(57)【要約】【課題】特定の塩基配列を有する核酸を簡便に且つ短時間で効率的に増幅させることができる、新規な原理に基づく核酸の増幅方法を提供すること。【解決手段】(a)増幅対象の塩基配列を含むＤＮＡを鋳型とし、前記塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマー対を用いてＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を行って、直鎖状ＤＮＡ断片を得ること；及び(b)前記プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡを鋳型とし、(a)により得られた直鎖状ＤＮＡ断片の３'末端を複製起点として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を連鎖的に行うことを特徴とする、核酸の増幅方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)増幅対象の塩基配列を含む鋳型ＤＮＡと、前記塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマー対とを用いてＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を行って、直鎖状ＤＮＡ断片を得ること；及び
(b)前記プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡを鋳型とし、(a)により得られた直鎖状ＤＮＡ断片の３'末端を複製起点として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を行うこと；
を含むことを特徴とする、核酸の増幅方法。
【請求項２】
(a)と(b)とを同一温度条件下で行う、請求項１記載の方法。
【請求項３】
増幅対象の塩基配列を含む鋳型ＤＮＡが、ＲＮＡを鋳型とする逆転写によって得られたＤＮＡ鎖を含むものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
(i)増幅対象の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマー対；
(ii)前記プライマー対と同一の塩基配列を同一分子上に含む環状１本鎖ＤＮＡ；
(iii)鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；
(iv)ｄＮＴＰ；
を含む、核酸増幅用キット。
【請求項５】
２本鎖の標的核酸分子を検出する方法であって、
(a)標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプライマー対、前記プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰを、検出対象の試料に添加して、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが活性を有する温度にて酵素反応させること；
(b)酵素反応させた試料中で、核酸が増幅されたか否かを確認すること；及び
(c)核酸が増幅された場合に、検出対象の試料中に２本鎖の標的核酸分子が存在すると決定すること；
を含む前記方法。
【請求項６】
１本鎖の標的核酸分子を検出する方法であって、
(a)標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプライマー、標的核酸分子の前記標的塩基配列の領域と異なる領域の標的塩基配列を有するプライマー、これらのプライマーの少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰを、検出対象の試料に添加して、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが活性を有する温度にて酵素反応させること；
(b)酵素反応させた試料中で、核酸が増幅されたか否かを確認すること；及び
(d)核酸が増幅された場合に、検出対象の試料中に１本鎖の標的核酸分子が存在すると決定すること；
を含む前記方法。
【請求項７】
(i)２本鎖の標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプライマー対；
(ii)前記プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ；
(iii)鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；及び
(iv)ｄＮＴＰ；
を含む、２本鎖の標的核酸分子の検出用キット。
【請求項８】
(i)１本鎖の標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプライマー
(ii)標的核酸分子の前記標的塩基配列の領域と異なる領域の標的塩基配列を有するプライマー；
(iii)(i)及び(ii)のプライマーの少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ；
(iv)鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；及び
(v)ｄＮＴＰ；
を含む、１本鎖の標的核酸分子の検出用キット。
【請求項９】
(vi)逆転写酵素を更に含む、請求項８記載の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅方法、特には、特定のプライマーと環状１本鎖ＤＮＡとの組合せを用いる核酸の増幅方法、前記方法を利用して標的遺伝子の存在の有無を検出する方法及び前記方法に使用する検出用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、研究機関、医療機関、検査機関その他様々な現場において、標的遺伝子の特異的な塩基配列に基づく分析・検出方法が数多く用いられている。例えば、ヒト・動物など生体由来の試料（体液や細胞片）や環境由来の試料に含まれる病原菌、カビ、ダニなどのアレルゲンといった病原性の微生物・微小動物、ウイルスや花粉などの存在を分析・検出する場合にも、それらの検出対象が有する標的遺伝子の特異的な塩基配列を検出する方法が用いられている。これら核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を検出する方法は、タンパク質を検出する方法と比較して、短時間且つ高感度で行うことができる。また、試料中に本来含まれる核酸の量が検出限界以下であっても、無細胞系を用いて比較的簡単に且つ特異的に増幅することができる。これらの利点から、核酸を増幅する方法を利用して、あるいは核酸を増幅する方法と組合せて、標的遺伝子の特異的な塩基配列を検出する方法が数多く開発されている。
現在、最も一般的に使用されている核酸の増幅手法としては、温度サイクルを利用して鋳型の変性、鋳型へのプライマーのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応のサイクルを数十回行い、プライマー対によって挟まれる領域の核酸を増幅するＰＣＲ法が挙げられる。しかし、温度サイクルを利用して核酸を増幅する方法では、温度サイクルを制御するための機器（サーマルサイクラーなど）が高価であることや、核酸の増幅に最適な温度サイクルの検討・設定などが必要とされる。
よって近年、温度サイクルを利用せずに一定温度条件下でＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を進行させる核酸増幅方法が考えられてきた。その代表的なものがＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法である（特許文献１）。ＬＡＭＰ法では、標的遺伝子の６つの領域に対して、合成されるＤＮＡ鎖の３'末端が常にループを形成して次のＤＮＡ増幅反応の複製起点となるような、４つのプライマーを設計して用い、標的遺伝子の核酸分子を増幅させている。
また、特許文献２では、標的遺伝子中の２箇所の不連続な隣接領域に相補的な塩基配列を５'末端及び３'末端に有し且つ標的遺伝子に相補的でないリンカー領域を有する直鎖ＤＮＡ分子をプローブとして設計し、標的遺伝子に対して前記プローブをループ状にハイブリダイズさせ並置する５'末端と３'末端との間をリガーゼで連結して環状化させ、前記リンカー領域に相補的なプライマーを用いて、環状化した前記プローブの塩基配列を増幅する方法について記載する。
しかしながら、これら既存の方法にはコスト、検出方法の設計及び操作、検出感度といった点において課題も残されており、これらの課題を充分に満足する新たな核酸増幅方法及び検出方法が必要とされている。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０００／２８０８２号パンフレット
【特許文献２】特表２００５−５０８５９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、特定の塩基配列を有する核酸を簡便に且つ短時間で効率的に増幅させることができる、新規な原理に基づく核酸の増幅方法を提供することである。
また本発明の目的は、前記増幅方法を利用して、試料中の標的遺伝子の存在の有無を迅速且つ明確に検出することができる、高感度な検出方法を提供することである。
また本発明の更なる目的は、これらの方法に有用な特定のプライマーと環状１本鎖ＤＮＡとの組合せを含む、核酸増幅用キット及び検出用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、特異的塩基配列を有する鋳型核酸分子に対して、前記塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーと、前記プライマーと同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡとの組合せを用いてＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を連鎖的に行うことにより、周期的な温度制御の必要なく、簡便且つ短時間の操作で、前記特異的な塩基配列の核酸を効率的に増幅させることができることを見出した。
また本発明者は、上述する核酸の増幅方法を利用して、試料中の標的遺伝子の有無、特には、生体又は環境に由来する試料中のアレルゲン、ウイルス、病原菌等といった微生物の存在の有無を、迅速且つ高感度に検出できることを見出した。
これらの方法、及びこれらの方法に有用なキットは、具体的には以下の通りである。
【０００６】
本発明の核酸の増幅方法は、
(a)増幅対象の塩基配列を含むＤＮＡを鋳型とし、前記塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマー対を用いてＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を行って、直鎖状ＤＮＡ断片を得ること；及び
(b)前記プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡを鋳型とし、(a)により得られた直鎖状ＤＮＡ断片の３'末端を複製起点として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を連鎖的に行うこと；
を含むことを特徴とする。
(a)と(b)とは、使用する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが活性を有する温度で行われるが、好ましくは、(a)と(b)とを同一温度条件下で行う。
また、好ましくは、増幅対象の塩基配列を含むＤＮＡが、ＲＮＡを鋳型とする逆転写によって得られたＤＮＡ鎖を含むものである。
【０００７】
本発明の核酸の増幅方法に有用なキットは、
(i)増幅対象の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマー対；
(ii)前記プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ；
(iii)鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；
(iv)ｄＮＴＰ；
を含む、核酸増幅用キットである。
【０００８】
本発明の２本鎖の標的核酸分子を検出する方法は、
(a)標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプライマー対、前記プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰを、検出対象の試料に添加して、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが活性を有する温度にて酵素反応させること；
(b)酵素反応させた試料中で、核酸が増幅されたか否かを確認すること；及び
(c)核酸が増幅された場合に、検出対象の試料中に２本鎖の標的核酸分子が存在すると決定すること；
を含む。
【０００９】
本発明の１本鎖の標的核酸分子を検出する方法は、
(a)標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプライマー、標的核酸分子の前記標的塩基配列の領域と別の領域の標的塩基配列を有するプライマー、これらのプライマーの少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ、逆転写酵素、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰを、検出対象の試料に添加して、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが活性を有する温度にて酵素反応させること；
(b)酵素反応させた試料中で、核酸が増幅されたか否かを確認すること；及び
(d)核酸が増幅された場合に、検出対象の試料中に１本鎖の標的核酸分子が存在すると決定すること；
を含む。
【００１０】
本発明の２本鎖の標的核酸分子を検出する方法に有用なキットは、
(i)２本鎖の標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプライマー対；
(ii)前記プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ；
(iii)鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；及び
(iv)ｄＮＴＰ；
を含む、２本鎖の標的核酸分子の検出用キットである。
【００１１】
本発明の１本鎖の標的核酸分子を検出する方法に有用なキットは、
(i)１本鎖の標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプライマー
(ii)標的核酸分子の前記標的塩基配列の領域と異なる領域の標的塩基配列を有するプライマー；
(iii)(i)及び(ii)のプライマーの少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ；
(iv)鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；及び
(v)ｄＮＴＰ；
を含む、１本鎖の標的核酸分子の検出用キットである。
好ましくは、(vi)逆転写酵素を更に含む、前記検出用キットである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、新規で効率的な核酸増幅方法を提供する。
また本発明は、前記核酸増幅方法を利用して標的遺伝子の有無を検出する、簡易的且つ迅速な検出方法を提供する。この検出方法を用いることにより、病原性微生物やウイルスその他に特異的な標的遺伝子を簡易的な操作で迅速且つ明確に検出することができる。
また本発明は、これらの方法に有用な、プライマーと環状１本鎖ＤＮＡとの組合せを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の核酸増幅方法においては、ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応によって、増幅対象とする塩基配列を１回又は複数回反復して含む多様な鎖長の増幅産物が得られ、これらの増幅産物が鋳型又は複製起点として役割を果たす更なるＤＮＡポリメラーゼ伸長反応が連鎖的に進行して、増幅対象とする塩基配列を効率的に増幅することができる。
本発明の増幅対象の塩基配列（本明細書中では「標的塩基配列」とも呼ぶ）を含む鋳型ＤＮＡは１本鎖又は２本鎖の直鎖状又は環状のＤＮＡであり、この鋳型ＤＮＡ中に含まれる増幅対象の塩基配列は、鋳型ＤＮＡ中において特異的な領域の塩基配列である。また、本発明の方法は、逆転写酵素を用いてＲＮＡ分子に相補的な塩基配列を合成したｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして行うこともできる。この場合には、本発明の増幅対象の塩基配列は、ＲＮＡ分子中ウラシル（Ｕ）であった塩基がチミン（Ｔ）に置き換わった塩基配列である。
【００１４】
本発明の増幅方法に用いるプライマー対は、鋳型ＤＮＡ中の増幅対象の標的塩基配列に相補的な塩基配列を有するものであり、鋳型ＤＮＡに基づいて、プライマー対に挟まれた領域（プライマー対の塩基配列を含む）を直鎖状ＤＮＡ断片として得ることができるものであればよい。よって、鋳型ＤＮＡが２本鎖のＤＮＡである場合には、プライマー対の各プライマーは、別々の鎖上の標的塩基配列を有する。鋳型ＤＮＡが１本鎖のＤＮＡである場合には、プライマー対のうち一方のプライマーは、鋳型ＤＮＡ鎖上に存在する増幅対象の塩基配列とは異なる領域の標的塩基配列を有する。
本発明の方法は、少なくとも１つのプライマー対を用いて行うことができ、複数のプライマー対を用いる場合、その数に上限はないが、例えば入れ子として設計して用いることもできる。例えば１〜５対、好ましくは１〜３対、より好ましくは２〜３対、特に好ましくは２対である。
各プライマーは、対をなすプライマーや他のプライマー対のプライマーと同一の配列や相補的な配列を有していない方が好ましい。
対をなすプライマーが結合する領域間の相対距離（塩基数）は、本発明の反応が進行するのであれば特に制限はないが、最も内側のプライマー対のプライマーが結合する領域間の相対距離はより少ない方が好ましく、その外側のプライマー対と隣接する内側のプライマー対とが結合する領域間の相対距離もより少ない方が好ましい。上記相対距離（塩基数）は、好ましくは０ｂ〜１ｋｂであり、より好ましくは０〜１００ｂである。
本発明に使用するプライマーとしては、鋳型ＤＮＡと相補的な２重鎖を形成し得るのであれば特に制限はないが、８〜４０merのものが好ましく、より好ましくは１６〜２５merのものである。また、鋳型ＤＮＡ（標的塩基配列）又はプライマーのＧＣ含量、二次構造のとり易さ等、その他プライマー設計において一般的に考慮される性質についても、当業者の技術常識の範囲内のものである。このようなプライマーの設計及び合成は、本技術分野で通常用いられている設計プログラム等の手法を用いて行うことができる。
逆転写酵素を用いてＲＮＡ分子中の塩基配列を合成したｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いる場合も、同様に、該ＲＮＡ分子が２本鎖であるか１本鎖であるかに応じて、上述のようにプライマー対を設計することができる。
【００１５】
本発明の方法で使用する環状１本鎖ＤＮＡは、プライマー対の少なくとも一方のプライマーと同一の塩基配列を少なくとも１つ含むものであり、その少なくとも一方のプライマーと同一の塩基配列とは、増幅対象の塩基配列と相補的な塩基配列を有するものである。環状１本鎖ＤＮＡは、１つのプライマーと同一の塩基配列が一定の間隔で反復して複数含まれるように設計されてもよく、また異なる複数のプライマーと同一の塩基配列が１回又は複数回反復して含まれていてもよい。複数のプライマー対を用いる場合、環状１本鎖ＤＮＡに含まれる塩基配列は、最も内側に用いたプライマー対の塩基配列の少なくとも一方と同一であるのが好ましい。
環状１本鎖ＤＮＡ中、プライマーと同一の塩基配列以外の領域の塩基配列は、本発明が特異的に反応するのであれば特に制限はないが、少ない方が好ましい。また、３'→５'エキソヌクレア−ゼ活性を持たない鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、プライマーと同一の塩基配列の５'側にチミン（Ｔ）を１塩基付加することが好ましい。
環状１本鎖ＤＮＡの鎖長は、本発明が特異的に反応するのであれば特に制限はないが、１６ｂ〜１０ｋｂのものが好ましく、より好ましくは２０〜１００ｂである。このような環状１本鎖ＤＮＡの設計及び合成は、本技術分野で通常用いられている設計プログラム等の手法を用いて行うことができる。
本発明の方法で使用するＤＮＡポリメラーゼは鎖置換型５'-３'ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するものであり、塩基対の相補鎖を正しく合成するものが好ましい。また３'→５'エキソヌクレア−ゼ活性は持っていても良いが持っていないものが好ましく、５'→３'エキソヌクレア−ゼ活性は持たないものが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼの至適温度は、５０〜９０℃であるのが好ましく、より好ましくは６０〜７２℃である。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばBacillus stearothermophilus由来のBst DNA Polymerase large fragment、Pyrococcus属細菌由来のDeep VentR(R) (exo-) DNA polymerase(New England Biolabs Incorporation製)、Herculase(R)II Fusion DNA polumerase（STRATAGENE社製）、Thermococcus属由来のVentR(R) (exo-) DNA Polymerase、TherminatorTM DNA Polymerase 、TherminatorTMII DNA Polymerase (New England Biolabs Incorporation製）、KOD Dash DNA polymerase (東洋紡社製)といったものが、単独で、あるいはキットの形態で入手可能である。互いの酵素活性を妨げない限りは、２種類以上のＤＮＡポリメラーゼを併用することもできる。
【００１６】
ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応は、一般的な核酸増幅に使用されるバッファー（Tris-HCl、KCl、（NH4）2SO4、MgSO4などの塩類を含む）、例えば使用するＤＮＡポリメラーゼに付属の最適化された組成のものを用いてもよい。
上述するような適切なバッファーに、鋳型ＤＮＡ、本発明のプライマー対、本発明の環状１本鎖ＤＮＡ、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及び基質となる４種のデオキシリボヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を添加し、この反応溶液を鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが該酵素活性を有する温度、例えば５０〜９０℃、好ましくは６０〜７２℃に保つことによって、温度サイクル制御なしに同一容器内で１回の操作にて核酸を効率的に増幅することができる。また、複数のプライマー対を用いる場合は、本発明の反応温度条件をさらに低い条件、例えば３０〜５０℃に設定することができる。ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の温度条件は、用いる鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの活性を有する温度に依存する。使用する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが該酵素活性を有する温度の範囲内であれば、必ずしも増幅反応全体を通して同一温度（等温）を保たなくてもよいが、増幅反応全体を通して同一温度（等温）に保つこと（同一温度条件下）が好ましい。
核酸の増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応で核酸が増幅される際に反応溶液中で生成するピロリン酸マグネシウムの沈殿によって確認することができる（国際公開第２００１／０８３８１７号パンフレット）。また、本技術分野で通常使用される核酸染色蛍光色素など、例えばエチジウムブロミドやSYBR Green I(CAMBREX社製)等を常法に従って用いて、蛍光の有無や強度により、核酸の増幅を確認することもできる。
【００１７】
次に、図面を用いて、本発明の核酸の増幅方法の態様を具体的に説明する。
まず、第一段階で、増幅対象の特異的な塩基配列を含む鋳型ＤＮＡとプライマー対とのＤＮＡポリメラーゼ伸長反応によって、直鎖状ＤＮＡ断片が得られる（図１）。
２本鎖の鋳型ＤＮＡ中の２つの特異的な塩基配列の領域Ａ、Ｂを増幅対象とする場合、各領域の一方の鎖上の配列をＡ１及びＢ１、他方の鎖上の配列をＡ２及びＢ２と規定する。プライマー対のうち、一方のプライマーはＡ１と相補的な塩基配列、すなわちＡ２の塩基配列を有するように設計し、他方のプライマーはＢ２と相補的な塩基配列、すなわちＢ１を有するように設計する（図１、(i)）。
このプライマー対と前記鋳型ＤＮＡとのＤＮＡポリメラーゼ伸長反応によって、５'末端にＡ２と同一の塩基配列を有し３'末端にＢ２と同一の塩基配列を有する直鎖状ＤＮＡ断片と、５'末端にＢ１と同一の塩基配列を有し３'末端にＡ１と同一の塩基配列を有する直鎖状ＤＮＡ断片との組合せが得られる。この得られた直鎖状ＤＮＡ断片が、第二段階が開始される際の複製起点となる（図１、(ii)）。
第二段階で鋳型となる環状１本鎖ＤＮＡは、プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列（Ａ２及び/又はＢ１）を含むように設計する（図２、(i)）。図２では、Ａ２及びＢ１の各々と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡを示している。上述するように、得られる直鎖状ＤＮＡ断片は各々３'末端にプライマー対と相補的な塩基配列（Ａ１又はＢ２）を有するため、その直鎖状ＤＮＡ断片の３'末端領域（Ａ１、Ｂ２）が、環状１本鎖ＤＮＡ中のプライマー対と同一の塩基配列（Ａ２、Ｂ１）領域に対してアニールして複製起点となり、環状１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼ伸長反応が起こる（図２、(i)）。合成されたＤＮＡ鎖は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによって剥されながらローリングサークル様に伸長する（図２、(ii)）。その剥されて伸長するＤＮＡ鎖に対して、反応溶液中に存在するプライマーがアニールして複製起点となってＤＮＡポリメラーゼ伸長反応が起こり（図２、(iii)）、前記プライマーを複製起点として合成し剥されたＤＮＡ鎖は、反応溶液中に存在するプライマー又は環状１本鎖ＤＮＡに対してアニールしてＤＮＡポリメラーゼ伸長反応が起こる（図２、(iv)）。
上で説明する第一段階の過程と第二段階の過程は、一旦、第二段階を開始する引き金となる直鎖状ＤＮＡ断片が合成された後は並列して同時進行する。また、このように連鎖的な増幅反応が進行し、結果として、増幅対象の特異的な塩基配列を１回又は複数回反復して含む、多様な鎖長のＤＮＡ鎖が合成される。
【００１８】
本発明の別の態様は、上述の核酸増幅方法の原理を利用する、標的遺伝子の検出方法である。本検出方法は、検出目的、検出対象の試料の由来、標的遺伝子などに応じて、多様な産業において様々な場面で行うことができる。
標的遺伝子が検出される試料としては、例えば、ヒトその他動物由来の体液や組織片から調製したものであってもよく、環境由来の土壌や海水、植物から調製したものであってもよく、工場で製造・加工された飲料や食料品、医薬品などであってもよい。これらは、直接、あるいは必要に応じて、適当な操作を用いて核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）抽出液として調製して、検出対象の試料として本発明の検出方法に用いることができる。このような試料の調製は、一般的な核酸検出方法に使用される通常の手法に従って行うことができる。
標的遺伝子は、微生物（細菌、カビなど）、アレルゲン（例えばダニ、花粉など）、ウイルスに特異的なものでもよく、またヒトその他動物のゲノム中の野生型又は変異型の遺伝子であってもよい。
【００１９】
本検出方法は、上述の核酸増幅方法の「鋳型ＤＮＡ」及び「増幅対象の塩基配列」を、それぞれ本検出方法の「標的核酸分子（すなわち標的遺伝子）」及び「標的遺伝子中の標的塩基配列」と置き換え、試料中に標的核酸分子（すなわち標的遺伝子）が存在する場合には、上述の核酸増幅方法と同様の原理によって、標的遺伝子中の標的塩基配列の核酸が増幅されることを利用したものである。
２本鎖の標的核酸分子を検出する場合には、
(a)標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプライマー対、前記プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰを、検出対象の試料に添加して、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが活性を有する温度にて酵素反応させること；
(b)酵素反応させた試料中で、核酸が増幅されたか否かを確認すること；及び
(c)核酸が増幅された場合に、検出対象の試料中に２本鎖の標的核酸分子が存在すると決定すること；によって、標的核酸分子を検出することができる。
１本鎖の標的核酸分子を検出する場合には、２本鎖の標的核酸分子を検出する場合における「標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプライマー対」及び「前記プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ」は、それぞれ「標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプライマーと、標的核酸分子の前記標的塩基配列の領域と異なる領域の標的塩基配列を有するプライマーとの組合せ」及び「これらのプライマーの少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ」に置き換えて、標的核酸分子が２本鎖の場合と同様の操作により１本鎖の標的核酸分子を検出することができる。
【００２０】
標的核酸分子がＲＮＡの場合には、上記(a)の酵素反応の工程において、更に逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）を試料に添加して酵素反応させることにより、上述の核酸増幅方法と同様、試料中のＲＮＡ分子に対して合成されるｃＤＮＡ鎖を鋳型として核酸が増幅されるか否かを確認し、核酸が増幅された場合には標的ＲＮＡ分子が存在すると決定することによって、標的ＲＮＡ分子の存在を検出することができる。
核酸の増幅は、上述と同様に、ピロリン酸マグネシウムの沈殿や、本技術分野で通常使用される核酸染色蛍光色素などを用いて、沈殿や蛍光の有無を指標として確認することができる。また、ピロリン酸マグネシウムの生成量や蛍光の強度を指標として、検出対象の試料中に存在する標的遺伝子の核酸量の多少について比較することもできる。
このようにして、本検出方法を用いることにより、試料中に存在する標的遺伝子の核酸がごく微量であっても、同一の反応容器内で１回の操作にて、標的遺伝子中の特異的塩基配列を効率的に増幅して検出することができる。本検出方法は、例えばマイクロチューブ、マイクロウェルプレート、マイクロチップなどの反応容器内で行ってもよく、またＨＴＳ（High-Throughput Screening）などの技術を用いてもよい。
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例】
【００２１】
薬品名後に会社名を記していないものは、和光純薬工業社製である。また、特別に記さない限り、溶媒は水である。
(ＴＥバッファー組成)
４ｍmol/l  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス-ヒドロキシメチル-アミノメタン）塩酸
１ｍmol/l  エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム２水和物（ＥＤＴＡ）
ｐＨ８．０に調整
(１．２％ＴＡＥ電気泳動用ゲル)
１．２％アガロース
４ｍmol/l  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
１ｍmol/l  ＥＤＴＡ
１ｍmol/l  酢酸
(２．０％ＴＡＥ電気泳動用ゲル)
２．０％アガロース
４ｍmol/l  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
１ｍmol/l  ＥＤＴＡ
１ｍmol/l  酢酸
【００２２】
例１
［標的の調製方法］
下記に示す酵素製品、Kit製品は、特別に記さない限り取扱説明書に従った。
ｐＵＣ１９（タカラバイオ社）を制限酵素DraＩ（タカラバイオ社）処理後、１．２％ＴＡＥ電気泳動用ゲルを使用し、電気泳動漕であるMupid-ex（アドバンス社）を用いて電気泳動（１００Ｖ、５０分）を行った。
その後、核酸染色試薬SYBR GreenＩ（CAMBREX社製）で染色、ゲルからの目的ＤＮＡ断片（約２ｋｂ）の切り出し、ＤＮＡ抽出キットNucleoSpin Extract Kit（MACHEREY-NAGEL社）を用いて回収し、標的調製液（１０mmol/l）とした。
【００２３】
［環状１本鎖ＤＮＡの合成］
2008099673.tif 000002
表１のプライマー２本（４３C：７５nmol/l、Bind：１.６nmol/l）と耐熱性のＤＮＡ連結酵素（耐熱性リガーゼ）を混合し、下記に示した温度で酵素反応を行った。
９５℃、２分間          −工程１
９５℃、１０秒間        −工程２
６０℃、１０秒間        −工程３    工程２〜４を２５サイクル
７０℃、１０分間        −工程４
９８℃、２分間          −工程５
４℃、∞                −工程６
反応終了後、Genとるくん（タカラバイオ社）を添加し、エタノール沈殿を行った。その後、得られたＤＮＡのペレットを７５％エタノールで２回、９９．５％エタノールで１回洗浄し、６５℃で乾燥させた後に、超純水で３０μlに溶解した。
その溶解液にExonucleaseＩ（タカラバイオ社）を添加し、３７℃、６０分反応させた後、エタノール沈殿を行った。得られたＤＮＡのペレットを７５％エタノールで２回、９９．５％エタノールで１回洗浄し、６５℃で乾燥させた後に、ＴＥバッファーで３０μlに溶解し、環状１本鎖ＤＮＡ調製液とした。
【００２４】
［特異的遺伝子増幅］
遺伝子検出に用いたプライマーを表２に記す。共にHPLC精製を行っている（Invitrogen社製）。
2008099673.tif 000003
遺伝子検出反応には、下記を使用した。
酵素：Bst DNA ポリメラーゼ（New England Biolabs Incorporation製）４U/２５μl 
標的：標的調製液  ０．５μl/２５μl
λゲノム：λゲノム（タカラバイオ社）  ０．５ng/μl
(反応バッファー組成）
１/１０量            Bst DNA ポリメラーゼ付属のバッファー
１μmol/l            表２のプライマー（Forward-in、Reverse-in）
０．５mmol/l each    dNTP
１μmol/l             環状１本鎖DNA調製液
５％                 Dimethylsulfoxide
各試薬を表３の条件で混合し、９５℃にて５分間インキュベーションした後、４℃に急冷し、酵素を添加後、６３℃にて６０分間インキュベーションした。
【００２５】
［ＤＮＡ増幅の確認方法］
核酸染色試薬SYBR GreenＩを１/１０に希釈し、サンプル２５μlに対して１μlを混合し、３０２nmの波長を当て高感度フィルターで観察した。結果を表３と図３、４に示す。
2008099673.tif 000004
以上の実験１〜６の結果から、酵素＋標的を含むもの（実験３および実験６）では迅速な核酸の増幅が確認された。一方、酵素は存在するが標的を含まないもの（実験２および実験５）では、核酸の増幅は確認されなかった。また、標的配列以外のＤＮＡを含んでいても核酸の増幅は確認されなかった（実験５）ことから、配列を特異的に認識していることが確認された。尚、酵素を含んでいないもの（実験１および実験４）については核酸の増幅は起こっていない。
【００２６】
例２
［特異的遺伝子増幅］
例１と同様に調製した環状１本鎖ＤＮＡ調製液を用いて特異的遺伝子増幅を行った。
遺伝子検出に用いたプライマーを表４に記す。共にHPLC精製を行っている（Invitrogen社製）。
2008099673.tif 000005
遺伝子検出反応には、下記を使用した。
酵素：Bst DNA ポリメラーゼ（New England Biolabs Incorporation製）４U/２５μl 
標的：標的調製液  ０．５μl/２５μl
λゲノム：λゲノム（タカラバイオ社）  ０．５ng/μl
(反応バッファー組成）
１/１０量            Bst DNA ポリメラーゼ付属のバッファー
１μmol/l            表４のプライマー（Forward-in、Reverse-in）
０．２μmol/l        表４のプライマー（Forward-out、Reverse-out）
０．５mmol/l each    dNTP
１μmol/l             環状１本鎖DNA調製液
５％                 Dimethylsulfoxide
各試薬を表５の条件で混合し、９５℃にて５分間インキュベーションした後、４℃に急冷し、酵素を添加後、６３℃にて６０分間インキュベーションした。
【００２７】
［ＤＮＡ増幅の確認方法］
核酸染色試薬SYBR GreenＩを１/１０に希釈し、サンプル２５μlに対して１μlを混合し、３０２nmの波長を当て高感度フィルターで観察した。結果を表５に示す。
2008099673.tif 000006
以上の実験７〜１２の結果から、酵素＋標的を含むもの（実験９および実験１２）では迅速な核酸の増幅が確認された。一方、酵素は存在するが標的を含まないもの（実験８および実験１１）では、核酸の増幅は確認されなかった。また、標的配列以外のＤＮＡを含んでいても核酸の増幅は確認されなかった（実験１１）ことから、配列を特異的に認識していることが確認された。尚、酵素を含んでいないもの（実験７および実験１０）については核酸の増幅は起こっていない。
上記実施例のように、本発明により核酸配列を特異的に認識し、かつ迅速な核酸増幅が可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の核酸増幅方法の原理（第一段階）を示す。
【図２】本発明の核酸増幅方法の原理（第二段階）を示す。
【図３】表３の実験結果（実験１〜実験３）を示す。
【図４】表３の実験結果（実験４〜実験６）を示す。
【図５】表３の実験１〜実験３のサンプルの電気泳動の結果を示す。
【図１】
2008099673.tif 000007
【図２】
2008099673.tif 000008
【図３】
2008099673.tif 000009
【図４】
2008099673.tif 000010
【図５】
2008099673.tif 000011
【配列表】
2008099673000001.app