(57)【要約】      （修正有）【課題】アカルボース醗酵において、生産培地を最適化し、酸素供給、温度、ｐＨ、せん断力等に関して、増殖と生産物生成にとっての最適条件を提供。【解決手段】アカルボース発酵の培養液におけるオスモル濃度に関して範囲２００〜５００ミリオスモル／ｋｇに維持する方法、流加発酵において、基質が一定時間に一部分ずつか連続的に添加されるか、または完全連続発酵の範疇で、完全栄養液が添加される、所望のオスモル濃度範囲を維持する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地のオスモル濃度が、範囲２００〜５００ミリオスモル／ｋｇに設定され、そして維持されることを特徴とする、アカルボース製造のための発酵方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
アカルボースの改良された発酵による製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アカルボース（ａｃａｒｂｏｓｅ）は、強力なα−グルコシダーゼ阻害剤であって、真性糖尿病の治療のために経口的に投与される市販名グルコベイ（ＧｌｕｃｏｂａｙＲ）の抗糖尿病薬として使用されている。活性化合物は、発酵によって得られる；生産菌は、土壌細菌アクチノプラネス種（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐｅｃ．）ＳＥ５０／１１０、もしくはそれから誘導された変異株である。
【０００３】
一般に、アカルボースのような活性化合物の発酵生産は、方法の最適化なしでは経済的でない。したがって、原則として、達成できる時空収量に関して発酵をかなり改良することが必要である。収量における改良は、当業者に既知の種々の方法によって達成されるであろう。これらは、例えば、生産菌の突然変異誘発処理および生残細胞からのより高い生産変異株の選択を含む；これらの改良された生産菌株は、再度、この方法にかけることができる。また、菌株改良は、しばしば、分子生物学の技術を組み入れることによって達成できる。さらなる重要なアプローチは、生産培地を最適化することであり、その成分および量的組成は、最高生産収量が達成されるようでなければならない。最後に、また、発酵操作も、酸素供給、温度、ｐＨ、せん断力等に関して、増殖と生産物生成にとっての最適条件に生産菌を接触させることによって、収量の増加に寄与できる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、最後に述べた最適化戦略、すなわち、発酵条件の改良に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
驚くべきことに、発酵液のオスモル濃度−通常は、微生物発酵では考慮されないパラメーター−が、アカルボース発酵の最終収量に顕著な効果を及ぼすことが発見された。このことはすべて、臨界オスモル濃度範囲が、全く極端な範囲にあるのではなくて、例えば２００ミリオスモル（ｍｏｓｍｏｌ）／ｋｇ〜６００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇの中庸のオスモル濃度、すなわち、しばしば微生物培養の栄養液において達する範囲にあるので、一層驚くべきことである。この範囲内のオスモル濃度は、例えば、ヒトの血液が約４００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇの値をもつので、通常は、完全に生理的であると言える。驚くべきことに、低い栄養液オスモル濃度、例えば＜２００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇばかりでなく、より高い栄養液オスモル濃度、例えば＞６００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇもまた、有意に、より低い生産性に導き、そしてしばしば、そのような条件下でのアカルボース培養は、全く生産物生成を示さないことさえあることが分かった。
【０００６】
アカルボース生成菌の生産性の顕著なオスモル濃度依存に基づき、新しい制御戦略が、二次代謝産物アカルボースの発酵について開発されたが、その制御戦略は、比較しうる微生物発酵、特に工業分野においては、今日まで使用されていなかった。この制御戦略の基本は、適切な様式で実施されるべき浸透活性基質の添加によって、オスモル濃度を所望の最適範囲内に保つことである。その基質は、流加法として実施される発酵に対して、一定時間に分割してでも、連続的にでも添加することができる。しかしながらまた、驚くべきことに、完全連続法において二次代謝産物発酵を実施することによって、すなわち、１種以上の基質を含有する栄養液の添加によって、一定のオスモル濃度を保つことも可能である；この型式の連続発酵においては、定常状態のオスモル濃度が、培養においてつくられ
る。問題の浸透活性基質は、好ましくは、培養される生産菌の増殖を促進する物質である。これらは、特に、Ｃ源、Ｎ源および塩類を含む。個々の基質でも、また基質の混合物でも、オスモル濃度の安定化のために培養液にフィードすることができる。
【０００７】
それ故、本発明は、２つの本質的態様を含む：
１．  目的が、アカルボース発酵の培養液におけるオスモル濃度に関して定められた範囲に維持することである、制御戦略。
【０００８】
２．  流加発酵の範疇で、基質が、一定時間に一部分ずつか連続的に添加されるか、または完全連続発酵の範疇で、完全栄養液が添加されることを特徴とする、所望のオスモル濃度範囲を維持する方法。
【０００９】
アカルボース発酵を最適化する努力では、種々の変った方法が、生産性に及ぼすそれらの影響に関して試験された。栄養液組成および発酵の実施様式の両方が、生産物収量に影響を及ぼすことが分かった。これらの結果は、野生型菌株でもより高い生産性の高成績変異株の両方でも、全く同一か、または同じように観察された。
【００１０】
培地については、種々の栄養液組成が、アカルボース発酵のために成功裏に使用することができる（Ｆｒｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ドイツ特許第２６  １４  ３９３号）。一般に、炭素源、ビタミンおよび微量元素、塩類および緩衝物質を含有する栄養液を使用することが有利である。適切な炭素源の１つの例は、マルトースであって、これは、アカルボース分子の構造的要素を形成する。経済的な理由から、より安価な炭素源、例えばグルコース、マルトースおよびより高分子のグルコースオリゴマーを含有する澱粉加水分解物を使用することが得策である。適切な窒素源は、個々のアミノ酸、例えばグルタミンもしくはアスパラギン、タンパク質加水分解物もしくはタンパク質抽出物、または大豆粉、馬鈴薯粉、グルテンもしくは他の複合タンパク質−もしくはペプチド含有基質のような高タンパク質原料である。栄養液中に燐酸塩および鉄塩を加えたり、また緩衝物質、例えば炭酸カルシウムを用いてｐＨを調節することが得策であることも分かった。微量元素は、複合栄養液基質および／または水道水によって、栄養液に供給される。もし、脱塩水が使用される場合は、微量元素濃縮液を添加することが有利であった。
【００１１】
発酵操作については、ｐＨを、生理学的範囲内、すなわちｐＨ５〜８に保ち、そして限界を避けるような十分な酸素を培地に供給することが有利である。最適な生産性は、温度範囲３０℃付近で得られる。アカルボース生産菌は、繊維状細菌であるので、撹拌タンク発酵において極端に高い撹拌速度を避け、かくしてもはや許容されないせん断力を避けることが、さらに得策である。
【００１２】
発酵を最適化する過程において、驚くべきことに、栄養液組成によって生ずるオスモル濃度が、アカルボース生産性に非常に顕著な影響を及ぼすことが分かった。この影響は、全く極端な値に限られるのではなく、むしろ生理学的範囲内に完全に存在する。高いばかりでなく低いオスモル濃度も、生産性におけるかなりの低下に導くことは、さらに驚くべきことである。この関係は、図１および２において明らかにされる。オスモル濃度の最適値は、約４００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇに存在する。値＞５００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇまたは＜３００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇは、生産性において明らかな低下へと導き、値＞６００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇまたは＜２００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇは、生産性における非常に顕著な低下へと導く；若干の場合、特に該オスモル濃度範囲の限界値または外側では、アカルボース生産は、全く認めることができなかった。一般に、低いオスモル濃度は、微生物の代謝活性に悪影響を与えず、そしてかなり高いオスモル濃度も、普通は許容されるので、この関係は、微生物にとっては驚くべきことである。
【００１３】
アカルボース生産性へのオスモル濃度の影響は、もし、発酵中のオスモル濃度が、好適な範囲に維持できるならば、発酵は、成功裏に最適化できるに違いないということを示唆する。一方、微生物の培養中のオスモル濃度の経過は、栄養液からの浸透活性基質の消費によって、そして他方、増殖の間に栄養液中に遊離される浸透活性産物の生成によって決定される。アカルボースのバッチ発酵の場合には、図３に示された経過を得る；発酵の開始時のオスモル濃度は、ほぼ５００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ、すなわち、わずかな生産性の阻害を既に誘導する値である。発酵の間、オスモル濃度は、最適範囲を通り越して減少し、次いで、再び生産性の低下に導く値に達する。
【００１４】
オスモル濃度が制御された運転様式を可能にする制御戦略を開発する試みが、ここに行われた。通常は、微生物培養への栄養液基質の添加の目的は、基質濃度によって生じる特定の代謝状態を生み出すことである。基質制限を避けるためにも、また特定の基質制限を生み出すためにも、この経過における試験が、しばしば行われた。しかしながら、本試験の場合は、制御の目的は、浸透活性栄養液成分の添加によって、一定の好適なオスモル濃度範囲を維持することである；しかしながら、同時に、無意識的に生じる過度の、または過度に不均衡な基質濃度による不利益な効果が、基質の添加によって生み出されるということは、注意する必要がある。
【００１５】
オスモル濃度が制御された運転方法の３つの型が試験された；
１．  発酵の間、一定時間に少量ずつ新鮮栄養液を添加すること；これは、段階的にオスモル濃度を捜し求めた最適値にもたらすことができる。
【００１６】
２．  流加法における発酵の間の１種以上の基質の連続添加；この方法では、オスモル濃度は、全発酵期間で好適な範囲に維持することができる。
【００１７】
３．  新鮮栄養液の連続添加および生産物を含有する培養ブロスの連続抜き取りによる完全連続発酵；この場合には、オスモル濃度はまた、全発酵期間で好適な範囲に維持できるし、そして同時に、アカルボースの生成に最適な定常状態が、培養中に達成できる。
【００１８】
一定時間に少量の新鮮栄養液の添加は、技術的に単純に実施される方法である。しかしながら、その方法は、オスモル濃度が段階で適応させられるだけであるという欠点をもち、そしてある環境において、比較的大量の新鮮な基質の添加は、生合成の調節に望ましくない効果をもつ。特に、後者の状態は、二次代謝に関係する生合成経路の場合では重要である。一定時間での少量の新鮮栄養液の添加は、振盪フラスコにおいて実験室規模で実施された。驚くべきことに、新鮮栄養液の一部分のバッチ法での添加によって、培養ブロスのオスモル濃度は、最適と認識される３５０〜４５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇの範囲にうまく保たれ、かくして、生産物収量の有意な増加が達成された。（図４：オスモル濃度の経過および表１：最終アカルボース収量）。この場合には、経時的に数ポイント（例えば、４８および９６時間後）で比較的大量の栄養液を添加するか、または連続添加に近い、比較的短い時間隔での比較的少量の栄養液を添加することが可能である。
【００１９】
発酵中の栄養液の連続添加は、パイロット規模で実施され、試験された。その方法は、実施例２に記述される。使用された栄養基質は、例を挙げれば、栄養液において普通に使用される炭素源（澱粉加水分解物）であった。他の栄養液成分（窒素源、塩類）または多数の栄養液成分の組み合わせ物もまた、同様の方法で使用することができた。培養ブロスのオスモル濃度は、ほぼ３５０〜ほぼ４５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇの好適な範囲に維持することができた（図５）。発酵液中への連続フィードをほぼ４０時間目に開始することによって発酵の開始時におけるオスモル濃度の低下を防げることが、明白になった。反対に、浸透制御下にない対照発酵方法のオスモル濃度は、既に図３に示したように、全発酵期間にわたって低下する。表２は、流加法における栄養液成分の連続フィードによって達成さ
れたオスモル濃度制御発酵操作が、収量における有意な改良を可能にすることを示している。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
【表２】
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【００２２】
実施例３は、オスモル濃度制御のための完全連続発酵操作を記す。代謝における調節現象のために、最高の生産性は、増殖が事実上または完全に停止した後でなければ達成されないので、二次代謝産物の完全連続発酵は、多くの場合には原則として不可能である。しかしながら、増殖と生産物生成の間の平行は、可能であるべき連続培養には絶対的な前提条件である。したがって、アカルボース発酵の場合に、完全連続様式の運転が成功裏に実施できたことは、全く驚くべきことであると考えざるを得ない。図６は、培養ブロスにおけるオスモル濃度が、連続法の操作によって好適な範囲に保つことができたことを示している。その結果、図７に示すように、生産性は、数回の容量変化を通じてバッチ発酵での最高値において成功裏に維持された。
【００２３】
本発明では、オスモル濃度最適値が、菌株に特異的なパラメーターであることを指摘することは重要である。菌株改良技術によって作製された種々の高生産菌株は、それらのオ
スモル濃度最適値において異なるかもしれない。変化したオスモル濃度最適値をもつ高生産変異株を作製することは、まさに菌株改良のねらいであろう。それ故、本発明の明細書に述べられたオスモル濃度値は、例示であり、そして使用された生産菌株に適合する。オスモル濃度最適値は、各々新しく作製された高生産変異株に対して新たに決定されるべきであり、そしてオスモル濃度制御発酵は、記述された様式で最適オスモル濃度を維持するよう試験するために実施されねばならない。
【実施例１】
【００２４】
アカルボース発酵への一度に少量の新鮮栄養液添加によるオスモル濃度制御
アカルボース生産菌株を、次の栄養液９０ｍｌを入れた１  ｌ容振盪フラスコ中で培養した：澱粉加水分解物１００ｇ／ｌ、酵母エキス７ｇ／ｌ、カゼイン加水分解物３ｇ／ｌ、ＣａＣＯ３３ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４３ｇ／ｌ、水道水、ｐＨ６．９。栄養液を、オートクレーブで１２１℃、１０分間殺菌し、次いで、種母培養を接種し、回転数２５０ｒｐｍの振盪機で３０℃において培養した。先に特定した組成の１．５倍濃度栄養液を、４８、７２時間、または４８、９６時間後に、各時間２０ｍｌ添加した。フィード液は、１２１℃で１０分間、オートクレーブで殺菌された。オスモル濃度は、日に一度、氷点降下を測定することによって決定した；アカルボース含量は、日に一度、ＨＰＬＣによって測定した。
【実施例２】
【００２５】
アカルボース発酵への栄養液基質の連続添加によるオスモル濃度制御
アカルボース生産菌株を、次の栄養液１６００ｌを入れた３０００ｌ発酵槽中で培養した：澱粉加水分解物１００ｇ／ｌ、酵母エキス７ｇ／ｌ、カゼイン加水分解物３ｇ／ｌ、ＣａＣＯ３３ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４３ｇ／ｌ、水道水、ｐＨ６．９。栄養液を、連続工程で殺菌（１５０℃、５２秒）し、前殺菌した発酵槽中に満たし、３００ｌ発酵槽で作製された種母培養を接種し、そして次の条件下で発酵させた：温度：３１℃、上部内圧：１．０〜１．８ｂａｒ、撹拌数：１５０〜２２０ｒｐｍ、通気量：５００〜１０００ｌ／ｍｉｎ。４８時間から、澱粉加水分解物溶液を約３．２  ｌ／ｈｒのフィード速度で連続的にフィードした；その溶液は水道水中澱粉加水分解物１６３ｋｇを含有し（最終容量：２３３  ｌ）、そして１２１〜１２５℃で２０分間殺菌された。オスモル濃度は、日に一度、氷点降下を測定することによって決定した。アカルボースはＨＰＬＣによって測定した。
【実施例３】
【００２６】
連続アカルボース発酵によるオスモル濃度制御
アカルボース生産菌株を、次の栄養液１６００ｌを入れた３０００ｌ発酵槽中で培養した：澱粉加水分解物１００ｇ／ｌ、Ｌ−アスパラギン・２Ｈ２Ｏ  ２０ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４３ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２ｇ／ｌ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  １ｇ／ｌ、Ｍｇ３（ＰＯ４）２・８Ｈ２Ｏ  ２ｇ／ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／ｌ、ＺｎＣｌ２０．１ｇ／ｌ、水道水、ｐＨ６．８。栄養液を、連続工程で殺菌（１５０℃、５２秒）し、前殺菌した発酵槽中に満たし、３００ｌ発酵槽で作製された種母培養を接種し、そして次の条件下で発酵させた：温度：３１℃、上部内圧：１．０〜１．８ｂａｒ、撹拌数：１５０〜２２０ｒｐｍ、通気量：５００〜１０００ｌ／ｍｉｎ。４８時間から、澱粉加水分解物溶液を約３．２  ｌ／ｈｒのフィード速度で連続的にフィードした；その溶液は水道水中澱粉加水分解物１６３ｋｇを含有し（最終容量：２３３  ｌ）、そして１２１〜１２５℃で２０分間殺菌された。９６時間後、培養ブロスの１部分２００  ｌを進行中の発酵から抜き取り、そして前殺菌した３００ｌ発酵槽中に無菌条件下で移送した。次いで、新鮮栄養液を、流速１日当たり０．３３発酵槽容量で、この培養に連続的にフィードした；生成物含有の培養ブロスを、同じ速度で発酵槽から連続的に抜き取った。オスモル濃度およびアカルボースは、実施例２のように測定した。
【００２７】
本発明の特徴および主たる態様は以下のとおりである。
【００２８】
１．  オスモル濃度が、範囲２００〜６００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇに設定され、そして維持されることを特徴とする、アカルボース調製のための発酵方法。
【００２９】
２．  オスモル濃度が、範囲３００〜５００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇに設定され、そして維持されることを特徴とする、前記１項記載の方法。
【００３０】
３．  １種以上の栄養液成分が、発酵過程においてアカルボースを生成する培養物に存在するか、または添加されることを特徴とする、アカルボース調製のための発酵方法。
【００３１】
４．  １種以上の栄養液成分の添加が、培養物中のオスモル濃度が範囲２００〜６００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ内に維持されるように実施されることを特徴とする、前記３項記載の方法。
【００３２】
５．  １種以上の栄養液成分の添加が、培養物中のオスモル濃度が範囲３００〜５００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ内に維持されるように実施されることを特徴とする、前記３項記載の方法。
【００３３】
６．  栄養液成分または成分群が、一定時間に、分割された部分として培養物に存在するか、または添加されることを特徴とする、前記３〜５項記載の方法。
【００３４】
７．  栄養液成分または成分群が、連続的に培養物に存在するか、または添加されることを特徴とする、前記３〜５項記載の方法。
【００３５】
８．  栄養液成分または成分群が、連続的に培養物に存在するか、または添加され、そして生産物を含有する培養ブロスが、培養物から連続的に抜き取られることを特徴とする、前記３〜５項記載の方法。
【００３６】
９．  生産物を含有する培養液が、培養物から一定時間に少量抜き取られ、そして交替に、新鮮栄養液が、一定時間に少量培養物に添加されることを特徴とする、アカルボース調製のための発酵方法。
【００３７】
１０．発酵が、流加法で実施され、そしてフィード基質溶液が、一定時間に分割してか、または連続的に添加されることを特徴とする、アカルボース調製のための発酵方法。
【００３８】
１１．発酵が連続法として実施されることを特徴とする、アカルボース調製のための発酵方法。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】アカルボース発酵におけるアカルボースの生産性に及ぼすオスモル濃度の影響を表すグラフである。
【図２】アカルボース発酵における培地成分のオスモル濃度がアカルボースの生産性に及ぼす影響を表すグラフである。
【図３】パイロット規模のアカルボースのバッチ発酵における経時的なオスモル濃度の変化を表すグラフである。
【図４】新鮮栄養液を間欠的添加して、培養ブロスのオスモル濃度を一定に保持した事例を表すグラフである。
【図５】パイロット規模でのアカルボースバッチ発酵におけるオスモル濃度の制御例を表すグラフである。
【図６】連続アカルボース発酵におけるオスモル濃度の制御例を表すグラフである。
【図７】パイロット規模でのアカルボース連続発酵における経時的なアカルボース生産性の変動を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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