(57)【要約】      （修正有）【課題】目標物質の変化速度がビデオレート以上のときにも適切な観察や解析を行うことができる光量検出方法、光量検出装置及び顕微鏡を提供する。【解決手段】標本から来る光を、特定の波長とそれ以外の波長とに分割する波長分割手段と前記標本から来る全波長域の光量及びこの光量のうちの前記分割手段を経た特定の波長域以外の光量をそれぞれ検出する検出手段と、前記全波長域の光量から前記特定の波長域以外の光量を差し引いて前記特定の波長域の光量を演算する演算手段とを有する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本から来る光を、特定の波長とそれ以外の波長とに分割する波長分割手段と、
前記標本から来る全波長域の光量及びこの光量のうちの前記波長分割手段を経た特定の波長域以外の光量をそれぞれ検出する検出手段と、
前記全波長域の光量から前記特定の波長域以外の光量を差し引いて前記特定の波長域の光量を演算する演算手段と
を備えていることを特徴とする光量検出装置。
【請求項２】
前記光は、励起光が照射された前記標本から発せられた蛍光であることを特徴とする請求項１記載の光量検出装置。
【請求項３】
請求項１又は２記載の光量検出装置を備えていることを特徴とする顕微鏡。
【請求項４】
標本から来る全波長域の光量を検出する第１工程と、
第１工程の後、前記全波長域の光量の中から特定の波長域以外の光量を検出する第２工程と、
第２工程の後、前記第１工程で検出された全波長域の光量から前記第２工程で検出された特定の波長域以外の光量を差し引いて前記特定の波長域の光量を演算する第３工程と
を含むことを特徴とする光量検出方法。
【請求項５】
前記光は、励起光が照射された前記標本から発せられた蛍光であることを特徴とする請求項４記載の光量検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は光量検出装置、顕微鏡及び光量検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
工業分野、生物学分野において蛍光型コンフォーカル顕微鏡が広く使用され、観察だけでなく定量解析に用いられている。
【０００３】
目標物質（例えば生物細胞）に標識として蛍光試薬を与え、励起光を照射して蛍光像を観察し、間接的に目標物質の振る舞いを解析することができる（下記特許文献参照）。
【０００４】
近年、蛍光の波長域が長波長に広がり、蛍光試薬の種類が増えている。複数の蛍光試薬を用いることにより、１波長の光による励起で同時に複数の波長の蛍光を発光させ、複数個の細胞内物質の挙動を同時に解析することができる。
【０００５】
ところで、生体細胞（標本）の観察は数日間に亘って行われることもあるが、細胞内物質の動態観察や解析には細胞の変化速度に合わせた観察を行いたいという要望がある。細胞の変化速度はビデオレートより高いことがある（例えばミリ秒）。
【特許文献１】特開２００５−２８３６５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、蛍光は微弱光であるため、蛍光の検出時間を短くすることは検出される光量が一層不足することになり、細胞内物質の動態観察等を適切に行うことは困難であった。
【０００７】
この発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、その課題は目標物質の変化速度がビデオレート以上のときにも適切な観察や解析を行うことができる光量検出方法、光量検出装置及び顕微鏡を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため請求項１記載の発明は、標本から来る光を、特定の波長とそれ以外の波長とに分割する波長分割手段と、前記標本から来る全波長域の光量及びこの光量のうちの前記波長分割手段を経た特定の波長域以外の光量をそれぞれ検出する検出手段と、前記全波長域の光量から前記特定の波長域以外の光量を差し引いて前記特定の波長域の光量を演算する演算手段とを備えていることを特徴とする。
【０００９】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の光量検出方法において、前記光は、励起光が照射された前記標本から発せられた蛍光であることを特徴とする。
【００１０】
請求項３記載の発明は、請求項１又は２記載の光量検出装置を備えていることを特徴とする顕微鏡である。
【００１１】
請求項４記載の発明は、標本から来る全波長域の光量を検出する第１工程と、第１工程の後、前記全波長域の光量の中から特定の波長域以外の光量を検出する第２工程と、第２工程の後、前記第１工程で検出された全波長域の光量から前記第２工程で検出された特定の波長域以外の光量を差し引いて前記特定の波長域の光量を演算する第３工程とを含むことを特徴とする。
【００１２】
請求項５記載の発明は、請求項４記載の光量検出方法において、前記光は、励起光が照射された前記標本から発せられた蛍光であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
この発明によれば、目標物質の変化速度がビデオレートより高いときにも適切な観察や解析を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、この発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
【００１５】
図１はこの発明の第１実施形態に係る光量検出方法を実施するための落射蛍光型コンフォーカル顕微鏡を示す概念図である。
【００１６】
この落射蛍光型コンフォーカル顕微鏡は、レーザ光源４と蛍光ブロック５と対物レンズ３とピンホール板７と結像レンズ（第２対物レンズ）６と蛍光検出装置（光量検出装置）８と画像処理回路（演算手段）２０とモニタ２１とを備えている。
【００１７】
レーザ光源４は励起光を出射する。
【００１８】
蛍光ブロック５は例えばダイクロイックプリズムである。蛍光ブロック５はレーザ光源４から出射された励起光を反射させるが、標本２からの反射光（蛍光）を透過させる。標本２はステージ１に載置された細胞容器９内に収容された培養細胞等である。培養細胞は複数の蛍光試薬（例えば蛍光性の有機物質）によって多色蛍光染色されている。
【００１９】
対物レンズ３は励起光を標本２に集光させる。
【００２０】
ピンホール板７にはピンホール７ａが形成されている。ピンホール７ａは対物レンズ３の焦点面（標本面２ａ）と共役な位置に置かれ、標本面２ａで発せられた光だけを通過させる。
【００２１】
結像レンズ６は標本２で励起された蛍光をピンホール７ａに集光させる。
【００２２】
蛍光検出装置８は、ピンホール７ａを通過した標本２の蛍光を検出し、蛍光の光量に応じた光強度信号を出力する。
【００２３】
画像処理回路２０は例えばワンチップマイクロコンピュータで構成される。画像処理回路２０は、蛍光検出装置８から出力された光強度信号に基づいて、標本２のすべての波長（後述する波長λ１，λ２，λ３，λ４）に対応するそれぞれの蛍光像をモニタ２１に表示させたり、標本２の目的とする特定の波長の蛍光像だけをモニタ２１に表示させたり、標本２の複数の波長に対応する複数の蛍光像を合成し、合成した１つの蛍光像だけを表示させたりすることができる。
【００２４】
次に、落射蛍光型コンフォーカル顕微鏡の動作を図１に基づいて説明する。
【００２５】
レーザ光源４から出射された励起光は、蛍光ブロック５に入射し、蛍光ブロック５で反射され、対物レンズ３に導かれる。対物レンズ３を通った励起光は対物レンズ３の光路上に置かれた標本２に照射される。
【００２６】
励起光によって標本２中の蛍光物質が励起され、励起光よりも波長の長い蛍光が発生する。複数の蛍光試薬が用いられているので、１波長の励起光によって複数の異なる波長の蛍光が発生する。
【００２７】
蛍光は励起光とともに再び対物レンズ３を通り、蛍光ブロック５に入射する。蛍光は蛍光ブロック５を透過するが、励起光は遮断される。蛍光ブロック５を透過した蛍光は結像レンズ６で集光され、標本面２ａからの蛍光だけがピンホール７ａを通過する。
【００２８】
その後、蛍光は蛍光検出装置８で検出されて電気信号に変換され、モニタ２１に蛍光画像が表示される。
【００２９】
図２はこの発明の第１実施形態に係る蛍光検出装置の構成を説明する概念図である。
【００３０】
蛍光検出装置８は集光レンズ９と波長選択フィルタ（波長分割手段）１０とフォトマルチプライヤ（検出手段）１１，１２とを備えている。
【００３１】
図２では波長分割手段として波長選択フィルタ１０が記載されているが、波長選択フィルタ１０は反射（又は透過）特性の異なる複数のフィルタ（図示せず）で構成され、電動ターレット（図示せず）に保持されている。波長選択フィルタ１０を構成する複数のフィルタの中から選択された特定のフィルタが光路上に配置される。
【００３２】
フォトマルチプライヤ１１，１２は光を電気に変換する光電変換素子であり、受け取った微弱光を１０万〜１０００万倍の電流に変換する。
【００３３】
標本２で発生した蛍光の波長をλ１，λ２，λ３，λ４としたとき、ピンホール７ａを通過した波長λ１，λ２，λ３，λ４の蛍光は集光レンズ９に入射する。集光レンズ９に入射した蛍光は波長選択フィルタ１０に入射する。例えば、波長λ１の蛍光を検出する場合には、波長λ１の蛍光だけを反射させ、それ以外の波長λ２〜λ４の蛍光を透過させる特性を有するフィルタを、波長選択フィルタ１０を構成する複数のフィルタの中から選択する。このとき、フォトマルチプライヤ１１は波長λ２〜λ４の蛍光を検出し、フォトマルチプライヤ１２は波長λ１の蛍光を検出する。同様に、波長λ２の蛍光を検出する場合には、現在選択されているフィルタを、波長λ２の蛍光だけを反射させ、波長λ１，λ３，λ４の蛍光を透過させる特性を有するフィルタに切り換える。同様に、波長λ３，λ４の蛍光をそれぞれ選択するときには、波長λ３，λ４の蛍光だけを反射させるフィルタをそれぞれ選択すればよい。
【００３４】
フォトマルチプライヤ１１，１２から出力された信号（光強度信号）は画像処理回路２０へ供給される。
【００３５】
画像処理回路２０は以下に述べる処理を行う。
【００３６】
例えば、複数の蛍光像を合成して１つの蛍光画像だけをモニタ２１に表示させる場合、蛍光退色期間内に波長選択フィルタ１０を切り換えてそれぞれの波長に対応する蛍光像を取得する（図３参照）。
【００３７】
図３は画像処理回路で行われる処理を説明するフローチャートである。図３において、Ｓ１〜Ｓ７は各処理ステップを示す。
【００３８】
まず、準備動作として、実際の露光時間より長い時間（例えばビデオレート）での波長λ１〜λ４（全波長域）の蛍光の光量（光強度）を検出する（第１工程）（Ｓ１）。例えば、フォトマルチプライヤ１１で検出された波長λ２〜λ４の蛍光の光量とフォトマルチプライヤ１２で検出された波長λ１の蛍光の光量とを加算して全波長域の蛍光の光量を計算する。準備動作を短時間で行う場合には本準備動作の全光量の時間比例の光量を全光量とする。
【００３９】
次に、目的とする波長（例えば波長λ１）の蛍光に対応するフィルタを選択する（Ｓ２）。
【００４０】
その後、目的とする特定の波長以外の波長（λ２〜λ４）の蛍光の光量（光強度）を検出する（第２工程）（Ｓ３）。
【００４１】
次に、第１工程で検出された全波長域（λ１〜λ４）の蛍光の光量から第２工程で検出された目的とする特定の波長以外の波長（λ２〜λ４）の蛍光の光量を差し引いて目的とする波長（λ１）の光量（光強度）を計算する（第３工程）（Ｓ４）。
【００４２】
その後、波長選択フィルタ１０の複数のフィルタの切換えが終了したか否かを判断する（Ｓ５）。
【００４３】
切換えが終了していないとき（ＮＯ）、ステップＳ２へ戻る。
【００４４】
切換えが終了したとき（ＹＥＳ）、標本２の蛍光退色期間が経過したか否かを特定の波長以外の波長（λ２〜λ４）の光量で判断する（Ｓ６）。例えば、Ｉt=0はステップＳ１のときの光量を示す。所定の時間間隔Δｔで、その前後の波長（λ２〜λ４）の光強度の比が０．９５以上であるとき（ＹＥＳ）、標本２の蛍光退色期間を経過していないとして、ステップＳ２へ戻る。波長（λ２〜λ４）の光強度比が０．９５未満のとき（ＮＯ）、蛍光退色期間を経過して退色が目立つとしてステップＳ７へ進む。
【００４５】
次に、波長（λ２〜λ４）の光強度の比が０．５以上であるか否かを判断する（Ｓ７）。
【００４６】
波長（λ２〜λ４）の光強度の比が０．５以上であるとき（ＹＥＳ）、ステップＳ１へ戻り、設定を変えて波長λ１〜λ４の蛍光画像の取得処理を実行する。
【００４７】
波長（λ２〜λ４）の光強度の比が０．５未満のとき（ＮＯ）、処理を終了する。
【００４８】
従来、特定の波長の蛍光だけを検出していたのに対し、目的とする波長の蛍光の光量を、予め検出した全波長域の蛍光の光量から目的とする特定の波長域以外の波長の蛍光の光量を差し引いて検出するようにしたので、検出に用いられる蛍光の光量を大幅に増加させることができ、画像取得の高速化に対応することができる。波長の分割数をＭとすると、１波長だけを選択する従来の方法の蛍光の光量が１/Ｍであるのに対し、この実施形態の方法の蛍光の光量は（１−１／Ｍ）となるので、検出に用いられる蛍光の光量は従来例に比べて（Ｍ−１）倍となる。例えば、この実施形態のように波長を４分割した場合には、検出に用いられる蛍光の光量は従来例に比べて３倍となる。すなわち、波長の分割数が多くなる程検出に用いられる蛍光の光量が大きくなり、蛍光の検出時間が短く（例えば１０ｍｓｅｃ（従来３０ｍｓｅｃ程度））なっても所望の露光量を得ることができる。
【００４９】
この実施形態によれば、目的とする波長域の蛍光の光量を、予め検出した全波長域の蛍光の光量から目的とする特定の波長域以外の波長の蛍光の光量を差し引いて検出するので、従来例よりも大きな蛍光の光量が得られ、目標物質の変化速度がビデオレート以上のときにも適切な観察や解析を行うことができる。近年、明るくて退色の少ない蛍光ナノ粒子も使用されており、高速化対応が可能になる。
【００５０】
図４はこの発明の第２実施形態に係る蛍光検出装置の構成を説明する概念図であり、第１実施形態と共通する部分には同一符号を付してその説明を省略する。
【００５１】
この実施形態は、波長分割手段として、波長選択フィルタ１０に代えて干渉フィルタ１３を用いた点で第１実施形態と相違する。
【００５２】
干渉フィルタ１３は、波長λ１の蛍光を透過させる第１干渉フィルタ１３ａと、波長λ２の蛍光を透過させる第２干渉フィルタ１３ｂと、波長λ３，λ４を透過させる第３、４干渉フィルタ（図示せず）とを有する。第１干渉フィルタ１３ａ等は例えばターレット（図示せず）に載置され、４つのフィルタの中からいずれかの干渉フィルタが選択的に光路上に配置される。なお、ターレットには第１干渉フィルタ１３ａ等の干渉フィルタを載置していない部分（光が素通りする部分）が設けられている。
【００５３】
フォトマルチプライヤ（検出手段）１４は干渉フィルタ１３ａ等を透過した光を検出する。フォトマルチプライヤ１４から出力された信号（光強度信号）は画像処理回路２０へ供給され、画像処理回路２０で第１実施形態と同様の処理が行われる。
【００５４】
なお、光学的な干渉フィルタ１３ａ等を用いて波長を選択する代わりに電気的に波長を選択する電気的波長選択素子（例えばＡＯＴＦ（Ａｃｏｕｓｔｏ−Ｏｐｔｉｃ  Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｆｉｌｔｅｒ）、液晶薄膜を使用した素子等）によって波長を選択してもよい。
【００５５】
この実施形態によれば、第１実施形態と同様の効果を奏する。
【００５６】
なお、上記各実施形態では光量を検出する検出手段としてフォトマルチプライヤ１１，１２，１４を用いたが、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）を検出手段として用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１はこの発明の第１実施形態に係る光量検出方法を実施するための落射蛍光型コンフォーカル顕微鏡を示す概念図である。
【図２】図２はこの発明の第１実施形態に係る蛍光検出装置の構成を説明する概念図である。
【図３】図３は画像処理回路で行われる処理を説明するフローチャートである。
【図４】図４はこの発明の第２実施形態に係る蛍光検出装置の構成を説明する概念図である。
【符号の説明】
【００５８】
２：標本、１０：波長選択フィルタ（波長分割手段）、１１，１２，１４フォトマルチプライヤ（検出手段）、１３：干渉フィルタ（波長分割手段）、２０：画像処理回路（演算手段）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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