(57)【要約】【課題】ヒトまたは霊長類ＭＡｄＣＡＭ−１のクローン化や特徴づけをすること。【解決手段】α４β７インテグリンに結合し、ＡＣＴ−１モノクローナル抗体のエピトープ特異性を有する抗体または抗原結合断片を活性成分として含有してなる、ヒトにおいて炎症性の腸疾患を治療するための医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α４β７インテグリンに結合し、ＡＣＴ−１モノクローナル抗体のエピトープ特異性を有する抗体または抗原結合断片を活性成分として含有してなる、ヒトにおいて炎症性の腸疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
炎症性の腸疾患が、潰瘍性結腸炎、クローン病、腹腔疾患、セロネガティブ関節症に関連する腸疾患、微細もしくはコラーゲン蓄積大腸炎、好酸球性胃腸炎および窩炎からなる群より選ばれる請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
抗体またはその抗原結合断片がキメラ抗体、キメラ抗原結合断片、ヒト化抗体、およびヒト化抗原結合断片からなる群より選ばれる請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
抗体またはその抗原結合断片がモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である請求項１〜３いずれか記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性の腸疾患を治療するための医薬組成物に関する。
【０００２】
関連出願
本願は、１９９５年９月１日に出願された米国出願番号０８／５２３，００４（代理人事件番号ＬＫＳ９４−０４Ａ）の一部継続出願である、１９９５年２月２０日に出願された米国出願番号０８／３８６，８５７（代理人事件番号ＬＫＳ９４−０４）の一部継続出願であり、それらの教示は全て、それぞれ参考として本明細書の一部を構成する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
循環系からリンパ組織へのリンパ球の帰還と、炎症部位へのリンパ球の移動は、二次リンパ組織（例えば腸間膜リンパ小節やパイエル斑（ＰＰ）に見られる高内皮性後毛細管小静脈（ＨＥＶ）を含む後毛細管小静脈で発現したレセプターとの相互作用によって調節される。Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｍ．Ｐ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１：  ７６７−８０４（１９９３）；Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．，Ｃｅｌｌ，６７：１０３３−１０３６（１９９１）；Ｐｉｃｋｅｒ，Ｌ．Ｊ．ら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０：５６１−５９１（１９９２）；及びＳｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．，Ｃｅｌｌ，７６：３０１−３１４（１９９４））。これらの相互作用は本質的に組織特異的である。
【０００４】
炎症（慢性炎症など）は、リンパ球、リンパ芽球及び単核食細胞などの白血球による、冒された組織の浸潤を特徴とする。通常の循環中や炎症中に、白血球が種々の組織に選択的に移動する際の著しい選択性は、Ｂｕｔｃｈｅｒその他が提唱するところによると、複数のレセプター−リガンド相互作用が関与する一連の接着と活性化によってもたらされる（Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．，Ｃｅｌｌ，６７：１０３３−１０３６（１９９１）；ｖｏｎＡｄｒｉａｎ，Ｕ．Ｈ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ，８８：７５３８（１９９１）；Ｍａｙａｄａｓ，Ｔ．Ｎ．ら，Ｃｅｌｌ，７４：５４１（１９９３）；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．，Ｃｅｌｌ，７６：３０１（１９９４））。初期段階として、白血球と内皮の間に一過性の回転相互作用があるが、これはセレクチン類（場合によってはα４インテグリンも関与）とその炭水化物リガンドとの相互作用によってもたらされる。血流方向への回転を特徴とするこの相互作用は、公知の方法で評価できる（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｍ．Ｂ．及びＴ．Ａ  ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃｅｌｌ，６５：８５９（１９９１）；ＷＯ９２／２１７４６，Ｓｐｒｉｎｇｅｒら（１９９２年１２月１０日））。この相互作用に続いて、ケモカインのような化学誘引物質とそのレセプターによって媒介される活性化が起こり、それがインテグリン接着性の活性化事象を引き起こし、血管壁を通過する白血球の移動方向に影響を与える。このような二次シグナルが、今度は、白血球インテグリンとその内皮リガンド（Ｉｇ様レセプターとＥＣＭ）を介して内皮に対する白血球の強固な接着と、それに続く、血管内皮を横切って起こる循環系からの経内皮移動とを誘発する。
【０００５】
パイエル斑（ＰＰ）やリンパ小節（例えば末梢リンパ小節（ＰＬＮ））などの二次リンパ組織では、白血球の通行と帰還が、白血球表面の帰還レセプターと後毛細管小静脈を裏打ちする内皮細胞（特に高内皮性後毛細管小静脈（ＨＥＶ））との相互作用によって調節される（Ｇｏｗａｎｓ，Ｊ．Ｌ．及びＥ．Ｊ．Ｋｎｉｇｈｔ，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．，１５９：２５７（１９６４））。血管アドレシン（ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｄｄｒｅｓｓｉｎ）と呼ばれるレセプター群は、内皮細胞表面に存在し、白血球亜集合の移動とそれに続く管外溢出を調節する。血管アドレシンは制限された発現パターンを示し、その組織特異的発現は、白血球通行の特異性に重要な貢献をしている（Ｐｉｃｋｅｒ，Ｌ．Ｊ．ら，およびＥ．Ｃ．Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０：５６１−５９１（１９９２）；Ｂｅｒｇ，Ｅ．Ｌ．ら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｉｎａｔｉｏｎ，２：１１１（１９９１）；Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．，Ｃｅｌｌ，６７：１０３３−１０３６（１９９１））。
【０００６】
粘膜血管アドレシンＭＡｄＣＡＭ−１（粘膜アドレシン細胞接着分子−１）はリンパ球に対する免疫グロブリンスーパーファミリー接着レセプターであり、ＶＣＡＭ−１やＩＣＡＭ−１とは異なる。ＭＡｄＣＡＭ−１は、リンパ球管外溢出部位に選択的に発現される約６０ｋｄ糖蛋白質として、マウスで同定された。具体的に述べると、ＭＡｄＣＡＭ−１の発現は、パイエル斑や小腸及び大腸の基底膜の後毛細管小静脈のような腸−関連組織またはリンパ器官を含む粘膜組織の血管内皮細胞、および泌乳性乳線で報告されているが、末梢リンパ小節では報告されていない。ＭＡｄＣＡＭ−１は、パイエル斑に対するリンパ球の結合に関与する（Ｓｔｒｅｅｔｅｒ，Ｐ．Ｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：４１−４６（１９８８）；Ｎａｋａｃｈｅ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：１７９−１８１（１９８９）；Ｐｉｃｋｅｒ，Ｌ．Ｊ．ら，Ａｎｎu ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １０：５６１−５９１（１９９２）；Ｂｒｉｓｋｉｎ，Ｍ．Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６３：４６１（１９９３）；Ｂｅｒｇ，Ｅ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６６：６９５−６９８（１９９３）；Ｂｅｒｌｉｎ，Ｃ．ら，Ｃｅｌｌ，７４：１８５−１９５（１９９３））。ＭＡｄＣＡＭ−１は、プロ炎症刺激によって、インビトロで誘導されうる（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｅ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：５２３９−５２５０（１９９３））。
【０００７】
ＭＡｄＣＡＭ−１は、パイエル斑への帰還に関与するリンパ球帰還レセプターであるリンパ球インテグリンα４β７（ＬＰＡＭ−１（マウス）、α４βｐ（マウス）とも呼ばれる）と特異的に結合する（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｃ．ら，Ｃｅｌｌ，８０：４１３−４２２（１９９４）；Ｂｅｒｌｉｎ，Ｃ．ら，Ｃｅｌｌ，７４：１８５−１９５（１９９３）；およびＥｒｌｅ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３：５１７−５２８（１９９４））。α４β１とα４β７の両方と相互作用するＶＣＡＭ−１およびフィブロネクチン（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｃ．ら，Ｃｅｌｌ，７４：１８５−１９５（１９９３）；Ｓｔｒａｕｃｈ，Ｕ．Ｓ．ら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：２６３（１９９４））とは対照的に、ＭＡｄＣＡＭ−１はα４β７に対する選択的レセプターである。
【０００８】
例えば潰瘍性結腸炎やクローン病のような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、胃腸管の炎症が関与する衰弱性及び進行性の疾患でありうる。米国だけでも推定２００万人の人々を冒している症状には、腹痛、さしこみ、下痢および直腸出血などがある。ＩＢＤ治療には、抗炎症剤（コルチコステロイドおよびスルファサラジンなど）、免疫抑制剤（６−メルカプトプリン、シクロスポリンおよびアザチオプリンなど）及び外科手術（結腸切除など）などが用いられている。Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２５：９２８−９３７（１９９１）及びＰｏｄｏｌｓｋｙ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２５：１００８−１０１６（１９９１）。
【０００９】
いくつかの研究によって、細胞接着分子ＩＣＡＭ−１が、白血球表面リガンド、すなわちＭａｃ−１またはＬＦＡ−１に対する接着を介して、炎症部位への白血球補充を媒介することが示唆されている（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：４２５−４３４（１９９０））。また、α４β１インテグリン（ＶＬＡ−４）を認識する血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）は、インビボにおける白血球補充に役割を果たしているとも報告されている（Ｓｉｌｂｅｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：１５５４−１５６３（１９９４））。ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１またはＭａｃ−１との相互作用や、ＶＣＡＭ−１とα４β１との相互作用を阻害することによって、ＩＢＤを治療できるとの提案がある（例えばＷＯ９３／１５７６４）。しかしながら、これらの治療標的は複数の器官の炎症プロセスに関与すると思われ、機能の阻害は全身的な免疫機能不全を引き起こしかねない。
【００１０】
ＶＣＡＭ−１やＩＣＡＭ−１とは対照的に、ＭＡｄＣＡＭは胃腸管に選択的に発現され、リンパ球上に認められるα４β７インテグリンを結合し、これらの細胞の、粘膜部位（腸壁のパイエル斑など）への帰還に関与する（Ｈａｍａｎｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５２：３２８２−３２９３（１９９４））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＭＡｄＣＡＭの、そのレセプターα４β７との結合に対して阻害因子を使用することは、これまで提案されていない。さらに、ヒトのα４及びα７の遺伝子と蛋白質は同定されているが（Ｙｕａｎら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１０９７−１１０８（１９９０）；Ｅｒｌｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１１００９−１１０１６（１９９１）；Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｍ．Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１：７６７−８０４（１９９３）；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．，Ｃｅｌｌ，７６：３０１−３１４（１９９４））、ヒトまたは霊長類ＭＡｄＣＡＭ−１はまだクローン化や特徴づけがなされていない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の要旨は、
〔１〕  α４β７インテグリンに結合し、ＡＣＴ−１モノクローナル抗体のエピトープ特異性を有する抗体または抗原結合断片を活性成分として含有してなる、ヒトにおいて炎症性の腸疾患を治療するための医薬組成物、
〔２〕  炎症性の腸疾患が、潰瘍性結腸炎、クローン病、腹腔疾患、セロネガティブ関節症に関連する腸疾患、微細もしくはコラーゲン蓄積大腸炎、好酸球性胃腸炎および窩炎からなる群より選ばれる〔１〕記載の医薬組成物、
〔３〕  抗体またはその抗原結合断片がキメラ抗体、キメラ抗原結合断片、ヒト化抗体、およびヒト化抗原結合断片からなる群より選ばれる〔１〕又は〔２〕記載の医薬組成物、
〔４〕  抗体またはその抗原結合断片がモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である〔１〕〜〔３〕いずれか記載の医薬組成物
に関する。
【００１３】
発明の要約
本発明は、以下、単離及び／又は組換え（例えば本質的に純粋な）霊長類ＭＡｄＣＡＭと呼ぶ、蛋白質またはポリペプチドに関する。一態様として、霊長類ＭＡｄＣＡＭは、α４β７インテグリンを発現する細胞（具体的にはリンパ球）に選択的に結合できる。本発明の組換え蛋白質は変異体を含み、本明細書に記載の宿主細胞で生産できる。さらに、例えば、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその変異体を免疫原として用いることにより、本発明の蛋白質と反応する抗体を生産することができる。このような抗体またはその断片は、治療、診断及び研究に有用である。例えば、これらの抗体は、ＭＡｄＣＡＭの精製と研究、ＭＡｄＣＡＭを発現する細胞の同定、試料中のＭＡｄＣＡＭの検出または定量などに使用できる。
【００１４】
さらに本発明は、霊長類ＭＡｄＣＡＭ（ヒトＭＡｄＣＡＭなど）をコードする単離及び／又は組換え（例えば本質的に純粋な）核酸に関する。さらに他の側面として、本発明は、本発明の蛋白質またはその一部をコードする核酸を含有する、プラスミドやレトロウイルスベクターなどの組換え核酸構築物に関する。該核酸と構築物を、組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭを製造するために使用することができる。他の態様として、本発明の核酸は、霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする二番目の核酸とハイブリッド形成することができ、かつ、（例えば細胞中に導入された場合に）その蛋白質の発現を阻害できるアンチセンス核酸をコードする。
【００１５】
また、ＭＡｄＣＡＭ機能のリガンド及び／又は阻害因子（例えばアンタゴニスト）を同定する方法も、本発明に包含される。例えば、ＭＡｄＣＡＭとそのリガンドα４β７インテグリンとの結合を阻害するアンタゴニストを同定するために設計されたアッセイ法（例えば接着アッセイ法）に、霊長類ＭＡｄＣＡＭ（変異体を含む）を使用できる。
【００１６】
さらに本発明は、治療法（ＭＡｄＣＡＭ分子を発現する腸−関連内皮に対する白血球結合の結果として起こる胃腸管や他の組織への白血球（リンパ球や単球など）補充に関連する疾患に冒された個体の治療法を含む）であって、その個体（例えば、霊長類などの哺乳類）に、内皮ＭＡｄＣＡＭに対する白血球の結合を阻害する薬物または化合物（抗体など）の有効量を投与することを含む治療法にも関係する。抗体はモノクローナル抗体、キメラ及び／又は人体に適合させた抗体またはその抗原結合性断片であることが好ましく、β７鎖を含有するインテグリン（α４β７など）を発現する白血球の、ＭＡｄＣＡＭを発現する内皮への接着を阻害する。ある態様では、そのようなモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、ＦＩＢ２１、ＦＩＢ３０、ＦＩＢ５０４及びＡＣＴ−１からなる群より選択されるモノクローナル抗体の抗原特異性を持つ。
【発明の効果】
【００１７】
本願の請求された方法によって、炎症性腸疾患、例えば潰瘍性結腸炎、クローン病、窩炎（Ｐｏｕｃｈｉｔｉｓ）、腹腔疾患、微細（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ）またはコラーゲン蓄積大腸炎及び好酸球性胃腸炎などを、ただしこれらに限られるわけではないが、治療できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
蛋白質とペプチド
本発明は、霊長類ＭＡｄＣＡＭ（粘膜アドレシン細胞接着分子）と呼ばれる単離及び／又は組換え（例えば本質的に純粋なものを含む）蛋白質またはポリペプチドと、霊長類ＭＡｄＣＡＭの変異体に関する。好ましい態様では、本発明の単離及び／又は組換え蛋白質が、（本明細書に規定する）霊長類ＭＡｄＣＡＭの特性、活性または機能的特徴、例えば結合機能（例えばα４β７インテグリンと結合する能力）及び／又は細胞接着分子機能（例えばインビトロ及び／又はインビボでα４β７依存性接着などの細胞接着を媒介する能力）及び／又は本明細書に規定する免疫学的特性などの少なくとも１つの性質を有する。例えば、本発明蛋白質のいくつかは、α４β７インテグリンと選択的に結合することができ、それによって、白血球などのα４β７インテグリンを保持する細胞（特にＴ細胞またはＢ細胞などのリンパ球）に対するα４β７依存性細胞接着を、インビトロ及び／又はインビボで媒介する。一側面として、本発明の蛋白質は、異型細胞接着（例えば、リンパ球などの白血球に対する内皮細胞の異型細胞接着）を媒介できる。
【００１９】
もう１つの態様として、本発明の蛋白質は、同じ霊長類種または異なる霊長類種に由来する霊長類α４β７インテグリンを結合し、かつ／または、細胞接着分子機能（例えば、インビトロ及び／又はインビボにおける、α４β７依存性接着などの細胞接着を媒介する能力）を持つことができる。例えば、本明細書に示すように、ｃＤＮＡクローン体の発現によって哺乳類細胞で生産したヒトとアカゲザルのＭＡｄＣＡＭ−１蛋白質は、ヒトリンパ球上に存在するα４β７インテグリンに選択的に結合でき、α４β７インテグリンを保持する細胞に対する選択的接着を媒介できる細胞接着分子として機能できる。
【００２０】
本明細書でいう「単離（された）」蛋白質またはポリペプチドとは、哺乳類細胞内に存在する時の状態よりも精製された蛋白質またはポリペプチドである。「単離（された）」蛋白質またはポリペプチドとしては、本明細書に記述する方法や類似の方法もしくは他の適切な方法で得られる蛋白質またはポリペプチドが挙げられ、本質的に純粋な蛋白質またはポリペプチド、化学合成によって生産された蛋白質またはポリペプチド（例えば合成ペプチド）、生物学的方法と化学的方法の組み合わせで生産された蛋白質またはポリペプチド、単離された組換え蛋白質またはポリペプチドなどが含まれる。蛋白質は、少なくとも約５０重量％の単離された状態で、好ましくは少なくとも約７５重量％の単離された状態で、より好ましくは本質的に純粋な状態で、得ることができる。本明細書でいう「組換え」蛋白質またはポリペプチドとは、組換え核酸の発現によって生産された蛋白質またはポリぺプチドである。
【００２１】
本明細書で「霊長類ＭＡｄＣＡＭ」とは、天然に存在する若しくは内因性の霊長類ＭＡｄＣＡＭ蛋白質、天然に存在する若しくは内因性の対応する霊長類ＭＡｄＣＡＭと同じアミノ酸配列を持つ蛋白質（例えば組換え蛋白質）、及び上記いずれかの機能的変異体（例えば、突然変異及び／又は組換え技術によって生産された機能的断片及び／又は変異体）をいう。したがって、本明細書に定義するように該用語は、成熟霊長類ＭＡｄＣＡＭ、グリコシル化または非グリコシル化ＭＡｄＣＡＭ蛋白質、霊長類ＭＡｄＣＡＭの多形または対立遺伝子変異体、及び他のイソ型（例えば、択一的スプライシングまたは他の細胞内プロセスによって生産されるもの、並びに機能的断片を包含する。
【００２２】
天然に存在する若しくは内因性の霊長類ＭＡｄＣＡＭ蛋白質としては、霊長類（例えば、ヒトまたはアカゲザル、コットントップタマリンなどの他の非ヒト霊長類）に自然に存在する成熟ＭＡｄＣＡＭ、多形または対立遺伝子変異体及び他のイソ型が挙げられる。このような蛋白質は、霊長類ＭＡｄＣＡＭを自然に生産する供給源から回収できる。これらの蛋白質、及び天然に存在するまたは内因性の対応する霊長類ＭＡｄＣＡＭと同じアミノ酸配列を持つ霊長類ＭＡｄＣＡＭ蛋白質は、その対応する霊長類の名前で呼ばれる。例えば、対応する霊長類がヒトなら、その蛋白質はヒトＭＡｄＣＡＭ蛋白質（例えば、適当な宿主細胞で生産された組換えヒトＭＡｄＣＡＭ）と称する。
【００２３】
霊長類ＭＡｄＣＡＭの「機能的変異体」としては、機能的断片、機能的変異蛋白質及び／又は機能的融合蛋白質が挙げられる。一般に、本発明が包含する霊長類ＭＡｄＣＡＭの断片または一部としては、成熟霊長類ＭＡｄＣＡＭと比較してアミノ酸（すなわち１以上のアミノ酸）の欠失（すなわち１以上の欠失）をもつもの（例えばＮ末端欠失体、Ｃ末端欠失体または内部欠失体）が挙げられる。成熟霊長類ＭＡｄＣＡＭに関連する、隣接するアミノ酸だけが欠失している断片または一部や、隣接しないアミノ酸が欠失している断片または一部も想定される。
【００２４】
一般に、本発明が包含する霊長類ＭＡｄＣＡＭの変異体または誘導体としては、１以上の隣接するアミノ酸残基若しくは不連続なアミノ酸残基が相違する天然の若しくは人工的な変異体や、１以上の残基が修飾されている修飾ポリペプチド、及び１以上の修飾残基を含む変異体が挙げられる。好ましい変異体は、１以上の隣接する若しくは隣接しないアミノ酸残基の付加、欠失及び／又は置換によって相違する霊長類ＭＡｄＣＡＭの天然の若しくは人工的な変異体である。
【００２５】
霊長類ＭＡｄＣＡＭの「機能的断片または一部」、「機能的変異体」及び／又は「機能的融合蛋白質」とは、霊長類ＭＡｄＣＡＭの特性、活性及び／又は結合機能など（例えばα４β７インテグリンを結合する能力）の機能的特徴、及び／又は細胞接着分子機能（例えば、α４β７依存的接着のような細胞接着を、インビトロ及び／又はインビボで媒介できる能力）などの少なくとも１つを持ち、および／または、霊長類ＭＡｄＣＡＭの免疫学的特性の少なくとも１つを保持する、単離及び／又は組換え蛋白質またはオリゴペプチドをいう。
【００２６】
本明細書において、霊長類ＭＡｄＣＡＭの「免疫学的特性の少なくとも１つ」を有する蛋白質、ポリペプチドまたはオリゴペプチドとは、（ａ）選択されたエピトープ特異性を持つ抗体であって、天然に存在するまたは内因性の霊長類ＭＡｄＣＡＭに結合するか、あるいは天然に存在するまたは内因性の霊長類ＭＡｄＣＡＭ（例えばヒトＭＡｄＣＡＭ−１）と同じアミノ酸配列を有する蛋白質に結合する抗体の、少なくとも１つによって結合されるもの、及び／又は（ｂ）選択されたエピトープ特異性を持つ抗体であって、天然に存在するまたは内因性の霊長類ＭＡｄＣＡＭに結合するか、あるいは天然に存在するまたは内因性の霊長類ＭＡｄＣＡＭと同じアミノ酸配列を持つ蛋白質に結合する抗体の、適当な動物における形成を誘導できる免疫原であるものをいう。例えば、適当な断片は、単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭに対して生じる及び／又は単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭと反応する抗体と、交差反応できる。
【００２７】
適当な断片または変異体は、スクリーニングによって同定できる。例えば、蛋白質のＮ末端、Ｃ末端または内部領域を段階的に欠失させることができ、その結果生じる蛋白質を、本明細書に記述するアッセイのような適当な結合または接着アッセイで、スクリーニングすることができる。生じた蛋白質がそのアッセイで活性を示す場合、その生じた蛋白質（「断片」）は機能的である。本明細書に示す霊長類ＭＡｄＣＡＭの構造と機能に関する情報及びネズミのＭＡｄＣＡＭと他の接着分子の構造と機能に関する情報は、霊長類ＭＡｄＣＡＭを機能ドメインに分割するための基礎を与える（下記参照）。
【００２８】
変異体という用語は、霊長類ＭＡｄＣＡＭ（例えば成熟ヒトＭＡｄＣＡＭ−１）を第１部分とし、それに、自然界にみられる霊長類ＭＡｄＣＡＭには存在しない第２部分が結合してなる融合蛋白質をも包含する。したがって、該第２部分は、アミノ酸、オリゴペプチドまたはポリペプチドであってもよい。第１部分は、その融合蛋白質のＮ末端位置、Ｃ末端位置または内部にあってもよい。一態様として、融合蛋白質は、第１部分としてのヒトＭＡｄＣＡＭまたはその一部と、リンカー配列とアフィニティーリガンド（例えば酵素、抗原、エピトープタグなど）を含む第２部分とを含有する。
【００２９】
別の態様は、融合蛋白質が、例えば、霊長類ＭＡｄＣＡＭ部分のＣ末端で、免疫グロブリン部分（１以上の免疫グロブリン定常領域など）、好ましくは霊長類のもののＮ末端に融合してなるハイブリッドであり、Ｃａｐｏｎら，米国特許第５，４２８，１３０号及び同第５，２２５，５３８号、これらの特許の教示は全て参考文献として本明細書の一部を構成する、などに従って製造されるものなど）などのハイブリッド免疫グロブリンである。ハイブリッド免疫グロブリンとしては、免疫グロブリン鎖の少なくとも一部、好ましくは完全な免疫グロブリンドメイン（例えばＣＨ１やヒンジ）の少なくとも１つを含有する融合蛋白質またはポリペプチドが挙げられる。「免疫アドヘシン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ」の他の例は、既に報告されている（Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．Ｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４９：１６４−１６７（１９９１）；Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：３５６１−３５６８（１９９３）；Ｓｔａｕｎｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１４７１−１４７６（１９９２）；Ｃａｐｏｎ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉら， J．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：９３８−９４６（１９９５））。例えば、霊長類（例えばヒト）ＭＡｄＣＡＭの全部または一部と、免疫グロブリン重鎖または軽鎖定常領域またはその一部とを含有する融合蛋白質を、（例えばその融合蛋白質をコードする核酸を調製することによって）調製することができる。融合物は、一般的には、ＭＡｄＣＡＭのC末端が免疫グロブリン定常領域のＮ末端につながるように構築される。しかしながらＭＡｄＣＡＭのN末端が免疫グロブリン定常領域のＣ末端につながっている融合蛋白質も作成できる。好ましくは、リガンド（例えばα４β７インテグリン）に結合する能力がある霊長類ＭＡｄＣＡＭの一部であり、完全な細胞外ドメインまたは２つの膜貫通領域を欠くＮ末端免疫グロブリンドメインを含む一部などを使用することが好ましい（例えば実施例３を参照）。
【００３０】
選択した定常領域のタイプと、融合ポリペプチドに使用する部分（例えば軽鎖定常領域、重鎖定常領域（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭから得られるγ１、γ２、γ３、γγ４、α１、α２、δ、ε及びμ定常領域など）及びその一部）に応じて、またそれらを、互いに及び／又は他のハイブリッド免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖と、多量体型に集合させるかどうかによって、様々なハイブリッド免疫グロブリン分子（例えば単量体型、ホモ二量体型、ヘテロ二量体型、ホモ四量体型、ヘテロ四量体型）を生産することができる（Ｃａｐｏｎら，米国特許第５，４２８，１３０号及び同第５，２２５，５３８号を参照）。好ましい態様として、融合蛋白質は、完全な重鎖定常領域を含むか、あるいは少なくとも、機能的に活性なヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。エフェクター機能を仕立てるために、特定の定常領域（例えばＩｇＧ１）、その誘導体または一部を選択してもよい。例えば、Ｆｃレセプターへの結合を最小限に抑え（実施例３；Ｗｉｎｔｅｒら，ＧＢ２，２０９，７５７Ｂ；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら，ＷＯ８９／０７１４２）、および／または補体を固定する（ＷＯ９４／２９３５１，１９９４年１２月２２日）などのために、変異した定常領域（変異体）を融合蛋白質に組込むことができる。
【００３１】
「霊長類ＭＡｄＣＡＭ」蛋白質の例としては、本発明のヒトまたはアカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１核酸によってコードされる蛋白質、例えば図１（配列番号２）、図２（配列番号４）または図３（配列番号６）に記載の、若しくは実質上それらに記載されているに等しい、アミノ酸配列を持つ蛋白質とその機能的な一部が挙げられる。好ましい態様では、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたは誘導体が、図１（配列番号２）、図２（配列番号４）または図３（配列番号６）に示す蛋白質に対して、少なくとも約５５％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％類似するアミノ酸配列を持つ。
【００３２】
ＭＡｄＣＡＭ構造
免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーの構成要素であるネズミＭＡｄＣＡＭ−１  は、免疫グロブリン関連配列とムチン様配列の両方を持つマルチドメイン分子である（Ｂｒｉｓｋｉｎ，Ｍ．Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６３：４６１（１９９３））。図６に示すように、ネズミ型は、Ｉｇ様接着レセプターＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１のドメインと相同であり、インテグリン結合に関係する２つのアミノ末端免疫グロブリン型ドメインを含有する。第３の（膜近位）免疫グロブリン型ドメインは、このクラスの接着レセプターとは無関係であるが、他の粘膜関連免疫グロブリンスーパーファミリー構成要素であるＩｇＡとの相同性を持つ。上記３つの免疫グロブリン型ドメインに加えて、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１は、第２Ｉｇ様ドメインと第３のＩｇ様ドメインの間に、セリン／スレオニンリッチなムチン型ドメインを持つ。これらの構造要素は、ＭＡｄＣＡＭ−１が細胞接着カスケードにおいて２以上の機能を促進することを示唆しており、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１に関する最近の研究は、ＭＡｄＣＡＭ−１がセレクチン結合とインテグリン結合の両方に役割を果たすことを支持している（Ｍｏｏｒｅ，Ｋ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１８：４４５（１９９２）；Ｂａｒｇａｔｚｅ，Ｒ．Ｆ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：９９−１０８（１９９５））。またこれに関連して、腸間膜リンパ小節で発現したネズミＭＡｄＣＡＭ−１は、末梢小節アドレシンエピトープＭＥＣＡ−７９に関連するＬ−セレクチン結合性炭水化物を提示できると報告されている（Ｂｅｒｇ，Ｅ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６６：６９５（１９９３））。
【００３３】
本明細書に記述するように、ヒト及びアカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１蛋白質は、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１の２つのアミノ末端免疫グロブリン様インテグリン結合性ドメインと相同な、２つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインを持つ（図１〜３、６）。しかし、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１のムチン／ＩｇＡドメインに相同な領域内の配列の類似性は、はるかに少ない。ヒト及びアカゲザルレセプターの膜近位領域は、ムチン様配列の長さと近位Ｉｇ（ＩｇＡ様）ドメインの欠失に関して、（互いに、若しくはネズミＭＡｄＣＡＭ−１と比較して）かなりの変動を示す。
【００３４】
ヒトＭＡｄＣＡＭ−１には、１つのアミノ酸多形と、ムチン領域内のセリン／スレオニン／プロリンリッチな反復のコピー数の変動とを示す２つのイソ型が同定された。これら２つのイソ型はゲノムＤＮＡにコードされているようであり、この配列の異なるプロセシング及び／又は対立遺伝子変異を示唆している。これら２つのイソ型は、α４β７結合親和性の調節機構及び／又はセレクチン結合用の炭水化物の提示機構の選択肢として機能するだろう。本明細書に記述する霊長類ＭＡｄＣＡＭに、これらのＩｇ様ドメインとムチンドメインが存在することは、インテグリン結合ばかりでなくセレクチン結合におけるその役割とも合致する。
【００３５】
ネズミＭＡｄＣＡＭ−１で最近行われたドメイン交換実験では、ＭＡｄＣＡＭ−１のドメイン１はα４β７を弱く結合できるものの、強いインテグリン活性化が無ければ、接着が乏しいことが示された。２つのアミノ末端Ｉｇ様ドメイン（これらはＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１のドメインと類似する）かあれば、野生型ネズミＭＡｃＤＡＭ−１に匹敵する活性化非依存的なα４β７結合活性を示し得る。
【００３６】
ネズミＭＡｄＣＡＭ−１のドメイン１に存在する短いモチーフ（ＧＬＤＴＳＬ）は、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２及びＩＣＡＭ−３のドメイン１、ＶＣＡＭ−１のドメイン１及び４を含む他のＩｇ様接着レセプターに保存されており、それらのインテグリン結合に必要である（Ｓｔａｕｎｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｃｅｌｌ，５２：９２５−３３（１９８８）；Ｓｔａｕｎｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３９：６１（１９８９）；Ｏｓｂｏｒｎ，Ｌ．ら，Ｃｅｌｌ，５９：１２０３（１９８９）；Ｆａｗｃｅｔｔ， J．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６０：４８１（１９９２））。Ｇ−（Ｉ／Ｌ）−（Ｄ／Ｅ）−（Ｔ／Ｓ）−（Ｐ／Ｓ）−Ｌというこの配列は、これらのインテグリン結合ドメインのβシートｃとｄの間に位置する。該ＧＬＤＴＳＬモチーフは、本発明が特徴づけた霊長類ＭＡｄＣＡＭにも認められた。
【００３７】
ＩＣＡＭ−１のドメイン１のこのモチーフ内のＥ３４（Ｇｌｕ34）（上記下線部）と、ＶＣＡＭ−１内のＤ４０（Ａｓｐ40）（上記太字部分）の突然変異誘発は、それぞれＬＦＡ−１とα４β１の結合に著しい影響を与えた（Ｏｓｂｏｒｎ，Ｌ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２４：６０１−６０８（１９９４）；Ｒｅｎｚ，Ｍ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２５：１３９５−１４０６（１９９４）；Ｓｔａｕｎｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ら，Ｃｅｌｌ，６１：２４３−２５４（１９９０）；Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ，Ｒ．Ｈ．ら， J．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２５：２１５−２２２（１９９４））。さらに最近になって、２つのＮ末端ドメインを含むＶＣＡＭ−１の断片が結晶学的構造決定をされた（Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３７３：５３９−５４４（１９９５）；Ｗａｎｇ，Ｊ−Ｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９２：５７１４−５７１８（１９９５））。ＶＣＡＭ−１中の保存されたモチーフ（ＱＩＤＳＰＬ）は、第１ＩｇドメインのＣＤループのＮ末端部分で、インテグリンが容易に接近できそうな位置に、高度に露出されているようである。
【００３８】
ネズミＭＡｄＣＡＭ−１のこのモチーフ内で、アミノ酸６１をロイシンからアルギニンに変える（Ｌ６１→Ｒ６１）ヌクレオチド置換を施すと、α４β７を発現する休止リンパ球とＭＡｄＣＡＭ−１との相互作用が破壊される。したがってネズミＭＡｄＣＡＭ−１も、そのインテグリンリガンド（α４β７）を結合するために、この保存されたアミノ酸モチーフ（ＧＬＤＴＳＬ）を、そのＮ末端ドメインのコンピューターで予測されるＣＤループ内に必要とする。
【００３９】
ヒトＭＡｄＣＡＭｃＤＮＡクローン体４と２０（図１及び２）を比較すると、アミノ末端の２２５アミノ酸がクローン体４と２０で同一であることがわかった。この領域は、予想される１８アミノ酸疎水性リーダーまたはシグナル配列と、２つの免疫グロブリン型ドメインとを含む。霊長類及びネズミＭＡｄＣＡＭ−１を用いてこの領域を整列させると、次の保存性が示される：（１）予想シグナルペプチド（ヒト蛋白質間で同一、アカゲザル及びネズミシグナルペプチドと類似）；（２）第１Ｉｇ様ドメイン内の２対のシステイン残基、各対のシステイン間には３アミノ酸が介在する；（３）Ｉｇ様ドメイン１の予想Ｃ−Ｄループ中の９アミノ酸からなる配列（「ＬＤＴＳＬ」モチーフを含む）、一般的なインテグリン認識部位と考えられる（各霊長類クローン体間で同一）；（４）異常に大きい第２免疫グロブリン型ドメイン。システイン残基に挟まれた約７０アミノ酸を持つ第２Ｉｇ様ドメインは、そのサイズから考えて、Ｉｇ様接着レセプターにより典型的に認められるＣ２型（定常）ドメインではなく、「Ｖ」（可変）型ドメインに分類されるだろう（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｔ．ら，  Ａｄｖ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：１−６２（１９８９）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｆ．ら，Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：３８１−４０５（１９８８））。このドメインには、負に荷電した残基を豊富に含む伸長Ｃ’−Ｅループがあり、これは特徴づけられた霊長類、ネズミ及びヒトＭＡｄＣＡＭ−１クローン体のそれぞれに共通するが、関連する接着レセプターには認められない。
【００４０】
クローン体４と２０に認められる次の領域は、セリン、スレオニン及びプロリン残基の出現率（クローン体４で６９％、クローン体２０で７６％）の点で、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１のムチンドメインに似ている（図１と図２の囲んだ部分）。この領域は、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１とアミノ酸組成は似ているが、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１とは著しく異なる。したがって、インテグリン結合性Ｉｇ様ドメインの保存に関する選択は、ムチン配列のそれよりも強いようである。ヒトＭＡｄＣＡＭ−１ドメインはクローン体４では７１アミノ酸長、クローン体２０では４７アミノ酸長である。また、この領域は２つの多形を含む：（１）アミノ酸２４０の多形、これはクローン体４ではプロリン（Ｐ）、クローン体２０ではセリン（Ｓ）である；（２）アミノ酸２４２の多形、これはクローン体４ではアスパラギン（Ｎ）、クローン体２０ではアスパラギン酸（Ｄ）である。さらに、ヒトムチンドメインは、ＰＰＤＴＴＳ（Ｑ／Ｐ）Ｅという配列からなる８アミノ酸の反復を含み、この反復配列はクローン体４では８回、クローン体２０では５回現れる。
【００４１】
ヒトムチンドメインは高度に反復性であるので、クローン体４と比べてクローン体２０中の反復が３つ欠如しているのは、オープンリーディングフレームを維持し、インテグリン結合に関して機能的なレセプターを与える択一的スプライシングまたは突然変異（例えば異常型組換え）などのプロセスの結果であろう。このことは、ムチン配列の一部または全部がインテグリン結合にとって重要でないことを示唆している。また、α４β７に対する活性化非依存性接着には、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１のＩｇ様ドメイン１及び２だけでも十分であることがわかっており、これもまた、ネズミムチン配列がインテグリン結合にとって重要でないことを示している。この点に関して興味深いのは、単離したアカゲザルクローン体がこの反復領域のほとんどを欠くことである。
【００４２】
残りのC末端側の１１０アミノ酸（４７アミノ酸に続いて、２０アミノ酸からなる予想疎水性膜貫通領域があり、それに続いて４３アミノ酸の細胞質テイルがある）は、クローン体４と２０の間で同一である。ムチン領域のＣ末端直後の４７アミノ酸は、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１のＩｇＡ型Ｉｇドメインに対応する領域である。ヒト蛋白質とアカゲザル蛋白質はこの領域が似ているが、それらはネズミＭＡｄＣＡＭ−１とは異なる。ネズミＭＡｄＣＡＭ−１と比較すると、ヒト蛋白質はこの領域が５９アミノ酸短く、Ｉｇ様ドメインの特徴を何ら持たない。全てのレセプターの膜貫通領域は類似しているが、細胞質テイルはヒト（霊長類では２６、マウスでは２０）ＭＡｄＣＡＭ−１の方がかなり長い（４３アミノ酸）。
【００４３】
組換え蛋白質の製造法
本発明のもう１つの側面は、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその誘導体（例えば一部）を製造する方法に関する。組換え蛋白質は、例えば、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその誘導体をコードする組換えＤＮＡ分子の、適当な宿主細胞における発現などによって得ることができる。
【００４４】
霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその変異体の発現に適した構築物も提供する。この構築物は適当な宿主細胞に導入することができ、組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその変異体を発現する細胞を生産し、それを培養中に維持することができる。このような細胞は種々の目的に有用であり、接着アッセイ（例えば、リガンド及び／又はＭＡｄＣＡＭが媒介する接着の阻害因子候補をスクリーニングするためのアッセイ）や、特徴づけ、単離及び／又は精製（例えばアフィニティー精製）用の蛋白質の生産などに使用したり、免疫原などとして使用できる。好適な宿主細胞としては、原核細胞（これには大腸菌、枯草菌及び／又は他の適当な細菌などの細菌細胞が含まれる）や、真核細胞、例えばカビ細胞や酵母細胞（例えばピチア  パストリス、アスペルギルス種、サッカロミセス  セルビジエ、シゾサッカロミセス  ポンベ、ニューロスポラ  クラッサ）または他の下等真核細胞、および昆虫由来の細胞（例えばＳｆ９昆虫細胞）や哺乳類由来の細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、ＨｕＴ７８細胞、２９３細胞）などの高等真核細胞を挙げることができる（例えばＡｕｓｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，（１９９３）を参照。）。一態様として、膜結合成熟蛋白質を発現することのできる宿主細胞を使用する。他の態様として、Ｃ末端膜貫通領域と細胞質テイルを欠く可溶型ＭＡｄＣＡＭなどの可溶型ＭＡｄＣＡＭを分泌できる宿主細胞を使用する。
【００４５】
組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその誘導体を生産する宿主細胞は次のように作成できる。例えば、所望の蛋白質のコード配列の全部または一部をコードする核酸は、核酸ベクター、例えばプラスミド、ウイルスまたは他の適当な発現用レプリコンなどのＤＮＡベクターなどに挿入できる。種々のベクターを利用することができ、それらには単一コピーまたは多コピーとして維持されるベクターや、宿主細胞染色体に組込まれるベクターなどが含まれる。
【００４６】
ＭＡｄＣＡＭ−１遺伝子の転写および／または翻訳シグナルを使用して、発現を制御することができる。別法として、所望の蛋白質のコード配列の全部または一部をコードする核酸の発現に適した発現ベクターも利用できる。適切な発現ベクターはいくつかの成分を含有でき、それらには次の１以上が含まれるが、これらに限られるわけではない：複製起点、選択可能マーカー遺伝子、１以上の発現制御因子、例えば転写制御因子など（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）、および／または１以上の翻訳シグナル、（霊長類または異種霊長類若しくは非霊長類種由来の）膜標的（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）または分泌のシグナル配列またはリーダー配列。構築物中、シグナル配列は、該ベクターから提供されるものであってもよいし、その霊長類ＭＡｄＣＡＭコード配列、または他の供給源から提供されるものであってもよい。
【００４７】
プロモーターは適切な宿主細胞での発現用に供給される。プロモーターは構成的であってもよいし、誘導性であってもよい。ベクターでは、該プロモーターが、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその誘導体をコードする核酸に実施可能に連結しており、コードされているポリペプチドの発現を支配できる。原核生物宿主に適した種々のプロモーター（例えば大腸菌にはｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）および真核生物宿主に適した種々のプロモーター（例えば酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）、ＳＶ４０、ＣＭＶ）を、利用できる。
【００４８】
さらに、発現ベクターは通例、該ベクターを保持する宿主細胞を選択するための選択可能マーカーおよび複製可能発現ベクターの場合、起点または複製（ａｎ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を含む。抗生物質耐性または薬物耐性を付与する産物をコードする遺伝子は一般的な選択可能マーカーであり、原核細胞（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性用のＴｅｔ遺伝子）中および真核細胞（例えばネオマイシン（Ｇ４１８またはゲネチシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、またはハイグロマイシン耐性遺伝子）中で、使用できる。ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカー遺伝子は、メトトレキセートによる選択を、種々の宿主で可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えばＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）は、酵母における選択可能マーカーとしてしばしば使用される。ウイルス（例えばバキュロウイルス）やファージベクター、及び宿主細胞のゲノムに組み込むことができるレトロウイルスベクターなどのベクターの使用も予想される。また本発明は、これらの発現ベクターを保持する細胞にも関する。
【００４９】
例えば、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその誘導体をコードする核酸をベクターに取り込み、１以上の発現制御因子に実施可能に連結し、その構築物を、発現に適した条件下に維持される宿主細胞に導入することによって、コードされているポリペプチドを生産することができる。構築物は、選択した宿主細胞に適した方法（例えば形質転換、形質導入、エレクトロポレーション、感染など）で細胞に導入できる。蛋白質の生産には、上記構築物を含有する宿主細胞を、発現に適した条件下（例えば、誘導物質、適当な塩類、成長因子、抗生物質、栄養補給物などを補足した培地の存在下）に維持する。コードされた蛋白質（例えばヒトＭＡｄＣＡＭ−１）は、その宿主細胞または培地から単離できる。
【００５０】
融合蛋白質もこの方法で生産できる。例えば、いくつかの態様は、霊長類ＭＡｄＣＡＭ  ｃＤＮＡまたはその一部を、例えばＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋／−（ストラタジーン）、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２（ファルマシア）、ｐｃＤＮＡ−３（インビトロジェン）及びｐＥＴ−１５ｂ（ノバ−ジェン）などの適当な発現ベクターに挿入することによって生産できる。次に、得られた構築物を、発現に適した宿主細胞に導入する。発現後、適当なアフィニティーマトリックス担体を利用して、細胞溶解液から融合蛋白質を単離または精製できる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編，第２巻，増補２６，１６．４．１〜１６．７．８頁（１９９１）を参照）。さらに、アフィニティーラベルは、融合蛋白質の検出手段となる。例えば、抗原またはエピトープアフィニティーラベルを含有する融合蛋白質の細胞表面発現またはその特定の細胞画分における存在は、適当な抗体を利用して検出できる。
【００５１】
核酸、構築物およびベクター
本発明は、本明細書に記載の霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその変異体をコードする配列を持つ単離されたおよび／または組換え（例えば、本質的に純粋なものを含む）核酸に関する。
【００５２】
本明細書でいう「単離された」核酸とは、その起源の細胞ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ（例えば細胞中や、ライブラリーのような核酸の混合物中に存在する場合など）から分離された核酸であり、さらなるプロセシングを受けていてもよい。「単離された」核酸としては、本明細書に記載の方法、類似の方法または他の適当な方法で得られる核酸が挙げられ、例えば本質的に純粋な核酸、化学合成によって生産された核酸、生物学的方法と化学的方法の組み合わせによって生産された核酸、及び単離された組換え核酸などがある（例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｂ．Ｌ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９（９）：２４７１−２４７６（１９９１）；Ｌｅｗｉｓ，Ａ．Ｐ及びＪ．Ｓ．Ｃｒｏｗｅ，Ｇｅｎｅ，１０１：２９７−３０２（１９９１）を参照）。本明細書でいう「組換え」核酸とは、組換えＤＮＡ法によって生産された核酸であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素を用いたベクターへのクローニングなどといった人工的組換え法による操作で作成される核酸を含む。また「組換え」核酸は、細胞の天然の機構を介して起こる組換え事象によってもたらされる核酸であって、所望の組換え事象を許容し、それを起こりやすくするように設計された核酸の、細胞への導入後に選択される核酸であってもよい。
【００５３】
一態様として、上記核酸またはその一部は、（本明細書に規定する）霊長類ＭＡｄＣＡＭの特性、活性または機能的特徴、例えば結合活性（例えば、α４β７インテグリンを結合する能力）及び/又は細胞接着分子機能（例えば、α４β７依存性接着などの細胞接着を、試験管内及び／又は生体内で媒介する能力）及び／又は本明細書に規定する免疫学的特性などの、少なくとも１つを持つ蛋白質またはポリペプチドをコードする。
【００５４】
より具体的に述べると、本発明は、ヒトまたはアカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１またはその変異体をコードする配列を持つ、単離されたおよび／または組換え核酸またはその一部に関する。
【００５５】
さらに本発明は、以下を特徴とする、単離された及び／又は組換え核酸に関する：
（１）以下の核酸にハイブリダイズできること：（ａ）霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする核酸、例えば、図１（配列番号１）、図２（配列番号３）または図３（配列番号５）に記載のヌクレオチド配列、若しくは実質上そこに記載されているに等しいヌクレオチド配列を持つ核酸；（ｂ）（ａ）のうちいずれかの相補鎖；若しくは（ｃ）前記核酸の一部（読み取り枠を含む一部など）；あるいは、
（２）霊長類ＭＡｄＣＡＭ（例えば、配列番号２、配列番号４または配列番号６）のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードできること；あるいは、
（３）上記の両特徴を持つこと。
【００５６】
一態様として、該核酸は、図１、図２または図３、（それぞれ配列番号１、３または５）に示すヌクレオチド配列のいずれか、若しくはそのＭＡｄＣＡＭコード領域の１つと、少なくとも約５０％のヌクレオチド配列類似性を共有する。より好ましくは、該核酸は、図１、図２または図３（それぞれ配列番号１、３または５）のいずれか、若しくはそのＭＡｄＣＡＭコード領域と、少なくとも約７５％のヌクレオチド配列類似性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％のヌクレオチド配列類似性を共有する。
【００５７】
これらの基準に合致する単離されたおよび／または組換え核酸としては、天然に存在する霊長類ＭＡｄＣＡＭの配列若しくはその天然に存在する配列の変異体と同一の配列を持つ核酸が挙げられる。そのような変異体としては、１以上の残基の付加、欠失または置換によって相違する突然変異体、１以上の残基が修飾されている修飾核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡアナログなど）および１以上の修飾残基を含む突然変異体などが挙げられる。
【００５８】
本発明の核酸は、前記の選択した核酸にハイブリダイズするものを含めて、例えば高ストリンジェント条件または中ストリンジェント条件下で、検出または単離できる。核酸ハイブリダイゼーションに関する「高ストリンジェント条件」と「中ストリンジェント条件」は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編，第１巻，増補２６，１９９１）の２．１０．１−２．１０．１６頁（特に２．１０．８−１１を参照）と６．３．１−６頁に説明され、その教示は参照により本明細書に取り込まれる。プローブ長、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のミスマッチ率、温度およびイオン強度などの因子が、核酸ハイブリッドの安定性に影響を与える。したがって高または中ストリンジェント条件は、一部には、既知の核酸（例えばＤＮＡ）の特徴と、その既知核酸に対するハイブリダイゼーションを評価しようとする他の核酸の特徴に応じて、実験的に決定できる。
【００５９】
（ａ）霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする核酸（例えば図１（配列番号１）、図２（配列番号３）及び図３（配列番号５）に記載の核酸）、（ｂ）そのような核酸の相補鎖、若しくは（ｃ）その一部に、（例えば高または中ストリンジェント条件下で）ハイブリダイゼーションできることを特徴とする単離されたおよび／または組換え核酸は、さらに、（本明細書に規定する）霊長類ＭＡｄＣＡＭの特性、活性または機能的特徴、例えば結合機能（例えば、α４β７インテグリンを結合する能力）及び／又は細胞接着分子機能（例えば、α４β７依存性接着などの細胞接着を、試験管内及び／又は生体内で媒介する能力）及び／又は本明細書に規定する免疫学的特性などの少なくとも１つを持つ蛋白質またはポリペプチドをコードしてもよい。好ましい核酸は、少なくとも約４０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチドの長さを持つ。
【００６０】
本発明の核酸によってコードされる霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその変異体の結合機能は、リガンド結合に関する標準的なアッセイ（例えば、単離された及び／又は組換えＭＡｄＣＡＭとα４β７インテグリンの間の複合体の形成をモニターするアッセイ）または標準的な接着アッセイ（例えば、組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭを発現する第1細胞と、α４β７インテグリンを保持する第２細胞の間の接着をモニターするアッセイ）または他の適当な方法で検出できる。結合及び／又は接着アッセイ若しくは他の適当な方法を、本発明のポリペプチドをコードする核酸の同定及び／又は単離操作に使用することもできる（例えば実施例１を参照）。本発明の核酸がコードする蛋白質またはポリペプチドの抗原特性は、霊長類ＭＡｄＣＡＭに結合する抗体を用いる免疫学的方法（例えば免疫ブロッティング、免疫沈降法及びイムノアッセイ（放射線イムノアッセイやＥＬＩＳＡなど））によって決定できる。
【００６１】
本発明の核酸は、蛋白質またはポリペプチドの生産に使用できる。例えば、前記のように霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする核酸（例えばＤＮＡ）を、さらなる配列操作若しくはコードされているポリペプチドの適当な宿主細胞における生産のために作成される、種々の構築物およびベクターに組込むことができる。
【００６２】
本発明のさらなる態様は、センス鎖を含む標的分子に全部または一部が相補的で、その標的分子とハイブリダイゼーションできるアンチセンス核酸である。標的はＤＮＡであってもよいし、そのＲＮＡ体（すなわちＤＮＡのＴ残基がＲＮＡ体ではＵ残基である）であってもよい。細胞に導入されると、アンチセンス核酸は、そのセンス鎖がコードする遺伝子の発現を阻害できる。アンチセンス核酸は標準的な技術で生産できる。
【００６３】
ある態様として、このアンチセンス核酸は、ある標的核酸に対して完全にまたは部分的に相補的で、該標的核酸とハイブリダイズすることができ、該標的核酸は、図１（配列番号２）、図２（配列番号３）または図３（配列番号５）に示す上段の鎖の相補鎖の配列を持つ核酸にハイブリダイゼーションできる。例えば、アンチセンス核酸は、図１（配列番号１）、図２（配列番号３）または図３（配列番号５）の読み取り枠の上段の鎖に示す配列を持つ標的核酸若しくはハイブリダイズするに足るその一部に、相補的であってもよい。もう１つの態様として、アンチセンス核酸は、哺乳類ＭＡｄＣＡＭをコードする標的核酸に対して完全にまたは部分的に相補的で、その標的核酸とハイブリダイズできる。
【００６４】
また、本発明の核酸は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（または他の症状）と、冒された組織における霊長類ＭＡｄＣＡＭ発現の増大との間の関係を評価するための（例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおける）プローブとしても使用できる。また本発明の核酸は、例えば霊長類から得た試料（炎症を起こした組織など）中の多形または対立遺伝子変異体を（ＲＮＡまたはＤＮＡとのハイブリダイゼーションなどによって）検出及び／又は単離するためのプローブとしても使用できる。さらに、１以上の冒された霊長類から得た試料中の特定の変異体の存在または出現頻度を、正常な霊長類由来の試料と比較すれば、それは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（または他の症状）と特定の変異体との間に存在する関係の指標となり、ひいてはそれを、その症状の診断に使用することができる。
【００６５】
実施例に記述するように、アカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡクローン体を発現クローニングによって単離し、そのｃＤＮＡをプローブとして、ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ヒトＭＡｄＣＡＭ−１をコードする２種類の核酸が単離され、それらを特徴づけた。さらなるヒト、アカゲザルまたは他の霊長類遺伝子もしくはｃＤＮＡを得ることもできる。例えば、本明細書に記載の遺伝子やその十分な一部は、それが単離された及び／又は組換え体あるいは合成物であるかどうかにかかわらず、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその変異体をコードするさらなる核酸を、適当な供給源（例えば霊長類のゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリー）から、本明細書に記載の方法または他の適当な方法に従って（例えばハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、発現クローニング若しくは他の適当な技術によって）検出及び／又は回収するための、プローブまたはプライマーとして使用できる。
【００６６】
一態様として、霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする核酸は、ＰＣＲ増幅のような方法で生産できる。例えば、本明細書に記載の霊長類ＭＡｄＣＡＭ  ｃＤＮＡの一部に相補的もしくは実質上相補的な配列を含む適当なプライマー（例えば一対のプライマーや、ネステッド（入れ子型）プライマー）を設計することができる。例えば、コード配列の５’−または３’−末端及び／又はコード配列に隣接する５’−または３’−末端に相補的なプライマーを設計できる。このようなプライマーを、適当な鋳型核酸と共にポリメラーゼ連鎖反応に使用することにより、例えば霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする核酸を得ることができる。好適な鋳型としては、例えば本明細書に記述する構築物（ｐｃＤ３ＰＭＡｄ、ｐｃＤ３ＨｕＭＡｄ−４またはｐｃＤ３ＨｕＭＡｄ−２０など）、ｃＤＮＡライブラリー、霊長類（例えばヒト）ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの他の適当な供給源が挙げられる。プライマーは、鋳型として選択した構築物の隣接配列に相補的な部分を、適宜、含有してもよい。
【００６７】
さらなる遺伝子またはｃＤＮＡは、本明細書に記載の用途に対応する用途を持つ霊長類ＭＡｄＣＡＭの発現に使用でき、また、本明細書に記載の方法を用いて構築物、宿主細胞及び抗体を生産する際にも使用できる。本明細書に記載の方法には、アカゲザル及びヒトＭＡｄＣＡＭ−１を単離し、操作するための方法、ベクター及び宿主株を構築するための方法、蛋白質を生産及び使用するための方法、抗体を生産するための方法などがあり（ただしこれらに限られない）、これらは他の霊長類にも適用できる。
【００６８】
治療法と組成物
本発明は、（１）「霊長類ＭＡｄＣＡＭ」を試験管内及び／又は生体内で結合でき、およびかつ／または、（２）「霊長類ＭＡｄＣＡＭ」の活性または機能的特徴、例えば結合機能（例えば、α４β７インテグリンを結合する能力）及び／又は細胞接着分子機能（例えば、α４β７依存性接着などの細胞接着を、試験管内及び／又は生体内で媒介する能力）を阻害できる、抗体をも提供する。そのような抗体としては、ｃＤＮＡクローン体４、c ＤＮＡクローン体２０またはｃＤＮＡクローン体３１ＤによってコードされるヒトまたはアカゲザルＭＡｄＣＡＭを結合できる抗体などが挙げられる。また、天然に存在する若しくは内在性の霊長類ＭＡｄＣＡＭ（例えばヒトＭＡｄＣＡＭ）を結合できる抗体も包含される。抗体は、試験管内及び／又は生体内で霊長類ＭＡｄＣＡＭを選択的に結合できる（例：（例えば免疫組織学的に評価したときに）粘膜組織及び／又は脾臓で発現される霊長類ＭＡｄＣＡＭに選択的に結合する）ことが好ましい。
【００６９】
一態様として、本発明の抗体は、霊長類ＭＡｄＣＡＭを結合し、かつ、（例えばヒトの）α４β７インテグリンに対する「霊長類ＭＡｄＣＡＭ」の結合を阻害することによって、ＭＡｄＣＡＭが媒介する細胞接着を（好ましくは選択的に）阻害できる。このような抗体は、試験管内及び／又は生体内で、α４β７インテグリンを保持する細胞、例えば白血球（特にＴ細胞やＢ細胞のようなリンパ球）に対するα４β７依存性接着を、阻害できる。例えば、ＭＡｄＣＡＭ-1に対するＲＰＭＩ８８６６細胞の接着を特異的に阻害する抗体を産出する１１種類のハイブリドーマが同定された（実施例２，１０Ｇ４、８Ｃ１、１０Ｇ３、９Ｇ１２、９Ｅ４、７Ｈ１２、１０Ｆ２、１０Ａ６、１Ｅ５、２Ｆ５、７Ｇ１１と命名したハイブリドーマ）。したがって、α４β７インテグリンを保持する細胞の、粘膜組織（腸−関連組織またはリンパ器官を含む）内の血管内皮細胞に対する細胞接着を阻害できる抗体は、本発明の抗体に包含される。
【００７０】
該抗体は、霊長類ＭＡｄＣＡＭを高い親和性（例えば、Ｋａが約１〜１０ｎＭもしくはＫｄが約１×１０-8〜１×１０-10 ｍｏｌ-1）で結合できることが好ましい。
【００７１】
本発明の抗体は、加工、研究、診断及び治療などを含む様々な用途に有用である。例えば、これらを使用して、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその変異体を（例えばアフィニティー精製や他の適当な方法によって）単離されたおよび／または精製したり、ＭＡｄＣＡＭの構造（例えばコンフォメーション）と機能を研究することができる。
【００７２】
本発明の抗体は、（例えば試験管内での）診断的用途や治療的応用において、ＭＡｄＣＡＭ機能を調節するためにも使用できる。例えば、抗体は、阻害因子として作用して、本明細書に記述するように、霊長類ＭＡｄＣＡＭの結合機能及び／又は細胞接着分子機能を阻害（軽減または防止）することができる。
【００７３】
さらに、本発明の抗体を用いて、試料（例えば組織または体液（炎症性滲出物、血液、血清、腸液など）または本発明の核酸でトランスフェクションされた細胞）中の霊長類ＭＡｄＣＡＭを検出し、かつ／または、そのレベルを測定することができる。例えば、試料（組織及び／又は体液など）を霊長類から得て、適当な免疫学的方法を用いて、霊長類ＭＡｄＣＡＭレベルを検出及び／又は測定することができる。その免疫学的方法としては、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、放射線免疫アッセイ及び免疫組織学などが挙げられる。一態様として、試料中の選択した霊長類ＭＡｄＣＡＭを検出する方法であって、単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭを結合する抗体を、選択した霊長類ＭＡｄＣＡＭに対する該抗体の特異的結合に適した条件下で、試料と接触させ、形成される抗体−ＭＡｄＣＡＭ複合体を検出することを含む方法を提供する。
【００７４】
該方法の応用として、ある霊長類ＭＡｄＣＡＭ−１と反応する抗体を用いて、ヒト及び非ヒト霊長類中の正常組織と炎症組織とを、霊長類ＭＡｄＣＡＭの反応性及び／又は発現について、（例えば免疫組織学的に）対比、分析することができる。したがって、本発明の抗体は、正常組織と炎症組織における霊長類（例えばヒトＭＡｄＣＡＭ−１）の発現を対比、評価する免疫学的方法を与え、それによって、疾患の存在、疾患の進行及び／又は抗霊長類ＭＡｄＣＡＭ−１療法の炎症性疾患における効力を評価できる。
【００７５】
また本発明は、本明細書に定義する「霊長類ＭＡｄＣＡＭ」（機能的な変異体、例えば可溶型霊長類ＭＡｄＣＡＭ（例えば、分泌された蛋白質のように膜貫通領域と細胞質テイルの全部または一部を欠くもの）及び機能的な融合蛋白質（例えば、霊長類ＭＡｄＣＡＭ部分のC末端と免疫グロブリン部分のN末端とが融合してなるハイブリッド免疫グロブリン）などを含む）をも提供する。これらの分子は、加工、研究、診断および治療など、種々の応用に有用である。
【００７６】
例えば、霊長類ＭＡｄＣＡＭ、ＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇ融合蛋白質または他の組換え可溶型霊長類ＭＡｄＣＡＭ分子は、霊長類ＭＡｄＣＡＭ：α４β７相互作用のリガンドまたは阻害因子（例えば遮断性抗体）を同定するためのアッセイに使用できる。本明細書において阻害因子とは、リガンド（α４β７インテグリンを含む）に対する霊長類ＭＡｄＣＡＭ−１の結合を阻害（軽減または防止）し、および／または、該リガンドによって媒介される細胞応答の誘引を阻害する化合物をいう。有効量とは、霊長類ＭＡｄＣＡＭ−１に対する結合または接着の阻害及び／又はシグナリングの阻害を達成するに足る量（例えば、霊長類ＭＡｄＣＡＭ−１リガンド（α４β７インテグリン（ヒトα４β７インテグリンとその霊長類相同体など）を含む）を保持する細胞の、単離された及び／又は組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭに対する接着を阻害するに足る量）をいう。
【００７７】
一側面として、霊長類ＭＡｄＣＡＭのリガンドまたは霊長類ＭＡｄＣＡＭを結合する薬物を検出または同定する方法であって、試験すべき１以上の薬物（またはリガンド候補）を、本明細書に定義する単離された及び／又は組換え「霊長類ＭＡｄＣＡＭ」（「機能的変異体」を含む）と、該ＭＡｄＣＡＭに対するリガンドの結合に適した条件下に接触させ、該薬物と霊長類ＭＡｄＣＡＭとの間の複合体の形成を検出することを含む方法を提供する。一態様として、試験すべき薬物を、組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその機能的変異体を発現する宿主細胞と、該ＭＡｄＣＡＭまたはその機能的変異体に対するリガンドの結合に適した条件下に混合する。また一態様として、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその機能的変異体を適当なラベル（例えば蛍光ラベル、同位体ラベル）で標識し、そのラベルの検出によって結合を決定する。結合の特異性は、例えば標識していない薬物、標識していない単離された及び／又は組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその機能的変異体、若しくは霊長類ＭＡｄＣＡＭの第２リガンドなどを競争因子として用いる競争または置換によって評価できる。
【００７８】
もう１つの側面として、霊長類ＭＡｄＣＡＭによって媒介される細胞接着の阻害因子を検出する方法も提供する。一態様として、試験すべき薬物を、霊長類ＭＡｄＣＡＭのリガンド並びに単離された及び／又は組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその機能的変異体（例えば融合蛋白質）と、リガンドと該ＭＡｄＣＡＭまたはその機能的変異体との結合に適した条件下に混合する。リガンドと霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその機能的変異体との間の複合体の形成をモニターする。適当な対照（例えば薬物の不在下における結合）と比べて薬物の存在下にリガンドの結合が減少したら、それはその薬物が阻害因子であるという指標になる。例えば、実施例３に記載のアッセイと融合蛋白質を使用して、阻害剤を検出することができる。試験すべき薬物を、組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭを発現する第１細胞及びα４β７インテグリンを保持する第2の細胞と、該第２細胞に対する該第１細胞の接着に適した条件下に、混合することができる。該第１細胞と該第２細胞との接着をモニターし、適当な対照と比べて接着が減少（軽減または完全に破壊）したら、それはその薬物が阻害因子であるという指標になる。ＭＡｄＣＡＭ-1のリガンドを自然に発現する細胞または細胞群（例えば白血球（α４β７＋ Bリンパ球、Ｔリンパ球など））若しくはＭＡｄＣＡＭ−１のリガンドを発現する他の細胞（例えば組換え細胞）を使用できる。
【００７９】
実施例3に記述するようなアッセイを用いると、結合を阻害する化合物を試験管内で同定できる。本明細書に示すように、霊長類ＭＡｄＣＡＭ部分を持つ融合蛋白質（2つのキメラＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇ融合物）は、溶液中で、α４β７陽性リンパ球に結合することができる。したがって、霊長類ＭＡｄＣＡＭ（機能的変異体を含む）、特に可溶型霊長類ＭＡｄＣＡＭ分子及び融合蛋白質（実施例3に記載のキメラＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇ融合物など）は、α４β７：ＭＡｄＣＡＭ相互作用の阻害因子候補及び生体内における炎症部位に対するリンパ球補充の阻害因子候補となり、それは後述するように、治療において有効でありうる。これらの分子の生体内効力は、本明細書に記述する方法（例えば実施例４及び５を参照）または他の適当な方法を用いて評価できる。例えば、実施例５に記載のような霊長類モデルを使用できる。ＣＤ４５ＲＢHi／ＳＣＩＤモデルは、クローン病及び潰瘍性大腸炎の両方と類似性を持つマウスモデルとなる（実施例４、Ｐｏｗｒｉｅ，Ｆ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１：５５３−５６２（１９９４））。このモデルにおける効力は、モノクローナル抗体に用いた実験手順と同様の手順で評価できる（実施例４）。投与（例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）及び経口（ｐ．ｏ．））後の、111 Ｉｎ−標識細胞の結腸に対する補充の阻害や、大腸基底膜中のＣＤ＋Ｔリンパ球数の減少などといったパラメーターを評価できる。ヒトの炎症性腸疾患と類似する腸障害を発生させるノックアウトマウスも既に記述されており（Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｗ．及びＥｈｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｏ．，Ｃｅｌｌ，７５：２０３−２０５（１９９３））、またＮＯＤマウスは、インスリン依存性真性糖尿病の動物モデルとなる。
【００８０】
さらに本発明は、α４β７インテグリンに対するＭＡｄＣＡＭ結合及び／又はα４β７が媒介する細胞応答の誘発を阻害することによって、胃腸路または他の粘膜組織に対する白血球補充に関連する疾患（例えばＩＢＤ）を治療できるという発見に関する。結合を阻害する化合物または薬物としては、本明細書に定義する「霊長類ＭＡｄＣＡＭ」（可溶型霊長類ＭＡｄＣＡＭ分子及び融合蛋白質を含む）や、ＭＡｄＣＡＭ及び／又はα４β７インテグリンを結合する抗体またはその抗原結合性断片を挙げることができる。この方法に使用できる抗体としては、組換え型または非組換え型のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒトに適合させたおよび／または抗イディオタイプ抗体が挙げられる。
【００８１】
ＭＡｄＣＡＭまたはα４β７を結合するモノクローナル抗体は既に記述されている。例えば、ＭＥＣＡ−３６７はＩｇＧ２ａサブタイプの抗ＭＡｄＣＡＭ抗体であり、Ｇａｌｌａｔｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３０４：３０（１９８３）及びＭｉｃｈｉｅら, Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４３：１６８８−１６９８（１９９３）に記述されている。ACT-1は、α４β７インテグリンを結合するモノクローナル抗体である（Lazarovitsら, J. Immunol, 133:1857（1984）；
Schweighofferら, J. Immunol., 151:717-729（1993））。FIB21はβ7鎖を結合し、Berlinら, Cell, 74:184-195（1993）やAndrew, D.P.ら, J. Immunol., 153:3847-3861（1994）に記述、特徴づけがなされている。
【００８２】
他のポリクローナルまたはモノクローナル抗体、例えば前記の抗体と同じまたは類似のエピトープに結合する抗体などは、本明細書に記載の方法、当該技術分野で公知の方法、または他の適当な方法（例えばKohlerら, Nature, 
256:495-497（1975）、Harlowら, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual,（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）またはCurrent Protocols in Molecular Biology,第2巻（増補27,1994年夏）, Ausubelら編（John Wiley & Sons:ニューヨーク州ニューヨーク）,第11章（1991））に従って作成できる。また、α4β7インテグリン（好ましくはヒトα4β7インテグリン）を保持する細胞に対する結合に関して、10G4、8C1、10G3、9G12、9E4、7H12、10F2、10A6、1E5、2F5または7F11と命名されたハイブリドーマ細胞株によって生産される抗体のいずれか1つと、競争できる抗体を作成することもできる。
【００８３】
例えば、適当な哺乳類（マウス、ラット、ウサギ、ヒツジなど）中で適当な免疫原に対して抗体を生じさせることができる。免疫原としては、例えば、ＭＡｄＣＡＭ、α4β7、またはそれらの免疫原性断片を挙げることができる。例えば、ある霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその変異体を生産し、それを免疫原として、適当な免疫化法で抗体を生じさせることができる。
【００８４】
抗体産生細胞（リンパ球など）は、例えば感作動物のリンパ小節または脾臓から単離できる。次に、これらの細胞を適当な不死化細胞（例えば骨髄腫細胞株）と融合することによって、ハイブリドーマを形成させる。融合細胞は、選択培養技術を使用して単離できる。所望の特異性を持つ抗体を産生する細胞は、適当なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）によって選択できる（例えば実施例２を参照）。
【００８５】
一態様として、免疫原を、例えばＭＡｄＣＡＭ、α４β７またはそれらの免疫原性断片を結合する抗体としてもよい。これによって生じた抗体は抗イディオタイプ抗体であることができ、これもまた本発明で使用できる（米国特許第４，６９９，８８０号）。
【００８６】
単鎖抗体、キメラ、ヒトに適合させたまたは霊長類に適応させた（例えばＥＰ０，５９２，４０６；Ｐａｄｌａｎら，１９９４年４月１３日などに従ってＣＤＲ移植または再表面処理した）抗体ならびに異なる種に由来する部分を含むキメラまたはＣＤＲ移植単鎖抗体が、本発明で使用できる。これらの抗体の様々な部分は、従来の技術を用いて、互いに化学的に結合するか、若しくは遺伝子操作技術を用いて、一つの連続的蛋白質として調製することができる。例えば、キメラまたはヒトに適合させた鎖をコードする核酸を発現させることによって、連続的蛋白質を製造することができる。例えばＣａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙら，欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号、Ｂｏｓｓら，米国特許第４，８１６，３９７号、Ｂｏｓｓら，欧州特許第０，１２０，６９４Ｂ１号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら，国際特許第８６／０１５３３号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら，欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号、Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号およびＷｉｎｔｅｒ，欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１号を参照のこと。また、霊長類に適応させた抗体については、Ｎｅｗｍａｎ，Ｒ．ら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５−１４６０（１９９２）を、単鎖抗体についてはＬａｎｄｅｒら，米国特許第４，９４６，７７８号とＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８）をも参照のこと。
【００８７】
さらに、抗体の機能的断片（キメラ、ヒトに適合させた、霊長類に適応させたまたは単鎖抗体の断片を含む）も製造できる。前記の抗体の機能的断片は、それらが由来する完全長抗体の結合機能の少なくとも１つを保持し、好ましくは、相互作用を阻害する能力を保持する。例えば、α４β７インテグリン、ＭＡｄＣＡＭまたはそれらの一部に結合できる抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2 断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような断片は、酵素的切断や組換え技術によって生産できる。例えば、パパインまたはペプシン切断によって、それぞれＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2 断片を生成させることができる。別法として、天然の停止部位の上流に１以上の停止コドンが導入されている抗体遺伝子を用いて、種々の先端欠失型抗体を生産することもできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）2 重鎖部分をコードするキメラ遺伝子を、重鎖のヒンジ領域とＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列を含むように設計することができる。
【００８８】
本願に係る方法に使用できる抗体及びその抗原結合性断片としては、ＭＡｄＣＡＭ及び／又はα４β７に結合する抗体、例えば抗β７鎖抗体などが挙げられる。例えば、ＦＩＢ２１、ＦＩＢ３０、ＦＩＢ５０４及びＡＣＴ−１ならびにそれらの混合物からなる群より選ばれる抗体を、投与することができる。別法として、もしくはそれに加えて、これらの抗体の抗原断片を投与することもできる。
【００８９】
ＭＡｄＣＡＭとα４β７インテグリンの結合を阻害する化合物または薬物は、ＭＡｄＣＡＭ−１分子を発現する組織の白血球（リンパ球、単球など）浸潤（組織における白血球の補充及び／又は蓄積を含む）に関係する疾患の治療において、本願に係る方法に従って投与することができる。そのような疾患を治療するには、（１以上の）化合物または薬物の有効量を個体（例えば哺乳類（ヒトや他の霊長類など））に投与する。例えば、炎症性疾患（胃腸路（腸−関連内皮を含む）、他の粘膜組織、若しくはＭＡｄＣＡＭ−１分子を発現する組織（例えば、小腸大腸の基底膜の細静脈のような腸−関連組織、乳腺（泌乳性乳腺など））の白血球浸潤に関連する疾患を含む）を、本願方法に従って治療できる。さらに、ＭＡｄＣＡＭ−１分子を発現する細胞（例えば内皮細胞）に対する白血球結合の結果として起こる、組織の白血球浸潤に関連する疾患を持つ個体を、本発明に従って治療できる。
【００９０】
特に好ましい態様では、そのように治療できる疾患として、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えば潰瘍性大腸炎、クローン病、回腸炎、腹腔疾患、非熱帯性スプルー、セロネガティブ関節症に関連する腸疾患、微細またはコラーゲン性大腸炎、好酸球性胃腸炎、若しくは直腸結腸切除術や回腸肛門吻合術後に起こる窩炎（ｐｏｕｃｈｉｔｉｓ）などが挙げられる。
【００９１】
膵炎とインシュリン依存性真性糖尿病は、本発明の方法を用いて治療できるその他の病気である。ＭＡｄＣＡＭ−１は、ＮＯＤ（非肥満糖尿病）マウス、ならびにＢＡＬＢ／ｃマウス及びＳＪＬマウスの外分泌腺・膵臓中のいくつかの血管によって発現されると報告されている。ＭＡｄＣＡＭ−１の発現は、ＮＯＤマウスの膵臓の炎症を起こした島の内皮上で誘導されると報告されており、またＭＡｄＣＡＭ−１は、インスリン炎の初期段階にＮＯＤ島内皮によって発現される主要アドレシンであった（Ｈａｎｎｉｎｅｎ，Ａ．ら, Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９２：２５０９−２５１５（１９９３））。さらに、島内にはα４β７を発現するリンパ球の蓄積が認められ、ＭＡｄＣＡＭ−１は、炎症を起こした島の血管に対する（α４β７による）リンパ球細胞の結合と関係した（Ｈａｎｎｉｎｅｎ，Ａ．ら, Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２５０９−２５１５（１９９３））。
【００９２】
本発明方法に従って治療できる粘膜組織関連炎症性疾患の例としては、乳腺炎（乳腺）、胆嚢炎、胆管炎または胆管周辺炎（胆管と肝臓周辺の組織）、慢性気管支炎、慢性副鼻腔炎、喘息及び（例えば胃腸路における）対宿主性移植片病などが挙げられる。クローン病に見られるように、炎症はしばしば粘膜表面を超えて広がるので、間質性繊維症をもたらす胚の慢性炎症性疾患、例えば過敏性肺炎、コラーゲン病、類肉腫症及び他の突発性疾患なども治療できる。
【００９３】
化合物は、α４β７インテグリンに対するＭＡｄＣＡＭの結合を阻害する有効量で投与される。治療の場合、有効量とは、所望の治療及び／又は予防効果を達成するに足る量（例えば、ＭＡｄＣＭＡが媒介する結合及び／又はシグナリングを軽減または予防することによって、白血球の接着と浸潤及び／又は関連する細胞応答を阻害するに足る量）になるだろう。化合物は、１回量で投与してもよいし、多数回量で投与してもよい。用量は、当該技術分野で知られる方法によって決定でき、例えば患者の年齢、感受性、耐性及び総合的健康状態などに依存する。抗体の好適な用量としては、１処置あたり０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇ−体重が考えられる。
【００９４】
化合物または薬物は、本発明に従って、単独で、若しくはもう1つの薬物と組み合わせて、個体（例えばヒト）に投与できる。化合物または薬物は、その追加薬物投与の前、追加薬物投与と同時または追加薬物投与後に投与できる。一態様として、内皮ＭＡｄＣＡＭに対する白血球の結合を阻害する１以上のモノクローナル抗体を投与する。あるいは、内皮リガンドに対する白血球の結合を阻害するモノクローナル抗体を、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体または抗β７抗体に加えて投与する。例えば、ＭＡｄＣＡＭ以外の内皮リガンドに対する白血球の結合を阻害する抗体（例えば抗ＩＣＡＮ−１抗体や抗ＶＣＡＭ−１抗体など）を投与することもできる。もう１つの態様として、追加の薬学的に活性な成分（例えばスルファサラジン、抗炎症性化合物、ステロイド系抗炎症性化合物または他の非ステロイド系抗炎症性化合物）を、前記化合物または薬物（例えば本発明の抗体）と組み合わせて投与してもよい。
【００９５】
様々な投与経路が可能であり、治療すべき状態または疾患に応じて、腸管外投与法（静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下注射など）、経口投与法（食餌法など）、局所投与法、吸入投与法（気管支内吸入、鼻孔内吸入または経口吸入、鼻孔内滴剤など）、直腸投与法などが挙げられるが、必ずしもこれらに限られるわけではない。腸管外投与が好ましい投与法である。
【００９６】
投与すべき化合物の製剤は、選択した投与経路に応じて変化するだろう（例えば液剤、乳剤、カプセル剤など）。投与すべき化合物を含む適当な組成物を、生理学的に許容される担体または賦形剤中に調製することができる。液剤や乳剤の場合は、適当な担体として、例えば食塩水や緩衝培地などの水溶液、アルコール／水溶液、乳液、懸濁液などが挙げられる。腸管外用の賦形剤としては、食塩溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲルまたは脂肪油などを挙げることができる。静脈内用の賦形剤としては、種々の添加物、保存剤、液体、栄養または電解物質補充剤などを挙げることができる（一般的にはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第16版，Ｍａｃｋ編，１９８０を参照のこと）。吸入法の場合は、化合物を可溶化し、適当な投与用ディスペンサー（アトマイザー、ネブライザーまたは加圧エアゾールディスペンサーなど）に入れることができる。
【実施例】
【００９７】
実施例
以下、実施例によって本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
【００９８】
概論
ネズミＭＡｄＣＡＭ  ＤＮＡプローブとズー  ブロットとを用いる低ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーション解析によって、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１とそれより高等な種との間には、ヌクレオチド保存があまりないことが示された。霊長類及びヒトホモログのクローン化には機能発現法を使用し、それによって、ＭＡｄＣＡＭ−１リガンド（α４β７）を高レベルに発現する標的リンパ球細胞株への接着能を付与するc ＤＮＡを形質導入した細胞を同定し、そのｃＤＮＡを回収した。ヒト組織供給源は少なかったので、まず、ＭＡｄＣＡＭ−１の霊長類相同体を同定した。
【００９９】
発現クローニングのために、アカゲザルの腸間膜リンパ小節由来の霊長類ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、真核発現ベクターｐＲＳＶｓｐｏｒｔ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ製）中に作成した。ＣＨＯ／Ｐ細胞株を用いる高効率形質導入株（Ｈｅｆｆｅｒｎａｎ，Ｍ．及びＪ．Ｄ．Ｄｅｎｎｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：８５−９２（１９９１））を使用した。ライブラリーを分離し、個々のプール（約１，５００クローン体に相当）を２４ウェル組織培養プレートのウェル内で形質導入した。細胞接着アッセイを行なって、ＭＡｄＣＡＭ−１の既知のリガンドであるα４β７インテグリンを発現するT及びB細胞株に対する接着表現型を付与するｃＤＮＡを同定した。接着は、形質導入された細胞に対するＴ及びＢ細胞株のロゼット形成によって、顕微鏡的に同定した。所望の表現型を付与するプールを、さらに細分化し続けることによって、単一の完全長ｃＤＮＡクローン体（クローン体３１Ｄと命名）を同定した。このｃＤＮＡのアミノ末端部分のＤＮＡ配列決定によって、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１（Ｂｒｉｓｋｉｎ，Ｍ．Ｊ．らＮａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．），３６３：４６１−４６４（１９９３））に対する該アカゲザルクローン体の相同性が、蛋白質レベルでも核酸レベルでも明らかになった。
【０１００】
一過性トランスフェクションによってＣＨＯ／Ｐ細胞に導入すると、クローン体３１Ｄから得たｃＤＮＡ挿入物は、α４β７を発現する２つの細胞株、すなわち（１）ＴＫ１，ネズミＴ細胞リンパ腫（Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５５６−５６１（１９８０））と（２）ＲＰＭＩ８８６６，ヒトＢ細胞リンパ腫（Ｅｒｌｅ, Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３：５１７−５２８（１９９４））に対する結合を媒介できる蛋白質の発現を指示した。アカゲザルｃＤＮＡを形質導入した細胞に対するＴＫ１細胞の結合は、α４（ＭＡｂ  ＰＳ／２）またはβ７（ＭＡｂ  ＦＩＢ５０４）インテグリンのいずれかに対する抗体によって遮断することができ、アカゲザルｃＤＮＡ（ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ中のクローン体３１Ｄ）を一過性トランスフェクションしたＣＨＯ／Ｐ細胞に対するＲＰＭＩ８８６６の結合は、抗α４β７ＭＡｂであるＡＣＴ−１によって遮断された。対照実験において、ヒトＶＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡは、ＲＰＭＩ８８６６ヒトＢ細胞株に結合できなかった。α４β１を発現するがα４β７を発現しないＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞は、ＶＣＡＭ−１を結合するが、アカゲザルｃＤＮＡを発現する形質導入体を結合できないことがわかった。
【０１０１】
ネズミＭＡｄＣＡＭ−１の霊長類（アカゲザル）ホモログをコードするｃＤＮＡをプローブとして、ハイブリダイゼーション法によって、ヒトホモログをコードするクローン体を得た。ヒトＭＡｄＣＡＭ−１クローン体を得るために、２つのｃＤＮＡライブラリー（１つは組織学的に正常なヒト腸間膜リンパ小節（ＭＬＮ）に由来し、もう１つはクローン病患者から得た炎症を起こしたＭＬＮリンパ小節に由来する）を、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ製のλＺｉｐｌｏｘファージベクター中に構築した。上記アカゲザルクローン体から得たｃＤＮＡを用いて、これらのライブラリーをスクリーニングした。よく似たサイズを持つ２種類のヒトｃＤＮＡが単離された。予備的な配列分析によると、これらのクローン体は、それぞれ完全長であるようだった。ヒト及びアカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１  ｃＤＮＡの分析は、コードされている蛋白質のそれぞれが、疎水性リーダーと推定される配列（図１〜３の下線部）と、それぞれ推定成熟ヒトまたはアカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１に相当する蛋白質からなる残余部分とを持つことを示す。
【０１０２】
機能を評価するために、ヒトｃＤＮＡ挿入物をｐＣＤＮＡ３発現ベクター（インビトロジェン）中にサブクローニングし、一過性発現アッセイを用いて機能を立証した。ヒトｃＤＮＡは機能的蛋白質として発現させることができ、α４β７を発現する細胞に対する特異的な結合を媒介できる。したがって、これら2つのヒトｃＤＮＡクローン体をヒトＭＡｄＣＡＭ−１  ｃＤＮＡと呼ぶ。
【０１０３】
霊長類ｃＤＮＡとヒトｃＤＮＡ両方の安定な形質導入体を、マウスプレＢ細胞株Ｌ１−２及びＣＨＯ細胞中に作成した。Ｌ１−２形質導入体を用いてマウスを免疫化し、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体を作成した。ＭＡｄＣＡＭ−１とα４β７の間の相互作用を阻害できる抗体を同定した。ヒトＭＡｄＣＡＭ−１に対する遮断性抗体の生産は、意義深い進歩である。なぜなら、ヒトホモログとの交差反応性を持つこのような遮断性抗体をネズミＭＡｄＣＡＭ−１を用いて生産しようとした過去の試みは失敗に終わっているからである。
【０１０４】
実施例１  アカゲザルとヒトＭＡｄＣＡＭ−１のｃＤＮＡのクローニング
ＲＮＡの単離とメッセージの選抜
全ＲＮＡは、（ａ）霊長類（アカゲザル）腸間膜リンパ小節（ＭＬＮ）；  
（ｂ）組織学的に正常なヒト腸間膜リンパ小節；  （ｃ）クローン病の患者由来のヒト腸間膜リンパ小節（回腸小節）；  および（ｄ）組織培養細胞からＣｓＴＦＡTM（トリフルオロ酢酸セシウム）試薬（ファルマシア；Ｃａｔ．＃１７−０８７−０２）の使用により単離された。腸間膜リンパ小節由来の全ＲＮＡは、アカゲザルの２種（マカク  ファサイキュラリス、およびマカク  ムラッタ）から得られ、ポリ−Ａ  ＲＮＡの単離前に併合した。組織培養細胞（１−５×１０8 ）はリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で一度洗浄し、ピペッティングにより均質化すると同時に、組織は、最初に、液体窒素中で瞬間冷凍し、５．５Ｍ  イソチオシアン酸グアニジン、２５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、０．５％  ラウレルサルコシンナトリウム、および０．２Ｍ  ２−メルカプトエタノールを含有する溶液中でダウンスホモジナイゼーションに付された。不純物を除去した分離物は、ＣｓＴＦＡの緩衝物上に重層するとともに、全ＲＮＡを２０時間、３０，０００ＲＰＭの遠心分離によりペレットにした。
【０１０５】
ｍＲＮＡはプロメガ社のｐｏｌｙＡＴｒａｃｔ  ｍＲＮＡ  アイソレーションシステムで選抜した。該システムは、ビオチン化したオリゴ（ｄＴ）プライマーを、真核生物のメッセージのポリＡ末端とハイブリダイズするために（溶液中で）使用する。ハイブリッドは、微磁気粒子および磁気分離スタンドと共役したストレプトアビジンを用いて、高いストリジェンシーで得、洗浄した。ｍＲＮＡは、このシステム中で一回の精製で選抜し、収率は、全ＲＮＡ収率の１−２％の範囲であった。全ＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方のインテグリティーはゲル電気泳動および臭化エチジウム染色により解析した。
【０１０６】
ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡは、スーパースクリプトTMラムダシステム（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔTM  ｌａｍｄａ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｃａｔ．＃１８２５６−０１６）を、ヒトライブラリーの場合は、λＺｉｐｌｏｘTMベクター（ギブコ／ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、ガイゼルスブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、ＭＤ、Ｃａｔ．＃１９６４３−０１４）と、または、アカゲザルライブラリーの場合は、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１ベクター（ギブコ／ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、Ｃａｔ．＃１５３８８−０１０）とのいずれかと共に使用することによって合成された。通常のプロトコールから下記の改良をした。ｃＤＮＡは第１鎖か第２鎖にのみ（しかし両方でない）をα32Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、量の推定は、等分量のｃＤＮＡフラクションの臭化エチジウム染色の検査により行った。
【０１０７】
ＤＮＡシークエンシング
アカゲザルおよびヒトＭＡｄＣＡＭ−１の完全なｃＤＮＡは、それぞれ、まず最初にライブラリーベクターｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１とｐＺＬ１（λＺｉｐｌｏｘTMから取り出した）から単離した。制限地図に基づき、ｃＤＮＡの内部領域からのシークエンシングを行いやすくするため、断片をブルースクリプト（Ｂｌｕｗｓｃｒｉｐｔ）  ベクター（ストラタジーン）にサブクローン化した。これらのクローン体のシークエンス解析の後、シークエンスを相補するようにオリゴヌクレオチドプライマーを作成した。両鎖のオーバーラップする配列を得た。シークエンス解析は、シーケナーゼ  バージョン２．０  Ｔ７  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（ユナイテッド  ステーツ  バイオケミカル）と35Ｓ−ｄＣＴＰ（アマシャム  ライフ  サイエンス  アンド  ニュー  イングランド  ニュークリアー）と共に、シーケナーゼTM  ７−デアザ−ｄＧＴＰ  ＤＮＡシークエンシングキットを利用した。Ｇ−Ｃリッチな配列には、デルタＴＡＱシークエンシングキット（ＵＳＢ）とガンマ32Ｐ−ＡＴＰ（アマシャム社製）Ｇ−Ｃリッチ  シークエンスを用いた。
【０１０８】
シークエンスは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅシステム（ＤＮＡＳＴＡＲ社）を用いて入力し解析した。ヌクレオチド配列のアラインメントは、ウェートされた残基のウェート表による、ギャップ  ペナルティー（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）  １０およびギャップ  レングス  ペナルティー（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）  １０、およびデフォルトパラメーター（ｄｅｆａｕｌｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）（アラインメントパラメーター（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）と対をなすものに関しては：ｋｔｕｐｌｅ＝２、ギャップ  ペナルティー（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝５、ウインドー（ｗｉｎｄｏｗ）＝４、およびダイアゴナルセーブド（ｄｉａｇｏｎａｌ  ｓａｖｅｄ）＝４である）を用いたクラスタルメソッドにより行った。
【０１０９】
アミノ酸配列アラインメントはＰＡＭ２５０残基重量表で、ギャップ  ペナルティー（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）１０およびギャップ  レングス  ペナルティー（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）１０、およびデフォルトパラメーター（ｄｅｆａｕｌｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）（アラインメントパラメーター（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）と対をなすものに関しては：ｋｔｕｐｌｅ＝１、ギャップ  ペナルティー（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝３、ウインドー（ｗｉｎｄｏｗ）＝４、およびダイアゴナルセーブド（ｄｉａｇｎａｌ  ｓａｖｅｄ）＝５である）を用いたクラスタルメソッドにより行った。
【０１１０】
アカゲザル発現ライブラリーの調製
サイズフラクション手順は、大きい挿入断片（＞１．５ｋｂ）を確保するアカゲザル発現ライブラリーの構築のために、またわずかに改良した。一巡の分画の後、一番目の（最も大きい）ｃＤＮＡの画分のみを取って置き、残りの画分は貯めておき次の一巡の分画にかけた。次の一巡の一番目の画分は、前の一巡の一番目の画分と共に貯めておき、この一巡の二番目の画分もまた使用した。これらの２つの画分を沈澱させ、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１ベクターとのライゲーションに加え、そしてそれぞれのライゲーションの画分は、ライブラリーのタイターおよび平均挿入断片サイズの両方を評価するために、エレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂバクテリア（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））に形質転換した。一番目の最も大きいｃＤＮＡフラクションのみのライゲーションの評価は、平均１．９ｋｂの挿入断片サイズおよび中間値が２ｋｂのサイズを持つ２４０万個の独立なクローン体を作ることの可能性を示した。
【０１１１】
実際のスクリーニングされたライブラリーは、１００枚の５０μｇ／ｍｌのアンピシリンのＬＢ寒天プレートに１，５００クローン体／プレートの密度でプレーティングし（１００個の１，５００クローン体／プールを生じさせる）、３７℃で一晩培養した１５０，０００の独立クローン体を含有した。個々のプールの精製のために、それぞれのプレートに約２ｍｌのルリア培地（ＬＢ）を重層し、各々のプレートのコロニーを標準組織培養細胞スクラッパーでこそぎ落とし、またバクテリアの懸濁物を微量遠心チューブに移した。精製の前に、各々のプールからグリセロールストックを作成した。プラスミドＤＮＡはＱＩＡｐｒｅｐスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の使用説明書に従って用いて精製した。
【０１１２】
形質導入
ＣＨＯ／Ｐ細胞（ヘッファナン、Ｍ．およびＪ．Ｄ．デニス、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．、１９：８５−９２（１９９１））を、形質導入に約２４時間先立って、４０，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに接種した。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥTM試薬（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）；Ｃａｔ．＃１８３２４−０１２）を用いて、推薦された、プロトコールに基本的に従って、２４ウェルプレートに以下のように最適化して、ＤＮＡを一過性に形質導入した：
２００ｎｇのＤＮＡ（プラスミドプールまたは精製された対照のＤＮＡを示す）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ１還元血清培地（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））で２０μｌに希釈し、１８μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ１と２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥTM試薬からなる２０μｌの混合物に希釈した。このリポソーム混合物は、さらに約３０分間、周囲の温度でインキュベートし、その後、２００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ１を添加し、完全な混合物を、さらにＣＨＯ／Ｐ細胞のウェルに重層し、インキュベーターに戻した。３７℃で２．５時間のインキュベートの後、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を有する２４０μｌのＭＥＭ−α（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））培地をと共に各々のウェルに添加し、細胞をさらに１８−２４時間、３７℃でインキュベートした。培地は、さらに１０％ＦＣＳを含む標準ＭＥＭ−αに変え、約２０−２４時間後、接着アッセイを行った。
【０１１３】
発現クローニングのための接着アッセイ
発現クローニングスクリーニングにおける接着アッセイのために、高レベルのα４β７を発現するネズミＴ細胞リンパ腫ＴＫ１（ブッチャー，Ｅ．Ｃ．等、ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１０：５５６−５６１（１９８０））を接着の表現型を授ける能力があるｃＤＮＡを導入したＣＨＯ／Ｐ細胞を検出する為に使用した。ＴＫ１細胞は２％ウシ胎児血清、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、２ｍＭ  Ｍｇ2+、および２ｍＭ  Ｃａ2+を補ったＨＢＳＳ（ハンクス  バランスド塩溶液、Ｃａ2+またはＭｇ2+は無し）からなる、アッセイ緩衝液中、２×１０6 ／ｍｌの密度で再懸濁された。ＤＮＡプールにより形質導入した各々のウェルは、ＶＣＡＭ−１（それは、初期リンパ小節中に高レベルで発現する）により仲介される接着、あるいは、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１発現プラスミドの潜在的な混入を除去するため、ヒトＶＣＡＭ−１（ＭＡＢ  ２Ｇ７；グラバー、Ｎ．Ｔ．、等．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４５：８１９−８３０（１９９０））およびネズミＭＡｄＣＡＭ−１（ＭＡｂ  ＭＥＣＡ−３６７；アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（ロックバイル、ＭＤ）、アクセッションＮｏ．ＨＢ９４７８；ストリーター、Ｐ．Ｒ．、等、ネーチャー、３３１：４１（１９８８））；ブッチャーのＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，４０３，９１９も参照せよ）の両方に対するモノクローナル抗体を含有する混ぜた上清０．２５ｍｌと共にプレインキュベートした。４℃で１５分間のインキュベーションの後、０．２５ｍｌのＴＫ１細胞懸濁物（５×１０5 ＴＫ１細胞）を、各々のウェルに添加し、振盪台上でのインキュベーションを、さらに３０分間、４℃で続けた。プレートを、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）の大きいビーカー中で、緩やかに反転することにより洗浄し、続いて、最低限１時間の固定のために、１．５％グルタルアルデヒドの入ったＰＢＳのビーカーで反転した。ウェルは、さらに顕微鏡的（１０×対物レンズ）にＴＫ１細胞のロゼッティングを調べた。
【０１１４】
アカゲザルクローン体の精製
１種以上のＴＫ１ロゼットを産生するプールをさらに以下のプロトコールで再分画した。：陽性プールを示すＤＮＡでＤＨ１０Ｂを再び形質転換し、９６枚の１００ｍｍペトリ皿に約２００コロニー／プレートの密度でプレーティングした。ニトロセルロース膜をレプリカプレートの作成に使用し、各々のプレートの１セットをさらに前記のＤＮＡ精製および続く接着アッセイに付した。陽性プールを示すレプリカプレートは、そしてさらに、レプリカプレートを行い、アンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養した５個のコロニーのプールにサブフラクションした。一巡以上のＤＮＡ精製と接着アッセイの後、個々のクローン体を、さらに培養することができ、ＴＫ１細胞の接着を授与するクローン体を同定した。
【０１１５】
ＭＡｄＣＡＭ−１をコードすることを示す完全長のクローン体を得、クローン体３１Ｄと称した。ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１（Ｐ２５）で構築した、クローン体３１Ｄは、５’−ＳａｌＩからＮｏｔＩ−３’ｃＤＮＡ挿入断片を含有する。クローン体３１Ｄを有するＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ株の形質転換体を得た。安定な細胞株における発現のため、本ｃＤＮＡを、Ｇ４１８選抜に適したｎｅｏ耐性遺伝子を持つ発現ベクターｐｃＤＮＡ−３（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にサブクローン化した。特に、クローン体３１Ｄの挿入断片はＥｃｏＲＩ（５’）およびＮｏｔＩによる消化により切り離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断したｐｃＤＮＡ−３に挿入しｐｃＤ３ｐＭＡｄを得た。
【０１１６】
結果
１，５００個の独立クローン体のプールに分割した、ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、アカゲザル腸間膜リンパ小節（ＭＬＮ）から精製したｍＲＮＡから構築した。各々のプールは、一過性にＣＨＯ／Ｐ細胞株に形質導入し、形質導入後４８時間後、細胞接着アッセイを、ネズミＴ細胞リンパ腫ＴＫ１を用いて行った。ＶＣＡＭ−１がＭＬＮで発現したので、アッセイを、抗−ＶＣＡＭ−１  ＭＡｂ２Ｇ７（グラバー，Ｎ．Ｔ．、等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４５：８１９−８３０（１９９０））の存在下で行った。さらに、ＩＣＡＭ  ｃＤＮＡにより仲介された接着を評価するために４℃で試験を行った（ＴＫ１細胞は、高レベルのＬＦＡ−１を発現し、ＬＦＡ−１は４℃では機能しない）。該アッセイの顕微鏡検査によると、ＴＫ１細胞の顕著なロゼッティングを有するいくつかのウェルが示された。形質導入を繰り返し、プールにより仲介された結合が、抗−β７または抗−α４  ＭＡｂｓにより阻害されうるかどうかを決定することによるさらなる解析のために、二つのウェルを選んだ。プールの中の一つへのＴＫ１の結合は、抗−α４  ＭＡｂ  ＰＳ／２または抗−β７  ＭＡｂ  ＦＩＢ  ５０４いずれかとのＴＫ１細胞のプレインキュベーションによって完全に阻害される。このプールは、３１Ｄと呼ぶ１つのクローン体を、単離するまで３巡のサブフラクションに付された。精製したクローン体３１Ｄは、抗−α４または抗−β７抗体によって阻害されうるＴＫ１細胞結合を仲介した。
【０１１７】
クローン体３１Ｄの挿入断片の大きさは約１．８ｋｂであった。アミノ−末端のシークエンシングは、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１の霊長類のホモログと一致する幾つかの特徴を示した。シグナルペプチドは両方とも２１アミノ酸の長さであった。アミノ酸の類似性はわずか４８％であることがわかったが、非−保存置換を考慮すれば、相同性は７１％であった。さらに、クローン体３１Ｄによってコードされる蛋白質は、Ｉｇ−ファミリー接着レセプターに独特の特徴：最初の免疫グロブリンドメイン中の３−４（本件では３）アミノ酸離れた二対のシステインを有する。最終的に、最初の二つのシステインに対して８アミノ酸Ｃ末端側は、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１の配列と同一である９アミノ酸の範囲である。この領域の中には、ＬＤＴＳＬ配列があり、それはインテグリン／Ｉｇファミリーメンバーの相互作用のコンセンサスモチーフを配列する。このモチーフは、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３およびＶＣＡＭ−１（オズボーン，Ｌ．等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、１２４：６０１−６０８（１９９４）；レンツ，Ｍ．Ｅ．等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、１２５：１３９５−１４０６（１９９４））等の他のＩｇ接着レセプターに関係する一般的な保存を有するが、この正確な配列が、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１にのみに、以前に見つけられた。本モチーフの機能的な重要性は、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１におけるモチーフのアミノ酸６１の最初のＬ（ロイシン）からＲ（アルギニン）へ変換させたポイント変異がＭＡｄＣＡＭ−１：α４β７結合に劇的な影響を有する事実により示唆される（示されていない）。これらの配列の特徴に伴う機能的研究は、クローン体３１Ｄが、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１に対する霊長類のホモログをコードすることを示す。
【０１１８】
ヒトファージライブラリーのスクリーニングとヒトクローン体の精製
ヒトファージｃＤＮＡライブラリーをλＺｉｐｌｏｘTMベクター（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）／ＢＲＬ）において構築した。ヒトｃＤＮＡも、前記の正常または炎症を起こした腸間膜リンパ小節（ＭＬＮ）のどちらかから単離したＲＮＡから作成した。ｃＤＮＡは前記のように合成し、該ファージベクターに連結し、細菌株Ｙ１０９０（ＺＬ）（”ＺＬ”＝Ｚｉｐｌｏｘ）でのタイターを測定した。正常およびクローンＭＬＮファージライブラリー両方由来の約５００，０００個の独立のクローン体（５０，０００個クローン体／フィルター）の複製のフィルターを32P ラベルした全長アカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１ｃ  ＤＮＡでスクリーニングした。
【０１１９】
プローブを調製するために、約１．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片を、クローン体３１Ｄから切り出し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（ＢＩＯ  １０１）を用いて単離した。該断片は、ランダムヘキサマーを用いてプライミングして、α32P −ｄＣＴＰでラベルした（マニアティス．等、モレキュラー  クローニング中（コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー、コールド  スプリング  ハーバー、ニューヨーク、１９９０））。
【０１２０】
スクリーニング条件は下記のようである：５０，０００ファージクローン体を、ＮＺＹＣＭ寒天（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）／ＢＲＬ）を含む１５０ｍｍのペトリ皿にプレーティングした。７−１６時間にわたってインキュベーションした後、プレートに１３２ｍｍのニトロセルロースフィルター（シュライチャーおよびシュエル，キーン，ＮＨ）を２分間重ね合わせ、次いで５分間、ファージクローン体の１番目および２番目の（複製）リフトに、個々に、移した。フィルターは、次いで５分間、変性溶液（１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｎ水酸化ナトリウム）に浸し、次いで１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で中和した。フィルターは１５分間、風乾し、次いで２時間、８０℃、減圧下で焼き付けた。
【０１２１】
フィルターを、２Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4 、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハート（１×デンハート溶液は０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％フィコール、および０．０２％ポリビニル−ピロリドンである）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および５０μｇ／ｍｌ  変性サケ精子ＤＮＡ中で、２時間、５５℃でプレハイブリダイゼーションし、その後、同じ緩衝液中で、一晩５５℃でハイブリダイズした。フィルターは、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）中で、室温で一度洗浄し、次いで、６５℃で、０．１×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ中で、３から４回の洗浄を行った。フィルターは、バックグラウンドを減らすことを見るためにガイガーカウンターでモニターされた。
【０１２２】
陽性クローン体はプラーク精製し、ｃＤＮＡ挿入断片を含むプラスミドｐＺＬ１をＣＲＥ  ＬＯＸレコンビネーション  システム（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））を用いて切り離した（プラスミドｐＺＬ１はラムダＺｉｐｌｏｘベクター本体中に含まれる）。特に、精製したファージプラークを２００μｌのファージ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０１％ゼラチン）中、５分間、室温で懸濁した。次いで、２０μｌのファージ懸濁液を１００μｌのＤＨ１０Ｂ（ＺＬ）の一晩培養液に添加し、さらに５分間インキュベートした。混合物の希釈液を、次いでアンピシリン５０μｇ／ｍｌおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 を補ったＬＢプレートにプレーティングし、３０℃で一晩インキュベートした。ｐＺＬ１ベクター中に挿入したｃＤＮＡを含む、単一のコロニーを標準一晩培養液として培養し、プラスミドをＱｉａｇｅｎプラスミド精製試薬を用いて精製した。
【０１２３】
はっきりした機能のヒトＭＡｄＣＡＭ−１ｃＤＮＡクローン体の同定
組織学的に正常なヒト腸間膜リンパ小節、およびクローン病の患者由来の炎症を起こした腸間膜リンパ小節由来の二つのヒトｃＤＮＡライブラリーを、完全なアカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１ｃＤＮＡをプローブとして用いてスクリーニングした。１つのクロス−ハイブリダイするクローン体を正常なライブラリーから単離し、２つのクロス−ハイブリダイするクローン体をクローン病のライブラリーから単離した。クローン病のライブラリーから単離した２つクローン体のうち１つは約１．３ｋｂであり、５’−末端で不完全であるように見え、シークエンスを行わなかった。正常なライブラリー由来のクローン体（クローン体４）は、クローン病のライブラリーから単離した、より長いクローン体（１５５８ｂｐ）（クローン体２０）より、わずかに大きかった（１６２４ｂｐ）。これらの２つのｃＤＮＡは、大きさで約１００ｂｐ異なるが、それらの５’および３’非翻訳配列は、ほとんど同じ長さであった。それらは両方がアカゲザル配列とほとんど同一であるアミノ−末端シグナル配列を含んでいるので、各々のクローン体は全長を示した。
【０１２４】
さらに、予備的なシークエンシングは、霊長類ｃＤＮＡと同じアミノ−末端のＩｇ−様ドメインの顕著な特徴を示した。これらのクローン体の大きさの差は、非翻訳配列の長さに帰することができないので、おそらく変化はコード領域に帰するであろう。
【０１２５】
各々のクローン体が、機能的なヒトＭＡｄＣＡＭ−１をコードするかどうかを決定するために、各々のクローン体の挿入断片をＧ４１８選抜に適切であるｎｅｏ耐性遺伝子を持つｐＣＤＮＡ−３発現ベクター（インビトロゲン、サンディエゴ、ＣＡ）にサブクローン化した。ヒトｃＤＮＡ（３’−末端にＮｏｔＩオリゴ−ｄＴプライマー、および５’−末端にＳａｌＩアダプターを用いて作成された）を、プラスミドｐＺＬ１を含有するλＺｉｐｌｏｘベクターに連結した。ｃＤＮＡ挿入断片を有するｐＺＬ１ベクターは、前記のように切り離した。サブクローニングのためにクローン体４および２０の挿入断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いてｐＺＬ１骨格から消化により切り離した。該ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ（５’→3') 断片を１％アガロースゲルで電気泳動を行った後、ジーンクリーン（Ｂｉｏ１０１）で単離し、該断片を、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いて切断したｐｃＤＮＡ−３に連結した。ライゲーション混合物は、ＤＨ１０Ｂ  Ｅ．ｃｏｌｉ  マックスエフェシェンシー株（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））を形質転換するために用い、形質転換体を５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン（Ａｍｐ）を補ったＬＢ寒天で選抜を行って得た。ｐｃＤ３ｈｕＭＡｄ４（クローン体４由来の挿入断片）およびｐｃＤ３ｈｕＭＡｄ２０（クローン体２０由来の挿入断片）で示されるプラスミドを得、制限消化により解析した。
【０１２６】
クローン体ｐｃＤ３ｈｕＭＡｄ４（クローン体４由来の挿入断片）またはｐｃＤ３ｈｕＭＡｄ２０（クローン体２０由来の挿入断片）を一過性にＣＨＯ／Ｐ細胞へ形質導入した。ＣＨＯ／Ｐ形質導入体のヒトＢ細胞リンパ腫ＲＰＭＩ８８６６（図５）またはＴＫ１細胞（示していない）への接着により評価されるように、各々のクローン体は結合および接着をを仲介しうる機能的な蛋白質の発現を指示する。
【０１２７】
ＣＨＯ／Ｐ形質導入体のＲＰＭＩ８８６６細胞への接着は、対照ＩｇＧによるのではなく、抗−α４β７  ＭＡｂ  ＡＣＴ−１を用いてプレインキュベートすることにより阻害された。形質導入体のＴＫ１細胞への接着は、抗−β７  ＭＡｂ  ＦＩＢ  ５０４により阻害された。これらの結果は、クローン体４（正常な腸間膜小節ライブラリー由来）およびクローン体２０（クローン病のライブラリー由来）各々が、機能的なＭＡｄＣＡＭ−１蛋白質をコードすることを示す。さらにこれらのはっきりしたｃＤＮＡを特徴付けるために、両方のクローン体を完全にシークエンスした。
結果
ヒトＭＡｄＣＡＭ−１をコードするクローン体４および２０由来のｃＤＮＡは、それぞれ、１６２８ｂｐおよび１５４３ｂｐの長さである。クローン体４由来のｃＤＮＡ（図１；配列番号：１）は、４０６アミノ酸の推定される蛋白質（配列番号：２）をコードする１２１８ｂｐの読み枠、および４１０ｂｐの３’非翻訳領域を含むが、５’非翻訳領域は、含まなかった。クローン体２０由来のｃＤＮＡ（図２；配列番号：３）は、４ｂｐの５’非翻訳配列、３８２アミノ酸の予想される蛋白質（配列番号：４）をコードする１１４６ｂｐの読み枠、および３９３ｂｐの３’非翻訳領域を含む。推定される１８アミノ酸のシグナル配列の切断後、コードされる蛋白質の推定される分子量は、４０，９１０（クローン体４）および３８，３７５（クローン体２０）ダルトンである。
【０１２８】
複数のアラインメントは、ＭＡｄＣＡＭ−１の異なるクローン化された種間の相同性の程度を解析するために行われた。ヌクレオチドのアライメントは、マウスとラットのＭＡｄＣＡＭ−１ｃＤＮＡ間では８１．９％の相同性、マウスとアカゲザルｃＤＮＡ間では４１．８％の相同性、ネズミとヒト（クローン体４）ＭＡｄＣＡＭ−１ｃＤＮＡ間では４２．１％の相同性、およびネズミとヒト（クローン体２０）ＭＡｄＣＡＭ−１ｃＤＮＡ間では４１．８％の相同性を示した。ヒトクローン体４およびクローン体２０ｃＤＮＡとのアカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１のヌクレオチド配列のアライメントは、それぞれ７０．７％および７５．０％の相同性を示した。
【０１２９】
アミノ酸配列相同性はマウスとラットＭＡｄＣＡＭ−１間では７８．５％、マウスとアカゲザルでは４４．３％、およびネズミとヒトクローン体４がコードするＭＡｄＣＡＭ−１間では３９％であることが決定された。
【０１３０】
ｃＤＮＡクローン体４および２０の比較は、セリン、スレオニンおよびプロリン残基の頻度（クローン体４が６９％、クローン体２０が７６％）による（図１と図２で囲まれた）、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１のムチンドメインとの相同性がある領域を示した。この領域は、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１にアミノ酸組成において似ているが、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１とは高く異なる。該ドメインは、クローン体４では７１アミノ酸の長さ、およびクローン体２０では４７アミノ酸の長さである。該領域は、２つの多型も含んでいる。：（１）アミノ酸２４０における多型であり、それがクローン体４においてはプロリン（Ｐ）でありクローン体２０においてはセリン（Ｓ）である；および（２）アミノ酸２４２における多型であり、それがクローン体４においてはアスパラギン（Ｎ）でありクローン体２０においてはアスパラギン酸（Ｄ）である。さらに、ヒトムチンドメインが、配列ＰＰＤＴＴＳ（Ｑ／Ｐ）Ｅからなる８アミノ酸の繰り返しを含み、それが、クローン体４では８回およびクローン体２０では５回現れる。
【０１３１】
クローン体４および２０の起源を評価するため、該繰り返しの側に位置するＰＣＲプライマーを、ヒトゲノムＤＮＡを増幅するために使用した。下記のプライマーを使用した。：
5'-CTC TAC TGC CAG GCC ACG-3' （プライマー＃１、配列番号：７）
5'-AGC CTG GGA GAT CTC AGG G-3' （プライマー＃２、配列番号：８）
5'-GCC ACG ATG AGG CTG CCT GG-3'（プライマー＃３、配列番号：９）
5'-GTG GAG CCT GGG CTC CTG GG-3'（プライマー＃４、配列番号：１０）
該プライマーは、ネステッドプライマーである。一回目の反応においては、プライマー１および２を使用した。二回目の増幅反応には、一回目の反応の１：１０００希釈物を調製し、１μｌをプライマー３および４と共に使用した。増幅反応は、０．５μｇのゲノムＤＮＡ、１０ピコグラムの対照プラスミド（ｐｃＤ３ＨｕＭＡｄ４またはｐｃＤ３ＨｕＭＡｄ２０）、または前にＺｉｐｌｏｘライブラリーのために調製した約１ｍｇの二本鎖ｃＤＮＡのいずれかを含んだ。ゲノムＤＮＡは３つの供給源から得た（プロメガ、クロンテック、およびジャーカット細胞から精製したもの）。増幅の条件は：９４℃で５分を１サイクル；９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、７２℃で１分を２５サイクルし、７２℃で５分を１サイクル行った。
【０１３２】
ゲノムＤＮＡからの増幅反応により、テンプレートとしてクローン体４およびクローン体２０ｃＤＮＡのいずれかを用いてＰＣＲ反応の個々の産物に由来する２つのバンドを得た。このデータから２つのｃＤＮＡクローン体はゲノムＤＮＡによりコードされるイソ型であり、恐らく択一的スプライシング、または２つの異なる対立遺伝子からの転写により生じるのであろう。拡大した多型および配列の発散は他のムチン配列において証明されている（例えば、ヒルケンス，Ｊ、等．、Ｔｒｅｎｄｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ、１７：３５９−３６３（１９９２））。例えば、腸のムチンの反復部分は、ネズミとヒトの間に良く保存されてはいない（ガム，Ｊ．Ｇ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：２２７３３−２２７３８（１９９１））。一つの予告は、ネズミゲノム構造の解析に基づいて、ヒトゲノムＤＮＡはこの領域にイントロンを含むことができることである。もしそうであれば、本実験に用いたＰＣＲプライマーは、イントロンにわたるであろうし、ヒトゲノムＤＮＡの増幅は、ｃＤＮＡ対照の増幅により産生されるものと同じ大きさのバンドを産生することが期待されないであろう。ヒトＭＡｄＣＡＭ−１ゲノムクローン体の単離および解析は結果的にクローニングアーチファクトの可能性を除いた。クローン体２０イソ型および炎症病または活性間に相互関係があるかどうかを決定するために、正常および／または正常な個人およびＩＢＤ、クローン病または他の炎症の条件を有する患者由来の炎症を起こした組織の評価を行うことができる。
【０１３３】
ネズミ、アカゲザル、およびヒトＭＡｄＣＡＭ−１の２つのイソ型の比較は、これらのレセプターのアミノ末端部分がおそらくα４β７認識に関与するドメイン構造を提示することを示唆する。対照的に、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１のムチン／ＩｇＡドメインの位置に一致する位置のこれらのレセプターの領域は、アミノ酸組成が似ているが（セリン、スレオニン、プロリン−リッチなムチン領域）、他からさらに発散する。
【０１３４】
ヒトＭＡｄＣＡＭ−１  ＲＮＡの発現
ヒトの複数の組織のノーザンＩおよびＩＩ（クロンテック，パロ  オルト市、カリフォルニア州により市販調製された）、または前記のようにして調製された細胞株および組織由来の２μｇのポリＡ＋ＲＮＡを用いて、ノーザン解析を行った。ＲＮＡは１％アガロース  ホルムアルデヒドゲルにより変性し、電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（イモビロン、ミリポア）へ標準キャピラリーブロット法によって転写した。ＲＮＡ試料は、細胞または組織ＲＮＡそれぞれの質および量が均等であることを最初に確かめるために臭化エチジウムで染色した。転写後、ＲＮＡはＵＶクロスリンキング（ストラタリンカー、ストラタジーン）により膜に固定し、このブロットおよび市販調製されたブロットをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（クロンテック）中６８℃で１時間プレハイブリダイズした。クローン体４由来のｃＤＮＡ挿入断片を、ランダムヘキサマーを用いたプライミングによりα32P −ｄＣＴＰでラベルした（マニアティス等、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル、コールド  スプリング  ハーバー、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリーズ、ニューヨーク、（１９９））。ハイブリダイゼーションは２×１０6 ｃｐｍ／ｍｌの濃度の変性プローブを用いてＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ中６８℃で１時間行った。
【０１３５】
ブロットは、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、６０分間６５℃で、３０分で洗浄の一回の交換をして洗浄した。露光時間は、増感スクリーンを用いて４８時間した。この露光の後、該ブロットは０．５％  ＳＤＳ中１０分間の洗浄ではがし、同じ条件下でβ−アクチンｃＤＮＡを用いて再ハイブリダイズした。露光時間は２時間した。
【０１３６】
結果
プローブとしてクローン体４由来の完全なｃＤＮＡ挿入断片を用いてＭＡｄＣＡＭ−１発現についてノーザンブロットを調べた。約１．６ｋｂの単一のＲＮＡ種が、小腸中で高度に発現し、結腸および脾臓中で、より少ない程度で発現した。顕著な発現は、これらの条件下でアッセイした、胸腺、前立腺、卵巣、精巣および末梢血液白血球（ＰＢＬ）を含む他の組織において観察されなかった。この発現の組織特異的パターンは、パイエル板、ＭＬＮ（腸間膜リンパ小節）、腸の粘膜固有層におけるＭＡｄＣＡＭ−１の制限された発現および脾臓中の脾性白髄小節の周りの洞縁（ｔｈｅ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｓｉｎｕｓ  ａｒｏｕｎｄ  ｓｐｌｅｎｉｃ  ｗｈｉｔｅ  ｐｕｌｐ  ｎｏｄｕｌｅｓ）における若干の発現（ヘムラー、Ｍ．Ｅ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８：３６５（１９９０）；ベルグ，Ｅ．Ｌ．等、炎症化の細胞内分子機構（セルラー  アンド  モレキュラー  メカニズムズ  オブ  インフラムメーション）、２：１１１（１９９１）；ブリスキン，Ｍ．Ｊ．等、ネーチャー、３６３：４６１（１９９３））を示すマウスにおける研究と一致する。顕著な発現は、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、または腎臓を含むアッセイされた他の組織において観察されなかった。；しかしながら、低レベルの発現が、膵臓において検出された。これらのデータは、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１発現が、粘膜組織および脾臓における発現に組織特異的であることを示す。；詳細な組織分布の免疫組織化学的解析はヒトＭＡｄＣＡＭ−１に対するモノクロナール抗体を用いて行うことができる（下記を参照）。
【０１３７】
実施例２．ＭＡｄＣＡＭ−１クローン体の特徴付け
機能的接着アッセイ
プラスミド：
以下のプラスミドを機能的接着アッセイに用いた：（１）ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ製）またはｐｃＤＮＡ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を対照として用いた；（２）ｐＣＤＭ８中のネズミＭＡｄＣＡＭ−１（ｐＣＤＭＡＤ−７；ブリスキン（Ｂｒｉｓｋｉｎ，Ｍ．Ｊ．），ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６３：４６１  （１９９３））；（３）ｐｃＤＮＡ３中の７ドメインヒトＶＣＡＭ−１（ポルテ（Ｐｏｌｔｅ，Ｔ．），ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：５９０１（１９９０））（ｐＣＤ３ＶＣＡＭ）；および（４）ｐｃＤＮＡ−３中のヒトＭＡｄＣＡＭ−１（ｐＣＤｈｕＭＡｄ４）（前記参照）。
【０１３８】
モノクローナル抗体：
以下のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を機能的接着アッセイに用いた：（１）抗ネズミＭＡｄＣＡＭ−１  ＭＡｂ  ＭＥＣＡ−３６７（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ロックビル，メリーランド州），寄託番号ＨＢ９４７８；ストリーター（Ｓｔｒｅｅｔｅｒ，Ｐ．Ｒ．），ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：４１（１９８８）；およびブッチャー（Ｂｕｔｃｈｅｒ）に対する米国特許番号５，４０３，９１９）；（２）抗ヒトＶＣＡＭ−１  ＭＡｂ  ２Ｇ７（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（ロックビル，メリーランド州）；グラバー（Ｇｒａｂｅｒ，Ｎ．Ｔ．），ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５：８１９−８３０（１９９０））；（３）抗ネズミα４β７  ＭＡｂ  ＤＡＴＫ  ３２（アンドリュー（Ａｎｄｒｅｗ，Ｄ．Ｐ．），ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３：３８４７−３８６１（１９９４））；（４）抗ネズミβ７  ＭＡｂ  ＦＩＢ  ５０４（アンドリュー（Ａｎｄｒｅｗ，Ｄ．Ｐ．），ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３：３８４７（１９９４））；（５）抗ヒトα４β７  ＭＡｂ  ＡＣＴ−１（ラザロビッツ（Ｌａｚａｒｏｖｉｔｓ，Ａ．Ｉ．），ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：１８５７（１９８４））；（６）抗ヒトインテグリンβ１（ＣＤ２９）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製；サンホゼ，カリフォルニア州，カタログ番号＃５５００３４）；ならびに（７）無関係の対照としてネズミＩｇＧ１およびラットＩｇＧ２Ａ。
【０１３９】
細胞株
以下の細胞株を機能的接着アッセイに用いた：
（１）ネズミＴ細胞リンパ腫ＴＫ１（ブッチャー（Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．），ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０：５５６−５６１（１９８０）；ブッチャー（Ｅ．Ｂｕｔｃｈｅｒ）（スタンフォード，カリフォルニア州）；（２）ＲＰＭＩ  ８８６６、α４β７（そしてα４β１ではない）を発現するヒトＢ細胞リンパ腫株（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（ロックビル，メリーランド州）；アール（Ｅｒｌｅ，Ｄ．Ｊ．），ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３：５１７（１９９４）；アール（Ｄ．Ｅｒｌｅ）からの供与物）；（３）ＪＵＲＫＡＴ、α４β１（そしてα４β７ではない）を発現するヒトＴ細胞株（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（ロックビル，メリーランド州））；および（４）Ｒａｍｏｓ、α４β１（そしてα４β７ではない）を発現するヒト（Ｂリンパ球）バーキットリンパ腫細胞株（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（ロックビル，メリーランド州），寄託番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５９６）。
【０１４０】
機能的接着アッセイ：
機能的接着アッセイのために、以下のように変えて前記（実施例１）のように、様々な種のＭＡｄＣＡＭ−１、ヒトＶＣＡＭ−１をコードするプラスミド、および対照プラスミドを、一過性トランスフェクションによりＣＨＯ／Ｐ細胞に導入した。数個のウェルが抗体阻害実験のためにトランスフェクションされるので、トランスフェクションされる複数のウェルの原リポソーム混合物を、まず各プラスミドに対して作製した。これは、いくつかのリポソーム混合物が各ウェルにトランスフェクションされることを確実にした。
【０１４１】
トランスフェクションの４８時間後、培地を除いた。抗体上清（０．２５ｍｌ）（抗ヒトＶＣＡＭ−１  ＭＡｂ  ２Ｇ７または抗ネズミＭＡｄＣＡＭ−１  ＭＡｂ  ＭＥＣＡ−３６７のいずれかを含む）、もしくは対照として０．２５ｍｌの接着アッセイ緩衝液を加え、そして該混合物を４℃で１５分間プレインキュベーションした。
【０１４２】
並行して、リンパ球細胞株（ＲＰＭＩ  ８８６６またはＪｕｒｋａｔ）をスピンして沈殿させ、そして２％子ウシ血清、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．３、２ｍＭ  Ｍｇ++および２ｍＭ  Ｃａ++を補ったＨＢＳＳ（Ｃａ++またはＭｇ++なし）からなるアッセイ緩衝液で、２×１０6 ／ｍｌの密度で再懸濁した。これらのＲＰＭＩ  ８８６６またはＪＵＲＫＡＴ細胞懸濁物の０．２５ｍｌのアリコート（５×１０5 細胞）を、少量の様々な精製抗体と共に、または等量のＤＡＴＫ  ３２上清と共に４℃で１５分間プレインキュベーションした。ＤＡＴＫ  ３２を細胞株とのプレインキュベーションに用いた場合、アッセイの開始に先立って、接着アッセイのために合計０．５ｍｌの量を得るために、ウェル（トランスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）を含む）中に存在する上清または緩衝液を吸引した。
【０１４３】
プレインキュベーションのために、精製抗体（ＡＣＴ  １、ＦＩＢ  ５０４抗β１）および対照ＩｇＧ抗体を２０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。０．２５ｍｌの抗ヒトＶＣＡＭ−１（ＭＡｂ  ２Ｇ７）または抗ネズミＭＡｄＣＡＭ−１（ＭＡｂ  ＭＥＣＡ−３６７）を含む抗体上清（無希釈で用いた）をプレインキュベーションに用いた。０．２５ｍｌのＤＡＴＫ  ３２の抗体上清をプレインキュベーションに用いた。
【０１４４】
プレインキュベーション後、細胞株（ＪｕｒｋａｔまたはＲＰＭＩ  ８８６６）をウェル中でトラスフェクタント（ｔｒａｎｆｅｃｔａｎｔｓ）と組み合わせて、そしてロッキングプラットフォーム上でインキュベーションをさらに３０分間４℃で続けた。
【０１４５】
アッセイを前記のように固定した。プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の大きなブレーカー中で穏やかに反転させて洗浄し、続いて、固定のために１．５％グルテルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を含むＰＢＳのブレーカー中で最低１時間反転させた。２０×倍率で視野中のリンパ球およびＣＨＯ細胞の両方を数えて、接着を評価した。各アッセイに対して、ＣＨＯ／Ｐ細胞当たりの結合したリンパ球の数を、標準誤差を有する４つの視野の最小値として平均化した。各場合における結果は、同様の結果を有する３つの行われた実験の１つからのものである。
【０１４６】
結果
ネズミＭＡｄＣＡＭ−１は、α４β７（そしてα４β１ではない）を発現するリンパ球を特異的に結合する。ヒトＭＡｄＣＡＭ−１リンパ球の相互作用の特異性を決定するために、接着アッセイを行って、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１を発現する一過性トランスフェクションされたＣＨＯ／Ｐ細胞の、α４β７しか発現しないＲＰＭＩ  ８８６６細胞株（アール（Ｅｒｌｅ，Ｄ．Ｊ．），ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３：５１７（１９９４））へ、またはα４β１を独占的に発現するＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔへ結合する能力を評価した。これらの細胞株の結合を、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１およびヒトＶＣＡＭ−１を発現する一過性トランスフェクションされたＣＨＯ／Ｐ細胞の結合と比較した。結果は図４Ａ〜４Ｂに示す。
【０１４７】
ＲＰＭＩ  ８８６６細胞は対照トランスフェクタントには結合しなかったが、ヒトまたはネズミＭＡｄＣＡＭ−１を発現するトランスフェクタントには貪欲に結合した。この結合は抗α４β７  ＭＡｂ  ＡＣＴ−１とのプレインキュベーションにより完全に阻害された（図４Ａ）。ＶＣＡＭ−１トランスフェクタントはＲＰＭＩ  ８８６６に結合しなかった。このことは、α４β７／ＶＣＡＭ−１相互作用が活性化依存であるという以前の証明（ポスティゴ（Ｐｏｓｔｉｇｏ，Ａ．Ａ．），ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２４７１−２４８３（１９９３）；ルエッグ（Ｒｕｅｇｇ，Ｃ．），ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１７：１７９−１８９（１９９２））と一致している。抗ＶＣＡＭ−１  ＭＡｂ  ２Ｇ７を用いたＦＡＣＳ分析が約６０％のトランスフェクション効率を示したように、ＲＰＭＩ  ８８６６細胞がＶＣＡＭ−１トランスフェクタントを結合しないのは、発現の欠乏によるものではなかった。さらに、同じＶＣＡＭ−１トランスフェクタントはＪｕｒｋａｔ細胞を結合でき、そして結合は抗ＶＣＡＭ−１または抗β１  ＭＡｂのいずれかとのプレインキュベーションにより完全に阻害された（図４Ｂ）。ネズミおよびヒトＭＡｄＣＡＭ−１トランスフェクタントはＪｕｒｋａｔ細胞（α４β１陽性株）を結合しなかった。これらのデータは、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１が選択的にα４β７インテグリンを発現するヒト白血球リンパ球と結合することができることを実証している。
【０１４８】
Ｌ１−２およびＣＨＯ細胞トランスフェクタント
マウスＬ１−２細胞株は前Ｂリンパ腫由来であり、ユージン・ブッチャー（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｂｕｔｃｈｅｒ）博士（スタンフォード大学、スタンフォード、カリフォルニア州）から得た。ＭＡｄＣＡＭ−１に対するアカゲサルまたはヒトｃＤＮＡをいずれかコードする遺伝子を、前記のようにｐｃＤＮＡ−３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）にサブクローニングした。生じたプラスミド（ｐｃＤ３ＨｕＭＡｄ４、ｐｃＤ３ＨｕＭＡｄ２０、またはｐＣＤ３ＰＭａｄ（アカゲサル））を、以下のようなトランスフェクションによりＬ１−２細胞に導入した：Ｌ１−２細胞を約１０6 ／ｍｌの密度になるまで増やした。５０、２５または１２．５×１０6 個いずれかの細胞をＨＢＳＳで洗浄し、それから２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．０５を補ったＨａｎｋｓ平衡化塩溶液からなる０．８ｍｌの緩衝液に再懸濁した。最終量２００μｌにした２０μｇの鎖状プラスミド、５００μｇのｔＲＮＡおよびＨＢＳＳからなる溶液を、細胞懸濁物に加えて合計量１ｍｌにした。室温で１０分インキュベーションの後、細胞／ＤＮＡ混合物をエレクトロポレーションキュベット（ＢｉｏＲａｄ製、リッチモンド、カリフォルニア州）に移し、ＢｉｏＲａｄ遺伝子パルサー中で２５０ボルト、９６０ｍＦでエレクトロポレーションした。続いてさらに室温で１０分インキュベーションし、標準Ｌ１−２成長培地（ＲＭＰＩ  １６４０、１０％  Ｈｙｃｌｏｎｅ  ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌ  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｔｙｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（Ｇｉｂｃｏ製）および０．２９ｍｇ／ｍｌ  Ｌグルタミン（Ｇｉｂｃｏ製）で細胞を２５ｍｌに希釈し、そして３７℃のインキュベーターに戻した。４８時間後、細胞を遠心分離によりペレットにし、０．８ｍｇ／ｍｌでＧ４１８（ジェネティシン；Ｇｉｂｃｏ製）を補った５０ｍｌのＬ１−２培地に再懸濁した。細胞懸濁物の希釈物を９６−ウェルマイクロタイタープレートにプレートし、単一コロニーを成長させ、ＭＡｄＣＡＭ−１の発現を分析した。
【０１４９】
ＭＡｄＣＡＭ−１を発現するＬ１−２細胞クローン体は、ＴＫ１細胞への付着により検出できた。Ｌ１−２（非トランスフェクション細胞）およびＴＫ１細胞は両方、単一細胞懸濁物として成長する。ＭＡｄＣＡＭ−１の表面発現は、ＴＫ１細胞上に発現したα４β７との相互作用の効能により接着を媒介する能力によって検出することができる。この相互作用の特異性を、抗β７  ＭＡｂ  ＦＩＢ  ５０４を用いたＴＫ１細胞の前処理による阻害によりさらに立証した。
【０１５０】
アカゲサルまたはヒトいずれかのＭＡｄＣＡＭ−１クローン体で安定にトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（中国ハムスター卵巣細胞；アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（ロックビル，メリーランド州））を、以下の例外と共に、Ｌ１−２細胞に対して前記したようなエレクトロポレーションにより調整した。ＣＨＯ細胞成長用培地はデオキシリボヌクレオシド（Ｇｉｂｃｏ製）および１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ製）および５０Ｕ／ｍｌ  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ製）および０．２９ｍｇ／ｍｌ  Ｌグルタミン（Ｇｉｂｃｏ製）を含むα−ＭＥＭであった。選択培地は、０．５５ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ製）を含む同じ培地からなっていた。単一クローンを成長させ、細胞をアッセイの１日前に２４ウェルプレートにウェル当たり５０，０００細胞でプレートした点を除き、前記（一過性について）の機能的接着アッセイを用いてＲＰＭＩ  ８８６６細胞のα４β７依存結合を示す能力について分析した。この基準を用いて、ＣＨＯ  ＨｕＭＡｄ  ４と呼ぶ株を設立した。
【０１５１】
接着を阻害する力のあるモノクローナル抗体
ヒトＭＡｄＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＬ１−２  ＭＡｄＣＡＭ−１トランスフェクタントで免疫して作製した。マウスをＨＢＳＳに再懸濁した１０００万個の細胞で、２週間間隔で３回腹腔内に免役し、そして最後の４回目の免疫（ＨＢＳＳに再懸濁した１０００万個の細胞）を静脈内に注射した。最初の免疫を、アカゲサルＭＡｄＣＡＭ−１を発現する２つのクローン体（Ｌ１−２細胞クローン体２３およびクローン体１９）の混合物で行った。残りの投与は、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１を発現する単一のＬ１−２クローン体（Ｌ１−２クローン体ＨｕＭＡＤ４／１７）で行った。
【０１５２】
約５，０００個のハイブリドーマを生じる好結果の融合を行った。最後の静脈内注射の４日後、脾臓を除き、単一細胞懸濁物を無血清ＤＭＥＭ培地中で調整した。ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）ら（ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．），ら，Ｎａｔｕｒｅ，２９９：５５０−５５２（１９９７））の方法にしたがって、これらの細胞を融合パートナーＳＰ２／０と融合させた。２０ｍｌの脾臓細胞および２０ｍｌのＳＰ２／０細胞を組み合わせて、８００ｇで５分間スピンして、培地を吸引により除いた。３７℃にプレウォームした５０％ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ１５００）（ベーリンガーマンハイム製、インディアナポリス、インディア州）溶液を細胞ペレットに２分間かけて加え、続いて１０ｍｌのＤＭＥＭ培地を３分間かけて加えた。細胞懸濁物を６００ｇで３分間スピンし、上清を除いた。ペレットを、２０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン硫酸塩、およびＨＡＴ選択培地（Ｓｉｇｍａ製、セントルイス、ミズーリ州）を含むＤＭＥＭ培地に穏やかに再懸濁した。細胞を、１０個の９６ウェル平底マイクロタイタープレートに２００μｌ／ウェルでプレートした。
【０１５３】
融合の１０日後、蛍光染色により、ウェル由来の上清をＣＨＯヒトＭＡｄＣＡＭ−１トランスフェクタント（ＣＨＯ  ＨｕＭＡｄ  ４細胞）に対する反応性についてスクリーンした。試料あたり５００，０００個の細胞の染色を、５０μｌの各上清および５０μｌの細胞を用いて、本質的に既述のように行った（ハーロー（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｄ．Ｌａｎｅ），１９８９，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバー研究所，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク州）。二次抗体は、１：２００に希釈したＦＩＴＣ−標識抗ネズミＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ製）であった。強い反応性は、非トランスフェクションＣＨＯ細胞と比較して、蛍光の２〜３対数の増加として判断した。
【０１５４】
４８個の抗体上清を、ＣＨＯ  ＨｕＭＡｄ  ４細胞に対する強い反応性について選択した。それから、これらの抗体上清を、ＣＨＯ  ＨｕＭＡｄ  ４細胞のＲＰＭＩ  ８８６６細胞への接着をブロックするそれらの能力についてスクリーンした。特異的抗ヒトＭＡｄＣＡＭ−１  ＭＡｂにより影響されないので、対照として、Ｒａｍｏｓ細胞がＶＣＡＭ−１トランスフェクタントと結合するのを阻害する上清の能力を試験した。ブロッキング抗ヒトＭＡｄＣＡＭ−１モノクローナル抗体を同定するために、以下のアッセイを行った。対照トランスフェクタントを供給するために、ＣＨＯ／Ｐ細胞を前記のようにｐＣＤ３ＶＣＡＭでトランスフェクションし、そしてトランスフェクションの４８時間後アッセイした。接着阻害アッセイの４８時間前に、ウェル当たり４０，０００個のＶＣＡＭ−１一過性トランスフェクタント細胞を２４ウェルプレートにプレートした。アッセイの２４時間前に、ウェル当たり５０，０００個のＣＨＯＨｕＭＡｄ  ４トランスフェクタント細胞を、２４ウェルプレートにプレートした。アッセイの日に、各抗ヒトＭＡｄＣＡＭ−１上清（０．２５ｍｌ）をＣＨＯＨｕＭＡＤ  ４トランスフェクタントまたはＶＣＡＭ−１トランスフェクタントのいずれかを含むウェルに加え、そして混合物を４℃で１５分間プレインキュベートした。（１）ＲＰＭＩ  ８８６６細胞をＭＡｄＣＡＭ−１トランスフェクタントと共に、または（２）Ｒａｍｏｓ細胞（α４β１を発現するヒトＢ細胞株）をＶＣＡＭ−１トランスフェクタントと共に用いて、接着アッセイを行った。
【０１５５】
並行して、細胞（ＲＰＭＩ  ８８６６またはＲａｍｏｓ）を２×１０6 ／ｍｌの密度で、２％子ウシ血清、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．３、２ｍＭ  Ｍｇ++および２ｍＭ  Ｃａ++を補ったＨＢＳＳ（Ｃａ++またはＭｇ++なし）からなるアッセイ緩衝液に再懸濁した。抗体と共にトランスフェクタントをプレインキュベーションした後、０．２５ｍｌのＲＰＭＩ  ８８６６またはＲａｍｏｓ細胞懸濁物（５×１０５細胞）を各ウェルに加え、そしてロッキングプラットフォーム上でのインキュベーションを４℃でさらに３０分間続けた。前記のようにウェルを洗浄し、固定し、そして試験して、結合の阻害を評価した。
【０１５６】
試験した４８個のハイブリドーマ上清中１１個が、ＲＰＭＩ  ８８６６細胞のＭＡｄＣＡＭ−１を発現しているトランスフェクタントへの接着を阻害し、実質的なブロッキング活性を示した。Ｒａｍｏｓ細胞のＶＣＡＭ−１を発現しているトランスフェクタントへの接着は影響されず、α４β７媒介相互作用の選択的阻害を示した。選択したブロッキングハイブリドーマを、限定希釈によりサブクローン化した。
【０１５７】
結果
アカゲサルまたはヒトＭＡｄＣＡＭ−１を発現する安定細胞株を、ネズミ前Ｂリンパ腫Ｌ１−２中に作製した。これらの細胞を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫し、ハイブリドーマを調製した。ヒトＭＡｄＣＡＭ−１を発現するＣＨＯ  ＨｕＭＡｄ  ４トランスフェクタントの免疫蛍光染色により、生じた融合をスクリーンした。約１，０００個のウェルのスクリーニングにより、ＣＨＯ  ＨｕＭＡｄ  ４トランスフェクタントに対して強い反応性を示す４８個の上清が製造されたが、しかるに非トランスフェクションＣＨＯ細胞は陰性であった。続いて、ＲＰＭＩ  ８８６６細胞のヒトＭＡｄＣＡＭ−１トランスフェクタントへの接着を特異的にブロックするそれらの能力について、これらの上清を試験した。
【０１５８】
試験した４８個のハイブリドーマ上清中１１個が、ＲＰＭＩ  ８８６６細胞のＭＡｄＣＡＭ−１への接着を特異的に阻害することができたが、しかるにＲａｍｏｓ細胞（α４β１を発現する）のＶＣＡＭ−１トランスフェクタントへの接着は、同じ上清により影響されなかった。これらのハイブリドーマを、１０Ｇ４、８Ｃ１、１０Ｇ３、９Ｇ１２、９Ｅ４、７Ｈ１２、１０Ｆ２、１０Ａ６、１Ｅ５、２Ｆ５、７Ｇ１１と名付けた。
【０１５９】
実施例３．ヒトＭＡｄＣＡＭ−１−ＩｇＧキメラの設計および機能的分析
ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧキメラの構築
ｐｃＤ３ｈｕＭＡｄ４（実施例１）と呼ばれる、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、サンディエゴ、カリフォルニア州）中のヒトＭＡｄＣＡＭ−１クローン体４  ｃＤＮＡを、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１の細胞外領域のＰＣＲ増幅のための鋳型として用いて、ヒトＩｇＧ１の定常領域と融合させた。ヒトＭＡｄＣＡＭ−１コード配列（ＡＴＧコドン、太字）の５’末端を含む、プライマーＨＵＭＡＤＩＧ４／２（配列番号：１１）を合成した：
ＨｉｎｄＩＩＩ
５’−ＧＧＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＣＧＧＡＣＴＧＧ
ＣＣＣ−３’
この５’プライマーをＨＵＭＡＤＩＧ２（配列番号：１２）と名付けた３’プライマーと共に用いて、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１の２つのアミノ末端免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメインをコードする領域を増幅した。プライマーＨＵＭＡＤＩＧ２（配列番号：１２）は、配列番号：１のコード鎖ヌクレオチド６６７〜６８３に相補的な部分を含み、以下の配列を有している：
ＳｐｅＩ
５’−ＣＣＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧＡＣ−３’
あるいは、５’プライマーを３’プライマーＨＵＭＡＤＩＧ３と共に用いて、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１の全細胞外ドメインをコードする領域を増幅した（クローン体４）。３’プライマーＨＵＭＡＤＩＧ２（配列番号：１２）は、配列番号：１のコード鎖ヌクレオチド９９２〜１０１０に相補的な部分を含み、以下の配列を有している：
ＳｐｅＩ
５’−ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＧＴＴＴＧＧＡＣＧＡＧＣＣＴＧＴＴＧ−３’
プライマーは、示されているように、５’ＨｉｎｄＩＩＩ部位または３’ＳｐｅＩ部位を有するように設計された。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（サンディエゴ、カリフォルニア州）製のＰＣＲ最適化キット（ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ  ｋｉｔ）を用い、これらのプライマーを用いて、２つの異なるＭＡｄＣＡＭ断片をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩで消化して、クローニング用末端を生じさせた。続いて、該産物をＧｌａｓｓｍａｘ  ＤＮＡ単離システム（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｇｉｂｃｏ製、ベテスダ、メリーランド州）を用いて、ゲル電気泳動により精製した。
【０１６０】
ＣＨ１、Ｈ（ヒンジ）、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む約１ｋｂの断片を、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩでの消化により、Ｆｃ変異ヒト定常領域を持つヒト免疫グロブリンγ１重鎖をコードする構築物から切り出した。この構築物によりコードされる抗体を、これより後イソタイプ適合の無関係な対照として用いた。この構築物中のヒト定常領域は、シムズ（Ｓｉｍｓ，Ｍ．Ｊ．）ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６−２３０８（１９９３））およびウォルドマン（Ｗａｌｄｍａｎｎ）ら（国際公開第９３／０２１９１号パンフレット，２月４日，１９９３（２３頁））により述べられているように、最初ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ重鎖のＰＣＲ増幅により得られ（レイクマン（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ，Ｌ．）ら，Ｎａｔｕｒｅ，３２２：３２３−３２７（１９８８））、この説明は各々全体において参照により本明細書に取り込まれる。この構築物の定常領域の変異（Ｌｅｕ234 →Ａｌａ234 およびＧｌｙ237 →Ａｌａ237 ）はヒトＦｃγレセプターとの結合を減少するように設計され、オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発により製造された。このように、製造されたＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇ融合は、Ｌｅｕ234 →Ａｌａ234 およびＧｌｙ237 →Ａｌａ237 変異の導入を除き、シムズ（Ｓｉｍｓ）ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６−２３０８（１９９３））およびウォルドマン（Ｗａｌｄｍａｎｎ）ら（国際公開第９３／０２１９１号パンフレット）により述べられたＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ定常領域断片を含む。
【０１６１】
Ｆｃ変異ＩｇＧ１定常領域をコードする１ｋｂのＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＧｌａｓｓｍａｘ  ＤＮＡ単離システム（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｇｉｂｃｏ製、ベテスダ、メリーランド州）を用いて、ゲル電気泳動により精製した。（ａ）２つのＭＡｄＣＡＭ−１のＮ末端Ｉｇドメインまたは（ｂ）全細胞外ドメインのいずれかを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩ断片であるこの定常領域断片を、３ウェイライゲーションにより、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したベクターｐＥＥ１２（ステファンス（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ｌ．）およびコケット（Ｍ．Ｌ．Ｃｏｃｋｅｔｔ），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：７１１０（１９８９）ならびにベービントン（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．Ｒ．）およびヘンシェル（Ｃ．Ｃ．Ｇ．Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ），１９８７，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州））にライゲーションした。微生物株ＤＨ１０Ｂの形質転換体を得た。コロニーを成長させ、ミニプラスミドプレップを制限地図を作製して分析した。Ｆｃ変異ＩｇＧ１定常領域に融合させたＭＡｄＣＡＭ−１の全細胞外ドメイン（構築物ＨｕＭＡｄＩｇ２１）または２つのＮ末端Ｉｇドメイン（構築物ＨｕＭＡｄＩｇ３１またはＨｕＭＡｄＩｇ３８）のいずれかからなる融合蛋白質をコードする３つの構築物を、全ＭＡｄＣＡＭ−１部分を通じて配列決定し、セグメントの正しい融合およびＰＣＲ導入変異の非存在を確認した。
【０１６２】
最初の試験のために、標準条件（９６０μＦ、２５０Ｖ）下でＢｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒでのエレクトロポレーションを用い、各構築物を１ｍｌのＲＰＭＩ緩衝液（無血清）および２５μｇのプラスミド中の単層の５×１０7 個のＣＯＳ細胞上で一過性トランスフェクションした。トランスフェクションの７２〜９６時間後、上清を集め、０．４５μフィルターに通し、０．０５％アジ化ナトリウムの存在下４℃で保存した。キメラの製造は、抗ヒトＩｇＧ１抗体を捕捉抗体として、およびアルカリンフォスファターゼに結合した同じ抗体を２次抗体として用い、サンドイッチＥＬＩＳＡにより確認した。無関係な対照抗体（同一の定常領域を有する）を標準として用いた。また、キメラは抗ヒトＭＡｄＣＡＭ−１モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットによっても分析し、約２００ｋｄに泳動することが分かり、ホモ二量体の大きさと一致していた。
【０１６３】
溶解性ヒトＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇキメラは特異的にα４β７陽性細胞に結合する
以前にＭｎ++の存在下でのみＭＡｄＣＡＭ−１を結合することが示されたＴ細胞株ＨｕＴ  ７８を染色する能力について、４つの異なるトランスフェクション由来の上清をアッセイした。それに応じて、このアッセイに用いた各溶液は２ｍＭ  Ｍｎ++を含んでいた。ＨｕＴ  ７８細胞（ヒトＴ細胞リンパ腫株；（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション、寄託番号ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  １６１）は、α４β７を持つ細胞である。キメラの結合特異性を試験するために、ＨｕＴ  ７８細胞を培地単独（２％  ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０）、または培地および１０μｇ／ｍｌの抗β７抗体ＦＩＢ  ５０４のいずれかと共にプレインキュベートした。約１００，０００個の細胞を氷上で１５分間インキュベートし、それから２％  ＦＣＳ／２ｍＭ  Ｃａ++／２ｍＭ  Ｍｎ++を含むＨＢＳＳで洗浄した。それから、細胞を氷上で２０分間培地と共にもう一度、または４つの独立したトランスフェクションの１つ由来の上清と共に（２つはＭＡｄＣＡＭ−１の全細胞外ドメインを含むキメラ（クローン体２１）と共に、そして２つは２つのＮ末端Ｉｇドメインを含む切断型のＭＡｄＣＡＭ（クローン体３８）と共に）２０分間インキュベーションした。洗浄後、それから細胞をフィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）と結合させた抗ヒトＩｇＧ抗体と共にインキュベーションし、バックグラウンド以上の染色をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ）により評価した。キメラ上清と共にインキュベーションした細胞しかバックグラウンド以上に染色されなかったが、しかるにβ７  ＭＡｂとのプレインキュベーションはこの染色をバックグラウンドレベルまで減少され、キメラのα４β７インテグリンとの特異的相互作用を示した（図１７Ａ〜１７Ｅ）。
【０１６４】
ヒトＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇキメラを分泌する永久ＮＳＯ細胞株をエレクトロポレーションによるトランスフェクション後、既述（コケット（Ｃｏｃｋｅｔｔ，Ｍ．Ｌ．），ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：６６２−６６７（１９９０））のように無グルタミン培地中での成長により選択した。クローン体株を攪拌培養での成長に採用した。これらのクローン体株の３つ由来の上清（試料Ｂ〜Ｄ）、および部分精製キメラ（クローン体２１、プロテインＡとの結合により精製した、試料Ａ）を、Ｂ細胞株ＲＰＭＩ  ８８６６の接着を維持する能力について試験した。簡単に言えば、ＮＥＮ  ｍａｘｉｓｏｒｂプレートを１００μｌ／ウェルの炭酸緩衝液、ｐＨ  ９．５中の２０μｇ／ｍｌのプロテインＡと共に４℃で一晩インキュベーションした。それから、プレートをＲＰＭＩ  １６４０培地（無血清）で２度洗浄した。１００μｌのキメラ（またはＲＰＭＩの一連の希釈物）をウェルに３７℃で２時間結合させ、それから１度洗浄した。それから、ウェルをＦＣＳを用いて１時間３７℃でブロックし、１度洗浄し、そしてそれから、対照として抗ヒトＶＣＡＭ−１  ＭＡｂ（２Ｇ７）または抗ヒトＭＡｄＣＡＭ−１  ＭＡｂ  １０Ｇ３（実施例２）のいずれかを含む組織培養上清と共にプレインキュベーションした。２Ｇ７および１０Ｇ３  ＭＡｂを細胞の添加前に除いた。ＲＰＭＩ  ８８６６細胞をＢＣＥＣＦ−ＡＭ染色（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ；２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｏｕｒｅｓｃｅｉｎ），アセトキシメチルエステル；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製）とのプレインキュベーションにより蛍光標識し、１００μｌの細胞を各ウェルに加え（最終濃度１０5 細胞／ウェル）、そしてロータリーシェーカーで３０分間室温でインキュベーションした。ＲＰＭＩ  ８８６６細胞の固定キメラへの結合を、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＩＤＥＸＸ）を用いて蛍光値を読むことにより評価した。抗ヒトＭＡｄＣＡＭ−１  ＭＡｂのみが細胞のＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇキメラとの結合をブロックできたので、特異的結合は立証された（表１）。
【０１６５】
これらおよび他のこのようなキメラ融合蛋白質を、剤（例えば、低分子）のキメラとのα４β７の結合をブロックする能力を評価するために用いて、α４β７−ＭＡｄＣＡＭ相互作用の阻害剤を同定することができる。さらに、キメラ融合蛋白質は溶液中のα４β７陽性リンパ球と結合することができるので、それらは炎症部位へのｉｎ  ｖｉｖｏリンパ球補充の候補阻害剤を供給する。
【０１６６】
【表１】
2008231112.tif 000002
実施例４．結腸へのリンパ球補充の阻害
Ａ．マウスにおける結腸炎のＤＳＳ−誘導
既述（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９：２３８−２４９，１９９３）のように、ＢＡＬＢ／ｃマウスをそれらの飲み水中の５％デキストランナトリウム硫酸塩（ＤＳＳ）溶液に１０日の期間の間接触させた。この期間の間に、マウスは軟便および観血性下痢を含む結腸炎の臨床的症状を発達させた。ヒトにおける潰瘍結腸炎に似た、多病巣性上皮傷害および潰瘍は、作用させたマウス由来の結腸粘膜の組織学的実験における証拠である。さらに、作用させたマウスは１０日目までに最初の体重の２０〜３０％を失った。
【０１６７】
β７およびＭＡｄＣＡＭ相互作用の抗体妨害
結腸へのリンパ球の補充をブロックするときにおけるβ７−特異的抗体の効率を決定するために、既に特徴付けられて既述されているように（ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｃ．），ら，Ｃｅｌｌ  ７４：１８５−１９５，１９９３；ミシェ（Ｍｉｃｈｉｅ，Ｓ．Ａ．），ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４３：１６８８−１６９８，１９９３；ハマン（Ｈａｍａｎｎ，Ａ．），ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３２８２−３２９３，１９９４）、生理食塩水中のＦＩＢ２１またはＦＩＢ３０のいずれかからなる１００μｇのβ７に対するモノクローナル抗体、もしくは同量のイソタイプ適合対照ラットモノクローナル抗体（アンドリュー（Ａｎｄｒｅｗ）ら，前述）を、ＤＳＳ処理の１０日の経過期間にわたって、ＢＡＬＢ／ｃマウスに毎日腹膜内（ｉ．ｐ．）に注射した。
【０１６８】
評価方法
２つの方法を用いて、結腸炎マウスにおける白血球浸潤および粘膜傷害を阻害する抗体療法の効率を評価した。最初の方法では、上皮傷害および白血球細胞質浸潤の程度を評価するために評点システムを用いて、２人の知らされていない観察者により組織学的に処理を判断した（表２）。この評価のために、結腸組織を最初に１０％中性緩衝化ホルマリン中で固定し、脱水し、パラフィン中に包埋し、切片にし、そして実験の前に切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０１６９】
【表２】
2008231112.tif 000003
β７インテグリンを発現するリンパ球およびＭＡｄＣＡＭを発現する粘膜細静脈の検出および半定量のために免疫組織化学を用いて、さらなる組織学的評価を行なった。既述（リングラー（Ｒｉｎｇｌｅｒ，Ｄ．Ｊ，），ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１３４：３７３−３８３（１９８９））のように、結腸組織をまずＯＣＴ化合物中でスナップ凍結し、凍結中に切片にし、そして切片を続いてアセトン中で１０分間４℃で固定した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、非特異的抗体結合部位をＰＢＳで希釈した１０％正常ウサギ血清で１０分間ブロックし、続いて、連続して、３０分間室温（ＲＴ）で、ＰＢＳで２０μｇ／ｍｌにしたＦＩＢ２１抗体、ビオチニル化ウサギ抗ラットポリクローナル抗体、アビジン−ペルオキシダーゼ複合体、ならびに最後にＴｒｉｓ緩衝液で希釈したクロモゲン、ジアミノベンジジンおよび過酸化水素で洗浄した。
【０１７０】
次の方法では、同系のドナーマウス由来の放射腺標識腸間膜リンパ節リンパ球を用いて、リンパ球の結腸への補充を定量的に評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを５％  ＤＳＳに９（１０の代わり）日間置いて、８日目に、マウスに１００μｇの生理食塩水中のＦＩＢ２１（抗β７）、ＭＥＣＡ−３６７（抗ＭＡｄＣＡＭ）、両者の混合物、またはイソタイプ適合対照モノクローナル抗体をｉ．ｐ．注射したことを除き、動物実験の実験計画は、前記のものと同様であった。９日目に、腸間膜リンパ節細胞をドナー同系ＢＡＬＢ／ｃマウスから単離し、51Ｃｒで標識し、そして５．０×１０6 細胞／マウスを３０分間３７℃で、生理食塩水中の５００μｇの対照抗体、２５０μｇのＭＥＣＡ−３６７、５００μｇのＦＩＢ２１、または両者（合計量は７５０μｇである）と共にインキュベーションした。それから、標識細胞および抗体をＤＳＳ−処理受容マウスに静脈（ｉ．ｖ．）注射した。注射の１時間後、全長の結腸を全実験動物から集め、そしてγ−放射をγ−カウンターを用いて測定した。
【０１７１】
データ分析
動物の各グループに対して得た平均値間の違いを、１対のＴ検定を用いて、統計上の有為さについて評価した。Ｐ＜０．０５の時に、平均間の違いは有為であると見なした。
【０１７２】
結果
組織学的に、粘膜に対する浸潤および上皮傷害は、下行結腸、直腸および盲腸において最も激しかった。免疫組織化学による結腸の凍結組織切片の分析により、最も有為なβ７+ リンパ球の補充が右結腸にあることが示された。さらに、粘膜血管アドレシン（ａｄｄｒｅｓｓｉｎ）、ＭＡｄＣＡＭ−１の発現のレベルは、ＤＳＳ処理初期（３日）の腸粘膜の血管においては低レベルでしか発現しないが、ＤＳＳ処理の９日後、劇的に増加することが分かった。このことは、β７およびＭＡｄＣＡＭ−１の相互作用がＤＳＳ誘導結腸炎の間の結腸粘膜における炎症過程に関連しているという結論を支持している。
【０１７３】
ＤＳＳに１０日間曝したマウスおよびβ７特異的抗体を用いた日々の治療の組織学的評価は、等量の対照抗体を受けた動物と比較して、白血球補充（ＦＩＢ３０に対してＰ＜０．０１およびＦＩＢ２１に対してＰ＜０．００１）ならびに上皮傷害（Ｐ＜０．０５）の実質的な減少が右（上行）結腸で起きたことを示した（図７Ａおよび７Ｂ）。さらに、これらの動物由来の凍結切片の免疫組織化学を用いた分析により、ＤＳＳ処理の間に結腸の他の部分ではなく右結腸に補充したβ７+ 細胞の数が減少したことが示された。
【０１７４】
それから、同系ドナー由来の放射線標識腸間膜リンパ球を用いて、炎症を起こした結腸へのリンパ球の補充を定量的に評価した。ＤＳＳ処理レセプターにおけるこれらの細胞の注射の１時間後、β７特異的抗体またはＭＡｄＣＡＭ特異的抗体のいずれかで処理したマウスの結腸に補充した51Ｃｒ標識細胞の数に減少の傾向があったが、しかし同位体適合対照抗体で処理したマウスにおいてはなかった（図８）。
【０１７５】
Ｂ．重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ）マウスにおける結腸炎の誘導および結腸へのリンパ小節細胞の補充の阻害
ＣＤ４５ＲＢhiＣＤ４+ Ｔ細胞で再構築された重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ）マウスは、結腸炎および激るいそう症候群（ａ  ｓｅｖｅｒｅ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を発現する。ＣＤ４５ＲＢhiＣＤ４+ Ｔ細胞で再構築したｓｃｉｄマウスにおいて発現する結腸炎は、ｓｃｉｄマウスにおいて誘導された結腸炎が、病原性でないが、病気の誘導にＣＤ４+ Ｔ細胞の存在を明瞭に必要とする点で、大部分の他のＩＢＤのネズミ科モデルと異なる（ポウリー（Ｐｏｗｒｉｅ），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：１７１（１９９５）、その教義はそのまま参照することで、本明細書中に組み込まれている）。
【０１７６】
モリゼイら（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）およびポウリーら（Ｐｏｗｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．）の改変法（Ｍｏｒｒｉｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：２３７（１９９３）；Ｐｏｗｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍ．，５：１４６１（１９９３），その教義はそのまま参照することで、本明細書中に組み込まれている）をＢＡＬＢ／ｃ脾臓から単離された、顆粒白血球、ＣＤ８+ Ｔ細胞、Ｂ２２０+ 細胞、Ｉ−Ａ+ 細胞およびＭＡＣ−１+ マクロファージを消耗させることによりＣＤ４+ Ｔ細胞を増やすために用いた。ＣＤ４５ＲＢhi細胞をセルソーターにより、抗ＣＤ４５ＲＢで染色された最も明るい４０〜４５％のＣＤ４+ 細胞を捨てて、選別した。１×１０6 個のＣＤ４５ＲＢhiまたはＣＤ４５ＲＢloＴ細胞を尾静脈内に静脈（ｉ．ｖ．）注射することにより、感受容ｓｃｉｄマウスを再構築した。４匹のマウスをＣＤ４５ＲＢhiＴ細胞で再構築し、４匹のマウスをＣＤ４５ＲＢloＴ細胞で再構築した。
【０１７７】
再構築されたマウスを、体重変化および糞潜在血液の発生について週毎に測定した。一般的に、再構築後４〜６週間以内に、同数のＣＤ４５ＲＢloＴ細胞で再構築した対照ｓｃｉｄマウスに関してＣＤ４５ＲＢhiＴ細胞で再構築したマウスの体重の違いが、統計的に有為になった（図１８）。
【０１７８】
２、３および５×１０4 個の細胞を用い、このモデル内に結腸炎を誘導することができる。一般的に１〜５×１０5 個が用いられる。病気の兆候の速度論は、所定の再構築についてマウス間で同一ではないが、結腸炎は、、同様に激しく、一度体重が開始時の７５〜８５％に減少するほどである。組織構造観察は、他者の報告と一致しており、このモデルにおける結腸炎が、粘膜および粘膜下組織におけるＣＤ４+ Ｔ細胞の大規模な浸潤、上皮未成熟、潰瘍、陰窩過形成、杯状細胞の損失および陰窩膿瘍（ｃｒｙｐｔ  ａｂｓｅｓｓｅｓ）により特徴づけられることを示す。また、クローン病と同様に、ｓｃｉｄモデルにおけるＩＢＤは、深いフィステルを有する粘膜経壁の浸潤により特徴づけられる。結腸炎の他のネズミ科モデルと異なり、病気の激しさは、遠位の結腸のみに限定されず、横行および近位の結腸においても同じ激しさがある。
【０１７９】
β７の抗体妨害およびＭＡｄＣＡＭ相互作用
抗ネズミＭＡｄＣＡＭ−１抗体（ＭＡｂ  ＭＥＣＡ−３６７；アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ロックビレ、ＭＤ）、寄託番号ＨＢ  ９４７８；ストリーターら（Ｓｔｒｅｅｔｅｒ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，３３１：４１（１９８８）；また、ブッチャー（Ｂｕｔｃｈｅｒ）に与えられた米国特許第５，４０３，９１９号明細書を参照せよ）および抗ネズミβ７抗体（ＭＡｂ  ＦＩＢ  ５０４；アンドリューら（Ａｎｄｒｅｗ，Ｄ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３：３８４７（１９９４））をこれらの研究に使用した。
【０１８０】
ｓｃｉｄマウスを２×１０5 個のＣＤ４５ＲＢhiまたはＣＤ４５ＲＢloＣＤ４＋Ｔ細胞で再構築した。再構築５ヶ月後、２００μｇ／日のラットＩｇＧ２ａ対照抗体または１００μｇ／日のＦＩＢ−５０４（ネズミβ７特異的）＋１００μｇ／日のＭＥＣＡ−３６７（ネズミＭＡｄＣＡＭ特異的）の混合物をマウスに１４日の間注射した。抗体はＰＢＳ中においた。各処理群には５匹のマウスがあった。１４日後、111 Ｉｎ−オキシンで標識した５×１０6 個の腸間膜リンパ小節細胞（ＢＡＬＢ／ｃ）をマウスに静脈注射した。標識細胞の養子移入後２４時間で、組織を採取し、放射活性について評価した。細胞の非特異的トラッピングにより与えられる、組織における放射活性のバックグラウンドのレベルを２％ＰＢＳ緩衝化ホルムアルデヒドで固定した５×１０6 個の標識細胞の注射により評価した。結果を脾臓の％カウント／分（ＣＰＭ）で標準化し、バックグラウンドを補正した結腸におけるＣＰＭとして表した。
【０１８１】
このＣＤ４５ＲＢhiＣＤ４＋Ｔ細胞で再構築されたｓｃｉｄマウスの大腸への浸潤の定量的な評価は、同数のＣＤ４５ＲＢloＣＤ４＋Ｔ細胞で再構築されたｓｃｉｄレセプターに見られるレベルと比べ１０〜１００倍の局在化の増加を表した。この結腸における標識細胞の増加された蓄積を、抗β７と抗ＭＡｄＣＡＭモノクローナル抗体との組合せを用いて２週間処理することにより、５０〜７５％阻害した（図１９）。
【０１８２】
他の実験において、ｓｃｉｄマウスを５×１０4 個のＣＤ４５ＲＢhiまたはＣＤ４５ＲＢloＣＤ４+ Ｔ細胞で再構築した。再構築の際に、マウスを（ａ）５００μｇのＦＩＢ５０４（β７特異的）（６匹のマウス）；（ｂ）５００μｇのＭＥＣＡ−３６７（ＭＡｄＣＡＭ特異的）（３匹のマウス）；（ｃ）１ｍｇのイソタイプ適合対照抗体（７匹のマウス）；または、（ｄ）１ｍｇのＦＩＢ５０４＋ＭＥＣＡ−３６７（各５００μｇ）（５匹のマウス）のいずれかで処理した。再構築に続いて、抗体を１週間の間隔で投与した：（ａ）２５０μｇのＦＩＢ５０４；（ｂ）２５０μｇのＭＥＣＡ−３６７；（ｃ）５００μｇのイソタイプ適合対照；または（ｄ）５００μｇのＦＩＢ５０４＋ＭＥＣＡ−３６７（各２５０μｇ）。
【０１８３】
処理の４ヶ月後、マウスに５×１０6 個の111 Ｉｎ標識した腸間膜リンパ小節細胞（ＢＡＬＢ／ｃ）を注射し、放射活性のレベルを測定することにより結腸への補充を評価した。結果を図１９で述べるように計算した。再構築の時間から始めて、ＦＩＢ５０４およびＭＥＣＡ−３６７を単独でまたは組み合わせて用いて４ヶ月間、ｓｃｉｄマウスを処理することで、結腸へのリンパ球の増加させた補充を１００％まで阻害した（図２０）。
【０１８４】
ｓｃｉｄマウスを、２．０×１０5 〜４．０×１０5 個のＣＤ４５ＲＢhiまたはＣＤ４５ＲＢloＣＤ４+ Ｔ細胞で再構築した。４ヶ月後、マウスをＦＩＢ５０４（β７特異的）＋ＭＥＣＡ−３６７（ＭＡｄＣＡＭ特異的）（全２００μｇ／日について１００μｇの各ＭＡｂ／日）またはイソタイプ適合対照抗体（２００μｇ／日）の組合せを用いて、１４日間処理した。抗体をＰＢＳ中においた。各実験群は４匹のマウスで構成した。右および左結腸の凍結断片を、マウスＣＤ４に特異的なラットモノクローナル抗体で染色し、ファストレッド（Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ）またはＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール）クロモーゲンのいずれかを用いて発現させた。各マウス由来の右結腸および左結腸の１横断面を、レイカ  クアンティメット５００イメージ  アナライザー（ａ  Ｌｅｉｃａ  Ｑｕａｎｔｉｍｅｔ  ５００  Ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いてＣＤ４のポジティブ染色について分析した。１０倍対物レンズを用いてその全体おける各部を調べた。有為さをｔ検定を用いて決定した。データは平均陽性数／組織領域±１標準偏差で表す。
【０１８５】
細胞系譜のマーカーおよび分化状態に対して特異的な抗体のパネルを用いる免疫組織化学による組織構造評価は、ＣＤ４５ＲＢhiＴ細胞で再構築されたｓｃｉｄマウスの結腸に浸潤している細胞が、実質上全てＣＤ４+ Ｔ細胞であることを示した。ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＢ２２０+ Ｂ細胞を、使用条件下では単離することができなかった。さらに、これらのマウスをβ７およびＭＡｄＣＡＭ特異的モノクローナル抗体の組合せで処理することにより、対照に関して上行または下行結腸中のＣＤ４+ Ｔ細胞数を有為に減少させた（図２１）。腸間膜リンパ小節細胞の約９５％がリンパ球であるので、これらの結果は、リンパ球上のα４β７とＭＡｄＣＡＭとの相互作用が結腸中の炎症部へのリンパ球の補充に重要であり、この相互作用をブロックする薬剤が炎症を減少することができることを示している。
【０１８６】
実施例５  吸収不良性腸炎をもつ一般的なマーモセット（カリスリックス  ジャカハス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ））における柔突起変化の分析モデルの解説
一般的なマーモセット（カリスリックス  ジャカハス）は、新規の世界的な非ヒト霊長類であり、それらはニューイングランド地方霊長類研究センター（ＮＥＲＰＲＣ）での閉鎖条件下において、ステロイド非反応性、体重減少に特徴づけられる自発性吸収不良症候群、下痢、および吸収能の低下と一致した小腸粘膜変化を発現している。これらの組織構造の変化には小腸柔突起の萎縮および融合およびヒトにおけるセリアック症（非熱帯性スプルー）と同様、単核白血球の基底膜内への浸潤が含まれる。ＮＥＲＰＲＣでの病理学公記録保管文書から回顧した分析により、８０％以上の一般的なマーモセットが、様々な程度で、吸収不良性腸炎を持つことが死後の実験時に示された。
【０１８７】
抗体治療プロトコール
ＮＥＲＰＲＣにおいて、広い範囲のコロニーから成体の一般的なマーモセットを、研究用に選択した。全動物における基礎の研究には、身体検査、全血球数（ＣＢＣ）、血液化学プロフィール、血清Ｂ１７、ｃ−反応性蛋白質および腸壁切開による全厚み空腸生検を含まれた。腹部手術からの回復に続いて、動物を、２ｍｇ／ｋｇ／日のＡＴＣ−１モノクローナル抗体、α４β７の配座エピトープに対するブロッキングモノクローナル抗体で１４日間処理した（シュバイホッファーら（Ｓｃｈｗｅｉｇｈｏｆｆｅｒ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：７１７−７２９，１９９３）。以前の研究により、この抗体はカリスリックス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）α４β７と交差反応することが示された。抗体治療前に行われた全ての評価を第１０日目と第１４日目の抗体治療の間で繰り返した。
【０１８８】
空腸生検の分析
各マーモセット由来の全厚み空腸生検を２人の無関係な病理学者が組織学的に評価し、柔突起構造を次の格付け基準に従って評価した。
柔突起萎縮
０−正常の粘膜の厚さおよび柔突起の高さ
１−穏やかな萎縮；柔突起の軽微な短化；正常の約７５％の高さ
２−中程度の萎縮；正常の高さの約３３〜５０％の柔突起
３−激しい萎縮；短い（普通の３３％未満）または観察できる柔突起がない
柔突起融合
０−正常；融合なし
１−試料中１〜２個の柔突起が融合
２−試料中１〜２から５０％の間の柔突起が融合
３−試料中５０％より多い柔突起が融合
データ分析
各群の動物で得られる平均値間の違いを組み合わせｔ検定を用いて統計的な有為さについて評価した。Ｐが０．０５未満のとき平均値間の違いを有意であるとした。
【０１８９】
結果
ＡＴＣ−１モノクローナル抗体を用いた抗体治療の前後における柔突起の融合および萎縮についての平均値を図９および１０にそれぞれ示す。明らかに、柔突起萎縮（Ｐ＜０．０１）のほとんど完全な解消およびＡＴＣ−１抗体を用いた２週間にわたる治療後に柔突起融合改善の傾向があった。ＡＴＣ−１により認識されるもの以外のエピトープに対して方向づけられた様々なモノクローナル抗体で処理された他の動物は、柔突起の融合および萎縮値の減少に効果がないので、効果は外来免疫グロブリンにさらすという非特異的な効果に比べ二次的なものではなかった。
【０１９０】
実施例６  コットントップタマリン（ｔｈｅ  Ｃｏｔｔｏｎ  Ｔｏｐ  Ｔａｍａｒｉｎ）における結腸炎の消散
モデルの解説
コットントップタマリン（ＣＴＴ）（サグイナス  オエディプス（Ｓａｇｕｉｎｕｓ  ｏｅｄｉｐｕｓ））は、ヒトにおける潰瘍化結腸炎に臨床的および組織形態的に似た、自発的な、そしてしばしば慢性的な結腸炎を発生する新規の世界的な非ヒト霊長類である（マダラら（Ｍａｄａｒａ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．），Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，８８：１３−１９（１９８５））。
【０１９１】
免疫治療、臨床評価および粘膜生検
臨床評価、結腸粘膜生検および結腸炎ＣＴＴのＡＴＣ−１免疫治療を含む実験プロトコールを始めた（図１３）。ＡＴＣ−１はヒトα４β７と反応するネズミＩｇＧ１モノクローナル抗体である（シュバイホッファーら（Ｓｃｈｗｅｉｇｈｏｆｆｅｒ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：７１７−７２９（１９９３）；ラザロビッツら（Ｌａｚａｒｏｖｉｔｓ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：１８５７−１８６２（１９８４）；アールら（Ｅｒｌｅ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３．５１７−５２８（１９９４））。作用させた動物由来の結腸炎粘膜のＡＣＴ−１抗体で免疫組織学的染色することによって評価したところ、ＡＴＣ−１がタマリン中で交差反応することがわかった。これらの初期の試験的研究により、ヒト結腸炎粘膜と同様、作用させた動物由来の結腸の基底膜内にある単核細胞のうちの４０〜８０％がα４β７＋であることが示された。また、ＣＴＴ末梢血リンパ球（ＰＢＬ）についてフローサイトメトリーを用いたところ、ＡＴＣ−１がＣＴＴ由来のα４β７と交差反応することがわかった。
【０１９２】
下痢および体重減少の臨床診察に基づき、マサチューセッツ、ソウボロスにあるニューイングランド地方霊長類研究センターにおいて広範囲のコロニーから慢性結腸炎をもつＣＴＴを選んだ。結腸炎の存在を確認するため（２または３の組織学的炎症活性値で規定される）、臨床的るいそうおよび下痢を有すると記録されたコロニーの動物を、抗体免疫治療の実験的評価に先立って多くの機会に、結腸粘膜生検試料の通常の組織学的評価により結腸炎症活性について評価した（図１３）。小児科ファイバーオプティクス内視鏡（ａ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｆｉｂｅｒｏｐｔｉｃ  ｅｎｄｏｓｃｏｐｅ）を用いて、肛門から２〜３ｃｍにある末端下行結腸由来の粘膜試料試験により、少なくとも２度の結腸炎炎症活性について、慢性的な結腸炎ＣＴＴを予備選択した。炎症活性値は、基底膜、陰窩管腔、陰窩上皮および表皮内の好中球の相対数に基づいた。特に、急性および慢性炎症活性の組織病理学的な評価系を用いた（マダラら（Ｍａｄａｒａ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．），Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，８８：１３−１９（１９８５）により述べられている）。全生検試料について評価し、普通の粘膜を０、最も激しく炎症をおこした粘膜を３で表わすことで４群に選別した。０および１の値は、前兆となる結腸炎を表わさず、一方２〜３の値は、中程度から激しい結腸炎活性を表わす。研究用に選択された動物には、（１）一番目の生検試料において慢性の結腸炎を思わせるような、表面および陰窩上皮の中程度（階級２）または激しい（階級３）構造変化、（２）免疫治療前に３〜７日ばらばらに少なくとも２度生検試料において中程度（階級２）または激しい（階級３）炎症活性を有していた。これらの基準を満たす生検試料には陰窩分岐の存在および／または、基底膜および／または上皮区画のいずれにも多型核白血球（ＰＭＮ）の浸潤を伴う損失という特徴があった。
【０１９３】
従って、研究用に選択された動物は、結腸炎炎症活性および最近鎮静した形跡のない慢性の臨床的に関連した結腸炎を繰り返している形跡を有していた。さらに、モノクローナル抗体の投与初日に持続する下痢は、研究に含まれる動物には必須である。結腸炎の確認から５日以内に、動物はＡＴＣ−１モノクローナル抗体を用いて免疫治療を始めた。
【０１９４】
滅菌した発熱原を有しない流動路を用いて中空繊維細胞発酵層中で培養することにより、ＡＴＣ−１を生産させ、Ａ蛋白質アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で使用する前に滅菌０．９％ＮａＣｌ中に希釈した。また、ＣＴＴは絶滅に瀕した種であるので、結腸炎ＣＴＴに投与する前に抗体の薬物速度論的解析を行なうために、関連した種である一般的なマーモセット（カリスリックス  ジャカハス）由来のＰＢＬにおいて、ＡＣＴ−１がα４β７と交差反応することが示された。研究のこの成分について、始めに静脈に１回注入し、２４時間後に次に筋肉内注射した際に、ＡＣＴ−１は２匹の正常な成体の一般的マーモセットに投与した。これらの動物において２．０ｍｇ／ｋｇのＡＴＣ−１の静脈投与は、１回の筋肉内注射後２〜２４時間の間で抗体の継続した吸収を用い、約５０時間の半減期と考えられる血清を生産した。この投与形式を用い、抗体の山の血清濃度は、約６０μｇ／ｍＬであり、一方谷の濃度は１８．０μｇ／ｍＬ以上であった。有害な臨床効果は、ＡＣＴ−１を投与されたマーモセットには見られなかった。
【０１９５】
これらの観点において、研究要件（ｎ＝４；集齢＝３１齢）を満たすコットントップタマリンの半数に第１日目に２．０ｍｇ／ｋｇの投与量でＡＣＴ−１の丸薬を静脈内（ｉ．ｖ．）に１回投与し、続いて２４時間毎に同じ量の筋内（Ｉ．Ｍ．）注射を７回し、全部で８日間の免疫治療を施された。他の半数の慢性的結腸炎対照動物（ｎ＝４；集齢＝２６齢）には、抗体８６Ｄ、ＣＴＴ中で交差反応しない（データを示さず）ヒツジＴＣＲγδに対するネズミモノクローナル抗体を与えた（マッカイら（Ｍａｃｋａｙ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９：１４７７−１４８３（１９８９））。この無関係なイソタイプ適合抗体を生産し、精製し、ＡＣＴ−１として同一の条件下で投与した。
【０１９６】
結腸粘膜生検を再び第一回抗体投与（第０日）の時点、および第５、第１０および第２０日に採取した。生検を無関係な組織学者が評価した。追加の結腸生検を免疫組織学のために凍結した。組織構造分析について、肛門から２〜３ｃｍで採取した結腸粘膜生検試料を、ＯＣＴ組成物中で直ぐに急速冷凍し、近接した範囲から採取した複製試料を１０％リン酸緩衝ホルマリン中で固定し、普通の組織学的技術により加工し、パラフィン中で包埋して６．０μｍの厚さに切り、断片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。続いて、ホルマリン固定試料を組織構造について試験した。アセトン固定され、凍結された断片を用い、以前に述べたアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ免疫組織化学的技術（レイラーら（Ｒｉｎｇｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．），Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，４９：３４９−３６４（１９８８））の順に第一抗体を除去することによりインビボで投与されたネズミＩｇＧ１を検出した。
【０１９７】
動物管理人には、治療方式（ＡＣＴ−１対イソタイプ適合無関係モノクローナル抗体）について分からないようにし、下痢、半固体または固体のように糞を分類することにより、１日あたりの基準について、各動物における糞の粘稠度を評価した。値は次のように割当てた：０、形のある固体の糞；１、数個の固形物を有する液体状の糞（半固体）；２、液体状の糞（下痢）。動物を一日おきに体重測定し、一方、血液を同じ間隔でフローサイトメトリー、血液学、および抗体濃度、抗マウスＩｇＧ力価、臨床化学、または急性期蛋白質等のさらなる分析のための血清または血漿の保存用に採取した。
コンピューター補助された形態計測映像分析
定量的な、コンピューター補助された、粘膜生検断片の形態計測分析をレイカ  クアンティメット５００イメージアナライザーを用いて行なった。最初にアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ技術を用いて、以前に述べたように（リングラーら（Ｒｉｎｇｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．），Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，４９：３４９−３６４（１９８８））、粘膜断片の免疫組織化学的分析を行ない、特異的な白血球細胞型を詳細にした。好中球、β７+ 細胞および単球／マクロファージ（Ｍφ）を同定するために、それぞれ一次試薬として順に、ヒツジ抗エラスターゼポリクローナル抗体（バイオデザイン、ケンネブルク、ＭＥ）を好中球を同定するために、パラホルムアルデヒド−、アセトン−、またはホルマリンー固定化凍結断片を使用して、ＦＩＢ２１モノクローナル抗体（ラットＩｇＧ２ａ）をβ７鎖を同定するために（アンドリューら（Ａｎｄｒｅｗ，Ｄ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３：３８４７−３８６１（１９９４））、およびＨＡＭ−５６モノクローナル抗体（マウスＩｇＭ）をマクロファージを同定するために（ダコ株式会社、カーピンテリア、ＣＡ）用いた。エラスターゼ抗体を用いて染色された組織断片の試験から、この試薬だけがＣＴＴ結腸粘膜中の多型核白血球細胞を認識したことが詳細に記録された。ＴおよびＢ細胞を数えるために、それぞれ、第一試薬として順に、ヒトＣＤ３へのウサギポリクローナル抗体（ダコ株式会社、カーピンテリア、ＣＡ）、およびＬ２６モノクローナル抗体（マウスＩｇＧ２ａ）（ダコ株式会社、カーピンテリア、ＣＡ）を用いて、ホルマリン固定化、パラフィン包埋化組織断片を使用した。第一抗体検出用に、種およびイソタイプ特異的第二試薬を、組織中におけるＡＣＴ−１または無関係なネズミＩｇＧ１抗体の認識を排除するために用いた。免疫組織化学的手段後、各細胞数を２〜４個の任意の粘膜の領域／断片において数えた。細胞を褐色ジアミノベンジジン反応生成物から生じる色波長に基づいて選択したところ、色選択基準は各細胞特異的マーカーについて分析した全断片において同一であった。凍結断片の形態およびβ７＋白血球およびマクロファージの高い相関密度のために、これらの細胞型の定量化を、粘膜の免疫反応断片域として推定し、一方、全ての他の白血球細胞を、細胞数／粘膜域として評価した。ある特定の時点における各動物の生検試料由来の値と第０日の同一の動物から得られる値とを比較して得られる値は、処理群内で前処理（第０日）値の平均（±１ＳＥＭ）％で表した。従って、１００％未満の値（下記表３に太字で記載）は、前処理試料と比較して白血球細胞密度の減少を表しており、一方１００％を数える値は、粘膜白血球細胞密度の増加を表している。組み合わせｔ検定を用い、ある特定の時点における細胞密度の平均の未処理値と前処理時の値とを比較することで、有為さを決定した。平均値間の差は、Ｐが０．０５未満の時、有為であると考えた。
【０１９８】
血液学およびフローサイトメトリー
α４β７インテグリンを発現するリンパ球を、以前に述べた方法（マッカイら（Ｍａｃｋａｙ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９：１４７７−１４８３（１９８９））を用い、フローサイトメトリーおよびＡＣＴ−１モノクローナル抗体により数えた。ＡＣＴ−１の飽和血清濃度を、注入プロトコールで達成したので、血清中に外来投与されたＡＣＴ−１を用いて、血液中のα４β７＋リンパ球数を数えることができた。簡単には、１００μＬのＥＤＴＡで凝血を阻止させた血液をＰＢＳ／１０％ウサギ血清／５％ヒトＡＢ血清で２０分間４℃で希釈することにより、各血液コレクションにおける各動物由来の全血液を分析した。ブロッキング血清を除去した後、ＡＣＴ−１で処理された動物の場合には、血球を、直接１００μＬのフルオレセイン結合したウサギ抗マウスＩｇＧ（ダコ株式会社、カーピンテリア、ＣＡ）とインキュベートさせるか又は、無関係な抗体または前処理血液試料を与えた動物の場合、続いて二次抗体で１０μｇ／ｍＬになるように血液にＡＣＴ−１を添加した。各試料について、最小限の１０，０００個の細胞を分析した。ベーカー５０００血液分析機（ａ  Ｂａｋｅｒ  ５００  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎａｌｙｚｅｒ）を用い適切にコットントップタマリン赤血球、白血球および血小板を排除して、普通の血球値および示差解析を行なった。血液分析、およびフローサイトメトリーの結果から、血液のμＬあたりのα４β７＋リンパ球の絶対数を計算した。
【０１９９】
結果／推論
血清濃度
研究の初めの１０日間にＡＣＴ−１および無関係なイソタイプ適合抗体の血清濃度は、一般的に両方とも１０μｇ／ｍＬ以上であった。研究２〜１０日目に、１０μｇ／ｍＬの濃度で全血液中に用いたビオチン化ＡＣＴ−１は、ＡＣＴ−１で処理された動物におけるフローサイトメトリーにより評価される際に、有為な標識末梢リンパ球を欠乏させ、一方、第０日の無関係な抗体で処理された動物において同じ抗体は、ヒトリンパ球におけるＡＣＴ−１の染色プロフィールと同様に、７０〜９０％の間の末梢リンパ球プールを認識した。まとめると、これらの結果は、結腸炎ＣＴＴにおけるＡＣＴ−１に関する治療プロトコールが、末梢循環のリンパ球上のα４β７インテグリンの飽和を導くということを示した。
【０２００】
また、結腸炎ＣＴＴの結腸粘膜の基底膜内にある、血管外のα４β７+ 細胞を認識するＡＣＴ−１の能力を評価した。免疫組織化学的技術を用いて研究動物由来の結腸粘膜生検中のネズミＩｇＧ１を検出し、予想されるように、抗体注入前の第０日目からではなく、ＡＣＴ−１で処理された動物における研究の最初の１０日間で、全ての生検時点において、基底膜内にある単核白血球細胞膜について、ＡＣＴ−１を観察した。標識されていない基底膜細胞を無関係な抗体を投与した動物内で観察した。従って、研究において利用された投与形式は、ＡＣＴ−１の血清濃度を中和し、付随する血管外の認識し、および結腸炎粘膜内の免疫細胞を標識した。ＡＣＴ−１抗体は、標的部位、即ち、末梢血液内のリンパ球、および特に結腸炎粘膜内の血管外の区画に位置していた。
【０２０１】
臨床効果
４匹の試験動物は全て、前処理および第０日の生検試料の両方において、段階２または３のどちらかの結腸炎炎症活性を維持し、そのために３種の動物を５日までに分離させた。加えて、４匹全ての動物の粘膜構造内の変化は、これら４匹の動物が持続性の結腸炎を有することを証明した。従って、全ての動物は慢性病の病歴をもつことが明らかとなった。
【０２０２】
結腸粘膜生検の組織病理学的解析を行った。ＡＣＴ−１を用いた免疫治療の前および５日後における典型的なＣＴＴ（動物Ｓｇｏ  ３２６−８４およびＳｇｏ  １７−８５）からの結果は、結腸炎ＣＴＴ中の結腸粘膜の顕微鏡的変化に対するＡＣＴ−１免疫治療の治療効果を説明した。免疫治療前に、上皮区画および陰窩管腔内に化膿した滲出物があり、完全に区別される杯状細胞の喪失で特徴づけられる未成熟上皮および基底膜が単核白血球および化膿した炎症性浸潤により広げられた（Ｓｇｏ  ３２６−８４、筋肉粘膜）。ＡＣＴ−１免疫治療後、免疫組織化学技術を用いて、基底膜内に単核白血球細胞膜にＡＣＴ−１を位置づけさせ（Ｓｇｏ  １７−８５、筋肉粘膜）、好中球成分の炎症浸潤が解消し、完全に分化した杯状細胞を観察し、そして基底膜は単核白血球または／および好中球により、さらに広げられなかった（Ｓｇｏ  ３２６−８４）。
【０２０３】
結腸炎ＣＴＴの糞粘稠度に対するＡＣＴ−１の治療効果は著しかった（図１４）。１回目の投与後２４時間以内に、下痢が少なくとも半固体糞成分へ改善することが観察され、一方、７２時間までに全ての動物において、固体糞への完全な解消が全ての動物において生じた。対照動物は改善せず、全研究期間中、下痢であることが観察され、加えて、この動物群に対する前選択の基準が、効果的に自然な鎮静をもつものを除去することが示された。
【０２０４】
全ての動物は、抗体注射終了後約１週間、固体糞を維持した（図１１）。個々の動物に関して、１匹の動物（Ｓｇｏ  ６３−９３）は第４日目から第２０日目のプロトコールの終了まで固体糞をした（図１１）。２匹の動物（Ｓｇｏ  １２９−９１、Ｓｇｏ  １７−８５）は、研究第１４日後に半固体糞に逆戻りした（図１１）。４匹目の動物（Ｓｇｏ  ３２６−８４）は、第６日〜第２０日の間、下痢の持続的な改善／解消を示した。
【０２０５】
同様に、結腸における白血球浸潤が、ＡＣＴ−１を投与されたＣＴＴにおいて著しく和らげられた。前処理生検と比べ、ＡＣＴ−１で処理された動物由来の結腸粘膜（結腸粘膜のホルマリン固定化生検試料）の組織分析は、浸潤活性および付随した粘膜の構造的変化において改善を示した。結腸炎症活性の組織評価系（マダラら（Ｍａｄａｒａ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．），Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，８８：１３−１９（１９８５））を用いたところ、ＡＣＴ−１で処理された動物は基準の前処理値と比べ、全ての時点において炎症活性値の著しい減少をしており、一方、対照抗体を投与した動物の値は変化しなかった（図１５）。第２０日の無関係処理群の炎症値には変化がなかった（図１５）。ＡＣＴ−１処理された群の全ての時点で炎症活性の平均未処理値は統計的に第０日での同じ動物の値より低かった（第５日および第１０日、Ｐ＜０．０５；第２０日、Ｐ＜０．０１）。
【０２０６】
個々の動物に関して、４匹全ての試験動物は、ＡＣＴ−１免疫治療の間または後に炎症活性に改善を示した。２匹の動物（Ｓｇｏ  １２９−９１およびＳｇｏ  １７−８５）における結腸炎は完全に第１０日までに解消された（図１２）。他の動物（Ｓｇｏ  ６３−９３）は第２０日までに結腸炎活性の完全な解消を示さず、一方４匹目の動物（Ｓｇｏ３２６−８４）の粘膜生検値は研究期間の間ずっと改善を示した（図１２；Ｓｇｏ  ３２６−８４における第２０日の２つの生検は０および１と評価された）。さらに、動物３２６−８４は研究期間中、元の体重の２０％増加した。
【０２０７】
効果のより定量的な評価を提供するために、全ての研究動物由来の結腸粘膜内にある白血球部分集合のコンピューター補助した形態映像分析を行った。表３は慢性結腸炎ＣＴＴの結腸炎症活性に対するＡＣＴ−１免疫治療の効果の分析結果を示している（前処理値のパーセントとして表現）。ＡＣＴ−１免疫治療により、抗体投与前に測定される基準数と比較して粘膜白血球の密度が大幅に減少し、一方対照群は無関係抗体の投与後に一般的に同数の又は増加した粘膜白血球数を有していた。ＡＣＴ−１抗体の第１回投与後１０日で、前処理値に比べ約３０％弱の粘膜単核白血球がβ７インテグリンを発現していた。この減少は末梢循環プールのα４β７＋白血球数を減少させず（図１６）、また対照動物由来の結腸粘膜中のα４β７＋白血球数が増加または大きく変化しないままなので、操作または非特異的な効果にも関係しない。同様に、粘膜Ｔ細胞は、ＡＣＴ−１で処理した動物において第５日目で約５０％に、第１０日目で約２５％にまで減少し、一方、同じ時点における無関係抗体群の粘膜Ｔ細胞は変化しなかった。粘膜Ｂ細胞において比較できるような減少は、ＡＣＴ−１処理群には見られたが、対照群には見られなかった。また、興味深いことにＡＣＴ−１免疫治療は、α４β７を僅かまたはほとんど発現しない粘膜白血球の密度を減少した。好中球は第１０日と第２０日で４０〜４５％まで、ＡＣＴ−１処理された動物においては２０％にまで減少したが、ＰＭＮの減少は対照群では観察されなかった。同様に粘膜マクロファージは、全ての治療後生検試料においてＡＣＴ−１を投与した動物において３０〜４５％にまで減少し、一方対照群におけるマクロファージは変化しなかった。興味深いことに、免疫組織化学およびクローン化されたヒトＭＡｄＣＡＭ（１０Ｇ３、実施例２）に特異的な交差反応性モノクローナル抗体を用いたところ、ＡＣＴ−１または対照抗体で処理された結腸炎ＣＴＴにおいて、発現の変化が見られなかった。
【０２０８】
【表３】
2008231112.tif 000004
ＡＣＴ−１投与に帰することができる研究動物において、明白な毒性は観察されなかった。研究動物のうちで肝臓および腎臓の機能の臨床化学評価に変化が見られるものはなかった（データ示さず）。ＡＣＴ−１抗体は非分解性モノクローナル試薬であり（ラザロビッツら（Ｌａｚａｒｏｖｉｔｓ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：１８５７−１８６２（１９８４））、白血球減少は、研究の間、どの動物にも見られなかった。実際に、研究の始めの週の間、対照動物を含む全ての試験動物において好中球に対する傾向（周辺血液におけるピーク数は４０×１０3 ／μＬに近く；ＣＴＴ標準範囲は１．４−１２．０×１０3 ／μＬ）があった。その際に、抗体を投与するのに毎日の麻酔／操作が用いられた。また、周辺血液におけるリンパ球の絶対数が１８×１０3 ／μＬ近くになるような（ＣＴＴ通常範囲は０．６−５．７×１０3 ／μＬである）ＡＣＴ−１を投与された動物におけるリンパ球増加に対する傾向があった。。従って、ＡＣＴ−１処理群の結腸への白血球細胞型の補充の減少により、末梢循環プール中の白血球数を変化させることはできなかった。
【０２０９】
要約
慢性結腸炎コットントップタマリンに投与した際に、α４β７インテグリンに対するモノクローナル抗体は、下痢および結腸炎症活性を急速に解消して、結腸炎を改善する効果を示した。これらは組織炎症活性値と糞粘稠度との間に完全な相互関係があることを明らかにした。糞粘稠度が、一般的にＡＣＴ−１抗体を受けた動物において１−２日で改善されるという観察結果は注目すべきものである。更に、粘膜白血球部分集合の関連した密度は、一般的に抗α４β７抗体を用いた免疫治療に応じて弱められた。また、これらの結果は、器官または組織特異的（粘膜特異的）であるような炎症過程に対して効き目のある治療を明らかにしている。
【０２１０】
結腸炎ＣＴＴにおけるＡＣＴ−１の治療効果は、消化管へのリンパ球補充の阻害により媒介されるかもしれない。代わりに、または加えて、観察された治療効果は、他の細胞相互作用における変化またはα４β７インテグリンにより媒介される前兆事象における変化に影響するかもしれない。これらの結果は、ＡＣＴ−１抗体がα４β７インテグリン作用の効果的なアンタゴニストであり、α４β７インテグリン作用の阻害が炎症腸疾患を有する個々動物の臨床治療技術における器官または組織特異的な処理方法とすることができることを示している。さらに、結果は、炎症性腸疾患の病原におけるα４β７インテグリンの役割を示している。α４β７インテグリンは、潜在的に、炎症性腸疾患に対する組織特異的な治療標的を提供する。
【０２１１】
均等物
当業者は、日常の実験を用いるだけで、ここで詳細に記載された本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。かかる均等物は、請求の範囲に包含されることを意図する。
【０２１２】
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
［１］  霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする単離された核酸。
［２］  単離された核酸が組換え体である、［１］記載の単離された核酸。
［３］  該核酸がストリンジェントな条件下で二番目の核酸とハイブリダイズし、該二番目の核酸が図１（配列番号：１）、図２（配列番号：３）または図３（配列番号：５）に示されるヌクレオチド配列を有する、［１］記載の単離された核酸。
［４］  該核酸が本質的に純粋である、［３］記載の単離された核酸。
［５］  該核酸が図１（配列番号：２）に示されるポリペプチド、図２（配列番号：４）に示されるポリペプチド、図３（配列番号：６）に示されるポリペプチドまたは対応する成熟蛋白質をコードする、［１］記載の単離された核酸。
［６］  組換え核酸である、［５］記載の単離された核酸。
［７］  該核酸が本質的に純粋である、［５］記載の単離された核酸。
［８］  図１（配列番号：１）に示されるヌクレオチド配列、図２（配列番号：３）に示されるヌクレオチド配列、図３（配列番号：５）に示されるヌクレオチド配列およびコード配列を含有してなる前記のいずれかの一部からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を有する［５］記載の単離された核酸。
［９］  ［１］記載の核酸を含有してなる組換え核酸構築物。
［１０］  組換え核酸が発現制御配列に実施可能に連結している、［９］記載の組換え核酸構築物。
［１１］  該核酸が図１（配列番号：２）、図２（配列番号：４）、図３（配列番号：６）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸を含有してなる［９］記載の組換え核酸構築物。
［１２］  核酸が発現制御配列に実施可能に連結している、［１１］記載の組換え構築物。
［１３］  単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭ。
［１４］  霊長類ＭＡｄＣＡＭがヒトＭＡｄＣＡＭであり、ストリンジェントな条件下で二番目の核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされ、該二番目の核酸が図１（配列番号：１）または図２（配列番号：３）に示されるヌクレオチド配列を有する、［１３］記載の単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭ。
［１５］  霊長類ＭＡｄＣＡＭが図１（配列番号：２）、図２（配列番号：４）に示されるヒトＭＡｄＣＡＭまたは前記のいずれかの対応する成熟蛋白質である、［１３］記載の単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭ。
［１６］  霊長類ＭＡｄＣＡＭがアカゲザルＭＡｄＣＡＭであり、ストリンジェントな条件下で二番目の核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされ、該二番目の核酸が図３（配列番号：５）に示されるヌクレオチド配列を有する、［１３］記載の単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭ。
［１７］  霊長類ＭＡｄＣＡＭが図３（配列番号：６）に示されるアカゲザルＭＡｄＣＡＭまたは対応する成熟蛋白質である、［１３］記載の単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭ。
［１８］  図１（配列番号：２）の１９〜４０６、図２（配列番号：４）の１９〜３８２または図３（配列番号：６）の２２〜３４６のアミノ酸からなるアミノ酸配列を本質的に有する［１５］記載の単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭ。
［１９］  α４β７インテグリンへの結合および細胞接着の媒介からなる群より選ばれた１以上の機能を有する単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭ。
［２０］  細胞接着がα４β７インテグリン依存性である、［１９］記載の単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭ。
［２１］  結合がα４β７に対して選択的である、［２０］記載の単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭ。
［２２］  ［２］記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
［２３］  核酸が発現制御配列に実施可能に連結し、それによって宿主細胞を発現に適した条件下で維持した時に霊長類ＭＡｄＣＡＭが発現される、［２２］記載の宿主細胞。
［２４］  霊長類ＭＡｄＣＡＭを含有してなる融合蛋白質。
［２５］  第１部分および第２部分を含有してなり、該第１部分が霊長類ＭＡｄＣＡＭであり、該第２部分が少なくとも免疫グロブリン鎖またはその変異体の一部である、［２４］記載の融合蛋白質。
［２６］  該第１部分がそれのＣ末端で第２部分のＮ末端に結合している、［２５］記載の融合蛋白質。
［２７］  第１部分が全細胞外ドメインを含むヒトＭＡｄＣＡＭの断片および２つのＮ末端免疫グロブリンドメインを含むヒトＭＡｄＣＡＭの断片からなる群より選ばれた、［２５］記載の融合蛋白質。
［２８］  第２部分が少なくとも免疫グロブリン重鎖定常部またはその変異体の一部である、［２５］記載の融合蛋白質。
［２９］  免疫グロブリン重鎖がＩｇＧクラスである、［２８］記載の融合蛋白質。
［３０］  第２部分が免疫グロブリン重鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する、［２８］記載の融合蛋白質。
［３１］  ［２５］記載の融合蛋白質を含有してなるハイブリッド免疫グロブリン。
［３２］  該ハイブリッド免疫グロブリンがホモ二量体である、［３１］記載の融合蛋白質を含有してなるハイブリッド免疫グロブリン。
［３３］  必要に応じてコード配列が発現制御配列に実施可能に連結している、［２４］記載の融合蛋白質をコードするコード配列を含む核酸を含有してなる核酸構築物。
［３４］  必要に応じてコード配列が発現制御配列に実施可能に連結している、［２５］記載の融合蛋白質をコードする配列を含む核酸を含有してなる、核酸構築物。
［３５］  下記工程からなる霊長類ＭＡｄＣＡＭの製造方法：
（ａ）  宿主細胞に霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする核酸を含有してなる核酸構築物を導入し、それによって少なくとも１つの発現制御配列に実施可能に連結された該コード配列を有する組換え宿主細胞を製造する工程；および
（ｂ）  工程（ａ）において製造された宿主細胞を核酸が発現される条件下で適した培地中で維持する工程。
［３６］  さらに霊長類ＭＡｄＣＡＭを単離する工程を有する、［３５］記載の方法。
［３７］  霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする組換え核酸を含む宿主細胞を核酸の発現に適した条件下で維持し、それによって霊長類ＭＡｄＣＡＭが製造される工程からなる霊長類ＭＡｄＣＡＭの製造方法。
［３８］  さらに霊長類ＭＡｄＣＡＭを単離する工程を有する［３７］記載の方法。
［３９］  霊長類ＭＡｄＣＡＭに結合する抗体またはその機能的部分。
［４０］  該抗体が霊長類ＭＡｄＣＡＭの１以上の機能を阻害することができる、［３９］記載の抗体。
［４１］  該抗体が選択的にα４β７依存性接着を阻害することができる、［３９］記載の抗体。
［４２］  霊長類がヒトである、［４０］記載の抗体。
［４３］  下記工程からなる試料中の選択された霊長類ＭａｄＣＡＭの検出方法：
ａ）  選択された霊長類ＭＡｄＣＡＭへの該抗体の特異的結合に適した条件下で単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭと結合する抗体に試料を接触させる工程；および
ｃ）  抗体−ＭＡｄＣＡＭ複合体を検出する工程。
［４４］  単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭに対するリガンドの結合に適した条件下で試験される薬物を単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭと組み合わせて（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）、該薬物および霊長類ＭＡｄＣＡＭ間の複合体の形成を検出または測定する工程からなる、霊長類ＭＡｄＣＡＭのリガンドまたは霊長類ＭＡｄＣＡＭと結合する薬物の検出または同定方法。
［４５］  下記工程からなる霊長類ＭＡｄＣＡＭのリガンドまたは霊長類ＭＡｄＣＡＭと結合する薬物の検出または同定方法。
ａ）  組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭに対するリガンドの結合に適した条件下で試験される薬物を組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭを発現する宿主細胞と組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）工程；および
ｂ）  該薬物および霊長類ＭＡｄＣＡＭ間の複合体の形成を検出または測定する工程。
［４６］  下記工程からなる霊長類ＭＡｄＣＡＭのそのリガンドへの結合の阻害剤の検出方法：
ａ）  霊長類ＭＡｄＣＡＭに対するリガンドの結合に適した条件下で試験される薬物を霊長類ＭＡｄＣＡＭのリガンドおよび単離されたおよび／または組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭを含有してなる組成物と組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）工程；および
ｂ）  霊長類ＭＡｄＣＡＭおよびリガンド間の結合を検出または測定し、それによって適したコントロールと比較して減少した結合が該薬物が阻害剤であることを示す工程。
［４７］  単離されたおよび／または組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭが融合蛋白質である、［４６］記載の方法。
［４８］  単離されたおよび／または組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭを含有してなる組成物が組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭを発現している宿主細胞を含む、［４６］記載の方法。
［４９］  下記工程からなる、ＭＡｄＣＡＭにより媒介される細胞接着の阻害剤の検出方法：
ａ）  試験される薬物、組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭを発現している第１細胞およびα４β７インテグリンを有している第２細胞を該第１細胞の該第２細胞への接着に適した条件下で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）工程；および
ｂ）  該第１および第２細胞間の接着を検出または測定し、それによって適したコントロールと比較して減少した接着が該薬物が阻害剤であることを示す工程。
［５０］  薬物が抗体または抗体断片である［４９］記載の方法。
［５１］  白血球のＭＡｄＣＡＭへの結合を阻害できる有効量の抗体を個体に投与する工程からなる、分子ＭＡｄＣＡＭを発現している組織の白血球浸潤と関連する疾患を有する個体の治療方法。
［５２］  疾患が分子ＭＡｄＣＡＭを発現する腸−関連内皮への白血球の結合の結果としての胃腸管または他の組織への白血球補充と関連する疾患であり、抗体が白血球の内皮ＭＡｄＣＡＭへの結合を阻害できる［５１］記載の方法。
［５３］  抗体がモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である［５２］記載の方法。
［５４］  モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がβ７鎖を含んでいるインテグリンを発現している白血球およびＭＡｄＣＡＭを発現している内皮の接着を阻害する［５３］記載の方法。
［５５］  モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がα４β７インテグリンと結合する［５４］記載の方法。
［５６］  モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がβ７と結合する［５５］記載の方法。
［５７］  モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＭＡｄＣＡＭと結合する［５６］記載の方法。
［５８］  モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＦＩＢ  ２１、ＦＩＢ  ３０、ＦＩＢ  ５０４およびＡＣＴ−１からなる群より選ばれたモノクローナル抗体の抗原特異性を有する［５４］記載の方法。
［５９］  モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＦＩＢ  ２１、ＦＩＢ  ３０、ＦＩＢ  ５０４およびＡＣＴ−１からなる群より選ばれ、またはその抗原結合断片である［５８］記載の方法。
［６０］  モノクローナル抗体がＡＣＴ−１である［５９］記載の方法。
［６１］  モノクローナル抗体がキメラ抗体およびヒトに適合させた抗体からなる群より選ばれる［５４］記載の方法。
［６２］  白血球がリンパ球である［５４］記載の方法。
［６３］  白血球が単球である［５４］記載の方法。
［６４］  疾患が炎症性の腸疾患である［５４］記載の方法。
［６５］  疾患が潰瘍性結腸炎である［６４］記載の方法。
［６６］  疾患がクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）である［６４］記載の方法。
［６７］  疾患が腹腔疾患、セロネガティブ関節症に関連する腸疾患、微細もしくはコラーゲン蓄積大腸炎、好酸球性胃腸炎、または窩炎である［６４］記載の方法。
［６８］  モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がα４β７と結合する［６４］記載の方法。
［６９］  モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＭＡｄＣＡＭと結合する［６４］記載の方法。
［７０］  モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＦＩＢ  ２１、ＦＩＢ  ３０、ＦＩＢ  ５０４およびＡＣＴ−１からなる群より選ばれたモノクローナル抗体の抗原特異性を有する［６４］記載の方法。
［７１］  モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＦＩＢ  ２１、ＦＩＢ  ３０、ＦＩＢ  ５０４およびＡＣＴ−１からなる群より選ばれ、またはその抗原結合断片である［７０］記載の方法。
［７２］  モノクローナル抗体がＡＣＴ−１である［７１］記載の方法。
［７３］  モノクローナル抗体がキメラ抗体およびヒトに適合させた抗体からなる群より選ばれる［６４］記載の方法。
［７４］  白血球の内皮ＭＡｄＣＡＭへの結合を阻害する１以上のモノクローナル抗体が投与される［６４］記載の方法。
［７５］  白血球の内皮リガンドへの結合を阻害する１以上のモノクローナル抗体が投与される［６４］記載の方法。
［７６］  少なくとも１のモノクローナル抗体がＭＡｄＣＡＭ以外の内皮リガンドへの白血球の結合を阻害する［７５］記載の方法。
［７７］  内皮ＭＡｄＣＡＭまたはα４β７インテグリンと結合する有効量の抗体を個体に投与する工程からなる個体における炎症性の腸疾患の治療方法。
［７８］  抗体がモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である［７７］記載の方法。
［７９］  モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がα４β７インテグリンと結合する［７８］記載の方法。
［８０］  モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がβ７と結合する［７９］記載の方法。
［８１］  モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＭＡｄＣＡＭと結合する［７８］記載の方法。
［８２］  モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＦＩＢ  ２１、ＦＩＢ  ３０、ＦＩＢ  ５０４およびＡＣＴ−１からなる群より選ばれたモノクローナル抗体の抗原特異性を有する［７８］記載の方法。
［８３］  モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＦＩＢ  ２１、ＦＩＢ  ３０、ＦＩＢ  ５０４およびＡＣＴ−１からなる群より選ばれ、またはその抗原結合断片である［８２］記載の方法。
［８４］  モノクローナル抗体がＡＣＴ−１である［８３］記載の方法。
［８５］  モノクローナル抗体がキメラ抗体およびヒトに適合させた抗体からなる群より選ばれる［７８］記載の方法。
［８６］  疾患が潰瘍性結腸炎である［７８］記載の方法。
［８７］  疾患がクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）である［７８］記載の方法。
［８８］  疾患が腹腔疾患、セロネガティブ関節症に関連する腸疾患、微細もしくはコラーゲン蓄積大腸炎、好酸球性胃腸炎、または窩炎である［７８］記載の方法。
［８９］  霊長類ＭＡｄＣＡＭに対して特異性を有する抗体の有効量を投与する工程からなる、分子ＭＡｄＣＡＭを発現している組織の白血球浸潤と関連する疾患を有する霊長類の治療方法。
［９０］  抗体が霊長類ＭＡｄＣＡＭのα４β７インテグリンとの相互作用を阻害することができる、［８９］記載の方法。
［９１］  疾患が分子ＭＡｄＣＡＭを発現する腸−関連内皮への白血球の結合の結果としての組織の白血球浸潤と関連する疾患である、［８９］記載の方法。
［９２］  霊長類ＭＡｄＣＡＭと結合する抗体の有効量を霊長類に投与する工程からなる、霊長類における炎症性腸疾患の治療方法。
［９３］  抗体が霊長類ＭＡｄＣＡＭのα４β７インテグリンとの相互作用を阻害できる、［９２］記載の方法。
［９４］  霊長類ＭＡｄＣＡＭの有効量または霊長類ＭＡｄＣＡＭを含有してなるハイブリッド免疫グロブリンの有効量を投与する工程からなる、分子ＭＡｄＣＡＭ−１を発現している組織の白血球浸潤と関連する疾患を有する霊長類の治療方法。
［９５］  霊長類ＭＡｄＣＡＭまたは霊長類ＭＡｄＣＡＭを含有してなるハイブリッド免疫グロブリンが、霊長類ＭＡｄＣＡＭのα４β７インテグリンとの相互作用を阻害することができる、［９４］記載の方法。
［９６］  該ハイブリッド免疫グロブリンが融合蛋白質を含み、第１部分および第２部分を含有してなり、該第１部分が霊長類ＭＡｄＣＡＭであり、該第２部分が少なくとも免疫グロブリン鎖の一部である、［９４］記載の方法。
［９７］  疾患が分子ＭＡｄＣＡＭを発現する腸−関連内皮への白血球の結合の結果としての組織の白血球浸潤と関連する疾患である、［９４］記載の方法。
［９８］  霊長類ＭＡｄＣＡＭの有効量または霊長類ＭＡｄＣＡＭを含有してなるハイブリッド免疫グロブリンの有効量を霊長類に投与する工程からなる、霊長類における炎症性の腸疾患の治療方法。
［９９］  霊長類ＭＡｄＣＡＭまたは霊長類ＭＡｄＣＡＭを含有してなるハイブリッド免疫グロブリンが、霊長類ＭＡｄＣＡＭのα４β７インテグリンとの相互作用を阻害することができる、［９８］記載の方法。
［１００］  該ハイブリッド免疫グロブリンが融合蛋白質を含み、第１部分および第２部分を含有してなり、該第１部分が霊長類ＭＡｄＣＡＭであり、該第２部分が少なくとも免疫グロブリン鎖の一部である、［９８］記載の方法。
【０２１３】
配列表
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(1) GENERAL INFORMATION:
(i) APPLICANT: 
(A)  NAME: LeukoSite, Inc.
(B)  STREET: 215 First Street
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(D)  STATE/PROVINCE: Massachusetts
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(i) APPLICANT/INVENTOR:
(A)  NAME: Douglas J. Ringler
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(i) APPLICANT/INVENTOR:
(A)  NAME: Dominic Picarella
(B)  STREET: 2 North Bennet Court, #4
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(i) APPLICANT/INVENTOR:
(A)  NAME: Walter Newman
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(C)  CITY: Boston
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Thereof
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(A) ADDRESSEE: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P.C.
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Met Asp Phe Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Leu  
1               5                  10                  15      
CTC GGC CAG TCC CTC CAG GTG AAG CCC CTG CAG GTG GAG CCC CCG GAG        96
Leu Gly Gln Ser Leu Gln Val Lys Pro Leu Gln Val Glu Pro Pro Glu  
20                  25                  30          
CCG GTG GTG GCC GTG GCC TTG GGC GCC TCG CGC CAG CTC ACC TGC CGC       144
Pro Val Val Ala Val Ala Leu Gly Ala Ser Arg Gln Leu Thr Cys Arg  
35                  40                  45              
CTG GCC TGC GCG GAC CGC GGG GCC TCG GTG CAG TGG CGG GGC CTG GAC       192
Leu Ala Cys Ala Asp Arg Gly Ala Ser Val Gln Trp Arg Gly Leu Asp  
50                  55                  60                  
ACC AGC CTG GGC GCG GTG CAG TCG GAC ACG GGC CGC AGC GTC CTC ACC       240
Thr Ser Leu Gly Ala Val Gln Ser Asp Thr Gly Arg Ser Val Leu Thr  
65                  70                  75                  80  
GTG CGC AAC GCC TCG CTG TCG GCG GCC GGG ACC CGC GTG TGC GTG GGC       288
Val Arg Asn Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gly Thr Arg Val Cys Val Gly  
85                  90                  95      
TCC TGC GGG GGC CGC ACC TTC CAG CAC ACC GTG CAG CTC CTT GTG TAC       336
Ser Cys Gly Gly Arg Thr Phe Gln His Thr Val Gln Leu Leu Val Tyr  
100                 105                 110          
GCC TTC CCG GAC CAG CTG ACC GTC TCC CCA GCA GCC CTG GTG CCT GGT       384
Ala Phe Pro Asp Gln Leu Thr Val Ser Pro Ala Ala Leu Val Pro Gly  
115                 120                 125              
GAC CCG GAG GTG GCC TGT ACG GCC CAC AAA GTC ACG CCC GTG GAC CCC       432
Asp Pro Glu Val Ala Cys Thr Ala His Lys Val Thr Pro Val Asp Pro  
130                 135                 140                  
AAC GCG CTC TCC TTC TCC CTG CTC GTC GGG GGC CAG GAA CTG GAG GGG       480
Asn Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Val Gly Gly Gln Glu Leu Glu Gly  
145                 150                 155                 160  
GCG CAA GCC CTG GGC CCG GAG GTG CAG GAG GAG GAG GAG GAG CCC CAG       528
Ala Gln Ala Leu Gly Pro Glu Val Gln Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gln  
165                 170                 175      
GGG GAC GAG GAC GTG CTG TTC AGG GTG ACA GAG CGC TGG CGG CTG CCG       576
Gly Asp Glu Asp Val Leu Phe Arg Val Thr Glu Arg Trp Arg Leu Pro  
180                 185                 190          
CCC CTG GGG ACC CCT GTC CCG CCC GCC CTC TAC TGC CAG GCC ACG ATG       624
Pro Leu Gly Thr Pro Val Pro Pro Ala Leu Tyr Cys Gln Ala Thr Met  
195                 200                 205              
AGG CTG CCT GGC TTG GAG CTC AGC CAC CGC CAG GCC ATC CCC GTC CTG       672
Arg Leu Pro Gly Leu Glu Leu Ser His Arg Gln Ala Ile Pro Val Leu  
210                 215                 220                  
CAC AGC CCG ACC TCC CCG GAG CCT CCC GAC ACC ACC TCC CCG GAG CCT       720
His Ser Pro Thr Ser Pro Glu Pro Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Pro  
225                 230                 235                 240  
CCC AAC ACC ACC TCC CCG GAG TCT CCC GAC ACC ACC TCC CCG GAG TCT       768
Pro Asn Thr Thr Ser Pro Glu Ser Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Ser  
245                 250                 255      
CCC GAC ACC ACC TCC CAG GAG CCT CCC GAC ACC ACC TCC CAG GAG CCT       816
Pro Asp Thr Thr Ser Gln Glu Pro Pro Asp Thr Thr Ser Gln Glu Pro  
260                 265                 270          
CCC GAC ACC ACC TCC CAG GAG CCT CCC GAC ACC ACC TCC CCG GAG CCT       864
Pro Asp Thr Thr Ser Gln Glu Pro Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Pro  
275                 280                 285              
CCC GAC AAG ACC TCC CCG GAG CCC GCC CCC CAG CAG GGC TCC ACA CAC       912
Pro Asp Lys Thr Ser Pro Glu Pro Ala Pro Gln Gln Gly Ser Thr His  
290                 295                 300                  
ACC CCC AGG AGC CCA GGC TCC ACC AGG ACT CGC CGC CCT GAG ATC TCC       960
Thr Pro Arg Ser Pro Gly Ser Thr Arg Thr Arg Arg Pro Glu Ile Ser  
305                 310                 315                 320  
CAG GCT GGG CCC ACG CAG GGA GAA GTG ATC CCA ACA GGC TCG TCC AAA      1008
Gln Ala Gly Pro Thr Gln Gly Glu Val Ile Pro Thr Gly Ser Ser Lys  
325                 330                 335      
CCT GCG GGT GAC CAG CTG CCC GCG GCT CTG TGG ACC AGC AGT GCG GTG      1056
Pro Ala Gly Asp Gln Leu Pro Ala Ala Leu Trp Thr Ser Ser Ala Val  
340                 345                 350          
CTG GGA CTG CTG CTC CTG GCC TTG CCC ACG TAT CAC CTC TGG AAA CGC      1104
Leu Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Thr Tyr His Leu Trp Lys Arg  
355                 360                 365              
TGC CGG CAC CTG GCT GAG GAC GAC ACC CAC CCA CCA GCT TCT CTG AGG      1152
Cys Arg His Leu Ala Glu Asp Asp Thr His Pro Pro Ala Ser Leu Arg  
370                 375                 380                  
CTT CTG CCC CAG GTG TCG GCC TGG GCT GGG TTA AGG GGG ACC GGC CAG      1200
Leu Leu Pro Gln Val Ser Ala Trp Ala Gly Leu Arg Gly Thr Gly Gln  
385                 390                 395                 400  
GTC GGG ATC AGC CCC TCC TGAGTGGCCA GCCTTTCCCC CTGTGAAAGC             1248
Val Gly Ile Ser Pro Ser                                  
405                                      
AAAATAGCTT GGACCCCTTC AAGTTGAGAA CTGGTCAGGG CAAACCTGCC TCCCATTCTA    1308
CTCAAAGTCA TCCCTCTGCT CACAGAGATG GATGCATGTT CTGATTGCCT CTTTGGAGAA    1368
GCTCATCAGA AACTCAAAAG AAGGCCACTG TTTGTCTCAC CTACCCATGA CCTGAAGCCC    1428
CTCCCTGAGT GGTCCCCACC TTTCTGGACG GAACCACGTA CTTTTTACAT ACATTGATTC    1488
ATGTCTCACG TCTCCCTAAA AATGCGTAAG ACCAAGCTGT GCCCTGACCA CCCTGGGCCC    1548
CTGTCGTCAG GACCTCCTGA GGCTTTGGCA AATAAACCTC CTAAAATGAT AAAAAAAAAA    1608
AAAAAAAAAA AAAAAA                                                    1624
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 406 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:
Met Asp Phe Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Leu 
1               5                  10                  15     
Leu Gly Gln Ser Leu Gln Val Lys Pro Leu Gln Val Glu Pro Pro Glu 
20                  25                  30         
Pro Val Val Ala Val Ala Leu Gly Ala Ser Arg Gln Leu Thr Cys Arg 
35                  40                  45             
Leu Ala Cys Ala Asp Arg Gly Ala Ser Val Gln Trp Arg Gly Leu Asp 
50                  55                  60                 
Thr Ser Leu Gly Ala Val Gln Ser Asp Thr Gly Arg Ser Val Leu Thr 
65                  70                  75                  80 
Val Arg Asn Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gly Thr Arg Val Cys Val Gly 
85                  90                  95     
Ser Cys Gly Gly Arg Thr Phe Gln His Thr Val Gln Leu Leu Val Tyr 
100                 105                 110         
Ala Phe Pro Asp Gln Leu Thr Val Ser Pro Ala Ala Leu Val Pro Gly 
115                 120                 125             
Asp Pro Glu Val Ala Cys Thr Ala His Lys Val Thr Pro Val Asp Pro 
130                 135                 140                 
Asn Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Val Gly Gly Gln Glu Leu Glu Gly 
145                 150                 155                 160 
Ala Gln Ala Leu Gly Pro Glu Val Gln Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gln 
165                 170                 175     
Gly Asp Glu Asp Val Leu Phe Arg Val Thr Glu Arg Trp Arg Leu Pro 
180                 185                 190         
Pro Leu Gly Thr Pro Val Pro Pro Ala Leu Tyr Cys Gln Ala Thr Met 
195                 200                 205             
Arg Leu Pro Gly Leu Glu Leu Ser His Arg Gln Ala Ile Pro Val Leu 
210                 215                 220                 
His Ser Pro Thr Ser Pro Glu Pro Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Pro 
225                 230                 235                 240 
Pro Asn Thr Thr Ser Pro Glu Ser Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Ser 
245                 250                 255     
Pro Asp Thr Thr Ser Gln Glu Pro Pro Asp Thr Thr Ser Gln Glu Pro 
260                 265                 270         
Pro Asp Thr Thr Ser Gln Glu Pro Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Pro 
275                 280                 285             
Pro Asp Lys Thr Ser Pro Glu Pro Ala Pro Gln Gln Gly Ser Thr His 
290                 295                 300                 
Thr Pro Arg Ser Pro Gly Ser Thr Arg Thr Arg Arg Pro Glu Ile Ser 
305                 310                 315                 320 
Gln Ala Gly Pro Thr Gln Gly Glu Val Ile Pro Thr Gly Ser Ser Lys 
325                 330                 335     
Pro Ala Gly Asp Gln Leu Pro Ala Ala Leu Trp Thr Ser Ser Ala Val 
340                 345                 350         
Leu Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Thr Tyr His Leu Trp Lys Arg 
355                 360                 365             
Cys Arg His Leu Ala Glu Asp Asp Thr His Pro Pro Ala Ser Leu Arg 
370                 375                 380                 
Leu Leu Pro Gln Val Ser Ala Trp Ala Gly Leu Arg Gly Thr Gly Gln 
385                 390                 395                 400 
Val Gly Ile Ser Pro Ser 
405     
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1539 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..1146
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:
ATG GAT TTC GGA CTG GCC CTC CTG CTG GCG GGG CTT CTG GGG CTC CTC        48
Met Asp Phe Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Leu  
1               5                  10                  15      
CTC GGC CAG TCC CTC CAG GTG AAG CCC CTG CAG GTG GAG CCC CCG GAG        96
Leu Gly Gln Ser Leu Gln Val Lys Pro Leu Gln Val Glu Pro Pro Glu  
20                  25                  30          
CCG GTG GTG GCC GTG GCC TTG GGC GCC TCG CGC CAG CTC ACC TGC CGC       144
Pro Val Val Ala Val Ala Leu Gly Ala Ser Arg Gln Leu Thr Cys Arg  
35                  40                  45              
CTG GCC TGC GCG GAC CGC GGG GCC TCG GTG CAG TGG CGG GGC CTG GAC       192
Leu Ala Cys Ala Asp Arg Gly Ala Ser Val Gln Trp Arg Gly Leu Asp  
50                  55                  60                  
ACC AGC CTG GGC GCG GTG CAG TCG GAC ACG GGC CGC AGC GTC CTC ACC       240
Thr Ser Leu Gly Ala Val Gln Ser Asp Thr Gly Arg Ser Val Leu Thr  
65                  70                  75                  80  
GTG CGC AAC GCC TCG CTG TCG GCG GCC GGG ACC CGC GTG TGC GTG GGC       288
Val Arg Asn Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gly Thr Arg Val Cys Val Gly  
85                  90                  95      
TCC TGC GGG GGC CGC ACC TTC CAG CAC ACC GTG CAG CTC CTT GTG TAC       336
Ser Cys Gly Gly Arg Thr Phe Gln His Thr Val Gln Leu Leu Val Tyr  
100                 105                 110          
GCC TTC CCG GAC CAG CTG ACC GTC TCC CCA GCA GCC CTG GTG CCT GGT       384
Ala Phe Pro Asp Gln Leu Thr Val Ser Pro Ala Ala Leu Val Pro Gly  
115                 120                 125              
GAC CCG GAG GTG GCC TGT ACG GCC CAC AAA GTC ACG CCC GTG GAC CCC       432
Asp Pro Glu Val Ala Cys Thr Ala His Lys Val Thr Pro Val Asp Pro  
130                 135                 140                  
AAC GCG CTC TCC TTC TCC CTG CTC GTC GGG GGC CAG GAA CTG GAG GGG       480
Asn Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Val Gly Gly Gln Glu Leu Glu Gly  
145                 150                 155                 160  
GCG CAA GCC CTG GGC CCG GAG GTG CAG GAG GAG GAG GAG GAG CCC CAG       528
Ala Gln Ala Leu Gly Pro Glu Val Gln Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gln  
165                 170                 175      
GGG GAC GAG GAC GTG CTG TTC AGG GTG ACA GAG CGC TGG CGG CTG CCG       576
Gly Asp Glu Asp Val Leu Phe Arg Val Thr Glu Arg Trp Arg Leu Pro  
180                 185                 190          
CCC CTG GGG ACC CCT GTC CCG CCC GCC CTC TAC TGC CAG GCC ACG ATG       624
Pro Leu Gly Thr Pro Val Pro Pro Ala Leu Tyr Cys Gln Ala Thr Met  
195                 200                 205              
AGG CTG CCT GGC TTG GAG CTC AGC CAC CGC CAG GCC ATC CCC GTC CTG       672
Arg Leu Pro Gly Leu Glu Leu Ser His Arg Gln Ala Ile Pro Val Leu  
210                 215                 220                  
CAC AGC CCG ACC TCC CCG GAG CCT CCC GAC ACC ACC TCC CCG GAG TCT       720
His Ser Pro Thr Ser Pro Glu Pro Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Ser  
225                 230                 235                 240  
CCC GAC ACC ACC TCC CCG GAG TCT CCC GAC ACC ACC TCC CAG GAG CCT       768
Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Ser Pro Asp Thr Thr Ser Gln Glu Pro  
245                 250                 255      
CCC GAC ACC ACC TCC CCG GAG CCT CCC GAC AAG ACC TCC CCG GAG CCC       816
Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Pro Pro Asp Lys Thr Ser Pro Glu Pro  
260                 265                 270          
GCC CCC CAG CAG GGC TCC ACA CAC ACC CCC AGG AGC CCA GGC TCC ACC       864
Ala Pro Gln Gln Gly Ser Thr His Thr Pro Arg Ser Pro Gly Ser Thr  
275                 280                 285              
AGG ACT CGC CGC CCT GAG ATC TCC CAG GCT GGG CCC ACG CAG GGA GAA       912
Arg Thr Arg Arg Pro Glu Ile Ser Gln Ala Gly Pro Thr Gln Gly Glu  
290                 295                 300                  
GTG ATC CCA ACA GGC TCG TCC AAA CCT GCG GGT GAC CAG CTG CCC GCG       960
Val Ile Pro Thr Gly Ser Ser Lys Pro Ala Gly Asp Gln Leu Pro Ala  
305                 310                 315                 320  
GCT CTG TGG ACC AGC AGT GCG GTG CTG GGA CTG CTG CTC CTG GCC TTG      1008
Ala Leu Trp Thr Ser Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu  
325                 330                 335      
CCC ACC TAT CAC CTC TGG AAA CGC TGC CGG CAC CTG GCT GAG GAC GAC      1056
Pro Thr Tyr His Leu Trp Lys Arg Cys Arg His Leu Ala Glu Asp Asp  
340                 345                 350          
ACC CAC CCA CCA GCT TCT CTG AGG CTT CTG CCC CAG GTG TCG GCC TGG      1104
Thr His Pro Pro Ala Ser Leu Arg Leu Leu Pro Gln Val Ser Ala Trp  
355                 360                 365              
GCT GGG TTA AGG GGG ACC GGC CAG GTC GGG ATC AGC CCC TCC              1146
Ala Gly Leu Arg Gly Thr Gly Gln Val Gly Ile Ser Pro Ser 
370                 375                 380         
TGAGTGGCCA GCCTTTCCCC CTGTGAAAGC AAAATAGCTT GGACCCCTTC AAGTTGAGAA    1206
CTGGTCAGGG CAAACCTGCC TCCCATTCTA CTCAAAGTCA TCCCTCTGTT CACAGAGATG    1266
GATGCATGTT CTGATTGCCT CTTTGGAGAA GCTCATCAGA AACTCAAAAG AAGGCCACTG    1326
TTTGTCTCAC CTACCCATGA CCTGAAGCCC CTCCCTGAGT GGTCCCCACC TTTCTGGACG    1386
GAACCACGTA CTTTTTACAT ACATTGATTC ATGTCTCACG TCTCCCTAAA AATGCGTAAG    1446
ACCAAGCTGT GCCCTGACCA CCCTGGGCCC CTGTCGTCAG GACCTCCTGA GGCTTTGGCA    1506
AATAAACCTC CTAAAATGAA AAAAAAAAAA AAA                                 1539
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 382 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:
Met Asp Phe Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Leu 
1               5                  10                  15     
Leu Gly Gln Ser Leu Gln Val Lys Pro Leu Gln Val Glu Pro Pro Glu 
20                  25                  30         
Pro Val Val Ala Val Ala Leu Gly Ala Ser Arg Gln Leu Thr Cys Arg 
35                  40                  45             
Leu Ala Cys Ala Asp Arg Gly Ala Ser Val Gln Trp Arg Gly Leu Asp 
50                  55                  60                 
Thr Ser Leu Gly Ala Val Gln Ser Asp Thr Gly Arg Ser Val Leu Thr 
65                  70                  75                  80 
Val Arg Asn Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gly Thr Arg Val Cys Val Gly 
85                  90                  95     
Ser Cys Gly Gly Arg Thr Phe Gln His Thr Val Gln Leu Leu Val Tyr 
100                 105                 110         
Ala Phe Pro Asp Gln Leu Thr Val Ser Pro Ala Ala Leu Val Pro Gly 
115                 120                 125             
Asp Pro Glu Val Ala Cys Thr Ala His Lys Val Thr Pro Val Asp Pro 
130                 135                 140                 
Asn Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Val Gly Gly Gln Glu Leu Glu Gly 
145                 150                 155                 160 
Ala Gln Ala Leu Gly Pro Glu Val Gln Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gln 
165                 170                 175     
Gly Asp Glu Asp Val Leu Phe Arg Val Thr Glu Arg Trp Arg Leu Pro 
180                 185                 190         
Pro Leu Gly Thr Pro Val Pro Pro Ala Leu Tyr Cys Gln Ala Thr Met 
195                 200                 205             
Arg Leu Pro Gly Leu Glu Leu Ser His Arg Gln Ala Ile Pro Val Leu 
210                 215                 220                 
His Ser Pro Thr Ser Pro Glu Pro Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Ser 
225                 230                 235                 240 
Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Ser Pro Asp Thr Thr Ser Gln Glu Pro 
245                 250                 255     
Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Pro Pro Asp Lys Thr Ser Pro Glu Pro 
260                 265                 270         
Ala Pro Gln Gln Gly Ser Thr His Thr Pro Arg Ser Pro Gly Ser Thr 
275                 280                 285             
Arg Thr Arg Arg Pro Glu Ile Ser Gln Ala Gly Pro Thr Gln Gly Glu 
290                 295                 300                 
Val Ile Pro Thr Gly Ser Ser Lys Pro Ala Gly Asp Gln Leu Pro Ala 
305                 310                 315                 320 
Ala Leu Trp Thr Ser Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu 
325                 330                 335     
Pro Thr Tyr His Leu Trp Lys Arg Cys Arg His Leu Ala Glu Asp Asp 
340                 345                 350         
Thr His Pro Pro Ala Ser Leu Arg Leu Leu Pro Gln Val Ser Ala Trp 
355                 360                 365             
Ala Gly Leu Arg Gly Thr Gly Gln Val Gly Ile Ser Pro Ser 
370                 375                 380         
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1721 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 4..1038
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:
AGC ATG GAT CGG GGC CTG GCC CTC CTG CTG GCG GGG CTT CTG GGG CTC        48
Met Asp Arg Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu  
1               5                  10                  15  
CTC CAG CCG GGC TGC GGC CAG TCC CTC CAG GTG AAG CCC CTG CAG GTG        96
Leu Gln Pro Gly Cys Gly Gln Ser Leu Gln Val Lys Pro Leu Gln Val  
20                  25                  30      
GAG CCC CCG GAG CCG GTG GTG GCC GTG GCC CTG GGC GCC TCT CGC CAG       144
Glu Pro Pro Glu Pro Val Val Ala Val Ala Leu Gly Ala Ser Arg Gln  
35                  40                  45          
CTC ACC TGC CGC CTG GAC TGC GCG GAC CGC GGG GCC ACG GTG CAG TGG       192
Leu Thr Cys Arg Leu Asp Cys Ala Asp Arg Gly Ala Thr Val Gln Trp  
50                  55                  60              
CGG GGC CTG GAC ACC AGC CTG GGC GCG GTG CAG TCG GAC GCG GGC CGC       240
Arg Gly Leu Asp Thr Ser Leu Gly Ala Val Gln Ser Asp Ala Gly Arg  
65                  70                  75                  
AGC GTC CTC ACC GTG CGC AAC GCC TCG CTG TCG GCG GCC GGG ACC CGT       288
Ser Val Leu Thr Val Arg Asn Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gly Thr Arg  
80                  85                  90                  95  
GTG TGC GTG GGC TCC TGC GGG GGC CGC ACC TTC CAG CAC ACC GTG CGG       336
Val Cys Val Gly Ser Cys Gly Gly Arg Thr Phe Gln His Thr Val Arg  
100                 105                 110      
CTC CTT GTG TAC GCC TTC CCG GAC CAG CTG ACC ATC TCC CCG GCA GCC       384
Leu Leu Val Tyr Ala Phe Pro Asp Gln Leu Thr Ile Ser Pro Ala Ala  
115                 120                 125          
CTG GTG CCT GGT GAC CCG GAG GTG GCC TGT ACG GCC CAC AAA GTC ACG       432
Leu Val Pro Gly Asp Pro Glu Val Ala Cys Thr Ala His Lys Val Thr  
130                 135                 140              
CCT GTG GAC CCC AAT GCG CTC TCC TTC TCC CTG CTC CTG GGG GAC CAG       480
Pro Val Asp Pro Asn Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Leu Gly Asp Gln  
145                 150                 155                  
GAA CTG GAG GGG GCC CAG GCT CTG GGC CCG GAG GTG GAG GAG GAG GAG       528
Glu Leu Glu Gly Ala Gln Ala Leu Gly Pro Glu Val Glu Glu Glu Glu  
160                 165                 170                 175  
GAG GAG CCC CAG GAG GAG GAG GAC GTG CTG TTC AGG GTG ACA GAG CGC       576
Glu Glu Pro Gln Glu Glu Glu Asp Val Leu Phe Arg Val Thr Glu Arg  
180                 185                 190      
TGG CGG CTG CCG ACC CTG GCA ACC CCT GTC CTG CCC GCG CTC TAC TGC       624
Trp Arg Leu Pro Thr Leu Ala Thr Pro Val Leu Pro Ala Leu Tyr Cys  
195                 200                 205          
CAG GCC ACG ATG AGG CTG CCT GGC TTG GAG CTC AGC CAC CGC CAG GCC       672
Gln Ala Thr Met Arg Leu Pro Gly Leu Glu Leu Ser His Arg Gln Ala  
210                 215                 220              
ATC CCG GTC CTG CAC GGC CCG ACC TCC CGG GAG CCC CCC GAC ACG ACC       720
Ile Pro Val Leu His Gly Pro Thr Ser Arg Glu Pro Pro Asp Thr Thr  
225                 230                 235                  
TCC CCG GAA CCC CGG GCC GCG ACC TCC CCG GAG ACC ACC CCC CAG CAG       768
Ser Pro Glu Pro Arg Ala Ala Thr Ser Pro Glu Thr Thr Pro Gln Gln  
240                 245                 250                 255  
GGC TCC ACA CAC AGC CCC AGG AGC CCG GGC TCT ACC AGG ACT TGC CGC       816
Gly Ser Thr His Ser Pro Arg Ser Pro Gly Ser Thr Arg Thr Cys Arg  
260                 265                 270      
CCT GAG ATC TCC CAG GCT GGG CCC ACG CAG GGA GAA GTG ATC CCA ACA       864
Pro Glu Ile Ser Gln Ala Gly Pro Thr Gln Gly Glu Val Ile Pro Thr  
275                 280                 285          
GGC TCG TCC AAA CCT ACG GGT GAC CAG CTG CCC GCG GCT CTG TGG ACC       912
Gly Ser Ser Lys Pro Thr Gly Asp Gln Leu Pro Ala Ala Leu Trp Thr  
290                 295                 300              
AGC AGT GCG GTG CTG GGA CTG CTG CTC CTG GCT TTG CCC ACC TAC CAC       960
Ser Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Thr Tyr His  
305                 310                 315                  
CTC TGG AAA CGT TGC CGG CAC CTG GCT GAG GAC GGC GCC CAC CCA CCA      1008
Leu Trp Lys Arg Cys Arg His Leu Ala Glu Asp Gly Ala His Pro Pro  
320                 325                 330                 335  
GCT TCT CTG AGT AGC CAG CCC TTC CCC CTG TGAAGGGAAA ATAGGTTGGA        1058
Ala Ser Leu Ser Ser Gln Pro Phe Pro Leu                       
340                 345                       
CCCCTTCAAG CTGAGAACTG GTCGGGGCAA ACCTGCCTCC CATTCTATTC AAAGTCATCG    1118
CTCTGGTCAC AGAGAGGGAC GCACATTCTG ATTGCCTCCT TTGGAAAGGC TCATCAGAAA    1178
CTCAAAAGAA GGTGATCGTT TGTCCCGCCT ACCCGTGACC TGGAAGCCCC CGCCCCGCTC    1238
GAGTGACCCC TGACTTTCTG GACGGAACCA ACGTACTTCT TACATATATT GATTCATGTG    1298
TCATATCTCC CTAAAATGCG TAAAACCAGC TGTGCCCCGA CCACCTTGGG CCCCTGCCAT    1358
CAGGACCTCC TGAGGCTTTG GCAAATAAAC CTCCTAAAAG GATAGAAACT GAAACTTGTG    1418
GCCGGGCGCG GTGGCTCAAG CCTGTAATCC CAGCACTTTG GGAGGCCGAG GTGGGTGGAT    1478
CACGAGGTCA GGAGATCGAG ACCATCCTGG CTAACCCGTG AAACCCCGTC TCTACTAAAA    1538
AAATACAAAA ATTAGCCGGG AGCGGTGGCG GGCGCCTGTA GTCCCAGCTA CTCGGGAGGC    1598
TGAGGCAGGA GAATGGCGTG AACCCGGGAG GCGGAGCTTG CAGTGAGCTG AGATCCGGCC    1658
ACTGCACTCC AGCCTGGGGG ACAGAGCGAG ACTCCGTCTC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA    1718
AAA                                                                  1721
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(ii) MOLECULE TYPE: protein
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Met Asp Arg Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Leu 
1               5                  10                  15     
Gln Pro Gly Cys Gly Gln Ser Leu Gln Val Lys Pro Leu Gln Val Glu 
20                  25                  30         
Pro Pro Glu Pro Val Val Ala Val Ala Leu Gly Ala Ser Arg Gln Leu 
35                  40                  45             
Thr Cys Arg Leu Asp Cys Ala Asp Arg Gly Ala Thr Val Gln Trp Arg 
50                  55                  60                 
Gly Leu Asp Thr Ser Leu Gly Ala Val Gln Ser Asp Ala Gly Arg Ser 
65                  70                  75                  80 
Val Leu Thr Val Arg Asn Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gly Thr Arg Val 
85                  90                  95     
Cys Val Gly Ser Cys Gly Gly Arg Thr Phe Gln His Thr Val Arg Leu 
100                 105                 110         
Leu Val Tyr Ala Phe Pro Asp Gln Leu Thr Ile Ser Pro Ala Ala Leu 
115                 120                 125             
Val Pro Gly Asp Pro Glu Val Ala Cys Thr Ala His Lys Val Thr Pro 
130                 135                 140                 
Val Asp Pro Asn Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Leu Gly Asp Gln Glu 
145                 150                 155                 160 
Leu Glu Gly Ala Gln Ala Leu Gly Pro Glu Val Glu Glu Glu Glu Glu 
165                 170                 175     
Glu Pro Gln Glu Glu Glu Asp Val Leu Phe Arg Val Thr Glu Arg Trp 
180                 185                 190         
Arg Leu Pro Thr Leu Ala Thr Pro Val Leu Pro Ala Leu Tyr Cys Gln 
195                 200                 205             
Ala Thr Met Arg Leu Pro Gly Leu Glu Leu Ser His Arg Gln Ala Ile 
210                 215                 220                 
Pro Val Leu His Gly Pro Thr Ser Arg Glu Pro Pro Asp Thr Thr Ser 
225                 230                 235                 240 
Pro Glu Pro Arg Ala Ala Thr Ser Pro Glu Thr Thr Pro Gln Gln Gly 
245                 250                 255     
Ser Thr His Ser Pro Arg Ser Pro Gly Ser Thr Arg Thr Cys Arg Pro 
260                 265                 270         
Glu Ile Ser Gln Ala Gly Pro Thr Gln Gly Glu Val Ile Pro Thr Gly 
275                 280                 285             
Ser Ser Lys Pro Thr Gly Asp Gln Leu Pro Ala Ala Leu Trp Thr Ser 
290                 295                 300                 
Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Thr Tyr His Leu 
305                 310                 315                 320 
Trp Lys Arg Cys Arg His Leu Ala Glu Asp Gly Ala His Pro Pro Ala 
325                 330                 335     
Ser Leu Ser Ser Gln Pro Phe Pro Leu 
340                 345 
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(D) TOPOLOGY: unknown
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CTCTACTGCC AGGCCACG                                                    18
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GCCACGATGA GGCTGCCTGG                                                  20
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GGACTAGTGG TTTGGACGAG CCTGTTG                                          27
【図面の簡単な説明】
【０２１４】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡクローン体４のサブクローン体から決定したヌクレオチド配列（配列番号１）と、そのオープンリーディングフレームによってコードされる予想される蛋白質の配列（ＭＡｄＣＡＭ−１；配列番号２）を表す図である。予想されるシグナルペプチドと膜貫通領域に太い下線を引いてある。２つのＩｇ様ドメインのシステイン残基を、潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位と同様に囲んである。７１アミノ酸からなり、ＰＰＤＴＴＳ（Ｑ／Ｐ）Ｅ反復を含有するムチンドメインを、細い線で囲んである。
【図２】図２は、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡクローン体２０のサブクローン体から決定したヌクレオチド配列（配列番号３）と、そのオープンリーディングフレームによってコードされる予想蛋白質の配列（ＭＡｄＣＡＭ−１；配列番号４）を示す図である。予想されるシグナルペプチドと膜貫通領域に太い下線を引いてある。２つのＩｇ様ドメインのシステイン残基を、潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位と同様に囲んである。４７アミノ酸からなり、ＰＰＤＴＴＳ（Ｑ／Ｐ）Ｅ反復を含有するムチンドメインを、細い線で囲んである。
【図３】図３は、アカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡクローン体３１Ｄのサブクローン体から決定した核酸配列（配列番号５）と、そのオープンリーディングフレームによってコードされる予想される蛋白質の配列（ＭＡｄＣＡＭ−１；配列番号６）を示す図である。予想されるシグナルペプチドと膜貫通領域に太い下線を引いてある。２つのＩｇ様ドメインのシステイン残基を囲んである。ＰＰＤＴＴＳ（Ｑ／Ｐ）Ｅ反復を一つだけ含有するムチンドメインを、細い線で囲んである。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１を形質導入した細胞の、α４β７を発現するリンパ球に対する選択的結合を表すヒストグラムである。図４Ａは、α４β７を発現する（α４β１は発現しない）ＲＰＭＩ８８６６細胞（０．５×１０6 ／ウェル）が、ネズミまたはヒトＭＡｄＣＡＭ−１を発現するＣＨＯ／Ｐ細胞には結合するが、ヒトＶＣＡＭ−１を形質導入したＣＨＯ／Ｐ細胞や、ｐｃＤＮＡ−３を形質導入したＣＨＯ／Ｐ細胞には結合しないという実験結果を示している。図４B は、ヒトＶＣＡＭ−１を形質導入したＣＨＯ／Ｐ細胞が、Ｊｕｒｋａｔ細胞（これは高レベルのα４β１を発現する）には結合するが、ネズミまたはヒトＭＡｄＣＡＭ−１  を形質導入したＣＨＯ／Ｐ細胞や、対照としてのｐｃＤＮＡ−３を形質導入したＣＨＯ／Ｐ細胞には結合し得なかったという実験結果を示している。結合は、ＣＨＯ／Ｐ細胞１個あたりに結合したＲＰＭＩ８８６６細胞数（図４Ａ）か、ＣＨＯ／Ｐ細胞１個あたりに結合したＪｕｒｋａｔ細胞の数を、少なくとも４つの視野（１０×対物レンズ）の平均値±標準誤差として示してある。表に示すように、結合反応には、対照ＩｇＧ、抗α４β７（モノクローナル抗体ＡＣＴ−１）、または抗ネズミＭＡｄＣＡＭ−１（モノクローナル抗体ＭＥＣＡ−３６７）を含めた。
【図５】図５は、クローン体４及び２０によってコードされているヒトＭＡｄＣＡＭ−１  がＲＰＭＩ８８６６細胞を結合し、その結合がＡＣＴ−１抗体によって阻害されることを示すヒストグラムである。棒は、１回の実験の４つの視野の平均値を、標準偏差と共に表している。
【図６】図６は、ネズミ及びヒトＭＡｄＣＡＭ−１の推定ドメイン構造を表す図である。細胞接着に関係する、ジスルフィド結合で結合した２つのＮ末端免疫グロブリンドメイン（輪で示した部分）、膜貫通領域及び細胞質テイルが、ネズミ、アカゲザル及びヒト蛋白質に存在する。ヒトＭＡｄＣＡＭ−１は、より長い細胞質テイルを持つ。ムチンドメインに認められる８アミノ酸反復は、ヒトイソ型には４または８コピー存在するが、ネズミとアカゲザルには１回しか現れない。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、飲用水中のＤＳＳに１０日間さらされたマウスの左（下行）及び右（上行）結腸から得た、炎症活性と上皮損傷の組織学値を表すグラフである。無関係なラットＩｇＧ２ａ抗体、ＦＩＢ２１抗体またはＦＩＢ３０抗体を与えた３群のマウスを示す。
【図８】図８は、飲用水中のＤＳＳを１０日間与えたマウスから得た、１分あたりのγカウント（ｃｐｍ）（±１ＳＥＭ）を、総投入カウントの百分率として表すグラフである。水のみを与えた陰性対照群、ＤＳＳのみを与えた陽性対照群、無関係なラットＩｇＧ２ａ抗体、ＦＩＢ２１、ＭＥＣＡ−３６７またはＦＩＢ２１とＭＥＣＡ−３６７を与えた試験群からなる６群を示す。
【図９】図９は、２ｍｇ／ｋｇ／日のＡＣＴ−１モノクローナル抗体による処置の前及び１４日後の普通のマーモセットの空腸生検試料から得た、絨毛融合に関する組織学的値（±１ＳＥＭ）を表すグラフである。
【図１０】図１０は、２ｍｇ／ｋｇ／日のＡＣＴ−１モノクローナル抗体による処置の前及び１４日後の普通のマーモセットの空腸生検試料から得た、絨毛萎縮に関する組織学的値（±１ SEM）を表すグラフである。
【図１１】図１１は、ＡＣＴ−１抗体で処置した結腸炎動物（コットントップタマリン）の糞の粘稠度を表す図である。
【図１２】図１２は、ＡＣＴ−１抗体で処置した結腸炎動物（コットントップタマリン）における炎症活性を組織学的に評価した図である。
【図１３】図１３は、ＡＣＴ−１抗体による慢性結腸炎コットントップタマリンの治療の実験手順を表す図である。
【図１４】図１４は、慢性結腸炎コットントップタマリンにＡＣＴ−１抗体（−●−）または無関係なイソ型適合抗体（−○−）を投与した場合の、糞の粘稠度に対する治療効果を表すグラフである。
【図１５】図１５は、ＡＣＴ−１抗体または無関係な対照モノクローナル抗体で処置した慢性結腸炎（ｃｏｌｉｔｉｃ  ｃｏｌｉｔｉｃ）コットントップタマリンにおける、結腸の炎症活性に対するＡＣＴ−１免疫療法の治療効果を示すヒストグラムである。各棒は、第０日における同じ動物の値と特定の時点における値とを比較することによって各動物について計算した、炎症活性の絶対変化の、一処置群内の平均±１ＳＥＭを表す。
【図１６】図１６は、ＡＣＴ−１抗体で処置した結腸炎コットントップタマリンの末梢循環プールにおけるα４β７＋リンパ球の絶対数を表すヒストグラムである。各棒は、ＡＣＴ−１によって検出されるα４β７+ 細胞の血中濃度の平均（±１ＳＥＭ）を表す。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｅは、ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇキメラによるＨｕｔ７８細胞の特異的染色を示す、ＦＡＣＳ分析の結果を表すプロットである。ヒトＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇキメラ構築物で仮トランスフェクションしたCOS 細胞（４回の独立したトランスフェクションから得た）の上清を、２ｍＭ  Ｍｎ2+の存在下にＨｕｔ７８細胞と共に培養し、結合したキメラを、ヒトＩｇＧ１に特異的なフィコエリトリン結合抗体を用いて検出した。図１７Ａ，培地対照；図１７Ｂ〜１７Ｃ，クローン体２１（ヒトＭＡｄＣＡＭの全細胞外ドメインを含む）を形質導入した細胞の上清；図１７Ｄ〜１７Ｅ，細胞クローン体３８（ヒトＭＡｄＣＡＭの２つのＮ末端Ｉｇドメインを含む）の上清。細胞を培地のみで予備培養した後の結合（右側）。抗β７ＭＡｂＦＩＢ５０４と共に細胞を予備培養することによって、結合が阻害された（左側）。
【図１８】図１８は、１×１０6 ＣＤ４５ＲＢhiＴ細胞（■）で復元した重症複合免疫不全症（ｓｃｉｄ）マウスの体重と、同数のＢＡＬＢ／ｃ脾臓に由来するＣＤ４５ＲＢloＴ細胞（▲）で復元した対照ｓｃｉｄマウスとの体重の相違を表すグラフである。疾患の進行を評価するため、毎週、受容マウスの体重を測定した。
【図１９】図１９は、ＣＤ４５ＲＢhiＴ細胞で復元したｓｃｉｄマウスに静脈内注射した１１１In−標識腸間膜リンパ小節細胞の、結腸における蓄積量が、同数のＣＤ４５ＲＢloＴ細胞で復元したｓｃｉｄマウスの結腸における蓄積量より増大することと、抗β７モノクローナル抗体（ＦＩＢ５０４）と抗ＭＡｄＣＡＭ（ＭＥＣＡ−３６７）モノクローナル抗体の組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）による２週間の治療で、蓄積が阻害されることを表すヒストグラムである。結果は、膵臓のカウント／分（ＣＰＭ）に対して正規化し、かつ、バックグラウンドについて補正した％ＣＰＭとして、表してある。
【図２０】図２０は、ｓｃｉｄマウスの結腸における 111Ｉｎ−標識細胞（静脈内注射したもの）の蓄積が、ＦＩＢ５０４、ＭＥＣＡ−３６７またはＦＩＢ５０４＋ＭＥＣＡ−３６７による４ヶ月間（復元時から開始）の処置で、完全に阻害されることを示すヒストグラムである。左から右へ：ＣＤ４５ＲＢloＴ細胞で復元され、無関係なイソ型適合対照ラットＩｇＧ２ａを投与されたｓｃｉｄマウス；ＣＤ４５ＲＢhiＴ細胞で復元され、無関係なイソ型適合対照ラットＩｇＧ２ａ、ＦＩＢ５０４、ＭＥＣＡ−３６７またはＦＩＢ５０４＋ＭＥＣＡ−３６７のいずれかを投与されたｓｃｉｄマウス。
【図２１】図２１は、ＦＩＢ５０４とＭＥＣＡ−３６７の組み合わせで１４日間処置したｓｃｉｄマウスの上行（右）または下行（左）結腸におけるＣＤ４+ Ｔ細胞の数（マウスＣＤ４に特異的なラット抗体で左及び右結腸の凍結切片を染色することによって決定）が、イソ型適合対照ラットＩｇＧ２ａ抗体で処置されたマウスと比較して減少することを示すヒストグラムである。
【図１】
2008231112.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008231112.tif 000011
【図８】
2008231112.tif 000012
【図９】
2008231112.tif 000013
【図１０】
2008231112.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2008231112.tif 000017
【図１４】
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【図１５】
2008231112.tif 000019
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2008231112.tif 000023
【図２０】
2008231112.tif 000024
【図２１】
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