(57)【要約】【課題】  試料容器に含まれる磁気不純物からの磁気信号により正確な測定ができない。【解決手段】  正逆それぞれの方向に配向用外部磁界を印加して得られた２つの測定信号の差分を求めることで、配向用外部磁界に依存しない試料容器に含まれる磁気不純物からの磁気信号をキャンセルできる。試料容器に含まれる磁気不純物の影響を低減し、目的とする結合した磁気マーカの信号を高感度に計測できる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中に浮遊した被測定物質に磁性粒子を結合させて、その磁性粒子から発生する磁気信号を磁気センサで測定し、被測定物質を検出する方法であって、
磁性粒子と結合した前記被測定物質を含む溶液試料に、配向用の外部磁界を印加し、第一の磁気信号を測定する第一の工程と、
前記第一の工程と逆方向の配向用の外部磁界を印加し、第二の磁気信号を測定する第二の工程と、
記第一の磁気信号と前記第二の磁気信号との差分を測定する工程を有することを特徴とした磁気信号計測方法。
【請求項２】
請求項１に記載の磁気信号計測方法において、前記第一の工程前に、着磁用の外部磁界を印加する工程を有し、
前記着磁用の外部磁界の強度が配向用の外部磁界よりも強いことを特徴とする磁気信号計測方法。
【請求項３】
請求項１に記載の磁気信号計測方法において、磁気信号の測定位置と異なる場所で磁界を印加し、その後試料を磁気信号の測定位置に移動させて磁気信号を測定することを特徴とする磁気信号計測方法。
【請求項４】
試料を入れる容器と、
前記容器を同心円上に保持する円形の試料ホルダーと、
記試料ホルダーをその中心軸周りに回転させる機構と、
回転中に容器が移動する同心円のいずれかの位置に配置された磁気センサと、
回転中に容器が移動する同心円のうち、前記磁気センサとは異なる位置に配置された配向用外部磁界を印加する磁石とを備え、
極性の異なる配向用の外部磁界の磁気信号差分を測定することを特徴とする磁気信号計測装置。
【請求項５】
請求項４に記載の磁気信号計測装置において、同心円上の異なる２つの位置に極性の異なる配向用の磁界を印加するための磁石が配置されており、前記試料ホルダーの回転方向を反転させて極性の異なる配向用の磁界の印加された磁気信号をそれぞれ計測し、極性の異なる配向用の外部磁界の磁気信号差分を測定することを特徴とする磁気信号計測装置。
【請求項６】
前記容器が移動する同心円上に２つの磁気センサと極性の異なる２つの配向用の磁界を印加するための磁石が交互に配置され、前記試料ホルダーを回転させて極性の異なる配向用の磁界の印加された磁気信号をそれぞれ計測し、前記極性の異なる配向用の外部磁界の磁気信号差分を測定することを特徴とする磁気信号計測装置。
【請求項７】
請求項４に記載の磁気信号計測装置において、前記磁石は、前記試料の着磁用にも用いられ、着磁用の磁石により試料に加える磁束密度が100ガウス以上、1000ガウス以下であることを特徴とする磁気信号計測装置。
【請求項８】
請求項４に記載の磁気信号計測装置において、前記磁石は、前記試料の着磁用にも用いられ、着磁用の磁石により試料に加える磁束密度が、前記試料および前記容器に含まれる磁性体の磁化の向きを変更させるのに必要な強度を有することを特徴とする磁気信号計測装置。
【請求項９】
請求項４に記載の磁気信号計測装置において、前記配向用の磁石により試料に加える磁束密度が1ガウス以上、1000ガウス以下であることを特徴とする磁気信号計測装置。
【請求項１０】
請求項４に記載の磁気計測装置において、前記磁石が永久磁石であることを特徴とする磁気信号計測装置。
【請求項１１】
請求項４に記載の磁気計測装置において、前記磁石が電磁石であることを特徴とする磁気信号計測装置。
【請求項１２】
請求項４に記載の磁気信号計測装置において、前記磁石が電磁石であり、前記試料が前記電磁石の磁極を通過するタイミングでパルス磁場を印加することを特徴とする磁気信号計測装置。
【請求項１３】
請求項４に記載の磁気信号計測装置において、前記磁気センサは、SQUID磁束計であることを特徴とする磁気信号計測装置。
【請求項１４】
請求項４に記載の磁気信号計測装置において、前記磁気センサは、ＧＭＲセンサであることを特徴とする磁気信号計測装置。
【請求項１５】
請求項４に記載の磁気信号計測装置において、前記磁気センサは、光ポンピング磁束計であることを特徴とする磁気信号計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は磁性微粒子と磁気センサを用い、磁気信号により生体物質など分析する装置、例えば免疫グロブリン、ホルモン、腫瘍マーカ、感染症などの検査に用いられる免疫検査装置や感染症、食中毒など病原菌検査に用いられる血液培養装置、細菌培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原抗体反応のような特異的な結合反応を利用して種々の生体物質（ホルモン、抗体、抗原、腫瘍マーカなど）や病原菌、ウイルス、がん細胞、ＤＮＡ、環境有害物質等の検査が可能である。近年、これらの検査対象を高感度かつ迅速に検出する要求が高まっており、そのための免疫検査装置の開発が盛んに行われている。免疫検査の一般的な方法として、検出対象とする抗原に選択的に結合する検出用抗体を蛍光酵素等の光学マーカで標識して、抗原−抗体の結合反応を光学マーカからの光信号を検出し、抗原の種類及び量を検出する光学的方法がある。しかし、光学的方法では、検出感度が十分ではなく、また、未結合の光学マーカを洗い流す工程（洗浄工程）が必要であった。
【０００３】
近年、磁気微粒子と磁気センサを用い、抗原抗体反応を検出する磁気的方法が提案されている。この磁気的方法では、磁気微粒子で磁気的に標識された抗体（以下、磁気マーカという）を検出対象の物質と結合させ、結合した磁気マーカから発生する磁気信号を磁気センサを用いて検出する。高感度な磁気センサーであるＳＱＵＩＤを使用することで、光学的方式よりも高い検出感度が得られている。
【０００４】
磁気微粒子をラベルとして磁気信号によるバイオ物質を検出する方法はいろいろな方式が提案されている。
【０００５】
特許文献１に記載の方法では、被測定物質を容器に固定した後、磁気マーカと反応させ、未結合の磁気マーカを洗浄した後に容器に固定された被測定物質と結合した磁気マーカからの残留磁気信号をSQUID磁気センサーで測定している。
【０００６】
特許文献２に記載の方法では、被測定物質を含む溶液と磁気マーカを溶液中で混合することで、被測定物質と磁気マーカを結合させ凝集体を形成し、未結合磁気マーカが存在した状態で、外部磁場を印加し磁気マーカの方向を揃えた後、磁場を遮断したあとの磁気信号を測定している。溶液中に浮遊した磁気マーカはブラウン運動により、その磁気モーメントの方向がランダムになるため、磁界により磁気モーメントの方向を揃えても、磁界を遮断すると徐々に磁気信号が減衰する。磁気マーカがターゲット物質と結合し凝集すると、回転体としての体積が増加するため、磁気信号の減衰が遅くなるが、未結合の磁気マーカの磁気信号は早く減衰する。磁気信号の減衰特性が異なるため、未結合マーカを除去することなく結合マーカの磁気信号を測定できている。類似の方法は非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、特許文献３でも報告されている。
【０００７】
特許文献４、非特許文献４の方法では、被測定物質を容器に固定した後、磁気マーカと反応させ、未結合の磁気マーカが存在する状態で容器に固定された被測定物質と結合した磁気マーカからの信号をSQUID磁気センサーで測定している。未結合の磁気マーカはブラウン運動により、その磁気モーメントの方向がランダムになるため磁気信号が減衰する。そのため、未結合マーカを洗浄することなく結合した磁気マーカからの信号を測定できている。類似の方法は非特許文献５でも報告されている。
【０００８】
特許文献５および特許文献６では磁化率測定を利用した方法が報告されている。特許文献５ではＳＱＵＩＤ磁気センサの磁束検出方向と直角な方向から、磁気マーカを磁化させる直流磁界を印加し、ＳＱＵＩＤ磁気センサの磁束検出領域内を移動する磁気マーカより生じた磁界の変化を測定している。特許文献６では磁気マーカに対して交流磁界を印加し、その信号をＳＱＵＩＤ磁気センサを用いて抗原抗体反応を検出している。
【０００９】
このように、様々な方法で結合した磁気マーカからの磁気信号が計測されているが、測定される磁気信号には、外来の環境磁気信号および容器に含まれる磁気不純物からの磁気信号、容器に非特異的に結合した磁気マーカからの磁気信号が雑音信号として含まれる。精度良く測定するためには、これらの磁気信号を低減する必要がある。
【００１０】
【特許文献１】特願昭６１−２３５７７４号公報
【特許文献２】特願平２−１５５５１号公報
【特許文献３】特表平１０−５１３５５１号公報
【特許文献４】特開２００５―２５７４２５号公報
【特許文献５】特開２００１−３３４５５号公報
【特許文献６】特開２００１−１３３４５８号公報
【非特許文献１】Y. R. Chemla, et al.: Proc. National Acad. Sciences of U.S.A. 97, 14268 (2000)
【非特許文献２】A. Haller, et al.: IEEE Trans. Appl. Supercond. 11, 1371 (2001)
【非特許文献３】H.L.Grossman, et al.: Proc. National Acad. Sciences of U.S.A. 101, 129 (2004)
【非特許文献４】K. Enpuku, et al.: IEEE Trans. Appl. Supercond. 13, 371 (2003)
【非特許文献５】R. Kotitz, et al.: IEEE Trans. Appl. Supercond. 7, 3678(1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
前述したように、測定される磁気信号には、結合磁気マーカ、未結合磁気マーカだけでなく、雑音信号としてセンサー自身の雑音信号、外来の環境磁気信号および容器に含まれる磁気不純物からの磁気信号、容器に非特異的に結合した磁気マーカからの磁気信号が含まれる。精度良く測定するためには、これらの磁気信号を低減する必要がある。
【００１２】
容器の製造工程では、原料や作製工程など細心の注意を払い作製しても、磁気不純物の混入を完全に押さえることは極めて困難である。また、容器自身に磁気不純物が含まれていなくても、磁性を帯びた粉塵などが容器底面などに付着する可能性がある。光学的方式では、このような容器の汚染は問題になっていない。蛍光体などの光学的マーカに用いられる物資は、通常の製造工程や使用環境では存在せず、混入したり付着することがないためである。しかしながら、一般的な環境でも磁性を持った物質は多数存在する。このため、容器の不純物や汚染は磁気的検出に特有の新しい課題である。
【００１３】
一方、容器へのマーカの非特異吸着は光学的方法でも問題となっている。通常、容器表面は非特異吸着を防止するためBSAなどのブロッキング剤でコーティングするが、マーカの非特異吸着を完全に防止することが困難である。特に、測定容器を洗浄して再利用する方式、例えばフローセル方式の検査装置では、測定容器に付着したマーカを除去するため複数回の洗浄が行われるが、再現性良く完全に除去することは困難であり、検出下限濃度を制限する要因となっている。
【００１４】
本発明の目的は、容器に含まれる、あるいは、容器表面に付着した磁気不純物および容器に非特異的に結合した磁気マーカ（以下これらを容器に結合した磁気不純物と呼ぶ）からの磁気信号をキャンセルし、これらの磁気信号の影響を受けない検査技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、被測定物質を容器に固定するための固相抗体を使用しない磁気的計測の場合、測定信号から未結合磁気マーカ、および容器に結合した磁気不純物を除去し、結合磁気マーカの信号を高精度に測定できることを見いだした。例えば、特許文献２、特許文献３、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３の測定方法に適用可能である。
【００１６】
図１に本発明の方法を用いた測定手順の例を模式的に示す。図では、測定対象物質として複数の結合サイトを表面に有する細胞、例えば白血球や病原菌、を例に示すが、本発明はその他の物質、例えば抗体、ホルモン、タンパク質、DNAなど結合アッセイにより測定可能な物質が対象となる。
【００１７】
（a）試料容器１に、測定対象物質２を含む溶液試料（例えば血清など）および測定対象物質と特異的に結合する物質（抗体）が固定された磁性粒子（磁気マーカ）を加える。加えた磁気マーカの一部は測定対象物質２の結合部位と結合する。以下、測定対象物質と結合した磁気マーカを結合磁気マーカ３と呼ぶ。また、結合せずに溶液中に分散した磁気マーカを未結合磁気マーカ４と呼ぶ。また、一部の磁気マーカは容器壁面に非特異的に吸着する。この磁気マーカを非特異吸着磁気マーカ５と呼ぶ。また、図には容器に混入あるいは表面に付着している可能性がある磁気不純物６も示している。図に示した小さな矢印は磁気モーメントの方向７を示す。この段階では、磁気モーメントの方向は一方向に揃っていないため磁気信号は比較的弱い。この状態で配向用磁場を印加して測定を行うこともできるが、次に述べるように着磁用磁場を印加して、各磁気マーカの磁化方向を揃えると共に、飽和磁界に近い強い磁界で測定前に磁化した方が強い磁気信号が期待できる。
(b)着磁用外部磁界８を磁石９を用いて印加し、磁気マーカを磁化する。この時、未結合磁気マーカ４はその磁気モーメントの方向が着磁用外部磁界８の方向に沿うように、粒子自体が回転することができる。一方、測定対象物質２と結合している複数の磁気マーカは独立して回転できないが、強い磁界を印加することで、磁気微粒子内部のスピンの方向が着磁用外部磁界８の方向に沿って変化するため、測定対象物質と結合している複数の磁気マーカの磁気モーメントの方向を一方向に揃えることができる。強度はおよそ飽和磁化に必要な磁界程度である。この時に、磁気不純物も磁化され着磁用外部磁界の方向に沿って磁気モーメントを持つ。
【００１８】
着磁用外部磁界を遮断すると、ブラウン運動により結合磁気マーカおよび未結合磁気マーカの磁気モーメントの方向がランダムになる。一方、容器に固定されている非特異吸着磁気マーカ５および磁気不純物６は当初の磁気モーメントの方向を維持したままである。
【００１９】
この着磁の工程により結合マーカからの信号が増加するが、同時に磁気不純物からの信号も増加することになるため、強磁場による着磁を行わずに、測定した方が好ましい結果となる場合もあり得る。
【００２０】
(c)次に、配向用外部磁界１０を磁石１１で印加し、ランダムになった磁気マーカを再び配向用外部磁界１０の方向に揃える。印加する磁界の強度を磁気マーカや磁気不純物の保持力以下としすれば、磁気マーカおよび磁気不純物に含まれる磁性体内部のスピンの方向は変わらない。しかし、適切な時間印加することで、溶液中に浮遊している未結合の磁気マーカ自身を回転させ、マーカの磁気モーメントの方向を配向用外部磁界の方向に揃えることができる。また、被測定物質に結合している磁気マーカも被測定物質とともに回転可能なため、結合している磁気マーカの磁気モーメントも配向用外部磁界の方向に揃えることができる。なお、配向用外部磁界の方向は必ずしも着磁用外部磁界と一致する必要はないが、ここでは同じ方向とした。
【００２１】
(d) 配向用外部磁界を遮断後、磁気マーカの磁気モーメントの方向が再びランダムになるため、試料から発生する磁気信号が減衰する。結合マーカ３よりも未結合磁気マーカ４の方が早く磁気信号が減衰する。これはブラウン回転運動の緩和時間が回転体の体積に比例するためである。そこで、未結合磁気マーカ４からの磁気信号は大きく減衰するが、結合磁気マーカ３空の磁気信号があまり減衰していないタイミングで、磁気信号を測定すれば結合磁気マーカ３からの磁気信号を選択的に測定できる。この測定信号を信号１とする。信号１には非特異吸着磁気マーカ５および磁気不純物６からの磁気信号も含まれる。
【００２２】
(e) 次に、極性が逆の配向用外部磁界１２を磁石１３で印加する。この時、溶液中に浮遊した結合磁気マーカ３および未結合磁気マーカ４の磁気モーメントは逆方向に配向するが、容器に吸着した非特異吸着磁気マーカ５および磁気不純物６はその磁気モーメントの方向が変化しない。溶液中に浮遊している磁気マーカはマーカ自身が回転することで磁気モーメントの方向が逆方向に変化できるが、非特異吸着磁気マーカ５および磁気不純物６は容器に固定されているため、磁性体自身が回転して配向用外部磁界の方向に磁気モーメントの方向を揃えることができない。また、印加する配向用外部磁界の強度が磁気マーカや磁気不純物の保持力以下であるため、磁性体内部のスピンの方向を変えて配向用外部磁界の方向に磁気モーメントの方向を揃えることもできない。その結果、非特異吸着磁気マーカ５および磁気不純物６はその磁気モーメントの方向が変化しない。
【００２３】
(f) 配向用外部磁界を遮断後、未結合磁気マーカ４の信号はブラウン運動の影響により大きく減衰するが、結合磁気マーカ３の磁気信号があまり減衰していないタイミングで試料からの磁気信号を測定する。この測定信号を信号２とする。信号２には信号１とは逆方向の結合および未結合磁気マーカの信号が含まれる。また、非特異吸着磁気マーカ５および磁気不純物からの磁気信号も含まれるが、配向用外部磁界では非特異吸着磁気マーカおよび磁気不純物６に含まれる磁性体のスピンの方向を変えるほど強くないため、信号２に含まれる非特異吸着磁気マーカおよび磁気不純物からの信号は信号１に含まれているこれらの信号と等価である。したがって、信号１から信号２を差し引くことで、容器に固定した非特異吸着磁気マーカおよび磁気不純物からの磁気信号成分を除去できる。
【００２４】
以上のように、本発明によれば、容器に固定された磁性物質からの信号と、固定されていない溶液中の未結合マーカおよび未結合マーカからの磁気信号を分離できる。この結果、従来問題であった容器の磁性不純物や容器に吸着したマーカの信号の影響を低減できる。
【００２５】
図２に本発明の適用が可能な装置構成の例を示す。図２(a)に示すように、配向用外部磁界を電磁石１４で印加し、その後磁気センサー１５で試料１６の磁気信号を測定する場合、電磁石１４に流す電流を反転させることで逆方向の配向用外部磁界を容易に印可でき、本発明の方法を適用できる。また、図２(b)に示すように、２つの極性が異なる配向用外部磁界を印可するための磁石１７，１８を用意し、片方の磁石１７である方向に外部磁界を印加し配向させた後、磁気信号の測定を行い、次に極性が逆のもう一つの磁石１８で逆方向の外部磁界を印加し配向させた後、磁気信号を測定することで本発明の方法を実施できる。磁石１７，１８は永久磁石でも電磁石でもかまわないが、どちらの場合も漏れ磁場の影響を防ぐ必要がある。上下２つの磁石で試料に平行磁場を印加する方法や、試料がコイル上にあるときのみパルス磁場を印加するなどの工夫が必要である。図２(a)および(b)の方法は試料１６を移動させているが、図２(c)に示すように、磁気センサー１５上に試料１６を配置した状態で、電磁石１９により磁場を印可し、電磁石に流す電流を切った後に測定を行う方法でも、電磁石１９に流す電流を反転させて測定することで本発明を実施することができる。
【発明の効果】
【００２６】
以上のように、本発明によれば、容器に固定させた磁性物質からの信号と、結合マーカおよび未結合マーカからの磁気信号を分離できる。この結果、従来問題であった容器の磁性不純物や容器に吸着したマーカの信号の影響を低減でき、より高感度、高精度な測定が可能となる。また、本発明により容器の磁気不純物の影響を低減できるので、容器の製造や品質管理が容易になる。場合によっては、磁気不純物濃度が低い容器の製造に必要な特別な工程や製造装置が不要になると期待される。さらに、測定時に磁性不純物が容器に付着することで誤った測定結果が発生することを防止できる。本技術を例えば免疫グロブリン、ホルモン、腫瘍マーカなどの検査に適用すれば微量検体での迅速・高感度な検査が期待できる。また、感染症、食中毒など病原菌検査では判定までに時間がかる血液培養、細菌培養が必要であったが、本技術を用いた磁気的検出により培養無しでの病原菌検査ができる可能性があり、病原菌の迅速検査に貢献できると期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下の説明では、残留磁気信号を有する磁気微粒子で標識された抗体（磁気マーカ）を使用し、１次微分の平面型ＳＱＵＩＤグラジオメータで検査試薬と反応した試料からの磁気信号を検出する、磁気的バイオ検査装置を例に、本発明の実施例を説明する。以下の開示は、本発明の一実施例にすぎず、本発明の技術範囲を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００２８】
図３は本発明の一実施例である磁気的バイオ検査装置の構成を示す断面図である。環境磁気雑音のＳＱＵＩＤ２８への入力を低減するために、ＳＱＵＩＤを冷却するための冷却容器２１、電磁シールド２９および磁気シールド３０、３１によって囲まれている。電磁シールド２９はアルミニウムなど電気抵抗が低い金属材料で構成されており、磁気シールド３０、３１は、パーマロイ等の高透磁率材料から構成されている。磁気シールド３０の一部には試料容器７１を挿入するための切欠き穴３８が形成されている。
【００２９】
試料容器７１は非磁性の円盤型試料台３２に、固定ネジ３３により回転軸３５に固定されている。図４に実験で使用した試料容器７１の模式図を示す。容器は樹脂などの非磁性材料で作製されている。容器７１は円形で、外周部に１２カ所の円錐台の形状の窪み部分７０があり、中央には装置に固定するための穴７２が開いている。窪み部分の底面の直径は５ｍｍである。窪み部分に試料１６が入れられており、各窪みを容器番号１から１２で表す。試料台３２は回転機構３４に接続された回転軸３５によって回転する。回転機構３４は、移動ステージ３６、３７上で３次元方向に移動可能となっており、回転機構３５の移動により、試料容器７１の一部が切り欠き穴３８を通って、磁気シールド３０の内部へ移動され、窪み部分７０の底面とサファイヤウインドウ２９が近接するように位置調整される。
【００３０】
試料１６とＳＱＵＩＤ２８との距離を小さくし、試料から発生する磁気信号の検出感度及び空間分解能を高くするために、サファイヤウインドウ２９の下部にＳＱＵＩＤ２８が配置されている。試料容器７１が回転することで、複数の試料１６が順次、ＳＱＵＩＤ２８の上を通過し、そのときの磁気信号が計測される。通常20-60rpmで使用し、40-100回転分の信号を測定し、加算平均処理を行いSN比を改善している。サファイヤウインドウ２９は非磁性の円筒部品３９に固定されており、上下方向に位置合わせが可能である。また、SQUIDと対向する位置には配向用外部磁場発生用の磁化機構４２を設置した。磁化機構４２は２つの磁石４０，４０‘とヨーク４１で構成されており、２つの磁石の間に垂直方向の平行磁界が発生するように２つの磁石の磁化方向は揃っている。磁化機構４２を上下逆さまに配置することで配向用外部磁場の方向を反転できる。印加磁場の強度は約100ガウスであった。
【００３１】
ＳＱＵＩＤ２８は外層２２と内槽２３の間が断熱真空層となっている冷却容器２１の断熱真空層に配置され、熱伝導率の高い銅ロッド２６及びサファイヤロッド２５を介して液体窒素２４により間接的に冷却されている。冷却容器の外槽２２、内槽２３は、ＳＵＳやＦＲＰ等の非磁性材料で構成される。ＳＱＵＩＤ２８と銅ロッド２６との間にサファイヤロッド２５を介することにより、銅ロッド２６から発生する磁気雑音の影響を低減する効果がある。
【００３２】
本実施例の免疫検査装置ではＳＱＵＩＤ２８として、高温超電導ＳＱＵＩＤグラジオメータを使用した。図５は高温超電導ＳＱＵＩＤグラジオメータの構成を模式的に示す平面図である。図５(a)は全体を示す図、図５(b)は中央部分の拡大図である。検出コイル６２及びＳＱＵＩＤリング６４は、ＳｒＴｉＯ３やＭｇＯ等の単結晶を結晶方位をずらしてバイクリスタル接合面６１で張り合わされた構造のバイクリスタル基板６０上に形成された、ＹＢａ２Ｃｕ３Ｏｘ等の高温超電導材料を加工することで作製した。ＳＱＵＩＤリング６４は、バイクリスタル基板６０に形成されたバイクリスタル接合面６１を横切っており、バイクリスタル接合面６１上に形成された超電導薄膜に粒界ジョセフソン結合６５が形成されている。その結果、ＳＱＵＩＤリング６４には２カ所の粒界ジョセフソン結合６５が形成される。今回使用したＳＱＵＩＤでは、１枚の基板上に同じ検出コイルと結合した２つのＳＱＵＩＤリング６４，６４’が形成されており、そのうち特性が良い方のＳＱＵＩＤを実験で使用した。
【００３３】
検出コイル６２は、一辺が５ｍｍの２つのループを持つ８の字型の微分コイルを構成しており、検出コイル６２に磁束が入力すると、２つのループの各ループに生じる誘導電流の差分量が検出コイルの中央部分６６を経由してＳＱＵＩＤリング６４、６４‘に流れる。この電流が磁束として検出される。フィードバックコイル６７は、検出コイル６２のうち片方のループを囲むように基板６０上にパターニングされ形成されている。２つのフィードバックコイル６７，６７’の内、片方を使用した。配線の接続が必要なところには超電導薄膜の上に、金の配線パッド６３，および６８がパターニングされている。配線パッド６３はＳＱＵＩＤリング６４と電気接続されており、配線パッド６８はフィードバックコイル６７と電気接続されている。
【００３４】
試料測定前に、図４に示した非磁性試料容器７１の磁気信号を測定した。窪み部分７０に試料を入れない状態で試料容器をネオジム磁石（表面磁束密度250mT）に近づけ空の試料容器に含まれる磁気不純物を磁化させた後、磁石を遠ざけた。
【００３５】
試料容器を図３に示した測定装置の円盤型試料台３２に固定し、容器から発生する磁気信号の変化を測定した。まず、Ｓ極が上になるように磁化機構４２を配置した状態で測定を行い、測定信号１を得た。次にN極が上になるように磁化機構４２を配置した状態で測定を行い、測定信号２を得た。
【００３６】
図６に測定して得られた測定信号１、測定信号２およびそれらの差分の時間波形を示す。測定信号１の容器番号９の位置に振幅10mΦ0程度の大きな磁気信号の変化が観察される。容器をアルコールで拭いてもこの信号を除去できなかったことから、容器に含まれる磁気不純物からの信号と考えられる。もし、配向用外部磁界を反転させたときに、磁気不純物の磁化方向も反転していたら、上下方向に反転した磁気信号が検出されるはずであるが、測定信号２でも同じ信号が観察されている。その結果、測定信号１から測定信号２を差し引いた差分波形では容器番号９の位置の磁気信号の変化がキャンセルされている。また、図６の容器番号７近傍や１０近傍の小さな磁気信号の変動も差分波形では振幅が小さくなっており、本発明の方法が容器の雑音信号除去に有効なことを確認できる。
【００３７】
次に実際の試料を測定した場合の本発明の効果について示す。  本実施例では、図７に示すように測定対象物質として表面にビオチン５１が結合したポリマービーズ５２を使用した。ポリマービーズの粒径は１μmである。
【００３８】
磁気マーカ５３には市販のストレプトアビジン修飾の磁気マーカ（Ｒ＆Ｄ  system社製）を使用した。ストレプトアビジンはビオチンと特異的に結合するため、この磁気マーカによりビオチンで修飾されたポリマー粒子を検出できる。
【００３９】
まず、濃度0.1mg/mlに希釈した磁気マーカ溶液100μlとポリマービーズ５２が10000個含まれた40μlのポリマービーズ溶液を容量２mlのエッペンチューブ５４に入れ、５分おきにボルテックスで撹拌しながら１５分間反応させた。その後、磁気マーカを磁化するためネオジム磁石にエッペンチューブを近づけ、約1500ガウスの磁界を印加した。その後、図６の磁気信号波形を示した非磁性試料容器７１の窪み部分７０の３カ所に反応後の溶液35μlを加えた。
【００４０】
空の試料容器の測定と同様に、ネオジム磁石に近づけ試料及び試料容器を飽和磁気まで磁化させた後、Ｓ極が上になるように磁化機構４２を配置した状態とN極が上になるように磁化機構４２を配置した状態で測定を行い、測定信号１および測定信号２を得た。
【００４１】
図８に容器番号８−１０の３カ所の磁気信号波形を示す。(a)は測定信号１、(b)は測定信号２、(c)は差分波形である。試料の磁気信号強度を各試料位置における信号の最大振幅と定義する。３カ所とも同じ試料が入っており、理想的には同じ磁気信号強度が観察されるはずである。しかし、測定信号１の容器番号９の位置には図６で示した磁気不純物の信号があるため大きな磁気信号強度を示した。配向用外部磁界を反転させて測定した測定信号２では、容器番号８および１０の信号波形は上下方向に反転しており、配向用外部磁界の反転により測定対象であるポリマービーズに結合した磁気マーカの磁化方向が反転していることがわかる。容器番号９の信号波形は反転していないが、これは図６に示したように配向用外部磁界で反転しない磁気不純物の影響である。このように、通常の測定信号では容器雑音の影響を受け正しい測定が困難であった。しかし、本発明の方法を用い、２つの測定信号の差分を求めることで、容器の磁気不純物の影響を除去できる。図８(c)の差分波形からわかるように、容器番号8-10の３つの試料ともほぼ同じ磁気信号強度が得られている。また、差分を求めることで信号強度は約２倍に増加している。容器番号９の位置の磁気不純物だけではなく、試料８と９の間や試料９と１０の間で観察されていた測定信号の変動も抑制されていることがわかる。以上の結果から本発明により、容器雑音の影響を低減すると共に測定対象物質からの磁気信号強度を増加させ、ＳＮ比を大きく改善できることを確認できた。
【００４２】
図９に得られた磁気信号強度とポリマービーズ個数との関係（検量線）を示す。ポリマービーズの数に応じて磁気信号が単調に変化している。この曲線を検量線として用いれば、測定した磁気信号から試料中のポリマービーズ個数を求めることができる。本実施例では、測定対象物質である表面にビオチン５１が結合したポリマービーズ５２に対して、そのビオチンと特異的に結合するアビジンで修飾された磁気マーカを使用してポリマービーズの個数を測定できることを示した。
測定対象が病原菌の場合はその病原菌の表面に存在するタンパク質や糖鎖などと特異的に結合する抗体で修飾された磁気マーカを用いれば、病原菌の個数に応じた強度の磁気信号を計測でき、磁気信号から病原菌の有無だけでなくその個数を求めることができる。したがって、感染症や食中毒の検査などに利用できる。
【実施例２】
【００４３】
本実施例では、図１０に示すように試料容器７１が回転する円周上に極性が逆の２つの磁化機構４２，４３を配置した。実施例１では磁化機構４２を上下逆さまに配置することで、配向用外部磁界の方向を反転させたが、本実施例では試料容器７１の回転方向を反転させることで、測定直前に試料に印加される配向用外部磁界の方向を反転できる。試料は２つの磁化機構を通過するが、試料の磁気モーメントは測定直前に通過する磁化機構の磁界の方向に揃う。
【００４４】
２つの磁化機構４２，４３はSQUID２８の位置を０度として右回りに１５０度の位置に磁化機構４２を、左回りに150度の位置に磁化機構４３を設置した。磁化機構４３は磁化機構４２と同じ構造であるが、磁界の方向が逆向きである。試料位置での磁束密度は約100ガウスであった。実施例１と同じく、ビオチン修飾ポリマービーズと磁気マーカを反応させた試料を使用した。最初にネオジム磁石に近づけ試料及び試料容器を飽和磁気まで磁化させた後、まず試料容器を20rpmの速度で右回転させて磁気信号を測定した。この場合、S極が上向きの磁石の上を通過した後、SQUID上を通過する。40回転分の信号を測定し、４０回の信号加算平均処理を行った（測定信号１）。次に、逆向きに回転させて磁気信号を測定した。この場合、N極が上向きの磁石の上を通過した後、SQUID上を通過するので、浮遊した磁気マーカは逆方向に配向する。40回転分の信号を測定し、４０回の信号加算平均処理を行った（測定信号２）。回転方向を逆転させると測定された磁気信号の時間波形とSQUIDと試料との相対的な位置関係も逆転する。そこで、測定信号２を左右反転させた後で、測定信号１との差分を求めた。
【００４５】
その結果、実施例１と同様に、非測定物質である凝集した磁気マーカを含む磁気マーカ溶液からの磁気信号は差分波形では約２倍に増加すること、非特異吸着磁気マーカあるいは磁気不純物に対応した乾燥磁気マーカからの信号は差分波形では大きく減少することを確認できた。
【実施例３】
【００４６】
本実施例では、図１１に示すように試料容器７１が回転する円周上に極性が逆の２つの磁化機構４２，４３を配置し、さらに２つのＳＱＵＩＤ２８，２８‘を配置した。実施例２では２つの磁石を使用し、試料容器７１の回転方向を反転させることで、測定直前に試料に印加される配向用外部磁界の方向を反転したが、本実施例では磁気センサも２つ配置することで、図１１の矢印方向に回転させることで、磁化機構４２を通過後の磁気信号をＳＱＵＩＤ２８で、磁化機構４３を通過後の磁気信号をＳＱＵＩＤ２８’で測定できる。
【００４７】
磁化機構４３は磁化機構４２と同じ構造であるが、磁界の方向が逆向きである。試料位置での磁束密度は約100ガウスであった。実施例１、２と同じく、ビオチン修飾ポリマービーズと磁気マーカを反応させた試料を使用した。最初にネオジム磁石に近づけ試料及び試料容器を飽和磁気まで磁化させた後、試料容器を20rpmの速度で右回転させて２つのSQUIDで検出される磁気信号（２系統）を同時に測定した。40回転分の信号を測定し、４０回の信号加算平均処理を行った。このようにして測定された２つのＳＱＵＩＤで測定された磁気信号を試料がＳＱＵＩＤを通過したタイミングを合わせて差し引いた。その結果、実施例１および２と同様に、非測定物質である凝集した磁気マーカを含む磁気マーカ溶液からの磁気信号は差分波形では約２倍に増加すること、非特異吸着磁気マーカあるいは磁気不純物に対応した乾燥磁気マーカからの信号は差分波形では大きく減少することを確認できた。
【実施例４】
【００４８】
本実施例では、電磁石を使用した磁化機構４６を使用した。図１２に使用した測定装置の断面構造模式図を示す。磁化機構４６のコイル４８は電源４７に接続されており、試料１４が磁化機構４６の磁極４９，４９‘の間を通過するタイミングでパルス電流を流すことができる。電流の方向を反転させることで印加する配向用外部磁界の方向を反転できる。また、大きな電流を流すことで着磁用の磁界を印加することも可能である。
【００４９】
本実施例では、実施例１から３と同じく、ビオチン修飾ポリマービーズと磁気マーカを反応させた試料を使用して測定を行った。
【００５０】
ビオチン修飾ポリマービーズと磁気マーカの反応溶液35μlを試料容器７１の窪み部分７０に入れた後、試料容器を20rpmで右回転させながら磁化機構４６の磁極４９，４９‘の間を通過するタイミングでコイル４８にパルス幅1-10msの電流を流した。印加した磁場強度は500から1000ガウス程度である。
【００５１】
次に、印加するパルス磁場の強度を100ガウスに下げ、SQUID２８で磁気信号を測定した。40回転分の信号を測定し、４０回の加算平均処理を行った（測定信号１）。次に、電流の向きを反転させ、逆方向に100ガウスの磁界を印加した状態で、やはり40回転分の信号を測定し、４０回の加算平均処理を行った（測定信号２）。測定信号１から測定信号２を差し引くことで差分信号波形を求めた。
【００５２】
その結果、実施例１から３と同様に、非測定物質である凝集した磁気マーカを含む磁気マーカ溶液からの磁気信号は差分波形では約２倍に増加すること、非特異吸着磁気マーカあるいは磁気不純物に対応した乾燥磁気マーカからの信号は差分波形では大きく減少することを確認できた。
【００５３】
ここで述べた３つの実施例では、いずれもビオチンで修飾されたポリマー粒子について報告したが、溶液中の測定対象物質が磁気マーカと結合あるいは凝集体を形成する反応系に適用できる。いくつかの例を示すと、図１３(a)のように、表面に１次抗体８４が固定されたポリマー粒子８１を使用し、測定対象物質の抗原８２と抗原に結合する２次抗体で修飾された磁気マーカ８３を反応させ、１次抗体-抗原-磁気マーカの凝集体を形成させることで、本手法を適用して抗原の検出が可能となる。従来の洗浄が必要な光学的方法では、試料を容器に固定するための固定用抗体が必要なため容器のコストが高いという問題や自分で固定用抗体を固定させるには手間と時間が必要であった。図１１(a)のようにポリマービーズ表面で１次抗体-抗原-磁気マーカの凝集体を形成させることで、本発明の方法を適用できるとともに固定用抗体の準備に必要な手間とコストを低減できる。
【００５４】
また、図１３(b)のように細胞やバクテリア８７の細胞膜表面の特定のタンパク質と選択的に結合する抗体８５で修飾された磁気マーカ８３を使用した細胞やバクテリアの検出にも適用できる。タンパク質に比べ細胞やバクテリアはそれ自体が大きい。そのため、ポリマービーズ表面に細胞やバクテリアを固定しなくても、浮遊した細胞やバクテリアに結合した磁気マーカのブラウン回転緩和時間は、未結合磁気マーカのブラウン回転運動緩和時間よりも充分長い。従って緩和時間の違いを利用して結合した磁気マーカからの磁気信号を選択的に計測できると同時に、本発明の方法を適用可能である。
【００５５】
さらに図１１(c)のようにビオチン８６で修飾された細胞膜表面の特定のタンパク質に結合する抗体８８と、アビジン８９で修飾された磁気マーカ８３を使用した、細胞やバクテリアの検出にも適用できる。この場合、アビジン８９で修飾された磁気マーカを用意すれば、市販されているビオチン８６で修飾された細胞膜表面の特定のタンパク質に結合する抗体を利用して種々の細胞や病原菌を測定できるというメリットがある。
【００５６】
また、本実施例では磁気センサーとしてSQUIDを使用したが、ＧＭＲセンサー、ＭＲセンサー、光ポンピング磁束計、フラックスゲート磁束計、ホール素子などの磁気センサーを使用した場合も同様の効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の方法を用いた測定手順の説明図。
【図２】本発明の適用が可能な装置構成の例を示す図。
【図３】本発明の実施例で使用した磁気的バイオ検査装置の構成を示す断面図。
【図４】実施例で使用した試料容器の模式図。
【図５】１次微分平面型グラジオメータを使用した場合の試料の磁化方向と検出される磁気信号波形の関係を説明する図。
【図６】空の試料容器の磁気信号波形。
【図７】実施例１における試料の作製方法を説明するための図。
【図８】ポリマービーズ試料の測定結果および本発明の適用結果。
【図９】磁気信号強度とポリマービーズ個数の関係。
【図１０】実施例２における磁化機構およびＳＱＵＩＤの配置を説明するための図。
【図１１】実施例３における磁化機構およびＳＱＵＩＤの配置を説明するための図。
【図１２】実施例４で使用した磁気的バイオ検査装置の構成を示す断面図。
【図１３】本発明が適用可能な反応系の例。
【符号の説明】
【００５８】
１…試料容器、２…測定対象物質、３…結合磁気マーカ、４…未結合磁気マーカ、５…非特異吸着磁気マーカ、６…磁気不純物、７…磁気モーメントの方向、８…着磁用外部磁界、９…磁石、１０…配向用外部磁界、
１１…磁石、１２…逆の配向用外部磁界、１３…磁石、１４…電磁石、１５…磁気センサー、１６…試料、１７…磁石、１８…磁石、１９…電磁石、２０…サファイヤウインドウ、
２１…冷却容器、２２…外槽、２３…内槽、２４…液体窒素、２５…サファイヤロッド、２６…銅ロッド、２８、２８’…ＳＱＵＩＤ、２９…電磁シールド
３０…磁気シールド、３１…磁気シールド、３２…試料台、３３…固定ネジ、３４…回転機構、３５…回転軸、３６…移動ステージ（垂直方向）、３７…移動ステージ（水平方向）、３８…切欠き穴、３９…円筒部品、
４０，４０‘…磁石、４１…ヨーク、４２…磁化機構、４３…磁化機構、
４６…磁化機構、４７…電源、４８…コイル、４９、４９‘…磁極、
５１…ビオチン、５２…ポリマービーズ、５３…磁気マーカ、５４…エッペンチューブ、
６０…バイクリスタル基板、６１…バイクリスタル接合面、６２…検出コイル、６３…配線パッド、６４…ＳＱＵＩＤリング、６５…粒界ジョセフソン結合、６６…検出コイルの中央部分、６７…フィードバックコイル、６８…配線パッド（フィードバックコイル用）、
７０…窪み部分、７１…試料容器、７２…固定するための穴、
８１…ポリマー粒子、８２…抗原、８３…磁気マーカ、８４…１次抗体、８５…抗体、８６…ビオチン、８７…細胞やバクテリア、８８…抗体、８９…アビジン。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008286616.tif 000009
【図８】
2008286616.tif 000010
【図９】
2008286616.tif 000011
【図１０】
2008286616.tif 000012
【図１１】
2008286616.tif 000013
【図１２】
2008286616.tif 000014
【図１３】
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