(57)【要約】【課題】培養細胞から産生された高純度の細胞外マトリクスを簡易かつ安価に回収する。【解決手段】細胞をアルギン酸ビーズにより包み込むステップＳ１と、アルギン酸ビーズにより包まれた状態の細胞を培養するステップＳ２と、培養されたアルギン酸ビーズに包まれた状態の細胞を洗浄するステップＳ３と、アルギン酸ビーズを溶解するステップＳ４と、溶解されたアルギン酸を除去するステップＳ５とを備える細胞外マトリクスの回収方法を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞をアルギン酸ビーズにより包み込むステップと、
アルギン酸ビーズにより包まれた状態の細胞を培養するステップと、
培養されたアルギン酸ビーズに包まれた状態の細胞を洗浄するステップと、
アルギン酸ビーズを溶解するステップと、
溶解されたアルギン酸を除去するステップとを備える細胞外マトリクスの回収方法。
【請求項２】
前記アルギン酸ビーズを溶解するステップが、クエン酸等のカルシウムキレート材料によりアルギン酸ビーズを溶解する請求項１に記載の細胞外マトリクスの回収方法。
【請求項３】
アルギン酸を除去した後、細胞を分離するステップをさらに備える請求項１に記載の細胞外マトリクスの回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外マトリクスの回収方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、培養細胞が細胞外マトリクスを産生することは知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
細胞外マトリクスは、多細胞生物体を構成する細胞を取り巻いて存在する様々な物質の総称であり、多細胞生物体が力学的に組織を組み立てるために不可欠であることが知られている。したがって、培養細胞から産生される細胞外マトリクスを効率的に回収して、必要とされる部位に供給することにより、組織の再生を促進することができる。
【非特許文献１】Su San Mok et al., "Aggrecan Synthesized byMature Bovine Chondrocytes Suspended in Alginate", Metabolixm ofCartilage Aggrecan in Twe Distinct Pools, Vol. 269, No.52, Issue of December 30, pp.33021-33027, 1994, USA，The Journal ofBiological chemistry
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、培養細胞から産生される細胞外マトリクスは、細胞を培養する際に培養培地内に分泌されるので、これを分離するには、培養培地から細胞外マトリクスを精製することが必要となる。培養培地にはＦＢＳ等のタンパク質が含まれているので、これらタンパク質と細胞外マトリクスとの区別が困難であるため、精製するには手間とコストがかかるという問題がある。
【０００４】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、培養細胞から産生された細胞外マトリクスを簡易かつ安価に回収することを可能とする細胞外マトリクスの回収方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、細胞をアルギン酸ビーズにより包み込むステップと、アルギン酸ビーズにより包まれた状態の細胞を培養するステップと、培養されたアルギン酸ビーズに包まれた状態の細胞を洗浄するステップと、アルギン酸ビーズを溶解するステップと、溶解されたアルギン酸を除去するステップとを備える細胞外マトリクスの回収方法を提供する。
【０００６】
本発明によれば、細胞をアルギン酸ビーズにより包み込んだ状態で培養することで、細胞から産生される細胞外マトリクスをアルギン酸ビーズ内に産生させることができる。産生された細胞外マトリクスはアルギン酸ビーズ内に捕らえられるので、外部の培地内に流出されることなく保持される。
そして、洗浄ステップによりアルギン酸ビーズ外面に付着した培地等を除去した後、アルギン酸ビーズを溶解し、溶解されたアルギン酸を除去することにより、純度の高い細胞外マトリクスを回収することができる。この場合に、細胞外マトリクスとともに細胞も回収されることとなるが、細胞内に存在する細胞外マトリクスをも回収することができる。
【０００７】
上記発明においては、前記アルギン酸ビーズを溶解するステップが、クエン酸等のカルシウムキレート材料によりアルギン酸ビーズを溶解することとしてもよい。
このようにすることで、タンパク質を含まないクエン酸等のカルシウムキレート材料によりアルギン酸ビーズを溶かすことができ、純度の高い細胞外マトリクスを容易に分離回収することができる。
【０００８】
また、上記発明においては、アルギン酸を除去した後、細胞を分離するステップをさらに備えることとしてもよい。
このようにすることで、細胞外マトリクスのみを高い純度で回収することができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、培養細胞から産生された細胞外マトリクスを簡易かつ安価に回収することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の一実施形態に係る細胞外マトリクスの回収方法について、図１を参照して説明する。
本実施形態に係る細胞外マトリクスの回収方法は、図１に示されるように、細胞をアルギン酸ビーズにより包み込む第１のステップＳ１と、細胞を培養する第２のステップＳ２と、培養された細胞を洗浄する第３のステップＳ３と、アルギン酸ビーズを溶解する第４のステップＳ４と、溶解されたアルギン酸を除去する第５のステップＳ５とを備えている。
【００１１】
第１のステップＳ１は、２．５％アルギン酸溶液内に細胞を投入するステップと、細胞を投入したアルギン酸溶液を１．５％カルシウム液内に滴下するステップとを備えている。アルギン酸溶液内に投入した細胞を、アルギン酸溶液とともにカルシウム液内に滴下することにより、アルギン酸が硬化する。これにより、アルギン酸が細胞を包んだアルギン酸ビーズが構成される。
【００１２】
第２のステップＳ２は、第１のステップＳ１により構成された細胞入りのアルギン酸ビーズを所定の培地内に投入して所定の培養条件下に配することで培養する。
所定の培地は、例えば、ＤＭＥＭである。培地としては、目的に応じて血清濃度を増減したり、細胞外マトリクスの産生を促進するためにビタミンＣ等の栄養分を添加したりしてもよい。ＦＢＳ（ウシ胎児血清）等の血清にはタンパク質が含まれるので、血清濃度を低減することにより培地内に含有されるタンパク質の量を減らすことができる。所定の培養条件は、例えば、温度３６．５℃、ＣＯ２濃度５％である。培養期間は、例えば、２週間である。
【００１３】
第２のステップＳ２においては、細胞がアルギン酸ビーズにより被覆されているので、細胞が培養されることにより産生される細胞外マトリクスは、アルギン酸ビーズ内に捕らえられ、培地内に漏出することなく保持される。
【００１４】
第３のステップＳ３は、第２のステップＳ２において製造された細胞入りのアルギン酸ビーズを、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）により洗浄する。これにより、アルギン酸ビーズの外面に付着していた培地を除去することができる。
【００１５】
培地内には血清に含まれるタンパク質が存在しているので、これを除去することにより、回収される細胞外マトリクスの純度を向上することができる。また、細胞から産生された細胞外マトリクスはアルギン酸ビーズ内に保持されているので、アルギン酸ビーズ外面の洗浄によっても失われることなく、アルギン酸ビーズ内に保持される。
【００１６】
第４のステップＳ４は、第３のステップＳ３において洗浄された細胞入りのアルギン酸ビーズを、タンパク質を含まないクエン酸バッファ内に投入することにより溶解させる。
これにより、アルギン酸ビーズ内に保持されていた細胞および該細胞が産生した細胞外マトリクスがクエン酸バッファ内に流出する。
【００１７】
第５のステップＳ５は、第４のステップＳ４においてアルギン酸ビーズを溶解させたクエン酸バッファを、所定のフィルタに透過させることにより、あるいは、遠心分離にかけることにより、細胞および細胞外マトリクスとアルギン酸およびクエン酸バッファとに分離する。これにより、細胞および細胞外マトリクスを回収することができる。
【００１８】
このように、本実施形態に係る細胞外マトリクスの回収方法によれば、細胞から産生される細胞外マトリクスを培地内に流出させることなくアルギン酸ビーズ内に捕獲するので、培養工程、洗浄工程のいずれにおいても喪失されることがない。また、タンパク質を含まないクエン酸バッファ内に溶解させることにより、簡易かつ安価に回収することができる。その結果、細胞から産生される細胞外マトリクスを無駄なく簡易に高い純度で回収することができるという利点がある。
【００１９】
細胞外マトリクスとともに細胞を回収することにより、細胞内に含有されている細胞外マトリクスをも無駄なく回収することができる。
また、さらに遠心分離することにより、細胞を除去し、細胞外マトリクスのみを分離回収することとしてもよい。
【００２０】
なお、本実施形態においては、アルギン酸ビーズを溶解させるためにクエン酸バッファを使用したが、これに代えて、他の任意のカルシウムキレート材料を採用することにしてもよい。
また、細胞数が少ない場合には、第１のステップＳ１の前に、まず細胞を培養して増殖させ、細胞数を増やすステップを加えてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞外マトリクスの回収方法を示すフローチャートである。
【図１】
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