(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子工学的にγ-シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを製造し、使用する手段の提供。【解決手段】バシラス属由来γ-シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの特定のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用して主としてγ-シクロデキストリンを生成するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、及びこのタンパク質をコードするDNA。澱粉または澱粉分解物を含有する溶液に少なくとも上記タンパク質を反応させるα-、β-及びγ-シクロデキストリンを含有する組成物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表に示す配列番号２のアミノ酸番号１から７０２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用して主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項２】
配列表に示す配列番号２のアミノ酸番号２９から７０２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用して主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項３】
DNAがバチルス属細菌由来のDNAである請求項１又は２のいずれか１項に記載のDNA。
【請求項４】
バチルス属細菌がバチルスクラーキー７３６４株（FERM BP-7156）である請求項３記載のDNA。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のDNAを含有する組換えプラスミド。
【請求項６】
請求項５記載のプラスミドにより形質転換された形質転換体。
【請求項７】
請求項５記載のプラスミドにより形質転換された大腸菌である形質転換体。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の形質転換体を培養し、澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用して主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、澱粉並びにデキストリン、アミロペクチン及びアミロースのような澱粉分解物の中から選ばれた基質に作用し、γ-シクロデキストリン（γ-CD）を主生成物として生成させるシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えプラスミドとその形質転換体、該形質転換体を用いた、澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質に作用し、γ-シクロデキストリン（γ-CD）を主生成物として生成させるシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの製造方法、及び該組換えシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを用いたγ-シクロデキストリン（γ-CD）及び所望のCDバランス（α-、β-及びγ-CDバランス）を有するCD含有組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（CGTase； EC 2.4.1.19）は澱粉などのα-1,4-グルカンに作用し、その分子内転移活性により環状α-1,4-グルカンであるシクロデキストリン（CD）を生成させる酵素である。CGTaseにより生成されるCD の重合度は主として6 〜 8 であり、それぞれα-、β-及びγ-CDと呼ばれる。このCD生成反応とは別にCGTase は、分子間転移反応を通して、カップリング(Coupling)反応（CD を開環させ生じる直鎖オリコ゛糖を受容体糖分子に転移させる）や不均化(Disproportionation )反応（受容体糖分子に直鎖オリコ゛糖を転移させる）を触媒する。さらに、CGTaseは微弱ながらα-1,4-グルコシド結合の加水分解反応も触媒する。CD は多くの分子と包接物を作り、その化学的・物理的諸性質を変化させる事が可能である為、CGTase は食品、医薬、化粧品産業において重要な酵素として位置付けられている。その為、1939 年バシラス・マセランス(Bacillus macerans )酵素によるCD 合成反応に始り（E. B. Tilden and S. J. Pirt, J. Am. Chem. Soc., 63, 2900-2902, 1939）、その後、CGTase生産菌の検索や酵素の精製なども含め、多くの研究がなされてきた（Sumio Kitahata, Naoto Tsuyama and Shigetaka Okada, Agr. Biol. Chem., 38 (2), 387-393, 1974 、Sumio Kitahata and Shigetaka Okada, Agr. Biol. Chem., 38 (12), 2413-2417, 1974、Sumio Kitahata and Shigetaka Okada, J. Jap. Soc. Starch Sci., 29 (1), 13-18, 1982 、Michio Kubota, Yoshiki Matsuura, Shuzo Sakai and Yukiteru Katsube, Denpun Kagaku, 38  (2), 141-146, 1991、Lionel J. Bovetto, Daniel P. Backer, Jaques R. Villette, Philippe J. Sicard, and Stephane J-L. Bouquelet, Biotechnology and Applied Biochemstry, 15, 48-58, 1992、Shinske Fujiwara, Hirofumi Kakihara, Kim Myung Woo, Andre Lejeune, Mitsuhide Kanemoto, Keiji Sakaguchi, and Tadayuki Imanaka, Applied and environmental microbiology, 58 (12), 4016-4025, 1992 、Florian Binder, Otto Huber and August Bock, Gene, 47, 269-277, 1986、Keiji Kainuma, Toshiya Takano and Kunio Yamane, Appl. Microbiol. Biotechnol., 26, 149-153, 1987、Takahiro Kaneko, Tetsuo Hamamoto and Koki Horikoshi, J. general Microbiology, 134, 97-105, 1988、Murai Makela, Pekka Mattsson, M. Eugenia Schinina, and Timo Korpela, Biotechnology and Applied biochemistry, 10, 414-427, 1988、Ernest K. C. Yu, Hiroyuki Aoki, and Masanaru Misawa, Appl. Microbiol. Biotechnol., 28, 377-379, 1988）。
【０００３】
本CGTase はその合成する主CDの種類によってα-、β-CGTase及びγ-CGTaseとして分類される。過去に報告された多くはα-あるいはβ- CGTaseであり、γ-CGTase として報告されている酵素は数少ない（Shigeharu Mori, Susumu Hirose, Takaichi Oya, and Sumio Kitahata, Oyo Toshitsu Kagaku, 41 (2), 245-253, 1994、Yoshito Fujita, Hitoshi Tsubouchi, Yukio Inagi, Keiji Tomita, Akira Ozaki, and Kazuhiro Nakanishi, J. Fermentation and Bioengineering, 70 (3), 150-154, 1990、Takashi Kato and Koki Horikoshi, J. Jpn. Soc. Starch Sci., 33 (2), 137-143, 1986）。又、γ-CGTaseとして報告されている酵素においても、γ-CD生成量が5 % 以下であったり、反応後期にβ-CDの生成速度が加速され、γ-CDと同量若しくはそれ以上のβ-CDが生成したり、あるいは10 % 以上の基質濃度では著しくγ-CDの生産量が低下し、その対策として反応液中にエタノールを共存させる等と工業的に利用可能な酵素ではなかった。
【０００４】
一方、α-あるいはβ-CGTase の構造遺伝子を改変し、γ-CDの生成量を改善する試みも行われている（Akira Nakamura, Keiko Haga, and Kunio Yamane, Biochemstry, 32, 6624-6631, 1993、Michio Kubota, Yoshiki Matsuura, Shuzo Sakai and Yukiteru Kutsume, Oyo Toshitsu Kagaku, 41 (2), 245-253, 1994）。しかし、これもγ-CD生成量が増加しても元来の活性で生ずるβ-CDが顕著に減少せず、工業的観点から考えると充分とはいえなかった。それ故、α-CD及びβ-CDに関しては、各分野に利用されているが、γ-CDに関しては、ほとんど行われていない。CD含有含有組成物についても同様であり、α-あるいはβ-CDを主成分とするCD含有組成物は各分野に利用されているがγ-CDを主成分とするCD含有組成物の利用は少ない。CD含有組成物においては、それを調製する際用いるCGTaseがα-、β-あるいはγ-CGTaseによってそのCD組成が決定されてしまい、所望のCDバランスのCD含有組成物の調製は困難であった。
【０００５】
この様な状況に鑑み、本発明者等はバチルスクラーキー７３６４が、γ-CDを主生産物とする新規γ-CGTaseを生産する事を発見し、本酵素を利用したγ-CD及び所望のCDバランスのCD含有組成物製造方法を完成させ、先に特許出願した（特開2001-327299号公報、特開2001-327284号公報）。
【０００６】
しかしながら、これらの微生物は酵素生産性が充分とは言えず、γ-CD及び所望のCDバランスのCD含有組成物を工業スケールで調製しようとすると、微生物を大量に培養しなければならないという問題があった。この問題を解決するために従来は、微生物の酵素生産性を改善する為、野生株を紫外線、エックス線、NTG（N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン）やEMS（エチルメタンスルホネート）等の薬品を用いた煩雑な育種操作を行い、酵素生産性の向上した変異株を作製するといった手法が行われていた。更に、CGTaseを生産する微生物はCGTaseと同時に少量のα-アミラーゼを生産する場合が多い。このため、CGTaseを澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質に作用させ、γ-シクロデキストリン（γ-CD）を主生成物として生成させる際、粗酵素中に混在するα-アミラーゼによってγ-CDが加水分解される事によって、収量低下が起こる。この問題を解決する方法の一つとして、粗酵素を精製してアミラーゼを除くことが考えられるが、この場合は、酵素生産コストが高くなる問題が生じる。別の方法として、人工的な手法でアミラーゼ遺伝子の発現を抑制することによって、相対的にCGTase活性を増加させる方法が考えられる。しかしながら、本手法においても、アミラーゼ活性のみを選択的に抑制した変異株の取得は、困難な場合が多い。
【０００７】
一方、現在は、有用な酵素をコードする遺伝子を容易に取得する事が可能であり、本遺伝子を含む組換えDNAを作製し、微生物に導入する事で比較的容易に所望量の酵素が取得できるようになった。
【０００８】
かかる状況に鑑み、上記γ-CGTaseをコードする遺伝子を突き止め、その遺伝子配列を解析すること、遺伝子を組み込んだ形質転換体により酵素の生産性や活性を改善する事は重要な技術である。更に、遺伝子を取得できれば、変異体を作製する事により、活性の高い酵素を得る事ができ、更には蛋白質工学的手法を用いて、耐熱性、耐pH 性の向上、反応速度が増大された酵素を得る事も期待できる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明は、澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質に作用し、γ-シクロデキストリン（γ-CD）を主生成物として生成させるシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えプラスミドとその形質転換体、該形質転換体を用いた、澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質に作用し、γ-シクロデキストリン（γ-CD）を主生成物として生成させるシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの製造方法、及び該組換えシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを用いたγ-シクロデキストリン（γ-CD）及び所望のCDバランス（α-、β-及びγ-CDバランス）を有するCD含有組成物の製造方法を提供する事を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、γ-CDを主生産物とする新規γ-CGTaseを自然界より探索した結果、目的とするγ-CGTaseを好アルカリ性バチルス属細菌が産生する事を見出し（特開2001-327299号公報、特開2001-327284号公報）、澱粉腐敗液から分離した該好アルカリ性バチルス属細菌をバチルスクラーキ7364株と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM BP-7156として寄託している。
更に鋭意研究を重ねた結果、本菌株のγ-CGTase遺伝子を単離することに成功し、さらに大腸菌等の微生物での発現に成功した。本発明はそれらの知見に基づきて完成されたものである。
【００１１】
本発明は以下の通りである。
（請求項１）配列表に示す配列番号２のアミノ酸番号１から７０２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用して主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
（請求項２）配列表に示す配列番号２のアミノ酸番号２９から７０２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用して主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
（請求項３）DNAがバチルス属細菌由来のDNAである請求項１又は２のいずれか１項に記載のDNA。
（請求項４）バチルス属細菌がバチルスクラーキー７３６４株（FERM BP-7156）である請求項３記載のDNA。
（請求項５）請求項１から４のいずれか１項に記載のDNAを含有する組換えプラスミド。
（請求項６）請求項５記載のプラスミドにより形質転換された形質転換体。
（請求項７）請求項５記載のプラスミドにより形質転換された大腸菌である形質転換体。
（請求項８）請求項６又は７に記載の形質転換体を培養し、澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用して主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするタンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、本発明者等が見出した好アルカリ性バチルス属細菌、特にバチルスクラーキー７３６４由来のγ-CGTase遺伝子を基に、遺伝子工学的手法により、組換えγ-CGTase生産微生物を作製したものであって、これを培養すれば酵素の生産性の改善と不純物の少ないγ-CGTaseを産生させる事が可能になった点で、極めて優れている。又、本組換え酵素を工業的規模で生産することが可能になった結果、γ-シクロデキストリン（γ-CD）及び所望のCDバランス（α-、β-及びγ-CDバランス）を有するCD含有組成物の製造が飛躍的に効率よく製造する事ができる点においても、非常に価値がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
請求項１１に記載のタンパク質は、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から７０２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。さらに、請求項１１に記載のタンパク質は、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から７０２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用して主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質である。
請求項１２に記載のタンパク質は、配列表の配列番号２のアミノ酸番号２９から７０２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。さらに、請求項１２に記載のタンパク質は、配列表の配列番号２のアミノ酸番号２９から７０２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用し、主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質である。
配列番号２のアミノ酸において、アミノ酸番号1〜２８で示されるアミノ酸配列はシグナルペプチドに関するものであり、アミノ酸番号２９から７０２で示されるアミノ酸配列は、酵素（シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ）のタンパク質に関するものである。従って、請求項１１に記載のタンパク質は、シグナルペプチド及び酵素（シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ）のタンパク質を含み、請求項１２に記載のタンパク質は、酵素のタンパク質のみからなる。しかし、請求項１１に記載のタンパク質及び請求項１２に記載のタンパク質は、いずれも、澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用して主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有する。
また、請求項１１に記載のタンパク質及び請求項１２に記載のタンパク質は、それぞれ、１つ若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものであることもできる。アミノ酸の置換、欠失、挿入若しくは付加の箇所及びアミノ酸に特に制限はない。アミノ酸の置換、欠失、挿入若しくは付加が加わっても、澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用して主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であればよい。
尚、アミノ酸の挿入とは、所定のアミノ酸配列内への新たなアミノ酸の加入を意味し、アミノ酸の付加とは、所定のアミノ酸配列の外への新たなアミノ酸の加入（追加）を意味する。また、シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性(γ-シクロデキストリン生成活性、β-及びα-シクロデキストリンの生成活性)については後述する。
【００１４】
請求項１に記載のDNAは、請求項１１に記載のタンパク質をコードするDNAである。さらに、請求項２に記載のDNAは、請求項１２に記載のタンパク質をコードするDNAである。
【００１５】
請求項３に記載の配列表に示す配列番号１の321〜2426塩基の塩基配列を有するDNAは、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から７０２で示されるアミノ酸配列をコードし、請求項３に記載の配列表に示す配列番号１の405〜2426塩基の塩基配列を有するDNAは、配列表の配列番号２のアミノ酸番号２９から７０２で示されるアミノ酸配列をコードする。尚、シグナルペプチドに関するアミノ酸配列をコードするDNAは、配列表に示す配列番号１の321〜404塩基の塩基配列を有する。
【００１６】
請求項１３に記載のタンパク質は、請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNA と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAでコードされ、かつ澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用して主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であり、請求項４に記載のDNAは、請求項１３に記載のタンパク質をコードするDNAである。
【００１７】
本発明でいうストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、実施例に示したサザンハイブリダイゼーションの処理条件よりも強い条件でハイブリダイズする事を意味する。具体的には、実施例におけるハイブリダイズ溶液よりも構成成分の濃度が高いか、ハイブリダイゼーション温度が高いか、洗浄液の構成成分の濃度が低いか、洗浄液の温度が高いかの、いずれかの条件である場合をいう。
一般に、二本鎖のDNAは、熱やアルカリ処理によって水素結合が解離し一本鎖となり（変性）、徐々に温度を下げる事により次第に2本鎖のDNAに再生する。この変性再生はDNA2本鎖の相同性が高いほど、変性が起こりにくく、再生し易い。そこで、異なる2種類の２本鎖DNAが存在する時、変性を行い、その後、再生を行う事により異種のDNA同士は、配列間の相同性のレベルに依存して、2本鎖DNAを形成する。この方法により、異なるDNA間の相同性を調べる事をハイブリダイゼーション法と呼ぶ。本発明のDNA は、配列番号２のアミノ酸番号１から７０２で示されるアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸番号２９から７０２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列（該アミノ酸配列またはその１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列）をコードする遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するDNA(但し、澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用して主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAに限る)も包含する。この事は、ストリンジェントな条件下で行えば、γ-CGTase 構造遺伝子と相同性の高いDNAを効率よく選択でき、その中から、澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用して主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを、前記シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を常法により適宜選別することで、請求項4に記載のDNA及び請求項13に記載のタンパク質を得ることができる。
【００１８】
請求項１〜３に記載のDNAは、例えば、バチルス属細菌由来のDNAであることが出来、さらに、バチルス属細菌はバチルスクラーキー７３６４株（FERM BP-7156）であることができる。但し、請求項１〜３に記載のDNAであれば、起源に係わりなく本発明に含まれる。
【００１９】
さらに本発明は、請求項１から６のいずれか１項に記載のDNAを含有する組換えプラスミドを包含する。請求項１から６のいずれか１項に記載のDNAを含有させるためのベクターには特に制限はない。ベクターの種類やプロモーターの種類について後述する。上記ベクターへの請求項１から６のいずれか１項に記載のDNAの挿入は公知の方法で適宜行うことができる。
【００２０】
さらに本発明は、上記組換えプラスミドにより形質転換された形質転換体を包含する。
形質転換される菌体としては、例えば、大腸菌を例示することができる。大腸菌以外の宿主については後述する。上記菌体の形質転換は、公知の方法で適宜行うことができる。
【００２１】
さらに本発明は、上記本発明の形質転換体を培養する工程、並びに澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用して主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程を含むタンパク質の製造方法を包含する。形質転換体の培養方法は、形質転換体の元となる菌体の種類に応じて公知の方法で適宜行うことができる。また、タンパク質の採取も、常法を用いて行うことができる。採取されたタンパク質は適宜精製等に付されることもできる。
【００２２】
本発明の第1のCD組成物の製造方法では、澱粉、デキストリン、アミロペクチン及びアミロースからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する溶液(原料溶液)に本発明の組換えタンパク質であるCGTase並びにβ-及びα-シクロデキストリンの生成活性がγ-シクロデキストリンの生成活性と比較して高いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（具体的にはバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTase）を同時に反応させてα-CD、β-CD及びγ-CDを生成させる。
【００２３】
β-及びα-シクロデキストリンの生成活性がγ-シクロデキストリンの生成活性と比較して高いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼであるバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseについて以下に説明する。
本発明において、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseは、γ-CDに比べてα-及び/又はβ-CDを優先的に生成するCGTaseである。このようなバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseは、バチルス(Bacillus)属由来のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、クレブシエラ(klebsiella)属由来のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、サーモアナエロバクター(Thremoanaerobactor) 属由来のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、及びブレビバクテリウム(Brevibacterium)属由来のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくとも1種であることができる。そのようなCGTaseとしては、例えば、下記表１に示されたバチルスエスピー(B. sp.) AL-6、バチルスステアロサーモフィラス(B. stearothermophilus)、バチルスメガテリウム(B. megaterium)、バチルスサイクランス(B. circulans)、バチルスマセランス(B. macerans)を挙げることができる他、以下の表１に示されたバチルスオーベンシス(B.ohbensis)、クレブシエラニューモニア(Klebsiella pneumoniae)、サーモアナエロバクターエスピー(Thermoana erobactor sp.)、ブレビバクテリウムエスピー(Brevibacterium sp) No. 9605等を挙げることができる。
【００２４】
【表１】
2008099702.tif 000002
【００２５】
本発明の第1のCD組成物の製造方法では、原料溶液の濃度は、例えば、1〜30%の範囲とし、CGTaseをそれぞれ0.05〜300U（乾燥澱粉１ｇ当り）用い、4.5〜12のpH範囲、20〜75℃の温度にて１〜96時間酵素反応を行うことで、α-CD、β-CD及びγ-CDを含有する組成物を生成させることができる。
【００２６】
本発明の第2のCD組成物の製造方法では、澱粉、デキストリン、アミロペクチン及びアミロースからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する原料溶液に本発明の組換えタンパク質であるCGTaseを反応させ、次いでバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseを反応させてα-CD、β-CD及びγ-CDを生成させる。原料溶液の濃度は、例えば、1〜30%の範囲とし、原料溶液に本発明の組換えタンパク質であるCGTaseを0.05〜300U（乾燥澱粉１ｇ当り）加え、4.5〜12のpH範囲、20〜75℃の温度にて１〜96時間酵素反応を行う。次いで、反応液を加熱して本発明の組換えタンパク質であるCGTaseを失活させた後、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTase0.05〜300U（乾燥澱粉１ｇ当り）を反応液に加え、4.5〜12のpH範囲、20〜75℃の温度にて１〜96時間酵素反応を行うことで、α-CD、β-CD及びγ-CDを含有する組成物を生成させることができる。
【００２７】
本発明の第３のCD組成物の製造方法では、澱粉、デキストリン、アミロペクチン及びアミロースからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する原料溶液にバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseを反応させ、次いで本発明の組換えタンパク質であるCGTaseを反応させてα-CD、β-CD及びγ-CDを生成させる。
原料溶液の濃度は、例えば、1〜30%の範囲とし、原料溶液にバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseを0.05〜300U（乾燥澱粉１ｇ当り）加え、4.5〜12のpH範囲、20〜75℃の温度にて１〜96時間酵素反応を行う。次いで、反応液を加熱してバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseを失活させた後、本発明の組換えタンパク質であるCGTase0.05〜300U（乾燥澱粉１ｇ当り）を反応液に加え、4.5〜12のpH範囲、20〜75℃の温度にて１〜96時間酵素反応を行うことで、α-CD、β-CD及びγ-CDを含有する組成物を生成させることができる。
【００２８】
反応条件(酵素の使用量、反応時間、反応温度等)は、例えば、γ-シクロデキストリンの生成量を１としたときに、α-シクロデキストリンの生成量が0.1〜2の範囲となり、β-シクロデキストリンの生成量が0.1〜2の範囲となるように設定することができる。好ましくは、γ-シクロデキストリンの生成量を１としたときに、α-シクロデキストリンの生成量が0.1〜1の範囲となり、β-シクロデキストリンの生成量が0.1〜0.5の範囲となるように設定する。また、反応条件(酵素の使用量、反応時間、反応温度等)は、例えば、α-シクロデキストリンの生成量を１としたときに、β-シクロデキストリンの生成量が0.1〜1.5の範囲となり、γ-シクロデキストリンの生成量が0.1〜2の範囲となるように設定することもできる。好ましくは、α-シクロデキストリンの生成量を１としたときに、β-シクロデキストリンの生成量が0.3〜0.9の範囲となり、γ-シクロデキストリンの生成量が0.5〜1の範囲となるように設定する。
【００２９】
例えば、本発明の第1のCD組成物の製造方法では、本発明の組換えタンパク質であるCGTaseの使用量に対するバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseの使用量の比を変化させること、CGTaseの最適温度がCGTaseの種類により異なる場合、反応温度を、いずれかのCGTaseの最適温度に近づけることで、各CDの生成比を変化させることで、生成量の比を変化させることができる。
本発明の第2のCD組成物の製造方法では、本発明の組換えタンパク質であるCGTaseによるγ-シクロデキストリンを主成分とするCDsの生成条件(酵素の使用量、反応温度、反応時間)と、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseによるα-シクロデキストリン及び/又はβ-シクロデキストリンを主成分とするCDsの生成条件(酵素の使用量、反応温度、反応時間)とを変化させることで、生成量の比を変化させることができる。
本発明の第3のCD組成物の製造方法では、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseによるα-シクロデキストリン及び/又はβ-シクロデキストリンを主成分とするCDsの生成条件(酵素の使用量、反応温度、反応時間)と、本発明の組換えタンパク質であるCGTaseによるγ-シクロデキストリンを主成分とするCDsの生成条件(酵素の使用量、反応温度、反応時間)とを変化させることで、生成量の比を変化させることができる。
【００３０】
本発明のCD組成物の製造方法により得られるα-、β-及びγ-シクロデキストリンの混合物を含有する溶液は、さらに精製してシクロデキストリン混合物シラッフ゜とすることもできる。この精製は、通常の水飴やオリゴ糖シラッフ゜と同様の常法により行うことができる。例えば、この精製は、固形分を除去するための濾過、活性炭処理による脱色、イオン交換樹脂による脱塩を適宜組み合わせて行うことができる。また、本発明の製造方法により得られるα-、β-及びγ-シクロデキストリンを含有する組成物中には、α-，β-およびγ-CDなどの他に、ク゛ルコースなどの単糖類、各種オリコ゛糖(マルトースなど)或いはデキストリンなども含有している場合があり、これらを常法により適宜分離することもできる。
【００３１】
また、本発明の製造方法により得られるα-、β-及びγ-シクロデキストリンを含有する組成物を含有する溶液を上記のように精製してシクロデキストリン混合物シラッフ゜を得たのち、得られたシラッフ゜を乾燥してシクロデキストリン混合物粉末を得ることもできる。シラップの乾燥には、スプレードライ法や凍結乾燥法を用いることができる。乾燥法により、結晶状、凍結乾燥状、粉末状、顆粒状などの任意の形態とすることができる。
【００３２】
以下に本発明についてさらに詳細に説明する。
γ-CGTase 遺伝子
上述の様に、本発明によるγ-CGTase遺伝子は、澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質に作用し、γ-シクロデキストリン（γ-CD）を主生成物として生成させるシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA配列であり、γ-CGTaseの部分アミノ酸配列情報をもとに、当該酵素生産菌（バチルスクラーキー7364株）の染色体DNAを鋳型としたPCR法によって当該酵素をコードする遺伝子を取得する事に成功し、さらに大腸菌等の微生物での発現にも成功する事によって決定されたものである。
１）微生物の寄託
本発明の典型的な遺伝子を含むプラスミドpGFT-01（後記載する実施例参照）で形質転換された、本発明γ-CGTaseを著量に発現する大腸菌JM109は、ＧＣＧ３１と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM BP-7648として寄託している。
２）γ-CGTase の酵素学的性質
本発明は、本発明者等によるγ-CGTaseの発見に基づくものであるが、本酵素はバチルスクラーキ7364株から産生されたものであり、その酵素学性質は以下の通りであった（実施例１）。尚、γ-CD生成活性は以下の方法で測定した。
450 μlの1.5 % 可溶性澱粉溶液／25 mM Gly-NaCl-NaOH 緩衝液（pH 10.5）を40℃で保温し、適当に希釈した酵素溶液50 μl を添加することで反応を開始した。反応開始0,5,10,15,20,30 分後にそれぞれ500 μl の0.05 N HClを添加する事で反応を停止した。反応液に5 mM BCG溶液（in 20 % Ethanol） を添加混合後、20 分間室温で保持し、2 ml の１M BCG緩衝液（pH 4.2）を加え630 nm の吸光度を測定した。該吸光度値からあらかじめ作成した検量線を用いて反応液中のγ-CD含量を求めた。γ-CGTase サイクリック活性1 unitを上記反応条件で単位時間当りに1 μmolのγ-CDを生成させる酵素量と定義した。
ａ）BCG法によるγ-CGTase サイクリック活性の測定は、150 mgの可溶性澱粉を10 ml の所定pH 緩衝液（pH3-8: 1/4 × McIlvaine 緩衝液（図１中◆）、 pH8-10.5: 25 mM Gly-NaCl-NaOH緩衝液（図１中■）、 pH 10.5-11.9: 25 mM Na2HPO4-NaOH緩衝液（図１中■））に溶解し、その450 μl を基質溶液として用いた。その結果、BCG法によるサイクリック活性の至適pH は10.0-10.5であった（図１）。
【００３３】
ｂ）至適温度
BCG法によるγ-CGTase サイクリック活性の測定は、150 mgの可溶性澱粉を10 ml の 25 mM Gly-NaCl-NaOH緩衝液 （pH 10.0）に溶解し、その450 μl を基質溶液として用いた。所定温度で10 分間反応した。その結果、BCG法によるサイクリック活性の至適温度60 ℃であった（図2）。
ｃ）pH 安定性
BCG法によるγ-CGTase サイクリック活性の測定は、150 mgの可溶性澱粉を10 ml の 25 mM Gly-NaCl-NaOH緩衝液 （pH 10.0）に溶解し、その450 μl を基質溶液として用いた。酵素10 μlに所定のpHの緩衝液90 μlを添加し（a）至適pH 測定に用いた各pH 緩衝液を使用）、4 ℃で24時間放置後、25 mM Gly-NaCl-NaOH緩衝液（pH 10.0）100μl を添加し、その50μlを基質に加え反応を行なった。反応は40 ℃で20分間行なった。
pH 安定性は、pH 6から11まで安定であった（図３）。
【００３４】
ｄ）温度安定性
BCG法によるγ-CGTase サイクリック活性の測定は、150 mgの可溶性澱粉を10 ml の 25 mM Gly-NaCl-NaOH緩衝液 （pH 10.0）に溶解し、その450 μl を基質溶液として用いた。酵素10 μlに25 mM Gly-NaCl-NaOH緩衝液（pH 10.0）を90 μl加え、所定の温度で15分間保持後、その50μlを基質に加え反応を行なった。反応は40 ℃で10分間行なった。本酵素は50℃で15分間処理で、無処理の８０％以上の活性を示した（図4）。
ｅ）分子量
本酵素のSDS-PAGEにより、各種標準タンパク質との相対移動度から求めた分子量は６８KDaであった。
【００３５】
ｆ）等電点
等電点電気泳動により、各種標準タンパク質との相対移動度から求めた等電点は3.98であった。
ｇ）N末端アミノ酸配列
常法により、アプライド・バイオシステムズ製気相プロテインシーケンサー「４７７A型」を使用して分析を行ったところ、本酵素は、N末端に配列番号３に示すアミノ酸配列を有していた。
【００３６】
ｈ）内部アミノ酸配列
常法により、本酵素を断片化し、HPLC法により単離したペプチド断片のN末端配列をアプライド・バイオシステムズ製気相プロテインシーケンサー「４７７A型」を使用して分析を行ったところ配列番号４に示すアミノ酸配列を有していた。
【００３７】
３）γ-CGTase 遺伝子解析
バチルスクラーキ（Bacillus clrkii） 7364の染色体DNAを鋳型として、成熟酵素のN末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列から設計したプライマーを用いてPCR反応を行った。得られたPCRフラグメントは、γ-CGTaseのN末端から9番目のN以降をコードする1470 bpの遺伝子断片である事が判明した。次いで、染色体DNAを制限酵素Sac Iで完全分解した後、セルフリティゲーション（self-ligation）させて得られた環状DNAを鋳型として、1470 bpのPCRフラグメントの上流配列から設計したアンチセンスプライマー及び下流配列から設計したセンスプライマーヲ用いてinverse PCR反応を行い、目的酵素遺伝子の全塩基配列を決定した。
【００３８】
４）組換えγ-CGTase遺伝子の単離・同定
クローニングしたDNA 断片が目的γ-CGTase をコードする遺伝子である事を確認するため、Full F-primer : 5'-gACTTgTACTAAgACAACCTTACg-3' 及びFull R-primer : 5'-gCATCggCTCTACTCATTTCA-3'を用いて、染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、γ-CGTase の構造遺伝子、プロモター及び転写終結シグナルを含む2530 bp のPCRフラグメントを得た。次いで、該DNA断片をpGEM-T にligation し、大腸菌JM-109に挿入した。本形質転換大腸菌（pGFT-01/JM109） をLB 培地で16 時間培養後、菌体を破砕し、遠心分離によって不溶物を除去した上澄液はBCG、γ-CD サイクリック 活性で0.35 U/ml の活性を有している事を確認した。更に、本上澄液を粗酵素として、1% 可溶性澱粉（25 mM グリシン-NaCl-NaOH 緩衝液 pH 10）に作用させたところ、HPLCでγ-CDが主生成物であるCGTaseであることを確認した。
次いで、pGFT-01/JM109 をLB 培地で大量培養（600 ml）し、γ-CGTase の精製を行った。精製はγ-CD 結合アフィニティーカラム及びゲル濾過による2段階のプロセスで行い、SDS-PAGE でシングルバンドまで精製した。
本形質転換大腸菌（pGFT-01/JM109）が生産した酵素の諸性質を表２に纏めた。
【００３９】
【表２】
2008099702.tif 000003
【００４０】
本形質転換大腸菌が生産したγ-CGTaseのN末端配列を常法により、アプライド・バイオシステムズ製気相プロテインシーケンサー「４７７A型」を使用して分析を行ったところ、本酵素は、N末端に配列番号３に示すアミノ酸配列を有していた。
この組換え型γ-CGTaseの酵素学的特性はバチルスクラーキー7364由来のγ-CGTaseとほぼ一致した。従って、前述の組換えγ-CGTaseをコードするDNAはバチルスクラーキー7364由来のものであると判断した。
【００４１】
５）組換えγ-CGTaseをコードする遺伝子の発現／製造
a)発現ベクター
本発明によるγ-CGTaseをコードする断片を、宿主細胞内で複製可能であるか、あるいは染色体に組み込まれかつ同遺伝子が発現可能な状態で含むDNA分子、特に発現ベクターの形態として宿主細胞の形質転換を行えば、宿主細胞において本発明によるγ-CGTaseを産生する事ができる。従って、本発明によれば、本発明によるγ-CGTaseをコードする遺伝子を含んだDNA分子、特に発現ベクターが提供される。好ましくはこのベクターはプラスミドである。
【００４２】
本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞によってウイルス、プラスミド、コスミドベクター等から適宜選択可能である。例えば、宿主細胞が枯草菌の場合はｐUB系のプラスミド、大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、ｐBR322、BluesscriptIISK(+), pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pGEM-T pCR2.1, pLEX, pJL3, pSW1, pSE280, pSE420, pHY300PLK 等のプラスミドベクターが上げられるが、大腸菌で発現するには、ｐBR322、BluesscriptIISK(+), pGEM-T、pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pCR2.1が好適であり、枯草菌で発現するにはpHY300PLKが好適である。ｐBR、ｐUC系プラスミド、酵母の場合はYep,Ycp系、YIP系ベクターなどが挙げられる。このプラスミドは形質転換体の薬剤耐性や栄養要求マーカーなどの選択マーカーを含むものが好ましい。さらに、発現ベクターとしては、γ-CGTase遺伝子の発現に必要なプロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位、転写終結シグナルなどのDNA配列を有している事が好ましい。
【００４３】
プロモーターとしては、大腸菌においては一般に慣用されるlac、 trp、 tac、T7等のプロモーターが好ましく用いる事ができるし、野生株のγ-CGTaseの発現に使用されているプロモーターをそのまま用いても発現が可能である。配列番号２に示しているアミノ酸配列の１番から702番までの配列にはシグナルペプチドを含んでいるが、後記の実施例に示すようにこの配列をそのまま用いても構わない。又、枯草菌においては、キシロースオペロン、ズブチリシン、SPACなどのプロモーター、酵母ではADH、PHO、GAL、GAP等のプロモーターが好ましく用いる事ができる。
【００４４】
b)形質転換体／培養
宿主としては、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母などが挙げられ、形質転換体の培養条件でアミラーゼを産出しない物であれば良い。本発明によるCGTaseの製造方法は、上記形質転換細胞を培養し、この培養物中から、澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質に作用し、γ-シクロデキストリン（γ-CD）を主生成物として生成させるシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を採取する事を特徴とするものである。又、本発明による組換えγ-CGTaseは上記遺伝子の発現産物である。即ち、本発明によるγ-CGTaseは、配列番号２のアミノ酸番号１から７０２で示されるアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸番号２９から７０２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列（該アミノ酸配列またはその１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列）を有し、かつ例えば澱粉デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用し、γ-シクロデキストリン（γ-CD）を主生成物として生成させる（即ち、主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低い）シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質である。
【００４５】
本発明の形質転換体の培養に用いる栄養培地としては、炭素源、窒素源、無機物及び必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有する物であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。炭素源としては、グルコース、マルトースなどのマルトオリゴ糖、フラクトース、澱粉、デキストリン、グリセリンなどの炭化水素が挙げられる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、グルタミン酸などのアミノ酸、尿素などの無機窒素有機窒素化合物が用いられる。更に、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、CSL、大豆粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸などの窒素含有有機天然物も使用可能である。無機物としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等が用いられる。その他にビオチン、チアミン等の微量栄養素を必要に応じて使用する。培養法としては液体培養法がよく、工業的には通気攪拌培養法が適している。培養温度とpHは使用する形質転換体の増殖にもっとも適した条件を選べば良い。培養時間は培養時間によって変わってくるが、組換えγ-CGTaseの生成が確認された時、好ましくは生成量が最大に達した時に培養を停止する。この様にして得られた培養物から本発明の組換えγ-CGTaseを採取するには、先ず、培養液中の菌体を超音波などの物理的手法で破砕するか、有機溶剤やリゾチーム等の酵素によって細胞膜を溶菌した後、残査を遠心分離や濾過法によって除去する。これを限外膜濾過、塩析、溶剤沈澱法などの処理を行う事によって工業用用途の濃縮粗酵素液が調製できる。さらに、本濃縮酵素をγ-CDを固定化させたアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ケ゛ル濾過クロマトグラフィー、等の周知の単離精製方法を組み合わせる事により、容易に精製酵素標品を得る事ができる。
【００４６】
c)γ-シクロデキストリン（γ-CD）及び所望のCDバランス（α-、β  -及びγ-CDバランス）を有するCD含有組成物の製造方法
本発明によれば、上記のγ-CGTase を用いたγ-シクロデキストリン（γ-CD）及び所望のCDバランス（α-、β-及びγ-CDバランス）を有するCD含有組成物の製造方法が提供される。即ち、本発明方法によりCDを製造する為には、例えば、1〜30%の澱粉（澱粉又はその組成画分、加工澱粉などを含む）を含有する水溶液に本組換えγ-CGTase酵素液（精製酵素又は粗酵素）単独もしくは他起源の微生物が産生するCGTase（α-及びβ-CGTase）を0.1〜300U（乾燥澱粉１ｇ当り）併用添加し、pH4.5から12、温度20から60℃にて１〜96時間酵素反応を行う。尚、澱粉は必要に応じ、予め加熱し、液化処理を施して用いる。
【００４７】
上述のような方法で調製した糖類 (含有組成物)中には、α-，β-およびγ-CDなどの他に、グルコースなどの単糖類、各種オリゴ糖(マルトースなど)或いはデキストリンなども含有している場合がある。また、必要に応じて所望の単一重合度を有するCDを分離(結晶化、クロマト分画、酵母などによる醗酵処理及び酵素処理などによる)して用いることもできる。なお形態は、上述の方法で得られるような含有組成物状の他、結晶状、凍結乾燥状、粉末状、顆粒状などの任意の形態であることはいうまでもない。本発明によるCDは、これまで市販されているCDと同様に経口摂取可能な全ての飲食品、例えば、茶類、清涼飲料などの飲料類、キャンディー、ゼリー、和菓子などの和洋菓子類、ヨーグルト、アイスクリームなどの乳製品類、ハム、ソーゼージなどの畜肉加工品類、蒲鉾、なると等の水産加工品類や麺類、漬物類、その他調理済加工食品類やインスタント
食品類などに、香料などの安定化や乳化作用および賦形剤などとして添加・共存させ、安全な食品添加物であるCDを使用することにより、極めて簡便に且つ効果的に飲食品の嗜好性及び機能性を向上させるものである。また、飲食品のみならず医薬品や化粧料などの有効成分の安定化や乳化作用、賦形剤などとしても利用することが可能である。
【００４８】
本発明のCDの使用方法は、飲食品、医薬品や化粧料中にCDが共存する条件であれば特に限定されるものではない。例えば、CDを基礎となる飲食品素材加工中に同時に添加しても、或いは基礎飲食品加工終了後に添加してもよく、各種食品の製造工程の実状に適した添加方法を用いればよい。CDの添加量は、飲食品の場合、基礎となる飲食品本来の味質並びに風味を損なわない限り特に限定はないが、一般に20重量％以下の添加量で添加するのが好ましい。20重量％以上では、CDが有するマスキンク゛効果により、基礎となる飲食品の味質或いは風味を変えて、嗜好性を減じてしまう懸念があるので好ましくはない。医薬品や化粧料の場合には、有効成分の効果効能を損なわない限り特に限定はない。
【実施例】
【００４９】
以下に本発明の実施例を示すが、これは本発明を更に具体的に説明する為のものであり、本発明が以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
【００５０】
本酵素はバチルスクラーキ7364株から産生されたものであり、以下の方法で調製した。
バチルスクラーキ7364株(FERM BP-7156)を炭素源としてネオタック #30T（日本食品化工（株）製） 1.0 % (w/v)、窒素源としてソヤフラワーFT（日清製油製）0.5 %及び酵母エキス （Difco 製）0.5 %、K2HPO4 0.1 %、MgSO4・7H2O 0.02 %及びNa2CO3 0.8 % を含む液体培地で37 ℃、48 時間振とう培養するとその培養液中にCGTaseを分泌した（Blue value 法 20 U/ml 培養上澄）。
得られたCGTaseをアフィニティークロマトグラフィー法により精製した。
【００５１】
γ-CGTase活性は以下の方法でγ-CD生成活性（環状化活性）として測定した。
即ち、450 μlの1.5 % 可溶性澱粉溶液／25 mM Gly-NaCl-NaOH 緩衝液（pH 10.5）を40℃で保温し、適当に希釈した酵素溶液50 μl を添加することで反応を開始した。反応開始0,5,10,15,20,30 分後にそれぞれ500 μl の0.05 N HClを添加する事で反応を停止した。反応液に5 mM BCG溶液（in 20 % Ethanol） を添加混合後、20 分間室温で保持し、2 ml の１M BCG緩衝液（pH 4.2）を加え630 nm の吸光度を測定した。該吸光度値からあらかじめ作成した検量線を用いて反応液中のγ-CD含量を求めた。γ-CGTase サイクリック活性1 unitを上記反応条件で単位時間当りに1 μmolのγ-CDを生成させる酵素量と定義した。
【００５２】
（実施例１） 精製γ-CGTaseの酵素化学的特性
実施例1-1 精製酵素の調製
バチルスクラーキ7364株の培養及び該菌株の産生するγ-CGTaseの精製はアフィニティークロマトグラフィー法により行った。
【００５３】
実施例1-2 精製酵素の酵素学的特性
１）作用
可溶性澱粉を基質として、10 %(w/v) になるように50 mM グリシン-NaCl-NaOH  (pH 10.0) 緩衝液に溶解したものを基質溶液とした。基質溶液5 ml に上記精製酵素を0.5 U/g DSになるように添加し、50 ℃で48時間反応させた。反応生成物を特願2000-151056に記載したHPLC法で調べたところ、48 時間後ではγ-CD が9.7 %、α- 及びβ-CD はそれぞれ1.7及び0.9 % （HPLC area）生成した。
【００５４】
２）至適pH
BCG法によるγ-CGTase サイクリック活性の測定は、150 mgの可溶性澱粉を10 ml の所定pH 緩衝液（pH3-8: 1/4 × McIlvaine 緩衝液 pH8-10.5: 25 mM Gly-NaCl-NaOH緩衝液 pH 10.5-11.9: 25 mM Na2HPO4-NaOH緩衝液）に溶解し、その450 μl を基質溶液として用いた。その結果、BCG法によるサイクリック活性の至適pH は10.0-10.5であった（図１）。
【００５５】
３）至適温度
BCG法によるγ-CGTase サイクリック活性の測定は、150 mgの可溶性澱粉を10 ml の 25 mM Gly-NaCl-NaOH緩衝液 （pH 10.0）に溶解し、その450 μl を基質溶液として用いた。所定温度で10 分間反応した。その結果、BCG法によるサイクリック活性の至適温度60 ℃であった（図2）。
【００５６】
４） pH 安定性
BCG法によるγ-CGTase サイクリック活性の測定は、150 mgの可溶性澱粉を10 ml の 25 mM Gly-NaCl-NaOH緩衝液 （pH 10.0）に溶解し、その450 μl を基質溶液として用いた。酵素10 μlに所定のpHの緩衝液90 μlを添加し（a）至適pH 測定に用いた各pH 緩衝液を使用）、4 ℃で24時間放置後、25 mM Gly-NaCl-NaOH緩衝液（pH 10.0）100μl を添加し、その50μlを基質に加え反応を行なった。反応は40 ℃で20分間行なった。
pH 安定性は、pH 6から11まで安定であった（図３）。
【００５７】
５）温度安定性
BCG法によるγ-CGTase サイクリック活性の測定は、150 mgの可溶性澱粉を10 ml の 25 mM Gly-NaCl-NaOH緩衝液 （pH 10.0）に溶解し、その450 μl を基質溶液として用いた。酵素10 μlに25 mM Gly-NaCl-NaOH緩衝液（pH 10.0）を90 μl加え、所定の温度で15分間保持後、その50μlを基質に加え反応を行なった。反応は40 ℃で10分間行なった。本酵素は50℃で15分間処理で、無処理の８０％以上の活性を示した（図4）。
【００５８】
６）分子量
本酵素のSDS-PAGEにより、各種標準タンパク質との相対移動度から求めた分子量は６８KDaであった。
【００５９】
７）等電点
等電点電気泳動により、各種標準タンパク質との相対移動度から求めた等電点は3.98であった。
【００６０】
８） N末端アミノ酸配列
常法により、アプライド・バイオシステムズ製気相プロテインシーケンサー「４７７A型」を使用して分析を行ったところ、本酵素は、N末端に配列番号３に示すアミノ酸配列を有していた。
【００６１】
９）内部アミノ酸配列
常法により、本酵素を断片化し、HPLC法により単離したペプチド断片のN末端配列をアプライド・バイオシステムズ製気相プロテインシーケンサー「４７７A型」を使用して分析を行ったところ配列番号４に示すアミノ酸配列を有していた。
【００６２】
（実施例２）
実施例２−１ 染色体DNAの調製
バチルスクラーキ（Bacillus clarkii） 7364 の染色体DNAはN. Declerck等の報告（N. Declerck, P. Joyet, D. Le Coq and H. Heslot, J. Biotech., 8, 1998, 23-38）を参考に以下のように調製した。バチルスクラーキ（Bacillus clarkii） 7364株を酵素生産培地にて培養した培養液（40 ml）より遠心分離によって（8,000 rpm, 10 min）菌体を集めた。得られた菌体を5 ml のTESS緩衝液（30 mM Tris/HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 25 % sucrose）で2 回洗浄後、3 mlの同緩衝液に懸濁した。菌体懸濁液を65 ℃で10 分間処理し、37 ℃まで冷却した。リゾチーム水溶液（50 mg/ml）を1 ml 添加し、37 ℃で1時間反応した。次いで、プロテイナーゼ K を25 mg/ml になる水に溶解後、1 時間37 ℃で自己消化させその500 μl 添加し、同温度で2時間反応した。10 % SDS 1 mlを加え、65 ℃で10 分間処理する事で反応を停止した。反応液をTE 飽和フェノール及びフェノール/クロロフォルム（2 回）で処理し、エタノール沈澱によって回収した染色体DNAを1.2 ml のTEに溶解後、RNAase溶液（500 μg/ml）を10 μg/mlになるように添加し、37 ℃で2時間反応した。フェノール/クロロフォルム（2 回）で処理し、エタノール沈澱によって染色体DNAを回収した。本操作によって162 μgの染色体DNAを得た。
【００６３】
実施例２−２ γ-CGTase をコードするDNA断片の取得と塩基配列の決定
Plasmidsの調製、制限消化、ライゲーション及び大腸菌の形質転換は既報の方法に準じて行った（Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1982) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）。塩基配列の決定はベックマン・コールター（Beckman Coulter ）社のマルチキャピラリーDNA解析システムCEQ2000を用いたダイデオキシ・チェイン・ターミネーション（the dideoxy chain termination）法で行った。DNA鎖の塩基配列の決定及びコンピューター解析はGENETYX-WINを用いて行った。
γ-CGTaseをコードする遺伝子の部分断片は、染色体DNAを鋳型として、N-terminal F primer：5'-AAYgTIAAITAYgCIgARgARgT-3'及びDomain Cr primer：5'-gCRTCICCIggYTTICCCATDCC-3' を用いてPCRを行う事で調製した。これらプライマーは、N-terminal F primerについてはエドマン法で決定した成熟蛋白のN末端アミノ酸配列の内、9番目以降のN-V-N-Y-A-E-E、Domain Cr primer については成熟蛋白のプロテアーゼによるランダム分解より得られたペプチド
断片のN末端アミノ酸配列の一部PMGKPGDAに基づき設計した。以下にPCRの反応条件を纏めた。
【００６４】
【表３】
2008099702.tif 000004
【００６５】
上記反応液について、94 ℃で5 分間加熱した後、94 ℃で1分間、51 ℃で2 分間、72 ℃で3分間のサイクルを30回繰り返してから、最後に72 ℃で10分間保温した。本PCRによって得られた約1500 bp のフラグメントをT-ベクター pGEM-Tにライゲーション後、塩基配列を決定した。該塩基配列から推定されるアミノ酸配列中には、エドマン分析から得られたN末端アミノ酸配列（成熟酵素N末端アミノ酸配列及び酵素内部ペプチドN末端配列）と完全に一致する配列が認められ、更にアミラーゼファミリー酵素群のコンセンサス配列を見出す事ができた。そこで、該遺伝子断片はγ-CGTase成熟酵素蛋白のN末端から9番目以降をコードする1470 bpの断片であると断定した。
【００６６】
上記実施例で調製した染色体DNAを制限酵素Sac I, EcoRI、BamHI 等で完全消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。分離したDNA断片を常法によりナイロン膜に転写し、上記１４７０bpのフラグメントを得る際に行ったPCRにおいて、ｄNTPと１：１の割合でDig標識したｄNTPを混同し、同様の条件でPCRを行う事で調製したDig標識1470bp DNA断片を用いて、前述ナイロン膜に固定したDNA断片とサザンハイブリダイズさせた（Southern et al, J. Mol. Biol., 98, 503-517, 1975）。 条件は５× SSC、１％SDS、１０％デキストラン、０．５mg /ml サケ変性DNAからなる溶液中、６５℃で１６−２０時間ハイブリダイズを行い、その後、２× SSC、１％SDSからなる溶液中、６５℃で30分間3回洗浄した。その結果、SacIで消化したDNA断片の約２５００ｂｐの断片がハイブリダイズした。
【００６７】
次いで、該フラグメントの5'-及び3'-上流及び下流領域を取得するため以下の実験を行った。先ず、染色体DNAをSac Iで完全消化した後、消化物をモノメリックサークル（monomeric circles）が生成する様適当な条件下でT4DNA リガーゼを加え、16 ℃で一昼夜反応させた（消化染色体DNA 1μg、10 ×ライゲーション・バッファー 10 μl、T4 リガーゼ700 U／1 ml ）。得られたSac I-self-circulized DNA 分子を鋳型として、inverse anti primer：5'-gATCTgTTACAATATgATAAAT-3'及びinverse sense primer：5'-TTATTAGACggTCAATCGTTA-3' を用いてPCRを行った。これらプライマは、inverse anti primerについては前述1470 bpのフラグメントの5'-上流域から、inverse sense primerについては前述1470 bpフラグメント3'-下流の塩基配列に基づき設計した。以下にPCRの反応条件を纏めた。
【００６８】
【表４】
2008099702.tif 000005
【００６９】
上記反応液について、94 ℃で5 分間加熱した後、94 ℃で0.5分間、47 ℃で0.5 分間、72 ℃で0.5分間のサイクルを10回、94 ℃で0.5分間、50 ℃で0.5 分間、72 ℃で1分間のサイクルを10回、94 ℃で1分間、50 ℃で2 分間、72 ℃で3分間のサイクルを10回繰り返してから、最後に72 ℃で10分間保温した。本PCRによって得られた約2000 bp のフラグメントをT-ベクター pGEM-Tにligation後、塩基配列を決定した。その結果、γ-CGTase の残りのN末端配列及び開始コドン、リボソーム結合領域（RBS）及びプロモーター配列を含む約0.4 Kbp の上流域塩基配列及び残りのC末端領域及び終始コドン、inverted repeatを含む約0.2 Kbp の下流域の塩基配列を決定し、配列番号１に示す塩基配列が決定された。
【００７０】
実施例2-3 組換えプラスミドpGFT-01 及び大腸菌の形質転換
配列番号１ に示したγ-CGTase 遺伝子及びそのフランキング領域（Flanking region） を染色体DNAを鋳型として、Full F-primer : 5'-gACTTgTACTAAgACAACCTTACg-3' 及びFull R-primer : 5'-gCATCggCTCTACTCATTTCA-3'をprimerとしてPCRを行った。反応に用いたprimerは開始コドンから237 bp 上流配列及び終始コドンから77 bp下流の塩基配列から設計した。
以下にPCRの反応条件を纏めた。
【００７１】
【表５】
2008099702.tif 000006
【００７２】
上記反応液について、94 ℃で5 分間加熱した後、94 ℃で1.0分間、55 ℃で1.5 分間、72 ℃で3分間のサイクルを32回繰り返してから、最後に72 ℃で10分間保温した。
得られた約2.5 KbpのDNA断片をT-ベクター pGEM-Tにライゲーション及び大腸菌JM109へ挿入後、プラスミドｐGFT-01）を大量調製し、プライマーウォーキング（primer walking） 法によって全塩基配列の確認を行い、少なくとも配列番号１に示す塩基配列を有するDNAが含まれていることを確認した。
【００７３】
実施例３ 大腸菌が生産するγ-CGTaseの精製と酵素学的性質
pGFT-01/JM109 をLB 培地で大量培養（600 ml）し、γ-CGTase の精製を行った。精製は上記実施例１の方法に準じ、γ-CD 結合アフィニティーカラム及びゲル濾過による2段階のプロセスで精製が可能であり、SDS-PAGE でシングルバンドまで精製した。15.5mg(79.8U)のタンパク質が得られた(回収率73%)。
本形質転換大腸菌（pGFT-01/JM109）が生産した酵素の諸性質を表６に纏めた。
【００７４】
【表６】
2008099702.tif 000007
活性はいずれもBCG法で測定した。活性測定の諸条件は前述のとおりである。
バチルスクラーキ（B. clarkii）の生産する酵素(1)及び大腸菌生産酵素(2)のSDS-PAGEの結果を図5に示す。大腸菌生産酵素の諸性質は、バチルスクラーキ（B. clarkii）の生産する酵素とほぼ同様な諸性質を示した。
【００７５】
（実施例４）大腸菌が生産するγ-CGTaseを用いたCD含有組成物の調製（１）
コーンスターチを常法によりα−アミラーゼを用いて液化させ、濃度20重量％、グルコース当量７の澱粉液化液を調製した。次いでこの澱粉液化液をpH７に調整した後、実施例３記載の大腸菌産生γ-CGTaseをUF 濃縮膜（PM-10）を用いて濃縮したものを粗酵素液として、１単位/g基質添加し、55℃，48時間反応させた。その後、本反応液を加熱し酵素を失活させ、脱色、イオン交換などの精製を行いCDを含む含有組成物を調製した。その糖組成をHPLC 法で求めた。
【００７６】
【表７】
2008099702.tif 000008
【００７７】
（実施例 ５）大腸菌が生産するγ-CGTaseを用いたCD含有組成物の調製（２）
コーンスターチを常法によりα-アミラーゼを用いて液化させ、濃度10重量％、ク゛ルコース当量７の澱粉液化液を調製した。次いでこの澱粉液化液をpH 7に調整した後、実施例３記載の大腸菌産生γ-CGTaseをUF 濃縮膜（PM-10）を用いて濃縮したものを粗酵素液として2単位／ｇ基質添加し、55℃，48時間反応させた。その後、本反応液を90℃まで加熱し酵素を失活させ、75℃まで冷却後Bacillus属由来のCGTase(日本食品化工(株)製)を40単位／ｇ基質添加し、24時間反応させた。90℃まで加熱し酵素を失活させ、脱色、イオン交換などの精製を行いCDを含む含有組成物を調製した。その糖組成をHPLC 法で求めた。
【００７８】
【表８】
2008099702.tif 000009
【００７９】
（実施例 ６）
コーンスターチを常法によりα-アミラーゼを用いて液化させ、濃度10重量％、グルコース」当量７の澱粉液化液を調製した。次いでこの澱粉液化液をpH 7に調整した後、実施例３記載の大腸菌産生γ-CGTaseをUF 濃縮膜（PM-10）を用いて濃縮したものを粗酵素液として３単位／ｇ基質、および20単位／ｇ基質のBacillus属由来のCGTase(日本食品化工(株)製)を同時に添加し、55℃，72時間反応させた。その後、本反応液を90℃まで加熱し酵素を失活させ、脱色、イオン交換などの精製を行いCDを含む含有組成物を調製した。その糖組成をHPLC 法で求めた。
【００８０】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】BCG法によるγ-CGTase サイクリック活性に対するpH の影響。
【図２】BCG法によるγ-CGTase サイクリック活性に対する温度の影響。
【図３】BCG法によるγ-CGTase サイクリック活性に対するpH安定性。
【図４】BCG法によるγ-CGTase サイクリック活性に対する温度安定性。
【図５】バチルスクラーキ（B. clarkii）の生産する酵素及び大腸菌生産酵素のSDS-PAGEの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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