(57)【要約】  【課題】  本発明は、多段階を要しない、容易で効率的なＬ−カルニチンの製造方法を提供する。【解決手段】以下の工程を含む、Ｌ−カルニチンの製造方法。（１）１，３−ジハロ−２−プロパノールにハロヒドリンエポキシダーゼの存在下、シアニドドナーを作用させて、光学選択的に（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを得る工程。（２）（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのハロゲンをトリアルキルアミンで置換し、Ｌ−カルニチンニトリルハライドを得る工程。（３）Ｌ−カルニチンニトリルハライドのニトリル基を加水分解し、Ｌ−カルニチンを得る工程。  本方法により、不斉炭素を持たない１，３−ジハロ−２−プロパノールを出発として、わずか３段階で、光学純度を低下させずにＬ−カルニチンを効率的に得ることが可能となる。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、Ｌ−カルニチンの製造方法。
（１）１，３−ジハロ−２−プロパノール（一般式１）にハロヒドリンエポキシダーゼの存在下、シアニドドナーを作用させて、光学選択的に（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（一般式２）を得る工程。
【化１】
2008133198.tif 000014
（式中Ｘはハロゲン原子を示す。）
【化２】
2008133198.tif 000015
（式中Ｘはハロゲン原子を示す。）
（２）（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（一般式２）のハロゲンをトリアルキルアミン（一般式３）で置換し、Ｌ−カルニチンニトリルハライド（一般式４）を得る工程。
【化３】
2008133198.tif 000016
（上記式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３は、それぞれ、互いに独立し、同一または異なって、置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ２０炭化水素基である。）
【化４】
2008133198.tif 000017
（３）Ｌ−カルニチンニトリルハライド（一般式４）のニトリル基を加水分解し、Ｌ−カルニチン（一般式５）を得る工程。
【化５】
2008133198.tif 000018
【請求項２】
前記工程（２）において、（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度を１〜２０質量％とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程（２）において、トリアルキルアミンを（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルに対して１．１〜８．０当量作用させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（２）において、反応温度を１０〜３０℃とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（３）において、反応温度を２０〜７０℃とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（１）及び（２）において、（Ｒ）―４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル及びＬ−カルニチンニトリルハライドを単離することなく、１，３−ジハロ−２−プロパノールからワンポットでＬ−カルニチンを製造する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＬ−カルニチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−カルニチンはビタミンＢＴとも言われ、生体内で脂肪酸の代謝に関係している重要な化合物である。心臓疾患治療剤（特許文献１）、過脂肪質血症治療剤（特許文献２）、静脈疾患治療剤等（特許文献３）として注目されてきた。
【０００３】
従来のＬ−カルニチン製造法としては、Ｄ−マンニトールを原料として製造する方法（特許文献４）、γ−ハロアセト酢酸エステルを原料として酵素により不斉還元することを特徴とする方法（特許文献５）、リパーゼを用いて光学選択的に（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを合成することを特徴とする方法（特許文献６）、γ−ブチロベタイン又はクロトノベタインから微生物によってＬ−カルニチンを製造する方法（特許文献７）、カルニチンアミドハライドをｄ−樟脳酸により光学分割し、Ｌ−カルニチンに導く方法（特許文献８）などが挙げられる。
【０００４】
【特許文献１】特開昭５４−７６８３０号
【特許文献２】特開昭５４−１１３４０９号
【特許文献３】特開昭５８−８８３１２号
【特許文献４】特開昭５７−１６５３５２号
【特許文献５】特開昭５９−１１８０９３号
【特許文献６】特開平０２−２７９９５号
【特許文献７】特開昭６０−２２４４８８号
【特許文献８】特公昭４５−９１７２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のごとく、Ｌ−カルニチンは化学合成法で製造されたラセミ体を光学分割する方法、及び微生物や酵素を用いて生化学的に採取する方法で製造されている。
【０００６】
化学合成法は、高濃度で反応が行えることや反応時間が短くて済むことなど、工業生産上や経済性の面から利点があるが、光学分割するために比較的高価な光学分割剤を必要とすることなどの欠点がある。また不要な対掌体を有効利用する方法の開発が不可欠となる。
【０００７】
一方、生化学的方法は、酵素、微生物の触媒作用を利用し、高い光学純度で目的物を合成できる利点がある。しかし、酵素反応は反応基質や生成物阻害を受けることもあり、高濃度に生成物を蓄積することが困難となる場合がある。また、補酵素や補因子を必要とする反応では、それらの追添加やリサイクルが必要となり、工程が煩雑となる。さらには発酵法で製造する場合、生育に必要な栄養分を補給や代謝系の制御など、煩雑な反応制御が必要となる場合がある。
【０００８】
より具体的には、Ｄ−マンニトールを原料とする方法の場合、光学分割する必要はないものの、多くの工程を含み高価かつ危険な四酢酸鉛を必要とする。γ−ハロアセト酢酸エステルを原料とする方法の場合、エステル基が低級の場合酵素の還元作用が低い。リパーゼを用いる方法や光学分割剤を用いる方法は、不要な光学活性化合物が発生してしまう。γ−ブチロベタイン若しくはクロトノベタインから微生物によってＬ−カルニチンを製造する方法は、釜効率が０．５％〜１．５％程度と低く生産性が悪い。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑み、多段階を要しない、容易で効率的なＬ−カルニチンの製造方法を鋭意検討した結果、１，３−ジハロ−２−プロパノールを出発とし、光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを経るルートで、光学分割剤を使用せず、かつ光学純度を低下させることなく、わずか三段の反応で効率的にＬ−カルニチンを得ることができるルートを見出し、本発明を完成させた。  
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の工程を含む、Ｌ−カルニチンの製造方法である。
（１）１，３−ジハロ−２−プロパノール（一般式１）にハロヒドリンエポキシダーゼの存在下、シアニドドナーを作用させて、光学選択的に（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（一般式２）を得る工程。
【化１】
2008133198.tif 000002
（式中Ｘはハロゲン原子を示す。）
【化２】
2008133198.tif 000003
（式中Ｘはハロゲン原子を示す。）
（２）（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（一般式２）のハロゲンをトリアルキルアミン（一般式３）で置換し、Ｌ−カルニチンニトリルハライド（一般式４）を得る工程。
【化３】
2008133198.tif 000004
（上記式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３は、それぞれ、互いに独立し、同一または異なって、置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ２０炭化水素基である。）
【化４】
2008133198.tif 000005
（３）Ｌ−カルニチンニトリルハライド（一般式４）のニトリル基を加水分解し、Ｌ−カルニチン（一般式５）を得る工程。
【化５】
2008133198.tif 000006
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、不斉炭素を持たない１，３−ジハロ−２−プロパノールを出発として、わずか３段階で、光学純度を低下させずにＬ−カルニチンを効率的に得ることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、以下の工程を含む、Ｌ−カルニチンの製造方法である。
（１）１，３−ジハロ−２−プロパノール（一般式１）にハロヒドリンエポキシダーゼの存在下、シアニドドナーを作用させて、光学選択的に（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（一般式２）を得る工程。
【化１】
2008133198.tif 000007
（式中Ｘはハロゲン原子を示す。）
【化２】
2008133198.tif 000008
（式中Ｘはハロゲン原子を示す。）
（２）（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（一般式２）のハロゲンをトリアルキルアミン（一般式３）で置換し、Ｌ−カルニチンニトリルハライド（一般式４）を得る工程。
【化３】
2008133198.tif 000009
（上記式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３は、それぞれ、互いに独立し、同一または異なって、置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ２０炭化水素基である。）
【化４】
2008133198.tif 000010
（３）Ｌ−カルニチンニトリルハライド（一般式４）のニトリル基を加水分解し、Ｌ−カルニチン（一般式５）を得る工程。
【化５】
2008133198.tif 000011
上記式中、Ｘは、入手が容易であるの観点から塩素、即ち、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、また、臭素である、１，３−ジブロモ−２−プロパノールが好ましい。
式３のトリアルキルアミンとしては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン等が好ましい。
【００１３】
第１の工程では、１，３−ジハロ−２−プロパノールにハロヒドリンエポキシダーゼの存在下、シアニドドナーを作用させて、光学選択的に（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを得る。
【００１４】
シアニドドナーとは、具体的には青酸（ＨＣＮ）、青酸ナトリウム（ＮａＣＮ）、青酸カリウム（ＫＣＮ）、アセトンシアンヒドリンなどを指す。本発明で使用するシアニドドナーとしては、シアン化水素、シアン化カリウム、シアン化ナトリウムが好ましい。
【００１５】
ハロヒドリンエポキシダーゼとは、１，３−ジハロ−２−プロパノールを、脱ハロゲン化水素して、下記一般式（６）、
【化６】
2008133198.tif 000012
[Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素を示す。]
で表されるエピハロヒドリンを合成する活性、及びその逆反応を触媒する活性を有する酵素（EC number:4.5.1.-）を意味する。
【００１６】
この酵素を産生する微生物としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）sp.N-1074（FERM BP-2643）、ミクロバクテリウム（Microbacterium）sp.N-4701（FERM BP-2644）、アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）AD1、マイコバクテリウム（Mycobacterium）sp.GP1、アースロバクター（Arthrobacter）sp.AD2等が挙げられる。好ましい微生物としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）sp.N-1074（FERM BP-2643）である。
【００１７】
また、ハロヒドリンエポキシダーゼ及びそれをコードする遺伝子は、例えば、GenBankに公表されており、コリネバクテリウム（Corynebacterium）sp.N-1074由来のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（hheB）のAccession番号はD90350である。
【００１８】
上記の微生物が産生するハロヒドリンエポキシダーゼの他にも、ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を適当なベクターに組込んで作製した遺伝子組換え微生物が産生するものも使用できる。また、上述の微生物にニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理等を施し変異させた変異体微生物が産生する酵素、野生型の酵素遺伝子を改変し、酵素機能を改変した酵素についても、上記のハロヒドリンエポキシダーゼ活性を有するものであれば本発明に用いることができる。
【００１９】
前記ハロヒドリンエポキシダーゼを生産する微生物を培養するための培地としては、通常これらの微生物が生育し得るものであれば何れのものでも使用できる。炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、マルトースやフルクトース等の糖類、酢酸、クエン酸やフマル酸等の有機酸あるいはその塩、またはエタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、硫酸、塩酸、燐酸やホウ酸などの無機酸あるいはその塩、用いられる微生物が利用可能なナトリウム、マグネシウム、カリウム、カルシウムなどを含む無機塩、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケル微量金属塩、微生物育成促進剤としてビタミンＢ１、Ｂ２、Ｃ、Ｋ等のビタミン等が必要に応じて適宜添加される。
【００２０】
本発明の微生物の培養は、通常は液体培養で行われるが、固体培養によっても行うことができる。培養は１０〜５０℃の温度で、ｐＨ  ２〜１１の範囲で行われる。微生物の生育を促進させるために通気攪拌を行ってもよい。培養により得られた微生物は、培養液そのまま若しくは該培養物から遠心分離等の集菌操作によって得られる微生物菌体、若しくは菌体処理物（例えば、菌体破砕物、粗酵素、精製酵素）あるいは常法により固定化した菌体または菌体処理物の形で、ハロヒドリンエポキシダーゼとして利用することができる。
【００２１】
酵素溶液を調製する場合、その抽出は常法、例えば超音波処理、フレンチプレス、酵素処理等によって実施すればよい。調製物にはハロヒドリンエポキシダーゼ以外の成分が含まれていても反応に悪影響を与えなければ特に精製する必要はない。目的の酵素が失活することを防止するため、プロテアーゼ阻害剤、金属イオン等を添加することも可能である。
【００２２】
上記調製に際しては、目的の酵素遺伝子が高発現する観点から、上述の遺伝子組換え微生物を培養して得られるハロヒドリンエポキシダーゼが好ましい。また、形質転換に用いる宿主微生物としては、大腸菌や酵母等、すでに汎用的な宿主―ベクター系が確立されているものが例示できる。またロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌に属する微生物も好適な宿主として挙げられる。しかし、特にこれらに限定されるものではなく、目的酵素遺伝子が高発現するものであれば他の宿主微生物を用いることもできる。
【００２３】
１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとからの酵素反応は、酵素活性の最適ｐＨ４〜１０の付近である水または緩衝液の存在下で行われる。緩衝液としては、例えば、青酸、リン酸、ホウ酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸又は酢酸等の塩等によって構成される緩衝液、トリス緩衝液あるいはグッド緩衝液等が例示され、青酸とその塩によって構成される緩衝液、トリス緩衝液が好ましく、特に、青酸とその塩によってのみ構成される緩衝液が緩衝剤由来の不純物が混入しない点で好ましい。
【００２４】
上記緩衝液への、シアニドドナー、１，３−ジハロ−２−プロパノール、ハロヒドリンエポキシダーゼの投入順序については、特に制限されないが、シアニドドナーとハロヒドリンエポキシダーゼの混合溶液へ、１，３−ジハロ−２−プロパノールを添加する方法が、反応開始時に高い反応速度を得られる点、及びエピハロヒドリンの副生を抑えることができる点で好ましい。反応系内のシアニドドナーは、反応開始時において０．０１〜１．５ｍｏｌ／ｋｇとなるように調整することが好ましく、０．８〜１．５ｍｏｌ/ｋｇの方がより好ましい。
【００２５】
また、１，３−ジハロ−２−プロパノールは反応開始時において０．０１ｍｏｌ/ｋｇ以上となるように予め系内に存在させておくことが、反応開始時に高い反応速度を得られる点で好ましい。
【００２６】
シアニドドナーは反応の進行により消費されるため、常に反応系内に０．０５〜１．５ｍｏｌ/ｋｇ存在させておくことが好ましい。シアニドドナーの使用量は、最終的に使用する１，３−ジハロ−２−プロパノールの１．０〜２．０当量とすることが、反応速度の向上、及びシアニドドナーの効率的な利用の観点から好ましい。
【００２７】
反応温度は、１０〜３０℃とすることが酵素の安定性が良く、円滑に反応が進行する点から好ましい。
【００２８】
反応が進行するに際し、反応液中にハロゲン化水素が生成するためｐＨが低下していくが、反応系内にアルカリを追添加することにより、系内のｐＨを酵素の活性が発揮される７．０〜８．５とすることが、反応の円滑な進行、及び副反応抑制の観点から好ましい。
【００２９】
系内に加えるアルカリとしては、ハロゲン化水素と塩を形成し、その塩の水溶液が酵素の活性が発揮されるｐＨ領域にあるものであれば特に制限されず、例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金属またはアンモニアの、水酸化物あるいは弱酸との塩が挙げられ、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、シアン化ナトリウム、シアン化カリウムが好ましい。アルカリの使用形態としては、特に制限されないが、取り扱いの容易さから水溶液が好ましい。
【００３０】
ハロヒドリンエポキシダーゼの使用量は特に制限されず、反応が円滑に進行する量を使用すればよい。例えば、反応開始時において反応液１ｇあたり１Ｕ〜１０００Ｕ使用することができる。ここで、１Ｕ（ユニット）とは、２０℃、ｐＨ８．０の緩衝液中において、１，３−ジクロロ−２−プロパノールから１分間に１μｍｏｌのエピクロロヒドリンを生成することができる酵素量のことを表す。
【００３１】
反応時間は、基質等の濃度、菌体濃度、又はその他の反応条件等によって適時選択するが、１〜１２０時間で反応が終了するように条件を設定するのが好ましい。
【００３２】
上述の方法により、（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを反応系内に０．３ｍｏｌ／ｋｇを超えて蓄積させることができる。反応液中に生成、蓄積した（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは公知の方法を用いて採取及び精製することができる。例えば、反応液から遠心分離等の方法を用いて菌体を除いた後、酢酸エチルなどの溶媒で抽出を行い、減圧下に溶媒を除去することにより、やや黄味４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの透明溶液を得ることができる。また減圧下で蒸留することによりさらに精製することもできる。
【００３３】
第２の工程では、（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのハロゲンをトリアルキルアミンで置換し、Ｌ−カルニチンニトリルハライドを得る。
（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルからＬ−カルニチンを導く場合、該ニトリルを加水分解してからトリアルキルアミンによる４級化反応（以下、４級化反応と略す）を行う方法が考えられるが、（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを加水分解して（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸を得るのは容易なことではない。
【００３４】
例えば、塩基を触媒として加水分解を行おうとすると、脱ハロゲン化水素化が起こり、エポキシ化合物が生成してしまう。さらにこのエポキシ化合物は、塩基性条件下では非常に不安定であり、異性化して４−ヒドロキシクロトン酸誘導体に変化する。
【００３５】
また、特開平４−１２４１５７号に示されているように、塩酸によるニトリルの加水分解反応では、過酷な条件下での反応が必要であり、煩雑な単離操作も相まって収率が６０％程度と十分ではない。また強酸性条件下であるために、後のトリアルキルアミンを作用させる４級化反応において一部のトリアルキルアミンが残留酸、クロトン酸の中和に使用され、効率が悪い。
さらに、ニトリルを酸で加水分解した後、アルコールを加えてエステルを製造し、その後、４級化反応を行う方法も考えられるが、この方法は製造したエステルを再び加水分解によりカルボン酸に戻す必要があるため、効率的ではない。
【００３６】
また、ニトリルをアミドまで加水分解させ、アミドの４級化反応を行う方法も考えられる。しかし、化学的反応により効率よく４-ハロ-３-ヒドロキシブチルアミドを得ることは容易ではない。一般的に塩酸などの鉱酸やアルカリを使用してニトリルを水和し、アミドに変換する方法が知られているが、例えば酸触媒による水和反応では、塩酸中で沸騰させるなどの厳しい条件が必要であり、ここで一部脱水反応が進行してしまう。また対応する酸が副生し効率よくアミドを生成することができない。また塩基性触媒による水和反応では、４-ハロ-３-ヒドロキシブチロニトリルを原料とする場合は、上述のようにエポキシ化合物の生成とそれに対応するクロトン酸誘導体生成反応が起こってしまい、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを製造することは容易ではない。
【００３７】
よって、（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルをＬ−カルニチンに導く製造ルートとしては、まず（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルにトリアルキルアミンを作用させ、その後、該ニトリルを加水分解する順序が好ましい。
【００３８】
Ｌ−カルニチンニトリルハライドを製造する４級化反応（以下４級化反応と略す）について、（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを無溶媒でトリアルキルアミンを作用させて４級化反応を行う場合、無水のトリアルキルアミンを反応させた方が、副反応を抑制しＬ−カルニチンニトリルハライドを高収率で得ることができるため、より好ましい。ただし、低沸点のトリアルキルアミンを使用する場合、より効率的に反応を進めるためには、オートクレーブ等の装置を必要とする場合がある。その場合、下記に記載するように水溶液で使用しても構わない。
【００３９】
４級化反応において、（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの溶液を用いて反応を行う場合、その溶媒は特に限定されるものではない。有機溶剤でも水でも、第１の工程で得られた（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル溶液をそのまま用いても良い。
【００４０】
使用される有機溶剤としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどのアルコール系溶媒、アセトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、プロピオン酸エチル、メタクリル酸メチルなどのエステル系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルムなどの塩素系溶媒、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。これらの混合溶剤であっても構わない。
この反応の際に使用するトリアルキルアミンは、無水のトリアルキルアミンでもその水溶液でもどちらでも構わないが、水と相溶性のある有機溶剤を溶媒として用いた場合は、水溶液を用いた方が高収率と高反応速度をもたらすことが多く、より好ましい。しかし、総じて有機溶剤よりも水を単独で溶媒として用いて反応を行う方が高収率と高反応速度をもたらすため、（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを水に溶かした水溶液か、１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、ハロヒドリンエポキシダーゼを用いて（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを合成した反応あがりの水溶液をそのまま用いることが、より好ましい。
【００４１】
４級化反応における（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度は、特に限定されないが、通常０．１〜５０質量％程度であり、濃度が高すぎたり低すぎたりすると反応速度の低下を招くことから１〜２０質量％程度がより好ましい。トリアルキルアミンの使用量は、特に限定されるものではないが、通常（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルに対して１．０〜２０．０当量（モル）であり、１．１〜８．０当量程度がより好ましい。反応温度は特に限定されるものではないが、通常−１０℃〜６０℃程度であり、高い反応速度と収率を得るために、１０℃〜３０℃程度がより好ましい。
【００４２】
以上のようにして合成したＬ−カルニチンニトリルハライドは、抽出、カラム分離、再結晶等の定法に従い、単離精製することができる。
【００４３】
第３の工程では、Ｌ−カルニチンニトリルハライドを加水分解してＬ−カルニチンを得る。この加水分解反応の方法は特に限定されず、酸触媒、塩基触媒を用いた種々の公知の方法で行うことができる。例えば特公昭３６−２１７１８号、特公昭３７−５１７１号、特公昭３６−２１８６５号に記載されているように、濃塩酸中で加熱することにより加水分解する方法がある。
【００４４】
また、一旦、Ｌ−カルニチンアミドハライドに変換させて２段階で加水分解を行う方法も有効で、例えば特公昭３８−２３号に示されているように、過酸化水素水溶液や過酸化ナトリウム、過酸化カリウム、過酸化バリウム等の無機過酸化物とアンモニアを用いてニトリルをアミドに変換することが可能で、特公昭４５−９１７２号に示されているように、カルニチンニトリルハライドを塩酸中１５〜５５℃で１０〜６０時間反応させることで、カルニチンアミドハライドを製造することが可能である。
【００４５】
かかる後にアミドを加水分解すれば、Ｌ−カルニチンを得ることができる。アミドを加水分解する方法としては、例えば特公昭４３−２６８４９号、特開昭５５−１３２９９号にはシュウ酸を用いて加水分解反応を行う方法、特公昭４３−２６８５０号にはｎ−亜硝酸ブチルと氷酢酸及び塩酸ガスを用いて加水分解する方法、特開平１−２８７０６５号には、塩基としてアルカリ金属水酸化物やアルカリ土類金属水酸化物を用いた加水分解反応が示されている。塩基性物質としては、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩または重炭酸塩、第３級アミン、第４級アンモニウムヒドロキシド、塩基性陰イオン交換樹脂などが挙げられ、具体的にはＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、トリエチルアミン、ＮＨ４ＯＨ、ＩＲＡ−４００などが挙げられる。これらは単独で用いても、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。特にＮａＯＨ、ＫＯＨは反応を室温下でも効率よく進めることができるのでより好ましい。
【００４６】
塩基の使用量は、カルニチンアミドハライドに対して等モル以上になるように加えればよく、１．１〜２．０当量程度がより好ましい。カルニチンアミドハライドの濃度は特に限定されないが、通常は１〜５０質量％程度で、５〜３０質量％程度がより好ましい。反応温度は特に限定されないが、通常は５〜１００℃が好ましく、３０〜７０℃がより好ましい。
【００４７】
溶媒としては、水とアルコールなどの有機溶媒との混合溶媒系でも反応は支障なく進むが、反応速度と副反応抑制の観点から水のみを使用することが好ましい。また４級化反応を水溶媒で行った場合は、そのまま継続して水溶媒中で加水分解反応を行うことがより好ましい。
【００４８】
以上に示した製造ルートの中で、Ｌ−カルニチンの光学純度を決める主たるステップは（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する第１の工程であり、第２及び第３の工程を経ても、第１の工程で製造した（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの光学純度を保ち、光学純度の高いＬ−カルニチンを製造することが可能である。
【００４９】
また製造したＬ−カルニチンは、公知の方法を用いて採取及び精製することができる。例えば第３の工程終了後、中和操作を施した後に溶媒を留去し、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等のアルコールを用いて副生する無機塩を除去、または電気透析で同じく無機塩を除去し、かかるのちに良溶媒である上記のようなアルコール系溶媒と、アセトンのような貧溶媒を用いて再結晶する方法が挙げられる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。
＜参考例＞  各種化合物の分析条件
本発明において使用したＨＰＬＣは日本分光製であり、詳細を以下に示す。
【００５１】
[ＨＰＬＣ分析条件１]
１）１，３−ジクロロ−２−プロパノール（以下、ＤＣＰと略す）
（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（以下、（Ｒ）−ＣＨＢＮと略す）
４−ヒドロキシクロトノニトリル（以下、ＨＣ−ＣＮと略す）
３−ヒドロキシグルタロニトリル（以下、Ｄｉ−ＣＮと略す）
<試料調製方法>               : 反応液を移動相に溶解
<カラム>                     : Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ-３Ｖ， 
４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ、 粒径５μｍ
（ＧＬサイエンス製）
<カラムオーブン温度>  : ４０℃
<移動相>              : ０．０５質量％  トリフルオロ酢酸水溶液、１ｍＬ/ｍｉｎ
<検出器>              : 示差屈折計(日本分光製ＲＩ-２０３１)
<保持時間>            ：ＤＣＰ               ３３ｍｉｎ
：（Ｒ）−ＣＨＢＮ  １１．０ｍｉｎ
：ＨＣ-ＣＮ          ７．５ｍｉｎ
：Ｄｉ−ＣＮ         ５．１ｍｉｎ
【００５２】
[ＨＰＬＣ分析条件２]
２）Ｌ−カルニチンニトリルハライド（以下Ｌ−Ｃａｒ−ＣＮと略す）
Ｌ−カルニチンアミドハライド（以下Ｌ−Ｃａｒ−アミドと略す）
Ｌ−カルニチン（以下Ｌ−Ｃａｒと略す）
<試料調製方法>               : 反応液を移動相に溶解
<カラム>              ：Ｓｈｏｄｅｘ  ＩＣ  ＹＫ−４２１， 
４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１２５ｍｍ（ＧＬサイエンス製）
<カラムオーブン温度>  : ４０℃
<移動相>              : ３ｍＭ  ＨＮＯ３ａｑ／ＡＴＮ＝４：６、１ｍＬ/ｍｉｎ
<検出器>        : 電気伝導度検出器（ＣＤ−５）  Ｓｈｏｄｅｘ製
<保持時間>      ：Ｌ−Ｃａｒ−ＣＮ  ７．１ｍｉｎ
：Ｌ−Ｃａｒ−アミド  １０．１ｍｉｎ  
：Ｌ−Ｃａｒ  ７．９ｍｉｎ
【００５３】
＜実施例１＞  L-Car合成：１
以下のようにしてハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換微生物の培養を行い、それを用いて１，３−ジクロロ−２−プロパノールから（Ｒ）−ＣＨＢＮを合成した。
【００５４】
i）菌体懸濁液の調製
ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持つ大腸菌(Escherichia coli) ＪＭ１０９/ｐＳＴ１１１（FERM P-12065）を、ＬＢ培地(１質量％ バクトトリプトン、０．５質量％ バクトイーストエキス、０．５質量％ ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ、５０μｇ/ｍｌアンピシリン) １００ｍＬ×２０本植菌し、３７℃で２０時間振盪培養した。培養菌体を５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）で洗浄し、５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）を２０ｇになるように加え、懸濁した。この菌体懸濁液０．２５ｇを５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）１００ｍＬに加え、さらに５０ｍＭとなるように１，３-ジクロロ-２-プロパノールを加え、２０℃で１０分間反応した。ＨＰＬＣにより反応液中のエピクロロヒドリンの量を測定したところ、１１ｍＭであった。すなわち、１０分当たり１１００μｍｏｌのエピクロロヒドリンが生成したことになり、この菌体懸濁液の活性は菌体懸濁液１ｇあたり４４０Ｕであることがわかった。この菌体懸濁液を５０ｍＭ  トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）で菌体懸濁液１ｇあたり４００ｕｎｉｔになるように希釈した。
なお、ｐＳＴ１１１は、コリネバクテリウム（Corynebacterium） ｓｐ．Ｎ-１０７４のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ｈｈｅＢ）を含むBamHI-PstI1サイト（１Ｋｂ 断片）をｐＵＣ１１８ に結合させたプラスミドである。また、ｐＳＴ１１１は、特開平５−３１７０６６公報に記載されており、ＪＭ１０９/ｐＳＴ１１１は、ＦＥＲＭ  Ｐ-１２０６５として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東１-１-１中央第６)に平成３年３月１日付け寄託されている。
【００５５】
ii）１，３−ジクロロ−２−プロパノールからの（Ｒ）−ＣＨＢＮの合成
ｐＨ電極、ならびにｐＨコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した３０００ｍＬ容４つ口フラスコに水１９４８．５ｇ、ＨＣＮ６３．２４ｇ（２．３４ｍｏｌ）を入れ、３０質量％ＮａＯＨ ７．６ｇ（０．０５７ｍｏｌ）で、ｐＨ７．５に調整した。１，３-ジクロロ-２-プロパノール１４６．６８ｇ（１．１４ｍｏｌ）を入れ、均一に溶解するまで攪拌した。
上記ｉ）の菌体懸濁液２２１．１４ｇを加え、２０℃で反応を開始した。系内のｐＨを７．５〜７．６に維持するよう、３０質量％ＮａＯＨを投入するようにｐＨコントローラーを設定し、投入されたＮａＯＨとほぼ等モルの割合で１，３-ジクロロ-２-プロパノール， ＨＣＮを追加していくことで、系内の１，３-ジクロロ-２-プロパノールの濃度を０．５ｍｏｌ/ｋｇを超えないよう、また、系内のシアンイオン濃度を１．１ｍｏｌ/ｋｇを超えないようにした。
３０時間後、各化合物の組成等は表１の通りであった。（反応液全量１１４０．１５ｇ）
【００５６】
【表１】
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【００５７】
この反応液を塩酸でｐＨ＝５．０に調節し、５０℃、７０Ｔｏｒｒで１２時間、窒素を２０ｍｌ／ｍｉｎでバブリングしながらＨＣＮの除去を行った。反応系内のＨＣＮを硝酸銀で滴定、１ｐｐｍ以下であることを確認した。この時系内の（Ｒ）−ＣＨＢＮは１３．６３質量％まで濃縮された。
この反応終了液、約９５０ｇを採取し、さらにエバポレーターで反応液を５７７．６ｇ（（Ｒ）−ＣＨＢＮ：２３．４０質量％）まで濃縮した。この反応液に酢酸エチル３６０ｇ×３を用いて（Ｒ）−ＣＨＢＮの抽出を行った。抽出した酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後減圧下に濃縮し、（Ｒ）−ＣＨＢＮの粗生成物を１４０．３５ｇ得た。さらに単蒸留により精製を行い、精製（Ｒ）−ＣＨＢＮ：１３０．１７ｇを得た。この精製品のＧＣ面積百分率によるＣＨＢＮの純度は９９．２％であった。
【００５８】
iii）トリメチルアミンＬ−Ｃａｒ−ＣＮ合成
ii）の工程で調製した精製（Ｒ）−ＣＨＢＮ  ２０．１０ｇ（０．１６８ｍｏｌ）に３０質量％トリメチルアミン水溶液６９．９０ｇ（０．３５５ｍｏｌ）を加え、３０℃で反応を開始した。７時間後（Ｒ）−ＣＨＢＮの転化率は１００％に達し、Ｌ−Ｃａｒ−ＣＮ：２１．０ｇ（収率７１．０％）生成していることを確認した。
【００５９】
ｉv）Ｌ−Ｃａｒ合成
iii）の反応終了液４４．９ｇを、減圧下で残留トリメチルアミンを気化させたあと、１０Ｎの塩酸１０．７ｇを加えて撹拌しながら徐々に加熱し７０℃まで上昇させた。３時間後、水７．７ｇを加えて放冷した後、ＮａＯＨ水溶液で溶液を中和した。活性炭で脱色ろ過したあと蒸発乾固させ、エタノールで洗浄後さらに乾燥させた。これに氷酢酸４０．０ｇを加えて沸騰水浴中に加熱溶解させて不溶の塩を熱時濾過し、母液を冷却したところ、カルニチン塩化物が析出してきた。これを濾別してメタノールで再結晶を行うと、Ｌ−カルニチンクロライドを１１．０ｇ（収率６６．３％）を得ることができた。
【００６０】
＜実施例２＞  L-Car合成：２
実施例１のiii)の反応終了液４４．７ｇに３０質量％ＮａＯＨ水溶液２１．８ｇ（０．１６４ｍｏｌ）を室温下で加えた後、３０質量％Ｈ２Ｏ２水溶液２０．５ｇ（０．１８１ｍｏｌ）を１時間かけて加えて３０℃で２４時間撹拌した。反応終了液をＨＣｌで中和し、得られた水溶液を減圧下で乾燥させ、エタノールを加えた。析出した塩を濾過で除いた後、エタノール−アセトン系溶媒で再結晶を行うと、Ｌ−カルニチン分子内塩が９．１ｇ（６８．８％）が得られた。
＜実施例３＞  L-Car合成：３
ｉ）Ｌ−Ｃａｒ−ＣＮ合成
実施例１のｉ）で合成した（Ｒ）−ＣＨＢＮ：１３．６３質量％の水溶液１５０．２ｇに３０質量％トリメチルアミン水溶液１０１．２ｇ（０．５１４ｍｏｌ）を加え、１０℃で撹拌し、反応を行った。１５時間後、（Ｒ）−ＣＨＢＮの転化率は１００％に達し、Ｌ−カルニチンニトリルハライドは２４．７ｇ（収率８０．９％）生成していることを確認した。
ii)  Ｌ−Ｃａｒ合成
上記i)の反応終了液２５０．２ｇに３０質量％ＮａＯＨ水溶液４５．６ｇ（０．３４２ｍｏｌ）を室温下で加えた後、３０質量％Ｈ２Ｏ２水溶液４２．６ｇ（０．３７６ｍｏｌ）を１時間かけて加えて３０℃で２４時間撹拌した。反応終了液をＨＣｌで中和し、得られた水溶液を減圧下で乾燥させ、エタノールを加えた。析出した塩を濾過で除いた後、エタノール−アセトン系溶媒で再結晶を行うと、Ｌ−カルニチン分子内塩が２１．８ｇ（７９．１％）が得られた。