(57)【要約】【課題】タンパクや核酸等の非特異吸着が少なく、特に、生化学・医薬品分野で特出する高感度と低ノイズを発現する磁性粒子およびその製造方法ならびにプローブ結合粒子を提供すること。【解決手段】磁性粒子の製造方法は、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第１ポリマー層を形成する工程、前記第１ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第２ポリマー層を形成する工程、並びに、前記グリシジル基を化学修飾することにより、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含む極性基を導入する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第１ポリマー層を形成する工程、
前記第１ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第２ポリマー層を形成する工程、並びに、
前記グリシジル基を化学修飾することにより、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含む極性基を導入する工程
を含む、磁性粒子の製造方法。
【請求項２】
前記グリシジル基を化学修飾する工程が、アミノ基を導入する反応を含む、請求項１に記載の磁性粒子の製造方法。
【請求項３】
前記グリシジル基を化学修飾する工程が、アルデヒド基を導入する反応を含む、請求項１に記載の磁性粒子の製造方法。
【請求項４】
前記グリシジル基を化学修飾する工程が、カルボキシル基を導入する反応を含む、請求項１に記載の磁性粒子の製造方法。
【請求項５】
前記グリシジル基を化学修飾する工程がさらに、前記カルボキシル基を活性エステル基に変換する反応を含む、請求項４に記載の磁性粒子の製造方法。
【請求項６】
前記グリシジル基を有する第２ポリマー層を形成する工程は、グリシジル基を有する第２ポリマー層を形成する工程であり、
前記グリシジル基の一部を加水分解する工程をさらに含む、請求項１ないし５のいずれかに記載の磁性粒子の製造方法。
【請求項７】
前記母粒子は、核粒子と、該核粒子の表面に形成された前記超常磁性微粒子を含む磁性体層と、を含み、
前記第１ポリマー層を形成する工程は、前記磁性体層上に前記第１ポリマー層を形成する工程である、請求項１ないし６のいずれかに記載の磁性粒子の製造方法。
【請求項８】
超常磁性微粒子を含む母粒子と、
前記母粒子の表面に形成された、疎水性の第１ポリマー層と、
前記第１ポリマー層上に形成された、アミノ基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有する第２ポリマー層と、
を含む、磁性粒子。
【請求項９】
超常磁性微粒子を含む母粒子と、
前記母粒子の表面に形成された、疎水性の第１ポリマー層と、
前記第１ポリマー層上に形成された、アルデヒド基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有する第２ポリマー層と、
を含む、磁性粒子。
【請求項１０】
超常磁性微粒子を含む母粒子と、
前記母粒子の表面に形成された、疎水性の第１ポリマー層と、
前記第１ポリマー層上に形成された、カルボキシル基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有する第２ポリマー層と、
を含む、磁性粒子。
【請求項１１】
超常磁性微粒子を含む母粒子と、
前記母粒子の表面に形成された、疎水性の第１ポリマー層と、
前記第１ポリマー層上に形成された、活性エステル基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有する第２ポリマー層と、
を含む、磁性粒子。
【請求項１２】
前記母粒子は、核粒子と、該核粒子の表面に形成された前記超常磁性微粒子を含む磁性体層と、を含み、
前記第１ポリマー層は、前記磁性体層上に形成された、請求項６ないし１０のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項１３】
プローブ結合に用いられる請求項７ないし１２のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項１４】
請求項７ないし１３のいずれかに記載の磁性粒子と、該磁性粒子に結合するプローブとを含む、プローブ結合粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性粒子およびその製造方法、ならびにプローブ結合粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、磁性粒子は、磁気分離による洗浄が容易で、抗原と抗体との免疫反応やＤＮＡ同士またはＤＮＡとＲＮＡとのハイブリダイゼーション、医薬品候補物質と体内物質の相互作用などの研究において優れた反応場を提供できることから、特に診断薬や医薬品研究用などの生化学用途への応用が活発になっている。
【０００３】
中でも、生化学用担体粒子としては、物理吸着感作用として主にポリスチレン粒子が、化学結合感作用として主にカルボキシル基変性ポリスチレン粒子が広く使用されている。しかしながら、これらの粒子は、細胞、タンパク、ＤＮＡなどの試験検体中に存在する、目的としない他の生理活性物質等の吸着（以下、本明細書において「非特異吸着」という）が大きく、この非特異吸着が感作粒子の性能を阻害する。すなわち、非特異吸着はこれらの粒子を使用するうえでの大きな障害になっていた。
【０００４】
非特異吸着の少ない生化学用担体としては、アガロース、セファロースなど糖鎖に基づくゲル体が使用されているが、結合したプローブの活性が低くなる傾向があり、十分なシグナルが得られないことが多い。
【０００５】
磁性粒子に関しても同様に、非特異吸着を低減させることが求められており、その目的から粒子表面にグリシジル基を導入した磁性粒子が提案されている。たとえば、特開２００６−１３１７７１号公報では、超常磁性微粒子をスチレンおよびグリシジルメタクリレートに分散させ、超音波処理で微分散させてから重合する方法が提案されている。しかしながら、この方法では、磁性体の被覆が不十分で非特異吸着の低減が不十分であるうえに、平均粒子径が２００ｎｍ以下と粒子径が小さいため磁気分離性も不十分である。
【０００６】
本出願人は、特許第３７３８８４７号公報で、磁性体の脱落、鉄イオンなどの磁性体成分に由来する物質の溶出がなく、均一粒子径を有する診断薬用粒子を簡便かつ効率的に製造することを目的として、２層のポリマーコートを設ける工程を含む磁性粒子の製造方法を開示し、さらに、特開２００５−８３９０４号公報および特開２００５−８３９０５号公報で、非特異吸着を低減した磁性粒子を開示したが、さらなる非特異吸着の低減が望まれている。
【０００７】
なお、必ずしも非特異吸着を低減させる目的ではないが、グリシジル基を導入した磁性粒子として、例えば、特表平２−５０１７５３号公報では、核粒子の存在下、磁性体とモノマーとの混合物を重合し、さらにポリマーコートする方法が提案されている。しかしながら、この方法では、磁性体とモノマーとの混合物のうち、核粒子上で重合する部分はわずかであり、結果的に極めて少量の磁性体しか核粒子に取り込むことができないため、磁気分離性に劣っていた。
【０００８】
また、特表平１０−５０５１１８号公報では、グリシジル基を導入した磁性粒子に、アミノ基を導入する反応が記載されているが、この磁性粒子はイオン交換を目的とした多孔質の粒子であり、非特異吸着が著しい。
【０００９】
さらに、特表２００６−５１１９３５号公報では、粒子表面および内部に磁性体を析出させ、さらにグリシジル基を有するポリマーでコートする提案がなされている。しかしながら、この方法では、粒子表面にまで磁性粒子を析出させた場合、グリシジル基を有するポリマーでのコートのみでは磁性粒子の被覆が不十分であり、非特異吸着性を低減させることができない。
【特許文献１】特開２００６−１３１７７１号公報
【特許文献２】特許第３７３８８４７号公報
【特許文献３】特開２００５−８３９０４号公報
【特許文献４】特開２００５−８３９０５号公報
【特許文献５】特表平２−５０１７５３号公報
【特許文献６】特表平１０−５０５１１８号公報
【特許文献７】特表２００６−５１１９３５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、タンパクや核酸等の非特異吸着が少なく、特に、生化学・医薬品分野で特出する高感度と低ノイズを発現する磁性粒子およびその製造方法ならびにプローブ結合粒子に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を重ね、最外層にグリシジル基を有するポリマーコート層を重合し、さらにこれを化学修飾することで、生化学・医薬品分野で特出する高感度および低ノイズを発現する磁性粒子が得られることを見出し、本発明を完成させた。本発明によれば、以下の様態の磁性粒子およびその製造方法を提供することができる。
【００１２】
本発明の第１の態様に係る磁性粒子の製造方法は、
超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第１ポリマー層を形成する工程、
前記第１ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第２ポリマー層を形成する工程、並びに、
前記グリシジル基を化学修飾することにより、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含む極性基を導入する工程を含む。
【００１３】
上記磁性粒子の製造方法において、前記グリシジル基を化学修飾する工程が、アミノ基を導入する反応を含むことができる。
【００１４】
上記磁性粒子の製造方法において、前記グリシジル基を化学修飾する工程が、アルデヒド基を導入する反応を含むことができる。
【００１５】
上記磁性粒子の製造方法において、前記グリシジル基を化学修飾する工程が、カルボキシル基を導入する反応を含むことができる。
【００１６】
上記磁性粒子の製造方法において、前記グリシジル基を化学修飾する工程がさらに、前記カルボキシル基を活性エステル基に変換する反応を含むことができる。
【００１７】
上記磁性粒子の製造方法において、前記グリシジル基を化学修飾する工程がさらに、前記カルボキシル基を活性エステル基に変換する反応を含むことができる。
【００１８】
本発明の第２の態様に係る磁性粒子の製造方法は、
前記母粒子は、核粒子と、該核粒子の表面に形成された前記超常磁性微粒子を含む磁性体層と、を含み、
前記第１ポリマー層を形成する工程は、前記磁性体層上に前記第１ポリマー層を形成する工程である。
【００１９】
本発明の第３の態様に係る磁性粒子は、
超常磁性微粒子を含む母粒子と、
前記母粒子の表面に形成された、疎水性の第１ポリマー層と、
前記第１ポリマー層上に形成された、アミノ基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有する第２ポリマー層と、
を含む。
【００２０】
本発明の第４の態様に係る磁性粒子は、
超常磁性微粒子を含む母粒子と、
前記母粒子の表面に形成された、疎水性の第１ポリマー層と、
前記第１ポリマー層上に形成された、アルデヒド基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有する第２ポリマー層と、
を含む。
【００２１】
本発明の第５の態様に係る磁性粒子は、
超常磁性微粒子を含む母粒子と、
前記母粒子の表面に形成された、疎水性の第１ポリマー層と、
前記第１ポリマー層上に形成された、カルボキシル基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有する第２ポリマー層と、
を含む。
【００２２】
本発明の第６の態様に係る磁性粒子は、
超常磁性微粒子を含む母粒子と、
前記母粒子の表面に形成された、疎水性の第１ポリマー層と、
前記第１ポリマー層上に形成された、活性エステル基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有する第２ポリマー層と、
を含む。
【００２３】
上記磁性粒子において、前記母粒子は、核粒子と、該核粒子の表面に形成された前記超常磁性微粒子を含む磁性体層と、を含み、
前記第１ポリマー層は、前記磁性体層上に形成されることができる。
【００２４】
上記磁性粒子は、プローブ結合に用いられることができる。
【００２５】
本発明の第７の態様に係るプローブ結合粒子は、
上記磁性粒子と、該磁性粒子に結合するプローブとを含む。
【発明の効果】
【００２６】
上記磁性粒子は、タンパク質や核酸等の非特異吸着が少ないため、生化学・医薬品分野で特出する高感度および低ノイズを発現し、生化学検査用として高いＳ／Ｎ比を得ることができる。
【００２７】
また、上記磁性粒子の製造方法によれば、タンパクや核酸等の非特異吸着が少なく、特に、生化学・医薬品分野で特出する高感度と低ノイズを発現できる磁性粒子を効率よく製造することができる。
【００２８】
さらに、上記プローブ結合粒子によれば、プローブの脱離が少なく、非特異吸着が少なく、かつ高感度である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の一実施形態に係る磁性粒子およびその製造方法ならびにプローブ結合粒子について説明する。
【００３０】
１．磁性粒子およびその製造方法
本発明の一実施形態に係る磁性粒子の製造方法は、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第１ポリマー層を形成する工程、前記第１ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第２ポリマー層を形成する工程、並びに、前記グリシジル基を化学修飾することにより、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含む極性基を導入する工程を含む。
【００３１】
１．１．母粒子
母粒子の形態としては、例えば、（Ｉ）有機ポリマー等の非磁性体の連続相中に超常磁性微粒子が分散している粒子、（ＩＩ）超常磁性微粒子の２次凝集体をコアとし、有機ポリマー等の非磁性体をシェルとする粒子、（ＩＩＩ）有機ポリマー等の非磁性体からなる核粒子と、該核粒子の表面に設けられた超常磁性微粒子の２次凝集体層（磁性体層）とを含む粒子が挙げられる。これらの中では、優れた磁気応答性を有し粒子径を均一に制御できる点で、（ＩＩＩ）超常磁性微粒子を含む磁性体層が核粒子の表面に形成された母粒子が好ましい。以下、（ＩＩＩ）の母粒子の構成について説明する。
【００３２】
１．１．１．核粒子
核粒子は、基本的に非磁性物質であり、有機物質および無機物質のいずれも使用可能であり、診断薬用粒子の使用目的等によって適宜選択することができる。有機物質の代表例としては、例えばポリマーを挙げることができる。かかるポリマーとしては、特に、ビニル系ポリマーが好ましく、最も好ましくは、架橋ポリスチレン、架橋ポリメチルメタクリレートである。これらポリマーは、カルボキシル基などの官能基が導入されていても良い。
【００３３】
核粒子の平均粒子径は、好ましくは、０．４〜２００μｍ、さらに好ましくは０．８〜１００μｍ、最も好ましくは１．０〜５０μｍである。核粒子の平均粒子径が０．４μｍ未満では、磁気分離性に劣る場合がある。一方、核粒子の平均粒子径が２００μｍを超えると、重力沈降が著しくなり、プローブを結合した粒子として反応場が不均一になる場合がある。
【００３４】
核粒子の材質は、複合化の際の加工性、軽量性の観点からポリマーなどの有機物質が好ましい。なお、本発明において「平均粒子径」とは、電子顕微鏡写真上にて１００個の粒子の粒子径を無作意に測定して求めたものである。
【００３５】
上述した特定範囲の平均粒子径を有する核粒子としてのポリマー粒子は、例えばビニル系モノマーの懸濁重合、あるいはポリマーバルクの粉砕によって得ることもできる。均一な粒子径を有する核粒子の作製方法としては、特公昭５７−２４３６９号公報記載の膨潤重合法、あるいは本出願人が先に提案した重合方法（特開昭６１−２１５６０２号公報、同６１−２１５６０３号公報、同６１−２１５６０４号公報）によって容易に製造することができる。
【００３６】
１．１．２．超常磁性微粒子
超常磁性微粒子としては、粒子径２０ｎｍ以下（好ましくは粒子径５〜２０ｎｍ）の酸化鉄系の微粒子が代表的であり、ＭｎＦｅ２Ｏ４（Ｍｎ＝Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ０．５Ｆｅ０．５等）で表現されるフェライト、Ｆｅ３Ｏ４で表現されるマグネタイト、あるいはγ−Ｆｅ２Ｏ３が挙げられ、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ないγ−Ｆｅ２Ｏ３およびＦｅ３Ｏ４のいずれか一方を含むことが好ましい。
【００３７】
核粒子と超常磁性微粒子との比（核粒子：超常磁性微粒子）は、重量比で９５：５〜２０：８０が好ましい。超常磁性微粒子がこの範囲の量より少ないと、磁気分離性に劣る場合がある。超常磁性微粒子がこの範囲の量より多いと、核粒子の対する量が過剰となり、複合化されない超常磁性微粒子が多くなる場合がある。
【００３８】
超常磁性微粒子は、核粒子と後工程で使用する単量体モノマーとの親和性や相溶性との観点から、表面が疎水化されたものが望ましい。磁性体微粒子の表面の疎水化処理方法としては、特許第３７３８８４７号に記載の方法が挙げられる。このような超常磁性微粒子は、公知の磁性流体から適当な貧溶媒で粒子を析出、洗浄することによっても得られる。
【００３９】
１．１．３．磁性体層が形成された母粒子
超常磁性微粒子を含む磁性体層を母粒子の表面に形成する方法としては、核粒子と超常磁性微粒子とを混合し、核粒子の表面に超常磁性微粒子を物理的に吸着させることにより、磁性体層を形成する方法が好ましい。本発明において、「物理的吸着法」とは、化学反応を伴わない吸着法、結合法を指すものである。核粒子の表面に超常磁性微粒子を吸着させる方法としては、例えば、核粒子と超常磁性微粒子とをドライブレンドして、物理的に強い力を外部から加えることにより双方の粒子を複合化させる方法により作製する方法が挙げられる。物理的に強い力を負荷する方法としては、例えば、乳鉢、自動乳鉢、ボールミル、ブレード加圧式粉体圧縮法、メカノフュージョン法のようなメカノケミカル効果を利用するもの、あるいは、ジェットミル、ハイブリダイザー等の高速気流中衝撃法を利用するものが挙げられる。効率よくかつ強固に複合化を実施するには、物理的吸着力が強いことが望ましい。物理的吸着力が強い複合化を実施するには、攪拌翼付き容器中で攪拌翼の周速度が好ましくは１５ｍ／秒以上、より好ましくは３０ｍ／秒以上、さらに好ましくは４０〜１５０ｍ／秒で複合化を実施することが挙げられる。撹拌翼の周速度が１５ｍ／秒より低いと、核粒子の表面に超常磁性微粒子を吸着させるのに十分なエネルギーを得ることができないことがある。なお、撹拌翼の周速度の上限については、特に制限はないが、使用する装置、エネルギー効率等の点から自ずと決定される。
【００４０】
１．２．疎水性の第１ポリマー層
次に、母粒子の表面に形成される疎水性の第１ポリマー層（以下、単に「第１ポリマー層」ともいう）の構成およびその形成方法について述べる。
【００４１】
疎水性の第１ポリマー層を形成するためのモノマー（以下、「第１モノマー部」ともいう）は、８０重量％以上の疎水性モノマーを含み、好ましくは９５重量％以上の疎水性モノマーを含み、さらに好ましくは９８重量％以上の疎水性モノマーを含む。第１モノマー部中の疎水性モノマーが８０重量％未満であると、非特異吸着が悪化する場合がある。ここで、疎水性モノマーとは、２５℃における水への溶解度が２．５重量％以下の重合性モノマーの単体および混合物である。疎水性モノマーは単官能性（非架橋性）モノマー、架橋性モノマーのいずれであってもよく、単官能性モノマーおよび架橋性モノマーの混合物でもよい。
【００４２】
母粒子の存在下で、副原料である重合開始剤、乳化剤、分散剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤などが必要に応じて添加された液体中で、主原料である８０重量％以上の疎水性モノマーを含む第１モノマー部を重合することにより、第１ポリマー層を形成することができる。このように、重合によって第１ポリマー層を形成することにより、磁性体層を効果的に被覆することができ、かつ、非特異吸着を効果的に低減させることができる。
【００４３】
第１モノマー部に使用可能な疎水性モノマーのうち単官能性モノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレンなどの芳香族ビニル単量体、メチルアクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、イソボニルアクリレート、イソボニルメタクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルなどを例示することができる。また、疎水性モノマーのうち架橋性モノマーとしては、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレートなどの多官能性（メタ）アクリレート、ブタジエン、イソプレンなどの共役ジオレフィン、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートなどを例示することができる。
【００４４】
第１モノマー部は、２０重量％未満の非疎水性モノマー（親水性モノマー）を含んでいてもよい。非疎水性モノマーのうち、単官能性モノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、イタコン酸などのカルボキシル基を有するモノマー、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールアクリレート、グリセロールメタクリレート、メトキシエチルアクリレート、メトキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、３−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレートなどの親水性官能基（例えば水酸基、アミノ基、アルコキシ基、等）を有する（メタ）アクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、ダイアセトンアクリルアミド、Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（２−ジメチルアミノプロピル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）（メタ）アクリルアミドなどを例示できる。非疎水性モノマーのうち、架橋性モノマーとして、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ポリビニルアルコールのポリ（メタ）アクリルエステルなどの親水性のモノマーを例示することができる。第１モノマー部に含まれる非疎水性モノマーは、２０重量％未満であり、好ましくは５重量％未満であり、さらに好ましくは２重量％未満である。
【００４５】
第１モノマー部中の架橋性モノマー（疎水性モノマー、非疎水性モノマーあわせて）の比率は、第１ポリマー層を構成するモノマー部１００重量％中に好ましくは１〜４０重量％であり、さらに好ましくは５〜２０重量％である。第１モノマー部中の架橋性モノマーの比率が４０重量％を超えると、粒子が多孔質化して非特異吸着を増加させることがある。
【００４６】
重合開始剤としては、水への溶解性の観点から分類すると、油溶性重合開始剤が好ましい。水溶性の重合開始剤を用いると複合粒子表面での重合でなく、磁性体被覆粒子を含まない疎水性モノマーのみが重合した新粒子が多量に生じる傾向がある。
【００４７】
油溶性重合開始剤としては、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、ターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルペルオキシド、アゾビスイソブチロニトリル等の過酸化化合物、アゾ化合物などを挙げることができる。
【００４８】
水溶性開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム等の過硫酸塩、過酸化水素、２−２アゾビス（２−アミノプロパン）鉱酸塩、アゾビスシアノ吉草酸およびそのアルカリ金属塩およびアンモニウム塩等があげられ、また、過硫酸塩、過酸化水素塩と重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、塩化第一鉄等を組み合わせたレドックス開始剤もあげられ、中でも過硫酸塩が好適に用いられる。これらの重合開始剤のモノマー全体に対する割合は０．０１〜８重量％の範囲が好適に用いられる。
【００４９】
乳化剤としては、通常使用されている陰イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤等を単独もしくは組み合わせて用いることができる。例えば陰イオン性界面活性剤としては、高級アルコール硫酸エステルのアルカリ金属塩、アルキルベンゼンスルホン酸のアルカリ金属塩、コハク酸ジアルキルエステルスルホン酸のアルカリ金属塩、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸のアルカリ金属塩、ポリオキシエチレンアルキル（またはアルキルフェニル）エーテルの硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル（またはアルキルフェニル）エーテルのリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ナトリウムのホルマリン縮合物などの陰イオン性界面活性剤の他、エレミノールＪＳ−２、ＪＳ−５〔製品名、三洋化成（株）製〕、ラテムルＳ−１２０、Ｓ−１８０Ａ、Ｓ−１８０、ＰＤ−１０４〔製品名、花王（株）製〕、アクアロンＨＳ−１０、ＨＳ−２０、ＫＨ−１０〔製品名、第一工業製薬（株）製〕、アデカリアソープＳＥ−１０Ｎ、ＳＲ−１０〔製品名、旭電化工業（株）製〕などの反応性乳化剤などを挙げることができる。
【００５０】
また、非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどのほか、アクアロンＲＳ−２０（第一工業製薬（株）製）、アデカリアソープＮＥ−２０（旭電化工業（株）製）などの反応性非イオン性界面活性剤を挙げることができる。
【００５１】
第１ポリマー層の形成における重合系へのモノマーの添加方法は、とくに制限されず、一括方式、分割方式あるいは連続添加方式のいずれであっても良い。重合温度は重合開始剤によって異なるが、通常１０〜９０℃好ましくは３０〜８５℃であり、重合に要する時間は通常１〜３０時間程度である。
【００５２】
また、第１ポリマー層の厚さは、好ましくは０．００５〜２０μｍであり、より好ましくは０．０１〜５μｍである。また、第１ポリマー層は磁性体層を完全に被覆していることが好ましい。
【００５３】
本実施形態に係る磁性粒子において、母粒子の表面に第１モノマー層が形成されていることにより、超常磁性微粒子の漏出を防止することができる。特に、本実施形態に係る磁性粒子において、母粒子が核粒子と、核粒子の表面に形成された超常磁性微粒子を含む磁性体層とを含む場合、母粒子の表面に第１モノマー層が形成されていることにより、超常磁性微粒子の漏出を効果的に防止することができる。
【００５４】
１．３．グリシジル基を有する第２ポリマー層
次に、第１ポリマー層上に形成されるグリシジル基を有する第２ポリマー層（以下、単に「第２ポリマー層」ともいう）の構成およびその形成方法について述べる。
【００５５】
第２ポリマー層は、好適な低非特異吸着性の粒子表面を形成するための官能基導入を主目的とする。低非特異吸着性の粒子表面は、例えばプローブ結合用磁性粒子の表面として好適である。
【００５６】
第２ポリマー層を形成するためのモノマー（以下、「第２モノマー部」ともいう）は、２０重量％以上のグリシジル基含有モノマーを含み、好ましくは４０重量％以上のグリシジル基含有モノマーを含み、さらに好ましくは８０重量％以上のグリシジル基含有モノマーを含む。第２ポリマー層を構成するその他のモノマーとしては、上記第１モノマー部に使用するモノマーとして例示したものを使用することができる。所定量のグリシジル基含有モノマーを含む第２モノマー部を重合することにより、２以上のグリシジル基を有する第２ポリマー層を得ることができる。第２ポリマー層に含まれるグリシジル基は通常２以上である。
【００５７】
第２ポリマー層は、第１ポリマー層の形成方法と基本的に同様の方法にて形成することができる。すなわち、第１ポリマー層が形成された粒子の存在下で、副原料である重合開始剤、乳化剤、分散剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤などが必要に応じて添加された液体中で、主原料である第２モノマー部の重合を行なうことにより、第２ポリマー層を形成することができる。
【００５８】
ここで、グリシジル基を含む共重合性モノマーとしては、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル等を例示できる。
【００５９】
第２モノマー部には、架橋性モノマーがさらに含まれることが好ましく、その比率は、第２モノマー部１００重量％中に好ましくは１〜４０重量％であり、さらに好ましくは５〜２０重量％である。第２モノマー部中の架橋性モノマーの比率が４０重量％を超えると、粒子が多孔質化して非特異吸着を増加させることがある。
【００６０】
第２ポリマー層の形成における重合系へのモノマーの添加方法は、とくに制限されず、一括方式、分割方式あるいは連続添加方式のいずれであっても良い。重合温度は重合開始剤によって異なるが、通常１０〜９０℃好ましくは３０〜８５℃であり、重合に要する時間は通常１〜３０時間程度である。
【００６１】
第２ポリマー層の厚さは、第１ポリマー層に比較して薄くすることが可能であり、好ましくは０．００５〜５μｍであり、より好ましくは０．００５〜１μｍである。
【００６２】
１．４．グリシジル基の化学修飾
第２ポリマー層のグリシジル基を化学修飾する工程は、例えば以下の反応を含むことができる。
これらの反応は２以上を組み合わせても良い。
【００６３】
（ａ）アミノ基を導入する反応、
（ｂ）アルデヒド基を導入する反応、
（ｃ）−１．カルボキシル基を導入する反応、
（ｃ）−２．カルボキシル基を導入した後、該カルボキシル基を活性エステル基に変換する反応
すなわち、第２ポリマー層のグリシジル基を化学修飾することにより、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含む極性基を導入することができる。ここで、前記極性基はプローブと反応可能な官能基であることが好ましく、例えば、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、および活性エステル基から選択される少なくとも１つであることが好ましい。例えば、得られた磁性粒子の第２ポリマー層が前記極性基および後述する２，３−ヒドロキシプロピル基を有する場合、プローブとの結合性が良好であり、かつ、非特異吸着が少ない。
【００６４】
以下、上記反応について順に述べる。
【００６５】
１．４．１．アミノ基を導入する反応
（ａ）アミノ基を導入する反応は、より具体的には、グリシジル基を有する第２ポリマー層が形成された粒子にアミノ化剤を作用させることにより、第２ポリマー層にアミノ基を導入する反応である。この反応により、アミノ基導入磁性粒子が得られる。このアミノ基導入磁性粒子は、プローブ結合用として好適に用いることができる。
【００６６】
アミノ化剤としては、例えば、アンモニア、分子中に２個のアミノ基を有する有機化合物（ジアミン）、あるいは、分子中に３個以上のアミノ基を有する有機化合物を挙げることができ、分子中に２個以上のアミノ基を有する有機化合物がより好ましい。
【００６７】
ここで、ジアミンとしては、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、ｏ−フェニレンジアミンなどの１級ジアミンなどが挙げられる。また、分子中に３個以上のアミノ基を有する有機化合物としては、１，２，３−トリアミノプロパン、テトラ（アミノメチル）メタン、１，３，５-トリアミノベンゼン、１，２，３，４−テトラアミノベンゼンなどが挙げられる。
【００６８】
アミノ基を導入する反応は、乾燥粒子をそのままアミノ化剤に分散させて実施してもよいし、あるいは、粒子を水系溶媒に分散させた状態で実施しても良い。水系溶媒とは、水溶性有機溶媒と水との混合溶媒、あるいは、水である。ここで、水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン、ジメチルホルムアミドなどを例示できる。アミノ基を導入する反応の好ましい温度、時間は、第２ポリマー層中のグリシジル基の濃度、溶媒の有無、溶媒の種類などによって異なるが、通常、４℃〜１００℃、好ましくは、２０℃〜８０℃で、通常、１０分〜４８時間、好ましくは、１時間〜２４時間である。なお、アミノ基を導入する反応では、全てのグリシジル基がアミノ化される必要はない。
【００６９】
本実施形態に係る磁性粒子におけるアミノ基の量は、好ましくは０．１μｍｏｌ／ｇ〜１００μｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．５μｍｏｌ／ｇ〜５０μｍｏｌ／ｇである。アミノ基の量が０．１μｍｏｌ未満ではプローブの結合量が少なくなりシグナルが劣る場合があり、１００μｍｏｌ／ｇを超えると非特異吸着が増える場合がある。
【００７０】
アミノ基を導入する反応の前に、２以上のグリシジル基の一部を加水分解してもよい。また、アミノ基を導入する反応と同時に、２以上のグリシジル基の一部を加水分解してもよい。あるいは、アミノ基を導入する反応の後に、残留する２以上のグリシジル基の全てあるいは一部を加水分解してもよい。
【００７１】
グリシジル基を加水分解することにより、２，３−ジヒドロキシプロピル基が生成する。第２ポリマー層が２，３−ジヒドロキシプロピル基を有することにより、非特異吸着を低減することができる。グリシジル基の加水分解は、例えば、水系溶媒中で適当な酸触媒または塩基触媒によって進行する。好ましくは、アミノ基を導入する反応の前または後に、水溶媒中で、硫酸などの酸触媒を用いてグリシジル基を加水分解する。これにより、加水分解を速やかにかつ確実に行なうことができる。この場合、加水分解の好ましい温度は、通常４℃〜１００℃、好ましくは２０℃〜８０℃であり、加水分解の好ましい時間は、通常５分〜２４時間、好ましくは３０分〜１２時間である。
【００７２】
アミノ基を導入する反応によって得られる磁性粒子の一例としては、例えば、超常磁性微粒子を含む母粒子と、母粒子の表面に形成された、疎水性の第１ポリマー層と、第１ポリマー層上に形成された、アミノ基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有する第２ポリマー層とを含む磁性粒子が挙げられる。ここで、母粒子は核粒子と、該核粒子の表面に形成された前記超常磁性微粒子を含む磁性体層と、を含み、第１ポリマー層は磁性体層上に形成されることができる。第２ポリマー層がアミノ基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有することにより、プローブとの結合性が良好であり、かつ、非特異吸着が非常に少ない。
【００７３】
１．４．２．アルデヒド基を導入する反応
（ｂ）アルデヒド基を導入する反応は、より具体的には、第２ポリマー層に含まれるグリシジル基を加水分解によりジオール基に変換し、酸化剤を用いて該ジオール基を酸化的開列することにより、アルデヒド基を生成させる反応である。この反応により、アルデヒド基導入磁性粒子が得られる。このアルデヒド基導入磁性粒子は、プローブ結合用として好適に用いることができる。
【００７４】
グリシジル基の加水分解の条件は、上記（ａ）アミノ基を導入する反応で説明した通りである。
【００７５】
ジオールのアルデヒド化に適する酸化剤としては、過ヨウ素酸、過ヨウ素酸塩、四酢酸鉛などの公知の酸化剤が挙げられる。このうち、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウムなどの過ヨウ素酸塩は、水系溶媒中で容易に反応が進むため好ましい。
【００７６】
アルデヒド基を導入する反応は、過ヨウ素酸塩など水系溶媒が適する酸化剤の場合、例えば、グリシジル基の加水分解の後、洗浄、磁気分離により上清を除き、酸化剤水溶液を加えて、反応を実施することができる。また、四酢酸鉛など有機溶媒が適する酸化剤の場合、グリシジル基を加水分解した後、洗浄、磁気分離により上清を除き、さらに乾燥させた後、酸化剤溶液に乾燥粒子を分散させてアルデヒド化を実施することが好ましい。アルデヒド基を導入する反応の好ましい温度および時間は、第２ポリマー層中のグリシジル基の濃度、加水分解の程度、溶媒の種類などによって異なるが、反応温度は通常４℃〜１００℃、好ましくは２０℃〜８０℃であり、反応時間は通常１分〜１２時間、好ましくは１０分〜６時間である。なお、アルデヒド基を導入する反応では、全てのグリシジル基がアルデヒド化される必要はない。
【００７７】
本実施形態に係る磁性粒子におけるアルデヒド基の量は、好ましくは０．１μｍｏｌ／ｇ〜１００μｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．５μｍｏｌ／ｇ〜５０μｍｏｌ／ｇである。アルデヒド基の量が０．１μｍｏｌ未満ではプローブの結合量が少なくなりシグナルが劣る場合があり、１００μｍｏｌ／ｇを超えると非特異吸着が増える場合がある。
【００７８】
アルデヒド基を導入する反応によって得られる磁性粒子の一例としては、例えば、超常磁性微粒子を含む母粒子と、母粒子の表面に形成された、疎水性の第１ポリマー層と、第１ポリマー層上に形成された、アルデヒド基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有する第２ポリマー層とを含む磁性粒子が挙げられる。ここで、母粒子は核粒子と、該核粒子の表面に形成された前記超常磁性微粒子を含む磁性体層と、を含み、第１ポリマー層は磁性体層上に形成されることができる。第２ポリマー層がアルデヒド基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有することにより、アミノ基を有するプローブと混合することにより該プローブと容易に結合するためプローブの結合が容易であり、かつ、非特異吸着が少ない。
【００７９】
１．４．３．カルボキシル基を導入する反応
（ｃ）−１．カルボキシル基を導入する反応としては、例えば、（ｉ）第２ポリマー層に含まれるグリシジル基にカルボキシル化剤（例えば、ジカルボン酸、アミノカルボン酸、あるいは、分子中に３個以上のカルボキシル基を有する有機化合物）を作用させる反応、（ｉｉ）第２ポリマー層に含まれるグリシジル基を加水分解して得られた水酸基に、カルボキシル化剤（例えば、カルボン酸無水物、カルボン酸塩化物）を作用させる反応、（ｉｉｉ）適当な脱水触媒の存在下で、第２ポリマー層に含まれるグリシジル基を加水分解して得られた水酸基に、分子中に２個以上のカルボキシル基を有する有機化合物（例えば、ジカルボン酸、あるいは、分子中に３個以上のカルボキシル基を有する有機化合物）を作用させる反応などが挙げられる。この反応により、カルボキシル基導入磁性粒子が得られる。このカルボキシル基導入磁性粒子は、プローブ結合用として好適に用いることができる。
【００８０】
導入されるカルボキシル基量の制御のしやすさから、上記（ｉｉ）の反応が好ましく、（ｉｉ）第２ポリマー層に含まれるグリシジル基を加水分解して得られた水酸基に、カルボキシル化剤としてカルボン酸無水物を作用させる反応が特に好ましい。ここで、カルボン酸無水物は、多価カルボン酸無水物であり、その具体例としては、無水イタコン酸、無水コハク酸、無水シトラコン酸、無水ドデセニルコハク酸、無水トリカルバニル酸、無水グルタル酸、無水マレイン酸、無水ヘキサヒドロフタル酸、無水メチルテトラヒドロフタル酸、無水ハイミック酸等の脂肪族ジカルボン酸無水物；１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸二無水物、シクロペンタンテトラカルボン酸二無水物等の脂環族多価カルボン酸二無水物；無水フタル酸、無水ピロメリット酸、無水トリメリット酸、無水ベンゾフェノンテトラカルボン酸等の芳香族多価カルボン酸無水物を挙げることができる。このうち、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸などの１，２−ジカルボン酸無水物がより好ましい。
【００８１】
第２ポリマー層に含まれるグリシジル基を加水分解して得られた水酸基に、カルボキシル化剤としてカルボン酸無水物を作用させる具体的な方法としては、例えば、カルボン酸無水物を溶解させた有機溶剤に、加水分解した粒子の乾燥粉体を分散し、室温〜８０℃で１〜２４時間攪拌する方法が挙げられる。ここで用いられる有機溶剤としては、限定されないが、例えば、ピリジン、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。また、触媒としては、硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸、塩化亜鉛、酢酸ナトリウム、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、４−ピロリジノピリジン、トリエチルアミンを使用してもよい。これらの有機溶剤、触媒のうち、ピリジンが有機溶剤兼触媒として好適である。
【００８２】
なお、本実施形態に係る磁性粒子上の全ての水酸基がエステル化される必要はなく、水酸基の一部がエステル化されずに水酸基のまま残ることが好ましい。
【００８３】
上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の場合、カルボキシル基を導入する反応の前に、２以上のグリシジル基の一部を加水分解するか、あるいは、カルボキシル基を導入する反応と同時に、２以上のグリシジル基の一部を加水分解するのが好ましい。また、上記（ｉ）の場合、カルボキシル基を導入する反応の後に、残留する２以上のグリシジル基の全てあるいは一部を加水分解してもよい。
【００８４】
本実施形態に係る磁性粒子におけるカルボキシル基の量は、好ましくは０．１μｍｏｌ／ｇ〜１００μｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．５μｍｏｌ／ｇ〜５０μｍｏｌ／ｇである。カルボキシル基の量が０．１μｍｏｌ未満ではプローブの結合量が少なくなりシグナルが劣る場合があり、一方、１００μｍｏｌ／ｇを超えると非特異吸着が増える場合がある。
【００８５】
カルボキシル基を導入する反応によって得られる磁性粒子の一例としては、例えば、超常磁性微粒子を含む母粒子と、母粒子の表面に形成された、疎水性の第１ポリマー層と、第１ポリマー層上に形成された、カルボキシル基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有する第２ポリマー層とを含む磁性粒子が挙げられる。ここで、母粒子は核粒子と、該核粒子の表面に形成された前記超常磁性微粒子を含む磁性体層と、を含み、第１ポリマー層は磁性体層上に形成されることができる。第２ポリマー層がカルボキシル基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有することにより、非特異吸着が少ないうえに、生化学分野で広く扱われるカルボキシル基が導入されているため、従来の知見を生かして該粒子を利用することができる。
【００８６】
１．４．４．カルボキシル基を導入した後、該カルボキシル基を活性エステル基に変換する反応
（ｃ）−２．カルボキシル基を導入した後、該カルボキシル基を活性エステル基に変換する反応としては、例えば、上記カルボキシル基を導入する反応によって得られるカルボキシル基導入磁性粒子をさらに適当な活性化剤で修飾することにより、活性エステル基を導入する方法が挙げられる。この反応により、活性エステル基導入磁性粒子が得られる。この活性エステル基導入磁性粒子は、プローブ結合用として好適に用いることができる。適当な活性化剤としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドが挙げられる。また、活性エステル基は特に限定されないが、例えば、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基、Ｎ−スルホスクシンイミジルオキシカルボニル基が挙げられる。
【００８７】
活性エステル基を導入する具体的な方法としては、例えば、カルボキシル基導入磁性粒子の水分散体に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを加えて、室温〜８０℃で１〜２４時間攪拌する方法が挙げられる。
【００８８】
本実施形態に係る磁性粒子における活性化エステル基の量は、好ましくは０．１μｍｏｌ／ｇ〜１００μｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．５μｍｏｌ／ｇ〜５０μｍｏｌ／ｇである。活性化エステル基の量が０．１μｍｏｌ未満ではプローブの結合量が少なくなりシグナルが劣る場合があり、一方、１００μｍｏｌ／ｇを超えると非特異吸着が増える場合がある。
【００８９】
活性エステル基を導入する反応によって得られる磁性粒子の一例としては、例えば、超常磁性微粒子を含む母粒子と、母粒子の表面に形成された、疎水性の第１ポリマー層と、第１ポリマー層上に形成された、活性エステル基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有する第２ポリマー層とを含む磁性粒子が挙げられる。ここで、母粒子は核粒子と、該核粒子の表面に形成された前記超常磁性微粒子を含む磁性体層と、を含み、第１ポリマー層は磁性体層上に形成されることができる。第２ポリマー層が活性エステル基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有することにより、アミノ基を有するプローブと混合することにより該プローブと容易に結合するためプローブとの結合が容易であり、かつ、プローブの剥離が少ないうえに、非特異吸着が少ない。
【００９０】
１．５．粒子径および使用方法
本実施形態に係る磁性粒子の平均粒子径は、好ましくは０．４〜２００μｍ、さらに好ましくは０．８〜１００μｍ、最も好ましくは１．０〜５０μｍである。平均粒子径が０．４μｍ未満では、磁気分離性に劣る場合がある。一方、平均粒子径が２００μｍを超えると、重力沈降が著しくなりプローブを結合した粒子として反応場が不均一になる場合がある。
【００９１】
本実施形態に係る磁性粒子は、水系分散体または乾燥粉体として用いられる。水系分散体は、通常、グリシジル基を化学修飾する工程の後、蒸留水などの水系溶媒で洗浄し、水系溶媒を加えて攪拌、ホモジナイザー、超音波などの処理により得られる。溶媒乾燥粉体は、水系分散体の加熱乾燥、真空乾燥、スプレードライ、凍結乾燥などによって得られる。
【００９２】
２．用途
本実施形態に係る磁性粒子は、プローブ結合用粒子として好適に使用することができ、より具体的には、生化学分野での化合物担体用粒子および診断薬用の化学結合担体用粒子等のアフィニティー担体として利用でき、特に、抗原または抗体等の一次プローブを結合させた免疫検査用およびプロテオーム用のプローブ結合用磁性粒子として、特出する高感度および低ノイズを発現することができる。
【００９３】
本実施形態に係るプローブ結合用磁性粒子において、検査対象となる物質は、免疫検査用試薬および被検査試料に含まれる生体関連物質、化学物質、および生物である。本発明において、「生体関連物質」とは、生体に関わるすべての物質をいう。生体関連物質としては、例えば、生体に含まれる物質、生体に含まれる物質から誘導された物質、生体内で利用可能な物質が挙げられる。
【００９４】
生体関連物質は特に限定されないが、例えば、タンパク質（例えば、酵素、抗体、アプタマー、受容体等）、ペプチド（例えばグルタチオン等）、核酸（例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等）、糖質、脂質、ホルモン（例えば、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、インシュリン、グルカゴン、成長ホルモン等）、およびその他の細胞または物質（例えば、血小板、赤血球、白血球等の各種血球細胞を含む各種血液由来物質、各種浮遊細胞や、ウイルス・細菌・真菌・原虫・寄生虫などの構成要素であるタンパク質や核酸）が挙げられる。タンパク質としては、より具体的には、生体由来のタンパク質、前立腺特異マーカー、膀胱ガンマーカー等の各種ガンのマーカーとなるタンパク質等が挙げられる。
【００９５】
検査対象となる化学物質は特に限定されないが、例えば、ダイオキシン類等の環境汚染物質、医薬品（例えば、抗生物質、抗がん剤、抗てんかん剤等）があげられる。
【００９６】
検査対象となる生物は特に限定されないが、例えば、各種癌細胞、各種浮遊細胞、ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ＨＩＶウイルス、風疹ウイルス、インフルエンザウイルス等）、細菌（例えば、淋菌、ＭＲＳＡ、大腸菌等）、真菌（例えば、カンジダ、白癬菌、クリプトコックス、アルペルギルス等）、原虫・寄生虫（例えば、トキソプラズマ、マラリア等）等が挙げられる。
【００９７】
本実施形態に係るプローブ結合用磁性粒子のうち、アルデヒド基導入粒子および活性エステル基導入粒子によれば、実際に使用するに当たり、プローブと該粒子とを混合するだけで、該粒子の表面にプローブを化学的に結合させることができる。
【００９８】
本実施形態に係るプローブ結合用磁性粒子のうち、アミノ基導入粒子およびカルボキシル基導入粒子によれば、アミノ基またはカルボキシル基が粒子の表面に導入されているため、実際に使用するに当たり、水溶性カルボジイミドなどの公知の活性化剤により、プローブまたは該粒子のカルボキシル基を活性化させて、プローブと該粒子とを混合することで、該粒子の表面にプローブを化学的に結合させることができる。
【００９９】
プローブを該粒子の表面に結合させた後、過剰のプローブを洗浄し、必要に応じて未反応の活性基を不活化する。不活化剤として、エタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン等の水酸基を含有する不活化剤を使用するのが好ましい。また、プローブを該粒子の表面に結合させた後、通常行われるブロッキングの操作は不要であるが、上述の不活化工程において、アルブミン、スキムミルク、カゼイン等のブロッキング剤を併用してもかまわない。以降は、粒子を用いた通常の工程に移行すればよい。
【０１００】
本実施形態に係るプローブ結合用磁性粒子に担持することができるプローブは、タンパク質（抗原または抗体）、核酸、または、化合物であり、このうち抗原または抗体が好ましい。この場合、抗原または抗体としては、被検体中に一般に含まれている成分に反応するものであれば特に制限されないが、例えば、アンチプラスミン検査用抗アンチプラスミン抗体、Ｄダイマー検査用抗Ｄダイマー抗体、ＦＤＰ検査用抗ＦＤＰ抗体、ｔＰＡ検査用抗ｔＰＡ抗体、ＴＡＴ検査用抗トロンビン＝アンチトロンビン複合体抗体、ＦＰＡ検査用抗ＦＰＡ抗体等の凝固線溶関連検査用抗原または抗体；ＢＦＰ検査用抗ＢＦＰ抗体、ＣＥＡ検査用抗ＣＥＡ抗体、ＡＦＰ検査用抗ＡＦＰ抗体、フェリチン検査用抗フェリチン抗体、ＣＡ１９−９検査用抗ＣＡ１９−９抗体等の腫瘍関連検査用抗原または抗体；アポリポタンパク検査用抗アポリポタンパク抗体、β２−ミクロブロブリン検査用抗β２−ミクロブロブリン抗体、α１−ミクログロブリン検査用抗α１―ミクログロブリン抗体、免疫グロブリン検査用抗免疫グロブリン抗体、ＣＲＰ検査用抗ＣＲＰ抗体等の血清蛋白関連検査用抗原または抗体；ＨＣＧ検査用抗ＨＣＧ抗体等の内分泌機能検査用抗原または抗体；ＨＢｓ抗原検査用抗ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗体検査用ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体検査用ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ−１抗体用ＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗体検査用ＨＩＶ−２抗原、ＨＴＬＶ−１検査用ＨＴＬＶ−１抗原、マイコプラズマ症検査用マイコプラズマ抗原、トキソプラズマ検査用トキソプラズマ抗原、ＡＳＯ検査用ストレプトリジンＯ抗原等の感染症関連検査用抗原または抗体；抗ＤＮＡ抗体検査用ＤＮＡ抗原、ＲＦ検査用熱変成ヒトＩｇＧ等自己免疫関連検査用抗原または抗体；ジゴキシン検査用抗ジゴキシン抗体、リドカイン検査用抗リドカイン抗体等の薬物分析用抗原または抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。
【０１０１】
また、本実施形態に係るプローブ結合用磁性粒子は、酵素・ホルモン等のタンパク質、ＤＮＡ・ＲＮＡ等の核酸、脂質、あるいは生理活性糖鎖化合物を粒子表面に化学結合法で感作させるアフィニティー担体としても利用できる。さらに、本実施形態に係るプローブ結合用磁性粒子に、解析対象の化学物質（被解析化学物質；リガンド分子に該当する）を化学結合により固定化し、タンパク物質等との特異的相互作用を用いて当該相互作用を解析および／または測定することによって、被解析化学物質と特異的な相互作用を有するタンパク質等（ターゲット分子に該当する）を選別し、精製することが可能である。
【０１０２】
具体的には、粒子に結合させるリガンド分子としては、本実施形態に係るプローブ結合用磁性粒子が有する官能基の少なくとも１つと反応しうる官能基を有する物質であれば特に限定されないが、例えば、核酸、ペプチド核酸、ホルモン、分子量５００〜１００万のタンパク質、糖鎖、多糖類、細胞、アプタマー、ウイルス、酵素、各種のアフィニティー用タグ捕捉物質、ビオチン等の補酵素、特定の生理活性作用を有する（あるいは、特定の生理活性作用を有する可能性がある）化学物質等を使用することができる。
【０１０３】
３．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、各実施例および比較例において、評価は以下の方法で行った。
【０１０４】
３．１．評価方法
３．１．１．粒子径
レーザ回折式粒度分布測定装置（（株）島津製作所製）ＳＡＬＤ−２００Ｖにより、粒子の数平均粒子径を測定し、これを粒子の粒子径とした。
【０１０５】
３．１．２．非特異吸着および感度
プローブ結合用磁性粒子について、非特異吸着および感度の評価を下記に示す方法にしたがって行なった。プローブ結合用磁性粒子の１重量％分散液１００μＬをチューブに取り磁気分離して上澄みを除去した。これに、目的物質であるタンパク質（２０Ｓプロテアソーム）を含むことが確認されているＪｕｒｋａｔ細胞破砕液５００μｌを注ぎ、さらにタッチミキサーで振動を与えて前記粒子を分散させた後、常温にて２時間回転倒混和させた。引き続きこのチューブを磁気分離した後、上澄みを除去し、０．０５％非イオン性界面活性剤ＮＰ４０を含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ１ｍｌを注いでタッチミキサーで前記粒子を分散させた。同様の処理をさらに２回繰り返した後、内容物を別の未使用のチューブに移し、磁気分離を行なった後、上澄みを除去した。引き続きこのチューブに０．５％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液５０μｌを注いでタッチミキサーでごく軽く振動を与えて前記粒子を分散させた。１０分間放置した後、磁気分離を行ない、上澄みの２０μｌを採取した。バイオラッド社製プレミックスサンプルバッファー中での濃度が２ｗｔ％になるように２−メルカプトエタノールを溶解させ、このうち２０μｌをチューブに採取した。これに上記剥離工程で採取した上澄み２０μｌを混ぜ、チューブヒーターにて１００℃で５分間加熱した。バイオラッド社製縦型電気泳動システム「ミニプロティアン３」、バイオラッド社製プレキャストポリアクリルアミドゲル「レディーゲルＪ（１５％）」、およびバイオラッド社製プレミックス泳動バッファーを用いて、ゲル１レーンあたり２０μｌをアプライし、電気泳動を行った。染色はバイオラッド社製シルバーステインプラスキットを用いて標準的な手法で行った。染色されたゲルはバイオラッド社製デンシトメーター「ＧＳ−７００」でスキャンして画像化した。染色されたゲルの画像において、２０Ｓプロテアソームのサブユニットを構成するタンパクに相当する分子量３１ｋ付近の数本のバンドが明瞭に確認された場合を感度「良好」、それ以外を感度「不良」とした。また、染色されたゲルの画像で、分子量３１ｋ付近以外にバンドがほとんど確認されない場合を非特異吸着「良好」、それ以外を非特異吸着「不良」とした。
【０１０６】
３．２．合成例
３．２．１．核粒子の作製
７５％ジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド溶液（日本油脂製「パーロイル３５５−７５（Ｓ）」、以下、「パーロイル」という。）２質量部を１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液２０質量部に混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを粒子径０．７７μｍのポリスチレン粒子１３質量部および水４１質量部の入ったリアクターに入れ、２５℃で１２時間攪拌した。別の容器でメチルメタクリレート（以下、「ＭＭＡ」という。）９５質量部およびトリメチロールプロパントリメタクリレート（以下、「ＴＭＰ」という。）５質量部を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液４００質量部に乳化し、前記リアクターに入れ、４０℃で２時間攪拌した後、７５℃に昇温して８時間重合した。室温まで冷却後、遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥、粉砕した。これを核粒子Ａ−１とする。粒子径は１．５μｍであった。
【０１０７】
３．２．２．母粒子の作製（磁性体層の形成）
油性磁性流体（商品名：「ＥＸＰシリーズ」，（株）フェローテック製）にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性微粒子（平均一次粒子径：０．０１μｍ）を得た。
【０１０８】
次いで、上記核粒子Ａ−１  １５ｇおよび上記疎水化された超常磁性微粒子２０ｇをミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６２００ｒｐｍ）で５分間処理し、超常磁性微粒子からなる磁性体層を表面に有する母粒子Ａ−２（粒子径：１．７μｍ）を得た。
【０１０９】
３．２．３．母粒子への第１、第２ポリマー層の形成
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５重量％水溶液３７５ｇを１Ｌセパラブルフラスコに投入し、次いで、母粒子Ａ−２  １５ｇを投入し、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱した。別の容器に入れたドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５重量％水溶液１００ｇに、ＭＭＡ１８ｇ、ＴＭＰ２ｇ、およびパーロイル０．４ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした前記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した（以上、第１ポリマー層の形成）。
【０１１０】
滴下終了後、６０℃に保持して１時間攪拌した後、別の容器に入れたドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５重量％水溶液７５ｇに、グリシジルメタクリレート１０．５ｇ、ＴＭＰ１．５ｇ、およびパーロイル０．３ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした上記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。その後７５℃に昇温し、さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた（以上、第２ポリマー層の形成）。
【０１１１】
次いで、磁気を用いて前記セパラブルフラスコ中の粒子を分離し、蒸留水を用いて洗浄した。以上の工程により、グリシジル基を有する第２ポリマー層が形成された磁性粒子Ａ−３（粒子径：２．７μｍ）を得た。
【０１１２】
３．３．実施例１．アミノ基導入プローブ結合用磁性粒子の作製とプローブ結合磁性粒子の評価
グリシジル基を有する第２ポリマー層が形成された磁性粒子Ａ−３の水分散液から磁気分離によって単離した粒子をアセトンに分散させ、磁気分離して洗浄する操作を５回繰り返した後、前記粒子を再びアセトンに分散させ、磁気分離により上清を除去した後、該粒子を乾燥させた。次に、該粒子０．５０ｇを１００ｍｌフラスコに入れ、エチレンジアミン２５ｇを加えた後、間接超音波を２０分間照射して分散させてから、窒素雰囲気下で５０℃にて３時間加熱攪拌した（アミノ基の導入）。
【０１１３】
冷却後、磁気分離により前記粒子を単離し、該粒子を蒸留水に分散させ、磁気分離して洗浄する操作を５回繰り返した後、磁気分離により上清を除去し、次に、１％硫酸水溶液５ｇに該粒子を加え、間接超音波を２０分間照射して分散させ、次いで、６０℃で５時間攪拌した（残留グリシジル基の加水分解）。
【０１１４】
続いて、磁気分離により前記粒子を単離し、純水に分散させ磁気分離して洗浄する操作を５回繰り返した後、乾燥させることにより、０．４９ｇのアミノ基導入磁性粒子Ａｍ−１を得た。
【０１１５】
アミノ基導入磁性粒子Ａｍ−１を、濃度が１ｗｔ％になるように純水に希釈分散して、水分散液を調製した。次に、この水分散液５００μｌをチューブに取り、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ６（Ｂｕｆｆｅｒ−１）にて３回洗浄後、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ−１に分散し、これに標的物質である２０Ｓプロテアソームを特異的に捕捉するためのプローブとなるタンパク質（抗２０Ｓプロテアソームα６・マウスＩｇＧ抗体）０．０５ｍｇを添加し、さらに、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）０．２５ｍｇを加え撹拌した後、室温下２時間撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次いで、ＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌを加え、室温で２時間撹拌を行った。さらに、ＰＢＳ（−）緩衝液にて５回洗浄した後、ＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌで粒子を分散させることにより、プローブ（抗体）結合磁性粒子の分散液を得た。
【０１１６】
電気泳動の染色ゲルの画像を図１に示す。図１に示すように、本実施例で得られたプローブ結合磁性粒子においては、感度「良好」でかつ非特異吸着「良好」であった。
【０１１７】
３．４．実施例２．アルデヒド基導入プローブ結合用磁性粒子の作製とプローブ結合磁性粒子の評価
グリシジル基を有する第２ポリマー層が形成された磁性粒子Ａ−３の水分散液から磁気分離によって単離した粒子０．５ｇに、１％硫酸水溶液５ｇを加え、間接超音波を２０分間照射して分散させ、次いで、６０℃で５時間攪拌した（グリシジル基の加水分解）。
【０１１８】
続いて、磁気分離により前記粒子を単離し、純水に分散させ磁気分離して洗浄する操作を５回繰り返した。さらに磁気分離により単離した前記粒子に５．６ｍｇ/ｍＬ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２０ｍＬを加え、攪拌しながら室温で１時間反応させた（アルデヒド基の導入）。
【０１１９】
次に、磁気分離により前記粒子を単離し、その上清のホルムアルデヒド量をＰＩＥＲＣＥ社製Glycoprotein Carbohydrate Estimation Kitで定量したところ、粒子１ｇ当たり１１μｍｏｌのアルデヒド基が導入されていることが確認できた。次いで、この粒子を蒸留水に分散させ、磁気分離して洗浄する操作を５回繰り返した後、蒸留水に分散させて、０．４９ｇのアルデヒド基導入磁性粒子ＡＬ−１を含む１％分散液を得た。
【０１２０】
アルデヒド基導入磁性粒子ＡＬ−１の１ｗｔ％水分散液５００μｌをチューブに取り、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。ｃｉｔｒａｔｅ-ｃａｒｂｉｎａｔｅバッファー  ｐＨ１０（Ｂｕｆｆｅｒ−２）にて３回洗浄した後、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ−２に分散し、これに標的物質である２０Ｓプロテアソームを特異的に捕捉するためのプローブとなるタンパク質（抗２０Ｓプロテアソームα６・マウスＩｇＧ抗体）０．０５ｍｇを添加し、室温下５時間撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次いで、ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）５００μｌを加え、室温で２時間撹拌を行った。さらに、ＰＢＳ（−）緩衝液にて５回洗浄した後、ＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌで前記粒子を分散させることにより、プローブ（抗体）結合磁性粒子の分散液を得た。
【０１２１】
電気泳動の染色ゲルの画像を図１に示す。図１に示すように、本実施例で得られたプローブ結合磁性粒子においては、感度「良好」でかつ非特異吸着「良好」であった。
【０１２２】
３．５．実施例３．カルボキシル基導入プローブ結合用磁性粒子の作製とプローブ結合磁性粒子の評価
グリシジル基を有する第２ポリマー層が形成された磁性粒子Ａ−３の水分散液から磁気分離によって単離した粒子１．０ｇに、１％硫酸水溶液１０ｇを加え、間接超音波を２０分間照射して分散させ、次いで、６０℃で５時間攪拌した（グリシジル基の加水分解）。
【０１２３】
続いて、磁気分離により前記粒子を単離し、純水に分散させ磁気分離して洗浄する操作を５回繰り返し、さらに乾燥させた。得られた乾燥粒子１．０ｇを１０ｍｌのピリジンで洗浄してから５ｍｌのピリジンに分散させた後、２５ｍｌのピリジンに３ｇの無水コハク酸を溶解した溶液を加え、６０℃で２時間撹拌した（カルボキシル基の導入）。
【０１２４】
反応後、磁気を用いて前記粒子を分離し、アセトンで３回、続いて０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で３回、さらに蒸留水で４回洗浄してから蒸留水に分散させて、１．０ｇのカルボキシル基導入磁性粒子Ｃａ−１を含む１％分散液を得た。
【０１２５】
カルボキシル基導入磁性粒子Ｃａ−１の１ｗｔ％水分散液５００μｌをチューブに取り、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。Ｂｕｆｆｅｒ−１にて３回洗浄後、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ−１に分散し、これに標的物質である２０Ｓプロテアソームを特異的に捕捉するためのプローブとなるタンパク質（抗２０Ｓプロテアソームα６・マウスＩｇＧ抗体）０．０５ｍｇを添加し、さらに、ＥＤＣ０．２５ｍｇを加え撹拌した後、室温下２時間撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次いで、ＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌを加え、室温で２時間撹拌を行った。さらに、ＰＢＳ（−）緩衝液にて５回洗浄した後、ＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌで前記粒子を分散させて、プローブ（抗体）結合磁性粒子の分散液を得た。
【０１２６】
電気泳動の染色ゲルの画像を図１に示す。図１に示すように、本実施例で得られたプローブ結合磁性粒子においては、感度「良好」でかつ非特異吸着「良好」であった。
【０１２７】
３．６．実施例４．活性エステル基導入プローブ結合用磁性粒子の作製とプローブ結合磁性粒子の評価
実施例３で得られたカルボキシル基導入磁性粒子Ｃａ−１を含む１％分散液１００ｍＬをビーカーに取り、磁気分離で上澄みを除去した。Ｂｕｆｆｅｒ−１にて３回洗浄後、１００ｍＬのＢｕｆｆｅｒ−１に分散し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド０．１６ｇおよびＥＤＣ０．１８ｇを加え、室温下２時間撹拌を行った（活性エステル基の導入）。
【０１２８】
反応終了後、磁気分離と分散を繰り返して５回洗浄し、さらに蒸留水に前記粒子を分散させて、１．０ｇの活性エステル基導入磁性粒子Ａｃ−１を含む１％分散液を得た。
【０１２９】
活性エステル基導入磁性粒子Ａｃ−１の１ｗｔ％水分散液５００μｌをチューブに取り、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ６（Ｂｕｆｆｅｒ−１）にて３回洗浄後、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ−１に分散し、これに標的物質である２０Ｓプロテアソームを特異的に捕捉するためのプローブとなるタンパク質（抗２０Ｓプロテアソームα６・マウスＩｇＧ抗体）０．０５ｍｇを添加し、室温下２時間撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次いで、ＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌを加え、室温で２時間撹拌を行った。さらに、ＰＢＳ（−）緩衝液にて５回洗浄した後、ＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌで前記粒子を分散させることにより、プローブ（抗体）結合磁性粒子の分散液を得た。
【０１３０】
電気泳動の染色ゲルの画像を図１に示す。図１に示すように、本実施例で得られたプローブ結合磁性粒子においては、感度「良好」でかつ非特異吸着「良好」であった。
【０１３１】
３．７．比較例１．グリシジル基を化学修飾する工程を含まない例
グリシジル基を有する第２ポリマー層が形成された磁性粒子Ａ−３をそのまま、濃度が１ｗｔ％になるように純水に希釈分散して、水分散液を調製した。次に、この水分散液５００μｌをチューブに取り、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。Ｂｕｆｆｅｒ−１にて３回洗浄後、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ−１に分散し、これに標的物質である２０Ｓプロテアソームを特異的に捕捉するためのプローブとなるタンパク質（抗２０Ｓプロテアソームα６・マウスＩｇＧ抗体）０．０５ｍｇを添加し、室温下２時間撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次いで、ＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌを加え、室温で２時間撹拌を行った。さらに、ＰＢＳ（−）緩衝液にて５回洗浄した後、ＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌで前記粒子を分散させることにより、プローブ（抗体）結合磁性粒子の分散液を得た。
【０１３２】
電気泳動の染色ゲルの画像を図１に示す。図１に示すように、本比較例で得られたプローブ結合磁性粒子においては、感度「不良」でかつ非特異吸着「良好」であった。
【０１３３】
３．８．比較例２．市販アガロースゲル
アガロースゲルを担体とした市販の２０Ｓプロテアソーム捕捉キット（メルク社製 Proteasome Isolation Kit, Human）により得られた抽出液２０μｌをチューブに採取し、非特異吸着および感度の評価を行った。電気泳動の染色ゲルの画像を図１に示す。本比較例で用いたアガロースゲルを担体とした２０Ｓプロテアソーム捕捉キットにおいては、感度「不良」でかつ非特異吸着「良好」であった。
【０１３４】
３．９．比較例３．第１ポリマー層がない例
グリシジル基を有する第２ポリマー層が形成された磁性粒子Ａ−３の代わりに、第１ポリマー層を設けず、グリシジル基を有する第２ポリマー層のみを形成した磁性粒子Ｂを用いた以外は、実施例３と同様の方法でカルボキシル基導入磁性粒子Ｃａ−２を得、このカルボキシル基導入磁性粒子Ｃａ−２を用いて実施例３と同様の方法でプローブ結合磁性粒子を形成し、このプローブ結合磁性粒子の非特異吸着および感度の評価を行った。電気泳動の染色ゲルの画像を図１に示す。本比較例で用いたプローブ結合磁性粒子においては、感度「不良」でかつ非特異吸着「不良」であった。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】実施例１〜４で得られたプローブ結合粒子の非特異吸着および感度を示す電気泳動パターンである。
【図１】
2008032411.tif 000002