本発明の自動遺伝子検出装置においては、遺伝子センサ移動手段４３を用いてカンチレバー３６を走査し、遺伝子センサ３３の任意の領域の幾何学形状を測定し得る。これは、遺伝子センサ移動装置４３を制御する移動制御装置４０および計算機４１によって駆動され得る。計算機４１には、カンチレバー３６の走査を制御するプログラム、エネルギー付与手段３８の光量や電圧値を任意に制御するプログラム、表面画像を取得、合成、および処理するプログラム、二本鎖核酸ハイブリダイゼーション量または解離量などを数値化、可視化、計算、および統計処理を行うプログラム、これらの測定を自動化するプログラムを備え得る。
【０１０６】
なお、本発明の自動遺伝子検出装置の上記各構成部材の詳細およびその連結は、特に詳細に説明しないが、当該分野の公知技術を採用し、当業者の知識に従って構成され得る。
【０１０７】
本発明に係る銅張積層体の実施の一形態について説明したが、本発明は、これによって何ら限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲で以って当業者の知識に基づき、種々なる改良、変更、修正を加えた様態で実施し得るものである。ＤＮＡを代表例として本発明を説明したが、本発明は、ＲＮＡ、タンパク質、多糖類、脂質および他の高分子の加工および分析にも応用可能である。本明細書引用された文献は、各文献に掲載されている核酸配列およびアミノ酸配列を含めて、それらの全体が参照として本明細書に援用され、それら出典を明示して本明細書の一部とみなす。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】ポジ型フォトレジストを用いる、本発明の実施の形態１の概略を示す図
【図２】ポジ型フォトレジストを用いる、本発明の実施の形態１の改変例の概略を示す図
【図３】ポジ型フォトレジストを用いる、本発明の実施の形態１の改変例における形状変化した遺伝子センサを示す図
【図４】ネガ型フォトレジストを用いる、本発明の実施の形態１の概略を示す図
【図５】ネガ型フォトレジストを用いる、本発明の実施の形態１の改変例の形状変化した遺伝子センサを示す図
【図６】光硬化性樹脂を用いる、本発明の実施の形態２の概略を示す図
【図７】塑性変形層を用いる、本発明の実施の形態３の概略を示す図
【図８】塑性変形層を用いる、本発明の実施の形態３の概略を示す図
【図９】非弾性変化する層を用いる、本発明の実施の形態４の概略を示す図
【図１０】非弾性変化する層を用いる、本発明の実施の形態４の概略を示す図
【図１１】本発明の自動遺伝子検出装置の概略を示す図
【符号の説明】
【０１０９】
１０１、６０１、７０１、９０１  基板
１０２  核酸プローブ（一本鎖）
１０３  遺伝子核酸サンプル
１０４  標識物質（遮光物質）
１０５  フォトレジスト層
１０６、６０６、７０４、９０４  支持層
１０８  標識物質（遮光挿入剤）
１０９  光源
１１０  光源駆動装置
１１１  位置検出器
１１２  ＡＦＭ駆動装置
１１３、７０６  ＡＦＭ探針
２１３  二本鎖形成領域
１１４  支持層形状
１１５  支持層形状
１１６  支持層形状
４１７  ネガ型フォトレジスト
４１８  支持層形状
５１９  支持層形状
５２０  支持層形状
６０４  光硬化性樹脂
６０５  光硬化を起こす官能基をもつ挿入剤
６１３  凝集体
７０５  塑性変形層
７０７  圧電素子
７０８  電源
７０９、９０９  レーザ光源
７１０、９１０  レーザ駆動装置
７１１、９１１  フォトマル
７１２、９１２  位置検出器
９０５  導電層
９０６  塑性変形層
９０７  カンチレバー
９０８  導電層
９１３  電圧印加装置
２９  洗浄手段
３０  核酸解離装置
３１  サンプル溶液リザーバ
３２  反応槽
３３  遺伝子センサ
３４  温度制御装置
３５  移動ステージ
３６  カンチレバー
３７  基板表面幾何学形状測定装置
３８  露光装置／電圧印加装置
３９  制御装置
４０  移動制御装置
４１  計算機
４２  標識物質リザーバ
４３  遺伝子センサ移動手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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