(57)【要約】      （修正有）【課題】基本条件下で架橋多糖類ゲルを製造するための方法の提供。【解決手段】（ａ）アルカリ性媒体に混合された多糖類（ただし、カードランを除く）を二官能性または多官能性エポキシドと接触させ、エポキシ架橋された多糖類を提供する工程であって、該エポキシドがエーテル結合により該多糖類に連結される工程と、（ｂ）前記エポキシ架橋多糖類を前記アルカリ性媒体からエポキシドを除去することなく乾燥させ、架橋多糖類マトリクスを形成する工程と、（ｃ）前記架橋多糖類マトリクスを酸性媒体で中和して架橋多糖類ゲルを形成する工程と、を含む方法。得られるゲルは、分解特性が改善され、種々の医学および化粧品用途に有用なものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋多糖類ゲルを生成するための方法であって、
（ａ）アルカリ性媒体に混合された多糖類（ただし、カードランを除く）を二官能性または多官能性エポキシドと接触させ、エポキシ架橋された多糖類を提供する工程であって、該エポキシドがエーテル結合により該多糖類に連結される工程と、
（ｂ）前記エポキシ架橋多糖類を前記アルカリ性媒体からエポキシドを除去することなく乾燥させ、架橋多糖類マトリクスを形成する工程と、
（ｃ）前記架橋多糖類マトリクスを酸性媒体で中和して架橋多糖類ゲルを形成する工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記架橋多糖類マトリクス形成工程（ｂ）後、前記中和工程（ｃ）に先立って、前記架橋多糖類マトリクスを水混和性溶媒で洗浄する工程を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多糖類がヒアルロン酸、ペクチン、キサンタンまたはアルギン酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記多糖類が、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、ヒアルロン酸またはカルボキシメチルスターチの陰イオンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記多糖類がヒアルロン酸である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記エポキシドが、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテルまたはエポキシ基で置換されたペンタエリトリトールである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記エポキシドが、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アルカリ性媒体のｐＨが９〜１２の範囲である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記アルカリ性媒体が、１〜５ｗｔ／ｖｏｌパーセントの多糖類および０．０５〜０．５ｗｔ／ｖｏｌパ−セントのエポキシドを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記エポキシドを、少なくとも４５℃の温度で前記多糖類に接触させる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記多糖類マトリクスを、真空下で、少なくとも３５℃の温度で乾燥させる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ａ）及び（ｂ）が、アルカリ性条件下で行われる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記洗浄工程が、前記架橋多糖類マトリクスをアセトンで洗浄する工程を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記中和工程（ｃ）が、前記架橋多糖類ゲルを凍結乾燥する工程および該ゲルを再構成する工程を更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記凍結乾燥した架橋多糖類ゲルが、リン酸塩緩衝生理食塩水中で再構成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記多糖類を生物活性物質と組み合わせる工程を更に含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、架橋多糖類組成物、該組成物を調製するための方法、および化粧品、医学および医薬品用途に該組成物を用いることに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、グリコサミノグリカンとして知られるポリマーの分類のメンバーである。ＨＡは長鎖線状多糖類であり、通常、分子式（Ｃ14Ｈ20ＮＮａ11）n（式中、ｎはＨＡの供給源およびＨＡを単離する方法により変動する可能性がある）を有するナトリウム塩として存在する。分子量が１４×１０6までのＨＡが報告されている。
【０００３】
ＨＡおよびその塩は、ヒト臍帯、オンドリのとさかおよび殆ど全ての脊椎動物の臓器の接続マトリクスを含む多くの供給源から単離することができる。また、ＨＡは、連鎖球菌のような細菌の莢膜成分でもあり、従って、米国特許第５，４１１，８７４号明細書（Ｆｅｒｍｅｎｔｅｃｈ  Ｌｔｄ）に報告されていうような発酵法により得ることができる。
【０００４】
ＨＡは、非免疫原性であり、従って医学分野に大きな可能性がある。粘弾性特性があるため、高分子量（１００万を超える）のＨＡは、創傷治療、眼科手術、整形外科手術および薬物送達を含む種々の臨床分野で特に有用であることが見出されている。また、ＨＡは、化粧品への用途を含む種々の非医学分野でも有用である可能性がある。
【０００５】
しかし、ＨＡをヒトに投与することの欠点の１つは、ヒアルロニダーゼのような酵素および人体内に見られるフリーラジカルにより、ＨＡが分解されることである。更に、ＨＡは、室温で水溶性であり、このことによっても特定の用途にはあまり適さない可能性がある。
【０００６】
ＨＡのより安定な形態を調製するための種々の試みが、特にＨＡ分子を架橋する方法によってなされてきた。例えば、ヒドロキシル基はエーテル結合を介して架橋され、カルボキシル基はエステル結合を介して架橋される。ＨＡは、ｐＨレベル９未満ではカルボキシル基を介してエステル結合が形成され、９を超えるｐＨレベルではヒドロキシル基を介してエーテル結合が形成されることにより架橋される。本発明者らは、エーテル結合の方が生理的分解への抵抗性が高いため有用である可能性があることを見出した。
【０００７】
多数の文献に、ＨＡゲルを架橋する種々の方法が報告されている。例えば、米国特許第４，５８２，８６５号明細書（Ｂｉｏｍａｔｏｒｉｘ  Ｉｎｃ）には、架橋剤としてジビニルスルホンを用いてＨＡを架橋することにより（それ自身によるか親水性ポリマーと混合することによるかの何れかによる）形成された架橋したＨＡのゲルが報告されている。
【０００８】
米国特許第５，８２７，９３７号明細書（Ａｇｅｒｕｐ）は、多糖類の水溶液を形成し、多官能性架橋剤の存在下で架橋を開始し、ゲル化が起こる前に架橋反応が終了しないように立体的に妨げ（例えば溶液を希釈することによる）、次に、立体的な妨げのない状態にして（例えば溶液を蒸発させることによる）架橋を続け、粘弾性ゲルが形成されるようにして調製した多糖類ゲル組成物を報告している。この方法での架橋は、アルカリ性または酸性条件下で行うことができる。
【０００９】
国際公開第００／４６２５３号パンフレット（Ｆｅｒｍｅｎｔｅｃｈ  Ｌｔｄ）には、２つの異なる種類の架橋結合によりＨＡを他のポリマーと架橋することが報告されている。異なる種類の結合の形成は、異なる官能基を介して架橋することにより達成される。例えば、結合の種類の１つは、ヒドロキシル基を介した架橋により形成することができ、別の官能基結合は、カルボキシル基を介した架橋により形成することができる。
【００１０】
国際公開第８７／０７８９８号パンフレットには、多糖類を多官能性エポキシドと反応させ、過剰なエポキシドを除去し、乾燥させることによって多糖類を架橋し、フィルム、粉末材料または同様の乾燥生成物にすることが報告されている。
【００１１】
米国特許第４，９６３，６６６号明細書（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）には、アルカリ性条件下で、多糖類を低濃度の架橋剤で一置換してエーテル結合を形成する方法が報告されている。この混合物は、洗浄してｐＨ５．５にすることによりいくつかのエステル結合を誘発させられ、次に、実施例の１つでは、ゆっくりと蒸発させることにより濃縮し、エステル結合での架橋を完了させる。別の例では、アンモニアを付加することによりｐＨを増大させ、次に、ゆっくりと蒸発させて主としてエーテル結合およびある程度のエステル結合での架橋を完了させる。
【００１２】
架橋ＨＡの特性を改善するための試みが行われているが、患者に投与したときの分解特性を改善した架橋ＨＡゲルを提供することが有用であろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の開示
実施形態の１つでは、本発明は、架橋多糖類ゲルを生成する方法を提供する。まず、アルカリ性媒体と混合された多糖類を二官能性または多官能性エポキシドと接触させて本質的にエポキシ架橋した多糖類を形成するが、ここで、エポキシドは実質的にエーテル結合により多糖類に連結される。次に、アルカリ性媒体からエポキシドを除去することなく、エポキシ架橋多糖類を乾燥する。得られる乾燥架橋多糖類マトリクスは、次に、適切な水混和性溶媒で洗浄され、酸性媒体で処理されることによって、架橋多糖類ゲルを形成することができる。
【００１４】
本発明の実施形態には種々の多糖類の出発物質を用いることができる。適切な多糖類には、ＨＡ、ペクチン、キサンタンまたはアルギン酸のほか、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストランまたはカルボキシメチルスターチの陰イオンが含まれる。ＨＡは、特に適切な出発物質とすることができる。架橋剤として用いるのに適切なエポキシドには、１，４−ブタンジオールエーテル、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテルおよび／またはエポキシ基で置換されたペンタエリトリトールが含まれる。しかし、本発明には他のエポキシドも適切である可能性があることは理解されると考える。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に報告した方法により調製される架橋多糖類ゲルを提供する。このゲルは、患者に投与されるときの分解特性が改善されている可能性がある。
【００１６】
更に別の実施形態では、本発明は、実質的にエーテル結合により１，４−ブタンジオールグリシジルエーテルと架橋され、分解に抵抗性を有するように十分に架橋したＨＡを含む生体適合性ゲルを提供する。
【００１７】
本明細書で用いる場合、「分解に抵抗性を有するように十分に架橋した」という語句は、ゲルが生理的条件下で長期間にわたってヒアルロニダーゼ攻撃に対して比較的安定であるか、小さなゲージの針で押し出し成形または噴出成形されることに耐性があることを意味する。実施形態の１つでは、本発明者らは、濃度１５ｍｇ／ｍｌのゲル０．４ｍｌを、０．５ｍｇヒアルロニダーゼおよび３ｍｌリン酸塩緩衝生理食塩水と組み合わせ、少なくとも３７℃の温度で２日間貯蔵しても７５パーセント未満のウロン酸しか放出しない生体適合性ゲルを生成することができた。ウロン酸放出は、実施例で報告するＵＶ吸光度法により測定することができる。ある実施形態では、ゲルは、前記条件下で７０パーセント以下のウロン酸しか放出することができず、より詳細には６５パーセント以下のウロン酸しか放出することができない。
【００１８】
第１の態様では、本発明は、架橋多糖類ゲルを生成するための方法であって、
（ａ）アルカリ性媒体中に混合された多糖類を二官能性または多官能性エポキシドと接触させ、本質的にエポキシ架橋された多糖類を調製する工程であって、エポキシドが実質的にエーテル結合により多糖類に連結される工程と、
（ｂ）アルカリ性媒体から実質的にエポキシドを除去することなくエポキシ架橋多糖類を乾燥させて架橋多糖類マトリクスを形成する工程と、
（ｃ）任意選択的に架橋多糖類マトリクスを水混和性溶媒で洗浄する工程と、
（ｄ）架橋多糖類マトリクスを酸性媒体で中和して架橋多糖類ゲルを形成する工程と、を含む方法を提供する。
【００１９】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様による方法により調製された、ヒアルロニダーゼ分解に実質的に抵抗性の架橋多糖類ゲルを提供する。
【００２０】
第３の態様では、本発明は、実質的にエーテル結合により１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルと架橋し、ゲルが実質的に分解に抵抗性であるように十分に架橋したヒアルロン酸を含む生体適合性ゲルを提供する。
【００２１】
第４の態様では、本発明は、本発明の第２の態様による架橋多糖類ゲルと、生物活性物質と、薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
第５の態様では、本発明は、本発明の第３の態様による生体適合性ゲルと、生物活性物質と、薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
第６の態様では、本発明は、それが必要な被験者の障害を治療または予防する方法であって、本発明の第４の態様によるゲルの治療効果のある量を投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
第７の態様では、本発明は、それが必要な被験者の障害を治療または予防する方法であって、本発明の第５の態様による医薬組成物の治療効果のある量を投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
第８の態様では、本発明は、それが必要な被験者の障害を治療薬または予防薬を製造する際の本発明の第３の態様によるゲルの使用を提供する。
【００２６】
第９の態様では、本発明は、それが必要な被験者の障害を治療薬または予防薬を製造する際の本発明の第４の態様による医薬組成物の使用を提供する。
【００２７】
この明細書全体を通して、文脈から他の意味に解釈することが必要でなければ、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べられた要素、整数若しくは工程、または要素、整数若しくは工程の群を含むことを示唆するが、他の何れの要素、整数若しくは工程、または要素、整数若しくは工程の群を除外することを意味しないことは理解されるであろう。
【００２８】
本明細書に含まれている文献、決議書、材料、装置、論文等に論じられていることは、本発明の前後関係を示すためのみのものである。これらの事項の何れかまたは全ては、先行技術の根拠の一部を形成するか、本出願の各請求項の優先日の前にオーストラリアに存在していたような本発明に関連する分野の一般的な常識であったことの承認と受け取られるものではない。
【００２９】
本発明を更に明確に理解することができるようにするために、以下の図面および例を参照して好ましい実施形態を記載することにする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
発明を実施するための形態
実施形態の１つでは、本発明は、多糖類架橋ゲルを作るための方法を提供する。この方法は、一般に、
（ａ）多糖類出発物質をアルカリ性媒体中で二官能性または多官能性エポキシドと接触させることによりエポキシ架橋多糖類を形成し、本質的に架橋された多糖類を形成する工程であって、エポキシドが実質的にエーテル結合により多糖類に連結される工程と、
（ｂ）アルカリ性媒体から実質的にエポキシドを除去することなくエポキシ架橋多糖類を乾燥させる工程と、
（ｃ）任意選択的に乾燥したエポキシ架橋多糖類を水混和性溶媒で洗い、架橋した多糖類マトリクスを形成する工程と、
（ｄ）エポキシ架橋多糖類を酸性媒体で中和し、架橋多糖類ゲルを形成する工程と、を含む。
【００３１】
エポキシド架橋多糖類ゲルを上記のように形成すると、従来の架橋多糖類ゲルに比較してゲルの分解への抵抗性が改善されると判断されるので有利である。
【００３２】
多糖類出発物質は、ＨＡ、ペクチン、キサンタン、またはアルギン酸を含む広範囲の適切な天然カルボン酸塩含有多糖類のほか、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストランまたはカルボキシメチルスターチのような中性多糖類の陰イオンから選択することができる。
【００３３】
実施形態の１つでは、ＨＡは、多糖類の出発物質として用いられる。ＨＡは、多数の供給源、例えばオンドリのとさかから抽出することができる。ある実施形態では、広範囲の分子量の有機材料を抽出することにより直接得た全ての酸のヒアルロン酸含有分子画分を用いることが望ましい可能性がある。これらの画分は、加水分解、酸化、酵素化学剤、または機械的手順または照射手順のような物理的手順を含む種々の従来の手順で得ることができる。得られる分子画分の分離および精製は、分子ろ過により達成することができる。適切な精製ＨＡ分画の例は、Ｂａｌａｚｓによりパンフレット「Ｈｅａｌｏｎ」−−眼科手術における使用法の指針−−Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ及びＲ．Ｓｔｅｇｍａｎｎ編（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）ニューヨーク８１９８３の５頁に報告されている「非炎症性−ＮＩＦ−ＮａＨＡヒアルロン酸ナトリウム」である。
【００３４】
他の適切なＨＡ出発物質には、「ヒアラスチン（Ｈｙａｌａｓｔｉｎｅ）」ブランドおよび「ヒアレクチン（Ｈｙａｌｅｃｔｉｎ）」ブランドのＨＡが含まれる。ヒアラスチン画分の平均分子量は約５０，０００〜１００，０００であり、ヒアレクチン画分の平均分子量は約５００，０００〜７３０，０００である。また、これら２つの画分を組み合わせた画分も単離され、平均分子量が約２５０，０００と約３５０，０００との間であるという特徴が示される。この組み合わせた画分は、特定の出発物質で利用可能な総ヒアルロン酸の収量８０％で得ることができ、ヒアレクチン画分は、出発ＨＡの収量３０％、ヒアラスチン画分は収量５０％で得ることができる。これらの分画の調製は、欧州特許出願公開第０１３８５７２Ａ３号明細書に報告されている。他の適切なＨＡ出発物質には、以下の例に報告される繊維状および粉末状ＨＡ材料が含まれる。
【００３５】
多糖類は、低脂肪族エポキシドまたはその対応するエピハロヒドリンのような二官能性または多官能性エポキシドを含む種々の適切な多官能性架橋エポキシドにより架橋することができる。適切なエポキシドの特定の例には、１．４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル、エポキシ基で置換されたペンタエリトリトール（例えばＳＨＥＬＬ１６２）およびそれらのエピハロヒドンが含まれる。実施形態の１つでは、前記多官能性架橋剤には、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルが含まれる。
【００３６】
多糖類出発物質は、アルカリ性媒体中で架橋剤と組み合わせることができる。実施形態の１つでは、約１〜約５ｗ／ｖパーセント、更に詳細には約４ｗ／ｖパーセントの多糖類をアルカリ性媒体に加えることができる。アルカリ性媒体は、水酸化ナトリウムまたは他の適切な塩基材料で形成することができる。水酸化ナトリウムまたは他の塩基材料の濃度は、総混合物の約０．１〜約１ｗ／ｖパーセント、更に詳細には約１％とすることができる。架橋剤は、架橋剤濃度を約０．０５〜約０．５％、更に詳細には約０．１％にするようにアルカリ性混合物に加えることができる。アルカリ性媒体のｐＨは、約９〜１２、更に詳細には約９とすることができる。
【００３７】
得られるアルカリ性混合物は、多糖類とエポキシドとの架橋を促進する条件下でインキュベートすることができる。例えば、混合物は、約４５℃の水浴で約２時間インキュベートすることができる。これらの条件下で架橋したＨＡは、実質的にエーテル結合を含むことになり、これは、酸性条件下で形成されるエステル結合より生理的分解に対する抵抗性が一般に大きい。
【００３８】
インキュベートした後、架橋した混合物を従来の方法により乾燥し、多糖類マトリクスを形成することができる。例えば、架橋した混合物は、高度真空下で、約３５℃〜４５℃で約１．５時間混合物を激しく撹拌して水を除去することにより乾燥することができる。乾燥後、多糖類マトリクスは、水混和性溶媒、例えばイソプロピルアルコール水補助溶媒で数時間洗うことができる。最後に、洗ったマトリクスを酸性媒体で中和して架橋多糖類ゲルを形成することができる。例えば、マトリクスは、１〜２パーセント酢酸の水溶液で処理して架橋多糖類ゲルを形成することができる。任意選択的には、架橋多糖類ゲルを、リン酸塩緩衝生理食塩水混合物で更に処理してゲルの粘性に影響を及ぼすことができる。
【００３９】
以下の実施例に更に報告されているように、前記方法により形成された多糖類ゲルは、患者に投与されたときに分解に抵抗性を有するほど十分に架橋している。ゲルの分解特性が優れているため、得られる架橋多糖類ゲルは、種々の用途に用いることができる。実施形態の１つでは、架橋多糖類ゲルは、組織を増強するため、関節炎を治療するため、組織接着を治療するため、および哺乳類細胞をコーティングして免疫原性を減少させるために用いることができる。別の実施形態では、架橋多糖類ゲルは、化粧品用途、矯正移植片、ホルモン補充療法、ホルモン療法、避妊法、間接潤滑化、および眼球手術に用いることができる。
【００４０】
架橋多糖類ゲルは、小さなゲージの針を通した押し出し成形の後でも実質的に分解に抵抗性を有したままであるので有利である。ゲルがせん断応力に抵抗性であれば、針を通して押し出されると、ゲルが破壊されて小さな粒子になる可能性がある。詳細には、本発明の実施形態の架橋多糖類ゲルは、２７、３０または３２ゲージの針のような小さなゲージの針を通して押し出された後でも分解に抵抗性を有する。従って、これらのゲルは、溶液またはゲルの構造的一体性を実質的に失うことなく、組織または皮膚内に注入されるのに特に適切である。
【００４１】
別の実施形態では、架橋多糖類ゲルは、患者に投与するために生物活性物質と組み合わせることができる。本発明とともに用いるのに適切な生物活性物質には、ホルモン、サイトカイン、ワクチン、細胞、組織増強物質、またはそれらの混合物が含まれる。適切な組織増強物質の例には、コラーゲン、デンプン、デキストラノマー、ポリラクチド、ポリ−β−ヒドロキシブチレート、および／またはそれらのコポリマーが含まれる。
【００４２】
生物活性物質の付加的な例は、米国特許第５，６７６，９６４号明細書に報告されており、これは、本明細書において、適切な生物活性物質、これらの物質を含む架橋多糖類ゲルを調製する方法および生物学的に活性物質を投与する方法を説明するために参照により組み入れられる。
【００４３】
適切な生物活性物質には、種々のアルカロイド、ペプチド、フェノチアジン、ベンゾジアゼピン、チオキサンテン、ホルモン、ビタミン、抗痙攣薬、抗精神病薬、制吐薬、麻酔薬、睡眠薬、食欲減退薬、精神安定薬、筋弛緩薬、冠拡張薬、抗腫瘍薬、抗生物質、抗菌薬、抗ウイルス薬、抗マラリア薬、炭酸脱水酵素阻害薬、非ステロイド系抗炎症薬、血管収縮薬、コリン作動薬、コリン拮抗薬、アドレナリン作動薬、アドレナリン拮抗薬、麻薬拮抗薬を含むことができる。
【００４４】
生物活性物質は、多糖類出発物質と物理的に混合することにより本発明の適切な架橋多糖類ゲルと組み合わせることができる。生物活性物質は、固体の形、例えば凍結乾燥粉末または溶液で組み合わせることができる。
【００４５】
架橋多糖類ゲルを生物活性物質（ｖｅｈｉｃｌｅ）に対する輸送手段として用いることは、架橋多糖類ゲルと角膜上皮との間に特定の親和性が存在する眼科学で特に有用である。生物活性物質が弾性−粘性特性のある濃縮溶液または固体の形態で角膜上皮上に投与されると、透明で付着性であり、生物活性物質のバイオアベイラビリティが長期間に及ぶ均質で安定なフィルムが形成される。また、本発明の実施形態の架橋多糖類ゲル輸送手段は、粘膜の疾病（例えばｍｏｕｎｔの疾病）の治療および皮膚科治療のために適切とすることができる。
【００４６】
ある実施形態では、上記の生物活性ゲルは、口腔、直腸、非経口、皮下、局所または皮内に用いるための医薬品製剤に形成することができる。適切な医薬品製剤は、固体または半固体形、例えば丸薬、錠剤、ゼラチンカプセル、カプセル、座剤または軟ゼラチンカプセルとすることができる。非経口および皮下に用いるためには、筋肉内または皮内用または輸液または静脈注射に意図される医薬品製剤を用いることができ、従って、１つまたはそれ以上の医薬品に許容可能な賦形剤または希釈剤と混合される活性化合物の溶液または活性化合物の凍結乾燥粉末として存在することができる。また、局所製剤の形の医薬品製剤は、例えば鼻腔用スプレー、局所用クリームおよび軟膏または皮内投与のために特別に調製した絆創膏に適切とすることができる。
【００４７】
製剤は、ヒトまたは動物に投与することができる。実施形態の１つでは、架橋多糖類ゲルは、溶液、スプレー、軟膏およびクリームに対しては約０．０１％〜１０％の間の生物活性物質、固体形製剤に対しては約１５％〜５０％の間の生物活性物質を含むことができる。
【００４８】
本発明においては、「アルカリ性媒体」という用語には、水に溶解した水酸化物塩、好ましくは水酸化ナトリウムが含まれるが、これに限定されない。
【００４９】
本発明においては、「酸性媒体」という用語には、水に溶解した有機または無機酸、好ましくは酢酸が含まれるが、これに限定されない。
【実施例】
【００５０】
架橋ゲルの合成
繊維状ヒアルロン酸［Ｊａｖｅｎｅｃｈ ＨＴＬ製（分子量１．６〜１．３３ＭＤ）］および粉末状ヒアルロン酸［Ｆｌｕｋａ製、Streptococcus equi（ストレプトコッカス・エクイ）由来（分子量１．６９ＭＤ）］（０．５ｇ）はそれぞれ別に、１時間にわたって激しく撹拌しながら１％ＮａＯＨ（１２．５ｍｌ）に溶解した。１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）（１２．５μｌ）を５分間激しく撹拌しながら加え、その後、得られた溶液を水浴に入れて４５℃で２時間撹拌せずにインキュベートした。インキュベート時間が終了すると、混合物を浴から取り出し、１分間激しく撹拌し、その後３５〜４０℃の高度真空下で１．５時間水を除去した。得られた透明の多糖類マトリクスをイソプロピルアルコールおよび水の混合物（ＩＰＡ／Ｈ2Ｏ）（６：４、２５ｍｌ）で２２時間洗い、その後ＩＰＡ／Ｈ2Ｏ混合物を２２時間毎にあと２回入れ替えた（即ち総洗浄時間６６時間）。ＩＰＡ／Ｈ2Ｏ混合物を除去し、その後撹拌しながら１．３パーセント酢酸水溶液（２５ｍｌ）を加えた。３５分後、両試料は、完全に膨潤したゲルを生成するが、「繊維状」ゲル（「試料Ａ」）は、「粉末状」ゲル（「試料Ｂ」）より顕著に粘性が大きい。
【００５１】
次に、このゲルは、ＩＰＡ（５０ｍｌ）、ＩＰＡ／Ｈ2Ｏ（６：４、２５ｍｌ）、ＩＰＡ／Ｈ2Ｏ（８：２、１００ｍｌ）、その後ＩＰＡ（５０ｍｌ）による一連の洗浄に供された。次に、得られる不透明のゴム様材料を凍結乾燥すると不透明の硬質シートになった。次に、このシートを、以下の実施例に用いるために、濃度１５ｍｇ／ｍｌおよび２０ｍｇ／ｍｌで新しく調製したリン酸塩緩衝整理食塩水で２４時間にわたって再構成した。試料Ａは圧力下で５００μｍメッシュに押し通し、試料Ｂは圧力下で３００μｍメッシュに押し通した。試料は３ヶ月の期間用いたが、保存中に分解することはなかった。
【００５２】
カルバゾールアッセイ
ウロン酸とカルバゾールとの反応は、異なる化合物中のウロン酸の分量を推定するのに満足できる方法である。標準滴定曲線を確定するために、ＢｉｔｔｅｒとＭｕｉｒ［Ｔ．ＢｉｔｔｅｒとＨ．Ｍ．Ｍｕｉｒ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第４巻３３０〜３３４頁（１９６２）］に報告された手順を続けて行った。
【００５３】
試薬
Ａ：０．０２５Ｍ四ホウ酸ナトリウム１０Ｈ2Ｏの９８％硫酸溶液
Ｂ：０．１２５％カルバゾールの無水エタノール溶液（４℃の暗所で１２週間安定）
Ｃ：０、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５および１００μｇ／ｍｌの１１グルクロノラクトン溶液の脱イオン水溶液を安息香酸で飽和したもの（４℃で６ヶ月安定）
【００５４】
試薬Ａ（５ｍｌ）をチューブに入れ、−７０℃まで冷却した。次に、溶液Ｃ（１ｍｌ）を加えた。チューブを密封し、室温まで暖めた。次にチューブを振とうし、激しく沸騰した水浴内で１０分間加熱した。次に、チューブを室温まで冷却した。次に、試薬Ｂの一定分量（０．２ｍｌ）を加えた。再び、チューブを振とうして１５分間加熱した。室温に戻した後、５３０ｎｍでＵＶ吸収を測定した。図１は、グルクロノラクトンの濃度の関数としてのＵＶ吸収値の滴定曲線を示す。
【００５５】
試料ＡおよびＢのヒアルロニダーゼに対する抵抗性
試料ＡおよびＢからヒアルロニダーゼにより放出されるウロン酸（ＵＡ）の濃度を求めるために、Ｘ．Ｂ．Ｚｈａｏ、Ｊ．Ｅ．Ｆｒａｓｅｒ、Ｃ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、Ｃ．Ｌｏｃｋｅｔｔ、Ｂ．Ｊ．ＷｈｉｔｅのＪ．Ｍａｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ第１３巻１１〜１６頁（２００２）に報告される手順に続き、以下に報告するような変更形態を行った。
【００５６】
種々の濃度での各ゲル（２０ｍｇ／ｍｌでの試料Ａ、１５ｍｇ／ｍｌでの試料Ａ、２０ｍｇ／ｍｌでの試料Ｂおよび１５ｍｇ／ｍｌでの試料Ｂ）１ｍｌを１ｍｇのヒアルロニダーゼ（１０１０Ｕ含有）を含む６ｍｌのリン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ＝７．４）に懸濁し、３７℃でインキュベートした。５日後、各試料０．５ｍｌを２ｍｌイソプロパノールで希釈した。酵素で破壊されていない残りのゲルは、３０分にわたって遠心することにより沈殿させて除去した。次に、ウロン酸を含む上清液体を激しく沸騰した水浴に３０分間入れて加熱し、酵素を変性させて、再び３０分間遠心して酵素を除去した。各チューブの量を３．５ｍｌに調節した。ヒアルロニダーゼにより放出されたＵＡの濃度は、５３０ｎｍでのＵＶ吸収を測定することにより、図１に示す滴定曲線から求めた。図２は、異なるＵＶ値の比較を示す。
【００５７】
低濃度のバイオポリマーを含むゲルには（例えば１５ｍｇ／ｍｌの試料Ａを２０ｍｇ／ｍｌの試料Ａに比較すると）より低濃度のＵＡが観察された。また、試料Ａは、濃度１５および２０ｍｇ／ｍｌの両方で試料Ｂより有意に分解が少なかった。
【００５８】
５日間インキュベートした後のＵＡの濃度（μｇ／ｍｌゲル溶液）を滴定曲線（図１）から求めた。分析のために０．５ｍｌ試料を容量３．５ｍｌに希釈したため希釈係数を７（即ち３．５／０．５）と考慮した。
【００５９】
［ＵＡ］：ゲル上清中のＵＡの濃度
［ＵＡdil］：滴定曲線から推定したＵＡの濃度
ｙ＝０．０１７２［ＵＡdil］＋０．０２１５
［ＵＡdil］＝（ｙ−０．０２１５）／０．０１７２（式中、ｙ＝５３０ｎｍでの最大吸収値）
［ＵＡ］＝［ＵＡdil］×７＝［（ｙ−０．０２１５）／０．０１７２］×７
試料Ａ、２０ｍｇ：ｙ＝０．４３９、［ＵＡ］＝１７０μｇ／ｍｌ
試料Ａ、１５ｍｇ：ｙ＝０．３５１５、［ＵＡ］＝１３４μｇ／ｍｌ
試料Ｂ、２０ｍｇ：ｙ＝０．５５９、［ＵＡ］＝２１９μｇ／ｍｌ
試料Ｂ、１５ｍｇ：ｙ＝０．５３９、［ＵＡ］＝２１１μｇ／ｍｌ
【００６０】
試料Ａと市販のゲルであるレスティラン（Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ）（商標）およびパーレン（Ｐｅｒｌａｎｅ）（商標）との比較
試料ＡとＲｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）ゲル［Ｑ−Ｍｅｄ  ＡＢ製、スウェーデン  ウプサラ］とＰｅｒｌａｎｅ（商標）ゲル［Ｑ−Ｍｅｄ  ＡＢ製、スウェーデン  ウプサラ］との比較を以下に記載するように行った。
【００６１】
各ゲルの試料（０．４ｍｌ）を、０．５ｍｇヒアルロニダーゼ（５０５Ｕ）を含む３ｍｌのリン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ＝７．４）に懸濁し、３７℃でインキュベートした。試験したゲルは、濃度２０ｍｇ／ｍｌおよび１５ｍｇ／ｍｌのＲｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）ゲル、濃度２０ｍｇ／ｍｌおよび１５ｍｇ／ｍｌのＰｅｒｌａｎｅ（商標）ゲルおよび濃度２０ｍｇ／ｍｌおよび１５ｍｇ／ｍｌの試料Ａであった。１日後、０．２５ｍｌの各ゲルを２ｍｌのイソプロパノールで希釈した。酵素で破壊されなかった残りのゲルは、３０分にわたって遠心し、沈殿させて除去した。次に、ゲルの各チューブを激しく沸騰した水浴に入れて３０分間加熱して酵素を変性させ、再び３０分間遠心して酵素を除去した。各チューブの容量を２ｍｌに調節した。ヒアルロニダーゼにより放出されたＵＡの濃度は、５３０ｎｍでのＵＶ吸収を測定することにより滴定曲線から求めた。各ゲルの１日目のＵＶ吸収曲線を図３に示す。
【００６２】
１５ｍｇ／ｍｌおよび２０ｍｇ／ｍｌの両方の系列に対して、試料Ａは、Ｐｅｒｌａｎｅ（商標）およびＲｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）ゲルに比較して分解性が優れていた（即ち放出されたＵＡが低濃度であった）。実際、濃度２０ｍｇ／ｍｌでの試料Ａは、濃度１５ｍｇ／ｍｌのＰｅｒｌａｎｅ（商標）ゲルより分解しなかった。
【００６３】
ゲル劣化に関する針の大きさの影響
ゲルの劣化に関する針の大きさの影響を求めるために、３２Ｇ針を通して噴出成形または押し出し成形したＲｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）ゲル、３０Ｇ針を通して噴出成形または押し出し成形したＰｅｒｌａｎｅ（商標）ゲル、および３２Ｇ針および３０Ｇ針を通して押し出し成形した試料Ａ（５００μｍ）に上に記載した手順を繰り返した。ゲル濃度は、１５ｍｇ／ｍｌに固定した。
【００６４】
最初に、この手順条件（０．１５ｇ／ｌのヒアルロニダーゼ）でゲルの分解の最大レベルがいつ得られるのかを確定するために試行実験を行った。
【００６５】
２日後に得られる値は、１日後に得られる値より僅かに高かった。そこで、第３の組の測定値を１２日後に取ったが、ＵＡの放出は、ゲルが殆ど分解された最初の４８時間に比べて極めて低かった（図４参照）。このことから、異なるゲルのＵＡ放出（即ち分解）を比較するためには、２日間のインキュベート期間で十分であると判断された。図５は、各実験に対する２日後の５３０ｎｍでのＵＶ吸収を示す。
【００６６】
ＵＶ最大値およびＵＡ濃度を表１に列挙する。
【００６７】
【表１】
2008133474.tif 000002
【００６８】
表１は、針の大きさが小さくなるにつれて分解のレベルが一般に大きくなることを示している。図６に示すように、試料Ａが３２Ｇ針を通して押し出されても、ＵＡ濃度は押し出し成形されていないＰｅｒｌａｎｅ（商標）ゲルおよびＲｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）ゲルの両方に見られる値より低いままであり、従って、試料Ａの分解特性が向上したことが示された。
【００６９】
ゲルの分解の程度の評価
まず、各ゲルの最大分解レベルを確定した。ヒアルロニダーゼ存在下で１時間ゲル溶液を潅流することによりＵＡ抽出を行った。遠心することなく、０．２５ｍｌ試料に酸性処理（カルバゾールアッセイ手順を参照）を行った。分析する前に、溶液量を２ｍｌに調節した。
【００７０】
ＵＶスペクトルおよび滴定曲線から得たＵＡ濃度を表２に示す。
【００７１】
【表２】
2008133474.tif 000003
【００７２】
計算した濃度が類似していることにより、記載した条件下で最大分解レベルに近づいたことが示される。
【００７３】
次に、表１および表２の結果により、各ゲルに対する尺度とすることができると考えられる最大ＵＡ放出に比較して、以下に列記した実験条件で放出されるＵＡのパーセントを計算する基準が得られた。
％ＵＡ＝［ＵＡ］／［ＵＡ］max×１００
ゲル：１５ｍｇ／ｍｌを０．４ｍｌ
ヒアルロニダーゼ：０．５ｍｇ
溶媒：ＰＢＳ  ３ｍｌ
【００７４】
【表３】
2008133474.tif 000004
【００７５】
ヒアルロニダーゼ抵抗性の研究により、本発明の実施形態により形成された試料Ａは、２つの市販の架橋多糖類ゲルより分解性が小さいことが示された。このアッセイ法は、柔らかい流動ゲルではなく、緻密で硬いゲルを試験するのに一般に用いられる方法に基づくものであり、高濃度の酵素を用いるものであったことに留意されたい。従って、全てのゲルは、２日後には有意な分解性を示した。それにもかかわらず、結果は、本発明の実施形態により形成された架橋多糖類ゲルは、市販のゲルより分解特性が改善されたことを示している。
【００７６】
広く記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されるような本発明に多数の変形形態および／または変更形態を作ることができることは、当業者には理解されると考える。したがって、本実施形態は、あらゆる点において例示的なものであって限定的なものでないとみなされるものである。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
図面の簡単な説明
【図１】実施例に記載されたヒアルロン酸基層上へのヒアルロニダーゼの滴定曲線を示す図である。
【図２】実施例に記載された試料Ａと試料Ｂとの間のウロン酸（ＵＡ）放出の比較を示す図である。
【図３】実施例に記載された１日後のゲル中のＵＡのＵＶ吸収を示す図である。
【図４】実施例に記載された１、２および１２日目の５３０ｎｍにおけるＵＡのＵＶ吸収を示す図である。
【図５】実施例に記載された２日インキュベートした後の５３０ｎｍにおけるＵＡのＵＶ吸収を示す図である。
【図６】実施例に記載された種々のゲルの比較を示す図である。
【図１】
2008133474.tif 000005
【図２】
2008133474.tif 000006
【図３】
2008133474.tif 000007
【図４】
2008133474.tif 000008
【図５】
2008133474.tif 000009
【図６】
2008133474.tif 000010