(57)【要約】【課題】新規エビアレルゲンを提供する。【解決手段】本発明のエビアレルゲンはエビコラーゲン又はそのポリペプチド断片からなる。本発明によれば、新規エビアレルゲンを提供し、これを用いて、抗エビアレルゲン抗体、エビアレルゲン混入検査方法、エビアレルゲン混入検査用試薬、エビアレルゲン感受性測定方法、エビアレルゲン感受性測定用試薬等を提供することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エビコラーゲン又はそのポリペプチド断片からなることを特徴とするエビアレルゲン。
【請求項２】
前記エビコラーゲンは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析による分子量が１１０〜１４０キロダルトンである請求項１記載のエビアレルゲン。
【請求項３】
前記エビコラーゲンは、クルマエビ又はボタンエビ由来である請求項１又は２記載のエビアレルゲン。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つに記載のエビアレルゲンを認識する抗エビアレルゲン抗体。
【請求項５】
抗血清、ＩｇＧ画分、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体である請求項４記載の抗エビアレルゲン抗体。
【請求項６】
試料中のエビアレルゲンの混入を検査する方法であって、試料から抽出物を調製し、前記抽出物中のエビコラーゲン又はそのポリペプチド断片の存在の有無を検出することを特徴とするエビアレルゲン混入検査方法。
【請求項７】
前記試料は、飲食品又はその原材料である請求項６記載のエビアレルゲン混入検査方法。
【請求項８】
前記エビコラーゲンは、クルマエビ又はボタンエビ由来である請求項６又は７記載のエビアレルゲン混入検査方法。
【請求項９】
前記抽出物中のエビコラーゲン又はそのポリペプチド断片の存在の有無を検出する手段が、請求項４又は５記載の抗エビアレルゲン抗体を用いた免疫学的検出手段である請求項６〜８のいずれか１つに記載のエビアレルゲン混入検査方法。
【請求項１０】
試料中のエビアレルゲンの混入を検査するために用いられる検査用試薬であって、請求項４又は５記載の抗エビアレルゲン抗体を含むことを特徴とするエビアレルゲン混入検査用試薬。
【請求項１１】
請求項４又は５記載の抗エビアレルゲン抗体を含有する溶液を含む請求項１０記載のエビアレルゲン混入検査用試薬。
【請求項１２】
請求項４又は５記載の抗エビアレルゲン抗体を担持した担体を含む請求項１０記載のエビアレルゲン混入検査用試薬。
【請求項１３】
被験者の生体試料又はその調製物に、請求項１〜３のいずれか１つに記載のエビアレルゲンを作用させ、前記生体試料又はその調製物に含まれるＩｇＥ抗体のうち、前記エビアレルゲンに結合するＩｇＥ抗体の量を測定することを特徴とするエビアレルゲン感受性測定方法。
【請求項１４】
被験者のエビアレルゲンに対する感受性を測定するために用いられる測定用試薬であって、請求項１〜３のいずれか１つに記載のエビアレルゲンを含むことを特徴とするエビアレルゲン感受性測定用試薬。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか１つに記載のエビアレルゲンを含有する溶液を含む請求項１４記載のエビアレルゲン感受性測定用試薬。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか１つに記載のエビアレルゲンを担持した担体を含む請求項１４記載のエビアレルゲン感受性測定用試薬。
【請求項１７】
更に、標識抗ＩｇＥ抗体を含む請求項１４〜１６のいずれか１つに記載のエビアレルゲン感受性測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エビアレルゲン及び抗エビアレルゲン抗体に関し、更に、エビアレルゲン混入検査方法、エビアレルゲン混入検査用試薬、エビアレルゲン感受性測定方法、並びにエビアレルゲン感受性測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
わが国における食物アレルギーの主な原因食物は、卵、牛乳、大豆、エビ・カニや魚類などである。年齢によって原因食物の頻度は異なり、成人ではエビ・カニなどの甲殻類によるアレルギーがもっとも高頻度に認められる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
このエビによるアレルギーは即時型であり、摂食（あるいは接触）の直後から３０分以内に口腔粘膜症状（口唇のしびれ、浮腫など）、皮膚症状（蕁麻疹など）、消化器症状（吐き気、嘔吐、下痢など）や呼吸器症状（喘息、息切れなど）が出現する。ときには重篤な全身性のアナフィラキシーショックに陥ることもある（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
従来、エビによるアレルギーの原因物質としては、エビトロポミオシン(TMS)やエビアルギニンキナーゼ(AK)が同定されていた（例えば、非特許文献３及び４参照。）。
【０００５】
一方、最近、魚アレルギー患者において魚コラーゲンがアレルゲンとなることが報告されている（例えば、非特許文献５及び６参照。）。
【非特許文献１】Yoneyama K, Ono A. Study of food allergy among university students in Japan. Allergology International 2002; 51: 205-208.
【非特許文献２】中村  晋、飯倉洋治: 最新食物アレルギー. 永井書店 2004; 241-244.
【非特許文献３】Daul CB, Slattery M, Reese G, et al : Identification  of the major brown shrimp（Penaeus aztecus）allergen as the muscle protein tropomyosin. Int Arch Allergy Immunol 1994; 105: 49-55.
【非特許文献４】Yu CJ, Lin YF, Chiang BL, Chow LP. Proteomics and immunological analysis of a novel shrimp allergen, Pen m 2. J Immunol. 2003; 170: 445-453.
【非特許文献５】Hamada Y, Nagasima Y，Shiomi K, et al. Reactivity of IgE in fish-allergic patients to fish muscle collagen．Allergology International 2003; 52: 139-147.
【非特許文献６】Sakaguchi M, Toda M, Ebihara T, et al. IgE antibody to fish gelatin (type I collagen) in patients with fish allergy. J Allergy Clin Immunol. 2000; 106: 579-584.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
エビアレルギー患者の多くはエビトロポミオシン(TMS)とエビアルギニンキナーゼ(AK)の両方あるいはいずれかのＩｇＥ抗体を保有する。しかしながら、これらのアレルゲンに対する抗体が陰性である患者もあることから，他の未同定アレルゲンもまた発症に重要な役割を果たしていると考えられる。
【０００７】
したがって本発明の目的は、新規エビアレルゲンを提供し、これを用いて、抗エビアレルゲン抗体、エビアレルゲン混入検査方法、エビアレルゲン混入検査用試薬、エビアレルゲン感受性測定方法、エビアレルゲン感受性測定用試薬等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、エビ尾肉（筋肉）に含まれるコラーゲンがアレルゲンであることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１０】
（１）エビコラーゲン又はそのポリペプチド断片からなることを特徴とするエビアレルゲン。  
【００１１】
（２）前記エビコラーゲンは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析による分子量が１１０〜１４０キロダルトンである前記（１）記載のエビアレルゲン。
【００１２】
（３）前記エビコラーゲンは、クルマエビ又はボタンエビ由来である前記（１）又は（２）記載のエビアレルゲン。  
【００１３】
（４）前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のエビアレルゲンを認識する抗エビアレルゲン抗体。  
【００１４】
（５）抗血清、ＩｇＧ画分、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体である前記（４）記載の抗エビアレルゲン抗体。  
【００１５】
（６）試料中のエビアレルゲンの混入を検査する方法であって、試料から抽出物を調製し、前記抽出物中のエビコラーゲン又はそのポリペプチド断片の存在の有無を検出することを特徴とするエビアレルゲン混入検査方法。  
【００１６】
（７）前記試料は、飲食品又はその原材料である前記（６）記載のエビアレルゲン混入検査方法。  
【００１７】
（８）前記エビコラーゲンは、クルマエビ又はボタンエビ由来である前記（６）又は（７）記載のエビアレルゲン混入検査方法。  
【００１８】
（９）前記抽出物中のエビコラーゲン又はそのポリペプチド断片の存在の有無を検出する手段が、前記（４）又は（５）記載の抗エビアレルゲン抗体を用いた免疫学的検出手段である前記（６）〜（８）のいずれか１つに記載のエビアレルゲン混入検査方法。  
【００１９】
（１０）試料中のエビアレルゲンの混入を検査するために用いられる検査用試薬であって、前記（４）又は（５）記載の抗エビアレルゲン抗体を含むことを特徴とするエビアレルゲン混入検査用試薬。  
【００２０】
（１１）前記（４）又は（５）記載の抗エビアレルゲン抗体を含有する溶液を含む前記（１０）記載のエビアレルゲン混入検査用試薬。  
【００２１】
（１２）前記（４）又は（５）記載の抗エビアレルゲン抗体を担持した担体を含む前記（１０）記載のエビアレルゲン混入検査用試薬。  
【００２２】
（１３）被験者の生体試料又はその調製物に、前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のエビアレルゲンを作用させ、前記生体試料又はその調製物に含まれるＩｇＥ抗体のうち、前記エビアレルゲンに結合するＩｇＥ抗体の量を測定することを特徴とするエビアレルゲン感受性測定方法。
【００２３】
（１４）被験者のエビアレルゲンに対する感受性を測定するために用いられる測定用試薬であって、前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のエビアレルゲンを含むことを特徴とするエビアレルゲン感受性測定用試薬。
【００２４】
（１５）前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のエビアレルゲンを含有する溶液を含む前記（１４）記載のエビアレルゲン感受性測定用試薬。
【００２５】
（１６）前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のエビアレルゲンを担持した担体を含む前記（１４）記載のエビアレルゲン感受性測定用試薬。
【００２６】
（１７）更に、標識抗ＩｇＥ抗体を含む前記（１４）〜（１６）のいずれか１つに記載のエビアレルゲン感受性測定用試薬。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、新規エビアレルゲンを提供し、これを用いて、抗エビアレルゲン抗体、エビアレルゲン混入検査方法、エビアレルゲン混入検査用試薬、エビアレルゲン感受性測定方法、エビアレルゲン感受性測定用試薬等を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、エビ尾肉（筋肉）に含まれるコラーゲンがアレルゲンであることを新たに見出したことによる発明である。すなわち、本発明のエビアレルゲンはエビコラーゲン又はそのポリペプチド断片からなる。
【００２９】
本発明のエビアレルゲンにおいて用いられる、エビコラーゲンは、例えば、蛯原、入江の方法（蛯原哲也，入江伸吉：魚類および無脊椎動物コラーゲン細胞学マトリックス研究法（Ｉ）コラーゲン技術研修会刊 1998; 52-57.）のような公知の技術を用いて得ることができる。すなわち、エビの尾肉（筋肉）等を原料にして、均一化、洗浄液による洗浄、エタノールによる脱脂、ペプシンによる消化・抽出、ＮａＣｌによる塩析、酢酸溶液可溶化後の透析、の各処理を経ること等によって得ることができる。
【００３０】
コラーゲンは様々な生物が保有し、その構造や性質は類似している。基本的には分子量約１０万のポリペプチド鎖３本から構成され、未変性コラーゲンではそれらがヘリックス構造をとっている。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりゲルに展開すると、ポリペプチド鎖１本の１量体（α鎖）、２本の２量体（β鎖）、３本の３量体（γ鎖）にわかれる。ただし、原料組織からの抽出性や得られる分子種（１量体（α鎖）、２量体（β鎖）、３量体（γ鎖）の別）は、動物の種類、又は用いる組織によって大きく異なる。
【００３１】
本発明において用いられるエビコラーゲンについては、エビ筋肉組織からの抽出時のペプシン消化を２回程度繰り返すことにより、コラーゲン精製分画を容易に得ることができる。そのようにして得られたコラーゲン精製分画には、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動―クマシー染色分析において略シングルバンドを示す程度に、コラーゲンの１量体（α鎖）が精製されている。
【００３２】
本発明のエビアレルゲンにおいて用いられる、エビコラーゲンは、上記の方法以外の方法によっても適宜得ることができる。また、エビコラーゲンは、公知の技術を利用して、適宜これを濃縮、精製することができる。
【００３３】
原料エビの種類に特に制限はないが、食用エビであるクルマエビ（Penaeus japonicus）又はボタンエビ（Pandalus platyceros）等を好ましく例示できる。
【００３４】
本発明のエビアレルゲンにおいては、例えばアレルゲン性、抗体産生能、抗体結合能等の特性において、エビコラーゲンの免疫学的特性を保持するものであれば、そのポリペプチド断片を用いることもできる。すなわち、例えば、抗原−抗体反応の特異性を決定する局所構造であるエピトープは、一般的にそのアミノ酸長は１０〜数十アミノ酸程度である。したがって、エビコラーゲンにもそのようなの免疫学的特性を保持する部分ポリペプチド断片が存在するものと考えられる。
【００３５】
なお、本発明において「免疫学的」とは、当該分野で一般に用いられる用語と同義に用いられ、ヒトに対する免疫性を利用するものだけでなく、例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、サル、ウシ、ニワトリ、モルモット、ラット、マウス等、他の動物に対する免疫性を利用するものも含まれる。
【００３６】
本発明のエビアレルゲンにおいては、その免疫学的特性を保持する範囲であれば、可逆的あるいは不可逆的に、他物質と結合させた状態で使用することができる。例えば、樹脂、ガラス、プラスチック、金属、色素分子、放射性物質、蛍光物質、生体高分子、有機材料分子などに結合させた状態で使用することができる。また結合させるものの性状に特に制限はなく、例えば、ゲル状、ナノ粒子状、コロイド状、ビーズ状、多孔質状、プレート状などであってもよい。
【００３７】
本発明のエビアレルゲンは、以下のように利用することができる。
【００３８】
例えば、試料から抽出物を調製し、本発明のエビアレルゲン（エビコラーゲン又はそのポリペプチド断片）を物質的指標にして、前記抽出物中のエビアレルゲン（エビコラーゲン又はそのポリペプチド断片）の存在の有無を検出する。前記試料としては、飲食品又はその原材料等が挙げられる。
【００３９】
これによれば、飲食品中にエビアレルゲンの混入があるかどうかを製造業者又はその管理者が簡便に検査することができ、これを製品のパッケージ等に表示することによって、購入者に知らしめることができる。そして、エビアレルギー発症履歴を有するか、発症のおそれのある消費者がその飲食品を摂取することを防止することができる。
【００４０】
なお、コラーゲンは溶化しゼラチンとなっても抗原性が保たれることが知られている。したがって、本発明のエビアレルゲン（エビコラーゲン又はそのポリペプチド断片）を物質的指標にする場合でも、加熱処理された飲食品中のエビアレルゲンとしての抗原性は保たれるものと考えられ、後述する免疫学的検出手段によって簡便に検出することができる。
【００４１】
また、本発明のエビアレルゲンは、以下のようにも利用することができる。
【００４２】
例えば、被験者の生体試料又はその調製物に、本発明のエビアレルゲンを作用させ、前記生体試料又はその調製物に含まれるＩｇＥ抗体のうち、前記エビアレルゲンに結合するＩｇＥ抗体の量を測定する。これによって、被験者のエビコラーゲンに対する感受性を測定し、又はエビコラーゲンによるアレルギー症状の病態を測定することができる。
【００４３】
被験者の生体試料又はその調製物としては、血液、血清、血漿等が挙げられる。
【００４４】
前記エビアレルゲンに結合するＩｇＥ抗体の量を測定する手段としては、例えば、まず、本発明のエビアレルゲンを、マイクロプレートやビーズに固相化しておき、前記生体試料又はその調製物に含まれるＩｇＥ抗体のうちその固相に本発明のエビアレルゲンを介して結合するものを、結合せずに溶液中にとどまるものから洗浄操作や、遠心操作により分離し、これをＩｇＥ抗体に対する抗体で測定する方法で行うことができる。ＩｇＥ抗体に対する抗体としては、抗ヒトIgE-β-galactosidase標識抗体等が市販されている。
【００４５】
上記の測定方法を簡便且つ迅速にできるようにするためには、本発明のエビアレルゲンを含むエビアレルゲン感受性測定用試薬が提供され得る。また、本発明のエビアレルゲンの他に必要とされる任意の試薬を更に含むエビアレルゲン感受性測定用試薬としても提供され得る。他に必要とされる任意の試薬としては、例えば、上記抗ヒトIgE-β-galactosidase標識抗体等の標識抗ＩｇＥ抗体が挙げられる。
【００４６】
一方、本発明の抗エビアレルゲン抗体は、本発明のエビアレルゲンを認識する抗エビアレルゲン抗体であり、具体的には、抗血清、ＩｇＧ画分、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体等の抗エビアレルゲン抗体である。その調製方法としては、当該分野で周知のいずれの技術をも用いることができる。例えば、本発明のエビアレルゲンを免疫動物に投与し、当該動物からの抗血清の採取する。免疫動物としては、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、サル、ウシ、ニワトリ、モルモット、ラット、マウス等が挙げられる。
【００４７】
本発明の抗エビアレルゲン抗体においては、その免疫学的特性を保持する範囲であれば、可逆的あるいは不可逆的に、他物質と結合させた状態で使用することができる。例えば、樹脂、ガラス、プラスチック、金属、色素分子、放射性物質、蛍光物質、生体高分子、有機材料分子などに結合させた状態で使用することができる。また結合させるものの性状に特に制限はなく、例えば、ゲル状、ナノ粒子状、コロイド状、ビーズ状、多孔質状、プレート状などであってもよい。
【００４８】
本発明の抗エビアレルゲン抗体は、以下のように利用することができる。
【００４９】
例えば、上述の、試料中のエビアレルゲンの存在の有無を検出する方法において、エビコラーゲン又はそのポリペプチド断片の存在の有無を検出する手段として、本発明の抗エビアレルゲン抗体を用いた免疫学的検出手段を用いることができる。
【００５０】
免疫学的検出手段はＥＬＩＳＡ法やイムノクロマト法等をはじめとして各種の方法が広く普及しており、当該分野の当業者であれば、公知の技術を適宜利用することに困難はない。
【００５１】
上記の検査方法を簡便且つ迅速にできるようにするためには、本発明の抗エビアレルゲン抗体を含むエビアレルゲン混入検査用試薬が提供され得る。また、本発明の抗エビアレルゲン抗体の他に必要とされる任意の試薬を更に含むエビアレルゲン混入検査用試薬としても提供され得る。更に、他に必要とされる任意の試薬としては、例えば、抗エビアレルゲン抗体を認識する抗ＩｇＧ―Ｆｃフラグメント抗体等、抗ＩｇＧ２次抗体が挙げられる。
【実施例】
【００５２】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００５３】
<製造例１>  クルマエビコラーゲンの精製
クルマエビの尾肉より、蛯原、入江の方法（蛯原哲也，入江伸吉：魚類および無脊椎動物コラーゲン細胞学マトリックス研究法（Ｉ）コラーゲン技術研修会刊 1998; 52-57.）に従い、以下のようにしてコラーゲンを精製した。
【００５４】
エビ尾肉を氷冷した洗浄液（0.1μM N-ethylmaleimide，10μM PMSF，1mM EDTA, 25mM Na2HPO4；用時調整）の中に入れ、ガラスホモジナイザーで均質化した。この溶液を10000rpm（15000×ｇ）、１０分間、４℃で遠心し（以下の遠心操作も、特に記載のない場合はこの遠心条件による。）、沈殿に洗浄液を加えて３〜１０時間攪拌した。再度遠心し，沈殿に洗浄液を加えて攪拌、この洗浄工程を５〜7回繰り返した。上清のタンパク質濃度が１０μg/ml以下になったことを確認し、沈殿に約１０倍量の冷エタノールを加え約３時間攪拌、上清が透明になるまで数回繰り返した。この脱脂沈殿に約１０倍量の１mg/mlペプシン‐０．５M酢酸（抽出液）を加え、一晩攪拌した。これを遠心してその上清を回収した。また、遠心後の沈殿には再度抽出液を加えて同様に抽出を行った。遠心後の上清を合わせて、これに終濃度２MになるようにNaClを加え、一晩攪拌した。これを遠心して、その沈殿に約１０倍量の０．０５M酢酸を加え溶解させた後、再度遠心し、その上清を透析膜（PIERCE社製、Rockford，IL）に入れ、0.005M Tris-HCl，pH7.5 に対して一晩透析し、更に、透析外液のpHが７．５に安定するまで繰り返し透析を行った。透析後、遠心し、その沈殿に約１０倍量の0.05M 酢酸を加え溶解させ、再度遠心した。この上清を回収、0.005M 酢酸に対して一晩透析後、２０分間遠心し、その上清（クルマエビコラーゲン精製物）を得た。
【００５５】
得られた上清を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処し、クマシー染色を行った。その結果を図１に示す。
【００５６】
コラーゲンは様々な生物が保有し、その構造や性質は類似している。基本的には分子量約１０万のポリペプチド鎖３本から構成され、未変性コラーゲンではそれらがヘリックス構造をとっている。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりゲルに展開すると、ポリペプチド鎖１本の１量体（α鎖）、２本の２量体（β鎖）、３本の３量体（γ鎖）にわかれる。
【００５７】
図１に示すように、分子量マーカーとの対比から、得られた上清からは約１２０キロダルトン（ｋＤａ）のバンドが主要バンドとして認められ、これがコラーゲンの１量体（α鎖）であると考えられた。また、コラーゲンの２量体（β鎖）、３量体（γ鎖）に相当するバンドはわずかに認められるのみであった。その他に４２ｋＤａ付近にごくわずかなバンドが認められた。
【００５８】
<試験例１>  エビアレルゲン夾雑物質の確認
エビアレルギー患者の多くはエビトロポミオシン（TMS）とエビアルギニンキナーゼ（AK）の両方あるいはいずれかに対する特異的ＩｇＥ抗体を保有する。
【００５９】
そこで、抗エビトロポミオシン抗体（マウス由来）、及び抗エビアルギニンキナーゼ抗体（マウス由来）を用いて、製造例１のクルマエビコラーゲン精製物中に、これらが夾雑物質として混入していないかどうかを以下のようにして調べた。なお、これらの抗体はつぎのように作製した。すなわち、大正エビ（クルマエビ属）の尾肉を煮沸し，その抽出液を硫安塩析した後、陰イオン交換カラムおよびハイドロキシアパタイトカラムを用いてエビトロポミオシンを単離した。この精製トロポミオシンをアラム（アジュバント）ともにマウスに免疫し、常法に従い抗エビトロポミオシン抗体（マウス抗血清）を得た。また、クルマエビ尾肉のホモジネイトを作製し、硫安塩析後、ニッケルキレートカラムを用いてアルギニンキナーゼを単離した。この精製アルギニンキナーゼをアラム（アジュバント）ともにマウスに免疫し、常法に従い抗エビアルギニンキナーゼ抗体（マウス抗血清）を得た。
【００６０】
製造例１のクルマエビコラーゲン精製物を、０．０５Ｍ炭酸-重炭酸緩衝液，ｐＨ9.6で１０μg/mlに調製し、９６穴平底マイクロプレートの１ウェル中に１００μｌ（約１μg）ずつ添加し、4℃一晩静置し、固相化した。PBSTで３回洗浄後、上記エビ主要アレルゲン抗体（マウス抗血清）（抗TMS、抗AK、各25000倍）を室温で６０分間反応させた。洗浄後、アルカリフォスファターゼ（Alp）標識抗マウス IgG抗体（2000倍）を室温で６０分間反応させた。洗浄後、1mg/ml p-nitro phenyl phosphateを室温で１５分間反応させた。0.2M EDTAを加えて反応を停止し、405nmで吸光度を測定した。また、それぞれの抗体についての陽性コントロールとして、エビトロポミオシン(TMS)とエビアルギニンキナーゼ(AK)を９６穴平底マイクロプレートの１ウェル中にそれぞれ約０．１μg含まれるように固相化し、同様に測定した。その結果を表１に示す。
【００６１】
【表１】
2008255054.tif 000002
【００６２】
表１に示すように、製造例１のクルマエビコラーゲン精製物は、抗エビトロポミオシン抗体（マウス抗血清）、及び抗エビアルギニンキナーゼ抗体（マウス抗血清）に対しては全く反応性を有さず、２種の抗体のエビコラーゲンへの反応量（吸光度）は、それぞれblankと等しかった。
【００６３】
以上の結果、及び上述のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果から、製造例１のクルマエビコラーゲン精製物には、エビトロポミオシン(TMS)やエビアルギニンキナーゼ(AK)の混入はなく、エビコラーゲンのアレルゲン性を評価するために十分に精製されていると判断された。
【００６４】
<試験例２>  クルマエビコラーゲンの同定
製造例１で得られたタンパク質がコラーゲンであることを確認するために、未変性コラーゲンのヘリックス構造に特異的に結合する色素であるSirius-redによる染色を行った。具体的には、製造例１のクルマエビコラーゲン精製物について、コラーゲン同定キットである「Sircol Collagen Assayキット」（商品名、英国Biodye science社製、Northern Ireland）を用いて、Sirius-redによる染色の程度を測定した。また、加熱処理（変性）したものについても同様に測定した。図２にはその結果を示す。
【００６５】
図２に示すように、非加熱（未変性）の試料は色素Sirius-redで染色されたが、加熱処理（変性）の試料では染色性が大きく低下した。この結果はウシコラーゲンの結果と同様であった。
【００６６】
コラーゲンのアミノ酸組成は極めて特徴的でグリシンが多く、疎水性アミノ酸が少なく、チロシンがほとんど含まれていないため、280nmの吸収がほとんど認められない。そこで、図３には、製造例１で得られたタンパク質（クルマエビコラーゲン）の紫外線吸収特性について、ウシコラーゲン及びBSA（ウシ血清アルブミン）の紫外線吸収特性と比較した。具体的には、製造例１のクルマエビコラーゲン精製物とウシのコラーゲン及びBSAを、それぞれ１mg/mlの濃度に精製水で調整し、240−300nmの波長での紫外線吸収特性を比較した。
【００６７】
図３に示すように、BSAは280nmに明瞭な吸収ピークを認めたのに対し、製造例１のクルマエビコラーゲン精製物、又はウシコラーゲンでは280nmに吸収ピークを認めなかった。
【００６８】
以上から、製造例１で得られたタンパク質がコラーゲンであることが確認された。
【００６９】
<製造例２>  ボタンエビコラーゲンの精製
ボタンエビの尾肉より、製造例１と同様にしてコラーゲンを精製した。その結果、クルマエビコラーゲンと同様の特性を有する、分子量約120キロダルトン（ｋＤａ）のボタンエビコラーゲンを精製することができた。
【００７０】
<試験例３>  エビコラーゲンのアレルゲン性
エビアレルギー患者（エビCAP RAST陽性２３例）の血清中で、エビコラーゲンに対するＩｇＥ抗体の発現量が増加しているかどうかを調べる目的で、以下のようにして、間接ELISA法による測定を行った。なお、上記エビアレルギー患者は、エビの摂食で口唇浮腫やじん麻疹、また接触皮膚炎(調理中)などのアレルギーを発症した経験があり、その血清は、市販のアレルゲンIgE抗体検査キット（CAP-RAST）での判定で陽性である。
【００７１】
製造例１又は製造例２で得られたエビコラーゲンを、０．０５Ｍ炭酸-重炭酸緩衝液、ｐＨ9.6で１０μg/mlに調製し、９６穴平底マイクロプレートの１ウェル中に約1μg含まれるように固相化した。PBST（PBS,0.05% Tween 20）で３回洗浄後、エビアレルギー患者の血清を1％BSA-PBSTで５倍に希釈して分注し、室温で３時間反応させた。PBSTで３回洗浄後、抗ヒトIgE-β-galactosidase標識抗体（「CAP RAST FEIAキット」（商品名）、ファディア株式会社製）を１％BSA-PBSTで15倍希釈して分注し、４℃で一晩反応させた。PBSTで３回洗浄後、0.3mM 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactopyranosideを加え、３７℃の恒温槽中で９０分間反応させた。最後に0.1M Glycine-NaOH、pH10.2を加えて反応を停止させた。蛍光単位（FU）は、マイクロプレートリーダー「Fluoroskan II」（商品名、米国Titertek社製）を用いて測定し、100蛍光単位(FU)以上を抗体陽性とした。
【００７２】
その結果を表２に示す。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
表２に示すとおり、抗原としてクルマエビコラーゲンを用いた場合には、エビアレルギー患者２３例のうち８例（３５％）が抗体陽性であった。また、抗原としてボタンエビコラーゲンを用いた場合には、エビアレルギー患者２３例のうち５例（２２％）が抗体陽性であった。
【００７５】
以上から、一部のエビアレルギー患者（エビCAP RAST陽性２３例）の血清で、エビコラーゲンに対するＩｇＥ抗体の発現量が増加していることが明らかとなった。したがって、エビコラーゲンがエビアレルギー症状の原因物質のひとつであることが示唆された。
【００７６】
<試験例４>  他の動物由来のコラーゲンとの交差反応性
コラーゲンは様々な生物が保有し、その構造や性質は類似している。また、Sakaguchiらは魚アレルギー患者の魚ゼラチンＩｇＥ抗体陽性率は約３０％であったと報告している（上記非特許文献６参照。）。
【００７７】
そこで、試験例３で示されたエビコラーゲンのアレルゲン性が、エビアレルギー患者の血清中に存在する他の動物由来のコラーゲンに起因するＩｇＥ抗体との反応によるものではないことを確認するために、エビコラーゲンの交差反応性について調べた。具体的には、サバとウシのコラーゲンを用いた抑制法ELISAによって、エビアレルギー患者の血清中に存在するコラーゲンＩｇＥ抗体の特異性について検討した。
【００７８】
まず、製造例１で得られたクルマエビコラーゲンを、０．０５Ｍ炭酸-重炭酸緩衝液、ｐＨ9.6で１０μg/mlに調製し、９６穴平底マイクロプレートの１ウェル中に約1μg含まれるように固相化した。別の試験管に製造例１で得られたクルマエビコラーゲンと、サバとウシのコラーゲンの各々について、20μg/mlから、4μg/ml、0.8μg/mlと段階的に希釈した溶液を用意し、５倍に希釈したコラーゲンIgE陽性プール血清（試験例３での陽性者３例の血清を混合したもの）を等量加えて混合、４℃で一晩反応させた。コラーゲン固相化プレートをPBSTで３回洗浄後、試験管に作製したコラーゲンと血清の混合液を100μlずつ分注し室温で３時間反応させた。以後は、試験例３と同様にして測定を行った。抑制率は次式により求めた。
・抑制率（％）＝（抑制剤未添加穴のFU?抑制剤添加穴のFU）÷抑制剤未添加穴のFU×100
【００７９】
その結果を図４に示す。図４に示すとおり、抑制剤にエビコラーゲンを用いた場合には、固相化クルマエビコラーゲンと血清との反応が濃度依存的に抑制された。これに対し、サバやウシのコラーゲンを抑制剤に用いた場合には全く抑制されなかった。
【００８０】
以上から、エビコラーゲンは、他種コラーゲンとの交差反応性が低いアレルゲンであることが明らかとなった。また、試験例３で示されたエビコラーゲンのアレルゲン性が、エビアレルギー患者の血清中に存在する他の動物由来のコラーゲンに起因するＩｇＥ抗体との反応によるものではなく、エビコラーゲン特異的なＩｇＥ抗体の発現量の増加によるものであると考えられた。
【００８１】
<実施例１>  エビコラーゲン特異的ＩｇＥ抗体保有者の検出
一般成人１７５例におけるエビ又はサバのコラーゲンに対するＩｇＥ抗体保有状況を調べた。具体的には、各被験者から血清を採取し、試験例３と同様にして、陽性者を検出した。その結果を表３に示す。
【００８２】
【表３】
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【００８３】
表３に示すように、ＩｇＥ抗体陽性者はクルマエビで３例（1.7％）、サバで４例（2.3％）であった。エビとサバの抗体値間には相関が認められず、両者にＩｇＥ抗体を保有したのは1例のみであった。また、エビコラーゲンＩｇＥ抗体を保有した３例はいずれもエビやカニの摂食によりじん麻疹や口唇浮腫などの経験を持っていた。
【００８４】
以上のように、エビアレルギー発症者と、エビコラーゲンＩｇＥ抗体保有者との相間が認められることから、アレルゲンとしてのエビコラーゲンや、これを用いて作製することができる抗エビアレルゲン抗体等を、エビアレルギーの測定等に応用することができることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】製造例１のクルマエビコラーゲン精製物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処しクマシー染色した写真である。
【図２】未変性コラーゲンヘリックス構造に特異的に結合する色素であるSirius-redによる染色を行った結果を示す図表である。
【図３】製造例１で得られたクルマエビコラーゲンの紫外線吸収特性を、ウシコラーゲン及びBSA（ウシ血清アルブミン）の紫外線吸収特性と比較した結果を示す図表である。
【図４】エビ、サバおよびウシのコラーゲンを抑制剤に用いた抑制法ELISAの結果を示す図表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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