(57)【要約】【課題】オートファジーの研究及びオートファジーに関与する疾患の治療薬のスクリーニングに用いることのできるモデル動物の提供。【解決手段】ＧＡＢＡＲＡＰ又はＧＡＴＥ１６のアミノ末端にＧＦＰタグが結合した修飾ＧＡＢＡＲＡＰ又は修飾ＧＡＴＥ１６を全身に発現しているトランスジェニック非ヒト動物又はその子孫。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＢＡＲＡＰ又はＧＡＴＥ１６のアミノ末端にＧＦＰタグが結合した修飾ＧＡＢＡＲＡＰ又は修飾ＧＡＴＥ１６を全身に発現しているトランスジェニック非ヒト動物又はその子孫。
【請求項２】
非ヒト動物がマウスである請求項１記載のトランスジェニック非ヒト動物又はその子孫。
【請求項３】
疾患モデル非ヒト動物である請求項１又は２項記載のトランスジェニック非ヒト動物又はその子孫。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のトランスジェニック非ヒト動物又はその子孫に被験物質を投与し、ＧＡＢＡＲＡＰ又はＧＡＴＥ１６が関与する疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オートファジーの実行部隊の一員と認識されているＬＣ３ホモログであるＧＡＢＡＲＡＰ又はＧＡＴＥ１６の修飾体を発現しているトランスジェニック非ヒト動物又はその子孫に関する。
【背景技術】
【０００２】
オートファジーは、隔離膜が伸長しオルガネラを含む細胞質成分を取り囲んだ脂質二重膜構造体がリソソームと融合し、その内容物をリソソーム内の消化酵素が分解する細胞内大規模分解経路である。このオートファジーの因子が全身で欠損したマウスは新生児致死性である（非特許文献１）。脳において欠損すると、神経変性疾患になり（非特許文献２）、肝臓において欠損すると、肝肥大を伴う肝炎になる（非特許文献２）。また、ガン細胞においては、オートファジーに関する遺伝子のいくつかが減少しているとの報告がある（非特許文献３）。
【０００３】
ＬＣ３（microtubule associated protein 1A light chain3）は微小管関連タンパク質の１つとして、脳から単離されてきた（非特許文献４、５）。その後の研究でＬＣ３は、オートファジーの際のモディファイヤーとしてＡｐｇ７とＡｐｇ３によってスビキチン様修飾をうけて細胞質型ＬＣ３（ＬＣ３−Ｉ）から膜結合型ＬＣ３（ＬＣ３−II）になり、オートファゴソーム膜上に局在することがわかってきた（非特許文献６〜９）。かかる点から、ＬＣ３は、オートファジーの実行部隊の一員と認識されるに至っている。
【０００４】
一方、ＧＡＢＡＲＡＰは神経伝達に関わるＧＡＢＡ受容体と結合する因子として脳において発見されたが、これがオートファジー因子であるＬＣ３のホモログであった。in vitroではＬＣ３と同様の修飾を受ける事がわかっているが、細胞内動態の解析は全くされていない。脳においてオートファジーを欠損させたマウスでは、神経変性疾患様表現型を示す（非特許文献２）。この時、このマウスではＧＡＢＡＲＡＰの発現も上昇していた。従って、脳における神経変性疾患に関してはＧＡＢＡＲＡＰが関与している可能性がある。
【０００５】
また、ＧＡＴＥ１６は、神経伝達物質などを細胞外に輸送する経路の輸送を促進する因子として脳より単離された。これがオートファジー因子であるＬＣ３のホモログであった。in vitroではＬＣ３と同様の修飾を受ける事がわかっているが、細胞内動態の解析は全くされていない。また、肝臓においてオートファジーを欠損させると、ＧＡＴＥ１６の発現量も増加する。従って、ＧＡＴＥ１６がオートファジーの欠損により引き起こされる、病態に関与している可能性がある。
【非特許文献１】J Cell Biol. 2005 May 9;169(3):425-434.
【非特許文献２】Nature 2006 Jun 15:441(7095)880-884
【非特許文献３】Nature. 1999 Dec 9;402(6762):672-676.
【非特許文献４】J. Biol. Chem., 269：11492-11497, 1994
【非特許文献５】J. Neurosci. Res., 43：535-544, 1996
【非特許文献６】EMBO J., 19：5720-5728, 2000
【非特許文献７】J. Cell Biol., 152：657-668, 2001
【非特許文献８】J. Biol. Chem., 276：1701-1706, 2001
【非特許文献９】J. Biol. Chem., 277：13739-13744, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このようにオートファジーは、種々の生理機能や疾患に関与していることが判明しており、注目されているが、これまでオートファジーに着目した医薬の開発はなされていない。
従って、本発明の目的は、オートファジーの研究及びオートファジーに関与する疾患の治療薬のスクリーニングに用いることのできるモデル動物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明は、ＧＡＢＡＲＡＰ及びＧＡＴＥ１６に着目して研究してきたところ、これらのアミノ末端にＧＦＰを結合した修飾ＧＡＢＡＲＡＰ又は修飾ＧＡＴＥ１６を発現する遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト動物の作製に成功し、このトランスジェニック動物が全身に修飾ＧＡＢＡＲＡＰ又は修飾ＧＡＴＥ１６を発現しており、オートファジーが関与する疾患の研究モデルとして、又は医薬のスクリーニングモデルとして有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ＧＡＢＡＲＡＰ又はＧＡＴＥ１６のアミノ末端にＧＦＰが結合した修飾ＧＡＢＡＲＡＰ又は修飾ＧＡＴＥ１６を全身に発現しているトランスジェニック非ヒト動物又はその子孫を提供するものである。
また、本発明は上記トランスジェニック非ヒト動物又はその子孫に被験物質を投与し、ＧＡＢＡＲＡＰ又はＧＡＴＥ１６が関与する疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物を用いれば、オートファジーが関与する疾患の研究、各種疾患におけるオートファジーの役割の研究、さらにはオートファジーが関与する疾患の治療薬の検索が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、アミノ末端にＧＦＰが結合した修飾ＧＡＢＡＲＡＰ又は修飾ＧＡＴＥ１６を全身に発現しているものである。ここでＧＡＢＡＲＡＰ及びＧＡＴＥ１６遺伝子は、すでにクローニングされている（Tanida et al, J. Biol. Chem. 2001；276(3)：1701-1706, Tanida et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, Sep 6；296(5)：1164-1170、Gene Bank Accession No.AF161586）。GFP(Green Fluorescent Protein)は、オワンクラゲがもつ分子量約２７kpaの蛍光タンパク質であり、この遺伝子もすべてクローニングされている（Prasher et al. Gene. 1992 Feb 15;111(2):229-33、Gene Bank Accession No.DQ893101）。
【００１１】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、例えば前記修飾ＧＡＢＡＲＡＰ又は修飾ＧＡＴＥ１６遺伝子を組み込んだＤＮＡ（組み換えＤＮＡ）常法に従い非ヒト動物に導入することにより作製できる。この組み換えＤＮＡは、ＧＦＰをコードする遺伝子をＧＡＢＡＲＡＰｃＤＮＡ又はＧＡＴＥ１６ｃＤＮＡのセンス方向の上流に導入することにより得られる。ここで、組み換えＤＮＡには、非ヒト動物において当該修飾ＧＡＢＡＲＡＰ又は修飾ＧＡＴＥ１６を発現させるための適切なプロモータを用いることができる。このようなプロモータとしては、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＥＦ１−αプロモータ等が挙げられる。
【００１２】
かくして得られる組み換えＤＮＡを導入するための非ヒト哺乳動物としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等が挙げられる。好ましくは、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス又はラットであり、なかでもモルモット、ハムスター、マウス、ラット等の齧歯目（Rodentia）が好ましく、とりわけマウスが好ましい。
【００１３】
本発明のトランスジェニック動物は、例えば非ヒト哺乳動物の受精卵に、前記組み換えＤＮＡを導入し、当該受精卵を当該動物の雌に着床させることにより作製される。ここで、受精卵としては、雄精前核時期（受精後約１２時間位）のものが好ましい。また組み換えＤＮＡの導入方法としては、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等が挙げられるが、マイクロインジェクション法が特に好ましい。
【００１４】
組み換えＤＮＡを導入した受精卵は、当該受精卵と同種の動物の雌に着床させる。着床の手段は、偽妊娠雌性動物の卵管に人工的に移植、着床させる手段が好ましい。かくして、受精卵を着床させた動物から生まれた仔の中から、目的とする遺伝子を発現している個体を選別し、当該個体を継代すればよい。
【００１５】
得られたトランスジェニック動物に目的遺伝子が含まれているか否かの確認は、ＤＮＡを採取し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びサザンブロッティング法による導入遺伝子の解析によって行うことができる。
【００１６】
また得られたトランスジェニック動物における修飾ＧＡＢＡＲＡＰ又は修飾ＧＡＴＥ１６の発現は、臓器ごとに細胞破砕液を調製し、抗ＧＦＰ抗体を用いてウェスタンブロット法により確認できる。
【００１７】
本発明のトランスジェニック動物は、全身に修飾ＧＡＢＡＲＡＰ又は修飾ＧＡＴＥ１６が発現していることから、ＧＡＢＡＲＡＰ又はＧＡＴＥ１６をコントロールする因子をスクリーニングでき、オートファジーが関与する疾患の研究、例えば神経変性疾患、肝臓疾患、ガン化等に関与する因子のスクリーニングに用いることができる。
【００１８】
また、本発明のトランスジェニック動物に被験物質を投与し、ＧＡＢＡＲＡＰ又はＧＡＴＥ１６の増域を評価すれば、ＧＡＢＡＲＡＰ又はＧＡＴＥ１６が関与する疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。ＬＣ３が関与する疾患としては、神経変性疾患（例えばアルツハイマー症、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病）、肝炎（急性肝炎、慢性肝炎）、肝硬変、ガン、感染症、免疫異常等が挙げられる。
【実施例】
【００１９】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００２０】
実施例１
（１）ＧＦＰ−ｔａｇの導入：合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲ法を用いて、ＧＡＢＡＲＡＰ ｃＤＮＡのセンス方向の上流（タンパク質のアミノ酸末端の上流）に、ＧＦＰ（green fluorescent protein）をコードする塩基配列を導入した（ＧＦＰ−ＧＡＢＡＲＡＰ  ＤＮＡ断片）。
【００２１】
（２）得られたＧＦＰ−ＧＡＢＡＲＡＰ  ＤＮＡ断片をＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーターの下流に導入した。作成した［ＣＭＶプロモーター−ＧＦＰ−ＧＡＢＡＲＡＰ  ＤＮＡ］断片を用いて、定法に従い、ＧＦＰ−ＧＡＢＡＲＡＰトランスジェニックマウスを作成した。その後、遺伝的に安定させるために、野生型Ｂ６Ｊマウスと交配を続け、世代間を安定的にＧＦＰ−ＧＡＢＡＲＡＰ発現用ＤＮＡ断片が遺伝していくのをＰＣＲ法を用いたgenotypingにより確認した。具体的には、まずマウス尾部より定法に従い、ゲノムDNAを抽出し、そのDNAを鋳型にCAGSFプライマー（5'-GGCTTCTGGCGTGTGACC-3'：配列番号１）とGABARAPRvプライマー（5'-TCACAGACCGTAGACAC-3'：配列番号２）を用いて、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素により、目的の断片約４００ｂｐを増幅していることで、遺伝子型を判定した。
【００２２】
（３）臓器におけるＧＦＰ−ＧＡＢＡＲＡＰタンパク質の発現は、定法に従って臓器ごとにダウンス型ホモジナイザーで組織を破壊後、１％ＳＤＳ存在下でタンパク質を抽出し、遠心によ不溶物質を取り除くことで、細胞破砕液を調製し、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分子量ごとに分離後、抗ＧＦＰ抗体を用いてウエスタンブロット法により確認できた。
【００２３】
ＧＦＰ−ＧＡｂＡＲＡＰｔｇマウス各臓器におけるＧＦＰ−ＧＡＢＡＲＡＰの発現を調べた。調べたすべての臓器において、目的タンパク質の発現を認められた（図２）。
【００２４】
また、マウス組織ををホルムアミド存在下で固定し、超薄切片を調製ご、臓器ごとに蛍光顕微鏡を用いた観察を行い、各臓器に発現している事を確認した（図３）。
【００２５】
実施例２
（１）ＧＦＰ−ｔａｇの導入：合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲ法を用いてＧＡＴＥ１６ ｃＤＮＡのセンス方向の上流（タンパク質のアミノ酸末端の上流）に、ＧＦＰ(green fluorescent protein)をコードする塩基配列を導入した（ＧＦＰ−ＧＡＴＥ１６ＤＮＡ断片）。
【００２６】
得られたＧＦＰ−ＧＡＴＥ１６ＤＮＡ断片をＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーターの下流に導入した。作成した［ＣＭＶプロモーター−ＧＦＰ−ＧＡＴＥ１６ＤＮＡ］断片を用いて、定法に従い、ＧＦＰ−ＧＡＴＥ１６トランスジェニックマウスを作成した。その後、遺伝的に安定させるために、野生型Ｂ６Ｊマウスと交配を続け、世代間を安定的にＧＦＰ−ＧＡＴＥ１６発現用ＤＮＡ断片が遺伝していくのをＰＣＲ法を用いたgenotypingにより確認した。具体的には、まずマウス尾部より定法に従い、ゲノムＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡを鋳型にＣＡＧＳＦプライマー（5'-GGCTTCTGGCGTGTGACC-3'：配列番号１）とG16Rvプライマー（5'- TCAGAAGCCAAAAGTGTTC-3' ：配列番号２）を用いて、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素により、目的の断片約４００ｂｐを増幅していることで、遺伝子型を判定した。
【００２７】
（３）臓器におけるＧＦＰ−ＧＡＴＥ１６タンパク質の発現は、定法に従って臓器ごとに細胞破砕液を調製し、抗ＧＦＰ抗体を用いてウエスタンブロット法により確認できた。
【００２８】
また、臓器ごとに蛍光顕微鏡を用いた観察を行い、各臓器に発現している事を確認した（図６）。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＧＦＰ−ＧＡＢＡＲＡＰタンパク質発現のために導入したＤＮＡ断片の模式図を示す。
【図２】ＧＦＰ−ＧＡＢＡＲＡＰ  ｔｇマウスの多臓器における、ＧＦＰ−ＧＡＢＡＲＡＰの発現を示す図である（ウエスタンブロット）。
【図３】ＧＦＰ−ＧＡＢＡＲＡＰ  Ｔｇマウスの多臓器における、ＧＦＰ−ＧＡＢＡＲＡＰの発現を示す図である（蛍光顕微鏡）。
【図４】ＧＡＰ−ＧＡＴＥ１６タンパク質発現のために導入したＤＮＡ断片の模式図を示す。
【図５】各臓器におけるＧＦＰ−ＧＡＴＥ１６タンパク質の発現を示す図である。
【図６】ＧＦＰ−ＧＡＴＥ１６  Ｔｇマウスの各臓器における、ＧＦＰ−ＧＡＴＥ１６発現を示す図（蛍光顕微鏡）である。
【図１】
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【図４】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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