(57)【要約】【課題】アルミニウム耐性に関与する遺伝子を同定し、その遺伝子の利用方法を提供する。【解決手段】アルミニウム感受性突然変異体（ａｌｓ２変異体）と、カサラスとの交配によって得られたＦ２ 集団を用いたマップベースクローニングによって、アルミニウム耐性に関与する遺伝子（Ａｌｓ２遺伝子）を同定し、新規遺伝子として単離した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、発現可能に導入することを特徴とするアルミニウム耐性が促進された形質転換体の生産方法。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）以下の（ｉｉｉ）もしくは（ｉｖ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉｉｉ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは、
（ｉｖ）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
下記の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとが導入されており、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチドを発現してなる形質転換体。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチド；
（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチド。
【請求項３】
アルミニウム耐性を抑制するポリヌクレオチドであって、
下記の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項４】
アルミニウム耐性を抑制するポリペプチドであって、
下記の（ａ）または（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項５】
請求項４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３または５に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一部を含む形質転換体選抜用マーカー遺伝子。
【請求項７】
請求項３または５に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項８】
請求項３または５に記載のポリヌクレオチド、または、請求項７に記載の組換え発現ベクターが導入されており、かつ、アルミニウム耐性に関与するポリペプチドを発現してなる形質転換体。
【請求項９】
請求項２または８に記載の形質転換体を含む食品。
【請求項１０】
少なくとも請求項３または５に記載のポリヌクレオチド、あるいは、請求項５に記載の組換え発現ベクターのいずれかを含むことを特徴とする形質転換キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルミニウム耐性に関与する新規遺伝子およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
酸性土壌は、世界の耕地面積の約４割を占めている。また、酸性土壌は、植物の生育が阻害される典型的な問題土壌である。植物の生育阻害は、アルミニウム毒性によって引き起こされる。アルミニウムイオンは、低濃度（数μＭ）でも、すばやく根の伸長阻害を引き起こし、根からの養水分の吸収を阻害する。その結果、植物が、様々なストレスに弱くなる。このため、酸性土壌での植物の生産性は、非常に低い。
【０００３】
アルミニウムによる生育阻害は、植物の種類によって異なる。つまり、植物の種類によって、アルミニウム耐性は大きく異なる。イネ科植物の中では、イネのアルミニウム耐性は最も強い。イネ科植物のアルミニウム耐性は、イネ，ライ麦＞コムギ＞オオムギの順となる。
【０００４】
アルミニウム耐性は、植物の品種間でも大きく異なる。例えば、日本型イネ品種のアルミニウム耐性は、インド型イネ品種よりも強い。
【０００５】
しかし、イネの生産量が多い地域は、酸性土壌であることが多い。例えば、酸性硫酸土水稲栽培地域および酸性陸栽培地域であることが多い。しかも、イネの生産量が多い地域では、アルミニウム耐性の弱い品種のイネが栽培される。このため、イネの生産性が、非常に低くなる。このため、酸性土壌での植物の生産性を向上するために、アルミニウム耐性の強いイネの作出が、求められる。
【０００６】
このように、アルミニウムイオンは、植物の生育を阻害する最大の因子である。
【０００７】
本願発明者は、植物のアルミニウム耐性について、精力的に研究を行っており（例えば、特許文献１〜３，非特許文献１〜４参照）、イネからアルミニウム耐性に関与する遺伝子（Ａｌｓ１遺伝子）を単離することに成功している（特許文献４  本願出願時において未公開）。
【特許文献１】特開２００４−１０５１６４号公報（２００４年４月８日公開）
【特許文献２】特開２００４−３４４０２４号公報（２００４年１２月９日公開）
【特許文献３】特開２００５−０５８０２２号公報（２００５年３月１０日公開）
【特許文献４】特願２００６−０７２７０６（２００６年３月１６日出願）
【非特許文献１】Ma, J. F. 2005. Plant root responses to three abundant soil mineral: silicon, aluminum and iron. Crit. Rev. Plant Sci. 24, 267-281.
【非特許文献２】Ma, J. F., Nagao, S., Huang, C. F., Nishimura, M. 2005. Isolation and characterization of a rice mutant hypersensitive to Al. Plant Cell Physiol. 46, 1054-1061.
【非特許文献３】Ma, J. F., Shen, R., Zhao, Z., Wissuwa, M., Takeuchi, Y., Ebitani, T. and Yano, M.: Response of rice to Al stress and identification of quantitative trait loci for Al tolerance. Plant Cell Physiol. 43：652-659 (2002).
【非特許文献４】Delhaize E, Ryan PR, Hebb DM, Yamamoto Y, Sasaki T and Matsumoto H 2004: Engineering high-level aluminum tolerance in barley with the ALMT1 gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 15249-15254
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、アルミニウム耐性に関与する遺伝子は、本願発明者によって、Ａｌｓ１遺伝子が同定されたにすぎず、植物のアルミニウム耐性メカニズムも、ほとんど解明されていない。
【０００９】
本発明の目的は、アルミニウム耐性に関与する遺伝子を同定し、その遺伝子の利用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、アルミニウム耐性に関与する遺伝子について鋭意に検討した。その結果、アルミニウム感受性突然変異体（ａｌｓ２変異体）と、カサラスとの交配によって得られたＦ２ 集団を用いたマップベースクローニングによって、当該遺伝子を同定し、その配列を特定することに成功して、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
本発明の形質転換体の生産方法は、下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、発現可能に導入することを特徴としている。
【００１２】
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）以下の（ｉｉｉ）もしくは（ｉｖ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉｉｉ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは、
（ｉｖ）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００１３】
上記の発明によれば、アルミニウム耐性が促進された（アルミニウム耐性が付与された）形質転換体を生産することができる。
【００１４】
ここで、本発明において「アルミニウム耐性」とは、アルミニウム存在下においても正常に成長できる植物の能力のことである。言い換えると、「アルミニウム耐性」は、アルミニウムによる生育阻害に対する抵抗性のことである。「アルミニウム」は、イオン化されているものでも、塩を形成しているものであってもよい。また、「アルミニウム」は、アルミニウムおよびアルミニウムを含む化合物を示すものとする。「アルミニウム耐性を促進する」とは、アルミニウム耐性能を向上させる（付与する）ことを示す。
【００１５】
本発明の形質転換体は、下記の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとが導入されており、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチドを発現してなる形質転換体。
【００１６】
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチド；
（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチド。
【００１７】
この形質転換体は、異なる染色体に座乗するアルミニウム耐性を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されており、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチドを発現している。このため、この形質転換体は、アルミニウム耐性が付与されることにより、根からアルミニウムを排除する結果、アルミニウムの吸収が抑制され、アルミニウムの蓄積量を減少させることができる。これにより、アルミニウムによる生育阻害を低減できる。それゆえ、酸性土壌での生産性を高めることができる。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、アルミニウム耐性を抑制するポリヌクレオチドであって、下記の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドである。
【００１９】
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００２０】
上記の発明によれば、アルミニウム耐性を抑制するポリペプチドを翻訳産物として得ることができる。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、アルミニウム耐性を抑制するポリペプチドであって、下記の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドである。
【００２２】
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列。
【００２３】
上記の発明によれば、アルミニウム耐性を抑制することができる。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドは、前記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【００２５】
上記の発明によれば、アルミニウム耐性を抑制するポリペプチドを翻訳産物として得ることができる。
【００２６】
本発明の形質転換体選抜用マーカー遺伝子は、前記いずれかのアルミニウム耐性を抑制するポリヌクレオチドの少なくとも一部を含んでいることを特徴としている。
【００２７】
本発明にかかるアルミニウム耐性を抑制するポリヌクレオチドは、それが発現している細胞（特に植物細胞）のアルミニウム耐性を抑制することができる。このため、そのようなポリヌクレオチドを含むマーカー遺伝子は、アルミニウム耐性が弱い品種を選抜するために、利用することができる。
【００２８】
なお、アルミニウム耐性を促進するポリヌクレオチドの少なくとも一部を含むマーカー遺伝子によれば、アルミニウム耐性を抑制することができる。このため、そのようなポリヌクレオチドを含むマーカー遺伝子は、アルミニウム耐性が強い品種を選抜するために、利用することができる。
【００２９】
本発明にかかる組換え発現ベクターは、上記の何れかのアルミニウム耐性を抑制するポリヌクレオチドを含むものである。上記の組換え発現ベクターは、本発明にかかるポリヌクレオチドを細胞に導入するための組換え発現ベクターとして利用できるだけでなく、本発明にかかるポリヌクレオチドを選抜用マーカーとして用いた場合には、他の遺伝子を細胞に導入するための組換え発現ベクターとしても利用できる。
【００３０】
本発明にかかる形質転換体は、上記のポリヌクレオチドまたは上記の組換え発現ベクターが導入されており、かつ、アルミニウム耐性を抑制するポリペプチドを発現しているものである。ここで、上記ポリヌクレオチドは、アルミニウム耐性に関与するポリヌクレオチドであるため、上記形質転換体は、植物（形質転換植物）であることが好ましい。
【００３１】
この形質転換体は、上記アルミニウム耐性を抑制するポリヌクレオチドまたは組換え発現ベクターが、アルミニウム耐性を抑制するポリペプチドの発現を促進させるプロモーターとともに導入されている。このため、アルミニウム耐性を抑制するポリペプチドを発現させることによって、この形質転換体のアルミニウム耐性を減少させることができる。
【００３２】
本発明の食品は、前記形質転換体を含むことを特徴としている。すなわち、この食品は、アルミニウム耐性が促進または抑制された形質転換体を含むものである。
【００３３】
本発明の形質転換キットは、少なくとも上記のポリヌクレオチド、あるいは、上記の組換え発現ベクターのいずれかを含むことを特徴とするものである。本発明にかかる形質転換キットは、上記の形質転換キットを用いれば、本発明にかかるポリペプチドを発現する形質転換体を簡便かつ効率的に得ることができる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、アルミニウム耐性に関与するポリペプチドを産生させることによって、アルミニウム耐性を促進または抑制することができる。
【００３５】
特に、本発明のポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターがポリペプチドの発現を促進させるプロモーターとともに導入された、アルミニウム耐性が高められた形質転換体には、アルミニウム耐性が付与されるため、アルミニウムによる生育阻害を低減できる。それゆえ、酸性土壌での生産性を高めることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明の実施の形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。なお、配列番号１は、変異型イネ（ａｌｓ２変異体）に由来する変異型ａｌｓ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列である。配列番号２は、配列番号１の変異型ａｌｓ２遺伝子にコードされるポリペプチド（変異型ａｌｓ２タンパク質）アミノ酸配列である。配列番号３は、野生型イネ（日本晴およびコシヒカリ）に由来する野生型Ａｌｓ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列である。配列番号４は、配列番号３の野生型Ａｌｓ２遺伝子にコードされるポリペプチド（野生型Ａｌｓ２タンパク質）のアミノ酸配列である。
【００３７】
（１）本発明にかかるポリヌクレオチド
本発明にかかるポリヌクレオチドは、アルミニウム耐性に関与するポリペプチドをコードするものである。「アルミニウム耐性に関与する」とは、アルミニウム耐性を促進（増強）または抑制（減少）させることを示す。
【００３８】
ここで、上記「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言でき、ヌクレオチドの重合体が意図されている。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言でき、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列からなるポリヌクレオチドを示している。
【００３９】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であってもよい。
【００４０】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、アルミニウム耐性に関与するポリヌクレオチドであって、下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドである。
【００４１】
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）以下の（ｉｉｉ）もしくは（ｉｖ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉｉｉ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｖ）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００４２】
上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドは、アルミニウム耐性を抑制するポリヌクレオチドである。上記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドは、アルミニウム耐性を促進するポリヌクレオチドである。このように、配列番号１および３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、アルミニウム耐性に関与する遺伝子である。
【００４３】
具体的には、配列番号１のポリヌクレオチドは、イネの変異体（ａｌｓ２変異体）由来の変異型ａｌｓ２遺伝子の塩基配列（ｃＤＮＡ配列）である。ａｌｓ２変異体は、野生型のイネに比べてアルミニウム耐性能が低い突然変異体である。このように、配列番号１は、アルミニウム耐性能が低いａｌｓ２変異体由来のアルミニウム耐性を抑制するポリヌクレオチド（変異型ａｌｓ２遺伝子）である。
【００４４】
一方、配列番号３のポリヌクレオチドは、野生型イネ（日本晴およびコシヒカリ）において発現している、野生型イネ由来の野生型Ａｌｓ２遺伝子の塩基配列（ｃＤＮＡ）である。イネは、アルミニウム耐性の強い代表的な植物である。特に、日本型イネ品種は、強いアルミニウム耐性を有するため、酸性土壌で栽培しても、生育は阻害されにくい。このように、配列番号３は、アルミニウム耐性能が強い野生型イネに由来するアルミニウム耐性を促進するポリヌクレオチド（野生型Ａｌｓ２遺伝子）である。
【００４５】
上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも90％の同一性、好ましくは少なくとも95％の同一性、最も好ましくは少なくとも97％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、60℃で 2×SSC 洗浄条件下で結合することを意味する。上記ハイブリダイゼーションは、「Molecular Cloning （Third Edition）」 （J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。
【００４６】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、アルミニウム耐性に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００４７】
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加され、かつ、アルミニウム耐性を抑制するポリペプチド；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加され、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチド。
【００４８】
上記「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、もしくは付加ができる程度の数（例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、特に好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００４９】
配列番号４は、本発明者が見出したアルミニウム耐性を促進するポリペプチドである。このポリペプチドは、例えば、配列番号３に示される野生型Ａｌｓ１遺伝子にコードされる。また、配列番号４のポリペプチドに変異が生じると、アルミニウム耐性を抑制するポリペプチドとなる。
【００５０】
このようなアミノ酸の変異は、本発明にかかるポリヌクレオチドの変異（欠失、置換、もしくは付加）によって生じる。例えば、後述の実施例のように、アルミニウムに感受性を示す突然変異体（ａｌｓ２変異体）は、野生型のイネに比べてアルミニウム耐性が弱い。そこで、配列番号１の変異型ａｌｓ２遺伝子と、配列番号３の野生型Ａｌｓ２遺伝子とを比較すると、変異型ａｌｓ２遺伝子では、野生型Ａｌｓ２遺伝子の９５３番目の塩基（Ｇ）が欠失している。このため、野生型Ａｌｓ２タンパク質と変異型ａｌｓ２タンパク質とでは、その欠失部位以降の遺伝子にコードされるアミノ酸配列が異なる。そして、このようなアミノ酸配列の変異により、変異型ａｌｓ２タンパク質は、アルミニウム耐性が抑制される。つまり、ａｌｓ２変異体のアルミニウム耐性は、野生型イネのアルミニウム耐性よりも。顕著に低くなる。その結果、ａｌｓ２変異体は、アルミニウムに対して感受性となり、アルミニウムにより生育が阻害される。
【００５１】
本発明者は、後述する実施例に示すように、本発明にかかるポリヌクレオチドの１つであるイネのアルミニウム耐性を向上させるポリヌクレオチド（Ａｌｓ２遺伝子）が、イネの第１２染色体に座乗することを明らかにした。
【００５２】
なお、本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドのフラグメントであるオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００５３】
本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖（コード鎖）およびアンチセンス鎖（非コード鎖）といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を包含する。また、ＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。本発明にかかるポリヌクレオチドの一例である、配列番号１に示す塩基配列は、配列番号２に示すポリペプチドのｃＤＮＡ配列である。
【００５４】
さらに、本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００５５】
本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明にかかるポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。このプローブは、配列番号３に示すＡｌｓ２遺伝子において、ａｌｓ２変異体では欠失している配列の少なくとも一部に、特異的にハイブリダイズするものであることが好ましい。これにより、確実にアルミニウム耐性を促進する遺伝子を取得できる。
【００５６】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明にかかるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。また、例えば、公知のイネの配列情報に基づいて、Ａｌｓ２遺伝子領域を増幅できるようなプライマーを設計し、そのプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）またはＲＴ−ＰＣＲ産物を鋳型にして、Ａｌｓ２遺伝子領域を増幅することによっても、本発明にかかるポリヌクレオチドを取得することができる。
【００５７】
本発明にかかるポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、イネ科植物であることが好ましい。後述する実施例においては、野生型のイネ（コシヒカリ）およびａｌｓ２変異体から本発明にかかるポリヌクレオチド（野生型Ａｌｓ２遺伝子および変異型ａｌｓ２遺伝子）を取得しているが、これに限定されるものではない。
【００５８】
このような本発明にかかるポリヌクレオチドは、植物のアルミニウム耐性メカニズムの解明に利用することができる。
【００５９】
（２）本発明にかかるポリペプチド
本発明にかかるポリペプチドは、上記（１）に記載したポリヌクレオチドの翻訳産物であり、少なくともアルミニウム耐性に関与するものである。
【００６０】
ここで、上記「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」とも換言できる。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片を示している。
【００６１】
本発明にかかるポリペプチドは、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。ここで、「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質を示す。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されたものとする。
【００６２】
本発明にかかるポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主によっては、本発明にかかるポリペプチドは、グリコシル化など、糖鎖修飾される場合もある。本発明にかかるポリペプチドには、このような修飾されたポリペプチドも含まれる。
【００６３】
本発明にかかるポリペプチドとしては、例えば、少なくともアルミニウム耐性に関与するポリペプチドであって、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチドである。
【００６４】
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルミニウム耐性を抑制するポリペプチドである。
【００６５】
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列；または
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチド。
【００６６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、変異型ａｌｓ２遺伝子にコードされる４７１アミノ酸（開始コドンを含む）からなる変異型ａｌｓ２タンパク質である。配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、例えば、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの翻訳産物である。
【００６７】
一方、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、野生型Ａｌｓ２遺伝子にコードされる４６５アミノ酸（開始コドンを含む）からなる野生型Ａｌｓ２タンパク質である。配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、例えば、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの翻訳産物である。
【００６８】
配列番号１に示される塩基配列（変異型ａｌｓ２遺伝子）は、配列番号３に示される塩基配列（野生型Ａｌｓ２遺伝子）の９５３番目の塩基（Ｇ）が欠失している。このため、野生型Ａｌｓ２タンパク質と変異型ａｌｓ２タンパク質とでは、その欠失部位以降の遺伝子にコードされるアミノ酸配列が異なる。このような変異により、上記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドは、アルミニウム耐性を抑制するポリペプチドとなり、上記（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドは、アルミニウム耐性を促進するポリペプチドとなる。
【００６９】
なお、配列番号３の９５３番目の塩基（Ｇ）が欠失する変異以外にも、配列番号４のポリペプチドをコードするような変異が、配列番号１のポリヌクレオチドに生じることによっても、同様の結果となる。
【００７０】
また、上記ポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含むものであってもよい。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００７１】
（３）形質転換用マーカー遺伝子
本発明にかかるポリヌクレオチドは、形質転換用マーカー遺伝子として利用することができる。すなわち、本発明にかかる形質転換体選抜用マーカー遺伝子は、上記（１）に記載した本発明にかかるポリヌクレオチドからなるものであればよい。本発明にかかるポリヌクレオチドは、アルミニウム耐性に関与する遺伝子である。
【００７２】
特に、野生型Ａｌｓ２タンパク質をコードする野生型Ａｌｓ２遺伝子は、アルミニウム耐性を促進する。このため、野生型Ａｌｓ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入された細胞は、アルミニウム存在下でも、生育が阻害されない。これは、アルミニウムを排除した結果、アルミニウム蓄積量が減少するためである。従って、アルミニウム存在下での生育状態またはアルミニウムの蓄積量（アルミニウム吸収量）を測定することにより、当該ポリヌクレオチドが導入された細胞を選抜することができる。
【００７３】
具体的には、本発明にかかるポリヌクレオチドを形質転換用マーカー遺伝子として利用するには、例えば、当該ポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターを構築し、当該発現ベクターを目的の細胞に導入する。当該発現ベクターが導入され、アルミニウム耐性を付与するポリペプチドが発現している細胞のアルミニウム蓄積量は減少する。従って、アルミニウム存在下で培養して、発現ベクターの導入前後のアルミニウム蓄積量を測定することによって、アルミニウムに関与しているポリヌクレオチドが発現している細胞を選抜することができる。また、例えば、アルミニウム耐性が強い品種を選抜することもできる。
【００７４】
上述の例では、本発明にかかるポリヌクレオチドを形質転換細胞に発現させる遺伝子とマーカー遺伝子との両方の目的で用いているが、本発明にかかるポリヌクレオチドをマーカー遺伝子としてのみ用いることも可能である。また、例えば、植物のカルス細胞に特異的な転写プロモーターを使用することにより、本発明にかかるポリヌクレオチドの選択マーカーとしての発現時期の制御も可能である。この場合は、さらに目的の細胞内で発現させたいタンパク質をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターを構築し、当該発現ベクターを用いて形質転換すればよい。また、本発明にかかるポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターを構築せずに、本発明にかかるポリヌクレオチドを単独で目的の細胞に導入することも可能である。
【００７５】
また、配列番号３に示されるポリヌクレオチドのうち、９５３番目の塩基は、配列番号１に示される変異型ａｌｓ２遺伝子では欠失している。このため、配列番号３に示される塩基配列の９５３番目の塩基を含むポリヌクレオチドは、本発明にかかるマーカー遺伝子として利用することができる。
【００７６】
例えば、配列番号３に示されるポリヌクレオチドにおいて、９５３番目の塩基を含む２０〜１００個の連続した塩基からなるポリヌクレオチドは、アルミニウム耐性の強い細胞を選抜するために利用することができる。すなわち、このようなポリヌクレオチドは、アルミニウム耐性の強い細胞を選抜するためのマーカー遺伝子として利用することができる。
【００７７】
一方、配列番号１に示されるポリヌクレオチドにおいて、９５３番目の塩基を含む２０〜１００個の連続した塩基からなるポリヌクレオチドは、アルミニウム耐性の弱い細胞を選抜するためのマーカー遺伝子として利用することができる。
【００７８】
（４）本発明にかかる組換え発現ベクターおよび形質転換キット
本発明にかかる組換え発現ベクターは、上記（１）に記載した本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されるものではない。例えば、配列番号１または３に示すｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。
【００７９】
ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明にかかるポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
【００８０】
本組換え発現ベクターは、本発明にかかるポリペプチドを発現させるために用いることができることはいうまでもないが、本発明にかかるポリヌクレオチドをマーカー遺伝子として利用し、他の遺伝子を組み込んで当該他の遺伝子がコードするタンパク質を発現させるための組換え発現ベクターとしても利用できる。
【００８１】
本発明にかかるポリヌクレオチドがホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ハイグロマイシンのような抗生物質に抵抗性を与える薬剤耐性遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明にかかるポリヌクレオチドとを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。
【００８２】
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、イネ，きゅうり，アブラナ，またはトマト等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００８３】
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、アグロバクテリウム感染法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、およびパーティクルガン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００８４】
本発明にかかる形質転換キットは、上記（１）に記載した本発明にかかるポリヌクレオチド、または、本発明にかかる組換え発現ベクターの少なくともいずれかを含むものであればよい。その他の具体的な構成については特に限定されるものではなく、必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればよい。当該形質転換キットを用いることにより、簡便かつ効率的に形質転換細胞を得ることができる。
【００８５】
（５）本発明にかかる形質転換体
本発明にかかる形質転換体は、上記（１）に記載した本発明にかかるポリヌクレオチド、または、上記（４）に記載の組換え発現ベクターが導入されており、かつ、アルミニウム耐性に関与するポリペプチドが発現している形質転換体であれば、特に限定されるものではない。ここで「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。
【００８６】
また、ここで、「ポリヌクレオチドが導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味するが、本発明では、これに加えてゲノム中に含まれる本発明のポリヌクレオチドが生体内で発現している場合も含むものとする。
【００８７】
形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述した組換え発現ベクターをホスト細胞に導入して形質転換する方法を挙げることができる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記（４）においてホスト細胞として例示した植物細胞等を挙げることができる。
【００８８】
本発明にかかる形質転換体は、植物細胞または植物体であることが好ましい。このような形質転換植物には、アルミニウム耐性が促進または抑制される。このため、細胞内または植物体内において、アルミニウムの含有量（蓄積量）を減少または増加させることができる。そして、上記ポリヌクレオチドまたは組み換え発現ベクターが、ポリペプチドの発現を促進させるプロモーターとともに導入された上記形質転換体では、アルミニウム耐性が促進または抑制され、細胞内のアルミニウムを減少または増加させることができる。すなわち、野生型Ａｌｓ２タンパク質をコードする遺伝子が導入されると、アルミニウム耐性が促進され、変異型ａｌｓ２タンパク質をコードが導入されると、アルミニウム耐性が抑制される。
【００８９】
特に、アルミニウム耐性を促進するポリヌクレオチドまたは組み換え発現ベクターが、ポリペプチドの発現を促進させるプロモーターとともに導入された上記形質転換体では、アルミニウム耐性が付与されることにより、根からアルミニウムを排除する結果、アルミニウムの吸収が抑制され、アルミニウムの蓄積量を減少させることができる。これにより、アルミニウムによる生育阻害を低減できる。
【００９０】
ここで、本発明者は、既に、イネにおけるアルミニウム耐性に関与する別の遺伝子（Ａｌｓ１遺伝子）を単離し、その塩基配列を特定している（特許文献４）。
【００９１】
配列番号５は、野生型イネのＡｌｓ１遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列である。配列番号６は、配列番号５の野生型イネのＡｌｓ１遺伝子にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列である。野生型Ａｌｓ１遺伝子は、アルミニウム耐性を促進するポリペプチドをコードする。
【００９２】
Ａｌｓ１遺伝子は、イネの第６染色体に座乗しており、Ａｌｓ２遺伝子とは異なる部位に存在する。そして、この遺伝子の変異によって、アルミニウム耐性能が大きく異なる。
【００９３】
このようなアミノ酸の変異は、野生型Ａｌｓ１遺伝子の変異（欠失、置換、もしくは付加）によって生じる。アルミニウムに感受性を示す突然変異体（ａｌｓ１変異体）は、野生型のイネに比べてアルミニウム耐性が弱い。ａｌｓ１変異体は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１２３番目〜１２７番目のアミノ酸が欠失している。これにより、ａｌｓ１変異体のアルミニウム耐性は、顕著に低下する。このため、ａｌｓ１変異体は、アルミニウムに対して感受性となり、アルミニウムにより生育が阻害される。
【００９４】
従って、配列番号６に示されるアミノ酸に生じる変異は、１２３番目〜１２７番目のアミノ酸を保持するような変異であることが好ましい。
【００９５】
また、野生型Ａｌｓ１タンパク質と野生型Ａｌｓ２タンパク質とは、いずれも、アルミニウム耐性を促進するポリペプチドである。しかし、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、異なる染色体に座乗している。このため、野生型Ａｌｓ１遺伝子および野生型Ａｌｓ２遺伝子の少なくともいずれか一方を、植物に導入すれば、植物にアルミニウム耐性能を付与することができる。
【００９６】
さらに、野生型Ａｌｓ１遺伝子および野生型Ａｌｓ２遺伝子の両方を導入することによって、一方の遺伝子を導入した場合よりも、アルミニウムに対して強い耐性を有する植物を作製することができる。
【００９７】
すなわち、本発明にかかる形質転換体は、下記の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、下記の（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとが導入されており、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチドを発現してなるものであってもよい。
【００９８】
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列アミノ酸配列からなり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチド；
（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたなアミノ酸配列からなり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチドポリペプチド。
【００９９】
上記（ａ）および（ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、野生型のＡｌｓ２遺伝子であり、（ｃ）および（ｄ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、野生型のＡｌｓ１遺伝子である。いずれの遺伝子にコードされるポリペプチドも、アルミニウム耐性を促進するポリペプチドである。このため、この形質転換体は、アルミニウム耐性を促進するポリペプチドを発現させることによって、アルミニウム耐性が付与される。これにより、アルミニウム存在下でも、生育が阻害されない。これは、根からアルミニウムを排除する結果、アルミニウムの吸収が抑制され、アルミニウム蓄積量が減少するためである。従って、野生型Ａｌｓ１タンパク質および野生型Ａｌｓ２タンパク質を発現する形質転換体によれば、アルミニウムによる生育阻害を低減できる。
【０１００】
なお、ゲノム内に本発明にかかるポリヌクレオチドが導入された形質転換植物体がいったん得られれば、当該植物体から得られる種子にも当該ポリヌクレオチドが導入されている。本発明には、形質転換植物から得られる種子も含まれる。
【０１０１】
植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば、特に限定されるものではない。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系等のバイナリーベクターを用いることが好ましい。バイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。また、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターを有するベクターであることが好ましい。プロモーターとしては公知のプロモーターを好適に用いることができ、具体的には、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、ユビキチンプロモーターやアクチンプロモーターを挙げることができる。なお、植物細胞には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【０１０２】
植物細胞への組み換え発現ベクターの導入には、アグロバクテリウム感染法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、およびパーティクルガン法等、従来公知の方法を用いることができる。また、形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて公知の方法で行うことが可能である。
【０１０３】
（６）本発明にかかる食品
本発明の食品は、本発明にかかる形質転換体を含むものである。この食品は、アルミニウム耐性が付与された形質転換体を含むものであることが好ましい。ＴＬＯ本発明の食品には、ヒトが摂取するものはもちろん、家畜に与える飼料なども含まれる。
【０１０４】
コメは、日本ばかりではなく、世界各地で主食とされている消費量の多い植物である。また、果物や野菜も、生産量および消費量が多い。このため、これらの農作物は、特に安全性が重要視される。
【０１０５】
従って、高いアルミニウム耐性が付与された形質転換体を含む食品は、コメ、野菜、および果物のような農産物であることが好ましい。これにより、安全性が高く、有用な米（イネ）、野菜、および果物の栽培を実現できる。
【０１０６】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１０７】
以下の実施例では、アルミニウムがすばやくイネの伸長阻害を起こす特徴を利用して、γ線照射したイネ（コシヒカリ）のＭ３の種子から、アルミニウム感受性突然変異体（ａｌｓ２変異体）をまず単離した。その後、この変異体とインド型イネ（Kasalath）と交配し、マッピング用の集団を作った。そして、マイクロサテライトマーカーなどを利用して、Ａｌｓ２遺伝子のクローニングを行った。また、以下の実施例では、比較のため、本発明者が既に取得しているａｌｓ１変異体を用いた。
【０１０８】
〔Ａｌ感受性の評価〕
ａｌｓ２変異体、ａｌｓ１変異体、および野生型（品種：コシヒカリ）間において、Ａｌ感受性を比較するために、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む０、１０、３０および５０μＭのＡｌ溶液に、５日齢の苗を、２４時間曝した。相対的な根の伸長（ＲＲＥ）を用いて、それぞれの種のＡｌ感受性を評価した。図２は、根の伸長に及ぼすＡｌ濃度の影響を示すグラフである。図２に示すように、１０、３０、および５０μＭ  Ａｌにおける根の伸長は、ａｌｓ２変異体では、それぞれ３６％、１７％および１２％まで抑制された。また、野生型（ＷＴ）では、それぞれ７３％、５１％、および３２％まで抑制され、ａｌｓ１変異体では、それぞれ１１％、８％、および８％まで抑制された。このことは、ａｌｓ２変異体のＡｌ感受性が、ａｌｓ１変異体よりも低いことを示唆している。なお、相対的な根の伸長（ＲＲＥ）は、（Ａｌ存在下における根の伸長／Ａｌ非存在下における根の伸長×１００）として算出した。また、データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝１０）で示した。
【０１０９】
また、ａｌｓ２変異体、ａｌｓ１変異体、野生型（品種：コシヒカリ）、およびａｌｓ２変異体とａｌｓ１変異体との交配群（ａｌｓ１×ａｌｓ２，ａｌｓ２×ａｌｓ１）の相対的な根の伸長（ＲＲＥ）を比較したところ、図３に示すように、ａｌｓ１変異体およびａｌｓ２変異体の根の伸長が、Ａｌによって顕著に抑制されていることが確認された。
【０１１０】
さらにこれらの感受性を比較するために、ａｌｓ２変異体、ａｌｓ１変異体および野生型の種を、酸性土壌（ｐＨ４．６）、石灰により調整された酸性土壌（ｐＨ５．４）、およびアルミニウム毒性のない沖積土壌（ｐＨ５．４）上にそれぞれ播種し、これらの植物を、毎日水道水を与えて培養した。１週間後、苗を慎重に抜き取った。根の泥を落すための洗浄後、それらの根の長さを比較した。図４および図５は、その結果を示す図である。これらの図に示すように、中性の土壌において成長させたときのａｌｓ１変異体、ａｌｓ２変異体および野生型との間に、根の長さの違いは生じなかった。しかしながら、これらを酸性の土壌において成長させたとき、ａｌｓ１変異体およびａｌｓ２変異体の根の成長はかなり抑制されたが、野生型の根の成長は抑制されなかった。興味深いことに、石灰を加えた酸性の土壌において、ａｌｓ２変異体の根の成長は、抑制されなかったが、ａｌｓ１変異体の根の成長は顕著に抑制された。この結果は、溶液中で成長させた結果と一致した。
【０１１１】
〔Ａｌ含有量の決定〕
ａｌｓ２変異体と野生型との間で根におけるＡｌの蓄積を比較するため、ａｌｓ２変異体および野生型の根の各２０本を、０．５ｍＭのＣａＣｌ２を含む０、１０、２０および１００μＭのＡｌ溶液に、１２時間曝した。その後、３つの根の切片（０−１ｃｍ、１−２ｃｍ、および２−３ｃｍ）を、根から切り取った。図６（ａ）〜図６（ｃ）は、根の異なる部分のＡｌ含有量を示すグラフである。図６（ａ）〜図６（ｃ）に示すように、Ａｌ濃度には関係なく、ａｌｓ２変異体の根の先端（０−１ｃｍ）におけるＡｌ含有量は、野生型よりも顕著に高かった（図６（ａ））。しかし、基部では野生型と変異体との間にアルミニウム含量の差がほとんどなかった（図６（ｂ）図６（ｃ））。このことは、根の先端からＡｌを排除する効果は、ａｌｓ２変異体では崩壊していることを示唆している。なお、Ａｌ濃度の測定は、グラファイトファーネス原子吸光分析装置を用い、データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）で示した。
【０１１２】
〔遺伝子解析〕
ａｌｓ２変異体の遺伝子解析のために、ａｌｓ２変異体および野生型植物間の戻し交配から得られた１６４本のＦ２ の苗を用いた。まず、２０μＭのＡｌ溶液におけるＦ２ の苗のＡｌ感受性を調べた。そして、各々の苗の相対的な根の伸長（ＲＲＥ）をそれらの親株と比較して、各苗の表現型を決定した。図７は、そのＦ２ 集団のＡｌ感受性を示すグラフである。図７に示すように、４０本の苗（ＲＲＥ＜３０％）がＡｌ感受性を示し、１２４本の苗（ＲＲＥ＞４０％）がＡｌに対して耐性を有していた。Ａｌ耐性の苗、およびＡｌ感受性の苗の分離は、３：１の比率に一致した（ｘ２＝０．０３３、０．７５＜Ｐ＜０．９）。このことは、ａｌｓ２変異体のＡｌ感受性は、単一の劣性遺伝子により制御されていることを示唆している。
【０１１３】
〔Ａｌｓ２遺伝子のラフマッピング〕
イネのＡｌ抵抗性に必要とされるＡｌｓ２遺伝子のマッピングのために、ａｌｓ２変異体およびインディカ品種Ｋａｓａｌａｔｈの間の交配から得られた１９６本のＦ２ の苗のＡｌ抵抗性を、２０μＭ  Ａｌ溶液を用いて評価した。図８は、そのＦ２ 集団のＡｌ感受性を示すグラフである。図８に示すように、ＲＲＥの測定結果は、複峰性分布（bi-modal分布）を示した。２つのグループ間に重なりがあるものの、Ｆ２ 集団はＡｌ感受性グループと、Ａｌ抵抗性グループとに分離された。なお、ＲＲＥが２０％より少ない４６本の苗をＡｌ感受性であるとみなし、１５０本の苗（ＲＲＥ＞２０％）をＡｌ抵抗性であるとみなした。分離比率は１：３（ｘ２ ＝０．２４５、０．５＜Ｐ＜０．７５）であり、これにより、ａｌｓ２変異体は、単一の劣勢遺伝子により制御されていることが確認された。
【０１１４】
次に、バルク法により、Ａｌｓ２遺伝子のマッピングを行った。バルク法による解析を行うために、Ａｌ感受性Ｆ２ 植物およびＡｌ耐性Ｆ２ 植物のそれぞれ１０本のＤＮＡを同量、プールすることによって、２つの親株ＤＮＡおよび２つのバルクＤＮＡを準備した。すべてのイネゲノムを網羅する、５９の多型ＩｎＤｅｌマーカーを、Ａｌｓ２遺伝子の連鎖を調べるために用いた。また、プールしたＤＮＡを用いて、Ａｌｓ２遺伝子に対する連鎖を調べた。その結果、Ａｌｓ２遺伝子は、第１２染色体の短腕上に座乗していることが明らかとなった。図９は、Ａｌｓ２遺伝子をイネ第１２染色体の短腕上にマッピングした模式図である。Ａｌ感受性の４６本のＦ２ 植物を用いた共分離解析により、図９に示すように、Ａｌｓ２遺伝子は、第１２染色体上のＣ６２８９６マーカーがこの遺伝子に連結される。また、Ａｌｓ２遺伝子は、Ｃ６２８９６マーカーから１３．７ｃＭの距離を有していることを確認した。さらに、３つの多型マーカーＭａＯｓ１２１９、ＭａＯｓ１２２９、およびＭａＯｓ１２１０を追加して、Ａｌｓ２遺伝子のマッピングしたところ、イネ第１２染色体の短腕上にあるＭａＯｓ１２１９およびＭａＯｓ１２２９間において、１．１ｃＭおよび４．５ｃＭ間隔で、それぞれＡｌｓ２遺伝子をマッピングした（図９）。
【０１１５】
〔Ａｌｓ２遺伝子のファインマッピング〕
次に、ａｌｓ２変異体／Ｋａｓａｌａｔｈからの９８６本のＦ２ 植物の集団を用い、Ａｌｓ２遺伝子のファインマッピングを行った。図１０は、Ａｌｓ２遺伝子をマッピングした遺伝子地図である。なお、図１０中の数字は、それぞれのマーカーおよび遺伝子間の組換え体を示す。イネ第１２染色体（１２Ｓ〜１２Ｌ）を示す線は、ＢＡＣクローン（ＢＡＣｓ）を示す線に部分的に重なる。Ａｌｓ２遺伝子は、後述のように、最終的に、ＩｎＤｅｌマーカーＭａＯｓ１２５０とＭａＯｓ１２４６の間にある３８．５ｋｂの候補領域にマッピングされた。
【０１１６】
具体的には、初めに、ａｌｓ２変異体／Ｋａｓａｌａｔｈ集団のＡｌ感受性植物を用いて、３つの重複するＢＡＣクローンを網羅するＩｎＤｅｌマーカーＭａＯｓ１２１９およびＭａＯｓ１２３７間において、Ａｌｓ２遺伝子をマッピングした。次に、ＭａＯｓ１２１９およびＭａＯｓ１２３７間の２５本の組み換え植物の遺伝子型を、Ｆ３ 種子を用いてさらに確認した。これと同時に、２つのマーカー間に、５つの多型マーカーを発生させた。組み換え植物および多型マーカーを用いたこの遺伝子のさらなるマッピングにより、Ａｌｓ２遺伝子は、２つの重複するＢＡＣクローン（ＡＬ９５４８２５およびＡＬ７３１７６１）上において、ＭａＯｓ１２５０とＭａＯｓ１２４６との間に、２つのマーカーおよび遺伝子間の３および２の組換体のそれぞれとともに、位置することが示された。他の２つのマーカーＭａＯｓ１２４９およびＭａＯｓ１２４８は、この遺伝子に堅く結合されていた。
【０１１７】
２つの堅く結合されたマーカーを用いて、この遺伝子の候補領域をさらに狭めるために、ａｌｓ２変異体／９３−１１からの３５６本のＦ２ 植物を有するもう１つのマッピング集団を用いた。この集団において、ＭａＯｓ１２４６とこの遺伝子との間に１つの組み換えが生じたが、２つのマーカーと遺伝子との間に組み換えは生じなかった。
【０１１８】
図１０に示すように、ＴＩＧＲウェブサイト上の予想から、Ａｌｓ２遺伝子の候補領域（ＭａＯｓ１２５０およびＭａＯｓ１２４６間の領域）には、３５ｋｂにわたり、６つの候補遺伝子が存在する。ａｌｓ２変異体におけるこれらの候補遺伝子のＯＲＦｓ配列は、１つの候補遺伝子（塗りつぶされた遺伝子）のコード配列において、ＡＴＧから９５３個目の塩基対の欠失が存在することが示される。これは、その候補遺伝子が、Ａｌｓ２遺伝子であることを示唆する。そして、Ａｌｓ２遺伝子の全長ｃＤＮＡのアライメントから、この遺伝子がイントロンを有さず、ＯＲＦの長さは１３９８ｂｐであることが明らかとなった。従って、Ａｌｓ２遺伝子は、４６５のアミノ酸からなるＡｌｓ２タンパク質をコードすることが予測された。なお、図中の２つの矢印は、この遺伝子のＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーを示す。
【０１１９】
〔Ａｌｓ２遺伝子の塩基配列〕
Ａｌｓ２遺伝子の候補遺伝子の配列を決定するために、ａｌｓ２変異体における候補遺伝子のＯＲＦを増幅させるようにプライマーを設計した。抽出されたＰＣＲ産物を、ＱｕｉｃｋＳｔｅｐＴＭ２  ＰＣＲ精製キットを用いて、そのプロトコルに従って精製した。その後、鋳型として用いる精製産物を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ配列決定キットを用いて増幅させ、製造業者の使用方法に沿ってＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ３１０シーケンサーを通して、配列を決定した。
【０１２０】
なお、ＰＣＲおよび電気泳動の条件は、以下の通りである。１×ＰＣＲバッファ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｎｇ  ＤＮＡ、プライマーをそれぞれ０．５μＭ、ｄＮＴＰをそれぞれ０．２ｍＭ、および０．５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む１０μｌ溶液中において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）遺伝子増幅を行った。ＰＣＲを以下のように遂行した。９４℃で１０分間おいた後、９４℃での３０秒間の変性を３５回行った。次に、５５℃で１分間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長させた。そして、７２℃で５分間伸長させた。ＰＣＲ産物を、０．５×ＴＢＥバッファ中の３％アガロースゲル上に分離させた。臭化エチジウムで染色し、ＵＶ下で可視化した。
【０１２１】
〔マルチプル配列アライメントおよび系統樹〕
Ａｌｓ２遺伝子にコードされるＡｌｓ２タンパク質のマルチプル配列アライメントを、ＢｉｏＥｄｉｔソフトウエアのＣｌｕｓｔａｌＷ  ｐｒｏｇｒａｍを用いて行った。選択されたＣ２Ｈ２  Ｚｎフィンガータンパク質間の系統発生上の関係を分析するために、まずマルチプル配列アライメントを最初に行った。図１は、コシヒカリ、Ｋａｓａｌａｔｈおよびａｌｓ２変異体のＡｌｓ２タンパク質のアミノ酸配列を比較する図である。なお、マルチプル配列アライメントには、ＢｉｏＥｄｉｔソフトウエアのＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いた。図１において、四角で囲った部分は、保存ドメインＣ２Ｈ２を示す。
【０１２２】
また、ＣｌｕｓｔａｌＸ（１．８１）ソフトウエアを用いて、ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ法により、系統樹を組み立てた。系統樹を、ＴｒｅｅＶｉｅｗにより表示した。図１１は、作成した系統樹であり、Ｃ２Ｈ２型Ｚｎフィンガータンパク質間の系統発生的関係を示している。図１１において、ＮＰ＿９１５６８８、ＸＰ＿４７０３６１、ＸＰ＿４８３７９７、ＸＰ＿４７４５７９、ＸＰ＿４６６３６９、ＢＡＤ３６７００、ＸＰ＿４７５３３６、ＢＡＤ８２６２０、ＢＡＤ２９６５２、ＢＡＢ６４１８８、ＢＡＤ３０４９４、ＢＡＤ７２２０４、およびＢＡＤ３５５１４は、イネ由来である。Ａｔ１ｇ３４３７０、Ａｔ５ｇ２２８９０、ＡｔＴＴ１、ＡｔＷＩＰ２、ＡｔＷＩＰ３、ＡｔＷＩＰ４、ＡｔＷＩＰ５、およびＡｔＷＩＰ６は、シロイヌナズナ由来である。ＺｍＩＤ１、ＺｍＩＤ−Ｒ１、ＺｍＩＤ−Ｒ７、ＺｍＩＤ−Ｒ１０、およびＺｍＩＤ−Ｒ９は、トウモロコシ由来である。スケールバーは、１部位当たりのアミノ酸置換数を示している。
【０１２３】
なお、ブラスト検索の結果、Ａｌｓ２遺伝子は、Ｃ２Ｈ２型のＺｎフィンガーファミリーに属することが示された。Ｃ２Ｈ２型のＺｎフィンガーファミリーは、亜鉛イオンと等位の、２つの保存システインおよびヒスチジンを含み、かつ核酸結合に関与することが予想される。Ｃ−Ｘ（１−５）−Ｃ−Ｘ１２−Ｈ−Ｘ（３−６）−Ｈのパターンが、Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガータンパク質の多くに見られた。このパターンのＸは、いずれのアミノ酸であっても良く、数字は残基の数を示している。このパターンによると、Ａｌｓ２タンパク質は、２つのＺｎフィンガー構造を有する（図１）。コシヒカリおよびＫａｓａｌａｔｈのいずれも、遺伝子中に２つの保存ドメインを有している。しかし、４７１個のアミノ酸配列に引き伸ばされた変異型ａｌｓ２タンパク質は、フレームシフトにより１個のＺｎフィンガードメインを失っている（図１）。なお、イネおよびシロイヌナズナ由来のＡｌｓ２遺伝子のホモログが、それぞれ、５つおよび２つ、データベース上で発見された。そして、これらが１つの集団に分類されることが系統発生解析により示された（図１１）。しかしながら、これらの機能は未知である。
【０１２４】
〔ＲＮＡの単離およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ〕
野生型イネ（品種：コシヒカリ）を用いて、Ａｌｓ２遺伝子の発現パターンを調べた。６日齢の野生型の苗を、それぞれ０または５０μＭのＡｌ溶液を含む、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２ 溶液に６時間曝した。次に、根の先端（０−１ｃｍ）、根の基底部（１−２ｃｍ）、および新芽を切り取り、ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡを調製した。Ａｌｓ２遺伝子の相対的な発現を調べるために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。図１２は、Ａｌｓ２遺伝子の発現量を示すグラフである。図１２に示すように、根の先端におけるこの遺伝子の発現レベルが、地上部における発現レベルの７倍を示した。また、これらを５０μＭ  Ａｌに６時間曝したとき、根および地上部のいずれも、この遺伝子がＡｌにより誘導されなかった。なお、ＯｓＨｉｓｔｏｎｅ３をコントロールとして用い、データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）で示した。
【０１２５】
以上のように、ａｌｓ２変異体は、ａｌｓ１変異体と異なる。すなわち、ａｌｓ２変異体は、水溶液および土壌培地の両方において、ａｌｓ１変異体よりもＡｌに対して感受性が低かった（図２および５）。ａｌｓ２変異体の根におけるＡｌの蓄積パターンは、ａｌｓ１変異体とは異なっていた。ａｌｓ２変異体の根におけるＡｌ蓄積量は、特に根の先端において、野生型のＡｌ蓄積量よりも高く、外部のＡｌ濃度に対して相関的に増加した（図６）。このことは、ａｌｓ２変異体において、根の先端からＡｌを排除するメカニズムが崩壊していることを示唆している。一方、ａｌｓ１変異体は、根の先端（０−１ｃｍ）において、野生型と同量のＡｌを蓄積し、根の基底部において、野生型よりも少ないＡｌを蓄積した（図示せず）。このことは、根の先端のような感受性の高い組織から、他のより感受性の低い組織への内部転流が、ａｌｓ１変異体において損傷を受けている可能性を示唆している。さらに、２つの遺伝子は異なるタンパク質をコードしていた。Ａｌｓ２遺伝子は、転写因子であると予想され、同定されていないＣ２Ｈ２型のＺｎフィンガーをコードしていると予想される。一方、Ａｌｓ１遺伝子は、推定上のＡＢＣトランスポーターをコードしている。従って、Ａｌｓ２遺伝子およびＡｌｓ１遺伝子は、異なるプロセスによって、Ａｌを解毒すると考えられる。
【０１２６】
遺伝子地図に基づくクローニングアプローチを用いて、Ｃ２Ｈ２型ＺｎフィンガーをＡｌｓ２遺伝子の候補遺伝子として定義した。これは、下記の２つの理由に基づく。
【０１２７】
１）大きいマッピング集団（２つの集団からの総数１３４２のＦ２ 植物）を用い、２つの近接して隣り合うマーカー、および遺伝子のそれぞれの間に、それぞれ３つの組換え体が存在した（図１０）。さらに、２つの堅く結合したマーカーＭａＯｓ１２４８およびＭａＯｓ１２４９は、Ｃ２Ｈ２型Ｚｎフィンガーから６ｋｂおよび２ｋｂしか離れていなかった。
【０１２８】
２）変異体における６つの候補遺伝子のＯＲＦ配列は、この遺伝子（Ｃ２Ｈ２型Ｚｎフィンガー）のみが、そのコード配列に１塩基対の欠失を有することを示した。この欠失の結果、フレームシフトが生じるため、多くのアミノ酸が変化し、１つのＺｎフィンガードメインを失った。Ｃ２Ｈ２型Ｚｎフィンガーは、核酸結合に関与していると予想されたが、下流の遺伝子が、この転写因子によって調節されているかは明確ではない。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明のポリヌクレオチドは、アルミニウム耐性に関与する遺伝子である。このため、アルミニウム耐性を促進する遺伝子を発現させることにより、アルミニウムによる植物の生育阻害を、低減できる。それゆえ、本発明は、特に農業、および食品産業に、好適に利用することができ、ひいては、世界の食糧不足問題の解決に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】コシヒカリ、Ｋａｓａｌａｔｈおよびａｌｓ２変異体のＡｌｓ２タンパク質のアミノ酸配列を比較する図である。
【図２】ａｌｓ１変異体，ａｌｓ２変異体，および野生型イネの根の伸長に及ぼすＡｌ濃度の影響を示すグラフである。
【図３】ａｌｓ１変異体，ａｌｓ２変異体，野生型イネ，およびａｌｓ１変異体とａｌｓ２変異体との交雑体（Ｆ１ ）のＡｌ耐性を比較するグラフである。
【図４】ａｌｓ２変異体，および野生型イネの生育状態を比較する図である。
【図５】ａｌｓ１変異体，ａｌｓ２変異体，および野生型イネの生育状態を比較する図である。
【図６】（ａ）〜（ｃ）は、野生型イネ（コシヒカリ）およびａｌｓ２変異体における、根の異なる部分のＡｌ含有量を示すグラフである。
【図７】ａｌｓ２変異体および野生型イネ（コシヒカリ）の戻し交配から得られたＦ２ 集団のＡｌ感受性を示すグラフである。
【図８】ａｌｓ２変異体およびインド型イネ（Kasalath）の戻し交配から得られたＦ２ 集団のＡｌ感受性を示すグラフである。
【図９】Ａｌｓ２遺伝子をイネ第１２染色体の短腕上にマッピングした模式図である。
【図１０】Ａｌｓ２遺伝子の遺伝子地図である。
【図１１】Ａｌｓ２遺伝子の系統図である。
【図１２】Ａｌｓ２遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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