(57)【要約】【課題】本発明の目的は、飲食品、飼料、医薬品、化粧品等の各種用途に有用な、免疫学的に高い機能を発揮するラクトバチルス属乳酸菌を提供することにある。【解決手段】免疫賦活作用・抗アレルギー作用を有するラクトバチルス属乳酸菌。；ラクトバチルス・パラカゼイ  ＮＨＨ２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６２）、ラクトバチルス・プランタラム  ＮＨＴ４株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６４）、ラクトバチルス・ガセリ  ＮＨＭＴ２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６５）、およびラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウス  ＮＨＭＦ１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６３）からなる群から選択される前記乳酸菌。；前記乳酸菌を有効成分として含有することを特徴とする、免疫賦活作用・抗アレルギー作用を有する組成物。；前記乳酸菌、もしくは前記組成物を含有する、飲食品、飼料、化粧品または医薬品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫賦活作用・抗アレルギー作用を有するラクトバチルス属乳酸菌。
【請求項２】
ラクトバチルス・パラカゼイ  ＮＨＨ２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６２）、ラクトバチルス・プランタラム  ＮＨＴ４株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６４）、ラクトバチルス・ガセリ  ＮＨＭＴ２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６５）、およびラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウス  ＮＨＭＦ１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６３）からなる群から選択される請求項１記載の乳酸菌。
【請求項３】
請求項１または２に記載の乳酸菌を有効成分として含有することを特徴とする、免疫賦活作用・抗アレルギー作用を有する組成物。
【請求項４】
請求項１または２に記載の乳酸菌、もしくは請求項３記載の組成物を含有する、飲食品、飼料、化粧品または医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活作用・抗アレルギー作用を有する乳酸菌に関し、詳しくは、免疫賦活作用・抗アレルギー作用を有し、新規なラクトバチルス属乳酸菌、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、糞便や各種発酵食品中に含まれており、ヨーグルト等の発酵食品として古くから利用されてきた。近年は各種の機能性食品の原料としての利用が進められており、中でも特にラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌は、プロバイオティクスの代表として位置づけられている。
特許文献１及び２には、各種の乳酸菌の菌体やその細胞質画分等が免疫賦活作用を有することが記載されている。また、特許文献３には、ラクトバチルス属乳酸菌の抗アレルギー剤としての用途が記載されている。しかし、これらの従来報告されている乳酸菌よりもより高い免疫賦活作用、抗アレルギー作用等の免疫機能を発揮する乳酸菌が求められていた。
【０００３】
【特許文献１】特開平５−２５２９００号公報
【特許文献２】特開平７−２２８５３６号公報
【特許文献３】特開２００４−２６７２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、飲食品、飼料、医薬品、化粧品等の各種用途に有用な、免疫学的に高い機能を発揮するラクトバチルス属乳酸菌を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上述の目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、従来報告されているラクトバチルス属乳酸菌よりも高い免疫賦活作用を有すると同時に、高い抗アレルギー作用をも有するラクトバチルス属乳酸菌を見出した。すなわち、ヒト糞便中から単離された新規なラクトバチルス属乳酸菌が、ヒト末梢血リンパ球に対し免疫賦活作用を発揮すること、およびヒト好塩基球に対し抗アレルギー作用を発揮することを確認した。本発明は係る知見に基づくものである。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の〔１〕〜〔４〕を提供するものである。
〔１〕  免疫賦活作用・抗アレルギー作用を有するラクトバチルス属乳酸菌。
〔２〕  ラクトバチルス・パラカゼイ  ＮＨＨ２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６２）、ラクトバチルス・プランタラム  ＮＨＴ４株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６４）、ラクトバチルス・ガセリ  ＮＨＭＴ２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６５）、およびラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウス  ＮＨＭＦ１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６３）からなる群から選択される〔１〕記載の乳酸菌。
〔３〕  〔１〕または〔２〕に記載の乳酸菌を有効成分として含有することを特徴とする、免疫賦活作用・抗アレルギー作用を有する組成物。
〔４〕  〔１〕または〔２〕に記載の乳酸菌、もしくは〔３〕記載の組成物を含有する、飲食品、飼料、化粧品または医薬品。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、生体において高い免疫賦活作用・抗アレルギー作用を発揮するラクトバチルス属乳酸菌が提供される。係る乳酸菌は、飲食品、飼料、化粧品、医薬品等の各種用途において有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の乳酸菌は、免疫賦活作用・抗アレルギー作用を発揮する。免疫賦活作用（アジュバント作用）とは、生体の免疫機能を活性化する作用を意味する。具体的には、単核球等のリンパ球における、抗原感作後の抗原特異的抗体及びサイトカインの産生増強作用ならびに抗原未感作時のサイトカイン産生増強作用を意味する。ここで、サイトカインとは様々な種類があるが、炎症性サイトカインに分類されるものを挙げることができる。炎症性サイトカインとは、生体において炎症を引き起こす原因となるサイトカインを意味し、例えばＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−８である。本発明において免疫賦活作用を有するという場合には、これらのうちの少なくとも１種類のサイトカインの産生を増強するものであればよい。
【０００９】
一方、抗アレルギー作用とは、生体のアレルギー反応を抑制する作用を意味し、具体的には、好塩基球細胞等の免疫細胞におけるヒスタミンの細胞内蓄積抑制作用および細胞外放出抑制作用、並びに単核球等のリンパ球における抗原感作後及び抗原未感作時のサイトカインの産生増強作用を意味する。ここでいうサイトカインとしては、ＴH１サイトカインを挙げることができる。ＴH１サイトカインとは、ＴH１細胞が産生するサイトカインであり、例えばＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγである。
【００１０】
本発明の乳酸菌は、免疫賦活作用と抗アレルギー作用の少なくとも一方を発揮するものであればよく、両方を発揮していてもよい。また、本発明の乳酸菌は、生菌体であっても死菌体であってもよい。死菌体は、生菌体を加熱（例えば、９０〜１２０℃で２０分〜１時間程度）、凍結乾燥等することにより調製され得る。
【００１１】
本発明の乳酸菌は、ラクトバチルス属に属する。ラクトバチルス属微生物としては、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウスを挙げることができる。
【００１２】
本発明の乳酸菌は、ヒトをはじめとする各種哺乳類の糞便、発酵乳製品、漬物などから採取可能である。例えば、これらの適量をＭＲＳ培地等の培地に植え付けて（例えば、ＭＲＳ培地の場合は３７℃、４８時間）培養後、培養液を常法により遠心分離等して集菌し、必要に応じて精製、凍結乾燥して得ることができる。
【００１３】
本発明者らは、免疫賦活作用・抗アレルギー作用を発揮するラクトバチルス属乳酸菌として、ラクトバチルス・パラカゼイ  ＮＨＨ２株、ラクトバチルス・プランタラム  ＮＨＴ４株、ラクトバチルス・ガセリ  ＮＨＭＴ２株、ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウス  ＮＨＭＦ１株を、天然物から単離し、細菌学的性状、１６Ｓ−ｒＤＮＡシーケンス等の結果から新たに同定した。
【００１４】
すなわち、まずヒト糞便を適宜希釈し、変法ＬＢＳ寒天培地（ＬＢＳ寒天培地（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｄｉｇｅｓｔ  ｏｆ  Ｃａｓｅｉｎ  １０．０ｇ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ５．０ｇ、Ｍｏｎｏｐｏｔａｓｓｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ６．０ｇ、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ  ２．０ｇ、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ２０．０ｇ、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０  １．０ｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ  Ｈｙｄｒａｔｅ  ２５．０ｇ、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ０．５７５ｇ、Ｍａｎｇａｎｅｓｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ０．１２ｇ、Ｆｅｒｒｏｕｓ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ０．０３４ｇ、Ａｇａｒ  １５．０ｇ）８４ｇ、Ｌａｂ−ｌｅｍｃｏ  ｐｏｗｄｅｒ  ８ｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ・３Ｈ2Ｏ  １５ｇ、精製水  １０００ｍｌ、Ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ３．７ｍｌ）に塗沫した。変法ＬＢＳ培地は、Ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ以外の各成分を加温しながら溶解した後、５０℃まで冷やし、Ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを加えて（ｐＨ４．３となる）平板として調製した。嫌気条件にて、３７℃・７２時間培養し、形成したコロニーより、ＮＨＨ２株、ＮＨＴ４株、ＮＨＭＴ２株、ＮＨＭＦ１株の４種を単離した。単離された各細菌の細菌学的性状を調べたところ、表１の通りであった。
【００１５】
【表１】
2008099632.tif 000002
【００１６】
上記細菌学的性質のほか、１６Ｓ−ｒＤＮＡシーケンスその他の遺伝学的検討を行った結果から、最終的に以下の４種に分類された。
【００１７】
１．ラクトバチルス・パラカゼイ  ＮＨＨ２株
ＮＨＨ２株からＤＮＡを抽出し、プライマー１６Ｓ−２７ｆ（配列番号９）および１６Ｓ−１５２５ｒ（配列番号１０）を用いて１６Ｓ−ｒＤＮＡシーケンスを行った。１６Ｓ−ｒＤＮＡシーケンスの手順及び条件は以下の通りである。まず、菌体からＤＮＡを抽出し、１６Ｓ−２７ｆ、１６Ｓ−１５２５ｒプライマーを用い、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲの条件は、９４℃・２分、続いて、９４℃・１分−５０℃・１分−６８℃・１分３０秒を３０サイクル、最後に６８℃・７分とした。次に、得られるＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社)を用いて精製した。そして、精製したＤＮＡを鋳型に、１６Ｓ−２７ｆ、１６Ｓ−１５２５ｒの各プライマーを用い、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９６℃・２分、続いて９６℃・１０秒−５０℃・５秒−６０℃・４分を３０サイクルとした。このようにして得られるＰＣＲ産物を精製後、ＤＮＡシーケンサーにて配列を解読した。解読配列をＢＬＡＳＴＮでホモロジー検索した。
【００１８】
１６Ｓ−ｒＤＮＡシーケンスの結果、配列番号１および配列番号２に記載の塩基配列からなる１６Ｓ−ｒＤＮＡ（配列番号１：ＮＨＨ２−ｆｏｒｗａｒｄ、配列番号２：ＮＨＨ２−ｒｅｖｅｒｓｅ）を得た。係る塩基配列と、各種ラクトバチルス属乳酸菌の１６ＳｒＤＮＡとの相同性検索を行った結果、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）及びラクトバチルス・ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の３種の可能性があると考えた。そのため、Ｌ．Ｊ．Ｈ．Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｔｉｍｍｉｎｓ；Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９，２９，９０−９２に準拠して、これらの３種のラクトバチルス菌のそれぞれに特異的なプライマーを用いたＰＣＲを行い、増幅の程度を確認した。ＰＣＲは、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ検出用プライマー（配列番号１３及び配列番号１４）、Ｌ．ｃａｓｅｉ検出用プライマー（配列番号１５及び配列番号１６）、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ検出用プライマー（配列番号１７及び配列番号１８）を用いて、次の組成の反応液を用いた：５Ｘｂｕｆｆｅｒ（ｐｒｏｍｅｇａ）  １０μｌ、ＮＴＰｓ  ４μｌ、ＭｇＣｌ2  ４μｌ、ｔｅｍｐｌａｔｅ  １μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ  １μｌ  ｅａｃｈ、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．１μｌ、滅菌ＤＷ  ｔｏ  ５０μｌ。ＰＣＲ条件は、９４℃・３分、次に４５℃・４５秒−７２℃・１分のサイクルを１回、続いて９４℃・４５秒−４５℃・４５秒−７２℃・１分のサイクルを３０回、更に続いて９４℃・４５秒、４５℃・４５秒、７２℃・５分とした。
【００１９】
その結果、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）に特異的プライマーの場合にのみ増幅を確認したことから、本菌株をラクトバチルス・パラカゼイの一種として特定した。
【００２０】
ラクトバチルス・パラカゼイ  ＮＨＨ２株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２００６年９月２６日付けで寄託済みであり、その受託番号は、ＮＩＴＥ  Ｐ−２６２である。
【００２１】
２．ラクトバチルス・プランタラム  ＮＨＴ４株
ＮＨＴ４株からＤＮＡを抽出し、上述のＮＨＨ２株と同様に１６Ｓ−ｒＤＮＡシーケンスを行ったところ、配列番号７および配列番号８に記載の塩基配列からなる１６Ｓ−ｒＤＮＡ（配列番号７：ＮＨＴ４−ｆｏｒｗａｒｄ、配列番号８：ＮＨＴ４−ｒｅｖｅｒｓｅ）を得た。係る塩基配列と、各種ラクトバチルス属乳酸菌の１６Ｓ−ｒＤＮＡとの相同性検索を行った。その結果、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）と同定された。
【００２２】
ラクトバチルス・プランタラム  ＮＨＴ４株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２００６年９月２６日付けで寄託済みであり、その受託番号は、ＮＩＴＥ  Ｐ−２６４である。
【００２３】
３．ラクトバチルス・ガセリ  ＮＨＭＴ２株
ＮＨＭＴ２株からＤＮＡを抽出し、上述のＮＨＨ２株と同様に１６Ｓ−ｒＤＮＡシーケンスを行ったところ、配列番号３および配列番号４に記載の塩基配列からなる１６Ｓ−ｒＤＮＡ（配列番号３：ＮＨＭＴ２−ｆｏｒｗａｒｄ、配列番号４：ＮＨＭＴ２−ｒｅｖｅｒｓｅ）を得た。係る塩基配列と、各種ラクトバチルス属乳酸菌の１６Ｓ−ｒＤＮＡとの相同性検索を行った。その結果、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）と同定された。
【００２４】
ラクトバチルス・ガセリ  ＮＨＭＴ２株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２００６年９月２６日付けで寄託済みであり、その受託番号は、ＮＩＴＥ  Ｐ−２６５である。
【００２５】
４．ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウス  ＮＨＭＦ１株
ＮＨＭＦ１株からＤＮＡを抽出し、上述のＮＨＨ２株と同様に１６Ｓ−ｒＤＮＡシーケンスを行ったところ、配列番号５および配列番号６に記載の塩基配列からなる１６Ｓ−ｒＤＮＡ（配列番号５：ＮＨＭＦ１−ｆｏｒｗａｒｄ、配列番号６：ＮＨＭＦ１−ｒｅｖｅｒｓｅ）を得た。係る塩基配列と、各種ラクトバチルス属乳酸菌の１６Ｓ−ｒＤＮＡとの相同性検索を行った。その結果、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）に分類されるものと推測された。しかし、サリシン（糖）代謝性を日本ビオメリュー社製の「ａｐｉ５０ＣＨ」キットを用いて該キットに添付の説明書に準じて確認したところ、サリシン代謝陰性であったことから、ラクトバチルス・サリバリウス  サブスピーシーズ・サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）と同定した。
【００２６】
ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウス  ＮＨＭＦ１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２００６年９月２６日付けで寄託済みであり、その受託番号は、ＮＩＴＥ  Ｐ−２６３である。
【００２７】
本発明の乳酸菌は、免疫賦活作用・抗アレルギー作用を発揮する本発明の組成物の有効成分として利用することができる。本発明の組成物において、上記本発明の乳酸菌の存在形態は、有効成分としての作用を発揮することを条件として、用途に応じて定めることができる。例えば、生菌体および死菌体であってもよいし、培地を含む状態の培養物や培養物の精製品であってもよい。
【００２８】
本発明の組成物においては、上述の乳酸菌を、本発明の乳酸菌の発揮する免疫賦活作用、抗アレルギー作用を損なわずに、乳酸菌と共に組成物を構成することのできる他の成分と組み合わせる。このような他の成分としては、本発明の乳酸菌の機能の維持、増殖のための栄養成分等（例えば、炭素原源、窒素源、ビタミン、ミネラル類等）を挙げることができる。
【００２９】
このような本発明の乳酸菌はそのまま、或いは上述のように本発明の組成物の形で、飲食品、飼料、化粧品、医薬品等またはそれらの原料として利用することができる。この場合、本発明の組成物や乳酸菌は、各用途に応じた他の成分、例えば経口的に摂取される用途の場合、たんぱく質、脂質、炭水化物、食物繊維、ビタミンなどと組み合わせて用いることができる。また適当な担体、例えば賦形剤、希釈剤、充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、表面活性剤、滑剤などと組み合わせて用いることもできる。特に医薬品の場合には上述の担体のうち薬理学的に許容される担体と共に用いられることが一般的である。また、必要に応じて着色剤、保存剤、安定化剤、香料、甘味料等を添加することもできる。
【００３０】
飲食品としては、例えば、発酵乳、乳酸菌飲料、健康食品、パン・菓子等の乳酸菌含有食品、清涼飲料、食品添加物、漬物、ハム・ソーセージ等の食肉加工製品が挙げられる。飼料としては例えば、実験動物、家畜、ペット、展示用動物等の動物用飼料が挙げられる。医薬品の製剤形態も特に限定されない。経口投与に適する形態としては例えば液剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、散剤等の形態が挙げられる。また、軟膏等外用薬の形態であってもよい。化粧品としては、例えば化粧水、クリーム、乳液、洗顔料等が挙げられる。
【００３１】
本発明の飲食品、飼料、化粧品、医薬品における上記本発明の乳酸菌又は組成物の配合割合は、利用する乳酸菌の種類、形態、適用者の状況（年齢、健康状態、体格等）により調整され一般化することは困難であるが、通常、１日の乳酸菌摂取量に換算して１０ｍｇ／日〜１０ｇ／日となるような範囲とすることができる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
〔試薬〕
ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２)はＧｅｎｚｙｍｅ社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ)、ヒトインターロイキン−４（ＩＬ−４）はＰＥＰＲＯ  ＴＥＣＨ社（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）より購入した。Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステル（Ｌ−ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ：ＬＬＭＥ）はＢＡＣＨＥＭ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ)、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）はＣＨＥＭＩＣＯＮ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）より購入した。
【００３３】
〔乳酸菌〕
Ｌ３１：ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）  ＮＨＨ２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６２）
Ｌ３２：ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）  ＮＨＴ４株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６４）
Ｌ３３：ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）  ＮＨＭＴ２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６５）
Ｌ３４：ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓａｌｌｉｖａｒｉｕｓ）  ＮＨＭＦ１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６３）
以下の実施例では、上記４種の菌をそれぞれＬ３１、Ｌ３２，Ｌ３３，Ｌ３４の略称で表記することがある。
【００３４】
実施例１  〔乳酸菌の免疫賦活作用（１）乳酸菌の抗原特異的抗体産生増強効果〕
体外免疫によるヒト末梢血リンパ球の抗原感作時に、凍結乾燥した乳酸菌の加熱死菌体を共存させることで、抗原感作が増強され、抗原特異的抗体産性細胞が増加されるかをＥＬＩＳＰＯＴ法により検証した。
【００３５】
（ヒト末梢血リンパ球の分離）
ヘパリン入り真空採血管を用いて健常人から採血し、等量のＰＢＳで希釈し、よく混和した。あらかじめ５０ｍｌ遠心管にリンパ球分離液（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＬＳＭ，Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を１５ｍｌ分注し、その上に希釈した血液２５ｍｌをＬＳＭと血液の境界面を乱さないように静かに重層した。続いて、室温にて、４００×ｇで３０分間遠心した。ＬＳＭと血漿の境界に白い帯状に浮遊する末梢血単核球層（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および単球）を、パスツールピペットを用いて、血清でコーティングした５０ｍｌ遠心管に回収した。回収した単核球懸濁液の３倍以上のＥＲＤＦ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を加え、よく混和し、２００×ｇで５分間遠心した。得られた細胞のペレットをＥＲＤＦ培地に再懸濁し、２００×ｇで５分間遠心した。この洗浄操作を血小板の混入がなくなるまで２〜３回繰り返した。
【００３６】
なお、細胞数の計測は自動血球計数装置Ｆ−５２０（Ｓｙｓｍｅｘ，Ｈｙｏｇｏ，Ｊａｐａｎ）にて行った。
また、採血はヘルシンキ合意および九州大学大学院農学研究院等倫理審査委員会の定める指針に基づき、ドナーの同意のもと行った。
【００３７】
（Ｌ−Ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ（ＬＬＭＥ）処理）
１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度になるように末梢血単核球をＥＲＤＦ培地に懸濁した後、終濃度が０．２５ｍＭになるようにＬＬＭＥを添加し、時折攪拌しながら室温で２０分間処理した。処理した細胞をＥＲＤＦ培地で３回洗浄し、ＬＬＭＥを十分に除去した後、体外免疫に用いた。
【００３８】
（体外免疫によるヒト末梢血リンパ球の抗原感作と乳酸菌処理）
抗原感作は、末梢血単核球を１穴あたり５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように４８穴プレートに播種し、ＩＬ−２（１または１０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−４（１または１０ｎｇ／ｍｌ）、２−メルカプトエタノール（５０μＭ）および抗原としてβ−ラクトグロブリン（β−ＬＧ；１０μｇ／ｍｌ）を添加して行った。この方法で抗原感作を行ったものをコントロール（Ｃｔｒｌ）とした。この際、Ｄｐ＋Ｋと明記した画分においては、ポジティブコントロールとして、１μＭＣｐＧ−Ｄ（ｇｇＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧｇｇＧ（配列番号１１），Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｈｏｋｋａｉｄｏ，Ｊａｐａｎ）大文字はｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ、小文字はｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂａｃｋｂｏｎｅｓ）を抗原、サイトカイン類とともに添加し、３日後に１μＭ  ＣｐＧ−Ｋ（ｔｃｇａｇｃｇｒｒｃｒｃＣ（配列番号１２），Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）をさらに添加し培養を行ったものを用いた。
【００３９】
なお、すべての培養には３７℃、５％  ＣＯ2条件下、１０％非働化ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ，ＴＲＡＣＥ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ：ＭＥＩＪＩ  ＳＥＩＫＡ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ)、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ：ＭＥＩＪＩ  ＳＥＩＫＡ）を含むＥＲＤＦ培地を用いた。
【００４０】
また、乳酸菌Ｌ３１，Ｌ３２，Ｌ３４処理は、抗原感作時に、１または１０μｇ／ｍｌの凍結乾燥した乳酸菌の加熱死菌体を加え、６〜８日間培養することにより行った。乳酸菌の加熱死菌体は、培養後ミリＱ水で２回洗浄した各菌株を、１００℃、３０分加熱処理後、凍結乾燥して調製したものを用いた。
【００４１】
（抗原特異的抗体産生細胞の検出（ＥＬＩＳＰＯＴ法））
抗原特異的抗体産生細胞の存在は、ＥＬＩＳＰＯＴ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ｓｐｏｔ  ａｓｓａｙ）法により確認した。
まず、９６穴セルロース膜底プレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＨＡ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の各穴にＰＢＳで希釈した抗原（１０μｇ／ｍｌ）を１００μｌずつ分注し、４℃で一晩静置し抗原を膜上に吸着させた。非吸着の抗原を除去するためＰＢＣを各穴に２００μｌずつ分注し、３分間静置した後、吸引除去した。この洗浄操作を３回繰り返した。
【００４２】
次に、非特異的抗体の吸着を防ぐために１％フィッシュゼラチン（ＦＧ）−ＰＢＳを各穴に２００μｌずつ分注し、３７℃で２時間静置し、ブロッキングを行った。前述の洗浄操作を３回行った後、細胞の調製を行った。すなわち、体外免疫開始から６日目の細胞を１．５ｍｌチューブに回収し、細胞数の計測を行った後、６，０００ｒｐｍで１分遠心し、上清を回収した。残った細胞ペレットは、ＩＬ−２（１Ｕ／ｍｌ)、ＩＬ−４（１ｎｇ／ｍｌ）、２−メルカプトエタノール（５０ｍＭ）を含む新しい１０％ＦＢＳ含有ＥＲＤＦに、細胞濃度が１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調整した。これを各穴に１００μｌずつ分注し、３７℃、５％  ＣＯ2条件下で２０時間培養した。培養終了後、細胞液を吸引除去し、前述の洗浄操作を３回行った。
【００４３】
次に、１％  ＦＧ−ＰＢＳで１０，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗ヒトＩｇＭ抗体（ＥＬＩＳＡ用２次抗体と同じ）を各穴に１００μｌずつ分注し、３７℃で２時間反応させた。ＴＰＢＳで前述と同様の洗浄操作を３回行った後、基質液ＴｒｕｅＢｌｕｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を各穴に５０μｌずつ分注し、３７℃で反応させ、抗原特異的抗体産生細胞を青色のスポットとして検出した。反応が十分に進んだところで、脱イオン水を用いて各穴を洗浄し、反応を停止させた。遮光した状態で十分に乾燥させた後、ＭＥＬＩＰＵＮＣＨ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてセルロース膜を打ち抜き、透明なシールに挟み込んで固定した。これをスキャナー画像としてコンピューターに取り込み、取り込んだ画像を、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪで解析し、スポット数の数値化を行った。
【００４４】
図１に、β−ＬＧ特異的抗体産生細胞および非特異的結合抗体産生細胞のスポット画像及びスポット数を示す。図１中、「β−ＬＧ」は、β−ＬＧ特異的抗体産生細胞に相当するスポット画像及びスポット数である。一方、「ＦＧ」は、ブロッキング試薬であるＦＧに特異的な抗体を産生する細胞、つまり非特異的に結合する抗体を産生する細胞に相当するスポット画像及びスポット数である。なお、図１中の１または１０の数値は添加した乳酸菌の加熱死菌体濃度（μｇ／ｍｌ）を表す。図１から、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４に、有意な抗原特異的抗体産生増強効果が認められた。
【００４５】
実施例２  〔乳酸菌の免疫賦活作用（２）乳酸菌による免疫応答増強効果〕
体外免疫によるヒト末梢血リンパ球の抗原感作時に凍結乾燥した乳酸菌の加熱死菌体を共存させることで、末梢血リンパ球の免疫応答が増強され、その結果として、炎症性サイトカインの発現量が増強されるかを、ＣＢＡ法により検証した。
【００４６】
（培養上清中のサイトカイン産生量の測定）
実施例１と同様の条件で乳酸菌添加または無添加（コントロール及びＤｐＫ）で調製した培養上清について、培養上清中に分泌された各種サイトカインの濃度を測定した。尚、本実施例では乳酸菌としてＬ３１，Ｌ３２，Ｌ３３，及びＬ３４の４種を用いた。
【００４７】
培養上清中に分泌された各種サイトカインの濃度は、ＢＤTM  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＢＡ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）のＨｕｍａｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＩＬ−８，ＩＬ−１β，ＩＬ−６，ＩＬ−１０，ＴＮＦ，ＩＬ−１２ｐ７０の測定用）およびＨｕｍａｎ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ（ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＦＮ−γの測定用）を用い、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用い測定した。測定は、それぞれのキットに付属のプロトコールに基づき行った。
【００４８】
ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−８の各炎症性サイトカインの濃度の測定結果を、図２−１、図２−２、図２−３、図２−４に示す。図２−１〜２−４から明らかな通り、Ｌ３１〜Ｌ３４の乳酸菌株に、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−８等の炎症性サイトカインの発現増強効果が認められた。
【００４９】
実施例３
次に、健常人及びアレルギー患者より採取した末梢血リンパ球に、凍結乾燥した乳酸菌の加熱死菌体を共存させた場合に、末梢血リンパ球の免疫応答が増強され、その結果として、炎症性サイトカインの発現量が増強するか、ＣＢＡ法により検証した。
【００５０】
実施例１において、採取対象を健常人およびアレルギー患者としたこと、体外免疫を行わない未処理の末梢血リンパ球に乳酸菌を添加したこと、乳酸菌としてＬ３１，Ｌ３２，Ｌ３３，及びＬ３４の４種を用いたこと、及び乳酸菌加熱死菌体を０．１または１μｇ／ｍＬの濃度で添加したことのほかは同様にして培養上清を得た。そして各乳酸菌添加または無添加（コントロール及びＤｐＫ）で調製した培養上清について、培養上清中に分泌された各種サイトカインの濃度を、実施例２と同様にＣＢＡ法に基づき測定した。
【００５１】
各炎症性サイトカインの濃度の測定結果を、図３−１、図３−２、及び図３−３（健常人）；図３−４、図３−５及び図３−６（アレルギー患者）に示す。なお、図３−１〜図３−６中の０．１または１の数値は添加した乳酸菌の加熱死菌体濃度（μｇ／ｍｌ）を表す。図３−１〜３−６から明らかなように、健常人においてはＬ３１に強いＴＮＦ産生増強が認められたが、アレルギー患者においては、Ｌ３３に強いＴＮＦ産生増強が、Ｌ３１，Ｌ３２に強いＩＬ−６，ＩＬ−８産生増強が、Ｌ３４に弱いＩＬ−６，ＩＬ−８産生増強効果が認められた。
【００５２】
実施例４  〔乳酸菌の抗アレルギー作用  （１）乳酸菌のヒスタミン蓄積抑制効果及び（２）ヒスタミン遊離抑制効果〕
乳酸菌のＫＵ８１２Ｆにおけるヒスタミン蓄積抑制効果および遊離抑制効果を、上清サンプル及び細胞ライセートサンプル中のβ−ヘキソサミニダーゼ活性を算出することにより検証した。
【００５３】
（ヒト好塩基球様細胞株ＫＵ８１２Ｆの分化誘導および乳酸菌処理）
ＫＵ８１２Ｆ（東北大学加齢医学研究所より入手）は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（日水製薬株式会社）を用い、３７℃、５％、ＣＯ2／９５％ａｉｒの条件下で培養した。実施例１と同様の条件で凍結乾燥し調製した乳酸菌の加熱死菌体Ｌ３１，Ｌ３２，Ｌ３３，Ｌ３４のそれぞれを、ＫＵ８１２Ｆに０．１または１μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３日間処理を行い、ヒスタミン遊離能の変化を追跡した。
【００５４】
（β−ヘキソサミニダーゼ活性の測定）
細胞から分泌されたあるいは細胞内のヒスタミン量は、脱顆粒の際にヒスタミンなどのケミカルメディエーターとともに放出されるβ−ヘキソサミニダーゼという顆粒内酵素の酵素活性を測定することにより推定した。
【００５５】
上述の乳酸菌処理をしたＫＵ８１２Ｆ細胞を、２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅになるように調整し、タイロード液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2，１．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１１．９ｍＭ  ＮａＨＣＯ3，０．４ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．２）で２回洗浄した。１５０μｌのタイロード液で再懸濁した後、１０μＭ  イオノマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理し、３７℃で１時間反応させた（イオノマイシン刺激）。一方、イオノマイシンを添加しないほかは同様に処理したものを用意した（無刺激）。
【００５６】
１時間後、遠心して上清を回収し、上清サンプルとした。得られた細胞ペレットは、１５０μｌの０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で溶解し、細胞ライセートサンプルとした。得られた上清サンプルおよび細胞ライセートサンプルをそれぞれ４０μｌずつ、９６ｗｅｌｌイムノプレートに添加し、そこに基質として２ｍＭ  ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（ＮＡＧ）を１００μｌ添加して、３７℃で３０分静置し発色反応を行った。反応終了後、０．２Ｍ  グリシンを１５０μｌずつ添加することによって反応を停止させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。一方、乳酸菌を添加しないほかは同様に調製及び測定したサンプルをコントロールとした。
【００５７】
（１）乳酸菌のヒスタミン蓄積抑制効果
ＫＵ８１２Ｆに対する乳酸菌のヒスタミン蓄積抑制効果は、相対ヒスタミン蓄積量で評価した。相対ヒスタミン蓄積量は、上清サンプル及び細胞ライセートサンプル中のβ−ヘキソサミニダーゼ活性として算出した。相対ヒスタミン蓄積量の結果を、無刺激の場合を図４−１に、イオノマイシン刺激の場合を図４−２に示す。その結果、Ｌ３３及びＬ３４に、有意なヒスタミン蓄積抑制効果が認められた（図４−１及び図４−２）
【００５８】
（２）乳酸菌のヒスタミン遊離抑制効果
ＫＵ８１２Ｆに対する乳酸菌のヒスタミン遊離抑制効果は、相対ヒスタミン遊離活性で評価した。相対ヒスタミン遊離活性は、イオノマイシン刺激時での（上清サンプル中のβ−ヘキソサミニダーゼ活性）／（上清及び細胞ライセートサンプル中のβ−ヘキソサミニダーゼ活性）×１００として産出した。相対ヒスタミン遊離活性の結果を図５に示す。図５から明らかなように、Ｌ３２において相対ヒスタミン遊離活性の抑制が認められた。
【００５９】
実施例５  〔乳酸菌の抗アレルギー作用  （３）乳酸菌の抗アレルギー効果〕
ヒト末梢血リンパ球のサイトカイン産生に対する乳酸菌の影響を検証した。
まず、体外免疫を行う抗原感作時に乳酸菌を添加し、末梢血リンパ球のサイトカイン産生に対する影響を検証した。すなわち、測定対象であるサイトカインをＴH１サイトカインＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γとしたほかは実施例２の条件に従いサンプルの調製及び測定を行った。ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γの測定結果を図６−１及び図６−２に示す。なお、図６−１および図６−２中の１または１０の数値は添加した乳酸菌の加熱死菌体濃度（μｇ／ｍｌ）を表す。図６−１および図６−２から明らかなように、Ｌ３２にＴH１型サイトカインであるＩＬ−１２  ｐ７０の発現増強作用が、またＬ３１〜Ｌ３４にＴH１型サイトカインであるＩＦＮ−γの発現増強作用が認められた。
【００６０】
次に、分離直後の末梢血リンパ球に乳酸菌を添加し、そのサイトカイン産生に対する影響を検証した。すなわち、採取対象を健常人及びアレルギー患者としたこと、及び乳酸菌加熱死菌体を０．１または１μｇ／ｍLの濃度で添加したこと以外は実施例１と同様に末梢血単核球を採取して同様に調整後、抗原感作を行わずに乳酸菌の加熱死菌体を添加し、培養した。続いて、実施例２の条件に従いＴH１サイトカインであるＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γを測定した。各サイトカインの測定結果を図７−１及び図７−２（健常人）；図７−３及び図７−４に示す（アレルギー患者）。なお、図７−１〜７−４中の０．１または１の数値は添加した乳酸菌の加熱死菌体濃度（μｇ／ｍｌ）を表す。図７−１〜図７−４から明らかなように、健常人末梢血リンパ球に対しては、Ｌ３２が強いＩＬ−１２  ｐ７０産生増強効果を、Ｌ３１〜３４が弱いＩＦＮ−γ産生増強効果を示した。さらにアレルギー患者由来末梢血リンパ球に対しては、Ｌ３１、Ｌ３２が強いＩＬ−１２  ｐ７０産生増強効果を示し、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３３が強いＩＦＮ−γ産生増強効果を示した。
【００６１】
実施例６  〔既知の乳酸菌との比較（免疫賦活活性）〕
本発明の乳酸菌と既知の乳酸菌との間で、免疫賦活活性の比較試験を行った。
既知の乳酸菌としては、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の４株（Ｌ１（ＪＣＭ１０２８），Ｌ２（ＪＣＭ１０３４），Ｌ３（ＪＣＭ１１３２），Ｌ４（ＪＣＭ１２２９））、ラクトバチルス・アミロヴォルス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）の１株（Ｌ５（ＪＣＭ２１２５））、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）の３株（Ｌ１０（ＪＣＭ１１３０），Ｌ１１（ＪＣＭ１１３１），Ｌ１２（ＪＣＭ８７８７））、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の２株（Ｌ１６（ＪＣＭ１０２２），Ｌ１７（ＪＣＭ８７９１））を用いた。
【００６２】
Ｌ３１等の代わりにこれらの既知の菌株を加熱死菌体として用いた他は、実施例１と同様にしてサンプルを調製しスポット数を測定し、ＤｐＫのスポット数に対する相対値（比スポット数）を算出した。尚、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５については、乳酸菌死菌体の添加量を０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌの３種類とした。各菌の比スポット数の結果をＬ３１、Ｌ３２、Ｌ３３、Ｌ３４の結果とあわせて図８に示す。なお、図８中の０．１、１または１０の数値は添加した乳酸菌の加熱死菌体濃度（μｇ／ｍｌ）を表す。
【００６３】
図８から明らかなように、本発明の乳酸菌、特にＬ３１，Ｌ３２，Ｌ３４は、他の乳酸菌と比較して高い免疫賦活活性を示すことが明らかとなった。
【００６４】
実施例７  〔既知の乳酸菌との比較（サイトカイン産生能）〕
本発明の乳酸菌と既知の乳酸菌とのサイトカイン産生能の比較を、実施例６と同様に行った。ＩＬ−１２ｐ７０については、各群の測定値のＤｐＫの測定値に対する相対値を算出した。ＩＬ−６の測定値は、コントロールの測定値に対する相対値を算出した。各菌の各サイトカインの結果をＬ３１〜３４の結果とあわせて図９−１（ＩＬ−１２ｐ７０）及び図９−２（ＩＬ−６）に示す。なお、図９−１および図９−２中の０．１、１または１０の数値は添加した乳酸菌の加熱死菌体濃度（μｇ／ｍｌ）を表す。
図９−１および図９−２から明らかなように、本発明の乳酸菌のＬ３１，Ｌ３２，Ｌ３３およびＬ３４は、他の乳酸菌と比較して高い免疫賦活活性を示すことが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、本発明の乳酸菌の体外免疫における抗原特異的抗体産生増強効果を示す図である。
【図２−１】図２−１は、本発明の乳酸菌の体外免疫におけるＴＮＦ産生増強効果を示す図である。
【図２−２】図２−２は、本発明の乳酸菌の体外免疫におけるＩＬ−６産生増強効果を示す図である。
【図２−３】図２−３は、本発明の乳酸菌の体外免疫におけるＩＬ−１β産生増強効果を示す図である。
【図２−４】図２−４は、本発明の乳酸菌の体外免疫におけるＩＬ−８産生増強効果を示す図である。
【図３−１】図３−１は、本発明の乳酸菌の健常人末梢血リンパ球からのＴＮＦ産生増強効果を示す図である。
【図３−２】図３−２は、本発明の乳酸菌の健常人末梢血リンパ球からのＩＬ−６産生増強効果を示す図である。
【図３−３】図３−３は、本発明の乳酸菌の健常人末梢血リンパ球からのＩＬ−１β産生増強効果を示す図である。
【図３−４】図３−４は、本発明の乳酸菌のアレルギー患者末梢血リンパ球からのＴＮＦ産生増強効果を示す図である。
【図３−５】図３−５は、本発明の乳酸菌のアレルギー患者末梢血リンパ球からのＩＬ−６産生増強効果を示す図である。
【図３−６】図３−６は、本発明の乳酸菌のアレルギー患者末梢血リンパ球からのＩＬ−８産生増強効果を示す図である。
【図４−１】図４−１は、本発明の乳酸菌の無刺激下におけるヒスタミン蓄積抑制効果を示す図である。
【図４−２】図４−２は、本発明の乳酸菌のイオノマイシン刺激下におけるヒスタミン蓄積抑制効果を示す図である。
【図５】図５は、本発明の乳酸菌のヒスタミン遊離抑制効果を示す図である。
【図６−１】図６−１は、本発明の乳酸菌の体外免疫時におけるＩＬ−１２ｐ７０産生増強効果を示す図である。
【図６−２】図６−２は、本発明の乳酸菌の体外免疫時におけるＩＦＮ−γ産生増強効果を示す図である。
【図７−１】図７−１は、本発明の乳酸菌の健常人末梢血リンパ球からのＩＬ−１２ｐ７０産生増強効果を示す図である。
【図７−２】図７−２は、本発明の乳酸菌の健常人末梢血リンパ球からのＩＦＮ−γ産生増強効果を示す図である。
【図７−３】図７−３は、本発明の乳酸菌のアレルギー患者末梢血リンパ球からのＩＬ−１２ｐ７０産生増強効果を示す図である。
【図７−４】図７−４は、本発明の乳酸菌のアレルギー患者末梢血リンパ球からのＩＦＮ−γ産生増強効果を示す図である。
【図８】図８は、本発明の乳酸菌と既知の乳酸菌との免疫賦活活性の比較を示す図である。
【図９−１】図９−１は、本発明の乳酸菌と既知の乳酸菌とのＩＬ−１２ｐ７０産生能の比較を示す図である。
【図９−２】図９−２は、本発明の乳酸菌と既知の乳酸菌とのＩＬ−６産生能の比較を示す図である。
【図１】
2008099632.tif 000003
【図２−１】
2008099632.tif 000004
【図２−２】
2008099632.tif 000005
【図２−３】
2008099632.tif 000006
【図２−４】
2008099632.tif 000007
【図３−１】
2008099632.tif 000008
【図３−２】
2008099632.tif 000009
【図３−３】
2008099632.tif 000010
【図３−４】
2008099632.tif 000011
【図３−５】
2008099632.tif 000012
【図３−６】
2008099632.tif 000013
【図４−１】
2008099632.tif 000014
【図４−２】
2008099632.tif 000015
【図５】
2008099632.tif 000016
【図６−１】
2008099632.tif 000017
【図６−２】
2008099632.tif 000018
【図７−１】
2008099632.tif 000019
【図７−２】
2008099632.tif 000020
【図７−３】
2008099632.tif 000021
【図７−４】
2008099632.tif 000022
【図８】
2008099632.tif 000023
【図９−１】
2008099632.tif 000024
【図９−２】
2008099632.tif 000025
【配列表】
2008099632000001.app