(57)【要約】      （修正有）【課題】高い代謝能やインスリン反応性を有する高度発達型培養筋細胞を、より生体に近似な状態で効率的に作製し、その高い収縮活動を長期間にわたり持続させる方法、及び、任意の人為的刺激に伴う収縮活動依存的な筋発達過程やインスリン反応性上昇をはじめとする糖代謝環境変化の測定方法等を提供する。【解決手段】（１）筋芽細胞をフィーダー細胞上で培養する工程、（２）筋芽細胞を高アミノ酸含有培地で筋管細胞に分化誘導させる工程、及び（３）分化誘導した筋管細胞に電気パルス刺激を与える工程、から成る筋管細胞の作製方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）筋芽細胞をフィーダー細胞上で培養する工程、（２）筋芽細胞を高アミノ酸含有培地で筋管細胞に分化誘導させる工程、及び（３）分化誘導した筋管細胞に電気パルス刺激を与える工程、から成る筋管細胞の作製方法。
【請求項２】
高アミノ酸含有培地に含まれる各アミノ酸の含量が表１に示された範囲にある、請求項１記載の作製方法。
【請求項３】
電気パルス刺激が10〜50V、0.001〜4Hz、1〜24msパルス幅にて0.5〜120時間与えられる、請求項１又は２記載の作製方法。
【請求項４】
電気パルス刺激が20〜40V、0.1〜1Hz、1〜24msパルス幅にて2〜24時間与えられる、請求項３記載の作製方法。
【請求項５】
少なくとも工程（３）を高酸素分圧状態の培地を用いて行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項６】
高酸素分圧状態が高酸素濃度ガスを培地に溶解させることにより得られるものである、請求項５記載の作製方法。
【請求項７】
工程（１）が１〜６日間、及び工程（２）が３〜１２日間行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項８】
弾性基体上で細胞を培養する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項９】
弾性基体が予め細胞接着因子で処理されている、請求項８に記載の作製方法。
【請求項１０】
細胞接着因子で予め処理された弾性半透膜から成る底部を有するインサートチャンバー内で細胞を培養し、上下方向に対向して設置された電極によって電気パルス刺激が与えられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項１１】
筋芽細胞が、野生型筋芽細胞と、細胞外部位に標識物質を有する組換え型GLUT4を構成的に発現する組換え型筋芽細胞を含むことを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項１２】
組換え型筋芽細胞が外来刺激依存的な組換え型GLUT4の膜移行活性を有する、請求項１１記載の作製方法。
【請求項１３】
組換え型GLUT4の細胞内部位に更に標識物質が結合している、請求項１１又は１２記載の作製方法。
【請求項１４】
標識物質が抗原エピトープである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項１５】
フィーダー細胞に予め分化誘導処理を施す、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項１６】
フィーダー細胞がNIH-3T3-L1線維芽細胞であり、筋芽細胞がマウス筋芽細胞株C2C12である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の作製方法で得られる分化型培養筋管細胞。
【請求項１８】
請求１７に記載の筋管細胞を用いるインスリン依存的な糖取り込み能の測定方法であって、インスリンを含有する培地で培養することによりインスリン刺激を与えた後、該培地に更に糖を添加して培養し、その後に糖取り込み能を測定することを特徴とする、前記測定方法。
【請求項１９】
請求１７に記載の筋管細胞用いる組換え型GLUT4の膜移行活性の測定方法であって、該細胞を固定した後、該細胞膜上に存在する組換え型GLUT4の細胞外部位の標識物質の量を測定することから成る、前記方法。
【請求項２０】
請求１７に記載の筋管細胞用いる組換え型GLUT4の膜移行活性の測定方法であって、該細胞膜上に存在する組換え型GLUT4及び該細胞膜上に移行した後に再び細胞内に取り込まれた組換え型GLUT4の細胞外部位の標識物質の量を測定することから成る、前記方法。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の測定方法を利用する筋肉を標的とした薬剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い収縮活動能力および高い代謝能を有する長期培養可能な筋管細胞をフィーダー細胞上で作製する方法、該方法で得られる分化型培養筋管細胞及び、フィーダー細胞混在化における筋管細胞の刺激反応性活動の選択的測定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋肉の運動すなわち筋細胞の収縮伸展活動は、大きなエネルギー消費に加え、メカニカルな刺激を伴う。そして、生体内ではこの両者の複合的な刺激がインスリンに良く反応する「健康な筋細胞」を作り上げている。そして、健康な筋細胞では、インスリンや運動刺激によく反応する糖の取り込み亢進がみられる。しかし、２型糖尿病を患ったような状態ではこのインスリン反応性は減弱し、いわゆるインスリン抵抗性が惹起される。そして、適度な運動刺激は、このインスリン抵抗性を効果的に改善することが知られている。
【０００３】
このようなインスリン抵抗性を効果的に改善する為の薬剤を研究するために、生体を模した優れた培養細胞系は薬剤のスクリーニングに非常に大きな戦力となる。しかしながら、収縮伸展するという筋細胞の特性を考慮した培養筋細胞系はこれまでにあまり作製されておらず、通常の培養条件で得られる培養筋細胞はほとんど収縮能力が発達していない。そのため、このような培養筋細胞は高い代謝能を有するに至らず、生体の筋を模しているとは言い難い。
【０００４】
更に、従来に技術においては、ある程度までその活動能力を発達させても、獲得した収縮能力により培養皿から剥離する問題点があり、高度発達型培養筋細胞の収縮活動能力を十分に鍛えることができなかった。また、高度発達化した筋管細胞を長期間維持することも難しかった。
【０００５】
非特許文献１には、筋芽細胞をフィーダー細胞上で培養することにより筋細胞の発達とその収縮活動維持に効果的であることが報告されているが、この方法では初代培養線維芽細胞をフィーダー細胞が用いられている。結果、上部に培養された筋管細胞は電気パルス刺激なしに自発的に収縮を開始し、サルコメア構造を形成するとしている。
【０００６】
しかし、非特許文献１に記載された方法では、筋は電気パルス刺激なしにサルコメア構造を形成し、その収縮活動を人為的にオンオフやその強度をコントロールすることが困難であるため、収縮依存的な筋発達度やインスリン反応性獲得過程を評価する目的には全く適していない。
【０００７】
一方、特許文献１には、筋芽細胞にパルス波による電気刺激を与えて自動収縮能を有する筋細胞を得る方法が記載されている。又、特許文献２には、上下方向の電流を流す細胞培養措置及び細胞培養方法が記載されている。
【０００８】
しかしながら、これらに記載の細胞培養方法でも未だ取り込み測定等の代謝能の研究に適した筋細胞を作製することに成功してはいない。又、従来の代謝能の測定条件は培養筋細胞に適したものではなかった。
【０００９】
更に、フィーダー細胞の存在下、すなわち異種の細胞が混在する共培養系において、筋細胞のみの代謝能やインスリン反応性だけを選択的に評価することは難しく、一般的な生化学的評価方法では、フィーダー細胞と筋細胞との総和としての反応しかとらえることができない。このため、共培養系においては、筋細胞に対する薬剤の効果などを選択的かつ正確に評価することができない。
【００１０】
培養細胞の生物反応を選択的に評価するために、各種のリポーター遺伝子を利用する方法がある。リポーター遺伝子は各種の遺伝子導入方法（リポソーム法、ウイルス法、エレクトロポレーション法）により目的の細胞へと導入される。しかしながら、上記のいずれの方法においても、異種細胞が混在する共培養系において筋細胞にのみ選択的にリポーター遺伝子を導入することができない。そのため、筋細胞の発するインスリン反応性などの生物反応だけを共培養下から抽出することが困難である。
【００１１】
これまでに、分化を誘導することによって互いに細胞融合する性質を有する骨格筋系培養筋細胞では、レポーター遺伝子などを恒常的に発現する筋芽細胞と野生型の筋芽細胞を特定の割合で混合培養して分化を誘導することにより、任意の遺伝子を筋管細胞へ導入できることが知られている（非特許文献２）。
【非特許文献１】Cell Motility and the Cytoskeleton 58: 200-211, 2004
【非特許文献２】American Journal Physiology Endocrinology & Metabolism 291:817-828,2006
【特許文献１】特開２００５−２７５０１
【特許文献２】特開２００３−２２５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、上記従来技術における課題を解決することである。即ち、本発明の目的は、高い代謝能やインスリン反応性を有する高度発達型培養筋細胞を、より生体に近似な状態で効率的に作製し、その高い収縮活動を長期間にわたり持続させる方法を提供することである。また、任意の人為的刺激に伴う収縮活動依存的な筋発達過程やインスリン反応性上昇をはじめとする糖代謝環境変化の測定を可能とすることである。更に、異種細胞の存在下においても、その高度発達型培養筋細胞のみの代謝能を選択的に測定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は鋭意研究の結果、適当なフィーダー細胞上で筋芽細胞を培養し、更に適切な電気パルスを付与しながら分化誘導することにより格段に効率よく高度発達化を促すことができ、長期間にわたりその収縮活動刺激を負荷でき、筋発達度ならびにインスリン反応性に対する運動効果の評価に適した生体に近似な高度発達型培養筋細胞を作製することが可能であることを見いだし、本発明を完成した。
【００１４】
即ち、本発明は以下の態様にかかる。
［態様１］（１）筋芽細胞をフィーダー細胞上で培養する工程、（２）筋芽細胞を高アミノ酸含有培地で筋管細胞に分化誘導させる工程、及び（３）分化誘導した筋管細胞に電気パルス刺激を与える工程、から成る筋管細胞の作製方法。
［態様２］高アミノ酸含有培地に含まれる各アミノ酸の含量が表１に示された範囲にある、態様１記載の作製方法。
［態様３］電気パルス刺激が10〜50V、0.001〜4Hz、1〜24msパルス幅にて0.5〜120時間与えられる、態様１又は２記載の作製方法。
［態様４］電気パルス刺激が20〜40V、0.1〜1Hz、1〜24msパルス幅にて2〜24時間与えられる、態様３記載の作製方法。
［態様５］少なくとも工程（３）を高酸素分圧状態の培地を用いて行う、態様１〜４のいずれか一項に記載の作製方法。
［態様６］高酸素分圧状態が高酸素濃度ガスを培地に溶解させることにより得られるものである、態様５記載の作製方法。
［態様７］工程（１）が１〜６日間、及び工程（２）が３〜１２日間行われる、態様１〜６のいずれか一項に記載の作製方法。
［態様８］弾性基体上で細胞を培養する、態様１〜７のいずれか一項に記載の作製方法。
［態様９］弾性基体が予め細胞接着因子で処理されている、態様８に記載の作製方法。
［態様１０］細胞接着因子で予め処理された弾性半透膜から成る底部を有するインサートチャンバー内で細胞を培養し、上下方向に対向して設置された電極によって電気パルス刺激が与えられる、態様１〜９のいずれか一項に記載の作製方法。
［態様１１］筋芽細胞が、野生型筋芽細胞と、細胞外部位に標識物質を有する組換え型GLUT4を構成的に発現する組換え型筋芽細胞を含むことを特徴とする、態様１ないし１０のいずれか一項に記載の作製方法。
［態様１２］組換え型筋芽細胞が外来刺激依存的な組換え型GLUT4の膜移行活性を有する、態様１１記載の作製方法。
［態様１３］組換え型GLUT4の細胞内部位に更に標識物質が結合している、態様１１又は１２記載の作製方法。
［態様１４］標識物質が抗原エピトープである、態様１１〜１３のいずれか一項に記載の作製方法。
［態様１５］フィーダー細胞に予め分化誘導処理を施す、態様１〜１４のいずれか一項に記載の作製方法。
［態様１６］フィーダー細胞がNIH-3T3-L1線維芽細胞であり、筋芽細胞がマウス筋芽細胞株C2C12である、態様１〜１５のいずれか一項に記載の作製方法。
［態様１７］態様１〜１６のいずれか一項に記載の作製方法で得られる分化型培養筋管細胞。
［態様１８］請求１７に記載の筋管細胞を用いるインスリン依存的な糖取り込み能の測定方法であって、インスリンを含有する培地で培養することによりインスリン刺激を与えた後、該培地に更に糖を添加して培養し、その後に糖取り込み能を測定することを特徴とする、前記測定方法。
［態様１９］請求１７に記載の筋管細胞用いる組換え型GLUT4の膜移行活性の測定方法であって、該細胞を固定した後、該細胞膜上に存在する組換え型GLUT4の細胞外部位の標識物質の量を測定することから成る、前記方法。
［態様２０］請求１７に記載の筋管細胞用いる組換え型GLUT4の膜移行活性の測定方法であって、該細胞膜上に存在する組換え型GLUT4及び該細胞膜上に移行した後に再び細胞内に取り込まれた組換え型GLUT4の細胞外部位の標識物質の量を測定することから成る、前記方法。
［態様２１］態様１８〜２０のいずれか一項に記載の測定方法を利用する筋肉を標的とした薬剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明方法で作製された筋管細胞は従来の方法に比べより筋構造が発達した肥大した筋管細胞を形成しており、その筋構造の発達の程度は非常に優れたものである。また、筋構造の発達や収縮活動は、電気パルス刺激により任意にコントロールできる。
【００１６】
更に、従来は長時間の電気パルス刺激を付与することは細胞が基底面から剥離するために不可能であったが、本発明はその問題点を解決する方法を提供する。すなわち、筋形成過程を従来の方法（2時間程度で剥離がはじまる）より、さらに長時間（〜48時間以上たってもほとんど剥離は見られない）ため、あらゆる発達程度の筋細胞の機能を調べることができる。このことは、上記筋細胞を標的とした様々な薬剤のスクリーニングする条件を飛躍的に広く取りうることを意味している。
【００１７】
又、本発明の選択的測定方法を使用することによって、この糖代謝の指標となるGLUT4の膜移行活性が、本発明で得られた筋管細胞では、従来の細胞に比べ促進されていることが測定できる。又、従来よりも長期間にわたり筋管細胞の運動を負荷して鍛えることができ、筋細胞の更なる肥大とエネルギー代謝能の亢進を促すことが出来る。
【００１８】
従って、本発明方法によって、収縮および代謝能の両面において、従来と比較して遙かに高度に発達した培養筋細胞を作製し、さらに鍛錬が可能で、かつ該細胞を用いてその代謝能を高感度で選択的に評価できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
［分化型培養筋管細胞の作製］
本発明の筋管細胞の作製方法において「筋芽細胞」は当業者に公知の任意のものを使用することができる。由来する動物の種類又は組織等に特に制限はないが、ヒトを含む霊長類、マウス及びラット等の哺乳類細胞が好ましく、又、骨格筋、平滑筋及び心筋等に由来するもので良い。
【００２０】
更に、「筋芽細胞」として細胞株化された任意の細胞を使用することも出来る。このような細胞株の例として、マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２（ATCC No. CRL1772）、ラット骨格筋由来の筋芽細胞株Ｌ６（ATCC No.CRL1458）及びラット心筋芽細胞株Ｈ９Ｃ２（ATCC No.CRL1446）などを挙げることが出来る。
【００２１】
培養に使用される培地は細胞の種類等に応じて、公知の任意の種類から当業者が適宜選択することが出来る。例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）及び最小必須培地（ＭＥＭ培地）等を挙げることが出来る。更にこれらの培地には、細胞の分化誘導を阻害しない範囲で、細胞の増殖を促進する等の目的で、各種因子、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、アルブミン、トランスフェリン、ホルモン、細胞成長因子、ビタミン等を適宜含有させることが出来る。
【００２２】
通常、播種細胞数１〜１０ｘ１０4個／ウェル程度、湿度１００％、培養温度３７℃、培地のｐＨ7.2〜7.4程度で培養を実施するが、その他の培養条件は通常の範囲で当業者が適宜決めることが出来る。
【００２３】
本発明の筋管細胞の作製方法において、第一段階の筋芽細胞をフィーダー細胞上で培養する段階は、まず、適当な基体上に適当数のフィーダー細胞を播種し、これをほぼコンフルエントな状態になるまで培養し、その後に、該フィーダー細胞上に筋芽細胞を播種し、通常、１〜６日間程度、好ましくは、筋芽細胞が増殖してコンフルエント（培養容器表面全体に密になった状態）になるまで培養する。例えば、筋芽細胞株を１〜６日程度、10〜20%ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ培地にて密になるまで培養する。
【００２４】
フィーダー細胞としては、当業者に公知の適当な細胞を適宜選択して使用することができるが、実施例に示すように、NIH-3T3L1線維芽細胞を用いるのが好ましい。更に、このようなフィーダー細胞に、予め、適当量のインスリン、デキサメサゾン、及び／又はイソブチル−１−メチルキサンチンのような当業者に公知の適当な化合物を用いる１〜数日間の分化誘導処理等の前処理を施すことにより、本発明方法において、フィーダー細胞としてより優れた効果を奏することが出来る。或いは、遺伝子改変型の線維芽細胞をフィーダー細胞として使用することも可能である。
【００２５】
第ニ工程及び第三工程で使用する培地は高アミノ酸含有培地である。その結果、分化誘導が促進され、電気パルス刺激による収縮活動に伴う培養細胞の疲労を除去することが出来る。高アミノ酸含有培地に含まれる各アミノ酸の含量(mg/l)は、通常の培地に含まれる量の約２〜５倍の必須アミノ酸ならびに、通常の培地に含まれない非必須アミノ酸（L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-プロリン）を添加したものに相当し、代表的な例を以下の表１に示す。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
筋芽細胞の分化誘導効果を促進するために、少なくとも第三工程で使用する培地を高酸素分圧状態にすることが好ましい。更に、全ての工程で使用する培地を高酸素分圧状態にすることがより好ましい。かかる高酸素分圧状態は、例えば、使用する前に、培地に高酸素濃度ガス（９５％酸素、５％二酸化炭素）を適当時間吹き込むことによって、酸素を十分に溶解させることにより得ることが出来る。或いは、本発明方法を高酸素濃度ガス雰囲気下で実施することによっても培地の高酸素分圧状態を達成することが出来る。又、筋管形成を促進させるための栄養源の補給及び老廃物の除去を目的とした培地交換は適当な間隔（例えば、１２〜２４時間おき）に実施することが好ましい。
【００２８】
又、第二工程及び第三工程で使用する培地に添加されるウシ血清濃度は比較的低いことが好ましく、例えば、1〜5%の範囲である。更に、栄養補強の目的で適当量（0.5〜10 g/l）のグルコース等の糖を添加することが出来る。又、筋細胞の分化およびインスリン反応性に大きく影響を与える各種物質、例えば、アスコルビン酸、レチノイン酸、K252a(チロシンキナーゼの活性を修飾する薬剤)、PPAR(peroxisome proliferater-activated receptors)群のアゴニスト・アンタゴニスト等も添加することが出来る。
【００２９】
第二工程は、通常、３〜１２日間行われ、筋芽細胞を筋菅細胞に分化誘導させる。第三工程は、分化誘導した筋菅細胞に電気パルス刺激を与える段階であり、かかる電気パルス刺激は、好ましくは、10〜50V、0.001〜10Hz、1〜24msパルス幅にて0.5〜120時間、更に好ましくは、20〜40V、0.1〜4Hz、1〜24msパルス幅にて2〜24時間与えられる。この電気刺激により、細胞の膜電位依存性チャンネルを活性化し、筋細胞のサルコメア構造を発達させる。さらに、同時に収縮活動を促進させてエネルギー消費量を高める。尚、このような電気パルスを発生させる装置自体は当業者に公知である。尚、電気刺激は水平方向又は垂直方向にかけることができるが、電気刺激を垂直方向にかける本発明の上下対向電極型電気パルス刺激負荷培養装置を用いることによって、得られた筋菅細胞をその後のシステム、例えば、薬剤の活性評価系等へと簡便に移行させることが可能となる。
【００３０】
尚、電気パルス刺激前あるいは刺激中にマトリゲル・コラーゲン・エラスチン等の細胞外マトリックスを保護する物質やクレアチンやカルニチン等のエネルギー源となる物質を添加することができる。
【００３１】
分化誘導の過程で筋細胞の収縮力が増加するために、培養中に自らの収縮活動により細胞が培養面から剥離する可能性がある。そこで、これを防ぐ為に、弾性基体上で細胞を培養することが好ましい。この基体は、筋細胞の増殖に悪影響を与えないようなものであれば当業者に公知の任意の材質、例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)、ポリエチレンテレフタレート、及び、マトリゲル等を使用することが出来る。更に、培養後の操作性を考慮して、基体は半透膜のような液体成分が透過できるような形態とすることが好ましい。
【００３２】
更に、筋細胞の分化誘導と細胞接着を促進させるために、コラーゲン、フィブロネクチン、及びエラスチン等の当業者に公知の細胞接着因子（細胞外基質）、徐放性の分化誘導促進因子、薬剤、および栄養素等で基体を予め処理することが好ましい。これは、当業者に公知の任意の手段、例えば、該基体をこのような各物質を含む溶液に浸すことでこれらの物質を基体表面へと予め吸着させる等の手段によって実施することが出来る。尚、この溶液に含まれる上記各物質の割合及び濃度等は、培養細胞の種類、培地の種類、弾性基体の材質等に応じて当業者が適宜選択することが出来、その結果、細胞が接着する基体表面に適度な弾性を持たせることができる。
【００３３】
［複数種類の筋芽細胞から成る混合培養系］
本発明方法において、更に、筋芽細胞として、複数種類の筋芽細胞を使用してこれらを混合培養することが可能である。例えば、野生型筋芽細胞と、細胞外部位に標識物質を有する組換え型GLUT4を構成的に発現する組換え型筋芽細胞を混合培養することができる。
【００３４】
このような混合培養によって、細胞外部位に標識物質を有する組換え型GLUT4を構成的に発現するものであり、又、外来刺激依存的な組換え型GLUT4の膜移行活性を有する分化型培養筋管細胞を作製することができる。
【００３５】
細胞外部位に標識物質を有する組換え型GLUT4を構成的に発現する組換え型筋芽細胞は、例えば、非特許文献２に記載の方法に準じて調製することが出来る。ここで、標識物質としては、タンパク質の標識するための物質として当業者に公知の任意の物質、例えば、myc, flag, HAおよびxpress等の「抗原エピトープ（アミノ酸配列）」として知られている物質、及び、「enhanced cyan fluorescent protein (ECFP)」のような各種の蛍光タンパク質を含む。
【００３６】
該標識物質をコードする塩基配列をGLUT4遺伝子の適当な部位に挿入して組換え遺伝子を作成する。このような部位としては、GLUT4が細胞膜上に移行した際に細胞外部に露出する部分、例えば、Ｎ末端からみて第一番目及び二番目の貫通部位の間の細胞外露出部位等に相当する塩基配列が好適である。こうして得られた組換え遺伝子を適当なベクターに連結して得られる発現ベクターで筋芽細胞を形質転換することによって、このような標識物質を有する組換え型GLUT4を構成的に発現する、組換え型筋芽細胞を作成することが出来る。尚、「構成的に発現する」とは、挿入遺伝子が「構成的プロモーター」の調節下にあり、特に細胞外からの刺激がない状態で、実質的に恒常的に一定量の遺伝子産物が産生されることを意味する。
【００３７】
尚、組換え型GLUT4には、細胞外部位に加えて、細胞内部位に更に標識物質が結合していても良い。こうすることによって、組換え型GLUT4の細胞内における発現効率（細胞毎に発現量及び発現している細胞数）を視覚的に簡便に確認することが出来る。更に、細胞外部位と細胞内部位に結合させた標識物質が異なる場合には、例えば、夫々の標識物質に対する異なる抗体を使用することによって、細胞膜上に存在する組換え型GLUT4と細胞内に存在する組換え型GLUT4の量を個別に測定することが可能となる。尚、標識物質が結合させるGLUT4の細胞内部位としては、例えば、Ｃ末端の細胞内部位を挙げることが出来る。従って、このような場合には、GLUT4遺伝子の３‘末端に該標識物質をコードする塩基配列を誘導させた組換え遺伝子を作成することにより、細胞内部位に標識物質を結合させることができる。
【００３８】
野生型筋芽細胞と、細胞外部位に標識物質を有する組換え型GLUT4の他に、更に、他のタンパク質を発現する外来性遺伝子が導入されている組換え型筋芽細胞を加えて混合培養することも可能である。その結果、複数種類の任意のタンパク質が共発現される分化型培養筋管細胞を容易に作成することが出来る。
【００３９】
野生型筋芽細胞と組換え型筋芽細胞との混合培養における細胞数の比は、筋芽細胞の種類、最終的に得られる分化型培養筋管細胞での組換えタンパク質の発現量等の諸条件に応じて、適宜選択することができるが、通常、100:1〜1:100の割合である。
【００４０】
尚、筋発達程度の測定には従来の生化学的・細胞生物学的手法など、当業者が適宜決めることが出来る。好ましくは、抗サルコメリックアルファアクチニン抗体、抗ミオシン抗体、抗F-アクチン抗体あるいはファロイジン染色などを用いた細胞免疫染色法を実施する。
【００４１】
［インスリン依存的な糖取り込み能の測定方法］
筋細胞の代謝能、特に、糖の取り込み活性は、培養液中の糖の濃度に依存して敏感に変化してしまう、という問題点がある。本発明の測定方法においては、筋管細胞の代謝能の評価を行う際に、従来の反応液（Krebs-Ringer Phosphate Buffer HEPES:KRPH）に適当量（例えば、1〜1000nM程度）のインスリンを含有する培地で適当な時間（例えば、５〜２０分間）培養することによりインスリン刺激を与えた後、適当量（例えば、１０〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３５ｍＭ、特に２５ｍＭ前後）の糖（例えば、グルコース）を添加し、更に一定時間（１０〜５０分間程度）培養し、その後に測定することにより、上記問題点が解決される。即ち、本発明の測定方法は、基底状態の糖取り込み量が減少し、インスリン依存的な糖取り込みが極めてよく評価できる系であることが確認された。即ち、生体の筋で観察されるインスリン反応性が、本発明の測定方法によって再現できることが示された。更に、代謝反応に必須である酸素を十分に供給するため、測定段階において、既に記載の方法によって富酸素状態にした培地及び反応液を用いることが好ましい。従って、代謝能の評価は、従来の２−デオキシグルコースの取り込み方法（Kanzaki M and Pessin JE, J Biol Chem, 2001年、第276巻（45号）, 42436-42444頁）に上記の点を改変したものを用いる。
【００４２】
［組換え型GLUT4の膜移行活性の測定方法］
本発明の測定方法は、上記の分化型培養筋管細胞を用いて、組換え型GLUT4の膜移行活性を測定するものである。具体的には、例えば、該細胞を固定した後、細胞膜上に存在する組換え型GLUT4の細胞外部位の標識物質の量、即ち、組換え型GLUT4の細胞膜への移行量、を測定することから成る。この場合には、ある時点で細胞膜上に存在する組換え型GLUT4の量を測定することになる。この方法では、例えば、当業者に公知の方法により、該標識物質に対する抗体を用いた免疫染色法により標識物質の量を測定することが出来る。より具体的には、ローダミンなどの蛍光色素を結合させた二次抗体を反応させて、その蛍光量を共焦点顕微鏡など使用して測定する。
【００４３】
更に、分化型培養筋管細胞として、ヒト以外の動物（例えば、マウス及びラット等の齧歯類）体内に移植し、生着し一定期間経過した後に、再び取り出した該細胞を固定して以後の測定に使用することによって、生体内環境下での膜移行活性を測定することも可能となる。
【００４４】
外来の刺激などによって細胞膜上に移行したGLUT4は、その後、エンドサイトーシスによって細胞内に再び移動することが知られている。従って、組換え型GLUT4の膜移行活性を測定するための別の方法として、細胞膜上に存在する組換え型GLUT4、及び細胞膜上に移行した後に再び細胞内に取り込まれた組換え型GLUT4の細胞外部位の標識物質の量を測定することもできる。この場合には、ある一定期間中に細胞膜上に移行した組換え型GLUT4の総量を測定することが可能となる。この方法、例えば、当業者に公知の方法により、標識物質に対する抗体を適当量、例えば、０．０１〜５００μｇ／ｍｌ含む培養液中で分化型培養筋管細胞を培養し、その後、該細胞抽出液中に含まれる標識物質の量を抗体との抗原抗体反応を利用して測定することが出来る。標識物質の量は、例えば、標識物質が放射性物質である場合には、液体シンチレーションカウンター又はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて直接測定することができ、又、細胞免疫染色法、ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)、免疫沈降法、及びウェスタンブロット法等の当業者に公知の任意の方法で測定することが出来る。
【００４５】
この方法においても、分化型培養筋管細胞を上記の動物体内に移植し、生着し一定期間経過した後に、再び取り出した該細胞を使用することが可能である。例えば、生着した後に、標識物質に対する抗体を動物血液中に注射し、生着した分化型培養筋管細胞の膜上に存在する組換え型GLUT4の細胞外部位にある標識物質と反応させることが出来る。
【００４６】
以上の膜移行活性の測定方法を利用し、外来刺激に依存的な組換え型GLUT4の膜移行活性を測定することが出来る。即ち、当業者に公知の適当な方法・手段によって、インビトロ又はインビボで分化型培養筋管細胞に外的刺激を与え、その後、上記測定方法によって、標識物質の量、即ち、組換え型GLUT4の膜移行活性を測定する。外来刺激としては、例えば、インスリン等の化学物質、電気刺激、運動、活性酸素、低酸素刺激等を挙げることが出来る。
【００４７】
従って、外来刺激に依存的な組換え型GLUT4の膜移行活性を測定に際しては、例えば、上記に示したように、インスリン存在下での本発明の分化型培養筋管細胞を培養することによりインスリン刺激を与えたり、該細胞の培養中に、例えば、１〜１００V、０．０１〜１０Hz、０．０１〜５００ｍｓの電気パルスを０．５〜２００時間かける等の手段によって適当な電気刺激を与えたり、又は、動物にインスリンを投与することによってインスリン刺激を与える。
【００４８】
本発明の分化型培養筋管細胞を用いる上記の各測定方法によって、組換え型GLUT4の膜移行活性、即ち、糖の取り込み活性を測定することが可能となる。又、各種の外来刺激に依存的な組換え型GLUT4の膜移行活性及び糖の取り込み活性を測定することが出来る。
【００４９】
従って、本発明の膜移行活性の測定方法を利用した、筋肉を標的とする薬剤（糖尿病治療薬、インスリン抵抗性改善薬、糖の取り込み亢進薬、代謝能改善薬、分化誘導促進薬、収縮増強薬など）のスクリーニングを非常に簡便、容易（ハイスループット）かつ正確に実施することが可能となる。このようなスクリーニングは当業者に公知の任意の方法で実施することが出来る。例えば、試験対象となる薬剤などの化学物質の存在下又は非存在下で、且つ、外来刺激の存在下又は非存在下で、本発明の測定を行い、その結果得られる組換え型GLUT4膜移行活性を比較すること等により行うことが可能である。
【００５０】
更に、GLUT4を発現する筋芽細胞と野生型筋芽細胞との混合比率や培養条件を適切に調節することにより、培養筋細胞のGLUT4発現量や発現している筋管細胞の割合をコントロールできる。そのため、該スクリーニングによって開発された薬剤の作用・効果が、GLUT4の発現量によってどのように変化するかを追跡することも可能となる。このことは、健常者・代謝病患者のGLUT4発現量の個人差を考えると極めて重要である。
【００５１】
尚、本発明の筋管細胞の作製方法に使用する培養装置に特に制限は特にないが、好適な構成例として、例えば、下部平板電極、ウェル型培養皿、インサートチャンバー、蓋体、及び、上部電極を有する、上下対向電極型電気パルス刺激負荷培養装置を挙げることが出来る。ここで、上下電極間に挿入されるインサートチャンバーの底部は細胞接着因子で予め処理された弾性の半透膜のような基体から成ることが好ましい。このような半透膜自体は、例えば、ポリエチレンテレフタレートやヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)等の素材から成っている。このような培養装置には、電気パルス発生装置等のその他の任意の構成要素を含むことが出来る。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例に則して本発明を更に説明するが、これはあくまで本発明の一例であり、本発明の技術的範囲はこれらによって限定されるものではなく、本明細書の記載に基づき、当業者が容易に想到し得る任意の変型・修飾法も本発明の範囲である。尚、方法又は手段に関して特に記載のない場合には、当業者に公知の周知方法で実施した。
【００５３】
［作製例１］
野生型NIH-3T3-L1線維芽細胞（ATCC No. CL-173）を4 x 104/ウェル（カバーグラスを底面に設置した６ウェルプレート）となるように播種した。その後、線維芽細胞がコンフルエントとなるまで3日間、3 ml/ウェルのダルベッコ改変イーグル培地（4.5g/lグルコース）＋10%牛血清を用いて培養した。その後、野生型マウス筋芽細胞株C2C12細胞を4 x １０４個/ウェルとなるように播種した。筋芽細胞がコンフルエントとなるまで3日間、3 ml/ウェルのダルベッコ改変イーグル培地(1g/lグルコース)＋10%牛胎児血清を用いて培養した後、ダルベッコ改変イーグル培地＋2%牛血清に置換して6日間培養を行い、筋管細胞へと分化誘導させた。また、栄養源の供給ならびに老廃物の除去を目的に培地交換は分化誘導後、24時間おきに行った(図１参照)。その後、カバーグラスを4ウェルディッシュ上に移し、5 mlダルベッコ改変イーグル培地＋2%牛血清を用いて電気パルス刺激を行った(電気刺激条件：電圧40 V、頻度1 Hz、パルス幅2 ms、36時間)。電気パルス刺激前あるいは刺激中に細胞外マトリックスを保護する物質としてマトリゲル（100 μg／mL）、コラーゲン(5μg/mL)及び、エラスチン（2μg/mL）、並びに、エネルギー源としてのクレアチン(10 mM)、さらにカルニチン(100μM)を添加した。
【００５４】
その結果、フィーダー細胞なし（No feeder）の場合と比較して、フィーダー細胞を用いた場合には、全体としての筋管形成量はそれほど大きな差はないが、筋管一本あたりの太さが増加していることが分かった（図２）。即ち、フィーダー細胞は筋管形成において促進的に働くことが確認された。
【００５５】
［測定例１］
作製例１に従って作製した、NIH-3T3L1線維芽細胞上のC2C12筋管細胞をダルベッコPBS(-) + 2% パラホルムアルデヒド + 0.2% Triron X-100を用いて固定した。ＰＢＳ（−）で３回ｘ１０分間洗浄後、５％牛血清を添加したＰＢＳ（−）で１時間振とうしてブロッキングを行った。次に、一次抗体としての抗αアクチニン抗体（Sigma）又は抗カベオリン３抗体（BD Biosciences）を、１％牛血清アルブミンを添加したＰＢＳ（−）で２００倍希釈したものを用いて１時間振とうした。ＰＢＳ（−）で５回ｘ１０分間洗浄後、二次抗体としてローダミンを結合した抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson Laboratory社）を、１％牛血清アルブミンを添加したＰＢＳ（−）で２０００倍希釈したものを用いて１時間振とうした。その後、カバーグラスを取り出し、Ｖｅｃｔａ  Ｓｈｉｅｌｄを滴下したスライドグラス上にのせ、コンフォーカル共焦点顕微鏡下でローダミン（赤色の染色）、ファロイジン（緑色の核染色）、DAPI（青色の核染色）、ECFPの発現を観察した。NIH-3T3L1線維芽細胞を用いない場合、サルコメア構造（αアクチニンによる赤い染色部分を参照）の形成は観察されるが、その形成は膜表面に部分的に留まっていた（図３左）。一方、NIH-3T3L1線維芽細胞をフィーダー細胞として用いた場合、電気刺激に応答したサルコメア構造の発達は明らかに促進されていた。即ち、NIH-3T3L1線維芽細胞をフィーダー細胞として用いた場合にのみ、細胞深部まで発達したサルコメア構造の形成が見られた（図３右）。
【００５６】
一方、NIH-3T3L1線維芽細胞をフィーダー細胞として用いた場合であっても、電気パルス刺激を与えなかった場合（図４左）には、サルコメア構造の発達は全く観察されなかった。このことは、サルコメア構造の形成に電気パルス刺激が必須であることを示している。
【００５７】
更に、NIH-3T3L1線維芽細胞をフィーダー細胞として用いた場合にのみ、カベオリン３抗体でラベルされる（赤色の染色）種々の代謝関連タンパク質の輸送に重要だと考えられているt-tubule高次構造が観察された（図５Ａ，Ｂ，Ｃ）。一方、フィーダー細胞なしでは、このような高次構造は観察されなかった（図５Ｄ，Ｅ，Ｆ）。
【００５８】
また、フィーダー細胞として骨髄由来間質細胞（TBR）を用いた場合（図６右）では、NIH-3T3L1線維芽細胞をフィーダー細胞として用いた場合（図６左）に比べて、フィーダー細胞としての効果は弱く、電気パルス刺激に応答したサルコメア構造の発達は観察されるものの部分的に留まっていた（図６右）。
【００５９】
尚、長期間にわたる電気パルス刺激によって筋管細胞はダメージを受けるが、フィーダー細胞上で培養した筋管細胞ではダメージは少なく、強い収縮刺激を負荷することが可能であった（図７）。
【００６０】
［作製例２］
野生型NIH-3T3-L1線維芽細胞を4 x 104/ウェル（カバーグラスを底面に設置した６ウェルプレート）となるように播種した。その後、線維芽細胞がコンフルエントとなるまで3日間、3 ml/ウェルのダルベッコ改変イーグル培地（4.5g/lグルコース）＋10%牛血清を用いて培養した。その後、野生型マウス筋芽細胞株C2C12細胞と非特許文献２に記載の方法で作製したGLUT4を恒常的に発現するC2C12変異体クローンをそれぞれ2 x10４個/ウェルとなるように混合播種した。筋芽細胞がコンフルエントとなるまで3日間、3 ml/ウェルのダルベッコ改変イーグル培地(1g/lグルコース)＋10%牛胎児血清を用いて培養した後、ダルベッコ改変イーグル培地＋2%牛血清に置換して6日間培養を行い、筋管細胞へと分化誘導させた。また、栄養源の供給ならびに老廃物の除去を目的に培地交換は分化誘導後、24時間おきに行った。その後、カバーグラスを4ウェルディッシュ上に移し、5 mlダルベッコ改変イーグル培地＋2%牛血清を用いて電気パルス刺激を行った(電気刺激条件：電圧40 V、頻度1 Hz、パルス幅2 ms、36時間)。その結果、フィーダー細胞の混在化でも筋細胞にのみ選択的に任意の遺伝子を導入することができることが確認された（図８）。従って、この方法を用いることにより、異種細胞の混在化においても筋管細胞の生物反応だけを選択的に抽出して測定することが可能となる。
【００６１】
［測定例２］
作製例２に従って作製した、組換えGLUT4を発現するC2C12筋管細胞を終濃度100 nMのインスリンで６０分間刺激した。インスリン刺激開始直後より終濃度４μg/mlの抗ｍｙｃモノクローナル抗体を培地中に添加した。インスリン刺激終了後、ＰＢＳ（−）で５回洗浄して、細胞膜上に存在する抗ｍｙｃ抗体を除去した後、Laemmli｀s bufferを用いて細胞抽出液を調製した。細胞抽出液は、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ホースラディッシュパーオキシダーゼを結合した抗マウスＩｇＧ抗体を用いたウエスタンブロット解析を行った。なお、検出はウエストスーパーフェムトディテクションキット（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて行った。その結果、インスリン刺激によって細胞内に取り込まれた抗ｍｙｃ抗体の量は、インスリン刺激前の電気パルス刺激によって著しく増加し、更に、NIH-3T3L1線維芽細胞をフィーダー細胞として用いた場合、この効果がより強くなることが分かった。即ち、フィーダー細胞なしの場合、電気刺激によってインスリン依存的なＧＬＵＴ４膜移行量は約１．７倍に増加していた。一方でフィーダー細胞ありの場合、電気刺激によってインスリン依存的なＧＬＵＴ４膜移行量は約２．５倍に増加していた。このことは、フィーダー細胞の存在によって運動刺激効果がより良く見える条件になっていることを示している（図９）。
【００６２】
［作製例３］
更に、フィーダー細胞（3T3L1線維芽細胞）を1μg/ml insulin, 1μM dexamethasone, 0.5 mM isobutyl-1-methylxanthineにて１日間前処理した。その後、GLUT4-C2C12と野生型C2C12筋芽細胞をその上に播種し、作製例２と同様に分化を誘導させた。血清除去後、即定例２に従い、100 nMのインスリンによって誘導されるGLUT4の膜移行量をmyc抗体によるELISA法にて測定した。図１０に示した結果から、フィーダー細胞を前処理することによって、インスリン反応性の組換えGLUT4膜移行活性が顕著に増加したことが判る。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明を利用することにより、筋細胞を標的とした様々な薬剤（糖尿病治療薬、インスリン抵抗性改善薬、糖の取り込み亢進薬、代謝能改善薬、分化誘導促進薬、収縮増強薬など）のスクリーニングを、従来の継代可能な筋細胞株の分化方法と比較して飛躍的に生体筋に近い細胞内構造を構築させることができる。これによって、筋形成過程の深度あるいはスピードを測定することが可能となる。
【００６４】
本発明の作製方法では、混合培養すなわちGLUT4を発現する筋芽細胞と野生型筋芽細胞との混合比率や培養条件を適切に調節することにより、培養筋細胞のGLUT4発現量や発現している筋管細胞の割合をコントロールできる。そのため、該スクリーニングによって開発された薬剤の作用・効果が、GLUT4の発現量によってどのように変化するかを追跡することも可能となる。このことは、健常者・代謝病患者のGLUT4発現量の個人差を考えると極めて重要である。また、本発明方法を用いれば、GLUT4と複合体を形成するタンパク質（IRAPなど）の動態を、例えばプロテオミクス技術を用いて解析することも可能となり、GLUT4やGLUT4複合体の安定性の測定をも容易に可能とする。これらの応用も全て筋肉を標的とした新しい様々な薬剤のスクリーニングにおいて、基礎的な情報を提供するものである。
【００６５】
又、作製された培養筋細胞のインスリン刺激や電気パルスによる収縮活動は人為的にコントロールすることができるため、例えば、生体における運動（筋肉の収縮伸展活動）刺激がいかにしてインスリン抵抗性を改善しているのかなど、培養細胞の利点を生かした研究（例えば、分子生物学、細胞生物学、生化学、遺伝子工学的手法を用いた研究）が可能になる。
【００６６】
更に、フィーダー細胞に様々な遺伝子工学的な手法を用いて様々なタンパク質・因子を分泌することもできる。この方法を用いれば、様々な遺伝子を発現するフィーダー細胞を作製し、その中から筋細胞の糖代謝能、収縮能、分化能を改善、あるいは改悪するタンパク質・因子を同定することも可能となり、新しい様々な薬剤のスクリーニングにフィーダー細胞の側からアプローチすることも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明における筋管細胞の作製方法の概略を示す。
【図２】線維芽細胞をフィーダーとして用いた場合（下）の筋管形成の促進を示す写真（倍率    ｘ２０）である。
【図３】電気パルス刺激依存的なサルコメア構造形成に及ぼすフィーダー細胞の効果（右）を示す写真（倍率：ｘ４０）である。
【図４】電気刺激（EPS：右）を与えた場合にのみ、サルコメア構造の発達が観察されることを示す写真（倍率：ｘ４０）である。
【図５】フィーダー細胞を使用した場合（下）のt-tubule構造の形成を示す写真（倍率：ｘ４０）である。
【図６】フィーダー細胞としてＮＩＨ３Ｔ３Ｌ１線維芽細胞（左）又はＴＢＲ細胞（右）を使用した場合の電気パルス刺激依存的なサルコメア構造形成の促進の様子を比較した写真（倍率：ｘ４０）である。
【図７】長期間にわたる電気パルス刺激によって筋管細胞はダメージを受ける（左）が、フィーダー細胞上で培養した筋管細胞ではダメージは少ない(右)ことを示す写真（倍率：ｘ２０）である。
【図８】フィーダー細胞（arrowheads）の混在化でも分化した筋細胞（arrows）にのみ選択的に任意の遺伝子を導入することができることを示す写真（倍率：ｘ６０）である (Green:ECFPのシグナル, Blue:DAPIによる核の染色) 。
【図９】フィーダー細胞の存在によって、電気パルス刺激に応答したインスリン依存的なGLUT４膜移行が増強されることを示すグラフである。
【図１０】フィーダー細胞の前処理による、インスリン反応性の組換えGLUT4膜移行活性の増加を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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