(57)【要約】  【課題】  樹脂製担体に高効率かつ高密度に吸着することができる融合タンパク質と、融合タンパク質を固定化した、抗体捕捉能の高い抗体捕捉担体と、抗体捕捉担体に抗体が高密度に集積化された抗体固定担体を提供する。  【解決手段】  本発明は、抗体結合性ドメインと、１０〜１２０個のアミノ酸からなるタグ配列とを含む融合タンパク質であって、この融合タンパク質の樹脂製担体に対する吸着係数が２よりも大きい、融合タンパク質と、これを固定化した抗体捕捉担体と、この抗体捕捉担体に抗体が高密度に集積化された抗体固定担体である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体結合性ドメインと、１０〜１２０個のアミノ酸からなるタグ配列とを含む融合タンパク質であって、この融合タンパク質の樹脂製担体に対する吸着係数が２よりも大きい、
融合タンパク質。
【請求項２】
前記タグ配列は、同数の酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸とを含むポリイオンタグを有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記タグ配列は、発現タグを有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記タグ配列は、同数の酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸とを含むポリイオンタグと、発現タグとを有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ポリイオンタグが、下記一般式（１）または（２）で表される配列である、請求項２または４に記載の融合タンパク質。
【化１】
2008255046.tif 000023
式中、Ａは酸性アミノ酸、Ｂは塩基性アミノ酸、Ｘは中性アミノ酸、ｎは２〜２０の整数を示す。
【請求項６】
前記タグ配列は、抗体結合性ドメインのＮ末端に結合している、請求項１〜５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記抗体結合性ドメインは、プロテインＡまたはプロテインＧを構成する配列の一部あるいはその変異体の繰り返し構造である、請求項請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記抗体結合性ドメインは、プロテインＡのＢドメイン、あるいは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＢドメインの変異体である、請求項請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記抗体結合性ドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＢドメインの変異体の繰り返し構造である、請求項請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
樹脂製担体と、
樹脂製担体上に固定化された請求項１〜９のいずれかに記載の融合タンパク質と、
を有する抗体捕捉担体。
【請求項１１】
樹脂製担体と、
樹脂製担体上に固定化された請求項１〜９のいずれかに記載の融合タンパク質と、
前記融合タンパク質に結合している抗体と
を有する抗体固定化担体。
【請求項１２】
前記抗体が、マウス、ウサギ、ヒト、モルモット、イヌ、ネコ、ブタの群から選ばれる動物種由来の抗体である、請求項１１に記載の抗体固定化担体。
【請求項１３】
樹脂製担体上に請求項１〜９のいずれかに記載の融合タンパク質を固定化し、
この融合タンパク質に抗体を結合した抗体捕捉担体を用いて、
抗原を検出する抗原検出方法。
【請求項１４】
前記抗原の検出が、サンドイッチ法である、請求項１３に記載の抗原検出方法。
【請求項１５】
前記サンドイッチ法に用いる抗原検出用抗体が、ヤギ由来ポリクローナル抗体、ニワトリ由来ポリクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体の群から選ばれるいずれかの抗体である、請求項１４に記載の抗原検出方法。
【請求項１６】
尿中の抗原を検出する、請求項１４または１５に記載の抗原検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹脂に対する吸着効率を向上させた融合タンパク質、これを用いた抗体捕捉担体および抗原検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインＡは、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス細菌）が産生する４２ｋＤａのタンパク質である。このタンパク質は、抗体の定常領域（Ｆｃ領域）と親和性を示す。このように抗体に結合する別のタンパク質としては、例えばストレプトコッシ属細菌が産生するプロテインＧ、ペストストレプトコッカス・マグナス細菌が産生するプロテインＬなどが挙げられる。これらの抗体結合性タンパク質を適当な担体に固定化すれば、抗体捕捉担体を作成することができる。このような抗体捕捉担体は、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体の工業的な精製プロセスに用いられている。
【０００３】
また、抗原を捕捉・検出する抗体固定化担体が知られている。抗体固定担体は、例えば抗原の検出に用いられる。上記プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬを固定化した抗原検出用のマイクロウェルプレートは市販されている。抗体固定化単体は、（１）担体と抗体とを、直接共有結合あるいは物理吸着させる、（２）担体上に固定化した抗体結合性タンパク質に抗体を結合させる、ことにより、得られる。（１）の方法を用いると、抗体が担体に強固に結合する。しかし、この方法では、抗体と担体とが直接相互作用する。このため、抗体の変性が引き起こされる、あるいは固定化される抗体の配向性が揃わないという問題がある。一方、（２）の方法を用いると、固定化により抗体の変性が起こらない。また、抗体結合性タンパク質の多くは抗体の定常領域を認識するので、固定化される抗体の配向性が制御できる。このように抗体結合性タンパク質を用いて抗体を固定化することにより、比活性の高い抗体固定担体が得られる。抗体捕捉担体としては、例えば上記の抗体捕捉担体が用いられる。
【０００４】
プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬなどの抗体結合性タンパク質では、抗体との結合性が高いアミノ酸領域である、抗体結合性ドメインが特定されている。例えば、プロテインＡでは、５つの異なる抗体結合性ドメイン（Ａ〜Ｅドメイン）を有している。プロテインＡは、マウス、ラビッド、ヒト由来の抗体に対し認識性が高いことが知られている。一方、異なる抗体結合性ドメインを複数種有するため、その他の動物種由来の抗体とも、弱く結合する。したがって、プロテインＡあるいはプロテインＧなどの抗体結合性タンパク質を固定化した担体上で２種の抗体を用いるサンドイッチ酵素結合免疫吸着定量法（以下「ＥＬＩＳＡ」という。）に使用すると、バックグラウンドシグナルが増加するだけで、抗原を高感度に検出することは困難である。
【０００５】
プロテインＡのＢドメインは、５８個のアミノ酸からなる抗体結合性ドメインである。このＢドメインは、単独でも抗体に対する高い親和性を示す。また、Ｂドメインに変異を導入し、安定性を向上させたＺドメインが知られている（例えば、非特許文献１参照）。このＺドメインを繰り返し構造とすることで、ドメインの抗体結合性が向上する。Ｚドメインを２回繰り返したＺＺドメインを目的タンパク質の末端に融合させるための発現ベクターも設計されている（例えば、非特許文献２参照）。この文献には、ＺＺドメインが目的タンパク質の精製あるいは抽出に利用できることが開示されている。また、ＺＺドメインと緑色蛍光蛋白質または赤色蛍光タンパク質とを融合したタンパク質も作成されている（例えば、非特許文献２参照）。この融合タンパク質は、抗原検出用のプローブとしての利用が可能である。したがって、抗体結合性ドメインを基板に固定して用いることができれば有用である。
【０００６】
タンパク質を基板に物理吸着させるのは、通常タンパク質表面と基板との疎水性相互作用を利用する。これを利用した上記プロテインＡやプロテインＧを吸着させた樹脂製の担体は、すでに市販されている。一方、タンパク質は一般的に分子サイズが小さくなるに伴って、疎水性相互作用が低下し、基板への吸着効率が低下する傾向がある。したがって、プロテインＡやプロテインＧの抗体結合性ドメインのみを効率的に樹脂性の担体に吸着させるのは、困難である。
【０００７】
この問題を解決するために、例えばプロテインＧのＣドメインが３回繰り返された抗体結合性ドメイン端末に繊維状タンパク質を融合したタンパク質が開発されている（例えば、特許文献１参照）。この文献には、約１７０個のアミノ酸からなる抗体結合性ドメインに対して、約３６０個のアミノ酸からなる繊維状タンパク質を融合したタンパク質を用いると、疎水性基板に対する吸着がよくなることが開示されている。
【０００８】
また、上記繊維状タンパク質と抗体結合性ドメインの融合タンパク質を疎水表面に対して吸着させた場合、数ｎｍの凹凸を有する構造体を形成し、吸着することが開示されている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００９】
さらに、プロテインＡのＢドメイン由来のＺＺドメインを細胞表層に提示した酵母菌体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った例が開示されている（例えば、非特許文献５参照）。
【非特許文献１】ヨーン  ニルソン（Ｂｊｏｒｎ  Ｎｉｌｓｏｎ）、他８名、「スタフィロコッカスのプロテインＡに基づく合成ＩｇＧ結合ドメイン（Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎＡ）」、プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、英国、アイアールエル  プレス  リミテッド（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、１９８７年、第１巻、第２号、ｐ．１０７−１１３
【非特許文献２】ローウェンナドラー（Ｌｏｗｅｎｎａｄｌｅｒ）、他  名、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１９８７年、第５８巻、ｐ８７−９７
【非特許文献３】キーライ  ハン（Ｑｉ−Ｌａｉ  Ｈｕａｎｇ）、他７名、「タンパク質ＺＺと強化緑色蛍光タンパク質との融合タンパク質の免疫測定への応用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＺＺ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」、ジャーナル  オブ  イムノロジカル  メソッド（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、オランダ、エルゼビア（ＥＬＳＥＶＩＥＲ）、２００６年、第３０９巻、ｐ．１３０−１３８
【非特許文献４】キーライ  ハン（Ｑｉ−Ｌａｉ  Ｈｕａｎｇ）、他５名、「タンパク質ＺＺと赤色蛍光タンパク質ディーエスレッドとの融合タンパク質とその免疫測定への応用（Ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＺＺ  ａｎｄ  ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＤｓＲｅｄ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）」、バイオテクノロジー  アンド  アプライドバイオケミストリー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、英国、ポートランド  プレス  リミテッド（Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．）、２００６年、第４３巻、ｐ．１２１−１２７
【非特許文献５】ゲン  タナカ（Ｇｅｎ  Ｔａｎａｋａ）、他３名、「自己接着性抗体結合性タンパク質を用いた抗体マイクロウェルアレイの製造（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  ａｒｒａｙ  ｗｉｔｈ  ｓｅｌｆ−ａｄｈｅｒｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」、アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、オランダ、エルゼビア（ＥＬＳＥＶＩＥＲ）、２００６年、第３５０巻、ｐ．２９８−３０３
【非特許文献６】ワイ．ナカムラ（Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ）、他５名、「Ｉｇ−Ｇドメインの酵母表面表示による新規な全細胞免疫吸着剤の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍｅｉｎ）」、アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ドイツ、シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、２００１年、第５７巻、ｐ．５００−５０５
【特許文献１】特開２００５−２２００２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、特許文献１に記載の融合タンパク質では、抗体結合性ドメインを、その約２倍のサイズの繊維状タンパク質と結合させる。このため、分子全体を占める抗体結合性ドメインの比率が小さくなる。このような融合タンパク質を疎水性基板上に集積すると、疎水性基板の２／３を繊維状タンパク質が占め、一方でその１／３を抗体結合性ドメインが占めることになる。
【００１１】
また、非特許文献５に記載されている界面の凹凸構造は、抗体に対する接触効率を高めるとともに、抗体以外のタンパク質に対しても非特異的吸着を起こす可能性が高い。
【００１２】
また、非特許文献６では、酵母菌体数を変化させると、検出シグナルが増加するなどの例が開示されているにすぎない。この文献には、従来のマイクロウェルプレートを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡに適用して高感度化に成功した例は、記載されていない。
【００１３】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、樹脂製担体に高効率かつ高密度に吸着することができる融合タンパク質を提供することにある。
【００１４】
また、本発明の別の目的は、融合タンパク質を固定化した、抗体捕捉能の高い抗体捕捉担体を提供することにある。さらに、本発明の目的は、この抗体捕捉担体に抗体が高密度に集積化された抗体固定担体を提供することにある。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、上記抗体固定化担体を利用した抗原検出方法、特にサンドイッチＥＬＩＳＡによる抗原検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、新規な融合タンパク質を作成して、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【００１７】
本発明の融合タンパク質は、抗体結合性ドメインと、１０〜１２０個のアミノ酸からなるタグ配列とを含む融合タンパク質であって、この融合タンパク質の樹脂製担体に対する吸着係数が２よりも大きい。
【００１８】
本発明では、分子サイズの小さい抗体結合性ドメインに、この抗体結合性ドメインの分子サイズを超えない程度のタグ配列を付加する。このタグ配列が、融合タンパク質の多量体の形成に寄与する。この結果、融合タンパク質の樹脂製担体の疎水性界面への吸着効率を促進することができる。
【００１９】
本発明では、得られる融合タンパク質全体を占める抗体結合性ドメインの比率は半分以上であることが好ましい。また、融合タンパク質の分子サイズも小さい。この結果、融合タンパク質を樹脂製担体に吸着させた際、抗体結合性ドメインが占める密度をより高くすることができる。
【００２０】
前記タグ配列は、同数の酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸とを含むポリイオンタグを含むものであってもよい。また、前記タグ配列は、発現タグを含むものであってもよい。あるいは、同数の酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸とを含むポリイオンタグと、発現タグとを含むものであってもよい。前記ポリイオンタグが、特に下記一般式（１）または（２）で表される配列であれば好ましい。
【化１】
2008255046.tif 000002
式中、Ａは酸性アミノ酸、Ｂは塩基性アミノ酸、Ｘは中性アミノ酸、ｎは２〜２０の整数を示す。
【００２１】
前記タグ配列は、抗体結合性ドメインのＮ末端に結合しているとよい。
【００２２】
前記抗体結合性ドメインは、プロテインＡまたはプロテインＧを構成する配列の一部あるいはその変異体の繰り返し構造であればよい。前記抗体結合性ドメインは、プロテインＡのＢドメイン、あるいは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＢドメインの変異体の繰り返し構造であると、好ましい。このＢドメインの繰り返し構造の繰り返しが２回であると、よい。
【００２３】
本発明の抗体捕捉担体は、樹脂製担体と、樹脂製担体上に固定化された上記融合タンパク質とを有する。
【００２４】
本発明の抗体捕捉担体は、抗体特異性の高い抗体結合性ドメインを融合タンパク質内に有する。また、上記したように樹脂製担体上に、融合タンパク質を高密度に固定化できる。この結果、抗体捕捉能の高い抗体捕捉担体が得られる。
【００２５】
本発明の抗体固定化担体は、樹脂製担体と、樹脂製担体上に固定化された上記融合タンパク質と、前記融合タンパク質に結合している抗体とを有する。本発明の抗体固定化担体は、高密度に抗体を結合させることができる。この結果、高い抗原捕捉能を有する抗体固定化担体を得ることができる。前記抗体が、マウス、ウサギ、ヒト、モルモット、イヌ、ネコ、ブタの群から選ばれる動物種由来の抗体であると好ましい。
【００２６】
本発明の抗原検出方法は、樹脂製担体上に上記融合タンパク質を固定化し、この融合タンパク質に抗体を結合した抗体捕捉担体を用いて、抗原を検出する。前記抗原の検出が、サンドイッチ法であるとよい。本発明の抗原検出方法を用いると、抗原結合性タンパク質を用いない従来のサンドイッチＥＬＩＳＡに対して、抗原を高感度に検出できる。これは、本発明の融合タンパク質が樹脂製の担体に対して優れた吸着性を有することと、本発明で使用する抗体結合性ドメインが抗体種に対する選択性が高いこととの相乗効果である。
【００２７】
このように、本発明の抗原検出方法を用いると、ＣＸＣＬ１などの尿中の微量抗原を検出することができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の融合タンパク質は、抗体結合性ドメインと、１０〜１２０個のアミノ酸からなるタグ配列とを含む融合タンパク質であって、この融合タンパク質の樹脂製担体に対する吸着係数が２よりも大きい。したがって、抗体結合性ドメインが高密度に集積化された樹脂製の担体、すなわち高い抗体結合量を有する抗体捕捉担体を得ることができる。この抗体捕捉担体に対し、抗体を結合させることで、抗体が高密度に集積化された抗体固定担体を得ることができる。また、吸着係数が２、特に吸着係数が４よりも大きい融合タンパク質を用いた抗体捕捉担体を用いることにより、高感度に抗原が検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００３０】
［融合タンパク質］
本発明の融合タンパク質は、抗体結合性ドメインと、１０〜１２０個のアミノ酸からなるタグ配列とを含む融合タンパク質であって、この融合タンパク質の樹脂製担体に対する吸着係数が２よりも大きい。
【００３１】
［抗体結合性ドメイン］
本発明で使用する抗体結合性ドメインは、プロテインＡあるいはプロテインＧ由来の抗体結合性ドメインであればよい。さらに好ましくはプロテインＡのＢドメインであることが好ましい。さらに好ましい形態として、プロテインＡのＢドメインの変異体であるＺドメインであることが好ましい。これらのＢドメインあるいは下記表１に示す配列番号１のＺドメインの機能的性質を保持したままで、さらにアミノ酸配列に改変を加えたものであってもよい。本発明のいう好適な改変としては、抗体に対する結合性をさらに向上させるためのアミノ酸改変、あるいは抗体の種選択性を向上させるためのアミノ酸改変などが挙げられる。このような改変体を作製するための手法としては、エラープローンＰＣＲ、ＤＮＡシャフリングなどのランダム変異導入法などが挙げられる。さらには好適な変異体を選別するための方法として、ファージディスプレイなどの各種表層ディスプレイ法などが挙げられる。
【表１】
2008255046.tif 000003
【００３２】
これらの抗体結合性ドメインは、繰り返し配列であることが好ましい。好適な繰り返し回数としては、天然のプロテインＡが５つの相同性の高いドメインから構成されることから５回以下であることが好ましく、さらに好ましい形態は２回である。
【００３３】
上記のＺドメインは５８個のアミノ酸から構成される。したがって、この２回繰り返し配列とは、単純に１１６個のアミノ酸となる。しかしながら、２つのドメインの連結部位に、機能的に損なわれない配列および長さのペプチド配列がリンカーとして含まれていても良い。このリンカー配列としては１〜１０アミノ酸の範囲であることが好ましい。リンカー配列は特に限定されるものではない。
【００３４】
［タグ配列］
本発明の融合タンパク質におけるタグ配列は、１０〜１２０個のアミノ酸からなるタグ配列である。融合タンパク質は、このタグ配列により、樹脂製担体に物理的吸着をする。融合タンパク質の樹脂製担体に対する吸着係数は、２よりも大きい。融合タンパク質の樹脂製担体に対する吸着係数が２よりも大きければ、配列は特に限定されない。アミノ酸長が長くなればなるほどその吸着係数は大きくなる。一方、アミノ酸長が長くなれば、融合タンパク質中でタグ配列の占める割合が多くなる。この結果、単位表面積当りを占める抗体結合性ドメインの数は減少する。また、タグ配列のアミノ酸数が１２０個を超えると、抗体が非特異的に結合する割合が増加するので望ましくない。本発明では、このようなタグ配列を抗体結合性ドメインと結合させることで、抗体結合性ドメイン間の相互作用（静電相互作用、疎水結合）を強めている。この結果、本発明の効果を生じさせることができる。
【００３５】
本発明のタグ配列は、ポリイオンタグ、発現タグ、ポリイオンタグと発現タグの両方のいずれかを含む。また、他の機能性の配列、これらを連結している任意のアミノ酸配列を含む。これらの全てのアミノ酸を含めて、１０〜１２０個のアミノ酸からなるタグ配列であればよい。
【００３６】
（吸着係数）
吸着係数とは、５０μｇ／ｍＬの融合タンパク質溶液をポリスチレン製の担体に疎水吸着させた場合の吸着量を、これと同濃度の抗体結合性ドメインのみをポリスチレン製の担体に疎水吸着させた場合の吸着量で割った値である。吸着係数は以下の数式（１）により算出される。
【数１】
2008255046.tif 000004
【００３７】
上記の吸着重量は、タンパク質濃度を測定することで算出できる。吸着重量は、吸着前の初期タンパク質溶液濃度と、吸着後のタンパク質溶液濃度の差を算出し、その減少率から算出することが好ましい。また吸着係数を算出する樹脂製の担体としては、ポリスチレン製の樹脂製担体であることが好ましい。担体の形状としては、マイクロウェルプレート状であることが好適である。
【００３８】
上記の吸着重量を測定する方法としては、ビシンコニン酸を用いるＢＣＡ法（Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０．７６−８５．１９８５）が好適である。
【００３９】
（ポリイオンタグ）
タグ配列は、同数の酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸とを含むポリイオンタグを含むとよい。タグ配列にポリイオンタグを用いると、ポリイオンコンプレックスを形成する。したがって、タグ配列を構成するアミノ酸の数が少なくても、融合タンパク質の樹脂製担体に対する吸着係数を増大させることができる。
【００４０】
ポリイオンタグは、少なくとも同数の酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸とが含まれるものであれば、その配列が規則性を有するものであっても、ランダムな配列であってもよい。ポリイオンタグが一定の規則性をもって配列していれば、融合タンパク質間の静電的な相互作用が起きやすくなるので、樹脂製担体に対する吸着係数を増大させることができる。
【００４１】
少なくとも同数の酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸とが含まれるポリイオンタグとしては、以下の配列が例示できる。なお、式中、Ａは、グルタミン酸、アスパラギン酸の酸性アミノ酸を、Ｂは、リジン、またはアルギニンの塩基性アミノ酸を意味する。なお、下記の式においては、いずれも式の左側がポリペプチドのＮ末端を、右側をＣ末端を示す。
【化２】
2008255046.tif 000005
式中、Ａは酸性アミノ酸、Ｂは塩基性アミノ酸、ｎおよびｘは１〜２０の整数を示す。
これらのポリイオンタグのうち、下記化学式（１）で表される配列が好ましい。
【化３】
2008255046.tif 000006
【００４２】
ポリイオンタグは、タグ内に、中性アミノ酸を含んでいてもよい。使用できる中性アミノ酸としては、中性アミノ酸であれば特に制限はないが、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、またはイソロイシンであれば好ましい。タグ内に中性アミノ酸を含むポリイオンタグとしては、例えば、下式のような配列を有するものが例示できる。下式において、Ｘは、中性アミノ酸を示す。Ｘを構成する中性アミノ酸は、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。中性アミノ酸が含まれると、中性アミノ酸による疎水性相互作用により、酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸とが引き合う。この結果、融合タンパク質中におけるタグ配列の見かけのサイズが小さくなるので、樹脂製基板に高密度に吸着できる。
【化４】
2008255046.tif 000007
式中、Ａは酸性アミノ酸、Ｂは塩基性アミノ酸、Ｘは中性アミノ酸、ｎは２〜２０の整数を示す。
これらのポリイオンタグのうち、下記化学式（１）で表される配列が好ましい。
【化５】
2008255046.tif 000008
【００４３】
ポリイオンタグは、さらにタグ内にシステインを含む配列であってもよい。ポリイオンコンプレックスは、通常中性付近で形成される。酸性またはアルカリ性の溶液中では、アミノ酸側鎖の荷電が消失してしまい、ポリイオンコンプレックスを形成できない。しかし、ポリイオンタグ中にシステインを含めば、システイン中のイオウ（Ｓ）により共有結合（ジスルファイド結合）が形成される。この結果、中性以外の溶液中であっても、融合タンパク質の安定なポリイオンコンプレックスが形成できるので好ましい。タグ内にシステインを含むポリイオンタグとしては、例えば、下式のような配列を有するものが例示できる。
【化６】
2008255046.tif 000009
式中、式中、Ａは酸性アミノ酸、Ｂは塩基性アミノ酸、Ｘは中性アミノ酸、Ｃは、システインを、ｎ及びｍは、それぞれ２〜５の整数を示す。
【００４４】
このように、ポリイオンタグを用いると、分子間のイオン結合あるいはジスルファイド結合の形成により、多量体が形成される。本発明にいう多量体には、２個以上の融合タンパク質で構成される多量体が含まれる。このように本発明では、ポリイオンタグを用いることにより融合タンパク質を多量化できる。融合タンパク質の多量体を形成することにより、分子サイズが増大し、水溶性が低下するので、疎水性の樹脂製担体への吸着が促進される。また、融合タンパク質の多量体の形成は、溶液中であっても、樹脂製担体の界面上であってもよい。
【００４５】
（発現タグ）
本発明のタグ配列は、組み換えタンパク質の生産に用いられる発現タグであってもよい。発現タグは、発現量を増大させるための発現タグ、アフィニティ精製用のための発現タグ、抗体検出用の発現タグ、可溶化を促進するため発現タグなどの機能を有する。本発明で用いることのできる発現タグとしては、上記ポリイオンタグのアミノ酸と発現タグのアミノ酸の合計が、１０〜１２０個となるペプチド配列を有するものであればよい。好ましい発現タグとしては、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｔ７タグ、ＨＳＶタグ、ｐｅｒＢタグ、ＨＡタグ、Ｔｒｘタグ、ＣＢＰタグ、ＣＢＤタグ、またはＣＢＲタグが挙げられる。さらに好ましくは、表２に示す、配列番号２記載のＳタグ、および配列番号３記載のＨｉｓタグであることが好ましい。これらの発現タグは、１種類に限られず、２種類以上を組み合わせて連結して用いてもよい。
【表２】
2008255046.tif 000010
【００４６】
タグ配列は、上記ポリイオンタグと発現タグとが、連結されていてもよい。連結する場合には、発現タグは、ポリイオンタグのＮ末端側に結合されていればよい。
【００４７】
タグ配列は、さらに、トロンビン、エンテロキナーゼなどのプロテアーゼ認識配列などの機能性の配列を含んでいてもよい。
【００４８】
（抗体結合性ドメインと融合タンパク質の結合）
本発明で用いるタグ配列は、その機能が損なわれないのであれば、抗体結合性ドメインのＮ末端あるいはＣ末端いずれに結合していてもよいが、好ましくはＮ末端である。
【００４９】
上記タグ配列を抗体結合性ドメインの末端に連結する際、適当なリンカー配列を介して連結することが好ましい。好ましいリンカー配列としては、ＧＳリンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ(ｎは繰り返し回数)などが挙げられるが、限定されるものではない。好ましくは、ＧＳリンカーを１〜３回（ｎは１〜３の整数）繰り返したものをリンカーとして用い、抗体結合性ドメインとタグ配列を連結するようにすることが好ましい。
【００５０】
［融合タンパク質の製造］
本発明の融合タンパク質は、このアミノ酸配列をコードする遺伝子を作製し、大腸菌などの宿主生物に遺伝子を導入することで、組換えタンパク質として生産可能である。用いる宿主生物としては、大腸菌であること好ましい。大腸菌発現に使用するプロモーターは、Ｔ７、ｌａｃ、Ｔ７ｌａｃ、Ｔｒｐなどが挙げられるが、特に限定されるものではなく、本発明の抗体結合性タンパク質を十分に発現可能なプロモーターであれば限定されるものではない。
【００５１】
［抗体捕捉担体］
本発明の融合タンパク質は、樹脂製の担体に固定化させることで、抗体捕捉担体を得ることができる。本発明において、抗体捕捉担体とは、抗体を選択的に結合可能な担体のことをいう。
【００５２】
融合タンパク質の樹脂製担体への固定化は、架橋剤を用いて融合タンパク質と樹脂製担体とを共有結合させる、物理的に疎水吸着させるなどにより行う。好ましい方法は、物理的な疎水吸着である。
【００５３】
物理的吸着の方法としては、特に制限はなく、公知の方法による。具体的には、以下のような方法による。１〜１０００μｇ／ｍＬのタンパク質溶液に樹脂製担体を浸漬し、１０分から４８時間インキュベートする方法が挙げられる。また、上記ポリイオンタグを含む融合タンパク質の樹脂製担体への吸着は、中性の緩衝液中で行うことが好ましい。好適な中性緩衝液としてＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）が挙げられる。またインキュベーション温度としては、４℃から８０℃が好適である。特に上記化学式３で示されるシステインを含むポリイオンタグを有する抗体結合性タンパク質に関しては、常温より高い温度でインキュベーションすることが好ましく、さらに好適な形態として４０℃から７０℃の温度で、３〜１２時間インキュベーションする方法が好ましい。
【００５４】
固定化する樹脂製担体は、疎水性の高い樹脂製の担体であることが好ましく、好適な樹脂としてポリスチレン樹脂、ポリメチルメタキシレート樹脂、ラテックス樹脂、アクリル樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、テフロン（登録商標）樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン樹脂、アルキド樹脂、メラミン樹脂、ポリイミド樹脂、フェノール樹脂などが挙げられる。特に、ポリスチレン樹脂、ポリメチルメタキシレート樹脂、ラテックス樹脂であることが好ましい。
【００５５】
樹脂製担体の形態としては、その用途に対して最適な形状であれば形態は特に限定されない。例えば、抗体の精製に用いる場合は、粒子状あるいは繊維状の形状であることが好ましい。また抗原検出方法に使用する場合は、板状あるいは粒子状であることが好ましく、汎用性の高いマイクロウェルプレート形状であることが好ましい。さらに好ましくは、ポリスチレン製のマクロウェルプレートであることが好ましい。
【００５６】
上記抗体捕捉担体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであっても、捕捉することができる。捕捉するのに好ましい抗体としては、マウス由来、ウサギ由来、ヒト由来、モルモット由来、イヌ由来、ネコ由来、ブタ由来のいずれかの抗体であればよい。これらの動物種により生産される抗体であることがより好ましい。
【００５７】
本発明の抗体捕捉担体は、上記の動物由来の抗体を分離・精製するための担体として利用することができる。
【００５８】
上記抗体捕捉担体に抗体を捕捉（結合）させる条件としては、単離したい抗体溶液を中性条件下で担体と接触させればよい。特に、ｐＨ７．０〜７．５の緩衝液中において抗体を結合させることが好ましい。好ましい緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液である。
【００５９】
本発明の抗体捕捉担体によって捕捉された抗体分子は、適当な溶出条件にすることによって、回収することが可能である。上記溶出条件としては、ｐＨ３〜６の溶出緩衝液を用いて溶出することが可能である。緩衝液としては、クエン酸ナトリウムを含む緩衝液であることが好ましい。
【００６０】
［抗原検出］
本発明の抗体固定担体は、標的となる抗原分子に対する特異的な抗体を抗体捕捉担体に固定させている。すなわち、本発明の抗体固定担体は、高密度で抗体が固定化されており、また抗体の配向性を制御されているため、抗原検出方法にも有効に使用することができる。
【００６１】
上記抗体固定担体を用いた、抗原検出方法としては、標識化した抗原を検出する方法、抗体固定担体に未標識の抗原を捕捉し、標識化した検出用抗体を用いて検出する方法（サンドイッチ法）、の２種類が可能である。特にサンドイッチ法では、未標識抗原を検出可能であり、また２種類の抗体の特異性により抗原を検出することから、抗原検出の高感度化が可能となる。
【００６２】
本発明にいう抗原検出の高感度化とは、１）検出シグナルが向上し、検量線傾きが増加すること、２）（ブランクシグナルの標準偏差／検量線傾き）が減少すること、の２点で定義される（ＩＵＰＡＣの濃度の検出限界の定義に基づく）。好ましい高感度化の定義としては、上記２つを満たすことが好ましい。
【００６３】
本発明の抗原検出方法に使用する抗原捕捉用抗体は、上記抗体捕捉単体で捕捉される抗体のうち、標的の抗原分子に特異性を有しており、かつ融合タンパク質と結合性を有する動物種の抗体であることが好ましい。好ましい抗体種としては上記記載の、マウス由来、ウサギ由来、ヒト由来、モルモット由来、イヌ由来、ネコ由来、ブタ由来のいずれかの抗体が挙げられる。最も好ましい抗体としては、ＺＺドメインと結合性の高いマウス由来あるいはウサギ由来の抗体であることが好ましい。
【００６４】
本発明の抗原検出方法、特にサンドイッチ法に用いる標識化された抗原検出用抗体としては、融合タンパク質が親和性を示さない動物種由来の抗体であることが好ましい。好ましい抗体種としては、ヤギ由来、ニワトリ由来の抗体（ポリクローナル抗体）であることが好ましい。さらにこれらの動物種以外の抗体であっても、抗体の定常領域を含まないＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｆａｂフラグメントの２量体）、一本鎖抗体も好適な抗体として使用可能である。
【００６５】
抗原検出用抗体の標識としては、ペルオキシダーゼ標識、アルカリホスファターゼ標識、ビオチン標識、蛍光標識、ジゴキシゲニン標識など公知の標識が挙げられる。好ましい抗原検出用抗体の標識は、検出系との適合性で判断されればよく、本発明において限定されるものではない。
【００６６】
本発明の抗原検出方法は、特に比較的低分子量のペプチド抗原に対して、その優位性を発揮できる。一般に、低分子量のペプチド抗原に関しては、その検出限界は下がる傾向にある。本発明のいう低分子量ペプチド抗原とは、２０ｋＤａ以下の抗原を示す。特に、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、抗原の分子サイズが小さいと、抗原が固層化抗体に結合したとしても、配向性の影響を大きく受ける。このため高感度に抗原を検出できない。本発明の抗原検出方法を用いれば、固層化された抗体の配向性が制御されており、抗体に捕捉された低分子量ペプチドも、溶液側に提示される。これらの効果により、本発明の抗原検出方法は、特に低分子量のペプチド抗原の検出感度が向上する。
【００６７】
本発明の抗原検出方法は、ヒト体液由来の抗原分子を測定することが可能である。好ましい試料としては、血液、血清、生体組織抽出物、尿、便、唾液などが挙げられる。
【００６８】
本発明の抗原検出方法を用いれば、従来の抗原検出方法よりも高感度に抗原の検出が可能となる。測定試料が対象となる抗原濃度が低い尿であっても、抗原の検出ができる。尿中の抗原としては、例えば癌マーカーとなるタンパク質であることが好ましく、特に腎癌マーカー、膀胱癌マーカーであることが好ましい。さらに好ましくは膀胱癌マーカーである。例えば膀胱癌に特異的なタンパク質であるＣＸＣＬ１濃度を、ヒト尿から測定することができる。
【実施例】
【００６９】
以下本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００７０】
以下の実施例において、ポリイオンタグを構成するアミノ酸について、アラニン：Ａ、システイン：Ｃ、グルタミン酸：Ｅ、リシン：Ｋのアルファベットをそれぞれのアミノ酸を示す略号として用いた。
【００７１】
［融合タンパク質発現ベクターの調整］
（実施例）
（抗体結合性ドメインの製造）
抗体結合性ドメインは、プロテインＡのＢドメインに由来するＺドメインを２回繰り返した配列を使用した。Ｚドメイン遺伝子は、上記表１に示す、配列番号１をコードするセンス鎖およびアンチセンス鎖の合成オリゴヌクレオチドを作製し、これをアニーリングすることで作製した。作製したＺドメインをコードする遺伝子は、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（ノバジェン社製）にＴＡクローニングにより、クローニングし、ｐＴ７−Ｚ１を得た。次に、ｐＴ７−Ｚ１より、Ｚドメインを制限酵素ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩで切り出し、アガロースゲル泳動した後、染色し、Ｚドメイン断片を精製した。精製したＺドメイン断片は、さらにｐＴ７−Ｚ１のＮｈｅＩ切断部位にクローニングし、ｐＴ７−ＺＺを作製した。
【００７２】
（実施例１）
次に、ＺＺドメインのｐＥＴ３０（ａ）ベクター（ノバジェン社製）にクローニングした。ｐＴ７−ＺＺより、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩでＺＺドメインを切断し、アガロースゲル泳動した後、精製した。得られたＺＺドメイン断片は、ｐＥＴ３０（ａ）ベクターのＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位にクローニングした。さらに、ＳａｌＩ部位にＴＡＡストップコドンを有するオリゴＤＮＡを挿入し、ｐＥＴ-ＺＺを得た。このｐＥＴ-ＺＺがコードする融合タンパク質「タグＺＺ」（実施例１）のアミノ酸配列を、下記表３の配列番号４に示す。融合タンパク質「タグＺＺ」は、発現タグを含んでいるが、ポリイオンタグを有していないタグ配列を有する融合タンパク質である。また、タグ配列部分にｐＥＴ３０（ａ）ベクター由来の発現タグであるＨｉｓタグ、Ｓタグおよびプロテーゼ切断配列を含んでいる。
【表３】
2008255046.tif 000011
【００７３】
（実施例２）
下記表４に示す配列番号６及び７記載のオリゴヌクレオチドを１００℃に加熱後、冷却することにより、ポリイオンタグ１（（Ｋ−Ａ−Ｅ−Ｇ）２Ｃ−Ｇ）２）をコードするオリゴＤＮＡを作製した。オリゴＤＮＡは、ｐＥＴ-ＺＺの制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ｐＥＴ−ＳＥＬＦを作製した。このｐＥＴ−ＳＥＬＦがコードする融合タンパク質「ＳｅｌｆＺＺ」（実施例２）のアミノ酸配列を表５の配列番号４に示す。この実施例１の融合タンパク質「ＳｅｌｆＺＺ」は、ポリイオンタグを含むタグ配列を有する融合タンパク質である。
【表４】
2008255046.tif 000012
【表５】
2008255046.tif 000013
【００７４】
（実施例３）
下記表６に示す配列番号８および９記載のオリゴヌクレオチドを１００℃に加熱後、冷却することにより、ポリイオンタグ２（（Ｋ）７（Ｅ）７）をコードするオリゴDNAを作製した。オリゴＤＮＡは、ｐＥＴ-ＺＺの制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ｐＥＴ−Ｋ７Ｅ７を作製した。このｐＥＴ−Ｋ７Ｅ７がコードする融合タンパク質「Ｋ７Ｅ７ＺＺ」（実施例３）のアミノ酸配列を表７の配列番号１０に示す。この実施例１の融合タンパク質「Ｋ７Ｅ７ＺＺ」は、ポリイオンタグを含むタグ配列を有する融合タンパク質である。
【表６】
2008255046.tif 000014
【表７】
2008255046.tif 000015
【００７５】
（実施例４）
下記表８に示す配列番号１１および１２記載のオリゴヌクレオチドを１００℃に加熱後、冷却することにより、比較タグ１（Ｋ７）をコードするオリゴＤＮＡを作製した。オリゴＤＮＡは、ｐＥＴ-ＺＺの制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ｐＥＴ−Ｋ７を作製した。このｐＥＴ−Ｋ７がコードする融合タンパク質「Ｋ７ＺＺ」（実施例４）のアミノ酸配列を、表９の配列番号１３に示す。実施例４の融合タンパク質は、発現タグを含んでおり、またポリイオンタグを含まない融合タンパク質である。
【表８】
2008255046.tif 000016
【表９】
2008255046.tif 000017
【００７６】
（融合タンパク質発現条件および精製）
上記得られたｐＥＴ−ＺＺ、ｐＥＴ−ＳＥＬＦ、ｐＥＴ−Ｋ７Ｅ７、およびｐＥＴ−Ｋ７は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主に形質転換し、発現用大腸菌を調整した。融合タンパク質の発現は、ＬＢ培地（カナマイシン添加）において行った。これらの大腸菌を、ＯＤ０．６に達するまで３７℃で振とう培養した。その後、ＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、１２時間培養した。培養後、大腸菌を遠心分離にて回収し、８Ｍ尿素を含む緩衝液中で、超音波破砕した。不溶性の残さを遠心分離にて除去し、無細胞抽出液を調整した。融合タンパク質は、無細胞抽出液より金属キレートレジンを用い精製を行った。
【００７７】
精製した融合タンパク質溶液は、分子量１０，０００カットオフ値の透析膜を用い、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）に置換を行った。透析の結果得られた融合タンパク質溶液は、ＢＣＡ測定試薬および濃度既知のアルブミンを用い、タンパク質濃度を比色定量した。
【００７８】
（比較例１）
比較例１として使用するＺＺ（コントロール）ペプチドは、上記融合タンパク質発現条件および精製で得られた実施例１のタグＺＺをプロテアーゼ処理して、タグ部分を除去することで得た。タグＺＺのプロテアーゼ処理は、エンテロキナーゼ（インビトロジェン社製）を用いて行った。エンテロキナーゼは、ＥＫ  ａｗａｙレジン（インビトロジェン社製）を用い溶液より除去した。透析およびタンパク質濃度の測定は、上記と同様の手順で行った。
【００７９】
［融合タンパク質の吸着量の測定および吸着係数の算出］
上記得られた実施例１「タグＺＺ」、実施例２「ＳｅｌｆＺＺ」、実施例３「Ｋ７Ｅ７ＺＺ」、実施例４「Ｋ７ＺＺ」、比較例１「ＺＺ」の各融合タンパク質を用いて、以下の方法により樹脂製担体に対する吸着量を測定し、吸着係数を求めた。
【００８０】
融合タンパク質のポリスチレンプレートに対する吸着量は、９６穴ポリスチレンプレート（ヌンク社製、マキシソープ９６穴プレート）に５０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ溶液）の融合タンパク質溶液を１００μＬ添加し、５０℃で３時間インキュベートすることにより測定した。融合タンパク質の吸着量は、インキュベート前後の融合タンパク質溶液に含まれるタンパク質濃度の減少率をもって算出した。タンパク質濃度は、ＭｉｃｒｏＢＣＡ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ(ピアス社製)を用い測定した。作製した融合タンパク質の吸着係数は、上記式１に基づいて算出した。融合タンパク質の吸着量の測定値および吸着係数の算出値を表１０に示す。
【表１０】
2008255046.tif 000018
【００８１】
表１０から、本発明の実施例１〜３の融合タンパク質は、樹脂製担体に対する吸着係数が、２．８１、４．５、４．８と、発現タグの効果により比較例１に対し、優れていることがわかる。
【００８２】
また、表１０から、本発明の実施例２〜３の融合タンパク質は、樹脂製担体に対する吸着係数が、４より大きくなっており、発現タグとポリイオンタグの相乗効果によりきわめて優れていることがわかる。
【００８３】
［抗体捕捉担体に対する抗体結合率の算出］
実施例１（タグＺＺ）、実施例２（ＳｅｌｆＺＺ）、実施例３「Ｋ７Ｅ７ＺＺ」、実施例４「Ｋ７ＺＺ」、比較例１（ＺＺ）の各融合タンパク質を９６穴ポリスチレンプレートに５０μｇ／ｍＬの融合タンパク質溶液を１００μＬ添加し、５０℃で３時間インキュベートして、吸着させた。
【００８４】
インキュベート後、融合タンパク質溶液を除去し、２５０μＬのＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％）で３回洗浄し、さらにＰＢＳ（ｐＨ７．０）で３回洗浄し、抗体捕捉担体である抗体捕捉プレートを作製した。また、コントロール用として、融合タンパク質を吸着していないプレートをコントロール用の抗体捕捉担体として用いた。
【００８５】
上記抗体捕捉担体（抗体捕捉プレート）に対し、ペルオキシダーゼ標識されたウサギＩｇＧ抗体（シグマ製）溶液１００μＬ（ＰＢＳ）を添加した。抗体溶液を添加後、室温にて６時間インキュベートした。インキュベート後、抗体溶液を除去し、ＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ０．０５％）で３回洗浄した。洗浄後の、プレートにＴＭＢ試薬（１００μＬ）を添加し、室温で２０分インキュベートした。その後、１ＮのＨＣｌ(１００μＬ)添加し、反応を停止した。吸光度は、４５０ｎｍの波長を測定することで行い、抗体固定率を測定した。抗体固定率は、コントロール用である未処理のプレートの吸光度を１とし相対値を算出した。結果を表１１に示す。
【表１１】
2008255046.tif 000019
【００８６】
表１１から、本発明の融合タンパク質は、ＺＺドメインのみの比較例１の抗体固定率７．７に比べ、抗体固定率が、１６（実施例１）、２３（実施例２）、２５（実施例３）、１０（実施例４）と、高いことがわかる。
【００８７】
［ＣＸＣＬ１（ＧＲＯａｌｐｈａ）のサンドイッチＥＬＩＳＡにおける比較］
ＣＸＣＬ１のサンドイッチＥＬＩＳＡは、捕捉抗体としてマウスＩｇＧモノクローナル抗体、検出抗体として、ビオチン標識ヤギポリクローナル抗体を用いた。検出はＨＲＰ標識アビジンを用い、ＴＭＢを基質として用いた。上記抗体試薬は、Ｒ＆Ｄ社製を使用した。組換えＣＸＣＬ１は、３００，１５０，１００，５０，２５，１０．５，０ｐｇ／ｍＬの希釈溶液を作製し、標品として使用した。
【００８８】
上記抗体捕捉担体に、捕捉抗体（ＰＢＳ溶液）を添加し６時間インキュベートした。抗体溶液を除去した後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。その後１％ＢＳＡ (ＰＢＳ)溶液を添加し、１２時間インキュベートした。ＢＳＡ溶液を除去後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、抗原捕捉プレートを作製した。次に、ＣＸＣＬ１希釈溶液(ＰＢＳＴ)を添加し、２時間インキュベートした。インキュベート後、ＣＸＣＬ１溶液を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次にビオチン標識抗体を添加し２時間インキュベートした。インキュベート後、抗体溶液を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次にＨＲＰ標識アビジンを添加し、１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次にＴＭＢ発色試薬を添加し、２０分インキュベートした。その後、１ＮＨＣｌを添加し反応を停止した。その後、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの発色値を測定した。図１に測定結果を示す。図１のデータから算出される濃度範囲０〜３００ｐｇ／ｍＬにおける各プロットの回帰直線傾きおよび寄与率（ＩＵＰＡＣ定義）を表１２に示す。
【表１２】
2008255046.tif 000020
【００８９】
図１及び表１２から、本発明の実施例の融合タンパク質を用いると、寄与率が０．９９９と大きく、ＥＬＩＳＡ検出シグナルが大きく向上することが明らかとなった。また、検量線の傾きも同様に増大しており、検出感度が向上したことを示している。
【００９０】
また、タグＺＺ（実施例１）とＳｅｌｆＺＺ（実施例２）を比較すると、これらの吸着係数はそれぞれ、２．８１および４．５と大きな違いがある。しかしながら、検出感度に関しては大きな差はみられなかった。このことから、ＥＬＩＳＡに使用する融合タンパク質は吸着係数が２より大きいことで、十分検出感度が向上できることが示された。
【００９１】
［プロテインＡコートプレートを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにおける比較］
上記実施例２の融合タンパク質と、プロテインＡをコートした担体（比較例２）とを用いて、上記と同様にしてサンドイッチＥＬＩＳＡにおける比較を行った。図２に測定結果を示す。図２のデータから算出される濃度範囲０〜１００ｐｇ／ｍＬにおける各プロットの回帰直線傾きを表１３に示す。
【表１３】
2008255046.tif 000021
【００９２】
上記結果から、プロテインＡをコートした担体でサンドイッチＥＬＩＳＡを行うと、検出シグナルが増加するが、検量線傾きは減少することが示された（図２）。一方、本発明の実施例１の場合は、ＥＬＩＳＡ検出シグナルが大きく向上し、検量線の傾きも同様に増大しており、検出感度が向上している。すなわち、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいては、プロテインＡであるより、プロテインＡ由来の抗体結合性部分配列であるＺドメインを用いた融合タンパク質を用いるほうが、定量に適することが必要であることがわかった。
【００９３】
［ＣＸＣＬ１０のサンドイッチＥＬＩＳＡにおける比較］
ＣＸＣＬ１０のサンドイッチＥＬＩＳＡは、捕捉抗体としてマウスＩｇＧモノクローナル抗体、検出抗体として、ビオチン標識ヤギポリクローナル抗体を用いた。検出はＨＲＰ標識アビジンを用い、ＴＭＢを基質として用いた。上記抗体試薬は、Ｒ＆Ｄ社製を使用した組換えＣＸＣＬ１０は、２５０，１２５，６３，３１，１５，０ｐｇ／ｍＬの希釈溶液を作製し、標品として使用した。条件は、上記ＣＸＣＬ１のサンドイッチＥＬＩＳＡにおける比較と同じ方法で行った。図３に測定結果を示す。図３のデータから算出される濃度範囲０〜１２５ｐｇ／ｍＬにおける各プロットの回帰直線傾きおよび寄与率（ＩＵＰＡＣ定義）を表１４に示す。
【表１４】
2008255046.tif 000022
【００９４】
この結果から、図３及び表１４から、本発明の実施例の融合タンパク質を用いると、ＥＬＩＳＡ検出シグナルが大きく向上することが明らかとなった。また、検量線の傾きも、比較例に比べ増大しており、検出感度が向上したことを示している。本発明の融合タンパク質を用いると、ＣＸＣＬ１以外の抗原においても、検出感度が向上することがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、ＣＸＣＬ１のＥＬＩＳＡ結果である。４種の抗体結合プレート（未処理プレート、ＺＺ（コントロール）、タグＺＺ、ＳｅｌｆＺＺ）を用いた際の発色値を示す。
【図２】図２は、プロテインＡコートプレートを用いたＣＸＣＬ１のＥＬＩＳＡ結果である。３種の抗体結合プレート（未処理プレート、プロテインＡコートプレート、ＳｅｌｆＺＺ）を用いた際の発色値を示す。
【図３】図３は、ＣＸＣＬ１０のＥＬＩＳＡ結果である。４種の抗体結合プレート（未処理プレート、ＺＺ（コントロール）、タグＺＺ、ＳｅｌｆＺＺ）を用い際の発色値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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