(57)【要約】【課題】本発明の目的は、ヌクレアーゼ耐性が高く、優れたRNA干渉効果を奏することができる二本鎖RNAを提供することである。【解決手段】標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列を含むセンス鎖、及び該センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖を有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる二本鎖RNAにおいて、下記の(i)〜(iv)の構成を一体として備えさせる：(i)前記センス鎖の3’末端又は前記アンチセンス鎖の3’末端の一方のみにダングリングエンドを備えさせる。(ii)前記ダングリングエンドを有しない側では、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖が完全相補的に対合させ、平滑末端を形成させる。(iii)前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖において、前記平滑末端側から１〜６番目のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよい。(iv)前記センス鎖の3’末端にダングリングエンドが形成されている場合には、前記アンチセンス鎖は２３塩基から構成されるものにし、また前記アンチセンス鎖の3’末端にダングリングエンドが形成されている場合には、前記アンチセンス鎖は２３〜２６塩基から構成されるものにする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列を含むセンス鎖、及び該センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖を有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる二本鎖RNAであって、
前記二本鎖RNAの両末端の内、一方はダングリングエンドを有し、他方は平滑末端を形成しており、
前記ダングリングエンドは、前記センス鎖の3’末端又は前記アンチセンス鎖の3’末端の一方に形成されており、
前記平滑末端側では、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖が完全相補的に対合しており、
前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖において、平滑末端側から１〜６番目のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよく、且つ
前記センス鎖の3’末端にダングリングエンドが形成されている場合には、前記アンチセンス鎖は２３塩基から構成されており、また前記アンチセンス鎖の3’末端にダングリングエンドが形成されている場合には、前記アンチセンス鎖は２３〜２６塩基から構成されている、ことを特徴とする二本鎖RNA。
【請求項２】
前記ダングリングエンドが、２〜６個のヌクレオチドから構成されている、請求項１に記載の二本鎖RNA。
【請求項３】
前記アンチセンス鎖の3’末端にダングリングエンドが形成されている、請求項１又は２に記載の二本鎖RNA。
【請求項４】
前記アンチセンス鎖の3’末端にダングリングエンドが形成されており、且つ前記センス鎖の3'末端側から１及び２番目のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドで構成されている、請求項１乃至３のいずれかに記載の二本鎖RNA。
【請求項５】
前記センス鎖が２１個のヌクレオチドから構成されてなり、且つ前記アンチセンス鎖が２３個ヌクレオチドから構成されてなるものであり、前記アンチセンス鎖の3’末端に２個のヌクレオチドから構成されるダングリングエンドが形成されている、請求項３又は４に記載の二本鎖RNA。
【請求項６】
前記センス鎖の3’末端のみにダングリングエンドが形成されている、請求項１又は２に記載の二本鎖RNA。
【請求項７】
前記センス鎖が２５個のヌクレオチドから構成されてなり、且つ前記アンチセンス鎖が２３個ヌクレオチドから構成されてなるものであり、前記センス鎖の3’末端に２個のヌクレオチドから構成されるダングリングエンドが形成されている、請求項６に記載の二本鎖RNA。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ガンやエイズなどの難病を効率的に治療する医薬の開発は、ライフサイエンス分野における大きな一つの課題である。この課題を克服できる可能性がある有力な方法の一つとして、近年、長い二本鎖RNAを用いるRNAi(RNA interference)法が注目されている。（非特許文献１参照）。しかしながらこのRNAi法は、哺乳細胞においてインターフェロン反応が誘導されることが確認され、哺乳動物細胞系ではRNAi法は適用し難いと考えられた。そこでTuschlらは、3’末端にダングリングエンドをもつ21塩基長の短い二本鎖RNAを化学的に合成し、哺乳導入細胞へ直接導入させることにより、インターフェロン応答を回避し配列特異的に高い遺伝子発現抑制能を示すことを報告した（非特許文献２参照）。また、非特許文献２では、センス鎖及びアンチセンス鎖の双方の3’末端に2塩基のダングリングエンドをもつ21塩基長のsiRNA（small interference RNA）は非常に高いRNA干渉効果が観測されたが、それ以外の短い二本鎖RNAにおいては顕著なRNA干渉効果が観測されなかったことを報告している。この報告により、今日では21塩基長の二本鎖RNAを用いたRNA干渉法が一般的となっている。また、近年では、27塩基対からなる二本鎖RNAが21塩基長からなるsiRNAに比べ100倍程度高いRNA干渉効果を示すことが明らかとなり、注目を浴びている。（非特許文献3参照）。
【０００２】
このsiRNA法は合成RNAを用いるのでサンプル調製も比較的容易であり、取り扱い操作も簡便で、かつ、非常に強力な効果を示す為、ライフサイエンス分野のみならずバイオビジネス分野においても大きな注目を浴びている。
【０００３】
しかしながら、短いRNAを用いるsiRNA法においても高濃度のRNA分子を用いる場合や細胞種においてインターフェロン応答が確認されるという報告がある。また、RNA分子を臨床的に応用していくには、生体内において、そのRNA分子が耐性を備えていること、即ちヌクレアーゼ耐性を有していることが必要とされる。このような従来技術を背景として、低濃度でも高い遺伝子ノックダウン能（RNA干渉効果）と共に、優れたヌクレアーゼ耐性をも備えている新しいタイプのRNA干渉分子の開発が期待されている。
【非特許文献１】Fire et. al, Nature, 391, 806-811 (1998)
【非特許文献２】Tuschl et. al., EMBO Journal, 20, 6877-6888 (2001)
【非特許文献３】J. Rossi et. al. Nature Biotech., 23, 222-226 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、上記従来技術の課題を解決することを目的とする。具体的には、本発明の目的は、ヌクレアーゼ耐性が高く、優れたRNA干渉効果を奏することができる二本鎖RNAを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねたところ、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列を含むセンス鎖、及び該センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖を有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる二本鎖RNAにおいて、下記の(i)〜(vi)の構成を充足させることにより、ヌクレアーゼ耐性が高く、格段に優れたRNA干渉効果を奏する二本鎖RNAを獲得できることを見出した。
(i)前記センス鎖の3’末端又は前記アンチセンス鎖の3’末端の一方のみにダングリングエンドを備えさせる。
(ii)前記ダングリングエンドを有しない側では、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖が完全相補的に対合させ、平滑末端を形成させる。
(iii)前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖において、前記平滑末端側から１〜６番目のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよい。
(iv)前記センス鎖の3’末端にダングリングエンドが形成されている場合には、前記アンチセンス鎖は２３塩基から構成されるものにし、また前記アンチセンス鎖の3’末端にダングリングエンドが形成されている場合には、前記アンチセンス鎖は２３〜２６塩基から構成されるものにする。
【０００６】
本発明は、上記知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。即ち、本発明は、下記に掲げる二本鎖RNAを提供する。
項１．  標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列を含むセンス鎖、及び該センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖を有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる二本鎖RNAであって、
前記二本鎖RNAの両末端の内、一方はダングリングエンドを有し、他方は平滑末端を形成しており、
前記ダングリングエンドは、前記センス鎖の3’末端又は前記アンチセンス鎖の3’末端の一方に形成されており、
前記平滑末端側では、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖が完全相補的に対合しており、
前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖において、平滑末端側から１〜６番目のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよく、且つ
前記センス鎖の3’末端にダングリングエンドが形成されている場合には、前記アンチセンス鎖は２３塩基から構成されており、また前記アンチセンス鎖の3’末端にダングリングエンドが形成されている場合には、前記アンチセンス鎖は２３〜２６塩基から構成されている、ことを特徴とする、二本鎖RNA。
項２．  前記ダングリングエンドが、２〜６個のヌクレオチドから構成されている、項１に記載の二本鎖RNA。
項３．  前記アンチセンス鎖の3’末端にダングリングエンドが形成されている、項１又は２に記載の二本鎖RNA。
項４．  前記アンチセンス鎖の3’末端にダングリングエンドが形成されており、且つ前記センス鎖の3'末端側から１及び２番目のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドで構成されている、項１乃至３のいずれかに記載の二本鎖RNA。
項５．  前記センス鎖が２１個のヌクレオチドから構成されてなり、且つ前記アンチセンス鎖が２３個ヌクレオチドから構成されてなるものであり、前記アンチセンス鎖の3’末端に２個のヌクレオチドから構成されるダングリングエンドが形成されている、項３又は４に記載の二本鎖RNA。
項６．  前記センス鎖の3’末端のみにダングリングエンドが形成されている、項１又は２に記載の二本鎖RNA。
項７．  前記センス鎖が２５個のヌクレオチドから構成されてなり、且つ前記アンチセンス鎖が２３個ヌクレオチドから構成されてなるものであり、前記センス鎖の3’末端に２個のヌクレオチドから構成されるダングリングエンドが形成されている、項６に記載の二本鎖RNA。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の二本鎖RNAによれば、ヌクレアーゼ耐性も高く、優れたRNA干渉効果を奏し、しかもその効果の持続性も優れている。更に、本発明の二本鎖RNAは、人工的に修飾されたRNAを用いなくても良いので、合成の面においても特別な処理を必要とせず、また、製造コスト面においても従来法と変わる点は無い。また、大量合成も可能であるので、医薬品の開発や学術的利用などその応用範囲は広く、産業上の利用価値が極めて高いと言える。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の二本鎖RNAは、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列を含むセンス鎖、及び該センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖を有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる二本鎖RNAであって、下記(1)〜(5)の構成を備えていることを特徴とするものである。
(1)前記二本鎖RNAの両末端の内、一方はダングリングエンドを有し、他方は平滑末端を形成しており、
(2)前記ダングリングエンドは、前記センス鎖の3’末端又は前記アンチセンス鎖の3’末端の一方に形成されており、
(3)前記平滑末端側では、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖が完全相補的に対合しており、
(4)前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖において、平滑末端側から１〜６番目のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよく、且つ
(5)前記センス鎖の3’末端にダングリングエンドが存在する場合には、前記アンチセンス鎖は２３塩基から構成されており、また前記アンチセンス鎖の3’末端にダングリングエンドが存在する場合には、前記アンチセンス鎖は２３〜２６塩基から構成されている。
【０００９】
以下、本発明の二本鎖RNAについて詳述する。
【００１０】
本発明の二本鎖RNAは、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列を含むセンス鎖を含む。
【００１１】
ここで、標的遺伝子とは、RNA干渉効果によって遺伝子発現の抑制対象となる遺伝子である。本発明の二本鎖RNAにおいて、標的対象遺伝子については、特に制限されず、該二本鎖RNAの用途に基づいて適宜選択することができる。
【００１２】
標的遺伝子中の標的配列については、RNA干渉効果によって遺伝子発現を抑制可能な配列である限り特に制限されず、公知の方法で、具体的には、NCBIのBLASTサーチ等を用いて適宜決定することができる。例えば、標的遺伝子のコード領域(ORF)の開始コドンから５０〜１００塩基下流のエキソン部分にある塩基"AA"に続く１９〜３０塩基からなる領域であって、GC含有量が50%前後の領域を標的配列とすればよい。このような標的配列に対する相補鎖を採用することで、優れたRNA干渉効果を獲得することが、当業界で経験的に明らかにされている。また、例えば、上記標的配列は、IDT社（Integrated DNA Technologies, INC）のマニュアル（Dicer Substrate RNAi Design）に従って設定することが出来る。また最近では、（i）アンチセンス鎖の5’末端がA/Uペアであり、（ii）センス鎖の5’末端がG/Cペアであり、（iii）アンチセンス鎖の5’末端側に5つ程度のA/Uペアがあり、且つ（vi）2本鎖中に9つ以上のG/Cペアが無い2本鎖RNAを設計することで高いRNA干渉効果をもつ2本鎖RNAをデザインできると報告されている（Ui-Tei et. al, Nucleic Acids Res., 32, 936-948 (2004)）。
【００１３】
本発明の二本鎖RNAにおいて、ダングリングエンドがセンス鎖の3'末端に存在している場合、センス鎖は、標的配列に相補的な塩基配列の3'末端に、ダングリングエンドを構成する塩基配列が連結した塩基配列からなるものである。また、ダングリングエンドがアンチセンス鎖の3'末端に結合している場合、センス鎖は、標的配列に相補的な塩基配列からなるものである。
【００１４】
本発明の二本鎖RNAにおいて、センス鎖を構成するヌクレオチドの数については、後述するダングリングエンドがセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれに存在しているかによって異なるが、例えば１９〜３０個、好ましくは２１〜２９個、更に好ましくは２１〜２７個が例示される。より具体的には、ダングリングエンドがセンス鎖の3'末端に存在する場合であれば、センス鎖を構成するヌクレオチドの数は、通常２４〜２９個、好ましくは２４〜２７個、更に好ましくは２５〜２７個が挙げられ；またダングリングエンドがアンチセンス鎖の3'末端に存在する場合であれば、センス鎖を構成するヌクレオチドの数は、通常２１〜２４個、好ましくは２１〜２３個、更に好ましくは２１〜２２個、特に好ましくは２１個が挙げられる。なお、ここで、センス鎖の3'末端にダングリングエンドが存在する場合には、センス鎖を構成するヌクレオチドの数とは、当該ダングリングエンドを構成するヌクレオチドの数と、標的配列に相補的な塩基配列を構成するヌクレオチドの数の総和を意味する。また、アンチセンス鎖の3'末端にダングリングエンドが存在する場合には、センス鎖を構成するヌクレオチドの数とは、標的配列に相補的な塩基配列を構成するヌクレオチドの数を意味する。
【００１５】
また、本発明の二本鎖RNAは、上記センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖を有する。
【００１６】
本発明の二本鎖RNAにおいて、ダングリングエンドがセンス鎖の3'末端に存在している場合、当該アンチセンス鎖は、センス鎖の「標的配列に相補的な塩基配列」部分に対して相補的である塩基配列からなるものである。一方、ダングリングエンドがアンチセンス鎖の3'末端に存在している場合、当該アンチセンス鎖は、センス鎖の「標的配列に相補的な塩基配列」部分に対して相補的である塩基配列の3'末端に、ダングリングエンドを構成する塩基配列が連結した塩基配列からなるものである。
【００１７】
なお、ダングリングエンドが前記センス鎖の3’末端に存在する場合には、当該アンチセンス鎖を構成するヌクレオチドの数は、２３個である。また、ダングリングエンドがアンチセンス鎖の3’末端に存在する場合には、当該アンチセンス鎖を構成するヌクレオチドの数は、２３〜２６個、好ましくは２３〜２５個、更に好ましくは２３〜２４個、特に好ましくは２３個である。
【００１８】
また、本発明において、センス鎖及びアンチセンス鎖はRNA鎖であり、これらを構成するヌクレオチドは、基本的にはリボヌクレオチドであるが、分解酵素耐性の向上を目的として2’−O−メチル修飾型や2’−F修飾型、LNA（Locked Nucleic Acid）等の各種化学修飾型ヌクレオチド、或いはデオキシリボヌクレオチド等をRNA配列中に含んでいてもよい。このような化学修飾型ヌクレオチドとしては、具体的には、ホスホロチオエート型、ボラノフォスフェート型DNA/RNA等のリン酸骨格を修飾したもの；2’−0Me修飾RNA、2’−F修飾RNA等の2’修飾ヌクレオチド；LNA（Locked Nucleic Acid）やENA（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids）等のヌクレオチドの糖分子を架橋した修飾ヌクレオチド；PNA（ペプチド核酸）、モリフォリノヌクレオチド等の基本骨格が異なる修飾ヌクレオチド；５−フルオロウリジンや５−プロピルウリジンなどといった塩基修飾型ヌクレオチド等が例示される。
【００１９】
本発明の二本鎖RNAには、前述するように、センス鎖の3’末端又はアンチセンス鎖の3’末端の一方のみにダングリングエンドが存在している。本明細書において、ダングリングエンドという用語とは、対合する塩基が存在しないために二本鎖を形成できず、一本鎖が単独で存在している塩基配列部分を意味する。
【００２０】
本発明の二本鎖RNAにおいて、ダングリングエンドを構成するヌクレオチドの数は、ダングリングエンドの存在位置等に応じて適宜設定すればよいが、通常２〜６個、好ましくは２〜４個、更に好ましくは２個が例示される。
【００２１】
また、ダングリングエンドを構成するヌクレオチドの配列についても、特に限定されない。例えば、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、又はこれらを組み合わせて、配列が適宜設定されていればよい。また、分解酵素耐性の向上を目的として2’−O−メチル修飾型や2’−F修飾型、LNA（Locked Nucleic Acid）等の前述する各種化学修飾型ヌクレオチドをダングリングエンド配列中に含んでいてもよい。
【００２２】
本発明の二本鎖RNAは、上記センス鎖とアンチセンス鎖がハイブリダイズしたものであり、前記センス鎖の3’末端又は前記アンチセンス鎖の3’末端の一方にダングリングエンドが存在し、ダングリングエンドが存在しない側は、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖が完全相補的に対合して平滑末端を形成している。ここで、「完全相補的に対合」とは、ダングリングエンドを存在させることなく、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖がハイブリダイズしていることを意味する。
【００２３】
また、本発明の二本鎖RNAにおいて、RNA干渉効果をより一層有効に奏させるという観点から、前記ダングリングエンドを有していない側（即ち、平滑末端側）では、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の平滑末端側から１〜６番目、好ましくは１〜４番目、更に好ましくは１及び２番目のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよい。特に、前記センス鎖の3’末端側が平滑末端を形成している場合において、前記センス鎖の平滑末端側（即ち3’末端側）から１〜４番目、好ましくは１〜３番目、更に好ましくは１及び２番目のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドで構成されていていることによって、一層有効なRNA干渉効果を奏させることができる。
【００２４】
更に、本発明の二本鎖RNAとして、格段に優れたRNA干渉効果を発現させるという観点から、以下の(A)〜(D)の態様の二本鎖RNAが好適に例示される。
(A)センス鎖が２１個のヌクレオチドから構成されてなり、且つアンチセンス鎖が２３個のヌクレオチドから構成されてなり、アンチセンス鎖の3’末端に２個のヌクレオチドからなるダングリングエンドが存在する二本鎖RNA。
(B)センス鎖が２１個のヌクレオチドから構成されてなり、且つアンチセンス鎖が２３個のヌクレオチドから構成されてなり、アンチセンス鎖の3’末端に２個のヌクレオチドからなるダングリングエンドが存在し、センス鎖の3’末端側から１及び２番目のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドにより構成されている、二本鎖RNA。
(C)センス鎖が２３個のヌクレオチドから構成されてなり、且つアンチセンス鎖が２５個のヌクレオチドから構成されてなり、アンチセンス鎖の3’末端に２個のヌクレオチドからなるダングリングエンドが存在し、センス鎖の3’末端側から１及び２番目のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドにより構成されている、二本鎖RNA。
(D)センス鎖が２５個のヌクレオチドから構成されてなり、且つアンチセンス鎖が２３個のヌクレオチドから構成されてなり、センス鎖の3’末端に２個のヌクレオチドからなるダングリングエンドが存在する二本鎖RNA。
【００２５】
本発明の二本鎖RNAは、標的遺伝子の発現を抑制することを目的として、細胞内に導入されることにより使用される。具体的には、本発明の二本鎖RNAについて、従来siRNAとして使用されているRNAと同様の方法で、目的の細胞内に導入され使用される。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。これらの実施例は、単なる例示であり、本発明を限定するものではない。
【００２７】
実施例
1. 様々なタイプの2本鎖RNAのデザインと合成
ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子のmRNAと相同配列を持ち、ウミシイタケルシフェラーゼの遺伝子発現を抑制できる21塩基長〜27塩基長からなる1本鎖RNA（アンチセンス鎖）と、該1本鎖と相補的な21塩基長〜27塩基長のRNA（センス鎖）の2本鎖RNAをデザイン合成した。該二本鎖RNAはアンチセンス鎖とセンス鎖の組み合わせにより様々な形態の二本鎖を形成できる。該2本鎖RNAにおいてダングリングエンド（一本鎖領域）を持たない完全２本鎖RNAをDS (double strand) RNA、二本鎖RNAの両末端にダングリングエンド（オーバーハング）を持つ2本鎖RNAをSi RNA、センス鎖の5’末端を左側に示したときに右側のみにダングリングエンド（オーバーハング）を持つ2本鎖RNAをRO (Right Overhang) RNA、センス鎖の5’末端を左側に示したときに左側のみにダングリングエンド（オーバーハング）を持つ2本鎖RNAをLO (Left Overhang) RNAと名付けた。また、各種2本鎖RNAの命名はセンス鎖をA（A1又はA2）、アンチセンス鎖をB（B1のみ）とし、センス鎖およびアンチセンス鎖となる１本鎖RNAの塩基の数を記載することにより区別している。また、RNAの3’末端の２塩基にDNAを持つものがあり、1本鎖RNAの塩基の数の次にddと記載する。センス鎖は2種類のものをデザインしたので区別のためにA１及びA2としている。例えば、完全2本鎖の27塩基長からなる２本鎖RNAはDS 27A1/27B1 RNA；右側に2塩基長のダングリングエンドを持ち、27塩基長のセンス鎖と25塩基長のアンチセンス鎖からなる2本鎖RNAをRO 27A1/25B1 RNA；左側に2塩基長のダングリングエンドを持ち、21塩基長のセンス鎖と23塩基長のアンチセンス鎖からなり、且つセンス鎖の3’末端に2塩基のDNAを持つ２本鎖RNAをLO 21ddA2/23B1 RNAと記載する。図１に、デザイン・合成した2本鎖RNAを示す。また、使用したRNAの配列は、以下の通りである。
＜センス鎖＞
27nt 27A1:5’-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3’
27A2:5’-GGCCUUUCACUACUCCUACGAGCACCA−3’
25nt 25A1:5’-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGC-3’
25A2:5’-GGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3’
23nt 23A1:5’-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGA-3’
23A2:5’-GGCCUUUCACUACUCCUACGAGC-3’
23A2:5’-GGCCUUUCACUACUCCUACGAdGdC-3’
21nt 21A1:5’-CUGGCCUUUCACUACUCCUAC -3’
21A2:5’-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3’
21A2:5’-GGCCUUUCACUACUCCUACdGdA-3’
＜アンチセンス鎖＞
27nt 27B1:5’-GUGCUCGUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3’
25nt 27B1:5’-GCUCGUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG -3’
23nt 27B1:5’-UCGUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3’
21nt 27B1:5’-GUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3’ 
(アンダーライン部位はデオキシリボヌクレオチド)。
【００２８】
全てのRNAは林化成株式会社より購入し（HPLC精製、MALDI-TOF MS解析済み）、UVスペクトル検出器を用い、260nmの吸光度を測定することにより濃度を算出した。また、universal buffer（林化成株式会社製）中、同モルのセンス鎖およびアンチセンス鎖１本鎖RNAを混合し、92℃で２分間加熱した後、4℃まで徐々に温度を下げることで作成した。合成した各種2本鎖RNAは、20％ ポリアクリルアミドゲルを用い、250Vの条件化で60分間電気泳動し、その後、銀染色キット（GEヘルスケア バイオサイエンス）で2本鎖RNAを染色することにより確認した。
【００２９】
２．様々な2本鎖RNAの分解酵素耐性
２−１．DS RNAの分解酵素耐性（参考試験）
完全２本鎖RNA であるDS RNA（DS 27A1/27B1 RNA, DS 25A1/25B1 RNA, DS 23A1/23B1 RNA, DS 21A1/21B1 RNA：図１参照）のヌクレアーゼ耐性を検討した。実験は、最終濃度が2 μMになるよう調整した各種DS RNAを10％FBS（三光純薬株式会社）を含むRPMI-1640培地（インビトロジェン社製）中(最終量110μl)、37℃でインキュベートし、0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h後にそれぞれ10μl取り、2μlのローデングダイを含むサンプルチューブに添加した。分解反応を停止させる為、サンプル採取後すぐ液体窒素中にて凍結し、−20℃にて保存した。得られた産物を20％ ポリアクリルアミドゲルを用い250Vで70分間サンプルを電気泳動した。その後、銀染色キット（GEヘルスケア バイオサイエンス社製）で産物を染色し（染色条件は製品マニュアル参照）、ChemiImager 4000(Alpha Innotech corporation製)でゲル解析を行った。比較として、一般にsiRNA法で使用されている21塩基長のRNAからなり、3’末端に2塩基長のダングリングエンドを持つSi 21A2/21B1 RNAも同様の方法で分解酵素耐性を検討した。
【００３０】
図2にDS RNAの分解酵素耐性結果を示す。この結果より、２本鎖RNAの鎖長が長い方が分解酵素耐性に優れていることが示唆された。
【００３１】
２-２．Si RNAの分解酵素耐性（参考試験）
2本鎖RNAの両末端の3’末端側に2nt のダングリングエンドを持つSi RNA（Si 27A2/27B1 RNA, Si 25A2/25B1 RNA, Si 23A2/23B1 RNA, Si 21A2/21B1 RNA：図１参照）のヌクレアーゼ耐性を検討した。実験は、上記２−１と同様の条件下で行った。
【００３２】
図３にSi RNAの分解酵素耐性結果を示す。その結果、27塩基長Si RNA(それぞれ、Si 27A2/27B1 RNA)は、10％血清を含む培地中においても比較的安定に存在していた。一方、25塩基長、23塩基長および21塩基長のRNAからなるSi RNA(Si 25A2/25B1 RNA, Si 23A2/23B1 RNA, Si 21A2/21B1 RNA)は、RNA鎖長が短くなるにつれ分解速度が速くなり、特にSi 21A2/21B1 RNAは10時間程度で完全に分解されていた。
【００３３】
２-３．RO RNAの分解酵素耐性
センス鎖の5’末端を左側に示したときに右側にダングリングエンド（オーバーハング）をもつ2本鎖RNAであるRO RNA（RO 27A1/25B1 RNA, RO 27A1/23B1 RNA, RO 27A1/21B1 RNA, RO 25A1/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）, RO 25A1/21B1 RNA, RO 23A1/21B1 RNA, RO 23A1/27B1 RNA, RO 23A1/25B1 RNA, RO 21A1/25B1 RNA, RO 21A1/23B1 RNA：図１参照）のヌクレアーゼ耐性を検討した。実験は、２−１と同様の条件下で行った。
【００３４】
図４及び５にRO RNAの分解酵素耐性結果を示す。その結果、３’末端にダングリングエンドを持つRO RNAは、DS RNA同様、RNAの鎖長が短くなるにつれ、その分解酵素耐性も減少した。また、ダングリングエンドとなる１本鎖RNA領域の長さも短い方が高い分解酵素耐性を示した。RO 25A1/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）は、最も優れたRO 27A1/25B1 RNAの分解酵素耐性に比べ若干劣るものの、優れた分解酵素耐性を示しており、Si 21A2/21B1 RNAと比較しても格段に高い耐性を示すことが明らかとなった（図４）。
【００３５】
一方、５’末端にダングリングエンドを持つRO RNAは、全ての２本鎖RNAにおいて速やかに分解され、Si 21A2/21B1 RNAよりも分解速度は増していた（図５）。
【００３６】
なお、それぞれの半減期は、RO 27A1/25B1 RNAで約82時間、RO 27A1/23B1 RNAで約32時間、RO 27A1/21B1 RNAで約2.5時間、RO 25A1/23B1 RNAで約26時間、RO 25A1/21B1 RNAで約2時間、RO 23A1/21B1 RNAで約6時間、RO 23A1/27B1で0.5時間以下、RO 23A1/25B1で0.5時間以下、RO 21A1/25B1で0.5時間以下、及びRO 21A1/23B1で0.5時間以下であった。
【００３７】
２−４．LO RNAの分解酵素耐性
センス鎖の5’末端を左側に示したときに左側にダングリングエンド（オーバーハング）をもつ2本鎖RNA であるLO RNA（LO 25A2/27B1 RNA,LO 23A2/25B1 RNA, LO 21A2/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）：図１参照）のヌクレアーゼ耐性を検討した。実験は、上記２−１と同様の条件下で行った。
【００３８】
図６にLO RNAの分解酵素耐性結果を示す。その結果、鎖長が長いLO RNAの方が鎖長が短いLO RNAよりも高い分解酵素耐性を示す傾向が認められたが、LO 21A2/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）は優れた分解酵素耐性を備えていることが確認された。また、見かけの構造が同様なRO RNAとLO RNAを比較したとき（例えば、RO 27A1/25B1 RNAと LO 25A2/27B1 RNA や、RO 23A1/21A1 RNA と LO 21A2/23B1 RNA）、LO RNAの方がRO RNAよりも優れた分解酵素耐性を示しているとこが明らかとなった。
【００３９】
なお、LO RNAのそれぞれの半減期は、LO 25A2/27B1 RNAで100時間以上、LO 23A2/25B1 RNAで100時間以上、及びLO 21A2/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）で約53時間であった。
【００４０】
３．様々な２本鎖RNAのDicerによるプロセシング
３‐１．DS RNAのDicerによるプロセシング（参考試験）
それぞれのDS RNA（図１参照）のDicerによるプロセシングを検討した。Dicerによる切断実験は、20mM Tris-HCl(pH 8.0), 15 mM NaCl, 2.5mM Mg2Cl溶液中、0.5 UのリコンビナントDicer（Gene Therapy Systems社製）と最終濃度2 μMになるよう調整したDS RNAをサンプルチューブに10 μl準備し、37℃に設定したインキュベーター中、12時間インキュベートした。その後、Dicerによる切断反応を停止させる為に、2μlのDicer Stop Solution (Gene Therapy Systems社製)を反応溶液に加え、更に2μlのローデングダイを加えた。得られた産物を20％ポリアクリルアミドゲルを用い250Vで70分間サンプルを電気泳動した。その後、銀染色キット（GEヘルスケア バイオサイエンス社製）で産物を染色し（染色条件は製品マニュアル参照）、ChemiImager 4000(Alpha Innotech corporation製)でゲル解析を行った。また、コントロールとしてDicer処理していない21塩基長の2本鎖RNAからなるsiRNA (Si 21A2/21B1 RNA)を用いた。
【００４１】
図７に結果を示す。その結果、DS 27A1/27B1 RNAはリコンビナントDicer存在下においてSi 21A2/21B1 RNAと同様の位置にバンドが確認され、Dicerの切断によって2塩基のダングリングエンドを含む21塩基長のsiRNAが生成していることが強く示唆された。また、DS 25A1/25B1 RNAも同様にリコンビナントDicerによりプロセシングを受けていた。DS 23A1/23B1 RNAは、２本鎖RNAの１部はプロセシングされていたものの、殆どの２本鎖RNAでプロセシングを受けていなかった。DS 21A1/21B1 RNA は、全くDicerによるプロセシングされていなかった。この結果、RNA鎖長の長い2本鎖RNAの方がDicerによるプロセシングを受けやすいことが示唆された(図７)。
【００４２】
３‐２．Si RNAのDicerによるプロセシング（参考試験）
Si RNA（図１参照）のDicerによるプロセシングを検討した。Dicerによる切断実験は、３−１と同様の条件で行った。図８に結果を示す。その結果、Si 27A2/27B1 RNAはリコンビナントDicerにより21塩基長の2本鎖RNAまでプロセシングを受けていることが明らかとなった。また、Si 25A2/25B1 RNAも同様にリコンビナントDicerにより21塩基長の2本鎖RNAまでプロセシングを受けていることが明らかとなった。Si 23A2/23B1 RNAは殆どの2本鎖RNAがリコンビナントDicerによるプロセシングを受け21塩基長の2本鎖RNAが生成していたが、1部のRNAで21塩基長のRNA以外の産物が生成していた。これらの結果より、Si RNAにおいてもRNA鎖長の長い方がDicerによるプロセシングを受けやすいことが分かった。また、DS RNAに比べSi RNAの方がDicerによるプロセシングを受けやすいことも明らかとなった(図８)。
【００４３】
３‐３．RO RNAのDicerによるプロセシング
RO RNA (RO 27A1/25B1 RNA, RO 27A1/23B1 RNA, RO 27A1/21B1 RNA, RO 25A1/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）, RO 25A1/21B1 RNA, RO 23A1/21B1 RNA, RO 23A1/27B1 RNA, RO 23A1/25B1 RNA, RO 21A1/25B1 RNA, RO 21A1/23B1 RNA：図1参照)のDicerによるプロセシングを検討した。Dicerによる切断実験は、上記３−１と同様の条件で行った。得られた結果を図９に示す。その結果、センス鎖に27塩基長の1本鎖RNAをもつRO RNA (RO 27A1/25B1 RNA, RO 27A1/23B1 RNA, RO 27A1/21B1 RNA)は、全てのタイプでリコンビナントDicerによるプロセシングを受け、21塩基長の2本鎖RNAと同等の位置にバンドが確認された。センス鎖に25塩基長の1本鎖RNAを持ち、3’末端にダングリングエンドをもつRO 25A1/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）及びRO 25A1/21B1 RNAについては、リコンビナントDicerによる処理後、RO 25A1/21B1 RNAにおいて21塩基長の2本鎖RNAと同様に位置にバンドが確認されたものの、RO 25A1/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）においては21塩基長の2本鎖RNAの位置にバンドが確認されず、異なったDicing産物が存在する可能性が示唆された。また、どちらの2本鎖RNAもDicer処理後のRNAのバンドは大きく広がっていた。また、センス鎖に23塩基長の1本鎖RNAを持ち、3’末端にダングリングエンドをもつRO 23A1/21B1 RNA及び、アンチセンス鎖の5’末端をリン酸化したRO 23A1/21B1p RNAも同様に評価した。RO 23A1/21B1 RNAは１部がDicerによるプロセシング反応にて21塩基長の2本鎖RNAと同様のバンドが確認された。RO 23A1/21B1p RNAは全ての分子がDicerによるプロセシングを受けていることが明らかとなった。この結果より、リン酸化している方がDicerによる認識を受けやすいことが示唆された。一方、5’末端にダングリングエンドを持つRO RNA（RO 23A1/25B1 RNA, RO 21A1/25B1 RNA, RO 21A1/23B1 RNA）は、リコンビナントDicerで処理した後も、処理する前と殆ど同じ位置にバンドが確認され、Dicerによるプロセシングを受けてないことが明らかとなった(図９)。
【００４４】
３‐４．LO RNAのDicerによるプロセシング
センス鎖の5’末端を左側に示したときに左側にダングリングエンド（オーバーハング）をもつ2本鎖RNA であるLO RNA（LO 25A2/27B1 RNA,LO 23A2/25B1 RNA,LO 21A2/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）：図1参照）のDicerによるプロセシングを検討した。また、LO RNAのセンス鎖の3’末端に２塩基のDNAを持つLO RNA (LO 23ddA2/25B1 RNA(本発明二本鎖RNA)、及びLO 21ddA2/23B RNA(本発明二本鎖RNA):図１参照)についても同様にDicerによるプロセシングを検討した。 Dicerによる切断実験は、上記３−１と同様の条件で行った。
【００４５】
結果を図１０及び図１１に示す。この結果から、LO 25A2/27B1 RNAはリコンビナントDicerで処理することにより、21塩基長の2本鎖RNAとほぼ同位置にバンドが確認され、21 塩基長のsiRNAにプロセシングされていることが強く示唆された。また、LO 23A2/25B1 RNAも同様にDicerによるプロセシングを受け、21塩基長の2本鎖RNAとほぼ同位置にバンドが確認された。また、LO 21A2/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）は、そのRNA鎖長が極端に短いにも関わらず、2本鎖RNA分子の殆どがDicerによるプロセシングを受け21塩基長のRNAが生産されていた。また、プロセシングを受けていないLO 21A2/23B1 RNAは、Dicer処理をしていないRNAと同位置であった(図１０)。LO 23ddA2/25B1 RNA(本発明二本鎖RNA)及びLO 21ddA2/23B RNA(本発明二本鎖RNA)については、LO 23ddA2/25B1 RNAはDicerによるプロセシングを受け21塩基長の2本鎖RNAとほぼ同位置にバンドが確認されたが、LO 21ddA2/23B RNAはDicer存在下及び非存在下において同様の位置にバンドが確認され、プロセシングを受けにくいことが分かった(図１１)。
【００４６】
４．様々なタイプの2本鎖RNAのRNA干渉効果
４−１．DS RNAのRNA干渉効果（参考試験）
それぞれのDS RNA(図１参照)のRNA干渉効果をウミシイタケルシフェラーゼをターゲットとして評価した。実験前に1x105cell/mlに調整したHeLa細胞（ヒト子宮頸ガン細胞、東北大学加齢医学研究所）を９６wellプレート上にそれぞれ100μl撒き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェル上の古い培地を取り除き、抗生物質を含ない新しい培地をウェルにそれぞれ80 μl加え、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼを発現するベクター(psiCHECKTM-2 Vector: プロメガ社製)とLipofectamineTM  2000 (商品名、インビトロジェン社製)の複合溶液を10μlずつHeLa細胞が入ったそれぞれのウェルに加えた。ここで発現ベクターは１ウェルあたり0.02μgになるように、またLipofectamineTM  2000は１ウェルあたり0.2μlになるよう設定し、OptiMem(インビトロジェン社製)で必要量を調整した。また、複合体を形成させる為に、発現ベクターとLipofectamineTM  2000をOptiMemを用いて混合した後、室温で30分間インキュベートした。上記複合溶液を加えた後、細胞を5％ CO2 存在下、37℃で4時間インキュベートした。その後、ウミシイタケルシフェラーゼの遺伝配列と相同的なアンチセンス配列を含む2本鎖RNA を最終濃度が0nM, 0.2nM, 0.5nM, 1nM, 2nM, 5nM, 10nMになるようLipofectamineTM  2000 (インビトロジェン社製) と複合体を形成させ、10μlの複合体溶液を発現ベクターを導入したHeLa細胞に加えた。ここで、1ウェルあたりの最終量は100 μlとなる。RNAとLipofectamineTM  2000の複合溶液は、1ウェルあたり5 μlのRNA水溶液と5 μlのLipofectamineTM  2000 (0.2μl) OptiMem溶液を混合し、30分間室温でインキュベートすることにより作成した。2本鎖RNAを導入した後、48時間インキュベートし、Dula-GloTMLuciferase Assay System（プロメガ社製）を用いてホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現量をルミノメータ（MicroLumat LB96p: BERTHOLD社製）で測定し、ホタルルシフェラーゼの発現量をコントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼの発現量(%)を算出した。
【００４７】
図１２には0.5 nM濃度のときの各種DS RNAのRNA干渉効果の結果を示す。その結果、0.5ｎMにおけるそれぞれのルシフェラーゼ発現量は、DS 25A1/25B1 RNAで59.32 (±3.19)％、DS 21A1/21B1 RNAで69.37 (±2.37)％であった。
【００４８】
４−２．Si RNAのRNA干渉効果
Si RNA(図１参照)のRNA干渉効果をウミシイタケルシフェラーゼをターゲットとして評価した。実験は４−１と同様の条件で行った。
【００４９】
図１３には0.5 nM濃度のときのSi RNAのRNA干渉効果の結果を示す。その結果、ルシフェラーゼ発現量は、Si 25A2/25B1 RNAで55.21 (±1.60)％であった。
【００５０】
４−3．RO RNAのRNA干渉効果
それぞれのRO RNA(図1参照)のRNA干渉効果をウミシイタケルシフェラーゼをターゲットとして評価した。実験は上記４−１と同様の条件で行った。
【００５１】
図１４に0.5 nM濃度のときの各種RO RNAのRNA干渉効果の結果を示す。その結果、RO 27A1/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）や RO 25A1/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）といった、アンチセンス鎖に23塩基長のRNAを持つものにおいて、高い遺伝子発現抑制能を示し、優れたRNA干渉効果が観測された。特に、 RO 25A1/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）は、非常に優れたRNA干渉効果を示し、DS RNAやSi RNAに比べても、RO 25A1/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）は顕著に高いRNA干渉効果が観測された。なお、RO 27A1/23B1 RNA のRNA干渉効果はDS 27A1/27B1 RNAやSi 21A2/21B1 RNAと同程度であった。一方、その他のRO RNA（RO 27A1/25B1 RNA, RO 27A1/21B1 RNA，RO 27A1/21B1 RNA，RO 23A1/21B1 RNA，RO 23A1/21B1p RNA，RO 23A1/25B1 RNA, RO 23A1/25B1 RNA，RO 21A1/25B1 RNA，RO 21A1/23B1 RNA）は特別に高いRNA干渉効果は観測されなかった。なお、0.5ｎMにおけるそれぞれのルシフェラーゼ発現量は、RO 27A1/25B1 RNAで58.15(±3.14)％、RO 27A1/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）で30.09 (±2.17)％、RO 27A1/21B1 RNAで61.74 (±0.71)％、RO 25A1/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）で13.25 (±0.70)％、RO 25A1/21B1 RNAで73.14 (±7.79)％、RO 23A1/21B1 RNAで80.06 (±1.62)％、RO 23A1/21B1p RNAで57.79 (±1.97)％、RO 23A1/25B1 RNAで38.19 (±1.99)％、RO 21A1/25B1 RNAで65.32 (±4.31)％、及びRO 21A1/23B1 RNAで52.81 (±2.84)％であった。
【００５２】
これらの結果より、RO RNAを用いる場合は、センス鎖の3’末端にダングリングエンドを持ち、かつ、アンチセンスが23塩基長のものが適しており、特にRO 25A/23B RNAは非常に優れた遺伝子発現抑制能を保有するという知見が得られた。
【００５３】
４−４．LO RNAのRNA干渉効果
それぞれのLO RNA(図1参照)のRNA干渉効果をウミシイタケルシフェラーゼをターゲットとして評価した。 実験は上記４−１と同様の条件で行った。
【００５４】
図１５に、0.5 nM濃度のときの各種LO RNA（LO 23A2/25B1 RNA,LO 21A2/23B1 RNA）のRNA干渉効果の結果を示し、図１６にセンス鎖3'末端の２塩基にDNAを持つLO RNA (LO 23ddA2/25B1 RNA,LO 21ddA2/23B1 RNA)のRNA干渉効果の結果を示す。
【００５５】
その結果、今回使用したLO RNA (LO 23A2/25B1 RNA,LO 21A2/23B1 RNA, LO 23ddA2/25B1 RNA,LO 21ddA2/23B1 RNA；全て本発明二本鎖RNA)において高い遺伝子発現抑制能が観測された。特に、 LO 21A2/23B1 RNA、LO 23ddA2/25B1 RNA、及びLO 21ddA2/23B1 RNAは、特段に優れたRNA干渉効果を示し、DS RNAやRO RNAと比べると、少なくとも数十倍〜数倍高いものであった。0.5ｎMにおけるそれぞれのルシフェラーゼ発現量は、LO 23A2/25B1 RNAで25.18(±1.97)％、LO 21A2/23B1 RNAで9.57 (±0.39)％、LO 23ddA2/25B1 RNAで8.57 (±0.79)％、LO 21ddA2/23B1 RNAで8.65(±2.19)％であった。
【００５６】
これらの結果より、アンチセンス鎖の3’末端にダングリングエンドを持つLO RNAは非常に高いRNA干渉効果を示すことが明らかとなった。この理由として、LO RNA構造をもつRNAは、細胞内におけるDicerやRISCなどのRNA干渉反応に必要なタンパク質群に認識される可能性が高いのではないかと考察する。また、LO RNAの中でも、LO 21A/23B RNAやセンス鎖の3’末端に2塩基のDNAを持つLO 23ddA2/25B1 RNA及びLO 21ddA2/23B1 RNAは特に優れたRNA干渉効果を示し、また、今回用いた様々な2本鎖RNAの中で格段に優れたRNA干渉効果を示した。
【００５７】
５．様々な２本鎖RNAのRNA干渉効果の持続性
次に、様々な２本鎖RNAのRNA干渉効果の持続性を検討した。RNA干渉効果の持続性を評価するために、50nMに調整した２本鎖RNAをそれぞれ７日間、HeLa細胞（ヒト子宮頸ガン細胞、東北大学加齢医学研究所）とインキュベートし、その後のRNA干渉効果を追跡した。遺伝子発現抑制実験で用いたターゲットはウミシイタケルシフェラーゼで、測定の48時間前にホタル及びウミシイタケルシフェラーゼの遺伝子をもつベクター(psiCHECKTM-2 Vector: プロメガ社製)をLipofectamineTM  2000(インビトロジェン社製)を用い細胞へ導入させた。遺伝子発現抑制解析は、Dula-GloTMLuciferase Assay System（プロメガ社製）を用いてホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現量をルミノメータで測定し、ホタルルシフェラーゼの発現量をコントロールとしウミシイタケルシフェラーゼの発現量（％）を算出した。ここで使用した発現ベクターやRNAの導入方法は前述と同様の方法でLipofectamineTM  2000と複合体を形成させ、それぞれ10 μlのサンプルを細胞に添加した。また、細胞溶液の最終容量は100 μlになるよう調整した。
【００５８】
得られた結果を図１７、図１８、及び図１９に示す。その結果、RO RNAにおいてRNA干渉効果が高かったRO 27A1/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）やRO 25A1/23B1 RNA（本発明二本鎖RNA）において７日目で高い遺伝子発現抑制が観測され、RNA干渉効果の持続性にも優れていることが明らかとなった。また、LO 23A2/25B1 RNAやLO 21A2/25B1 RNAにおいても７日目で高い遺伝子発現抑制が観測され、特にLO 21A2/23B1 RNA (本発明二本鎖RNA)において優れたRNA干渉効果の持続性が観測された。
【００５９】
６．各種二本鎖RNAのHeLa細胞に対する細胞毒性
二本鎖RNA（DS RNA, Si RNA, RO RNA, LO RNA）のHeLa細胞に対する細胞毒性を評価した。実験前に1x105cell/mlに調整したHeLa細胞（ヒト子宮頸ガン細胞、東北大学加齢医学研究所）を９６wellプレート上にそれぞれ100μl撒き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェル上の古い培地を取り除き、抗生物質を含ない新しい培地をウェルにそれぞれ90 μl加えた。各種RNAの細胞毒性は、細胞内におけるRNAの毒性を評価する為に、LipofectamineTM 2000(インビトロジェン社製)で2本鎖RNAを積極的に細胞中へ導入させることにより評価した。2本鎖RNA の最終濃度が0nM, 0.2nM, 0.5nM, 1nM, 2nM, 5nM, 10nMになるようLipofectamineTM  2000 (インビトロジェン社製) と複合体を形成させ、10μlの複合体を上記の90 μlの培地を含むHeLa細胞へ加え、1ウェルあたりの最終量を100 μlとした。RNAとLipofectamineTM  2000の複合溶液は、1ウェルあたり5 μlのRNA水溶液と5 μlのLipofectamineTM  2000 (0.2μl) OptiMem溶液を混合し、30分間室温でインキュベートすることにより作成した。2本鎖RNAを導入したHeLa細胞は5％ CO2 存在下、37℃で48時間インキュベートした。その後、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ社製）中のCellTiter-Glo Reagent を各ウェルに50μl加え、約60min攪拌後、ルミノメータ（MicroLumat LB96p: BERTHOLD社製）で各ウェル中のLuminescence量を測定した。測定したLuminescence量は生細胞中のATPに依存するので、コントロール細胞のLuminescence量（RNAが0nM、LipofectamineTM  2000が0μlのとき。これを生存率100％とする。）と各種2本鎖を導入した細胞のLuminescence量の相対値を算出することにより、各ウェル中の生存率を算出した。（プロメガ社CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assayマニュアル参照。）
今回使用した2本鎖RNAの最大濃度である10nMのときの細胞生存率の結果を図２０に示す。図２０において、「A」はDS RNA、「B」はSi RNA、「C」はRO RNA、「D」はLO RNAを用いたときの細胞生存率の結果である。その結果、全て二本鎖RNAにおいて顕著な細胞毒性は観測されなかった。また、今回得られた結果の中で生存率が比較的低いもの（生存率約80％）においても、LipofectamineTM  2000を単独で同量（0.2μl）加えたときと比べると高い生存率を示した（生存率  約60％）。即ち、生存率が比較的低いものについてもRNAによる毒性ではなく、LipofectamineTM  2000による毒性の影響が可能性として十分に高いと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】合成した各種2本鎖RNAの構造を示す図である。
【図２】DS RNA のヌクレアーゼ耐性結果を示す図である。
【図３】Si RNA のヌクレアーゼ耐性結果を示す図である。
【図４】RO RNA(RO 27A1/25B1 RNA, RO 27A1/23B1 RNA, 27A1/21B1 RNA， RO 25A1/23B1 RNA, RO 25A1/21B1 RNA, RO 23A1/21B1 RNA) のヌクレアーゼ耐性結果を示す図である。
【図５】RO RNA(RO 23A1/27B1 RNA, RO 23A1/25B1 RNA, RO 21A1/25B1 RNA, RO 21A1/23B1 RNA) のヌクレアーゼ耐性結果を示す図である。
【図６】LO RNA のヌクレアーゼ耐性結果を示す図である。
【図７】DS RNA のDicerによるプロセシングを検討した結果を示す図である。
【図８】Si RNA のDicerによるプロセシングを検討した結果を示す図である。
【図９】RO RNA のDicerによるプロセシングを検討した結果を示す図である。
【図１０】LO RNA のDicerによるプロセシングを検討した結果を示す図である。
【図１１】センス鎖の3’末端に2塩基のDNAを持つLO RNA のDicerによるプロセシングを検討した結果を示す図である。
【図１２】0.5 nM濃度のときのDS RNAのRNA干渉効果の結果を示す図である。
【図１３】0.5 nM濃度のときのSi RNAのRNA干渉効果の結果を示す図である。
【図１４】0.5 nM濃度のときのRO RNAのRNA干渉効果の結果を示す図である。
【図１５】0.5 nM濃度のときのLO RNAのRNA干渉効果の結果を示す図である。
【図１６】0.5 nM濃度のときのセンス鎖の3’末端に2塩基のDNAを持つLO RNA LO RNAのRNA干渉効果の結果を示す図である。
【図１７】2本鎖RNA（DS 25A1/25B1 RNA， DS 21A1/21B1 RNA, Si 25A2/25B1 RNA, Si 23A2/23B1 RNA, Si 21A2/21B1 RNA）のRNA干渉効果の持続性を示す図である。
【図１８】2本鎖RNA（RO 27A1/25B1 RNA，RO 27A1/23B1 RNA, RO 25A1/23B1 RNA, RO 25A1/21B1 RNA, RO 23A1/21B1 RNA）のRNA干渉効果の持続性を示す図である。
【図１９】2本鎖RNA（LO 23A2/25B1 RNA，LO 21A2/23B1 RNA）のRNA干渉効果の持続性を示す図である。
【図２０】10 nM濃度の各種2本鎖RNAをHeLa細胞に加えたときの細胞生存率を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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