(57)【要約】【課題】生化学的性質もよく解析されているMardin-Darby Canine Kidney Cell（イヌの腎臓の細胞）から、長い継代培養においても、核酸トランスポート活性が野生型と比較して有意に低下している細胞株を提供すること。【解決手段】野生型と比較して内因性核酸トランスポート活性が有意に低下したイヌ腎臓培養細胞株、例えば、内因性核酸トランスポート活性が野生型の約１５分の１であるような、イヌ腎臓培養細胞株、該細胞株に外来性核酸トランスポーターを形質転換して作製される、形質転換細胞、及び、該形質転換細胞を使用する、核酸トランスポーター機能解析方法。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型と比較して有意に低下した内因性核酸トランスポート活性を有するイヌ腎臓培養細胞株。
【請求項２】
内因性核酸トランスポート活性が野生型の１５分の１である、請求項１記載のイヌ腎臓培養細胞株。
【請求項３】
内因性核酸トランスポート活性が50 〜60 pmol/min/mg proteinである、請求項１又は２記載のイヌ腎臓培養細胞株。
【請求項４】
内因性核酸トランスポート活性がウリジンの取り込みで測定した活性である、請求項１ないし３のいずれか一項に記載のイヌ腎臓培養細胞株。
【請求項５】
内因性核酸トランスポート活性が少なくとも３０回の継代培養において変化しない、請求項１ないし４のいずれか一項に記載のイヌ腎臓培養細胞株。
【請求項６】
核酸系抗癌剤を用いる選択により作製される、請求項１ないし５のいずれか一項に記載のイヌ腎臓培養細胞株。
【請求項７】
MDCK-NTD22細胞（FERM P-21035）である、請求項１ないし６のいずれか一項に記載のイヌ腎臓培養細胞株。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか一項に記載の細胞株に外来性核酸トランスポーターを形質転換して作製される、形質転換細胞。
【請求項９】
形質転換が一過性又は安定発現系である、請求項８記載の形質転換細胞。
【請求項１０】
外来性核酸トランスポーターがhENT1, hENT2, hCNT2及びhCNT3から成る群から選択される、請求項８又は９記載の形質転換細胞。
【請求項１１】
請求項８ないし１０のいずれか一項に記載の形質転換細胞を使用する、核酸トランスポーター機能解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型と比較して内因性核酸トランスポート活性が有意に低下したイヌ腎臓培養細胞株、該細胞株を用いて作製される形質転換細胞、及び、該形質転換細胞を使用する核酸トランスポーター機能解析方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸およびその誘導体である多くの抗癌剤、抗ウイルス薬はその親水性のため、細胞膜を通過するのに特異的な輸送担体を必要とし、この輸送担体は核酸トランスポーターと呼ばれる。哺乳動物の核酸トランスポーターは大きく2種類のファミリー、即ち、拡散型トランスポーター（equilibrative nucleoside transporter:ENT）及び濃縮型トランスポーター（concentrative nucleoside transporter:CNT）に分類される。
【０００３】
ENTs は１１回細胞膜貫通型タンパク質で種々の組織に広く分布しており，基質特異性に乏しい。これまでに、nM 濃度のNBMPR で抑制されるENT1とNBMPR 非感受性のENT2を含む、数種類の分子種が知られている。一方、CNTs ファミリーは限られた組織に発現する１３回細胞膜貫通型でNa勾配を利用したシンポートシステムを構築している。哺乳動物の主なCNT の３分子種はNBMPR 非感受性である。CNT1はピリミジンヌクレオシドを選択的に輸送し、CNT2はプリンヌクレオシド選択性で、CNT3は基質選択性は低い。加えて、２種類のNBMPR 感受性CNTs：cs(concentrative sensitive)及びcsg(concentrative, sensitive, and guanosinepreferring)NT が白血球細胞で報告されているがその分子実態は不明である。目下のところNTs が病因となる疾患はわかっていない。
【０００４】
これまでに様々な核酸系抗癌剤や抗ウイルス薬がこれら核酸トランスポーターの基質となることが報告されている。このような核酸トランスポーターの基質特異性や機能を評価する時に汎用される方法として、核酸トランスポーター遺伝子をクローニングし、それを哺乳動物細胞内に発現させ、目的基質の取り込み実験をおこなうという手法がある。この実験系は簡易で非常に有用な系であり他の多くのトランスポーターの実験でも用いられるのであるが、核酸トランスポーターの機能を評価する際に使用する培養細胞の殆ど全てに内因性ENTが発現しており高いバックグランドが存在するという問題があり、導入したENTの活性評価はできないか、若しくは非常に難しい。一方で、CNTの活性評価時には常にENTの阻害剤を入れなければならない。
【０００５】
従って、これまでに海外ではleukemia cells, lymphoma cellsやPK15 (pig kidney cell line)から変異原性物質の曝露および核酸系抗癌剤による選択により核酸トランスポーター活性欠失細胞が確立されてきた（非特許文献１）。これらのうちでPK15核酸トランスポーター活性欠失細胞（PK15NTD）のみが接着性細胞であり、実験系に最も適していることからPK15NTDを用いた核酸トランスポーターの機能評価の報告が最も多く見られる（非特許文献２）。
【非特許文献１】Josep M. and Peter G.W. Plagemann, Biochimica et Biophysica, Acta, 1110(1992)51-58
【非特許文献２】Jeffrey L. et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol.275, No.12, pp.8375-8381, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ブタ腎臓由来のPK15細胞は、ヒトへの感染性は明らかではないもののC-type virusを産生する細胞であることが知られており、少なくとも日本への輸入時には審査が必要となる等、実際の使用に際して様々な問題点がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決すべく、生化学的性質もよく解析されているMardin-Darby Canine Kidney Cell（イヌの腎臓の細胞）から、核酸系抗癌剤による選択のみにより核酸トランスポート活性を欠失した細胞(MDCK-NTD22)を単離することに成功し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、野生型と比較して内因性核酸トランスポート活性が有意に低下したイヌ腎臓培養細胞株、該細胞株に外来性核酸トランスポーターを形質転換して作製される、形質転換細胞、及び、該形質転換細胞を使用する、核酸トランスポーター機能解析方法に係る。
【発明の効果】
【０００９】
MDCK-NTD22細胞に代表される本発明のイヌ腎臓培養細胞株の核酸トランスポート活性は、野生型と比較して有意に低下しており、更に、その性質は選択に使用した抗癌剤非存在下における少なくとも３０回の継代によって変化することがない安定したものであった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のイヌ腎臓培養細胞株において、「野生型と比較して有意に低下した内因性核酸トランスポート活性」とは、具体的には、例えば、野生型の１５分の１程度以下であり、本明細書の実施例に記載したウリジンの取り込み活性を測定するトランスポートアッセイにおいて、55〜60 pmol/min/mg protein、例えば、57.3 pmol/min/mg protein程度の非常に低い値を有する活性を意味する。
【００１１】
その結果、該細胞に各種の外来性核酸トランスポーターを導入して得られる形質転換細胞を用いて核酸トランスポーター機能解析を行う際に、本発明の細胞株に起因する内因性核酸トランスポート活性によるバックグランドを低く抑えることが出来る。
【００１２】
本発明細胞株の内因性核酸トランスポート活性は、非常に安定しており、該細胞株を作製する際の選択に使用した核酸系抗癌剤の非存在下での少なくとも３０回の継代培養においても実質的に変化しないことを特徴とする。
【００１３】
本明細書の実施例に記載されているように、本発明の細胞株は、野生型のイヌ腎臓培養細胞株を使用し、核酸系抗癌剤を用いる選択により作製することが出来る。その一例であるMDCK-NTD22は、2006年9月22日付けで、〒305-8566茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号FERM P-21035が付与されている。
【００１４】
当業者に公知の任意の方法を用いて、本発明細胞株に各種の任意の外来性核酸トランスポーターを一過性又は安定発現系で形質転換して形質転換細胞を作製することが出来る。外来性核酸トランスポーターの例として、例えば、ヒト組織由来のhENT1, hENT2, hCNT2及びhCNT3を挙げることが出来る。
【００１５】
こうして作製される形質転換細胞は、内因性核酸トランスポート活性によるバックグランドを低く、形質導入された外来性核酸トランスポーター活性を高感度で検出することが出来るので、核酸トランスポーター機能解析に有利に使用することが出来る。
【００１６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない場合には、以下の実施例は、当業者に公知の標準的な遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い、実施することが出来る。又、本明細書中に引用された文献の記載内容は、本明細書の開示及び内容の一部を構成するものである。
【実施例１】
【００１７】
［本発明細胞株の作製］
細胞培養
Mardin-Darby Canine Kidney (MDCK)細胞はAmerican Type Culture Collectionより購入した。MDCK細胞の培養にはMinimum Essential Medium (Invitrogen)に10% fetal bovine serum、1 mM Na-pyruvate、50 U/mLペニシリン、50 mg/mLストレプトマイシンを加えた培地を用い、37℃、5% CO2の気相中で培養した。
【００１８】
核酸トランスポート活性欠失MDCKの単離
MDCK細胞をcytosine arabinoside (Ara-C, Sigma) (1 μM)及びtubercidin (1 μM, Sigma)の存在下で４週間培養した。次にこの細胞を600 cells/mLの濃度でコラーゲンコートディッシュに播種し、Ara-Cおよびtubercidinを2μMに増量して２週間培養をおこなった。得られたコロニー14個を単離し、後述の方法でトランスポート活性を測定した。それらのうち最もトランスポート活性の低い細胞をMDCK-nucleoside transport deficient (MDCK-NTD22)とした。こうして単離した本発明のMDCK-NTD22細胞株と親細胞である野生型MDCK（MDCK-WT）細胞株の形態を撮影した顕微鏡写真を示す（図１）。
【実施例２】
【００１９】
［本発明細胞株の特性］
ウリジン取り込み活性の比較
以下の要領で、MDCK-NTD22細胞株とMDCK-WT細胞株によるウリジン（10μM）の取り込みによるトランスポート活性の比較を行った。その結果、MDCK-NTD22細胞株のトランスポート活性（ウリジンの取り込み活性）はMDCK-WT細胞株の約１５分の１程度しかないことが示された（図２）。具体的には、MDCK-NTD22細胞株のトランスポート活性は57.3 pmol/min/mg proteinであった。
【００２０】
長期培養による活性の変化
実施例１において本発明の細胞株の選択に際して使用した核酸系抗癌剤であるAra-C及びtubercidine（2μM）の存在下又は非存在下で、長期培養したときのウリジン（10μM）の取り込み活性（1分間incubation）の変化を検討した。その結果、本発明のMDCK-NTD22細胞株は、核酸系抗癌剤の存在下又は非存在下のいずれの培養条件においても、少なくとも３０回の継代（P30）後も極めて低いトランスポート活性が維持されることが示された（図３）。尚、培養は上記の「細胞培養」に記載した条件に準じて実施した。
【実施例３】
【００２１】
［本発明細胞株を用いた核酸トランスポーター機能解析用形質転換細胞の作製及び機能解析］
ヒト核酸トランスポーターのcDNAクローニングと哺乳動物細胞発現ベクターの作製
ヒトequilibrative nucleoside transporter (hENT)1, ヒトconcentrative nucleoside transporter (hCNT)2及び hCNT3のcDNAはヒト小腸cDNAより、hENT2 cDNAはヒト骨格筋cDNAよりクローニングした。これらcDNAはヒト小腸total RNAおよびヒト骨格筋total RNA(東洋紡)をReady-To-Go RT-PCR Beadsとrandom hexmer (GE healthcare)を用いて作製した。得られたcDNAクローンはpCR-Blunt II-TOPO vector (Invitrogen)に挿入し、Dye Terminator Cycle Sequencing-Quick Start KitおよびCEQ2000 DNA Analysis System (Beckman Coulter)によりDNA塩基配列の確認をおこなった。
【００２２】
これら4種の核酸トランスポーターcDNAをpcDNA3.1/Zeo (-)vector (Invitrogen)にサブクローニングし、得られたベクターをhENT1/pcDNA, hENT2/pcDNA, hCNT2/pcDNA, 及びhCNT3/pcDNAとした。また同時にhENT1 cDNAのC末端にPCR法によりFLAGタグを導入したベクターも作製し、hENT1-F/pcDNAとした。またhENT1 cDNAをpAcGFP-C1 vector (Clontech)にサブクローニングし、得られたvectorをhENT1-GFP/pGFPとした。これら全てのinsertのDNA塩基配列は上記の方法で確認した。
【００２３】
一過性発現系の作製
一過性発現ではMDCK-NTD22細胞を24well plateに2-3×105 cells/mLの濃度で播種し、pcDNA3.1/Zeo (-), hENT1/pcDNA, hENT2/pcDNA, hCNT2/pcDNA, 及びhCNT3/pcDNAをそれぞれ0.7 μg, Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いてトランスフェクションをおこなった。
【００２４】
安定発現系の作製
安定発現系の作製はMDCK-NTD22細胞を100-mmディッシュに3×105 cells/mLの濃度で播種し、pcDNA3.1/Zeo (-)又はhENT1-F/pcDNA 15 μg、Lipofectamine 2000を用いてトランスフェクションをおこなった。トランスフェクションから48時間後、培地に500μg/mLの濃度でZeocin (Invitrogen)を加えセレクションを開始した。二週間後細胞を希釈し、複数のコロニーを単離した。得られたこれらの細胞のトランスポート活性を測定し、最も活性の高いコロニー由来の細胞をhENT1-F/MDCK-NTD22とした。またpcDNA3.1/Zeo (-)をトランスフェクションして得られた細胞をMock/MDCK-NTD22とした。
【００２５】
hENT1-GFP/pGFPのトランスフェクションについては、上記と同様におこなった。トランスフェクションから48時間後、培地に400 μg/mLの濃度でG418 (Calbiochem)を加えセレクションを開始した。その後上記と同様にコロニーを作製し、OLYMPUS FLUOVIEW ver 2.3（オリンパス）を用いて蛍光を検出し、最も蛍光強度の高いコロニー由来の細胞をhENT1-GFP/MDCK-NTD22とした。
【００２６】
トランスポートアッセイ
一過性発現系を用いたトランスポートアッセイでは、上記の方法によるトランスフェクションの24時間後に、細胞をtransport medium (KCl 5.4 mM, CaCl2 1.8 mM, MgSO4 1.2 mM, HEPES 10 mM, NaCl 137 mM)で洗浄し、[3H]基質 （10μM）([3H]Uridine):Moravek Biochemicals, Inc.)を含んだtransport mediumを加えることにより反応を開始した。この細胞を37℃のCO2 インキュベーター内でincubationした後、氷冷したtransport mediumを加えて反応を停止した。さらに氷冷したtransport mediumで3回洗浄した後、0.2% SDSを加え、振盪器を用いて5時間以上振盪することにより細胞を可溶化した。放射活性はLSC6100液体シンチレーションカウンター (Aloka)にて測定し、タンパク質定量はBio-Rad Dc protein assay kit (Bio-Rad)を用いておこなった。
【００２７】
得られた結果を図４に示す。尚、図４に示したウリジン取り込み量の値は、核酸トランスポーターcDNAを導入された形質転換細胞における測定値から非導入細胞（Mock/MDCK-NTD22）における測定値（34.2 pmol/min/mg protein）を差し引いたものである。これらの結果から、本発明のMDCK-NTD22株を宿主細胞として用いて、該細胞株に外来性核酸トランスポーターで形質転換して得られた形質転換細胞は核酸取り込み活性を獲得できたことが示された。更に、こうして得られた形質転換細胞は核酸トランスポーター機能解析に使用できることが確認された。
【００２８】
一方、安定発現系を用いたトランスポートアッセイ（Uridine及びRibavirin取り込み（速度論的解析）では、上記のトランスフェクションで得られたMock/MDCK-NTD22及びhENT1-F/MDCK NTD22を24-well plate に2-3×105 cells/mLの濃度で播種し、[3H]基質 ([3H]Uridine（３分間incubation）及び[3H]Ribavirin（７分間incubation）:Moravek Biochemicals, Inc.)を用いる上記の方法でトランスポートアッセイ及びタンパク質定量をおこなった。その結果を図５に示す。
【００２９】
形質転換細胞内におけるhENT1の局在解析
hENT1-GFP/MDCK-NTD22をFalcon Cell Culture inserts（Falcon）に2×105 cells/mLの濃度で播種し、insert well上で14日間培養した。その後、wellの膜を採取しスライドガラス上に固定し、OLYMPUS FLUOVIEW ver 2.3にて蛍光を解析した（図６）。その結果、トランスポーター（hENT1-GFP）が基底外側(basolateral)に局在していることが観察された。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
MDCK細胞はトランスポーターの機能解析で最も多く使用される細胞であり、極性を有し、更に、その生化学的性質もよく解析されているので、本発明の細胞株は核酸トランスポーターの機能評価におけるホスト細胞としてこれまでにないメリットを持った有用な細胞であり、且つ、入手に際しても様々な問題点もなく、非常に使用しやすい細胞である。
【００３１】
本発明の細胞株は、従来の野生型MDCK細胞と比べて内因性核酸トランスポーター活性が有意に低下している。従って、本発明の細胞株の系を使用すれば、遺伝子導入した各種の外来性核酸トランスポーター活性を評価する際のバックグランドが極めて低く、従来のような阻害剤を使用しなくても、導入した該トランスポーターに関して高感度の活性評価を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】MDCK-NTD22細胞株とMDCK-WT細胞株の顕微鏡写真（倍率：100倍）を示す。
【図２】MDCK-NTD22細胞株（●）とMDCK-WT細胞株（○）によるウリジンの取り込み活性の比較の結果を示すグラフである。各値は少なくとも３回の独立アッセイにおいて得られた値の平均値であり、その標準偏差と併せて示されている。
【図３】MDCK-NTD22細胞株とMDCK-WT細胞株を長期培養したときのウリジン取り込み活性の変化を示すグラフである。各値は少なくとも３回の独立アッセイにおいて得られた値の平均値であり、その標準偏差と併せて示されている。
【図４】一過性発現系により得られた形質転換細胞を用いたトランスポートアッセイの結果を示すグラフである。
【図５】安定発現系により得られた形質転換細胞を用いたトランスポートアッセイの結果を示すグラフである。各値は３回の独立アッセイにおいてhENT1-F/MDCK-NTD22で得られた値からMock/MDCK-NTD22の値を差し引いた値の平均値であり、その標準偏差と併せて示されている。
【図６】形質転換細胞内におけるhENT1の局在解析の結果を示す写真（倍率：400倍）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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