(57)【要約】【課題】一つの統一された方法で、化合物、抗体、脂質等のリンカーを介さずに、様々な糖類を直接固体表面上に固定化する方法の提供。【解決手段】糖類のアルデヒドと一般式：Ｈ２Ｎ−Ｘ−ＳＨで示されるリンカー化合物とを反応させて、糖類にＳＨ基を導入し、このＳＨ基を介して、固体表面上に糖類を固定化する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元糖を固体表面上に直接固定化する方法であって、
一般式（Ｉ）：Ｒ−ＣＨＯ［式中、Ｒは、アルデヒド基を除く還元糖の部分。］で示されるアルデヒド基を有する還元糖を、
一般式（ＩＩａ）：Ｈ２Ｎ−Ｘ−ＳＨ
［式中、Ｘは炭素数１〜３のアルキレン基またはフェニレン基。］で示されるアミノ基およびチオール基を分子内に有する化合物、または
一般式（ＩＩｂ）：Ｈ２Ｎ−Ｙ−Ｓ−Ｓ−Ｚ−ＮＨ２
［式中、ＹおよびＺは、同一または異なって、炭素数１〜３のアルキレン基またはフェニレン基。］で示されるアミノ基およびジスルフィド結合を分子内に有する化合物と２０〜４０℃にて反応させて、シッフ塩基を調製し、ついで、得られたシッフ塩基をボラン化合物の存在下、２０〜４０℃にて還元して、
一般式（ＩＩＩａ）：Ｒ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｘ−ＳＨ
［式中、ＲおよびＸは、それぞれ、上記定義と同じである。］で示されるチオール修飾還元糖、または
一般式（ＩＩＩｂ）：Ｒ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｙ−Ｓ−Ｓ−Ｚ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｒ
［式中、Ｒ、ＹおよびＺは、それぞれ、上記定義と同じである。］で示されるジスルフィド修飾還元糖を調製し、ついで、
一般式（ＩＩＩａ）で示されるチオール修飾還元糖または一般式（ＩＩＩｂ）で示されるジスルフィド修飾還元糖を固体表面に接触させることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ボラン化合物が、ＢＨ３・ＨＮ(ＣＨ3) ２である請求項１記載の方法。
【請求項３】
還元糖とタンパク質との間の相互作用力を測定する方法であって、
一般式（ＩＩＩａ）：Ｒ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｘ−ＳＨ
［式中、Ｒは、アルデヒド基を除く還元糖の部分であって、Ｘは炭素数１〜３のアルキレン基またはフェニレン基である。］で示されるチオール修飾還元糖、または
一般式（ＩＩＩｂ）：Ｒ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｙ−Ｓ−Ｓ−Ｚ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｒ
［式中、Ｒは、アルデヒド基を除く還元糖の部分であって、ＹおよびＺは、同一または異なって、炭素数１〜３のアルキレン基またはフェニレン基である。］で示されるジスルフィド修飾還元糖を原子間力顕微鏡のカンチレバーのプローブ表面に固定化し、前記還元糖の部分との間の相互作用力を測定すべきタンパク質を固体基板に固定化し、還元糖固定化プローブとタンパク質固定化固体基板との距離を変化させつつ、フォースカーブを得、
得られたフォースカーブから、前記還元糖の部分と前記タンパク質との間の結合の破断力を求め、前記破断力に基づき相互作用力を評価することを特徴とする方法。
【請求項４】
前記カンチレバーのプローブ表面が金で被覆されている請求項３の方法。
【請求項５】
１または複数の還元糖が固体表面上に直接固定化されているバイオチップであって、
基板；
前記基板上に形成された１または複数の電極配線；
前記１または複数の電極配線を被覆する絶縁膜；および
前記１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって形成された１または複数のセンシング部を含み、
ここに、前記１または複数の還元糖は前記１または複数のセンシング部の底部に露出した電極配線の表面に直接固定化されていることを特徴とするバイオチップ。
【請求項６】
少なくとも、作用電極、対極および参照電極を含むバイオセンサーであって、
ここに、前記作用電極は、請求項５に記載のバイオチップであることを特徴とするバイオセンサー。
【請求項７】
請求項６に記載のバイオセンサーの作用電極、対極および参照電極を、被検試料を含有しない対照溶液に浸漬し、前記作用電極を処理する前に、前記作用電極の第１の電気的信号を測定し；
前記バイオセンサーの作用電極、対極および参照電極を、被検試料を含有する試験溶液に浸漬し、前記作用電極を被検試料で処理した後、前記作用電極の第２の電気的信号を測定し；次いで、
第１の電気的信号と第２の電気的信号との強度差から、試験溶液中に存在する毒素タンパク質を検出する方法。
【請求項８】
第１および第２の電気的信号が、酸化還元電流値である請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多様な炭化水素、特に、糖類を固体表面上に直接固定化する方法に関する。さらに、本発明は、糖類とタンパク質との間の相互作用を検出する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
生物において、全ての活性は、生体物質の相互作用に起因する。これらの生体物質は、細胞の多くの生物学的活性を制御し媒介する。これらの生体物質のなかでも、タンパク質は重要な役割を演じる。いくつかのタンパク質は、主に単一の単量体（例えば、小分子基質における変化を触媒する酵素）として機能するが、全てのタンパク質の大部分でないとしても、かなりの割合のタンパク質が、パートナー分子と関連して、または、分子集合体の成分として機能する。
ＤＮＡ、炭化水素、脂質その他の細胞成分も互いに関連し、細胞中でイベントを行っている。かくして、細胞機能の理解を得るためには、単離した状態および相互作用した状態の双方で、これらの生体物質の機能を理解するべきである。
しかしながら、細胞は静的なものではなく、内的および外的に発生した信号が、形状、分化、生存度、代謝その他の固有特性を変化させているため、このプロセスは複雑である。
【０００３】
多くの研究者により、全てのイベント、相互作用の観察が試みられているが、体系的な観察は不可能である。したがって、研究者は、迅速かつ容易に標的相互作用を検出するセンサーを開発してきた。これらのセンサーからの信号はイベントの各情報から獲得され、メカニズムを理解するために統合される。
たくさんの分析ツールが一つの相互作用の同定を可能にする。ほとんどの簡便かつ有用な方法は、相互作用する標的生体物質に蛍光マーカーを標識することである。より精密な光学顕微鏡の開発が、蛍光マーカーの使用を促進し、相互作用はイン・ビボで容易に検出可能になった。
【０００４】
生体内では、タンパク質−タンパク質、タンパク質−化合物、タンパク質−炭化水素および炭化水素−炭化水素の間で様々な相互作用が起きている。このような相互作用は、生物学的に意味のあるイベントを開始させ、その結果、細胞すなわち生体組織はその代謝を維持することができる。
上記の相互作用のなかでも、炭化水素−タンパク質相互作用が生物の細胞間コニケーション、シグナリング、細胞接着、受精および免疫学的プロセスにおいて、重要な役割を演じる。これらの相互作用は、細菌毒性タンパク質やウイルスによる宿主細胞の感染も開始する。したがって、炭化水素−タンパク質相互作用の分子関係を理解することは、生物における生物学的プロセスについての有用な情報が得られるだけではなく、有効なバイオ医療薬の開発の助けとなる。
【０００５】
炭化水素は、様々な物質を占める大きな成分分類を構成し、科学、生物学、物質科学および関連分野において重要な役割を演じる。生物学系において、特に、炭化水素の研究は基礎的生化学プロセスを調査し、新規医薬物質を同定する有望な成果であると認識されている。核酸やタンパク質に加えて、炭化水素は生物学的機能を決定し、広範囲にわたる生理学的プロセスに影響する。したがって、それらを研究し、特徴付けることの重要性は増大していく。
【０００６】
生体内における炭化水素は、単糖、オリゴ糖、多糖として存在し、一般に、糖類は、単糖として存在する場合、細胞の主なエネルギー源として利用されている。また、オリゴ糖または多糖の構造体を形成するときにはエネルギー源の蓄積のみならず、細胞表面の支持体としての役割と同時にタンパク質を認識する標識者の役割をする。また、このような糖類は、化学、生物学、物理化学、材料工学およびそれらの関連分野の応用で重要な役割をする。
【０００７】
多くの病原菌によって産生されるタンパク毒はもっとも特徴的な毒性因子である。これらの毒素は、典型的に、宿主細胞上のオリゴ糖受容体に結合する。
例えば、ビブリオコレラ毒性タンパク質は非常によく知られた病原体であり、ＡＢ５ファミリーに属し、酵素活性および毒性を有するＡサブユニットおよび分子の受容体結合部位を形成する５つのＢサブユニットから構成される。５つのＢサブユニットは同一であり、細胞表面受容体の炭化水素部分へ五量体で付着する。
また、ビブリオコレラ毒性タンパク質は高い相互作用により、Galβ1→3GalNacβ1→4(NeuAcα2→3)Galβ1→4Glc1→1'セラミド構造を有するガングリオシドＧＭ１と結合し、この相互作用は、ＡＢ５ファミリー毒と受容体との間の標準的な糖類−タンパク質相互作用であると認識されている。
【０００８】
すなわち、糖類は核酸やタンパク質のように基本的な生物学的機能を決定する重要な役割とともに、広い範囲の生理学的な作用に影響を及ぼす重要な生化学的要素である。特に、生物学的な観点からの糖類とタンパク質との間の相互作用の研究は、基礎的な生物学的作用を明らかにすることにより新薬開発にも非常に役に立つことである。
【０００９】
糖類の生物学的作用の基礎研究のため、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、電気化学検出法（ＥＣ）等の観察手法が有用である。これらの観察手法において、対象を直接固体表面上に固定化する必要がある。
【００１０】
また、近年、新薬開発プロセス、医療診断等などの分野において、バイオチップが注目され、研究開発が盛んに進められている。
バイオチップとは、固体表面上（固相化担体としては、シリコン基板、ガラス基板、高分子、金基板など）にＤＮＡ等の核酸、酵素や抗体のごときタンパク質、ペプチド等のバイオ分子アレイ、あるいは細胞等を固定化し、固定化されたバイオ分子アレイ等のプローブ物質に特定のターゲット物質が結合したときに生じる特異的な反応を検出するものである。
バイオチップの代表例として、基板上にＤＮＡを高密度に固定化し、ハイブリダイゼーションにより相補的な配列の存在を検出するＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）や、タンパク質を固定化し相互作用するタンパク質を検出するタンパク質チップ（プロテインチップ）やなどがある［特許文献１、２、３、４］。
同様に、糖類を固体表面に固定化すれば、糖類チップを作製することができ、糖類を基質とするタンパク質の検出に有用である。
【００１１】
したがって、糖類の分析や単糖類から複雑な構造をもつ糖タンパクあるいは糖脂質の糖類を固定化させるための方法が報告されてきた。糖類を固体表面に固定化させることは糖類をより容易に応用しようとすることであり、関連研究が多く報告されている。
【００１２】
ＡＦＭ、ＳＰＲおよびＥＣによる分析を行うためには、ガングリオシドＧＭ１などの標的炭化水素を固体基板の表面に共有結合させなければならない。
【００１３】
このガングリオシドＧＭ１は細胞膜の成分であり、セラミド成分のため膜に固定されている。しかしながら、セラミド結合炭化水素部分の固体表面へのイン・ビトロ固定化は疎水性相互作用を用いる限定的な方法である［非特許文献１］。
共有結合のため、Niらは、マレイミド活性化炭化水素を合成して、システイン含有ペプチドおよびタンパク質の部位特異的グリコシル化を行った［非特許文献２］。Nyquistらは、チオアセチルＧＭ１糖脂質の合成にｌｙｓｏ−ＧＭ１を用いた［非特許文献３］。
【００１４】
しかしながら、これら２つの共有結合の方法は、合成を特定の炭化水素部分に限定し、２’−アミノエチルグリコシドか修飾セラミドのｌｙｓｏ形態にしか適用できない。
また、糖類を直接固体表面に固定化させることではなく、化合物、抗体、脂質等のリンカーを介して、間接的に固定化させる方法が報告されているにすぎず、さらに、糖類を一つの統一された方法で固定化するのではなく、特定の糖類を特定の方法で固定化させる研究結果しか報告されていない。
【００１５】
【特許文献１】特開２００５−１６４３８７
【特許文献２】特開２００５−１６４３８８
【特許文献３】特開２００６−１５３７３３
【特許文献４】特願２００６−２０６８２２
【非特許文献１】Valdes-Gonzalez, T., J. Inagawa, and T. Ido. 2001. Neuropeptides interact with glycolipid receptors - A surface plasmon resonance study. Peptides 22:1099-1106.
【非特許文献２】Ni, J. H., S. Singh, and L. X. Wang. 2003. Synthesis of maleimide-activated carbohydrates as chemoselective tags for site-specific glycosylation of peptides and proteins. Bioconjugate Chemistry 14:232-238.
【非特許文献３】Nyquist, R. M., A. S. Eberhardt, L. A. Silks, Z. Li, X. Yang, and B. I. Swanson. 2000. Characterization of self-assembled monolayers for biosensor applications. Langmuir 16:1793-1800.
【非特許文献４】Hase, S. 1994. High-performance liquid chromatography of pyridylaminated saccharides. Methods in Enzymology 230:225-237.
【非特許文献５】Natsuka, S., and S. Hase. 1998. Analysis of N- and O-glycans by pyridylamination. Methods in Molecular Biology 76:101-113.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
そこで、本発明は、一つの統一された方法で、化合物、抗体、脂質等のリンカーを介さずに、様々な糖類を直接固体表面上に固定化する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、還元糖を直接固体表面に固定化するために、固体表面に結合するアンカーを還元糖に導入するための新規な修飾方法を開発した。
チオール基（−ＳＨ）またはジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）は金などの固体表面に結合するため、アンカーとして好ましい。
また、本発明に用いる還元糖は、その直鎖構造において、末端にアルデヒド基を有する。従来、還元糖のアルデヒド基と２−アミノピリジンとの間のシッフ塩基反応に基づくピリジルアミノ化（図１）が行われており、逆相ＨＰＬＣ分析において高感度かつ高分離能のため糖コンジュゲートからグリカンアナログの分析に広く用いられている［非特許文献４および５］。
【００１８】
そこで、本発明は、ピリジルアミノ化を改良し、分子内にアミノ基とチオール基またはジスルフィド結合とを有する化合物を用いて、アンカーとしてチオール基またはジスルフィド結合を還元糖に導入する修飾方法を提供する。この修飾方法は還元糖を用いる点で、ピリジルアミノ化と同じであるが、糖脂質、糖タンパク質その他の炭化水素を含む全ての炭化水素部分に用いることができるので、より有用である。
【００１９】
本発明において、ピリジルアミノ化で用いられるアミノピリジンの代わりに、分子内にアミノ基とチオール基またはジスルフィド結合とを有する化合物を用いて、還元糖を修飾する。本発明において、分子内にアミノ基とチオール基またはジスルフィド結合とを有する化合物として、例えば、４−アミノベンゼンチオール（Ｈ２Ｎ−Ｃ６Ｈ４−ＳＨ）または４−アミノフェニルジスルフィド（Ｈ２Ｎ−Ｃ６Ｈ４−Ｓ−Ｓ−Ｃ６Ｈ４−ＮＨ２）が挙げられる。
【００２０】
図２に、本発明の修飾方法の反応スキームを示す。還元糖修飾の第１段階として、ｐＨ３から４程度の酸性条件下で、上記化合物のアミノ基と還元糖のアルデヒド基とを反応させてシッフ塩基を調製する。シッフ塩基は分子内にＣ＝Ｎ二重結合を有し、酸やアルカリで容易に分解するため、第２段階として、シッフ塩基を還元して安定化することによって、チオール基またはジスルフィド結合を修飾した本発明の還元糖を得る。
本発明において、還元糖の修飾により得られたシッフ塩基は、水溶性であるため、このシッフ塩基を還元する還元剤として、水溶性であることが要件である。また、還元性が強い場合には、糖部分を分解してしまうおそれがあるため、還元力の弱い還元剤を用いる必要がある。
これら２つの要件を満たす還元剤として、ボラン化合物が挙げられる。ボランＢＨ３は気体であるため、シッフ塩基水溶液に通気する必要がある。また、毒性が強いため、取り扱いには注意が必要である。
ボランとルイス塩基との錯体は安定な固体であるため計量が容易であり、還元剤として市販されているため入手しやすい。ボランとルイス塩基との錯体として、例えば、ＢＨ３・ＨＮ（ＣＨ３）２が挙げられる。
【００２１】
より詳しくは、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）  還元糖を固体表面上に直接固定化する方法であって、
一般式（Ｉ）：Ｒ−ＣＨＯ［式中、Ｒは、アルデヒド基を除く還元糖の部分。］で示されるアルデヒド基を有する還元糖を、
一般式（ＩＩａ）：Ｈ２Ｎ−Ｘ−ＳＨ
［式中、Ｘは炭素数１〜３のアルキレン基またはフェニレン基。］で示されるアミノ基およびチオール基を分子内に有するリンカー化合物、または
一般式（ＩＩｂ）：Ｈ２Ｎ−Ｙ−Ｓ−Ｓ−Ｚ−ＮＨ２
［式中、ＹおよびＺは、同一または異なって、炭素数１〜３のアルキレン基またはフェニレン基。］で示されるアミノ基およびジスルフィド結合を分子内に有するリンカー化合物と２０〜４０℃にて反応させて、シッフ塩基を調製し、ついで、得られたシッフ塩基をボラン化合物の存在下、２０〜４０℃にて還元して、
一般式（ＩＩＩａ）：Ｒ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｘ−ＳＨ
［式中、ＲおよびＸは、それぞれ、上記定義と同じである。］で示されるチオール修飾還元糖、または
一般式（ＩＩＩｂ）：Ｒ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｙ−Ｓ−Ｓ−Ｚ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｒ
［式中、Ｒ、ＹおよびＺは、それぞれ、上記定義と同じである。］で示されるジスルフィド修飾還元糖を調製し、ついで、
一般式（ＩＩＩａ）で示されるチオール修飾還元糖または一般式（ＩＩＩｂ）で示されるジスルフィド修飾還元糖を固体表面に接触させることを特徴とする方法。
（２）前記ボラン化合物が、ＢＨ３・ＨＮ（ＣＨ３）２である（１）に記載の方法。
（３）  還元糖とタンパク質との間の相互作用力を測定する方法であって、
一般式（ＩＩＩａ）：Ｒ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｘ−ＳＨ
［式中、Ｒは、アルデヒド基を除く還元糖の部分であって、Ｘは炭素数１〜３のアルキレン基またはフェニレン基である。］で示されるチオール修飾還元糖、または
一般式（ＩＩＩｂ）：Ｒ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｙ−Ｓ−Ｓ−Ｚ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｒ
［式中、Ｒは、アルデヒド基を除く還元糖の部分であって、ＹおよびＺは、同一または異なって、炭素数１〜３のアルキレン基またはフェニレン基である。］で示されるジスルフィド修飾還元糖を原子間力顕微鏡のカンチレバーのプローブ表面に固定化し、前記還元糖の部分との間の相互作用力を測定すべきタンパク質を固体基板に固定化し、還元糖固定化プローブとタンパク質固定化固体基板との距離を変化させつつ、フォースカーブを得、
得られたフォースカーブから、前記還元糖の部分と前記タンパク質との間の結合の破断力を求め、前記破断力に基づき相互作用力を評価することを特徴とする方法。
（４）前記カンチレバーのプローブ表面が金で被覆されている（３）の方法。
（５）１または複数の還元糖が固体表面上に直接固定化されているバイオチップであって、
基板；
前記基板上に形成された１または複数の電極配線；
前記１または複数の電極配線を被覆する絶縁膜；および
前記１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって形成された１または複数のセンシング部を含み、
ここに、前記１または複数の還元糖は前記１または複数のセンシング部の底部に露出した電極配線の表面に直接固定化されていることを特徴とするバイオチップ。
（６）少なくとも、作用電極、対極および参照電極を含むバイオセンサーであって、
ここに、前記作用電極は、（５）に記載のバイオチップであることを特徴とするバイオセンサー。
（７）（６）に記載のバイオセンサーの作用電極、対極および参照電極を、被検試料を含有しない対照溶液に浸漬し、前記作用電極を処理する前に、前記作用電極の第１の電気的信号を測定し；
前記バイオセンサーの作用電極、対極および参照電極を、被検試料を含有する試験溶液に浸漬し、前記作用電極を被検試料で処理した後、前記作用電極の第２の電気的信号を測定し；次いで、
第１の電気的信号と第２の電気的信号との強度差から、試験溶液中に存在する毒素タンパク質を検出する方法。
（８）第１および第２の電気的信号が、酸化還元電流値である（７）に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の目的は、糖類−タンパク質間、特に、ガングリオシドＧＭ１とビブリオコレラ毒性タンパク質間の相互作用メカニズムを明らかにすることにある。本発明において、両者の間の正確な相互作用を調べるため、３つのバイオナノテクノロジーを用いる。相互作用力を測定するために原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用い、フローシステムでのキネティクスを算出するために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用い、高感度オン／オフ検出システムとして電気化学分析を用いる。
各分析手法は個別には利点があるが、制約もある。各分析手法から得られた結果を統合して、これらの分析手法の相関から正確な相互作用メカニズムを検討する。これは、細胞膜レベルでの毒性メカニズムを理解する上でも有用であろう。さらに、この分析手法は他の特異的相互作用にも適用可能である。
【００２３】
実施例１：単糖類グルコースへのチオール基導入
まず、単糖類グルコース（分子量１８０）へのチオール基（ＳＨ基）導入を試みた。
グルコースをチオール修飾するための反応スキームを図２に示す。ピリジルアミノ化についての先行技術や市販のキット付属のマニュアルによれば、反応は９０または８０℃で１時間行われる。しかしながら、この加熱条件下では、糖類が分解する可能性がある。さらに、チオール修飾の第１段階で得られるシッフ塩基が不可逆的なアマドリ転位を起こして、所望するチオール修飾還元糖が得られない可能性がある。そこで、この実施例において、反応を２０〜４０℃で行った。
この温度範囲で反応を行えば、上記した分解反応や副反応を抑制することができ、また室温で簡便に反応を行うことができるので、利点が多い。
【００２４】
２０、３０および４０℃の各温度にて、５０ｍＭのグルコースと２５ｍＭの４−アミノフェニルジスルフィドを１：１の水／酢酸混合溶媒２ｍＬ中で反応させて、グルコース誘導シッフ塩基を調製した。
このときの溶液のｐＨは３から４の間であった。このような低ｐＨ条件で、シッフ塩基は効率よく進行するが、ジスルフィド結合は開裂しない。
以下の反応で、還元剤の投与によりジスルフィド結合が開裂し、チオール基となる。このチオール基同士は、緩和な酸化剤によりジスルフィド結合を形成し、還元剤によりチオール基に戻る。
【００２５】
シッフ塩基反応により、Ｃ＝Ｎ二重結合が生成する。この反応によりアミノベンゼンチオール部位のπ共役系が広がり、黄色を呈する。そこで、４００ｎｍでの生成物の吸光度の経時変化を測定することによって、反応を追跡した。その結果を図３に示す。
２０℃での反応に対する吸光度データから、２時間程度で、３０℃および４０℃での反応と比較して低いレベルで飽和した。
また、反応時間は、反応の第１段階で得られるシッフ塩基のアマドリ転位や糖の分解が発生しないように、反応温度に依存して変化する。例えば、２０℃で反応を行った場合、適当な反応時間は、２時間以内、好ましくは１時間以内、より好ましくは、１５分以上３０分以内である。一方、４０℃では、反応が急激に進行しているため、３０分以内に終了することが好ましい。
【００２６】
次に、１００ｍＭのＢＨ３・ＮＨ（ＣＨ３）２の存在下、水溶液中で得られたシッフ塩基を還元し、溶媒を除去した後、Ｈ２Ｏを溶出液とするカラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、水溶性の黄色粉末として最終生成物を得た。
【００２７】
最終生成物の１Ｈ−ＮＭＲ測定から、反応により６ｐｐｍ付近にアミン結合に由来するピークが出現したことが分かる（図４）。この結果は、グルコースと４−アミノベンゼンチオールが反応した結果、このアミン結合が形成されたことを示す。
この生成物の正確な質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより測定した。チオール修飾グルコースの質量の計算値は２８９であり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる測定値は２９０であった（図５）。
これらの結果から、本発明の方法により、チオール基で修飾された単糖類グルコース（ＧｕｌＳＨ）が合成されたことが確認された。
所望により、適当な酸化条件下で、チオール修飾糖類を反応させて、ジスルフィド結合を有する二量体を形成することもできる。
【００２８】
チオール修飾グルコースの結合能を確認する方法として、チオール修飾グルコースを金表面上で処理することによって、ＳＰＲ分析を行った（図６）。対照実験として、未処理グルコースをインジェクションしてもＲＵに変化は生じなかったが、チオール修飾グルコースをインジェクションすると、ベースラインが９００ＲＵ上昇した。この結果から、チオール修飾グルコースがチオール基を介して直接金基板上に固定化されたことが示された。
【００２９】
実施例２：多糖類へのチオール基導入
実施例１と同様に、５ｍＭの多糖類を２．５ｍＭの４−アミノフェニルジスルフィドと反応させた。ここで、多糖類として、セラミド部分を除去したＧＭ１を用いた（図７）。反応は、２０、３０および４０℃の各温度にて行った。実施例１でのグルコースと比較して、ＧＭ１の濃度が低いため、４００ｎｍにおける吸光度は低いが、３０℃以上で、ＧＭ１がチオール修飾されることが分かった（図８）。
実施例１と同様に、カラムクロマトグラフィーにより精製して、水溶性の黄色粉末として最終生成物を得た。
カラム精製した最終生成物の正確な質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより測定した。チオール修飾ＧＭ１の質量の計算値は、Ｎａを除くと１１０８、Ｎａを含めた場合１１３０であり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる測定値は、それぞれ、１１０８および１１３０であった（図９）。
したがって、本発明の方法により、チオール基で修飾された多糖類ＧＭ１（ＧＭ１ＳＨ）が合成されたことが確認された。この条件で得られたチオール修飾ＧＭ１を便宜上ＧＭ１ＳＨ１と表記する。
所望により、適当な酸化条件下で、チオール修飾糖類を反応させて、ジスルフィド結合を有する二量体を形成することもできる。
【００３０】
しかしながら、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果から分かるように、多くの副生成物が生成している。そこで、目的の生成物の収率を向上させるため、ＧＭ１の反応量を１０倍にして（１００ｍＭ）、３０℃にて４−アミノフェニルジスルフィドと反応させた。カラム精製した最終生成物についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果から、依然として副生成物が検出されたが、収率が向上し、副反応は抑制された（図１０）。この条件で得られたチオール修飾ＧＭ１を便宜上ＧＭ１ＳＨ２と表記する。
【００３１】
実施例３：表面プラズモン共鳴法による相互作用キネティクス分析
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法は、キネティックデータ（巨大分子間の相互作用についての微視的速度定数）を収集するための手段を提供する。この原理を図１１に示す。
ＳＰＲ現象は、導電性薄膜において屈折率が異なる媒体の界面で発生する（図１１）。入射角とエネルギー（波長）と特定の組合せで、入射光は導電性薄膜のプラズモン（電子電荷密度波）を励起する。このとき、自由電子モデルで表される自由電子挙動を示さなければならないため、導電性薄膜に用いる金属の選択が重要である。一般に、安定性のため、金が用いられる。エバネッセント波によるエネルギーの特性吸収が生じ、ＳＰＲは、特定の入射（ＳＰＲ角）にて、反射光の強度の低下として見られる。
リガンドがセンサーチップに付着するか、または、分析物がリガンドに結合したとき、センサーチップ表面の濃度が増加し、ＳＰＲ反応を生じ、ＳＰＲ角のＳＰＲ変化として観察される（図１２）。特定の屈折率の寄与（すなわち、濃度の単位変化により生じた屈折率の変化）は組成によらず様々なタンパク質で非常に似通り、他の巨大分子の値は同一のオーダーである。その結果、測定された応答は結合した分析物の質量に関連し、分析物の特性にあまり依存しない。異なる分子に対する屈折率の寄与は付随的なものであり、そのため、付着した検出分子量および結合した分析物量の双方を同じ検出原理で測定することができる。
【００３２】
ＳＰＲを測定することができる市販の機器の導入は巨大分子相互作用の研究を簡便にし、少量の分析物で、分子間相互作用のリアルタイム観察を可能にした。
面倒なサンプル調製を必要とせずに、吸着や分解などの動的プロセスを迅速に観察できるため、表面相互作用を検出するためのＳＰＲの使用は有利である。吸着の速度および度合いについての情報を迅速に得ることができ、誘電特性、会合／分離キネティクスおよび特異的リガンド−分析物相互作用のアフィニティー定数の決定を可能にする。
この実施例では、相互作用キネティクスを得るための相対比較ツールとしてＳＰＲ分析を用いる。ＳＰＲの結果は定量的ではないが、定量分析としては良好なシステムである。
【００３３】
今まで、ビブリオコレラ毒素の毒性メカニズムにおいて、ガングリオシドＧＭ１とＢサブユニットとの相互作用が研究の対象とされてきたが、Ａサブユニットも毒性メカニズムに関与し、ｃＡＭＰレベルの増大に重要な役割を演じるため、Ａサブユニットが参加する相互作用特性を比較する必要がある。
比較ＳＰＲ相互作用分析のため、まず、ＡおよびＢサブユニットを用いた。Ａサブユニットの構造解析の結果（図１３）、ＡサブユニットのＮ末端が、Ｂサブユニットと相互作用している。そのため、Ａサブユニットは、ＢｉＡＣｏｒｅＣＭ５チップのデキストランと共有結合するはずである。
Ａサブユニットがデキストラン表面へ結合するとき、２００μｇ／ｍＬのＡサブユニットを１０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４）と混合し、固定化効率を上昇させた。Ａサブユニットを金チップ上に固定化した後、Ｂサブユニットを１００、５０、２５、１０または５μｇ／ｍＬの濃度で、連続してインジェクションした。ＡおよびＢサブユニット間の相互作用について記載された比較データは公開されていないため、直接分析は不可能であるが、ある程度合理的な範囲のキネティクスデータが得られた（図１４）。
【００３４】
実施例４：電気化学検出法による相互作用オン／オフ分析
基本的な科学的疑問に答えるため、および、実用的なアプリケーションのため、生体分子と電子部品とを統合して機能的な装置を構築することが魅力的である。バイオエレクトロニクスの分野の主たる活動は、電子信号の形態で生体認識または生体触媒プロセスをトランスデュースするバイオセンサーの開発に関する。それゆえ、この分野は主に医療およびバイオテクノロジー工業において抗体−抗原またはＤＮＡ−タンパク質をセンシングする免疫センサーとして開発されてきた。
【００３５】
比較可能な機器感度を有し、しかも、小型化が可能であるため、電気化学免疫センサーは顕著な利点を有する。さらに、バルクの溶液ではなく金属電極表面上で発生する電気化学反応を測定するため、検出時間も著しく短縮される。電気化学免疫センサーは、通常、電気化学トランスデューサーおよびこのトランスデューサー表面上に固定されたインタラクティブな物質からなる。リガンド−受容体会合の相互作用は差電気化学反応の発生をもたらす。
【００３６】
この実施例において、直接電場および、標的インタラクティブ分子のハイブリダイゼーションに起因するＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６溶液の実測電気化学反応変化を用いて、生体分子間（五糖類毒素Ｂ−毒素Ａサブユニット）の相互作用を検出した。この検出法は高い再現性と感度を示した。
【００３７】
電気化学検出において、２つのパラメータ（ＣＶおよびＳＷＶ）が非常に重要である。バイオ機能表面上での固定化およびハイブリダイゼーション後のサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）データを図１５ａに示す。この図から、標的生体分子のハイブリダイゼーションにより、酸化還元ピーク電流が明らかに低下していることが分かる。Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６溶液中で起こる酸化還元反応は、還元曲線および酸化曲線のピークによるピーク電位の差ΔＥｐでもって明確に識別できる。ＣＶ電流は固定化分子層の荷電効果による容量性電流を多くの割合で含むが、矩形波ボルタンメトリー（ＳＷＶ）は悪影響を低減する。固定化およびハイブリダイゼーション後の酸化還元ピーク電流の差はＣＶを用いて観察したときと比べて、顕著に促進されている（図１５ｂ）。
したがって、酸化還元電流の変化は非常に顕著であり、この実測変化は相互作用を電気化学的に検出し得る可能性のあるバイオセンサーの開発の基礎を形成する。
【００３８】
（１）毒素ＡおよびＢサブユニット間の相互作用分析
電気化学検出法を用いて、最初にコレラ毒素ＡおよびＢ間の相互作用分析を行った。ＡまたはＢサブユニットは、カルボキシル基を介して予備処理した金表面に共有結合させた。
ＡまたはＢサブユニットのいずれか一方のサブユニットを固定化した後、他方のサブユニットをハイブリダイズさせ、各段階で電流値変化を観察した。
Ｂサブユニットを金表面に固定化し、ＡサブユニットをハイブリダイズさせたときのＳＷＶ電流の変化（図１６）は、Ａサブユニットを金表面に固定化し、Ｂサブユニットをハイブリダイズさせたときの変化（図１７）よりも大きかった。これは、Ｂサブユニット（１２ｋＤａ）がＡサブユニット（２７ｋＤａ）よりも小さいため、同一表面上に大量に固定化されたからと考えられる。
しかしながら、いずれサブユニットを先に金表面に固定化しても、ＡおよびＢサブユニット間のハイブリダイゼーション後の最終電流値は誤差範囲で同レベルであった。
以上の結果から、サブユニット間の相互作用の最終判断には、いずれのサブユニットを金表面に固定化するかは影響しないが、多種のサブユニットのうちより小さなサイズ（分子量）を有するものを先に固体表面に固定化したほうが、より高い密度で配列できるため有利であると考えられる。
【００３９】
（２）チオール修飾五糖類を用いた結合能の確認
次に、実施例２で合成したＧＭ１ＳＨ１およびＧＭ１ＳＨ２の結合能を、チオール基修飾なしのＧＭ１の結合能と比較した。
上記３種類の糖を予備処理していない金表面に直接固定化し、結合前後の電流値の変化を観察した。
ＧＭ１ＳＨ２は、ＧＭ１ＳＨ１と比較して、固定化による電流値の変化が大きく、高度に固定化されることが分かった（図１８）。このことは、糖類、特に、多糖類へのチオール基修飾反応は、原料濃度を高くしたほうがよいことを示している。
【００４０】
（３）五糖類、毒素Ａおよび毒素Ｂサブユニット間の相互作用の分析
上記したように、ビブリオコレラ毒素タンパク質とガングリオシドＧＭ１の糖鎖部分との相互作用は毒性メカニズムに必要な知識である。Ｂサブユニットに加えて、Ａサブユニットもこの相互作用に参画する。したがって、この実施例において、ＧＭ１ＳＨを金表面に直接固定化した後、一連の相互作用を分析した。
２つのＧＭ１ＳＨを異なる条件で固定化した後、先にＢサブユニットを糖類と接触させ、その後、Ａサブユニットとハイブリダイズさせた。ＳＷＶにおける電流変化はＧＭ１ＳＨ固定化後の電流差以外はほぼ同じであった（図１９および２０）。
しかしながら、酸化還元の度合いを表すＣＶにおける電流変化は別のパターンを示した。ＧＭ１ＳＨ１と比較して、ＧＭ１ＳＨ２は高密度で金表面に固定化されているため、Ｂサブユニットの結合により金表面のほとんどが覆われてしまい、酸化還元が発生しにくかったと考えられる。
【００４１】
なお、図１８において、チオール基修飾なしのＧＭ１を金表面に接触させたときにも電流値が変化しているが、これは物理的な吸着によるものである。データは示さないが、別の実験で、チオール基修飾なしのＧＭ１が金表面に吸着した状態で、毒素ＡまたはＢサブユニットを接触させても、電流値の変化は生じなかった。したがって、基板上にチオール基修飾なしの糖類が結合していても、糖類とタンパク質間の相互作用の確認には影響がない。
チオール基を介して糖類を金表面に化学結合させた場合、糖類は表面から起立しているためにタンパク質と相互作用を起こすが、チオール基修飾なしの糖類が金表面に物理吸着している場合、糖類は表面上に横たわり、タンパク質と相互作用を起こさないと考えられる。
【００４２】
電気化学システムは、相互作用後の電流変化しか示さないので、結合速度や結合力を説明することは難しい。しかしながら、これらの結果によれば、電気化学検出法は、高感度および操作の簡便性から、他のどのツールよりも優れている。
【００４３】
実施例５：糖類チップを有するバイオセンサーの構築
実施例４の結果から、糖類を金表面に固定化したチップ上で、タンパク質サブユニットのハイブリダイゼーションを観察できることが明らかとなったので、糖類チップを搭載したバイオセンサーを構築した。
【００４４】
本発明による糖類チップの上面図を図２１に示す。この実施例では、ガラス基板１０上に８本の電極配線１３を形成し、一度に８点測定が可能な糖類チップ１を形成した。
電極配線１３の一方の端部にはバイオ分子アレイ領域１３１が形成され、他方の端部にはバイオ分子アレイ領域で検出した電気的信号を取り出すためのパッド１３２が形成されている。
図２２にバイオ分子アレイ領域１３１の拡大上面図を示す。バイオ分子アレイ領域１３１上には絶縁性レジスト膜１４が形成され、この絶縁膜に１または複数の孔を設けることによって、バイオ分子を固定化するための１または複数のセンシング部１３１ａが形成されている。
バイオ分子アレイ領域１３１には、センシング部１３１ａの直径が５μｍ以上の場合、図２２ａに示すように単一のセンシング部を形成することができ、センシング部１３１ａの直径がサブミクロン以下２０ｎｍ程度までの場合、図２２ｂに示すように複数のセンシング部を配列させることができる。
【００４５】
従来の半導体製造技術を用いれば、基板上にセンシング部を形成することができるので、上記の条件に限定されることなく、適宜、当業者によく知られた他の条件でセンシング部を形成することができる。
また、センシング部の大きさや個数も、使用の形態に適合させて、適宜増減することができる。
【００４６】
バイオ分子アレイ領域１３１の断面図を図２３ａに示す。この実施例では、ガラス基板１０上に、まず、Ｔｉ薄膜１３ａを形成し、その上にＡｕ薄膜１３ｂを形成することによって、Ａｕ／Ｔｉ積層薄膜からなる電極配線１３を形成した。Ａｕ薄膜を直接ガラス基板に形成することもできるが、Ａｕ薄膜の接着強度が弱いので、Ａｕ薄膜の剥離を防止し、バイオチップの信頼性を向上させるためにＴｉ薄膜を用いた。Ｔｉ以外にＣｒを用いることもできる。
【００４７】
この図が示すように、絶縁性レジスト膜に形成された孔は、下部層の電極配線の表面にまで達している。すなわち、バイオ分子アレイ領域に形成されたセンシング部の側面は絶縁性レジスト膜１４により定められ、センシング部の底部は電極配線１３の表面により定められている。
この構成を用いて、図２３ｂに示すように、センシング部１３１ａの底部の露出した電極表面上にチオール基を修飾した糖類プローブ２を固定化する。
【００４８】
酸素プラズマ照射などの方法により、センシング部の底部に露出した電極表面上の不純物質を除去する。
その後、基板をＧＭ１ＳＨ２の溶液に１時間浸漬して、ＧＭ１ＳＨをＳＨ基を介して電極表面に結合させる。
センシング部の底部にのみ糖類プローブ２が固定化されるように、前記のレジスト１４はＤＴＤＰＡの−ＳＨ基が結合しない材料であることが必要である。
最後に、リン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）で洗浄することによって、センシング部の底部に固定化されていない未結合の糖類を除去して、糖類チップを作製する。
本発明において、この糖類プローブ２にターゲット３であるタンパク質が結合したときの酸化還元電位の変化を検出する。
【００４９】
本発明の糖類チップを作製するために、半導体製造技術で用いられているフォトファブリケーション技術およびナノファブリケーション技術を用いた。ここでは、「ナノファブリケーション技術」なる用語は、ナノインプリンティング技術、蒸着技術、エッチング技術などを組み合わせた技術を意味する。ナノファブリケーション技術はすでにＩＣやＬＳＩ製造技術の１つとして確立されているため、従来のＤＮＡチップのように小型化や製造工程の自動化が可能で、チップの大量生産や低コスト化につながる。
「ナノインプリンティング技術」なる用語は、ナノサイズのパターンのモールドを用いて、レジスト膜にパターンを転写する技術を意味し、レジストにモールドを圧接した後、光照射によりレジストを硬化させる光ナノインプリンティング技術；および、加熱により軟化させたレジストにモールドを圧接し、冷却によりレジストを硬化させる熱ナノインプリンティング技術を含む。
【００５０】
実施例６：原子間力顕微鏡による相互作用力の測定
【００５１】
今までに、ガングリオシドＧＭ１とビブリオコレラ毒素のＢサブユニットとの相互作用について多くの報告がなされているが、その正確な相互作用の力は調べられていなかった。さらに、相互作用に対するＡサブユニットの寄与についてはほとんど報告されていない。したがって、ガングリオシドＧＭ１とビブリオコレラ毒素のＡおよびＢサブユニットとの間の相互作用力の測定は、非常に意義がある。
【００５２】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）は操作が比較的簡単であり、多くの研究者がイメージングにＡＦＭを用いているため、その技術は洗練されている。水平方向の解像度が高いので、小さなサンプルを観察することができ、均一性の悪い物質をマッピングすることができる。接触面積が小さなことも汚染や表面粗さの悪影響を排除する。ＡＦＭは、固体表面のイメージングに用いられるだけではなく、フォースカーブを測定するのにも用いることができる。このようなフォースカーブは、弾性、硬度、接着力、および表面電荷密度などの局所的物質特性の価値ある情報を提供する。この理由から、フォースカーブの測定は、表面科学、物質工学、生物学などの多様な分野で重要なものとなった。
【００５３】
初期段階では、原子間力測定技術は、表面および分子間力の正確な測定を可能にし、この分野での理解を向上させた。しかしながら、物質特性および装置の複雑性による制限のため、限定された系の研究しかされていなかった。
１９９４年、単一分子実験のための新たなタイプのＡＦＭ測定が投入された。単一ポリマー分子を引き延ばす力や単一結合を破壊する力は、以前測定されていたが、簡便さや正確性は当該分野を大いに刺激した。今日におけるＡＦＭ測定の主たる目的は、本質的に相互作用力を研究することにある。媒質を横切る２つの生体分子間の相互作用は生物学における基本的な問題のひとつである。
【００５４】
ＡＦＭを用いて原子間力を記録するには、カンチレバーに取り付けたプローブがサンプル表面との間の原子間力によって変位するため、カンチレバーのたわみをモニターする。ついで、カンチレバーのたわみからのデータを用いて、フォースカーブとして力を描写する（図２４）。原子間力の測定は、対象とする生体分子表面の吸着水の吸着力を相殺するために液体中で行う。
【００５５】
図２４に、フォースカーブの一例を示す。具体的には、基板上のある一点において、基板とプローブとの距離が十分離れた状態Ａから、両者を接近させ状態Ｂ、状態Ｃへと移行させ、一定の距離または負荷力になったところで、基板とプローブとを離反させ、状態Ｄを通過し、状態Ａに戻るサイクルにおいて、基板とプローブとの間の距離に対して、プローブへの負荷力をプロットする。
状態Ａでは、基板とプローブ、すなわち、タンパク質と糖類とが十分に離れているため、プローブに負荷力は生じていない。両者を接近させていくと、状態Ｂにおいて、タンパク質と糖類とは接触していないが、引力が生じて、カンチレバーは下向きにたわむ。さらに両者を接近させていくと、斥力が生じ、距離に応じて負荷力は上昇し、カンチレバーは上向きにたわむ（状態Ｃ）。
基板とプローブとが十分に接近し、タンパク質と糖類とが確実に結合した状態から、今度は、基板とプローブとを離反させる。図２４には描写されていないが、この実施例においては基板表面にタンパク質が固定化されているため、タンパク質と糖類とが確実に結合した状態で、基板とプローブとの間にまだ距離がある。
タンパク質と糖類とが確実に結合した状態は、別途、確認を行い、適当な距離または負荷力に達した時点で、基板とプローブとの離反を開始する。
基板とプローブとを離反させる過程において、タンパク質と糖類との結合により、プローブに負の負荷力が生じ、カンチレバーは下向きにたわむ（状態Ｄ）。さらに、基板とプローブとを離反させると、ある距離で、負荷力は急激に０となる。これは、タンパク質と糖類との結合が破断されたことを意味する。したがって、状態Ｄにおける最小の負荷力の絶対値を破断力Ｆと定義することができる。
基板上のある箇所で複数回、または、基板上の複数箇所で、複数の破断力Ｆを求め、複数の破断力を区分し、発生頻度のヒストグラムを作成する。このヒストグラムにガウス型ピーク解析を適用して、相互作用力を算出する。
【００５６】
（１）毒素ＡおよびＢサブユニット間の相互作用力分析
ＳＰＲおよび電気化学分析と同様に、まず、ビブリオコレラ毒素ＡおよびＢサブユニット間の相互作用のフォースカーブを得た。
Ａサブユニットは、適当な間隔を作るために複数のリンカーを用いて金被覆カンチレバーのプローブ先端に共有結合させた（図２５ａ）。一方、Ｂサブユニットは、ジチオビス（スクシンイミジルオクタノアート）をリンカーとして用いて金基板上に固定した（図２５ｂ）。
【００５７】
複数回測定したフォースカーブから破断力のヒストグラムを作成し、このヒストグラムにガウス型ピーク解析を適用して、相互作用力を算出した（図２６）。
ＡおよびＢサブユニット間の相互作用力は１８４．２±４．５ｐＮ（ｐ＜０．０００１）となった。
この相互作用力は、他のリガンド−受容体間の相互作用力と同等であった（表１）。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
（２）毒素Ｂサブユニットおよび五糖類ＧＭ１間の相互作用力分析
つぎに、ＧＭ１ＳＨ２を金被覆カンチレバーのプローブ先端に固定化した。一方、Ｂサブユニットは、上記したように、ジチオビス（スクシンイミジルオクタノアート）をリンカーとして用いて金基板上に固定した。
糖類を金基板上に固定し、タンパク質をカンチレバーのプローブ先端に固定化することもできるが、タンパク質の結合部位を制御する観点から、タンパク質を金基板上に固定することが好ましい。
複数回測定したから破断力のヒストグラムを作成し、このヒストグラムにガウス型ピーク解析を適用して、相互作用力を算出した（図２７）。
ＧＭ１ＳＨ２とＢサブユニットとの間の相互作用力は、５１４．０±６９．５ｐＮ（ｐ＜０．０００１）となった。
このように、本発明の方法によれば、糖類を固体表面に直接固定化することができるので、糖類が関与する相互作用の力を測定することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】従来のピリジルアミノ化反応
【図２】本発明による糖類へのチオール修飾プロセス
【図３】本発明によるグルコースへのチオール修飾プロセスの時間経過
【図４】本発明によるチオール修飾グルコースのＮＭＲチャート
【図５】本発明によるチオール修飾グルコースのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦチャート
【図６】本発明によるチオール修飾グルコースの金表面固定化のＳＰＲチャート
【図７】セラミド部分を除去したガングリオシドＧＭ１の化学構造
【図８】本発明によるＧＭ１へのチオール修飾プロセスの時間経過
【図９】本発明によるチオール修飾グルコースのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦチャート
【図１０】本発明によるチオール修飾グルコースのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦチャート
【図１１】ＳＰＲ装置の構成を示す概略図
【図１２】ＳＰＲの原理を示す概略図
【図１３】ビブリオコレラ毒性タンパク質のＸ線結晶構造
【図１４】ビブリオコレラ毒性タンパク質のＡサブユニットとＢサブユニットとの間の相互作用についてのＳＰＲ分析結果
【図１５】ハイブリダイゼーションを示すボルタノメトリー結果：サイクリックボルタノグラム（ａ）；矩形波ボルタノグラム（ｂ）
【図１６】ビブリオコレラ毒性タンパク質のＡサブユニットとＢサブユニットとのハイブリダイゼーションを示すボルタノメトリー結果
【図１７】ビブリオコレラ毒性タンパク質のＡサブユニットとＢサブユニットとのハイブリダイゼーションを示すボルタノメトリー結果
【図１８】チオール修飾ＧＭ１の金基板上への結合を示すボルタノメトリー結果
【図１９】チオール修飾ＧＭ１とビブリオコレラ毒性タンパク質のＡサブユニットおよびＢサブユニットとの相互作用の結果を示すボルタノメトリー結果
【図２０】チオール修飾ＧＭ１とビブリオコレラ毒性タンパク質のＡサブユニットおよびＢサブユニットとの相互作用の結果を示すボルタノメトリー結果
【図２１】本発明の糖類チップの上面図
【図２２】本発明の糖類チップのバイオ分子アレイ領域の上面図
【図２３】本発明のバイオ分子アレイ領域の断面図
【図２４】ＡＦＭにより測定される典型的なフォースカーブ
【図２５】ビブリオコレラ毒性タンパク質のＡサブユニットとＢサブユニットとの間の相互作用についてのＡＦＭ分析のための構成を図示する概略図
【図２６】ビブリオコレラ毒性タンパク質のＡサブユニットとＢサブユニットとの間の相互作用力のヒストグラム
【図２７】ビブリオコレラ毒性タンパク質のＢサブユニット（Ｂ）と五糖類ＧＭ１（Ｐ）との間の相互作用力のヒストグラム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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