(57)【要約】【課題】リンパ節転移の有無、程度及びリンパ節転移の回復と関連性を有する遺伝子を特定する。【解決手段】リンパ節転移を発症した癌患者群とリンパ節転移を発症しない癌患者群との間で発現量が有意に変化した遺伝子として、リンパ節転移との有無、程度及びリンパ節転移の回復との関連性が示唆されていなかったLin7c遺伝子を同定することに成功した。さらに、Lin7c遺伝子の発現量を亢進することによって、リンパ節転移の予防及び回復が可能であることを実証した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、リンパ節転移の改善剤。
【請求項２】
上記ポリヌクレオチドが遺伝子治療用担体に担持されていることを特徴とする請求項１記載のリンパ節転移の改善剤。
【請求項３】
上記遺伝子治療用担体がウイルスベクターであることを特徴とする請求項２記載のリンパ節転移の改善剤。
【請求項４】
上記リンパ節転移が口腔、咽頭、食道又は肺に発癌する扁平上皮癌のリンパ節転移であることを特徴とする請求項１記載の改善剤。
【請求項５】
配列番号２に表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、リンパ節転移の予防剤。
【請求項６】
上記ポリヌクレオチドが遺伝子治療用担体に担持されていることを特徴とする請求項５記載のリンパ節転移の予防剤。
【請求項７】
上記遺伝子治療用担体がウイルスベクターであることを特徴とする請求項６記載のリンパ節転移の予防剤。
【請求項８】
上記リンパ節転移が口腔、咽頭、食道又は肺に発癌する扁平上皮癌のリンパ節転移であることを特徴とする請求項５記載のリンパ節転移の予防剤。
【請求項９】
配列番号２に表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を機能しうる形で有する遺伝子治療用ベクター。
【請求項１０】
ウイルスベクターであることを特徴とする請求項９記載の遺伝子治療用ベクター。
【請求項１１】
リンパ節転移症例に対して使用されることを特徴とする請求項９記載の遺伝子治療用ベクター。
【請求項１２】
上記リンパ節転移が口腔、咽頭、食道又は肺に発癌する扁平上皮癌のリンパ節転移であることを特徴とする請求項９記載の遺伝子治療用ベクター。
【請求項１３】
配列番号２に表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質を測定できる試薬を含む、リンパ節転移の有無又はその程度の診断薬。
【請求項１４】
上記試薬が抗Lin7c抗体であるタンパク質に対する抗体を含有するものであることを特徴とする請求項１３記載のリンパ節転移の有無又はその程度の診断薬。
【請求項１５】
上記リンパ節転移が口腔、咽頭、食道又は肺に発癌する扁平上皮癌のリンパ節転移であることを特徴とする請求項１３記載のリンパ節転移の有無又はその程度の診断薬。
【請求項１６】
配列番号２に表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子の発現量を測定できる試薬を含む、リンパ節転移の有無又はその程度の診断薬。
【請求項１７】
上記試薬が上記ポリヌクレオチドのmRNAに特異的にハイブリダイズする１本鎖又は２本鎖のポリヌクレオチド、又はこれらの標識体を含有するものであることを特徴とする請求項１６記載のリンパ節転移の有無又はその程度の診断薬。
【請求項１８】
上記リンパ節転移が口腔、咽頭、食道又は肺に発癌する扁平上皮癌のリンパ節転移であることを特徴とする請求項１６記載のリンパ節転移の有無又はその程度の診断薬。
【請求項１９】
検査対象患者由来の生体試料における、配列番号２に表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
上記遺伝子の発現レベルに基づき上記検査対象患者におけるリンパ節転移の有無及び/又は可能性を判断する工程と
を含む、リンパ節転移判定方法。
【請求項２０】
上記リンパ節転移が口腔、咽頭、食道又は肺に発癌する扁平上皮癌のリンパ節転移であることを特徴とする請求項１９記載のリンパ節転移判定方法。
【請求項２１】
供試物質を、癌細胞由来細胞株に接触させる工程と
当該細胞株における、配列番号２に表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子の発現を検出する工程と、
上記供試物質によって上記遺伝子の発現量が促進された場合には、上記供試物質をリンパ節転移抑制剤の候補物質として同定する工程と
を含む、リンパ節転移抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２２】
上記リンパ節転移が口腔、咽頭、食道又は肺に発癌する扁平上皮癌のリンパ節転移であることを特徴とする請求項２１記載のリンパ節転移抑制剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ節転移が更に転移・拡散することを防止するリンパ節転移の改善剤、リンパ節転移を有効に予防しうる予防剤及びこれらに使用できる遺伝子治療用ベクターに関し、また、リンパ節転移の診断に適用できるリンパ節転移の有無又はその程度の診断薬及びリンパ節転移判定方法に関し、更にはリンパ節転移抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
転移とは、腫瘍が不連続的に進展していく様式であって、原発巣から腫瘍細胞が離れて他臓器・他組織に拡大するものをいう。そのうちリンパ節転移は原発部位において腫瘍細胞がリンパ管に入りリンパ液に運ばれて下流のリンパ節に移住し、そこを第2、第3の増殖部位として腫瘤を形成するものである。
【０００３】
リンパ節転移の診断方法には、画像検査として、コンピューター断層撮影（CT）、磁気共鳴映像法（MRI）、超音波診断法（US）、シンチグラフィ法があり、生検検査として、手術中に癌病巣からリンパ液を受けるリンパ節を病理診断する方法がある。治療法は、外科的にはリンパ節郭清術があり、そのほかに、化学療法、放射線療法がある。ところで、PDZドメインを１つ含む膜タンパク質として、線虫で発見されたLin7の中のひとつにLiｎ7cと呼ばれる膜タンパク質が知られている。Lin7は、PDZドメインを介して、EGF受容体の線虫ホモログであるLET23と結合して、その局在決定に寄与し、細胞増殖や分化の細胞間シグナルに関与している。哺乳類のLin7がEGF受容体の局在決定に関わるという知見は得られていない。しかし、上皮細胞において、GABA受容体に結合して、そのエンドサイトーシスを抑制する事により、その局在決定に関与する。また、PDZ領域を足場に、さまざまのPDZ領域を含むタンパク質と結合することがしられている。非特許文献１〜３を参照されたい。
【０００４】
このようなPDZドメインを１つ含む膜タンパク質、特にLin7タンパク質と、上述したようなリンパ節転移の発症との関連性については、何ら示唆されていない。
【０００５】
【非特許文献１】Butz S, Okamoto M, Sudhof TC.A tripartite protein complex with the potential to couple synaptic vesicle exocytosis to cell adhesion in brain. Cell. 1998 Sep 18;94(6):773-82.
【非特許文献２】Simske JS, Kaech SM, Harp SA, Kim SK.LET-23 receptor localization by the cell junction protein LIN-7 during C. elegans vulval induction. Cell. 1996 Apr 19;85(2):195-204.
【非特許文献３】Perego C, Vanoni C, Villa A, Longhi R, Kaech SM, Frohli E, Hajnal A, Kim SK, Pietrini G.PDZ-mediated interactions retain the epithelial GABA transporter on the basolateral surface of polarized epithelial cells. EMBO J. 1999 May 4;18(9):2384-93
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、リンパ節転移の有無及び程度と関連性を有する遺伝子を特定し、リンパ節転移が更に転移・拡散することを防止する改善剤、リンパ節転移を有効に予防しうる予防剤及びこれらに使用できる遺伝子治療用ベクターを提供することを目的とする。また、本発明は、リンパ節転移の有無及び程度と関連性を有する遺伝子を特定し、リンパ節転移の診断に適用できるリンパ節転移の有無又はその程度の診断薬及びリンパ節転移判定方法並びにリンパ節転移抑制剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、リンパ節転移を発症した癌患者群とリンパ節転移を発症しない癌患者群との間で発現量が有意に変化した遺伝子として、リンパ節転移との有無及び程度との関連性が示唆されていなかった特定の遺伝子を同定することに成功した。さらに、本発明者らは、当該遺伝子の発現量を亢進することによって、リンパ節転移の予防が可能であることを実証することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下を包含する。
【０００９】
（１）配列番号２に表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、リンパ節転移の改善剤。
（２）  上記ポリヌクレオチドが遺伝子治療用担体に担持されていることを特徴とする（１）記載のリンパ節転移の改善剤。
（３）  上記遺伝子治療用担体がウイルスベクターであることを特徴とする（２）記載のリンパ節転移の改善剤。
（４）  上記リンパ節転移が口腔、咽頭、食道又は肺に発癌する扁平上皮癌のリンパ節転移であることを特徴とする（１）記載の改善剤。
【００１０】
（５）  配列番号２に表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、リンパ節転移の予防剤。
（６）  上記ポリヌクレオチドが遺伝子治療用担体に担持されていることを特徴とする（５）記載のリンパ節転移の予防剤。
（７）  上記遺伝子治療用担体がウイルスベクターであることを特徴とする（６）記載のリンパ節転移の予防剤。
（８）  上記リンパ節転移が口腔、咽頭、食道又は肺に発癌する扁平上皮癌のリンパ節転移であることを特徴とする（５）記載のリンパ節転移の予防剤。
（９）  配列番号２に表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を機能しうる形で有する遺伝子治療用ベクター。
【００１１】
（１０）  ウイルスベクターであることを特徴とする（９）記載の遺伝子治療用ベクター。
（１１）  リンパ節転移症例に対して使用されることを特徴とする（９）記載の遺伝子治療用ベクター。
（１２）  上記リンパ節転移が口腔、咽頭、食道又は肺に発癌する扁平上皮癌のリンパ節転移であることを特徴とする（９）記載の遺伝子治療用ベクター。
（１３）  配列番号２に表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質を測定できる試薬を含む、リンパ節転移の有無又はその程度の診断薬。
（１４）  上記試薬が抗Lin7c抗体であるタンパク質に対する抗体を含有するものであることを特徴とする（１３）記載のリンパ節転移の有無又はその程度の診断薬。
【００１２】
（１５）  上記リンパ節転移が口腔、咽頭、食道又は肺に発癌する扁平上皮癌のリンパ節転移であることを特徴とする（１３）記載のリンパ節転移の有無又はその程度の診断薬。
（１６）  配列番号２に表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子の発現量を測定できる試薬を含む、リンパ節転移の有無又はその程度の診断薬。
（１７）  上記試薬が上記ポリヌクレオチドのmRNAに特異的にハイブリダイズする１本鎖又は２本鎖のポリヌクレオチド、又はこれらの標識体を含有するものであることを特徴とする（１６）記載のリンパ節転移の有無又はその程度の診断薬。
（１８）  上記リンパ節転移が口腔、咽頭、食道又は肺に発癌する扁平上皮癌のリンパ節転移であることを特徴とする（１６）記載のリンパ節転移の有無又はその程度の診断薬。
（１９）  検査対象患者由来の生体試料における、配列番号２に表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子の発現レベルを測定する工程と、上記遺伝子の発現レベルに基づき上記検査対象患者におけるリンパ節転移の有無及び/又は可能性を判断する工程とを含む、リンパ節転移判定方法。
【００１３】
（２０）  上記リンパ節転移が口腔、咽頭、食道又は肺に発癌する扁平上皮癌のリンパ節転移であることを特徴とする（１９）記載のリンパ節転移判定方法。
（２１）  供試物質を、癌細胞由来細胞株に接触させる工程と、当該細胞株における、配列番号２に表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子の発現を検出する工程と、上記供試物質によって上記遺伝子の発現量が促進された場合には、上記供試物質をリンパ節転移抑制剤の候補物質として同定する工程とを含む、リンパ節転移抑制剤のスクリーニング方法。
（２２）  上記リンパ節転移が口腔、咽頭、食道又は肺に発癌する扁平上皮癌のリンパ節転移であることを特徴とする（２１）記載のリンパ節転移抑制剤のスクリーニング方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、リンパ節転移を発症した癌患者群において発現量が有意に減少するといったプロファイルを示す遺伝子を特定するとともに、当該遺伝子の発現を亢進することによってリンパ節転移を予防できるといった知見に基づくものである。本発明において、転移とは、腫瘍が不連続的に進展していく様式であって、原発巣から腫瘍細胞が離れて他臓器・他組織に拡大するものをいう。そのうちリンパ節転移は原発部位において腫瘍細胞がリンパ管に入りリンパ液に運ばれて下流のリンパ節に移住し、そこを第2、第3の増殖部位として腫瘤を形成するものである。Lin7cの発現亢進により、原発巣、あるいは転移リンパ節において腫瘍細胞は互いに強固に結合し、リンパ管に侵入、あるいは周囲組織に浸潤しにくくなり、さらなる転移を防止することができる。
【００１５】
特に本発明において、Lin７cは細胞接着因子カドヘリンの主要因子であり、その発現量を計測、あるいは調制することにより、扁平上皮癌の転移の判定や予防、治療ができることを明らかにした。本発明において対象とするリンパ節転移は、固形癌、特に扁平上皮癌においては、細胞接着に主なメカニズムとしてカドヘリンが作用している。このため、固形癌、特に口腔、咽頭、食道、肺などに発癌する扁平上皮癌全般に本発明が及ぶものと考えられる。
【００１６】
本発明によれば、上記の定義によって特定されるリンパ節転移が更に転移・拡散することを防止する改善剤、リンパ節転移を有効に予防しうる予防剤及びこれらに使用できる遺伝子治療用ベクターを提供することができる。また、本発明によれば、上記の定義によって特定されるリンパ節転移の有無や程度を診断しうる診断薬及びリンパ節転移判定方法を提供することができる。さらに、本発明によれば、上記の定義によって特定されるリンパ節転移を予防しうる新規なリンパ節転移抑制剤のスクリーニング方法を提供することができる。以下、本発明より提供されるこれら医薬関連発明を具体的に説明する。
【００１７】
リンパ節転移改善剤及び予防剤
後述の実施例で示したように、Lin7c遺伝子の発現低下がリンパ節転移の発症に関与することが明らかになった。ここで、Lin7c遺伝子は、タンパク質結合部位であるPDZドメインを有するタンパク質をコードしている。ヒト由来Lin7c遺伝子の塩基配列を配列番号１に示し、ヒト由来Lin7c遺伝子によってコードされるヒト由来Lin7cタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。なお、Lin7c遺伝子は、ヒト以外の生物、例えばDanio rerio（アクセッションNo: NP_001004672）、Mus musculus（アクセッションNo: NP_035829）、Gallus gallus（アクセッションNo: NP_001026238）、Rattus norvegicus（アクセッションNo: NP_068623）、Macaca mulatta（アクセッションNo: XP_001089490）においも同定されている。本発明においてLin7c遺伝子と表現した場合、由来に限定されず全ての生物由来Lin7c遺伝子を技術範囲として含んでいる。
【００１８】
特に、本発明に係るリンパ節転移改善剤及び予防剤としては、ヒト由来のLin7c遺伝子を有効成分とすることが好ましい。なお、本発明において、リンパ節転移改善剤とは、リンパ節転移を発症している患者に対して処方され、当該リンパ節転移が更に転移・拡散することを防止する薬剤である。また、本発明において、リンパ節転移予防剤とは、リンパ節転移を発症していない患者（特に、リンパ節転移が疑われる患者）に対して処方され、リンパ節転移の発症を防止する薬剤である。Lin7c遺伝子を有効成分とする遺伝子治療剤をリンパ節転移発症患者或いはリンパ節転移の発症を予防する患者に導入する場合、その投与形態としては特に限定されない。投与形態としては、非ウイルスベクターを用いる形態とウイルスベクターを用いる形態を挙げることができる。遺伝子治療剤を用いた治療計画の概要は、公知の文献（例えば、別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術（羊土社（1996））や、別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法（羊土社,（1997）））を参照することができる。
【００１９】
非ウイルスベクターを用いた形態では、Lin7c遺伝子を組み込んだLin7c遺伝子発現ベクターを調製する。そして、得られた遺伝子発現ベクターを、リン酸−カルシウム共沈法、リポソームを用いてＤＮＡ分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクチン法、リポフェクトアミン法）、ＤＮＡ直接注射法（ｎａｋｅｄ−ＤＮＡ法）、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Gene Gun）で坦体（金属粒子）とともにＤＮＡ分子を細胞に移入する方法等により細胞内に取り込ませる。ここで用いられる発現ベクターとしては、例えばｐＣＡＧＧＳ（Gene 108,193-200(1991)）や、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラタジーン社）などが挙げられる。
【００２０】
一方、ウイルスベクターを用いた形態では、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを用いることができる。具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスにLin7c遺伝子を含む遺伝子発現カセットを導入して組換えウイルスを調製する。そして、得られた組換えウイルスを細胞に感染させることによって、細胞内にLin7c遺伝子を導入することができる。前記ウイルスベクターのうち、アデノウイルスの感染効率が他のウイルスベクターを用いた場合よりもはるかに高いことが知られており、この観点からは、アデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。
【００２１】
本発明のリンパ節転移改善剤又は予防剤の患者への導入法としては、遺伝子治療剤を直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法及びヒトからある種の細胞を取り出して体外でＤＮＡを当該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法が挙げられる（日経サイエンス、１９９４年４月号、２０−４５頁、月刊薬事、３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊、１２（１５）、（１９９４））。
【００２２】
ｉｎ ｖｉｖｏ法により投与する場合は、治療目的の疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与するか、又は病変の認められる組織そのものに直接局所投与することができる。ここで、非ウイルスベクターによる遺伝子治療では、局所投与や組織移行性を高めた剤形との組み合わせ等によってターゲットとなる部位の近傍に遺伝子を導くことが好ましいが、ウイルスベクターによる遺伝子治療では、必ずしも局所投与をする必要はなく、静脈内投与も可能である。
【００２３】
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の製剤形態（例えば液剤など）をとり得る。例えば有効成分であるLin7c遺伝子を含有する注射剤とされた場合、当該注射剤は常法により調製することができ、例えば適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、フィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。当該注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。また、ＨＶＪ−リポソーム等のリポソームにおいては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などのリポソーム製剤の形態とすることができる。また、疾患部位の周囲に遺伝子を存在し易くするために、徐放性の製剤（ミニペレット製剤等）を調製し患部近くに埋め込むことも可能であり、あるいはオスモチックポンプなどを用いて患部に連続的に徐々に投与することも可能である。
【００２４】
製剤中のLin7c遺伝子の含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができる、これを数日ないし数ヶ月に１回投与するのが好ましい。以上のような本発明の遺伝子改善剤又は予防剤は、全てのリンパ節転移発症患者或いはリンパ節転移の発症を予防する患者に適用可能であるが、好ましくは扁平上皮細胞癌に罹患しリンパ節転移を発症した患者、口腔扁平上皮細胞癌に罹患しリンパ節転移発症リスクが高いと判定された患者に有効に用いられる。
【００２５】
リンパ節転移診断薬及び判定方法
本発明に係るリンパ節転移診断薬は、Lin7cタンパク質を測定することができる試薬を含有するものが例示される。ここで「Lin7cタンパク質を測定することができる試薬」の成分としては、具体的には、抗Lin7c抗体及びその標識体が挙げられる。また当該Lin7cタンパク質は、PDZドメインを有しており、CASK、PSD-95、Mint1等と結合していることが知られている。したがって、CASK、PSD-95、Mint1等やこれらの標識体を試薬として使用することができる。
【００２６】
ここで「抗Lin7c抗体」は、公知の文献に従って容易に作製することもできるし、上市された製品として購入することもできる。抗Lin7c抗体を作製するための公知の文献としては、例えば、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane,H.D.ら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)や、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社（1993）等を挙げることができる。具体的には、Lin7cタンパク質又はその一部を免疫原に用いて常法により適宜動物を免疫することにより、抗Lin7c抗体を作製することができる。ここで抗Lin7c抗体を作製するための免疫原としては、（Ａ）Lin7cタンパク質、（Ｂ）Lin7cとＧＳＴ等との融合タンパク、（Ｃ）Lin7cタンパク質の一部よりなるオリゴペプチドとＫＬＨ等とのコンジュゲート、等が挙げられる。
【００２７】
（Ａ）に示したLin7cタンパク質は、Lin7c遺伝子をクローニングして適当な発現ベクターに挿入し、これを大腸菌もしくは培養細胞株に導入し、当該形質転換体より常法により当該タンパク質を大量に生産し精製することによって得ることができる。まず、Lin7遺伝子としてヒト由来のLin7c遺伝子をクローニングする際には、配列番号１に示した塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むcDNAを準備する。当該cDNAは、例えば、ヒト由来培養細胞から抽出したmRNAを鋳型としたPCR反応等によりクローニングすることができる。当該クローニングは、例えばMolecular cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等の基本書に基づき当業者であれば容易に行うことができる。次に、クローニングされたcDNAを、pcDNA3.1誘導体、pRc/RSV、pRc/CMV、pEF誘導体、pREP9誘導体（インビトロジェン社）、pIRESneo（クロンテック社）等の発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入して形質転換体を作製する。当該宿主細胞としては、外来遺伝子を宿主染色体中に安定に組み込むことのできる細胞であれば何でも良く、例えばCHO細胞、L929細胞、C127細胞、BALB/c3T3細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）などが挙げられ、これらの細胞はATCC（American Type Culture Collection）等から入手可能である。また、宿主細胞への発現ベクターの導入は、例えばリン酸カルシウム法（J.Virol.,52,456-467(1973)）、LT-１（Panvera社）を用いる方法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記の組換え発現ベクターが宿主染色体中に安定に組み込まれた形質転換体を選別することができる。
【００２８】
以上のようにして得られた形質転換体を好適な条件下で培養し続けることにより、Lin7c遺伝子を高発現させ、Lin7cタンパク質を生産させることができる。発現・生産されたLin7cタンパク質の単離・精製法としては、例えば日本生化学会編、新生化学実験講座1、タンパク質Ｉ-分離・精製・性質-(1990)に記載された方法が挙げられる。以上のようにして、免疫原であるLin7cタンパク質を調製することができる。
【００２９】
（Ｂ）に示した融合タンパクは、例えば、上述したLin7c遺伝子を含むcDNAをpGEX-6P-1（ファルマシア）等のＧＳＴ融合タンパク発現ベクターに導入し、これを大腸菌に導入して形質転換体を得、その後常法により菌体を破砕、融合タンパクを抽出して、グルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシア）等を用いて精製を行うことにより、得ることができる。また（Ｃ）に示したコンジュゲートは、適当なオリゴペプチドを合成後、ＫＬＨやＢＳＡタンパク質と混合することにより得ることができる。
【００３０】
以上のような免疫原により免疫感作する動物種としては、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、ウシ、ロバ、ヒツジ、ウマ等何れでも良い。また、得られた抗血清より精製抗体を得るためには、常法によりアフィニティー精製を行えば良い。診断にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れも使用し得るが、モノクローナル抗体が望ましい。
【００３１】
以上のようにして得られた抗体をもとに、種々の抗体フラグメントを作製することも可能である。当該抗体フラグメントとは、例えば抗体のペプシン消化によって生成され得る F(ab')2フラグメント、F(ab')2フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって生成され得るFab'フラグメント、あるいは抗体をパパインおよび還元剤で処理することによって生成され得る 2FabまたはFabフラグメント等が挙げられ、これらの抗体フラグメントも本発明における「Lin7cタンパク質を測定することができる試薬」となり得る。
【００３２】
さらに、これらの抗体または抗体フラグメントを酵素等で標識した標識体も、本発明における「Lin7cタンパク質を測定することができる試薬」となり得る。具体的な酵素標識法としては、例えばグルタルアルデヒド法、過ヨーソ法、マレイミド法、及びピリジル・ジスルフィド法が挙げられる。標識に用いられる酵素としては、例えばウシ小腸・アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビ・ぺルオキシダーゼなどが挙げられる。これらの標識抗体は、例えば、酵素免疫測定法、医学書院（1978）等の基本書に従い、当業者ならば容易に作製することができる。
【００３３】
前述したように、Lin7cタンパク質と結合することが知られている、CASK、PSD-95、Mint1等やこれらの標識体も、本発明における「Lin7cタンパク質を測定することができる試薬」となり得る。以上の抗Lin7c抗体、CASK、PSD-95、Mint1等又はこれらの標識体等を含有する試薬を、例えばウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液（pH7.0）等の適当な緩衝液中に存在させることにより、リンパ節転移診断薬の成分とすることができる。その際、測定方法に応じて、例えば酵素標識二次抗体、発色剤、発色補助剤、停止液、標準品等をも含有するキットの形態において使用することが可能である。
【００３４】
以上のような、Lin7cタンパク質を測定することができる試薬を含有する診断薬を用いてリンパ節転移を診断する方法としては、以下の方法が例示される。
【００３５】
まず被験試料としては、リンパ節転移発症の病態を反映する組織であれば特に限定されない。例えば、生検組織としては患者からの腫瘍部位又は入手可能ならば正常部位をバイオプシーにて一部採取したものを使用することができる。また、リンパ節に転移している可能性のある場合、リンパ節組織を被検試料とすることもできる。また、被検試料としては血液を使用することもできる。
【００３６】
Lin7cタンパク質を測定することができる試薬として抗Lin7c抗体又はその標識体を用いる場合は、上述した被験試料を、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織染色法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの常法に供することにより、被験試料におけるLin7c遺伝子の発現レベルを検出することができる。検出は、いずれも酵素免疫測定法、医学書院（1978）等の基本書に基づき容易に実施することができる。ＥＬＩＳＡ法の場合、１次抗体（抗Lin7c抗体）でプレートをコートし、試料中に存在するピルビン酸カルボキシラーゼを結合後、２次抗体（アルカリフォスファターゼ化等の標識抗体）と反応させ、Lin7c遺伝子の発現産物（Lin7cタンパク質）に結合した抗体を検出する手法が簡便である。
【００３７】
以上のようなLin7c遺伝子の発現レベルの検出結果、陰性対象（健常人サンプル又はリンパ節転移を発症していない癌患者）においてはLin7cタンパク質が検出されるのに比して、診断対象においてはLin7cタンパク質の発現量が低下しているか、又は発現が消失している場合には、当該診断対象はリンパ節転移を発症しているか、又はリンパ節転移の発症リスクが高いと判断される。
【００３８】
次に、本発明に係るリンパ節転移診断薬は、Lin7c遺伝子の発現量を測定することができる試薬を含有するものが例示される。具体的には、試薬としては、Lin7c遺伝子の発現（ｍＲＮＡの存在）を特異的に検出し得るポリヌクレオチド、あるいはその標識体を挙げることができる。また、使用可能なポリヌクレオチドとしては、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。ここで、Lin7c遺伝子のmRNAを特異的に検出し得るポリヌクレオチドとしては、Lin7c遺伝子のmRNAに特異的にハイブリダイズするプローブとして機能するもの、及びLin7c遺伝子のmRNAを鋳型とした増幅反応におけるプライマーとして機能するものを挙げることができる。
【００３９】
上記プローブとして機能するポリヌクレオチドとしては、Lin7c遺伝子のmRNAに特異的にハイブリダイズできるならば、ハイブリダイズの位置に限定されない。さらに、Lin7c遺伝子のmRNAに特異的にハイブリダイズできるならば、ハイブリダイズの長さも限定されない。
【００４０】
より具体的に、Lin7c遺伝子のｍＲＮＡを特異的に検出し得るポリヌクレオチドは、配列番号１に示したヒト由来Lin7c遺伝子の塩基配列に基づいて適宜設計することができる。設計されたポリヌクレオチドは、短いものであればＤＮＡ合成機を用いて合成され、長いものであればＰＣＲにより、さらに適当な制限酵素部位があればそれを利用することなどにより、適宜調製することができる。
【００４１】
以上のようなポリヌクレオチドを含有するLin7c遺伝子の発現量測定試薬を、例えばTE緩衝液等の反応に支障を与えないような適当な緩衝液中に存在させることにより、リンパ節転移診断薬の成分とすることができる。その際、測定方法に応じて、例えば逆転写酵素、Taq polymerase、dNTP、反応停止液等をも含有するキットの形態において使用することが可能である。
【００４２】
具体的には、Lin7c遺伝子のmRNA測定用ポリヌクレオチドはハイブリダイゼーションのプローブ又はＰＣＲのプライマーとして、リンパ節転移の診断に用いられる。ここで、ＰＣＲプライマーとして用いる場合の好ましい長さとしては、15塩基〜50塩基程度の長さが挙げられ、またハイブリダイゼーションのプローブとして用いる場合の好ましい長さとしては、20塩基〜591塩基程度の長さが挙げられる。
【００４３】
これら本発明の診断用ポリヌクレオチドを用いたリンパ節転移の診断方法としては、以下の方法が挙げられる。１）上述した診断用の１本鎖ポリヌクレオチド（正鎖及び逆鎖）を核酸増幅反応におけるプライマーとして用い、診断対象より採取した被検試料などから得られた全ＲＮＡ又はポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型とした核酸増幅反応によりLin7c遺伝子の発現レベルを検出する方法。２）上述した診断用の１本鎖または２本鎖ポリヌクレオチドを標識し、これを例えばノーザンブロット解析におけるプローブとして使用し、前記全ＲＮＡまたはポリ（Ａ）ＲＮＡをハイブリダイズ対象とすることによりLin7c遺伝子の発現レベルを検出する方法。
【００４４】
以上の１）および２）におけるLin7c遺伝子の発現レベルの検出は、例えばMolecular Cloning 2nd Edt.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等の基本書に基づき行うことができる。以下に具体例を示す。
【００４５】
核酸増幅反応によってLin7c遺伝子の発現レベルを検出する場合、まず、上述したプライマー用ポリヌクレオチドを常法により合成する。次に、被験用の細胞などより、常法により全ＲＮＡ又はポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出・精製し、これを鋳型として逆転写酵素により１本鎖ｃＤＮＡを調製する。当該１本鎖ｃＤＮＡの調製は、例えば Superscript pre-amplification system (Life Technologies, Gaithersburg,MD)等を用いることにより容易に行うことができる。その後、先のプライマーを添加し、常法により例えばＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応の条件としては、例えば９５℃１分、６０℃１分、７２℃２分を３０サイクル行った後に、７２℃で１０分加熱するような条件が挙げられる。このＰＣＲ反応物を適当な濃度のアガロースゲルにて電気泳動することにより、Lin7c遺伝子のｍＲＮＡの検出及び当該mRNAの定量を行うことができる。結果として、陰性対象（健常人サンプル又はリンパ節転移を発症していない患者由来のサンプル）と異なり、被験細胞においてLin7c遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量）が低下しているか、又は発現が消失している場合には、当該診断対象はリンパ節転移を発症しているか、又はリンパ節転移の発症リスクが高いと判断される。
【００４６】
さらに、核酸増幅反応を利用した診断方法としては、以下の原理に基づくものが例示される。まず、前記と同様に生検組織等よりＲＮＡの抽出・精製を行い、ビオチン化プライマーを用いた対象検体の増幅（ＰＣＲ反応）を、前記と同様の手法により行う。その後、アルカリ処理により増幅産物の一本化を行い、相補的ＤＮＡプローブを固定化した固相とのハイブリダイゼーションを行う。その後固相を洗浄し、酵素標識アビジンを反応させる。固相を洗浄した後、酵素基質を添加して発色反応を行い、吸光度を測定することにより、Lin7c遺伝子のｍＲＮＡの有無を検出することができる。
【００４７】
その他、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ法（Fernandez et al.,Mol. Carcinog, 20,317-326, 1997）を用いることによっても診断を行うことが可能である。
【００４８】
次に、２）のハイブリダイズ反応によってLin7c遺伝子の発現レベルを検出する場合、まず、上述した１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドを放射標識やビオチン標識してプローブを作製する。２本鎖のポリヌクレオチドは、例えば前記１）の手法により調製されたＰＣＲ反応物を、ニックトランスレーション法又はランダムプライムラベリング法などで32Ｐ標識することなどにより作製される。次に、被験用の細胞などより、常法により全ＲＮＡ又はポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出・精製し、常法によりホルムアルデヒドゲル電気泳動及びナイロンメンブレンへのブロッティングを行う。このメンブレンと、先のプローブとのハイブリダイゼーションを行うことにより、Lin7c遺伝子のｍＲＮＡ発現の有無を検出することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、２本鎖ポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合、例えば５０％（v/v）ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１０％（ｗ／ｖ）デキストラン、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡの条件で４２℃、１６−２４時間ハイブリダイズさせた後に、２×ＳＳＣ中で室温、１０分間２回洗浄し、更に６０℃、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で２０分間２回洗浄するような条件が挙げられる。当該ハイブリダイゼーションの結果として、陰性対象（健常人サンプル又はリンパ節転移を発症していない患者由来のサンプル）と異なり被験細胞においてLin7c遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量）が低下しているか、又は発現が消失している場合には、当該診断対象はリンパ節転移を発症しているか、又はリンパ節転移の発症リスクが高いと判断される。
【００４９】
なお、当該プライマーおよびプローブによる検出は、診断のみならず、組織のｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎにも応用される。
【００５０】
さらに、マイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を用いてLin7c遺伝子の発現レベルを検出することもできる。この場合、まず、Lin7c遺伝子全長又は上述した診断用のポリヌクレオチドをマイクロアレイ上で合成するか、又はマイクロアレイの表面に固定する。固定するポリヌクレオチドの長さとしては、15〜50塩基程度のものが例示される。次に、被験用の細胞などより全ＲＮＡ又はポリ（Ａ）ＲＮＡを調製し、これを蛍光等でラベルする。蛍光ラベルした全RNA又はポリ（Ａ）ＲＮＡを含む溶液をマイクロアレイに接触させ、固定化されたポリヌクレオチドと蛍光ラベルした全RNA又はポリ（Ａ）ＲＮＡとをハイブリダイズさせる。その後、マイクロアレイ上の蛍光を検出することなどにより、Lin7c遺伝子の発現レベルを検出することができる。
【００５１】
リンパ節転移抑制剤のスクリーニング方法
上述したように、Lin7c遺伝子の発現を亢進することでリンパ節転移の改善及び予防効果を期待することができ、Lin7c遺伝子自身をリンパ節転移の改善薬・予防薬の有効成分とすることもできるが、当該Lin7c遺伝子発現を増加させる物質も、同様にリンパ節転移の改善剤・予防薬の有効成分とすることができる。本発明においては、そのようなLin7c遺伝子の発現を促進する物質のスクリーニング方法を提供することができる。
【００５２】
すなわち、本発明により提供される、Lin7c遺伝子発現促進物質のスクリーニング系としては、Lin7c遺伝子の発現調節領域（プロモーター／エンハンサー）の３’末端にレポーター遺伝子を連結したプラスミドを宿主細胞に導入して形質転換細胞を作製し、当該形質転換細胞に供試物質を添加する系が例示される。ここで、レポーター遺伝子としては、プロモーター活性を検出することのできる遺伝子であれば特に限定されず、例えばルシフェラーゼ、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、ＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）、あるいはＧＨ（成長ホルモン）などの遺伝子が挙げられる。当該遺伝子を組み込んだレポーターベクターは、例えばpGL3-Basic Vector(ルシフェラーゼベクター；Promega社)等が市販されており、容易に入手できる。宿主細胞としては、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞などが一般的である。当該形質転換細胞は、レポーター遺伝子を一過的に発現するものであっても良いし、当該遺伝子を安定に発現できるものであっても良い。作製された形質転換細胞に対して被験物質を添加してインキュベーション後、細胞を破砕してレポーター活性（例えばルシフェラーゼ活性）を測定することで、供試物質によるLin7c遺伝子の発現促進能を判定することができる。
【００５３】
本スクリーニング系でLin7c遺伝子の発現促進能を有すると判定された供試物質は、リンパ節転移の改善剤・予防剤としての候補物質として、薬理試験に供されることとなる。ここで、供試物質としては、特に限定されず、機能未知の物質であっても機能既知の物質であっても良い。さらに、供試物質としては、リンパ節転移の抑制作用や予防作用が知られている物質を用いても良い。この場合には、リンパ節転移の抑制作用や予防作用が知られている物質によるLin7c遺伝子の発現促進機能をテストする、或いはリンパ節転移の抑制作用を再評価することとなる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定的に解釈されるものではない。
【００５５】
〔リンパ節転移症例に関与する遺伝子の解析〕
以下に説明する本実施例において使用されたヒトの口腔扁平上皮癌由来の細胞株はCa9-22、Ho-1-N-1、Ho-1-u-1、HSC-2、HSC-3、HSC-4 (ヒューマンサイエンス研究資源バンク,大阪)、OK92 (本発明者の研究室にて舌癌から初代培養されたもの)、Sa3 and H1 (和歌山県立医科大学の藤田先生から提供されたもの)である。全ての細胞株は150x20 mmディッシュ(Nunc, Roskilde,Denmark)上で、37℃に維持され（大気は5％の二酸化炭素と95％の空気で湿度が維持された大気）、10％牛胎児血清と50Units/mlのペニシリンとストレプトマイシンを含んだDulbecco's modified Eagle's medium F-12 HAM (SIGMA Chemical Co, St. Louis, MO)培養液にて培養した。
【００５６】
また、口腔外科手術を行った5人の患者から採取した口腔正常角化細胞は実験を通してのコントロール（NOK）として使用された。研究の開始前にインフォームド・コンセントを行いこれらの患者から同意を得ている。得られた正常口腔角化細胞の組織はDulbecco's phosphate buffered saline (PBS)中で洗われ、その後4℃で一晩0.25%のトリプシンEDTA溶解液(SIGMA)に漬けられた。結合組織から上皮組織を分離した後に、それらを優しくピペッティングを行いながら0.25%のトリプシンEDTA溶解液で、15分37℃でインキュベートし細胞成分に解体した。分離された上皮細胞はコラーゲンI、コーティングされた60mmディッシュに撒かれ、0.4%の牛下垂体エキス(BPE)、0.1%のハイドロコルチゾン副腎ホルモン、0.1%のトランスフェリン、0.1%のエピネフリン、および0.1%のGA-1000(Clonetics)を含有したKeratinocyte Basal Medium-2 (Clonetics, MD, USA)培養液で培養した。
【００５７】
また、本実施例では、千葉大学の倫理審査委員会によって承認された説明文に従ってインフォームド・コンセントが得られた患者から腫瘍組織と正常口腔組織(入手可能な時)を同時に、千葉大学病院での手術時に入手した。切除された組織は2つの部分に分け、一方は直ちに凍結し、使用まで-80℃に蓄えられて、他方は病理学診断用に10%ホルマリンで固定した。各癌の組織の組織病理学的な診断は、千葉大学病院の病理部門により腫瘍の国際的な組織分類に従って行った。臨床病理のステージ決定はInternational Union against Cancer のTNM分類によって決定した。すべての患者は組織学的に扁平上皮癌と診断され、それぞれの腫瘍サンプルは、検体の80%以上が腫瘍組織であることが保証されているかのチェックが行った。ゲノムDNAはプロティナーゼK消化法にて抽出され、トータルRNAはメーカーのプロトコルに従って、Trizol試薬(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA)を使って抽出した。
【００５８】
リンパ節転移症例で発現が有意に低下する遺伝子の同定
HSC-2、HSC-3及びNOKsから抽出したタンパク質溶液を２次元電気泳動に供試、ゲルイメージを解析し、リンパ節転移症例において有意に発現が低下しているスポットを特定した。その後、当該スポットを質量分析に供してpeptide-mass fingerprintingによって、当該スポットのタンパク質を同定した。詳細を以下に述べる。
【００５９】
先ず、完全な単層に成長した培養細胞を7Mの尿素、2Mのチオ尿素、4%w/v CHAPS、10mM Tris pH8.0を含む溶解バッファによって処理し、超音波処理(氷上で3x10sパルス)により溶解した。サンプルは20分間、13000rpmで遠心分離し、タンパク質を含んでいる上澄み液を取り出した。タンパク質濃度はProtein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)によって測定し、溶解バッファによって1mg/mlに調節した。タンパク質サンプルは30mM Tris HClでpH8.5に調整した。この研究における、5つの正常口腔粘膜上皮細胞（NOKs）のタンパク質は独立して抽出されて、定量後同量ずつ混合した。
【００６０】
標識前の各サンプルから同量ずつタンパクを取り、コントロール用サンプル（pooled standard sample）とした。およそ50μgのそれぞれのタンパクを4μlに抽出したものに1μlのCyDye Cy2、Cy3又はCy5(各0.2mM) (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)を混ぜ、氷上で30秒間インキュベートした。そして、10mM lysine(試薬400ピコモルあたり1μl)の添加によって反応を停止させ、氷上で10間静置した。
【００６１】
前述の通りCy2でラベリングされたコントロール用サンプルと、Cy3又はCy5でラベリングされたサンプルとを実験デザインに従った組み合わせで混ぜ、等電点電気泳動(IEF)に用いた。混ぜ合わせたラベリング済みのサンプルに同量の2xサンプルバッファ(7 Mの尿素、2Mのチオ尿素、4% w/v CHAPS、2% v/v Pharmalytes pH3-10)を追加した。サンプルの総量を標準再水和バッファ(7 Mの尿素、2Mのチオ尿素、4% w/v CHAPS、1% v/v Pharmalytes pH 3-10)によって450μlに調節した。Immobiline DryStrips(pH 3-10 NL、24cm)はIEFに用いる前にメーカー(Amersham Biosciences)のプロトコルに従って再水和した。IEFはIPGphor ＩＩ IEFユニット(Amersham Biosciences)を用いて最大電流50μA/strip、20℃の設定で、500Vhで500V、1000Vhで1000V、および64000Vhで8000Vまで行った。2次元目の電気泳動は、Ettan DIGEシステム(Amersham Biosciences)を用いて、標準のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)プロトコルによって行った。
【００６２】
2次元電気泳動は、12%のアクリルアミドisocratic Laemmliゲルで、Ettan DALT six装置(Amersham Biosciences)を使って行った。20℃の条件でブロモフェノールブルー色素がゲルの底面に到達した時点で電気泳動を終了させた。
【００６３】
次に、ゲルイメージ解析のため、ゲル上のラベリングされたタンパク質をTyphoon 9400 imager(Amersham Biosciences)を用いて視覚化した。Cy2イメージは、蛍光フィルタ520nm BP（band pass）40で、488nmレーザーを使ってスキャンした。Cy3イメージは、蛍光フィルタ580nm BP30で、532nmレーザーを使ってスキャンした。Cy5イメージは、蛍光フィルタ670nm BP30で、633nmレーザーを使ってスキャンした。すべてのゲルは100μmの解像度でスキャンした。
【００６４】
分析に先がけてImageQuant V 5.0(Amersham Biosciences)を用いて、ゲルイメージと無関係なエリアを取り除き、イメージを切り出した。ゲルイメージは、DeCyder Batch ProcessorとDIA(differential in-gel analysis)ソフトウェアモジュール(Amersham Biosciences)を用いて自動的に分析された。個々のゲルで、Cy2でラベリングされたイメージ(コントロール用サンプル)は、DeCyder-DIAソフトウェアを使って、それぞれ、NOKs、HSC-2、およびHSC-3からのCy3またはCy5のイメージのいずれかと比較された。イメージを標準化するためにDyCyder-BVA(biological variation analysis)ソフトウェア(Amersham Biosciences)を用い、それぞれのゲル上の、Cy2でラベリングされたコントロール用サンプルを基準に各ゲルをマッチさせる事で、ゲルのイメージを比較した。ゲル上のスポット検出のための概算数は、3000に設定した。サンプル間タンパク質量の変化の統計分析に続き、基準スポットマップの複数ゲル間での重ね合わせをDeCyder-BVAソフトウェアモジュールを用いて行った。それぞれの発現レベルの統計的有意差は、ログ比率でのスチューデントのｔ検定を用いて計算した。この分析は、ペアでt検定をすることと等しく、ゲル中のサンプルのペアを考慮することで精度を高めた。研究において使われた全てのゲルにおいて発現レベルが統計的に有意な(p<0.001)増加または減少を示したタンパク質スポットのみを発現差があるスポットとみなした。
【００６５】
2次元電気泳動の結果及びゲルイメージ解析の結果を図１に示した。図１中、矢印で示したスポットが、リンパ節転移症例において有意に発現低下したタンパク質を示している。
【００６６】
リンパ節転移症例において有意に発現低下したスポットを切り出し質量分析及びpeptide-mass fingerprintingに供した。HSC-2、HSC-3及びNOKsそれぞれについて、スポット切り出し用に別に電気泳動されたゲルを固定し、SYPRO Ruby(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA)で染色した。ゲルの蛍光イメージはDeCyderソフトウェアを使ってCyDyeイメージと重ね合わせた。ピックアップするスポットのリストはDeCyderから生成され、自動スポット取り扱いシステム、Ettan spot picker (Amersham Biosciences)にエクスポートされた。
【００６７】
Spot pickerにより画素情報をDeCyderソフトウェアからリファレンスマーカーと共にx-y座標に変換した。目的のスポットを直径2mmの丸いプラグとして切除し、96wellマイクロタイタプレートの中に移した。ゲルから切除したタンパク質のスポットを、50mM NH4HCO3、5mM CaCl2、および12.5 ng/μlトリプシンを含んでいる酵素溶液によってゲル内消化した。精製されたサンプルを、α-シアノ-4-ヒドロキシル桂皮酸のマトリックス結晶と混合した状態でステンレス鋼ターゲット上に固定し、空気で乾燥させた。質量決定は、AXIMA-CFR質量分析計(Shimadzu Co. Ltd., Kyoto, Japan) を用いて行った。タンパク質は、Web上の Mascot Search (Matrix Science, Ltd., London, UK)を用いて、peptide-mass fingerprinting (PMF)法によって同定された。
【００６８】
MALDI-TOF-massの結果を図２に示した。その結果、リンパ節転移症例においては、Lin7cタンパク質の存在量が有意に低下していることが明かとなった。
【００６９】
免疫組織化学
次に、本実施例では、免疫組織化学（IHC）染色によって、リンパ節転移症例及びリンパ節転移のない症例におけるLin7cタンパク質の発現レベルを観察した。IHC染色は、パラフィン包埋標本を厚さ4μmでスライスし、脱パラフィンと水洗後、30分間の0.3% H2O2で内因性ペルオキシダーゼを処理し、その後、室温で2時間、1.5%のブロッキング血清(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)入りPBSで処理し、100倍希釈のLin7C抗体(Santa Cruz Biotechnology)を、湿潤箱のなかで、室温で30分間インキュベートし、PBSバッファにより3回洗ことで行った。
【００７０】
次に、エンビジョンリージェントキット(Dako, Kyoto, Japan)で処理して、3，3’-ジアミノベンジジン四塩酸塩(Dako)で発色を行う。最後に、ヘマトキシリンによって対比染色し、マウントした。ネガティブなコントロールとして、2箇所のセクションは一次抗体なしで免疫染色を行った。免疫組織化学染色の結果を図３A-Dに示した。図３Aは正常口腔組織の代表例であり、細胞膜にこのLin7cタンパクが発現していることを示している。図３Bは口腔扁平上皮癌組織であってリンパ節転移のない症例の代表例あり、細胞膜にこのタンパクが発現していることを示している。図３Cは口腔扁平上皮癌組織であってリンパ節転移のある症例の代表例であり、細胞膜におけるLin7cタンパクの発現が低下していることを示している。図３Dはリンパ節転移組織の代表例であり、細胞膜のこのタンパクの発現が低下していることを示している。
【００７１】
次に、Lin7cタンパク質発現を測定するために、ポジティブな腫瘍細胞の平均の百分率で表したスコア法を使用した。その方法は、各セクション中の400倍拡大で、ランダムに少なくとも5つのフィールドを選択し、Lin7cの染色強度を次の通り得点付けした。すなわち、weakには加点１、moderateには加点２及びintenseには加点３とした。この値に、ポジティブな腫瘍細胞のパーセンテージを掛け合わせたものを、IHCスコアとした。Lin7c-IHCスコアが56未満のケースはネガティブであると考えた。患者の臨床状態に関係するいかなる情報や知識も持たない2人の病理学者が別々に、各ケースのスコアをつけた。Lin7c-IHCスコアと臨床病理の機能間の統計的有意差はフィッシャーの正確確立検定よって評価された。P<0.05は重要であると考えられた。
【００７２】
臨床指標との比較の結果を、IHCスコアで分散図として図４A-Cに示した。図４Aにおいて、Tは腫瘍臨床検体を意味し、Nは正常口腔組織を意味し、ｐN(‐)はリンパ節非転移症例を意味し、ｐN(＋)はリンパ節転移症例を意味している。図４Bは癌部のIHCスコアを正常組織のIHCスコアで割ったものをリンパ節非転移症例（ｐN(‐)）とリンパ節転移症例（ｐN(＋)）とに分けて分散図として示している。図４Cは、免疫組織学的染色で使用した検体のmRNAを用いて、定量的RT-PCR法でLin7c遺伝子のｍRNAの発現値を確認し、癌部の発現値を正常組織で割った百分率を、リンパ節非転移症例（ｐN(‐)）とリンパ節転移症例（ｐN(＋)）に分けて分散図として示している。図４A〜Cから判るように、リンパ節転移を有する症例では、Lin7cタンパクの発現がタンパク質レベル及びmRNAレベルにおいて有意に低下していることが明かとなった。
【００７３】
なお、Lin7c遺伝子のｍRNAの発現レベルを測定するための定量的RT-PCRは以下のように行った。コントロールには逆転写反応のないものを用意した。cDNA合成の前に、残留するゲノムDNAをDNaseＩtreatment (DNA-free; Ambion, Austin, TX)を使って全RNAから除去し、SuperscriptTM reverse transcriptase (Life Technologies, Grand Island, NY) とoligod (T) primerを使用して逆転写した。
【００７４】
Lin7c遺伝子のmRNA発現を確認するためのプライマーとして、5’-ACGCAGGCAACAGACCTAAT-3’(nucleotides 580-599；配列番号３)及び5’-CCACTACTCCCGTTAAGACA-3’(nucleotides 821-802；配列番号４)を設計し、合成した。増幅された産物は３％アガロースゲルを用いた電気泳動を行い、産物の大きさと純度を確認した。PCR産物を確認するため、pCR 2.1vector (Invitrogen)を用いてクローニングを行った。その後、LightCycler FastStart DNA Master SYBR GreenＩkit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を用いてReal-Time PCRを行った。
【００７５】
スタンダードカーブを作成するために、正常口腔組織から抽出した全RNAの300、30、3.0及び0.3ngからcDNAを転写した。LightCycler (Roche)を使用したPCR反応は、通法に従い2μ1のFirstStart DNA Master SYBR GreenＩmix(Roche）、3 mMのMgCl2、0.2μ1のプライマーを含む最終反応容量20 μlの混合液を使用した。反応液は、ガラス製のキャピラリーチューブにいれ、初期変性は95℃10分、増幅のためのサイクル数は４５回で、変性95℃10秒、アニーリング56℃10秒、伸長反応72℃で冷却プログラムの温度変化率は、20℃/秒とした。転写されたLin7c遺伝子のmRNA量は、それぞれのスタンダードカーブとnormalized to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)から計算した。
【００７６】
発現低下したLin7c遺伝子の解析
Lin7c遺伝子の発現が有意に低下しているリンパ節転移症例において、Lin7c遺伝子の発現低下がDNAの突然変異又はエピジェネティックな制御であると仮定し、DNA sequence method及びPCR-based methylation assay を行った。
【００７７】
Lin7c遺伝子のシーケンスの変化をPCR-direct sequencing methodを用いて解析した。5つのオリゴプライマーを用いてエクソン1−5を含むLin-7C 遺伝子の完全長クローニングを行った。
【００７８】
すべてのエクソンおよびそれに隣接するイントロのシーケンスは、ヒューマンゲノムサイエンスのデータを参考にした。PCRで使用したプライマーはPrimer 3 プログラムを用いて作成した。各エクソン増幅に対し使用したプライマーは以下のとおりである。
エクソン1を増幅するため、5’-GGTACTCACTTTTCCGGCTTC-3’（配列番号５）及び5’-ATTGGCATTCGGGAGGAGACA-3’（配列番号６）を設計した。エクソン2を増幅するため5’-TTGCCCTTGAGGAATGAATC-3’（配列番号７）及び5’-GGTCAGGGAGAGTAAAAACC-3’（配列番号８）を設計した。エクソン3を増幅するため5’-TCACAGAGAACTCAAGCATGG-3’（配列番号９）及び5’-AAGTTCGATGTGGTTTAAAGAGT-3’（配列番号１０）を設計した。エクソン4を増幅するため5’-GGGGGAAACAAAAGATGAAAG-3’（配列番号１１）及び5’-TTTACGGAACTCCCTTAGGA-3’（配列番号１２）を設計した。エクソン5を増幅するため5’-TGGTAAGGCAGGATTATTTCTT-3’（配列番号１３）及び5’-ATGATTACCGACGTTACGGT-3’（配列番号１４）を設計した。
【００７９】
上述のプライマーセットを用いて、100ngのテンプレートDNAに対して0.01単位のLA-Taq DNA polymerase (Takara)を加え、滅菌蒸留水で25μlになるよう調整した。PCRは以下のサイクルでおこなった。すなわち、94℃、10秒の変性処理の後、60℃、10秒のアニーリング反応、72℃、30秒の伸長反応を１サイクルとし、45サイクル行った。配列決定はPerkin Elmer社のDye Terminator sequencing kitを用いて行った。エタノール沈殿物は5% LongRange/8 Mの尿素を含む36cmのロングゲル上で泳動・抽出したのちPerkin Elmer 社のABI377で分析した。
【００８０】
分析の結果として得られたチャートを図５に示した。Lin7c遺伝子の発現が低下している２０症例中６症例のDNA配列に変化が認められ、これら６例中、図５に示した４症例でアミノ酸の変化を伴った突然変異が検出された。
【００８１】
また、Lin7c遺伝子のCpG island周辺のメチレーションは、PCR-based methylation assayで解析した。DNAサンプルはエタノール沈殿後、滅菌蒸留水に溶解しmCpG-sensitive BstUＩ(1μg/unit, New England Biolabs, Beverly, MA)中で60℃、16時間処理した。処理後のDNAは、以下のプライマーを用いて増幅した（図６参照）。すなわち、forwardプライマー5’-CCAGGCTTGACTCCTCTACG-3’（配列番号１５）及びreverseプライマー5’-ATCGAAAACACGGGGAGGAT-3’（配列番号１６）を使用した。PCRは、処理後のDNAサンプル１μlに対し2.5pmolのプライマー、50μM dNTPs、10mM Tris-HCl buffer (pH 8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2及び0.5単位のAmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA)を添加し、25μlの反応液でおこなった。増幅後のPCR産物は3％アガロースゲル上で電気泳動を行い、エチレンブロマイド伝染した後、紫外線を照射し可視化した。末梢血のDNAをSssＩmethylase (New England Biolabs)で処理したものを、ポジティブコントロールとして使用した。また未処理の末梢血をネガティブコントロールとして使用した。電気泳動の結果を図７に示す。
【００８２】
また、DNAメチルトランスフェラーゼインヒビターである5-aza-2’-deoxycytidine(5-aza-2’-dC)(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を用いて脱メチル化解析を行い、Lin7c遺伝子のmRNAの発現回復を、口腔扁平上皮癌由来細胞株（Ca9-22、OK92、Ho-1-N-1、Ho-1-u-1、HSC-2、HSC-3、HSC-4、Sa3及びH1）にて確認した。各細胞は5-aza-2’-dC剤の濃度0あるいは2μMの溶液中で5日間処理し、PBSで洗浄後、さらに無反応液中で10日間培養した。その後RNAを抽出し、定量的リアルタイムPCRでLin7c遺伝子の発現状態を確認した。結果を図８に示す。
【００８３】
図６に示すように遺伝子５’側プロモーター領域にグアニンとシトシンが豊富に存在する、CpG islandがある場合、その領域のメチル化の有無が、遺伝子の発現を調節していると言われている。正常組織ではメチル化されておらず、遺伝子の発現スイッチがONの状態になっているが、癌組織ではメチル化されており、発現スイッチがOFFになっている。これが現在認められた重要な癌抑制遺伝子の発現低下の原因と考えられている。図７に示したように、口腔扁平上皮癌由来細胞株では、９株中９株で、Lin7c遺伝子の発現が低下している２０症例中１８症例でCpG island領域のメチル化が検出された。また、図８に示したように、メチル化の認められた口腔扁平上皮癌由来細胞株すべてで、脱メチル化剤を培養液中に入れ培養すると、Lin7c遺伝子のｍRNAの発現が回復した。
【００８４】
〔Lin7c遺伝子の機能解析〕
Invasion Assay
先ず、口腔扁平上皮癌由来細胞株９株に、トランスフェクション試薬であるFuGENE-6を用いて、ヒトLin7cのcDNAを導入した発現ベクター（pME18SFL3）をトランジェントに導入した。導入後、４８時間留置した。Mock細胞としてベクター（pME18SFL3）のみを同様に導入した細胞株をコントロールとして用いた。トランスフェクション後、リアルタイムPCRで遺伝子発現状態を確認した。リアルタイムPCRは前述のとおりである。結果を図９に示す。
【００８５】
次に、トランスフェクション後、各細胞株をスライドガラスに培養したのち、４％パラホルムアルデヒドで５分間固定した。その後、0.01% Triton X-100 PBS溶液（pH 7.4）中で10分間浸透し、5%スキムミルクPBS溶液（pH7.4）中で非特異的抗体ブロッキング処理を1時間行った。その後、一次抗体（goat anti-Lin7c (Santa Cruz Biotechnology、1:100希釈)中で2時間インキュベートを行いPBSで洗浄後、二次抗体（rabbit anti-goat secondary antibody labeled with Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands)）中で1時間インキュベート後、蛍光顕微鏡で観察した。蛍光顕微鏡は、Leica DMIRBE inverted stand equipped with a Leica TCS2-MP confocal system(Leica Laserteknik, Mannheim, Germany)とCoherent Mira tuneable pulsed titanium sapphire laser(Coherent Laser Group, Santa Clara, CA, USA)を使用した。結果を図１０に示す。
【００８６】
次に、得られた９つのトランスフェクション細胞の浸潤能をQCMTM 96-Well Cell Invasion Assay Kit (Chemicon, Temecula, CA)を用いて解析した。ECMatrixTMでコーティング処理したメンブレンからなる９６ウェルチャンバーの１ウェルに、5×105個/mlの細胞濃度となるように血清非含有培地（Dulbecco’s modified Eagle’s medium F-12 HAM ）を0.1ml入れ、そのチャンバーを、１ウェルに１５０μｌの血清含有培地を入れた９６ウェルトレーに差し込み、37℃、５％CO2中のインキュベータ内で16時間培養した。その後、メンブレン通過した浸潤能をもつ細胞を剥離するために、１ウェルに150μlの剥離液を入れた９６ウェルトレーに差込み、３０分間処理した。メンブレンより剥離した細胞を、CyQuant GR dyeで発色させ480/520nｍで検出した。結果を図１１に示す。
【００８７】
図９に示したように、遺伝子導入法により、発現低下していたLin7c遺伝子を強制発現させることに成功した。図９において「Mock」は発現ベクターのみを導入した口腔扁平上皮癌由来細胞株を示し、「Lin7c遺伝子」はLin7c遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した口腔扁平上皮癌由来細胞株を示している。図９に示したように、Lin7c遺伝子のmRNAを５０〜３０００倍の範囲で強制発現できた。
【００８８】
また、図１０に示したように、強制発現されたLin7c遺伝子は、Lin7cタンパク質として細胞膜に存在していることが確認された。さらに、図１１に示すように、細胞膜にLin7cタンパク質を発現している口腔扁平上皮癌由来細胞株では、細胞の移動、及び浸潤能が抑制されることが明かとなった。
【００８９】
パスウェイ解析
次に、Lin7cタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする標的遺伝子群を、Ingenuity Pathway Analysis software (Ingenuity Systems, Mountain View, CA)を用いてパスウェイ解析した。その結果、20遺伝子が選び出された（図１２）。選び出された各遺伝子のmRNAの発現量をリアルタイムPCRを用いて解析した。リアルタイムPCRに使用するプライマーは上述のPrimer 3 programを用いて作成した。使用した各プライマーは表１の通りである。
【００９０】
【表１】
2008169132.tif 000002
【００９１】
リアルタイムPCRの結果を図１３に示す。図１３に示したように、パスウェイ解析によって選び出された２０遺伝子のmRNA全てにおいて、発現量が変化することが明かとなった。すなわち、Lin7cタンパク質は、これら２０遺伝子によってコードされたタンパク質群と直接的又は間接的に相互作用することが明かとなった。これら２０遺伝子には、口腔扁平上皮癌において細胞接着、及び浸潤・転移との関係が報告されている細胞接着機構カドヘリンーカテニンシステムに関与する遺伝子群が含まれている。
【００９２】
免疫化学染色及びウェスタンブロット解析
パスウェイ解析によりリストアップされた遺伝子のうち、口腔扁平上皮癌で細胞の接着、及び浸潤・転移との関係が報告されている細胞接着機構カドヘリンーカテニンシステムに関与する遺伝子として、CTNNB1（表１におけるNo.1）及びCASK（表１におけるNo.2）に注目した。図１３に示した結果から、これら各遺伝子のｍRNAレベルは、正常口腔粘膜由来表皮角化細胞と比較して、口腔扁平上皮癌細胞で低下しているが、Lin7c遺伝子を強制発現させるとこれに伴い同様に強発現を示した。パスウェイ解析によれば、Lin7c遺伝子はCASK遺伝子を介してCTNNB1遺伝子と関与している。これらCASK遺伝子及びCTNNB1遺伝子の発現状況と、Lin7c遺伝子の発現状況とが同様なプロファイルを示していることから、Lin7c遺伝子の発現状況と、細胞接着機構は密接に関係していることが示唆された。すなわち、Lin7c遺伝子の発現低下によって細胞接着システムの崩壊が生じる結果、癌細胞の移動を許可していると考えられた。これを裏付けるため、Lin7c抗体、CASK抗体及びCTNNB1抗体を用いて免疫化学染色及びウェスタンブロット解析を行った。
【００９３】
免疫化学染色では、先ず、細胞株HSC3をスライドガラスに培養し、PBSで洗浄後、４％パラホルムアルデヒドで５分間固定、0.01％Triton X-100含有のPBSで10分間浸透し、５％スキムミルク含有PBSで非特異的抗体ブロッキング処理ブロッキングを１時間おこなった。PBSで洗浄後、Lin7c、CASK、CTNNB1の抗体を２時間インキュベートした。PBSで洗浄後、Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Leiden, the Netherlands)を１時間インキュベートした。さらに、核染色のためDAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)で染色した。カバーガラスをかけて、蛍光装置を備える顕微鏡（Leica DMIRBE）で観察し、蛍光画像をLeica TCS2-MP confocal system (Leica Laserteknik, Mannheim, Germany)でイメージングした。結果を図１４に示す。
【００９４】
また、ウェスタンブロット解析では、Lin7cを導入した細胞株及びMOCKを導入した細胞株並びに未導入の細胞株からそれぞれタンパク質成分を抽出し、Lin7c抗体、CASK抗体、CTNNB1抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。
【００９５】
詳細には、タンパク質抽出溶液を１０％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、PVDF膜（Bio Lad）へ転写した。0.1％Tween-20含有TBS（T-TBST）で洗浄後、5％スキムミルク含有T-TBSTでブロッキングを30分行い、Lin7c抗体、CASK抗体又はCTNNB1抗体を16時間インキュベートした。T-TBSTで洗浄後、ヒストファインビオチン標識抗ヤギIgG抗体（ニチレイ）の２次抗体を2時間インキュベートし、ECL＋Kit（アマシャム）を用いて発光させ可視化させた。結果を図１５に示す。
【００９６】
図１４及び１５に示したように、Lin7c遺伝子を強制発現させることによって、CASK遺伝子及びCTNNB1遺伝子の発現レベルが回復することが、タンパク質レベルで明かとなった。この結果、やはりLin7c遺伝子の発現レベルを回復することによって、細胞接着細胞接着システムを回復させることができ、癌細胞が一旦獲得した浸潤能及び転移能を抑制できることが明かとなった。
【００９７】
細胞遊走能の解析
次に、Lin7c遺伝子の機能解析の一環として、wound healing assay（引っかき試験）によって細胞遊走能を解析した。先ず、ヒト全長Lin7c constructをToyoboより購入し、pcDNA4/TO vectors (Invitrogen)へ挿入したのち、FuGENE6 kit (Roche)を用いてCa9-22細胞株へ導入した。Zeocin (Sigma)を用いてクローニングし、Lin7c安定発現株であるCa9-22Lin-7C 5-5とCa9-22Lin-7C a-1を作製した。Lin7c遺伝子の発現は、モノクローナル抗体(Santa Cruz)を用いてウエスタンブロッティングで確認した。
【００９８】
作製したCa9-22Lin-7C 5-5、Ca9-22Lin-7C a-1、Ca9-22Lin-7C Mock（ベクターのみ導入した株）にて、wound healing assay（引っかき試験）を行った。具体的には、ディッシュに細胞を播き、単層のコンフルエントの状態で、マイクロピペットチップを用いて直線に細胞を引っかいた。その後、顕微鏡（Leica DMIRBE ）200倍率で4時間後、8時間後に細胞の状態を観察した。結果を図１６に示す。
【００９９】
図１６に示したように、Lin7c遺伝子を強制発現させた口腔扁平上皮癌細胞株2株と、発現ベクターのみを導入した細胞株における細胞遊走能を比較したところ、コンフルエント状態の細胞単層を引っ掻いてから8時間後で、遺伝子発現株2株とベクターのみの細胞とでは細胞の移動距離が明らかに異なっていた。この結果から、Lin7c遺伝子の発現により、口腔扁平上皮癌細胞における細胞遊走能が有意に抑制されることが認められた。
【０１００】
転移能の解析
次に、Lin7c遺伝子の機能解析の一環として、ヒト口腔扁平上皮癌由来細胞株を舌に移植した実験動物を作製し、当該動物における癌転移を観察することで、Lin7c遺伝子の強制発現による転移能抑制効果を検証した。
【０１０１】
先ず、各クローンから2×105個の細胞を調整し、生後６週間のthe BALB/cAnNcrj-nu/nu mice(Charles River Japan)の舌へ直接注入した。その後、検体マウスの舌とともに顎下腺、肝臓、肺を採取し、DNAを抽出した。そのサンプルを、ヒト特異的Alu シークエンスのプライマーを用いたRT-PCRで発現を確認した。また、発現量の比較基準として、各サンプルに対しマウス特異的遺伝子であるARG RICHの検出を同じくPCRで行った。
【０１０２】
すべてのマウスは無病原体下（specific pathogen-free conditions）で飼育した。また動物実験はすべてChiba University laboratory animal centerのガイドラインにのっとり進められた。RT-PCRの結果を図１７に示した。その結果、ベクターのみの細胞を移植した5例中4例に肺への転移が認められたのに対し、Lin7c遺伝子を強制発現させた細胞株の移植では5例全てにおいて転移は認めらなかった。この結果から、Lin7c遺伝子の発現により転移が有意に抑制されたことが動物実験を用いた系において確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】二次元電気泳動及びゲルイメージ解析の結果を示す写真である。
【図２】MALDI-TOF-massの結果を示すスペクトル図である。
【図３】免疫組織化学染色の結果を示す写真である。
【図４】臨床指標との比較の結果をIHCスコアで示す分散図である。
【図５】配列解析の結果として得られたチャート図である。
【図６】Lin7c遺伝子のプロモーター領域におけるCpG islandを示す模式図である。
【図７】PCR-based methylation assayにおける電気泳動の結果を示す写真である。
【図８】定量的リアルタイムPCRでLin7c遺伝子の発現状態を確認した結果を示す特性図である。
【図９】Invasion AssayにおけるリアルタイムPCRの結果を示す特性図である。
【図１０】Invasion Assayにおける蛍光顕微鏡観察の結果を示す写真である。
【図１１】Invasion Assayにおける浸潤能を示す特性図である。
【図１２】パスウェイ解析によって選び出された２０遺伝子のネットワークを示す模式図である。
【図１３】パスウェイ解析によって選び出された２０遺伝子の発現状態を示すリアルタイムPCRの結果を示す特性図である。
【図１４】CTNNB1抗体及びCASK抗体を用いた免疫化学染色の結果を示す写真である。
【図１５】Lin7c抗体、CTNNB1抗体及びCASK抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１６】wound healing assayの結果を示す写真である。
【図１７】ヒト口腔扁平上皮癌由来細胞株を舌に移植した実験動物から採取した各種組織におけるRT-PCRの結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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