(57)【要約】【課題】本発明の課題は、膵β細胞のインスリン分泌を促進する物質および体内組織細胞によるグルコースの取込みを促進する物質を見出し、糖尿病に代表されるメタボリックシンドロームの予防に有効な成分を提供することである。  【解決手段】非発酵型ルイボス茶の特異な成分であるアスパラチンに膵β細胞インスリン分泌促進作用および骨格筋細胞グルコース取込み促進作用を認め、本発明を完成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスパラチンを有効成分とする膵β細胞インスリン分泌促進剤。
【請求項２】
アスパラチンを有効成分とする体内組織細胞によるグルコース取込み促進剤。
【請求項３】
体内組織細胞が骨格筋細胞であることを特徴とする請求項２記載のグルコース取込み促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスパラチンを有効成分とし、アスパラチンのすい臓β細胞インスリン分泌能促進剤および体内組織細胞グルコース取り込み能促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
統合医療の提唱者であるアンドルー・ワイル医師は、「ワイル博士の医食同源」の中で、炭水化物の栄養指標としてグリセミック指数を重要視している。グリセミック指数は、種々の炭水化物の血糖値におよぼす度合いをあらわす指数であり、グリセミック指数の高い炭水化物は血糖値上昇が速く、インスリン反応が高くなる。
【０００３】
工業的プロセスを経て生産される精製炭水化物食品は現代食に氾濫しており、これらの食品はグリセミック指数が高くなっている。ハワイ先住民であるポリネシア系の人たちは、従来、タロイモの澱粉より作る半発酵食物のポイ、パンの木の実、サツマイモといった低グリセミック食品を食していたが、現在は精製炭水化物食に偏り、肥満度が高く、高血圧、２型糖尿病、心臓病の罹患率が上昇している。つまり、高グリセミック食品は、高血圧、２型糖尿病、心臓病といった、いわゆるメタボリックシンドロームと深く関わっていると推察される。
【０００４】
こうした背景から、特に糖尿病や糖尿病予備軍を対象とした血糖値上昇を抑制する薬剤や食品因子はメタボリックシンドローム抑制には有用と考えられる。
【０００５】
薬剤としては、インスリン濃度を高めることにより血糖値を低下させるインスリン、および、トルブタミドなどのスルホニル尿素系薬剤、肝臓からの糖の放出を抑え、骨格筋や脂肪細胞での糖取り込みや利用を促進する作用をもつ塩酸ブホルミン、塩酸ピオグリタゾンなどのビグアナイド系薬剤およびインスリン抵抗性改善薬、腸管からの糖吸収過程にかかわるα-グルコシダーゼを阻害するボグリボーズなどのα-グルコシダーゼ阻害薬がある。
【０００６】
特定保健用食品の表示許可を受けている関与成分にも、血糖値抑制効果を示すものがあり、いずれも腸管からの糖吸収過程にかかわる成分である。特定保健用食品としては、糖質の消化・吸収を遅延させる難消化性デキストリンおよび豆鼓エキス、α-アミラーゼ阻害作用の小麦アルブミン、スクラーゼ阻害作用のL-アラビノース、糖質消化酵素阻害作用のグァバ葉ポリフェノールの5成分である。
【０００７】
日本人では、95％以上が２型糖尿病と推定されるが、２型糖尿病は、膵β細胞からのインスリン分泌能低下とインスリンの標的臓器である骨格筋、肝臓、脂肪組織でのインスリン感受性の低下（インスリン抵抗性）が様々に組み合わさってインスリン作用の低下が起こり、高血糖を来した状態である。欧米人に比べて、遺伝的に膵β細胞からのインスリン分泌能の低いことが日本人の２型糖尿病の特徴として指摘されるようになっており(第3回日本医学会特別シンポジウム記録集、41-56、2001)、現在、特定保健用食品で表示許可を受けているような腸管吸収抑制によらない、インスリン分泌を促進する食品因子およびグルコースの取り込みを促進する食品因子が望まれている。
【０００８】
ルイボスは、原産地は南アフリカで、学名をアスパラサス・リネアリスといい、これを原料とし、発酵してできるルイボス茶は、欧米では美容と健康のために飲用されている。成分としては、鉄、カルシウム、銅、亜鉛、マンガンなどのミネラルや、抗酸化作用，活性酸素除去作用のあるＳＯＤ様物質といわれるフラボノイドを含んでいる。
【０００９】
炎症や細胞の老化防止に効果があり、肌荒れ、口内炎、アトピー性皮膚炎、高血圧の改善、がん予防作用などが報告されている。
【００１０】
また、このルイボス茶抽出物には糖尿病改善治療剤として公開特許公報が存在する。一つは、抽出物のフラボノイド含量は0.041％であり、尿糖消失により糖尿病改善作用を認めた発明である(特開平05 - 246875号公報、特許文献１)。
【００１１】
他の一つは、抽出物の成分組成は、アスパラチンを含む糖化フラボノイドの含量が0.1〜5％の抽出物を使用しており、尿糖消失および血糖値低下により糖尿病改善作用を認めているが、活性酸素除去作用物質と糖化合物の抗酸化作用物質との組み合わせによる作用と記載している(特開平06-199695号公報、特許文献２)。
【００１２】
ところで、最近、非発酵型ルイボス茶が開発され、この非発酵型ルイボス茶は、従来の発酵型ルイボス茶よりも抗酸化力が強く、特異的な成分として糖化フラボノイドの一種、アスパラチンを多く含むことが報告されている(J. Agric. Food Chem. 51, 7472-7474(2003)、非特許文献１)。
【００１３】
従来の発酵型ルイボスにはアスパラチンは0.1％程度であり(前掲、非特許文献１)、アスパラチンの生体内での作用についてはまったく不明と言って良い状態であった。本発明者らはアスパラチンを非発酵型ルイボス茶より精製し、アスパラチンに肝癌細胞の増殖抑制活性と癌細胞の転移抑制活性を見出している(2006年度日本農芸化学会)。
【００１４】
【特許文献１】特開平05 - 246875号公報
【特許文献２】特開平06 - 199695号公報
【非特許文献１】J. Agric. Food Chem. 51、7472-7474(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の課題は、膵β細胞のインスリン分泌を促進する物質および体内組織細胞によるグルコースの取込みを促進する物質を見出し、糖尿病に代表されるメタボリックシンドロームの予防に有効な成分を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、非発酵型ルイボス茶の特異な成分であるアスパラチンに膵β細胞インスリン分泌促進作用および骨格筋細胞グルコース取込み促進作用を認め、本発明を完成した。
【００１７】
すなわち本発明は、
(１)アスパラチンを有効成分とする膵β細胞インスリン分泌促進剤、
(２)アスパラチンを有効成分とする体内組織細胞によるグルコース取込み促進剤、
(３)体内組織細胞が骨格筋細胞であることを特徴とする(2)記載のグルコース取込み促進剤
に関するものである。
アスパラチンは、次のような構造式を有している。
【００１８】
【化１】
2008214274.tif 000002
【００１９】
アスパラチンの製造方法は、非発酵型ルイボス茶を出発原料とし、水、エタノール、アセトンなどの親水性有機溶媒、もしくは含水親水性有機溶媒で抽出する。含水層を濃縮、親水性有機溶媒を溜去後、吸着樹脂にアスパラチンを吸着させ、吸着樹脂を脱イオン水で洗浄後、吸着したアスパラチンを親水性有機溶媒で溶出させる。これをさらにシリカゲル、HP20SS吸着樹脂、ウィンタリング、結晶化などで精製する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によって、アスパラチンが膵β細胞インスリン分泌促進剤、体内組織細胞によるグルコース取込み促進剤として利用でき、結果として血糖値の上昇を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に本発明の実施例を挙げて、より詳細に説明するが、本発明はそれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
(アスパラチンの調製)
非発酵型ルイボス茶より、アスパラチンを精製した。アスパラチンは、287nmに特異的な極大吸収を示すが、これを指標としてHPLCで分析し精製を行った。アスパラチンをエタノールにてソックスレー抽出し、濃縮、ヘキサンを添加し、ヘキサン層と含水エタノール層を形成するまで脱イオン水を攪拌しながら添加した。含水エタノール層を濃縮、脱エタノール後、吸着樹脂にアスパラチンを吸着させた。吸着樹脂を脱イオン水で洗浄後、吸着したアスパラチンをエタノールで溶出させ、これをさらにシリカゲル、HP20SS吸着樹脂、ウィンタリング、結晶化などで精製し、純度96.3％のアスパラチンを得た。
【００２３】
調製したアスパラチンについて、膵β細胞インスリン分泌促進作用および骨格筋細胞グルコース取込み促進作用に対する効果について検証した。
【実施例２】
【００２４】
(膵β細胞インスリン分泌能促進作用の確認)
膵β細胞インスリン分泌能促進作用は、ラット膵臓β細胞由来のRIN-5Fを用いて測定した。
【００２５】
[維持培養]
RIN-5F 細胞(ATCC、CRL-2058)は、L-グルタミン(和光純薬社製)300mg/L、NaHCO3(和光純薬社製)1.8〜3.0g/L、ストレプトマイシン100μg/L、ペニシリン100 units/mlを添加し、10％ウシ胎児血清(FBS)含有RPMI 1640培地(10%FBS/RPMI 1640) を用いて、37℃、5％CO2/95％空気下CO2インキュベーター(Model IT43、ヤマト科学)で培養した。
【００２６】
5 mlの10%FBS/RPMI 1640培地にRIN-5F 細胞を懸濁し、25cm2細胞培養用フラスコ(NUNKTM)に播種した。細胞を播種後、48〜72時間CO2インキュベーター内で静置した後、フラスコ底面に吸着しなかった細胞を吸引除去し、5mlの新鮮な培地に交換した。3日おきに培地を交換し、増殖した細胞はトリプシン処理によってプレート底面より剥離してから継代培養し、実験に使用した。
【００２７】
[インスリン分泌能検定のための培養]
RIN-5細胞から分泌されるインスリン量の測定は、Nomuraらの方法を一部改変して行った (Bioorg. Med. Chem. 11, 3807-3813 (2003)) 。
【００２８】
RIN-5細胞を2.5 × 105細胞/mlとなるように10%FBS/RPMI 1640培地に懸濁し、24穴プレート(NUNKTM)に1穴当り1ml播種し、CO2インキュベーター内で72時間培養した。培地を吸引除去後、10μMまたは100μMアスパラチンを含む1%FBS/RPMI 1640、1mlでさらに3時間培養した。対照としてアスパラチンを含まない1%FCS/RPMI 1640、1mlを添加した群を設けた。各濃度群について3穴用意し測定した。培養後、培養上清を回収し、High Range Rat Insulin ELISA (Mercodia社製)を用いて培地中のインスリン濃度を測定した。統計処理は、One-way Analysis of Varianceの後、Dunnett Multiple Comparisons Testを実施した。アスパラチンを含まない1%FBS/RPMI 1640で培養した場合に比較して、10μMおよび100μMアスパラチンを含む1%FBS/RPMI 1640で培養したRIN-5Fにおいて有意差(p<0.01)のあるインスリン増大を認め、アスパラチンによるインスリン分泌促進能を認めた (図1) 。
【実施例３】
【００２９】
(グルコース取り込み能促進作用の確認)
グルコース取り込み能促進作用は、ラット由来L6筋芽細胞を用いて測定した。
【００３０】
[維持培養]
L6筋芽細胞は、Yagasakiらの方法で培養した。(Cytotechnology, 43, 97-103 (2003))
L-グルタミン（和光純薬工業、大阪）584 mg/l、NaHCO3、1.2〜2.0 g/l、ストレプトマイシン100 μg/l、ペニシリン100 units/mlを添加した10%FBS/DMEM培地（日水製薬、東京）を用いて、37℃、5%CO2/95%空気下CO2インキュベーターで維持培養した。
【００３１】
5 mlの培地にL6筋芽細胞を懸濁し、25 cm2細胞培養用フラスコに播種した。翌日、フラスコ底面に接着しなかった細胞を吸引除去し、5 mlの新鮮な培地に交換した。3日おきに培地を交換し、増殖した細胞はトリプシン処理によってプレート底面から剥離してから継代培養し、実験に使用した。
【００３２】
[糖取り込み能検定のための培養]
L6筋管細胞に取り込まれたグルコース量の測定は、Doiらの方法(Biochem. Biophys. Res. Commun., 312, 1111-1117(2003))に基づき、一部改変して行った。
【００３３】
L6筋芽細胞を5.0×104cells/mlとなるように10%FBS/DMEM培地に懸濁し、24穴プレート（NUNKTM）に1穴当り0.4 ml播種し、CO2インキュベーター内で培養した。3日おきに培地を交換し、11日間培養して筋管を形成させた。その後、培地を吸引除去し、0.4 ml/穴のBuffer Bで2時間培養した。Buffer Bとは、 Krebs-Henseleit buffer（Sigma）に0.1％BSA（和光純薬工業、大阪）、10 mM Hepes（和光純薬工業、大阪）、2 mMピルビン酸（和光純薬工業、大阪）、5 mM D(＋)-グルコース（和光純薬工業、大阪）を添加したものである。
【００３４】
その後、ASPを含むBuffer Bに交換して直ちに各wellから25 mlずつ1.5 mlマイクロテストチューブに培地を回収し、この時を培養0時間とした。4時間培養後、再び25 mlずつ培地を回収し、0時間のときに回収した培地とともにグルコースCII-テストワコー（和光純薬工業、大阪）を用いてグルコース濃度を測定した。対照として0.4 ml/穴にBuffer Bのみ添加した群を設けた。各濃度群について3穴用意し測定した。
【００３５】
0時間と4時間後に検出したグルコース濃度より1穴あたりの総量を計算し、0時間の1穴当りのグルコース総量から4時間後のグルコース総量を差し引いて得た値をグルコース取込量とした。統計処理は、One-way Analysis of Varianceの後、Dunnett Multiple Comparisons Testを実施した。アスパラチンを含まないBuffer Bで培養した場合に比較して、10μMアスパラチンを含むBuffer Bで培養したL66筋管細胞において有意差(p<0.05)のあるグルコース取込み量の増大を認め、100μMでもグルコース取込み量の増大傾向を認めた (図2)。
【実施例４】
【００３６】
(動物実験)
[動物飼育]
db/db, db/+, +/+系雄マウス（日本チャールス・リバー社製）を5週齢で購入し、明期8:00〜20:00、室温22±1℃、相対湿度60±5％の空調飼育室内で5室ケージを用いて飼育した。db/db系雄マウスは糖尿病モデルマウスであり、db/+, +/+系雄マウスは正常形質のマウスである。これらマウスに固型飼料（CE-2, CLEA JAPAN社製）を与え、水道水と共に3日間自由摂取させた。その後、20%カゼイン食（20C，AIN-93処方）に切り換え、さらに4日間飼育した後、db/dbマウスは2群に分けた。6週齢となったdb/dbマウスを血糖値、体重共に有意差が生じないよう2群に分け、対照群(n=6)には20Cを、実験群(n=4)には20Cに0.1％アスパラチンを添加した飼料を与え3週間飼育した。その後は，0.2％アスパラチンを添加した飼料を与えて飼育した。
【実施例５】
【００３７】
(空腹時血糖値測定)
空腹時血糖値の測定は1〜2週に一度行った。午前9時に飼料を取り除き（水は与えたまま）4時間の絶食後、メスにより尾静脈を軽く刺傷した後、血液を目盛り付きガラス毛細管マイクロピペット（10 ml用、Drummond Scientific 社製）を用いて吸引し採血した。吸引採取された血液は、40 mlの超純水が入った1.5 mlマイクロテストチューブの中に吹き込み、溶血させ、氷中で保存した。
【００３８】
その後、20％（w/w）トリクロロ酢酸溶液を50 ml添加し、撹拌、12,000 r.p.m.、4℃、5 分間遠心分離した。その上清80 mlをグルコースCII-テストワコーを用いて血糖値を測定した。統計処理はOne-way Analysis of Varianceの後，Tukey-Kramer Multiple Comparisons Testにより行った。3週目以降8週目まで、アスパラチンを投与した群(n=6)では、対照群(n=4)と比較し血糖値の有意な上昇抑制(p<0.01)を認めた。また、同時期に20Cで飼育した正常形質を示すdb/+系および+/+系マウスでは血糖値の異常な上昇は認めず、血糖値の上昇はdb/db系雄マウスのもつ固有の遺伝形質であることを示した(図3)。
【実施例６】
【００３９】
(グルコース負荷試験)
アスパラチン投与5週後、11週齡のdb/dbマウスを35日目の午後8時から36日目の午前11時まで15時間絶食後、超純（MQ）水に溶解したアスパラチンを20 mg/ml/100 g体重となるようにマウスに経口投与した。対照群には超純水のみ投与した。その2時間後に血液を採取し（図4、0 h値）、両群のdb/dbマウスに超純水に溶解したグルコース溶液を200mg/ml/100 g体重となるようにマウスの腹腔内に注射した。グルコースを負荷してから、0.5、1.0、1.5、2.0時間後の血液を経時的に採取した。血液採取法および測定法は上記に準じた。
【００４０】
統計処理はOne-way Analysis of Varianceの後，Student’s t-testにより行った。グルコース負荷後の血糖値上昇は, 対照群(n=6)に比較してアスパラチンを投与した群(n=4)では0.5〜2.0時間にわたって有意に低値(p<0.05)を示した(図4)。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ラット膵β細胞由来RIN-5F細胞からのインスリン分泌に対するアスパラチンの影響を示す図。
【図２】ラットL6筋管細胞によるグルコース取込みに対するアスパラチンの影響を示す図。
【図３】糖尿病モデル、db/db系雄マウス空腹時血糖値に対するアスパラチンの影響を示す図。
【図４】糖尿病モデル、db/db系雄マウスにおける腹腔内注射糖負荷に対するアスパラチンの影響を示す図。
【図１】
2008214274.tif 000003
【図２】
2008214274.tif 000004
【図３】
2008214274.tif 000005
【図４】
2008214274.tif 000006