(57)【要約】【課題】ＤＮＡを含む検体が塗布されたろ紙中の標的ＤＮＡを、液体への溶出操作を介さずに迅速・高感度に、かつ定量的に測定する方法を提供する。さらに、本発明は、陽性者の割合が低い疾患又は感染においても容易に低コストで実施可能な簡便、迅速、高感度なスクリーニング方法を提供する。【解決手段】以下の工程を含む、体液検体中の検出対象遺伝子を検出又は定量する方法：（Ａ）体液検体をろ紙に付着させる工程；（Ｂ）前記ろ紙を洗浄液で洗浄する工程；（Ｃ）前記ろ紙を鋳型として使用してリアルタイムＰＣＲ法により体液検体中に存在する検出対象遺伝子を増幅させる工程；及び（Ｄ）光電子増倍管を用いる検出器を用いて増幅された遺伝子に起因する蛍光を検出又は定量する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、体液検体中の検出対象遺伝子を検出又は定量する方法：
（Ａ）体液検体をろ紙に付着させる工程；
（Ｂ）前記ろ紙を洗浄液で洗浄する工程；
（Ｃ）前記ろ紙を鋳型として使用してリアルタイムＰＣＲ法により体液検体中に存在する検出対象遺伝子を増幅させる工程；及び
（Ｄ）光電子増倍管を用いる検出器を用いて増幅された遺伝子に起因する蛍光を検出又は定量する工程。
【請求項２】
工程（Ｂ）における洗浄液が、水又は培地である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
体液検体が尿である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（Ａ）が紙おむつ中で行なわれる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
検出対象遺伝子が病原体遺伝子である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法を行なうための試験キットであって、少なくとも、ろ紙と、検出対象遺伝子に対して特異的なプライマーとを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿などの体液を検体として、検体中に含まれる病原性微生物などの遺伝子を検出又は定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアッセイは、感染性疾患をもたらす細菌、マイコプラズマ、ウイルスなどの病原体を高感度で迅速に検出することが可能である。ＰＣＲ法の一種であり、増幅を経時的に測定するリアルタイムＰＣＲ法は、感度の高さに加えて、短時間での定量的な測定を可能にした。
【０００３】
このようなＤＮＡの定量を目的としたリアルタイムＰＣＲでは、ＤＮＡ検体は液体の形態で供されるのが一般的であった。しかし、液体検体からＤＮＡを抽出する際などには、微量の飛沫によって検体が汚染される可能性がある。また、尿のような検体は、少量の検体を精製なしでそのまま直接反応液に加えて（この方法を「ストレート」と以後表記することがある）用いることができるが、尿中に存在する何らかの阻害物質のために高効率でＰＣＲ反応を行なうことは困難である（Yamaguchi, 1992；Chang, 1996）。ＰＣＲベースの増幅・検出技術が急速に進歩している一方で、液体の検体の収集、輸送、保存及びそれらからの核酸の精製に関しての不便は、あまり改善されて来なかった。
【０００４】
ＤＮＡを含む検体を塗布したろ紙から、加熱によりＤＮＡを液体に溶出する技術も考案されている。また、体液検体を取り扱うためのロボットシステムがＤＮＡ精製のために開発されている。しかし、ロボットシステムは、検体を比較的大量に必要とすることに加え、そのような高価なシステムがどこでも導入し使用することができるわけではない。
【０００５】
上記のようないずれの改善策を講じるとしても、核酸抽出工程を必要とする場合、抽出の効率やばらつきがＰＣＲの定量性に影響することは避け難い。
【０００６】
糞便を溶解した液をろ紙に含ませ、そのろ紙をＰＣＲ反応溶液に漬けてからＰＣＲを行なう方法が考案されている（特許文献１）。しかし、この方法もまた、溶液の段階を含み、定量性や飛沫による汚染などの問題を解決できない。
【０００７】
ＰＣＲベースのアッセイをより効率的にかつコスト的に有利にするためには、以下のような特徴を有する方法が理想的であると考えられる：i）廉価であって容易に体液検体を収集できること、ii）非常に少量の検体を用いる高感度なアッセイであること、iii）安全な輸送のために検体を非感染性にする工程を含むこと、iv）室温での長期の検体の保存が可能であること、及びv）ＤＮＡ精製プロセスが不要であること。
【０００８】
これらの要求のいくつか（即ち収集及び保存）を満たす簡便な方法としては、乾燥血液スポットの使用が参考になる（Greeves, 1990）。同じ考え方に沿って、表面に殺菌剤を含むろ紙が商業的に開発された。何らかの溶液でろ紙を洗浄することにより、阻害物質が低減され、そのことによって従来のＰＣＲについてはろ紙上で行なうことが可能になった（Yourno, 1992）。
【０００９】
しかし、現在までのところ、リアルタイムＰＣＲについては、ろ紙上で病原体遺伝子等を定量的に検出することは成功していない。
【００１０】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）による妊婦の初感染が胎児への感染、即ち、先天性感染を引き起こすことがよく知られている。先天性ＣＭＶ感染の頻度は、全出生児の０．２〜０．５％とみられている。感染胎児の約１割が重篤な障害を伴って出生するが、出生時無症候児でもその１割以上で難聴等の神経学的障害を示すと考えられている。したがって、無症候感染児をも同定可能なスクリーニング法の開発が先天性ＣＭＶ感染症対策上重要である。
【００１１】
従来、先天性ＣＭＶ感染の同定は、生後３週以内の尿中ＣＭＶの検出で行われてきたが、全新生児から液体尿を収集・輸送・保存し、解析するには相当な労力がかかる。一方、新生児ガスリー血（ろ紙に採取された乾燥血液）を用いたネステッド（nested）ＰＣＲによる検出法の報告があるが、この方法は、新生児にとって侵襲性の高い血液を用いること、さらに、先天性ＣＭＶ感染児の血中ＣＭＶ量は尿中の約１／１００〜１０,０００であるため陽性児を見逃す可能性が高いこと、などが問題として挙げられる（Boppana, 2005; Halwachs-Baumann, 2002）。
【００１２】
したがって、迅速、廉価、簡便な方法の開発は、全新生児の中から先天性ＣＭＶ感染によるリスクを有する新生児を特定することを目的としたＣＭＶスクリーニングプログラムの施行のために重要である（Revello and Gerna 2002; Pass 2001）。
【特許文献１】特開２００６−１６６７１１
【非特許文献１】Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Biotechnology 10:413-417 (1992)
【非特許文献２】Yamaguchi, Y., Hironaka, T., Kajiwara, M., Tateno, E., Kita, H., and Hirai,K.  Increased sensitivity for detection of human cytomegalovirus in urine by removal of inhibitors for the polymerase chain reaction. J. Virol. Methods 37, 209-218 (1992)
【非特許文献３】Chang, D., M. Wang, W. C. Ou, R. T. Tsai, C. Y. Fung, and Y. J. Hwang.  A simple method for detecting human polyomavirus DNA in urine by the polymerase chain reaction. J.Virol.Methods 58:131-136 (1996)
【非特許文献４】Greeves, L. G., R. J. Leeming, K. Hyland, S. I. Dempsey, and D. J. Carson. 1990.  Neuroblastoma in a patient with dihydropteridine reductase deficiency. Eur.J.Pediatr. 149:713-715 (1990)
【非特許文献５】Yourno, J. and J. Conroy.  A novel polymerase chain reaction method for detection of human immunodeficiency virus in dried blood spots on filter paper. J Clin.Microbiol. 30:2887-2892 (1992)
【非特許文献６】Boppana, S.B., Fowler, K.B., Pass, R.F., Rivera, L.B., Bradford, R.D., Lakeman,F.D., & Britt,W.J.  Congenital cytomegalovirus infection: association between virus burden in infancy and hearing loss. J. Pediatr. 146, 817-823 (2005)
【非特許文献７】Halwachs-Baumann, G., B. Genser, S. Pailer, H. Engele, H. Rosegger, A. Schalk, H. H. Kessler, and M. Truschnig-Wilders.  Human cytomegalovirus load in various body fluids of congenitally infected newborns. J Clin.Virol. 25 Suppl 3:S81-S87 (2002)
【非特許文献８】Revello, M.G. & Gerna, G.  Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus, and newborn infant. Clin. Microbiol. Rev. 15, 680-715 (2002)
【非特許文献９】Pass, R.F.  Cytomegalovirus. pp. 2675-2705. In Fields VIrology, 4th. ed. eds. Knipe, D.M. & Howley, P.M., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA; (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ＤＮＡを含む検体が塗布されたろ紙中の標的ＤＮＡを、液体への溶出操作を介さずに迅速・高感度に、かつ定量的に測定する方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、陽性者の割合が低い疾患又は感染においても容易に低コストで実施可能な簡便、迅速、高感度なスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ろ紙上に新生児尿を収集し、ろ紙のまま迅速簡便に尿中のＤＮＡを定量する方法を確立し、本発明を完成した。
【００１５】
本発明によれば、
〔１〕  以下の工程を含む、体液検体中の検出対象遺伝子を検出又は定量する方法：
（Ａ）体液検体をろ紙に付着させる工程；
（Ｂ）前記ろ紙を洗浄液で洗浄する工程；
（Ｃ）前記ろ紙を鋳型として使用してリアルタイムＰＣＲ法により体液検体中に存在する検出対象遺伝子を増幅させる工程；及び
（Ｄ）光電子増倍管を用いる検出器を用いて増幅された遺伝子に起因する蛍光を検出又は定量する工程；
〔２〕  工程（Ｂ）における洗浄液が、水又は培地である、前記〔１〕記載の方法；
〔３〕  体液検体が尿である、前記〔１〕記載の方法；
〔４〕  工程（Ａ）が紙おむつ中で行なわれる、前記〔３〕記載の方法；
〔５〕  検出対象遺伝子が病原体遺伝子である、前記〔１〕記載の方法；
〔６〕  前記〔１〕記載の方法を行なうための試験キットであって、少なくとも、ろ紙と、検出対象遺伝子に対して特異的なプライマーとを含むキット、
が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、（１）液体のＤＮＡ検体を扱う必要がないことから、高感度なＰＣＲでの液体検体の扱いに伴う汚染が低減されること、（２）検体からのＤＮＡ溶出に必要な煩雑な作業が省略されること、（３）ＤＮＡ溶出に伴うＤＮＡ回収率及びＤＮＡ検出効率を起因とする定量性の不正確さが解消されること、（４）乾燥ろ紙検体の形態での検体の長期保存・大量保存が可能であること、（５）検出操作の自動化が可能であること、（６）多量の検体を同時に検査することが可能であること、（７）検体採取及び工程が簡便であるため、省力化・コスト削減が図れること、（８）結果の信頼性・正確性が高いこと、などの利点が挙げられる。
【００１７】
したがって、ハイスループットスクリーニング及び医学分野における診断のための迅速検査に特に適している。また、ろ紙を紙おむつに組み込めば、新生児・乳幼児に対して非侵襲性の安全で容易な尿検体採取が可能である。
【００１８】
また、本発明は、体液中の各種病原体などの検出に幅広く応用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の方法においては、最初に、体液検体をろ紙に付着させることによりろ紙に検体を収集する。体液検体としては、全血以外のものであればよく、例えば尿、唾液、髄液（ＣＳＦ）、血漿、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液などを用いることができる。検体は、検出対象の病原体又は遺伝子により、あるいは被験者の便宜により、適宜選択することができる。例えば、新生児の先天性ＣＭＶ感染のスクリーニングについては、検体採取が非侵襲性で、ウイルス存在量が他の体液と比較して多いことから、尿を選択することが有利である。
【００２０】
体液検体をろ紙に付着させる方法には特に制限はない。例えばろ紙に体液をスポットしたり、体液にろ紙を浸漬することができる。被験者が新生児又は乳幼児である場合は、紙おむつにろ紙を装着しておくことにより容易に尿検体を収集することができる。
【００２１】
ろ紙としては、特に制限なく医学・生化学分野で一般的に使用されるものを使用することができる。表面処理（殺菌剤処理など）の有無についても特に制限はない。本発明の方法に特に適したろ紙としては、Isocode(商品名、Schleicher & Schuell社)やFTAelute(商品名、Whatman社）などが挙げられる。
【００２２】
検出対象遺伝子としては、例えばサイトメガロウイルス、ポリオーマウイルスなどのウイルス；Chramydia trachomatis、Neisseriagonorrhoeae、Trichomonas vaginalis、Mycoplasma genitaliumなどの細菌・原虫などの微生物の遺伝子が挙げられるが、これらに限らない。さらに、疾患・症状の指標となる各種マーカー遺伝子を検出対象遺伝子とすることもできる。これらの検出対象遺伝子に対して特異的なプライマーの設計は、当業者には充分公知である。なお、検出対象遺伝子増幅用のプライマー対は、少なくとも一方が検出対象遺伝子に対して特異的であればよい。
【００２３】
第二の工程においては、体液検体を付着させたろ紙を洗浄する。この洗浄工程により検体中に含有されていた阻害物質が除去されて検査の感度及び正確性が向上する。洗浄は、通常、洗浄液で１回すすぐことで充分である。この操作は、例えば少量の洗浄液を入れたチューブに、検体を付着させ乾燥させたろ紙を入れて、洗浄液をアスピレーションにより取り除くことにより行なうことができる。洗浄液としては、医学・生化学分野で一般的に使用される各種緩衝液、生理食塩水、細胞培養用などの各種培地、水などを適宜使用することができるが、簡便性、経済性及び効果などの点から、水（蒸留水）及び培地が最適である。
【００２４】
第三の工程においては、上記で準備した検体付着ろ紙を鋳型としてそのまま使用して反応液中に入れ、リアルタイムＰＣＲ法を行い、体液検体中に存在した検出対象遺伝子を増幅させる。リアルタイムＰＣＲの反応液は、ろ紙のほか、一般に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、検出対象遺伝子を特異的に増幅させるためのプライマー対、ｄＮＴＰｓ、５’末端を蛍光物質で３’末端をクエンチャー物質で標識されたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、至適塩濃度の緩衝液などを含み、ウラシル−Ｎ−グルコシダーゼを含むことが望ましい。５’末端蛍光物質としてはＦＡＭ（succinimidyl esters of carboxy-fluorescein）など、３’末端クエンチャー物質としてはＴＡＭＲＡ（succinimidyl esters of carboxytetramethylrhodamine）などが適している。
【００２５】
ＤＮＡポリメラーゼは、一般にＰＣＲに使用されるものでよいが、その中でも耐熱性の高いものが特に適しており、例えば９５℃で１５分の処理に耐えるポリメラーゼが最も好ましい。具体的には、「SureStart Taq」ＤＮＡポリメラーゼ(商品名、Stratagene社)や「AmpliTaq Gold」ＤＮＡポリメラーゼ(商品名、Applied Biosystems社)などが挙げられる。
【００２６】
リアルタイムＰＣＲ反応に供した検体付着ろ紙へのＤＮＡポリメラーゼや増幅産物の不可逆的かつ非特異的な吸着を防ぐために、サケ精子などより得られたキャリアＤＮＡを一般的には１〜１０ng/μL、最も好ましくは２ng/μLの濃度で、及び／又は牛血清アルブミンのようなタンパクを一般的には５０〜２００μg/μL、最も好ましくは１００μg/μLの濃度となるように加えることが望ましい。
【００２７】
ＰＣＲ条件としては、一般的に行われるサイクル前のステップは５０℃、２分後、９５℃、１０分であるが、それよりも長く９５℃で加熱することが、ろ紙からの核酸の溶出のために望ましい。一方、長時間の９５℃での加熱はＤＮＡポリメラーゼの活性を低下させるおそれがある。したがって、サイクル前のステップとして５０℃、２分後、好ましくは９５℃、１５分〜２０分、最も好ましくは、９５℃、１５分加熱を行なった後に、温度サイクルを開始することが望ましい。
【００２８】
第四の工程は、第三の工程と平行して進行することができる。本発明においては、遺伝子増幅を検出するために光電子増倍管（photomultiplier tube；ＰＭＴ）、特にＰＭＴスキャン方式を用いることが重要である。ろ紙を入れたままの状態での測定であるので、他の方式の検出器では検出の正確性、検出感度又は定量性が低下し、不利であることが見出された。
【００２９】
本発明の方法は、必要な要素をセットにして試験キットとして提供することにより、より便利に行なうことができる。試験キットには、少なくともろ紙と、検出対象遺伝子に対して特異的なプライマーとを含むが、それ以外に、例えばＰＣＲ用のＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液など、上述したリアルタイムＰＣＲの必要成分や、反応用容器などを含んでいてもよい。そのようなキットは当業者が容易に設計することができる。
【００３０】
本発明の方法は、上述の有利な特徴のため、特に新生児の先天性感染症のスクリーニング等に有用であり、特に全新生児を対象としたＣＭＶスクリーニングの目的のためには本発明の方法は理想的である。
【００３１】
ＣＭＶスクリーニングを例にして説明すると、先天性ＣＭＶ感染を有する新生児の尿検体中のＣＭＶの検出に必要な感度は、少なくとも１０３コピー/μLである。これに対し、本発明の方法におけるＣＭＶの検出限界は５０コピー/μL以下であったので、はるかに高いものであった。したがって、本発明の方法によれば、従来の核酸抽出を要する方法等のような擬陽性の可能性が排除されるうえ、陽性の検体を見落とす危険性もほとんど又は全くなく、正確な判定が可能である。さらに、本発明の方法のコストは、ろ紙・反応試薬及び標準物質を含め、充分に低く（１検体当り８００円未満）、経済性の点からも全新生児を対象としたＣＭＶスクリーニングに使用するうえで充分現実的である。
【００３２】
以下の実施例においてはＣＭＶを病原体の例として使用したが、他の病原体又は検出対象遺伝子を用いる場合であっても基本的に同様であり、当業者は、目的に応じて最適なプライマー、検体、反応条件等を選択することにより適宜理想的な方法を設計することができる。
【実施例１】
【００３３】
１．ウイルス及び検体
ヒト被検材料の収集及び使用は、各協力機関の倫理委員会の承認及びインフォームド・コンセントを得たうえで行なった。０歳〜１５歳の新生児〜小児３４人から、採取時期の異なる計５５の尿検体を、紙おむつの皮膚に接触する側の表面シートに切れ込みを入れ、表面シートと吸収体との間にろ紙を装着して乳幼児に使用させることにより収集した。３４人のうち、顕性１不顕性５の計６人が先天性感染新生児であった。その他の２８人は、生後にＣＭＶ感染を受けた未熟児、骨髄移植患児、肺炎や肝炎を発症した小児、健常児など、先天性感染新生児以外のさまざまな乳幼児ないし小児であった。上記の乳幼児ないし小児の一部から全血、血漿、髄液、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を、また、健康成人より、全血、血漿、唾液を、常法によりそれぞれ収集した。
【００３４】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）Towne株（ＡＴＣＣより入手）を、一般的な方法によってｈＴＥＲＴ−ＢＪ1細胞（Invitrogen社より入手）で増殖させた。ウイルス粒子を含む培養上清を回収し、０．４５μm径のフィルター（Corning社製）でろ過後、２５，０００rpm（ベックマンＳＷ２８ローター）、６時間の超遠心分離を行なった。ウイルス粒子のペレットを得、一般的な生理リン酸緩衝液に懸濁した。この精製ウイルス粒子を、上記体液検体のなかでＣＭＶ陰性であった検体に添加して用いた。
【００３５】
ＰＣＲの鋳型は以下のようにして調製した。
【００３６】
精製ＤＮＡは、尿及びこれらの各体液検体から、「QIAamp viral RNA」及び「QIAamp DNA mini」キット（いずれも商品名；Qiagen社製）をそれぞれ業者の指示書にしたがって用いて調製した。
【００３７】
体液検体及び精製ウイルス粒子を添加したＣＭＶ陰性検体を、それぞれろ紙（特に示さない限り、商品名Isocode）に塗布した。その後、室温で風乾させた。これらのろ紙から直径３mmのディスクを打ち抜いて、２００μLの水（ＤＷ）を入れたチューブに入れて１回すすいだ後、２種類の方法で使用した。
【００３８】
第一の方法では、このディスクを直接ＰＣＲ反応において鋳型として用いた（本発明の方法。「ディスク上」）。
【００３９】
第二の方法では、９５℃で３０分間インキュベートすることによりディスクから溶液中にＤＮＡを回収し、この溶出液をＰＣＲ反応に用いた。
【００４０】
２．リアルタイムＰＣＲ法
ＣＭＶ検出のためのリアルタイムＰＣＲ法は、ＵＬ８３遺伝子を標的とするプライマー（Shibata, D., Martin, W.J., Appleman, M.D., Causey, D.M., Leedom, J.M., & Arnheim, N. Detection of cytomegalovirus DNA in peripheral blood of patients infected with human immunodeficiency virus. J. Infect. Dis. 158, 1185-1192 (1988)）及び５’末端にＦＡＭ、３’末端にＴＡＭＲＡを標識したＴａｑＭａｎプローブ（５’−ＴＴＣＧＧＣＧＡＡＧＡＴＧＣ−３’）のプライマーセットを用いて行なった。
【００４１】
５０μLの反応混合液は、１×「Brilliant QPCR Master Mix」（商品名；Stratagene社製）、５μgのＢＳＡ（ＮＥＢ社製）、０．２μMプライマー、０．１２５μM  ＴａｑＭａｎプローブ、及びキャリアＤＮＡとして１００ngのサケ精子ＤＮＡを含んでいた。なお、「Brilliant QPCR Master Mix」には、ホットスタート型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのひとつ「SureStart Taq」ＤＮＡポリメラーゼ(商品名；Stratagene社製)、ウラシル−Ｎ-グルコシダーゼ、至適塩濃度の緩衝液が含まれている。
【００４２】
ＰＣＲは、５０℃で２分及び９５℃で１５分の１サイクルの後、９５℃で１５秒、５８℃で３０秒、及び７２℃で３０秒の６０サイクルの条件で、リアルタイムＰＣＲ装置（特に示さない限り、商品名「Stratagene Mx3500P」）を用いて行なった。
【００４３】
３．ろ紙上でのリアルタイムＰＣＲ法による尿試料中のＣＭＶの検出効率
本発明のリアルタイムＰＣＲ法の用量依存性及び検出限界を以下のようにして調べた。
【００４４】
上記で調製したＣＭＶ粒子の希釈物を、ＣＭＶ陰性の乳幼児尿に添加した。この希釈したＣＭＶ粒子が添加された尿３μLを直径３mmのディスクに吸収させた。５０μLの反応混合液に、上記ディスクを加えリアルタイムＰＣＲを行なった
結果を図１に示す。精製ＤＮＡのコピー数を標準として用いて本方法におけるＣＭＶの検出限界を求めると、ＣＭＶ粒子を添加した尿を吸収させたディスクでは、約５０コピー/３μL（１反応）であった。検出されたコピー数（縦軸）は、７〜１７０，０００コピー/μLでろ紙上に添加したＣＭＶ粒子数（横軸）と平行な関係を有していた。また、ろ紙ディスクを用いた検出効率を各測定点での平均値として求めると、精製ＤＮＡの約１５％程度であった。
【００４５】
したがって、ろ紙ディスクを用いる本発明の方法は、尿中のＣＭＶを効率的かつ定量的に検出できた。
【００４６】
４．本発明の方法と他の方法との相関
本発明の方法の実用性を確認するために、３４人の新生児及び幼児から得た５５の尿検体中のＣＭＶを、i）これらの検体からの精製ＤＮＡ（もとの尿３μL分に相当）、ii）３μLの尿検体そのもの、及びiii）３μLの尿検体を塗布したろ紙ディスク、を鋳型として用いて、上記と同様にリアルタイムＰＣＲで定量的に検出した。図２に「精製ＤＮＡ」を横軸に「尿塗布ろ紙ディスク」の結果を縦軸に、測定結果を例示する。
【００４７】
これらの３種の鋳型を用いる方法において、測定されたＣＭＶコピー数は良好な相関を示した（相関係数は、「精製ＤＮＡ」と「尿そのもの」の間で０．８９；「精製ＤＮＡ」と「尿塗布ろ紙ディスク」間で０．９２；「尿そのもの」と「尿塗布ろ紙ディスク」間で０．９４）。各検体の「精製ＤＮＡ」中ＣＭＶ  ＤＮＡが１００％検出されるという前提で、同じ量のＣＭＶ  ＤＮＡを含むはずの「尿そのもの」もしくは「尿塗布ろ紙ディスク」中のＣＭＶ  ＤＮＡがどれだけ検出されたかを計算することで各検体の検出効率を求めることができる。そして、各検体の検出効率の平均値を算出することにより「尿そのもの」及び「尿塗布ろ紙ディスク」を鋳型とした場合の方法としての平均的な検出効率がそれぞれ約１４％及び約１３％であることが明らかになった。この検出効率は、上記３の実験で、精製ウイルス粒子（その精製ＤＮＡとは基本的に同じコピー数となる）をＣＭＶ陰性尿に添加して作製した人工的な検体（試料）を用いて得られた結果とよく一致したことから、臨床検体を用いた場合にも「尿塗布ろ紙ディスク」を用いる方法が有効であることが確認された。重要なことは、先天性ＣＭＶ感染の新生児の出生４日以内に得られた６つのすべての尿検体におけるＣＭＶコピー数はろ紙ディスク上でのリアルタイムＰＣＲの検出限界よりもはるかに高かったことである。
【００４８】
５．本発明の方法を用いた紙おむつ中での尿の収集とＣＭＶの検出
健常な新生児１００人及び先天性ＣＭＶ感染児１人の紙おむつにろ紙を装着し、排尿のあったところでろ紙を回収し自然に乾燥させた。リアルタイムＰＣＲ実施担当者にはどのろ紙がどの新生児から採取したかわからないようにして、上記と同じ方法で本発明によるろ紙ディスク上でのＣＭＶの検出を行なった。
【００４９】
その結果、先天性ＣＭＶ感染児より得られたろ紙のみがＣＭＶ陽性であった。したがって、本発明の方法は、新生児のＣＭＶスクリーニングプログラムに適用可能であることが明らかになった。
【００５０】
６．検出方式の比較
反応プレートのウェル中にろ紙ディスクを含むリアルタイムＰＣＲ法において蛍光を検出するために異なる方式の機器を試験した。
【００５１】
０コピー及び５．１×１０５コピーのＣＭＶ  ＤＮＡを塗布したろ紙片を直接リアルタイムＰＣＲ反応液に加え、ＣＣＤ方式の「ABI  7700」（Applied Biosystems）とＰＭＴスキャン方式（photomultiplier tube scanning system）の「STRATAGENE  MX3500P」の両機で同じ温度サイクル条件で増幅し、シグナルを検出した。
【００５２】
結果を図３に示す。パネル（Ａ）はSTRATAGENE  MX3500P、パネル（Ｂ）はABI  7700での結果である。
【００５３】
この結果から、シグナル検出のためにＣＣＤカメラを用いる機器（パネル（Ｂ））ではろ紙ディスク自体に起因する非特異的シグナルの影響を受けるため、０コピーと５．１×１０５コピーとで顕著な差がなく、本方法による検出に適さないが、ＰＭＴスキャン方式の機器（パネル（Ａ））ではろ紙ディスク自体に起因する非特異的シグナルの影響を受けないため、本方法に使用可能であることが判明した。
【００５４】
７．洗浄液の比較
本方法においてＰＣＲ反応を行なう前のろ紙の洗浄の条件を検討した。
【００５５】
約１．０×１０６コピーのＣＭＶ  ＤＮＡを塗布したろ紙片を、各種の洗浄液で洗浄後、直接リアルタイムＰＣＲ反応液に加え、Stratagene  MX3500Pで同じサイクル条件で増幅した。洗浄液としては以下のものを用いた：水（Ａ）、ＭＥＭ培地（Ｂ）、Lysis緩衝液（非特許文献５）（Ｃ）、ＦＴＡ精製試薬（商品名；Whatmann社製）（Ｄ）。洗浄なしのものを（Ｅ）とした。
【００５６】
結果を図４に示す。この条件下において洗浄なし（Ｅ）では蛍光が検出されなかったため、本発明の方法においては、ＰＣＲ反応前のろ紙の洗浄が必要であることが判明した。また、洗浄に使用する液体としては、特に制限はないが、水又は培地が最適であることが判明した。
【００５７】
８．尿以外の体液検体を用いたろ紙上でのリアルタイムＰＣＲ法
上記で使用した尿に加え、種々の体液検体を上記と同じ本発明の方法でＣＭＶ検出について解析した。
【００５８】
それぞれＣＭＶ陰性の体液（尿、唾液、血漿、髄液及び全血）又は水（ＤＷ）に添加し、３μL当り３．４×１０５個のＣＭＶウイルス粒子となるようにし、この３μL分を塗布した３mm径のろ紙ディスクを複数用意した。この一部のろ紙ディスクについては、ろ紙ディスクを５０μLの水の入ったチューブに入れ９５℃で３０分間インキュベートすることによりＤＮＡをろ紙から溶出させた。i) ３μLのＣＭＶウイルス粒子添加検体をそのまま加えたもの、ii) ３μL分のＣＭＶ添加検体を塗布したろ紙ディスク、及びiii)ろ紙より溶出されたＤＮＡを鋳型として用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。結果を表１に示す。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
表１に示すように、ろ紙上でのリアルタイムＰＣＲ法は、全血を除き、種々の体液検体中のＣＭＶの検出に適用可能であった。例えば、唾液中のＣＭＶ量は、唾液検体そのものを直接反応に加えると１５％が、ろ紙上での反応では７．４％が検出可能である。血漿および全血ではすでに報告されているようにヘモグロブリンによる阻害（Al Soud, W. A. and P. Radstrom  Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J Clin. Microbiol. 39:485-493(2001)）が強く、特に全血はろ紙上でもろ紙から溶出してもリアルタイムＰＣＲによる定量検出には適さなかった。ろ紙上での検出効率がろ紙より溶出した場合に比べ相対的に低いことは、i)水に精製ＣＭＶウイルス粒子を添加したものを塗布したろ紙でも同様な結果であること、ii)水に精製ＣＭＶウイルス粒子を添加したものを直接反応させる際に水で1度ないし３度洗浄したろ紙（検体は塗布されていない）を加えると１５％しかＣＭＶが検出されないことから、ろ紙が反応物やポリメラーゼを非特異的に吸着させるためであると推定される。
【００６１】
なお、表1には気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液への適用を示していないが、これは、ＣＭＶ陰性の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液検体は入手できなかったためで、その代わりに１μL当り約４×１０４  ＣＭＶゲノムコピーを含むＢＡＬ試料を用いて検出効率の評価を行なった。  ＢＡＬ検体そのもの（反応液中に３μL添加）及び３μLのＢＡＬ検体を吸収させたディスクを用いたリアルタイムＰＣＲにおける検出効率は、それぞれ７．８±０．２％及び３．６±０．１％であった。
【００６２】
９．ろ紙を用いたリアルタイムＰＣＲのための最適化
ろ紙の種類を変えて、ろ紙上でのＰＣＲ反応の効率を検討した。ろ紙としては、表面が殺菌剤で処理された３種のろ紙（「ＦＴＡカード」（Whatman）、「Generation  Caputureカード」（Gentra）、「Isocode」（Shuleicher & Schuell））及び遺伝子欠損の評価に使用されている「Guthrieカード」（Guthrie and Susi, 1963; Scriver 1998；Advantec）の４種の市販品を試験した  。
【００６３】
直径３mmのろ紙ディスクにＣＭＶウイルス粒子希釈液を添加したものを直接使用して、従来法でＣＭＶのＩＥ遺伝子を標的とするプライマーセットを用いて行なった（Borg, K. L., S. A. Nordbo, P. Winge, and A. Dalen.  Detection of cytomegalovirus using 'boosted' nested PCR. Mol.Cell Probes 9:251-257(1995)）。反応混合液５０μLは、１×  ｒＴａｑ緩衝液（商品名；Ｔａｋａｒａ社製）、０．２mM  ｄＮＴＰ、３mM  ＭｇＣｌ２、１．２５U  ｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Takara社製）、０．２５μM  ＩＥ遺伝子を標的とするプライマー（グライナー社にてカスタム合成）、及びキャリアＤＮＡとして１０ngのサケ精子ＤＮＡを含有していた。サイクル条件は、”Caballero, O. L., C. L. Menezes, M. C. Costa, S. C. Fernandes, T. M. Anacleto, R. M. de Oliveira, E. A. Viotti, E. R. Tavora, S. S. Vilaca, E. Sabbaga, F. J. de Paula, P. F. Tavora, L. L. Villa, and A. J. Simpson. Highly sensitive single-step PCR protocol for diagnosis and monitoring of human cytomegalovirus infection in renal transplant recipients. J.Clin.Microbiol. 35:3192-3197（1997）”に記載されたとおりであったが、サーマルサイクラー「GeneAmp 2700」（商品名；Applied Biosciences社製）で全部で４５サイクルを行なったことのみ違っていた。ＰＣＲ産物（３９３bp）の量をアガロースゲル電気泳動で半定量的に比較した。
【００６４】
結果を図５に示す。矢印はＰＣＲ産物の位置を表す。図５において、ろ紙Ａ＝「ＦＴＡカード」（Whatman）、Ｂ＝「Generation  Caputureカード」（Gentra）、Ｃ＝「Guthrieカード」（Advantec）、Ｄ＝「Isocode」（Shuleicher & Schuell）であった。
【００６５】
ろ紙Ｄ（「Isocode」）は、他のものよりも感度が優れていたが、他のろ紙でも使用可能であることが判明した。また、ろ紙上に殺菌剤のコーティングがされていないこと以外は「Isocode」ろ紙と同じろ紙（903 paper）も同様のＰＣＲ効率を示したので、ろ紙上の殺菌剤処理の有無がＰＣＲ反応に影響しないこともわかった。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明の方法によるＣＭＶ検出効率及び検出限界を表す図である。
【図２】本発明の方法と尿から精製したＤＮＡを鋳型として用いる方法とによる結果の相関を表す図である。黒い逆三角（▼）は、先天性ＣＭＶ感染新生児より出生４日以内に採取した尿、白い丸（○）はその他の小児から採取した尿をそれぞれ検体として用いた結果を表す。
【図３】本発明の方法における蛍光検出方式の比較を示す図である。パネル（Ａ）＝ＰＭＴ方式（Stratagene  MX3500P）、パネル（Ｂ）＝ＣＣＤ方式（ABI  7700）。
【図４】本発明の方法におけるろ紙の洗浄の効果を表す図である。Ａ＝水、Ｂ＝ＭＥＭ培地、Ｃ＝Lysis buffer、Ｄ＝ＦＴＡ精製溶液、Ｅ＝洗浄なし。
【図５】種々のろ紙を使用した従来法のＰＣＲによるＣＭＶウイルス粒子からの遺伝子の増幅を示すＰＣＲ産物のゲル電気泳動の写真である。以下のろ紙に希釈した精製ＣＭＶウイルス粒子を塗布した：Ａ＝「ＦＴＡカード」（Whatman）、Ｂ＝「Generation  Caputureカード」（Gentra）、Ｃ＝「Guthrieカード」（Advantec）、Ｄ＝「Isocode」（Shuleicher & Schuell）。「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はろ紙塗布に用いた希釈した精製ウイルス粒子を直接ＰＣＲ反応に加えたものである。それぞれにおいてレーン１〜４は、以下の精製ＣＭＶ粒子数（ゲノムＤＮＡコピー数と基本的に同じ）を各反応の鋳型として用いた。レーン１＝５×１０５、２＝５×１０４、３＝５×１０３、４＝０（陰性）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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