(57)【要約】【課題】迅速にジェノタイピングすることができる新たな遺伝子タイピング方法および上記ジェノタイピングに利用できる新たな核酸検出方法を提供する。【解決手段】少なくとも一種の核酸プローブが固定された支持体を準備するステップ（１）と、前記核酸プローブの少なくとも一部について、その少なくとも一部配列と相補的な標識化核酸を準備するステップ（２）と、前記標識化核酸と被検物中に含まれる被検物核酸とをハイブリダイズし得る状態におくステップ（３）と、前記ステップ（３）にて得た核酸混合物と前記支持体に固定した核酸プローブとをハイブリダイズし得る状態におくステップ（４）と、前記支持体上の標識化核酸を計測するステップ（５）と、を含む、核酸検出方法。【選択図】図１
2008199927.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種の核酸プローブが固定された支持体を準備するステップ（１）と、
前記核酸プローブの少なくとも一部について、その少なくとも一部配列と相補的な標識化核酸を準備するステップ（２）と、
前記標識化核酸と被検物中に含まれる被検物核酸とをハイブリダイズし得る状態におくステップ（３）と、
前記ステップ（３）にて得た核酸混合物と前記支持体に固定した核酸プローブとをハイブリダイズし得る状態におくステップ（４）と、
前記支持体上の標識化核酸を計測するステップ（５）と、を含む、
核酸検出方法。
【請求項２】
前記ステップ（４）と（５）との間に、核酸プローブとハイブリダイズをしない核酸混合物を除去する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被検物核酸は、前記核酸プローブの配列の少なくとも一部と同一の配列を有するものを、非対称PCRにより増幅したものであることを特徴とする請求項１又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸プローブが複数種あり、前記非対称PCRがマルチプレックス非対称PCRである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子タイピングに用いる請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法
【請求項６】
(11)検査対象遺伝子の少なくとも一部の配列と同一の配列を有する少なくとも1種の核酸プローブを固定した基板を準備すること、
(12)被検物に含まれる少なくとも一部の被検物遺伝子が、前記検査対象遺伝子である場合に、前記被検物遺伝子から、前記核酸プローブと同一の核酸配列を含む少なくとも1種の一本鎖核酸を増幅すること、
(13)前記核酸プローブと少なくとも一部の配列が相補的である、標識化核酸ターゲットを準備すること、
(14)(12)で増幅した一本鎖核酸と(13)で準備した標識化核酸ターゲットをハイブリダイズし得る状態におくこと、
(15)(14)でハイブリダイズし得る状態に置いた後に得た混合物を(11)で準備した基板に固定した核酸プローブとハイブリダイズし得る状態におくこと、
(16)(15)において、ハイブリダイズし得る状態にした後に、(14)で得た混合物の残渣を(11)の基板から除去すること、
(17)(16)で得た基板の標識を計測することで、標識化核酸ターゲットとハイブリダイズした前記一本鎖核酸を特定すること
を含む、遺伝子タイピング方法。
【請求項７】
基板に固定した核酸プローブの種類は、1〜1000種類の範囲である請求項6に記載の方法。
【請求項８】
核酸プローブの塩基数は、20〜100塩基の範囲である請求項6または7に記載の方法。
【請求項９】
一本鎖核酸の増幅は、マルチプレックス非対称PCRにより行われる請求項6〜8のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
マルチプレックス非対称PCRは、検査対象である遺伝子の特異的な配列部位に対するプライマーセットを用いて行う、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
一本鎖核酸の増幅は、核酸プローブ鎖側の配列を増幅することで行う請求項6〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
標識化核酸ターゲットは、核酸プローブと同じ長さで完全に相補鎖とする請求項6〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
(12)の一本鎖核酸と(13)の標識化核酸ターゲットは、溶液中で熱変性後、アニーリングさせることでハイブリダイズし得る状態におく、請求項6〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
(14)において、被検物に検査対象遺伝子と同一の配列を有する遺伝子が含まれる場合には、一本鎖核酸と標識化核酸ターゲットがヘテロ２本鎖を形成し、(15) のハイブリダイゼーションにおいて、標識化核酸ターゲットの核酸プローブへのハイブリダイゼーションが阻害される請求項6〜13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
標識化核酸ターゲットの標識が蛍光標識である請求項6〜14のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
(17)における一本鎖核酸の特定は、蛍光検出と相対比の算出を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
(17)において、蛍光検出と相対比の算出は、蛍光スキャナーにより基板の蛍光イメージを取得することで行う請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
(17)において、相対比の算出は、蛍光イメージより基板上の核酸プローブの蛍光強度を取得することで行う請求項16または17に記載の方法。
【請求項１９】
(17)において、相対比の算出は、前記検査対象遺伝子を含む前記被検物と、前記検査対象遺伝子を含まないリファレンス被検物の蛍光イメージより、それぞれの基板上の同一の核酸プローブの蛍光強度比を取得することで行なう請求項16〜18のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
(17)において、相対比の算出は、前記検査対象遺伝子を含む前記被検物と、前記検査対象遺伝子を含まないリファレンス被検物の蛍光イメージから取得した各核酸プローブの蛍光強度を正規化した後、それぞれの基板上の同一の核酸プローブの蛍光強度比を取得することで行なう請求項16〜19のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速に細菌などのゲノムに含まれている遺伝子をタイピングする方法に関する。特に、院内感染や敗血症の起因菌の同定やその菌の薬剤耐性、毒性を、所有する遺伝子から同定するのに、本発明は、非常に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ジェノタイピング法としては、PCR, DNAマイクロアレイがある。PCRは、特定の遺伝子の配列上に一組のプライマーを作製し、このプライマーで挟まれた領域を酵素により増幅する。増幅した結果は、ゲル電気泳動にかけて、増幅産物のバンドを検出し、その移動距離から塩基長を測定し、確認する。検体のDNAをPCRし、ゲル電気泳動により、バンドが生じれば、その遺伝子を有していると判断する。この方法では、１回の操作で測定できる遺伝子数は１個であり、多数の遺伝子を同定するためには、膨大な時間がかかってしまう。また、これを改良した方法として、マルチプレックスPCRもあるが、偽バンドが出やすくなるため、判断を誤る危険性が高い。これらの方法は、ゲル電気泳動でバンドのサイズだけで判断し、増幅産物の配列をチェックできないところに問題がある。
【０００３】
一方、DNAマイクロアレイは、検体のDNAを蛍光標識し、その蛍光標識されたゲノムDNAをDNAマイクロアレイ上でハイブリダイゼーションを行ない、遺伝子を検出する。DNAマイクロアレイ上のDNAスポットが蛍光を発すれば、遺伝子を有していると判断する。この方法の問題点は、標識操作、ハイブリダイゼーションに、長い時間を要することにある。標識操作の際、標識作業とDNAに取り込まれなかった蛍光物質を取り除く精製過程も必要であり、それが要する時間を長くしている。さらに、ゲノムDNAを完全にマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせるには、12-16時間を必要とするため、検出するまでには、2-3日かかることになる。
【０００４】
そのため、ゲノムDNAとDNAマイクロアレイ上のプローブとのハイブリダイゼーションを促進する試みがなされている(例えば、特許文献1および2)。
【特許文献１】特開２００３−２４８００８号公報
【特許文献２】特開２００５−２４５３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記にも述べたように、院内感染や敗血症の起因菌の同定やその菌の薬剤耐性、毒性を同定することは、治療方針を決めるためにも大変重要であり、緊急性を要するのは、もちろんのことである。そのため、医療現場では、迅速にジェノタイピングする方法が必要とされている。
【０００６】
そこで本発明の目的は、迅速にジェノタイピングすることができる新たな遺伝子タイピング方法を提供することにある。
【０００７】
さらに本発明は、上記ジェノタイピングに利用できる新たな核酸検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下のとおりである。
[1]少なくとも一種の核酸プローブが固定された支持体を準備するステップ（１）と、
前記核酸プローブの少なくとも一部について、その少なくとも一部配列と相補的な標識化核酸を準備するステップ（２）と、
前記標識化核酸と被検物中に含まれる被検物核酸とをハイブリダイズし得る状態におくステップ（３）と、
前記ステップ（３）にて得た核酸混合物と前記支持体に固定した核酸プローブとをハイブリダイズし得る状態におくステップ（４）と、
前記支持体上の標識化核酸を計測するステップ（５）と、を含む、
核酸検出方法。
[2]前記ステップ（４）と（５）との間に、核酸プローブとハイブリダイズをしない核酸混合物を除去する工程を含む、[1]に記載の方法。
[3]前記被検物核酸は、前記核酸プローブの配列の少なくとも一部と同一の配列を有するものを、非対称PCRにより増幅したものであることを特徴とする[1]又は[2]に記載の方法。
[4]前記核酸プローブが複数種あり、前記非対称PCRがマルチプレックス非対称PCRである、[3]に記載の方法。
[5]遺伝子タイピングに用いる[1]〜[4]のいずれかに記載の方法
[6](11)検査対象遺伝子の少なくとも一部の配列と同一の配列を有する少なくとも1種の核酸プローブを固定した基板を準備すること、
(12)被検物に含まれる少なくとも一部の被検物遺伝子が、前記検査対象遺伝子である場合に、前記被検物遺伝子から、前記核酸プローブと同一の核酸配列を含む少なくとも1種の一本鎖核酸を増幅すること、
(13)前記核酸プローブと少なくとも一部の配列が相補的である、標識化核酸ターゲットを準備すること、
(14)(12)で増幅した一本鎖核酸と(13)で準備した標識化核酸ターゲットをハイブリダイズし得る状態におくこと、
(15)(14)でハイブリダイズし得る状態に置いた後に得た混合物を(11)で準備した基板に固定した核酸プローブとハイブリダイズし得る状態におくこと、
(16)(15)において、ハイブリダイズし得る状態にした後に、(14)で得た混合物の残渣を(11)の基板から除去すること、
(17)(16)で得た基板の標識を計測することで、標識化核酸ターゲットとハイブリダイズした前記一本鎖核酸を特定すること
を含む、遺伝子タイピング方法。
[7]基板に固定した核酸プローブの種類は、1〜1000種類の範囲である[6]に記載の方法。
[8]核酸プローブの塩基数は、20〜100塩基の範囲である[6]または[7]に記載の方法。
[9]一本鎖核酸の増幅は、マルチプレックス非対称PCRにより行われる[6]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10]マルチプレックス非対称PCRは、検査対象である遺伝子の特異的な配列部位に対するプライマーセットを用いて行う、[9]に記載の方法。
[11]一本鎖核酸の増幅は、核酸プローブ鎖側の配列を増幅することで行う[6]〜[10]のいずれかに記載の方法。
[12]標識化核酸ターゲットは、核酸プローブと同じ長さで完全に相補鎖とする[6]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[13](12)の一本鎖核酸と(13)の標識化核酸ターゲットは、溶液中で熱変性後、アニーリングさせることでハイブリダイズし得る状態におく、[6]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14](14)において、被検物に検査対象遺伝子と同一の配列を有する遺伝子が含まれる場合には、一本鎖核酸と標識化核酸ターゲットがヘテロ２本鎖を形成し、(15) のハイブリダイゼーションにおいて、標識化核酸ターゲットの核酸プローブへのハイブリダイゼーションが阻害される[6]〜[13]のいずれかに記載の方法。
[15]標識化核酸ターゲットの標識が蛍光標識である[6]〜[14]のいずれかに記載の方法。
[16](17)における一本鎖核酸の特定は、蛍光検出と相対比の算出を含む、[15]に記載の方法。
[17](17)において、蛍光検出と相対比の算出は、蛍光スキャナーにより基板の蛍光イメージを取得することで行う[16]に記載の方法。
[18]（17）において、相対比の算出は、蛍光イメージより基板上の核酸プローブの蛍光強度を取得することで行う[16]または[17]に記載の方法。
[19](17)において、相対比の算出は、前記検査対象遺伝子を含む前記被検物と、前記検査対象遺伝子を含まないリファレンス被検物の蛍光イメージより、それぞれの基板上の同一の核酸プローブの蛍光強度比を取得することで行なう[16]〜[18]のいずれかに記載の方法。
[20](17)において、相対比の算出は、前記検査対象遺伝子を含む前記被検物と、前記検査対象遺伝子を含まないリファレンス被検物の蛍光イメージから取得した各核酸プローブの蛍光強度を正規化した後、それぞれの基板上の同一の核酸プローブの蛍光強度比を取得することで行なう[16]〜[19]のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
一般的なDNAマイクロアレイの手法では、抽出したDNAを標識し、ハイブリダイゼーションを行ない、遺伝子を同定するまでに、2-3日間の時間と手間を要する。それに対して、本発明の遺伝子タイピング方法では、DNAの前処理からハイブリダイゼーションまでが、約３時間以内で完了することができ、これまでの方法に比べ、非常に迅速な検出手法を提供することができる。
【００１０】
さらに本発明の核酸検出方法は、従来の被検物遺伝子の増幅物を直接、プローブとハイブリダイズさせる方法に比べて、DNAの前処理(主に増幅)からハイブリダイゼーションの完了までの時間が、短縮でき、非常に迅速な方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
[核酸検出方法]
本発明の核酸検出方法は、少なくとも以下の（１）〜（５）のステップを含む。
ステップ（１）：少なくとも一種の核酸プローブが固定された支持体を準備する、
ステップ（２）：前記核酸プローブ全種類について、その少なくとも一部配列と相補的な標識化核酸を準備する、
ステップ（３）：前記標識化核酸と被検物中に含まれる被検物核酸とをハイブリダイズし得る状態におく、
ステップ（４）：前記ステップ（３）にて得た核酸混合物と前記支持体に固定した核酸プローブとをハイブリダイズし得る状態におく、
ステップ（５）：前記支持体上の標識化核酸を計測する。
【００１２】
ステップ（１）
ステップ（１）においては、少なくとも一種の核酸プローブが固定された支持体を準備する。ここで、支持体は、例えば、基板、ビーズ、その他、核酸プローブを固定できる固形物であることができる。本発明において、「核酸」には、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、mRNA、全RNA、hnRNA、合成RNAを含む全てのDNA及びRNAを意味するものとする。核酸プローブの調製方法、および核酸プローブの支持体への固定化方法は、常法を用いて実施することができる。支持体に固定した核酸プローブの種類は、例えば、1〜1000種類の範囲とすることができるが、この範囲を超えた数の核酸プローブを用いることもできる。核酸プローブの塩基数は、例えば、20〜100塩基の範囲、好ましくは20〜80塩基の範囲、より好ましくは20〜60塩基の範囲であることができる。核酸プローブを固定した基板については、後述の本発明の遺伝子タイピング方法の説明において詳述する。
【００１３】
ステップ（２）
ステップ（２）においては、前記ステップ（１）で準備する支持体に固定される核酸プローブの少なくとも一部について、その少なくとも一部配列と相補的な標識化核酸を準備する。準備する標識化核酸は、核酸プローブの全種類について、核酸プローブの配列と完全に相補的な核酸であることが好ましい。標識化としては、例えば、蛍光標識、同位体標識(例えば、放射性同位体、安定同位体)等を挙げることができる。
【００１４】
ステップ（３）
ステップ（３）においては、前記標識化核酸と被検物中に含まれる被検物核酸とをハイブリダイズし得る状態におく。被検物中に含まれる被検物核酸と標識化核酸との間で相補鎖が存在する場合は、ハイブリダイズが生じ、相補鎖が存在しない場合には、被検物核酸と標識化核酸との間では、ハイブリダイズは生じない。
【００１５】
本発明において、被検物は特に制限はなく、遺伝子を含む生物試料であればよい。そのような生物試料としては、例えば、細菌、ウイルス、ファージ、血液、髄液、咽頭分泌物、細胞、組織等を挙げることができる。
【００１６】
上記被検物核酸は、核酸プローブの配列の少なくとも一部と同一の配列を有するものを、非対称PCRにより増幅したものであることができる。さらに、前記核酸プローブは複数種あり、前記非対称PCRがマルチプレックス非対称PCRであることができる。被検物核酸の増幅については、後述する本発明の遺伝子タイピング方法のステップ(12)を参照することができる。
【００１７】
上記ステップ(１)〜(３)は順不同で実施することができる。
【００１８】
ステップ（４）
ステップ（４）においては、前記ステップ（３）にて得た核酸混合物と前記支持体に固定した核酸プローブとをハイブリダイズし得る状態におく。ステップ（３）でハイブリダイズし得る状態に置いた後に得た混合物には、被検物核酸と標識化核酸との間で相補鎖が存在する場合は、ハイブリダイズした2本鎖も含まれ、相補鎖が存在しない場合には、被検物核酸と標識化核酸との間では、ハイブリダイズは生じず、標識化核酸は一本鎖のまま含まれる。このような混合物を支持体に固定した核酸プローブとハイブリダイズし得る状態におくと、一本鎖のままの標識化核酸は、核酸プローブとハイブリダイズして支持体に固定される。しかし、ステップ（３）において、被検物核酸が含まれる場合には、被検物核酸と標識化核酸がヘテロ２本鎖を形成し、ステップ(４) のハイブリダイゼーションにおいて、標識化核酸の核酸プローブへのハイブリダイゼーションが阻害される。
【００１９】
ステップ（４）と（５）との間には、核酸プローブとハイブリダイズをしない核酸混合物を除去する工程を含むことができる。この核酸混合物を除去する工程は、後述する本発明の遺伝子タイピング方法のステップ(16)を参照することができる。
【００２０】
ステップ（５）
ステップ（５）においては、ステップ（４）で得た前記支持体上の標識化核酸を計測する。標識化核酸とハイブリダイズした前記被検物核酸を特定する。標識が、蛍光標識の場合の詳細は、後述するステップ(17)に記載の方法を参照できる。標識が放射性同位体標識の場合、例えば、一般には32Pを用いて核酸に取り込ませて標識することができる。また、その検出は、X線感光フィルムなどに写し取り検出できる。
【００２１】
上記本発明の核酸検出方法は、種々の核酸検出に用いることができ、例えば、ＳＮＰの検出方法としても利用できる。さらに上記本発明の核酸検出方法は、遺伝子タイピングに用いることもできる。以下に、上記本発明の核酸検出方法を利用した本発明の遺伝子タイピング方法について説明する。
【００２２】
本発明の遺伝子タイピング方法は、以下の(11)〜(17)のステップを含む。
(11)検査対象遺伝子の少なくとも一部の配列と同一の配列を有する少なくとも1種の核酸プローブを固定した基板を準備すること、
(12)被検物に含まれる少なくとも一部の被検物遺伝子が、前記検査対象遺伝子である場合に、前記被検物遺伝子から、前記核酸プローブと同一の核酸配列を含む少なくとも1種の一本鎖核酸を増幅すること、
(13)前記核酸プローブと少なくとも一部の配列が相補的である、標識化核酸ターゲットを準備すること、
(14)(12)で増幅した一本鎖核酸と(13)で準備した標識化核酸ターゲットをハイブリダイズし得る状態におくこと、
(15)(14)でハイブリダイズし得る状態に置いた後に得た混合物を(11)で準備した基板に固定した核酸プローブとハイブリダイズし得る状態におくこと、
(16)(15)において、ハイブリダイズし得る状態にした後に、(14)で得た混合物の残渣を(11)の基板から除去すること、
(17)(16)で得た基板の蛍光を計測することで、標識化核酸ターゲットとハイブリダイズした前記一本鎖核酸を特定すること。
【００２３】
ステップ(11)
ステップ(11)においては、検査対象遺伝子の少なくとも一部の配列と同一の配列を有する少なくとも1種の核酸プローブを固定した基板を準備する。核酸プローブは、被検物に含まれる被検物遺伝子と少なくとも一部が、同一の配列を有するように選択することができる。ステップ(11)は、上記ステップ（１）の一態様である。
【００２４】
基板に固定した核酸プローブの種類は、特に制限はなく、遺伝子タイピングの対象となる被検物や遺伝子タイピングの目的等を考慮して適宜決定することができる。基板に固定した核酸プローブの種類は、例えば、1〜1000種類の範囲とすることができるが、この範囲を超えた数の核酸プローブを用いることもできる。核酸プローブの塩基数は、例えば、20〜100塩基の範囲、好ましくは20〜80塩基の範囲、より好ましくは20〜60塩基の範囲であることができる。
【００２５】
本発明において、「核酸」には、前述のように、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、mRNA、全RNA、hnRNA、合成RNAを含む全てのDNA及びRNAを意味するものとする。核酸プローブを固定した基板は、例えば、DNAチップであることができる。DNAチップは、公知のDNAチップをそのまま用いることができる。
【００２６】
ステップ(12)
ステップ(12)においては、 被検物に含まれる少なくとも一部の被検物遺伝子が、前記検査対象遺伝子である場合に、前記被検物遺伝子から、前記核酸プローブと同一の核酸配列を含む少なくとも1種の一本鎖核酸を増幅する。
【００２７】
本発明において、前述のように、被検物は特に制限はなく、遺伝子を含む生物試料であればよい。そのような生物試料としては、例えば、細菌、ウイルス、ファージ、血液、髄液、咽頭分泌物、細胞、組織等を挙げることができる。
【００２８】
上記一本鎖核酸の増幅は、被検物に含まれる少なくとも一部の被検物遺伝子が、前記検査対象遺伝子である場合にのみ生じるように、増幅の条件を設定する。被検物に含まれるいずれの被検物遺伝子も、前記検査対象遺伝子でない場合には、上記一本鎖核酸の増幅は生じないように、増幅の条件を設定する。
【００２９】
一本鎖核酸の増幅は、例えば、マルチプレックス非対称PCRにより行うことができる。そして、マルチプレックス非対称PCRは、検査対象遺伝子の特異的な配列部位に対するプライマーセットを用いて行う。こうすることで、上記一本鎖核酸の増幅は、被検物に含まれる少なくとも一部の被検物遺伝子が、前記検査対象遺伝子である場合にのみ生じる。
【００３０】
マルチプレックスPCR(MPCR)は、複数、例えば、１０組程度のプライマーセットを用いて一度にPCRをする方法であり、アシンメトリック(非対称) (APCR)は、１組のプライマーのうち、片方のプライマーを１０〜１００倍程度の濃度にしてPCRをする方法である。マルチプレックス非対称PCRは、これらを組み合わせたPCRであり、MPCRの利点である様々な長短の塩基配列を一度に増幅することができ、また、一本鎖DNAを得やすくする方法である。
【００３１】
さらに、一本鎖核酸の増幅は、被検物遺伝子(2本鎖)の核酸プローブ鎖側の配列を増幅するように、使用するプライマーの設計、プライマー比率を調整することで行う。
【００３２】
ステップ(13)
ステップ(13)においては、前記核酸プローブと少なくとも一部の配列が相補的である、標識化核酸ターゲットを準備する。ステップ(13)は、上記ステップ（２）の一態様である。尚、本発明では、標識化核酸と標識化核酸ターゲットとは同義で使用する。
【００３３】
標識化核酸ターゲットは、好ましくは、核酸プローブと同じ長さで完全に相補鎖とする。標識化には、本技術分野で良く知られた物質を適宜使用でき、例えば、蛍光標識を用いることができる。蛍光標識には、例えば、Cy3、Cy5、FITCのような蛍光色素を用いることができる。蛍光標識を施した核酸ターゲットは本技術分野で良く知られた方法により適宜調製することができる。
【００３４】
上記ステップ(11)〜(13)は順不同で実施することができる。
【００３５】
ステップ(14)
ステップ(14)においては、ステップ (12)で増幅した一本鎖核酸とステップ(13)で準備した標識化核酸ターゲットをハイブリダイズし得る状態におく。ステップ(14)は、上記ステップ（３）の一態様である。ステップ(14)においては、具体的には、(12)で増幅した一本鎖核酸を含む溶液と標識化核酸ターゲットを含む溶液を混合し、この混合物をハイブリダイズし得る状態におくことができる。
【００３６】
ハイブリダイズし得る状態とは、具体的には、ステップ(12)の一本鎖核酸とステップ(13)の標識化核酸ターゲットとを溶液中で熱変性後、アニーリングさせることを含む。熱変性の温度は、例えば、90〜100℃の範囲とし、アニーリングの温度は、用いる核酸ターゲットの配列により適宜調整することができるが、例えば、45〜65℃の範囲とすることができる。
【００３７】
ステップ(12)で増幅した一本鎖核酸とステップ(13)で準備した標識化核酸ターゲットをハイブリダイズし得る状態におくと、一本鎖核酸と標識化核酸ターゲットとの間で相補鎖が存在する場合は、ハイブリダイズが生じ、相補鎖が存在しない場合には、一本鎖核酸と標識化核酸ターゲットとの間では、ハイブリダイズは生じない。
【００３８】
ステップ(15)
ステップ(15)においては、 (14)でハイブリダイズし得る状態に置いた後に得た混合物を(11)で準備した基板に固定した核酸プローブとハイブリダイズし得る状態におく。ステップ(15)は、上記ステップ（４）の一態様である。
【００３９】
ステップ(14)でハイブリダイズし得る状態に置いた後に得た混合物には、一本鎖核酸と標識化核酸ターゲットとの間で相補鎖が存在する場合は、ハイブリダイズした2本鎖も含まれ、相補鎖が存在しない場合には、一本鎖核酸と標識化核酸ターゲットとの間では、ハイブリダイズは生じず、一本鎖核酸も標識化核酸ターゲットも一本鎖のまま含まれる。このような混合物を基板に固定した核酸プローブとハイブリダイズし得る状態におくと、一本鎖のままの標識化核酸ターゲットは、核酸プローブとハイブリダイズして基板に固定される。しかし、(14)において、被検物に検査対象遺伝子と同一の配列を有する遺伝子が含まれる場合には、一本鎖核酸と標識化核酸ターゲットがヘテロ２本鎖を形成し、ステップ(15) のハイブリダイゼーションにおいて、標識化核酸ターゲットの核酸プローブへのハイブリダイゼーションが阻害される。
【００４０】
基板に固定した核酸プローブとのハイブリダイズし得る状態とは、用いる核酸プローブにより温度は適宜調整することができるが、例えば、温度が45〜65℃の範囲である。
【００４１】
ステップ(16)
ステップ(16)においては、ステップ(15)において、ハイブリダイズし得る状態にした後に、ステップ(14)で得た混合物の残渣をステップ(11)の基板から除去する。
具体的には、ステップ(14)で得た混合物の残渣を洗浄する。洗浄は、例えば、2x SSC(300 mM NaCl/30 mM クエン酸Na), 1x SSC(150 mM NaCl/15 mM クエン酸Na), 0.2x SSC(30 mM NaCl/3 mM クエン酸Na)の順で、基板を2分間ずつ洗浄することで行なうことができる。洗浄後には、標識化核酸ターゲットがハイブリダイズした核酸プローブが残る。
【００４２】
ステップ(17)
ステップ(17)においては、ステップ(16)で得た基板の標識を計測することで、標識化核酸ターゲットとハイブリダイズした前記一本鎖核酸を特定する。ステップ(17)は、上記ステップ（５）の一態様である。
【００４３】
標識が蛍光標識である場合には、ステップ(16)で得た基板の蛍光を計測することで、蛍光標識核酸ターゲットとハイブリダイズした前記一本鎖核酸を特定する。この場合、基板には、蛍光標識核酸ターゲットがハイブリダイズした核酸プローブが残るので、この蛍光標識からの蛍光を計測する。例えば、蛍光スキャナーにより基板の蛍光イメージを取得し、蛍光検出/相対比の算出を行うことで、どの核酸プローブに蛍光標識核酸ターゲットがハイブリダイズし、どの核酸プローブに蛍光標識核酸ターゲットがハイブリダイズしなかったかを、特定することができる。その結果、一本鎖核酸とハイブリダイズして除去された蛍光標識核酸ターゲットが特定でき、一本鎖核酸を特定することができる。
【００４４】
図1を用いてさらに詳細に説明する。
まず、検出対象遺伝子が存在しない場合には、図1の上図に示すように、蛍光標識オリゴターゲットは、DNAチップのプローブにハイブリダイズして、すべてのプローブにおいて蛍光が検出される。
【００４５】
それに対して、検出対象遺伝子が存在する場合、調べたい遺伝子の特異的な配列部位にて作製したプライマーセットを用いて、検体となるゲノムDNAからマルチプレックス非対称PCRにて各遺伝子の一本鎖DNAを増幅する。この一本鎖DNAは、DNAチップに固定されたプローブ鎖側の配列を増幅する。プローブに対して同じ長さで完全に相補鎖になる蛍光標識オリゴターゲットのミックスと先に増幅させた一本鎖DNAを溶液中で熱変性後、アニーリングさせる。各遺伝子のプローブ箇所は、プライマーに挟まれるように設計してある。
【００４６】
そうすると、図1の下図の左端に示すように、このアニーリングの過程で、遺伝子が存在した場合は、一本鎖DNAとオリゴターゲットがヘテロ２本鎖を形成する。そのため、蛍光標識オリゴターゲットのDNAチップへのハイブリダイゼーションが阻害されることになる。このアニーリングした混合液をDNAチップ上でハイブリダイゼーションし、蛍光スキャナーにより、DNAチップの蛍光イメージを取得する。
【００４７】
この方法により、遺伝子が存在した場合、DNAチップ上のDNAスポットは、蛍光強度が減衰、または消失する。逆に、遺伝子が存在しない場合は、DNAスポットは、減衰せずに、蛍光を発する。
【００４８】
図1の上図に示すように、検体DNAを含まないリファレンスサンプルにより、同一の反応を行ない、全スポットが蛍光を発しているデータを取得し、スポットごとに検体サンプルとの相対比を算出することにより、どの遺伝子が存在したか同定することができる。
【００４９】
この方法では、DNAチップとハイブリダイゼーションするのは、蛍光標識オリゴターゲットである。そのため、ゲノムDNAハイブリダイゼーションの場合と比べ、ターゲットが短く、その結果、ハイブリ過程を短縮することが可能となる。これにより、これまでゲノムDNAを用い場合には、12-16時間かかっていた反応を、例えば、1時間に短縮することができる。
【００５０】
さらに、ゲノムDNAに蛍光標識をしないため、マルチプレックス非対称PCRの後の精製の必要がなく、ハイブリダイゼーションの前工程でかかる時間も短縮することができる。さらには、蛍光標識ヌクレオチドを用いずに増幅するため、増幅効率が高く、通常のDNAマイクロアレイで使用するゲノムDNA量を、例えば、約1000分の1まで減らす事もできる。
【００５１】
これらの各工程での短縮により、検出までの時間が、これまで、約2-3日間かかっていたところを、例えば、3時間以下まで短縮することが可能となる。
【００５２】
他の効果としては、この方法では、一つの遺伝子を認識するのに、プライマー２種、プローブ１種の計３箇所の配列を用いるため、PCRや通常のDNAマイクロアレイと比べ、配列の認識精度が高まる。
【実施例】
【００５３】
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
[(A)プローブ及びプライマー設計]
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)をモデルとして、MRSAの遺伝子の中から31種の遺伝子を選択した。31種の遺伝子名、アクセッションNo.等を表１に示す。１つの遺伝子に、１または２種の45merプローブを設計し、その配列は、表２に示す。プローブは、5'末端にDNattachリンカーを修飾したオリゴヌクレオチドを日清紡績株式会社（東京、日本）にて合成した。DNattachリンカーは、紫外光を照射することにより、金表面に効率よく、強固に結合する特徴を有する。オリゴターゲットとして、プローブと完全に相補鎖となる5'末端Cy3標識した45merオリゴヌクレオチドをSIGMA-ALDRICH Japan(東京、日本)で合成した。
また、それぞれの遺伝子のPCRプライマーは、プローブ配列を挟むように設計した。プライマー配列は、表３に示す。プライマーは、SIGMA-ALDRICH Japanまたは日清紡績株式会社（東京、日本）で合成した。
【００５４】
【表１】
2008199927.tif 000003
【００５５】
【表２】
2008199927.tif 000004
【００５６】
【表３】
2008199927.tif 000005
【００５７】
[(B)マルチプレックス非対称PCR]
プライマーは、それぞれ遺伝子ごとにリアルタイムPCRにより、PCR効率を測定し、このPCR効率に従って４つのグループ（A, B, C, D）に分けた。マルチプレックス非対称PCRは、次の条件により、グループごと行なった。
【００５８】
マルチプレックス非対称PCR溶液条件
検体DNA 2ng
Ampdirect Plus (島津製作所)  1x
NovaTaq Hot Start DNA polymerase (Novagen) 0.05U
プローブ鎖側プライマーミックス 0.4μM
ターゲット鎖側プライマーミックス 0.04μM
この条件で混合した溶液を以下の温度条件でインキュベートした。
マルチプレックス非対称PCR温度条件
95℃ 10分間・・・(1)
94℃ 20秒間・・・(2)
55℃ 20秒間・・・(3)
72℃ 20秒間・・・(4)
72℃  7分間・・・(5)
(2)〜(4)を40回繰り返した。
この条件でA〜Dグループごとに増幅した産物を混合して、ハイブリダイゼーション実験に用いた。
【００５９】
[(C)DNAチップの作製]
DNAチップの基板として、20mmx20mmのプラスチック板に、クロム、金を順に真空蒸着した金コート基板を用いた。
プローブ溶液の調製として、5'末端DNattachリンカー修飾プローブを100μMになるようにスタンピング溶液（3xSSC、5% (w/w) ポリエチレングリコール(MW 約8000)、0.5% Tween 20、1mM NaOH）に溶解した。このプローブ溶液を金コート基板に１つのプローブあたり、４スポットをDNAアレイヤーによりスタンプした。スタンプ後、チップに999 mJ/cm2で紫外光を照射し、プローブを基板の金表面に固定した。その後、基板を超純水で洗浄し、結合しなかったプローブを取り除き、エアーで水分を飛ばし、乾燥させた。
【００６０】
[(D)アニーリングとハイブリダイゼーション]
Cy3標識したオリゴヌクレオチドターゲットとマルチプレックス非対称PCR産物をそれぞれのオリゴターゲットが1fmol/μlになるように、またそれぞれの産物が約10fmol/μlになるように25μlのハイブリダイゼーション溶液(400 mM NaCl, 40 mM TrisHCl, pH 8.3, 4 mM EDTA, 0.3% SDS)に希釈した。さらに、リファレンスのために、マウスGAPDHの遺伝子のPCR産物をマルチプレックス非対称PCR産物の代わりに加えたハイブリダイゼーション混合液を作製した。それぞれのハイブリダイゼーション混合液を95℃で10分間熱変性し、その後、60℃ で30分間インキュベートし、オリゴターゲットと産物をアニーリングさせた。このステップで、混合液に含まれるゲノムDNAの産物と配列が相補鎖になっているオリゴターゲットは、産物と２本鎖を形成し、次のハイブリダイゼーションのステップで、チップ上のプローブへの結合が阻害される。次に、このハイブリダイゼーション混合液を予め60℃に温めておいたDNAチップ上に載せ、DNAチップごと湿箱に入れ、60℃で１時間ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションの後、DNAチップを湿箱から取り出し、すぐに室温で２分間ずつ３種の洗浄溶液（2xSSC, 1xSSC, 0.2xSSC）で洗浄した。DNAチップをエアーで水分を飛ばし、乾燥した後、DNAチップは、マイクロアレイスキャナーDNAscope IV (Biomedical Photometrics, Ontario, CANADA)で蛍光イメージをスキャニングした。蛍光イメージの各スポットの蛍光強度は、MACROView(Biomedical Photometrics)ソフトを用いて、計算した。
【００６１】
蛍光強度のデータは、Microsoft Excelにエキスポートし、次の方法により、ローカルノーマライゼーションした。MRSAサンプルとリファレンス(マウスGAPDH)のデータに関して、チップ上の４つのネガティブコントロール遺伝子(Actb, NF-L, LHCP, PsbW)の１６スポットの値についてスキャッタープロットを作成し、リニアーフィッティングした直線から傾きを求め、この傾きをノーマライゼーションの係数とした。この係数により、MRSAサンプルのデータを標準化し、MRSAサンプルとリファレンスとの各スポットの相対比を求めた。
【００６２】
[(E)MRSA７株の実験結果]
本方法の性能を実証するために、７株(N315, MW2, TY114, COL, JCSC1978, JCSC6306, JCSC3057)のMRSAのゲノムDNAを用いて、上記(A)〜(D)の通りに実験を行なった。図２は、７株のサンプルを用いたときのDNAチップの蛍光イメージを示している。リファレンスは、すべてのスポットが蛍光を発している。それに対して、７株（図２b-h）は、スポットが完全に消失、または蛍光強度が減少しており、遺伝子の存在を明確に示している。また、７株は、それぞれ異なる蛍光パターンを持っており、これは、それぞれが異なるジェノタイプを持っていることを示している。
【００６３】
７株とリファレンスとの各スポットの蛍光強度比をグラフにしたものが、図３である。この結果から、MRSA株が持っている遺伝子のスポットの場合、相対比が、0.2未満になっていることが判明した。また、 遺伝子を持っていないスポットの場合には、相対比が、0.4以上になっていることが判明した。このことから、この実施例においては、遺伝子の存在を判定するための相対比の閾値としては、中間点の0.3とすることが最適であり、この閾値による判定の結果、100%の精度で7株をジェノタイピングすることができた。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、遺伝子のタイピングを必要とする様々な分野において有用であるが、特に、院内感染や敗血症の起因菌の同定やその菌の薬剤耐性、毒性を、所有する遺伝子から同定を必要とする分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の方法の説明図。
【図２】７株のサンプルを用いたときのDNAチップの蛍光イメージを示す。
【図３】７株とリファレンスとの各スポットの蛍光強度比の関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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