(57)【要約】      （修正有）【課題】ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおいて、強力な創傷治癒活性を示す組成物の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または特定のアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは９０％が同一であるポリペプチドを含む創傷治療剤および創傷治療用組成物。更なる活性物質として止血活性物質、成長因子、抗感染物質、鎮痛物質、抗炎症物質を含んでいても良い。この組成物は、局所、全身、経口、皮下、経皮、筋肉内、または腹腔内に投与される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
創傷治療のための、任意の適当な賦形剤と共に、
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは９０％が同一であるポリペプチドを含む創傷治療用組成物。
【請求項２】
人体または動物体の創傷の治療方法において使用するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは９０％が同一であるポリペプチドを含む創傷治療用組成物。
【請求項３】
少なくとも２種の活性物質を含み、
そのうち１種は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは９０％が同一であるポリペプチドである、請求項１〜２に記載の創傷治療用組成物。
【請求項４】
さらなる１種の活性物質が、止血活性物質、成長因子、抗感染物質、鎮痛物質、抗炎症物質、またはそれらの組合せである、請求項３に記載の創傷治療用組成物。
【請求項５】
局所、全身、経口、皮下、経皮、筋肉内、または腹腔内の投与に適した形態をしている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の創傷治療用組成物。
【請求項６】
局所投与に適した形態が、クリーム、ゲル、パップ剤、ポマード、塗布剤、乳剤、ローション、乳濁液、噴霧剤、洗眼剤、滴剤、散剤を含む、請求項５に記載の創傷治療用組成物。
【請求項７】
全身投与に適した形態が、注射液および坐薬を含む、請求項５に記載の創傷治療用組成物。
【請求項８】
経口投与に適した形態が、飲用懸濁液、シロップ、錠剤、カプセル、丸薬を含む、請求項５に記載の創傷治療用組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、０．０１〜９０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％、より好ましくは１〜５重量％の量で存在する、請求項１〜８に記載の創傷治療用組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９の組成物を含む創傷治療用医療用具。
【請求項１１】
ドレッシング材、包帯、経皮的医療用具、薬剤放出制御型医療用具、または薬剤溶出ステントの形態をしている、請求項１０に記載の創傷治療用医療用具。
【請求項１２】
急性創傷および／または慢性創傷を治療するための医薬組成物の製造における、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは９０％が同一であるポリペプチドの使用。
【請求項１３】
急性創傷が、切開創、裂傷、擦過傷、刺傷、穿通創、打撲傷、血腫、挫滅傷を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
慢性創傷が、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍、角膜潰瘍、消化器潰瘍、虚血、放射線障害、および乾癬、座瘡、湿疹などの皮膚病に起因する創傷を含む、請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創傷の治療に関する。特には、本発明は、創傷治療剤、この創傷治療剤を含む組成物、およびそれを含有する医療用具に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織における創傷の治癒は、複雑な修復過程である。例えば、皮膚の創傷治癒過程は、創傷部位への様々な特殊化した細胞の動員、細胞外基質および基底膜の沈着、血管形成、選択的プロテアーゼ活性、ならびに上皮再形成を伴う。
【０００３】
創傷の治癒を促進する物質を供給する必要性は常にある。急性の創傷および慢性の創傷の場合に、または一般に治癒しにくい人（例えば、高齢者）には、治癒速度の増大が望ましいことが多い。創傷は、生活の質に大きく影響を及ぼし、また死亡する場合さえもあるので、臨床的に可能な限り治癒速度を増大させる必要があることが多い。
【０００４】
多くの創傷治療剤および創傷治療用組成物が既に市販されているが、完全に満足させる物はない。やはり、効果的で、迅速で、かつ美的に許容できる創傷の修復をもたらす代替の創傷治療剤および創傷治療用組成物を提供することは、今なお重要な問題である。
【０００５】
本出願人の出願である、国際公開第０３／０７４０７３号には、血管形成の調節に関わる５４個の遺伝子のファミリーについて記載されている。これらの遺伝子の中で、国際公開第０３／０７４０７３号においてアンジオデンシン（Ａｎｇｉｏｄｅｎｓｉｎｅ）とも呼ばれている「タンパク質１５６Ａ」（本明細書では配列番号２）をコードする、「遺伝子１５６」（本明細書では配列番号１）が血管形成を促進すると記載されている。タンパク質１５６Ａは、２１７個のアミノ酸を含み、ミトコンドリアの配列シグナルを有し、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ実験によって検出される。タンパク質１５６Ａは、いかなる膜貫通領域も保存領域も含まない。国際公開第０３／０７４０７３号には、ヒト内皮細胞における遺伝子１５６のアンチセンスの発現、即ち遺伝子１５６の阻害は、毛細血管の形成を阻害することが記載されている。国際公開第０３／０７４０７３号は、さらに、遺伝子１５６およびタンパク質１５６Ａに関して、血管形成促進活性である可能性のあることを予測している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
その研究が深まるにつれて、本発明者等は、驚くべきことに、タンパク質１５６Ａが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで強力な創傷治癒活性を示すことを見出した。国際公開第０３／０７４０７３号は、タンパク質１５６Ａに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏの血管形成促進活性可能性のみに言及しており、このように、タンパク質１５６Ａがｉｎ  ｖｉｖｏでの創傷治癒に作用を及ぼす可能性について本発明者等は思い至っていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明者等は、創傷修復に対するタンパク質１５６Ａの強い効力に気付いて本当に驚いた。
【０００８】
加えて、本発明者等は、タンパク質１５６Ａがまた、瘢痕の最終的な美的な面に特に有効であり、より正常に近くて、より色素沈着が少ないように見えることを見出した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
したがって、本発明は、第１の態様では、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは９０％が同一であるポリペプチドを含む創傷治療剤に関する。
【００１０】
用語「配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは９０％が同一であるポリペプチド」は、配列番号２のアミノ酸配列と５０％、好ましくは７０％、より好ましくは９０％が同一であり、創傷治癒活性を示す全てのポリペプチドを意味する。それはまた、創傷治癒活性を有するタンパク質１５６Ａの断片も含む。
【００１１】
本明細書で使用する用語「創傷」は、特に限定されないが、以下のことを指している。
−  皮膚の表皮および／または真皮の損傷、
−  内部または外部の組織または器官、例えば眼、粘膜、肺、腎臓、心臓、腸、腱または肝臓などの障害、損傷あるいは外傷に起因する創傷、
−  例えば静脈、小静脈、動脈、および毛細血管などの血管組織の損傷または障害。
【００１２】
本明細書では、用語「創傷治療」は、創傷の治癒に関係する全ての様々なステップを述べるために使用される。したがって、それは、傷をふさぐ血塊を形成するステップ、炎症性細胞による血塊の侵襲と、それに続く線維芽細胞および毛細血管の侵襲により、創縁を引き合わせる収縮性の肉芽組織を形成するステップ、ならびに切断された表皮の縁が前方に移動して、裸出した創傷表面を覆うステップを含む。用語「創傷治療」は、皮膚の治療に限定されるのではなく、上記のような他の種類の創傷の組織修復も含む。
【００１３】
第２の態様では、本発明は、治療有効量の配列番号２、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは９０％が同一であるポリペプチドを、それを必要とする患者に投与することを含む創傷の治療方法にも関する。
【００１４】
用語「治療有効量」は、許容できない毒性症状が出ることなく、期待される医療成果、即ち創傷治癒の達成を可能にする量を意味する。前記「治療有効量」は、治療する個々の状態、患者の肉体的な状態、および治療の期間などの要因で変わるであろう。
【００１５】
本発明は、さらに、第３の態様では、創傷治療のための、任意の適当な賦形剤と共に、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは９０％が同一であるポリペプチドを含む創傷治療用組成物に関する。
【００１６】
特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは９０％が同一であるポリペプチドを含む組成物から、内毒素が除去される。
【００１７】
本発明による創傷治療剤および創傷治療用組成物の主な利点の１つが、治癒速度の増大と、組織的に本来の組織に非常に近いところまで損傷組織が回復することである。
【００１８】
さらに、本発明者等は、本発明による創傷治療剤および創傷治療用組成物が、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏでの内皮細胞移動の刺激に活性であることを指摘した。タンパク質１５６Ａはまた、血管形成を一度刺激するだけではなく、真皮および表皮における細胞の再生を含めて、創傷修復過程の幅広い刺激まで、創傷の治癒に包括的な役割を果たしていると思われる。
【００１９】
本発明はまた、人体または動物体の創傷の治療方法において使用するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは９０％が同一であるポリペプチドを含む創傷治療用組成物にも関する。
【００２０】
特定の実施形態では、上記の創傷治療用組成物は、少なくとも２種の活性物質を含み、そのうち１種は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは９０％が同一であるポリペプチドである。別の実施形態では、さらなる１種の活性物質は、止血活性物質、成長因子、抗感染物質、鎮痛物質、抗炎症物質、またはそれらの組合せである。
【００２１】
さらに別の実施形態では、本発明による創傷治療用組成物は、局所、全身、経口、皮下、経皮、筋肉内、または腹腔内の投与に適した形態である。
【００２２】
局所投与に適した形態は、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、パップ剤、ポマード、塗布剤、乳剤、ローション、乳濁液、噴霧剤、エアロゾル、洗眼剤、滴剤、散剤を含む。
【００２３】
全身投与に適した形態は、注射液および坐薬を含む。
【００２４】
経口投与に適した形態は、飲用懸濁液、シロップ、錠剤、カプセル、丸薬を含む。
【００２５】
本発明によれば、上記の創傷治療用組成物では、前記ポリペプチドが、０．０１〜９０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％、より好ましくは１〜５重量％の量で存在する。
【００２６】
特定の実施形態では、本発明の組成物は液状であり、活性ポリペプチドが、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．５ｍｇ／ｍＬの量で存在する。
【００２７】
本発明の意味する「組成物」は、皮膚薬を含めた医薬組成物および化粧用組成物を包含している。
【００２８】
用語「適当な賦形剤」には、動物油脂および植物油脂、鉱油、合成油、エステル油、ワックス、直鎖高級アルコール、脂肪酸、界面活性剤、リン脂質、ゲル化剤および／または増粘剤、アルコール、ポリオール（グリセリンおよびプロピレングリコールを含む）、粘土鉱物等の充填剤、ソフトフォーカス粉末、防腐剤、芳香剤、顔料および純水などの既知の原材料が含まれる。この用語には、例えばマンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、フコマンナン、プロテオグリカン、グルコサミノグリカン、キチン、キトマンナン等の多糖類も含まれる。本発明が上記の賦形剤に限定されないことを、本出願人はさらに言及する。当業者であれば、特定の投与形態に適する最良の賦形剤を選択することが可能である。
【００２９】
第４の態様では、本発明は、さらに、上記の創傷治療剤または創傷治療用組成物を含む創傷治療用医療用具に関する。
【００３０】
好ましい実施形態では、この医療用具は、ドレッシング材、包帯、経皮的医療用具、薬剤放出制御型医療用具、または薬剤溶出ステントの形態である。
【００３１】
本発明の意味する範囲内の適当なドレッシング材とは、いかなる限定もされないが、親水コロイドドレッシング材、ヒドロセルロースドレッシング材、アルギン酸塩ドレッシング材、ヒドロゲルドレッシング材、キトサン系ドレッシング材、セルロース誘導体ドレッシング材、および創傷の保護および修復に役立つ任意の他の種類のドレッシング材である。
【００３２】
「経皮的医療用具」は、例えば粘着パッチ等の、物質の経皮的過程による徐放のための用具を意味する。
【００３３】
「薬剤溶出ステント」は、「被覆」または「薬剤添加」ステントとも呼ばれ、活性物質「タンパク質１５６Ａ」で被覆されたステントを意味する。
【００３４】
本発明はまた、急性創傷および／または慢性創傷を治療するための上記の創傷治療剤、創傷治療用組成物、または創傷治療用医療用具の使用にも関する。
【００３５】
本発明はまた、急性創傷および／または慢性創傷を治療するための医薬組成物の製造における、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは９０％が同一であるポリペプチドの使用にも関する。
【００３６】
基本的には、急性創傷は、創傷を引き起こした物によって様々な種類に分類することができる。例えば、切開創または切創、裂傷、擦過傷およびかすり傷、熱傷、釘または針などの皮膚を刺す物に起因する刺傷、体内に刺さるナイフ等の物に起因する穿通創、体内に食い込む、もしくは貫通する銃弾または類似の発射体に起因する銃創である。急性創傷はまた、打撲傷または打ち身、血腫、長時間にわたって加えられた大きな、または極度の力に起因する挫滅傷などの閉鎖創もあり得る。他の急性創傷は、乾癬、座瘡、湿疹などの皮膚病によるものである。
【００３７】
本発明によって治療できる別の種類の創傷は、慢性創傷である。一般的な慢性創傷は、通常は脚に起こり、主に高齢者を冒す静脈性潰瘍、慢性創傷の別の主要な原因である糖尿病性潰瘍、踵、肩甲骨および仙骨などの常に圧力にさらされる身体部分の動きを妨げる麻痺などの状態の人々に通常起こる褥瘡性潰瘍、最も一般的には細菌、ウイルス、真菌またはアメーバによる感染に起因する角膜潰瘍、および消化器潰瘍である。他の種類の慢性創傷は、虚血および放射線障害などの原因による。
【実施例】
【００３８】
ここで、本発明を次の実施例を参照してさらに説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１：組換えタンパク質１５６Ａの産生
タンパク質１５６Ａは、遺伝子１５６によってコードされる全タンパク質に一致する組換えタンパク質である。タンパク質１５６Ａは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｂ１２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓに発現し、８Ｍ尿素を用いて細菌の細胞から抽出され、液体クロマトグラフィーを使用して金属イオン（Ｎｉ）キレートカラム上で精製された。精製された組換えタンパク質１５６Ａの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって制御され、６５％以上であることが示された。使用の前に、Ｅｎｄｏ−Ｔｒａｐカラム（Ｐｈａｍａｃｉａ）を使用して、精製したタンパク質１５６Ａを含有する溶液から内毒素を除去して、試験を行った。精製した、内毒素を含まない組換えタンパク質１５６Ａを、２Ｍ  尿素、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有するｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に保存した。
【００４０】
実施例２：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質１５６Ａによる内皮細胞移動の刺激
ＳａｔｏおよびＲｉｆｋｉｎによって記述された創傷アッセイ（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９８８；１０７：１１９９）を若干変更して、細胞移動を試験した。増殖培地ＥＧＭ−２ＭＶ（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で増殖したＨＵＶＥＣを２４ウェルプレートに増殖培地５００μＬ入りウェル１個につき８０，０００個の細胞数で接種し、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃でコンフルエンスまで増殖させた。細胞は、プラスチックのチップで１ラインだけ掻き取られた。損傷した後、培地を、５００ｎＭ（１５μｇ．ｍＬ−１）のタンパク質１５６Ａを補充した（試験、図１Ｂ）、または補充していない（対照、図１Ａ）新しい培地に取り替えた。培養１８時間後に、細胞は観察され、倒立顕微鏡で撮影された（Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｒｕｎｇｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）。
【００４１】
図１Ａは、培養１８時間後に、創傷が、対照の条件下（増殖培地のみ）でまだ存在していることを示している。
【００４２】
図１Ｂは、培養１８時間後に、創傷が、試験の条件下（増殖培地＋タンパク質１５６Ａ）で完全に治癒していることを示している。
【００４３】
内皮細胞の移動は新血管形成および創傷修復の重要な特徴の１つであるから、したがって、タンパク質１５６Ａは、創傷治療のための治療の先導役である可能性がある。
【００４４】
実施例３：Ｓｗｉｓｓ系ヌードマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質１５６Ａの治癒活性の予備的試験
２匹の動物に、ケタミン−キシラジン（８０ｍｇ／ｋｇ−１２ｍｇ／ｋｇ；型番：Ｋ−１１３、Ｓｉｇｍａ、Ｆｒａｎｃｅ）の腹腔内注射によって麻酔をかけ、次いで、０．５／１０の刃物を使用して、各マウスの右脇腹に皮膚を横断して傷を付けた（長さ１ｃｍ、深さ約１〜２ｍｍ；図２Ａ参照）。次に、媒体溶液（ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２Ｍ  尿素、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２）または試験溶液（媒体＋０．５ｍｇ・ｍＬ−１  タンパク質１５６Ａ）のいずれか２００μＬを、損傷した１０分後に動物の創傷に局所的に塗布した。
【００４５】
局所塗布４８時間後での創傷治癒の検査では、タンパク質１５６Ａで治療された創傷（図２Ｃ参照）は完全に治癒していたが、媒体で治療された創傷（図２Ｂ参照）はまだ治癒しておらず、大きく開いたままであった。
【００４６】
実施例４：Ｓｗｉｓｓ系ヌードマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質１５６Ａの治癒活性の試験
８匹の健康な雌のＳｗｉｓｓ系ヌードマウスに実施例３のように麻酔を施した。各マウスの右脇腹に、０．５／１０の刃物を使用して、それぞれが長さ１ｃｍ、深さ約１〜２ｍｍの２本の皮膚横断創傷を施した。
【００４７】
第１日目、動物達を損傷した１０分後に、８匹のマウスを無作為に４匹ずつ２群に分けた。全ての治療は、局所塗布によって施された。治療計画を表１にまとめる。
【００４８】
【表１】
2008255096.tif 000002
【００４９】
群１のマウスは、損傷した１０分後に、２００μＬの媒体溶液（ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２Ｍ  尿素、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２）を各創傷に局所的に塗布して治療した。
【００５０】
群２のマウスは、損傷した１０分後に、２００μＬの試験溶液（ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２Ｍ  尿素、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍｇ・ｍＬ−１  タンパク質１５６Ａ）を各創傷に局所的に塗布して治療した。
【００５１】
創傷の写真は、媒体または試験溶液での治療９６時間後に撮影された。
図３Ａ：媒体塗布９６時間後の群１のマウスの写真。
図３Ｂ：タンパク質１５６Ａ塗布９６時間後の群２のマウスの写真。
【００５２】
図３の写真で図示されるように、局所塗布９６時間後での創傷治癒の検査では、タンパク質１５６Ａで治療された創傷（群２、図３Ｂ）は完全に治癒していたが、媒体で治療された創傷（群１、図３Ａ）はまだ治癒しておらず、大きく開いたままであった。
【００５３】
実施例５：豚モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質１５６Ａの治癒活性の試験
皮膚創傷治癒活性
飼育豚に、ケタミン／アザペロン（１０ｍｇ／ｋｇ−２ｍｇ／ｋｇ  ＩＭ）の筋肉内注射によって麻酔をかけ、次いで、２本の平行で縦方向の皮下組織に達する皮膚横断創傷を施した（図４）。
【００５４】
次に、媒体溶液（ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２Ｍ  尿素、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、対照側「Ｃ」）または試験溶液（媒体＋０．５ｍｇ・ｍＬ−１  タンパク質１５６Ａ、試験側「Ｔ」）のいずれか５ｍＬを、損傷した１０分後に動物の創傷に局所的に塗布した。
【００５５】
両方の創傷の観察では、この外科的処置直後の時期で、著しい差異を示した。外科的処置後数時間で、試験側「Ｔ」に痂皮ができた（図５）。その後、痂皮は２週間そこにあり、その後こすれ落ちた。痂皮の下での治癒は、創傷の目視の外観で判断すると、正常であると思われた。３週間後、創傷は、滑らか／平らで、薄かった（図６）。対照側「Ｃ」の痂皮は、２日後にしか、できなかった。この対照の創傷の全体的な様相は、試験側「Ｔ」よりも平らではなく、最終的により厚く、より収縮していた。
【００５６】
角膜創傷治癒活性
飼育豚に、ケタミン／アザペロン（１０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ  ＩＭ）の筋肉内注射によって麻酔をかけ、次いで、角膜表面に乱切を施した。
【００５７】
次に、媒体溶液（ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２Ｍ  尿素、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、対照側）または試験溶液（媒体＋０．５ｍｇ・ｍＬ−１  タンパク質１５６Ａ、試験側）のいずれか１ｍＬを、損傷した１０分後に乱切の傷に局所的に塗布した。
【００５８】
２日目に、この動物は屠殺され、その組織が採取された。
【００５９】
治療された区域および治療されなかった区域の両方において、毛様体突起の浮腫が見られた。しかしながら、治療されなかった区域では、強い浮腫によって、非潰瘍性の角膜上皮が側方に剥離したが、治療された区域では、このような浮腫はほとんど無かった。
【００６０】
実施例６：治療された、および治療されていない皮膚創傷の組織学的分析
飼育豚に、ケタミン／アザペロン（１０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ  ＩＭ）の筋肉内注射によって麻酔をかけ、次いで、２本の平行で縦方向の皮下組織に達する皮膚横断創傷を施した。
【００６１】
次に、媒体溶液（ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２Ｍ  尿素、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、対照側）または試験溶液（媒体＋０．５ｍｇ・ｍＬ−１  タンパク質１５６Ａ、試験側）のいずれか５ｍＬを、損傷した１０分後に動物の創傷に局所的に塗布した。
【００６２】
５日目に、この動物は屠殺され、対照創傷および試験創傷の両方の区域が採取された。ホルマリン固定し、パラフィン包埋した塊を加工して、通常のＨＥＳ染色のために、連続的な５ミクロンの切片を採取した区域から作製した。
【００６３】
治療されていない動物においては（図７Ａ）、損傷した後５日目には、創傷はまだ皮下深部まで貫通していたが、治療された群では（図７Ｂ）、皮膚の全層（真皮および表皮）で縁同士の接近が見られるという結果が示された。
【００６４】
これらの様々な試験で、治療された創傷と対照の創傷との間に大きな差異があることが示された。試験創傷（タンパク質１５６Ａで治療）の治癒は、常に、より速く、より薄く、より平らで、完全であった。創傷の最終的な美的な面も、より良好であった。この分子は、さらに、角膜潰瘍の試験的モデルで強い活性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】創傷のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ後のＨＵＶＥＣ内皮細胞叢の写真である。損傷後、細胞はＶＥＧＦおよびＦＧＦ２で培養される。
【図１Ｂ】創傷のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ後のＨＵＶＥＣ内皮細胞叢の写真である。損傷後、細胞はＶＥＧＦ、ＦＧＦ２およびタンパク質１５６Ａで培養される。
【図２Ａ】ヌードマウスに施された創傷の写真である。
【図２Ｂ】媒体溶液の局所塗布４８時間後の、ヌードマウスに施された創傷の写真である。
【図２Ｃ】タンパク質１５６Ａの局所塗布４８時間後の、ヌードマウスに施された創傷の写真である。
【図３Ａ】媒体塗布９６時間後の、損傷を与えた４匹のマウスの写真である。
【図３Ｂ】タンパク質１５６Ａ塗布９６時間後の、損傷を与えた４匹のマウスの写真である。
【図４】飼育豚の背に施された２本の皮膚横断平行創傷の写真である。
【図５】媒体溶液（「Ｃ」：対照）またはタンパク質１５６Ａ（「Ｔ」：試験）の塗布数時間後の、２本の皮膚横断平行創傷の写真である。
【図６】媒体溶液（「Ｃ」：対照）またはタンパク質１５６Ａ（「Ｔ」：試験）の塗布３週間後の、２本の皮膚横断平行創傷の写真である。
【図７Ａ】媒体溶液塗布５日後に採取された創傷の切片の写真である。
【図７Ｂ】タンパク質１５６Ａの塗布５日後に採取された創傷の切片の写真である。
【図１Ａ】
2008255096.tif 000003
【図１Ｂ】
2008255096.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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