(57)【要約】【課題】  ヒトインターロイキン−５受容体（ｈＩＬ−５Ｒ）に結合活性を有する新規なアミノ酸配列を有する合成ペプチドの製造を提供する。【解決手段】  本発明は、ヒトインターロイキン−５受容体（ｈＩＬ−５Ｒ）に結合する、新規なアミノ酸配列を有するペプチド、該ペプチドを有するヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有するペプチド、並びに該ペプチドを含有するヒトインターロイキン−５受容体（ｈＩＬ−５Ｒ）結合ペプチドに関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列AELAALEAELAALEGGGGGGGKLKLLKWKLAKLKA(配列番号１)、
アミノ酸配列AELAALEAELAALEGGGGGGGKLALLKWKLAKLKA（配列番号２）、
またはアミノ酸配列AELAALEAELAALEGGGGGGGKLKALKWKLAKLKA(配列番号３)
の少なくとも何れかのアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列AELAALEAELAALEGGGGGGGKLKLLKWKLAKLKA（配列番号１)、
アミノ酸配列AELAALEAELAALEGGGGGGGKLALLKWKLAKLKA（配列番号２）、
またはアミノ酸配列AELAALEAELAALEGGGGGGGKLKALKWKLAKLKA（配列番号３）
の少なくとも何れかのアミノ酸配列を有するヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有するペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列AELAALEAELAALEGGGGGGGKLKLLKWKLAKLKA（配列番号１）、
アミノ酸配列AELAALEAELAALEGGGGGGGKLALLKWKLAKLKA（配列番号２）、
またはアミノ酸配列AELAALEAELAALEGGGGGGGKLKALKWKLAKLKA（配列番号３)
の少なくとも何れかのアミノ酸配列を有するペプチドを含有する、ヒトインターロイキン−５受容体結合性ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトインターロイキン-５受容体(ｈＩＬ-５Ｒ)に結合する新規なアミノ酸配列を有するペプチドに関する。本発明はまた、該ペプチドを有するヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有するペプチドにも関する。本発明は更に、該ペプチドを含有するヒトインターロイキン-５受容体結合ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン-５（以下「ＩＬ−５」と記載する。）は５０−６０ｋＤのホモ二量体として活性を有する糖タンパク質で、そのｃＤＮＡは１３４個のアミノ酸をコードしている。ＩＬ−５は、他の多くのサイトカインと異なり、ホモ二量体として機能することが特徴である。主な作用細胞は好酸球であるが、マウスではＢ細胞の機能発現にも重要な役割を果たす。産生細胞は主に活性化Ｔ細胞と肥満細胞である（非特許文献１，２参照）。最近では、気管支喘息などのアレルギー疾患の局所炎症反応への関与が注目されており、精力的に研究が進められている。
【０００３】
一方、ＩＬ−５受容体（特許文献１）はＩＬ−５に特異的なサブユニットα鎖と共通受容体β鎖から構築される。β鎖単独ではＩＬ−５に対して結合能を有しないのに対して、α鎖は単独で低親和性受容体 (マウス：Ｋｄ＝３０ｎＭ、ヒト：Ｋｄ＝７００ｐＭ)を構築し、β鎖とともに発現すると高親和性受容体（マウス：Ｋｄ＝１５０ｐＭ、ヒト：Ｋｄ＝４５０ｐＭ）となる（非特許文献３，４参照）。
【０００４】
生体では、マウスでもヒトでも低親和性受容体は検出されず、ＩＬ−５受容体は生理的には高親和性受容体の形で存在していると考えられる。ＩＬ−５受容体のβ鎖はＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦと共通しており、そのシグナル伝達機構も極めて類似している。しかし、その標的細胞や作用はまたまったく異なっており、ＩＬ−５の反応特異性はα鎖によって規定されていると考えられる。
【０００５】
ＩＬ−５受容体からのシグナル伝達には、他のサイトカインと同様にＪａｋ１、Ｊａｋ２、Ｆｙｎ、Ｌｙｎなどのチロシンキナーゼが使われる。α鎖にＪａｋ２が、β鎖にＪａｋ１が構成的に会合し、ＩＬ−５のシグナル伝達に重要な役割を果たしている。
【０００６】
これまで、１９アミノ酸残基を有するペプチドライブラリーよりＩＬ−５受容体α鎖に結合し、ＩＬ−５のアンタゴニストとして作用するペプチドが合成されている。本ペプチドの活性体は分子内に存在する３個のシステイン残基がジスルフィド結合を形成し、２量体としてはたらく（非特許文献５参照）。
【０００７】
また、これまでヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有するために、安定なαヘリックス構造を有する合成ペプチド（非特許文献６）及び、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体に結合するヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有するペプチドについて報告されている（非特許文献７，特許文献２参照）。
【特許文献１】特許第２７４９７３０号公報
【特許文献２】特開２００５−１５４３８２号公報
【非特許文献１】ケイ・タカツら、イムノロジカル  レビュー  １０２、１０７、１９８８年（Ｔａｋａｔｓｕ，  Ｋ．ら  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．，  １０２，  １０７，  １９８８）
【非特許文献２】シー・ジェー・サンダーソンら  イムノロジカル  レビュー  １０２、２９、１９８８年（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ,  Ｃ．  Ｊ．  ら  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．，  １０２，  ２９，  １９８８．）
【非特許文献３】エス・ミタら  ザ  ジャーナル  オブ  エクスペリエンタル  メディスン、１６８、８６３、１９８８年（  Ｍｉｔａ，  Ｓ．ら  J．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １６８，  ８６３，  １９８８．）
【非特許文献４】エス・ミタら  プロシーディング  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  ユーエスエー、８６、２３１１、１９８９年（  Ｍｉｔａ，  Ｓ．  らＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８６，  ２３１１，  １９８９．）
【非特許文献５】ビー・ピー・イングランドら  プロシーディング  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  ユーエスエー、９７、６８６３、２０００年（  Ｅｎｇｌａｎｄ，  Ｂ．  ＰらＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９７，  ６８６３，  ２０００）．
【非特許文献６】アイ・フジイら  テトラヘドロン  レター、４２、３３２３、２００１年（  Ｆｕｊｉｉ，  Ｉ．らＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ４２，  ３３２３，  ２００１．）
【非特許文献７】ペプチド  サイエンス  ３５１、２００１年（  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３５１，  ２００１．）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、これらヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有する合成ペプチドとＩＬ−５受容体であるＩＬ−５受容体α鎖との結合は報告されていない。ここでヘリックス・ループ・ヘリックス構造とはαヘリックス構造のＮ−末端配列およびＣ−末端配列がループのアミノ酸配列によって隔てられている高次構造を意味する。そこで、ＩＬ−５受容体に結合し、ＩＬ−５がＩＬ−５受容体に結合するのを阻害する化合物は、アレルギー疾患における一連の反応連鎖を中断させ、その結果アレルギー疾患をより有効に予防または治療し得ると期待される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は上記課題に鑑み、ヒトＩＬ−５の受容体に結合活性を有するペプチドを提供するものである。より具体的には、本発明は、アミノ酸配列：
AELAALEAELAALEGGGGGGGKLKLLKWKLAKLKA(IL5-R10-23と略す)(配列番号１)、
AELAALEAELAALEGGGGGGGKLALLKWKLAKLKA(IL5-R10-23-K24Aと略す)（配列番号２）、または
AELAALEAELAALEGGGGGGGKLKALKWKLAKLKA(IL5-R10-23-L25Aと略す)(配列番号３)
の少なくともいずれかを有するペプチドである。
【００１０】
本発明はまた、アミノ酸配列：
AELAALEAELAALEGGGGGGGKLKLLKWKLAKLKA(IL5-R10-23と略す)(配列番号１)、
AELAALEAELAALEGGGGGGGKLALLKWKLAKLKA(IL5-R10-23-K24Aと略す)（配列番号２）、または
AELAALEAELAALEGGGGGGGKLKALKWKLAKLKA(IL5-R10-23-L25Aと略す)(配列番号３)
の少なくともいずれかを有するヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有するペプチドである。
【００１１】
本発明は更に、アミノ酸配列：
AELAALEAELAALEGGGGGGGKLKLLKWKLAKLKA(IL5-R10-23と略す)(配列番号1)、
AELAALEAELAALEGGGGGGGKLALLKWKLAKLKA(IL5-R10-23-K24Aと略す)（配列番号2）、または
AELAALEAELAALEGGGGGGGKLKALKWKLAKLKA(IL5-R10-23-L25Aと略す)(配列番号3)
の少なくともいずれかを有するペプチドを含有する、ヒトインターロイキン−５受容体結合性ペプチドである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のペプチドは、ヒトインターロイキン−５受容体（ｈＩＬ−５Ｒ）に結合して複合体を形成する。従って、ＩＬ−５受容体（ｈＩＬ−５Ｒ）のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用する。従って、アレルギー反応の抑制剤として利用できると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、実施例を挙げ本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではないことは無論である。
表１には、本発明のペプチドの配列を示す。配列番号４は、配列番号１から３までの本発明のペプチドを得るためのペプチドの一般式である。このペプチドは、ヘリックス・ループ・ヘリックス構造を示す。従って、本発明のペプチドはヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有する。なお、表１の配列において、Ａはアラニン、Ｅはグルタミン酸、Ｌはロイシン、Ｇはグリシン、Ｋはリジン、Ｗはトリプトファン、をそれぞれ表す。また、配列番号４においてＸは、任意の天然アミノ酸を示す。
【表１】
2008214254.tif 000002
【００１４】
表２には、本発明の実施例で使用するプライマーの塩基配列を示す。配列番号６は、ランダムプライマーであり、配列中のｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔの何れかの塩基が当てはまり、ＭはＡかＣの何れかの塩基がはいる。なお、塩基配列では、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを表す。
【表２】
2008214254.tif 000003
【００１５】
本発明のペプチドは、Ｆｍｏｃ法による固相ペプチド合成法で製造出来る。この方法では合成しようとするペプチドのカルボキシ末端アミノ酸の９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）誘導体を、Ｒｉｎｋアミド樹脂に導入する。次に、Ｆｍｏｃ基を除去して得られる樹脂上のアミノ酸の遊離となったアミノ基に第２のＦｍｏｃ−アミノ酸を導入する。この操作を繰り返し、目的とするペプチド鎖が構築できたら全保護基を除くと共にペプチド樹脂から切り離す。今日では、自動合成機が市販されているのでこれを用いれば簡単にペプチドを合成できる。
【００１６】
ファージライブラリーの作製
配列番号４で示すアミノ酸配列、AELAALEAELAALEGGGGGGGKLXXLKXKLXXLKA（式中Ｘは任意の天然アミノ酸を表す）を有する２０５種類のペプチドからなるファージ表層ペプチドライブラリーを次のように作製した。
【００１７】
Ｎ末プライマー:
5’-GAACTGGCAGCTCTGGAAGCGGAACTGGCGGCACTCGAAGGTGGCGGCGGTGGTGGCGGCAAGCTG-3’（配列番号５）およびランダムプライマー:
5’-CCACCGCCGTTCGACNNMNNMAACTTTNNMTTCGATNNMNNMAACTTTCGACCACCTCCGAGGCCTCCGCCAAGG-3’（配列番号６）を用い、オーバーラップＰＣＲによりライブラリーＤＮＡ断片を作製した。
【００１８】
得られたＤＮＡ断片を鋳型として、再度ＰＣＲを行い、制限酵素部位（ＳａｃＩ，ＸｈｏＩ）を導入したライブラリーＤＮＡ断片を作製した。この際用いたプライマーは、Ｎ末プライマー：5’-ATGGCGGAGCTCGCAGCTCTGGAAGCG-3’（配列番号７）であり、Ｃ末プライマー：5’-CCTCCGAGGCCTCCGCCAAGGAGCTCCGTCCACGCG-3’（配列番号８）である。
【００１９】
得られたライブラリーＤＮＡ断片を制限酵素（ＳａｃＩ，ＸｈｏＩ）で処理し、これを制限酵素（ＳａｃＩ，ＸｈｏＩ）で処理したファージミドベクターとライゲーションした。精製したライゲーション溶液を、エレクトロポレーション法によりＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテントセルに形質転換し、ファージライブラリー溶液を得た。
【００２０】
実施例２
ファージディスプレイ法によるペプチドの選択
ヒトインターロイキン−５受容体のα鎖（以下ｈＩＬ−５Ｒαと略す）を固定化したマイクロタイタープレートを用い、受容体に結合したファージの選択を行った。
【００２１】
ＰＢＳに溶解した１ｍｇ／ｍＬ塩化シアヌル５０μＬをマイクロタイタープレート（Ｃ８  ＣＯＶＡＬＩＮＫ  ＮＨ２：  ＮＵＮＣ）の各ウェルに文中し、室温で５分間反応させた。ＰＢＳ（３００μＬ）を用いて３回洗浄した後２０ｍＭの炭酸バッファー（ｐＨ８．８）に溶解した５μｇ／ｍＬのｈＩＬ５−Ｒαの溶液５０μＬを各ウェルに分注し、室温で一晩反応させた。
【００２２】
反応終了後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（３００μＬ）で３回洗浄した後、ブロッキング溶液（ＰＢＳ、１％（Ｗ／Ｖ）  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）２００μＬを加えた。室温で１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（３００μＬ）で２回洗浄し、受容体結合プレートを作製した。
【００２３】
受容体結合プレートの１−２ウェルに調製したファージ溶液５０μＬを加え、室温で２時間穏やかに撹拌し、受容体に結合していないファージを洗い出し、受容体に結合するファージを選択した。受容体に結合したファージを解離させるために０．２Ｍグリシン塩酸（ｐＨ２．５）５０μＬを加えた。室温で激しく撹拌したのち、１．５ｍＬチューブにファージ溶出液を移した。ファージ溶出液は酸性であるため直ちに、溶出液５０μＬに対して１ＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）７５μＬを加え中和した。
【００２４】
中和したファージ溶出液はあらかじめ３．５ｍＬのＳＢ＋ｔｅｔ培地で培養しておいたＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ＯＤ６００＝０．３−０．６）に加え、３７℃、２００ｒｐｍで３０分間しんとうし、ファージを大腸菌に感染させた。アンピシリンを終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように加え、１時間培養した後、ヘルパーファージ１００μＬを加え、１時間しんとうし感染させた。その後１５００×ｇで１５分間遠心分離し、菌体を回収した。
【００２５】
回収した菌体は、２０ｍＬのＳＢ＋ａｍｐ，  ｔｅｔ，  ｋａｎ培地にけんだくし、３７℃、１６０ｒｐｍで１時間培養した後、温度を３０℃に下げて、一晩培養し、ファージを精製した。このようにして、ｈＩＬ５−Ｒαに結合するペプチドを提示したファージを得た。その中からＤＮＡの配列決定を行い、ｈＩＬ５−Ｒαに結合するペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号１乃至３）を決定した。
【００２６】
実施例３
本発明のペプチドの製造
ｈＩＬ５−Ｒαに結合能を有するファージが提示していた、配列番号１−３のアミノ酸配列を有するペプチドを固相合成した。ペプチドは、Ｍｏｄｅｌ  ４３３Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、Ｆｍｏｃ法、０．１ｍＭスケールで合成した。目的のアミノ酸を縮合した後、樹脂をジエチルエーテルですすぎ、乾燥させた樹脂を５０ｍＬファルコンチューブに移した。クリベージ溶液１０ｍＬを加え、撹拌し、１〜３時間反応させた。
【００２７】
反応終了後、表礼したジエチルエーテル３０  ｍＬを加え、氷上で１０分間静置し、ペプチドを析出させた。４℃、３０００×ｇで５分間遠心分離し、再び沈殿を得た。沈殿を乾燥させた後、１５ｍＬ程度の蒸留水に溶解し、綿栓ろ過によってレジンを除去した後、凍結乾燥させた。凍結乾燥させたペプチドを１０ｍＬ程度の蒸留水に溶解し、逆送高速液体クロマトグラフィー（Ｌ−６２００  Ｉｎｔｅｌｉｇｅｎｔ  Ｐｕｍｐ：  Ｈｉｔａｃｈｉ）を用い、精製した。
【００２８】
本発明のペプチドとｈＩＬ−５Ｒαとの結合試験
表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００  ｓｙｓｔｅｍ：ＢＩＡＣＯＲＥ）により、配列番号1−３のアミノ酸配列を有するペプチドのｈＩＬ−５Ｒαへの結合を調べた。
【００２９】
アミンカップリング法を用い、センサーチップ（ＣＭ５  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｇｒａｄｅ：ＢＩＡＣＯＲＥ）にｈＩＬ−５Ｒαを固定化した。センサーチップのフローセル２にＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸)とＮＨＳ  （Ｎ−ヒドロキシサクシイミド)の等量混合物を流速１０  μＬ／ｍｉｎで１０分間反応させ、センサーチップ上のカルボキシル基を活性化した。
【００３０】
その後、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に２０μｇ／ｍＬとなるように調製したｈＩＬ−５Ｒαを流速１０μＬ／ｍｉｎで１０分間反応させ、固定化した。その後、エタノールアミンを流速１０μＬ／ｍｉｎで１０分間反応させ、未反応のカルボキシル基を不活性化した。反応は全て２５℃で行い、溶媒にはＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  （１０ｍＭＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  ３ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．００５％Ｐ２０）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用いた。
【００３１】
種々のペプチド溶液を調製し、流速２０μＬ／ｍｉｎで２分間反応させ、表面プラズモン共鳴を測定した。得られた結果はＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて解析し、以下のＳｃａｔｃｈａｒｄプロットにより、以下の関係式から解離定数Ｋｄを求めた。
Ｒｅｑ＝ＫaＣ／（１＋ＫａＣ），  Ｋｄ＝１／Ｋａ
【００３２】
ここで、Ｒｅｑは平衡状態におけるペプチドの結合量（ＲＵ）、Ｋaは親和定数（Ｍ−１）、Ｃはペプチドの濃度（Ｍ）、Ｋｄは解離定数（Ｍ）を表す。その結果、ＩＬ５−Ｒ１０−２３は３．０×１０−４Ｍ、ＩＬ５−Ｒ１０−２３−Ｋ２４Ａは４．９×１０−５Ｍ、ＩＬ５−Ｒ１０−２３−Ｌ２５Ａは４．７×１０−５Ｍであった。結果を表３に示す。
【表３】
2008214254.tif 000004
【００３３】
表３からわかるように、本発明のペプチドは大きな解離定数を有し、ＩＬ−５Ｒと強く結合しているのがわかる。
【配列表】
2008214254000001.app