(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト由来の細胞に簡便かつ迅速に老化を誘導し、かつ、均一な老化誘導細胞を得るための手段の提供。【解決手段】ｈＴＥＲＴを発現するヒト由来の細胞に対して、活性型Ｒａｓタンパクの発現操作を行なうことにより、前記細胞に老化を誘導する老化誘導方法。この場合において、活性型Ｒａｓタンパクの発現操作は、テトラサイクリン又はその誘導体により前記細胞を処理して行なう。前記老化誘導方法は、ｈＴＥＲＴ遺伝子、並びに活性型ｒａｓ遺伝子を前記細胞に導入する手順をも含むものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈＴＥＲＴを発現するヒト由来の細胞に対して、活性型Ｒａｓタンパクの発現操作を行なうことにより、前記細胞に老化を誘導する老化誘導方法。
【請求項２】
テトラサイクリン又はその誘導体により前記細胞を処理して前記発現操作を行なうことを特徴とする請求項１記載の老化誘導方法。
【請求項３】
ｈＴＥＲＴ遺伝子、並びに活性型ｒａｓ遺伝子を前記細胞に導入する手順を含む請求項１記載の老化誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト由来細胞の老化誘導方法に関する。より詳細には、ｈＴＥＲＴを発現するヒト由来の細胞に対して、活性型Ｒａｓタンパクの発現操作を行なうことにより、前記細胞に老化を誘導する老化誘導方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、正常体細胞は、細胞分裂回数が６０回前後になると分裂を停止することが知られている。この現象は、「細胞の老化（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）」と考えられ、特に「分裂寿命による老化（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ａｇｉｎｇ）」と呼ばれている。
【０００３】
真核生物の染色体の末端部には、繰り返し配列を有するＤＮＡと種々のタンパクからなる「テロメア」と呼ばれる構造がある。テロメアは、染色体末端を保護する役目を有している。
【０００４】
正常体細胞では、細胞分裂の度にこのテロメアの長さ（テロメア長）が短縮することが知られており、テロメア長の短縮がある一定の閾値を越えると細胞は分裂を停止して、「分裂寿命による老化」状態となることが分かっている。
【０００５】
一方、近年、細胞にｒａｓ遺伝子を強制発現させたり、酸化ストレスを負荷したりすることで、「分裂寿命による老化」と同様の不可逆的な増殖停止状態が引き起こされることが明らかにされた。
【０００６】
この不可逆的な増殖停止状態にある細胞は、「分裂寿命による老化」状態にある細胞と同様の細胞形態を呈し、かつ、共通の分子機序によって分裂停止状態に陥っていることが明らかにされた。
【０００７】
このため、現在では、このような不可逆的な増殖停止状態にある細胞を、「ストレスに対する反応としての老化」状態にある細胞とみなすようになっており（非特許文献１参照）、「細胞の老化」の概念は、従来の「分裂寿命による老化」のみならず、この「ストレスに対する反応としての老化」をも包含し得る広い概念へと変化してきている。
【０００８】
ここで、上記のＲａｓタンパクについて簡単に説明する。Ｒａｓタンパクは、ｒａｓ遺伝子によってコードされている低分子量ＧＴＰ結合タンパクであり、哺乳類では３種類（Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ）が知られている。点突然変異により、Ｒａｓタンパクの１２、１３、６１番目のアミノ酸残基が置換されると、活性型になり、トランスフォーミング活性を持つようになることが知られている。
【０００９】
非特許文献２には、レトロウイルスベクターにより活性型のｒａｓ遺伝子を細胞に導入し、発現させると、上述の通り「ストレスに対する反応としての老化」を細胞に誘導できることが報告されている。
【非特許文献１】Nat Biotechnol. 2002 Jul;20(7):682-8
【非特許文献２】Cell 1997 Mar 7; 88(5): 593-602
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
細胞に老化を誘導する場合において、「分裂寿命による老化」を誘導するためには、細胞を６０回前後も分裂させてテロメア長の短縮を引き起こす必要がある。これには、通常２〜３ヶ月にわたって細胞を継代し続ける必要があるため、非常に煩雑であり、老化を誘導した細胞を適宜必要に応じて迅速に供給することが困難であった。
【００１１】
一方、「ストレスに対する反応としての老化」を誘導する場合、上記の活性化型ｒａｓ遺伝子の導入による方法によれば、１週間程度で細胞に老化を誘導することが可能である。しかし、非特許文献２に開示されるような従来法では、実験の都度に、活性化型ｒａｓ遺伝子を搭載したレトロウイルスベクターを細胞に感染させる必要があり、操作が煩雑であった。
【００１２】
また、活性化型ｒａｓ遺伝子を導入する際において、細胞が既に相当回数の分裂を経て、細胞のテロメア長が短縮しているような場合には、「分裂寿命による老化」による影響をも考慮する必要があり、均一な老化誘導細胞を得ることができなかった。
【００１３】
そこで、本発明では、ヒト由来の細胞に簡便かつ迅速に老化を誘導し、かつ、均一な老化誘導細胞を得るための手段を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明では、ｈＴＥＲＴを発現するヒト由来の細胞に対して、活性型Ｒａｓタンパクの発現操作を行なうことにより、前記細胞に老化を誘導する老化誘導方法を提供する。
【００１５】
また、活性型Ｒａｓタンパクは、テトラサイクリン又はその誘導体により細胞を処理することにより発現させることができるよう工夫した。
【００１６】
ここで、ｈＴＥＲＴ（ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）について簡単に説明する。ｈＴＥＲＴは、テロメラーゼの逆転写酵素部分であり、テロメラーゼの触媒サブユニットである。また、テロメラーゼとは、細胞分裂によるテロメア長の短縮に拮抗して、テロメア長を維持する酵素であって、テロメア配列の鋳型となるＲＮＡ、及び、逆転写酵素を構成要素に含む。
【００１７】
ｈＴＥＲＴ遺伝子を発現させた細胞は、細胞分裂によりテロメア長が短縮しても、ｈＴＥＲＴによりテロメアが修復され、テロメア長が維持されるので、無限に分裂することが可能となる。このように、ｈＴＥＲＴ遺伝子の導入により、細胞に無限増殖能を誘導することを、「細胞の不死化」という。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、ヒト由来の細胞を簡便かつ迅速に老化誘導し、均一な老化誘導細胞を得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明では、ｈＴＥＲＴを発現するヒト由来の細胞に、活性型Ｒａｓタンパクの発現操作を加えることにより、前記細胞に老化を誘導する老化誘導方法を提供する。
【００２０】
ｈＴＥＲＴ遺伝子を発現させた細胞は、細胞分裂によりテロメア長が短縮しても、ｈＴＥＲＴによりテロメアが修復されるため、テロメア長が維持された状態となっている。このため、本発明に係る老化誘導方法においては、実験の都度、供される細胞のテロメア長の長短による条件のバラつきを考慮する必要がなく、均一な老化誘導細胞を得ることが可能となる。
【００２１】
また、本発明では、活性型Ｒａｓタンパクを、テトラサイクリン又はその誘導体により細胞を処理することで簡便に発現させることができるように工夫した。
【００２２】
テトラサイクリン又はその誘導体の処理により、細胞に目的遺伝子を発現させる方法としては、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｒｅｘシステム（Tetracycline-Regulated Expression system）がある。このシステムは、テトラサイクリン又はその誘導体を用いて、哺乳類細胞に導入した遺伝子を高レベルに発現誘導させるシステムである。
【００２３】
以下、図４に基づいて、Ｔ−Ｒｅｘシステムについて簡単に説明する。
【００２４】
まず、目的遺伝子を挿入した発現用ベクター（ｐｃＤＮＡＴＭ４／ＴＯ）とＴｅｔレプレッサー（ＴｅｔＲ）を恒常的に発現させる調節用ベクター（ｐｃＤＮＡＴＭ６／ＴＲ）を細胞にコトランスフェクトする。
【００２５】
トランスフェクトの方法は、一般に用いられる方法でよく、リン酸カルシウム共沈法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法／リポソーム法、マイクロインジェクション法やウイルスベクターを利用した方法を用いることができる。
【００２６】
これにより、細胞中では、調節用ベクターからＴｅｔレプレッサーが恒常的に発現し（図４（１）参照）、Ｔｅｔリプレッサーのホモダイマー２分子が、発現用ベクターの２つのＴｅｔオペレーター配列（ＴｅｄＯ２）に結合する（図４（２）参照）。この状態にあっては、転写開始点（ＴＡＴＡボックス）からの転写が抑制され、目的遺伝子（ｇｅｎｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）は発現しない。
【００２７】
しかし、テトラサイクリン又はその誘導体（ｔｅｔ）を細胞培養液中に添加すると、テトラサイクリン又はその誘導体がＴｅｔリプレッサーホモダイマーと結合して（図４（３）参照）、Ｔｅｔリプレッサーホモダイマーの立体構造を変化させる（図４（４）参照）。これにより、Ｔｅｔリプレッサーホモダイマーは、Ｔｅｔオペレーター配列から離れ、目的遺伝子の転写が誘導される。
【００２８】
このＴ−Ｒｅｘシステムの発現用ベクター及び調節用ベクターに由来する上記のＴｅｔリプレッサー遺伝子配列やＴｅｔオペレーター配列等を、レトロウイルスベクターに挿入して細胞に感染させ、細胞染色体に導入すれば、テトラサイクリン又はその誘導体の処理によって導入した目的遺伝子を発現する細胞を作出することができる。
【００２９】
このように作出した細胞において目的遺伝子として活性化型ｒａｓ遺伝子を挿入しておくことで、テトラサイクリン又はその誘導体により処理するだけで、簡便に活性化型Ｒａｓタンパクの発現による細胞老化を誘導することができる。
【００３０】
また、本発明においては、細胞に予めｈＴＥＲＴ遺伝子を導入し発現させているため、Ｔ−Ｒｅｘシステムの発現用ベクター及び調節用ベクターに由来する上記配列を染色体に組み込んだ細胞は、無限増殖能を有することとなる。従って、無限に継代して維持することが可能で、継代細胞から随時に細胞を取り出して、老化誘導に供することができ、かつ、テトラサイクリン又はその誘導体により処理するだけで老化誘導が可能であるので、迅速な老化誘導細胞の提供が可能となる。
【実施例１】
【００３１】
実施例１では、本発明に係る方法により、ヒトの繊維芽細胞の老化誘導を行った。
【００３２】
まず、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）由来のレトロウイルスベクターであるｐＣＸｂｓｒを構築した。ｐＣＸｂｓｒは、ＭｕＬＶ由来のエンハンサーに換えてヒトサイトメガロウイルス由来のエンハンサーを搭載した上、ブラスチジンＳ耐性遺伝子を挿入している。なお、後述するｐＣＸｎｅｏは、ブラスチジンＳ耐性遺伝子に換えて、ネオマイシン耐性遺伝子を挿入したものである。ｐＣＸｂｓｒ及びｐＣＸｎｅｏの詳細な構成については、ＧｅｎＢａｎｋ（アクセションナンバーＡＢ０４１９２７及びＡＢ０４１９２８）で参照が可能である。
【００３３】
続いて、ｐＣＸｂｓｒに、Ｔ−Ｒｅｘシステムの発現用ベクター（ｐｃＤＮＡＴＭ４／ＴＯ）に由来するＴｅｔオペレーター配列を挿入し、レトロウイルスベクター ｐＣＸｂｓｒＲ(ＴＯ)（参考文献１：Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 20;97(13):7290-5参照）を作製した。さらに、このｐＣＸｂｓｒＲ(ＴＯ)に活性型ｒａｓ（Ｈ−ｒａｓ Ｖ１２）ｃＤＮＡ（参考文献２：Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Nov 11;100(23):13567-72参照）を挿入し、レトロウイルスベクターｐＣＸｂｓｒＲ(ＴＯ／Ｈ−ｒａｓ Ｖ１２)を作製した。また同様に、ｔｅｔリプレッサーを発現するレトロウイルスベクター ｐＣＸｎｅｏ／ＴＲ−２（参考文献１参照）を作製した。
【００３４】
これら組み換えレトロウイルスベクターｐＣＸｂｓｒＲ(ＴＯ／Ｈ−ｒａｓ Ｖ１２)及びｐＣＸｎｅｏ／ＴＲ−２を、ｈＴＥＲＴを発現するヒト正常繊維芽細胞（参考文献２参照）に感染させ、両方の組み換えレトロウイルスベクターに感染した細胞を樹立した。
【００３５】
レトロウイルスベクターの産生ならびに感染については、参考文献２の方法に従った。簡単に説明すると、まずエコトロピック（同種指向性）マウス白血病ウイルスパッケージング細胞（Ｐｌａｔ−Ｅ）に、Ｆｕｇｅｎｅ６（ロシュ）を用いて、レトロウイルスベクターをトランスフェクトした。ここで、パッケージング細胞とはレトロウイルスの構造タンパク質をコードするgag、pol、env遺伝子を導入した細胞である。この細胞に目的の遺伝子を組み込んだ組換えレトロウイルスを導入すると、組換えレトロウイルス粒子を産生することができる。
【００３６】
トランスフェクト２日後に、パッケージング細胞の培養上清からレトロウイルスベクターを回収して、ｈＴＥＲＴを発現するヒト正常繊維芽細胞に感染させた。感染２日後に、ブラスチジンＳにより組み換え遺伝子が導入された細胞を選択した。なお、参考文献２に開示したｈＴＥＲＴを発現するヒト正常繊維芽細胞の作成、選別も同様の方法で行なっている。
【００３７】
このようにして得られた細胞について、培養液中にテトラサイクリンの誘導体であるドキシサイクリンを１mｇ／ｍｌの濃度で添加し、活性化型Ｒａｓタンパクの発現を誘導して老化誘導を行なった。その結果について、以下に説明する。
【００３８】
図１（Ａ）は、ドキシサイクリンを添加したのち７日後の細胞の形態を示す。細胞の密度は疎であり、各細胞は、正常な繊維芽細胞の形状と異なり、大型で不整な形状を呈する。
【００３９】
これに対して、図１（Ｂ）に示すドキシサイクリンを添加しなかった細胞では、細胞は極めて密であり、各細胞は、正常な繊維芽細胞の形状と同様に、紡錘形状を呈する。
【００４０】
また、図３は、ヒト繊維芽細胞の初代培養細胞を、（Ａ）では６０回、（Ｂ）では２０回継代した後の形態を示す参考図である。
【００４１】
図３（Ａ）は、６０回の継代に伴う多数の細胞分裂により、細胞は「分裂寿命による老化」によって分裂を停止し、細胞密度は疎となっている。各細胞は、正常な繊維芽細胞の形状と異なり、大型で不整な形状を呈し、典型的な老化細胞の形態を示している。
【００４２】
これに対し、図３（Ｂ）では、継代回数は２０回に留まるため、細胞は活発な分裂状態を維持し、細胞は極めて密であり、各細胞は、正常な繊維芽細胞の形状と同様に、紡錘形状を呈している。
【００４３】
図１（Ａ）に示されるドキシサイクリンを添加した細胞は、図３（Ａ）に示される細胞と同様の形態的特長を呈し、老化による分裂停止状態にあることが分かる。このことは、本発明に係る老化誘導方法により、ドキシサイクリンの添加後７日という非常に短い期間で、簡便かつ迅速に老化を誘導できることを示すものである。
【００４４】
次に、図１（Ａ）及び（Ｂ）の細胞において、活性型Ｒａｓタンパクの発現を調べた。図２は、定法により図１（Ａ）及び（Ｂ）の細胞からタンパク抽出液を調製し、活性型Ｒａｓタンパクに対する抗体を用いてウェスタンブロットを行なった結果を示す図である。
【００４５】
図２において、ドキシサイクリンを添加していない細胞（図２中（−）のレーン）では、活性型Ｒａｓタンパクの発現は認められない。一方、ドキシサイクリンを添加した細胞（図２中（＋）のレーン）では、活性型Ｒａｓタンパクの顕著な発現が認められる。
【００４６】
このことは、ドキシサイクリンの処理によって、細胞に活性型Ｒａｓタンパクが発現誘導され、該活性型Ｒａｓタンパクが、図１で確認された細胞老化を誘導したことを証明するものである。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明に係る老化誘導方法は、ヒト由来の細胞を利用した細胞老化研究において、細胞の老化や癌化のメカニズムの解明に用いることができ、該メカニズムに関与する新たな分子の発見や新薬の開発に役立てることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明に係る老化誘導方法により、老化を誘導したヒト繊維芽細胞の形態を示す図である。
【図２】本発明に係る老化誘導方法において、細胞中に発現された活性型Ｒａｓタンパクを示す図である。
【図３】継代によって老化を誘導したヒト繊維芽細胞の初代培養細胞の形態を示す図である。
【図４】Ｒ−Ｔｅｘシステムの概略を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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