(57)【要約】【課題】  鳥コクシジウム感染症を予防するためのワクチンの提供。【解決手段】  鳥コクシジウム原虫（Ｅｉｍｅｒｉａ）が発現する蛋白質の内、少なくともミクロネーム１、ミクロネーム２、ミクロネーム５、及びアピカルメンブレン抗原１の４種類の蛋白質を発現するＤＮＡベクターを含む鳥コクシジウム症に対するＤＮＡワクチン。これらのＤＮＡベクターはクそれぞれ鶏体内で機能するプロモーター制御下に配置されたＤＮＡベクターであるのが好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥コクシジウム原虫（Ｅｉｍｅｒｉａ）が発現する蛋白質の内、少なくともミクロネーム１、ミクロネーム２、ミクロネーム５、及びアピカルメンブレン抗原１の４種類の蛋白質を発現するＤＮＡベクターを含む鳥コクシジウム症に対するＤＮＡワクチン。
【請求項２】
ミクロネーム１、ミクロネーム２、ミクロネーム５、アピカルメンブレン抗原１がそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４のアミノ酸配列からなるものである請求項１のＤＮＡワクチン
【請求項３】
ミクロネーム１、ミクロネーム２、ミクロネーム５、アピカルメンブレン抗原１をコードする遺伝子が、それぞれ鶏体内で機能するプロモーター制御下に配置されたＤＮＡベクターを含む請求項１又は２記載の鳥コクシジウム症に対するＤＮＡワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鳥コクシジウム症の感染予防に有用な抗原遺伝子を発現するＤＮＡベクターを構成成分とするＤＮＡワクチン及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
コクシジウム症は腸に異常が起きる疾病であり、鶏などの家禽飼育において、軽症では下痢や飼料の肉転換率低下、重症では急性死亡など多様な問題を引き起こす。
この病気はアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）属の寄生虫によって引き起こされる。この属には、Ｅ．アッセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、Ｅ．テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）、Ｅ．マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、Ｅ．ネカトリクス（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ）、Ｅ．ブルネッチ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、Ｅ．ミチス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）及びＥ．パラエコックス（Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ）が含まれる。この他に、Ｅ．ミバチ（Ｅ．ｍｉｖａｔｉ）及びＥ．ハガニ（Ｅ．ｈａｇａｎｉ）種をメンバーに加える研究者もいる。これらは全て類似の生活環を有するが、組織特異性や病原性を異にする。Ｅ．アッセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）またはＥ．マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）による鳥の感染は、飼料の消化に大きな役割を果たす小腸部分に感染するので、特にブロイラーに大きな損害をもたらす。
【０００３】
コクシジウム症は抗コクシジウム剤の投与で対処されうるが、薬剤耐性株が頻繁に出現し、新しい薬剤の開発には多くのコストが必要である。更に、これら薬剤の多くは肉に残留し、それが消費者に問題を起こす可能性もある。
アイメリア属の弱毒株あるいは不活化した虫体を鳥に免疫して病気を予防する試みがなされてきた。早熟株のような弱毒生ワクチン株は野生型のアイメリア属各種のオーシストを鳥に感染させ、糞便に再びオーシストが排出されるまでの時間が短くなった虫を集めることによって得られる（非特許文献１）。しかしながら、このような弱毒ワクチンで免疫した鳥においても寄生虫は増殖し、病変が検出されるのである。一方、不活化ワクチンの防御レベルは充分には程遠い。更に、これらワクチンを大量生産するにはたくさんの鳥が必要であり、生産コストが高くなるという欠点がある。
【０００４】
ところで一般に遺伝子組換え技術により得られる組み換え体をワクチンとして用いることも広く検討されている。組み換え技術によるワクチンでは抗原蛋白質やその遺伝子の探索が重要となってくる。
鳥コクシジウムに関しても、今までに、多数の防御抗原候補の遺伝子が報告されてきた。例えば、Ｍ．Ｃ．Ｊｅｎｋｉｎｓらはアッセルブリナの膜画分抽出物で免疫した兎血清を用いてスクリーニングした２５０ｋＤａのメロゾイト表面蛋白質の一部をコードするｃＤＮＡについて記載している（非特許文献２、特許文献１）。或いは、アイメリア原虫に対するモノクローナル抗体を使って、アイメリア原虫の抗原遺伝子がスクリーニングされた（特許文献２〜７）。ミクロネーム２（特許文献８）、ＧＡＰＤＨ（特許文献９）、アピカルメンブレン抗原１（特許文献１０）なども有望なワクチン抗原として知られている。
【０００５】
しかしながら、今までに報告された抗原候補は、組み換え蛋白質として、あるいは抗原を発現する組み換えウイルスとして鳥に接種した場合でも、いずれも部分的な防御効果を示すにとどまっていた。そのため、より一層感染防御能のある、実用性のあるワクチンが求められていた。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５１２２４７１号公報
【特許文献２】米国特許第５０２８６９４号公報
【特許文献３】米国特許第５２７９９６０号公報
【特許文献４】米国特許第５３８７４１４号公報
【特許文献５】米国特許第５４４９７６８号公報
【特許文献６】米国特許第５６０２０３３号公報
【特許文献７】米国特許第５８１４３２０号公報
【特許文献８】特開２００５−２８７４２２号公報
【特許文献９】特開２００５−０７３６９９号公報
【特許文献１０】特開２００５−３４６０８５号公報
【０００７】
【非特許文献１】J. Parasitol. 1975, 61:1083-1090
【非特許文献２】Exp. Parasitol. 1988, 66: 96-107
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
かかる従来技術の下で、本発明者らは、鳥コクシジウム原虫に対して有効なワクチンを開発すべく種々検討した結果、鳥コクシジウム原虫（Ｅｉｍｅｒｉａ）が発現する蛋白質の内、ミクロネーム１、ミクロネーム２、ミクロネーム５、及びアピカルメンブレン抗原１の４種類の蛋白質を発現するＤＮＡベクターを含むＤＮＡワクチンが、これらの蛋白質の内１種或いは任意の２〜３種を発現するＤＮＡベクターを含むＤＮＡワクチンに比べ、飛躍的に高い感染防御能を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かくして本発明によれば、鳥コクシジウム原虫（Ｅｉｍｅｒｉａ）が発現する蛋白質の内、少なくともミクロネーム１（以下、ＭＩＣ１という）、ミクロネーム２（以下、ＭＩＣ２という）、ミクロネーム５（以下、ＭＩＣ５という）、及びアピカルメンブレン抗原１（以下、ＡＭＡ１という）の４種類の蛋白質を発現するＤＮＡベクターを含む鳥コクシジウム症に対するＤＮＡワクチンが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明を詳述する。
本発明のＤＮＡワクチンは、鳥コクシジウム原虫（Ｅｉｍｅｒｉａ）の、少なくともＭＩＣ１、ＭＩＣ２、ＭＩＣ５、及びＡＭＡ１の蛋白質を発現するＤＮＡベクターを含むものである。本発明のＤＮＡワクチンを構成するＤＮＡベクターは、上記４種の蛋白質を発現する１種類のＤＮＡベクターのみからなるものでもよいし、上記４種の内１〜３種の蛋白質を発現するＤＮＡベクターと、これが発現する蛋白質とは異なる上記４種の内１〜３種の蛋白質を発現するＤＮＡベクターとの組み合わせであってもよい。もちろん、各１種の蛋白質を発現するようにしたＤＮＡベクターを４種類混合してもよい。ＤＮＡベクター内での、上記４種の蛋白質をコードするＤＮＡの安定性の観点から、上記４種の内１〜２種の蛋白質を発現するＤＮＡベクターを組み合わせて用いるのが好ましい。
【００１１】
［Ａ］ミクロネーム１及びそれをコードする遺伝子
本発明において、ミクロネーム１（ＭＩＣ１）は、前述のアイメリア属に属する原虫のミクロネームという器官の中の一蛋白であり、Ｔｏｍｌｅｙらが最初に報告した（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．、４９（２），２７７−２８８，１９９１）。この蛋白質をコードする遺伝子の情報は、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＡＦ０３２９０５として登録されている。ＭＩＣ１をコードするｃＤＮＡ配列、及びアミノ酸配列もこの情報の中に含まれている。本発明に用いるＭＩＣ１は必ずしも登録された配列のものに限定されず、１又は複数のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により修飾されていてもＭＩＣ１の抗原性を有する限り、本発明に含まれる。その一具体例としては配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質が挙げられる。ここで、修飾の対象となるアミノ酸残基の数は、好ましくは全配列に対して１０％以下、より好ましくは５％以下であり、特に好ましくは１０個未満である。
【００１２】
［Ｂ］ミクロネーム２の蛋白質及びそれをコードする遺伝子
本発明において、ミクロネーム２（ＭＩＣ２）もまた、アイメリア原虫のミクロネームという器官の中の一蛋白であり、この蛋白質をコードする遺伝子の情報は、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＡＦ１１１８３９及びＡＦ１１１７０２として２種類のイソフォームがそれぞれ登録されている。本発明に用いるＭＩＣ２は必ずしも登録されたものに限定されず、１又は複数のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により修飾されていてもＭＩＣ２の抗原性を有する限り、本発明に含まれる。その一具体例としては配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質が挙げられる。ここで、修飾の対象となるアミノ酸残基の数は、好ましくは全配列に対して１０％以下、より好ましくは５％以下であり、特に好ましくは１０個未満である。
【００１３】
［Ｃ］ミクロネーム５の蛋白質及びそれをコードする遺伝子
本発明において、ミクロネーム５（ＭＩＣ５）もまた、アイメリア原虫のミクロネームという器官の中の一蛋白であり、Ｂｒｏｗｎ  Ｐ．Ｊ．らによって報告された（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．、１０７，９１−１０２，２０００）。この蛋白質をコードする遺伝子の情報は、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＡＪ２４５５３６として登録されている。本発明のＭＩＣ５は必ずしも登録されたものに限定されず、１又は複数のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により修飾されていてもＭＩＣ５の抗原性を有する限り、本発明に含まれる。その一具体例としては配列番号３のアミノ酸配列を有する蛋白質が挙げられる。ここで、修飾の対象となるアミノ酸残基の数は、好ましくは全配列に対して１０％以下、より好ましくは５％以下であり、特に好ましくは１０個未満である。
【００１４】
［Ｄ］アピカルメンブレン抗原１の蛋白質及びそれをコードする遺伝子
本発明において、アピカルメンブレン抗原１（ＡＭＡ１）蛋白質は、アイメリア原虫のミクロネームという器官からアピカルという器官に移動し、更にその後、虫の表層に発現する蛋白である。ＡＭＡ１蛋白質のアミノ酸配列は特開２００６−１８０８７２号公報の配列番号４として開示されている。本発明のＡＭＡ１蛋白質は必ずしもこれに限定されず、１又は複数のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により修飾されていてもＡＭＡ１蛋白質の抗原性を有する限り、本発明に含まれる。ここで、修飾の対象となるアミノ酸残基の数は、好ましくは全配列に対して１０％以下、より好ましくは５％以下であり、特に好ましくは１０個未満である。
【００１５】
ＭＩＣ１、ＭＩＣ２、及びＭＩＣ５をコードする遺伝子をそれぞれ得る方法としては、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されている遺伝子情報（ＡＦ０３２９０５、ＡＦ１１１８３９又はＡＦ１１１７０２、ＡＪ２４５５３６）を使ってアイメリアのｃＤＮＡライブラリーからポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）で目的のｃＤＮＡを増幅して得る方法が挙げられる。ＡＭＡ１をコードするＤＮＡを得る方法は、特開２００６−１８０８７２号公報に記載されている。
【００１６】
［Ｅ］ベクター
本発明のＤＮＡワクチンの有効成分であるＤＮＡベクターは、鳥コクシジウム原虫（Ｅｉｍｅｒｉａ）のＭＩＣ１、ＭＩＣ２、ＭＩＣ５、ＡＭＡ１の少なくとも１つの蛋白質をコードするＤＮＡをベクターに組み込んだＤＮＡベクターである。ベクターとしては、ウイルスベクターや非ウイルスベクターが挙げられるが、安全性の観点から非ウイルスベクターが好ましい。非ウイルスベクターとしては、プラスミド、コスミド、ファージなどのような目的の蛋白質をコードするＤＮＡを組み込むＤＮＡ導入型非ウイルスベクター；カチオン性リポソームやカチオン性ポリマーなどのような目的の蛋白質をコードするＤＮＡと複合体を形成するタイプの非ウイルスベクター；などが挙げられる。中でも、安全性・操作性の観点からＤＮＡ導入型非ウイルスベクターが好適に用いられる。具体的には、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭなどのプラスミド、λファージ、Ｍ１３ファージなどのファージ、ｐＨＣ７９などのコスミドなどが挙げられる。また、これらのプラスミドに必要に応じてクローニングサイト、プロモーター、転写終結シグナルなどを挿入した修飾プラスミドを用いることもできる。
ＤＮＡ導入型非ウイルスベクターを用いて本発明に用いるＤＮＡベクターを得るには、ベクターを適当な制限酵素で切断し、必要に応じてリンカーなどを介して目的の蛋白質をコードするＤＮＡや後述するプロモーターを挿入する、一般的な組み換えベクターの構築方法を採用すればよい。
【００１７】
［Ｆ］鶏体内で発現するプロモーター
本発明に用いるＤＮＡベクター中のＭＩＣ１、ＭＩＣ２、ＭＩＣ５及び／又はＡＭＡ１をコードする遺伝子の上流に、これらの遺伝子が制御下になるように、鶏体内で機能するプロモーターを配置することができる。鶏体内で機能するプロモーターとしては、鶏の構成蛋白質（例えばβ−アクチン）のプロモーターや鶏に感染するウイルス由来のプロモーターが好適に用いられ、具体的には鶏β−アクチンプロモーター（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１１，８２８７−８３０１，１９８３）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、特開２００１−０００１８８号公報で開示されているＰｅｃプロモーターなどが例示される。
【００１８】
［Ｇ］ＤＮＡワクチン
本発明のＤＮＡワクチンは、上述した少なくとも４種類の蛋白質を発現するＤＮＡベクターを有効成分として含んだものであり、通常、保存安定剤など薬理学的に問題のない成分を、燐酸バッファー（ＰＢＳ）などの溶媒に可溶化して用いることができる。
【００１９】
更に、ワクチン効果を高めるため、細胞表層にあるトール様レセプターに認識されて細胞性免疫を活性化することが知られているオリゴヌクレオチド（いわゆるＣｐＧ）を添加することもできる。
ＣｐＧの添加量に格別な制限は無いが、ＤＮＡベクター総量に対して、通常５〜１００重量％、好ましくは１０〜３０重量％である。
【００２０】
本発明のＤＮＡワクチンの投与方法に格別の制限はなく、筋肉注射、静脈注射、腹腔内注射、卵内接種などの方法が一般的な方法として挙げられる。接種量は、鶏１羽当り、有効成分であるＤＮＡベクター量で通常０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｍｌの濃度の注射液５０μｌ程度である。また、筋肉への接種に当たっては、市販のエレクトロ・ポレーターや遺伝子銃などを使用してＤＮＡワクチンを体内へ導入する効率を高めることが好ましい。
【実施例】
【００２１】
本発明のプラスミドの構築は特に記載がない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．  Ｎ．Ｙ．  ２００１年）記載の標準的な分子生物学手法を用いて行った。尚、制限酵素で切断したＤＮＡ断片はアガロースゲル電気泳動後、ゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社、製品番号：２８７０４）を用いて精製した。文中で特に断らない限り、ポリメラーゼ・チェイン反応（ＰＣＲ）は、Ｅｘ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社、製品番号：ＲＲ００１Ａ）を用い、変性条件を９４℃にて１分、アニーリング条件を５５℃にて２分、伸張反応条件を７２℃にて３分として、３０サイクル反応させた。
【００２２】
１．ＭＩＣ１の蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
１．１  アイメリア・テネラのｃＤＮＡライブラリーの調製
アイメリア・テネラの日本野外分離株（財団法人  畜産生物科学安全研究所より分与）のオーシスト１×１０８個からスポロゾイトを常法に従って調製し、ＰＢＳで洗浄後、リシスバッファー（４Ｍ  グアニジンチオシアネート、２５  ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５％ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、０．１Ｍ  β−メルカプトエタノール）０．５ｍｌで溶解させた。この液をオリゴｄＴカラム（Ｆａｓｔ−Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ分離キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に通してｍＲＮＡを精製した。
相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）はｃＤＮＡ合成キット（タカラバイオ社、製品番号：６１２０）を用いて合成した。二本鎖ＤＮＡを合成した後、ｃＤＮＡライブラリーキット（タカラバイオ社、製品番号：６１１９）に包含されているカセットアダプターを用いて、マニュアルに従ってｃＤＮＡライブラリーを調製した。
【００２３】
１．２  ＭＩＣ１の蛋白質をコードするｃＤＮＡ断片のクローニング
アイメリア・テネラのＭＩＣ１蛋白のゲノム配列及びｃＤＮＡ配列は、前述の如く、既に発表されている（Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．（１９９１）４９，２７７−２８８）ので、その情報を基にＰＣＲでｃＤＮＡ断片をクローニングすることができる。使用したＰＣＲプライマーは、Ｍ１Ｆ１（配列番号５）、Ｍ１Ｆ２（配列番号６）、Ｍ１Ｆ３（配列番号７）、Ｍ１Ｆ４（配列番号８）、Ｍ１Ｆ５（配列番号９）、Ｍ１Ｆ６（配列番号１０）、Ｍ１Ｒ１（配列番号１１）、Ｍ１Ｒ２（配列番号１２）、Ｍ１Ｒ３（配列番号１３）、Ｍ１Ｒ４（配列番号１４）、Ｍ１Ｒ５（配列番号１５）、Ｍ１Ｒ６（配列番号１６）である。１．１で調製したアイメリア・テネラｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして、Ｍ１Ｆ１とＭ１Ｒ１、Ｍ１Ｆ２とＭ１Ｒ２、Ｍ１Ｆ３とＭ１Ｒ３、Ｍ１Ｆ４とＭ１Ｒ４、Ｍ１Ｆ５とＭ１Ｒ５、Ｍ１Ｆ６とＭ１Ｒ６の各プライマーセットを使ってＰＣＲを実施した。
【００２４】
その結果、約０．５〜０．６ｋｂの大きさのバンドがそれぞれ増幅された。次に、Ｍ１Ｆ３とＭ１Ｒ３のプライマーセットで増幅されたＤＮＡ断片と、Ｍ１Ｆ４とＭ１Ｒ４のプライマーセットで増幅されたＤＮＡ断片を各々１ｎｇずつ加えて新しい鋳型として、Ｍ１Ｆ３とＭ１Ｒ４のプライマーセットでＰＣＲを実施し、１．１ｋｂのＤＮＡ断片が増幅した。同様に、Ｍ１Ｆ５とＭ１Ｒ５のプライマーセットで増幅されたＤＮＡ断片と、Ｍ１Ｆ６とＭ１Ｒ６のプライマーセットで増幅されたＤＮＡ断片を各々１ｎｇずつ加えて新しい鋳型として、Ｍ１Ｆ５とＭ１Ｒ６のプライマーセットでＰＣＲを実施し、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。
【００２５】
さらに、Ｍ１Ｆ１とＭ１Ｒ１のプライマーセットで増幅された０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片と、Ｍ１Ｆ３とＭ１Ｒ４のプライマーセットで増幅された１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を各々１ｎｇずつ加えて新しい鋳型として、Ｍ１Ｆ１とＭ１Ｒ４のプライマーセットでＰＣＲを実施し、１．６ｋｂのＤＮＡ断片が増幅した。この断片と、Ｍ１Ｆ５とＭ１Ｒ６のプライマーセットで増幅させた約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を各々１ｎｇずつ加えて新しい鋳型として、Ｍ１Ｆ１とＭ１Ｒ６のプライマーセットでＰＣＲを実施し、約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅させた。
【００２６】
この約２．４ｋｂｐＤＮＡ断片をＰＣＲ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐクローニング  キット（ストラタジーン社、製品番号：２１１１８８）に入っているプラスミドベクターに、製品添付マニュアルに従いライゲーションして、キット内に含まれているコンピテントセルに導入した。そして得られた複数の形質転換株から候補プラスミドを調製し、それらのインサートＤＮＡをシーケンスした。その結果、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３２９０５として登録されているＭＩＣ１蛋白のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を完全に含む２４４２ｂｐのＤＮＡが挿入されたプラスミドｐＰＣＲ−ＭＩＣ１が得られた。
【００２７】
２．ＭＩＣ２の蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
アイメリア・テネラのＭＩＣ２蛋白質をコードする遺伝子のクローニングは、特開２００５−２８７４２２号の実施例（特に段落００３１と図１及び２）に示された方法で調製し、ＮＣＢＩ遺伝子バンクに登録されているＭＩＣ２の遺伝子配列ＡＦ１１１８３９と同一のＤＮＡ配列を有するｃＤＮＡであるｐＰＣＲ−ＥｔＭＩＣ２を得た。ＩＩ
【００２８】
３．ＭＩＣ５の蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
アイメリア・テネラのＭＩＣ５蛋白のｃＤＮＡ配列は、前述の如く、既に発表されている（Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．、１０７，９１−１０２，２０００）ので、その情報を基にＰＣＲでｃＤＮＡ断片をクローニングすることができた。使用したＰＣＲプライマーは、ＥｔＭ５−Ｆ（配列番号１７）、ＥｔＭ５−Ｒ（配列番号１８）、ＥｔＭ５−１Ｆ（配列番号１９）、ＥｔＭ５−２Ｒ（配列番号２０）、ＥｔＭ５−３Ｆ（配列番号２１）、ＥｔＭ５−４Ｒ（配列番号２２）、ＥｔＭ５−５Ｆ（配列番号２３）、ＥｔＭ５−６Ｆ（配列番号２４）、ＥｔＭ５−７Ｒ（配列番号２５）、ＥｔＭ５−８Ｒ（配列番号２６）である。実施例１．１で調製したアイメリア・テネラｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして、ＥｔＭ５−５ＦとＥｔＭ５−７Ｒ、ＥｔＭ５−６ＦとＥｔＭ５−８Ｒ、ＥｔＭ５−１ＦとＥｔＭ５−２Ｒ、ＥｔＭ５−ＦとＥｔＭ５−Ｒ、ＥｔＭ５−３ＦとＥｔＭ５−４Ｒの各プライマーセットを使ってＰＣＲを実施した。
【００２９】
その結果、約０．５〜１．０ｋｂの大きさのバンドがそれぞれ増幅された。次に、ＥｔＭ５−６ＦとＥｔＭ５−８Ｒのプライマーセットで増幅されたＤＮＡ断片と、ＥｔＭ５−１ＦとＥｔＭ５−２Ｒのプライマーセットで増幅されたＤＮＡ断片を各々１ｎｇずつ加えて新しい鋳型として、ＥｔＭ５−６ＦとＥｔＭ５−２ＲのプライマーセットでＰＣＲを実施し、１．３ｋｂのＤＮＡ断片が増幅した。同様に、ＥｔＭ５−ＦとＥｔＭ５−Ｒのプライマーセットで増幅されたＤＮＡ断片と、ＥｔＭ５−３ＦとＥｔＭ５−４Ｒのプライマーセットで増幅されたＤＮＡ断片を各々１ｎｇずつ加えて新しい鋳型として、ＥｔＭ５−ＦとＥｔＭ５−４ＲのプライマーセットでＰＣＲを実施し、約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。
【００３０】
さらに、ＥｔＭ５−６ＦとＥｔＭ５−２Ｒのプライマーセットで増幅された１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片と、ＥｔＭ５−ＦとＥｔＭ５−４Ｒのプライマーセットで増幅された０．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を各々１ｎｇずつ加えて新しい鋳型として、ＥｔＭ５−６ＦとＥｔＭ５−４ＲのプライマーセットでＰＣＲを実施し、２．１ｋｂのＤＮＡ断片が増幅した。この断片と、ＥｔＭ５−５ＦとＥｔＭ５−７Ｒのプライマーセットで増幅させた約０．８ｋｂのＤＮＡ断片を各々１ｎｇずつ加えて新しい鋳型として、ＥｔＭ５−５ＦとＥｔＭ５−４ＲのプライマーセットでＰＣＲを実施し、約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を増幅させた。
【００３１】
この約２．８ｋｂｐＤＮＡ断片をＰＣＲ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐクローニング  キット（ストラタジーン社、製品番号：２１１１８８）に入っているプラスミドベクターに、製品添付マニュアルに従いライゲーションして、キット内に含まれているコンピテントセルに導入した。そして得られた複数の形質転換株から候補プラスミドを調製し、それらのインサートＤＮＡをシーケンスした。その結果、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ２４５５３６として登録されているＭＩＣ５蛋白のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を完全に含む２８１２ｂｐのＤＮＡが挿入されたプラスミドｐＰＣＲ−ＭＩＣ５を得た。
【００３２】
４．  ＡＭＡ１蛋白質をコードするｃＤＮＡのクローニング
アイメリア・テネラのＡＭＡ１蛋白質をコードするｃＤＮＡは、特開２００６−１８０８７２号公報の実施例１に記載されている方法に従って得た。
【００３３】
５．  その他の遺伝子のクローニング
５．１  ミクロネーム３をコードする遺伝子のクローニング
ＰＣＲプライマーＭＩＣ３ｇ（配列番号２７）とＭＩＣ３ｂ（配列番号２８）を使って、前記１．１で調製したアイメリア・テネラｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行ったところ、約４００ｂｐのＰＣＲ断片が増幅された。この増幅断片をシークエンスしたところ、３８１ｂｐであり、Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍのｍｉｃｒｏｎｅｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （３８％）やＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉのミクロネーム  （３４％）とホモロジーがあった。この増幅断片をＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ  （Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いてＤＩＧ標識した。このＤＩＧ標識されたＰＣＲ産物をプローブとして、アイメリア・テネラｃＤＮＡライブラリー（前記１．１のｃＤＮＡライブラリーをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＬａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔで作製したライブラリー）をスクリーニングした。その結果、２６１９ｂｐの挿入領域を有し８６５個のアミノ酸をコードするアイメリア・テネラ由来の遺伝子を有するクローン（λＺＡＰクローン）を得た。この８６５個のアミノ酸配列について、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサーチをしたところ、やはりＮｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍのｍｉｃｒｏｎｅｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮｃＭＩＣ１）やＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉのミクロネームと相同性があることがわかった。従ってこのアミノ酸配列はアイメリア・テネラのミクロネーム３（以下、ＭＩＣ３という）に相当すると判断した。
【００３４】
５．２  ミクロネーム４をコードする遺伝子のクローニング
ＭＩＣ４遺伝子全長をクローニングすることは出来なかったが、ＭＩＣ４の一部分（図４中のａ、ｂ、ｃで表される領域）のみが、以下の方法によりクローニングされた。
ＰＣＲプライマーＭ４−２Ｒ（配列番号２９）とＭ４−３Ｆ（配列番号３０）を使って、前記１．１で調製したアイメリア・テネラｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行ったところ、約４８０ｂｐのＰＣＲ断片が増幅された（このＤＮＡ断片は図４のｃに示す領域に相当し、ＭＩＣ４ｃと命名）。また、Ｍ４−１Ｆ（配列番号３１）とＭ４−１Ｒ（配列番号３２）のプライマーセットで増幅ＤＮＡが得られ（このＤＮＡ断片は図４のａに示す領域に相当し、ＭＩＣ４ａと命名）、更にＭ４−６Ｆ（配列番号３３）とＭ４−７Ｒ（配列番号３４）のプライマーセットで増幅ＤＮＡが得られ（このＤＮＡ断片は図４のｂに相当し、ＭＩＣ４ｂと命名）、これら３断片をそれぞれｐＰＣＲ  Ｓｃｒｉｐｔ  ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）にクローニングしたベクターをｐＰＣＲ−Ｍ４ａ、ｐＰＣＲ−Ｍ４ｂ、ｐＰＣＲ−Ｍ４ｃと命名し、シークエンスで挿入ＤＮＡ配列を確認した。
【００３５】
６．  ＤＮＡベクターの調製
ＤＮＡワクチン用のベクターとして、特開２００４−０００１１１号公報の実施例で開示したプラスミドｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡを用いた。このプラスミドは、ｐＵＣ１８を用いて構築されたものであり、鶏β−アクチンプロモーターを有する。このプロモーターの制御下に上記１から５でクローニングされた各遺伝子を挿入してＤＮＡベクターを調製した。
以下、具体的に記載する。
【００３６】
６．１  ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ１の調製
前記１．１で得られたｐＰＣＲ−ＭＩＣ１を制限酵素ＸｂａＩとＳａｌＩで切断して挿入ＤＮＡを切り出し、同じくＸｂａＩ／ＳａｌＩで切断したｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡとライゲーションして、ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ１（図１）を作製した。
【００３７】
６．２  ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ２の調製
特開２００５−２８７４２２号の実施例２の記載に従って、ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ２を得た。
【００３８】
６．３  ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ５の調製
前記３で得られたｐＰＣＲ−ＭＩＣ５を制限酵素ＸｂａＩとＳａｌＩで切断して挿入ＤＮＡを切り出し、同じくＸｂａＩ／ＳａｌＩで切断したｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡとライゲーションして、ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ５（図２）を作製した。
【００３９】
６．４  ｐ４５ＢａｃＥｔＭＡＭ１の調製
特開２００６−１８０８７２号の実施例５の記載に従って、ｐ４５ＢａｃＥｔＡＭＡ１を得た。
【００４０】
６．５  ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ３の調製
前記５．１でＭＩＣ３のＤＮＡと判断されたＤＮＡが挿入されていたλＺＡＰクローンから制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断して挿入ＤＮＡを切り出し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩで切断したｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡとライゲーションしてｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ３（図３）を作製した。
【００４１】
６．６  ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ４ａｂｃの調製
実施例５．２で得られたＭＩＣ４ａ、ＭＩＣ４ｂ、及びＭＩＣ４ｃの３ＤＮＡ断片をインフレームで発現するベクターｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ４ａｂｃを構築する為、ＭＩＣ４ａのＮ末端に制限酵素サイトと翻訳開始コドンを、ＭＩＣ４ｃＤＮＡ断片の両末端に制限酵素サイトをＰＣＲで導入する必要があった。ｐＰＣＲ−Ｍ４ｃを鋳型にしてＰＣＲプライマーＭ４Ｃｓｔｏｐ−Ｆ（配列番号３５）とＭ４Ｃ３−Ｒ（配列番号３６）でＰＣＲを行い、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断して約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。また、ｐＰＣＲ−Ｍ４ａを鋳型にしてＰＣＲプライマーＡＴＧＭ４Ａ−Ｆ（配列番号３７）とＭ４−１ＲのプライマーセットでＰＣＲを行い制限酵素ＸｂａＩとＢｇｌＩＩで切断して、約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。更に、ｐＰＣＲ−Ｍ４ｂを制限酵素ＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで切断して、約０．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。回収したこの３ＤＮＡ断片をＸｂａＩ／ＳａｌＩで切断したプラスミドｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡのＸｂａＩ／ＳａｌＩサイトにＴ４ＤＮＡライゲースを用いて挿入して出来たプラスミドをｐ４５ＢａｃＭＩＣ４ａｂｃと命名した。ＭＩＣ４ａｂｃのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の塩基配列とアミノ酸配列とは、それぞれ配列番号３８と３９のとおりである。ｐＰＣＲ−ＭＩＣ４ａｂｃを制限酵素ＸｂａＩとＳａｌＩで切断して挿入ＤＮＡを切り出し、同じくＸｂａＩ／ＳａｌＩで切断したｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡとライゲーションして、ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ４ａｂｃ（図５）を作製した。
【００４２】
実施例１，２、比較例１〜５  ＤＮＡワクチンの効果試験
・混合ＤＮＡワクチンの調製
ＤＮＡワクチンサンプルは、燐酸バッファー（ＰＢＳ）１ｍｌ当たり１ｍｇになるように調製するが、混合ＤＮＡワクチンの場合は、ＤＮＡワクチン全体で１ｍｇになるように、表１中の○で示した各ＤＮＡベクターを等量ずつ混合した。また、アジュバントとしてＣｐＧ（配列番号４３）とＣｐＧ−３０（配列番号４４）もそれぞれ０．１ｍｇずつ含むように調製した。
【００４３】
・鶏免疫法及びコクシジウム（アイメリア・テネラ）攻撃試験方法
ＳＰＦ卵（日本生物科学研究所）から孵化した鶏（ＬｉｎｅＭ）が２週齢の時に、上記（実施例７．１）のようにして調製されたＤＮＡワクチンサンプルを、５０μｌ／羽ずつ後肢筋肉に注射した後、直ちに接種部位にエレクトロ・ポレーター（Ｇｅｎｔｒｏｎｉｃｓ社、モデルＥＣＭ８３０）を使って電気刺激（５０Ｖ、２０μ秒、１秒間隔で３回、更に電極を逆にして３回）した。１週間後、同様にして同量のＤＮＡワクチンを接種した。ＤＮＡワクチン接種２週後（３８日齢）にＤＮＡワクチン接種群及び攻撃対照群の鶏のそ嚢内に、アイメリア・テネラの日本野外分離株の胞子形成オーシスト１０００個を単回強制経口投与することにより攻撃を行なった。また、攻撃しない鶏を非攻撃対照群とした。攻撃後８日目に各鶏を解剖し腸の病変を観察し、病変に応じて０（正常）、１（軽度の病変）、２（中軽度の病変）、３（中度の病変）または４（重度の病変）のスコアを付けた。各群毎にスコアを集計して、統計処理を行った。
【００４４】
・コクシジウム攻撃試験結果
１２５羽のＳＰＦ鶏を９群に分け、その内の７群に混合ＤＮＡワクチンを接種し、残る２群（２０羽）には、ワクチンを接種しなかった。混合ＤＮＡワクチンに含まれるＤＮＡベクターは、表１に記載した。７．２に記載した方法に従って、混合ワクチン接種群（７群）と接種しなかった２群の内の１群にアイメリア・テネラのオーシストを経口投与した。残る１群は非攻撃対照群としてコクシジウム攻撃もしなかった。この攻撃試験結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
表１に示したように、ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ１、ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ２、ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ５、ｐ４５ＢａｃＥｔＡＭＡ１からなる混合ＤＮＡワクチンを接種した６群、及び更にｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ３やｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ４ａｂｃをも含む混合ＤＮＡワクチンを接種した１群の鶏が統計上の有意差を持って、病変の程度が低かった。それに対し、１群の６種からｐ４５ＢａｃＥｔＡＭＡ１を欠いた５種を接種した２群や、ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ５を欠いた３群、ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ２を書いた４群、ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ１を欠いた５群では、攻撃対照群（８群）と比べて統計上の有意差は無かった。また６群のｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ２の代わりにｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ４ａｂｃにした混合ＤＮＡワクチンを接種した７群も有意差のあるワクチン効果が見られなかった。
【００４７】
表１の結果より、少なくともＭＩＣ１、ＭＩＣ２、ＭＩＣ５、ＡＭＡ１の蛋白質を発現するＤＮＡベクター４種を含む混合ＤＮＡワクチンが鳥コクシジウム症に対するワクチンとして効果があり、このうちのどれか１つを欠いても効果が低下することがわかった。
【００４８】
実施例３  ＤＮＡワクチンの効果試験（その２）
・ＣＭＶプロモーターを利用したＤＮＡベクターの調製
ＣＭＶプロモーターを含む市販プラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社；カタログ＃：２１２２０９）を鋳型としてＰＣＲプライマーＣＭＶＢｇｌＩ−Ｆ（配列番号４０）とＣＭＶＸｂａ−Ｒ（配列番号４１）でＣＭＶプロモーターの５’端にＳｆｉＩサイト、３’端末にＸｂａＩサイトを導入してプロモーター部分を増幅させ、ｐＰＣＲ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ベクターにクローニングして、ｐＰＣＲ−ＣＭＶを得た。クローニングされたＣＭＶプロモーターをシーケンスして配列を確認した。この確認されたＣＭＶプロモーター配列を配列番号４２に記載する。先に得られたｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ１、ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ２、ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ５、ｐ４５ＢａｃＥｔＡＭＡ１のβーアクチンプロモーター部分を、ｐＰＣＲ−ＣＭＶから制限酵素ＢｇｌＩとＸｂａＩで切断して得たＣＭＶプロモーターで置換したプラスミドをそれぞれ構築して、ｐ４５ｃｍｖＥｔＭＩＣ１、ｐ４５ｃｍｖＥｔＭＩＣ２、ｐ４５ｃｍｖｔＭＩＣ５、ｐ４５ｃｍｖＥｔＡＭＡ１と命名した。
【００４９】
・混合ＤＮＡワクチンの調製
実施例３で使用するＤＮＡワクチンサンプルは、ＰＢＳ  １ｍｌ当たり、混合するＤＮＡベクターｐ４５ｃｍｖＥｔＭＩＣ１、ｐ４５ｃｍｖＥｔＭＩＣ２、ｐ４５ｃｍｖＥｔＭＩＣ５、ｐ４５ｃｍｖＥｔＡＭＡ１をそれぞれ０．２５ｍｇずつ混合した。また、アジュバントとしてＣｐＧとＣｐＧ−３０もそれぞれ０．１ｍｇずつ含むように調製した。
【００５０】
・鶏免疫法及びコクシジウム（アイメリア・アッセルブリナ）攻撃試験方法
ＳＰＦ卵（日本生物科学研究所）から孵化した鶏（ＬｉｎｅＭ）が２週齢の時に、実施例８．１の混合ＤＮＡワクチンを、実施例７．２と同様な方法で接種した。１週間後、同様にして同量のＤＮＡワクチンを追加接種した。ＤＮＡワクチン接種２週後（３８日齢）にＤＮＡワクチン接種群及び攻撃対照群の鶏のそ嚢内に、アイメリア・アッセルブリナの日本野外分離株の胞子形成オーシスト５０００個を単回強制経口投与することにより攻撃を行なった。また、攻撃しない鶏を非攻撃対照群とした。攻撃後４日目に各鶏を解剖し腸の病変を観察し、病変に応じて０（正常）から４（重度の病変）のスコアを付けた。群毎にスコアを集計して、統計処理を行った。
【００５１】
・コクシジウム（アイメリア・アッセルブリナ）攻撃試験結果
４０羽のＳＰＦ鶏を３群に分け、その内の１群に混合ＤＮＡワクチンを接種し、残る２群には、ワクチンを接種しなかった。８．２に記載した方法に従って、混合ワクチン接種群（１群）と接種しなかった２群の内の１群（２群）にアイメリア・アッセルブリナのオーシストを経口投与した。残る１群は非攻撃対照群としてコクシジウム攻撃をしなかった。この攻撃試験結果を表２に示す。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
表２に示したように、ｐ４５ｃｍｖＥｔＭＩＣ１、ｐ４５ｃｍｖＥｔＭＩＣ２、ｐ４５ｃｍｖｔＭＩＣ５、ｐ４５ｃｍｖＥｔＡＭＡ１からなる混合ＤＮＡワクチンを接種した１群の鶏は有意に病変の程度が低かった。この結果より、少なくともＭＩＣ１、ＭＩＣ２、ＭＩＣ５、ＡＭＡ１の蛋白質を発現するＤＮＡベクター４種を含む混合ＤＮＡワクチンがアイメリア・アッセルブリナによる攻撃に対しても有効であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、ＤＮＡベクター  ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ１の制限酵素地図である。
【図２】図２は、ＤＮＡベクター  ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ５の制限酵素地図である。
【図３】図３は、ＤＮＡベクター  ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ３の制限酵素地図である
【図４】図４は、アイメリア・テネラのＭＩＣ４蛋白のｃＤＮＡとクローニング領域である。
【図５】図５は、ＤＮＡベクター  ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ４ａｂｃの制限酵素地図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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