(57)【要約】【課題】本発明の課題は、皮膚のバリア機能は保持したまま皮膚を透過し、強いメラニン産生阻害作用を有し、かつ皮膚刺激性や皮膚感作性といった安全性上の問題もないメラニン産生阻害を有する皮膚組成物を得ることである。【解決手段】本発明においては転写因子であるMITFの転写阻害作用を利用して、メラニン産生の鍵酵素となるチロシナーゼ等のmRNAの発現を阻害する物質を皮膚組成物に配合することにより、メラニン産生抑制効果の高い皮膚組成物の開発が可能となり、さらに、核酸のような巨大分子を皮膚に浸透させるためにカチオン性リン脂質を配合することにより、皮膚刺激性や皮膚感作性といった安全性上の問題もないメラニン産生阻害を有する皮膚組成物の提供を可能とした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
MITFのデコイDNA効果を有するオリゴヌクレオチドを配合することを特徴とする皮膚組成物。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが、その塩基配列中に5’-CATGTG-3’からなる塩基配列を含むことを特徴とする請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
塩基対の長さが20以上30以下であることを特徴とする請求項1又は請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドの塩基配列がセンス配列5’-ATGCCAACATGTGGTTACAA-3’、アンチセンス配列3’-TACGGTTGTACACCAATGTT-5’（配列番号301）であることを特徴とする請求項１記載の皮膚組成物。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドの塩基配列がセンス配列5’-TGGAGATCATGTGATGACTT-3’、アンチセンス配列3’-ACCTCTAGTACACTACTGAA-5’（配列番号421）であることを特徴とする請求項１記載の皮膚組成物。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドの塩基配列がセンス配列5’-AGTCAGTCATGTGCTTTTCA-3’、アンチセンス配列3’-TCAGTCAGTACACGAAAAGT-5’（配列番号2101）であることを特徴とする請求項１記載の皮膚組成物。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドの塩基配列がセンス配列5’-GCCAAGACATGTGATAATCA-3’、アンチセンス配列3’-CGGTTCTGTACACTATTAGT-5’（配列番号2221）であることを特徴とする請求項1記載の皮膚組成物。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドの塩基配列がセンス配列5’- GAAAAAGTTAGTCATGTGCTTTGCAGAAGA -3’、アンチセンス配列        3’-CTTTTTCAATCAGTACACGAAACGTCTTCT-5’（配列番号30M）であることを特徴とする請求項1記載の皮膚組成物。
【請求項９】
請求項1〜請求項8に記載のオリゴヌクレオチドとカチオン性脂質を配合することを特徴とする皮膚組成物
【請求項１０】
カチオン性脂質が、カチオン化リン脂質であることを特徴とする請求項９記載の皮膚組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン産生抑制効果を有する皮膚組成物に関する。より詳細には、本発明は転写因子であるMITFが、本発明のMITFデコイオリゴヌクレオチドと結合することにより、本来結合すべきDNAに結合することを阻害するものである。このため、メラニン産生に関連するチロシナーゼ等の各種酵素類のmRNAの発現が抑制され、メラニン産生を抑制する効果のある皮膚組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線による皮膚の黒化や、シミ・ソバカスといった皮膚の色素沈着を改善するため、メラニン産生を阻害する成分、または生成したメラニン色素を還元する作用を有する成分がスクリーニングされ美白用皮膚組成物に配合されてきた。例えば、アスコルビン酸、システイン、ハイドロキノン、及びこれらの誘導体、胎盤抽出物、植物又は藻類の抽出物などが利用されている。
【０００３】
しかしながら、アスコルビン酸、システイン，ハイドロキノン及びこれらの誘導体は、酸化還元反応を受けやすく不安定であり、胎盤抽出物や植物又は藻類の抽出物は、有効量を配合すると美白用皮膚組成物に好ましくない臭いや色を付与する等の問題点があり、効果の高いメラニン産生抑制物質の開発が望まれていた。
【０００４】
また、皮膚組成物は皮膚を透過して薬効を発揮するため、この表皮バリアを透過させることが必須である。しかし、皮膚組成物の有効成分が、例えば核酸のような巨大分子である場合、そのまま皮膚に浸透させることは更に難しかった。このような理由から、核酸のような巨大分子を有効成分とする皮膚組成物の開発は困難であった。
【０００５】
以上のような背景から、皮膚のバリア機能は保持したまま皮膚を透過し、薬効を発揮する薬剤の開発が望まれていた。
【特許文献１】特開平６−２４９５５号公報
【特許文献２】特開平５−３０１８１１号公報
【特許文献３】特開平７−２５８０６０号公報
【特許文献４】特開平８−２０８４５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、上記のような問題点を解決し、強いメラニン産生阻害作用を有し、かつ皮膚刺激性や皮膚感作性といった安全性上の問題もないメラニン産生阻害効果を有する皮膚組成物を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
近年、バイオテクノロジーの進歩に伴って、遺伝子発現を制御することで病気を治療する新しい医薬品の開発が盛んに行われてきている。その１つとしてオリゴヌクレオチド等を用いた核酸医薬が挙げられるが、本発明においては転写因子であるMITFの転写阻害作用を利用して、メラニン産生の鍵酵素となるチロシナーゼ等のmRNAの発現を阻害する物質を皮膚組成物に配合することにより、メラニン産生抑制効果の高い皮膚組成物の開発に至った。
【０００８】
メラニンはアミノ酸のチロシンがチロシナーゼ、TRP-1（チロシナーゼ関連タンパク質-1）、TRP-2（ドーパクロムトートメラーゼ）等のチロシナーゼ関連酵素の作用を受けて合成される。メラニン合成には、上記3酵素が重要な働きをするが、これらの酵素の産生を制御しているのがMITFである。（一部TRP-2遺伝子だけはやや異なる制御も受ける。）MITFにはMITF-M、MITF-B、MITF-H、MITF-C、MITF-A5種類のアイソフォームが存在するが、本明細書ではMITF-Mを指すものである。チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2遺伝子のプロモーター上にはMボックスと呼ばれる共通の制御配列が存在し、MITF-MはこのMボックスに結合することにより、これらの酵素遺伝子の転写を活性化することが知られている。
【０００９】
そこで本発明者はメラニン産生細胞にMITFデコイオリゴヌクレオチドを導入し、産生されるメラニン産生量を測定した結果、明らかに産生されるメラニン量が減少されることを確認した。すなわち、MITFのデコイオリゴヌクレオチドを細胞に導入することにより、MITFの転写活性を阻害し、メラニン産生の抑制に結びつくことを発見し、本発明をするに至った。
【００１０】
さらに、本発明者らは、核酸のような巨大分子を皮膚に浸透させるために鋭意検討を重ねた結果、カチオン性リン脂質が浸透促進剤として優れることを見いだし、本発明を完成するに至った。以下にその検討結果について示す。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のチロシナーゼをコードするmRNAを特異的に切断するRNA干渉物質はメラニン産生抑制効果を有し、カチオン性リン脂質と組合わせる皮膚組成物は、皮膚刺激性や皮膚感作性といった安全性上の問題を生じることなく、それぞれの相乗効果により、高い美白効果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。本発明で用いられるMITFデコイオリゴヌクレオチドは、MITFの転写効果を特異的に阻害できるオリゴヌクレオチドであればその塩基配列、及び構造は規定されるものではない。MITFの転写効果を特異的に阻害できるMITFデコイオリゴヌクレオチドの塩基配列は、その塩基配列の中に5’-CATGTG-3’配列を有する構造の2本鎖オリゴDNAを取りうるもの等が選択できるが、いずれの構造によるものでも限定されるものではない。
【００１３】
これら、MITFデコイオリゴヌクレオチドの塩基配列は、様々なものが利用できるが、一例として例えば、配列番号301、421、2101、2221、30Mの２本鎖DNAが挙げられる。
【００１４】
〔配列番号301〕
5’-ATGCCAACATGTGGTTACAA-3’
3’-TACGGTTGTACACCAATGTT-5’
【００１５】
〔配列番号421〕
5’-TGGAGATCATGTGATGACTT-3’
3’-ACCTCTAGTACACTACTGAA-5’
【００１６】
〔配列番号2101〕
5’-AGTCAGTCATGTGCTTTTCA-3’
3’-TCAGTCAGTACACGAAAAGT-5’
【００１７】
〔配列番号2221〕
5’-GCCAAGACATGTGATAATCA-3’
3’-CGGTTCTGTACACTATTAGT-5’
【００１８】
〔配列番号30M〕
5’-GAAAAAGTTAGTCATGTGCTTTGCAGAAGA-3’
3’-CTTTTTCAATCAGTACACGAAACGTCTTCT-5’
【００１９】
また、本発明に用いられるカチオン性脂質は、特にカチオン性リン脂質が望ましい。例えば、大豆レシチン、コーンレシチン、綿実油レシチン、卵黄レシチン、卵白レシチンなどの天然レシチン；リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン等のリゾホスホリピド；水素添加レシチン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリンなどを例示することができる。
そして、本発明では前記したようなリン脂質のうちの一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。リン脂質を含有することで、本発明に係るオリゴヌクレオチドの皮膚浸透性を高めることができる。
【００２０】
MITFの転写効果を特異的に阻害するMITFデコイオリゴヌクレオチドの皮膚組成物への配合量は、0.000001〜10.0重量％の濃度範囲とすることが望ましく、特に0.001〜5.0重量%の範囲が最適である。含有量が0.000001重量%未満であると充分な効果が発揮されず、10.0重量%以上加えても効果はほぼ一定である。
【００２１】
また、MITFの転写効果を特異的に阻害するMITFデコイオリゴヌクレオチドと共に配合するカチオン性脂質、特にカチオン化リン脂質の皮膚組成物への配合量は、0.001〜10重量％の濃度範囲とすることが望ましく、特に0.01〜2重量%の範囲が最適である。カチオン化リン脂質の含有量が0.001重量%未満であると充分な効果が発揮されず、10重量%以上加えても効果はほぼ一定である。
【００２２】
本発明の皮膚組成物は、上記必須成分のほかの化粧品、医薬部外品、医薬品に用いられる水性成分、油性成分、植物抽出物、動物抽出物、粉末、界面活性剤、油剤、アルコール、PH調整剤、防腐剤、酸化防止剤、増粘剤、色素、香料等を必要に応じて混合して適宜配合することにより調製される。本発明の皮膚組成物の剤形は特に限定されず、化粧水、乳液、クリーム、パック、パウダー、スプレー、軟膏、分散液、洗浄料等種々の剤形とすることができる。
【００２３】
以下、本発明におけるメラノサイトにかかわる効果試験、およびヒトでの効果試験の実施例を示す。さらに、その素材を用いた皮膚組成物への応用処方例等について述べるが、ここに記載された実施例に限定されないのは言うまでもない。
【実施例】
【００２４】
〔細胞の培養〕
メラノーマ細胞（HM3KO）のトリプシン処理を行ない、5%牛胎児血清を含有するOpti-MEM（Invitrogen社）培地で細胞を分散させ、12well
plateに5×104/wellを播種し、1日間、37℃で培養を行なう。培地量は各wellあたり1mlになるように添加し培養する。
【００２５】
〔MITFデコイオリゴヌクレオチドの調製〕
配列番号301のMITFデコイオリゴヌクレオチド5’-ATGCCAACATGTGGTTACAA-3’（ センス鎖：Mw  6411 ）と、3’-TACGGTTGTACACCAATGTT-5’（アンチセンス鎖： Mw  6393、クラボウ株式会社にて作成）に10μMになるようにSTE  bufffer  （0.2M  Tris-HCl、1M
-NaCl、0.1M- EDTA：PH 7.0）を加え、良く撹拌する。  溶解させたセンス鎖、アンチセンス鎖の溶液を混合し、沸騰水溶液中（95℃〜98℃）で、60sec.放置する。その後自然冷却し、２重鎖のMITFデコイオリゴヌクレオチドを調製する。他の配列番号421、2101、2221、30Mのオリゴヌクレオチドも同様に調製する。
【００２６】
〔細胞に添加するMITFデコイオリゴヌクレオチドとカチオン性脂質の調製〕
段落００２５で調製した2重鎖MITFデコイオリゴヌクレオチド溶液と、カチオン性脂質としてLipofectamine Reagent (Invitrogen社)、Plus
Reagent (Invitrogen社)、およびOpti-MEM (Invitrogen社)培地をそれぞれ表1の量添加し、調製する。
【００２７】
【表１】
2008115092.tif 000002
【００２８】
段落００２４の条件で1日培養したメラノーマ細胞に段落００２５の方法で調製したMITFデコイオリゴヌクレオチド調製液50μlを加え、3時間インキュベートを行なう。3時間後、培地を新鮮な5%牛胎児血清を含有するOpti-MEM（Invitrogen社）培地に交換し、3日間培養を行なう。
【００２９】
〔評価方法〕
細胞内に産生されたメラニン量の測定は培養後、細胞を2N-NaOHに溶解し405nmの吸光度を測定した。また、細胞増殖度は2N-NaOHに溶解した細胞溶解液の一部を BCA法によるタンパク測定法により540nmの吸光度で測定し、タンパク量に換算した。メラニン産生度は、単位タンパク量あたりのメラニン量の割合で計算した。また、美白効果の陽性対照物質としてβ-アルブチンを用い、効果の比較を行った。
〔計算式：メラニン産生度(%)＝（試料添加区の405nmの吸光度値／試料添加区の540nmの吸光度値）／（無添加区の405nmの吸光度値／無添加区の540nmの吸光度値）×100〕
【００３０】
【表２】
2008115092.tif 000003
【００３１】
表２に、配列番号301，421，2101, 2221, 30MのMITFデコイオリゴヌクレオチドをメラノーマ細胞に添加した場合のメラニン産生量の結果を示した。若干MITFデコイの配列の種類により、メラニン産生量に差が見られるが、配列番号30MのMITFデコイオリゴヌクレオチドは200nMの添加で、メラニン産生量が69.4%まで抑制された。現在メラニン産生抑制物質として広く使用されているβ-アルブチン（表２ではアルブチンと記載）は、400μM添加でメラニン産生量が77.0%であった。配列番号30MのMITFデコイオリゴヌクレオチドは、β-アルブチンと比較して濃度比で1000倍以上の効果を発揮し、本発明品による高い効果が確認された。
【００３２】
〔実施例２〕
（塗布によるヒトでの効果確認試験
１）
被験者として、20〜60歳の女性10名に１日２回（朝、夜）連続２ヵ月間、試験品と比較品1,2のそれぞれを使用させ、塗布部位の状態を試験前後で比較し、改善効果を調べた。本試験には、試験品として段落００３７で示した皮膚組成物（乳液組成物２）を用い、比較品１には段落００３７に示した皮膚組成物からホスファチジルセリンを除いた皮膚組成物を、比較品２には段落００３７に示した皮膚組成物から配列番号30MのMITFデコイオリゴヌクレオチドを除いた皮膚組成物を作成し、その使用による効果について調べた。本発明の有効成分を配合した皮膚組成物を毎日使用しながら肌の美白効果を塗布開始前及び１ヶ月塗布後におけるアンケートで集計し、効果の確認を行った。結果は表３に示す。表中の数字は、人数を示している。表３からも明らかなように、カチオン性リン脂質としてホスファチジルセリン、および配列番号30MのMITFデコイオリゴヌクレオチドとを配合した試験品では評価点数が80点であった。一方、カチオン性リン脂質としてホスファチジルセリンのみからなる比較品２では評価点数が33点であり、また配列番号30MのMITFデコイオリゴヌクレオチドのみからなる比較品１では評価点数が52点であった。この結果から明らかなように、MITFデコイオリゴヌクレオチドとカチオン性リン脂質を併用することによって高い美白効果が得られることが認められた。
【００３３】
【表３】
2008115092.tif 000004
【００３４】
次に、本発明の各種成分を配合した皮膚組成物の処方例の例を示すが、本発明はこれに限定されるものでない。
【００３５】
〔皮膚組成物の処方例〕
（クリーム軟膏１）                      
（重量％）
a)ミツロウ                                           
2.0
b)大豆リン脂質                                       
0.5
c)ステアリン酸                                        8.0
d)スクワラン                                        
10.0
e)自己乳化型グリセリルモノステアレート               
3.0
f)ポリオキシエチレンセチルエーテル(20E.O.)            1.0
g)水酸化カリウム                                     
0.3
h)防腐剤・酸化防止剤                    
適量
i)精製水                                             
残部
j)配列番号30MのＭＩＴＦデコイオリゴヌクレオチド      0.001
製法：a)〜f)までを加熱溶解し、80℃に保つ。ｇ)〜i)までを加熱溶解し、80℃に保ち、a)〜f)に加えて乳化する。40℃でj)を添加し、37℃まで撹拌しながら冷却する。
【００３６】
（乳液組成物１）                                 
（重量％）
a)ミツロウ                                            0.5
b)ワセリン                                           
2.0
c)スクワラン                                        
8.0
d)ソルビタンセスキオレエート                         
0.8
e)ポリオキシエチレンオレイルエーテル(20E.O.)          1.2
f)d-δ-トコフェロール                                 0.2
g)リゾレシチン                                       
0.001
h)精製水                                             
残部
i)防腐剤・酸化防止剤                                  
適量
j)エタノール                                         
7.0
k)配列番号2221のMITFデコイオリゴヌクレオチド        0.000001
製法：a)〜g)までを加熱溶解し、80℃に保つ。h)〜i)までを加熱溶解し、80℃に保ち、a)〜g)に加えて乳化し、50℃まで撹拌しながら冷却する。50℃でj)を40℃でk)を添加し、37℃まで攪拌冷却する。
【００３７】
（乳液組成物２）                             
（重量％）
a)ミツロウ                                           
0.5
b)ワセリン                       
2.0
c)スクワラン                                        
8.0
d)ソルビタンセスキオレエート                         
0.8
e)ポリオキシエチレンオレイルエーテル(20E.O.)          1.2
f)クエルセチン                          
0.1
g)ホスファチジルセリン                           
2.0
h)精製水                                             
残部
i)防腐剤・酸化防止剤                                  
適量
j)エタノール                                         
7.0
k)配列番号301のMITFデコイオリゴヌクレオチド
5.0
製法： a)〜g)までを加熱溶解し、80℃に保つ。h)〜i)までを加熱溶解し、80℃に保ち、a)〜g)に加えて乳化し、50℃まで撹拌しながら冷却する。50℃でj)を、40℃でk)を添加し、37℃まで攪拌冷却する。
【００３８】
（化粧水様組成物１）                                 
(重量%)
a)リゾレシチン                                        
10.0
b)ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(20E.O.)    2.0
c)エタノール                                           
6.0
d)香料               
適量
e)防腐剤・酸化防止剤                                
適量
f)精製水                                         
残部
g)ヒアルロン酸                                          0.1
h)配列番号2101のMITFデコイオリゴヌクレオチド
5.0
i)配列番号421のMITFデコイオリゴヌクレオチド
5.0
製法： a)〜e）を均一に混合する。ｆ）〜i）を均一に混合し、a)〜e）混合物に加える。
【００３９】
（化粧水様組成物２）                                 
(重量%)
a)水素添加レシチン              
0.5
b)ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(20E.O.)    2.0
c)エタノール                                           
6.0
d)香料                 
適量
e)防腐剤・酸化防止剤                                    
適量
f)精製水                                               
残部
g)キサンタンガム                                        0.1
h)配列番号30MのMITFデコイオリゴヌクレオチド
10.0
製法：a)〜e）を均一に混合する。ｆ）、g）、h)を均一に混合し、a)〜e）混合物に加える。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明のチロシナーゼをコードするmRNAを特異的に切断するRNA干渉物質とカチオン性リン脂質からなる皮膚組成物は、それぞれの相乗効果により、高い美白効果を示すことから、広く美白皮膚外用剤に応用が期待できる。
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月14日(2007.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008115092000001.app