(57)【要約】【課題】脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法を提供する。【解決手段】  ペプチドは３から６個のアミノ酸残基で構成し、且つ少なくとも１個のアミノ酸残基はリシン（Ｌｙｓ）であるペプチドとし、官能基は−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−ＣＯ−とし、Ｘは酸素または窒素原子、ＹはＣ1-6アルキレン基とし、１個または２個の酸素または窒素原子を挿入してもよく、スペーサは親水性ポリマーとし、脂質は以下の式に示すホスファチジルエタノールアミンカルボニルであって、【化５】2008115147.tif 000007  Ｒ1とＲ2は同じでもよく、それぞれ直鎖または分枝状Ｃ7-30アルキル基又はＣ7-30のアルケニル基で、液相で反応を行う。そのステップは（ａ）ペプチドのアミノ酸残基Ｌｙｓを保護基で保護し、（ｂ）脂質−スペーサ−官能基と反応させ、（ｃ）ペプチドのアミノ酸残基Ｌｙｓ上の保護基を除去する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法であって、
ペプチドは３から６個のアミノ酸残基から構成され、且つ少なくとも一個のアミノ酸残基はリシン（Ｌｙｓ）であるペプチドであって、
官能基は、−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−ＣＯ−であって、Ｘは酸素または窒素原子、ＹはＣ1-6アルキレン基とし、これに１または２個の酸素または窒素原子を挿入し又は挿入せず、
スペーサは親水性ポリマーとし、
脂質は次の化学式に示すホスファチジルエタノールアミンカルボニルとし、
【化１】
2008115147.tif 000006
Ｒ1とＲ2は等しくても異なってもよく、且つそれぞれ直鎖または分枝状を呈するＣ７−３０アルキル基またはＣ７−３０アルケニル基であって、
液相で反応を行い、（ａ）始めにペプチド中に含まれるアミノ酸残基Ｌｙｓを保護基で保護し、（ｂ）続いて脂質−スペーサ−官能基と反応させ、（ｃ）最後にペプチドのアミノ酸残基Ｌｙｓ上の保護基を除去するステップから成ることを特徴とする脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項２】
該ペプチドのアミノ酸残基は、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、バリン（Ｖａｌ）からなるグループのうちから選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする請求項１記載の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項３】
該ペプチドのアミノ酸残基は、直線状または環状配列を呈することを特徴とする請求項１記載の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項４】
該ペプチドは、６から１４個のアミノ酸残基で構成され、且つ１個のアミノ酸残基はＬｙｓであるペプチドである、請求項１記載の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項５】
該ペプチドは、セグリチド（ｓｅｇｌｉｔｉｄｅ）、オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）、Ｔｙｒ3−ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ、Ｄ−Ｐｈｅ1−オクトレオチド、ランレオチド（ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ）及びバプレオチド（ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅ）からなるグループのうちから選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする請求項４記載の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項６】
該官能基は、コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、無水コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、またはＮ−ヒドロキシルコハク酸イミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｉｌｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）から派生した基であることを特徴とする請求項１記載の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項７】
該スペーサは、ポリビニルピロリジン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ）、ポリメタクリレート（ｐｏｌｙｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリエチルオキサゾリン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｏｘａｚｏｌｉｎｅ）、ポリビニルメチルエーテル（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）からなるグループのうちから選ばれた少なくとも一種の化合物から派生した基であることを特徴とする請求項１の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項８】
該スペーサは、ポリエチレングリコールから派生した基であり、且つ―（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m―を具え、ｍは３４から４６であることを特徴とする請求項７記載の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項９】
該ポリエチレングリコールは、ＰＥＧ６００、またはＰＥＧ２０００、またはＰＥＧ３０００であることを特徴とする請求項８記載の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項１０】
上記〔化１〕中のＲ1とＲ2は、それぞれ直鎖または分枝状Ｃ12-24アルキル基またはＣ12-24アル
ケニル基であることを特徴とする請求項１記載の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項１１】
上記〔化１〕中のＲ1とＲ2は、ドデシル（ｄｏｄｅｃｙｌ）、ミリスチル（ｍｙｒｉｓｔｙｌ）、パルミトイル（ｐａｌｍｉｔｙｌ）、ステアリル（ｓｔｅａｒｙｌ）、オレイル（ｏｌｅｙｌ）、及び９−トコセニル（９−ｄｏｃｏｓｅｎｙｌ）からなるグループから選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする請求項９記載の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項１２】
該ステップ（ａ）においてペプチド上のアミノ酸残基ｌｙｓを保護するのに使用する保護基は、第三ブチルオキシカルボニル（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、アリルオキシカルボニル（ａｌｌｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリジン）エチル（１−（４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６−ｄｉｏｘｏｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｉｄｅｎｅ）ｅｔｈｙｌ、１−（１’―アダマンチル）−１−メチルエトキシカルボニル（１−（１’―ａｄａｍａｎｔｙｌ）−１−Ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）からなるグループから選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする請求項１記載の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項１３】
該ステップ（ａ）及び（ｂ）は、非プロトン性溶剤中において進行せしめることを特徴とする請求項１記載の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項１４】
該非プロトン性溶剤は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｒａｎｅ）、ジメチルスルホオキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ヘキサメチルホスホルアミド（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、及びアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌ）からなるグループから選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする請求項１３記載の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項１５】
脂質−スペーサ−官能基と該ペプチドの用量比率は、官能基部分：ペプチド部分＝４：１から１：４であることを特徴とする請求項１記載の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項１６】
各ステップの反応温度は、１５から５０℃の間であることを特徴とする請求項１記載の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項１７】
該ステップ（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ１２から３６時間反応を行うことを特徴とする請求項１記載の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項１８】
該ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）においていずれかのステップの期間またはいずれかのステップの後に、更にペプチド部分の環化反応を行うことを特徴とする請求項１記載の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法。
【請求項１９】
標的指向性リポソームであって、請求項１記載の方法で得られる脂質−スペーサ−官能基−ペプチドを主要成分とすることを特徴とする標的指向性リポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液相環境下で脂質−スペーサ−官能基−ペプチドを合成する方法に関し、特に、高収率で生成物を得ることができ、生産性がよく、量産することができる脂質−スペーサ−官能基−ペプチドの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、１９６５年にイギリスのケンブリッジ大学のＢａｂｒａｈａｍ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＡｌｅｃ  Ｂａｎｇｈａｍが発見した。リポソームは、リン脂質とコレステロールなどを膜材として脂質中空微粒子を形成し、微粒子径は約０，００２５ｍｍから３．５マイクロメートルで水相中に懸濁し、脂質膜（微粒子表面）は主にリン脂質分子のリン酸側が構成する脂質２層である。リン脂質分子のリン酸側は親水性であり、脂質側は疎水性であるため、形成される脂質層両面は親水、層内は疎水性の膜である。水溶性物質は粒子内の溶液として覆われ、脂溶性物質は粒子皮膜層内に留まることができるため、リポソームは水性物質を覆い包む油性物質のキャリアとして用いることができる。
【０００３】
上述のリポソームの特徴から、リポソームは１９７０年代以降、薬物のキャリアとして認められるようになった。特に、抗癌薬物に適用された。リポソームは、抗癌薬物をキャリア内に包みこみ、癌細胞の部位まで指向するとそこで抗癌薬物を放出し、腫瘍部位に直接作用し、また、正常な組織には進入しにくいため正常な細胞への傷害を低減することができる。次に、リポソームを用いることの主な利点を以下に述べる。
１．薬物をリポソーム内に包み込み薬物動態学を変化させ、薬物の血液中での半減期を延長する。リポソームの大きさは約１００ナノ・メートルで、腫瘍の新生血管壁の穴を通ることができ、抗癌薬物を包んだリポソームが大量に腫瘍に累積し、治療効果を増進する。このようなリポソームは受動的標的指向性（ｐａｓｓｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）を有する。
２．毒性の高い薬物をリポソーム内に包み、好ましくない副作用を減少できる。
３．リポソームの脂質組成、粒子サイズ、構造、調製方法及び内包する薬物の選択性が大きく、各種の異なる状況に対応でき、さまざまな応用が可能である。
４．リポソームは、リン脂質で構成され、細胞膜の成分と同じであるため、生物体内で分解され、毒性をもたず、更にタンパク質のように免疫反応を引き起こすことがないため、何度も使用できる。
【０００４】
リポソームの標的組織への集中作用を高めるため、リポソーム上に細胞―特定リガンドを加え、リポソームと標的細胞との作用を促進し、癌細胞がリポソームを取り込む能力を高め、定点での薬物放出を達成し、抗癌薬物の一般組織への非特異毒性を低減し、抗癌効果を増進する。一般には、モノクローナル抗体またはリガンドを使用してリポソーム上に共有結合し、細胞表面のレセプタまたは抗原認識を経て特定細胞に進入する。この種の標的指向性リポソームは指向性をもたないリポソームに比べ治療効果が良好である。
【０００５】
例を挙げると、オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）はソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）の類似物であり、８個のアミノ酸残基を具えた環状構造である。オクトレオチドは成長ホルモン、グルカゴン、インスリンに対して効果的な抑制剤である。オクトレオチドをリポソーム上に結合すると標的指向性リポソームを形成でき、この好悪図の重要な成分は脂質−ポリエチレングリコール−オクトレオチドである。陳氏等が〔特許文献１〕で提示した脂質−ポリエチレングリコール−オクトレオチドの調製方法は、その合成過程を以下の化学反応式［化２］で簡単に説明することができる。
【化２】
2008115147.tif 000002
【特許文献１】米国特許第６５５２００７（Ｂ２）号明細書
【０００６】
呉氏等による［特許文献２］では、脂質−ポリエチレングリコール−オクトレオチドの製法を開示している。以下の化学反応式［化３］に示す。
【化３】
2008115147.tif 000003
上記の脂質−ポリエチレングリコール−オクトレオチドの調製方法は、いずれも固相環境での合成である。固相合成のステップは煩雑で、少なくとも６つのステップが必要であり、時間がかかり、調製コストも嵩む。更に、固相での脂質−ポリエチレングリコール−オクトレオチドの合成は、収率に影響する要因が多く、ペプチドのアミノ酸残基数量（数が多いほど収率は低い）、開裂方法、環化条件及び精製条件によって決まる。脂質とポリエチレングリコールは大型分子であるため、最後のステップでペプチドの開裂と環化を行う際に立体障害の問題があり、反応時間が長くなり収率が低下する。このほか、固相合成装置は各バッチで合成できる最大量が１ミリモルに限られるため、固相環境で脂質−ポリエチレングリコール−オクトレオチドを大量生産することはできない。
【特許文献２】ＥＵ特許第１３１９６６７（Ａ２）号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
固相環境で脂質−ポリエチレングリコール−ペプチドを合成する上での各種欠点にかんがみ、本発明は液相環境で脂質−スペーサ−官能基−ペプチドを調製する方法を提供することを課題とする。本発明の方法は非プロトン性溶剤中で合成反応を行い、ステップが簡単で生産効率が高いという長所を具え、大量合成に用いることができ且つコストを大幅に削減できる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、脂質−スペーサ−官能基−ペプチドを調製する方法を提供し、そこで、ペプチドは、３から１６個のアミノ酸残基から構成され、且つ少なくとも一個のアミノ酸残基はリシン（Ｌｙｓ）であるペプチドであり、官能基は−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−ＣＯ−とし、Ｘは酸素または窒素原子とし、ＹはＣ1-6アルキレン基とし、これに１または２個の酸素または窒素原子を挿入してもよく、スペーサは親水性ポリマーとし、脂質は以下の化学式［化４］に示すホスファチジルエタノールアミンカルボニルとし、
【化４】
2008115147.tif 000004
Ｒ1とＲ2は等しくても異なってもよく、且つそれぞれ直鎖または分枝状を呈するＣ７−３０アルキル基またはＣ７−３０アルケニル基を表し、
該調製方法は液相で反応を行い且つ以下のステップを含み、（ａ）始めにペプチド中に含まれるアミノ酸残基Ｌｙｓを保護基で保護し、（ｂ）続いて脂質−スペーサ−官能基と反応させ、（ｃ）最後にペプチドのアミノ酸残基Ｌｙｓ上の保護基を除去する。
【０００９】
本発明の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドを調製する方法において、ペプチドは３から１６個のアミノ酸残基から成り且つ少なくとも１個のアミノ酸残基はＬｙｓであるペプチドである。これらのアミノ酸残基は、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、バリン（Ｖａｌ）からなるグループから選ぶ。これらのアミノ酸残基は、直線状または環状配列を呈してもよい。より好ましくは、６から１４個のアミノ酸残基で構成し、且つ１個のアミノ酸残基がＬｙｓであるソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）類似物であることが望ましい。具体的な実例としてセグリチド（ｓｅｇｌｉｔｉｄｅ）（環［Ｎ−メチル基−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ］）、オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）（Ｄ−Ｐｈｅ−環［Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ］−Ｔｈｒ（ｏｌ））、Ｔｙｒ3−オクトレオチド、Ｄ−Ｐｈｅ1−オクトレオチド、ランレオチド（ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ）（ＤβＮａｌ−環［Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｌ］−Ｔｈｒ（ｏｌ））、バプレオチド（ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅ）（Ｄ−Ｐｈｅ−環［Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ］−Ｔｒｐ）、Ｄ−Ｐｈｅ−環［Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ］−Ｔｈｒ（ｏｌ）等が挙げられる。
【００１０】
本発明の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドを調製する方法において、スペーサ上に−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−ＣＯ−で表される官能基を結合し、ここでＸは酸素または窒素原子、ＹはＣ1-6アルキレン基とし、これに１または２個の酸素または窒素原子を挿入してもよい。官能基のカルボニル基側を利用してペプチドと−ＣＯＮＨ−結合を生成し、官能基の別の一端Ｘはスペーサと結合でき、これによりスペーサとペプチドを結合する。官能基はコハク酸、無水コハク酸（ＳＡ）、Ｎ−ヒドロキシルコハク酸イミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｉｌｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）などの化合物から派生した基とする。
【００１１】
本発明の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドを調整する方法において、スペーサの効用は親水側ペプチドと疎水側脂質を結合することであり、そのため親水性を具えた長鎖ポリマーの使用が適している。スペーサの具体例として、ポリビニルピロリジン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ）、ポリメタクリレート（ｐｏｌｙｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリエチルオキサゾリン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｏｘａｚｏｌｉｎｅ）、ポリビニルメチルエーテル（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）等から派生した基が挙げられる。より好ましくは、ポリエチレングリコールから派生した基で且つ―（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m―を具え、ｍは３４から４６であることが望ましく、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ２０００またはＰＥＧ３０００が最適である。
【００１２】
本発明の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドを調製する方法において、［化３］に示すホスファチジルエタノールアミンカルボニルのＲ1とＲ2は同じでも異なってもよく、それぞれＣ12-24アルキル基またはＣ12-24アルケニル基を表し、アルキル基及びアルケニル基は直鎖または分枝状を呈すことができる。具体例として、ドデシル（ｄｏｄｅｃｙｌ）、ミリスチル（ｍｙｒｉｓｔｙｌ）、パルミトイル（ｐａｌｍｉｔｙｌ）、ステアリル（ｓｔｅａｒｙｌ）、オレイル（ｏｌｅｙｌ）、及び９−トコセニル（９−ｄｏｃｏｓｅｎｙｌ）等が挙げられる。より好ましくは、ステアリル及びオレイルが望ましい。
【００１３】
本発明の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドを調製する方法において、ステップ（ａ）及び（ｃ）に述べる保護基の種類及び保護基のアミノ酸残基上の結合と除去方法はペプチド合成の公知技術であり、当該分野に習熟した者は保護したいアミノ酸残基及びそのペプチド鎖中の位置に応じて決定してよい。本発明の方法においてはペプチド上のアミノ酸残基Ｌｙｓを保護するために使用する保護基の具体例として、第三ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−ＣＩＺ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｏｃ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリジン）エチル（Ｄｄｅ）、１−（１’―アダマンチル）−１−メチルエトキシカルボニル（Ａｄｐｏｃ）等が挙げられる。
【００１４】
本発明の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドを調製する方法において、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は全て液相環境で反応を行う。ステップ（ａ）及び（ｂ）はペプチドと脂質−スペーサ−官能基とをそれぞれ非プロトン性溶剤中において進行し、非プロトン性溶剤の具体例として、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、及びアセトニトリル（ＡＣＮ）等が挙げられる。より好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びテトラヒドロフランが望ましい。
【００１５】
本発明の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドを調製する方法において、官能基部分のカルボキシル基数及びペプチド部分のアミノ基数に基づいて、脂質−スペーサ−官能基とペプチドの用量比率を決定することができる。より好ましくは、官能基部分：ペプチド部分を４：１から１：４の比率に維持して反応を進行するとよく、官能基部分：ペプチド部分を１：２の比率にすると更によい。
【００１６】
本発明の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドを調製する方法において、各ステップは全て温度が１５から５０℃の間で進行し、よりよくは２０から３５℃の間が望ましい。ステップ（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ１２から３６時間反応を行う必要があり、より好ましくは、２０から２８時間が望ましい。
【００１７】
本発明の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドを調製する方法において、ペプチドのアミノ酸残基が直線状の配列を呈している場合、状況に応じてペプチド部分の環化ステップを行うことができる。このペプチド環化の方法は公知技術であり、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のどのステップの期間またはどのステップの後に行ってもよい。
【００１８】
本発明の脂質−スペーサ−官能基−ペプチドを調製する方法によって得られる生成物は標的指向性リポソームの主要処方成分とすることができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法は、非プロトン性溶剤中で合成反応を行い、ステップが簡単で生産効率が高いという長所を具え、大量合成に用いることができ且つコストを大幅に削減できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
実施例により製造工程ステップまたは組成構造を説明する。以下の説明では次の略号を使用する。
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
ＤＳＰＥ：ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＰＥ：ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
ＢＯＣ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＳＡ：無水コハク酸
ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルクロリン
【００２１】
実施例１：Ｄ−Ｐｈｅ−環［Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ］−Ｔｈｒ（ｏｌ）合成
オクトレオチド１００ミリグラムを丸底フラスコに入れ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを５ミリリットル加えて溶解する。オクトレオチドが完全に溶解したら、（Ｂｏｃ）2Ｏを２０マイクロリットル加える。混合物を室温で２４時間反応させた後、真空システムで溶剤を吸引し、粗製品Ｄ−Ｐｈｅ−環−［Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ］−Ｔｈｒ（ｏｌ）を得る。最後に、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．社製Ｈｉｂａｒ  ２５０−１０  Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ  ＲＰ−１８（７マイクロメートル）のカラムで、溶離剤は０．１％三フッ化酢酸／Ｈ2Ｏ、分析時間を４０分（８０％〜１０％）とし、高速液体クロマトグラフィにより粗製品を精製する。その結果、滞留時間は２９．４分間、メインピークの溶液を凍結乾燥して得られる白色固体粉末（７２ミリグラム、収率７０％）を収集し、マススペクトロメトリは［Ｍ＋Ｈ］+＝１１１９Ｄａであった。
【００２２】
実施例２：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＳＡ合成
ＤＳＰＥ１５グラムとカルボニルジイミダゾール３．９グラムを混合してトルエン７０ミリリットルに溶解し、更にトリエチルアミン２グラムを加え、１００℃で１時間反応させる。ＰＥＧ４０グラム（平均分子量２０００）をトルエン１５ミリリットルに溶解し、上述の溶液中に滴下し反応を継続する。反応終了後、溶剤を除去し、得られた固体生成物をアセトン５００ミリリットルに溶解し、溶解しない固体はろ過して除去する。ろ液を吸引乾燥して得られた固体生成物を陽イオン交換樹脂を用いて生成物をＮａ+型に置換し、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＨが得られる。続いて、コハク酸イミド２．１グラムをピリジン１．７グラムを含むトルエン溶液１００ミリリットルに溶解し、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＨと反応を継続し、エチルエーテル５００ミリリットルを加え（反応溶液相体積の約５倍量）、得られた固体生成物がＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＳＡである。その後、クロロホルムで平衡化したシリカゲル６０カラム（粒子径６２から２００マイクロメートル、１．５×３０センチメートル）により、溶離剤はクロロホルム／メタノール＝４／１で生成物を分離する。上述のＴＬＣ法で生成物の純生成物部分を収集し、減圧乾燥法で溶剤を除去する。生成物はマススペクトロメトリ［Ｍ＋Ｈ］+＝２８９２Ｄａと測定され、核磁気共鳴装置（1Ｈ ＮＭＲ）分析結果は以下のとおりである。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）
δ０．７８〜１．４０（６６Ｈ、ジアルキルＨ）
δ２．３３（４Ｈ、ｂｒｔ、ＣＯ−ＣＨ2）
δ３．６４（１６０Ｈ、ｂｒｓ、ＰＥＧ−Ｈ）
δ３．８５〜４．５０（９Ｈ、ｍ、グリセロール−Ｈ及びＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ）
【００２３】
実施例３：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−オクトレオチド合成
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＳＡを１００ミリグラムとＤ−Ｐｈｅ−環［Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ］−Ｔｈｒ（ｏｌ）を３４．６ミリグラムとを混合し、６ミリリットルのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解する。固体が完全に溶解してから、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを４．１ミリグラムとジシクロヘキシルカルボジイミドを６．４ミリグラム加え、共に２４時間反応させる。その後溶剤を除去する。５ミリリットルの９５％三フッ化酢酸を加えて、Ｄ−Ｐｈｅ−環［Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ］―Ｔｈｒ（ｏｌ）上の保護基Ｂｏｃを除去し、３０分反応させた後溶剤を除去する。過量のクロロホルムを加え静置して溶液に沈殿を生じるようにし、ろ紙Ｎｏ．４２でろ過し、ろ液を濃縮した後再度過量のクロロホルムを加え、上述のステップを数回重複してから、ろ液を減圧濃縮装置で濃縮すれば化合物ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−オクトレオチドが得られ、これは淡褐色固体（１２２ミリグラム、収率９１％）である。高速液体クロマトグラフィで生成物を分析し、溶離剤は０．１％三フッ化酢酸／ＣＨ3ＣＮを使用するほかは、その他の分析条件は実例１と同様である。その結果、滞留時間は１４．５分、マススペクトロメトリは［Ｍ＋Ｈ］+＝３８９３Ｄａと測量され、核磁気共鳴装置（1Ｈ ＮＭＲ）分析結果は以下のとおりである。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）
δ０．８４〜１．４０（６６Ｈ、ジアルキルＨ）
δ３．６４（１６０Ｈ、ｂｒｓ、ＰＥＧ−Ｈ）
δ３．８５〜４．５０（９Ｈ、ｍ、グリセロール−Ｈ及びＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ）
δ８．０４（４Ｈ、ベンジル）
【００２４】
実施例４：薄膜ハイドレート法によるドキソルビシン薬物を含む標的指向性リポソーム（オクトレオチド−リポソーム−ドキソルビシン）合成
ＤＳＰＣ（７０モル）／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ２０００／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ２０００−オクトレオチド（３：２：０．０９４：０．２０６モル比）、ＤＳＰＣ（７０モル）／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ２０００−オクトレオチド（３：２：０．２０６モル比）、ＤＳＰＣ（７０モル）／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ２０００−オクトレオチド（３：２：０．３モル比）を計量してそれぞれ２５０ミリリットルの丸底フラスコに入れ、更に個別に８ミリリットルのクロロホルムを加え均一に溶解させる。遠心式減圧濃縮機を用いて６０℃で有機溶液を真空吸引し、クロロホルムを完全に除くとフラスコ壁上に脂質薄膜が形成される。乾燥後、更に、脂質薄膜が形成された丸底フラスコ内に５ミリリットルの２５０ｍＭ硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ５．０、５３０ｍＯｓ）を加える。６０℃の水浴中にて振り動かしてフラスコ壁上の脂質薄膜が全部硫酸アンモニウム溶液中に分散するようにすると、多層膜リポソーム（マルチラメラベシクル、ＭＬＶ）が得られる。多層膜リポソーム懸濁液を液体窒素及び６０℃水浴で凍結と解凍を６回繰り返した後、高圧フィルタ押出装置（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  Ｉｎｃ．社、バンクーバー、カナダ）でろ過・押出を行い単層リポソームを得る。
【００２５】
続いてドキソルビシン薬物の内包を行う。リン脂質１マイクロモルに対してドキソルビシン１４０グラムの割合で、予め濃度１０ミリグラム／ミリリットルに調製したドキソルビシン薬物ストックをリポソーム懸濁液中に加え、６０℃と１００ｒｐｍで３０分間反応させる。反応が完了したら、懸濁液を即座に氷水浴で冷却する。ドキソルビシンを内包したリポソーム懸濁液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０ゲルろ過カラムを通し、０．９％塩化ナトリウムを溶離剤として内包されなかったドキソルビシン薬物を除去する。カラムを通過したリポソーム懸濁液を収集し、更に高速遠心装置で１５００００ｘｇで９０分間遠心する。大部分の上澄みを除去し、少量の上澄み液を残し、沈殿したリポソームを再度均一に懸濁する。０．２２マイクロメートルフィルタでリポソーム懸濁液をろ過し、最終製品（オクトレオチド−リポソーム−ドキソルビシン）を得る。リポソーム内のドキソルビシン薬物の濃度測定と粒径分析を行う。
１．Ｎ４  Ｐｌｕｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）サブミクロン粒子アナラ      イザを用いて、リポソーム平均粒径は７５から９５ナノメートルの常態分布で      あることが測定された。
２．蛍光分光装置（ＪＡＳＣＯ社、ＦＰ６２００）を用い４７５ナノメートル励起光      及び５８０ナノメートル発光において測定したところ、リポソーム内に内包さ      れたドキソルビシン薬物濃度は２ミリグラム／ミリリットルであった。
【００２６】
実施例５：標的指向性リポソーム細胞活性実験
この実験は、膵臓腫瘍細胞ＡＲ４２Ｊのオクトレオチド−リポソーム−ドキソルビシン標的指向性リポソーム薬物の取り込み状況を分析する。実験には適量の娘細胞を培養して行う必要がある。まずＡＲ４２Ｊ細胞を５×１０5細胞／ウェルで６−ウェル培養プレートに培養し、一晩の時間を経過させて細胞粘着させる。細胞が粘着してから、ことなる組み合わせの薬物を調製し、それぞれコントロールセット（１ミリリットル／ウェルＨＢＳＳ処理）、自由型ドキソルビシン、リポソーム−ドキソルビシン（自身で合成）、及びオクトレオチド−リポソーム−ドキソルビシンとする。１ミリリットル／ウェルの濃度で細胞に加え、それぞれ２及び４時間薬物取り込み反応を行う。反応時間終了後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し薬物反応を終結する。続いて５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液で１０分間作用させ、細胞を溶解し、取り込まれた薬物を放出させる。放出された摂取薬物を十分に均一に混合した後、１ミリリットルを取り使い捨てキュベットに入れ、ドキソルビシン薬物が自発性蛍光特性を生じることができることを利用し、４７５ナノメートル励起光と５８０ナノメートル発光のもとスペクトラム分析を行う。また同時に、溶解した細胞にタンパク質量化分析を行い細胞数の標準化を行う。最後に取り込まれた薬物濃度と標準化した細胞数を対照し、細胞の摂取薬物分子数を得るとともに、実験組別比較を行う。
【００２７】
表１に示すように、ＡＲ４２Ｊ細胞が異なる処方の薬物を取り込む状況では、コントロールセットはＨＢＳＳ処理したため、ドキソルビシンの取り込みはなく、ドキソルビシンの存在下でのみドキソルビシンの取り込みがあることを示している。自由形ドキソルビシンは細胞中の取り込みが最も高く、細胞の２時間の取り込みは９６．４３×１０9分子／細胞、４時間の取り込みは１１０．８３×１０9分子／細胞であった。リポソーム特性を備えたリポソーム−ドキソルビシン（自身で合成）では、細胞の２時間と４時間の取り込みはそれぞれ１．８９×１０9分子／細胞と２．４６×１０9分子／細胞であった。標的指向性腫瘍治療薬物オクトレオチド−リポソーム−ドキソルビシンは異なる処方で２時間と４時間で異なる取り込みがあった。オクトレオチド−リポソームドキソルビシンは１．９７×１０9分子／細胞と３．１４×１０9分子／細胞であった。４％オクトレオチド−リポソーム−ドキソルビシンは２．２６×１０9分子／細胞と３．４３×１０9分子／細胞であった。６％オクトレオチド−リポソーム−ドキソルビシンは２．９８×１０9分子／細胞と５．３５×１０9分子／細胞であった。
【表１】
2008115147.tif 000005