(57)【要約】      （修正有）【課題】固相担体または高分子に固定化しやすい糖鎖化合物の提供。【解決手段】アジド基とアルキン基との反応によるトリアゾール環を有するような糖鎖化合物であって、さらに所望の官能基を末端に導入した糖鎖化合物。具体的には、糖鎖末端にメルカプト基あるいはアミノ基を持つβ−ラクトシドが例示される。本糖鎖化合物は、固相担体の種類によらず、固定化が容易で、糖鎖の分析あるいはウィルス、毒素、微生物を除去する手段として用いられる。【選択図】図１
2008231014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：（G1・・・Gn）−Ｌ−Ｘ［式中、G1、・・Gnは、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Lは、−O−（CH2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−からなる群より選択される１つ以上の連結基であり；nは２〜１００の整数であり；mは８〜２０の整数であり、；Ｘは、トリアゾール環を含み、末端に反応性基を有するスペーサーを表わす。］で示される糖鎖化合物。
【請求項２】
前記Xが、
【化１】
2008231014.tif 000005
で表わされる構造（式中、Ｒは、末端に反応性基を有する任意のスペーサーを意味する）である、請求項1記載の糖鎖化合物。
【請求項３】
ｍが１２である、請求項１または２記載の糖鎖化合物。
【請求項４】
前記Rに含まれる末端の反応性基が、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−OH、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−F、および−Iからなる群より選択される少なくとも１つ、２つ以上の組合せ、または同種および／または異種の2つ以上の組合せである、請求項１から３までのいずれかに記載の糖鎖化合物。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれかに記載の糖鎖化合物を製造する方法であって、(G1)x(G2)y(G3)z-L-Ｎ3［式中、G1、G2及びG3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり，互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Ｌは−O−（CH2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−からなる群より選択される１つ以上の連結基であり；x、y、及びzは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり；mは８〜２０の整数であり；ただしｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない］で示される糖鎖プライマーのアジド基を、末端にアルキンを有し、反対側末端に反応性基を有する化合物の該アルキン部分と反応させる工程を含む方法。
【請求項６】
請求項１から４までのいずれかに記載の糖鎖化合物を製造する方法であって、式（Ｉ）：（G1・・・Gn）−Ｌ−Ｎ３［式中、G1、・・Gnは、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Lは、−O−（CH2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−からなる群より選択される１つ以上の連結基であり；nは２〜１００の整数であり；mは８〜２０の整数である］で示される化合物のアジド基を、末端にアルキンを有し、反対側末端に反応基を有する化合物のアルキン部分と反応させる工程を含む方法。
【請求項７】
前記式（Ｉ）：（G1・・・Gn）−Ｌ−Ｎ３で示される化合物を、(G1)x(G2)y(G3)z-L-Ｎ3［式中、G1、G2及びG3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり，互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Ｌは−O−（CH2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−からなる群より選択される１つ以上の連結基であり；x、y、及びzは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり；nは、８〜２０の整数である。ただしｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない］で示される糖鎖プライマーを動物細胞に加えて培養することによって得る工程をさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記末端にアルキンを有する化合物が、アルキンを有する末端とは反対の末端に、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−OH、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−F、および−Iからなる群より選択される少なくとも１つ、２つ以上の組合せ、または同種および／または異種の2つ以上の組合せである反応性基を有する、請求項５から７までのいずれかに記載の糖鎖化合物を製造する方法。
【請求項９】
前記アルキンが、プロパルギル基である請求項５から８までのいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から４までのいずれかに記載の糖鎖化合物におけるＸ中の末端の反応性基を、固相担体または高分子に結合した反応性基と反応させる工程を含む、固定化糖鎖体または高分子化糖鎖体の製造方法。
【請求項１１】
前記糖鎖化合物におけるＸ中の末端の反応性基が、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−OH、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−F、および−Iからなる群より選択される少なくとも１つ、２つ以上の組合せ、または同種および／または異種の2つ以上の組合せである、請求項１０記載の固定化糖鎖体または高分子化糖鎖体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の低分子化合物あるいは高分子化合物などの担体、或いは固相担体へ、容易に付加することができる新規糖鎖化合物、その製造方法、およびその糖鎖化合物を用いた固定化糖鎖体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は構造が複雑であり、同じ生体分子であるDNAやタンパク質よりも産業上の利用の為の開発が遅れている。しかし、近年、糖鎖の研究が急速に進展し、産業上の利用への模索も進められてきている。特に、細胞分化、ガン化、免疫反応等への糖鎖の関わりについて新しい事実が明らかにされつつある。例えば、細胞表層における糖鎖は、タンパク質や脂質と相互作用することによって、生体内における細胞分化、ガン化、免疫反応等の重要なプロセスに関与している。また、糖鎖は、細胞表層における細胞認識、接着、細胞間のシグナル伝達において重要な役割を担っていることも明らかになってきている。
【０００３】
糖鎖の生体内における様々な重要なプロセスにおけるメカニズムを分子レベルで解析しようと、糖鎖アレイが利用されている。例えば、24種類の糖脂質をブチルシランでコーティングしたスライドガラス上にスポットし、糖脂質の脂質部分とガラス表面の疎水的相互作用を利用して固定化した糖脂質アレイがタカラバイオ株式会社より販売されている。
【０００４】
このような技術において、糖鎖を固定化する方法としては、糖鎖を非共有結合によって固相担体に固定化する方法が知られているが、安定して固定することができず、洗浄工程により糖鎖が洗い流されてしまう可能性がある。また、共有結合によって糖鎖を固相担体に固定化する手法として、ディールス・アルダー反応によって固定化する手法やマイケル付加反応によって固定化する方法も知られている。しかしながら、タンパク質との非特異的吸着が大きいことや、基板上のチオールの酸化による反応点が減少するといった問題点を有している。
【０００５】
また、特許文献１には、糖鎖がスペーサー基を介してチオアルキル化によって固相担体に結合している糖鎖アレイを作製する方法が開示されている。しかし、この方法で糖鎖を、スペーサー基を介してチオアルキル化する工程は煩雑である。
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−７８４１８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在用いられている糖鎖を固定化する方法では、糖鎖を修飾する工程が煩雑という問題がある。従って特異的でかつ作成が容易な固定化糖鎖体の開発が強く望まれている。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、検出対象と特異的に相互作用することができ、かつ固定化糖鎖体を容易に作成するのに役立つ糖鎖化合物、その製造方法、およびその糖鎖化合物を用いた固定化糖鎖体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、アジド基を有した糖鎖を、クリックケミストリーライゲーション反応によって、アルキンと種々の官能基とをそれぞれ末端に有する化合物と結合させることで、種々の官能基を有する糖鎖化合物が得られることを見出し、以下に示す、糖鎖化合物、その作成方法、およびその応用により上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１０】
すなわち、本発明は、式（Ｉ）：（G1・・・Gn）−Ｌ−Ｘ［式中、G1、・・Gnは、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Lは、−O−（CH2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−からなる群より選択される１つ以上の連結基であり；nは２〜１００の整数であり；mは８〜２０の整数であり、；Ｘは、トリアゾール環を含み、末端に反応性基を有するスペーサーを表わす。］で示される糖鎖化合物を提供する。
【００１１】
上記Xは、
【化２】
2008231014.tif 000003
で表わされる構造（式中、Ｒは、末端に反応性基を有する任意のスペーサーを意味する）であり得る。
【００１２】
上記ｍは１２でありうる。
【００１３】
上記Rに含まれる末端の反応性基は、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−OH、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−F、および−Iからなる群より選択される少なくとも１つ、２つ以上の組合せ、または同種および／または異種の2つ以上の組合せであり得る。
【００１４】
本発明はまた、上記糖鎖化合物を製造する方法であって、(G1)x(G2)y(G3)z-L-Ｎ3［式中、G1、G2及びG3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり，互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Ｌは−O−（CH2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−からなる群より選択される１つ以上の連結基であり；x、y、及びzは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり；ただしｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない］で示される糖鎖プライマーのアジド基を、末端にアルキンを有し、反対末端に反応性基を有する化合物のアルキン部分と反応させる工程を含む方法を提供する。
【００１５】
本発明ではさらに、上記糖鎖化合物を製造する方法であって、式（Ｉ）：（G1・・・Gn）−Ｌ−Ｎ３［式中、G1、・・Gnは、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Lは、−O−（CH2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−からなる群より選択される１つ以上の連結基であり；nは２〜１００の整数であり；mは８〜２０の整数である］で示される化合物のアジド基を、末端にアルキンを有し、反対末端に反応性基を有する化合物のアルキン部分と反応させる工程を含む方法を提供する。
【００１６】
上記式（Ｉ）：（G1・・・Gn）−Ｌ−Ｎ３で示される化合物は、(G1)x(G2)y(G3)z-L-Ｎ3［式中、G1、G2及びG3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり，互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Ｌは−O−（CH2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−からなる群より選択される１つ以上の連結基であり；x、y、及びzは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり；nは、８〜２０の整数である。ただしｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない］で示される糖鎖プライマーを動物細胞に加えて培養することによって得られた化合物であり得る。
【００１７】
上記末端にアルキンを有する化合物は、アルキンを有する末端とは反対の末端に、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−OH、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−F、および−Iからなる群より選択される少なくとも１つ、２つ以上の組合せ、または同種および／または異種の2つ以上の組合せである、反応性基を有する化合物であり得る。
【００１８】
上記アルキンは、プロパルギル基であり得る。
【００１９】
本発明では、さらに、上記いずれかの糖鎖化合物におけるＸ中のＲにおける末端の反応性基を、固相担体に結合した反応性基と反応させる工程を含む、固定化糖鎖体の製造方法を提供する。
【００２０】
上記Ｘ中のＲにおける末端の反応性基は、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−OH、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−F、および−Iからなる群より選択される少なくとも１つ、２つ以上の組合せ、または同種および／または異種の2つ以上の組合せである、反応性基を有する化合物であり得る。
【発明の効果】
【００２１】
以上のように、本発明を適用することによって、迅速で簡便でかつ特異的な固定化糖鎖体を作成する為の糖鎖化合物、その作成方法が得られる。なお、糖鎖化合物に付加している官能基は、糖鎖の還元末端に繋がっているアルキル鎖の末端に存在することにより、糖鎖そのものの機能に影響しにくい特徴を有する。また、本発明は、ポリマーやデンドリマーなどへの固定化により、高分子化することによる糖鎖化合物の利用や、フィルター等に固定化することにより毒素・ウィルス等の有害な物質を除去する血液浄化システムの吸着剤としての利用、また、固相担体と結合して糖鎖アレイやウィルス又は細菌毒素の検出基盤を作製する上で非常に有用であると考えられる。また、糖鎖付加型新規機能性物質の作製や、ELISA法などの免疫学的方法やプラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス測定法などの糖鎖との相互作用を特定するための固定化糖鎖体を作製するために有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２３】
本発明の糖鎖化合物は、式（Ｉ）：（G1・・・Gn）−Ｌ−Ｘで表わされる。ここで、式中、G1、・・GnのGは、それぞれ独立して異なるまたは同じ環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合している。糖鎖は、最低2個の単糖残基又はその誘導体を含み、残基数の上限はないが、固体に固定化する為の応用を考えると、残基数１００個までで構成されることが好ましい。従って、単糖残基の数を表すnは、２から１００までのいずれかの整数が好ましい。単糖残基の種類は特に制限はないが、ペントース及びヘキソースを使用するのが好ましい。またアルドース、ケトースのいずれも使用することができる。
【００２４】
式中Lは、−O−（CH2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−からなる群より選択される１つ以上の連結基でありここで、mは８〜２０の整数である。限定はされないが、好ましくは、mは８である。
【００２５】
式中のXは、トリアゾール環を含み、末端に反応性基を含むスペーサーを表わす。好ましくは、Xは、
【化３】
2008231014.tif 000004
で表わされる構造である。ここで、Ｒは、末端に反応性基を有する任意の化合物を意味する。
【００２６】
ここで、Rの末端の反応性基は、特に制限はされないが、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−OH、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−F、および−Iからなる群より選択される少なくとも１つ、２つ以上の組合せ、または同種および／または異種の2つ以上の組合せであり得る。
【００２７】
本発明に用いられる糖鎖は、公知の方法で人工的に合成して作成することもでき、特に限定はされないが、好ましくは動物細胞を糖鎖が得られるような条件下にて培養することで得られる。またはその為に動物細胞の培養培地に加えられる糖鎖プライマー自体が、本発明の糖鎖として用いられる。動物細胞は特に限定されず、所望の糖鎖化合物の種類に応じて様々な動物細胞が用いられ得る。動物細胞の例としては、ヒト由来、マウス由来、サル由来、ラット由来などの哺乳動物細胞が挙げられ、特にＢ１６マウスメラノーマ細胞、ラットＰＣ１２細胞、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞、ラットＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ヒトＭＯＬＴ−４細胞、ヒトＨＬ−６０細胞、サル腎臓由来ベロ細胞などが好適に用いられ得る。培養は、通常の動物細胞の培養条件に従って行う。
【００２８】
糖鎖化合物が得られるような条件とは、例えば、上記の動物細胞を、室温から４５℃までの温度の間で１時間から７０時間までの間の時間でＤＭＥＭ／Ｆ１２などの培養培地で前培養した後、糖鎖プライマーを添加した培地に置換してさらに培養を行い、糖鎖伸長反応を行うことなどである。
【００２９】
ここで、糖鎖プライマーは、用いられる細胞種、所望の糖鎖構造により任意に選択することができる。好ましい糖鎖プライマーの例としては、式（Ｉ）：（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)z−Ｌ−Ｎ3で表される化合物が挙げられる。ここで、式中、Ｇ1、Ｇ2及びＧ3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2)m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−から選択される連結基であり；ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり、好ましくは０〜５、さらに好ましくは０から３であり、ｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない。また、mは、８〜２０の整数であり、好ましくは８〜１６、特に好ましくは１２である。単糖としては、限定はされないが、ペントース及びヘキソースを使用するのが好ましい。またアルドース、ケトースのいずれも使用することができる。
【００３０】
このような糖鎖プライマーを各種細胞の培地に添加して細胞を培養すると、細胞は、プライマーを取り込み、その糖鎖部分に更に糖を付加してグリコシル化し、その糖付加生成物を細胞内には蓄積せずに細胞外に分泌する。付加される糖は、細胞により異なる。
【００３１】
得られる細胞培養物または細胞培養物から細胞を除いた上清は、糖鎖プライマーから伸長して得られた生成物である糖鎖を含有する。この細胞培養物または細胞培養物の上清をそのまま、あるいは上清を固体吸着剤等と接触させるなどして濃縮および／または精製工程に供した後に、本発明の糖鎖化合物の作成に使用することができる。
【００３２】
本発明の糖鎖化合物は、(G1)x(G2)y(G3)z-L-Ｎ3［式中、G1、G2及びG3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり，互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Ｌは上述の通りであり；x、y、及びzは、それぞれ独立して０〜１０の整数であるが、ｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない］で示される糖鎖プライマーのアジド基を、末端にアルキンを有する化合物のアルキン部分と反応させる工程を含む方法によって得ることができる。あるいは、本発明の糖鎖化合物は、式（Ｉ）：（G1・・・Gn）−Ｌ−Ｎ３［式中、G1、・・Gnは、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；L、ｎは上述の通りである］で示される化合物のアジド基を、末端にアルキンを有する化合物のアルキン部分と反応させる工程を含む。アルキン基の例としてはプロパルギル基が好ましい。
【００３３】
また、末端にアルキンを有する化合物は、アルキン部分とは反対の末端に、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−OH、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−F、および−Iからなる群より選択される少なくとも１つ、２つ以上の組合せ、または同種および／または異種の2つ以上の組合せである、反応性基を有することが好ましい。例えば、アジド基末端を有する糖鎖と市販の２−プロピニルアミンを反応させればアミノ基を末端に有する糖鎖が生成され、プロパギルアルコールを用いれば水酸基、ベンゼンスルホン酸プロパルギルを用いればスルホン酸基、臭化プロパルギルや塩化プロパルギルを用いればハロゲン基を末端に有する糖鎖が生成される。また、市販されていない場合でも、プロパルギル基を有する化合物と、導入したい目的の官能基を有する化合物を縮合反応等で、目的の官能基を導入することもできる。例えば、図１に示すように、３−メルカプトプロピオン酸（化合物１）と、２−プロピニルアミン（化合物２）との縮合反応により、化合物３が得られ、この化合物によりチオール基の導入が可能となる。類似の方法により、糖鎖化合物に様々な官能基の導入が可能となる。
【００３４】
アジド基とアルキン基との反応は、クリックケミストリーライゲーション反応において行い得る。Ｃｕ（ＰＰｈ３）３Ｂｒを触媒として用いる方法や、電子線照射による方法等が知られている。
【００３５】
より詳細には、トリアゾール環が形成されるように、還流溶媒（トルエン等）中において生成物がもたらされるのに充分な時間（例えば、３０〜４０時間）にてアジド基とアルキン基とを反応させる。反応混合物に触媒（銅等）を添加することによって、反応を室温にて水性溶媒中で進行させ、トリアゾール環成分を得ることができる。Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元するための還元剤の存在下で触媒量のＣｕ（ＩＩ）を添加することによって触媒される。好ましい還元剤には、アスコルビン酸塩、金属銅、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ1、グルタチオン、システイン、Ｆｅ2+、Ｃｏ2+、および印加電位が含まれる。さらに好ましい還元剤には、Ａｌ、Ｂｅ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、ＮｉおよびＺｎから成る群より選択される金属が含まれる。
【００３６】
アジド基とアルキン基とのクリックケミストリーライゲーション反応は、金属銅と接触している溶液中で反応を行うことによっても触媒され得る。金属銅は、そのクリックケミストリーライゲーション反応に対する触媒作用に直接的または間接的に寄与する。好ましい方式では、前記溶液は、水溶液である。この場合アジド基を有する糖鎖とアルキン基を有する反応化合物とは、等モル量で存在しうる。
【００３７】
あるいは、アジド基とアルキン基とのクリックケミストリーライゲーション反応は、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｄ、Ｚｒ、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｉ、ＲｈおよびＷから成る群より選択される金属イオンを有する触媒量の金属塩を添加することにより触媒される。このようなクリックケミストリーライゲーション反応は、前記金属イオンを触媒活性形に還元するための還元剤の存在下で行われる。好ましい還元剤には、アスコルビン酸塩、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ1、グルタチオン、システイン、Ｆｅ2+、Ｃｏ2+、印加電位、ならびにＡｌ、Ｂｅ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、ＮｉおよびＺｎから成る群より選択される金属が含まれる。
【００３８】
本発明の糖鎖化合物は、様々な固相担体に結合して、固定化糖鎖体の製造に用いられる。その場合に用いられる固相担体としては、本発明のアジド基とアルキン基との反応により得られる基を介した糖鎖の結合を可能とするものであれば、特に制限なく用いることができる。このような固相担体としては、例えば、フィルターペーパーなどの紙からなる固相担体、市販のメンブレンフィルター、ガラス固相担体、シリコン固相担体、その他の高分子化合物を含む固相担体、金、銀、プラチナ、鉄などの金属を含む固相担体等が挙げられる。固相担体としては、本発明の固定化糖鎖体の作成を容易にするために、水酸基、カルボキシル基、アミノ基等の官能基を導入するための官能基を有していること、あるいは、アミノ基などの官能基が導入されたガラス固相担体、Au-S結合により官能基の導入が可能である金固相担体等を用いることが好ましい。例えば、フィルターペーパーは水酸基を有しており、その水酸基を用いて糖鎖が有する反応基と反応しうる基を有するように固相担体を改変することができる。また、末端あるいは側鎖部分に反応性基を有する高分子やデンドリマーも糖鎖化合物の固定、すなわち高分子化に用いることが可能である。
【００３９】
より具体的に、本発明の糖鎖化合物の製造方法およびそれを固相担体に結合して、固定化糖鎖体を製造する方法を例示しながら説明する。
【００４０】
本発明においては、クリックケミストリーライゲーション反応により、糖鎖を、アジド基とアルキン基とを結合させて得られるトリアゾール環を有し反応性の基を末端に有するように改変した後、固相担体と結合させる。
【００４１】
糖鎖は、動物細胞と糖鎖プライマーとを一緒に培養することで得ることができる。この糖鎖をそのまま、あるいは固体吸着剤等と接触させるなどして濃縮および／または精製工程に供した後に、糖鎖を修飾する。例えば、アジド基末端を有する糖鎖と市販の２−プロピニルアミンをクリックケミストリーライゲーション反応にて反応させれば、アミノ基を末端に有する糖鎖が生成される。
【００４２】
一方、固相担体は、例えば水酸基を有するフィルターペーパーを用い得る。このフィルターペーパーの水酸基部分を反応させて、例えばカルボキシル基末端を有する固相担体とし得る。カルボキシル基末端の導入方法は特に限定はされないが、フィルターペーパーの水酸基とハロゲン化酢酸とを反応させることによってなされ得る。
【００４３】
このようにして得られた固相担体のカルボキシル基と糖鎖のアミノ基とを反応させて、アミド結合により糖鎖を固相担体に結合させる。
【００４４】
あるいは、カルボキシル基を有するレーヨン（商品名：パラモス、ダイワボウレーヨン製造）を固相担体として用いることにより、レーヨンのカルボキシル基に、糖鎖に結合しているアミノ基を直接反応させることができ、アミド結合により糖鎖を固定化した固相担体が得られる。
【００４５】
本発明の糖鎖化合物は、単一の種類又は複数の種類の糖鎖を精製して、固定化に用いてもよいし、複数の種類の糖鎖が含まれる状態で、未精製のまま固定化させることも可能である。単一種類の糖鎖を精製する場合、固定化糖鎖体を毒素、ウィルス、あるいはバクテリア等の吸着材として用いることができる。複数の種類の糖鎖を固定化することにより糖鎖アレイ等を作製することも可能である。また、未精製での糖鎖を使用することで、例えば細胞由来の糖鎖化合物から機能性糖鎖をスクリーニングすることも可能である。本発明の糖鎖化合物から得られた固定化糖鎖体と様々な物質を接触させて、糖鎖や糖鎖と相互作用する物質の分析および／または吸着などを行うことが可能である。糖鎖と相互作用する物質には、限定はされないが、ウィルス、微生物、原虫、植物細胞、動物細胞などがある。ここでいうウィルスには、病原性を有するインフルエンザウィルス、ＨＩＶウィルス、肝炎ウィルス、ＳＡＲＳウィルスなどの他、様々なＤＮＡウィルス、ＲＮＡウィルス、レトロウィルスが含まれる。また、微生物には、細菌、真菌、放線菌などが含まれる。また、毒素には、限定はされないが、生物由来の有機化合物である、アコニチン、イボテン酸、ムッシモール、エキサイトトキシン、エラブトキシン、クラ−レ、コルヒチン、サキシトキシン、シガトキシン、テタヌストキシン、テトロドトキシン、ドウモイ酸、パリトキシン、ボツリヌストキシン、リシン、シクトキシン、トリゴネリン、グラミシジン、ニコチンなど、合成物の有機化合物である、ホスゲン、サリン、ソマン、タブン、VX、ダイオキシン、トルエン、ビフェニル、モノフルオロ酢酸、塩化メチル水銀、四エチル鉛など、および有毒生物の棘や牙による毒液由来のものがある。その他単体（フッ素 (F2)、オゾン（酸素の同素体、O3）、リン（白リン・黄リン、P4）セレン (Se)、ヒ素 (As)カドミウム (Cd)、水銀 (Hg)、鉛 (Pb)、タリウム (Tl) など プルトニウム (Pu)、ポロニウム (Po) など）、無機化合物（フッ化水素 (HF)、シアン化水素 (HCN)、硫化水素 (H2S)、一酸化炭素 (CO)など、シアン化カリウム（青酸カリ、KCN）、シアン化ナトリウム (NaCN)、水酸化ナトリウム（苛性ソーダ、NaOH）、アジ化ナトリウム (NaN3)など 塩化水銀(II)（昇汞、HgCl2）、二クロム酸カリウム (K2Cr2O7)、塩化金酸 (HAuCl4)、硝酸銀 (AgNO3) など）が挙げられる。
【００４６】
以下に、本発明の糖鎖化合物の具体例を実施例の態様で示すが、本発明はこれに限定されない。
【実施例】
【００４７】
（実施例１）１２−アジドドデシル  β−ラクトシドを、官能基を導入するターゲットとなる糖鎖化合物として用い、クリックケミストリーライゲーション反応によりチオール基の導入を行った。図１に示すスキームに従った。
【００４８】
１０６．１４ｍｇ（１ｍｍｏｌ）の３−メルカプトプロピオン酸（図１の化合物１）、５５．０８ｍｇ（１ｍｍｏｌ）の２−プロピニルアミン（図１の化合物２）、及び３００ｍｇ（１．０８ｍｍｏｌ）のＤＭＴ−ＭＭを１０ｍｌの水に溶解し、室温にて一晩反応した。
生成した沈殿物を、遠心分離により回収した後、水で十分洗浄した。その後、凍結乾燥させ、２０．２ｍｇの粉末（図１の化合物３）を得た。薄層クロマトグラフィーにより、原料の消失と新規なスポットが１スポットであることを確認した。
【００４９】
２０ｍｇ（０．０３６ｍｍｏｌ）の１２−アジドドデシル  β−ラクトシド（図１の化合物４）、５ｍｇ（０．０３５ｍｍｏｌ）の上記で得られた化合物３、２．６ｍｇ（０．０２ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、及び０．６ｍｇ（１．２μｍｏｌ）のＣｕ（ＰＰｈ３）３Ｂｒを２００μｌのテトラヒドロフランに溶解し、室温にて４８時間、反応させた。反応後、空気を噴き込むことにより溶媒を除去し、１００μｌのジメチルスルホキシドで溶解後、５ｍｌの水を加え再沈殿させ、遠心分離により沈殿物を回収した。更に、得られた沈殿物を水で十分に洗浄した後、凍結乾燥させ２２．５ｍｇの粉末（図１の化合物５と未反応の化合物４の混合物）を得た。
【００５０】
上記の操作により得られた、図１の化合物５と未反応の化合物４の混合物について、ＤＴＮＢ法によりチオール基の定量により、チオール基の導入率を測定したところ、４４．３％であった。
【００５１】
得られた化合物をＮＭＲにより分析した結果を図３に示すが、原料である１２−アジドドデシル  β−ラクトシド由来のピーク以外に、クリックケミストリーライゲーション反応によって生じ得る新規なピークを検出できたことから、クリックケミストリーライゲーション反応により結合し、末端にチオール基を有する所望の糖鎖化合物できたことが確認できた。
【００５２】
（実施例２）１２−アジドドデシル  β−ラクトシドを、官能基を導入するターゲットとなる糖鎖化合物として用い、２−プロピニルアミンをクリックケミストリーライゲーション反応により連結させることによりアミノ基の導入を行った。更に、ポリアクリル酸に縮合反応させることにより、高分子化を行った。
【００５３】
具体的には、以下のようにして、１２−アジドドデシル  β−ラクトシドへのアミノ基の導入、更にはポリアクリル酸への縮合反応による高分子化を行った。スキームについては、図２に示す。
【００５４】
アミノ基の導入
１００ｍｇ（０．１８１ｍｍｏｌ）の１２−アジドドデシル  β−ラクトシド（図２の化合物４）、１０ｍｇ（０．１８２ｍｍｏｌ）の２−プロピニルアミン（図２の化合物２）、１３ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピニルエチルアミン、及び３ｍｇ（０．００６ｍｍｏｌ）のＣｕ（ＰＰｈ３）３Ｂｒを１ｍｌのテトラヒドロフランに溶解し、室温で４８時間、反応させた。その後、ガスを吹き込むことにより溶媒を除去した。残った乾固物を５００ｕｌのジメチルスルホキシドに溶解した後、１２ｍｌの水を加え糖鎖化合物を再沈殿させた。沈殿物を遠心分離により回収した後、十分に水で洗浄した、凍結乾燥させ、３４．５ｍｇの粉末（図２の化合物６と未反応の化合物４の混合物）を得た。薄層クロマトグラフィーにより、原料である２−プロピニルアミンの消失と新規スポットがニンヒドリン反応により呈色することを確認した。
【００５５】
得られた化合物をＮＭＲにより分析した結果を図４に示すが、原料である１２−アジドドデシル  β−ラクトシド由来のピーク以外に、クリックケミストリーライゲーション反応によって生じ得る新規なピークを検出できたことから、クリックケミストリーライゲーション反応により所望の糖鎖化合物が生成されたことが確認された。
【００５６】
ポリアクリル酸への固定化による高分子化
以上の操作で得られたアミド基を導入した１２−アジドドデシル  β−ラクトシド（図２の化合物６）を含む粉末  ９.1ｍｇとポリアクリル酸（図２の化合物７）５４０ｍｇを６００μｌのN,N‐ジメチルホルムアミドに溶解し、１５．２ｍｇ（４０μｍｏｌ）のＨＡＴＵを加え、一晩反応させた。反応後、空気を噴く込むことにより溶媒を除去し、１０ｍｌの水で溶解後、遠心分離し上清を回収した。次に、回収した上清を凍結乾燥させ、１８．７ｍｇの粉末を得た。得られた粉末をＮＭＲにより分析したところ、水溶性であるポリアクリル酸由来のピークに加え、水に不溶性の１２−アジドドデシル  β−ラクトシド由来のピークを検出できたことにより、ポリアクリル酸への固定化による高分子（図２の化合物８）ができたことを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】糖鎖へのチオール基導入のスキームを示す。
【図２】糖鎖へのアミノ基導入のスキームを示す。
【図３】チオール基を導入した糖鎖化合物のNMRのチャートを示す。
【図４】アミノ基を導入した糖鎖化合物のＮＭＲのチャートを示す。
【図１】
2008231014.tif 000006
【図２】
2008231014.tif 000007
【図３】
2008231014.tif 000008
【図４】
2008231014.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月5日(2007.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2008231014.tif 000010