(57)【要約】【課題】  生体内でのＩＬ−１１の産生を促進する物質（インターロイキン−１１産生促進剤）であって、安全性が高く、長期連用することが可能であって、保存性に優れた物質を提供すること。【解決手段】  ラクトフェリンを有効成分として含有するインターロイキン−１１産生促進剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリンを有効成分として含有するインターロイキン−１１産生促進剤。
【請求項２】
ラクトフェリンを有効成分として含有する、インターロイキン−１１産生促進のための食品添加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトフェリンを有効成分とするインターロイキン−１１産生促進剤に関する。更に詳しくは、肝機能保護、血小板造血促進、神経細胞の分化促進、破骨細胞の生成促進とその機能を介した骨代謝の改善等に効果を有するインターロイキン−１１産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト・インターロイキン−１１前駆体は１９９のアミノ酸から成り、２１のシグナルペプチドが切断されて、１７８アミノ酸からなる成熟型インターロイキン−１１が分泌される。インターロイキン−１１（以下、ＩＬ−１１と略記することがある。）は間葉系由来の多様な細胞に発現が認められ、fibroblast、keratinocyte、chondrocyte、trophoblast、synoviocyte、骨髄stroma細胞、osteoblastなどで発現し、発現は炎症性サイトカインやホルモンによって惹起される。
【０００３】
インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）には、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化抑制、肝細胞からの急性期蛋白の産生増強、破骨細胞の生成促進、神経細胞の分化促進、精子形成促進等の多様な生物活性が存在する。また、ＩＬ−１１には様々な抗炎症作用が知られ、敗血症抑制、ＬＰＬ活性抑制、血管内皮細胞のアポトーシス抑制、肺粘膜・消化管粘膜保護作用、肝障害防護効果、関節結合組織分解防御作用等が知られている（非特許文献１）。
【０００４】
このようなインターロイキン−１１による免疫系に対する作用や抗炎症作用、造血作用を利用した予防・治療剤が開示されている（特許文献１〜４）。
【０００５】
生理活性蛋白質であるインターロイキン−１１は、組換え遺伝子操作法により生産され、製剤が開発されて医療現場に提供され始めている。しかしながら、特許文献５に開示されているように、ＩＬ−１１は、水溶液中において中性付近のｐＨ領域で比較的安定であるものの、温度に依存して加水分解するため液状製剤では実用上要求される期間の長期保存が困難であり、実際上、凍結乾燥製剤とせざるを得ない状況であった。凍結乾燥製剤とするために、ＩＬ−１１溶液を−３０℃以下まで急速に冷却して過冷却の状態とし、溶液の過冷却を破って凍結させ、その後、乾燥させる一般的な凍結乾燥方法では、再溶解時に一過的に白濁が観察されるという問題点が残されていた。
【０００６】
生理活性蛋白質の凍結乾燥製剤は臨床使用に際し、注射用水を用いて再溶解して調製する。その際、異物の混入など、製剤の異常の有無を肉眼で容易に確認できるよう、速やかに再溶解されることが必要である。このために、一過性であっても再溶解時の白濁を生じるようなＩＬ−１１の凍結乾燥製剤は、異物の混入等と紛らわしい外見を一時的に呈するために臨床現場で扱いにくいものとされていた。
【０００７】
ラクトフェリン（lactoferrin：以下、ＬＦと略記することがある。）は、主に母乳中に含まれている分子量約８０キロダルトンの鉄結合性糖蛋白質であり、大腸菌、カンジダ菌、クロストリジウム菌、ブドウ球菌等の有害微生物に対する抗菌作用や、免疫賦活作用、抗腫瘍作用等、様々な作用をもつ乳タンパク質として知られている。ラクトフェリンは乳由来の糖タンパク質であることから、安全性が高く、長期連用することが可能で、それ自体は殆ど無味無臭であり、各種の食品・医薬品・飼料の添加物として、汎用性が高い。
【０００８】
しかしながら、ラクトフェリンのインターロイキン−１１の産生の促進効果は知られていなかった。
【特許文献１】特開平５−１７８７５６号公報
【特許文献２】特開平８−１２７５３９号公報
【特許文献３】特開平８−１７６００８号公報
【特許文献４】特開平８−１７６００９号公報
【特許文献５】特開２００５−６０３７７号公報
【非特許文献１】バイオセラピー（Biotherapy）、第１５巻、第６号、２００１年、第６９７−７０９頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明者らは、前記のようなＩＬ−１１蛋白質製剤の問題点に鑑み、ＩＬ−１１蛋白質の凍結乾燥製剤を使用するのではなく、生体内で効果的にＩＬ−１１を誘導することによって、ＩＬ−１１が有する生理活性を享受することによってこれら蛋白質製剤としての問題点を回避するという着想を得た。すなわち、本発明の目的は、生体内でのＩＬ−１１の産生を促進する物質（インターロイキン−１１産生促進剤）であって、安全性が高く、長期連用することが可能であって、保存性に優れた物質を提供することにある。
【００１０】
さらに、本発明の目的は、肝機能保護、血小板造血促進、末梢血幹細胞増加促進、神経細胞の分化促進、破骨細胞の生成促進とその機能を介した骨代謝の改善等に効果を有し、治療・予防を目的とした医薬品として有用な、ラクトフェリンを有効成分とするインターロイキン−１１産生促進剤を提供することにもある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、上記のようなインターロイキン−１１産生促進剤を探索する研究を長年に渡って鋭意行ってきた。その結果、乳由来の糖蛋白質であるラクトフェリンに、ＩＬ−１１を誘導する効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
従って、本発明は、次の[１]にある。
[１]  ラクトフェリンを有効成分として含有するインターロイキン−１１産生促進剤。
【００１３】
また、本発明は、次の[２]〜[９]にもある。
[２]  有効成分としてのラクトフェリン、及び薬学的に許容される担体を含有してなる、インターロイキン−１１産生促進剤。
[３]  ラクトフェリンを有効成分として含有する、インターロイキン−１１産生促進のための飲食品。
[４]  飲食品が健康食品、機能性食品、特別用途食品、栄養機能食品、又は特定保健用食品の形態である[３]に記載の飲食品。
[５]  インターロイキン−１１産生促進剤を製造するためのラクトフェリンの使用（Ｕｓｅ）。
[６]  インターロイキン−１１産生促進のための飲食品を製造するためのラクトフェリンの使用（Ｕｓｅ）。
[７]  ラクトフェリンを有効成分として含有する、インターロイキン−１１産生促進のための食品添加剤。
[８]  ラクトフェリンを有効成分として含有する、インターロイキン−１１産生促進のための飼料。
[９]  有効成分としてのラクトフェリン、及び薬学的に許容される担体を含有してなるインターロイキン−１１産生促進剤を投与することにより、ほ乳類のインターロイキン−１１産生促進を行う方法（Ｍｅｔｈｏｄ）。
【００１４】
また、本発明に係るインターロイキン−１１産生促進剤は、特に肝機能改善、肝機能保護、骨密度維持、骨密度増加、骨質量維持、又は骨質量増加の作用を好適に発揮するものである。従って、本発明は、ラクトフェリンを有効成分として含有する、肝機能改善剤、肝機能保護剤、骨密度維持剤、骨密度増加剤、骨質量維持剤、又は骨質量増加剤にもある。また、本発明は、有効成分としてのラクトフェリン、及び薬学的に許容される担体を含有してなる、肝機能改善剤、肝機能保護剤、骨密度維持剤、骨密度増加剤、骨質量維持剤、又は骨質量増加剤にもある。さらに、本発明は、これらの剤を製造するためのラクトフェリンの使用（Ｕｓｅ）にもある。
【００１５】
さらに、本発明は、ラクトフェリンを有効成分として含有する、肝機能改善、肝機能保護、骨密度維持、骨密度増加、骨質量維持、又は骨質量増加のための飲食品にもある。また、本発明は、これらの飲食品を製造するためのラクトフェリンの使用（Ｕｓｅ）にもある。
【００１６】
また、本発明は、ラクトフェリンを有効成分として含有する、肝機能改善、肝機能保護、骨密度維持、骨密度増加、骨質量維持、又は骨質量増加のための食品添加剤にもある。
【００１７】
また、本発明は、ラクトフェリンを有効成分として含有する、肝機能改善、肝機能保護、骨密度維持、骨密度増加、骨質量維持、又は骨質量増加のための飼料にもある。
【００１８】
また、本発明は、有効成分としてのラクトフェリン、及び薬学的に許容される担体を含有してなる、肝機能改善剤、肝機能保護剤、骨密度維持剤、骨密度増加剤、骨質量維持剤、又は骨質量増加剤を投与することにより、ほ乳類の肝機能改善、肝機能保護、骨密度維持、骨密度増加、骨質量維持、又は骨質量増加を行う方法（Ｍｅｔｈｏｄ）にもある。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、新規なインターロイキン−１１産生促進剤を提供する。本発明のインターロイキン−１１産生促進剤は、生体内で効果的にインターロイキン−１１を誘導することが可能であることから、肝機能保護、血小板造血促進、末梢血幹細胞増加促進、神経細胞の分化促進、破骨細胞の生成促進とその機能を介した骨代謝の改善等を目的とした医薬品として有用である。
【００２０】
また、本発明に係るインターロイキン−１１産生促進剤は、安全性が高く、長期連用することが可能であって、保存性に優れているために、臨床現場においても取り扱い容易なものである。
【００２１】
本発明に係るインターロイキン−１１産生促進剤は、ラクトフェリンを有効成分として含有してなるものである。このために、本発明に係るインターロイキン−１１産生促進剤は、乳に由来するものであるために、ヒトおよび動物に対する安全性が高く、副作用の心配なく長期間に渡って継続して日常的に摂取することができる。さらに、本発明の有効成分であるラクトフェリンは、耐熱性があり、水溶性であり、水溶液中でも安定であるために、本発明に係るインターロイキン−１１産生促進剤は、薬剤や飲食品として安定である。さらに、本発明に係るインターロイキン−１１産生促進剤は、経口投与が可能であるために、簡便で汎用性が高い。さらに、本発明に係るインターロイキン−１１産生促進剤は、生体材料として比較的安価な乳又はホエー等の原料から安定して大量に製造することができる。さらに、本発明の有効成分であるラクトフェリンは、もともと無味無臭であるために、嗜好品とともに好適に経口摂取可能なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の好ましい実施形態について以下に詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。なお、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００２３】
本発明は、ラクトフェリンを有効成分とするインターロイキン−１１産生促進剤である。
【００２４】
本発明のインターロイキン−１１産生促進剤は、肝機能保護、血小板造血促進、末梢血幹細胞増加促進、神経細胞の分化促進、破骨細胞の生成促進とその機能を介した骨代謝の改善等に対して優れた効果を発揮することから、当該薬効を期待する医薬品として適用することが可能である。
【００２５】
本発明に使用するラクトフェリンは、市販のラクトフェリンや、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等。）の初乳、移行乳、常乳、末期乳、又はこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等を原料とし、例えばイオン交換クロマトグラフィー等の常法により、前記原料から分離して得られるラクトフェリンを用いることができる。中でも、工業的規模で製造されている市販のラクトフェリン（例えば、森永乳業社製）を使用することが好適である。更に、遺伝子工学的手法により、微生物、動物細胞、トランスジェニック動物等で生産したラクトフェリンを使用することも可能である。
【００２６】
本発明に使用されるラクトフェリンは、ヒトのための医薬組成物、飲食品に使用する場合には、哺乳動物のなかでも、その乳が伝統的に飲食用に用いられている牛、羊、山羊などの乳に由来するラクトフェリンが好ましく、特に牛乳由来のものが好ましい。これらは歴史的な年月の間、ヒトの飲食に使用されていたために、ヒトに対する安全性が極めて高い水準で担保されているからである。また、牛乳由来のホエーは、乳製品製造の副産物として安定して大量に得ることができるという利点があるために、本発明に使用するラクトフェリンの原料として、特に好適である
【００２７】
ここで、ラクトフェリンの調製（乳等の原料からのラクトフェリンの分離、精製）方法の一例を以下に示す。まず、イオン交換体（たとえばＣＭ−セファロースＦＦ（商品名、アマシャムファルマシア社製））をカラムに充填し、塩酸を通液し、水洗してイオン交換体を平衡化する。続いて、４℃に冷却したｐＨ６．９の脱脂牛乳をカラムに通液し、透過液を回収し、再度同様にカラムに通液する。次いで、蒸留水をカラムに通液し、食塩水を通液し、イオン交換体に吸着した塩基性蛋白質の溶出液を得る。この溶出液に飽和度８０％の硫酸アンモニウムを添加し、タンパク質を沈殿させ、遠心分離して沈殿物を回収する。回収した沈殿物を、飽和度８０％の硫酸アンモニウム溶液で洗浄し、脱イオン水を添加して溶解し、得られた溶液を限外濾過膜モジュール（たとえばＳＬＰ００５３（商品名、旭化成社製））を用いて脱塩し、凍結乾燥して、粉末状ウシラクトフェリンを得る。このようにして、純度が９５質量％以上のウシラクトフェリンが得られる。なお、本明細書におけるラクトフェリンの純度は液体クロマトグラフ法により測定して得られる値とする。
【００２８】
本発明のインターロイキン−１１産生促進剤の効果において、ラクトフェリン中の金属含有量は特に限定されず、本発明では、ラクトフェリンを塩酸やクエン酸等により脱鉄したアポ型ラクトフェリン；該アポ型ラクトフェリンを、鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせて得られる飽和度１００％の状態の金属飽和ラクトフェリン；及び１００％未満の各種飽和度で金属が結合している状態の金属部分飽和ラクトフェリンからなる群から選ばれる、いずれか１種又は複数種の混合物を用いることができる。
【００２９】
本発明に使用するラクトフェリンの好ましい形態としては、ヒト由来のラクトフェリン、またはウシ由来のラクトフェリンが例示され、１種を単独で使用することも、複数種を混合して用いることも可能である。
【００３０】
これらタンパク質においては、種、属、個体等の違いによって、１又は複数の位置での１又は複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異が当然存在し、このような変異を有する遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸においても変異が生じている場合がある。本発明に用いることができるラクトフェリンには、インターロイキン−１１産生促進活性が損なわれない範囲において、このような変異を含むものも含有される。
【００３１】
本発明における、ラクトフェリンに基づくインターロイキン−１１産生促進効果は、ウェスタンブロッティング、ノーザンブロッティング、またはＥＬＩＳＡ等の分子生物学的または免疫学的評価法により、インターロイキン−１１の産生量を測定することができる。なお、該測定方法については、本発明の試験例又は実施例において、詳細に記載する。
【００３２】
本発明のインターロイキン−１１産生促進剤はラクトフェリン、若しくはこれらを製剤学的に許容される製剤担体と組合わせて、経口的、又は非経口的にヒトを含む哺乳動物に投与することができる。本発明の医薬製剤の投与単位形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、点鼻剤等を例示できる。製剤化にあたっては製剤担体として通常の薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、流動性促進剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、香料、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。これらを用いて常法に従ってインターロイキン−１１産生促進剤の製剤を製造することができる。
【００３３】
結合剤として、デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が例示される。
【００３４】
崩壊剤としては、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が例示される。
【００３５】
界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０等が例示される。
【００３６】
滑沢剤としては、タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等が例示される。
【００３７】
流動性促進剤としては、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が例示される。
【００３８】
本発明の製剤中に含まれるラクトフェリンの量は特に限定されず適宜選択すればよいが、例えばいずれも通常製剤中に０．０００１〜７５質量％、好ましくは０．００１〜５０質量％とするのがよい。
【００３９】
本発明の製剤の投与方法は特に限定されず、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて決定される。本発明の製剤の有効成分の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件等により適宜選択される。通常有効成分としてのラクトフェリンの量は、０．０１〜２０００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．１〜１５００ｍｇ／ｋｇ／日、特に好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる量を目安とするのが良く、１日１回又は複数回に分けて投与することができる。
【００４０】
本発明のインターロイキン−１１産生促進剤は、肝機能保護、血小板造血促進、末梢血幹細胞増加促進、神経細胞の分化促進、破骨細胞の生成促進等に対して顕著な効果を示すことから、インターロイキン−１１が関与する疾患、例えば血小板減少症、クローン病、慢性関節リウマチ、肝炎、骨粗鬆症等に対する治療・予防用の医薬として有用である。本発明のインターロイキン−１１産生促進剤は、単独で使用しても良いが、公知の前記疾患の予防・治療剤と併用して使用することも可能である。併用することによって、前記疾患の予防・治療効果を高めることができる。併用する前記疾患の予防・治療剤は、本発明の組成物中に有効成分として含有させても良いし、本発明の組成物中には含有させずに別個の薬剤として組合わせて製品化し、使用時に組み合わせても良い。
【００４１】
また、本発明のインターロイキン−１１産生促進剤は、有効成分であるラクトフェリンを、食品又は飲料に対して、添加剤として添加して飲食品組成物の形態で製造することができ、経口的に摂取することが可能である。
【００４２】
このような飲食品組成物（インターロイキン−１１産生促進のための飲食品）の形態としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の氷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；惣菜、パン類；経腸栄養食品、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料；特定保健用食品、健康補助食品等の機能性食品等が例示される。
【００４３】
機能性食品の形態としては、顆粒状、タブレット状又は液状のサプリメントであることが、有効成分の摂取量を把握し易いという点で好ましい。
【００４４】
本発明の飲食品組成物において、ラクトフェリンを添加する量は、飲食品組成物の形態によって適宜設定されるが、通常の食品又は飲料中０．０００１〜７５質量％、好ましくは０．００１〜５０質量％となるように添加すればよい。
【００４５】
本発明のインターロイキン−１１産生促進のための飲食品には、有効成分である前記ラクトフェリンの他に、例えば、ラクチュロース、マルチトール、及びラクチトール等のアルコール吸収抑制性の糖類、およびそれ以外の糖類、例えばデキストリン、デンプン等；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等を含有させることができる。
【００４６】
本発明のインターロイキン−１１産生促進のための飲食品は、インターロイキン−１１産生促進用といった用途が表示された飲食品、例えば、「インターロイキン−１１産生促進用と表示された、ラクトフェリンを有効成分として含有する飲食品」として販売することが好ましい。
【００４７】
前記「表示」の行為（表示行為）には、需要者に対して上記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、上記用途を想起・類推させうるような表示であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、すべて本発明の「表示」の行為に該当する。しかしながら、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により表示することが好ましい。具体的には、本発明の飲食品に係る商品又は商品の包装に上記用途を記載する行為を表示行為として挙げることができ、さらに商品又は商品の包装に上記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為、等を例示できる。
【００４８】
一方、表示される内容（表示内容）としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示）であることが好ましく、そのような表示内容を、包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。
【００４９】
また、例えば、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、医薬用部外品等としての表示を例示することができる。特に、厚生労働省によって認可される表示、例えば、特定保健用食品制度、これに類似する制度にて認可される表示を例示できる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク低減表示等を例示することができ、詳細にいえば、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）、及びこれに類する表示が、典型的な例として列挙することが可能である。
【００５０】
以上のような用途の表示を行うために使用する文言は、「インターロイキン−１１産生促進」という文言に限られるものでなく、それ以外の文言であっても、上記のインターロイキン−１１産生促進の効果を表現する文言であれば、本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。
【００５１】
本発明のインターロイキン−１１産生促進のための食品添加剤は、各種食品添加剤を製造する際に、ラクトフェリンを含有させることによって製造することができる。ラクトフェリンとしては、上述したインターロイキン−１１産生促進剤等の製造に用いられるラクトフェリンと同様のものを用いることができる。
【００５２】
食品添加剤には、有効成分としてのラクトフェリンの他に、通常使用される賦形剤等の添加剤を所望により含有させることができる。また、食品添加剤として公知の他の成分を所望により含有させることもできる。食品添加剤の形態には特に制限はなく、粉末、顆粒、タブレット、液体等、食品添加剤の通常の形態をとることができる。
【００５３】
本発明のインターロイキン−１１産生促進のための食品添加剤は、インターロイキン−１１産生促進のための飲食品を製造するために添加することができる。従って、有効成分としてのラクトフェリンを含み、且つインターロイキン−１１産生促進のための飲食品を製造するために添加することができるものであれば、本発明のインターロイキン−１１産生促進のための食品添加剤の範囲に含有されるものである。
【００５４】
食品添加剤に関する表示の行為については、飲食品について上述した通りである。以上のような用途の表示を行うために使用する文言は、「インターロイキン−１１産生促進用」という文言に限られるものでなく、それ以外の文言であっても、上記のインターロイキン−１１産生促進の効果を表現する文言であれば、本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。
【００５５】
さらに、本発明のインターロイキン−１１産生促進剤は、飼料にラクトフェリンを添加して飼料組成物の形態で製造することができ、一般的な哺乳動物や家畜類、養魚類、愛玩動物に経口的に投与することが可能である。このような飼料組成物（インターロイキン−１１産生促進のための飼料）としては、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が例示される。飼料組成物の形態には特に制限はなく、それぞれの飼料の通常の形態とすることができるが、顆粒状、タブレット状又は液状のサプリメントであることが、有効成分の摂取量を把握し易いという点で好ましい。
【００５６】
本発明の飼料には、本発明にかかる有効成分の他に、例えば、穀類（例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、マイロ等）；粕類（例えば、大豆油粕、ナタネ油粕、ヤシ油粕、アマニ油粕等の植物性油粕類、及びコーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類）；糠類（例えば、フスマ、麦糠、米糠、脱脂米糠等）；動物性飼料類（例えば、魚粉、脱脂粉乳、ホエー、イエローグリース、タロー等）；酵母類（例えば、トラル酵母、ビール酵母等）；鉱物質飼料（例えば、第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等）；油脂類；単体アミノ酸；糖類等を含有させて飼料組成物として製造することができる。
【００５７】
本発明の飼料組成物において、ラクトフェリンを添加する量は、飼料組成物の形態によって適宜設定されるが、通常の飼料中０．０００１〜７５質量％、好ましくは０．００１〜５０質量％となるように添加すればよい。
【００５８】
[実施例]
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５９】
ウシ・ラクトフェリン（森永乳業社製）１５０ｇ、ラクチュロース粉末（森永乳業社製）１００ｇ、マルツデキストリン（松谷化学工業社製）６３５ｇ、脱脂粉乳（森永乳業社製）８５ｇ、ステビア甘味料（三栄源エフ・エフ・アイ社製）１ｇ、ヨーグルト・フレーバー（三栄源エフ・エフ・アイ社製）５ｇ、グリセリン脂肪酸エステル製剤（理研ビタミン社製）２４ｇの各粉末を添加して均一に混合し、打錠機（畑鉄鋼所社製）を使用して、錠剤１錠当り０．５ｇとし、１２錠／分打錠速度、９．８ＫＰａの圧力で前記混合粉末を連続的に打錠し、インターロイキン−１１産生促進効果を有し、末梢血幹細胞増加や神経細胞の分化促進に有用な薬剤であるラクトフェリンを含有するタブレット１８００錠（約９００ｇ）を製造した。
【実施例２】
【００６０】
ホエー蛋白加水分解物（森永乳業社製）１０．８ｋｇ、デキストリン（昭和産業社製）３６ｋｇ、および少量の水溶性ビタミンとミネラルを水２００ｋｇに溶解して水相をタンク内に調製した。これとは別に、大豆サラダ油（太陽油脂社製）３ｋｇ、パーム油（太陽油脂社製）８．５ｋｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）２．５ｋｇ、レシチン（味の素社製）０．２ｋｇ、脂肪酸モノグリセリド（花王社製）０．２ｋｇ、及び少量の脂溶性ビタミンを混合溶解して油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、７０℃に加温し、更に、ホモゲナイザーにより１４．７ＭＰａの圧力で均質化した。次いで、９０℃で１０分間殺菌した後、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約５９ｋｇを調製した。この中間製品粉末５０ｋｇに、蔗糖（ホクレン社製）６．８ｋｇ、アミノ酸混合粉末（味の素社製）１６７ｇ、およびウシ・ラクトフェリン（森永乳業社製）６０ｇを添加し、均一に混合して、インターロイキン−１１産生促進効果を有し、肝機能保護に有用な薬剤であるラクトフェリンを含有する経腸栄養食粉末約５６ｋｇを製造した。
【００６１】
[試験例]
次に試験例を示して本発明を詳細に説明する。
【００６２】
［試験例１］
本試験は、薬物誘導肝障害モデルにおける、ラクトフェリン（以下、ＬＦと表記することがある）経口投与による肝臓でのＩＬ−１１産生促進効果と、それに起因する肝障害の改善効果を調べるために行った。
【００６３】
（１）試験方法
雄６週齢のＩＣＲマウス（日本チャールスリバー）を１週間予備飼育した。Ｄ−ガラクトサミン塩酸塩（和光純薬工業社製）を生理食塩水に溶解して５０ｍｇ／ｍｌの溶液を作成し、５００ｍｇ／ｋｇ体重に相当する溶液を腹腔内に投与した。Ｄ−ガラクトサミン溶液投与の当日から１５日間、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン：シグマ社製）、およびラクトフェリン（ＬＦと略記する。森永乳業社製）を蒸留水に溶解して３０ｍｇ／ｍｌの溶液を作成し、３００ｍｇ／ｋｇ体重の容量を経口ゾンデで胃内投与した。なお、腹腔内投与、胃内投与をともに行わない群を未投与群とした。最初のガラクトサミン溶液投与から１４日目に再度同量のガラクトサミン溶液を腹腔内投与（２回目投与）した。
【００６４】
これらとは別に、ラクトフェリンの最小有効投与量を検討するために、ＬＦ：３ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製し、上記の方法に従い、それぞれ３０ｍｇ／ｋｇ体重、１００ｍｇ／ｋｇ体重、３００ｍｇ／ｋｇ体重の容量で効果を比較検討した。
【００６５】
ＢＳＡおよびラクトフェリンの最終経口投与の２４時間後、クロロホルム麻酔下で心臓採血および肝臓採取を行った。
【００６６】
肝臓からのＲＮＡの抽出はRNA-Bee（カタログ番号：CS-105B。テル−テスト社製）を用いて行い、抽出したＲＮＡからのｍＲＮＡの精製はTurbo-DNA Free（カタログ番号：1907。アンビオン社製）を用いて行った。得られたｍＲＮＡ からExScript RT reagent kit（カタログ番号：RR035A。宝酒造社製）を用いてｃＤＮＡを作成し、SYBR Premix Ex Taq（カタログ番号：RR041A。宝酒造社製）、およびマウスインタローロイキン−１１プライマーを用いてマウスインターロイキン−１１に対してリアルタイムＰＣＲを行い、マウスＩＬ−１１のｍＲＮＡ発現量を定量した。なお、標準試料として、マウスＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量を定量し、この値でマウスＩＬ−１１のｍＲＮＡ発現量の値を割ったものを相対的発現量として比較に用いた。未投与群の平均値を１として、ＢＳＡおよびラクトフェリン投与群の発現量を表した。
【００６７】
肝臓からの蛋白質抽出は、Mammalian cell lysis kit（カタログ番号：MCL-1。シグマ社製）を用いて行った。蛋白質の定量はBCA Protein Assay Reagent (カタログ番号：#23227。ピアス社製）を用いて行った。調整したサンプル５０ｍｇをNuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel（カタログ番号：NP0321BOX。インビトロジェン社製）を用いて電気泳動し、蛋白質転写用メンブレンHybond-P（カタログ番号：RPN2020F。アマシャム社製）に転写した後、抗マウスＩＬ−１１抗体（カタログ番号：AF-418-NA。R&D systems社製）を用いてイムノブロットを行い、ECL Plus（カタログ番号：RPN2132。アマシャム社製）およびHyperfilm ECL（カタログ番号：RPN2103K。アマシャム社製）を用いてマウスＩＬ−１１を検出した。デンシトメーター（機種番号：GS-700。バイオラッド社製）および解析ソフトQuantity One（Ver.4.41。バイオラッド社製）を用いてフイルム上で検出したＩＬ−１１を定量した。
【００６８】
心臓採血サンプルから血清を採取し、トランスアミナーゼＣＩＩテストワコー（カタログ番号：431-30901。和光純薬工業社製）を用いてＧＯＴ（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ）、ＧＰＴ（グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）濃度をそれぞれ測定した。
【００６９】
（２）試験結果
本試験の結果を図１〜３に示す。
【００７０】
図１は、肝臓中におけるＩＬ−１１のｍＲＮＡの発現量を、未投与群に対する相対発現量として示している。その結果、各群のｍＲＮＡ相対発現量は、未投与群では、１．００±０．９４、ＢＳＡ投与群では、０．４０±０．２８であったのに対し、ＬＦ（ラクトフェリン）投与群では、１．４１±２．７４（ｔ検定の結果、ＢＳＡ群との有意差はｐ＝０．０５８５であった。）であった。このことから、ラクトフェリンの投与により、ＩＬ−１１のｍＲＮＡ発現量が増加していることが確認された。
【００７１】
また、図２は、肝臓中におけるＩＬ−１１蛋白質の発現量（ｎｇ／５０μｇ肝臓組織中の蛋白質）を示している。その結果、各群のＩＬ−１１蛋白質の発現量は、未投与群（図２においてｎｏｎ  ｔｒｅａｔと表記された群）では、０．５５±０．５２（ｎｇ／５０μｇ）、ＢＳＡ投与群では、０．９９±１．００（ｎｇ／５０μｇ）、であったのに対し、ＬＦ投与群では、１．６６±１．０２（ｎｇ／５０μｇ）であり、ｔ検定の結果、未投与群に対してＩＬ−１１蛋白質の発現量は有意に増加していることが確認された。このことから、ラクトフェリンの投与によってＩＬ−１１蛋白質の発現量が増加することが確認された。
【００７２】
さらに、図３は、ラクトフェリン経口投与によるＤ−ガラクトサミン誘導肝障害に対する抑制効果を示している。図３の左図（ｓｅｒｕｍ  ＧＯＴ）は、Ｄ−ガラクトサミン誘導肝障害に対する血清中のＧＯＴ量（Ｕ／ｍｌ）を指標とした抑制効果を示している。その結果、各群のＧＯＴ量は、未投与群では、７７．９７±１３．８３、であったのに対し、ガラクトサミン２回目投与後（図３の左図のＧａｌＮ×２）の、ＢＳＡ投与群では、１６４．２２±１０５．５５、ＬＦ投与群では、７８．４１±２７．６３であり、ｔ検定の結果、ガラクトサミン２回目投与後のＢＳＡ投与群とＬＦ投与群の間に有意差が確認された。このことから、ＩＬ−１１産生促進作用を有するラクトフェリン（ＬＦ）の投与によって肝機能が改善（肝機能保護）されることが確認された。
【００７３】
また、図３の右図（ｓｅｒｕｍ  ＧＰＴ）は、Ｄ−ガラクトサミン誘導肝障害に対する血清中のＧＰＴ量（Ｕ／ｍｌ）を指標とした抑制効果を示している。その結果、各群のＧＰＴ量は、未投与群では、６５．１０±２４．９４、であったのに対し、ガラクトサミン２回目投与後の、ＢＳＡ投与群では、２４８．６２±２０９．９２、ＬＦ投与群では、７３．１８±３０．３５であり、ｔ検定の結果、ガラクトサミン２回目投与後のＢＳＡ投与群とＬＦ投与群の間に有意差が確認された。このことから、ＩＬ−１１産生促進作用を有するラクトフェリン（ＬＦ）の投与によって肝機能が改善（肝機能保護）されることが確認された。
【００７４】
また、図４は、ラクトフェリンの用量依存的な肝障害抑制効果を、血中ＧＯＴ濃度（図４の上図）と血中ＧＰＴ濃度（図４の下図）の比較によって示している。その結果、血中ＧＯＴ濃度（ｕｎｉｔ／ｍｌ）は、未投与群で６１．３±５．０であったのに対し、ＢＳＡ投与群では１１２．８±３５．５、ＬＦ投与群の３０ｍｇ／ｋｇ体重の投与群（ＬＦ３０）では８９．５±２１．５、１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与群（ＬＦ１００）では６９．４±９．６、３００ｍｇ／ｋｇ体重の投与群（ＬＦ３００）では、５４．３±６．０となり、ｔ検定の結果、ＬＦが１００ｍｇ／ｋｇ体重以上の投与群（ＬＦ１００及びＬＦ３００）でＢＳＡ群との間に有意差が確認された。
【００７５】
さらに血中ＧＰＴ濃度（ｕｎｉｔ／ｍｌ）は未投与群で３４．９±１４．２であったのに対し、ＢＳＡ投与群では６１．３±３２．４、ＬＦ投与群の３０ｍｇ／ｋｇ体重の投与群（ＬＦ３０）では５３．８±３５．１、１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与群（ＬＦ１００）では３４．２±８．５、３００ｍｇ／ｋｇ体重の投与群（ＬＦ３００）では２５．８±５．４となり、ｔ検定の結果、ＬＦが３００ｍｇ／ｋｇ体重の投与群（ＬＦ３００）でＢＳＡ群との間に有意差が確認された。
【００７６】
以上の実験から、ラクトフェリンが、インターロイキン−１１産生促進剤としての作用を有すること、さらに、このインターロイキン−１１産生促進剤としての作用は、肝機能保護及び肝機能改善の効果をもたらしていることがわかった。
【００７７】
［試験例２］
本試験は、老化促進マウスモデル（ＳＡＭＰ６）における、ラクトフェリン経口投与による大腿骨骨髄および小腸上皮組織でのＩＬ−１１産生促進効果と、それらに起因する骨密度増加効果を調べるために行った。
【００７８】
（１）試験方法
遺伝子疾患により老化が促進しており、特に骨密度低下が若年齢から発症する骨粗鬆症モデル（老人性骨粗鬆症モデル）として研究に用いられているＳＡＭＰ６マウス（日本エスエルシーより購入）を、６週齢時より飼育を開始し、５ヶ月齢まで飼育し、その後、該マウスを実験に供した。
【００７９】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：シグマ社製）を生理食塩水で溶解して、濃度を３０ｍｇ／ｍｌに調整し、対照試料とした。また、ラクトフェリン（森永乳業社製）を生理食塩水に溶解し、濃度を１０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌにそれぞれ調整し、それぞれ試験試料とした。
【００８０】
ＢＳＡ投与群：３００ｍｇ／ｋｇ体重、ＬＦ投与群：１００ｍｇ／ｋｇ体重、３００ｍｇ／ｋｇ体重、１０００ｍｇ／ｋｇ体重の用量となるように、各試料をそれぞれＳＡＭＰ６マウスに経口ゾンデで胃内に４週間連日投与し、最終投与（投与終了後）の３日後にクロロホルム麻酔下で大腿骨および小腸上皮組織を採取した。
【００８１】
大腿骨骨髄および小腸上皮組織からのＲＮＡの抽出、およびリアルタイムＰＣＲ法でのＩＬ−１１の測定は前述の試験例１と同様に行った。また、採取した大腿骨の残りの一方をエタノールで固定し、動物用マイクロCT Latheta（アロカ社製）を用いて、骨密度を測定した。
【００８２】
（２）試験結果
本試験の結果を図５〜７に示す。図５は、ＳＡＭＰ６マウスの大腿骨中のＩＬ−１１のｍＲＮＡ発現量を示す。また、図６は、ＳＡＭＰ６マウスの小腸上皮におけるＩＬ−１１のｍＲＮＡ発現量を示す。さらに、図７は、ＳＡＭＰ６マウスの大腿骨平面骨密度を示している。なお、図５、図６における測定値は、ＢＳＡ投与群における測定値の平均を１とした相対発現量で示した。
【００８３】
その結果、図５に示すように、大腿骨中のＩＬ−１１のｍＲＮＡ発現量は、ＢＳＡ（１．００±０．３８）に対し、ＬＦ１００ｍｇ／ｋｇ体重投与群で２４．１０±３１．２４、ＬＦ３００ｍｇ／ｋｇ体重投与群で２１．８０±１６．９５、ＬＦ１０００ｍｇ／ｋｇ体重投与群で９．６２±１３．８２となり、ｔ検定の結果、ＢＳＡ投与群とＬＦ３００ｍｇ／ｋｇ体重投与群の間で、ＩＬ−１１のｍＲＮＡ発現量に有意な増加が確認された。このことから、ラクトフェリンの投与によって、大腿骨中のＩＬ−１１のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００８４】
また、図６に示すように、小腸上皮中のＩＬ−１１のｍＲＮＡ発現量は、ＢＳＡ（１．００±０．５９）に対し、ＬＦ１００ｍｇ／ｋｇ体重投与群で１．１１±０．４９、ＬＦ３００ｍｇ／ｋｇ体重投与群で２．３２±１．８７、ＬＦ１０００ｍｇ／ｋｇ体重投与群で１．３５±０．８４となり、ｔ検定の結果、ＢＳＡ投与群とＬＦ３００ｍｇ／ｋｇ体重投与群の間で、ＩＬ−１１のｍＲＮＡ発現量に有意な増加が確認された。このことから、ラクトフェリンの投与によって、小腸上皮中のＩＬ−１１のｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。
【００８５】
さらに、図７に示すように、ＳＡＭＰ６マウス平面骨密度（ｍｇ／ｃｍ２）は、ＢＳＡ投与群で、７３．５±４．３に対し、ＬＦ１００ｍｇ／ｋｇ体重投与群で８５．６±６．２、ＬＦ３００ｍｇ／ｋｇ体重投与群で８１．７±５．９、ＬＦ１０００ｍｇ／ｋｇ体重投与群で８２．７±６．４となり、ｔ検定の結果、ＢＳＡ投与群といずれのＬＦ投与群の間においても、平面骨密度に有意な増加が確認された。このことから、ＩＬ−１１産生促進作用を有するラクトフェリン（ＬＦ）の投与によって、マウスの骨密度が増加することが確認された。
【００８６】
以上の実験から、ラクトフェリンが、インターロイキン−１１産生促進剤としての作用を有すること、さらに、このインターロイキン−１１産生促進剤としての作用は、骨密度維持及び骨密度増加（骨質量維持及び骨質量増加）の効果をもたらしていることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１はＧａｌＮ肝炎誘導モデルマウスの肝臓ＩＬ−１１ｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図２】図２はＧａｌＮ肝炎誘導モデルマウスの肝臓ＩＬ−１１蛋白質発現量を示す図である。
【図３】図３は肝炎誘導モデルマウスの肝障害抑制効果を示す図である。
【図４】図４は肝炎誘導モデルマウスの用量依存的な肝障害抑制効果を示す図である。
【図５】図５は老人性骨粗鬆症モデルマウスの骨中ＩＬ−１１ｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図６】図６は老人性骨粗鬆症モデルマウスの腸管上皮組織中ＩＬ−１１ｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図７】図７は老人性骨粗鬆症モデルマウスの平面骨密度を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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