(57)【要約】【課題】安全性が高く、粒子径が小さいことにより透明性が高く、且つ、経皮吸収性が良いタンパク質ナノ粒子を含む抗老化皮膚外用剤を提供すること。【解決手段】活性成分を内包したタンパク質ナノ粒子を含む、抗老化皮膚外用剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分を内包したタンパク質ナノ粒子を含む、抗老化皮膚外用剤。
【請求項２】
タンパク質ナノ粒子の平均粒子サイズが１０〜１００ｎｍである、請求項１に記載の抗老化皮膚外用剤。
【請求項３】
タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％の活性成分を含有する、請求項１又は２に記載の抗老化皮膚外用剤。
【請求項４】
活性成分が、抗酸化成分、保湿成分、活性酸素除去剤、抗炎症剤、アンチエイジング剤、コラーゲン合成促進剤、抗しわ剤、ビタミン剤、ミネラル、又はアミノ酸類からなる群より選ばれる少なくとも一種である、請求項１から３の何れかに記載の抗老化皮膚外用剤。
【請求項５】
活性成分が、イオン性物質または脂溶性物質である、請求項１から４の何れかに記載の抗老化皮膚外用剤。
【請求項６】
タンパク質がコラーゲン、ゼラチン、酸処理ゼラチン、アルブミン、オバルブミン、オバルブミン、カゼイン、トランスフェリン、グロブリン、フィブロイン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、又はビトロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種である、請求項１から４の何れかに記載の抗老化皮膚外用剤。
【請求項７】
ナノ粒子の形成中および／又は形成後にタンパク質が架橋処理されている、請求項１から６の何れかに記載の抗老化皮膚外用剤。
【請求項８】
酵素を用いて架橋処理を行う、請求項７に記載の抗老化皮膚外用剤。
【請求項９】
下記の工程（ａ）から（ｃ）によって作製されるカゼインナノ粒子を含む、請求項１から６の何れかに記載の抗老化皮膚外用剤。
（ａ）カゼインをpH８以上１１未満の塩基性水性媒体に混合する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得た溶液に少なくとも１種の活性成分を添加する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得た溶液をpH3.5〜7.5の水性媒体に注入する工程；
【請求項１０】
下記の工程（ａ）から（ｃ）によって作製されるカゼインナノ粒子を含む、請求項１から６の何れかに記載の抗老化皮膚外用剤。
（ａ）カゼインをpH８以上１１未満の塩基性水性媒体に混合する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得た溶液に少なくとも１種の活性成分を添加する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得た溶液のpH を等電点からpH1以上離れたpHまで下降させる工程；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性成分を内包したタンパク質ナノ粒子を含む抗老化皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、皮膚外用剤には種々の薬効を有する薬剤や皮膚水分保持能向上が期待される保湿剤や抗酸化剤が配合されてきた。例えば、日焼けによるシミ、ソバカスを予防又は改善するために、メラニン生成の抑制物質、例えばアルブチン、トラネキサム酸、コウジ酸、アスコルビン酸類等が配合されている。また、皮膚老化を予防又は改善するために、ビタミンＡやその脂肪酸エステル等が配合されている。近年の研究の結果、皮膚中のマトリックス成分の減少や変性が、老化に伴うシワやたるみ、ハリの低下などに大きくかかわっていることが明らかとなってきた。特にマトリックスの主要な成分であるコラーゲンの減少は、皮膚のたるみ、ハリの低下に関わり、またエラスチン分解酵素の発現により起こるエラスチンの分解変性は、弾力性の低下の原因と考えられ、コラーゲン産生亢進作用剤、コラーゲン分解酵素阻害剤、エラスチン分解酵素阻害剤などが抗老化剤として配合されている。
【０００３】
これら薬剤は一定の効果を示すものの、皮膚老化防止に十分な効果を示すには至っていなかったり、あるいは製剤中で変質するなどして初期の薬効が得られない場合が多く、その改善が望まれていた。また、上記薬剤配合の皮膚外用剤の剤型として、ローション剤は皮膚へ塗布後に垂れ落ちやすく、クリーム剤やゲル状剤は基剤から薬剤が放出しにくいため、薬効が充分に発揮されないことがある。
【０００４】
化粧品においては、近年、より明確な肌効果が求められるようになってきており、ナノテクノロジーをはじめ様々な新しい技術を取り入れることにより、機能性・使用性の向上、他社品との差別化が計られている。肌は一般的に、角質層がバリアーとして存在するために薬物の皮膚への浸透性が低い。肌効果を十分に発揮させるためには、有効成分の皮膚透過性の改善が不可欠である。また、皮膚に対して高い有効性を持っていても、保存安定性が悪かったり、皮膚に刺激を起こしやすかったりするために製剤化が困難な成分も多い。これらを解決すべく、経皮吸収性の改善および保存安定性の向上、皮膚刺激性の低減など目的とした、様々な微粒子材料の開発が進められている。現在、超微細乳化やリポソームなど各種微粒子材料が研究されている（たとえば、非特許文献１）。
【０００５】
乳化物やリポソームの代わりに高分子材料を用いれば、その構造上、保存安定性や生体内における粒子の安定性の点で、大きく改善されることが予想される。しかし、ほとんどの研究は乳化重合をはじめとする合成高分子を用いたものであり、より安全なキャリアーが求められている。たとえば、特許文献１は、高分子材料を用いたナノ粒子抗老化皮膚外用剤を提案している。特許文献２は、スキンケア成分を含む架橋高分子ナノ粒子を提案している。これらは界面活性剤を使用した乳化物や、モノマーもしくはマクロマー（重合性基を持つ合成高分子）の重合物であり、安全性に懸念がある。
【０００６】
非特許文献２では、生体適合性高分子である乳酸・グリコール酸共重合体（PLGA）ナノ粒子を提案している。しかし、PLGAは加水分解されやすく保存安定性に問題がある。また、体内で加水分解された場合、乳酸が産生し、悪影響を及ぼす懸念がある。
【０００７】
天然高分子は合成高分子と同様に高い構造安定性を示しながら、合成高分子よりも格段に安全性が高く、DDSキャリアーとしての利点を兼ね備えている。しかし、合成高分子に比べて天然高分子キャリアーの困難な点は、粒子作製方法である。天然高分子の粒子作製方法としては、噴霧乾燥、凍結乾燥およびジェットミルが利用できるが、ほとんどの場合、粒子サイズはミクロンサイズであり、大きさの制御が困難である。
【０００８】
【非特許文献１】西田  光広、フレグランスジャーナル、11月、17（2005）
【非特許文献２】辻本広行、Drug Delivery System、21-4、405（2006）
【特許文献１】特開２００２−３０８７２８公報
【特許文献２】特開２００４−２４４４２０公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、安全性が高く、粒子径が小さいことにより透明性が高く、且つ、皮膚への浸透性が良いタンパク質からなるナノ粒子を含む抗老化皮膚外用剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、活性成分を内包したタンパク質ナノ粒子を調製し、皮膚に適用した結果、安全性、透明性が高く、且つ、良好な皮膚浸透性が示されることを実証した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明によれば、活性成分を内包したタンパク質ナノ粒子を含む、抗老化皮膚外用剤が提供される。
好ましくは、タンパク質ナノ粒子の平均粒子サイズは１０〜１００ｎｍである。
好ましくは、０．０１〜５０重量％のタンパク質ナノ粒子を含有する。
好ましくは、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％の活性成分を含有する。
【００１２】
好ましくは、活性成分は、抗酸化成分、保湿成分、活性酸素除去剤、抗炎症剤、アンチエイジング剤、コラーゲン合成促進剤、抗しわ剤、ビタミン剤、ミネラル、又はアミノ酸類からなる群より選ばれる少なくとも一種である。
好ましくは、活性成分は、イオン性物質または脂溶性物質である。
好ましくは、タンパク質はコラーゲン、ゼラチン、酸処理ゼラチン、アルブミン、オバルブミン、オバルブミン、カゼイン、トランスフェリン、グロブリン、フィブロイン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、又はビトロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種である。
【００１３】
好ましくは、ナノ粒子の形成中および／又は形成後にタンパク質が架橋処理されている。
好ましくは、架橋剤は酵素を用いることができる。
酵素としては、タンパク質の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼを用いることができる。
【００１４】
好ましくは、本発明の抗老化皮膚外用剤は、下記の工程（ａ）から（ｃ）によって作製されるカゼインナノ粒子を含む。
（ａ）カゼインをpH８以上１１未満の塩基性水性媒体に混合させる工程；
（ｂ）工程（ａ）で得た溶液に少なくとも１種の活性成分を添加する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得た溶液をpH3.5〜7.5の水性媒体に注入する工程；
【００１５】
好ましくは、本発明の抗老化皮膚外用剤は、下記の工程（ａ）から（ｃ）によって作製されるカゼインナノ粒子を含む。
（ａ）カゼインをpH８以上１１未満の塩基性水性媒体に混合させる工程；
（ｂ）工程（ａ）で得た溶液に少なくとも１種の活性成分を添加する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得た溶液のpH をカゼインの等電点からpH1以上離れたpHまで下降させる工程；
【発明の効果】
【００１６】
本発明の抗老化皮膚外用剤における活性成分を内包した粒子はナノ粒子であるため、吸収性が高い。また、タンパク質ナノ粒子を用いるため、化学架橋剤や合成界面活性剤を用いることなく製造でき、安全性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態についてさらに具体的に説明する。
本発明の抗老化皮膚外用剤は、活性成分を内包したタンパク質ナノ粒子を含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明で用いる活性成分の種類は、皮膚から吸収されて抗老化活性を示す成分であれば特に限定されないが、好ましくは、抗酸化成分、保湿成分、活性酸素除去剤、抗炎症剤、アンチエイジング剤、コラーゲン合成促進剤、抗しわ剤、ビタミン剤、ミネラル、又はアミノ酸類から選ぶことができる。
【００１９】
抗酸化剤成分としては、例えば、カロテン類、レチノイン酸、レチノール、ビタミンＣ及びその誘導体、カイネチン、アスタキサンチン、トレチノイン、ビタミンＥおよびその誘導体、セサミン、α−リポ酸、コエンザイムＱ１０、フラボノイド類、エリソルビン酸、没食子酸プロピル、BHT（ジ-n-ブチルヒドロキシトルエン）、BHA（ブチルヒドロキシアニソール）、コウキエキス、大豆エキス、紅茶エキス、茶エキス、エイジツエキスなどを挙げることができる。
保湿成分としては、例えば、カンテン、ジグリセリン、ジステアリルジモニウムヘクトライト、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、へキシレングリコール、ヨクイニンエキス、ワセリン、尿素、ヒアルロン酸、セラミド、リピジュア、イソフラボン、アミノ酸、コラーゲン、ムコ多糖、フコダイン、ラクトフェリン、ソルビトール、キチン・キトサン、リンゴ酸、グルクロン酸、プラセンタエキス、海藻エキス、ボタンピエキス、アマチャエキス、オトギリソウエキス、コレウスエキス、マサキ抽出物、コウカエキス、マイカイ花エキス、チョレイエキス、サンザシエキス、ローズマリーエキス、デュークエキス、カミツレエキス、オドリコソウエキス、レイシエキス、セイヨウノコギリソウエキス、アロエエキス、マロニエエキス、アスナロエキズ、ヒバマタエキス、オスモインエキス、オーツ麦エキス、チューベロースポリサッカライド、冬虫夏草エキス、大麦エキス、オレンジ抽出物、ジオウエキス、サンショウエキス、ヨクイニンエキスなどを挙げることができる。また、カゼインナノ粒子の場合は、カゼイン自体が保湿性を有する。
【００２０】
活性酸素除去剤としては、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、マンニトール、ベータカロチン等のカロテノイド類、アスタキサンチン、ルチン及びその誘導体、ビリルビン、コレステロール、トリプトファン、ヒスチジン、クエルセチン、クエルシトリン、カテキン、カテキン誘導体、没食子酸、没食子酸誘導体、オウゴン抽出物、イチョウ抽出物、ユキノシタ抽出物、メリッサ抽出物、ゲンノショウコ抽出物、ボタンピ抽出物、パセリ抽出物、トルメンチラ抽出物、羅漢果抽出物、海藻抽出物、ヤシャジツ抽出物、ジコッピ抽出物等を挙げることができる。
【００２１】
抗炎症剤としては、アズレン、グアイアズレン、塩酸ジフェンヒドラミン、酢酸ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、メフェナム酸、フェニルブタゾン、インドメタシン、イブプロフェン及びケトプロフェンから選ばれる化合物並びにそれらの誘導体並びにそれらの塩、オウゴンエキス、カワラヨモギエキス、キキョウエキス、キョウニンエキス、クチナシエキス、クマザサ抽出液、ゲンチアナエキス、コンフリーエキス、シラカバエキス、ゼニアオイエキス、トウニンエキス、桃葉エキス並びにビワ葉エキスから選ばれる植物抽出物等を挙げることができる。
【００２２】
アンチエイジング剤、コラーゲン合成促進剤、抗しわ剤、ビタミン剤、ミネラル、又はアミノ酸類も公知の化合物を用いることができる。
【００２３】
上記した活性成分は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００２４】
また、これらのうち、脂溶性の活性物質とカゼイン疎水性部分の相互作用を利用して、カゼインナノ粒子内に活性物質を内包できることが見出され、これらの粒子は水溶液中で安定に存在することが見出されたため、これらの成分のうち、好ましくはＣｌｏｇＰが０より大きく、より好ましくはＣｌｏｇＰが１以上であり、さらに好ましくはＣＬｏｇＰが３以上である。
【００２５】
また、カゼインとイオン性多糖または別種のイオン性タンパク質との混合粒子により、イオン性活性成分を内包することも見出された。
【００２６】
本発明の抗老化皮膚外用剤は、０．０１〜５０重量％のタンパク質ナノ粒子を含有することが好ましく、０．１〜１０重量％のタンパク質ナノ粒子を含有することがさらに好ましい。本発明の抗老化皮膚外用剤は、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％の活性成分を含有することが好ましく、タンパク質の重量に対して、０.１〜５０重量％の活性成分を含有することがさらに好ましい。
本発明において、活性成分は、タンパク質ナノ粒子の形成時に添加してもよいし、ナノ粒子の作成後に添加してもよい。
【００２７】
本発明で用いるタンパク質ナノ粒子の平均粒子サイズは、通常は１〜１００ｎｍであり、好ましくは１０〜１００ｎｍであり、より好ましくは1０〜５０ｎｍであり、さらに好ましくは１０〜４０ｎｍであり、特に好ましくは２０〜４０ｎｍである。
【００２８】
本発明で用いるタンパク質の種類は特に限定されないが、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパクが好ましく、分子量１万から１００万程度のタンパク質を用いることが好ましい。タンパク質の由来は特に限定されないが、天然に存在するタンパク質、特にヒト由来のタンパク質を用いることが好ましい。タンパク質として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。コラーゲン、ゼラチン、酸処理ゼラチン、アルブミン、オバルブミン、カゼイン、トランスフェリン、グロブリン、フィブロイン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、又はビトロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種を使用することができる。また、タンパク質の由来は特に限定するものではなく、牛、豚、魚、植物および遺伝子組み換え体のいずれも用いることができる。遺伝子組み換えゼラチンとしては、例えばEP1014176Ａ２号、米国特許6,992,172号に記載のものを用いることができるがこれらに限定されるものではない。その中で好ましいものは、カゼイン、酸処理ゼラチン、コラーゲン、又はアルブミンであり、最も好ましいものはカゼイン、又は酸処理ゼラチンである。本発明でカゼインを用いる場合、カゼインの由来は特に限定されず、乳由来であっても、豆由来であってもよく、α−カゼイン、β−カゼイン、γ−カゼイン、κ−カゼインおよびそれらの混合物を使用することができる。カゼインは、単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２９】
本発明に用いられるタンパク質は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００３０】
本発明では、ナノ粒子の形成中および／又は形成後にタンパク質を架橋処理することができる。上記した架橋処理は、酵素を用いることができる。酵素としては、タンパクの架橋作用が知られているものであれば特に制限されず、その中で好ましいものはトランスグルタミナーゼである。
【００３１】
トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、遺伝子組み換え体を用いることができる。具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼ、ヒト由来リコンビナントトランスグルタミナーゼなどが挙げられる。
【００３２】
本発明において架橋処理のために用いられる酵素の量は、タンパク質の種類に応じて適宜設定することが出来るが、標準的には、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％程度を添加することができ、好ましくは、１〜５０重量％程度を添加することができる。
【００３３】
酵素による架橋反応の時間は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、１時間から７２時間反応することができ、好ましくは、２時間から２４時間反応することができる。
【００３４】
酵素による架橋反応の温度は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃で反応することができ、好ましくは、２５℃から６０℃で反応することができる。
【００３５】
本発明に用いられる酵素を単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３６】
本発明のナノ粒子は、特許文献特開平６−７９１６８号公報、又はC.Coester著、ジャーナル・ミクロカプスレーション、２０００年、１７巻、p.１８７−１９３に記載の方法に準じて作製することができるが、架橋方法としてグルタルアルデヒドの代わりに酵素を用いることが好ましい。
【００３７】
また、本発明においては、酵素架橋処理を有機溶媒中で行うことが好ましい。ここで用いる有機溶媒としては、エタノール、イソプロパノール、アセトン、THFなどの水溶性有機溶媒が好ましい。
さらに、本発明においては、架橋処理後に有機溶媒を留去し、水分散することが好ましい。有機溶媒を留去前に水を加えてもよく、留去後に水を加えても良い。
【００３８】
本発明の抗老化皮膚外用剤には、脂質（リン脂質など）、アニオン性多糖、カチオン性多糖、アニオン性タンパク質、カチオンタンパク質、又はシクロデキストリンから選択される１種以上の成分を添加することもできる。脂質（リン脂質など）、アニオン性多糖、カチオン性多糖、アニオン性タンパク質、カチオンタンパク質、及びシクロデキストリンの添加量は特に限定されないが、一般的にはタンパク質の重量に対して０.１〜１００重量％の量で添加することができる。本発明の抗老化皮膚外用剤においては、上記成分とタンパク質の比を変えることよって、徐放速度を調整することができる。
【００３９】
本発明に用いることができるリン脂質として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。
【００４０】
本発明に用いることができるアニオン性多糖とはカルボキシル基、硫酸基又はリン酸基等の酸性極性基を有する多糖類である。以下に具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、アルギン酸、ペクチン、カラギーナン、フコイダン、アガロペクチン、ポルフィラン、カラヤガム、ジェランガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸類等が挙げられる。
【００４１】
本発明に用いることができるカチオン性多糖とは、アミノ基等の塩基性極性基を有する多糖類である。以下に具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。キチン、キトサンなどのグルコサミンやガラクトサミンを構成単糖として含むものなどが挙げられる。
【００４２】
本発明に用いることができるアニオン性タンパク質とは等電点が生理的ｐＨよりも塩基性側にあるタンパク質およびリポタンパク質である。具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リゾチーム、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、α−キモトリプシンなどが挙げられる。
【００４３】
本発明に用いられるカチオンタンパク質とは等電点が生理的ｐＨよりも酸性側にあるタンパク質およびリポタンパク質である。具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ポリリジン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、オバルブミンなどが挙げられる。
【００４４】
本発明においては、下記の工程（ａ）から（ｃ）によって作製されるカゼインナノ粒子を用いることができる。
（ａ）カゼインをpH８以上１１未満の塩基性水性媒体に混合させる工程；
（ｂ）工程（ａ）で得た溶液に少なくとも１種の活性成分を添加する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得た溶液をpH3.5〜7.5の水性媒体に注入する工程；
【００４５】
さらに本発明においては、下記の工程（ａ）から（ｃ）によって作製されるカゼインナノ粒子を用いることができる。
（ａ）カゼインをpH８１１未満以上の塩基性水性媒体に混合させる工程；
（ｂ）工程（ａ）で得た溶液に少なくとも１種の活性成分を添加する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得た溶液のpH を等電点からpH1以上離れたpHまで下降させる工程；
【００４６】
本発明においては、所望のサイズのカゼインナノ粒子を作製できる。また、疎水性の活性成分とカゼイン疎水性部分の相互作用を利用して、カゼインナノ粒子内に活性成分を内包できる。さらに、これらの粒子は水溶液中で安定に存在することが見出された。
また、カゼインとイオン性多糖または別種のイオン性タンパク質との混合粒子により、イオン性活性成分を内包することも見出された。
【００４７】
本発明のカゼインナノ粒子の作製方法は、カゼインを塩基性水性媒体液に混合し、塩基性水性媒体中に注入する方法と、カゼインを塩基性水性媒体液に混合し、攪拌しながら、pHを下降させる方法が挙げられる。
【００４８】
カゼインを塩基性水性媒体液に混合し、塩基性水性媒体中に注入する方法としては、シリンジによるのが簡便で好ましいが、注入速度、溶解性、温度、撹拌状態を満足する方法であれば特に限定しない。一般的には、注入速度は、1mL/minから100mL/minで注入することができる。塩基性水性媒体の温度は、適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃にすることができ、好ましくは、２５℃から７０℃にすることができる。水性媒体の温度は、適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃にすることができ、好ましくは、２５℃から６０℃ですることができる。攪拌速度は、適宜設定することができるが、標準的には、100rpmから3000rpmにすることができ、好ましくは、200rpmから2000rpmである。
【００４９】
カゼインを塩基性水性媒体液に混合し、攪拌しながら、pHを下降させる方法としては、酸を滴下するのが簡便で好ましいが、溶解性、温度、撹拌状態を満足する方法であれば特に限定しない。塩基性水性媒体の温度は、適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃にすることができ、好ましくは、２５℃から７０℃にすることができる。攪拌速度は、適宜設定することができるが、標準的には、100rpmから3000rpmにすることができ、好ましくは、200rpmから2000rpmである。
【００５０】
本発明に用いる水性媒体は、有機酸または塩基、無機酸または無機塩基の水溶液、又は緩衝液を用いることができる。
【００５１】
具体的には、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、カルボン酸、酒石酸、コハク酸、酢酸またはフタル酸、トリフルオロ酢酸、モルホリノエタンスルホン酸、2-〔4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル〕エタンスルホン酸のような有機酸；トリス（ヒドロキシメチル）、アミノメタン、アンモニアのような有機塩基；塩酸、過塩素酸、炭酸のような無機酸；燐酸ナトリウム、燐酸カリウム、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウムのような無機塩基を用いた水溶液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
本発明に用いる水性媒体の濃度は、約10mMから約１Mが好ましい。より好ましくは、約20mMから約200mMである。
【００５３】
本発明に用いる塩基性水性媒体のpHは、８以上が好ましく、８から１２が好ましい。より好ましくはpH９から１１である。pHが高すぎると加水分解の懸念や取り扱い上の危険性があるため、上述の範囲が好ましい。
【００５４】
本発明において、カゼインをpH８以上の塩基性水性媒体に混合させる温度は、０〜80℃が好ましく、10〜60℃が好ましい。より好ましくは、20〜40℃である。
【００５５】
本発明に用いる酸性水性媒体のpHは、好ましいpHは3.5〜7.5である。より好ましくはpHは５から６である。
【００５６】
本発明の抗老化皮膚外用剤はさらに、添加物を含むことができる。添加物としては特に限定することはないが、抗酸化成分、活性酸素除去剤、抗炎症剤、アンチエイジング剤、コラーゲン合成促進剤、抗しわ剤、ビタミン剤、ミネラル、アミノ酸類、抗菌剤、紫外線吸収剤、保湿剤、柔軟剤、経皮吸収促進剤、無痛化剤、防腐剤、酸化防止剤、色素剤、増粘剤、香料、又はpH調整剤から選択される１種以上のものを使用することができる。
【００５７】
本発明で用いることができる抗菌剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。抗菌剤が、ピロクトンオラミン、イソプロピルメチルエーテル、ヒノキチオール、ジンクピリチオン、クリンバゾール、塩化ベンザルコニウム、感光色素101、感光色素201、クロルヘキシジン、サリチル酸、フェノール、ケトコナゾール及びミコナゾールなどが挙げられる。
【００５８】
本発明で用いることができる紫外線吸収剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。紫外線防止剤が、サリチル酸ホモメンチル、４−メトキシケイ皮酸−２−エチルヘキシル、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノンスルホン酸、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノンスルホン酸ナトリウム、４−ｔ−ブチル−４’−メトキシ−ジベンゾイルメタン、酸化チタンおよび酸化亜鉛等が挙げられる。
【００５９】
本発明で用いることができる保湿剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。カンテン、ジグリセリン、ジステアリルジモニウムヘクトライト、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、へキシレングリコール、ヨクイニンエキス、ワセリン、尿素、ヒアルロン酸、セラミド、リピジュア、イソフラボン、アミノ酸、コラーゲン、ムコ多糖、フコダイン、ラクトフェリン、ソルビトール、キチン・キトサン、リンゴ酸、グルクロン酸、プラセンタエキス、海藻エキス、ボタンピエキス、アマチャエキス、オトギリソウエキス、コレウスエキス、マサキ抽出物、コウカエキス、マイカイ花エキス、チョレイエキス、サンザシエキス、ローズマリーエキス、デュークエキス、カミツレエキス、オドリコソウエキス、レイシエキス、セイヨウノコギリソウエキス、アロエエキス、マロニエエキス、アスナロエキズ、ヒバマタエキス、オスモインエキス、オーツ麦エキス、チューベロースポリサッカライド、冬虫夏草エキス、大麦エキス、オレンジ抽出物、ジオウエキス、サンショウエキス、ヨクイニンエキスなどが挙げられる。
【００６０】
本発明で用いることができる柔軟剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。グリセリン、ミネラルオイル、エモリエント成分（例えば、イソステアリン酸イソプロピル、イソステアリン酸ポリグリセリル、イソノナン酸イソトリデシル、イソノナン酸オクチル、オレイン酸、オレイン酸グリセリル、カカオ脂、コレステロール、混合脂肪酸トリグリセリド、コハク酸ジオクチル、酢酸ステアリン酸スクロース、シクロペンタシロキサン、ジステアリン酸スクロース、パルミチン酸オクチル、ヒドロキシステアリン酸オクチル、ベヘン酸アラキル、ポリベヘン酸スクロース、ポリメチルシルセスキオキサン、ミリスチルアルコール、ミリスチン酸セチル、ミリスチン酸ミリスチル、ラウリン酸ヘキシルなど）が挙げられる。
【００６１】
本発明で用いることができる経皮吸収促進剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。エタノール、ミリスチン酸イソプロピル、クエン酸、スクワラン、オレイン酸、メントール、N-メチル-2-ピロリドン、アジピン酸ジエチル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジエチル、セバシン酸ジイソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸イソプロピル、オレイン酸オクチルドデシル、イソステアリルアルコール、2-オクチルドデカノール、尿素、植物油、動物油が挙げられる。
【００６２】
本発明で用いることができる無痛化剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ベンジルアルコール、塩酸プロカイン、塩酸キシロカイン、 クロロブタノールなどが挙げられる。
【００６３】
本発明で用いることができる防腐剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。安息香酸、安息香酸ナトリウム、パラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、過酸化水素、ギ酸、ギ酸エチル、ジ亜塩素酸ナトリウム、プロピオン酸、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸カルシウム、ペクチン分解物、ポリリジン、フェノール、イソプロピルメチルフェノール、オルトフェニルフェノール、フェノキシエタノール、レゾルシン、チモール、チラム、ティートリー油が挙げられる。
【００６４】
本発明で用いることができる酸化防止剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ビタミンA、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール、レチニルアセテート、レチニルパルミテート、レチノイン酸トコフェリル、ビタミンＣおよびその誘導体、カイネチン、β−カロテン、アスタキサンチン、ルテイン、リコピン、トレチノイン、ビタミンＥ、α−リポ酸、コエンザイムＱ１０、ポリフェノール、ＳＯＤ、フィチン酸などが挙げられる。
【００６５】
本発明で用いることができる色素剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。オキアミ色素、オレンジ色素、カカオ色素、カオリン、カルミン類、グンジョウ、コチニール色素、酸化クロム、酸化鉄、二酸化チタン、タール色素、クロロフィルなどが挙げられる。
【００６６】
本発明で用いることができる増粘剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。クインスシード、カラギーナン、アラビアガム、カラヤガム、キサンタンガム、ジェランガム、タマリンドガム、ローカストビーンガム、トラガントガム、ペクチン、デンプン、シクロデキストリン、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００６７】
本発明で用いることができる香料として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ジャコウ、アカシア油、アニス油、イランイラン油、シナモン油、ジャスミン油、スウィートオレンジ油、スペアミント油、ゼラニウム油、タイム油、ネロリ油、ハッカ油、ヒノキ油、フェンネル油、ペパーミント油、ベルガモット油、ライム油、ラベンダー油、レモン油、レモングラス油、ローズ油、ローズウッド油、アニスアルデヒド、ゲラニオール、シトラール、シベトン、ムスコン、リモネン、バニリンなどが挙げられる。
【００６８】
本発明で用いることができるpH調整剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、リン酸、コハク酸が挙げられる。
【００６９】
本発明の抗老化皮膚外用剤の剤型は特に限定されないが、例えば、液剤、湿布剤、塗布剤、ゲル剤、クリーム剤、エアゾール剤、ローション剤、粉剤、泡剤、化粧水、ボディーソープ、石鹸、粧料などを挙げることができる。
【００７０】
本発明の抗老化皮膚外用剤の投与方法としては、経皮・経粘膜投与が挙げられる。
【００７１】
本発明の抗老化皮膚外用剤の投与量は、活性成分の種類及び使用量、使用者の体重、疾患の状態などに応じて適宜設定することができるが、一般的には、１回の投与につき、１μｇ〜５０ｍｇ／ｃｍ2程度を投与することができ、好ましくは２．５μｇ〜１０ｍｇ／ｃｍ2程度を投与することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７２】
実施例１：
カゼイン（乳由来・和光純薬製）１００ｍｇを、ｐＨ１０、５０mMリン酸バッファー１０ｍLに混合させる。クマリン６（和光純薬製）0.015ｍｇをエタノール0.1mLに溶解させる。この２種の溶液を混合し、塩酸を加えpHを７.5に調整したところ、カゼインナノ粒子が得られた。
上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計、ニッキソー（株）製ナノトラックを用い測定したところ、２９nmであった。
【００７３】
実施例２：
カゼインNa（乳由来・和光純薬製）10ｍｇをpH９、５０mMリン酸バッファー1ｍLに混合させる。グリチルレチン酸（和光純薬製）1.7ｍｇをエタノール0.25mLに溶解させる。カゼイン溶液に攪拌下、グリチルレチン酸溶液を滴下し、この混合液を、外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、１mLをマイクロシリンジを用いて、pH5、２００mMのリン酸バッファー水１０ｍL中に注入したところ、グリチルレチン酸を内包したカゼインナノ粒子の水分散液が得られた。
上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計、ニッキソー（株）製マイクロトラックを用い測定したところ、83nmであった。
【００７４】
実施例３：
カゼイン（乳由来・和光純薬製）２０ｍｇ、プロタミン硫酸塩（和光純薬製）１ｍｇをpH１０、５０mMリン酸バッファー１ｍLに混合させる。α−リポ酸１ｍｇをイオン交換水に溶解させる。この２種の溶液を混合し、外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、１mLをマイクロシリンジを用いて、pH5、２００mMのリン酸バッファー水１０ｍL中に注入したところ、カゼインナノ粒子が得られた。
上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計、日機装（株）製ナノトラックを用い測定したところ、４８nmであった。
【００７５】
実施例４：
カゼインNa（乳由来・和光純薬製）10ｍｇをpH９、５０mMリン酸バッファー1ｍLに混合させる。酢酸トコフェロール1.7ｍｇをエタノール0.25mLに溶解させる。カゼイン溶液に攪拌下、酢酸トコフェロール溶液を滴下し、この混合液を、外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、カゼイン溶液１mLをマイクロシリンジを用いて、２００mMのリン酸バッファー水１０ｍL中に注入したところ、酢酸トコフェロールを内包したカゼインナノ粒子の水分散液が得られた。
上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計、ニッキソー（株）製マイクロトラックを用い測定したところ、124nmであった。
【００７６】
実施例５：
エタノール0.5ｍＬ、カゼイン（乳由来・和光純薬製）２０ｍｇ、pH１０、５０mMリン酸バッファー１ｍLを混合させる。β-カロテン（和光純薬製）0.5ｍｇをエタノール0.25mLに溶解させる。カゼイン溶液に攪拌下、β-カロテン溶液を滴下し、この混合液を、外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、マイクロシリンジを用いて、pH5、３００mMのリン酸バッファー水１０ｍL中に注入することで、カゼインナノ粒子が得られた。
上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計、日機装（株）製ナノトラックを用い測定したところ、８８nmであった。
【００７７】
実施例６：
酸処理ゼラチン10ｍｇ、TG-S（味の素製）5ｍｇを水1ｍLに溶解させる。外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、ゼラチン溶液１mLをマイクロシリンジを用いて、グリチルレチン酸1.7ｍｇを溶解したエタノール１０ｍL中に注入したところ、ゼラチンナノ粒子が得られた。外設55℃で5時間静置し、ゼラチンナノ粒子を酵素架橋する。
上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計、ニッキソー（株）製マイクロトラックを用い測定したところ、80nmであった。
【００７８】
実施例７：
カゼインNa（乳由来・和光純薬製）10ｍｇをpH９リン酸バッファー1ｍLに混合させる。パルミトイルアスコルビン酸（和光純薬製）1ｍｇをエタノール0.２mLに溶解させる。この２液を混合し、外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、カゼイン溶液１mLをマイクロシリンジを用いて、pH5のリン酸バッファー水１０ｍL中に注入したところ、パルミトイルアスコルビン酸を内包したカゼインナノ粒子の水分散液が得られた。
上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計、ニッキソー（株）製マイクロトラックを用い測定したところ、124nmであった。
【００７９】
実施例８：
カゼイン（乳由来・和光純薬製）10ｍｇをpH10、５０mMリン酸バッファー1ｍLに混合させる。レチノイン酸1mgをエタノール0.3mLに溶解させる。カゼイン溶液にポリリジン1％水溶液0.2ｍLを加え、攪拌下、レチノイン酸溶液を滴下し、この混合液を、外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、カゼイン溶液１mLをマイクロシリンジを用いて、pH5、２００mMのリン酸バッファー水１０ｍL中に注入したところ、レチノイン酸を内包したカゼインナノ粒子の水分散液が得られた。
上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計（大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００）を用い測定したところ、69nmであった。
【００８０】
実施例９：
酸処理ゼラチン10ｍｇ、TG-S（味の素製）5ｍｇを水1ｍLに溶解させる。外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、ゼラチン溶液１mLをマイクロシリンジを用いて、トコフェロール1.7ｍｇを溶解したエタノール１０ｍL中に注入したところ、ゼラチンナノ粒子が得られた。外設55℃で5時間静置し、ゼラチンナノ粒子を酵素架橋する。
上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計、ニッキソー（株）製マイクロトラックを用い測定したところ、95nmであった。
【００８１】
試験例１：
実施例２から６に記載のナノ粒子分散液を室温にて１ヶ月保存後、ニッキソー（株）製マイクロトラックを用い平均粒経を測定した。
比較例１として、合成ポリマー（ＰＬＧＡ）のナノ粒子分散液であるナノインパクト（ホソカワミクロン製）。
試験例１の測定結果を表１に示す。
【００８２】
【表１】
2008255020.tif 000002
【００８３】
試験例２：ヘアレスラット摘出皮膚試験
実施例１で作製したカゼインナノ粒子分散液４００μＬを染み込ませた2cm角の不織布をヘアレスラット摘出皮膚に貼付し、30分間静置した。この皮膚をOCTコンパウンド（サクラファインテック（株）製）で包埋し、液体窒素で凍結した。これをカールツァイス（株）製クリオスタット（cryostat）を用いて凍結切片を作製し、DAPI入り封入剤でプレパラートガラス上に固定・封入したのち、蛍光顕微鏡観察した。
【００８４】
比較例１：未貼付
比較例２：
以下のものについても試験例２と同様に蛍光顕微鏡観察を行った。
カゼイン（乳由来・和光純薬製）１００ｍｇを、蒸留水１０ｍLに混合させる。クマリン６（和光純薬製）0.015ｍｇをエタノール0.1mLに溶解させる。この２種の溶液を混合して得られた分散液。
【００８５】
比較例３：
以下のものについても試験例２と同様に蛍光顕微鏡観察を行った。
エタノール50％水溶液に0.15ｍｇ/ｍＬ濃度のクマリン６を溶解した液。
【００８６】
試験例３：SDラットin vivo試験
SDラットに麻酔注射後、実施例１で作製したカゼインナノ粒子分散液４００μＬを染み込ませた2cm角の不織布を腹部皮膚に貼付し、60分間静置した。この皮膚をOCTコンパウンド（サクラファインテック（株）製）で包埋し、液体窒素で凍結した。これをカールツァイス（株）製クリオスタット（cryostat）を用いて凍結切片を作製し、DAPI入り封入剤でプレパラートガラス上に固定・封入したのち、蛍光顕微鏡観察した。
【００８７】
比較例４：
以下のものについても試験例３と同様に蛍光顕微鏡観察を行った。
エタノール50％水溶液に0.15ｍｇ/ｍＬ濃度のクマリン６を溶解した溶液。
【００８８】
比較例２、３、４、５、及び実施例１、２のヘアレスラット摘出皮膚およびＳＤラット皮膚切片の蛍光顕微鏡写真を図１ａ〜６ａに示す。図１ｂ〜６ｂは、図１a〜６aと同一視野でのDAPI染色による組織の写真を示す。
【００８９】
上記の実施例より、本発明の抗老化皮膚外用剤は皮膚への浸透性と安定性が高いことが分かる。
また、天然高分子を用いることによって、安全性が高い。
更に粒子径が小さいことにより透明性が高い。
【００９０】
実施例１で作製したカゼインナノ粒子分散液をモニター5名に評価してもらったところ、全員が塗り伸ばしやすさ、さっぱり感に優れ、べたつきがないなど、使用感も良好であると回答した。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、比較例２の蛍光顕微鏡観察の結果を示す。
【図２】図２は、比較例３の蛍光顕微鏡観察の結果を示す。
【図３】図３は、比較例４の蛍光顕微鏡観察の結果を示す。
【図４】図４は、実施例１の蛍光顕微鏡観察の結果を示す。
【図５】図５は、比較例５の蛍光顕微鏡観察の結果を示す。
【図６】図６は、実施例２の蛍光顕微鏡観察の結果を示す。
【図１】
2008255020.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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