(57)【要約】【課題】外部からのバックグランド蛍光等の影響を受けず光学測定でき，基板の表面を簡便に化学処理が行えることができるバイオチップを提供することである。【解決手段】検体中の被検出物質を蛍光又は発光標識し、蛍光又は発光強度により検出するバイオチップであって、不透明樹脂基板と不透明樹脂基板上の一部に製膜された固定化層と、固定化層に固定された有機分子と、を少なくとも備えている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の被検出物質を蛍光又は発光標識し、蛍光又は発光強度により検出するバイオチップであって、不透明樹脂基板と前記不透明樹脂基板上の一部に製膜された固定化層と、上記固定化層に固定された有機分子と、を少なくとも備えたバイオチップ。
【請求項２】
前記有機分子が、少なくともシランカップリング又はチオール基の何れか一方を介して前記固定化層に固定された請求項１記載のバイオチップ。
【請求項３】
前記有機分子が前記固定化層にシランカップリングを介して固定された請求項１記載のバイオチップ。
【請求項４】
前記固定化層が金属、半導体層又は酸化物である請求項１〜３のいずれか記載のバイオチップ。
【請求項５】
前記固定化層がシリカである請求項１又は２記載のバイオチップ。
【請求項６】
前記シリカが化学処理、蒸着またはスパッタで製膜されている請求項５記載のバイオチップ。
【請求項７】
前記不透明樹脂基板が標識された被検出物質の蛍光又は発光の波長に対して光の透過率が５％以下である請求項１〜６のいずれか記載のバイオチップ。
【請求項８】
前記不透明樹脂基板が不透明な物質を含有する樹脂基板である請求項１〜７のいずれか記載のバイオチップ。
【請求項９】
前記不透明な物質が黒色である請求項１〜８のいずれか記載のバイオチップ。
【請求項１０】
被検出物質の検出がハイブリダイゼーション反応又は抗原抗体反応である請求項１〜９のいずれか記載のバイオチップ。
【請求項１１】
前記固定化層上の有機分子が固定された領域外に、一以上の付加機能を付与した請求項１〜１０のいずれか記載のバイオチップ。
【請求項１２】
前記付加機能の一つが、疎水機能である請求項１１に記載のバイオチップ。
【請求項１３】
前記付加機能の一つが、特異吸着機能である請求項１１に記載のバイオチップ。
【請求項１４】
前記付加機能の一つが、非特異吸着機能である請求項１１に記載のバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオチップに関し、特に、検体中の被検出物質を蛍光又は発光標識し、蛍光又は発光強度により検出するバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、検体中の情報を得るために被検出物質を検出する一連の工程をマイクロメートルオーダーの微小空間内ですべて行ってしまう、いわゆるバイオチップに注目が集まっている。
【０００３】
バイオチップにおける被検出物質の検出方法としては、光学的あるいは電気的に検出する方法が一般的に知られている。特に光学的な検出方法として、検体中の被検出物質を蛍光又は発光標識し、蛍光又は発光強度を測定する方法が、比較的簡便で且つ定量的であるため多く利用されている。
【０００４】
上記光学検出においては蛍光又は発光強度を測定するため、ノイズ除去を考えた場合、基板や外部環境、さらには基板形状（例えばエッジ部）に起因したバックグランド蛍光の影響を極力抑える必要がある。
【０００５】
そこで、例えば特許文献１及び特許文献２ではバイオチップの基板材料として比較的安価で成形が容易な樹脂を選択し、バックグランド蛍光を抑えるために樹脂基板を不透明にすることが提案されている。
【０００６】
また、特許文献４では、バイオチップの基板材料としてはガラス（特に石英ガラス）を使用することが提案されている。その理由は、基板材料をガラスにすることで樹脂基板に見られるような基板自体の蛍光を抑えることができるからである。
【０００７】
一方で、バイオチップでは、ノイズ除去の問題とは別に、検体中の微量成分を高感度に検出したい場合、基板の各部位でその表面を機能的（生体分子の特異吸着性や非特異吸着防止性）に改質し、被検出物を検出部のみに捉えることが必要となる。
【０００８】
前述の樹脂基板では、通常表面が不活性であるため、その表面を機能的に改質するための例えばシランカップリング等の化学的な処理を行うことが難しい。そのため特許文献３では、樹脂基板の表面を酸化／還元処理しシランカップリング等の化学的な処理を行うことが提案されている。
【０００９】
それに対しガラス基板の表面にはＯＨ基が多数存在するため前述のシランカップリング等化学的な処理を行い易く、樹脂基板と比べ簡便に良質の機能性表面を得ることができるという特徴がある。しかし、ガラス基板は樹脂基板と比べ成形性が悪く、また材料その物の価格も高価であるという問題があった。
【特許文献１】特開２００３−１３０８７４号公報
【特許文献２】特開２００５−１８９０５０号公報
【特許文献３】特開２００５−１２１４４３号公報
【特許文献４】特開２００６−１２６１７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、材料、成形性、工程の面から安価に製作が可能なこと，基板、形状、外部からのバックグランド蛍光等の影響を受けず光学測定を行えること，基板の表面を簡便に化学処理が行えるようにすること、ができるバイオチップを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は前記目的を達成するために、本発明のバイオチップは、検体中の被検出物質を蛍光又は発光標識し、蛍光又は発光強度により検出するバイオチップであって、不透明樹脂基板と前記不透明樹脂基板上の一部に製膜された固定化層と、上記固定化層に固定された有機分子と、を少なくとも備えている。
【００１２】
本発明のバイオチップにおいては、有機分子が、少なくともシランカップリング又はチオール基の何れか一方を介して固定化層に固定されていることが好ましい。
【００１３】
本発明のバイオチップにおいては、有機分子が固定化層にシランカップリングを介して固定されていることが好ましい。
【００１４】
本発明のバイオチップにおいては、固定化層が金属、半導体層又は酸化物であることが好ましい。
【００１５】
本発明のバイオチップにおいては、固定化層がシリカであることが好ましい。
【００１６】
本発明のバイオチップにおいては、シリカが化学処理、蒸着またはスパッタで製膜されていることが好ましい。
【００１７】
本発明のバイオチップにおいては、不透明樹脂基板が標識された被検出物質の蛍光又は発光の波長に対して光の透過率が５％以下であることが好ましい。
【００１８】
本発明のバイオチップにおいては、不透明樹脂基板が不透明な物質を含有する樹脂基板であることが好ましい。
【００１９】
本発明のバイオチップにおいては、不透明な物質が黒色であることが好ましい。
【００２０】
本発明のバイオチップにおいては、被検出物質と前記有機分子との反応がハイブリダイゼーション反応又は抗原抗体反応であることが好ましい。
【００２１】
本発明のバイオチップにおいては、固定化層上の有機分子が固定された領域外に、一以上の付加機能を付与したものであることが好ましい。その付加機能として疎水機能であることが好ましい。さらに、その付加機能として特異吸着機能又は非特異吸着機能であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、光学検出時のバックグランド蛍光を低減することができる。また、バイオチップの基板の表面を簡便に良質な機能表面を得ることができる。さらに、基板に複数の付加機能を付与することで、光学検出時の蛍光強度を増加することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下本発明に係るバイオチップの好ましい実施の形態を説明する。
【００２４】
〔バイオチップ〕
ここでバイオチップとは、ＤＮＡ、蛋白質、糖鎖等のバイオ分子、や細胞等を基板上（支持体）に固定化し、固定化されたバイオ分子等と、バイオ分子あるいはそれ以外の化合物を接触させ、生じた特異的な相互作用を検出するものを意味し、ＤＮＡチップ、マイクロチップ、バイオセンサー、Lab on a chip及びμ-TAS（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）等が含まれる。
【００２５】
（不透明樹脂基板）
本発明の基板としては、熱可塑性樹脂、熱可塑性樹脂等からなる樹脂基板を使用することができる。成形性、量産性、不透明物質の混合性等の理由から、例えば、ポリエチレン、ポリカーボネイト、ポリメチルメタアクリレート（アクリル）、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、トリアセチルセルロース、飽和環状ポリオレフィン樹脂等の材料からなるものを使用することができる。このような材料の中から特に、表面処理の容易性からポリメチルメタアクリレート、ポリエチレンテレフタレートが使用されるのが好ましい。
【００２６】
不透明樹脂基板は、上述の材料からなる樹脂基板に不透明な物質を混ぜ合わせることで作製することができる。不透明な物質としては、染料、顔料、着色されたビーズ、ペレット等が使用できる。特に、不透明な物質が黒色の場合、バックグランド蛍光を大幅に減少することができる。黒色の不透明な物質として、顔料、特にカーボンブラックが着色性、耐熱性、光吸収性の理由で使用されるのがより好ましい。
【００２７】
不透明とは、不透明樹脂基板が標識された被検出物質の蛍光又は発光の波長に対して光の透過率が５％以下であること意味する。５％以下としたのは、これ以上透過率が高いと光の吸収が不十分で、基板及び外部からのバックグランドが気になるからである。好ましくは１％以下であり、より好ましくは０％である。
（固定化層）
上述の不透明樹脂基板の必要な領域に固定化層として、金属、半導体層又は酸化物がバイオチップに求められる特性に応じて製膜される。製膜される固定化層は、金属、半導体層又は酸化物から選ばれ、一の材料であっても、又は金属と半導体層等のように組み合わせであってもよい。組み合わせには、不透明樹脂基板の表面において領域ごとに異なる材料が製膜される場合、異なる材料が上下に積層されて製膜される場合等求められる特性に応じて適宜製膜される。
【００２８】
固定化層は、有機分子を固定する支持体としての機能を果たすことになる。さらには、固定化層は、有機分子を固定する支持体の機能に加えて、付加機能が付与されるための領域としても機能する。
【００２９】
本発明において金属として金、銀、銅、白金及びアルミニウム等を使用することができる。また、金属材料は単一の金属元素からなる純金属であっても、複数の金属元素あるいは金属元素と非金属元素から形成される合金であっても良い。特に、金がチオール基との反応性の理由から好適に使用されることが好ましい。不透明樹脂基板に金属を製膜する方法として蒸着法、スパッタ法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法及び金属ペースト等の溶剤を使用することができる。金属の厚さとしては１ｎｍ以上１０μｍ以下が好ましく、１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下がより好ましい。
【００３０】
本発明において半導体としてＳｉで代表される単一材料からなる半導体やＧａＡｓ等で代表される化合物半導体等を使用することができる。特に、Ｓｉがシランカップリング剤との反応性の理由から好適に使用されるとことが好ましい。不透明樹脂基板に半導体を製膜する方法としては蒸着法、スパッタ法及びイオンプレーティング法を使用することができる。半導体の厚さとしては１ｎｍ以上１０μｍ以下が好ましく、１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下がより好ましい。
【００３１】
さらに、本発明において酸化物としてシリカ（ＳｉＯ２）、ＴｉＯ２  、Ａｌ２Ｏ３及びＩｎ２Ｏ３(Ｓｎ及びＦドープ物含む)等を使用することができる。特に、ＳｉＯ２がシランカップリング剤との反応性の理由から好適に使用されることが好ましい。不透明樹脂基板に酸化物を製膜する方法としてはスパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法及びポリシラザン溶液等を用いた化学修飾法を使用することができる。酸化物の厚さとしては１ｎｍ以上１０μm以下が好ましく、１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下がより好ましい。
【００３２】
また、金属、半導体層又は酸化物が樹脂基板に対し直接成膜し難い材料である場合、内部の組成と表面層の組成が異なる基板を用いることで、容易に基板表面に製膜することができる。すなわち、基板と固定化層の両方に親和性の高い素材を中間層として製膜することで、固定化層を樹脂基板に容易に製膜することができる。
【００３３】
中間層としては基板、固定化層との親和性や、成膜方法で適宜変更されるため特に限定されないが、例えば基板表面に薄いアクリル層やＰＥＴ層を設けることで、ポリシラザン溶液によるＳｉＯ２の成膜時に、膜を強固に固定することができる。
（有機分子の固定化層への固定）
上述の有機分子が、少なくともシランカップリング又はチオール基の何れか一方を介して固定化層に固定される。
【００３４】
シランカップリングによる有機分子の固定は、シランカップリング剤を使用することによって行われる。シランカップリング剤は、固定化層の表面と親和性のある加水分解基と、有機材料と親和性を有する官能基、例えばビニル基、エポキシ基、アミノ基、メルカトプ基を有する有機珪素化合物をいう。
【００３５】
例えば、加水分解基としてシラノール基（Ｓｉ-ＯＨ）を与える官能基（エトキシ基等）を分子の一端に備えたシランカップリング剤では、固定化層の表面にＯＨ基が存在するとシラノール基を介して強く結合し、有機分子を固定化層に結合することができる。シランカップリング剤は導入したい官能基、固定したい固定化層の種類に応じて適宜調整することができる。官能基の種類に応じてアミノシラン及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）シラン等のシランカップリング剤を使用することができる。
【００３６】
チオール基を介して例えば金属表面に有機分子を固定化層に固定することができる。本発明においては、固定化層に固定化したい有機分子、例えばアミノ基、カルボキシル基及びＰＥＧを一端に備え、他端に金属結合性官能基してチオール基を備えた化合物や、末端にチオール基を備えた一本鎖DNAまたはRNA等を介して有機分子が固定化層に固定される。
【００３７】
チオール基及び有機分子を備えた化合物として、例えばアミノアルカンチオール、カルボキシアルカンチオール、及びＰＥＧチオールを使用することができる。
【００３８】
また、シランカップリング又はチオール基の何れか一方を介して固定化層に固定された有機分子に、さらに同種の又は別類のシランカップリング又はチオール基を介して有機分子を固定、結合することも可能である。
【００３９】
（固定化層への付加機能の付与）
本発明において固定化層は不透明樹脂基板に対し有機分子を簡便な方法で固定化するために製膜されている。本発明の別の側面において、固定化層に付加機能を付与することでバイオチップとしての機能を向上させることが可能となる。
【００４０】
付加機能を付与する方法として、例えばシランカップリング剤を用いて固定化層の検出部領域以外に非特異吸着防止機能を付与することができる。
【００４１】
その一例として次の方法が挙げられる。アミノ基と抗体等、タンパク質を特異的に吸着するような末端を持ったシランカップリング剤で不透明樹脂基板の表面に処理が施され、固定化層上に検出部が形成される。検出部以外の例えば送液部はタンパク質の非特異吸着を抑制するようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等を末端にもつシランカップリング剤で不透明樹脂基板の表面が処理され、固定化層上に機能異なる領域を形成することが可能となる。
【００４２】
また、別の態様では、固定化層の特定の領域に、疎水機能を付与することができる。その一例として次の方法が挙げられる。主成分がフッ素系樹脂、シリコーン樹脂等の溶剤を用いたコーティング。
（被検出物質の検出）
被検出物質の検出が、ハイブリダイゼーション反応又は抗原抗体反応の何れか一方、又は両反応組み合わせることで行われる。
【００４３】
ハイブリダイゼーション反応とは、核酸のハイブリッド形成または核酸雑種分子形成のことを言い、核酸の１次構造、すなわち塩基配列の相同性を調べたり、相同の塩基配列をもつ核酸を検出したりする方法として用いられる。つまり、１本鎖にした核酸同士が、相補性をもつ塩基対間（Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ）で水素結合ができ二重らせんの２本鎖核酸を形成する性質を利用し、目的遺伝子を検出することが可能である。
【００４４】
抗原抗体反応とは、抗体がその対応する物質（抗原）と結合する反応であり、目的とする抗原とそれに対応する抗体の結合量を何らかの手段で測定することにより、検体中の抗原量を測定することが可能である。
【００４５】
本発明は検体中の成分を蛍光により検出する際に、安価で且つ機能的表面処理を簡便に行って作製することが可能なバイオチップに関するものである。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。但し、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００４７】
〔実施例１〕
本発明の第１実施例のバイオチップ１０は、図１（ａ）に示すように、不透明（黒色）に着色した樹脂基板１と、樹脂基板１の表面に形成されたマクロメートルの溝４と、樹脂基板１に製膜されたシリカ膜２と、を備えている。
【００４８】
不透明（黒色）に着色した樹脂基板１はアクリルに不透明の物質として黒色樹脂を０．１％加えたものから製造される。樹脂基板１の透過率は０％で、その厚さ1ｍｍである。作製した樹脂基板１に公知の機械加工技術を利用して、幅１００μｍ、深さ１００μｍの溝４が形成される。
【００４９】
樹脂基板１の溝４が形成された面の表面に化学修飾法（ポリシラザン）で厚さ300nmのシリカ膜２が製膜される。
【００５０】
製膜されたシリカ膜２に対し、図１（ｂ）のＡ-Ａ断面図に示すように、例えばシランカップリング技術を用いてシリカ膜２の表面を化学的に処理することで、シリカ膜２に有機分子が固定される。有機分子を固定することでシリカ膜２の表面に機能性領域３を形成（例えば生体分子の特異吸着性、非特異吸着防止性）することができる。つまり、活性化の低い樹脂基板であってもシリカ膜を形成することで、シランカップリング等の表面改質処理を適用することができる。上述の方法でバイオチップを作製することで、安価且つ簡便にチップを作製出来ると同時に、バックグランド蛍光の低減によるノイズダウン、検出部のみへの被検出物の吸着によるシグナルアップにより、蛍光検出時の高感度検出が可能となる。
【００５１】
〔実施例２〕
本発明の第２実施例のバイオチップ１０は、図２（ａ）に示すように、不透明（黒色）に着色した樹脂基板１と、樹脂基板１上に製膜されたシリカ膜２と、を備えている。
【００５２】
不透明（黒色）に着色した樹脂基板１は実施例１と同様な方法で製作される。さらに、樹脂基板１の表面に化学修飾法で厚さ３００ｎｍのシリカ膜２製膜される。但し、本実施例においては、樹脂基板１の表面に溝は形成されていない。
【００５３】
次に図２（ｂ）のＡ-Ａ断面図に示すように、製膜されたシリカ膜２の検体送液部５以外の領域が、例えばフッ素系樹脂コーティングの処理を施すことにより疎水的に改質され、疎水機能領域６が形成される。親疎水のバランスで検体送液部５のみ検体が流れるようにすることが可能となる。製膜されたシリカ膜２上の検体送液部５に、例えばシランカップリング技術を用いてシリカ膜２の表面を化学的に処理することで、シリカ膜２に有機分子が固定される。有機分子を固定することでシリカ膜２の表面に機能性領域３を形成（生体分子の特異吸着性、非特異吸着防止性）することができる。
【００５４】
実施例１と同様に、活性化の低い樹脂基板であってもシリカ膜を形成することで、シランカップリング等の表面改質処理を適用することができる。上述の方法でバイオチップを作製することで、安価且つ簡便にチップを作製出来ると同時に、バックグランド蛍光の低減によるノイズダウン、検出部のみへの被検出物の吸着によるシグナルアップにより、蛍光検出時の高感度検出が可能となる。
【００５５】
さらに他の側面として、シリカ膜２上の機能性領域３以外の領域に他の機能、疎水機能領域６を付与することができる。これによりバイオチップとしての機能をさらに向上させることができる。
【００５６】
〔実施例３〕
本発明の具体的な使用方法を、抗原抗体反応の用途を例に説明する。
【００５７】
本発明の第３実施例のバイオチップ１０は、図３（ａ）に示すように、不透明（黒色）に着色した樹脂基板１と、樹脂基板１の表面に検体送液用の流路として形成されたマクロメートルの溝７と、樹脂基板１に製膜されたシリカ膜２と、を備えている。さらに溝７は、入口７ａと出口７ｂを備えている。溝７、入口７ａ及び出口７ｂは、公知の機械加工技術を利用して加工され、溝７は幅１００μｍ、深さ１００μｍ、入口７ａ及び出口７ｂは直径１０００μｍ、深さ１００μｍで形成される。樹脂基板１をポリシラザン溶液で処理することにより、樹脂基板１の表面のシリカ膜２が製膜される。
【００５８】
図３（ｂ）のＡ-Ａ断面図に示すように樹脂基板１上に形成された送液流路となる溝７の底面を機能的に、検出部のみ抗体を捉え、それ以外の部分では非特異的に吸着することを抑制するように表面が改質される。改質方法としては、まず検出部となる領域に対して、アミノ基と抗体等、タンパク質を特異的に吸着するような末端を持ったシランカップリング剤で処理を行い、検出部に特異吸着機能部８が形成される。次いで、検出部領域以外の送液部に対して、タンパク質の非特異吸着を抑制するようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等を末端にもつシランカップリング剤で処理を行い、送液部に非特異吸着機能部９が形成される。特異吸着機能部８と非特異吸着機能部９の形成は、本実施例の順序及び方法に限定されるものではない。
【００５９】
このように処理を行ったチップに蛍光標識された検体を送液することで、検出部でのみ被検出物質を特異的に吸着し、光強度が増強されると同時に、基板、形状、外部からのバックグランド蛍光を抑制出来、結果、高感度に検出出来るチップを安価に作製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明のバイオチップの第１実施例を示す概略図
【図２】本発明のバイオチップの第２実施例を示す概略図
【図３】本発明のバイオチップの第３実施例を示す概略図
【符号の説明】
【００６１】
１０：バイオチップ、１：樹脂基板、２：シリカ膜，３：機能領域、４：溝、５: 検体送液部、６：疎水機能領域、７：溝、７ａ：入口、７ｂ：出口、８：特異吸着機能部、９：非特異吸着機能部
【図１】
2008224327.tif 000002
【図２】
2008224327.tif 000003
【図３】
2008224327.tif 000004