(57)【要約】【課題】オートファジーの研究及びオートファジーに関与する疾患の治療薬のスクリーニングに用いることのできるモデル動物を提供する。【解決手段】ＬＣ３のアミノ末端にポリヒスチジンタグ及びＦｌａｇタグが結合した修飾ＬＣ３を全身に発現しているトランスジェニック非ヒト動物又はその子孫。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＣ３のアミノ末端にポリヒスチジンタグ及びＦｌａｇタグが結合した修飾ＬＣ３を全身に発現しているトランスジェニック非ヒト動物又はその子孫。
【請求項２】
修飾ＬＣ３が、ＬＣ３のアミノ末端にＭＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧ及びＤＹＫＤＤＤＤＫに結合したものである請求項１記載のトランスジェニック非ヒト動物又はその子孫。
【請求項３】
非ヒト動物がマウスである請求項１又は２記載のトランスジェニック非ヒト動物又はその子孫。
【請求項４】
疾患モデル非ヒト動物である請求項１〜３のいずれか１項記載のトランスジェニック非ヒト動物又はその子孫。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載のトランスジェニック非ヒト動物又はその子孫に被験物質を投与し、ＬＣ３が関与する疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オートファジーの実行部隊の一員と認識されているＬＣ３の修飾体を発現しているトランスジェニック非ヒト動物又はその子孫に関する。
【背景技術】
【０００２】
オートファジーは、隔離膜が伸長しオルガネラを含む細胞質成分を取り囲んだ脂質二重膜構造体がリソソームと融合し、その内容物をリソソーム内の消化酵素が分解する細胞内大規模分解経路である。このオートファジーの因子が全身で欠損したマウスは新生児致死性である（非特許文献１）。脳において欠損すると、神経変性疾患になり、肝臓において欠損すると、肝肥大を伴う肝炎になる（非特許文献１，２）。また、ガン細胞においては、オートファジーに関する遺伝子のいくつかが減少しているとの報告がある（非特許文献３）。
【０００３】
ＬＣ３（microtubule associated protein 1A light chain3）は微小管関連タンパク質の１つとして、脳から単離されてきた（非特許文献４、５）。その後の研究でＬＣ３は、オートファジーの際のモディファイヤーとしてＡｐｇ７とＡｐｇ３によってスビキチン様修飾をうけて細胞質型ＬＣ３（ＬＣ３−Ｉ）から膜結合型ＬＣ３（ＬＣ３−II）になり、オートファゴソーム膜上に局在することがわかってきた（非特許文献６〜９）。かかる点から、ＬＣ３は、オートファジーの実行部隊の一員と認識されるに至っている。
【非特許文献１】J Cell Biol. 2005 May 9;169(3):425-434.
【非特許文献２】Nature 2006 Jun 15:441(7095)880-884
【非特許文献３】Nature. 1999 Dec 9;402(6762):672-676.
【非特許文献４】J. Biol. Chem., 269：11492-11497, 1994
【非特許文献５】J. Neurosci. Res., 43：535-544, 1996
【非特許文献６】EMBO J., 19：5720-5728, 2000
【非特許文献７】J. Cell Biol., 152：657-668, 2001
【非特許文献８】J. Biol. Chem., 276：1701-1706, 2001
【非特許文献９】J. Biol. Chem., 277：13739-13744, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このようにオートファジーは、種々の生理機能や疾患に関与していることが判明しており、注目されているが、これまでオートファジーに着目した医薬の開発はなされていない。
従って、本発明の目的は、オートファジーの研究及びオートファジーに関与する疾患の治療薬のスクリーニングに用いることのできるモデル動物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明は、ＬＣ３に着目して研究してきたところ、ＬＣ３のアミノ末端にポリヒスチジンタグとＦｌａｇタグを結合した修飾ＬＣ３を発現する遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト動物の作製に成功し、このトランスジェニック動物が全身に修飾ＬＣ３を発現しており、オートファジーが関与する疾患の研究モデルとして、又は医薬のスクリーニングモデルとして有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、ＬＣ３のアミノ末端にポリヒスチジンタグ及びＦｌａｇタグが結合した修飾ＬＣ３を全身に発現しているトランスジェニック非ヒト動物又はその子孫を提供するものである。
また、本発明は上記トランスジェニック非ヒト動物又はその子孫に被験物質を投与し、ＬＣ３が関与する疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物を用いれば、オートファジーが関与する疾患の研究、各種疾患におけるオートファジーの役割の研究、さらにはオートファジーが関与する疾患の治療薬の検索が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、アミノ末端にポリヒスチジンタグ及びＦｌａｇタグが結合した修飾ＬＣ３を全身に発現しているものである。ここでＬＣ３遺伝子は、すでにクローニングされている（Tanida et al, J. Biol. Chem. 2001；296(3)：1701-1706, Tanida et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, Sep 6；296(5)：1164-1170、Gene Bank accession No. AF087871）。ポリヒスチジンタグとしては、ヒスチジンが６個連続して結合しているペプチドであればよいが、好ましくはＭＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧである。また、Ｆｌａｇｔａｇとしては、ＤＹＫＤＤＤＤＫ等が挙げられる。
【０００９】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、例えば前記修飾ＬＣ３遺伝子を組み込んだＤＮＡ（組み換えＤＮＡ）常法に従い非ヒト動物に導入することにより作製できる。修飾ＬＣ３遺伝子は、ヒスチジンタグをコードするオリゴヌクレオチド及びＦｌａｇタグをコードするオリゴヌクレオチドをＬＣ３ ｃＤＮＡのセンス方向の上流に導入することにより得られる。ここで、組み換えＤＮＡには、非ヒト動物において当該修飾ＬＣ３を発現させるための適切なプロモータを用いることができる。このようなプロモータとしては、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ、SV40プロモータ、EF1-αプロモータ等が挙げられる。
【００１０】
かくして得られる組み換えＤＮＡを導入するための非ヒト哺乳動物としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等が挙げられる。好ましくは、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス又はラットであり、なかでもモルモット、ハムスター、マウス、ラット等の齧歯目（Rodentia）が好ましく、とりわけマウスが好ましい。
【００１１】
本発明のトランスジェニック動物は、例えば非ヒト哺乳動物の受精卵に、前記組み換えＤＮＡを導入し、当該受精卵を当該動物の雌に着床させることにより作製される。ここで、受精卵としては、雄精前核時期（受精後約１２時間位）のものが好ましい。また組み換えＤＮＡの導入方法としては、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等が挙げられるが、マイクロインジェクション法が特に好ましい。
【００１２】
組み換えＤＮＡを導入した受精卵は、当該受精卵と同種の動物の雌に着床させる。着床の手段は、偽妊娠雌性動物の卵管に人工的に移植、着床させる手段が好ましい。かくして、受精卵を着床させた動物から生まれた仔の中から、目的とする遺伝子を発現している個体を選別し、当該個体を継代すればよい。
【００１３】
得られたトランスジェニック動物に目的遺伝子が含まれているか否かの確認は、ＤＮＡを採取し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びサザンブロッティング法による導入遺伝子の解析によって行うことができる。
【００１４】
また得られたトランスジェニック動物における修飾ＬＣ３の発現は、臓器ごとに細胞破砕液を調製し、抗ＬＣ３抗体及び抗Ｆｌａｇ抗体を用いてウェスタンブロット法により確認できる。
【００１５】
本発明のトランスジェニック動物は、全身に修飾ＬＣ３が発現していることから、ＬＣ３をコントロールする因子をスクリーニングでき、オートファジーに関与する疾患の研究、例えば神経変性疾患、肝臓疾患、ガン化等に関与する因子のスクリーニングに用いることができる。
【００１６】
また、本発明のトランスジェニック動物に被験物質を投与し、ＬＣ３の増域を評価すれば、ＬＣ３が関する疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。ＬＣ３が関与する疾患としては、神経変性疾患（例えばアルツハイマー症、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病）、肝炎（急性肝炎、慢性肝炎）、肝硬変、ガン等が挙げられる。
【実施例】
【００１７】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００１８】
実施例１
（１）ＨｉｓＦｌａｇ−ｔａｇの導入：合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲ法を用いて、ＬＣ３ ｃＤＮＡのセンス方向の上流（タンパク質のアミノ酸末端の上流）に、以下のアミノ酸を含むペプチドをコードする塩基配列を導入した。
Ｈｉｓ−ｔａｇ：ＭＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧ（配列番号１）
Ｆｌａｇ−ｔａｇ：ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２）
【００１９】
（２）得られたＨｉｓＦｌａｇ−ＬＣ３をコードするＤＮＡ断片をＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモータの下流に導入した。（図１参照）。
作成した［ＣＭＶプロモータ−ＨｉｓＦｌａｇ−ＬＣ３ ＤＮＡ］断片を用いて、定法に従い、ＨｉｓＦｌａｇ−ＬＣ３トランスジェニックマウスを作成した。その後、遺伝的に安定させるために、野生型Ｂ６Ｊマウスと交配を続け、世代間を安定的にＨｉｓＦｌａｇ−ＬＣ３の発現ＤＮＡ断片が遺伝していくのをＰＣＲ法を用いたｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇにより確認した。具体的には、まずマウス尾部より定法に従い、ゲノムDNAを抽出し、そのDNAを鋳型にCAGSFプライマー（5'-GGCTTCTGGCGTGTGACC-3'：配列番号３）とＬＣ３Rvプライマー（5'- TTAGAACGTCTCCTGGGAGGCGTAGACC -3'：配列番号４）を用いて、KOD-plus- DNA polymerase酵素により、目的の断片約400bpを増幅していることで、遺伝子型を判定した。
【００２０】
（３）臓器におけるＨｉｓＦｌａｇ−ＬＣ３タンパク質の発現は、定法に従って臓器ごとにダウンス型ホモジナイザーで組織を破壊後、１％ＳＤＳ存在下でタンパク質を抽出し、遠心により不溶物質を取り除くことで、細胞破砕液を調製し、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分子量ごとに分離後、抗ＬＣ３抗体及び抗Ｆｌａｇ抗体を用いてウエスタンブロット法により確認できた（図２）。
【００２１】
（４）アフィニティ精製が可能であるかどうかについては、このトランスジェニックマウスより、脳を取り出し、定法に従って、脳細胞破砕液より抗ＦｌａｇＭ２アガロースを用いてＨｉｓＦｌａｇ−ＬＣ３タンパク質及び相互作用するタンパク質の精製が可能であった（図３）。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＨｉｓＦＬＡＧ−ＬＣ３タンパク質発現のために導入したＤＮＡ断片の模式図を示す。
【図２】各臓器におけるＨｉｓＦＬＡＧ−ＬＣ３タンパク質の発現を示す図である。
【図３】アフィニティ精製の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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