(57)【要約】【課題】  新規な細胞融合性リポソーム及びそれを用いた細胞導入方法を提供する。【解決手段】  リポソーム１０００に、該リポソームに親水性物質１０１０を介して、細胞膜結合性を有する疎水性物質１０２０を結合させて、細胞融合性リポソーム１０５０とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームに親水性物質を介して、細胞膜結合性を有する疎水性物質が結合していることを特徴とする細胞融合性リポソーム。
【請求項２】
前記親水性物質は、ポリエチレングリコール、タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリアミド、オリゴヌクレオチド、多糖類、グリコール酸、乳酸、及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞融合性リポソーム。
【請求項３】
前記疎水性物質は、飽和または不飽和の炭化水素鎖、脂質鎖、あるいは複合脂質鎖を含むことを特徴とする請求項１あるいは２に記載の細胞融合性リポソーム。
【請求項４】
前記炭化水素鎖、脂質鎖、複合脂質鎖は、置換基を有する請求項３に記載の細胞融合性リポソーム。
【請求項５】
前記疎水性物質は、炭素数８から２２である飽和または不飽和の炭化水素であることを特徴とする請求項３に記載の細胞融合性リポソーム。
【請求項６】
脂質二重層の内側に内包物を有し、且つ親水性物質を介して、疎水性物質が結合されている細胞融合性リポソームを用意し、前記細胞融合性リポソームと細胞とを融合させて、該細胞に前記内包物を導入することを特徴とする物質導入方法。
【請求項７】
前記親水性物質がポリエチレングリコール、あるいはその誘導体を含み構成され、前記疎水性物質が炭素数８から２２の範囲の飽和または不飽和の炭化水素を含むことを特徴とする請求項６記載の物質導入方法。
【請求項８】
基板に固定化されており、且つ内包物を有する請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞融合性リポソームを用意し、該細胞融合性リポソームと細胞とを融合させて、該細胞に前記内包物を導入するとともに、該細胞を前記基板に固定化することを特徴とする細胞への物質導入方法。
【請求項９】
請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞融合性リポソームを可動部に保持し、細胞に近接あるいは接触させることで、該細胞融合性リポソームと細胞とを融合させて該細胞に前記内包物を導入することを特徴とする細胞への物質導入法。
【請求項１０】
前記細胞内に導入され、且つ該細胞内の分子と結合し得る蛍光分子プローブが、前記内包物か、あるいは前記脂質２重層の内部に含まれることを特徴とする請求項６から９に記載の細胞への物質導入方法。
【請求項１１】
請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞融合性リポソームが、架橋剤を介して、基板に固定化されていることを特徴とするリポソーム固定化基板。
【請求項１２】
請求項８から９に記載の物質導入方法によって、前記内包物が導入されている前記細胞が、前記基板に固定化されていることを特徴とする細胞固定化基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞融合性を備えたリポソーム、該リポソームを用いた細胞への物質導入方法、リポソーム固定化基板、及び細胞固定化基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞生物学や細胞工学の発展に伴い、細胞内の分子挙動を観察するために細胞内分子プローブや、様々な試薬を細胞内に導入する技術の重要性が高まってきている。
【０００３】
また、細胞内のタンパク質を網羅的に発見する機能的プロテオーム解析技術の発展により、数多くの病気の原因タンパク質や、診断マーカーの候補として挙げられる細胞内タンパク質が発見されてきている。
【０００４】
しかし、これらの発見されたタンパク質は、細胞内での機能自体が不明であることが多く、タンパク質の機能を、細胞内で調べる技術が必要とされており、この点からも、細胞内分子プローブ等の技術が必要とされ始めている。
【０００５】
さらに、機能が明らかとなった病気の原因タンパク質に対しても、分子標的薬開発におけるスクリーニングや、バリデーション等の創薬技術にも細胞内物質導入技術は必要とされている。また、さらに細胞内物質の異常を調べる細胞診断技術にも細胞内物質導入技術は必要とされている。
【０００６】
一方、これまでのタンパク質などの物質を導入する手法としては、プロテイントランスダクションドメインを使った方法（非特許文献１）や、ウイルスを利用した導入方法（特許文献１）が知られている。
【０００７】
しかしながら、これらの導入方法は、導入に成功する確率が一般的には低く、細胞の種類によって導入のし易さが異なることが指摘されている。
【０００８】
また、物理的に細胞膜に穿孔を開ける方法として、エレクトロポレーション法あるいは超音波やレーザーを利用した様々な方法が開発されてきているが、当該方法は、細胞傷害性が大きいことが指摘されている。
【特許文献１】国際公開第０３／０１４３３８号パンフレット
【非特許文献１】Ｊａｍｅｓ  Ｅ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｈ．Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｎ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌ  （２００５），Ｖｏｌ．５，ｐｐ．７８２−７８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
細胞膜への物質導入に関しては、細胞傷害性を勘案すると、化学的導入方法やウイルスを利用した導入方法が実用化する上では好ましいと考えられる。
【００１０】
しかしながら、細胞毒性の観点、あるいはウイルスを使用することに伴い内在する危険性の点からは、新規な物質導入方法の確立が求められる。
【００１１】
そこで、本発明は新規な物質導入方法、及びそれに使用される新規な細胞融合性リポソーム、当該リポソームを利用した物質導入方法、リポソーム固定化基板、及び細胞固定化基板を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第１の本発明は、細胞融合性リポソームに関し、リポソームに親水性物質を介して、細胞膜結合性を有する疎水性物質が結合していることを特徴とする。
【００１３】
第２の本発明は、細胞への物質導入方法に関する。まず、脂質二重層の内側に内包物を有し、且つ親水性物質を介して、細胞膜結合性を有する疎水性物質が結合されている細胞融合性リポソームを用意する。そして、前記細胞融合性リポソームと細胞とを融合させて、該細胞に前記内包物を導入することを特徴とする。
【００１４】
第３の本発明は、細胞への物質導入方法に関する。まず、基板に固定化されており、且つ内包物を有する前記第１あるいは第２の本発明に記載の細胞融合性リポソームを用意し、該細胞融合性リポソームと細胞とを融合させる。そして、該細胞に前記内包物を導入するとともに、該細胞を前記基板に固定化することを特徴とする。
【００１５】
第４の本発明は、リポソーム固定化基板に関し、前記第１の本発明に記載されている細胞融合性リポソームが、架橋剤を介して、基板に固定化されていることを特徴とする。
【００１６】
第５の本発明は、細胞固定化基板に関し、前記第３の本発明に記載の物質導入方法により、前記細胞が前記基板に固定化されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、新規な細胞融合性リポソーム、及びそれを用いた細胞への物質導入方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（第１の実施形態：細胞融合性リポソーム）
まず、図１を用いて、本実施形態に斯かる細胞融合性リポソームに関して説明する。
【００１９】
１０５０は、細胞融合性リポソームであり、１０００が、脂質２重層と呼ばれるものである。本実施形態においては、この脂質２重層１０００に、親水性物質１０１０を介して、細胞膜結合性を有する疎水性物質１０２０が結合している。
【００２０】
Ａ）親水性物質
本発明に用いられる親水性物質としては、以下の群の中から選択される少なくとも一種である。ポリエチレングリコール、タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリアミド、オリゴヌクレオチド、多糖類、グリコール酸、乳酸、及びこれらの誘導体である。勿論、前記親水性物質が、上述した群を構成する材料からなる重合体、あるいは共重合体であってもよい。なかでもポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は好ましいものの一例である。
【００２１】
上記リポソーム表面に結合した融合剤（細胞膜結合性を有する前記疎水物質と前記親水性物質をあわせたもの）における前記疎水物質は、その疎水性のために、水中では、当該疎水物質同士が凝集したりする。その結果、前記疎水性物資は、外部の細胞膜にアクセスすることができにくい。
【００２２】
しかしながら、ＰＥＧ等の親水性物質を介して、前記疎水性物質を配置すると、当該疎水物質は水中で凝集が妨げられ、その結果、この疎水物質が細胞膜に結合することができる。つまり、ＰＥＧ等の親水性物質は、前記疎水物質の細胞膜結合を助ける役割がある。
【００２３】
なお、ＰＥＧ等の親水性ポリマーが存在することにより、リポソーム表面上の前記疎水物質は、リポソーム膜から遠く離れることができるので、前記疎水物質の細胞膜への結合を容易にすることができる。
【００２４】
Ｂ）細胞膜結合性を有する疎水性物質
本発明に用いられる疎水性物質としては、飽和または不飽和の炭化水素鎖、細胞膜を構成する脂質及び複合脂質鎖からなる群より選択される。好ましくは炭素数８から２２の範囲の飽和または不飽和の炭化水素から選択されることを特徴とする物質である。例えれば、脂質と呼ばれるものである。
【００２５】
具体的には、オレイル基、ステアリル基、パルミトイル基、あるいはミリストイル基であるが、これらに限定されるものではない。尚、複合脂質とは分子中に糖やリン酸を含む脂質のことであり、代表的なものとして細胞膜構成成分であるリン脂質が挙げられる。なお、疎水性物質として上述した群を構成する材料が置換基を有していてもよい。すなわち、前記した炭化水素鎖等が置換基を備えている場合も、本実施形態に係る発明に包含される。
【００２６】
Ｃ）脂質２重層
本発明に用いられる脂質２重層としては、いわゆるリポソーム膜のことであり、これは細胞膜の成分であるリン脂質を主成分として、水溶液中で自己集合してできる脂質二重膜からなる小胞のことである。なお、脂質２重層であれば、必ずしも、リン脂質２重層でなくてもよい。
【００２７】
また、細胞融合性を有する小胞であれば、いわゆるミセルと呼ばれる構造体やリソソームなども、本発明に適用可能である。
【００２８】
図２は、図１を部分的に拡大した模式図であり、２０００は脂質２重層を、２０１０は親水性物質、２０２０は細胞結合性を有する疎水性物質である。２０５０は、脂質２重層の内側領域（内包物が存在する領域）を示している。
【００２９】
図２に記載しているように、親水性物質２０１０と脂質２重層２０００とは、当該脂質２重層を構成する脂質にＰＥＧ等の親水性物質が化学的に結合して構成されている。
【００３０】
親水性物質２０１０と脂質２重層２０００と結合部において、結合部にあたるアミノ基（ＮＨ−ＣＯ）が、当該脂質２重層に由来するものか、或は、親水性物質２０１０側に由来するものかの判別は難しい。つまり、細胞融合性リポソーム自体からは、いずれに由来するものであるかの判別は難しいが、本実施形態に係る発明は、いずれの場合をも含むものである。
【００３１】
例えば、図３は、リポソームに対して外来性の脂質分子３０９０と末端に官能基、たとえばアミノ基、を持つ親水性物質３０１０からなる分子、すなわち脂質−ＰＥＧ−アミノ基をリポソーム膜に結合させている。その後、親水性物質３０１０の端部官能基に、細胞結合性を有する疎水性物質（図は省略している）を結合させる。
【００３２】
あるいは、図４のように、脂質−ＰＥＧ−ＮＨＳ（図中３０８８）を結合させる。
【００３３】
どちらの場合においても、最終的な構成はリポソーム膜（脂質）５０００−ＰＥＧ５０１０−脂質５０２０（図５）になる。ＰＥＧは、あくまで親水性物質の例であるが、リポソーム由来の脂質あるいは外部から挿入した脂質のどちらに結合してもよい。
【００３４】
Ｄ）細胞融合性リポソームの作り方
以下に本実施形態に係る細胞融合性リポソームの作り方に関して、その一例を実施例１の記載した。
【００３５】
Ｅ）その他
なお、本実施形態に係る発明に適用される親水性物質及び、細胞結合性があり疎水性物質である脂質を有する材料としては、以下のものを採用できる。
【００３６】
即ち細胞膜修飾剤であるＢＡＭ（Ｂｉｏ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ａｎｃｈｏｒ  ｆｏｒＭｅｍｂｒａｎｅ）と呼ばれる材料である。例えば、日本油脂株式会社のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（商標）  ＯＥ−０２０ＣＳを利用できる。ＢＡＭは、一般的には、細胞膜へのアンカーとして脂質オレイル基（本発明における疎水性物質）と、親水性物質であるために物質の水溶性を高めることができるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とからなる。そして、生理活性物質や材料表面に結合させるために、ＰＥＧ鎖末端に各種の反応性基を導入した構造を有する場合もある。
【００３７】
以上、説明した本実施形態に係る細胞融合性リポソームを用いれば、リポソーム外周にＰＥＧなどの親水性物質が結合しているだけのものに比べて、前記疎水性物質の存在により、細胞膜に結合して融合し易くなる。
【００３８】
ここでいう前記疎水性物質とは、前記親水性物質のリポソームと反対側の端部に位置するもののことである。
【００３９】
なお、本実施形態に係る細胞融合性リポソームを基板に固定化すれば、基板固定化融合性リポソームを得ることができる。固定化の手法については、実施形態３あるいは後述の実施例２において説明している。
【００４０】
以下、別の実施形態に係る発明について説明するが、本実施形態において説明した技術事項は、以下の実施形態に係る発明においても、矛盾しない限り、適用できる。
【００４１】
（第２の実施形態：物質導入方法）
図６から図１０を用いて、本実施形態に係る物質導入方法に関する発明について説明する。なお、これらの図において上段の（ａ）では、上述の実施形態１に係るリポソーム６５００と、細胞６９００との全体像を模式的に示している。そして、下段（ｂ）では、リポソームと細胞とが結合し、融合する箇所を拡大した様子を示している。
【００４２】
まず、図６（ａ）、（ｂ）に示すように、以下に示すリポソームを用意する。
脂質二重層６０００の内側に内包物（図は省略している。）を有し、且つ親水性物質６０１０を介して、疎水性物質６０２０が結合されている細胞融合性リポソーム６５００を用意する。そして、融合対象となる細胞６９００と、このリポソーム６５００とを溶液中に共存させる。なお、６９６０は、細胞膜の拡大図である。
【００４３】
図７は、細胞とリポソームとの結合過程を示している。
【００４４】
図７（ａ）に示すように、リポソーム６５００と細胞６９００とが徐々に近づき、まず、リポソーム６０００の外縁に、親水性物質を介して結合している細胞結合性の疎水性物質６０２０が細胞膜内に入り込む。斯かる状態では、疎水性物質６０２０がリポソーム側に由来するのか、細胞膜に由来するのかは、区別がつかない場合が多い。なお、図６と同一のものを指す場合には、図６と同一の番号を付している。
【００４５】
図８は、リポソーム６５００と細胞６９００との距離が更に縮まる接近過程である。細胞膜６９６０内に、アンカーとして埋め込まれた疎水性物質６０２０により、細胞６９００とリポソーム６５００とが接近する。この場合、親水性物質６０１０が両者間に複雑に絡み合うことになる。
【００４６】
図９は、リポソーム６５００と細胞６９００とが実際に融合し始める融合過程を示している。図８（ｂ）における両者の接触部分を中心に細胞膜６９６０が分断し、リポソーム６５００を細胞内に取り込むように、両者が融合していく。なお、リポソームの内包物自体は図６（ｂ）から図１０（ｂ）では省略して、図示していない。
【００４７】
所定の時間を経て、リポソームが細胞内に融合した、新たな融合細胞６９９５が誕生する（図１０（ｂ））。図１０（ｂ）の７０００は、融合細胞６９９５の細胞膜の拡大図であり、７０５０は、その細胞膜の内側の位置を示している。
【００４８】
こうして、リポソームおよび、その内包物を、所望の細胞へ導入することが可能となる。
【００４９】
このような導入方法は、物質導入に際して、細胞にダメージを与え難く、リポソームの内包物全体が導入されることになるので、内包物を一定量にしておけば、細胞へ導入する物質も一定量にすることが可能となる。
【００５０】
更に、内包物として、多種類の試薬を含有させておけば、それらを一括して細胞内へ導入することが可能となる。
【００５１】
Ｆ）内包物
前記内包物には、何らかの目的のために導入しようとする導入物質と共に、実際には溶媒も含まれている。導入物質は、水溶性であれば特に制限されるものではない。
【００５２】
この導入物質の一例としては、細胞内のシグナル分子の挙動を調べるために、細胞内に導入され、且つ該細胞内の分子と結合し得る蛍光分子プローブが挙げられる。
【００５３】
また、リン酸緩衝液生理食塩水に溶解した次の物質なども前記導入物質の例として挙げられる。抗体や酵素等のタンパク質、ｃＤＮＡやＲＮＡｉなどの核酸、単糖、オリゴ糖や糖鎖など糖類、有機化合物、無機化合物、また、これらの複合性物質等である。
【００５４】
なお、細胞内へ導入しようとする物質が、分子全体あるいは一部分が疎水性の場合であっても、以下のような理由で細胞内への導入が可能である。細胞内への導入物質が分子全体あるいは一部分が疎水性の場合には、当該物質をリポソーム膜自体の内部に取り込める。すなわち、図６の６０００で示される膜自体の内部である。この状態で、上述した細胞融合過程を経ると、結果的には、細胞内に物質を導入できる。この場合、リポソームを構成する脂質２重層の内側には、内包物として溶媒のみにしておくこともできる。
【００５５】
すなわち、本実施形態に係る発明には、リポソームの所謂内包物を細胞内へ導入することのみならず、リポソーム膜の内部に導入されている物質を、細胞融合過程を通して、細胞膜へ導入することも含まれる。
【００５６】
また、更に、リポソームに膜タンパク質を組み込んで、細胞膜へ導入すると、細胞膜に膜タンパクを移植（導入）できることになる。この膜タンパク質は、親水性−疎水性−親水性の構成からなり、疎水性部分が細胞膜中にあって、両端の親水性部分は細胞膜の内側と外側に飛び出ている。膜タンパク質は、疎水性部分があるので、水溶液中では凝集して溶けないが、このように膜タンパク質をリポソームに組み込み、そして細胞膜に融合させることによって、細胞膜自体に膜タンパク質を導入することができるようになる。膜タンパク質には、レセプターと呼ばれる、細胞の内外の情報を交換するインターフェースとなっている非常に重要なタンパク質があり、この細胞融合の技術は極めて有用である。
【００５７】
また、細胞内に導入したい所望の物質を、前記融合性リポソームに内包させておき、該融合性リポソームが細胞膜に結合し融合することで、内包した物質を細胞内へ導入することができる。さらに、この融合性リポソームを固定化することで、リポソームの固定化位置として定義された位置に細胞を物質導入と同時に固定化することができる。なお、この種々物質を内包した融合性リポソームを基板上にアレイ状に固定化することで細胞内に種々物質を効率よく導入できる。また、どの細胞にどんな物質が導入されているのかにつき、その固定化位置情報より知ることもできる。
【００５８】
（第３の実施形態：固定化）
次に、本実施形態に係る発明について、図１１を用いて説明する。
【００５９】
まず、基板１１００に固定化された、細胞融合性リポソーム１０５０を用意する。図１１において、１０２０は、細胞融合性を有する疎水性物質（例えば、脂質である。）であり、１０１０は、ＰＥＧ等の親水性物質である。そして、基板には、必要に応じて、１１０５コーティング材でコートしておくのがよい。１１０６は、架橋剤であり、基板へのリポソームの固定化に際して、必要に応じて用いられる。１２５６は内包物の一部である導入物質を示している。
【００６０】
このように、基板に固定化されているリポソームを用いて、上述の実施形態２において説明した、細胞融合過程を経ることによって、基板に固定化されたままの状態で、細胞融合が実現する。その結果、融合細胞自体も基板に固定化されていることになり、換言すれば、位置情報と当該位置に存在する融合細胞が何であるかの情報の２つが取得できる。そのため、複数の内包物をそれぞれ内包した複数個の固定化融合性リポソームを用いると以下のような利点がある。複数の細胞にそれぞれ、このリポソームを導入した場合、これら融合性リポソームを特定の位置に固定化すれば、導入によって得られる固定化細胞にどの内包物が導入したかを特定できる。つまり、複数の内包物を、それぞれ細胞内へ導入し、それぞれの内包物の効果を細胞内で試験する場合、導入された内包物が明らかな細胞が同時に多数得られる。そのため、効率よく試験を進めたい場合に、本実施形態に係る発明を利用することは、極めて有効である。
【００６１】
なお、細胞融合性のリポソームを基板に固定化する方法については、実施例２において詳述している。
【００６２】
Ｇ）基板
石英や硝子やプラスチックなどの基板が好ましいが、例えば可視光に対して、透明な固体材料からなるものであれば好適に利用できる。なお、ガラス基板上にアミノ基を付加するために、タンパク質を硝子表面に物理吸着させて使用することも可能である。
【００６３】
Ｈ）コーティング材
例えば、架橋剤を基板表面に結合させるために、基板表面にアミノ基等の官能基を必要とする場合、コーティング材としてアルブミン、グロブリンやカゼインなどのタンパク質やポリリジンあるいはアミノシランなどを利用できる。そして、これらを基板表面にコートして、該基板表面にアミノ基を提供することができる。架橋剤の種類によってコーティング材は適当な材料を選択すればよい。また必ずしもコーティング材は必要としない。
【００６４】
Ｉ）架橋剤
架橋剤は、反応基（官能基に反応性を持った基である、例えば、ＮＨＳ基やマレイミド基に代表される。）を２つ持った化合物が挙げられる。ＰＥＧの両端に反応基をもったものを架橋剤として利用することもできる。なお、架橋剤は、あらかじめ基板上に結合させてから、リポソームを固定化することもできるし、リポソームに架橋剤を結合させてから基板に結合させることもできる。また、その他の方法でも結合させることができる。
【００６５】
また、架橋剤は、リポソーム由来の脂質に化学結合させることもできるし、リポソーム膜に結合させるための外来性の脂質に化学結合させることもできる。更に、「脂質−ＰＥＧ−反応基」で構成される架橋剤を、その脂質部分でリポソーム膜に挿入して結合させて、他方の反応基で基板表面と結合させて、リポソームを基板に固定化するために用いることもできる。
【００６６】
本実施形態に係る発明によれば、融合細胞が、前記基板に固定化されている細胞固定化基板を実現することができる。
【実施例】
【００６７】
（実施例１：細胞融合性リポソームの作製方法）
精製緑色蛍光タンパク質（クロンテック社製）（以後ＧＦＰと呼ぶ）をリン酸緩衝液食塩水（ｐＨ７．４）（以下、ＰＢＳという。）で希釈して１０μＭ溶液を調製する。この溶液を、以下ＧＦＰ溶液と呼ぶ。
【００６８】
バイアルに入った正電荷エンプティーリポソームＥＬ−０１−Ｃ（日本油脂株式会社製）に、ＧＦＰ溶液２ｍｌ添加したのち混和する。室温で３０分間静置した後、この懸濁液にＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＤＳＰＥ−０２０ＰＡ（日本油脂株式会社製）を終濃度０．１ｍＭになるように添加する。室温１０分間静置した後、このリポソームの懸濁液に４８ｍｌのＰＢＳを混和し、７５０×ｇで５分間室温で遠心する。この液の沈殿を回収し、１ｍｌのＰＢＳで懸濁する。この懸濁液をリポソーム懸濁液という。
【００６９】
このリポソーム懸濁液に、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＯＥ−０２０ＣＳ（日本油脂株式会社製）を、終濃度０．１ｍＭになるように添加し、室温で３０分間反応させると図１で示した融合性リポソームが調製できる。また、リポソーム懸濁液中のリポソームは基板上に架橋剤を使って固定化してからＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＯＥ−０２０ＣＳを反応させてもよい。この場合、図１１で示した基板上に固定化した融合性リポソームが調製でき、下記実施例２に詳細な調製法を記載した。しかし、融合性リポソームの固定化は融合性リポソームを調製した後に固定化してもよい。
【００７０】
ここで記載した調製手順は一例であり、リポソーム外側表面に親水性物質を介して疎水性物質が結合しているものが調製できれば、その調整方法は限定されるものではない。
【００７１】
（実施例２：融合細胞固定化基板の作製方法）
作製方法の一例を図１２（ａ）から（ｆ）に示した。
（ａ）１２０５はウシ血清アルブミン（シグマ社製）であり、ＰＢＳに溶解して０．１％溶液を調製し、この溶液を０．２２マイクロメーター孔を持つ膜でろ過する。これをＢＳＡ液と呼ぶ。直径５ｍｍのウエルを１２個もつ高撥水性印刷スライドグラス（松浪硝子工業株式会社製）１２００を用い、１ウエルにＢＳＡ液を０．０３ｍｌ滴下し、乾燥を避けて室温で１６時間静置する。このスライドグラスをミリＱ水（以後、水と表記）で洗浄し、風乾する。これをＢＳＡコートウエルと呼ぶ。
（ｂ）１２０６は二価性架橋剤ＢＳ３（ピアス社製）であり、ジメチルスルホキシドで溶解し１０ｍＭ溶液を調製する。この溶液をＰＢＳで５０倍希釈する。この液をＢＳ３溶液と呼ぶ。ＢＳＡコートウエルにＢＳ３溶液を０．０３ｍｌ滴下し、室温で２０分間静置する。水でそのウエル表面を洗浄し、窒素ガスを吹きつけて迅速にウエル表面を乾燥させる。
（ｃ）そのウエルに上記実施例１に記載したリポソーム懸濁液を０．０３ｍｌ滴下し、乾燥を避けて、１時間室温で静置する。このウエルをＰＢＳで穏やかに洗浄する。このウエルをリポソーム固定化ウエル（リポソーム固定化基板）と呼ぶ。１２２１はリポソーム表面のアミノ基（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＤＳＰＥ−０２０ＰＡ由来）を、１２５５は固定化されたリポソームを、１２５６は内包物の一部である導入物質を示している。
（ｄ）ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＯＥ−０２０ＣＳ（日本油脂株式会社製）を、ジメチルスルホキシドに溶解して１０ｍＭ溶液を調製する。この液をＰＢＳで希釈して１００μＭ溶液を調製する。この溶液を融合剤液と呼ぶ。リポソーム固定化ウエルに融合剤液を０．０３ｍｌ滴下し、室温で１時間静置する。このウエルをＰＢＳで穏やかに洗浄する。このウエルを融合性リポソーム固定化ウエルと呼ぶ。１２５０は固定化された融合性リポソーム、１０１０は親水性物質、１０２０は細胞膜に結合するための疎水性物質を示している。
（ｅ）６９００で示されているヒト白血病細胞Ｋ５６２をＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳで細胞を懸濁し、１×１０６個／ｍｌの細胞密度の細胞懸濁液を調製する。融合性リポソーム固定化ウエルに細胞懸濁液を０．０３ｍｌ滴下し、３７度で３０分間乾燥を避けて加温する。
（ｆ）このウエルをＰＢＳで穏やかに洗浄すると６９９５で示されている固定化ＧＦＰ導入細胞が得られる。ＧＦＰ導入細胞が固定化されたウエルにＰＢＳ０．０１ｍｌ滴下し、倒立型蛍光顕微鏡でこのウエル上に固定化された細胞の蛍光を観察する。
【００７２】
（実施例３）
作製方法の別の一例を図１３（ａ）から（ｆ）に示した。
（ａ）１２０５に示したウシ血清アルブミン（シグマ社製）を、ＰＢＳに溶解して０．１％溶液を調製し、この溶液を０．２２マイクロメーターの孔を持つ膜でろ過する。これをＢＳＡ液と呼ぶ。１２００としてスライドグラス（松浪硝子工業株式会社製）を用い、ＢＳＡ液にスライドグラスを浸漬し、室温で１６時間静置する。このスライドグラスをミリＱ水（以後、水と表記）で洗浄し、風乾する。これをＢＳＡコートスライドと呼ぶ。
（ｂ）１３００で示される直径１ｍｍの穴があいた厚さ２ｍｍのシリコンゴムをＢＳＡコートスライド上に貼り付ける。１３０６は二価性架橋剤ＢＳ３（ピアス社製）であり、ジメチルスルホキシドで溶解し１０ｍＭ溶液を調製する。この溶液をＰＢＳで５０倍希釈する。この液をＢＳ３溶液と呼ぶ。ＢＳＡコートスライド上のシリコンゴムの穴の中にＢＳ３溶液を０．００５ｍｌ注入滴下し、乾燥を避けて室温で２０分間静置する。水でそのウエル表面を洗浄し、窒素ガスを吹きつけて迅速にウエル表面を乾燥させる。
（ｃ）そのウエルに上記実施例１に記載したリポソーム懸濁液を０．００５ｍｌ滴下し、乾燥を避けて、１時間室温で静置する。このウエルをＰＢＳで穏やかに洗浄する。このウエルをリポソーム固定化ウエルと呼ぶ。１３２１はリポソーム表面のアミノ基（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＤＳＰＥ−０２０ＰＡ由来）、１３５５は固定化されたリポソームを示している。また、１３５６は内包物、１３０６は架橋剤、１２００は基板、１２０５はコーティング材、１３００はシリコンゴムを示している。
（ｄ）ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＯＥ−０２０ＣＳ（日本油脂株式会社製）を、ジメチルスルホキシドに溶解して１０ｍＭ溶液を調製する。この液をＰＢＳで希釈して１００μＭ溶液を調製する。この溶液を融合剤液と呼ぶ。リポソーム固定化ウエルに融合剤液を０．００５ｍｌ滴下し、室温で１時間静置する。このウエルをＰＢＳで穏やかに洗浄する。このウエルを融合性リポソーム固定化ウエルと呼ぶ。１０１０は親水性物質、１０２０は細胞膜に結合するための疎水性物質を示している。
（ｅ）６９００で示されているヒト白血病細胞Ｋ５６２をＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳで細胞を懸濁し、１×１０６個／ｍｌの細胞密度の細胞懸濁液を調製する。融合性リポソーム固定化ウエルに細胞懸濁液を０．００５ｍｌ滴下し、３７度で３０分間乾燥を避けて加温する。
（ｆ）このウエルをＰＢＳで穏やかに洗浄すると６９９５で示されている固定化ＧＦＰ導入細胞が得られる。固定化ＧＦＰ導入細胞スライドをＰＢＳが１０ｍｌ入った１０ｃｍ培養皿の中に浸漬し、倒立型蛍光顕微鏡でこのスライドを観察する。こうして、シリコンゴムの穴の位置で定義された場所だけに固定化された融合性リポソームの内包物であるＧＦＰが導入された細胞が観察できる。固定化リポソームの固定化位置を決めるためにこの例ではシリコンゴムを使用しているが、リポソームが所望の位置に固定化できればどんな方法を使ってもよい。
【００７３】
（実施例４）
上記の実施例１から３において、融合性リポソームが固体基板上に固定化されている実施例を示した。本実施例に示すように可動部に融合性リポソームを保持させることでＧＦＰ導入細胞を作成することもできる。本実施例における手法を用いることで、細胞に対して穿孔のための外力を与えることのない物質導入が可能になると同時に細胞−融合性リポソーム間の距離を接近させることで所望の細胞との選択的融合を促すこともできる。以下に作製方法の一例を図１４（ａ）から（ｃ）に示した。
（ａ）倒立蛍光顕微鏡に取り付けたマイクロマニピュレータを用いて、上記実施例１の手順に従って調整した融合性リポソームをホールディングピペットに保持させる。融合性リポソームの保持は倒立蛍光顕微鏡により確認する。
（ｂ）倒立蛍光顕微鏡下で上記融合性リポソームを所望の細胞に接近させる。
（ｃ）ホールディングピペットを介して融合性リポソームと細胞表面とを接触させることにより６９９５で示されている固定化ＧＦＰ導入細胞が得られる。融合の確認およびリポソーム内包物の観察は倒立蛍光顕微鏡により観察を行なう。
【００７４】
また、公知の方法で所望の細胞を基板上に予め固定しておけば、ＧＦＰが導入された固定化細胞を得ることができる。細胞と融合性リポソームとの融合過程を促すために可動部を利用して両者の距離を縮めるだけでなく、物理的あるいは化学的な外力をさらに加える工程を含んでもよい。
【００７５】
本実施例の手法は細胞に対して所望の内包物を導入することができると同時に、観察を行ないながら目的の細胞内に内包物を投入する順番や投入の瞬間からの経時変化を追うことによる細胞ダイナミクス観察に対して適用することができる。
【００７６】
以上、本発明に係る実施例について説明した。
【００７７】
細胞内にタンパク質などの物質を導入するために、本発明に係る融合性リポソームは、表面に親水性物質でつながれた疎水性物質を持ち、該疎水性物質が細胞膜に結合する性質を利用して、リポソームを細胞膜に結合させるものである。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、細胞内のシグナル分子の挙動を調べるために、蛍光標識付きの抗体などに代表される分子プローブを細胞内へ導入できる技術である。そして、細胞内のシグナル分子の観察により、各種疾患の原因究明のための測定システムに利用できる。また、創薬のための細胞内での物質挙動のバリデーションシステムや病気の診断のための細胞診断装置の基本技術としての利用が期待できる。更にまた、本発明に係る細胞融合性リポソームは、導入物質として医薬をいれておけば、いわゆるドラッグデリバリーシステムなどにも適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明に係る細胞融合性リポソームを概念的に示したものである。
【図２】本発明に係る細胞融合性リポソームを概念的に示したものである。
【図３】本発明に係る細胞融合性リポソームを概念的に示したものである。
【図４】本発明に係る細胞融合性リポソームを概念的に示したものである。
【図５】本発明に係る細胞融合性リポソームを概念的に示したものである。
【図６】本発明に係る細胞融合性リポソームと細胞との融合過程を概念的に示した図である。
【図７】本発明に係る細胞融合性リポソームと細胞との融合過程を概念的に示した図である。
【図８】本発明に係る細胞融合性リポソームと細胞との融合過程を概念的に示した図である。
【図９】本発明に係る細胞融合性リポソームと細胞との融合過程を概念的に示した図である。
【図１０】本発明に係る細胞融合性リポソームと細胞との融合過程を概念的に示した図である。
【図１１】本発明に係る基板に固定化されている細胞融合性リポソームの概念図である。
【図１２】実施例２を説明するための図である。
【図１３】実施例３を説明するための図である。
【図１４】実施例４を説明するための図である。
【符号の説明】
【００８０】
１０００  脂質２重層
１０１０  親水性物質
１０２０  細胞結合性を有する疎水性物質
１０５０  融合性リポソーム
１１００  基板
１１０５  コーティング材
１１０６  架橋剤
１２００  基板
１２０５  コーティング材
１２０６  架橋剤
１２２１  リポソーム表面のアミノ基
１２５０  固定化された融合性リポソーム
１２５５  固定化されたリポソーム
１２５６  内包物
１３００  ブロッキング材
１３０６  所望の位置に修飾された架橋剤
１３２１  リポソーム表面のアミノ基
１３５５  所望の位置に固定化されたリポソーム
１３５６  内包物
２０００  リポソームの脂質２重層
２０１０  親水性物質
２０２０  疎水性物質
２０５０  リポソームの内側
３０００  リポソームの脂質２重層
３０１０  親水性物質
３０９０  脂質
３０８８  脂質−ＰＥＧ−反応基からなる試薬
５０００  リポソームの脂質２重層
５０１０  親水性物質
５０２０  疎水性物質
６０００  リポソームの脂質２重層
６０１０  親水性物質
６０２０  疎水性物質
６９６０  細胞膜
６５００  融合性リポソーム
６９００  細胞
６９９５  融合性リポソームの内包物が導入された細胞
７０００  リポソームが融合した後の細胞膜
７０５０  細胞の内部
１４００  可動部
【図１】
2008081486.tif 000003
【図２】
2008081486.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2008081486.tif 000008
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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