(57)【要約】【課題】樹状細胞は、抗原特異的免疫応答において重要な役割を果たす。抗原提示樹状細胞の移動または活性化を促進または阻害することにより、疾患状態（癌および自己免疫疾患を含む）を処置するための材料および方法を提供すること。【解決手段】本発明は、樹状細胞は、抗原特異的免疫応答において重要な役割を果たす、抗原提示樹状細胞の移動または活性化を促進または阻害することにより、疾患状態（癌および自己免疫疾患を含む）を処置するための材料および方法を提供する。特に、ケモカインは、免疫応答を開始、増幅または調節するために使用される。１つの実施形態において、ケモカインは、樹状細胞を抗原送達部位に誘引するために使用される。抗原送達部位における樹状細胞の数の増加は、より多くの抗原取り込みおよび改変された免疫応答を意味する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患状態の処置のための医薬品の製造における、樹状細胞の移動を方向付け得るケモカインの使用であって、前記ケモカインが、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、Ｔｅｃｋ、ＤＣｔａｃｔｉｎ−β、６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ、ＬＥＣ、ＭＤＣ、およびＭＩＰ−５からなる群より選択される、使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、前記樹状細胞が、未成熟樹状細胞である、使用。
【請求項３】
請求項２に記載の使用であって、前記ケモカインが、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＤＣ、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−５からなる群より選択される、使用。
【請求項４】
請求項１に記載の使用であって、前記ケモカインが、ＭＩＰ−３βである、使用。
【請求項５】
哺乳動物における免疫応答を増強する方法であって、該方法は、ケモカインＭＣＰ−４またはケモカインＭＣＰ−４の生物学的に活性な画分を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記ケモカインが、組換えケモカインである、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、前記ケモカインがヒトケモカインである、方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法であって、該方法は、前記ケモカインの徐放を可能にする物質を送達部位に投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項９】
請求項５に記載の方法であって、該方法は、前記ケモカインとともに抗原を投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、ＭＣＰ−４および抗原を含む融合タンパク質が、前記哺乳動物に投与される、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、前記抗原が、腫瘍関連抗原である、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、前記抗原が、腫瘍関連抗原である、方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の方法であって、前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原、または真菌抗原である、方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法であって、前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原または真菌抗原である、方法。
【請求項１５】
請求項９に記載の方法であって、前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、Ｈｋｅｒ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、ｐ５３ならびにテロメラーゼからなる群より選択される、方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載の方法であって、前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、Ｈｋｅｒ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、ｐ５３ならびにテロメラーゼからなる群より選択される、方法。
【請求項１７】
請求項９に記載の方法であって、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の組み合わせを投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１０に記載の方法であって、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の組み合わせを投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１９】
請求項５に記載の方法であって、前記ケモカインとともに活性化薬剤を投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２０】
請求項５に記載の方法であって、前記ケモカインが、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、局所投与、またはベクターの形態で投与される、方法。
【請求項２１】
ＭＣＰ−４および抗原を含む、融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項２１に記載の融合タンパク質であって、前記抗原が腫瘍関連抗原である、融合タンパク質。
【請求項２３】
請求項２２に記載の融合タンパク質であって、前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、Ｈｋｅｒ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、ｐ５３ならびにテロメラーゼからなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項２２に記載の融合タンパク質であって、前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原または真菌抗原である、融合タンパク質。
【請求項２５】
請求項２１に記載の融合タンパク質を含む、プラスミド。
【請求項２６】
請求項２３に記載のプラスミドであって、樹状細胞に特に適したプロモーター配列をさらに含む、プラスミド。
【請求項２７】
請求項２１に記載の融合タンパク質を含む、ウイルスベクター。
【請求項２８】
６Ｃｋｉｎｅおよび抗原を含む、融合タンパク質。
【請求項２９】
請求項２８に記載の融合タンパク質であって、前記抗原が腫瘍関連抗原である、融合タンパク質。
【請求項３０】
請求項２９に記載の融合タンパク質であって、前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、Ｈｋｅｒ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、ｐ５３ならびにテロメラーゼからなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項３１】
請求項２９に記載の融合タンパク質であって、前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原または真菌抗原である、融合タンパク質。
【請求項３２】
請求項２８に記載の融合タンパク質を含む、プラスミド。
【請求項３３】
請求項３２に記載のプラスミドであって、樹状細胞に特に適したプロモーター配列をさらに含む、プラスミド。
【請求項３４】
請求項２８に記載の融合タンパク質を含む、ウイルスベクター。
【請求項３５】
明細書に記載のケモカインおよび使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、欧州特許出願第０  ９７４  ３５７  Ａ１（１９９８年７月１６日に出願および２０００年１月２６日公開）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、癌を含む疾患状態の処置におけるヒトケモカインの使用に関連する。投与されたケモカインは、すべての抗原提示の樹状細胞または樹状細胞の特定のサブセットのいずれかの移動を方向付ける。１つの実施形態において、樹状細胞を活性化するように設計された疾患特異的抗原および／または部分は、ケモカインとともに投与される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原の取り込みおよびＴ細胞へのそれらの提示に従事している。従って、ＤＣは、抗原特異的免疫応答において重要な役割を果たす。
【０００４】
ＤＣは、種々のリンパ組織および非リンパ組織において身体の至る所に広範囲に分布した形態学的に類似な細胞型の多様な集団により表わされる（Ｃａｕｘら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １６：２；Ｓｔｅｉｎｍａｎ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１−２９６）。これらの細胞には、脾臓のリンパＤＣ、およびリンパ節、表皮のランゲルハンス細胞、ならびに血液循環内の明瞭でない細胞が挙げられる。ＤＣは、それらの形態学、表面のＭＨＣクラスＩＩ発現の高レベルならびにＴ細胞の結合および同時刺激を媒介するいくつかのアクセサリー分子（Ｂ７−１[ＣＤ８０]およびＢ７−２［ＣＤ８６］）（Ｉｎａｂａら、１９９０、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１９７−２０６；Ｆｒｅｎｄｅｎｔｈａｌら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：７６９８）、ならびにＴ細胞、Ｂ細胞、単球、およびナチュラルキラー細胞上で発現された特定の他の表面マーカーの非存在に基づいたグループとして集団的に分類される。
【０００５】
ＤＣは、骨髄由来であり、血流から組織の至るところまで前駆体として移動し、ここでＤＣはこの表皮におけるランゲルハンス細胞のような常在の細胞となる。
【０００６】
末梢において、病原体侵入後、新鮮なランゲルハンス細胞のような未成熟ＤＣは、抗原を捕獲しプロセシングする炎症部位（Ｋａｐｌａｎら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１７１７−１７２８；ＭｃＷｉｌｌｉａｍら、１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１３３１−１３３６）に補充される（Ｉｎａｂａら、１９８６．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：６０５−６１３；Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３９２５−３９３３；Ｒｏｍａｎｉら、１９８９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１１６９−１１７８；Ｐｕｒｅら、１９９０．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１４５９−１４６９；Ｓｃｈｕｌｅｒら、１９８５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：５２６−５４６）。
【０００７】
次いで、抗原が負荷されたＤＣは、リンパ管を経由して末梢組織から、リンパ節のＴ細胞が豊富な領域まで移動し、ここで成熟ＤＣは、相互連結細胞（ＩＤＣ）と呼ばれる（Ａｕｓｔｙｎら、１９８８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６４６−６５１；Ｋｕｐｉｅｃ−Ｗｅｇｌｉｎｓｋｉら、１９８８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６３２−６４５；Ｌａｒｓｅｎら、１９９０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１４８３−１４９４；Ｆｏｓｓｕｍ、Ｓ．１９８８、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：９７−１０５；Ｍａｃａｔｏｎｉａら、１９８７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１６５４−１６６７；Ｋｒｉｐｋｅら、１９９０．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：２８３３−２８３８）。この部位で、これらは、未処置のＴ細胞に対してプロセシングされた抗原を提示し、そして抗原特異的な初期のＴ細胞応答を発生する（Ｌｉｕら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１２９９−１３０７；Ｓｏｒｎａｓｓｅら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１５−２１；Ｈｅｕｆｌｅｒら、１９８８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：７００−７０５）。
【０００８】
末梢組織からリンパ器官までのこれらの移動の間、ＤＣは、表現型および機能において劇的な変化を含む成熟過程を経る（Ｌａｒｓｅｎら、１９９０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１４８３−１４９４；Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎら、１９９０、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１１７：１５９−１８４；Ｄｅ  Ｓｍｅｄｔら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１４１３−１４２４）。特に、可溶性タンパク質を効率的に捕獲およびプロセシングし特異的な記憶およびエフェクターＴ細胞を活性化するのに有効な、新鮮なランゲルハンス細胞のような未成熟のＤＣと対照的に、リンパ器官のＩＤＣのような成熟ＤＣは、未処置のＴ細胞の初回刺激において顕著に効果的であるが抗原の捕獲およびプロセシングにおいては乏しい（Ｉｎａｂａら、１９８６．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：６０５−６１３；Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３９２５−３９３３；Ｒｏｍａｎｉら、１９８９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１１６９−１１７８；Ｐｕｒｅら、１９９０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１４５９−１４６９；Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：３８９−４００；Ｃｅｌｌａら、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１０−１６）。
【０００９】
ＤＣの移動（ｔｒａｆｆｉｃ）パターンを制御するシグナルは、複雑であり、十分には理解されていない。
【００１０】
ＴＮＦαおよびＬＰＳにより提供されたシグナルが、組織から排出リンパ器官まで常在のＤＣの移動をインビボにおいて誘導することは公知である（Ｄｅ  Ｓｍｅｄｔら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１４１３−１４２４；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：１３１７−１３２２；Ｒｏａｋｅら、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２２３７−２２４７；Ｃｕｍｂｅｒｂａｔｃｈら、１９９２、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．７５：２５７−２６３；Ｃｕｍｂｅｒｂａｔｃｈら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．８４：３１−３５）。
【００１１】
ケモカインは、白血球の移動および活性化を調節する低分子量タンパク質である（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ、１９９３、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３５１：１８３−１８６；Ｓｃｈａｌｌら、１９９４、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：８６５−８７３；Ｒｏｌｌｉｎｓ、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：９０９−９２８；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら、１９９４、Ａｄｖ．Ｉｍｕｎｏｌ．５５：９７−１７９）。これらは、活性化された白血球自身、ならびに炎症刺激に際しての内皮細胞および上皮細胞を含む間質細胞により分泌される（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ、１９９３、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３５１：１８３−１８６；Ｓｃｈａｌｌら、１９９４、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：８６５−８７３；Ｒｏｌｌｉｎｓ、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：９０９−９２８；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら、１９９４、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：９７−１７９）。ケモカインに対する応答は、７つの膜貫通Ｇタンパク質共役レセプターにより媒介される（Ｒｏｌｌｉｎｓ、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：９０９−９２８；Ｐｒｅｍａｃｋら、１９９６、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１１７４−１１７８；Ｍｕｒｐｈｙ、Ｐ．Ｍ．１９９４、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：５９３−６３３）。いくつかのケモカイン（例えば、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−３、ＭＣＰ−４、マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ（発現および分泌された正常なＴ細胞の活性化に際する制御）、ＳＤＦ−１、Ｔｅｃｋ（胸腺発現ケモカイン）およびＭＤＣ（マクロファージ由来ケモカイン））は、インビトロにおいてＤＣを誘引することが報告されている（Ｓｏｚｚａｎｉら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：３２９２−３２９５；Ｓｏｚｚａｎｉら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１９９３−２０００；Ｘｕら、１９９６、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６０：３６５−３７１；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：１３１７−１３２２；Ｒｏａｋｅら、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２２３７−２２４７）。
【００１２】
最近では、研究者らは、癌の処置においてＤＣの活性化を利用することを試みている。動物のモデルにおいて、わずか２×１０５の抗原パルスＤＣは、未処置のマウスに注入した場合、免疫を誘導する（Ｉｎａｂａら、１９９０、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１９７−２０６）。Ｆｌａｍａｎｄら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９４、２４：６０５−６１０）は、Ｂ細胞リンパ腫からのイディオタイプ抗原を用いてマウスＤＣをパルスし、未処置のマウスにそれらを注射した。この処置は、次の腫瘍攻撃からレシピエントマウスを効果的に保護し、そして免疫を持続する状態を確立した。抗原単独の注入、または抗原を用いてパルスされたＢ細胞は、効果がなく、このことは、抗腫瘍応答を担うＤＣの独特な特徴であることを示唆する。ＤＣは抗腫瘍免疫を誘導することが可能なだけでなく、ＤＣが、このプロセスの発生に絶対的に必須であると仮定されている（Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：７２２−７２７；Ｇｒａｂｂｅら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６：１１７−１２０；Ｈｕａｎｇら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９６１−９６５）。Ｈｕａｎｇおよび共同研究者ら（Ｈｕａｎｇら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９６１−９６５）は、抗腫瘍免疫を産生することが公知であるＢ７−１トランスフェクト腫瘍を用いてマウスに接種した。彼らは、ＭＨＣ適合性ＡＰＣを有するマウスだけが腫瘍チャレンジを拒絶することが可能であることを実証した。ヒトにおける研究では、ＤＣについての類似の役割を実証している。ペプチド特異的ＣＴＬはペプチドパルスＤＣを使用して、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞から容易に誘導されることが報告されているが、ペプチドパルス単球を使用した場合は誘発されていない（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１５３：９９６−１００３）。
【００１３】
樹状細胞の原発性腫瘍病変への組織学的浸潤が、膀胱癌、肺癌、食道癌、胃癌および鼻咽頭癌の患者における非常に長期化した患者の生存および転移性疾患の発生の減少と関連していることは、臨床的に非常に興味がある。対照的に、比較的乏しい臨床的予後は、ＤＣを伴う散在性の浸潤を示す病変を有する患者で観察され、転移性の病変は、頻繁に、ＤＣ浸潤が欠けている（Ｂｅｃｋｅｒ，１９９３，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ７：１８７；Ｚｅｉｄら，１９９３，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２５：３３８；Ｆｕｒｉｈａｔｏｎら，１９９２，６１：４０９；Ｔｓｕｊｉｔａｎｉら，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ  ６６：２０１２；Ｇｉａｎｎｉら，１９９１，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１８７：４９６；Ｍｕｒｐｈｙら，１９９３，Ｊ．Ｉｎｖ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１００：３３５８）。最近、進行したＢ細胞リンパ腫の患者を、患者自身の腫瘍イディオタイプでパルスしたＤＣで処置した（Ｈｓｕら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（１）：５２）。このことにより、患者のＢ細胞リンパ腫において測定可能な減少が生じた。ＰＳＭ抗原でパルスしたＤＣを用いた前立腺癌の処置は、Ｍｕｒｐｈｙらにより報告されている（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  １９９６  ２９：３７１）。
【００１４】
インターロイキン４（ＩＬ−４）もしくは腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）のいずれかと組み合わせた顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）に応答して、循環単球またはＣＤ３４造血性前駆体から多数のＤＣをインビトロ増殖させる技術が、最近出てきた（Ｓａｌｌｕｓｔｏら，１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９−１１１８；Ｒｏｍａｎｉら，１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：８３−９３：Ｃａｕｘ
ら，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：２５８）。ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の組み合わせは、末梢血単球を強力なＤＣへと分化させるように誘導する（ＫｉｅｒｔｓｃｈｅｒおよびＲｏｔｈ，１９９６，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．５９：２０８−２８１）。これら２つのサイトカインの組み合わせを用いると、インビトロで末梢血から１００倍のＤＣの収量の増加が達成される。
【００１５】
マウスにおいて、種々の群により、腫瘍抗原を負荷したインビトロで生成されたＤＣは、腫瘍の発生を予防し、より重要なことには、確立された腫瘍の退行を誘導することが示された。黒色腫の患者を、ＭＡＧＥ−１腫瘍抗原由来のペプチドでパルスしたＧＭ−ＣＳＦ活性化ＡＰＣを用いて処置する臨床試験を行った（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５３：９９６−１００３）。免疫する前は、２名の患者に由来する腫瘍浸潤リンパ球は、ＣＤ４＋が優性であり、それぞれ、特異的腫瘍反応性を欠いていた。対照的に、同じ患者に由来する腫瘍浸潤リンパ球を免疫した後は、ＣＤ８＋が優性であり、ＭＡＧＥ−１特異的抗腫瘍細胞傷害性が示された。従って、これらの研究から、ＤＣが、免疫応答を刺激する独特かつ強い能力を有することが明らかである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従って、樹状細胞治療は、疾患（特に、癌）の処置に対する非常に確実な（ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ）アプローチを示す。抗原提示樹状細胞を増殖かつ活性化させるだけでなく、治療的に有用かつ予防的に有用であるように、ＤＣの移動を促進するために使用され得る、改善された材料および方法が継続して必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の要旨）
本発明は、抗原提示樹状細胞の移動もしくは活性化を促進または阻害することにより疾患状態を処置するための材料および方法を提供することによって、前述の必要性を満たす。現在では、ケモカインは、有用な治療的薬剤であることが発見されている。本発明に従って処置され得る疾患状態としては、寄生生物感染、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、癌、自己免疫疾患、移植片拒絶、およびアレルギーが挙げられる。
【００１８】
本発明は、疾患状態を処置する方法を提供し、この方法は、疾患状態の処置が必要な個体に、未成熟樹状細胞の抗原送達部位への移動を増大させるに十分な量のケモカインを投与する工程を包含する。本発明の１つの局面において、ケモカイン（例えば、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−３α、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、Ｔｅｃｋ、ＤＣ  ｔａｃｔｉｎ−β、６Ｃｋｉｎｅ、ＭＤＣ、ＭＩＰ−５またはこれらの組み合わせ）が投与される。本発明の好ましい方法において、疾患関連抗原（例えば、腫瘍関連抗原）は、ケモカインとともに投与される。
【００１９】
本発明の別の局面は、疾患状態を処置する方法を提供し、この方法は、疾患状態を処置する必要のある個体に、未成熟樹状細胞の抗原送達部位への移動を減少させるに十分な量のケモカインを投与する工程を包含する。
【００２０】
本発明のなお別の局面において、サイトカイン（特に、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４）は、ケモカインと組み合わせて、ケモカインの前またはケモカインと同時のいずれかで投与される。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の投与は、前駆体からのＤＣの生成を刺激し、それにより、抗原を捕捉し、プロセシングするに利用可能なＤＣの数を増大させる。
【００２１】
本発明のなお別の局面は、活性化薬剤（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＲＡＮＫ−ＬまたはＲＡＮＫのアゴニスト、およびｔｏｌｌ様レセプターファミリーの分子のアンタゴニスト）は、組織から、排出リンパを通ってリンパ器官へ向かうＤＣの移動を駆動する成熟シグナルを提供するために投与される。
【００２２】
本発明はまた、哺乳動物における免疫応答を増強する方法を提供し、この方法は、ケモカインＭＣＰ−４またはＭＣＰ−４の生物学的に活性なフラグメントを哺乳動物に投与する工程を包含する。ヒトＭＣＰ−４（ｈＭＣＰ−４）は、ヒト血液の樹状細胞に対して活性であり、樹状細胞および樹状細胞前駆体を血液から補充する。好ましい局面において、このケモカインは、組換えケモカインである。最も好ましくは、このケモカインは、例えば、組換えケモカインと抗原の融合タンパク質の形態で、抗原とともに投与される。このような抗原は、腫瘍関連抗原、細菌抗原、ウイルス抗原または真菌抗原であり得る。
【００２３】
さらに、本発明は、哺乳動物における免疫応答を増強する方法を提供し、この方法は、ケモカイン６Ｃｋｉｎｅまたは６Ｃｋｉｎｅの生物学的に活性なフラグメントを哺乳動物に投与する工程を包含する。ヒト６Ｃｋｉｎｅは、ヒト血液樹状細胞に対して活性であり、樹状細胞および樹状細胞前駆体を血液から補充する。樹状細胞の補充により、ケモカイン６Ｃｋｉｎｅは、抗腫瘍薬剤として働き、具体的には、腫瘍血管に対する新脈管形成効果を発揮することが示される。好ましい局面において、このケモカインは、組換えケモカインである。最も好ましくは、このケモカインは、例えば、組換えケモカインと抗原の融合タンパク質の形態で、抗原とともに投与される。このような抗原は、腫瘍関連抗原、細菌抗原、ウイルス抗原または真菌抗原であり得る。
【００２４】
本発明のなお別の局面において、サイトカイン（特に、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４）は、ケモカインと組み合わせて（ケモカインの前またはケモカインと同時のいずれか）投与される。
【００２５】
最後の局面において、本発明は、ＭＣＰ−４またはＭＣＰ−４の生物学的に活性な部分および抗原、ならびに６Ｃｋｉｎｅまたは６Ｃｋｉｎｅの生物学的に活性な部分および抗原を含む融合タンパク質を提供する。これらの融合タンパク質は、プラスミド、ウイルスベクターの形態で、または組換えベクターの形態で哺乳動物に投与され得る。
本発明は以下を提供する。
（１）疾患状態の処置のための医薬品の製造における、樹状細胞の移動を方向付け得るケモカインの使用。
（２）項目１に記載の使用であって、前記ケモカインが、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、Ｔｅｃｋ、ＤＣｔａｃｔｉｎ−β、６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ、ＬＥＣ、ＭＤＣ、およびＭＩＰ−５からなる群より選択される、使用。
（３）項目１に記載の使用であって、前記ケモカインが、樹状細胞の抗原送達部位への移動を方向付け得る、使用。
（４）項目１に記載の使用であって、前記ケモカインが、樹状細胞のリンパ器官への移動を方向付け得る、使用。
（５）項目１に記載の使用であって、前記疾患状態が、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、寄生生物感染または癌である、使用。
（６）項目１に記載の使用であって、前記疾患状態が、自己免疫疾患、組織拒絶、またはアレルギーである、使用。
（７）項目５に記載の使用であって、前記疾患状態が、黒色腫、乳癌、すい臓癌、結腸癌、肺癌、神経膠腫、肝細胞癌、子宮内膜癌、胃癌、腸癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌、精巣癌、肝臓癌、頭部および頚部の癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、眼の癌、膀胱癌、神経膠芽細胞種、および転移性癌腫からなる群より選択される癌である、使用。
（８）項目３に記載の使用であって、前記樹状細胞が、未成熟樹状細胞である、使用。
（９）項目８に記載の使用であって、前記ケモカインが、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＤＣ、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−５からなる群より選択される、使用。
（１０）項目４に記載の使用であって、前記ケモカインが、ＭＩＰ−３βである、使用。
（１１）項目３に記載の使用であって、少なくとも１つの疾患関連抗原の使用をさらに包含する、使用。
（１２）項目１１に記載の使用であって、前記抗原が、腫瘍関連抗原である、使用。
（１３）項目１１に記載の使用であって、前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原、または真菌抗原である、使用。
（１４）項目１２に記載の使用であって、前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、Ｈｋｅｒ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼならびにｐ５３からなる群より選択される、使用。
（１５）項目１４に記載の使用であって、前記癌が前立腺癌であり、かつ前記腫瘍関連抗原が、ＰＳＡおよび／またはＰＳＭである、使用。
（１６）項目１４に記載の使用であって、前記疾患状態が黒色腫であり、かつ前記腫瘍関連抗原がＭｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００またはチロシナーゼである、使用。
（１７）項目１に記載の使用であって、活性化薬剤の使用をさらに包含する、使用。
（１８）項目１５に記載の使用であって、前記活性化薬剤が、ＴＮＦα、ＲＰ−１０５、抗ＣＤ４０抗体および非メチル化ＣｐＧモチーフを含む核酸、またはｔｏｌｌ様レセプターのリガンドから選択される、使用。
（１９）項目１に記載の使用であって、ケモカインとともに、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の組み合わせの使用をさらに包含する、使用。
（２０）項目１に記載の使用であって、前記ケモカインが、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、局所投与、またはベクターの形態で投与される、使用。
（２１）哺乳動物における免疫応答を増強する方法であって、該方法は、ケモカインＭＣＰ−４またはケモカインＭＣＰ−４の生物学的に活性な画分を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（２２）項目２１に記載の方法であって、前記ケモカインが、組換えケモカインである、方法。
（２３）項目２１に記載の方法であって、前記ケモカインがヒトケモカインである、方法。
（２４）項目２１に記載の方法であって、該方法は、前記ケモカインの徐放を可能にする物質を送達部位に投与する工程をさらに包含する、方法。
（２５）項目２１に記載の方法であって、該方法は、前記ケモカインとともに抗原を投与する工程をさらに包含する、方法。
（２６）項目２５に記載の方法であって、ＭＣＰ−４および抗原を含む融合タンパク質が、前記哺乳動物に投与される、方法。
（２７）項目２５に記載の方法であって、前記抗原が、腫瘍関連抗原である、方法。
（２８）項目２６に記載の方法であって、前記抗原が、腫瘍関連抗原である、方法。
（２９）項目２５に記載の方法であって、前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原、または真菌抗原である、方法。
（３０）項目２６に記載の方法であって、前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原または真菌抗原である、方法。
（３１）項目２５に記載の方法であって、前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、Ｈｋｅｒ８、高分子量黒色腫抗原
、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、ｐ５３ならびにテロメラーゼからなる群より選択される、方法。
（３２）項目２６に記載の方法であって、前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、Ｈｋｅｒ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、ｐ５３ならびにテロメラーゼからなる群より選択される、方法。
（３３）項目２５に記載の方法であって、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の組み合わせを投与する工程をさらに包含する、方法。
（３４）項目２６に記載の方法であって、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の組み合わせを投与する工程をさらに包含する、方法。
（３５）項目２１に記載の方法であって、前記ケモカインとともに活性化薬剤を投与する工程をさらに包含する、方法。
（３６）項目２１に記載の方法であって、前記ケモカインが、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、局所投与、またはベクターの形態で投与される、方法。
（３７）ＭＣＰ−４および抗原を含む、融合タンパク質。
（３８）項目３７に記載の融合タンパク質であって、前記抗原が腫瘍関連抗原である、融合タンパク質。
（３９）項目３８に記載の融合タンパク質であって、前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、Ｈｋｅｒ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、ｐ５３ならびにテロメラーゼからなる群より選択される、融合タンパク質。
（４０）項目３８に記載の融合タンパク質であって、前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原または真菌抗原である、融合タンパク質。
（４１）項目３７に記載の融合タンパク質を含む、プラスミド。
（４２）項目３９に記載のプラスミドであって、樹状細胞に特に適したプロモーター配列をさらに含む、プラスミド。
（４３）項目３７に記載の融合タンパク質を含む、ウイルスベクター。
（４４）哺乳動物における免疫応答を増強する方法であって、該方法は、ケモカイン６Ｃｋｉｎｅまたはケモカイン６Ｃｋｉｎｅの生物学的に活性な画分を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（４５）項目４４に記載の方法であって、前記ケモカインが、組換えケモカインである、方法。
（４６）項目４４に記載の方法であって、前記ケモカインがヒトケモカインである、方法。
（４７）項目４４に記載の方法であって、該方法は、前記ケモカインの徐放を可能にする物質を送達部位に投与する工程をさらに包含する、方法。
（４８）項目４４に記載の方法であって、該方法は、前記ケモカインとともに抗原を投与する工程をさらに包含する、方法。
（４９）項目４８に記載の方法であって、６Ｃｋｉｎｅおよび抗原を含む融合タンパク質が、前記哺乳動物に投与される、方法。
（５０）項目４８に記載の方法であって、前記抗原が、腫瘍関連抗原である、方法。
（５１）項目４９に記載の方法であって、前記抗原が、腫瘍関連抗原である、方法。
（５２）項目４８に記載の方法であって、前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原、または真菌抗原である、方法。
（５３）項目４９に記載の方法であって、前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原、または真菌抗原である、方法。
（５４）項目４８に記載の方法であって、前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、Ｈｋｅｒ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、ｐ５３ならびにテロメラーゼならびにＣ２６結腸癌からなる群より選択される、方法。
（５５）項目４９に記載の方法であって、前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、Ｈｋｅｒ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、ｐ５３ならびにテロメラーゼならびにＣ２６結腸癌からなる群より選択される、方法。
（５６）項目４８に記載の方法であって、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の組み合わせを投与する工程をさらに包含する、方法。
（５７）項目４９に記載の方法であって、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の組み合わせを投与する工程をさらに包含する、方法。
（５８）項目４４に記載の方法であって、前記ケモカインとともに活性化薬剤を投与する工程をさらに包含する、方法。
（５９）項目４４に記載の方法であって、前記ケモカインが、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与
、局所投与、またはベクターの形態で投与される、方法。
（６０）６Ｃｋｉｎｅおよび抗原を含む、融合タンパク質。
（６１）項目６０に記載の融合タンパク質であって、前記抗原が腫瘍関連抗原である、融合タンパク質。
（６２）項目６１に記載の融合タンパク質であって、前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、Ｈｋｅｒ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、ｐ５３ならびにテロメラーゼからなる群より選択される、融合タンパク質。
（６３）項目６１に記載の融合タンパク質であって、前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原または真菌抗原である、融合タンパク質。
（６４）項目６０に記載の融合タンパク質を含む、プラスミド。
（６５）項目６４に記載のプラスミドであって、樹状細胞に特に適したプロモーター配列をさらに含む、プラスミド。
（６６）項目６０に記載の融合タンパク質を含む、ウイルスベクター。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で引用されるすべての参考文献は、その全体が、参考として援用される。
【００２７】
インビボでのＤＣ移動を誘導するシグナルと、それらのケモカインに対する応答との間の関係は、これまで公知ではなかった。本発明者らは、ＤＣにより発現されるケモカインレセプターのパターンは、それらの成熟段階に従って変化し、ケモカインがＤＣサブセットの移動を駆動するために使用され得、それにより、免疫応答の開始を制御し得ることを発見した。ケモカインは、本発明に従って、未成熟ＤＣサブセットを抗原送達部位に選択的に誘引するアジュバントとして使用され得る。自己免疫疾患、組織拒絶またはアレルギーの状況において、本発明は、例えば、ＣＣＲ６アゴニストおよびアンタゴニスト、ＣＣＲ７アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにＣＣＲ２アゴニストおよびアンタゴニストの発生を介して、ＤＣの移動を妨害することにより、ＤＣ機能をブロックする方法を提供する。
【００２８】
免疫系に抗原を提示するＤＣのサブセットに依存して、応答は劇的に変化する。ＤＣは、寛容を誘導し得る。胸腺の髄質において見出されたＤＣは、自己選択的胸腺細胞を発生させるネガティブ選択において役割を果たし得る（Ｂｒｏｃｋｅｒら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５（３）：５４１−５５０）。ＤＣはまた、自己反応性末梢Ｔ細胞に寛容させる（Ｋｕｒｔｓら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６（２）：２３９−２４５；Ａｄｌｅｒら，１９９８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（１０）：１５５５−１５６４）。マウスＤＣの特定のサブセット（おそらく、リンパ起源の）は、免疫寛容を誘導することが提唱された（Ａｒｄａｖｉｎ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２（６４２２）：７６１−７６３）。さらに、リンパＤＣに対する候補ヒト対応物（ＤＣ−２）（Ｇｒｏｕａｒｄら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５（６）：１１０１−１１１１）がＩＬ−１２を分泌できないという最近の説明は、この亜集団による提示の後に、免疫応答がＴＨ−２型に向かって偏向され得ることを示唆する。
【００２９】
目的が免疫応答を減少させることである場合、ＤＣに寛容させること（自己免疫、アレルギー）が増大されるか、または応答の質がＤＣ−２を特異的に増大させることにより改変される（ＴＨ２より大きなＴＨ１、すなわち、アレルギーにおいて）。
【００３０】
本発明において使用するためのケモカインは、ＤＣの制限されたサブセット、特に、未成熟ＤＣに対して活性な、身体の天然のタンパク質である。これらのケモカインのいくつか（ＭＩＰ−３α、Ｔｅｃｋ、ＭＤＣおよびＭＣＰ−４、ならびに６Ｃｋｉｎｅが挙げられるが、これらに限定されない）が、本発明者らにより同定された。
【００３１】
本発明を実施する際に使用されるケモカインは、天然産物に対して同一のアミノ酸配列を有する組換えタンパク質、または天然産物に由来し得るが、その本来の走化性特性を保持しつつその薬物動態特性を変化させる改変を含む組換えタンパク質であり得る。ケモカインの送達の様式は、注射（皮内、筋肉内および皮下が挙げられる）または局所的（例えば、軟膏またはパッチ）によってであり得る。
【００３２】
ケモカインはまた、ベクター（例えば、ウイルスベクター）（例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）、または操作されたプラスミドＤＮＡによって核酸配列として送達され得る。
【００３３】
本明細書中で使用される用語「ケモカイン」は、走化性因子を含み得る。走化性因子は、低分子化合物（これは、未成熟ＤＣにより発現されるケモカインレセプターの選択的アゴニストである）であり得る。ＣＣＲ６（ケモカインＭＩＰ−３αの天然のレセプター）は、このようなレセプターの例である。
【００３４】
本発明の特に好ましい実施形態において、ケモカインは、疾患関連抗原とともに投与される。この抗原は、任意の分子部分であり得、これに対して、免疫応答の増大または低下が調べられる。これは、ヒトまたは動物において疾患を引き起こすことが公知の生物（例えば、細菌、ウイルス、寄生生物（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、および真菌）に由来する抗原を含む。これはまた、腫瘍により発現される抗原(腫瘍関連抗原)および植物抗原(アレルゲン)を含む。
【００３５】
本発明において使用するための腫瘍関連抗原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＨＫｅｒ  ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、αフェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ、ならびにｐ５３。この列挙は、本発明の実施において使用され得る抗原の型を網羅することを意図するのではなく、単に例示するに過ぎない。
【００３６】
抗原の異なる組み合わせが使用され得、これは、異なる人種グループ、性別、地理的分布、および疾患の病期に従って最適な機能を示す。本発明の１つの実施形態において、少なくとも２つ以上の異なる抗原が、ケモカインの投与とともに投与される。
【００３７】
抗原は、ケモカインと同じ部位および同じ時間に、または４８時間を越えない遅延の後に送達または投与され得る。同時投与または組み合わせた投与は、本明細書中で使用される場合、ケモカインおよび抗原が、被験体に、一般的な処置スケジュールの過程の間に、（ａ）時間内に同時または（ｂ）異なる時間のいずれかに投与される。後者の場合において、２つの化合物は、意図された効果を達成するために十分に近い時間内に投与される。抗原は、タンパク質、または１または数個のペプチドの形態、あるいは送達ベクターに含まれる核酸配列の形態にあり得る。
【００３８】
原発性癌および転移制癌が、ともに、本発明に従って処置され得る。処置され得る癌の型としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：黒色腫、乳癌、膵臓癌、結腸癌、肺癌、神経膠腫、肝細胞癌、子宮内膜癌、胃癌、腸癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌、精巣癌、肝臓癌、頭部および頚部の癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、眼の癌、膀胱癌、神経膠芽細胞種、および転移性癌。用語「癌（腫）」とは、呼吸器系癌、胃腸管系癌、尿生殖器系癌、前立腺癌、内分泌系癌、および黒色腫を含む、上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍をいう。転移性は、本明細書中でこの用語が使用される場合、原発性腫瘍（局所的リンパ節を含む）から離れた部位への腫瘍の拡がりとして規定される。
【００３９】
ＤＣの成熟を達成、誘導または刺激するように設計された部分は、有利に投与され得る。このような薬剤は、組織からリンパ節への移動を促進する成熟シグナルを提供する。この部分は、例えば、ＴＮＦ−αもしくはＲＰ−１０５のような身体の天然産物、またはＤＣ上の特異的構造を認識するアゴニスト抗体（例えば、抗ＣＤ−４０抗体）、または別の物質であり得る。活性化物質は、非メチル化ＣｐＧモチーフ、またはＤＣを刺激することが公知のｔｏｌｌ様レセプターのアゴニストを含む核酸の配列であり得る。ケモカインおよび／または抗原がプラスミドベクターにより送達される本発明の実施形態において、これらの核酸配列は、ベクターの一部であり得る。
【００４０】
ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４は、有利には、ケモカインおよび／または抗原と組み合わせて投与され得る。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の投与組み合わせは、前駆体からＤＣの生成を刺激する。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４は、循環未成熟ＤＣの数を増大させる目的で投与され得る。これは、ケモカインの引き続く注射により、局所的に補充され得る。このプロトコルは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を使用して、少なくとも５〜７日間の全身的な前処置を含む。別の方法は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の局所的投与により、同じ部位に送達される抗原を拾い上げ得る、ＤＣ前駆体（単球）の未成熟ＤＣへの局所的分化に都合がよい。
【００４１】
一般に、ケモカインおよび／または抗原および／または活性化薬剤および／またはサイトカインは、薬学的キャリア中に有効量のケモカインおよび／または抗原および／または活性化薬剤および／またはサイトカインを含む薬学的組成物として投与される。これらの試薬は、生理学的に刺激のない安定剤および賦形剤とともに、例えば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤（例えば、免疫原性アジュバント）中に、さらなる活性成分または不活性成分を用いた治療的用途のために組み合わせられ得る。薬学的キャリアは、患者に本発明の組成物を送達するために適切な任意の適合性の、非毒性物質であり得る。
【００４２】
有効な治療に必要な試薬の量は、多くの異なる要因（投与の手段、標的部位、患者の身体的状態、および投与されている他の医薬品が挙げられる）に依存する。従って、処置投薬量は、安全性および有効性を最適化するために力価測定されるべきである。特定の癌を処置するための有効用量を試験する動物は、ヒト投薬量のさらなる予測指標を提供する。種々の考慮事項が、例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ
Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版（１９９０），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載される。投与のための方法は、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、または筋肉内投与、経皮的拡散などについて、そこでおよび以下に議論される。薬学的に受容可能なキャリアとしては、水、生理食塩水、緩衝液、および例えば、ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙに記載される他の化合物が挙げられる。徐放処方物、または徐放装置は、連続的な投与のために使用され得る。
【００４３】
ケモカインおよび／または抗原および／または活性化薬剤についての投薬量範囲は、通常は、適切なキャリアとともに、１ｍＭ濃度未満、代表的には、約１０μＭ濃度未満、通常は、約１００ｎＭ未満、好ましくは、約１０ｐＭ（ピコモル濃度）未満、および最も好ましくは、約１ｆＭ（フェムトモル濃度）未満の量にあると予測される。一般に、処置は、化合物の最適な用量未満のより少量の投薬量を用いて開始される。その後、投薬量は、その環境下での最適な効果が達成されるまで、少量ずつ増大される。特定の状況のための適切な用量および投薬レジメンの決定は、当該分野の技術範囲内である。
【００４４】
本願発明の実施におけるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の好ましい生物学的に活性な用量は、循環ＣＤ１４＋／ＣＤ１３＋前駆体細胞の数；ＤＣ前駆体および成熟ＤＣの表面上での抗原提示分子の発現；Ｔ細胞への抗原提示活性；および／または成熟ＤＣ機能と一致した抗原依存性Ｔ細胞応答の刺激の最大の増加を誘導する投薬組み合わせである。本発明の実施において、皮下投与するために使用されるＩＬ−４の量は、代表的には、約０．０５〜約８．０μｇ／ｋｇ／日、好ましくは、０．２５〜６．０μｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは、０．５０〜４．０μｇ／ｋｇ／日の範囲にある。皮下投与に使用されるＧＭ−ＣＳＦの量は、代表的には、約０．２５μｇ／ｋｇ／日〜約１０．０μｇ／ｋｇ／日、好ましくは、約１．０〜８．０μｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは、２．５〜５．０μｇ／ｋｇ／日の範囲にある。特定の患者のための有効量は、上記のパラメーターの１以上における有意な変化を測定することにより確立される。
【００４５】
ケモカインＭＣＰ−４またはＭＣＰ−４の生物学的に活性なフラグメントの投与が、用量依存性様式においてインビボでマウスの樹状細胞の補充を促進し、血液から単離されたヒト樹状細胞に対しても活性であることが見出された。生物学的に活性なフラグメントは、測定可能な免疫応答を刺激するに十分なＭＣＰ−４分子の部分を意味する。この応答は、血清中の免疫グロブリンレベルの抗原特異的刺激の増強（代表的には、Ｂ細胞応答として公知）として測定され得る。さらに、ＭＣＰ−４の生物学的に活性なフラグメントは、免疫グロブリンの特定のクラス（例えば、Ｔ細胞における増大を要するＩｇＧ２ａ）の生成を刺激する。さらに、ＭＣＰ−４の生物学的に活性なフラグメントは、抗原特異的抗腫瘍応答を増強する。増強した応答は、抗原を発現する腫瘍を使用したチャレンジの後のより遅延した腫瘍増殖またはより遅延した腫瘍指標により測定され得る。増強した免疫応答はまた、リンパ球の規定された集団（血液、脾臓、リンパ節、腫瘍）の抗原特異的細胞傷害性応答の分析により測定され得る。当然のことながら、ＣＣＲ２アゴニスト（例えば、薬物発見スクリーニングにより見出される）である低分子はまた、抗原特異的抗腫瘍応答を増強することが認識される。根本的理由は、全てのＭＣＰ（１〜４）が天然のＣＣＲ２アゴニストであり、引き続き人工的な低分子アゴニストが同じ効果を有し得ることである。多くの現在の治療剤は、有機化学合成により得られる低分子である。
【００４６】
好ましい実施形態は、組換えｈＭＣＰ−４タンパク質単独または送達部位における徐放を可能にする物質（デポー）；ｈＭＣＰ−４またはｈＭＣＰ−４の画分および抗原からなる融合タンパク質（９アミノ酸より大きなペプチドまたはタンパク質）；  ｈＭＣＰ−４またはｈＭＣＰ−４の画分（抗原を伴うかまたは伴わない）をコードするＤＮＡまたはウイルスベクター（９アミノ酸より大きなペプチドまたはタンパク質）、あるいは送達ベクターに含まれる核酸配列と組み合わせられた組換えｈＭＣＰ−４タンパク質からなるが、これらに限定されない。
【００４７】
ヒトＭＣＰ−４（ｈＭＣＰ−４）は、ケモカインのＣＣファミリーに属する。その配列は、１９９６年に最初に公開された（Ｕｇｕｃｃｉｏｎｉら，１９９６，Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＭＣＰ−４），Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ＭＣＰ−３およびＥｏｔａｘｉｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２３７９−２３９４）。ヒトＭＣＰ−４は、７５アミノ酸残基からなる８．６ｋＤａのペプチドである（図３）。これはまた、ＣＫ−β−１０、ＳＣＹ−Ａ１３およびＮＣＣ−１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ９９６１６）として公知であり、新たなケモカイン命名においてＣＣＬ１３と再度名づけられた（Ｚｌｏｔｎｉｋら，２０００，Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｏｌｅ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１２：１２１−１２７）。
【００４８】
６Ｃｋｉｎｅは、ケモカインのＣＣファミリーに属する（Ｈｅｄｒｉｃｋら，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１５８９−１５９３）。ＣＫ−β−９、ｅｘｏｄｕｓ−２およびＳＬＣ(ヒトタンパク質についてはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号０００５８５
）として公知であり、ＣＣＬ２１と再度名づけた。ヒト６Ｃｋｉｎｅ（ｈ６Ｃｋｉｎｅ）は、ケモカインＣＣＲ７に結合する一方、マウス６Ｃｋｉｎｅ（ｍ６Ｃｋｉｎｅ）は、ＣＣＲ７およびＣＸＣＲ３レセプターに結合するが、親和性は低い（Ｊｅｎｈら，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３７６５−３７６９）。マウス６Ｃｋｉｎｅは、マウスにおける腫瘍に注射された場合、抗腫瘍効果を有することが示されている（Ｓｈａｒｍａら，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４５５８−４５６３）。
【００４９】
６Ｃｋｉｎｅ様ＭＩＰ−３βおよびＭＣＰ−４は、成熟ＤＣの移動を誘導する。興味深いことに、６ＣｋｉｎｅならびにＭＩＰ−３βは、成熟の後に全てのヒトＤＣ集団（ＣＤ１ａ＋ランゲルハンス細胞、ＣＤ１４＋間質ＤＣ、単球由来ＤＣ、循環血液ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ、単球、および循環血液ＣＤ１１ｃ−プラズマ細胞様ＤＣを含む）の移動を誘導し得る。６Ｃｋｉｎｅに対する応答は、いくつかのＤＣアクチベーター（ＣＤ４０−Ｌ、ＴＮＦ−α、およびＬＰＳを含む）により誘導される成熟の後に観察される。ＭＩＰ−３βの場合において見られるように、ＣＣＲ７は、６Ｃｋｉｎｅを介してＤＣ活性化の間に上方調節され、おそらく６Ｃｋｉｎｅに対する応答を説明する。
【００５０】
従って、ケモカインｈ６Ｃｋｉｎｅは、癌処置において使用され得ることが提唱されている。好ましい実施形態は、以下からなるが、これらに限定されない：組換えｈ６Ｃｋｉｎｅタンパク質単独または送達部位におけるその徐放を可能にする物質（腫瘍部位におけるデポー）と組み合わせた組換えｈ６Ｃｋｉｎｅタンパク質；融合タンパク質またはｈ６Ｃｋｉｎｅもしくはｈ６Ｃｋｉｎｅの画分および腫瘍への構築物の送達を可能にする標的化部分(例えば、抗体または抗体のフラグメント、タンパク質リガンド、１０アミノ酸よ
り大きなペプチド)からなる、化学的連結により作製された構築物；ｈ６Ｃｋｉｎｅもし
くはｈ６Ｃｋｉｎｅの画分（上記の標的化部分を有するかまたは有さない）をコードするＤＮＡもしくはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス）。
【実施例】
【００５１】
本発明は、以下の非限定的な実施例により例示され得る。以下の実施例は、以下の材料および方法を参照することによって容易に理解され得る。
【００５２】
（造血因子、試薬および細胞株）  組換えＧＭ−ＣＳＦ(比活性：２．１０６Ｕ／ｍｇ
，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）を、飽和濃度の１００ｎｇ／ｍｌにて使用した。組換えヒトＴＮＦα（比活性：２×１０７Ｕ／ｍｇ，Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を、最適濃度の２．５ｎｇ／ｍにて使用した。組換えヒトＳＣＦ（比活性：４×１０５Ｕ／ｍｇ，Ｒ＆Ｄ  Ａｂｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を、２５ｎｇ／ｍｌの最適濃度にて使用した。組換えヒトＩＬ−４（比活性：２．１０７Ｕ／ｍｇ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）を、５０Ｕ／ｍｌの飽和濃度にて使用した。組換えヒトケモカインＭＩＰ−１α（比活性：２×１０５Ｕ／ｍｇ，９×１０１２Ｕ／Ｍ）、ＲＡＮＴＥＳ（比活性：１×１０４Ｕ／ｍｇ，８×１０１０Ｕ／Ｍ）、ＭＩＰ−３α（比活性：４×１０５Ｕ／ｍｇ，３×１０１２Ｕ／Ｍ）およびＭＩＰ−３β（比活性：１×１０４Ｕ／ｍｇ，９×１０１０Ｕ／Ｍ）を、Ｒ＆Ｄ（Ａｂｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）から得た。ＬＰＳを、１０ｎｇ／ｍｌにて使用した（Ｓｉｇｍａ）。
マウスＣＤ４０リガンドトランスフェクト細胞株（ＣＤ４０−Ｌ  Ｌ  細胞）を、ＤＣ成熟の刺激因子として使用した。
【００５３】
（臍帯血ＣＤ３４＋  ＨＰＣからのＤＣの生成）  臍帯血サンプルを、全期間の送達の後に得た。ＣＤ３４＋抗原を有する細胞を、記載のように（Ｃａｕｘら，１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：６９５−７０６；Ｃａｕｘら，１９９０，Ｂｌｏｏｄ．７５：２２９２−２２９８）、抗ＣＤ３４＋モノクローナル抗体（Ｉｍｍｕ−１３３．３，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ  Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ被覆マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍＢＨ，Ｂｅｒｇｉｓｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＭｉｎｉｍａｃｓ分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ポジティブ選択を介して単球画分から単離した。全ての実験において、単離した細胞は、８０％〜９９％  ＣＤ３４＋であった。精製の後、ＣＤ３４＋細胞を、１０％  ＤＭＳＯ中で低温保存した。
【００５４】
ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαの存在下で、記載のように（Ｃａｕｘら，１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：６９５−７０６）、エンドトキシンを含まない培地（１０％（ｖ／ｖ）非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＵＫ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５×１０−５Ｍ  Ｄ−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｌｅｖａｌｌｏｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を補充したＲＰＭＩ
１６４０（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）からなる）(完全培地とも
いわれる)中で確立した。融解した後、ＣＤ３４＋細胞を、２５〜７５ｃｍ２培養容器（
Ｌｉｎｂｒｏ，ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｃｒｏｎ，ＯＨ）中で２×１０４細胞／ｍｌに増殖させるために播種した。最適条件を、これらの培養物を、５日目および１０日目に新たなＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαを含む培地を使用して分割することにより維持した（細胞濃度：１〜３×１０５細胞／ｍｌ）。ＣＤ１ａ＋ＤＣは、１２日目には、７０〜９０％の細胞の間である。
【００５５】
（ＦＡＣＳソーティングによるＣＤ８６発現に従う未成熟ＤＣおよび成熟ＤＣの単離）
ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαの存在下での培養の１２日後に、細胞を収集し、ＦＩＴＣ結合体化ＯＫＴ６（ＣＤ１ａ）（Ｏｒｔｈｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）およびＰＥ結合体化ＩＴ２．２（ＣＤ８６）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で標識した。細胞を、ＣＤ１ａおよびＣＤ８６発現に従って、未成熟ＣＤ１ａ＋ＣＤ８６−ＤＣ集団、および成熟ＣＤ１ａ＋ＣＤ８６＋ＤＣ集団に、ＦＡＣＳｔａｒｐｌｕｓ（登録商標）（レーザー設定：出力２５０ｍＷ、励起波長４８８ｎｍ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して分離した。染色およびソーティングの手順全てを、細胞凝集を避けるために、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡの存在下で行った。ソートした集団の再分析により、純度＞９８％であることが示された。
（末梢血単球からのＤＣの生成）  単球を、ＰＢＭＣの調製、続いて５２％  Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配の後に、免疫磁性除去（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｄｙｎａｌ  Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）により精製した。除去を、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体（４Ｇ２）、抗ＣＤ８モノクローナル抗体（ＯＫＴ８）、抗ＣＤ５６モノクローナル抗体（ＮＫＨ１，Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）および抗ＣＤ１６モノクローナル抗体（ＩＯＮ１６，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）を使用して行った。単球由来樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で精製単球を６〜７日間培養することにより生成した（Ｓａｌｌｕｓｔｏら，１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９−１１１８）。
【００５６】
（インビトロで生成したＤＣの成熟の誘導）  ＣＤ３４＋ＨＰＣを、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＴＮＦαの存在下で６日目まで培養し、ＧＭ−ＣＳＦ単独の存在下で６日目〜１２日目まで、それらの未成熟を保つために培養した。ＣＤ３４＋ＨＰＣ由来の未成熟ＤＣまたは単球由来ＤＣを、ＴＮＦα（２．５ｎｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＣＤ４０ＬトランスフェクトＬ細胞（５ＤＣについて１つのＬ細胞）の存在下で、３時間〜７２時間の間、記載のように（Ｃａｕｘら，１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：１２６３−１２７２）、活性化した。
【００５７】
（末梢血または扁桃からのＣＤ１１ｃ＋ＤＣの精製）  ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを、末梢血または扁桃から以前に記載のように調製した（Ｇｒｏｕａｒｄら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ
３８４：３６４−３６７）。簡潔には、扁桃除去を受けた子供から得た扁桃を、細かく刻み、コラゲナーゼＩＶおよびＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ）を使用して消化した。収集した細胞を、ＳＲＢＣ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を含有するＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを介して５００ｒｐｍにて１５分間、次いで、２０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。末梢血単球（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅにより単離した。ＣＤ３＋Ｔ細胞（ＯＫＴ３）、ＣＤ１９＋Ｂ細胞（４Ｇ７）、およびＣＤ１４＋単球（ＭＯＰ９）を、磁性ビーズ（抗マウスＩｇ被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｄｙｎａｌ）により、得られた低密度細胞から取り出した。第２の除去を、抗ＮＫＨ１、抗グリコホリンＡ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）および抗ＣＤ２０（１Ｆ５４）を使用して行った。残りの細胞を、以下のｍＡｂを用いて染色した：抗ＣＤ１ａ  ＦＩＴＣ（ＯＫＴ６）；抗ＣＤ１４  ＦＩＴＣ、抗ＣＤ５７  ＦＩＴＣ、抗ＣＤ１６  ＦＩＴＣ、抗ＣＤ７  ＦＩＴＣ、抗ＣＤ２０  ＦＩＴＣ、抗ＣＤ３  ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）；抗ＣＤ４  ＰＥ−Ｃｙ５（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）ならびに抗ＣＤ１１ｃ  ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。ＣＤ４＋ＣＤ１１ｃ＋系列−ＤＣを、ＦＡＣＳｔａｒＰｌｕｓ（登録商標）を使用した細胞ソーティングにより単離した（レーザー設定：出力２５０ｍＷ、励起波長４８８ｎｍ）。除去、染色およびソーティングの手順全てを、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下で行った。ソートした集団の再分析により、純度＞９７％であることが示された。
【００５８】
（走化性アッセイ）  細胞移動を、走化性マイクロチャンバ技術（４８ウェル  Ｂｏｙｄｅｎ  ｍｉｃｒｏｃｈａｍｂｅｒ，Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）（Ｂａｃｏｎら，１９８８，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９５：９６６−９７４）を使用して評価した。簡潔には、ヒト組換えＭＩＰ−３αおよびＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳを、ＲＰＭＩ  １６４０培地中に１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度に希釈し、走化性チャンバの下方のウェルに添加した。５０μｌのＲＰＭＩ  １６４０培地中の１０５細胞／ウェル（またはＣＤ１１ｃ＋ＤＣについては５×１０４細胞/ウェル）を、下方のウェルを分離する標準的な５μｍ孔のポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルター（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）を備えるチャンバの上方のウェルにアプライした。このチャンバを、５％  ＣＯ２の加湿空気中、３７℃にて１時間インキュベートした。次いで、フィルターの下面に移動した細胞を、Ｆｉｅｌｄ’ｓ  ＡおよびＦｉｅｌｄ’ｓ  Ｂ（ＢＤＨ，Ｄｏｒｃｅｔ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して染色し、２つのランダムに選択した低倍率視野（倍率×２０）において、イメージアナライザー（ソフトウェア：Ｖｉｓｉｏｎ  ＥｘｐｌｏｒｅｒおよびＥＴＣ  ３０００，Ｇｒａｐｈｔｅｋ，Ｍｉｒｍａｎｄｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して数えた。各アッセイを二連で行い、結果を、２視野あたりの移動細胞の平均±ＳＤとしてあらわした。
【００５９】
（総ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの合成）  細胞を、上記のように調製し、総ＲＮＡを、製造業者により言及されたように、チオシアン酸グアニジウム法により抽出した（ＲＮＡｇｅｎｔｓ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。ＤＮＡｓｅ  Ｉ（ＲＱ１  ＲＮＡｓｅ非含有ＤＮＡｓｅ，Ｐｒｏｍｅｇａ）処理の後に、ＲＮＡを、分光光度計により定量し、質を、ホルムアルデヒド変性条件下での電気泳動により評価した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＲＮＡｓｅ非含有条件下で抽出した総ＲＮＡから合成した。この反応を、製造業者により記載されるように、５μｇの総ＲＮＡ、２５ｎｇ／μｌのオリゴｄＴ１２−１８プライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｏｒｓａｙ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐａｓｅ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して行った。全てのサンプルに関して、ｃＤＮＡの合成を制御し、β−アクチンプライマーを使用して２１サイクルのＲＴ−ＰＣＲにより較正した。
【００６０】
（ＲＴ−ＰＣＲ分析）  半定量的ＰＣＲを、最終容積１００μｌの反応混合物（その１×緩衝液とともに２．５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素（５Ｕ／μｌ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、５％  ＤＭＳＯ、および１μＭの各正方向および逆方向プライマーを含む）中でＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００サーマルサイクラーにおいて行った。ＣＣＲ６（登録番号Ｚ７９７８４）およびＣＣＲ７（登録番号Ｌ０８１７６）プライマーを、ケモカインレセプター間の最低の相同性の領域内に指定した。以下：
【００６１】
【化１】
2008133296.tif 000002
を、ＲＴ−ＰＣＲおよび配列決定に使用した。両方のケモカインレセプターのために、反応混合物を、以下の条件を使用する３０サイクルおよび３５サイクルのＰＣＲに供した：９４℃で１分、６１．５℃で２分、および７２℃で３分。ＰＣＲ産物を、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む１．２％アガロースゲル上で可視化した。推定サイズ(ＣＣＲ
６については１，０２１ｂｐおよびＣＣＲ７については１，０６７ｂｐ)に移動した反応
産物をゲル精製し、色素ターミネーター技術を使用して、ＡＢＩ  ３７３Ａ配列決定機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ．）で配列決定確認のためにｐＣＲＩＩ  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｅｅｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にサブクローニングした。２つの他のオリゴヌクレオチド：
【００６２】
【化２】
2008133296.tif 000003
を、１．２％アガロースゲル上で分離したＰＣＲ産物とのハイブリダイゼーションのため
のプローブとして使用し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）にブロットした。
【００６３】
（カルシウム蛍光測定）  細胞内Ｃａ２＋濃度を、蛍光プローブＩｎｄｏ−１を使用して、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８５，２６０：３４４０−３４５０）により報告される技術に従って、測定した。簡潔には、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中に１０７細胞／ｍｌに再懸濁した（上記を参照のこと）。次いで、細胞を、遮光して、３μｇ／ｍｌのＩｎｄｏ−１  ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とともに室温にて４５分間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、ＨＢＳＳ／１％  ＦＣＳ中で１０７細胞／ｍｌに再懸濁した。細胞内Ｃａ２＋濃度の測定の前に、細胞を、予め３９℃に温めたＨＢＳＳ／１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／１．６ｍＭ  ＣａＣｌ２中に１０倍に希釈した。サンプルを、連続して攪拌しながら３３０ｎｍで励起し、Ｉｎｄｏ−１蛍光を、８１０光電子倍増管検出システム（ソフトウェア：Ｆｅｌｉｘ，Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＮＪ）にて、４０５ｎｍ（Ｃａ２＋と錯体化した色素）および４８５ｎｍ（Ｃａ２＋非含有培地）での時間の関数として測定した。結果を、２つの発光波長で得られた値の比率として表す。
【００６４】
（インサイチュハイブリダイゼーション）  インサイチュハイブリダイゼーションを、記載されたように行った（Ｐｅｕｃｈｍａｕｒら，１９９０，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：３８３−３９０）。２対のプライマーを、ＲＴ−ＰＣＲによりＭＩＰ−３α遺伝子（登録番号Ｄ８６９５５）およびＭＩＰ−３β遺伝子（登録番号Ｕ７７１８０）のオープンリーディングフレームの大部分を増幅するために使用した。
【００６５】
【化３】
2008133296.tif 000004
を、６２℃のアニーリング温度で上記のように使用した。次いで、ＰＣＲ産物を、適合したプロモーターとともにセンスプローブおよびアンチセンスプローブの生成のために、ｐＣＲＩＩ  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｅｅｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にクローニングした。ＭＩＰ−３αおよびＭＩＰ−３βの３５Ｓ標識したセンスプローブおよびアンチセンスプローブを、それぞれ、３６７ｂｐフラグメントおよび４３５ｂｐフラグメントの転写物を複製する（ｒｕｎ  ｏｆｆ）ことにより得た。６μｍのヒト扁桃の切片を、アセトンおよび４％  パラホルムアルデヒド、続いて０．１Ｍ  トリエタノールアミン/０．２５％無水酢酸中で固定した。この切片を、一晩ハイ
ブリダイズし、ＲＮＡｓｅ  Ａで処理し、２４日間曝した。展開させた後、切片を、ヘマトキシリンで染色した。
【００６６】
（実施例１：ＣＤ３４＋由来ＤＣの発生の間のＭＩＰ−３αおよびＭＩＰ−３βに対する差示的応答性）
ＤＣ移動（ｔｒａｆｆｉｃ）の調節を理解するために、成熟の異なる段階におけるＤＣの種々のケモカインに対する応答を研究した。ＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαの存在下で培養したＣＤ３４＋ＨＰＣから生成し、Ｂｏｙｄｅｎマイクロチャンバにおいて、ケモカインに応答して移動するそれらの能力について、異なる培養日数で試験した。ＭＩＰ−３αおよびＭＩＰ−３βは、ＣＤ３４＋由来ＤＣをＭＩＰ−１αまたはＲＡＮＴＥＳより２〜３倍に増加した。しかし、ＭＩＰ−３αおよびＭＩＰ−３βにより誘引されたＤＣを、培養の異なる時点で回収した。ＭＩＰ−３αに対する応答は、既に、４日目に検出され、５〜６日目に最大であり、１０日目まで続いた。１３〜１４日目には、ＭＩＰ−３αに対する応答は、通常、失われた。対照的に、ＭＩＰ−３βに対応する応答は、１０日目より前に検出され得ず、１３日目にピークに達し得、１５日目を超えて持続し得た。より早い時点では、培養中の細胞の大部分が、なおＤＣ前駆体（ＣＤ１ａ−ＣＤ８６−）であった場合、ＭＩＰ−３αに対する応答は、１〜１０ｎｇ／ｍｌ（実験に依存して）の濃度にて検出され得た。対照的に、４日後、ほとんど全ての細胞が未成熟ＤＣ（ＣＤ１ａ＋ＣＤ８６−）であった場合、３００ｎｇ／ｍｌ以上が、細胞を誘引するために必要であり、このことは、成熟の間に細胞の連続的な脱感作を示唆する。比較的高濃度のＭＩＰ−３β（３００ｎｇ／ｍｌ）もまた、成熟ＤＣ（ＣＤ１ａ＋ＣＤ８６＋）を増大させるために必要であった。チェッカーボード分析により、ＭＩＰ−３αおよびＭＩＰ−３βが走化性を誘導するが、ＤＣのケモキネシスを誘導しないことが確立された。
【００６７】
成熟の段階と、ＭＩＰ−３αおよびＭＩＰ−３βに対する応答との間の関係を確認するために、ＣＤ３４＋由来ＤＣを、ＣＤ８６発現に従って、未成熟ＤＣ（ＣＤ１ａ＋ＣＤ８６−）および成熟ＤＣ（ＣＤ１ａ＋ＣＤ８６＋）へと培養の１０日目にＦＡＣＳによりソートした。ＣＤ１ａ＋ＣＤ８６−は、ＭＩＰ−３αに専ら応答したが、ＣＤ１ａ＋ＣＤ８６＋は、主にＭＩＰ−３βに応答した。これらの観察により、ＭＩＰ−３αおよびＭＩＰ−３βにより増加した細胞が、実際にＤＣ（ＣＤ１ａ＋）であったこともまた確認された。ＤＣ成熟とケモカイン応答性との間の相関は、ＤＣの未成熟性が、６日目から１２日目にＴＮＦαを除去することにより維持され、それらの成熟性が、ＴＮＦα、ＬＰＳまたはＣＤ４０Ｌの添加により同期化された場合、さらに例示される。ＭＩＰ−３αに対する応答は、ＴＮＦα、ＬＰＳおよびＣＤ４０Ｌを使用した４８時間の成熟の際に強く減少された。同時に、ＭＩＰ−３βに対する応答は、３つのシグナルすべてにより誘導され、ＣＤ４０ＬおよびＬＰＳは、ＴＮＦαより強力であった。動態学的実験において、ＭＩＰ−３αに対する応答は、ＣＤ４０活性化のわずか２４時間後に５０〜７０％減少し、７２時間目には、完全に失われた。ＭＩＰ−３βに対する応答は、ＣＤ４０活性化の２４時間後に既に最大になり、比較的高濃度（４８時間で１００〜３００ｎｇ／ｍｌ）のケモカインを要した。
【００６８】
合わせて考えると、これらの結果により、未成熟ＣＤ３４＋由来ＤＣがＭＩＰ−３αに応答し、一方で成熟ＤＣがＭＩＰ−３βに応答することが確立される。
【００６９】
（実施例２：ＭＩＰ−３αおよびＭＩＰ−３βに対する応答は、ＣＤ３４＋由来ＤＣに対するそれぞれのレセプターＣＣＲ６およびＣＣＲ７の発現と並行する）
ＭＩＰ−３αおよびＭＩＰ−３βの応答性の調節の機構を明らかにするために、それらそれぞれのレセプターＣＣＲ６  ｍＲＮＡ（Ｐｏｗｅｒら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８２５−８３５；Ｇｒｅａｖｅｓら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８３７−８４４；Ｂａｂａら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４８９３−１４８９８；Ｌｉａｏら，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３６：２１２−２１７）およびＣＣＲ７  ｍＲＮＡ（Ｙｏｓｈｉｄａら，１９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３８０３−１３８０９）の発現を、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより研究した。ＣＤ３４＋  ＨＰＣからのＤＣ発生の間、ＣＣＲ６  ｍＲＮＡを、６日目に最初に検出し、１０日目までに増大し、その後、減少したが、１４日目には、わずかに検出可能であった。対照的に、ＣＣＲ７  ｍＲＮＡは、１０日目に現れ、１４日目まで確実に増大した。さらに、ＣＤ４０Ｌ依存性成熟は、ＣＣＲ６  ｍＲＮＡの連続的な下方調節を誘導し（これは、７２時間後にほとんど検出可能であった）、２４時間程度の早さでＣＣＲ７  ｍＲＮＡの上方調節を誘導した。同様な結果は、ＬＰＳまたはＴＮＦαのいずれかによる誘導性ＤＣ成熟の後に得られた。活性化後のＣＣＲ７  ｍＲＮＡの上方調節を、ｃＤＮＡライブラリーのサザンブロット分析により確認した。
【００７０】
移動アッセイならびにＣＣＲ６およびＣＣＲ７の発現の調節と調和して、ＭＩＰ−３αは、休止/未成熟ＤＣにおいて専らＣａ２＋フラックスを誘導し、ＭＩＰ−３βは、成熟
ＤＣにおいてのみＣａ２＋フラックスを誘導した。最大のＣａ２＋フラックスは、３０ｎｇ／ｍｌのＭＩＰ−３αおよび３０ｎｇ／ｍｌのＭＩＰ−３βを用いて、それぞれ、未成熟ＤＣおよび成熟ＤＣに対して観察された。
【００７１】
これらの結果は、ＭＩＰ−３αおよびＭＩＰ−３βに対する応答性の変化が、ＣＣＲ６
ｍＲＮＡおよびＣＣＲ７  ｍＲＮＡの発現の調節に関連することを示し、ＣＣＲ６およびＣＣＲ７が、それぞれ、ＭＩＰ−３αおよびＭＩＰ−３βについてのＤＣ上で発現される主要な機能的レセプターであることを示唆する。
【００７２】
（実施例３：ＭＩＰ−３βに対する応答はまた、単球由来ＤＣの成熟の際に誘導される）
ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４の存在下で単球を６日間培養することにより生成した単球由来ＤＣは、代表的には、未成熟ＤＣである（ＣＤ１ａ＋、ＣＤ１４−、ＣＤ８０ｌｏｗ、ＣＤ８６ｌｏｗ、ＣＤ８３−）（Ｃｅｌｌａら，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１０−１６；Ｓａｌｌｕｓｔｏら，１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９−１１１８）。それらは、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳに応答して移動したが、ＭＩＰ−３αに対しても、ＭＩＰ−３βに対しても応答せず、移動しなかった。単球由来ＤＣのＭＩＰ−３αに対する応答の欠如は、それらの細胞上でのＣＣＲ６発現の非存在に従う（Ｐｏｗｅｒら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８２５−８３５；Ｇｒｅａｖｅｓら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８３７−８４４）。ＴＮＦα、ＬＰＳ、またはＣＤ４０Ｌにより誘導される成熟に際して、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳに対する応答は失われたが、ＭＩＰ−３βに対する応答が誘導された。ＣＤ３４＋由来ＤＣを使用する場合と同様に、ＭＩＰ−３βに対する応答は、ＴＮＦα、ＬＰＳまたはＣＤ４０Ｌにより誘導された成熟に際して観察されたＣＣＲ７  ｍＲＮＡ発現の上方調節と相関した。繰り返すと、ＴＮＦＲまたはＣＤ４０シグナル伝達の後にＣＣＲ７の上方調節は、初期の時点（３ｈ）で生じた。さらに、移動およびケモカインレセプター発現のデータは、Ｃａ２＋フラックス結果と一致した。
【００７３】
これらの結果により、成熟の際に、ＤＣが種々のケモカインに対するそれらの応答性を失うが、１つのケモカインＭＩＰ−３βには感受性になるという概念は、単球由来ＤＣに及ぶ。
【００７４】
（実施例４：末梢血ＣＤ１１ｃ＋ＤＣは、成熟後にＭＩＰ−３βに応答して移動する）末梢血（または扁桃）から単離された未成熟ＣＤ１１ｃ＋ＤＣに対するＭＩＰ−３αおよびＭＩＰ−３βの走化性活性もまた研究した。新たに単離したＤＣは、ＭＩＰ−３αに応答して移動しなかったが、ＭＩＰ−３βに応答して移動し、これらの細胞におけるＣＣＲ６の非存在およびＣＣＲ７  ｍＲＮＡ発現との相関が観察された。しかし、ＧＭ−ＣＳＦとの一晩の培養の後に生じることが公知の成熟は、ＭＩＰ−３βに対するＣＤ１１ｃ＋ＤＣの応答に向けられるが、ＭＩＰ−３αに対する応答には向けられなかった。再び、ＭＩＰ−３βに対する応答は、ＣＣＲ７  ｍＲＮＡ発現の誘導と相関した。
【００７５】
従って、たとえ血液から新たに単離された未成熟ＣＤ１１ｃ＋ＤＣが、ＭＩＰ−３αに応答できないとしても、これらの結果は、ＭＩＰ−３βに対する応答性に依存した成熟がまた、エキソビボで単離されたＤＣに適用されることを示す。
【００７６】
（実施例５：インビボでＭＩＰ−３αは、炎症を生じた上皮において発現され、ＭＩＰ−３βは、扁桃のＴ細胞富化領域内で発現される）
実施例４において報告された知見の物理的関連性を、ＭＩＰ−３αの分析および炎症を生じた扁桃の切片でのインサイチュハイブリダイゼーションによるＭＩＰ−３β  ｍＲＮＡ発現を通じて取り組んだ。ＭＩＰ−３αのｍＲＮＡは、炎症を生じた上皮陰窩において高レベルで検出されたが、Ｔ細胞富化領域においても、Ｂ細胞濾胞においても検出されなかった。実際に、ＭＩＰ−３α発現は、上皮陰窩を覆う細胞に制限されていた。対照的に、ＭＩＰ−３β  ｍＲＮＡの発現は、Ｔ細胞富化領域に制限されていた。最も強いシグナルは、散在した細胞において存在し、分布は、ＩＤＣの分布と重なっていた。副皮質（ｐａｒａｃｏｒｔｉｃａｌ）領域の外側では、シグナルは、Ｂ細胞濾胞においても、上皮陰窩においても検出されなかった。連続切片は、ＭＩＰ−３αが豊富に発現される上皮陰窩内のＭＩＰ−３β発現の明らかな不在を示した。ＭＩＰ−３αおよびＭＩＰ−３βのセンスプローブは、バックグラウンドハイブリダイゼーションを生成しなかった。
【００７７】
従って、ＭＩＰ−３α発現は、未成熟ＤＣが補充されるべき抗原進入の部位において炎症を生じた上皮に制限される。対照的に、ＭＩＰ−３βは、副皮質領域において検出されるのみであり、ここで成熟ＩＤＣは、ホーミングし、第１のＴ細胞応答を生成する。
【００７８】
（実施例６：マウスモデルにおけるインビボでのケモカインＭＩＰ−３α投与）
ＭＩＰ−３αは、本発明者らがインビトロでマウス未成熟樹状細胞についての走化性因子であることを示し、ケモカインＭＩＰ−３αがインビボで未成熟ＤＣを誘引し、インビボで腫瘍に対する抗原特異的免疫応答を調節する能力を研究した。腫瘍関連抗原が同じ時間に送達される場合、より多くのＤＣが抗原を捕捉するために利用可能である。従って、この抗原に対する抗原特異的応答が増加されるはずである。
【００７９】
ケモカインはプラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ３，ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を介してインビボで送達され、このベクターは、ＣＭＶプロモーター（ＰＭＩＰ−３α）の制御下でマウスＭＩＰ−３αをコードするｃＤＮＡを含む。使用した抗原は、Ｅ．ｃｏｌｉから単離したβ−ガラクトシダーゼであった。この抗原を、同じプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３（ｐＬａｃｚといわれる）を介してインビボで送達した。腫瘍は、β-ガラクトシダー
ゼをコードする遺伝子で安定にトランスフェクトされた同系ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣ２６結腸癌であった。従って、この系において、β−ガラクトシダーゼが、腫瘍関連抗原を規定する。
【００８０】
６匹の６週齡の雌性マウスの群を、空のｐｃＤＮＡ３プラスミド（ネガティブコントロール）、抗原単独をコードするプラスミドｐＬａｃｚ、またはｐＬａｃｚおよびＰＭＩＰ−３αの混合物のいずれかを注射した。注射（５０μｇの総プラスミド）を、４週間の間毎週、後足の踵に行った。その後、マウスにβ−ガラクトシダーゼを発現するＣ２６腫瘍細胞株を皮下注射した。代表的には、全てのマウスは、１０日後に、皮下に腫瘍を発生させた。これらのマウスの群における腫瘍の出現をモニターした。腫瘍の出現は、ｐＬａｃｚおよびｐＬａｃｚ＋ＰＭＩＰ−αの注射の後に遅延した（図１）。このことは、腫瘍関連抗原をコードするプラスミドでの免疫が、腫瘍移植に対する保護効果を有することを示す。この遅延は、ｐＬａｃｚを用いるより、ｐＬａｃｚ＋ＰＭＩＰ−３αを用いるほうが大きかった。このことは、ケモカインＭＩＰ−３αが抗原をとともに送達された場合、腫瘍関連抗原特異的免疫応答を増大させることを示唆する。
【００８１】
優れた抗腫瘍応答は、強いＴ細胞媒介性抗原特異的細胞傷害性（ＣＴＬ活性）と関連すると考えられる。従って、同じ群のマウスにおけるＣＴＬ活性を、腫瘍接種して３０日後に分析した。脾細胞を取り出し、インターロイキン−２の存在下で、照射した同系ＤＣおよびβ−ガラクトシダーゼ由来の免疫優性なＣＴＬペプチドを使用して５日間刺激した。次いで、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を安定にトランスフェクトした細胞株（Ｐ１３．１）を溶解するそれらの能力を、β−ガラクトシダーゼを発現しない親細胞株Ｐ８１５を溶解するそれらの能力と並行して、測定した（図２）。これを、異なる比のエフェクター（脾細胞）対標的（Ｐ１３．１またはＰ８１５）を使用して行った。この結果は、腫瘍チャレンジの前にｐＬａｃｚ＋Ｐ−ＭＩＰ−３αを注射したマウスは、ｐＬａｃｚまたはＰＣＤＮＡ３単独でのみ注射したマウスより、腫瘍関連抗原β−ガラクトシダーゼに対して大きなＣＴＬ活性を有する。
【００８２】
（実施例７：インビボマウスモデルにおけるケモカインｈＭＣＰ−４投与）
本発明者らは、ｈＭＣＰ−４局所的注射が、用量依存性様式でマウスにおいてインビボでの樹状細胞の補充を促進し得ることを示した（図４）。
【００８３】
６〜１０週齡の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｉｆｆａ−Ｃｒｅｄｏ，Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、標準的な条件下で本発明者らの施設にて維持した。動物およびそれらの世話に関する手順は、ＥＥＣ（欧州経済共同体）会議の指示（８６／６０９，ＯＪＬ  ３５８，１，１９８７年１２月１２日）に合わせて行った。組換えヒトＭＣＰ−４タンパク質（＞９７％純度（図３））を、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから得、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ)中に再懸濁した。３匹のマウスの群
に、ＰＢＳ単独またはＰＢＳ中の種々の量のヒトＭＣＰ−４を、５０μ容量で右後足踵に皮内注射した。マウスを２〜２０時間後に屠殺し、注射部位の皮膚および注射部位から排出する膝窩リンパ節を取り出した。皮膚における局所的細胞補充を、標準的な技術に従って、特異的モノクローナル抗体を使用して、免疫組織化学により試験した。細胞懸濁液を、ＲＰＭＩ  １６４０および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中にリンパ節から調製した。細胞を計数し、標準的な技術に従って、ＰＢＳおよび２％  ＦＣＳ中で、ビオチン−ＣＤ１１ｃ抗体およびＦＩＴＣ−ＣＤ１１ｂ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、続いて、ＰＥ−ストレプトアビジン（Ｄａｋｏ）を含有するＰＢＳおよび２％  ＦＣＳ中で染色した。ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃの発現（これは、マウス樹状細胞の集団を規定する）を、Ｆａｃｓｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して、分析した。この分析および計数から、各リンパ節におけるＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋の数を決定した。これらの実験は、以下を示す：（Ａ）ｈＭＣＰ−４の局所的注射が、短期間（２時間）の後に、注射部位におけるＣＤ１１ｂを発現する細胞の補充を誘導し得ること。これらの細胞は、マウス血液樹状細胞または樹状細胞前駆体（例えば、単球）であり得る。なぜなら、両方とも、ＣＤ１１ｂを発現し得るからである。マウスにおいて、循環する血液樹状細胞は、技術的な制限に起因して、同定されなかった。しかし、ヒトにおいては、血液樹状細胞が単離され得、それらは、ｈＭＣＰ−４に対する走化性アッセイに応答する（図３）。（Ｂ）排出リンパ節において、抗原特異的免疫応答が開始される場合、ｈＭＣＰ−４は、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃの同時発現により同定される樹状細胞の補充を誘導するが、長期間（２０時間）の後のみである。この遅延は、排出リンパ節に移動するために、皮膚において最初に補充される樹状細胞またはそれらの前駆体に必要な成熟および移動時間に対応する可能性が最も高い。
【００８４】
（実施例８：ヒト血液由来の樹状細胞のｈＭＣＰ−４に対する応答）
ｈＭＣＰ−４はまた、ヒト樹状細胞（血液から単離された樹状細胞を含む）に対して活性である（図５）。
【００８５】
パネルＡ：ヒト循環血液ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを磁性ビーズ除去により富化し、種々のケモカインに応答するトランスウェル（５μｍ孔サイズ）移動アッセイにおいて研究した。この移動を、２時間後に三重染色：系列マーカーＦＩＴＣ、ＨＬＡ−ＤＲ  ｔｒｉｃｏｌｏｒおよびＣＤ１１ｃ  ＰＥにより明らかにし、Ｆａｃｓにより染色した。各ケモカインを広範囲の濃度（１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）に対して試験し、最適応答のみを示す。結果を、移動指数として表し、３〜１０の独立した実験から得た平均値を示す。血液ＣＤ１１ｃ＋は主にＭＣＰ−４ならびにＭＣＰ１、ＭＣＰ２およびＭＣＰ３に対して応答する（示さず）。ＳＤＦ−１は選択性を欠き、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣに対して強く活性である唯一の他のケモカインである。
【００８６】
パネルＢ：異なるヒトＤＣおよびＤＣ前駆体の集団（血液ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ、単球、単球由来ＤＣ、ＣＤ１ａ＋ランゲルハンス細胞前駆体およびＣＤ１４＋間質ＤＣ前駆体を含む）を、ＭＣＰ−１およびＭＣＰ−４に応答するトランスウェル（５μｍ孔サイズ）移動アッセイにおいて研究した。全ての集団は、ＣＤ１ａ＋ランゲルハンス細胞前駆体を除いて、ＭＣＰ−４に応答する。さらに、単球由来ＤＣは、ＣＣＲ２とは異なるレセプターを介して、ＭＣＰ−４に応答するが、ＭＣＰ−１には応答しない。
【００８７】
重要なことには、ＭＣＰ−４は、ヒトＤＣに対して活性である。特に、他のケモカインと比較すると、ＭＣＰ−４は、循環血液ＣＤ１１ｃ＋ＤＣの移動を誘導する最も強力なケモカインである。ＭＣＰ−１、およびＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３は、血液ＤＣに対して類似の活性を示す。ＭＣＰは、これらの細胞上で発現されるＣＣＲ２を介して血液ＤＣを補充するようである。さらに、ＭＣＰ−４は、ＣＣＲ２を発現しないＣＤ１ａ＋ランゲルハンス細胞前駆体を除いて、全てのＤＣまたはＤＣ前駆体の集団（血液ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ、単球、単球由来ＤＣ、ＣＤ１４＋間質型ＤＣ前駆体）に対して活性である。最後に、ＭＣＰ−４（ＭＣＰ−１ではない）は、おそらく、ＣＣＲ２とは異なるレセプターを介して、単球由来ＤＣの移動を誘導する。
【００８８】
（実施例９：インビボマウスモデルにおけるｈＭＣＰ−４およびβ−ガラクトシダーゼの投与）
さらに、ｈＭＣＰ−４を、プラスミドＤＮＡワクチン接種により誘導される抗原特異的免疫応答のアジュバントとして使用し得る。さらに、ｈＭＣＰ−４がプラスミドＤＮＡワクチン接種のアジュバントとして使用される場合、これは、プラスミドＤＮＡによりコードされた抗原を発現する腫瘍でその後チャレンジしたマウスの防御を増大し得る。
【００８９】
６〜８週齡の７匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｉｆｆａ−Ｃｒｅｄｏ，Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）の群に、ＰＢＳ単独またはＰＢＳ中の１００ｎｇのヒトＭＣＰ−４を、５０μｌの容量で、右後足踵の皮下に注射した。３時間後、マウスの同じ部位に、５０μｌ容量のＰＢＳの下で、コントロールｐｃＤＮＡ３プラスミド（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）５０μｇまたはＣＭＶプロモーター下のβ−ガラクトシダーゼをコードするｐｃＤＮＡ３プラスミド（ｐＬａｃｚ，ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）５０μｇを注射した。この免疫プロトコルを、１週間間隔で４回繰り返した。
【００９０】
最初の免疫の１日前、および最後の免疫の１週間後に血清を回収した。血清中のβ−ガラクトシダーゼ特異的免疫グロブリンのレベルを、以前に記載のように（Ｍｅｎｄｏｚａら，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５７７７−５７８１）、特異的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。
【００９１】
図６に見られるように、ＭＣＰ−４注射は、β−ガラクトシダーゼＤＮＡ免疫(右後足
踵に１００ｎｇ  ｈＭＣＰ−４注射して３時間後の５０μｇ  ＤＮＡ注射)の後に抗原特
異的体液性応答を増大する。図６は、４回の免疫の後に測定した抗β−ガラクトシダーゼ抗体を示す［ＰＢＳ＋ｐＬａｃｚと比較した場合のｈＭＣＰ−４＋ｐＬａｃｚの有意性：ステューデント検定］。
【００９２】
最後に免疫して１週間後、マウスの群に、１００μｌ容量のＲＰＭＩ−１６４０の下で、β−ガラクトシダーゼを発現する５×１０４のＣ２６−ＢＡＧ結腸癌細胞（親切にも、Ｍａｒｉｏ  Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｎａｚｉｏｎａｌｅ  Ｔｕｍｏｒｉ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙから譲り受けた）を右脇腹に皮下注射してチャレンジした。腫瘍の発生を、触知により１週間３回評価した。
【００９３】
図７に見られるように、ＭＣＰ−４注射は、マウスを、β−ガラクトシダーゼを発現するＣ２６結腸癌細胞株でチャレンジした場合に、β−ガラクトシダーゼＤＮＡ免疫(右後
足踵に１００ｎｇのｈＭＣＰ−４を注射して３時間後の５０μｇのＤＮＡ注射、腫瘍チャレンジする前に４回の免疫)により誘導された抗腫瘍効果を増大する［ＰＢＳ＋ｐＬａｃ
ｚと比較した場合のｈＭＣＰ−４＋ｐＬａｃｚの有意性：ｐ＜０．０５、ｌｏｇｒａｎｋ
ＭＣＰ−４対抗（ｏｐｐ）：異なる部位に注射したｈＭＣＰ−４］。
【００９４】
従って、実施例７〜９は、ケモカインｈＭＣＰ−４が、免疫応答、特に抗腫瘍応答のアジュバントとして使用され得ることを示す。ＭＣＰ−４投与により媒介された増強された免疫応答を、血清中の抗原特異的免疫グロブリンレベルの増強として測定した。従って、ＭＣＰ−４投与に対するＢ細胞応答の増強が明らかに存在する。さらに、切り替えにＴ細胞媒介補助を要する免疫グロブリンのサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａ）が増大するので、Ｔ細胞媒介性応答もまた増大するようである。
【００９５】
（実施例１０：ヒト樹状細胞のｈ６Ｃｋｉｎｅケモカインに対する応答）
この実施例において、本発明者らは、ヒト６Ｃｋｉｎｅ（ｈ６Ｃｋｉｎｅ）が、インビトロでのヒトの樹状細胞の公知のサブセット全てについての走化性因子であることを示した。特に、ｈ６Ｃｋｉｎｅは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＣＤ４０Ｌとの３時間という短時間のインキュベーション後のヒト血液樹状細胞に対して活性である（図８）。
【００９６】
異なるヒトＤＣ集団（ＣＤ１ａ＋ランゲルハンス細胞、ＣＤ１４＋間質ＤＣ、単球由来ＤＣ、循環血液ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ、単球、および循環血液ＣＤ１１ｃ−プラズマ細胞様ＤＣを含む）を、成熟の前および後に、ヒト６Ｃｋｉｎｅに対して応答する移動アッセイにおいて研究した。ＣＤ３４−由来ＤＣ前駆体を、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＴＮＦおよびＳＣＦの存在下で６日間培養した後に、ＣＤ１ａ発現およびＣＤ１４発現に従ってＦａｃｓソーティングにより単離した。細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ単独（未成熟）中で１２日目まで、またはＧＭ−ＣＳＦ＋ＣＤ４０−Ｌ（成熟）中で最後の２日間培養した。単球由来ＤＣを、単球をＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４の存在下で５日間培養することにより生成し、ＣＤ４０−Ｌを使用して、最後の２日間、活性化させた（成熟）かまたは活性化させなかった（未成熟）。ヒト循環血液ＣＤ１１ｃ＋ＤＣおよびＣＤ１１ｃ−プラズマ細胞様ＤＣを、磁性ビーズの除去により富化し、三重染色を使用して、系統マーカーＦＩＴＣネガティブ、ＨＬＡ−ＤＲ  ｔｒｉｃｏｌｏｒポジティブ、ならびにＣＤ１１ｃ  ＰＥポジティブおよびＣＤ１１ｃ  ＰＥネガティブにｆａｃｓソートした。ＣＤ１１ｃ＋ＤＣおよびＣＤ１１ｃ−プラズマ細胞様ＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−３の存在下で、ＣＤ４０Ｌとともに（成熟）またはＣＤ４０Ｌなしで（未成熟）、３時間培養した。
【００９７】
移動アッセイを、５μｍ孔サイズまたは８μｍ孔サイズのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（６．５ｍｍ直径，ＣＯＳＴＡＲ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して、１〜３時間の間行い、ｆａｃｓ分析により明らかにした。全ての集団が、ＣＤ４０−Ｌ活性化後にのみ６Ｃｋｉｎｅに応答した。
【００９８】
（実施例１１：腫瘍モデルにおけるケモカインｍ６Ｃｋｉｎｅ遺伝子移入）
この実施例において、本発明者らは、以下を示した：
ｍ６Ｃｋｉｎｅを発現するように操作されたＣ２６結腸癌腫瘍細胞は、あまり腫瘍形成性ではなく、この効果は、インビボでのＣＤ８＋細胞およびナチュラルキラー細胞活性に依存する（図９）；
ｍ６Ｃｋｉｎｅを発現するＣ２６腫瘍は、親腫瘍と比較して、樹状細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞により有意に浸潤される（図１０）；および
ｍ６Ｃｋｉｎｅを発現するように操作されたＣ２６結腸癌腫瘍細胞は、親Ｃ２６腫瘍よりあまり抗原性ではない（図１１）。
【００９９】
６〜１０週齡の雌性ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｉｆｆａ−Ｃｒｅｄｏ，Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、標準的な条件下で維持した。動物およびそれらの世話に関する手順は、ＥＥＣ（欧州経済共同体）会議の指示（８６／６０９，ＯＪＬ  ３５８，１，１９８７年１２月１２日）に合わせて行った。全ての腫瘍細胞培養を、１０％  ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１ｍＭ  ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、Ｇｅｎｔａｌｌｉｎ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｕｎｉｏｎ，ＮＪ）、２×１０−５Ｍ  β−２メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ  Ｐａｒｋ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）中で行った。全ての細胞培養を、３７℃にて５％  ＣＯ２の加湿インキュベーター中で行った。マウス６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣをコードするｃＤＮＡ（ｍ６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ）を、ＣＭＶプロモーターを含むｐｃＤＮＡ３ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。Ｃ２６結腸癌腫瘍細胞（親切にも、Ｍａｒｉｏ  Ｐ．Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｎａｚｉｏｎａｌｅ  ｐｅｒ  ｌｏ  Ｓｔｕｄｉｏ  ｅ  ｌａ  Ｃｕｒａ  ｄｅｉ  Ｔｕｍｏｒｉ，  Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙから譲り受けた）を、製造業者の指示に従って、Ｆｕｇｅｎｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、この構築物を用いてトランスフェクトした。ｍ６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ  ｍＲＮＡ（Ｃ２６−６ＣＫ）を発現する単一のＣ２６クローンを、８００μｇ／ｍｌでのネオマイシン（Ｓｉｇｍａ）選択の後に得た。Ｃ２６腫瘍細胞またはＣ２６−６ＣＫ腫瘍細胞を、１００μｌのＤＭＥＭ中で右脇腹にＳ．Ｃ．注射し、腫瘍増殖を、１週間に３回触知することによりモニターした。抗体除去のために、腫瘍接種の１日前に、２００μｌのＰＢＳ中の０．５ｍｇの抗ＣＤ８（クローン２．４３）精製抗体、ラットコントロール（ＧＬ１１３）精製抗体または２００μｌのウサギ抗アシアロＧＭ１血清（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を、ｉ．ｐ．注射し、次いで、０．２ｍｇの抗体または１００μｌの抗アシアロＧＭ１血清を３日後に、および実験過程の間に１週間に１回注射した。図１０は、皮下Ｃ２６−６ＣＫ細胞注射が、親腫瘍細胞と比較して、ｌｏｇｒａｎｋ分析により有意に遅延した腫瘍取り込み（ｉｎｔａｋｅ）を生じる（ｐ＜０．０１）ことを示す(Ａ
およびＢ：Ｃ２６＋コントロール  対  Ｃ２６−６ＣＫ＋コントロール)。インビボで特
定の抗体を用いたＣＤ８＋細胞（Ａ）またはナチュラルキラー細胞活性（Ｂ）の除去は、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍細胞の遅延した腫瘍形成性を部分的に戻す。このことは、ＣＤ８＋細胞およびＮＫ細胞は、腫瘍増殖の遅延において役割を果たすことを示す。
【０１００】
腫瘍を、約１ｃｍのサイズに達したときに外科手術により取り出した。腫瘍塊を、小さな断片に細かく刻み、コラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）溶液中で３７℃にて３０分間攪拌しながらインキュベートした。次いで、懸濁液を、数回ＤＭＥＭ中で洗浄した。細胞懸濁液の染色を、ＰＢＳおよび５％  ＦＣＳ中で行った。ＦＩＴＣ標識特異的抗体、ビオチン標識特異的抗体またはＰＥ標識特異的抗体とのインキュベーションの前に、Ｆｃレセプターを、ＦｃブロックＴＭ  ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してブロックした。この研究において使用した種々の抗体（全て、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ製）は、ＣＤ８β（５３−５．８）、ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）、抗ＭＨＣクラスＩＩ  Ｉ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄ（２６９）、ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）であった。ビオチン化抗体を、ＰＥストレプトアビジン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して明らかにした。表現型パラメーターを、ＦａｃＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）で獲得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。図１０において、Ｃ２６野生型腫瘍またはｍ６Ｃｋｉｎｅを発現するＣ２６−６ＣＫ腫瘍を、腫瘍懸濁液全体のフローサイトメトリー分析によりＣＤ８  Ｔ細胞およびＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣクラスＩＩ＋樹状細胞（ＤＣ）の浸潤について分析した（ｎ＝７）。データは、Ｃ２６腫瘍と比較して、両方のＣ２６−６ＣＫ腫瘍中の白血球サブセットの有意な補充を示す（ステューデントのｔ検定）。これらの結果は、腫瘍へのｍ６Ｃｋｉｎｅ遺伝子移入は、免疫応答（抗腫瘍応答を含む）を開始するに必須の細胞である樹状細胞、および適応性免疫応答のエフェクター細胞であるＣＤ８  Ｔ細胞の補充の両方を促進することを示唆する。
【０１０１】
いくつかの実験において、動物から腫瘍を取り出し、ＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）中に包埋して液体窒素中で急速冷凍し、免疫組織化学手順の前に−８０℃で保存した。スライドガラスに適用した５μｍの低温保持切片を、アセトン中で固定し、室温にて１０分間、１％  Ｈ２Ｏ２とともにインキュベートした。次いで、スライドを、ビオチンブロックＴＭ試薬およびアビジンブロックＴＭ試薬（ともに、Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とともにインキュベートした。全てのインキュベーションを、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中の３回の２分間洗浄の後に行った。次いで、スライドを、二次抗体（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の同じ種に由来する血清の１／１０希釈物とともに３０分間プレインキュベートした。次いで、スライドを、５μｇ／ｍｌの精製ＣＤ１０５（クローンＭＪ７／１８，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ビオチン化二次抗体(Ｖｅｃｔｏｒのウ
サギ抗ラット)、ストレプトアビジン−アルカリ（ＶｅｃｔｏｒのＡＢＣキット）と連続
してインキュベートした。酵素反応物を、対応するＶｅｃｔｏｒ基質を使用して発色させた。脈管形成アッセイを、インビボで発生中の腫瘍細胞を含むＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）ペレットのヘモグロビン含有量を決定することにより行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２×１０５のＣ２６細胞またはＣ２６−６ＣＫ細胞と混合した０．５ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌを、腹部正中線にｓ．ｃ．注射した。９日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌペレットを取り出し、周りの結合組織を解剖して除去し、ペレットを、９０分間４℃にてＭａｔｒｉＳｐｅｒｓｅ溶液  ｖ／ｖ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で溶かした。ヘモグロビン含有量を、Ｄｒａｂｋｉｎ法（Ｓｉｇｍａの試薬）により決定した。図１１Ａは、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍は、親Ｃ２６腫瘍よりあまり血管を形成しないことを示す。図１１Ｂは、Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイにおいて、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍細胞がＣ２６細胞よりあまり脈管を形成しないことを示す。全体的に、これらの結果は、ｍ６Ｃｋｉｎｅケモカインの腫瘍への遺伝子移入が、腫瘍血管に対して血管静止的（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）効果を有することを示す。
【０１０２】
これらの結果は、ケモカイン６Ｃｋｉｎｅが、遺伝子移入を介して癌の処置に使用され得ることを示す。好ましい実施形態は、以下からなるが、これらに制限されない：ｍ６Ｃｋｉｎｅもしくはｈ６Ｃｋｉｎｅまたはｍ６Ｃｋｉｎｅもしくはｈ６Ｃｋｉｎｅの画分をコードするＤＮＡまたはウイルスベクター(例えば、アデノウイルス)（標的化部分（ペプチドまたは抗体）を伴うかまたは伴わない）。
【０１０３】
（実施例１２：インビボでのケモカイン６Ｃｋｉｎｅの腫瘍への局所的送達）
この実施例において、本発明者らは、組換えヒトまたは組換えマウス６Ｃｋｉｎｅタンパク質の既に存在するＣ２６腫瘍への注射が、腫瘍保有マウスの生存を増すことを示した。ｈ６Ｃｋｉｎｅの注射は、腫瘍増殖を遅延させる（図１２）。
【０１０４】
６〜１０週齡の雌性ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｉｆｆａ−Ｃｒｅｄｏ，Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、標準的な条件下で維持した。動物およびそれらの世話に関する手順は、ＥＥＣ（欧州経済共同体）会議の指示（８６／６０９，ＯＪＬ  ３５８，１，１９８７年１２月１２日）に合わせて行った。全ての腫瘍細胞培養を、１０％  ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１ｍＭ  ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、Ｇｅｎｔａｌｌｉｎ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｕｎｉｏｎ，ＮＪ）、２×１０−５Ｍ  β−２メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ  Ｐａｒｋ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）中で行った。全ての細胞培養を、３７℃にて５％  ＣＯ２の加湿インキュベーター中で行った。Ｃ２６細胞を、Ｍａｒｉｏ  Ｐ．Ｃｏｌｏｍｂｏ（Ｍｉｌａｎｏ，  Ｉｔａｌｙ）から譲り受けた。
【０１０５】
Ｃ２６腫瘍細胞を、１００μｌのＤＭＥＭにて右脇腹にｓ．ｃ．注射し、腫瘍増殖を、１週間に３回触知することによりモニターした。いくつかの実験において、腫瘍容積を、カリパスを使用してモニターし、以下のように予測した：腫瘍容積＝小さな直径２×大きな直径×０．４。組換えケモカインを用いた処置に関しては、マウスに、５０μｌのＰＢＳ下で１０ｎｇの＞９７％純度の組換えヒトまたはマウス６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を腫瘍内注射した。図１は、ｈ６Ｃｋｉｎｅまたはｍ６Ｃｋｉｎｅを使用して注射したマウスが、ＰＢＳビヒクル単独と比較した場合に、生存の改善を示すことを示す（Ａ）。ｈ６Ｃｋｉｎｅの注射はまた、腫瘍の増殖を低減させた（Ｂ）。これらのデータは、組換え６Ｃｋｉｎｅケモカインの腫瘍内送達が抗腫瘍効果を有することを示す。
【０１０６】
（実施例１３：ｒＡｄ／６Ｃｋｉｎｅの転移性腫瘍の緩和）
雌性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ＢｙＪ；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、０．２ｍｌ（培地）の容量中の３×１０１５  ４Ｔ１−ｐ５３乳腺腫瘍細胞（同系）を使用して、動物の左脇腹に皮下経路にて注射した。腫瘍が５０〜１００ｍｍ３のサイズに成長したときに、動物に、ＶＰＢＳ中の１００μｌのＣＭＣＢ（１ｅ１０  ＰＮ／注射）を腫瘍内注射した。マウスに１週間あたり３回（月曜日、水曜日、金曜日）２週間にわたり注射した。腫瘍を、カリパスを使用して１週間に３回測定（長さ、幅、深さ）し、腫瘍容積を、以下の式に従って計算した：Ｖ＝４／３ｒ３
ここで、ｒ＝（Ｗ（ｍｍ）＋Ｌ（ｍｍ）＋Ｄ（ｍｍ））／６
動物を、腫瘍が１０００ｍｍ３を超えた場合に屠殺した。
【０１０７】
各群から３匹のマウスを屠殺し、腫瘍が５０ｍｍ３に達したときに（代表的には、１０日目）開始して、腫瘍および肺を、以下に記載した生化学的分析のために組織処理のために切除し、肉眼および組織化学的手段により転移の存在を評価した。
【０１０８】
図１３に示されるように、６Ｃｋｉｎｅは、免疫を増大し、脈管形成を抑制することにより、確立された腫瘍において腫瘍増殖を阻害し、自発的な転移を阻害する。
【０１０９】
本発明の多くの改変およびバリエーションが本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行われ得、当業者にも明らかである。本明細書中に記載される特定の実施形態は、例示により提供されるに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ、このような特許請求の範囲に与えられる等価物の全範囲とともに限定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、ＭＩＰ−３αおよび腫瘍関連抗原を含むプラスミドを用いた免疫が、腫瘍移植に対する防御効果を有することを示す。
【図２】図２は、ケモカインＭＩＰ−３αの投与に伴うより大きなＣＴＬ活性を示す。
【図３】図３は、ケモカインｈＭＣＰ−４のヌクレオチド配列および部分的アミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、ｈＭＣＰ−４注射が、マウスにおいて用量依存性様式でインビボで樹状細胞の補充を促進することを示す。
【図５】図５は、ｈＭＣＰ−４がヒト血液における樹状細胞の補充において活性であることを示す。
【図６】図６は、ＭＣＰ−４注射が、β−ガラクトシダーゼＤＮＡ免疫の後に抗原特異的体液性応答を増大させることを示す。
【図７】図７は、マウスがβ−ガラクトシダーゼを発現するＣ２６結腸癌細胞株でチャレンジされたときに、ＭＣＰ−４が、β−ガラクトシダーゼＤＮＡ免疫により誘導される抗腫瘍効果を増大させることを示す。
【図８】図８は、ｈ６Ｃｋｉｎｅがヒト血液における樹状細胞の補充において活性であることを示す。
【図９】図９は、ｍ６Ｃｋｉｎｅを発現するように操作されたＣ２６結腸癌腫瘍細胞が、あまり腫瘍形成性ではなく、この効果が、インビボにおいてＣＤ８＋細胞およびナチュラルキラー細胞活性に依存することを示す。
【図１０】図１０は、ｍ６Ｃｋｉｎｅを発現するＣ２６腫瘍が、親腫瘍と比較した場合に、樹状細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞により有意に浸潤されることを示す。
【図１１】図１１は、ｍ６Ｃｋｉｎｅを発現するように操作されたＣ２６結腸癌腫瘍細胞が、親Ｃ２６腫瘍よりも抗原性でないことを示す。
【図１２】図１２は、ｈ６Ｃｋｉｎｅの注射が、インビボにおいてマウスの腫瘍増殖を遅延させることを示す。
【図１３】図１３は、６Ｃｋｉｎｅが、インビボにおいて確立された腫瘍の腫瘍増殖および自発的な転移を阻害することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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