(57)【要約】【課題】            高い保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、抗炎症効果、美白効果、及び痩身効果を発揮する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤並びに皮膚外用剤を提供する。【解決手段】      ハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤並びにハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤。ハマベンケイソウ属植物としては、ハマベンケイソウを用いることが好ましい。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する、皮膚外用剤。
【請求項２】
ハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する、保湿剤。
【請求項３】
ハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する、抗老化剤。
【請求項４】
ハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する、抗酸化剤。
【請求項５】
ハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する、抗炎症剤。
【請求項６】
ハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する、美白剤。
【請求項７】
ハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する、痩身剤。
【請求項８】
ハマベンケイソウ属植物ハマベンケイソウの抽出物を有効成分として含有する、皮膚外用剤。
【請求項９】
ハマベンケイソウ属ハマベンケイソウの抽出物を有効成分として含有する、保湿剤。
【請求項１０】
ハマベンケイソウ属ハマベンケイソウの抽出物を有効成分として含有する、抗老化剤。
【請求項１１】
ハマベンケイソウ属ハマベンケイソウの抽出物を有効成分として含有する、抗酸化剤。
【請求項１２】
ハマベンケイソウ属ハマベンケイソウの抽出物を有効成分として含有する、抗炎症剤。
【請求項１３】
ハマベンケイソウ属ハマベンケイソウの抽出物を有効成分として含有する、美白剤。
【請求項１４】
ハマベンケイソウ属ハマベンケイソウの抽出物を有効成分として含有する、痩身剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、抗炎症効果、美白効果及び痩身効果を発揮する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤並びに皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、皮膚の美観を保つことに対する女性の関心は非常に高く、シワ、シミ、タルミなどは女性の肌に対する悩みの上位に常に位置する。これらの悩みのうち、シワやタルミは、加齢等による真皮線維芽細胞の機能低下や、それに伴うコラーゲンやエラスチン等の真皮マトリックスの減少や変性、さらには紫外線等の外来ストレスによる酸化障害などが重要な要因となっている。また、もう一方の大きな悩みである、皮膚の色黒は一部不明な点もあるがホルモンの異常や日光の紫外線の刺激によるメラニン色素の産生が原因であり、その中でも、シミやソバカスはメラニン色素が異常沈着することが、その要因である。
【０００３】
これまでの皮膚外用剤の分野では、上述の皮膚の美観を損なうような諸症状を防止、或いは改善するために、さまざまな細胞賦活剤や抗酸化剤、メラニン産生抑制剤の検索及び配合検討が成されてきた。
【０００４】
例えば、細胞賦活剤としては、ポンカンのエッセンス（特許文献１参照）、ツリガネニンジン属、クサギ及びそれらの抽出物（特許文献２参照）、有機溶媒によるクロレラ抽出物（特許文献３参照）等、抗酸化剤としては、キク科ヘテロテカ属植物抽出物（特許文献４参照）やカユンアンギンの抽出物（特許文献５参照）等、さらにメラニン産生抑制剤としては、ホンダワラの抽出物（特許文献６参照）、ショウガ属植物の抽出物（特許文献７参照）等が知られている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−１３１０４５号公報
【特許文献２】特開２０００−１７８１９８号公報
【特許文献３】特開平１１−３３５２９３号公報
【特許文献４】特開平１１−１８０８８６号公報
【特許文献５】特開平１０−１８２４１３号公報
【特許文献６】特開平１０−３３０２２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
天然由来成分は、様々な薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物や菌類などが皮膚外用剤や飲食品などの分野に幅広く応用されている。しかし、天然由来成分の中には未だその効果が知られていないものも数多く存在し、優れた保湿作用、細胞賦活作用、抗酸化作用、美白作用などを有する有効成分の開発が期待されていた。本発明は、このような有効成分を見出すためになされたものであり、皮膚外用剤や飲食品などの分野に幅広く応用が可能な保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、皮膚外用剤や飲食品などの分野に幅広く応用が可能な保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤を見出すために、天然由来の種々の物質について検討を行った。その結果、ハマベンケイソウ属植物の抽出物に優れた、保湿作用、抗老化作用、抗酸化作用、抗炎症作用、美白作用及び痩身作用を見出し、さらに検討を重ね、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、ハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤並びにハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤及び痩身剤を提供するものである。
【０００８】
さらに本発明は、ハマベンケイソウ属植物ハマベンケイソウの抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤並びに、ハマベンケイソウ属植物ハマベンケイソウの抽出物を有効成分として含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、優れた効果を有する皮膚外用剤、保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の原料として用いられる植物であるハマベンケイソウ属植物（Mertensia  Rnth.は、ムラサキ科（Borahinaceae）に属する双子葉植物で、北半球の亜寒帯・寒帯地域に分布し、約４０種が知られている。本発明においてハマベンケイソウ属植物としては、ハマベンケイソウ（Mertensia maritima (L.) S. F. Gray subsp. asiatica Takeda ）、エゾルリソウ（Mertensia pterocarpa (Turcz.) Tatew. et Ohwi var. yezoensis Tatew. et Ohwi）、バージニアブルーベルズ（Mertensia virginica (L.) Pers. ex Link）、アルパインブルーベルズ（Mertensia alpina (Torr.) G. Don）、アスペンブルーベルズ（Mertensia arizonica Greene）、ビューティフルブルーベルズ（Mertensia bella Piper）、ショートスタイルブルーベルズ（Mertensia brevistyla S. Wats. ）、アイダホブルーベルズ（Mertensia campanulata A. Nels. ）、トールフリンジドブルーベルズ（Mertensia ciliata (James ex Torr.) G. Don 、Mertensia ciliata (James ex Torr.) G. Don var. ciliata 、Mertensia ciliata (James ex Torr.) G. Don var. stomatechoides (Kellogg) Jepson ）、ドルモンズブルーベルズ（Mertensia drummondii (Lehm.) G. Don ）、フランシスカンブルーベルズ（Mertensia franciscana Heller）、ロッキーマウンテンブルーベルズ（Mertensia humilis Rydb.）、プレイリーブルーベルズ（Mertensia lanceolata (Pursh) DC.、Mertensia lanceolata (Pursh) DC. var. brachyloba (Greene) A. Nels. 、Mertensia lanceolata (Pursh) DC. var. coriacea (A. Nels.) Higgins & Welsh 、Mertensia lanceolata (Pursh) DC. var. lanceolata、Mertensia lanceolata (Pursh) DC. var. secundorum Cockerell 、Mertensia maritima (L.) S.F. Gray var. asiatica (Takeda) Welsh 、Mertensia maritima (L.) S.F. Gray var. maritima -- ）、スモールブルーベルズ（Mertensia longiflora Greene）、マクドガルズブルーベルズ（Mertensia macdougalii Heller）、オイスターリーフ（Mertensia maritima (L.) S.F. Gray ）、オボロングリーフブルーベルズ（Mertensia oblongifolia (Nutt.) G. Don）、トールブルーベルズ（Mertensia paniculata (Ait.) G. Don 、Mertensia paniculata (Ait.) G. Don var. paniculata）、アラスカトールブルーベルズ（Mertensia paniculata (Ait.) G. Don var. alaskana (Britt.) L.O. Williams ）、ノーザンブルーベルズ（Mertensia paniculata (Ait.) G. Don var. borealis (J.F. Macbr.) L.O. Williams）、イーストウッズブルーベルズ（Mertensia paniculata (Ait.) G. Don var. eastwoodiae (J.F. Macbr.) Hulten ）、ブロードリーフブルーベルズ（Mertensia platyphylla Heller、Mertensia platyphylla Heller var. platyphylla 、Mertensia platyphylla Heller var. subcordata (Greene) L.O. Williams ）、シェイドブルーベルズ（Mertensia umbratilis Greenm.）等を用いることができる。本発明においては、これらのハマベンケイソウ属植物の中のハマベンケイソウを用いることが、本発明の効果の点から好ましい。
【００１１】
本発明におけるハマベンケイソウ属植物は、ハマベンケイソウ属植物の原体や乾燥物を用いてもよいが、各種溶媒を用いて抽出した抽出物を用いるのが好ましい。抽出には、ハマベンケイソウ属植物の茎、葉、花、種子、根、地下茎、果実、芽などのいずれの部位を用いても構わないが、有効性の点からは茎葉若しくは全草を用いるとよい。抽出の際は、生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。抽出は、抽出溶媒に浸漬するか、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、撹拌や抽出溶媒中でホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
【００１２】
抽出溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール、１、３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール、エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類、酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができ、これらより１種又は２種以上を選択して用いる。また、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種又は２種以上の超臨界流体や亜臨界流体を用いてもよい。
【００１３】
ハマベンケイソウ属植物の上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができるが、濃縮、乾固した物を水や極性溶媒に再度溶解して使用することもでき、これらの生理作用を損なわない範囲で脱色、脱臭、脱塩等の精製処理やカラムクロマトグラフィー等による分画処理を行った後に用いてもよい。ハマベンケイソウ属植物の葉の前記抽出物やその処理物及び分画物は、各処理及び分画後に凍結乾燥し、用時に溶媒に溶解して用いることもできる。
【００１４】
ハマベンケイソウ属植物の抽出物は、優れた保湿作用、抗老化作用、抗酸化作用、抗炎症作用、美白作用、及び痩身作用を有し、ハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤として利用することができる。ハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分とする保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤は、皮膚に外用するだけではなく、毛髪に利用することや経口摂取も可能であり、食品、飲料、あるいは医薬品などにも応用することが可能である。
【００１５】
ハマベンケイソウ属植物の抽出物は、アルギナーゼ活性促進作用（保湿作用）、細胞賦活作用（抗老化作用、肌荒れ改善作用）、メラニン産生抑制作用（美白作用）、過酸化脂質耐性作用（抗酸化作用）、スーパーオキサイドアニオン消去作用（抗酸化作用）、ヒアルロニダーゼ阻害作用（抗炎症作用）、中性脂肪蓄積抑制作用（痩身作用）を発揮し、保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤として有用である。
【００１６】
ハマベンケイソウ属植物の抽出物を皮膚外用剤に配合する際の配合量は、皮膚外用剤の種類や使用目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して０．０００１〜５０．０質量％が好ましく、より好ましくは、０．００１〜２５．０質量％である。
【００１７】
ハマベンケイソウ属植物の抽出物を配合する皮膚外用剤の剤型は任意であり、例えば、ローションなどの可溶化系、クリームや乳液などの乳化系、カラミンローション等の分散系として提供することができる。さらに、噴射剤と共に充填したエアゾール、軟膏剤、粉末、顆粒などの種々の剤型で提供することもできる。
【００１８】
なお、ハマベンケイソウ属植物の抽出物を配合する皮膚外用剤には、ハマベンケイソウ属植物の抽出物の他に、必要に応じて、通常医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪用化粧料及び洗浄料に配合される、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤、香料、樹脂、防菌防黴剤、アルコール類等を適宜配合することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲において、他の保湿剤、細胞賦活剤、あるいは抗酸化剤との併用も可能である。
【実施例】
【００１９】
以下にハマベンケイソウ属植物抽出物の製造例、各作用を評価するための試験、皮膚外用剤や食品としての処方例、使用試験についてさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。
【００２０】
［抽出物１］
ハマベンケイソウの全草の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの５０容量％エタノール水溶液に、分散させ、撹拌しながら室温にて２時間抽出した。抽出上清を濾別したのち、減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、抽出物１を得た。
【００２１】
［抽出物２］
ハマベンケイソウの全草の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの熱水で２０分間加熱抽出した。抽出上清を濾別したのち、凍結乾燥を行い、抽出物２を得た。
【００２２】
上記抽出物１、抽出物２を用いて、アルギナーゼ活性促進作用、細胞賦活作用、メラニン産生抑制作用、過酸化脂質耐性作用、スーパーオキサイドアニオン消去作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用、中性脂肪蓄積抑制作用の評価を行った。なお各評価結果に記載した*及び**は、ｔ検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を*で、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を**でそれぞれ表したものである。
【００２３】
［アルギナーゼ活性促進作用］
ヒト皮膚角化細胞を１ウェル当たり２．０×１０4個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を５％添加したものを用いた。２４時間後１．２ｍＭＣａＣｌ2を含む５％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地によって、各濃度に調整した抽出物２を含有するサンプル液に交換しさらに９日間培養した。培地は３日に１回交換した。培養終了後、培養上清を採取し、アルギナーゼ活性促進能の評価を行った。アルギナーゼはアルギニンを加水分解し、オルニチンと尿素を生成する。尿素はウレアーゼによってアンモニアに分解され、アンモニアはペンタシアノニトロシル鉄（ＩＩＩ）酸ナトリウム二水和物（ニトロプルシッドナトリウム）存在下でサリチル酸、次亜塩素酸と反応し、インドフェノールが生成する。アルカリ性条件下でインドフェノールの吸収（５７０ｎｍ）を測定し、尿素濃度を求め、アルギナーゼ活性の定量を行った。尿素定量のため、和光純薬社製尿素窒素Ｂ−テストワコーを用いて同様の測定を行い、検量線を作成した。また、ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔにて、各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量あたりのアルギナーゼ活性促進能を求めた。サンプルを添加しないブランクの値を１００とした時の相対値により、アルギナーゼ活性促進能を評価した。結果は、表１に示した通りであり、ハマベンケイソウ抽出物は、高いアルギナーゼ活性促進作用が認められた。
【００２４】
【表１】
2008231020.tif 000002
【００２５】
［真皮線維芽細胞賦活作用］
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間後、１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整したサンプル培養液に交換しさらに４８時間培養した。
次にＭＴＴ試薬を４００μｇ／ｍＬとなるように培地にて調整し、上清を除いた細胞に添加し約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価は試料無添加時のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値を求めて行った。結果は、表２に示した通りであり、ハマベンケイソウ抽出物は、有意な真皮線維芽細胞賦活作用が認められた。
【００２６】
【表２】
2008231020.tif 000003
【００２７】
［真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進作用］
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整した抽出物１を含有するサンプル培養液に交換しさらに２４時間培養した。
培養上清中に分泌されたタイプ１コラーゲン量はＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２、２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。評価ではサンプル培養液の他にネガティブコントロールとして０．５％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を、ポジティブコントロールとして５０μＭのＬ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩（ＶＣＰＭｇ）を含有する０．５重量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。
評価はコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値を求めて行った。PIERCE社製BCA Protein Assay Kitにてタンパク量を測定し単位細胞又は単位タンパク量当りのコラーゲン産生量を求め、ネガティブコントロールの単位当りコラーゲン産生量を１００とした時の相対値を求めて行った。結果は、表３に示した通りであり、ハマベンケイソウ抽出物は、有意な真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進作用が認められた。
【００２８】
【表３】
2008231020.tif 000004
【００２９】
［表皮細胞賦活作用］
ヒト表皮未全角化細胞（ＨａＣａＴ  ｃｅｌｌ）を１ウェルあたり２．０×１０4個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児結成（ＦＢＳ）を添加して用いた。２４時間後、５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整した抽出物２を含有する培養液に培地を交換し、さらに２４時間培養した。
次にＭＴＴ試薬を１００μｇ／ｍＬとなるように培地にて調整し交換し約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価はコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値を求めて行った。結果は、表４に示した通りであり、ハマベンケイソウ抽出物は、有意な表皮細胞賦活作用が認められた。
【００３０】
【表４】
2008231020.tif 000005
【００３１】
［表皮細胞を用いた過酸化脂質耐性作用］
ヒト表皮未全角化細胞（ＨａＣａＴ  ｃｅｌｌ）を１ウェルあたり２．０×１０4個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０質量％のウシ胎児結成（ＦＢＳ）を添加して用いた。２４時間後、１０質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整した抽出物２を含有する培養液に培地を交換し、さらに２４時間培養した。
ｔ−ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅを添加したＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液に交換し、２時間培養した。さらに１５０μｇ／ｍＬニュートラルレッドを含有するＰＢＳ（−）に交換し３７℃で２時間培養した。続いて１ｗ／ｖ％昨酸を含有する５０質量％エタノール水溶液に交換し、細胞内に取り込まれたニュートラルレッドを抽出し、抽出液の５４０ｎｍの吸光度を測定した。評価は、ｔ−ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ無添加のコントロールの細胞生存率を１００とした時の相対値を求めて行った。有意差検定は、抽出物２無添加の場合と、抽出物２を添加した場合の細胞生存率に有意差があるかどうかを検定した。結果は、表５に示した通りであり、ハマベンケイソウ抽出物は、有意な過酸化脂質耐性作用が認められた。特に抽出物２を１ｍｇ／ｍＬ添加したサンプルは、ｔ−ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ無添加のコントロールとほぼ同程度の高い細胞生存率を示した。
【００３２】
【表５】
2008231020.tif 000006
【００３３】
［スーパーオキサイドアニオン消去能評価作用］
０．２５ｍＭ  ＷＳＴ−１及び１ｍＭハイポキサンチンを含有するＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液７５μＬ、ＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液にて各濃度に調整した抽出物１を含有するサンプル溶液２５μＬを添加する。さらに、キサンチンオキシダーゼ２５μＬ（０．００７５ユニット）を添加し、３７℃で１５分間反応させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。サンプル溶液に替えてＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液のみを添加した場合の吸光度を（Ａ）、サンプル溶液を添加した場合の吸光度を（Ｂ）としたとき、スーパーオキサイドアニオン消去率は次式によって求めた。
消去率（％）＝［１−（Ｂ）／（Ａ）］×１００
結果は、表６に示した通りであり、ハマベンケイソウ抽出物は、有意なスーパーオキサイドアニオン消去作用が認められた。
【００３４】
【表６】
2008231020.tif 000007
【００３５】
[中性脂肪蓄積抑制作用]
皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞Ｃｒｙｏ  ＨＰＲＡＤ−ＳＱ（三光純薬株式会社）を１ウェル当り１．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＰＧＭ培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ、１００μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ含有）を用いた。細胞がコンフルエントになる直前に抽出物１を添加したＰＧＭ−分化用培地（１０μｇ／ｍＬ  インスリン、１μＭ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、２００μＭ  ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ、５００μＭ  Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ含有）に交換し、脂肪細胞への分化誘導を行った。分化誘導開始後、コントロール群が成熟して細胞内に多数の脂肪滴が蓄積されるまで、１０〜１４日間培養した。細胞を回収後、１０％中性緩衝ホルムアルデヒド液を用いて細胞を固定した。ＰＢＳ（−）にて洗浄の後、０．５ｗ／ｖ％  オイルレッドＯ溶液を添加し、３７℃で２時間培養した。ＰＢＳ（−）にて洗浄の後、メタノールを添加し、色素を抽出した。抽出後、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍ、６５０ｎｍの吸光度をそれぞれ測定し、両測定値の差を用いて中性脂肪蓄積抑制作用の評価を行った。評価は、試料無添加のブランクにおける中性脂肪蓄積量を１００とした相対値を求めて行った。結果は、表７に示した通り、ハマベンケイソウ抽出物は、有意な中性脂肪蓄積抑制作用が認められた。
【００３６】
【表７】
2008231020.tif 000008
【００３７】
［メラニン産生抑制作用］
評価は、以下の手順で行った。Ｂ１６メラノーマ細胞を９０ｍｍディッシュ１ディッシュ当り１．８×１０４個となるように播種し、５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて培養した。２４時間後に５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に抽出物２を添加して各濃度に調整した抽出物２添加培地に交換した。さらに５日間培養し、培養終了後にトリプシンにより細胞を剥離して回収した。回収した細胞を遠心し、細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記に示した判定基準によりその黒化状況を目視で判定した。評価では、抽出物２を添加せず５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地のみで培養し、ネガティブコントロールとし、抽出物２のかわりに５０ｍＭ乳酸ナトリウムを添加して培養し、ポジティブコントロールとした。また同時に、沈殿物に組織溶解剤（商品名Ｓｏｌｖａｂｌｅ[パーキンエルマー製]）を添加して煮沸し、室温に戻して分光光度計（日立社製分光光度計Ｕ−３０１０）により５００ｎｍの吸光度を測定した。評価結果は表８に示したとおり、ハマベンケイソウ抽出物は、有意なメラニン産生抑制作用が認められた。
評価基準
判定１：ポジティブコントロールと同程度（ほぼ白色）
判定２：ポジティブコントロールより僅かに黒い（薄い褐色）
判定３：ポジティブコントロールとネガティブコントロールの中間（褐色）
判定４：ネガティブコントロールより僅かに白い（黒褐色）
判定５：ネガティブコントロールと同程度（ほぼ黒色）
【００３８】
【表８】
2008231020.tif 000009
【００３９】
［ヒアルロニダーゼ阻害作用］
ヒアルロン酸カリウム塩（ヒト臍の緒由来）を０．９ｍｇ／ｍＬになるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、基質溶液とした。市販のヒアルロニダーゼ（ウシ精巣由来）を５，３００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、酵素溶液とした。酵素溶液は用事調製とした。試験管に緩衝液で各濃度に調製した抽出物１を含有するサンプル溶液０．１ｍＬ、及び酵素溶液０．０３ｍＬを試験管にとり、３７℃で２０分間反応させた。次に活性化剤を０．０６ｍＬ加え、３７℃で２０分間反応させた。さらに基質溶液を０．１５ｍＬ加え、３７℃で１時間反応させた。０．４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．０６ｍＬを加え反応を停止させた後すぐに氷冷し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）を０．０６ｍＬ添加し、３分間煮沸した後さらに氷冷した。ｐ−ＤＡＢＡ溶液を２．０ｍＬ添加し、３７℃で２０分間反応させた後、各試験管から９６ウェルマイクロプレートに移しかえ、マイクロプレートリーダーを用いて５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールには、サンプルを溶かすのに用いた緩衝溶液のみを加えたものを用いた。ヒアルロニダーゼの活性が阻害されると分解産物であるＮ−アセチルグルコサミンが減少し、ｐ−ＤＡＢＡによる吸光度が低くなる。このことを利用し、阻害活性は次式より求めた。評価結果は表９に示したとおり、ハマベンケイソウ抽出物は、有意なヒアルロニダーゼ阻害作用が認められた。
阻害率（％）＝（コントロール吸光度−サンプル吸光度）／コントロール吸光度×１００
【００４０】
【表９】
2008231020.tif 000010
【００４１】
本発明を実施した処方例を示す。
【００４２】
［処方例１］乳液
（１）スクワラン                                      １０．０（質量％）
（２）メチルフェニルポリシロキサン                      ４．０
（３）水素添加パーム核油                                ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質                              ０．１
（５）モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）    １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン                        １．０
（７）グリセリン                                        ４．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（９）カルボキシビニルポリマー                          ０．１５
（10）精製水                                          ５３．８５
（11）アルギニン（１質量％水溶液）                    ２０．０
（12）抽出物１                                          ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、冷却を開始し、（11）と（12）を順次加え、均一に混合する。
【００４３】
［処方例２］化粧水
（１）エタノール                                      １５．０（質量％）
（２）ポリオキシエチレン（４０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油    ０．３
（３）香料                                              ０．１
（４）精製水                                          ７８．３８
（５）クエン酸                                          ０．０２
（６）クエン酸ナトリウム                                ０．１
（７）グリセリン                                        １．０
（８）ヒドロキシエチルセルロース                        ０．１
（９）抽出物２                                          ５．０
製法：（１）に（２）及び（３）を溶解する。溶解後、（４）〜（８）を順次添加した後、十分に攪拌し、（９）を加え、均一に混合する。
【００４４】
［処方例３］クリーム
（１）スクワラン                                      １０．０（質量％）
（２）ステアリン酸                                      ２．０
（３）水素添加パーム核油                                ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質                              ０．１
（５）セタノール                                        ３．６
（６）親油型モノステアリン酸グリセリン                  ２．０
（７）グリセリン                                      １０．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（９）アルギニン（２０質量％水溶液）                  １５．０
（10）精製水                                          ４０．７
（11）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液）      １５．０
（12）抽出物１                                          １．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、（11）を加え、冷却を開始し、４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。
【００４５】
［処方例４］美容液
（１）精製水                                          ２７．４５(質量％)
（２）グリセリン                                      １０．０
（３）ショ糖脂肪酸エステル                              １．３
（４）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液）      １７．５
（５）アルギン酸ナトリウム(１質量％水溶液)            １５．０
（６）モノラウリン酸ポリグリセリル                      １．０
（７）マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル            ３．０
（８）N-ラウロイル-L-グルタミン酸
ジ（フィトステリル−２−オクチルドデシル）          ２．０
（９）硬化パーム油                                      ２．０
（10）スクワラン（オリーブ由来）                        １．０
（11）ベヘニルアルコール                                ０．７５
（12）ミツロウ                                          １．０
（13）ホホバ油                                          １．０
（14）１、３−ブチレングリコール                      １０．０
（15）Ｌ−アルギニン（１０質量％水溶液）                ２．０
（16）抽出物１                                          ５．０
製法：（１）〜（６）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（14）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、５０℃にて（15）を加える。さらに４０℃まで冷却し、（16）を加え、均一に混合する。
【００４６】
［処方例５］水性ジェル
（１）カルボキシビニルポリマー                          ０．５（質量％）
（２）精製水                                          ８６．７
（３）水酸化ナトリウム（１０質量％水溶液）              ０．５
（４）エタノール                                      １０．０
（５）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（６）香料                                              ０．１
（７）抽出物２                                          ２．０
（８）ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油    ０．１
製法：（１）を（２）に加え、均一に攪拌した後、（３）を加える。均一に攪拌した後、（４）に予め溶解した（５）を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた（６）〜（８）を加え、均一に攪拌混合する。
【００４７】
［処方例６］クレンジング料
（１）スクワラン                                      ８１．０（質量％）
（２）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル    １５．０
（３）精製水                                            ３．０
（４）抽出物１                                          １．０
製法：（１）と（２）を均一に溶解する。これに、（３）と（４）を順次加え、均一に混合する。
【００４８】
［処方例７］洗顔フォーム
（１）ステアリン酸                                    １６．０（質量％）
（２）ミリスチン酸                                    １６．０
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン                  ２．０
（４）グリセリン                                      ２０．０
（５）水酸化ナトリウム                                  ７．５
（６）ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン                １．０
（７）精製水                                          ３６．５
（８）抽出物２                                          １．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（５）〜（７）の水相成分を８０℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合撹拌する。冷却を開始し、４０℃にて（８）を加え、均一に混合する。
【００４９】
［処方例８］メイクアップベースクリーム
（１）スクワラン                                      １０．０(質量％)
（２）セタノール                                        ２．０
（３）グリセリントリ−２−エチルヘキサン酸エステル      ２．５
（４）親油型モノステアリン酸グリセリル                  １．０
（５）プロピレングリコール                            １１．０
（６）ショ糖脂肪酸エステル                              １．３
（７）精製水                                          ６９．４
（８）酸化チタン                                        １．０
（９）ベンガラ                                          ０．１
（10）黄酸化鉄                                          ０．４
（11）香料                                              ０．１
（12）抽出物１                                          １．２
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（５）〜（７）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（８）〜（10）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（11）と（12）の成分を加え、均一に混合する。
【００５０】
［処方例９］乳液状ファンデーション
（１）メチルポリシロキサン                              ２．０(質量％)
（２）スクワラン                                        ５．０
（３）ミリスチン酸オクチルドデシル                      ５．０
（４）セタノール                                        １．０
（５）ポリオキシエチレン(２０Ｅ．Ｏ．)
ソルビタンモノステアリン酸エステル              １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン                        ０．７
（７）１、３−ブチレングリコール                        ８．０
（８）キサンタンガム                                    ０．１
（９）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（10）精製水                                          ５７．４
（11）酸化チタン                                        ９．０
（12）タルク                                            ７．４
（13）ベンガラ                                          ０．５
（14）黄酸化鉄                                          １．１
（15）黒酸化鉄                                          ０．１
（16）香料                                              ０．１
（17）抽出物２                                          １．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（10）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（11）〜（15）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（16）と（17）の成分を順次加え、均一に混合する。
【００５１】
［処方例１０］油中水型エモリエントクリーム
（１）流動パラフィン                                  ３０．０(質量％)
（２）マイクロクリスタリンワックス                      ２．０
（３）ワセリン                                          ５．０
（４）ジグリセリンオレイン酸エステル                    ５．０
（５）塩化ナトリウム                                    １．３
（６）塩化カリウム                                      ０．１
（７）プロピレングリコール                              ３．０
（８）１、３−ブチレングリコール                        ５．０
（９）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（10）抽出物１                                          １．０
（11）精製水                                          ４７．４
（12）香料                                              ０．１
製法：（５）と（６）を（11）の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した（４）に撹拌しながら徐々に加える。これを混合した後、７０℃にて加熱溶解した（１）〜（３）に均一に分散する。これに（７）〜（10）を（11）の残部に７０℃にて加熱溶解したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。
【００５２】
［処方例１１］パック
（１）精製水                                          ５８．９(質量％)
（２）ポリビニルアルコール                            １２．０
（３）エタノール                                      １７．０
（４）グリセリン                                        ５．０
（５）ポリエチレングリコール（平均分子量１０００）      ２．０
（６）抽出物２                                          ５．０
（７）香料                                              ０．１
製法：（２）と（３）を混合し、８０℃に加温した後、８０℃に加温した（１）に溶解する。均一に溶解した後、（４）と（５）を加え、攪拌しながら冷却を開始する。４０℃まで冷却し、（６）と（７）を加え、均一に混合する。
【００５３】
［処方例１２］入浴剤
（１）香料                                              ０．３(質量％)
（２）抽出物２                                          １．０
（３）炭酸水素ナトリウム                              ５０．０
（４）硫酸ナトリウム                                  ４８．７
製法：（１）〜（４）を均一に混合する。
【００５４】
［処方例１５］飲料
（１）抽出物２                                          ８．０(質量％)
（２）エリスリトール                                    １．０
（３）クエン酸                                          ０．１
（４）ステビア                                          ０．０１
（５）精製水                                          ９０．８９
製法：（１）〜（５）を均一に混合する。