(57)【要約】【課題】細胞培養が可能であり、かつ剥離及び回収が可能な基板、及びその製造方法を提供すること。【解決手段】  熱応答性高分子からなる被覆層を表面に有する支持体からなる基板において、該熱応答性高分子からなる被覆層の被覆面積が５０ｃｍ2以上であり、かつ該熱応答性高分子の被覆量の面内変動係数が３０％以下であることを特徴とする基板。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱応答性高分子からなる被覆層を表面に有する支持体からなる基板において、該熱応答性高分子からなる被覆層の被覆面積が５０ｃｍ2以上であり、かつ該熱応答性高分子の被覆量の面内変動係数が３０％以下であることを特徴とする基板。
【請求項２】
熱応答性高分子の平均被覆量が１．０μg/cm2から１０．０μg/cm2である、請求項１に記載の基板。
【請求項３】
熱応答性高分子からなる被覆層が、波長２００ｎｍ〜８００ｎｍの光照射によって固定化されたものである、請求項２に記載の基板。
【請求項４】
熱応答性高分子からなる被覆層が、該熱応答性高分子を構成するモノマーを実質的に励起しない波長の光の照射によって固定化されたものである、請求項１から３の何れかに記載の基板。
【請求項５】
支持体がポリエチレンテレフタレート又はその誘導体である、請求項１から４の何れかに記載の基板。
【請求項６】
熱応答性高分子が、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーである、請求項１から５の何れかに記載の基板。
【請求項７】
請求項１から６の何れかに記載の基板からなる、細胞培養用基板。
【請求項８】
支持体の表面に、熱応答性高分子からなる被覆層を、該熱応答性高分子からなる被覆層の被覆面積が５０ｃｍ2以上であり、かつ該熱応答性高分子の被覆量の面内変動係数が３０％以下となるように設ける工程を含む、請求項１から７の何れかに記載の基板の製造方法。
【請求項９】
モノマーを実質的に励起しない波長の光が、波長２００ｎｍ〜８００ｎｍの光である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
熱応答性高分子を構成するモノマーを支持体の表面に接触させた状態で、該モノマーを実質的に励起しない波長の光を照射することによって該モノマーを重合して支持体の表面に熱応答性高分子からなる被覆層を設ける、請求項８または９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養に適した基板、及びその製造方法に関する。より詳細には、本発明は、細胞を培養することができ、かつ培養した細胞を培養器から剥離して細胞のみを容易に得ることが可能な細胞培養用基板、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養は生化学的な現象の理解や有用物質の産生などに用いられ、また近年、幹細胞の発見や培養技術の進歩により、再生医療を始めとする細胞を用いた治療に大きな注目が寄せられている。細胞を用いた毒性試験や薬効試験は、動物実験の代替法として大きな役割を担っており、動物愛護の観点からも今後ますます重要性が増すと考えられる。
【０００３】
細胞の多くは接着性を有しており、体内においてはコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどの生体高分子に接着し、増殖・分化することが知られている。同様に細胞培養においても接着性を有する細胞の多くは、培養する際に何らかの基材に接着する必要がある。従来、支持体としては表面処理したガラスあるいは高分子が用いられていた。例えばポリスチレンにγ線照射あるいはシリコーンコーティングをおこなった支持体がある。また、コラーゲンやフィブロネクチンのような生体高分子を表面に塗設した支持体も用いられる。
【０００４】
増殖する細胞は支持体上で培養後、一般的に別の支持体に植え継ぐ必要があり、多くの場合はタンパク質分解酵素やキレート剤が用いられている。タンパク質分解酵素は細胞表面にあるタンパク質を分解し、細胞と支持体の間の結合および細胞間の結合を切る役目を担っている。一方、タンパク質分解酵素は細胞の生存率に大きな影響を与えることが知られており、タンパク質分解酵素やキレート剤を用いずに細胞を支持体から分離する手法は細胞にダメージを与えない方法として重要である。再生医療においても同様に、体外で培養した細胞にダメージを与えずに、さらに細胞間の結合を切断しない方法で細胞又は組織化した細胞を支持体から分離し、体内に戻すことが求められており、タンパク質分解酵素を用いずに支持体から分離する方法が求められている。
【０００５】
上記問題を解決するために、熱応答性ポリマーを高分子基板の表面に被覆した細胞培養支持体材料が特許文献１に開示されている。しかしながら、特許文献１では、細胞培養支持体材料を製造する際に電子線照射が必要で、大面積で均一な細胞培養支持体材料を得るには製造上困難があった。また、アクリルアミドポリマーを高分子支持体表面上に被覆する簡便な方法として、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）支持体上に紫外線照射する方法が特許文献２に開示されているが、特許文献２における紫外線照射は親水化が目的であり、疎水性が好まれる細胞培養には適していなかった。
【０００６】
【特許文献１】特開平２−２１１８６５号公報
【特許文献２】特開昭６３−９２６５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細胞培養が可能であり、かつ剥離及び回収が可能な基板、及びその製造方法を提供することを解決すべき課題とした。特に本発明は、製造の際に電子線照射を必要とすることなく、大面積で均一な基板及びその製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、熱応答性高分子からなる被覆層を表面に有する支持体からなる基板において、該熱応答性高分子からなる被覆層の被覆面積と、該熱応答性高分子の被覆量の面内変動係数を所望の範囲内に設定した基板を提供することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  熱応答性高分子からなる被覆層を表面に有する支持体からなる基板において、該熱応答性高分子からなる被覆層の被覆面積が５０ｃｍ2以上であり、かつ該熱応答性高分子の被覆量の面内変動係数が３０％以下であることを特徴とする基板。
（２）  熱応答性高分子の平均被覆量が１．０μg/cm2から１０．０μg/cm2である、（１）に記載の基板。
（３）  熱応答性高分子からなる被覆層が、波長２００ｎｍ〜８００ｎｍの光照射によって固定化されたものである、（２）に記載の基板。
【００１０】
（４）  熱応答性高分子からなる被覆層が、該熱応答性高分子を構成するモノマーを実質的に励起しない波長の光の照射によって固定化されたものである、（１）から（３）の何れかに記載の基板。
（５）  支持体がポリエチレンテレフタレート又はその誘導体である、（１）から（４）の何れかに記載の基板。
（６）  熱応答性高分子が、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーである、（１）から（５）の何れかに記載の基板。
（７）  （１）から（６）の何れかに記載の基板からなる、細胞培養用基板。
【００１１】
（８）  支持体の表面に、熱応答性高分子からなる被覆層を、該熱応答性高分子からなる被覆層の被覆面積が５０ｃｍ2以上であり、かつ該熱応答性高分子の被覆量の面内変動係数が３０％以下となるように設ける工程を含む、（１）から（７）の何れかに記載の基板の製造方法。
（９）  モノマーを実質的に励起しない波長の光が、波長２００ｎｍ〜８００ｎｍの光である、（８）に記載の方法。
（１０）  熱応答性高分子を構成するモノマーを支持体の表面に接触させた状態で、該モノマーを実質的に励起しない波長の光を照射することによって該モノマーを重合して支持体の表面に熱応答性高分子からなる被覆層を設ける、（８）または（９）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の基板は、細胞培養に用いることができる。本発明の基板を用いて細胞を培養した場合、細胞の付着と増殖が良好であり、かつ細胞の剥離及び回収も容易に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
＜支持体材料＞
本発明の基板において使用される支持体としては、高分子化合物からなるプラスチックフィルムが用いることができるが、また高分子化合物をラミネートした紙、ガラス、金属などを用いることもできる。プラスチックフィルムとしては、セルロースフイルム（ニ酢酸セルロース、三酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルソース等）、ポリエステルフィルム（ポリエチレンテレフタレート、ポリトリメチレンナフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンナフタレート等）、ポリエチレンフィルム、ポリプロピレンフィルム、ポリ塩化ビニルフィルム、ポリエチレンナフタレートフィルム、ポリカーボネートフィルム、ポリビニルアルコールフィルム、ポリビニルアセタールフィルム等あるいはシリコーンゴムを用いることができる。
【００１４】
本発明の基板を製造する際には、支持体の表面に熱応答性高分子を光照射によって固定することが好ましい。従って、支持体の材料としては、より長波長まで光を吸収する材料であることが好ましい。支持体は、好ましくはポリエステルフィルムであり、特にポリエチレンテレフタレート又はその誘導体からなるフィルムが好ましい。
【００１５】
支持体の形状はフィルム状で支持体として十分な強度を持つことが好ましい。また、多孔質である場合も好ましく用いられる。支持体材料に固定化された熱応答性高分子からなる被覆層の被覆面積は、連続して５０ｃｍ2以上であり、連続して８０ｃｍ2以上で１００００ｃｍ2以下が好ましい。ここで云う連続してとは被覆層が連続していることを意味しており、パターン化されていても良いが、アイランド状のように独立に分離していてはならない。さらに、細胞培養で常用されるウェル形状であってもよい。
【００１６】
＜熱応答性高分子＞
本発明の基板においては、支持体の表面に、熱応答性高分子からなる被覆層が存在する。本発明で用いる熱応答性高分子とは、好ましくは、温度により親疎水性が変化する化合物である。本発明で用いることができる熱応答性高分子としては、特公平６−１０４０６１号に記載のアクリルアミド誘導体からなるポリマー、ビニルエーテル誘導体からなるポリマー、特開平５−２４４９３８号、特開２０００−２１２１４４、特開２０００−２１９７０８、特開２０００−２１９７０９号に記載の高分子化合物を用いることができる。
【００１７】
本発明で用いる熱応答性高分子は、好ましくは、支持体の吸収に対して１０ｎｍ以上短波領域に吸収を示すモノマーからなる高分子化合物が好ましく、特に２０ｎｍ以上短波領域に吸収を示すモノマーからなる高分子化合物が好ましい。例えば、支持体と、該支持体の吸収に対して１０ｎｍ以上短波領域に吸収を示すモノマーとの組み合わせの好ましい例としては、支持体がポリエチレンテレフタレートであり、モノマーがＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマーである組み合わせを挙げることができる。
【００１８】
＜重合方法＞
本発明において、熱応答性高分子からなる被覆層を、支持体の表面に設けるためには、熱応答性高分子の前駆体であるモノマーを支持体と接触させた状態で、該モノマーを実質的に励起しない波長の光を照射することによって該モノマーを重合し、これによって支持体の表面に熱応答性高分子からなる被覆層を設けることができる。モノマーを実質的に励起しない波長の光を照射する際には、例えば、２００ｎｍから可視領域（好ましくは、２００ｎｍ〜８００ｎｍ）の光を照射することが好ましい。例えば、光源として水銀ランプやレーザーを用いて光照射する方法が挙げられる。この際、光照射波長は、照射光が支持体のみに吸収されて、支持体を励起し、熱応答性高分子の前駆体であるモノマーには実質的に吸収されないことが好ましい。即ち、本発明においては、熱応答性高分子からなる被覆層は、該熱応答性高分子を構成するモノマーを実質的に励起しない波長の光の照射によって固定化することが好ましい。照射光が該モノマーに実質的に吸収されない（即ち、モノマーを実質的に励起しない）とは、支持体の光エネルギー吸収量に対して、モノマーの光エネルギー吸収量が２０％以下であることをいう。
【００１９】
上記の通り、熱応答性高分子の前駆体であるモノマーは、溶液として支持体表面を被覆した状態で、光照射により重合化して、熱応答性高分子からなる被覆層として支持体表面に固定される。該モノマーは水溶液としても有機溶媒中に溶解してもよいが、環境上の観点からは水溶液が好ましい。水溶液の場合には過ヨウ素酸ナトリウムやリボフラビンのような酸素除去剤を併用するのが好ましいが、後者が特に好ましい。溶液の濃度は好ましくは０．１％から５０％であり、１％から２０％が特に好ましい。
【００２０】
光照射はモノマー溶液が支持体材料を被覆した状態で行なうが、モノマー被覆量は0.1ｍg/cm2から100ｍg/cm2が好ましく、1.0ｍg/cm2から50ｍg/cm2が特に好ましい。
【００２１】
また、モノマーを予め、重合してダイマーあるいはそれ以上の重合度のポリマーとして支持体を被覆後、光照射により固定化してもよい。
【００２２】
＜重合量＞
本発明の基板は、支持体上の熱応答性高分子の平均被覆量が多すぎると、基板が温度に関わらず親水的となり、疎水性を好む細胞培養基板としては使用できない。また、支持体上の熱応答性高分子の平均被覆量が少なすぎると、細胞が培養後に剥離できない。したがって支持体上の熱応答性高分子の平均被覆量は1.0〜10.0μg/cm2であり、1.0〜6.0μg/cm2であることが好ましく、1.2〜5.0μg/cm2であることが特に好ましい。さらに、熱応答性高分子の被覆量の面内変動係数は３０％以下であり、２０％以下で３%以上が好ましい。特に好ましくは１５％以下で１％以上である。
【００２３】
熱応答性高分子の被覆量はFTIR/ATR法によって求めることができる。すなわち、FTIR/ATR法で吸収率を測定し、予め既知の量のポリマーをキャスティングコーとした試料を参照として被覆量を測定することができる。
【００２４】
被覆量の面内変動係数は、作成した熱応答性高分子を被覆した基板１ｃｍ2当りFTIR/ATR測定を１０点行い、その吸収率の変動係数として求めることができる。変動係数は母集団の標準偏差の平均値に対する比で、百分率で表す。
【００２５】
＜細胞培養＞
本発明の基板は、好ましくは細胞培養に用いることができる。本発明の基板を用いた培養に用いられる細胞の種類に特に限定はないが、例えば脊椎動物由来の細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、肝実質細胞、繊維芽細胞、小腸上皮細胞、表皮角化細胞、心筋細胞、骨芽細胞、骨髄間葉細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞など接着性を有する細胞が挙げられる。細胞を培養する際には、通常、細胞濃度1x101〜5ｘ105セル／平方センチで播種される。好ましくは、1x102〜１ｘ105セル／平方センチで播種される。細胞の培養条件は、培養する細胞の種類に応じて適宜選択が可能であり、使用する培養液は例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地，HamF10培地などが挙げられる。培養中の温度は基板上の化合物が疎水的な性質を発現する条件で行なう。培養後は、温度を低下させて、基板上の化合物をより親水的にすることで細胞を剥離することができる。剥離に際しては、国際公開ＷＯ２００２／８３８７号公報あるいは国際公開ＷＯ２００２／１０３４９号公報に記載されているような高分子膜を利用してもよい。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１：
和光純薬製リボフラビン0.002％水溶液に、アルドリッチ社製のｎ−イソプロピルアクリルアミドを溶解して１０重量％の水溶液を得た。シャーレ内に直径８ｃｍのＰＥＴフイルム（50.2cm2：富士写真フイルム製）を浸漬し、ＰＥＴ表面のモノマー量が20mg/cm2となるようにした。シャーレ上部より、ウシオ電機株式会社製の紫外線露光装置（光源水銀灯）を用いて光照射を行った。この際に、ＰＥＴフイルム表面に照射される光の３６０ｎｍでの強度分布が１０％以下となるように調整した。照射時間を表１に示すように変化させることで、重合量およびＰＥＴフイルムへの固定化量を制御した。光照射後、ＰＥＴフイルムをシャーレより取り出し、水洗して、モノマーおよび固定化されていないｎ−イソプロピルアクリルアミドを除去した。除去後自然乾燥した。
【００２８】
得られたＰＥＴシートについてＦＴＩＲ／ＡＴＲ法を用いて1590cm-1をベースとした1650cm-1の吸収率より求めた。予め既知の量のポリマーをキャスティングコーとした試料を参照として、吸収率より固定化量を算出した。
【００２９】
さらに、1cm2あたり10点測定を行い、吸収率の面内変動係数を求めた。結果を表１に示した。
【００３０】
【表１】
2008104412.tif 000002
【００３１】
表１に示すように、水銀灯からの光照射という簡便な方法により、大面積でも変動係数３０％以下の被覆層を有する基板が得られた。
【００３２】
実施例２
実施例１と同様にリボフラビン0.002％水溶液にｎ−イソプロピルアクリルアミドを溶解して５重量％のモノマー水溶液を得た。シャーレ内に１０ｃｍ角のＰＥＴフイルム（100cm2：富士写真フイルム製）を浸漬し、ＰＥＴ表面のモノマー量が５mg/cm2となるようにした。シャーレ上部より、波長２６６ｎｍの連続発信レーザー光により走査露光を行った。走査時間を変化させることで、重合量およびＰＥＴフイルムへの固定化量を制御した。光照射後、ＰＥＴフイルムをシャーレより取り出し、水洗して、モノマーおよび固定化されていないｎ−イソプロピルアクリルアミドを除去した。除去後自然乾燥した。
【００３３】
得られたＰＥＴシートについてＦＴＩＲ／ＡＴＲ法を用いて1590cm-1をベースとした1650cm-1の吸収率より求めた。予め既知の量のポリマーをキャスティングコートした試料を参照として、吸収率より固定化量を算出した。
【００３４】
さらに、1cm2あたり10点測定を行い、吸収率の面内変動係数を求めた。結果を表２に示した。
【００３５】
【表２】
2008104412.tif 000003
【００３６】
表２に示すように、短時間に大面積で均一な固定化ができた。
【００３７】
実施例３：細胞培養
実施例１および実施例２で作成した試料１−１から１−５および２−１から２−５をＵＶ照射により滅菌した。滅菌した試料をシャーレにいれ、１０％ＦＢＳおよびペニシリンストレプトマイシンを含むＭＥＭ培地中で、試料１ｃｍ2あたりに、３×１０4個のマウス血管内皮細胞を播種し、３７℃で３日間培養した。培養後、電顕観察により細胞の付着および増殖状況を観察した。さらに、温度を２２℃に低下させて、３０分後の細胞の剥離状況を観察した。実験は各試料について複数回行った。結果を表３に示した。
【００３８】
【表３】
2008104412.tif 000004
【００３９】
表３に示すように、本発明の試料は細胞の付着と増殖が観測され、かつ低温にすることで剥離できることがわかった。特に、モノマーを励起しないレーザー露光を行って調製した試料は、付着、増殖が良好でかつほとんど全ての細胞が剥離できることがわかった。