(57)【要約】【課題】コンビナトリアルライブラリーの分野、新規のポリケチドおよび抗生物質およびそれらを調製する方法の提供。【解決手段】改変型ポリケチドシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を調製する方法であって、この方法は、足場として、天然に存在するPKSをコードする配列を使用する工程、および、変異誘発、不活化、または置換のいずれかにより、酵素活性をコードするヌクレオチド配列部分を改変する工程を含み、次いで、このように改変されたPKSをコードするヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞を改変するために使用され得、このように改変された細胞は、その足場化が酵素活性の改変を支持するために使用されたPKSにより生成されるものとは異なるポリケチドを生成するために使用される、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化１Ａ】
2008169226.tif 000044
の化合物であって、
そのグリコシル化形態および単離された立体異性体形態を含み；
ここで、Ｒ＊は、１−１５Ｃの直鎖、分岐、または環状の、飽和または不飽和の、置換または不置換のヒドロカルビルであり；
Ｒ１〜Ｒ６の各々は、独立して、Ｈまたはアルキル（１−４Ｃ）であって、ここでＲ１の任意のアルキルは必要に応じて置換され得；
Ｘ１〜Ｘ５の各々は、独立して、Ｈ２、ＨＯＨ、または＝Ｏであり；または
Ｘ１〜Ｘ４の各々は、Ｈであり、そして式（６）の化合物は、環において、該Ｘの位置に隣接する２位−３位、４位−５位、６位−７位、８位−９位、および／または１０位−１１位にπ結合を含み；
ただし：
Ｒ１〜Ｒ６の少なくとも２つはアルキル（１−４Ｃ）であり；そして
該化合物は、図６Ｂの化合物１７、２４および２８、図１２（Ａ）の化合物３０１〜３１１、ならびに図１２（Ｂ）の化合物３１２〜３２２以外である、
化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、
Ｒ１〜Ｒ６の少なくとも３つがアルキルであり；そして／または
Ｘ２が＝Ｏであり；そして／または
Ｘ１がＯＨであり；そして／または
Ｘ４およびＸ５がＯＨであり；そして／または
Ｒ＊が置換アルキルであり、そして／または
Ｒ１が置換アルキルである、
化合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリケチドの翻訳後の水酸化および／またはグリコシル化によって入手可能な、抗生物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府助成金への言及
この研究は、一部、国立衛生研究所からの補助金CA66736によって支援された。米国政府は、本発明につき特定の権利を有する。
【０００２】
技術分野
本発明は、コンビナトリアルライブラリーの分野、新規のポリケチドおよび抗生物質およびそれらを調製する方法に関する。より詳細には、新しいポリケチドの構築および、エリスロマイシン遺伝子クラスターにより例示されるような、天然に存在するPKS由来のポリケチドシンターゼにより合成されるポリケチドのライブラリーに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
ポリケチドは、一連のクライゼン型縮合およびその後の改変を通じて、2-炭素単位から最終的に合成される多様な化合物の大きなファミリーを代表する。このグループのメンバーは、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、抗癌剤（例えば、ダウノマイシン）および免疫抑制剤（例えば、FK506およびラパマイシン））を含む。ポリケチドは、多くの型の生物（真菌および菌糸体細菌（特に放線菌属）を含む）に生じる。
【０００４】
ケト酸の多くのラクトンが、標準的な有機化学を使用して合成されてきた。これらは、Vedejesら、J.Am  Chem  Soc(1987)109:5437-5446により合成される一連の不飽和ケトラクトン（本明細書の図11の式201、202、および203で示される）が含まれる。さらなる式204および205の化合物（図11においてもまた示される）は、Vedejesら、Ｊ.Am  Chem  Soc  (1989)111:8430-8438により報告されるように合成された。さらに、化合物206-208（図11）は、Borowitz  J  Heterocyclic  Chem(1975)12(1):101-106により合成され;化合物209は、Irelandら、J  Org  Chem(1980)45:1868-1880により合成された。
【０００５】
ポリケチドは、ポリケチドシンターゼ（PKS）によりインビボで合成される。この酵素活性タンパク質のグループは、2-炭素単位の縮合もまた触媒し、例えば、脂肪酸およびプロスタグランジンを生じる脂肪酸シンターゼとは異なるカテゴリーにあると考えられる。それらの構築および合成様式が非常に異なる2つの主要な型のPKS  が公知である。これらは、一般に、タイプIまたは「モジュラー性」およびタイプII「芳香性」と呼ばれる。
【０００６】
本発明の主題であるPKS足場は、タイプIまたは「モジュラー性」PKSと命名されたグループのメンバーである。この型では、1セットの別個の活性部位が、炭素鎖アセンブリおよび改変の各工程について存在するが、個別のタンパク質は、このような別個の活性部位を多数含む。この型の唯一の多機能タンパク質があり得、例えば、これは6-メチルサリチル酸の生合成に必要とされる（Beck,Jら、Eur  J.  Biochem(1990)192:487-498);Davis,Rら、Abstracts  of  Genetics  of  Industrial  Microorganism  Meeting,  Montreal,  Abstract  288頁（1994））。より一般的には、そして細菌由来のタイプI  PKSアセンブリにおいて、末端生成物であるポリケチドを生じるように組み立てられたいくつかのこのような多官能性タンパク質が存在する（Cortes,Jら、Nature(1990)348:176;Donadio,Sら、Science（1991）252：675；MacNeil,D,Jら、Gene（1992）115：119）。
【０００７】
多くのモジュラー性PKS遺伝子がクローニングされた。米国特許第5,252,474号は、アベルメクチンのシンターゼをコードする遺伝子のクローニングを記載し；同第5,098,837号はスピラマイシンのシンターゼをコードする遺伝子のクローニングを記載し、欧州出願791,655および同791,656はそれぞれタイロシン、およびプラテノリド（platenolides)についてのシンターゼをコードする遺伝子を記載する。
【０００８】
例示される系として使用されるエリスロマイシンについてのPKSは、モジュラー性PKSである。エリスロマイシンは、最初は、  Philippine  archipelago由来の土壌試料から見出された、S.erythraeus（Saccharopolyspora  erythraeaとして再分類されるため）から単離された  。遺伝子のクローニングは、Donadio,Sら、Science（1991）252：675に記載された。詳細は、Perun,  T.J.「Drug  Action  and  Drug  Resistance  in  Bacteria」第一巻、S.Mitsuhashi（編）University  Park  Press,Baltimore,1977により総説される。抗生物質は、発酵の様々な段階の間に、様々なグリコシル化形態（A、B、C、およびDで表される）で生じる。S.erythraeus由来の完全なエリスロマイシン生合成遺伝子クラスターは、Donadioら、Industrial  Microorganisms:  Basic  and  Applied  Molecular  Genetics(1993)R.H.Baltz、G.D.HegemanおよびP.L.Skatrud(編）（Amer  Soc  Microbiol)によりマッピングされ、そして配列決定され、そして完全なPKSは、3個の別個の遺伝子によりコードされるDEBS-1、DEBS-2、およびDEBS-3で通常表される3個のこのような多官能性タンパク質のアセンブリである。
【０００９】
PKS複合体をコードする遺伝子の発現は、遺伝子が、PKSのACPドメインを翻訳後修飾する、必要とされる補助的なホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素を有しない宿主細胞中に形質転換される場合、ポリケチドの合成酵素による生成を可能にするために十分でないかもしれない。これらのトランスフェラーゼの幾つかをコードする遺伝子は、WO97/13845に記載される。さらに、合成されたポリケチドのグリコシル化を媒介する酵素は、WO97/23630において記載される。WO98/27203は、適切なホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ発現系を供給することによる、通常はこれらを生成しない宿主におけるポリケチドの生成を記載する。この出願の内容は、本明細書において参考として援用される。
【００１０】
モジュラー性PKSクラスターのポリケチドシンターゼ経路を変更することが試みられてきた。例えば、欧州出願238,323は、律速段階のシンターゼ遺伝子を導入することによりポリケチド生成を増強するためのプロセスを記載し、そして米国特許第5,514,544号は、生成の増強のための、シンターゼについてのアクチベータータンパク質の使用を記載する。米国特許第4,874,748号および同5、149、639号は、モジュラー性PKS遺伝子一般のクローニングに有用なシャトルベクターを記載する。微生物染色体への改変型遺伝子の導入の方法は、WO93/13663に記載される。開始ユニットを変化させるために、アベルメクチン生成ポリケチドシンターゼについてのローディングモジュールと置換する、エリスロマイシン生成ポリケチドシンターゼのDEBS-1タンパク質についてのローディングモジュールの改変は、Marsden,Andrew  F.A.ら、Science（1998）279：199-202  およびOliynyk,Mら、Chemistry  and  Biology(1996)3:833-839に記載された。1998年1月15日に公開されたWO98/01571は、エリスロマイシンPKSの操作、およびこのような操作から生じるポリケチドを記載する。さらに、これもまた、1998年1月15日に公開されたWO98/01546は、ポリケチド合成のための開始ユニットおよび伸長ユニットの性質を改変するためのハイブリッドモジュラー性PKS遺伝子を記載する。
【００１１】
さらに、例えば、米国特許第5,063,155号および同第5,168,052号は、モジュラー性PKS系を使用する抗生物質の調製を記載する。多くのモジュラー性PKSが、クローニングされてきた。米国特許第5,098,837号、EP791,655、EP791,656および米国特許第5,252,474号を参照のこと。
【００１２】
モジュラー性PKSとは対照的に、タイプII  PKSは、幾つかのタンパク質を含み、各タンパク質は、タイプIポリケチドシンターゼにおいて見られるタンパク質よりも単純である。これらの酵素の活性部位は、繰り返し使用されるので、タンパク質自体は、一般に、単一官能性または二官能性である。例えば、Streptomyces由来の芳香族PKS複合体は、これまでに、3個のオープンリーディングフレームにおいてコードされる3個のタンパク質を含むことが見出されている。第1のタンパク質は、ケトシンターゼ（KS）およびアシルトランスフェラーゼ（AT）活性を提供し、第二は、鎖長決定因子（CLDF）を提供し、そして第三は、アシルキャリアタンパク質（ACP）である。
【００１３】
本発明は、モジュラー性PKS遺伝子クラスター由来のPKS系に関する。これらのクラスターの性質およびそれらの操作は、以下にさらに記載される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本願発明によって以下が提供される：
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）天然に存在するモジュラーＰＫＳをコードするヌクレオチド配列から改変されたＰＫＳをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を調製する方法であって、該天然に存在するモジュラーＰＫＳが、酵素活性をコードする第一の領域および足場アミノ酸配列をコードする第二の領域を含み、該方法は、少なくとも１つの該第一の領域を改変する工程を包含する、方法。
（項目２）前記改変する工程が少なくとも１つの前記第一の領域を欠失させることまたは不活化させることを含み；または
ここで、該改変する工程が、少なくとも１つの該第一の領域を、天然に存在する異なるＰＫＳ遺伝子または同じ天然に存在するＰＫＳ遺伝子の異なる領域由来の対応する酵素活性をコードする領域で置換することを含む、
項目１に記載の方法。
（項目３）前記ヌクレオチド配列がヌクレオチド配列が少なくとも３つのＰＫＳモジュールをコードする、項目１または２に記載の方法。
（項目４）前記改変する工程が異なる延長単位の利用をもたらし；そして／または
ここで該改変する工程が異なる開始単位の利用をもたらし；そして／または
ここで該改変が異なる鎖長のポリケチドをもたらす、
項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）項目１〜４のいずれか１項に記載の方法によって入手可能な改変されたＰＫＳをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
（項目６）項目５に記載の核酸を含むように改変された細胞培養物。
（項目７）ポリケチドを調製する方法であって、該ポリケチドが産生される条件下で、項目６に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。
（項目８）項目７に記載の方法によって調製される、新規ポリケチド。
（項目９）抗生物質を調製する方法であって、項目８に記載のポリケチドをグリコシル化する工程を包含する、方法。
（項目１０）項目９に記載の方法によって調製された、抗生物質。
（項目１１）異なるポリケチドシンターゼの多重性について、発現ベクターを含むコロニーのライブラリーを構築する方法であって、
項目１〜４のいずれか１項に記載の方法により入手されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターの混合物で組換え宿主細胞を形質転換する工程；
該形質転換された細胞を、個々のコロニーに分離する工程、および
該コロニーを培養する工程、
を包含する、方法。
（項目１２）ポリケチドコンビナトリアルライブラリーを調製する方法であって、項目１１に記載の方法によって入手されたコロニーのライブラリーを前記ポリケチドが産生される条件下で培養する工程を包含する、方法。
（項目１３）コロニーのライブラリーを含む多数の細胞コロニーであって、該ライブラリーの各コロニーは、天然に存在するＰＫＳ遺伝子クラスターに由来するモジュラーＰＫＳをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含み、少なくとも１つの酵素活性が欠失され、そして／または該活性の異なるバージョンによって置換されているか、あるいは該天然に存在するＰＫＳによって産生されるポリケチド以外のポリケチドを生じるように変異されており、そして
該ライブラリーの各コロニーに含まれるヌクレオチド配列は、異なるＰＫＳをコードする、
多数の細胞コロニー。
（項目１４）前記天然に存在するＰＫＳ遺伝子クラスターのライブラリーは、エリスロマイシン遺伝子クラスターであり；そして／または
該ライブラリーの少なくとも１つのコロニーにおいて、前記異なるバージョンは、異なるモジュラーＰＫＳもしくは同じＰＫＳ遺伝子クラスターの別の領域に由来する対応する酵素活性であり；そして／または
前記発現ベクターに含まれるＰＫＳモジュールの数は、該ライブラリーの少なくとも１つのコロニーにおいて異なり；そして／または
コードされたＰＫＳにより利用される延長単位は、該ライブラリーの少なくとも２つのコロニーにおいて異なり；そして／または
含まれるＰＫＳにより利用される開始単位は、該ライブラリーの少なくとも２つのコロニーにおいて異なり；そして／または
還元サイクルの特異性は、該ライブラリーの少なくとも２つのコロニーにおいて異なる、
項目１３に記載の多数の細胞コロニー。
（項目１５）モジュラーＰＫＳタンパク質のライブラリーを調製する方法であって、前記発現ベクターが該モジュラーＰＫＳタンパク質の産生を起こす条件下で、項目１３または１４に記載の多数の細胞コロニーまたはコロニーのライブラリーを培養する工程を包含する、方法。
（項目１６）項目１５に記載の方法によって調製されたＰＫＳタンパク質のライブラリー。
（項目１７）コロニーのライブラリーを含む多数の細胞コロニーであって、該ライブラリーの各コロニーは、天然に存在するＰＫＳに由来するモジュラーＰＫＳを含み、少なくとも１つの酵素活性が欠失されているか、または該活性の異なるバージョンによって置換されているか、あるいは該天然に存在するＰＫＳによって産生されるポリケチド以外のポリケチドを生じるように変異された該遺伝子の形態から産生されており、そして
該ライブラリーの各コロニーは、異なるＰＫＳである、
多数の細胞コロニー。
（項目１８）前記天然に存在するＰＫＳは、エリスロマイシンＰＫＳであり；そして／または
ＰＫＳのモジュールの数は、該ライブラリーの少なくとも１つのコロニーにおいて異なり；そして／または
該ＰＫＳにより利用される延長単位は、該ライブラリーの少なくとも２つのコロニーにおいて異なり；そして／または
該ＰＫＳにより利用される開始単位は、該ライブラリーの少なくとも２つのコロニーにおいて異なり；そして／または
還元サイクルの特異性は、該ライブラリーの少なくとも２つのコロニーにおいて異なる、
項目１７に記載の多数の細胞コロニー。
（項目１９）ポリケチドのコンビナトリアルライブラリーを調製する方法であって、合成が前記異なるＰＫＳタンパク質により行われるポリケチドが産生される条件下で、項目１７または１８に記載の細胞コロニーまたはコロニーのライブラリーを培養する工程を包含する、方法。
（項目２０）項目１９に記載の方法によって調製されたポリケチドのコンビナトリアルライブラリー。
（項目２１）天然に存在するＰＫＳ由来のポリケチドシンターゼを含有するコロニーを培養することにより生じるポリケチドのコンビナトリアルライブラリーを含む多数のポリケチドであって、少なくとも１つの酵素活性が欠失され、そして／または該活性の異なるバージョンによって置換されているか、あるいは該天然に存在するＰＫＳによって産生されるポリケチド以外のポリケチドを生じるように変異されており、そして
該ライブラリー内の各ＰＫＳは、異なるポリケチドを産生する、
ライブラリー。
（項目２２）少なくとも２つのポリケチドにおいて鎖長が異なり；そして／または
異なる延長単位から形成された少なくとも２つのポリケチドを含み；そして／または
異なる酸化状態の少なくとも２つのポリケチドを含み；そして／または
異なる立体化学の少なくとも２つのポリケチドを含み；そして／または
異なる開始単位から形成された少なくとも２つのポリケチドを含む、
項目２１に記載のライブラリー。
（項目２３）標的部分と結合するかまたは反応する首尾よい候補ポリケチドを同定する方法であって、
首尾よい候補が該標的部分との複合体を形成するような条件下で、項目２０、２１または２２に記載のライブラリーを、該標的部分と該ライブラリー中の各ポリケチドとを接触させることによって、スクリーニングする工程、および
任意の形成された複合体を検出し、従って、該首尾よい候補として該ライブラリーのポリケチドを同定する工程、
を包含する、方法。
（項目２４）以下の式：
【００１５】
【化２Ａ】
2008169226.tif 000002
【００１６】
の化合物であって、
そのグリコシル化形態および単離された立体異性体形態を含み；
ここで、Ｒ＊は、１−１５Ｃの直鎖、分岐、または環状の、飽和または不飽和の、置換または不置換のヒドロカルビルであり；
Ｒ１およびＲ２の各々は、独立して、Ｈまたはアルキル（１−４Ｃ）であって、ここでＲ１の任意のアルキルが必要に応じて置換され得；
Ｘ１はＨ２、ＨＯＨ、または＝Ｏであり；
ただし：
Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つはアルキル（１−４Ｃ）でなければならず；および
該化合物は図６Ａの化合物１、２、３、５および６以外である、
化合物；
あるいは、以下の式：
【００１７】
【化３Ａ】
2008169226.tif 000003
【００１８】
の化合物であって、
そのグリコシル化形態および単離された立体異性体形態を含み；
ここで、Ｒ＊は、１−８Ｃの直鎖、分岐、または環状の、飽和または不飽和の、置換または不置換のヒドロカルビルであり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は、独立して、Ｈまたはアルキル（１−４Ｃ）であって、ここでＲ１の任意のアルキルは必要に応じて置換され得；
Ｘ１  およびＸ２の各々は、独立して、Ｈ２、ＨＯＨ、または＝Ｏであり；
ただし：
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも２つはアルキル（１−４Ｃ）である、
化合物；
あるいは、以下の式：
【００１９】
【化４Ａ】
2008169226.tif 000004
【００２０】
の化合物であって、
そのグリコシル化形態および単離された立体異性体形態を含み；
ここで、Ｒ＊は、１−１５Ｃの直鎖、分岐、または環状の、飽和または不飽和の、置換または不置換のヒドロカルビルであり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は、独立して、Ｈまたはアルキル（１−４Ｃ）であって、ここでＲ１の任意のアルキルは必要に応じて置換され得；
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の各々は、独立して、Ｈ２、ＨＯＨ、または＝Ｏであり；
ただし：
Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つはアルキル（１−４Ｃ）でなければならず；そして
該化合物は、図６Ａの化合物８以外である、
化合物；
あるいは、以下の式：
【００２１】
【化５Ａ】
2008169226.tif 000005
【００２２】
の化合物であって、
そのグリコシル化形態および単離された立体異性体形態を含み；
ここで、Ｒ＊は、１−８Ｃの直鎖、分岐、または環状の、飽和または不飽和の、置換または不置換のヒドロカルビルであり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は、独立して、Ｈまたはアルキル（１−４Ｃ）であって、ここでＲ１の任意のアルキルは必要に応じて置換され得；
Ｘ＊およびＸ２の各々は、独立して、Ｈ２、ＨＯＨ、または＝Ｏであり；
ただし：
Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つはアルキル（１−４Ｃ）であり；そして
該化合物は、図６Ａの化合物９以外である、
化合物；
あるいは、以下の式：
【００２３】
【化６Ａ】
2008169226.tif 000006
【００２４】
の化合物であって、
そのグリコシル化形態および単離された立体異性体形態を含み；
Ｒ＊は、１−１５Ｃの直鎖、分岐、または環状の、飽和または不飽和の、置換または不置換のヒドロカルビルであり；
Ｒ１〜Ｒ５の各々は、独立して、Ｈまたはアルキル（１−４Ｃ）であって、ここでＲ１の任意のアルキルは必要に応じて置換され得；
Ｒ６はアルキル（１−５Ｃ）であり；
Ｘ１およびＸ３およびＸ６の各々は、独立して、Ｈ２、ＨＯＨ、または＝Ｏであり；
ただし：
Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つはアルキル（１−４Ｃ）である、
化合物；
あるいは、以下の式：
【００２５】
【化７Ａ】
2008169226.tif 000007
【００２６】
の化合物であって、
そのグリコシル化形態および単離された立体異性体形態を含み；
ここで、Ｒ＊は、１−１５Ｃの直鎖、分岐、または環状の、飽和または不飽和の、置換または不置換のヒドロカルビルであり；
Ｒ１〜Ｒ５の各々は、独立して、Ｈまたはアルキル（１−４Ｃ）であって、ここでＲ１の任意のアルキルは必要に応じて置換され得；
Ｒ６はアルキル（１−５Ｃ）であり；
Ｘ２は、ＯＨ、またはＨであり；
Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５の各々は、独立して、Ｈ２、ＨＯＨ、または＝Ｏであり；またはＸ４はＨであり、そして
式（８）の化合物は、９位と１０位との間にπ結合を有し、
ただし：
Ｘ２がＨの場合、Ｘ３およびＸ４のうちの少なくとも１つはＨＯＨまたは＝Ｏである、
化合物。
（項目２５）以下の式：
【００２７】
【化８Ａ】
2008169226.tif 000008
【００２８】
の化合物であって、
そのグリコシル化形態および単離された立体異性体形態を含み；
ここで、Ｒ＊は、１−１５Ｃの直鎖、分岐、または環状の、飽和または不飽和の、置換または不置換のヒドロカルビルであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の各々は、独立して、Ｈまたはアルキル（１−４Ｃ）であって、ここでＲ１の任意のアルキルは必要に応じて置換され得；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の各々は、独立して、Ｈ２、ＨＯＨ、または＝Ｏであり；あるいは、
Ｘ１、またはＸ２、またはＸ３またはＸ４は、Ｈであり、そして式（５）の化合物は、８位と９位との間、または６位と７位との間、または４位と５位との間、または２位と３位との間にπ結合を含み；
ただし：
Ｒ１〜Ｒ５のうちの少なくとも２つはアルキル（１−４Ｃ）であり；そして
該化合物は、図６Ａの化合物１３または１４、または図１１の化合物２０５、２１０〜２１３以外である、
化合物。
（項目２６）項目２５に記載の化合物であって、
Ｒ１−Ｒ６のうちの少なくとも３つはアルキル（１−４Ｃ）であり；そして／または
ここでＸ１はＯＨであり；そして／または
Ｘ２は＝Ｏであり；そして／または
Ｘ３はＨである、
化合物。
（項目２７）以下の式：
【００２９】
【化９Ａ】
2008169226.tif 000009
【００３０】
の化合物であって、
そのグリコシル化形態および単離された立体異性体形態を含み；
ここで、Ｒ＊は、１−１５Ｃの直鎖、分岐、または環状の、飽和または不飽和の、置換または不置換のヒドロカルビルであり；
Ｒ１〜Ｒ６の各々は、独立して、Ｈまたはアルキル（１−４Ｃ）であって、ここでＲ１の任意のアルキルは必要に応じて置換され得；
Ｘ１〜Ｘ５の各々は、独立して、Ｈ２、ＨＯＨ、または＝Ｏであり；または
Ｘ１〜Ｘ４の各々は、Ｈであり、そして式（６）の化合物は、環において、該Ｘの位置に隣接する２位−３位、４位−５位、６位−７位、８位−９位、および／または１０位−１１位にπ結合を含み；
ただし：
Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つはアルキル（１−４Ｃ）であり；そして
該化合物は、図６Ｂの化合物１７、２４または２８、図１２（Ａ）の化合物３０１〜３１１、または図１２（Ｂ）の化合物３１２〜３２２以外である、
化合物。
（項目２８）項目２７に記載の化合物であって、
Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも３つがアルキルであり；そして／または
Ｘ２が＝Ｏであり；そして／または
Ｘ１がＯＨであり；そして／または
Ｘ４およびＸ５がＯＨであり；そして／または
Ｒ＊が置換アルキルであり、そして／または
Ｒ１が置換アルキルである、
化合物。
本発明の開示
本発明は、ポリケチドのコンビナトリアルなライブラリーの生成のための組換え物質を提供し、ここで、ライブラリーのポリケチドメンバーは、3個の系を足場として使用する、天然に存在するPKS系由来の様々なPKS系によってこれらの系を足場として使用することにより合成される。一般に、これらのライブラリーの多くのメンバーそれ自身が、新規の化合物であり得、そして本発明は、これらのライブラリーの新規のポリケチドメンバーをさらに含む。従って、本発明の方法は、個々のポリケチドの調製に関する。ポリケチドは、新規であってもなくても良いが、調製の方法は、ポリケチドを調製するより簡便な方法を可能にする。得られたポリケチドは、代表的にはグリコシル化を介して、それらを抗生物質に変換するためにさらに改変され得る。本発明はまた、本発明のライブラリーのスクリーニングによって、所望される結合活性を有する新規のポリケチドを回収するための方法を含む。
【００３１】
従って、1つの局面において、本発明は、改変型ポリケチドシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を調製する方法に関する。この方法は、足場として、天然に存在するPKSをコードする配列を使用する工程、および、変異誘発、不活化、または置換のいずれかにより、酵素活性をコードするヌクレオチド配列部分を改変する工程を含む。次いで、このように改変されたPKSをコードするヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞を改変するために使用され得、このように改変された細胞は、その足場化が酵素活性の改変を支持するために使用されたPKSにより生成されるものとは異なるポリケチドを生成するために使用される。本発明はまた、このように生成されたポリケチドおよび抗生物質（次いで、ポリケチドから変換され得る）に関する。
【００３２】
別の局面では、本発明は、コロニーのライブラリーを含む多数の細胞コロニーに関し、ここで、ライブラリーの各コロニーは、天然に存在するPKSに由来するが異なるモジュラー性PKSを生成のための発現ベクターを含む。好ましい実施態様では、異なるPKSは、エリスロマイシンPKS由来である。任意の場合では、異なるモジュラー性PKSのライブラリーは、酵素活性をコードする天然に存在する遺伝子または遺伝子クラスターの1個以上の領域を、その活性を変化させ、天然に存在する遺伝子の足場部分をインタクトのまま残すように改変することにより入手される。所望である場合、1つより多い足場供給源が使用され得るが、単一の足場上のモジュールのクラスターに基づくのが好ましい。別の局面では、本発明は、コロニーのライブラリーを含む多数の細胞コロニーに関し、ここで、ライブラリーの各コロニーは、天然に存在するPKS（好ましくはエリスロマイシンPKS）由来の異なるモジュラー性PKSを含む。本発明はまた、PKS複合体のライブラリーの生成方法、およびこれらのコロニーの培養によるポリケチドライブラリーの生成方法、ならびにこのように生成されたライブラリーに関する。さらに、本発明は、得られたポリケチドライブラリーをスクリーニングする方法、およびそのポリケチドライブラリー中に含まれる新規のポリケチドに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明を実施する態様
エリスロマイシンPKS複合体の性質、およびモジュラーPKSについてのモデルとしてそれをコードする遺伝子クラスターを再検討することは、一般に役に立ち得る。
【００３４】
図1Aは、抗生物質エリスロマイシンのポリケチド骨格の合成酵素をコードする遺伝子クラスターの図表の提示である。エリスロマイシンPKSタンパク質アセンブリは、DEBS-1、DEBS-2、およびDEBS-3と称される３つの高分子量タンパク質（＞200ｋD）を含み、各々は別々の遺伝子によってコードされる（Caffreyら、FEBS  Lett  (1992)  304:225）。図1Aの図は、各々３つのタンパク質は、合成酵素の２つのモジュールを含むことを示す--反応物のサブセットが分子にさらなる２炭素ユニットを提供することが要求されるモジュール。図1Aに示されるように、モジュール1および2はDEBS-1；モジュール３および４はDEBS-2、およびモジュール５および６はDEBS-3に存在する。最小のモジュールは、ケト合成酵素（KS）、アシルトランスフェラーゼ（AT）、およびアシルキャリアタンパク質（ACP）を含むモジュール３に典型的である。これらの３つの機能は、伸長ユニットを活性化し、そしてそれを増殖分子の残りに付与するに十分である。モジュール内に含まれ得るさらなる活性は、クライゼン転位ではない反応に関連し、そしてデヒドラターゼ活性（DH）、エノイルレダクターゼ活性（ER）、およびケトレダクターゼ活性（KR）を含む。第１のモジュールはまた、ATおよびACP活性の反復を含む。なぜなら、第１のモジュールは、開始転位を触媒するからである（すなわち、それは、開始ユニットの性質を決定するATおよびACPによって提示される「ローディングドメイン」で始まるからである）。示されないが、モジュール３は変異によって不活化されているKR領域を有する。分子の「終結」は、モジュール６のチオエステラーゼ活性（TE）によって調節される。このチオエステラーゼはマクロリド環の環化を触媒し、それによってポリケトン産物の産生を増加するように思われる。
【００３５】
この場合の産物は6dEBである；この分子の構造および番号付けを図1Aに示す。抗生物質エリスロマイシンA、B、C、およびDへの変換は、一般にはD-デソサミンまたはL-ミカロース（L-mycarose）によるグリコシル化を必要とする；後者はエリスロマイシンAおよびBにおけるクラジノースに変換する。図1Bは、エリスロマイシンの後PKS（post-PKS）生合成（グリコシル基の負荷および修飾を含む）の図である。
【００３６】
示されるように、6dEBは遺伝子eryFによってエリスロノリドＢに変換される。これは次いで、eryBによってグリコシル化され、３位にL-ミカロースを含む3-O-ミカロシルエリスロノリドＢが得られる。次いで酵素eryCはこの化合物を、Ｄ-デソサミンによる5位でのグリコシル化によってエリスロマイシンＤに変換する。従って、エリスロマイシンＤは、グリコシル化により、および６位でのヒドロキシル基の付加によって、6dEBとは異なる。エリスロマイシンＤは、３位でのＬ-ミカロース残基をメチル化することにより、eryGによって触媒される反応においてエリスロマイシンＢに変換され得る。エリスロマイシンＤは12位でのヒドロキシル基の付加によって、エリスロマイシンＣに変換される。エリスロマイシンＡはeryGによって触媒されるミカロース残基のメチル化によって、エリスロマイシンＣから得られる。一連のエリスロマイシン抗生物質は、従って、ポリケチドフレームワークのヒドロキシル化のレベルによって、およびグリコシル残基のメチル化状態によって異なる。
【００３７】
図２は、DEBS-1をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む最初の２つのモジュールにおける領域の詳細な図を示す。酵素活性をコードする領域は、リンカーまたは「足場」コード領域によって分離される。これらの足場領域は、適切な距離および正確な順で酵素活性を配置するアミノ酸配列をコードする。従って、これらのリンカー領域は、集合的に、種々の活性が特定の順序および間隔で配置されるように足場をコードすることが考えられ得る。この組織化は、残りの遺伝子において、ならびに他の天然に存在するモジュラーＰＫＳ遺伝子クラスターにおいて同様である。
【００３８】
３つのDEBS-1、２、および３タンパク質は、遺伝子セグメントery-AI、ery-AII、およびery-AIIIによってそれぞれコードされる。これらのリーディングフレームは、エリスロマイシン耐性遺伝子（ermEまたはeryR）から約10kb離れた位置で開始する細菌染色体上に位置する。
【００３９】
エリスロマイシンに関する上記の詳細な記載は、一般にモジュラーPKSに典型的である。従って、図示されたエリスロマイシンよりも、本発明のライブラリーを作製するポリケチド合成酵素は、他のモジュラーPKS（例えば、ラパマイシン、アベルメクチン、FK-506、FR-006、モネンシン、リファマイシン、ゾラフェン-Ａ、スピノシン、スクアレスタチン、またはチロシンなどの産生を生じる）の合成酵素に由来し得る。
【００４０】
足場として使用される天然に存在するPKS遺伝子に拘らず、本発明は、クラスターによって産生されるタンパク質複合体が1つ以上の関連（respect）における活性を変化させ、次いでPKSの天然産物ではないポリケチドを産生するように、エリスロマイシンPKSまたは他の天然に存在するPKS遺伝子クラスターにおける修飾を生じることによって、ライブラリーまたは個々の修飾形態（最終的にポリケチド）を提供する。従って、新規のポリケチドは調製され得るか、または一般にポリケチドが本発明の方法を使用して、より容易に調製され得る。天然に存在するPKS遺伝子クラスター由来の多数の異なる遺伝子または遺伝子クラスター（各々は天然クラスターから異なる様式で修飾されている）を提供することによって、ポリケチドの効果的な組み合わせライブラリーは、これらの活性における複数の改変の結果として産生され得る。本発明において使用される全てのPKSコード配列は、エリスロマイシンPKSによって示される、天然に存在するPKS「由来」のモジュラーポリケチド合成酵素を提示する。以下にさらに示されるように、この誘導体の割り当ておよび束縛は、タンパク質レベルおよびコードヌクレオチド配列レベルの両方において記載され得る。
【００４１】
エリスロマイシンまたは他の天然に存在するPKS「由来」のモジュラーPKSによって、天然に存在する遺伝子の全ての利用される部分の足場を保持するモジュラーポリケチド合成酵素（またはその対応するコード遺伝子）が意味される（全てのモジュールがクラスターに含まれる必要はない）。定常足場において、少なくとも１つの酵素活性は、活性を変化させるように、変異、欠失、または置換される。変化は、これらの活性が欠失されるか、または活性の異なるバージョンによって置換される場合、または単に、天然に存在する産物ではないポリケチドがこれらの総合的な活性から生じるような方法で変異される場合、変化する。これは、産物ポリケチドにおける対応位置での、開始ユニットおよび/または伸長ユニット、および/または立体化学、および/または鎖長もしくは環化および/または還元もしくは脱水サイクル結果の変化が得られるから起こる。欠失活性が置換される場合、置換活性の起源は異なる天然に存在するポリケチド合成酵素における対応する活性から、または同じPKSの異なる領域から生じ得る。例えば、エリスロマイシンの場合、任意または全てのDEBS-1、DEBS-2、およびDEBS-3タンパク質は、これらのいずれかが含まれ得る誘導体または部分において含まれ得る；しかしエリスロマイシンPKSタンパク質の足場は、考慮されるどの誘導体においても保持される。同様の考えが、対応するery-A1、ery-AII、ery-AIII遺伝子にあてはまる。
【００４２】
誘導体は、好ましくは少なくとも、エリスロマイシンまたは他の天然に存在するPKS遺伝子クラスターに由来するチオエステラーゼ活性を含み得る。
【００４３】
要約すると、天然に存在するPKS「由来」のポリケチド合成酵素は、天然に存在する合成酵素遺伝子の全てまたは使用される部分によってコードされる足場を含み、少なくとも２つの機能的なモジュール、好ましくは３つのモジュール、およびより好ましくは4つ以上のモジュールを含み、ならびにこれらの機能的モジュールの1つ以上の活性の変異、欠失または置換を含み、その結果生じるポリケチドの性質は変化される。この定義はタンパク質レベルおよび遺伝子レベルの両方に適用する。特に好ましい実施態様は、KS、AT、KR、DH、またはERが、異なるPKSまたは同じPKS内の別の位置からの活性のバージョンによって、欠失または置換されている実施態様を含む。少なくとも１つの非凝縮サイクル酵素活性（KR、DH、またはER）が欠失されているか、または任意のこれらの活性が合成された最終的なポリケチドを変化させるように変異されている誘導体もまた、好ましい。
【００４４】
従って、産生されるポリケチドに関して、ポリケチド合成酵素を構築するための５つの自由度（degrees  of  freedom）が存在する。第１に、ポリケチド鎖長は、PKSにおけるモジュールの数によって決定される。第２に、PKSの炭素骨格の性質は各位置での伸長ユニット--例えば、マロニル、メチルマロニル、またはエチルマロニルなどの性質を決定するアシルトランスフェラーゼの特異性によって決定される。第３に、ローディングドメイン特異性もまた、生じるポリケチドの炭素骨格における効果を有する。従って、ローディングドメインは異なる開始ユニット（例えば、アセチル、プロピオニルなど）を使用し得る。第４に、ポリケチドの種々の位置での酸化状態は、モジュールのデヒドラターゼ部分およびレダクターゼ部分によって決定される。これは、ポリケチドにおいて、ケトン、アルコール二重結合または単結合の存在および位置を決定する。最後に、得られるポリケチドの立体化学は、合成酵素の３つの局面の機能である。第１の局面は、伸長ユニットとして置換されたマロニルと関連するAT/KS特異性に関連し、これは還元サイクルが欠損している場合、または脱水酵素は鏡像異性を破壊するので、還元サイクルがケトレダクターゼのみを含む場合のみ、立体化学に影響を与える。第２に、ケトレダクターゼの特異性は、任意のβ-OHの鏡像異性を決定する。最後に、伸長ユニットとしての置換されたマロニルについてのエノイルレダクターゼ特異性は、完全なKR/DH/ERが利用可能である場合、結果に影響を与える。
【００４５】
開始ユニットを制御するローディングドメイン特異性を変化させる上記の変化である以下の実施例の実施において、有用なアプローチは、別の開始ユニットならびにモジュール１伸長化ユニットを取り込む能力を生じるモジュール1におけるKS活性を改変することである。このアプローチはPCT出願WO97/02358に記載され、ここで、KS-1活性は変異によって不活化される。次いでポリケチド合成は、モジュール1ジケチド産物の化学的に合成されたアナログを供給することによって開始される。この局面の実施例の実施もまた本明細書中以下に示される。
【００４６】
従って、モジュラーPKSシステムおよび特にエリスロマイシンPKSシステムは、合成されるべきポリケチドの広い範囲を可能にする。芳香族PKSシステムと比較して、広い範囲の、脂肪族モノマー（アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソバレリルなど）、芳香族（アミノヒドロキシベンゾイル）、脂環族（alicycle）（シクロヘキサノイル）、およびヘテロ環（チアゾリル）を含む開始ユニットが、種々のマクロ環ポリケチドいおいて見出される。最近の研究は、モジュラーPKSがそれらの開始ユニットに対してリラックスされた特異性を有することを示した（Kaoら、Science  (1994)、前出）。モジュラーPKSもまた、各縮合環における伸長ユニットの選択に関してかなりの多様性を示す。縮合反応に続くβケト還元の程度もまた、遺伝子操作によって変化されることが示されている（Donadioら、Science(1991)、前出；Donadio,  S.ら、Proc  Natl.  Acad  Sci  USA（1993）90：7119-7123）。同様に、ポリケチド産物のサイズは、適切な数のモジュールを有する変異体を設計することによって変化され得る（Kao,  C.M.ら、J  Am  Chem  Soc(1994)  116:11612-11613）。最後に、これらの酵素は、高度に制御された様式でのそれらの産物における不斉中心の強力な（impressive）範囲の生成について特に周知である。本発明の方法によって生成されるポリケチドおよび抗生物質は、代表的には単一立体異性形態である。本発明の化合物が立体異性対の混合物として生じ得るが、このシステムを使用して個々の立体異性体を生成することがより実用的である。従って、モジュラーPKS経路内の組み合わせポテンシャルは任意の天然に存在するモジュラー（例えば、エリスロマイシン）に基づき、PKS足場は実際に制限されない。
【００４７】
一般に、PKSのポリケチド産物は、抗生物質活性を示すために、代表的にグリコシル化によってさらに改変されなければならない。ポリケチドのグリコシル化の方法は、当該分野において一般に公知である；グリコシル化は、適切なグリコシル化酵素を提供することによって細胞内で達成され得るか、または化学合成手段を使用してインビボで達成され得る。
【００４８】
抗生物質モジュラーポリケチドは、任意の多数の異なる糖を含み得るが、Ｄ-デスオサミンまたはそれに近いアナログは最も一般的である。エリスロマイシン、ピクロマイシン、ナルボマイシン、およびメチマイシンは、デスオサミンを含む。エリスロマイシンはまた、L-クラジノース（3-O-メチルミカロース）を含む。タイロシンはミカミノース（4-ヒドロキシデスオサミン）、ミカロースおよび6-デオキシ-Ｄ-アロースを含む。2-アセチル-1-ブロモデスオサミンは、Masamuneら,Ｊ  Am  Chem  Soc（1975）97:3512,3513によって、ポリケチドをグリコシル化するためのドナーとして使用されている。他に、明らかにより安定なドナーには、グリコシルフルオリド、チオグリコシド、およびトリクロロアセチミデートが含まれる；Woodward,R.B.ら、J  Am  Chem  Soc  (1981)  103:3215;Martin,  S.F.ら、Am  Chem  Soc(1997)119:3193;Toshima,K.ら、J  Am  Chem  Soc  (1995)117:3717;Matsumoto,Tら、Tetrahedron  Lett(1988)29:3575。グリコシル化もまた、出発物質としてマクロライドを使用して、および改良を作製するためにマクロライドを合成し得ないS.  erythraeaの変異体を使用して、もたらされ得る。方法は、本明細書中以下の実施例に示される。
【００４９】
天然に存在するPKSに由来する多重性モジュラー性PKSを構築する方法
天然に存在するPKSの誘導体は、関連遺伝子の操作によって調製され得る。多量のモジュラーPKS遺伝子クラスターがマッピングされ、そして／または配列決定されている。これらには、完全にマッピングされ、そして配列決定された、エリスロマイシン、ソラフェンA（Soraphen  A）、リファマイシン、およびラパマイシン、ならびに部分配列決定された、FK506およびオレアンドマイシンならびにマッピングされ、そして部分配列決定されたカンジシジンアベルメクチン（avermectin）およびネマデクチン（nemadectin）を含む。さらなるモジュラー性PKS遺伝子クラスターが、時間の進行とともに、利用可能になることが予測される。これらの遺伝子は、標準的な技術を用いて操作されて、活性コード領域を欠失または不活化し、同じかまたは異なるPKS系に由来する対応する活性をコードする遺伝子の領域を挿入し、あるいはそうでなければ、遺伝子変更を入手するために、標準的な手順を使用して変異され得る。当然、所望の誘導体コード配列の部分またはすべては、標準的な固相合成方法（例えば、Jayeら、J.Biol.Chem（1984）239:6331によって記載されるような方法、および例えば、Applied  Biosystems、Inc.から市販されている方法）を用いて合成され得る。
【００５０】
天然に存在するPKSの種々の誘導体をコードするヌクレオチド配列、従ってライブラリーの構築のための種々のポリケチドを入手するために、所望の数の構築物を、酵素活性コード部分を「混合および適合」することによって入手し得、そして変異は、ネイティブな宿主PKS遺伝子クラスターまたはその部分へと導入され得る。
【００５１】
変異は、従来からの技術を用いてネイティブ配列に作製し得る。変異についての基質は、遺伝子のクラスター全体またはそれらの１または２のみであり得；変異についての基質はまた、これらの遺伝子の１以上の部分であり得る。変異のための技術は、変異を含む合成オリゴヌクレオチドを調製すること、および制限エンドヌクレアーゼ消化を用いてPKSサブユニットをコードする遺伝子へと変異された配列を挿入することを包含する。（例えば、Kunkel、T.A.Proc  Natl  Acad  Sci  USA（1985）82：448；Geisselsoderら、BioTechniques（1987）５：786を参照のこと。）あるいは、変異は、ミスマッチプライマー（一般に、10〜20ヌクレオチド長）を用いてもたらされ得る。ミスマッチプライマーは、ミスマッチ二重鎖の融解温度より低い温度で、ネイティブヌクレオチド配列（一般に、RNA配列に対応するｃDNA）にハイブリダイズする。プライマーは、プライマー長および塩基組成を比較的狭い範囲内に維持すること、および変異塩基を中心に位置するように維持することによって特異的となし得る。ZollerおよびSmith、Methods  Enzymol.（1983）100：468．プライマー伸長は、DNAポリメラーゼを用いてもたらされ、産物がクローニングされ、そしてプライマー伸長鎖の分離によって得られる変異DNAを含むクローンが選択される。選択は、変異プライマーをハイブリダイゼーションプローブとして用いて達成され得る。この技術はまた、多重点変異を生成するのに適用され得る。例えば、Dalbie-McFarlandら、Proc    Natl    Acad  Sci  USA（1982）79：6409を参照のこと。PCR変異誘発はまた、所望の変異をもたらすための用途が見い出される。
【００５２】
酵素活性をコードするヌクレオチド配列の選択された部分のランダム変異誘発は、当該分野で公知のいくつかの異なる技術（例えば、オリゴヌクレオチドリンカーをプラスミドにランダムに挿入すること、X線または紫外線での照射、インビトロDNA合成の間の正確でないヌクレオチドの組込み、誤りがちなPCRの変異誘発、合成変異体の調製、および化学物質でのインビトロでのプラスミドDNAの損傷による）を用いて達成され得る。化学変異原には、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ニトロソグアニジン、ヒドロキシルアミン、塩基を損傷または除去しそれにより正常な塩基対形成を阻害する薬剤（例えば、ヒドラジンまたは蟻酸）、ヌクレオチド前駆体のアナログ（例えば、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン）、またはアクリジン、インターカレート剤（例えば、プロフラビン、アクリフラビン、キナクリン）などを含む。一般に、プラスミドDNAまたはDNAフラグメントは、化学物質で処理され、E.coliへと形質転換され、そして変異体プラスミドのプールまたはライブラリーとして増殖させる。
【００５３】
酵素活性をコードする領域の変異された形態を提供することに加えて、異なるPKSシンターゼ由来、または同じPKSシンターゼの異なる位置に由来する対応する活性をコードする領域が、例えば、適切なプライマーを用いたPCR技術を用いて回収され得る。「対応する」活性をコードする領域によって、活性の同一の一般型をコードするそれらの領域（例えば、遺伝子クラスターの１つの位置におけるケトレダクターゼ活性が、遺伝子クラスターの別の位置、または異なる遺伝子クラスターにおいてケトレダクターゼをコードする活性に「対応する」）が意味される；同様に、完全なレダクターゼサイクルは、対応する（例えば、KR/DH/ERがKR単独に対応する）とみなされ得る。
【００５４】
宿主ポリケチドシンターゼにおける特定の標的領域の置換が作製される場合、この置換は、適切な制限酵素を用いてインビトロで行われ得るか、またはドナープラスミドにおける置換遺伝子と、レシピエントプラスミドにおけるレセプター領域とをつないで組み立てる相同配列を含む組換え技術を用いてインビボでもたらされ得る。有利には異なる温度感受性のプラスミドを含むこのような系は、例えば、PCT公開（WO96/40968)において記載されている。
【００５５】
宿主PKS遺伝子における酵素活性を置換するため、または宿主PKS遺伝子のこれらの領域における変異を支持するための種々の操作を行うために使用されるベクターは選択され得、コード配列の発現が適切な宿主においてもたらされ得るような様式でもたらされるコード配列に作動可能に連結された制御配列を含み得る。しかし、単純なクローニングベクターもまた使用され得る。
【００５６】
誘導体化したPKSをコードするPKS遺伝子を入手するために使用したクローニングベクターが、コードヌクレオチド配列に作動可能に連結された、発現のための制御配列を欠如する場合、ヌクレオチド配列は、適切な発現ベクターへと挿入される。これは、個々に行われる必要はないが、単離されたコードヌクレオチド配列のプールは、宿主ベクターに挿入され得、得られたベクターは宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ得、そして得られた細胞は、個々のコロニーへとプレートして広げられ得る。
【００５７】
適切な制御配列は、真核生物および原核生物宿主細胞において機能する配列を含む。好ましい宿主には，真菌系（例えば、酵母）および原核生物宿主が含まれるが、単一細胞培養（例えば、哺乳動物細胞）もまた、使用され得る。しかし、このような系を使用するのには特定の利点は存在しない。特に好ましいのは、酵母および原核生物宿主であり、これらは、Streptomyces  spp．と適合可能な制御配列を使用する。種々の型の生物の単一細胞培養についての適切な制御配列は、当該分野で周知である。分泌をもたらす制御を含む、酵母における発現のための制御系は、広範に利用可能であり、そして日常的に使用される。制御エレメントは、プロモーター（必要に応じてオペレーター配列を含む）、および宿主の性質に依存して他のエレメント（例えば、リボゾーム結合部位）を含む。原核生物宿主のための特に有用なプロモーターは、二次代謝物としてポリケチドの産生をもたらすPKS遺伝子クラスターからのものを含み、これには、芳香族（II型）PKS遺伝子クラスターからのものが含まれる。例には、actプロモーター、tcmプロモーター、スピラノマイシンプロモーターなどがある。しかし、他の細菌プロモーター（例えば、糖代謝酵素（例えば、ガラクトース、ラクトース（lac）およびマルトース）をコードする遺伝子に由来するものもまた有用である。さらなる例は、トリプトファン（trp）のような化合物についての生合成酵素を、およびβラクタマーゼ（bla）をコードする遺伝子、バクテリオファージλPL  に由来するプロモーター、  およびT5プロモーターを含む。さらに、合成プロモーター（例えば、tacプロモーター（米国特許第4,551,433号）が使用され得る。
【００５８】
宿主細胞の増殖に比例してPKS置換配列の発現の調節を可能にする他の調節配列もまた、所望され得る。調節配列は、当業者に公知であり、そして例としては、化学的刺激または物理的刺激（これには、調節性化合物の存在を含む）に応答してスイッチオンまたはオフされる遺伝子の発現を生じる配列を含む。調節性エレメントのほかの型、例えば、エンハンサー配列もまた、ベクター中に存在し得る。
【００５９】
選択なマーカーはまた、組換え発現ベクター中に含められ得る。形質転換された細胞株について選択するのに有用な種々のマーカーが公知であり、そして一般に、これは、形質転換された細胞が適切な選択培地において増殖される場合、その発現が細胞に選択可能な表現型を付与する遺伝子を含む。このようなマーカーは、例えば、プラスミドに対して抗生物質耐性または感受性を付与する遺伝子を含む。あるいは、いくつかのポリケチドが天然に着色され、そしてこの特徴は本発明の構築物によって首尾よく形質転換された細胞をスクリーニングするためのビルトインのマーカーを提供する。  
【００６０】
種々のPKSヌクレオチド配列、またはこのような配列の混和物は、別個の制御エレメントを伴うかまたは例えば単一のプロモーターの制御下で、個々のカセットとして１以上の組換えベクターへとクローニングされ得る。PKSサブユニットまたは混和物成分は、他のPKSサブユニットまたは混和物成分の簡便な欠失および挿入を可能にする隣接する制限部位を含み得、その結果、ハイブリッドPKSが生成され得る。このような独特の制限部位の設計は、当業者に公知であり、そして上記に記載の技術、例えば、部位特異的変異誘発およびPCRを用いて達成され得る。
【００６１】
上記に記載のように、特に有用な制御配列は、それ自身が、または適切な調節系を用いて、栄養菌糸において増殖期から静止期に転移の間に発現を活性化するものである。例示されたプラスミドpCK7中に含まれる系（すなわち、actI/actIIIプロモーター対およびアクチベーター遺伝子であるactII-ORF４）が、特に好ましい。特に好ましい宿主は、ポリケチドの産生のための自らの自己手段を欠き、その結果、よりきれいな結果が得られる、宿主である。この型の例示の宿主細胞には、PCT公開WO96/40968において記載される改変されたS.coelicolor  CH999培養物およびS.lividansの同様の株が含まれる。
【００６２】
次いで、異なるポリケチドの産生のための種々のPKS系をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、適切な宿主細胞に形質転換して、ライブラリーを構築する。１つの直接的なアプローチでは、このようなベクターの混合物を、選択した宿主細胞に形質転換し、そして得られた細胞を個々のコロニーへとプレートし、そして首尾よい形質転換体について選択する。次いで、個々のコロニーの各々は、特定のPKSシンターゼ、および究極的には特定のポリケチドを産生する能力を有するコロニーを表す。代表的に、コロニーのいくつかには重複がある；各メンバーコロニーにおいて異なるPKSを含む形質転換されたコロニーのサブセットは、ライブラリーとみなされ得る。あるいは、発現ベクターを個々に使用して宿主を形質転換し得る。次いで、この形質転換された宿主は、ライブラリーへと構築される。種々の戦略を開発して、天然に存在する宿主遺伝子クラスターに由来するPKS遺伝子クラスターを各々が含む複数のコロニーを入手し得、その結果、ライブラリーでの各コロニーは、異なるPKSおよび究極的には異なるポリケチドを産生する。ライブラリーによって産生される異なるポリケチドの数は、代表的には少なくとも４、より代表的には少なくとも10、そして好ましくは少なくとも20、より好ましくは少なくとも50であり、これは、異なる変更したPKS遺伝子クラスターおよびPKS遺伝子産物の同様の数を反映する。ライブラリーにおけるメンバーの数は、任意に選択される；しかし、出発物質、伸長単位、立体異性化学、酸化状態、および鎖長の変化に関して上記に概説した自由度の程度は、非常に大きい。
【００６３】
本発明の組換えベクターを適切な宿主に導入するための方法は、当業者に公知であり、そして代表的に、CaCl2または他の薬剤（例えば、二価カチオン）リポフェクション、DMSO、プロトプラスト形質転換、およびエレクトロポレーションの使用を含む。
【００６４】
WO98/27203に開示されるように（これは、本明細書において参考として援用する）、いくつかの宿主は、シンターゼのアシルキャリアタンパク質を活性化する、適切な翻訳後機構を天然には含まないにもかかわらず、広範で種々の宿主が使用され得る。これらの宿主を適切な組換え酵素で改変して、これらの改変をもたらし得る。
【００６５】
ポリケチド産生コロニーは、公知の技術を用いて同定しそして単離され得、そして産生されたポリケチドは、さらに特徴付けられ得る。これらのコロニーによって産生されたポリケチドは、ライブラリーを代表するパネル中に集合的に使用され得るか、または活性について、個々に評価され得る。
【００６６】
従って、ライブラリーは、以下の４つのレベルで考慮され得る：（1）各々が異なるPKSクラスターをコードするがすべてが天然に存在するPKSクラスターに由来する異なるPKSコード配列を有する複数のコロニー；（２）コード配列によって産生されたPKSのメンバーであるタンパク質を含むコロニー；（3）産生されたポリケチド；ならびに（4）このポリケチドに由来する抗生物質。当然、組合せライブラリーもまた、構築され得、ここで、例えば、エリスロマイシンPKSに由来するライブラリーのメンバーは、例えばラパマイシンPKSクラスターに由来するものと同一のライブラリーの一部とみなされ得る。
【００６７】
ライブラリーにおけるコロニーを誘導して、関連のシンターゼを合成し、従って、関連のポリケチドを合成して候補ポリケチドのライブラリーを入手する。培地中に分泌されたポリケチドは、所望の標的（例えば、レセプター、シグナル伝達タンパク質など）の結合についてスクリーニングされ得る。上清自体は、スクリーニングについて使用され得るか、またはポリケチドの部分もしくは完全精製をまず、行い得る。代表的に、このようなスクリーニング方法は、ライブラリーのそれぞれのメンバーのレセプターまたは他の標的リガンドに対する結合を検出する工程を包含する。結合は、直接または競合アッセイを介するかのいずれかで検出され得る。このようなライブラリーを結合についてスクリーニングする方法は、当該分野で周知である。
【００６８】
あるいは、ライブラリーの個々のポリケチドメンバーを、所望の標的に対して試験し得る。この事象において、標的の生物学的応答を測定するスクリーニングがより容易に包含され得る。
【００６９】
実際、大多数の新規ポリケチドが、以下の実施例において例示するように、本発明の方法に従って、調製された。これらの新規ポリケチドは、上記に記載のように、グリコシル化反応を介して、抗生物質活性を有する化合物の形成における有用な中間体である。上記に示すように、個々のポリケチドは、適切な糖誘導体と反応させて、抗生物質活性の化合物を入手する。抗生物質活性は、代表的なスクリーニングアッセイ、例えば、Lehrer、R.ら、J.Immunol  Meth  （1991）137：167−173に示されるようなアッセイを用いて、確認し得る。
【００７０】
本発明の主題である新規ポリケチドを以下に記載する。本発明の主題である新規抗生物質は、６-および12-水酸化およびグリコシル化形態のこれらのポリケチドを含む。
【００７１】
１つの実施態様において、本発明のポリケチドは、構造（1）の化合物およびこれらのグリコシル化形態を含む。この化合物は、以下のポリケチド構造：
【００７２】
【化１】
2008169226.tif 000010
【００７３】
を含み、
その単離された立体異性体形態を含み；
ここで、R＊は、1−15Cの直鎖、分岐、または環状、飽和または不飽和、置換または不置換されたヒドロカルビルであり；
R1およびR2の各々は、独立して、Hまたはアルキル(1−4C)であって、ここでR1の任意のアルキルが必要に応じて置換され得；
X1はH2、HOH、または＝Oであり；
ただし：
R1およびR2の少なくとも１つはアルキル（1−4C）でなければならず；および
該化合物は図6Aの化合物１、２、３、５および６以外である；
式（1）の特に好ましい実施態様は、図6Aに示す化合物４を含む。
【００７４】
別の実施態様において、本発明のポリケチドは、式（2）の化合物およびこれらのグリコシル化形態を含む。これらの化合物は、以下のポリケチド構造：
【００７５】
【化２】
2008169226.tif 000011
【００７６】
を含み、
その単離された立体異性体形態を含み；
ここで、R＊は、1−15Cの直鎖、分岐、または環状、飽和または不飽和、置換または不置換されたヒドロカルビルであり；
R1、R2およびR3の各々は、独立して、Hまたはアルキル(1−4C)であり、
ここでR1の任意のアルキルは必要に応じて置換され得；
X1  およびX2の各々は、独立して、H2、HOH、または＝Oであり；
ただし：
R1、R2およびR3の少なくとも２つはアルキル（1−4C）である。
【００７７】
別の実施態様において、本発明のポリケチドは、構造（３）の化合物およびこれらのグリコシル化形態を含む。この化合物は、以下のポリケチド構造：
【００７８】
【化３】
2008169226.tif 000012
【００７９】
を含み、
その単離された立体異性体形態を含み；
ここで、R＊は、1−15Cの直鎖、分岐、または環状、飽和または不飽和、置換または不置換されたヒドロカルビルであり；
R1、R2およびR3の各々は、独立して、Hまたはアルキル(1−4C)であって、ここでR1の任意のアルキルは必要に応じて置換され得；
X1  およびX2の各々は、独立して、H2、HOH、または＝Oであり；
ただし：
R1およびR2の少なくとも１つはアルキル（1−4C）でなければならず；そして  
化合物は、図６Aの化合物８以外である。
【００８０】
式（3）のポリケチドの抗生物質形態は、対応するグリコシル化形態である。。
【００８１】
さらに別の実施態様は、これらのグリコシル化形態を含む以下の式のポリケチドである。これらのポリケチドは、以下の構造を有する構造（４）の化合物に由来する誘導体である：
【００８２】
【化４】
2008169226.tif 000013
【００８３】
その単離された立体異性体形態を含み；
ここで、R＊は、1−15Cの直鎖、分岐、または環状、飽和または不飽和、置換または不置換されたヒドロカルビルであり；
R1、R2およびR3の各々は、独立して、Hまたはアルキル(1−4C)であって、ここでR1の任意のアルキルは必要に応じて置換され得；
X*  およびX2の各々は、独立して、H2、HOH、または＝Oであり；
ただし：
R2およびR3の少なくとも１つはアルキル（1−4C）であり；そして化合物は、図６Aの化合物９以外である。
【００８４】
さらに別の実施態様は、ポリケチドシンターゼ系の５つのモジュールの縮合の結果である。ポリケチド形態のこの化合物は、以下の式：
【００８５】
【化５】
2008169226.tif 000014
【００８６】
の化合物であって、
そのグリコシル化形態および単離された立体異性体形態を含み；
ここで、R＊は、1−15Cの直鎖、分岐、または環状、飽和または不飽和、置換または不置換されたヒドロカルビルであり；
R1、R2、R3、R4、およびR5の各々は、独立して、Hまたはアルキル(1−4C)であって、ここでR1の任意のアルキルは必要に応じて置換され得；
X1、X2、X3およびX4の各々は、独立して、H2、HOH、または＝Oであり；またはX1、X2、X3およびX4は、Hであり、そして式(5）の化合物は、8-9位、または６-7位、または4-5位、または2-3位にπ結合を含み；
ここで：
R1〜R5の少なくとも２つはアルキル（1−4C）であり；そして
この化合物は、図6Aの化合物13または14、あるいは図11の化合物205、210〜213以外である。
【００８７】
式（5）を含む好ましい形態の化合物は、少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つのR1〜R5がアルキル（1-4C）であり、好ましくは、メチルまたはエチルであるものである。
【００８８】
X1が-OHであり、そして/またはX2が＝Oであり、そして/またはX3がHである化合物もまた好ましい。
【００８９】
これらの化合物のグリコシル化形態もまた、有用な抗生物質である。
【００９０】
６つのモジュールによってもたらされる縮合から得られるものは、以下の式を含む化合物であり：
【００９１】
【化６】
2008169226.tif 000015
【００９２】
そのグリコシル化形態および単離された立体異性体形態を含み；
ここで、R＊は、1−15Cの直鎖、分岐、または環状、飽和または不飽和、置換または不置換されたヒドロカルビルであり；
R1〜R6の各々は、独立して、Hまたはアルキル(1−4C)であって、ここでR1の任意のアルキルは必要に応じて置換され得；
X1〜X5の各々は、独立して、H2、HOH、または＝Oであり；または
X1〜X5の各々は、独立してHであり、そして式(5）の化合物は、このXの位置に隣接する環において、2位-3位、4位-5位、6位-7位、8位-9位、および/または10位-11位にπ結合を含み；
そして：
R1〜R6の少なくとも２つはアルキル（1−4C）であり；そして
該化合物は、図6Bの化合物17、24または28、図12（A)の化合物301〜311、あるいは図12(B)の化合物312〜322以外である。
【００９３】
式６を含む好ましい化合物は、R1〜R5の少なくとも３つがアルキル（1−4C）、好ましくはメチルまたはエチルであり；より好ましくは、  R1〜R5の少なくとも４つがアルキル（1−4C）；好ましくはメチルまたはエチルである化合物である。
【００９４】
X2がH2、=OまたはH＞…OHであり；そして/またはX3がHであり、そして/またはX1がOHであり；そして/またはX4がOHであり、そして/またはX5がOHである化合物もまた好ましい。
【００９５】
図６B〜６Fの式18〜23、25〜27、29〜75、および101および113の式の化合物もまた、特に好ましい。  R1〜R5がメチルであり、  X2が=Oであり、  X1、X4およびX5がOHである場合の可変なR*を伴う化合物もまた好ましく、これらの例は、図6Gおよび６Hの式96〜100および104〜107に示される。上記のグリコシル化形態もまた好ましい。
【００９６】
モジュール性PKSの６つのモジュールによって触媒される縮合から得られる他のポリケチドは、以下の式を含む化合物であり：
【００９７】
【化７】
2008169226.tif 000016
【００９８】
そのグリコシル化形態および単離された立体異性体形態を含み；
ここで、R＊は、1−15Cの直鎖、分岐、または環状、飽和または不飽和、置換または不置換されたヒドロカルビルであり；
R1〜R5の各々は、独立して、Hまたはアルキル(1−4C)であって、ここでR1の任意のアルキルは必要に応じて置換され得；
R6はアルキル（1-5C）であり；
X1およびX3およびX6の各々は、独立して、H2、HOH、または＝Oであり；
ただし：
R1〜R4の少なくとも２つはアルキル（1−4C）である。
【００９９】
これらおよびこれらに対応するグリコシル化形態もまた、本発明に含まれる。
【０１００】
なお他の化合物は以下の式：
【０１０１】
【化８】
2008169226.tif 000017
【０１０２】
に含まれるの化合物であって、
その単離された立体異性体形態を含み；
R＊は、1−15Cの直鎖、分岐、または環状、飽和または不飽和、置換または不置換されたヒドロカルビルであり；
R1〜R5の各々は、独立して、Hまたはアルキル(1−4C)であって、ここでR1の任意のアルキルは必要に応じて置換され得；
R6はアルキル(1−5C)であり；
X2は、OH、またはHであり；
X1、X3、X4およびX5の各々は、独立して、H2、HOH、または＝Oであり；あるいはX3またはX4はHであり、そして
式(8)の化合物は、7-8位または9-10位との間にπ結合を有し、
ただし：
X2がHの場合、X3およびX4の少なくとも１つはHOHまたは＝Oである。
【０１０３】
これらおよびこれらの対応するグリコシル化形態もまた、本発明に含まれる。
【０１０４】
上記のように、グリコシル化形態は有用な抗生物質である。
【０１０５】
上記に示すように、本発明の化合物におけるR*は、置換されてもよく置換されていなくてもよい。適切な置換基は、ハロ（F、Cl、Br、I）、N3、OH、O-アルキル（1-6C）、S-アルキル（1-6C）、CN、O-アシル（1-7C）、Ｏ-アリール（6-10C）、O-アルキルアリール（7-14C）、NH2、NH-アルキル（1-6C)、およびN-（アルキル）2を含む。
【０１０６】
R1における適切な置換基は、R*についてのものと同じ基から選択される。さらに、R1およびR*における置換基は、エポキシド環のような環系、あるいはO,またはN、またはSを含むより大きなヘテロ環式環を形成し得る。R*およびR1についての好ましい置換基は、ハロ、OHおよびNH2である。置換されていない形態もまた好ましい。
【０１０７】
本発明の範囲内で抗生物質として特に有用なのは、本明細書における図８に示す式82〜93の化合物である。
【０１０８】
本発明の化合物のなお別の実施態様は、図９における化合物94として示される。そのグリコシル化形態（化合物95として示す）は、抗生物質として有用である。
【実施例】
【０１０９】
以下の実施例は例示を意図しており、本発明の限定を意図しない。
材料および方法
一般技術：
細菌株、プラスミド、および培養条件。1995年３月30日発行のWO  95/08548に記載のS.coelicolor  CH999を発現宿主として用いた。DNA操作はEscherichia  coli  MC1061中で行った。プラスミドはE.coli  ET12567(dam  dcm  hsdS  Cmr)(MacNeil,  D.J.  J  Bacteriol(1988)170:5607)により継代し、S.coelicolorの形質転換の前に非メチル化DNAを生成した。E.coli株は標準条件下で増殖させた。S.coelicolor株はR2YE寒天プレート上で増殖させた(Hopwood,  D.A.ら、Genetic  manipulation  of  Streptomyces.  A  laboratory  manual.  The  John  Innes  Foundation:  Norwich,  1985)。pRM5(これもまたWO  95/08548に記載)は、colEIレプリコン、適切な短縮型SCP2*Streptomycesレプリコン、双方向的クローニングを可能とする２つのact-プロモーター、actII-ORF4アクチベーターをコードする遺伝子(これは増殖期から定常期への遷移の間にactプロモーターからの転写を誘導する)、および適切なマーカー遺伝子を含む。操作された(engineered)制限部位は、天然に存在するPKSの個別のドメインをコードするカセットから開始するPKS遺伝子クラスターのコンビナトリアルな構築を促進する。
【０１１０】
pRM5をPKSの発現に用いる場合、(ｉ)全ての関連の生合成遺伝子がプラスミドに保有されており(plasmid-borne)、従って、E.coli中で容易に操作および変異されやすい、(ii)PKS遺伝子クラスターのライブラリー全体が同じ細菌宿主中で発現され得、この細菌宿主は遺伝的および生理学的に詳しく特徴づけられており、かつポリケチドのインビボ産生に必要とされる補助的な活性の全てではないにしても大部分をおそらくは含む、(iii)ポリケチドは二次代謝物のような様式で産生され、そのためインビボで潜在的に生物活性の化合物を合成することの毒性の影響が軽減される、そして(iv)このように産生された分子は、同じ経路が野生型生物またはブロックされた(blocked)変異体中で発現された場合よりも副反応を受けることが少ない。
【０１１１】
DNAおよび生物体の操作。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をTaqポリメラーゼ(Perkin  Elmer  Cetus)を用いて、酵素の製造者が推奨する条件下で行った。DNA操作のための標準的なインビトロ技術を用いた(Sambrookら、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual  (最新版))。E.coliをBio-RadのE.coliパルス装置(Pulsing  apparatus)でBio-Radにより提供されるプロトコルを用いて形質転換した。S.coelicolorを標準的手順で形質転換し(Hopwood,  D.A.ら、Genetic  manipulation  of  Streptomyces.  A  laboratory  manual.  The  John  Innes  Foundation:  Norwich,  1985)、そして形質転換体を2mLの500μg/mlチオストレプトン重層を用いて選択した。
【０１１２】
調製Ａ
完全なエリスロマイシンPKS遺伝子クラスターの構築
エリスロマイシンPKS遺伝子の回収
エリスロマイシンPKS遺伝子クラスターの種々の部分はライブラリー調製のプロセスの任意の段階で別々に操作され得るが、全遺伝子クラスターの便利な供給源を１つの場所で有することが望ましくあり得る。それゆえ、全エリスロマイシンPKS遺伝子クラスターが所望であれば単一のプラスミドから回収され得る。これを以下、プラスミドdMAK705(Hamiltonら、J  Bacteriol  (1989)171:4617)の誘導体を利用して例示し、温度感受性ドナープラスミド(これは第１の許容的な温度では複製可能であり、かつ第２の非許容的な温度では複製が不可能である)とレシピエントプラスミドとの間でのインビボでの組換えを可能とする。このようにクローン化されたeryA遺伝子はpRM5の誘導体であるpCK7を与えた(McDanielら、Science(1993)262:1546)。対照プラスミドpCK7fを、eryAIのフレームシフト変異を有するように構築した。pCK7およびpCK7fはE.coli中での遺伝子操作のためのColEIレプリコン、ならびに短縮型SCP2*(低コピー数)Streptomycesレプリコンを有する。
【０１１３】
これらのプラスミドはまた多様なactI/actIIIプロモーター対およびactII-ORF4、アクチベーター遺伝子を含む。アクチベーター遺伝子はこれらのプロモーターからの転写のために必要とされ、そして栄養菌糸体の増殖から定常期への遷移の間の発現を活性化する。PKS遺伝子の高レベル発現は菌糸体増殖の定常期の開始時に起こる。従って組換え株はコードされたポリケチドを二次代謝物として産生する。
【０１１４】
より詳細には、完全なeryA遺伝子を含むシャトルプラスミドであるpCK7(図３)(これは元々はpS1(Tuanら、Gene(1990)90:21)からクローンされた)を以下のように構築した。モジュラーDEBS  PKS遺伝子を増大的に、温度感受性「ドナー」プラスミド(すなわち第１の許容的な温度では複製可能であり、かつ第２の非許容的な温度では複製が不可能であるプラスミド)から「レシピエント」シャトルベクターに、二重の組換え事象を通じて、図４に示すように、移動した。pS1由来の25.6kbのSphIフラグメントをpMAK705(Hamiltonら、J  Bacteriol  (1989)171:4617)のSphI部位に挿入して、eryAII、eryAIII、およびeryAIの3'末端を含むドナープラスミドであるpCK6(CmR)を得た。この温度感受性pSC101誘導体の複製は30℃で生じるが、44℃で静止する。レシピエントプラスミドpCK5(ApR、TcR)は、eryAI開始コドン(Caffreyら、FEBS  Lett(1992)304:255)からeryAIIの始めに近いXcmI部位までの12.2kbのeryAフラグメント、テトラサイクリン耐性遺伝子(Tc)をコードする1.4kbのEcoRI-BsmI  pBR322フラグメント、およびeryAIIIの末端からの4.0kbのNotI-EcoRIフラグメントを含む。PacI、NdeI、およびリボソーム結合部位をpCK5中のeryAI開始コドンのところに操作した。pCK5はpRM5(上記)の誘導体である。5’および3’領域の相同性は各々4.1kbおよび4.0kbである。MC1061  E.coliをpCK5およびpCK6で形質転換し、そして30℃でカルベニシリンおよびクロラムフェニコールの選択に供した。両プラスミド(ApR、CmR)を含むコロニーを次に、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールのプレート上で44℃で再び画線培養した(streak)。２つのプラスミド間の単一の組換え事象により形成された共組込み体(cointegrate)のみが生存性であった。生存していたコロニーを30℃でカルベニシリン選択下で増殖させ、第２の組換え事象を通じてこの共組込み体を分割させた。pCK7組換え体を富化させるために、コロニーをカルベニシリンプレート上で44℃で再び画線培養した。得られたコロニーの約20％が所望の表現型(ApR、TcS、CmS)を示した。最終的なpCK7の候補を制限マッピングにより詳細にチェックした。対照プラスミドであるpCK7f(これはeryAIにおいてフレームシフトエラーを含む)を同様のやり方で構築した。pCK7およびpCK7fをE.coli  ET12567(MacNeil,  J  Bacteriol(1988)170:5607)に形質転換して、非メチル化プラスミドDNAを生成し、そして次にStreptomyces  coelicolor  CH999中に移動した。
【０１１５】
CH999／pCK7をR2YE培地上で増殖させると、この生物は多量の２つのポリケチドを産生した。増殖培地にプロピオネート(300mg/L)を加えると、ポリケチド産物が収率でおよそ２倍増加する結果となった。プロトンおよび13C  NMR分光法をプロピオン-l-13C酸供給実験と組み合わせて、主生成物を6dEB(＞40mg/L)として確認した(図１Ａ)。副生成物は8,8a-デオキシオレアンドライド(＞10mg/L)と同定され(図１Ａ)、これは明らかに6dEB生合成経路においてプロピオネートの代わりにアセテート出発単位から生じる。13C2酢酸ナトリウム供給実験はアセテートが副生成物中に取り込まれることを確認した。３つの高分子量タンパク質(＞200kDa)、おそらく、DEBS1、DEBS2、およびDEBS3(Caffreyら、FEBS  Lett(1992)304:255)もまた、CH999/pCK7の粗抽出物中でSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により観察された。CH999／pCK7fからはポリケチド産物は観察されなかった。発明者らはこれによって米国癌協会(American  Cancer  Society)により提供される援助を承認する(IRG-32-34)。
【０１１６】
実施例１
DEBS  ATおよびKRドメインの置換のための足場の調製
DEBSの６つのモジュールの各々について、アシルトランスフェラーゼ(AT)ドメインと還元(KRまたはDH/ER/KR)ドメインとの選択された境界に操作されたエンドヌクレアーゼ制限部位を含むようにサブクローンを作製した。制限部位をPCR変異誘発によりサブクローン中に導入した。BamHI部位をATドメインの5’境界のために用い、PstI部位をATドメインと還元性ドメインとの間に導入し、そしてXbaIを還元性ドメインの3’末端で用いた（図５を参照のこと）。この結果、以下の操作された配列が得られた(小文字は操作された制限部位を示す)：
【０１１７】
【数１】
2008169226.tif 000018
【０１１８】
実施例2
ラパマイシンPKS由来のカセットの調製
Streptomyces  hygroscopicus  ATCC29253由来のゲノムDNAのコスミドライブラリーを用いて、エリスロマイシン遺伝子クラスターの酵素活性領域中への置換物として用いられるラパマイシンPKS遺伝子クラスターから調製されるDNAカセットを調製した。カセットを、PCR増幅により、適切なコスミドまたはサブクローンから、表１に示されるプライマー対を用いて調製し、そして適切な制限部位をカセットの末端に導入するように設計した。rapAT2カセットにはBglIIおよびPstI部位が隣接し、そしてrapAT14カセットにはBamHIおよびPstI部位が隣接する。還元サイクルカセットにはPstIおよびXbaI部位が隣接する。大きなDH／ER／KRカセットを2つのピースに増幅し、次に長いDNA配列のPCR増幅の間に導入されるエラーを最小化するために、操作されたXhoI部位で接合させた。rapKR4カセットを、上記のrapDH/KR4カセット由来の1.3kbのNheI/XbaIフラグメントをpUC19中のXbaI部位にクローン化することにより作製した。pUC19中にXbaIのインフレームおよび上流のPstI部位が存在し、これはカセットの5’末端で以下の接合を生じる：
【０１１９】
【表１】
2008169226.tif 000019
【０１２０】
実施例３
ラパマイシンPKSカセットによるDEBSモジュールの置換
以下は典型的な手順である。産物は図６にその番号で示され、ここでRはメチルまたは水素であり得る。表および他の場所でのこれらの数の表示において、「a」はR＝メチルを表し、そして「b」はR＝水素を表す。
【０１２１】
ａ）DEBS  DH/ER/KR4の置換。エリスロマイシン遺伝子の一部のモジュール４(eryDH/ER/KR4)を、第１のラパマイシンモジュール(rapDH/ER/KR1）またはラパマイシンのモジュール4(rapDH/KR4)のいずれかの対応のラパマイシン活性と置き換えた。置換はKaoら、Science(1994)265:509-512の技術を利用した。ドナープラスミドを、最初にDEBSのDH/ER/KR4に隣接する1kbp領域を増幅して、左の隣接部の3’末端にPstI部位を、そして右の隣接部の5’末端にXbaI部位を含むようにすることによって、調製した。フラグメントをこの実施例の段落b)でKR6について述べる方法と同様のやり方で温度感受性ドナープラスミドに連結し、そして実施例２に記載のように調製されたラパマイシンカセットをPstI/XbaI部位に挿入した。レシピエントプラスミドは調製Ａに記載のpCK7であった。インビボ組換え技術により発現プラスミドpKOS011-19(eryDH/ER/KR4→rapDH/ER/KR1)およびpKOS011-21(eryDH/ER/KR4→rapDH/KR4)が得られた。両ベクターにおいて、PstIおよびXbaI部位がDEBS中に導入される接合は以下の通りである：
【０１２２】
【数２】
2008169226.tif 000020
【０１２３】
得られた発現ベクターをS.coelicolor  CH999に形質転換し、そして首尾よい形質転換体を上記のように増殖させた。rapDH/ER/KR1カセットを含む形質転換体は図６に23で示されるポリケチド（ここでRはメチルまたはHである）を産生した。rapDH/KR4カセットを有するプラスミドを含む形質転換体は図６に24で示されるポリケチド（ここでRはメチルまたはHである）を産生した。図示されるように、これらのポリケチドは、Rがメチルである24の場合には6,7アルケンによって6-デオキシエリスロノリドBとは異なり、そしてRがメチルである23の場合にはC6-メチル立体化学により異なる。
【０１２４】
b)DEBS  KR6の置換。段落a)で述べたのと類似の方法で、ドナープラスミドの構築において、eryKR6がrapDH/KR4で置換されたプラスミドpKOS011-25を、DEBSのKR6ドメインに隣接する領域を置換することによって調製した。
【０１２５】
eryKR6ドメインに隣接する約1kbの領域を以下のプライマー(配列番号38−41)を用いてPCR増幅した。：
【０１２６】
【数３】
2008169226.tif 000021
【０１２７】
次にこれらのフラグメントを、多重クローン化部位領域がフラグメントの制限部位(すなわち左隣接部についてはBamHI/PstIおよび右隣接部についてはXbaI/NsiI)を収容するように改変されたpMAK705誘導体中にクローン化した。次にカセットを上記プラスミドのPstI/XbaI部位中に挿入して、インビボ組換えプロトコルのためのドナープラスミドを生成した。DEBS中に操作された得られたPstIおよびXbaI接合は以下の通りである：
【０１２８】
【数４】
2008169226.tif 000022
【０１２９】
DEBSのKR6ドメインに隣接する領域を用いてドナープラスミドを構築した。
【０１３０】
S.coelicolor  CH999の形質転換体により、図６に74で示されるポリケチド(ここでRはメチルまたはH)の産生を生じた。
【０１３１】
c)DEBS  KR2の置換。eryKR2酵素活性を、一連のベクター中で、pKAO263のPstI/XbaI部位中へのインビトロ挿入を用いて置換した。pKAO263はKao,  C.M.  J  Am  Chem  Soc(1996)118:9184-9185に記載のpCK13の誘導体である。これは、Bedford,D.ら、Chem  an  Biol  (1996)3:827-831に記載の類似の２-モジュールDEBS系のものと同じに位置するPstIおよびXbaI制限部位を導入することによって調製された。３つの発現プラスミド：pKOS099-7(eryKR2→rapDH/KR4)；pKAO392(eryKR2→rapKR2)；およびpKAO410(eryKR2→rapDH/ER/KR1)を調製した。これらのプラスミドは、S.coelicolor  CH999に形質転換すると、図６において、RがHまたはメチルの場合には構造12、３および10のポリケチドを、そしてRがメチルの場合には10を、各々産生する結果となった。さらなるベクターpKAO400(eryKR2→rapKR4)はpKAO392と同様の結果を生じた。
【０１３２】
d)DEBS  AT2の置換。モジュール２由来のDEBS  AT活性を、ATモジュール２ドメインに隣接する制限部位BamHIおよびPstIをpCK12(Kaoら、J  Am  Chem  Soc(1995)112:9105-9106)中に挿入した後に、切除した。BamHI/PstIによる切断の後、rapAT2を含むBglII/PstIフラグメントを挿入した。得られた操作されたDEBS/rapAT2接合は以下の通りである(BamHI/BglII連結-GGATCT；PstI-CTGCAG)：
【０１３３】
【数５】
2008169226.tif 000023
【０１３４】
得られたプラスミドpKOS008-51で形質転換されたS.coelicolor  CH999は、図６に示されるポリケチド６（ここでRはメチルまたはHである）を産生した。
【０１３５】
実施例４
DEBS還元性サイクルドメイン切除
以下は代表的な手順である。産物を番号で示し、そして番号で表される構造を図６に示し、ここでRは以下で示すようにメチル(a)または水素(b)のいずれかであり得る。
【０１３６】
二重オリゴヌクレオチドリンカー(ΔRdx)を、還元性サイクルドメインの完全な切除を可能とするように設計した。２つの合成オリゴヌクレオチド(配列番号：46−47)：
【０１３７】
【数６】
2008169226.tif 000024
【０１３８】
を、ハイブリダイゼーションの際にPstI-およびXbaI-に適合する末端を生成するように設計した。この二重リンカーを、切除する還元性ドメインの適切な左および右の隣接領域を含む組換えドナープラスミドのPstI-およびXbaI-部位に連結した。実施例３の段落a)のインビボ組換え技術を次に用いた。ドナープラスミドは、切除される還元性ドメインの左および右の隣接領域を含むように改変されたプラスミドのPstIおよびXbaI部位に連結される、PstIおよびXbaI適合末端を有する二重リンカーΔRdxを含んでいた。ドナープラスミドをレシピエントプラスミドpCK7と再び組み合わせて、pKOS011-13(eryKR6→ΔRdx)を生成し、そしてレシピエントプラスミドpCK13と再び組み合わせてpKOS005-4(eryKR2→ΔRdx)を生成した。S.coelicolor  CH999に形質転換する場合、プラスミドpKOS011-13はポリケチド30、31、77および78（ここでRは各場合においてメチルまたはHである）を産生した。プラスミドpKOS005-4では、ポリケチド2（ここでRはメチルまたはHである）を産生した(図６)。
【０１３９】
実施例５
DEBSの特異的変異誘発によるマクロライド環サイズの操作
以下は典型的な手順である。産物は番号で示され、そして番号で表される構造は図６に示され、ここでRは以下に示すようにメチル(a)または水素(b)のいずれかであり得る。
【０１４０】
Kao,  C.M.ら、Science(1994)265:509-512の発現系を用いて、DEBS2およびDEBS3の非存在下で(プラスミドpCK9中で)のDEBS1単独(1＋2)の発現は、最初の２つのモジュールの予期されたトリケチド産物である(2R,3S,4S,5R)-2,4-ジメチル-3,5-ジヒドロキシ-n-ヘプタン酸L-ラクトン(「ヘプタン酸L-ラクトン」(図６の化合物１、ここでRはメチルである；図７も参照のこと))(1〜3mg/L)の産生をもたらした(Kao,  C.M.ら、  J  Am  Chem  Soc(1994)116:11612-11613)。従ってチオエステラーゼは酵素複合体からのトリケチドの遊離に必ずしも必須ではない。
【０１４１】
さらに２つの欠失変異体PKSを構築した。第１のものはTEに融合したDEBS1を含み、そして第２のPKSはTEに融合した最初の５つのDEBSモジュールを含んでいた(図７Ｂおよび７Ｃ)。プラスミドpCK12およびpCK15はそれぞれ、バイモジュラー性(bimodular)(「1＋2＋TE」)およびペンタモジュラー性(pentamodular)(「1＋2＋3＋4＋5＋TE」)のPKSをコードする遺伝子を含んでいた。
【０１４２】
pCK12中の1＋2＋TEのPKSは、モジュール6のアシルを有するタンパク質(ACP-6)のカルボキシ末端へのモジュール2のアシルを有するタンパク質(ACP-2)のカルボキシ末端の融合を含んでいた。従って、ACP-2は本質的にインタクトであり、そしてACP-6とTEとの間に天然に見いだされるアミノ酸配列が続く。プラスミドpCK12はpS1(Tuan,  J.S.ら、Gene(1990)90:21)を起源とするeryAのDNAを含んでいた。pCK12は、ACP-2のカルボキシ末端とACP-6のカルボキシ末端との間の欠失以外は、pCK7(Kaoら、Science(1994)、前出)と同一である。融合はDEBS1の残基L3455とDEBS3の残基Q2891との間で生じる。SpeI部位がこれらの2つの残基の間に存在し、そのため融合のところのDNA配列はCTCACTAGTCAG(配列番号48)である。
【０１４３】
pCK15中の1＋2＋3＋4＋5＋TE  PKSは、モジュール5のβ-ケトレダクターゼ(KR-5)の下流の融合物76アミノ酸およびACP-6の上流の５アミノ酸を含んでいた。従って、融合はKR-5とACP-5との間の非保存領域のカルボキシ末端に向かって生じ、そして組換えモジュール５は本質的に野生型モジュール５と６との間のハイブリッドであった。プラスミドpCK15はpS1(Tuanら、Gene(1990)、前出)を起源とするeryAのDNAを含んでいた。pCK15はpCK7(Kaoら、Science(1994)、前出)の誘導体であり、そして以前に記載されたインビボ組換え戦略(Kaoら、Science(1994)、前出)を用いて構築された。pCK15は、DEBS3の残基G1372とA2802との間に生じるKR-5とACP-6との間の欠失、およびカナマイシン耐性遺伝子(Oka  A.ら、J  Mol  Biol(1981)147:217)を含む平滑末端化SalIフラグメントのpCK7の平滑末端化HindIII部位への挿入以外は、pCK7と同一である。アルギニン残基がG1372とA2802との間に存在し、そのため融合のところのDNA配列はGGCCGCGCCである。
【０１４４】
プラスミドpCK12およびpCK15をS.coelicolor  CH999中に導入し、そしてポリケチド産物を形質転換株から以前に記載された方法(Kaoら、Science(1994)、前出)に従って精製した。種々の形質転換体：上記のCH999／pCK12およびCH999/pCK15ならびにCH999/pCK9から得られた産物を図７に示す。
【０１４５】
CH999/pCK12は、1Hおよび13C  NMR分光法で決定されるように、ヘプタン酸L-ラクトン(図６の化合物１、ここでRはメチルである；図７も参照のこと)(20mg/L)を産生した。このトリケチド産物は、上記の非修飾DEBS1タンパク質を単独で発現するCH999/pCK9により産生される産物と同一である。しかし、CH999/pCK12はこの化合物をCH999/pCK9よりも有意に多量(約1mg/Lに対して＞10mg/L)で産生し、これはTEがモジュール2のACPドメインに結合したトリケチド鎖のチオ開裂を触媒する能力を示す。CH999／pCK12はまた有意量の化合物(RがHである)、化合物の新規のアナログ(Rがメチルである)、(10mg/L)を産生し、これはプロピオネートの代わりにアセテート開始ユニットを取り込んだ結果である。これは、インタクトなPKSを発現するCH999／pCK7が、上記の6dEBに加えて8,8a-デオキシオレアンドライド(図1A参照)を産生する能力を暗示する。
【０１４６】
化合物１(RがHである)はCH999/pCK9で検出されなかったので、それがCH999/pCK12から容易に単離されることは、TEの存在に起因するDEBS1のターンオーバー率の増大のさらなる証拠を提供する。換言すれば、TEは、天然の基質である6dEBよりもアシルユニットが４つ短い「外来」モジュールに結合した中間体を有効に認識し得る。しかし、トリケチド産物はおそらく、化合物１(ここでRはメチルまたはHである)中で、典型的な発酵条件下で(pH7)で自発的に環化し得るので、酵素触媒されるラクトン化を伴う生合成モデルと、酵素触媒される加水分解とその後の自発的ラクトン化を伴う生合成モデルとを識別することは不可能である。従って、1＋2＋TE  PKSがトリケチドのC-5ヒドロキシルを入り求核試薬として認識する能力は不明確である。
【０１４７】
CH999/pCK15は、多量の(8R,9S)-8,9-ジヒドロ-8-メチル-9-ヒドロキシ-10-デオキシメトノライド(図６の化合物13)(10mg/L)を産生し、ペンタモジュラー性PKSが活性であることを実証している。化合物13は、天然に豊富でかつ13Cが富化した物質の1Hおよび13C  NMR分光法、等核相関分光法(COSY)、異核相関分光法(HETCOR)、質量分析法、および分子モデリングを用いて特徴づけられた。化合物13は、10-デオキシメトノリド（10-deoxymethomolide）のアナログ(化合物14、Lambalot,  R.H.ら、J  Antibiotics(1992)45：1981-1982)であり、マクロライド系抗生物質メチマイシン(methymycin)のアグリコンである。ペンタモジュラー性酵素による13の産生は、DEBS中のモジュール５および６中の活性部位ドメインが活性の損失なしに接合され得ることをことを実証する。従って、個別のモジュールならびに活性部位は独立した存在であり、機能的であるべき近接のモジュールとの会合に依存しないことが明らかである。ヘキサケチド産物の末端カルボキシルとC-11ヒドロキシルとのエステル化によって形成される12員のラクトン環は、1＋2＋3＋4＋5＋TE  PKS(そしておそらくTE自体)が、DEBSの天然産物6dEBよりもアシルユニットが１つ短いポリケチド鎖のラクトン化を触媒する能力を示していた。実際、化合物13の形成は、密接に関連する12員のヘキサケチドマクロライドであるメチマイシンの生合成を模倣し得、これはしばしば、相同の14員ヘプタケチドマクロライドであるピクロマイシン(picromycin)および／またはナルボマイシン(narbomycin)と共に生じる(Cane,  D.E.ら、J  Am  Chem  Soc(1993)115:522-566)。エリスロマイシンPKSの足場はこのように、短い鎖長ならびに長い鎖長の広範なマクロラクトンの生成に用いられ得る。
【０１４８】
1＋2＋3＋4＋5＋TE  PKSの構築は、以前には特徴づけられていなかった12員のマクロラクトンの生合成をもたらし、これは生物学的に活性なマクロライドのアグリコンに非常に似ているが、区別される。活性部位ドメインおよびモジュールの明らかな構造的および機能的独立性、ならびに緩和したラクトン化の特異性は、これらの酵素を操作して新規なモジュラー性PKSを産生するための多数の自由度の存在を示唆する。
【０１４９】
実施例６
ポリケチド産物の産生および分析
実施例１〜５に記載のように、DEBS中のドメイン置換により作製される発現ベクターを、Streptomyces  coelicolor  CH999またはS.lividans  K4-114のいずれかの中に、標準的技術(D.A.Hopwoodら(1985)「Genetic  Manipulation  of  Streptomyces:  A  Laboratory  Manual」、(The  John  Innes  Foundation,  Norwhich))を用いて形質転換した。両宿主株とも、天然のアクチノロジン(actinorhodin)ポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターの完全な欠失を有し、そのため天然のポリケチド産物を産生しない。形質転換体を150mmのR2YE寒天プレート上で２日間、30℃で増殖し、この時点で寒天スラブをディッシュから持ち上げ、そして４mmのガラスビーズの層、5mMのプロピオン酸ナトリウムを補充した50mLの液体R2YE培地、および約１gのXAD-16樹脂ビーズを含む新しいディッシュに置いた。これを30℃でさらに７日間保持した。
【０１５０】
XAD-16樹脂を減圧濾過により採取し、水で洗浄し、次に10mLずつのエタノールで２回抽出した。抽出物を合わせ、そしてスラリーまでエバポレーションし、これを酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルを飽和NaHCO3で１回洗浄し、そしてエバポレーションして粗生成物を得た。試料をエタノールに溶解し、そしてLC/MSで分析した。HPLCは4.6×150mmのC18逆相カラムを用い、80：19：1のH2O/CH3CN/CH3CO2Hから99：1のCH3CN/CH3CO2Hまでのグラジエントを用いた。質量スペクトルをAPCIイオン源を装着したPerkin-Elmer/Sciex  API100LCスペクトロメーターを用いて記録した。各遺伝子構築物は代表的には、これはPKSをそれぞれ、プロピオニル-CoAおよびアセチル-CoAでプライムすることから生じる、表２に文字「ａ」(R＝メチル)および「b」(R＝H)で示される対の産物の形成をもたらした。
さらなる実施例
前述の技術を用いて、表２に示すDEBS構築物を調製した。構築物をS.coelicolor  CH999中に形質転換したときに得られる産物を、図６中にそれらの数で示し、ここで表２中「a」で示される実施態様のRはメチルを表し、表２中「b」で示される実施態様では水素を表す。発現ベクターのうちのいくつかはインビトロでの連結によって調製された。多重ドメイン置換は、単一置換発現プラスミド中への続いてのインビトロ連結によって作製された。他のものはインビボ組換えによって得られた。
【０１５１】
【表２−１】
2008169226.tif 000025
【０１５２】
【表２−２】
2008169226.tif 000026
【０１５３】
【表２−３】
2008169226.tif 000027
【０１５４】
【表２−４】
2008169226.tif 000028
【０１５５】
実施例７
14,15-ジヒドロ-6-デオキシエリスロノリドB(図９の化合物94)の調製
３つの100mmR2YE寒天プレート上で培養したS.coelicolor  CH999/pJRJ2の３日培養物に、10mgの(2S,3R)-3-ヒドロキシ-2-メチル-4-ペンテン酸（pentenoic  acid）N-アセチルシステアミンチオエステルを2mLの9：1の水／DMSOに溶解した溶液を重層し、そして乾燥させた。培養物を30℃でさらに４日間インキュベートした。寒天を刻み、そして等容量の酢酸エチルで２回抽出した。抽出物を合わせて、エバポレーションした。シリカゲルクロマトグラフィーによる精製(1：1の酢酸エチル／ヘキサン)により0.75mgの14,15-デヒドロ-6-デオキシエリスロノリドB(図９の化合物94)が得られ、APCI-MSは[M＋H]＋=385であった。
【０１５６】
図６Ｇおよび６Ｈの化合物96〜107および化合物113で表されるようなR*および／またはR1が異なる類似の化合物を、前段落に記載したのと同様の様式で調製したが、適切なジケチドをN-アセチルシステアミンチオエステルとして代わりに用いた。これらの化合物をこの様式で調製し、そしてその構造を確認した。
【０１５７】
適切な誘導体化ジケチドの調製を実施例17に記載する。
【０１５８】
実施例８
1-(2-メルカプトピリミジニル)-2-O-メトキシカルボニル-(D)-デソサミンの合成
以下の実施例のグリコシル化反応のために、表題化合物を試薬として用いた。この実施例の段落(A)および(B)の転化を図10に示す。
【０１５９】
(A)  1,2-ジ-O-メトキシカルボニル-(D)-デソサミンの調製：50mLのCH2Cl2中の1.00gの(D)-デソサミン(4.74mmol)に3.06gのジイソプロピルエチルアミンを加えた。混合物を周囲温度で10分間攪拌し、次に４℃に冷却した。クロロギ酸メチル(1.34g)を４℃で滴下した。反応混合物を周囲温度まで加温し、そして終夜攪拌した。乾燥するまで溶媒をエバポレーションし、酢酸エチル(150mL)を加えて生成物を抽出し、そして残った固体を濾過した。酢酸エチルを減圧下で除去し、そして粗生成物をシリカゲルカラム(酢酸エチル：メタノール：トリエチルアミンは84：5：1  v/v/v)で精製して、1.29gの生成物を得た(収率88％)。
【０１６０】
(B)  1-(2-メルカプトピリミジニル)-2-O-メトキシカルボニル-(D)-デソサミンの調製：1,2-ジ-O-メトキシカルボニル-(D)-デソサミン(1.00g、3.436mmol)および0.7697gの2-メルカプトピリミジン（2-mercaptopyrimdine）(6.872mmol)の25mLの２口フラスコ（2-neck  flash）の中の混合物を減圧下で45分間乾燥した。ジクロロエタン(10mL)、トルエン(５mL)、およびDMF(５mL)を加え、周囲温度で攪拌し、次に７mLのSnCl4(CH2Cl2中1M)を加えた。反応混合物を80℃で終夜保持した。反応を１NのNaOHを混合物が塩基性になるまで加えることによって停止させた。溶液を300mLの酢酸エチルで抽出し、そして有機層を飽和水性NaHCO3(3×150mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濾過し、そしてエバポレーションした。生成物をシリカゲルカラム(1：1の酢酸エチル：ヘキサンから１％のトリエチルアミンを含む酢酸エチルまで)で精製して、0.25gの1-(2-メルカプトピリミジニル)-2-O-メトキシカルボニル-(D)-デソサミンおよび0.5gの回収された1,2-ジ-O-メトキシカルボニル-(D)-デソサミンを得た。
【０１６１】
実施例９
5-O-[1-β-(2-O-メトキシカルボニル-(D)-デソサミニル)]-6-デオキシエリスロノリドBおよび5-O-(1-β-(D)-デソサミニル)-デオキシエリスロノリドB
(図８中の化合物86および87)の調製
(A)  6-デオキシエリスロノリドB(6-DEB)(15mg、39μmol)および1-(2-メルカプトピリミジニル)-2-O-メトキシカルボニル-(D)-デソサミン(65mg、200μmol)の混合物を減圧下で乾燥し、次に窒素雰囲気下に置いた。これにCH2Cl2(1mL)、トルエン(0.5mL)、および粉末4Aモレキュラーシーブ(50mg)を加え、そして混合物を10分間、周囲温度で攪拌した。トリフルオロメタンスルホン酸銀(64mg、250μmol)を加え、そして反応をLC/MS分析が完了を示すまで攪拌した(18〜20時間)。混合物を無水Na2SO4を通して濾過し、そしてエバポレートして、粗生成物を得た。残渣を数滴のアセトニトリルに溶解し、そしてC-18固相抽出カートリッジ(Whatman)にロードした。未反応のデソサミンを、20％のCH3CN／H2Oで洗浄することによって除去し、そしてグリコシル化生成物および残留マクロライドアグリコンを100％CH3CNで溶出することによって回収した。最終的な分離をHPLCにより半調製(semiprep)C-18カラム(10mm×150mm)を用いて行った(CH3CN／H2O、20％定組成（isocratic）で５分間、次に20％から80％で30分間)。HPLC画分をLC/MSによりチェックし、そして同じ生成物を含む画分を合わせた。溶媒を減圧除去し、8.4mgの5-O-[1-β-(2-O-メトキシカルボニル-(D)-デソサミニル)]-6-デオキシエリスロノリドB(図８の化合物86)を得た(収率36％)。APCI-MSは[M＋H]＋＝602であった。
【０１６２】
(B)  段落(A)の5-O-[1-(2-O-メトキシカルボニル-(D)-デソサミニル)]-6-デオキシエリスロノリドB（１〜６mg）を１mLのメタノール、0.2mLのH2O、および0.2mLのトリエチルアミンに溶解し、70℃で３時間保持した。溶媒の減圧除去により、粗生成物を得た。これを数滴のCH3CNに溶解し、そしてWhatmanC18固相抽出カートリッジに付した。カラムを25mLの水中の20％CH3CNで洗浄し、次に生成物を100％CH3CNで溶出した。溶媒の蒸発により5-O-(1-β-(D)-デソサミニル)-6-デオキシエリスロノリドB(図８の化合物87)が定量的な収率で得られた。APCI-MSは[M＋H]＋＝544であった。
実施例10
5-O-[1-β-(2-O-メトキシカルボニル-(D)-デソサミニル)]-8,8a-デオキシオレアンドリドおよび5-O-(1-β-(D)-デソサミニル)-8,8a-デオキシオレアンドリド
(図８中の化合物88および89)の調製
(A)    8,8a-デオキシオレアンドリド(12mg)を実施例９(A)に記載のように処理して、5-O-[1-β-(2-O-メトキシカルボニル-(D)-デソサミニル)]-8,8a-デオキシオレアンドリド(収率60％)(図８の化合物88)を得た。APCI-MSは[M＋H]＋＝508であった。
【０１６３】
(B)    段落(A)の5-O-[1-β-(2-メトキシカルボニル-(D)-デソサミニル)]-8,8a-デオキシオレアンドリドを実施例９(B)に記載のように処理して、5-O-(1-β-(D)-デソサミニル)-8,8a-デオキシオレアンドリド(図８の化合物89)を定量的な収率で得た。APCI-MSは[M＋H]＋＝530であった。
【０１６４】
実施例11
5-O-[1-β-(2-メトキシカルボニル-(D)-デソサミニル)]-3,6-ジデオキシ-3-オキソエリスロノリドB(図８の化合物90)および5,11-ビス-(O-[1-β-(2-メトキシカルボニル-(D)-デソサミニル)])-3,6-ジデオキシ-3-オキソエリスロノリドB(図８中の化合物92)の調製
3,6-ジデオキシ-3-オキソエリスロノリドB(6mg)を実施例９(A)に記載のように処理して、5-O-[1-β-(2-O-メトキシカルボニル-(D)-デソサミニル)]-3,6-ジデオキシ-3-オキソエリスロノリドB(図８の化合物90)を収率44％で得た。APCI-MSは[M＋H]＋＝600であった。第2の生成物、5,11-ビス-(O-[1-β-(2-O-メトキシカルボニル-(D)-デソサミニル)])-3,6-ジデオキシ-3-オキソエリスロノリドB(図８中の化合物92)もまたこの混合物から収率26％で単離された；APCI-MSは[M＋H]＋＝815であった。
【０１６５】
実施例12
5-O-(1-β-(D)-デソサミニル)-3,6-ジデオキシ-3-オキソエリスロノリドB(図８の化合物91)および5,11-ビス-O-(1-β-(D)-デソサミニル)-3,6-ジデオキシ-3-オキソエリスロノリドB(図８の化合物93)の調製
実施例11の5-O-[1-β-(2-メトキシカルボニル-(D)-デソサミニル)]-3,6-ジデオキシ-3-オキソエリスロノリドBを実施例９(B)に記載のように処理して、5-O-(1-β-(D)-デソサミニル)-3,6-ジデオキシ-3-オキソエリスロノリドB(図８の化合物91)を定量的な収率で得た。APCI-MSは[M＋H]＋＝542であった。
【０１６６】
実施例11の5,11-ビス(O-[1-β-(2-メトキシカルボニル-(D)-デソサミニル)])-3,6-ジデオキシ-3-オキソエリスロノリドBを実施例９(B)に記載のように処理して、5,11-ビス-O-(1-β-(D)-デソサミニル)-3,6-ジデオキシ-3-オキソエリスロノリドB(図８の化合物93)を定量的な収率で得た。APCI-MSは[M＋H]＋＝699であった。
実施例13
2'-O-メトキシカルボニル-(8R,9S)-10-デオキシ-8,9-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-8-メチルメチマイシン(図８の化合物82)および3,9-ビス-(O-[1-β-(2-メトキシカルボニル-(D)-デソサミニル)])-(8R,9S)-10-デオキシ-8,9-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-8-メチルメトノリド(図８中の化合物84)の調製
(8R,9S)-10-デオキシ-8,9-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-8-メチルメチマイシン(12mg)を実施例９(A)の手順に従って処理して、2'-O-メトキシカルボニル-(8R,9S)-10-デオキシ-8,9-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-8-メチルメチマイシン(図８の化合物82)を得た（34％）。APCI-MSは[M＋H]＋＝544であった。第2の生成物、3,9-ビス-(O-[1-β-(2-O-メトキシカルボニル-(D)-デソサミニル)])-(8R,9S)-10-デオキシ-8,9-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-8-メチルメトノリド(図８中の化合物84)もまたこの混合物から単離された(33％)；APCI-MSは[M＋H]＋＝759であった。
【０１６７】
実施例14
(8R,9S)-10-デオキシ-8,9-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-8-メチルメチマイシン(図８の化合物83)および(8R,9S)-10-デオキシ-8,9-ジヒドロ-9-(1-β-(D)-デソサミニルオキシ)-8-メチルメチマイシン(図８中の化合物85)の調製
実施例13の2'-O-メトキシカルボニル-(8R,9S)-10-デオキシ-8,9-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-8-メチルメチマイシンを実施例９(B)に記載のように処理して、(8R,9S)-10-デオキシ-8,9-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-8-メチルメチマイシン(図８の化合物83)を定量的な収率で得た。APCI-MSは[M＋H]＋＝486であった。
【０１６８】
実施例13の3,9-ビス-(O-[1-β-(2-メトキシカルボニル-(D)-デソサミニル)])-(8R,9S)-10-デオキシ-8,9-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-8-メチルメトノリドを実施例９(B)に記載のように処理して、(8R,9S)-10-デオキシ-8,9-ジヒドロ-9-ヒドロキシ-8-メチルメチマイシン(図８中の化合物85)を定量的な収率で得た(C18固相抽出カートリッジからの溶出は100％メタノールで行った)。APCI-MSは[M＋H]＋＝643であった。
【０１６９】
実施例15
14,15-デヒドロエリスロマイシンA(図９の化合物95)の調製
実施例７の14,15-デヒドロ-6-デオキシエリスロノリドB(0.75mg)のサンプルを0.6mLのエタノールに溶解し、そして滅菌水で3mLに希釈した。この溶液を用いて、100mmR2YE寒天プレート上で30℃で３日間培養したSaccharopolyspora  erythraea  WHM34(eryA)を重層した。乾燥後、プレートを30℃で４日間インキュベートした。寒天を刻み、そして酢酸エチル中の1％トリエチルアミン100mLずつで３回抽出した。抽出物を合わせ、そしてエバポレートさせた。粗生成物を分取HPLC(C18逆相、1%酢酸を含む水−アセトニトリル勾配)で精製した。画分を質量分析で分析し、そして精製14,15-デヒドロエリスロマイシンA(図９の化合物95)を含む画分をプールし、トリエチルアミンで中和し、そしてシロップ状になるまでエバポレートさせた。これを水に溶解し、そして等量の酢酸エチルで３回抽出した。有機抽出物を合わせて、飽和NaHCO3水で１回洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートさせて0.15mgの生成物を得た。APCI-MSは[M＋H]＋＝733であった。
【０１７０】
実施例16
14-オキソ-8,8a-デオキシオレアンドリド(化合物108)および8,8a-デオキシオレアンドリド-14-カルボン酸(化合物109)およびその誘導体の調製
これらの化合物は14,15-デヒドロ-6-デオキシエリスロノリド(deoxyerythonolide)B(図９の化合物94)のオゾン分解によって調製され得る。
【０１７１】
化合物94のメタノール溶液を−40℃に冷却し、そして反応容器の出口に取り付けたKI溶液中にI2の形成が観察されるまで、オゾンを溶液中にバブリングする。窒素ガスでの散布によって、過剰のオゾンを溶液からパージし、化合物94のオゾン化物の溶液を提供する。この溶液をMe2Sで処理して、オゾン化物をアルデヒドである化合物108まで還元する。
【０１７２】
あるいは、オゾン化物をH2O2の添加によって酸化して、対応するカルボン酸である化合物109を提供し得る。
【０１７３】
アルデヒドを還元的アミノ化(例えば、アミンおよびNaBH3CNを用いて軽い酸性条件下で、あるいはオキシムの形成とその後の触媒水素化を通じて)によってアミンに転化する方法は当該分野で周知である。同様に、カルボン酸を化合物110のようなエステルまたはアミドに転化する方法も周知である(例えば、カルボジイミド試薬をアルコールまたはアミンの存在下で用いる活性化によって)。いずれの手順においてもジアミンを用いて、化合物111および112のような二量体のマクロライドを生成する(図６Ｈを参照のこと)。
【０１７４】
実施例17
ジケチドチオエステル合成：(2S,3R)-3-ヒドロキシ-2-メチル-4-ペンテン酸N-アセチルシステアミンチオエステル
全てのジケチドチオエステルを通常の手順によって合成した。ここで(2S,3R)-3-ヒドロキシ-2-メチル-4-ペンテン酸N-アセチルシステアミンチオエステルの合成を例示する。エナンチオ選択的なシン−アルドール縮合をD.A.Evansら、J  Am  Chem  Soc(1992)114:9434〜9453の手順に従って行った。次の操作はD.E.  Caneら、J  Antibiotics(1995)48:647〜651の一般手順に従った。
【０１７５】
(4S)-N-プロピオニル-4-ベンジル-2-オキサゾリジノン(1.17g、5.0mmol)とアクロレイン(0.4mL、11mmol)との間のアルドール縮合による[4S,3(2S,3R)]-4-ベンジル-3-(3-ヒドロキシ-2-メチル-4-ペンテノイル)-2-オキサゾリジノンの合成をD.A.Evansら、J  Am  Chem  Soc(1992)114:9434〜9453により記載されるように行った。SiO2でのクロマトグラフィー(2：1のヘキサン／酢酸エチル)の後に、0.72gの付加物(収率50％)を得た。
【０１７６】
アルドール付加物をt-ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート(0.63mL、2.7mmol)および2,6-ルチジン(0.35mL、3mmol)でTHF中、0℃で処理して、クロマトグラフィー(4：1のヘキサン／酢酸エチル)の後に、O-シリルエーテルを定量的な収率で得た。
【０１７７】
20mLのO-シリルエーテルのTHF溶液を氷上で冷却し、そして2.8mLの水を加え、続いて0.61mLの50%H2O2を加えた。10分後、2mLの215mgのLiOH＊H2O水溶液を加えた。反応をTLCでモニターし、これにより１時間後に完了が明らかにした。1.25gの亜硫酸ナトリウムの8mLの水溶液を加え、そして揮発物をロータリーエバポレーターで減圧下で除去した。得られた水性混合物を20mLずつのCH2Cl2で３回抽出し、次いで、pH2まで6NのHClを用いて酸性化し、そして50mLずつの酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出物を合わせ、ブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートさせて、生成した酸を470mg(70％)の無色油状物として得た。
【０１７８】
この酸を10mLの無水ジメチルホルムアミド中に溶解し、そして氷上で冷却した。ジフェニルホスホリルアジド(1.25mL)およびトリエチルアミン(1.06mL)を加えた後、混合物を２時間、氷上で攪拌した。
【０１７９】
N-アセチルシステアミン(1.5mL)を加え、そして混合物を一晩室温で攪拌した。水で希釈した後、混合物を酢酸エチルで３回抽出した。抽出物を合わせて、ブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートさせて、粗O-シリルチオエステルを得た。クロマトグラフィー(1：1のヘキサン／酢酸エチル)により純粋な生成物(460mg、70％)を得た。
【０１８０】
O-シリルチオエステル(400mg)を25mLのアセトニトリルに溶解し、そして5mLの水を加え、続いて2mLの48％HFを加えた。２時間後、追加の2mLの48％HFを加えた。全体で3.5時間後、反応を飽和NaHCO3を中性のpHまで添加することによって停止した。生成物を３回の酢酸エチルで抽出し、そして合わせた抽出物をブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートさせて、デシル化チオエステルを得た。クロマトグラフィー(酢酸エチル)により150mg(56％)の純粋な(2S,3R)-3-ヒドロキシ-2-メチル-4-ペンテン酸N-アセチルシステアミンチオエステルを得た。APCI-MC：[M＋H]＋＝232。
【０１８１】
【数７】
2008169226.tif 000029
【０１８２】
他のジケチドチオエステルは、アクロレインの代わりに適切なアルデヒドを置き換えることにより調製した。
【０１８３】
実施例18
抗菌活性の測定
抗菌活性は、Bacillus  cereusを試験有機体として用いるディスク拡散アッセイ(disk  diffusion  assay)を用いるか、あるいは液体培養物中での最小阻止濃度(MIC)を、Staphylococcus  pneumoniaeの感受性株および耐性株に対して測定するかのいずれかを使用して測定した。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１Ａ】図1Ａ（配列番号1〜3）は、S.erythraeus由来のエリスロマイシンPKS複合体の図であり、各多官能性タンパク質の機能を示し、そして6-デオキシエリスロノリドB（6dEB）、D-デソサミンおよびＬ-クラジノースの構造も示す。
【図１Ｂ】図1Ｂは、エリスロマイシンＡ〜ＤのPKS後生合成の図を示す。
【図２】図2Ａは、  S.erythraeus由来のDEBS-1の図であり、リンカー領域により分離される機能領域を示し；図2Ｂは、触媒ドメインの完全なレパートリーを有する仮想的なモジュールを示す。
【図３】図3は、完全なエリスロマイシン遺伝子クラスターを含むベクターの図を示す。
【図４】図4は、図3のベクターの構築方法を示す。
【図５】図5は、操作の容易さのために導入される制限部位の位置を伴うエリスロマイシン遺伝子クラスターの図を示す。
【図６Ａ】図6Ａ〜６Ｈは、エリスロマイシンPKS遺伝子クラスターを操作することにより生成されるポリケチドの構造を示す。
【図６Ｂ】図6Ａ〜６Ｈは、エリスロマイシンPKS遺伝子クラスターを操作することにより生成されるポリケチドの構造を示す。
【図６Ｃ】図6Ａ〜６Ｈは、エリスロマイシンPKS遺伝子クラスターを操作することにより生成されるポリケチドの構造を示す。
【図６Ｄ】図6Ａ〜６Ｈは、エリスロマイシンPKS遺伝子クラスターを操作することにより生成されるポリケチドの構造を示す。
【図６Ｅ】図6Ａ〜６Ｈは、エリスロマイシンPKS遺伝子クラスターを操作することにより生成されるポリケチドの構造を示す。
【図６Ｆ】図6Ａ〜６Ｈは、エリスロマイシンPKS遺伝子クラスターを操作することにより生成されるポリケチドの構造を示す。
【図６Ｇ】図6Ａ〜６Ｈは、エリスロマイシンPKS遺伝子クラスターを操作することにより生成されるポリケチドの構造を示す。
【図６Ｈ】図6Ａ〜６Ｈは、エリスロマイシンPKS遺伝子クラスターを操作することにより生成されるポリケチドの構造を示す。
【図７−１】図７Ａ(配列番号1）、7Ｂ（配列番号4）および7Ｃ(配列番号1〜3）は、図3のベクター由来のPKS遺伝子クラスター誘導体の構築を示す。
【図７−２】図７Ａ(配列番号1）、7Ｂ（配列番号4）および7Ｃ(配列番号1〜3）は、図3のベクター由来のPKS遺伝子クラスター誘導体の構築を示す。
【図８】図8は、図６Ａ〜6Ｆのいくつかのポリケチドから得られる抗生物質を示す。
【図９】図9は、不飽和開始部分を含むポリケチド、および対応する抗生物質を示す。
【図１０】図10は、ポリケチドをグリコシル化するために使用される試薬の、抗生物質活性を有するＤ-デソサミン誘導体を調製するための調節を示す。
【図１１】図11は、公知であり以前に生成された12員環マクロライドの構造を示す、
【図１２Ａ】図12Ａおよび12Ｂは、公知であり以前に生成された14員環マクロライドの構造を示す。
【図１２Ｂ】図12Ａおよび12Ｂは、公知であり以前に生成された14員環マクロライドの構造を示す。
【数８−１】
2008169226.tif 000030
【数８−２】
2008169226.tif 000031
【数８−３】
2008169226.tif 000032
【数８−４】
2008169226.tif 000033
【数８−５】
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【数８−６】
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【数８−７】
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【数８−８】
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【数８−９】
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【数８−１０】
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【数８−１１】
2008169226.tif 000040
【数８−１２】
2008169226.tif 000041
【数８−１３】
2008169226.tif 000042
【数８−１４】
2008169226.tif 000043
【図１Ａ】
2008169226.tif 000045
【図１Ｂ】
2008169226.tif 000046
【図２】
2008169226.tif 000047
【図３】
2008169226.tif 000048
【図４】
2008169226.tif 000049
【図５】
2008169226.tif 000050
【図６Ａ】
2008169226.tif 000051
【図６Ｂ】
2008169226.tif 000052
【図６Ｃ】
2008169226.tif 000053
【図６Ｄ】
2008169226.tif 000054
【図６Ｅ】
2008169226.tif 000055
【図６Ｆ】
2008169226.tif 000056
【図６Ｇ】
2008169226.tif 000057
【図６Ｈ】
2008169226.tif 000058
【図７−１】
2008169226.tif 000059
【図７−２】
2008169226.tif 000060
【図８】
2008169226.tif 000061
【図９】
2008169226.tif 000062
【図１０】
2008169226.tif 000063
【図１１】
2008169226.tif 000064
【図１２Ａ】
2008169226.tif 000065
【図１２Ｂ】
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