(57)【要約】【課題】目的の細胞におけるネガティブ選択を可能にするマーカー遺伝子を開発する。【解決手段】レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していないポリペプチド、またはレバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していないポリペプチドをコードする遺伝子を、ネガティブ選択マーカーとして用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネガティブ選択マーカー遺伝子およびポジティブ選択マーカー遺伝子を含む融合遺伝子であって、
該ネガティブ選択マーカー遺伝子および該ポジティブ選択マーカー遺伝子はそれぞれ第１および第２のプロモータに作動可能に連結されており、
該ネガティブ選択マーカー遺伝子がコードするポリペプチドは、
レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していないポリペプチド、または
レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していないポリペプチド
である、選択マーカー融合遺伝子。
【請求項２】
前記第１および第２のプロモータは、グラム陽性菌由来のプロモータである、請求項１に記載の融合遺伝子。
【請求項３】
前記ネガティブ選択マーカー遺伝子が、ＳａｃＢ遺伝子、ｆｅｆＡ遺伝子、ｌｅｖ遺伝子、ｍｌｆｔ遺伝子、ｌｓｃ遺伝子、ｌｓｘＡ遺伝子からなる群より選択される遺伝子に由来する、請求項１に記載の融合遺伝子。
【請求項４】
前記ネガティブ選択マーカー遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａからなる群より選択される細胞由来の野生型ＳａｃＢ遺伝子に由来する、請求項１に記載の融合遺伝子。
【請求項５】
前記ネガティブ選択マーカー遺伝子が、
（Ａ）野生型ＳａｃＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列において第２０位〜第４４位に存在するＡｌａ−Ｘ−Ａｌａの少なくともいずれか一方のＡｌａが置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（Ｂ）上記（Ａ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していない、ポリペプチド；あるいは
（Ｃ）上記（Ａ）もしくは（Ｂ）に示されるポリペプチドのフラグメントであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していない、ポリペプチド
をコードする請求項１に記載の融合遺伝子。
【請求項６】
前記ネガティブ選択マーカー遺伝子が、
（Ａ）野生型ＳａｃＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列において第２０位〜第４４位に存在するＡｌａ−Ｘ−ＡｌａよりもＮ末端側のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（Ｂ）上記（Ａ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していない、ポリペプチド；あるいは
（Ｃ）上記（Ａ）もしくは（Ｂ）に示されるポリペプチドのフラグメントであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していない、ポリペプチド
をコードする請求項１に記載の融合遺伝子。
【請求項７】
前記ネガティブ選択マーカー遺伝子が、
（Ａ）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列において第２０位〜第４４位に存在するＡｌａ−Ｘ−Ａｌａの少なくともいずれか一方のＡｌａが置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（Ｂ）上記（Ａ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していない、ポリペプチド；あるいは
（Ｃ）上記（Ａ）もしくは（Ｂ）に示されるポリペプチドのフラグメントであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していない、ポリペプチド
をコードする、請求項１に記載の融合遺伝子。
【請求項８】
前記ネガティブ選択マーカー遺伝子が、
（Ａ）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列において第２０位〜第４４位に存在するＡｌａ−Ｘ−ＡｌａよりもＮ末端側のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（Ｂ）上記（Ａ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していない、ポリペプチド；あるいは
（Ｃ）上記（Ａ）もしくは（Ｂ）に示されるポリペプチドのフラグメントであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していない、ポリペプチド
をコードする、請求項１に記載の融合遺伝子。
【請求項９】
前記ポジティブ選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である、請求項１に記載の融合遺伝子。
【請求項１０】
前記ポジティブ選択マーカー遺伝子が、グラム陽性菌由来の薬剤耐性遺伝子である、請求項１に記載の融合遺伝子。
【請求項１１】
前記ポジティブ選択マーカー遺伝子が、エリスロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ遺伝子、ｐｈｏｓｐｈｏ  ｂｅｔａ−ｇｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ遺伝子、ａｌａｎｉｎｅ  ｒａｃｅｍａｓｅ遺伝子、ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子、ｏｃｈｒｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ遺伝子、ａｍｂｅｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ遺伝子、ａｓｐａｒａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子、ｎｉｓｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ遺伝子、ｌａｃｔａｃｉｎ  Ｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ遺伝子、ｌｅｖａｎａｓｅ遺伝子、ｃｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子、ｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子からなる群より選択される、請求項１に記載の融合遺伝子。
【請求項１２】
グラム陽性菌細胞における二重選択用マーカーとして用いるための、請求項１に記載の融合遺伝子。
【請求項１３】
前記細胞が、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｌｉｓｓｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｓｐｈａｅｒａ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ、Ｐａｒａｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ、Ａｔｏｐｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａからなる群より選択される、請求項１２に記載の融合遺伝子。
【請求項１４】
異種配列をゲノム中に残すことなく標的細胞のゲノム配列を改変するための、請求項１に記載の融合遺伝子。
【請求項１５】
請求項１に記載の遺伝子を備えている、細胞の二重選択用キット。
【請求項１６】
前記細胞がグラム陽性菌細胞である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記細胞が、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｌｉｓｓｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｓｐｈａｅｒａ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ、Ｐａｒａｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ、Ａｔｏｐｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａからなる群より選択される、請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
目的の細胞を二重選択する方法であって、
請求項１に記載の融合遺伝子を細胞内に導入する工程；
ポジティブ選択のための条件下で該細胞を培養する工程；
前記ネガティブ選択マーカー遺伝子を除去する工程；および
ネガティブ選択のための条件下で該細胞を培養する工程
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記細胞がグラム陽性菌細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｌｉｓｓｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｓｐｈａｅｒａ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ、Ｐａｒａｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ、Ａｔｏｐｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ネガティブ選択マーカー遺伝子を備えている、目的の細胞をネガティブ選択するためのキットであって、
該遺伝子がコードするポリペプチドは、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していないポリペプチド、またはレバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していないポリペプチドである
キット。
【請求項２２】
前記細胞がグラム陽性菌細胞である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記細胞が、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｌｉｓｓｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｓｐｈａｅｒａ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ、Ｐａｒａｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ、Ａｔｏｐｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａからなる群より選択される、請求項２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネガティブ選択マーカーとして利用可能な遺伝子およびその利用に関するものであり、より詳細には、宿主細胞内で発現させたとき、スクロース存在下で宿主細胞の生育を阻害する遺伝子およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
代謝工学的手法を用いた有用物質の生産には、ゲノム上の複数の遺伝子を破壊する技術、および複数の外来遺伝子をゲノム上に導入する技術が用いられている。遺伝子破壊および外来遺伝子導入が行われた細胞株を効率よく選抜するための選択マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子が用いられる。このような選択マーカーは、選択マーカーを含む細胞を選択する（生存させる）ポジティブ選択マーカーといわれている。
【０００３】
近年、技術が高度化し、１つのゲノム上において複数の遺伝子改変を行う必要性が生じてきた。単一の標的に対して複数の遺伝子改変を行う場合には、複数の選択マーカーを組み合わせて使用することが必要である。しかし、選択マーカーとして使用可能な薬剤耐性遺伝子の種類は限られている。このために、使用可能な新たな選択マーカーの開発が望まれている。
【０００４】
他のタイプの選択マーカーとして、選択マーカーを含む細胞を排除（殺傷）するネガティブ選択マーカーが知られている。ネガティブ選択マーカー遺伝子としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来のＳａｃＢ遺伝子、ｔｅｔＡＲ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子等が知られている（非特許文献１）。ネガティブ選択マーカーは単独で用いられても、ポジティプ−ネガティブ選択（ＰＮＳ）法のような二重選択法としてポジティブ選択マーカーと組み合わせて用いられてもよい。
【０００５】
ＳａｃＢ遺伝子は、レバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）活性を有する酵素の１つであるＳａｃＢタンパク質をコードする遺伝子である。ＳａｃＢタンパク質は、スクロースを分解し、レバン（ｌｅｖａｎ）を生成する。グラム陰性菌は、細胞内においてＳａｃＢタンパク質が発現すると、スクロース存在下において生育することができない。このように、スクロース存在下においてＳａｃＢ遺伝子が導入された細胞株を排除（ネガティブ選択）することにより、目的とする遺伝子改変細胞株を効率よく選択することが可能である（非特許文献２）。
【０００６】
グラム陰性菌におけるＳａｃＢ遺伝子の発現が、スクロース存在下において細胞に致死性を付与する理由は、明らかになっていない。グラム陰性菌において、レバンスクラーゼ活性はペリプラズムに局在していることが知られているので、レバンスクラーゼ活性により生成される高分子量のレバンがペリプラズム内に蓄積することが、細胞に致死性を付与する要因の１つとして考えられる。
【０００７】
グラム陽性菌は細胞外膜を有していないのでペリプラズム領域が存在しない。細胞外膜を有していないグラム陽性菌では、ＳａｃＢタンパク質は細胞外へ放出され、その結果、細胞内においてレバンが生成も蓄積もされ得ないと考えられる。しかし、グラム陽性菌であっても、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ等の一部の菌においては、ＳａｃＢ遺伝子の発現によって細胞に致死性が付与される（非特許文献３）。非特許文献３に示される結果は、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのように、細胞壁中にミコール酸（Ｍｙｃｏｌｉｃ  ａｃｈｉｄｓ）を含むグラム陽性菌においては、ミコール酸に起因して形成された細胞外膜様構造のためにＳａｃＢタンパク質が細胞内に留まり、同様に形成されたペリプラズム様領域にレバンが蓄積したからであると考えられる。
【０００８】
通常のグラム陽性菌は、細胞壁中にミコール酸を有していないので、細胞内にてレバンが生成も蓄積もされない。そのために、ＳａｃＢ遺伝子が細胞内で発現していたとしても、スクロース存在下で細胞に致死性は付与されない。このことは、通常のグラム陽性菌においては、ＳａｃＢ遺伝子をネガティブ選択マーカーとして使用することができないことを示している。
【０００９】
導入したい遺伝子をプロモータとマーカー遺伝子との間に挿入することにより、ポジティブ選択マーカー遺伝子をネガティブ選択マーカーとして用いることができる。同様に、導入したい遺伝子をプロモータとマーカー遺伝子との間に挿入することにより、ネガティブ選択マーカー遺伝子をポジティブ選択マーカーとして用いることができる。もちろん、導入したい遺伝子の挿入部位はプロモータとマーカー遺伝子との間に限られず、マーカー遺伝子の中に目的の遺伝子を挿入しても、マーカー遺伝子の発現を抑えることができる。
【００１０】
この観点を利用した、大腸菌にＳａｃＢ遺伝子をマルチコピー数導入して細胞内に過剰発現させることにより、ＳａｃＢ遺伝子をポジティブ選択マーカーとして用いる技術が報告されている（特許文献１）。
【００１１】
また、シグナル配列切断活性を欠失した変異型ＳａｃＢ遺伝子を、細胞壁中にミコール酸を有さないグラム陽性菌にマルチコピー数導入して細胞内に過剰発現させることにより、変異型ＳａｃＢ遺伝子をポジティブ選択マーカーとして用いる技術が報告されている（特許文献２）。
【特許文献１】ＷＯ９２／１４８１９号公報（公開日：１９９２年９月３日）
【特許文献２】特表平１１−５１４５２７号公報（公表日：平成１１年１２月１４日）
【非特許文献１】Ｒｅｙｒａｔ  Ｊ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｓｅｐｔ．１９９８；４０１１−４０１７
【非特許文献２】Ｊａｇａｒ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １９９２；５４６２−５４６５
【非特許文献３】Ｐｅｌｉｃｉｃ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １９９６；１１９７−１１９９
【非特許文献４】Ｂｏｒｃｈｅｒｔ  Ｔ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １９９１；２７６−２８２
【非特許文献５】Ｂｒａｍｕｃｃｉ  Ｍ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９６；３９４８−３９５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＳａｃＢタンパク質は、そのシグナル配列切断活性を欠失すると、ＳａｃＢ前駆体タンパク質からシグナル配列が切断されないので細胞外に分泌されない（非特許文献４）。もちろん、このような変異型ＳａｃＢタンパク質は野生型のようなペリプラズム局在性を有していないが、遺伝子を細胞に過剰発現させたことにより細胞質膜近傍に変異型ＳａｃＢタンパク質が存在し、その結果、細胞質膜および細胞壁近傍にレバンが生成および蓄積されて、変異型ＳａｃＢ遺伝子がポジティブ選択マーカーとして機能したと考えられる（非特許文献５）。
【００１３】
しかしながら、変異型ＳａｃＢ遺伝子をポジティブ選択マーカーとして用いるためには、特許文献２に記載されているように、宿主細胞内にマルチコピーの変異型ＳａｃＢ遺伝子が存在していなければならない。シングルコピーの変異型ＳａｃＢ遺伝子をグラム陽性菌細胞に導入した場合では、宿主細胞にスクロース誘因の致死性が観察されない（非特許文献５）。
【００１４】
二重選択用マーカーに用いられる選択マーカー遺伝子のうち二度目の選択に用いられるマーカー遺伝子は、宿主細胞内に導入されるコピー数がシングルであることが好ましい。特に、単一の標的に対して複数の遺伝子改変を行う場合には、シングルコピーの遺伝子が存在するだけでマーカーとして機能し得ることは非常に重要である。特許文献２および非特許文献５に記載の方法では、シングルコピーの変異型ＳａｃＢ遺伝子を導入した宿主細胞がスクロース存在下で致死性を示していないので、変異型ＳａｃＢ遺伝子をネガティブ選択マーカー遺伝子として使用することはできない。
【００１５】
さらに、近年、異種遺伝子としての選択マーカー遺伝子を形質転換体に残さない技術の開発が熱望されているが、特許文献１および２のような構成を有する選択マーカーではこのような技術に適用することができない。
【００１６】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、グラム陽性菌において利用可能なネガティブ選択マーカー遺伝子、およびこれを用いる遺伝子改変技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子は、ネガティブ選択マーカー遺伝子およびポジティブ選択マーカー遺伝子を含む融合遺伝子であって、該ネガティブ選択マーカー遺伝子および該ポジティブ選択マーカー遺伝子はそれぞれ第１および第２のプロモータに作動可能に連結されており、該ネガティブ選択マーカー遺伝子がコードするポリペプチドは、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していないポリペプチド、またはレバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していないポリペプチドであることを特徴としている。
【００１８】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子において、上記第１および第２のプロモータは、グラム陽性菌由来のプロモータであることが好ましい。
【００１９】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子において、上記ネガティブ選択マーカー遺伝子は、ＳａｃＢ遺伝子、ｆｅｆＡ遺伝子、ｌｅｖ遺伝子、ｍｌｆｔ遺伝子、ｌｓｃ遺伝子、ｌｓｘＡ遺伝子からなる群より選択される遺伝子に由来する遺伝子であってもよい。
【００２０】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子において、上記ネガティブ選択マーカー遺伝子はまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａからなる群より選択される細胞由来の野生型ＳａｃＢ遺伝子に由来する遺伝子であってもよい。
【００２１】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子において、上記ネガティブ選択マーカー遺伝子はまた、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかをコードしている遺伝子であってもよい：（Ａ）野生型ＳａｃＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列において第２０位〜第４４位に存在するＡｌａ−Ｘ−Ａｌａの少なくともいずれか一方のＡｌａが置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド；または（Ｂ）上記（Ａ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していないポリペプチド；あるいは（Ｃ）上記（Ａ）もしくは（Ｂ）に示されるポリペプチドのフラグメントであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していないポリペプチド。
【００２２】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子において、上記ネガティブ選択マーカー遺伝子はまた、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかをコードしている遺伝子であってもよい：（Ａ）野生型ＳａｃＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列において第２０位〜第４４位に存在するＡｌａ−Ｘ−ＡｌａよりもＮ末端側のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列からなるポリペプチド；または（Ｂ）上記（Ａ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していないポリペプチド；あるいは（Ｃ）上記（Ａ）もしくは（Ｂ）に示されるポリペプチドのフラグメントであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していないポリペプチド。
【００２３】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子において、上記ネガティブ選択マーカー遺伝子はまた、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかをコードしている遺伝子であってもよい：（Ａ）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列において第２０位〜第４４位に存在するＡｌａ−Ｘ−Ａｌａの少なくともいずれか一方のＡｌａが置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド；または（Ｂ）上記（Ａ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していないポリペプチド；あるいは（Ｃ）上記（Ａ）もしくは（Ｂ）に示されるポリペプチドのフラグメントであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していないポリペプチド。
【００２４】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子において、上記ネガティブ選択マーカー遺伝子はまた、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかをコードしている遺伝子であってもよい：（Ａ）配列番号１〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列において第２０位〜第４４位に存在するＡｌａ−Ｘ−ＡｌａよりもＮ末端側のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列からなるポリペプチド；または（Ｂ）上記（Ａ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していないポリペプチド；あるいは（Ｃ）上記（Ａ）もしくは（Ｂ）に示されるポリペプチドのフラグメントであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していないポリペプチド。
【００２５】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子において、上記ポジティブ選択マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子であってもよい。
【００２６】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子において、上記ポジティブ選択マーカー遺伝子はまた、グラム陽性菌由来の薬剤耐性遺伝子であってもよい。
【００２７】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子において、上記ポジティブ選択マーカー遺伝子はまた、エリスロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ遺伝子、ｐｈｏｓｐｈｏ  ｂｅｔａ−ｇｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ遺伝子、ａｌａｎｉｎｅ  ｒａｃｅｍａｓｅ遺伝子、ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子、ｏｃｈｒｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ遺伝子、ａｍｂｅｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ遺伝子、ａｓｐａｒａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子、ｎｉｓｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ遺伝子、ｌａｃｔａｃｉｎ  Ｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ遺伝子、ｌｅｖａｎａｓｅ遺伝子、ｃｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子、ｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子からなる群より選択される遺伝子であってもよい。
【００２８】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子は、グラム陽性菌細胞における二重選択用マーカーとして用いられる遺伝子であってもよい。
【００２９】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子において、上記細胞はまた、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｌｉｓｓｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｓｐｈａｅｒａ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ、Ｐａｒａｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ、Ａｔｏｐｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａからなる群より選択される細胞であってもよい。
【００３０】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子は、異種配列をゲノム中に残すことなく標的細胞のゲノム配列を改変するための遺伝子であってもよい。
【００３１】
本発明に係るグラム陽性菌細胞における二重選択用キットは、本発明に係る選択マーカー融合遺伝子を備えていることを特徴としている。
【００３２】
本発明に係る目的の細胞を二重選択する方法は、本発明に係る融合遺伝子をグラム陽性菌細胞内に導入する工程；ポジティブ選択のための条件下で該細胞を培養する工程；上記ネガティブ選択マーカー遺伝子を除去する工程；およびネガティブ選択のための条件下で該細胞を培養する工程を包含することを特徴としている。なお、上記ネガティブ選択マーカー遺伝子を除去する工程は、上記融合遺伝子全体を除去する工程であってもよい。
【００３３】
本発明に係るネガティブ選択マーカー遺伝子は、該遺伝子がコードするポリペプチドは、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していないポリペプチド、またはレバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していないポリペプチドであることを特徴としている。
【００３４】
本発明に係る目的の細胞をネガティブ選択するためのキットは、本発明に係るネガティブ選択マーカー遺伝子を備えていることを特徴としている。
【００３５】
本発明に係るキットにおいて、上記ネガティブ選択マーカー遺伝子は、上述した特徴を有している遺伝子であればよく、グラム陽性菌由来のプロモータに作動可能に連結されていることが好ましい。また、上記細胞は、上述した特徴を有している細胞であればよい。
【発明の効果】
【００３６】
本発明を用いれば、グラム陽性菌細胞をネガティブ選択することが可能である。また、本発明を用いれば、グラム陽性菌細胞を二重選択することが可能である。さらに、本発明は、異種遺伝子としての選択マーカー遺伝子を形質転換体に残さないターゲティング技術として利用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
〔１．ネガティブ選択マーカー遺伝子〕
本発明者らは、レバンスクラーゼ活性を有しているポリペプチドをコードする遺伝子の特定の変異体が、細胞をネガティブ選択するための選択マーカー遺伝子として機能することを見出した。
【００３８】
すなわち、本発明は、細胞をネガティブ選択するためのネガティブ選択マーカー遺伝子を提供する。ネガティブ選択マーカー遺伝子は、この遺伝子を含む細胞を排除（殺傷）するための選択マーカーとして機能する遺伝子であり、この遺伝子を用いて目的の細胞を選択することをネガティブ選択という。具体的には、ネガティブ選択では、ネガティブ選択マーカー遺伝子が導入されていない細胞のみを生育し得る所定の条件下において細胞を培養することによって、ネガティブ選択マーカー遺伝子が導入されている細胞株を排除し、ネガティブ選択マーカー遺伝子が導入されていない目的細胞を選択し得る。
【００３９】
なお、グラム陽性菌細胞において使用されているネガティブ選択マーカー遺伝子として、ｕｒａｃｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｕｐｐ）遺伝子、ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ（ｂｌａＩ）遺伝子、ｍａｚＦ遺伝子等が挙げられる（”ｍａｚＦ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｕｎｍａｒｋｅｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ３４（２００６）、および”Ｎｅｗ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｆｒｅｅ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒｓ．”，Ａｐｐｌｉｅｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７２４１−７２５０（２００４）参照のこと）。
【００４０】
本発明に係るネガティブ選択マーカー遺伝子は、レバンスクラーゼの変異体をコードしている。本明細書において使用される場合、特に説明がない限り、「レバンスクラーゼ」は「レバンスクラーゼ活性を有するポリペプチド」が意図され、「レバンスクラーゼポリペプチド」または「レバンスクラーゼタンパク質」と交換可能に使用される。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「レバンスクラーゼ活性」は、スクロースを分解し、レバンを生成する活性が意図される。「レバンスクラーゼの変異体」は「変異型レバンスクラーゼ」と交換可能に使用される。変異型レバンスクラーゼは、具体的には、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していないポリペプチド、またはレバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していないポリペプチドである。
【００４２】
「シグナル配列」は、「シグナル配列からなるポリペプチド」が意図され、分泌タンパク質などが細胞外へ移行する際に必要な配列である。細胞内において合成されるレバンスクラーゼの前駆体は、シグナル配列のプロセッシング部位が切断されることにより成熟配列に変換され、細胞外に分泌される。本明細書中で使用される場合、レバンスクラーゼの「シグナル配列」は、グラム陰性菌または一部のグラム陽性菌においては、細胞内において発現したレバンスクラーゼをペリプラズムまたはペリプラズム様領域に移行させる機能を有するポリペプチドであることが意図され、その他のグラム陽性菌においては、細胞内において発現したレバンスクラーゼを細胞外に移行させる機能を有するポリペプチドであることが意図される。
【００４３】
「変異型レバンスクラーゼ」の１つである「レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していないポリペプチド」は、レバンスクラーゼ前駆体からシグナル配列が除去されないように、シグナル配列のプロセッシング部位が変異した変異型レバンスクラーゼポリペプチドが意図される。このような変異体においては、レバンスクラーゼ前駆体からシグナル配列が除去され得ないために、レバンスクラーゼポリペプチドの成熟配列を上記のように移行させることができない。
【００４４】
また、別の「変異型レバンスクラーゼ」である「レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していないポリペプチド」は、レバンスクラーゼ前駆体からシグナル配列が欠落するように変異した変異型レバンスクラーゼポリペプチドが意図される。このような変異型レバンスクラーゼポリペプチドは、シグナル配列を有していないために、レバンスクラーゼポリペプチドの成熟配列を上記のように移行させることができない。
【００４５】
このように「変異型レバンスクラーゼポリペプチド」は、野生型ポリペプチドの有するレバンスクラーゼ活性を保持しているポリペプチドであり、かつシグナル配列の切断活性を有していないかまたはシグナル配列を有していないポリペプチドが意図される。また、「変異型レバンスクラーゼ遺伝子」は、上記変異型レバンスクラーゼポリペプチドをコードする遺伝子であることが意図される。
【００４６】
なお、本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用される。本明細書中で使用される場合、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００４７】
本発明に係るネガティブ選択マーカー遺伝子としては、上述したように、レバンスクラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の変異型遺伝子が採用され得る。レバンスクラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子として好ましいものは、ＳａｃＢ遺伝子、ｆｅｆＡ遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＪ５０８３９１，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ由来のｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）、ｌｅｖ遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｑ８ＧＧＶ４，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ由来のｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）、ｍｌｆｔ遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ；ＡＡＴ８１１６５，Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）、ｌｓｃ遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｏ６８６０９，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ由来のｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）、ｌｓｘＡ遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＢＡＡ９３７２０，Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ由来のｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本発明のネガティブ選択マーカー遺伝子として、ＳａｃＢ遺伝子由来の遺伝子を例に挙げて説明する。
【００４９】
上述したように、ＳａｃＢ遺伝子は、レバンスクラーゼ活性を有するポリペプチドの１つであるＳａｃＢタンパク質をコードする遺伝子である。ＳａｃＢタンパク質は、ＳａｃＢ前駆体タンパク質として生成された後にシグナル配列が切断されることにより生成される。ＳａｃＢタンパク質は、スクロースを分解し、レバンを生成する。野生型ＳａｃＢ遺伝子としては、Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉ、またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａに由来する野生型ＳａｃＢ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
なお、例示列挙した上記８つの細胞に由来するＳａｃＢ前駆体タンパク質は、配列番号１〜８に示されるアミノ酸配列として提供され、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構成する塩基配列は、配列番号９〜１６に示される塩基配列として提供される。上記８つの細胞に由来するＳａｃＢ遺伝子のうち、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＳａｃＢ遺伝子は、２９アミノ酸のシグナル配列を有するＳａｃＢ前駆体タンパク質として細胞内にて合成される。
【００５１】
本発明のネガティブ選択マーカー遺伝子は、（Ａ）野生型ＳａｃＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列において、第２０位〜第４４位に存在するＡｌａ−Ｘ−Ａｌａの少なくともいずれか一方のＡｌａが置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子であり得る。すなわち、配列番号１〜８に示されるようなアミノ酸配列として提供される野生型ＳａｃＢ前駆体タンパク質のシグナル配列の切断活性に関与する部位が変異していることにより、シグナル配列の切断活性を有していない変異型ＳａｃＢタンパク質をコードする遺伝子であり得る。
【００５２】
また、本発明のネガティブ選択マーカー遺伝子は、（Ｂ）上記（Ａ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していないポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
【００５３】
さらに、本発明のネガティブ選択マーカー遺伝子は、（Ｃ）上記（Ａ）もしくは（Ｂ）に示されるポリペプチドのフラグメントであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していないポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
【００５４】
また、本発明のネガティブ選択マーカー遺伝子は、（Ａ）野生型ＳａｃＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列において、第２０位〜第４４位に存在するＡｌａ−Ｘ−ＡｌａよりもＮ末端側のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子であり得る。すなわち、配列番号１〜８に示されるようなアミノ酸配列として提供される野生型ＳａｃＢ前駆体タンパク質のシグナル配列が変異していることにより、シグナル配列を有していない変異型ＳａｃＢタンパク質をコードする遺伝子であり得る。
【００５５】
さらに、本発明のネガティブ選択マーカー遺伝子は、（Ｂ）上記（Ａ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していないポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
【００５６】
さらにまた、本発明のネガティブ選択マーカー遺伝子は、（Ｃ）上記（Ａ）もしくは（Ｂ）に示されるポリペプチドのフラグメントであって、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していないポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
【００５７】
ポリペプチドのアミノ酸配列におけるいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変し得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異型が存在することもまた周知である。当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。
【００５８】
他の実施形態において、本発明に係る遺伝子の変異型は、上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドをコードする遺伝子であって、（Ｉ）当該遺伝子の塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなる遺伝子；（ＩＩ）当該遺伝子の塩基配列またはその相補配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子；または（ＩＩＩ）当該遺伝子の塩基配列と少なくとも８０％同一な塩基配列からなる遺伝子であり得る。
【００５９】
ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第３版，Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｌｌ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（２００１）」（本明細書中に参考として援用される）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルター洗浄することが意図される。
【００６１】
本発明は、目的の細胞をネガティブ選択する方法、および目的の細胞をネガティブ選択するためのキットもまた提供する。
【００６２】
本発明に係る目的の細胞をネガティブ選択する方法は、本発明に係るネガティブ選択マーカー遺伝子を用いることを特徴としており、具体的には、ネガティブ選択マーカー遺伝子を細胞内に導入する工程、およびネガティブ選択のための条件下で該細胞を培養する工程を包含することが好ましい。本発明に係る目的の細胞をネガティブ選択する方法は、グラム陽性菌細胞をネガティブ選択するために用いられることが好ましい。
【００６３】
また、本発明に係る目的の細胞をネガティブ選択するためのキットは、本発明に係るネガティブ選択マーカー遺伝子を備えていることを特徴としている。本発明に係る目的の細胞をネガティブ選択するためのキットは、グラム陽性菌細胞をネガティブ選択するために用いられることが好ましい。なお、本明細書中で使用される場合、「キット」は、各種成分の少なくとも１つが別物質（例えば、容器）中に含有されている形態であることが意図される。
【００６４】
本発明に係るネガティブ選択マーカー遺伝子を具体的に説明するために、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＳａｃＢ遺伝子に由来する変異型ＳａｃＢ遺伝子を例に挙げて説明したが、本発明において、ネガティブ選択マーカー遺伝子が、上記変異型ＳａｃＢ遺伝子に限定されないことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００６５】
このように、本発明に係るネガティブ選択マーカー遺伝子を用いれば、目的とする細胞をネガティブ選択することができる。
【００６６】
〔２．選択マーカー融合遺伝子〕
本発明はまた、目的の細胞を選択するための選択マーカー融合遺伝子を提供する。本明細書中で使用される場合、「選択マーカー融合遺伝子」は、目的の細胞を複数回選択するためのマーカー遺伝子が意図され、ポジティブ選択マーカー遺伝子とネガティブ選択マーカー遺伝子とを含んでいる。「選択マーカー融合遺伝子」は、「二重選択マーカー融合遺伝子」または「ポジティブ−ネガティブ選択マーカー融合遺伝子」と交換可能に使用される。なお、本明細書中で使用される場合、「二重選択」は、単一のポジティブ選択と単一のネガティブ選択のみからなる選択に限定されず、少なくとも１回のポジティブ選択と少なくとも１回のネガティブ選択を含む選択が意図される。
【００６７】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子は、上述したネガティブ選択マーカー遺伝子を含んでおり、ポジティブ選択マーカー遺伝子をさらに含んでいることを特徴としている。なお、ポジティブ選択マーカー遺伝子は、この遺伝子を含む細胞を選択する（生存させる）ための選択マーカーとして機能する遺伝子であり、この遺伝子を用いて目的の細胞を選択することをポジティブ選択という。具体的には、ポジティブ選択では、ポジティブ選択マーカー遺伝子が導入された細胞のみを生育し得る所定の条件下において細胞を培養することによって、ポジティブ選択マーカー遺伝子が導入されていない細胞株を排除し、ポジティブ選択マーカー遺伝子が導入された目的細胞を選択し得る。
【００６８】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子に含まれるポジティブ選択マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子が好ましく、特にグラム陽性菌由来の薬剤耐性遺伝子がより好ましい。本発明のポジティブ選択マーカー遺伝子としては、好ましくは、エリスロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ遺伝子、ｐｈｏｓｐｈｏ  ｂｅｔａ−ｇｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ遺伝子、ａｌａｎｉｎｅ  ｒａｃｅｍａｓｅ遺伝子、ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子、ｏｃｈｒｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ遺伝子、ａｍｂｅｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ遺伝子、ａｓｐａｒａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子、ｎｉｓｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ遺伝子、ｌａｃｔａｃｉｎ  Ｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ遺伝子、ｌｅｖａｎａｓｅ遺伝子、ｃｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子、またはｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子に含まれるポジティブ選択マーカー遺伝子およびネガティブ選択マーカー遺伝子は、細胞を複数回選択するために、それぞれ第１および第２のプロモータに作動可能に連結されている。
【００７０】
本明細書中において使用される場合、「作動可能に連結される（連結されている）」は、目的の配列が、特定の転写翻訳調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサなど）の制御下に配置されることにより、その発現が調節され得る構成であることが意図される。目的の遺伝子の上流にプロモータが配置されることにより、目的の遺伝子がプロモータに作動可能に連結される。なお、プロモータは、目的の遺伝子に隣接して配置される必要はない。
【００７１】
本明細書中において使用される場合、「プロモータ」は、作動可能に連結されている遺伝子の転写開始に関与する遺伝子であることが意図される。本発明に係る選択マーカー融合遺伝子に含まれる、ネガティブ選択マーカー遺伝子およびポジティブ選択マーカー遺伝子は、それぞれ独立してネガティブ選択マーカータンパク質およびポジティブ選択マーカータンパク質を発現することが好ましいので、それぞれ別個のプロモータに作動可能に連結されていることが好ましい。
【００７２】
このため、それぞれのプロモータは、連結されている遺伝子の転写を別個独立に制御する。本発明に係る選択マーカー融合遺伝子において、ネガティブ選択マーカー遺伝子に連結されている第１のプロモータはグラム陽性菌由来のプロモータ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のプロモータ）が好ましく、ポジティブ選択マーカー遺伝子に連結されている第１のプロモータはグラム陽性菌由来のプロモータ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ由来のプロモータ）が好ましいが、これらに限定されない。
【００７３】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子は、グラム陽性菌細胞における二重選択用マーカーとして使用し得る。本明細書中で使用する限り、「二重選択用マーカー」は、細胞をネガティブ選択およびポジティブ選択するために用いられる二機能性マーカー遺伝子であることが意図される。「二重選択」としては、例えば、目的の遺伝子およびマーカー遺伝子がゲノム内に挿入された細胞をポジティブ選択条件下において選択した後に、相同組換えなどによってゲノムからマーカー遺伝子が排除された細胞をネガティブ選択条件下において生育させることによって、目的とする細胞（すなわち、選択マーカー遺伝子をゲノム内に残すことなくターゲティングされた細胞）のみを選択する技術が挙げられるが、これに限定されない。
【００７４】
本発明の適用対象として好ましい細胞はグラム陽性菌細胞であることが好ましい。グラム陽性菌は、グラム染色により紫色に染色される細菌をいう。代表的なグラム陽性菌としては、球菌（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属）、胞子形成桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属）、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属など）、コリネフォルム細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属など）、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）が挙げられる。
【００７５】
本発明の適用対象として好ましい細胞は、細胞壁にミコール酸を含まないグラム陽性菌細胞であることがより好ましい。本明細書中で用いられる場合、「細胞壁にミコール酸を含まないグラム陽性菌」には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属等は含まれない。
【００７６】
本発明の適用対象として好ましい細胞はいわゆる乳酸菌細胞であることがさらにより好ましい。本明細書中で用いられる場合、「乳酸菌」は、炭水化物を分解して乳酸を生成することによってエネルギーを獲得する微生物のうち細菌に属するものが意図される。好ましい乳酸菌としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｌｉｓｓｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ属、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属、Ｌａｃｔｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ属、Ｐａｒａｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ属、Ａｔｏｐｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＯｌｓｅｎｅｌｌａ属が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明に係る選択マーカー融合遺伝子は、異種配列をゲノム中に残すことなく標的細胞のゲノム配列を改変するために用いられ得る。本明細書中で用いられる場合、「異種配列」は、「異種遺伝子配列」または「外来遺伝子配列」と交換可能に使用され、遺伝子が導入されるべき細胞と異なる細胞に由来する遺伝子配列が意図される。また、「異種配列をゲノム中に残すことなく標的細胞のゲノム配列を改変する」は、異種遺伝子としての選択マーカー遺伝子を形質転換体に残すことなく遺伝子ターゲティングを行うことが意図される。
【００７８】
このように、本発明に係る選択マーカー融合遺伝子を用いれば、より精度良く目的とする細胞を選択することができる。
【００７９】
〔３．選択マーカー融合遺伝子を含むベクター〕
本発明は、上述した遺伝子を含むベクターを提供する。本発明に係るベクターは、上述した遺伝子を含むものであれば、特に限定されない。例えば、ネガティブ選択マーカー遺伝子または選択マーカー融合遺伝子のｃＤＮＡが挿入された発現ベクターなどが挙げられる。本発明に係るベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００８０】
発現ベクターの場合、ベクターの具体的な種類には特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、上記遺伝子を確実に発現し得るように、宿主細胞の種類に応じて目的の遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。このような発現ベクターを使用すれば、上記遺伝子を導入した細胞において、当該細胞中に選択マーカー融合遺伝子がコードするポリペプチドを発現させることができる。
【００８１】
〔４．グラム陽性菌細胞を二重選択するための方法およびキット〕
本発明は、目的の細胞を二重選択するための方法およびキットを提供する。
【００８２】
本発明に係る細胞を二重選択する方法は、上述した選択マーカー融合遺伝子を用いることを特徴としており、具体的には、上述した融合遺伝子を細胞内に導入する工程；ポジティブ選択のための条件下で該細胞を培養する工程；ネガティブ選択マーカー遺伝子を除去する工程；および、ネガティブ選択のための条件下で該細胞を培養する工程を包含することが好ましい。本発明に係る目的の細胞をネガティブ選択する方法は、グラム陽性菌細胞を二重選択するために用いられることが好ましい。選択マーカー融合遺伝子をグラム陽性菌細胞に導入する工程には、当該分野において周知の遺伝子導入技術（例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等）が採用され得る。また、目的遺伝子を標的細胞のゲノムに挿入するための技術もまた、当該分野において周知である。
【００８３】
なお、「ポジティブ選択のための条件」は、本発明の選択マーカー融合遺伝子に含まれるポジティブ選択マーカー遺伝子がコードするポリペプチドが発現した細胞が生育可能な条件であって、当該ポリペプチドが発現していない細胞が生育不能な条件が意図される。例えば、上記ポジティブ選択マーカー遺伝子として、エリスロマイシン耐性遺伝子を用いた場合、「ポジティブ選択のための条件」は、エリスロマイシン耐性遺伝子を有さない細胞が生育不能となる量のエリスロマイシンが培地中に含まれることが意図される。
【００８４】
また、ネガティブ選択マーカー遺伝子を除去する工程においては、細胞をネガティブ選択することを可能にするために、グラム陽性菌細胞のゲノムに挿入された融合遺伝子のうちネガティブ選択マーカー遺伝子のみを該細胞から除去すればよいが、上記融合遺伝子すべてを除去してもよい。ネガティブ選択マーカー遺伝子の除去は、ゲノム上に組み込まれているネガティブ選択マーカー遺伝子配列を他の塩基配列で（例えば、相同組換えなどによって）置換することによって実現され得る。
【００８５】
具体的には、ネガティブ選択マーカー遺伝子の周辺領域の塩基配列を増幅し、増幅した塩基配列を用いて、ゲノム上のネガティブ選択マーカー遺伝子が挿入された領域を相同組換えすることによって、ネガティブ選択マーカー遺伝子をゲノム上から除去する。また、増幅した塩基配列と外来遺伝子とをつないだ遺伝子断片を用いて、ゲノム上のネガティブ選択マーカー遺伝子が挿入された領域を相同組換えすることによって、ネガティブ選択マーカー遺伝子をゲノム上から除去してもよい（図５参照のこと）。
【００８６】
さらに、「ネガティブ選択のための条件」は、本発明の選択マーカー融合遺伝子に含まれるネガティブ選択マーカー遺伝子がコードするポリペプチドが発現した細胞が生育不能な条件であって、当該ポリペプチドが発現していない細胞が生育可能な条件が意図される。例えば、上記ネガティブ選択マーカー遺伝子として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＳａｃＢ遺伝子に由来する変異型ＳａｃＢ遺伝子を用いた場合、「ネガティブ選択のための条件」は、変異型ＳａｃＢ遺伝子を有する細胞が生育不能となる量のスクロースが培地中に含まれることが意図される。
【００８７】
上述したように、変異型ＳａｃＢ遺伝子がコードするポリペプチドは、レバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列の切断活性を有していないポリペプチド、またはレバンスクラーゼ活性を有しかつシグナル配列を有していないポリペプチドであるので、当該ポリペプチドは細胞内に存在される。これにより、当該細胞を所定濃度のスクロース存在下において培養した場合、上記ポリペプチドが発現した細胞を排除し得、細胞をネガティブ選択することが可能となる。
【００８８】
本発明に係るグラム陽性菌細胞における二重選択用キットは、上述した選択マーカー融合遺伝子を備えていることを特徴としている。本発明に係る目的の細胞を二重選択するためのキットは、グラム陽性菌細胞を二重選択するために用いられることが好ましい。これにより、本発明の選択マーカー融合遺伝子を用いてグラム陽性菌細胞を形質転換し、当該グラム陽性菌細胞をポジティブ選択のための条件下で培養することによってポジティブ選択し、当該グラム陽性菌細胞をネガティブ選択のための条件下で培養することによってネガティブ選択することができる。なお、本発明に係る二重選択用キットは、二重選択に供すべき細胞をさらに備えていてもよい。
【００８９】
本発明に係るグラム陽性菌細胞を二重選択するための方法およびキットを用いれば、上述した選択マーカー遺伝子を導入したグラム陽性菌細胞をポジティブ選択した後に、さらにネガティブ選択することによって、目的とする細胞を二重選択することが可能である。また、本発明は、選択マーカー遺伝子をゲノム内に残すことなくターゲティングされた細胞のみを選択するための技術に適用され得る。
【００９０】
なお、グラム陽性菌細胞を二重選択する方法およびキットは、上述した態様に限定される必要はなく、上述した以外の細胞を二重選択する方法および細胞の二重選択用キットの具体的な態様を、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００９１】
以下に、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、請求項および上記実施形態に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００９２】
［１．材料および方法］
〔１−１．変異ＳａｃＢ遺伝子の構築〕
ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのＳａｃＢ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃  ＮＰ＿３９１３２５）に基づいて、ＳａｃＢ遺伝子のプロモータ領域を含む領域を増幅するプライマー（ＳａｃＢ＿ＰｓｔＩ）を合成した。次に、ＳａｃＢ遺伝子のシグナルペプチドプロセッシングサイトの１つ前のアラニンをトリプトファンに置換したプライマー（ＳａｃＢ（Ｗ２９）＿Ｒ）を合成した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ増幅により断片１の増幅を行った。
【００９３】
ＰＣＲ増幅を、ＳａｃＢ＿ＰｓｔＩ＿Ｆプライマー（５’−ｇｇｇｇｃｔｇｃａｇａａａａａｇｇｃａａｃｔｔｔａｔｇｃｃｃａｔｇｃａａｃａｇａａａｃ−３’（配列番号１７））、およびＳａｃＢ（Ｗ２９）＿Ｒプライマー（５’−ｔｔｔｔｇｇｔｔｃｇｔｔｔｃｔｔｔｃｃａａａａｃｇｃｔｔｇａｇｔｔ−３’（配列番号１８））を含む、表１に示す反応液を用いて、９４℃で２分間の反応後、９４℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、および７４℃で１分間の伸長を３０サイクル行い、反応液を４℃で保存した。
【００９４】
【表１】
2008199963.tif 000002
【００９５】
ＰＣＲ反応液を１％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで４０分間電気泳動した。目的とする増幅産物のみをアガロースゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【００９６】
また、ＳａｃＢ（Ｗ２９）＿Ｒの逆相補配列であるＳａｃＢ（Ｗ２９）＿Ｆ、およびＳａｃＢ遺伝子の終始コドンまでを増幅するＳａｃＢ＿ＢａｍＨＩを合成した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ増幅により断片２の増幅を行った。
【００９７】
ＰＣＲ増幅を、ＳａｃＢ（Ｗ２９）＿Ｆプライマー（５’−ａａｃｔｃａａｇｃｇｔｔｔｔｇｇａａａｇａａａｃｇａａｃｃａａａａ−３’（配列番号１９））、およびＳａｃＢ＿ＢａｍＨＩ＿Ｒプライマー（５’−ｃｃｃｇｇａｔｃｃｇｇａｔａｔｃｇｇｃａｔｔｔｔｃｔｔｔｔｃｇｃｔｔｔｔｔａｔｔｔｇ−３’（配列番号２０））を含む、表２に示す反応液を用いて、９４℃で２分間の反応後、９４℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、および７４℃で１分間の伸長を３０サイクル行い、反応液を４℃で保存した。
【００９８】
【表２】
2008199963.tif 000003
【００９９】
ＰＣＲ反応液を１％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで４０分間電気泳動した。目的とする増幅産物のみをアガロースゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製した。
【０１００】
次に、精製した断片１および断片２を含む混合液をテンプレートとして、ＳａｃＢ＿ＰｓｔＩ＿Ｆ、およびＳａｃＢ＿ＢａｍＨＩ＿Ｒを用いてＰＣＲ増幅を行い、変異型ＳａｃＢ遺伝子断片を作製した。
【０１０１】
ＰＣＲ増幅を、表３に示す反応液を用いて、９４℃で２分間の反応後、９４℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、および７４℃で１分間の伸長を３０サイクル行い、反応液を４℃で保存した。
【０１０２】
【表３】
2008199963.tif 000004
【０１０３】
ＰＣＲ反応液を１％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで４０分間電気泳動した。目的とする増幅産物のみをアガロースゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製し、変異型ＳａｃＢ遺伝子断片を構築した。
【０１０４】
〔１−２．変異型ＳａｃＢ遺伝子導入ベクターの構築〕
変異型ＳａｃＢ遺伝子断片を、制限酵素（ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ）を用いて処理した後、１％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで４０分間電気泳動した。目的とする断片のみをアガロースゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。また、ｐＵＣ１８（タカラバイオ製）を、制限酵素（ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ）を用いて処理した後、１％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで４０分間電気泳動した。制限酵素（ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ）で切断されたｐＵＣ１８のみをアガロースゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製した。
【０１０５】
制限酵素（ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ）で切断した変異型ＳａｃＢ遺伝子およびｐＵＣ１８を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  ｋｉｔ（ニッポンジーン製）を用いてライゲーションし、得られたプラスミドを用いて大腸菌Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を形質転換した。形質転換体細胞を、アンピシリン１００ｐｐｍ含有ＬＢ寒天培地に植菌し、変異型ＳａｃＢ／ｐＵＣ１８を構築した。
【０１０６】
〔１−３．ポジティブ−ネガティブ選択マーカー融合遺伝子の構築〕
変異型ＳａｃＢ遺伝子と共に細胞の二重選択に用いるポジティブ選択マーカーとして、いわゆる乳酸球菌の１つであるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｉｔｓ由来のエリスロマイシン耐性遺伝子を用いた。図２の模式図に示すように、変異型ＳａｃＢ遺伝子およびエリスロマイシン耐性遺伝子が、それぞれＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＳａｃＢプロモータおよびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ由来のＥｍＲプロモータに連結された、ポジティブ−ネガティブ選択マーカー融合遺伝子を構築した。
【０１０７】
ポジティブ選択マーカーとしてのエリスロマイシン耐性遺伝子およびプロモータを以下のように構築した。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ由来のプラスミドｐＩＬ２５３配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃  ＡＦ０４１２３９）に基づいて、配列番号２１に示すプロモータ領域を含むエリスロマイシン耐性遺伝子を合成した。なお、合成断片の５’末端にはＢａｍＨＩを付加し、３’末端にはＰｓｔＩ部位およびＳａｃＩ部位を付加した。
【０１０８】
合成断片を、制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ）を用いて処理した後、１％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで４０分間電気泳動した。目的とする断片のみをアガロースゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。また、変異型ＳａｃＢ／ｐＵＣ１８を、制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ）を用いて処理した後、１％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで４０分間電気泳動した。制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ）で切断された変異型ＳａｃＢ／ｐＵＣ１８のみをアガロースゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【０１０９】
制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ）で切断したエリスロマイシン耐性遺伝子および変異型ＳａｃＢ／ｐＵＣ１８をＬｉｇａｔｉｏｎ−ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  ｋｉｔ（ニッポンジーン製）を用いてライゲーションし、得られたプラスミドを用いて大腸菌Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を形質転換した。形質転換体細胞を、アンピシリン１００ｐｐｍおよびエリスロマイシン５００ｐｐｍ含有ＬＢ寒天培地に植菌し、変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ／ｐＵＣ１８を構築した。
【０１１０】
〔１−４．大腸菌−Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉシャトルベクターへの変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ断片のクローニング〕
変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ断片を、図３に示すプラスミドマップで表される大腸菌−Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）シャトルベクター（ｐＵＣ１８＿ｐＧＴ２３２）にクローニングした。ｐＧＴ２３２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃  Ｕ２１８５９）は、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ  １００−２３株が保持している機能未知プラスミド（ｃｒｙｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ）である。
【０１１１】
クローニングを以下のように行った。変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ／ｐＵＣ１８を、制限酵素（ＰｓｔＩ）を用いて処理した後、１％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで４０分間電気泳動した。変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ断片のみをアガロースゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【０１１２】
また、ｐＵＣ１８＿ｐＧＴ２３２を、制限酵素（ＰｓｔＩ）を用いて処理した後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて脱リン酸化を行った。脱リン酸化反応液を１％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで４０分間電気泳動した。ｐＵＣ１８＿ｐＧＴ２３２をアガロースゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【０１１３】
制限酵素（ＰｓｔＩ）で切断した変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ断片およびｐＵＣ１８＿ｐＧＴ２３２をＬｉｇａｔｉｏｎ−ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  ｋｉｔ（ニッポンジーン製）を用いてライゲーションし、得られたプラスミドを用いて大腸菌Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を形質転換した。形質転換体細胞を、アンピシリン１００ｐｐｍおよびエリスロマイシン５００ｐｐｍ含有ＬＢ寒天培地に植菌し、変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ／ｐＵＣ１８＿ｐＧＴ２３２を構築した。
【０１１４】
〔１−５．変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ／ｐＵＣ１８＿ｐＧＴ２３２のＬ．ｒｅｕｔｅｒｉへの導入〕
変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ／ｐＵＣ１８＿ｐＧＴ２３２をＬ．ｒｅｕｔｅｒｉに導入したクローンを以下のように作製した。
【０１１５】
変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ／ｐＵＣ１８＿ｐＧＴ２３２導入大腸菌からプラスミドを抽出し、エタノール沈殿後、ＤＮＡペレットを滅菌水で溶解した。ＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ製）にＬ．ｒｅｕｔｅｒｉを植菌し、ＯＤ６００＝０．８になるまで３７℃で静置培養を行った。遠心分離により、培地を除去した後、菌体ペレットを滅菌水で懸濁し、再度遠心分離した。この操作を５回繰り返した。
【０１１６】
菌体ペレットを３０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧ１５００  ２５０μｌで懸濁し、１００μｌずつ分注した。変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ／ｐＵＣ１８＿ｐＧＴ２３２  ２μｇとＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ受容菌（Ｊａｐａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ製）とを、０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ−ｒａｄ製）に移し、２．５ｋＶ、２５μＦ、２００ΩにセットしたＧｅｎｅ  ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ製）を用いて、電気パルスを印加した。その後、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ受容菌をＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ製）１ｍｌに植菌し、３７℃で２時間静置培養を行った。さらに、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ受容菌をエリスロマイシン８ｐｐｍ含有ＭＲＳ寒天培地に植菌し、３７℃で一晩培養し、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ（変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ／ｐＵＣ１８＿ｐＧＴ２３２）を作製した。
【０１１７】
〔１−６．変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ断片のＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ細胞への導入〕
相同組換えを利用して乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が変異ＳａｃＢ＿ＥｍＲ断片に置換された遺伝子破壊株を作製するために、まず相同組換えによる遺伝子破壊に必要な遺伝子破壊用断片を以下のとおり構築した。
【０１１８】
相同組換えに必要な２つの相同領域３ｋｂをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅を、Ｌｒ＿ｌｄｈ１５１１＿ｎｅｓ＿Ｆ（５’−ｔｃｃｔｇｇａｇｃｔｃｔｔｇｃｔｔａｔｇｔａｔｔｇａｇｔｇｇ−３’（配列番号２２））、およびｌｄｈ１５１１＿ＦＲ４（５’−ｃａｔｔｔｃｇｔｇａａｔｇｃｃｔｃｇａｇｔｔｃａｔａａａａａｃｃｇｃ−３’（配列番号２３））、ならびにｌｄｈ１５１１＿ＳＦ４（５’−ｇｃｇｇｔｔｔｔｔａｔｇａａｃｔｃｇａｇｇｃａｔｔｃａｃｇａａａｔｇ−３’（配列番号２４））、およびＬｒ＿ｌｄｈ１５１１＿ｎｅｓ＿Ｒ（５’−ｔｔｇｇｔｇａｇｃｔｃｃｔｔｔｃｔｃａｔｔｇｇｃａａｔｇｇｃ−３’（配列番号２５））をそれぞれ含む表４に示す反応液を用いて、９８℃で３０秒間の反応後、９８℃で１０秒間の変性、４８℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で４５秒間の伸長を３０サイクル行い、さらに７２℃で９０秒間の反応後、反応液を４℃で保存した。
【０１１９】
【表４】
2008199963.tif 000005
【０１２０】
各ＰＣＲ反応液を、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＰＣＲ＆ｇｅｌ  ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｇｅｍａ製）を用いて精製し、精製した各ＰＣＲ反応液０．１μｌを混合し、第２のＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。第２のＰＣＲ反応を、Ｌｒ＿ｌｄｈ１５１１＿ｎｅｓ＿Ｆ（５’−ｔｃｃｔｇｇａｇｃｔｃｔｔｇｃｔｔａｔｇｔａｔｔｇａｇｔｇｇ−３’（配列番号２６））、およびＬｒ＿ｌｄｈ１５１１＿ｎｅｓ＿Ｒ（５’−ｔｔｇｇｔｇａｇｃｔｃｃｔｔｔｃｔｃａｔｔｇｇｃａａｔｇｇｃ−３’（配列番号２７））を含む表５に示す反応液を用いて、９４℃で２分間の反応後、９４℃で１０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で９０秒間の伸長を３０サイクル行い、さらに７２℃で１８０秒間の反応後、反応液を４℃で保存した。
【０１２１】
【表５】
2008199963.tif 000006
【０１２２】
ＰＣＲ反応液を、アガロースゲルにアプライし、約６ｋｂのＰＣＲ増幅断片のみをアガロースゲルから切り出し、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＰＣＲ＆ｇｅｌ  ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｇｅｍａ製）を用いて精製した。精製した約６ｋｂのＰＣＲ増幅断片を制限酵素（ＳａｃＩ）を用いて処理し、別途制限酵素（ＳａｃＩ）処理したｃｈａｒｏｍｉｄ  ９−３６（ニッポンジーン製）と混合した後、エタノール沈殿を行った。
【０１２３】
ＤＮＡペレットを滅菌水で溶解後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  ｋｉｔ（ニッポンジーン製）を用いて１６℃で３０分間ライゲーション反応を行った。このライゲーション産物をＬＡＭＢＤＡ  ＩＮＮ（ニッポンジーン製）を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ製）に導入した。導入細胞をＬＢＡｐ１００ｐｐｍ寒天培地で選抜し、ｌｄｈ＿ｆｒａｇｍｅｎｔ／ｃｈａｒｏｍｉｄを構築した。
【０１２４】
次に、６ｋｂの増幅断片内のＸｈｏＩサイトに変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ断片の挿入を以下のように行った。変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ／ｐＵＣ１８をテンプレートとして変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ断片のＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅は、ＳａｃＢ＿Ｆ（ＸｈｏＩ）（５’−ａｔｇｃｃｔｃｇａｇａａａａａｇｇｃａａｃｔｔｔａｔｇｃｃｃａｔｇｃ−３’（配列番号２８））、およびＥｍＲ＿Ｒ（ＸｈｏＩ）（５’−ｇｃｔｃｃｔｃｇａｇｇｃａａｇｔｇｃｔｇｔｔｇｃｇａｇｔｔ−３’（配列番号２９））を含む表６に示す反応液を用いて、９８℃で３０秒間の反応後、９８℃で１０秒間の変性、４８℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で４５秒間の伸長を３０サイクル行い、さらに７２℃で４５秒間の反応後、反応液を４℃で保存した。なお、使用したプライマーにはＸｈｏＩサイトを付加した。
【０１２５】
【表６】
2008199963.tif 000007
【０１２６】
ＰＣＲ反応液をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＰＣＲ＆ｇｅｌ  ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｇｅｍａ製）を用いて精製した後、ＸｈｏＩ処理を３７℃で終夜行った。ＸｈｏＩ反応液をアガロースゲルにアプライし、目的とする断片のみをゲルから切り出し、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＰＣＲ＆ｇｅｌ  ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｇｅｍａ製）を用いて精製した。精製した断片をＸｈｏＩ処理したｌｄｈ＿ｆｒａｇｍｅｎｔ／ｃｈａｒｏｍｉｄと混合した後、エタノール沈殿を行った。ＤＮＡペレットを滅菌水で溶解した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  ｋｉｔ（ニッポンジーン製）を用いて、１６℃で３０分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション産物をＬＡＭＢＤＡ  ＩＮＮ（ニッポンジーン製）を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５  α（ＴＯＹＯＢＯ製）に導入した。導入細胞をＬＢＡｐ１００ｐｐｍＥｍ５００ｐｐｍ寒天培地で選抜を行い、ｌｄｈ＿変異ＳａｃＢ＿ＥｍＲ／ｃｈａｒｏｍｉｄを構築した。
【０１２７】
ｌｄｈ＿変異ＳａｃＢ＿ＥｍＲ／ｃｈａｒｏｍｉｄをＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ  ＪＣＭ１１１２に導入し、変異ＳａｃＢ＿ＥｍＲ断片がゲノムに挿入された乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を作製した。
【０１２８】
［２．結果］
〔２−１．変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ／ｐＵＣ１８＿ｐＧＴ２３２を導入したＬ．ｒｅｕｔｅｒｉの、スクロース存在下における致死効果〕
Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ（変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ／ｐＵＣ１８＿ｐＧＴ２３２）をスクロース添加ＭＲＳ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し、スクロースによる致死効果の検証を以下のように行った。
【０１２９】
Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ（変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ／ｐＵＣ１８＿ｐＧＴ２３２）をエリスロマイシン８ｐｐｍ含有ＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ製）１１ｍｌで前培養した。翌日、１００μｌの培養液をエリスロマイシン８ｐｐｍ含有ＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ製）１１ｍｌへ植え継ぎ、ＯＤ６００＝２．０まで培養し、滅菌水を用いて１０−２〜１０−５までの段階希釈系列を作製した。これを、０重量％、１重量％、５重量％、１０重量％および１５重量％のスクロースを添加したエリスロマイシン８ｐｐｍ含有ＭＲＳ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に１００μｌづつ植菌し、翌日形成されたコロニー数をカウントした。
【０１３０】
【表７】
2008199963.tif 000008
【０１３１】
スクロース添加培地において、スクロース５重量％添加培地において、１／１０４以下に生育する細胞数を減少させる効果が確認された。これは、変異型ＳａｃＢ遺伝子をグラム陽性菌細胞におけるネガティブ選択マーカーとして使用するのに十分な致死効果であるといえる。よって、変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲは、グラム陽性菌細胞におけるポジティプ−ネガティブ選択（ＰＮＳ）のための選択マーカー遺伝子として使用可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明を用いれば、これまでになし得なかった、グラム陽性菌のネガティブ選択が可能になるので、新たな遺伝子改変技術の発展に貢献し得る。また、異種遺伝子をゲノム中に残すことなく標的細胞のゲノム配列を改変させることができるので、組換え遺伝子を含まない食品の開発に寄与し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】図１は、変異型ＳａｃＢ遺伝子の構築方法を示す概略図である。
【図２】図２は、変異型ＳａｃＢ遺伝子とエリスロマイシン耐性遺伝子とを含む遺伝子断片を示す模式図である。
【図３】図３は、大腸菌−Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉシャトルベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図４】図４は、変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ断片の構築方法を示す概略図である。
【図５】図５は、変異型ＳａｃＢ＿ＥｍＲ断片の破壊方法を示す概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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