(57)【要約】 【課題】細胞培養槽におけるバクテリア等の混入をその初期に、簡便に、安価に検出できる細胞培養槽のバクテリア等混入検知方法及びその装置を提供する。【解決手段】動物または植物細胞１３の細胞培養槽１０に、バクテリア等の原核生物のみ代謝できるトレーサーガス２２を注入し、細胞培養槽１０からの排気されるトレーサーガス２２をトレーサーガス分析計２３でモニタすることによって、原核生物の混入を検知するものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物または植物細胞の細胞培養槽に、原核生物のみ代謝できるトレーサーガスを注入し、細胞培養槽からの排気されるトレーサーガスをモニタすることによって、原核生物の混入を検知することを特徴とする細胞培養槽のバクテリア等混入検知方法。
【請求項２】
トレーサーガスは、細胞培養槽に供給する空気などの酸素含有ガスと混合して細胞培養槽に供給し、細胞培養槽からの排気中のガス成分中のトレーサーガス濃度の減少の検出をもって、原核生物の混入を検知する請求項１記載の細胞培養槽のバクテリア等混入検知方法。
【請求項３】
上記トレーサーガスが水素である請求項１又は２記載の細胞培養槽のバクテリア等混入検知方法。
【請求項４】
細胞接種前の動物または植物細胞の細胞培養槽に、水素消費能力の確認されているバクテリア等を接種し、滅菌操作を行ったのち、酸素を含むガスと水素ガスを注入し、排気中のガス組成の変化を測定することによって、細胞培養槽および滅菌・除菌操作が適正であるかどうかを評価することを特徴とする細胞培養槽のバクテリア等混入検知方法。
【請求項５】
上記の水素消費能力の確認されているバクテリアが、水素消費能力の確認されている芽胞形成菌である請求項４に記載の細胞培養槽のバクテリア等混入検知方法。
【請求項６】
培養液が充填されると共に動物または植物細胞が接種された細胞培養槽と、その細胞培養槽に原核生物のみ代謝できるトレーサーガスを注入するガス供給手段と、細胞培養槽のガスを排気するガス排気手段と、ガス排気手段からのトレーサーガスをモニタするトレーサーガス分析計とを備えたことを特徴とする細胞培養槽のバクテリア等混入検知装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物または植物細胞の細胞培養槽におけるバクテリア等の原核生物の混入（コンタミネーション、汚染）を検知する細胞培養槽のバクテリア等混入検知方法及びその装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動物または植物細胞の培養は、培養槽に培養液を充填し、その培養液に細胞を接種させ、その培養液中に空気などの酸素含有ガスを散気して増殖させるが（特許文献１）、酸素含有ガスを培養槽内に供給することによりバクテリア等の原核生物の混入のおそれがある（非特許文献１）。
【０００３】
培養液のコンタミネーション、汚染を検出する方法としては以下のものが行われ、あるいは提案されてきた。
【０００４】
（１）培養槽の濁りの状態を目視で確認する方法
（２）培養槽内の液を培地に接種し、コロニーの繁殖をもって確認する方法
（３）培養槽に指標菌を接種して滅菌操作を行い、滅菌できなければ培養槽あるいは滅菌方法に欠陥があると判断する方法（非特許文献２）
（４）培養液を抜き出し、バクテリア等のＤＮＡと結合する蛍光色素を添加して蛍光顕微鏡で観察する方法（非特許文献３）
（５）培養液からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ（polymerase chain reaction ）で増幅して、バクテリア等の遺伝子を検出する方法（非特許文献３）
（６）培養槽の上部空間に蓄積した揮発性成分を高感度のケミカルガスセンサーで分析し、そのパターンから検知する方法（非特許文献４）
【特許文献１】特開平７−２３６４６８号公報
【非特許文献１】スタニエら（原著：1976年発行）、高橋ら訳、「微生物学  上」、培風館、1978年 1月発行、ｐ６７−６８
【非特許文献２】Freshney,R.I. 著、三井洋司訳「動物細胞培養の実際」、丸善、1990年 2月発行、ｐ９６−１１５
【非特許文献３】土壌微生物研究会、「新・土の微生物（３）遺伝子と土壌」、微生物博友社、1998年10月発行、ｐ３０−３４
【非特許文献４】Kreij,K.et al. "On-line detection of microbial contaminations in animal cell reactor cultures using an electric nose device" Journal Cytotechnology,Springer,the Netherlands,2005年12月発行、Vol,48,p41-58
【非特許文献５】児玉徹、五十嵐泰夫、「水素細菌」、微生物、医学出版センター、1986年発行、Vol.,No.5,p512-518
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、（１）では、バクテリア等の混入がよほど顕著であれば検知できるが、少量では検知できない。また（２）では検知まで１週間以上の培養期間が必要で、いずれにしても、バクテリア等の混入の直後に検知して再滅菌するというような対応が取れる方法ではない。（３）は基準の作成には良いが、偶発的なバクテリア等の混入には対応できない。
【０００６】
（４）、（５）、（６）は新規な方法であるが、（４）は、やはり少量の混入が検知しにくく、（５）は、検出操作の過程で空気中のバクテリア等が混入して誤った結果が出るおそれがある。（６）は高価であると思われる。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、上記課題を解決し、細胞培養槽におけるバクテリア等の混入をその初期に、簡便に、安価に検出できる細胞培養槽のバクテリア等混入検知方法及びその装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために請求項１の発明は、動物または植物細胞の細胞培養槽に、原核生物のみ代謝できるトレーサーガスを注入し、細胞培養槽からの排気されるトレーサーガスをモニタすることによって、原核生物の混入を検知することを特徴とする細胞培養槽のバクテリア等混入検知方法である。
【０００９】
請求項２の発明は、トレーサーガスは、細胞培養槽に供給する空気などの酸素含有ガスと混合して細胞培養槽に供給し、細胞培養槽からの排気中のガス成分中のトレーサーガス濃度の減少の検出をもって、原核生物の混入を検知する請求項１記載の細胞培養槽のバクテリア等混入検知方法である。
【００１０】
請求項３の発明は、上記トレーサーガスが水素である請求項１又は２記載の細胞培養槽のバクテリア等混入検知方法である。
【００１１】
請求項４の発明は、細胞接種前の動物または植物細胞の細胞培養槽に、非特許文献５に記載されているような水素消費能力の確認されているバクテリア等を接種し、滅菌操作を行ったのち、酸素を含むガスと水素ガスを注入し、排気中のガス組成の変化を測定することによって、細胞培養槽および滅菌・除菌操作が適正であるかどうかを評価することを特徴とする細胞培養槽のバクテリア等混入検知方法である。
【００１２】
請求項５の発明は、上記の水素消費能力の確認されているバクテリアが、水素消費能力の確認されている芽胞形成菌である請求項４に記載の細胞培養槽のバクテリア等混入検知方法である。
【００１３】
請求項６の発明は、培養液が充填されると共に動物または植物細胞が接種された細胞培養槽と、その細胞培養槽に原核生物のみ代謝できるトレーサーガスを注入するガス供給手段と、細胞培養槽のガスを排気するガス排気手段と、ガス排気手段からのトレーサーガスをモニタするトレーサーガス分析計とを備えたことを特徴とする細胞培養槽のバクテリア等混入検知装置である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、細胞培養槽内にバクテリアなどの原核生物が混入した場合に、その細胞培養槽に注入したトレーサーガスの濃度変化によって、バクテリアの混入を検出できるという優れた効果を発揮するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の好適な一実施の形態を添付図面に基づいて詳述する。
【００１６】
図１において、細胞培養槽１０には培養液１１が充填され、上部は若干の気相１２ができている。
【００１７】
培養液１１には、医薬品や化粧品などを製造するために増殖すべき、動物または植物の細胞（真核細胞）１３が接種される。
【００１８】
動物または植物の細胞１３は通常酸素（空気）を必要とするので、給気ライン１４から、空気など酸素含有ガス１５が、除菌のための給気フィルタ１６および酸素溶解効率を上げる機能を持つ散気装置１７を経由して培養液１１中に注入される。
【００１９】
細胞培養槽１０の気相１２には、培養液１１や細胞１３との間で物質交換をしたのちに排出されるガスを排気するガス排気手段としての排気ライン１８が接続され、その排気ライン１８に、外部から逆流してバクテリア等が混入するのを防止する排気フィルタ１９が接続される。
【００２０】
本発明では、給気フィルタ１６の上流側の給気ライン１４の途中に分岐部２０を設け、その分岐部２０にトレーサーガス供給手段としてのトレーサーガス供給ライン２１が接続され、水素などのトレーサーガス２２が給気ライン１４を通して、酸素含有ガス１５と共に給気フィルタ１６を通し、散気装置１７にて培養液１１に注入される。
【００２１】
このトレーサーガス２２は、培養液１１を通過して排気ライン１８から排出されるが、培養液１１内にバクテリア等が混入していると、消費されて、排気ライン１８中での濃度が低下する。
【００２２】
これを検知するため、ガスクロマトグラフなどトレーサーガス分析計２３を設置し、分析用ガスの採取部２４，２５を給気ライン１４と排気ライン１８に設ける。すなわち給気フィルタ１６の上流側に給気ガス採取部２４を、排気フィルタ１９の下流側に排気ガス採取部２５を設ける。
【００２３】
両採取部２４，２５から採取したガス中のトレーサーガス濃度に差があれば、トレーサーガスが消費された、即ちバクテリア等が混入したと判断する。
【００２４】
一般にバクテリア等の原核生物は、その細胞の構造や成分が真核細胞（動物と植物）と根本的に異なっており（非特許文献１）、真核細胞が利用できない物質を消費する。その代表的なものが水素である。グラム陰性・陽性を問わず多種多様なバクテリアが、水素を高速で消費する能力を持つ。一方、非特許文献５によれば、酵母、カビ等の真核生物において水素資化（利用）の確認された例は無い。
【００２５】
そこで本発明では、細胞培養槽１０に人為的に水素あるいは原核生物が利用できるガス成分の一つまたは複数をトレーサーガス２２として添加し、排気ガス中のその成分をトレーサーガス分析計２３により分析して、注入濃度に対する減少割合を見ることによって、バクテリア等による消費の有無を検知し、バクテリア等の混入を、その初期に、簡便に、安価に検出できる。
【００２６】
トレーサーガスとしては、水素が一つの候補であるが、水素以外にも原核生物が特異的に利用できるガスを添加することが考えられる。
【００２７】
次に本発明の他の実施の形態を説明する。
【００２８】
上述の実施の形態においては、細胞培養槽１０内にバクテリア等の混入を検出する例で説明したが、本実施の形態では、図１の培養槽１０にあらかじめトレーサーガス消費能力の確認された芽胞形成菌などのバクテリアを接種して、細胞培養槽１０の滅菌操作を行い、その後、図１のように酸素含有ガス１５とトレーサーガス２２を供給して、給気ライン１４と排気ライン１８のトレーサーガス２２の濃度差をトレーサーガス分析計２３で経時的に測定するものである。
【００２９】
時間とともにトレーサーガスの濃度差が増大していけば、細胞培養槽１０の滅菌操作、またはフィルタ１６，１９の除菌操作が不十分であったことを示す。この場合、トレーサーガスとして水素を用いる。
【００３０】
次に、トレーサーガスとしての水素が本当にバクテリア混入の検出に有効かどうかを試験した。
【００３１】
バクテリア等が混入した細胞培養槽１０を模擬するものとして、容積６５ｍＬの密閉容器（バイアル瓶）に排水処理装置（活性汚泥法）の流出水を３０ｍＬ入れ、気相１２に水素を２ｍＬ注入して３０℃で回転培養した。気相１２の水素濃度を経時的にガスクロマトグラフで分析したところ、図２のように、試験開始時に水素含有率が５．２％であった気相１２は、急速な水素消費が見られ、培養時間８０時間経過後には水素含有率がゼロとなった。
【００３２】
ガスクロマトグラフの検出感度は０．０１％のオーダーと考えられるので、この場合、数分〜十数分程度で水素消費の検知が可能である。また、バクテリア等の濃度が、この１／１００程度でも２４時間で検知できる。
【００３３】
細胞培養槽１０に混入したバクテリア等がトレーサーガスの成分を利用できるものであれば、本発明により、その初期段階で短時間に簡便に検出でき、再滅菌などの操作によって致命的な事態になることが防止できる。
【００３４】
またこの方法を採用すれば、混入したバクテリア等がトレーサーガスの成分を利用できるかどうかの懸念は払拭される。
【００３５】
現状、トレーサーガスとして水素以外の成分については実証例がないが、今後、実証を積み重ねて、トレーサーガスを混合ガスとしていけば、バクテリア等の検出率も上がっていくことが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の一実施の形態を示す装置の概略図である。
【図２】本発明において、バクテリアの水素消費速度を測定した結果を示す図である。
【符号の説明】
【００３７】
１０  細胞培養槽
１３  動物または植物細胞
１４  供給ライン
１８  排気ライン（ガス排気手段）
２１  トレーサーガス供給ライン（トレーサーガス供給手段）
２２  トレーサーガス
２３  トレーサーガス分析計
【図１】
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【図２】
2008104379.tif 000004