(57)【要約】【課題】イソアミルアルコールの生成は抑制されるが、他の香気成分は高生成する新規変異酵母を交雑法にて育種、造成する。【解決手段】各種醸造酵母を変異処理し、セルレニン含有培地及び５’−５’−５’−トリフルオロ−Ｄ，Ｌ−ロイシン含有培地で生育した菌株から収得したカプロン酸エチル及び酢酸イソアミルを多く生成する変異酵母例えばきょうかい１７０１号（Ｋ−１７０１）、特にカプロン酸エチルを多く生成しかつ、酸生産性の少ないきょうかい１６０１号酵母（Ｋ−１６０１）ときょうかい９号酵母（Ｋ−９）との交雑により、生ヒネ香「ムレ香」の前駆物質といわれるイソアミルアルコールの生成量を少なくしかつ、醗酵力が強く酸生成量の少ない新規酒造適性を有する新規変異酵母を育種、造成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
醸造酵母を変異処理し、セルレニン含有培地及び５’−５’−５’−トリフルオロ−Ｄ，Ｌ−ロイシン含有培地で生育する菌株からカプロン酸エチル及び酢酸イソアミルを多く生成する高エステル生成変異酵母を選択し、該高エステル生成変異酵母と吟醸用清酒酵母とを交雑すること、を特徴とするイソアミルアルコールの生成が少なく、カプロン酸エチルは多く生成し、酸生成は少なく、発酵力は強く、香味がすぐれている変異酵母を育種する方法。
【請求項２】
高エステル生成変異酵母がきょうかい１６０１号酵母（Ｋ−１６０１）であり、吟醸用清酒酵母がきょうかい９号酵母（Ｋ−９）であること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法によって製造してなる変異酵母。
【請求項４】
請求項３に記載の変異酵母を使用すること、を特徴とするイソアミルアルコールの生成が少なく、カプロン酸エチル高生成で且つ酸生成の少ない、清酒、焼酎、ビール、ワインから選ばれる酒類を短時間で製造する方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法によって製造してなるムレ臭が抑制された香味のすぐれた酒類。
【請求項６】
酒類が清酒であり、且つ、既存のきょうかい酵母で製造した清酒に比して、イソアミルアルコールの生成量が少なく、カプロン酸エチルは高生成で、酢酸イソアミルもバランス良く生成しており、酸生成も少なく、香り華やかで香味の整ったふくらみを有するものであること、を特徴とする請求項５に記載の酒類。
【請求項７】
長期間、高温に貯蔵してもムレ臭のひとつであるイソバレルアルデヒドの生成量が少ないこと、を特徴とする請求項６に記載の酒類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規酵母及びそれを用いる酒類の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類についての多様化の要望が近年になって特に高まり、例えば芳香性豊かな清酒に対する消費者の要望が高まりを見せている。
【０００３】
このようなニーズに対応するため、香りの高い酵母の育種が行われ、例えば香りの高い酵母の変異株の収得方法の１つで、脂肪酸合成酵素を阻害する抗生物質として知られるセルレニン耐性株より収得するカプロン酸エチル高生成変異酵母の収得方法（特許文献１）と、ロイシンアナログの５’−５’−５’−トリフルオロ−Ｄ，Ｌ−ロイシン耐性株より収得される、酢酸イソアミル高生成変異酵母の収得方法（特許文献２）の２方法を利用して、酢酸イソアミル及びカプロン酸エチルを高生成し且つ酸生成の少ない変異酵母の育種が成功を収め、一部、きょうかい清酒用酵母１６０１号（Ｋ−１６０１：非特許文献１、２）、きょうかい清酒用酵母１７０１号（Ｋ−１７０１：非特許文献３）として実用化されている。
【０００４】
これらの変異酵母はすぐれた酵母であるが、変異酵母の短所である発酵力が低いという欠点は避けられないし、酢酸イソアミル高生成変異酵母は、当然のことながら、酢酸イソアミルの前駆物質であるイソアミルアルコールも多く生成するものである。しかしながら、イソアミルアルコールは、清酒の劣化臭の原因物質のひとつである生ヒネ香「ムレ臭」といわれるイソバレルアルデヒドの前駆物質である。
【０００５】
したがって、香気成分である酢酸イソアミルを高生成せしめると、それに付随してイソアミルアルコールも高生成してしまい、このような変異酵母で製造した清酒では、イソアミルアルコールが酸化されて「ムレ臭」といわれるイソバレルアルデヒドに変化し、品質、特に香りの劣化は避けられない。この欠点は、貯蔵期間が長いほど、そして貯蔵温度が高いほど増幅される。
【特許文献１】特許第２６３２６５４号公報
【特許文献２】特公平７−１４３３５号公報
【非特許文献１】日本醸造協会誌、９０（１０）７５１−７５８（１９９５）
【非特許文献２】日本醸造協会誌、８（７）５６５−５６９（１９９３）
【非特許文献３】日本醸造協会誌、９６（１０）６７９−６８７（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、イソアミルアルコールの生成量が各種きょうかい酵母に比して低く、カプロン酸エチル高生成で酢酸イソアミルもバランス良く生成するという香味にすぐれ、発酵力が強く酸生成量も少ない新規変異酵母を新たに造成することを目的とする。また、本発明は、生ヒネ香「ムレ臭」のひとつであるイソバレルアルデヒドの生成を抑制した香りの高い清酒等酒類を新規に製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、酢酸イソアミルを高生成する酵母はイソアミルアルコールも高生成するのが通常であって、酢酸イソアミルは高生成する一方イソアミルアルコールの生成は抑制するという特性は両立し難い性質ということができるところ、本発明は、このような両立し難い性質を併有する新規酵母を育種するためになされたものである。
【０００８】
そのうえ更に、カプロン酸エチルは高生成し、且つ発酵力は強く、酸生成量も少ないという性質も併有する新規酵母を育種するためになされたものである。
【０００９】
上記目的、両立し難い目的を達成するため、本発明者らは、各方面から検討の結果、育種した酵母の用途のひとつが酒類の醸造、つまり飲食品の製造である点に鑑み、人工的な遺伝子操作によるのではなく、既存の酵母の交雑によって目的とする変異酵母を新たに育種、造成することとした。
【００１０】
そして、本発明者らは、鋭意研究した結果、醸造酵母を変異処理し、セルレニン含有培地及び５’−５’−５’−トリフルオロ−Ｄ，Ｌ−ロイシン含有培地で生育した菌株から取得され、カプロン酸エチル及び酢酸イソアミルを多く生成する高エステル生成変異酵母と、吟醸用清酒酵母とを交雑したところ、イソアミルアルコールの生成が少なく、しかし酢酸イソアミルはバランス良く生成し、且つ、カプロン酸エチルは多く生成し、酸生成は少なく、発酵力は強く、香味が優れている新規変異酵母を取得することにはじめて成功した。
【００１１】
本発明に係る変異酵母は、上記したように、近年育種された高エステル生成酵母と従来よりすぐれた清酒を醸し出す優良酵母として使用されており、例えば長年吟醸用清酒酵母として広く使用されている酵母を交雑することによって得ることができる。
【００１２】
香りの高い高エステル生成変異酵母としては、脂肪酸合成酵素を阻害する抗生物質として知られるセルレニン耐性株より収得するカプロン酸エチル高生成変異酵母の収得方法と、ロイシンアナログの５'−５'−５'−トリフルオロ−Ｄ，Ｌ−ロイシン耐性株より収得される、酢酸イソアミル高生成変異酵母の収得方法の２方法を利用して育種され、すでに実用化されている酢酸イソアミル及びカプロン酸エチル双方のエステルを高生成し、かつ酸生成の少ないＫ−１６０１号酵母及びＫ−１７０１号酵母が例示される。なお、これらの変異酵母はイソアミルアルコール生産性は維持している。
【００１３】
また、後者の酵母としては、従来より吟醸用清酒酵母等として広く使用されている酵母が適宜使用され、例えば、きょうかい７号酵母（Ｋ−７）、きょうかい７０１号酵母（Ｋ−７０１）、きょうかい９号酵母（Ｋ−９）、きょうかい９０１号酵母（Ｋ−９０１）、きょうかい１００１号酵母（Ｋ−１００１）、等が例示される。
【００１４】
高エステル生成変異酵母とＫ−９等常用されている優良酵母をマス−メーティング（Ｍａｓｓ−ｍａｔｉｎｇ）法その他常法にしたがって交雑することにより、目的とする変異酵母を取得することができる。
【００１５】
このようにして、酢酸イソアミル及びカプロン酸エチル高生成のＫ−１６０１号及びＫ−１７０１号酵母とＫ−９号等の優良常用酵母との交雑により、イソアミルアルコールの生成量が既存の各種きょうかい酵母等より少なくかつ、カプロン酸エチル高生成で、酢酸イソアミルもバランス良く生成するという香味に優れた交雑株で、かつ一般的な変異酵母の短所である醗酵力が弱いという弱点をなくし、さらに酸生成の少ない変異酵母の造成を行い、最終的にＫ−１６０１号酵母とＫ−９号酵母との交雑株を特にすぐれた変異酵母として選抜した。又、造成した酵母はＫ−１６０１号、Ｋ−１７０１号、きょうかい７号酵母（Ｋ−７号）、きょうかい７０１号酵母（Ｋ−７０１）、Ｋ９号、きょうかい９０１号酵母（Ｋ−９０１）及びきょうかい１００１号酵母（Ｋ−１００１）等、代表的な各種清酒用きょうかい酵母とは容易に識別が可能であり、酵母の保存管理は勿論のこと、酒母もろみ管理等品質管理上優れた新規酒造適性を有する清酒酵母である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、一方の親株として例えばＫ−１６０１号酵母を使用したにもかかわらず（すなわち、カプロン酸エチル及び酢酸イソアミルを高生成するとともにイソアミルアルコールも高生成する変異酵母を使用したにもかかわらず）、得られた交雑株は、カプロン酸エチルを両親株よりも高生成する一方、酢酸イソアミルも両親株には多少劣るもののバランス良く生成するが、イソアミルアルコールの生成はＫ−１６０１といった高エステル生成変異酵母よりもはるかに低いというきわめて特徴的な特性を有する交雑株を得ることができる。
【００１７】
このような交雑株は従来知られておらず、したがって本発明に係る変異酵母は新規変異酵母ということができる。
【００１８】
本発明を実施するには、Ｋ−１６０１、Ｋ−９といった市販されている酵母を親株として用い、公知の交雑法（例えば、マス−メーティング法）によって交雑し、目的菌株をスクリーニングすればよい。交雑株の確認方法も後記する方法によれば迅速的確に行うことができるので、本願明細書の記載によれば本発明は充分に実施可能である。
【００１９】
また、上記きょうかい酵母のほか、高エステル高生成変異酵母も、例えば次のような操作を行うことにより適宜育種可能であるので、この点からしても、本発明は充分に実施可能である。
【００２０】
すなわち、先ず各種醸造酵母を変異処理するが、変異処理としては常法が使用される。変異の物理的方法としては、紫外線照射、放射線照射などがあり、化学的方法としては、変異剤、例えば、エチルメタンサルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、アクリジン系色素などの溶液に懸濁させる変異方法がある。
【００２１】
変異酵母は、セルレニン含有培地で培養する。セルレニンの添加は、固体培地、液体培地のいずれでもよく、１０〜１００μＭ、好ましくは２５μＭ程度添加して使用する。処理酵母としては、清酒酵母、焼酎酵母、ビール酵母、ワイン酵母、パン酵母のいずれの酵母でもセルレニン耐性株を得ることができる。各種酵母を変異処理した後、セルレニン含有培地に移し、３０℃、１週間程度培養して生育した菌株を分離し、これから、カプロン酸をよく生成する酵母を採用すればよい。
【００２２】
このようにして得た変異酵母は、次いでロイシンアナログ（５'−５'−５'−トリフルオロ−Ｄ，Ｌ−ロイシン）を０．５〜５ｍＭ、例えば１ｍＭ程度添加した固体培地等の培地にて３０℃で２日間程度培養して、生じたコロニーを分離し、これからイソアミルアルコール及び酢酸イソアミルをよく生成する酵母を採用すればよい。
【００２３】
このようにして、カプロン酸エチル及び酢酸イソアミルを高生成する高エステル生成酵母を取得することができ、本酵母の取得は充分に実施可能である。また、所望するのであれば、セルレニン含有培地での処理とロイシンアナログ培地での処理について、その順序を逆にしてもよいし、同時に行ってもよい。
【００２４】
高エステル生成酵母とＫ−９といった市販のすぐれた酵母との交雑株は、親株がイソアミルアルコールを高生成するにもかかわらず、その生成が著しく抑制されるという特筆すべき著効を奏する。しかもその一方で、親株と比較しても、酢酸イソアミルもバランス良く生成し、カプロン酸エチルは高生成するという著効も奏する。そのうえ、本交雑株は、一方の親株が本来有している発酵力が強く、酸生成量も少ないという特性は維持されているという著効も併せ奏される。
【００２５】
このようにして育種、造成された新規変異酵母は、これを用いることにより香味のすぐれた酒類を醸造することができる。得られた酒類は、親株を用いた場合に比して、カプロン酸エチルは高生成され、酢酸イソアミルもバランス良く生成される一方、生ヒネ香「ムレ臭」といわれるイソバレルアルデヒドのプレカーサーといわれるイソアミルアルコール生成量が非常に低く、このような著効を奏する清酒等の酒類は従来にはなく、新規である。事実、２０℃という高温に３ヶ月という長期間保存したにもかかわらず、イソバレルアルデヒドの生成量が親株を用いた場合に比して大幅に低いことが実際に確認されている。
【００２６】
したがって、本発明によれば、ムレ臭のない香味のすぐれた清酒、焼酎等の酒類を効率的に製造できるという著効が奏される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、カプロン酸エチル及び酢酸イソアミルを高生成する高エステル生成変異酵母と、香味、発酵力とともに酒造適性にすぐれた特性を有し、広く使用されている酵母（例えば、吟醸用清酒酵母：好適例のひとつとしてＫ−９号酵母が挙げられる）とを交雑することにより、イソアミルアルコールの生成が少なく、カプロン酸エチル等エステル高生成でかつ、酸生成の少ない発酵力の強い香味の優れた新規酵母を造成するものであり、この新規酵母を用いてムレ臭が低い香味のすぐれた酒類を製造するものである。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を清酒酵母、清酒醸造を例にとって更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００２９】
（交雑株の造成）
Ｋ−１６０１号及びＫ−１７０１号酵母よりランダムに多くの一培体株を分離し、それらの中から、カプロン酸エチル及び酢酸イソアミルを高生成で、かつイソアミルアルコール及び酸生成が少なく、発酵力の強い一培体株泡なし性の１６０１−Ｈｐ１０（接合型（ＭＡＴａ））を選択した。
【００３０】
一方、Ｋ−９号酵母及びＫ−９０１号酵母よりＫ−１６０１号及びＫ−１７０１号酵母の一倍体株の分離方法と同様にランダムに多くの一倍体株を分離し、最終的にイソアミルアルコール及び酸生成が少なく、醗酵力の強い香味に優れた１倍体株を、泡なし性の９−Ｈｐ５（接合型（ＭＡＴα））を選択した。選択したＫ−１６０１号酵母の一倍体株とＫ−９号酵母の１倍体株との交雑株の多くから、小仕込み試験により最も目的にあった二倍体株の泡なし性の交雑株（９−Ｈｐ５×１６０１−Ｈｐ１０）Ｄｐ−１２を選択した。
【００３１】
（１）Ｋ−１６０１号、Ｋ−１７０１号、Ｋ−９号酵母及びＫ−９０１号酵母の一倍体株の分離方法、接合型の決定方法
供試酵母をＢｌｌｇ．５°麦汁培地に３０℃、２日間振とう培養した酵母菌体を殺菌水で洗浄した後、０．４％酢酸カリウム含有寒天培地（胞子形成培地）に塗布し、３０℃、２日間培養して形成させた胞子を殺菌水で洗浄し、これに細胞壁溶解酵素（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ  １００Ｔ生化学工業）０．０５％加えて、３０℃、１時間作用させて細胞壁を溶解し胞子を遊離させた後、５８℃、２０分加熱し、二倍体酵母を滅菌処理した後、Ｂｌｌｇ．１０°麹汁寒天平板培地上に塗布し、３０℃、７〜１０間培養して一倍体酵母を増殖させた。生育してきたコロニーをランダムに釣菌して麦汁培地で３０℃、３日間培養後、あらかじめ同様に培養しておいたサッカロミセス・セレビシエの標準株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＦＯ  １０１７５（ＭＡＴａ）及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＦＯ  １０１７６（ＭＡＴα）の酵母と麦汁寒天平板培地上で交叉画線し、３０℃、３日間培養した後、交叉部分の一部を釣菌してＢｌｌｇ．５°麹汁培地で、３０℃、２日間培養後、前記同様に胞子形成培地にて胞子を形成させ交雑後の接合子形成の有無により供試菌の一倍体酵母の接合型を決定した。
【００３２】
（２）Ｋ−１６０１号酵母の一倍体株１６０１−Ｈｐ１０（接合型（ＭＡＴａ））とＫ−９号酵母の一倍体株９−Ｈｐ５（接合型ＭＡＴα））の交雑方法
Ｍａｓｓ−ｍａｔｉｎｇ法によった、すなわち前記で決定されたＫ−１６０１号とＫ−９号酵母の一倍体株をＢｌｌｇ．５°麹汁で３０℃、２日間前培養後、Ｂｌｌｇ．１０°麦汁寒天平板培地上で交叉画線して交雑させ、多くの交雑株の中より胞子形成の有無や、各一倍体株及び交雑二倍体株の菌学的諸性質の比較等により交雑の確認を行い、最終的に小仕込み試験により目的株である（９−Ｈｐ５×１６０１−Ｈｐ１０）Ｄｐ−１２を選択した。
【００３３】
（３）育種株の交雑確認方法
i）交雑確認培地組成
供試酵母をＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース２％、寒天２．５％）１０ｍｌに植菌し、３０℃、２日間培養後、ガラクトース識別培地（酵母エキス０．１５％、ポリペプトン０．２％、ＫＨ2ＰＯ4  ０．１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０４％、ガラクトース２％、寒天２５％）、アラニン識別培地（Ｄｉｆｃｏ．  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  Ｗ／Ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ、グルコース２％、アラニン０．５％）、セルレニン識別培地（Ｄｉｆｃｏ．  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ、グルコース２％、寒天２．５％、セルレニン１ｐｐｍ）の各々の寒天平板識別培地に１シャーレあたり２００〜３００細胞数になる様塗布し、ガラクトース識別培地は３０℃、３〜４日、アラニン識別培地は３８℃、３〜４日、セルレニン識別培地は３０℃及び３５℃それぞれの温度で３〜７日培養し、生育してきたコロニーにそれぞれのＴＴＣ上層培地（ガラクトース識別培地にはガラクトース０．５％、２，３，５−Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄ  ０．０５％、寒天１．５％）、アラニン識別培地及びセルレニン識別培地にはグルコース０．５％、２，３，５−Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ０．０５％、寒天１．５％）、を重層後、３０℃、３〜４時間培養後ＴＴＣ染色性及び各々の識別培地における生育性を比較して、Ｄｐ−１２は９−Ｈｐ５（（ＭＡＴα））と１６０１−Ｈｐ１０（（ＭＡＴａ））との交雑株であることを確認できた。
【００３４】
ii）交雑確認方法
Ｋ−９号酵母の一倍体株９−Ｈｐ５（接合型ＭＡＴα））のガラクトース識別培地３０℃及びアラニン識別培地３８℃それぞれの識別培地において、良く生育しかつ、それぞれのＴＴＣ染色性は各々白色と赤色を示すのに対し、Ｋ−１６０１号酵母の一倍体株１６０１−Ｈｐ１０（接合型（ＭＡＴａ））は前記２方法の識別培地では全く生育できない特性を有する。この一倍体株同士の交雑株（９−Ｈｐ５×１６０１−Ｈｐ１０）Ｄｐ−１２はガラクトース識別培地３０℃で良く生育しかつ、ＴＴＣ染色性は赤色を呈し、アラニン識別培地３８℃で良く生育しかつ、ＴＴＣ染色性は白色を呈すことから、双方の一倍体株の持たない特性を有するので明らかに交雑されたことが確認できる。又、セルレニン識別培地３５℃においては９−Ｈｐ５は全く生育不可能なのに対し、１６０１−Ｈｐ１０は良く生育しかつ、ＴＴＣ染色性は白色を呈するのに対して、交雑株（９−Ｈｐ５×１６０１−Ｈｐ１０）Ｄｐ−１２は良く生育しかつ、ＴＴＣ染色性は赤色を呈するこのことからも交雑株が双方の一倍体株の特性を有していることが、確認されるとともに、又、セルレニン耐性が交雑株に受け継がれていることも確認できた。
【００３５】
交雑株の各種確認方法一覧を下記表１に示す。
【００３６】
【表１】
2008054560.tif 000002
【００３７】
（４）Ｋ−１６０１号酵母とＫ−９号酵母の一培体株及び交雑株の小仕込み結果
交雑株及び一倍体株の小仕込み結果では、交雑株は親株のＫ−９号酵母及びＫ−１６０１号酵母に比べ、カプロン酸エチルの生成量が高いわりに、酢酸イソアミルも比較的多く生成する。反面、イソアミルアルコール及び酸生成量が少なくかつ、非常に醗酵力の強い２倍体株を造成した。得られた結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
2008054560.tif 000003
【００３９】
なお、小仕込みは次のようにして行った。
小仕込み方法；
α米（乾燥蒸米）１１５ｇ、Ａ麹（アルコール脱水麹）３５ｇ、汲み水２７０ｍｌ  １５℃、一定醗酵。
【００４０】
（５）純米吟醸総米８ｔ仕込み結果
表３の仕込み配合にて純米吟醸総米８トン仕込にて吟醸酒を製造した。製成酒の一般成分の分析結果を表４に示した。
【００４１】
（表３）
純米吟醸総米８トン仕込み配合
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
原料          酒母        初添        中添        留添            計
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
総米（ｋｇ）  ５６０  １，１１０  ２，２２０  ４，１１０    ８，０００
蒸米（ｋｇ）  ３８０      ８００  １，８００  ３，５７０    ６，５５０
麹米（ｋｇ）  １８０      ３１０      ４２０      ５４０    １，４５０
汲み水（Ｌ）  ６５０  １，３５０  ３，０００  ６，２００  １１，２００
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
原料米；精米歩合６０％  五百万石
【００４２】
（表４）
一般成分
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
Ｋ−９０１  Ｋ−１７０１  Ｋ−１６０１      交雑株
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
アルコール分（％）      １８．２      １８．１      １７．８    １７．９
日本酒度                ＋３．０      ＋１．５      ＋１．０    ＋０．５
酸度                    ２．００      ２．１５      １．５５    １．４５
アミノ酸度              １．２５      １．３５    １．４      １．２０
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
【００４３】
得られた製成酒の香気成分をガスクロマトグラフィーによって分析した。香気成分分析条件を以下に示し、得られた香気成分結果を表５に示した。
【００４４】
（ＧＬＣ分析条件）
島津ＧＣ−９Ａ（ＦＩＤ）
Ｃｏｌｕｍｎ  ＰＥＧ  １５４０  １０％  ６０／８０  Ｕｎｉｐｏｒｔ  Ｒ  Ｇｌａｓｓ  ３φ×３ｍ
Ｃａｒｒｉｅｒ  ｇａｓ      ０．６ｍｌ／ｍｉｎ
Ｈ2   ｇａｓ                ０．８ｍｌ／ｍｉｎ
Ａｉｒ                      ０．８ｍｌ／ｍｉｎ
ＩＮＪ／ＤＥＴ  Ｔｅｍ      １８０℃
Ｃｏｌｕｍｎ  Ｔｅｍ  ６０℃（１０ｍｉｎ）→１００℃（５℃／ｍｉｎ）→１００℃（ｈｏｌｄ）
Ｒａｎｇｅ                  １０2
Ａｔｔｅｎ                  １
測定方法      ヘッドスペース法（５２℃／３０ｍｉｎ）
【００４５】
（表５）
香気成分
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
Ｋ−９０１  Ｋ−１７０１  Ｋ−１６０１  交雑株
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
アセトアルデヒド            ２８            ４０          ２１    ３９
ｎ−プロピルアルコール      ７２            ５９          ６５    ５５
イソブチルアルコール        ４９            ２８          ２２    ３７
イソアミルアルコール      １３３          ２１５        １８４  １１２
酢酸エチル                  ６５            ４４          ４６    ２９
酢酸イソアミル            ３．１          ４．８        ３．２  ２．１
カプロン酸エチル          ２．１          ４．０        ５．８  ９．２
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
単位；ｐｐｍ
【００４６】
また、得られた製成酒について、下記の有機酸組成分析条件にて有機酸組成の分析を行い、表６の結果を得た。
【００４７】
（有機酸組成分析条件）
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｓｈｉｎ−ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０２  Ｈ（７．９ｍｍφ×３０ｃｍ）
Ｍｏｂｉｌｅ  ｐｈａｓｅ：  ０．８５％  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  Ａｃｉｄ：  Ｗａｔｅｒ（７：９３，ｖ／ｖ）
Ｃｏｌｕｍｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：  ５０℃、６５℃
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：  １．０ｍｌ／ｍｉｎ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ：  １５μｌ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：  ＵＶ  ２１０  ｎｍ
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ：  ｐｅａｋ  ｈｅｉｇｈｔ  ｍｅｔｈｏｄ
【００４８】
（表６）
有機酸組成
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
Ｋ−９０１    Ｋ−１７０１    Ｋ−１６０１    交雑株
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
クエン酸          ９７          ８２            ９３            １０１
ピルビン酸        ８            ９９            ９              ９
リンゴ酸          ３３４        １２１          １９７          １８５
コハク酸          ２７８        ２３２          １８６          １８６
乳酸              ３０４        ３４２          ２６６          ２３２
フマル酸          ７            ４              ４              ８
酢酸            ｔｒａｃｅ    ｔｒａｃｅ      ｔｒａｃｅ      ｔｒａｃｅ
ピログルタミン酸  ２４          １９            １０            ２９
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
合計              １０５２      ８９９          ７６５          ７５０
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
単位；ｐｐｍ
【００４９】
製造した清酒のもろみ経過、香気成分、及び酸度の分析結果交雑株は、醗酵力が強いのでもろみ日数が短縮でき、イソアミルアルコールの生成が少なく、カプロン酸エチル等エステル高生成でかつ、酸生成の少ない結果となり、官能試験の結果においては、香り華やかで香味の整ったふくらみのある吟醸酒で、苦が渋味や雑味も特に指摘されるものでなく、オフフレーバー等の問題点も無かった。
【００５０】
（６）貯蔵温度及び貯蔵時間とイソバレルアルデヒド（ムレ臭成分）生成量の比較
次に、得られた製成酒について、火入れしたもの及び火入れをしない生に分け、それぞれ、５℃及び２０℃にて０〜３ヶ月間貯蔵し、イソバレルアルデヒドの生成量の比較を行った。
【００５１】
イソバレルアルデヒドの分析は下記表７に示した分析条件にて行った。得られた結果は表８及び図１に示した。
【００５２】
（表７）
（ＧＬＣ分析条件）
島津  ＧＣ−１７００（ＦＩＤ）
Ｃｏｌｕｍｎ    Ｊ＆Ｗ社製、ＤＢ−ＷＡＸキャピラリーカラム（０．２５ｍｍ×０．２５μｍ×３０ｍ）
Ｃａｒｒｉｅｒ  ｇａｓ    Ｈｅ、０．９ｍｌ／ｍｉｎ
ＩＮＪ／ＤＥＴ  Ｔｅｍ    ２５０℃
Ｃｏｌｕｍｎ  Ｔｅｍ    ５０−７０℃（１℃／ｍｉｎ）、７０−２２０℃（５℃／ｍｉｎ）
Ｒａｎｇｅ    ４
Ａｔｔｅｎ    １
スピリット比    １／１００
試料    ２μｌ
測定方法    酢酸エチル抽出法
【００５３】
（表８）
（分析結果）
貯蔵温度とイソバレルアルデヒド生成量
生５℃                              生２０℃
Ｋ−９０１  Ｋ−１６０１  交雑株    Ｋ−９０１  Ｋ−１６０１  交雑株
０ケ月  ０．００２  ０．００４  ０．００４    ０．００２  ０．００４  ０．００４
１ケ月  ０．０２      ０．０８    ０．０２        ０．２      ０．５      ０．２
２ケ月    ０．１１    ０．１６    ０．０９        ０．８      １．１      ０．６
３ケ月    ０．１５    ０．２５    ０．１３        １．２      １．９      ０．９
火入れ５℃                            火入れ２０℃
Ｋ−９０１  Ｋ−１６０１    交雑株    Ｋ−９０１  Ｋ−１６０１  交雑株
０ヶ月  ０．００２  ０．００４  ０．００４    ０．００２  ０．００４  ０．００４
１ヶ月  ０．００２  ０．００４  ０．００４    ０．００２  ０．００４  ０．００４
２ヶ月  ０．００２  ０．００４  ０．００４    ０．００２  ０．００４  ０．００４
３ヶ月  ０．００２  ０．００４  ０．００４    ０．００２  ０．００４  ０．００４
【００５４】
生酒の劣化臭である「ムレ香」の主体をなすイソバレルアルデヒドの弁別閾値は上立香で１．７〜１．８ｐｐｍ、含み香で２．４ｐｐｍといわれており、清酒中には一般的に０．１〜２ｐｐｍ含まれている。この成分は清酒中のイソアミルアルコールを前駆体とし、麹由来の酵素的酸化反応により、生酒の貯蔵温度が高いほどかつ、貯蔵時間が長いほどイソバレルアルデヒドが加速的に生成されることが判明（文献；西村顕、醸協８８（１１）８５２（１９９３））しているが、図１に示したように、火入れ処理のされていないＫ−１６０１号酵母の生酒貯蔵酒のイソバレルアルデヒドの生成量は貯蔵温度２０℃では、貯蔵月数が多いほど非常に多くなる反面、Ｋ−７０１号酵母及び交雑株のイソバレルアルデヒドの増加量は少なく、特に交雑株の増加量が少なく抑えられている。
【００５５】
（７）交雑株の識別方法
交雑株と各種きょうかい酵母との識別は次のようにして行った。すなわち、下記する組成の識別培地を用いて、下記する識別方法にて行った。
【００５６】
１）交雑株の識別培地組成
供試酵母をＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース２％、寒天２・５％）１０ｍｌに植菌し、３０℃、２日間培養後、マルトース、ガラクトース及びα−メチル−Ｄ−グルコシド識別培地（（α−ＭＧ識別培地）（酵母エキス０．１５％、ポリペプトン０．２％、ＫＨ2ＰＯ4  ０．１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０４％、マルトース、ガラクトース及びα−ＭＧの各々の識別培地に該当する炭素源の糖類を２％、寒天２．５％））、アラニン識別培地（Ｄｉｆｃｏ．  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  Ｗ／Ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍｕ  Ｓｕｌｆａｔｅ、グルコース２％、アラニン０．５％）、セルレニン識別培地（Ｄｉｆｃｏ．  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ、グルコース２％、寒天２．５％、セルレニン  １ｐｐｍ）、β−アラニン識別培地（日本醸造協会製）の各々の寒天平板識別培地に１シャーレあたり２００〜３００細胞数になる様塗布し、ガラクトース識別培地は３０℃、３〜４日、アラニン識別培地は３８℃、３〜４日、β−アラニン識別培地及びセルレニン識別培地は３０℃及び３５℃それぞれの温度で３〜７日培養し、生育してきたコロニーにそれぞれのＴＴＣ上層培地（ガラクトース識別培地にはガラクトース  ０．５％、２，３，５−Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄ  ０．０５％、寒天１．５％）、アラニン識別培地及びセルレニン識別培地にはグルコース０．５％、２，３，５−Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄ  ０．０５％、寒天  １．５％）、を重層後、３０℃、３〜４時間培養後ＴＴＣ染色性及び各々の識別培地における生育性を比較して、交雑株と各種きょうかい酵母との識別を行った。
【００５７】
２）各種きょうかい酵母と交雑株との識別方法
各酵母の菌学的性質は表９に示したが、この性質を利用して識別することができる。
【００５８】
【表９】
2008054560.tif 000004
【００５９】
清酒製造用酵母として、代表的なＫ−７、Ｋ−７０１、Ｋ−９、Ｋ−９０１、Ｋ−１００１及び高エステル生成酵母としてＫ−１６０１、Ｋ−１７０１酵母と新規育種交雑株（９×１６０１）Ｄｐ−１２との識別方法として、図２に示したようにセルレニン１ｐｐｍを含むセルレニン識別培地３０℃において良く生育しかつ、ＴＴＣ染色性が赤色に染色されるのはＫ−１６０１号酵母、Ｋ−１７０１酵母と交雑株の（９×１６０１）Ｄｐ−１２であり、反面セルレニン識別培地３０℃で全く生育できないのはＫ−７、Ｋ−７０１、Ｋ−９、Ｋ−９０１及びＫ−１００１号酵母の従来の代表的なきょうかい酵母である。
【００６０】
このグループをβ−アラニン識別培地３５℃において生育性を示し、ＴＴＣ染色性が赤色に染色されるＫ−９、Ｋ−９０１及びＫ−１００１号酵母と、不生育を示すＫ−７及びＫ−７０１号酵母とに区別される。セルレニン識別培地３０℃で良く生育し、ＴＴＣ染色性が赤色を示すＫ−１６０１号、Ｋ−１７０１号及び交雑株（９×１６０１）Ｄｐ−１２酵母の高エステル生成酵母は、マルトース、ガラクトース、ロイシン及びα−ＭＧの各種識別培地で良く生育しかつ、染色性が赤色を示すのがＫ−１７０１酵母と交雑株（９×１６０１）Ｄｐ−１２であり、不生育又は生育しても極く僅かで染色性は白色を示すのがＫ−１６０１酵母である。
【００６１】
又、ガラクトース識別培地３０℃で良く生育してＴＴＣ染色性が赤色を示すＫ−１７０１酵母と交雑株（９×１６０１）Ｄｐ−１２は、ガラクトース識別培地３５℃で良く生育しＴＴＣ染色性は赤色を示すが、反面全く生育性を示さないのが交雑株（９×１６０１）Ｄｐ−１２であり、交雑株の識別が可能になる。
【００６２】
なお、図３に示すようにロイシン識別培地３０℃では交雑株も含め全ての供試酵母は良く生育し、ＴＴＣ染色性が赤色を示すが、Ｋ−１６０１号酵母のみ良く生育しかつ、ＴＴＣ染色性が白色を示す。しかし、ロイシン識別培地３５℃での平板培地における培養条件では、良く生育しかつ、ＴＴＣ染色性が赤色に染色されるのが交雑株を含めＫ−９、Ｋ−９０１及びＫ−１００１号酵母であり、反面良く生育しかつ、ＴＴＣ染色性が白色を示すのがＫ−７、Ｋ−７０１及びＫ−１７０１号酵母であり、全く生育できないのがＫ−１６０１号酵母のみである。
【００６３】
以上の識別方法を用いることにより、交雑株（９×１６０１）Ｄｐ−１２は清酒醸造用酵母として全国的に広く使用されている各種きょうかい酵母とは性質が異なる新たな酒造適性をもつ清酒用酵母でありかつ、他の優良清酒酵母と識別が可能な新規清酒酵母である。保存中の自然変異や汚染酵母の有無の確認が可能なことから、酵母の保存管理、酒母及びもろみ管理等品質管理上優れた新規酵母である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】貯蔵温度とイソバレルアルデヒド生成量との関係を示す。
【図２】識別方法を示す。
【図３】識別方法を示す。
【図１】
2008054560.tif 000005
【図２】
2008054560.tif 000006
【図３】
2008054560.tif 000007