(57)【要約】      （修正有）【課題】植物矮小化遺伝子をFox hunting systemにより探索し、単離同定して、その遺伝子を導入した矮小化形質転換植物を提供する。【解決手段】(a)特定の配列を示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は(b)特定の配列を示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物体を矮小化させる活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に含む、矮小化形質転換植物からなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
(b)配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物体を矮小化させる活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子を発現可能に含む、矮小化形質転換植物。
【請求項２】
前記遺伝子が、
(c)配列番号１に示す塩基配列からなるDNA、又は
(d)配列番号１に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ植物体を矮小化させる活性を有するタンパク質をコードするDNA
を含む、請求項１に記載の形質転換植物。
【請求項３】
前記植物が、双子葉植物又は単子葉植物である、請求項１又は２に記載の形質転換植物。
【請求項４】
請求項１又は２に定義した遺伝子を植物の組織又は細胞に導入して植物体を再生することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の矮小化形質転換植物を作製する方法。
【請求項５】
前記遺伝子が、それを含む組換えベクターを用いて導入される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の形質転換植物において、請求項１又は２に定義した遺伝子を過剰発現させて矮小化を誘導することを含む、植物の矮小化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、矮小化形質転換植物、その作製方法及び植物の矮小化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、遺伝子の機能を解析するための方法の１つに、T-DNA内に組み込まれた転写のエンハンサー配列を利用して、植物遺伝子の転写を活性化した突然変異体を作製し、その転写活性化された遺伝子のクローニングをする、アクティベーションタギング法が用いられている（非特許文献１）。この方法を用いて、植物矮小化遺伝子が見出されている（特許文献１）。その矮小化遺伝子は、NCBI（National center for biotechnology information）のアクセッションナンバーでAt4g31910、At1g04910、At4g35700、At1g49770である。
【０００３】
しかし、アクティベーションタギング法を網羅的な遺伝子機能の解析（ゲノムに存在する遺伝子の機能をまとめて解析すること）に用いるには問題があった。例えば、シロイヌナズナのようなモデル植物では、10Kbのゲノム領域の中に平均２個以上の遺伝子が存在するが、アクティベーションタギング法では、タグ内のアクチベータとしてエンハンサー配列が用いられており、転写活性化可能なゲノム領域は挿入部位前後5Kbにも及ぶため、エンハンサーによる遺伝子活性化の効果が１つの遺伝子に限定されず、複数の遺伝子の転写が活性化され、複合表現型が生じていた（非特許文献２）。
【０００４】
この問題を避けるため、本発明者らは、「Fox hunting system (Full length cDNA over-expression gene hunting system)」と命名した手法を開発した（特許文献２）。Fox hunting systemとは、強発現させる遺伝子ソースとして完全長cDNAライブラリーを用い、これを混合物のまま強発現型のT-DNAベクターを有するアグロバクテリウムを介して植物に遺伝子導入し、得られたT1種子を播種し、表現型のスクリーニングを行う方法である。興味深い表現型が現れた場合、その系統に挿入されていた完全長cDNAをPCR及びシーケンスによって調べ、原因遺伝子を同定する。
【０００５】
Fox hunting systemの利点として、例えば、(i)完全長cDNAライブラリーは、遺伝子が機能するときに必要な全アミノ酸情報を含むため、導入する遺伝子が本来有する全機能を発揮することができ、従って通常のcDNAライブラリーに比べ、機能発現の効率がはるかに高いこと、また全てのcDNA断片が本来の開始コドン及び停止コドン情報を備えているため、発現のためのタンパク質融合化などの必要がなく、タンパク質発現効率が高いこと、(ii)何億クローンものライブラリーに感染させても１植物には1〜2クローンしか導入されないので、形質転換植物体には別々のクローンが導入され、cDNAの単離と表現形質の確認は２回程度で少なくてすむこと、(iii)従来のcDNAライブラリーでは、全てのmRNA分子がそのままの量比でcDNA分子に置き換わるため、発現量の多い構造タンパク質遺伝子群や通常は発現量の少ない情報伝達関連遺伝子群などの各cDNA存在比が発現量によって大きく異なっているが、Fox hunting systemのライブラリーでは、遺伝子の発現量にかかわらず全てのクローンが同一の割合で含まれる「標準化」されたライブラリーを使用でき、ゲノムをタギングするときよりも高効率で別種遺伝子の機能検定を行うことができること（但し、シロイヌナズナやイネなど標準化完全長cDNAが整備されつつあるものはそれを利用してもよい。また、構造タンパク質等の発現量の多いタンパク質の機能を解析したい場合は、標準化されていない通常の完全長cDNAライブラリーを利用してもよい。）、(iv)完全長cDNAを含んだ植物集団を一度全て揃えるという「ライン化」をすることなく、ライブラリー内の全ての遺伝子機能検索をひとまとめに行えるので、簡単に目的の変異体を得ることができ、わずかな労力で特定の性質を付与する遺伝子（本来その遺伝子が有している機能であるか否かを問わない）のスクリーニングを行うことができる、などが挙げられる。
【０００６】
【特許文献１】国際公開第2005/026345号パンフレット
【特許文献２】再公表2003/018808号公報
【非特許文献１】Walden,Rら、Plant Mol Biol, 1994, 26(5):p.1521-8
【非特許文献２】Ichikawaら、Plant J, 2003, 36:p.421-429
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、植物矮小化遺伝子を見出し、その遺伝子を形質転換した植物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記Fox hunting systemを用いて、約15,000のシロイヌナズナの形質転換体系統を作製し、その突然変異表現型系統を観察したところ、矮小化を示す形態学的変異体を見出し、その変異の原因となる遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）(a)配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
(b)配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物体を矮小化させる活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子を発現可能に含む、矮小化形質転換植物。
（２）前記遺伝子が、
(c)配列番号１に示す塩基配列からなるDNA、又は
(d)配列番号１に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ植物体を矮小化させる活性を有するタンパク質をコードするDNA
を含む、（１）に記載の形質転換植物。
（３）前記植物が、双子葉植物又は単子葉植物、例えばアブラナ科、ナス科、イネ科及びマメ科からなる群から選択されるいずれかの科に属するものである、（１）又は（２）に記載の形質転換植物。
（４）（１）又は（２）に定義した遺伝子を植物の組織又は細胞に導入して植物体を再生することを含む、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の矮小化形質転換植物を作製する方法。
（５）前記遺伝子が、それを含む組換えベクターを用いて導入される、（４）に記載の方法。
（６）（１）〜（３）のいずれか１項に記載の形質転換植物において、（１）又は（２）に定義した遺伝子を過剰発現させて矮小化を誘導することを含む、植物の矮小化方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、植物矮小化遺伝子を各種植物に形質転換して植物を矮小化することが可能となり、これによって、例えば穀粒の数が増えたときに倒れることなく、台風などの風害に強くなり、作物等の収量を上げること、また表現形質の多様化などを行うことができる。観賞用植物の場合、花茎などが短くなることによりシルエットの異なった植物が作成できるため、新たな商品価値の創造にもつながる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
１．植物矮小化遺伝子の単離
植物矮小遺伝子は、例えば、シロイヌナズナを用いたFox hunting systemにより取得できる。しかし、以下の手法はシロイヌナズナに限定されず、他の植物（特に被子植物）にも適用可能である。
【００１２】
具体的には、以下の手順で行うことができる。
(１)完全長cDNA及び内部標準遺伝子を含むcDNA混合物の作製
完全長cDNAとは、mRNAの完全なコピーを意味し、得られたcDNAよりも長いcDNAが存在する場合でも完全長cDNAに含めることができる。
【００１３】
完全長cDNAは、当業者に公知の方法により、目的のmRNAから調製することができる。例えば、シロイヌナズナに由来するmRNAから、Cap-trapper法（Carninci,P.,ら、Genomics, 1996. 37(3):P. 327-36）、Cap-finder法（Zhao,Z.,ら、J.Biotechnol., 1999. 73(1)：p.35-41）等の手法で調製することができる。また、cDNAの配列決定がされている、独立行政法人理化学研究所のシロイヌナズナ完全長cDNAコレクションを用いてもよい。
【００１４】
完全長cDNAをクローニングするためのベクターとしては、例えばSfiIのような、8塩基以上を認識し、かつ挿入DNAの方向を一方向に規定できる制限酵素部位を、cDNA挿入部位の両側に持つものを用いるのが好ましい。
【００１５】
当業者に公知の手法を利用して、前記完全長cDNAを担持する完全長cDNAライブラリーを調製することができる。ライブラリーを調製するためのベクターとして、例えばLambda Zap II、Lambda FLC-1-B、pTAS、pBIGなどが挙げられる。
【００１６】
また、後に表現型をスクリーニングするための内部標準として、例えば細菌由来の腫瘍遺伝子（tms1、iaaM、rolB、tmr等）を用いてもよい。tms1及びiaaMは、それぞれ、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、アグロバクテリウム・チューメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)由来のトリプトファン 2-モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子であり、オーキシン応答が増強されると高発現する。rolBは、アグロバクテリウム・リゾゲネシス（Agrobacterium rhyzogenesis）由来のオーキシン感受性に関係する遺伝子である。tmrは、アグロバクテリウム・チューメファシエンス由来のサイトカイニン生合成で働く遺伝子である。これらの腫瘍遺伝子は、多くの植物の形態に劇的な影響を与えることが知られている（Casanovaら、Biotechnol Adv, 23, 2005, 3-39；Romanoら, Plant Mol Biol, 27, 1995, 1071-83；Smartら, Plant Cell, 3, 1991, 647-656）。腫瘍遺伝子は、ライブラリーのcDNAの均一性の指標として使用できるが、シロイヌナズナに形質転換後は、これらの腫瘍遺伝子は第二世代において突然変異系統から排除される。これらの腫瘍遺伝子はPCRで増幅できる。
【００１７】
(２)完全長cDNAライブラリーの標準化
背景技術で述べたように、従来のcDNAライブラリーでは、遺伝子の発現量によって各cDNAクローンの存在比が大きく異なる。そこで、遺伝子の発現量にかかわらず全てのクローンが同一の割合で含まれるようにライブラリーを作製する「標準化」を行うことが好ましい。
【００１８】
完全長cDNAを、各クローンにつき等量ずつ混合すれば、標準化完全長cDNA混合物を得ることができる。これを行うには、合成された完全長cDNAの５’末端配列と３’末端配列を決定（シングルパスシーケンス）して、重複の無い（末端部における一部の領域の配列が共通しない）完全長cDNAクローンを選別し、これをデータベース化しておく。
【００１９】
標準化された完全長cDNAライブラリーは、それぞれ互いに異なるcDNAを選別した上で等量ずつ混合したものであり、従来のcDNAライブラリーが有する分子種の不均一性はなく、全体的に均一である。従って、ゲノム遺伝子の多コピー遺伝子群をも考慮すると、ゲノムをタギングするときよりも公平に、すなわち高効率に、別種遺伝子の機能検定を行うことができる。
【００２０】
シロイヌナズナでは全ゲノムの50％以上に相当する標準化完全長cDNAが現在整備されており、本発明においては、これらの整備された標準化完全長cDNAを使用することができる。
【００２１】
(３)発現ベクターへの完全長cDNAのクローニング
得られた完全長cDNA又は標準化完全長cDNAを、アグロバクテリウム・チューメファシエンスによる植物形質転換のためのT-DNA発現ベクターにクローニングすることができる。T-DNAとは、双子葉植物の腫瘍であるクラウンゴールの病原細菌であるアグロバクテリウムの病原性株に見出されるTiプラスミドが有する特定領域であり、この細菌が植物に感染すると、T-DNAが植物細胞に転移し、ゲノムDNA中に組み込まれる。
【００２２】
このT-DNAの内部には、完全長cDNAの発現を調節するための配列が含まれる。発現調節配列としては、植物細胞内で、恒常的に若しくは条件的に発現を引き起こすプロモーター配列と、ターミネーターが連結したカセットを組込むのが好ましい。好ましい恒常発現型プロモーター配列としては、カリフラワーモザイクウイルス（Cauliflower Mosaic Virus）の35Sプロモーター配列（Sanders,P.R.ら、Nucleic Acids Res,1987.15（4）:p.1543-58）が挙げられ、誘導型プロモーターとしてはグルココルチコイド誘導型プロモーター配列（Aoyama,T.ら、Plant J,1997.11（3）:p.605-12）、エストロゲン誘導型プロモーター配列（Zuo,J ら、Plant J,2000.24（2）:p.265-273）などが挙げられる。本発明においては、これらのプロモーターを任意に組み合わせて（連結して）使用することも可能である。プロモーターの組合せは、恒常発現型又は誘導型同士でもよく、両者を組合せたものでもよい。
【００２３】
また、後の植物体選抜のために、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子を挿入してもよい。
【００２４】
前述の完全長cDNA又は標準化完全長cDNAをそのプロモーター配列の下流にセンス方向、又はアンチセンス方向になるように、酵素反応により、例えばT4リガーゼを用いて挿入する。これにより、センス鎖を発現させた場合は、当該cDNAをコードする遺伝子の過剰発現がもたらす表現形質の変化を、アンチセンス鎖を発現させた場合は、当該cDNAをコードする遺伝子の過少発現がもたらす表現形質の変化を知ることができる。
【００２５】
(４)完全長cDNAライブラリーのシロイヌナズナへの導入
次に、前記完全長cDNA又は標準化完全長cDNA、あるいは腫瘍遺伝子が挿入されたT-DNAの集団（Full-length cDNA over-expressor library; FOX library）を常法によりアグロバクテリウムに導入し、ライブラリーを作製した後、そのライブラリー中のcDNAを、アグロバクテリウムによる感染を介してシロイヌナズナに導入（形質転換）する。
【００２６】
植物へのアグロバクテリウムの感染は、ディッピング法、フローラルディッピング法などを用いることができる。ディッピング法の場合は、植物体の束を、アグロバクテリウムが含まれる液体中に30〜60秒浸漬する。フローラルディッピング法の場合は、直接植物宿主の花芽を浸漬し、鉢をトレイに移し、覆いをして一晩湿度を保つ。翌日覆いを取り、植物をそのまま生育させて種子を収穫する。
【００２７】
(５）表現形質によるスクリーニング
アグロバクテリウムのFOXライブラリーを用いてシロイヌナズナを形質転換した形質転換植物(T0世代)から得られた種子を、例えばハイグロマイシンを含む培地に播種する。発芽約１週間以内に形質転換植物を選択することができるので、ハイグロマイシン耐性苗を選択するために更に培養する必要はない。選択された植物(T1世代)は土壌に移植し、種子を回収する。
【００２８】
(６）表現形質の再確認及び変異形質の原因となる遺伝子の同定
興味のある形質転換植物（例えば、他の形質転換植物と比較して植物体の伸長が遅いもの、節間が短いもの、下偏生長を示すもの等、矮小に関係すると思われる形質を有する植物）からゲノムDNAを抽出し、このDNAから、T-DNA中に含まれるプロモーター配列とターミネーター配列の近傍の塩基配列情報をもとにプライマーを設計し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、これらの転写制御領域に挟まれたcDNAを単離する。このcDNAを、再び前記と同様のプロモーター配列とターミネーター配列を持ったT-DNAに挿入し、これを、正常植物に再導入して、表現形質の再確認を行う。そして、cDNAの配列決定を行うことにより、変異形質の原因となる遺伝子を同定することができる。
【００２９】
２．単離同定された矮小化遺伝子
前記手法により単離同定された植物矮小化遺伝子は、シロイヌナズナのAt1g66820（系統名：F02347）である。At1g66820の塩基配列を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２に示す。なお、配列番号１の塩基配列の1〜53番目は5’UTR、384〜544番目は3’UTRである。
【００３０】
配列番号２に示す各アミノ酸配列からなるタンパク質は、植物を矮小化させる活性を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加などの変異が生じてもよい。
【００３１】
例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列の1〜10個、1〜8個、好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、付加あるいは置換してもよい。
【００３２】
また、配列番号２のいずれかに示すアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、植物体を矮小化させる活性を有するタンパク質をコードする遺伝子でもよい。前記70％以上の相同性は、好ましくは80％以上、85％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性をいう。
【００３３】
前記アミノ酸の欠失、付加、及び置換は、前記タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異が導入される。
【００３４】
ここで、本発明において「植物体を矮小化させる活性」とは、矮小化遺伝子を発現させたときの植物体を、野生型よりも遅く成長させる活性を意味する。例えば、矮小化遺伝子を発現させたときの植物体（例えばシロイヌナズナ）の背丈が、野生型の２／３〜１／１０、好ましくは１／３〜１／１０に減少させる活性を意味する。また、「植物体を矮小化させる活性を有する」とは、前記活性が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。このような矮小化活性（又は矮小化能力）を有する植物を、本明細書では矮小化植物という。
【００３５】
前記矮小化遺伝子はまた、配列番号１に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物体を矮小化させる活性を有するタンパク質をコードするDNAを含む。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、45℃、6×SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、その後の50〜65℃、0.2〜1×SSC、0.1％SDSでの洗浄が挙げられ、或いはそのような条件として、65〜70℃、1×SSCでのハイブリダイゼーション、その後の65〜70℃、0.3×SSCでの洗浄、を挙げることができる。
【００３６】
いったん矮小化遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたcDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、矮小化遺伝子を得ることができる。さらに部位特異的突然変異誘発等によって矮小化遺伝子をコードする改変されたDNAを合成することができる。
【００３７】
３．組換えベクター及び形質転換植物の作製
（１）組換えベクターの作製
本発明に用いる組換えベクターは、前記矮小化遺伝子を適当なベクターに挿入することによって作製できる。矮小化遺伝子を植物細胞へ導入し、発現させるためのベクターとしては、pBI系のベクター、pUC系のベクター、pTRA系のベクターが好適に用いられる。pBI系及びpTRA系のベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる。pBI系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3等が挙げられる。pUC系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、pUC18、pUC19、pUC9等が挙げられる。また、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV)、インゲンマメモザイクウイルス（BGMV)、タバコモザイクウイルス（TMV）等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
【００３８】
ベクターに矮小化遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００３９】
前記矮小化遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには、プロモーター、矮小化遺伝子のほか、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、5'-UTR配列などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４０】
「プロモーター」としては、植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるDNAであれば、植物由来のものでなくてもよい。具体例としては、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Pnos)、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来PRタンパク質プロモーター等が挙げられる。
【００４１】
「ターミネーター」は、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよい。具体例としては、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Tnos)、カリフラワーモザイクウイルスポリＡターミネーター等が挙げられる。
【００４２】
「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、例えばCaMV35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。
【００４３】
（２）矮小化形質転換植物の作製
本発明の矮小化形質転換植物は、前記矮小化遺伝子又はそれを含む組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。形質転換植物（トランスジェニック植物）は以下のようにして得ることができる。
【００４４】
本発明における形質転換の対象は、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)を含む)又は植物細胞である。
【００４５】
形質転換に用いられる植物としては、双子葉植物、単子葉植物、例えばアブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科等に属する植物（下記参照）が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、アブラナ、キャベツ、ハクサイ（Brassica）など。
ナス科：タバコ（Nicotiana tabacum)、ナス、ジャガイモ（Solaneum）、トマト（Lycopersicon）、トウガラシ（Capsicum）など。
バラ科：バラ（Rosa）、イチゴ（Fragaria）、サクラ（Prunus）、リンゴ（Malus）など。
キク科：キク（Chrysanthemum）、ヒマワリ（Helianthus）など。
ナデシコ科：カーネーション（Dianthus caryophyllus）など。
イネ科：トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ（Hordeum）、コムギ（Triticum）など。
ラン科：カトレア（Cattleya）、コチョウラン（Phalaenopsis）など。
ユリ科：チューリップ（Tulipa）など。
マメ科：ダイズ(Glycine max)、エンドウ（Pisum）、ソラマメ（Vicia）、フジ（Wisteria）など。
【００４６】
前記矮小化遺伝子又は組換えベクターを植物中に導入する方法としては、アグロバクテリウム法、PEG-リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。例えばアグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合と組織片を用いる場合がある。プロトプラストを用いる場合は、Tiプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、リーフディスクにより対象植物の無菌培養葉片に感染させる方法（リーフディスク法）やカルス（未分化培養細胞）に感染させる等により行うことができる。また、単子葉植物のアグロバクテリウム法による形質転換には、アセトシリンゴンが形質転換率を高めるのに使用できる。
【００４７】
遺伝子が植物に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、in situハイブリダイゼーション等により行うことができる。例えば、形質転換植物からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。
【００４８】
形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。植物体の再生は、一般的には、適当な種類のオーキシンとサイトカイニンを混ぜた培地の上で根を分化させてから、サイトカイニンを多く含む培地に移植させシュートを分化させた後にホルモンを含まない土壌に移植することによって行う。
【００４９】
このようにしてAt1g66820などの矮小化遺伝子が導入された形質転換植物は、矮小の表現型を示す。At1g66820の遺伝子が導入されたシロイヌナズナは、節間が短い表現型も示す。
【００５０】
なお、本明細書における「表現型」という用語は、「表現形質」と同義で用いる。これらは、容易に観察または測定できる植物の形態学的特徴を意味する。
【００５１】
矮小の表現形質は、台風などの自然環境による被害（風害等）にさらされても、植物が倒れる可能性が減るなどの利点がある。また、鑑賞用植物において消費者の好みに合った小型の植物を提供できる。
【００５２】
４．植物の矮小化方法
本発明によれば、形質転換植物において、植物矮小化遺伝子を過剰発現させて矮小化を誘導することを含む、植物の矮小化方法が提供される。
【００５３】
矮小化遺伝子を過剰発現させる方法は、例えば、成長期の植物に対し物質投与、環境ストレス付与などがある。誘導プロモーターの場合、化学物質（ステロイドやアルコールなど）投与、或いは温度、乾燥などのストレス誘導プロモーターの場合、それぞれに応じた物理的ストレスが誘導条件になる。
【実施例１】
【００５４】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
１．方法
（１）標準化完全長cDNA及びマーカー遺伝子から構成されるcDNA混合物の調製
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana Columbia株）完全長cDNAライブラリーを次の２つのベクターを用いて構築した。ライブラリーRAFL2〜RAFL6（RAFL:RIKEN Arabidopsis full-length cDNA clone）にはベクターLambda Zap II (Stratagene, La Jolla, USA)を、ライブラリーRAFL7〜RAFL11にはベクターLambda FLC-1-B (Stratagene, La Jolla, USA)を用いた。
【００５５】
これらのライブラリーからのクローンをシングルパスシーケンスして（Sekiら, 2002, Plant J, 31, 279-92）、重複しないクローンを選択し、各クローンについて平均最終濃度が14ng/mlの約15,000cDNAから成る完全長cDNA混合物を調製した。
【００５６】
これらのクローンの約3分の1は、ある重複したcDNAを含んでいることをRAFL clone sequencing project (Yamadaら, 2003, Science 31 October 2003:Vol. 302. no. 5646, pp. 842 - 846)からわかっていたので、このクローン混合物は約10,000の重複しない完全長cDNAから成ることになる。
【００５７】
RAFL2及びRAFL3ライブラリー(全部で1,623クローンに対応）におけるSfiIクローニング部位に対する完全長cDNAの向きは、RAFLクローンの残りのSfiIクローニング部位と反対向きであった。表現型スクリーニングのための内部標準とするために、オーキシン合成(tms1, iaaM) （Comaiら, 1982, J Bacteriol, 149, 40-6；Klee ら, 1984, Proc Natl Acad Sci USA, 81, 1728-32）、オーキシン感受性 (rolB) (Furnerら, 1986, Nature, 319, 422-427)、及びサイトカイン合成(tmr) (Lichtensteinら, 1984, J Nol Appl Genet, 2, 354-62)に関連する４つの細菌遺伝子をPCRにて増幅し、pBluescript-由来ベクターのSfiI部位にクローニングした。各対照プラスミドを別々に完全長cDNA 混合物に30 ng/mlの濃度で加えた。増幅に用いる対照遺伝子のDNA鋳型およびPCRプライマーは以下のとおりである。
pT281 (tms1)：
5’-AGAGGCCAAATCGGCCATGTCAGCTTCACCTCTCCTT-3’  (配列番号３)
5’-AGAGGCCCTTATGGCCCTAATTTCTAGTGCGGTAGTTAT-3’  （配列番号４）
pCP3 (iaaM)：
5’-AGAGGCCAAATCGGCCATGTATGACCATTTTAATTCACCC-3’  （配列番号５）
5’-AGAGGCCCTTATGGCCCTAATAGCGATAGGAGGCGTTG-3’  （配列番号６）
pLJ-1 (rolB)：
5’-TCCTCTAGAGGCCAAATCGGCCATGGATCCCAAATTGCTATTCCT-3’  （配列番号７）
5’-TGATCTAGAGGCCCTTATGGCCTTAGGCTTCTTTCTTCAGGTTTA-3’  （配列番号８）
pT281 (tmr)：
5’-AGAGGCCAAATCGGCCATGGACCTGCATCTAATTTTCG-3’  （配列番号９）
5’-AGAGGCCCTTATGGCCCCTAATACATTCCGAACGGATGA-3’  （配列番号１０）
【００５８】
（２）標準化完全長cDNAのアグロバクテリウムライブラリーの調製
前記（１）で調製したcDNA混合物をSfiI(Takara Bio)で消化し、アグロバクテリウムバイナリーベクターpBIG2113SFのSfiI部位にT4リガーゼ(New England BioLabs, Beverly, USA)を用いてクローニングした。pBIG2113SFベクターはpBIG2113N(Tajiら, 2002, Plant J, 29, 417-26)を由来とし、完全長cDNAが35Sプロモーターに対してセンス方向に挿入されるように2つのSfiI部位をpBIG2113NのXbaI部位に挿入した。
【００５９】
図１(a)にバイナリーベクターの例を示す。ElはCaMV 35Sプロモーターの5’-上流配列（-419から-90）、P35SはCaMV 35Sプロモーター(-90から-1）、ΩはTMVの5’-上流配列、NOS-TはTiプラスミドのノパリン合成遺伝子のポリアデニル化シグナル、Hygはハイグロマイシン耐性遺伝子を示す。矢印は、cDNAを回収するのに使用されるGS4プライマーとGS6プライマーの位置を示す。LBはレフトボーダー、RBはライトボーダーを示す。
【００６０】
ライゲーションは、バイナリーベクターに対して6倍モル過剰量のpBluescriptで組み立て、そのライゲーション産物でE. coli DH10B (Invitrogen)をエレクトロポレーション法によって形質転換し、コロニーを混合してプラスミドライブラリーを単離した。
【００６１】
アグロバクテリウムGV3101を、プラスミドライブラリーでエレクトロポレーションによって形質転換し、生じた細菌コロニーを混合してアグロバクテリウムライブラリーを調製した。
【００６２】
（３）形質転換及び植物の生育
形質転換及び植物の生育は、既報(Ichikawaら, 2003, Plant J, 36, 421-429)に記載されている。
【００６３】
短い野生型シロイヌナズナ(Col-0)及び形質転換株をcultivation container system (Arasystem, Gent, Belgium)で長日条件（16時間明期、8時間暗期）下で22℃にて生育させた。野生型植物を、アグロバクテリウムライブラリーを用いてフローラルディッピング法(Cloughら, 1998, Plant J, 16, 735-43)により形質転換した。
【００６４】
ハイグロマイシン耐性T1苗を50 mg/lハイグロマイシンを含む基本寒天培地(BAM)上で7日間選択し、土壌に移した(Nakazawaら, 2003, Biotechniques, 34, 28-30)。目に見える表現型（例えば、成長率、植物体の色、開花期、稔性の変化等）をスコアし、表現型(FT1P)を示す全ての植物を新しいArasystemトレイに移し、更に観察した。
DNA分析のために、ロゼット葉か花のいずれかを全FT1P植物から採取した。
【００６５】
（４）DNAゲルブロット分析及びハイグロマイシン耐性試験
サザンブロッティングは、既報(Meyerら, 1995, Mol Gen Genet, 249, 265-73)に従って実施した。20系統を無作為に選んで、T2植物を前記（３）植物材料及び植物の生育に記載したように、3週間土壌生育させた。１系統につき3つの植物体から葉を採取し、液体窒素内でホモジナイズした。
【００６６】
ゲノムDNAをDNeasy plant mini kit (Qiagen, Tokyo, Japan)を用い、指示書に従って単離した。ハイグロマイシン耐性遺伝子の部分を含むpBIG2113SFから増幅した0.5 kb PCR 断片をDIG DNA Labeling Mix (F. Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland)を用いて標識した。
【００６７】
DNA鋳型用PCR プライマーとして以下のものを用いた。
HN: 5’-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG-3’  （配列番号１１）
HC: 5’-TCGAGAGCCTGCGCGACG-3’  （配列番号１２）
【００６８】
ハイブリダイゼーションは、溶液（5XSSC, 50 % ホルムアミド, 0.1 % N-ラウロイルサルコシン, 0.02 % SDS, 2 % ブロッキング試薬(F. Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland)）を用いてプローブ濃度を5 ng/ml、44℃にて行い、第２洗浄を0.1XSSC, 0.1 % SDSの溶液を用いて行う以外は、指示書に従った。
【００６９】
化学発光は、ハイブリダイゼーション膜をDIG Nucleic Acid Detection Kit (F. Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland)にて処理した後、LumiVisionPRO (Aisin)によって検出した。
【００７０】
ハイグロマイシン耐性を調べるために、FT1P系統から得られた平均40個の種子をハイグロマイシン含有BAM培地に播いた。発芽10日後、播いた種子あたりの耐性苗の数を計測した。
【００７１】
（５）FT1P植物からの完全長cDNAの増幅とクローニング
ロゼット葉又は花の約200mg（生体量）を採取した。
５つのセラミック粒（CERAMICS YTZ ball, D: 2.3 mm, Nikkato, Japan)及び300μlの溶解バッファーを植物材料に加え、Shake Master (Shake Master ver.1.0, Bio Medical Science, Tokyo, Japan)を用いてホモジナイズした。ゲノムDNAをWizard Magnetic 96 DNA Plant System (Promega, Tokyo, Japan)を用いて抽出した。ワークステーションシステム (Tecan genesis workstation150, Tecan, Tokyo, Japan)を導入して抽出キットに記載されている抽出プロトコールを実行した。
【００７２】
Gatewayベクターへのクローニングの際にはcDNA PCRに以下のプライマーを用いた。
B1GS7:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCTAGAGGCCCTTATGGCCG-3’  （配列番号１３）
B2GS8:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCGAGTTAATTAAATTAATCCCCC-3’  （配列番号１４）
【００７３】
pBIG2113SF ベクターへのクローニングの際には以下のプライマーペアを用いた：
GS4: 5’-ACATTCTACAACTACATCTAGAGG-3’  （配列番号１５）
GS6: 5’-CGGCCGCCCCGGGGATC-3’  （配列番号１６）
【００７４】
短い断片に対するPCR条件は、94℃30秒変性、62℃30秒アニーリング、72℃120秒伸長とした。長い断片に対するPCR条件は、94℃30秒変性、58℃30秒アニーリング、68℃180秒伸長とした。両ケースとも、反応前にDNAを8分間95℃にて変性した。
【００７５】
（６）PCR断片の発現ベクターへのクローニング及び配列決定
GatewayベクターPCR断片をまずBP clonaseによって指示書に従ってpDONR-207 ベクターにクローニングし(Invitrogen, Carlsbad, USA)、挿入した完全長cDNA 断片を下記のattL1およびattL2 プライマーを用いて配列決定した。
attL1: 5’-TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC-3’  （配列番号１７）
attL2: 5’-GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC-3’  （配列番号１８）
【００７６】
pBIG2113SFへのクローニングのために、T1植物からのPCR断片をSfiIで消化し、ベクターのSfiI部位にクローニングした。得られた構築物を、例えばF02347系統の場合、pF02347とした。挿入した完全長cDNA断片をGS6プライマーを用いて配列決定した。
【００７７】
（７）野生型植物体と矮小化遺伝子の形質転換植物体の比較
F02347系統の植物からゲノムDNAを抽出して、GS4,GS6プライマーを用いて上記の通りcDNAを増幅し、pBIG2113SFへクローニングを行った。この構築物とアグロバクテリアを用いて野生型シロイヌナズナへ導入し、At1g66820遺伝子の形質転換体を作製した。１形質転換体を選び、種を回収し、その子孫を３２個体成育させ、播種後１ヶ月たったときの植物の高さを測定した。さらにこの３２個体からそれぞれ種を回収し、ハイグロマイシン培地に播種を行い、３２個体のうちT-DNAが挿入されていなかった９個体を特定し、T-DNAが挿入されていた２３個体と、されていなかった９個体の植物長の比較を行った。
【００７８】
２．結果
（１）約10,000の標準化シロイヌナズナ完全長cDNAを含むアグロバクテリウム発現ライブラリーの構築
シロイヌナズナ完全長cDNAライブラリーを作製するのと同じモル比で約10,000の独立したシロイヌナズナ完全長cDNAを混合した。cDNAは理研のシロイヌナズナ完全長cDNAコレクション由来であり、各cDNAは配列決定されている（Sekiら、2002, Plant J., 31, 279-92）。また、内部標準として、形態的表現型及び不稔を誘発することが知られている４つの細菌の腫瘍遺伝子を混合した。この内部標準は、ライブラリーのcDNA発現量の指標として使用できるが、シロイヌナズナに形質転換後は、腫瘍遺伝子は第２世代で突然変異系統から排除される。tms1 (Kleeら、1984, Proc Natl Acad Sci U S A, 81, 1728-32)、iaaM （Comaiら、1982, J Bacteriol, 149, 40-6）、rolB （Furnerら、1986, Nature, 319, 422-427）及びtmr (Lichtensteinら、1984, J Mol Appl Genet, 2, 354-62)を使用した。これらの腫瘍遺伝子は多くの植物の形態に劇的影響を持つことが知られている。これら４つの腫瘍遺伝子を、個々の完全長cDNAに対してモル比で約２倍量を添加すると、約7,500のcDNAクローン毎に１つ、各腫瘍遺伝子が出現すると予測される。
【００７９】
アグロバクテリウムライブラリー（FOXアグロバクテリウムライブラリー）を作製後、T-DNA特異的プライマーを設計し、ランダムに選択したアグロバクテリウムコロニーから単離したDNAで、PCRを行った。34のアグロバクテリウムコロニーから得られたPCR断片を増幅し、電気泳動を行ったところ、20コロニーが単鎖cDNA構築物を含み、11コロニーが２つの異なるcDNA構築物を含み、1コロニーが３つの異なるcDNA構築物を含み、2コロニーが空のベクターを含んでいた（図１(b))。図１(b)のレーン1,2,5,6,7,9,10,13,15,17,19及び22で、複数のバンドが増幅されたことが示された（レーンMはLambda/HindIIIマーカー）。
【００８０】
また、これらの45の増幅されたcDNA断片の平均サイズは1.4Kbであり、0.3Kb〜3.0Kbの範囲内であった。45のcDNA断片を配列決定したところ、すべてのcDNAが互いに独立していた。
【００８１】
（２）シロイヌナズナFOX系統の作製
シロイヌナズナFOX系統を作製するために、FOXアグロバクテリウムライブラリーを使用して、シロイヌナズナColumbia-0 (Col-0)生態型を形質転換した。フローラルディッピング法後、T0植物から得られた種子を集め、ハイグロマイシン含有BAMプレート上で選択した（Nakazawaら、2003, Biotechniques, 34, 28-30）。プレートにより発芽１週間以内に形質転換植物が選択されるので、ハイグロマイシン耐性苗を選択するために更に培養をする必要がない。ハイグロマイシン耐性T1苗を、土壌に移植し、15,000を超えるシロイヌナズナ稔性FOX系統を作製した。導入遺伝子の存在を確認するため、24のランダムに選択された植物を、プローブとしてハイグロマイシン遺伝子を用いたマーカー遺伝子の存在についてサザン法で分析した。全ての系統がハイグロマイシン耐性遺伝子を含んでおり、シロイヌナズナFOX系統に平均2.6のT-DNAが挿入されていた。
【００８２】
（３）シロイヌナズナFOX系統の完全長cDNAのサイズ分布及び配列の相違
完全長cDNAが発現ベクターに組み込まれ、そのサイズ分布が平均1.4Kbで、0.3〜3Kbの範囲内であったため、このサイズ分布がシロイヌナズナFOX系統に反映されているかを調べた。
【００８３】
FOX系統で組み込まれたcDNAのサイズ分布とばらつきを調べるため、T-DNA特異的プライマーを使って、ランダムに選択したFOX植物から単離したゲノムDNAでPCRを行った。106の系統でのサイズ分布は、0.3Kb〜4.2Kbの範囲内で、平均1.4Kbであった。図1(c)に、Lamdbaベクターにおいて277のランダムに選択されたRAFL cDNA（白のバー）と比較した、シロイヌナズナFOX植物から増幅された106のRAFL cDNA断片のサイズ分布を示す。分布パターンの類似性をはっきりさせるため、Lambdaベクターから得られた値を２で割り、グラフにプロットした。
【００８４】
これらの系統から増幅されたPCR断片の平均数は、1植物当たり1.2であった。またDNAゲルブロット分析を行ったところ、1系統当たり平均2.6のT-DNAが挿入されていた。しかし、FOX植物からは平均1.2のPCR断片しか回収されなかった。この低いPCR断片回収率は、集団内に空のベクターが存在することよって部分的には説明できるが、主に、T-DNAタンデムまたは逆位反復などの２重のT-DNAの組み込みが生じたことによると考えられる（De Buckら, 1999, Plant J, 20, 295-304; De Neveら, 1997, Plant J, 11, 15-29; Krizkovaら, 1998, Plant J, 16, 673-80）。
【００８５】
cDNAの分布の平均サイズと範囲は、FOXアグロバクテリウムライブラリーで観察されるものと非常に似ており、また277のランダムに選択されたシロイヌナズナ完全長cDNAで観察されるものとも類似していた（図１(c)）。
【００８６】
また、40のPCR断片を配列決定したところ、これらは異なる完全長cDNA由来であり、内部標準としてcDNA混合物に添加した細菌腫瘍遺伝子とも同一ではなかった（表１）。
【００８７】
【表１】
2008099637.tif 000002
2008099637.tif 000003
【００８８】
（４）シロイヌナズナFOX系統の表現型のモニタリング
15,547のT1 FOX系統を作製する過程で、表現型（成長率、植物の色、開花期、稔性等）をモニターし、表現型が変化した1,487系統を集めた。
【００８９】
これらの見かけ上の形態的突然変異体系統と、シロイヌナズナのアクチベーションタクド系統に現れた形態的突然変異体と比較したところ、様々なカテゴリーでの突然変異体の分布はほとんど同じであったが、Fox系統の方がずっと強い変異を示した。これはFox系統の効率性を示しており、主に、強力なCaMVプロモーターとノパリン合成（NOS）ターミネーターの制御下で、完全長cDNAが適切に発現することによると考えられる。
【００９０】
T2世代の突然変異表現型の遺伝率を確認するため、T1世代で現れた117の薄緑色の突然変異系統（表２）を生育し、T2世代の突然変異の表現型を探した。
【００９１】
【表２】
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【００９２】
これらの表現型をモニターするために、各20苗ずつ生育した。20苗から優性がはっきりと確立されるのは難しいにもかかわらず、60系統が薄緑色の表現型を示した（即ち、表２でT2表現型率が５０％以上示した系統の数が60）。また、40の形態的突然変異体についても調べ、元の突然変異体の表現型を示す7系統を見出した。これはT2世代の導入遺伝子の抑制によるものか、T1FOX植物のうち誤って突然変異体と同定されたものと考えられる。特に矮小化及び葉形の突然変異体は選択プレートから移動した後、環境ストレスにより生じたものと考えられる。
【００９３】
（５）腫瘍遺伝子により生じる形態
内部標準として４つの腫瘍遺伝子tms1、iaaM、rolB及びtmrを、完全長cDNAライブラリーと混合した。iaaM 及び tms1は、それぞれP.syringae 及び A.tumefaciens由来のトリプトファン2-モノオキシゲナーゼをコードし、これらの遺伝子が高発現してオーキシン応答が増強される（Comaiら, 1982, J Bacteriol, 149, 40-6）。rolB は、Agrobacterium rhyzogenesis由来であり、オーキシンに対する感受性に関係している。tmrは、Agrobacterium tumefaciens由来の腫瘍遺伝子であり、サイトカイニンの生合成に機能する。各腫瘍遺伝子を、完全長cDNAと比較して２倍のモル等量の割合で完全長cDNAと混合した。
【００９４】
完全長cDNAの発現量と分布をモニターするため、シロイヌナズナFOX系統における腫瘍遺伝子の出現を調べた。まず、腫瘍遺伝子によって生じた突然変異について形質転換植物の形態をモニターした。形態的表現型を有していたのは２つだけであった。tms1及びiaaMのいずれの場合でもオーキシン応答が増強されるので、これらの遺伝子を含む植物では、頂芽優性と小型の表現型が促進されていた（図２）。これらの形態的な違いは、他の形態的突然変異と非常にはっきりと容易に区別される。図２(a)は、同期間成長させた、iaaM高発現植物と野生型（WT）植物を比較したものである。図２(b)は、iaaM高発現植物の近接写真である。図２(c）は、tms1高発現植物である。
【００９５】
tmrの高発現は、植物苗を致死させたが、rolBの高発現は、はっきりとした表現型を示さなかった。15,547のシロイヌナズナFOX系統のうち、13のtmr1及びiaaMの高発現突然変異体が存在した。見かけ上のこれらの突然変異体は、理論値（15,000のうち4）と比較して高かった。これは、細菌培養における、形質転換されたアグロバクテリアの増殖の差に依存している可能性があると考えられる。前記腫瘍遺伝子の利点の１つは、突然変異体は不稔なので、rolB以外は、次の世代に持ち越されないことである。
【００９６】
（６）PCRで再生した完全長cDNAでの再形質転換によるFOX突然変異体の発現
導入された完全長cDNAと突然変異体の表現型との関係を更に明らかにして検討するため、幾つかのFOX突然変異体を様々な形態のカテゴリーから選択した。F00721及びF00745は野生型と比較してゆっくりと成長した（図３(a)：野生型、(b)：F00721及び(c)：F00745）。F01049は濃緑色で下偏生長した葉を有していた（図３(d)）。F01310は斑入りの葉を有していた（図３(e)）。F02347は成長の非常に早い段階で花をつけ、非常に小さい形態を有していた（図３(f)）。F02635は株立ちの植物体で弱い頂芽優性であった（図３(g)）。ゲノムPCRで単離された完全長cDNAで再形質転換した後、すべて元の表現型が再現された。対応する遺伝子を表３にまとめた。非常に興味深いのは、表現型を付与する遺伝子に未知の遺伝子が含まれており、その遺伝子の過剰発現によって表現型が生じていることが分かる。
【００９７】
【表３】
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【００９８】
（７）野生型植物体と矮小化遺伝子の形質転換植物体の比較
移植後１ヶ月たった野生型（9個体）は、平均値で37.2cm（標準偏差3.7）に対し、At1g66820遺伝子を導入した形質転換植物（23個体）は13.8cm（標準偏差8.2）であり（図４）、野生型の３分の１近くに矮性化した。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明の矮小化形質転換植物は、農業・園芸分野等で応用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】(a)は、完全長cDNAを導入したバイナリーベクター構築物を示す。(b)は、増幅cDNAの電気泳動像を示す。(c)は、RAFL cDNAのサイズ分布を示す。
【図２】シロイヌナズナでの腫瘍遺伝子の高発現表現型又は野生型の表現型を示す。
【図３】(a)は、シロイヌナズナの野生型の表現型を示す。(b)〜(g)は、シロイヌナズナの矮小化に関する系統の表現型を示す。
【図４】シロイヌナズナの野生型と矮小化遺伝子が導入された形質転換植物の背丈の比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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