(57)【要約】【課題】ヘパリンの存在及びヘマトクリットに非感受性のアッセイの提供。【解決手段】エカリンを含むアッセイ試薬を用いるフィブリノーゲンアッセイを行う方法。フィブリノーゲンアッセイを行う装置は、カバー（１０）、オーバーレイ（２０）及びベース（３０）を含む。カバー（１０）は光透過性のガラス又はポリマーの薄いシートであって、サンプル受容開口部（１４）及び細長い開口部（１２）を有する。オーバーレイ（２０）は、ガラス又はポリマーの薄いシートであって、サンプルウェル（２２）、反応チャンバ（２４）、及び反応チャンバ（２４）とサンプルウェル（２２）とを連絡する通路（２６）を有する。【選択図】図１
2008224687.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノーゲンアッセイを行う方法であって、
（ｉ）（１）液体サンプルを受容するためのサンプルウェルと、（２）複数の磁性粒子が均一に分散して埋め込まれているエカリンを含む乾燥試薬マトリックスを含む反応チャンバとを有する反応スライドを振動磁場に付し、
ここで前記サンプルウェルと反応チャンバとは、前記サンプルウェル内に置かれ前記反応チャンバの容量に対応する液体分析物サンプルの分量が前記サンプルウェルから前記反応チャンバへと移送されるような幾何形状を有する移送ゾーンを介して液体連通しており、
（ｉｉ）フィブリノーゲンアッセイを遂行するための適切な条件下で、全血又は血液由来サンプルを前記サンプルウェルに添加し、これによって前記サンプルを前記反応チャンバに導入し、前記試薬を可溶化させ、且つ、前記粒子を解放して、前記振動磁場に対する相対粒子運動の程度の変化に対応して前記振動磁場によって誘起される振動パターンを描くように運動させ、
ここで前記振動パターンは開始時間と停止時間を有し、
（ｉｉｉ）前記反応チャンバを光学的にモニターして、次の（ｉｉｉａ）、（ｉｉｉｂ）、（ｉｉｉｃ）のうちの一以上のパラメータを測定し、
（ｉｉｉａ）前記フィブリノーゲンアッセイのための前記開始時間と前記停止時間、
（ｉｉｉｂ）前記粒子振動の最大振幅Ａと前記粒子振動の後続残留ポストピーク最小振幅Ｂ、
（ｉｉｉｃ）ＡとＢの間の領域における、前記粒子振動曲線の傾き又は前記曲線によって規定される面積、
そして
（ｉｖ）前記開始時間と前記停止時間、又は少なくともＢ、又は前記傾き、又は前記面積を用いて前記パラメータ（ｉｉｉａ）〜（ｉｉｉｃ）の少なくとも一つを、標準サンプル中の凝固性フィブリノーゲン濃度と関連付けて、前記全血又は血液由来サンプル中の凝固性フィブリノーゲン濃度を測定する
ことを含む方法。
【請求項２】
前記乾燥試薬は、バッファーと結合剤からなる群から選択される少なくとも一種の剤を更に含有するものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フィブリノーゲンアッセイを行う方法であって、
（ｉ）（１）液体サンプルを受容するためのサンプルウェルと、（２）反応チャンバと、（３）前記サンプルウェルと前記反応チャンバとの間に置かれこれらと液体連通している通路手段とを有する前記反応スライドを振動磁場に付し、
ここで前記反応チャンバは、エカリンを包含する乾燥試薬マトリックスを含み、当該エカリン中には複数の磁性粒子が均一に分散して埋め込まれており、且つ前記乾燥試薬マトリックスは前記反応チャンバにのみ存在し、
（ｉｉ）フィブリノーゲンアッセイを遂行するための適切な条件下で、ある量の全血又は血液由来サンプルを前記サンプルウェルに添加し、
ここで、前記サンプルの前記量は、当該サンプルが前記反応チャンバに入ったり前記乾燥試薬マトリックスと接触したりすることなく前記通路手段を実質的に満たすのに十分なものであり、
（ｉｉｉ）ある量のバッファー希釈液とプロトロンビンを前記サンプルウェルに添加し、
ここで前記バッファーの前記量は、前記サンプルを前記反応チャンバへと流し込むのに十分な量であって、これによって前記試薬を可溶化させ、そして、粒子を解放して、前記振動磁場に対する相対粒子運動の程度の変化に対応して前記振動磁場によって誘起される振動パターンを描くように運動させ、
ここで前記振動パターンは開始時間と停止時間を有し、
（ｉｖ）前記磁気粒子の振動を光学的にモニターしてフィブリノーゲンアッセイのために前記開始時間と前記停止時間とを測定し、
そして
（ｖ）前記開始時間と前記停止時間を用いて、前記開始時間と前記停止時間を、標準サンプル中の凝固性フィブリノーゲン濃度と関連付けて、前記全血又は血液由来サンプル中の凝固性フィブリノーゲン濃度を測定する
ことを含む方法。
【請求項４】
フィブリノーゲンアッセイを行う方法であって、
（ｉ）（１）液体サンプルを受容するためのサンプルウェルと、（２）複数の磁性粒子が均一に分散して埋め込まれているエカリンを含む乾燥試薬マトリックスを含む反応チャンバとを有する反応スライドを振動磁場に付し、
ここで前記サンプルウェルと反応チャンバとは、前記サンプルウェル内に置かれ且つ前記反応チャンバの容量に対応する液体分析物サンプルの分量が前記サンプルウェルから前記反応チャンバへと移送されるような幾何形状を有する移送ゾーンを介して液体連通しており、
（ｉｉ）フィブリノーゲンアッセイを遂行するための適切な条件下で、全血又は血液由来サンプルを前記サンプルウェルに添加し、これによって前記サンプルを前記反応チャンバに導入し、前記試薬を可溶化させ、そして前記粒子を解放して、前記振動磁場に対する相対粒子運動の程度の変化に対応して前記振動磁場によって誘起される振動パターンを描くように運動させ、
ここで前記振動パターンは開始時間と停止時間を有し、
（ｉｉｉ）前記反応チャンバを光学的にモニターして、前記粒子振動の最大振幅Ａと前記粒子振動の後続残留ポストピーク最小振幅Ｂとを測定し、
そして
（ｉｖ）少なくともＢを用いて、少なくともＢを、標準サンプル中の凝固性フィブリノーゲン濃度と関連付けて、前記全血又は血液由来サンプル中の凝固性フィブリノーゲン濃度を測定する
ことを含む方法。
【請求項５】
Ｂのみを用いて前記サンプル中の前記フィブリノーゲン濃度を測定する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
比Ａ／Ｂ又はＢ／Ａを用いて前記サンプル中の前記フィブリノーゲン濃度を測定する請求項４に記載の方法。
【請求項７】
Ａ−Ｂを用いて前記サンプル中の前記フィブリノーゲン濃度を測定する請求項４に記載の方法。
【請求項８】
（Ａ−Ｂ）／Ａ、又はＡ／（Ａ−Ｂ）を用いて前記サンプル中の前記フィブリノーゲン濃度を測定する請求項４に記載の方法。
【請求項９】
Ａ／Ｂ及び（Ａ−Ｂ）／Ａを用いて前記サンプル中の前記フィブリノーゲン濃度を測定する請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
ＡとＢの間の領域における振動曲線の傾きを用いて前記サンプル中のフィブリノーゲン濃度を決定する請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
ＡとＢの間の領域によって規定される振動曲線の上方若しくは下方の面積、又はその一部を用いて前記サンプル中のフィブリノーゲン濃度を決定する請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記乾燥試薬は、バッファーと結合剤からなる群から選択される少なくとも一種を更に含有するものである請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
フィブリノーゲンアッセイを行う方法であって、
（ｉ）（１）液体サンプルを受容するためのサンプルウェルと、（２）反応チャンバと、（３）前記サンプルウェルと前記反応チャンバとの間に置かれ且つこれらと液体連通している通路手段とを有する反応スライドを振動磁場に付し、
ここで前記通路手段は、エカリンを包含する乾燥試薬マトリックスを有し、当該エカリン中には複数の磁性粒子が均一に分散して埋め込まれており、且つ前記乾燥試薬は前記通路にのみ存在し、
（ｉｉ）フィブリノーゲンアッセイを遂行するための適切な条件下で、全血又は血液由来サンプルを前記サンプルウェルに添加し、
ここで、前記サンプルの量は、当該サンプルが前記通路手段と前記反応チャンバとを実質的に満たし且つ前記試薬と混合されて前記試薬を前記反応チャンバへと流し込むのに十分な量であって、これによって前記磁性粒子を解放し、前記振動磁場に対する相対粒子運動の程度の変化に対応して前記粒子を前記振動磁場によって誘起される振動パターンを描くように運動させ、
ここで前記振動パターンは開始時間と停止時間を有し、
ここで前記振動パターンは動的粒子振動曲線において粒子振動のピーク最大振動まで上昇し、粒子振動のポストピーク最小振幅まで減少し、そして前記動的粒子振動曲線は前記振動曲線の下方に測定可能な傾きと面積とを有し、
（ｉｉｉ）前記反応チャンバを光学的にモニターして、次の（ｉｉｉａ）、（ｉｉｉｂ）、（ｉｉｉｃ）のうちの一以上のパラメータを測定し、
（ｉｉｉａ）前記フィブリノーゲンアッセイのための前記開始時間と前記停止時間、
（ｉｉｉｂ）前記粒子振動の最大振幅Ａと前記粒子振動の後続残留ポストピーク最小振幅Ｂ、
（ｉｉｉｃ）ＡとＢの間の領域における前記粒子振動曲線の傾き又は前記曲線によって規定される面積、
そして
（ｉｖ）前記開始時間と前記停止時間、又は少なくともＢ、又は前記傾き、又は前記面積を用いて前記パラメータ（ｉｉｉａ）〜（ｉｉｉｃ）の少なくとも一つのパラメータを、標準サンプル中の凝固性フィブリノーゲン濃度と関連付けて、前記全血又は血液由来サンプル中の凝固性フィブリノーゲン濃度を測定する
ことを含む方法。
【請求項１４】
ステップ（ｉｉ）の前に、ある量の蒸留水を、当該蒸留水が毛管作用によって前記通路へと取り込まれるのに十分な量で前記サンプルウェルに添加し、これによって、前記全血若しくは前記血液由来サンプルの添加前に、前記乾燥試薬を可溶化すると共に前記磁性粒子を解放する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
フィブリノーゲンアッセイを行う方法であって、
（ｉ）フィブリノーゲンアッセイを遂行するための適切な条件下で、全血又は血液由来サンプルを反応スライドのサンプルウェルに添加し、ここで前記反応スライドは（１）液体サンプルを受容するための前記サンプルウェルと、（２）反応チャンバと、（３）前記サンプルウェルと前記反応チャンバとの間に置かれ且つこれらと液体連通している通路手段とを有し、
ここで前記通路手段は、エカリンを包含する乾燥試薬マトリックスを有し、当該エカリン中には複数の磁性粒子が均一に分散して埋め込まれており、且つ前記乾燥試薬マトリックスは前記通路にのみ存在し、
ここにおいて前記サンプルウェルに添加される、前記全血又は前記血液由来サンプルの量は、前記通路手段と前記反応チャンバを実質的に満たし且つ前記試薬を前記反応チャンバに流し込んで前記磁性粒子を解放するのに十分なものであり、
（ｉｉ）前記反応スライドを、前記全血又は前記血液由来サンプルを前記サンプルウェルに添加する時あるいはその少し後で振動磁場に付し、
ここで前記振動磁場は、前記振動磁場に対する相対粒子運動の程度の変化に対応して、前記解放された磁性粒子に振動パターンを描かせ、
ここで前記振動パターンは開始時間と停止時間を有するものであり、
そして
（ｉｉｉ）  前記反応チャンバを光学的にモニターして、次の（ｉｉｉａ）、（ｉｉｉｂ）、（ｉｉｉｃ）；
（ｉｉｉａ）前記磁性粒子振動の少なくとも一つのポストピーク最小振幅Ｂ、  （ｉｉｉｂ）前記粒子振動曲線の傾き、
（ｉｉｉｃ）前記粒子振動の最大振幅ＡとＢの間の領域での曲線によって規定される面積、
のうちの一以上のパラメータを測定し、これらのパラメータ（ｉｉｉａ）〜（ｉｉｉｃ）の少なくとも一つを標準サンプル中の凝固性フィブリノーゲン濃度と関連付けて、前記全血又は血液由来サンプル中の凝固性フィブリノーゲン濃度を測定する
ことを含む方法。
【請求項１６】
定量フィブリノーゲンアッセイを行う方法であって、
（ｉ）乾燥試薬マトリックスをある量の希釈された血液サンプルと接触させ、ここで前記乾燥試薬マトリックスは、複数の磁性粒子が均一に分散して埋め込まれたエカリンを包含するものであると共に、反応チャンバに収容されて、中心点の周りに磁界の北極と南極をスピンさせることを含む方法によって生成される回転磁場に付され、また、前記ある量の希釈された血液サンプルは、前記反応チャンバを満たすのに十分な量であって、これによって前記磁性粒子を解放して回転磁場の影響の下で移動させ、
（ｉｉ）前記血液サンプルが凝固する間、前記磁性粒子の前記回転磁場に対する応答を光学的にモニターして、凝固時間をフィブリノーゲン濃度に関連させる応答曲線を生成し、
（ｉｉｉ）前記応答曲線から凝固時間終点を決定し、
そして
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）からの凝固時間終点を、凝固時間終点とフィブリノーゲン含量とを関連付ける、記憶された標準較正曲線と比較して、前記比較によってサンプル中の凝固性フィブリノーゲンの量を決定する、
ここで前記標準較正曲線は、フィブリノーゲン量が既知であるサンプルを用いて調製したものである
ことを含む方法。
【請求項１７】
前記希釈された血液サンプルは希釈された全血である請求項１６に記載のフィブリノーゲンアッセイを行う方法。
【請求項１８】
前記希釈された血液サンプルは希釈された血漿である請求項１６に記載のフィブリノーゲンアッセイを行う方法。
【請求項１９】
前記希釈された血液サンプルは抗凝固剤を更に含有する請求項１７に記載のフィブリノーゲンアッセイを行う方法。
【請求項２０】
フィブリノーゲンアッセイを行う装置であって、
（ｉ）液体サンプルを受容するためのサンプルウェルと反応チャンバとを有する反応スライドと、
ここで前記反応チャンバは、エカリンを包含する乾燥試薬マトリックスを含み、当該エカリン中には複数の磁性粒子が均一に分散して埋め込まれており、前記サンプルウェルと反応チャンバとは、前記サンプルウェル内に置かれ前記反応チャンバの容量に対応する液体分析物サンプルの分量が前記サンプルウェルから前記反応チャンバへと移送されるような幾何形状を有する移送ゾーンを介して液体連通しており、
（ｉｉ）回転磁場と振動磁場からなる群から選択される磁場と、
（ｉｉｉ）前記磁性粒子の前記磁場に対する応答を検出する光学的手段と、
を含む装置。
【請求項２１】
前記希釈された血液サンプルは希釈された全血である請求項２０に記載のフィブリノーゲンアッセイを行う装置。
【請求項２２】
前記希釈された全血は抗凝固剤を更に含有する請求項２１に記載のフィブリノーゲンアッセイを行う装置。
【請求項２３】
更に較正曲線記憶手段を含む請求項２１に記載のフィブリノーゲンアッセイを行う装置。
【請求項２４】
前記希釈された血液サンプルは希釈された血漿である請求項２０に記載のフィブリノーゲンアッセイを行う装置。
【請求項２５】
全血又は血液由来サンプルをフィブリノーゲンアッセイ試薬に接触させてフィブリンクロットを形成し、これを全血又は血液由来サンプル中のフィブリノーゲン含量に関連付ける、フィブリノーゲンアッセイにおいて、フィブリノーゲンアッセイ試薬が、凝固誘導活性剤としてエカリンを含有することを特徴とする改良されたフィブリノーゲンアッセイ。
【請求項２６】
前記フィブリノーゲンアッセイ試薬は乾燥化学試薬である請求項２５に記載のフィブリノーゲンアッセイ。
【請求項２７】
前記フィブリノーゲンアッセイ試薬は液体試薬である請求項２５に記載のフィブリノーゲンアッセイ。
【請求項２８】
フィブリノーゲンアッセイを行う反応スライドであって、液体サンプルを受容するためのサンプルウェルと反応チャンバとを有し、
ここで前記反応チャンバは、エカリンを包含する乾燥試薬マトリックスを含み、当該エカリン中には複数の磁性粒子が均一に分散して埋め込まれており、前記サンプルウェルと反応チャンバとは、前記サンプルウェル内に置かれそして前記反応チャンバの容量に対応する液体分析物サンプルの分量が前記サンプルウェルから前記反応チャンバへと移送されるような幾何形状を有する移送ゾーンを介して液体連通している、反応スライド。
【請求項２９】
前記乾燥試薬マトリックスは、バッファーと凍結乾燥安定剤とからなる群から選択される一員以上を更に含有する請求項２８に記載の反応スライド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エカリンを乾式仕様又は液式仕様で含有する試薬を用いてフィブリノーゲンアッセイを行う方法、及びその分析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、臨床アッセイとして用いられる凝固アッセイでは、フィブリンクロット（凝塊）の形成に要する時間を測定する。凝固アッセイは、主に抗凝固剤療法を受けた患者のスクリーニング、診断及びモニタリングに用いられる。
凝固アッセイの種類は数多くある。例えば、プロトロンビン時間（ＰＴ）、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、フィブリノーゲンアッセイ（即ち、サンプル中の凝固性フィブリノーゲンの濃度測定）、トロンビン凝固時間（ＴＣＴ）としても知られるトロンビン時間、活性化凝固時間（ＡＣＴ）等が挙げられる。これらアッセイの内、最もよく行われるのはプロトロンビン時間である。
【０００３】
プロトロンビン時間試験及び活性化部分トロンボプラスチン時間試験はそれぞれ、患者のクロット形成能を決定するために通常行われる臨床試験である。これら試験及び上記の他の試験は、患者の中で心臓病の患者に対して術前評価及び抗凝固剤療法を行うために病院、診療所及び研究室にて広く用いられている。これらの試験はそれぞれ時間測定に基づくが、多くの場合、フィブリノーゲンが重合しフィブリン凝固物になる時に起こる、終点あるいは凝固時間と称される時間を測定する。
【０００４】
血漿中又はクエン酸処理全血中の凝固性フィブリノーゲンの濃度を決定することは、患者の血液凝固障害の検討やフィブリノーゲンに影響を与える薬物治療の追跡（モニタリング）に重要である。免疫学的方法と凝固試験の双方がフィブリノーゲンの定量において用いられてきた。しかし、免疫学的方法は、診断上不利な点が多く、その結果、実用上重要な方法とされていない。
【０００５】
血液凝固試験においては、フィブリノーゲン量は凝固物（即ちクロット）の形成に要する時間によって決定される。この試験方法の内で最も重要なものがクラウスの方法である（非特許文献１参照）。
【０００６】
クラウスの方法においては、希釈された血漿（即ち弱フィブリノーゲン溶液）を、血漿中トロンビン濃度が約５５０Ｕｍｌ-1の濃トロンビン溶液と混合する。検量線を用いて、サンプル中のフィブリノーゲン量を、凝固物が目視されるまでに要した時間に相関させる。血液凝固時の混濁の形成を測光学的に記録する凝固試験も知られている（ラッゲら、非特許文献２参照）。
【０００７】
最後に、形成された凝固物を単離しそのタンパク質量を測定する定量的方法も知られている。このアプローチにおいては、サンプルをトロンビンと反応させ、形成した凝固物を単離し、洗浄した後、乾燥させる。次いで、凝固物中のタンパク質含量若しくはその重量を測定する。
【０００８】
ベッカーら（特許文献１）は血漿中のフィブリノーゲンとフィブリノーゲン分裂産物とを同時に定量する方法を開示している。この方法では、トロンビン様活性を有するヘビ毒酵素を用いる。この方法では、フィブリノーゲン分裂産物量の指標となる、酵素の添加から混濁形成までの時間を測定する。次いで、混濁形成速度を測定し、サンプル中に存在するフィブリノーゲン量を決定する。
【０００９】
これら多くの凝固アッセイにおいては、サンプルの光学濃度の変化をモニターし、反応を評価する。例えば、ナテルソンら（非特許文献３）、リプスコム（特許文献２）、斉藤ら（特許文献３）、ボウマンら（特許文献４）、グロスら（特許文献５）、エイシェルバーガーら（特許文献６）、ベッカーら（特許文献７）、キャラハンら（非特許文献４）、及びキャロルら（非特許文献５）参照。
【００１０】
上述したクラウスの方法のように血液凝固速度によりアッセイをおこなうことの他に、ヴァーミレンらによるクラウス法の変法を用いて、血液凝固速度によりフィブリノーゲンをアッセイすることができる（非特許文献６）。また、ランプリングらの亜硫酸塩沈殿（非特許文献７）、ラトノフらの全凝固性フィブリノーゲン法（非特許文献８）、あるいはフィブリノーゲンのフィブリンポリマーへの転化における混濁速度測定に基づくＤｕ  Ｐｏｎｔ社製アッセイシステム（Ｄｕ  Ｐｏｎｔ  Ａｃａ  ＴＭ、Ｄｕ  Ｐｏｎｔ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌ．ＵＳＡ）によって行われている。ヴァーミレンらの方法においては、終点を示すフィブリンウェブが現われるまで凝固混合物の内外にわたって連続的に動く、ガラスフック若しくは白金ループを用いる。
【００１１】
臨床的背景
現在、米国内における年間の急性心筋梗塞症例数は７５０，０００名であり、他の動脈性塞栓現象、肺塞栓症（ＰＥ）及び深部静脈血栓（ＤＶＴ）と合わせた症例数は１００万を超える。これら症例の約２５〜３５％が、血栓溶解治療の対象候補となり得る。この治療においては、線維素溶解性薬剤を静脈内投与し、閉塞する血液クロットの溶解を促進する。しかし、この治療を行った場合、０．５％の割合で頭蓋内出血が起き、１〜２０％の割合でかなりの頭蓋外出血が起こる。現在、血栓溶解治療をモニターするための簡便で、信頼性が高く、且つ迅速な診断機器は存在しない。
【００１２】
現在出現しつつある挑戦は、効果を最大にし、且つ出血の危険性を最小にするために血栓溶解治療をいかにより良くコントロールするかということである。これまでの所、この挑戦に応える診断アッセイは一つとして現われていないが、フィブリノーゲン診断アッセイに他の各種指標（indicators）を組み込むことによって治療法が改良されるであろう。
【００１３】
フィブリノーゲン測定は、臨床で正確に且つ簡便に行うことは困難であるが、血栓溶解治療において、特に出血危険の評価や一旦起こってしまった場合の出血の治療管理に関して重要なパラメータである。初期フィブリノーゲン低下の測定も、組換え組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｒｔ−ＰＡ）等のフィブリン選択剤と関連するものであっても、溶解プロセスの開始を確認するうえで有用となる。これは、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ及びアニストレプラーゼ等の他のフィブリン選択剤に対しても同様に重要であるが、それは、これら薬剤が全身的溶解作用によって働くためである。
【００１４】
フィブリノーゲン測定のための多くの従来技術方法においては、血球による干渉を防ぐため、アッセイを行う前に血液の遠沈を行う必要がある。しかし、血球の分離には時間がかかり、アッセイに要する全体の時間が増加する。このようなアーティファクトは、フィブリノーゲン自身を含む、血液凝固に関連する各種タンパク質上に対するプラスミンの作用によって生じる。これは、血液サンプル採取後、インビトロで起こる。数分間遅れただけでも、結果は不正確となる。この問題を解決する方法の一つとして、試験前にサンプル保存用血液採取チューブに、添加剤としてプラスミノーゲン活性剤やプラスミンの阻害剤を用いることが行われてきた。しかし、阻害剤を用いた場合、更に費用がかかるうえ、引き続き採取サンプルについて行うことのできる機能的アッセイの範囲を限定することになる。
【００１５】
上述したように、過去においては、ストレプトキナーゼを用いてトロンビン時間試験を行い、ストレプトキナーゼに対する抗体が溶解作用の一部を中和する、ＰＥやＤＶＴにおける溶解作用の存在が証明されていた。乾式化学試験カードに全血一滴を添加することによって行うことのできる、簡便で、迅速、且つ正確なフィブリノーゲンアッセイは、特定の患者に対して行う血栓溶解治療の最適化に対し貢献し得る現在の診断において重要な改良となるであろう。更に、このようなシステムの診断能力は、現在開発中のこれから新しく出回る多くの血栓溶解薬を治験するうえでの助けとなるであろう。従って、このようなアッセイの必要性は明らかである。
【００１６】
脱フィブリノーゲン化剤アンクロッドである、マラヤ毒蛇（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）から精製した毒成分を治療に応用した例としては、虚血性発作、へパリン誘発血小板減少症（ＨＩＴ）の患者におけるヘパリン置換治療、不安定狭心症及び再狭窄の治療が挙げられる。虚血性発作は、血液クロット又は血栓による脳内の血流妨害によって生じる。
フィブリノーゲンはトロンビンの天然基質である。トロンビンはフィブリノーゲンペプチドＡ及びＢの双方を切断し、その結果得られるフィブリンが重合又は架橋し、フィブリンクロットが生成する。フィブリノーゲンは、アンクロッドである、セリンプロテアーゼ（フィブリノーゲンペプチドＡを切断するがＢは切断しない）によっても作用する。この不完全プロセシングによって、重合はするが架橋はしないフィブリンが生成する。アンクロッドは他のプロテアーゼ活性も有し、フィブリンＡ鎖の別の部位の切断に対して触媒作用を有する。フィブリノーゲンの不完全プロセシング及びアンクロッドによるフィブリンの更なる分解の結果、インビボでのプラスミノーゲンの活性化が起こり得る。引き続いてフィブリンが更に分解し、その結果肝臓によってフィブリン分解産物（ＦＤＰ）が排出される。
【００１７】
フィブリノーゲンレベルの顕著な低下によって血栓の形成が減少し、血液粘度が低下する。これら二つの因子（場合によってはこれに加えて繊維素溶解性カスケードの活性化）によって、虚血性発作の原因となるクロットの領域における血流量が増加する。これは、患者にとって良好な結果が得られる可能性を高める。良好な結果はフィブリノーゲンの顕著な低下に伴うものであるが、フィブリノーゲンの完全な排除に伴うものではない（フィブリノーゲンが全く存在しない場合、出血のコントロールができなくなるため）。したがって、アンクロッド注入を測定し、フィブリノーゲンが適切なレベルに維持されていることを確認するうえでポイントオブケア（ＰＯＣ）試験が必要となる。血液サンプルを臨床検査のために中央ラボラトリーへと輸送することは時間の浪費となり、臨床医の治療管理能力を阻害することとなる。また、血液サンプルを中央ラボラトリーへ輸送する間に、アンクロッドによってサンプルが更に脱フィブリノーゲン化される可能性がある。これによって、患者を治療効果発現領域に保持するのに必要なアンクロッドの量に関して、臨床医が誤った判断を下すおそれがある。しかし、ＰＯＣ式アッセイによってフィブリノーゲン濃度の迅速な決定及び治療の正しい調整が行えるであろう。
【００１８】
乾式化学法を用いたＰＯＣ試験については、特許文献８〜特許文献１４に開示されてきた。これら特許の内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。特許文献１５は、振動磁場及び乾式化学試薬を用いるフィブリノーゲン試験を開示している。特許文献１６は、当業界で「黄金標準」とされているフィブロメータを用いた測定値に対して高い相関性を示す非常に正確なフィブリノーゲン測定値を提供する回転磁場を用いるフィブリノーゲン試験を開示している。
【００１９】
残念ながら、（通常トロンビン試薬又はレプチラーゼ試薬を用いる）これらの方法はヘマトクリットによって撹乱される。従って、上の乾式化学技術を用い、且つヘマトクリットによって撹乱されないＰＯＣアッセイが必要となる。
【特許文献１】米国特許第４，６９２，４０６号
【特許文献２】米国特許第４，７２０，７８７号
【特許文献３】米国特許第４，２１７，１０７号
【特許文献４】米国特許第４，２８９，４９８号
【特許文献５】米国特許第３，４５８，２８７号
【特許文献６】米国特許第４，０４７，８９０号
【特許文献７】米国特許第４，６９２，４０６号
【特許文献８】米国特許第４，８４９，３４０号
【特許文献９】米国特許第５，１１０，７２７号
【特許文献１０】米国特許第５，３５０，６７６号
【特許文献１１】米国特許第５，６０１，９９１号
【特許文献１２】米国特許第５，６５８，７２３号
【特許文献１３】米国特許第５，６７０，３２９号
【特許文献１４】米国特許第５，６７７，１３３号
【特許文献１５】米国特許第５，３５０，６７６号
【特許文献１６】米国特許第５，６７０，３２９号
【非特許文献１】Ａｃｔａ  Ｈａｅｍａｔ．（１９５７）１７：２３７−２４６
【非特許文献２】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８７）３３（３）：４２０
【非特許文献３】Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．（１９７４）６１（６）：８２８−８３３
【非特許文献４】キャラハンら、「ＰＴ凝固反応からの半定量的フィブリノーゲン定量」Ｔｅｃｈ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｔｅｃｈ．ＴＨＲ８８０４，ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ１９８８  ｂｙ  Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｎ．Ｃ．，ＵＳＡ
【非特許文献５】キャロルら、「クロットサイン及び凝固試験における新しいアスペクト」１９８９年７月、Ｏｒｔｈｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎ，Ｊ．，ＵＳＡ
【非特許文献６】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ（１９６３）８：４１８−４２４
【非特許文献７】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ（１９７６）６７：４３
【非特許文献８】Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．（１９５１）３７：３１６−３２０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
従って、本発明の一目的は、ヘマトクリットによって撹乱されない乾式化学ベースのフィブリノーゲンアッセイを提供することである。
【００２１】
本発明の更なる目的は、従来のクラウス式液式アッセイでの使用に適したエカリンを用いるフィブリノーゲンアッセイを提供することである。
【００２２】
本発明の更なる目的は、ヘパリンに対し比較的感受性の低いフィブリノーゲンアッセイを提供することである。
【００２３】
本発明の更なる目的は、当該フィブリノーゲンアッセイを行うためのキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明のこれらの目的及び他の目的は、全血又は血液由来サンプルを、エカリンを含むフィブリノーゲンアッセイ試薬と接触させてフィブリンクロット又は凝固物を形成させ、このフィブリンクロット形成をサンプル中のフィブリノーゲン含量に相関させることを含み、当該フィブリノーゲンアッセイ試薬は乾式化学仕様（フォーマット）又は液式化学仕様のどちらかであることができる、フィブリノーゲンアッセイを行う方法と、このようなアッセイを行うための装置及び反応スライドの発見によって達成された。
【００２５】
添付図面を参照して以下の詳細な説明によって本発明を十分に理解すれば、本発明のより完全な評価並びにそれに付随する利益の多くは容易に得られるであろう。当該添付図面において同一の参照番号は、数々の図中の同一若しくは同等部分を示すものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
血栓溶解療法の管理を補助するために、改善された診断的アプローチの開発の要求が増大しつつある。所要時間の短いフィブリノーゲン測定の開発は、患者に明らかな利益をもたらし得る一領域である。更に、簡単、迅速且つ便利なフィブリノーゲンアッセイは血栓溶解療法以外、例えば、手術後の出血の管理；術前評価；肝臓病患者又は肝臓移植後の患者；播種性血管内凝固（ＤＩＣ）患者；虚血性発作及びヘパリン誘起血小板減少のアンクロッド（ancrod）療法のモニタリングに；更に、患者のベッドサイドにおける出血を評価するための汎用ツールとして応用可能であろう。本発明は現行のアッセイシステムに見られる問題点の解決に向けられたものである。
【００２７】
フィブリノーゲンアッセイにおいてヘマトクリットは、撹乱因子であることがわかっている。クラウス式アッセイにおいてヘマトクリットの影響は、血漿サンプルを１０〜２０倍に希釈することで最小限に抑制される。本発明のアッセイは、ヘマトクリットに比較的非感応性のフィブリノーゲン測定を提供する。このアッセイの鍵は、直接フィブリノーゲンには作用しないが、エカリンを試薬とすることにより間接的に作用する試薬の使用にある。
クラウス式アッセイにおいてヘパリンは、特に高濃度（＞０．５Ｕ／ｍＬ）において凝固時間を延長することが判明している。これにより、従来のアッセイによれば、フィブリノーゲンの濃度が人為的に低く計算されることになる。アッセイ成分は、ヘパリンの影響を除くため調整することができる。フィブリノーゲンアッセイに関する他の懸念は、一般的にはフィブリノーゲン分解生成物（ＦＤＰ）の影響であり、詳しくはアンクロッド（ancrod）治療による生成物である。ＦＤＰはクラウス式アッセイに影響を及ぼすことが知られているので、この妨害は乾式化学法のみならず参照方法においても見られるであろう。ＦＤＰの影響は、正しい凝固酵素を選択することにより最小限にすることができる。フィブリノーゲンの構造は、人により異なるであろうし、アッセイが異なればみかけのフィブリノーゲン濃度に影響するであろう。
【００２８】
本発明は、エカリンをアッセイ試薬として用い、アッセイ反応に含まれる磁性粒子の運動のモニタリングに基づく新規なフィブリノーゲンアッセイを提供する。エカリンは、エキス・カリナタス（Echis carinatus）の毒素から得られるタンパク質プロトロンビンアクチベータ（Ｅ．Ｃ．３.４.９９.２７）であり、コルナリクらによって１９６９年に単離された。エカリンは、プロトロンビンのカルシウム非依存活性化により、クエン酸処理全血又血漿を凝固させる。モリタら、更にコルナリクとブロンバックによって、エカリンは、分子量５０〜６０ＫＤａ（キロダルトン）の一本鎖グリコプロテインであって、ＥＤＴＡ、グルタチオン、システイン及びメルカプトエタノールによって阻害されるメタロプロテイナーゼ活性を発揮すると特性化されている。ジイソプロピル−フルオロホスフェート（ＤＦＰ）、大豆トリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ）、オボムコイド及びアプロチニン等の通常のセリンプロテイナーゼ阻害剤はエカリンを不活性化しない。
【００２９】
エカリンは、ヒトプロトロンビン分子の３２３Ａｒｇ−３２４Ｉｌｅ結合の加水分解による開裂を触媒し、これによってチモーゲンフラグメントを一切放出することなくトロンビン活性が生ずる。活性プロトロンビンのこの形態は、メイゾトロンビンと呼ばれている。メイゾトロンビンは、ヘパリン−ＡＴＩＩＩコンプレックスによって阻害されない。メイゾトロンビンは、フィブリノーゲンに作用してフィブリノーゲンアッセイにおいてクロットを形成する。
【００３０】
本フィブリノーゲンアッセイにおいてエカリンの使用が有益であるのは、以下の理由による。
【００３１】
１．エカリン及びメイゾトロンビンは、一般的な抗凝固剤であるヘパリンに阻害されない。ヘパリンは、フィブリノーゲンに直接作用する凝固剤トロンビンを使用する多くの商業的アッセイの結果を撹乱する。
２．エカリンは、全アッセイ中を通してメイゾトロンビンを生成し、それは、低レベル（２０〜１００ｍｇ／ｄｌ）及び高レベル（２００〜３００ｍｇ／ｄｌ）のフィブリノーゲンを含む臨床サンプルのＡ／Ｂ値（以下参照）の差異を増幅する。
３．エカリンに基づく本発明アッセイにおいては、多くの商業的アッセイと比較してフィブリノーゲン感度、再現性及びダイナミックレンジが増大されている。
上記のように、本アッセイにおいては、多数の磁性粒子が埋め込まれ、それらが全体に均一に分散している乾式試薬マトリックスを振動磁場又は回転磁場、好ましくは振動磁場に付す。振動磁場又は回転磁場は、参照用に先に本願に含ませた米国特許第５，３５０，６７６号又は米国特許第５，６７０，３２９号のいずれかに従って得ることができる。
【００３２】
続いて、全血又は血液由来サンプルを該試薬に添加し、該試薬を可溶化させることにより、粒子を解放させ、振動磁場に誘起される振動パターンで粒子を動かす。米国特許第５，１１０，７２７号で詳細を論じたように、磁場の影響下で、解放された磁性粒子は円柱構造体又は積層を形成し、それらは振動磁場下においては、これらの円柱構造体又は積層の配向の変化によりフリッカー現象が出現する。
【００３３】
粒子の振動は、粒子に入射光を当て、反射（散乱）光線を検出することにより光学的にモニターされる。サンプルを乾式試薬マトリックスに添加する以前において、乾式試薬マトリックスに捕捉されている磁性粒子は振動不能である。サンプルを乾式試薬マトリックスに添加することにより磁性粒子を解放した後、粒子が構成する最大数の円柱構造体又は積層が最大限振動することが素早く観測でき、図３のＡに示すような最大振幅をもたらす。反応の進行に伴い、凝固物が生成し、粒子が構成する増加している数の円柱構造体又は積層の振動度合いを制限する。フリッカーパターンにおけるこの緩やかな減少により、図３のＢに示すような残留ポストピーク最小振幅が出現する。
【００３４】
本アッセイにおいては、該振動磁場に対し相対的な粒子運動の度合いをモニターして、アッセイの開始時間及び停止(stop)時間を測定するか、あるいは、凝固時間以外の一以上の速度論曲線の特徴を利用してサンプル中のフィブリノーゲン濃度を測定する。
【００３５】
本血液凝固モニタリングシステムにおいては、高いフィブリノーゲンレベルにより、粒子振動を大きく制限するフィブリンクロットが生成する結果、ピークシグナル後に、より低い最小振動シグナルを生じると考えられている。図４から理解できるように、凝固曲線は複雑である。１からスタートすると、粒子振動の最初の徴候は明白である。磁性粒子振動の強度も明白である。光学的にモニターされる磁性粒子振動の強度は、アッセイ開始（１）からそれぞれ波形エンベロープの上方部および下方部のピーク（２、２’）にかけて増加する。
【００３６】
ピークにおける振動シグナル振幅はＡで示され、図４において２と２’との間のシグナルの差で表される。Ａが生起する時間、即ちｔAが凝固時間である。頂点から波形エンベロープをたどっていくと、ｔA以降振幅が減少する。
【００３７】
ｍ1、ｍ2及びｍ3の三点が示されている。ｍ1及びｍ3の二点は任意に選択されるが、固定された時間である。点ｍ2は変化点として選択される。ｍ1、ｍ2又はｍ3における曲線の傾きはフィブリノーゲンの尺度（測定値）として用いることができる。これらの曲線の傾斜が、最高のフィブリノーゲンレベルにおいて最も急峻（最も負）であり、フィブリノーゲンの減少にともなって急でなくなるからである。
【００３８】
ｍ3を通過後は、振動シグナル振幅は時間の経過とともに減少しつづけ、結局は漸近線値Ｂに接近する。フィブリノーゲン濃度はＡ／Ｂ及び（Ａ−Ｂ）／Ａに比例する。又、フィブリノーゲン濃度はＢに反比例し、Ａ−Ｂに正比例するが、一般的にこれらのパラメータは単独では、Ａ／Ｂ又は（Ａ−Ｂ）／Ａよりも正確度が低い。
【００３９】
更に正確なフィブリノーゲン濃度の測定値は、速度論曲線の積分部分により得られる面積である。例えば、２と２’との間を延びる直線、即ち左側の振幅Ａと；右側の振幅Ｂ’と（ここで、振幅Ｂ’は時間ｔBにおける曲線の振幅；ｔBは、通常ｔAから１０秒後の時刻とｔBの９０％まで、更に典型的な場合ｔBの６０％、との間の値である）；上下それぞれの波形エンベロープにより規定される領域とにより限定される面積をαと表わされ、この面積はサンプル中のフィブリノーゲン濃度に反比例する。
別の領域、即ち、βで表される面積を用いてもよい。βは、振幅Ａの側辺、振幅ｔBを他の側辺とする長方形の面積から、αで表される面積を引いた面積に等しい。βを二つの部分として図４に示す。即ち、上部β1と下部β2である。振幅Ｂ’を通過して延び、点２及び点２’における振幅Ａに相当する線の垂直線として構成される平行線４及び４’を横断する線は、βの正確な境界を規定するための補助となる。βは、フィブリノーゲン濃度に直接比例し、且つ非常に正確である。
【００４０】
βとαとを組み合わせて用いてもよい。即ち、フィブリノーゲンレベルを指示する比又は差として採用される。更に、α及び/又はβは時間と無関係に、例えば常にｔBを面積計算のための水平値として用いることによっても計算可能である（図４参照）。
【００４１】
図５は、凝固曲線の幾つかの速度論的パラメータが、種々の量のフィブリノーゲン欠損血漿で希釈したプール正常血漿からなるクエン酸処理血漿サンプルとレプチラーゼとを含む乾式試薬スライドについて、フィブリノーゲン濃度と共にいかに変化するかを示している。
【００４２】
従って、本発明は、磁性粒子乾式化学技術を用いるフィブリノーゲン測定を提供する。このアプローチを用いて、以下にリストしたアプローチの各々と共にフィブリノーゲンを測定することができる。
【００４３】
すべて本明細書に参照用として含ませる米国特許第４，８４９，３４０号；５，１１０，７２７号；５，３５０，６７６号；５，６０１，９９１号；５，６５８，７２３号；５，６７０，３２９号又は５，６７７，１３３号のいずれかに記載の反応スライドのようなキャピラリースライドの配置は、適切なパターン化仕様（フォーマット）を創出し、試薬を収納しそしてサンプルのモニタリングを行うために理想的に適したものであるが、本発明のアッセイは、磁性粒子を含む予め測定した量の乾式試薬を任意の固体表面（例えばマイクロタイタープレートウェル又は実質的に平坦な表面）に単に添加することにより完全に機能する。本技術の好ましい態様は乾式化学仕様であるが、エカリンを用いるアッセイも、「フィブロメータ」（本産業分野において黄金標準とされるフィブリノーゲンアナライザー）や「トロンボライザー」（オルガノン・テクニカから市販）等の従来の実験室アナライザーで液式化学仕様において実施可能である。
【００４４】
乾式試薬を、血液又は血液由来サンプル添加時に迅速に溶解するように調製することは重要である。表面の凍結乾燥、さらに好ましくは、キャピラリー又はキャピラリーに近い距離で二表面を近接して並列させることが最も良く機能する。これにより、サンプルの迅速な浸透と溶解を可能にする低含有物が大量に生産できる。
【００４５】
凍結乾燥は磁性粒子含有乾式試薬の調製に優れた好結果をもたらすものであるが、室温乾燥、真空乾燥、乾燥剤による乾燥、対流乾燥又は他種の乾燥を用いて好結果を得ることもできる。例えば、反応スライド（適所にスペーサーを備える）試薬の室温乾燥に続き、カバーを取り付けると、自己メータリング乾式試薬含有エレメントを得ることができる。
【００４６】
好ましい一態様においては、図１及び図２に図示する反応スライドを使用する。図１は、スライド部品であるカバー（１０）、オーバーレイ（２０）及びベース（３０）の相対的位置を示す分解図である。カバー（１０）は光透過性のガラス又はポリマーの薄いシートを含み、サンプル受容開口部（１４）を有すると共に、カバーの末端（１６）に近い部位に細長い開口部（１２）が形成されている。
オーバーレイ（２０）は、典型的には透過性のガラス又はポリマーの薄いシートを含み、切り抜き部が形成され、該切り抜き部はサンプルウェル（２２）、反応チャンバ（２４）、及び反応スペースとサンプル受容開口部とを連通する任意的通路（２６）を基本的に形成するように示した形状をとる。
【００４７】
このように、基本的に図示したように、オーバーレイ（２０）の切り抜き部は、互いに連通するサンプルウェル（２２）及び反応チャンバ（２４）を形成するような形状、あるいはサンプルウェル（２２）、反応チャンバ（２４）及び及び通路（２６）を含む形状をとることができる。
【００４８】
反応チャンバ（２４）は、カバー、オーバーレイ及びベースを組み立てた時の反応容量を規定する。テーパ（先細）壁（２５）は、通路（２６）とサンプルウェル（２２）との間、あるいは通路（２６）が使用されていなければ通路（２６）と反応チャンバ（２４）との間の移行部分を形成することが有利である。オーバーレイの末端は、（２９）で示すように閉鎖されている。
【００４９】
ベース（３０）はガラス又はポリマー材料のシートを含み、このシートは通常カバー（１０）又はオーバーレイ（２０）よりも幾分厚めである。
図に示すように、カバー（１０）の長さ（図面で左から右）は、オーバーレイ（２０）の長さとほぼ等しい。カバー（１０）及びオーバーレイ（２０）の幅（図面で上から下）は、ほぼ等しく、典型的にはベース（３０）の幅未満である。カバー、オーバーレイ及びベースを組み立てる時、ベース（３０）に対向するカバー（１０）の底表面はベース（３０）の上部表面から、反応チャンバの容量に対応するサンプル量を、毛管作用により同時に反応量に引き込むのに十分短い距離だけ離して配置する。この作用はベント（１２）の存在により可能となる。使用に際して、磁性粒子が全体に均一に分散した乾式試薬が反応チャンバ（２４）に充填される。
【００５０】
図２は、反応スライドの長手方向の垂直断面図であって、アッセイ測定を行う磁性粒子を使用するための装置と共に示す。この図において、反応スライド１は、永久磁石（１９５）に近接して配設されている。永久磁石（１９５）の直下に、所望の周波数で開閉するサイクル電圧用の電源（１９９）により駆動する電磁石（１９６）が存在する。本発明の実施において、上記永久磁石を（電磁石なしに）使用して、該永久磁石を、反応スライドの平面に基本的に平行な面に沿って前後に動かすことによって振動磁場を創出することが可能である。その他の態様において、上記の電磁石は振動磁場発生に使用される。更に別の態様において、図２に示すように両方の磁石が使用される。
【００５１】
反応チャンバ上への入射光を与えるためには、赤外又は近赤外発光ダイオード等の光源が、又、反応体積（６６）内のサンプルから反射される光線を検出するために置かれた検出器又はセンサーが適切に配置される。矢印（１９８）で示される反射光線は、検出器（４００）で検出される。検出器（４００）は、反射（散乱）光線を検出可能ならしめる任意の位置に配置することができるが、９０度位置及び１０度位置の間（両端を含む）の位置が好ましく、９０度位置及び４５度位置の間が更に好ましく、９０度位置及び７５度位置の間が最も好ましい。
【００５２】
クロット形成速度論的アプローチ
本アッセイで使用する試薬は、当技術分野において知られているｐＨ範囲（典型的には６．５〜８．０）に調整するのに十分なバッファーとともに、普通の血漿又はクエン酸処理全血を、Ｂの最小値に近い値で凝固させるために十分量のエカリン、更に磁性粒子を含む。この十分量は、典型的には８．３ｍｇ・ｍｌ-1であるが、広範囲において変化できる（米国特許第５，１１０，７２７号参照）。血液サンプルは、通常希釈の必要はなく、乾式化学アッセイ混合物に直接添加することができる。しかしながら、本実施態様においては、１：２（容量）以内の幾分の希釈、最も好ましくは１：４（容量）以下の希釈が可能であり、必要に応じて希釈を行う。場合によっては、１：１０（容量）、又更に１：２０（容量）という高度希釈の採用は、例えば非常高いフィブリノーゲンレベルにおいて有利である。
【００５３】
上記の理由から、磁性粒子と組み合わせて使用する適切な乾式試薬の調製に用いる種々の凝固試薬の正確な量は特定できないが、凝固試薬の量は各実施態様において記載するように機能的に決定される。バッファーの種類と濃度は、ｐＨに比べ重要度が低いであろう。血液凝固反応に通常用いられるバッファーを、一般に使用することができる。オーレンス（Ｏｗｒｅｎｓ）、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）及びトリス（Ｔｒｉｓ）がその例であり、ヘペスが好ましい。
【００５４】
本発明において、乾式化学配合物はエカリン、及びフィブリン重合禁止剤、カルシウム、一種以上のバッファー及び／又は一種以上の安定剤等の任意成分を含むのが好ましい。これら成分は、好ましくは以下の濃度で用いることができる(記載の濃度は、サンプル添加及び乾式化学試薬再構成後の最終アッセイ濃度)。
【００５５】
エカリン又は他のプロトロンビン活性化剤；０．１〜５．０Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．４〜１．６Ｕ／ｍＬ、最も好ましくは約０．８Ｕ／ｍＬ。
【００５６】
フィブリン重合禁止剤、好ましくはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ；１．０〜１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは５〜１００μｇ／ｍＬ、最も好ましくは約２
５μｇ／ｍＬ。
【００５７】
カルシウム；１．０〜１２．５ｍＭ、好ましくは１．０〜６．０ｍＭ、最も好ましくは約３．０ｍＭ。
【００５８】
常磁性酸化鉄粒子（ＰＩＯＰ）；１．０ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは３〜１５ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約８．３ｍｇ／ｍＬ。
【００５９】
凍結乾燥のための次のものを含む一種以上の添加剤及び／又は安定剤；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）５００〜５０，０００ＭＷ、ラクトース、マルトース、スクロース等の糖類１〜１０００ｍｇ／ｍＬ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ。
【００６０】
ｐＨ６．５〜８．０、好ましくは７．０〜８．０、最も好ましくは約７．８に維持する一種以上のバッファー。血液産物と共に使用するために好適な通常のバッファー、特に上記に挙げたバッファーがこのバッファーになり得る。
【００６１】
上記に列記したような添加物等の要因も性能に影響を及ぼす可能性がある。更に、最適ｐＨ及びバッファーの選択は、選択した試薬の特定ロットに幾分依存するかも知れない。乾式試薬の溶解特性の改善のため及び可溶化に際しての磁性粒子のより良い分散のためにある種の添加剤の使用も得策である。正確な量は凝固剤の性質に依存する可能性があり、ロット番号ごとに異なる可能性がある。当分野の通常の能力を有する技術者であれば、本明細書に記述した枠組の範囲内で、これらの可変因子を最適化できる。
【００６２】
クロット形成速度論を用いてフィブリノーゲンを測定するためには、凝固時間を使用しないことが好ましい。代わりに、凝固曲線（図３及び図４に示す）の特徴を反映する速度論的パラメータを用いる。図３において、Ａはピーク高さ最大値（最大振動振幅）であり、ＢはＡ到達以後に観測される最小値（残留ポストピーク最小値）である。
【００６３】
ＡおよびＢの両方又はＢのみを用いて、サンプル中のフィブリノーゲン濃度に比例する因子を決定する。以下の測定値を用いることができる。即ち、（ｉ）Ｂのみ、（ｉｉ）Ａ／Ｂ(又はＢ／Ａ）、（ｉｉｉ）Ａ−Ｂ又は（ｉｖ）（Ａ−Ｂ）／Ａ又はＡ／（Ａ−Ｂ）を用いることができる。あるいは、（ｖ）図４に示すようにＡＢ間の負の傾斜を利用することができる。更に、図４に示すように、（ｖｉ）凝固曲線に囲まれた領域面積を用いる。この領域はピーク(Ａ)における縦軸とＡ以後の設定時間（例えば４５秒）に限定してもよい。Ａは規格化され、各々の別個のアッセイ曲線について規格化される。
【００６４】
凝固時間アプローチ（クラウス式）
使用する試薬は、ｐＨを調整するのに十分な量のバッファーとともに、エカリンを含み、エカリンの濃度は、普通血漿又はクエン酸処理全血を凝固させるために十分な濃度であり、その濃度がまだ増加する時点で得られる絶対最小値より幾分高いＢ値を有する。磁性粒子の濃度は、典型的には８．３ｍｇ・ｍｌ-1であるが、広範囲において変化できる（米国特許第５，１１０，７２７号参照）。本実施態様において、分析対象の血液サンプルは最初にバッファー−基質の組合せにより希釈する。一般に用いられるバッファーが使用でき、好ましくはオーレンスバッファー、ＨＥＰＥＳ又はトリスが好ましい。エカリンの基質はプロトロンビン（１Ｕ／ｍＬ）である。希釈したサンプルは続いて、適切なアナライザー中の乾式化学アッセイ混合物へ添加する。その後、凝固時間を測定する。
【００６５】
クラウス式（凝固時間に基づく）方法においては、ファーミレン（Vermylen）らがＣｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，（１９６３）８：４１８〜４２４で論じた十分なダイナミックレンジを達成するためにサンプルの希釈が必要である。本システムにおいては、サンプルのプレ希釈によって達成する。
【００６６】
フィブリノーゲンスクリーニングテスト（凝固時間に基づく）
本実施態様で使用する試薬は、バッファー及び／又は安定剤とともにエカリンを含む。血液サンプルは希釈すべきではなく、直接乾式化学混合物に添加する。その後、凝固時間を測定する。このスクリーニングは一般的に、フィブリノーゲンが異常であることを決定するのに有用である。
【００６７】
第一の（速度論的）好ましい実施態様において、血液又は血液由来サンプル中の凝固性フィブリノーゲンレベルを測定する（フィブリノーゲンアッセイを行う）本発明の方法は以下のステップ（ｉ）〜（ｉｖ）を含む。即ち、
（ｉ）（１）液体サンプルを受容するためのサンプルウェルと、（２）多数の磁性粒子が埋め込まれ、それらが全体に均一に分散しているエカリンを含む乾式試薬マトリックスを含む反応チャンバとを有する反応スライドを振動磁場又は回転磁場に付し、
（ｉｉ）全血又は血液由来サンプルをサンプルウェルに添加することにより、サンプルを同時に反応チャンバに導入し、該試薬を可溶化させ、粒子を解放させて磁場に応答して運動させ、
（ｉｉｉ）光学的に反応チャンバをモニターし、粒子振動の最大振幅Ａ及び粒子振動の後続ポストピーク最小振幅Ｂを測定し、且つ
（ｉｖ）少なくともＢ、又はＡＢ間の速度論的凝固曲線により規定される領域を用いてサンプル中のフィブリノーゲン濃度を測定する。
【００６８】
図５は、エカリンに基づくフィブリノーゲンアッセイのフィブリノーゲン濃度に対するＡ／Ｂの応答曲線を示す。
【００６９】
第二の（終点）好ましい実施態様において、フィブリノーゲンアッセイを行う方法は以下のステップ（ｉ’）〜（ｉｖ’）を含む。即ち、
（ｉ’）（１）液体サンプルを受容するためのサンプルウェルと、（２）多数の磁性粒子が埋め込まれ、それらが全体に均一に分散しているエカリンを含む乾式試薬マトリックスを含む反応チャンバとを有する反応スライドを振動磁場又は回転磁場に付し、
ここでサンプルウェルとサンプルチャンバとが、サンプルウェルに配置したある容量の液体分析対象サンプルであって、該反応チャンバの体積に対応する該サンプルが自発的に該サンプルウェルから該反応チャンバへ輸送されるような形状の輸送ゾーンを通じて液間接続しており、
（ｉｉ’）全血又は血液由来サンプル（例えば、ヘペスバッファーとプロトロンビン中に２〜２０容量倍に希釈）をサンプルウェルに添加することにより、サンプルを自発的に反応チャンバに導入し、該試薬を可溶化させ、粒子を開放させて磁場に応答して運動させ、
（ｉｉｉ’）光学的に反応チャンバをモニターし、該磁場に対する粒子運動の程度に対応して、フィブリノーゲンアッセイの開始時間と停止時間を測定し、且つ
（ｉｖ’）開始時間と停止時間を用いてサンプル中のフィブリノーゲン濃度を測定する。
クロット形成速度論に基礎を置く第一の実施態様が、凝固時間に基礎を置く第二の実施態様より低濃度のクロット形成試薬を典型的に用い得ることを認識すべきである。しかしながら、用いられる試薬の正確な濃度は、上記のように種類と効力にともなって変化しうる。更に、第二の実施態様は、より低いフィブリノーゲン濃度において結果の信頼性が低下するため、効用範囲が狭くなる傾向にあろう。
【００７０】
更なる他の実施態様は、第一の実施態様と同程度の試薬濃度を用いるが、凝固速度論パラメータ（第一の実施態様のように）の代わりに、第二の実施態様におけるように希釈しないサンプルについて凝固時間を測定する。このアプローチは、最も臨床的に有用なフィブリノーゲンレベル範囲（低い正常値から正常値未満）にわたり高感度である定量的スクリーニングテストを提供し、又、希釈しない全血又は血漿サンプルからのフィブリノーゲン異常の迅速評価に有用であり得る。本実施態様は、解釈用標準曲線と共に利用した時にトロンビン時間、レプチラーゼ時間又は等価なテストもしくはフィブリノーゲン値に類似した結果を提供する。フィブリノーゲン対凝固時間の逆数（１／凝固時間）のプロットの利用は当技術分野において知られている。
【００７１】
本発明を全体的に説明してきたが、特定の実施例により更に理解しやすく説明するが、これらは例示のためであり、特に断らない限り発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７２】
エカリン又はバトロキソビンを用いるフィブリノーゲン検出用乾式化学反応スライドを、次の一般的な手順によって形成した。
０．８Ｕ／ｍＬのエカリン（ＰｅｎｔａＰｈａｒｍ）又は３．０Ｕ／ｍＬのバトロキソビン（ＰｅｎｔａＰｈａｒｍ）を含む溶液（２５μＬ）、３．０ｍＭの塩化カルシウム（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）及び８．３ｍｇ／ｍＬのＰＩＯＰを、適当な添加剤及び安定剤と共に組立てた反応スライドデバイス（図１参照）に注入し、冷凍させた後、凍結乾燥させて乾式化学配合物を得た。
【００７３】
反応スライドを、常磁性粒子の動きを測定するための機器（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社から市販されており、米国特許第５，１１０，７２７号に記載されている）である、ＴＡＳ（血栓溶解評価システム）アナライザに設置し、反応スライドカードに、血漿、クエン酸処理全血又は血液由来サンプルを３０μＬ添加した。ＴＡＳアナライザのプログラムを組んでクロット式波形及びＡ／Ｂ比を検出した。また、波形をその後の分析用に電子的に記録した。
【００７４】
冷凍プールしたヒト血漿（ＦＡＣＴ、２５０ｍｇ／ｄＬフィブリノーゲン、Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びフィブリノーゲン自然欠乏性（＜１５ｍｇ／ｄＬ）ヒト血漿サンプルを３７℃にて解凍し、周囲温度に保った。ＦＡＣＴとフィブリノーゲン欠乏性血漿を一緒に希釈し、ＦＡＣＴ含量が０％、２０％、４０％、６０％、８０％及び１００％の血漿サンプルを得た。各サンプル３０μＬをＴＡＳアナライザ内に設置した反応スライドに添加し、凝固時間及びＡ／Ｂ比を測定した。
【００７５】
図５は、様々なレベルのフィブリノーゲンを含む血漿サンプルについて、エカリン並びにバトロキソビン乾式化学アッセイを行った際のＡ／Ｂ応答の比較を示したものである。エカリンに基づくフィブリノーゲンアッセイにおいては、バトロキソビンに基づくフィブリノーゲンアッセイに比べて、高い直線性を示し、また、凝固時間逆数についても均一な応答を示している。
【００７６】
図５及び図６においては、活性化酵素としてエカリンを用いた場合に、バトロキソビンを用いた場合と比べて感度及びダイナミックレンジにおいてかなり有利になることが示されている。
【００７７】
液式エカリンに基づくフィブリノーゲンアッセイ
クエン酸処理全血を１５００ｒｐｍにて１５分間遠沈した。血漿を濃縮赤血球から除去し、廃棄した。濃縮赤血球を上で調製した各種血漿サンプルを用いて１：１の割合で希釈し、様々なフィブリノーゲン濃度のクエン酸処理全血サンプルを得た。様々なフィブリノーゲンレベルのこれらクエン酸処理全血サンプルを、下に示す希釈バッファを用いて１：１の割合で希釈した。ＳＴＡＧＯ  ＳＴ４凝固アナライザ内の反応セル中にて、希釈サンプル５０μＬとエカリンベースの液体試薬５０μＬとを混合し、凝固時間を記録した。
【００７８】
図７は、液式ベースのエカリンアッセイにおける逆数凝固時間応答を示す。データが示すように、試験したフィブリノーゲンレベルについては直線性が高い。
上記実施例において希釈血液サンプル若しくは血漿サンプル（血液由来サンプル）の調製に用いた希釈試薬は、主に５０ｍＭのヘペスバッファー、カルシウム３．０ｍＭ、ｐＨ７．８、１．０Ｕ／ｍＬプロトロンビン（エカリン基質）であった。血液サンプル又は血漿サンプルは、希釈バッファを用いて１：１〜１：２０の割合で希釈することができた。
【００７９】
上で調製した（遠沈し血漿を得た）血液サンプル及び血漿サンプルを、更にクラウスアッセイの変法（ダーデトロンビン試薬、ダーデ−バーリング）においてＳＹＳＭＥＸ  ＣＡ１０００凝固アナライザを用いて試験し、参照フィブリノーゲン値を決定した。
【００８０】
臨床サンプル及びプロトコル
クラウス法：クラウス法の変法（ＦｉｂｌａｓｔｉｎTM、Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔ
ｅｋｎｉｋａ）を参照方法として用いた。クエン酸処理血漿を血液から遠沈によって単離し、血漿をＦｉｂｌａｓｔｉｎTM（トロンビン）試薬と混合した。凝固時間をトロンボライザ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）を用いて測定した。
乾式化学フィブリノーゲン試験：乾式化学反応スライドを上記の様に調製し、好ましい実施態様で記載したように処方した。
【００８１】
患者試験：１２名の健康なボランティアに対し、１Ｕ／Ｋｇのアンクロッドの単独注入を６時間に亘って行った。各ボランティアからのクエン酸処理全血サンプルの採取をアンクロッド注入開始前に行い、注入開始後７２時間までは間隔をおいて採取した。エカリンベースのフィブリノーゲン反応スライド、バトロキソビンベースの反応スライド及び参照方法を用いて、各サンプルについて分析を２回行った。各サンプルのヘマトクリットについても測定を行った。
【００８２】
図８及び図９は、バトロキソビンに基づくアッセイ及びエカリンに基づくアッセイにおいてＡ／Ｂ比を用いて応答を測定するための、クエン酸処理全血中のフィブリノーゲン測定用の用量−応答曲線を示す。図８と図９との比較から、エカリンを含む反応スライドの感度が著しく高いことがわかる。更にサンプルのヘマトクリット範囲が３５〜４７％である。図９に示す高い相関性によって、アッセイ性能に対するヘマトクリットの作用は最小であることがわかる。
【００８３】
以上の説明から、本発明の更なる修正及び変更が可能である事は明らかである。従って、上の具体的記述以外に、添付したクレームの範囲内において本発明を実施することができることは理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】血液又は血液由来サンプル中の凝固性フィブリノーゲンレベルを測定するための本発明に係る終点方法あるいは動力学的方法を行う際に用いることができる、組み立て式反応スライドの分解斜視図である。
【図２】磁性粒子を用いて反応を測定する装置と共に、反応スライドの長手方向垂直断面図を示すものである。
【図３】フィブリノーゲンアッセイにおける凝固曲線を示し、Ａは粒子振動の最大振幅を示し、Ｂは粒子振動の後続残留ポストピーク最小振幅を示す。
【図４】特定のアルゴリズムを構築しフィブリノーゲンを測定するためのパラメータとして用いることができる動力学的凝固波形の更なる特徴を示すものである。
【図５】エカリンアッセイ並びにバトロキソビンアッセイにおけるＡ／Ｂ比の比較を示すものである。
【図６】様々なレベルのフィブリノーゲンを含む血漿サンプルについて、エカリン及びバトロキソビン乾式化学アッセイを行った際の凝固時間応答の逆数を比較したものである。
【図７】液式ベースのエカリンアッセイにおける凝固時間応答の逆数を示す。
【図８】Ａ／Ｂ比を用いて乾式化学バトロキソビンベースのアッセイにおける応答を測定するための用量−応答曲線を示す。
【図９】Ａ／Ｂ比を用いて乾式化学エカリンベースアッセイにおける応答を測定するための用量−応答曲線を示す。
【図１】
2008224687.tif 000003
【図２】
2008224687.tif 000004
【図３】
2008224687.tif 000005
【図４】
2008224687.tif 000006
【図５】
2008224687.tif 000007
【図６】
2008224687.tif 000008
【図７】
2008224687.tif 000009
【図８】
2008224687.tif 000010
【図９】
2008224687.tif 000011