(57)【要約】【課題】検体中の抗体を従来よりも高感度に検出できる試薬及び検出方法を提供すること。【解決手段】第１の抗ＨＩＶ抗体（第１抗体）に結合可能な第１抗原が感作され、第１抗体を特異的に検出する第１担体粒子と、第２の抗ＨＩＶ抗体（第２抗体）に結合可能な第２抗原が感作され、第２抗体を特異的に検出する第２担体粒子と、を含む抗ＨＩＶ抗体検出試薬を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する抗体を検出する試薬であって、
第１の抗ＨＩＶ抗体（第１抗体）に結合可能な第１抗原が感作され、前記第１抗体を特異的に検出する第１担体粒子と、
第２の抗ＨＩＶ抗体（第２抗体）に結合可能な第２抗原が感作され、前記第２抗体を特異的に検出する第２担体粒子と、を含む抗ＨＩＶ抗体検出試薬。
【請求項２】
前記第１抗原が、前記第１担体粒子に結合されたハプテンと前記ハプテンに結合可能なハプテン結合物質とを介して前記第１担体粒子に感作され、
前記第２抗原が、前記第２担体粒子に結合されたハプテンと前記ハプテンに結合可能なハプテン結合物質とを介して前記第２担体粒子に感作される、請求項１記載の試薬。
【請求項３】
前記ハプテンがビオチンであり、前記ハプテン結合物質がアビジンある、請求項２記載の試薬。
【請求項４】
前記第１担体粒子が、前記第１抗原以外のＨＩＶ抗原を実質的に感作されておらず、
前記第２担体粒子が、前記第２抗原以外のＨＩＶ抗原を実質的に感作されていない、請求項１〜３の何れかに記載の試薬。
【請求項５】
前記第１抗体が、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）に対する抗体であり、
前記第２抗体が、２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）に対する抗体である、請求項１〜４の何れかに記載の試薬。
【請求項６】
前記第１抗原が、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）のｅｎｖ領域の抗原であり、
前記第２抗原が、２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）のｅｎｖ領域の抗原である、請求項１〜５の何れかに記載の試薬。
【請求項７】
前記第１抗体が、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）のｅｎｖ領域のｇｐ４１抗原に対する抗体であり、
前記第１抗原が、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）のｅｎｖ領域のｇｐ４１抗原であり、
前記第２抗体が、２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）のｅｎｖ領域のｇｐ３６抗原に対する抗体であり、
前記第２抗原が、２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）のｅｎｖ領域のｇｐ３６抗原である、請求項１〜６の何れかに記載の試薬。
【請求項８】
前記第１抗原が、リコンビナント抗原であり、
１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）のｅｎｖ領域のｇｐ４１のペプチド抗原が感作され、前記第１抗体を特異的に検出する第３担体粒子をさらに含む、請求項７記載の試薬。
【請求項９】
前記第１担体粒子及び前記第２担体粒子が、磁性粒子である、請求項１〜８の何れかに記載の試薬。
【請求項１０】
前記第１担体粒子及び前記第２担体粒子が容器内で緩衝液中に分散している、請求項１〜９の何れかに記載の試薬。
【請求項１１】
前記第１担体粒子及び前記第２担体粒子の粒径が０．５〜５μｍである、請求項１〜１０の何れかに記載の試薬。
【請求項１２】
試薬中の担体粒子の濃度が０．５〜２０ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜１１の何れかに記載の試薬。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れかに記載の試薬と、前記第１抗体及び前記第２抗体に結合可能な標識抗体を含む標識抗体試薬と、を備える抗ＨＩＶ検出試薬キット。
【請求項１４】
前記標識抗体が、酵素により標識された抗体であり、
前記酵素に対する基質を含む基質試薬をさらに備える、請求項１３記載の試薬キット。
【請求項１５】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する抗体を検出する試薬を製造する方法であって、
前記ＨＩＶに対する第１抗体に結合可能な第１抗原を第１担体粒子に感作する工程、
前記ＨＩＶに対する第２抗体に結合可能な第２抗原を第２担体粒子に感作する工程、及び
前記第１抗原が感作された第１担体粒子と前記第２抗原が感作された第２担体粒子とを混合する工程、を含み、
前記第１担体粒子が前記第１抗原以外のＨＩＶ抗原が実質的に感作されておらず、
前記第２担体粒子が前記第２抗原以外のＨＩＶ抗原が実質的に感作されていない、抗ＨＩＶ抗体検出試薬の製造方法。
【請求項１６】
検体中のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する抗体を検出する方法であって、
前記検体と、前記ＨＩＶに対する第１抗体に結合可能な第１抗原が感作され、前記第１抗体を特異的に検出するための第１担体粒子と、前記ＨＩＶに対する第２抗体に結合可能な第２抗原が感作され、前記第２抗体を特異的に検出するための第２担体粒子とを混合する工程、
前記第１担体粒子上に形成された前記第１抗体と前記第１抗原との第１複合体と、前記第２担体粒子上に形成された前記第２抗体と前記第２抗原との第２複合体とを検出する工程、
を含む、抗ＨＩＶ抗体の検出方法。
【請求項１７】
前記検出工程において、前記混合工程において得られた混合液に前記第１抗体及び前記第２抗体に結合可能な標識抗体を添加し、この標識抗体の標識に基づいて前記第１複合体と前記第２複合体とを検出する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記検出工程において、前記第１複合体と前記第２複合体とを定量することにより、前記検体中の抗ＨＩＶ抗体を検出する、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体に含まれる抗ＨＩＶ抗体を検出するための試薬、試薬キット、試薬の製造方法及び抗ＨＩＶ抗体を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus: HIV）は、エンベロープ（ｅｎｖ）を有する一本鎖ＲＮＡ（＋鎖）ウイルスであり、レトロウイルス科に属する。ＨＩＶには、１型ＨＩＶ（Human Immunodeficiency Virus type1: HIV-1）及び２型ＨＩＶ（Human Immunodeficiency Virus type2: HIV-2）が存在する。生体にＨＩＶが侵入すると、生体内ではＨＩＶを排除するためにＨＩＶに結合可能な複数種類の抗体が産生される。この生体から血液などの検体を採取し、抗ＨＩＶ抗体を検出することにより、この生体がＨＩＶに感染しているか否かを検査することができる。
【０００３】
検体中の抗ＨＩＶ抗体を検出する方法としては、例えば特許文献１に記載の方法が知られている。この方法によると、ＨＩＶ−１のｇａｇ領域ｐ２４リコンビナント抗原をＨＩＶ抗原として感作したヒト赤血球と、ＣＫＳ（ＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−マンノオクチュロソネート・シチジル・トランスフェラーゼ又はＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ）とを含む試薬を用いることにより抗ＨＩＶ抗体の検出が行われる。
【０００４】
【特許文献１】特開平７−３０１６３３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、検体中の抗ＨＩＶ抗体を従来よりも高感度に検出することのできる試薬、試薬の製造方法及び抗ＨＩＶ抗体の検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、第１の抗ＨＩＶ抗体（以下、第１抗体とする）に結合可能な第１抗原が感作され、第１抗体を特異的に検出する第１担体粒子と第２の抗ＨＩＶ抗体（以下、第２抗体とする）に結合可能な第２抗原が感作され、第２抗体を特異的に検出する第２担体粒子とを含む抗ＨＩＶ抗体検出試薬を提供する。
【０００７】
また、本発明は、上記の抗ＨＩＶ抗体検出試薬と、第１抗体及び第２抗体に結合可能な標識抗体を含む標識抗体試薬とを備える抗ＨＩＶ検出試薬キットを提供する。
【０００８】
また、本発明は、ＨＩＶに対する第１抗体に結合可能な第１抗原を第１担体粒子に感作する工程、ＨＩＶに対する第２抗体に結合可能な第２抗原を第２担体粒子に感作する工程、及び
前記第１抗原が感作された第１担体粒子と前記第２抗原が感作された第２担体粒子とを混合する工程を含む抗ＨＩＶ抗体検出試薬の製造方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、検体と、ＨＩＶに対する第１抗体に結合可能な第１抗原が感作され、第１抗体を特異的に検出するための第１担体粒子と、ＨＩＶに対する第２抗体に結合可能な第２抗原が感作され、第２抗体を特異的に検出するための第２担体粒子とを混合する工程、第１担体粒子上に形成された第１抗体と第１抗原との第１複合体と、第２担体粒子上に形成された第２抗体と第２抗原との第２複合体とを検出する工程を含む、抗ＨＩＶ抗体の検出方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、検体中の抗ＨＩＶ抗体を高感度に検出することができ、生体へのＨＩＶ感染の有無をより正確に診断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本実施形態の試薬は、検体中の抗ＨＩＶ抗体を検出するために用いられる試薬であり、第１担体粒子と第２担体粒子とを含む。第１担体粒子は、検体中のＨＩＶに対する第１抗体を特異的に検出するためのものであり、第１抗体に結合可能な第１抗原が感作されている。第１担体粒子には、実質的に、第１抗原以外のＨＩＶ抗原は感作されていない。第２担体粒子は、検体中のＨＩＶに対する第２抗体を特異的に検出するためのものであり、第２抗体に結合可能な第２抗原が感作されている。第２担体粒子には、実質的に、第２抗原以外のＨＩＶ抗原は感作されていない。即ち、第１担体粒子は、第１抗体を検出するための担体粒子であり、第２担体粒子は第２抗体を検出するための担体粒子である。第１担体粒子及び第２担体粒子は、容器内の緩衝液中で分散状態にあることが好ましい。
【００１２】
抗原の担体粒子への感作方法としては特に限定されず、担体粒子に直接抗原を感作してもよいし、間接的に感作してもよい。ここで、間接的に感作する、とは、担体粒子と抗原との間に特定の物質（以下、介在物質とする）を介在させて担体粒子に抗原を固定化することを意味する。介在物質は互いに結合可能な二種類の物質（第１介在物質及び第２介在物質）であることが好ましく、且つ抗ＨＩＶ抗体とは実質的に結合しない物質であることが好ましい。第１介在物質としてハプテンを用い、第２介在物質としてこのハプテンに結合する物質（以下、ハプテン結合物質とする）を用いることが好ましい。ハプテンとしては、ビオチン、２，４−ジニトロフェノール、２，４，６−トリニトロフェノール、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などを用いることができる。ハプテン結合物質としては、ハプテンを２分子以上同時に結合できる物質であることが好ましく、例えば上記ハプテンに対する抗体を用いることができる。ハプテンとしてビオチンを用いる場合はアビジンやストレプトアビジンを用いることもできる。
【００１３】
第１介在物質及び第２介在物質の例として、アビジン及びビオチンの組み合わせを用いる場合、例えば、担体粒子にアビジン（又はビオチン）を固定化し、抗原にビオチン（又はアビジン）を結合させると、担体粒子に固定化されたアビジン（又はビオチン）と抗原に結合したビオチン（又はアビジン）が結合し、これによって担体粒子に抗原を固定化することができる。ビオチン等のハプテンを結合させた抗原や、アビジン等のハプテン結合物質を固定化した担体粒子は例えば市販のものを用いることができる。
【００１４】
ハプテンを結合させた抗原は、上記のハプテンと抗原とを架橋剤を用いて結合することにより調製することもできる。架橋剤は、ハプテンとポリペプチドとの結合に通常用いられる架橋剤であれば特に限定されない。具体的には、ハプテンに架橋剤を用いて官能基を導入し、この官能基を抗原が有する官能基と反応させることによりハプテンとタンパク質とを結合させることができる。抗原が有する官能基に架橋剤を用いてさらに別の官能基を導入することもできる。
例えば、抗原の末端のアミノ基に架橋剤を用いて導入したスルフヒドリル基を、ハプテンに架橋剤を用いて導入した、スルフヒドリル基と反応性が高い官能基（例えばマレイミド基）と反応させることにより、ハプテンと抗原とを結合させることができるが、この形態に限定されない。
【００１５】
上記の架橋剤として用い得る化合物としては、限定されないが、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＡＣ)、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)、２−イミノチオラン、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルチオアセテート(ＳＡＴＡ)、Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルチオプロピオネート(ＳＡＴＰ）、Ｎ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル ６−マレイミドヘキサノエート、Ｎ−スクシンイミジル ４−ヨードアセチルアミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオネート、Ｎ−スクシンイミジルｍ−マレイミドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ４−マレイミドブチレート、Ｎ−スクシンイミジル （ｐ−マレイミドフェニル）アセテート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートなどが挙げられ、これらの１種を用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。
【００１６】
ＨＩＶにはＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２が存在するため、偽陰性を回避するためにも、第１抗原及び第２抗原は一方が抗ＨＩＶ−１抗体に対する抗原であり他方が抗ＨＩＶ−２抗体に対する抗原であることが好ましい。抗原は、ＨＩＶのｅｎｖ領域やｇａｇ領域などに対応することが好ましく、具体的にはＨＩＶ−１のｇａｇ領域ｐ２４抗原、ＨＩＶ−１のｅｎｖ領域ｇｐ４１抗原、ＨＩＶ−２のｅｎｖ領域ｇｐ３６抗原などが例示される。第１抗原はＨＩＶ−１のｅｎｖ領域ｇｐ４１抗原であり、第２抗原はＨＩＶ−２のｅｎｖ領域ｇｐ３６抗原であることが好ましい。また、本実施形態の試薬は、上記以外のＨＩＶ抗原を感作した担体粒子をさらに含んでいてもよい。
【００１７】
第１抗原及び第２抗原としては、公知の方法によって調製したものを用いることができる。例えば、抗原をコードするＤＮＡを適当なプラスミドに組み込み、この組み換えプラスミドを大腸菌や酵母などの宿主にトランスフォームし、プラスミドに組み込まれたＤＮＡから抗原（リコンビナント抗原）を発現させることができる。また、ペプチド自動合成装置（例えば、Applied Biosystems社  モデル４３０Ａ等）を用いて抗原（ペプチド抗原）を化学的に合成することもできる。第１抗原及び第２抗原はリコンビナント抗原及びペプチド抗原の何れであってもよい。
【００１８】
第１抗原としてリコンビナント抗原及びペプチド抗原の何れかを感作した第１担体粒子、及び第２抗原としてリコンビナント抗原及びペプチド抗原の何れかを感作した第２担体粒子の他に、第１抗原とは異なる方法で調製した同種の抗原を感作した第３担体粒子を試薬に含有させてもよい。
【００１９】
例えば、第１抗原としてＨＩＶ−１  ｅｎｖ領域ｇｐ４１のリコンビナント抗原を感作した第１担体粒子と、第２抗原としてＨＩＶ−２  ｅｎｖ領域ｇｐ３６のペプチド抗原を感作した第２担体粒子の他に、ＨＩＶ−１  ｅｎｖ領域ｇｐ４１のペプチド抗原を感作した担体粒子や、ＨＩＶ−２  ｅｎｖ領域ｇｐ３６のリコンビナント抗原を感作した担体粒子を試薬に含有させてもよい。検体中には、リコンビナント抗原には反応しにくい抗ＨＩＶ−１抗体が稀に含まれていることがあるため、上記のように第１担体粒子だけでなく、ＨＩＶ−１  ｅｎｖ領域ｇｐ４１のペプチド抗原を感作した担体粒子を試薬に含有させることにより、偽陰性を回避し、より精度良く抗ＨＩＶ抗体の検出を行うことができる。
【００２０】
担体粒子としては、抗原を感作することができるものであれば特に限定されず、例えば、ニトロセルロースやカルボキシルセルロースなどのセルロースエステル類、ラテックス、ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体などの天然又は合成の樹脂及びその誘導体、ガラス(例えば活性化ガラス)、シリカゲル、カオリン、タルク、シリカ−アルミナ、アルミナ、硫酸バリウム、コバルト、鉄などの無機材料からなる粒子や、金などの金属コロイドを挙げることができる。
【００２１】
また、担体粒子は磁気を有する粒子（磁性粒子）であることが好ましい。磁性粒子が反応容器内で液中に分散している場合、反応容器外から磁石を近づけることによって迅速且つ簡便に集磁することができ、反応容器内の液体成分を廃棄し新たに別の液体を添加することができる。従って、Ｂ／Ｆ分離やバッファーの置換などを迅速且つ容易に行うことができる。
【００２２】
担体粒子は小粒径のものを用いることが好ましい。また、担体粒子が小粒径であるほど、担体粒子の単位質量当たりの表面積が増大し、多くの抗原を担体粒子に感作することができる。担体粒子の粒径は、具体的には、０．５〜５μｍが好ましく、０．５〜３μｍがより好ましい。試薬中の担体粒子の濃度は、０．５〜２０ｍｇ／ｍＬ（０．０５〜２ｗ／ｖ％）が好ましく、より好ましくは２〜１５ｍｇ／ｍＬ（０．２〜１．５ｗ／ｖ％）である。特に担体粒子が磁性粒子の場合、上記濃度範囲の担体粒子を用いることによって、迅速に集磁を行うことができる。
【００２３】
上記の試薬を、抗ＨＩＶ抗体を含む検体と混合すると、第１担体粒子上では第１抗原と抗ＨＩＶ抗体との複合体が形成され、第２担体粒子上では第２抗原と抗ＨＩＶ抗体との複合体が形成される。これらの複合体の有無の検出又は複合体の定量的検出によって、検体に抗ＨＩＶ抗体が含まれているかを判定することができる。
【００２４】
担体粒子上に形成された複合体を検出する方法としては、特に限定されないが、標識抗体（標識物質が結合された抗体）を用いることが好ましい。この標識抗体は複合体を構成する抗原、抗体、又は両者に特異的に結合することが好ましく、特に抗ＨＩＶ抗体に結合する標識抗ＩｇＧ抗体又は標識抗ＩｇＭ抗体であることが好ましい。標識物質としては、検出可能なシグナル（例えば、蛍光、発光、発色、放射線）を発する物質（例えば、蛍光物質、発光物質、発色物質、放射性同位体など）や酵素などが挙げられる。酵素としては、特に限定されないが、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが好適に用いられる。
【００２５】
酵素標識抗体を用いた場合、担体粒子上の複合体に酵素標識抗体を結合させ、さらにここにこの酵素に対応する基質を添加する。基質の添加前には、未反応の標識抗体を含む反応容器内の液体成分を除去しておくことが好ましい。基質は、上述の酵素による酵素反応で化学変化を起こす。この基質の化学変化に起因する反応液の光学的状態の変化（発光強度、蛍光強度、吸光度などの変化）を検出することによって、複合体を検出することができる。
【００２６】
例えば、酵素としてＡＬＰを用い、基質としてｐ−メトキシフェニルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸、チモールフタレインリン酸、フェノールフタレインリン酸、ジオキセタン類縁体、これらの塩や類縁体などを用いた場合は、酵素反応によって基質からシグナル（発光や発色）が発せられる。このシグナルを検出することによって、標識酵素の存在量、即ち担体粒子上の複合体の存在量を測定することができる。
【００２７】
本実施形態のように実質的に一種類の抗原を感作した担体粒子を複数種類含む試薬を用いることによって、複数の抗原を感作した担体粒子を含む試薬（従来の試薬）を用いるよりも高感度に複数種類の抗体を検出することができる。即ち、抗ＨＩＶ−１抗体に対する抗原と抗ＨＩＶ−２抗体に対する抗原を感作した担体粒子を含む試薬を用いるよりも、実質的に抗ＨＩＶ−１抗体に対する抗原のみを感作した担体粒子、及び実質的に抗ＨＩＶ−２抗体に対する抗原のみを感作した担体粒子の両方を含む試薬を用いた方が高感度に抗ＨＩＶ抗体を検出することができる。さらに、本実施形態の試薬を用いると、検出の際のバックグラウンドノイズが比較的低い。よって、従来の試薬に比べて本実施形態の試薬の方がシグナルとバックグラウンドノイズとの比（Ｓ／Ｎ比）が高く、より高感度であると言える。
【００２８】
本実施形態の試薬は、以下のようにして製造することができる。
先ず、第１担体粒子を適当な緩衝液中で分散させ、そこに第１抗体に結合可能な第１抗原を含む第１抗原溶液を添加する。攪拌などの操作によって、第１担体粒子に第１抗原を感作させる。第１抗原溶液には実質的に第１抗原以外のＨＩＶ抗原は含まれていないため、第１担体粒子には実質的に第１抗原以外のＨＩＶ抗原は感作されない。従って、第１抗原が感作された第１担体粒子は、検体中の第１抗体を特異的に検出する担体粒子となる。
次に、第２担体粒子を適当な緩衝液中で分散させ、そこに第２抗体に結合可能な第２抗原を含む第２抗原溶液を添加する。攪拌などの操作によって、第２担体粒子に第２抗原を感作させる。第２抗原溶液には実質的に第２抗原以外のＨＩＶ抗原は含まれていないため、第２担体粒子には実質的に第２抗原以外のＨＩＶ抗原は感作されない。従って、第２抗原が感作された第２担体粒子は、検体中の第２抗体を特異的に検出する担体粒子となる。
介在物質を介して抗原を担体粒子に感作する場合は、抗原の感作前に上述の架橋剤等を用いて介在物質を抗原及び／又は担体粒子に結合させることができる。
【００２９】
第１抗原が感作された第１担体粒子と、第２抗原が感作された第２担体粒子とを混合し、適当な緩衝液中でこれらの粒子を分散させることにより、本実施形態の試薬とすることができる。
なお、第１抗原及び第２抗原とは異なる種類のＨＩＶ抗原を感作させた担体粒子を調製し、これを試薬に含有させてもよい。
【００３０】
本発明の一実施形態の試薬キットは、上記の第１担体粒子と第２担体粒子とを含む抗ＨＩＶ抗体検出試薬と、上記の標識抗体を含む標識抗体試薬とを含む。さらに、標識抗体として酵素標識抗体を用いる場合は、この酵素に対する基質を含む基質試薬を含むことが好ましい。
【００３１】
（実施例）
１）検体
ＨＩＶ非感染者１名から血液を採取して調製した血清を陰性検体とし、ＨＩＶ感染者２名からそれぞれ血液を採取して調製した血清を陽性検体１及び陽性検体２とした。また、ブランク用検体として精製水を用意した。
【００３２】
２）試薬の調製
Ｒ１試薬（反応緩衝液）
０．１Ｍ  トリエタノールアミン（ｐＨ７．６）、０．１ｗ／ｖ％ＢＳＡ、及び０．１ｗ／ｖ％  ＮａＮ３を含む溶液を調製し、Ｒ１試薬とした。
【００３３】
Ｒ２−１試薬（抗原感作粒子試薬）
緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＮａＰＢ（ｐＨ７．５）を含む）に市販のストレプトアビジンが感作された磁性粒子（平均粒径２μｍ）（以下、ストレプトアビジン感作磁性粒子とする）を０．５ｗ／ｖ％の濃度となるように添加し、さらにここに第１リコンビナント抗原溶液（ビオチンを感作したＨＩＶ−１  ｅｎｖ領域ｇｐ４１ペプチド抗原（１５ｋＤａを５μｇ／ｍＬ含む）を添加した。この混合液を室温で１時間攪拌した。攪拌後、遠心して磁性粒子を沈降させ、溶液成分を廃棄した。ここに緩衝液Ｂ（２ｗ／ｖ％  ＢＳＡ、０．０１Ｍ  ＧＴＡ（ｐＨ８．０）、及び５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）を添加し、ＢＳＡブロッキングを行った。遠心して磁性粒子を沈降させ、溶液成分を廃棄し、緩衝液Ｃ（０．１Ｍ  ＧＴＡ緩衝剤（ｐＨ７．７）、２．０ｗ／ｖ％  ＢＳＡ、及び０．１％  ＮａＮ３を含む）を添加した。これを第１抗原感作粒子試薬Ａとした。
【００３４】
緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＮａＰＢ（ｐＨ７．５）を含む）に市販のストレプトアビジン感作磁性粒子（平均粒径２μｍ）を０．５ｗ／ｖ％の濃度となるように添加し、さらにここに第１ペプチド抗原溶液（ビオチンを感作したＨＩＶ−１  ｅｎｖ領域ｇｐ４１ペプチド抗原（４ｋＤａを１．２５μｇ／ｍＬ含む）を添加した。この混合液を室温で１時間攪拌した。攪拌後、遠心して磁性粒子を沈降させ、溶液成分を廃棄した。ここに緩衝液Ｂを添加し、ＢＳＡブロッキングを行った。遠心して磁性粒子を沈降させ、溶液成分を廃棄し、緩衝液Ｃを添加した。これを第１抗原感作粒子試薬Ｂとした。
【００３５】
第１ペプチド抗原溶液ではなく、第２抗原溶液（ビオチンを感作したＨＩＶ−２  ｅｎｖ領域ｇｐ３６ペプチド抗原（４ｋＤａ）を１．２５μｇ／ｍＬ含む）を用いること以外は第１抗原感作粒子試薬と同様にして第２抗原感作粒子試薬を調製した。
前記第１抗原感作粒子試薬Ａと前記第１抗原感作粒子試薬Ｂと前記第２抗原感作粒子試薬とを６：３：１の比率で混合し、この混合液をＲ２−１試薬とした。混合液中の粒子濃度は０．５ｗ／ｖ％であった。
【００３６】
Ｒ３試薬（ＡＬＰ標識抗体試薬）
以下の物質を含む溶液を調製し、Ｒ３試薬とした。
３．５ｎｇ／ｍＬ  ＡＬＰ標識マウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体
０．１Ｍ  ＭＥＳ(2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid)  ｐＨ６．５
０．１５Ｍ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２
０．１ｗ／ｖ％  ＮａＮ３
【００３７】
Ｒ４試薬（分散試薬）
以下の物質を含む溶液を調製し、Ｒ４試薬とした。
０．１Ｍ  ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）  ｐＨ９．６
１ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．１ｗ／ｖ％  ＮａＮ３
【００３８】
Ｒ５試薬（基質試薬）
以下の物質を含む溶液を調製し、Ｒ５試薬とした。
CDP-Star with Sapphirine-II（ジオキセタンの類縁体（ＡＬＰの発光基質）、アプライドバイオシステムズ社製）
【００３９】
洗浄試薬
以下の物質を含む溶液を調製し、洗浄試薬とした。
２０ｍＭ  トリス  ｐＨ７．４
０．１ｗ／ｖ％  Ｔｗｅｅｎ２０
０．１ｗ／ｖ％  ＮａＮ３
０．８ｗ／ｖ％  ＮａＣｌ
【００４０】
３）測定
Ｒ１試薬１２０μＬと、検体１０μＬとを混合し、４２℃２．２５分間反応させた。次に、ここにＲ２−１試薬３０μＬを添加し、４２℃１．５分間反応させた。
反応後、遠心分離により磁性粒子を沈降させ、溶液を廃棄した。ここに洗浄試薬を添加し、遠心分離により磁性粒子を沈降させ、溶液を廃棄した。これを三度繰り返した後、Ｒ３試薬１００μＬ添加し、４２℃２．７５分間反応させた。
反応後、遠心分離により磁性粒子を沈降させ、溶液を廃棄した。ここに洗浄試薬を添加し、遠心分離により磁性粒子を沈降させ、溶液を廃棄した。これを三度繰り返した後、Ｒ４試薬３０μＬ及びＲ５試薬１００μＬを添加し、４２℃５分間反応させた。
反応液の発光強度を発光測定装置で測定し、発光強度をカウント値として算出した。
【００４１】
（比較例１）
以下のようにＲ２−２試薬を調製し、Ｒ２−１試薬ではなくＲ２−２試薬を用いること以外は、実施例と同様にして発光強度のカウント値を算出した。
緩衝液Ａにストレプトアビジン感作磁性粒子を０．５ｗ／ｖ％の濃度となるよう添加し、さらにここに混合抗原溶液（ビオチンを感作したＨＩＶ−１  ｅｎｖ領域ｇｐ４１リコンビナント抗原（１５ｋＤａ）３μｇ／ｍＬ、ビオチンを感作したＨＩＶ−１  ｅｎｖ領域ｇｐ４１ペプチド抗原（４ｋＤａ）０．３７５μｇ／ｍＬ、及びビオチンを感作したＨＩＶ−２  ｅｎｖ領域ｇｐ３６ペプチド抗原（４ｋＤａ）０．１２５μｇ／ｍＬを含む）を添加した。この混合液を室温で１時間攪拌した。攪拌後、遠心して磁性粒子を沈降させ、溶液成分を廃棄し、緩衝液Ｃを添加した。これをＲ２−２試薬とした。
【００４２】
（比較例２）
以下のようにＲ２−３試薬を調製し、Ｒ２−１試薬ではなくＲ２−３試薬を用いること以外は、実施例と同様にして発光強度のカウント値を算出した。
緩衝液Ａにストレプトアビジン感作磁性粒子を０．５ｗ／ｖ％の濃度となるよう添加し、さらにここに混合抗原溶液（ビオチンを感作したＨＩＶ−１  ｅｎｖ領域ｇｐ４１リコンビナント抗原（１５ｋＤａ）１０μｇ／ｍＬ、ビオチンを感作したＨＩＶ−１  ｅｎｖ領域ｇｐ４１ペプチド抗原（４ｋＤａ）０．７５μｇ／ｍＬ、及びビオチンを感作したＨＩＶ−１  ｅｎｖ領域ｇｐ３６ペプチド抗原（４ｋＤａ）０．２５μｇ／ｍＬを含む）を添加した。この混合液を室温で１時間攪拌した。攪拌後、遠心して磁性粒子を沈降させ、溶液成分を廃棄し、緩衝液Ｃ（０．１Ｍ  ＧＴＡ緩衝剤（ｐＨ７．７）、２．０ｗ／ｖ％  ＢＳＡ、及び０．１％  ＮａＮ３を含む）を添加した。これをＲ２−３試薬とした。
【００４３】
検出結果を表１、図１及び図２に示す。
【００４４】
【表１】
2008051780.tif 000002
【００４５】
表１及び図１より、ブランク用検体の測定においては、Ｒ２−１試薬、Ｒ２−２試薬及びＲ２−３試薬の何れを用いても殆ど発光が検出されなかった。また、陰性検体の測定においては、Ｒ３−３試薬よりもＲ２−１試薬又はＲ２−２試薬を用いた方が低いカウント値が検出された。
【００４６】
表１及び図２より、陽性検体１及び陽性検体２の何れの測定においては、比較例１又は比較例２よりも実施例１の試薬を用いた方が高いカウント値が検出され、高感度にＨＩＶ抗体を検出できたことが示された。
【００４７】
また、上記のように陰性検体の測定においては低いカウント値が検出されたことより、比較例１及び２に比べて実施例のＳ／Ｎ比（シグナル（Ｓ）とバックグラウンドノイズ（Ｎ）の比）が高いことが示された。以上より、本実施例の試薬を用いるとより高感度で病原体を検出することができるため、この検出結果を用いて精度良く感染症を診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ブランク用検体及び陰性検体のカウント値を示すグラフである。
【図２】陽性検体のカウント値を示すグラフである。
【図１】
2008051780.tif 000003
【図２】
2008051780.tif 000004