(57)【要約】【課題】  ムチンによるＢ細胞の傷害を抑制し、抗体産生能を回復し得るＢ細胞傷害抑制剤である。【解決手段】  本発明のＢ細胞傷害抑制剤は、抗ムチン抗体を有効成分として含有することからなる。抗ムチン抗体は体内（血中）のムチンと特異的に結合し、Ｂ細胞に対するムチンの傷害性を低下させ、Ｂ細胞の抗体産生能の回復・向上を図ることができる。従って、Ｂ細胞の傷害又は機能低下が原因で起こる又は起こると考えられている様々な疾患（免疫不全症、自己免疫疾患など）の予防・治療に利用される可能性がある。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ムチン抗体を有効成分として含有するＢ細胞傷害抑制剤。
【請求項２】
抗ムチン抗体が、上皮性ムチンに対する抗体である請求項１記載のＢ細胞傷害抑制剤。
【請求項３】
抗ムチン抗体が、ムチンの糖鎖部分を認識する抗体である請求項１又は２記載のＢ細胞傷害抑制剤。
【請求項４】
抗ムチン抗体が、モノクローナル抗体である請求項１〜３のいずれかに記載のＢ細胞傷害抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＢ細胞傷害抑制剤に関する。より詳細には、免疫細胞であるＢ細胞の傷害を抑制・回復し得るＢ細胞傷害抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムチンは、Ｏ−グリコシド結合を介してポリペプチド（コア蛋白質）に結合した無数の糖鎖を有する糖蛋白質である。ムチンは、気管、胃腸などの消化器、生殖腺などの内腔を覆い、細胞保護作用を有する他、その糖鎖構造による細胞間相互作用（白血球、細菌、ウイルスとの相互作用）が明らかにされている。
ところで、上皮性癌患者の血液中には、正常では検出できないムチンが検出され、現在、少なくとも９種の上皮性ムチン（上皮性癌細胞に由来するムチン）の存在することが知られている（非特許文献１参照）。上皮性癌患者においては、ムチンがB細胞のシグレック２（CD22）に結合して、Ｂ細胞の活性化シグナルの情報伝達を抑制し、脾臓Ｂ細胞のサブポプレーションであるＣＤ２１、ＣＤ１ｄ陽性細胞が特異的に減少し、当該細胞で構成される脾臓マージナルゾーンの形成不全をもたらす。その結果、担癌患者においては、Ｂ細胞の一機能であるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体産生能を著しく低下させることが知られていた（非特許文献２参照）。
【非特許文献１】Glycobiology vol.10, No5, pp.439-449 (2000)
【非特許文献２】京都産業大学先端科学技術研究所所報第3報（2004年７月発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上述のように、上皮性癌患者においては、ムチンがB細胞における抗体産生能を低下させるため、担癌患者の免疫力の低下が起こりやすいという問題があった。
本発明者は、係る問題を解消するために種々検討したところ、担癌患者の免疫増強を図るには、Ｂ細胞の傷害を抑制・回復することが重要であり、担癌患者に抗ムチン抗体を投与することにより、Ｂ細胞の傷害抑制を図ることができることを見出した。
本発明は係る知見に基づくものであり、担癌患者などのように、Ｂ細胞が傷害を受けて機能が低下している患者の免疫力を増強することができる、Ｂ細胞傷害抑制剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、抗ムチン抗体を有効成分として含有するＢ細胞傷害抑制剤であり、当該抗ムチン抗体としては上皮性ムチンに対する抗体が好ましく、更にムチンの糖鎖部分を認識する抗体、より好ましくはモノクローナル抗体が使用される。
【発明の効果】
【０００５】
本発明のＢ細胞傷害抑制剤によれば、抗ムチン抗体は体内（血中）のムチンと特異的に結合し、Ｂ細胞に対するムチンの傷害性を低下させることができ、Ｂ細胞の抗体産生能の回復・向上を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
前記のとおり、本発明は、抗ムチン抗体を有効成分として含有するＢ細胞傷害抑制剤である。
本発明で使用される抗ムチン抗体は、各種ムチン（特に上皮性ムチン）と特異的に結合し得る抗体を意味し、当該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はそれらの混合物であってもよく、係る抗体の調製法は、当業者にとって周知であり、慣用の方法に準じて調製することができる。
また、均一な抗体を安定的に取得できる点からモノクローナル抗体を使用することが好ましい。更に、エピトープとしてはコア蛋白質部分であってもよいが、反応性の点から糖鎖領域を認識する抗ムチン抗体が好ましい。
【０００７】
抗ムチン抗体を調製する際に使用される免疫原としては、抗ムチン抗体を産生し得る免疫原（ムチン抗体産生免疫原という）であれば特に限定されず、ムチンの他、ムチンを発現している癌細胞（例えば、ヒト腸癌細胞LS180等）などが例示できる。
【０００８】
より具体的には、当該抗ムチンポリクローナル抗体は、免疫動物（例えば、馬、牛、羊、山羊、兎、モルモット、ラット、マウス等）の抗血清より調製でき、例えば、アジュバントを含むムチン抗体産生免疫原を免疫動物の皮下などに投与し、当該投与を適当な間隔・回数（例えば１〜２週間で、４〜６回程度）で繰り返し、最終免疫後に全血を採集して、抗血清を分離する。ついで、当該抗血清を、ＢｒＣＮ活性化セファロースなどにムチンを結合させた担体を使用したカラムで精製することにより、精製抗ムチンポリクローナル抗体を得ることができる。
【０００９】
また、本発明で使用される抗ムチンモノクローナル抗体は、ムチン抗体産生免疫原で免疫した免疫動物（例えば、ラット、マウス、鶏、馬、牛、羊、山羊、兎、モルモット等）の感作細胞（例えば、脾細胞、リンパ球等）と、例えばミエローマ細胞などの増殖性を有する細胞とを、細胞融合技術により融合させてハイブリドーマを作製し、ムチンに特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマを適当な培地中で培養するか、動物の腹腔内に投与して腹水中に抗体を産生させて、産生したモノクローナル抗体を採取することにより得ることができる。
【００１０】
上記の抗ムチン抗体の調製方法は既に発表されており、例えば、生化学、第６６巻、第１３８７−１４００（１９９４）；京都産業大学国土利用開発研究所紀要、第１０号、第４６−６４（１９９０）；特開平３−２８０８９４公報；特開平６−１７２２１９公報；特開平７−１０１９９７公報などに記載されているので、それらを参照することができる。
なお、抗ムチン抗体は、腫瘍マーカー（ムチン）を検査する臨床検査試薬として既に使用・販売されており、そこで使用されている抗ムチン抗体を使用することもできる。
【００１１】
本発明のＢ細胞傷害抑制剤の患者への投与部位・経路としては、生体内でムチンと結合し作用を発現できる部位・経路であれば特に限定はされないが、一般的には、静脈内投与、腹腔内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与などが挙げられ、静脈内投与が好ましい。さらに、体内に埋め込まれた装置を介した投与経路も挙げられ、具体的には、オスモチックポンプなどを用いて患者に連続的に徐々に投与する手法や、徐放性製剤（例えばミニペレット製剤）を患者に埋め込む手法などが挙げられる。
【００１２】
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の製剤形態（例えば液剤など）をとり得る。例えば、抗ムチン抗体を含有する注射剤とする場合、当該注射剤は常法により調製することができ、例えば適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。当該注射剤には必要に応じて慣用の安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコールなどが挙げられる。更に必要に応じて、例えば、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤などを含んでいてもよい。製剤形態としては、凍結保存又は凍結乾燥などにより水分を除去した製剤が好ましく、凍結乾燥製剤は用時に注射用精製水などを加え、再分散させる。
【００１３】
本発明のＢ細胞傷害抑制剤の効果的な投与量及び投与スケジュールは、当業者が経験的に適宜設定することができる。抗ムチン抗体の投与量は、疾患の程度、患者の年齢、体重等により適宜調節することができるが、通常、一日当り０．００１ｍｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ・体重の範囲から選択され、好ましい範囲は０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ・体重であり、より好ましくは０．０５〜１ｍｇ／ｋｇ・体重であり、更に好ましくは０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ・体重であり、一日に１回若しくは数回に分けて又は持続的に投与される。
【００１４】
本発明のＢ細胞傷害抑制剤は、Ｂ細胞の傷害又は機能低下が原因で起こる又は起こると考えられている様々な疾患の予防・治療に利用される。例えば、担癌患者の免疫機能の低下の予防・治療に利用される他、自己免疫疾患の予防・治療に利用される可能性がある。
【００１５】
なお、本発明のＢ細胞傷害抑制剤は、ヒト以外の哺乳動物を対象とする動物薬としても利用できる。対象となる哺乳動物としては、家畜類（例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ウサギ等）、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコ等）が挙げられ、また疾患としても前記の疾患を挙げることができる。
【実施例】
【００１６】
以下、比較例、実施例及び製剤例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１７】
比較例１
(1)脾臓マージナルゾーンＢ細胞の減少
マウス乳癌細胞株TA3-Ha（ムチン産生株）又はTA3-St（ムチン非産生株）の2×10６細胞をそれぞれA/J マウスの腹腔内に移植して8日目に脾臓を摘出し、白血球細胞を調製した。次に、蛍光標識した抗CD1d抗体及び抗CD21抗体で細胞を染色し、フローサイトメーターで解析を行った。その結果を図１に示した。なお、図中、四角で囲った領域が脾臓マージナルゾーンＢ細胞であり、脾臓マージナルゾーンＢ細胞はCD1d及びCD21が高発現していることが知られている。
図１に示したように、TA3-Ha担癌マウスでは脾臓マージナルゾーンＢ細胞が有意に減少していたのに対して、TA3-St担癌マウスでは陰性対照(PBS)のマウスと比べて変化はなかった。即ち、TA3-Ha（ムチン産生株）担癌マウスでは、脾臓マージナルゾーンＢ細胞が減少していた。
【００１８】
(2)T細胞非依存性抗原に対する抗体産生
上記(1)と同様に、TA3-Ha又はTA3-StをA/Jマウスの腹腔内に移植して5日目および7日目にT細胞非依存性抗原であるTNP-フィコール10μｇを尾静脈より静注した。8日目に採血し、血清中の抗TNP抗体を以下の方法により検出した。
TNP-BSAを固相化したプレートに、5% BSAを含むPBSで希釈した血清を加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスIgM抗体又は抗マウスIgG抗体を加えてさらに室温で1時間インキュベートした。再度プレートを洗浄後、TMB基質を加えて発色を行った。30分間反応後、硫酸を加えて反応を停止し、吸光度を測定した。その結果を図２に示す。
図２に示されるように、TA3-Ha担癌マウスにおいてはT細胞非依存性抗原に対する免疫応答が低下していた。
【００１９】
実施例１
抗ムチン抗体処理による担癌マウス脾臓マージナルゾーンＢ細胞の傷害抑制
比較例１と同様に、TA3-HaをA/J マウスの腹腔内に移植して3日目、5日目及び7日目に5μｇのMLS128 (抗Tn抗体、ヒト腸癌細胞LS180を免疫原として作製した抗ムチンモノクローナル抗体)を尾静脈より投与した。対照として、同じサブクラスのマウスＩｇＧ抗体(Ctl Ab)を同様に投与した。
8日目に脾臓を摘出して白血球細胞を調製し、蛍光標識した抗CD1d抗体及び抗CD21抗体で細胞を染色後、フローサイトメーターで解析を行った。その結果を図３に示す。
図３に示したように、MLS128を投与したTA3-Ha担癌マウスでは脾臓マージナルゾーンＢ細胞の減少が抑えられおり、Ｂ細胞の傷害が抑制されていることが明らかとなった。上記比較例１−(2)の結果を考慮すると、抗ムチン抗体を投与することにより、TA3-Ha担癌マウスにおいても免疫応答は維持されていることが示された。
【００２０】
製剤例１
0.02Mリン酸緩衝液（0.15M NaCl及び0.01%ポリソルベート80含有、pH7.4）100ml中にMLS128 (抗Tn抗体)100mg及びヒト血清アルブミン100mgを含む水溶液を無菌的に調製し、5mlずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】比較例１-(1)における脾臓マージナルゾーンＢ細胞の変化を示す図である。図中、四角で囲った領域が脾臓マージナルゾーンＢ細胞である。
【図２】比較例１-(2)におけるT細胞非依存性抗原に対する抗体産生を示す図である。
【図３】実施例１における脾臓マージナルゾーンＢ細胞の変化を示す図である。図中、四角で囲った領域が脾臓マージナルゾーンＢ細胞である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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