(57)【要約】      （修正有）【課題】生体から採取したＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する変換処理が適切に行われているか否かを判別できる、変換処理の確認方法の提供。【解決手段】生体から採取したＤＮＡと、前記生体のゲノムに含まれず且つシトシンを含む配列Ａを有する精度管理用核酸とを混合する工程、前記工程で得られた混合液中の非メチル化シトシンを、シトシン以外の塩基に変換する工程、前記精度管理用核酸のシトシンが前記他の塩基に変換されたか否かを判定する工程、及び前記判定工程の結果に基づいて前記変換工程が適切に行われたか否かを確認する工程、を含む変換処理の確認方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から採取したＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する変換処理が適切に行われたか否かを確認する方法であって、
前記生体から採取したＤＮＡと、前記生体のゲノムに含まれず且つシトシンを含む配列Ａを有する精度管理用核酸とを混合する工程、
前記工程で得られた混合液中の非メチル化シトシンを、シトシン以外の塩基に変換する工程、
前記精度管理用核酸のシトシンが前記他の塩基に変換されたか否かを判定する工程、及び
前記判定工程の結果に基づいて前記変換工程が適切に行われたか否かを確認する工程、を含む変換処理の確認方法。
【請求項２】
前記判定工程が、前記配列Ａ中のシトシンが前記他の塩基に変換された場合の配列である配列Ａ’にハイブリダイズ可能な第１ポリヌクレオチドを用いて、前記配列Ａ中のシトシンがシトシン以外の塩基に変換されたか否かを判定する第１判定工程、及び前記配列Ａにハイブリダイズ可能な第２ポリヌクレオチドを用いて、前記配列Ａ中のシトシンがシトシン以外の塩基に変換されたか否かを判定する第２判定工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１判定工程において用いた第１ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、シトシンがシトシン以外の塩基に変換されたか否かを判定し、
前記第２判定工程において用いた第２ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、シトシンがシトシン以外の塩基に変換されたか否かを判定する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第１ポリヌクレオチドが、ストリンジェントな条件で前記配列Ａ’にハイブリダイズすることができ、
前記第２ポリヌクレオチドが、ストリンジェントな条件で前記配列Ａにハイブリダイズすることができる、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
前記配列Ａ中のシトシンが非メチル化シトシンであり、
前記判定工程において、前記配列Ａ中のシトシンがシトシン以外の塩基に変換されたと判定された場合、前記確認工程において前記生体から採取したＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンが他の塩基に変換されたことが確認される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記配列Ａ中のシトシンがメチル化シトシンであり、
前記検出工程において、前記配列Ａ中のシトシンがシトシン以外の塩基に変換されなかったと判定された場合、前記確認工程において前記生体から採取したＤＮＡに含まれるメチル化シトシンが他の塩基に変換されなかったことが確認される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記変換工程において、前記生体から採取したＤＮＡに対する変換処理と、前記精度管理用核酸に対する変換処理とを同一容器内で行う、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記変換工程において、前記非メチル化シトシンと亜硫酸水素塩とを接触させることにより、前記非メチル化シトシンをウラシルに変換する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記精度管理用核酸が、前記生体のゲノムに含まれず且つ非メチル化シトシンを含まない配列Ｂを有し、
前記変換工程の後、前記生体のゲノムに含まれず且つ非メチル化シトシンを含まない配列Ｂにハイブリダイズ可能な第３ポリヌクレオチドを用いて前記精度管理用核酸を定量し、前記判定工程時の前記精度管理用核酸の量が、前記混合工程時の前記精度管理用核酸の量に比べてどの程度減少したかを算出する工程、及び
前記算出結果に基づいて、前記判定工程時の前記生体から採取したＤＮＡの量が、前記混合工程時の前記生体から採取したＤＮＡの量に比べてどの程度減少したかを推測する工程をさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記第３ポリヌクレオチドが、ストリンジェントな条件で前記配列Ｂにハイブリダイズすることができる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
以下のいずれかの配列を含む核酸分子：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列において、少なくとも一つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加されたヌクレオチド配列であり、且つヒトゲノムに含まれないヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列；および
（ｄ）配列番号２のヌクレオチド配列において、少なくとも一つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加されたヌクレオチド配列であり、且つヒトゲノムに含まれないヌクレオチド配列。
【請求項１２】
前記（ａ）および前記（ｂ）のいずれかのヌクレオチド配列と、前記（ｃ）および前記（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列とを含む、請求項１１記載の核酸分子。
【請求項１３】
さらに以下のいずれかの配列を含む請求項１１または１２記載の核酸分子：
（ｅ）配列番号３のヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号３のヌクレオチド配列において、少なくとも一つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加されたヌクレオチド配列であり、且つヒトゲノムに含まれないヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号４のヌクレオチド配列；および
（ｈ）配列番号４のヌクレオチド配列において、少なくとも一つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加されたヌクレオチド配列であり、且つヒトゲノムに含まれないヌクレオチド配列。
【請求項１４】
前記（ｅ）および前記（ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列と、前記（ｇ）および前記（ｈ）のいずれかのヌクレオチド配列とを含む請求項１３記載の核酸分子。
【請求項１５】
生体から採取したＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する変換処理が適切に行われたか否かを確認するために用いられる試薬キットであって、
請求項１１〜１４のいずれかに記載の核酸分子と、
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドと、
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列中のシトシンがし都心以外の塩基に変換された場合のヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドと、を含む変換処理確認用試薬キット。
【請求項１６】
ＤＮＡ中の非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する変換剤をさらに含む、請求項１５記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡの所定の領域におけるシトシンのメチル化を検出する際に行われる変換処理が適切に行われたか否かを確認する方法及びこれに用いられる核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
高等真核生物の染色体ＤＮＡでは、ＤＮＡを構成する塩基のうちＣ（シトシン）の５位がメチル化修飾を受けていることがある。この高等真核生物におけるＤＮＡのメチル化は遺伝情報の発現抑制機構として機能している。ゲノムＤＮＡにおいてＣｐＧを多く含む領域（ＣｐＧアイランド、ＣＧ島）は遺伝子のプロモーター領域に存在することが多い。このため、ＣｐＧアイランドがメチル化されていると、転写因子がプロモーターに結合することができず、遺伝子の転写が抑制される。ＣｐＧアイランドがメチル化を受けていない場合は、プロモーター領域に転写因子が結合可能となり、遺伝子が転写可能な状態になる。このようなＤＮＡのメチル化による遺伝子発現の制御は、初期胚発生、組織特異的な遺伝子の発現、哺乳動物に特徴的な現象である遺伝子刷り込みやＸ染色体の不活性化、染色体の安定化、ＤＮＡ複製のタイミング等の様々な生理的、病理的な現象に重要な役割を果たしている。さらに近年、がんやその他の疾病にこのＤＮＡのメチル化が強く関与することが明らかになってきている。
【０００３】
ＤＮＡ中のメチル化されていないシトシン（非メチル化シトシン）は、変換処理（シトシンを別の塩基に変換する処理（例えば、亜硫酸水素塩などの塩基を変換する試薬（以下、変換剤とする）とＤＮＡとを接触させる処理））によって別の塩基に変換するが、メチル化されているシトシン（メチル化シトシン）は変換処理を行っても別の塩基に変換しないことが知られている。これを利用し、検出対象である検体中のＤＮＡに対して変換処理を施し、シトシンが別の塩基に変換しているかどうかをメチル化特異的ＰＣＲ法（ＭＳ−ＰＣＲ、非特許文献１参照）等によって検出する。これにより、そのＤＮＡの特定の領域がメチル化されているか否かを検出（メチル化検出）することができる（特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、変換処理を適切に行わないと、メチル化検出の際に誤った結果が出てしまう可能性がある。このため、検体のメチル化検出の際には、変換処理が適切に行われたかどうかを確認することが好ましい。
【０００５】
変換処理が適切に行われていることを確認するためのコントロールとして、非メチル化シトシンを含むことが既知であるヒトゲノム由来のコントロールＤＮＡを用いることができる（例えば、CpGenomeTM Universal Unmethylated DNA(CHEMICON)など）。また、変換処理を施してもメチル化シトシンが変換されないことを確認するためのコントロールとして、メチル化シトシンを含むヒトゲノム由来のコントロールＤＮＡを用いることができる（例えば、CpGenomeTM Universal Methylated DNA(CHEMICON)など）。
検体に含まれるＤＮＡの変換処理及びメチル化検出に伴って、上述のコントロールの変換処理及びメチル化検出を行うことにより、検体に対する変換処理が適切に行われたかどうかを推測することができる。
【０００６】
【非特許文献１】Ｊａｍｅｓ  Ｇ．ＨＥＲＭＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ：  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  Ｖｏｌ．９３，  ｐｐ．９８２１−９８２６，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９６.
【特許文献１】米国特許６０１７７０４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のようなコントロールＤＮＡはヒトゲノム由来であるため、ヒトから採取した検体と混合して同一容器で変換処理及びメチル化の検出を行うと、変換処理後のメチル化検出の際に検体及びコントロールＤＮＡの何れに由来するメチル化を検出しているのか判別できない。従って、上記のようなヒトゲノム由来の配列を有するコントロールＤＮＡを用いる場合は、変換処理を別々の容器で行う必要がある。しかしながら、別々の容器では変換処理を同じ条件下で行うことができない。このため、コントロールＤＮＡのメチル化検出結果に基づいて、検体に対する変換処理が適切に行われたか否かを高い信頼性で確認することができない。
【０００８】
本発明は、上記のような事情に鑑みて為されたものであり、従来よりも高い信頼性で変換処理が適切に行われているか否かを判別できる、変換処理の確認方法及び確認用試薬キットを提供することが目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、生体から採取したＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する変換処理が適切に行われたか否かを確認する方法であって、前記生体から採取したＤＮＡと、前記生体のゲノムに含まれず且つシトシンを含む配列Ａを有する精度管理用核酸とを混合する工程、前記工程で得られた混合液中の非メチル化シトシンを、シトシン以外の塩基に変換する工程、前記精度管理用核酸のシトシンが前記他の塩基に変換されたか否かを判定する工程、及び前記判定工程の結果に基づいて前記変換工程が適切に行われたか否かを確認する工程、を含む変換処理の確認方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、以下のいずれかの配列を含む核酸分子を提供する。
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列において、少なくとも一つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加されたヌクレオチド配列であり、且つヒトゲノムに含まれないヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列；および
（ｄ）配列番号２のヌクレオチド配列において、少なくとも一つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加されたヌクレオチド配列であり、且つヒトゲノムに含まれないヌクレオチド配列。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、ＤＮＡに対する非メチル化シトシンからシトシンへの変換処理が適切に行われたか否かを高い信頼性で確認することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の一実施形態である確認方法は、メチル化検出の対象となるＤＮＡを含む検体と、精度管理用核酸とを混合する工程（混合工程）と、混合工程で得られた混合液中の非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する工程（変換工程）と、混合液中の精度管理用核酸のシトシンが他の塩基に変換されたか否かを判定する工程（判定工程）と、判定工程で得られた判定結果に基づいて変換工程における変換処理が適切に行われたか否かを確認する工程（確認工程）とを含む。
【００１３】
検体としては、生体のゲノムＤＮＡを含むものであれば特に限定されず、例えば血液、血清、リンパ液、尿、乳頭分泌液、手術や生検により採取した組織の一部などを用いることができる。ゲノムＤＮＡは細胞内に存在するため、精度管理用核酸と混合する前に細胞からゲノムＤＮＡを溶液中に遊離させることが好ましい。例えば、市販のキットでゲノムＤＮＡの抽出・精製を行うことができる。また、細胞を可溶化する界面活性剤を含む緩衝液と、検体とを混合し、物理的処理（攪拌、ホモジナイズ、超音波処理など）を行うことによって、細胞内のゲノムＤＮＡを溶液中に遊離させることができる。この場合、物理的処理の後に細胞の破片を遠心分離によって沈殿させ、ゲノムＤＮＡを含む上清を後の変換処理及びメチル化解析に供することができる。このような緩衝液を用いることにより、上記のようなキットによるゲノムＤＮＡの抽出・精製等が不要となり、簡単な遠心操作のみで短時間且つ簡便に検出用試料を得ることができる。ここで用いられる界面活性剤は細胞を可溶化することができるものであれば特に限定されないが、コール酸ナトリウムやドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などを好適に用いることができる。
【００１４】
精度管理用核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、安定性の観点から二本鎖ＤＮＡであることがもっとも好ましい。
精度管理用核酸は検体中のゲノムには含まれない配列を有する。この配列はシトシンを少なくとも１塩基含み、変換処理の対象となる配列（以下、この配列をＢＳ配列とする）である。例えば検体がヒトから採取したものである場合、検体にはヒトゲノムが含まれている。よって、ＢＳ配列は、ヒトゲノムに含まれない配列であれば、人為的に設計した配列であってもよいし、他の生物種のゲノムに含まれる配列であってもよい。
例えば、以下のような配列を例示することができる。
5'-gggccggcaagccacgaacccaccc-3'（配列番号１）
5'-ccccgagccgcacgcgccaccgagg-3'（配列番号２）
これらの配列はヒトゲノムに含まれない配列であり、精度管理用核酸は、これらの配列のうち何れか一方のみを含んでいても良く、両方とも含んでいても良い。ヒトゲノムに含まれない配列であり且つシトシンを１塩基以上含んでいる配列であれば、これらの配列において１つ以上のヌクレオチドが変異（置換、欠失、挿入、付加など）した配列をＢＳ配列として用いることができる。
【００１５】
ＤＮＡチップによってメチル化検出を行う場合は、精度管理用核酸は配列番号１および配列番号２の何れか一方のポリヌクレオチドを含んでいればよい。この場合、このポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを固定化した基盤をＤＮＡチップとして用いることができる。また、ＭＳ−ＰＣＲによってメチル化検出を行う場合は、精度管理用核酸は上記の両方の配列を含むことが好ましい。この場合、上記の一方の配列の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、他方の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドとをプライマーセットとして用いることができる。
【００１６】
ＢＳ配列が検体中のゲノムに含まれない配列であるため、ＢＳ配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドは検体中のゲノムに実質的にハイブリダイズせず、検体中のゲノムに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドはＢＳ配列に実質的にハイブリダイズしない。このため、ゲノムに特異的なポリヌクレオチド及びＢＳ配列に特異的なポリヌクレオチドの何れを用いるかによって、精度管理用核酸および検体が共存した溶液中であっても何れのメチル化を検出しているのかを識別することができる。従って、検体に対する変換処理と精度管理用核酸に対する変換処理とを同時に同一容器内で行うことが可能となる（図１参照）。なお、図１は従来法による変換処理の確認方法と本実施形態による変換処理の確認方法とを示す模式図である。従来法では、検体を含む容器とコントロールＤＮＡを含む容器とを別々に用意し、それぞれの容器に対して変換処理を行い、変換処理後それぞれの容器に対して検体あるいはコントロールＤＮＡのメチル化検出を行う。本実施形態の方法では、検体と精度管理用核酸とを混合し、変換処理の後に検体のメチル化検出と精度管理用核酸のメチル化検出とを行うために変換処理後の混合液を分注する。
【００１７】
ＴａｑＭａｎ（ロシュダイアグノスティクス社の登録商標）ＰＣＲ法（Heid et al, 1996, Genome Research, Vol.6(10), 986-994）を用いると、変換処理を行った後、混合液を分注することなく同一容器内で検体のメチル化検出と精度管理用核酸のメチル化検出とを行うことも可能である（Panda et al, 2002, Cell, Vol. 109, 307-320参照）。この場合、検体にハイブリダイズするプライマーセット（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）と、精度管理用核酸にハイブリダイズするプライマーセットと、検体にハイブリダイズするＴａｑＭａｎプローブＡと、精度管理用核酸にハイブリダイズするＴａｑＭａｎプローブＢとを変換処理後の混合液に添加する。この際、たとえばＴａｑＭａｎプローブＡおよびＴａｑＭａｎプローブＢにそれぞれ異なる波長の蛍光を発する蛍光物質を標識しておくと、励起光を照射したときに混合液から発せられる光の波長によって、検体のメチル化検出と精度管理用核酸のメチル化検出とを、変換処理後の混合液を分注することなく、実行することができる。また、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法とＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法とを組み合わせることも可能である。たとえば、検体のメチル化検出をＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法によって行い、精度管理用核酸のメチル化検出をＴａｑＭａｎＰＣＲ法によって行うと、変換処理後の混合液を分注することなく、同じ容器内で検体のメチル化検出と精度管理用核酸のメチル化検出とを行うことができる。
【００１８】
検体に対する変換処理と精度管理用核酸に対する変換処理とを全く同一の条件下で行うことによって、精度管理用核酸のメチル化の検出結果に基づいてより信頼性高く検体に対する変換処理が適当であったか否かを確認することができる。また、これらの変換処理を同一容器で行うことによって、変換処理を別々の容器で行うよりも、簡便に操作を行うことができ、試薬の消費量を低減することもできる。
【００１９】
検体と精度管理用核酸とを混合した混合液には、変換処理が施される（変換工程）。変換処理とは、非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基（即ち、ウラシル、チミン、アデニン又はグアニン）に変換する処理である。変換工程においては、好ましくは、非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する変換剤が混合液に添加される。このような変換剤として、亜硫酸水素塩が好ましく用いられる。亜硫酸水素塩としては、亜硫酸水素のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などを用いることができる。これらのうち何れか１つ以上を用いてＤＮＡを処理すると、ＤＮＡ中の非メチル化シトシンは脱アミノ化によってウラシルへ変換される。一方、上記のような変換剤はＤＮＡ中のメチル化シトシンには作用せず、他の塩基への変換は起こらない。この変換剤は、精製水や緩衝液等の適当な溶媒に溶解し、溶液として用いることが好ましい。変換剤として亜硫酸水素塩を用いる場合、試料中のＤＮＡの非メチル化シトシンを充分に変換できる程度であれば混合液への添加量は特に限定されない。例えば、混合液に６ｍｍｏｌの亜硫酸水素ナトリウムを添加する場合、１０〜３０分間、５０〜８０℃でインキュベートすることにより非メチル化シトシンのウラシルへの変換を行うことができる。また、亜硫酸水素塩を低濃度（例えば３Ｍの亜硫酸水素ナトリウム溶液５２０μｌ）で用いる場合は、非メチル化シトシンを充分に変換できる程度の時間及び温度で変換を行えばよい。変換剤は亜硫酸水素塩に限定されず、メチル化シトシンを変換せず、非メチル化シトシンを選択的に他の塩基に変換することのできるものであればよい。
【００２０】
このような変換処理を行うことにより、検体中のＤＮＡの特定領域や精度管理用核酸におけるシトシンがメチル化されている場合と、メチル化されていない場合とでＤＮＡ配列が異なる。このＤＮＡ配列の相違を上記のＭＳ−ＰＣＲ、ＤＮＡチップ、ＤＮＡシーケンサーなどを用いて解析することにより、検体中のＤＮＡや精度管理用核酸のメチル化の有無を検出することができる。
【００２１】
精度管理用核酸のメチル化解析にＭＳ−ＰＣＲやＤＮＡチップを用いる場合は、非メチル化シトシンが別の塩基に変換された場合のＢＳ配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチドＵとする）と、非メチル化シトシンが変換されなかった場合のＢＳ配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチドＭとする）とを用いて、シトシンが変換されたか否かを検出することができる。これらのポリヌクレオチドは、ＢＳ配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。ＰＣＲの場合、これらの核酸ハイブリダイゼーション反応におけるストリンジェンシーは、主にＰＣＲ反応液中の温度と塩濃度とに左右され、高温、低塩濃度であるほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズしにくくなる）（J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989) 参照）。また、ＤＮＡチップを用いる場合は、ホルムアミド等の存在下でハイブリダイゼーションを行うことができる。ストリンジェントな条件の具体例としては、「５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌの核酸を含む溶液中、ハイブリダイゼーション温度４２℃」を例示することができるが、これに限定されない。本明細書において、「ハイブリダイズする」とはストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【００２２】
ＭＳ−ＰＣＲによりメチル化の検出を行う場合は、精度管理用核酸が第１のＢＳ配列と第２のＢＳ配列を有することが好ましい。この場合、２種類のポリヌクレオチドＵ（プライマーセットＵとする：シトシンが別の塩基に変換された場合の第１のＢＳ配列にハイブリダイズするフォワードプライマーＵ、及びシトシンが別の塩基に変換された場合の第２のＢＳ配列にハイブリダイズするリバースプライマーＵ）と、２種類のポリヌクレオチドＭ（プライマーセットＭとする：シトシンが変換されなかった場合の第１のＢＳ配列にハイブリダイズするフォワードプライマーＭ、及びシトシンが変換されなかった場合の第２のＢＳ配列にハイブリダイズするリバースプライマーＭ）とを用いることができる。
【００２３】
ＭＳ−ＰＣＲによりメチル化検出を行う場合は、変換処理を行った後の混合液を少なくとも４つの容器に分注することが好ましい。これらの容器のうち、二つ（容器Ａ及び容器Ｂとする）は検体のＤＮＡのメチル化検出に用いられ、残りの二つ（容器Ｃ及び容器Ｄとする）は精度管理用核酸のメチル化検出に用いられる。
容器Ａでは検体ＤＮＡの特定領域のシトシンが変換処理によってシトシン以外の塩基に変換された場合の配列にハイブリダイズするプライマーを用いてメチル化検出を行う。容器Ｂでは検体ＤＮＡの特定領域のシトシンが別の塩基に変換しなかった場合の配列にハイブリダイズするプライマーを用いてメチル化検出を行う。容器Ａにおいて核酸の増幅が認められ、且つ容器Ｂにおいて核酸の増幅が認められなかった場合には特定領域のシトシンは非メチル化シトシンであったことが推測される。容器Ｂにおいて核酸の増幅が認められ且つ容器Ａにおいて核酸の増幅が認められなかった場合には特定領域のシトシンはメチル化シトシンであったことが推測される。
【００２４】
一方、容器Ｃでは精度管理用核酸のＢＳ配列のシトシンが変換処理によってシトシン以外の塩基に変換された場合のＢＳ配列にハイブリダイズするプライマーを用いてメチル化検出を行う。容器Ｄでは精度管理用核酸のシトシンが変換されなかった場合のＢＳ配列にハイブリダイズするプライマーを用いてメチル化検出を行う。
【００２５】
精度管理用核酸のＢＳ配列に含まれるシトシンが非メチル化シトシンである場合は、変換処理が適切であれば、ＢＳ配列中のシトシンがシトシン以外の塩基に変換される。このため、容器Ｃにおいて精度管理用核酸の増幅が認められ、且つ容器Ｄにおいて精度管理用核酸の増幅が認められなかった（又は増幅効率が著しく悪い）場合、ＢＳ配列中の非メチル化シトシンが適切にシトシン以外の塩基に変換されたことがわかる。この結果に基づき、検体中のＤＮＡの非メチル化シトシンもシトシン以外の塩基に変換され、変換処理が適切に行われたと推測することができる。よって、容器ＡおよびＢで得られた検出結果は信頼性の高いものであると考えることができる。
一方、容器Ｃにおいて精度管理用核酸の増幅が認められず（又は増幅効率が著しく悪く）、容器Ｄにおいて精度管理用核酸の増幅が認められた場合、ＢＳ配列中の非メチル化シトシンが変換処理を施されたにもかかわらずシトシン以外の塩基に変換されなかったことがわかる。この結果に基づき、検体中のＤＮＡの非メチル化シトシンもシトシン以外の塩基に変換されず、変換処理が適切に行われなかったと推測することができる。よって、容器ＡおよびＢで得られた検出結果は信頼性の低いものであると考えられ、これを受けて再実験を行う等の対応を取ることができる。
【００２６】
精度管理用核酸のＢＳ配列に含まれるシトシンがメチル化シトシンである場合は、変換処理が適切であれば、ＢＳ配列中のシトシンがシトシン以外の塩基に変換されない。このため、容器Ｃにおいて精度管理用核酸の増幅が認められず（又は増幅効率が著しく悪く）、且つ容器Ｄにおいて精度管理用核酸の増幅が認められた場合、ＢＳ配列中のメチル化シトシンが変換処理で変換されなかったことがわかる。従って、検体中のＤＮＡのメチル化シトシンも他の塩基に変換されず、変換処理が適切に行われたと推測することができる。
一方、容器Ｃにおいて精度管理用核酸の増幅が認められ、容器Ｄにおいて精度管理用核酸の増幅が認められなかった（又は増幅効率が著しく悪い）場合、ＢＳ配列中のメチル化シトシンが変換処理により他の塩基に変換されてしまったことがわかる。従って、検体中のＤＮＡのメチル化シトシンも他の塩基に変換され、変換処理が適切に行われなかったと推測することができる。
【００２７】
ＭＳ−ＰＣＲやＤＮＡチップによって精度管理用核酸や検体のメチル化検出を行う際は検出結果を所定の閾値と比較することにより、メチル化の有無を判定することが好ましい。例えば、ＭＳ−ＰＣＲを用いる場合、閾値は以下のようにして設定され得る。
【００２８】
先ず複数の検体を用いて定量的リアルタイムＰＣＲによりゲノムの特定の領域のメチル化検出を行う。ここで、リアルタイムＰＣＲにおいて反応液から所定の値の蛍光強度などのシグナルに達するまでのサイクル数を検出サイクル数とする。メチル化されていると判定された検体（メチル化検体）のプライマーセットＵを用いた際の検出サイクル数と、メチル化されていないと判定された検体（非メチル化検体）のプライマーセットＵを用いた際の検出サイクル数とを比較し、メチル化検体と非メチル化検体とを最も高確率で分離できる値を閾値として用いることができる。検体のサイクル数がこの閾値以上であった場合は、メチル化されていないと判定され、この閾値未満であった場合は、メチル化されていると判定される。
【００２９】
さらに、メチル化検体のプライマーセットＭを用いた際の検出サイクル数と、非メチル化検体のプライマーセットＭを用いた際の検出サイクル数を比較し、メチル化検体と非メチル化検体とを最も高確率で分離できる値を閾値として用いることも可能である。検体のサイクル数がこの閾値以上であった場合は、メチル化されていると判定され、この閾値未満であった場合は、メチル化されていないと判定される。
プライマーセットＵを用いた際の閾値と、プライマーセットＭを用いた際の閾値とを併用して検体のメチル化の有無を判定してもよいし、何れかのみを用いて判定してもよい。
【００３０】
変換処理後、メチル化検出を行う前にＤＮＡの精製を行うことが好ましい。ＤＮＡ精製は市販の精製キット（例えば、キアゲン社製ＱｌＡｑｕｉｋ（商品名）など）を用いることができる。
検体のＤＮＡのメチル化を検出するにあたり、混合工程時に比べてどの程度ＤＮＡが回収できたか（以下、回収率ともいう）を算出することが好ましい。ＤＮＡ精製や変換処理を行うと、核酸が損失し、メチル化検出前の混合液中のＤＮＡ量は混合工程時よりも減少している。回収率は、閾値の設定やメチル化の判定において有用な情報となり得る。
【００３１】
回収率が低いとメチル化しているかどうかを判定するための閾値を厳格に設定する必要があるが、回収率が高いと柔軟に閾値を設定することができる。
例えば、定量的リアルタイムＰＣＲを用いてある遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化の検出を行う場合について、以下に説明する。所定の検出サイクル数を閾値として、プライマーセットＭで閾値以上の検出サイクル数で増幅が確認され、プライマーセットＵで閾値未満の検出サイクル数で増幅が確認された（又は増幅が確認されなかった）場合は、前記プロモーター領域のシトシンはメチル化されていると判定することができる。
一方、プライマーセットＵで閾値未満の検出サイクル数で増幅が確認され（又は増幅が確認されず）、プライマーセットＭで閾値以上の検出サイクル数で増幅が確認された場合は、プロモーター領域はメチル化されていないと判定することができる。
【００３２】
このような場合、回収率が低いと、多少の回収率の変動が閾値に対して大きな影響を与えるため、閾値を厳格に設定する必要がある。例えば、メチル化の有無が未知の検体にプライマーセットＭを添加してメチル化検出を行った結果、検出サイクル数が閾値未満であった場合、メチル化されていないために検出サイクル数が閾値未満であったのか、回収率が低い（ＰＣＲの鋳型となるＤＮＡ量が少ない）ことによって検出サイクル数が閾値未満であったのかを判別することが困難である。しかしながら、回収率が高いと、多少回収率が変動しても閾値に与える影響が小さいため、閾値の設定を柔軟に行うことができる。
以上より、メチル化検出においてＤＮＡの回収率を上昇させることは有益であり、その際に回収率を測定する技術が重要となる。
【００３３】
以下、回収率の測定について説明する。
検体中のＤＮＡがどの程度減少しているかを判定するために、ＢＳ配列の他に、非メチル化シトシンを含まず、且つ検体中のゲノムに含まれない配列（以下、Ｕｎｉ配列とする）をさらに有する精度管理用核酸を用いることができる。Ｕｎｉ配列は、非メチル化シトシンだけでなくメチル化シトシンも含まないことが好ましい。回収率の測定は、定量的リアルタイムPCRやDNAチップなどを用いて行うことができる。
【００３４】
予め検体と混合する精度管理用核酸の量（質量、コピー数など）を計測しておき、変換処理やＤＮＡ精製の後にＵｎｉ配列にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを用いて精度管理用核酸の量を定量すると精度管理用核酸の回収率を算出することができる。この値に基づき、検体のゲノムＤＮＡがどの程度減少したかを推測することができる。例えば、検体と１００の精度管理用核酸とを混合し（混合工程）、変換処理及びＤＮＡ精製の後に定量的リアルタイムＰＣＲによって精度管理用核酸が１０残っているという結果が出た場合は、回収率は１０％となる。従って、混合工程の時に比べて変換処理及びＤＮＡ精製を経ることにより検体に含まれていたゲノムＤＮＡも１０分の１となっていると推測することができる。
【００３５】
Ｕｎｉ配列としては、例えば、以下のような配列を例示することができる。
5'-gtttatgtttttggggtgttggaag-3'（配列番号３）
5'-gaggggataagaatttgagagagg-3'（配列番号４）
これらの配列はヒトゲノムに含まれない配列であり、精度管理用核酸は、これらの配列のうち何れか一方のみを含んでいても良く、両方とも含んでいても良い。ヒトゲノムに含まれない配列であり且つ非メチル化シトシンを含まない配列であれば、これらの配列において１つ以上のヌクレオチドが変異（置換、欠失、挿入、付加など）した配列をＵｎｉ配列として用いることができる。
【００３６】
ＤＮＡチップによって精度管理用核酸の定量を行う場合は何れか一方のポリヌクレオチドを含んでいればよい。この場合、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドを固定化した基盤をDNAチップとして用いることができる。
【００３７】
また、定量的リアルタイムＰＣＲによって精度管理用核酸の定量を行う場合は第１のＵｎｉ配列および第２のＵｎｉ配列として上記の配列を両方含み、第１のＵｎｉ配列が精度管理用核酸の５’末端に位置し、第２のＵｎｉ配列が精度管理用核酸の３’末端に位置することが好ましい。これにより、第１のＵｎｉ配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドと第２のＵｎｉ配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドとをプライマーセットとして用いて定量的リアルタイムＰＣＲを行うと、精度管理用核酸の全長を増幅することができ、精度管理用核酸の質量を定量することができる。
【００３８】
定量的リアルタイムＰＣＲとしては、公知の方法（たとえば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法やＴａｑＭａｎＰＣＲ法など）を用いることができる。ＴａｑＭａｎＰＣＲ法を用いる場合、図２（ａ）に示されるように精度管理用核酸は第１のＵｎｉ配列と第２のＵｎｉ配列との間にＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズする配列（プローブ用配列）を有する。
プローブ用配列としては、例えば、以下のような配列を例示することができる。
5'-tgggtgggttgtgaggtggtg-3'（配列番号５）
プローブ用配列は、ＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズするものであればその配列は特に限定されず、上記のプローブ用配列において１つ以上のヌクレオチドが変異（置換、欠失、挿入、付加など）した配列をプローブ用配列として用いることができる。
【００３９】
ＴａｑＭａｎプローブとしては、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド又は上記の配列の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いることができる。ＴａｑＭａｎプローブの５’末端及び３’末端の一方には第１標識物質が結合しており、もう一方には第２標識物質が結合している。前記第１標識物質及び前記第２標識物質は、所定の波長の光を照射することにより蛍光を発することができる物質（蛍光物質）であることが好ましい。第１標識物質と第２標識物質とが所定の距離未満に位置する場合、第１標識物質が前記所定の波長の光によって蛍光を発し、この蛍光によって、第２標識物質の蛍光が消光される。また、これらが所定の距離以上離れている場合は、第１標識物質の蛍光が第２標識物質まで達しないため、反応液に所定の波長の光を照射することによって反応液中の第１標識物質及び第２標識物質の両方又は一方が蛍光を発する。
【００４０】
上記のような性質を有するものであれば、第１標識物質及び第２標識物質の組み合わせは特に限定されない。例えば、第１標識物質としては、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＶＩＣ等が挙げられ、第２標識物質としては、６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）等が挙げられる。
【００４１】
第２標識物質が第１標識物質の発する蛍光を消光するためには、これらの物質が所定の距離以内である必要がある。この所定の距離は、標識物質の種類によって異なるが、約１００Å以下であることが好ましい。この距離は約３０ｍｅｒのポリヌクレオチドに相当するため、プローブの長さは３０ｍｅｒ以内であることが好ましい。また、特異性を維持するために、このプローブは１０ｍｅｒ以上、好ましくは１２ｍｅｒ以上、より好ましくは１５ｍｅｒ以上の長さである。ＴａｑＭａｎプローブの配列は、プローブ用配列（又はプローブ用配列の相補鎖）に完全に相補的である必要はなく、ハイブリダイズできる程度の相補性を有していればよい。
【００４２】
ＴａｑＭａｎＰＣＲ法を用いた場合は、検体に、上記のポリヌクレオチドセット（プライマーセットおよびＴａｑＭａｎプローブ、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）、逆転写酵素、及びＤＮＡポリメラーゼ（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する）を添加し、標識物質の励起波長を照射しながらＰＣＲ反応を進行させる。
【００４３】
また、ＰＣＲ反応においてプライマーが伸長しているときは、ＴａｑＭａｎプローブはＤＮＡに結合している状態である必要がある。このため、プライマーのＴｍ値よりもＴａｑＭａｎプローブのＴｍ値の方が高いことが好ましい。より好ましくは、ＴａｑＭａｎプローブのＴｍ値はプライマーのＴｍ値よりも８〜１２℃高い。これにより、同じストリンジェンシーではプライマーよりもＴａｑＭａｎプローブの方がＤＮＡに強固に結合することができる。
【００４４】
Ｔｍ値はプライマーの配列や長さに左右される。プライマーの配列中にＧＣが多いほど、及び／又は、プライマーの長さが長いほどＴｍ値が高くなる。また、ＴａｑＭａｎプローブにＤＮＡの副溝（Minor groove）に結合する副溝結合物質（ＭＧＢ：Minor groove binder）を結合させるとＴａｑＭａｎプローブのＴｍ値が上昇するため、同じＴｍ値を変えることなくより短いプローブを設計することができる。
【００４５】
図２（ａ）には、５’末端側から順に第１のＵｎｉ配列、第１のＢＳ配列、プローブ用配列、第２のＢＳ配列及び第２のＵｎｉ配列を有する二本鎖ＤＮＡである精度管理用核酸の模式図が示される。図２（ｂ）には、図２（ａ）に示される精度管理用核酸と、プライマーおよびプローブが精度管理用核酸のいずれの領域にハイブリダイズするかを示した模式図が示される。
【００４６】
なお、定量的リアルタイムＰＣＲの際に２種類のプローブ（第１プローブ及び第２プローブ）を用いてもよい。この場合、第１プローブに第１標識物質を結合させ、第２プローブに第２標識物質を結合させることができる。また、第１プローブの両末端にそれぞれ第１標識物質及び第２標識物質を結合させ、さらに第２プローブの両末端にもそれぞれ第１標識物質及び第２標識物質を結合させることもできる。これによって反応液の蛍光強度を増大させることができる。
【００４７】
上述したポリヌクレオチドは公知の方法により製造することができる。例えば、ＡＢＩ社製  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  Ｍｏｄｅｌ  ８９０９  ＤＮＡ合成機などの装置を用いて化学的に合成することができる。また、上記のような塩基配列で構成されるように天然の核酸を制限酵素などによって切断し、本実施形態のポリヌクレオチドとして用いることも可能である。
【００４８】
なお、上述の精度管理用核酸は、Ｕｎｉ配列やＢＳ配列の他に上述の配列とは異なる配列を含んでいてもよい。例えば、図２（ａ）に示される精度管理用核酸において、第１のＢＳ配列とプローブ用配列との間に数ヌクレオチドの配列を含んでいてもよい。
【００４９】
（実施例１）
１．精度管理用核酸の調製
インビトロジェン社に以下に示す配列を有する３種類のポリヌクレオチドの合成を委託した。
5'-gtttatgtttttggggtgttggaag gggccggcaagccacgaacccaccc-3'（配列番号６）
5'-cctctctcaaattcttatcccctcat cctcggtggcgcgtgcggctcgggg-3'（配列番号７）
5'-gggccggcaagccacgaacccaccc tgtgggtgggttgtgaggtggtg ccccgagccgcacgcgccaccgagg-3'（配列番号８）
【００５０】
上記のポリヌクレオチドを用い、配列番号６のポリヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号７のポリヌクレオチドをリバースプライマー、配列番号８のポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとして下記の通りＰＣＲ反応液２５μＬを調製した。
１０×  Ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μＬ
フォワードプライマー（１０μＭ）  １μＬ
リバースプライマー（１０μＭ）  １μＬ
鋳型ＤＮＡ（０．２μＭ）  １μＬ
Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．２μＬ
ｄＨ２Ｏ  １８．８μＬ
【００５１】
上記の反応液を用い、下記の条件でＰＣＲを行った。
９５℃  ４分３０秒
９５℃  ３０秒、６０℃  １５秒、７２℃  １５秒を４０サイクル
７２℃  ５分
【００５２】
TA cloning kit（インビトロジェン社）によりＰＣＲ反応後の増幅産物をベクターに組み込み、このベクターを大腸菌（TOP 10）にトランスフォームした。この大腸菌を培養し（ＬＢ培地、３７℃、一晩静置）、大腸菌コロニーからＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ（キアゲン社）によりプラスミドを精製した。精製したプラスミドからクローニングサイトに組み込まれたＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法によりＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００（アプライドバイオシステムズ社）を使用して、添付のプロトコルに従って決定した。このヌクレオチド配列は以下の通りであった。
5'-gtttatgtttttggggtgttggaaggggccggcaagccacgaacccaccctgtgggtgggttgtgaggtggtgccccgagccgcacgcgccaccgaggatgaggggataagaatttgagagagg-3'（配列番号９）
【００５３】
これを精度管理用核酸として以下の実験に用いた。なお、ＰＣＲによって合成されるＤＮＡ中のシトシンは非メチル化シトシンであるため、この精度管理用核酸中のシトシンはすべてメチル化シトシンである。
【００５４】
精度管理用核酸の１番目〜２５番目の配列は第１のＵｎｉ配列、２６番目〜５０番目の配列は第１のＢＳ配列、５２番目〜７３番目の配列はプローブ用配列、７４番目〜９８番目の配列は第２のＢＳ配列、１０１番目〜１２４番目の配列は第２のＵｎｉ配列に相当する。
【００５５】
２．変換処理の確認
２．（１）精度管理用核酸のメチル化検出
検体としてヒト乳がん由来の培養細胞であるＭＤＡ  ＭＢ−２３１細胞を用いた。ＭＤＡ  ＭＢ−２３１細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ）からキアゲン社製のキット（商品名：Blood & Cell Culture DNA mini Kit）を用いてヒトゲノムの抽出を行った。
【００５６】
４つのエッペンドルフチューブ（チューブ１〜４）に精製水を分注し、チューブ１には精度管理用核酸１０ｐｇ、チューブ２には精度管理用核酸１０ｐｇおよびヒトゲノム４μｇ、チューブ３にはヒトゲノム４μｇを添加した。チューブ４にはＤＮＡを添加せず、ネガティブコントロール（ＮＣ）として用いた。
【００５７】
チューブ１〜４のぞれぞれに１２μｌの１０Ｎ  ＮａＯＨを加えて１０分間室温でインキュベートした。次に、各チューブに３Ｍの亜硫酸水素ナトリウム溶液５２０μＬを加え、５０℃１６時間インキュベートした（変換処理）。この亜硫酸水素塩処理された溶液に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ精製キット（キアゲン社ＱｌＡｑｕｉｋ（商品名））により精製し（ＤＮＡ精製）、検出用試料を得た。チューブ１〜４から得られた検出用試料をそれぞれ検出用試料１〜４とした。
【００５８】
検出用試料１を２つのチューブに分注し、これらのチューブをチューブ１ａおよび１ｂとした。検出用試料２〜４も同様にそれぞれ２つのチューブに分注し、チューブ２ａおよび２ｂ、チューブ３ａおよび３ｂ、チューブ４ａおよび４ｂとした。
【００５９】
チューブ１ａ、２ａ、３ａおよび４ａにはシトシンがウラシルに変換された場合の精度管理用核酸にハイブリダイズ可能なＢＳプライマーセット（ＢＳ−Ｆプライマー及びＢＳ−Ｒプライマー）を添加し、ＰＣＲを行った。
チューブ１ｂ、２ｂ、３ｂおよび４ｂには変換が起こらなかった場合の精度管理用核酸にハイブリダイズ可能なｎｏｎＢＳプライマーセット（ｎｏｎＢＳ−Ｆプライマー及びｎｏｎＢＳ−Ｒプライマー）を添加し、ＰＣＲを行った。
各プライマーの配列、ＰＣＲ反応液組成およびＰＣＲ反応条件は以下の通りである。
【００６０】
（プライマー配列）
ＢＳ−Ｆプライマー：5'-gggttggtaagttatgaatttattt-3'（配列番号１０）
ＢＳ−Ｒプライマー：5'-cctcaataacacatacaactcaaaa-3'（配列番号１１）
ｎｏｎＢＳ−Ｆプライマー：5'-aagccacgaacccacc-3'（配列番号１２）
ｎｏｎＢＳ−Ｒプライマー：5'-tcatcctcggtggcg-3'（配列番号１３）
【００６１】
（ＰＣＲ反応液組成）
１０×  Ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μＬ
ＢＳプライマーセット又はｎｏｎＢＳプライマーセット
Ｆプライマー（１０μＭ）  １μＬ
Ｒプライマー（１０μＭ）  １μＬ
検出用試料  １μＬ
Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．２μＬ
ｄＨ２Ｏ  １８．８μＬ
【００６２】
（ＰＣＲ反応条件）
９５℃  ４分３０秒
９５℃  ３０秒、６０℃  １５秒、７２℃  １５秒を３０サイクル
【００６３】
ＰＣＲ後、各反応液をアガロースゲルのウェルに収容し、電気泳動を行った。電気泳動後、アガロースゲルをエチジウムブロマイドで蛍光染色した。図３にアガロースゲルの蛍光写真を示す。
【００６４】
また、変換処理を行わないこと以外は上記と同様にして調製した検出用試料を用い、上記と同様にしてＢＳプライマーセット及びｎｏｎＢＳプライマーセットの何れかを添加してＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動後、アガロースゲルをエチジウムブロマイドで蛍光染色した。図４にアガロースゲルの蛍光写真を示す。
【００６５】
２．（２）ゲノムのメチル化検出
上記で調製した検出用試料１を２つのチューブに分注し、これらのチューブをチューブ１ｃおよび１ｄとした。検出用試料２〜４も同様にそれぞれ２つのチューブに分注し、チューブ２ｃおよび２ｄ、チューブ３ｃおよび３ｄ、チューブ４ｃおよび４ｄとした。
【００６６】
チューブ１ｃ、２ｃ、３ｃおよび４ｃにはシトシンがウラシルに変換された場合のＥカドヘリン遺伝子（Ｅｃａｄ）のＣｐＧアイランドにハイブリダイズ可能なＥｃａｄプライマーセット（Ｅｃａｄ−Ｆプライマー及びＥｃａｄ−Ｒプライマー）を添加し、ＰＣＲを行った。
チューブ１ｄ、２ｄ、３ｄおよび４ｄにはシトシンがウラシルに変換された場合のエストロゲンレセプターα（ＥＲα）のＣｐＧアイランドにハイブリダイズ可能なＥＲプライマーセット（ＥＲ−Ｆプライマー及びＥＲ−Ｒプライマー）を添加し、ＰＣＲを行った。
各プライマーの配列、ＰＣＲ反応液組成およびＰＣＲ反応条件は以下の通りである。
【００６７】
（プライマー配列）
Ｅｃａｄ−Ｆプライマー：5'-ttaggttagagggttatcgcgt-3'（配列番号１４）
Ｅｃａｄ−Ｒプライマー：5'-taactaaaaattcacctaccgac-3'（配列番号１５）
ＥＲ−Ｆプライマー：5'-ttttgggattgtatttgttttcgtc -3'（配列番号１６）
ＥＲ−Ｒプライマー：5'-aacaaaatacaaaccgtatccccg -3'（配列番号１７）
【００６８】
（ＰＣＲ反応液組成）
１０×  Ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μＬ
Ｅｃａｄプライマーセット又はＥＲプライマーセット
Ｆプライマー（１０μＭ）  １μＬ
Ｒプライマー（１０μＭ）  １μＬ
検出用試料  １μＬ
Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．２μＬ
ｄＨ２Ｏ  １８．８μＬ
【００６９】
（ＰＣＲ反応条件）
９５℃  ４分３０秒
９５℃  ３０秒、６０℃  １５秒、７２℃  １５秒を３０サイクル
【００７０】
ＰＣＲ後、各反応液をアガロースゲルのウェルに収容し、電気泳動を行った。電気泳動後、アガロースゲルをエチジウムブロマイドで蛍光染色した。図５にアガロースゲルの蛍光写真を示す。
【００７１】
また、変換処理を行わないこと以外は上記と同様にして調製した検出用試料を用い、上記と同様にしてＢＳプライマーセット及びｎｏｎＢＳプライマーセットの何れかを添加してＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動後、アガロースゲルをエチジウムブロマイドで蛍光染色した。図６にアガロースゲルの蛍光写真を示す。
【００７２】
３．結果
図３より、精度管理用核酸を含むチューブ１ａおよび２ａにおいて、ＢＳプライマーセットを用いた場合に蛍光バンドが観察され、その他のチューブでは蛍光バンドは観察されなかった。図４より、精度管理用核酸を含むチューブ１ａおよび２ａにおいて、ｎｏｎＢＳプライマーセットを用いた場合に蛍光バンドが確認され、その他のチューブでは蛍光バンドは観察されなかった。以上より、検体に施された変換処理は適切であったことがわかる。
【００７３】
図５より、変換処理を施した場合はゲノムを含むチューブ２ｃ、３ｃ、２ｄおよび３ｄにおいて蛍光バンドが観察された。また、図６より、変換処理を施さなかった場合は何れのチューブでも蛍光バンドは観察されなかった。よって、検体中のＥｃａｄのＣｐＧアイランドはメチル化されておらず、ＥＲαのＣｐＧアイランドもメチル化されていないことがわかる。精度管理用核酸のメチル化検出結果より、変換処理が適切であったことが確認されたため、より信頼性の高いＥｃａｄおよびＥＲαのメチル化検出結果を得ることができた。
【００７４】
（実施例２）
実施例１と同様にしてＭＤＡ  ＭＢ−２３１細胞から抽出したヒトゲノムに精度管理用核酸を混合し、これを分注して検出用試料５および６を調製した。
混合直後にＴａｑＭａｎＰＣＲにより精度管理用核酸の質量を測定した。検出用試料５に対しては実施例１と同様にして変換処理およびＤＮＡ精製を行った後、ＴａｑＭａｎＰＣＲにより精度管理用核酸の質量を測定した。検出用試料６に対しては変換処理を行わず、ＤＮＡ精製を行った後、ＴａｑＭａｎＰＣＲにより精度管理用核酸の質量を測定した。混合直後に測定した精度管理用核酸の質量に対するＤＮＡ精製後の精度管理用核酸の質量の百分率を回収率として算出した。
【００７５】
ＴａｑＭａｎＰＣＲは以下のようにして行われた。
プライマーおよびＴａｑＭａｎプローブの配列、ＰＣＲ反応液組成およびＰＣＲ反応条件は以下の通りである。なお、ＴａｑＭａｎＰＣＲは、試薬としてBrilliant QPCR Master Mix（ストラタジーン社）を用い、装置としてMx3005P Real-time PCR system (ストラタジーン社)を用いて添付の説明書に従って行った。
【００７６】
（プライマー配列）
Ｕｎｉ−Ｆプライマー：5'-gtttatgtttttggggtgttgga-3'（配列番号１８）
Ｕｎｉ−Ｒプライマー：5'-cctctctcaaattcttatcccctc-3' （配列番号１９）
（ＴａｑＭａｎプローブ配列）
5'-tgggtgggttgtgaggtgg-3' （配列番号２０）
【００７７】
（ＰＣＲ反応液組成）
２×  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  １２．５μＬ
Ｕｎｉ−Ｆプライマー（１０μＭ）  １μＬ
Ｕｎｉ−Ｒプライマー（１０μＭ）  １μＬ
ＴａｑＭａｎプローブ（１００μＭ）  ０．２５μＬ
検出用試料  １μＬ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｙｅ  ０．３７５μＬ
ｄＨ２Ｏ  ８．８７５μＬ
【００７８】
（ＰＣＲ反応条件）
９５℃  １０分
９５℃  ３０秒、６０℃  １５秒、７２℃  １５秒を４０サイクル
【００７９】
反応液の蛍光強度がThreshold（Mx3005P Real-time PCR systemに搭載されたソフトウェアで自動的に設定された値）を超えた時のサイクル数（以下、検出サイクル数とする）を表１に示す。実験はそれぞれ２度行われ、表１には２度の実験の検出サイクル数の平均値を示す。
【００８０】
【表１】
2008072950.tif 000002
【００８１】
混合工程直後に測定した精度管理用核酸の質量は７５９．４ｐｇであり、変換処理およびＤＮＡ精製を経た後に測定した精度管理用核酸の質量は０．８１ｐｇであり、変換処理を行わずにＤＮＡ精製のみ経た後に測定した精度管理用核酸の質量は３７５．６ｐｇであった。よって、検出用試料５の精度管理用核酸の回収率は０．１％であり、検出用試料６の精度管理用核酸の回収率は４９．５％であった。以上より、検体と本実施例の精度管理用核酸とが共存した検出用試料を用いて、精度管理用核酸の回収率を測定することができた。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】従来法による変換処理の確認方法と本実施形態による変換処理の確認方法とを示す模式図である。
【図２】（ａ）５’末端側から順に第１のＵｎｉ配列、第１のＢＳ配列、プローブ用配列、第２のＢＳ配列及び第２のＵｎｉ配列を有する精度管理用核酸の模式図である。（ｂ）精度管理用核酸と、プライマーおよびプローブが精度管理用核酸のいずれの領域にハイブリダイズするかを示した模式図である。
【図３】変換処理を行った場合の精度管理用核酸のメチル化検出結果を示すアガロースゲルの写真である。
【図４】変換処理を行わなかった場合の精度管理用核酸のメチル化検出結果を示すアガロースゲルの写真である。
【図５】変換処理を行った場合のＥｃａｄおよびＥＲのメチル化検出結果を示すアガロースゲルの写真である。
【図６】変換処理を行わなかった場合のＥｃａｄおよびＥＲのメチル化検出結果を示すアガロースゲルの写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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