(57)【要約】【課題】自閉症の早期、簡便かつ信頼性のある診断手段を提供する。【解決手段】トランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）又は上皮成長因子（ＥＧＦ）のいずれか、あるいはこれらの内の２以上を主成分とする自閉症診断薬。この自閉症診断薬を用いて、ヒト血液試料中のＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦのいずれか、あるいはこれらの内の２以上の濃度を測定する自閉症検定方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗トランスフォーミング成長因子ベータ１抗体を主成分とする自閉症診断薬。
【請求項２】
前記自閉症診断薬が、ヒト血液試料中のトランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦβ１）濃度を測定するために使用されるものである請求項１に記載の自閉症診断薬。
【請求項３】
前記抗トランスフォーミング成長因子ベータ１抗体が、未標識の抗トランスフォーミング成長因子ベータ１抗体、及び／又は、標識化抗トランスフォーミング成長因子ベータ１抗体からなる請求項１又は請求項２に記載の自閉症診断薬。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載の自閉症診断薬を含んで構成される自閉症診断キット。
【請求項５】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載の自閉症診断薬、又は請求項４に記載の自閉症診断キットを用いて、ヒト血液試料中のトランスフォーミング成長因子ベータ１濃度を測定する自閉症検定方法。
【請求項６】
抗肝細胞増殖因子抗体を主成分とする自閉症診断薬。
【請求項７】
前記自閉症診断薬が、ヒト血液試料中の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）濃度を測定するために使用されるものである請求項６に記載の自閉症診断薬。
【請求項８】
前記抗肝細胞増殖因子抗体が、未標識の抗肝細胞増殖因子抗体、及び／又は、標識化抗肝細胞増殖因子抗体からなる請求項６又は請求項７に記載の自閉症診断薬。
【請求項９】
請求項６〜請求項８のいずれかに記載の自閉症診断薬を含んで構成される自閉症診断キット。
【請求項１０】
請求項６〜請求項８のいずれかに記載の自閉症診断薬、又は請求項９に記載の自閉症診断キットを用いて、ヒト血液試料中の抗肝細胞増殖因子濃度を測定する自閉症検定方法。
【請求項１１】
抗上皮成長因子抗体を主成分とする自閉症診断薬。
【請求項１２】
前記自閉症診断薬が、ヒト血液試料中の上皮成長因子（ＥＧＦ）濃度を測定するために使用されるものである請求項１１に記載の自閉症診断薬。
【請求項１３】
前記抗上皮成長因子抗体が、未標識の抗上皮成長因子抗体、及び／又は、標識化抗上皮成長因子抗体からなる請求項１１又は請求項１２に記載の自閉症診断薬。
【請求項１４】
請求項１１〜請求項１３のいずれかに記載の自閉症診断薬を含んで構成される自閉症診断キット。
【請求項１５】
請求項１１〜請求項１３のいずれかに記載の自閉症診断薬、又は請求項１４に記載の自閉症診断キットを用いて、ヒト血液試料中の上皮成長因子濃度を測定する自閉症検定方法。
【請求項１６】
抗トランスフォーミング成長因子ベータ１抗体、抗肝細胞増殖因子抗体及び抗上皮成長因子抗体の内のいずれか２以上の抗体を主成分とする自閉症診断薬。
【請求項１７】
前記自閉症診断薬がヒト血液試料中のトランスフォーミング成長因子ベータ１濃度、肝細胞増殖因子濃度及び上皮成長因子濃度の内のいずれか２以上を測定するために使用されるものである請求項１６に記載の自閉症診断薬。
【請求項１８】
前記抗トランスフォーミング成長因子ベータ１抗体、抗肝細胞増殖因子抗体、抗上皮成長因子抗体が、それぞれ、未標識のもの、及び／又は、標識化されたものからなる請求項１６又は請求項１７に記載の自閉症診断薬。
【請求項１９】
請求項１６〜請求項１８のいずれかに記載の自閉症診断薬を含んで構成される自閉症診断キット。
【請求項２０】
請求項１６〜請求項１８のいずれかに記載の自閉症診断薬、又は請求項１９に記載の自閉症診断キットを用いて、ヒト血液試料中のトランスフォーミング成長因子ベータ１濃度、肝細胞増殖因子濃度及び上皮成長因子濃度の内のいずれか２以上を測定する自閉症検定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は自閉症の診断薬に関する。さらに詳しくは本発明は、自閉症診断の指標として有効であることが新規に見出された生体タンパク質に対する抗体を主成分とする自閉症の診断薬の発明と、これに関連する発明に関する。
【背景技術】
【０００２】
自閉症はアメリカのカナー博士により１９４３年に“情緒接触の自閉的障害”として最初に記載された障害である。発症は人生の極めて早期であり、主要症状として周囲からの極端な孤立と自閉化、特異な言語症状、強迫的な同一性保持が指摘されている。自閉症は、人生の早い時期に障害が現れ、発達の過程によって状態が変わっていく発達障害であり、未だ特定できない高次の中枢神経系の障害であると推測されている。
【０００３】
一方、高機能自閉症とは、３歳位までに現れ、他人との社会的関係の形成の困難さ、言葉の発達の遅れ、興味や関心が狭く特定のものにこだわることを特徴とする行動の障害である自閉症のうち、知的発達の遅れを伴わないものをいう。自閉症の罹病率は、子供１万人あたり７〜１６人であり、高機能自閉症は自閉症のおおよそ１１〜３４％であると報告されている（非特許文献１）。高機能自閉症の原因は現在のところ明らかでないが、脳の機能障害および発達障害を基盤とする生物学的要因と、発達段階における環境からの心理学的要因とが複雑に絡み合っているものと推測されている。
【０００４】
【非特許文献１】マッキントッシュ，KEら著、 Annotation:The similarities and differences between autistic disorderand Asperger's disorder: a review of the empirical evidence.Journal of Child Psychology and Psychiatry. (2004) 45: 421-434.  自閉症の診断は、米国精神医学会の診断基準（ＤＳＭ−ＩＶ）、世界保健機構ＷＨＯのＩＣＤ−１０、ＡＤＩ−Ｒ（Autism Diagnostic Interview-Revised ）を用いた面接で行なわれている。自閉症では出生後早期に頭囲の拡大がみとめられており、この時期の神経細胞やグリアの新生の増加もしくは細胞死の減少が存在していると考えられる。さらに、この過程には神経成長因子が関与していることが強く示唆されている（非特許文献２）。また、自閉症の病態の特殊性から、早期診断、早期治療、社会復帰活動、予防といった包括的な治療体系の確立が望まれているが、自閉症の生物学的マ−カ−は未だ確立されていない。
【０００５】
【非特許文献２】マッカフェリー，Ｐら著、 Macrocephaly and the control of brain growth in autistic disorders.Progress in Neurobioligy (2005) 77: 38-56.  ところで、トランスフォーミング成長因子ベータ１（ Transforming Growth Factor β1 ：以下、「ＴＧＦβ１」とも呼ぶ) は発達や組織修復に関与する多機能性を持つ調節サイトカインのサブタイプの一つである。ＴＧＦβは脳内ではグリアと神経細胞にて産生され、ＴＧＦβ１は主に傷害修復に関係するサイトカインと考えられているが、神経系における調節因子としても重要な役割を担っている（非特許文献３）。ＴＧＦβ１とその受容体は発達段階の神経系に発現していることから、脳の発達に関与していることが示唆されており（非特許文献４）、ＴＧＦβ１ノックアウトマウスにおいて広範な細胞死を伴う重篤な皮質の発達障害が認められる（非特許文献５）。これらから、脳発達におけるＴＧＦβ１の役割を考えると、自閉症患者の病態生理との関連が考えられる。
【０００６】
【非特許文献３】ゴメス，ＦＣら著、 Emerging roles for TGF-betal in nervous system development.Int J Dev Neurosci (2005) 23: 413-424.
【非特許文献４】ボートナー，Ｍら著、 The transforming growth factor-betas: structure, signaling, and rolesin nervous system development and functions.J Neurochem (2000) 75: 2227-2240.
【非特許文献５】ブリオンネ，ＴＣら著、 Loss of TGF-betal leads to increased neuronal cell death andmicrogliosis in mouse brain.Neuron (2003) 40: 1133-1145.  次に、肝細胞増殖因子（Hepatocyte Growth Factor：以下、「ＨＧＦ」とも呼ぶ）は、肝蔵のみならず腎臓、肺、心血管系そして神経系などに存在し、臓器の再生、保護の役割を担っている。またＨＧＦはげっ歯類において、終脳における腹側から背側への介在ニューロンの移動促進（非特許文献６）や、顆粒細胞の増殖分化の制御（非特許文献７）など胎生期の神経細胞発達に関与している（非特許文献８）。更に、ＨＧＦは新生児期の大脳皮質錐体細胞樹状突起の形成を制御し、神経細胞の発達に不可欠であることがわかっている（非特許文献９）。これらの脳の発達におけるＨＧＦの役割を考慮すると、自閉症患者の病態生理にＨＧＦが関与していることが考えられる（非特許文献１０）。近年、自閉症患者の脳脊髄液中のＨＧＦが健常群に比べて顕著に高値であると報告されたことから（非特許文献１１）、末梢血中ＨＧＦ濃度の異常が推定されるが，これまでのところ報告はない。
【０００７】
【非特許文献６】パウエル，ＥＭら著、 Hepatocyte growth factor/scatter factor is a motogen for interneuronsmigrating from the ventral to dorsal telencephalon.Neuron (2001) 30: 79-89.
【非特許文献７】アイエラキ，Ａら著、Viable hypomorphic signaling mutant of the Met receptor reveals a rolefor hepatocyte growth factor in postnatal cerebellar development.Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99: 15200-15205.
【非特許文献８】マイナ，Ｆら著、 Hepatocyte growth factor, a versatile signal for developing neurons.Nature Neurosci (1999) 2: 213-217.
【非特許文献９】グティーレッツ，Ｈら著、 HGF regulates the development of cortical pyramidaldendrites.Development (2004) 131: 3717-3726.
【非特許文献１０】レビット，Ｐら著、Regulation of neocortical interneuron development and the implicationsfor neurodevelopmental disorders.Trends Neurosci (2004) 27: 400-406.
【非特許文献１１】ヴァーガス，ＤＬら著、 Neuroglial activation and neuroinflammation in the brain of patientswith autism.Ann Neurol (2005) 57: 67-81.  更に、上皮成長因子（ Epidermal Growth Factor：以下「ＥＧＦ」とも呼ぶ）とその関連因子は、ＥＧＦレセプターに結合し、繊維芽細胞や上皮細胞の増殖を促進させる働きがあり、増殖、分化、血管新生、アポトーシスの抑制において重要な役割を果たしている。また、ＥＧＦは成人脳の神経細胞や星状細胞にその存在が確認され、脳神経におけるＥＧＦの役割を考慮すると自閉症患者の病態生理にＥＧＦが関与していることが考えられる（非特許文献１２）。さらに血液中に投与された放射性標識されたＥＧＦは脳血流関門を急速に通過することから、末梢血中のＥＧＦ濃度は脳内ＥＧＦ濃度を反映していると考えられる（非特許文献１３）。
【０００８】
【非特許文献１２】フェラー，Ｉら著、 Transforming growth factor-alpha (TGF-) and epidermal growth factor-receptor(EGF-R) immunoreactivity in normal and pathologic brain.Prog Neurobiol (1996) 49: 99-123.
【非特許文献１３】パン，Ｗら著、 Entry of EGF into brain is rapid and saturable.Peptides (1999) 20: 1091-1098.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
自閉症は、前述したとおり簡便な生物学的マ−カ−が確立されておらず、その診断が困難であり、早期に適切な処置を講じることができず、そのことが症状をさらに悪化させる原因になっている。従って、医療の現場から、自閉症を早期に診断できる診断薬および診断方法の開発が望まれている。
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、自閉症患者の血清中におけるＴＧＦβ１、ＨＧＦ、ＥＧＦのそれぞれのレベルが、健常者のそれらと比較して有意に低下していることを見出した。
【００１１】
そして、このようなＴＧＦβ１、ＨＧＦあるいはＥＧＦのレベルの違いを利用することにより、抗トランスフォーミング成長因子ベータ１抗体（抗ＴＧＦβ１抗体）、抗肝細胞増殖因子抗体（抗ＨＧＦ抗体）あるいは抗上皮成長因子抗体（抗ＥＧＦ抗体）を用いて自閉症の早期、簡便かつ信頼性のある診断が可能となることを知った。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
〔用語の意味、定義〕
以下、本明細書における用語の意味あるいは定義について述べる。
【００１３】
「自閉症」とは、主要症状として周囲からの極端な孤立と自閉化、特異な言語症状、強迫的な同一性保持があげられており、人生の早い時期に障害が現れ、発達の過程によって状態が変わっていく発達障害である。「高機能自閉症」とは、３歳位までに現れ、他人との社会的関係の形成の困難さ、言葉の発達の遅れ、興味や関心が狭く特定のものにこだわることを特徴とする行動の障害である自閉症のうち、知的発達の遅れを伴わないものをいう。
【００１４】
「血液試料」とは、ヒト（自閉症患者に限定されない）又は動物（例えば自閉症モデル動物）から採取した血液の他、これらの血液から調製した血清、血液又は血清を含む組成物（例えば、ｐＨ緩衝液による希釈物等）、あるいはこれらの凍結乾燥物等を限定なく包含する概念である。
【００１５】
「抗トランスフォーミング成長因子ベータ１抗体」とは、トランスフォーミング成長因子ベータ１を抗原として用いて精製された抗体をいう。該抗体は、トランスフォーミング成長因子ベータ１に結合する能力があればよく、ポリクロ−ナル抗体、モノクロ−ナル抗体を含む。また好ましいものとしては、特異的にトランスフォーミング成長因子ベータ１に結合するポリクロ−ナル抗体、モノクロ−ナル抗体等が挙げられる。
【００１６】
「標識化抗トランスフォーミング成長因子ベータ１抗体」とは、トランスフォーミング成長因子ベータ１抗体をペルオキシダ−ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ、アルカリフォスファタ−ゼ、グルコ−ス−６−リン酸脱水素酵素等の酵素、デルフィニウム等の蛍光標識、放射性同位元素標識または同位元素標識、ビオチン等を結合させ、トランスフォーミング成長因子ベータ１を定量化できるように工夫された抗体をいう。
【００１７】
更に、「標識化抗トランスフォーミング成長因子ベータ１抗体」には、ビオチン、２，４−ジニトロフェノ−ル等で修飾した抗トランスフォーミング成長因子ベータ１も含まれる。この際には、該標識化抗トランスフォーミング成長因子ベータ１抗体に標識化したアビジン、標識化抗２，４−ジニトロフェノ−ル抗体を更に用いて定量化できる。
【００１８】
「抗肝細胞増殖因子抗体」とは、肝細胞増殖因子を抗原として用いて精製された抗体をいう。該抗体は、肝細胞増殖因子に結合する能力があればよく、ポリクロ−ナル抗体、モノクロ−ナル抗体を含む。また好ましいものとしては、特異的に肝細胞増殖因子に結合するポリクロ−ナル抗体、モノクロ−ナル抗体等が挙げられる。
【００１９】
「標識化抗肝細胞増殖因子抗体」とは、肝細胞増殖因子抗体をペルオキシダ−ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ、アルカリフォスファタ−ゼ、グルコ−ス−６−リン酸脱水素酵素等の酵素、デルフィニウム等の蛍光標識、放射性同位元素標識または同位元素標識、ビオチン等を結合させ、肝細胞増殖因子を定量化できるように工夫された抗体をいう。
【００２０】
更に、「標識化抗肝細胞増殖因子抗体」には、ビオチン、２，４−ジニトロフェノ−ル等で修飾した抗肝細胞増殖因子も含まれる。この際には、該標識化抗肝細胞増殖因子抗体に標識化したアビジン、標識化抗２，４−ジニトロフェノ−ル抗体を更に用いて定量化できる。
【００２１】
「抗上皮成長因子抗体」とは、上皮成長因子を抗原として用いて精製された抗体をいう。該抗体は上皮成長因子に結合する能力があればよく、ポリクロ−ナル抗体、モノクロ−ナル抗体を含む。また好ましいものとしては、特異的に上皮成長因子に結合するポリクロ−ナル抗体、モノクロ−ナル抗体等が挙げられる。
【００２２】
「標識化抗上皮成長因子抗体」とは、上皮成長因子抗体をペルオキシダ−ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ、アルカリフォスファタ−ゼ、グルコ−ス−６−リン酸脱水素酵素等の酵素、デルフィニウム等の蛍光標識、放射性同位元素標識または同位元素標識、ビオチン等を結合させ、上皮成長因子を定量化できるように工夫された抗体をいう。
【００２３】
更に、「標識化抗上皮成長因子抗体」には、ビオチン、２，４−ジニトロフェノ−ル等で修飾した抗上皮成長因子も含まれる。この際には、該標識化抗上皮成長因子抗体に標識化したアビジン、標識化抗２，４−ジニトロフェノ−ル抗体を更に用いて定量化できる。
【００２４】
なお、上記したＴＧＦβ１、ＨＧＦ、ＥＧＦや、抗ＴＧＦβ１抗体、抗ＨＧＦ抗体、抗ＥＧＦ抗体は、それら自体としてはいずれも公知であるため、本明細書ではこれらのアミノ酸配列等の説明は省略する。
【００２５】
〔ＴＧＦβ１に関連する発明〕
本発明の内、ＴＧＦβ１に関連する発明群は以下の通りである。
【００２６】
１）抗ＴＧＦβ１抗体を主成分とする自閉症診断薬。
【００２７】
２）ヒト血液試料中のＴＧＦβ１濃度を測定するために使用されるものである、上記１）の自閉症診断薬。
【００２８】
３）未標識の抗ＴＧＦβ１抗体、及び／又は、標識化抗ＴＧＦβ１抗体からなる、上記１）又は２）の自閉症診断薬。
【００２９】
４）上記の１）〜３）のいずれかの自閉症診断薬を含んで構成される自閉症診断キット。
【００３０】
５）ヒト血液試料中のＴＧＦβ１濃度を測定するために使用されるものである、上記４）の自閉症診断キット。
【００３１】
６）上記の１）〜３）のいずれかの自閉症診断薬、あるいは上記４）又は５）の自閉症診断キットを用いて、ヒト血液試料中のＴＧＦβ１濃度を測定する自閉症検定方法。
【００３２】
７）上記の１）〜３）のいずれかの自閉症診断薬、あるいは上記４）又は５）の自閉症診断キットを用いて、自閉症の治療薬の効果を検定する検定方法。
【００３３】
８）上記の１）〜３）のいずれかの自閉症診断薬、あるいは上記４）又は５）の自閉症診断キットを用いて、少なくとも自閉症モデル動物を包含する動物の血液試料中のＴＧＦβ１濃度を測定する自閉症の検定方法。
【００３４】
９）ＴＧＦβ１をヒト体内において増加させる化合物である自閉症治療薬。
【００３５】
〔ＨＧＦに関連する発明〕
本発明の内、ＨＧＦに関連する発明群は以下の通りである。
【００３６】
１）抗ＨＧＦ抗体を主成分とする自閉症診断薬。
【００３７】
２）ヒト血液試料中のＨＧＦ濃度を測定するために使用されるものである、上記の１）の自閉症診断薬。
【００３８】
３）未標識の抗ＨＧＦ抗体、及び／又は、標識化抗ＨＧＦ抗体からなる、上記１）又は２）の自閉症診断薬。
【００３９】
４）上記の１）〜３）のいずれかの自閉症診断薬を含んで構成される自閉症診断キット。
【００４０】
５）ヒト血液試料中のＨＧＦを測定するために使用されるものである、４）の自閉症診断キット。
【００４１】
６）上記の１）〜３）のいずれかの自閉症診断薬、あるいは上記４）又は５）の自閉症診断キットを用いて、ヒト血液試料中のＨＧＦ濃度を測定する自閉症検定方法。
【００４２】
７）上記の１）〜３）のいずれかの自閉症診断薬、あるいは上記４）又は５）の自閉症診断キットを用いて、自閉症の治療薬の効果を検定する検定方法。
【００４３】
８）上記の１）〜３）のいずれかの自閉症診断薬、あるいは上記４）又は５）の自閉症診断キットを用いて、少なくとも自閉症モデル動物を包含する動物の血液試料中のＨＧＦ濃度を測定する自閉症の検定方法。
【００４４】
９）ＨＧＦをヒト体内において増加させる化合物である、自閉症の治療薬。
【００４５】
〔ＥＧＦに関連する発明〕
本発明の内、ＥＧＦに関連する発明群は以下の通りである。
【００４６】
１）抗ＥＧＦ抗体を主成分とする自閉症診断薬。
【００４７】
２）ヒト血液試料中のＥＧＦ濃度を測定するために使用されるものである、上記の１）の自閉症診断薬。
【００４８】
３）未標識の抗ＥＧＦ抗体、及び／又は、標識化抗ＥＧＦ抗体からなる、上記１）又は２）の自閉症診断薬。
【００４９】
４）上記の１）〜３）のいずれかの自閉症診断薬を含んで構成される自閉症診断キット。
【００５０】
５）ヒト血液試料中のＥＧＦを測定するために使用されるものである、４）の自閉症診断キット。
【００５１】
６）上記の１）〜３）のいずれかの自閉症診断薬、あるいは上記４）又は５）の自閉症診断キットを用いて、ヒト血液試料中のＥＧＦ濃度を測定する自閉症検定方法。
【００５２】
７）上記の１）〜３）のいずれかの自閉症診断薬、あるいは上記４）又は５）の自閉症診断キットを用いて、自閉症の治療薬の効果を検定する検定方法。
【００５３】
８）上記の１）〜３）のいずれかの自閉症診断薬、あるいは上記４）又は５）の自閉症診断キットを用いて、少なくとも自閉症モデル動物を包含する動物の血液試料中のＥＧＦ濃度を測定する自閉症の検定方法。
【００５４】
９）ＥＧＦをヒト体内において増加させる化合物である、自閉症の治療薬。
【００５５】
〔複数因子系に関連する発明〕
本発明の内、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ、ＥＧＦから選ばれる２種以上を対象とする複数因子系に関連する発明群は、以下の通りである。
【００５６】
１）抗ＴＧＦβ１抗体、抗ＨＧＦ抗体及び抗ＥＧＦ抗体の内のいずれか２以上の抗体を主成分とする自閉症診断薬。
【００５７】
２）ヒト血液試料中のＴＧＦβ１濃度、ＨＧＦ濃度及びＥＧＦ濃度の内のいずれか２以上を測定するために使用されるものである、１）の自閉症診断薬。
【００５８】
３）抗ＴＧＦβ１抗体、抗ＨＧＦ抗体、抗ＥＧＦ抗体が、それぞれ、未標識のもの、及び／又は、標識化されたものからなる、上記１）又は２）の自閉症診断薬。
【００５９】
４）上記の１）〜３）のいずれかの自閉症診断薬を含んで構成される自閉症診断キット。少なくとも上記いずれかの自閉症診断薬を含んで構成された自閉症診断用のキットであれば、この自閉症診断キットに該当する。自閉症診断キットは、この種のキットが備えることがある他の任意の構成要素、例えば希釈用の緩衝液等の構成要素を備えることができる。
【００６０】
５）ヒト血液試料中のＴＧＦβ１濃度、ＨＧＦ濃度及びＥＧＦ濃度の内のいずれか２以上を測定するために使用されるものである、上記４）の自閉症診断キット。
【００６１】
６）上記の１）〜３）のいずれかの自閉症診断薬、あるいは上記４）又は５）の自閉症診断キットを用いて、ヒト血液試料中のＴＧＦβ１濃度、ＨＧＦ濃度及びＥＧＦ濃度の内のいずれか２以上を測定する自閉症検定方法。
【００６２】
７）上記の１）〜３）のいずれかの自閉症診断薬、あるいは上記４）又は５）の自閉症診断キットを用いて、自閉症の治療薬の効果を検定する検定方法。
【００６３】
８）上記の１）〜３）のいずれかの自閉症診断薬、あるいは上記４）又は５）の自閉症診断キットを用いて、少なくとも自閉症モデル動物を包含する動物の血液試料中のＴＧＦβ１濃度、ＨＧＦ濃度及びＥＧＦ濃度の内のいずれか２以上を測定する自閉症の検定方法。
【発明の効果】
【００６４】
以上の手段により、自閉症の早期、簡便かつ信頼性のある診断が可能となる。特に抗ＴＧＦβ１抗体、抗ＨＧＦ抗体、抗ＥＧＦ抗体、又はこれらを適宜な手段で標識化してなる標識化抗体を用いて、ヒト（患者）の血液試料中のＴＧＦβ１、ＨＧＦ、ＥＧＦの濃度を測定することによって、自閉症の診断を容易に行うことができる。
【００６５】
更に、これらの抗体の内のいずれか２以上の抗体を主成分とする自閉症診断薬あるいはこの自閉症診断薬を含んで構成される自閉症診断キットを利用する場合、２種類以上の指標に基づく自閉症診断を同時に行うことにより、診断の信頼性を更に高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
次に、本発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。
【００６７】
〔ＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦのいずれかに関連する発明の実施形態〕
本発明による自閉症の診断は、例えば次のように行なうことが出来る。ヒトの血液から血清を調製し、血清中のＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦの量を種々の方法により定量する。望ましくは、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦに対して特異性の高い抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦを検出・定量する。自閉症患者の血清中のＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦの濃度が健常者の場合より有意に低いことを利用し、自閉症を診断できる。
【００６８】
血清中のＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦを測定する具体的な方法としては、例えば、以下の工程からなる方法を挙げることができる。
【００６９】
１．ポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバ−、セファロ−ス等の固相に抗ＴＧＦβ１抗体、抗ＨＧＦ抗体又は抗ＥＧＦ抗体を固定する工程、
２．診断する患者の血清を固相に加える、または接触させる工程、
３．固相を洗浄する工程、
４．標識化された抗ＴＧＦβ１抗体、抗ＨＧＦ抗体又は抗ＥＧＦ抗体を加える、または接触させる工程、
５．該標識を用いてＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦの量を測定する工程。
【００７０】
更に、具体的な血清中のＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦを測定する方法としては、例えば、以下の工程からなる方法を挙げることができる。
【００７１】
１．ポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバ−、セファロ−ス等の固相に抗ＴＧＦβ１抗体、抗ＨＧＦ抗体又は抗ＥＧＦ抗体を固定する工程、
２．診断する患者の血清を固相に加える、または接触させる工程、
３．固相を洗浄する工程、
４．ビオチンまたは２，４−ジニトロフェノ−ルで修飾した抗ＴＧＦβ１抗体、抗ＨＧＦ抗体又は抗ＥＧＦ抗体を加える、または接触させる工程、
５．標識化アビジンまたは標識化２，４−ジニトロフェノ−ル抗体を加える、または接触させる工程、
６．該標識を用いて、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦ量を測定する工程。
【００７２】
更に、具体的な血清中のＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦを測定する方法としては、例えば、以下の工程からなる方法を挙げることができる。この方法において、固相の形状として小球、ウェル、試験管等が挙げられる。
【００７３】
１．ポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバ−、セファロ−ス等の固相に抗ＴＧＦβ１抗体、抗ＨＧＦ抗体又は抗ＥＧＦ抗体を固定する工程、
２．診断する患者の血液を固相に加える、または接触させる工程、
３．固相を洗浄する工程、
４．ビオチンで修飾した抗ＴＧＦβ１抗体、抗ＨＧＦ抗体又は抗ＥＧＦ抗体を加える、または接触させる工程、
５．標識化アビジンを加える、または接触させる工程、
６．該標識を用いてＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦの量を測定する工程。
【００７４】
抗原またはＥＬＩＳＡのスタンダ−ドとして用いられるＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦは市販されているので、それらを用いるか、または以下の方法で調製することができる。
【００７５】
遺伝子工学的手法を用いる場合、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦをコードする遺伝子を適切なベクタ−に組み込み、これを適切な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換の培養上清から目的とする組換えＴＧＦβ１、組換えＨＧＦ又は組換えＥＧＦをそれぞれ得ることができ、均質な多量のＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦの生産に好適である。上記宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、植物または動物細胞を用いることができる。
【００７６】
抗ＴＧＦβ１抗体、抗ＨＧＦ抗体又は抗ＥＧＦ抗体は、それぞれＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦを抗原として、ウサギ、ニワトリ、シチメンチョウなどに免疫することにより、調製される。標識化抗ＴＧＦβ１抗体、標識化抗ＨＧＦ抗体又は標識化抗ＥＧＦ抗体は、それぞれ抗ＴＧＦβ１抗体、抗ＨＧＦ抗体又は抗ＥＧＦ抗体をビオチン化試薬や架橋剤付きペルオキシダ−ゼの市販されているキットを用いて、反応させ、調製することができる。
【００７７】
本方法は、また自閉症の治療薬の判定にも有用である。すなわち、ヒト体内又はモデル動物体内においてＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦを増加させる作用を有する化合物は、自閉症の治療薬として有用である可能性がある。また、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦの量が低いモデル動物（マウスやラットなど）は、自閉症の動物モデルとしても有用である。従って、この検定方法を利用することにより、新しい自閉症の治療薬のスクリ−ニングも行なうことが可能である。
【００７８】
このような方法で見出される治療薬には、非経口的または経口的に投与できる薬物が含まれ得る。その治療薬の正確な投与量および投与計画は、個々の治療対象毎の所要量、治療方法、疾病または必要性の程度、および、当然医師の判断によることが必要である。
【００７９】
非経口的投与する場合の投与量、投与回数は限定されないが、症状、年齢、体重、投与形態等によって異なり、例えば注射剤として皮下または静脈に投与する場合、成人の患者の体重１ｋｇ、一日当たり約０．１ｍｇ〜約２５００ｍｇの範囲、好ましくは約１ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲から投与量が選択され、例えば噴霧剤として気管に投与する場合、成人の患者の体重１ｋｇ、一日当たり約０．１ｍｇ〜約２５００ｍｇの範囲、好ましくは約１ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲から投与量が選択される。投与計画としては、連日投与または間欠投与またはその組み合わせがある。
【００８０】
経口的投与する場合の投与量、投与回数はは限定されないが、症状、年齢、体重、投与形態等によって異なり、例えば、成人の患者の体重１ｋｇ、一日当たり約０．５ｍｇ〜約２５００ｍｇの範囲、好ましくは約１ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲から投与量が選択される。
【００８１】
本方法で得られる自閉症の治療薬を、薬学的に許容しうる非毒性の担体と混和することにより医薬組成物を製造することができる。このような組成物を、非経口投与用（皮下注射、筋肉注射、または静脈注射）に調製する場合は、特に溶液剤形または懸濁剤形がよく、膣または直腸投与用の場合は、特にクリ−ムまたは坐薬のような半固形型剤形がよく、経鼻腔投与用の場合、特に粉末、鼻用滴剤、またはエアロゾル剤形がよい。
【００８２】
組成物は一回量投与剤形で投与することができ、また例えばレミントンの製薬科学（マック・パブリッシング・カンパニ−、イ−ストン、ＰＡ、１９７０年）に記載されているような製薬技術上良く知られているいずれかの方法によって調製できる。
【００８３】
注射用製剤は医薬担体として、例えば、アルブミン等の血漿由来蛋白、グリシン等のアミノ酸、マンニト−ル等の糖を加えることができる。注射剤形で用いる場合には更に緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。また、水溶製剤、凍結乾燥製剤として使用する場合、凝集を防ぐためにＴｗｅｅｎ８０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）などの界面活性剤を添加するのが好ましい。
【００８４】
又、注射剤以外の非経口投与剤形は、蒸留水又は生理食塩液、ポリエチレングリコ−ルのようなポリアルキレングリコ−ル、植物起源の油、水素化したナフタレン等を含有してもよい。例えば坐薬のような膣又は直腸投与用の製剤は、一般的な賦形剤として、例えばポリアキレングリコ−ル、ワセリン、カカオ油脂等を含有する。膣用製剤では、胆汁塩、エチレンジアミン塩、クエン酸塩等の吸収促進剤を含有しても良い。吸入用製剤は固体でも良く、賦形剤として例えばラクト−スを含有してもよく、また経鼻腔滴剤は水又は油溶液であってもよい。
【００８５】
〔複数因子系に関連する発明の実施形態〕
本発明の内、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ、ＥＧＦから選ばれる２種以上を対象とする複数因子系に関連する発明に関しても、（１）その診断、（２）ＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦを測定する具体的な方法、（３）抗原またはＥＬＩＳＡのスタンダ−ドとして用いられるＴＧＦβ１、ＨＧＦ又はＥＧＦの準備、（４）抗ＴＧＦβ１抗体、抗ＨＧＦ抗体又は抗ＥＧＦ抗体の準備、（５）自閉症治療薬のスクリ−ニングへの利用、（６）治療薬の投与量および投与計画、（７）医薬組成物としての調製、等に関する上記種々の実施形態を、同様に行うことができる。
【実施例】
【００８６】
次に本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって限定されない。
【００８７】
〔実施例１：ＴＧＦβ１〕
（１）被験者
高機能自閉症の男性患者１９名〔平均年齢：２３．４歳（標準偏差２．６）、年齢範囲：１８歳〜２８歳〕を被験者に選び、ならびに同一年齢層の健康者２１名〔平均年齢：２２．７歳（標準偏差２．３）、年齢範囲：１８歳〜２６歳〕も正常対照として被験者に選んだ。すべての患者は、高機能自閉症の診断基準ＡＤＩ−Ｒ（ Autism Diagnostic Interview-Revised）に従って診断した。
（２）実験方法
被験者の血清検体を採取し、測定まで−８０℃で保存した。ＴＧＦβ１の血清レベルはトランスフォーミング成長因子ベータ１測定キット（Ｒ＆Ｄ Systems社、米国）を用い、製造者の指示に従って測定した。
【００８８】
すなわち、合成トランスフォーミング成長因子ベータ１タイプII受容体をコ−ティングした９６穴プレートを使用し、希釈した血清２００μＬを添加した。定量用のスタンダ−ドとして、合成ヒトＴＧＦβ１（３１. ２−２０００  ｐｇ／ｍＬ）を添加したものを用いた。室温で３時間反応させた後、緩衝液で３回洗浄した。その後、抗ワサビペルオキシダ−ゼ標識ＴＧＦβ１特異的ポリクローナル抗体（２００μＬ）を添加し、室温で９０分間反応させた。次に、緩衝液で３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液（２００μＬ）を添加し、遮光し室温で２０分間反応させた後、停止液（２Ｎ硫酸：５０μＬ）を添加して反応を止め、３０分以内に４５０ｎｍと５５０ｎｍの波長での吸光度を自動マイクロプレートリーダー（ＥＬ３４０Ｉ、ＢＩＯ−ＴＥＣ社、米国）で測定した。検体中のＴＧＦβ１の含量をサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ法にて測定し、検量線からそのＴＧＦβ１の濃度を算出した。
（３）統計分析
データは平均値±標準偏差で示した。２群間の統計分析はマンホイットニ  Ｕ−テストで解析した。０．０５以下のｐ値は統計的に有意とした。
（４）結果
ｉ）全被験者における血清ＴＧＦβ１の濃度
正常対照、および高機能自閉症の被験者における血清ＴＧＦβ１濃度の散布状態を図１に示す。
【００８９】
上記実験結果に見られるように、高機能自閉症患者の血清ＴＧＦβ１濃度（平均値：７．３４  ｎｇ/ ｍｌ）は同一年齢層の正常対照の濃度（平均値：１４．４８  ｎｇ/ ｍｌ）と比べて有意に低いことがわかった。ＴＧＦβ１は脳の発達過程において極めて重要な役割を果たしていることより、減少した血清ＴＧＦβ１値は高機能自閉症の病態生理学に寄与しているものと考えられる。例えば、患者の血清ＴＧＦβ１値が、健常者の血清ＴＧＦβ１値の平均値−標準偏差の値（１２．８４  ｐｇ/ ｍｌ）より低い場合、高機能自閉症と診断される。
【００９０】
要するに、本実験により、ＴＧＦβ１は自閉症の病態生理学において極めて重要な役割を果たし、血液ＴＧＦβ１は自閉症の生物学的マーカーとして有用であることが確認できた。
【００９１】
〔実施例２：ＨＧＦ〕
（１）被験者
高機能自閉症の男性患者１９名〔平均年齢：２３．４歳（標準偏差２．６）、年齢範囲：１８歳〜２８歳〕を被験者に選び、ならびに同一年齢層の健康者２１名〔平均年齢：２２．７歳（標準偏差２．３）、年齢範囲：１８歳〜２６歳〕も正常対照として被験者に選んだ。すべての患者は、高機能自閉症の診断基準ＡＤＩ−Ｒ（ Autism Diagnostic Interview-Revised）に従って診断した。
（２）実験方法
被験者の血清検体を採取し、測定まで−８０℃で保存した。ＨＧＦの血清レベルは肝細胞増殖因子測定キット（Ｒ＆Ｄ Systems社、米国）を用い、製造者の指示に従って測定した。
【００９２】
すなわち、抗肝細胞増殖因子モノクロナル抗体を９６穴プレートにコ−ティングし、緩衝液（１５０μＬ）と、希釈した血清５０μＬを添加した。定量用のスタンダ−ドとして、ヒトＨＧＦ（１２５−８０００  ｐｇ／ｍＬ）を添加したものを用いた。室温で２時間反応させた後、緩衝液で３回洗浄した。その後、抗ワサビペルオキシダ−ゼ標識ＨＧＦポリクローナル抗体（２００μＬ）を添加し、室温で２時間反応させた。次に、緩衝液で３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液（２００μＬ）を添加し、遮光し室温で３０分間反応させた後、停止液（２Ｎ硫酸：５０μＬ）を添加して反応を止め、３０分以内に４５０ｎｍと５５０ｎｍの波長での吸光度を自動マイクロプレートリーダー（ＥＬ３４０Ｉ、ＢＩＯ−ＴＥＣ社、米国）で測定した。検体中のＨＧＦの含量をサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ法にて測定し、検量線からそのＨＧＦの濃度を算出した。
（３）統計分析
データは平均値±標準偏差で示した。２群間の統計分析はマンホイットニ  Ｕ−テストで解析した。０．０５以下のｐ値は統計的に有意とした。
（４）結果
ｉ）全被験者における血清ＨＧＦの濃度
正常対照、および高機能自閉症の被験者における血清ＨＧＦ濃度の散布状態を図２に示す。
【００９３】
上記実験結果に見られるように、高機能自閉症患者の血清ＨＧＦ濃度（平均値：５０５．２  ｐｇ/ ｍｌ）は同一年齢層の正常対照の濃度（平均値：８２５．２  ｎｇ/ ｍｌ）と比べて有意に低いことがわかった。ＨＧＦは脳の発達過程において極めて重要な役割を果たしていることより、減少した血清ＨＧＦ値は高機能自閉症の病態生理学に寄与しているものと考えられる。例えば、患者の血清ＨＧＦ値が、健常者の血清ＨＧＦ値の平均値−標準偏差の値（６０７．０  ｐｇ/ｍｌ）より低い場合、高機能自閉症と診断される。
【００９４】
要するに、本実験により、ＨＧＦは自閉症の病態生理学において極めて重要な役割を果たし、血液ＨＧＦは自閉症の生物学的マーカーとして有用であることが確認できた。
【００９５】
〔実施例３：ＥＧＦ〕
（１）被験者
高機能自閉症の男性患者１９名〔平均年齢：２３．４歳（標準偏差２．６）、年齢範囲：１８歳〜２８歳〕を被験者に選び、ならびに同一年齢層の健康者２１名〔平均年齢：２２．７歳（標準偏差２．３）、年齢範囲：１８歳〜２６歳〕も正常対照として被験者に選んだ。すべての患者は、高機能自閉症の診断基準ＡＤＩ−Ｒ（ Autism Diagnostic Interview-Revised）に従って診断した。
（２）実験方法
被験者の血清検体を採取し、測定まで−８０℃で保存した。ＥＧＦの血清レベルは上皮成長因子測定キット（Ｒ＆Ｄ Systems社、米国）を用い、製造者の指示に従って測定した。
【００９６】
すなわち、抗上皮成長因子モノクロナル抗体を９６穴プレートにコ−ティングし、緩衝液（５０μＬ）と、希釈した血清２００μＬを添加した。定量用のスタンダ−ドとして、ヒトＥＧＦ（３．９−２５０  ｐｇ／ｍＬ）を添加したものを用いた。室温で２時間反応させた後、緩衝液で３回洗浄した。その後、抗ワサビペルオキシダ−ゼ標識ＥＧＦポリクローナル抗体（２００μＬ）を添加し、室温で１時間反応させた。次に、緩衝液で３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液（２００μＬ）を添加し、遮光し室温で２０分間反応させた後、停止液（２Ｎ硫酸：５０μＬ）を添加して反応を止め、３０分以内に４５０ｎｍと５５０ｎｍの波長での吸光度を自動マイクロプレートリーダー（ＥＬ３４０Ｉ、ＢＩＯ−ＴＥＣ社、米国）で測定した。検体中のＥＧＦの含量をサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ法にて測定し、検量線からそのＥＧＦの濃度を算出した。
（３）統計分析
データは平均値±標準偏差で示した。２群間の統計分析はマンホイットニ  Ｕ−テストで解析した。０．０５以下のｐ値は統計的に有意とした。
（４）結果
ｉ）全被験者における血清ＥＧＦの濃度
正常対照、および高機能自閉症の被験者における血清ＥＧＦ濃度の散布状態を図３に示す。
【００９７】
上記実験結果に見られるように、高機能自閉症患者の血清ＥＧＦ濃度（平均値：８０．９６  ｐｇ/ ｍｌ）は同一年齢層の正常対照の濃度（平均値：３１５．１  ｎｇ/ ｍｌ）と比べて有意に低いことがわかった。ＥＧＦは脳の発達過程において極めて重要な役割を果たしていることより、減少した血清ＥＧＦ値は高機能自閉症の病態生理学に寄与しているものと考えられる。例えば、患者の血清ＥＧＦ値が、健常者の血清ＥＧＦ値の平均値−標準偏差の値（１９１．５  ｐｇ/
ｍｌ）より低い場合、高機能自閉症と診断される。
【００９８】
要するに、本実験により、ＥＧＦは自閉症の病態生理学において極めて重要な役割を果たし、血液ＥＧＦは自閉症の生物学的マーカーとして有用であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明によって自閉症の早期、簡便かつ信頼性ある診断手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】実施例１に係る正常対照、自閉症の患者における血清ＴＧＦβ１濃度の散布図である。
【図２】実施例２に係る正常対照、自閉症の患者における血清ＨＧＦ濃度の散布図である。
【図３】実施例３に係る正常対照、自閉症の患者における血清ＥＧＦ濃度の散布図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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