(57)【要約】【課題】フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を簡便に検出する方法及びそれに用いる手段が提供される。【解決手段】反応容器にボトロセチンの存在下で固定化したフォンビルブランド因子に、グリコプロテインＩｂのフォンビルブランド因子結合部位を含む部分蛋白質のカルボキシル末端にイムノグロブリン分子のＦｃ部分のアミノ末端を融合させてなるキメラ蛋白質を結合させ、前記イムノグロブリン分子のＦｃ部分を検出することにより、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合又はこの結合の阻害を検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合又はこの結合の阻害を検出する方法において、 フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を惹起する物質の存在下で、フォンビルブランド因子を反応容器に固定化し、この固定化されたフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとを反応させることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を惹起する物質がボトロセチンもしくはリストセチン又はこれらの両者である請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの反応の際に、又は該反応に先立って、グリコカリシンを含む試料を反応容器に加えて、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合の阻害を検出し、それによってグリコカリシンを測定することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの反応の際に、又は該反応に先立って、検出対象物質を含む試料を反応容器に加えて、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合の阻害を検出し、それによってフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を阻害する物質を検出することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血栓活性物質及びグリコカリシンの検出法に関し、詳しくは、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を阻害する物質を検出または測定する方法、及び該方法の実施に直接使用する手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞、脳梗塞あるいは末梢動脈閉塞症等の血栓症は、その患者数が世界的にも非常に多く、診断、治療すべき重要な疾患である。これら血栓症の発症には血小板が重要な役割を果たしている。一般に動脈硬化性病変等により血管の内腔に存在する血管内皮細胞が障害されると、障害部位に血小板が粘着して活性化を起こし、血小板による血小板血栓が生じ、最終的に閉塞性の病変へと進展する。
【０００３】
血小板の活性化を検出する方法の一つに、血漿中のグリコカリシン濃度を測定する方法がある。グリコカリシンは、血小板表面上に存在する膜糖蛋白質であるグリコプロテインＩｂα鎖の細胞外部分が酵素的に切断された蛋白質であり、分子量約１３５ＫＤａの大きさを持つ。血漿中のグリコカリシン濃度は血小板の障害あるいは活性化により上昇することが知られており、現在臨床診断において血栓性疾患の有無を検出するマーカーとして使用されている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
グリコカリシン濃度の測定方法は数々報告されているが、いずれも２種のグリコカリシンに対するモノクローナル抗体を用い、サンドウィッチ法により検出するＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法である（非特許文献１、非特許文献２）。簡単に説明すると、１番目のモノクローナル抗体を９６穴型プレート等に固相化し、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）等の蛋白質でブロッキングした後、測定する患者の血漿（あるいは血清）を添加する。グリコカリシンは固相化したモノクローナル抗体に特異的に結合し、プレートを洗浄後、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ等の酵素あるいはビオチン等で標識した２番目のモノクローナル抗体を加え、１番目のモノクローナル抗体に結合したグリコカリシンに２番目の抗体を特異的に結合させる。洗浄後２番目の抗体に標識した酵素により特定の紫外吸収もしくは可視吸収、蛍光、又は発光を示す物質へと変換される基質を加える酵素反応を行う。患者血漿中のグリコカリシン量は２番目の抗体の結合量と正の相関を示すことから、酵素反応によって生成した反応物の量を定量することにより、患者血漿中のグリコカリシンの濃度を測定することができる。また、１種類の抗グリコカリシン抗体を用いた競合ＥＬＩＳＡ法によるグリコカリシンの測定法も報告されているが（非特許文献３）、競合阻害を示すグリコカリシン濃度のＩＣ50値が約４μｇ／ｍｌであり、血漿中のグリコカリシン濃度（健常人で約２μｇ／ｍｌ、非特許文献１）の測定に耐えうるものではない。
【０００５】
上記のサンドウィッチ法によるグリコカリシン定量法は現在広く用いられているが、新たに同様の測定系を作製しようとした場合、２種の認識部位の異なる抗グリコカリシンモノクローナル抗体を入手する必要がある。一般に市販のモノクローナル抗体は非常に高価であり、またモノクローナル抗体を作製するためには免疫するためのグリコカリシンの入手、免疫マウス脾臓からのハイブリドーマの取得、モノクローナル抗体産生細胞のスクリーニング等多くの労力を要する。また、上記のサンドウィッチＥＬＩＳＡ法は酵素反応量からグリコカリシン濃度の絶対量を測定することは不可能であり、多くの場合濃度既知のグリコカリシンを数種の濃度で測定し、その検量線と比較することにより測定したい被験試料中の濃度を算出しなければならない。そこで、煩雑なモノクローナル抗体の作製を
することなく、簡便にグリコカリシンの絶対濃度を測定し得る方法を確立することは、広く臨床診断に用いるという観点から重要である。
【０００６】
また、血栓症発症の初期段階では、血管内皮細胞が障害されることにより露出した内皮下組織（コラーゲン等）に血中のフォンビルブランド因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ）が結合し、フォンビルブランド因子に血小板上の膜糖蛋白質グリコプロテインＩｂが結合し、血小板が血管壁に粘着して、活性化する（非特許文献４、非特許文献５）。このため、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合を阻害することが、血栓症を治療、予防する抗血栓薬の重要なターゲットである。しかし、両蛋白質の結合を阻害することにより抗血栓性を示すことが証明されている物質は少ない。
【０００７】
フォンビルブランド因子の５０４−７２８番目のアミノ酸配列を有する組み換え体蛋白質ＶＣＬは、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合を阻害することにより抗血栓作用を示すことが報告されている（非特許文献６）。また、ヒトフォンビルブランド因子に対するモノクローナル抗体ＡＪｖＷ−２は特異的にフォンビルブランド因子に結合することにより出血傾向を示すことなく抗血栓活性を示すことが報告されている（非特許文献７、特許文献１）。さらに、蛇毒由来の蛋白質ＡＳ１０５１は血小板グリコプロテインＩｂに特異的に結合し、同様に出血傾向を示すことなく抗血栓性を示す（特許文献２）。
また、色素化合物であるオーリントリカルボン酸（ａｕｒｉｎ ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ、「ＡＴＡ」）もフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合阻害活性を示すことが報告されているが（非特許文献８）、その結合特異性が高くないこと（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）、阻害活性を示すのは重合した高分子画分にあることなどが知られている（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４）。
【０００８】
上記のように、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合阻害は抗血栓薬の重要なターゲットであるにも関わらず、両者の結合を阻害し、抗血栓活性を報告している低分子化合物はなく、このような物質を見出すことは血栓症の治療、予防を考える上で重要である。
【０００９】
蛋白質以外のフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合を阻害する物質としては、オーリントリカルボン酸（ＡＴＡ）が挙げられるが、本物質は、すでに述べたように高分子に重合した物質に阻害活性が存在することが知られている。Ｍ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら（非特許文献１５）は、ゲル濾過で分画したＡＴＡのフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ依存的な血小板凝集であるリストセチン凝集に対する阻害活性を調べ、分子量２５００の重合物が最も活性が強いと結論しているが、ゲル濾過で低分子画分に溶出される部分に活性がほとんど存在しないことも示している（前記文献中の図１、図３）。また同報告中では、活性を示すＡＴＡ重合体の具体的な構造、分子量に関しては特定されていない。ＡＴＡの単量体の合成に関しては、Ｒ．Ｄ．Ｈａｕｇｗｉｔｚ（特許文献３）がすでに報告しているが、現在までのところ単量体あるいは構造が特定できる重合体にフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ結合阻害を示すデータは報告されておらず、近年でもＡＴＡの重合物のゲル濾過分画を用いた活性評価が報告されている（非特許文献１６）現状から考え、構造の特定できるＡＴＡ誘導体には、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ阻害活性は存在しないと考えられる。
【００１０】
前述したＭ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら（非特許文献１５）の報告では多数の陰性荷電（ｐｏｌｙａｎｉｏｎ）、多数の芳香環（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ）の存在がフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合阻害に必要であることが述べられている。多数の陰性荷電がフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合阻害に働きやすい
ことは、陰性荷電を持つ多糖であるヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）がフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合を阻害することとも一致する（非特許文献１７）。本報告では、ヘパリンの分子量が小さいほどフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合阻害活性が低くなることも報告している。
【００１１】
ヘパリンは、本来血中凝固因子であるトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、凝固系第１０因子（Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ）を阻害する物質である。フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合に対してより選択性を持たせたようなヘパリン誘導体（非特許文献１８）も報告されているが、その平均分子量は１０，０００以上である。
【００１２】
また、蛋白質に結合しやすい物質の中には、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合に対してある程度選択的に阻害活性を示す物質も報告されている。色素化合物であるエバンスブルー（Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ）はフォンビルブランド因子（同文献中では、Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ）関与の血小板凝集を選択的に阻害することが示されているが、いずれも血漿を含まない条件での血小板凝集に対する実験結果であり、血漿蛋白質が存在する状態での活性については触れていない（非特許文献１９）。エバンスブルーは本来血清アルブミンに非常に強く結合する物質であり、その性質から生体の血液体積測定、血管からの血液の漏洩を見る手段などに用いられる（非特許文献２０）。
【００１３】
すなわち、この様に血漿中の蛋白質に強く結合する物質は、生体、例えば人への治療を考えた場合、全く効果が見られないはずである。このような物質の一つとして、スルフォバシン（非特許文献２１）等がある。スルフォバシンは、同報告によれば、ある程度のフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合への特異性が見られたものの、その界面活性剤に類似する構造から考えると、血液中、血漿中では血漿蛋白質への結合のためその活性が見られないはずである。事実、前記報告では、血漿中での血小板凝集に対する阻害活性は示されていない。
【００１４】
以上述べたきたように、これまでフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合を生体内で阻害し得るような、低分子の化合物は知られていない。血栓性疾患に対する、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合を阻害する薬剤を考えた場合、注射剤として用いるのであれば、蛋白質あるいは重合物のような高分子の化合物でよい。しかし同作用機序の経口投与可能な薬剤を創出するためには、血液中（血漿中）でのフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ依存的な血小板凝集を完全に、選択的に阻害するような、重合物でない低分子物質を見出すことが重要である。
しかし、これまでその様な化合物は見出されていない。その理由としては、簡便にその様な物質をスクリーニングできるようなアッセイ系が存在しないことが挙げられる。
【００１５】
後述するようにこれまで一般的に用いられているフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ結合を検出するアッセイ方法は、125Ｉラベル化を行ったフォンビルブランド因子を血小板、あるいはフォルマリン固定化した血小板に対して結合させる方法であるが、この方法ではラジオアイソトープを用いる煩雑さ、ヒトあるいは動物から採血を行い、血小板を取得しなければならないという大量入手の困難さが含まれる。
【００１６】
以下にこれまで一般的に用いられてきた方法と、それを解決する手段について具体的に述べる。
【００１７】
フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合は通常の状態では観察されず、血流内などのズリ応力が生じる条件下でのみ起こると考えられている（非特許文献２２）。しかし、両蛋白質の結合を人為的に観察する方法として、抗生物質であるリストセチン（非特許文献２３）、あるいは蛇毒由来の蛋白質であるボトロセチン（非特許文献２４
）の添加が知られている。すなわち両物質はフォンビルブランド因子の特定の位置に結合することによりフォンビルブランド因子の構造変化を引き起こし、通常の条件では起こらないフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合を惹起する物質として知られている。両蛋白質の結合を観察する方法としては、Ｆｕｊｉｍｕｒａらの報告しているような以下の方法がある（非特許文献２５）。
【００１８】
ヒトフォンビルブランド因子を常法により125Ｉラベルし、フォルマリン固定化した血小板に対して一定量のリストセチンあるいはボトロセチン存在下で結合させる。この結合はフォンビルブランド因子が、固定化した血小板表面上のグリコプロテインＩｂに特異的に結合することによるものであり、未結合のフォンビルブランド因子を洗浄、除去後、125Ｉ量を測定することにより両蛋白質の結合量を測定することができる。Ｍｉｕｒａらは、フォルマリンによる固定化血小板の代わりに、固定化した抗血小板膜蛋白質抗体を介して血小板を９６穴プレートに固定し、同様の方法で両蛋白質の結合を検出している（非特許文献２６）。
【００１９】
また、Ｍａｔｓｕｉらは固相化したコラーゲンに結合したフォンビルブランド因子にグリコプロテインＩｂα鎖の細胞外部位の部分蛋白質であるグリコカリシンをボトロセチン存在下で結合させる方法を報告している（非特許文献２７）。
【００２０】
さらに、Ｍｏｒｉｋｉらは、グリコプロテインＩｂを膜上に発現する組換え蛋白質の発現細胞を作製し、125Ｉラベルしたフォンビルブランド因子がボトロセチン存在下で膜上のグリコプロテインＩｂに結合することを報告している。
【００２１】
Ｍｏｒｉｋｉらはさらに、結合惹起物質なしにフォンビルブランド因子に結合するような、アミノ酸配列に変異を持つグリコプロテインＩｂ発現細胞作製し、結合実験を行っているが、その結合量はボトロセチンあるいはリストセチン存在下での結合量に比べ非常に低いものであった（非特許文献２８）。
【００２２】
上記のように、これまで報告されているフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合を高感度に検出する方法は、いずれも血小板、あるいはグリコプロテインＩｂ発現細胞を大量に取得し、それに対するフォンビルブランド因子の結合を検出する方法であった。したがって常時血小板あるいは細胞を、大量に調製することは非常に繁雑であり、もっと簡便にフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合を検出する方法を見出すことが必要であった。
【００２３】
また、これまで用いられてきた方法はいずれも液相中にボトロセチンあるいはリストセチンといった結合惹起物質を添加した方法に限られていた。しかし、ボトロセチンあるいはリストセチン量は、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合量に変化を与える。また、例えば９６穴プレートを用いて多数の結合実験を行う場合には、液相に惹起物質を加えるこれらの方法は煩雑である。また、上述した低分子のフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合阻害物質を探索する場合、非常に多検体の結合実験を行うことが必要とされ、上記の問題を解決することも重要であった。
【００２４】
すでに述べたように、低分子量の真のフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ結合阻害物質は未だに発見されていない。ここで言う「真の阻害物質」とは、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を特異的に阻害する物質であって、蛋白質変性物質、界面活性剤をはじめとする一般的に蛋白質の構造を変化させる物質、又は蛋白質に非特異的に結合する物質のように、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合を阻害するものであっても、非特異的に阻害するものは真の阻害物質ではない。
【００２５】
真のフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ結合阻害物質は前述したように抗体、蛇毒由来等の蛋白質、あるいはその活性本体が高分子量であるオーリントリカルボン酸（ＡＴＡ）等の色素物質では知られているが、これまでに低分子量物質、例えば分子量２０００以下の物質、特に経口投与が有効な分子量１０００以下の物質では知られておらず、この様な物質を迅速に見出す評価系を構築し、発見することが必要であった。
【特許文献１】ＷＯ９６／１７０７８
【特許文献２】ＷＯ９５／０８５７３
【特許文献３】ＷＯ９１／０６５８９
【非特許文献１】Ｊ．Ｈ．Ｂｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８３，６９１−７０２，１９９４
【非特許文献２】Ｓ．Ｋｕｎｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ，Ｃｈｅｍ．，３７，１６９−１７２，１９９１
【非特許文献３】Ｈ．Ｂｅｓｓｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，５９，４９７−５０７，１９９０
【非特許文献４】Ｊ．Ｐ．Ｃｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，８７，５８６−５９６，１９７６
【非特許文献５】Ｋ．Ｊ．Ｃｌｅｍｅｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ，，７８，２６６−２７０，１９９７
【非特許文献６】Ｋ．Ａｚｚａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７３，３１８−３２３，１９９５
【非特許文献７】Ｓ．Ｋａｇｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１２２，１６５−１７１，１９９７
【非特許文献８】Ｍ．Ｄ．Ｐｈｉｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７２，１９８９−１９０３，１９８８
【非特許文献９】Ｋ．Ａｚｚａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７５，２０３−２１０，１９９６
【非特許文献１０】Ｄ．Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ，，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８７，５８１−５８５，１９９６
【非特許文献１１】Ｒ．Ｍ．Ｌｏｚａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４８，３０−３６，１９９７
【非特許文献１２】Ｍ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７８，２２９１−２２９８，１９９１
【非特許文献１３】Ｚ．Ｇｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，７１，７７−８８，１９９３
【非特許文献１４】Ｈ．Ｍａｔｓｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９６，１２９９−１３０４．１９９７
【非特許文献１５】Ｍ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７８，２２９１−２２９８，１９９１
【非特許文献１６】Ｔ．Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，４７，６−１５，１９９４
【非特許文献１７】Ｍ．Ｓｏｌｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８７，１７８７−１７９３，１９９１
【非特許文献１８】Ｍ．Ｓｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９３，９９２−９９９，１９９６
【非特許文献１９】Ｅ．Ｐ．Ｋｉｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｄｉａｔｈｅｓ．Ｈａｅｍｏｒｒａｈ．，３４，７７０−７７９，１９７５
【非特許文献２０】Ｍ．Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ ＆ Ｒ．Ａ．Ｒａｗｓｏｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，３９，３０７，１９５９
【非特許文献２１】Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｎ； Ｔ．Ｋａｍｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，４８，９２４−９２８，１９９５
【非特許文献２２】Ｔ．Ｔ．Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，６５，８２３−８３１，１９８５
【非特許文献２３】Ｍ．Ａ．Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ｂ．Ｇ．Ｆｉｒｋｉｎ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，２６，３６２−３６９，１９７１
【非特許文献２４】Ｍ．Ｓ．Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７５，４５１４−４５１８，１９７８
【非特許文献２５】Ｙ．Ｆｕｊｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．，７７，１１３−１２０，１９９１
【非特許文献２６】Ｓ．Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３６，２１５−２２０，１９９６
【非特許文献２７】Ｔ．Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２１，３７６−３８１，１９９７
【非特許文献２８】Ｔ．Ｍｏｒｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９０，６９８−７０５，１９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
上記の技術背景の問題点を要約すると、以下の３点が挙げられる。
（１）グリコカリシンの定量法は血栓症の診断に重要であるが、従来行われている高感度な方法はサンドウィッチＥＬＩＳＡ法であり、２種の認識部位の異なるモノクローナル抗体を必要とし、定量には標準物質による検量線が必要である。
（２）低分子のフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合阻害物質を見出し、薬剤に適用することが血栓症治療、予防を考えた上で重要であるが、これまでにフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合阻害をターゲットとした低分子で、かつ抗血栓作用を報告している薬剤は存在しない。
（３）前記（２）の薬剤を見出すためにフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合阻害実験を多検体行う必要があるが、これまでに知られている方法は煩雑であり、また精度、感度にも問題がある可能性がある。
【００２７】
本発明は上記観点からなされたものであり、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を簡便に検出する方法、グリコカリシンの簡便な測定法及び簡便なフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合阻害を作用点とする抗血栓薬となりうる物質の測定法、並びにこれらの測定法に用いる手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った。すなわち、まず、グリコプロテインＩｂα鎖の部分蛋白質をイムノグロブリン分子のＦｃ部分と結合させたキメラ分子（以下、「キメラ蛋白質」という）を得るための、動物細胞による蛋白質発現系を作製した。また、フォンビルブランド因子をボトロセチン存在下で固定化することにより、上記のキメラ蛋白質、すなわちグリコプロテインＩｂ分子が、液相の結合惹起物質なしに、固定化したフォンビルブランド因子に対して特異的に結合することを見出し、その結合量を市販で容易かつ安価に入手可能な抗イムノグロブリンＦｃ抗体、あるいは直接キメラ蛋白質を標識することにより、簡便に結合実験を行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２９】
すなわち、本発明による第一の方法は、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合又はこの結合の阻害を検出する方法において、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を惹起する物質の存在下で、フォンビルブランド因子を反応容器に固定化し、この固定化されたフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとを反応させることを特徴とする方法である。
【００３０】
また、本発明による第二の方法は、反応容器に固定化したフォンビルブランド因子に、グリコプロテインＩｂα鎖のフォンビルブランド因子結合部位を含む部分蛋白質のカルボキシル末端にイムノグロブリン分子のＦｃ部分のアミノ末端を融合させてなるキメラ蛋白質又は標識物質で標識した該キメラ蛋白質を結合させ、前記イムノグロブリン分子のＦｃ部分又は前記標識物質を検出することにより、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合又はこの結合の阻害を検出する方法である。
【００３１】
また、本発明の第三の方法は、反応容器にグリコプロテインＩｂα鎖のフォンビルブランド因子結合部位を含む部分蛋白質のカルボキシル末端にイムノグロブリン分子のＦｃ部分のアミノ末端を融合させてなるキメラ蛋白質を固定化し、フォンビルブランド因子あるいは標識物質で標識したフォンビルブランド因子を結合させ、結合したフォンビルブランド因子又は前記標識物質を検出することにより、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合又はこの結合の阻害を検出する方法である。
【００３２】
第二の方法又は第三の方法の好ましい態様は、フォンビルブランド因子に前記キメラ蛋白質を結合させる際に、又は該結合に先立って、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を惹起する物質を反応容器に加えることを特徴とする方法である。
前記フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を惹起する物質としては、ボトロセチンもしくはリストセチン又はこれらの両者が挙げられる。
また、前記第二の方法の他の態様は、フォンビルブランド因子を、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を惹起する物質の存在下で反応容器に固定化することを特徴とする方法である。
【００３３】
第一の方法、第二の方法又は第三の方法において、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ又はキメラ蛋白質との反応の際に、又は該反応に先立って、グリコカリシンを含む試料を反応容器に加えて、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ又はキメラ蛋白質との結合の阻害を検出することにより、グリコカリシンを測定することができる。
【００３４】
また、第一の方法、第二の方法又は第三の方法において、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ又はキメラ蛋白質との反応の際に、又は該反応に先立って、検出対象物質を含む試料を反応容器に加えて、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ又はキメラ蛋白質との結合の阻害を検出することにより、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を阻害する物質を検出することができる。
【００３５】
さらに本発明は、グリコプロテインＩｂα鎖のフォンビルブランド因子結合部位を含む部分蛋白質のカルボキシル末端にイムノグロブリン分子のＦｃ部分のアミノ末端を融合させてなるキメラ蛋白質を提供する。
【００３６】
また本発明は、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの反応の阻害によりグリコカリシンを測定するためのキットであって、フォンビルブランド因子と、グリコプロテインＩｂα鎖のフォンビルブランド因子結合部位を含む部分蛋白質のカルボキシル末端にイムノグロブリン分子のＦｃ部分のアミノ末端を融合させてなるキメラ蛋白質とを含むキットを提供する。
【００３７】
さらに本発明は、前記のフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合又はこの結合の阻害を検出する方法のいずれかによって検出される化合物であって、血漿中でのグリコプロテインＩｂとフォンビルブランド因子が関与する血小板の凝集を特異的に阻害する活性を有し、かつ、分子量が２０００以下であることを特徴とする化合物を提供
する。
【００３８】
前記化合物としてより具体的には、式（１）に示す構造を有する化合物が、さらに具体的には式（２）に示す化合物が挙げられる。但し、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立してＨ又はＣｌを表し、Ｒ3はＣＨ3又はＨを表す。
【化１】
2008224684.tif 000002
【化２】
2008224684.tif 000003
【００３９】
なお、本明細書において「キメラ蛋白質」というときは、グリコプロテインＩｂのフォンビルブランド因子結合部位を含む部分蛋白質のカルボキシル末端にイムノグロブリン分子のＦｃ部分のアミノ末端を融合させてなるキメラ蛋白質を意味する。また、本発明の方法において、グリコプロテインＩｂというときは、グリコプロテインＩｂ自体もしくはキメラ蛋白質またはその両方を指す場合がある。
【００４０】
本明細書において、「検出」というときは、主として物質又は現象を見出すことを意味するが、その結果としてその物質の量又は現象の程度を測定することを含むことがある。また、「測定」というときは、主として物質の量又は現象の程度を測定することを意味するが、その物質又は現象を見出すことを含むことがある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４２】
＜１＞キメラ蛋白質
本発明のキメラ蛋白質は、ヒトあるいはその他の哺乳動物の血小板膜糖蛋白質の１つであるグリコプロテインＩｂα鎖のフォンビルブランド因子に対する結合部位を含む部分蛋白質と、マウス、ヒトあるいはその他の哺乳動物のイムノグロブリン分子重鎮（Ｈ鎖）のＦｃ部分を、遺伝子工学的に結合した蛋白質である。該キメラ蛋白質は、培養細胞を用いて生産することができる。キメラ蛋白質において、グリコプロテインＩｂα鎖のフォンビルブランド因子結合部位を含む部分蛋白質と、イムノグロブリン分子のＦｃ部分は、該部分蛋白質のカルボキシル末端とＦｃ部分のアミノ末端とで連結される。
【００４３】
グリコプロテインＩｂα鎖の部分蛋白質の一例としては、グリコプロテインＩｂα鎖分子のアミノ末端のアミノ酸残基から３１９位のアスパラギン酸残基までの配列（アミノ酸番号１−３１９）を持つ部分蛋白質があげられるが、フォンビルブランド因子の結合部位がアミノ酸番号１−２９３（Ｖ．Ｖｉｎｃｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１８４７３−１８４７９，１９８８）さらに２５１−２８５（Ｖ．Ｖｉｃｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，２７４−２８０，１９９０）内に含まれる部分であると考えられていることから、少なくともこの部分を含む部分蛋白質ならばよい。
【００４４】
また、イムノグロブリン分子のＦｃ部分は由来はいかなる動物でも良く、さらにいかなるサブタイプでも良いが、市販のポリクローナル抗体及び／またはモノクローナル抗体、プロテインＡ、またはプロテインＧ等で、精製及び／または検出することができるものであればよい。イムノグロブリン重鎖は、アミノ末端側よりＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン（ＩｇＥではさらにＣＨ４ドメイン）と呼ばれる領域が順に配列している。
【００４５】
キメラ蛋白質に用いるＦｃ部分の一例としては、これらの配列のうちヒンジ領域からＣＨ３ドメインまでの連続した配列があればよいが、市販のポリクローナル抗体及び／またはモノクローナル抗体、プロテインＡ、またはプロテインＧ等で、精製及び／または検出することができるという観点からは、ヒンジ部分は必須ではなく、部分的にアミノ酸残基の欠失、挿入等の変異を有していても良い。
【００４６】
また、イムノグロブリンとしては、ヒト、マウスなどいずれに由来するものでも良いが、一例としてマウス由来のものが挙げられる。また、イムノグロブリンのサブタイプとしては、いずれのサブタイプでも良いが、一例としてはＩｇＧが挙げられ、さらにサブクラスとしてはいずれのサブクラスでも良く、一例としてＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ等が挙げられる。
【００４７】
本発明のキメラ蛋白質のアミノ酸配列の一例を、配列番号７及び配列番号１４に記載する。尚、配列番号７及び配列番号１４において、Ｎ末端の１６アミノ酸残基は、シグナルペプチドを構成すると推定される。
【００４８】
本発明のキメラ蛋白質は、それをコードするキメラ遺伝子（キメラ蛋白質遺伝子）を、適当な細胞で発現させることにより製造することができる。キメラ蛋白質遺伝子は、グリコプロテインＩｂα鎖遺伝子およびイムノグロブリン重鎖の遺伝子をそれぞれ、遺伝子工学的手法に基づいてｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、ＤＮＡ断片などから取得し、あるいは化学合成的に作製し、それらを連結することにより作製することができる。
【００４９】
グリコプロテインＩｂα鎖遺伝子は、例えばヒト巨核球系の細胞株であるＨＥＬ細胞のｍＲＮＡからファージベクターなどを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーから、公知のグリコプロテインＩｂα鎖遺伝子のＤＮＡ配列をもとに設計した適当なプライマーＤＮＡを用いて逆転写ＰＣＲ反応により取得できる。また、ｃＤＮＡライブラリーから公知のＤＮＡ配列をもとに設計したプローブＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションを行うことにより、グリコプロテインＩｂα鎖遺伝子を含むクローンを取得することができる。あるいは、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に登録されているグリコプロテインＩｂα鎖遺伝子を含むプラスミド（ｐＧＰＩｂ２．４、寄託番号：ＡＴＣＣ６５７５５）から、適当な制限酵素を用いて切り出すことにより取得することができる。
【００５０】
イムノグロブリン重鎖の遺伝子は、例えばマウスのイムノグロブリン産生ハイブリドーマのｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡ、あるいはファージなどを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーから、公知のイムノグロブリン重鎖遺伝子のＤＮＡ配列をもとに設計した適当なプライマーＤＮＡを用いて逆転写ＰＣＲ反応により取得できる。また、ｃＤＮＡライブラリーから、公知のＤＮＡ配列をもとに設計したプローブＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションを行うことにより、マウスイムノグロブリン遺伝子を含むクローンを取得することができる。
【００５１】
キメラ蛋白質遺伝子は、グリコプロテインＩｂα鎖遺伝子の全長あるいは一部と、マウスイムノグロブリン重鎮γ１遺伝子あるいはγ２ａ遺伝子の全長あるいは一部を用いて、適当な制限酵素で各ＤＮＡ鎖を切断後結合させることによって得られる。両遺伝子の切断及び結合は、グリコプロテインＩｂα鎖のフォンビルブランド因子結合部位を含む部分蛋白質のカルボキシル末端にイムノグロブリン分子のＦｃ部分のアミノ末端を融合させたキメラ蛋白質をコードするように行えばよい。また、キメラ蛋白質を細胞外に分泌させる場合は、グリコプロテインＩｂα鎖の部分がシグナルペプチドを含むようにすればよい。
【００５２】
上記のようにして作製したキメラ蛋白質遺伝子を、適当な宿主−ベクター系を用いて発現させる。宿主としては、動物細胞、昆虫細胞などの細胞が挙げられる。またベクターは、宿主細胞でベクターとして機能するものであれば特に制限されず、宿主細胞に適したプロモーターを有する発現ベクターを用いることが好ましい。キメラ蛋白質遺伝子を発現ベクターに挿入して得られる組換えベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換細胞を培養することにより、キメラ蛋白質を製造することができる。
【００５３】
上記のようにして製造されるキメラ蛋白質は、そのまま用いることもできるが、イムノグロブリン分子のＦｃ部分を利用して、プロテインＡ、プロテインＧ、抗イムノグロブリン抗体等を固定化したアフィニティークロマトグラフィー等を用いて、容易に精製することができる。
【００５４】
＜２＞フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合又はこの結合の阻害を検出する方法
本発明のフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合又はこの結合の阻害を検出する第一の方法は、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を惹起する物質（以下、「結合惹起物質」ともいう）の存在下で、フォンビルブランド因子を反応容器に固定化し、この固定化されたフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとを反応させることを特徴とする。
フォンビルブランド因子を、結合惹起物質の存在下で固定化することにより、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとを液体中で反応させる際に、結合惹起物質を添加する工程を省くことができる。
【００５５】
フォンビルブランド因子は、ヒト血液から、Ｈ．Ｒ．Ｇｒａｌｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６２，４９６（１９７８）に記載の方法等にしたがって、調製することができる。
【００５６】
結合惹起物質としては、ボトロセチン及びリストセチン等、好ましくはボトロセチンが挙げられる。
【００５７】
フォンビルブランド因子を固定化する反応容器としては、ポリスチレン、ポリカーボネート等の合成樹脂又はガラス等の素材の容器が挙げられる。より具体的には、ポリスチレン製９６穴マルチウェルプレート等が挙げられる。フォンビルブランド因子を含む溶液を上記反応容器に注入することにより、フォンビルブランド因子を容器の壁面に固定化することができる。また、反応容器の壁面にコラーゲンを固定化しておき、このコラーゲンにフォンビルブランド因子を結合させることもできる。フォンビルブランド因子又はコラーゲンを反応容器に固定する条件は、これらを固定することができれば特に制限されないが、例えば、ポリスチレン製容器を用いる場合には、中性、好ましくはｐＨ６．８〜７．８、より好ましくはｐＨ７．４程度の溶液を用いることが望ましい。
【００５８】
フォンビルブランド因子の固定化に際しては、フォンビルブランド因子を含む溶液と結合惹起物質を含む溶液を各々反応容器に加えてもよいが、フォンビルブランド因子と惹起物質の両方を含む溶液を調製し、これを反応容器に注入することが、作業効率の点から好ましい。また、フォンビルブランド因子を固定化した反応容器は、ウシ血清アルブミン溶液等を加えることにより、壁面の未結合部位のブロッキングをしておくことが好ましい。
【００５９】
反応容器にフォンビルブランド因子を固定化した後、反応容器を洗浄し、次にグリコプロテインＩｂを加えると、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合反応が起こる。この反応は、液相で行われる。続いて、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を検出する。この検出は、通常フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合の検出に用いられる方法により行うことができる。
【００６０】
本発明の第二の方法は、反応容器に固定化したフォンビルブランド因子に、前記のキメラ蛋白質又は標識物質で標識した該キメラ蛋白質を結合させ、前記イムノグロブリン分子のＦｃ部分又は前記標識物質を検出することにより、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合又はこの結合の阻害を検出する方法である。
【００６１】
より具体的には、反応容器にフォンビルブランド因子を含む溶液を加えて、フォンビルブランド因子を反応容器の壁面に固定化する。続いて、反応容器にキメラ蛋白質を含む溶液を加えて、固定化されたフォンビルブランド因子にキメラ蛋白質を結合させる。この
結合は、フォンビルブランド因子とキメラ蛋白質との反応系に、結合惹起物質を存在させることによって惹起することができる具体的には、フォンビルブランド因子に前記キメラ蛋白質を結合させる際に、又は該結合に先立って、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を惹起する物質を反応容器に加える。例えば、上記第一の方法と同様にしてフォンビルブランド因子を結合惹起物質の存在下で反応容器に固定化しておくか、反応容器にキメラ蛋白質を含む溶液を加えるのと同時に、または前後して結合惹起物質を添加する。
【００６２】
キメラ蛋白質は、その分子中に含まれるグリコプロテインＩｂのフォンビルブランド因子結合部位で、固定化されたフォンビルブランド因子に結合する。こうしてフォンビルブランド因子に結合したキメラ蛋白質の検出は、例えば、その分子中に含まれるイムノグロブリン分子のＦｃ部分を検出することにより行うことができる。Ｆｃ部分の検出は、通常免疫測定に用いられる方法を使用することができる。
【００６３】
具体的には、例えば、Ｆｃ部分に特異的に結合する物質、例えばプロテインＡ、プロテインＧ、抗イムノグロブリン抗体等を標識したものを反応容器に加え、該標識を検出する。標識物質としては、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ等の酵素、ビオチン、アビジン、又はフルオレセイン等の蛍光物質、ユーロピウム、ランタノイド等の蛍光性を有する希土類を含む化合物等が挙げられる。ビオチン又はアビジンは、これにさらにアビジン又はビオチンを結合した他の標識物質を結合させることにより検出する。また、酵素は、適当な基質を加えて酵素反応を行い、可視吸光、紫外吸光、蛍光、発光等を検出することに行うことができる。さらに、蛍光物質又は蛍光性を有する化合物等は、励起光を照射することにより発する蛍光によって検出することができる。
【００６４】
また、キメラ蛋白質として、予め標識物質で標識したキメラ蛋白質を用い、この標識物質を検出することによっても、固定化されたフォンビルブランド因子に結合したキメラ蛋白質を検出することができる。標識物質及びその検出法は、上記のＦｃ部分の検出に用いられるものと同様である。
【００６５】
標識物質で標識したキメラ蛋白質を用いる場合には、キメラ蛋白質は精製したものを用いることが好ましい。
【００６６】
キメラ蛋白質の精製は、前述したようにイムノグロブリン分子のＦｃ部分を利用してアフィニティークロマトグラフィー等によって行うことができる。
【００６７】
本発明の第三の方法は、反応容器に固定化した前記のキメラ蛋白質に、フォンビルブランド因子又は標識物質で標識したフォンビルブランド因子を結合させ、フォンビルブランド因子の部分構造又は前記標識物質を検出することにより、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合又はこの結合の阻害を検出する方法である。
【００６８】
より具体的には、反応容器に、キメラ蛋白質の部分構造と結合する抗体、好ましくはイムノグロブリンＦｃ部分と結合する抗体、プロテインＡ、又はプロテインＧ等を含む溶液を加えて反応容器の壁面に固定化する。続いて、反応容器にキメラ蛋白質を含む溶液を加えて、固定化された抗体、プロテインＡ、又はプロテインＧ等にキメラ蛋白質を結合させることにより、キメラ蛋白質を固定化した反応容器を作製することができる。あるいは、キメラ蛋白質を直接反応容器に固定化することも可能である。
【００６９】
続いて、反応容器にフォンビルブランド因子又は標識物質で標識したフォンビルブランド因子を含む溶液を加えて、固定化されたキメラ蛋白質にフォンビルブランド因子を結合させる。この結合は、フォンビルブランド因子とキメラ蛋白質との反応系に、結合惹起
物質を存在させることによって惹起することができる。具体的には、フォンビルブランド因子に前記キメラ蛋白質を結合させる際に、又は該結合に先立って、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を惹起する物質を反応容器に加える。例えば、反応容器にフォンビルブランド因子又は標識物質で標識したフォンビルブランド因子を含む溶液を加えるのと同時に、または前後して結合惹起物質を添加する。
【００７０】
フォンビルブランド因子は、固定化されたキメラ蛋白質に結合する。こうしてキメラ蛋白質に結合したフォンビルブランド因子の検出は、例えば、フォンビルブランド因子に結合する抗体を用いることによって行える。フォンビルブランド因子に結合した抗体の検出は、通常免疫測定に用いられる方法を使用することができる。
【００７１】
具体的には、例えば、フォンビルブランド因子に結合する抗体を、あらかじめアルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ等の酵素、ビオチン、アビジン、又はフルオレセイン等の蛍光物質、ユーロピウム、ランタノイド等の蛍光性を有する希土類を含む化合物等で標識しておく方法等が挙げられる。ビオチン又はアビジンは、これにさらにアビジン又はビオチンを結合した他の標識物質を結合させることにより検出する。また、酵素は、適当な基質を加えて酵素反応を行い、可視吸光、紫外吸光、蛍光、発光等を検出することに行うことができる。さらに、蛍光物質又は蛍光性を有する化合物等は、励起光を照射することにより発する蛍光によって検出することができる。
【００７２】
また、フォンビルブランド因子として、予め標識物質で標識したフォンビルブランド因子を用い、この標識物質を検出することによっても、固定化されたキメラ蛋白質に結合したフォンビルブランド因子を検出することができる。標識物質及びその検出法は、上記のフォンビルブランド因子に結合する抗体の検出に用いられるものと同様である。
【００７３】
上記の第一、第二又は第三の方法において、グリコプロテインＩｂ（又はキメラ蛋白質）を反応容器に加えるのと実質的に同時に、又はグリコプロテインＩｂの添加に先立って、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合を阻害する物質（以下、「結合阻害物質ともいう」）を反応容器に加え、該阻害物質を加えない場合と、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合を比較することにより、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合の阻害を検出することができる。
【００７４】
また、上記の第一、第二又は第三の方法において、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの反応の際に、又は該反応に先立って、検出対象物質を含む試料を反応容器に加えて、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合の阻害を検出することにより、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂとの結合を阻害する物質を検出することができる。また、既知量の結合阻害物質を用いて、阻害物質の量と、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合との関係を示す標準曲線を作成しておくと、未知量の阻害物質を定量することができる。
【００７５】
フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合を阻害し、抗血栓作用を有する低分子量の化合物は、現在まで報告されていない。本発明の方法は、従来の方法に比べて非常に簡便であり、そのような低分子化合物の探索にも有用である。
【００７６】
＜３＞グリコカリシンの測定法及びキット
上記の第一の方法、第二の方法又は第三の方法において、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ又はキメラ蛋白質との反応の際に、又は該反応に先立って、グリコカリシンを含む試料を反応容器に加えて、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ又はキメラ蛋白質との結合の阻害を検出することにより、グリコカリシンを測定することができる。既知量のグリコカリシンを用いて、グリコカリシン濃度と、フォンビルブラ
ンド因子とグリコプロテインＩｂ又はキメラ蛋白質の結合との関係を示す標準曲線を作成しておくと、未知量のグリコカリジンの濃度を測定することができる。
【００７７】
本発明によるグリコカリシンの測定は、フォンビルブランド因子とキメラ蛋白質とをキットとして用意しておくと、簡便に行うことができる。そのようなキットとして具体的には、フォンビルブランド因子と、キメラ蛋白質と、結合惹起物質と、既知量のグリコカリシンと、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗イムノグロブリン抗体と、該標識を検出するための試薬と、洗浄用緩衝液とを含むキットが例示される。また、他の態様として、フォンビルブランド因子と、標識物質で標識したキメラ蛋白質と、結合惹起物質と、既知量のグリコカリシンと、該標識を検出するための試薬と、洗浄用緩衝液とを含むキットが例示される。
【００７８】
＜４＞低分子量の真のフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ結合阻害物質
前記＜２＞に示した本発明のフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合に対する阻害を検出する方法を用いることにより、低分子量の真のフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ結合阻害物質を検索（スクリーニング）することができる。ここで、「真の阻害物質」とは、血漿中でのグリコプロテインＩｂとフォンビルブランド因子の関与する血小板の凝集を特異的に阻害する物質をいう。蛋白質変性物質、界面活性剤をはじめとする一般的に蛋白質の構造を変化させる物質、又は蛋白質に非特異的に結合する物質のように、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合を阻害するものであっても、非特異的に阻害するものは真の阻害物質ではない。
【００７９】
真の阻害物質は、血漿中におけるリストセチン、ボトロセチンを用いたフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ依存的な血小板凝集に対する阻害活性と、コラーゲン、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）等を用いたフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ依存的な血小板凝集に対する阻害活性を測定し、これらを比較することによって識別することができる。すなわち、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ依存的な血小板凝集（例えばリストセチン惹起血小板凝集）を阻害し、それと同じ濃度においてフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ非依存的な血小板凝集（例えばコラーゲン又はＡＤＰにより惹起される血小板凝集）を実質的に阻害しない化合物は、真のフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ結合阻害物質である。
【００８０】
本発明の阻害物質は、例えば１ｍＭの濃度において、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ依存的な血小板凝集を、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上阻害することが好ましい。また、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂ非依存的な血小板凝集の阻害が３０％以下、好ましくは２５％以下であれば、実質的に阻害しないものとみなすことができる。
【００８１】
また、低分子量とは、好ましくは２０００以下、より好ましくは１０００以下であることをいう。さらに、本発明の阻害物質は、重合体でなくても活性を発現し得るものであることが好ましい。
【００８２】
上記のように本発明の方法によって検索される低分子量の抗血栓活性物質として具体的には、前記化２に示す構造を有する化合物が挙げられる。同化合物としてより具体的には、Ｋ１７４２７Ａ、Ｋ１７４２７Ｂ、Ｋ１７４２７Ｃ及びＫ１７４２７Ｄと命名された以下に示す化合物が挙げられる。これらの化合物は、クウチオプラネス属に属する放線菌（Ｃｏｕｃｈｉｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．ＡＪ９５５３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１２））から、フォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合を著しく阻害する活性を有する物質として見出されたものである。以下に、これらの化合物の物理化学的性状及び製造法の一例を説明する。
【００８３】
（１）Ｋ１７４２７Ａ、Ｋ１７４２７Ｂ、Ｋ１７４２７Ｃ及びＫ１７４２７Ｄの物理化学的性状
【００８４】
１）Ｋ１７４２７Ａの物理化学的性状
性状：黄色アモルファス状固体
分子式：Ｃ44Ｈ44Ｏ14Ｃｌ2
質量分析（高分解能ＦＡＢ−ＭＳ）
実測値：８６６．２１１７（Ｍ）+
計算値：８６６．２１０８
比旋光度：［α］D24−６０°（ｃ ０．０９，ＴＨＦ）
紫外吸収スペクトル：λmax（ε）２３５（５７０００）、２７６（５９５００）、４２７（２５０００）
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＣＯ2Ｄ）δ：７．６４（２Ｈ，ｓ）、６．０４（２Ｈ，ｓ）、５．３８（２Ｈ，ｓ）、３．４５（８Ｈ，ｓ）、２．０５（２Ｈ，ｍ）、１．２８（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、１．０４（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、０．３８（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）
13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，ＣＤ3ＣＯ2Ｄ）δ：２０５．９（ｓ）、１７３．２（ｓ）、１７１．８（ｓ）、１６２．１（ｓ）、１５４．６（ｓ）、１３５．５（ｄ）、１３４．８（ｓ）、１３１．４（ｓ）、１２０．８（ｓ）、１２０．２（ｓ）、１１４．５（ｄ）、１１３．１（ｓ）、１１１．３（ｓ）、９４．２（ｄ）、７７．６（ｓ）、５５．４（ｑ）、４８．１（ｄ）、４４．３（ｄ）、３５．０（ｄ）、１６．３（ｑ）、６．７（ｑ）
溶解性：ジメチルスルホキシド、ピリジン、酢酸に易溶、水に難溶
構造式：前記式（２）で表される構造。
【００８５】
２）Ｋ１７４２７Ｂの物理化学的性状
性状：黄色アモルファス状固体
分子式：Ｃ43Ｈ42Ｏ14Ｃｌ2
質量分析（高分解能ＦＡＢ−ＭＳ）
実測値：８５２．１９９７（Ｍ）+
計算値：８５２．１９５２
比旋光度：［α］D25−６１°（ｃ ０．１３，ＴＨＦ）
紫外吸収スペクトル（メタノール）：λmax（ε）２３５（４１０００）、２７３（４３０００）、４３４（１８５００）
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＣＯ2Ｄ）δ：７．８１（２Ｈ，ｓ）、６．１７（１Ｈ，ｓ）、６．１４（１Ｈ，ｓ）、５．５４（１Ｈ，ｓ）、５．５０（１Ｈ，ｓ）、３．６２（３Ｈ，ｓ）、３．５８（３Ｈ，ｓ）、３．５３（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）、３．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ）、３．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ）、１．２０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、１．１７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）、１．０４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）、０．９７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）、０．５２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）
溶解性：ジメチルスルホキシド、ピリジン、酢酸に易溶、水に難溶
構造式：前記式（１）において、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｃｌ、Ｒ3＝Ｈで表される構造。
【００８６】
３）Ｋ１７４２７Ｃの物理化学的性状
性状：黄色アモルファス状固体
分子量（ＥＳＩ−ＭＳ）：７９９（Ｍ＋Ｈ）+
紫外吸収スペクトル：λmax２３４、２８１、４１８
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ：７．５９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８
．４Ｈｚ）、７．２５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．１４（２Ｈ，ｓ）、６．０５（２Ｈ，ｓ）、５．３７（２Ｈ，ｂｒｓ）、３．５９（６Ｈ，ｓ）、３．４６（２Ｈ，ｂｒ）、２．１２（２Ｈ，ｍ）、１．３８（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）、１．１５（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、０．６４（６Ｈ，ｂｒ）
構造式：前記式（１）において、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝ＣＨ3で表される構造。
【００８７】
４）Ｋ１７４２７Ｄの物理化学的性状
性状：黄色アモルファス状固体
質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）：８３３（Ｍ＋Ｈ）+
紫外吸収スペクトル：λmax２３４、２７６、４２３
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ：７．７７（２Ｈ，ｓ）、７．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．１５（１Ｈ，ｓ）、６．０９（１Ｈ，ｓ）、６．０８（１Ｈ，ｓ）、５．４６（１Ｈ，ｓ）、５．３７（１Ｈ，ｂｒｓ）、３．６１（３Ｈ，ｓ）、３．５４（４Ｈ，ｓ）、３．４２（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）、２．１２（２Ｈ，ｍ）、１．３９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、１．２０（６Ｈ，ｍ）、０．６３（３Ｈ，ｂｒ）、０．５０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）
構造式：前記式（１）において、Ｒ1＝Ｃｌ、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝ＣＨ3で表される構造。
【００８８】
（２）Ｋ１７４２７Ａ、Ｋ１７４２７Ｂ、Ｋ１７４２７Ｃ及びＫ１７４２７Ｄの製造法
【００８９】
本発明のフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合阻害物質Ｋ１７４２７Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ（以下、単に「阻害物質」という。）は、例えばクウチオプラネス（Ｃｏｕｃｈｉｏｐｌａｎｅｓ）属に属する放線菌、例えばクウチオプラネス エスピー．（Ｃｏｕｃｈｉｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．）ＡＪ９５５３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１２）を、利用可能な炭素源、窒素源を含む液体あるいは固体栄養培地を用いて培養することにより、生産することができる。
【００９０】
栄養培地の炭素源として好ましくはグルコース、シュークロース、でんぷん等の炭水化物、グリセロールなどが用いられる。窒素源としては酵母エキス、ペプトン、コーンスティープパウダー、大豆粉、綿実粉（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）等の天然成分、アミノ酸、あるいは硫酸アンモニウム、尿素等の無機窒素含有化合物などが用いられる。
【００９１】
阻害物質の生産のための培養は、上記栄養培地を入れた試験管、フラスコ等を用いた振盪培養又は静置培養、ジャーファーメンター、タンクなどを用いた通気撹拌培養等により行うことができる。培養は、通常２０℃から４０℃の範囲で行うことができるが、好ましくは２５℃から３７℃の間で行われる。
【００９２】
培養終了後の培養ブロスからの阻害物質の抽出は、適切な溶媒による抽出、あるいは吸着樹脂などにより阻害物質を吸着させた後、適切な溶剤にて溶出することにより行うことができる。さらに、阻害物質の精製は、溶媒抽出、吸着樹脂、活性炭、イオン交換樹脂、シリカゲル等を用いたクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の方法を組み合わせることにより行うことができる。
【００９３】
具体的には例えば、クウチオプラネス エスピー．ＡＪ９５５３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１２）株の菌体をアセトンで抽出し、抽出物からアセトンを留去し、残渣を水に懸濁する。この水懸濁液のｐＨを２に調製後、酢酸エチルを加えて抽出する。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、得られる残渣を陰イオン交換クロマトグラフィーにより分画する。例えば、前記残渣は、含水メタノールに溶解して、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学）を充填したカラムに吸着させ、メタノールで溶出させる。次に、溶出液をＯＤＳカラムを用いたＨ
ＰＬＣで分画するか、あるいはシリカゲルＴＬＣによって分画することによって、阻害物質が取得される。得られた阻害物質が上記のいずれの化合物であるかは、上記の物理化学的性状を調べることによって知ることができる。
【実施例】
【００９４】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００９５】
〔実施例１〕
キメラ蛋白質遺伝子の作製
【００９６】
＜１＞グリコプロテインＩｂα鎖遺伝子のクローニング
ヒトグリコプロテインＩｂα鎖遺伝子のクローニングは、ヒト赤白血病細胞（Ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ：ＨＥＬ）より、モレキュラー・クローニング（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））記載の方法でｃＤＮＡライブラリーを構築することにより行った。
【００９７】
すなわちヒト赤白血病細胞を１６０ｎＭのフォルボール・エステル（ｐｈｏｒｂｏｌ−１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ−１３−ａｃｅｔａｔｅ：ＰＭＡ）を含む培地で４８時間培養して刺激した後、培地を取り除き、グアニジン・チオシアネート（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）緩衝液（４．０Ｍグアニジン・チオシアネート、０．１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１％ ２−メルカプトエタノ−ル）を細胞に添加し、細胞を懸濁させた。細胞懸濁液を、ポリトロンホモゲナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ社製）にて破砕処理した。
【００９８】
細胞破砕液に、終濃度０．５％のラウリルザルコシネート（ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｙｌ ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ）を添加した。この溶液を１０分、５０００×ｇで遠心分離し、沈殿を取り除いた。遠心上清を、超遠心分離用チューブに入れた塩化セシウム−ＥＤＴＡ液（５．７Ｍ ＣｓＣｌ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）に上層し、２０時間、１０００００×ｇにて超遠心分離処理を行った。沈殿したＲＮＡを回収し、エタノール沈殿法により精製し、全ＲＮＡを得た。
【００９９】
取得した全ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカラムに共し、ｍＲＮＡを得た。このｍＲＮＡ １０μｇを用い、ランダムヘキサマーオリゴＤＮＡをプライマーとして、逆転写酵素にて一本鎖ＤＮＡを作製後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてＥｃｏＲＩアダプターを接続した。アダプターを接続したｃＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化処理後、ゲル濾過カラムを用いて、精製した。このＤＮＡに、制限酵素ＥｃｏＲＩ部位に挿入できる様に調製されたラムダｇｔ１０アーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて接続した。この組換えＤＮＡをファージにパッケージング処理し、ｃＤＮＡライブラリーを得た。
【０１００】
このファージを大腸菌ＮＭ５１４に感染させた。生じたファージプラークに対し、ライジオアイソトープ（32Ｐ）で末端ラベルしたオリゴＤＮＡ（配列番号１）をプローブに用い、プラークハイブリダイゼーションを行った。すなわち、生じたファージプラークをニトロセルロースフィルターに転写し、アルカリ変性液（０．５Ｍ水酸化ナトリウム、１．５Ｍ食塩）でＤＮＡを変性させた。中和液（０．５Ｍトリス塩酸ｐＨ７．０、１．５Ｍ食塩）で中和し、８０℃で二時間加熱してＤＮＡをフィルターに固定化した。プローブＤＮＡは合成ＤＮＡ（パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社製、ＤＮＡ合成機
３８０Ａ型にて化学合成）をγ−32Ｐ−ＡＴＰでＴ４ ＤＮＡキナーゼ（宝酒造製）を作用させＤＮＡの５'末端をラベル化したものを用いた。尚、上記オリゴＤＮＡの塩基配列は、公知のヒトグリコプロテインＩｂα鎖遺伝子の塩基配列（Ｊ．Ａ．Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，５６１５−５６１９（１９８７））に基づいて設定した。
【０１０１】
ファージプラークＤＮＡを転写したニトロセルロースフィルター（直径１３２ｍｍ）を１枚につき１×１０6ｃｐｍ（ｃｏｕｎｔ ｐｅｒ ｍｉｎｕｉｔｅ）のプローブを含む４ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．９Ｍ食塩、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％ラウリル硫酸ナトリウム、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン、１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ）に浸し、４２℃で１６時間ハイブリダイズさせた。このフィルターを１×ＳＳＣ（０．８７５％食塩、０．４４１％クエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム溶液で３７℃３０分間、３回洗浄し、非特異的にフィルターに吸着したプローブを取り除いた。乾燥後、Ｘ線フィルムを用いてオートラジオグラフィーを行った。その結果、陽性クローン４株を得た。
【０１０２】
各々の陽性クローンからファージを分離し大腸菌ＮＭ５１４に感染させ、増殖させた後、それぞれ塩化セシウム密度勾配超遠心法にてファージＤＮＡを精製した。このファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アガロース電気泳動にてＤＮＡを精製した。この精製したＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、大腸菌ＸＬＩＩｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換して形質転換体を得た。形質転換体からアルカリＳＤＳ法にてプラスミドを調製し、プラスミドＤＮＡの塩基配列を、ジデオキシ法により、パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社製３７７型ＤＮＡシーケンサーを用い、機器のプロトコールに従って決定した。
【０１０３】
得られた陽性クローンのうち１株は２．４ｋｂのｃＤＮＡを有し、Ｊ．Ａ．Ｌｏｐｅｚら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．８４、ｐｐ．５６１５−５６１９（１９８７））が発表したヒトグリコプロテインＩｂα遺伝子の全長を有するクローンであることを確認した。このプラスミドをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＧＰＩｂＡｌｐｈａとする。
【０１０４】
＜２＞イムノグロブリンのＦｃ（γ１由来）部分をコードする遺伝子のクローニング
マウスイムノグロブリンγ１のＦｃ部分の遺伝子は、マウスハイブリドーマ細胞株ＭＢ４０．３より、全ＲＮＡを抽出し、逆転写ＰＣＲ法により取得した。すなわち、ＭＢ４０．３細胞の培養液１０ｍｌより、遠心分離により細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（１ｍｌ）（日本ジーン社製）により細胞を溶解し、１８Ｇの注射針を用いてシリンジングした。５分間放置した後、２００μｌのクロロホルムを加えて混和し、２分間静置した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分）し、水相を回収した。水相に５００μｌの２−プロパノールを加えて混和し、５分間静置した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分）により全ＲＮＡを沈殿させ、７５％エタノールで洗浄した後、１００μｌの滅菌水に溶解した。
【０１０５】
上記のように調製したＭＢ４０．３細胞全ＲＮＡ３μｇ（２０μｌ）を鋳型とし、ランダムプライマー及び逆転写酵素（ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ＧＩＢＣＯ社製））を用いてｃＤＮＡを作製した。上記ｃＤＮＡに対し、配列番号２及び３のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動により精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで切断したｐＧＥＭ−３Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に結合し、得られた組換えＤＮＡで大腸菌ＸＬＩＩｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ社製）を形質転換した。得られた形質転換体の１つを培養し、アルカリＳＤＳ法にてプラスミドを調製し、その塩基配列を、ジデオキシ法により、パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社製３７７型ＤＮＡシーケンサーを用い機器のプロトコールに従って、決定した。得られたマウスイムノグロブリンγ１のＦｃ部分の遺伝子断片の塩基配列を配列番号４に示した。このプラスミドをｐＧＥＭｍＩｇＧ１Ｆｃとした。
【０１０６】
＜３＞キメラ蛋白質（ＧＰＩｂ−ｍＩｇＧ１Ｆｃ）を発現するプラスミドの作製
上記のように得られたヒトグリコプロテインＩｂ遺伝子とマウスイムノグロブリンガンマ１のＦｃ部分を融合させたキメラ蛋白質は以下の方法で作製した。
【０１０７】
まずグリコプロテインＩｂα鎖遺伝子を含むプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＧＰＩＡｌｐｈａを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により分離し、グリコプロテインＩｂα鎖遺伝子のＮ末領域である約１０００ｂｐのＤＮＡを回収した。これをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＧＰＩｂＥＸを作製した。
【０１０８】
一方、前述のように得られたマウスイムノグロブリンγ１の部分遺伝子を含むプラスミドｐＧＥＭｍＩｇＧ１Ｆｃを制限酵素ＸｂａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で分離して、ＩｇＧ１Ｆｃ遺伝子７００ｂｐを回収した。このＤＮＡと、制限酵素ＸｂａＩで切断後ＣＩＡＰ処理を施したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＧＰＩｂＥＸを結合させ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＧＰＩｂＩｇＧ１ＦｃＦＨを取得した。この遺伝子にコードされる蛋白質をＧＰＩｂ−ｍＩｇＧ１Ｆｃと名付け、その遺伝子配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号６及び７に示した。尚、配列番号６において、Ｎ末端の１６アミノ酸残基は、シグナルペプチドを構成すると推定される。
【０１０９】
さらにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＧＰＩｂＩｇＧ１ＦｃＦＨを制限酵素ＸｈｏＩで切断後、アガロースゲル電気泳動でＧＰＩｂＦｃＦＨをコードするＤＮＡを分離し、このＤＮＡを動物細胞用発現ベクターｐＳＤ（Ｘ）のＸｈｏＩ部位に挿入し、プロモーターの下流にＧＰＩｂ遺伝子が挿入された発現ベクターｐＳＤＧＰＩｂＩｇＧ１ＦｃＦＨを取得した。上記の手順の概要を図１に示す。プラスミドｐＳＤＧＰＩｂＩｇＧ１ＦｃＦＨを保持するエシェリヒア・コリＸＬＩＩｂｌｕｅ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＪ１３４３４）は、１９９８年４月２日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１６７４９の受託番号で寄託され、１９９９年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１９が付与されている。
【０１１０】
＜４＞イムノグロブリンのＦｃ部分（γ２ａ由来）をコードする遺伝子のクローニング
マウスイムノグロブリンγ２ａのＦｃ部分の遺伝子は、マウスハイブリドーマ細胞株Ｗ６／３２より、全ＲＮＡを抽出し、逆転写ＰＣＲ法により取得した。すなわち、Ｗ６／３２細胞の培養液１０ｍｌより、遠心分離により細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社製）１ｍｌにより細胞を溶解し、１８Ｇの注射針を用いてシリンジングした。５分間放置した後、２００μｌのクロロホルムを加えて混和し、２分間静置した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分）し、水相を回収した。水相に５００μｌの２−プロパノールを加えて混和し、５分間静置した後、遠心分離（１５０００×ｒｐｍ、１５分）により全ＲＮＡを沈殿させ、７５％エタノールで洗浄後、１００μｌの滅菌水に溶解した。
【０１１１】
上記のようにして調製したＷ６／３２細胞の全ＲＮＡ３μｇ（２０μｌ）を鋳型とし、ランダムプライマー及び逆転写酵素（ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ＧＩＢＣＯ社製））を用いて、ｃＤＮＡを作製した。上記ｃＤＮＡに対し、配列番号８及び９に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで切
断した後、アガロースゲル電気泳動により精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで切断したｐＧＥＭ−３Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に結合し、得られた組換えＤＮＡで大腸菌ＸＬＩＩｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換した。得られた形質転換体の１つを培養し、アルカリＳＤＳ法にてプラスミドを調製し、その塩基配列を、ジデオキシ法により、パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社製３７７型ＤＮＡシーケンサーを用い機器のプロトコールに従って、決定した。得られたマウスイムノグロブリンγ２ａのＦｃ部分の遺伝子断片の塩基配列を配列番号１０に示した。このプラスミドをｐＧＥＭｍＩｇＧ２ａＦｃとした。
【０１１２】
＜５＞キメラ蛋白質（ＧＰＩｂ−ｍＩｇＧ２ａＦｃ）を発現するプラスミドの作製
上記のように得られたヒトグリコプロテインＩｂ遺伝子とマウスイムノグロブリンγ２ａのＦｃ部分をコードする遺伝子を融合させたキメラ蛋白質遺伝子は、以下の方法で作製した。
【０１１３】
まず、グリコプロテインＩｂα鎖遺伝子を含むプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＧＰＩｂＡｌｐｈａをＫｐｎＩ及びＸｂａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により精製を行い、グリコプロテインＩｂ遺伝子のアミノ末端から３１９番目のアスパラギン酸までの配列を含むＫｐｎＩ−ＸｂａＩ ＤＮＡフラグメントを得た。
【０１１４】
また、前述のように得られたマウスイムノグロブリンγ２ａの部分遺伝子を含むプラスミドｐＧＥＭｍＩｇＧ２ａＦｃを用いて、配列番号９及び１２に示した塩基配列を有する２種の合成プライマーを用い、ＰＦＵ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いたＰＣＲ反応（アニーリング温度５５℃、３０サイクル）により、５'側にＸｂａＩサイト、３'側にＸｈｏＩサイトを持つマウスイムノグロブリンγ２ａのＦｃ部分の遺伝子断片を作製した。この遺伝子断片をＸｂａＩ及びＸｈｏＩによって消化した後、アガロースゲル電気泳動により精製し、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−に結合し、得られた組換えプラスミドで大腸菌ＸＬＩＩｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換した。
【０１１５】
得られた形質転換体から、アルカリＳＤＳ法にてプラスミドを調製し、その塩基配列を、ジデオキシ法により、パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社製３７７型ＤＮＡシーケンサーを用い、機器のプロトコールに従って、決定した。その結果、配列番号１０に示す塩基配列の５'末端の６塩基がＴＣＴＡＧＡＣに置換され、３'末端の６塩基が除去された塩基配列であることが確かめられた。このプラスミドをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｍＩｇＧ２ａとした。本プラスミドをＸｂａＩ及びＸｈｏＩを用いて切断し、アガロースゲル電気泳動により精製を行い、マウスイムノグロブリンγ２ａのＦｃ部分遺伝子のＸｂａＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。
【０１１６】
上記の様に取得したヒトグリコプロテインＩｂ遺伝子のＫｐｎＩ−ＸｂａＩ断片とマウスイムノグロブリンγ２ａのＦｃ部分遺伝子のＸｂａＩ−ＸｈｏＩ断片を、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−に結合し、得られた組換えプラスミドで大腸菌ＸＬＩＩｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換した。得られた形質転換体の１つを培養し、アルカリＳＤＳ法にてプラスミドを調製し、グリコプロテインＩｂのＮ末端側部分（アミノ酸番号１−３１９、シグナルペプチドを含む）とマウスイムノグロブリンγ２ａのＦｃ部分が結合した蛋白質（キメラ蛋白質）をコードする遺伝子（配列番号１３）を含むプラスミドを得た。このプラスミドをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＧＰＩｂＦｃ２ａと名付け、コードされる遺伝子に対応するキメラ蛋白質を特にＧＰＩｂ−ｍＩｇＧ２ａＦｃと名付け、そのアミノ酸配列を配列番号１４に示した。尚、配列番号１４において、Ｎ末端の１６アミノ酸残基は、シグナルペプチドを構成すると推定される。
【０１１７】
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＧＰＩｂＦｃ２ａを保持するエシェリヒア・コリＸＬＩＩｂｌｕｅ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＪ１３４３２）は、１９９８年３月１９日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１６７１９の受託番号で寄託され、１９９９年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１８が付与されている。
【０１１８】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＧＰＩｂＦｃ２ａをＸｈｏＩにより消化後、アガロース電気泳動を用いて精製し、このキメラ蛋白質の遺伝子を含むＸｈｏＩ断片を、＜３＞と同様の動物細胞発現ベクターｐＳＤ（ｘ）のＸｈｏＩ部位に結合したプラスミドｐＳＤＧＰＩｂＦｃ２ａを得た。さらにｐＧＰＩｂＦｃｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔをＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩにより消化後、キメラ蛋白質の遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片を、ＳＲαプロモーター（Ｋ．Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｙ．Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０，２７−３２ １９９０）を有する動物細胞発現用ベクターｐＭｉｋＮｅｏ（＋）（東京大学医科学研究所、丸山和夫先生より恵与）のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入し、プラスミドｐＭｉｋＧＰＩｂＦｃを得た。ｐＭｉｋＧＰＩｂＦｃを取得した手順の概要を図２に示した。
【０１１９】
〔実施例２〕
キメラ蛋白質（ＧＰＩｂ−ｍＩｇＧ１Ｆｃ）の動物細胞を用いた生産
キメラ蛋白質の生産細胞は以下の方法により作製した。ＣＨＯｄｈｆｒ-細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）（１０ｍｌ）を用いて、５×１０5個／１０ｃｍシャーレになるように、３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。この細胞に、実施例１＜３＞にく記載の通り調製したｐＳＤＧＰＩｂＩｇＧ１Ｆｃを形質導入した。形質導入は、以下に示すようにリン酸カルシウムにより行った。
【０１２０】
すなわち、１０ｃｍシャーレあたり約１０μｇのｐＳＤＧＰＩｂＩｇＧ１Ｆｃを０．５ｍｌの０．１２５Ｍ塩化カルシウムを含むＢＥＳパッファー（ｐＨ６．９６）０．５ｍｌに添加後、シャーレにまんべんなく滴下し、３５℃、３％ＣＯ2下で終夜培養した後、シャーレをＰＢＳで２回洗浄後、核酸不含α−ＭＥＮ培地でさらに約２４時間３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。このようにして形質導入した細胞を、さらにメソトレキセート（ＭＴＸ）０．０５ｕＭ、１０％ウシ胎児血清を含む核酸不含α−ＭＥＭ培地中で培養することにより、キメラ蛋白質生産細胞を取得した。
【０１２１】
上記の様にして得たキメラ蛋白質産生細胞は、Ｆ１７５細胞培養用フラスコでメントレキセート（ＭＴＸ）０．０５ｕＭ、１０％ウシ胎児血清を含む核酸不含α−ＭＥＭ培地中でほぼ６０％コンフルエントになるまで培養した後、培地をメソトレキセート（ＭＴＸ）０．０５ｕＭを含む無血清培地ＡＳＦ１０４培地（味の素社製）に交換し、４日後、培養用上清を回収した。
【０１２２】
〔実施例３〕
キメラ蛋白質（ＧＰＩｂ−ｍＩｇＧ２ａＦｃ）の動物細胞を用いた生産
キメラ蛋白質の生産細胞は、以下の方法により作製した。ＣＨＯＫ１細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）（１０ｍｌ）を用いて、５×１０5個／１０ｃｍシャーレになるように、３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。この細胞に、実施例１で調製したｐＭｉｋＧＰＩｂＦｃを形質導入した。形質導入は、以下に示すようにリン酸カルシウム法により行った。
【０１２３】
すなわち、１０ｃｍシャーレあたり約１０μｇのｐＭｉｋＧＰＩｂＦｃを０．５ｍｌの０．１２５Ｍ塩化カルシウムを含むＢＥＳバッファー（ｐＨ６．９６）０．５ｍｌに添加後、シャーレにまんべんなく滴下し、３５℃、３％ＣＯ2下で終夜培養した後、シャー
レをＰＢＳで２回洗浄後、Ｄ−ＭＥＭ培地でさらに約２４時間３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。このようにして形質導入した細胞を、さらにＧ４１８（８５０μｇ／ｍｌ）、１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地中で培養することにより、Ｇ４１８耐性細胞であるキメラ蛋白質生産細胞を取得した。
【０１２４】
上記の様にして得たキメラ蛋白質産生細胞は、Ｆ１７５細胞培養用フラスコでＧ４１８（８００μｇ／ｍｌ）、１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地中でほぼ６０％コンフルエントになるまで培養した後、培地をＧ４１８（８００μｇ／ｍｌ）を含む無血清培地ＡＳＦ１０４培地（味の素社製）に交換し、４日後培養用上清を回収した。
【０１２５】
回収した培養上清を遠心分離して固形物を除去した後、上清１６０ｍｌを、２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で洗浄したＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｈｉｔｒａｐ（１ｍｌ、ファルマシア社製）カラムに通してキメラ蛋白質をカラムに吸着させた。カラムを２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で十分洗浄した後、０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ４．５）で溶出を行った。キメラ蛋白質の溶出は、ＵＶモニターによって２８０ｎｍを検出することによって行い、キメラ蛋白質溶出画分は１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．５）を加えることにより直ちに中和した。上記のようにして得られたキメラ蛋白質は、ＳＤＳ電気泳動の結果、還元下で約８０Ｋｄａ、非還元下で約２倍の分子量を示す蛋白質であった。
【０１２６】
〔実施例４〕
固定化したフォンビルブランド因子とボトロセチンの混合物に対するキメラ蛋白質の結合の検出
【０１２７】
＜１＞抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によるキメラ蛋白質の結合の検出
ボトロセチンは、ボトロプス・ジャララカ（Ｂｏｔｒｏｐｓ ｊａｒａｒａｃａ）粗毒凍結乾燥品（シグマ社製）１ｇより、Ｒｅａｄ（Ｍ．Ｓ．Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７５，４５１４−４５１８，１９７８）により報告されている方法に準じて精製することにより、取得した。
【０１２８】
また、９６穴マルチタイタープレートへのフォンビルブランド因子、ボトロセチンの混合液の固定化は以下のように行った。まず、常法により調製したフォンビルブランド因子の生理的食塩水溶液（２５０μｇ／ｍｌ）とボトロセチンの生理的食塩水溶液（５００μｇ／ｍｌ）を適当に希釈した後、図２に示したそれぞれの濃度比になるように混合した後、その５０μｌ、９６穴マルチタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ヌンク社製）の各ウェルに加えた。４℃で終夜静置した後、生理的トリスバッファー（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム；Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、以下、「ＴＢＳ」という）にて１回（１５０μｌ）洗浄し、１０％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＴＢＳ １００μｌを加えて約３時間静置した後、ＴＢＳで３回洗浄し、フォンビルブランド因子固定化プレートを得た。
【０１２９】
上記の様にボトロセチン存在下でフォンビルブランド因子を固定化したプレートに対し、１％ＢＳＡを含むＴＢＳ ２５μｌと、キメラ蛋白質（ＧＰＩｂ−ｍＩｇＧ１Ｆｃ）産生細胞の無血清培地を用いた培養上清を０．１％ＢＳＡを含むＴＢＳで８倍に希釈した溶液２５μｌを加え、１時間室温にてインキュベートした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（１５０μｌ）で３回洗浄した。抗マウスＩｇＧ−Ｆｃヤギポリクローナル抗体（カタログＮｏ．５５４８２、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ社製）をＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（カタログＮｏ．１４１８１６５、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いてキットに添付されたプロトコール記載の方法で、ビオチン化した。このビオチン化抗マウスＩｇＧＦｃ抗体約２μｇ／ｍｌを含む０．１％ＢＳ
Ａ／ＴＢＡ溶液５０μｌを前記プレートに加え、１時間、室温にてインキュベートした。さらに０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（１５０μｌ）で３回洗浄した後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ ｋｉｔ（ビオチン検出用キット、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｔａｎｄａｒｄ、カタログＮｏ．ＡＫ−５０００、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）の試薬（ビオチン化アルカリフォスファターゼ及びストレプトアビジンの混合液）をマニュアルに記載の方法の１／５濃度に調製した０．１％ＢＳＡ／ＴＢＳ溶液５０μｌを加えて、１時間室温にてインキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（１５０μｌ）で５回洗浄後パラニトロフェニルフォスフェート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｓｐｈａｔｅ）を１ｍｇ／ｍｌになるように溶解した、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む１００ｍＭ ＮａＨＣＯ3溶液を１００μｌ加え、約１時間発色反応を行い、発色後４０５ｎｍの吸光度を測定した。図３に示した通り、ボトロセチンおよびフォンビルブランド因子の量依存的に、キメラ蛋白質の結合が観察された。
【０１３０】
＜２＞ユーロピウム（Ｅｕ）ラベル法を用いたキメラ蛋白質の結合の検出
実施例３で得た、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムで精製したキメラ蛋白質（ＧＰＩｂ−ｍＩｇＧ２ａＦｃ）溶液を生理的食塩水に対して透析後、約２００μｇ／１．５ｍｌの溶液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いた限外濾過により７８０μｌ（濃度約２５０μｇ／ｍｌ）に濃縮した。そのうち５００μｌ（約１２５μｇのＧＰＩｂ−ｍＩｇＧ２ａＦｃを含む）に５０μｌの０．５Ｍ ＮａＨＣＯ3を加えた後、Ｅｕ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（化合物としてＥｕｒｏｐｉｕｍ ＤＴＴＡ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、ＤＥＬＦＩＡ １２４４−３０２、Ｗａｌｌａｃ社製）０．２ｍｇを生理的食塩水２５０μｌに溶解したものを５０μｌ添加した後、約４０時間室温で撹拌しながらＥｕｒｏｐｉｕｍ ＤＴＴＡ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅを反応させた。
【０１３１】
上記反応液を、ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ（内径１６ｍｍ、長さ６０ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いてゲル濾過し、未反応の試薬とキメラ蛋白質とを分離した。ゲル濾過は、溶出液に生理的食塩水を用い、流速１ｍｌ／分で行った。Ｅｕでラベル化されたキメラ蛋白質は、溶出体積４０−４８ｍｌの部分に回収された。蛋白質定量キット（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用い、ＩｇＧを標準物質として蛋白定量を行った結果、溶出溶液中のラベル化されたキメラ蛋白質の濃度は、６．４μｇ／ｍｌの濃度であった。以下、この値をキメラ蛋白質濃度として、以下の実験を行った。
【０１３２】
上記のように調製したユーロピウム（Ｅｕ）ラベル化したキメラ蛋白質と、ボトロセチン存在下で固定化したフォンビルブランド因子との結合の検出を、以下の通り行った。実施例４＜１＞で示した方法にしたがって、フォンビルブランド因子２．５μｇ／ｍｌとボトロセチン２．５μｇ／ｍｌの混合溶液（ＴＢＳ）を９６穴マルチタイタープレート（マイクロタイトレーションプレートＤＥＬＦＩＡ、１２４４−５５０、Ｗａｌｌａｃ社製）の各ウェルに加え、終夜固定化した後、洗浄、ブロッキング、洗浄を行い、フォンビルブランド固定化プレートを作製した。
【０１３３】
上記プレートに、２５μｌの０．５％ＢＳＡを含むアッセイバッファー（Ａｓｓａｙ
Ｂｕｆｆｅｒ、Ｗａｌｌａｃ ＤＥＬＦＩＡ １２４４−１０６、Ｗａｌｌａｃ社製、組成：０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ ウシγグロブリン、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−４０、２０μＭ ＤＴＰＡ（ジエチレンドリアミン四酢酸）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒｄ ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．８）、０．０５％アジ化ナトリウム）あるいはさらに結合阻害物質として組み換え体ＡＳ１０５１（Ｃｙｓ８１をＡｌａに置換したもの）（Ｎ．Ｆｕｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９５／０８５７３）を終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように加え、さらにユーロピウム（Ｅｕ）ラベル化したキメラ蛋白質の同アッセイバッファー溶液（１００ｎｇ／ｍｌ）２５μｌを加えて、１分間振とう撹拌した後、室温で２
時間静置した。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（１５０μｌ）で５回洗浄した後、蛍光増強緩衝液（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒ、１２４４−１０４、Ｗａｌｌａｃ社製、組成：１５μＭ β−ＮＴＡ（２−ナフトイルトリフロオロアセトン）、５０μＭ ＴＯＰＯ（トリ−ｎ−オクチルフォスフィンオキシド）、１ｇ／Ｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１００ｍＭ 酢酸−フタル酸水素カリウム緩衝液）１００μｌを加えて１分間振とう撹拌した後、ＤＥＬＦＩＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ蛍光光度計（１２３０ ＡＲＣＵＳ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、Ｗａｌｌａｃ社製）を用いてユーロピウム（Ｅｕ）量の測定を行った（測定時間：１秒間）。測定の値（結合阻害物質添加及び非添加）とＣＶ（偏差）（％）値を表１に示した。
【表１】
2008224684.tif 000004
【０１３４】
〔実施例５〕
結合阻害物質によるフォンビルブランド因子とキメラ蛋白質の結合阻害の検出
【０１３５】
＜１＞抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によるキメラ蛋白質の結合阻害の検出
フォンビルブランド因子の固定化を、フォンビルブランド因子２．５μｇ／ｍｌとボトロセチン２．５μｇ／ｍｌの混合溶液（ＴＢＳ）で行ったこと、及び、固定化フォンビルブランド因子とキメラ蛋白質産生細胞の培養上清との反応の際、阻害活性を測定したい結合阻害物質を加えておくこと以外は、実施例４＜１＞の方法と同様に行った。
【０１３６】
結合阻害物質としては、抗ヒトフォンビルブランド因子モノクローナル抗体であるＡＪｖＷ−２、及び、クロタルス・ホリダス・ホリダスの蛇毒由来のヒトグリコプロテインＩｂ結合ペプチドを用いた。
【０１３７】
ＡＪｖＷ−２を産生するハイブリドーマは、平成６年８月２４日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にそれぞれ順にＦＥＲＭ Ｐ−１４４８７の受託番号で寄託され、平成７年９月２９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、ＦＥＲＭ ＢＰ−５２４８の受託番号で寄託されている（ＷＯ９６／１７０７８参照）。該ハイブリドーマを培養すれば、ＡＪｖＷ−２を得ることができる。
【０１３８】
また、前記ヒトグリコプロテインＩｂ結合ペプチドは、クロタルス・ホリダス・ホリダスの蛇毒由来の多量体ペプチドから得られる一本鎖ペプチド（ＡＳ１０５１）の８１位のシステイン残基がアラニン残基に置換されたもの（変異型ＡＳ１０５１）である。ＡＳ１０５１は、これをコードする遺伝子を、８１位のシステイン残基がアラニン残基に置換されるように改変し、該遺伝子を大腸菌で発現させることにより得た。ｐＣＨＡ１を保持するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＣＨＡ１（Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＪ１３０２３）は、平成６年８月１２日より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、ＦＥＲＭ ＢＰ−４７８１の受託番号のもとでブダペスト条約に基づき国際寄託されている（ＷＯ９５／０８５７３参照）。尚、ＡＳ
１０５１自体もヒトグリコプロテインＩｂ結合ペプチドであり、変異型ＡＳ１０５１の検出と同様にして検出することができる。
【０１３９】
ＡＪｖＷ−２及び変異型ＡＳ１０５１のキメラ蛋白質（すなわちグリコプロテインＩｂ）に対する結合阻害活性を図４に示した。
【０１４０】
＜２＞ユーロピウム（Ｅｕ）ラベル法を用いたキメラ蛋白質の結合阻害の検出
フォンビルブランド因子の固定化を、フォンビルブランド因子２．５μｇ／ｍｌとボトロセチン２．５μｇ／ｍｌの混合溶液（ＴＢＳ）で行ったこと、及び、固定化フォンビルブランド因子とユーロピウム（Ｅｕ）ラベル化したキメラ蛋白質との反応の際、阻害活性を測定したい結合阻害物質を加えておくこと以外は、実施例４＜２＞の方法と同様に行った。
【０１４１】
結合阻害物質としては、抗ヒトフォンビルブランド因子抗体であるＡＪｖＷ−２、変異型ＡＳ１０５１を用いた。両物質のキメラ蛋白質（すなわちグリコプロテインＩｂ）に対する結合阻害活性を図５に示した。
【０１４２】
〔実施例６〕
血漿中のグリコカリシンの検出
【０１４３】
＜１＞抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法にグリコカリシンの検出
ヒト血漿の調製は、１８Ｇの注射針を用いて健康なボランティアから採血した血液に、１／１０容の３．８％クエン酸ナトリウム水溶液を加え、３０００×ｒｐｍで１０分間、遠心分離した後、その上清を分離することにより行った。
【０１４４】
実施例５＜１＞の方法と同様にして作製したフォンビルブランド因子固定化プレートに対し、３人の独立に採取したヒト血漿をＴＢＳで順次２倍に希釈し（合計８段希釈）、その２５μｌを上記プレートに加え、さらに、キメラ蛋白質産生細胞を無血清培地で培養した培養上清を０．１％ＢＳＡを含むＴＢＳで８倍に希釈した溶液２５μｌを加え、１時間室温にてインキュベートした。その後の反応、発色操作は実施例５＜１＞に示した方法と同様に行い、その結果の平均値を図６に示した。
【０１４５】
健常人のグリコカリシンの血中濃度は約２μｇ／ｍｌと報告されており、このことより、本検出系では５０％の結合阻害を示すグリコカリシン濃度は約４００ｎｇ／ｍｌであり、グラフの直線性から６０ｎｇ／ｍｌ以上のグリコカリシン量は十分測定可能であると考えられた。
【０１４６】
＜２＞ユーロピウム（Ｅｕ）ラベル化したキメラ蛋白質を用いたグリコカリシンの検出
上記＜１＞の方法で独立に調製したヒト血漿をＴＢＳで順次２倍に希釈し（合計８段希釈）、実施例５＜１＞の方法と同様に作製したフォンビルブランド因子固定化プレート（プレートは、マイクロタイトレーションプレートＤＥＬＦＩＡ、１２４４−５５０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製を使用）に２５μｌを加え、さらに実施例４＜１＞と同様にして調製したユーロピウム（Ｅｕ）ラベル化したキメラ蛋白質のアッセイバッファー溶液（１００ｎｇ／ｍｌ、Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ；１２４４−１０６、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製））２５μｌを加えて反応させた。その後の洗浄操作、測定操作は実施例５＜２＞と同様に行い、その結果の平均値を図７に示した。
【０１４７】
健常人のグリコカリシンの血中濃度は約２μｇ／ｍｌと報告されており、このことより、本検出系では５０％の結合阻害を示すグリコカリシン濃度は約６０ｎｇ／ｍｌであり、３０ｎｇ／ｍｌ以上のグリコカリシン量は十分測定可能であると考えられた。
【０１４８】
〔実施例７〕
固定化したフォンビルブランド因子に対するボトロセチン存在下におけるキメラ蛋白質の結合の検出と阻害物質による結合阻害の検出
【０１４９】
＜１＞キメラ蛋白質の結合の検出
ヒトフォンビルブランド因子（２．５μｇ／ｍｌ）を含むＴＢＳ溶液（５０μｌ）を９６穴プレートの各ウェルに加え、４℃で終夜固相化した後、ＴＢＳ（１５０μｌ）で１回洗浄した後、５％ＢＳＡを含むＴＢＳで約３時間ブロッキングを行った。プレートをＴＢＳ（１５０μｌ）で２回洗浄した後、２５μｌのアッセイバッファー（Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ、１２４４−１０６、Ｗａｌｌａｃ社製、組成は実施例４＜２＞に記載）あるいはさらに阻害物質として組み換え体ＡＳ１０５１（Ｃｙｓ８１をＡｌａに置換したもの）を終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように加え、実施例４＜２＞で調製したユーロピウム（Ｅｕ）ラベル化したキメラ蛋白質（１００ｎｇ／ｍｌ）およびボトロセチン（５００ｎｇ／ｍｌ）を含むアッセイバッファー（２５μｌ）を順次加え、室温で約３時間放置した。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（１５０μｌ）で５回洗浄した後、蛍光増強緩衝液（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１２４４−１０４、Ｗａｌｌａｃ社製、組成は実施例４＜２＞に記載）１００μｌを加えて１分間振とうした後、１４２ＯＡＲＶＯマルチラベルカウンター（Ｗａｌｌａｃ社製）を用いてユーロピウム（Ｅｕ）量の測定を行った（測定時間：１秒間）。測定の値（サンプル非添加、阻害サンプル添加）とＣＶ（％）値を表２に示した。
【表２】
2008224684.tif 000005
【０１５０】
＜２＞阻害物質によるキメラ蛋白質の結合阻害の測定
阻害活性を測定したい結合阻害物質を加えておくこと以外は、実施例７＜１＞の方法と同様に行った。
結合阻害物質としては実施例５＜１＞に示した抗ヒトフォンビルブランド因子モノクローナル抗体であるＡＪｖＷ−２、同様に実施例５＜１＞に示したヒトグリコプロテインＩｂ結合蛋白質である変異型ＡＳ１０５１を用いた。
ＡＪｖＷ−２、変異型ＡＳ１０５１のキメラ蛋白質（すなわちグリコプロテインＩｂ）に対する結合阻害活性を図８に示した。
【０１５１】
〔実施例８〕
固定化したキメラ蛋白質に対する結合惹起物質存在下におけるフォンビルブランド因子の結合の検出と結合阻害物質による結合阻害の検出
【０１５２】
＜１＞ボトロセチンを用いた結合の検出
まず、ヒトフォンビルブランド因子の生理的食塩水溶液（３００μｇ／ｍｌ）５００μｌに５０μｌの０．５Ｍ ＮａＨＣＯ3を加えた後、Ｅｕ−ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（化合物としてＥｕｒｏｐｉｕｍ ＤＴＴＡ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、ＤＥＬＦＩＡ １２４４−３０２、Ｗａｌｌａｃ社製）０．２ｍｇを生理的食塩水２５０μ
ｌに溶解したものを５０μｌ添加した後、約４０時間室温で撹拌しながら反応させた。
【０１５３】
上記反応液を、ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ（内径１６ｍｍ、長さ６０ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いてゲル濾過し、未反応の試薬とフォンビルブランド因子とを分離した。ゲル濾過は、溶出液に生理的食塩水を用い、流速１ｍｌ／分で行った。Ｅｕでラベル化されたヒトフォンビルブランド因子は、溶出体積４０−４８ｍｌの部分に回収された。
【０１５４】
上記のように調製したユーロピウム（Ｅｕ）ラベル化したフォンビルブランド因子と、固定化したキメラ蛋白質とのボトロセチン存在下で結合の検出を、以下の通り行った。まず抗マウスイムノグロップリンポリクローナル抗体（カタログＮｏ．５５４８２、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ社製、１μｇ／ｍｌ）の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）溶液５０μｌを、９６穴マルチタイタープレート（マイクロタイトレーションプレートＤＥＬＦＩＡ、１２４４−５５０、Ｗａｌｌａｃ社製）の各ウェルに加え終夜固定化した後、洗浄、５％ＢＳＡを含むＴＢＳ（１００μｌ）によりブロッキングした後、ＴＢＳ（１５０μｇ／ｍｌ）で３回洗浄を行った。さらにキメラ蛋白質のＴＢＳ溶液（０．５μｇ／ｍｌ）５０μｌを加え、室温で３時間静置することにより固定化した抗マウスイムノグロブリン抗体に、キメラ蛋白質を結合させ、キメラ蛋白質固定化プレートを作製した。
【０１５５】
キメラ蛋白質固定化プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（１５０μｌ）で３回洗浄した後、実施例４＜１＞で示した方法と同様に、２５μｌのアッセイバッファー（Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ、１２４４−１０６、Ｗａｌｌａｃ社製、組成は実施例４＜２＞に記載）あるいはさらに阻害物質として組み換え体ＡＳ１０５１（Ｃｙｓ８１をＡｌａに置換したもの）を終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように加え、さらにユーロピウム（Ｅｕ）ラベル化したフォンビルブランド因子（５００ｎｇ／ｍｌ）とボトロセチン（５００ｎｇ／ｍｌ）を含むアッセイバッファー（２５μｌ）を順次加え、室温で約３時間放置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（１５０μｌ）で５回洗浄した後、蛍光増強緩衝液（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１２４４−１０４、Ｗａｌｌａｃ社製、組成は実施例４＜２＞に記載）１００μｌを加えて１分間振とうした後、１４２０ＡＲＶＯマルチラベルカウンター（Ｗａｌｌａｃ社製）を用いてユーロピウム（Ｅｕ）量の測定を行った（測定時間：１秒間）。測定の値（サンプル非添加、阻害サンプル添加）を表３に示した。
【表３】
2008224684.tif 000006
【０１５６】
＜２＞阻害物質によるキメラ蛋白質の結合阻害の測定
阻害活性を測定したい結合阻害物質を加えておくこと以外は、実施例８＜１＞の方法と同様に行った。
【０１５７】
結合阻害物質としては実施例５＜１＞に示した抗ヒトフォンビルブランド因子モノクローナル抗体であるＡＪｖＷ−２、同様に実施例５＜１＞に示したヒトグリコプロテインＩｂ結合蛋白質である変異型ＡＳ１０５１を用いた。
【０１５８】
ＡＪｖＷ−２、変異型ＡＳ１０５１のキメラ蛋白質（すなわちグリコプロテインＩｂ）に対する結合阻害活性を図９に示した。
【０１５９】
＜３＞リストセチンを用いた結合の検出
＜１＞と同様の方法を用いて作製したユーロピウム（Ｅｕ）ラベル化したフォンビルブランド因子、およびキメラ蛋白質固定化プレートを用いた。
【０１６０】
キメラ蛋白質固定化プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（１５０μｌ）で３回洗浄した後、２５μｌのアッセイバッファー（Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ、１２４４−１０６、Ｗａｌｌａｃ社製、組成は実施例４＜２＞に記載）あるいはさらに阻害物質として組み換え体ＡＳ１０５１（Ｃｙｓ８１をＡｌａに置換したもの）を終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように加え、さらにユーロピウム（Ｅｕ）ラベル化したフォンビルブランド因子（５００ｎｇ／ｍｌ）と種々の濃度（２、１、０．５、０．２５および０ｍｇ／ｍｌ）の硫酸リストセチン（シグマ社製）を含むアッセイバッファー（２５μｌ）を順次加え、室温で約２時間放置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（１５０μｌ）で５回洗浄した後、蛍光増強緩衝液（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１２４４−１０４、Ｗａｌｌａｃ社製、組成は実施例４＜２＞に記載）１００μｌを加えて１分間振とうした後、１４２０ＡＲＶＯマルチラベルカウンター（Ｗａｌｌａｃ社製）を用いてユーロピウム（Ｅｕ）量の測定を行った（測定時間：１秒間）。
【０１６１】
リストセチン濃度と結合したフォンビルブランド因子のカウント、および結合阻害物質である組み換え体ＡＳ１０５１（終濃度２０μｇ／ｍｌ）存在下での結合したフォンビルブランド因子のカウントを表４に示した。
【表４】
2008224684.tif 000007
【０１６２】
〔実施例９〕
実施例７の方法を用いたグリコプロテインＩｂとフォンビルブランド因子の結合を阻害する物質のスクリーニング
実施例７の方法を用いて、グリコプロテインＩｂとフォンビルブランド因子の結合を阻害する物質のスクリーニングを行った。具体的には、阻害活性を測定したいサンプルを加えておくこと以外は、実施例７＜１＞の方法と同様に行った。種々の化合物、放線菌、糸状菌等の培養液、あるいはそれらの有機溶剤抽出物をサンプルとして用いた。
【０１６３】
その結果、日本国神奈川県横浜市の四季の森公園の土壌から採取された放線菌ＡＪ９５５３株の培養液、あるいはその有機溶剤（ブタノール、酢酸エチル）抽出画分に、グリコプロテインＩｂとフォンビルブランド因子の結合を著しく阻害する物質を見出した。
【０１６４】
〔実施例１０〕
放線菌ＡＪ９５５３株を用いた阻害物質の生産と単離、構造解析
【０１６５】
＜１＞ＡＪ９５５３株からのＫ１７４２７ＡおよびＢの製造法
ＡＪ９５５３株を試験管に５ｍｌ張り込んだシード用培地（Ｂｅｅｆ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ社製）０．１％、グルコース１％、Ｓｔａｒｃｈ Ｓｏｌｕｂｌｅ（ナカライテスク社製）１％、Ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｐｏｗｄｅｒ（和光純薬社製）０．５％、ポリペプトン（大日本製薬社製）１％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ社製）０．５％、炭酸カルシウム０．２％を含む、ｐＨ７．２）に植菌し、２８℃、１２０ｒｐｍで６日間振とう培養した。この培養液を５００ｍｌ容三角フラスコに７０ｍｌ張り込んだ培養用培地（グリセロール２％、Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ（Ｔｒａｄｅｒ ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ社製）１％、Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｐｏｗｄｅｒ（ナカライテスク社製）１％、炭酸カルシウム０．４％、硫酸ナトリウム０．３％、硫酸亜鉛７水和物０．００３％を含む、ｐＨ７．０）に、２％になるように接種し、さらに２８℃、１８０ｒｐｍで８日間振とう培養を行った。
【０１６６】
このようにして得られた培養液（１．６Ｌ）から遠心により菌体を得、これにアセトン（１Ｌ×２）を加えて、室温で１日抽出した。濾過により菌体残渣を分離後、減圧下アセトンを留去し、得られた残渣を水に懸濁させ。この水懸濁液を５％塩酸によりｐＨ２．０に調製後、酢酸エチル（４００ｍｌ×２）を加え抽出した。酢酸エチル層を減圧下で濃縮し、得られた残渣（１．３ｇ）を５０％メタノールに溶解させた。この溶液をダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学）を充填したカラムを用いてメタノールで溶出した。得られた画分をＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＡＭ−３２２）を用いたＨＰＬＣによりＫ１７４２７Ａ（４００ｍｇ）およびＫ１７４２７Ｂ（４０ｍｇ）を得た。
【０１６７】
＜２＞ＡＪ９５５３株からのＫ１７４２７ＣおよびＤの製造法
ＡＪ９５５３株を試験管に５ｍｌ張り込んだシード用培地（Ｂｅｅｆ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ社製）０．１％、グルコース１％、Ｓｔａｒｃｈ Ｓｏｌｕｂｌｅ（ナカライテスク社製）１％、Ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ Ｐｏｗｄｅｒ（和光純薬社製）０．５％、ポリペプトン（大日本製薬社製）１％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ社製）０．５％、炭酸カルシウム０．２％を含む、ｐＨ７．２）に植菌し、２８℃、１２０ｒｐｍで６日間振とう培養した。
【０１６８】
このようにして得られた培養液（４０ｍｌ）から遠心により菌体を得、これにアセトン（５０ｍｌ）を加えて、室温で１日抽出した。濾過により菌体残渣を分離後、減圧下アセトンを留去した。得られた水懸濁液を５％塩酸によりｐＨ２．０に調製後、酢酸エチル（２０ｍｌ×２）を加え抽出した。酢酸エチル層を減圧下で濃縮し、得られた残渣を５０％メタノールに溶解させた。この溶液をダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学）を充填したカラムを用いてメタノールで溶出した。得られた両分をシリカゲル分取ＴＬＣ（メルク社）により分画し（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル／メタノール／水、６０：４０：５：０．５）、Ｋ１７４２７Ｃ（３．２ｍｇ）およびＫ１７４２７Ｄ（２．２ｍｇ）を得た。
【０１６９】
〔実施例１１〕
グリコプロテインＩｂとフォンビルブランド因子との結合を阻害する低分子量物質Ｋ１７４２７Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄを生産する放線菌ＡＪ９５５３の同定、生理的試験
Ｋ１７４２７Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄを生産する放線菌ＡＪ９５５３株の分類学的検討を行った結果を以下に示す。
【０１７０】
１．形態学的特徴
ＩＳＰ［インターナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）］規定の寒天培地上、２８℃、１４日間培養後、顕微鏡下観察では基底菌糸は良好に伸長、分岐し、オレンジ色である。ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属菌株様のジグザグ伸長は観察されない。気菌糸は基底菌糸上から形成し、成熟すると気菌糸由来の胞子連鎖を形成する。胞子嚢は形成されない。胞子は卵状から単桿状の分節胞子であって、通常その大きさは、０．４〜１×１〜１．５μｍである。熟成した胞子を水中に投じると、その胞子は鞭毛を有し遊走性を示す。
【０１７１】
２．各種寒天培地上での生育及び培養性状
各種寒天培地上での生育及び培養性状（２８℃、１４日間培養）を表５に示す。
【表５】
2008224684.tif 000008
【０１７２】
３．生育温度
オートミール寒天培地で１４日間培養したときの生育状況を以下に示す。
８℃：生育せず
３０℃：生育良好
１８℃：僅かに生育
３７℃：生育良好
２０℃：生育普通
４２℃：生育普通
２８℃：生育良好
４５℃：生育せず
【０１７３】
４．炭素源の利用性
プリッドハム・ゴトリーブ寒天を基礎培地とし、下記各種糖を添加して２８℃、１４日間培養したときの生育状況を以下に示す。−：生育せず。＋：生育普通
Ｄ−グルコース ＋
ラフィノース −
Ｄ−キシロース ＋
Ｄ−マンニトール ＋
Ｌ−アラビノース ＋
イノシトール −
Ｌ−ラムノース ＋
シュークロース ＋
Ｄ−フルクトース ＋
Ｄ−ガラクトース ＋
【０１７４】
５．菌体成分
細胞壁からは、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸、３−ＯＨ−ジアミノピメリン酸、グリシン及びリジンが検出され、細胞液タイプはＶＩ型であると考えられる。また分類上の特徴である全菌体糖成分はアラビノース及びキシロースであり、糖パターンはＤ型であった。主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ４）であった。また細胞壁ペプチドグリカンのアシルタイプは、グリコリル型であった。
【０１７５】
６．１６８リボソームＲＮＡ塩基配列解析本菌株の１６８リボソームＲＮＡ塩基配列を調べた結果、本菌株はミクロモノスポラシア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａ）科に所属するクウチオプラネス カエルレウス（Ｃｏｕｃｈｉｏｐｌａｎｅｓ ｃａｅｒｕｌｅｕｓ）と最も近縁であった。
【０１７６】
以上のことから、本菌株は放線菌の中でもクウチオプラネス属（Ｃｏｕｃｈｉｏｐｌａｎｅｓ）に属することは明らかであり、従ってＡＪ９５５３株をクウチオプラネス エスピー ＡＪ９５５３（Ｃｏｕｃｈｉｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．ＡＪ９５５３）と称することとした。
【０１７７】
なお、本菌株は、１９９９年１月６日に通商産業省工業技術院生命工学技術研究所（郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にブタペスト条約に基づいて寄託されており、受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−６６１２である。
【０１７８】
本発明において、クウチオプラネス エスピー ＡＪ９５５３（Ｃｏｕｃｈｉｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．ＡＪ９５５３）の変異株等の誘導体も、阻害物質を産生する性質を有する限り、生理的な性質が本菌株と異なっていても、阻害物質の製造に使用することができる。変異株は、例えばＸ線若しくは紫外線などの照射処理、例えばナイトロジェンマスタード、アザセリン、亜硝酸、２−アミノプリン若しくはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の変異誘起剤による処理、ファージ接触、形質転換、形質導入又は接合などの通常用いられている菌種変異処理方法によりクウチオプラネス エスピー ＡＪ９５５３（Ｃｏｕｃｈｉｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．ＡＪ９５５３）を変異させることにより得ることができる。
【０１７９】
〔実施例１２〕
Ｋ１７４２７Ａ、Ｃ、ＤのグリコプロテインＩｂとフォンビルブランド因子の結合に対する阻害活性
【０１８０】
＜１＞実施例４のグリコプロテインＩｂとフォンビルブランド因子の結合阻害を検出する方法を用いたＫ１７４２７Ａ、Ｃ、Ｄの阻害活性の測定
単離したＫ１７４２７Ａ、Ｃ、ＤのグリコプロテインＩｂとフォンビルブランド因子の結合に対する阻害活性を、測定に１４２０ＡＲＶＯマルチラベルカウンター（Ｗａｌｌａｃ社製）（測定時間：１秒間）を用いたこと以外は実施例４に示した方法と同様の方法を用いて測定した。図１０にそれぞれの化合物の、グリコプロテインＩｂとフォンビルブ
ランド因子の結合阻害活性を示した。
【０１８１】
＜２＞ヨード１２５ラベルフォンビルブランド因子とホルマリン固定化血小板の結合に対するＫ１７４２７Ａ、Ｃ、Ｄの阻害活性の測定
【０１８２】
（１）固定化血小板の調製
固定化血小板の調製法は、以下の方法にしたがって行った。１８Ｇの注射針を用いて採血した健常人ボランティアの血液５０ｍｌに、１／１０容になるように３．８％クエン酸ナトリウムを加え、５０ｍｌディスポーザブルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ ２０９６）に二分した後、冷却遠心機（ＫＵＢＯＴＡ ８８００）を用いて、９００ｒｐｍ、１５分、室温で遠心分離を行って、上清を多血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ； ＰＲＰ）として回収した。ＰＲＰに等容の２％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを加え、穏やかに混和した後４℃で一晩静置した。本溶液を上記と同様の冷却遠心機を用いて、３０００ｒｐｍ、１０分、遠心分離を行い、上清をデカンテーションにより取り除いた後、約２０ｍｌ／ｔｕｂｅのＰＢＳを加えて、ピペットで穏やかに沈殿を懸濁させた。さらに３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの遠心分離、ＰＢＳによる懸濁を２回繰り返した後、最終的に最初のＰＲＰ量と同様のＰＢＳ溶液とし、これを固定化血小板懸濁液とした。
【０１８３】
（２）ヒト血清からのフォンビルブランド因子の精製
ヒト血清からのフォンビルブランド因子の精製は、Ｈ．Ｒ．Ｇｒａｌｎｉｃｋら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，６２，４９６（１９７８））の方法にしたがって行った。
【０１８４】
（３）フォンビルブランド因子の125Ｉラベル化
125Ｉラベル化を行うチューブは、予めＩｏｄｏｇｅｎ（Ｐｉｅａｒｃｅ社製、０．５ｍｇ／ｍｌ）のジクロロメタン溶液１．５ｍｌを加えた後、窒素気流下で溶媒を除去し、Ｉｏｄｇｅｎの固相化を行った。ゲル濾過により得た高分子量フォンビルブランド因子（０．１９ｍｇ／１．５ｍｌ）を反応チューブに入れ、Ｎａ125Ｉ、１８．５Ｍｂｑを加えて室温で２分間反応させた後、あらかじめＢＳＡでブロッキングし洗浄したＰＤ１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラムにアプライし、ＴＢＳで溶出を行った。溶出液は０．５ｍｌずつフラクション分取し、各フラクションの125Ｉ比活性をガンマカウンターＰａｃｋａｒｄ Ｍｕｌｔｉ Ｐｒｉａｓ ４を用いて測定した。125Ｉ−フォンビルブランド因子を多く含むフラクションを集め、数本に分割した後、使用まで−８０℃で保存した。
【０１８５】
（４）固定化血小板に対する125Ｉ−フォンビルブランド因子の結合に対するＫ１７４２７Ａ、Ｃ、Ｄの阻害活性の測定
アッセイを行う９６ｗｅｌｌフィルタープレート、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＨＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、０．４５μＭ）は、予め１％ＢＳＡ／ＴＢＳ（１００μｌ）を各ウェルに加え数時間静置することによりフィルターのブロッキングを行った。前述の固定化血小板懸濁液をＴＢＳで１０倍に希釈した懸濁液２０μｌ、被験サンプルを５μｌ加え、さらに０．８μｇ／ｍｌのボトロセチン、あるいは２．４ｍｇ／ｍｌのリストセチンを含む125Ｉ−フォンビルブランド因子溶液（約８００，０００ｃｐｍ）２５μｌを加えて、３０分静置した。吸引によりウェル中の溶液を濾過した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（１００μｌ）を加え、さらに吸引することにより洗浄を行った。
【０１８６】
ガンマカウンターを用いた測定は以下のように行った。
【０１８７】
上記洗浄後の９６ウェルフィルタープレートからパンチ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、型番ＭＡＰＫ ８９６ ＯＢ）を用いてフィルターを離脱し、６ｍｌ容ポリスチレンチュー
ブに分注して、Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｕｌｔｉ Ｐｒｉａｓ４を用いて125Ｉの放射線量を測定した。Ｋ１７４２７Ａ、Ｃ、Ｄの阻害活性を図１１に示した。
【０１８８】
上記に示した＜１＞、＜２＞の結果より、Ｋ１７４２７Ａ、Ｃ、ＤによるグリコプロテインＩｂとフォンビルブランド因子の結合阻害活性は、通常広く用いられている＜２＞の方法より、本発明である＜１＞の方法（実施例４の方法）でより感度良く検出することが可能であった。
【０１８９】
〔実施例１３〕
Ｋ１７４２７Ａの血小板凝集に対する阻害活性
１８Ｇの注射針を用いて採血した健常人ボランティアの血液５０ｍｌに、１／１０容になるように３．８％クエン酸ナトリウムを加え、５０ｍｌディスポーザブルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ ２０９６）に二分した後、冷却遠心機（ＴＯＭＹ社製）を用いて、９００ｒｐｍ、１５分、室温で遠心分離を行い、上清を多血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ； ＰＲＰ）として回収した。さらに、下層は１５００ｒｐｍ、１０分、室温にて遠心分離し、その上清を貧血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｐｏｏｒ ｐｌａｓｍａ； ＰＰＰ）として回収した。上記のように調製したＰＲＰを用い、測定機としてＨｅｍａｔｒａｃｅｒ ８０１（二光バイオサイエンス社製）を用いて被験サンプルの血小板凝集阻害活性を測定した。予め被験サンプル（２．５−５μｌ）を入れた測定用の専用キュベットに１００μｌのＰＲＰを加えて測定器にセットし、２分間の撹拌の後（３７℃）、１０倍濃度の凝集物質溶液を添加し、透過光の変化を測定した。凝集物質添加前のＰＲＰの透過光を０％、ＰＰＰの透過光を凝集１００％とし、阻害物質による凝集阻害率を、下記式によって数値化した。
凝集阻害率＝
１００−（阻害物質添加した際の凝集率−凝集物質添加直後の凝集率）／（コントロールの凝集率−凝集物質添加直後の凝集率）×１００
【０１９０】
凝集惹起物質としては硫酸リストセチン（Ｓｉｇｍａ社製、終濃度１．２ｍｇ／ｍｌ）、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）（エムシーメディカル社製、終濃度１０μＭ）、コラーゲン（エムシーメディカル社製、終濃度１０μｇ／ｍｌ）を用いた。
【０１９１】
Ｋ１７４２７Ａのそれぞれの凝集惹起物質による凝集に対する阻害活性を図１２に示した。また、上記の通り計算した各濃度における、各凝集惹起物質による血小板凝集に対する凝集阻害率を表６に示した。
【表６】
2008224684.tif 000009
【０１９２】
Ｋ１７４２７Ａは、５００μＭ以上の濃度においてリストセチンによる凝集を完全に阻害したが、１ｍＭにおいてもＡＤＰ、コラーゲンによる凝集を実質的に阻害しなかった。また、Ｋ１７４２７Ｂ、Ｃ、Ｄの血小板凝集に対する阻害活性は測定していないが、非常に類似の構造であること、実施例１２に示したとおりグリコプロテインＩｂとフォンビ
ルブランド因子の結合を阻害することから、同様にリストセチン凝集のみを特異的に阻害することが容易に推定される。
【産業上の利用可能性】
【０１９３】
本発明により、グリコプロテインＩｂとフォンビルブランド因子との結合又はその阻害を簡便に検出することができる。本発明の方法により、グリコカリシンの簡便かつ定量性に優れた定量法、およびフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合阻害物質の簡便かつ操作性に優れた測定法が提供される。
【０１９４】
フォンビルブランド因子をボトロセチン等の結合惹起物質の存在下で固定化することにより、液相にボトロセチンあるいはリストセチンなどの結合惹起物質を添加することなく、簡便に再現性よくフォンビルブランド因子とグリコプロテインＩｂの結合を観察することができる。
【０１９５】
また、本発明のキメラ蛋白質の利用により、グリコカリシン等の結合阻害物質を検出または定量する際、モノクローナル抗体の作製や入手を必要としない。
【０１９６】
また本発明はグリコプロテインＩｂの部分蛋白質をイムノグロブリン分子のＦｃ部分と結合させたキメラ分子（キメラ蛋白質）の動物細胞を用いた製造法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１】ＧＰＩｂ−ｍＩｇＧ１Ｆｃ発現系の構築の概要を示す図である。
【図２】ＧＰＩｂ−ｍＩｇＧ２ａＦｃ発現系の構築の概要を示す図である。
【図３】ボトロセチンの量に対する固定化したフォンビルブランド因子とキメラ蛋白質の結合量（ＥＬＩＳＡ法）を示す図である。
【図４】フォンビルブランド因子とキメラ蛋白質の結合に対する阻害物質の活性（ＥＬＩＳＡ法）を示す図である。
【図５】フォンビルブランド因子とキメラ蛋白質の結合に対する阻害物質の活性（Ｅｕラベル法）を示す図である。
【図６】ヒト血漿中のグリコカリシンの定量（ＥＬＩＳＡ法）の一例を示す図である。
【図７】ヒト血漿中のグリコカリシンの定量（Ｅｕラベル法）の一例を示す図である。
【図８】フォンビルブランド因子とキメラ蛋白質の結合に対する阻害物質の活性（液層にボトロセチンを存在させる方法）を示す図である。
【図９】フォンビルブランド因子とキメラ蛋白質の結合に対する阻害物質の活性（キメラ蛋白質を固定化する方法）を示す図である。
【図１０】フォンビルブランド因子とキメラ蛋白質の結合に対する阻害物質Ｋ１７４２７Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの活性（Ｅｕラベル法）を示す図である。
【図１１】フォンビルブランド因子とキメラ蛋白質の結合に対する阻害物質Ｋ１７４２７Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの活性（125ヨードラベル法）を示す図である。
【図１２】Ｋ１７４２７Ａ物質の血小板リストセチン惹起凝集、およびＡＤＰ、コラーゲン惹起凝集に対する阻害活性を示す図である。
【図１】
2008224684.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008224684.tif 000016
【図８】
2008224684.tif 000017
【図９】
2008224684.tif 000018
【図１０】
2008224684.tif 000019
【図１１】
2008224684.tif 000020
【図１２】
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【配列表】
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