(57)【要約】【課題】簡便な腎障害の検査手段を提供し、この検査手段に利用する腎障害に関連して見られる物質、例えば尿中のポドカリキシンおよび／またはネフリンを測定する方法を提供することである。【解決手段】腎障害に関連して見られるポドサイトの表面に存在するタンパク質を細胞表面から遊離させる処理を施すことにより尿中に含有される細胞表面に存在する物質および／または遊離の物質を測定することで上記測定方法を提供することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎障害に関連して尿中に認められる物質を測定する方法であって、
前記尿中に認められる測定対象物質が尿中に含有される細胞表面に存在する物質および／または尿中に遊離状態で存在している物質であり、
尿試料中に含まれる前記測定対象物質を処理する工程を含み、
前記処理工程を経た尿中に含有される細胞表面に存在する物質
および尿中に予め遊離状態で存在している物質を
合わせて測定する工程を含むことを特徴とする、
測定方法。
【請求項２】
尿中に含有される細胞表面に存在する物質および／または尿中に遊離状態で存在している物質を処理する工程が、当該物質を可溶化、変性および／または分散させる工程である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
尿中に含有される細胞表面に存在する物質および／または尿中に遊離状態で存在している物質を処理する工程が、尿試料を界面活性剤で処理する工程である、請求項１または２に記載の測定方法。
【請求項４】
尿中に含有される細胞表面に存在する物質および／または尿中に遊離状態で存在している物質を処理する工程が、カオトロピック塩または塩酸グアジニンを含む処理剤で処理する工程である、請求項１または２に記載の測定方法。
【請求項５】
尿試料が、全尿または尿を遠心分離して得られる上清画分である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項６】
腎障害に関連して尿中に認められる物質が、ポドカリキシンおよび／またはネフリンである請求項１〜５のいずれか１項に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料とりわけ尿中成分、ポドカリキシンおよび／またはネフリンの検出または測定方法および腎障害の検査手段に関する。さらに、ポドカリキシンおよび／またはネフリンの測定用試薬ならびに測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
糸球体たこ足細胞は腎炎発症時に多様な変化を見せることが知られている。たとえば、先天性ネフローゼ症候群の患者では、たこ足細胞のネフリンは発現していないことが証明され、タンパク尿の出現にたこ足細胞、とりわけネフリンの重要性が明らかとなってきた。尿沈渣中に含まれる成分は、腎に由来する成分、尿路から混入してくる成分、さらには尿中で析出してくる成分等多種である。尿沈渣の種類、量を調べることは、腎、尿路疾患の鑑別とその程度を知る上で非常に重要である。これらは通常染色法による鏡検により行われている。腎のたこ足細胞（ポドサイト）表面に存在する糖タンパク質であるポドカリキシンをマーカーとしてポドサイトを鏡検により検出することは腎症の病態把握に有用であることが述べられている（非特許文献１）。
【０００３】
しかしながら、これらの測定はいずれも、染色による鏡検、モノクローナル抗体を用いた蛍光標識免疫染色による鏡検により行われていた。これらの方法では１検体ずつ鏡検により検査するため、操作が煩雑で多数検体の測定は困難であった。
一方、ヒトポドカリキシンを酵素免疫測定法または免疫凝集法により測定する方法が（特許文献１）に述べられているが、この内容は何れもヒトポドカリキシンの免疫学的測定の方法例を開示したに過ぎず、実際の臨床検体の測定方法、結果及びその臨床的有用性については開示されていない。
【非特許文献１】Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１８，３５−４１（１９９８）
【特許文献１】特許公報第２９３２８３７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は簡便な腎障害の検査手段を提供することであり、この検査手段に利用する腎障害に関連して見られる物質、例えば尿中のポドカリキシンおよび／またはネフリンを測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、腎障害に関連して見られる尿沈渣に含まれる物質、例えばたこ足細胞、膜タンパク質、尿細管および腎糸球体の構成細胞に着目し、その表面に存在する物質、例えばポドカリキシン、ネフリンを細胞表面から遊離させる処理を施すことにより尿中に含有される細胞表面に存在する物質および／または遊離する物質の測定方法を見出した。腎障害に関連して見られるこれらの物質の測定方法が腎障害の検査に有用であることを見出し本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．腎障害に関連して尿中に認められる物質を測定する方法であって、
前記尿中に認められる測定対象物質が尿中に含有される細胞表面に存在する物質および／または尿中に遊離状態で存在している物質であり、
尿試料中に含まれる前記測定対象物質を処理する工程を含み、
前記処理工程を経た尿中に含有される細胞表面に存在する物質
および尿中に予め遊離状態で存在している物質を
合わせて測定する工程を含むことを特徴とする、
測定方法。
２．尿中に含有される細胞表面に存在する物質および／または尿中に遊離状態で存在している物質を処理する工程が、当該物質を可溶化、変性および／または分散させる工程である、前項１に記載の測定方法。
３．尿中に含有される細胞表面に存在する物質および／または尿中に遊離状態で存在している物質を処理する工程が、尿試料を界面活性剤で処理する工程である、前項１または２に記載の測定方法。
４．尿中に含有される細胞表面に存在する物質および／または尿中に遊離状態で存在している物質を処理する工程が、カオトロピック塩または塩酸グアジニンを含む処理剤で処理する工程である、前項１または２に記載の測定方法。
５．尿試料が、全尿または尿を遠心分離して得られる上清画分である、前項１〜４のいずれか１項に記載の測定方法。
６．腎障害に関連して尿中に認められる物質が、ポドカリキシンおよび／またはネフリンである前項１〜５のいずれか１項に記載の測定方法。
【発明の効果】
【０００７】
腎障害に関連して見られるポドサイトの表面に存在する物質、例えばポドカリキシンおよび／またはネフリンを細胞表面から遊離させることにより、尿中に含有される物質および／または遊離の物質を測定する本発明の方法は、簡便かつ迅速に検査でき、腎障害診断に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は腎障害の検査の手段としての腎障害に関連して認められる物質の測定に関し、次のような特徴を有する。
【０００９】
本発明の測定の対象となる物質は、腎障害に関連して認められる物質であって尿中に含有される物質であれば特に限定されないが、尿沈渣に含まれる物質、例えばたこ足細胞、膜タンパク質、尿細管および腎糸球体の構成細胞に着目し、その表面に存在する物質、例えばポドカリキシン、ネフリン等が挙げられる。本発明の測定法はこれらの物質を遊離状態に変換する処理工程を経て行われる。上記物質を遊離状態に変換する処理工程とは、界面活性剤で処理する工程を含むものである。この処理を施すことにより該物質が細胞表面に存在し、また遊離した状態で尿中に存在することとなる。
【００１０】
尿中に含有されるポドカリキシンおよび／またはネフリンを測定する方法は、公知の免疫学的方法が適用される。なかでも、少なくとも直接または間接的にシグナル検出可能な物質または粒子で標識された標識抗体またはその一部の画分を用いる免疫クロマトグラフ法によることが、迅速かつ簡便な測定方法として好適である。
【００１１】
なお、本発明は上記の免疫クロマトグラフ方法を用いる腎障害の検査手段および測定試薬にも及ぶ。さらに、尿中に含有される細胞表面に存在する物質、例えばポドカリキシンおよび／またはネフリンを遊離状態に変換する処理工程を施すための前処理試薬及び前記免疫測定試薬と前処理試薬を組み合わせたポドカリキシン測定キットも含む。
【００１２】
本発明の課題解決手段の一は、尿中に含有される細胞表面に存在する物質、例えばポドカリキシンおよび／またはネフリンを測定する方法であって、尿中に含有される細胞表面に存在する物質を遊離状態に変換するに十分な処理工程を経た試料中の細胞表面に存在する物質及び／又は遊離の物質を測定することを特徴とする。すなわち、細胞表面に存在するポドカリキシンおよび／またはネフリンを遊離状態にすることによって、尿のどの一部分を採って測定を行なっても、ほぼ同一の濃度でポドカリキシンおよび／またはネフリンが存在することとなる。そして均一化されることにより、細胞表面のポドカリキシンおよび／もしくはネフリンおよび尿中に予め遊離状態で存在しているポドカリキシンおよび／もしくはネフリンを合わせて測定することも可能になる。
【００１３】
（測定試料の処理）
本発明に使用される尿試料は尿自体でもよく、尿を遠心分離して得られる尿沈渣画分又はその上清画分であってもよい。本発明の測定方法は尿試料を何ら処理することなく直接測定することが可能であるだけでなく、尿を遠心分離し尿沈渣を分画し、その画分の細胞表面に存在する物質、例えばポドカリキシンおよび／またはネフリンを測定することも可能である。測定に必要とされる尿の採取量は５０〜１００ｍＬ程度であり、５０ｍＬ程度であれば充分である。含まれるポドカリキシンおよび／またはネフリン等の濃度により、尿採取量を適宜減量させることも可能である。
【００１４】
（界面活性剤の添加）
本発明は、尿中に含有される細胞表面に存在する物質、例えばポドカリキシンおよび／またはネフリンを遊離状態に変換する一つの手段として界面活性剤で処理することが挙げられる。用いる界面活性剤の種類、濃度は細胞表面に存在するポドカリキシンおよび／またはネフリン等を遊離状態に変換できる作用があれば特に限定されないが、ポドカリキシンおよび／またはネフリン等の免疫測定に妨害を及ぼさない種類、濃度で用いることが好ましい。
【００１５】
本発明に使用される界面活性剤の例として、非イオン界面活性剤としてトリトンＸ−１００を例示するが、格別にこれらに限定されるものではない。当業者は、本発明に開示する結果をもとに、単純な実験的繰り返しにより効果の比較を行い、尿中に含有される細胞表面のポドカリキシンの遊離、測定に有効な界面活性剤を得ることができる。非イオン界面活性剤以外に、陽イオン、陰イオン界面活性剤、両イオン界面活性剤又は配糖体を適宜用いることも可能である。
【００１６】
さらに、界面活性剤を２種以上併用して用いることにより、より確実に可溶化又は分散させ均質化効果を達成することができる。
界面活性剤の添加量は、ポドカリキシンおよび／またはネフリン等の遊離の程度を考慮して、適宜増量・減量することにより選択可能であるが、一般的には０．０２〜５ｗ／ｖ％、好ましくは０．１〜２ｗ／ｖ％、より好ましくは０．２〜１ｗ／ｖ％の範囲で添加される。
【００１７】
処理条件として、温度・時間等は最適な条件を選択することが好ましいが、単純な実験的繰り返しにより決定することができる。この場合、１０〜４０℃の温度で数秒から数分程度の処理で充分である。また、前処理として予め界面活性剤を添加し、細胞表面に存在する物質、例えばポドカリキシンおよび／またはネフリン等を遊離させ均質化処理を行っておくことも可能である。
【００１８】
（界面活性剤以外の遊離処理剤）
界面活性剤以外の遊離処理剤として、一般に知られた、尿素、チオシアン酸塩、過ヨウ素酸塩及び過塩素酸塩等のカオトロピック塩、塩酸グアニジン等が挙げられる。これらは単独または界面活性剤と併せて用いることも可能である。
【００１９】
（ポドカリキシンの測定方法）
尿中に含有される細胞表面に存在するポドカリキシンおよび／または遊離のポドカリキシンを測定する方法として、少なくとも直接または間接的にシグナル検出可能な物質または粒子で標識された標識抗ポドカリキシン抗体またはその一部の画分を用いる免疫クロマトグラフ法によるポドカリキシンの測定方法が挙げられる。
【００２０】
（ネフリンの測定方法）
尿中に含有される細胞表面に存在するネフリンおよび／または遊離のネフリンを測定する方法として、少なくとも直接または間接的にシグナル検出可能な物質または粒子で標識された標識抗ポドカリキシン抗体またはその一部の画分を用いる免疫クロマトグラフ法により、ポドカリキシンと同様に測定することが可能である。
【００２１】
免疫クロマトグラフ法は通常、金コロイド、着色または蛍光ラテックス粒子等の標識用の微粒子に、抗体を吸着させ粒子標識抗体を調製して行なわれる。調製した標識粒子は通常、標識パッドと呼ばれる多孔性の担体に保持させて用いられる。
【００２２】
一方、ニトロセルロースメンブランのような多孔性の担体の一部に捕獲リガンドを固定化しておき、試料と上記標識粒子の反応を行いながら、毛管現象により、メンブラン中を標識粒子と被検物質の複合体を移動させ、捕獲リガンドに標識粒子をトラップさせ、その標識粒子のトラップ度合いを観察、測定することにより被検物質を測定することもできる。この方法は簡便でしかも短時間で測定が可能であることから、ベッドサイド検査に有用である。尿中のポドカリキシンまたはネフリンの測定においても、免疫クロマトグラフ法を用いることは、簡便かつ迅速に腎障害を検査することが可能となり臨床診断上非常に有用である。例えば、学童検診の尿検査において、通常の糖、タンパク等の検査と共に免疫クロマトグラフ法によるポドカリキシンおよび／またはネフリンの測定を行なうことにより、より確実に腎障害の検査を行うことができる。１つの担体に標識抗ポドカリキシン抗体および標識抗ポドカリキシン抗体を保持させれば、ポドカリキシンおよびネフリンを同時に測定することが可能である（図３）。
【００２３】
（実施例）
以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２４】
（実施例１）ポドカリキシン測定用免疫クロマトグラフ装置の調製
抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を０．１ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液ｐＨ７．２に溶解し、市販の着色ラテックス（粒径０．３μｍ  バングス社製）を加え、３７℃で３時間放置後遠心分離し、標識ラテックスを調製した。調製した標識ラテックスは３％のウシ血清アルブミンを含む緩衝液で２回洗浄したのち、市販のコンジュゲートパッド（ワットマン社製）に保持させ標識パッドを調製した。一方、捕獲リガンドは孔径０．８μｍのニトロセルロースメンブラン上にバイオドット社製のドッティング機を用いて、小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）を２．０ｍｇ／ｍＬの濃度で０．５ｍｍのラインを引き捕獲リガンドとした。調製したメンブランは１％のウシ血清アルブミンを含む緩衝液でブロッキングし、乾燥させ、図２及び図３に示すような免疫クロマトグラフ装置として調製し、ポドカリキシンの測定に用いた。
【００２５】
（尿試料の前処理）
尿試料の５０ｍＬをとり、ボルテックスミキサー処理後３０分静置した後５００×ｇで５分間遠心分離することにより尿沈渣を得た。その尿沈渣画分に１％のトリトンＸ−１００を含む生理食塩水０．２ｍＬを混和し、ボルテックスミキサーで３０秒間撹拌抽出し、沈渣画分を十分に分散させた。その分散した試料をそのまま前記免疫クロマトグラフ装置に供し測定した。
【００２６】
（対照）
前記の前処理を行った尿試料と同一の試料を同様に遠心分離し尿沈渣を採取し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体で免疫染色して鏡検下にポドサイトを観察した。
【００２７】
（測定結果）
本発明の方法による尿検体１０例の測定結果と、蛍光免疫染色による観察結果を表１に示した。その結果、１０例すべてについて、本発明の方法による結果と従来の蛍光免疫染色による鏡検の測定結果が一致した。また鏡検では前処理を行った尿試料について全例検査するのに約３時間要したが、本発明の方法では前処理後、約１５分で全例検査することが可能であった。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
（実施例２）ポドカリキシンおよびネフリン測定用免疫クロマトグラフ装置の調製
抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体および抗ヒトネフリンモノクローナル抗体を各々実施例１の方法と同様に処理し、ポドカリキシンおよびネフリン測定用免疫クロマトグラフ装置として調製した（図３）。
【００３０】
尿処理および対照については、実施例１と同様に操作した。
【００３１】
（測定結果）
本発明の方法による尿検体１０例の測定結果と、蛍光免疫染色による観察結果を表２に示した。その結果、１０例すべてついて、本発明の方法による結果と従来の蛍光免疫染色による鏡検の測定結果が一致した。
【００３２】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００３３】
腎障害に関連して見られるポドサイトの表面に存在する物質、例えばポドカリキシンおよび／またはネフリンを細胞表面から遊離させることにより、尿中に含有される物質および／または遊離の物質を測定する本発明の方法は、簡便かつ迅速に検査でき、腎障害診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】第１図は、免疫クロマトグラフ装置の概略を示す図であり、平面図を示す。
【図２】第２図は、免疫クロマトグラフ装置の概略を示す図であり、立体図を示す。
【図３】第３図は、免疫クロマトグラフ装置の概略を示す図であり、立体図を示す。
【符号の説明】
【００３５】
１  試料添加パッド（試料添加部位）
２  標識パッド（抗ポドカリキシン抗体標識着色粒子保持部
３  展開メンブラン
４  捕獲部位（抗ポドカリキシン抗体または小麦胚芽レクチン固定部）
５  吸収パッド
６  試料添加パッド（試料添加部位）
７  標識パッド（抗ポドカリキシン抗体標識着色粒子および抗ネフリン抗体標識着色粒子保持部）
８  展開メンブラン
９  捕獲部位（抗ポドカリキシン抗体固定部）
１０  捕獲部位（抗ネフリン抗体固定部）
１１吸収パッド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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