(57)【要約】【課題】  スフィンゴ糖脂質の免疫賦活活性をより高めることを目的とする。【解決手段】脂質膜内外に下記式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質の少なくとも１種を含有するリポソーム。2008231085.tif 000043【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質膜内外に下記式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質の少なくとも１種を含有するリポソーム。
式（１）
【化１】
2008231085.tif 000036
（式（１）中、Ｒ1は、下記式（１−１）
式（１−１）
【化２】
2008231085.tif 000037
（式（１−１）中、Ｒ3は、アルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ4は、アルキル基である。）を表し、Ｒ2は、水素原子または、α−ガラクトース基、α−グルコース基、α−マンノース基、α−グルコサミン基若しくはβ−グルコサミン基またはこれらの１以上の組み合わせからなる基である。）
【請求項２】
前記式（１）において、Ｒ2は、水素原子または、α−ガラクトース基、α−グルコース基、α−マンノース基、α−グルコサミン基若しくはβ−グルコサミン基またはこれらの２つまたは３つの組み合わせからなる基である、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
前記式（１）において、Ｒ2は、水素原子、下記Ｒ62、Ｒ63、Ｒ64またはＲ65である、請求項１に記載のリポソーム。
【化３】
2008231085.tif 000038
【請求項４】
前記式（１）において、Ｒ2は、水素原子である、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項５】
前記式（１）において、Ｒ1は、下記Ｒ51、Ｒ52、Ｒ53、Ｒ54、Ｒ55、Ｒ56、Ｒ57、Ｒ58、Ｒ59、Ｒ70、Ｒ71、Ｒ72、Ｒ73、Ｒ74、Ｒ75、Ｒ76、Ｒ77又はＲ78を表す、請求項１〜４のいずれか１項に記載のリポソーム。
【化４】
2008231085.tif 000039
【化５】
2008231085.tif 000040
【化６】
2008231085.tif 000041
【化７】
2008231085.tif 000042
【請求項６】
前記脂質膜を構成する脂質には、カチオン性の脂質が含まれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項７】
前記脂質膜を構成する脂質は、カチオン性の脂質がモル比で０．４以上を占める請求項１〜５のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項８】
前記カチオン性脂質の少なくとも１種が、１，２−ジオレイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパンである、請求項６または７に記載のリポソーム。
【請求項９】
前記脂質膜を構成する脂質は、１，２−ジオレイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン、３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロールおよび１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミンがモル比で０．７５以上を占める、請求項１〜７のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項１０】
さらに、前記脂質膜内外に、抗原を含む、請求項１〜９のいずれか１項のリポソーム。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリポソームを含む免疫賦活活性用組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリポソームを含むＩＦＮ−γ産生促進用組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリポソームを含むＩＬ−４産生促進用組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリポソームを含むＩＬ−１２産生促進用組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリポソームを含む抗体産生促進作用組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリポソームを含む抗腫瘍作用組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリポソームを含むＮＫＴ細胞活性化用組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリポソームを含む樹状細胞活性化用組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリポソームを含む抗ウイルス作用組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリポソームを含む抗アレルギー作用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、脂質膜内外に特定の構造からなるスフィンゴ糖脂質を含有するリポソームおよびこれを含む免疫賦活活性用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願出願人らは、特定のスフィンゴモナス属の菌体から分離されたスフィンゴ糖脂質について、免疫賦活活性等を有すること等を明らかにしている（特許文献１〜５）。しかしながら、これらの免疫賦活活性等は必ずしも充分とは言えず、さらなる活性化が求められていた。
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９２／１２９８６号公報
【特許文献２】特開平１１−４３４３７号公報
【特許文献３】特開２０００−５１６７６号公報
【特許文献４】特開２００２−０１０７９７号公報
【特許文献５】特開２００５−２６３７９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本願発明の目的は、上記課題を解決することであって、上記スフィンゴ糖脂質の免疫賦活活性をより高めることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題のもと、本願発明者は下記手段により上記課題を解決しうることを見出した。
（１）脂質膜内外に下記式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質の少なくとも１種を含有するリポソーム。
式（１）
【化１】
2008231085.tif 000002
（式（１）中、Ｒ1は、下記式（１−１）
式（１−１）
【化２】
2008231085.tif 000003
（式（１−１）中、Ｒ3は、アルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ4は、アルキル基である。）を表し、Ｒ2は、水素原子または、α−ガラクトース基、α−グルコース基、α−マンノース基、α−グルコサミン基若しくはβ−グルコサミン基またはこれらの１以上の組み合わせからなる基である。）
（２）前記式（１）において、Ｒ2は、水素原子または、α−ガラクトース基、α−グルコース基、α−マンノース基、α−グルコサミン基若しくはβ−グルコサミン基またはこれらの２つまたは３つの組み合わせからなる基である、（１）に記載のリポソーム。
（３）前記式（１）において、Ｒ2は、水素原子、下記Ｒ62、Ｒ63、Ｒ64またはＲ65である、（１）に記載のリポソーム。
【化３】
2008231085.tif 000004
（４）前記式（１）において、Ｒ2は、水素原子である、（１）に記載のリポソーム。
（５）前記式（１）において、Ｒ1は、下記Ｒ51、Ｒ52、Ｒ53、Ｒ54、Ｒ55、Ｒ56、Ｒ57、Ｒ58、Ｒ59、Ｒ70、Ｒ71、Ｒ72、Ｒ73、Ｒ74、Ｒ75、Ｒ76、Ｒ77又はＲ78を表す、（１）〜（４）のいずれか１項に記載のリポソーム。
【化４】
2008231085.tif 000005
【化５】
2008231085.tif 000006
【化６】
2008231085.tif 000007
【化７】
2008231085.tif 000008
（６）前記脂質膜を構成する脂質には、カチオン性の脂質が含まれる、（１）〜（５）のいずれか１項に記載のリポソーム。
（７）前記脂質膜を構成する脂質は、カチオン性の脂質がモル比で０．４以上を占める（１）〜（５）のいずれか１項に記載のリポソーム。
（８）前記カチオン性脂質の少なくとも１種が、１，２−ジオレイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパンである、（６）または（７）に記載のリポソーム。
（９）前記脂質膜を構成する脂質は、１，２−ジオレイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン、３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロールおよび１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミンがモル比で０．７５以上を占める、（１）〜（７）のいずれか１項に記載のリポソーム。
（１０）さらに、前記脂質膜内外に、抗原を含む、（１）〜（９）のいずれか１項のリポソーム。
（１１）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載のリポソームを含む免疫賦活活性用組成物。
（１２）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載のリポソームを含むＩＦＮ−γ産生促進用組成物。
（１３）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載のリポソームを含むＩＬ−４産生促進用組成物。
（１４）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載のリポソームを含むＩＬ−１２産生促進用組成物。
（１５）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載のリポソームを含む抗体産生促進作用組成物。
（１６）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載のリポソームを含む抗腫瘍作用組成物。
（１７）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載のリポソームを含むＮＫＴ細胞活性化用組成物。
（１８）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載のリポソームを含む樹状細胞活性化用組成物。
【発明の効果】
【０００６】
本願発明では、式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質（以下、「ＧＳＬ」ということがある）の少なくとも１種を脂質膜内外に含有したリポソームとすることにより、ＧＳＬの免疫賦活活性作用をより高めることが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下において、本願発明の内容について詳細に説明する。尚、本願明細書において「〜」とはその前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用される。
【０００８】
本願発明において、「リポソーム」とは、疎水部分をお互いに内側に向けて集合した脂質（本願明細書において、「脂質膜」ということがある）を有し、内部の水層から構成される物質を意味する。
また、本明細書における「脂質膜内外に下記式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質の少なくとも１種を含有する」とは、ＧＳＬが、脂質膜の表面および／または内部、ならびに、リポソームの内部のいずれかに含まれていることをいい、通常は、リポソームの脂質膜にその一部または全部が含有されている。
本願発明における脂質膜は、単層構造であっても、多層構造であってもよい。
【０００９】
本願発明では、上述のように、ＧＳＬをリポソーム化することにより、驚くべきことにＧＳＬの免疫賦活活性が高められることを見出したものである。糖脂質は、リポソーム化する際の脂質膜の脂質成分として用いられることはあるが、本願発明のように、糖脂質自身をリポソーム化する対象物質とすることは稀である。さらに、ＧＳＬのリポソーム化により、ＧＳＬの免疫賦活活性が著しく高められることは極めて驚くべきことである。
【００１０】
まず、本願発明で採用するＧＳＬについて詳細に説明する。本願発明で採用するＧＳＬは、下記式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質である。
式（１）
【化８】
2008231085.tif 000009
（式（１）中、Ｒ1は、下記式（１−１）
式（１−１）
【化９】
2008231085.tif 000010
（式（１−１）中、Ｒ3は、アルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ4は、アルキル基である。）を表し、Ｒ2は、水素原子または、α−ガラクトース基、α−グルコース基、α−マンノース基、α−グルコサミン基若しくはβ−グルコサミン基またはこれらの１以上の組み合わせからなる基である。）
【００１１】
式（１）のＲ1に含まれるＲ3のアルキル基は、シクロアルキル基を有していてもよく、該シクロアルキル基は、Ｒ3のアルキル末端でもよいし、鎖の中に含まれていてもよい。好ましいシクロアルキル基としては、シクロプロパン基があげられる。Ｒ3のアルキル基の炭素数としては、好ましくは１３〜２３、より好ましくは１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１である。また、Ｒ3のアルキル基及びアルケニル基は、好ましくは置換または無置換の直鎖のものである。また、アルケニル基に含まれる２重結合は、いずれの位置にあってもよい。
一方、Ｒ4のアルキル基の炭素数は好ましくは１０〜２０、より好ましくは１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６であり、さらに好ましくは、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。さらに、Ｒ4のアルキル基は、置換または無置換の直鎖アルキル基であることが好ましい。
【００１２】
さらに好ましくは、Ｒ1が下記Ｒ51〜Ｒ78のいずれかである。
【化１０】
2008231085.tif 000011
【化１１】
2008231085.tif 000012
【化１２】
2008231085.tif 000013
【化１３】
2008231085.tif 000014
【００１３】
また、式（１）のＲ1は、下記式（１−２）の立体構造をとるものが好ましい。
式（１−２）
【化１４】
2008231085.tif 000015
ここで、上記式（１−２）中のＲ3およびＲ4は、上記式（１−１）のＲ3およびＲ4と同義である。従って、上記Ｒ51〜Ｒ78も上記立体構造をとるものがより好ましい。
【００１４】
一方、式（１）において、Ｒ2は、水素原子または、α−ガラクトース基、α−グルコース基、α−マンノース基、α−グルコサミン基若しくはβ−グルコサミン基またはこれらの組み合わせからなる２または３つの組み合わせからなる基であることが好ましく、水素原子、下記Ｒ62、Ｒ63、Ｒ64またはＲ65であることがより好ましく、水素原子であることがさらに好ましい。Ｒ2が水素原子のものを採用することにより、各種免疫賦活活性の効果が、特に、向上する傾向に好ましい。
【化１５】
2008231085.tif 000016
【００１５】
さらに、本願発明のスフィンゴ糖脂質は１種類のみを採用しても良いし、２種類以上を採用しても良い。２種以上を組み合わせて含有させる場合の各成分の比率は特に制限されない。
【００１６】
ＧＳＬは、スフィンゴ糖脂質を有する菌体から抽出することによって得ることができる。例えば、国際公開ＷＯ９２／１２９８６号パンフレットや特開２００２−１０７９７号公報や特開２００５−２６３７９７号公報に記載の方法を採用することができる。スフィンゴ糖脂質は、スフィンゴモナス科に属する菌体中に含まれていることから、スフィンゴモナス科に属する菌のいずれかを用いて抽出すれば式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質を得ることができる。ここで、スフィンゴモナス科に属する菌とは、従来から一般的に「スフィンゴモナス属」（Sphingomonas）に属する菌と言われているものの他、該菌と実質的に同じ科に属するものとして分類される菌を含む趣旨である。本願発明で採用できる菌株としては、例えば、Microbiol. Immunol.,2000,44,563-575に示されるいずれの菌株も採用することができる。
【００１７】
ＧＳＬは、アセトンに対して不溶性であることから、抽出操作を行なう前に菌体をアセトンで洗浄しておくのが好ましい。ＧＳＬの抽出に用いる溶媒は、メタノールなどのアルコール系溶媒またはアルコール系溶媒とクロロホルムなどの極性溶媒の混合溶媒にするのが収率の点で好ましい。ただし、スフィンゴ糖脂質溶解性の溶媒であれば、これらの以外の溶媒を用いても構わない。
【００１８】
本願発明では、特に下記表に記載のＧＳＬを好ましく採用することができる。表中、「ceramide」の部分は、上記Ｒ51〜Ｒ78のいずれか１種以上である。また、本願発明で採用するＧＳＬは、下記に記載の菌株から得られたものに限定されるものでないことは言うまでもない。
【表１】
2008231085.tif 000017
【００１９】
また、スフィンゴ糖脂質の混合物が得られた場合は、本技術分野で周知の方法にしたがって各成分を分離することができる。例えば、特開２００５−２６３７９７号公報の記載に従って行うことができる。具体的には、クロマトグラフィー法によって、スフィンゴ糖脂質を完全に分離することができる。溶出液としてクロロホルム／メタノール混合溶液を用いた場合は、（１）ＧＳＬ−１、６〜１３、（２）ＧＳＬ−３、（３）ＧＳＬ−２、４、５の順に各スフィンゴ糖脂質が溶出する。また、ＧＳＬ−２、４、５は、異なる菌株が産生するため、極めて簡便に分離することができる。充填剤、溶出液、溶出速度、圧力、温度などのクロマトグラフィーの分離条件については、適宜調節することができる。また、スフィンゴ糖脂質の混合物に含まれる特定の物質のみに選択的に反応する試薬を作用させて該物質の誘導体を調製し、その誘導体の化学的性質または物理的性質を利用して分離を行なうこともできる。
【００２０】
また、ＧＳＬは、周知の合成法を組み合わせることによって合成することもできる。たとえば、糖とスフィンゴシン部分をあらかじめ合成するか、菌体から抽出しておき、アミド結合を形成することによってＧＳＬを調製することができる。
【００２１】
次に、本願発明のリポソームおよびリポソーム化の方法について述べる。
本願発明のリポソームの直径（「体積平均粒子径」）は、通常、２０〜２０００ｎｍであり、好ましくは、４０〜８００ｎｍである。このような範囲とすることにより、医薬化合物（医薬製剤）として用いるときにその効果が発揮されやすい。
リポソームの「体積平均粒子径」は、動的光散乱法等の原理に基づき求めることができる（D.D.Lasic、「liposomes: from basic to applications」、Elsevier Science Publishers、pp.1-171（1993）参照）。
【００２２】
本願発明のリポソームは、体積平均粒子径およびその粒子径±５％の粒子径を有する粒子の割合が粒子全体の５０％以上を占めていることが好ましい。
【００２３】
本願発明のリポソームにおけるＧＳＬの含有量は特に限定されないが、脂質膜を構成する総脂質量（ＧＳＬの含量は含まない）に対して０．０１〜３０％が好ましい。
【００２４】
本願発明におけるリポソームの脂質膜を構成する脂質としては、リポソーム化が可能な脂質であれば特に制限はなく、合成および天然の脂質を広く採用できる。例えば、以下に挙げる脂質を用いることができる。
【００２５】
１，２−ジオレイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（1,2-dioleoyl-3-(trimethylammonium) propane 、ＤＯＴＡＰ）、ホスファチジルコリン（大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）もしくはジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルエタノールアミン（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）もしくはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン（ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリンもしくはジステアロイルホスファチジルセリン等）、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール（ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）もしくはジステアロイルホスファチジルグリセロール等）、ホスファチジルイノシトール（ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトールもしくはジステアロイルホスファチジルイノシトール等）、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、ジガラクトシルジグリセリド類（ジガラクトシルジラウロイルグリセリド、ジガラクトシルジミリストイルグリセリド、ジガラクトシルジパルミトイルグリセリドもしくはジガラクトシルジステアロイルグリセリドなど）、またはガラクトシルジグリセリド類（ガラクトシルジラウロイルグリセリド、ガラクトシルジミリストイルグリセリド、ガラクトシルジパルミトイルグリセリドもしくはガラクトシルジステアロイルグリセリド等）、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシドまたはガングリオシド、コレステロール、コレステロールヘミサクシネート、３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、エルゴステロールまたはラノステロール、ジアルキルジメチルアンモニウム（dialkyl dimethylammnonium amphiphiles）、ポリグリセロールアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、アルキルグリコシド、アルキルメチルグルカミド、アルキルシュークロースエステル、ジアルキルポリオキシエチレンエーテル、ジアルキルポリグリセロールエーテル、ポリオキシエチレン−ポリ乳酸、長鎖アルキルアミン類（テトラデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ステアリルアミン等）、または長鎖脂肪酸ヒドラジド類（ミリスチン酸ヒドラジド、パルミチン酸ヒドラジドもしくはステアリン酸ヒドラジド等）などが挙げられる。
これらの脂質は単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２６】
この中でも、本願発明における脂質膜は、免疫賦活活性の向上のためには、カチオン性の脂質を含むことが好ましく、カチオン性の脂質がモル比で０．４以上を占めることがより好ましい。
カチオン性脂質としては、少なくともＤＯＴＡＰを含むことが好ましい。
特に本発明では、ＤＯＴＡＰ、ＤＣコレステロールおよびＤＯＰＥが、モル比で０．７５以上を占めることがより好ましく、ＤＯＴＡＰ、ＤＣコレステロールおよびＤＯＰＥがモル比で０．９０以上を占めることがさらに好ましい。
このような脂質組成とすることにより、免疫賦活活性がより高くなる傾向にあり好ましい。
【００２７】
さらに、本願発明では、脂質膜の構成成分として、上記脂質の他に必要に応じて他の物質を加えることもできる。具体的には、脂質膜の安定化剤、種々の機能性物質、電荷調整剤等が挙げられる。これらの他の物質は、リポソームを構成する総脂質量に対して約０．０００１〜３０％の範囲で含まれることが好ましい。
【００２８】
本願発明のリポソームは、本願発明の趣旨を逸脱しない範囲内において、種々の物質を封入していてもよい。封入される物質は、特に限定されず、例えば、医薬品に使用される物質が挙げられる。具体的には、造影化合物、抗腫瘍性化合物、抗酸化化合物、抗菌化合物、抗炎症化合物、血行促進化合物、美白化合物、肌荒れ防止化合物、老化防止化合物、発毛促進化合物、保湿化合物、ホルモン剤、ビタミン類、色素、およびタンパク質類などが挙げられる。封入される物質は、水溶性化合物であるか、あるいは水溶性塩の形態または可溶性化剤の添加により水溶性にされた形態であることが望ましい。疎水性または脂溶性の化合物であってもよい。
特に、本発明では、抗原を封入することが好ましい。抗原を封入することにより、抗原特異的な免疫応答の増強作用を誘導できるという利点があり好ましい。封入される抗原は、特に限定されず、例えば予防接種に使用される抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患の自己抗原、およびアレルゲンなどが挙げられる。
【００２９】
本願発明のリポソームは、公知の製造法に従って製造することができる。例えば、Bangham, A.D., Standish, M.M. and Watkins, J.C. "Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids."(1965) J. Mol. Biol. 13,238-252等に記載される方法を採用することができる。より具体的には、以下の手順に従って製造することができるが、これらの記載により本願発明のリポソームの製造方法が限定されるわけではない。
【００３０】
１）ＧＳＬを溶媒に溶解する。このときの溶媒は、脂質を溶解することができ、かつ沸点が低いことが好ましい。有機溶媒の具体例には、クロロホルム、メタノールなどが含まれる。また、３０〜７０℃で加温した後に超音波処理することが好ましい。
２）脂質膜を構成する成分（ＧＳＬを除く）を有機溶媒に溶解又は懸濁させる。ここで有機溶媒は、脂質を溶解することができ、かつ沸点が低いことが好ましい。有機溶媒の具体例には、クロロホルム、メタノール、エタノールなどが含まれる。
３）上記１）および２）で得られた溶液を混合し、溶媒を除去することにより、脂質膜を形成させる。
４）上記３）で得られた脂質膜に水性溶媒（好ましくは緩衝液）を添加して攪拌することにより、水性溶媒中に懸濁されたリポソームを得ることができる。
【００３１】
上記で得られたリポソームを含む水性溶媒(懸濁液)を、さらにフィルターに通すことにより、リポソーム の粒径を揃えることができる。またリポソームを含む水溶性溶媒を超遠心処理することにより、沈殿物としてリポソームを分離することができる。分離されたリポソームは必要に応じて洗浄してもよい。
【００３２】
リポソームが形成されたことの確認は、公知の方法によって行うことができる。例えば、公知のリポソームを形成する方法で作製された物質について、粒子径を光散乱で測定し、その平均粒子径が、２０００ｎｍ以下の場合は、本発明におけるリポソームが形成されたものとする。また、ここでいう粒子は、必ずしも完全な球状である必要はない。
【００３３】
本願発明のリポソームは、免疫賦活活性がより高められるという効果を有する。免疫賦活活性の中でも、特に、ＩＦＮ−γ産生促進、ＩＬ−４産生促進、ＩＬ−１２産生促進、抗体産生促進作用、抗腫瘍作用、ＮＫＴ細胞活性、樹状細胞活性、感染抵抗性増強用、抗ウイルス作用、ＩＬ−１０産生促進、ＮＫ細胞活性、抗アレルギー作用、ＩＬ−６産生促進、ＮＯ産出促進を高めることができ、ＩＦＮ−γ産生促進、ＩＬ−４産生促進、ＩＬ−１２産生促進、抗体産生促進作用、抗腫瘍作用、ＮＫＴ細胞活性、樹状細胞活性、感染抵抗性増強用、抗ウイルス作用をより高めることができ、ＩＦＮ−γ産生促進、ＩＬ−４産生促進、ＩＬ−１２産生促進、抗体産生促進作用、抗腫瘍作用、ＮＫＴ細胞活性、樹状細胞活性、感染抵抗性増強用をさらに高めることができ、ＩＦＮ−γ産生促進、ＩＬ−４産生促進、ＩＬ−１２産生促進、抗体産生促進作用、抗腫瘍作用を特に高めることができる。
【００３４】
ＩＦＮ−γ産生促進によって促進されるものの例としては、ＩＦＮ−γによって促進されるＴｈ１の誘導、マクロファージ活性化作用が挙げられる。
ＩＬ−４産生促進によって促進されるものの例としては、Ｔｈ２の誘導、抗体のクラススイッチの誘導が挙げられる。
本明細書における抗体産生促進とは、抗原特異的免疫応答の増強作用でありアジュバント作用をいう。
本明細書における、抗腫瘍作用とは、例えば、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞活性化を含む意図である。
ＮＫＴ細胞とは、例えば、ヒトＶα２４+ＮＫＴ細胞及びマウスＶα１４+ＮＫＴ細胞を含む趣旨である。また、ＮＫＴ細胞活性化とは細胞傷害活性の増強、サイトカイン産生増強及びＮＫＴ細胞の増殖促進を含む意図である。
本明細書における、樹状細胞活性化とは、例えば、抗原提示能亢進を含む意図である。
本明細書における、感染抵抗性増強作用とは、例えば、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞活性化を含む意図である。本願発明の感染抵抗性増強作用組成物は、サルモネラ感染症、結核への利用に特に有用である。
本明細書における、抗ウイルス作用とは、例えば、Ｉ型インターフェロン産生増強、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞活性化を含む意図である。本願発明の抗ウイルス作用組成物は、サイトメガロウイルス感染症、ヘルペスウイルス感染症などヘルペスウイルス科感染症への利用に特に有用である。
本明細書における、ＮＫ細胞活性化とは、例えば、感染細胞傷害を含む意図である。
本明細書における、抗アレルギー作用とは、例えば、好酸球浸潤抑制、肥満細胞抑制作用、ＩｇＥ産生抑制、化学伝達物質放出抑制を含む意図である。さらに、本願発明の抗アレルギー作用組成物は、副作用が弱い傾向にあり、花粉症、気管支喘息等への利用に特に有用である。
【００３５】
また、本願発明のリポソームおよびリポソームを含む組成物を医薬品若しくは医薬部外品やその有効成分として利用する場合、好ましくは、当業者に周知の方法によって製造可能な医薬組成物として投与することができる。医薬用組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等をあげることができる。上記の医薬組成物は、薬理学的、製剤学的に許容し得る添加物を加えて製造することができる。薬理学的、製剤学的に許容し得る添加物の例としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等をあげることができる。上記の医薬組成物には、本願発明の趣旨を逸脱しない範囲内で、他の効能を有する成分を１種又は２種以上配合してもよい。本願発明の医薬の投与量は特に限定されず、有効成分の種類などに応じて適宜選択することができ、さらに患者の体重や年齢、疾患の種類や症状、投与経路など通常考慮すべき種々の要因に応じて、適宜増減することができる。一般的には、成人一日あたり、０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇの範囲で用いることができる。また、投与方法も特に限定されず、注射剤、輸液剤等として、静脈注射により投与してもよいし、経口的に投与してもよい。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例を挙げて本願発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本願発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。従って、本願発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。
【００３７】
本実施例においては、表１に記載のＧＳＬ−７を用いて行った。これらのＧＳＬは、国際公開ＷＯ９２／１２９８６号公報、特開２００２−０１０７９７号公報、特開２００５−２６３７９７号公報に記載の方法に従って分離した。
また、本願実施例の各表において、「コントロール」とは、リポソームおよびリポソーム化していないＧＳＬ−７（Ｐ２０）のいずれも添加せず、他は同条件で行った比較例を示しており、「ＧＳＬ−７（Ｐ−２０）」とは、リポソーム化していないＧＳＬ−７（Ｐ２０）のみを添加し、他は同条件で行った比較例を示している。
【００３８】
実施例１  脾細胞からのＩＦＮ−γ産生誘導
（リポソームの調整）
ＧＳＬ−７は、Polysorbate-20(Wako製)を添加した注射用生理食塩水(Otuka Pharmaceutical製)に溶解し（０．５％溶液）、使用時に６０℃の恒温槽で１０分間加温した後、ソニケーターで２０分間超音波処理して実験に用いた。以下、上記の方法で溶解したＧＳＬ−７をＧＳＬ−７（Ｐ２０）と省略する。
次に、０．１モルのＧＳＬ−７に対し、下記表に示す組成の脂質を溶媒（クロロホルム：メタノール（体積比２：１））に溶解し、ナス型フラスコに入れ、室温で、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、脂質膜を形成した。
生理食塩水を加え、ボルテックスで混和後、１分超音波処理してリポソームを調製した。
【００３９】
（脂質組成）
リポソーム作製に使用した脂質は、コレステロール(Ｃｈｏｌ、Wako製)、１，２−ジオレイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン (ＤＯＴＡＰ、Avanti polar lipids製)、３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール、Sigma製）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ、Avanti polar lipids製)である。また、下記表は、０．１モルのＧＳＬ−７に対する量（モル）として示している。
【表２】
2008231085.tif 000018
【００４０】
（ＩＦＮ−γ産生促進能の測定）
C57BL/10ScSnマウス（8〜10週令、オス）（自家繁殖）の脾細胞（２×１０6） に、それぞれ、上記方法により調整したリポソームＡ〜Ｅおよびリポソーム化していないＧＳＬ−７（Ｐ２０）を添加して、４８時間後の培養上清中のＩＦＮ−γを測定した。このときの濃度は、ＧＳＬ−７の濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなる量とした。ＩＦＮ−γの測定は、捕捉抗体として精製抗ＩＦＮ−γ抗体（Ｒ４−６Ａ２）（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）と、検出抗体としてビオチン結合抗ＩＦＮ−γ抗体（ＡＮ−１８）（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）を用いたサンドイッチELISA法で行った。ビオチン結合抗体に続く反応でアルカリンフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＳＩＧＭＡ製）を結合させ、パラニトロフェニルフォスフェートを基質として発色させた。MICROPLATE READER Model 550（日本バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社製）で４０５ｎｍの波長の吸光度を測定した。組み換えマウスのＩＦＮ−γによる標準曲線から被験試料のＩＦＮ−γ濃度を算出した。
比較実験として、（１）リポソームＡ〜Ｅおよびリポソーム化していないＧＳＬ−７（Ｐ２０）のいずれも添加せず、他は同様に行ったもの（コントロール）、および（２）リポソーム化していないＧＳＬ−７（Ｐ２０）のみを添加し、他は同様に行ったもの（ＧＳＬ−７（Ｐ−２０））についても、下記に示した。
【００４１】
（結果）
結果を下記表に示した。これらの結果は、同じ条件下で行っているが、３回に分けて行ったため、同じ時に行ったもの毎に表に纏めた。
下記表に示すように、ＧＳＬ−７（Ｐ２０）を用いて脾細胞を刺激しても、１００ｎｇ／ｍｌの濃度では、コントロールと同様の量しか、ＩＦＮ−γの産生を誘導しなかった。
一方、リポソームＡおよびＢは、脾細胞からのＩＮＦ−γを有意に誘導した。特に、リポソームＢについては、顕著であった。
尚、ＩＦＮ−γの産生量に関し、下記表では、コントロールに対して、ＧＳＬ−７（Ｐ−２０）を添加した場合、有意差が認められていないが、ＧＳＬ−７（Ｐ−２０）の添加量を１μｇ／ｍｌ以上とすることにより、有意差が認められた。すなわち、本発明のリポソームは、リポソーム化していないＧＳＬ−７を用いる場合より、著しく少ない量で、ＩＦＮ−γの産生を促進することが認められた。
【表３】
2008231085.tif 000019
【００４２】
【表４】
2008231085.tif 000020
【００４３】
【表５】
2008231085.tif 000021
【００４４】
実施例２  リポソーム濃度の変更によるＩＦＮ−γ産生誘導
実施例１において、リポソームＢまたはＧＳＬ−７（Ｐ２０）を、ＧＳＬ−７の相当量が下記表に記載の量となるように変更し、他は同様に行い、それぞれの、サンプルのＩＦＮ−γ濃度を算出した。また、リポソームＢの脂質組成のみを添加し（ＧＳＬ−７を含まない）、他は同様に行った。
【００４５】
（結果）
これらの結果を下記表に示した。
【表６】
2008231085.tif 000022
上記表から明らかなとおり、リポソームＢの添加量を増やすことにより、ＩＦＮ−γの誘導が促進されることが確認された。
尚、上記表では、ＩＦＮ−γの産生量に関し、ＧＳＬ−７（Ｐ−２０）を添加した場合、コントロールに対して有意差が認められていないが、ＧＳＬ−７（Ｐ−２０）の添加量を１μｇ／ｍｌ以上とすることにより、コントロールに対して有意差が認められた。
【００４６】
実施例３  抗−ＣＤ１ｄｍＡｂおよびｉｓｏｔｙｐｅ  ｍＡｂによるＩＦＮ−γ産生促進効果への影響
実施例２のリポソームＢを、ＧＳＬ−７相当量が１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加した場合において、リポソームＢの添加と共に、濃度が４０μｇ／ｍｌとなるように、抗−ＣＤ１ｄｍＡｂ（BD Pharmingen製）またはｉｓｏｔｙｐｅｍＡｂ（BD Pharmingen製）を添加し、他は同様に行った。ここで、ｉｓｏｔｙｐｅ  ｍＡｂの添加は、全く関連性のない他の抗体によって、リポソームＢの活性が阻害されないかを確認するために行ったものである。
【００４７】
（結果）
これらの結果を比較例と共に下記表に示した。
【表７】
2008231085.tif 000023
これらの結果より、抗ＣＤ１ｄ  ｍＡｂを添加することにより、リポソームＢの活性が有意に阻害されることが確認された。また、ｉｓｏｔｙｐｅ  ｍＡｂを添加しても、リポソームＢのＩＦＮ−γの産生が阻害されることはなかった。
【００４８】
実施例４  各種マウスによるＩＦＮ−γ誘導
実施例１において、C57BL/10ScSnマウスを、C57BL/10ScSn(WT)マウス又はC57BL/10ScN(TLR4-/-マウス)に代え、リポソームＢ（ＧＳＬ−７相当濃度：５００ｎｇ／ｍｌ）を用い、脾細胞からのＩＦＮ−γ誘導について、同様に測定した。
また、リポソームＢの添加と同時に、anti-IL-12 p40/p70 mAb（BD Pharmingen製）２０μｇ／ｍｌを添加して、他は同様に行った。
【００４９】
（結果）
下記表に示すように、リポソームＢにより、いずれのマウスを用いた場合も、リポソームＢの添加により、ＩＦＮ−γの産生が促進され、anti-IL-12 p40/p70 mAbの添加により、有意にその添加量が減少した。
【表８】
2008231085.tif 000024
【００５０】
実施例５  脾細胞からのＩＬ−１２産生誘導
（ＩＬ−１２産生促進能の測定）
C57BL/10ScSn（WT）マウス（自家繁殖）の脾細胞（２×１０6） に、それぞれ、実施例１に記載の方法で調整したリポソームＢおよびリポソーム化していないＧＳＬ−７（Ｐ２０）を添加して、２４時間後の培養上清中のＩＬ−１２ｐ４０を測定した。このときの濃度は、ＧＳＬ−７の濃度が下記表に記載の量となるように調整した。ＩＬ−１２ｐ４０の測定は、ＯｐｔＥＩＡ  mouse cytokine detection set（BD Bioscience製）を用いて行った。他は、実施例１のＩＦＮ−γの測定に準じて行った。
【００５１】
（結果）
結果を下記表に示した。
【表９】
2008231085.tif 000025
リポソームＢの添加によって、ＩＬ−１２ｐ４０の産生が有意に促進されていることが認められた。また、リポソームＢの添加量を増やすことにより、ＩＬ−１２ｐ４０の産生量が増加することが認められた。
【００５２】
実施例６  抗−ＣＤ１ｄｍＡｂまたはｉｓｏｔｙｐｅｍＡｂによるＩＬ−１２産生促進効果への影響
実施例５のリポソームＢを、ＧＳＬ−７の量が５００ｎｇ／ｍｌとなるように添加した場合において、リポソームＢの添加と同時に、濃度が４０μｇ／ｍｌとなるように、抗−ＣＤ１ｄｍＡｂ（BD Pharmingen製）またはｉｓｏｔｙｐｅｍＡｂを添加し、他は同様に行った。
【００５３】
（結果）
その結果を比較例と共に下記表に示した。
【表１０】
2008231085.tif 000026
リポソームＢの添加による脾細胞からのＩＬ−１２  ｐ４０誘導はａｎｔｉ−ＣＤ１ｄ  ｍＡｂ(BD Pharmingen)の添加により有意に低下することが確認された。一方、ｉｓｏｔｙｐｅ  ｍＡｂを添加しても、リポソームＢのＩＬ−１２  ｐ４０誘導は阻害されなかった。
【００５４】
実施例７  各種マウスによるＩＬ−１２産生促進効果
実施例５において、C57BL/10ScSnマウスを、C57BL/10ScSn(WT)マウスおよびC57BL/10ScN(TLR4-/-マウス)に代え、リポソームＢを、ＧＳＬ−７量が５００ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、脾細胞からのＩＬ−１２誘導について、同様に測定した。
【００５５】
（結果）
その結果を、比較例と共に下記表に示した。
【表１１】
2008231085.tif 000027
表から明らかなとおり、リポソームＢを用いることにより、著しいＩＬ−１２誘導効果の向上が認められた。
【００５６】
実施例８  脾細胞由来のCD11c+樹状細胞によるリポソームの取り込み量
脾細胞由来のCD11c+樹状細胞によるリポソームの取り込み量について確認した。
C57BL/10ScSnマウス（8-10週令、オス）の脾細胞から磁気ビーズを結合させたanti-CD11c mAb（Miltenyi Biotec製）を用いて分離した樹状細胞を調製し、蛍光ラベルしたリポソームＢおよびリポソームＤを添加後９０分で樹状細胞による各リポソームの取り込み量についてフローサイトメーター（Beckman Coulter製）を用いて検討した。
【００５７】
図１に示すように、リポソームＢ（実線）とリポソームＤ（破線）で取り込み量の違いは認められなかった。
【００５８】
実施例９  樹状細胞活性化作用（１）
C57BL/6マウス（8-10週令、メス）に、１μｇのＧＳＬ−７（Ｐ２０）またはリポソームＢ（ＧＳＬ−７含量１μｇ）を尾静脈より投与し、１６時間後、脾臓を摘出した。摘出した脾臓から細胞浮遊液を調製した。脾細胞は、抗ＦｃγＲ抗体（２．４Ｇ２）で処理した後、ＰＥ標識抗ＣＤ１１ｃ抗体、ｂｉｏｔｉｎ標識抗ＣＤ８０抗体およびｂｉｏｔｉｎ標識抗ＣＤ８６抗体を添加した。細胞に抗体を添加した後、４℃、暗所で３０分反応させた。ｂｉｏｔｉｎ標識抗体を用いた細胞は、Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ結合ストレプトアビジンを４℃、暗所で３０分反応させた。測定はEPICS ELITE ESPで行った。
【００５９】
下記表に、比較例と共に示した。
下記表に示すように、コントロールより、ＧＳＬ−７（Ｐ２０）を投与した方が、ＮＫＴ細胞の活性化が高く、さらに、１μｇのＧＳＬ−７を含むリポソームＢを投与することにより、より高い樹状細胞の活性化が認められた。
【００６０】
【表１２】
2008231085.tif 000028
【００６１】
実施例１０  樹状細胞活性化作用（２）
C57BL/6マウス（8-10週令、メス）にリポソームＢ（ＧＳＬ−７含量１μｇ）を尾静脈より投与し、２時間後、脾臓を摘出した。脾細胞は、抗ＦｃγＲ抗体（２．４Ｇ２）で処理した後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１１ｃ抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ８α抗体およびｂｉｏｔｉｎ標識抗ＣＤ４０抗体を添加した。細胞に抗体を添加した後、４℃、暗所で３０分反応させた。ｂｉｏｔｉｎ標識抗体を用いた細胞は、Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ結合ストレプトアビジンを４℃、暗所で３０分反応させた。測定はEPICS ELITE ESPで行った。
【００６２】
下記表に、比較例と共に示した。
表に示すように、ＧＳＬ−７の添加により、ＣＤ８α+細胞において顕著なＣＤ４０の発現上昇が認められ、リポソームＢの添加により、より高い発現上昇が認められた。
【００６３】
【表１３】
2008231085.tif 000029
【００６４】
実施例１１  In vivoにおけるサイトカイン産生誘導
（ＩＦＮ−γ産生促進能とＩＬ−４産生促進能の測定）
C57BL/6マウス（8〜10週令、メス）に、実施例１で調整したＧＳＬ−７（Ｐ２０）（１０μｇ）またはリポソームＢ（ＧＳＬ−７の含量が１０μｇとなる量）を尾静脈より投与し、１６時間後の血清中ＩＦＮ−γとＩＬ−４濃度をIn vivo capture assay kit (日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製)を用いて測定した。
【００６５】
（結果）
下記表に、比較例と共に示した。
【表１４】
2008231085.tif 000030
ＧＳＬ−７（Ｐ２０）またはリポソームＢを投与することにより、ＩＦＮ−γの産生およびＩＬ−４の産生を有意に誘導した。特に、リポソームＢを投与した方が、リポソーム化されていないＧＳＬ−７（Ｐ２０）よりも、顕著に有意に誘導することが確認された。
【００６６】
実施例１２  ＮＴＫ細胞活性化作用（１）
（ＮＫＴ細胞の活性化の測定）
C57BL/6マウス（8〜10週令、メス）に、実施例１で調整したＧＳＬ−７（Ｐ２０）（１μｇ）またはリポソームＢ（ＧＳＬ−７の含量が１μｇとなる量）を尾静脈より投与し、１６時間後、肝臓および脾臓を摘出した。摘出した肝臓および脾臓から細胞浮遊液を調製した。肝臓からの細胞浮遊液は、４５％パーコールと６７．５％パーコールを用いた比重遠心法により肝臓内単核球を得た。肝臓内単核球および脾細胞は、抗ＦｃγＲ抗体（２．４Ｇ２）（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）で処理した後、ＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）、ビオチン標識抗ＴＣＲαβ抗体（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）を添加した。細胞に抗体を添加した後、４℃、暗所で３０分反応させた。ビオチン標識抗体を用いた細胞は、Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ結合ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ製）を４℃、暗所で３０分反応させた。測定はEPICS ELITE ESPで行った。
尚、ＮＴＫ細胞は、活性化すると細胞表面のＮＫ１．１分子がダウンレギュレーションされることが公知であるため、ＧＳＬ−７（Ｐ２０）またはリポソームＢの投与によるＮＫＴ細胞の活性化の指標としてＮＫ１．１分子の発現を調べた。
【００６７】
（結果）
下記表に、比較例と共に示した。
【表１５】
2008231085.tif 000031
リポソームＢを添加することにより、相当量のＧＳＬ−７（Ｐ２０）を投与した場合に比して、著しく高いＮＫＴ細胞の活性化が認められた。
尚、ＮＫＴ細胞の活性化に関し、上記表では、ＧＳＬ−７（Ｐ−２０）の添加した場合、コントロールに対して、有意差が認められていないが、ＧＳＬ−７（Ｐ−２０）の添加量をさらに高くすることにより、コントロールに対して有意差が認められた。
【００６８】
実施例１３  ＮＴＫ細胞活性化作用（２）
C57BL/6マウス（8-10週令、メス）にリポソームＢ（ＧＳＬ−７含量１μｇ）を尾静脈より投与し、２時間後、脾臓を摘出した。脾細胞は、抗ＦｃγＲ抗体（２．４Ｇ２）で処理した後、ＦＩＴＣ標識抗ＴＣＲβ抗体およびｂｉｏｔｉｎ標識抗ＣＤ４０Ｌ抗体を添加した。細胞に抗体を添加した後、４℃、暗所で３０分反応させた。ｂｉｏｔｉｎ標識抗体を用いた細胞は、Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ結合ストレプトアビジンを４℃、暗所で３０分反応させた。測定はEPICS ELITE ESPで行った。
【００６９】
（結果）
下記表に、比較例と共に示した。
表に示すように、リポソームＢの投与によりＮＫＴ細胞のＣＤ４０Ｌの発現上昇が認められた。
【００７０】
【表１６】
2008231085.tif 000032
【００７１】
実施例１４  抗体産生増強作用
（卵白アルブミン封入リポソームの調整）
卵白アルブミン（ＯＶＡ）（ＳＩＧＭＡ製）を封入したリポソーム（リポソームＦ）を調整した。
脂質組成は、０．１モルのＧＳＬ−７に対し、（正）１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン−Ｎ−[メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００] （1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy (polyethyleneglycol)-2000] Avanti polar lipids製）０．１モル、ＤＯＴＡＰ２モル、ＤＯＰＥ２モルとした。
実施例１のリポソームの調整に記載の方法で作製した脂質膜に、卵白アルブミン（ＯＶＡ）溶液（１００μｇ／ｍｌ）を加え、ボルテックスで混和後、１分超音波処理して調製してリポソームＦを得た。
【００７２】
（抗体産生増強作用の測定）
C57BL/6マウス（8〜10週令、メス）にリポソームＦ（ＧＳＬ−７が２５μｇとＯＶＡが２５μｇ含まれている量）を尾静脈より投与し、１４日後に採血し、血清中の抗ＯＶＡ抗体をＥＬＩＳＡで測定した。抗ＯＶＡ抗体価（ＩｇＧ２ａ）はＯＶＡをコーティングした９６穴プレートに段階希釈した血清を添加した。検出抗体には、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識した抗マウスＩｇＧ２ａ抗体を用いた。パラニトリロフェニルフォスフェート（p-nitrophenyl phosphate）を基質として発色させ、３ＮのＮａＯＨで反応停止後、マイクロプレートレーダーで４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００７３】
（結果）
下記表に、比較例と共に示した。
下記に示すように、リポソームＦを投与した場合、リポソーム化していないＧＳＬ−７（Ｐ２０）およびＯＶＡの混合液を投与した場合と比べて、高い抗ＯＶＡ抗体の産生増強が認められた。
【表１７】
2008231085.tif 000033
【００７４】
実施例１５  脾細胞からの抗原特異的ＩＦＮ−γ産生誘導
C57BL/6 マウス（8〜10週令、オス）に、実施例１４で調整したリポソームＦ（ＧＳＬ−７が２５μｇ含まれている量）を尾静脈より投与し、１週間後、脾臓を摘出した。脾細胞（５×１０5） をＯＶＡ（１ｍｇ／ｍｌ）で刺激し、９６時間後の培養上清中のＩＦＮ−γ量を測定した。ＩＦＮ−γ量の測定は、捕捉抗体として精製抗ＩＦＮ−γ抗体（Ｒ４−６Ａ２）と、検出抗体としてビオチン結合抗ＩＦＮ−γ抗体（ＡＮ−１８）を用いたサンドイッチELISAで行った。ビオチン結合抗体に続く反応でアルカリンフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを結合させ、パラニトロフケニルフォスフェートを基質として発色させた。MICROPLATE READER Model 550で４０５ｎｍの波長の吸光度を測定した。組み換えマウスＩＦＮ−γによる標準曲線から被験試料のＩＦＮ−γの濃度を算出した。
【００７５】
（結果）
下記表に、比較例と共に示した。
下記表に示すように、リポソームＦを投与した場合、リポソーム化していないＧＳＬ−７（Ｐ２０）およびＯＶＡの混合液を投与した場合と比べて、脾細胞からのＩＦＮ−γの産生が増強した。
【００７６】
【表１８】
2008231085.tif 000034
【００７７】
実施例１６  抗腫瘍免疫増強作用
C57BL/6 マウス（8-10週令、オス）に抗原としてＯＶＡを発現している腫瘍細胞、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞を３×１０6マウスのわき腹に皮下接種し、その１週間後、腫瘍径が８〜１０ｍｍとなったところでＧＳＬ−７（Ｐ２０）（２５μｇ）とＯＶＡ（２５μｇ）の混合液または実施例１４で調整したリポソームＦ（ＧＳＬ−７含量２５μｇ、およびＯＶＡ（２５μｇ））を尾静脈より投与し、２０日後に腫瘍の大きさを測定した。コントロールとしてリポソームＦの組成からＧＳＬ−７を除いたコントロールリポソームを用いた。腫瘍の体積については次に示す式で計算を行った。
腫瘍の体積 = 0.5×長径×（短径）2
その結果を下記表に示した。下記表から明らかなとおり、ＧＳＬ−７（Ｐ２０）＋ＯＶＡの添加により、腫瘍の縮退が認められ、リポソームＦの添加により、著しい腫瘍の縮退が認められた。
【００７８】
【表１９】
2008231085.tif 000035
また、これらの写真を図２に示した。
図２中、一列目から順に、コントロール、コントロールリポソームを投与した場合、ＧＳＬ−７（Ｐ２０）とＯＶＡの混合液を投与した場合、リポソームＦを投与した場合を示している。ＧＳＬ−７（Ｐ２０）＋ＯＶＡの添加により、腫瘍の縮退が認められ、リポソームＦの添加により、著しい腫瘍の縮退が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本願発明では、ＧＳＬを、リポソーム化することにより、ＧＳＬの各種免疫賦活活性能を高めることが可能になった。このため、免疫賦活活性剤として、従来のＧＳＬを用いるよりもさらに有用である。
特に、本発明では、従来のＧＳＬでは免疫賦活活性効果を示さなかった少ない量のＧＳＬでも、免疫賦活活性効果を示しうる点で極めて有効である。
加えて、本願発明のリポソームは、ＧＳＬのマイクロカプセル化としての役目も果たすという利点がある。すなわち、リポソームの粒径、脂質組成、荷電などの調整を通じてその生体内挙動を制御することができるため、ＧＳＬを直接投与する場合よりも、標的の臓器、組織の病巣へ効率よく送達させることができる。よって、医薬物質としての利用価値がより高いものとなった。
さらに、本願発明のリポソームは、毒性が低く、エンドトキシントレランスが誘導されないため、副作用が低いという観点からも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、脾細胞由来のCD11c+樹状細胞によるリポソームの取り込み量を示す。
【図２】図２は、リポソームの添加による、腫瘍の縮退を示す。んｎ
【図１】
2008231085.tif 000044
【図２】
2008231085.tif 000045
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月24日(2007.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
【図１】図１は、脾細胞由来のCD11c+樹状細胞によるリポソームの取り込み量を示す。
【図２】図２は、リポソームの添加による、腫瘍の縮退を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月16日(2007.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，２−ジオレイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパンおよび３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロールの少なくとも１種を含む脂質膜内外に、下記式（１）で表され、かつ、Ｒ1が、下記Ｒ51、Ｒ52、Ｒ53、Ｒ54、Ｒ55、Ｒ56、Ｒ57、Ｒ58、Ｒ59、Ｒ70、Ｒ71、Ｒ72、Ｒ73、Ｒ74、Ｒ75、Ｒ76、Ｒ77又はＲ78で表されるスフィンゴ糖脂質の少なくとも１種を、含有するリポソーム。
式（１）
【化１】
2008231085.tif 000046
（式（１）中、Ｒ2は、水素原子または、α−ガラクトース基、α−グルコース基、α−マンノース基、α−グルコサミン基若しくはβ−グルコサミン基またはこれらの１以上の組み合わせからなる基である。）
【化２】
2008231085.tif 000047
【化３】
2008231085.tif 000048
【化４】
2008231085.tif 000049
【化５】
2008231085.tif 000050
【請求項２】
前記式（１）において、Ｒ2は、水素原子または、α−ガラクトース基、α−グルコース基、α−マンノース基、α−グルコサミン基若しくはβ−グルコサミン基またはこれらの２つまたは３つの組み合わせからなる基である、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
前記式（１）において、Ｒ2は、水素原子、下記Ｒ62、Ｒ63、Ｒ64またはＲ65である、請求項１に記載のリポソーム。
【化６】
2008231085.tif 000051
【請求項４】
前記式（１）において、Ｒ2は、水素原子である、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項５】
前記脂質膜を構成する脂質は、１，２−ジオレイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパンおよび／または３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロールがモル比で０．４以上を占める請求項１〜４のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項６】
前記脂質膜を構成する脂質の少なくとも１種が、１，２−ジオレイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項７】
前記脂質膜を構成する脂質は、１，２−ジオレイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン、３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロールおよび１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミンがモル比で０．７５以上を占める、請求項１〜６のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項８】
さらに、前記脂質膜内外に、抗原を含む、請求項１〜７のいずれか１項のリポソーム。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のリポソームを含む免疫賦活活性用組成物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のリポソームを含むＩＦＮ−γ産生促進用組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のリポソームを含むＩＬ−４産生促進用組成物。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のリポソームを含むＩＬ−１２産生促進用組成物。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のリポソームを含む抗体産生促進作用組成物。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のリポソームを含む抗腫瘍作用組成物。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のリポソームを含むＮＫＴ細胞活性化用組成物。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のリポソームを含む樹状細胞活性化用組成物。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のリポソームを含む抗ウイルス作用組成物。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のリポソームを含む抗アレルギー作用組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
上記課題のもと、本願発明者は下記手段により上記課題を解決することを見出した。
（１）１，２−ジオレイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパンおよび３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロールの少なくとも１種を含む脂質膜内外に、下記式（１）で表され、かつ、Ｒ1が、下記Ｒ51、Ｒ52、Ｒ53、Ｒ54、Ｒ55、Ｒ56、Ｒ57、Ｒ58、Ｒ59、Ｒ70、Ｒ71、Ｒ72、Ｒ73、Ｒ74、Ｒ75、Ｒ76、Ｒ77又はＲ78で表されるスフィンゴ糖脂質の少なくとも１種を、含有するリポソーム。
式（１）
【化７】
2008231085.tif 000052
（式（１）中、Ｒ2は、水素原子または、α−ガラクトース基、α−グルコース基、α−マンノース基、α−グルコサミン基若しくはβ−グルコサミン基またはこれらの１以上の組み合わせからなる基である。）
【化８】
2008231085.tif 000053
【化９】
2008231085.tif 000054
【化１０】
2008231085.tif 000055
【化１１】
2008231085.tif 000056
（２）前記式（１）において、Ｒ2は、水素原子または、α−ガラクトース基、α−グルコース基、α−マンノース基、α−グルコサミン基若しくはβ−グルコサミン基またはこれらの２つまたは３つの組み合わせからなる基である、（１）に記載のリポソーム。
（３）前記式（１）において、Ｒ2は、水素原子、下記Ｒ62、Ｒ63、Ｒ64またはＲ65である、（１）に記載のリポソーム。
【化１２】
2008231085.tif 000057
（４）前記式（１）において、Ｒ2は、水素原子である、（１）に記載のリポソーム。
（５）前記脂質膜を構成する脂質は、１，２−ジオレイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパンおよび／または３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロールがモル比で０．４以上を占める（１）〜（４）のいずれか１項に記載のリポソーム。
（６）前記脂質膜を構成する脂質の少なくとも１種が、１，２−ジオレイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパンである、（１）〜（５）のいずれか１項に記載のリポソーム。
（７）前記脂質膜を構成する脂質は、１，２−ジオレイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン、３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロールおよび１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミンがモル比で０．７５以上を占める、（１）〜（６）のいずれか１項に記載のリポソーム。
（８）さらに、前記脂質膜内外に、抗原を含む、（１）〜（７）のいずれか１項のリポソーム。
（９）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のリポソームを含む免疫賦活活性用組成物。
（１０）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のリポソームを含むＩＦＮ−γ産生促進用組成物。
（１１）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のリポソームを含むＩＬ−４産生促進用組成物。
（１２）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のリポソームを含むＩＬ−１２産生促進用組成物。
（１３）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のリポソームを含む抗体産生促進作用組成物。
（１４）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のリポソームを含む抗腫瘍作用組成物。
（１５）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のリポソームを含むＮＫＴ細胞活性化用組成物。
（１６）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のリポソームを含む樹状細胞活性化用組成物。
（１７）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のリポソームを含む抗ウイルス作用組成物。
（１８）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のリポソームを含む抗アレルギー作用組成物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
まず、本願発明で採用するＧＳＬについて詳細に説明する。本願発明で採用するＧＳＬは、下記式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質であって、Ｒ1が、Ｒ51、Ｒ52、Ｒ53、Ｒ54、Ｒ55、Ｒ56、Ｒ57、Ｒ58、Ｒ59、Ｒ70、Ｒ71、Ｒ72、Ｒ73、Ｒ74、Ｒ75、Ｒ76、Ｒ77又はＲ78で表されるスフィンゴ糖脂質である。
式（１）
【化１３】
2008231085.tif 000058
（式（１）中、Ｒ2は、水素原子または、α−ガラクトース基、α−グルコース基、α−マンノース基、α−グルコサミン基若しくはβ−グルコサミン基またはこれらの１以上の組み合わせからなる基である。）
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
Ｒ51〜Ｒ78は、下記のとおりである。
【化１４】
2008231085.tif 000059
【化１５】
2008231085.tif 000060
【化１６】
2008231085.tif 000061
【化１７】
2008231085.tif 000062
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本願発明におけるリポソームの脂質膜を構成する脂質としては、１，２−ジオレイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパンおよび３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロールの少なくとも１種を含む。さらに、リポソーム化が可能な他の脂質を含んでいてもよく、合成および天然の脂質を広く採用できる。例えば、以下に挙げる脂質を用いることができる。