(57)【要約】【課題】安全性の高い天然物の中からセラミド合成促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするセラミド合成促進剤、皮膚のバリア機能改善剤、及びセラミド合成障害に起因する予防又は治療剤を提供する。【解決手段】本発明のセラミド合成促進剤、皮膚バリア機能改善剤、及びセラミド合成障害に起因する疾患の予防又は治療剤は、甘草の葉部からの抽出物を有効成分として含有せしめる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
甘草の葉部からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするセラミド合成促進剤。
【請求項２】
前記抽出物が、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリンからなる群より選ばれる１種又は２種以上の抽出溶媒を用いて前記甘草の葉部から抽出される抽出物であることを特徴とする請求項１に記載のセラミド合成促進剤。
【請求項３】
甘草の葉部からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚バリア機能改善剤。
【請求項４】
前記抽出物が、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリンからなる群より選ばれる１種又は２種以上の抽出溶媒を用いて前記甘草の葉部から抽出される抽出物であることを特徴とする請求項３に記載の皮膚バリア機能改善剤。
【請求項５】
甘草の葉部からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするセラミドの合成障害に起因する疾患の予防又は治療剤。
【請求項６】
前記抽出物が、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリンからなる群より選ばれる１種又は２種以上の抽出溶媒を用いて前記甘草の葉部から抽出される抽出物であることを特徴とする請求項５に記載のセラミドの合成障害に起因する疾患の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セラミド合成促進剤、皮膚バリア機能改善剤、及びセラミド合成障害に起因する疾患の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
セラミドは、皮膚最外層を覆う角層細胞間脂質の主成分として特異的に存在し、皮膚本来がもつ生体と外界とのバリア膜としての機能維持に重要な役割を果たしている。角層の構造は、レンガとモルタルとに例えられ、約１５層に積み重なった角層細胞を細胞間脂質が繋ぎ止める形で強固なバリア膜が形成されている。角層細胞は、アミノ酸を主成分とする天然保湿因子を含有して水分を保持し、一方、角質細胞間脂質は約５０％のセラミドを主成分とし、コレステロール、脂肪酸等の両親媒性脂質から構成されており、疎水性部分、親水性部分同士が繰り返される層板構造、いわゆるラメラ構造を特徴とするものである。
【０００３】
様々な内的及び外的要因によるバリア機能の低下（バリア障害）は、経表皮水分蒸散量を増加させ、皮膚のかさつき、落屑、掻痒感等を引き起こし、いわゆる乾燥肌に陥る。バリア障害に陥ると、皮膚の炎症が増大し、外界からの様々な刺激に対する防御機能が低下するという悪循環に陥る。最近の研究において、バリア障害として知られるアトピー性皮膚炎患者で角層セラミド成分、いわゆる細胞間脂質の減少や組成変化が報告されており（非特許文献１参照）、バリア機能の維持、改善にセラミドが重要であることが広く認識されている。
【０００４】
このような背景からバリア機能を改善する方法として、セラミドを外部から補う方法（非特許文献２参照）や皮膚のセラミド産生能を高める方法が種々検討されている（非特許文献３参照）。しかし、いずれの技術においても長期的な効果を認めることができず、かつ投与又は補給された物質の安定性が低い等の問題がある。
【非特許文献１】Akimoto K et al., J. Dermatol., 1993, 20, 1
【非特許文献２】Kenya I et al., フレグランスジャーナル, 2004, No.11, p23-32
【非特許文献３】Tanno O et al., Br. J. Dermatol., 2000, 143, 524
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、安全性の高い天然物の中からセラミド合成促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするセラミド合成促進剤、皮膚のバリア機能改善剤、及びセラミド合成障害に起因する予防又は治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明のセラミド合成促進剤、皮膚バリア機能改善剤、及びセラミド合成障害に起因する疾患の予防又は治療剤は、甘草の葉部からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、天然物である甘草の葉部からの抽出物を有効成分として含有し、安全性に優れたセラミド合成促進剤、皮膚バリア機能改善剤、及びセラミド合成障害に起因する疾患の予防又は治療剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明について詳細に説明する。
〔セラミド合成促進剤，皮膚バリア機能改善剤，セラミド合成障害に起因する疾患の予防又は治療剤〕
本発明のセラミド合成促進剤、皮膚バリア機能改善剤、及びセラミド合成障害に起因する疾患の予防又は治療剤は、甘草の葉部からの抽出物を有効成分として含有する。
【０００９】
ここで、本発明において「甘草の葉部からの抽出物」には、甘草の葉部を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１０】
本発明において使用する抽出原料は、甘草の葉部である。甘草は、マメ科に属し、古代より薬用又は甘味料の原料として利用されている有用植物である。特に根部にはグリチルリチンその他有用成分が含有されていることが確認されているが、これらの有用成分は甘草の葉部には含有されていない。これに対して、本発明者によって初めて確認されたセラミド合成促進作用を有する成分は、甘草の葉部に含有されている。
【００１１】
甘草には、Glychyrrhiza glabra、Glychyrrhiza inflata、Glychyrrhiza uralensis、Glychyrrhiza aspera、Glychyrrhiza eurycarpa、Glychyrrhiza pallidiflora、Glychyrrhiza yunnanensis、Glychyrrhiza lepidota、Glychyrrhiza echinata、Glychyrrhiza acanthocarpa等、様々な種類のものがあり、これらのうち、いずれの種類の甘草の葉部を抽出原料として使用してもよいが、特にGlychyrrhiza glabraの甘草の葉部を抽出原料として使用することが好ましい。
【００１２】
甘草の葉部からの抽出物に含有されるセラミド合成促進作用を有する物質の詳細は不明であるが、植物の抽出に一般に用いられている抽出方法によって、甘草の葉部からセラミド合成促進作用を有する抽出物を得ることができる。
【００１３】
例えば、上記植物を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより、セラミド合成促進作用を有する抽出物を得ることができる。乾燥は、天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、甘草の葉部の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１４】
抽出溶媒としては、極性溶媒を用いるのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００１５】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１６】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００１７】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０質量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０質量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して多価アルコール１０〜９０質量部を混合することが好ましい。
【００１８】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を溶出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００１９】
精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等により行うことができる。得られた抽出液はそのままでもセラミド合成促進剤、皮膚バリア機能改善剤、又はセラミド合成障害に起因する疾患の予防若しくは治療剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が使用しやすい。
【００２０】
甘草の葉部からの抽出物は、特有の匂いと味とを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、セラミド合成促進剤、皮膚バリア機能改善剤、又はセラミド合成障害に起因する疾患の予防若しくは治療剤に配合する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。
【００２１】
以上のようにして得られる甘草の葉部からの抽出物は、セラミド合成促進作用を有しているため、それらの作用を利用してセラミド合成促進剤の有効成分として用いることができる。また、甘草の葉部からの抽出物は、そのセラミド合成促進作用を利用して、皮膚バリア機能改善剤の有効成分として用いることもできる。具体的にはアトピー性皮膚炎等の炎症性疾患による皮膚バリア機能障害の予防、治療又は改善剤等の有効成分として用いることができる。さらに、甘草の葉部からの抽出物は、そのセラミド合成促進作用を利用して、セラミドの合成障害に起因する疾患（例えば、アトピー性皮膚炎等）の予防又は治療剤の有効成分として用いることもできる。
【００２２】
本発明のセラミド合成促進剤、皮膚バリア機能改善剤、又はセラミド合成障害に起因する疾患の予防若しくは治療剤は、甘草の葉部からの抽出物のみからなるものでもよいし、甘草の葉部からの抽出物を製剤化したものでもよい。
【００２３】
甘草の葉部からの抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化して提供することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。また、甘草の葉部からの抽出物は、他の組成物に配合して使用できるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【００２４】
なお、本発明のセラミド合成促進剤、皮膚バリア機能改善剤、又はセラミド合成障害に起因する疾患の予防若しくは治療剤は、必要に応じてセラミド合成促進作用を有する他の天然抽出物等を、甘草の葉部からの抽出物とともに配合して有効成分として用いることができる。
【００２５】
本発明のセラミド合成促進剤、皮膚バリア機能改善剤、又はセラミド合成障害に起因する疾患の予防若しくは治療剤の患者に対する投与方法としては、一般に経皮投与が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。また、本発明のセラミド合成促進剤、皮膚バリア機能改善剤、又はセラミド合成障害に起因する疾患の予防若しくは治療剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００２６】
本発明のセラミド合成促進剤は、甘草の葉部からの抽出物が有するセラミド合成促進作用を通じて、表皮におけるセラミドの合成を促進することができ、これにより皮膚最外層を覆う角層細胞間脂質におけるセラミド成分量を増加させることができる。また、本発明の皮膚バリア機能改善剤は、甘草の葉部からの抽出物が有するセラミド合成促進作用を通じて、皮膚のバリア機能を改善することができ、これによりアトピー性皮膚炎等により生じた皮膚バリア障害を予防、治療又は改善することができる。さらに、本発明のセラミド合成障害に起因する疾患の予防又は治療剤は、甘草の葉部からの抽出物が有するセラミド合成促進作用を通じて、セラミド合成障害に起因する疾患、例えばアトピー性皮膚炎等を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明のセラミド合成促進剤、皮膚バリア機能改善剤、又はセラミド合成障害に起因する疾患の予防若しくは治療剤は、これらの用途以外にもセラミド合成促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００２７】
なお、本発明のセラミド合成促進剤、皮膚バリア機能改善剤、又はセラミド合成障害に起因する疾患の予防若しくは治療剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００２８】
以下、製造例及び試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００２９】
〔製造例１〕甘草葉部抽出物の製造
甘草（Glycyrrhiza glabra）の葉部の乾燥物の粗砕物３００ｇに抽出溶媒２０００ｍＬを加え、ゆるく攪拌しながら７０℃にて３時間加熱抽出し、熱時濾過した。濾液を４０℃で減圧下にて濃縮し、さらに減圧乾燥器で乾燥して甘草葉部抽出物を得た。抽出溶媒を種々変更して上記抽出処理を行った場合の抽出物の収率を表１に示す。
［表１］
試  料            抽出溶媒            抽出物収率（質量％）
１                  水                    ２４．０
２         ５０質量％メタノール           ２１．７
３              エタノール                １２．７
４        ５０質量％プロパノール          １４．３
【００３０】
〔製造例２〕
製造例１と同一の抽出原料（甘草の乾燥葉部粗砕物）３００ｇに５０質量％１，３−ブチレングリコール水溶液２０００ｍＬを加え、攪拌しながら８０℃にて３時間加熱抽出して、熱時濾過し、固形分濃度３．８４質量％の甘草葉部抽出液１６００ｍＬを得た。
【００３１】
〔製造例３〕
抽出溶媒として５０質量％グリセリン水溶液を用いた以外は製造例２と同様にして、固形分濃度２．３７質量％の甘草葉部抽出液１７５０ｍＬを得た。
【００３２】
〔製造例４〕
抽出溶媒として５０質量％プロピレングリコール水溶液を用いた以外は製造例２と同様にして、固形分濃度３．６２質量％の甘草葉部抽出液１６４０ｍＬを得た。
【００３３】
〔試験例１〕セラミド合成促進作用試験
製造例１で得られた甘草葉部抽出物について、以下のようにしてセラミド合成促進作用を試験した。
【００３４】
（１）細胞培養
ヒト正常新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を６０ｍｍ ｄｉｓｈに播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて４日間培養を行った。培養上清を吸引し、分化誘導のための１．２ｍＭ塩化カルシウム含有培地に交換し、同時に試料（試料３，試料濃度：１０μｇ／ｍＬ）添加培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて１０日間培養を行った。培地は２日又は３日ごとに交換した。培養終了後、以下のようにして細胞を処理した。
【００３５】
（２）脂質抽出
培養上清を吸引除去し、２ｍＬのＰＢＳ（−）で培養細胞表面を２回洗浄した後、ＰＢＳ（−）を０．７５ｍＬ添加し、細胞をスクレイパーにてかきとり、超音波処理により破砕した。細胞破砕懸濁液にクロロホルム２ｍＬ、メタノール１ｍＬを加え１０分間振とうした後に遠心し、下層にあるクロロホルム層を回収した。回収したクロロホルム層にクロロホルム１ｍＬ、蒸留水２ｍＬを加え、１０分間振とうし、遠心した後に下層にあるクロロホルム層を別のチューブに分取後、窒素還流下で乾固させた。
【００３６】
（３）ＴＬＣ分析
抽出した脂質をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２：１）５０μＬに溶解し、薄層クロマトグラフィーによりセラミドの定量を行った（展開溶媒；クロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１）。試料無添加のセラミド合成量をコントロールとし、コントロールを１００としたときの試料添加時のセラミド合成量の値をセラミド合成促進率とした。
【００３７】
試験の結果、セラミド合成促進率は１２２．７％であった。このことから、甘草の葉部からの抽出物が優れたセラミド合成促進作用を有することが確認された。
【００３８】
〔試験例２〕セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）ｍＲＮＡ発現促進作用試験
製造例１で得られた甘草葉部抽出物について、以下のようにしてＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００３９】
（１）一本鎖ＤＮＡの調製
ヒト正常新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を３５ｍｍ ｄｉｓｈに播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養を行った。培養終了後、リン酸生理緩衝液１ｍＬで洗浄し、ハンクス液１ｍＬに交換した。これにTOREX FL20SE-30/DMRを４灯装着した紫外線照射装置を光源として紫外線ＵＶ−Ｂを５０ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射後直ちに試料（試料３，試料濃度：１０μｇ／ｍＬ）添加培地に交換し、２４時間培養した。培養終了後、常法により総ＲＮＡを調製した。また、「試料無添加」で培養した細胞に関しても同様にして総ＲＮＡを調製した。総ＲＮＡ調製は下記の方法を用いて行った。
【００４０】
細胞を１ｍＬのＲＮＡ抽出用試薬（商品名：ISOGEN，ニッポンジーン社製）で溶解し、クロロホルムを２００μＬ添加後、遠心（１２０００回転，４℃，１５分間）にて上層ＲＮＡ層を単離し、さらにイソプロパノールで濃縮を行った。濃縮沈殿させた総ＲＮＡをＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解して総ＲＮＡ標品とし、ＰＣＲ装置（TaKaRa PCR Themal Cycler MP，タカラバイオ社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（TaKaRa ExScript RT reagent Kit，RR035A，タカラバイオ社製）を用いてＳＰＴｍＲＮＡ発現量を測定するための鋳型に使用する一本鎖ＤＮＡを合成した。
【００４１】
（２）サイバーグリーン法を用いたリアルタイム−ＰＣＲ反応
ＳＰＴ遺伝子増幅用プライマーとして下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを作製した（タカラバイオ社製）。
センスプライマー：5'-CCAGACTGTCAGGAGCAACCATTA-3'
アンチセンスプライマー：5'-CGTGTCCGAGGCTGACCATA-3'
【００４２】
また、内部標準としてのＧ３ＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーとして下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを作製した（タカラバイオ社製）。
センスプライマー：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'
アンチセンスプライマー：5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'
【００４３】
「試料無添加」、「試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品をもとに調製した一本鎖ＤＮＡ及び検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液を用いて、リアルタイムＰＣＲ（Real Time PCR System Smart Cycler II，Cepheid社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（SYBR Premix Ex Taq，RR041A，タカラバイオ社製）でＰＣＲ反応を行った。なお、検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液は、原液濃度の相対値を便宜的に「１０００００」、「１００００」、「１０００」、「１００」及び「１０」の５段階の希釈系列とした。反応は、９５℃で１０秒間保温の後、９５℃で５秒間、６０℃で２０秒間の反応を４５サイクル繰り返し、１サイクルごとにサイバーグリーン色素の発光量を測定した。
【００４４】
（３）解析
各サイクルのサイバーグリーン色素の発光量からＳＰＴ及びＧ３ＰＤＨのそれぞれをコードするＤＮＡ断片の増幅曲線を作成した。検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液の希釈系列の増幅曲線から横軸に濃度、縦軸に増幅曲線の２次導関数が最大となるサイクル数をとった検量線を作成した。各発現定量用サンプルについては増幅曲線の２次導関数が最大となるサイクル数を検量線上にプロットし、相対的な発現量を算出した。ＳＰＴの発現量は、同一サンプルにおけるＧ３ＰＤＨの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加」の補正値を１００としたときの「試料添加」の補正値を算出した。
【００４５】
ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進率（％）は以下の式により求めた。
ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中、Ａは「試料添加」の補正値を表し、Ｂは「試料無添加」の補正値を表す。
【００４６】
上記式により算出した結果、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進率は１１４．７％であった。このことから、甘草の葉部からの抽出物は、優れたＳＰＴｍＲＮＡの発現を促進する作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明のセラミド合成促進剤、皮膚バリア機能改善剤、及びセラミド合成障害に起因する疾患の予防又は治療剤は、セラミドの合成障害による皮膚バリア機能の改善、アトピー性皮膚炎等の予防、治療又は改善に有用である。