(57)【要約】【課題】細胞の移植をすることなく、軸索再生を誘導することによって脊髄等の神経の損傷を修復することができる新規な手段を提供すること。【解決手段】骨形成タンパク質、骨形成タンパク質レセプター及び該レセプターの下流のシグナル因子の少なくともいずれか１つを阻害する物質を有効成分として含有する軸索伸長促進剤を提供した。例えば、本発明の軸索伸長促進剤は、ノギン（Noggin）又はノギンをコードする核酸を含む発現ベクターを有効成分として含有する。【選択図】図９
2008255071.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成タンパク質、骨形成タンパク質レセプター及び該レセプターの下流のシグナル因子の少なくともいずれか１つを阻害する物質を有効成分として含有する軸索伸長促進剤。
【請求項２】
前記有効成分がノギン、又はノギンをコードする核酸を含み細胞中でノギンを発現することができる組換えベクターである請求項１記載の促進剤。
【請求項３】
ノギンを有効成分として含有する請求項２記載の促進剤。
【請求項４】
前記シグナル因子がLIMドメインキナーゼである請求項１記載の促進剤。
【請求項５】
前記有効成分がLIMドメインキナーゼのドミナントネガティブ変異体又は該変異体をコードする核酸を含み細胞中で該変異体を発現することができる組換えベクターである請求項４記載の促進剤。
【請求項６】
前記変異体が、キナーゼドメインの活性を欠損する変異を有するものである請求項５記載の促進剤。
【請求項７】
前記変異体が、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列中の４６０番目のアスパラギン酸がアラニンに置換した変異体である請求項６記載の促進剤。
【請求項８】
損傷を受けた神経細胞用である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の促進剤。
【請求項９】
神経損傷に伴う症状の治療及び／又は予防用である請求項１ないし８のいずれか１項に記載の促進剤。
【請求項１０】
前記神経損傷が中枢神経損傷である請求項９記載の促進剤。
【請求項１１】
前記中枢神経損傷が脊髄損傷である請求項１０記載の促進剤。
【請求項１２】
前記脊髄損傷が外傷性の脊髄損傷である請求項１１記載の促進剤。
【請求項１３】
前記症状が運動機能障害である請求項９ないし１２のいずれか１項に記載の促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経損傷に伴う症状の治療等に有用な軸索伸長促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
成体哺乳類の中枢神経系は、一度損傷を受けると軸索の再生はほとんど起こらないことが知られている。そのため、成体脳や成体脊髄が損傷を受けると、その後一生神経ネットワークが欠損し続けることになり、損傷が重篤である場合には、重度の運動機能障害等を抱えることになる。
【０００３】
神経損傷部におけるニューロンの欠損を補うため、神経幹細胞を損傷部位に移植してニューロンに分化させる方法が検討されたが、損傷部位では幹細胞からのニューロンへの分化は制限されていた。この原因としては、損傷部位で誘導される種々の因子の作用が考えられている。すなわち、中枢神経の損傷部周辺では、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のような、発生段階におけるニューロンへの分化に関して役割を果たすタンパク質の発現の増大が見られるが（非特許文献１）、これらの因子が移植細胞のニューロンへの分化を制限していると考えられている。かかる観点から、移植細胞のニューロンへの分化を促進するため、ノギン（noggin）のような公知のBMPアンタゴニストを神経前駆細胞に導入し、このノギン発現細胞を移植に用いる方法が検討されている（非特許文献１）。実際にこの方法で、ラットにおいて、移植された神経前駆細胞のニューロン及びオリゴデンドロサイトへの分化の促進と、脊髄損傷後の運動機能の回復効果が認められている（非特許文献１）。
【０００４】
しかしながら、非特許文献１では、もっぱら移植細胞の分化にのみ焦点が当てられており、神経損傷治療の目的のために、細胞移植が前提となっている。しかしながら一方で、細胞死を免れた神経細胞に新たなネットワークを形成させることで、機能的な回復を図ろうとする試みが検証されている。すなわち、エフリン−Ｂ３、セマフォリン４Ｄ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、及び反発性ガイダンス分子（repulsive guidance molecule）のような、発生段階におけるニューロンネットワークの形成に役割を果たすタンパク質の発現の増大が、脊髄損傷後に見られるが（非特許文献２〜７）、これらが損傷した中枢神経軸索の再生を抑制していることが示されており、これらのタンパク質の機能を阻害することで、損傷中枢神経の機能的な再生が誘導できることが示されている。非特許文献２〜７は、非特許文献１に記載されるような従来の細胞移植とは異なる、薬剤を用いた神経損傷治療の可能性を示している。しかしながら、薬剤を用いた神経損傷の治療法として満足できる手法は未だ確立されていない。
【０００５】
【非特許文献１】Setoguchi, T., et al. Treatment of spinal cord injury by transplantation of fetal neural precursor cells engineered to express BMP inhibitor. Exp Neurol 189, 33-44 (2004).
【非特許文献２】Benson, M.D., et al. Ephrin-B3 is a myelin-based inhibitor of neurite outgrowth. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 10694-10699 (2005).
【非特許文献３】Bradbury, E.J., et al. Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury. Nature 416, 636-640 (2002).
【非特許文献４】Hata, K., et al. RGMa inhibition promotes axonal growth and recovery after spinal cord injury. J Cell Biol 173, 47-58 (2006).
【非特許文献５】Moon, L.D., Asher, R.A., Rhodes, K.E. & Fawcett, J.W. Regeneration of CNS axons back to their target following treatment of adult rat brain with chondroitinase ABC. Nat Neurosci 4, 465-466 (2001).
【非特許文献６】Moreau-Fauvarque, C., et al. The transmembrane semaphorin Sema4D/CD100, an inhibitor of axonal growth, is expressed on oligodendrocytes and upregulated after CNS lesion. J Neurosci 23, 9229-9239 (2003).
【非特許文献７】Setoguchi, T., et al. Traumatic injury-induced BMP7 expression in the adult rat spinal cord. Brain Res 921, 219-225 (2001).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、細胞の移植をすることなく、軸索再生を誘導することによって脊髄等の神経の損傷を修復することができる新規な手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ＢＭＰとＢＭＰレセプターとの結合を阻害する作用を有するノギン自体を脊髄の損傷部に投与することによって、BMPに媒介されるシグナル伝達を阻害すると、運動を制御する大脳皮質の神経細胞からの軸索の伸長を促進できること、それにより脊髄損傷を受けた生体の歩行運動機能の回復をも促進できることを見出し、本願発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、骨形成タンパク質、骨形成タンパク質レセプター及び該レセプターの下流のシグナル因子の少なくともいずれか１つを阻害する物質を有効成分として含有する軸索伸長促進剤を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、脊髄等の神経の損傷を修復できる軸索伸長促進剤が提供された。下記実施例に具体的に記載される通り、本発明の軸索伸長促進剤は、損傷部位の神経軸索の伸長を促進し、神経損傷に伴う運動機能障害等の症状を改善する。本発明の促進剤を用いれば、神経前駆細胞の移植を行なうことなく損傷部位の軸索を再生することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の軸索伸長促進剤は、正常な伸長が阻害された状態の神経細胞に対して、軸索伸長促進効果を奏することができる。すなわち、本発明の軸索伸長促進剤は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が阻害因子として関与する軸索伸長阻害機構を妨害することにより、軸索の伸長を促進することができる。
【００１１】
下記実施例に記載される通り、BMPは、BMPレセプターを有するニューロンに対し、軸索の伸長を阻害する作用を及ぼすが、BMPアンタゴニストとして知られるノギンでニューロンを処理すると、伸長阻害作用が消失し、軸索が伸長するようになる。従って、ＢＭＰとＢＭＰレセプターとの相互作用が引き金となって開始する軸索伸長阻害のシグナル経路をいずれかの段階で妨害すれば、ＢＭＰによる軸索伸長阻害作用を打ち消して、軸索の伸長を促進することができる。本発明の軸索伸長促進剤は、このような知見に基づき完成されたものであり、ＢＭＰ、ＢＭＰレセプター及びＢＭＰレセプターの下流のシグナル因子の少なくともいずれか１つを阻害する物質を有効成分として含有する。
【００１２】
そのような阻害物質としては、ＢＭＰ又はＢＭＰレセプターの発現段階から、ＢＭＰとレセプターとの結合段階及びそれに続くシグナル伝達経路を経て、ニューロンの軸索の伸長を阻害する段階までの、いずれの段階を阻害するものであってもよく、そのような阻害効果を有するいかなる物質をも用いることができる。ここで、ＢＭＰレセプターの下流で機能し、軸索の伸長阻害へと続くシグナル因子としては、例えば、本願発明者らが関与を見出したLIMドメインキナーゼ（LIMK）が挙げられる（実施例参照）。従って、上記阻害物質としては、特に限定されないが、例えば、BMPレセプター阻害物質としてはBMPアンタゴニストのノギン(noggin) (Yanagita, M. Cytokine Growth Factor Rev 16, 309-317 (2005).)等、シグナル因子阻害物質としてはLIMKを阻害するLIMKのドミナントネガティブ変異体等を挙げることができる。該ドミナントネガティブ変異体としては、LIMKのキナーゼドメインの活性を欠損する変異を有する変異体が挙げられ、例えば、キナーゼドメインを欠失した変異体、及び、下記実施例で用いられているLIMK1タンパク質の４６０番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した変異体（文献：Arber et al. Regulation of actin dynamics through phosphorylation of cofilin by LIM-kinase. Nature. 393:805-809 (1998).）等を挙げることができるが、これらに限定されない。ノギン等のBMPアンタゴニスト自体は周知であり、市販もされているため、そのような市販品を用いることができる。また、LIMKのドミナントネガティブ変異体は、当業者であれば、公知のLIMKの遺伝子配列及びアミノ酸配列情報に基づき、遺伝子工学的手法を用いた公知の常法により容易に調製することができる。配列表の配列番号１及び２に、公知のLIMK1(GenBankアクセッション番号NM_002314)の遺伝子配列及びアミノ酸配列を示す。配列番号１中、1201番〜1986番ヌクレオチドの領域がキナーゼドメインのコード領域である。
【００１３】
上記有効成分がタンパク質等のペプチド性物質である場合には、該有効成分は、該ペプチド性物質をコードする核酸の形態であってもよい。この場合、該核酸は、投与対象となる生体の細胞内で発現可能な形態で本発明の軸索伸長促進剤に含有される。すなわち、該核酸は、生体細胞内で発現可能な発現ベクターに組み込まれた組換えベクターの形態で本発明の軸索伸長促進剤に含有される。例えば、ヒトのノギンをコードする核酸の塩基配列は周知であり、GenBank Accession No. MN_005450、MN_130851、NM_130850等に記載されている。また、発現ベクターとしては、生体細胞内、好ましくは哺乳動物細胞内で発現可能なベクターであればいかなるものであってもよい。哺乳動物細胞内で発現可能なベクターは周知であり、種々のものが市販されているので、入手は容易である。該核酸は、公知の遺伝子工学的手法を用いて容易に調製することもできる。例えば、上記ペプチド性物質を発現する細胞から抽出したＲＮＡから、該ペプチド性物質の遺伝子のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより調製することにより、該ペプチド性物質をコードする核酸を得ることができる。ＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲは周知の方法により行なうことができる。また、核酸のベクターへの組み込みも周知の方法により行なうことができる。
【００１４】
本発明の軸索伸長促進剤は、上記した通りBMPの関与により正常な軸索伸長が阻害された神経細胞を対象とする。例えば、脊髄損傷部位ではBMP及びそのレセプターの発現が顕著に増大することが知られているが(Setoguchi, T., et al. Brain Res 921, 219-225 (2001); Setoguchi, T., et al. Exp Neurol 189, 33-44 (2004))、下記実施例に記載される通り、BMPはインビトロでBMPレセプターを有する神経細胞の軸索の伸長を阻害するため、脊髄損傷部における軸索再生の欠失は、BMPが損傷部位に存在する神経細胞からの軸索の伸長を阻害することが原因であるものと考えられる。実際に、下記実施例において、脊髄損傷部にBMPアンタゴニストのノギンを投与すると、損傷部の神経軸索の発芽が促進されて軸索の伸長が促進されることが示されており（図１１参照）、本発明の促進剤が脊髄損傷部における神経細胞の軸索伸長を促進する効果を奏することが示されている。従って、本発明の軸索伸長促進剤は、好ましくはBMPが軸索伸長の阻害因子として関与している神経損傷部位の神経細胞軸索を対象とし、特に好ましくは脊髄損傷部位に存在する神経細胞軸索を対象とする。なお、任意の神経損傷部位において、BMPが軸索伸長の阻害因子として関与しているか否かは、該神経損傷部位周辺でBMP及び／又はBMPレセプターの発現が増大しているか否かに基づいて判断することができる。BMP及び／又はBMPレセプターの発現増大が認められる場合、該神経損傷部位で生じる軸索伸長の阻害にはBMPが関与している可能性が高く、本発明の軸索伸長促進剤が有用であり得る。
【００１５】
下記実施例にラットの脊髄損傷モデルを用いて示される通り、本発明の軸索伸長促進剤を脊髄損傷部に投与すると、軸索が伸長して損傷が修復され、脊髄損傷による麻痺症状が緩和されて、歩行運動ができるようになる。従って、本発明の軸索伸長促進剤は、神経損傷に伴う運動機能障害等の症状の治療や予防に有用である。すなわち、本発明は、上記軸索伸長促進剤の、神経損傷に伴う症状の治療及び／又は予防用途を提供する。該神経損傷は、好ましくは中枢神経の損傷であり、より好ましくは脊髄損傷である。特に好ましくは、該脊髄損傷は、外傷性の脊髄損傷である。また、治療及び／又は予防の対象となる症状は、神経の損傷に起因して生じる運動機能又は感覚機能の障害であり、好ましくは麻痺等の運動機能障害である。ここで、「運動機能障害」とは、筋肉の随意運動力の喪失又は低下を意味する。
【００１６】
本発明の軸索伸長促進剤は、好ましくはＢＭＰの関与により神経細胞の軸索の伸長が阻害されている部位に投与される。上記した神経損傷に伴う症状の治療及び／又は予防に用いる場合にも、神経損傷部位に局部投与されることが好ましい。投与方法は特に限定されないが、通常、注射や点滴注入等により行なわれる。本発明の軸索伸長促進剤は、好ましくは生理食塩水や等張グルコース溶液等の溶液に有効成分を混合させて製剤される。製剤中には、防腐剤、酸化防止剤及び緩衝剤等のような、本発明の促進剤の無菌性、安定性及び等張性等を高める種々の公知の添加剤を含ませてもよい。
【００１７】
本発明の軸索伸長促進剤は、上記有効成分を0.00001〜90重量％、より好ましくは0.0001〜70重量％含有することが望ましい。その使用量は神経損傷の程度、年齢、体重、投与方法等に応じて適宜選択され、特に限定されないが、注射剤の場合、成人に対する有効成分量として通常１日10μｇ〜10 g程度、好ましくは1 mg〜1 g程度であり、数日間ないし数月間にわたり、断続的又は連続的に投与することができる。例えば、数日間ないし数月間にわたって連続的に投与したり、あるいは１日１回ないし数回の投与を数日ないし数月間繰り返すことができる。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００１９】
実験方法
１．軸索伸長アッセイ
ラット（Ｐ７−９）由来の生後小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）をトリプシン処理（0.25% トリプシンリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で37℃にて15分間）により分離した。該細胞を１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に再懸濁し、摩砕した後、血清含有ＤＭＥＭにて3回洗浄した。Ｂ２７を添加した血清非含有ＤＭＥＭ中でニューロンを培養し、ポリ−Ｌ−リジン被覆チェンバースライド（LabTek II; Nunc社、デンマーク国Roskilde）上に播種した。
【００２０】
播種したニューロンを、500ng/ml又は150ng/mlの組換えヒトＢＭＰ−２(rhBMP-2)で３７℃にて24時間インキュベートし、伸長アッセイを行った。コントロールは、rhBMP-2の分散媒(ＰＢＳ)のみでインキュベートを行なった。インキュベート後の細胞は、0.1Mリン酸緩衝液（ＰＢ）に溶解した４％（w/v）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液で1時間固定した。固定したニューロンをＰＢＳで洗浄後、５％ＢＳＡ及び0.1％ Triton X-100を含むＰＢＳで1時間処理した。次いで、ニューロン特異的βチューブリンIIIタンパク質を認識するモノクローナル抗体（1:1000、TuJ1; Covance Inc., カリフォルニア州Berkeley）で4℃にて一晩インキュベートした。ＰＢＳで3回洗浄した後、フルオレセイン結合二次抗体（1:1000; Molecular Probes社、オレゴン州Eugene）で室温にて1時間インキュベートした。ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC（PI-PLC）による前処理は、上記の通りB27添加した血清非含有DMEM中でCGNをインキュベートした後、2.0 U/mlのPI-PLC（Sigma-Aldrich, Inc., ミズーリ州St. Louis）で37℃にて3時間処理することにより行い、その後、上記の通りポリ−Ｌ−リジン被覆チェンバースライド上に播種して、rhBMP-2（500 ng/ml）の存在下又は非存在下で21時間インキュベートした。
【００２１】
上記の通り処理したニューロンの観察は、落射蛍光光学装置と位相差光学用ドライコンデンサーとを具備する倒立光学顕微鏡を用いて行った。TuJ1陽性ニューロンのそれぞれについて、軸索の最大長を測定した。軸索が分枝している場合には、最も長い分枝をたどって軸索の全長を測定し、当該ニューロンにおける最大長とした。
【００２２】
２．一過的トランスフェクション
一過的トランスフェクションは、Amaxa社のnucleofector技術（独国Koln）を用いて、製造者の指示書に従って行なった。
【００２３】
Smad6のトランスフェクションは次の通りに行なった。すなわち、5×106個のＣＧＮを、FLAG付加Smad6が組み込まれたpcDNA3（T. Taga博士より寄贈）2.0μｇの共存下又は非共存下で、0.5μｇのＧＦＰベクター（pmaxGFP；Amaxa社）にてトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を穏やかに遠心した後、上清を除去した。次いで該細胞を10％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で培養し、ポリ−Ｌ−リジンで被覆した3.5 cm組織培養皿上に播種した。トランスフェクションの24時間後、rhBMP-2(150 ng/ml)又は分散媒（ＰＢＳ）を含むＢ２７添加血清非含有ＤＭＥＭで培地を交換し、さらに24時間インキュベートした。次いで、細胞を４％（w/v）PFA中で固定し、抗TuJ1抗体で免疫染色して、軸索長の測定を行なった。
【００２４】
LIMK1ドミナントネガティブ変異体のトランスフェクションは次の通りに行なった。すなわち、ＣＧＮを、2μｇのFPC-1-myc LIMK1 D460A (LIMK1のドミナントネガティブ変異体; K. Mizuno博士より寄贈)共存下又は非共存下で、0.5μgのＧＦＰにてトランスフェクトした。トランスフェクションから24時間後、細胞をトリプシン処理し、rhBMP-2（150 ng/ml）又は分散媒（PBS）を加え、Ｂ２７を添加した血清非含有ＤＭＥＭ中で再培養して、チェンバースライド（LabTek II; Nunc社）上に播種した。24時間インキュベートした後、細胞を４％（w/v）ＰＦＡ中で固定した。
【００２５】
３．ウエスタンブロット解析
3.5 cm組織培養皿中で培養した細胞を穏やかに掻き取って低温のＰＢＳ中に収集し、3回洗浄した後、１％ノニデットＰ−４０、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、50 mMトリス塩酸（pH7.4）、2 mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、150 mM NaCl、1 mMオルトバナジウム酸ナトリウム、1 mM NaF、及びプロテアーゼ阻害剤混合物（Roche Applied Science、独国Mannheim）を含む溶解バッファー中に再懸濁した。これを4℃にて10分間振盪した後、20分間遠心した。得られた溶解産物は、Bio-Rad DC protein assay kit（Bio-Rad社）を用いてタンパク質濃度について標準化した。等量のタンパク質をそれぞれサンプルバッファー中で95℃にて10分間煮沸し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデンメンブレン上に転写し、５％ウシ血清アルブミン（BSA）及び0.05％ Tween 20を含むＰＢＳ中で室温にて1時間ブロッキングした。抗BMPR-II抗体（1:50; Abgent社、カリフォルニア州San Diego）、抗ホスホ-Smad1ポリクローナル抗体 (1:1000; Chemicon社, カリフォルニア州Temecula), 抗Smadポリクローナル抗体 (1:1000; Chemicon社), 抗Id1(C-20)ポリクローナル抗体 (1:200; Santa Cruz Biotech.社, カリフォルニア州Santa Cruz), 抗ホスホ-p38 MAPKモノクローナル抗体 (1:500; Cell Signaling Tech.社, マサチューセッツ州Danvers) 又は抗p38 MAPK (C-20) ポリクローナル抗体 (1:200; Santa Cruz Biotech.社)を用いて、メンブレンを一晩ブロットした。セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（1:1000; Cell Signaling Tech.社）を用いて、電気化学発光（ECL）系（Amersham Biosciences社、ニュージャージー州Piscataway）にてタンパク質の検出を行なった。
【００２６】
４．インビトロキナーゼアッセイ
Endo, M.ら, J Neurosci 23, 2527-2537(2003)に記載される方法でインビトロキナーゼアッセイを行った。培養CGNを3回洗浄し、キナーゼバッファー（50 mM Hepes-NaOH, pH 7.2; 150 mM NaCl; 1 mM MgCl2; 1 mM MnCl2; 10 mM NaF; 1mM Na3VO4; 5% グリセロール; 1% ノニデットP-40; 1 mMジチオスレイトール; 1 mMフッ化フェニルメチルスルホニル; 及びEDTA非含有プロテアーゼ阻害剤 (Complete mini; Roche社)）で溶解し、氷上で30分間インキュベートした。遠心後、Micro BCAタンパク質アッセイにより細胞溶解物中のタンパク質濃度を測定し、等量のタンパク質をそれぞれプロテインA−セファロース（Amersham Biosciences社）で4℃にて1時間前処理（preclear）した。上清を抗LIMK1（C-10）抗体及びプロテインA−セファロースとともに4℃にて一晩インキュベートした。遠心後、免疫沈降物をキナーゼバッファーで3回洗浄し、次いで、2μｇの(His)6-標識コフィリン存在下、50μM ATP及び5μCiの[γ−32P]ATP (3,000 Ci/mmol; Amersham Biosciences社)を含むキナーゼバッファー30μＬ中で30℃にて10分間インキュベートした。遠心後、上清を15％ SDS-PAGEで分離し、クマシーブリリアントブルー染色して総コフィリン活性を検出した。次いで、スラブゲル乾燥機でゲルを乾燥させ、32P標識コフィリンの放射活性を可視化し定量化した。遠心で得られた沈殿については、９％ SDS-PAGEで分離し、抗LIMK1（C-10）抗体を用いてイムノブロット解析を行ない、LIMK1を可視化した。なお、抗LIMK1（C-10）抗体及び(His)6-標識コフィリンはK. Mizuno博士より寄贈されたものである。
【００２７】
５．外科的処置
本研究で用いられた全ての動物に対する外科的介入並びにその後の管理及び処置は千葉大学の動物福祉特別委員会のガイドラインを厳守して行った。雌のSprague-Dawleyラット（180〜220 gm）を2％ハロタンで麻酔し、T9/T10脊椎レベルで椎弓切除を行うことにより、脊髄を露出させた。Infinite Horizon Spinal Cord Impactor (Precision Systems and Instrumentation社, ケンタッキー州Lexington)を用いて脊髄を挫傷させた。衝撃力は200 kdynにセットした（Cao, Q., et al. J Neurosci 25, 6947-6957 (2005)）。脊髄損傷直後より2週間の期間、ラットに浸透圧ミニポンプを取り付けた（容量200μＬ；注入速度0.5μＬ／時、Alzet 2002; Durect Corp., カリフォルニア州Cupertino）。ヒトFc（18個体、17.8μｇ/kg/日、2週間；Sigma-Aldrich社）又は組換えマウスノギン（noggin）(11個体、17.8μｇ/kg/日、2週間；R&D Systems社)を詰めたミニポンプをラットの背面皮下に留置し、ミニポンプの流出口に接続させたシラスティック(Silastic)(登録商標、DowCorning社)チューブは、先端が損傷部位に対しすぐ吻側にくるようにして、挫傷させた部位の脊髄硬膜下に留置した。該チューブを椎弓切除部位の尾側の棘突起に縫合して定位置に繋ぎとめた後、筋層及び皮膚層を縫合した。膀胱機能が回復するまでは、最低1日2回、手で腹圧をかける排尿介助を行なった。偽手術ラット(3個体)は、T9/T10脊椎レベルで椎弓切除を行い、脊髄を挫傷させずにミニポンプの留置のみ行なった。シラスティックチューブが硬膜から外れた個体や、自分の足を食害した個体については、統計解析から除外した。
【００２８】
６．行動試験
オープンフィールド環境下にて、BBB歩行運動評価スケール(BBB locomotor rating scale；Basso, D.M., Beattie, M.S. & Bresnahan, J.C. J Neurotrauma 12, 1-21 (1995))を用いて、損傷後10週間の行動の回復を評価した。数量化は、2名の観察者によりブラインド方式で行った。観察者間の判定値の差異は、BBBスコアリングスケールで1点以内であった。なお、BBBスケールではスコア0が完全麻痺、フルスコアの21が正常歩行を示す。
【００２９】
７．皮質脊髄路(CST)の順行性標識
傷害から8週後、麻酔下にてブレグマの２ｍｍ後方、２ｍｍ側方のそれぞれ深さ1.5ｍｍの位置にビオチン化デキストランアミン(BDA) (10％食塩水溶液、１皮質当り計４μＬ、MW 10,000；Molecular Probes社)を注入することにより、下行CST線維をBDA標識した。皮質１つに対し、4箇所に1μＬずつBDAを注入した。注入は、マイクロリッターシリンジ(Hamilton社、ネバダ州Reno)に取り付けた内径15〜20μｍのガラスキャピラリーを通して、0.25μＬのBDAを30秒間かけて投入した。BDA注入から14日後、PBSを灌流させてラットを死亡させ、４％ PFA中で固定した。ラットの脊髄を切開し、同様の固定液中で一晩後固定を行った。凍結保存は30％ショ糖PBS溶液中で行なった。損傷部位の５ｍｍ吻側及び５ｍｍ尾側にわたる脊髄塊（全長10ｍｍ）をTissue-Tek OCT(サクラファインテックジャパン社、東京)中に包埋した。包埋したブロックを矢状面又は横断面で50μｍ厚に切断し、各切片を確保した。いずれにおいても、損傷部位より５ｍｍ以上吻側及び尾側の位置の脊髄からも横断切片を得た。これらの切片は、PBSで1時間の洗浄を3回行い、還元剤NaBH4(10 mg/ml)中で2時間インキュベートした。次いで、0.3％ TritonX-100を含むPBSで透過化処理した後、0.15％ BSAを含むAlexa Fluor 488結合ストレプトアビジン（1:400; Invitrogen社、カリフォルニア州Carlsbad）PBS溶液で2時間インキュベートした。
【００３０】
８．数量化
損傷部位より吻側10ｍｍの横断切片における評価でBDAの取り込みが認められなかったラットについては、数量化から除外した。脊髄損傷後の修復反応の比較に用いたラットの個体数は、Fc処置コントロール個体が合計5匹、ノギン処置個体が合計6匹であった。損傷部位より吻側10ｍｍの横断面におけるBDA陽性線維の総ピクセル数を調べた。連続傍矢状切片を完全に再構築するため、全ての50μｍ厚切片を評価した。全ての連続矢状切片を軸位像に再構築し、損傷部を中心に４ｍｍ上部から４ｍｍ下部までの領域の灰白質中におけるBDA標識線維のピクセル数を、Scion Image software (Scion Corporation社, メリーランド州Frederick)を用いてカウントした。BDA標識線維のピクセル数は、損傷部位より上部４ｍｍで観察された線維に対する百分率として算出した。
【００３１】
９．組織の調製及び免疫組織化学
免疫組織化学的解析のため、非損傷脊髄並びに傷害後１日、３日及び７日の脊髄からそれぞれ新鮮な凍結組織を得た。ジエチルエーテルにより深い麻酔をかけた後、ラットを断頭し、脊髄を取り出した。該脊髄はTissue-Tek OCT中に包埋し、直ちにドライアイス上で−80℃で凍結した。クリオスタットで16μｍ厚の連続矢状切片を作製し、APSコートスーパーフロストプラススライドグラス（松浪硝子、大阪）上にマウントした。該切片を４％ PFA中で室温にて1時間固定し、PBSで3回洗浄後、５％ BSA及び0.1％ TritonX-100を含むPBS中で室温にて1時間ブロッキングした。該切片を1次抗体で4℃にて一晩インキュベートし、PBSで3回洗浄し、次いでフルオレセイン結合2次抗体（1:1,000; Invitrogen社）で室温にて1時間インキュベートした。1次抗体としては、抗TuJ1抗体（1:500）、抗MOSPモノクローナル抗体（1:200；Chemicon社）、抗GFAPモノクローナル抗体（1:400; Sigma-Aldrich社）、抗BMP-2/4モノクローナル抗体（1:50; R&D systems社）又は抗BMPタイプIIレセプター(BMP-RII)ポリクローナル抗体（1:50; Abgent社）を用いた。試料は蛍光顕微鏡下で観察した。
【００３２】
脊髄損傷後のグリア性瘢痕の形成を調べるため、上述のFc処置コントロールラット5匹及びノギン処置ラット6匹から得た10ｍｍ長の損傷脊髄塊の矢状切片を免疫染色した。1次抗体として抗GFAPモノクローナル抗体を用い、Scion Image softwareを用いてグリア性瘢痕の形成を定量的に解析した。デジタル顕微鏡画像をグレースケールに変換し、GFAP陽性領域に対しては閾値1-234/255、矢状断面全域に対しては閾値1-248/255とする同一の強度設定を用いて画像データを収集した。次いで、GFAP陽性細胞の領域を、それぞれの断面の総面積に対する百分率として算出した。同様の方法により、損傷脊髄の推定体積を算出した。
【００３３】
結果
１．ＢＭＰ−２は生後小脳ニューロンからの軸索の伸長を阻害する
まず、哺乳動物ＣＮＳ（中枢神経系）の軸索伸長の阻害にＢＭＰが寄与するか否かをインビトロで調べた。小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）は、ＢＭＰに対するレセプター並びにタイプII及びタイプIセリン／スレオニンキナーゼレセプターを発現しているので（データ示さず）、ＣＧＮを用いて実験を行なった。生後ラット（Ｐ７−９）由来のＣＧＮを、500 ng/ml濃度の組換えＢＭＰ−２（rhBMP-2）存在下又は非存在下で24時間培養し、軸索の長さを調べたところ、ＣＧＮをrhBMP-2で処理した場合には軸索の伸長が有意に阻害された（図１a, b）。
【００３４】
２．BMP-2による軸索伸長の阻害にはLIMKが関与する
LIMKファミリータンパク質は、種々のタイプの細胞においてアクチンの動態を調節する細胞質セリン／スレオニンキナーゼであり、CNS中で多量に発現していることが知られている（Mizuno, K., et al. Oncogene 9, 1605-1612 (1994)）。BMPタイプIIレセプター（BMP-RII）は、インビトロでLIMK1と相互作用し、LIMK1の活性を調節するということが報告されている（Foletta, V.C., et al. J Cell Biol 162, 1089-1098 (2003)； Lee-Hoeflich, S.T., et al. Embo J 23, 4792-4801 (2004)）。そこで、CGN中でBMP-2がLIMK1を活性化しているかどうかを調べるため、免疫沈降したLIMK1を利用してLIMK1のエフェクターであるコフィリンのリン酸化を測定することにより、LIMK活性を測定するアッセイを行った。rhBMP-2処理後のLIMK活性を表す32P標識コフィリンの放射活性についての代表的なラジオグラフィーを図２bに示す。写真濃度の解析により、LIMKの活性は、CGNにrhBMP-2 (150 ng/ml)を添加後30秒以内に有意に増大することが明らかとなった（図２a, b）。
【００３５】
次いで、BMP-2によるCGNの軸索伸長阻害作用にLIMKが関与しているかどうかを調べた。内生LIMK1活性の阻害には、LIMK1のドミナントネガティブ変異体を用いた。該変異体は、配列番号２に示すLIMK1アミノ酸配列のうち、４６０番目のアスパラギン酸がアラニンに置換したアミノ酸配列を有する変異体である。LIMK1変異体発現ベクターの共存下又は非共存下、GFP発現ベクターでCGNをトランスフェクトした。トランスフェクションから24時間後、CGNをトリプシン処理して再度プレートに播種した。次いで、CGNをrhBMP-2（150 ng/ml）と共にさらに24時間インキュベートした。該細胞をニューロン特異的なβチューブリンIII（TuJ1）に対する抗体で免疫染色し、ニューロンの軸索長を測定した。トランスフェクトした全ての細胞でGFPの発現が確認された。コントロールのGFP発現ニューロンの軸索の伸長はrhBMP-2により有意に阻害されたが、LIMK1ドミナントネガティブ変異体を発現させたニューロンでは、rhBMP-2の軸索伸長阻害作用は打ち消され、コントロールのニューロンよりも軸索が有意に伸長していた（図３）。LIMK1変異体それ自体は、軸索伸長効果を有していなかった。これらのことは、BMP-2が、LIMK1の活性化を介してCGNの軸索伸長阻害を媒介していることを示している。
【００３６】
３．BMP-2による軸索伸長の阻害にはRGMが関与する
近年、RGM(repulsive guidance molecule；反発性ガイダンス分子)ファミリーに属するRGMa、RGMb及びRGMcがBMPコレセプターとして作用することが報告されている（Samad, T.A., et al. J Neurosci 24, 2027-2036 (2004); Babitt, J.L., et al. J Biol Chem 280, 29820-29827 (2005); Babitt, J.L., et al. Nat Genet 38, 531-539 (2006)）。そこで、CGNにおけるBMP-2による軸索伸長阻害にRGMが関与しているか否かを調べた。Hata, K., et al. J Cell Biol 173, 47-58 (2006)に記載のRGMa特異的ポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット解析を行なったところ、CGN中でRGMaが発現していることが確認された。RGMはグリコシルホスファチジルイノシトールに連結する糖タンパク質であるため、ホスファチジルイノシトール特異的なホスホリパーゼC（PI-PLC）によって原形質膜から切り離される（Brinks, H., et al. J Neurosci 24, 3862-3869 (2004)）。そこで、上記した方法でCGNのPI-PLCによる前処理を行ない、前処理がBMP-2による軸索伸長阻害に及ぼす影響を調べたところ、前処理をすることでBMP-2による軸索伸長阻害効果が完全に消失することが確認された（図４）。すなわち、CGNの原形質膜からRGMを切り離して培養系内からRGMを消去すると、BMP-2による軸索伸長阻害作用が消失することが示された。このことは、CGNの軸索伸長に及ぼすBMP-2の阻害作用には、RGMがBMPのコレセプターとして機能することが必要であることを示唆している。
【００３７】
４．BMP-2による軸索伸長の阻害にはSmad経路及びMAPK経路は関与しない
ＢＭＰの下流のシグナル経路としては、レセプターを介し、レセプター調節Smadタンパク質（R-Smads; Smad 1/5/8）を経てシグナルを変換するSmad依存の経路と、Smadには依存しない経路があることが知られている（Miyazono, K., Maeda, S. & Imamura, T. Cytokine Growth Factor Rev 16, 251-263 (2005)）。そこで、ＢＭＰ−２が軸索の伸長に及ぼす阻害効果にR-Smadシグナルが関与しているか否かを調べた。ＣＧＮをrhBMP-2（150 ng/ml）で処理し、リン酸化Smad 1/5/8を特異的に認識する抗体を用いたウエスタンブロットによりSmad 1/5/8タンパク質のリン酸化状態を調べたところ、rhBMP-2の添加から5分以内にSmad 1/5/8のリン酸化の増大が認められた（図５）。このリン酸化の増大は、観察終了時（rhBMP-2添加後60分）まで持続していた。さらに、Smad 1/5/8の下流転写標的であるId1（Nakashima, K., et al. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 5868-5873 (2001)）の発現についても経時的にウエスタンブロット解析を行なったところ、rhBMP-2の添加後1時間以内にId1タンパク質レベルの強い上昇が認められた（図６）。以上より、BMP-2には、ＣＧＮ細胞においてSmadシグナル経路を活性化し、Id1発現を増大させる作用があることが確認された。
【００３８】
そこで、次いで、阻害的Smadとして知られるSmad6を用いてBMPの下流のSmad経路を抑制することにより、BMP-2による軸索伸長阻害にSmad経路が関与するかどうかを調べた。Smad6が組み込まれた哺乳動物発現ベクターの共存下又は非共存下、緑色蛍光タンパク質（GFP）でCGNをトランスフェクトした。トランスフェクションから24時間後、培地にBMP-2（150 ng/ml）又はコントロールとして分散媒のみを添加し、ニューロンをさらに24時間インキュベートした。次いでニューロンを固定し、抗TuJ1抗体で免疫染色して軸索長を測定した。その結果、Smad6を発現させてSmadシグナルを抑制したニューロンと、GFPのみを発現させたコントロールのニューロンとの間では、rhBMP-2の作用による軸索伸長阻害は同程度に観察され、差異は認められなかった（図７）。このことは、BMP-2による軸索伸長の阻害にはR-Smad経路は関与しないことを示唆している。
【００３９】
また、TGF-β活性化キナーゼである1/p38有糸分裂活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)は、TGF-β及びBMPにより活性化されることが知られている(Yamaguchi, K., et al. Science 270, 2008-2011 (1995))。そこで、BMP-2がp38 MAPKのリン酸化を誘導するかどうかを調べた。rhBMP-2 (150 ng/ml)処理又は非処理のCGNについて、リン酸化p38 MAPKを特異的に認識する抗体を用いたウエスタンブロットを行なったところ、観察時間内(5〜60分)では、rhBMP-2処理後のp38 MAPKのリン酸化レベルに有意な変化は認められなかった（図８）。このことは、BMP-2による軸索伸長の阻害にはp38 MAPKは関与しないことを示唆している。
【００４０】
５．脊髄損傷後におけるBMP-RII及びBMP-2の発現増強
脊髄損傷後における軸索再生の阻害にBMPが関与しているか否かを調べるため、免疫組織化学的解析により、成体ラット脊髄中でのBMP-RIIの分布パターンを調べた。脊髄損傷後1日、3日及び7日目のラット並びにコントロールの偽手術ラットから脊髄の新鮮凍結切片を得た。抗TuJ1抗体／抗BMP-RII抗体、抗MOSP(ミエリン／オリゴデンドロサイト特異的タンパク質)抗体／抗BMP-2/4抗体又は抗GFAP(グリア線維酸性タンパク質)抗体／抗BMP-2/4抗体を用いて二重免疫染色を行なった。
【００４１】
その結果、コントロールの偽手術脊髄ではBMP−RIIのシグナルは非常に弱かったが、脊髄損傷後7日の脊髄では、灰白質中でTuJ1陽性ニューロンにおけるBMP-RIIの誘導が認められた。BMP-RIIシグナルは、脊髄損傷後1日という早い時期からニューロン中に現れていた。BMP-2/4に対する免疫反応性は、偽手術脊髄では非常に弱く、一方、脊髄損傷後7日の損傷部位周辺では、MOSP陽性のオリゴデンドロサイト及びGFAP陽性のアストロサイトにおいて強く上昇していた。BMP-2/4シグナルは、脊髄損傷後1日以内に検出された。すなわち、脊髄損傷後の損傷部位周辺においては、BMP-RIIがニューロン中で誘導されており、一方BMP-2/4はオリゴデンドロサイト及び反応性アストロサイト中で誘導されていた。これらの結果は、脊髄損傷後のBMP-2及びBMP-7の上方制御を示す既報の結果（Setoguchi, T., et al. Brain Res 921, 219-225 (2001)； Setoguchi, T., et al. Exp Neurol 189, 33-44 (2004)）と矛盾しておらず、脊髄損傷後の軸索再生阻害はBMPによって生じるという考えを強く支持するものである。
【００４２】
５．ノギン処置による脊髄損傷後の機能回復の促進
ノギンとは、アフリカツメガエル胚のシュペーマンオーガナイザーから分泌される32kDaの糖タンパク質である。ノギンの機能に関しては、BMPのレセプターへの結合を遮断することにより、BMPの作用を中和すること；神経組織の形成を誘導し、腹側中胚葉を背側化すること；BMP-2及びBMP-4とは高い親和性で直接結合し、BMP-7とは低い親和性で結合すること；アクチビンやTGF-βとは結合しないこと等が知られている(Yanagita, M. Cytokine Growth Factor Rev 16, 309-317 (2005))。従って、ノギンは脊髄損傷の発生におけるBMPの特異的な関与を調べるための好適な手段となる。インビボ評価に先立ち、インビトロでノギンがrhBMP-2の効果を中和し得るかどうかを調べた。その結果、インビトロにおいて、CGNの軸索伸長に及ぼすrhBMP-2の効果は、ノギン処理により完全に消失することが確認された。
【００４３】
次いで、インビボでのノギンの効果をラット脊髄挫傷モデルを用いて調べた。胸部レベル(T9及びT10)の脊髄を衝撃力200 kdynで挫傷させた(Cao, Q., et al. J Neurosci 25, 6947-6957 (2005))。ノギン又はヒトFc(コントロール)のいずれかを、胸部損傷部位に近接するくも膜下腔内カテーテルを具備する浸透圧ミニポンプを介して投与した。偽手術ラットには、挫傷を行なわずに椎弓切除とカテーテル留置を行なった。脊髄損傷後10週間にわたってラットの歩行運動をモニターした。その結果を図９に示す。偽手術ラットでは、はじめの2週間は歩行活動に若干の悪化が認められたものの、3週間以内にBasso-Beattie-Bresnahan（BBB）歩行運動評価スケール(BBB locomotor rating scale；Basso, D.M., Beattie, M.S. & Bresnahan, J.C. J Neurotrauma 12, 1-21 (1995))によるフルスコアに達した(図９)。初期の悪化は、くも膜下腔内カテーテルによる脊髄の圧迫によるものと考えられた。脊髄挫傷ラットは全て、挫傷後初日はほぼ完全な対麻痺となり(図９)、その後徐々にBBBスコア評価に基づく歩行行動の部分的な回復を示した。脊髄損傷後4週間までは、ノギン処置ラットとコントロールのFc処置ラットとの間でBBBスコアに差異は認められなかったが、4週以降は、コントロールのFc処置ラットと比較して、ノギン処置ラットでは歩行能力がより向上していた。平均すると、術後10週の時点で、コントロールのFc処置ラットではBBBスコアは9.5であり、ノギン処置ラットではそれよりも有意に良好なBBBスコア13.0に達していた。以上の通り、ラットにおいて、ノギン処置により脊髄挫傷後の歩行運動の回復が促進されることが示された。
【００４４】
７．ノギン処置による脊髄損傷後の皮質脊髄路軸索の発芽の誘導
はじめに、ノギン処置により損傷部体積が減少するか増大するかを調べた。その結果、コントロール群とノギン処置群との間で脊髄の総体積に有意差はなく、脊髄損傷後の組織崩壊の程度はノギン処置によって上昇も低下もしないことが確認された（図１０）。
【００４５】
次いで、感覚運動皮質中にビオチン化デキストランアミン(BDA)を注入することにより、下行皮質脊髄路(CST)の構造の完全性について検討した。コントロールのFc処置ラット5匹とノギン処置ラット6匹の動物群について、傷害中心部から吻側５ｍｍ及び尾側５ｍｍの領域の組織塊を矢状面で切断した(図１１m, n)。吻側１０ｍｍ及び尾側１０ｍｍの分節は横断面で切断した(図１１a〜l)。コントロールのFc処置ラット及びノギン処置ラットについての、損傷部の吻側10ｍｍにおける代表的な横断面の顕微鏡像を、それぞれ図１１a〜c及び図１１g〜iに示す。
【００４６】
BDA標識した線維の定量解析は、標識された線維数をカウントすることにより行なった。損傷部の吻側10ｍｍの位置で観察された標識線維の総数は、コントロールのFc処置ラット(n = 5)とノギン処置ラット(n = 6)とでほぼ等しく(図１１o)、いずれの群でもBDA取り込みの程度は同等であることが示された。損傷部の尾側10ｍｍの位置では、コントロールのFc処置ラット及びノギン処置ラットいずれにおいても、背柱あるいは背側柱の腹側の部分に線維はほとんど観察されなかった（Fc処置；図１１d及びe、ノギン処置；図１１j及びk）。尾部分節に残され伸展している軸索が存在するのであれば標識線維は通常の位置に観察されるはずなので、このことから、背部又は背側部のCST軸索は残存しないことが示された。
【００４７】
しかしながら、ノギン処置したラットでは、発芽した軸索が白質中よりも灰白質中により広く伸展していた(図１１j, l)。一方、コントロールのFc処置ラットではそのような伸展は認められなかった(図１１f)。損傷部位を横切る縦断切片の観察によると、コントロールラット(図１１m)よりもノギン処置ラット(図１１n)の方が、損傷中心点からの背部CST束の退縮が少なかった。
【００４８】
次いで、損傷脊髄の連続傍矢状切片の再構築を行ない、標識線維数を評価した。脊髄中のBDA標識線維数は、損傷中心点より吻側４ｍｍから尾側４ｍｍまでの範囲で計測し、損傷部より吻側４ｍｍの位置で観察された線維の百分率として算出した。結果を図１１pに示す。コントロールラットでは観察された線維の百分率は低かったが、ノギン処置ラットでは、脊髄損傷部より吻側(1及び2ｍｍ)及び尾側(2ｍｍ)で観察された標識線維数は有意に高かった。
【００４９】
上記した通り、いずれの損傷ラットでも、損傷部より尾側の背部CSTの通常の位置に標識繊維が観察されなかったため（図１１d、j）、ノギン処置による標識繊維数の増大は、背部CST軸索の生存数が増大したことによって生じているわけではないものと考えられる。すなわち、以上の結果は、ノギンが脊髄損傷後に無損の腹部CST又は損傷した背部CSTからの繊維成長を有意に促進することを示している。さらに、このCSTの成長の増大は、CSTの遠位部と同様に近位部でも生じていた。
【００５０】
８．ノギン処置は脊髄損傷後のグリア性瘢痕形成には影響しない
BMPは、胚性及び成体神経幹細胞のアストロサイトへの分化を促進することが知られている。反応性アストロサイトはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）のような軸索成長阻害因子のソースとなり、グリア瘢痕の形成をもたらすため、ノギンによりアストロサイトの分化が阻害されていれば、それにより脊髄損傷後の軸索成長を促進する結果がもたらされ得る。そこで、ラット損傷脊髄における反応性アストログリオーシスを定量的に解析した。
【００５１】
コントロールラット及びノギン処置ラットから得た損傷脊髄の矢状切片を、抗GFAP抗体を用いて免疫染色して反応性アストロサイトを検出した結果、コントロールラット及びノギン処置ラットのいずれにおいても、SCI後の損傷部位周辺でGFAPに対する免疫反応性が増大していた。次いで、損傷中心点周辺におけるGFAPに対する免疫反応陽性領域の総面積をScion Imageソフトウェアを用いて解析し、SCI後10週におけるアストログリオーシスの進行度を評価した。GFAPへの免疫陽性度は各切片の総面積に対する百分率として算出し、評価を行なった。その結果、コントロール群とノギン処置群との間で免疫陽性度に有意差はなく、アストログリオーシスの進行度に有意差は認められなかった（図１２）。以上の結果は、投与されたノギンが損傷部位周辺の反応性アストロサイトの数を減少させることによってグリア性瘢痕を越える軸索の成長をもたらすという仮説を否定するものであり、ノギン処置は脊髄損傷後のグリア性瘢痕形成には影響しないことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】BMP-2による小脳顆粒ニューロン（CGN）の軸索伸長阻害作用を示す。a；ポリ−L−リジン被覆チェンバースライド上で培養したCGNの写真である。「コントロール」はrhBMP-2非存在下で培養したCGNを、「BMP-2」は可溶性rhBMP-2(500 ng/ml)存在下で培養したCGNを示す。スケールバーは25μｍを示す。b；それぞれのニューロンについて、軸索の最大長を測定した結果を示すグラフである。データは3回の独立した実験の平均値±標準誤差を表す。*；p＜0.01（スチューデントt検定）
【図２】CGNにおけるrhBMP-2処理によるLIMKの活性化について、インビトロキナーゼアッセイにより調べた結果を示す。a；上段は32P標識されたコフィリンのオートラジオグラフィー、下段はクマシー染色により示された総コフィリン活性を表す。b；リン酸化コフィリンのシグナル強度を数値化して表したグラフである。データは3回の独立した実験の平均値±標準誤差を表す。*；コントロールとの比較でp＜0.05、**；コントロールとの比較でp＜0.01（一元配置分散分析（ANOVA）の後、シェフェの多重比較検定を行なった）
【図３】LIMK1の阻害により、BMP-2による軸索伸長阻害作用が打ち消されることを示すグラフである。各ニューロンについて軸索の最大長を測定した結果を示す。「GFP」はGFP単独でトランスフェクトしたニューロン、「d/n LIMK1＋GFP」は、LIMK1ドミナントネガティブ変異体及びGFPでトランスフェクトしたニューロンについての結果である。データは3回の独立した実験の平均値±標準誤差を表す。*；コントロールとの比較でp＜0.05（一元配置ANOVAの後、シェフェの多重比較検定を行なった）
【図４】PI-PLCによる前処理により、BMP-2による軸索伸長阻害作用が打ち消されることを示すグラフである。PI-PLCによる前処理あり又は前処理なしのCGNニューロンを、rhBMP-2の存在下又は非存在下でインキュベートし、各ニューロンについて軸索の最大長を測定した。データは3回の独立した実験の平均値±標準誤差を表す。両群間で有意差はない。
【図５】CGNにおけるrhBMP-2によるSmad 1/5/8のリン酸化を経時的に解析した結果を示す。24時間培養したCGNを150 ng/mlのrhBMP-2で処理した。図中に示した時間はrhBMP-2による処理時間である。上段の写真はリン酸化Smad 1/5/8を特異的に認識する抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果、下段のグラフはそのシグナル強度を数値化して表したグラフである。グラフのデータは3回の独立した実験の平均値±標準誤差を表す。*；コントロールとの比較でp＜0.05（一元配置ANOVAの後、シェフェの多重比較検定を行なった）
【図６】CGNにおけるrhBMP-2によるId-1発現誘導を経時的に解析した結果を示す。図中に示した時間はrhBMP-2による処理時間である。上段の写真はId-1タンパク質のウエスタンブロット解析結果、下段のグラフはそのシグナル強度を数値化して表したグラフである。グラフのデータは3回の独立した実験の平均値±標準誤差を表す。*；コントロールとの比較でp＜0.05（一元配置ANOVAの後、シェフェの多重比較検定を行なった）
【図７】Smadの阻害がBMP-2による軸索伸長阻害作用に影響しないことを示すグラフである。各ニューロンについて軸索の最大長を測定した結果を示す。「GFP」はGFP単独でトランスフェクトしたニューロン、「Smad 6＋GFP」は、Smad 6及びGFPでトランスフェクトしたニューロンについての結果である。データは3回の独立した実験の平均値±標準誤差を表す。*；コントロールとの比較でp＜0.05（スチューデントt検定）
【図８】BMP-2で処理した培養CGNにおけるリン酸化p38 MAPK量をウエスタンブロットにより定量した結果を示す。上段はリン酸化p38 MAPK、下段は総p38 MAPKを表す。図中に示した時間はrhBMP-2による処理時間である。
【図９】BBB歩行スケールにより脊髄損傷後の歩行能力を評価した結果を示す。「ノギン」は脊髄損傷後にノギンを投与したラット、「コントロールFc」は脊髄損傷後にヒトFcを投与したラット、「偽手術」は脊髄を挫傷させずに椎弓切除とカテーテル留置を行なったラットを示す。*；コントロールFc処置ラットとの比較でp＜0.05（スチューデントt検定）
【図１０】脊髄損傷後の脊髄の体積を測定した結果を示すグラフである。両群間で有意差はない。データはコントロールのFc処置ラット18匹及びノギン処置ラット11匹それぞれについての平均値±標準誤差を表す。
【図１１】BDA標識した皮質脊髄路の脊髄損傷後10週における顕微鏡像及び標識線維数の解析結果である。a〜l；脊髄横断切片の顕微鏡像を示す（スケールバー：1mm）。a〜fはコントロールのFc処置ラットの脊髄横断切片であり、a〜cが損傷部より吻側10mm、d〜fが尾側10mmの像である。g〜lはノギン処置ラットの脊髄横断切片であり、g〜iが損傷部位より吻側10mm、j〜lが尾側10mmの像である。b、c、e、f、h、i、k及びlは、それぞれ左隣の写真中に示される部位の拡大像である。m及びn；損傷部位の縦断切片の顕微鏡像である（スケールバー：1mm）。mがFc処置ラット、nがノギン処置ラットである。左が吻側であり、星印は損傷中心部、矢印は退縮した皮質脊髄路線維を示す。o；損傷部より吻側10mmにおける標識繊維数の平均値±標準誤差を表すグラフである。Fc処置ラット5匹、ノギン処置ラット6匹のデータを示す。両群間に有意差はない。p；再構築した連続矢状切片を用いて標識繊維数を評価した結果を示すグラフである。損傷部より吻側４ｍｍから尾側４ｍｍまでの領域内の灰白質中に観察される標識繊維数を測定し、吻側４ｍｍにおける標識繊維数に対する百分率として算出して表した。横軸は、損傷中心点から吻−尾方向軸で表した測定部位の位置を表す。縦軸は標識繊維数の百分率を表す。エラーバーは標準誤差を示す。*；コントロールとの比較でp＜0.05（スチューデントt検定）
【図１２】グリア性瘢痕の形成を定量的に評価した結果を示す。抗GFAP抗体で免疫染色した損傷脊髄の横断切片の染色強度を、Scion Image softwareで解析して定量した。データはFc処置ラット5匹及びノギン処置ラット6匹についての平均値±標準誤差を表す。両群間で有意差はない。
【図１】
2008255071.tif 000003
【図２】
2008255071.tif 000004
【図３】
2008255071.tif 000005
【図４】
2008255071.tif 000006
【図５】
2008255071.tif 000007
【図６】
2008255071.tif 000008
【図７】
2008255071.tif 000009
【図８】
2008255071.tif 000010
【図９】
2008255071.tif 000011
【図１０】
2008255071.tif 000012
【図１１】
2008255071.tif 000013
【図１２】
2008255071.tif 000014
【配列表】
2008255071000001.app