(57)【要約】【課題】  光源が発する光の強度の変動を補償する。【解決手段】  光源から発せられる光を第１分光部（１２，１３）で分光し、所望の波長の光を励起光特定の波長（λEx）として試料セル１５へ入射させる。試料セル部からの光を、第２分光部（１６，１７）で分光して蛍光検出部１８で、蛍光強度を測定する。一方、第１分光部で選択されない光特定の波長（λR）を検出する参照光検出部１９を設け、前記参照光検出部により検出された光の強度の出力を、スペクトルデータ記憶部２１に記憶する。スペクトルデータにおける励起光波長、参照光波長、参照光強度から、励起光強度を算出する。測定した蛍光強度と、算出された励起光強度を基に、蛍光分光光度計の出力を求める。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、前記光源から発せられる光を分光し所望の波長の光を選択する第１分光部と、前記第１分光部で選択された波長の光の全てを励起光として入射される試料セル部と、前記試料セル部からの光を分光する第２分光部と、前記第２分光部からの光を検出する光検出部と、前記第１分光部で選択されない光を検出する参照光検出部と、前記参照光検出部により検出された光の強度の出力をスペクトルデータとして記憶するスペクトルデータ記憶部を備えた蛍光分光光度計。
【請求項２】
前記スペクトルデータ記憶部からスペクトルデータを読出し、前記スペクトルデータにおける励起光波長での光の強度と参照光波長での光の強度との比、及び前記参照光検出部の出力から、前記試料セル部に入射する励起光強度を補償する演算部を備えた請求項１に記載の蛍光分光光度計。
【請求項３】
前記試料セル部に入射する励起光と、前記第１分光部で選択されない光とは、波長が異なることを特徴とする請求項１に記載の蛍光分光光度計。
【請求項４】
前記試料セル部に入射する励起光と、前記第１分光部で選択されない光とは、回折次数が異なり、かつ、波長が同一であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光分光光度計。
【請求項５】
移動相を送液するポンプと、前記ポンプによって送液される移動相に試料を導入するインジェクタと、導入された試料を成分ごとに分離するカラムと、請求項１〜４いずれか１項に記載の蛍光分光光度計とを備え、分離された試料を前記試料セル部に導入する液体クロマトグラフ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に特定の波長の光を励起光として照射し、試料が発する蛍光を測定する蛍光分光光度計に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光分光光度計は、物質に光（励起光）を吸収させて励起状態とし、励起状態から再び基底状態に戻る際に発する光（蛍光）を測定し、試料に関する定性・定量分析を行なう装置である。蛍光分光光度計は、定量の感度・精度に優れ、液体クロマトグラフの検出器としても利用される。
【０００３】
一般的な蛍光分光光度計について図５に沿って説明する。光源３１から発した光が第１分光部すなわち励起側分光部（回折格子３２、スリット３３）で分光され、所望の波長の光（励起光）が試料セル３５中の試料に照射される。試料に照射された光は、そのエネルギーに対応した試料分子中の電子の一部を励起し、試料分子を励起状態にする。励起状態から再度基底状態に戻るときに発する光が、第２分光部すなわち蛍光側分光部（回折格子３６、スリット３７）で分光され、試料の蛍光として所望の波長の光λEmが検出部３８に到達する。蛍光の強度は励起光の強度に依存するので、励起光強度の変動が蛍光強度の測定に大きな影響を与える。励起光強度の変動を補償するために、励起光側分光部からの励起光λExは、試料セル３５に入射する前にビームスプリッタ３４によって分岐され、その一部の光が参照光λRとして参照光検出部３９に導かれる。蛍光検出部３８及び参照光検出部３９からの信号は、演算部４０に伝達され、蛍光検出器としての出力が演算される。蛍光検出器の出力として蛍光強度と励起光強度の比とすることで、励起光の変動の影響は抑制される。特許文献１〜３などに記載されるように、試料セル３５に入射する光を分岐させる構成が、一般的である。
【０００４】
【特許文献１】特開昭６３−  ８８４１２号公報
【特許文献２】特開平  ３−２７４４２７号公報
【特許文献３】特開２００１−８３０９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、参照光λRを得るために試料セル３５に入射する励起光λExを分岐するので、これにより試料に入射する励起光が減少する。励起光強度が減少すれば、試料が発する蛍光も減少する。蛍光分光光度計としての出力が弱くなり、蛍光分光光度計の利点でもある感度が低下し、高感度な分析が妨げられる。また、出射される光のエネルギーの一部を信号の安定化のために消費し、潜在的な性能の発揮を妨げている。本発明は、分光した所望の光を、光の強度を損ねることなく強度の補償を行なうことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような課題に鑑みなされた本発明は、光源と、前記光源から発せられる光を分光し所望の波長の光を選択する第１分光部と、前記第１分光部で選択された波長の光の全てを励起光として入射される試料セル部と、前記試料セル部からの光を分光する第２分光部と、前記第２分光部からの光を検出する光検出部と、前記第１分光部で選択されない光を検出する参照光検出部と、前記参照光検出部により検出された光の強度の出力をスペクトルデータとして記憶するスペクトルデータ記憶部を備える。
【０００７】
この構成により、光源から発せられた光は分光され、選択された波長の全てが試料セルに入射し、一方、参照光検出部には選択されなかった光が入射する。参照光検出部に入射する光は、スペクトルデータとしてスペクトルデータ記憶部に記憶される。
【０００８】
さらに、本発明に係る蛍光分光光度計は、スペクトルデータ記憶部からスペクトルデータを読出し、スペクトルデータにおける励起光波長での光の強度と参照光波長での光の強度との比、及び参照光検出部の出力から、試料セル部に入射する励起光強度を補償する演算部を備える。
【０００９】
この構成により、スペクトルデータ記憶部からスペクトルデータが読み出され、スペクトルデータにおける励起光波長での光の強度と参照光波長での光の強度との比、及び参照光検出部の出力から、試料セル部に入射する励起光強度を補償する演算が行なわれる。
【００１０】
さらに、本発明に係る蛍光分光光度計においては、前記試料セル部に入射する励起光と、前記第１分光部で選択されない光とは、波長が異なる関係、或いは、回折次数が異なり、かつ、波長が同一である関係である。
【００１１】
励起光として選択される以外の光として、励起光とは波長が異なる光、或いは、回折次数が異なり波長が同一の光が参照光とされる。
【発明の効果】
【００１２】
試料を照射する励起光を分岐することなく励起光強度を補償するので、励起光を損失することなく試料を励起することができる。また、光源のスペクトルを測定して記憶するので、光源のスペクトルの経時変化の影響を抑制することができる。すなわち、励起光の波長での光の強度及び参照波長での光の強度に関してより正確な比を算出することができ、励起光強度を正確に補償され、定量性が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
図１及び図２を参照しつつ、本発明に係る蛍光分光光度計について説明する。従来の蛍光分光光度計と同様に光源１１と、光源からの光を分光して所望の波長の光を選択する第１分光部すなわち励起側分光部（回折格子１２、スリット１３）と、測定に供される試料が配置される試料セル１５と、試料セル１５中の試料から発せられた蛍光について所望の波長を選択する第２分光部すなわち蛍光側分光部（回折格子１６、スリット１７）と、蛍光強度を測定する検出部１８とを備える。本発明に係る蛍光分光光度計においては、参照光検出部１９は、図１に示すように励起側分光部で分光される所望の励起光の波長とは異なる波長の光を測定するように配置されている。参照光検出部１９の受光面が大きい場合には、参照光検出部１９の前にもスリットが設けられる。そして、参照光検出部１９により測定された光の強度を回折格子１２の回動角に対応させて記録するスペクトルデータ記憶部２１を備えている。光源１１の発光スペクトルを波長λSとその波長における光の強度ISで表されるデータとしてスペクトルデータ記憶部２１に記憶しており、励起光の強度補償に際し、データがスペクトルデータ記憶部２１から読み出される。励起光波長λExは設定値、参照光検出部１９に入射する光の波長λRは励起光波長の設定値と光学系における配置から算出した値として得られる。得られた２つの波長(λEx、λR)と、読み出されたスペクトルから、読み出されたスペクトルにおけるそれぞれの波長の光強度（IEx,S、IR,S）が得られる。
【００１４】
演算部２０は、励起光強度IExと蛍光強度IEmとの比の演算、スペクトルデータ記憶部２１に記憶したスペクトルに基づいて励起光強度を補償する演算を行なう。参照光検出部１９で実際に測定された参照光の強度IRと、IEx,S／IR,Sとの積が、試料セル１５に入射する励起光の強度IExとなる。補償された励起光強度IExと蛍光強度IEmとから、蛍光分光光度計としての出力が得られる。
【００１５】
図２（ａ）に示すように、参照光検出部１９により測定されるスペクトルと、励起光の波長範囲でのスペクトルとは波長範囲は完全には一致せず、励起光として設定される波長範囲がλ１〜λ２とすると、参照光検出部１９で測定される波長範囲はλ１＋Δλ〜λ２＋Δλ（或いは、λ１−Δλ〜λ２−Δλ）となる。Δλの値の大きさは、参照光検出部１９の配置位置により定まり、参照光検出部１９の配置位置は回折格子１２の回折特性、光源からの光を入射させる角度、選択した波長の光のみを通過させるスリットの配置を考慮して、任意に設定することが可能である。
【００１６】
Δλの値を小さくすれば、励起光波長λExに近い波長での参照光が得られる。図２（ｂ）のように、スリット１３の開口部の直近にミラー２３を配設し、ミラー２３で反射した参照光λRは、参照光検出部１９に入射するようにして、参照光λRを取り出すようにすればよい。この場合、スリット１３の開口部は、選択した波長の光が結像する部分であるので、励起光を減少させないためには、ミラー２３は光路上に入らないように配設する方が良い。
【００１７】
回折格子を用いて分光する場合、回折格子周期ｄ、1mmあたりの溝本数Ｎ、回折次数ｍ（ｍ=0,±1,±2・・・）、波長λ、入射光と回折格子法線とのなす角（入射角）α、回折光と回折格子法線とのなす角（回折角）βについて、d(sinα±sinβ)=ｍλの関係式（グレーティング方程式）が成立し、回折格子に入射した光は回折次数ｍの値によって様々な角度に回折する。参照光検出部１９を設置する位置としては、同じ回折次数の波長範囲の光が入射するようにすることが、最も簡便な設計である。
【００１８】
光源は、使用により劣化し、発光スペクトルが変化することが一般的に知られている。図２（ｃ）は、横軸を波長、縦軸に光を強度として、光源の発光スペクトルを示す。2C-1は、使用時間がまだ短い光源のスペクトル、2C-2は、使用により劣化した光源のスペクトルである。光源が劣化すると、波長範囲の全体において光強度が減少し、スペクトルの形状（特徴的なピークの波長）が変化する。スペクトル2C-1からスペクトル2C-2への変化のように、光源の劣化が、特定の波長域において顕著である場合も稀ではない。このような場合、特定の波長（λ4）の変化量と他の波長（例えばλ3）の変化量が異なり、特定の波長（λ4）の変化量が大きいことになる。このような場合においても、本発明の蛍光分光光度計では、スペクトルデータ記憶部２１に、変化後のスペクトルに対応するスペクトルデータが記憶され、直近に測定したスペクトルデータを基に強度の補償を行なうので、正確な励起光強度を元に算出された分析を行なうことが可能である。
【００１９】
なお、蛍光分光光度計の光源１１としては、紫外・可視から赤外の広い波長範囲に亘って強い連続したスペクトルを発するキセノンランプが好適である。蛍光検出部１８，参照光検出部１９としては、フォトダイオードや光電子増倍管を用いることが可能である。
【００２０】
図３〜４を参照しつつ、本発明に係る蛍光分光光度計の光強度補償の動作について、詳述する。光源、回折格子等に付された符号は、図１に対応している。
【００２１】
蛍光分光光度計の電源を投入すると、光源１１が点灯される（S101）。光源１１の点灯の他、制御部の初期化動作や光学系部品の動作チェックも同様に行なわれる。
【００２２】
光源１１を点灯しても直後から安定に発光するものではなく、また、検出部（蛍光検出部１８，参照光検出部１９）の温度も定常状態には達しない。電源投入後、適当な時間（例えば１５分）、通電状態で待機して、所謂暖機運転が行なわれる（S102）。
【００２３】
所定の時間経過後、回折格子１２を回動させ、試料セル１５への励起光の波長範囲として、最も長い波長の光が入射する角度に設定する（S103）。このとき、試料セル１５に入射する波長λExとは異なる波長λRの光が参照光検出部１９に入射するので、参照光検出部１９の出力をスペクトルデータ記憶部２１に記憶させる（S104）。
【００２４】
次に、試料セル１５に短波長側の光が入射するように回折格子１２を回動させる（S105）。励起光の波長分解能によって定まる最小単位の波長分だけ短い波長の光を、試料セル１５に入射させるようにすると、より詳密なスペクトルデータを得ることが可能である。
【００２５】
回折格子の回動（S104）、参照光検出部１９の出力信号の記録（S105）の動作を、励起光の波長範囲として最も短い波長の光が入射する角度になるまで繰り返す（S106）。一連の動作により、参照光検出部１９に入射した光の強度がスペクトルデータ記憶部２１に記憶される。スペクトルデータ記憶部２１には、参照光検出部１９に入射する光の波長と参照光検出部１９への光の入射強度との関係で、スペクトルデータとして記憶される。
【００２６】
本発明に係る蛍光分光光度計による試料の測定に際して、励起波長λExの設定がなされると（S201）、回折格子１２を回動させ、波長λExの光を試料セル１５に入射させる。同時に、参照光検出部１９には励起光とは異なる波長λRの光が参照光として入射するので、参照光強度IRが測定される（S203）。
【００２７】
ここで、スペクトルデータ記憶部２１にスペクトルのデータが存在するか否かの確認がなされる（S204）。励起光を適切に補償するためのスペクトルデータが存在するか否かの判断であり、所定の判定基準の下に判定される。判定基準としては、(1)スペクトルデータ自体の存否、(2)スペクトルデータの信頼性、(3)スペクトルデータが測定された日時がある。全ての判定基準について合格とされたスペクトルデータであれば、励起光を補償するために適切である。
【００２８】
(1)スペクトルデータの自体の存在は、スペクトルデータ記憶部２１にスペクトルデータが記憶されているか否かが判断される。スペクトルデータが存在しなければ、後述のS207の処理へ進む。スペクトルデータが存在すれば、続いて次の判断がなされる。
【００２９】
(2)スペクトルデータの信頼性は、スペクトルデータ記憶部２１に存在するスペクトルデータについて、例えば、初期化動作の際にいずれかの箇所に不具合が発見された状態で測定されたデータである、というような評価によって行なう。蛍光分光光度計に不具合がある状態で取得されたデータは信頼性を欠くので、励起光を適切に補償するためのスペクトルデータが存在しないと判断され、S207の処理へ進む。スペクトルデータの信頼性に問題がなければ、さらに続いて次の判断がなされる。
【００３０】
(3)スペクトルデータが測定された日時が評価される。スペクトルデータが測定された日時が古ければ、光源１１の経時変化が進み、スペクトルが変化している可能性が高い。蛍光分光光度計のような分析装置で得られたデータには、通常、データを取得した日時が記録されているので、これを利用すればよい。或いは、ＯＳ（オペレーティングシステム）上であれば、ファイルが生成された日時がファイルに付与されるので、これを利用すればよい。また、スペクトルデータの日時が新しいものであっても、点灯・消灯の動作によって光源１１の発光部分には少なからず負荷が掛かるので、点灯・消灯の動作の有無を含めて評価するとよい。
【００３１】
正常なスペクトルデータが存在する場合には、スペクトルデータが読み出される（S205）。波長と光強度の関係で記録されたスペクトルデータにおける励起光の波長λExにおける強度IEx,Sと、参照光の波長λRにおける強度IR,Sとの比（IEx,S／IR,S）が算出され（S206）、この比と測定された参照光の強度IRの積（IR×IEx,S／IR,S）を試料セル１５に入射する光の強度として出力される。
【００３２】
上述の判定に基づいて、スペクトルデータが存在しなかったり、信頼性を欠いたり、また、スペクトルデータが古かったりする場合は、適切なスペクトルデータがない旨の表示がなされ（S207）、測定されたデータ（蛍光スペクトル）は、励起光の強度補償がなされていないものであるということを操作者に知らせる。光源１１のスペクトルデータが存在しない状態であることを知った操作者は、実行中の分析を終えた後、光源１１のスペクトルデータを補完するための操作を行なう。当該測定については、IEx,S/IR,Sを１として処理される（S208）。
【００３３】
そして、蛍光分光光度計は、IR×IEx,S／IR,Sの値に基づいて、結果を出力する（S209）。
【００３４】
S208の処理を経た場合は、IEx,S／IR,S＝１としているので、光強度の補償が行なわれていない。波形処理や定量計算等を行なう前に、スペクトルデータを補完して、光強度の補償の演算を行なう。
【００３５】
蛍光分光光度計の電源を投入し、光源１１から発せられる光の強度が安定した後（点灯後約１５分程度）に、或いは、試料の分析を行なう直前に、或いは、試料の分析を行った直後に、参照光検出部１９でのスペクトルの測定を行なうことで、正確な光強度補償ができる。
【００３６】
上記実施例は本発明の単に一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変更や修正することも可能である。これら変更や修正したものも本発明に包含されることは明らかである。  試料セル部としてフローセルを用いた場合、液体クロマトグラフ用の検出器として利用することが可能である。この場合、移動相を送液するポンプと、ポンプによって送液される移動相に試料を導入するインジェクタと、導入された試料を成分ごとに分離するカラムとを備える。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、蛍光分光光度計、液体クロマトグラフ用蛍光分光光度検出器として利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明に係る蛍光分光光度計の該略図である。
【図２】本発明に係る蛍光分光光度計で記録されたスペクトルの説明をするための概念図である。
【図３】光源スペクトルを記憶するための処理のフローチャートである。
【図４】本発明に係る蛍光分光光度計の光強度補償の処理のフローチャートである。
【図５】従来の蛍光分光光度計の該略図である。
【符号の説明】
【００３９】
１１，３１・・・・・・・・光源
１２，１６，３２，３６・・回折格子
１３，１７，３３，３７・・スリット
３４・・・・・・・・・・・ビームスプリッタ
１５，３５・・・・・・・・試料セル
１８，３８・・・・・・・・蛍光検出部
１９，３９・・・・・・・・参照光検出部
２０，４０・・・・・・・・演算部
２１・・・・・・・・・・・スペクトルデータ記憶部
２３・・・・・・・・・・・ミラー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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