(57)【要約】【課題】  電極ごとの製品間差に基づく測定値への影響を除くことができ、測定時における電極評価や評価に基づく補正の必要のない、簡便かつ測定精度に優れた二重鎖ＤＮＡ量の電気化学的測定方法を提供する。【解決手段】  二重鎖ＤＮＡを含む溶液に過剰量の二重鎖ＤＮＡ結合性物質を加え、更に二重鎖ＤＮＡ結合性物質と酸化電位が異なる標準物質を加えた後、二重鎖ＤＮＡ結合性物質と標準物質の電極酸化電気量を測定し、その値の比率より二重鎖ＤＮＡ量を求める。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質である二重鎖ＤＮＡを含む試料溶液に、該二重鎖ＤＮＡと結合する二重鎖ＤＮＡ結合性物質を該二重鎖ＤＮＡに対して過剰量加えて反応させた後、結合していない遊離の二重鎖ＤＮＡ結合性物質の量を電気化学的に測定して二重鎖ＤＮＡ量を求める二重鎖ＤＮＡの測定方法において、二重鎖ＤＮＡ結合性物質の酸化電位と異なる酸化電位を有する物質を標準物質として試料溶液に一定量加え、各々の酸化電位で電気化学的測定を行うことによって得られる電気量の比率から二重鎖ＤＮＡ量を求めることを特徴とする、二重鎖ＤＮＡ量の電気化学的測定方法。
【請求項２】
二重鎖ＤＮＡ結合性物質がビスベンズイミド誘導体である、請求項１に記載の二重鎖ＤＮＡ量の電気化学的測定方法。
【請求項３】
ビスベンズイミド誘導体がヘキスト３３２５８（商標）である、請求項２に記載の二重鎖ＤＮＡ量の電気化学的測定方法。
【請求項４】
標準物質の酸化電位が−１００ｍＶから５００ｍＶである、請求項１に記載の二重鎖ＤＮＡ量の電気化学的測定方法。
【請求項５】
標準物質がアスコルビン酸である、請求項１に記載の二重鎖ＤＮＡ量の電気化学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二重鎖ＤＮＡ量を求めるための電気化学的測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の酵素的増幅技術や塩基配列のシーケンス技術の発達により生物の遺伝子レベルでの理解が急速に進み、様々な生物の遺伝子配列が明らかになって来ている。この様な配列情報を利用していく上で、試料に含まれる二重鎖ＤＮＡ量を測定することは重要な基礎的技術の一つである。例えば、配列特異的なＤＮＡオリゴマーを用いたＰＣＲ（ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応）等の酵素的増幅反応を利用したＤＮＡ配列の検出方法では、増幅後の二重鎖ＤＮＡ量を測定することで、試料中に特定のＤＮＡ配列が存在するか否かを確認することができる。
【０００３】
従来、試料中に含まれる二重鎖ＤＮＡ量を測定する方法としては、多くの場合、二重鎖ＤＮＡ結合性物質として蛍光物質を使用し、反応後の蛍光強度より二重鎖ＤＮＡ量を求めるいわゆる蛍光測定法が用いられて来た。一方、微細加工技術を応用したマイクロリアクターの中で配列特異的な酵素的増幅反応を行い、特定配列の検出を行う試みがなされており、従来に比べ迅速に、かつ微量の試料で遺伝子検出ができる方法として期待されている。
しかしながら、この様なマイクロリアクターを利用した測定系を蛍光測定法に適用しようとした場合、光軸の設定や蛍光検出に高精度が要求され、また、何よりも検出装置が高価で大型化してしまう問題があった。
【０００４】
蛍光法に認められるこのような測定法上の問題を克服する新たな方法として、小型で汎用性に優れた電気化学的測定原理に基づく二重鎖ＤＮＡ量の測定方法が提案されつつある。この方法は二重鎖ＤＮＡを含む試料に過剰量の二重鎖ＤＮＡ結合性物質を加えて反応させた後、リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）等の電気化学的測定方法で計測し、得られた特定電位における電流値の変化量より遊離の二重鎖ＤＮＡ結合性物質量を求め、さらにその値より二重鎖ＤＮＡ量を求める方法である（例えば、特許文献１参照）。
この方法では、例えば、配列特異的な増幅反応後の試料に二重鎖ＤＮＡ結合性物質として一定の過剰量のヘキスト３３２５８（商標）を添加し、二重鎖ＤＮＡに結合していない遊離のヘキスト３３２５８の特定電位における酸化電流を電気化学的に測定し二重鎖ＤＮＡ量を求めるが、蛍光法の場合のように、蛍光標識された特殊で高価なインターカレーターや固定化されたプローブも必要なく、また、それ故に検出装置が小型で低価格であることから、汎用分野への応用が期待される技術である。
【０００５】
この様に電気化学的測定方法は測定系が簡略であるという優れた特性を有する反面、電極の表面状態や面積精度による測定値の変動が大きく、定量性に問題があり、また、測定の際に電極表面が二重鎖ＤＮＡ結合性物質で汚染され表面状態が変化することから、実用的な電気化学的二重鎖ＤＮＡ測定方法を開発する上での大きな問題点となっていた。
【特許文献１】特開２００２−２１８９９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記事情に鑑みてなされた本発明の課題は、高度な電極製造技術を必要とせず、事前に電極の性能評価やその評価に基づく補正を行うことなく、精度よく二重鎖ＤＮＡ量を測定できる実用性に優れた電気化学的な二重鎖ＤＮＡ量の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、電気化学的測定法が抱える使用電極の製品差に基づく測定性能上の問題を解決すべく鋭意検討を行った結果、意外にも二重鎖ＤＮＡ結合性物質の酸化電位と異なる酸化電位を有する標準物質を測定系に添加し、複数電位で電気化学的測定を行うことによって、上記問題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は被検物質である二重鎖ＤＮＡを含む試料溶液に、該二重鎖ＤＮＡと結合する二重鎖ＤＮＡ結合性物質を過剰量加えた後、結合していない遊離の二重鎖ＤＮＡ結合性物質の量を電気化学的に計測し二重鎖ＤＮＡ量を求める測定方法において、二重鎖ＤＮＡ結合性物質と異なる酸化電位を有する物質を標準物質として試料溶液に加えた後、各々の酸化電位で電気化学的測定を行い得られた電気量の比率から二重鎖ＤＮＡ量を求めることを特徴とする、（１）〜（５）に示す二重鎖ＤＮＡ量の電気化学的測定方法に関するものである。
（１）被検物質である二重鎖ＤＮＡを含む試料溶液に、該二重鎖ＤＮＡと結合する二重鎖ＤＮＡ結合性物質を該二重鎖ＤＮＡに対して過剰量加えて反応させた後、結合していない遊離の二重鎖ＤＮＡ結合性物質の量を電気化学的に測定して二重鎖ＤＮＡ量を求める二重鎖ＤＮＡの測定方法において、二重鎖ＤＮＡ結合性物質の酸化電位と異なる酸化電位を有する物質を標準物質として試料溶液に一定量加え、各々の酸化電位で電気化学的測定を行うことによって得られる電気量の比率から二重鎖ＤＮＡ量を求めることを特徴とする、二重鎖ＤＮＡ量の電気化学的測定方法。
（２）二重鎖ＤＮＡ結合性物質がビスベンズイミド誘導体である、（１）に記載の二重鎖ＤＮＡ量の電気化学的測定方法。
（３）ビスベンズイミド誘導体がヘキスト３３２５８（商標）である、（２）に記載の二重鎖ＤＮＡ量の電気化学的測定方法。
（４）標準物質の酸化電位が−１００ｍＶから５００ｍＶである、（１）に記載の二重鎖ＤＮＡ量の電気化学的測定方法。
（５）標準物質がアスコルビン酸である、（１）に記載の二重鎖ＤＮＡ量の電気化学的測定方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の二重鎖ＤＮＡ結合性物質と酸化電位が異なる物質を標準物質として使用する電気化学的測定方法を用いることによって、電極ごとの製品差に基づく測定値への影響を除くことができる。これにより、測定時における電極性能の評価や評価に基づく補正が必要なくなるので、測定操作が簡略化され時間短縮ができ、測定精度を大幅に向上することができる。また、高度な製品管理技術を要していた電極製造が容易化するため、経済的に多量の電極を製造し供給することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の電気化学的な二重鎖ＤＮＡ量の測定法は、ＰＣＲに代表される遺伝子の酵素的増幅法によって調製された試料中の二重鎖ＤＮＡ量を測定することや、単に試料中に含まれる複数種の二重鎖ＤＮＡの総量を測定することにも使用できる。
本発明で測定される二重鎖ＤＮＡを含む試料は、特に限定されるものではないが、例えば、特定のＤＮＡ配列の存在を検出するためには、そのＤＮＡ配列に対して相補的に結合するプライマーを加えてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った後、反応液中の二重鎖ＤＮＡの増幅量を測定することで存在の有無を確認することができる。この様な特定のＤＮＡ配列を検出するための酵素的増幅法にはＰＣＲ法の他、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等が例示されるが、二重鎖ＤＮＡを増幅できる方法であればどの様な方法でも利用可能である。
【００１１】
本発明における二重鎖ＤＮＡ結合性物質にはベンズイミド誘導体、例えばヘキスト３３２５８（商標）が良好に使用でき、他にフェロセン誘導体、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、コバルト錯体、白金錯体、銅錯体、アクチノマイシンＤ若しくはドーノマイシン又はそれらの誘導体などを例示することができ、二重鎖ＤＮＡとの結合によりその電気化学的性質が変化するものであれば、どの様なものでも使用できる。
【００１２】
本発明における電気化学的測定とは、作用極を一定電位に保持した状態で得られる電流量を測定するクロノアンペロメトリー（Ｃ．Ａ．）法、Ｃ．Ａ．法における電流量を一定時間積算するクロノクーロメトリー（Ｃ．Ｃ．）法、一定速度で電位を走引し電位−電流曲線を得るリニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）やサイクリックボルタンメトリー（Ｃ．Ｖ．）法などを言い、特定電位における電流値、電気量を測定することができれば、特に限定されるものではない。例えば、二重鎖ＤＮＡ量未知の試料に一定量かつ過剰量のヘキスト３３２５８と一定量の標準物質を添加し、添加した標準物質の酸化電位における電気化学的測定を行った後、電極の洗浄などを行うことなく、そのままの状態で二重鎖ＤＮＡに結合していない遊離のヘキスト３３２５８の電気化学的測定を行い、標準物質の電気化学的測定量を基に遊離のヘキスト３３２５８量を求めることで二重鎖ＤＮＡ量を定量的に測定することができる。なお、本発明における電気量とは、特定電位における電流値を一定時間積算する積算電流量、若しくはその積算電流量をクーロン量に換算したもの、又は一定速度で電位を走引させ電位−電流曲線を得るＬＳＶ法等において、一定電位から一定電位の間に流れた電流量を積算した積算電流量、若しくはその積算電流量をクーロン量に換算したものをいう。
【００１３】
本発明に利用される標準物質は、アスコルビン酸をはじめ、例えば没食子酸のように、標準酸化電位が−１００ｍＶ〜５００ｍＶにあって、二重鎖ＤＮＡ結合性物質及び二重鎖ＤＮＡとの結合性が無く、二重鎖ＤＮＡ結合性物質の酸化電位と異なる酸化電位を有する水溶性の物質であれば使用可能である。使用量としては、用いる標準物質及び二重鎖結合性物質の種類によっても異なるが、通常は被検試料溶液に添加する二重鎖ＤＮＡ結合性物質量に対して０．１〜２０倍モル、好ましくは０．２〜１０倍モルの標準物質を添加することが望ましい。二重鎖ＤＮＡ結合性物質量に対する標準物質の添加量が０．１倍モルを下回る場合は、測定した際の標準物質に基づく酸化電気量が相対的に小さくなるため測定誤差が大きくなり、逆に２０倍を上回る場合も二重鎖ＤＮＡ結合性物質に基づく酸化電気量が相対的に小さくなるためこれもまた測定誤差が大きくなる原因となる。
【実施例】
【００１４】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１
塩基数８０ｂｐから４９００ｂｐの電気泳動用のＤＮＡマーカーを用い、ＤＮＡ濃度が０〜３０ｎｇ／μＬのＴｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＡＰＳ）緩衝液溶液（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）を調製した。これらのＤＮＡ溶液４０μＬにヘキスト３３２５８（商標：ヘキスト社製）水溶液（３００μＭ）５μＬとアスコルビン酸水溶液（２ｍＭ）５μＬを加え電気化学的測定を行った。電気化学的測定には、Ａｇ／ＡｇＣｌを参照極とし、作用極に黒鉛電極（電極面積１ｍｍ２）と対極にＳＵＳ３０４（電極面積２ｍｍ２）を用いて２００ｍＶ、２０秒間のＣ．Ｃ．測定を行い、引き続いて５００ｍＶ、２０秒間のＣ．Ｃ．測定を行った。各ＤＮＡ濃度で測定した２００ｍＶ、２０秒間のＣ．Ｃ．測定で得られた積算電気量Ｑ２００と、５００ｍＶ、２０秒間のＣ．Ｃ．測定で得られた積算電気量Ｑ５００の比Ｑ５００／Ｑ２００を求め、Ｑ５００／Ｑ２００とＤＮＡ濃度の検量線（Ｒ2＝０．９６）を作成した。
次に、濃度不明のＤＮＡ試料３５μＬに、１００ｍＭのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．５）５μＬ、ヘキスト３３２５８水溶液（３００μＭ）５μＬ、及びアスコルビン酸水溶液（２ｍＭ）５μＬを加え、上記同様の電気化学的測定を行いＱ５００／Ｑ２００を求めた。検量線より、この試料のＤＮＡ量は、２０±２ｎｇ／μｌ（ｎ＝４）と分かった。
【００１５】
実施例２
１０ｍＭのＴＡＰＳ、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、各０．２ｍＭのｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三燐酸＝ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）、０．２５Ｕ／１０μＬのＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及び各０．２μＭのプライマー（λＤＮＡ０．５Ｋｂｐを増幅するセンスプライマーとアンチセンスプライマー）の組成で調製されたｐＨ８．５のＰＣＲ用反応液４０μＬを（Ａ）（Ｂ）２本の２００μＬ容ＰＣＲ用チューブに入れた。一方のチューブ（Ａ）にλＤＮＡを含む試料０．１μＬを添加し、もう一方のチューブ（Ｂ）に滅菌蒸留水０．１μＬを添加して、６５℃から９５℃の間で３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。
次に、（Ａ）（Ｂ）それぞれにヘキスト３３２５８水溶液（３００μＭ）５μＬとアスコルビン酸水溶液（２ｍＭ）５μＬを加え電気化学的測定を行った。電気化学的測定には、参照極をＡｇ／ＡｇＣｌとし、作用極（約１ｍｍ２）、対極（約２ｍｍ２）ともに金電極を用い、２００ｍＶにおける２０秒間のＣ．Ｃ．測定を行い、引き続いて４５０ｍＶにおける２０秒間のＣ．Ｃ．測定を行いＱ４５０／Ｑ２００（各Ｃ．Ｃ．測定における積算電気量比）を求めた。予め、実施例１で示した検量線の作成法に準じて作成しておいたλＤＮＡ検量線（Ｑ４５０／Ｑ２００に対するＤＮＡ濃度、Ｒ２＝０．９７）よりλＤＮＡ量を求めた結果、（Ａ）のλＤＮＡ濃度は２８±２ｎｇ／μＬ（ｎ＝４）、（Ｂ）の濃度は０〜３ｎｇ／μＬ（ｎ＝４）であった。
【００１６】
実施例３
実施例１におけるＣ．Ｃ．測定を自然電位から９００ｍＶのＬＳＶ（リニアスイープボルタンメトリー）とし、自然電位から２００ｍＶまでの積算電気量Ｑ０−２００と自然電位から４５０ｍＶまでの積算電気量Ｑ０−４５０の比（Ｑ０−２００／Ｑ０−４５０）を求め、得られたＱ０−２００／Ｑ０−４５０を基に検量線（Ｒ２＝０．９５）を作成した。次に、Ｃ．Ｃ．測定をＬＳＶとした以外は実施例１と同様にして、実施例１で使用した濃度不明のＤＮＡ試料を測定しＱ０−２００／Ｑ０−４５０を求めた。作成した上記検量線よりＤＮＡ濃度を求めたところ、１９±２ｎｇ／μＬ（ｎ＝４）であった。
【００１７】
実施例４
作用電極を黒鉛電極から真空蒸着装置で金を蒸着させたポリイミドフィルムを用いた金蒸着電極（電極面積約１ｍｍ２）に換えた以外は、実施例１と同様に操作を行った。予め作成した検量線（Ｒ２＝０．９６）より、濃度不明の試料は、ＤＮＡ濃度２０±２ｎｇ／μＬ（ｎ＝４）となり、実施例１と同様の結果を得た。
【００１８】
比較例１
実施例１において用いたアスコルビン酸水溶液を添加せず、そのまま５００ｍＶ、２０秒間のＣ．Ｃ．測定を行った。ＤＮＡ濃度０ｎｇ／μＬの積算電気量と各ＤＮＡ濃度の積算電気量の差を基に検量線（Ｒ２＝０．７５）を作成したが差の値のばらつきが大きく２０ｎｇ／μＬ以下の濃度範囲での定量性は得られなかった。次に、実施例１で使用した濃度不明の試料を用い、同じく５００ｍＶ、２０秒間のＣ．Ｃ．測定を行い、積算電気量を基に検量線よりＤＮＡ濃度を求めたが、１５〜２５ｎｇ／μＬの範囲の濃度であることは判明したが正確な濃度は分からなかった。
【００１９】
比較例２
実施例２において使用したアスコルビン酸水溶液を添加せず、４５０ｍＶ、２０秒間のＣ．Ｃ．測定を行うことによってλＤＮＡによる検量線の作成を試みたが、ブランク値とのばらつきが大きく、定量性のある検量線を作成することができなかった。そこで、検体ごとに使用する作用極の面積と電気抵抗を正確に計測し、その値に基づいて積算電気量を補正する処理を行い、検量線（Ｒ２＝０．９６）を作成した。
次に、測定検体ごとに使用する電極の作用極面積と電極抵抗を正確に計測したうえ、実施例２と同様にＰＣＲ反応を行った後、アスコルビン酸水溶液を添加せず、４５０ｍＶ、２０秒間のＣ．Ｃ．測定を行い、作用極面積による補正を行った後、上記検量線よりλＤＮＡ濃度を求めた。（Ａ）と同様の操作を行った試料のλＤＮＡ濃度は、２５±２ｎｇ／μＬ（ｎ＝４）、（Ｂ）と同様の操作を行った試料は０〜３ｎｇ／μＬ（ｎ＝４）であった。実施例２と同様に、試料中のλＤＮＡの量を確認できたが、検体ごとに使用する作用極面積を正確に計測しなければならず、実施例２の測定時間の３倍の時間を要した。
【００２０】
比較例３
実施例４においてアスコルビン酸水溶液を添加せず５００ｍＶ、２０秒間のＣ．Ｃ．測定を行ったが、使用した作用電極の金蒸着処理ロットによって、ブランク値との差のばらつきが大きく、定量性のある検量線を作成することができなかった。そこで、同一の金蒸着処理ロットの電極を用い、かつ電極面積を正確に計測し、更に、電極抵抗を測定し、面積と電極抵抗による補正を行って検量線（Ｒ２＝０．９６）を作成した。検量線を作成した物と同一の金蒸着処理ロットの電極を用い、電極面積を正確に計測し、面積の補正を行って、実施例４と同様にして濃度不明の試料の測定を行ったところ、１９±２ｎｇ／μｌ（ｎ＝４）の濃度であることが分かった。しかしながら、検量線作成と実際の測定に使用する作用電極について、金蒸着処理ロットを揃えたうえ、作用極面積を正確に計測し、更に電極抵抗を正確に測定し補正しなければならず、測定には実施例４の測定時間の３倍を要した。