(57)【要約】【課題】  有用物質の生産菌から有用物質を抽出する工程において溶菌力に優れ、かつ、工程中の有用物質の変質が少ない有用物質の生産方法を提供する。【解決手段】  対イオンがカルボキシレートアニオンであるカチオン性界面活性剤と加水分解酵素を使用する有用物質の生産方法であって、特に加水分解酵素がリゾチームであることが好ましい。カルボキシレートアニオン（ａ）は、２〜８価の多価カルボン酸のカルボキシレートアニオンが好ましい。有用物質としてはタンパク質、アミノ酸、核酸、抗生物質、抗体、糖類またはビタミン類が挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物から有用物質を生産する方法において、対イオンがカルボキシレートアニオン（ａ）であるカチオン性界面活性剤（Ａ）と、加水分解酵素（Ｂ）を使用することを特徴とする有用物質を生産する方法。
【請求項２】
該加水分解酵素（Ｂ）がリゾチームである請求項１記載の生産方法。
【請求項３】
該カチオン性界面活性剤（Ａ）が、第４級アンモニウム塩型活性剤である請求項１または２記載の生産方法。
【請求項４】
該カルボキシレートアニオン（ａ）が、２〜８価の多価カルボン酸のカルボキシレートアニオンである請求項１〜３いずれか記載の生産方法。
【請求項５】
有用物質が、タンパク質、アミノ酸、核酸、抗生物質、抗体、糖類またはビタミン類である請求項１〜４いずれか記載の生産方法。
【請求項６】
請求項５記載の生産方法によって生産されたタンパク質、アミノ酸、核酸、抗生物質、抗体、糖類またはビタミン類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用物質生産菌からタンパク質などの有用物質を抽出する際に使用される有用物質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物は、アミノ酸、タンパク質などの有用物質を生産するための宿主として広く利用されている。特に近年は、遺伝子工学技術を活用して、産業上有用なタンパク質の遺伝子を導入した形質転換された微生物を使用し、有用物質を効率的に製造する技術が知られるようになっている。
有用物質を生産する好ましい微生物の例として、大腸菌やシュードモナス属菌などのグラム陰性菌、バチルス属菌や乳酸菌などのグラム陽性菌、サッカロマイセス属やキャンディダ属などの酵母、アスペルギウス属やペニシリウム属などの糸状菌、ストレプトマイセス属やロドコッカス属などの放線菌を挙げることができる。
タンパク質などの有用物質の精製における第１の段階は、これらの有用物質を生産する細胞を溶解して、細胞成分を遊離させる段階である。
【０００３】
細胞の溶解方法には、物理的方法と化学的方法がある。このうち化学的細胞溶解法としては、界面活性剤を用いて細胞膜または細胞壁の完全性を破壊する方法がある。
提案されている非イオン性界面活性剤としては、糖鎖を有する非イオン性界面活性剤、アルキルアミンエチレンオキサイド付加物およびソルビタン脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物などがある。
イオン性界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤（例えば特許文献１）、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤（例えば特許文献２、３）が提案されている。
【０００４】
しかしながら、従来の非イオン性界面活性剤を用いる方法では溶菌力が不十分であるため大量合成には適さず、また、従来のイオン性界面活性剤を用いた方法では抽出されたタンパク質などの有用物質が変性してしまい、３次元コンホメーションを崩してしまうという問題点があった。
そこで本発明者らは、溶菌力に優れ、かつタンパク質などの有用物質を変性させにくい特定の化学構造のカチオン性界面活性剤を見いだした（特許文献４）。
【特許文献１】特開２００２−３３５９６９号公報
【特許文献２】特開２００２−１９９８８５号公報
【特許文献３】特開平５−６４５８４号公報
【特許文献４】特開２００６−３２０３１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、近年、菌による汚染防止の観点から、さらに高いレベルの溶菌性が望まれている。さらに微生物の種類によっては細胞壁が厚いものもあり、例えば酵母の場合、溶菌力が不十分で有用物質を完全に抽出できないという課題がある。そこで、さらに高いレベルの溶菌力を持ち、かつ有用物質を変性させずに抽出し高収率で生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の課題を解決するため鋭意検討した結果、対イオンをカルボキシレートアニオンとするカチオン性界面活性剤と加水分解酵素を併用することにより、それぞれの単独使用に比べてはるかに溶菌力に優れ、かつ、有用物質を変性させずに、高品質の有用物質を遊離、抽出することができる微生物による有用物質の生産方法を見出し、本発明に至った。
すなわち本発明は、対イオンがカルボキシレートアニオンであるカチオン性界面活性剤と加水分解酵素を使用して有用物質生産菌から有用物質を生産する方法、および該生産方法によって生産された有用物質である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の有用物質の生産方法は、特に大腸菌等の有用物質生産菌から有用物質を抽出するための生産方法として、従来よりも改善された溶菌力を有しており、また、従来よりも有用物質を変性することが少ない。
従って、高品質の有用物質、例えば、変性の程度が少なくて活性の高い酵素などを得ることができる。また、糖類などの生産性も良好である。さらに本発明の生産方法は、特に酵母等の細胞壁が厚い微生物に対して、従来より高い溶菌力を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の溶菌作用を発揮する必須成分は、対イオンがカルボキシレートアニオンであり、そのカチオン部分に疎水性基を有するカチオン性界面活性剤（Ａ）と、加水分解酵素（Ｂ）の２つである。
【０００９】
本発明の必須成分のカチオン性界面活性剤（Ａ）中の対イオンは、１価カルボン酸、または多価カルボン酸から構成されるカルボキシレートアニオンが好ましい。このカルボキシレートアニオンは、カルボン酸からプロトンを除いた−ＣＯＯ−イオンを有するイオンである。
【００１０】
カルボキシレートアニオンを構成するカルボン酸としては、以下の１価カルボン酸および多価カルボン酸があげられる。
【００１１】
１価カルボン酸
脂肪族飽和モノカルボン酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ベラルゴン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、２−エチルヘキサン酸など）；脂肪族不飽和モノカルボン酸（オレイン酸など）；脂肪族オキシモノカルボン酸（グリコール酸、乳酸、グルコン酸など）；アミノ酸（グリシン、アラニン、ロイシンなど）などが挙げられる。
【００１２】
多価カルボン酸
脂肪族飽和ジカルボン酸（シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、
ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸など）；脂肪族オキシジカルボン酸（ｄ−酒石酸など）；アミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸など）；脂肪族不飽和ジカルボン酸（マレイン酸、フマール酸、イタコン酸など）；芳香族ジカルボン酸（フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸など）；トリカルボン酸（トリメリット酸、クエン酸など）；テトラカルボン酸（ピロメリット酸、ブタンテトラカルボン酸、シクロペンタンテトラカルボン酸、エチレンジアミン四酢酸など）；ペンタカルボン酸（ジエチレントリアミン五酢酸など）などが挙げられる。
【００１３】
これらのうち好ましいのは、タンパク質などの変性されにくさの観点から多価カルボン酸であり、さらに好ましいのは２〜８価の多価カルボン酸、特に好ましいのはトリカルボン酸およびテトラカルボン酸、最も好ましいのはテトラカルボン酸である。
【００１４】
カチオン部分としては以下の第４級アンモニウムカチオン（ｑ１）およびアミン塩型カチオン（ｑ２）が挙げられる。
溶菌力の観点から好ましいのは第４級アンモニウムカチオン（ｑ１）である。
【００１５】
第４級アンモニウムカチオン（ｑ１）としては、例えば、一般式（１）で示される化合物が挙げられる。
【００１６】
【化１】
2008199958.tif 000002
【００１７】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、炭素数が１〜２２の直鎖または分岐の炭化水素基であって、Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１個は炭素数６以上の炭化水素基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００１８】
第４級アンモニウムカチオン（ｑ１）中のＲ1〜Ｒ4で示される炭化水素基としては、脂肪族炭化水素基および芳香族炭化水素基が挙げられる。
【００１９】
脂肪族炭化水素基としては、直鎖又は分岐のアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、ｉ−、ｓｅｃ−、およびｔ−ブチル基、２−メチルブチル基、２，２−ジメチルプロピル基、３−メチルブチル基、２−エチルヘキシル基など）およびアルケニル基（ビニル基、アリル基、メタリル基、など）が挙げられる。
【００２０】
芳香族炭化水素基としては、フェニル基、アリールアルキル基（ベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基など）およびアルキルアリール基（メチルフェニル基、エチルフェニル基、オクチルフェニル基、ノニルフェニル基、デシルフェニル基、ドデシルフェニル基など）が挙げられる。
【００２１】
Ｒ1〜Ｒ4の炭化水素基の好ましい組み合わせとしては、以下の（ｑ１１）〜（ｑ１４）が挙げられる。
（ｑ１１）１個のみが炭素数６〜２２の脂肪族炭化水素基であって、他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
ドデシルトリメチルアンモニウム、テトラデシルトリメチルアンモニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、オクタデシルトリメチルアンモニウム、ドデシルジメチルエチルアンモニウム、テトラデシルジメチルエチルアンモニウム、ヘキサデシルジメチルエチ
ルアンモニウム、オクタデシルジメチルエチルアンモニウム、ドデシルメチルジエチルアンモニウム、テトラデシルメチルジエチルアンモニウム、ヘキサデシルメチルジエチルアンモニウムおよびオクタデシルメチルジエチルアンモニウムなど。
【００２２】
（ｑ１２）２個のみが炭素数６〜２２の脂肪族炭化水素基であって、他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
オクチルデシルジメチルアンモニウム、ジオクチルジメチルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウム、デシルドデシルジメチルアンモニウム、ジドデシルジメチルアンモニウム、オクチルデシルメチルエチルアンモニウム、ジオクチルメチルエチルアンモニウム、ジデシルメチルエチルアンモニウム、ジドデシルメチルエチルアンモニウム、ジデシルメチルプロピルアンモニウム、ジドデシルエチルプロピルアンモニウムおよびジステアリルジメチルアンモニウムなど
【００２３】
（ｑ１３）１個のみが炭素数６〜２２の芳香族炭化水素基であって、他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
ベンジルトリメチルアンモニウム、ベンジルトリエチルアンモニウム、ベンジルトリプロピルアンモニウムおよびベンジルエチルジメチルアンモニウムなど。
【００２４】
（ｑ１４）１個のみが炭素数６〜２２の脂肪族炭化水素基、１個のみが炭素数６〜２２の芳香族炭化水素基かつ、他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
デシルジメチルベンジルアンモニウム、ドデシルジメチルベンジルアンモニウム、テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム、ヘキサデシルジメチルベンジルアンモニウムおよびヤシ油アルキルジメチルベンジルアンモニウムなど。
【００２５】
これらの（ｑ１）のうち、溶菌力の観点から、好ましいのは（ｑ１２）、さらに好ましいのはＲ1〜Ｒ4のうちの２個が炭素数８〜１４のアルキル基であるものである。
【００２６】
一方、アミン塩型カチオン（ｑ２）としては、１〜３級アミン塩型カチオンが挙げられる。
【００２７】
１級アミンカチオンを構成する１級アミンとしては、炭素数６〜１８のモノアルキルもしくはシクロアルキルアミン（例えばモノヘキシルアミン、モノシクロヘキシルアミン、モノオクチルアミンおよびモノドデシルアミンなど）が挙げられる。
２級アミンカチオンを構成する２級アミンとしては、少なくとも１個のアルキル基の炭素数が６〜１８のジアルキルアミン（例えばヘキシルメチルアミン、オクチルエチルアミンおよびメチルドデシルアミンなど）が挙げられる。
３級アミンカチオンを構成する３級アミンとしては、少なくとも１個のアルキル基の炭素数がトリアルキルアミン（例えばジメチルドデシルアミンなど）が挙げられる。
【００２８】
本発明におけるカチオン性界面活性剤（Ａ）の製造方法は、例えば、以下の３つの方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）第４級アンモニウムカチオンのアルキル炭酸塩と当量のカルボン酸（ａ0）を加えて、６０〜１００℃で３〜２０時間撹拌して反応させて塩交換し、その後、精製する方法。アルキル炭酸塩のアルキル基は炭素数１〜４のアルキル基、例えばメチル基、エチル基、プロピル基およびブチル基があげられる。
（２）４級アンモニウムハロゲン化物をカルボン酸の強塩基性塩で塩交換し、その後、精製する方法。カルボン酸の強塩基性塩としてはカルボン酸のアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）、アンモニウム塩およびアミン塩などが挙げられる。
（３）４級アンモニウム水酸化物をカルボン酸の強塩基性塩で塩交換し、その後、精製する方法。カルボン酸の強塩基性塩としてはカルボン酸のアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）、アンモニウム塩およびアミン塩などが挙げられる。
【００２９】
本発明のカチオン性界面活性剤（Ａ）は、使用に当たっては、必須成分である上記のカチオン性界面活性剤（Ａ）をそのまま使用してもよいし、必要により水で希釈して、水溶液状または水分散液状の水性希釈液として用いることができる。
水性希釈液における、水以外の成分の濃度は、対象となる菌体、有用物質の種類および抽出方法の種類によって適宜選択されるが、０．０１〜９９．９％、好ましくは０．１〜５０％である。
【００３０】
本発明のもう１つの必須成分である加水分解酵素（Ｂ）は、微生物の細胞膜または細胞壁もしくは両方を分解できる酵素であれば特に限定するものではない。
微生物の細胞膜や細胞壁を分解する能力の観点から、例えばリゾチーム、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、リパーゼなどの加水分解酵素が挙げられる。これらのうち、リゾチームが特に好ましい。
【００３１】
本発明の加水分解酵素（Ｂ）の添加量は、対象となる菌体、有用物質の種類および抽出方法の種類によって適宜選択されるが、１ｐｐｍ〜５％、好ましくは１０ｐｐｍ〜１％である。
【００３２】
本発明において、カチオン性界面活性剤（Ａ）と加水分解酵素（Ｂ）はどちらを先に微生物に作用させてもよく、混合物として同時に作用させてもよいが、溶菌性の観点からは、加水分解酵素を先に作用させ、その後カチオン性界面活性剤を作用させる方が好ましい。
【００３３】
本発明の有用物の生産方法において、カチオン性界面活性剤（Ａ）と加水分解酵素（Ｂ）による微生物の処理に当たっては、必須成分である上記のカチオン性界面活性剤（Ａ）と加水分解酵素（Ｂ）以外に、本発明の効果を阻害しない範囲において、有機溶剤（Ｃ）、他の界面活性剤（Ｄ）、溶解性安定化剤（Ｅ）の一部または全部をさらに予め含有していてもよいし、使用時に別途これらを適宜配合して使用してもよい。
【００３４】
カチオン性界面活性剤（Ａ）の水への溶解性を上げるため、必要により、水と相溶性のある有機溶剤（Ｃ）を加えてもよい。
この水と相溶性のある有機溶剤（Ｃ）としては、脂肪族アルコール系溶剤（メタノール、エタノールなど）、ケトン系溶剤（アセトン、メチルエチルケトンなど）、およびカルボン酸エステル系溶剤（酢酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸メチルなど）が挙げられる。
有機溶剤（Ｃ）の使用割合は、溶菌剤の重量に基づいて好ましくは１０重量％以下、さらに好ましくは５％以下（以下、特に限定しない限り％は重量％を表す）、特に好ましくは３％以下である。
【００３５】
本発明の生産方法において、溶菌性をさらに上げるために、必須成分のカチオン性界面活性剤（Ａ）と加水分解酵素（Ｂ）以外に、相乗効果のある他の界面活性剤（Ｄ）を適宜加えることができる。
この目的で使用する他の界面活性剤（Ｄ）としては、以下の非イオン性界面活性剤（Ｄ１）、（Ａ）以外のカチオン性界面活性剤（Ｄ２）、アニオン性界面活性剤（Ｄ３）、および両性界面活性剤（Ｄ４）から選ばれる１種以上が挙げられる。
【００３６】
非イオン性界面活性剤（Ｄ１）
（Ｄ１１）高級アルコールアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記する。）付加物：
炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコールおよびオレイルアルコールなど）のエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）１〜２０モルおよび／またはプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記）１〜２０モル付加物（ブロック付加物および／またはランダム付加物を含む。以下同様）［例えば、デシルアルコールのＥＯ８モル／ＰＯ７モルブロック付加物］が挙げられる。
【００３７】
（Ｄ１２）炭素数６〜２４のアルキルを有するアルキルフェノールのＡＯ付加物：
オクチルもしくはノニルフェノールのＥＯ１〜２０モルおよび／またはＰＯ１〜２０モ
ル付加物（例えば、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００およびＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１１４など）が挙げられる。
【００３８】
（Ｄ１３）ポリプロピレングリコールＥＯ付加物およびポリエチレングリコールＰＯ付加物：
プルロニック型界面活性剤などが挙げられる。
【００３９】
（Ｄ１４）脂肪酸ＡＯ付加物：
炭素数８〜２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸およびヤシ油脂肪酸など）のＥＯ１〜２０モルおよび／またはＰＯ１〜２０モル付加物などが挙げられる。
【００４０】
（Ｄ１5）多価アルコール型非イオン性界面活性剤：
炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビットおよびソルビタンなど）のＥＯおよび／またはＰＯ付加物；前記多価アルコールの脂肪酸エステルおよびそのＥＯ付加物（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０およびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０など）；アルキルグルコシド（例えば、Ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデカノイルスクロース、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドなど）；並びに、砂糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミドおよびこれらのＡＯ付加物（ポリオキシエチレン脂肪酸アルカノールアミドなど）；が挙げられ、脂肪酸としては前記のものが挙げられる。
【００４１】
（Ａ）以外のカチオン性界面活性剤（Ｄ２）としては、対イオンとしてハロゲンアニオン、ヒドロキシアニオン、アルキル硫酸アニオンおよび超強酸アニオンから選ばれる１種以上の対イオンを有するカチオン性界面活性剤が挙げられる。
ハロゲンアニオンとしては、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオンなど、アルキル硫酸アニオンとしてはメチル硫酸イオン、エチル硫酸イオンなど、超強酸アニオンとしてはテトラフルオロホウ素酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオンなどが挙げられる。
なお、（Ｄ２）を構成するカチオン部分は、（Ａ）で挙げたものと同様のカチオン部分が挙げられる。
（Ｄ２）の具体例として、塩化ベンザルコニウムおよび臭化セチルトリメチルアンモニウムなどが挙げられる。
【００４２】
アニオン性界面活性剤（Ｄ３）としては、炭素数８〜２４の炭化水素基を有する、エーテルカルボン酸またはその塩、硫酸エステルもしくはエーテル硫酸エステルおよびそれらの塩、スルホン酸塩、スルホコハク酸塩、リン酸エステルもしくはエーテルリン酸エステルおよびそれらの塩、脂肪酸塩、アシル化アミノ酸塩、並びに天然由来のカルボン酸およびその塩（例えばケノデオキシコール酸、コール酸およびデオキシコール酸など）が挙げられる。
【００４３】
両性界面活性剤（Ｄ４）としては、ベタイン型両性界面活性剤およびアミノ酸型両性界面活性剤が挙げられる。
具体的には、アミドスルホベタイン、コールアミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、コールアミドプロピルジメチルアンモニオ２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、カルボキシベタイン、ラウロイルサルコシンおよびメチルベタインが挙げられる。
【００４４】
これらの他の界面活性剤（Ｄ）のうち、必須成分のカチオン性界面活性剤（Ａ）と併用して溶菌性が向上する点で好ましいのは、非イオン性界面活性剤（Ｄ１）である。さらに多価アルコール型非イオン性界面活性剤（Ｄ１５）  が好ましく、多価アルコールの脂肪酸エステルおよびそのＥＯ付加物が特に好ましく、ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０が最も好ましい。
【００４５】
他の界面活性剤（Ｄ）の使用割合は、タンパク質の変性されにくさの観点から、溶菌剤の重量に基づいて好ましくは６０％以下、さらに好ましくは４０％以下、特に好ましくは２０％以下である。
また、（Ａ）の含有量に基づく（Ｄ）の含有量は、タンパク質の変性されにくさの観点から、好ましくは６０％以下、さらに好ましくは４０％以下である。
タンパク質の変性されにくさの観点から、（Ａ）の重量に基づく（Ｄ１）〜（Ｄ４）の含有量は以下の通りである。
（Ｄ１）は、好ましくは５０％以下、さらに好ましくは３０％以下、（Ｄ２）は、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、（Ｄ３）は、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、（Ｄ４）は、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下である。
【００４６】
必須成分のカチオン性界面活性剤（Ａ）の水への溶解性およびその水溶液の溶液の安定化剤（Ｅ）としてはキレート剤、有機酸およびその塩、多価アルコールがあげられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩、ポリリン酸およびその塩、メタリン酸およびその塩があげられる。
有機酸およびその塩としては、乳酸およびその塩、ヒアルロン酸およびその塩等があげられる。
多価アルコールとしては、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ペンタエリスリトール、キシリトール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールなどがあげられる。
これらの中で、溶解性の向上の観点から、多価アルコールが好ましく、さらに好ましくはグリセリンである。
【００４７】
本発明の溶菌剤における各成分の重量比（Ａ）／（Ｃ）／（Ｄ）／（Ｅ）は、タンパク質の変性のしにくさの観点から、好ましくは２０〜１００／０〜１０／０〜３０／０〜７０、さらに好ましくは３０〜１００／０〜５／０〜２５／０〜６０、特に好ましくは４０〜１００／０〜３／０〜２０／０〜５０である。
【００４８】
本発明の微生物による有用物質の生産方法で得られる有用物質は、上記の方法で得られるため、従来よりも純度が高く、また溶菌力に優れているので高い収量を得ることができる。
本発明の微生物による有用物質の生産方法としては、例えば、有用物質が組み換えタンパク質の場合、以下のような順序の工程による生産方法が挙げられる。
（１）タンパク質の培養工程：
大腸菌などのタンパク質生産体に組み換えタンパク質を培養させる。
（２）タンパク質の取り出し工程：
カチオン性界面活性剤および加水分解酵素の使用によってタンパク質生産体内のインクルージョンボディを取り出す。
（３）アンフォールディング工程：
インクルージョンボディ懸濁液（例えば１０ｍｇタンパク質／ｍＬ）に０．５モル／Ｌ以上のアンフォールディング剤および２０ミリモル／Ｌ以下の還元剤を加え軽くかきまぜ室温で数時間放置する。
（４）リフォールディング工程：
アンフォールディングされたタンパク質懸濁液に、０．２〜６モル／Ｌの濃度になるようにリフォールディング剤を加えて軽くかき混ぜ、室温で１晩放置する。またはリフォールディングバッファーで大希釈することによりリフォールディングを行う。
（５）分離・取り出し工程：
懸濁液から目的とする正常なタンパク質をカラムクロマトグラフィーなどによって分離して取り出す。
【００４９】
上記の（１）のタンパク質の培養工程におけるタンパク質生産体としては、以下の細菌細胞などが挙げられる。
細菌細胞としては、連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス属菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、真菌細胞：例えば酵母細胞およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞、昆虫細胞：例えばドロソフィラＳ２（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２）、スポドプテラＳf９（
ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）細胞、動物細胞：例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Ｂｏｗｓ）メラノーマ細胞、ならびに植物細胞等が挙げられる。
【００５０】
エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の具体例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０巻、１６０頁（１９６８年）を参照〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９巻、３０９頁（１９８１年）を参照〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）１２０巻、５１７頁（１９７８年）を参照〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）４１巻、４５９頁（１９６９年）を参照〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）３９巻、４４０頁（１９５４年）を参照〕、ＭＭ２９４〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２１７巻、１１１０頁（１９６８年）を参照〕などが挙げられる。
【００５１】
バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の具体例としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン、２４巻、２５５頁（１９８３年）を参照〕、２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５巻、８７頁（１９８４年）を参照〕などが挙げられる。
【００５２】
組み換えタンパク質の生産方法としては、具体的に次の方法がある。
（ｉ）目的タンパク産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込む。
（ｉｉ）得られた組み換えファージまたはプラスミドで宿主を形質転換し、培養後、目的タンパクの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する。
（ｉｉｉ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切りだし、該クローン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。
その後、適当な方法により、宿主を発現ベクターで形質転換し培養する。培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要により通気、攪拌を加えることもできる。
【００５３】
上記の（２）のタンパク質の取り出し工程では、例えば大腸菌の場合、本発明の生産方法を用いて、外膜のリン脂質層や内膜のペプチドグリカン層を溶解するまたは一部破壊することによって菌体内に生産されたインクルージョンボディを取り出す。
【００５４】
上記の（３）のアンフォールディング工程では、本発明の溶菌剤を用いたあとに、アンフォールディング剤でタンパクの３次元構造を崩してアンフォールディング）を行うアンフォールディング工程において使用されるアンフォールディング剤としては、塩酸グアニジン、尿素およびこれらの併用などが挙げられる。
なお、タンパク質が、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質である場合には、還元剤として塩酸グアニジンおよび／または尿素以外に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチ
オスレイトール、シスチンまたはチオフェノールなどを加えてもよい。
【００５５】
上記の（４）のリフォールディング工程におけるタンパク質のリフォールディング方法は、希釈法、透析法、界面活性剤利用法、人工シャペロン利用法および特願２００５−２３５９８０記載の方法いずれの方法でもリフォールディングすることができる。特に特願２００５−２３５９８０記載の方法は生産性・汎用性の観点から好ましい。
【００５６】
上記の（５）のタンパク質の分離・取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としては、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド、ビニルポリマーなどが挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等があり入手可能である。
【００５７】
本発明の有用物質の生産方法における有用物質としては、タンパク質（Ｐ１）、アミノ酸（Ｐ２）、核酸（Ｐ３）、抗生物質（Ｐ４）、抗体（Ｐ５）、糖類（Ｐ６）またはビタミン類（Ｐ７）が挙げられる。
【００５８】
タンパク質（Ｐ１）としては、酵素（Ｐ１−１）、組み換えタンパク質（Ｐ１−２）、ペプチド（Ｐ１−３）が挙げられる。
酵素（Ｐ１−１）としては、加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、転移酵素、合成酵素および脱離酵素などが挙げられる。
加水分解酵素としては、セルラーゼ、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、グルコアミラーゼなどが挙げられる。
異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼが挙げられる。
酸化還元酵素としては、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
転移酵素としては、アシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼなどが挙げられる。
合成酵素としては、脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ、クエン酸シンターゼなどが挙げられる。
脱離酵素としては、ペクチンリアーゼなどが挙げられる。
【００５９】
組み換えタンパク質（Ｐ１−２）としては、タンパク製剤、ワクチン等が挙げられる。
タンパク製剤としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第VIII因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン、カルシトニン等が挙げられる。
ワクチンとしては、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン等が挙げられる。
ペプチド（Ｐ１−３）としては、特にアミノ酸組成を限定するものではなく、ジペプチド、トリペプチドなどが挙げられる。
【００６０】
アミノ酸（Ｐ２）としては、例えばグルタミン酸、トリプトファン、アラニン、およびジペプチドなどが挙げられる。
核酸（Ｐ３）としてはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。
抗生物質（Ｐ４）としてはストレプトマイシンおよびバンコマイシンなどが挙げられる。
抗体（Ｐ５）としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が挙げられる。
糖類（Ｐ６）としては、ヒアルロン酸、アルブミン、セラミド、エリスリトール、トレハロース、リポ多糖およびシクロデキストリンなどが挙げられる。
ビタミン類（Ｐ７）としては、ビタミンＡ類およびそれらの誘導体並びにその塩、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２等のビタミンＢ類およびそれらの誘導体並びにその塩、ビタミンＣ類およびそれらの誘導体並びにその塩が挙げられる。
【００６１】
これらのうち本発明の有用物質の製造方法では、（Ｐ１）および（Ｐ２）、特に（Ｐ１）の生産に適している。
【００６２】
本発明の他の実施態様は、上記の有用物質産生方法で得られたタンパク質、アミノ酸、核酸、抗生物質、抗体、糖類またはビタミン類であり、例えば上記のものが挙げられる。
これらのうち好ましいのは（Ｐ１）、（Ｐ２）、および（Ｐ６）であり、特に（Ｐ１）および（Ｐ６）である。
【実施例】
【００６３】
以下の製造例、実施例、比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６４】
製造例１
５０ｍｌ三角フラスコに、ジデシルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩１６．０４ｇ（カチオン基として０．０４当量）を入れ、撹拌しながら、シクロペンタンテトラカルボン酸２．４６ｇ（カルボキシル基として０．０４当量）を少量ずつ加えた。撹拌機付き恒温槽で８０℃に加温しながら８時間撹拌し続けると、二酸化炭素およびメタノールが系外に放出され、ジデシルジメチルアンモニウムのシクロペンタンテトラカルボン酸塩１５．４９ｇ（収率９９．９％）を得た。
さらに、得られたカチオン活性剤５０部にグリセリン３０部、ＴＷＥＥＮ８０を２部、水１８部を加えて、本発明の実施例１および比較例１用のカチオン活性剤溶液を作成した。
【００６５】
製造例２
製造例１のシクロペンタンテトラカルボン酸をクエン酸に変更する以外は同様にして、ジデシルジメチルアンモニウムのクエン酸塩を得た後、グリセリン、ＴＷＥＥＮ８０、水を同様に加えて、本発明の実施例２および比較例２用のカチオン活性剤溶液を作成した。
【００６６】
製造例３
製造例１のシクロペンタンテトラカルボン酸をアジピン酸に変更する以外は同様にして、ジデシルジメチルアンモニウムのアジピン酸塩を得た後、グリセリン、ＴＷＥＥＮ８０、水を同様に加えて、本発明の実施例３および比較例３用のカチオン活性剤溶液を作成した。
【００６７】
製造例４
製造例１のシクロペンタンテトラカルボン酸を酢酸に変更する以外は同様にして、ジデシルジメチルアンモニウムの酢酸塩を得た後、グリセリン、ＴＷＥＥＮ８０、水を同様に加えて、本発明の実施例４および比較例４用のカチオン活性剤溶液を作成した。
【００６８】
製造例５
製造例１のジデシルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩をジステアリルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩に変更する以外は同様にして、ジステアリルジメチルアンモニウムのシクロペンタンテトラカルボン酸塩を得た後、グリセリン、ＴＷＥＥＮ８０、水を同様に加えて、本発明の実施例５および比較例５用のカチオン活性剤溶液を作成した。
【００６９】
実施例１〜５
製造例１〜５で作成したカチオン活性剤溶液と、リゾチームを使用して、（１）大腸菌に対する溶菌力、（２）タンパク質（セルラーゼ酵素）の変性のされにくさ、および（３）糖類（ヒアルロン酸）の生産性を評価した。
【００７０】
比較例１〜５
製造例１〜５で作成したカチオン活性剤溶液を使用して、比較の性能評価をおこなった。
【００７１】
比較例６〜８
比較用の活性剤溶液として、ラウリルアミンＥＯ２モル付加物のキシレン溶液（キシレンが７０％）、テトラデシルおよびペンタデシルアルコール混合物（重量比６／４）ＥＯ２モル付加物、および塩化ジデシルジメチルアンモニウムをそれぞれ使用し、比較の性能評価を行った。
【００７２】
比較例９
界面活性剤を併用しない比較用としてリゾチームのみを使用して、比較の性能評価をおこなった。
【００７３】
（１）大腸菌に対する溶菌力、（２）タンパク質（セルラーゼ酵素）の変性のされにくさ、および（３）糖類（ヒアルロン酸）の生産性の評価方法は以下の通りである。
＜溶菌力の評価方法＞
２ｍｌのスクリュー管に、大腸菌（Ｅ−ｃｏｌｉ）菌体溶液０．５ｍｌ、および１０００ｐｐｍリゾチーム水溶液を５０μｌ加え、２５℃で１時間放置した。その後、界面活性剤純分として５０％濃度になるように、希釈した界面活性剤水性希釈液５０μｌをマイクロピペットで加え、よく混合した。２０℃で３日間静置保存したものを試料として、超深度形状測定顕微鏡（KEYENCE社製、VK−８５００）で菌体数を測定した。あわせて、界面活性剤およびリゾチームをともに加えないブランクの菌体数も、３日間放置した大腸菌菌体溶液を試料として測定した。
比較例１〜８は１０００ｐｐｍリゾチーム水溶液を加えない以外は実施例と同様におこなった。比較例９は活性剤水性希釈液を加えない以外は実施例と同様におこなった。
溶菌力を以下の式で算出し、下記の判定基準で点数化した。
溶菌力（％）＝［１−（３日後の試料中の菌体数／ブランクの菌体数）］×１００
【００７４】
判定基準：
溶菌力：９０％以上・・・・・・・・・５点
：８０％以上、９０％未満・・・４点
：６０％以上、８０％未満・・・３点
：４０％以上、６０％未満・・・２点
：４０％未満・・・・・・・・・１点
その結果を表１に示す。
【００７５】
＜タンパク質の変性されにくさの評価方法＞
セルラーゼ酵素の変性度として評価した。
２ｍｌの遠心分離用チューブに、１％セチルメチルセルロース水分散液０．６ｍｌ、界面活性剤として０．２％濃度になるように希釈した界面活性剤水性希釈液０．６ｍｌ、２４０ｐｐｍリゾチーム１０μｌおよび、セルラーゼ（ナガセ社製、セルライザーHT）の１００ｐｐｍ水溶液を１０μｌ加え、手振り混合した。
３７℃で５分間静置後、遠心分離機（ベックマン社製Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ．１１）で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×３分）し、上層を分離して回収した。２０ｍｌ試験管に、上層０．２５ｍｌ、イオン交換水０．２５ｍｌおよび５％フェノール水溶液０．５ｍｌを入れて、混合した。
さらに濃硫酸を２．５ｍｌ加え、室温で１０分間静置後、混合し、その後２０分間２０℃で静置して試料溶液を得た。この試料溶液の４９０ｎｍにおける吸光度（セチルメチルセルロースが酵素で分解された生成物の吸収）を紫外可視分光光度計で測定した。ブランクには界面活性剤水希釈液とリゾチーム水溶液の混合溶液の代わりにイオン交換水０．６ｍｌを用いた。
比較例１〜８はリゾチーム水溶液を加えない以外は実施例と同様におこなった。比較例９は活性剤水性希釈液を加えない以外は実施例と同様におこなった。
溶菌程においてセルラーゼ（酵素）が変性されずに、活性が保たれて、セチルメチルセルロースが効率よく分解されている場合は、吸光度が大きくなる（ブランクに近い吸光度になる）。
タンパク質の変性されにくさは、以下の式で算出し、下記の判定基準で点数化した。
タンパク質の変性されにくさ（％）＝（試料溶液の吸光度／ブランクの吸光度）×１００
判定基準
タンパク質の変性されにくさ（％）が
９０％以上・・・・・・・５点
７０％以上、９０％未満・・・４点
５０％以上、７０％未満・・・３点
３０％以上、５０％未満・・・２点
３０％未満・・・・・・・１点
その結果を表１に示す。
【００７６】
＜糖類の生産性の評価方法＞
ヒアルロン酸の生産性として評価した。
グルコース５％、リン酸第１カリウム０．２％、ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％からなる培地１リットルを加熱殺菌後、ストレプトコッカス・ミュータンスを接種し、３７℃で撹拌下２日間培養した。
培養後の培地に、最終濃度１００ｐｐｍとなるようにリゾチームを加え、１時間撹拌し、次に最終濃度０．４重量％となるように各活性剤水性希釈液を加え、１時間攪拌し、遠心分離により菌体の破片をを除去した後、その上澄みを２回エタノール沈殿し、この沈殿を４０℃で真空乾燥し、精製ヒアルロン酸を得た。
糖類の生産性は、ヒアルロン酸の収量（ｇ／Ｌ）から、以下の判定基準を用いて点数化した。
判定基準
ヒアルロン酸の収量
：７（ｇ／Ｌ）以上・・・・・・・・・・・・５点
：５（ｇ／Ｌ）以上、７（ｇ／Ｌ）未満・・・４点
：４（ｇ／Ｌ）以上、５（ｇ／Ｌ）未満・・・３点
：３（ｇ／Ｌ）以上、４（ｇ／Ｌ）未満・・・２点
：３（ｇ／Ｌ）未満・・・・・・・・・・・・１点
結果を表１に示す。
【００７７】
【表１】
2008199958.tif 000003
【００７８】
表１の大腸菌に対する溶菌性の評価結果より、本発明の生産方法は、従来の界面活性剤、またはリゾチームのみを用いた従来の生産方法と比較して、溶菌性が極めて高く、さらに本発明者らが見出したカチオン性界面活性剤のみを用いた場合と比較しても、相加的効果にとどまらず、相乗効果により改良されているがわかる。
また、表１のヒアルロン酸の生産性の評価結果より、タンパク質に限らず糖類の生産性に関しても、本発明の生産方法は、従来の生産方法と比較して生産性が極めて高いことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の有用物質の生産方法は、タンパク質などの有用物質を生産菌から抽出する工程において使用できる。有用物質としては、タンパク質、アミノ酸、核酸、抗生物質、抗体、糖類またはビタミン類が挙げられる。また、本発明のカチオン性界面活性剤と加水分解酵素を併用する方法は細胞破壊して細胞を死滅させるための薬剤として利用することもできる。