(57)【要約】【課題】抗体アレイにより１つもしくは複数の生体分子(抗原)を検出する際に、バックグラウンドが少なく、検出感度、精度、定量性に優れた生体分子測定法を提供する。【解決手段】抗体アレイによる生体分子(抗原)検出系にビオチン化ルシフェラーゼを用い、さらにその濃度を高めることを特徴とする、S/N比の高い生体分子測定法。【効果】抗体アレイによる被検体中に含まれる生体分子(抗原)の検出に、ビオチン化ルシフェラーゼを用いることにより、従来の検出法よりも精度、感度、定量性の面で優れた検出が可能になった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体に由来する１もしくは複数の生体分子を、抗体アレイを用いて測定する方法において、
(a)抗体アレイに、ビオチン化修飾された被検体を添加し、
(b)更に、ストレプトアビジン及びビオチン化ルシフェラーゼを添加、結合させ、
(c)ATP、ルシフェリン及びMg2+を含有する試薬で発光させることにより、その発光量から生体分子を測定することを特徴とする生体分子測定法。
【請求項２】
被検体に由来する１もしくは複数の生体分子を、抗体アレイを用いて測定する方法において、
(a)抗体アレイに、被検体を添加し、
(b)被検体中に含まれる生体分子に特異的に結合するビオチン標識二次抗体を接触させ、
(c)次いで、ストレプトアビジン及びビオチン化ルシフェラーゼを添加、結合させ、
(d)ATP、ルシフェリン及びMg2+を含有する試薬で発光させることにより、その発光量から生体分子を測定することを特徴とする生体分子測定法。
【請求項３】
ビオチン化ルシフェラーゼが、ビオチン化ペプチド及び甲虫類由来のルシフェラーゼの融合タンパク質である請求項１又は２記載の生体分子測定法。
【請求項４】
請求項１又は２記載の生体分子測定法において、１×１０-11 mol / ml以上の濃度のビオチン化ルシフェラーゼを用いることにより、汎用標識酵素に比しS/N比を５倍以上向上させた生体分子測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体アレイとビオチン化ホタルルシフェラーゼを用いた、被検体中の生体分子測定法に関するものである。なお、本明細書における「測定」には、生体分子の存在の有無を判定する「検出」及び生体分子の存在量を決定する「定量」の両方が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
種々の生物のゲノム解読が進んでいる昨今、ゲノム研究の次の段階(ポストゲノム)として、タンパク質及び糖の機能研究が行われている。更に、多数のタンパク質間の相互作用が生命現象に与える影響の解明(プロテオーム)が求められている。このため、多数のタンパク質を網羅的かつ同時に検出することができる抗体アレイが注目されている。
【０００３】
抗体アレイを用いた被検体中の生体分子検出方法としては、アルカリフォスファターゼ(以下、ALPと略称する。)あるいはホースラディシュペルオキシダーゼ(以下、HRPと略称する。)といった汎用発光標識酵素、Cy3及びCy5といった蛍光標識酵素を用いたものが知られている。
前者の酵素は、生体内にも存在し、検出する際にバックグラウンドが高くなるといった欠点がある。このため、複数回の洗浄操作を要する等、検出時間の増大を招く。また、後者の酵素は、自家蛍光の影響等があり、タンパク質の発現量を反映しているとは言いがたい。抗体アレイは、被検体中の抗原濃度の定量化を行うことが重要な要素であるため、検出感度や精度の上昇といった問題の解決は重要課題である。
抗体アレイとは、タンパク質に対して特異的に認識し結合する抗体を直径数十μｍ程度のスポットとして格子状に整列させ、固定化したものである。
タンパク質を蛍光、又はビオチン標識し、抗体アレイに結合後、シグナルを検出することで被検体中のタンパク質の存在を確認した例が多数報告されている(例えば、非特許文献１参照)。
【０００４】
しかしながら上記の方法では、検出感度と定量性に問題があり、またタンパク質を直接標識するため、タンパク質の性質を変化させてしまう危険性を秘めている。
こういった問題点を解決するため、近年ではサンドイッチ法を用いた検出法が報告されている。この方法は、固定化抗体とは別に、標的タンパク質の別のエピトープを認識して結合する二次抗体を用いて検出する方法である。これまでにビオチン標識抗体を介してHRP標識アビジンあるいはALP標識ストレプトアビジン、Cy3標識ストレプトアビジンを用いて、化学発光法あるいは蛍光法を用いて検出している例が報告されている(例えば、非特許文献２参照)。
しかし、この方法でも検出感度、定量性、精度等が優れておらず、臨床診断用への応用は困難であると言わざるを得なかった。
【０００５】
【非特許文献１】Lin Y.等,Proteomics,Sep;3(9):1750-1757(2003)
【非特許文献２】Haab B.B.,Proteomics,Nov;3(11):2116-2122(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、抗体アレイ及びビオチン化ルシフェラーゼを用いることを特徴とする、検出感度、精度、定量性に優れた生体分子濃度の測定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者等は、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、ルシフェラーゼが持つバックグラウンドの低さ、測定時間の短さ等の利点に着目し、抗体アレイによる抗原検出系にビオチン化ルシフェラーゼを用い、更にその濃度を高めれば、前記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
（１）被検体に由来する１もしくは複数の生体分子を、抗体アレイを用いて測定する方法において、
(a)抗体アレイに、ビオチン化修飾された被検体を添加し、
(b)更に、ストレプトアビジン及びビオチン化ルシフェラーゼを添加、結合させ、
(c)ATP、ルシフェリン及びMg2+を含有する試薬で発光させることにより、その発光量から生体分子を測定することを特徴とする生体分子測定法。
（２）被検体に由来する１もしくは複数の生体分子を、抗体アレイを用いて測定する方法において、
(a)抗体アレイに、被検体を添加し、
(b)被検体中に含まれる生体分子に特異的に結合するビオチン標識二次抗体を接触させ、
(c)次いで、ストレプトアビジン及びビオチン化ルシフェラーゼを添加、結合させ、
(d)ATP、ルシフェリン及びMg2+を含有する試薬で発光させることにより、その発光量から生体分子を測定することを特徴とする生体分子測定法。
（３）ビオチン化ルシフェラーゼが、ビオチン化ペプチド及び甲虫類由来のルシフェラーゼの融合タンパク質である（１）又は（２）記載の生体分子測定法。
（４）（１）又は（２）記載の生体分子測定法において、１×１０-11 mol / ml以上の濃度のビオチン化ルシフェラーゼを用いることにより、汎用標識酵素に比しS/N比を５倍以上向上させた生体分子測定法。
【発明の効果】
【０００８】
抗体アレイによる被検体中に含まれる生体分子(抗原)の検出に、ビオチン化ルシフェラーゼを用いることにより、従来の検出法よりも精度、感度、定量性の面で優れた検出を行うことが可能になった。これにより、定量性が極めて重要と言われている臨床検査あるいは診断分野において、抗体アレイによる検出法を応用できる可能性が高まった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明で用いるビオチン化ルシフェラーゼとは、ビオチンホロエンザイムシンセターゼの作用によりビオチンが結合しうる性質を有するビオチン化ペプチド及び甲虫類のルシフェラーゼの融合タンパク質である。
また、ルシフェラーゼとしては、甲虫類由来のものが量子収率が高く好ましい。甲虫類由来のルシフェラーゼとしては、例えば、ルシオラ・クルシアタ（Luciola cruciata）、ルシオラ・ラテラリス（Luciola lateralis）〔何れもN. Kajiyama et al., Biochim. Biophys. Acta, 1120, 228 (1992)〕、ルシオラ・ミングレリカ（Luciola mingrelica）〔N. Yu. Philippova and N. N. Ugarova, Biokhimiya, 44, 1508 (1979)〕、フォティナス・ピラリス（Photinus pyralis）〔M.DeLuca and W. D. McElroy, Meth. Enzymol., 72, 3 (1978)〕、ピロフォラス・ピラジオフタラマス（Pyrophorus plagiophthalamus）〔K. V. Wood et al. SCIENCE, 244, 700 (1989)〕等のルシフェラーゼが挙げられる。
【００１１】
ビオチン化ペプチド及びホタルルシフェラーゼの融合タンパク質（以下、ビオチン化ルシフェラーゼと略称する。）は、両者の機能を損なわない範囲で、一次配列上の配置にはこだわらない。すなわち、何れをN末に配置してもよく、また、一方を他方の分子内に配置する場合もある。また、両者の間にリンカー配列、例えば(Gly4Ser)3〔J. S. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988)〕あるいはSer Ser Ala(Asp Asp Ala Lys Lys)4 Asp Gly〔M. W. Pantoliano et al., Biochemistry, 30, 10117 (1991)〕、を配置してもよい。
【００１２】
抗体のビオチン標識は、アミノ基と結合する活性エステルタイプ（N-Succinimidyl D-Biotinや5-(N-Succinimidyloxycarbonyl)pentyl D-biotinamide等）、チオール基と結合するマレイミドタイプ（N'-[2-(N-Maleimido) ethyl]-N-piperazinyl D-biotinamide, hydrochlorideや6-{N'-[2-(N-Maleimido) ethyl]-N-piperazyinylamido} hexyl D-biotinamide, hydroxide等）、アルデヒド基と結合するヒドラジンタイプ（D-Biotin hydrazideや6-Hydrazidohexyl D-biotinamide等）等から選択し、実施することができる。また、ストレプトアビジン標識は、グルタルアルデヒド、カルボジイミド類、あるいはマレイミド・ヒドロキシスクシンイミジルエステル型の２官能性の架橋試薬等を用いることができる〔北川常廣等編，酵素免疫測定法(蛋白質核酸酵素別冊No.31)(1987)，共立出版、P. Tijssen著，石川栄治監訳，エンザイムイムノアッセイ(1989), 東京化学同人〕。
【００１３】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。被検出中のターゲット物質としてBSAを用い、ビオチン標識したBSAをガラススライド基板上にスポットしたものを模擬的な抗体アレイとして用いた。レイアウトを図１及び図２に示した。
【実施例１】
【００１４】
図１に示したレイアウトの抗体アレイを用いてビオチン化ルシフェラーゼ濃度による検出感度の違いを検討した。アレイの周囲をDako Pen(DAKO社製)で囲みブロックに分け、3% BSA含有TBST溶液(140 mM NaCl, 2.6 mM KCl, 25 mM tris base, 0.1% Tween20) で室温、湿箱内において30分間ブロッキングした。
抗体アレイをTBST溶液で１分間×３回洗浄し、濃度の異なるストレプトアビジン-ビオチン化ルシフェラーゼ複合体試薬(1×10-12〜1×10-10 mol / ml)(特開2001-74736号公報の段落番号００１９の記載を参照)を夫々アレイ上のブロックに30μlずつ加えた。室温、湿箱内において30分間置き、TBST溶液で１分間×３回洗浄した。発光試薬溶液(0.5 mM ルシフェリン、0.8 mM ATP、 0.1 mM 酢酸マグネシウム、0.2% BSA、 2% スクロース、50mM トリシン)を各ブロック30μlずつ添加し、発光を検出装置で検出した。
【００１５】
抗体アレイの発光検出装置には、ルミノ・イメージアナライザー LAS-3000(FUJIFILM社製)を用いた。条件は、以下の通り撮影した。Exposure Type: Increment, Exposure Time: 5 min, Sensitivity/Resolution: standard, CCD温度: -30℃, Tray Position: 1
【００１６】
図３に５分間露光時の抗体アレイの発光検出画像を示した。ストレプトアビジン-ビオチン化ルシフェラーゼ複合体濃度を高めるにつれ、発光量が伸びていることが確認できた。複合体濃度1×10-10 mol / mlの検出感度は、1×10-11 mol / mlの複合体使用時の5〜6倍であったが、試薬の安定性等を考慮すると、1×10-11 mol / mlの濃度が抗体アレイによる生体分子(抗原)検出には最適であると考えられた。
【実施例２】
【００１７】
図２に示したレイアウトの抗体アレイを用いて、ビオチン化ルシフェラーゼを用いた場合及びALP 標識ストレプトアビジンを用いた場合の感度比較を行った。ビオチン化ルシフェラーゼでの検出は、前述と同じ方法で行った。ALP 標識ストレプトアビジンに関してはSouthern Biotech社の市販製品を用い、ビオチン化ルシフェラーゼの代わりに30μl添加した。ALP 標識ストレプトアビジンの発光試薬にはCDP-STAR(Novagen社製)を用いた。
【００１８】
図４及び図５に、ビオチン化ルシフェラーゼ及びALP 標識ストレプトアビジンを用いた場合の３分間露光時の抗体アレイの発光検出画像を示した。ALPを用いた検出ではバックグラウンドの高さが目立っており、ルシフェラーゼの優位性が確認できた。実際にS/N比を比較しても、10μg / mlのスポット(左から2列目)において、8.9(ルシフェラーゼ):1.7(ALP)と5倍以上の差が確認できた。S/N比は、以下のように算出した。S/N = (スポットの円内輝度値の総和) / (ブランク部分のスポットと同一半径円内輝度値の総和)
【００１９】
また、ALP 標識ストレプトアビジンの濃度・露光時間を変更しても、S/N比に変化が見られなかったことから、ビオチン化ルシフェラーゼの利用は、抗体アレイによる生体分子(抗原)検出において極めて有用であることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ビオチン標識BSAアレイのレイアウトＩを示す図。
【図２】ビオチン標識BSAアレイのレイアウトＩＩを示す図。
【図３】ビオチン化ルシフェラーゼ使用時の、抗体アレイによるBSA検出画像(５分間露光) を示す図。
【図４】ビオチン化ルシフェラーゼ使用時の、抗体アレイによるBSA検出画像(３分間露光) を示す図。
【図５】ALP標識ストレプトアビジン使用時の、抗体アレイによるBSA検出画像(３分間露光) を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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