(57)【要約】【課題】リガンド結合分子の新規な溶出方法を提供することを目的とする。【解決手段】リガンドとリガンド結合分子とを結合反応させ、リガンドとリガンド結合分子との複合体を酵素分解に供し、切断することで、リガンドからリガンドに特異的に結合したリガンド結合分子を遊離し、溶出する。あるいは、リガンドと担体とを酵素分解可能なリンカーを介して連結したリガンド担持担体とリガンド結合分子とを結合反応させ、リガンド担持担体とリガンド結合分子との複合体を酵素分解に供し、切断することで、担体からリガンドとリガンド結合分子との複合体を遊離し、リガンドに特異的に結合したリガンド結合分子を溶出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドとリガンド結合分子とを結合反応させる工程と、
前記リガンドとリガンド結合分子との複合体を酵素分解に供する工程と、
前記リガンド結合分子を溶出する工程と、
を含み、前記酵素分解によりリガンドからリガンド結合分子を遊離することを特徴とする、リガンド結合分子の溶出方法。
【請求項２】
上記リガンドが担体に担持されていることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記担体が磁性ビーズであることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
上記リガンド結合分子がディスプレイライブラリーであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
リガンドと担体とを酵素分解可能なリンカーを介して連結したリガンド担持担体とリガンド結合分子とを結合反応させる工程と、
前記リガンド担持担体とリガンド結合分子との複合体を酵素分解に供する工程と、
前記リガンド結合分子を溶出する工程と、
を含み、前記酵素分解により前記担体からリガンドとリガンド結合分子との複合体を遊離することを特徴とする、リガンド結合分子の溶出方法。
【請求項６】
上記担体が磁性ビーズであることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
上記酵素分解可能なリンカーがDNA、RNA及びペプチドから成る群より選択されるものであることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項８】
上記リガンド結合分子がディスプレイライブラリーであることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンドに結合する分子の溶出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
＜従来のリガンド結合分子の溶出法＞
タンパク質の同定やファージディスプレイ法において、従来のリガンド結合分子の溶出法では、比較的強くリガンドに結合しているファージやタンパク質を回収するためには、SDS、尿素、グアニジンHCl、低pHなどの過激な条件が選択されている。
【０００３】
＜従来のリガンド結合分子溶出法の問題点＞
リガンドは、リガンドのみの担体として用いられることはなく、何らかの樹脂担体に担持させた状態で使用される。一般にファージディスプレイ法では、(1)様々なペプチド配列もしくはタンパク質をファージ粒子表面に提示したファージの集団、即ちライブラリーをリガンド担持担体と混合して結合反応を行い、(2)適当な条件で洗浄して非特異的に結合したファージを減少させ、(3)目的のリガンドに親和性を有するファージクローンを溶出する。樹脂担体により幅があるが、リガンドに強く結合したファージは、SDS、尿素、グアニジンHCl、低pHなどの強い条件によって溶出する。これらの強い条件での溶出の問題点として、ファージによってはこれらの処理によってダメージを受ける。またこの時に、リガンドではなく担体にも少なからずファージが非特異的吸着しており、強い条件での溶出により、リガンドではなく担体に非特異的に吸着していたファージも一緒に溶出されてノイズとなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述するように、従来のリガンド結合分子溶出法では、強い条件下での溶出により、例えば、ファージディスプレイ法では、リガンド結合分子であるペプチドを提示するファージがダメージを受ける場合がある。また、リガンドではなく担体へリガンド結合分子が非特異的に吸着し、ノイズとなるといった問題があった。即ち、ディスプレイライブラリーからのアフィニティーセレクション(ライブラリーからリガンドに対する結合活性を指標にクローンを選ぶプロセス)において、強い条件下で溶出する際に、クローンがダメージを受けること、リガンドではなく担体に結合したクローンがノイズとして溶出されてしまうといった問題があった。
【０００５】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、リガンド結合分子の新規な溶出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、リガンドとリガンド結合分子とを結合反応させ、リガンドとリガンド結合分子との複合体を酵素分解に供し、切断することで、リガンドからリガンドに特異的に結合したリガンド結合分子を遊離し、溶出できることを見出した。また、リガンドと担体とを酵素分解可能なリンカーを介して連結したリガンド担持担体とリガンド結合分子とを結合反応させ、リガンド担持担体とリガンド結合分子との複合体を酵素分解に供し、切断することで、担体からリガンドとリガンド結合分子との複合体を遊離し、リガンドに特異的に結合したリガンド結合分子を溶出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は以下を包含する。
（１）リガンドとリガンド結合分子とを結合反応させる工程と、前記リガンドとリガンド結合分子との複合体を酵素分解に供する工程と、前記リガンド結合分子を溶出する工程とを含み、前記酵素分解によりリガンドからリガンド結合分子を遊離することを特徴とする、リガンド結合分子の溶出方法。
（２）上記リガンドが担体に担持されていることを特徴とする、（１）記載の方法。
（３）上記担体が磁性ビーズであることを特徴とする、（２）記載の方法。
（４）上記リガンド結合分子がディスプレイライブラリーであることを特徴とする、（１）記載の方法。
（５）リガンドと担体とを酵素分解可能なリンカーを介して連結したリガンド担持担体とリガンド結合分子とを結合反応させる工程と、前記リガンド担持担体とリガンド結合分子との複合体を酵素分解に供する工程と、前記リガンド結合分子を溶出する工程とを含み、前記酵素分解により前記担体からリガンドとリガンド結合分子との複合体を遊離することを特徴とする、リガンド結合分子の溶出方法。
（６）上記担体が磁性ビーズであることを特徴とする、（５）記載の方法。
（７）上記酵素分解可能なリンカーがDNA、RNA及びペプチドから成る群より選択されるものであることを特徴とする、（５）記載の方法。
（８）上記リガンド結合分子がディスプレイライブラリーであることを特徴とする、（５）記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係るリガンド結合分子の溶出方法によれば、リガンドに結合したリガンド結合分子のみを特異的に溶出できる。また、ディスプレイライブラリーからのアフィニティーセレクションにおいて、従来の一般的な溶出方法に比べて、リガンドに結合したクローンを選択的に溶出可能となるので、洗浄回数の減少により弱い結合クローンも回収可能となる。さらに、洗浄に要する時間も短くなり、またノイズが減るためパンニング回数も少なくできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るリガンド結合分子の溶出方法(Reaping Elution method；以下では「RE法」という)は、リガンドとリガンド結合分子とを結合反応させ、リガンドとリガンド結合分子との複合体を酵素分解に供し、切断することで、リガンドからリガンドに特異的に結合したリガンド結合分子を遊離し、溶出する方法である(以下では、「RE法の第1実施形態」という)。また、RE法は、リガンドと担体とを酵素分解可能なリンカーを介して連結したリガンド担持担体とリガンド結合分子とを結合反応させ、リガンド担持担体とリガンド結合分子との複合体を酵素分解に供し、切断することで、担体からリガンドとリガンド結合分子との複合体を遊離し、リガンドに特異的に結合したリガンド結合分子を溶出する方法である(以下では、「RE法の第2実施形態」という)。
【００１０】
従来のリガンド結合分子の溶出方法(図１Ａ)では、例えば、ファージディスプレイ法において、バイオポリマー(リガンド)を担持した磁性ビーズとファージ(リガンド結合分子を提示)を結合反応させ、強い条件下での溶出(例えば、強い溶出剤の使用)により、ファージがダメージを受けたり、リガンドではなく担体(この場合には磁性ビーズ)に結合したクローンがノイズとして溶出されてしまう。一方、RE法(図１Ｂ)によれば、リガンド自体又は酵素分解可能なリンカーを加水分解酵素による酵素分解に供すること(図１Ｂでは、「はさみ」として表示)で、リガンド結合分子又はリガンドとリガンド結合分子との複合体を担体から遊離し、リガンド結合分子を溶出することができる。このように、RE法によれば、リガンドに結合したリガンド結合分子のみを特異的に溶出できる。
【００１１】
ここで、リガンドとは、広義的に、ある一定以上の結合親和性で特異的な分子(例えば、タンパク質やペプチド等)と結合する分子を指す。一方、リガンド結合分子とは、当該リガンドに結合する分子を意味する。即ち、相互作用(結合)する2つの分子について、一方をリガンドと規定した場合には、他方がリガンド結合分子となる。
【００１２】
RE法の第1実施形態では、リガンドが酵素分解の対象となる。従って、リガンドとしては、酵素分解を受ける分子であればよく、例えば、バイオポリマーを認識する遺伝子(又は当該遺伝子によりコードされるタンパク質やペプチド)を収集する場合に使用される、アミロース、セルロース、キシラン、キチン、マンナン、ガラクタン、DNA、RNA、ペプチド、ポリペプチド等のバイオポリマーが挙げられる。なお、リガンドとしては、オリゴマー等の多量体であってもよい。さらに、RE法の第1実施形態で使用される酵素は、それぞれのリガンドを基質とする酵素であり、例えば、アミロースにはアミラーゼ、セルロースにはセルラーゼ、キシランにはキシラナーゼ、キチンにはキチナーゼ、マンナンにはマンナーゼ、ガラクタンにはガラクトシダーゼ、DNAにはDNアーゼ又は制限酵素、RNAにはRNアーゼ、ペプチドやポリペプチドにはペプチダーゼが挙げられる。
【００１３】
RE法の第1実施形態では、リガンドが不溶性の場合には、そのまま固相として使用できる。その他の場合においては、リガンドは担体に担持される。担体としては、例えば、磁性ビーズ、アガロースビーズ、イムノビーズ及び親水性ビーズ等のビーズ、並びに酵素免疫測定法(EIA)用のプレート等が挙げられる。リガンドは、例えば担体表面に配したアミノ基、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基及びトシル基等の官能基を利用して、ケミカルクロスリンキングにより共有結合させ、担体に結合させる。
【００１４】
RE法の第1実施形態では、リガンド結合分子として、例えば、ディスプレイライブラリーを用いることができる。ディスプレイライブラリーとは、種々の発現タンパク質とそれらをコードする遺伝子を対応した状態で物理的に結合又は会合した増幅可能なユニットの集合体を指す。本明細書では、各ユニットをクローンと呼ぶ。これらの中から目的とするクローンを結合活性を指標に選び出し、同じクローンを増幅することができる。ユニットがファージであるファージディスプレイライブラリーはその典型例である。他にユニットとして、大腸菌(Lu Z.ら, Biotechnology13(4):366 (1995))や酵母(Shustra, E. V.ら, J. Mol. Biol. 292(5):949 (1999))等の細胞を用いて、細胞表面にディスプレイする手法(cell surface display)もある。他にファージや細胞を用いず、ユニットとしてPCR増幅可能なRNAやDNAを用いて、インビトロ発現させたタンパク質を用いる、リボソームディスプレイ法(Mattheakis, L. C.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:9022 (1994)、並びにLipovsek, D.及びPluckthun. A., J. Immun. Methods, 290:51 (2004))、mRNAディスプレイ法(Keefe, A. H.及びSzostack, J. W., Nature 410:715 (2001))、In vitro compartmentalization(IVC)法(Mastrobattista, E.ら, Chem. Biol. 12:1291 (2005))等がある。
【００１５】
RE法の第1実施形態では、先ずリガンド(又はリガンド担持担体)とリガンド結合分子とを結合反応させる。ここで、結合反応とは、リガンドとリガンド結合分子との親和的結合等によりリガンドとリガンド結合分子との複合体が生じる状態を意味する。結合反応条件は、使用するリガンドとリガンド結合分子に応じて適宜選択することができる。例えば、リガンド結合分子を得るためのスクリーニング対象としてファージディスプレイライブラリーを用いた場合には、以下の結合反応条件により結合反応を行うことができる。
【００１６】
結合反応溶液組成は、例えば、生化学実験で通常よく用いられるPBS (8g NaCl, 0.2g KCl, 2.68g Na2HPO4・7H2O, 2.4g KH2PO4/L, pH7.4)やTBS (10mM Tris-HCl, 150m NaCl pH7.5) などのpHが中性付近のリン酸バッファーに、界面活性剤として0.1％Tween-20を添加した溶液でよい。一般にpHは中性付近からはずれるほど、結合ファージは減少する。条件を絞るために、結合反応溶液のpHがpH3〜pH10の範囲のバッファーを選ぶことができる。一般に塩濃度は高いほど結合するファージクローンは減少する。条件を絞るために塩濃度は、0M〜3Mの範囲で選ぶことができる。ブロッキングの目的で、例えば0.1%〜5%のBSA（牛血清アルブミン）、0.1%〜5%のスキムミルク、0.1%〜10%のFBS(牛胎児血清)、又は1mg/ml〜100mg/mlの核酸溶液を添加してもよい。結合反応は、例えば、温度を室温とし、1時間〜12時間混合すればよい。結合反応の温度は、例えば候補を絞る目的のために、0℃から50℃までの範囲で選択してもよい。50℃以上はT7ファージは致死的であるが、1ラウンドの選択しか行わず、DNAを回収して用いる場合には致死的な50℃以上も結合反応条件とし得る。攪拌は、例えばプロペラ型インバージョン式のチューブミキサーなら60rpm〜180rpmの攪拌速度で、チューブスタンド型ミキサーなら、リガンド担持担体が沈殿しない程度に5分間に1回1分程度の間歇ミキシングすればよい。結合反応のリガンド担持担体密度は、例えばφ1μmのビーズであれば、109/ml程度、または1mg/mlでよい。リガンド担持担体密度を増せば親和性の低いファージクローン複合体も回収でき、密度を下げれば親和性の低いファージクローンの複合体は減少する。
【００１７】
次いで、結合反応後にリガンド担持担体に結合していない遊離ファージを除くために洗浄を行うことができる。洗浄は、例えば、結合反応に用いるバッファーと同様に、PBSやTBSに0.1％Tween-20を添加した溶液を用いて行うことができる。洗浄溶液の容量は、例えば、結合反応液容量の数倍以上を用いればよい。洗浄時間は、例えば1回5分で洗浄液を交換し、この操作を3回繰り返せばよい。なお、洗浄過程は省略することも可能である。洗浄の省略により、親和性の低いクローンあるいは親和性が高くとも複合体形成速度が高く解離速度が早いクローンが得られ易い。一方、洗浄時間や回数は更に増やすことも可能である。洗浄時間の延長は、親和性が高く、複合体解離速度が遅いクローンが得られ易くなる。
【００１８】
次に、RE法の第1実施形態では、得られたリガンドとリガンド結合分子との複合体を、リガンドを対象とする酵素分解に供し、切断(分解)する。酵素分解の条件(例えば、酵素量、温度、pH等)は、使用する酵素に応じて適宜決定することができる。
【００１９】
リガンド結合分子の溶出は、洗浄液と同じ組成の溶液を用いて行うことが望ましい。例えば、リガンド結合分子を得るためのスクリーニング対象としてファージディスプレイライブラリーを用いた場合には、バッファー組成の変化により、ディスプレイタンパク質以外のファージ外郭で結合したノイズファージが遊離する可能性があるためである。同じ理由により、溶出条件の温度も洗浄操作と同じであることが望ましい。溶出時間は、酵素分解してリガンド結合クローン(リガンド結合分子)が回収可能な範囲において、できる限り温和で短時間(例えば、5分くらい)が望ましい。時間の延長により、ノイズファージが遊離してくるためである。このようにして、リガンドに結合したリガンド結合分子をリガンド(又はリガンドと担体)から遊離することができる。
【００２０】
一方、RE法の第2実施形態では、リガンドとしては、例えば、抗原、抗体、サイトカイン、サイトカインレセプター、酵素阻害剤、阻害を受ける酵素、補酵素、酵素、酵素基質等が挙げられる。ほとんどどんな化合物に対しても結合タンパク質が存在することから、ほとんどどんな化合物でもリガンドになり得る。また、上述のRE法の第1実施形態において、リガンドとして列挙したバイオポリマー(例えば、アミロース、セルロース、キシラン、キチン、マンナン、ガラクタン、DNA、RNA、ペプチド、ポリペプチド等）やキシロースをリガンドとしてもよい。さらに、リガンド結合分子としては、RE法の第1実施形態と同様に、例えば、ディスプレイライブラリーが挙げられる。
【００２１】
また、酵素分解可能なリンカーと対応する酵素(リンカー/酵素)としては、例えば、アミロース/アミラーゼ、セルロース/セルラーゼ、キシラン/キシラナーゼ、キチン/キチナーゼ、マンナン/マンナーゼ、ガラクタン/ガラクトシダーゼ、DNA/DNアーゼ又は制限酵素、RNA/RNアーゼ、及びペプチド、ポリペプチド又はタンパク質/ペプチダーゼ(例えば、ファクターXa、エンテロキナーゼ、トロンビン、プロリルエンドペプチダーゼ、V8プロテアーゼ)が挙げられる。なお、DNAやRNAを酵素分解可能なリンカーとして用いる場合には、1本鎖でも2本鎖でもよい。
【００２２】
さらに、RE法の第2実施形態で使用する担体としては、上述のRE法の第1実施形態で列挙したものが挙げられる。
【００２３】
RE法の第2実施形態では、先ず、リガンドと担体とを酵素分解可能なリンカーを介して連結し、リガンド担持担体を作製する。リガンドと酵素分解可能なリンカーとの間及び担体と酵素分解可能なリンカーとの間の結合は、RE法の第1実施形態におけるリガンドと担体との間の結合方法に準じて行うことができる。
【００２４】
次いで、RE法の第2実施形態では、RE法の第1実施形態に準じて、リガンド担持担体とリガンド結合分子とを結合反応させた後、洗浄し、リガンド担持担体上のリガンドとリガンド結合分子との結合により生じる複合体を得る。次いで、得られた複合体を、酵素分解可能なリンカーを対象とする酵素分解に供し、溶出し、リガンドとリガンド結合分子との複合体を遊離する。さらに固液分離によりリガンド結合分子の回収を行う。
【００２５】
具体的に、図１Ｃには、RE法の汎用化(第2実施形態)として、リガンドとしてベイトリガンド(例えば、高親和性阻害剤)、酵素分解可能なリンカーとして合成DNA及び担体としてエポキシ磁性ビーズを用いた場合を示す。合成DNAは、一方の末端をエポキシ磁性ビーズと連結するためにアミノ化し、他方の末端をベイトリガンドと連結するためにSH2基を有するようにする。次いで、これらベイトリガンド、合成DNA及びエポキシ磁性ビーズを連結する。さらに、得られた合成DNAを介して連結したベイトリガンド担持磁性ビーズとリガンド結合分子である標的酵素やタンパク質とを結合反応させ、当該磁性ビーズ上のベイトリガンドに標的酵素やタンパク質を結合させる。さらに、DNアーゼにより合成DNAを切断することで、ベイトリガンドに結合した標的酵素やタンパク質を磁性ビーズから遊離し、溶出することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２７】
〔実施例１〕アミロース結合クローン収集(RE法の第1実施形態)
1-1．アミロースビーズによるパンニング
森林性土壌より抽出、精製したDNA(メタゲノム)とT7SELCT 10-3b(NOVAGEN)を用いて、メタゲノムをソースとしたファージディスプレイライブラリー(FRTL17)を作製した(国際公開第2005/121336号パンフレット）。
【００２８】
使用直前に、マニュアルに従いIPTGで誘導をかけて調製した宿主大腸菌BLT5615(5ml)に対して、FRTL17 P2(2回増幅）溶菌液を50μl感染し、L培地で37℃で2時間培養して溶菌させた。
【００２９】
遠心した溶菌液上清を限外濾過遠心ユニット、アミコンYM-100を用いて、4mlのPBST(PBS+0.1％ Tween20)で3回洗浄して培地除去を行うと共に、5倍濃縮した。このファージ液(リガンド結合分子)100μlに100μgのアミロース磁性ビーズ(New England Biolabs No.E8035S)(リガンド担持担体：当該アミロース磁性ビーズでは、アミロース(リガンド)と磁性ビーズ(担体)とをアルファアミラーゼによって切断可能)を添加して、4℃で16時間混合した。上清を捨て400μlのPBSTで4回、400μlのPBSで1回洗浄した。このビーズに2.2μgのBacillus licheniformisアルファアミラーゼ(Sigma No.A4551)を含む100μlのPBSを添加して混合し、室温で5分置いた。放置後、上清を回収し、1ラウンド目の溶出液とした。
【００３０】
次いで、1ラウンド目の溶出液50μlを、IPTGで誘導をかけて調製した宿主大腸菌BLT5615(1ml)に感染し、37℃で培養して溶菌した。溶菌後、遠心して回収した上清の培地を前述と同様にして、PBSTに置換すると共に5倍濃縮した(1ラウンド終了)。このような操作を4ラウンド繰り返した。
【００３１】
ファージタイター(濃度)はNovagenのマニュアルに従い測定した。溶出液ファージタイターは、1ラウンド目は105/mlであったのに対し、4ラウンド目では108/mlに増加した。
【００３２】
1-2．エンリッチメントされたDNAのモニタリング
上記1-1において得られた各ラウンドの増幅後の5倍濃縮溶菌液100μlに、10％SDSを25μl添加し、70℃で10分保温した。次に100μlのTE(10mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA)飽和フェノールと25μlのクロロホルムを添加して1分間混合した。
【００３３】
15000rpmで1分遠心後、水層を回収し、1/10容の酢酸ナトリウムと2μlの20mg/mlグリコーゲンを添加して混合した。さらに、2.5容のエタノールを添加し、DNA沈殿を15000rpmで10分遠心して回収し、20μlのTEに溶解した。これをPCRの鋳型DNAとして、反応液20〜30μl当たり1μl使用した。
【００３４】
PCRは、酵素と反応液にEx-Taq(TAKARA)を用い、またプライマーとしてT7UP及びT7Down(Novagen)を0.2μMで使用した。プログラムは、96℃で2分を1サイクル、94℃で30秒、55℃で30秒及び72℃で90秒のサイクルを38サイクル、並びに72℃で5分を1サイクルで行った。
【００３５】
PCR終了後の反応液7μlをアガロース電気泳動で分析した。結果を図２に示す。図２は、アミロース磁性ビーズをRE法で用いた場合の各ラウンドの増幅後のインサートPCR解析結果（アガロース電気泳動パターン）を示す。数字はラウンド数を示し、Mはサイズマーカーである。
【００３６】
図２に示すように、ラウンドが進むに連れて特定のDNA断片がエンリッチ(S/N比の上昇)されていることが分かった。パンニング中の洗浄回数を3回にした場合にはより多くのDNA断片がエンリッチされたパターンが得られた。
【００３７】
1-3．収集されたDNA配列の解析
上記1-1において得られた4ラウンド目の溶出液を適当に希釈し、Novagenのマニュアルに従い宿主菌とソフトアーガーにプレーティングし、プラークを形成させた。次に、20余りのプラークからプラークPCRを行い、増幅されたDNA断片の配列を調べ、コードされているアミノ酸配列の相同性解析を行った。結果を表１及び図３Ａ〜Ｅに示す。表１は、アミロース磁性ビーズでRE法により回収されたDNA断片によりコードされるアミノ酸配列の相同性解析の結果である。図３Ａ〜Ｅは、表１の5クローンの各アミノ酸配列(配列番号１〜５)の相同性解析の結果のアラインメントを示す。また、図３Ａ〜Ｅにおいて、Query配列が得られたDNA断片によりコードされるアミノ酸配列であり、一方、Sbjct配列がヒットしたタンパク質のアミノ酸配列である。
【００３８】
【表１】
2008169119.tif 000002
【００３９】
その結果、表１及び図３Ａ〜Ｅに示すような糖の加水分解や修飾を行う酵素と明らかな相同性が認められた。以上の結果から、RE法により、ノイズが少なく、効率よく糖の加水分解又は転移を触媒する酵素遺伝子断片が収集できた。
【００４０】
〔実施例２〕ビオチン酵素断片クローンのエンリッチメント効率の比較(RE法の第2実施形態)
2-1．DNAスペーサー(酵素分解可能なリンカー)のビーズ(担体)への結合
以下の配列の相補的な24量体の5'末端アミノ化オリゴDNAと5’末端ビオチン化オリゴDNAを下記条件でアニーリングした。
5'末端アミノ化オリゴDNA：5'NH2-GCTGCAAGCTTTGAATTCGGATCC (SigmaGenosys：配列番号６)
5'末端ビオチン化オリゴDNA：5'Biotin-GGATCCGAATTCAAAGCTTGCAGC (SigmaGenosys：配列番号７)
【００４１】
各オリゴDNAを0.2mMとなるようにPBSに溶解して、等量混合した後、95℃で5分間置き、そのまま冷却せず、90℃にして20時間かけて30℃まで徐冷した。一部をポリアクリルアミド電気泳動して、90％以上が移動度の遅れから2重鎖となったと判断した。
【００４２】
次いで、アニーリングしたオリゴDNA溶液、3M (NH4)2SO4及び40mM炭酸バッファー(pH10.8)を各60μl混合し、更に3mgの磁性ビーズ(Dnynabeads M270-Eppoxy (Dynal))と37℃で16時間混合した。未反応のエポキシ基をブロックするために、1M Tris-HCl (pH 8.0)を400μl添加し、37℃で1時間混合した。
【００４３】
1時間の混合後、マグネットで分離して上清を除去し、400μlのTEでビーズを3回洗浄した。このビオチン化DNAビーズは使用するまでTE中で4℃で保存した。
【００４４】
2-2．ストレプトアビジンビーズ(リガンド担持担体)の調製
上記2-1で得られたビオチン化DNAビーズ1mgに、180μl(1mg/ml PBS)のストレプトアビジン(PIERCE)(リガンド)を添加し、4℃で一夜混合した。一夜の混合後、上清を除去し、400μlのPBST(PBS+0.1％Tween20)でビーズを3回洗浄し、使用するまでPBST中で4℃で保存した。
【００４５】
2-3．エンリッチメントファクターの測定
T7ファージクローン1SASD34は、提示部分におよそ76アミノ酸から成るビオチン酵素断片を保有し、ストレプトアビジンと結合するクローンである（特願2005-283992号）。
【００４６】
そこで、上記2-2で得られたビーズ200μgに、1x109個の野生型T7ファージとこの1/250量の1SASD34ファージ（ビオチン酵素遺伝子:リガンド結合分子）の混合物を200μl（PBST）添加し、23℃で1時間混合した。
【００４７】
1時間の混合後、上清を除去し、400μlのPBSTで5分3回洗浄した。3回目の洗浄中に洗浄液（ビーズ懸濁液）400μlを2等分して別チューブに移し、上清を除いた。一方には100μlの1％SDS、他方には100μlのDNaseI溶液(TKARA DNase I 700 U/ml PBS+5mM MnCl2)を添加混合し、23℃で5分置いた後、上清を回収した。
【００４８】
各々のファージタイターをソフトアーガー法でNovagenのマニュアルに従って測定した結果、1％SDS溶出液は0個/ml、DNaseI溶出液は1.5x104/mlであった。前者の条件ではSDSによりファージがダメージを受けたと考えられる。後者のプレートをアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンによってアフィニティー染色（特願2005-283992号）した結果、70プラーク中、60プラーク(85％)が陽性であった。この条件におけるエンリッチメントファクター(濃縮率)は212(0.4％→85％)となった。
【００４９】
以上のように、RE法により、1％SDSによる溶出より効率よく結合ファージを回収できた。
【００５０】
〔実施例３〕土壌メタゲノムからのRE法によるビオチン酵素遺伝子断片の回収(RE法の第2実施形態)
250μlの5xFRTL17P2/PBST(リガンド結合分子)と上記実施例２の2-2で得られたビーズ(リガンド担持担体)100μgを4℃で一夜混合し、実施例１と同様にして400μlのPBSTで5分3回の洗浄を行った。このビーズを100μlのDNaseI溶液で5分処理して回収したファージを大腸菌BLT5615に感染して増幅し、2ラウンドのパンニングを行った。
【００５１】
2ラウンド目で回収された溶出液をプレーティングし、プラークを形成させ、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを用いてアフィニティー染色(特願2005-283992号)した。結果を図４に示す。図４は、2ラウンド目の陽性プラーク染色パターンを示す。
【００５２】
図４に示すように、その結果、8.4％のプラークが染色された。さらに、対応するプラークをチップで回収し、Novagenのマニュアルに従ってプラークPCRを行い、増幅されたDNA断片の塩基配列を調べた。図５は、それぞれの陽性クローンにおける、増幅されたDNA断片の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列のアラインメントを示す。なお、図５において、四角で囲った「B」はビオチン結合アミノ酸位置を示す。
【００５３】
図５に示すように、いずれも新規なビオチン酵素遺伝子断片のビオチン結合部位を有していることが分かった。即ち、2回のスクリーニングだけでも新規なビオチン酵素断片が容易に10種以上収集できた。
【００５４】
以上の結果から、メタゲノムからRE法により効率よく、目的遺伝子断片が濃縮、回収された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
RE法は、ファージディスプレイ法やインビトロディスプレイ法によるインヒビター、酵素遺伝子クローニング、薬物標的同定に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１Ａ】図１Ａは、従来の溶出方法を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、RE法を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、RE法の汎用化を示す。
【図２】図２は、アミロース磁性ビーズをRE法で用いた場合の各ラウンドの増幅後のインサートPCR解析結果（アガロース電気泳動パターン）を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、表１のクローン(No.1)のアミノ酸配列(配列番号１)の相同性解析の結果のアラインメントを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、表１のクローン(No.2)のアミノ酸配列(配列番号２)の相同性解析の結果のアラインメントを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、表１のクローン(No.3)のアミノ酸配列(配列番号３)の相同性解析の結果のアラインメントを示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、表１のクローン(No.4)のアミノ酸配列(配列番号４)の相同性解析の結果のアラインメントを示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、表１のクローン(No.5)のアミノ酸配列(配列番号５)の相同性解析の結果のアラインメントを示す。
【図４】図４は、土壌メタゲノムからRE法でビオチン酵素遺伝子断片取得のためのバイオパンニング、2ラウンド目の陽性プラークのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンによる染色パターンを示す。
【図５】図５は、図４で得たそれぞれの陽性クローンにおける、増幅されたDNA断片の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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