(57)【要約】【課題】高トリグリセリド血症、脂肪肝又は糖尿病の予防若しくは改善に有用な医薬又は食品の提供。【解決手段】ニトロゲニステインを有効成分とするＨＮＦ−４α活性抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトロゲニステインを有効成分とするＨＮＦ−４α活性抑制剤。
【請求項２】
ニトロゲニステインを有効成分とするＦＸＲ標的遺伝子発現調節剤。
【請求項３】
ニトロゲニステインを有効成分とするＬＸＲα標的遺伝子発現調節剤。
【請求項４】
ニトロゲニステインを有効成分とする脂質代謝調節剤。
【請求項５】
ニトロゲニステインを有効成分とする糖代謝調節剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高トリグリセリド血症、脂肪肝又は糖尿病の予防若しくは改善に有用なＨＮＦ−４α（hepatocyte nuclear factor-4α）活性抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドなどの低分子脂溶性リガンドは、核内受容体へのリガンド特異的な結合を介して、個体発生における形態形成、細胞の増殖、分化、生体の恒常性の維持など多様な生理機能の調節に関与している。核内受容体はリガンドと結合することで立体構造が変化し、転写共役因子と複合体を形成する。この核内受容体と転写共役因子の複合体は、標的遺伝子のプロモーター領域の特定配列に結合し、さらに基本転写因子群をリクルートし、標的遺伝子の発現を転写レベルで制御する。
【０００３】
ＨＮＦ−４αは核内受容体の1種であり、肝臓に多く存在する転写因子として同定された（非特許文献１）。当初、ＨＮＦ−４αは、外因性リガンドの非存在下において標的遺伝子の転写を活性化することが報告されたが（非特許文献１）、その後の研究で、特定の脂肪酸アシルＣｏＡがＨＮＦ−４αを活性化することが示され、これらがＨＮＦ−４αの内因性リガンドであることが明らかになった（非特許文献２）。ＨＮＦ−４αは、ＭＴＰ（microsomal triglyceride transfer protein）、ａｐｏＢ（apolipoprotein B）、及びａｐｏＣIII（apolipoprotein CIII）等の脂質輸送に関わる遺伝子やＰＥＰＣＫ（phosphenolpyruvate carboxykinase）及びＧ６Ｐａｓｅ（glucose-6-phosphatase）等の糖代謝に関わる遺伝子の発現を正に制御することが知られている。ＨＮＦ−４αは、肝臓の他に、腎臓や小腸にも発現しており、脂肪酸の合成・輸送・分泌、細胞周期の調節など幅広く生体のエネルギー代謝や恒常性の維持に関わるものと考えられている。
【０００４】
実際に、肝臓特異的にＨＮＦ−４αを欠失させたマウスでは、肝臓におけるＭＴＰ及びａｐｏタンパク質の発現減少、血清コレステロール及び血清トリグリセリドの減少、及び体重減少が認められている（非特許文献３）。この様に、ＨＮＦ−４α活性抑制剤は、脂質代謝調節能及び糖代謝調節能を有し、高トリグリセリド血症、脂肪肝、糖尿病の予防あるいは改善剤として有用であると考えられる。しかしながら、これまでにＨＮＦ−４αのアンタゴニストの報告例はない。
【０００５】
ＨＮＦ−４αの転写活性は、ＦＸＲ（farnesoid X receptor）の標的遺伝子の一つであるＳＨＰ（small heterodimer partner）によって抑制されることが分かっている（非特許文献４）。ＦＸＲリガンドであるケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）と培養した肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞では、ＳＨＰ発現増強に伴い、ＨＮＦ−４α標的遺伝子であるＭＴＰ、ａｐｏＢの遺伝子発現が減少すること、及びＶＬＤＬ分泌が減少することが報告されている（非特許文献５）。しかしながら、ＣＤＣＡは毒性をもつリトコール酸に代謝されるため、医薬品あるいは食品としての活用は困難であると考えられている。以上のことから、安全で優れたＨＮＦ−４α活性抑制能を有する化合物の同定が望まれる。
【０００６】
一方、ニトロゲニステインは、フラボノイド類似化合物であり、チロシンキナーゼ阻害作用を有することが知られている（非特許文献６）。
しかしながら、ニトロゲニステインに脂質代謝調節能や糖代謝調節能があることは知られていない。
【非特許文献１】Sladek, F. M., et al., Genes Dev., 4, 2353-2365, 1990
【非特許文献２】Hertz, R., et al., Nature, 392, 512-516, 1998
【非特許文献３】Hayhurst, G. P., et al., Mol. Cel. Biol., 21, 1393-1403, 2001
【非特許文献４】Lee, Y., et al., Mol. Cell Biol., 20, 187-195, 2000
【非特許文献５】Hirokene, H., et al,. J. Biol. Chem., 279, 45685-45692, 2004
【非特許文献６】Cushman, M., et al., J. Med. Chem., 34, 798-806, 1991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、高トリグリセリド血症、脂肪肝又は糖尿病の予防若しくは改善に有用な医薬又は食品を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み、種々の物質を探索したところ、ニトロゲニステインにＨＮＦ−４α活性抑制作用があること、また、ＦＸＲ及びＬＸＲα（liver X receptor α）が標的とする脂質代謝関連遺伝子の発現調節作用を有することを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の１）〜５）に係るものである。
１）ニトロゲニステインを有効成分とするＨＮＦ−４α活性抑制剤。
２）ニトロゲニステインを有効成分とするＦＸＲ標的遺伝子発現調節剤。
３）ニトロゲニステインを有効成分とするＬＸＲα標的遺伝子発現調節剤。
４）ニトロゲニステインを有効成分とする脂質代謝調節剤。
５）ニトロゲニステインを有効成分とする糖代謝調節剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＨＮＦ−４α活性抑制を介して優れた脂質代謝調節能及び糖代謝調節能を発揮し、高トリグリセリド血症、脂肪肝又は糖尿病の予防若しくは改善に有用な医薬又は食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、ニトロゲニステイン（ｎｉｔｒｏｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）とは、４’−Ｎｉｔｒｏ−６−ｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅであり、下記構造式で表される化合物である。
【００１２】
【化１】
2008133247.tif 000002
【００１３】
斯かるニトロゲニステインは、例えばCushman, M., et al.，J. Med. Chem., 34, 798-806, 1991に記載の方法により製造することができる。また、ＡＬＥＸＩＳ社製等の市販品のニトロゲニステインを用いてもよい。
【００１４】
ニトロゲニステインは、後記実施例に示すように、ＨＮＦ−４αの転写活性抑制作用（実施例１）を有し、ＨＮＦ−４αの標的遺伝子であるＭＴＰ（microsomal triglyceride transfer protein）、ａｐｏＢ（apolipoprotein B）、ａｐｏＣIII（apolipoprotein CIII）、ＰＥＰＣＫ（phosphenolpyruvate carboxykinase）、及びＧ６Ｐａｓｅ（glucose-6-phosphatase）の遺伝子発現抑制作用（実施例２）を有する。ここで、ＭＴＰ、ａｐｏＢ及びａｐｏＣIIIはトリグリセリド分泌関連遺伝子であり、ＰＥＰＣＫ及びＧ６Ｐａｓｅは糖新生関連遺伝子であることから、ニトロゲニステインは、肝臓からのトリグリセリド分泌を抑制し、血中トリグリセリドの上昇を抑制すると共に、糖新生を抑制し、血糖調節や糖尿病の予防又は改善に有効であると考えられる。
【００１５】
また、ＨＮＦ−４αの転写活性は、ＦＸＲ（farnesoid X receptor）の標的遺伝子の一つであるＳＨＰ（small heterodimer partner）によって抑制されることが知られているが（前記非特許文献４）、ニトロゲニステインは、このＳＨＰ（small heterodimer partner）及び脂質分泌輸送関連遺伝子であるＰＬＴＰ（phospholipids transfer protein）の発現を増強する作用（実施例３）を有することが明らかになった。つまり、ニトロゲニステインは、ＦＸＲ標的遺伝子であるＳＨＰを介してＨＮＦ−４αの核内受容体の転写活性を抑制するものと考えられる。従って、ニトロゲニステインは、脂質代謝・糖代謝調節効果を発揮するＦＸＲ標的遺伝子調節剤となり得る。
【００１６】
更に、ＨＮＦ−４αと同様にＳＨＰにより制御される核内受容体としてＬＸＲα（liver X receptor α）があるが、ニトロゲニステインは、当該ＬＸＲαの標的遺伝子である脂肪酸合成関連遺伝子、ＳＲＥＢＰ１ｃ（sterol regulatory element binding protein）、ＡＣＣ１（acetyl-CoA carboxylase）、ＦＡＳ（fatty acid synthase）についてもその発現を抑制する作用（実施例４）を有することが確認された。従って、ニトロゲニステインは、肝臓の脂肪酸合成を抑制し、肝脂肪の予防又は治療効果を発揮するＬＸＲα標的遺伝子調節剤となり得る。
【００１７】
かように、ニトロゲニステインは、ＨＮＦ−４α活性抑制剤、脂質代謝調節剤、糖代謝調節剤、ＦＸＲ標的遺伝子調節剤及びＬＸＲα標的遺伝子調節剤（以下、ＨＮＦ−４α活性抑制剤等という）として使用することができ、また、ＨＮＦ−４α活性抑制剤等を製造するために使用することができる。当該ＨＮＦ−４α活性抑制剤等は、高トリグリセリド血症、脂肪肝又は糖尿病の予防若しくは改善効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、又は食品として使用可能である。また、当該ＨＮＦ−４α活性抑制剤等は、高トリグリセリド血症、脂肪肝又は糖尿病の予防若しくは改善等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した美容食品、病者用食品若しくは特定保健用食品等の機能性食品として使用することができる。
【００１８】
本発明のＨＮＦ−４α活性抑制剤等を医薬品として用いる場合の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、腸溶剤、トローチ剤、ドリンク剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与が挙げられる。また、このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、本発明のニトロゲニステインを単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤（ソルビトール、グルコース、乳糖、デキストリン、澱粉等の糖類、炭酸カルシウム等の無機物、結晶セルロース、蒸留水、ゴマ油、とうもろこし油、オリーブ油、菜種油等）、結合剤、滑沢剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等を適宜組み合わせて用いることができる。これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与であり、経口投与用製剤として用いる場合の当該製剤中の本発明のニトロゲニステインの含有量は、通常製剤中に０．００１〜８０質量％とするのが好ましく、特に０．５〜８０質量％とするのがより好ましい。
【００１９】
本発明のＨＮＦ−４α活性抑制剤等を食品として用いる場合の形態としては、例えば、パン、麺類等に代表される小麦粉加工食品、お粥、炊き込みご飯等の米加工食品、ビスケット、ケーキ、ゼリー、チョコレート、せんべい、アイスクリーム等の菓子類、豆腐、その加工食品等の大豆加工食品、清涼飲料、果汁飲料、乳飲料、炭酸飲料等の飲料類、ヨーグルト、チーズ、バター、牛乳等の乳製品、醤油、ソース、味噌、マヨネーズ、ドレッシング等の調味料、ハム、ベーコン、ソーセージ等の蓄肉、蓄肉加工食品、はんぺん、ちくわ、魚の缶詰等の水産加工食品、調理油ならびにフライ用油等が挙げられる。また、この他、カプセル等の錠剤食、濃厚流動食、自然流動食、半消化態栄養食、成分栄養食、ドリンク栄養食等の経口経腸栄養食品、機能性食品等の形態とすることもできる。
種々の形態の飲食品を調製するには、本発明のニトロゲニステインを単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。当該食品中の本発明のニトロゲニステインの含有量は、一般的に０．００１〜１質量％とするのが好ましく、更に０．００２〜０．２質量％、特に０．００５〜０．０５質量％とするのが好ましい。
【００２０】
本発明のＨＮＦ−４α活性抑制剤等を医薬品又は食品として使用する場合、成人１人当たりの１日の投与又は摂取量は、本発明のニトロゲニステインとして、例えば５〜２０００ｍｇ、更に１０〜１０００ｍｇ、特に２０〜５００ｍｇとするのが好ましい。また、当該製剤は、１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
【実施例】
【００２１】
実施例１  ニトロゲニステインのＨＮＦ−４α活性抑制能評価
【００２２】
ニトロゲニステインのＨＮＦ−４α活性抑制能をルシフェラーゼアッセイにより評価した。ヒト肝臓由来細胞株ＨｅｐＧ２を１２ウェルプレートにまき、１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）および１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、ＳＩＧＭＡ）中で１日培養した。評価は、ｐＧＶ−Ｂ２ベクターのホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＨＮＦ−４α標的遺伝子の一つであるヒトＭＴＰのプロモーター領域（ｎｔ  −２０４  ｔｏ  +３３，  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿０００２５３）を連結したＭＴＰレポータープラスミド（ＭＴＰｐ−Ｌｕｃ）とｐＧＶ−Ｐベクターのホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＨＮＦ−４αのコンセンサス結合配列であるＤＲ１（ＡＧＴＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧ（配列番号１））を連結したＤＲ１レポータープラスミド（ＤＲ１−Ｌｕｃ）の２種類で行った。レポータープラスミドおよびウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の上流にチミジンキナーゼプロモーター遺伝子が連結されたコントロールプラスミド（ｐｈＲＬ−ＴＫ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を同時に、１ウェルあたり各々０．３３、０．０３μｇを遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＨｅｐＧ２細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入後、２０μMのニトロゲニステインを含む無血清ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した。
【００２３】
ルシフェラーゼ活性測定には、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。細胞を溶解、溶解液にルシフェリンを含む基質溶液を加え、ルミノメーター（ＭｉｎｉＬｕｍａｔ、ベルトールド社）にてホタル及びウミシイタケルシフェラーゼの発光を各々測定した。本実験系でルシフェラーゼ活性（ＨＮＦ−４αの転写活性）を測定することにより、ＨＮＦ−４α活性抑制物質の評価を行った。ルシフェラーゼ活性（ＨＮＦ−４αの転写活性）は以下の式により計算した。 ルシフェラーゼ活性（ＨＮＦ−４αの転写活性）＝（ＭＴＰｐ−ＬｕｃまたはＤＲ１−Ｌｕｃによるホタルルシフェラーゼ発光計測値）／（ｐｈＲＬ−ＴＫによるウミシイタケルシフェラーゼ発光計測値）
また、ルシフェラーゼ活性は、溶媒コントロールであるＤＭＳＯによるＨＮＦ−４αの転写活性を１とした相対値で示した。
【００２４】
図１に示す様に、いずれのレポーターベクターを用いた場合も、２０μMのニトロゲニステインにより、ＨＮＦ−４αの転写活性が３０％以下に抑制された。従って、ニトロゲニステインはＨＮＦ−４α転写活性を抑制することが分かる。
【００２５】
実施例２  ニトロゲニステインによるＨＮＦ−４α標的遺伝子発現抑制
ニトロゲニステインによるＨＮＦ−４α標的遺伝子発現への影響を解析した。ヒト肝臓由来細胞株ＨｅｐＧ２を１２ウェルプレートにまき、１０％チャコール処理ＦＢＳ及び１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ中で１日培養した。培養開始から１日目に培地を無血清ＤＭＥＭに交換し、２日目に１、５、１０μMのニトロゲニステインまたは１０μMのゲニステインを含む培地に交換した。添加２４時間後の細胞からＲＮＡ抽出試薬を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １２５ｎｇを用いて逆転写反応を行った。合成されたｃＤＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ６．２５ｎｇ分）を用い、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法により、ＨＮＦ−４αの標的遺伝子であるトリグリセリド分泌関連遺伝子（ＭＴＰ、ａｐｏＢ、ａｐｏＣIII）、糖新生関連遺伝子（ＰＥＰＣＫ、Ｇ６Ｐａｓｅ）のｍＲＮＡ発現量の定量を行った。
【００２６】
解析に用いたプライマーの配列を以下に示す。
＜ＭＴＰ増幅用プライマー＞
５'側：ＧＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧ（配列番号２）
３'側：ＣＧＣＴＧＧＡＡＧＴＡＣＴＡＴＣＣＧＧＣ（配列番号３）
＜ａｐｏＢ増幅用プライマー＞
５'側：ＧＣＣＡＴＴＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＡＡＴＡ（配列番号４）
３'側：ＴＧＡＣＴＧＴＧＧＴＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴ（配列番号５）
＜ａｐｏＣIII増幅用プライマー＞
５'側：ＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＧＡＡＡＧＡＣＴＡＣＴＧＧＡ（配列番号６）
３'側：ＡＴＧＧＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＴＴＧ（配列番号７）
＜ＰＥＰＣＫ増幅用プライマー＞
５'側：ＧＴＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴＣＡＡＣ（配列番号８）
３'側：ＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＴＡＴＴＣＴＴＴＧＣＴＴＣ（配列番号９）
＜Ｇ６Ｐａｓｅ増幅用プライマー＞
５'側：ＧＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＡＴＴＧＴＡＧＣＣＴＣ（配列番号１０）
３'側：ＣＣＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡ（配列番号１１）
＜３６Ｂ４増幅用プライマー＞
５'側：ＣＴＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴＴ（配列番号１２）
３'側：ＣＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴ（配列番号１３）
【００２７】
尚、解析はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７０００  Ｓｅａｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオジャパン）を用いて行い、各遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、３６Ｂ４遺伝子のｍＲＮＡ発現量により補正した。また、遺伝子発現量は、コントロールとして使用したＤＭＳＯにおける遺伝子発現量を１とした相対値で示した。
【００２８】
図２に示す様に、ニトロゲニステインの存在下で培養したＨｅｐＧ２細胞において、ＨＮＦ−４α標的遺伝子であるＭＴＰ、ａｐｏＢ、ａｐｏＣIII、ＰＥＰＣＫ、及びＧ６Ｐａｓｅの遺伝子発現量がほぼ濃度依存的に抑制された。従って、ＨＮＦ−４α活性抑制作用を有するニトロゲニステインは、実際にＨＮＦ−４αの標的遺伝子の発現を抑制することが分る。つまり、ニトロゲニステインは肝臓からのトリグリセリド分泌を抑制することにより、血中トリグリセリドの上昇抑制に有効であり、糖新生を抑制することにより、血糖調節や糖尿病抑制に有効であると考えられる。
【００２９】
実施例３  ニトロゲニステインによるＦＸＲ標的遺伝子発現調節
ニトロゲニステインによるＦＸＲ標的遺伝子発現への影響を解析した。実施例３と同様に、ＨｅｐＧ２細胞を１、５、１０μMのニトロゲニステインと培養し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法により、ＦＸＲ標的遺伝子であるＳＨＰ、及び脂質分泌輸送関連遺伝子であるＰＬＴＰ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のｍＲＮＡ発現量の定量を行った。
【００３０】
解析に用いたプライマーの配列を以下に示す。
＜ＳＨＰ増幅用プライマー＞
５'側：ＡＡＣＴＧＣＣＡＧＡＣＡＧＡＣＣＣＣＡＧ（配列番号１４）
３'側：ＧＣＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴ（配列番号１５）
＜ＰＬＴＰ増幅用プライマー＞
５'側：ＡＴＴＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＧ（配列番号１６）
３'側：ＴＧＣＡＣＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＣ（配列番号１７）
【００３１】
図３に示す様に、ニトロゲニステイン存在下で培養したＨｅｐＧ２細胞において、ＳＨＰ、ＰＬＴＰの遺伝子発現量が増強した。従って、実施例３において、ＨＮＦ−４α標的遺伝子の発現抑制が示されたニトロゲニステインは、ＦＸＲ標的遺伝子の発現調節剤としても有用であることが明らかになった。つまり、ニトロゲニステインは、ＳＨＰを介してＬＸＲαやＨＮＦ−４α等の核内受容体の転写活性を抑制することにより、脂質代謝・糖代謝調節に有効であると考えられる。
【００３２】
実施例４  ニトロゲニステインによるＬＸＲα標的遺伝子発現調節
ニトロゲニステインによるＬＸＲα標的遺伝子発現への影響を解析した。実施例３、４と同様に、ＨｅｐＧ２細胞を１、５、１０μMのニトロゲニステインと培養し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法により、ＬＸＲαの標的遺伝子である脂肪酸合成関連遺伝子であるＳＲＥＢＰ１ｃ（ｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＡＣＣ１（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、ＦＡＳ（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）のｍＲＮＡ発現量の定量を行った。
【００３３】
解析に用いたプライマーの配列を以下に示す。
＜ＳＲＥＢＰ１ｃ増幅用プライマー＞
５'側： ＡＧＧＧＧＴＡＧＧＧＣＣＡＡＣＧＧＣＣＴ（配列番号１８）
３'側： ＧＡＡＧＣＡＴＧＴＣＴＴＣＧＡＡＡＧＴＧＣＡＡＴＣＣ（配列番号１９）
＜ＦＡＳ増幅用プライマー＞
５'側：ＧＴＡＧＧＴＧＴＴＡＧＧＣＡＴＧＴＣＣＣＡ（配列番号２０）
３'側：ＧＧＴＣＴＣＴＡＣＣＡＧＣＡＡＴＧＣＡＡＴ（配列番号２１）
＜ＡＣＣ１増幅用プライマー＞
５'側：ＧＧＡＧＡＴＧＴＡＣＧＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡ（配列番号２２）
３'側：ＡＣＣＣＧＡＣＧＣＡＴＧＧＴＴＴＴＣＡ（配列番号２３）
【００３４】
図４に示す様に、ニトロゲニステイン存在下で培養したＨｅｐＧ２細胞において、ＬＸＲα標的遺伝子であるＳＲＥＢＰ１ｃ、ＦＡＳ、及びＡＣＣ１の遺伝子発現量が濃度依存的に抑制された。従って、ニトロゲニステインは、実施例２、３において、ＨＮＦ−４α標的遺伝子の発現抑制作用、及びＦＸＲ標的遺伝子の発現調節作用が示されたニトロゲニステインは、ＬＸＲα標的遺伝子の発現調節剤としても有用であることが明らかになった。つまり、ニトロゲニステインは、肝臓の脂肪酸合成を抑制することにより、肝脂肪の抑制に有効であると考えられる。
【００３５】
実施例５  ニトロゲニステインによるアポリポタンパク質Ｂ分泌抑制
ニトロゲニステインによるアポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）分泌への影響を解析した。ヒト肝臓由来細胞株ＨｅｐＧ２を６ウェルプレートにまき、１０％チャコール処理ＦＢＳ及び１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭで培養した。培養開始から１日目に、５μMのニトロゲニステイン、及び５％のリポ蛋白欠乏血清（ＬＰＤＳ）を含む培地に交換した。添加後２日目に培地をニトロゲニステインを含む無血清ＤＭＥＭに交換し、その１８時間後に細胞及び培地を回収した。培地中に分泌されたａｐｏＢをＴｏｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ＥＬＩＳＡ  Ａｓｓａｙ  キット（ＡＬｅｒＣＨＥＫ）用いて定量した。各値は細胞内タンパク量で補正した。
【００３６】
図５に示す様に、ニトロゲニステイン存在下で培養したＨｅｐＧ２細胞において、ａｐｏＢ分泌が抑制された。従って、実施例３において、ＨＮＦ−４α標的遺伝子であるＭＴＰ及びａｐｏＢの遺伝子発現抑制が示されたニトロゲニステインは、実際にａｐｏＢ分泌を抑制することが明らかになった。
【００３７】
実施例６
下記成分を用い、常法に従って１錠２００mgの錠剤を製造した。
【００３８】
【表１】
2008133247.tif 000003
【００３９】
実施例７
下記成分を用い、常法に従って１錠２００mgの錠剤を製造した。
【００４０】
【表２】
2008133247.tif 000004
【００４１】
実施例８
茶葉１００ｇを温度８０℃の蒸留水１０００ｇで１０分間抽出し、ろ過した茶抽出液を調製した。次に、下記成分を混合し、脱気後、１３９℃で１０秒間加熱処理後、５００mLペットボトルに充填して容器詰飲料を製造した。
【００４２】
【表３】
2008133247.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ニトロゲニステインのＨＮＦ−４α活性抑制能を示したグラフ。Mean±S.D.  **:p<0.01
【図２】ニトロゲニステインのＨＮＦ−４α標的遺伝子発現調節能を示したグラフ。Mean±S.D. *:p<0.05、**:p<0.01
【図３】ニトロゲニステインのＦＸＲ標的遺伝子発現調節能を示したグラフ。Mean±S.D. *:p<0.05、**:p<0.01
【図４】ニトロゲニステインのＬＸＲα標的遺伝子発現調節能を示したグラフ。Mean±S.D. *:p<0.05、**:p<0.01
【図５】ニトロゲニステインのａｐｏＢ分泌抑制能を示したグラフ。Mean±S.D. *:p<0.05
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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