(57)【要約】【課題】ターゲットとプローブとの結合を仲介する仲介ポリヌクレオチドの提供【解決手段】本発明の仲介ポリヌクレオチドは、ターゲット結合領域Ｘと、プローブ結合領域Ｚと、ステムループ形成領域Ｙとを備える。前記ステムループ形成領域Ｙは、前記ターゲット結合領域Ｘの一部及び前記プローブ結合領域Ｚを含む。前記プローブ結合領域Ｚは、ニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列の切断されない側の配列を含む。ターゲットが非存在の場合には、前記ステムループ形成領域Ｙにおいてステムループ構造が形成されてプローブと前記プローブ結合領域Ｚとの結合が制限され、ターゲットが存在する場合には、前記ターゲットと前記ターゲット結合領域Ｘとが結合することで前記ステムループ構造が解除されて前記プローブと前記プローブ結合領域との結合が促進される。【選択図】図２
2008099570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲットとプローブとを仲介するポリヌクレオチドであって、
ターゲット結合領域と、プローブ結合領域と、ステムループ形成領域とを備え、
前記ステムループ形成領域が、前記ターゲット結合領域の一部、及び、前記プローブ結合領域を含み、
前記プローブ結合領域が、ニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列の切断されない側の配列を含み、
ターゲットが非存在の場合には、前記ステムループ形成領域においてステムループ構造が形成されてプローブと前記プローブ結合領域との結合が制限され、
ターゲットが存在する場合には、前記ターゲットと前記ターゲット結合領域とが結合することで前記ステムループ構造が解除されて前記プローブと前記プローブ結合領域との結合が促進される仲介ポリヌクレオチド。
【請求項２】
ターゲットとプローブとを仲介するポリヌクレオチドであって、
塩基配列ｘ２、ｘ３、ｙ３、ｚ２及びｙ２がこの順で連結された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、
塩基配列ｘ２とｘ３とがこの順で連結された塩基配列が、ターゲットとハイブリダイズ可能な塩基配列からなるターゲット結合領域を形成し、
塩基配列ｙ３の一部、ｚ２、及び、ｙ２の一部がこの順で連結された塩基配列が、プローブとハイブリダイズ可能な塩基配列からなるプローブ結合領域を形成し、
塩基配列ｘ３、ｙ３、ｚ２及びｙ２がこの順で連結された塩基配列が、ステムループ構造を形成するステムループ形成領域を形成し、前記ステムループ形成領域において、塩基配列ｘ３及びｙ３がこの順で連結する塩基配列と塩基配列ｙ２とが互いにステム構造を形成する逆方向反復配列であって、塩基配列ｚ２がループ構造を形成する配列であり、
前記ターゲットが非存在の場合には前記ステムループ構造が形成され、前記プローブと前記プローブ結合領域との結合が制限され、
前記ターゲットが存在する場合には、前記ターゲットと前記ターゲット結合領域とが結合することで前記ステムループ構造が解除されて前記プローブと前記プローブ結合領域との結合が促進されるポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記プローブ及び前記プローブ結合領域が二本鎖を形成した場合にニッキングエンドヌクレアーゼに認識部位が形成され、前記プローブが切断される側の配列を含み、前記プローブ結合領域が切断されない側の配列を含む請求項２記載の仲介ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ｚ２の長さが、４塩基である請求項２又は３に記載の仲介ポリヌクレオチド。
【請求項５】
長さが、３０〜６０塩基である請求項１から４のいずれか一項に記載の仲介ポリヌクレオチド。
【請求項６】
試料中の一本鎖ポリヌクレオチドを検出及び／又は測定する方法であって、
前記試料中に、請求項１及び請求項３から５のいずれか一項に記載の仲介ポリヌクレオチド、ニッキングエンドヌクレアーゼ、及び、一端に蛍光物質が結合され他端にクエンチャーが結合されたプローブを添加すること、並びに、
前記試料の蛍光発光を測定することを含む一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定方法。
【請求項７】
検出及び／又は測定対象の一本鎖ポリヌクレオチドのターゲット領域と仲介ポリヌクレオチドのターゲット結合領域とが二本鎖を形成することで、前記仲介ポリヌクレオチドのステムループ構造が解除される第１ステップ、
ステムループ構造の解除によりアクセス可能となった前記仲介ポリヌクレオチドのプローブ結合領域とプローブとが二本鎖形成する第２ステップ、
前記プローブ結合領域とプローブとの二本鎖形成領域にニッキングエンドヌクレアーゼが作用して前記プローブが切断され、切断されたプローブ断片が前記プローブ結合領域から解離するとともに蛍光を発光する第３ステップ、
プローブ断片の解離によりアクセス可能となった前記プローブ結合領域へ新たなプローブが結合して二本鎖形成する第４ステップ、及び、
前記第３ステップと前記第４ステップが繰り返される第５ステップ、を含む請求項６記載の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定方法。
【請求項８】
さらに、前記蛍光発光を経時的に測定することを含み、前記試料中の一本鎖ポリヌクレオチドの濃度をリアルタイムで検出及び／又は測定する請求項６又は７記載の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定方法。
【請求項９】
請求項６から８のいずれか一項に記載の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定方法を行うための装置であって、前記蛍光の発光測定装置を含む一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定用装置。
【請求項１０】
ニッキングエンドヌクレアーゼの使用方法であって、請求項６から８のいずれか一項に記載の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定方法においてニッキングエンドヌクレアーゼを使用する方法。
【請求項１１】
一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定キットであって、ニッキングエンドヌクレアーゼ、及び、取扱説明書を含む検出及び／又は測定キット。
【請求項１２】
さらに、一端に蛍光物質が結合され他端にクエンチャーが結合され、前記ニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列の切断される側の配列を含むプローブを含む請求項１１記載の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定キット。
【請求項１３】
一端に蛍光物質が結合され他端にクエンチャーが結合されたニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列の切断される側の配列を含むプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターゲットとプローブとを仲介する仲介ポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ｍＲＮＡのような一本鎖の核酸を検出・測定する方法として一般的には、例えば、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法、ノザンブロッティング法、モレキュラービーコン法（非特許文献１）、Ｂ−ＤＮＡ法（非特許文献２）などが挙げられる。
【０００３】
ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＲＮＡを一端逆転写してＤＮＡとしてからＰＣＲで増幅する方法である。この方法は、検出感度に極めて優れており、また、近年さまざまなリアルタイムＰＣＲシステムが市販されている。しかしながら、ＲＮＡを逆転写する点で、ＲＮＡの増減をリアルタイムで知ることはできない。
【０００４】
ノザンブロッティング法は、蛍光又は放射性同位体標識したプローブを用いてＲＮＡを検出する方法であるが、電気泳動やメンブレインへのトランファーなど時間や手間がかかる方法である。またやはり、ＲＮＡの増減をリアルタイムで知ることはできない。
【０００５】
モレキュラービーコン法は、蛍光物質及びクエンチャーが結合されたステムループ構造の分子がターゲットとハイブリダイズすると蛍光物質とクエンチャーとの距離ができて、蛍光が発光するという仕組みである。この方法の場合、ＲＮＡの増減をリアルタイムでしることができるが、ターゲットと蛍光物質とが１対１となるため、検出感度が問題となる。
【０００６】
Ｂ−ＤＮＡ（Branched DNA）法は、ターゲット分子を固相に固定した後、ターゲット分子に特異的な標識拡張子（Lavel Extender）をハイブリダイズさせ、さらに、前記標識拡張子に標識プローブが結合可能な配列が多数分岐したＢ−ＤＮＡ増幅子をハイブリダイズさせ、最後に標識プローブをハイブリダイズさせる方法である。この方法では検出感度の増幅については申し分ない。しかし、固定作業が必要であり、また、ＲＮＡの増減をリアルタイムで測定できない。
【非特許文献１】Tyagi S, Kramer FR. 1996. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol 14:303-308.
【非特許文献２】Urdea MS, Horn T, Fultz TJ, Anderson M, Running JA, Hamren S, Ahle D, Chang CA. 1991. Branched DNA amplification multimers for the sensitive, direct detection of human hepatitis viruses. Nucleic Acids Symp Ser:197-200.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ターゲットである一本鎖ポリヌクレオチドをプローブにより検出及び／又は測定可能とするターゲットとプローブとを仲介する仲介ポリヌクレオチドであって、好ましくは、簡便で特異性が高く、さらに好ましくは、ターゲットである前記一本鎖ポリヌクレオチドの濃度が変化する場合であってもリアルタイムで検出及び／又は測定が可能となる仲介ポリヌクレオチドの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の仲介ポリヌクレオチドは、ターゲットとプローブとを仲介するポリヌクレオチドであって、ターゲット結合領域と、プローブ結合領域と、ステムループ形成領域とを備え、前記ステムループ形成領域が、前記ターゲット結合領域の一部、及び、前記プローブ結合領域を含み、前記プローブ結合領域が、ニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列の切断されない側の配列を含み、ターゲットが非存在の場合には、前記ステムループ形成領域においてステムループ構造が形成されてプローブと前記プローブ結合領域との結合が制限され、ターゲットが存在する場合には、前記ターゲットと前記ターゲット結合領域とが結合することで前記ステムループ構造が解除されて前記プローブと前記プローブ結合領域との結合が促進される仲介ポリヌクレオチドである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明者らは、例えば、チューブからサンプルを取り出すことなく試薬を混ぜるだけで一本鎖の核酸を特異的に検出できる簡便な方法について研究を重ねた結果、ターゲットとなる検出対象の核酸と検出シグナルを発信するプローブとを仲介するポリヌクレオチドを使用する着想を得た。そして、鋭意研究を重ねた結果、この仲介ポリヌクレオチドにステムループ構造を導入すればターゲットの存在なしにはプローブと結合できず検出の特異性が向上することを見出した。さらに、プローブとして一端に蛍光物質が結合され他端にクエンチャーが結合されたプローブを用い、本発明の仲介ポリヌクレオチドと結合した前記プローブをニッキングエンドヌクレアーゼによって切断すれば連続的な蛍光シグナルが発信されて検出感度が高まるとともに、ターゲットの量の増減に応じて蛍光シグナルが発信されるため検出対象の検出・測定がリアルタイムで可能となることを見出し本発明に到達した。
【００１０】
本発明の仲介ポリヌクレオチドによれば、好ましくは、ニッキングエンドヌクレアーゼ及びプローブと共に本発明の仲介ポリヌクレオチドをサンプルチューブに添加するだけでターゲット（例えば、核酸など）の検出や測定が可能となる。また、好ましくは、特別な前処理や後処理が必要ない非常に簡便なターゲットの検出・測定方法が可能となる。さらに、使用するニッキングエンドヌクレアーゼは、様々なバッファーで活性を有し、また、廉価な酵素であるから、好ましくは、適用範囲が広くコストが低いターゲットの検出・測定方法が可能となる。上述したとおり、ニッキングエンドヌクレアーゼによる切断のため断続的に蛍光が発光されるため、好ましくは、時間の経過とともに検出感度も向上可能である。さらに、ターゲット結合領域とステムループ構造領域とがオーバーラップするため、本発明の仲介ポリヌクレオチドによれば、好ましくは、特異性が高いターゲットの検出・測定が可能となる。さらにまた、本発明の仲介ポリヌクレオチドは、ターゲットの濃度の増減を反映して蛍光発光を誘導できるから、好ましくは、ターゲットのリアルタイム検出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の仲介ポリヌクレオチドは、その他の態様として、塩基配列ｘ２、ｘ３、ｙ３、ｚ２及びｙ２がこの順で連結された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、塩基配列ｘ２とｘ３とがこの順で連結された塩基配列が、ターゲットとハイブリダイズ可能な塩基配列からなるターゲット結合領域を形成し、塩基配列ｙ３の一部、ｚ２、及び、ｙ２の一部がこの順で連結された塩基配列が、プローブとハイブリダイズ可能な塩基配列からなるプローブ結合領域を形成し、塩基配列ｘ３、ｙ３、ｚ２及びｙ２がこの順で連結された塩基配列が、ステムループ構造を形成するステムループ形成領域を形成し、前記ステムループ形成領域において、塩基配列ｘ３及びｙ３がこの順で連結する塩基配列と塩基配列ｙ２とが互いにステム構造を形成する逆方向反復配列であって、塩基配列ｚ２がループ構造を形成する配列であり、前記ターゲットが非存在の場合には前記ステムループ構造が形成され、前記プローブと前記プローブ結合領域との結合が制限され、前記ターゲットが存在する場合には、前記ターゲットと前記ターゲット結合領域とが結合することで前記ステムループ構造が解除されて前記プローブと前記プローブ結合領域との結合が促進されるポリヌクレオチドであってもよい。前記プローブ及び前記プローブ結合領域が二本鎖を形成した場合にニッキングエンドヌクレアーゼに認識部位が形成されることが好ましい。この場合、前記プローブが切断される側の配列を含み、前記プローブ結合領域が切断されない側の配列を含むことが好ましい。また、前記ｚ２の長さが、４塩基であることが好ましい。
【００１２】
本発明の仲介ポリヌクレオチドの全長は、３０〜６０塩基であることが好ましい。
【００１３】
本発明は、その他の態様において、試料中の一本鎖ポリヌクレオチドを検出及び／又は測定する方法であって、前記試料中に本発明の仲介ポリヌクレオチド、ニッキングエンドヌクレアーゼ、及び、一端に蛍光物質が結合され他端にクエンチャーが結合されたプローブを添加すること、並びに、前記試料の蛍光発光を測定することを含む検出及び／又は測定方法を提供する。
【００１４】
本発明の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定方法は、検出及び／又は測定対象の一本鎖ポリヌクレオチドのターゲット領域と仲介ポリヌクレオチドのターゲット結合領域とが二本鎖を形成することで、前記仲介ポリヌクレオチドのステムループ構造が解除される第１ステップ、ステムループ構造の解除によりアクセス可能となった前記仲介ポリヌクレオチドのプローブ結合領域とプローブとが二本鎖形成する第２ステップ、前記プローブ結合領域とプローブとの二本鎖形成領域にニッキングエンドヌクレアーゼが作用して前記プローブが切断され、切断されたプローブ断片が前記プローブ結合領域から解離するとともに蛍光を発光する第３ステップ、プローブ断片の解離によりアクセス可能となった前記プローブ結合領域へ新たなプローブが結合して二本鎖形成する第４ステップ、及び、前記第３ステップと前記第４ステップが繰り返される第５ステップ、を含むことが好ましい。
【００１５】
本発明の一本鎖ヌクレオチドの検出及び／又は測定方法は、さらに、前記蛍光発光を経時的に測定することを含み、前記試料中の一本鎖ポリヌクレオチドの濃度をリアルタイムで一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定することが好ましい。
【００１６】
本発明は、さらにその他の態様として、本発明の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定方法を行うための装置であって、前記蛍光の発光測定装置を含む一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定用装置を提供する。
【００１７】
本発明は、さらにその他の態様として、ニッキングエンドヌクレアーゼの使用方法であって、本発明の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定方法においてニッキングエンドヌクレアーゼを使用する方法を提供する。
【００１８】
本発明は、さらにその他の態様として、一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定キットであって、ニッキングエンドヌクレアーゼ及び取扱説明書を含む一本鎖核酸の検出及び／測定キットを提供する。本発明の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定キットは、さらに、一端に蛍光物質が結合され他端にクエンチャーが結合され、前記ニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列の切断される側の配列を含むプローブを含むことが好ましい。
【００１９】
本発明は、さらにその他の態様として、プローブであって、一端に蛍光物質が結合され他端にクエンチャーが結合されたニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列の切断される側の配列を含むプローブを提供する。
【００２０】
本発明において、「ポリヌクレオチド」とは、特に限定されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、遺伝子、オリゴヌクレオチド又は、従来公知のこれらの誘導体や類縁体等をいう。ポリヌクレオチドに含まれる塩基長は特に制限されず、例えば、２塩基以上であればポリヌクレオチドに含めてよい。また、特に制限しない限り、ポリヌクレオチドは、一本鎖でもよく、二本鎖でもよい。ポリヌクレオチドの製造方法としては、特に制限されず、例えば、従来公知の方法により化学合成により製造してもよく、酵素的にインビボ又はインビトロで製造してもよい。本発明において、「仲介ポリヌクレオチド」とは、ターゲットとプローブとの結合を仲介するポリヌクレオチドをいう。
【００２１】
本発明において、「ターゲット」とは、検出・測定対象となる一本鎖ポリヌクレオチド（遺伝子やｍＲＮＡを含む）及び／又は、前記一本鎖ポリヌクレオチドにおいて実際に本発明の仲介ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能な塩基配列やその領域を指す。本発明において、「プローブ」とは、本発明の仲介ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能な標識されたポリヌクレオチドをいう。本発明において「プローブ」は、一端に蛍光物質が結合して他端にクエンチャー（消光剤）を結合したプローブであって、プローブが切断されて両端が解離した場合に前記蛍光物質の蛍光が発光する蛍光プローブが好ましい。このような蛍光プローブにおける前記蛍光物質と前記クエンチャーの組み合わせとしては、特に制限されないが、例えば、ＦＡＭとＴＡＭＲＡ、ＦＡＭとＢＨＱ１、Ｃｙ３とＣｙ５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒとＱＳＹ（インビトロジェン）などが挙げられ、具体的には、商品名：ＴａｑｍａｎＰｒｏｂｅなどが挙げられる。また、本発明において「プローブ」は、後述するように、ニッキングエンドヌクレアーゼにより切断される側の認識配列を含むことが好ましい。
【００２２】
本発明において、ニッキングエンドヌクレアーゼとは、特定配列の二本鎖ポリヌクレオチドを認識して一方の鎖のみを切断する酵素をいう。二本鎖ＤＮＡを認識するニッキングエンドヌクレアーゼとしては、例えば、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ（いずれも、New England BioLabs社製）などが挙げられるが、これらに制限されない。下記表１に、上記ニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列を示す。切断される側の「｜」は切断箇所を示す。
【００２３】
【表１】
2008099570.tif 000003
【００２４】
本発明において、ステムループ構造とは、ヘアピンループ構造ともいい、一本鎖ポリヌクレオチド上に存在する逆方向反復配列間で水素結合によって生じる二本鎖部分（ステム）とそれに挟まれたループの部分からなる構造をいう。
【００２５】
次に、本発明の仲介ポリヌクレオチドについて説明する。本発明の仲介ポリヌクレオチドは、上述のとおり、ターゲットとプローブとの結合を仲介するポリヌクレオチドであって、ターゲット結合領域と、プローブ結合領域と、ステムループ形成領域とを備え、前記ステムループ形成領域が、前記ターゲット結合領域の一部及び前記プローブ結合領域とオーバーラップし、前記プローブ結合領域が、ニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列の切断されない側の配列を含み、ターゲットが非存在の場合には、ステムループ構造が形成されてプローブと前記プローブ結合領域との結合が制限され、ターゲットが存在する場合には、前記ターゲットと前記ターゲット結合領域とが結合することで前記ステムループ構造が解除されて前記プローブと前記プローブ結合領域との結合が促進されるものである。前記ニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列の一部は、ステムループのループ構造に該当することが好ましい。このような本発明の仲介ポリヌクレオチドによれば、ターゲットの一本鎖ポリヌクレオチドを、好ましくは、簡便に低コストで特異性が高く検出及び測定できる。その検出／測定スキームを図１に示す。本発明の仲介ポリヌクレオチド１は、ターゲット２と接触する前はステム構造６を形成している（図１（１））。この状態では蛍光物質４及びクエンチャー５を備えたプローブ３は、仲介ポリヌクレオチド１に結合できない。仲介ポリヌクレオチド１のステム構造を形成していない部分がターゲット２と二本鎖を形成すると（図１（２））、より安定な構造をとるために仲介ポリヌクレオチド１及びターゲット２の二本鎖形成が進行してステム構造６が解除され（図１（３））、プローブ結合領域がアクセス可能となる。このプローブ結合領域にプローブ３が結合する（図１（４））。そして、プローブ結合領域に形成された二本鎖ポリヌクレオチド部分にニッキングエンドヌクレアーゼ７が作用し（図１（５））、蛍光物質４とクエンチャー５とが分離し、蛍光８が発光する（図１（６））。すると、プローブ結合領域が空席となり、再度プローブ３が結合し（図１（４））、ニッキングエンドヌクレアーゼ７が作用し（図１（５））、蛍光８が発光し（図１（６））、このサイクルが繰り返され、蛍光発光量が増加していく。
【００２６】
本発明の仲介ポリヌクレオチドは、図２のように説明することができる。図２（Ａ）に示すとおり、本発明の仲介ポリヌクレオチドは、塩基配列ｘ２、ｘ３、ｙ３、ｚ２及びｙ２がこの順で連結された塩基配列で表すことができる。塩基配列ｘ２とｘ３とがこの順で連結された塩基配列は、ターゲットとハイブリダイズ可能な塩基配列からなるターゲット結合領域Ｘを形成する。前記ターゲット結合領域Ｘは、よりストリンジェントな条件でターゲットとハイブリダイズ可能であることが好ましく、ターゲットの相補配列と１個又は数個（例えば、２、３、４、５個）の塩基が付加、欠失、又は置換された配列であることがより好ましく、ターゲットの相補配列であることがさらにより好ましい。図２（Ｂ）に示すとおり、前記ターゲット結合領域Ｘにおいて、領域ｘ３は、ステムループ構造においてステム部分を形成する部分でもあり、領域ｘ２は、本発明の仲介ポリヌクレオチドがステムループ構造を形成する場合でもフリーな一本鎖部分として存在し、ターゲットが存在する場合に、領域ｘ３に先んじてターゲットと二本鎖構造を形成する部分である。領域ｘ２の長さとしては、例えば、５〜３０塩基であって、より好ましくは、８〜２５塩基であって、さらにより好ましくは、１０〜２０塩基である。また、領域ｘ３の長さとしては、例えば、５〜２０塩基であって、７〜１５塩基が好ましく、より好ましくは、８、９、１０、１１又は１２塩基である。
【００２７】
塩基配列ｙ３の一部、ｚ２、及び、ｙ２の一部がこの順で連結された塩基配列は、プローブとハイブリダイズ可能な塩基配列からなるプローブ結合領域Ｚを形成する（図２（Ａ））。前記プローブ結合領域Ｚは、よりストリンジェントな条件でプローブとハイブリダイズ可能であることが好ましく、プローブの相補配列と１個又は数個（例えば、２、３、４、５個）の塩基が付加、欠失、又は置換された配列であることがより好ましく、プローブの相補配列であることがさらにより好ましい。後述するように、前記プローブ結合領域Ｚは、ステムループ構造形成領域Ｙ内に含まれ、本発明の仲介ポリヌクレオチドがステムループ構造を形成する場合にはプローブとの結合が困難である。前記プローブ結合領域Ｚ及びプローブは、ニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列を含むことが好ましい。この場合、前記酵素により切断される（ニッキングされる）側の配列が、プローブに含まれることが好ましい。前記プローブ結合領域Ｚとプローブとは同じ長さであってよく、その長さとしては、ニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列の前後、すなわち５'及び３'側に、それぞれ０、１、２、３、４、又は５塩基を付加した長さが挙げられる。付加する長さは、本発明の仲介ポリヌクレオチドとプローブとが結合した場合に、ニッキングエンドヌクレアーゼが実質的に作用できる長さであることが好ましく、当業者であれば適宜設定できる。
【００２８】
塩基配列ｘ３、ｙ３、ｚ２及びｙ２がこの順で連結された塩基配列は、ステムループ構造を形成するステムループ形成領域Ｙを形成する（図２（Ｂ））。前記ステムループ形成領域Ｙにおいて、塩基配列ｘ３及びｙ３がこの順で連結する塩基配列と塩基配列ｙ２とは、両者間でステム構造を形成する逆方向反復配列である。本発明において、前記逆方向反復配列とは、塩基配列ｘ３及びｙ３がこの順で連結する塩基配列と塩基配列ｙ２とが完全に相補的であるものに限られず、ステムループ構造形成できれば、互いに１個又は数個（例えば、２、３、４、５個）の塩基が付加、欠失、又は置換された配列であってもよい。領域ｚ２は、ステムループ構造のループ部分に該当し、その長さとしては、例えば、２〜８塩基であって、好ましくは、４塩基である。本発明の仲介ポリヌクレオチドがステムループ構造を形成する条件としては、例えば、ニッキングエンドヌクレアーゼの反応可能な温度及びバッファー条件であることが好ましい。領域ｙ３には、ターゲット結合領域Ｘとプローブ結合領域Ｚとの間の領域が含まれる（図２（Ａ）参照）。この領域の長さとしては、例えば、０〜５塩基であって、好ましくは、１、２、３、４塩基である。この領域の長さ及び配列は、後述するとおり、ステム構造を形成するｙ２領域のΔＧｙ２を所定の値にすることを目的として適宜調節できる。
【００２９】
本発明の仲介ポリヌクレオチドの全長は、例えば、３０〜６０塩基であって、好ましくは、３５〜５５塩基であって、より好ましくは、４０〜５０塩基である。
【００３０】
本発明の仲介ポリヌクレオチドは、以下のようにして塩基配列を決定できる。すなわち、図３に示すような平衡反応図を計算機でシミュレーションしてそれぞれの状態の自由エネルギー差から平衡定数Ｋを算出し、図中のＬＰＴをシグナル、ＬＰ及びＬｓｔｅｍＰをノイズとしてＳ／Ｎ比が高いものを選択することができる。同図において、文字Ｌ、Ｐ、Ｔはそれぞれ仲介ＤＮＡ、プローブ、ターゲットＲＮＡを指す。以下に図に使われている常態の説明をする。Ｌｆｒｅｅ：ステム状態で無いＬ、ＬＰ：ＬとＰが結合したもの、ＬＴ：ＬとＴが結合したもの、ＬＰＴ：ＬとＰとＴが結合したもの、Ｌｓｔｅｍ：ステム状態のＬ、ＬｓｔｅｍＰ：Ｌがステム状態のままＰと結合したもの、ＬｓｔｅｍＴ：Ｌがステム状態のままＴと結合したもの、ＬｓｔｅｍＰＴ：Ｌがステム状態のままＰ及びＴと結合したもの、である。ただし、ΔＧはそれぞれの平衡状態における自由エネルギーの差を示している。
【００３１】
より簡単には、以下のようにする。まず、プローブ結合領域Ｚを決定する（図２参照）。プローブ結合領域Ｚは、使用するニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列の切断されない側の配列に基づき設計する（認識配列は、上記表１参照）。プローブ結合領域ＺのΔＧｚ及びプローブがニッキングエンドヌクレアーゼで切断された場合のΔＧｃｕｔが、以下を満たすようにする。
【００３２】
ΔＧｚ＜−１３
ΔＧｃｕｔ＞−１０
【００３３】
ここで、ΔＧは、ギプスの自由エネルギーであって、二本鎖形成部位の安定性を示す（低いほど安定する；単位は、ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。なお、ΔＧは、従来公知のプログラム、又は、Ｗｅｂサイトで容易に計算できる。ΔＧを計算する条件としては、例えば、温度が３７℃、ポリヌクレオチド濃度が１０ｎＭ、Ｎａが０．０４Ｍ、Ｍｇが０．００５Ｍ、などが挙げられる。なお、同じニッキングエンドヌクレアーゼを使用する場合には、あらたに本発明の仲介ポリヌクレオチドを設計する際にはここまでの工程を省くことができる。
【００３４】
次に、検出対象のターゲット配列に依存するｘ２及びｘ３の塩基配列を決定する。ｘ２及びｘ３は、連続してターゲット配列の相補配列とする必要がある。これらはそれぞれ、
ΔＧｘ２＜−１１、及び、
−２０＜ΔＧｙ２＜−１５
を満たすように設計する。
【００３５】
これらを設定するだけで、本発明の仲介ポリヌクレオチドの塩基配列とすることができる。塩基配列が決定すれば、従来公知の方法により、本発明の仲介ポリヌクレオチドを製造することができる。
【００３６】
以下に、本発明の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定方法について説明する。本発明の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定方法は、測定対象試料中に、本発明の仲介ポリヌクレオチド、ニッキングエンドヌクレアーゼ、及び、一端に蛍光物質が結合され他端に蛍光クエンチャーが結合されたプローブを添加すること、並びに、前記試料の蛍光発光を測定することを含む。測定対象のポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドでもよいが、一本鎖であることがより好ましい。
【００３７】
本発明の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定方法には、検出及び／又は測定対象の一本鎖ポリヌクレオチドのターゲット領域と仲介ポリヌクレオチドのターゲット結合領域とが二本鎖を形成することで、前記仲介ポリヌクレオチドのステムループ構造が解除される第１ステップ、ステムループ構造の解除によりアクセス可能となった前記仲介ポリヌクレオチドのプローブ結合領域とプローブとが二本鎖形成する第２ステップ、前記プローブ結合領域とプローブとの二本鎖形成領域にニッキングエンドヌクレアーゼが作用して前記プローブが切断され、切断されたプローブ断片が前記プローブ結合領域から解離するとともに蛍光発光が可能となる第３ステップ、プローブ断片の解離によりアクセス可能となった前記プローブ結合領域へ新たなプローブが結合して二本鎖形成する第４ステップ、及び、前記第３ステップと前記第４ステップが繰り返される第５ステップを含むことが好ましい。すなわち、いったん本発明の仲介ポリヌクレオチドがターゲットと結合すると、プローブの結合、プローブの切断・解離が連続して行われ、反応時間に比例して蛍光発光可能な蛍光物質が増加することが好ましい。
【００３８】
切断されたプローブに結合した蛍光物質の発光は、適切な波長の励起光の照射により行なわれる。例えば、前記蛍光物質がＦＡＭの場合、励起光の波長は４８８ｎｍであり、蛍光の波長は５２０ｎｍ付近測定することができる。なお、測定試料が複数ある場合には、別の蛍光物質を内部標準として添加しておくことが好ましい。この内部標準により試料間の蛍光測定の誤差を補正できる。前記内部標準の蛍光物質としては、特に制限されないが、プローブに結合された蛍光物質が検出される波長と異なる波長で検出可能な蛍光であることが好ましい。プローブの蛍光物質がＦＡＭの場合、例えば、ＲＯＸ（検出波長５０４ｎｍ）を使用できる。前記補正の方法としては、例えば、プローブのＦＡＭ蛍光シグナル強度を、内部標準のＲＯＸ蛍光シグナル強度で割った値を測定データとする方法などが挙げられる。
【００３９】
測定対象のＲＮＡ試料１ｎｍｏｌ／ｍｌに対して、使用する仲介ポリヌクレオチドとしては、例えば、２〜２０ｎｍｏｌ／ｍｌであって、好ましくは、３〜１０ｎｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは、４〜６ｎｍｏｌ／ｍｌである。また、蛍光−クエンチャープローブとしては、１００〜１０００ｍｏｌ／ｍｌであって、好ましくは、１５０〜４００ｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは、１８０〜２００ｍｏｌ／ｍｌである。さらに、ニッキングエンドヌクレアーゼとしては、０．１〜１ＫＵ／ｍｌであって、好ましくは、０．２５〜１ＫＵ／ｍｌ、より好ましくは、０．５〜１ＫＵ／ｍｌである。前記プローブ及びニックエンドヌクレアーゼとしては、上述のものを使用できる。また、酵素単位Ｕは、ニッキングエンドヌクレアーゼの製造業者が提供するものを使用できる。
【００４０】
本発明の検出及び／又は測定方法によれば、好ましくは、ターゲットの量が一定であれば、蛍光量を経時的に測定して増加の傾きを算出することでターゲット量の測定が可能である。また、経時的に測定し、増加の傾きが上昇すれば、ターゲット量が上昇し、増加の傾きは減少すれば、ターゲット量が減少していると分かる。すなわち、本発明によれば、好ましくは、ターゲットのリアルタイムの検出及び／又は測定が可能である。
【００４１】
本発明の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定用装置は、前記蛍光を測定する手段を含むほかは特に制限されない。蛍光の測定を経時的に行うことができ、必要に応じてグラフ化する手段及び／又はデータ補正プログラムを含むことが好ましい。前記データ補正としては、例えば、リアルタイム測定に必要なデータ補正が挙げられる。具体的な補正方法としては、実施例３で示す方法が挙げられる。また、前記蛍光測定手段としては、例えば、蛍光プレートリーダーが挙げられる。
【００４２】
本発明のニッキングエンドヌクレアーゼの使用方法は、本発明の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定方法におけるニッキングエンドヌクレアーゼの使用方法である。具体的には、図１（５）におけるニッキングエンドヌクレアーゼ７の使用方法である。
【００４３】
本発明の一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定キットは、ニッキングエンドヌクレアーゼ、及び、取扱説明書を含む。前記取扱説明書の説明としては、例えば、本発明の仲介ポリヌクレオチドの塩基配列の決定方法等の説明が挙げられる。本発明のキットにおいては、さらに、一端に蛍光物質が結合され他端にクエンチャーが結合され、前記ニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列の切断される側の配列を含むプローブを含んでもよい。
【００４４】
以下、実施例を用いて本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００４５】
（仲介ＤＮＡの作製）
下記ＲＮＡ（バクテリオファージＱβ由来；genbank：AY099114 / QbCDS, 3716-3749の相補鎖；配列番号１）を測定対象（ターゲット）とし、また、使用するニッキングエンドヌクレアーゼをＮｂ．ＢｂｖＣＩＡ（ＮＥＢ社製）として、本発明の仲介ＤＮＡ（以下、Ｌ−ＤＮＡともいう）を作製した（配列番号２）。下記配列番号１で表されるＲＮＡ配列の下線部がターゲット配列であって、Ｌ−ＤＮＡのターゲット結合領域である下記配列番号２で表される配列における下線部配列と相補的である。Ｌ−ＤＮＡは、委託合成により製造した（北海道システムサイエンス社）。
測定対象：5'- gauugauuag gaccgauccg acgagggcac cauc -3'  （配列番号１）
Ｌ−ＤＮＡ：5'- tgccctcgtc ggatcggtcc ttgctcctca gcaaggaccg atcc -3'  （配列番号２）
【００４６】
上記Ｌ−ＤＮＡ配列（配列番号２）において、領域ｘ２、ｘ３、ｙ３、ｚ２及びｙ２、並びに、プローブのΔＧｚ及びΔＧｃｕｔ、Ｌ−ＤＮＡのΔＧｘ２及びΔＧｙ２は、それぞれ、下記表２のようになる。なお、ΔＧは、３７℃、１０ｎＭ、Ｎａ：０．０４Ｍ、Ｍｇ：０．００５Ｍで計算した（DNA folding server又はHybridizataion server）。
【００４７】
【表２】
2008099570.tif 000004
【実施例２】
【００４８】
（既知量ＲＮＡサンプルの測定）
既知量ターゲットＲＮＡ（配列番号１、０．５ｎＭ〜１０ｎＭ）を含むサンプル試料５μｌに対して、１５μｌの下記表３の組成の検出溶液を加えて３７℃で蛍光を測定した。蛍光クエンチャープローブ（ＦＱ−プローブ；配列番号３）は、委託合成により製造した（シグマジェノシス社）。なお、下記プローブ配列の下線部が、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩＡの認識配列である。
ＦＱ−プローブ：ＦＡＭ−cttgctgagg agc−ＢＨＱ１  （配列番号３）
また、内部標準として、ＲＯＸリファレンスダイ（インビトロジェン社製）を使用した。
【００４９】
【表３】
2008099570.tif 000005
【００５０】
蛍光測定は、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System（Applied Biosystems社製）で経時的に行った。測定のための励起光の波長は４８８ｎｍであり、５２０ｎｍでＦＡＭの蛍光強度を測定し、５０４ｎｍでＲＯＸ蛍光強度を測定した。プローブのＦＡＭ蛍光シグナル強度を内部標準のＲＯＸ蛍光シグナル強度で割った値を測定値とした。さらに、この測定値と予め作製した標準曲線とから切断されたプローブの量を算出した。
【００５１】
前記測定の結果を図４（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図４（Ａ）に示すとおり、切断されたプローブの量は、経時的に略直線で上昇した。また、前記直線の傾きは、ターゲットの濃度に応じて上昇した。この直線の傾きとターゲット量との関係を示したのが図４（Ｂ）である。同図に示すとおり、直線の傾きとターゲット量はきれいな線形性を示し、リニアな相関関係があることが分かった（傾き＝０．４０×ターゲット濃度＋１．２８、Ｒ2＝０．９９）。すなわち、未知サンプルのある時点での傾きが分かれば、そのときのターゲット濃度が測定できる。このように、本発明の仲介ＤＮＡによれば、ターゲットの固定化、洗浄工程、前処理や後処理などをすることなく、簡便に一本鎖ＲＮＡを定性及び定量的に測定できた。なお、ターゲット１分子あたり１時間で５０分子程度の蛍光プローブが切断されていた。
【実施例３】
【００５２】
（ＲＮＡのリアルタイム測定）
バクテリアファージＱβのＱβレプリカーゼに＋鎖ＲＮＡ（配列番号４）を加えて−鎖ＲＮＡを合成させながら、本発明の方法で合成される−鎖ＲＮＡの測定を行った。前記Ｑβレプリカーゼは、ＲＮＡを＋鎖から−鎖を合成し、−鎖から＋鎖を合成する酵素である。この測定に用いたＬ−ＤＮＡは、以下のとおりである（配列番号５）。なお、蛍光クエンチャープローブは、実施例２と同様のＦＱ−プローブを使用した。
Ｌ−ＤＮＡ：5'- tttttttttgttttttttagatctcgaggcttgctcctcagcaagcctcgagat -3'  （配列番号５）
【００５３】
０、１２．５、２５及び５０ｎＭのＱβレプリカーゼを含む反応系に下記表４に示すような濃度で、Ｌ−ＤＮＡ、ＦＱ−プローブ、内部標準ＲＯＸ、ニッキングエンドヌクレアーゼ（Ｎｂ．ＢｂｖＣＩＡ（ＮＥＢ社製））を加えて３７℃で反応させながら蛍光強度を測定した。蛍光測定は、上述のとおり、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System（Applied Biosystems社製）で経時的に行った。測定のための励起光の波長は４８８ｎｍであり、５２０ｎｍでＦＡＭの蛍光強度を測定し、５０４ｎｍでＲＯＸ蛍光強度を測定した。プローブのＦＡＭ蛍光シグナル強度を内部標準のＲＯＸ蛍光シグナル強度で割った値を測定値とした。また、後述するデータ補正に用いるためにＱβレプリカーゼ及び＋鎖ＲＮＡに換えて５、１０及び２０ｎＭの標準ＲＮＡ試料を前記反応溶液に添加して測定した。
【００５４】
【表４】
2008099570.tif 000006
【００５５】
上記測定の結果を図５（Ａ）に示す。この測定データを補正して図５（Ｂ）に示すとおり、Ｑβレプリカーゼの添加量（０、１２．５、２５、５０ｎＭ）に応じて合成される−鎖ＲＮＡ（ターゲット）が経時的に増加する様子を示した解析データを得た。すなわち、本発明の仲介ＤＮＡにより、リアルタイムでＲＮＡ量が測定できることが示された。
【００５６】
前記測定データの補正は、例えば、下記通常補正と最高補正の２通りの補正方法で行うことができる。いずれの場合も、まず、蛍光測定値Ｆ、その変化速度（微分）をＶとして、ある時間ｔでのＦとそのτ時間後のＦとの差Ｖ＝（Ｆ（ｔ＋τ）−Ｆ（ｔ））／τを求める。通常補正の場合、標準ＲＮＡ試料について、ターゲット濃度に対して前記Ｖをプロットして標準曲線を描く（図５（Ｃ））。この標準曲線に基づき、未知サンプルのある時間ｔのＶから時間ｔでのターゲット濃度を得る：ＲＮＡ＝ａ×Ｖ−ｂ。最高補正は、蛍光退色やプローブの切断による減少を考慮した補正である。すなわち、蛍光退色の補正を行い、Ｆ２を求める；Ｆ２＝Ｆ×ｅｘｐ（ｋｄｅｃ×ｔ）。また、ＦＱ−プローブが切断により減少していくことの速度に対する影響を補正し、Ｖｃｏｒを求める；Ｖｃｏｒ＝Ｖ／（α×Ｆ２＋１）。その後、前記標準曲線からＲＮＡ濃度を得る；ＲＮＡ＝ａ×Ｖｃｏｒ−ｂ。さらに定常状態になるまでの緩和を補正する：ＲＮＡｃｏｒ＝（ＲＮＡ−ＲＮＡ０）／（１−ｅｘｐ（−ｋ２ｔ））＋ＲＮＡ０。ここで、ｋｄｅｃは退色速度定数、ｋ２は緩和速度定数、ＲＮＡ０は時間０に外装したときの緩和補正前ＲＮＡである。
【実施例４】
【００５７】
（Ｌ−ＤＮＡの特異性の確認）
実施例２と同様のＬ−ＤＮＡ及びＦＱ−プローブを使用した上記表３に示す反応溶液に、ターゲットＲＮＡ（１０ｎＭ）及び非ターゲットＲＮＡである酵母トータルＲＮＡ（２５μｇ、２５０μｇ）を加えて蛍光強度を測定し、Ｌ−ＤＮＡに対する非ターゲットＲＮＡの影響を調べた。その測定結果を図６（Ａ）に示す。同図において、実線がターゲットＲＮＡが存在する場合（＋）、破線がターゲットＲＮＡが存在しない場合（−）を示す。同図に示すとおり、非ターゲットＲＮＡである酵母トータルＲＮＡが２５ｎｇ（ターゲットの約１００倍）存在してもターゲットへの特異性は失われず、しかも、反応速度もほとんど影響されなかった。また、非ターゲットＲＮＡである酵母トータルＲＮＡが２５０ｎｇ（ターゲットの約１０００倍）存在する場合にも、反応速度は落ちるものの、ターゲットＲＮＡの有無で明確な差異がありターゲットへの特異性が失われないことが示された。
【００５８】
次に、実施例２と同様のＬ−ＤＮＡ及びＦＱ−プローブを使用した上記表３に示す反応溶液に、ターゲットＲＮＡ（１０ｎＭ）及びターゲットのアンチセンスＲＮＡ（１０ｎＭ、１００ｎＭ）を加えて蛍光強度を測定し、Ｌ−ＤＮＡに対するアンチセンスＲＮＡによる競合の影響を調べた。その測定結果を図６（Ｂ）に示す。同図において、実線がターゲットＲＮＡが存在する場合（＋）、破線がターゲットＲＮＡが存在しない場合（−）を示す。同図に示すとおり、アンチセンスＲＮＡが１０ｎＭの場合、反応速度が減少した。一方、アンチセンスＲＮＡが１００ｎＭの場合、ターゲットＲＮＡの有無で差がなく、Ｌ−ＤＮＡがターゲットと結合できなくなったことを示す。これらの結果は、Ｌ−ＤＮＡがターゲットＲＮＡに対して高い特異性があることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
以上説明したとおり、本発明の仲介ポリヌクレオチドは、例えば、ウイルス感染病態の臨床診断やトランスクリプトーム解析などに有用である。また、本発明の仲介ポリヌクレオチドを用いた一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定方法は、例えば、現在あまり利用用途がないニッキングエンドヌクレアーゼに有用な使用用途を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、本発明の仲介ポリヌクレオチドを用いた一本鎖ポリヌクレオチドの検出及び／又は測定方法を説明する図である。
【図２】図２は、本発明の仲介ポリヌクレオチドの構成を説明する図である。（Ａ）は、本発明の仲介ポリヌクレオチドの一次元構造の模式図であって、（Ｂ）は、本発明の仲介ポリヌクレオチドがステムループを形成した場合の模式図である。
【図３】図３は、本発明の仲介ポリヌクレオチドの平衡反応のシミュレーションの一例を示す図である。ＬＰＴ及びＬｓｔｅｍＰＴがターゲット依存シグナルで、ＬＰ及びＬｓｔｅｍＰがターゲット非依存のノイズと評価できる定常状態解析モデルである。
【図４】図４（Ａ）は、本発明の仲介ポリヌクレオチドを使用して既知量のターゲットＲＮＡに対するプローブの蛍光発光量を測定した結果の一例を示すグラフであり、図４（Ｂ）は、ターゲットＲＮＡの量と図４（Ａ）における傾きとの関係を示すグラフである。
【図５】図５（Ａ）は、本発明の仲介ポリヌクレオチドを使用してターゲットＲＮＡに対するプローブの蛍光発光量の測定データの一例を示すグラフであり、図５（Ｂ）は、図５（Ａ）の測定データを補正して測定時間におけるターゲットＲＮＡ量を算出した解析データの一例を示すグラフであり、図５（Ｃ）は、前記補正に使用した標準ＲＮＡ試料の標準曲線の一例を示すグラフである。
【図６】図６（Ａ）は、ターゲットＲＮＡ以外のＲＮＡが存在する場合の影響を調べた結果の一例を示すグラフであり、図６（Ｂ）は、ターゲットＲＮＡのアンチセンスＲＮＡが存在する場合の影響を調べた結果の一例を示すグラフである。
【符号の説明】
【００６１】
１・・本発明の仲介ポリヌクレオチド
２・・ターゲット
３・・プローブ
４・・蛍光物質
５・・クエンチャー
６・・ステム構造
７・・ニッキングエンドヌクレアーゼ
８・・蛍光発光
Ｘ・・ターゲット結合領域
Ｙ・・ステムループ形成部
Ｚ・・プローブ結合領域
ｘ２・・ステム形成時ターゲット結合領域
ｘ３・・ステム解離後ターゲット結合領域
ｙ２・・ステム形成領域
ｙ３・・ターゲット非結合ステム形成領域
ｚ２・・ループ領域
【配列表フリーテキスト】
【００６２】
配列番号２：仲介ＤＮＡ
配列番号３：プローブ
配列番号５：仲介ＤＮＡ
【図１】
2008099570.tif 000007
【図２】
2008099570.tif 000008
【図３】
2008099570.tif 000009
【図４】
2008099570.tif 000010
【図５】
2008099570.tif 000011
【図６】
2008099570.tif 000012
【配列表】
2008099570000001.app