(57)【要約】【課題】静電引力を利用することなしに基板表面に生理活性物質の失活を防ぎ、及び／又は生理活性物質を高濃度に固定化することができる、生理活性物質を固定した基板の製造方法を提供すること。【解決手段】生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板に、該生理活性物質を固定するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布する工程、及びその後に乾燥する工程を含むことを特徴とする、生理活性物質固定基板の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板に、該生理活性物質を固定するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布する工程、及びその後に乾燥する工程を含むことを特徴とする、生理活性物質固定基板の製造方法。
【請求項２】
生理活性物質の固定量の変動係数（ＣＶ値）が１５％以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生理活性物質を含む溶液の濃度が0.1mg/ml以上10mg/ml以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
生理活性物質を含む溶液の濃度が1mg/ml以上10mg/ml以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
生理活性物質を固定化するための層が、親水性ポリマー、疎水性ポリマー、自己組織化膜形成分子、又はその組み合わせからなるものである、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
親水性ポリマーを活性化することによって生理活性物質と共有結合させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
親水性ポリマー層の厚さが1nm以上300nm以下である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
親水性ポリマーが、デキストラン誘導体、セルロース化合物、ポリアクリル酸誘導体、又はポリビニルアルコール誘導体を含む、請求項５から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
金属基板の表面上に塗布した生理活性物質を含む溶液を、乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上で乾燥することを特徴とする、請求項１から８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
金属基板の表面上に塗布した生理活性物質を含む溶液を、乾球温度と湿球温度との温度差が１０℃以上で乾燥することを特徴とする、請求項１から８の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
金属基板の表面上に塗布した生理活性物質を含む溶液を、乾球温度と湿球温度との温度差が１３．５℃以上で乾燥することを特徴とする、請求項１から８の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板に、該生理活性物質を固定するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布する工程を、乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の環境において行うことを特徴とする、請求項１から１１の何れかに記載の製造方法。
【請求項１３】
生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板に、該生理活性物質を固定するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布する工程を、乾球温度と湿球温度との温度差が１０℃以上の環境において行うことを特徴とする、請求項１から１１の何れかに記載の製造方法。
【請求項１４】
生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板に、該生理活性物質を固定するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布する工程を、乾球温度と湿球温度との温度差が１３．５℃以上の環境において行うことを特徴とする、請求項１から１１の何れかに記載の製造方法。
【請求項１５】
金属基板の表面上に塗布した生理活性物質を含む溶液を乾燥した後に、乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の環境において静置することを特徴とする、請求項１から１４の何れかに記載の製造方法。
【請求項１６】
金属基板の表面上に塗布した生理活性物質を含む溶液を乾燥した後に、乾球温度と湿球温度との温度差が１０℃以上の環境において静置することを特徴とする、請求項１から１４の何れかに記載の製造方法。
【請求項１７】
金属基板の表面上に塗布した生理活性物質を含む溶液を乾燥した後に、乾球温度と湿球温度との温度差が１３．５℃以上の環境において静置することを特徴とする、請求項１から請求１４の何れかに記載の製造方法。
【請求項１８】
金属基板の表面上に塗布した生理活性物質を含む溶液を、１０分以内で乾燥することを特徴とする、請求項１から１７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
生理活性物質を含む溶液を、３００μｍ以下の平均液膜厚で塗布することを特徴とする、請求項１から１８の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
生理活性物質を含む溶液を、２０μｍ以下の平均液膜厚で塗布することを特徴とする、請求項１から１８の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
生理活性物質を含む溶液を、スピンコーター又はディスペンサーで塗布することを特徴とする、請求項１から２０の何れかに記載の方法。
【請求項２２】
生理活性物質が蛋白質である、請求項１から２１の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
蛋白質がプロテインＡ、プロテインＧ、アビジン類、カルモデュリン、又は抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１から請求項２３の何れか1項の方法により得られた基板であって、生理活性物質を固定化するための層が親水性ポリマーを含んで形成され、該親水性ポリマーの基板上への固定量が３ｎｇ／ｍｍ2以上３０ｎｇ／ｍｍ2以下であり、該生理活性物質を固定化するための層の固定量に対して、該生理活性物質の固定量が０．３倍以上３倍以下である基板。
【請求項２５】
親水性ポリマーの基板上への固定量が３ｎｇ／ｍｍ2以上２０ｎｇ／ｍｍ2以下である、請求項２４に記載の基板。
【請求項２６】
親水性ポリマーの基板上への固定量が３ｎｇ／ｍｍ2以上１５ｎｇ／ｍｍ2以下である、請求項２４に記載の基板。
【請求項２７】
生理活性物質の固定量が１ｎｇ／ｍｍ2以上４０ｎｇ／ｍｍ2以下である請求項２４に記載の基板。
【請求項２８】
生理活性物質の固定量が１ｎｇ／ｍｍ2以上２０ｎｇ／ｍｍ2以下である請求項２４に記載の基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質を固定化した基板の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、表面プラズモン共鳴分析などで使用するための、生理活性物質を固定化したセンサー用基板の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
生理活性物質を基板に共有結合で固定化する方法としては、基板の電荷と反対の電荷を生理活性物質を持たせて、静電引力を利用して基板近傍に生理活性物質を高濃度に局在させて結合させる方法が用いられてきた。この方法によれば、センサー用基板に、高濃度かつ均一に生理活性物質を固定することができるが、多量の溶液を使用する必要があり、溶液のｐＨは荷電濃縮が可能な範囲に限定され、生理活性物質が失活する懸念があった。
【０００６】
また、特許文献１及び非特許文献１には、基板への生理活性物質の固定について記載されているが、いずれも溶液中で固定を行っている。生理活性物質を乾燥させること、スピンコーターやディスペンサーにより溶液を塗布することは公知であるが、これまで、基板上に共有結合によって固定した生理活性物質は、共有結合によって失活しやすくなっているため、少量塗布することにより、乾燥しやすい状態におくことや、自発的に乾燥させることが懸念されていた。特許文献１では、生理活性物質の固定は流路中で行われるため、乾燥させたり、少量塗布することは適用できない。非特許文献１では、生理活性物質の固定方法が共有結合ではないため、乾燥させたり塗布を行ったとしても、洗浄の工程で結合が外れる可能性が高い。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第5,436,161号
【非特許文献１】Journal of Colloid and Interface Science 259(2003) 13-26
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、静電引力を利用することなしに基板表面に生理活性物質の失活を防ぎ、及び／又は生理活性物質を高濃度に固定化することができる、生理活性物質を固定した基板の製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、生理活性物質を含む溶液の薄膜をセンサー基板上に形成し、さらに乾燥濃縮することにより静電引力を利用することなしに基板表面に生理活性物質を高濃度に固定できることを見出した。さらに、本発明者らは、生理活性物質を含む溶液の薄膜を形成し、乾燥時間を短くすることによって、均一に生理活性物質を固定できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明によれば、生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板に、該生理活性物質を固定するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布する工程、及びその後に乾燥する工程を含むことを特徴とする、生理活性物質固定基板の製造方法が提供される。
好ましくは、生理活性物質の固定量の変動係数（ＣＶ値）は１５％以下である。
好ましくは、生理活性物質を含む溶液の濃度は0.1mg/ml以上10mg/ml以下である。
好ましくは、生理活性物質を含む溶液の濃度は1mg/ml以上10mg/ml以下である。
【００１１】
好ましくは、生理活性物質を固定化するための層は、親水性ポリマー、疎水性ポリマー、自己組織化膜形成分子、又はその組み合わせからなるものである。
好ましくは、親水性ポリマーを活性化することによって生理活性物質と共有結合させる。
好ましくは、親水性ポリマー層の厚さは1nm以上300nm以下である。
好ましくは、親水性ポリマーは、デキストラン誘導体、セルロース化合物、ポリアクリル酸誘導体、又はポリビニルアルコール誘導体を含む。
【００１２】
好ましくは、金属基板の表面上に塗布した生理活性物質を含む溶液を、乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上で乾燥する。
好ましくは、金属基板の表面上に塗布した生理活性物質を含む溶液を、乾球温度と湿球温度との温度差が１０℃以上で乾燥する。
好ましくは、金属基板の表面上に塗布した生理活性物質を含む溶液を、乾球温度と湿球温度との温度差が１３．５℃以上で乾燥する。
【００１３】
好ましくは、生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板に、該生理活性物質を固定するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布する工程を、乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の環境において行う。
好ましくは、生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板に、該生理活性物質を固定するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布する工程を、乾球温度と湿球温度との温度差が１０℃以上の環境において行う。
好ましくは、生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板に、該生理活性物質を固定するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布する工程を、乾球温度と湿球温度との温度差が１３．５℃以上の環境において行う。
【００１４】
好ましくは、金属基板の表面上に塗布した生理活性物質を含む溶液を乾燥した後に、乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の環境において静置する。
好ましくは、金属基板の表面上に塗布した生理活性物質を含む溶液を乾燥した後に、乾球温度と湿球温度との温度差が１０℃以上の環境において静置する。
好ましくは、金属基板の表面上に塗布した生理活性物質を含む溶液を乾燥した後に、乾球温度と湿球温度との温度差が１３．５℃以上の環境において静置する。
好ましくは、金属基板の表面上に塗布した生理活性物質を含む溶液を、１０分以内で乾燥する。
【００１５】
好ましくは、生理活性物質を含む溶液を、３００μｍ以下の平均液膜厚で塗布する。
好ましくは、生理活性物質を含む溶液を、２０μｍ以下の平均液膜厚で塗布する。
好ましくは、生理活性物質を含む溶液を、スピンコーター又はディスペンサーで塗布する。
好ましくは、生理活性物質は蛋白質である。
好ましくは、蛋白質はプロテインＡ、プロテインＧ、アビジン類、カルモデュリン、又は抗体である。
【００１６】
また、本発明の他の側面によれば、上記生理活性物質固定基板の製造方法によって得られる基板であって、生理活性物質を固定化するための層が親水性ポリマーを含んで形成され、該親水性ポリマーの基板上への固定量が３ｎｇ／ｍｍ2以上３０ｎｇ／ｍｍ2以下であり、該生理活性物質を固定化するための層の固定量に対して、該生理活性物質の固定量が０．３倍以上３倍以下の基板が提供される。
【００１７】
好ましくは、親水性ポリマーの基板上への固定量が３ｎｇ／ｍｍ2以上２０ｎｇ／ｍｍ2以下の基板である。
好ましくは、親水性ポリマーの基板上への固定量が３ｎｇ／ｍｍ2以上１５ｎｇ／ｍｍ2以下の基板である。
【００１８】
好ましくは、生理活性物質の固定量が１ｎｇ／ｍｍ2以上４０ｎｇ／ｍｍ2以下の基板である。
好ましくは、生理活性物質の固定量が１ｎｇ／ｍｍ2以上２０ｎｇ／ｍｍ2以下の基板である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法によれば、生理活性物質の固定量が均一なセンサー基板を製造することができ、製造に使用する生理活性物質の使用量を削減することができる。また、本発明の方法によれば、製造に使用する生理活性物質を含む溶液のｐＨを任意に設定することができるため、センサー基板表面の生理活性物質の失活を防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による生理活性物質固定基板の製造方法は、生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板に、該生理活性物質を固定するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布する工程、及びその後に乾燥する工程を含むことを特徴とする。
【００２１】
本発明の方法では、基板上に共有結合で固定した生理活性物質を乾燥させても失活することがなく、また、生理活性物質は共有結合により基板表面に固定化されるため、洗浄工程で生理活性物質が外れることもない。さらに、生理活性物質を溶液中で固定する場合にはｐＨをコントロールしなければ固定することはできないが、本発明による方法（乾燥法）では、生理活性物質に好ましいｐＨで固定することができる。また、本発明の方法によれば、生理活性物質を少量塗布することにより固定化することができ、溶液の使用量を減らすことができるためコストを削減することができる。
【００２２】
本発明の特徴をまとめると以下の通りである。従来技術のマイクロ流路を用いた方法では工程上、生理活性物質を含む溶液を流さなくてはならないため、生理活性物質が大量に必要となるのに対し、本発明の方法ではスピンコーター又はディスペンサーによる塗布方法を用いることができるため、生理活性物質の使用量は少量で十分である。本発明の方法では、生理活性物質を含む溶液のｐＨをコントロールする必要がないため、生理活性物質が失活しない。従来、生理活性物質は乾燥させると失活すると考えられていたが、乾燥させても失活はしなかった。また、本発明の方法では、生理活性物質の膜が均一であるため、定量的かつ速度論的評価の誤差を最小限に抑えることができる。
【００２３】
本発明の方法で製造される生理活性物質を固定した基板は、バイオセンサー用基板として用いることができる。本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサー では、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。以下、本発明による生理活性物質を固定した基板の製造方法について具体的に説明する。
【００２４】
（１）基板
本発明では、生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板の表面上に、生理活性物質を塗布する。本発明では、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２５】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００２６】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２７】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００２８】
上記の基板は、測定ユニットの誘電ブロックに固定され、一体化されて測定チップを構成しており、この測定チップが交換可能に形成されていてもよい。以下にその例を示す。
【００２９】
図１は、ＳＰＲを利用した測定に用いられるセンサユニット１０の分解斜視図である。センサユニット１０は、透明な誘電体である全反射プリズム（光学ブロック）２０と、この全反射プリズム２０の上に取り付けられる流路部材３０とで構成される。流路部材３０は、図中奥側に位置する第１流路３１と、図中手前側に位置する第２流路３２との２種類の流路を有している。詳細は後述するが、センサユニット１０を用いて測定を行う際には、これら２つの流路３１、３２を１組として、１つの試料の測定が行われる。流路部材３０には、各流路３１、３２が、それぞれ長手方向に６つずつ設けられており、１つのセンサユニット１０で６つの試料を測定できるようにしている。なお、各流路３１、３２の数は、６つに限ることなく、５つ以下でもよいし７つ以上でもよい。
【００３０】
全反射プリズム２０は、長尺な台形柱状に形成されたプリズム本体２１と、このプリズム本体２１の一端に設けられた把持部２２と、プリズム本体２１の他端に設けられた突出部２３とからなる。この全反射プリズム２０は、例えば、押し出し法などによって型成形されるものであり、プリズム本体２１、把持部２２、突出部２３の各部は、一体に成形されている。
【００３１】
プリズム本体２１は、下底よりも上底の方が長い略台形の縦断面を有しており、底面側面から照射された光を上面２１ａに集光する。プリズム本体２１の上面２１ａには、ＳＰＲを励起するための金属膜（薄膜層）２５が設けられている。金属膜２５は、流路部材３０の各流路３１、３２と対面するように、長方形状をなしており、例えば、蒸着法などによって成形される。この金属膜２５としては、例えば、金や銀などが使用され、その膜厚は、例えば、５０ｎｍである。なお、金属膜２５の膜厚は、金属膜２５の素材や測定時に照射される光の波長などに応じて適宜選択される。
【００３２】
金属膜２５の上には、生理活性物質を固定化するための層２６が設けられている。生理活性物質を固定化するための層２６は、生理活性物質を固定させるための結合基を有するものであり、この生理活性物質を固定化するための層２６を介して金属膜２５上に生理活性物質が固定される。
【００３３】
（２）生理活性物質を固定化するための層
金属基板には、生理活性物質を固定化するための層が設けられている。生理活性物質を固定化するための層は、自己組織化膜形成分子、親水性ポリマー、疎水性ポリマー、又はその組み合わせから構成することができるが、親水性ポリマーを使用することが好ましい。特に好ましい態様によれば、自己組織化膜形成分子と親水性ポリマーの組み合わせから構成することができる。
【００３４】
（２−１）自己組織化膜形成分子
本発明で言う自己組織化膜とは、外からの細かい制御を加えていない状態で、膜材料そのものがもつ機構によって形成される一定の秩序をもつ組織をもった単分子膜やＬＢ膜などの超薄膜のことを言う。この自己組織化により、非平衡な状況で長距離にわたって秩序がある構造やパターンが形成される。
【００３５】
自己組織化膜（SAMs）を用いた金属膜の被覆法は、ハーバード大のWhitesides教授らにより精力的に展開されており、その詳細は例えばChemical Review, 105, 1103-1169 (2005)に報告されている。金属として金を用いた場合、有機層形成化合物として一般式Ａ−１（一般式Ａ−１において、ｎは３から２０の整数を示し、Ｘは官能基を示す）に示すアルカンチオール誘導体を用いることにより、Au-S結合とアルキル鎖同士のvan der Waals力に基づき、配向性を持つ単分子膜が自己組織的に形成される。自己組織化膜は、アルカンチオール誘導体の溶液中に金基板を浸漬するという極めて簡便な手法で作成される。一般式Ａ−１においてX=NH2である化合物を用いて自己組織化膜を形成させることで、アミノ基を有する有機層で金表面を被覆することが可能となる。
【００３６】
【化１】
2008286776.tif 000002
【００３７】
末端にアミノ基を有するアルカンチオールは、アルキル鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物（一般式Ａ−２）（一般式Ａ−２において、ｎは３から２０の整数を示す）でもよく、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−３、Ａ−４）（一般式Ａ−３においてｎは３から２０の整数を示し、一般式４においてｎはそれぞれ独立に１から２０の整数を示す）と大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させた化合物でもよい。末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールと大過剰のヒドラジドまたはジアミンとの反応は、溶液状態で行ってもよく、また、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールを基板表面に結合した後、大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させてもよい。
【００３８】
【化２】
2008286776.tif 000003
【００３９】
A-2〜A-4のアルキル基の繰返し数は、3以上20以下が好ましく、さらに3以上16以下が好ましく、4以上8以下が最も好ましい。アルキル鎖が短いと自己組織化膜を形成しにくく、アルキル鎖が長いと水溶性が低下し、ハンドリングが困難になる。
【００４０】
本発明に用いるジアミンとしては、任意の化合物を用いることが可能であるが、バイオセンサー表面に用いる場合、水溶性ジアミンが好ましい。水溶性ジアミンとしては具体的に、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ピペラジン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ジヘキサメチレントリアミン、１．４−ジアミノシクロヘキサン等の脂肪族ジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、パラキシリレンジアミン、メタキシリレンジアミン、４，４‘−ジアモノビフェニル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４‘−ジアミノジフェニルケトン、４，４‘−ジアミノジフェニルスルホン酸等の芳香族ジアミンが挙げられる。バイオセンサー表面の親水性を向上させるという観点から、２つのアミノ基をエチレングリコールユニットで連結した化合物（一般式５）を用いることも可能である。本発明に用いるジアミンとしては、好ましくはエチレンジアミンまたは一般式Ａ−５（一般式Ａ−５において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）で表される化合物であり、より好ましくは、エチレンジアミンまたは1,2-ビス(アミノエトキシ)エタン（一般式Ａ−５において、n=2,m=1）である。
【００４１】
【化３】
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【００４２】
アミノ基を有するアルカンチオールは、単独で自己組織化膜を形成することも可能であり、また、他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成することも可能である。バイオセンサー表面に用いる場合、他のアルカンチオールとしては、生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な化合物を用いることが好ましい。生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な自己組織化膜に関しては、前述のWhitesides教授らにより詳細に検討されており、親水性基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化膜が非特異吸着抑制に有効であることが報告されている（Langmuir,17,2841-2850, 5605-5620, 6336-6343 (2001)）。本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールは、前記論文に記載された化合物を好ましく用いることが可能である。非特異吸着抑制能に優れ、入手が容易であることから、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールとしては、水酸基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−６）あるいはエチレングルコールユニットを有するアルカンチオール（一般式Ａ−７）（一般式Ａ−６において、ｎは３から２０の整数を示し、一般式Ａ−７において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）を用いることが好ましい。好ましくは、一般式Ａ−６において、ｎは５以上であり、１０以上であることがさらに好ましく、１０〜３０がさらに好ましく、最も好ましくは６〜１６である。
【００４３】
【化４】
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【００４４】
アミノ基を有するアルカンチオールを他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成する場合、A-2〜A-4のアルキル基の繰返し数は、4以上20以下が好ましく、さらに4以上16以下が好ましく、4以上10以下が最も好ましい。また、A-6,A-7のアルキル基の繰返し数は、3以上16以下が好ましく、さらに3以上12以下が好ましく、3以上8以下が最も好ましい。
【００４５】
本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールは、任意の割合で混合することが可能であるが、アミノ基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には活性エステル化されたカルボキシル基含有ポリマーの結合量が低下し、親水性基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には非特異吸着抑制能が減少する。それゆえ、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールの混合比は、１／１〜１／１，０００，０００の範囲であることが好ましく、１〜１／１，０００の範囲であることがより好ましく、１〜１／１０の範囲であることがさらに好ましい。活性エステル化されたカルボキシル基を含有するポリマーと反応する場合の立体障害低減の観点から、アミノ基を有するアルカンチオールの分子長は、親水性基を有するアルカンチオールの分子長よりも長いことが好ましい。
【００４６】
本発明で用いるアルカンチオールは、Northwestern大学のGrzybowski教授らによる総説（Curr. Org. Chem., 8, 1763-1797(2004).）およびその引用文献に基づいて合成された
化合物を用いても良く、また市販の化合物を用いてもよい。これらの化合物は、同仁化学（株）、Aldrich社、SensoPath Technologies社、Frontier Scientific Inc.社等から購
入可能である。本発明においてアルカンチオールの酸化生成物であるジスルフィド化合物は、アルカンチオールと同様に用いることが可能である。
【００４７】
（２−２）親水性ポリマーについて
本発明で用いることができる親水性ポリマーとしては、ゼラチン、アガロース、キトサン、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、澱粉、セルロース、又はこれらの誘導体、例えばカルボキシメチル誘導体、又は水膨潤性有機ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール又はこれらの誘導体などを挙げることができる。
【００４８】
本発明で用いる親水性ポリマーとしてはさらに、カルボキシル基含有合成ポリマーおよびカルボキシル基含有多糖類を用いることが可能である。カルボキシル基含有合成ポリマーとしては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、およびこれらの共重合体、例えば特開昭５９−５３８３６号明細書３頁２０行〜６頁４９行、特開昭５９−７１０４８号明細書３頁４１行〜７ページ５４行明細書に記載されているようなメタクリル酸共重合体、アクリル酸共重合体、イタコン酸共重合体、クロトン酸共重合体、マレイン酸共重合体、部分エステル化マレイン酸共重合、水酸基を有するポリマーに酸無水物を付加させたものなどが挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、天然植物からの抽出物、微生物発酵の生産物、酵素による合成物、または化学合成物の何れであってもよく、具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、セロウロン酸、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン等が挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、市販の化合物を用いることが可能であり、具体的には、カルボキシメチルデキストランであるＣＭＤ、ＣＭＤ−Ｌ、ＣＭＤ−Ｄ４０（名糖産業社製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、等を挙げることができる。
【００４９】
本発明で用いる親水性ポリマーの分子量は特に限定されないが、一般的には２００以上５００００００以下であることが好ましい。さらに好ましい親水性ポリマーの分子量は１０００００以上２００００００以下である。
【００５０】
上記したような親水性ポリマーは、本明細書中以下に説明するような自己組織化膜又は疎水性ポリマーを介して基板に固定してもよいし、あるいはモノマーを含む溶液から直接基板上に形成させることもできる。さらに、上記した親水性ポリマーは架橋することもできる。親水性ポリマーの架橋は当業者に自明である。
【００５１】
センサー表面に固定する親水性ポリマーは、水溶液中の膜厚が１ｎｍ以上300ｎｍ以下であることが好ましい。膜厚が薄いと生理活性物質固定量が減少し、またセンサー表面の水和層が薄くなるため生理活性物質自身の変性で被検体物質との相互作用が検出しにくくなる。膜厚が厚いと被検体物質が膜内に拡散する障害となり、また特にセンサー基板の親水性ポリマー固定面の反対側から相互作用を検出する場合は検出表面から相互作用形成部までの距離が長くなり、検出感度が低くなる。水溶液中の親水性ポリマー膜厚はＡＦＭ、エリプソメトリーなどで評価することができる。
【００５２】
また、本発明では、センサー表面に固定する親水性ポリマーの固定量は、３ｎｇ／ｍｍ2以上３０ｎｇ／ｍｍ2以下であることが好ましく、３ｎｇ／ｍｍ2以上２０ｎｇ／ｍｍ2以下が更に好ましく、３ｎｇ／ｍｍ2以上１５ｎｇ／ｍｍ2以下が最も好ましい。
【００５３】
親水性ポリマーの固定量は、種々の膜厚測定方法で検出した値を使用することができる。膜厚測定方法の例としては、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）などの走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）などの電子顕微鏡、水晶発振子マイクロバランス法（ＱＣＭ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、全反射測定法（ＡＴＲ）、外部反射法などの赤外分光法、エリプソメトリー法などの方法が挙げられる。固定量の具体的な算出法としては、例えばＳＰＭでは、基板上の親水性ポリマーが固定されているエリアと固定されていないエリアとの表面凹凸の差から固定量を算出、電子顕微鏡の場合は親水性ポリマーが固定された基板の切片観察から固定量を算出、赤外分光法では親水性ポリマーに帰属される吸収強度の検量線から固定量を定量、ＱＣＭ、ＳＰＲおよびエリプソメトリーでは各測定原理に基づき基板上の親水性ポリマー固定量を算出することができる。本発明の親水性ポリマーの固定膜厚は次のようにして算出した。分光エリプソメトリー（ファイブラボ社製）を用いて、まず親水性ポリマー固定前の基板の光学定数を求め、次いで親水性ポリマーを固定した基板乾燥状態で測定することで親水性ポリマー層の光学定数を算出する。基板表面が多層構成の場合は、各層を設置する毎にエリプソメトリー測定することで、各層の光学定数を順次算出でき、２層程度までは１層とみなして算出することも可能である。算出した各層の光学定数を定数として、単色エリプソメトリー（Ｈｅ-Ｎｅレーザー、ファイブラボ社製）を用いて測定した、親水性ポリマー固定前の基板と、親水性ポリマー固定後の乾燥基板との膜厚の差を親水性ポリマー層の厚みとする。ここで、乾燥状態とは親水性ポリマー層に液体状態の水が実質的に存在しないことを意味する。具体的には、本発明の生理活性物質が安定な温湿度条件で５分以上静置した恒常状態であり、より具体的には気温５℃から３０℃、湿度０％ＲＨから９０％で５分以上静置して恒常とした状態を示す。
【００５４】
（２−３）親水性ポリマーの活性化
親水性ポリマーとしてカルボキシル基を含有するポリマーを使用する場合、カルボキシル基を活性化することによって、自己組織化膜で被覆された基板に固定化することができる。カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法としては、公知の手法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化する方法、又はEDC単独により活性化する方法を好ましく用いることができる。この手法で活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーを、アミノ基を有する基板と反応させることで、本発明のバイオセンサーを製造することが可能となる。
【００５５】
また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として含窒素化合物を用いる方法があり、具体的には、下記一般式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）[式中、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立して置換基を有しても良いカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表し、Ｒ1及びＲ2は結合により５〜６員環を形成しても良く、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す]に示される含窒素化合物を用いることもできる。
【００５６】
【化５】
2008286776.tif 000006
【００５７】
ここで、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立して置換基を有しても良いカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表すが、好ましくはＲ１及びＲ２は結合により５〜６員環を形成する。特に好ましくは、ヒドロキシコハク酸、ヒドロキシフタル酸、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３、４−ジヒドロキシ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１、２、３−ベンゾトリアジン、及びその誘導体が提供される。
【００５８】
また、好ましくは下記化合物７で示される含窒素化合物を用いることもできる。
【００５９】
【化６】
2008286776.tif 000007
【００６０】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（ＩＩ）[式中、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表す]で表される化合物を用いることもできる。
【００６１】
【化７】
2008286776.tif 000008
【００６２】
具体的には、下記の化合物などを用いることができる。
【００６３】
【化８】
2008286776.tif 000009
【００６４】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記の化合物を用いることもできる。
【００６５】
【化９】
2008286776.tif 000010
【００６６】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（ＩＩＩ）[式中、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す]を用いることもできる。
【００６７】
【化１０】
2008286776.tif 000011
【００６８】
ここで、Ａで表される炭素原子またはリン原子の置換基としては、置換基を有するアミノ基が好ましく、ジメチルアミノ基やピロリジノ基の様なジアルキルアミノ基が好ましい。Mで表される（n-1）価の元素は、リン原子、ホウ素原子、ヒ素原子などが挙げられるが、好ましくはリン原子があげられる。Xで表されるハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、好ましくはフッ素原子が挙げられる。
【００６９】
また一般式（ＩＩＩ）で表される含窒素化合物の具体例としては、下記の化合物などが挙げられる。
【００７０】
【化１１】
2008286776.tif 000012
【００７１】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（IV）[式中、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す]を用いることもできる。
【００７２】
【化１２】
2008286776.tif 000013
【００７３】
具体的には、下記の化合物などを用いることができる。
【００７４】
【化１３】
2008286776.tif 000014
【００７５】
また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として、電子吸引性基を有するフェノール誘導体を使用することも好ましく、更に電子吸引性基のσ値が0.3以上であることが好ましい。具体的には、下記化合物１６などを用いることができる。
【００７６】
【化１４】
2008286776.tif 000015
【００７７】
更に、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法では、別にカルボジイミド誘導体物を併用することができ、好ましくは、水溶性カルボジイミド誘導体を併用する事ができ、更に好ましくは下記の化合物、（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride）を併用することができる。
【００７８】
【化１５】
2008286776.tif 000016
【００７９】
上記のカルボジイミド誘導体及び、含窒素化合物、またはフェノール誘導体は併用して使用するだけではなく、所望により、夫々、単独で用いることもできる。好ましくはカルボジイミド誘導体と含窒素化合物との併用である。
【００８０】
また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として、下記化合物を用いることもできる。該化合物は単独で用いることもできるが、カルボジイミド誘導体、含窒素化合物、フェノール誘導体と併用してもよい。
【００８１】
【化１６】
2008286776.tif 000017
【００８２】
さらに、カルボキシル基を含有するポリマーにおけるカルボン酸を活性化する手法としては、特願２００４−２３８３９６号（特開２００６−５８０７１号公報）「００１１」〜「００２２」に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いて活性化することによりカルボン酸アミド基を形成する方法）、並びに特願２００４−２７５０１２号（特開２００６−９０７８１号公報）「００１１」〜「００１９」に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物でエステルとした後に、アミンと反応させることによりカルボン酸アミド基を形成する方法）を好ましく用いることもできる。
【００８３】
なお、上記した特願２００４−２３８３９６号（特開２００６−５８０７１号公報）における特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体とは、下記一般式１で表されるウロニウム塩、下記一般式２で表されるホスホニウム塩、又は下記一般式３で表されるトリアジン誘導体を示す。
【００８４】
【化１７】
2008286776.tif 000018
【００８５】
（一般式１において、Ｒ1とＲ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は互いに一緒になって炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ3は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ-はアニオンを示す。一般式２において、Ｒ4とＲ5はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は互いに一緒になって炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ6は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ-はアニオンを示す。一般式３において、Ｒ7はオニウム基を示し、Ｒ8及びＲ9はそれぞれ独立に電子供与基を示す。）
【００８６】
（２−４）親水性ポリマーの基板への塗布
本発明において活性エステル化されたカルボキシル基を含有するポリマーは、溶液として基板と反応させてもよく、また、スピンコート等の手法を用いて基板上の薄膜を形成させた状態で反応させてもよい。好ましくは、薄膜を形成させた状態での反応である。
【００８７】
上記の通り、本発明において活性エステル化されたカルボキシル基を含有するポリマーは、薄膜状態で基板と反応させることが好ましい。基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。これらの薄膜形成法については、「コーティング技術の進歩」原崎勇次著、総合技術センター(1988)、「コーティング技術」技術情報協会(1999)、「水性コーティングの技術」シーエムシー(2001)、「進化する有機薄膜  成膜編」住べテクノリサーチ(2004)、「高分子表面加工学」岩森暁著、技報堂出版(2005)、等に説明されている。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法、ディスペンス法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。
【００８８】
スプレーコート法とは、微細化されたポリマー溶液を基板に吹きつけた状態で、基板を移動させることで、基板上にポリマー溶液を均一塗布する方法である。スプレーガンの引き金を引くと空気バルブとニードルバルブが同時に開き、ノズルからポリマー溶液が霧状に噴出し、ノズル先端にある空気キャップから噴出する空気で霧状のポリマー溶液がさらに微細化される。微細化されたポリマー溶液による塗布膜を基板表面に形成させた後、溶媒を蒸発させることで、膜厚の制御されたポリマーフイルムが容易に作成される。ポリマー溶液濃度、基板の移動速度等により、ポリマー薄膜の膜厚制御が可能となる。
【００８９】
ディスペンス法とは、塗布液を定量吐出するディスペンサーを使用して基板上にポリマー溶液を均一塗布する方法である。シリンジポンプなどの吐出装置からポリマー溶液を吐出しながら、吐出口を基板上で一定速度で動作させることで基板上の任意の場所に均一塗布することが可能である。基板と吐出口の間隔を一定に保つことで塗布量を均一にすることが可能で、さらに間隔を極力狭くすることで塗布液の厚みを薄くすることで塗布液使用量の削減、乾燥速度の向上が可能で好ましい。
【００９０】
スピンコート法とは、水平に設置した基板上にポリマー溶液を滴下した後に高速回転させ、遠心力によって基板全体にポリマー溶液を均一塗布する方法である。遠心力によるポリマー溶液の飛散と溶媒の蒸発に伴い、膜厚の制御されたポリマーフイルムが容易に作成される。回転数、ポリマー溶液濃度、溶剤の蒸気圧等により、ポリマー薄膜の膜厚制御が可能となる。本発明においてスピンコート時の回転数は特に制限されないが、回転数が低すぎる場合には基板上に溶液が残存し、回転数が高すぎる場合には使用可能な装置が制限されてしまう。
【００９１】
（２−５）疎水性ポリマー
本発明で用いることができる疎水性ポリマーは、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。
【００９２】
疎水性ポリマーを形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性ポリマーとしては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００９３】
本発明で好ましく用いられる疎水性ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００９４】
疎水性ポリマーの基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００９５】
疎水性ポリマーのコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、特に好ましくは１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。疎水性ポリマーの分子量は特に限定されないが、好ましい範囲は1万から5000万である。
【００９６】
（３）生理活性物質を固定化するための層への生理活性物質の固定
上記した生理活性物質を固定化するための層は、生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。例えば、生理活性物質を固定化するための層が、カルボキシル基を有する親水性ポリマーから構成されている場合は、このカルボキシル基を活性化した後に、アミノ基を有する生理活性物質を反応させることによって、当該生理活性物質を親水性ポリマーに固定化することができる。生理活性物質を生理活性物質を固定化するための層に固定化する際におけるカルボキシル基の活性化は、本明細書中上記（２−３）親水性ポリマーの活性化において記載した方法と同様の方法により行うことができる。
【００９７】
本発明では、生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板の表面上に、該生理活性物質を固定化するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布し、乾燥させることによって基板表面上に均一な膜を形成する。この際、生理活性物質は、生理活性物質を固定化するための層を構成する分子と共有結合することによって、金属基板の表面に固定化される。
【００９８】
本発明において、生理活性物質を固定化することができる官能基として、カルボキシル基やアミノ基などの官能基の他に、例えば、ビオチン結合性タンパク（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）、プロテインA、プロテインG、抗原、抗体（例えば、抗GST抗体等の公知のtag抗体）などの生理活性物質をあらかじめ固定し、この生理活性物質の上に、さらに下記に示すような生理活性物質を固定化する態様が可能である。また、ポリマーにアルカンを導入した固定化層を用いれば、脂質などの膜構造を有した生理活性物質を固定することが可能になる。また、用途に応じて、ポリマー鎖の長さ、ポリマーの厚み、ポリマーの密度、あるいは、ポリマーに導入する反応基の量を調整することにより、多様な蛋白に対応することが可能になる。またポリマーに固定基として、NTA（nitrilotriacetic acid）等などを導入すれば、金属キレートを介してHis-tagリガンド等を固定することができる。
【００９９】
（４）本発明で用いることができる生理活性物質
本発明で金属基板の表面に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【０１００】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【０１０１】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【０１０２】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
【０１０３】
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
【０１０４】
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【０１０５】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
【０１０６】
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
これらの生理活性物質のうち、蛋白質を用いることが好ましく、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン類、カルモデュリン、又は抗体を用いることがより好ましい。
【０１０７】
生理活性物質を含む溶液（塗布液）の濃度は、基板表面に固定する生理活性物質の濃度が高い方が好ましい。生理活性物質により異なるが、０.１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬ
で使用することが好ましく、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬである。
【０１０８】
（５）生理活性物質の塗布及び乾燥
生理活性物質を含む溶液の乾燥過程において、生理活性物質は塗布した溶液の外周部または、塗布液が乾固直前まで液が残った部分に析出する傾向がある。これにより基板表面に固定される生理活性物質の量に分布が発生し好ましくない。基板表面の生理活性物質固定量を均一にするため、塗布液の粘度は生理活性物質の基板表面への結合を阻害しない範囲で高くすることが好ましい。塗布液粘度を高くすることで、乾燥過程における塗布液中の生理活性物質の基板表面に対して水平方向の移動が抑えられ、結果として生理活性物質固定量のばらつきを抑えられる。乾燥過程における塗布液の粘度は０．９ｃＰ以上に保つことが好ましい。
【０１０９】
本発明の乾燥する工程とは、生理活性物質を含む溶液を塗布する塗布工程、塗布工程後の加熱や送風などによって溶液が乾燥する速度を上げ、意図的に乾燥させる工程、の２つの工程を含む工程のことをいう。ここで、生理活性物質を含む溶液（塗布液）の乾燥速度を上げることは生理活性物質固定量のばらつきを抑えることに効果がある。乾燥速度を上げ、生理活性物質の水平方向の移動速度に対して、十分早く乾燥を終了させることで、生理活性物質が実質的に移動する前に乾燥が終了し、ばらつきを抑えることが可能となる。乾燥速度を上げる方法は特に限定されないが、塗布液温度、乾燥環境温度を上げる、赤外線、レーザーなどの照射で蒸発エネルギーを加える、送風などで乾燥時の溶媒蒸気圧を下げる、溶液を薄層塗布して塗布量に対する蒸発面積を大きくするなどの方法が挙げられる。特に、塗布液が水を含む場合、乾球温度と湿球温度差の大きい環境で乾燥させることで乾燥速度は早くなる。乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の環境で乾燥させることが好ましく、さらに好ましくは１０℃以上、さらに好ましくは１３．５℃以上である。また、製造工程上、乾燥時間としては0.1秒以上１０分以内が好ましく、より好ましくは1秒以上５分以内、特に好ましくは1秒以上１分以内である。
【０１１０】
本発明では、上記塗布工程と、意図的に乾燥させる工程は、乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の環境において行うことが好ましく、さらに好ましくは乾球温度と湿球温度との温度差が１０℃以上の環境、さらに好ましくは乾球温度と湿球温度との温度差が１３．５℃以上の環境である。
【０１１１】
生理活性物質を含む溶液を塗布する方法としては、特に塗布液を定量吐出するディスペンサーを使用する方法が挙げられる。ディスペンサーは、シリンジに溶液を溜めてこれを吐出しても良く、ピペットを用いて吐出しても良い。特にピペトを用いることが、生理活性物質のディスペンサー内の残留量を削減することができ好ましい。ディスペンサーの吐出口を基板上で一定速度、一定間隔で動作させることで基板上の任意の場所に均一塗布することが可能である。ディスペンサーで塗布する場合、基板と吐出口の間隔を極力狭くし、塗布液厚みを薄くすることで生理活性物質の厚みを均一にすることができ、また乾燥速度を上げることができ、好ましい。また生理活性物質を含む溶液を塗布する好ましい方法として、スピンコートも挙げられる。この方法は、特に塗布膜厚を薄くする場合に好ましい。均一厚みの溶液を形成した後に乾燥させるため、スピンコーターは回転中の溶媒の蒸発を防ぐことが好ましい。このため、回転時に基板を密閉容器に入れておくなどの方法で、基板周辺の溶媒濃度が高い環境に保つことで、回転中の薄膜形成と薄膜形成後の乾燥速度を制御できるため、特に好ましい。これらの塗布工程後、温度・湿度を一定に保った条件下で乾燥させることが好ましい。エアナイフ法で生理活性物質溶液を乾燥することも好ましい。
【０１１２】
本発明において、「意図的に乾燥させる工程」における、乾燥方法とは、上記、加熱や送風による乾燥のほかに、スピンコート法やエアナイフ法を使用する乾燥方法のことも含まれる。
【０１１３】
さらに本発明では、金属基板の表面上に塗布した生理活性物質を含む溶液を乾燥した後（上記の塗布工程、意図的に乾燥させる工程の後）に、乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の環境において静置することが好ましく、さらに好ましくは乾球温度と湿球温度との温度差が１０℃以上の環境であり、さらに好ましくは乾球温度と湿球温度との温度差が１３．５℃以上の環境である。ここで、塗布工程の後、意図的に乾燥させる工程を省き、静置させる工程を行っても良い。静置工程における時間としては、1秒以上24時間以下で静置することが好ましく、より好ましくは1分以上6時間以下、さらに好ましくは5分以上2時間以下、最も好ましくは20分以上1時間以下である。
本発明の最も好ましい態様においては、生理活性物質を固定化するための層を有する金属基板に、該生理活性物質を固定するための層を構成する分子と共有結合を形成することができる生理活性物質を含む溶液を塗布する工程を乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上（さらに好ましくは１０℃以上、さらに好ましくは１３．５℃以上）の環境において行い、その後に、乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上（さらに好ましくは１０℃以上、さらに好ましくは１３．５℃以上）の環境で乾燥し、さらにその後に、乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上（さらに好ましくは１０℃以上、さらに好ましくは１３．５℃以上）の環境において静置することによって、生理活性物質固定基板を製造することができる。
【０１１４】
生理活性物質と被検体物質との相互作用を検出する場合、センサー表面の生理活性物質の固定量の変動は相互作用の定量的、速度論的評価の誤差の原因となる。この誤差を最小限に抑える目的で、生理活性物質の固定量を均一にすることが好ましい。相互作用の検出に使用される基板表面の生理活性物質の固定量のばらつきがＣＶ値（変動係数）（標準偏差／平均値）で１５％以下が好ましく、さらに好ましくは１０％以下である。ＣＶ値は、基板表面の少なくとも２点以上、好ましくは１０点以上、さらに好ましくは１００点以上の固定量から算出することができる。均一性は、生理活性物質を固定する前後のセンサー基板上の物質の量を定量することでも評価可能であるが、生理活性物質と結合することが知られている物質を蛍光標識して、この標識物質をセンサー基板に固定した後に蛍光顕微鏡などを用いて蛍光強度を測定することでも可能である。また、ＳＰＲイメージャー、エリプソメーター、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ、ＡＴＲ−ＩＲ装置などで生理活性物質の定量も可能である。
【０１１５】
また、本発明において、生理活性物質の具体的固定量は、前述の生理活性物質を固定化するための層として親水性ポリマーを使用した場合、単位面積あたりの親水性ポリマーの固定量（ｎｇ／ｍｍ2）に対して、０．３倍以上３倍以下であることが好ましく、好ましい生理活性物質の固定量は１ｎｇ／ｍｍ2以上４０ｎｇ／ｍｍ2以下で、より好ましくは、１ｎｇ／ｍｍ2以上２０ｎｇ／ｍｍ2以下である。親水性ポリマーの固定量に対する生理活性物質の固定量、および生理活性物質の固定量を、この範囲内にすることで、生理活性物質の失活抑制効果をさらに高く得ることができる。
【０１１６】
生理活性物質の固定量は、親水性ポリマーの固定量の算出方法と同様にして測定することができる。本発明においては、エリプソメトリー法で生理活性物質の固定厚みを算出した。分光エリプソメトリーを用いて、生理活性物質を固定した親水性ポリマーの乾燥状態での光学定数を求める。算出した光学定数を定数として、単色エリプソメトリーを用いて測定した生理活性物質固定後の乾燥状態の親水性ポリマー層膜厚と、生理活性物質固定前の親水性ポリマーの乾燥基板の膜厚との差を生理活性物質の固定膜厚とした。ここで、乾燥状態とは生理活性物質が固定された親水性ポリマー層に液体状態の水が実質的に存在しないことを意味する。具体的には、本発明の生理活性物質が安定な温湿度条件で５分以上静置した恒常状態であり、より具体的には気温５℃から３０℃、湿度０％ＲＨから９０％で５分以上静置して恒常とした状態を示す。
【０１１７】
（６）本発明の基板の使用方法
上記のようにして生理活性物質を固定化した本発明の基板は、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【０１１８】
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【０１１９】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の方法で製造される基板は、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【０１２０】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【０１２１】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【０１２２】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げ
られる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【０１２３】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【０１２４】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【０１２５】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【０１２６】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【０１２７】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【０１２８】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【０１２９】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【０１３０】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【０１３１】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【０１３２】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【０１３３】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【０１３４】
本発明のバイオセンサー を表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
【０１３５】
また、本発明のバイオセンサーは、例えば基板表面に導波路構造を保持した、屈折率変化を導波路を用いて検出するバイオセンサーとして用いることができる。この場合、基板表面の導波構造物は、回折格子と場合によっては付加層とを有している、この導波構造物は、薄い誘電層からなる平面的な導波体から成る。導波体に集光された光線は全反射によりこの薄い層内に導かれる。この導かれる光波（以降モードと呼ぶ）の伝播速度は、Ｃ／Ｎの値をとる。ここでＣは、真空中での光速であり、Ｎは導波体内を導かれるモードの有効屈折率である。有効屈折率Ｎは、一面では導波体の構成により、他面では薄い導波層に隣接する媒体の屈折率により決まる。光波の伝導は、薄い平面層内のみでなく、別の導波構造物、特にストリップ状の導波体によっても行われる。その場合は、導波構造物はストリップ状のフィルムの形状にされる。有効屈折率Ｎの変化は、導波層に隣接する媒体の変化と導波層自身もしくは導波層に隣接する付加層の屈折率および厚さの変化とにより生じることがバイオセンサーにとって重要な要素である。
【０１３６】
この方式のバイオセンサーの構成については、例えば特公平６−２７７０３号広報４ページ４８行目から１４ページ１５行目および第１図から第８図、米国特許第 6,829,073号のcolumn6の31行目からcolumn7の47行目および第9図A,Bに記載されている。
【０１３７】
例えば、一つの実施形態として、薄層が平面状の導波路層が基材（たとえばパイレックス（登録商標）・ガラス）上に設けられている構造がある。導波路層と基材とは、一緒にいわゆる導波体を形成する。導波路層は、たとえば酸化物層（ＳｉＯ２，ＳｎＯ２、Ｔａ２Ｏ５，ＴｉＯ２，ＴｉＯ２-ＳｉＯ２，ＨｆＯ２，ＺｒＯ２，Ａｌ２Ｏ３，Ｓｉ３Ｎ４，ＨｆＯＮ，ＳｉＯＮ，酸化スカンジウムまたはこれらの混合物）、プラスチック層（例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネートなど）、など多層の積層体が可能である。光線が全反射により導波路層内を伝播するには、導波路層の屈折率が隣接媒体（たとえば基材や後述の付加層）の屈折率より大でなければならない。基材もしくは測定物質に向いた導波路層表面もしくは導波路層体積内には、回折格子が配置されている。回折格子は、型押し、ホログラフィまたはその他の方法によって基板内に形成することができる。次いでより高い屈折率を有する薄い導波路膜を回折格子の上表面に被覆する。回折格子は導波路層への入射光線を集束したり、既に導波路層内を導かれているモードを放出したり、そのモードの一部を進行方向へ透過させ、一部を反射させたりする機能を持つ。導波路層は、格子域を付加層でカバーしておく。付加層は必要に応じて多層膜とすることができる。この付加層は、測定物質に含まれている物質の選択的検知を可能にする機能を持たせることができる。好ましい態様として付加層の最表面に、検知機能を持つ層を設けることができる。このような検知機能を持つ層として、生理活性物質を固定化し得る層を用いることができる。
【０１３８】
別の実施形態として、回折格子導波路のアレイがマイクロプレートのウェル内に組み込まれる形態も可能である（特表2007-501432）。すなわち回折格子導波路がマイクロプレートのウェル底面にアレイ状に配列されていれば、スループットの高い薬物または化学物質のスクリーニングを可能にすることができる。
【０１３９】
回折格子導波路は、回折格子導波路の上層（検知領域）上の生理活性物質検出を可能にするために、入射光線、および反射光を検出して屈折特性の変化を検出する。この目的のため、１つまたはそれより多くの光源（例えば、レーザ、ダイオード）及び１つまたはそれより多くの検出器（例えば、分光計、ＣＣＤカメラまたはその他の光検出器）を用いることができる。屈折率変化を測定するための方法として、２つの異なる動作モード−分光法、及び角度法がある。分光法においては、入射光として広帯域ビームが回折格子導波路に送られ、反射光が集められて、例えば分光計で測定される。共鳴波長（ピーク）のスペクトル位置を観測することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。また、角度法においては、公称上単一波長の光がある範囲の照射角を生じるように集束されて、回折格子導波路内に向けられる。反射光がＣＣＤカメラまたはその他の光検出器によって測定される。回折格子導波路によって反射された共鳴角の位置を測定することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。
【０１４０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【０１４１】
実施例１
（１）基板の作成
ゼオネックス（日本ゼオン社製）を射出成型して得られたプラスチックプリズムの上面に以下の方法で金薄膜を製膜した。スパッタ装置の基板ホルダにプリズムを取付け、真空（ベースプレッシャー1×10-3Pa以下）に引いてからArガスを導入し（1Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、基板ホルダにRFパワー（0.5kW）を約9分間印加してプリズム表面をプラズマ処理（基板エする。次に、Arガスを止めて真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（10〜40rpm）させながら、8inchのCrターゲットにDCパワー（0.2kW）を約30秒間印加して2nmのCr薄膜を成膜する。次に。Arガスを止めて再び真空に引き、Arガスを再び導入し、（0.5Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、8inchのAuターゲットにDCパワー（1kW）を約50秒間印加して50nm程度のAu薄膜を成膜する。
【０１４２】
上記で得られたAu薄膜を成膜したセンサースティックを、6-Amino-1-hexanethiol, hydrochloride（同仁化学社製）の1mM水溶液に40℃１時間浸漬し、超純水で5回洗浄した。
【０１４３】
（２）CMD(カルボキシメチルデキストラン)の活性エステル化
1重量%のCMD（名糖産業製：分子量100万、置換度0.59）溶液10g(カルボキシル基量：5×10-4mol)を溶解した後、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド２×１０-5Ｍ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５×１０-5Ｍ）を含む水溶液10mlを加え、室温で1時間攪拌した。
【０１４４】
（３）CMDの基板への結合反応
（１）で成された基板の上に、（２）で作成された活性エステル化されたCMD溶液１ｍLをマイクロピペットを用いてAu薄膜が設置されたプリズム面全面に滴下して被覆し、密閉式インナーカップを有するスピンコーター（Model408(特)、ナノテック社製）のインナーカップ上に回転中心から半径１３５ｍｍの位置に円弧の接線方向が基板の長軸方向となるように固定した。１０００ rpmで45 秒スピンコートすることで、アミノ基を有する基板上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で15分間反応させた後、1 N NaOH水溶液に30分浸漬し、超純水で5回洗浄することで、ＣＭＤ表面基板を作成した。AFMによる測定を行ったところ、膜厚は200nmであった。
【０１４５】
（４）Ｎ−アビジン修飾基板の作成
（３）で作成されたＣＭＤ基板表面に直径５ｍｍの円型穴を有するテフロン（登録商標）板を圧着することでキュベットを形成した。このキュペット内に、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との１：１混合液を１００μＬ添加し、室温で７分間静置してＣＭＤ基板表面を活性エステル化した。次いで、キュベット内を四ほう酸ナトリウム十水和物  ３．８ｇを純水１Ｌに溶解し塩酸（１ｍｏｌ／Ｌ）を添加してｐＨ８．５に調製した緩衝液（以降ほう酸バッファーと略記）に置換した。キュベット内のほう酸バッファーを窒素ガンで除去した後に、Ｎ−アビジン（PIECE社製）の５ｍｇ／ｍＬほう酸バッファー溶液（以降、Ｎ−アビジン５ｍｇ／ｍＬ溶液と略記）を活性エステル化したＣＭＤ表面に５μＬ滴下した。直ちに４０℃の空気恒温槽（乾球温度と湿球温度の差が10℃）に移動し、静置することで、１０分後にＮ−アビジン溶液は乾燥した。
【０１４６】
実施例で使用したＮ−アビジンの等電点はｐＨ６．３であり、ｐＨ６．３より高いｐＨではＮ−アビジンはマイナス電荷を持ち、ｐＨ６．３より低いｐＨではプラス電荷を有する。また、ＣＭＤ基板および、活性エステル化されたＣＭＤ基板はｐＨ５．０以上ではマイナス電荷を有する。
【０１４７】
（５）Ｎ−アビジン修飾基板のブロッキング処理
（４）で作成したキュベット内のＮ−アビジン修飾基板表面に、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ８．５に調整したエタノールアミン塩酸塩水溶液（１Ｍ。以降ブロッキング溶液と略記）を１００μＬ添加して、７分間室温で静置した。キュベット内をほう酸バッファーに置換、0.1Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に置換し、続いてｐＨ７．４のリン酸バッファーに置換することでブロッキング処理されたＮ−アビジン修飾基板を作成した。
【０１４８】
（６）Ｎ−アビジン修飾基板評価
Ｎ−アビジン修飾基板表面に固定化されたＮ−アビジン量をＳＰＲイメージャー（CWG社製  SPRイメージャー）を用いて、基板上を０.２５ｍｍ間隔で１２０点測定し、Ｎ−アビジンの平均固定量およびＣＶ値を評価した。結果を表１に示した。固定量ばらつきはＣＶ値＝固定量標準偏差／固定量平均値×１００で示した。１ＲＵはおよそ１ｐｇ／ｍｍ2のＮ−アビジン固定量に相当する。
【０１４９】
実施例２
実施例１のＣＭＤ表面基板表面に、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との１：１混合液を１ｍＬ滴下してＣＭＤ表面を被服し、室温で７分間静置してＣＭＤ基板表面を活性エステル化した。次いで、基板表面をほう酸バッファーで洗浄し、窒素ガンで除去した。
【０１５０】
活性エステル化されたＣＭＤ表面基板にＮ−アビジン５ｍｇ／ｍＬ溶液をシリンジポンプを用いて１００μＬ滴下し、さらにポリプロピレン製へらで溶液を延ばして基板表面全面を被服した後、スピンコート用密閉容器に設置した。この密閉容器を密閉式インナーカップを有するスピンコーター（Model408(特)、ナノテック社製）のインナーカップ上に回転中心から半径１３５ｍｍの位置に円弧の接線方向が基板の長軸方向となるように固定した（スピンコーター内の乾球温度と湿球温度の差は10℃）。基板を密閉容器に設置した状態で５００ｒｐｍで４５秒間回転した後、基板を密閉容器から取り出した。基板表面は密閉容器取り出し後およそ１秒でＮ−アビジン水溶液が乾燥した。
【０１５１】
このＮ−アビジン修飾基板表面を、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で洗浄、ブロッキング溶液中に７分間室温で浸漬した。次いでほう酸バッファー中に３回浸漬、0.1Ｎ水酸化ナトリウム水溶液３回浸漬し、続いてｐＨ７．４のリン酸バッファーに３回浸漬することでブロッキング処理されたＮ−アビジン修飾基板を作成した。
【０１５２】
作成したＮ−アビジン修飾基板をエリプソエーターの測定間隔を２．５ｍｍとしたこと以外、実施例１の方法で評価した。結果を表１に示した。
【０１５３】
実施例３
実施例２に記載の方法で活性エステル化されたＣＭＤ基板に、ディスペンサー（デスクトップ型画像認識付塗布専用ロボットＦＡＤ３２０ｓ、武蔵エンジニアリング社製）を用いて基板中央に幅１ｍｍ長さ１１ｃｍの範囲にＮ−アビジン５ｍｇ／ｍＬ溶液を塗布し、乾球温度と湿球温度の差が10℃の条件において静置したところ、３秒で乾燥した。この手順により作成したＮ−アビジン修飾表面の評価を実施例２と同様の方法で行った。評価結果を表１に示した。
【０１５４】
比較例１
実施例１の活性エステル化したＣＭＤ基板表面のキュベット内を０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ５．０に調整した１０ｍＭ酢酸水溶液（以降酢酸バッファーと略記）に置換した。酢酸バッファーを除去した後、Ｎ−アビジンの０．２ｍｇ／ｍＬ酢酸バッファー溶液（以降、Ｎ−アビジン０．２ｍｇ／ｍＬ溶液と略記）を活性エステル化したＣＭＤ表面に１００μＬ滴下した。室温で３０分静置した後、キュベット内のＮ−アビジン０．２ｍｇ／ｍＬ溶液をブロッキング溶液１００μＬに置換して、７分間室温で静置した。キュベット内を酢酸バッファーに置換、0.1Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に置換し、続いてｐＨ７．４のリン酸バッファーに置換することでブロッキング処理されたＮ−アビジン修飾基板を作成した。
【０１５５】
作成したＮ−アビジン修飾表面を実施例１と同様の方法で評価し、結果を表１に示した。
【０１５６】
比較例２
比較例１の酢酸バッファーを全てほう酸バッファーに置き換えたこと以外、比較例１と同じ方法でＮ−アビジン修飾基板を作成し、実施例１と同様の方法で評価し、結果を表１に示した。
【０１５７】
表１に示した通り、本発明の方法により、固定用基板と反対荷電となるｐＨにしなくても生理活性物質を基板表面に共有結合させることが可能であった。さらにスピンコート法、ディスペンス法を用いて、生理活性物質溶液を薄膜製膜することで均一な生理活性物質修飾表面を得た。
【０１５８】
【表１】
2008286776.tif 000019
【０１５９】
実施例４
（１）ストレプトアビジン修飾基板の作成
Ｎ−アビジンに代わってストレプトアビジン（PIERCE社製）を使用したこと以外、実施例２と同じ方法でストレプトアビジン修飾基板を作成した。
ストレプトアビジン（PIERCE社製）の等電点は約ｐＨ７であり、ホウ酸バッファー（ｐＨ８．５）の溶液中ではマイナス表面荷電を有している。
【０１６０】
（２）ストレプトアビジン修飾基板のビオチン化蛋白固定性能評価
ストレプトアビジン修飾基板はアビジン−ビオチン相互作用を使用して、ビオチン化ターゲット蛋白質を基板表面に変性を抑えて固定することができ、ターゲット蛋白質の固定方法として使用されている。
【０１６１】
作成したストレプトアビジン修飾基板のセンサー表面にポリプロピレン製の部材を被せることにより、幅（縦方向）１ｍｍ、長さ（横方法）７.５ｍｍ、深さ１ｍｍのセルを作成した。その後、基板を表面プラズモン共鳴装置に設置した。酢酸バッファーをセルに添加し、２０分間静置後の共鳴シグナルを測定した。同様の方法で測定したＣＭＤ表面基板の共鳴シグナルとの差をストレプトアビジン固定量とした。次に、酢酸バッファーをストレプトアビジン修飾基板のセルに添加し２０分間静置後、パーオキシダーゼ、わさび由来、ビオチン-ＸＸコンジュゲート（モレキュラープローブ社製、以降ビオチン化ＨＲＰと略記）溶液（１００μｇ／ｍＬ、酢酸バッファー）をセル内に３０分間充填し、その後酢酸バッファーで置換した。  ビオチンＨＲＰ溶液をセルに充填した前後の酢酸バッファー充填時の共鳴シグナル（RU値）の変化量をビオチンＨＲＰ固定量とした。結果を表２に示した。
【０１６２】
比較例３
Ｎ−アビジンに代わりストレプトアビジンを使用した以外、比較例１と同じ方法でストレプトアビジン修飾基板を作成した。
この基板を実施例４（２）と同じ方法でビオチンＨＲＰの固定量を評価した。評価結果を表２に示した。
【０１６３】
表２に示した通り本発明の方法を用いて作成したストレプトアビジン修飾基板はビオチン化蛋白質を多く固定することができた。
【０１６４】
【表２】
2008286776.tif 000020
【０１６５】
実施例５
実施例２と同じ方法で作成したＮ-アビジン修飾基板を用いて、ビオチン化ＨＲＰに代りビオチン化カルボニックアンハイドラーゼ（以降ビオチンＣＡと略記）を用いたこと以外、実施例４（２）と同じ方法で、Ｎ-アビジン固定量とビオチンＣＡ固定量を評価した。結果を表３に示した。
【０１６６】
実施例６
スピンコーター内の乾球温度と湿球温度の差を13.5℃としたこと以外、実施例２と同じ方法でＮ-アビジン修飾基板を作成し、評価した。
【０１６７】
実施例７
スピンコーター内の乾球温度と湿球温度の差を7.0℃としたこと以外、実施例２と同じ方法でＮ-アビジン修飾基板を作成し、評価した。
【０１６８】
実施例８
スピンコーター内の乾球温度と湿球温度の差を2.5℃としたこと以外、実施例２と同じ方法でＮ-アビジン修飾基板を作成し、評価した。
【０１６９】
【表３】
2008286776.tif 000021
【０１７０】
実施例９
（１）塗布液調製
ポリ(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロオクチルアクリレート)-ポリ(ベンジルメタクリレート)コポリマー（モノマー質量比４／６、質量平均分子量３万、以降ポリマーＡと略記）１.９ｇをメチルイソブチルケトンに溶解し、液量が１００ｍＬになるようにメチルイソブチルケトンを添加した。このポリマーＡ溶液を０.４５μｍフィルターで濾過し塗布液Ａを調製した。メチルイソブチルケトンは予めモレキュラーシーブス４Ａ １／１６で１６時間脱水処置したものを使用した。
【０１７１】
（２）ポリマーＡコーティング基板の作製
実施例１（１）の方法で作成したAu薄膜を成膜したセンサースティックを縦３０ｍｍ×横１３０ｍｍ×深さ１０ｍｍの密閉構造を有するアルミニウム容器内にセットした。このアルミニウム容器を実施例１（３）で使用したスピンコート機のインナーカップ上に金表面基板が中心から１３５ｍｍの位置に円弧の接線方向が長軸となるよう固定した。マイクロピペットを用いてこの金表面基板上に塗布液Ａを１００μＬ滴下し、金表面基板全面を塗布液Ａで被覆した。アルミニウム容器を密閉し、３０秒間静置した後、２００ｒｐｍで６０秒間回転させた。基板は５分間密閉容器中に静置した後、密閉容器から取り出し室温で一晩常圧乾燥させ、ポリマーＡコーティング基板を得た。
【０１７２】
（３）疎水性ポリマー表面基板の作製
上記のように作成したポリマーＡコーティングチップを６０℃に保温した1N NaOH水溶液に１６時間浸漬した後、純水の流水中で洗浄し、ポリマーＡコーティング層表面にＣＯＯＨ基が導入された疎水性ポリマー表面基板を作製した。
【０１７３】
（４）Ｎ−アビジン修飾基板の作成および評価
ＣＭＤ表面基板の代りに（３）で得られた疎水性ポリマー表面基板を使用したこと以外、実施例２と同様の方法で、アビジン修飾基板を作成し、Ｎ−アビジン固定量を評価した。Ｎ−アビジン固定量を表４に示した。
【０１７４】
実施例１０
（１）ＳＡＭ表面基板の作成
実施例１（１）の方法で作成したAu薄膜を成膜したセンサースティックを、1mMの7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール（同仁化学）のエタノール溶液を金属膜に接触するように１００μＬ滴下し、25℃で18時間表面処理を行った。その後、エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行った。このサンプルをＳＡＭ表面基板と呼ぶ。
【０１７５】
（２）Ｎ−アビジン修飾基板の作成および評価
ＣＭＤ表面基板の代りに（１）で得られたＳＡＭ表面基板を使用したこと以外、実施例２と同様の方法で、アビジン修飾基板を作成し、Ｎ−アビジン固定量を評価した。Ｎ−アビジン固定量を表４に示した。
【０１７６】
比較例４
実施例９（１）から（３）に記載方法で作成した疎水性ポリマー表面基板を、比較例２に記載の方法で、Ｎ−アビジンの固定量を評価した。Ｎ−アビジン固定量を表４に示した。
【０１７７】
比較例５
実施例１０の方法で作成したＳＡＭ表面基板を比較例２に記載の方法で、Ｎ−アビジンの固定量を評価した。Ｎ−アビジン固定量を表４に示した。
【０１７８】
【表４】
2008286776.tif 000022
【０１７９】
表４に示した通り本発明の方法は基板表面と生理活性物質とが荷電反発するｐＨにおいても生理活性物質を固定できた。
【０１８０】
つづいて、本発明において、生理活性物質を固定化するための層の固定量と生理活性物質の割合を調整した、センサー用基板の評価を以下に示す。
【０１８１】
実施例１１：本発明の基板
ゼオネックス（日本ゼオン社製）のペレットを２４０℃で溶解し、この溶融物を射出成型器で縦８ｍｍ×横１２０ｍｍ×１．５ｍｍのプリズム基板を成型した。この基板に平行平板型６インチ用スパッタ装置（ＳＨ−５５０、アルバック(株)社製）の基板ホルダにプリズムを取付け、真空（ベースプレッシャー1×10-3Pa以下）に引いてからArガスを導入し（1Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、基板ホルダにRFパワー（0.5kW）を約9分間印加してプリズム表面をプラズマ処理（基板エする。次に、Arガスを止めて真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（10〜40rpm）させながら、8inchのCrターゲットにDCパワー（0.2kW）を約30秒間印加して2nmのCr薄膜を成膜する。次に。Arガスを止めて再び真空に引き、Arガスを再び導入し、（0.5Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、8inchのAuターゲットにDCパワー（1kW）を約50秒間印加して50nm程度のAu薄膜を成膜する。
【０１８２】
上記で得られたAu薄膜を成膜した基板を、6-Amino-1-hexanethiol, hydrochloride（同仁化学社製）の1mM水溶液に40℃２０時間浸漬し、超純水で5回洗浄した。この基板をアミン表面基板を呼ぶ。
【０１８３】
（２）CMD(カルボキシメチルデキストラン)の活性エステル化
1重量%のCMD（名糖産業製：平均分子量100万、置換度0.67）溶液２０ｇ(カルボキシル基量：5×10-4mol)を溶解した後、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド１ｍＭ（同仁化学研究所製）を含む水溶液２０ｍＬを加え、室温で３分間攪拌した。
【０１８４】
（３）ＣＭＤの基板への結合反応
（１）で成された基板の上に、（２）で作成された活性エステル化されたCMD溶液をマイクロピペットを用いて1ml滴下し、Au薄膜を成膜したプリズム面全面を溶液で被覆し、スピンコーター（Model408(特)、ナノテック社製）の回転板上に回転中心から半径１３５ｍｍの位置に円弧の接線方向が基板の長軸方向となるように固定した。１０００ rpmで45 秒スピンコートすることで、アミノ基を有する基板上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で15分間反応させた後、1 N NaOH水溶液に30分浸漬し、超純水で5回洗浄することで、ＣＭＤ表面基板を作成した。
【０１８５】
（４）アビジン修飾基板の作成
（３）で作成したＣＭＤ表面基板表面に、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ、和光純薬製）との１：１混合液をマイクロピペットを用いて１ｍＬ滴下してＣＭＤ表面を被服し、室温で３０分間静置してＣＭＤ基板表面を活性エステル化した。次いで、基板表面を純水で洗浄し、窒素ガンで除去した。
【０１８６】
２３℃１０％ＲＨ（乾球湿球温度差１３．５℃）に調整した環境試験器（東京サーモテック製）に設置されたスピンコーター（アクティブ製）の回転板上に回転中心から半径１３５ｍｍの位置に円弧の接線方向が基板の長軸方向となるように活性エステル化されたＣＭＤ表面基板を固定した。この基板上にストレプトアビジン（和光純薬製）５ｍｇ／ｍＬ溶液をシリンジポンプ（ハーバード社製）を用いて１００μＬ滴下し、ポリプロピレン製へらで溶液を延ばして基板表面を全面被覆した後、１分間静置した後に５００ｒｐｍ４５秒間回転して乾燥させた。同じ操作でストレプトアビジン溶液の被覆と回転をさらに２回繰返し、その後同じ環境試験器中で３０分間静置した。
【０１８７】
このアビジン修飾基板表面に、２−アミノエタノール塩酸塩水溶液（１Ｍ、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８.５に調製）をマイクロピペットを用いて１ｍＬ滴下して２３℃で１４分間溶液で被覆した状態を保持した。次いでほう酸バッファー（四ホウ酸ナトリウム十水和物１０ｍＭを１Ｎ塩酸でｐＨ８.５に調製）中に３回浸漬、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間浸漬し、続いて純水に３回浸漬して洗浄した。さらに、２３℃１０％ＲＨ（乾球湿球温度差１３．５℃）に調整した環境試験器に設置されたスピンコーターの回転板上に回転中心から半径１３５ｍｍの位置に円弧の接線方向が基板の長軸方向となるように基板を固定し、１０００ｒｐｍ４５秒間回転して、乾燥したアビジン修飾表面を作成した。
【０１８８】
（５）ＣＭＤおよびアビジンの固定量測定
プリズム基板、（１）、（３）および（４）で作成したAu表面基板、アミン表面基板、ＣＭＤ表面基板およびアビジン修飾基板を各々分光エリプソメーター（ファイブラボ社製）で測定し、ゼオネックス、金、6-Amino-1-hexanethiol層、ＣＭＤ層、ストレプトアビジン固定ＣＭＤ層の各光学定数を求めた。この光学定数を使用して、単色エリプソメーター（ファイブラボ社製）でＣＭＤおよびストレプトアビジンの固定膜厚を算出した。測定手順は、まず（３）のＣＭＤ表面基板上の短軸中央部を長軸方向に１０ｍｍ間隔でＣＭＤ膜厚を測定した。次いで（４）アビジン修飾処理後の同じ基板の同じ位置の膜厚をエリプソメーターを用いて測定した。アビジン修飾したＣＭＤ膜厚と修飾前ＣＭＤ膜厚の差をアビジン固定厚みとした。
【０１８９】
（６）アビジン修飾表面のビオチン化蛋白固定量測定
アビジン修飾基板はアビジン−ビオチン相互作用を使用して、ビオチン化ターゲット蛋白質を基板表面に変性を抑えて固定することができ、ターゲット蛋白質の固定方法として使用されている。（４）で作成したアビジン修飾センサー表面にポリプロピレン製の部材を被せることにより、幅（縦方向）１ｍｍ、長さ（横方法）７.５ｍｍ、深さ１ｍｍのセルを作成した。このようにして作成したアビジン修飾基板の１本は直後にパーオキシダーゼ、わさび由来、ビオチン-ＸＸコンジュゲート（モレキュラープローブ社製、以降ビオチン化ＨＲＰと略記）の結合性能を評価し、もう一本は窒素中に封入し４５℃７日間保存したその後、ビオチンＨＲＰ結合性能を評価した。
【０１９０】
ビオチン化ＨＲＰ結合性能は、基板を表面プラズモン共鳴装置に設置し、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７.４、ニッポンジーン製）をセルに添加し２０分間静置後、ビオチン化ＨＲＰ溶液（１００μｇ／ｍＬ、ＰＢＳバッファー）をセル内に３０分間充填し、その後ＰＢＳバッファーで置換した。ビオチンＨＲＰ溶液をセルに充填した前後のＰＢＳバッファー充填時の共鳴シグナル（RU値）の変化量をビオチンＨＲＰ固定量とした。保存安定性は、アビジン修飾基板を窒素中４５℃７日間保管した後に前述の方法でビオチン化ＨＲＰ固定量を測定し、保存前に対する保存後の固定量を測定し、その比を保存安定性（固定性能残存率）として評価した。値が１．０に近いほど保存安定性に優れる。結果を表５に示した。
【０１９１】
実施例１２：
実施例１１の（２）ＣＭＤ(カルボキシメチルデキストラン)の活性エステル化において、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド１ｍＭに代り１０ｍＭとしたこと以外、実施例１１と同様の操作でアビジン修飾基板を作成し、性能を評価した。
【０１９２】
比較例１１：
実施例１１の（４）アビジン修飾基板の作成においてストレプトアビジンのスピンコート塗布を１回としたこと以外、実施例１１と同様の操作でアビジン修飾基板を作成し、性能を評価した。
【０１９３】
比較例１２：
実施例１１の（４）アビジン修飾基板の作成においてストレプトアビジンのスピンコート塗布を合計５回としたこと以外、実施例１１と同様の操作でアビジン修飾基板を作成し、性能を評価した。
【０１９４】
比較例１３：
実施例１１の（２）ＣＭＤの活性エステル化において、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド１ｍＭに代り０.０５ｍＭとしたこと以外、実施例１１と同様の操作でアビジン修飾基板を作成し、性能を評価した。
【０１９５】
【表５】
2008286776.tif 000023
【０１９６】
表５に示した通り、本発明の基板はビオチン化ターゲット蛋白を多く基板表面に固定し、保存安定性にも優れた。一方、ＣＭＤ固定量に対するアビジン固定量の比が低いと保存安定性は良好であるがビオチン化ターゲット蛋白結合性能が低くセンサー表面としての性能が低下し、比が高いと結合性能は高くなるが保存安定性が低下した。ＣＭＤ固定量が少ないとアビジン固定量が上がらず結合性能が低かった。
【０１９７】
実施例１３：
ストレプトアビジン溶液の被覆と回転を３回繰り返した後に、２３℃５０％ＲＨ（乾球湿球温度差６．７℃）の環境で３０分間静置したこと以外、実施例１１に記載の方法でアビジン修飾表面を作成した。実施例１１に記載の方法でこの表面のビオチン化蛋白固定量測定を測定した。結果を表６に示した。
【０１９８】
実施例１４：
実施例１１の方法で活性エステル化したＣＭＤ基板を、２３℃５０％ＲＨ（乾球湿球温度差６．７℃）に調整した環境試験器の中で実施例１１の方法でストレプトアビジン溶液をシリンジポンプを用いて１００μＬ滴下し、ポリプロピレン製へらで溶液を延ばして基板表面を全面被覆した後、実施例１１に記載のスピンコータ上に移動して、２３℃１０％ＲＨ（乾球湿球温度差１３．５℃）環境下でストレプトアビジン溶液を基板表面を全面被覆してから１分後に５００ｒｐｍ４５秒間回転して乾燥させた。同じ操作でストレプトアビジン溶液の被覆を２３℃５０％ＲＨ（乾球湿球温度差６．７℃）、スピンコート乾燥を２３℃１０％ＲＨ（乾球湿球温度差１３．５℃）でさらに２回繰り返し、その後２３℃１０％ＲＨ（乾球湿球温度差１３．５℃）で３０分間静置したこと以外実施例１１の方法でアビジン修飾基板を作成した。実施例１１に記載の方法でこの表面のビオチン化蛋白固定量測定を測定した。結果を表６に示した。
【０１９９】
【表６】
2008286776.tif 000024
【０２００】
表６に示した通り、本発明のバイオセンサーは生理活性物を含む溶液を基板表面に被覆する工程、および生理活性物質を含む溶液を乾燥後静置する工程での湿球乾球温度差を大きくすることでビオチン化ターゲット蛋白を多く基板表面に固定した。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】センサユニットの概略構成を示す分解斜視図である。
【符号の説明】
【０２０２】
１０  センサユニット
２０  全反射プリズム（光学ブロック）
２１  プリズム本体
２１ａ  上面
２２  把持部
２２ａ  溝
２３  突出部
２５  金属膜（薄膜層）
２６  生理活性物質を固定化するための層
２７  系合爪
２８  係合部
２８ａ  系合面
２９ａ  基準平面
３０  流路部材
３１  第１流路
３２  第２流路
３３  本体部
３４  取付部
３５  系合孔
３６  開口
ＳＳ１  センサ面
ＳＳ２  センサ面
【図１】
2008286776.tif 000025