(57)【要約】【課題】多発性骨髄腫などの癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して癌の検出方法及び細胞増殖抑制剤を提供すること。【解決手段】検体において１１番染色体ｑ２３領域の遺伝子の増幅を指標として当該検体の腫瘍化を検出及び／又は分類することを含む、癌の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体において１１番染色体ｑ２３領域の遺伝子の増幅を指標として当該検体の腫瘍化を検出及び／又は分類することを含む、癌の検出方法。
【請求項２】
前記遺伝子が、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子のいずれかである、請求項１に記載の癌の検出方法。
【請求項３】
増幅の指標が、正常検体と比較して１．３２倍以上である、請求項１又は２に記載の癌の検出方法。
【請求項４】
検体が、多発性骨髄腫の検体である、請求項１から３の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項５】
癌が多発性骨髄腫である、請求項１から４の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項６】
多発性骨髄腫の検体において、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の増幅を指標として当該検体の腫瘍化を検出及び／又は分類することを含む、多発性骨髄の検出方法。
【請求項７】
遺伝子の増幅を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、遺伝子増幅法、ＲＦＬＰ検出法、塩基配列決定法、またはアレイＣＧＨ法の何れかを用いて検出する、請求項１から６の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項８】
検体において、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子のいずれかの遺伝子の発現の増大を指標として当該検体の腫瘍化を検出及び／又は分類することを含む、癌の検出方法。
【請求項９】
ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を、インビトロで腫瘍細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法。
【請求項１０】
ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子の機能欠失型タンパク質を、インビトロで腫瘍細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法。
【請求項１１】
ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む、細胞増殖抑制剤。
【請求項１２】
ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子の機能欠失型タンパク質を含む、細胞増殖抑制剤。
【請求項１３】
ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を活性化する方法。
【請求項１４】
ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子を含む、細胞増殖活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多発性骨髄腫をその遺伝子型を観察することで初期に診断することを目的としてヒト１１番染色体ｑ２３．１領域のゲノム増幅を検出して癌を検出する方法に関する。また、本発明は、ＰＯＵ  ｄｏｍａｉｎ，ｃｌａｓｓ  ２，ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １（ＰＯＵ２ＡＦ１）遺伝子と多発性骨髄腫との関係についての知見を用いた腫瘍の増殖を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ：ＭＭ）はＢ細胞を起源とする形質細胞の異常増殖を原因とし、治療開始後も平均生存期間は約３年、５年生存率は１０％程度、１０年以上の生存率は約３〜５％前後と報告される長期予後が不良の疾患であるのが現状である。多発性骨髄腫の解説については、非特許文献１に記載されている。癌遺伝子のこの疾患に関する関与は、古くからｃ−ｍｙｃ、Ｂｃｌ−１／２が関与している報告、Ｎ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓの点突然変異、ＩｇＨ遺伝子群の複数遺伝子転座異常などの報告があるが、骨髄腫特有の遺伝子異常は明らかになっていない。これまでの研究により、細胞はその分化と増殖の過程で遺伝子の変化が連鎖的に起こり、その結果、腫瘍化に至ると考えられている。この点から、どのような遺伝子の変化が、多発性骨髄腫を誘導するのかは、未だ明らかではないため多発性骨髄腫の検出方法並びにその分類法（タイピング）に関して遺伝子を用いた検査方法は存在しない状況であった。
【０００３】
【非特許文献１】Ｂｈａｗｎａ  Ｓｉｒｏｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３６３，８７５−８７，２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
多発性骨髄腫の遺伝子レベルでのメカニズムが解明されれば、遺伝子レベルにおける多発性骨髄腫の腫瘍化課程での早期発見やその悪性度の診断を行うことが可能となり、さらに、当該メカニズムに基づく薬剤の選別、開発や治療方法を確立することも可能となるはずである。具体的には、多発性骨髄腫に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して、当該遺伝子を中心とした技術的検討を行うことにより、この課題を解決することができると考えられる。即ち、本発明は、多発性骨髄腫などの癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して癌の検出方法及び細胞増殖抑制剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ＤＮＡマイクロアレイを対象に行うＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＣＧＨ）、すなわちアレイＣＧＨ法は、ゲノムＤＮＡ上で多数の遺伝子増幅並びに欠失に伴う遺伝子異常を解析するための簡便で迅速な、最良の方法である。そして、腫瘍化並びに腫瘍の悪性化に関与するゲノム上の遺伝子異常を解析するためにＣＧＨアレイに搭載する８００種類のＢＡＣ／ＰＡＣ  ＤＮＡを選別する（Ｔａｋａｄａ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９６，１００−１０５，２００５）ことにより、多発性骨髄腫の腫瘍化を促進する癌遺伝子、すなわち、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の同定に成功した。そして、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の増幅、すなわち、ＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質の増加が多発性骨髄腫細胞の増殖を顕著に促進すること、また、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の転写産物を抑制すると多発性骨髄腫細胞の増殖が著しく低下することを見出すことに成功し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明によれば、検体において１１番染色体ｑ２３領域の遺伝子の増幅を指標として当該検体の腫瘍化を検出及び／又は分類することを含む、癌の検出方法が提供される。
【０００７】
好ましくは、前記遺伝子は、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子のいずれかである。
【０００８】
好ましくは、増幅の指標は、正常検体と比較して１．３２倍以上である。
好ましくは、検体は、多発性骨髄腫の検体である。
好ましくは、癌は多発性骨髄腫である。
【０００９】
好ましくは、多発性骨髄腫の検体において、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の増幅を指標として当該検体の腫瘍化を検出及び／又は分類することを含む、多発性骨髄の検出方法が提供される。
【００１０】
好ましくは、遺伝子の増幅を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、遺伝子増幅法、ＲＦＬＰ検出法、塩基配列決定法、またはアレイＣＧＨ法の何れかを用いて検出する。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、検体において、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子のいずれかの遺伝子の発現の増大を指標として当該検体の腫瘍化を検出及び／又は分類することを含む、癌の検出方法が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を、インビトロで腫瘍細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法が提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子の機能欠失型タンパク質を、インビトロで腫瘍細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法が提供される。
【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む、細胞増殖抑制剤が提供される。
【００１５】
本発明のさらに別の側面によれば、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子の機能欠失型タンパク質を含む、細胞増殖抑制剤が提供される。
【００１６】
本発明のさらに別の側面によれば、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を活性化する方法が提供される。
【００１７】
本発明のさらに別の側面によれば、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子を含む、細胞増殖活性化剤が提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、多発性骨髄腫細胞検体における腫瘍の分類、腫瘍化の兆候、腫瘍の回復の程度を的確に把握することが可能となった。また、多発性骨髄腫細胞において増幅するＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の転写産物を阻害することにより、当該多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制することができる。即ち、本発明によれば、新たに腫瘍化機能を見出したＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の転写阻害又は該遺伝子がコードするＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質の機能欠失型を含有する抗腫瘍化剤が提供される。これらの薬剤は腫瘍の個別性に基づく治療や腫瘍の予後の改善などの臨床上の観点から、あるいは腫瘍の基礎的研究の観点から非常に有用である。また、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量を測定すること、乃至はゲノムＤＮＡ上での同遺伝子の量を確認することあるいはＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質の量を測定することにより、多発性骨髄腫患者の腫瘍を遺伝学的分類することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
（１）癌の検出方法
本発明による癌の検出方法は、検体において１１番染色体ｑ２３領域の遺伝子の増幅を指標として当該検体の腫瘍化を検出及び／又は分類することを特徴とする。
【００２０】
これまでの研究から、ヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子（別名：ＯＢＦ−１（ＯＣＴ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １）、ＢＯＢ−１  （Ｂ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＯＢＦ−１）、ＯＣＡ−Ｂなどともいう）の転写産物は既に知られており、１１ｑ２３．１染色体に存在する遺伝子である（Ｊｕｎｋｅｒ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３３：  １４３−１４５，１９９６）。ヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の塩基配列はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースにＮＭ＿００６２３５番にて、またヒトＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質のアミノ酸配列は同データベースにＮＰ＿００６２２６番にて登録されている。ヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の塩基配列は配列番号１に記載するとおりであり、ＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質は配列番号１の塩基配列の５２４番目から１２９４番目までの領域をコードし、そのアミノ酸配列は配列番号２に示されるとおりである。
【００２１】
本明細書において「ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子」というのは、上記塩基配列で特定されるヒト由来の遺伝子をいい、「ＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質」というのは、該ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子がコードし、上記アミノ酸配列で特定されるタンパク質をいう。ヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子がコードするタンパク質は、ＰＯＵ  ｄｏｍａｉｎ（ＰＯＵドメインタンパク質はその配列の中に  ＰＯＵ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｏｍａｉｎとＰＯＵ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎという共通のＤＮＡ結合配列を持ち、転写調節因子として作用する。）を有し、転写因子ＯＣＴ１もしくはＯＣＴ２と結合しその活性を増強することが知られている。しかしながら、このヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子が、ヒト多発性骨髄腫発症に関わる重要な癌遺伝子であることは未だ知られていない。
【００２２】
同様に、１１番染色体ｑ２３領域に存在する遺伝子としては、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子が知られている。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースより各遺伝子は、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤとして、ＲＤＸ（ｒａｄｉｘｉｎ）はＮＭ＿００２９０６、ＦＤＸ１（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ  １  ，  ｎｕｃｌｅａｒ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）はＮＭ＿００４１０９、ＡＲＨＧＡＰ２０（Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２０）はＮＭ＿０２０８０９、ＬＡＹＮ（ｌａｙｉｌｉｎ）はＮＭ＿１７８８３４、ＳＮＦ１ＬＫ２（ＳＮＦ１−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  ２）はＮＭ＿０１５１９１、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂは２種のスプライスバリアントが存在（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ２  （ｆｏｒｍｅｒｌｙ  ２Ａ），  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａ  （ＰＲ  ６５），  ｂｅｔａ  ｉｓｏｆｏｒｍ  （ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ），  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １もしくはｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ２  （ｆｏｒｍｅｒｌｙ  ２Ａ），  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａ  （ＰＲ  ６５），  ｂｅｔａ  ｉｓｏｆｏｒｍ  （ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ），  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ２）し、ＮＭ＿００２７１６もしくはＮＭ＿１８１６９９、ＡＬＧ９（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ９  ｈｏｍｏｌｏｇ  （Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，  ａｌｐｈａ−  １，２−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））は、ＮＭ＿０２４７４０として登録されている。
【００２３】
上述したように、本発明の癌の検出方法の一例としては、多発性骨髄腫細胞におけるヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の増幅を検出することを特徴とする方法を挙げることができる。ヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の増幅を検出する対象となる多発性骨髄腫細胞は、検体提供者の生検細胞が好適である。この検体細胞は、健常人の骨髄細胞か、血液、多発性骨髄腫患者の当該腫瘍細胞であるかを問わないが、現実的には、検査等の結果、骨髄に腫瘍化が疑われる兆候が認められた場合の当該病変細胞、または、多発性骨髄腫であることが確定しているが、その進行度や回復度合いを判定する必要がある多発性骨髄腫の細胞、等が主な対象となり得る。
【００２４】
本発明の検出方法により、「検査等の結果、骨髄腫瘍化が疑われる病変部が認められた場合の当該病変細胞」におけるヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の増幅が認められた場合には、当該病変細胞は腫瘍化に向かって進行しているかあるいは既に腫瘍化した状態にあり、かつ、悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（本格的な化学療法等）を行う必要性が示される。また、「多発性骨髄腫であることが確定しているが、その分類法を判定する必要がある多発性骨髄腫細胞」におけるヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の増幅が認められた場合にも、当該腫瘍細胞の分類を行い、適切な本格的治療（本格的な化学療法等）を行う必要性が示される。検体として採取された多発性骨髄腫細胞は、必要な処理、例えば、採取された細胞からのＤＮＡあるいはＲＮＡの調整を行い、本検出方法を行う対象とすることができる。
【００２５】
本発明では、上述したように、多発性骨髄腫細胞におけるヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の増幅を検出することにより、当該細胞の腫瘍化の検出及び／又は分類を行うことが可能である。
【００２６】
本発明では、検体における１１番染色体ｑ２３領域の遺伝子の増幅を指標として検体の腫瘍化を検出及び／又は分類するが、検出及び／又は分類される癌の種類は、１１番染色体ｑ２３領域の遺伝子の増幅を示すものであれば特に限定されない。癌の具体例としては、例えば悪性黒色腫、悪性リンパ腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽細胞腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記のうち特に好ましい適用対象となる癌は、骨髄腫である。
【００２７】
本発明の方法において増幅の指標として使用される１１番染色体ｑ２３領域の遺伝子としては、例えば、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、及びＡＬＧ９遺伝子を挙げることができる。本発明の方法においては、上記のような遺伝子が、正常検体と比較して１．３２倍以上、好ましくは１．５倍以上、さらに好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上、さらに好ましくは４倍以上、特に好ましくは５倍以上増幅されている場合には、腫瘍化を示すものであると判断することができる。
【００２８】
ヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子などの１１番染色体ｑ２３領域の遺伝子の増幅の検出を直接的に行うための代表的な方法として、ＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法とＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法を挙げることができる。この態様の本検出方法は、ヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子を有するＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｒｉｖｅｄ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ（以下、ＢＡＣ  ＤＮＡ等ともいう）を標識し、ＦＩＳＨを行うと、ヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の増幅部分を検出することができる。具体的に、ヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子を有するＢＡＣ  ＤＮＡとしては、ＲＰ１１−２６２Ａ１２、ＲＰ１１−６８６Ｇ１４、ＲＰ１１−７９２Ｐ２等を挙げることができる。
【００２９】
上記の態様の方法は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を用いて行うことが、好適であり、かつ、現実的である。
【００３０】
通常に得られるＢＡＣ  ＤＮＡ等は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を多数製造して実用化するには少量であるので、当該ＤＮＡを遺伝子増幅産物として得る必要がある（この遺伝子増幅行程を「無尽蔵化」ともいう）。無尽蔵化においては、まずＢＡＣ  ＤＮＡ等を、４塩基認識酵素、例えば、ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩ等で消化した後、アダプターを加えてライゲーションを行う。アダプターは１０〜３０塩基、好適には１５〜２５塩基からなるオリゴヌクレオチドで、２本鎖は相補的配列を有し、アニーリング後、平滑末端を形成する側の３’−末端のオリゴヌクレオチドをリン酸化する必要がある。次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅し、無尽蔵化することができる。一方、各ＢＡＣ  ＤＮＡ等に特徴的な５０〜７０塩基のアミノ化オリゴヌクレオチドを検出用プローブとして用いることもできる。
【００３１】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ  ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。固体基盤としては、ガラス板が好ましい。ガラス等の固体基盤は、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着により基盤をコートすることがより好ましい。
【００３２】
上記の無尽蔵化したＤＮＡを基盤上にスポットする濃度は、好ましくは１０ｐｇ／μｌ〜５μｇ／μｌ、より好ましくは１ｎｇ／μｌ〜２００ｎｇ／μｌである。スポットする量は好ましくは１ｎｌ〜１μｌ、より好ましくは１０ｎｌ〜１００ｎｌである。また、基盤に定着させる個々のスポットの大きさ及び形状は、特に限定されないが、例えば、大きさは直径０．０１〜１ｍｍであり得、上面から見た形状は円形〜楕円形であり得る。乾燥スポットの厚みは、特に制限はないが、１〜１００μｍである。さらに、スポットの個数は、特に制限はないが、使用する基盤あたり１０〜５０，０００個、より好ましくは１００〜５，０００個である。それぞれのＤＮＡはＳｉｎｇｕｌａｒからＱｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅの範囲でスポットするが、ＤｕｐｌｉｃａｔｅあるいはＴｒｉｐｌｉｃａｔｅにスポットすることが好ましい。
【００３３】
乾燥スポットの調整は、例えば、スポッターを用いて無尽蔵化したＢＡＣ  ＤＮＡ等を基盤上にたらして、複数のスポットを形成した後、スポットを乾燥することにより製造することができる。スポッターとしてインクジェット式プリンター、ピンアレイ式プリンター、バブルジェット（登録商標）式プリンターが使用できるが、インクジェット式プリンターを使用することが望ましい。例えば、ＧＥＮＥＳＨＯＴ（日本ガイシ株式会社、名古屋）等を使用できる。
【００３４】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ  ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。
【００３５】
また、このヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の増幅を直接的に検出する手段の一つとしてサザンブロット法を挙げることができる。サザンブロット法は、検体から得られるゲノムＤＮＡを分離して固定し、これと、ヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子とのハイブリダイズを検出することにより、検体中の当該遺伝子の存在を検出する方法である。また、このヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の増幅を直接的に検出する手段の一つとしてＰＣＲ法も用いることができる。被検検体よりゲノムＤＮＡを分離して当該遺伝子の全部、または一部を増幅することが可能なプライマーを用いて増幅後、定量を行いことにより検出することが可能である。
【００３６】
また、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によりヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の増幅を検出してもよい。ノーザンブロット法は、検体から得られるｍＲＮＡを分離して固定し、これとヒトＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子とのハイブリダイゼーションを検出することにより、検体中の当該遺伝子のｍＲＮＡの存在を検出する方法である。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、逆転写反応とポリメラーゼ連鎖反応による目的遺伝子の増幅を経時的（リアルタイム）に測定する方法であり、増幅率に基づいて鋳型となるｍＲＮＡの定量を行なうことができる。この定量は蛍光色素を用いて行われ、二種類の方法がある。即ち、二重鎖DNAに特異的に挿入（インターカレート）して蛍光を発する色素 (例えば、SYBR green) を用いる方法と、増幅するDNA配列に特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法が知られている。
【００３７】
本発明においてはまた、検体において、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子のいずれかの遺伝子の発現の増大を指標として当該検体の腫瘍化を検出及び／又は分類することによって、癌を検出することができる。
【００３８】
例えば、本発明では、ＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質の量を解析し、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の発現の増大を指標として当該検体の腫瘍化を検出及び／又は分類することによって、癌を検出することができる。ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子以外の遺伝子の発現についても、当該遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体又はその断片を用いて、同様に解析することができる。以下、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の発現の増大を指標とする場合を例に挙げて説明する。
【００３９】
本方法に用いることができるＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質に対する抗体（以下、ＰＯＵ２ＡＦ１抗体という）は、ＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質の全部又は一部を抗原として、通常の方法で作製することができる。ＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質の一部とは、配列番号２に記載するＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質のアミノ酸配列のうち、例えば連続する少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは、少なくとも約１１〜２０個のアミノ酸からなるポリペプチドをいう。抗原とするＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質の全部又は一部の調製法は生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。
【００４０】
ポリクローナル抗体は、例えば上記抗原をマウス、モルモット、ウサギなどの動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などに複数回接種し十分に免疫した後、該動物から採血、血清分離して作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば上記抗原で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作製後、該ハイブリドーマ培養上清、又は該ハイブリドーマ投与マウス腹水から作製することができる。
【００４１】
上記のようにして調製したＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質抗体又はその断片を用いることによって検体試料中のＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質の発現量を知ることができる。測定には、例えばイムノブロット法、酵素抗体法（ＥＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法、免疫細胞染色などの免疫学的方法、又はウェスタンブロット法などが利用できる。ここで、ＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質抗体の断片とは当該抗体の一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）などをいう。また、検体試料としては、腫瘍が疑われる骨髄試料、組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。
【００４２】
（２）細胞の増殖抑制方法、及び細胞増殖抑制剤
本発明によれば、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を、インビトロで腫瘍細胞に導入することを含む細胞の増殖を抑制する方法、並びに上記のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む細胞増殖抑制剤が提供される。さらに本発明によれば、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子の機能欠失型タンパク質を、インビトロで腫瘍細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法、並びに上記の機能欠失型タンパク質を含む、細胞増殖抑制剤が提供される。
【００４３】
ｓｉＲＮＡは、約２０塩基（例えば、約２１〜２３塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡであり、このようなｓｉＲＮＡ は、細胞に発現させることにより、そのｓｉＲＮＡ の標的となる遺伝子（本発明においては、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子）の発現を抑制することができる。
【００４４】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡ は、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態のものでもよい。ここで、「ｓｉＲＮＡ 」とは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５'−リン酸、３'−ＯＨの構造を有しており、３'末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡ に特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡ と同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡ の中央部でｍＲＮＡを切断する。
【００４５】
ｓｉＲＮＡ の配列と、標的として切断するｍＲＮＡの配列とは１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡ の中央から外れた位置の塩基が一致していない場合については、ＲＮＡｉによる切断活性は部分的には残存することが多いので、必ずしも１００％一致していなくてもよい。
【００４６】
ｓｉＲＮＡの塩基配列と、発現を抑制すべきＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子の塩基配列との間で相同性のある領域は、当該遺伝子の翻訳開始領域を含まないことが好ましい。翻訳開始領域には種々の転写因子や翻訳因子が結合することが予想されるため、ｓｉＲＮＡ が効果的にｍＲＮＡに結合することができず、効果が低減することが予測されるからである。従って、相同性を有する配列は、当該遺伝子の翻訳開始領域から２０塩基離れていることが好ましく、より好ましくは当該遺伝子の翻訳開始領域から７０塩基離れている。相同性を有する配列としては、例えば、当該遺伝子の３'末端付近の配列でもよい。
【００４７】
本発明の別の態様によれば、ＲＮＡｉにより標的遺伝子の発現を抑制することができる因子として、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造から成るｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）を使用することができる。ｓｈＲＮＡとは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことを言う。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことができる。上記の通りｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明において有効に用いることができる。
【００４８】
ｓｈＲＮＡは好ましくは、３'突出末端を有している。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは約２０ヌクレオチド以上である。ここで、３'突出末端は、好ましくはＤＮＡであり、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド以上のＤＮＡであり、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチドのＤＮＡである。
【００４９】
上記の通り、本発明では、ＲＮＡｉによりＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子の発現を抑制することができる因子として、ｓｉＲＮＡ またはｓｈＲＮＡを使用することができる。ｓｉＲＮＡの長所としては、（１）細胞内に導入してもＲＮＡ自体は正常細胞の染色体内に組み込まれないので、子孫に伝わる変異を起こすような治療ではなく、安全性が高いこと、及び（２）短鎖二本鎖ＲＮＡは化学合成が比較的容易であり二本鎖にするとより安定であること、などが挙げられる。また、ｓｈＲＮＡの長所としては、遺伝子発現を長期間抑制することによって治療を行う場合、細胞内でｓｈＲＮＡを転写するようなベクターを作製して細胞内に導入することができることなどが挙げられる。
【００５０】
本発明で用いるＲＮＡｉによりＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子の発現を抑制することができるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成してもよいし、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロでＲＮＡを合成することによって作製することもできる。インビトロで合成する場合は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成することができる。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、ＲＮＡｉが引き起こされ、標的遺伝子の発現が抑制される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法、又は各種のトランスフェクション試薬（例えば、oligofectamine、Lipofectamineおよびlipofectionなど）を用いてそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【００５１】
上記したｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、細胞増殖抑制剤として有用である。本発明の細胞増殖抑制剤の投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、患部への直接投与などが挙げられる。本発明の薬剤は、医薬組成物として使用する場合、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。  薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
本発明の薬剤の製剤形態は特に限定されないが、例えば、液剤、注射剤、徐放剤などが挙げられる。本発明の薬剤を上記製剤として処方するために使用される溶媒としては、水性または非水性のいずれでもよい。
【００５３】
さらに、本発明の細胞増殖抑制剤の有効成分であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。
【００５４】
本発明の細胞増殖抑制剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの種類などを考慮して、当業者が決定することができる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの投与量は特に限定されないが、例えば、約０．１ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約１ｎｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。ＲＮＡｉは、一般に投与後１〜３日間効果が見られる。したがって、毎日〜３日に１回の頻度で投与することが好ましい。発現ベクターを用いる場合、１週間に１回程度投与することも可能である。
【００５５】
本発明では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞増殖抑制剤として使用することもできる。本発明で用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する５から１００の塩基配列に対して相補的な、またはハイブリダイズするヌクレオチドであって、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであっても良く、また機能に支障がない限りにおいて修飾されたものであってもよい。本明細書で言う「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドがすべて相補的であるもののみならず、ＤＮＡ又はｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが安定にハイブリダイズできる限り、多少のミスマッチが存在してもよい。
【００５６】
なお、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよい。適当な修飾を施すことにより、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは生体内で分解されにくくなり、より安定してITIIαを阻害できるようになる。このような修飾されたオリゴヌクレオチドとしては、Ｓ−オリゴ型（ホスフォロチオエート型）、Ｃ−５チアゾール型、Ｄ−オリゴ型（フォスフォジエステル型）、Ｍ−オリゴ型（メチルフォスフォネイト型）、ペプチド核酸型、リン酸ジエステル結合型、Ｃ−５プロピニルピリミジン型、２−Ｏ−プロピルリボース、２'−メトキシエトキシリボース型等の修飾型のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されているものでもよい。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性、水溶性、ＲＮＡへの親和性に特に優れている。リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、Ｓ−オリゴ型等のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基数は、５０以下であることが好ましく、２５以下であることがより好ましい。塩基数があまりに多くなると、オリゴヌクレオチドの合成の手間とコストが増大し、また、収率も低下する。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基数は５以上であり、９以上であることが好ましい。塩基数が４以下の場合には、標的遺伝子に対する特異性が低下して好ましくないためである。
【００５８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（又はその誘導体）は常法によって合成することができ、例えば、市販のＤＮＡ合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製など）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などで得ることができる。
【００５９】
本発明においてアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞増殖抑制剤として使用する場合には、一般的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドと製剤用添加物（担体、賦形剤など）とを含む医薬組成物の形態で提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトを含む哺乳動物に医薬として投与することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔などへの粘膜投与、または吸入投与など）の何れでもよい。
【００６０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの製剤形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤の形態、使用すべき製剤用添加物、製剤の製造方法などは、いずれも当業者が適宜選択可能である。
【００６１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量は、患者の性別、年齢または体重、症状の重症度、予防または治療といった投与目的、あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮して適宜選択することができる。投与量は、一般的には、０．１μｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．１μｇ／ｋｇ体重／日〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【００６２】
さらに本発明では、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子の機能欠失型遺伝子を細胞増殖抑制剤として使用することもできる。機能欠失型遺伝子とは、該当する遺伝子においてその機能を欠失するように変異が導入されている遺伝子のことを言う。具体的には当該遺伝子から作製されるアミノ酸配列の少なくとも１個の構成アミノ酸を欠くもの、少なくとも１個の構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの、少なくとも１個のアミノ酸が付加されたもの等の本来の機能を欠失した一般にムテインと呼ばれるタンパク質を翻訳する当該遺伝子がこれに相当する。
【００６３】
機能欠失型遺伝子を細胞増殖抑制剤として使用する場合は、有効成分である上記遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、上記遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００６４】
上記基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００６５】
機能欠失型遺伝子の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００６６】
機能欠失型遺伝子の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００６７】
また、上記した本発明の各種の遺伝子治療剤は、常法により調製されたリポソームの懸濁液に遺伝子を添加し凍結した後融解することにより製造することもできる。リポソームを調製する方法は、薄膜振とう法、超音波法、逆相蒸発法、界面活性剤除去法などがある。リポソームの懸濁液は超音波処理した後、遺伝子を添加するのが遺伝子の封入効率を向上させる上で好ましい。遺伝子を封入したリポソームはそのまま、又は水、生理食塩水などに懸濁して静脈投与することができる。
【００６８】
さらに本発明では、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子の機能欠失型タンパク質を細胞増殖抑制剤（即ち、タンパク質製剤）として使用することもできる。例えば、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の機能欠失型タンパク質を細胞増殖抑制剤として使用する場合には、有効成分である機能欠失型ＰＯＵ２ＡＦ１タンパク質又はその機能欠失型相同タンパク質は、製剤用添加物（例えば、担体、賦形剤など）を含む医薬組成物の形態で提供することができる。
【００６９】
上記のタンパク質製剤の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤などが挙げられる。
【００７０】
上記タンパク質製剤の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与などへの粘膜投与、又は吸入投与など）の何れでもよい。
【００７１】
上記タンパク質治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日あたり０．００１μｇ／ｋｇ体重から１０００μｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは０．００１μｇ／ｋｇ体重から１００μｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００７２】
上記した本発明の細胞増殖抑制剤は、その有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって腫瘍を抑制するのに使用することができる。上記抗腫瘍化剤はまた、その予防及び／又は治療有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって腫瘍の予防及び／又は治療をするのに使用することができる。
【００７３】
（３）細胞増殖の活性化方法、及び細胞増殖活性化剤
本発明によればさらに、ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を活性化する方法、並びに上記遺伝子を含む細胞増殖活性化剤が提供される。
【００７４】
ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子を取り扱う場合、当業者に公知の技術を用いて培養細胞などから取得したｃＤＮＡであってもよいし、又は本明細書の配列番号１に記載の塩基配列に基づいてＰＣＲ法などにより酵素学的に合成したものでもよい。ＰＣＲ法により配列番号１に記載した塩基配列を有するＤＮＡを取得する場合、ヒトの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計したプライマーを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片は大腸菌などの宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００７５】
ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の検出ブローブ又はプライマーの調製、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、２nd  Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法に準じて行うことができる。
【００７６】
ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子以外の遺伝子を取り扱う場合も、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の場合と同様に行うことができる。
【００７７】
ＲＤＸ遺伝子、ＦＤＸ１遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ２０遺伝子、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子、ＬＡＹＮ遺伝子、ＳＮＦ１ＬＫ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子、又はＡＬＧ９遺伝子から選択される遺伝子は、ベクターに組み込んだ組換えベクターの形態で用いることができる。ベクターとしてはウイルスベクター又は動物細胞発現用ベクター、好ましくはウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。中でも、レトロウイルスベクターは、細胞に感染後、ウイルスゲノムが宿主染色体に組み込まれ、ベクターに組み込んだ外来遺伝子を安定にかつ長期的に発現させる可能であるからレトロウイルスベクターを使用することが特に望ましい。
【００７８】
動物細胞発現用ベクターとしては例えばｐＣＸＮ２（Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００，１９９１）、ＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公報）又はその改変体などを用いることができる。
【００７９】
上記組換えベクターは適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。組換えベクターがウイルスベクターの場合、これを導入する宿主としてはウイルス生産能を有する動物細胞が用いられ、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。レトロウイルスベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＭＬＶなどが、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞などが用いられる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法などで行うことができる。また、組換えベクターが動物細胞発現用ベクターの場合、これを導入する宿主としては大腸菌Ｋ１２株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株などを使用でき、大腸菌の形質転換は当業者に公知である。
【００８０】
得られた形質転換体はそれぞれに適した培地、培養条件により培養する。例えば、大腸菌の形質転換体の培養は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有するｐＨ５〜８程度の液体培地を用いて行うことができる。培養は通常１５〜４３℃で約８〜２４時間程度行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、培養終了後、通常のＤＮＡ単離精製法により得ることができる。
【００８１】
また、動物細胞の形質転換体の培養は、例えば約５〜２０％のウシ胎児血清を含む１９９培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの培地を用いて行うことができる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１８〜６０時間行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、それを含有するウイルス粒子が培養上清中に放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシウム遠心法、ポリエチレングリコール沈澱法、フィルター濃縮法などにより得ることができる。
【００８２】
本発明の細胞増殖活性化剤は、有効成分である上記遺伝子又はその相同遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、上記遺伝子又はその相同遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００８３】
本発明で言う相同遺伝子とは、ある特定の遺伝子の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列を有する遺伝子；又はある特定の遺伝子の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子を言う。本発明で言う相同遺伝子は、好ましくは、腫瘍化活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子である。また、ある遺伝子の相同遺伝子には、当該遺伝子の断片も含まれる。
【００８４】
「塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
【００８５】
「ある特定の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列を有する遺伝子」は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。具体的には、上記の特定の遺伝子を利用し、このＤＮＡに変異を導入することにより取得することができる。例えば、上記の特定の遺伝子に対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法などを用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、２nd  Ｅｄ．、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載の方法に準じて行うことができる。
【００８６】
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニー又はプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、２nd  Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９などに記載されている方法に準じて行うことができる。
【００８７】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００８８】
上記の「ある特定の遺伝子の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子」は、上述のとおり、一定のハイブリダイゼーション条件下でコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法などを行うことにより得ることができる。
【００８９】
有効成分である上記遺伝子又はその相同遺伝子を配合するために使用する基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００９０】
本発明の細胞増殖活性化剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、細胞増殖活性化剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００９１】
本発明の細胞増殖活性化剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００９２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００９３】
実験材料：
用いた２８種の多発性骨髄腫由来細胞株は臨床サンプルより樹立したＡＭＯ１，ＫＭＭ１，ＫＭ−１，ＫＭ−４，ＫＭ−５，ＫＭ−６，ＫＭ−７，ＫＭ−１１，ＫＭＳ−５，ＫＭＳ−１１，ＫＭＳ−１８，ＫＭＳ−２０，ＫＭＳ−２６，ＫＭＳ−２７，ＫＭＳ−３４，ＫＭＳ−１２ＢＭ，ＫＭＳ−１２ＰＥ，ＫＭＳ−２１ＢＭ，ＫＭＳ−２１ＰＥ，ＫＭＳ−２８ＢＭ，ＫＭＳ−２８ＰＥ，ＨＳ，ＩＬＫＭ−１０，ＩＬＫＭ−１２，ＩＬＫＭ−１３，ＭＯＬＰ−２，ＭＯＬＰ−６，ＯＰＭ−２およびＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓにて形質転換した健常人由来の１種のリンパ球由来細胞株を使用した。これら細胞株を１０％胎児牛血清の存在下ＲＰＭＩ−１６４０にて培養を行った。臨床検体由来の３２人からの骨髄サンプルは名古屋市立大学病院より入手し、各患者の同意をもってかつ同組織の倫理委員会の承認を得て使用した。診断の際の多発性骨髄腫由来細胞の選別は抗ＣＤ１３８抗体ビーズを用いたａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によりポジティブセレクションにより行った。
【００９４】
実施例１：多発性骨髄腫細胞でのヒト遺伝子領域の増幅と欠失
多発性骨髄腫での新規な遺伝子増幅を検出するために、２８種類の多発性骨髄腫細胞から調製したゲノムＤＮＡを用いて、ＭＧＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｒｒａｙ−８００のＣＧＨアレイを使用したＣＧＨアレイ解析を行った。対象として健常人リンパ球細胞株由来ゲノムＤＮＡを使用しＣｙ５で標識した。被検ＤＮＡとして上記多発性骨髄腫細胞から調製したゲノムＤＮＡを使用しＣｙ３で標識した。具体的には、ＤｐｎＩＩ消化したゲノムＤＮＡ（０．５μｇ）を、各々０．６ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．６ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．６ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ  ｄＣＴＰ及び０．３ｍＭ  Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（多発性骨髄腫細胞）あるいは０．３ｍＭ  Ｃｙ５−ｄＣＴＰ（正常細胞）存在下で、ＢｉｏＰｒｉｍｅ  Ａｒｒａｙ  ＣＧＨ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により標識した。Ｃｙ３及びＣｙ５標識ｄＣＴＰはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社より入手した。両標識ゲノムＤＮＡをＣｏｔ−１  ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）存在下でエタノールを加えて沈殿させ、１２０μｌのハイブリダイゼーション混合液（５０％ホルムアミド、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ、２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ：１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１５ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ）、４％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ、ｐＨ７．０）に溶解した。３７℃で３０分間インキュベーション後、ハイブリダイゼーションチャンバーにセットしたＣＧＨアレイ上に加え、３７℃で３ｒｐｍ（ｒｏｕｎｄ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）のスピードで振とうしながら４８〜７２時間インキュベーションを行った。その後、ＣＧＨアレイを５０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液中で５０℃にて１５分間洗浄し、次に２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で５０℃にて１５分間洗浄した。風乾した後、ＣＧＨアレイをＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナー（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＣｙ３及びＣｙ５に由来する蛍光をモニタリングした。得られた結果をＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ６．０イメージングソフトウエア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。Ｃｙ３に由来する蛍光強度の平均とＣｙ５に由来する蛍光強度の平均を同じ値に調整し、個々の遺伝子のアレイＣＧＨによる量的変化をＣｙ３／Ｃｙ５のＲａｔｉｏを求めることにより検出した。ゲノムに異常がない場合にはＲａｔｉｏ値は１であるが、その比が底を２とするｌｏｇ値で正および負に０．４以上に外れるものを遺伝子に異常がある（増幅もしくは欠失）と判定した。増幅と欠失の染色体領域での異常に関し、全細胞株に対する異常細胞の頻度として、縦軸に増幅（緑）、欠失（赤）、横軸にＵＣＳＣ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  を参照（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／［ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｍａｙ，２００４］）し、染色体位置として示した（図１）。５０％以上の高頻度の増幅が１ｑ，７ｑ，８ｑに、欠失が１ｐ，１３ｑ，１４ｑ，１７ｐ，２２ｑに観察された。１４ｑ３２に最大頻度の欠失が観察されるが、多くの白血病、骨髄腫に観察されるｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｇａｍ���ａ  １  ｇｅｎｅ（ＩＧＨＧ１）の転座に伴う欠失によるものである。
【００９５】
さらに、高レベルの増幅（ｌｏｇ２  ｒａｔｉｏ＞２．０）、ホモ欠失（ｌｏｇ２  ｒａｔｉｏ  ＜−２．０）とに分類し、変化の大きかった遺伝子について観察された細胞と共に示した（表１）。
【００９６】
【表１】
2008072939.tif 000002
【００９７】
２８細胞株中１１株でホモ欠失している遺伝子が観察されたが、ＫＭＳ−５細胞では９ｐ２１．３領域のＭＴＡＰとＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６の欠失が観察された。一方、高レベルの増幅は２８細胞株中１１株で観察され、１６遺伝子が該当した。中でもＡＭＯ１とＭＯＬＰ−２の両細胞で１１ｑ２３領域のＰＯＵ２ＡＦ１とＰＰＰ２Ｒ１Ｂ遺伝子が増幅していることが判明した。遺伝子増幅が腫瘍の病理学的、臨床的意義が大きく治療法に繋がることからこの１１ｑ２３領域に注力して解析を行った。
【００９８】
実施例２：ＡＭＯ１とＭＯＬＰ−２細胞でのＦＩＳＨ解析
実施例１にてアレイＣＧＨ法にて確認された１１ｑ２３領域の染色体領域に関しＲＰ１１−７９２Ｐ２のＢＡＣクローンを用いて定法（Ｉｎｏｕｅ  Ｊ，  Ｏｔｓｕｋｉ  Ｔ，  Ｈｉｒａｓａｗａ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．；１６５：７１−８１．，２００４）により、ＦＩＳＨ解析を行った（図２）。両細胞株共に本来の染色体位置でのＦＩＳＨシグナル（矢印）に加え、多コピーからなる強い増幅シグナル（楔形）が観察され、確かに遺伝子増幅が起こっていることが確認された。
【００９９】
実施例３：ＡＭＯ１とＭＯＬＰ−２細胞でのＦＩＳＨ解析による増幅領域の絞り込みと構成される遺伝子の発現解析
ＲＰ１１−７９２Ｐ２をほぼ中心とする１５種のＢＡＣクローンを用いＦＩＳＨを行い、その蛍光シグナル強度から対応ゲノムＤＮＡ領域のコピー数を図式化した（図３左）。縦軸は１１ｑ２３領域でのＢＡＣクローンＩＤとそれらの相対的位置を示す。平均的に染色される輝度の最も高い領域（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓｌｙ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ（ＨＳＲｓ））は両細胞間でほぼ一致し、両者を考慮してＲＰ１１−２５Ｉ９と７０８Ｌ７の間約３Ｍｂ（メガベース）に絞り込まれた。
【０１００】
次に、絞り込まれた１１ｑ２３領域中に存在するＡＭＯ１、ＲＤＸ、ＡＲＨＧＡＰ２０、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＳＮＦ１ＬＫ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＡＬＧ９遺伝子について簡易定量を目的としたＰＣＲ反応を行った。ＲＴ−ＰＣＲの発現量のコントロールとして発現量が細胞種、条件で変化しにくいことで知られるＧＡＰＤＨを用いた。対数増殖期の各細胞よりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを採取後、定法にてｃＤＮＡを作製した。各遺伝子に特異的なプライマーと条件を事前に設定し、ＰＣＲ反応を行い３％アガロースゲルにて電気泳動を行った。ゲルイメージをＬＡＳ−３０００（富士写真フイルム）にて測定しＭｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（富士写真フイルム）にて画像解析した（図３右）。用いた細胞株は、１１ｑ２３領域の増幅のあったＡＭＯ１、ＭＯＬＰ−２に加え、この領域の増幅が観察されなかったＫＭＭ１、ＫＭ−５、さらにコントロールとして健常人由来のＬＣＬ（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｃｌｏｎｅ）を用いた。これらの定量結果をまとめたものが表２である。
【０１０１】
【表２】
2008072939.tif 000003
【０１０２】
ＡＭＯ１とＭＯＬＰ−２細胞において絞り込まれた領域で、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子発現は遺伝子増幅のない細胞（ＫＭＭ１、ＫＭ−５）の平均発現量に比べ４．５〜５．０倍に上昇していることが判明した。
【０１０３】
実施例４：多発性骨髄腫細胞株でのＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子のタンパク発現レベルの確認
８種の多発性骨髄腫細胞株についてＰＯＵ２ＡＦ１タンパクの発現量をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて定量した（図４）。各細胞をｐｒｏｔｅａｓｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含むＲＩＰＡバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．１％  ＳＤＳ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，ｐＨ７．４）にて溶解後、ＢＣＡ  ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）にてタンパク濃度を測定し各１０μｇをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した。これを、ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ膜に転写し、抗ＰＯＵ２ＡＦ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、コントロールとして抗β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ）にて一次検出後、パーオキシダーゼ結合二次抗体にてｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用い発色、検出した。図中ＰＯＵ２ＡＦ１タンパクに２種のバンドが観察されるが、分子量の小さいｐ３４に加えｐ３５が検出された。ｐ３４はｐ３５の転写後修飾によるアイソフォームであり、ＯＣＴ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １に対する転写活性化の増強効果が高いことが報告されている（Ｙｕ  Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．；１４：１５７−１６７．２００１）。図の下段にＦＩＳＨから測定されたＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子のゲノムＤＮＡ上のコピー数を示した。予想どおりゲノムＤＮＡ中にＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の増幅がみられたＡＭＯ１とＭＯＬＰ−２細胞は他の細胞に比し強いＰＯＵ２ＡＦ１タンパクの発現が観察された。
【０１０４】
実施例５：細胞へのＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子のｓｉＲＮＡ添加によるＰＯＵ２ＡＦ１タンパクの発現抑制と細胞増殖の抑制効果
ＰＯＵ２ＡＦ１のｓｉＲＮＡをＰＯＵ２ＡＦ１−Ａ：ＣＡＣＣＵＵＡＣＡＣＣＧＡＧＵＡＵＧＵ（配列番号３）、ＰＯＵ２ＡＦ１−Ｂ：ＧＧＵＵＣＵＧＵＧＵＣＵＧＣＡＧＵ（配列番号４）とデザインし購入（日本バイオサービス）した。２ｘ１０6個のＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の発現がみられたＡＭＯ１とＫＭＳ−２１ＢＭ細胞について２００ｎＭの各プライマーをＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｇｅｒｍａｎｙ）にて遺伝子導入後、その効率を蛍光標識のｐｍａｘＧＦＰ解析でモニターしながら実施例４と同様、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて解析した（図５、Ａ）。コントロールとして抗β−アクチン抗体を用いた。予想どおりｓｉＲＮＡ添加によるＰＯＵ２ＡＦ１タンパクの発現抑制が観察された。また１ｘ１０4個のＡＭＯ１とＫＭＳ−２１ＢＭ細胞にＰＯＵ２ＡＦ１のｓｉＲＮＡを遺伝子導入したものを９６ウェルプレートに播き、経時的に生細胞数をｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＷＳＴ）アッセイ（Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８；同仁堂）にて測定した（図５、Ｂ、Ｃ）。実験はトリプリケートで２回行い、アスタリスクは対応のないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔにて有意（ｐ＜０．０５）であった結果を示す。両細胞ともＰＯＵ２ＡＦ１のｓｉＲＮＡの導入により増殖が抑制された。
【０１０５】
実施例６：ＫＭＳ−１１細胞へのＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子発現細胞株の樹立、その分布、生細胞数に与える効果の観察
完全長ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子（ｐ３４）をＮ末端にＭｙｃが結合し発現する発現ベクター（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｐ３４−ＰＯＵ２ＡＦ１）として構築した。これを内在性ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の発現が低いＫＭＳ−１１細胞にＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒにて導入しＧ４１８（５０μｇ／ｍｌ）にて３週間薬剤選択した。ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子発現の有無を細胞破壊液を用いＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて抗Ｍｙｃ抗体にて検出した（図６、Ａ）。同時にＫＭＳ−１１細胞に外来遺伝子のないｐＣＭＶ−３Ｂを導入した細胞も用意しＭｏｃｋとした。予想どおり遺伝子導入したものだけに組み換えＰＯＵ２ＡＦ１タンパクが検出された。上記形質転換細胞をＳｈａｎｄｏｎ  Ｃｙｔｏｓｐｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ）のスライドガラス上に培養し遠心後１０％  ホルムアミドにて固定し抗Ｍｙｃポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）にて一晩染色した。反応した抗体をＡｌｅｘａ  ４８８標識ヒツジ由来抗ウサギ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し蛍光顕微鏡にて観察した。同時に核染色をＤＡＰＩにて行った。両者の色調を合わせたものをｍｅｒｇｅとして表示した（図６、Ｂ）。ＰＯＵ２ＡＦ１は核内タンパクでありＤＡＰＩと同様核に染色されたことが確認され、ＰＯＵ２ＡＦ１本来の分布を示していることが確認された。ＭｏｃｋとＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子発現細胞の両者でその細胞増殖速度を生細胞数としてＷＳＴアッセイを行った（図６、Ｃ）。ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の導入により細胞増殖速度が有意に速まることから該遺伝子の著しい増殖促進効果が確認された。
【０１０６】
実施例７：ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の制御遺伝子としてのＴＮＦＲＳＦ１７
ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子のノックアウトマウスを用いた実験からＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子がイムノグロブリン遺伝子以外の遺伝子発現に関わっていることが報告されている（Ｔｅｉｔｅｌｌ  ＭＡ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：５４６−５５３．２００３）。癌の発生や進展、細胞増殖、細胞接着や移動に関与する遺伝子としてＢＡＦＦＲ、ＴＮＦＲＳＦ１７（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１７）、Ｂｃｌ−２、ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ３、ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎらが知られているがリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析により多発性骨髄腫細胞株でＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の発現と挙動を共にする唯一の遺伝子がＴＮＦＲＳＦ１７であった（データは示していない）。そこで、ＴＮＦＲＳＦ１７の遺伝子発現の挙動を詳細に解析を行った（図７）。まず、２ｘ１０6個のＡＭＯ１とＫＭＳ−２１ＢＭ  細胞株にてＰＯＵ２ＡＦ１−ＡとＰＯＵ２ＡＦ１−Ｂの２００ｎＭの各ｓｉＲＮＡ（ＫＭＳ−２１ＢＭ細胞ではＰＯＵ２ＡＦ１−Ｂのみ）をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒにて遺伝子導入４８時間後、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて解析した（図７、Ａ）。両細胞ともＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子をノックダウンすることによりＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子発現が低下することが確認された。
【０１０７】
実施例６にてＫＭＳ−１１細胞へのＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子発現細胞株をＭｏｃｋと共に作製したがそれらについてのＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子発現についてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる比較を行った（図７、Ｂ）。この事例で、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子を強制発現させた細胞でＴＮＦＲＳＦ１７の遺伝子発現が増加することが確認された。データベース（ＲｅｃＧｒｏｕｐＳｃａｎ；  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｍｇｓ．ｂｉｏｎｅｔ．ｎｓｃ．ｒｕ／ｍｇｓ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｙｕｒａ／ＲｅｃＧｒｏｐＳｃａｎＳｔａｒｔ．ｈｔｍｌ）を用いてゲノムＤＮＡ上のヒトＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子の５’領域について転写因子結合部位を検索したところ転写開始点（＋１）上流３６４２ベースからＰＯＵ２ＡＦ１が転写を促進するｏｃｔａｍｅｒ  ｓｉｔｅの存在が確認された（図７、Ｃ）。次に、ＡＭＯ１とＫＭＳ−１１細胞（Ｍｏｃｋ、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子発現細胞）のクロマチンについてＰＯＵ２ＡＦ１タンパクに対する抗体を用いた免疫沈降物がｏｃｔａｍｅｒ  ｓｉｔｅを含有するかをＰＣＲにて検証した（図７、Ｄ）。用いたＰＣＲプライマーは図７、Ｃ矢印に示すようにｏｃｔａｍｅｒ  ｓｉｔｅを挟み込むものを用いた。抗ＰＯＵ２ＡＦ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）にて免疫沈降しその１／１００をＰＣＲ反応の鋳型として用いた。ｉｎｐｕｔは免疫沈降前のクロマチン材料、（−）は免疫沈降抗体が無い状態での陰性コントロールを示す。矢印に示すようにＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子発現細胞株と内在性ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子発現を示すＡＭＯ１細胞中にＰＯＵ２ＡＦ１タンパクと結合したｏｃｔａｍｅｒ  ｓｉｔｅが検出された。
【０１０８】
実施例８：ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子上流のｏｃｔａｍｅｒ  ｓｉｔｅを含む領域を用いたＰＯＵ２ＡＦ１発現ベクターと組み合わせたプロモーター−レポーターアッセイ
ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子上流のｏｃｔａｍｅｒ  ｓｉｔｅを含む３０７塩基対のＤＮＡ領域をＰＣＲにてクローニングし、野生型（ｗｔ；ＴＴＴＡＧＣＡＴ）および変異型（Ｍｕｔ；ＴＴＣＣＧＣＡＴ）のｏｃｔａｍｅｒ  ｓｉｔｅを含む領域をｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に導入しｐＧＬ３−ＴＮＦＲＳＦ１７−ｗｔ  ｏｃｔａｍｅｒおよびｐＧＬ３−ＴＮＦＲＳＦ１７−Ｍｕｔ  ｏｃｔａｍｅｒと命名した。ＫＭＳ−１１細胞に上記２種のルシフェラーゼプロモーター−レポーターベクターをｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＰＯＵ２ＡＦ１のｐ３４またはｐ３５と共に遺伝子導入効率を補正する内部標準用ベクターｐｈＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い遺伝子導入した。その４８時間後に、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて発光を測定した。ｐＧＬ３−ＴＮＦＲＳＦ１７−ｗｔ  ｏｃｔａｍｅｒとｐＣＭＶ−Ｔａｇ３（ｍｏｃｋ）を遺伝子導入したものを１とし、相対的なルシフェラーゼ活性を示した（図８）。ＰＯＵ２ＡＦ１のアイソフォームｐ３５、ｐ３４共にｏｃｔａｍｅｒｉｃ  ｓｉｔｅが野生型のものはコントロールに比し高いレポーター活性を示したが、その結合領域の変異により活性が低下したことから、ＰＯＵ２ＡＦ１は転写因子ＯＣＴ１もしくはＯＣＴ２と結合しその活性を増強することでＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子の発現調節を行っていることが確認された。
【０１０９】
実施例９：ＰＯＵ２ＡＦ１、ＴＮＦＲＳＦ１７両遺伝子メッセンジャーＲＮＡの発現相関
多発性骨髄腫細胞株および多発性骨髄腫臨床サンプルより樹立したプライマリー細胞におけるＰＯＵ２ＡＦ１、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子発現を定量ＰＣＲにて測定し、β−アクチンおよびβ２−マイクログロブリン（β２Ｍ）に対する比で示した（図９、Ａ：細胞株、Ｂ：プライマリー細胞）。ＰＯＵ２ＡＦ１、ＴＮＦＲＳＦ１７両遺伝子の発現は、細胞株でもプライマリー細胞においても相関が高く、両者とも有意なｐ値を示した（対応のないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔにて有意（ｐ＜０．０５））。このことから、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子の発現はＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の発現量により細胞株はもとより、臨床サンプルにおいても正の相関にて制御されていることが確認された。
【０１１０】
実施例１０：ｓｉＲＮＡを用いたＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子発現の抑制による細胞増殖の抑制効果
ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の発現が高いＡＭＯ１と発現の見られたＫＭＳ−２１ＢＭ細胞を用い、まず非特異的な配列をコントロールｓｉＲＮＡとし、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子のｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社；Ｍ−０１１２１７−００）を２００ｎＭ遺伝子導入４８時間後にβ−アクチンを指標とし、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子発現を定量ＰＣＲにて測定した（図１０、Ａ：ＰＯＵ２ＡＦ１、Ｂ：ＴＮＦＲＳＦ１７）。予想どおりＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子のｓｉＲＮＡによる抑制によりＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子発現は当然抑制されるが、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子のｓｉＲＮＡによるＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子発現は抑制されず、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子のｓｉＲＮＡによる抑制によりＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子の発現が抑制されたことから、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子がＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子の上流でＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子発現を制御していることが示された。またＡＭＯ１とＫＭＳ−２１ＢＭ細胞でＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子のｓｉＲＮＡによる抑制後の生細胞数をＷＳＴ法にて計測した（図１０、Ｃ）。両細胞共にＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子のｓｉＲＮＡ導入４日後から有意（アスタリスクは対応のないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ（ｐ＜０．０５））に細胞増殖の抑制が観察された。これらの結果からＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子の発現は、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の発現により正に制御され、その効果が細胞増殖効果として発揮されることが判明した。
【０１１１】
（実施例のまとめ）
（１）  アレイＣＧＨ法によるスクリーニングから、２８種の多発性骨髄腫由来細胞におけるＤＮＡの増幅遺伝子のスクリーニングと発現解析データを組み合わせた確認によりＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子に異常が観察された。
（２）  ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の発現はＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子発現の上流に位置し、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子発現を正に制御しその効果として細胞増殖を正に制御し、細胞増殖促進することで機能していることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】２８種類の多発性骨髄腫細胞から調製したゲノムＤＮＡを用いて、ＭＧＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｒｒａｙ−８００のＣＧＨアレイを使用したＣＧＨアレイ解析結果を示す。対象として健常人リンパ球細胞株由来ゲノムＤＮＡを使用し、増幅と欠失の染色体領域での全細胞種（２８種類）に対する頻度を、縦軸に増幅（緑）、欠失（赤）、横軸にＵＣＳＣ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｐｏｓｉｔｉｏｎを参照（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／［ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｍａｙ，２００４］）を参照とした染色体位置として示した。
【図２】アレイＣＧＨ法にて確認された１１ｑ２３領域の染色体領域に関しＲＰ１１−７９２Ｐ２のＢＡＣクローンを用いたＡＭＯ１とＭＯＬＰ−２細胞でのＦＩＳＨ解析の結果を示す。矢印は、本来の染色体位置でのＦＩＳＨシグナル、楔形は多コピーからなる強い増幅シグナルを示し、遺伝子増幅が起こっていることを示す。
【図３】１１ｑ２３領域の１５種のＲＰ−１１ＢＡＣクローンを用いＡＭＯ１とＭＯＬＰ−２細胞でのＦＩＳＨ解析により、その蛍光シグナル強度から対応ゲノムＤＮＡ領域のコピー数を算定し図式化した（図左）。縦軸は１１ｑ２３領域でのＢＡＣクローンＩＤとそれらの相対的位置を示す。平均的に染色される輝度の最も高い領域（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓｌｙ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ（ＨＳＲｓ））は両細胞間でほぼ一致し、両者を考慮してＲＰ１１−２５Ｉ９と７０８Ｌ７の間約３Ｍｂ（メガベース）に絞り込まれたことを示す。図右には、絞り込まれた１１ｑ２３領域中に存在するＡＭＯ１、ＲＤＸ、ＡＲＨＧＡＰ２０、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＳＮＦ１ＬＫ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、ＡＬＧ９遺伝子（メッセンジャーＲＮＡ）について簡易定量を目的としたＰＣＲ反応後３％アガロースゲルにて電気泳動を行った結果を示した。最下段に発現量のコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた結果を示した。細胞株は、１１ｑ２３領域の増幅のあったＡＭＯ１、ＭＯＬＰ−２および、この領域の増幅が観察されなかったＫＭＭ１、ＫＭ−５、さらにコントロールとして健常人由来のＬＣＬ（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｃｌｏｎｅ）を用いた。
【図４】８種の多発性骨髄腫細胞株についてＰＯＵ２ＡＦ１タンパクの発現量をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて定量した。上段にはタンパク量のモニターコントロールのβ−アクチンのＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ結果を示した。図中ＰＯＵ２ＡＦ１タンパクに観察される２種のバンドは、アイソフォームｐ３４とｐ３５を示す。図の下段にＦＩＳＨから測定されたＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子のゲノムＤＮＡ上のコピー数を示した。
【図５】Ａ：ＰＯＵ２ＡＦ１のｓｉＲＮＡ２種としてＰＯＵ２ＡＦ１−Ａ、ＰＯＵ２ＡＦ１−ＢをＡＭＯ１とＫＭＳ−２１ＢＭ細胞について遺伝子導入後、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて解析した結果を示した。下段にタンパク量のモニターコントロールのβ−アクチンのＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ結果を示した。Ｂ、Ｃ：１ｘ１０4個のＡＭＯ１とＫＭＳ−２１ＢＭ細胞にＰＯＵ２ＡＦ１のｓｉＲＮＡを遺伝子導入したものを９６ウェルプレートに播き、経時的に生細胞数をＷＳＴアッセイにて測定した結果を示した。実験はトリプリケートで２回行い、アスタリスクは対応のないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔにて有意（ｐ＜０．０５）であった結果を示す。
【図６】Ａ：完全長ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子（ｐ３４）をＮ末端にＭｙｃが結合し発現する発現ベクター（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｐ３４−ＰＯＵ２ＡＦ１）として構築し、内在性ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子の発現が低いＫＭＳ−１１細胞に遺伝子導入し３週間薬剤選択した。ＰＯＵ２ＡＦ１タンパク発現の状態を細胞破壊液を用いＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて抗Ｍｙｃ抗体にて検出した結果を示した。陰性コントロールとしてＫＭＳ−１１細胞に外来遺伝子のないｐＣＭＶ−３Ｂを導入した細胞も用意しＭｏｃｋとした。Ｂ：上記形質転換細胞をスライドガラス上に培養し抗Ｍｙｃポリクローナル抗体、Ａｌｅｘａ  ４８８標識ヒツジ由来抗ウサギ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し蛍光顕微鏡にて観察した結果を示した。核染色をＤＡＰＩにて行った結果を左に示した。さらに、両者の色調を合わせたものをｍｅｒｇｅとして表示した。下段にはＭｏｃｋの結果を示した。Ｃ：ＭｏｃｋとＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子発現細胞の両者でその細胞増殖速度を生細胞数としてＷＳＴアッセイを行った結果を示した。
【図７】Ａ：２ｘ１０6個のＡＭＯ１とＫＭＳ−２１ＢＭ細胞株にてＰＯＵ２ＡＦ１−ＡとＰＯＵ２ＡＦ１−Ｂの各ｓｉＲＮＡ（ＫＭＳ−２１ＢＭ細胞ではＰＯＵ２ＡＦ１−Ｂのみ）を遺伝子導入４８時間後、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて解析した結果を示した。ランダム配列による陰性コントロールのｓｉＲＮＡでのＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子の発現を１００とし、相対量を数値にて表した。Ｂ：ＫＭＳ−１１細胞へ外部から遺伝子導入によって樹立したＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子発現細胞株をＭｏｃｋコントロールと共にＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子発現についてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる比較を行った結果を示す。ＭｏｃｋコントロールにおけるＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子発現を１００とし相対的発現量として示した。Ｃ：データベースを用いたゲノムＤＮＡ上のヒトＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子５’領域について転写因子結合部位を検索し、転写開始点（＋１）上流３６４２ベースからＰＯＵ２ＡＦ１が転写を促進する可能性のあるｏｃｔａｍｅｒ  ｓｉｔｅの存在を示した。矢印は以降の実験に用いた上記ｏｃｔａｍｅｒ  ｓｉｔｅを検出するＰＣＲプライマーを示す。Ｄ：ＡＭＯ１と遺伝子導入ＫＭＳ−１１細胞（Ｍｏｃｋ、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子発現細胞）のクロマチンについてＰＯＵ２ＡＦ１タンパクに対する抗体を用いた免疫沈降物がｏｃｔａｍｅｒ  ｓｉｔｅを含有するかをＰＣＲにて検証した結果を示した。ＰＣＲプライマーは図７、Ｃ矢印に示すようにｏｃｔａｍｅｒ  ｓｉｔｅを挟み込むものを用い、各細胞の破壊液を抗ＰＯＵ２ＡＦ１抗体にて免疫沈降しその１／１００をＰＣＲ反応の鋳型として用いた。ｉｎｐｕｔは免疫沈降前のクロマチン材料、（−）は免疫沈降抗体が無い状態での陰性コントロールを示す。矢印は検出されたｏｃｔａｍｅｒ  ｓｉｔｅを示す。
【図８】ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子上流のｏｃｔａｍｅｒ  ｓｉｔｅを含むＤＮＡ領域中野生型（ｗｔ）および変異型（Ｍｕｔ）のｏｃｔａｍｅｒ  ｓｉｔｅを含むルシフェラーゼプロモーター−レポーターベクターをＰＯＵ２ＡＦ１のアイソフォームｐ３５、ｐ３４発現ベクターと共にＫＭＳ−１１細胞に遺伝子導入し発光を測定した結果を示す。ＴＮＦＲＳＦ１７−ｗｔ  ｏｃｔａｍｅｒを１とし、相対的なルシフェラーゼ活性を示している。
【図９】多発性骨髄腫細胞株および多発性骨髄腫臨床サンプルより樹立したプライマリー細胞におけるＰＯＵ２ＡＦ１、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子発現を定量ＰＣＲにて測定し、β−アクチンおよびβ２−マイクログロブリン（β２Ｍ）に対する比で示した（Ａ：細胞株、Ｂ：プライマリー細胞）。相関係数とｐ値を各グラフ右上に示す。
【図１０】Ａ、Ｂ：ＡＭＯ１、ＫＭＳ−２１ＢＭ細胞を用い、まず非特異的配列からなるｓｉＲＮＡをコントロールとし、ＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子のｓｉＲＮＡを遺伝子導入後β−アクチンを指標とし、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子発現を定量ＰＣＲにて測定しコントロールを１００として相対発現値を示した（Ａ：ＰＯＵ２ＡＦ１、Ｂ：ＴＮＦＲＳＦ１７）。Ｃ：ＡＭＯ１とＫＭＳ−２１ＢＭ細胞でＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子のｓｉＲＮＡによる抑制後（０，２，４，６日後）の生細胞数をＷＳＴ法にて計測した結果を示す。アスタリスクは対応のないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔにてコントロールに比し有意であったことを示す（ｐ＜０．０５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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