(57)【要約】      （修正有）【課題】ラマン分光装置において、試料セル中の被測定物質をラマン散乱デバイスの表面又はその近傍に効果的に引き寄せて、高感度なラマン分光分析を行うことを可能とする。【解決手段】ラマン分光装置１は、試料セル１０と、試料セル１０内の試料Ｓに接触するように配置され、試料接触面２０ｓに測定光Ｌ１が照射されてラマン散乱光を生じるラマン散乱デバイス２０と、ラマン散乱デバイス２０の試料接触面２０ｓに測定光Ｌ１を照射する測定光照射光学系３０と、ラマン散乱光を検出する検出手段４０とを備えたものである。ラマン分光装置１は、試料セル１０内に、電気泳動性を有する、若しくは電気泳動性を有するようあらかじめ調整された被測定物質を含む試料Ｓが充填又は流下されて、測定が行われるものであり、試料セル１０に、試料Ｓ中の被測定物質をラマン散乱デバイス２０の試料接触面２０ｓ側に電気泳動させる電圧印加手段５０が備えられたものである。【選択図】図１
2008164584.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料セルと、
該試料セル内の試料に接触するように配置され、試料接触面に測定光が照射されてラマン散乱光を生じるラマン散乱デバイスと、
該ラマン散乱デバイスの前記試料接触面に前記測定光を照射する測定光照射光学系と、
前記ラマン散乱光を検出する検出手段とを備えたラマン分光装置において、
前記試料セル内に、電気泳動性を有する、若しくは電気泳動性を有するようあらかじめ調整された被測定物質を含む流動性を有する試料が充填又は流下されて、測定が行われるものであり、
前記試料セルに、前記試料に対して電圧を印加して、該試料中の前記被測定物質を前記ラマン散乱デバイスの前記試料接触面側に電気泳動させる電圧印加手段が備えられていることを特徴とするラマン分光装置。
【請求項２】
前記ラマン散乱デバイスは、電極と、該電極上に順次形成された誘電体と前記試料に接触させられ表面増強ラマン散乱を生じさせる金属体とを備えたものであり、
前記電圧印加手段は、前記ラマン散乱デバイスの一部である前記電極と、前記試料を介して前記ラマン散乱デバイスに対して対向配置された対向電極とを備えたものであることを特徴とする請求項１に記載のラマン分光装置。
【請求項３】
前記ラマン散乱デバイスは、前記試料に接触させられ表面増強ラマン散乱を生じさせる金属体からなり、それ自身が電極として機能するものであり、
前記電圧印加手段は、前記ラマン散乱デバイスからなる電極と、前記試料を介して前記ラマン散乱デバイスに対して対向配置された対向電極とを備えたものであることを特徴とする請求項１に記載のラマン分光装置。
【請求項４】
前記金属体は、前記測定光の波長よりも小さい凹凸構造を有することを特徴とする請求項２又は３に記載のラマン分光装置。
【請求項５】
前記金属体の主成分は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、及びこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属であることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載のラマン分光装置。
【請求項６】
前記試料セルは、一端が前記ラマン散乱デバイスの前記試料接触面に接し、他端が前記対向電極に接したキャピラリー状セルであることを特徴とする請求項２〜５のいずれかに記載のラマン分光装置。
【請求項７】
前記ラマン散乱デバイスは、前記試料接触面に前記被測定物質とイオン結合する表面修飾が施されたものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のラマン分光装置。
【請求項８】
前記被測定物質が蛋白質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群より選ばれた少なくとも１種であり、
前記被測定物質とイオン結合する前記表面修飾が、カルボキシ基、スルホン酸基、リン酸基、アミノ基、４級アンモニウム基、イミダゾール基、及びグアニジニウム基からなる群より選ばれた少なくとも１種の基を有するものであることを特徴とする請求項７に記載のラマン分光装置。
【請求項９】
前記ラマン散乱デバイスは、前記試料接触面に前記被測定物質と共有結合する表面修飾が施されたものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のラマン分光装置。
【請求項１０】
前記被測定物質が蛋白質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群より選ばれた少なくとも１種であり、
前記被測定物質と共有結合する前記表面修飾が、反応性エステル基、ヒドラジド基、チオール基、及び反応性ジスルフィド基からなる群より選ばれた少なくとも１種の基を有するものであることを特徴とする請求項９に記載のラマン分光装置。
【請求項１１】
試料を、測定光が照射されラマン散乱光を生じさせるラマン散乱デバイスと接触させ、前記ラマン散乱光を検出するラマン分光方法において、
前記試料として、電気泳動性を有する、若しくは電気泳動性を有するようあらかじめ調整された被測定物質を含む流動性を有する試料を用意し、
前記試料を前記ラマン散乱デバイスと接触させた状態で、該試料に対して電圧を印加して、該試料中の前記被測定物質を前記ラマン散乱デバイスの前記試料接触面側に電気泳動により引き寄せ、
前記被測定物質を引き寄せた状態で、前記ラマン散乱光の検出を実施することを特徴とするラマン分光方法。
【請求項１２】
試料を、測定光が照射されラマン散乱光を生じさせるラマン散乱デバイスと接触させ、前記ラマン散乱光を検出するラマン分光方法において、
前記試料として、電気的に両性を有する被測定物質を含む流動性を有する試料を用意し、
前記試料のｐＨを調整して、前記被測定物質を正荷電状態又は負荷電状態に調整し、
前記試料を前記ラマン散乱デバイスと接触させた状態で、該試料に対して電圧を印加して、該試料中の前記被測定物質を前記ラマン散乱デバイスの前記試料接触面側に電気泳動により引き寄せ、
前記被測定物質を引き寄せた状態で、前記ラマン散乱光の検出を実施することを特徴とするラマン分光方法。
【請求項１３】
前記ラマン散乱デバイスが、前記試料接触面に前記被測定物質と共有結合又はイオン結合する表面修飾が施されたものであり、
該表面修飾と前記電気泳動により引き寄せられた前記被測定物質とを共有結合又はイオン結合させて前記ラマン散乱光の検出を実施することを特徴とする請求項１１又は１２に記載のラマン分光方法。
【請求項１４】
前記表面修飾と前記被測定物質とを共有結合又はイオン結合させた後、前記ラマン散乱光の検出を実施する前に前記電圧印加を停止することを特徴とする請求項１３に記載のラマン分光方法。
【請求項１５】
前記表面修飾と前記被測定物質とを共有結合又はイオン結合させた後、前記ラマン散乱光の検出を実施する前に不純物を除去することを特徴とする請求項１４に記載のラマン分光方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被測定物質を含む試料を、測定光が照射されラマン散乱光を生じさせるラマン散乱デバイスと接触させて、ラマン散乱光の検出を実施する装置及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ラマン分光分析は、物質に単波長光を照射して得られる散乱光を分光して、ラマン散乱光のスペクトル（ラマンスペクトル）を得る分析法であり、物質の同定等に利用されている。ラマン散乱光は微弱な光であるが、金属体、特に表面に微細な凹凸を有する金属体に物質を接触させた状態で光を照射すると、ラマン散乱光の強度が増強されることが知られている。この効果は、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）効果と称される。
【０００３】
一般に、ＳＥＲＳ効果を有するラマン散乱デバイスを用いてラマン分光分析を行う場合、試料中の被測定物質がラマン散乱デバイスの表面又はそのごく近傍に位置した状態で分析を行う必要があり、試料中の被測定物質がラマン散乱デバイスの表面に吸着した状態で分析を行うことが特に好ましい。これは、被測定物質がラマン散乱デバイスから離れるにつれて、ＳＥＲＳ効果が低減するからである。
【０００４】
例えば、表面プラズモンセンサの分野では、あらかじめ表面プラズモンが発生する金属膜上に被測定物質と特異結合するリガンドを固定しておき、金属膜表面に試料中の被測定物質を固定して、センシングを行うことがなされている。しかしながら、かかる方法では、リガンドと被測定物質との反応を充分に待たなければ、充分な量の結合量を確保できず、測定を迅速に実施することが難しい。しかも、リガンドと結合する物質は限られており、被測定物質の種類が限定されてしまう。
【０００５】
一方、蛋白質、ペプチド、及びアミノ酸等の被測定物質が複数含まれた試料の微量分析を行う際に被測定物質を分離する方法として、電気泳動法が知られている。電気泳動法の中では、試料の量が微量で済み、試料のジュール熱による対流の影響を無視できることから、キャピラリー電気泳動法が好ましい。
【０００６】
特許文献１，２には、キャピラリー電気泳動法による試料分離と分離された試料のラマン分光分析とを同時に行える装置が開示されている。
【０００７】
特許文献１には、被測定物質を電気泳動させるキャピラリー内にファイバ状のＳＥＲＳ活性微小電極を挿入することで、キャピラリー電気泳動によってＳＥＲＳ活性微小電極の周りに、分離された被測定物質を層状に集めることができ、ＳＥＲＳ活性微小電極に測定光を照射して分離された被測定物質のラマン分光分析を行う装置が開示されている（段落０００８及び図１等を参照）。
【０００８】
特許文献２には、キャピラリー電気泳動によって分離された複数の被測定物質をＳＥＲＳ活性基体の異なる箇所に析出させ、析出物のラマン分光分析を行う装置が開示されている（請求項７及び図４等を参照）。
【特許文献１】特開平9-281076号公報
【特許文献２】特表2003-511666号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１，２に記載の装置では、ＳＥＲＳ効果を有するラマン散乱デバイス上に被測定物質を集めることができる。  
しかしながら、特許文献１に記載の装置では、ラマン散乱デバイスを電気泳動用のキャピラリー内に挿入可能なファイバ状に加工する必要があり、ラマン散乱デバイスの加工が非常に複雑である。  
特許文献２に記載の装置では、キャピラリー電気泳動によって分離された複数の被測定物質をＳＥＲＳ効果を有するラマン散乱デバイス上に析出させる必要があるため、１つ１つの被測定物質の析出処理に手間と時間を要する。しかも、キャピラリー電気泳動によって分離された複数の被測定物質をラマン散乱デバイスの異なる箇所に析出させる処理が必要であるため、被測定物質の数だけ析出操作に多くの手間と時間を要する。
【００１０】
また、一般のラマン分光装置では試料セルは非キャピラリー状であるが、非キャピラリー状の試料セル中の被測定物質をラマン散乱デバイス上に集める方法については、提案されていない。
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、試料セルの形状に関係なく、試料セル中の被測定物質をラマン散乱デバイスの表面又はその近傍に効果的に引き寄せて、高感度なラマン分光分析を行うことができ、しかも装置構成が簡易で、分析を容易かつ迅速に実施できるラマン分光装置、及びこれを用いたラマン分光方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明のラマン分光装置は、
試料セルと、
該試料セル内の試料に接触するように配置され、試料接触面に測定光が照射されてラマン散乱光を生じるラマン散乱デバイスと、
該ラマン散乱デバイスの前記試料接触面に前記測定光を照射する測定光照射光学系と、
前記ラマン散乱光を検出する検出手段とを備えたラマン分光装置において、
前記試料セル内に、電気泳動性を有する、若しくは電気泳動性を有するようあらかじめ調整された被測定物質を含む流動性を有する試料が充填又は流下されて、測定が行われるものであり、
前記試料セルに、前記試料に対して電圧を印加して、該試料中の前記被測定物質を前記ラマン散乱デバイスの前記試料接触面側に電気泳動させる電圧印加手段が備えられていることを特徴とするものである。
【００１３】
「被測定物質が電気泳動性を有する」とは、被測定物質が荷電状態にあり、電場によって移動できる性質を有することを意味する。  
試料は、試料セル内全体に充填又は流下されてもよいし、試料セル内の一部に充填又は流下されてもよい。
【００１４】
参考までに、ラマン分光装置とは分野が異なるが、表面プラズモンセンサの分野においては、非キャピラリー状の試料セル内の試料に対して電圧を印加して、試料中の被測定物質を表面プラズモンが発生する金属膜側に電気泳動させて、被測定物質の検出を行うことが開示されている（特開平9-304339号公報の請求項１及び図１等）。
【００１５】
前記ラマン散乱デバイスは、電極と、該電極上に順次形成された誘電体と前記試料に接触させられ表面増強ラマン散乱を生じさせる金属体とを備えたものであり、
前記電圧印加手段は、前記ラマン散乱デバイスの一部である前記電極と、前記試料を介して前記ラマン散乱デバイスに対して対向配置された対向電極とを備えたものであることが好ましい。
【００１６】
前記ラマン散乱デバイスは、前記試料に接触させられ表面増強ラマン散乱を生じさせる金属体からなり、それ自身が電極として機能するものであり、
前記電圧印加手段は、前記ラマン散乱デバイスからなる電極と、前記試料を介して前記ラマン散乱デバイスに対して対向配置された対向電極とを備えたものであってもよい。
【００１７】
本明細書において、「対向電極」は、ラマン散乱デバイスに対して正面対向でも斜め対向でも構わない。また、ラマン散乱デバイスと対向電極との間に試料が存在するのであれば、対向電極の位置は特に制限されない。したがって、対向電極は試料中には配置されずに試料セルに取り付けられてもよいし、試料中に配置されてもよい。
【００１８】
表面増強ラマン散乱を生じさせる前記金属体は、前記測定光の波長よりも小さい凹凸構造を有することが好ましい。  
本明細書において、「測定光の波長よりも小さい凹凸構造」とは、凹凸構造をなす凸部及び凹部の平均的な大きさと平均的なピッチが測定光の波長よりも小さいことを意味する。凹部に金属はあってもなくてもよい。
【００１９】
前記金属体の主成分は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、及びこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属であることが好ましい。  
本明細書において、「主成分」は、含量９０質量％以上の成分と定義する。
【００２０】
前記試料セルは、一端が前記ラマン散乱デバイスの前記試料接触面に接し、他端が前記対向電極に接したキャピラリー状セルであることが好ましい。
【００２１】
前記ラマン散乱デバイスは、前記試料接触面に、前記被測定物質とイオン結合する表面修飾、及び／又は前記被測定物質と共有結合する表面修飾が施されたものであることが好ましい。
【００２２】
本発明の第１のラマン分光方法は、試料を、測定光が照射されラマン散乱光を生じさせるラマン散乱デバイスと接触させ、前記ラマン散乱光を検出するラマン分光方法において、前記試料として、電気泳動性を有する、若しくは電気泳動性を有するようあらかじめ調整された被測定物質を含む流動性を有する試料を用意し、前記試料を前記ラマン散乱デバイスと接触させた状態で、該試料に対して電圧を印加して、該試料中の前記被測定物質を前記ラマン散乱デバイスの前記試料接触面側に電気泳動により引き寄せ、前記被測定物質を引き寄せた状態で、前記ラマン散乱光の検出を実施することを特徴とするものである。
【００２３】
本発明の第２のラマン分光方法は、試料を、測定光が照射されラマン散乱光を生じさせるラマン散乱デバイスと接触させ、前記ラマン散乱光を検出するラマン分光方法において、前記試料として、電気的に両性を有する被測定物質を含む流動性を有する試料を用意し、前記試料のｐＨを調整して、前記被測定物質を正荷電状態又は負荷電状態に調整し、
前記試料を前記ラマン散乱デバイスと接触させた状態で、該試料に対して電圧を印加して、該試料中の前記被測定物質を前記ラマン散乱デバイスの前記試料接触面側に電気泳動により引き寄せ、前記被測定物質を引き寄せた状態で、前記ラマン散乱光の検出を実施することを特徴とするものである。
【００２４】
本発明の第１及び第２のラマン分光方法において、前記ラマン散乱デバイスが、前記試料接触面に前記被測定物質と共有結合又はイオン結合する表面修飾が施されたものであり、該表面修飾と前記電気泳動により引き寄せられた前記被測定物質とを共有結合又はイオン結合させて前記ラマン散乱光の検出を実施してもよい。また、かかる方法では、前記表面修飾と前記被測定物質とを共有結合又はイオン結合させた後、前記電圧印加を停止して前記ラマン散乱光の検出を実施することが好ましい。
【００２５】
また、前記表面修飾と前記被測定物質とを共有結合又はイオン結合させた後、前記ラマン散乱光の検出を実施する前に不純物を除去することが好ましい。  
ここで「不純物」とは、ラマン散乱デバイスと接触させた試料のうち、表面修飾と共有結合又はイオン結合された被測定物質を除いたものを意味する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のラマン分光装置は、試料セル内の試料に対して電圧を印加して、試料中の被測定物質をラマン散乱デバイスの試料接触面側に電気泳動させる電圧印加手段を備えた構成を有している。
【００２７】
本発明のラマン分光装置によれば、電気泳動性を有する、若しくは電気泳動性を有するようあらかじめ調整された被測定物質を含む流動性を有する試料を用い、電気泳動によって試料中の被測定物質をラマン散乱デバイスの試料接触面側に引き寄せることができる。
【００２８】
本発明のラマン分光装置では、試料セルの形状に関係なく、被測定物質のラマン散乱デバイスの表面又はその近傍への引き寄せ効果が得られる。本発明のラマン分光装置では、ラマン散乱デバイスの表面又はその近傍に充分な量の被測定物質が存在した状態で、確実に分析を行うことができ、表面増強ラマン散乱効果も効果的に得られるので、高感度な分析を安定して実施することができる。本発明のラマン分光装置は装置構成が簡易で、分析を容易かつ迅速に実施できる装置である。
【００２９】
本発明のラマン分光装置ではまた、必要に応じて、印加電圧を調整することで、ラマン散乱デバイスの表面又はその近傍に引き寄せられる被測定物質の量等も調整することができる。
【００３０】
ラマン散乱デバイスが試料接触面に被測定物質と結合する表面修飾を有している場合には、上記引き寄せ効果によって、ラマン散乱デバイスと被測定物質との結合を促進することができ、ラマン散乱デバイス表面への被測定物質の吸着量を増加させることができる。また、この場合は測定においてノイズとなる試料を除去してからラマン散乱光の検出を実施することができるため、高感度な分析を安定して実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
「第１実施形態」
図面を参照して、本発明に係る第１実施形態のラマン分光装置の構成、及びこれを用いたラマン分光方法について、説明する。図１は装置の全体図、図２，図３はラマン散乱デバイスの好適な例を示す図である。
【００３２】
本実施形態のラマン分光装置１は、試料セル１０と、試料セル１０内の試料Ｓに接触するように配置され、試料接触面２０ｓに測定光Ｌ１が照射されてラマン散乱光を生じる板状のラマン散乱デバイス２０と、ラマン散乱デバイス２０の試料接触面２０ｓに測定光Ｌ１を照射する測定光照射光学系３０と、ラマン散乱光を検出する検出手段４０とを備えたものである。
【００３３】
測定光照射光学系３０は、試料接触面２０ｓに対して特定の単波長光である測定光Ｌ１を照射する光学系であり、レーザ等の光源３１、及び必要に応じて光源３１から出射される光を導光するミラー，レンズ等の導光系（図示略）により構成されている。
【００３４】
検出手段４０は、測定光Ｌ１の照射によってラマン散乱デバイス２０の試料接触面２０ｓで生じる反射光と散乱光とを含む検出光Ｌ２が入射し、検出光Ｌ２を分光してラマン散乱光を検出し、ラマンスペクトルを得る分光検出器である。
【００３５】
試料セル１０は、互いに対向して離間配置された底板１１及び上板１２を備えた角型等の箱状セルである。試料セル１０は、絶縁性材料により構成されている。試料セル１０の上下は便宜上定めたものであり、試料セル１０の上下は適宜設計できる。
【００３６】
本実施形態において、試料セル１０には、試料Ｓに対して電圧を印加して、試料Ｓ中の上記被測定物質をラマン散乱デバイス２０の試料接触面２０ｓ側に電気泳動させる電圧印加手段５０が備えられている。
【００３７】
本実施形態において、ラマン散乱デバイス２０は、電極２１と、電極２１上に順次形成された誘電体２２と試料Ｓに接触させられ表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を生じさせる金属体２３とからなるデバイスである。ラマン散乱デバイス２０は、試料接触面２０ｓである金属体２３の表面が試料セル１０内の試料Ｓに接触するよう、電極２１が試料セル１０の底板１１に嵌め込まれて、試料セル１０に固定されている。ラマン散乱デバイス２０の試料セル１０への固定態様については、適宜設計できる。
【００３８】
試料セル１０の上板１２には、試料Ｓを介してラマン散乱デバイス２０に対して正面に対向配置された対向電極５１が嵌め込まれている。試料セル１０の外側に、ラマン散乱デバイス２０の一部をなす電極２１と対向電極５１とに電圧を印加するための電源５２及び配線５３が配設されている。
【００３９】
本実施形態では、ラマン散乱デバイス２０の一部をなす電極２１と対向電極５１と電源５２と配線５３とにより、電圧印加手段５０が構成されている。
【００４０】
ラマン散乱光の増強効果が大きいことから、ラマン散乱デバイス２０をなす金属体２３は、測定光Ｌ１の波長よりも小さい凹凸構造を有することが好ましい。
【００４１】
図２及び図３を参照して、ラマン散乱デバイス２０の好適な態様２０Ａ〜２０Ｆについて説明する。図２（ａ），（ｂ）は斜視図、図２（ｃ）及び図３（ａ）〜（ｃ）は断面図である。
【００４２】
図２（ａ）に示すラマン散乱デバイス２０Ａは、平坦な電極２１と平坦な誘電体２２との積層体の上に、複数の金属粒子２３ａがアレイ状に固着されたデバイスである。この例では、金属体２３は、複数の金属粒子２３ａからなる金属粒子層である。  
金属粒子２３ａの配列パターンは適宜設計でき、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、個々の金属粒子２３ａが凸部であり、金属粒子２３ａの平均的な径及びピッチが測定光Ｌの波長よりも小さく設計される。
【００４３】
図２（ｂ）に示すラマン散乱デバイス２０Ｂは、平坦な電極２１と平坦な誘電体２２との積層体の上に、金属細線２３ｂが格子状にパターン形成された金属パターン層からなる金属体２３が形成されたデバイスである。金属パターン層のパターンは適宜設計でき、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属細線２３ｂの平均的な線幅及びピッチが測定光Ｌの波長よりも小さく設計される。
【００４４】
図２（ｃ）に示すラマン散乱デバイス２０Ｃは、図４（ａ）〜（ｃ）に製造プロセスを示すように、被陽極酸化金属体（Ａｌ等）６０の一部を陽極酸化して金属酸化物体（Ａｌ２Ｏ３等）６２とし、陽極酸化の過程で形成される金属酸化物体６２の複数の微細孔６２ａ内に各々金属２３ｃをメッキ等により成長させて得られたデバイスである。このデバイスでは、金属酸化物体６２の微細孔６２ａ内に、頭部が金属酸化物体６２の表面より突出するまで金属２３ｃをマッシュルーム状に成長させてある（特開2005-172569号公報を参照）。微細孔６２ａを略規則的なパターンで開孔させることができるので、金属２３ｃは略規則的なパターンで配列させることができる。図４（ａ），（ｂ）は斜視図、図４（ｃ）は断面図である。
【００４５】
図２（ｃ）に示すラマン散乱デバイス２０Ｃでは、電極２１が被陽極酸化金属体の非陽極酸化部分（Ａｌ等）６１からなり、誘電体２２が被陽極酸化金属体６０の一部を陽極酸化して得られる金属酸化物体６２からなり、金属体２３が陽極酸化の過程で形成される金属酸化物体６２の複数の微細孔６２ａ内に成長させた複数のマッシュルーム状の金属２３ｃにより構成されている。
【００４６】
図２（ｃ）に示す例では、マッシュルーム状の金属２３ｃの頭部が粒子状であり、デバイスの表面から見れば、誘電体２２の表面に金属粒子層が形成された構造になっている。かかる構成では、マッシュルーム状の金属２３ｃの頭部が凸部であり、その平均的な径及びピッチが測定光Ｌの波長よりも小さく設計される。
【００４７】
ラマン散乱デバイス２０は、試料Ｓに接触させられ表面増強ラマン散乱を生じさせる金属体２３のみにより構成されてもよい。
【００４８】
図３（ａ）に示すラマン散乱デバイス２０Ｄは、図４（ａ），（ｂ）に示すように陽極酸化を実施し、陽極酸化により形成された金属酸化物体６２を除去して、被陽極酸化金属体の非陽極酸化部分６１のみを残したデバイスである（特開2006-250924号公報を参照）。かかるデバイスでは、金属体２３が表面に複数のディンプル状の凹部２３ｄを有する非陽極酸化部分６１により構成される。
【００４９】
図３（ｂ）に示すラマン散乱デバイス２０Ｅは、上記ラマン散乱デバイス２０Ｄの表面に、その凹凸形状に沿って金属層６３を成膜したものである（特開2006-250924号公報を参照）。
【００５０】
図３（ｃ）に示すラマン散乱デバイス２０Ｆは、上記ラマン散乱デバイス２０Ｅの金属層６３をアニール処理により粒子化して、被陽極酸化金属体の非陽極酸化部分６１上に金属粒子６４を形成したものである（特願2006-198009号（本件特許出願時において未公開）を参照）。
【００５１】
図２及び図３に示したラマン散乱デバイス２０Ａ〜２０Ｆでは、略規則的な凹凸構造の金属体２３が得られるので、ＳＥＲＳ効果がデバイスの面全体でばらつきなく得られ、好ましい。
【００５２】
金属体２３は、表面が粗面化された金属層により構成してもよい。粗面化方法としては、酸化還元等を利用した電気化学的な方法等が挙げられる。その他、ラマン散乱デバイス２０としては、ＳＥＲＳ効果を有する公知のデバイスを用いることができる。例えば、J.AM.CHEM.SOC. 2005, Vol.127, 14992-14993, ”Nanosphere arrays with controlled sub-10-nm gaps as surface-enhanced raman spectroscopy substrates”には、ＩＴＯ基板上に、ＣＴＡＢ（cetyltrimethylammonium bromide）で表面修飾した複数のＡｕ粒子を配列させたラマン散乱デバイスが記載されている。特開2005-233637号公報には、基板上に金ナノロッド薄膜を形成したラマン散乱デバイスが開示されている。
【００５３】
本実施形態のラマン分光装置１では、試料セル１０内に、電気泳動性を有する、若しくは電気泳動性を有するようあらかじめ調整された被測定物質を含む流動性を有する試料Ｓが充填又は流下されて、測定が行われる。試料Ｓは流動性を有していればよく、その状態としては液状、ゲル状、及びゾル状等が挙げられる。
【００５４】
本実施形態では、試料Ｓをラマン散乱デバイス２０と接触させた状態で、試料Ｓに対して電圧を印加して、試料Ｓ中の被測定物質をラマン散乱デバイス２０の試料接触面２０ｓ側に電気泳動させ、ラマン散乱デバイス２０の試料接触面２０ｓ側に被測定物質を引き寄せた状態で、ラマン散乱光の検出を実施することができる。
【００５５】
蛋白質、ペプチド、アミノ酸等の電気的に両性を有する被測定物質であれば、試料ＳのｐＨを調整して、被測定物質を正荷電状態又は負荷電状態に調整することができる。電極２１が陽極であれば被測定物質を負荷電状態に調整し、電極２１が陰極であれば被測定物質を正荷電状態に調整すれば、ラマン散乱デバイス２０の試料接触面２０ｓ側に被測定物質を引き寄せることができる。
【００５６】
本実施形態でのラマン分光装置１では、複数の被測定物質を含む試料Ｓの測定も可能である。この場合には、電気泳動速度の違いを利用して試料を分離し、ラマン散乱デバイス２０の試料接触面２０ｓに引き寄せられた順に測定を実施することができる。かかる測定を実施する場合には、１種の被測定物質の測定を終えるごとに、ラマン散乱デバイス２０を取り出して、試料接触面２０ｓの洗浄を実施することが好ましい。
【００５７】
ラマン散乱デバイス２０は、試料接触面２０ｓに被測定物質とイオン結合する表面修飾又は共有結合する表面修飾が施されたものであることが好ましい。かかる構成では、被測定物質がイオン結合又は共有結合によって試料接触面２０ｓに対して強固に吸着され、好ましい。かかる場合には、試料接触面２０ｓにおける被測定物質の濃度が高くなり、好ましい。
【００５８】
被測定物質が蛋白質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群より選ばれた少なくとも１種である場合、被測定物質とイオン結合する表面修飾としては、被測定物質と反対荷電を有する表面修飾基を用いることができ、カルボキシ基、スルホン酸基、リン酸基、アミノ基、４級アンモニウム基、イミダゾール基、グアニジニウム基、及びこれらの誘導体基等の表面修飾基を有するものが挙げられる。試料接触面２０ｓは、これらの表面修飾基を２種以上有していてもよい。
【００５９】
被測定物質が蛋白質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群より選ばれた少なくとも１種である場合、被測定物質と共有結合する表面修飾としては、Ｎ−ヒドロキシスクニンイミジルエステル等の反応性エステル基、カルボジイミド基、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール基、ヒドラジド基、チオール基、反応性ジスルフィド基、マレイミド基、アルデヒド基、エポキシド基、（メタ）アクリレート基、ヒドロキシル基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、及びこれらの誘導体基等の表面修飾基を有するものが挙げられる。試料接触面２０ｓは、これらの表面修飾基を２種以上有していてもよい。  
例示した表面修飾基の中でも、反応性エステル基、ヒドラジド基、チオール基、及び反応性ジスルフィド基等が好ましい。  
上記記載中、「反応性」とは被測定物質と反応性を有することを意味する。
【００６０】
ラマン散乱デバイス２０は、試料接触面２０ｓに被測定物質とイオン結合する表面修飾及び共有結合する表面修飾が施されたものであることが、特に好ましい。  
この場合、試料接触面２０ｓに対して、被測定物質とイオン結合する表面修飾と、被測定物質と共有結合する表面修飾とを同時に施してもよいし、これらの表面修飾を順次実施しても構わない。また、これらの表面修飾の表面修飾位置は特に制限されず、これらの表面修飾同士が互いに結合していてもよいし、これらの表面修飾は互いに独立して試料接触面２０ｓに結合していてもよい。
【００６１】
試料接触面２０ｓに対して、被測定物質とイオン結合する表面修飾を施し、さらにこの表面修飾を、被測定物質と共有結合する表面修飾で活性化することが特に好ましい。この場合、被測定物質とイオン結合する表面修飾と、被測定物質と共有結合する表面修飾とが互いに近接しており、１つ1つの被測定物質がイオン結合及び共有結合によって試料接触面２０ｓに対して強固に吸着されることとなり、好ましい。
【００６２】
例えば、はじめに試料接触面２０ｓに被測定物質とイオン結合するカルボキシ基を導入し、さらに導入したカルボキシ基を反応性エステル基、ヒドラジド基、チオール基、及び反応性ジスルフィド基等の被測定物質と共有結合する官能基の形態に誘導して、活性化することが好ましい。
【００６３】
被測定物質とイオン結合する表面修飾基と、被測定物質と共有結合する表面修飾基とを両方備えた表面修飾物質としては、
４，４−ジチオジブチル酸（ＤＤＡ）、１０−カルボキシ−１−デカンチオール、１１−アミノ−１−ウンデカンチオール、７−カルボキシ−１−へプタンチオール、１６−メルカプトヘキサデカン酸、１１，１１’−チオジウンデカン酸等の自己組織化膜を形成する分子；
アガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、デンプン、及びセルロース等のヒドロゲル、又はこれらの誘導体（例えばカルボキシメチル誘導体）；
ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、及びポリエチレングリコール等の水膨潤性有機ポリマー等が挙げられる。
【００６４】
例えば被測定物質がアデニンの場合、被測定物質とイオン結合する表面修飾基と、被測定物質と共有結合する表面修飾基とを両方備えた表面修飾物質としては、４，４−ジチオジブチル酸（ＤＤＡ）、及びカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）等が好ましく用いられる。
【００６５】
ラマン散乱デバイス２０として、上記のような試料接触面２０ｓに被測定物質とイオン結合する表面修飾又は共有結合する表面修飾が施されたものを用いる場合は、試料接触面２０ｓに被測定物質が化学結合によって吸着されているので、表面修飾と被測定物質とを共有結合又はイオン結合させた後、電圧印加を止めてからラマン散乱光の検出を実施しても高感度な測定を安定して実施することができる。
【００６６】
上記のように電圧印加を止めることができれば、ラマン散乱光の検出を実施する前に、ノイズとなる試料液を除去してからラマン散乱光の検出を実施することも可能である。ラマン散乱光の検出の際、試料液中で測定を実施する場合は、試料液中の測定対象ではない物質や溶媒のラマン散乱ピークが、被測定物質のラマン散乱ピークと重なって検出されることがあり、この場合、これら被測定物質以外のラマン散乱光はノイズとなるため、Ｓ／Ｎ比が低下してしまう。従って、表面修飾と被測定物質とを共有結合又はイオン結合させた後に、試料液が除去された状態でラマン散乱光の検出が実施される方が、高感度な検出をより安定して実施することが可能となり、好ましい。
【００６７】
試料液の除去は、試料接触面２０ｓに被測定物質を結合させた後、電圧印加を止める前に実施してもよいし、止めた後に実施してもよい。
【００６８】
試料液の除去後のラマン散乱光の検出方法は、被測定物質と表面修飾との結合が切れない方法であれば特に制限されない。例えば、試料液を除去後、そのまま試料セル１０に液体のない状態でラマン散乱光の検出を実施してもよいし、溶液を除去した後、試料セル１０及び試料接触面２０ｓを１回以上洗浄してからラマン散乱光の検出を実施してもよい。
【００６９】
洗浄の方法としては、超音波洗浄やラマン非活性かつ被測定物質に対して反応性を有さない溶媒を用いて洗浄する方法等が挙げられる。超音波洗浄を行う際は、被測定物質と表面修飾間の結合が切れない条件となるように注意する必要がある。ラマン非活性かつ被測定物質に対して反応性を有さない溶媒としては純水等が挙げられる。ここで、「ラマン非活性」とは、ラマン散乱ピークが、被測定物質のラマン散乱ピークと重ならないことを意味する。
【００７０】
洗浄後のラマン散乱光の検出は、試料セル１０に液体のない状態で実施してもよいし、試料セル１０をラマン非活性かつ被測定物質に対して反応性を有さない溶媒を注入してから実施してもよい。
【００７１】
本実施形態のラマン分光装置１は、以上のように構成されている。  
本実施形態のラマン分光装置１は、試料セル１０内の試料に対して電圧を印加して、試料中の被測定物質をラマン散乱デバイス２０の試料接触面２０ｓ側に電気泳動させる電圧印加手段５０を備えた構成を有している。
【００７２】
本実施形態のラマン分光装置１によれば、電気泳動性を有する、若しくは電気泳動性を有するようあらかじめ調整された被測定物質を含む流動性を有する試料Ｓを用い、電気泳動によって試料Ｓ中の被測定物質をラマン散乱デバイス２０の試料接触面２０ｓ側に引き寄せることができる。
【００７３】
本実施形態のラマン分光装置１では、試料セル１０の形状に関係なく、被測定物質のラマン散乱デバイス２０の表面又はその近傍への引き寄せ効果が得られる。本実施形態のラマン分光装置１では、ラマン散乱デバイス２０の表面又はその近傍に充分な量の被測定物質が存在した状態で、確実に分析を行うことができ、ＳＥＲＳ効果も効果的に得られるので、高感度な分析を安定して実施することができる。
【００７４】
本実施形態のラマン分光装置１ではまた、必要に応じて、印加電圧を調整することで、ラマン散乱デバイス２０の表面又はその近傍に引き寄せられる被測定物質の量等も調整することができる。
【００７５】
ラマン散乱デバイス２０が試料接触面２０ｓに被測定物質と結合する表面修飾を有している場合には、上記引き寄せ効果によって、ラマン散乱デバイス２０と被測定物質との結合を促進することができ、ラマン散乱デバイス２０表面への被測定物質の吸着量を増加させることができる。この場合も、高感度な分析を安定して実施することができる。
【００７６】
「背景技術」の項に挙げた特許文献１に記載の装置では、ラマン散乱デバイスを電気泳動用のキャピラリー内に挿入可能なファイバ状に加工する必要があるが、本実施形態の装置１では、ラマン散乱デバイスを特殊形状に加工する必要がない。  
また、特許文献１，２では、通常のキャピラリー電気泳動法によって試料分離を行うため、緩衝液を充填した２つの容器を用意し、これらの容器にそれぞれキャピラリーの一端と他端を浸漬させ、キャピラリー内に緩衝液を充填した後、キャピラリーの一端に試料を注入し、緩衝液を充填した２つの容器間に電圧を印加して、電気泳動を行う必要がある。本実施形態のラマン分光装置１では、緩衝液及びそれを充填する容器を必要とせず、試料セル１０内に試料Ｓを充填又は流下させて、試料Ｓに電圧を印加するだけでよい。  
したがって、本実施形態のラマン分光装置１は装置構成が簡易で、分析を容易かつ迅速に実施できる装置である。
【００７７】
（第１実施形態の設計変更例）
第１実施形態では、試料セルが箱状セルである場合について説明したが、図５に示すように、試料セル１０は一端がラマン散乱デバイス２０の試料接触面２０ｓに接し、他端が対向電極５１に接したキャピラリー状セルであってもよい。  
かかる構成においても、第１実施形態と同様に測定を実施することができ、同様の効果が得られる。かかる構成では、試料の量が微量で済み、試料のジュール熱による対流の影響を無視でき、好ましい。
【００７８】
「第２実施形態」
図面を参照して、本発明に係る第２実施形態のラマン分光装置の構成、及びこれを用いたラマン分光方法について、説明する。図６は装置の全体図である。本実施形態の装置は顕微ラマン分光装置であり、第１実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
【００７９】
本実施形態のラマン分光装置２は、第１実施形態と同様、試料セル１０と、試料セル１０内の試料Ｓに接触するように配置され、試料接触面２０ｓに測定光Ｌ１が照射されてラマン散乱光を生じる板状のラマン散乱デバイス２０と、ラマン散乱デバイス２０の試料接触面２０ｓに測定光Ｌ１を照射する測定光照射光学系３０と、ラマン散乱光を検出する検出手段４０とを備えたものである。
【００８０】
本実施形態では、試料Ｓの顕微観察を行うために、試料セル１０上に対物レンズ７１が配置されている。対物レンズ７１は、試料セル１０に対して図示ｘ−ｙ方向に２次元的に相対移動可能とされている。対物レンズ７１は、試料セル１０に対して図示ｚ方向にも相対移動可能とされている。
【００８１】
本実施形態において、測定光照射光学系３０は、レーザ等の光源３１、及び光分離素子３２により構成されている。光分離素子３２は、光源３１から出射された測定光Ｌ１を対物レンズ７１及び試料セル１０側に導き、ラマン散乱デバイス２０の試料接触面２０ｓで生じる反射光と散乱光とを含む検出光Ｌ２を検出手段４０に導く光学素子である。測定光照射光学系３０は必要に応じて、測定光Ｌ１の光路に、他のミラー，レンズ等の導光系（図示略）を備えていてもよい。
【００８２】
検出手段４０は、第１実施形態と同様、測定光Ｌ１の照射によってラマン散乱デバイス２０の試料接触面２０ｓで生じる検出光Ｌ２が入射し、検出光Ｌ２を分光してラマン散乱光を検出し、ラマンスペクトルを得る分光検出器である。本実施形態には、試料Ｓの顕微画像モニタも備えられている（図示略）。
【００８３】
試料セル１０は、第１実施形態と同様の箱状セルであり、試料セル１０の底板１１に第１実施形態と同様のラマン散乱デバイス２０が嵌め込まれている。
【００８４】
本実施形態においても、試料セル１０には、試料Ｓに対して電圧を印加して、試料Ｓ中の被測定物質をラマン散乱デバイス２０の試料接触面２０ｓ側に電気泳動させる電圧印加手段５０が備えられている。ただし、本実施形態では、対向電極５１は、対物レンズ７１とラマン散乱デバイス２０との間の光路を空けるように、試料セル１０中にラマン散乱デバイス２０に対して、斜めに対向配置されている。
【００８５】
本実施形態のラマン分光装置２は、以上のように構成されている。試料Ｓの顕微観察を実施しながら、ラマン分光分析の測定を実施できることを除けば、測定は第１実施形態と同様である。本発明は顕微ラマン分光装置２にも適用することができ、第１実施形態と同様の効果が得られる。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の技術は、物質に単波長光を照射して得られる散乱光を分光してラマンスペクトルを得、物質の同定等を行うラマン分光装置に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明に係る第１実施形態のラマン分光装置の全体図
【図２】（ａ）〜（ｃ）はラマン散乱デバイスの好適な例を示す図
【図３】（ａ）〜（ｃ）はラマン散乱デバイスの好適な例を示す図
【図４】（ａ）〜（ｃ）は図２（ｃ）に示すラマン散乱デバイスの製造プロセス図
【図５】図１のラマン分光装置の設計変更例
【図６】本発明に係る第２実施形態のラマン分光装置（顕微ラマン分光装置）の全体図
【符号の説明】
【００８８】
１、２  ラマン分光装置
１０  試料セル
２０、２０Ａ〜２０Ｃ  ラマン散乱デバイス
２０ｓ  試料接触面
２１  電極
２２  誘電体
２３  金属体
２０Ｄ〜２０Ｆ  自身が電極として機能するラマン散乱デバイス
３０  測定光照射光学系
４０  検出手段
５０  電圧印加手段
５１  対向電極
Ｓ  試料
Ｌ１  測定光
Ｌ２  検出光
【図１】
2008164584.tif 000003
【図２】
2008164584.tif 000004
【図３】
2008164584.tif 000005
【図４】
2008164584.tif 000006
【図５】
2008164584.tif 000007
【図６】
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