(57)【要約】【課題】  プロテインキナーゼ活性を小型の検出装置にて迅速、簡便且つ高感度に測定可能とする。【解決手段】  プロテインキナーゼと基質と既知量のＡＴＰとを接触させる反応工程と、ＡＴＰとＡＤＰとを分離する分離工程と、分離したＡＴＰを電極の表面に集めた状態で電気化学測定を行う測定工程とを有する。分離工程においては、ＡＴＰに特異的に結合する分子を固定化したビーズ担体を用いてＡＴＰを分離し、測定工程においては分離した前記ビーズ担体を前記電極の表面に集める。測定工程においてアデニンの酸化電流を測定する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインキナーゼと基質と既知量のＡＴＰとを接触させる反応工程と、
ＡＴＰとＡＤＰとを分離する分離工程と、
分離したＡＴＰとＡＤＰとのいずれか一方を電極の表面に集めた状態で電気化学測定を行う測定工程とを有することを特徴とするプロテインキナーゼ活性の測定方法。
【請求項２】
前記分離工程において、ＡＴＰとＡＤＰとのいずれか一方に特異的に結合し、他方に結合しない分子を固定化したビーズ担体を用いてＡＴＰとＡＤＰとのいずれか一方を分離し、
前記測定工程において、分離した前記ビーズ担体を前記電極の表面に集めることを特徴とする請求項１記載のプロテインキナーゼ活性の測定方法。
【請求項３】
前記ビーズ担体が磁気ビーズであり、前記測定工程において、前記電極の裏面に磁石を配置した状態で前記電気化学測定を行うことを特徴とする請求項２記載のプロテインキナーゼ活性の測定方法。
【請求項４】
前記測定工程においてアデニンの酸化電流を測定することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載のプロテインキナーゼ活性の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気化学測定を利用したプロテインキナーゼ活性の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内で起きる様々な生命現象は、タンパク質リン酸化反応により巧妙に制御されている。したがって生命現象の仕組みを理解するためには、そのカギを握る５００種類以上のプロテインキナーゼ群あるいはその阻害剤、さらにはその活性化剤のそれぞれの活性を効率的に測定する手法の開発が非常に重要な意味を持つ。プロテインキナーゼ活性及びその阻害活性、活性化剤の測定方法としては例えば３２Ｐで標識されたＡＴＰを酵素反応時に用い、オートラジオグラフィーにより放射性標識を測定する方法が知られており、良好な感度を得ることができる。しかしながら、前記測定方法には取扱いに大きな制約のある放射性同位体を用いなければならないという欠点がある。
【０００３】
そこで、放射性標識を用いることなくＥＬＩＳＡの原理を利用する方法も知られている。例えば特許文献１においては、リン酸化された基質に特異的に結合する抗体を用いて特異的に反応させ、酵素標識二次抗体を用い、吸光度測定により活性を測定する方法が開示されている（例えば、特許文献１等参照）。
【特許文献１】特開平７−２５８２９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載される方法のように吸光度測定等を利用する場合、光学系が必要であるため検出装置が大型化、複雑化する等の問題がある。また、酵素反応により発色させるため、測定操作が煩雑で測定に長時間を要するという問題も有している。
【０００５】
本発明はこのような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、プロテインキナーゼの活性を小型の検出装置にて迅速、簡便且つ高感度に測定可能なプロテインキナーゼ活性の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前述の目的を達成するために、本発明に係るプロテインキナーゼ活性の測定方法は、プロテインキナーゼと基質と既知量のＡＴＰとを接触させる反応工程と、ＡＴＰとＡＤＰとを分離する分離工程と、分離したＡＴＰとＡＤＰとのいずれか一方を電極の表面に集めた状態で電気化学測定を行う測定工程とを有することを特徴とする。
【０００７】
以上のようなプロテインキナーゼ活性の測定方法においては、電気化学的に活性な分子であるアデニンの酸化電流を指標として、プロテインキナーゼ活性を求める。例えば、未反応ＡＴＰとＡＴＰの酵素反応生成物であるＡＤＰとの混合物からＡＴＰのみを分離し、電極の表面に集めた状態で電気化学測定をした場合、得られるアデニン由来の酸化電流強度は、酵素反応に供したＡＴＰのうち未反応のＡＴＰ量を表すので、これを指標としてプロテインキナーゼ活性の測定が実現される。一方、未反応ＡＴＰとＡＴＰの酵素反応生成物であるＡＤＰとの混合物からＡＤＰのみを分離し、電極の表面に集めた状態で電気化学測定をした場合、得られるアデニン由来の酸化電流強度は、プロテインキナーゼによる作用を受けたＡＴＰ量、すなわちＡＤＰ量を表すので、これを指標としてプロテインキナーゼ活性の測定が実現される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、従来のオートラジオグラフィーやＥＬＩＳＡのような複雑な操作を必要とせず簡便にプロテインキナーゼ活性を測定することができる。また、本発明によれば、例えばＥＬＩＳＡの検出工程において用いられるような大型の測定機器を必要とすることなく、小型の電気化学測定装置を用いて、プロテインキナーゼの活性の高感度且つ正確な測定を実現することができる。さらに、本発明によれば、これらの活性測定に要する時間も大幅に短縮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明に係るプロテインキナーゼ活性の測定方法について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１０】
本発明においては、先ず、プロテインキナーゼと基質と既知量のＡＴＰ（アデノシン三リン酸）とを、所定時間例えば反応溶液中で接触させ、反応させる。これにより、プロテインキナーゼの作用を受けて基質はリン酸化される。一方ＡＴＰは、プロテインキナーゼの作用を受け、ＡＴＰの酵素反応生成物であるＡＤＰ（アデノシン二リン酸）を生じる。
【００１１】
酵素反応は、反応溶液に基質を分散させた状態、任意の担体に基質を固定化した状態のいずれで行ってもよい。また、後述する測定工程で用いられる電極の表面に基質を固定化した状態で酵素反応を行うことも可能であるが、この場合、反応溶液に含まれるＡＴＰやＡＤＰ等が電極の表面に非特異的に吸着してノイズを生じるおそれがある。
【００１２】
反応終了後、ＡＴＰとＡＴＰの酵素反応生成物であるＡＤＰ等とを分離する。ＡＴＰと酵素反応生成物との分離は、ＡＴＰとＡＤＰとのいずれか一方に特異的に結合し、他方に結合しない分子を固定化した担体を用い、担体と反応後の反応溶液とを接触させることにより実現される。
【００１３】
担体としては、磁気ビーズ、樹脂ビーズ等のビーズ担体、電極等、任意の担体を使用可能であるが、分離及び洗浄を確実に行うことができることから、ビーズ担体の使用が好ましい。特に磁気ビーズは、反応溶液からの収集及び電極表面へ集める作業を迅速且つ確実に行うことができる。
【００１４】
ＡＴＰとＡＤＰとのいずれか一方に特異的に結合し、他方に結合しない分子としては、このような機能を持つ分子であれば特に限定されないが、例えば未反応ＡＴＰを測定対象とする場合には、抗ＡＴＰ抗体、ＡＴＰアプタマー等を用いることができる。また、ＡＴＰの酵素反応生成物であるＡＤＰを測定対象とする場合には、ＡＤＰアプタマー等を用いることができる。
【００１５】
次に、分離したＡＴＰとＡＤＰとのいずれか一方を電極の表面に集めた状態で電気化学測定を行う。分離したＡＴＰとＡＤＰとのいずれか一方を電極の表面に集めた状態で電気化学測定を行うことで、アデニンと電極との間での電子授受を確実に行うことができ、また、アデニンが電極表面に濃縮されるので、より高感度な測定が実現される。
【００１６】
ＡＴＰとＡＤＰとのいずれか一方を電極の表面に集めた状態とするには、例えばＡＴＰとＡＤＰとのいずれか一方に特異的に結合する分子を固定化したビーズ担体を用いる場合、酵素反応終了後の反応溶液からビーズ担体を捕集し洗浄した後、ビーズ担体を懸濁した溶液を電極表面に滴下し、ビーズ担体を沈殿させることにより実現される。また、より確実にビーズ担体を電極の表面に近づけて測定感度を高めるために、ビーズ担体を懸濁した溶液を電極表面に滴下し、乾燥させ、物理的に吸着させてもよい。さらに、ビーズ担体として磁気ビーズを用いる場合、電極の裏面に磁石を置いた状態とし、磁石の磁気吸着力を利用することで、測定感度をより一層高めることができる。
【００１７】
次に、ＡＴＰとＡＤＰとのいずれか一方を電極の表面に集めた状態で電気化学測定を行う。すなわち、ＡＴＰ、ＡＤＰ等の構成成分であるアデニンを電気化学的に酸化する際に観察される酸化電流を測定する。酵素反応に供したＡＴＰのうち未反応ＡＴＰを電気化学測定の対象とした場合には、プロテインキナーゼ活性が強いほど酸化電流値は弱くなる傾向を示す。一方、酵素反応に供したＡＴＰのうちプロテインキナーゼの作用を受けて生成した酵素反応生成物（ＡＤＰ等）を電気化学測定の対象とした場合には、プロテインキナーゼ活性が強いほど酸化電流値は強くなる傾向を示す。
【００１８】
電気化学測定としては、例えば、微分パルスボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー等のボルタンメトリー、アンペロメトリー、クロノメトリー等が挙げられる。
【００１９】
電気化学測定に用いる電極の構造は任意であり、例えばカーボン等を印刷してなる印刷電極等を用いることができる。ただし、アデニンの酸化シグナルは金属等に比較すると弱いため、例えば、作用極表面積を大きくすることのできるカーボンナノチューブ等の良導電材料を印刷電極の表面に吸着させることにより、感度を高めることが好ましい。
【００２０】
以下、本発明のプロテインキナーゼ活性の測定方法の一実施形態として、磁気ビーズを用いて未反応ＡＴＰを分離し、その酸化電流を測定する方法について、図１を参照しながら説明する。
【００２１】
先ず、図１に示すように、プロテインキナーゼの基質ペプチド１を任意の担体２の表面に固定化し、基質ペプチド１とプロテインキナーゼと既知量のＡＴＰとを含む反応溶液を所定時間インキュベートする。基質ペプチド１に対するプロテインキナーゼが含まれている場合には、図１上段に示すように、プロテインキナーゼ活性の強さに応じてＡＴＰのリン酸基が基質ペプチド１に転移し、酵素反応生成物としてＡＤＰ等が生成する。一方、基質ペプチド１に対するプロテインキナーゼが含まれていない場合や、プロテインキナーゼ活性が阻害されている場合等には、図１下段に示すように、阻害の程度等に応じてＡＴＰが残存する。
【００２２】
所定時間反応させた後、ＡＴＰ特異的アプタマー３が結合した磁気ビーズ４と反応溶液とを混合する。これにより、反応溶液に含まれているＡＴＰのみを磁気ビーズ４に吸着させる。
【００２３】
次に、磁気ビーズ４を反応溶液から分離し、洗浄した後、電極５の表面に集める。この状態で電気化学測定を行う。電気化学測定を行う際には、例えば作用極の電位を正方向に変化させていき、電位変化に伴う電流変化を測定する。ＡＴＰが電極５の表面に集められている場合、電極電位を正方向に変化させていくと、ＡＴＰの構成成分であるアデニンの酸化電流が観察されるので、これを測定する。阻害剤の存在によりプロテインキナーゼ活性が阻害されていたり、基質ペプチド１に対するプロテインキナーゼが含まれていない場合等、反応溶液に含まれるプロテインキナーゼ活性が弱い場合には、反応溶液から多くのＡＴＰが分離されるので、その結果、図１（ｂ）に示すようにアデニン由来の酸化電流も強くなる。一方、プロテインキナーゼ活性が強く反応溶液におけるＡＴＰ量が少ない場合、図１（ａ）に示すようにＡＴＰのアデニン由来の酸化電流は弱いものとなる。したがって、分離したＡＴＰの構成成分であるアデニンの酸化電流を測定することで、間接的にプロテインキナーゼ活性を簡便且つ高感度に測定することができる。
【００２４】
なお、前述の説明においては、プロテインキナーゼの酵素活性を測定する方法を例に挙げて説明したが、本発明によれば、酵素反応の際に阻害剤を共存させ、求めたプロテインキナーゼ活性から阻害剤の活性を間接的に測定することも可能である。また、プロテインキナーゼの活性化剤の存在下で酵素反応させ、プロテインキナーゼの活性を測定することにより、活性化剤の活性を間接的に測定することも可能である。
【実施例】
【００２５】
本実施例では、プロテインキナーゼと基質とＡＴＰとを反応させた後の反応溶液中から、ＡＴＰ特異的結合タンパク質を固定した磁気ビーズを用いて未反応のＡＴＰを分離して電極上に濃縮し、その酸化電流を観察することによりプロテインキナーゼの活性又はその阻害活性の測定を試みた。
【００２６】
１．  ＡＴＰアプタマー固定磁気ビーズの作製
１００μＬのカルボキシル化磁気ポリスチレンビーズを１．５ｍＬのマイクロチューブに取り、４００μＬのＰＢＳ−Ｔ（０．１％のＴｗｅｅｎを含む５０ｍＭリン酸バッファー）を加えて５分間撹拌した。洗浄後、１００μＬのＥＤＣとＮＨＳを最終濃度が２ｍＭと５ｍＭになるようにＰＢＳ−Ｔを加えて１時間撹拌した。磁気ビーズを分離後、ＡＴＰアプタマー（ＡＴＰ特異的結合ヌクレオチド）のＰＢＳ−Ｔ溶液を、最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、１時間撹拌した。その後１００μＬのエタノールアミンを最終濃度が１００ｍＭとなるように添加して１時間インキュベートして磁気ビーズ表面をブロッキング後、洗浄し、再び１００μＬ中のＰＢＳ−Ｔに縣濁させてＡＴＰアプタマー固定ビーズ溶液とした。
【００２７】
２．  反応溶液中のキナーゼ活性の測定
５０μＬのチロシンキナーゼ溶液と５０μＬのＡＴＰ溶液とを混合して反応溶液を調製し、マイクロチューブ内で３０分間、３０℃でインキュベートした。前記チロシンキナーゼ溶液とは、任意濃度のチロシンキナーゼ（ｐ６０ｃ−Ｓｒｃ）と、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンと、０．２％β−メルカプトエタノールとアッセイバッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）中に含むものである。また、前記ＡＴＰ溶液とは、１５０ｍＭのＡＴＰと、任意濃度の基質Ｒａｔｔｉｄｅと、３０ｍＭのＭｇＣｌとを前記アッセイバッファー溶液中に含むものである。その後、１００μＬのＡＴＰアプタマー固定ビーズ溶液と混合し、室温で３０分間撹拌した。磁気的にビーズを収集し、洗浄後、５０μＬの酢酸バッファーに縣濁させた。
【００２８】
縣濁させたビーズ溶液を印刷電極上に滴下し、電気化学的測定を行ってＡＴＰの構成成分であるアデニンの酸化電流を観察した。具体的には、微分パルスボルタンメトリーにより、印刷電極内の銀／塩化銀参照電極に対する作用極の電位を０．７５Ｖから１．８Ｖに変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。ボルタンメトリーの条件は電位増加０．００４Ｖ、パルス振幅０．０５Ｖ、パルス期間０．２秒、スキャンレイト０．０１Ｖ／ｓであった。電位に対する電流変化の特性図を図２に示した。ＡＴＰアプタマー固定ビーズにより捕集されたＡＴＰは、＋１．２Ｖ付近にその構成成分のアデニンに由来する酸化ピークを有している。キナーゼによるリン酸化でＡＴＰが消費されると、＋１．２Ｖ付近でのアデニンの酸化ピーク電流値の減少が観察された。なお、参考として、反応溶液と接触させていないＡＴＰアプタマー固定ビーズ（アプタマーのみ）の測定結果、及び酢酸バッファーのみの測定結果を図２中に示す。また、反応溶液中のキナーゼ活性と酸化電流値との関係を図３に示した。これより、キナーゼ活性が高くなるにつれて電流値が減少することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の一実施形態について説明するための模式図であり、（ａ）は阻害剤なしの場合、（ｂ）は阻害剤ありの場合を示す。
【図２】実施例１で測定した電位に対する電流変化の特性図である。
【図３】プロテインキナーゼ活性と酸化電流との関係を示す特性図である。
【符号の説明】
【００３０】
１  基質ペプチド、２  担体、３  アプタマー、４  磁気ビーズ、５  電極
【図１】
2008122238.tif 000003
【図２】
2008122238.tif 000004
【図３】
2008122238.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月28日(2008.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインキナーゼと基質と既知量のＡＴＰとを接触させる反応工程と、
ＡＴＰとＡＤＰとを分離する分離工程と、
分離したＡＴＰとＡＤＰとのいずれか一方を電極の表面に集めた状態でＡＴＰまたはＡＤＰのアデニン由来の酸化電流を測定する測定工程とを有することを特徴とするプロテインキナーゼ活性の測定方法。
【請求項２】
前記分離工程において、ＡＴＰとＡＤＰとのいずれか一方に特異的に結合し、他方に結合しない分子を固定化したビーズ担体を用いてＡＴＰとＡＤＰとのいずれか一方を分離し、
前記測定工程において、分離した前記ビーズ担体を前記電極の表面に集めることを特徴とする請求項１記載のプロテインキナーゼ活性の測定方法。
【請求項３】
前記ビーズ担体が磁気ビーズであり、前記測定工程において、前記電極の裏面に磁石を配置した状態で前記酸化電流の測定を行うことを特徴とする請求項２記載のプロテインキナーゼ活性の測定方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
前述の目的を達成するために、本発明に係るプロテインキナーゼ活性の測定方法は、プロテインキナーゼと基質と既知量のＡＴＰとを接触させる反応工程と、ＡＴＰとＡＤＰとを分離する分離工程と、分離したＡＴＰとＡＤＰとのいずれか一方を電極の表面に集めた状態でＡＴＰまたはＡＤＰのアデニン由来の酸化電流を測定する測定工程とを有することを特徴とする。