(57)【要約】      （修正有）【課題】短日条件下で開花時期が遅延し、開花時期以外の形質においては野生株と実質的に同等の形質を有する短日植物を安定して得ること。【解決手段】（１）（ａ）特定なアミノ酸配列または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるＨｄ１タンパク質をコードするＤＮＡ；および（２）ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、短日条件下で短日植物の開花を遅延させるためのＤＮＡ発現カセット。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）（ａ）配列表の配列番号：１のアミノ酸配列からなるタンパク質または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、短日条件下で短日植物の開花を遅延させる作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；および
（２）１個以上のアミノ酸からなるペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、短日条件下で短日植物の開花を遅延させるためのＤＮＡ発現カセット。
【請求項２】
（１）のＤＮＡが、配列番号：２の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号：２の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、短日条件下で短日植物の開花を遅延させる作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、または、配列番号：２の塩基配列を有するＤＮＡに対して８５％以上の相同性を有し、かつ、短日条件下で短日植物の開花を遅延させる作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡである請求項１記載のＤＮＡ発現カセット。
【請求項３】
（２）のＤＮＡがタンデム・アフィニティー・プリフィケーション（tandem affinity purification、ＴＡＰ）タグをコードするＤＮＡである請求項１または２記載のＤＮＡ発現カセット。
【請求項４】
（２）のＤＮＡが配列番号：３の塩基配列を有する請求項３記載のＤＮＡ発現カセット。
【請求項５】
配列番号：４または５で示される塩基配列を有する請求項４記載のＤＮＡ発現カセット。
【請求項６】
短日植物がイネ、キク、アサガオ、コスモス、ダイズ、オナモミ、ポインセチア、トウモロコシおよびオオムギよりなる群から選択される請求項１ないし５のいずれか１項に記載のＤＮＡ発現カセット。
【請求項７】
（１）のＤＮＡのｍＲＮＡへの転写および／またはタンパク質への翻訳を抑制することなく、短日条件下で短日植物の開花を遅延させる請求項１ないし６のいずれか１項に記載のＤＮＡ発現カセット。
【請求項８】
長日条件下で短日植物の開花を遅延させることなく、短日条件下で短日植物の開花を遅延させる請求項１ないし７のいずれか１項に記載のＤＮＡ発現カセット。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のＤＮＡ発現カセットを含むベクター。
【請求項１０】
さらに、作動可能なプロモーター、ターミネーター、エンハンサーおよび／または薬剤耐性マーカー遺伝子を含む請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
プロモーターが、トウモロコシ・ユビキチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス  ３５Ｓプロモーター、アグロバクテリウムＴｉプラスミド由来ノパリンシンターゼプロモーターおよびアクチンプロモーターよりなる群から選択される請求項１０記載のベクター。
【請求項１２】
ターミネーターが、ノパリンシンターゼターミネーター、オクトピンシンターゼターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス  ３５ＳターミネーターおよびタバコＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターよりなる群から選択される請求項１０または１１記載のベクター。
【請求項１３】
請求項９ないし１２のいずれか１項に記載のベクターで形質転換した植物。
【請求項１４】
植物がイネ、キク、アサガオ、コスモス、ダイズ、オナモミ、ポインセチア、トウモロコシおよびオオムギよりなる群から選択される請求項１３記載の植物。
【請求項１５】
植物細胞、プロトプラスト、植物カルス、植物器官、植物組織または植物体である請求項１３または１４記載の植物。
【請求項１６】
請求項１３ないし１５のいずれか１項に記載の植物により産生されるＨｄ１−ＴＡＰ融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１３ないし１５のいずれか１項に記載の植物から得られる種子。
【請求項１８】
請求項９ないし１２のいずれか１項に記載のベクターで短日植物の細胞を形質転換し、該形質転換細胞から植物体を再生させることを含む、短日条件下で開花が遅延する短日植物の作製方法。
【請求項１９】
請求項９ないし１２のいずれか１項に記載のベクターで短日植物の細胞を形質転換し、該形質転換細胞を短日条件下で再生および栽培することを特徴とする短日植物の開花を遅延させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、短日条件下で短日植物の開花を遅延させる遺伝子、該遺伝子で形質転換した植物および該遺伝子を用いて短日植物の開花時期を人為的に遅延させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
開花は、繁殖に極めて深く関与するため、植物の生活環において重要な事象である。長日植物であるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の分子遺伝学的解析の研究により、概日リズム、光同調および光周性に関連する多くの遺伝子が近年同定されている。そして、Ｍｙｂ−様の転写因子をコードする"LATE ELONGATED HYPOCOTYL（ＬＨＹ）"および"CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（ＣＣＡ１）"を過剰発現させると遅い開花を生じることが（非特許文献１および２）、"EARLY FLOWERING 3（ＥＬＦ３）"および"GIGANTEA（ＧＩ）"は機能不明の核タンパク質をコードしていることが判明している。前者における突然変異は早期の開花を生じるが、後者における突然変異は開花を遅延させる（非特許文献３−５）。これらの概日時計関連遺伝子の発現は相互に関連しているため、それらの遺伝子経路はほとんど同定されていない。"CONSTANS（ＣＯ）"の発現レベルは、ＧＩ、ＬＨＹおよびＥＬＦ３の突然変異体において変化していることが記録されている。これらの概日時計遺伝子はＣＯ発現レベルが夜中にピークに達することを誘導すると考えられ、ＣＯ発現の時期のシフトは光周性開花の引き金として作用し、長日条件下で開花へ移行させるための遺伝子である"FLOWERING LOCUS T（ＦＴ）"および"SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1（ＳＯＣ１）"の発現を誘導すると考えられている（非特許文献６−１０）。ＣＯタンパク質はアミノ末端に向かうＧＡＴＡ転写因子のジンクフィンガーに類似するタンパク質の２の領域と、核内局在化およびカルボキシ末端付近におけるタンパク質−タンパク質相互作用に必要なＣＣＴ（ＣＯ、ＣＯ−様、ＴＯＣ１）ドメインとを含んでいる。一方、ＦＴ転写の活性化は、概日リズムによって制御されるＣＯ  ｍＲＮＡの合成量と長日条件下で光によって制御される転写後調節に依存することが提唱されている。
【０００３】
一方、短日植物であるイネ（Oryza sativa）の分子遺伝学的解析により、"PHOTOPERIOD SENSITIVITY 5（Ｓｅ５）"、"Heading-date 1（Ｈｄ１）"、"Heading-date 3a（Ｈｄ３ａ）"およびＯｓＧＩのような、シロイヌナズナ遺伝子の幾つかのオーソログが光周性開花に関与していることが明らかにされている（非特許文献１１−１４）。その中で、Ｈｄ１およびＨｄ３ａは、イネ品種間の異なる開花時期に寄与している量的形質遺伝子座として単離されたものであり、各々、シロイヌナズナにおけるＣＯおよびＦＴの相同性タンパク質をコードし（非特許文献１２および１３）、Ｓｅ５はフィトクロム発色団を生合成するヘムオキシゲナーゼであるＨＹ１に類似するタンパク質をコードしていることが判明している。このＳｅ５における突然変異は連続光および長日条件下ならびに短日条件下で顕著に早期の開花を引き起こし、光周性開花応答は示さない（非特許文献１１）。シロイヌナズナＧＩのイネ・オーソログであるＯｓＧＩは、ディファレンシャル・ディスプレイ法によって、Ｓｅ５突然変異体において発現が抑制された遺伝子として単離されたものである（非特許文献１４）。これらの研究から、ＯｓＧＩはシロイヌナズナに類似する様式を介してＨｄ１の発現を仲介して開花を制御するが、Ｈｄ１はそれとは異にしてＨｄ３ａの発現を仲介していることが仮定される。顕著に早期の開花と共に存在するＨｄ３ａを過剰発現するトランスジェニック・イネ植物体は、Ｈｄ３ａがシロイヌナズナにおけるＦＴとまさに同じくイネにおいて開花プロモーターとして作用することを示した（非特許文献１３）。しかし、シロイヌナズナにおけるＦＴとは反対に、Ｈｄ３ａのｍＲＮＡは短日条件下でのみ蓄積し、Ｈｄ３ａとＦＴの発現は異なる様式で調節されることが示されていた（非特許文献１５および１６）。
【０００４】
このような状況の下、Ｈｄ１（Ｅｈｄ１）遺伝子が単離され、これは植物の開花を促進する機能を有するタンパク質をコードすることが示されている（特許文献１）。そして、特許文献１に記載された発明では、Ｈｄ１遺伝子は、それ自体で植物の開花の促進に寄与し、そのアンチセンスｍＲＮＡ等を用いてＨｄ１遺伝子の機能を低下させた場合には、開花時期を遅延することができると記載されている。
【特許文献１】特開２００３−３３９３８２公報
【非特許文献１】Wang, Z. Y. and Tobin, E. M. (1998) Cell 93, 1207-17.
【非特許文献２】Green, R. M. and Tobin, E. M. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4176-9.
【非特許文献３】Fowler, S., Lee, K., Onouchi, H., Samach, A., Richardson, K., Morris, B., Coupland G., and Putterill J. (1999) EMBO J. 18, 4679-88.
【非特許文献４】Huq, E., Tepperman, J. M., and Quail, P. H. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 9789-94.
【非特許文献５】Hicks, K. A., Albertson, T. M., and Wagner, D. R. (2001) Plant Cell 13, 1281-92.
【非特許文献６】Kardailsky, I., Shukla, V. K., Ahn, J. H., Dagenais, N., Christensen, S. K., Nguyen, J. T., Chory, J., Harrison, M. J., and Weigel, D. (1999) Science 286, 1962-5.
【非特許文献７】Kobayashi, Y., Kaya, H., Goto, K., Iwabuchi, M., and Araki, T. (1999) Science 286, 1960-2.
【非特許文献８】Ledger, S., Strayer, C., Ashton, F., Kay, S. A., and Putterill, J. (2001) Plant J. 26, 15-22.
【非特許文献９】Suarez-Lopez, P., Wheatley, K., Robson, F., Onouchi, H., Valverde, F., and Coupland, G. (2001) Nature 410, 1116-20.
【非特許文献１０】Araki, T. (2001) Curr. Opin. Plant Biol. 4, 63-8.
【非特許文献１１】Izawa, T., Oikawa, T., Tokutomi, S., Okuno, K., and Shimamoto, K. (2000) Plant J. 22, 391-9.
【非特許文献１２】Yano, M., Katayose, Y., Ashikari, M., Yamanouchi, U., Monna, L., Fuse, T., Baba, T., Yamamoto, K., Umehara, Y., Nagamura, Y., and Sasaki, T. (2000) Plant Cell 12, 2473-84.
【非特許文献１３】Kojima, S., Takahashi, Y., Kobayashi, Y., Monna, L., Sasaki, T., Araki, T., and Yano, M. (2002) Plant Cell. Physiol. 43, 1096-105.
【非特許文献１４】Hayama, R., Izawa, T., and Shimamoto, K. (2002) Plant Cell. Physiol. 43, 494-504.
【非特許文献１５】Hayama, R., Yokoi, S., Tamaki, S., Yano, M., and Shimamoto, K. (2003) Nature 422, 719-22.
【非特許文献１６】Hayama, R. and Coupland, G. (2004) Plant Physiol. 135(2), 677-84.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、本発明者らが、単離したＨｄ１遺伝子を単独で導入したトランスジェニック植物体を作製して検討したところ、野生型（非トランスジェニック）植物体と比較して、Ｈｄ１遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルやタンパク質への翻訳レベルで多少の変化が認められるものの、開花時期は促進も遅延もしないことが明らかになった。したがって、Ｈｄ１遺伝子に関連する改変により開花時期が変化した植物体を得る手段が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、開花時期が変化した植物体を得るべく鋭意検討した結果、驚くべきことには、Ｈｄ１遺伝子にある種のペプチドをコードするヌクレオチド配列を融合して短日植物に導入するとその短日植物の開花時期が短日条件下で遅延することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］（１）（ａ）配列表の配列番号：１のアミノ酸配列からなるタンパク質または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、短日条件下で短日植物の開花を遅延させる作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；および
（２）１個以上のアミノ酸からなるペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、短日条件下で短日植物の開花を遅延させるためのＤＮＡ発現カセット；
［２］（１）のＤＮＡが、配列番号：２の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号：２の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、短日条件下で短日植物の開花を遅延させる作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、または、配列番号：２の塩基配列を有するＤＮＡに対して８５％以上の相同性を有し、かつ、短日条件下で短日植物の開花を遅延させる作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡである［１］記載のＤＮＡ発現カセット；
［３］（２）のＤＮＡがタンデム・アフィニティー・プリフィケーション（tandem affinity purification、ＴＡＰ）タグをコードするＤＮＡである［１］または［２］記載のＤＮＡ発現カセット；
［４］（２）のＤＮＡが配列番号：３の塩基配列を有する［３］記載のＤＮＡ発現カセット；
［５］配列番号：４または５で示される塩基配列を有する［４］記載のＤＮＡ発現カセット；
［６］短日植物がイネ、キク、アサガオ、コスモス、ダイズ、オナモミ、ポインセチア、トウモロコシおよびオオムギよりなる群から選択される［１］ないし［５］のいずれか１に記載のＤＮＡ発現カセット；
［７］（１）のＤＮＡのｍＲＮＡへの転写および／またはタンパク質への翻訳を抑制することなく、短日条件下で短日植物の開花を遅延させる［１］ないし［６］のいずれか１に記載のＤＮＡ発現カセット；
［８］長日条件下で短日植物の開花を遅延させることなく、短日条件下で短日植物の開花を遅延させる［１］ないし［７］のいずれか１に記載のＤＮＡ発現カセット；
［９］［１］ないし［８］のいずれか１に記載のＤＮＡ発現カセットを含むベクター；
［１０］さらに、作動可能なプロモーター、ターミネーター、エンハンサーおよび／または薬剤耐性マーカー遺伝子を含む［９］記載のベクター；
［１１］プロモーターが、トウモロコシ・ユビキチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス  ３５Ｓプロモーター、アグロバクテリウムＴｉプラスミド由来ノパリンシンターゼプロモーターおよびアクチンプロモーターよりなる群から選択される［１０］記載のベクター；
［１２］ターミネーターが、ノパリンシンターゼターミネーター、オクトピンシンターゼターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス  ３５ＳターミネーターおよびタバコＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターよりなる群から選択される［１０］または［１１］記載のベクター；
［１３］［９］ないし［１２］のいずれか１に記載のベクターで形質転換した植物；
［１４］植物がイネ、キク、アサガオ、コスモス、ダイズ、オナモミ、ポインセチア、トウモロコシおよびオオムギよりなる群から選択される［１３］記載の植物；
［１５］植物細胞、プロトプラスト、植物カルス、植物器官、植物組織または植物体である［１３］または［１４］記載の植物；
［１６］［１３］ないし［１５］のいずれか１に記載の植物により産生されるＨｄ１−ＴＡＰ融合タンパク質；
［１７］［１３］ないし［１５］のいずれか１に記載の植物から得られる種子；
［１８］［９］ないし［１２］のいずれか１に記載のベクターで短日植物の細胞を形質転換し、該形質転換細胞から植物体を再生させることを含む、短日条件下で開花が遅延する短日植物の作製方法；
［１９］［９］ないし［１２］のいずれか１に記載のベクターで短日植物の細胞を形質転換し、該形質転換細胞を短日条件下で再生および栽培することを特徴とする短日植物の開花を遅延させる方法
を提供する。
【０００８】
本願の特許請求の範囲および明細書中で単に「植物」という場合は、植物の細胞、プロトプラストないしカルス、植物器官（例えば、根、茎、葉、花弁、胚、胚乳、子房、茎頂、葯、花粉、種子、実など）、植物組織（表皮、師部、柔組織、木部、維管束など）および植物体などの植物がとり得るすべての形態を含むことを意味する。
【０００９】
本願の特許請求の範囲および明細書中で「１ないし数個のアミノ酸」という場合は、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１３個、さらに好ましくは１〜１０個、よりさらに好ましくは１〜７個、なおよりさらに好ましくは１〜５個のアミノ酸を意味する。
【００１０】
本願の特許請求の範囲および明細書中で用いる「短日条件」とは、１日当たりの日照時間または恒温チャンバー等で栽培する場合には１日当たりの照明時間が約１２時間以下であることを意味する。
恒温チャンバー等で人工栽培する際は、一般に照明時の温度は約３０℃、非照明時の温度は約２５℃である。また、照明の強度は約１００〜５００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１（波長４００−７５０ｎｍ）、好ましくは約１２０〜４００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１（波長４００−７５０ｎｍ）であり、さらに好ましくは約１５０〜３７０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１（波長４００−７５０ｎｍ）であり、よりさらに好ましくは約２５０〜３５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１（波長４００−７５０ｎｍ）である。
【００１１】
また、本願の特許請求の範囲および明細書中で用いる「長日条件」とは、日照時間または照明時間が約１２時間を超える以外は上記と同じ条件を意味する。
【００１２】
本願の特許請求の範囲および明細書中で用いる「開花を（が）遅延させる（する）」とは、同一の短日条件下において栽培した非トランスジェニック対照植物体（野生株）に対して、通常約７日以上、好ましくは約１０日以上、さらに好ましくは約１４日以上、最も好ましくは約２０日以上、トランスジェニック植物体の開花を（が）遅れさせる（遅れる）ことを意味する。一方、「開花を（が）遅延させる（する）ことなく」とは、同一の短日条件下において栽培した非トランスジェニック対照植物体（野生株）と実質的に同じ開花時期となることを意味し、ここに「実質的に同じ開花時期」とは同じ品種の個体間における開花時期の変動誤差の範囲内にあることを意味する。
【００１３】
本願の特許請求の範囲および明細書中で用いる「ストリンジェントな条件」とは、ある塩基配列に対して高い相同性を有する他の核酸配列が特異的にハイブリダイズすることができる条件を意味し、このような条件下であれば特に限定されるものではないが、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc. (1995), セクション２、４および６に見出すことができる。さらなるストリンジェントな条件は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら、Cold Spring Harbor Press (1989), 第７、９および１１章に記載されている。
【００１４】
本発明において好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約４２℃にて約４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション（または約４２℃にて約４×ＳＳＣおよび約５０％ホルムアミド中のハイブリダイゼーション）につづく、約４２℃にて約２×ＳＳＣ中の１回以上の洗浄が挙げられる。
【００１５】
また、本発明において好ましいよりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約６５℃にて４×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション（または約６５℃にて約４×ＳＳＣおよび約５０％ホルムアミド中のハイブリダイゼーション）につづく、約６５℃にて約２×ＳＳＣ中の１回以上の洗浄が挙げられる。
【００１６】
また、本発明において好ましいよりさらにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約４２℃にて約０.５〜２×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション（または約４２℃にて約０.５〜２×ＳＳＣおよび約５０％ホルムアミド中のハイブリダイゼーション）につづく、約４２℃にて約０.５〜２×ＳＳＣ中の１回以上の洗浄が挙げられる。
【００１７】
また、本発明において好ましい最もストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約６５℃にて約０.５〜２×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション（または約６５℃にて約０.５〜２×ＳＳＣおよび約５０％ホルムアミド中のハイブリダイゼーション）につづく、約６５℃にて約０.５〜２×ＳＳＣ中の１回以上の洗浄が挙げられる。
【００１８】
さらなる試薬をハイブリダイゼーションおよび／または洗浄緩衝液に添加してメンブレン、例えばニトロセルロースまたはナイロン・メンブレンに対する核酸分子の非特異的なハイブリダイゼーションを減少させることができることも当該技術分野において周知であり、これには例えばブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）またはサケもしくはニシンのキャリアーＤＮＡ）、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、短日条件下で開花時期が遅延し、開花時期以外の形質においては野生株と実質的に同等の形質を有する植物を安定して得ることができる。植物の開花時期を遅延させることができれば、地域間における日照時間差の影響を調整できるため植物の栽培地域の融通性を広げることができ、また、長期間にわたって開花段階の状態の植物を供給することができる。さらに、開花によって成長が停止する植物種においては、開花時期を遅延させることによってより高い成長段階の植物体を得ることができる。
【００２０】
なお、前述の特許文献１には、本発明のＨｄ１遺伝子に相当するＥｈｄ１(Ｈｄ１)遺伝子が植物（イネ）の開花（出穂）を促進すると記載されており、その遺伝子の発現をｍＲＮＡへの転写段階またはタンパク質への翻訳段階で抑制する公知の技術によって植物の開花時期を遅延させることができると記載されている。
【００２１】
これに対し、本発明は、Ｈｄ１タンパク質を他のペプチドとの融合タンパクとして発現させることにより、短日条件下で短日植物の開花が遅延することを見出し、他の形質においては野生株と実質的に同等の形質を有しつつ、かかる効果を奏する植物を得たものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明におけるＨｄ１タンパク質をコードするＤＮＡは、好ましくは配列番号：１のアミノ酸配列からなるタンパク質、またはそのアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、短日条件下で短日植物の開花を遅延させる作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。また、より好ましくは、配列番号：２の塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：２の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、短日条件下で短日植物の開花を遅延させる作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。ここで、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは前述の定義と同じである。
【００２３】
また、Ｈｄ１タンパク質をコードするＤＮＡには、配列番号：２の塩基配列を有するＤＮＡに対して、少なくとも８５％以上、好ましくは８７％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、なおよりさらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡも含まれる。
【００２４】
本発明のＨｄ１タンパク質をコードするＤＮＡの起源植物としては、例えば、イネ（Oryza sativa）、キク（Dendranthema morifolium）、アサガオ（Ipomoea nil）、コスモス（Cosmos bipinnatus）、ダイズ（Glycine max）、オナモミ（Xanthium strumarium）、ポインセチア（Euphorbia pulcherrima）、トウモロコシ（Zea mays）、オオムギ（Hordeum vulgare）などが挙げられる。
【００２５】
Ｈｄ１タンパク質をコードするＤＮＡは、上述のＨｄ１遺伝子を有する植物のゲノムから当該技術分野で周知慣用されている技術を用いて得ることができる。ここで、かかる周知慣用技術としては、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ゲノミックＰＣＲ、またはＨｄ１ホモログをプローブとしたｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリーのスクリーニングなどが挙げられる。
例えば、一般的にＨｄ１遺伝子を有する植物、例えばイネ品種農林８号の生体細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、逆転写によって調製したｃＤＮＡを鋳型とし、植物固有のＨｄ１遺伝子に対応するプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅する方法が挙げられる。この際用いるプライマーとしては、例えば以下のプライマーを挙げることができる。
Ｆｗプライマー：5'-CACCGGGATT GGATCCATG-3'（配列番号：６）
（ｐＥＮＴＲ用のCACC配列を付加している）
Ｒｖプライマー：5'-GAACCATGGA ACAGTACCA-3'（配列番号：７）
（Ｃ末端のＴＡＰ付加用に終止コドンを削除している）
【００２６】
本発明における１個以上のアミノ酸からなるペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡは、Ｈｄ１タンパク質との融合タンパク質として植物内で発現させた場合に、実質的に短日条件下にて開花を遅延させる以外の影響を及ぼさず、形態的に安定した形質転換植物体が得られるものであれば限定されるものではないが、好ましくは鎖長として１〜約１０００残基、より好ましくは約５０〜５００残基、さらに好ましくは約１００〜３００残基のペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡが好ましく、例えば、種々のフラグメントを含むタンデム・アフィニティー・ピュリフィケーション・タグ（tandem affinity purification tag、以下「ＴＡＰタグ」という）、Ｆｌａｇ  ｔａｇ、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇ、ＧＳＴ  ｔａｇまたはそれらの断片などをコードするＤＮＡが挙げられる。これらのペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡは、天然に存在するものであっても、その一部分を遺伝子工学的技術により改変したものであっても、あるいは全体を人工的に作製したものであってもよい。
とりわけ、５’側より、カルモジュリン結合ペプチド、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位および黄色ブドウ球菌のプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインからなるＴＡＰタグをコードするＤＮＡなどが好ましい（配列番号：３）（Invitrogen社および島根大学総合科学研究支援センター遺伝子機能解析分野  中川強博士の共同開発、中川博士より分与いただいた）。これらのＤＮＡは、当該技術分野における周知慣用技術を用いて調製することができる。
【００２７】
本発明のＤＮＡ発現カセットは、上述のＨｄ１タンパク質をコードするＤＮＡおよび１個以上のアミノ酸からなるペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡを作動可能に連結することにより作製することができ、本発明のＤＮＡ発現カセットにおけるＨｄ１タンパク質をコードするＤＮＡおよびペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡの位置は、両方が融合タンパク質として発現されて本発明の効果が奏される限り特に限定されず、５’側よりＨｄ１タンパク質をコードするＤＮＡおよびペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡがこの順序で作動可能に連結されていても、５’側よりペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡおよびＨｄ１タンパク質をコードするＤＮＡがこの順序で作動可能に連結されていてもよい。また、Ｈｄ１タンパク質をコードするＤＮＡおよびペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡの間、または両方もしくは一方の端部にはリンカーが含まれていてもよい。好ましくは、５'側よりＨｄ１タンパク質をコードするＤＮＡおよびペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡがこの順序で作動可能に連結されたＤＮＡ発現カセットである。
【００２８】
本発明のベクターは、上述の本発明のＤＮＡ発現カセットを適当なベクターに挿入することによって作製できる。この挿入用の適当なベクターとしては、本発明のＤＮＡ発現カセットを目的とする植物に導入することができ、かつ、その植物内で作動可能なものであれば特に限定されるものではなく、例えば、ｐＢＩ、ｐＴＲＡ、ｐＵＣシリーズなどのプラスミドベクター、タバコモザイクウイルス等の植物ウイルスベクターなどが挙げられる。
【００２９】
このベクターには、上述したＤＮＡ発現カセットのほか、そのＤＮＡ発現カセットの５'側、内部または３'側に、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、薬剤耐性マーカー遺伝子などの植物内で目的の遺伝子を有効に発現させるため、または遺伝子組換え操作を簡便に行うための種々の因子を含ませることができる。
プロモーターとしては、本発明のＤＮＡ発現カセットの転写を開始するものであれば限定されるものではないが、例えば、トウモロコシ・ユビキチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス  ３５Ｓプロモーター、アグロバクテリウムＴｉプラスミド由来ノパリンシンターゼプロモーター、イネ由来アクチンプロモーターなどが挙げられる。
【００３０】
また、ターミネーターとしては、本発明のＤＮＡ発現カセットの転写効率を向上し得るものであれば限定されるものではないが、例えば、ノパリンシンターゼターミネーター、オクトピンシンターゼターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス  ３５Ｓターミネーター、タバコＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターなどが挙げられる。
【００３１】
また、エンハンサーとしては、上述のプロモーターからの転写効率を高め得るものであれば限定されるものではないが、例えば、カリフラワーモザイクウイルス  ３５Ｓプロモーター内の５'側の配列を含むエンハンサー領域などが挙げられる。
【００３２】
薬剤耐性マーカー遺伝子としては、組換えベクターが導入された植物の選抜を容易にし得るものであれば限定されるものではないが、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（カナマイシン耐性を付与）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ハイグロマイシン耐性を付与）、ｂａｒ遺伝子（ビアラホス耐性）、ｂｒｓ遺伝子（ブラストサイジンＳ耐性を付与）、変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子（除草剤ビスピリバック耐性を付与）などが挙げられる。
【００３３】
本発明のベクターを導入して、短日条件下で開花時期を遅延させる短日植物としては、イネ（Oryza sativa）、キク（Dendranthema morifolium）、アサガオ（Ipomoea nil）、コスモス（Cosmos bipinnatus）、ダイズ（Glycine max）、オナモミ（Xanthium strumarium）、ポインセチア（Euphorbia pulcherrima）、トウモロコシ（Zea mays）、オオムギ（Hordeum vulgare）などが挙げられ、これらの植物の細胞、プロトプラスト、カルス、植物器官、植物組織に本発明のベクターを導入することができる。細胞、プロトプラスト、カルスにベクターを導入する場合は、それから分化・再生させてトランスジェニック植物体を作製することができ、植物体の開花時期を遅延させることができる。一般的に、植物の細胞、プロトプラスト、カルスにベクターを導入する方法としては、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド法、ウイルスベクター法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられ、植物細胞、カルス、植物器官または植物組織にベクターを導入する方法としては、パーティクルガン法、イン・プランタ法などが挙げられる。
【００３４】
本発明のベクターは、好ましくは植物細胞ないしカルスに導入し、導入細胞ないしカルスは当該技術分野における周知慣用技術に従って分化・再生させることができ、分化・再生したトランスジェニック植物体は発芽から開花までの期間にわたり短日条件下で生育することによりその開花を遅延させることができ、本発明はかかるトランスジェニック植物体の作製方法および短日植物の開花を遅延させる方法も提供する。
【００３５】
また、本発明のＤＮＡ発現カセットが生殖細胞に導入された場合には、かかるトランスジェニック植物体から得られる種子も同様の形質を有する植物体に生育する。したがって、本発明はかかるトランスジェニック植物体から得られる種子も提供する。
【００３６】
ベクターを導入したカルスやそれから再生したトランスジェニック植物体またはトランスジェニック植物体から得られた種子などの植物においてＨｄ１−ポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡがｍＲＮＡに転写され、またはタンパク質に翻訳されているかは、ＲＴ−ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロッティング法などの当該技術分野における周知慣用技術により調べることができる。
【００３７】
例えば、ウェスタンブロッティング法によれば、一定の段階まで成長した形質転換植物体の葉身などの器官から、Liuら, Plant Cell, 13, 1293-304 (2001)に記載されている方法などによって核抽出物を得る。その核抽出物を緩衝液に懸濁し、そこからＳｔｒａｔａｃｌｅａｎ（登録商標）樹脂などを用いてＤＮＡを沈澱させ、それをポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける。泳動後、抗−Ｈｄ１タンパク質抗体または抗−ＴＡＰ抗体（Open Biosystems社製）および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗−ウサギＩｇＧ抗体などを用いて融合タンパク質バンドを視覚化する。例えば、ＥＣＬ ｐｌｕｓ検出キット（Amersham社製)によって発光させて、Ｈｄ１−ＴＡＰ融合タンパク質の産生を検出することができる。
本発明は、これらトランスジェニック植物によって産生されるＨｄ１−ＴＡＰ融合タンパク質も提供する。
【実施例】
【００３８】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、これは説明することを意図するものであって、いかなる場合においても本発明がそれに限定されることを意図するものではない。
シロイヌナズナおよびイネにおける開花の光周期制御の分子メカニズムが極めて一致することが以前に示されている。しかし、このように分子メカニズムが類似するにもかかわらず、どのようにして光周期に対する反対の応答が起きるのかはいまだ明らかにされていない。以前の実験では、Ｈｄ３ａ遺伝子の光周期依存的な調整はＨｄ１遺伝子によって仲介されており、２つの植物でのＨｄ１の機能は相反するということが提唱された；すなわち、シロイヌナズナにおいては長日条件下でＣＯがＦＴの発現を誘導し、一方イネにおいては短日条件下においてＨｄ１がＨｄ３ａの発現を促進し、長日条件下ではＨｄ１がＨｄ３ａの発現を抑制することが提唱された。
【００３９】
イネにおける光周期開花におけるＨｄ１の役割をさらに理解するために、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターまたはトウモロコシ・ユビキチンプロモーター下流でＨｄ１タンパク質のＣ末端側またはＮ末端側にＴＡＰタグが融合して発現するトランスジェニック・イネ植物体（Ｕ１Ｃ、Ｓ１ＣおよびＳ１Ｎ）、ならびに、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター下流でＨｄ１タンパク質を単独で発現するトランスジェニック・イネ植物体（Ｓ１）を作製した。
【００４０】
イネ植物体からのＨｄ１遺伝子のクローニング
イネ品種農林８号からＨｄ１タンパク質をコードするＤＮＡの調製は、以下のようにＧＴＣ法によってｔｏｔａｌ  ｍＲＮＡを取得した後、ｃＤＮＡからプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって行った。
３０−４０日齢のイネ農林８号の葉身約１００ｍｇを２ｍｌ容量のチューブに入れ、液体窒素で凍結した。凍結した試料にステンレスビーズを入れ、マルチビーズショッカーを用いて試料を破砕した。それに６００μｌの抽出緩衝液（４.２Ｍのグアニジンチオシアネート、０.５％のＮ−サルコシン酸ナトリウム、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０.１％のＡｎｔｉｆｏａｍ Ａ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ（登録商標）（Sigma-Aldrich社製）、１滴のβ−メルカプトエタノール）を加えて混和し、１２０００ｒｐｍ、室温にて５分間遠心した。上清を新しいチューブに移し、３Ｍの酢酸ナトリウム６０μｌを加えて混和した。さらに、６００μｌのフェノール／クロロホルム（１：１）を加えてボルテックス攪拌した後、１５０００ｒｐｍ、室温にて５分間遠心した。生じた水層を新しいチューブに移した。この遠心分離により生じた水層を分離する作業を３回繰り返して得た水層に２.５倍量の９９.９％エタノールを加え、転倒混和した。さらに１５０００ｒｐｍ、４℃にて２０分間遠心分離し、得られた沈澱に４００μｌの滅菌水を加えて溶解し、沈澱の溶解後に１０Ｍの塩化リチウム１０μｌを加え、転倒混和した。溶液は氷中に３０分間以上静置した後に１５０００ｒｐｍ、４℃にて２０分間遠心分離した。得られた沈澱を７０％エタノールでリンスした後、乾燥させた。沈澱に５０μｌの滅菌水を加えて溶解し、農林８号のｔｏｔａｌ  ｍＲＮＡを調製した。
【００４１】
つぎに、１μｇのｔｏｔａｌ  ｍＲＮＡを、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）キット（Invitrogen社製）を用いて１本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。１μｇのこのｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いてＨｄ１タンパク質をコードするＤＮＡの増幅を行った。
Ｆｗプライマー：5'-CACCGGGATT GGATCCATG-3'（配列番号：６）
（ｐＥＮＴＲ用のCACC配列を付加している）
Ｒｖプライマー：5'-GAACCATGGA ACAGTACCA-3'（配列番号：７）
（Ｃ末端のＴＡＰ付加用に終止コドンを削除している）
ＰＣＲ反応は９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、ついで７２℃にて１分間の工程を３０サイクルし、その後に７２℃にて２分間伸長反応を行った。
このようにして得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動に付して目的のＤＮＡが増幅されていることを確認した。
【００４２】
植物形質転換用ベクターの構築
植物の形質転換用ベクターの構築にはベクターの構築にはバイナリーベクター法およびＧａｔｅｗａｙ（登録商標）法を利用し、ｐ２Ｋ−１＋ベクター、ｐＧＷＢ２９ベクター、ｐＧＷＮＴベクター（Gateway（登録商標）にＨｄ１遺伝子とＴＡＰ遺伝子を組み込んで作製した。
【００４３】
ｐ２Ｋ−Ｈｄ１：ＴＡＰ（Ｕ１Ｃ）ベクター
ｐ２Ｋ−１＋ベクターは、ｐＢＩＮ１９バイナリーベクターに、トウモロコシのユビキチン遺伝子の第１イントロンを含む約２ｋｂのプロモーター領域を含む領域、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター下に制御されたハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ）とノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーターを含む領域ならびにマルチクローニングサイト（BamHI、SmaI、KpnI、SpeIおよびSacI）を挿入したバイナリーベクターである。
【００４４】
ｐ２Ｋ−Ｈｄ１：ＴＡＰ（Ｕ１Ｃ）ベクターの構築のために、以下のプライマーを用いて、前記のようにして得たＨｄ１  ｃＤＮＡの５'側半分および３'側半分、ならびにＴＡＰ領域をメガプライマー法（Ke S-HおよびMadison, E.L., Nucleic Acids Research, vol. 16, 3371-3372 (1997)）によって各々増幅した。ＴＡＰ領域の増幅は、ｐＢＳ１４７９を鋳型として用いた。
Ｈｄ１  ５'側増幅用プライマー
Ｆｗプライマー：5'-CACCGGGATT GGATCCATG-3'（配列番号：６）
Ｒｖプライマー：5'-AAGAGTCCAC CTCCTCGTCC-3'（配列番号：８）
Ｈｄ１  ３'側増幅用プライマー
Ｆｗプライマー：5'-GTGGTACCTT CACAGATC-3'（配列番号：９）
Ｒｖプライマー：5'-TCCATCTTCT CTTTTCCATG AACCATGGAA CAGTACCA-3'（配列番号：１０）
ＴＡＰ領域増幅用プライマー
Ｆｗプライマー：5'-TGGAAAAGAG AAGATGGA-3'（配列番号：１１）
Ｒｖプライマー：5'-GCTCTAGAAC TAGTCGAT-3'（配列番号：１２）
【００４５】
増幅した各断片を鋳型として１つの連結した断片を作製した。この断片をｐ２Ｋ−１＋ベクターのKpnIサイトとSalIサイトの間に挿入し（ノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーターは除去）、植物形質転換用のバイナリーベクターｐ２Ｋ−Ｈｄ１：ＴＡＰ（Ｕ１Ｃ）を作製した。
【００４６】
ｐＧＷＢ２９−Ｈｄ１（Ｓ１Ｃ）およびｐＧＷＮＴ−Ｈｄ１（Ｓ１Ｎ）ベクター
ｐＧＷＢ２９ベクターは遺伝子を挿入すべき部位のＣ−末端（または、下流もしくは３'−末端）側にＴＡＰ領域を含むベクターである。また、ｐＧＷＮＴベクターはｐＢＳ１７６１由来のＴＡＰ領域をｐＧＷＢ２ベクターの遺伝子を挿入すべき部位のＮ−末端（または、上流もしくは５'−末端）側に組み込んで作製したベクターである。
ｐＧＷＢ２９−Ｈｄ１（Ｓ１Ｃ）およびｐＧＷＮＴ−Ｈｄ１（Ｓ１Ｎ）ベクターは、Gateway（登録商標）ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯクローニングキット（Invitrogen社製）を用いて構築した。エントリークローンであるｐＥＮＴＲ−Ｈｄ１を作製するために、以下のプライマー
Ｆｗプライマー：5'-CACCGGGATT GGATCCATG-3'（配列番号：６）
Ｒｖプライマー：5'-GAACCATGGA ACAGTACCA-3'（配列番号：７）
およびPlatinum pfxポリメラーゼ（Invitrogen社製）を用いたＰＣＲによって、Ｈｄ１遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ entry cloning vectorに組み込み（ｐＥＮＴＲ−Ｈｄ１）、配列を確認した。かかるＰＣＲおよびＴＯＰＯベクターへのクローニングは、製造業者の指示に従って行った。すでにＴＡＰ領域が組み込まれているｐＧＷＢ２９ベクターにｐＥＮＴＲ−Ｈｄ１をＬＲ反応（Gateway LR clonase Enzyme Mix（Invitrogen社製））させてＨｄ１遺伝子を組み込み、ｐＧＷＢ２９−Ｈｄ１（Ｓ１Ｃ）を作製した。
【００４７】
また、ｐＧＷＮＴベクターは以下のように作製した。ＴＡＰ領域は、ｐＢＳ１７６１を鋳型とし、以下のプライマー
Ｆｗプライマー：5'-TCTAGACCAT GGATGAAGCC GTGGAC-3'（配列番号：１３）
Ｒｖプライマー：5'-ACTAGTATAA GCTTATCGTC ATCATC-3'（配列番号：１４）
を用いて増幅した。増幅したＴＡＰ領域をｐＧＷＢ２ベクターに組み込んで、遺伝子を挿入すべき部位のＮ−末端側にＴＡＰ領域を含むバイナリーベクターｐＧＷＮＴを作製した。
【００４８】
ｐＧＷＢ２９およびｐＧＷＮＴへのＨｄ１遺伝子の組み込みは、Gatewayシステムを用いて行った。詳細には、先に作製したｐＥＮＴＲ−Ｈｄ１からattＬタグ付きのＨｄ１を切り出し、ベクターｐＧＷＢ２９のすでに組み込まれているＴＡＰ領域のＮ−末端側、および、ベクターｐＧＷＮＴに組み込んだＴＡＰ領域のＣ−末端側に組み込んで、各々、バイナリーベクターｐＧＷＢ２９−Ｈｄ１およびｐＧＷＮＴ−Ｈｄ１を作製した。
【００４９】
ｐＧＷＢ２−Ｈｄ１（Ｓ１）ベクター
ｐＥＮＴＲ−Ｈｄ１のＨｄ１をＬＲ反応（Gateway LR clonase Enzyme Mix (Invitrogen社製)によってｐＧＷＢ２ベクターに組み込んで、ｐＧＷＢ２−Ｈｄ１ベクターを作製した。
【００５０】
形質転換用Agrobacterium菌株の調製
バイナリーベクターを含むプラスミドをAgrobacterium tumefaciens  EHA101菌株のコンピテントセルに加え、エレクトロポレーション法によって形質転換した。形質転換菌株は、ＡＢ培地（１Ｌ当たり、グルコース（和光純薬工業（株）製）５ｇ、アガロース（和光純薬工業（株）製）１２ｇ、ＡＢバッファー（１Ｌ当たり、Ｋ２ＨＰＯ４  ６０ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ２６ｇ（すべて和光純薬工業（株）製））５０ｍｌ、ＡＢ salt（ＮＨ４Ｃｌ  ２０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ６ｇ、ＫＣｌ  ３ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ２６４ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ５０ｍｇ（すべて和光純薬工業（株）製））５０ｍｌ、ハイグロマイシン５０ｍｇ、カナマイシン５０ｍｇ）上、暗黒下、２５℃にて２日間生育させて選抜した。その結果、１つの陽性クローンを得、それをＹＴ培地（１Ｌ当たり、トリプトン１６ｇ（ナカライテスク（株）製）、乾燥酵母エキス（ナカライテスク（株）製）１０ｇ、塩化ナトリウム（和光純薬工業（株）製）５ｇ）中で培養した。そのクローンが形質転換用のバイナリーベクターを保持しているかをＰＣＲ法によって確認し、確認されたクローンは２×ＹＴ培地中、暗黒下、２５℃にて生育させた。得られた培養液からグリセロールストック（培養液：グリセロール＝１：１）を調製し、使用するまで−８０℃にて保存した。使用時には、−８０℃で保存していたグリセロールストックから滅菌したつまようじでＡＢ培地に塗布し、そのＡＢ培地を暗黒下、２２℃にて３日間培養して増殖した菌株を使用した。
【００５１】
カルスの誘導
以下の実験において、植物としては日本品種「農林８号」を用い、トランスジェニック植物は、２４時間の温度サイクル（明所下、３０℃にて１２時間；暗所下、２５℃にて１２時間）に設定した人工天候チャンバー内で生育させた。
籾を除去したイネ種子をプラスチックシャーレに入れ、７０％エタノールで１分間洗浄し、ついで２０％次亜塩素酸ナトリウム水溶液で１時間洗浄した。さらに、クリーンベンチ内に移して滅菌水で５回洗浄した種子をＭＳ４Ｄ培地（１Ｌ当たり、ＭＳ培地用混合塩類４.６ｇ（和光純薬工業（株）製）、スクロース２０ｇ（最終濃度２％）、ＫＭビタミン１０ｍｌ（Sigma-Aldrich Corp.社製、K3129）、２,４−Ｄ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ、アガロース８ｇを含む、ｐＨ５.６−５.８に調整）に置床し、明所下、３０℃にて３〜４週間培養してカルスを誘導した。
【００５２】
カルスへのAgrobacterium菌株の感染
誘導したカルスのみを、新たなＭＳ４Ｄ培地に移し、明所下、３０℃にて３日間培養した。一方、アグロバクテリウム菌株はＭＳＬＡ培地（１Ｌ当たり、ＭＳ培地用混合塩類４.６ｇ（和光純薬工業（株）製）、スクロース２０ｇ（最終濃度２％）、ＫＭビタミン１０ｍｌ（Sigma-Aldrich Corp.社製、K3129）、２,４−Ｄ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ、アセトシリンゴン溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを含む、ｐＨ５.６−５.８に調整）に懸濁し、ＯＤ６００で０.０１程度の濃度に調整したものを用いた。カルスの入ったプラスチックシャーレにアグロバクテリウム菌株懸濁液を注ぎ、３〜５分間静置して感染させた。その後、カルスに付着した余分な液体をペーパータオルで吸い取り、ＭＳ４ＤＡ培地（１Ｌ当たり、ＭＳ培地用混合塩類４.６ｇ（和光純薬工業（株）製）、スクロース２０ｇ（最終濃度２％）、ＫＭビタミン１０ｍｌ（Sigma-Aldrich Corp.社製、K3129）、２,４−Ｄ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ、アガロース８ｇ、アセトシリンゴン溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを含む、ｐＨ５.６−５.８に調整）に移し、暗所下、２２℃にて３日間培養した。
【００５３】
形質転換カルスの選抜
培養したアグロバクテリウム処理カルスは、２０〜３０ｍｌの滅菌水で２〜３回洗浄した。最後の洗浄はカルベニシリンを５００ｍｇ／ｍｌの濃度で滅菌水に加えて行い、カルスに付着しているアグロバクテリウムを除菌した。洗浄したカルスをＭＳ４ＤＨ５０培地（１Ｌ当たり、ＭＳ培地用混合塩類４.６ｇ（和光純薬工業（株）製）、スクロース２０ｇ（最終濃度２％）、ＫＭビタミン１０ｍｌ（Sigma-Aldrich Corp.社製、K3129）、２,４−Ｄ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ、アガロース８ｇ、カルベニシリン５００ｍｇ、ハイグロマイシン５０ｍｇを含む、ｐＨ５.６−５.８に調整）に置床し、明所下、３０℃にて２週間培養した（一次選抜）。一次選抜で増殖してきたカルス（ハイグロマイシン耐性カルス）をＭＳ４ＤＨ１００培地（１Ｌ当たり、ＭＳ培地用混合塩類４.６ｇ（和光純薬工業（株）製）、スクロース２０ｇ（最終濃度２％）、ＫＭビタミン１０ｍｌ（Sigma-Aldrich Corp.社製、K3129）、２,４−Ｄ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ、アガロース８ｇ、カルベニシリン５００ｍｇ、ハイグロマイシン１００ｍｇを含む、ｐＨ５.６−５.８に調整）に移し、明所下、３０℃にて２週間培養した（二次選抜）。さらに、二次選抜で増殖してきたカルスをＲ２ＲＨ５０培地（１Ｌ当たり、Ｒ２マクロ溶液（１Ｌ当たり、ＫＮＯ３  ８０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ６.７ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ５.０ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ３.０ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ５.４６ｇ（すべて和光純薬工業（株）製））５０ｍｌ、Ｒ２ミクロ溶液（１００ｍＬ中、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  １６０ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２２０ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  １２.５ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  ６００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  １２.５ｍｇ（すべて和光純薬工業（株）製））１ｍｌ、ＦｅＥＤＴＡ（１００ｍＬ中、Ｎａ２ＥＤＴＡ  ３７５ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２７５ｍｇ（すべて和光純薬工業（株）製））２ｍｌ、ＭＳビタミン１ｍｌ（Sigma-Aldrich Corp.社製）、スクロース３０ｇ(和光純薬工業（株）製)、ソルビトール３０ｇ(和光純薬工業（株）製)、アガロース１０ｇ(和光純薬工業（株）製)、ハイグロマイシン５０ｍｇを含む、ｐＨ５.６−５.８に調整）に移し、明所下、３０℃にて２週間培養して（三次選抜）、形質転換カルスを選抜した。
【００５４】
形質転換カルスからの植物体の再生および馴化
三次選抜で増殖してきたカルスをＲ２Ｒ培地（１Ｌ当たり、Ｒ２Ｒマクロ溶液５０ｍｌ、Ｒ２Ｒミクロ溶液１ｍｌ、ＦｅＥＤＴＡ  ２ｍｌ、ＭＳビタミン１ｍｌ（Sigma-Aldrich Corp.社製）、スクロース３０ｇ(和光純薬工業（株）製)、ソルビトール３０ｇ、アガロース１０ｇ(和光純薬工業（株）製)を含む、ｐＨ５.６−５.８に調整）に移し、明所下、３０℃にて培養し、２週間毎に新しい培地に移し替えた。再生個体が生長したら、Ｒ２Ｒ培地の入ったマジェンダボックスに移し、発根させた。再生個体は滅菌した育苗培土の入ったマジェンダボックスに移して発根させた。再生個体は滅菌した育苗培地の入ったマジェンダボックスに移植し、ビニールなどで覆って湿度を保ちながら温室で生育させ、４種類の形質転換イネ植物体（３０系統のＵ１Ｃ（トウモロコシ・ユビキチンプロモーター−Ｈｄ１−ＴＡＰ）、７系統のＳ１Ｃ（ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター−Ｈｄ１−ＴＡＰ）、１４系統のＳ１Ｎ（ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター−ＴＡＰ−Ｈｄ１）および３系統のＳ１（ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター−Ｈｄ１））を得た。
【００５５】
シロイヌナズナにおいては、光によるＣＯの転写後活性化が開花の光周期活性化に対する重要な事象であることが示唆されている。以前の実験では、３５Ｓ：：ＣＯ植物におけるＣＯタンパク質レベルが光周期に強く依存することが示唆された；すなわち、ＣＯタンパク質レベルは長日条件下では一日の終わりにピークを有して昼間は変動するのに対して、短日条件下ではＣＯタンパク質の発現量は長日条件下よりも低い。そこで、本発明者らは、トランスジェニック・イネ植物体において、Ｈｄ１遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルが光周期と相関を有するかについて調べた。
【００５６】
トランスジェニック・イネ植物体におけるＨｄ１−ＴＡＰ遺伝子の発現
得られたトランスジェニック・イネ植物体における導入ＤＮＡカセットのｍＲＮＡへの転写をＲＴ−ＰＣＲ法によって検討した。ＲＴ−ＰＣＲ法では、第１鎖のｃＤＮＡを鋳型として用い、増幅は９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、７２℃にて１分間のサイクルを３０回繰り返し、その後に７２℃にて７分間の伸長反応を行った。使用したプライマーは以下のとおりである。
Ｈｄ１：ＴＡＰ（Ｕ１Ｃ）増幅用プライマー
Ｆｗプライマー：5'-GTGGTACCTT CACAGATC-3'（配列番号：９）
Ｒｖプライマー：5'-TCAGGTTGAC TTCCCCGCGG AAT-3'（配列番号：１５）
Ｈｄ１：ＧＷ（Ｓ１ＣおよびＳ１Ｎ）増幅用プライマー
Ｆｗプライマー：5'-GTGGTACCTT CACAGATC-3'（配列番号：９）
Ｒｖプライマー：5'-CTGTTATCAA CCACTTTGTA CAAGAA-3'（配列番号：１６）
Ｈｄ１（Ｓ１）増幅用プライマー
Ｆｗプライマー：5'-GTTTGCAGAG AAGGAAGGGA GCGAGTG-3'（配列番号：１７）
Ｒｖプライマー：5'-CTGTTATCAA CCACTTTGTA CAAGAA-3'（配列番号：１６）
ユビキチン増幅用プライマー
Ｆｗプライマー：5'-CACAAGAAGG TGAAGCTCGC-3'（配列番号：１８）
Ｒｖプライマー：5'-GCCTTCTGGT TGTAGACGTA GG-3'（配列番号：１９）
その結果、２６系統のトランスジェニック・イネ植物体Ｕ１ＣにおいてＨｄ１：ＴＡＰカセットのｍＲＮＡの発現が検出され（図１Ａ）、７系統のＳ１Ｃおよび１４系統のＳ１Ｎにおいて、各々、Ｈｄ１：ＴＡＰカセット（図１Ｂ）およびＴＡＰ：Ｈｄ１カセット（図１Ｃ）のｍＲＮＡの発現が検出された。したがって、導入した再生植物体（いずれもＴ０）において本発明のＤＮＡ発現カセットが正常に発現していることがｍＲＮＡへの転写レベルで確認された。
また、後記するように、３系統のトランスジェニック・イネ植物体Ｓ１については、Ｔ１およびＴ２植物体でのＨｄ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。
【００５７】
トランスジェニック・イネ植物体におけるＨｄ１−ＴＡＰ融合タンパク質の発現
次に、タンパク質のレベルを調べるための抗体として抗−ＴＡＰペプチド抗体を用いて、各トランスジェニック植物体におけるＨｄ１−ＴＡＰ融合タンパク質を検出した。トランスジェニック・イネ植物体Ｕ１Ｃの核抽出物におけるＨｄ１−ＴＡＰ融合タンパク質の発現量を長日条件下および短日条件下で栽培した植物体について各々試験した。
【００５８】
４０−５０日齢のトランスジェニック・イネ植物体の葉身から、Liu, X.L.ら, Plant Cell, Vol.13, 1293-1304 (2001)に記載されている方法に従って核抽出物を得た。５ｇの葉から得た核抽出物を２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）、２.５ｍＭのジチオトレイトール、０.０２５％のＣＨＡＰＳ、１５％のスクロース、２５％（ｗ／ｖ）のグリセロールおよび０.５×ＣＯＭＰＬＥＴＥ（登録商標）プロテアーゼインヒビター・カクテル（Roche社製）からなる２ｍｌの溶液に懸濁した。この溶液に、５ｍＭのＮａＣｌを最終濃度０.４Ｍになるよう加えた。ついで、Ｓｔｒａｔａｃｌｅａｎ（登録商標）樹脂（Stratagene社製）を用いて２００μｇの抽出物を得、それを１２.５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。泳動ゲルに、抗−ＴＡＰ抗体（Open Biosystems社製）を一次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗ウサギ−抗ＩｇＧ抗体（Amersham社製）を二次抗体として順次反応させ、ＥＣＬ plus detection kit（Amersham社製）を用いて発光させ、ウェスタンブロット解析を行った。
【００５９】
その結果、まず、長日条件下で栽培した植物体では、Ｈｄ１−ＴＡＰ融合タンパク質が独立した系統において一日の終わり（ＺＴ(Zeitgeber Time)  １４ｈｒ）に存在した。恒常的に高い発現を与えるユビキチン・プロモーターのためにＨｄ１：ＴＡＰ  ｍＲＮＡ発現レベルは高いが、Ｈｄ１−ＴＡＰ融合タンパク質の発現量は非常に低く、ウェスタンブロットの検出限界付近のレベルであった（図２Ａ）。つぎに、Ｈｄ１−ＴＡＰ融合タンパク質は、長日条件および短日条件下で、ＺＴ  １０ｈｒでも検出された。短日条件下におけるＨｄ１−ＴＡＰ融合タンパク質の発現レベルは低く、長日条件下における発現と同等であった（図２Ｂ）。したがって、導入した再生植物体において本発明のＤＮＡ発現カセットが正常に発現していることが融合タンパク質への翻訳レベルでも確認された。
【００６０】
トランスジェニック・イネ植物体におけるＨｄ１遺伝子の過剰発現
特開２００３−３３９３８２（特許文献１）においては、Ｈｄ１遺伝子単独の過剰発現がイネの開花を促進することが示されている。そこで、本発明者らは、３系統のＨｄ１遺伝子組換えイネ植物体（Ｓ１−５、−２８および−３２株）を作製し、Ｈｄ１遺伝子のｍＲＮＡ量および開花日数を測定した。ｍＲＮＡ量の測定はreal-time ＰＣＲ法によって測定し、恒常的に発現しているユビキチンｍＲＮＡの量でＨｄ１  ｍＲＮＡ量を除することで個体間の変動を標準化した。real-time ＰＣＲに用いた各々のプライマーは以下のとおりである。
Ｈｄ１増幅用プライマー
Ｆｗプライマー：5'-TCAGCAACAG CATATCTTTC TCATCA-3'（配列番号：２０）
Ｒｖプライマー：5'-TCTGGAATTT GGCATATCTA TCACC-3'（配列番号：２１）
ユビキチン増幅用プライマー
Ｆｗプライマー：5'-AACCAGCTGA GGCCCAAGA-3'（配列番号：２２）
Ｒｖプライマー：5'-ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA-3'（配列番号：２３）
その結果、ｍＲＮＡ量はＴ１植物体において野生型（非トランスジェニック）植物体と同量、あるいは野生型植物体より上昇するものも見られたが（図５Ａ）、Ｔ２植物体においては野生型植物体よりも低下することが示された（図５Ｂ）。また、短日条件下におけるＴ２植物体の開花時期を測定したところ、いずれも野生型植物体と有意な差はなく、開花は遅延も促進もされないことが示された（図６）。すなわち、本実験では、Ｈｄ１遺伝子を単独で過剰発現させることを試みたが、実際に過剰発現する個体は得られず、Ｈｄ１遺伝子単独の強制的な発現によっては短日条件下での開花時期の遅延が起こらないことが確認された。
【００６１】
短日条件下で開花の遅延を引き起こすトランスジェニック植物体
以前の研究では、Ｈｄ１およびＨｄ２の機能的な対立遺伝子をＫａｓａｌａｔｈの非機能対立遺伝子で置換した日本型イネ栽培品種「日本晴」の準同質遺伝子系統において、Ｈｄ１の機能喪失が短日条件下では開花の遅延を引き起こし、長日条件下では開花の促進を引き起こすことが示されている。本発明者らは、開花時期表現型について、Ｈｄ１のｍＲＮＡの発現レベルが恒常的に高いＵ１Ｃ、Ｓ１ＣおよびＳ１Ｎトランスジェニック・イネ植物体を試験した。短日条件下において、これらのトランスジェニック・イネ植物体は野生型または野生型Ｔ１segregantのいずれよりも遅く開花し（図３Ａ）、これらの間の差が統計学的に有意であることをスチュデントｔ検定によって確認した。しかしながら、長日条件下では、それらは野生型と同様に開花した（図３Ｂ）。長日条件下では、トランスジェニック植物体と野生型植物体との間に開花時期の統計学的な差は存在しなかった。形態的には、Ｕ１Ｃ、Ｓ１ＣおよびＳ１Ｎトランスジェニック植物体が野生型植物体よりも丈においてより高い場合があった。しかしながら、これらすべてのトランスジェニック・イネ植物体は、穂長以外は形態的な異常を示さなかった（図４）。これは、植物体の穂長が開花により終止するところ、開花が遅延したためその期間の成長分だけ穂長が高くなったものであり、野生型植物体とＵ１Ｃ、Ｓ１ＣおよびＳ１Ｎトランスジェニック植物体との間には実質的に開花時期の遅延以外に異なる形質は認められなかった。一方、Ｓ１トランスジェニック・イネ植物体においてこのような遅延は認められなかった（図３Ａ）。したがって、本発明のＤＮＡ発現カセットで形質転換したトランスジェニック植物体は、野生型（非トランスジェニック）植物体と比較した場合に、短日条件下で開花時期が遅延すること、長日条件下では遅延しないこと、開花時期以外の形質において差異がないことが確認された。また、Ｈｄ１遺伝子を単独で過剰発現させても、開花時期に影響を与えないことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は植物バイオテクノロジーの分野に属し、短日植物の開花時期の調整に関する。本発明によれば、短日条件下で開花時期が遅延し、開花時期以外では野生株と実質的に同等の形質を有する植物を安定して得ることができ、植物の開花時期を人為的に遅延させることにより、植物の栽培地域の融通性、長期間にわたる開花段階の植物の供給、高い成長段階の植物体を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１はトランスジェニック・イネ植物体におけるＨｄ１：ＴＡＰを含むＤＮＡ発現カセットのｍＲＮＡ発現を示す図である。ユビキチン１プロモーター下に連結したＨｄ１：ＴＡＰを含むベクターを導入したイネ植物体（Ｕ１Ｃ）のｍＲＮＡ（Ａ）；カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター下に連結したＨｄ１：ＴＡＰを含むベクターを導入したイネ植物体（Ｓ１Ｃ）のｍＲＮＡ（Ｂ）；カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター下に連結したＴＡＰ：Ｈｄ１を含むベクターを導入したイネ植物体（Ｓ１Ｎ）のｍＲＮＡ（Ｃ）をＲＴ−ＰＣＲによって分析した。（Ａ）−（Ｃ）において、ＲＮＡはＺＴ  ６ｈｒに３０日齢のＴ０植物体から抽出した。ここに「ＺＴ」とはZeitgeber Timeを示し、図中の「ＷＴ」は野生株植物体を示す。（Ｄ）はＵ１Ｃ、Ｓ１ＣおよびＳ１Ｎ構築物の模式図を示す。図中の矢印はＲＴ−ＰＣＲのプライマー設計部位を示す。
【図２】図２はトランスジェニック・イネ植物体におけるＨｄ１−ＴＡＰ融合タンパク質の発現量を示す。長日条件下で生育させた野生型およびＵ１Ｃ植物体からＺＴ  １４ｈｒに採取した核抽出物中のＨｄ１−ＴＡＰ融合タンパク質（Ａ）または短日条件および長日条件下で生育させ、ＺＴ  １０ｈｒに採取したＨｄ１−ＴＡＰ融合タンパク質（Ｂ）をウェスタンブロッティングによって分析した。矢印はＨｄ１−ＴＡＰ融合タンパク質を示す。アスタリスクはロード対照としての非特異的なシグナルを示す。長日条件および短日条件の明／暗条件を示す。
【図３】図３はＨｄ１−ＴＡＰ融合タンパク質を発現するトランスジェニック・イネ植物体の開花時期を示す。試験した分離Ｔ１世代を横軸に示し、短日条件下（Ａ）および長日条件下（Ｂ）で栽培した植物体の出穂（開花）までの日数を縦軸に示す。データは平均値±ＳＥ（ｎ＝２−５）を示す。アッセイした系統はＷＴ（野生株）、無−transgene対照（ＮＣ）およびトランスジェニック植物体（Ｕ１Ｃ、ＳＣ１およびＳ１Ｎ）である。
【図４】図４は短日条件下で生育させた野生株植物体（左）およびＵ１Ｃトランスジェニック植物体（右）の表現型を示す図面代用写真である。Ｕ１Ｃ植物体の世代はＴ１である。
【図５】図５はトランスジェニック・イネ植物体におけるＨｄ１を単独で含むＤＮＡ発現カセットのｍＲＮＡ発現を示す図である。ｍＲＮＡ発現量は、Ｔ１植物体において野生型（非トランスジェニック）植物体と同量、あるいは野生型植物体より上昇するものも見られたが（Ａ）、Ｔ２植物体においては野生型植物体よりも低下することが示された（Ｂ）。
【図６】図６はＨｄ１タンパク質を単独で発現するトランスジェニック・イネ植物体の開花時期を示す。短日条件下におけるＴ２植物体の開花時期を測定したところ、いずれも野生型植物体と有意な差はなく、開花は遅延も促進もされないことが示された。
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
SEQ ID NO: 1
Amino acid sequence of Hd1 protein.
SEQ ID NO: 2
Polynucleotide sequence of Hd1 gene.
SEQ ID NO: 3
Polynucleotide sequence encoding tandem affinity tag (TAP).
SEQ ID NO: 4
Polynucleotide sequence of DNA expressing cassette (5'-Hd1-TAP-3').
SEQ ID NO: 5
Polynucleotide sequence of DNA expressing cassette (5'-TAP-Hd1-3').
SEQ ID NO: 6
Forward primer for PCR-amplifying polynucleotide sequence of Hd1 gene.
SEQ ID NO: 7
Reverse primer for PCR-amplifying polynucleotide sequence of Hd1 gene.
SEQ ID NO: 8
Reverse primer for PCR-amplifying polynucleotide sequence of 5'-region of Hd1 gene.
SEQ ID NO: 9
Forward primer for PCR-amplifying polynucleotide sequence of 3'-region of Hd1 gene.
SEQ ID NO: 10
Reverse primer for PCR-amplifying polynucleotide sequence of 3'-region of Hd1 gene.
SEQ ID NO: 11
Forward primer for PCR-amplifying polynucleotide encoding TAP.
SEQ ID NO: 12
Reverse primer for PCR-amplifying polynucleotide encoding TAP.
SEQ ID NO: 13
Forward primer for PCR-amplifying polynucleotide encoding TAP.
SEQ ID NO: 14
Reverse primer for PCR-amplifying polynucleotide encoding TAP.
SEQ ID NO: 15
Reverse primer for PCR-amplifying DNA expressing cassette (5'-Hd1-TAP-3').
SEQ ID NO: 16
Reverse primer for PCR-amplifying DNA expressing cassette (5'-Hd1-TAP-3' or 5'-TAP-Hd1-3').
SEQ ID NO: 17
Forward primer for PCR-amplifying polynucleotide sequence of Hd1 gene.
SEQ ID NO: 18
Forward primer for PCR-amplifying polynucleotide sequence of ubiquitin gene.
SEQ ID NO: 19
Reverse primer for PCR-amplifying polynucleotide sequence of ubiquitin gene.
SEQ ID NO: 20
Forward primer for PCR-amplifying polynucleotide sequence of Hd1 gene.
SEQ ID NO: 21
Reverse primer for PCR-amplifying polynucleotide sequence of Hd1 gene.
SEQ ID NO: 22
Forward primer for PCR-amplifying polynucleotide sequence of ubiquitin gene.
SEQ ID NO: 23
Reverse primer for PCR-amplifying polynucleotide sequence of ubiquitin gene.
【図１】
2008054512.tif 000003
【図２】
2008054512.tif 000004
【図３】
2008054512.tif 000005
【図４】
2008054512.tif 000006
【図５】
2008054512.tif 000007
【図６】
2008054512.tif 000008
【配列表】
2008054512000001.app