(57)【要約】【課題】アレルゲン等の検体を高感度に検出することができる分析用マイクロ流路デバイスを提供する。【解決手段】。マイクロ流路と、マイクロ流路内に固定された、目的物質と反応する反応物質と、反応量を測定する電気化学的検出用電極と、を備えた分析用マイクロ流路デバイスにおいて、流路構造を工夫し、流路内に設けられた反応物質保持部及び／又は電気化学的検出用電極に流体が略垂直に当る構造とした。【選択図】  図１２
2008051803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検液が流れる第１の流路と、
前記第１の流路と略平行な第２の流路と、
前記第１の流路と前記第２の流路とを略垂直に繋ぐ第３の流路と、を備え、
前記第３の流路入口近傍でかつ前記第１の流路内に、前記被検液に含まれる検体と特異的に反応する反応物質が固定された微粒子が流去しない状態で保持された反応物質保持部が設けられている、
ことを特徴とする分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項２】
被検液が流れる第１の流路と、
前記第１の流路と略平行な第２の流路と、
前記第１の流路と前記第２の流路とを略垂直に繋ぐ複数の第３の流路と、を備え、
前記第１の流路の床面であって前記複数の第３の流路の入口相互間領域に、前記被検液に含まれる検体と特異的に反応する反応物質が固定されてなる反応物質保持部が設けられている、
ことを特徴とする分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項３】
被検液が流れる第１の流路と、
前記第１の流路と略平行な第２の流路と、
前記第１の流路と前記第２の流路とを略垂直に繋ぐ第３の流路と、を備え、
前記第３の流路内には、前記第１の流路と略平行にフィルターが配置され、
前記フィルターの前記第１の流路側の面に、前記被検液に含まれる検体と特異的に反応する反応物質が固定されてなる反応物質保持部が設けられている、
ことを特徴とする分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項４】
被検液が流れる第１の流路と、
前記第１の流路と略平行な第２の流路と、
前記第１の流路における被検液の流れを前記第２の流路側に略垂直に曲げる流向変更手段と、を備え、
前記流向変更手段の近傍であって、前記第１の流路と前記第２の流路との間の領域に、前記第１の流路と略平行にフィルターが配置され、
前記フィルターの前記第１の流路側の面に、前記被検液に含まれる検体と特異的に反応する反応物質が固定されてなる反応物質保持部が設けられている、
ことを特徴とする分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項５】
前記流向変更手段は、前記第１の流路の下流側末端に設けられた、前記第１の流路と略垂直な壁面からなる、
ことを特徴とする請求項４に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項６】
前記第３の流路は、前記微粒子の直径よりも流路径が小さい複数の微細な流路群からなり、かつこれにより微粒子の流去が堰き止められる構造である、
ことを特徴とする請求項１に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項７】
前記第３の流路の直上に位置する前記第１の流路の壁面が、前記第３の流路側に傾斜している、
ことを特徴とする請求項１ないし３いずれかに記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項８】
前記フィルターの直上に位置する前記第１の流路の壁面が、前記フィルター側に傾斜している、
ことを特徴とする請求項４に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項９】
前記第３の流路の直下に位置する前記第２の流路の壁面が、前記第３の流路側に傾斜している、
ことを特徴とする請求項１ないし３いずれかに記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項１０】
前記フィルターの直下に位置する前記第２の流路の壁面が、前記フィルター側に傾斜している、
ことを特徴とする請求項４に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項１１】
前記分析用マイクロ流路デバイスは、
前記第１の流路用の溝が形成された第１の基板と、
前記第２の流路用の溝が形成された第２の基板と、
前記第３の流路用の貫通孔が形成された第３の基板とが、前記第１の基板、前記第３の基板、前記第２の基板の順に重ね合わされてなるものである、
ことを特徴とする請求項１ないし３いずれかに記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項１２】
前記分析用マイクロ流路デバイスは、
前記第１の流路用の溝及び前記第３の流路用の貫通孔が形成された第１ａの基板と、
前記第1の流路用の溝を蓋する第１ｂの基板と、
前記第２の流路用の溝が形成された第２の基板とが、前記第１ｂの基板、前記第１ａの基板、前記第２の基板の順に重ね合わされてなるものである、
ことを特徴とする請求項１に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項１３】
前記分析用マイクロ流路デバイスは、
前記第１の流路用の溝が形成された第１の基板と、
前記第２の流路用の溝が形成された第２の基板と、
前記フィルターとが、前記第１の基板、前記フィルター、前記第２の基板の順に重ね合わされてなるものである、
ことを特徴とする請求項４に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項１４】
前記第１の基板には、前記被検液を注入する注入孔と、前記被検液を排出する排出孔とが、設けられ、
前記第３の基板には、前記第２の流路用の溝と前記排出孔とを繋ぐ穴が形成されている、
ことを特徴とする請求項１１に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項１５】
前記第１ｂの基板には、前記被検液を注入する注入孔と、前記被検液を排出する排出孔とが、設けられている、
ことを特徴とする請求項１２に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項１６】
前記第１の基板には、前記被検液を注入する注入孔と、前記被検液を排出する排出孔とが、設けられている、
ことを特徴とする請求項１４に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項１７】
被検液が流れる流路Ａと、
前記流路Ａと略平行な流路Ｂと、
前記流路Ａと前記流路Ｂとを略垂直に繋ぐ流路Ｃと、を備え、
前記流路Ｃの直下であって前記流路Ｃと略直交する前記流路Ｂの床面に、電気化学検出用電極が設けられている、
ことを特徴とする分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項１８】
被検液が流れる流路Ａと、
前記流路Ａと略平行な流路Ｂと、
前記流路Ａと前記流路Ｂとを略垂直に繋ぐ複数の流路Ｃと、を備え、
前記流路Ａの床面部分であって前記複数の流路Ｃの入口相互間領域に、電気化学検出用電極が設けられている、
ことを特徴とする分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項１９】
被検液が流れる流路Ａと、
前記流路Ａと略平行な流路Ｂと、
前記流路Ａにおける前記被検液の流れを前記流路Ｂ側に略垂直に曲げる流向変更手段と、を備え、
前記流向変更手段の直下であって前記流路Ｂの床面に、電気化学検出用電極が設けられている、
ことを特徴とする分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項２０】
前記流向変更手手段は、前記流路Ａの下流側末端に設けられた、前記流路Ａと略垂直な壁面からなる、
ことを特徴とする請求項１９に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項２１】
前記流路Ｃは、複数の流路群からなる、
ことを特徴とする請求項１７に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項２２】
前記流路Ｃの直上に位置する前記流路Ａの壁面が、前記流路Ｃ側に傾斜している、
ことを特徴とする請求項１７又は１８に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項２３】
前記流路Ａの壁面であって前記流向変更手段の近傍部分が、前記フィルター側に傾斜している、
ことを特徴とする請求項２０に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項２４】
前記流路Ｃの直下に位置する前記流路Ｂの壁面が、前記流路Ｃ側に傾斜している、
ことを特徴とする請求項１８に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項２５】
前記流向変更手段の直下近傍部分であって、前記フィルターと対向位置する前記流路Ｂの壁面が、前記フィルター側に傾斜している、
ことを特徴とする請求項２０に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項２６】
前記分析用マイクロ流路デバイスは、
前記流路Ａ用の溝が形成された基板ａと、
前記流路Ｂ用の溝及び前記電気化学的検出用電極が形成された基板ｂと、
前記流路Ｃ用の貫通孔が形成された基板ｃとが、前記基板ａ、前記基板ｃ、前記基板ｂの順に重ね合わされてなるものである、
ことを特徴とする請求項１７に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項２７】
前記分析用マイクロ流路デバイスは、
前記流路Ａ用の溝が形成された基板ａと、
前記流路Ｂ用の溝が形成された基板ｂ１と、
前記電気化学的検出用電極が形成された基板ｂ２と、
前記流路Ｃ用の貫通孔が形成された基板ｃとが、前記基板ａ、前記基板ｃ、前記基板ｂ１、前記基板ｂ２の順に重ね合わされてなるものである、
ことを特徴とする請求項１７に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項２８】
前記分析用マイクロ流路デバイスは、
前記流路Ａ用の溝が形成された基板ａと、
前記流路Ｂ用の溝が形成された基板ｂと、
前記流路Ｃ用の貫通孔及び前記電気化学的検出用電極が形成された基板ｃとが、前記基板ａ、前記基板ｃ、前記基板ｂの順に重ね合わされてなるものである、
ことを特徴とする請求項１８に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項２９】
前記分析用マイクロ流路デバイスは、
前記流路Ａ用の溝が形成された基板ａと、
前記流路Ｂ用の溝及び前記電気化学的検出用電極が形成された基板ｂとが、重ね合わされてなるものである、
ことを特徴とする請求項２０に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項３０】
前記第３の流路の直下であって前記第３の流路と略直交する前記第２の流路の床面に、電気化学検出用電極が設けられている、
ことを特徴とする請求項１ないし３いずれかに記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項３１】
前記フィルターの直下に位置する前記第２の流路の床面に、電気化学検出用電極が設けられている、
ことを特徴とする請求項４に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項３２】
前記分析用マイクロ流路デバイスは、
前記第２の流路と略平行な第４の流路と、
前記第２の流路と前記第４の流路とを略垂直に繋ぐ第５の流路と、を更に備え、
前記第５の流路の直下であって前記第５の流路と直交する前記第４の流路の床面に、電気化学検出用電極が設けられている、
ことを特徴とする請求項１ないし３いずれかに記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項３３】
前記分析用マイクロ流路デバイスは、
前記第２の流路と略平行な第４の流路と、
前記第２の流路と前記第４の流路とを略垂直に繋ぐ複数の第５の流路と、を更に備え、
前記第２の流路の床面部分であって前記複数の第５の流路の入口相互間領域に、電気化学検出用電極が設けられている、
ことを特徴とする請求項１ないし３いずれかに記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項３４】
前記分析用マイクロ流路デバイスは、
前記第１の流路用の溝が形成された第１の基板と、
前記第２の流路用の溝及び前記電気化学的検出用電極が形成された第２の基板と、
前記第３の流路用の貫通孔が形成された第３の基板とが、前記第１の基板、前記第３の基板、前記第２の基板の順に重ね合わされてなるものである、
ことを特徴とする請求項３０に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項３５】
前記分析用マイクロ流路デバイスは、
前記第１の流路用の溝が形成された第１の基板と、
前記第２の流路用の溝が形成された第２ａの基板と、
前記電気化学的検出用電極が形成された第２ｂの基板と、
前記第３の流路用の貫通孔が形成された第３の基板とが、前記第１の基板、前記第３の基板、前記第２ａの基板、前記第２ｂの基板の順に重ね合わされてなるものである、
ことを特徴とする請求項３０に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項３６】
前記分析用マイクロ流路デバイスは、
前記第１の流路用の溝が形成された第１の基板と、
前記第２の流路用の溝及び前記電気化学的検出用電極が形成された第２の基板と、
前記フィルターとが、前記第１の基板、前記フィルター、前記第２の基板の順に重ね合わされてなるものである、
ことを特徴とする請求項３１に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項３７】
前記分析用マイクロ流路デバイスは、
前記第１の流路用の溝が形成された第１の基板と、
前記第２の流路用の溝が形成された第２ａの基板と、
前記電気化学的検出用電極が形成された第２ｂの基板と、
前記フィルターとが、前記第１の基板、前記フィルター、前記第２ａの基板、前記第２ｂの基板の順に重ね合わされてなるものである、
ことを特徴とする請求項３１に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項３８】
前記分析用マイクロ流路デバイスは、
前記第１の流路用の溝、前記第４の流路用の溝及び電気化学的検出用電極が形成された第１の基板と、
前記第２の流路用の溝が形成された第２の基板と、
前記第３の流路用の貫通孔及び第５の流路用の貫通孔が形成された第３の基板とが、前記第１の基板、前記第３の基板、前記第２の基板の順に重ね合わされてなるものである、
ことを特徴とする請求項３２に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項３９】
前記分析用マイクロ流路デバイスは、
前記第１の流路用の溝及び前記第４の流路用の溝が形成された第１ａの基板と、
前記電気化学的検出用電極が形成された第１ｂの基板と、
前記第２の流路用の溝が形成された第２の基板と、
前記第３の流路用の貫通孔及び前記第５の流路用の貫通孔が形成された第３の基板とが、前記第１ｂの基板、前記第１ａの基板、前記第３の基板、前記第２の基板の順に重ね合わされてなる、
ことを特徴とする請求項３２に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項４０】
前記分析用マイクロ流路デバイスは、
前記第１の流路用の溝及び第４の流路用の溝が形成された第１の基板と、
前記第２の流路用の溝が形成された第２の基板と、
前記第３の流路用の貫通孔、第５の流路用の貫通孔及び前記電気化学的検出用電極が形成された第３の基板とが、前記第１の基板、前記第３の基板、前記第２の基板に重ね合わされてなる、
ことを特徴とする請求項３３に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項４１】
前記第１の基板には、被検液を注入する注入孔と、被検液を排出する排出孔とが、設けられ、
前記第３の基板には、前記第２の流路用の溝と前記排出孔とを繋ぐ穴が設けられている、
ことを特徴とする請求項３４ないし３７いずれかに記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項４２】
前記第１の基板には、前記第１の流路の上流側に設けられた被検液を注入する注入孔と、前記第４の流路の下流側に設けられた被検液を排出する排出孔と、が設けられている、
ことを特徴とする請求項３８又は４０に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項４３】
前記第１ｂの基板には、前記第１の流路の上流側に設けられた被検液を注入する注入孔と、前記第４の流路の下流側に設けられた被検液を排出する排出孔と、が設けられている、
ことを特徴とする請求項３９に記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【請求項４４】
前記電気化学的検出用電極の表面には、前記被検液に含まれる検体と特異的に反応する反応物質が設けられている、
ことを特徴とする請求項１７から２９のいずれかに記載の分析用マイクロ流路デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検液に含まれる特定の物質である検体（例えば、アレルゲン）を検出する分析用マイクロ流路デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原抗体反応を用いた免疫分析法は、医療や生化学分野、アレルゲンなどの測定分野などにおいて重要な分析・計測方法として用いられているが、従来の免疫分析法は、分析に一日以上の時間を要すること、操作が煩雑である等の問題を有している。
【０００３】
このような中、基板にマイクロオーダーの流路を形成し、このマイクロ流路に抗体等を固定化することにより、分析時間の短縮化や分析操作の簡略化を図るマイクロ流路デバイス技術が提案されている。（例えば特許文献１、２参照。）。
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００３−０６２８２３号公報
【特許文献２】特開２００３−２８５２９８号公報
【０００５】
特許文献１は、抗原又は抗体を予めプラスチックまたはガラスなどからなる微粒子表面に固定させ、この反応微粒子をマイクロ流路内に充填してなるマイクロ流路デバイスに関する。この技術によると、反応場（反応微粒子が充填された領域）が小さくでき、しかも反応表面積を大きくできるので、装置の小型化とともに反応に要する時間を大幅に短縮することができるとされる。
【０００６】
この技術にかかるマイクロ流路デバイスの構造を図３３に示す。この図に基づいてこの技術を詳細に説明する。図３３に示すように、このマイクロ流路デバイスは、ガラスまたはプラスチックからなる基板６０１表面に、流路６０８、６０９、堰き止め部６２０、注入孔６０３、６０４、排出孔６０７が形成されている。また、酵素反応によって生じた物質の酸化還元電流を検出する電極６１３がシリコン基板６０２表面に形成され、両基板６０１、６０２を、流路と電極とが向かい合うようにして重ね合わされた構成となっている。
【０００７】
検体と特異的に反応する抗体が固定化された微粒子６０５を、バッファー液に分散させ注入孔６０３からチップに注入する。反応微粒子６０５は、堰き止め部６２０が流去しないように堰き止めている。図３３（ｂ）に示す堰き止め部６２０は、その上端面と基板６０２との隙間を微粒子６０５の直径未満とした構造である。
【０００８】
このデバイスの使用方法を説明する。まず、チップ内部の洗浄と、液の流れを均一化するために、外部ポンプなどを用いて、注入孔６０３からバッファー液を注入し、このバッファー液を流路６０８、６０９を経て排出孔６０７から排出させる。
【０００９】
この後、検体を含む被検液を注入穴６０４から外部ポンプなどを用いて注入し、検体と特異的に反応する抗体が固定化された微粒子６０５と反応させ、微粒子表面に検体を捕獲させる。
【００１０】
この後、未反応の検体を含む被検液をバッファー液で洗い流す。
【００１１】
この後、酵素を標識として付けた抗体を含む液を注入孔６０４から注入し、微粒子表面に微粒子６０５に固定された抗体−検体−酵素付抗体からなる複合体を形成させる。
【００１２】
この後、未反応の酵素付抗体をバッファー液で洗浄する。
【００１３】
この後、注入孔６０４から酵素により電気的活性物質に変化する基質材料を注入し、微粒子６０５の表面における酵素反応で変化した電気的活性物質の量を電極６１３で酸化還元電流として検出する。これにより、被検液中の検体の量を知ることができる。
【００１４】
上記電極６１３は、例えば図３３（ｂ）に示すように流路壁面に形成される。この電極や電極に繋ぐ配線として、特許文献３または４に記載されている技術が使用できる。
【００１５】
また、上記特許文献２には、このようなマイクロ流路デバイスにおいて、二つの基板の接合性を向上させる技術が記載されている。
【００１６】
【特許文献３】特開平１−２７２９５８号公報
【特許文献４】特開２００１−１５３８３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明者はマイクロ流路を用いた分析用デバイスについて種々な検討を行った。その結果、次のような課題があることを知った。
（１）流路内に反応微粒子を充填するマイクロ流路デバイスは、微粒子表面に反応物質が固定されているために反応可能面積を増大させることができるが、この利点を生かすためには、被検液が微粒子相互の間隙に流れる必要がある。被検液が微粒子相互の間隙を流れることにより被検液に含まれる抗原と微粒子表面に固定された抗体との接触機会が増大し、これにより初めて抗原抗体反応の効率が可能になるからである。
【００１８】
しかし、上記従来技術にかかるマイクロ流路デバイスでは、堰き止め部６２０で微粒子６０５を堰き止める構造上、図３４に模式的に示すように、流路壁６１０と微粒子群６０５との間に隙間空間６１１ができる。このため、被検液の多くが微粒子相互間の狭い間隙よりも、蛇行がなく流れ抵抗の小さい上記隙間空間６１１側を流れる。この結果、微粒子に固定された抗体と反応する抗原の量が少なくなり、実際の抗原濃度よりも薄い濃度の被検液を測定している場合と同様の結果となる。それゆえ、上記従来技術にかかるマイクロ流路デバイスにおいては、検出感度を十分に向上させることができない。
【００１９】
ここにおいて、隙間空間ができないように微粒子を密に充填すれば、このような問題が解消するようにも思える。しかし、そのようにはならない。なぜなら、堰き止め部６０５の下部では、堰き止め部６０５によって液の流れが妨げられ流れ抵抗が大きいのに対し、堰き止め部６０５の上部はこれよりも流れ抵抗が小さいので、やはり流れ抵抗の小さい上部（図３４の上部）により多くの被検液が流れるからである。
【００２０】
（２）他方、ビーズではなく、流路表面自体に抗体を固定する分析用マイクロ流路デバイスが知られているが、流体は流路表面から少し離れた内側をよく流れる性質がある。このため、この方式では、被検液の多くが抗体の固定された表面以外の領域を通過してしまう。それゆえ、流路表面自体に抗体を固定するこの方式においても、上記と同様の問題が生じる。
【００２１】
（３）分析用マイクロ流路デバイスにおける検出方法としては、蛍光色素による方法、熱レンズを用いた方法、放射性同位体を用いた方法、電気化学的検出方法等があり、このうち電気化学的検出方法が検出感度に優れ、再現性が高いが、電気化学的検出方法を用いた従来のイクロデバイスは、図３３（ｂ）及び図３７に示すように、電極６１３が流れ方向に平行に形成されている。このような構造においては、電極自体には酵素反応により生じた電気的活性物質を引き付ける力がないため、上記で説明したと同様な理由により、被検液に含まれる電気的活性物質の多くが電極表面以外の領域を通過してしまう。それゆえ、電極表面で酸化還元反応を起こすのは電極表面に接触する一部の電気的活性物質のみとなり、十分な検出感度が得られない。
【００２２】
本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものである。本発明の課題は、検出感度に優れた分析用マイクロ流路デバイスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上記課題を解決するための本発明は、被検液に含まれる検体と抗体等との反応効率を高めるため、被検液の流れを略垂直に曲げる手段を講じたことに特徴を有している。
一群の本発明のうち、反応部分にかかわるものを第１の発明群、検出部分にかかわるものを第２の発明群、両者を組み合わせたものを第３の発明群、及び電気化学的検出用電極の表面に、被検液に含まれる検体と特異的に反応する反応物質を設けた構成のものを第４の実施の形態群と称することとし、順次その内容を説明する。
【００２４】
〔第1の発明群〕
上記課題を解決するための第１の発明群の第１の態様は、被検液が流れる第１の流路と、前記第１の流路と略平行な第２の流路と、前記第１の流路と前記第２の流路とを略垂直に繋ぐ第３の流路と、を備え、前記第３の流路入口近傍であって前記第１の流路内に、前記被検液に含まれる検体と特異的に反応する反応物質が固定された微粒子が流去しない状態で保持された反応物質保持部が設けられていることを特徴とする分析用マイクロ流路デバイスである。
【００２５】
この構成によると、図３に示すように、第１の流路８から第３の流路１５を経由して第２の流路１０に被検液が流れる際に、矢印２０に示すように略直角に曲がる流れが生じる。これにより、微粒子１４全体と被検液に含まれる検体とが、均一に反応するようになり、反応効率が向上し、この結果検出感度を高めることができる。
【００２６】
上記課題を解決するための第１の発明群の第２の態様は、被検液が流れる第１の流路と、前記第１の流路と略平行な第２の流路と、前記第１の流路と前記第２の流路とを略垂直に繋ぐ複数の第３の流路と、を備え、前記第１の流路の床面であって前記複数の第３の流路の入口相互間領域に、前記被検液に含まれる検体と特異的に反応する反応物質が固定されてなる反応物質保持部が設けられていることを特徴とする分析用マイクロ流路デバイスである。
【００２７】
この構成によると、図４に示すように、第１の流路８から第３の流路１５を経由して第２の流路１０に被検液が流れる際に、矢印２０に示すように略直角に曲がる流れが生じる。これにより、反応物質保持部１６に固定された反応物質と被検液に含まれる検体とが、均一に反応するようになり、反応効率が向上し、検出感度を高めることができる。
【００２８】
ここで、床面とは、流路の底面を意味するが、分析用マイクロ流路デバイス自体は、どのような方向に向けても使用可能なので、実際の設置状態における流路の下面に限定されるものではない。また、上記入口相互間領域とは、或る１つの流路入口と隣の流路入口との間の部分、当該隣の流路入口と当該隣の流路入口の隣りに位置する流路の入口との間の部分、・・・の総和を意味している（図４（ｃ）の符号１１参照）。
【００２９】
上記課題を解決するための第１の発明群の第３の態様は、被検液が流れる第１の流路と、前記第１の流路と略平行な第２の流路と、前記第１の流路と前記第２の流路とを略垂直に繋ぐ第３の流路と、を備え、前記第３の流路内には、前記第１の流路と略平行にフィルターが配置され、前記フィルターの前記第１の流路側の面に、前記被検液に含まれる検体と特異的に反応する反応物質が固定されてなる反応物質保持部が設けられていることを特徴とする分析用マイクロ流路デバイスである。
【００３０】
上記課題を解決するための第１の発明群の第４の態様は、被検液が流れる第１の流路と、前記第１の流路と略平行な第２の流路と、前記第１の流路における被検液の流れを前記第２の流路側に略垂直に曲げる流向変更手段と、を備え、前記流向変更手段の近傍であって、前記第１の流路と前記第２の流路との間の領域に、前記第１の流路と略平行なフィルターが配置され、前記フィルターの前記第１の流路側の面に、前記被検液に含まれる検体と特異的に反応する反応物質が固定されてなる反応物質保持部が設けられていることを特徴とする分析用マイクロ流路デバイスである。
【００３１】
これらの構成によっても、上記第１の発明群の第２の態様と同様の効果が得られる。
【００３２】
ここで、複数の流路の径が過大であったり、フィルターのメッシュが大きすぎたりすると、反応物質が固定されていない部分を通過する検体量が増加する。すなわち、反応物質と反応しない検体量が増加する。他方、径が細かすぎると、液が流れにくくなり、流量が過小となる。このため、流路径やメッシュは、好ましくは１μｍ〜１００μｍとする。
【００３３】
なお、液の流れを垂直に曲げることなく、直線状の流路にフィルターを配置することも可能であるが、マイクロオーダーの流路には、その流路径と同等以下の微小なフィルターしか配置できないので、フィルター面積が過小となり、必要とする送液圧力が過大となってしまい、デバイスの破壊を招くおそれがある。これに対し、本発明のように平行な２つの流路の間にフィルターを配置する方法であると、フィルター面積を大きくできるため、このような問題が生じない。このような観点から、フィルターの面積や第３の流路の断面積（複数からなる場合にはその合計断面積）を１０3μｍ2〜１０7μｍ2、より好ましくは１０4μｍ2〜１０6μｍ2とすることが好ましい。
【００３４】
上記第１の発明群の第４の態様において、前記流向変更手段は、前記第１の流路の下流側末端に設けられた、前記第１の流路と略垂直な壁面からなる構成とすることが、設計上容易である。
【００３５】
上記第１の発明群の第１の態様において、前記第３の流路は、前記微粒子の直径よりも流路径が小さい複数の微細な流路群からなり、かつこれにより微粒子の流去が堰き止められる構造とすることができる。
【００３６】
微粒子を反応物質保持部から流去しないようにする構成としては、微粒子を磁性を有するものとし、外部に磁石を配置する方法も採用できるが、上記構成のほうが装置の簡略化できるため好ましい。
【００３７】
上記第３の流路の形状は、図１８（ａ）〜（ｅ）の符号１５に示すようなさまざまな形態をとりうるが、微粒子が流路を通過できないことが必要である。このためには、流路の最小径方向における流路径を、少なくとも微粒子の最大直径よりも小さくし、好ましくは流路の最小径方向における流路径を、微粒子の最小直径よりも小さくする。ただし、流路の最大径方向の流路径が微粒子の最大直径よりも大きい場合があってもよい。
【００３８】
上記第１の発明群の第１〜第３の態様において、前記分析用マイクロ流路デバイスは、前記第１の流路用の溝が形成された第１の基板と、前記第２の流路用の溝が形成された第２の基板と、前記第３の流路用の貫通孔が形成された第３の基板とが、前記第１の基板、前記第３の基板、前記第２の基板の順に重ね合わされてなる構成を採用することできる。この構成であると、上記第１の発明群の第１〜第３の態様の分析用マイクロ流路デバイスを容易に実現することができる。
【００３９】
上記第１の発明群の第４の態様において、前記分析用マイクロ流路デバイスは、前記第１の流路用の溝が形成された第１の基板と、前記第２の流路用の溝が形成された第２の基板と、前記フィルターとが、前記第１の基板、前記フィルター、前記第２の基板の順に重ね合わされてなる構成を採用することできる。この構成であると、上記第１の発明群の第４の態様の分析用マイクロ流路デバイスを容易に実現することができる。
【００４０】
また、上記第１の発明群の第２〜第４の態様においてこれらの構成を採用した場合、反応物質が劣化したときに基板の積層を一度はがし、第３の基板あるいはフィルターのみを取り替えることによって、再度分析用デバイスとして再使用可能であるというメリットもある。
【００４１】
また、上記第１の発明群の第１の態様においては、反応物質が劣化したときには、第２の流路側から第１の流路側に向かって液を逆流させ、液とともに微粒子を洗い出し、再度微粒子を充填すれば、再度分析用デバイスとして再使用可能である。
【００４２】
〔第２の発明群〕
上記課題を解決するための第２の発明群の第１の態様は、被検液が流れる流路Ａ（第1の流路に相当）と、前記流路Ａと略平行な流路Ｂ（第２の流路に相当）と、前記流路Ａと前記流路Ｂとを略垂直に繋ぐ流路Ｃ（第３の流路に相当）と、を備え、前記流路Ｃの直下であって前記流路Ｃと略直交する前記流路Ｂの床面に、電気化学検出用電極が設けられていることを特徴とする分析用マイクロ流路デバイスである。
【００４３】
上記課題を解決するための第２の発明群の第２の態様は、被検液が流れる流路Ａと、前記流路Ａと略平行な流路Ｂと、前記流路Ａと前記流路Ｂとを略垂直に繋ぐ複数の流路Ｃと、を備え、前記流路Ａの床面部分であって前記複数の流路Ｃの入口相互間領域に、電気化学検出用電極が設けられていることを特徴とする分析用マイクロ流路デバイスである。
【００４４】
上記課題を解決するための第２の発明群の第３の態様は、被検液が流れる流路Ａと、前記流路Ａと略平行な流路Ｂと、前記流路Ａにおける被検液の流れを前記流路Ｂ側に略垂直に曲げる流向変更手段と、を備え、前記流向変更手段の直下であって前記流路Ｂの床面に、電気化学検出用電極が設けられていることを特徴とする分析用マイクロ流路デバイスである。
【００４５】
これらの構成によると、図６（ｂ）、図７（ｂ）、図８（ｂ）、図９（ｂ）に示すように、電気化学的検出用電極１３に、電気的活性物質を含む被検液が略垂直に当たるように流れる。このため、被検液中の電気的活性物質のほとんどが電気化学的検出用電極１３に当たるようになるので、検出感度が飛躍的に向上する。
【００４６】
上記第２の発明群の第１の態様において、前記流路Ｃは、複数の流路群からなる構成とすると、より確実に電気化学的検出用電極に電気的活性物質を当てることができる。
【００４７】
上記第２の発明群の第１の態様において、前記分析用マイクロ流路デバイスは、前記流路Ａ用の溝が形成された基板ａと、前記流路Ｂ用の溝及び前記電気化学的検出用電極が形成された基板ｂと、前記流路Ｃ用の貫通孔が形成された基板ｃとが、前記基板ａ、前記基板ｃ、前記基板ｂの順に重ね合わされてなる構成を採用することできる。この構成であると、上記第２の発明群の第１の態様の分析用マイクロ流路デバイスを容易に実現することができる。
【００４８】
なお、凹凸のある流路を形成した基板に電極に繋がる配線を形成することは、製造上難しい場合がある。この場合、基板ｂを、流路Ｂが形成された基板ｂ１と、電気化学的検出用電極が形成された基板ｂ２と、からなる２枚構成とすることが好ましい。
【００４９】
上記第２の発明群の第２の態様において、前記分析用マイクロ流路デバイスは、前記流路Ａ用の溝が形成された基板ａと、前記流路Ｂ用の溝が形成された基板ｂと、前記流路Ｃ用の貫通孔及び前記電気化学的検出用電極が形成された基板ｃとが、前記基板ａ、前記基板ｃ、前記基板ｂの順に重ね合わされてなる構成を採用することできる。この構成であると、上記第２の発明群の第２の態様の分析用マイクロ流路デバイスを容易に実現することができる。この構成では、平面状である基板ｃに電極を設けるので、基板ｃを２枚構成とする必要はない。
【００５０】
上記第２の発明群の第３の態様において、前記分析用マイクロ流路デバイスは、前記流路Ａ用の溝が形成された基板ａと、前記流路Ｂ用の溝及び前記電気化学的検出用電極が形成された基板ｂとが、重ね合わされてなる構造を採用することできる。この構成であると、上記第２の発明群の第３の態様の分析用マイクロ流路デバイスを容易に実現することができる。
【００５１】
この場合においても、基板ｂを、流路Ｂが形成された基板ｂ１と、電気化学的検出用電極が形成された基板ｂ２と、からなる２枚構成とすることができる。
【００５２】
〔第３の発明群〕
上記課題を解決するための第３の発明群の第１の態様は、上記第１の発明群の第１〜３の態様において、前記第３の流路の直下であって前記第３の流路と略直交する前記第２の流路の床面に、電気化学検出用電極が設けられていることを特徴とする。
【００５３】
上記課題を解決するための第３の発明群の第２の態様は、上記第１の発明群の第４の態様において、前記フィルターの直下の前記第２の流路の床面に、電気化学検出用電極が設けられていることを特徴とする。
【００５４】
上記課題を解決するための第３の発明群の第３の態様は、上記第１の発明群の第１〜３の態様において、前記分析用マイクロ流路デバイスは、前記第２の流路と略平行な第４の流路と、前記第２の流路と前記第４の流路とを略垂直に繋ぐ第５の流路と、を更に備え、前記第５の流路の直下であって前記第５の流路と直交する前記第４の流路の床面に、電気化学検出用電極が設けられていることを特徴とする。
【００５５】
上記課題を解決するための第３の発明群の第４の態様は、上記第１の発明群の第１〜３の態様において、前記分析用マイクロ流路デバイスは、前記第２の流路と略平行な第４の流路と、前記第２の流路と前記第４の流路とを略垂直に繋ぐ複数の第５の流路と、を更に備え、前記第２の流路の床面部分であって前記複数の第５の流路の入口相互間領域に、電気化学検出用電極が設けられていることを特徴とする。
【００５６】
これらの構成によると、上述した第１の発明群による効果と、第２の発明群による効果を同時に得ることができ、これらが相乗的に作用して検出感度を更に高くできる。
【００５７】
上記第３の発明群の第１の態様において、前記分析用マイクロ流路デバイスは、前記第１の流路用の溝が形成された第１の基板と、前記第２の流路用の溝及び前記電気化学的検出用電極が形成された第２の基板と、前記第３の流路用の貫通孔が形成された第３の基板とが、前記第１の基板、前記第３の基板、前記第２の基板の順に重ね合わされてなる構成を採用することできる。この構成であると、上記第３の発明群の第１の態様の分析用マイクロ流路デバイスを容易に実現することができる。
【００５８】
上記第３の発明群の第２の態様において、前記分析用マイクロ流路デバイスは、前記第１の流路が形成された第１の基板と、前記第２の流路及び前記電気化学的検出用電極が形成された第２の基板と、前記フィルターとが、前記第１の基板、前記フィルター、前記第２の基板の順に重ね合わされてなる構成を採用することできる。この構成であると、上記第３の発明群の第２の態様の分析用マイクロ流路デバイスを容易に実現することができる。
【００５９】
上述したように、凹凸のある流路を形成した基板に電極に繋がる配線を形成することが、難しい場合がある。この場合、第２の基板を、第２の流路が形成された第２ａの基板と、電気化学的検出用電極が形成された第２ｂの基板と、からなる２枚構成とすることが好ましい。
【００６０】
上記第３の発明群の第３の態様において、前記分析用マイクロ流路デバイスは、前記第１の流路用の溝、前記第４の流路用の溝及び電気化学的検出用電極が形成された第１の基板と、前記第２の流路用の溝が形成された第２の基板と、前記第３の流路用の貫通孔及び第５の流路用の貫通孔が形成された第３の基板とが、前記第１の基板、前記第３の基板、前記第２の基板の順に重ね合わされてなる構成を採用することできる。この構成であると、上記第３の発明群の第３の態様の分析用マイクロ流路デバイスを容易に実現することができる。
【００６１】
この場合も、第１の基板を、第１の流路及び第４の流路が形成された第１ａの基板と、電気化学的検出用電極が形成された第１ｂの基板と、からなる２枚構成とすることができる。
【００６２】
上記第３の発明群の第４の態様において、前記分析用マイクロ流路デバイスは、前記第１の流路用の溝及び第４の流路用の溝が形成された第１の基板と、前記第２の流路用の溝が形成された第２の基板と、前記第３の流路用の貫通孔、第５の流路用の貫通孔及び前記電気化学的検出用電極が形成された第３の基板とが、第１の基板、第３の基板、第２の基板に重ね合わされてなる構成を採用することできる。この構成であると、上記第３の発明群の第４の態様の分析用マイクロ流路デバイスを容易に実現することができる。
【００６３】
〔第４の発明群〕
上記課題を解決するための第４の発明群は、上記第２の発明群の構成における電気化学的検出用電極の表面に、被検液に含まれる検体と特異的に反応する反応物質が設けられた構成の分析用マイクロ流路デバイスである。
【００６４】
従来技術にかかる流路デバイスにおいては、被検液の流れを障害しないようにするため、化学的検出用電極が流れに平行に設けられていたが、上記第２の発明群における電気化学的検出用電極は何れも、流路デバイス内を流れる被検液が略垂直に当る位置に設置されている。したがって、上記構成によると、被検液に含まれる検体が、当該電極表面に設けられた反応物質と効率よく接触するので、反応効率が高まり、この結果として検出感度が高まる。
【００６５】
例えば、被検液に含まれる検体を抗原物質とし、被検液に含まれる検体と特異的に反応する反応物質を抗体物質とした場合、被検液に含まれる抗原物質は、電極表面に略垂直に衝突するので、抗体物質と効率よく会合する。酵素などの標識付の抗体物質を流した場合にも同様なことが言えるので、上記構成の流路デバイスでは、電極表面上に抗体物質−抗原物質−酵素付抗体物質からなる複合体を効率よく形成させることができるが、この後、酵素付抗体物質の当該酵素により電気的活性物質に変化する基質物質を流すと、これまた同様に、基質物質が電極表面の酵素と効率よく反応するので、より多くの電気的活性物質が産出される。それゆえ、上記構成であると、より大きな電流が発生する結果、検出感度が向上するという作用効果が得られる。
【発明の効果】
【００６６】
以上に説明したように、本発明によると、簡便に使用することのでき、かつ検出感度に優れた分析用マイクロ流路デバイスを実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６７】
以下に、本発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。なお、上記に対応させ以下の説明においては、反応物質固定領域において液の流れを略垂直に曲げる構造の流路デバイスを第１の実施の形態群とし、電気化学的検出用電極に当る液の流れを略垂直に曲げる構造の流路デバイスを第２の実施の形態群とし、この両者を組み合わせたものを第３の実施の形態群とし、更に電気化学的検出用電極の表面に検体と特異的に反応する反応物質を設けた流路デバイスを第４の実施の形態群として区分し、それぞれについて順次説明する。
【００６８】
≪第１の実施の形態群≫
［実施の形態１−１］
図１は、本実施の形態にかかるマイクロ流路デバイスの概要を示す平面図であり、図２は、本実施の形態にかかるマイクロ流路デバイスの断面模式図である。なお、以下では断面模式図を単に断面図とする。
【００６９】
本実施の形態にかかるマイクロ流路デバイスは、第１の流路８と、第１の流路と平行な第２の流路と、両流路を垂直に繋ぐ第３の流路１５とを備えている。また、被検液やバッファー液（例えば、リン酸緩衝液）をデバイス内に送り込む注入孔４が第１の流路の上流側端部に形成され、被検液やバッファー液をデバイス外に送り出す排出孔７が第２の下流側端部に形成されている。さらに、第３の流路入口近傍であって第１の流路内に、被検液に含まれる検体と特異的に反応する反応物質が固定された微粒子１４が、流去しない状態で保持された反応物質保持部１６が形成されている。加えて、第２の流路の一部は、被検液に含まれる検体の量を検出する検出部６が形成されている。
【００７０】
このマイクロ流路デバイスは、図２に示すように３つの基板１〜３が積層された構造である。
【００７１】
図２に示すように、第１の基板１には、注入孔４と、第１の流路８と、排出孔７とが、形成されており、第３の流路入口近傍であって第１の流路内に、微粒子１４が流去しない状態で保持された反応物質保持部１６が設けられようになっている。第１の基板１の厚みは、好ましくは０．１ｍｍ〜５ｍｍ程度とする。
【００７２】
注入孔４及び排出孔７の形状は、特に限定されることは無く、円形、楕円形、多角形、その他不定形であってもよい。大きさは、直径１μｍ以上程度とする。
【００７３】
第１の流路８は、幅が１μｍ〜１ｍｍとし、深さは１μｍ〜１ｍｍとし、その断面形状は特に限定されず、四角形、台形、半円形等でよい。
【００７４】
また、固体微粒子としては、ガラス、プラスチックからなる微粒子や磁性粒子を用いることができる。また、反応物質としては、検体と特異的に反応して検体を捕獲できるものであれば良く、例えば、モノクロール抗体、ポリクロール抗体など抗体材料やインプリンティングポリマー、アプタマー材料、ペプチド材料など人工抗体材料と呼ばれているものを用いる。
【００７５】
第２の基板２には、第１の基板１に形成された第１の流路８に平行な第２の流路１０が形成されており、図２に示すように、第２の流路１０の上流側端部は第１の流路８の下流側端部と上下方向にその一部が重なりあっている。第２の基板の厚みは、好ましくは０．１ｍｍ〜５ｍｍ程度とする。流路１０は、幅が１μｍから１ｍｍとし、深さは１μｍから１ｍｍとする。その断面形状は特に限定されず、四角形、台形、半円形等でよい。さらに、第２の流路１０内には、検体の量を検出する検出部６が形成されている。
【００７６】
第３の基板３には、第１の流路８と第２の流路１０とを繋ぐ略垂直に繋ぐ第３の流路１５が形成されている。また、第３の基板に形成された第２の流路１０と、第１の基板１に形成された排出孔７とを繋ぐ孔が設けられている。
【００７７】
ここで、反応物質保持部１６から、微粒子が流去されないようにするために、微粒子１４を磁性を有する材料からなるものとし、第１の流路８外部に磁石を設ける構成を採用することもできるが、デバイス構成の簡略化、低コスト化のために、第３の流路１５を複数の微細な流路群からなるものとし、流路径を微粒子未満のサイズとすることにより、微粒子の流去を堰き止める構造を採用することが好ましい。
【００７８】
検出部６は、検出を行う場である。例えばデバイス外部に設けられた熱レンズ２５により検出を行う場合には、この部分に特段の手段を設ける必要は無い。しかし、検出の妨げになるようなものは形成しないことが好ましい。また、検出の精度を高めるために、第２の流路１０内に液を攪拌する手段を設けて、検出部を流れる液の濃度を均一化してもよい。
【００７９】
第３の流路１５の形状は、図１８に示すように、円形、角型、三角形、楕円形、十字形や、これらの組み合わせでも良く、その孔の形状やそれらの配列パターンについては、特に限定されるものではない。孔の内径（流路の内径）は０．１μｍから０．１ｍｍとする。また、第３の流路１５の構成として、一つの大きな貫通孔を設け、この貫通孔に図１９に示すような繊維状のものが絡み合ったフィルター５を配置したものを用いることができる。
【００８０】
上記基板のうち、第１の基板１及び第２の基板２は、ガラス、光熱硬化性樹脂、熱硬化性樹脂等を用いることができ、このような樹脂材料として、ポリオレフィン系樹脂、ポリメタクリル酸樹脂、ポリカーボネイト樹脂を用いることができる。第３の基板３は、ガラス、プラスチック材料、シリコンウエハ、プラスチックフィルム、金属膜形成フィルム等が例示できる。
【００８１】
第１の基板１及び第２の基板２は、ガラスに流路パターンをエッチング等により形成してもよく、また、流路パターンを形成した型に光熱硬化性樹脂または熱硬化性樹脂を流し込んで固めて一体構造のものとして作製してもよい。例えば、ポリオレフィン系樹脂、ポリメタクリル酸樹脂、ポリカーボネイト樹脂などからなる基板材料を、流路パターンに形成した型を用いてホットエンボス法により形成してもよい。
【００８２】
第３の基板３は、ガラスに複数の孔のパターンをエッチング等により形成してもよく、また、流路パターンを形成した型に光熱硬化性樹脂または熱硬化性樹脂を流し込んで固めて一体構造のものとして作製してもよい。また、第３の基板３に大きな一つの貫通孔を設け、この貫通孔にフィルターを取り付ける構成であってもよい。
【００８３】
なお、注入孔４は、反応物質保持部１６の上流側で第１の流路８と接続されていれば、どのような形態であってもよい。また、排出孔７を第２の基板２に形成してもよい。
【００８４】
また、第３の基板をなくして、その代わりに第１の基板を、第１の流路用の溝と第３の流路用の貫通孔が形成された第１ａの基板と、これの蓋をする第１ｂの基板とからなる２枚構成としてもよい。
【００８５】
図１、図２に示すマイクロ流路デバイスを用いて、例えば、アレルゲンなどの抗原を検出する方法を以下に説明する。
【００８６】
予め、マイクロ流路デバイスの流路８、１０、反応物質保持部１６、検出部６をバッファー液（例えば、リン酸緩衝液）で満たしておく。次に、注入孔４からバッファー液を注入してデバイス内をバッファー液で洗浄する。次に予め抗体材料を固定化した複数個の微粒子１４をバッファー液と共に注入孔４から注入する。この後、好ましくは、アルブミン水溶液を流して、流路８、１０、反応物質保持部１６、検出部６の表面へのタンパク質の非特異的吸着を防ぐためのアルブミン膜（非特異的吸着防止膜）を形成する。抗体材料を固定化する方法は、公知の方法でよい。
【００８７】
次に、抗原を含む被検液を注入孔４から入れて第１の流路８から反応物質保持部１６に移動させ、被検液中の抗原を固体微粒子１４に固定された抗体材料と抗原抗体反応を生じさせ、固定化抗体−抗原複合体を形成する。
【００８８】
本実施の形態の構成であれば、注入孔４から注入された流体は、反応物質保持部１６において図３に示すように、矢印２０のように水平方向の流れから、上下方向へと流れの変化が生じるので、流体は微粒子１４全体に接触しつつ流れる。よって、図３４に示すような従来構造の分析用マイクロ流路デバイスよりも抗原との会合機会が増えるので反応効率が向上する。また、反応時間の短縮が図れる。
【００８９】
この後、被検液に代えてバッファー液を注入孔４より入れて流路８、１０、反応部５、検出部６を洗浄する。
【００９０】
この後、酵素を標識として付けた抗体材料を含むバッファー液を注入孔４から注入し、反応部に固定化された抗体に捕獲されている抗原と抗原抗体反応を生じさせることで、微粒子表面に固定化抗体―抗原−酵素付抗体材料からなる複合体を形成させる。
【００９１】
次いで、未反応の酵素付抗体材料を除去するためにバッファー液を注入孔４より入れて流路８、９、１０、反応物質保持部１６、検出部６を洗浄する。
【００９２】
この抗原と酵素標識付抗体との反応においても、上記の抗原抗体反応で説明したと同様の理由のとおり、従来の構成にくらべ、高い反応率で反応が生じるので、流す酵素標識付抗体の量を少なくでき、また、反応時間の短縮も図れる。
【００９３】
次に、標識として用いた酵素により吸光度を変化させる基質材料を含むバッファー液を注入孔４から注入し、反応物質保持部１６に形成された固定化抗体―抗原−酵素付抗体材料からなる複合体の酵素と反応させることで、複合体の量に対応した吸光物質を生じさせる。標識として用いる酵素材料及び基質材料は、公知のものが使用できる。
【００９４】
この酵素反応においても、上記の抗原抗体反応で説明したと同様の理由で、従来の構成にくらべ、高い反応率で反応が生じるという効果がある。また、反応効率が上がるため、流す基質の量を少なくできるというメリットも生じ、また、反応時間の短縮も図れる。
【００９５】
この後、吸光度を変化させる物質の量を熱レンズ２５により検出することにより、検体の量を知ることができる。
【００９６】
ここで、固体微粒子に固定された反応物質が劣化した場合、排出孔７から液を流し、注入孔４から液とともに固体微粒子を洗い流し、再度固体微粒子を充填すれば、この分析用マイクロ流路デバイスを繰り返し使用することができる。また、別個に固体微粒子排出用の穴を設けて、この穴より固体微粒子を取り出す構成としてもよい。
【００９７】
［実施の形態１−２］
本実施の形態は、図４（ａ）に示すように、検体を認識する反応物質が、第１の流路の床面部分であって複数の第３の流路の入口相互間領域に、物理的または化学反応的に直接固定された反応物質保持部が設けられた構造である。固定する反応物質は、上記実施の形態１−１と同様でよい。また、流路構成、基板材料も上記実施の形態１−１と同様でよい。
【００９８】
本実施の形態の構成であれば、注入孔４から注入された流体は、反応物質保持部１６において図４（ｂ）に示すように、矢印２０のように水平方向の流れから、上下方向へと流れの変化が生じるので、反応物質保持部１６全体にわたって効率よく反応物質と抗原とが、反応するまた、反応時間の短縮も図れる。
【００９９】
ここで、基板に反応物質を直接固定化する場合、反応物質の交換は難しいという問題があり、デバイスは数回または使い捨てのような使用方法に限られていた。本実施の形態では、図４に示すように、反応物質は第３の基板２に固定化されているので、第１の基板１及び第３の基板３との間の接着を剥がし易い構造にしておけば、第２の基板２だけを交換することで認識材料を新しいものに交換できる。これにより、デバイスを繰り返し使用できる。
【０１００】
なお、図４（ｃ）のに示すように、反応物質保持部１６は、第１の流路の床面部分であって複数の第３の流路の入口相互間領域以外の領域１１に広がって形成されていてもよい。なお、図４（ｃ）は平面図である。
【０１０１】
［実施の形態１−３］
本実施の形態では、第３の基板３に一つの大きな穴があけられており、この穴にフィルターが配置され、前記フィルターの前記第１の流路側の面に、検体を認識する反応物質が固定された反応物質保持部１６が形成された構造である。これ以外の事項については、上記実施の形態１−２と同様の構成である。この構成によっても、上記実施の形態１−２と同様の効果が得られる。
【０１０２】
［実施の形態１−４］
本実施の形態は、図５に示すように、第３の基板に代えて、第1の基板と第２の基板の間にフィルター５が配置され、前記フィルターの第１の流路側の面に、検体を認識する反応物質が固定された反応物質保持部１６が形成された構造である。これ以外の事項については、上記実施の形態１−２と同様である。この構造によっても、上記実施の形態１−２と同様の効果が得られる。
【０１０３】
≪第２の実施の形態群≫
第２の実施の形態群は、検体の量を電気化学的に検出する分析用マイクロ流路デバイスに関する。
【０１０４】
［実施の形態２−１］
図６（ａ）は、本実施の形態にかかるマイクロ流路デバイスの断面図である。本実施の形態にかかるマイクロ流路デバイスは、流路Ａと、流路Ａと平行な流路Ｂと、両流路を垂直に繋ぐ流路Ｃとを備えている。また、流路Ｃの直下（流れ方向における直下）であって流路Ｃと略直交する流路Ｂの床面に、電気化学検出用電極１３が設けられている。なお、流路Ａは上記第1の実施例群における第1の流路に相当し、流路Ｂは第２の流路に相当し、流路Cは第３の流路に相当する。
【０１０５】
このマイクロ流路デバイスは、図６に示すように４つの基板ａ〜ｃが積層された構造である。
【０１０６】
図６に示すように、基板ａには、流路Ａが形成されている。基板ａの厚みは、好ましくは０．１ｍｍ〜５ｍｍ程度とする。
【０１０７】
基板ｂ１には、流路Ａと平行な流路Ｂが形成されている。また、注入孔４と流路Ａとを繋ぐ穴があけられている。基板ｂ１の厚みは、好ましくは０．００５ｍｍ〜５ｍｍ程度とする。
【０１０８】
基板ｂ２には、注入孔４と、排出孔７とが、形成されており、流路Ｃの直下（同上）であって流路Ｃと略直交する流路Ｂの床面に、電気化学検出用電極１３が設けられている。電気化学検出用電極１３は、通常、作用電極、対向電極、参照電極で構成されている。なお、参照電極は省略できる場合もあり、電極構成は、特に限定するものではない。従来の構成を利用できる。
【０１０９】
基板ｂ２の厚みは、好ましくは０．１ｍｍ〜５ｍｍ程度とする。形成される電極及びこれに繋がる配線パターンは、公知のものを用いることができる。
【０１１０】
基板ｃには、流路Ａと直交する流路Ｃが形成されている。また、注入孔４と流路Ａとを繋ぐ穴があけられている。基板ｃの厚みは、好ましくは０．００５ｍｍ〜５ｍｍ程度とする。
【０１１１】
流路Ａ、流路Ｃは、上記第１の実施の形態群で示した第１の流路及び第３の流路と同様の構成とすればよい。また、基板材料も第１の実施の形態群と同様でよい。なお、流路Ｃは、どのような形状でもかまわないが、好ましくは流路内で乱流が起きない構造とする。
【０１１２】
ここで、基板ｂ１と基板ｂ２とを別個に形成しているのは、流路によって基板に段差ができ、この段差部分に電極１３用の配線を形成することが、技術的に難しいためである。このような問題がなければ、基板ｂ１と基板ｂ２とを同一基板としてもよい。
【０１１３】
予め、マイクロ流路デバイスの流路Ａ、Ｂ、Ｃ、電気化学的検出用電極１３をバッファー液（例えば、リン酸緩衝液）で満たしておく。次に、注入孔４からバッファー液を注入して装置内をバッファー液で洗浄する。
【０１１４】
次に、電気的活性物質を含む被検液を注入孔４から入れる。
【０１１５】
本実施の形態の構成では、図６（ｂ）に示すように、液体が電極１３表面に直交して当たるように流れるので、液体中の電気的活性物質が電極表面に接触する確率が高くなり、酸化還元反応が効率よく起こるようになるので、電流値が大きくなり、高感度化が実現できる。
【０１１６】
［実施の形態２−２］
図７は、実施の形態２−２にかかるマイクロ流路デバイスの断面図である。本実施の形態では、流路Ｃを複数の微細な流路とした。これ以外の事項については、上記実施の形態２−１と同様である。この構成を採用することにより、液体中の電気的活性物質の電極への接触を高めることができる。
【０１１７】
この微細な流路としては、上記実施の形態１−１で用いた複数の孔からなる構成や、フィルターを用いることができる
【０１１８】
［実施の形態２−３］
図８は、実施の形態２−３にかかるマイクロ流路デバイスの断面図である。本実施の形態は、流路Ａの床面部分であって複数の流路Ｃの入口相互間領域に、電気化学検出用電極を設けた。これ以外の事項については、上記実施の形態２−２と同様である。この実施の形態では、流路Ｂの床面に電極を形成しないため、上記実施の形態２−１のように基板を２つに分ける必要性は無い。
【０１１９】
本実施の形態の構成では、図８（ｂ）に示すように、液体が電極１３表面に直交して当たるように流れるので、液体中の電気的活性物質が電極表面に接触する確率が高くなり、酸化還元反応が効率よく起こるようになるので、電流値が大きくなり、高感度化が実現できる。
【０１２０】
［実施の形態２−４］
図９は、実施の形態２−４にかかるマイクロ流路デバイスの断面図である。本実施の形態では、流路Ｃを設ける代わりに、流路Ａの下流側末端に流路Ａの流れを直角に変化させる壁面Ｘを設けた。これ以外の事項については、上記実施の形態２−１と同様である。
【０１２１】
本実施の形態の構成では、図９（ｂ）に示すように、液体が電極１３表面に直交して当たるように流れるので、液体中の電気的活性物質が電極表面に接触する確率が高くなり、酸化還元反応が効率よく起こるようになるので、電流値が大きくなり、高感度化が実現できる。
【０１２２】
≪第３の実施の形態群≫
第３の実施の形態群は、上記第１の実施の形態群と上記第２の実施の形態群とを組み合わせた構造に関する。
【０１２３】
［実施の形態３−１］
図１０は、実施の形態３−１にかかるマイクロ流路デバイスの断面図である。本実施の形態にかかるマイクロ流路デバイスは、第１の流路８（流路Ａに相当）と、第１の流路と平行な第２の流路（流路Ｂに相当）と、両流路を垂直に繋ぐ第３の流路１５（流路Ｃに相当）とを備えている。また、被検液やバッファー液（例えば、リン酸緩衝液）をデバイス内に送り込む注入孔４が第１の流路の上流側端部に形成され、被検液やバッファー液をデバイス外に送り出す排出孔７が第２の下流側端部に形成されている。さらに、第３の流路入口近傍であって第１の流路内に、被検液に含まれる検体と特異的に反応する反応物質が固定された微粒子１４が流去しない状態で保持された反応物質保持部１６が形成されている。加えて、第３の流路の直下であって第３の流路と略直交する第２の流路の床面に、電気化学検出用電極１３（検出部に相当）が設けられている。
【０１２４】
本実施の形態においては、第１の基板１が上記第２の実施の形態群の基板ａに相当し、第２の基板２が上記第２の実施の形態群の基板ｂに相当し、第３の基板が上記第２の実施の形態群の基板ｃに相当する。また、流路構成、基板材料も上記実施の形態１−１と同様でよい。また、流路構成、基板材料も上記実施の形態１−１と同様でよい。
【０１２５】
また、第２の基板２に電極を設けるが、段差の問題がある場合には、第２の基板を、第２の流路が形成された基板と、電極が設けられた基板との２つの基板からなる構成としてもよい。また、第１の基板と第３の基板とを一体形成してもよい。
【０１２６】
このマイクロ流路デバイスを用いて、アレルゲンなどの抗原を検出する方法を以下に説明する。
【０１２７】
予め、マイクロ流路デバイスの流路８、１０、１５、反応物質保持部１６、電気化学的検出用電極１３をバッファー液（例えば、リン酸緩衝液）で満たしておく。次に、注入孔４からバッファー液を注入してデバイス内をバッファー液で洗浄する。次に予め抗体材料を固定化した複数個の微粒子１４をバッファー液と共に注入孔４から注入する。この後、好ましくは、アルブミン水溶液を流してアルブミン膜（非特異的吸着膜）を形成し、流路８、１０、反応物質保持部１６、検出部６の表面へのタンパク質の非特異的吸着を防ぐ。
【０１２８】
次に、抗原を含む被検液を注入孔４から入れて反応物質保持部１６に移動させ、被検液中の抗原を固体微粒子１４に固定された抗体材料と抗原抗体反応を生じさせ、抗原を捕獲する。
【０１２９】
次に、被検液に代えてバッファー液を注入孔４より入れて流路８、１０、１５、反応物質保持部１６、電極１３を洗浄する。
【０１３０】
次に、酵素を標識として付けた抗体材料を含むバッファー液を注入孔４から注入し、反応部に固定化された抗体に捕獲されている抗原と抗原抗体反応を生じさせることで、微粒子表面に固定化抗体―抗原−酵素付抗体材料からなる複合体を形成させる。
【０１３１】
この後、未反応の酵素付抗体材料を除去するためにバッファー液を注入孔４より入れて流路８、１０、１５、反応物質保持部１６、電極１３を洗浄する。
【０１３２】
この抗原と酵素標識付抗体との反応においても、上記の抗原抗体反応で説明したと同様の理由のとおり、従来の構成にくらべ、高い反応率で反応が生じるので、流す酵素標識付抗体の量を少なくでき、また、反応時間の短縮もできる。
【０１３３】
次に、標識として用いた酵素により電気的活性物質を生じさせる基質材料を含むバッファー液を注入孔４から注入し、反応物質保持部１６に形成された固定化抗体―抗原−酵素付抗体材料からなる複合体の酵素と反応させることで、複合体の量に対応した電気的活性物質を生じさせる。標識として用いる酵素材料及び基質材料は、公知のものが使用できる。
【０１３４】
この後、電気的活性物質の量を電気化学的検出用電極１３により検出することにより、検体の量を知ることができる。
【０１３５】
［実施の形態３−２］
図１１は、実施の形態３−２にかかるマイクロ流路デバイスの断面図である。本実施の形態にかかるマイクロ流路デバイスは、固体微粒子に反応物質を固定することに代えて、第１の流路の床面部分であって複数の第３の流路の入口相互間領域に、物理的または化学反応的に直接固定された反応物質保持部１６が形成されている。これ以外の事項については、上記実施の形態３−１と同様である。
【０１３６】
［実施の形態３−３］
図１２は、実施の形態３−３にかかるマイクロ流路デバイスの断面図である。本実施の形態にかかるマイクロ流路デバイスは、第１の流路８（流路Ａに相当）と、第１の流路８と平行な第２の流路１０（流路Ｂに相当）と、第１の流路と第２の流路とを垂直に繋ぐ第３の流路１５（流路Ｃに相当）と、第２の流路１０と平行な第４の流路９と、第２の流路と第４の流路９とを垂直に繋ぐ第５の流路１７と、を備えている。また、被検液やバッファー液（例えば、リン酸緩衝液）をデバイス内に送り込む注入孔４が第１の流路の上流側端部に形成され、被検液やバッファー液をデバイス外に送り出す排出孔７が第４の下流側端部に形成されている。さらに、第３の流路入口近傍であって第１の流路内に、被検液に含まれる検体と特異的に反応する反応物質が固定された微粒子１４が流去しない状態で保持された反応物質保持部１６が形成されている。加えて、第２の流路１０と略直交する第５の流路の入口相互間領域路に、電気化学検出用電極１３（検出部に相当）が設けられている。
【０１３７】
図１２に示すように、第１の基板１には、注入孔４と、第１の流路８と、第４の流路９と、排出孔７とが、形成されており、第３の流路１５の入口近傍であって第１の流路内に、微粒子１４が流去しない状態で保持された反応物質保持部１６が設けられている。第１の基板１の厚みは、好ましくは０．１ｍｍ〜５ｍｍ程度とする。
【０１３８】
第２の基板２には、第１の基板１に形成された第１の流路８に平行な第２の流路１０が形成され、図２に示すように、第２の流路１０の上流側が第１の流路８の下流側端部と対応し、第２の流路１０の下流側が第４の流路９の上流側とが重なりあうように、第1の基板と対応せられている。第２の基板の厚みは、好ましくは０．１ｍｍ〜５ｍｍ程度とする。
【０１３９】
第３の基板には、第１の流路８と第２の流路１０とを繋ぐ略垂直に繋ぐ第３の流路１５と、第２の流路１０と第４の流路９とを繋ぐ略垂直に繋ぐ複数の第５の流路が形成されている。また、第５の流路の複数の入口相互の間であって第２の流路の床面でもある部分に、電気化学検出用電極１３（検出部に相当）が設けられた構造である。
【０１４０】
［実施の形態３−４］
図１３は、実施の形態３−４にかかるマイクロ流路デバイスの断面図である。本実施の形態は、反応物質を固定した微粒子１４を第１の流路８内に配置することなく、第１の流路８の床面部分であって、第３の流路１５の入口部分に反応物質を固定し、これを反応物質保持部１６とした点に特徴を有する。これ以外の事項については上記実施の形態３−３と同様である。
【０１４１】
［実施の形態３−５］
図１４は、実施の形態３−５にかかるマイクロ流路デバイスの断面図である。第５の流路１７を一つの穴とし、第５の流路１７の入口に電気化学検出用電極１３を設けなかった点、及び第５の流路１７の流れ方向における直上であって第４の流路９の床面に電気化学検出用電極１３を設けた点に特徴を有する。これ以外の事項については、上記実施の形態３−３と同様である。
【０１４２】
［実施の形態３−６］
図１５は、実施の形態３−６にかかるマイクロ流路デバイスの断面図である。第５の流路１７を複数の微細な流路群としたが、この入口部分に電気化学検出用電極１３を設けることなく、第５の流路１７の流れ方向における直上であって第４の流路９の床面に電気化学検出用電極１３を設けた点に特徴を有する。これ以外の事項については、上記実施の形態３−３と同様である。
【０１４３】
（上記実施の形態の共通事項）
上記実施の形態では、第１の流路８の壁面と第２の流路１０の壁面、第２の流路１０の壁面と第４の流路の壁面９とを、それぞれ平行としたものを示したが、図１６（ａ）〜（ｃ）、図１７（ａ）〜（ｃ）のように傾斜した構造、または流路端部を曲面にした構造を採用してもよい。この構造を採用することにより、液をよりスムーズに流すことができる。ただし、第２の流路１０や第４の流路９床面に電極を形成する場合には、当該流路に傾斜構造を採用しないことが好ましい。
【０１４４】
≪第４の実施の形態群≫
第４の実施の形態群は、被検液の流れを曲げ、被検液が電気化学的検出用電極に略垂直に当るようにした上記第２の実施の形態群において、電気化学的検出用電極の表面に、被検液に含まれる検体と特異的に反応する反応物質を配置したマイクロ流体デバイスに関する。
【０１４５】
［実施の形態４−１］
図２０（ａ）（ｂ）は、実施の形態４−１にかかるマイクロ流路デバイスの断面図である。本実施の形態にかかるマイクロ流路デバイスは、流路Ａ（第1の流路に相当）と、流路Ａと平行な流路Ｂ（第２の流路に相当）と、両流路を垂直に繋ぐ流路Ｃ（第３の流路に相当）とを備えており、流路Ｃの流れ方向における直下であって流路Ｃと略直交する流路Ｂの床面に電気化学検出用電極１３が設けらた構造である。この電気化学検出用電極１３は、前記したと同様、対向電極、作用電極、参照電極からなり、作用電極の表面に検体を認識する反応物質５１が設けられている。
【０１４６】
反応物質５１は、被検液に含まれる検出目的物質である検体と特異的に反応し、これを捕獲するものである。ただし、通常、反応物質５１に捕獲された検体は、捕獲された状態で順次他の物質と反応させられるので、分析使用時においては反応物質５１の状態が変動する。反応物質５１としては、モノクロール抗体、ポリクロール抗体など抗体材料や、インプリンティングポリマー、アプタマー材料、ペプチド材料など人工抗体材料と呼ばれているものなどが例示できる。また、これらの反応物質は、マイクロ流路デバイス内を流れる液体により流去しないように作用電極の表面に固定化されていればよい。その方法には制限はない。例えば、反応物質の自らの吸着力により電極表面に物理的に吸着されていてもよく、自己組織化膜を介して共有結合により固定化されていても良い。
【０１４７】
上記作用電極、対向電極の材質としては、金、白金、チタンなどが例示でき、参照電極の材質としては、銀／塩化銀（表層側）、または金、白金、チタンの上に銀／塩化銀（表層側）を形成したものが例示できる。
【０１４８】
なお、実施の形態４−１は、電気化学検出用電極１３の表面に反応物質が設けられていること以外は上記実施の形態２−１（図６）と同じである。図６及び図２５とも、電気化学検出用電極１３は対向電極、作用電極、参照電極で構成されており（不図示）、実施の形態４−１では、この電気化学検出用電極１３の構成部材の一つである作用電極の表面に反応物質が配置されている点において、上記実施の形態２−１と相違する。また、図２０（図６〜９、図２１〜２３も同様）の電気化学検出用電極１３は、作用電極と対向電極と参照電極とで構成されているが、作用電極を長手方向に沿って垂直方向から切断した場合における断面図であるので、図上に対向電極と参照電極が現れていない。これらの図においては、図面手前側に対向電極、図面奥側に参照電極が位置する。
【０１４９】
次に、被検液中に含まれる検体が抗原であり、電気化学検出用電極１３の作用電極上に設けられた反応物質が上記抗原と特異的に反応する抗体である場合を例として、本実施の形態にかかるマイクロ流路デバイスの基本的な操作方法を説明する。
【０１５０】
化学的検出用電極１３及び反応物質５１（抗体層）がバッファー液（例えば、リン酸ナトリウム液）に浸かるようにする。この後、注入孔４から更にバッファー液を注入しマイクロ流路デバイス内をバッファー液で洗浄する。次に、好ましくは、マイクロ流路デバイス内にアルブミン水溶液を流し、各流路及び電気化学的検出用電極１３の表面にアルブミン膜（非特異的吸着防止膜）を形成させる。これにより、これらの表面へのタンパク質の非特異的吸着が防止できる。
【０１５１】
次に、抗原を含む被検液を注入孔４から注入しデバイス内に被検液を流す。これにより、被検液中の抗原（検体）と電気化学的検出用電極１３の作用電極上に設けられた抗体とが抗原抗体反応し、被検液中の抗原が作用電極上に捕獲される。
【０１５２】
ここで、実施の形態４-１のマイクロ流路デバイスでは、図２０（ｂ）に示すように、注入孔４から注入された被検液は流路Ａを流れ、流路Ｃで略垂直方向に流れを変えられ、この流れが電気化学的検出用電極１３に略垂直に当たる。この後、矢印２０の水平方向の流れに変わる。この構造であると、被検液中に存在する検体（抗原分子）が、電気化学的検出用電極１３上に設けられた抗体の層（反応物質５１）に正面から衝突する。よって、被検液中の抗原分子を確実に抗体分子と反応させることができ、それゆえ反応時間の短縮と反応効率の向上が図れる。
【０１５３】
次に、被検液に代えて上記と同様なバッファー液を注入孔４より入れて流路Ａ〜Ｃ、電気化学的検出用電極１３を洗浄する。次いで、酵素を標識として付けた抗体材料を含むバッファー溶液を注入孔４から注入し、抗体層（反応物質５１）に捕獲された抗原と抗原抗体反応させ、電気化学的検出用電極１３の作用電極の表面に抗体―抗原−酵素付抗体材料からなる複合体を形成させる。
【０１５４】
再び、バッファー液を注入孔４より入れて、流路Ａ〜Ｃ、電気化学的検出用電極１３から、未反応の酵素付抗体材料を洗浄し、除去する。なお、この反応（抗原と酵素標識付抗体との反応）においても、上記の抗原抗体反応で説明したと同様、酵素付抗体材料を含むバッファー溶液が反応部位に正面からぶつかるので、反応が高効率で進む。よって酵素標識付抗体の量を少なくでき、また反応時間も少なくて済む。
【０１５５】
この後、酵素標識付抗体の酵素と反応して電気的活性物質を生じさせる基質材料を含むバッファー溶液を注入孔４から注入する。これにより、電気化学的検出用電極１３の作用電極上に形成された抗体―抗原−酵素付抗体材料からなる複合体の酵素と、上記基質材料とが反応し、複合体の量に相応した電気的活性物質を生じる。この生成量を電気化学的検出用電極１３で電流量として測定し、被検液に含まれていた検体の量を算出する。
【０１５６】
なお、本実施の形態（以下の実施の形態においても同様）にかかる分析用マイクロ流路デバイスは、流路構造や電極の位置等に特徴を有するものであるので、検体の種類、反応物質、更には標識として用いる酵素材料や基質材料などに特段の制限はない。よって、反応物質などは検体の種類に対応させて適宜選択して使用すればよい。
【０１５７】
［実施の形態４−２］
図２１（ａ）（ｂ）に、実施の形態４-２にかかるマイクロ流路デバイスの断面図を示す。本実施の形態は、流路Ｃを複数の微細な流路としたこと以外は上記実施の形態４−１と同様である。流路Ｃを複数の微細な流路としたこの構造であると、デバイス内の流れを一層確実に略垂直方向に変えられる。よって、一層、被検液中の抗原、酵素付抗体や基質物質の電気化学的検出用電極１３への衝突確率が高まるので、更に効率よく各反応が進む。
効率が高まる。
【０１５８】
上記複数の微細な流路からなる流路Ｃとしては、例えば流路Ａと流路Ｂの間に直径１μｍ〜２００μｍ程度の孔を有するフィルターやメッシュなどを配置するなどすればよい。
【０１５９】
［実施の形態４−３］
図２２（ａ）（ｂ）に、実施の形態４-３にかかるマイクロ流路デバイスの断面図を示す。本実施の形態は、流路Ｂの床面ではなく、流路Ａの床面部分であって複数の微小な流路Ｃの入口相互間領域（入口と入口の間の部分）に、電気化学検出用電極１３及び検体と特異的に反応する反応物質５１とを設けた点に特徴を有する。これ以外については、上記実施の形態４−２と同様な構造である。
【０１６０】
本実施の形態にかかるマイクロ流路デバイスでは、図２２（ｂ）に示すように、複数の微小な流路Ｃの入口相互間領域に電気化学検出用電極１３及び反応物質５１設けられている。言い換えると、流路Ａを流れる液体がその流れ方向を変えようとするところに、電気化学検出用電極１３と反応物質５１が配置されているので、流れ方向に平行に電極が配置された従来型に比較し、検体分子と反応物質５１等との接触確率が高い。よって、流路反応が高効率で進むという、上記した効果が得られる。
【０１６１】
また、この実施の形態４-３では、基板に流路Ｂや注入孔４、排出孔７のみを形成すれば足り、流路Ｂの床面に電極を形成する必要がないので、上記実施の形態４−１のようにｂ1とｂ2の２つの基板を用いる必要がない。よって、その製造が容易であるという利点がある。
【０１６２】
［実施の形態４−４］
図２３（ａ）（ｂ）に、実施の形態４-４にかかるマイクロ流路デバイスの断面図を示す。本実施の形態は、流路Ｃを設ける代わりに、流路Ａの下流側末端に流路Ａの流れを直角に変化させる壁面Ｘを設けた点に特徴を有する。これ以外は、上記実施の形態４−１と同様である。
【０１６３】
この実施の形態にかかるマイクロ流路デバイスでは、図２３（ｂ）に示すように、被検液の流れが流路Ａに設けられた壁面Ｘにより変更せられ、電気化学検出用電極１３に垂直に当たるように流れる。よって、電極が流れ方向に平行に配置された従来型に比較し、格段に被検液中の検体分子と反応物質５１との接触確率が高くなる。これにより、上述したような顕著な作用効果が得られる。
【０１６４】
この実施の形態においては、壁面Ｘの高さを高くするとともに、壁面Ｘの位置を電気化学検出用電極１３に近づけることにより、被検液をより確実に電気化学検出用電極１３と反応物質５１に当るようにすることができる。この構造では、壁面Ｘにより流れが阻止された被検液は乱流となるので、検体分子が種々な角度から電極に衝突するという効果が得られる。
【０１６５】
本発明の内容を実施例により、更に詳しく説明する。
【０１６６】
（実施例１）
実施例１は上記実施の形態３-３に対応するものである。実施例１にかかる分析用マイクロ流路デバイスは以下のようにして作製された。
【０１６７】
図２４に示すように、型基板１１５上に厚膜レジスト１１１を配置し（ａ〜ｂ）、次いで所望のパターンを形成したフォトマスク１１２を用いて型１１３を形成した（ｃ〜ｄ）。型１１３に熱硬化性樹脂ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）１１０を流し込んで、表面に第１の流路１１８、第４の流路１１９を形成した（ｅ〜ｆ）。この後、注入孔１１４、排出孔１１７を形成した（ｇ）。このようにして図２４（ｈ）に示す第１の基板１１０（ｈは平面図）を作製した。
【０１６８】
他方、図２５に示すように、ガラス基板１２０上に、ポジ型レジスト１２１を積層し（ａ〜ｂ）、フォトリソグラフィー法により幅０．３ｍｍ、長さ２ｍｍの長方形の穴を形成した後（ｃ〜ｄ）、ウェットエッチングによりガラス基板表面に、深さ０．０５ｍｍの長方形の流路１２２を形成した（ｅ）。これを第２の基板１２０（平面図ｆ）とした。
【０１６９】
更に、厚さ０．５ｍｍのアクリル基板を用意し、上記第１の基板１１０の流路１１８、１１９が第２の基板１２０の流路１２２の重なりあった部分に、直径０．０１ｍｍの大きさの複数の第３の流路１３２、第５の流路１３３を、図２６に示すようなパターンで形成した。このアクリル基板を第３の基板１３０とした。
【０１７０】
上記各基板の大きさは２５ｍｍ×２５ｍｍであり、流路１１８、１１９、１２２の幅は０．３ｍｍ、深さは０．０５ｍｍとした。また、上記第１の基板１１０と第２の基板１２０は、これらを重ね合わせたとき、流路１２２が流路１１８と１１９を跨ぎ、連結するように設計した。
【０１７１】
更に、上記第３の基板１３０に０．２ｍｍ角の作用電極１３５、参照電極１３４、対向電極１３６と３ｍｍ角の接続パッド１３７、１３８、１３９と、各々の電極と対応する接続パッドを繋ぐ配線１４０、１４１、１４２を形成した。形成方法としては、従来のフォトリソグラフィー法とリフトオフ法の組み合わせた方法で行い、電極と接続パッドとを露出させた状態とし、残りを絶縁膜（図示せず）で覆った。電極材料としては、白金を用い、基板との間の下地層としてチタンを用いた。
【０１７２】
第１の基板１１０と第３の基板１３０と第２の基板１２０とを貼り合わせた後、シリンジポンプ１５１、レオダインバルブ１５２を接続し、抗Cry J-1抗体を表面に固定した微粒子１７０を、リン酸バッファー液とともに注入孔１２４から注入することにより反応物質保持部を形成した。このようにして図２７に示す分析用マイクロ流路デバイス１５０を完成させた。
【０１７３】
次に、本実施例にかかる分析用マイクロ流路デバイス装置を用いた検出方法について、アレルゲンの検出方法を例として、図２７を参照しつつ説明する。
【０１７４】
予め、被検液として、ｐＨ７．４に調整したリン酸バッファー液にスギ花粉アレルゲンであるCry J-1を１００ｎｇ／ｍｌの濃度に調整した溶液を作製した。シリンジポンプ１５１を駆動させてリン酸緩衝液をマイクロ流路デバイス内に流しつつ、レオダインバルブ１５２から上記被検液を５μｌ注入した。これによりマイクロ流路デバイス内に配置されている微粒子１７０表面に固定化された抗Cry J-1抗体と、被検液中のCry J-1とを反応させた。
【０１７５】
この後、バッファー液のみを流して、デバイス内部を洗浄した。
【０１７６】
次に、酵素標識付抗Cry J-1抗体を含むリン酸バッファー液を流して、微粒子１７０の表面に抗体−抗原−酵素付抗体複合体を形成した。酵素としては、アルカリフォスフォターゼを用いた。
【０１７７】
この後、基質であるパラアミノフェニルフォスフェートの０．１ｍＭ濃度リン酸バッファー液をレオダインバルブ１５２から注入する方法により、注入孔１１４から分析用マイクロ流路デバイス１５０内へ入れた。チップに注入されたパラアミノフェニルフォスフェートは、微粒子１７０の表面に形成された抗体−抗原−酵素付抗体複合体のアルカリフォスフォターゼ酵素により、電気的活性物質であるパラアミノフェノールになり（酵素基質反応）、このパラアミノフェノールは、電極１５４で酸化還元電流として検出される。実際上は、電極１５４と、接続パッド１３７、１３８、１３９を介して接続した外部のポテンショメータで測定した。
【０１７８】
（比較例１）
比較例１として、図３３に示す従来構成のマイクロ流路デバイスを用意し、微粒子充填量等の条件を全て同じとして、上記実施例と同様の検出を行った。この結果、実施例１の電流値は、比較例１のマイクロ流路デバイスの電流値の約１０倍であった。
【０１７９】
この結果から、実施例１の構造のマイクロ流路デバイスは、検出感度が顕著に優れており、このマイクロ流路デバイスを用いると、検体が微量であっても、確実に検体の量を検出できることが判った。
【０１８０】
（実施例２）
図２８に実施例２にかかる分析用マイクロ流路デバイス装置を示した。この実施例２は、上記実施の形態３-４に対応するものであり、実施例２にかかる分析用マイクロ流路デバイスでは、第1の流路１１８内に微粒子を配置せず、この代わりに第１の流路１１８の床面であって第３の流路１３２の入口部分（第３の流路の入口相互間領域）に、抗Cry J-1抗体を物理的に固定化した反応物質保持部１９０を形成した構造である。入口相互間領域への抗Cry J-1抗体の固定化は、公知の方法を用いて行い、これ以外については、上記実施例１と同様にして、図２４に示す実施例２にかかる分析用マイクロ流路デバイス１８０を作製した。このマイクロ流路デバイス１８０を用いた装置（図２８）を用い、実施例１と同様にして、スギ花粉アレルゲンであるCry J-1の測定を行った。
【０１８１】
（比較例２）
比較例２として、図３５に示すマイクロ流路デバイス装置を作製した。比較例２では、図３５に示すように、公知の方法で基板２０１の一部に抗Cry J-1抗体材料２０６を形成し、別の部分に電極２１３を設けた。電極形状及び形成方法は実施例１と同様である。実施例1と同様に、幅０．２ｍｍ、深さ０．０５ｍｍの流路と注入孔及び排出孔を形成したＰＤＭＳ基板２０２を基板２０１に貼り合わせ、比較例２の分析用マイクロ流路デバイス１６１を作製した。
【０１８２】
比較例２のマイクロ流路デバイスについても、実施例１と同様に検出を行った。この結果、実施例２の電流値は、比較例２のマイクロ流路デバイスにおける測定電流値の約２０倍であることが確認された。
【０１８３】
（実施例３）
図２９に実施例３の全体構造を表す断面図を示す。実施例３は、上記実施の形態４-４（図２３）の変形例にかかるマイクロ流路デバイス装置である。図２９に示すように、実施例３にかかるマイクロ流路デバイス装置の主要部分は、第1の基板２１０と第２の基板２２０と第３の基板２３０の三枚の基板を重ねあわせて構成されている。
【０１８４】
第1の基板２１０には、被検液を注入する注入孔２１４、第1の流路２１２（実施の形態４-４における流路Ａ）と被検液を排出する排出孔２１７が形成されている。第２の基板２２０には、第２の流路２２１（実施の形態４-４における流路Ｂ）とその流路の床面に電気化学検出用電極２３４が形成されている。この電気化学検出用電極２３４は、対向電極２３１、作用電極２３２、参照電極２３３からなる。また、このマイクロ流路デバイスでは、第1の基板に設けられた壁面２１３が第1の流路の流れを略垂直方向に変更するように機能する。また、第２の基板２２０の上流側の壁と第1の基板の上記壁面２１３との間の部分が実施の形態４-４における流路Ｃに相当することになる。
【０１８５】
上記マイクロ流路デバイスの作製方法について説明する。先ず、実施例１と同様の方法で、厚さ約１ｍｍガラス製基板を用いて、図３０に示す工程に従って図３０（ｆ）に示す形状の第１の基板２１０を作製した。なお、図（ａ）〜（ｆ）は横断面図である。
【０１８６】
また、厚さ約０．３ｍｍのアクリル製基板を用い、図３１に示すような空孔２２１（実施の形態４-４における流路Ｃ）を形成した第２の基板２２０を作製した。
【０１８７】
他方、厚さ約０．６ｍｍのシリコン製の基板を第３の基板２３０として用い、公知のフォトリソグラフィー法とスパッタ法、真空蒸着法などの薄膜形成技術を用いて、この基板上に０．２ｍｍ角の対向電極２３１、作用電極２３２、参照電極２３３をそれぞれ形成した。また、各電極と外部機器との接続のための接続用パッド２３５、２５６、２３７をそれぞれ形成すると共に、接続線２３８、２３９、２４０により上記各電極と上記各パットとを電気的に接続した。このようにして、図３２に示す第３の基板２３０を作製した。
【０１８８】
上記対向電極２３５は白金で構成し、作用電極は白金／金（表面側）の二層構造とし、参照電極は白金／銀／塩化銀（表面側）の三層構造にした。各電極を形成後、各電極と接続用パッドを覆うことなく、その余の電極領域全面に酸化珪素層（絶縁膜）を積層した。この後、作用電極の表面に、スギ花粉アレルゲンであるCry J-1に対し特異的に反応する抗Cry J-1抗体を固定化した。なお、電気化学検出用電極２３４は、対向電極２３１、作用電極２３２、参照電極２３３によりが構成されている。
【０１８９】
抗Cry J-1抗体の固定化は次のようにして行った。作用電極２３２（金電極）の表面を純水で洗浄した後、この電極表面に、SH-C10H20-COOHとSH-C6H12-OHをモル比１：９で混合した１０ｍＭ濃度の溶液を流した。その後、電極表面を再び純水で洗浄した。これにより、作用電極の表面にカルボキシル基の突出した自己組織化膜（ＳＡＭ膜）が形成できる。次いで、水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）とNヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）との質量比１：１の混合物をｐＨ５．８のリン酸バッファー液（ＰＢＳ）で溶解し、上記混合物の１０ｍｇ／ｍｌ濃度の溶液を調製した。この溶液に電極部分を漬け、３７℃で２時間静置することにより、金電極に水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）とNヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を反応させた。その後、ｐＨ５．８のリン酸バッファー液で電極表面を洗浄した。
【０１９０】
次いで、抗Cry J-1抗体をｐＨ５．８のリン酸バッファー液に溶解し、抗Cry J-1抗体濃度１０ｍｇ／ｍｌの溶液を調製し、この溶液に金電極部分を漬け、３７℃で２時間静置した。これにより電極表面のＳＡＭ膜表面に抗Cry J-1抗体が固定化される。この後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のｐＨ７．４のリン酸バッファー液で電極表面を洗浄した。これにより、作用電極２３２上に抗Cry J-1抗体層（反応物質２４５）が形成されたマイクロ流路デバイス２６１を完成させた。
【０１９１】
上記とは別途で、シリンジポンプ２５１とレオダインバルブ２５２を備え、これらが樹脂製チューブで連結された送液装置と、樹脂製の排出チューブを用意した。そして、上記送液装置のチューブを上記マイクロ流路デバイス２６１の注入孔２１４に接続し、上記排出チューブを排出孔２１７に接続した。このようにして送液装置を備えたマイクロ流路デバイス装置となした。
【０１９２】
次に、図２９を参照しながら、スギ花粉アレルゲンであるCry J-1を検出するための操作方法について説明する。スギ花粉アレルゲンであるCry J-1をｐＨ７．４のリン酸バッファー液に入れ、Cry J-1が１００ｎｇ／ｍｌ濃度の被検液を予め調整した。シリンジポンプ２５１を駆動させ、ｐＨ７．４のリン酸バッファー液をマイクロ流路デバイス２６１内に流し、この状態でレオダインバルブ２５２から上記被検液を５μｌ注入した。当該被検液は注入孔２１４から第1の流路２１２に入り、第1の流路２１２の前方の壁面２１３により流れを変えられ、床面に電気化学検出用電極２３４が設けられた第２の流路２２１に入り、後排出孔２１７からマイクロ流路デバイス外に排出されることになる。
【０１９３】
このような流れにおいて、被検液は略垂直方向から電気化学検出用電極２３４にぶつかるので、被検液中のCry J-1は作用電極２３２に固定された抗Cry J-1抗体（反応物質２４５）に効率よく捕獲される。この後、再度バッファー液のみを流して、デバイス内部を洗浄した。
【０１９４】
次いで、レオダインバルブ２５２から酵素標識付抗Cry J-1抗体溶液を注入しマイクロ流路デバイス２６１内を流して、作用電極２３２の表面に抗体−抗原−酵素付抗体複合体を形成した。この場合における酵素としては、アルカリフォスフォターゼを用いた。
【０１９５】
この後、基質であるパラアミノフェニルフォスフェートの０．１ｍＭ濃度溶液をレオダインバルブ２５２から注入した。マイクロ流路デバイス２６１に入ったパラアミノフェニルフォスフェートは、作用電極２３２の表面に形成された抗体−抗原−酵素付抗体複合体のアルカリフォスフォターゼ酵素により、電気的活性物質であるパラアミノフェノールになる（酵素基質反応）。このパラアミノフェノールは、直下の作用電極２３２で酸化還元電流として検出される。具体的には、電極２３１，２３２，２３３に繋がった接続パッド２３５、２３６、２３７にポテンショメータを接続し、このポテンショメータにより測定した。
【０１９６】
（比較例３）
比較例３として、図３６に示す構造のマイクロ流路デバイスを作製した。比較例３にかかるデバイスは、流路３０８の床面に、対向電極３１１、作用電極３１２、参照電極３１３が順次配置されており、各電極面が流れ方向に平行になっている点で、上記実施例３と構造が異なる。なお、作用電極３１２への抗Cry J-1抗体を固定化等の条件はすべて実施例３と同様に行った。
【０１９７】
上記実施例３と比較例３を用いて、上記実施例３に記載の条件で電流値の測定を行った。その結果、実施例３の電流値は、比較例１のマイクロ流路デバイスの約１０倍であった。これにより、本実施例によると、検出感度が顕著に向上することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１９８】
上述したように、本発明によると、検体等との反応効率が格段に高い高感度な分析用マイクロ流路デバイスを提供できる。本発明の分析用マイクロ流体デバイスは、特定のタンパク質の検出に特に好適に使用できる。更にタンパク質以外の種々の物質の検出にも適用できる。よって、その産業上の利用可能性は大きい。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】実施の形態１−１にかかる分析用マイクロ流路デバイスの平面図である。
【図２】実施の形態１−１にかかる分析用マイクロ流路デバイスの断面図である。
【図３】実施の形態１−１にかかる分析用マイクロ流路デバイスにおける液の流れを示す概念図である。
【図４】図４（ａ）は、実施の形態１−２にかかる分析用マイクロ流路デバイスの断面図であり、図４（ｂ）は、液の流れを示す概念図であり、図４（ｃ）は、第３の基板の平面図である。
【図５】実施の形態１−４にかかる分析用マイクロ流路デバイスにおける液の流れを示す概念図である。
【図６】図６（ａ）は、実施の形態２−１にかかる分析用マイクロ流路デバイスの断面図であり、図６（ｂ）は、液の流れを示す概念図である。
【図７】図７（ａ）は、実施の形態２−２にかかる分析用マイクロ流路デバイスの断面図であり、図７（ｂ）は、液の流れを示す概念図である。
【図８】図８（ａ）は、実施の形態２−３にかかる分析用マイクロ流路デバイスの断面図であり、図８（ｂ）は、液の流れを示す概念図である。
【図９】図９（ａ）は、実施の形態２−３にかかる分析用マイクロ流路デバイスの断面図であり、図９（ｂ）は、液の流れを示す概念図である。
【図１０】図１０は、実施の形態３-１にかかる分析用マイクロ流路デバイスの断面図である。
【図１１】実施の形態３−２にかかる分析用マイクロ流路デバイスの断面図である。
【図１２】実施の形態３−３にかかる分析用マイクロ流路デバイスの断面図である。
【図１３】実施の形態３−４にかかる分析用マイクロ流路デバイスの断面図である。
【図１４】実施の形態３−５にかかる分析用マイクロ流路デバイスの断面図である。
【図１５】実施の形態３−６にかかる分析用マイクロ流路デバイスの断面図である。
【図１６】本発明分析用マイクロ流路デバイスの流路の変形例を示す断面図である。
【図１７】本発明分析用マイクロ流路デバイスの流路の変形例を示す断面図である。
【図１８】本発明分析用マイクロ流路デバイスにかかる第３の流路（微小孔）の形状例を示す図である。
【図１９】本発明分析用マイクロ流路デバイスにかかるフィルターの形状例を示す図である。
【図２０】図２０（ａ）は、実施の形態４-１にかかる分析用マイクロ流路デバイスの断面図であり、図２０（ｂ）は、液の流れを示す概念図である。
【図２１】図２１（ａ）は、実施の形態４-２にかかる分析用マイクロ流路デバイスの断面図であり、図２１（ｂ）は、液の流れを示す概念図である。
【図２２】図２２（ａ）は、実施の形態４-３にかかる分析用マイクロ流路デバイスの断面図であり、図２２（ｂ）は、液の流れを示す概念図である。
【図２３】図２３（ａ）は、実施の形態４-４にかかる分析用マイクロ流路デバイスの断面図であり、図２３（ｂ）は、液の流れを示す概念図である。
【図２４】実施例１の分析用マイクロ流路デバイスにかかる第１の基板の作製工程を示す図である。
【図２５】実施例１の分析用マイクロ流路デバイスにかかる第２の基板の作製工程を示す図である。
【図２６】実施例１の分析用マイクロ流路デバイスにかかる第３の基板の作製工程を示す図である。
【図２７】実施例１にかかる分析用マイクロ流路デバイス装置を説明する図である。
【図２８】実施例２にかかる分析用マイクロ流路デバイス装置を説明する図である。
【図２９】実施例３にかかる分析用マイクロ流路デバイス装置を説明する図である。
【図３０】実施例３の分析用マイクロ流路デバイスにかかる第1の基板の作製工程図である。
【図３１】実施例３の分析用マイクロ流路デバイスにかかる第２の基板の断面図である。
【図３２】実施例３の分析用マイクロ流路デバイスにかかる第３の基板とこの基板上に配置された電気化学的検出用電極を示す平面図である。
【図３３】図３３（ａ）は比較例１にかかる分析用マイクロ流路デバイスの平面図であり、図３３（ｂ）は断面図である。
【図３４】比較例１にかかる分析用マイクロ流路デバイスの部分拡大断面図である。
【図３５】比較例２にかかる分析用マイクロ流路デバイス装置の断面図である。
【図３６】比較例３にかかる分析用マイクロ流路デバイス装置の断面図である。
【図３７】従来の分析用マイクロ流路デバイスの液の流れと電極表面との関係を示す図である。
【符号の説明】
【０２００】
１、１１０、２１０  第１の基板
２、１２０，２２０  第２の基板
３、１３０，２３０  第３の基板
４、１１４、２１４、６０３、６０４  注入孔
５  フィルター
６  検出部
７、１１７、２０７、２１７、６０７  排出孔
８、１１８、２１２  第１の流路
１０、２２１  第２の流路
１５、１３２  第３の流路
９、１１９  第４の流路
１７、１３３  第５の流路
１１  入口相互間領域の周囲
１４、１７０、６０５  微粒子
１６、１９０  反応物質保持部
５１、２４５：反応物質（抗体）
２０  液体の流れ方向
２５  熱レンズ
１１１  レジスト
１２１、２１１  ポジ型フォトレジスト
１１２、２１３  フォトマスク
１１３  型
１３    電気化学的検出用電極
１３５、２３２、３１２  作用電極
１３６、２３３、３１３  参照電極
２３５、２３６、２３７  接続用パッド
１４０、１４１、１４２  配線
１５０、１６１，１８０、２６１  分析用マイクロ流路デバイス
１５１、２５１  シリンジポンプ
１５２、２５２  レオダインバルブ
６２０  堰き止め部
【図１】
2008051803.tif 000003
【図２】
2008051803.tif 000004
【図３】
2008051803.tif 000005
【図４】
2008051803.tif 000006
【図５】
2008051803.tif 000007
【図６】
2008051803.tif 000008
【図７】
2008051803.tif 000009
【図８】
2008051803.tif 000010
【図９】
2008051803.tif 000011
【図１０】
2008051803.tif 000012
【図１１】
2008051803.tif 000013
【図１２】
2008051803.tif 000014
【図１３】
2008051803.tif 000015
【図１４】
2008051803.tif 000016
【図１５】
2008051803.tif 000017
【図１６】
2008051803.tif 000018
【図１７】
2008051803.tif 000019
【図１８】
2008051803.tif 000020
【図１９】
2008051803.tif 000021
【図２０】
2008051803.tif 000022
【図２１】
2008051803.tif 000023
【図２２】
2008051803.tif 000024
【図２３】
2008051803.tif 000025
【図２４】
2008051803.tif 000026
【図２５】
2008051803.tif 000027
【図２６】
2008051803.tif 000028
【図２７】
2008051803.tif 000029
【図２８】
2008051803.tif 000030
【図２９】
2008051803.tif 000031
【図３０】
2008051803.tif 000032
【図３１】
2008051803.tif 000033
【図３２】
2008051803.tif 000034
【図３３】
2008051803.tif 000035
【図３４】
2008051803.tif 000036
【図３５】
2008051803.tif 000037
【図３６】
2008051803.tif 000038
【図３７】
2008051803.tif 000039