(57)【要約】    【課題】試料に照射される励起光の光量変化を正確に補正できる蛍光検出器及び蛍光分析方法を提供する。    【解決手段】光源ランプ２から光が発せられると、レンズ４ａ，４ｂ、励起側波長選択手段６及びレンズ８ａ，８ｂで構成される第１光学系により、試料セル１０中の試料に励起光が照射される。蛍光を含む試料セル１０中の試料からの光はレンズ１２ａ，１２ｂによって集光され、スリット１４を介して回折格子１６に入射し、波長ごとに分光されてアレイ状の光検出器１８の受光面上に結像する。光検出器１８の受光面に配列された受光素子のうち、励起光の波長に対応する受光素子が励起光受光部となり、それ以外の受光素子が蛍光受光部となる。蛍光光量補正部１９は蛍光受光部の検出信号を励起光受光部の検出信号で割り算した値を測定値として出力する。    【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、試料セルと、前記光源からの光を前記試料セル内の試料に励起光として照射するための第１光学系と、前記試料から発生した蛍光を検出するための蛍光検出部と、前記蛍光検出部に前記試料からの蛍光を選択的に入射させるための第２光学系と、を備えた蛍光検出器において、
前記試料セルからの散乱光を検出するための励起光検出部と、
前記試料セルにおける試料の蛍光測定部位と同じ部位からの散乱光を前記励起光検出部に入射させるための第３光学系と、
前記蛍光検出部の検出値を前記励起光検出部の検出値で補正する蛍光光量補正部と、をさらに備えていることを特徴とする蛍光検出器。
【請求項２】
前記第２光学系と第３光学系は分光素子を共用しており、
前記蛍光検出部と前記励起光検出部は前記分光素子の分光方向に受光素子が配列されたアレイ状光検出器により構成され、前記蛍光検出部は前記分光素子によって分光された光のうち蛍光波長の光を受光する位置に配置された受光素子であり、前記励起光検出部は前記分光素子によって分光された光のうち励起光波長の光を受光する位置に配置された受光素子である請求項１に記載の蛍光検出器。
【請求項３】
前記第２光学系と前記第３光学系は、蛍光波長帯域の光と励起光に相当する波長帯域の光の一方を反射させ、他方を透過させるように設定されたダイクロックミラーを共用し、前記ダイクロックミラーを経た光のうち蛍光波長帯域の光が前記蛍光検出部で検出され、励起光に相当する波長帯域の光が前記励起光検出部で検出されるように構成されている請求項１に記載の蛍光検出器。
【請求項４】
前記第２光学系と前記第３光学系は前記第１光学系から前記試料セルに入射される励起光の光軸を対称軸とする軸対称の位置に配置されている請求項１に記載の蛍光検出器。
【請求項５】
前記第３光学系は励起光波長を選択して前記励起光検出部に導く分光素子を備えている請求項４に記載の蛍光検出器。
【請求項６】
前記第２光学系と前記第３光学系は、前記試料セルからの光の一部を反射させて残りを透過させる光束分離手段を共用し、前記光束分離手段によって分離された光の一方が前記励起光検出部で検出され、他方が前記蛍光検出部で検出されるように構成されている請求項１に記載の蛍光検出器。
【請求項７】
前記第３光学系は励起光波長を選択して前記励起光検出部に導く分光素子を備えている請求項６に記載の蛍光検出器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に励起光を照射し、試料から発せられる蛍光を測定する蛍光検出器に関するものである。蛍光検出器は液体クロマトグラフの検出器として、又は単独の分光検出器などとして使用される。
【背景技術】
【０００２】
図６に従来の蛍光検出器の構成を概略的に示す。
一般的な蛍光検出器は、例えばキセノンランプなどの放電灯からなる光源２からの光を分光し、試料の吸収波長に相当する光を励起光として試料セル１０に集光するための第１光学系と、試料からの光を集光し、例えば光電子増倍管などの光検出器４８に入射させるための第２光学系とを備えている。
【０００３】
励起光を試料に照射するための第１光学系は、試料の吸収波長に合った光のみを励起光として取り出すためのグレーティングなどによる分光器や干渉フィルタなどのフィルタによって構成される励起側波長選択手段６と、光源２からの光を励起側波長選択手段６に集光するための一対のレンズ４ａ，４ｂと、励起側波長選択手段６からの励起光を試料セル１０の試料に照射するための一対のレンズ８ａ，８ｂと、で構成されている。
【０００４】
試料からの光を光検出器４８に入射させるための第２光学系は、蛍光波長の光を光検出器４８に入射させるための蛍光側波長選択手段４６と、試料からの光を蛍光側波長選択手段４６に集光するための一対のレンズ４４ａ，４４ｂと、で構成されている。
【０００５】
試料から発せられる蛍光光量は試料に照射される励起光光量に比例する。光源２の光量が変化すると励起光光量が変化し、試料から発せられる蛍光光量が変化するため、光源の光量の変化は蛍光測定のノイズとなる。
【０００６】
そこで、図６にも示されているように、励起側波長選択手段６から試料までの間に、例えばビームスプリッタ５０を配置し、励起光の一部を蛍光測定用の光検出器４８とは別途設けられた光検出器５２に入射させて測定し、光検出器４８で測定した蛍光光量を光検出器５２で測定した励起光光量で割り算した値を測定値として出力するようにして、光源２からの光量の変動によるノイズの影響を小さくすることが行なわれていた。同様の蛍光検出器は他にも報告されている（特許文献１参照。）。
【０００７】
また、図７に示されるように、試料セル１０の励起光が入射する側とは反対側に光検出器５２を配置し、試料セル１０を透過した励起光光量を測定して光検出器４８で測定した蛍光光量を光検出器５２で測定した励起光光量で割り算し、測定値として出力することも行なわれている。
【特許文献１】特開平８−１３６５２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
蛍光は、試料セル内に配置されている試料の励起光が照射されている部分から発光する。しかし、例えば液体クロマトグラフに用いられる蛍光検出器などは試料セルが小型であり、励起側の分光器から出射された光の一部がアパーチャやセルによって遮光される場合がある。このような場合、上記したような、光源の光量変化を補正するために測定する励起光光量と試料を励起している励起光光量とは完全には一致していない。そのため、光源光量の変動により生じる励起光光量の変化に伴なう、試料から発せられる蛍光光量の変化を完全に補正することができず、蛍光検出器の出力に光源光量の変化によるノイズを含んでしまっていた。蛍光検出器の出力に光源光量の変化によるノイズが含まれると、測定精度が低下し、高感度検出ができないという問題があった。
【０００９】
そこで本発明は、試料に照射される励起光の光量変化を正確に補正できる蛍光検出器を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、光源と、試料セルと、光源からの光を試料セル内の試料に励起光として照射するための第１光学系と、試料から発生した蛍光を検出するための蛍光検出部と、蛍光検出部に試料からの蛍光を選択的に入射させるための第２光学系と、を備えた蛍光検出器であって、試料セルからの散乱光を検出するための励起光検出部と、試料セルにおける試料の蛍光測定部位と同じ部位からの散乱光を励起光検出部に入射させるための第３光学系と、蛍光検出部の検出値を励起光検出部の検出値で補正する蛍光光量補正部と、をさらに備えていることを特徴とするものである。
【００１１】
本発明の蛍光検出器における好ましい形態として、第２光学系と第３光学系は分光素子を共用しており、蛍光検出部と励起光検出部は分光素子の分光方向に受光素子が配列されたアレイ状光検出器により構成され、蛍光検出部は分光素子によって分光された光のうち蛍光波長の光を受光する位置に配置された受光素子であり、励起光検出部は分光素子によって分光された光のうち励起光波長の光を受光する位置に配置された受光素子であるものを挙げることができる。
【００１２】
また、好ましい形態の別の例として、第２光学系及び第３光学系は、蛍光波長帯域の光と散乱光に相当する波長帯域の光の一方を反射させ、他方を透過させるように設定されたダイクロックミラーを共用し、ダイクロックミラーを経た光が蛍光検出部及び励起光検出部で検出されるように構成されているものを挙げることができる。
【００１３】
好ましい形態のさらに別の例として、前記第２光学系と前記第３光学系は前記第１の光学系から前記試料セルに入射される励起光の光軸を対称軸とする軸対称の位置に配置され、蛍光検出部は第２光学系から出射光が入射する位置に、励起光検出部は第３光学系からの出射光が入射する位置に配置されているものが挙げられる。
この場合、第３光学系は励起光波長を選択して励起光検出部に導く分光素子を備えていることが好ましい。そうすれば、励起光検出部側に導かれる光から試料から発せられた蛍光を除去できるので、励起光検出部で検出される光に蛍光を含むことによる誤差をなくすことができる。
【００１４】
また、好ましいさらに別の形態としては、第２光学系と第３光学系は、試料セルからの光の一部を反射させて残りを透過させる光束分離手段を共用し、その光束分離手段によって分離された光の一方が励起光検出部で検出され、他方が蛍光検出部で検出されるように構成されているものであってもよい。
この場合にも、第３光学系は励起光波長を選択して励起光検出部に導く分光素子を備えていることが好ましい。そうすれば、励起光検出部側に導かれる光から試料から発せられた蛍光を除去できるので、励起光検出部で検出される光に蛍光を含むことによる誤差をなくすことができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の蛍光検出器では、試料から発光される蛍光を検出する蛍光検出部とは別に、試料セル中の試料の蛍光測定部位からの散乱光を検出する励起光検出部を備え、蛍光検出部で測定した蛍光光量を励起光検出部で測定した散乱光量で割り算した値を測定値として出力するようにしたので、試料セルにおける蛍光が発せられる部位に照射されている励起光光量の変化を正確に把握して、その変化に対応して試料からの蛍光光量を正確に補正することができる。すなわち、試料セル中の試料からの散乱光量は試料に照射されている励起光光量の変動に対応しているため、散乱光量を測定してその値で試料からの蛍光光量を割り算した値を出力とすることで、試料に照射される励起光光量の変化に影響されない出力値を得ることができる。これにより、試料に照射される励起光光量の変化によるノイズの少ない高感度測定を行なうことができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
[実施例１]
図１は本発明にかかる蛍光検出器の第１の実施例を概略的に示す構成図である。
試料セル１０は例えば本発明が液体クロマトグラフの検出器として用いられる場合にはフローセルであるが、それに限らず、単独の分光蛍光検出器のセルであってもよい。
この蛍光検出器は、光源ランプ２で発生された光を試料セル１０中の試料に照射し、それによって発生する試料からの光を光検出器１８に入射させて検出する。
光源ランプ２と試料セル１０の間には、光源ランプ２からの光を分光して試料の吸収波長にあった波長を選択して取り出し、励起光として試料セル１０の試料に照射するための第１光学系が設けられている。第１光学系は、光源ランプ２からの光を集光するための一対のレンズ４ａ，４ｂと、グレーティングなどによる分光器や干渉フィルタなどのフィルタによって構成され、レンズ４ａ，４ｂによって集光された光を分光し、試料の吸収波長の光を選択して励起光として取り出すための励起側波長選択手段６と、励起側波長選択手段６からの励起光を試料セル１０に集光するための一対のレンズ８ａ，８ｂと、で構成されている。
【００１７】
試料セル１０と光検出器１８の間には、試料セル１０の試料からの蛍光及び散乱光を集光し、波長ごとに分光して光検出器１８に入射させるための第２光学系が設けられている。第２光学系は、試料セル１０の試料からの光を集光するための一対のレンズ１２ａ，１２ｂと、レンズ１２ａ，１２ｂで集光された光を回折格子１６に入射させるスリット１４、入射した光を波長ごとに分光する回折格子１６と、で構成されている。
【００１８】
光検出器１８は、例えばフォトダイオードアレイなど、複数の受光素子がアレイ状に配列されたものである。光検出器１８において、回折格子１６により分光された光のうち蛍光波長の光が入射する位置に配置されている受光素子が蛍光受光部を構成し、散乱光に相当する波長の光が入射する位置に配置されている受光素子が励起光受光部を構成する。この実施例では、光検出器１８の受光面に配置されている受光素子のうち、励起光波長の光に対応する受光素子が励起光受光部となり、蛍光波長の光に対応する受光素子が蛍光受光部となる。すなわち、一対のレンズ１２ａ，１２ｂ、スリット１４及び回折格子１６は、試料セル１０中の試料の蛍光測定部位と同じ部位からの散乱光を励起光受光部に入射させるための第３光学系も構成している。
【００１９】
１９は光検出器１８の蛍光受光部の信号を励起光受光部の信号で補正して出力する蛍光光量補正部である。すなわち蛍光光量補正部１９は、光検出器１８の励起光受光部に配置されている受光素子の信号で、蛍光受光部の受光素子の信号を割り算して蛍光光量の測定値として出力する。試料からの蛍光と散乱光はともに試料セル１０の試料に照射された励起光光量の変動によって同じように変動するため、測定した蛍光光量を散乱光量で割り算した値を測定値とすることで、試料に照射された励起光光量の変動による影響の少ない測定値を得ることができる。
【００２０】
この実施例の蛍光検出器の動作を説明する。
光源ランプ２から出た光はレンズ４ａ，４ｂによって集光され、励起側波長選択手段６に入射する。励起側波長選択手段６から出射された励起光はレンズ８ａ，８ｂによって集光され、試料セル１０内の試料に照射される。試料セル１０内で発生した蛍光及び散乱光はレンズ１２ａ，１２ｂによって集光されてスリット１４を介して回折格子１６に入射し、アレイ状の光検出器１８の受光面上に結像する。蛍光光量補正部１９により、光検出器１８の蛍光受光部に相当する受光素子の信号が励起光受光部に相当する受光素子の信号によって割り算された値が測定値として出力される。
【００２１】
[実施例２]
図２は蛍光検出器の第２の実施例を概略的に示す構成図である。
この実施例の蛍光検出器は、ダイクロックミラー２２を用いて、試料からの光を蛍光を含む光と散乱光を含む光とに分光し、それぞれを別々の光検出器２８ａ，２８ｂにより検出する。光検出器２８ａ，２８ｂとしては光電子増倍管やホトダイオードなどを用いることができる。この実施例においては、光検出器２８ａを励起光検出部、光検出器２８ｂを蛍光検出部とするが、本発明はこれに限定されるものではなく、光検出器２８ａを蛍光検出部、光検出器２８ｂを励起光検出部としてもよい。
【００２２】
光源ランプ２と試料セル１０の間には、光源ランプ２からの光を分光して試料の吸収波長の光を励起光として試料セル１０の試料に照射するための第１光学系が設けられているが、第１光学系の構成は実施例１のものと同じであるので、ここでの詳細な説明は省略する。
【００２３】
試料セル１０と光検出器２８ａ，２８ｂとの間には、試料からの蛍光を集光して蛍光検出部としての光検出器２８ｂに入射させる第２光学系と、試料セル１０中の試料の蛍光測定部位と同じ部位からの散乱光を集光して励起光検出部としての光検出器２８ａに入射させる第３光学系が配置されている。
【００２４】
蛍光を光検出器２８ｂに入射させるための第２光学系は、試料セルからの光を平行光にするレンズ２０と、蛍光波長を含む波長領域の光を反射させ、散乱光に相当する波長領域の光を透過させるダイクロックミラー２２と、ダイクロックミラー２２により反射された光のうち、蛍光波長の光のみを透過させる干渉フィルタ２４ｂと、干渉フィルタ２４ｂを透過した光を光検出器２８ｂの受光面に集光するレンズ２６ｂと、で構成されている。
【００２５】
散乱光を光検出器２８ａに入射させるための第３光学系は、レンズ２０と、ダイクロックミラー２２と、ダイクロックミラー２２を透過した光のうち、散乱光、すなわち励起光波長の光のみを透過させる干渉フィルタ２４ａと、干渉フィルタ２４ａを透過した光を光検出器２８ａの受光面に集光するレンズ２６ａと、で構成されている。
【００２６】
３０は光検出器２８ｂで得た蛍光光量の信号を光検出器２８ａで得た散乱光の信号で割り算することで補正し、補正後の値を測定値として出力する蛍光光量補正部である。実施例１の蛍光光量補正部１９と同様に、蛍光光量補正部３０から出力される測定値は、試料セル１０の蛍光測定部位と同じ部位からの散乱光によって蛍光光量が補正されるので、実際に試料に照射された励起光の変動によるノイズの小さいものとなる。
【００２７】
この実施例の蛍光検出器の動作を説明する。
光源ランプ２からの光が第１光学系を経て励起光として試料セル１０の試料に照射されると、試料からの蛍光及び散乱光が発せられる。試料からの蛍光及び散乱光はレンズ２０で平行光とされ、ダイクロックミラー２２に入射する。ダイクロックミラー２２により反射された光は干渉フィルタ２４ｂを経てレンズ２６ｂにより集光されて光検出器２６ｂに入射し、ダイクロックミラー２２を透過した光は干渉フィルタ２４ａを経てレンズ２６ａにより集光されて光検出器２６ａに入射する。ダイクロックミラー２２で反射された光は蛍光波長の光を含み、さらに干渉フィルタ２４ｂを経て蛍光波長の光が光検出器２８ｂに入射する。他方、ダイクロックミラー２２を透過した光は蛍光波長の光を含まない光であり、さらに干渉フィルタ２４ａを経て励起光波長の光が光検出器２８ａに入射する。したがって、光検出器２８ｂでは試料から発せられた蛍光光量が測定され、光検出器２８ａでは試料セル１０の蛍光測定部位と同じ部位からの散乱光量が測定される。蛍光光量補正部３０は光検出器２８ａ及び２８ｂの検出信号を読みとり、蛍光光量の信号を散乱光量の信号で割り算した値を測定値として出力する。
【００２８】
なお、この実施例では、特定波長領域の蛍光及び励起光を測定するように構成されているが、本発明はこれに限定されるものではなく、例えばダイクロックミラー、フィルタ及び集光レンズの組み合わせを蛍光検出側に増やして複数の波長領域の蛍光を検出するように構成してもよい。
【００２９】
[実施例３]
図３は蛍光検出器の第３の実施例を概略的に示す構成図である。
この実施例の蛍光検出器は、試料から発せられる蛍光を検出するための光検出器３６とは試料セル１０を挟んで反対側に試料セル１０中の試料の蛍光測定部位と同じ部位からの散乱光を測定するための光検出器４０が設けられている。光源ランプ２から試料セル１０までの間には第１光学系が設けられ、試料セル１０から光検出器３６までの間には第２光学系が設けられ、試料セル１０から光検出器４０までの間には第３光学系が設けられている。第１光学系については、実施例１及び実施例２と同じであるので、ここでの詳細な説明は省略する。
【００３０】
第２光学系は、試料セル１０の試料からの光を蛍光側波長選択手段３４に集光するための一対のレンズ３２ａ，３２ｂと、集光された光を分光する分光器や特定の波長領域の光のみを透過させるフィルタなどを備え、試料から発せられた蛍光波長の光を例えば光電子増倍管からなる光検出器３６に入射させる蛍光側波長選択手段３４と、で構成されている。
第３光学系は、試料セル１０の試料からの光を、例えばホトダイオードなどの光検出器４０に集光して入射させるための一対のレンズ３８ａ，３８ｂにより構成されている。
【００３１】
光検出器３６及び４０の検出信号は蛍光光量補正部３０に送信され、光検出器３６で得られた信号を光検出器４０で得られた信号で割り算した値が測定値として出力される。
この実施例では、光検出器４０で検出される光には試料セル１０の蛍光測定部位と同じ部位からの散乱光の他、試料から発せられた蛍光も含まれているが、試料から発せられる蛍光光量よりも試料から散乱する散乱光光量のほうがはるかに大きいため、無視することができる。図６や図７に示されているような従来の方法を用いた場合における、第１光学系から試料セルに照射される励起光量と実際に蛍光に寄与する励起光量との差によって生じる誤差に比べて、散乱光に含まれる蛍光によって生じる誤差のほうがはるかに小さくなる。
【００３２】
なお、第３光学系として、レンズ３８ｂと光検出器４０との間に、励起光波長の光を選択的に光検出器４０に入射させる波長選択手段を追加してもよい。そうすれば、光検出器４０で検出される光に試料から発せられる蛍光が含まれなくなるので、散乱光に蛍光が含まれることによって生じる誤差をなくすことができる。
【００３３】
[実施例４]
図４は蛍光検出器の第４の実施例を概略的に示す構成図である。
この蛍光検出器では、光源ランプ２から試料セル１０までの間に第１光学系が設けられ、試料セル１０から光検出器３６までの間に第２光学系が設けられ、試料セル１０から光検出器４０までの間に第３光学系が設けられている。
第１光学系の構成は実施例１，２及び３と同一であるため、ここでの詳細な説明は省略する。
【００３４】
第２光学系は、試料セル１０の試料からの光を蛍光側波長選択手段３４に集光するための一対のレンズ６０ａ，６０ｂと、レンズ６０ａ，６０ｂによって集光された光を光検出器３６側と光検出器４０側に分離するための、例えばビームスプリッタからなる光束分離手段６２と、光束分離手段６２を透過した光のうち蛍光波長帯域の光を選択して光検出器３６に導く蛍光側波長選択手段３４と、で構成されている。
第３光学系は、レンズ６０ａ，６０ｂと光束分離手段６２により構成されている。
【００３５】
上記の構成によれば、レンズ６０ａ，６０ｂによって集光された試料セル１０からの光の一部は光束分離手段６２で反射され、光検出器４０に導かれて測定される。一方、光束分離手段６２を透過した光は蛍光側波長選択手段３４に導かれ、そのうちの蛍光波長帯域の光が選択されて光検出器３６に導かれて測定される。
【００３６】
光検出器４０で検出される光には試料セル１０の蛍光測定部位と同じ部位からの散乱光の他、試料から発せられた蛍光も含まれているが、高感度分析においては試料から発せられる蛍光光量よりも試料から散乱する散乱光光量のほうがはるかに大きいため、無視することができる。このような誤差は、図６や図７に示した従来の蛍光検出器における、第１光学系から試料セルに照射される励起光量と実際に蛍光に寄与する励起光量との差に起因した誤差に比べてはるかに小さい。
【００３７】
なお、さらに蛍光光量補正部３０による補正精度を高めるために、図５に示すように、励起光に相当する波長を選択して、光電子増倍管やホトダイオードなどの光検出器４１に導く励起側波長選択手段６４を光束分離手段６２と光検出器４１との間に挿入することもできる。そうすれば、光検出器４１では蛍光を含まない試料からの散乱光を測定することができるので、散乱光に蛍光が含まれることによって生じる誤差をなくすことができる。
【００３８】
以上において説明した実施例１，２，３及び４では、光を集光する光学素子としてレンズが用いられているが、本発明はこれに限定されるものではなく、例えば凹面鏡や非球面鏡を用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】蛍光検出器の第１の実施例の構成を概略的に示す構成図である。
【図２】蛍光検出器の第２の実施例の構成を概略的に示す構成図である。
【図３】蛍光検出器の第３の実施例の構成を概略的に示す構成図である。
【図４】蛍光検出器の第４の実施例の構成を概略的に示す構成図である。
【図５】同実施例の構成に励起側波長選択手段を組み込んだ例を示す構成図である。
【図６】従来の蛍光検出器の構成の一例を概略的に示す構成図である。
【図７】従来の蛍光検出器の構成の他の例を概略的に示す構成図である。
【符号の説明】
【００４０】
２    光源ランプ
４ａ，４ｂ，８ａ，８ｂ，１２ａ，１２ｂ，２０，２６ａ，２６ｂ，３２ａ，３２ｂ，３８ａ，３８ｂ，６０ａ，６０ｂ    レンズ
６，６４    励起側波長選択手段
１０    試料セル
１４    スリット
１６    回折格子
１８    アレイ状光検出器
１９，３０    蛍光光量補正部
２２    ダイクロックミラー
２４ａ，２４ｂ    フィルタ
２８ａ，２８ｂ，３６，４０，４１    光検出器
３４    蛍光側波長選択手段
６２    ビームスプリッタ
【図１】
2008197088.tif 000003
【図２】
2008197088.tif 000004
【図３】
2008197088.tif 000005
【図４】
2008197088.tif 000006
【図５】
2008197088.tif 000007
【図６】
2008197088.tif 000008
【図７】
2008197088.tif 000009