(57)【要約】【課題】バイオマーカーとなる特異的な物質を見出し、それを高感度で測定する方法を提供する。【解決手段】サンドイッチELISA法による抗体の組み合わせをヤギ種抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体とマウス種抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体とし、バイオマーカーとなるＨＳＰ４７を、微量な場合でも測定することを可能にした。癌治療の効果判定及び経過観察時の病状の指標が得られ、さらに再発の早期発見に応用できるため有用である。  また、炎症性疾患や創傷治癒、膠原病や肺線維症、肝硬変などの組織に線維化を呈する疾患においては、その線維形成の程度を知る指標を得た。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＳＰ４７と特異的に結合する分子を含む癌バイオマーカー検出キット。
【請求項２】
ＨＳＰ４７と特異的に結合する分子が抗ＨＳＰ４７抗体である請求項１に記載の癌バイオマーカー検出キット。
【請求項３】
ＨＳＰ４７と結合する２つの抗体を含むことを特徴とする請求項２に記載の癌バイオマーカー検出キット。
【請求項４】
ＨＳＰ４７と結合する抗体がヤギ種抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体とマウス種抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体である請求項３記載の癌バイオマーカー検出キット。
【請求項５】
サンドイッチELISA法を用いた請求項４記載の癌バイオマーカー検出キット。
【請求項６】
癌がスキルス胃癌または大腸癌である請求項１〜５のいずれかに記載の癌バイオマーカー検出キット。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の癌バイオマーカー検出キットによる癌の診断方法。
【請求項８】
ＨＳＰ４７と結合する抗体がヤギ種抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体とマウス種抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体であるＨＳＰ４７検出キット。
【請求項９】
サンドイッチELISA法を用いた請求項８記載のＨＳＰ４７検出キット。
【請求項１０】
３０〜１００，０００ｎｇ／ｍｌの微量なＨＳＰ４７の定量が可能な請求項８記載の検査キット。
【請求項１１】
請求項８記載の検査キットによる炎症性疾患または全身性及び／もしくは局部的な線維化疾患、悪性新生物または創傷治癒状態の診断方法。
【請求項１２】
全身性及び／または局部的な線維化疾患が、膠原病、肺線維症、肝硬変である請求項１１記載の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子標的マーカーとしての分子シャペロンＨＳＰ４７を高感度に測定する方法及びそれを利用した癌、線維化疾患の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質が正常に機能するには、ポリペプチドが正しく折りたたまれて、機能を持った高次構造を作ること、その構造に異常を生じた場合には、合成を停止するなどの品質管理機構が必要となる。多くの蛋白質の折りたたみには、分子シャペロンの働きが極めて重要であることが知られている。
【０００３】
分子シャペロンとは、他の蛋白質の折りたたみ（folding）や会合に触媒的にかかわる一群の蛋白質であり、細胞内で変性した蛋白質の凝集防止、変性蛋白質の再生等を行い蛋白質の変性による細胞死から細胞を守る働きを持っている。
【０００４】
分子シャペロンは蛋白質の高次構造の制御に関わることから、近年、多くの神経変性疾患に関与するポリグルタミンリピートを持った病態や、プリオン病など種々の病態制御に役立つ可能性がある物質として注目されている。
【０００５】
中でも、分子シャペロンのひとつであるＨＳＰ４７は、コラーゲン特異的分子シャペロンで、コラーゲンが正しい３本鎖を形成する為に必須である。ＨＳＰ４７は、肝硬変、肺や腎臓の線維化疾患、膠原病、動脈硬化等のコラーゲンの関連する疾患において、著しく発現が昂進することがわかっており、その制御は線維化疾患の新しい治療方法となる可能性が期待されている。ＨＳＰ４７の測定方法として、サンドイッチ（sandwich）ELISA法による蛋白定量法が報告されているが、これまでの方法では、使用している抗体の感度の問題で、培養液中や血液中に存在するごくわずかなＨＳＰ４７を定量することは不可能であった。また、ＨＳＰ４７は、線維化が全身に及ぶような特殊な疾患のみの指標とされていた（非特許文献１）。
【０００６】
一方、従来から癌細胞が産生する、または非癌細胞が癌細胞に反応して産生する物質である腫瘍マーカーが発見されており、これらの癌細胞に特異的な分子の機能を直接制御することによって治療に結びつけようとする分子標的治療の研究が盛んに行われている。そして近年では、バイオマーカーという言葉が用いられ、単に癌かどうかの指標ばかりでなく、細胞が癌化する前から産生する指標物質や、癌の進展、転移の過程で産生される物質の研究が盛んに行われている。
【０００７】
バイオマーカーの例として、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ等、糖鎖抗原としてＣＡ１９−９等が挙げられる（非特許文献２）。ＣＥＡは主に消化管癌のバイオマーカーとして有用で、消化管癌において比較的高い陽性率が見られる。ＡＦＰは主に肝細胞癌のバイオマーカーとして有用である。ＰＩＶＫＡ−ＩＩも肝細胞癌のバイオマーカーとして有用で、ＡＦＰより特異性が高い。糖鎖抗原には予後の難しい膵、胆道癌のマーカーとして有望なものがあり、今後の展開が期待されている。しかしこれらのバイオマーカーには、早期癌など進行度が低い癌では陽性率は低い、良性疾患でも陽性となる場合があるなど、感度、良悪性の鑑別等に問題がある。
そこで、バイオマーカーとなるより特異的な物質の発見、及びそれを感度良く測定する方法を得ることが強く望まれている。
【０００８】
【非特許文献１】日薬理誌（Folia Pharacol. Jpn.）121,p.4-14,（2003）
【非特許文献２】Jpn J Cancer Chemoher 31（7）,p.1015-1020,（2004）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、バイオマーカーとなる特異的な物質を見出し、それを高感度で測定する方法を得ることにより、対象患者の一層細やかな病状把握を可能とすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは鋭意検討した結果、サンドイッチELISA法による抗体の組み合せを決定し微量なＨＳＰ４７を測定することを可能とした。さらに、癌組織におけるＨＳＰ４７の局在を検討するため、免疫染色による観察を行い、コラーゲン産生を示す間葉系細胞以外に、上皮由来である癌細胞が染色され、コラーゲン産生という形質転換を示すことを見出した。すなわち、正常上皮細胞にはＨＳＰ４７の染色は認めない（図６（Ａ））が、スキルス胃癌細胞では細胞質内に褐色の染色を示す（図６（Ｂ））。そして本来細胞内小器官である小胞体内に存在し、細胞外に逸脱することはない分子シャペロンＨＳＰ４７が、電子顕微鏡観察下に細胞外に逸脱する所見を認め（図７）、従来線維化疾患のみの指標となると思われていた分子シャペロンＨＳＰ４７がバイオマーカーとなることを見出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、以下に示すとおりである。
１．ＨＳＰ４７と特異的に結合する分子を含む癌バイオマーカー検出キット。
２．ＨＳＰ４７と特異的に結合する分子が抗ＨＳＰ４７抗体である前記１に記載の癌バイオマーカー検出キット。
３．ＨＳＰ４７と結合する２つの抗体を含むことを特徴とする前記２に記載の癌バイオマーカー検出キット。
４．ＨＳＰ４７と結合する抗体がヤギ種抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体とマウス種抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体である前記３記載の癌バイオマーカー検出キット。
５．サンドイッチELISA法を用いた前記４記載の癌バイオマーカー検出キット。
６．癌がスキルス胃癌または大腸癌である前記１〜５のいずれかに記載の癌バイオマーカー検出キット。
７．前記１〜６のいずれかに記載の癌バイオマーカー検出キットによる癌の診断方法。
８．ＨＳＰ４７と結合する抗体がヤギ種抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体とマウス種抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体であるＨＳＰ４７検出キット。
９．サンドイッチELISA法を用いた前記８記載のＨＳＰ４７検出キット。
１０．３０〜１００，０００ｎｇ／ｍｌの微量なＨＳＰ４７の定量が可能な前記８記載の検査キット。
１１．前記８記載の検査キットによる炎症性疾患または全身性及び／もしくは局部的な線維化疾患、悪性新生物または創傷治癒状態の診断方法。
１２．全身性及び／または局部的な線維化疾患が、膠原病、肺線維症、肝硬変である前記１１記載の診断方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、基礎的研究時に培養組織、細胞より逸脱するＨＳＰ４７を定量することが可能となる。また、臨床において血中のＨＳＰ４７濃度の上昇を測定することにより担癌状態のスクリーニング検査としての利用や、血中ＨＳＰ４７濃度の経時的変化を測定することにより癌治療の効果判定及び経過観察時の病状の指標、とくに再発の早期発見に応用できる。さらに炎症性疾患や創傷治癒、膠原病や肺線維症、肝硬変などの組織に線維化を呈する疾患においては、その線維形成の程度を知る指標とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態を具体的に説明する。
本発明は、感度や特異性が高く、簡便で非侵襲的に癌を診断できる癌バイオマーカー検出キットを提供する。ここで、癌バイオマーカーとは、単に癌であるかどうかの指標ばかりでなく、前癌状態、癌の進展、転移の指標を指し、抗癌剤を投与したときにその薬効の評価するための薬効マーカーとしての意義も含む。
【００１３】
本発明において検出可能な癌バイオマーカーは、具体的にはＨＳＰ４７である。ＨＳＰ４７は適用する動物種に固有のものであり、例えば、ヒトにおいては配列番号１、その他の動物（マウス）においては配列番号２のアミノ酸配列を有する。ゲノム配列はヒトにおいては第１１番染色体上に位置しており配列番号３を有する。
【００１４】
本発明の癌バイオマーカー検出キットは、ＨＳＰ４７と特異的に結合する分子を含む。ＨＳＰ４７と特異的に結合する分子は好ましくは抗ＨＳＰ４７抗体であり、本発明のキットは、具体的には、ウエスタンブロット法、酵素免疫測定吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)または免疫蛍光と組み合わせたバイオマーカー検出キットとして構成できる。中でも、酵素免疫測定吸着アッセイ(ELISA)による検出キットとして有用であり、以下、この態様について説明するが、他の手法による検出キットも慣用の技術を用いて同様に構成できる。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いることができる。
【００１５】
酵素免疫測定吸着アッセイ(ELISA)による検査キットは、ＨＳＰ４７に対する１次抗体と２次抗体を含む。また、２次抗体に対応する３次抗体を含んでもよい。さらに２次抗体の検出液その他のELISA法における慣用の試薬を含んでもよい。
【００１６】
１次抗体は好ましくは固相化抗体として不溶性担体に担持された状態で提供される。不溶性担体としては、マイクロプレート、プラスティックビーズ、ガラスビーズ、磁性微粒子等が挙げられる。１次抗体をこれらの不溶性担体に結合させる方法は、公知の化学的結合方法でもよいが物理的吸着方法で十分である。例えば、本発明の１次抗体を炭酸緩衝液やリン酸緩衝液等に溶解し、前記不溶性担体を加えて、０℃〜室温にて１時間以上放置した後、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン・ソルビタール・モノラウレート）、アジ化ナトリウム等を添加したＴｒｉｓ塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等により洗浄して未結合の抗体を除去して固相化担体を調製する。
【００１７】
２次抗体は、通常、酵素との結合体として提供される。２次抗体に結合させる酵素の例としては西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチン等が挙げられる。
なお、２次抗体に対応する３次抗体を用いる場合、３次抗体としては２次抗体に結合する抗体（例えば、２次抗体の動物種に対するＩｇＧ抗体）を用いることができる。この場合、前記酵素は３次抗体に結合させればよい。
【００１８】
本発明の検査キットでは、まず固相化抗体（１次抗体）と被験者から得た試料を接触させる。これによって抗原（ＨＳＰ４７）を捕捉させ、次いで試料液を廃棄し洗浄する。そこへ発色基質液を発色させる酵素をあらかじめ結合させた抗体酵素複合体（２次抗体）を加えると、再度抗原抗体反応がおこり、固相化抗体＋抗原＋抗体酵素複合体のサンドイッチ構造を構築する。２次抗体含有液を廃棄、洗浄し、未反応の酵素複合体（２次抗体）を全て除去した後、発色基質液を加え、発色に応じて試料の中の抗原の量を定量する。
【００１９】
１次抗体、２次抗体としては、ELISA法の一般的操作手順に従って、種々の動物種におけるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いることができる。抗原を免疫する動物は特に限定されず、抗体取得のために一般的に使用される動物が使用可能であるが、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、モルモット等の哺乳動物を用いるのが好適である。また、１次抗体と２次抗体の組み合わせはこれらの動物種によるモノクローナル抗体とポリクローナル抗体の各種の組み合わせが可能である。特に、ＨＳＰ４７を抗原とした場合、１次抗体をヤギ種抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体、２次抗体をマウス種抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体とする組み合わせが好ましい。かかる組み合わせを用いることにより、ＨＳＰ４７を高感度に検出することが可能となる。
【００２０】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体は慣用の方法により調製される。例えば、モノクローナル抗体はハイブリドーマから得ることができる。
ハイブリドーマを得るための抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球が使用される。抗原としては、例えば、被験者（例えば、ヒトやその他の動物）から分離・精製したＨＳＰ４７でもよいし、既知配列に基づいて合成したＨＳＰ４７でもよい。動物への抗原の投与は常法に従って行われる。例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと抗原との懸濁液もしくは乳化液を調製し、これを動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫する。免疫した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とをそれ自体公知の方法（G.Kohler et al .,Nature,256 495(1975)）により融合することにより、ハイブリドーマを作製することができる。
【００２１】
細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選抜にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地が常法により使用できる。
細胞融合により得られたハイブリドーマを限界希釈法等によりクローン化する。更に、その中でＨＳＰ４７を用いた酵素免疫測定法によりスクリーニングを行なうことで、ＨＳＰ４７に特異的に反応するモノクローナル抗体産生細胞株を得ることができる。
【００２２】
このようにして得られたハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。
【００２３】
これらのモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体は市販のものを用いてもよい。
癌組織のＨＳＰ４７の発現を確認するためには、モノクローナル抗体をを用いた免疫染色が可能である。ホルマリン固定、パラフィン包埋された手術検体の病理標本を使用し、ＨＳＰ４７の発現を既知の手技であるavidin-biotin-peroxydase colmplex （ＡＢＣ）法、Labeled StreptAvidin-Biotin（ＬＳＡＢ）法、デキストランポリマー法等にて免疫染色し、光学顕微鏡にて観察する事が可能である。１次抗体反応後に金コロイド標識した２次抗体を反応させ、グルタールアルデヒド及びオスミウムにて固定（post-embedding法）、標識銀増感液に浸漬（銀増感法）する事により電子顕微鏡による観察が可能である。
【００２４】
本発明の癌バイオマーカー検出キットは、癌治療の効果判定及び経過観察時の病状の指標等として利用可能であり、特にスキルス胃癌、大腸癌の指標として有用である。
ＨＳＰ４７を癌バイオマーカーとして用いた例はなく、本発明には、上に詳述したELISA法による方法のみならず、任意の手法によって被験者中のＨＳＰ４７量を測定する癌の診断方法が含まれる。ここで、診断とは、被験者が癌に罹患しているか否かや癌の進行度を含む各種の診断を含み、癌バイオマーカーであるＨＳＰ４７の経時的変化あるいは非罹患者から得た数値との比較、局在部位の特定等によって行うことができる。
【００２５】
また、本発明のＨＳＰ４７検出キット、特に１次抗体をヤギ種抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体、２次抗体をマウス種抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体としたキットは、高感度にＨＳＰ４７を検出可能であり、本発明は、従来にない高感度でのＨＳＰ４７検出キットを提供する。具体的には試料中３０〜１００，０００ｎｇ／ｍｌ程度のＨＳＰ４７検出キットとして有用である。
【００２６】
従って、本発明は、本発明のＨＳＰ４７検出キットを用いた癌以外の疾病、特に炎症性疾患または全身性及び／もしくは局部的な線維化疾患または創傷治癒状態の高感度な診断にも用いることができる。ここで、全身性及び／または局部的な線維化疾患の例としては、膠原病、肺線維症、肝硬変、悪性新生物の例としては、胃癌、大腸癌、食道癌、膵癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌等が挙げられる。その他、関節リウマチ、ケロイド等の診断、病態解析にも用いられると考えられる。
癌及びこれらの診断における試料は、慣用の方法により被験者から採取する。そのような試料の例としては、血液、血清、リンパ液、尿、組織液その他の体液及び組織が挙げられる。
【実施例】
【００２７】
以下に、実施例をあげて本発明について、更に詳細に説明を加えるが、以下の例は、本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。
固層化抗体（１次抗体）として、ヤギ種抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体（ N-17 Santa Cruz Biotecnology Co. USA ）を炭酸緩衝液で２００倍に希釈し、９６穴マルチウェルプレートに１００μｌずつ添加、４℃で１昼夜静置しプレート底面に付着させる。
リン酸緩衝液にてプレートを洗浄後、抗原物質として定量を行う培地もしくは血清１００μｌを添加し２時間抗原抗体反応を行わせる。洗浄後２次抗体としてマウス種抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体（ B-12 Santa Cruz Biotecnology Co. USA ）をリン酸緩衝液で１０００倍に希釈し２時間反応させた。ペルオキシダーゼ標識された抗マウスＩｇＧ抗体を３次抗体として使用し発色基質（TMB（3.3'-tetramethylbenndidine ,K-Blue-substrate）Cappel USA ）を反応させ、マイクロプレートリーダーにて吸光度を測定した。あらかじめ既知の濃度の合成ＨＳＰ４７を用いて吸光度曲線を作成しこれによりＨＳＰ４７の定量を行った。結果を図１に示す。既知の濃度の合成ＨＳＰ４７は、京都大学  再生医科研究所  永田  和宏教授により合成、供与されたものである。
【００２８】
実施例１
健常者１２名と術前胃癌患者（非スキルス胃癌７名、スキルス胃癌１４名）のＨＳＰ４７の血中濃度の比較では、健常者の血中濃度の平均値（標準偏差、ＳＤ）は９．７（９．７）ｎｇ／ｍｌ、非スキルス及びスキルス胃癌患者の血中濃度の平均値（最小値−最大値）は、各々１８．６（３０．２−１１．１）、３１．１（６６．８−１２．６）ｎｇ／ｍｌであった。ｃｕｔ  ｏｆｆ値を健常者の平均値＋２ＳＤとした際、各々陽性者は１４．３％、３５．７％であった。
【００２９】
実施例２
癌組織内にスキルス様の線維化を伴わない大腸癌患者３６名を対象にして、同様にＨＳＰ４７の血中濃度を測定した。免疫染色では癌細胞内にＨＳＰ４７の局在が示され、血中濃度の平均値（最小値−最大値）は７３．９（２７１．５−１０．９）ｎｇ／ｍｌであった。ｃｕｔ  ｏｆｆ値を健常者の平均値＋２ＳＤとした際、陽性者は９１．７％と高値であった。
【００３０】
実施例３
肝生検により病理組織学的に診断された慢性肝炎患者４３名、肝硬変患者３２名の血中濃度の平均値（最小値−最大値）は、２８．７（３００．９−０）、２１．１（２１９．３−０）であった。陽性者は各々７％、９．４％であった。
【００３１】
実施例４
肝細胞癌患者２０名を対象にして、同様にＨＳＰ４７の血中濃度を測定した。血中濃度の平均値（最小値−最大値）は１２.３（７０．５−０）ｎｇ／ｍｌであった。ｃｕｔ  ｏｆｆ値を健常者の平均値＋２ＳＤとした際、陽性者は１５．０％であった。
【００３２】
実施例１〜４で得たＨＳＰ４７の血中濃度の分布を図２に、その平均値、陽性率等の統計処理値を表１に示す。ここで、陽性率は前述のように病理組織学的に罹患が確認された割合である。
【００３３】
【表１】
2008122276.tif 000002
【００３４】
非スキルス胃癌、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌などでＨＳＰの血中濃度の上昇がみられるが、特に大腸癌、スキルス胃癌において数値変化が顕著に現れ、診断方法として有効であることが確認された。
【００３５】
実施例５
スキルス胃癌及び大腸癌患者における血中ＨＳＰ４７濃度を、従来から膠原病等のマーカーとして使用されているウサギ種抗ＨＳＰ４７抗体（Ｈ３００）とマウス種抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体（ＳＰＡ４７０）の組み合わせ、本発明のバイオマーカーとなるヤギ種抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体（Ｎ１７）とマウス種抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体（Ｇ１２）の組み合わせという２種類の１次−２次抗体組み合わせにおいて比較した（図３、４）。合成ＨＳＰ４７における反応は、ウサギ種抗ＨＳＰ４７抗体（Ｈ３００）とマウス種抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体（ＳＰＡ４７０）の組み合わせの方がヤギ種抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体（Ｎ１７）とマウス種抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体（Ｇ１２）の組み合わせよりＨＳＰ４７を感度よく測定していることがわかる（図１）。しかし、実際の患者血清においては本発明の抗体の組み合わせであるＮ１７−Ｇ１２の組み合わせの方がＨ３００−ＳＰＡ４７０より高感度であり抗体の組み合わせが血中濃度測定に重要であることが分かる。
【００３６】
実施例６
スキルス胃癌患者の術後状態とＨＳＰ４７の経時変化では、画像評価や既存の腫瘍マーカーでは検知しづらい病状変化を鋭敏に検出し得た。術後の経時変化を表すＣＴ画像を図５（Ａ）〜（Ｃ）に、ＨＳＰ４７とバイオマーカーとして知られるＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４の血中濃度の経時変化比較を表２に示す。術前のＣＴ画像（図５（Ａ））では前庭部小彎に胃壁の肥厚硬化を認めるが、術後６ヶ月のＣＴ画像（図５（Ｂ））では明らかな再発所見はない。術後１年後のＣＴ画像（図５（Ｃ））で脾門部に類円形の腫瘤及び、腹水の少量貯留が認められる。手術後１年目にやっと画像上再発所見を得られた症例で、ＨＳＰ４７の血中濃度はより早期段階から上昇しており、診断方法として有効であることがわかる。
【００３７】
【表２】
2008122276.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の特異的かつ高感度な分子の測定方法の決定は、対象患者の一層細やかな病状把握を可能とし有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ヤギ種抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体とマウス種抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体（N17-G12）、ウサギ種抗ＨＳＰ４７抗体とマウス種抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体（H300-SPA470）の吸光度曲線の比較。
【図２】各疾患のにおける血中ＨＳＰ４７の定量結果
【図３】胃癌患者の血中ＨＳＰ４７の定量におけるN17-G12とH300-SPA470の比較。
【図４】大腸癌患者の血中ＨＳＰ４７の定量におけるN17-G12とH300-SPA470の比較。
【図５】スキルス胃癌患者のＨＳＰ４７の（Ａ）術前、（Ｂ）術後６ヶ月、（Ｃ）術後１年の経時的変化（ＣＴ画像）。
【図６】正常部（Ａ）とスキルス胃癌組織（Ｂ）の抗ＨＳＰ４７抗体による免疫染色像。
【図７】スキルス胃癌組織の抗ＨＳＰ４７抗体による免疫電子顕微鏡像。
【図１】
2008122276.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
2008122276.tif 000007
【図５】
2008122276.tif 000008
【図６】
2008122276.tif 000009
【図７】
2008122276.tif 000010
【配列表】
2008122276000001.app