(57)【要約】【課題】細胞の健全性を損なうことなく、短時間のうちに細胞懸濁液から赤血球を除去する。【解決手段】赤血球を含む細胞懸濁液に凍結保護材を添加する保護材添加ステップＳ１１と、凍結保護材が添加された細胞懸濁液を凍結させる凍結ステップＳ１２と、凍結された細胞懸濁液を融解させる融解ステップＳ３とを備える赤血球の除去方法を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球を含む細胞懸濁液に凍結保護材を添加する保護材添加ステップと、
前記凍結保護材が添加された細胞懸濁液を凍結させる凍結ステップと、
凍結された細胞懸濁液を融解させる融解ステップとを備える赤血球の除去方法。
【請求項２】
前記凍結保護材が、１〜２０％、好ましくは、５〜１０％のジメチルスルホキシドを含む培養液である請求項１に記載の赤血球の除去方法。
【請求項３】
前記凍結ステップが、−１℃／分または−８０℃以下の温度で凍結する請求項２に記載の赤血球の除去方法。
【請求項４】
配送元において、赤血球を含む細胞懸濁液に凍結保護材を添加する保護材添加ステップと、
前記凍結保護材が添加された細胞懸濁液を凍結させる凍結ステップと、
凍結された細胞懸濁液を輸送する輸送ステップと、
配送先において、凍結された細胞懸濁液を融解させる融解ステップとを備える細胞の配送方法。
【請求項５】
赤血球を含む細胞懸濁液に凍結保護材を添加する保護材添加ステップと、
前記凍結保護材が添加された細胞懸濁液を凍結させる凍結ステップとを備える赤血球を含む細胞の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤血球の除去方法、細胞の配送方法および細胞の保存方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞をフローサイトメトリで解析する際に、細胞懸濁液に含まれる赤血球が解析の邪魔になるため、塩化アンモニウム等の溶血剤を用いて赤血球を溶血除去することが行われている（例えば、特許文献１、特許文献２参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特開平８−１２９０１２号公報
【特許文献２】特開２００６−３０８５７４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１および特許文献２のように、溶血剤を使用して赤血球を除去する方法は、溶血剤を添加してから赤血球が除去されるまでに３０分以上の時間を要するという不都合がある。また、溶血剤は細胞に対しても損傷を与える可能性があり、細胞の健全性が損なわれるという問題もある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞の健全性を損なうことなく、短時間のうちに細胞懸濁液から赤血球を除去することができる赤血球の除去方法、細胞の配送方法および細胞の保存方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、赤血球を含む細胞懸濁液に凍結保護材を添加する保護材添加ステップと、前記凍結保護材が添加された細胞懸濁液を凍結させる凍結ステップと、凍結された細胞懸濁液を融解させる融解ステップとを備える赤血球の除去方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、保護材添加ステップにおいて赤血球を含む細胞懸濁液に凍結保護材を添加した後、凍結ステップにおいて細胞懸濁液を凍結することにより、細胞の細胞膜が凍結から保護される一方、赤血球の細胞膜は損傷する。その後、凍結された細胞懸濁液を融解ステップにおいて融解することにより、凍結で損傷を受けた赤血球が溶血され、細胞懸濁液から除去される。
ここで、赤血球を含む細胞とは、全血、骨髄液あるいは組織から分離した細胞等である。
【０００８】
上記発明においては、前記凍結保護材が、１〜２０％、好ましくは５〜１０％のジメチルスルホキシドを含む培養液であることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記凍結ステップが、−１℃／分または−８０℃以下の温度で凍結することとしてもよい。
【０００９】
また、本発明は、配送元において、赤血球を含む細胞懸濁液に凍結保護材を添加する保護材添加ステップと、前記凍結保護材が添加された細胞懸濁液を凍結させる凍結ステップと、凍結された細胞懸濁液を輸送する輸送ステップと、配送先において、凍結された細胞懸濁液を融解させる融解ステップとを備える細胞の配送方法を提供する。
【００１０】
本発明によれば、配送元においては、保護材添加ステップにおいて赤血球を含む細胞懸濁液に凍結保護材が添加された後、凍結ステップにおいて凍結される。これにより、細胞を保護しつつ、赤血球を凍結させることができる。輸送ステップにおいては細胞懸濁液が凍結された状態で輸送される。そして、配送先においては、凍結されていた細胞懸濁液が融解される。これにより、赤血球を溶血させるとともに、細胞を健全な状態に回復することができる。
【００１１】
また、本発明は、赤血球を含む細胞懸濁液に凍結保護材を添加する保護材添加ステップと、前記凍結保護材が添加された細胞懸濁液を凍結させる凍結ステップとを備える赤血球を含む細胞の保存方法を提供する。
本発明によれば、保護材を添加した細胞懸濁液を凍結することにより、長時間にわたり細胞の健全な状態を維持しつつ細胞を保存することが可能となる。そして、保存された細胞は解凍することにより、細胞懸濁液内の赤血球を溶血して除去し、赤血球を含まない細胞を簡単に得ることができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、細胞の健全性を損なうことなく、短時間のうちに細胞懸濁液から赤血球を除去することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の一実施形態に係る赤血球の除去方法および細胞の配送方法について、図１および図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞の配送方法は、例えば、フローサイトメトリによる検査等を行うサンプルを輸送する際の配送方法であって、配送元における前処理Ｓ１と、輸送Ｓ２と、配送先における後処理Ｓ３とを含んでいる。
【００１４】
配送元における前処理Ｓ１は、採取された全血、骨髄液あるいは組織から分離された細胞等の赤血球を含む細胞の懸濁液に、凍結保護材を添加する保護材添加ステップＳ１１と、凍結保護材が添加された細胞懸濁液を凍結する凍結ステップＳ１２とを備えている。
凍結保護材としては、５〜１０％ジメチルスルホキシドを含む培養液（血清を含む）または市販の細胞用の凍結保護試薬（例えば、日本全薬工業株式会社製「セルバンカー」：登録商標）を採用することができる。
【００１５】
前記凍結ステップＳ１２は、例えば、プログラムフリーザにより−１℃／分で凍結する。あるいは、冷凍庫、液体窒素等により−８０℃以下の温度下に配することにより凍結する。
前記輸送Ｓ２は、前記凍結ステップＳ１２において凍結されたままの状態で輸送する輸送ステップである（以下、輸送ステップＳ２という。）。
【００１６】
また、配送先における後処理Ｓ３は、輸送されてきた凍結細胞懸濁液を解凍する解凍ステップである（以下、解凍ステップＳ３という。）。
解凍ステップＳ３は、３７℃で急速解凍することが最も好ましいが、室温で解凍することとしてもよい。
【００１７】
また、本実施形態に係る赤血球の除去方法は、凍結保護材を添加する上記保護材添加ステップＳ１１と、細胞懸濁液を凍結させる上記凍結ステップＳ１２と、凍結された細胞懸濁液を融解させる上記融解ステップＳ３とを備えている。
本実施形態に係る赤血球の除去方法によれば、凍結ステップＳ１２および融解ステップＳ３により、細胞懸濁液内に含まれる赤血球が溶血される。これにより、細胞懸濁液内の赤血球を容易に除去することができる。
【００１８】
この場合において、保護材添加ステップＳ１１において凍結保護材を添加しているので、凍結ステップＳ１１および融解ステップＳ３を行っても、細胞懸濁液内の細胞は健全な状態に維持することができる。したがって、赤血球のみを効率的に除去することができる。
【００１９】
従来、塩化アンモニウム等の溶血剤を細胞懸濁液に添加して行っていた溶血処理と比較すると、フローサイトメトリによる検査可能な状態となるまでの時間を大幅に短縮することができる。また、塩化アンモニウム等の溶血剤は、赤血球以外の必要な細胞に対しても悪影響を与え、細胞の健全性を害する可能性があるが、本実施形態においてはそのような不都合がなく、細胞の健全性を維持したまま、赤血球を除去することができるという利点がある。
【００２０】
また、本実施形態に係る細胞の配送方法によれば、配送前の前処理Ｓ１において、凍結保護材を添加して凍結することにより、その後の輸送ステップＳ２においては、長時間にわたり細胞の健全性を維持しつつ輸送することができる。この場合に、従来のような抗凝固剤（ＥＤＴＡ、ヘパリンあるいはクエン酸ナトリウム等）を使用する必要がない。また、配送後は、凍結されていた細胞懸濁液を解凍するだけで、検査に必要な健全な細胞を得ることができ、検査の邪魔となる赤血球を除去することができる。
【００２１】
すなわち、配送先の検査機関においては、溶血剤を使用することなく、極めて短時間の内に赤血球が除去された健全な細胞を得ることができ、フローサイトメトリにより精度よく細胞の解析を行うことができるという利点がある。
【００２２】
なお、本実施形態においては、赤血球の除去方法および細胞の配送方法について説明したが、これに代えて、本発明は、図２に示されるように、凍結保護材を添加する保護材添加ステップＳ１１と凍結保護材を添加した細胞懸濁液を凍結する凍結ステップＳ１２と、保存ステップＳ４とを含む細胞の保存方法に適用してもよい。このようにすることで、凍結保護材によって細胞の健全性を維持しつつ、細胞を凍結して長時間にわたり保存することができる。そして、このようにして保存した細胞を凍結するだけで、細胞懸濁液内に含まれている赤血球を溶血させて除去できる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施形態に係る赤血球の除去方法を説明するフローチャートである。
【図２】本発明の一実施形態に係る細胞の輸送方法を説明するフローチャートである。
【符号の説明】
【００２４】
Ｓ１１  凍結保護材添加ステップ（前処理）
Ｓ１２  凍結ステップ（前処理）
Ｓ２  輸送ステップ
Ｓ３  融解ステップ（後処理）
【図１】
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【図２】
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