(57)【要約】      （修正有）【課題】熱サイクル印加時に、温度遷移が速く、温度精度が高い熱サイクル印加装置を提供する。【解決手段】熱サイクル印加装置２１は、２つ以上の熱媒体を供給する熱媒体供給手段と、前記複数の熱媒体供給手段から供給された熱媒体を１つに集合し入口側から出口側に流す空洞部分と、前記熱媒体の流れの方向に沿って複数のサンプルを前記空洞部分に保持するサンプル保持部を有するチャンバ６とを備えた熱サイクル印加装置であって、熱媒体の供給を制御するために、流量特性が異なる開閉弁を１つの熱媒体につき並列に３つ以上有する。【選択図】図１
2008199901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上の熱媒体を供給する熱媒体供給手段と、前記複数の熱媒体供給手段から供給された熱媒体を１つに集合し入口側から出口側に流す空洞部分と、前記熱媒体の流れの方向に沿って複数のサンプルを前記空洞部分に保持するサンプル保持部を有するチャンバとを備えた熱サイクル印加装置において、熱媒体の供給を制御するために、流量特性が異なる開閉弁を１つの熱媒体につき並列に３つ以上有することを特徴とする熱サイクル印加装置。
【請求項２】
前記開閉弁が電気的に開閉制御可能な電磁弁であることを特徴とする請求項１に記載の熱サイクル印加装置。
【請求項３】
さらに、チャンバとは別体として並列に設けられ、該チャンバの出口側の一部と入り口の一部とに接続され、該チャンバの該出口側から熱媒体の一部を該入り口側に還流させるバイパス経路を備えたことを特徴とする請求項１または２に記載の熱サイクル印加装置。
【請求項４】
さらに、流量特性が異なる開閉弁を、それぞれの開閉弁の音速コンダクタンスＣと開時間の積を指標に制御する機構を備えたことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の熱サイクル印加装置。
【請求項５】
流量特性が異なる開閉弁が、音速コンダクタンスＣが０．１以上０．２以下dm3／(s・bar)の開閉弁から少なくとも一つ選択され、音速コンダクタンスＣが０．２以上０.５以下 dm3／(s・bar) の開閉弁から少なくとも一つ選択され、音速コンダクタンスＣが１．５以上３．５以下 dm3／(s・bar) の開閉弁から少なくとも一つ選択されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の熱サイクル印加装置。
【請求項６】
前記熱媒体が、気体であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の熱サイクル印加装置。
【請求項７】
前記熱媒体が、空気であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の熱サイクル印加装置。
【請求項８】
２つ以上の熱媒体を供給する熱媒体供給手段と、前記複数の熱媒体供給手段から供給された熱媒体を１つに集合し入口側から出口側に流す空洞部分と、前記熱媒体の流れの方向に沿って複数のサンプルを前記空洞部分に保持するサンプル保持部を有するチャンバとを備えた熱サイクル印加装置において、熱媒体の供給を制御するために、流量特性が異なる開閉弁を１つの熱媒体につき並列に３つ以上有することを特徴とする熱サイクル印加方法。
【請求項９】
前記開閉弁が電気的に開閉制御可能な電磁弁であることを特徴とする請求項８に記載の熱サイクル印加方法。
【請求項１０】
さらに、チャンバとは別体として並列に設けられ、該チャンバの出口側の一部と入り口の一部とに接続され、該チャンバの該出口側から熱媒体の一部を該入り口側に還流させるバイパス経路を備えたことを特徴とする請求項８または９に記載の熱サイクル印加方法。
【請求項１１】
さらに、流量特性が異なる開閉弁を、それぞれの開閉弁の音速コンダクタンスＣと開時間の積を指標に制御する機構を備えたことを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載の熱サイクル印加方法。
【請求項１２】
流量特性が異なる開閉弁が、音速コンダクタンスＣが０．１以上０．２以下dm3／(s・bar)の開閉弁から少なくとも一つ選択され、音速コンダクタンスＣが０．２以上０.５以下 dm3／(s・bar) の開閉弁から少なくとも一つ選択され、音速コンダクタンスＣが１．５以上３．５以下dm3／(s・bar) の開閉弁から少なくとも一つ選択されることを特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載の熱サイクル印加方法。
【請求項１３】
前記熱媒体が、気体であることを特徴とする請求項８〜１２のいずれかに記載の熱サイクル印加方法。
【請求項１４】
前記熱媒体が、空気であることを特徴とする請求項８〜１２のいずれかに記載の熱サイクル印加方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検定サンプルに熱サイクルを印加する方法および熱サイクル印加装置に関し、特に、流体流を利用してサンプルキャリア内の検定サンプルに熱サイクルを印加する方法および熱サイクル印加装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と呼ばれる核酸増幅技術が普及し、広く医学・生物学の研究や臨床診断、環境検査等の分野で高感度な核酸分析が可能となった。このＰＣＲは、２種類のプライマーを用いて特定配列を増幅する手法である。ＰＣＲは、２本鎖ＤＮＡを第１の温度で解離する変性工程（概ね９０〜９８℃）、解離した１本鎖ＤＮＡに第２の温度でプライマーを結合させるアニーリング工程（概ね５０〜７０℃）、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の働きにより第３の温度でプライマーから１塩基ずつ相補鎖を合成する伸張工程（概ね６０〜７５℃）の３段階の工程を１サイクルとして進行し、１サイクル毎にプライマーに挟まれた特定の核酸領域が２倍に増幅する。そこで、第１〜第３の温度との間を遷移させる熱サイクルをｎ回繰り返すことによって２のｎ乗倍のＤＮＡを複製することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
また２本鎖ＤＮＡの解離する温度が、そのＤＮＡの塩基長に概ね相関がある特徴を利用して、複製したＤＮＡが目的の領域かどうかを検証する手段の１つとして、ＤＮＡの複製後に、アニーリング工程の温度付近（概ね５０〜７０℃）から変性工程の温度付近（概ね９０〜９８℃）までの間を一定のランプレートでほぼ直線的に温度を増加させていく温度サイクル工程を最低1回行うことが一般的に実施されている。
【０００４】
核酸増幅のために核酸を含むサンプルに上記の熱サイクルを印加する方法としては、複数のサンプルを金属製ブロックに格納して金属製ブロックを加熱又は冷却することでサンプルに熱サイクルを印加するブロックサイクル法が一般的である。また高速に温度サイクルを印加するために、筒状空洞内に試料容器を配置し、熱風と冷風の圧縮空気を空洞の片側から交互に噴射させ、加熱及び冷却を行い、一定温度に保持するときは空気を微流量にする高速気相サイクル法も提案されている（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３参照）。
【０００５】
しかし、上記従来技術によるシステムには両方とも問題点がある。
まず、ブロックサイクル法は、熱伝達効率が悪く、作動させるのにエネルギーと時間がかかり過ぎ、好ましくない。すなわち熱サイクルを所定回数印加するために要する時間がかかり、核酸増幅のために要する所要時間が長くなる。
【０００６】
高速気相サイクル法では、試料容器境界の空気流速が非常に大きく、熱交換効率が高いため、昇温・冷却速度が大きくなり（１０〜４０℃／ｓｅｃ）、核酸増幅の所用時間が短いが、一方では一定の温度で保持する工程や、一定のランプレートで徐々に加熱していく工程などでは、温度応答があまりに速いため制御温度が一定にならず、目標温度付近を振動し、好ましくない。
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、第１３５０頁−第１３５４頁、１９８５年
【特許文献１】WO２００４／０４２０８６
【特許文献２】特表２００６−５０４４２９
【特許文献３】特願２００５−２９００８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記従来技術では、熱サイクルを所定回数だけ印加するために要する時間が長くなり、その結果、例えば、サンプルとして核酸を用い、所定の酵素によって核酸増幅を行う場合には、核酸増幅のための所要時間が長くなる。また、高速性を図ろうとすると熱サイクルの各温度精度が悪くなるという問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、熱サイクルにおいて、圧縮ガスを用いることによって高速で温度遷移させることができると共に、熱サイクル中の一定温度、あるいは一定ランプレートで温度を保持する際に温度精度を高くすることができる熱サイクル印加装置および熱サイクル印加方法を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１１】
１．２つ以上の熱媒体を供給する熱媒体供給手段と、前記複数の熱媒体供給手段から供給された熱媒体を１つに集合し入口側から出口側に流す空洞部分と、前記熱媒体の流れの方向に沿って複数のサンプルを前記空洞部分に保持するサンプル保持部を有するチャンバとを備えた熱サイクル印加装置において、熱媒体の供給を制御するために、流量特性が異なる開閉弁を１つの熱媒体につき並列に３つ以上有することを特徴とする熱サイクル印加装置。
２．前記開閉弁が電気的に開閉制御可能な電磁弁であることを特徴とする１の熱サイクル印加装置。
３．さらに、チャンバとは別体として並列に設けられ、該チャンバの出口側の一部と入り口の一部とに接続され、該チャンバの該出口側から熱媒体の一部を該入り口側に還流させるバイパス経路を備えたことを特徴とする１または２の熱サイクル印加装置。
４．さらに、流量特性が異なる開閉弁を、それぞれの開閉弁の音速コンダクタンスＣと開時間の積を指標に制御する機構を備えたことを特徴とする１〜３のいずれかの熱サイクル印加装置。
５．流量特性が異なる開閉弁が、音速コンダクタンスＣが０．１以上０．２以下dm3／(s・bar)の開閉弁から少なくとも一つ選択され、音速コンダクタンスＣが０．２以上０.５以下 dm3／(s・bar) の開閉弁から少なくとも一つ選択され、音速コンダクタンスＣが１．５以上３．５以下 dm3／(s・bar) の開閉弁から少なくとも一つ選択されることを特徴とする１〜４のいずれかの熱サイクル印加装置。
６．前記熱媒体が、気体であることを特徴とする１〜５のいずれかの熱サイクル印加装置。
７．前記熱媒体が、空気であることを特徴とする１〜５のいずれかの熱サイクル印加装置。
８．２つ以上の熱媒体を供給する熱媒体供給手段と、前記複数の熱媒体供給手段から供給された熱媒体を１つに集合し入口側から出口側に流す空洞部分と、前記熱媒体の流れの方向に沿って複数のサンプルを前記空洞部分に保持するサンプル保持部を有するチャンバとを備えた熱サイクル印加装置において、熱媒体の供給を制御するために、流量特性が異なる開閉弁を１つの熱媒体につき並列に３つ以上有することを特徴とする熱サイクル印加方法。
９．前記開閉弁が電気的に開閉制御可能な電磁弁であることを特徴とする８の熱サイクル印加方法。
１０．さらに、チャンバとは別体として並列に設けられ、該チャンバの出口側の一部と入り口の一部とに接続され、該チャンバの該出口側から熱媒体の一部を該入り口側に還流させるバイパス経路を備えたことを特徴とする８または９の熱サイクル印加方法。
１１．さらに、流量特性が異なる開閉弁を、それぞれの開閉弁の音速コンダクタンスＣと開時間の積を指標に制御する機構を備えたことを特徴とする８〜１０のいずれかの熱サイクル印加方法。
１２．流量特性が異なる開閉弁が、音速コンダクタンスＣが０．１以上０．２以下dm3／(s・bar)の開閉弁から少なくとも一つ選択され、音速コンダクタンスＣが０．２以上０.５以下 dm3／(s・bar) の開閉弁から少なくとも一つ選択され、音速コンダクタンスＣが１．５以上３．５以下dm3／(s・bar) の開閉弁から少なくとも一つ選択されることを特徴とする８〜１１のいずれかの熱サイクル印加方法。
１３．前記熱媒体が、気体であることを特徴とする８〜１２のいずれかの熱サイクル印加方法。
１４．前記熱媒体が、空気であることを特徴とする８〜１２のいずれかの熱サイクル印加方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る熱サイクル印加装置によれば、温度及び流量を制御した熱媒体を用いることによって高速で温度遷移させることができる。また、熱サイクルにおいて、一定温度に保持する場合に、それぞれの熱媒体流の制御に３つ以上の流量特性が異なる高速に切替可能な電磁弁を並列で使用することによって、温度遷移速度を低下させることなく、一定温度や一定傾きの温度制御精度を高めることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の実施の形態に係る熱サイクル印加装置について添付図面を用いて説明する。なお、図面において実質的に同一の部材には同一の符号を付している。
【００１４】
実施の形態
図１は、本発明の実施の形態に係る熱サイクル印加装置２１の構成を示すブロック図である。この熱サイクル印加装置２１は、熱媒体として圧縮ガス源１、マニホールド２、電磁弁３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、冷却コイル４、熱風ヒータ５、チャンバ６を備える。さらに、バイパス経路７を備えていてもよい。この熱サイクル印加装置２１では、圧縮ガス源１より供給された圧縮ガスがマニホールド２内に並列に設置された電磁弁３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆに分配される。圧縮ガスは、マニホールド２内の電磁弁３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆの後で、冷却ラインと加熱ラインに分割される。冷却ラインでは冷却コイル４を通過して冷却された後、冷風がチャンバ６に供給される。一方、加熱ラインでは熱風ヒータ５を通過して加熱された後、熱風がチャンバ６に供給される。電磁弁３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆの制御により冷却ライン及び加熱ラインからチャンバ６に供給される圧縮ガスを制御して、チャンバ６内に保持されたサンプルに所定の熱サイクルを印加する。
【００１５】
熱サイクルにおいて、高速に温度遷移させる場合でも、一定温度や一定傾きで温度制御する場合でも、熱媒体の温度はチャンバに供給される前に、サンプルの目標温度よりも加熱ラインは高温に、冷却ラインは低温になるように、予めある範囲内に制御しておくことが好ましい。その制御温度は、高速に温度遷移させる場合には、サンプルの目標温度との差が大きい方が遷移速度が上がり有利であるが、反面一定温度や一定傾きで温度制御する場合では、サンプルの目標温度との差が小さい方が温度制御精度が高まり有利であるなど、相反する要求となるため、その最適化が必要である。例えば目標温度が５０〜９５℃ぐらいの温度サイクルの場合には、熱媒体の温度は、加熱ラインは１５０〜２００℃、冷却ラインは０〜３０℃が好ましい。
【００１６】
急速に温度を遷移させる場合には、熱媒体の流量というよりも、サンプル境界付近での熱媒体の流速が重要であり、その流速は１０〜３０ｍ／秒が好ましい。そのためには、各熱媒体ラインに必ず１つは音速コンダクタンスＣが大きい、すなわち大流量を流すことが可能な電磁弁を設置するとともに、加熱の場合は電磁弁３ａ、３ｂ、３ｃを、冷却の場合は３ｄ、３ｅ、３ｆを目標温度近くなるまですべて開放し、最大流速を流すような制御が好ましい。またオーバーシュートしないで目標温度に迅速に精度良く到達させるためには、反対方向の電磁弁、すなわち加熱中であれば冷却ラインの電磁弁、冷却中であれば加熱用の電磁弁を使用して、最適にブレーキを掛けることが重要であるが、この場合に使用する電磁弁は、前記の音速コンダクタンスＣが大きいものでは制御が振動し不可能である。そこで、音速コンダクタンスＣが小さい、すなわち小流量を流すことが可能な電磁弁を各熱媒体ラインに必ず１つ設置して、最適のブレーキを掛けることが必要である。
【００１７】
一方、一定温度や一定傾きで温度制御する場合には、熱媒体を微流量にし、あるいは熱媒体の供給を停止させるなど細かなタイミングで制御するほうが温度制御精度を向上できる。そのためには、各熱媒体ラインに必ず１つは音速コンダクタンスＣが極めて小さい、すなわち微流量を流すことが可能な電磁弁を設置するとともに、その電磁弁を中心に制御することが好ましい。
【００１８】
制御方法は、現在温度と目標温度との上下関係のみで加熱あるいは冷却の電磁弁を全開する、いわゆる２位置制御法は、制御が振動しやすいので好ましくない。現在温度と目標温度との偏差に比例定数を乗じた値を出力値とする、いわゆるＰ制御（比例制御）が、振動が小さくなり好ましく、さらに振動が小さくなるＰＩＤ制御（比例積分微分制御）がより好ましい。
【００１９】
また本発明では複数の電磁弁を使用するので、制御出力を一元化するため各電磁弁の音速コンダクタンスＣと電磁弁の開時間との積を出力指標（以下Ｃ×Ｔと記す）にし、さらに加熱する出力値を正の数、冷却を負の数とすることで、加熱から冷却までの全電磁弁を１つの出力指標Ｃ×Ｔ値で制御することが可能である。詳細には、電磁弁ごとにＣ×Ｔ値の守備範囲を予め規定しておき、実際にどの電磁弁をどれぐらいの時間開放するかは、まずＣ×Ｔ値により、どの電磁弁が制御対象になるかを判断し、次に出力指標Ｃ×Ｔ値をその電磁弁のＣ値で除算して開放時間を決定する。この制御を一定周期毎に繰り返すのだが、この周期を短くすればより細かな制御か可能となり、温度制御精度も高くなる。しかし、実際には電磁弁の応答性に限界があり、あまり短時間の制御には追従しなくなる問題がある。汎用の電磁弁ではその時間が５〜２０msecぐらいであるので、このことも考慮すると、制御周期は１００〜２００msecが好ましい。もちろん応答性の速い特殊な電磁弁を使用する場合には、それ以下の制御周期でも可能であると思われる。
【００２０】
本発明の熱サイクル印加装置では、音速コンダクタンスＣの異なる複数の電磁弁を並列に配置することで、かつそれぞれの開閉弁の音速コンダクタンスと開時間の積を指標に制御することで、温度遷移速度を低下させることなく、一定温度や一定傾きの温度制御精度を高めることが可能となる。
【００２１】
なお、本明細書中では、「チャンバ」もしくは「サンプルチャンバ」という用語は、サンプルを保持でき、所望の温度に変化させた圧縮ガスが送り込まれる部分を示す。また、「サンプル」という用語は、試験サンプル又は検定サンプルを指し、ここでは、検査対象から採取した試料と様々な試験試薬を混合したものである。
【００２２】
以下に、この熱サイクル印加装置２１の各構成部材について説明する。
【００２３】
（圧縮ガス源）
圧縮ガス源１において、熱媒体として用いる圧縮ガスの圧力は０．０５ＭＰａ〜１．０ＭＰａの範囲内が好ましく、更に好ましくは０．２ＭＰａ〜０．５ＭＰａの範囲がよい。圧縮ガスの成分は、特に限定はないが、空気、二酸化炭素、窒素、アルゴンなどでもよい。特に好ましくは、廃棄およびリサイクルに関する問題を解消することができる空気がよい。また、圧縮ガスを用いることによってサンプルを高速に温度遷移させることができるので、非常に高速に温度変化させる必要があるサンプルでは、ランプ時間が重要な因子であるので、特に有用である。
【００２４】
（マニホールド）
圧縮ガスは、マニホールド部２で２種類の流路に分岐される。一方は、冷却ラインであって、熱交換コイル部に導かれ、冷却されてもよい。もしくは、空冷にて冷却されても良い。もう一方は、加熱ラインであって、熱風ヒータ５などにより加熱される。冷却ラインで冷却された圧縮ガスと、加熱ラインで加熱された圧縮ガスは、チャンバ６の入り口部で合流される。この冷却ラインからは、例えば、０℃〜３０℃の圧縮ガスと、加熱ラインからは、例えば、１５０℃〜２００℃の圧縮ガスがチャンバ６に入力され、所定の制御タイミングでチャンバ６内に送風される。マニホールド部２に設置された電磁弁３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆを制御して、圧縮ガスを所望の流量に調整することができる。電磁弁の個数は、冷却用、加熱用それぞれに３種類以上ずつ設置すると良い。なお、設置する電磁弁３ａ（あるいは３ｄ）、３ｂ（あるいは３ｅ）、３ｃ（あるいは３ｆ）は異なる規格の電磁弁である。好ましくは、音速コンダクタンスＣが０．１以上０．２以下dm3／(s・bar)の電磁弁、音速コンダクタンスＣが０．２以上０.５以下 dm3／(s・bar)の電磁弁、音速コンダクタンスＣが１．５以上３．５以下 dm3／(s・bar)の電磁弁を冷却用と加熱用にそれぞれ1個ずつ設置するのが好ましい。
【００２５】
（チャンバ部）
チャンバ６の流体流路部の構造は、断面積が３００ｍｍ２以下の直方体形状が好ましく、更に好ましくは、断面積が１５０ｍｍ２以下の直方体形状であればよい。チャンバ６の流体流路の外側は、耐熱性に優れた熱伝導度が小さい材料で構成することが好ましく、熱伝導度が０．３W／ｍＫ以下の材料で構成することが特に好ましい。マイクロヒュージ管を保持するための挿入部８は、３０本以下が好ましく、１５本以下が特に好ましい。マイクロヒュージ管の挿入部８は、圧縮ガスの流れる方向に沿って設けることが好ましい。さらに、挿入部８は、千鳥配置に設定するのがよい。ここで、千鳥配置とは、各サンプルを保持する挿入部８が圧縮ガスの流れる方向に沿って配置されると共に、圧縮ガスの流れる方向に対して挿入部８が１本毎にジグザグになるように設けられた配置をいう。また、各マイクロヒュージ管の挿入部８間の間隔は、圧縮ガスの流れる方向に沿った成分として３〜１０ｍｍの範囲であればよく、３〜５ｍｍの範囲内で等間隔配置するのが好ましい。
【００２６】
（マイクロヒュージ管）
マイクロヒュージ管は、チャンバ６内の一側面に設けられた挿入部９から空洞部に挿入されて保持される。このマイクロヒュージ管は、サンプル溶液部分が完全にチャンバ６内の圧縮ガスが流れる空洞部内に保持されるのが好ましい。更に、マイクロヒュージ管は、チャンバ内壁との距離が０．５ｍｍ以上離れている位置に設置できるよう設計されることがさらに好ましい。マイクロヒュージ管の詳細は、内部に空洞がある円筒形状が好ましく、外径φ１〜φ３ｍｍ、肉厚が０．２ｍｍ〜０．５ｍｍものが好ましい。マイクロヒュージ（microfuge）管は、３μＬから３０μＬの溶液を保持できるものがよい。なお、サンプルとして増幅する核酸が含まれる溶液を用いる場合には、その溶液部分がチャンバ６内の空洞部内に保持されることが好ましい。
【００２７】
（バイパス経路）
バイパス経路７を備えることにより、一定温度や一定傾きの温度制御精度をさらに高めることが可能となる。つまり一定温度や一定傾きの温度制御時など通常微小流量では、熱媒体が持つ時間当たりの熱容量が小さくため、サンプル間に温度分布が発生しやすく、サンプル間の温度差が発生する危険がある。かつ温度センサへの熱伝達速度が遅くなり、この遅れにより温度制御がしづらくなり温度制御精度が低下する可能性がある。しかしチャンバ６の出口部から圧縮ガスの一部を回収し、再び入口部に戻すバイパス経路７によって、圧縮ガスを還流させチャンバ６内を攪拌することができるので、サンプル間の温度分布を軽減させ、かつ温度センサへの熱伝達速度が上がり、温度制御精度が向上させることができる。バイパス経路７は、チャンバ６の風下側に設けられたバイパス経路入口と、風上側に設けられたバイパス経路出口とを接続して設けられている。このバイパス経路入口と出口の内径は、φ２ｍｍ〜φ１０ｍｍが好ましく、φ３ｍｍ〜φ６ｍｍが特に好ましい。また、バイパス経路入口と出口の間に、マイクロヒュージ管を保持するための全ての挿入部９が存在させることが好ましい。すなわち、バイパス経路７を接続するためのバイパス経路入口と出口とは、チャンバ６の一側面に設けられたマイクロヒュージ管を保持するための全ての挿入部９を挟んで設けることが好ましい。
【００２８】
（圧縮ガス還流用ポンプ）
チャンバ６の出口側から圧縮ガスの一部を入口側に還流させる方法は、チャンバ６の出口側の一部と入口側の一部とを接続するバイパス経路７を介してポンプ８を用いて強制的に還流させることによって実現できる。ここで使用されるポンプ８は、特に限定はないが、逆方向に流量制限がかかる逆止弁などの機構を有することが好ましい。更に好ましくは、ポンプヘッド部が小容量のダイヤフラムポンプがよい。また、ポンプ流量は、１Ｌ／ｍｉｎ〜２０Ｌ／ｍｉｎのものが好ましく、更に好ましくは４Ｌ／ｍｉｎ〜１０Ｌ／ｍｉｎがよい。  
【００２９】
チャンバ６内を流れる圧縮ガスの流量がポンプ８の能力範囲内の微少流量の場合には、チャンバ６内の風下側と風上側とを接続するバイパス経路７内のポンプ８の働きにより、循環風量が発生しチャンバ６内を撹拌することができる。このポンプでの攪拌により、サンプル間の温度分布を軽減できるとともに、温度制御精度も高くなる。一方、チャンバ６内の風量がポンプ８の能力を越える大流量の場合には、ポンプ８に設置されている逆止弁の働きによってポンプ８で形成されたバイパス経路７の流量がほぼ０になるので、チャンバ６の流量が低下することはない。つまり、温度を安定化するため微風量が要求される場合は、バイパス経路７が機能して循環風量が発生しチャンバ６内を撹拌することができる。一方、急激な温度変化を要求されている場合は、逆止弁の働きでバイパス経路７が実質的に機能しない状態となって大流量の圧縮ガスがチャンバ６内をそのまま流れてサンプルに急速に温度変化を生じさせることができる。つまりバイパス流路７やポンプ８を設けることで、温度遷移速度を低下させることなく、一定温度や一定傾きの温度制御時の精度を高めることが可能となる。
【実施例】
【００３０】
本発明の実施例では、実施の形態に係る熱サイクル印加装置を核酸増幅装置として用いる場合の具体的な例について説明する。この核酸増幅装置は、図１とほぼ同様の構成を有する。各構成部材について以下に説明する。
【００３１】
［実施例１］
ａ）圧縮ガス源１としては、約０．６ＭＰａの施設計装エアーから圧力レギュレータ（ＳＭＣ製ＡＲ４２５）により０．３ＭＰａに減圧した圧縮空気を入力した。
【００３２】
ｂ）マニホールド２は、図１に示す圧縮ガス回路を有し、且つ、電磁弁３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆを固定できるようにジュラコンを材料にして加工製作した。電磁弁３ａ、３ｄには、高流量特性を有するＣＫＤ社製の型番「ＧＦＡＢ４１−５−０−１２Ｃ−３」（音速コンダクタンスＣ：2.1 dm3／(s・bar)）の電磁弁を、電磁弁３ｂ、３ｅには低流量特性を有するＣＫＤ社製の型番「ＧＦＡＢ２１−１−０−１２Ｃ−３」（音速コンダクタンスＣ：0.31 dm3／(s・bar)）の電磁弁を、電磁弁３ｃ、３ｆには微流量特性を有するＣＫＤ社製の型番「ＧＦＡＢ１１−Ｚ−０−１２Ｃ−３」（音速コンダクタンスＣ：0.15 dm3／(s・bar)）の電磁弁を選定し、マニホールド２に設置した。
【００３３】
これらの電磁弁を使用した温度制御方法に関して以下に説明する。温度制御周期は１００msecとした。制御出力は音速コンダクタンスＣと電磁弁開時間の積を指標にする。具体的には一番小さい加熱ラインの電磁弁３ｆが全開のとき、すなわち100msec開放のときの積０．０１５s*( dm3／(s・bar))を100%とし、冷却ラインの同インピーダンスの電磁弁３ｃが全開のとき、-100%とし符号を付加した。他の電磁弁の出力はそれぞれの音速コンダクタンスＣで補正し、表１のように決定した。電磁弁の制御に関しては、現在温度と目標温度との偏差に比例常数Ｐあるいは積分微分補正したP’を乗算し電磁弁の出力％に変換する。さらに算出された出力％の範囲によりどの電磁弁を選択するかは、表１の電磁弁の守備範囲に示した基準で決定する。表１では電磁弁１個使用を原則としたが、もちろん同一ラインの電磁弁であれば２個３個複数使用でも問題はないと考えている。ただし別ラインの電磁弁との複数使用はエネルギー効率が悪くなるので好ましくない。また急激な温度遷移の場合には、同一のラインの電磁弁をすべて開放したほうが遷移速度は向上する。
【００３４】
加熱能力と冷却能力が異なる場合はその能力比を考慮して、どちらのラインの出力％をその比で補正するとさらに好ましい。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
ｃ）冷却コイル４には、内径φ５ｍｍの銅管を約５ｍ使用し、巻径約２００ｍｍのらせん状に巻いたものを使用した。その冷却コイル４を氷水中に浸漬して熱交換を行った。
【００３７】
ｄ）ヒータ５には、竹綱製作所製ＳＨ１Ａ（８００Ｗ／１００Ｖ）を使用し、熱風の温度を１８０℃に制御してチャンバ６に供給した。
【００３８】
ｅ）チャンバ６は、テフロン（登録商標）を材料にして加工製作した。その空洞部は高さ２０ｍｍ、幅６mm、長さ１００ｍｍの直方体形状とし、マイクロヒュージ管をチャンバ６の上部から挿入し、底面から約１ｍｍ離して風向に対して中央３６ｍｍ内に１３本を千鳥配置になるように設置できる構造とした。
【００３９】
ｆ）チャンバ６の空洞部の風下端から１０mmの位置に設けられた内径４mmのバイパス入口と、風上端から１０mmの位置に設けられた内径４mmのバイパス出口を接続するバイパス経路７を設けた。このバイパス経路７内には、ポンプ８を設けた。ポンプ８は、榎本マイクロポンプ製ＭＶ−６００Ｇのダイヤフラム型空気ポンプを使用し、ガス流量は約６Ｌ／ｍｉｎであった。このバイパス経路７によって、チャンバ６内を流れる圧縮空気が微少流量又は停止状態の際には、チャンバ６内の空気を撹拌することができる。
【００４０】
この実施例１では、図２に示すように、
ｉ）加熱して９８℃にする
ｉｉ）最初のサイクルのみ９８℃で約１５秒間保持する
ｉｉｉ）加熱して９８℃にする
ｉｖ）９８℃から７０℃に冷却する。
ｖ）７０℃で約５秒間保持する。
という熱サイクルでｉｉｉ〜ｖの熱サイクルを３４回繰り返して印加した。また、図３は、図２の最初の部分拡大図である。
【００４１】
このときの温度変動を測定すると、図４に示すような結果となった。図４の部分拡大図を図５に示す。全所用時間は４分４５秒、７０℃での温度制御時の標準偏差は約0.14℃であり、高速な温度遷移を実現し、かつ良好な温度制御精度を実現している。
【００４２】
［実施例２］
なお、ここでは図３に示すような熱サイクルを印加したが、熱サイクルとしては上記の場合に限られず、例えば、図６に示すような熱サイクルも印加することができる。図６の熱サイクルでは、
ｉ）加熱して９０℃にする
ｉｉ）最初のサイクルのみ９０℃で約１５秒間保持する
ｉｉｉ）加熱して９０℃にする。
ｉｖ）９０℃から６０℃に遷移させる。
ｖ）６０℃で３秒間保持する。
ｖｉ）６０℃から７２℃に遷移させる。
ｖｉｉ）７２℃で３秒間保持する。
という熱サイクルを複数回にわたって印加する場合の最初の部分拡大図を示している。この熱サイクルでは、図３の熱サイクルと比較すると、第１の温度（９０℃）、第２の温度（６０℃）に加えて、第３の温度（７２℃）での工程を設けている。このように、使用する酵素が働く温度に応じて熱サイクルを構成する温度を選択すればよい。また、この熱サイクルの回数は、サンプルに応じて適宜選択すればよい。例えば、核酸増幅がおよそ１０９（＝２３０倍）倍程度必要な場合には、３０サイクル程度行えばよい。
【００４３】
［実施例３］
次に、２本鎖核酸の解離温度が核酸の長さに相関する性質を利用して増幅した核酸の増幅長を解析する、いわゆる融解曲線解析とよばれる手法においての温度印加方法について具体的に説明する。
【００４４】
２本鎖核酸が解離したことを蛍光量の変化により検知する試薬システムおよび光学システムを採用して、図７に示すように、
ｉ）加熱して７０℃にする
ｉｉ）７０℃で約５秒間保持する
ｉｉｉ）徐々に加熱して傾き０．２℃／秒で９５℃に昇温する
という熱パターンを印加しながら、蛍光量が変化する最大点（変曲点）の温度を計測するのが、融解曲線解析である。この場合蛍光量が一方では温度に対して非常に敏感に変動するため、このときの温度制御精度を高めることが解析精度を向上させるのに重要である。
実施例においての温度変動を測定すると、図８に示すような結果となった。
【００４５】
このように温度をある小さな一定傾きに沿って昇温する場合は、一定温度に維持する方法とは異なる制御方法が有効である。すなわち一定温度制御の場合には冷却ラインおよび加熱ラインに設置した低流量および微流量特性の電磁弁２個のON／OFFを利用して冷風や熱風双方で制御するほうが好ましいが、ある小さな一定傾きで昇温させる場合は、加熱ラインに設置した微流量の電磁弁１個のON／OFFのみで制御するほうが好ましい。
【００４６】
すなわち基本的な制御方法は実施例１に記載の方法と同じであるが、目標温度が一定ではなく、時間とともに直線的に増加させる、つまり１周期毎に目標温度を一定値増加させる必要がある。さらにこのように一定傾きで昇温させる場合は、冷却能力が高くなるため実際の出力%を計算するときに大きく出力を減少させる係数を乗算する必要があり、検討を進めた結果、補正係数がほぼ０、つまり冷却ラインのバルブは使用しないほうが温度の振動がなく制御精度が高い結果となった。またこの場合は加熱でのオーバーシュートを防止する目的で加熱能力も極力低くなるように、音速インピーダンスＣができるだけ小さい電磁弁を使用することが重要であるので、電磁弁３ｆのみで制御することとした。
【００４７】
温度精度を拡大し解析するため、時々刻々と変化する目標温度とその時点での温度のずれをプロットしたものが図９である。バラツキを定量化するためその温度のずれの標準偏差を計算したところ、ＳＤ＝０．０４５℃であり、２ＳＤでも０．１℃以内と精度高い温度制御結果であった。
【００４８】
［比較例］
比較のために電磁弁３ｃと３ｆを使用せず、低流量特性を有する加熱ラインの電磁弁３ｅのみのON／OFF制御で、前記図７の熱サイクルを実施したところ、図１０、図１１に示す結果となった。同じくバラツキを定量化するため温度のずれの標準偏差を計算したところ、ＳＤ＝０．０６８であり、２ＳＤで約０．１４℃と、上記６バルブ仕様に比べて性能が明らかに低下した結果となった。
【００４９】
これらのことから熱媒体の供給を制御するために、流量特性が異なる開閉弁を１つの熱媒体につき並列に３つ以上有することを特徴とする本発明の熱サイクル印加装置や方法で、高速な温度遷移と高い温度制御精度の両立が実現される。
【００５０】
この核酸増幅装置によれば、核酸増幅を迅速に行うことができ、遺伝子判定、病原菌に対する薬剤選択などを迅速化できるので、産業界に大きく寄与することが期待される。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明に係る熱サイクル印加装置は、圧縮ガスを用いてサンプルを高速に温度遷移させることができ、かつ一定温度や一定の温度傾きの制御精度を高めた性能を有するので、サンプルに多数回の熱サイクルを印加する核酸増幅装置としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明の実施の形態に係る熱サイクル印加装置の構成を示す概略図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る熱サイクル例１である。
【図３】図２の拡大図である。
【図４】本発明の熱サイクル例１におけるデータである。
【図５】図４の拡大例である。
【図６】本発明の実施の形態に係る熱サイクル例２である。
【図７】本発明の実施の形態に係る加熱パターン例３である。
【図８】本発明の加熱パターン例３おけるデータである。
【図９】図８の拡大図である。
【図１０】従来法の加熱パターン例３おけるデータである。（比較例）
【図１１】図１０の拡大図である。（比較例）
【符号の説明】
【００５３】
１  圧縮ガス源、２  マニホールド、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ  電磁弁、４  冷却コイル、５  ヒータ、６  チャンバ、７  バイパス経路、８  ポンプ、９  マイクロヒュージ管挿入部、２１  熱サイクル印加装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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