(57)【要約】【課題】  乳酸菌またはその細胞表層または粗ペプチドグリカンによる花粉アレルギー症の改善および予防剤または食品を提供するものである。また、細胞表層および粗ペプチドグリカンの製造法を提供するものである。【解決手段】  乳酸菌またはその細胞表層または粗ペプチドグリカンを摂取するものであり、その際口腔、喉、眼の粘膜に接触させ効率よく吸収させる形態であり、花粉症によるクシャミ、鼻みず、鼻づまり、喉のイガイガ感や痛み、眼の痒みの症状を改善させ、事前に摂取したり接触することで予防するものでもある。また、加熱変性させることで、細胞表層または粗ペプチドグリカンを容易かつ安全に製造するものである。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌またはその細胞表層または粗ペプチドグリカンである花粉アレルギー症状の改善および予防剤または食品
【請求項２】
乳酸菌またはその細胞表層または粗ペプチドグリカンの２種または３種を含有することを特徴とする請求項１に記載の花粉アレルギー症状の改善および予防剤または食品
【請求項３】
乳酸菌またはその細胞表層または粗ペプチドグリカンのペプチドグリカンがＬ型−リジン−Ｄ型−アスパラギン酸のペプチドグリカンタイプである請求項１およびは２項に記載の花粉アレルギー症状の改善および予防剤または食品
【請求項４】
乳酸菌がラクトバチルス・ブルガリクス（ＪＣＭ１００２）、ラクトバチルス・ラムノーサス（ＡＴＣＣ７４６９）、ラクトバチルス・アシドフィルス（ラクトミン）である請求項１および２に記載の花粉アレルギー症状の改善および予防剤または食品
【請求項５】
加熱後分離する事を特徴とする請求項１〜４項に記載の細胞表層の製造方法
【請求項６】
請求項１〜４項に記載の粗ペプチドグリカンの製造方法
【請求項７】
摂取単位が１００立方ｃｍから粉末状である請求項１〜４項に記載の花粉アレルギー症状の改善および予防食品
【請求項８】
水分活性が０．６５〜０．０１ａｗ以下である請求項１〜４に記載の花粉アレルギー症状の改善および予防食品
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は花粉アレルギー症状の改善および予防剤または食品に関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、社会的問題になるほど、花粉症の増加は著しいものがある。花粉症などのアレルギー反応は、粘膜表面に付着した花粉に粘膜からの水分によって溶出したタンパク質や糖質等の抗原に起因することが知られている。これらの花粉は主として杉であるが、他にヒノキ、かば類、ブタクサとほぼ１年を通して、多くの人が花粉症に悩まされている。花粉はまず、鼻と目の粘膜に付着するので、花粉症の症状は鼻と眼における症状を訴える人が大多数である。また、鼻が詰まると口呼吸をしたりして花粉が喉に届き、イガイガ感や痛みを生じることがある。【０００３】  アレルギーはその発症の免疫学的機序により、Ｉ型からＩＶ型に分類されている。このうちＩ型アレルギーは即時型アレルギーであり、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、食物アレルギーが知られている。抗原に対するＩｇＥタイプの免疫グロブリンがその引き金である。これに対して、ＩＩ型、ＩＩＩ型アレルギーはＩｇＧおよびＩｇＭタイプの免疫グロブリンにより、ＩＶ型アレルギーはＴ細胞が活性化されて生じる。生産されたＩｇＥ抗体は皮膚や眼、鼻、気管、消化管などの粘膜組織に多い肥満細胞表面にあるＩｇＥ抗体の受容体に結合する。Ｉ型アレルギーの発症は、この抗体に抗原が結合すると肥満細胞からヒスタミン等を放出し、鼻の神経を刺激しクシャミ、鼻水を生じ、ロイコトリエンは血管を刺激し鼻づまりを生じ、同様に喉の神経を刺激して痛みやイガイガ感を生じ、目の神経を刺激して涙や痒みを生じる。なお、肥満細胞のみならず、抗原特異的なリンパ球と抗原との反応に伴い、これらから生産される各種サイトカインを介して、好酸球などが活性化され炎症反応が進行する。【０００４】  この症状を軽減するために、種々の薬剤が開発され提供されている。アレルギー性鼻炎には、抗ヒスタミン薬、消炎酵素薬、抗炎症薬等が使用されている。治療薬としての抗ヒスタミン薬は、眠気、口が渇くなどの副作用の他、前立腺肥大や緑内障を有する患者には使用できない。鼻に噴霧する局所ステロイドや経口ステロイド薬があるが、ステロイドとしての特異な副作用がある。また、分泌腺の機能亢進による諸症状の改善を化学物質や生体機能低下物質で改善する方法が知られているが、長期に渡って使用するには安全性が問題となる。例えば、粘膜の血管収縮薬は鼻詰まりに効果を示すが、使いすぎるとかえって鼻詰まりが強くなる薬剤性鼻炎を生じる。これらは、厚生労働省２１世紀型医療開拓推進研究事業のアレルギー性鼻炎ガイドライン班のアレルギー性鼻炎ガイドラインに記載されている。【０００５】  抗花粉症食品としては、発酵乳、ウーロン茶、甜茶等の効果が報告されている。しかし、これらの食品は花粉症を抑制するためには長期間食べ続ける必要があったり、また、一度発症したらその時点で摂取しても効果が現れなかったり、効果が短時間であるといった弱点がある。【０００６】  免疫研究の当初より種々の菌体やその組成物は動物に接種すると免疫活性が上昇する自然免疫増強などの免疫賦活効果が研究されていた。これらの報告では、細菌汚染に対する抵抗性に関連するマクロファージの活性化や腫瘍に対する抵抗性、細菌やウイルス感染に対する抵抗性に重要な役目を担うＩｇＧの増��作用が明らかされている。しかし、ＩｇＥが関連するＩ型アレルギーに関する研究は行われていなかった。近年、乳酸菌や納豆菌による抗アレルギーや花粉症予防の研究がなされている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の菌や乳酸菌を酵素で分解した免疫調節活性剤があり、ＩｇＥレベルの抑制作用を見ているが、細胞壁の酵素分解物がマウスにおいて卵白抗原に対するＩｇＥ抗体産生が抑制したことを示した（例えば、特許文献１参照）。しかし、マウスのＩｇＥレベルの抑制からだけでは人に効果を生じるのか否かは不明であり、実際、臨床ではＩｇＥレベルの上昇があってもアレルギーを示さない人や正常値でもアレルギー症状を示すことが知られている。【０００７】  エンテロコックス属の乳酸菌の細胞壁を融解した分解物をマウスに摂取させて、卵白、杉花粉エキスを抗原とする能動型皮膚アナフィラキシー反応を観察すると、アナフィラキシー抑制効果を示した（例えば、特許文献２参照）。また、ボランティアにより、エンテロコックス属に属する乳酸菌の細胞壁を融解した菌体全体の分解物を添加した飲料を飲み、花粉症の改善予防の効果を検討し、エンテロコックス菌体の分解物に鼻および目の症状の改善効果があったと示した（例えば、特許文献３参照）。しかし、これらの融解物の何が効果を示すのか、どこまで分解されると効果が出るのか全く物質を特定していない効果であり不明である。また、その他の菌での効果はどうなのか全く明らかにされず、多くの課題が残されている。【０００８】
【特許文献１】特開２０００−４８３０
【特許文献２】特開平１１−１２４３３６
【特許文献３】特開２００１−４６０２０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  以上に述べた従来の薬剤の使用は副作用が危惧され、また根治が可能といわれている減感作療法にはアナフィラキシーショックの危険性もある。そこで、安全性が確認されている食材で花粉症のアレルギー症状の改善や予防剤または食品が求められている。細菌類を酵素等で分解した物質を利用するものが検討されているが不明な部分が多い、そこで、食経験のある乳酸菌や効果を生じる画分を明確にし、容易で安全な製法や容易に携帯ができて必要な時に摂取でき、効果のあるものが求められている。また、花粉症を改善または予防する食品で効果を生じる効率よい摂取法に合わせた形態、形状が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明者は、前記課題を解決しようとするものであり、花粉アレルギー症状の改善および予防剤または食品が乳酸菌やその細胞表層または粗ペプチドグリカンにあり、少量で携帯ができ効率よく摂取できるものを提供するものである。更に詳しくは、本発明の花粉アレルギー症状の改善および予防剤は粘膜に接触させながら摂取や拭き取りを行い、また添加した食品では口腔内で溶解または咀嚼を繰り返えし、舌下や喉などの粘膜に吸収され易い性状、形態にすることで、クシャミ、鼻水、鼻づまり、眼のかゆみ、喉のイガイガ感、痛みに効果が高いものを提供するものである。なお、細胞表層または粗ペプチドグリカンは適切な加熱で容易かつ安全に分画できる製造法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】  そこで、乳酸菌やその細胞表層または粗ペプチドグリカンを摂取するとそれぞれが花粉症のクシャミ、鼻水、鼻づまり、喉のイガイガ感、痛みに効果がある事を認めた。また、粗ペプチドグリカンは眼のかゆみを軽減した。なお、数菌種の乳酸菌の粗ペプチドグリカンで評価したところペプチドグリカンのインターペプチドがＬ型−リジン−Ｄ型−アスパラギン酸（Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｓｐ）タイプであると同様な効果があることを見出した。また、これらの乳酸菌やその細胞表層または粗ペプチドグリカンを含む食品をアレルギー炎症の生じ易いまたは生じた近くの粘膜、すなわち舌下、眼の内壁や喉粘膜に接するような性状、形態とすることで、効果よく花粉症のクシャミ、鼻水、鼻づまり、眼のかゆみ、喉のイガイガ感、痛みを改善および防止することが認められた。また、細胞表層または粗ペプチドグリカンが適切な加熱で容易に分画して、高度の研究機器や毒性のある試薬に代わり実際的な設備や食品添加物レベルで製造することが可能となった。これらの試験は食する方法、すなわち、口腔内で溶解、または咀嚼を繰り返す特徴があるため、また痒みの程度を評価するため、全て人を対照にした試験が必要となり人による効果として示すことができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】  乳酸菌は古来より東ヨーロッパ等で発酵乳として食され、安全性が高い菌であり桿菌としてラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、球菌としてストレプトコックス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトコックス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、エンテロコックス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコックス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラゲノコックス属（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）およびビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）があり、本研究における乳酸菌とは、これらの菌属で食経験のある発酵乳やチーズ、漬物等の発酵食品から分離される菌種や人腸内由来で食品に使用されている菌種を挙げることができる。具体的には、ラクトバチラス属のブルガリクス、ヘルベティクス、アシドフィルス、カゼイ、ギャセリ、プランタラム、ブレビス、サケおよびラクトコックス属のラクチス、クレモリス、サーモフィラスおよびロイコノストック属のクレモリスおよびエンテロコックス属のフェシウムおよびビブィドバクテリウム属のビフィダム、ロンガム、ブレーベ、インファンティス、アドレッセンティスなどが挙げられる。【００１３】  乳酸菌は細胞表層を有し、これにより細胞の形を保つと共に外界と接しているために外界の物質を細胞内に導入する機構を有している。本発明の細胞表層とは、細胞全体から細胞質を除いたものをいい、細胞質膜、テイコ酸、細胞壁、表面薄層（Ｓｕｒｆａｃｅ−ｌａｉｙｅｒ）、きょう膜から構成されている。細胞表層にある細胞壁は、最も強固な膜でペプチドグリカンから成り、細胞壁重量の３０〜７０％を占めている。本発明の粗ペプチドグルカンはペプチドグリカンとリポテイコ酸が主体であるが、これはペプチドグリカン単独でもよいが、精製度と効果のバランスにて選択した。これらの細胞表層または粗ペプチドグリカンは培養菌体または乾燥菌体から調整することがでる。【００１４】  グラム陽性菌ではペプチドグリカンの構造はグリカン鎖（糖鎖）とペプチド（アミノ酸鎖）から構成される。糖鎖はＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン酸がβ１・４結合で直鎖上に連なる。そして、２本のグリカン鎖の間にはＮ−アセチルムラミン酸の３位のＣにある乳酸残基を介して４つのペプチドがあり、これは細菌類では同一の構造をなして細胞壁の最小構成単位として共通しているものでありテトラペプチドという。グリカン鎖に結合したテトラペプチドとこの間を架橋する１０個以内のアミノ酸からなるインターペプチドで構成されている。このインターペプチドの構造からペプチドグリカンには種々のタイプがあり、微生物の属、種により特異的なことが知られている。【００１５】  本研究の乳酸菌または細胞表層または粗ペプチドグリカンに含まれるペプチドグリカンには多種のタイプの存在が知られているが、Ｌ−リジン−Ｄ−アスパラギン酸タイプ、Ｌ−リジン−Ｌ−アラニンタイプ、Ｌ−リジン−Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニンタイプ、Ｌ−リジン−グリシンタイプ、Ｌ−リジン−Ｄ−グルタミン酸タイプ、Ｌ−オルニチン（リジン）−Ｄ−アスパラギン酸タイプ、Ｌ−��ルニチン−Ｄ−アスパラギン酸タイプ、Ｌ−オルニチン−Ｄ−アスパラギン酸タイプ、Ｌ−オルニチン−Ｌ−セリン−Ｄ−アスパラギン酸タイプ等を挙げることができるが、食経験の点からＬ−リジン−Ｄ−アスパラギン酸タイプがより好ましい。【００１６】  本研究における乳酸菌の製造法は、公知での任意の培地でよく３０〜４３℃で１０〜７２時間培養した培養液を遠心分離（５，０００〜１，０００×ｇ１０〜９０分間）して菌体を得、その菌体を水で希釈攪拌した後、再度、同様な条件で遠心洗浄し、これを２回繰り返し、培地成分等を除去して湿菌体を得ることができる。また、この湿菌体を公知の凍結乾燥法や加熱乾燥法により乾燥菌体を製造することができる。【００１７】  本研究における細胞表層の製造法は、この湿菌体または乾燥菌体を水で希釈して濃縮液を作成し、６５〜２５０℃で１０〜６０分間加熱し細胞を変性させ、石英または海砂もしくはガラスビーンズ（直径０．０１〜３．０ｍｍ）などを加え攪拌し菌体を破壊させ、また超音波破砕（１０〜５０Ｋｃ、１０〜９０分）でも同様に菌体を破壊できる。破壊した菌体液を遠心分離（５，０００〜１，０００×ｇ１０〜９０分間）し水で希釈攪拌した後、再度、同様な条件で遠心洗浄し、これを２回繰り返して細胞表層を得ることができる。加熱を加えたことで細胞が変性するが、より好ましくは加熱温度は６５℃から１３０℃、時間は１５〜６０分でよく、熱変性菌体の破壊におけるより好ましい条件は、ガラスビーンズは直径０．０５〜１．５ｍｍであり、超音波破壊は５〜２０Ｋｃ、１０〜３０分でよく、加熱により細胞表層が凝集するので遠心分離条件は低速の３，８００〜２，０００×ｇ１０〜３０分でよく、分離膜の孔径は０．１〜０．８μｍがより好ましい。この細胞表層は公知の方法で凍結乾燥や加熱乾燥で乾燥物を製造することができる。【００１８】  本研究における粗ペプチドグリカンの製造法は、生菌体または細胞表層画分を水にて１〜９０％液に希釈し、０．０１〜３０％の界面活性剤を加えた後、室温から９５℃付近に加温して攪拌後、遠心分離（７，０００〜２，０００×ｇ１０〜３０分）して沈殿物を得ることができる。洗浄するため蒸留水を加えて攪拌後、同様な条件で３回行い遠心洗浄し、粗ペプチドグリカンを得ることができる。また、これらの濃縮および洗浄には０．０１μ〜１．０μｍの分離膜を使用してもよい。細胞表層の分画時に加熱をしたことで細胞膜が凝集しており、より好ましくい加熱温度は室温から５０℃にて１５〜６０分でよく、遠心分離条件は３，８００〜２，０００×ｇ１０〜３０分でよく、分離膜の孔径は０．１〜０．８μｍでよい。この粗ペプチドグリカンは公知の方法で凍結乾燥や加熱乾燥で乾燥物を製造することができる。【００１９】  粗ペプチドグリカンの分画の製造に使用する界面活性剤は陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、中性界面活性剤で０．０１〜３０％の添加量を挙げることができるが、好ましくは、陰イオン界面活性剤のオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムなど、非イオン性界面活性剤のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルのツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）６０やシュガー脂肪酸エステルのリョウトウシュガーエステルＳ−５７０〜Ｐ−１６７０等の界面活性剤で０．１〜２０％の添加である。【００２０】  本発明の乳酸菌または細胞表層または粗ペプチドグリカンまたはこれらの２種または３種の混合物は、でん粉、乳糖、大豆蛋白質等の担体、賦形剤、滑沢剤、安定剤、水等を用いて周知の錠剤、カプセルや顆粒剤、またシートに含有させたり、点眼液に製剤することができる。本研究の花粉症の軽減効果および予防効果を生じる使用量は、症状、年齢等により異なるが、通常成人に対し有効成分として１日３．０ｇ〜０．１ｍｇで、特に好ましくは０．６ｇ〜３．０ｍｇであり、１日１回または数回に分けて服用することができる。また、眼のかゆみの改善予防には同様なグラム数を殺菌水１〜１００ｍｌに溶解させた液に１〜１００ｇ前後のティッシュペーパーのようなシートを浸し、これを眼の上に置き、目じりや目頭に軽く押し当てるとよい。【００２１】  本発明の食品としては、乳酸菌またはその細胞表層または粗ペプチドグリカンまたはこれらの２種または３種の混合物および食品材料の他、保存剤、香料、色素等を加えて、粉末、錠剤、カプセル、飴類、ゼリー類、チューインガム類などの形態で食品とすることが出来る。好ましくは口腔内の唾液で溶融、または咀嚼を続け、できる限り長時間、口腔内に留まる形状で舌下に入れることができ、微量ずつ溶出することが望ましい。本研究の花粉症の軽減効果および予防効果を生じる含有量は、症状、年齢等により異なるが、通常成人に対し有効成分として１日３．０ｇ〜０．１ｍｇで、特に好ましくは０．６ｇ〜３．０ｍｇであり、１日１回または数回に分けて摂取することができる。【００２２】  口腔内での溶解または咀嚼を繰り返す食品を考慮したときに、飲料は適さないし水分の多いものも適さない。そこで、適切な堅さと溶解性を持ち合わせるためには水分活性の少ないものが適切であり、水分活性が０．９５〜０．０１ａｗである食品が適するものとして挙げられる。固形を保ち種々の食品に利用することからすれば０．６５〜０．０１ａｗのものがより好ましい。【００２３】  口腔内で、特に溶解または咀嚼を繰り返す間に舌下や喉の粘膜に接する食品を考慮した際に、食品の形態として、人の口の大きさから摂取単位が１００立方ｃｍの大きさから粉末の大きさの食品を挙げられる。特に舌下や横に入れることが容易な大きさとすれば、３０立方ｃｍから１立方ｍｍの形態がより好ましい。
【実施例】
【００２４】  次に実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、以下の製造例や実施例等における部及び％は特に規定しない限り重量基準である。
【試験菌例】
【００２５】  本研究の使用菌はラクトバチルス・ブルガリクスＪＣＭ１００２（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス・ラクトミン（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）を用いた。これらの試験菌はこれまでに発酵乳やサプリメントとして食経験があり、理化学研究所、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、株式会社凍結乾燥研究所で菌株が取得できる。
【試験菌の調整例】
【００２６】  これらの菌を培養する培地は任意の乳酸菌培地でよく培養法は公知の方法でよい。例えば、脱脂乳培地、ＭＲＳ培地で低速または無攪拌のタンクを使用し、３０〜４０℃、５〜４８時間で培養することができる。ラクトバチルス・ブルガリクスＪＣＭ１００２、ラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９、ラクトバチルス・アシドフィルス・ラクトミンの培養法は乳酸菌用ＭＲＳブロス（Ｄｉｃｏ社）で５Ｌの培養液を作製し、１２０℃１５分の殺菌を行った後に３７℃に冷却し、すでに前記培地で３７℃１８時間予備培養した菌液を２％加えて３７℃にて１８〜２４時間培養して各々の培養物を得た。ラクトバチルス・ブルガリクスＪＣＭ１００２は４．３×１０９ｃｆｕ／ｍｌ、ラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９は４．２×１０９ｃｆｕ／ｍｌ、ラクトバチルス・アシドフィルス・ラクトミンは４．０×１０９ｃｆｕ／ｍｌとなった。必要量に応じて、上記培養を繰り返して菌体を製造した。
【湿菌体および凍結乾燥菌体の製造例】
【００２７】  これらの培養液を遠心機分離機（３，８００×ｇ２０分）にかけラクトバチルス・ブルガリクスＪＣＭ１００２は２４６ｇ、ラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９は２３５ｇ、ラクトバチルス・アシドフィルス・ラクトミンは２１６ｇの濃縮菌体を得た。この濃縮液を水で２回同条件にて遠心洗浄した湿菌体１００ｇを凍結乾燥するとラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９は１４．６ｇ、ラクトバチルス・ラクトバチルス・アシドフィルスは１３．８ｇの凍結乾燥菌体を得た。必要に応じて、上記培養を繰り返して湿菌体および凍結乾燥菌体を製造した。
【細胞表層の製造例】
【００２８】  細胞表層の製造法は各々の湿菌体３００ｇに蒸留水を２倍量加えよく攪拌し、９５℃にて３０分加熱し、ガラスビーンズ（直系０．１ｍｍ）を加え２０分間強く攪拌し菌体を破壊させた。この後、室温に戻し遠心分離（５，０００×ｇ３０分間）して沈殿させ、この画分を洗浄するため水を加え同様な条件で２度遠心洗浄し、細胞表層を分画した。これを凍結乾燥して、ラクトバチルス・ブルガリクスＪＣＭ１００２は５．６ｇ、ラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９は５．３ｇ、ラクトバチルス・アシドフィルス・ラクトミンは５．１ｇの凍結乾燥細胞表層を得た。必要に応じて、上記の方法を繰り返して細胞表層を製造した。
【粗ペプチドグリカンの製造例】
【００２９】  粗ペプチドグリカン分画の製造法は凍結乾燥細胞表層５．０ｇに１０倍量の希釈水を加え、５％のツィーン８０を加えた後４５℃で３０分攪拌した後、遠心分離（３，２００×ｇ２０分）して沈殿させ、洗浄するため蒸留水を加えて攪拌し、同様な条件にて遠心洗浄を３回繰り返した。この遠心沈殿物を７０℃にて加熱乾燥して、ラクトバチルス・ブルガリクスＪＣＭ１００２は２．２２ｇ、ラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９は２．１２ｇ、ラクトバチルス・アシドフィルス・ラクトミンは２．０７ｇの粉末状の粗ペプチドグリカン画分を得た。必要に応じて、上記の方法繰り返して粗ペプチドグリカンを製造した。
【試験試料】
【００３０】（１）試験組成物▲１▼；凍結乾燥菌体の製造例に準じて製造したラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９の凍結乾燥菌体０．３ｇをオブラートに包んで試験組成物とした。
（２）試験組成物▲２▼；細胞表層の製造例に準じて製造したラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９の細胞表層０．１ｇをオブラートに包んで試験組成物とした。
（３）試験組成物▲３▼；粗ペプチドグリカンの製造例に準じて製造したラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９の粗ペプチドグリカン０．００５ｇをオブラートに包んで試験組成物とした。
（４）試験組成物▲４▼；粗ペプチドグリカンの製造例に準じて製造したラクトバチラス・アシドフィラス・ラクトミンの粗ペプチドグリカン０．０２ｇをオブラートに包んで試験組成物とした。
（５）試験組成物▲５▼；粗ペプチドグリカンの製造例に準じて製造したラクトバチラス・ブルガリクスＪＣＭ１００２の粗ペプチドグリカン０．０５ｇをオブラートに包んで試験組成物とした。
（６）試験対照物▲６▼；試薬特級乳糖（和光純薬工業）０．１ｇをオブラートに包んで試験対照物とした。
【００３１】  １０名のボランティア（２０〜６０歳台）は、表１のアレルギー診断ガイドライン作成委員会作成の鼻アレルギー診断ガイドラインに沿って鼻炎症状を判定し、喉、眼の状況は独自で加えた判定表にて判定した。各ボランティアの症状の程度は全て重症であり、クシャミ２０〜１１回、鼻をかむ回数２０〜１１回、鼻詰まりの程度は口呼吸がかなりの時間有り、喉の状況は痛みを感じる、眼の状況は痒みがある方々であった。
【表１】
2008255084.tif 000002
【試験例１】
【００３２】  ボランティア１０名（２０〜６０歳台）を５名ずつのチームとして、１つのチーム５名は試験組成物▲１▼の定められた投与量が入ったオブラートを朝１回、昼１回、夕方１回の３回／日摂取し、これを２日間繰り返すがその他は食事制限もなく通常に生活した。試験組成物の溶解はできる限り舌下とした。試験組成物の摂取を止め何も処置をせずに過ごすと、翌日または翌々日には試験以前の状態に戻ったので、戻ったことを確認して次の試験に参加してもらった。試験組成物▲２▼〜▲５▼検査は試験組成物▲１▼と同様に行い、２日試験して症状が戻ったら適当な間隔で検査を継続した。ボランティア評価は起床から床につくまでを１日とし、クシャミの回数、鼻をかんだ回数、鼻詰まり、喉の違和感の程度にて判定した。アレルギー症状の度合いは、アレルギー診断ガイドに沿って評価し表２に示した。なお、試験中及び試験後においてボランティアは、健康上の問題を挙げるものはいなかった。
【比較例】
【００３３】  実施例と全く同じく５名のボランティアで行い、比較組成物として試験対照物▲６▼は定められた量の乳糖が入ったオブラートを舌下に入れ、朝１回、昼１回、夕方１回の３回／日摂取し１日通常に生活した。アレルギー性症状の度合いは、アレルギー診断ガイドに沿って実施例と同様な条件で評価し表２に示した。
【００３４】  表２の実施例結果に示されているように、実施前の症状に比較し花粉アレルギー性の症状であるクシャミ、鼻みず、鼻詰まり、喉の症状が試験組成物▲１▼〜▲５▼で大きく改善され、また、比較例は改善される事がなかった。
【表２】
2008255084.tif 000003
【試験例２】
【００３５】（７）試験組成物▲７▼；ラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９の粗ペプチドグリカンの製造例に準じて作成した粗ペプチドグリカン０．０１ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解させ、ティッシュペーパーに滲みさせて朝、昼、晩の３回／日目じりや目頭に押し当てまぶたを拭き取った。５名のボランティアで行った結果は症状が３＋から＋に改善された。試験中及び試験後において、ボランティアは眼の変調を訴えるものはいなかった。
【試験例３】
【００３６】（８）試験食品▲８▼；市販のチューインガム（キシリトール；（株）ロッテ）を半分に割り、片面に水分をつけた後、製造例に準じて製造したラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９の細胞表層０．０５ｇを乗せ、他の半分の片面を濡らし挟み込んで含有させて試験食品とした。
（９）試験食品▲９▼；市販のチューインガム（キシリトール；（株）ロッテ）を半分に割り、片面に水分をつけた後、製造例に準じて製造したラクトバチルス・アシドフィラス・ラクトミンの凍結乾燥菌体０．２ｇを乗せ他の半分の片面を濡らし挟み込んで含有させて試験食品とした。
（１０）試験食品▲１０▼；製造例に準じて製造したラクトバチルス・ブルガリクスＪＣＭ１００２の粗ペプチドグリカン０．０１ｇを加熱溶解した市販の飴玉（カンロ飴；カンロ（株））に加え、分散させながら冷却して直径２０ｍｍの飴玉として試験食品とした。
【００３７】  試験組成物の溶融は出来る限り舌下とし、朝、昼、晩の３回／日の摂取を行った。飴玉は舌下に入れたり横に接触させ約１５〜２０分間で溶解し、チューインガムの咀嚼の場合は合間に舌下に入れることを含めて約２０〜３０分ほど咀嚼した。試験例１と同じメンバーで５名からなる各ボランティアにて同様に２日間摂取を続け、その後は中止し、症状が戻ったことを確認し次の試験を繰り返した。その他は試験例１と全く同じに評価を行い、その結果は３表に示した。この試験中及び試験後においてボランティアは、健康上の問題を挙げるものはいなかった。
【表３】
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【００３８】  表３の実施例の結果に示されているように、実施前の症状に比較してアレルギー性の症状であるクシャミ、鼻みず、鼻づまり、喉のガイガ感や痛みの症状が試験食品▲８▼〜▲１０▼で著しく改善された。