(57)【要約】【課題】  遺伝子工学的手法を用いた組織因子の生産において、凝固活性に影響を与えることなく、コスト、生産量といった生産性を満足できる生産系を構築し、組換え組織因子を用いた凝固検査用試薬およびその製造方法を提供する。【解決手段】  昆虫又は昆虫培養細胞を宿主とする遺伝子工学的手法によって得られた組換え組織因子とリン脂質との複合体、及び前記昆虫又は昆虫培養細胞由来の可溶性成分を含有する凝固検査用試薬。宿主由来の可溶性成分は試薬の凝固活性に影響を及ぼさないので、当該試薬の製造方法における精製工程を簡略化することができる。【選択図】  図３
2008122288.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫又は昆虫培養細胞を宿主とする遺伝子工学的手法によって得られた組換え組織因子とリン脂質との複合体、及び前記昆虫又は昆虫培養細胞由来の可溶性成分を含有する凝固検査用試薬。
【請求項２】
前記組換え組織因子は、可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインを有する組換えウシ組織因子である請求項１に記載の凝固検査用試薬。
【請求項３】
前記組換え組織因子は、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列からなる組換えウシ組織因子である請求項１に記載の凝固検査用試薬。
【請求項４】
前記昆虫は、鱗翅目昆虫である請求項１〜３のいずれかに記載の凝固検査用試薬。
【請求項５】
前記鱗翅目昆虫はカイコである請求項４に記載の凝固検査用試薬。
【請求項６】
前記昆虫又は昆虫培養細胞由来の可溶性成分は、前記昆虫又は昆虫培養細胞由来の可溶性タンパク質を含んでいる請求項１〜５のいずれかに記載の凝固検査用試薬。
【請求項７】
組織因子のｃＤＮＡをバキュロウィルスＤＮＡへ組み込んだ組換えバキュロウィルスを昆虫又は昆虫培養細胞に感染させる工程；
前記昆虫又は昆虫培養細胞において、前記ｃＤＮＡから組換え組織因子を発現させる工程；
前記組換え組織因子を発現した昆虫又は昆虫培養細胞を破砕して得られる破砕物を含む溶液から不溶性成分を除去することにより、前記組換え組織因子を含む可溶性成分を得る工程；及び
前記可溶性成分とリン脂質とを混合して、前記組換え組織因子とリン脂質との複合体を形成させる工程
を含む凝固検査用試薬の製造方法。
【請求項８】
前記ｃＤＮＡは、ウシ組織因子の可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインをコードするｃＤＮＡである請求項７に記載の凝固検査用試薬の製造方法。
【請求項９】
前記ｃＤＮＡは、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡである請求項７に記載の凝固検査用試薬の製造方法。
【請求項１０】
前記可溶性成分を得る工程において、破砕物を含む溶液が、界面活性剤を含有する請求項７〜９のいずれかに記載の凝固検査用試薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外因系の血液凝固検査に用いられる凝固検査用試薬であって、従来と同等の凝固時間測定精度を確保しつつ、試薬の主要成分である組織因子に関する生産コストの低減を図ることができる凝固検査用試薬及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンボプラスチンは、組織因子と呼ばれるタンパク質とリン脂質との複合体であり、血液凝固に関与する因子である。ゆえにトロンボプラスチンは、様々な凝固検査に利用されている。例えば、血中のＩＩ因子、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、及びＸ因子の凝固能を総合的に調べるトロンボテスト用試薬は、主要成分として、ウシ脳組織トロンボプラスチン、フィブリノゲン及び第Ｖ因子、カルシウム、リン脂質を含有している。
【０００３】
主要成分のウシ脳組織トロンボプラスチンは、非特許文献１のＦｉｇ．３で示されているように、Ｎ末端から２１３番目までの細胞外ドメイン（可溶性ドメイン）と２１４番目から２３６番目までの膜貫通ドメインと２３７番目から２５７番目までの細胞内ドメインからなる全アミノ酸２５７個の組織因子とよばれるタンパク質に、リン脂質が結合した複合体である。このような構成を有するトロンボプラスチンは、従来より、ウシ大脳を原料として、アセトン粉末あるいは生理食塩水を用いてトロンボプラスチンを抽出することにより製造される。
【０００４】
原料として用いられるウシ大脳は狂牛病（ＢＳＥ）の高度感染部位の１つであることから、近年、製造現場において、原料として、ウシの大脳を使用しない製造方法が求められている。
【０００５】
遺伝子工学的技法を利用して、測定試薬としての活性を有する組換え組織因子を製造した報告としては、例えば、特許文献１、非特許文献２，特許文献２が挙げられる。
【０００６】
具体的には、特許文献１には、ヒトの遺伝子組換え組織因子を大腸菌で発現させ、ヒト組織因子に対して指向性の固定化モノクローナル抗体上でのアフィニティクロマトグラフィを用いて精製した組換えヒト組織因子をプロトロンビン試薬に適用したことが開示されている。
【０００７】
非特許文献２には、組換えウサギ組織因子（ｒＴＦ）を酵母で発現させ、ヒスチジンタグを利用して精製し、得られた組換えウサギ組織因子をプロトロンビン時間測定試薬に適用したことが報告されている。発現させたウサギの組織因子は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインからなる完全長のものであると報告されている。
【０００８】
同様に、特許文献２においても、細胞外ドメイン、脂質結合ドメイン、細胞内ドメインからなる完全長の組換えウサギ組織因子を酵母で発現させ、さらに組換え組織因子を選択的に富化するヒスチジンタグを利用して精製したウサギ組織因子をプロトロンビン時間測定試薬に適用したことが開示されている。
【０００９】
以上のように、いずれの場合も、宿主細胞由来不純物が試薬に混入することによる試薬の凝固活性の低減や測定精度の低減を防止するために、クロマトグラフィなどにより精製した組換え組織因子を使用している。しかしながら、組換え組織因子の精製は、宿主由来の不純物を効率的に分離除去する系を構築する必要がある。また、組換え組織因子を大量に生産する場合、この精製の工程に時間、労力、コスト等を要することから、組換え組織因子の生産性に問題がある。例えば、特異的抗体を使用したアフィニティクロマトグラフィを用いる精製方法は、大量生産の場合、特異的抗体の使用がコスト高をもたらす原因となる。また、ヒスチジンタグを用いたアフィニティクロマトグラフィを用いる精製方法は、大量生産に適した精製方法として、組換えウサギ組織因子で実用化されているものの、宿主の種類、組織因子の種類によっては、ヒスチジンタグの組換え組織因子への連結が凝固活性に影響を及ぼす場合があるとの理由から、精製後にヒスチジンタグを切断することになるが、このタグ切断工程の追加は生産コストアップの原因となる。
【００１０】
さらに、組織因子の種類によっては、その立体構造から、ヒスチジンタグを用いたクロマトグラフィーによっても、うまく精製できない場合がある。
【００１１】
【特許文献１】特表平６−５０５５６２
【特許文献２】特表平１１−５１４１０１
【非特許文献１】Yuko Takayenokiら「cDNA and amino acid sequences of bovine tissue factor (Biochemical and Biophysical Research Communications, 181(1991), 1145-1150)」
【非特許文献２】Cheryl L Brucatolら「Expression  of  recombinant  rabbit  tissue  factor  in  Pichia  pstoris，and  its  application  in  a  prothrombin  time  reagent（Protein  Expression  and  purification，26(2002)，386-393）」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、遺伝子工学的手法を用いた組織因子の生産において、凝固活性に影響を与えることなく、コスト、生産量といった生産性を満足できる生産系を構築し、これにより、当該組織因子を用いた凝固検査用試薬およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の凝固検査用試薬は、昆虫又は昆虫培養細胞を宿主とする遺伝子工学的手法によって得られた組換え組織因子とリン脂質との複合体、及び前記昆虫又は昆虫培養細胞由来の可溶性成分を含有する。
【００１４】
前記組換え組織因子は、可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインを有する組換えウシ組織因子であってもよいし、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列からなる組換えウシ組織因子であってもよい。
【００１５】
前記昆虫は、鱗翅目昆虫であることが好ましく、より好ましくはカイコである。
前記昆虫又は昆虫培養細胞由来の可溶性成分は、前記昆虫又は昆虫培養細胞由来の可溶性タンパク質を含んでいることが好ましい。
【００１６】
本発明の凝固検査用試薬の製造方法は、組織因子のｃＤＮＡをバキュロウィルスＤＮＡへ組み込んだ組換えバキュロウィルスを昆虫又は昆虫培養細胞に感染させる工程；前記昆虫又は昆虫培養細胞において、前記ｃＤＮＡから組換え組織因子を発現させる工程；前記組換え組織因子を発現した昆虫又は昆虫培養細胞を破砕して得られる破砕物を含む溶液から不溶性成分を除去することにより、前記組換え組織因子を含む可溶性成分を得る工程；及び前記可溶性成分とリン脂質とを混合して、前記組換え組織因子とリン脂質との複合体を形成させる工程を含む。
【００１７】
前記ｃＤＮＡは、ウシ組織因子の可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインをコードするｃＤＮＡ、あるいは配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡであることが好ましい。
【００１８】
前記可溶性成分を得る工程において、破砕物を含む溶液が、界面活性剤を含有することが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の凝固検査用試薬は、遺伝子工学的手法を用いて製造した組換え組織因子を使用し、宿主として用いた昆虫又は昆虫培養細胞の可溶性成分を含んでいるが、天然のトロンボプラスチンを含有する従来の凝固検査用試薬に匹敵する凝固活性、感度を示すことができる。
従って、本発明の凝固検査用試薬は、天然のトロンボプラスチンに代えて組換え組織因子を使用することから、製造現場において狂牛病などの原因となる大脳を扱わずに済み、安全である。さらに、本発明の凝固検査用試薬は、その製造方法において、組換え組織因子の精製工程を簡略化することができるので、生産性に優れ、しかも生産コストの低減を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
〔組換え組織因子及び当該組織因子のリン脂質複合体〕
はじめに、本発明の凝固検査用試薬に用いられる組換え組織因子、及び当該組換え組織因子とリン脂質との複合体（組換え組織因子−リン脂質複合体）について説明する。
本発明で用いられる組換え組織因子は、昆虫又は昆虫培養細胞を宿主とする遺伝子工学的手法によって得られたもので、このような遺伝子工学的手法によって得られた組換えウシ組織因子、組換えウサギ組織因子、組換えヒト組織因子などが挙げられる。
【００２１】
組換え組織因子としては、具体的には、リン脂質と複合化することによりヒト血液中のＶＩＩ因子を活性化するものであり、少なくとも天然の組織因子の可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインを有する。組換え組織因子の可溶性ドメインはＶＩＩ因子と相互作用するのに必要なドメインであり、膜貫通ドメインはリン脂質との複合体を形成するのに必要なドメインである。
【００２２】
好ましい組換え組織因子としては、リン脂質と複合体を形成してＶＩＩ因子を活性化する能力を損なわない範囲で、可溶性ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを有するものが挙げられ、例えば、組換えウシ組織因子の場合、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうちの数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したもので、リン脂質と複合体を形成してＶＩＩ因子を活性化するものが挙げられる。
【００２３】
ここで、配列番号１は、非特許文献１のＦｉｇ．３に示されている正常ウシ組織因子のアミノ酸配列であり、１番アミノ酸から２１３番アミノ酸までが可溶性ドメイン（細胞外ドメイン）に該当し、２１４番アミノ酸から２３６番目までが膜貫通ドメインに該当し、２３７番目から２５７番目までが細胞内ドメインに該当する。
【００２４】
上述したような組換え組織因子は、昆虫又は昆虫培養細胞を宿主とする遺伝子工学的手法によって得られる。詳細については、後述する。
【００２５】
本発明で用いられる組換え組織因子−リン脂質複合体は、上述した組換え組織因子の膜貫通ドメインにリン脂質が結合したものであり、天然のトロンボプラスチン（リン脂質複合体型の天然組織因子）と同程度の血液凝固活性を有するものである。このような複合体は、従来より公知の方法を利用して組換え組織因子とリン脂質とを混合することにより製造することができる。例えば、特許文献１，特許文献２、非特許文献２などに記載の方法で製造することができる。
【００２６】
複合体化に用いられるリン脂質は、一般に１２〜２２の炭素原子を有する脂肪酸を含有するリン脂質であり、当該脂肪酸は飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸のいずれであってもよい。好ましいリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリンなどが例示される。これらのリン脂質は、天然物、合成品のいずれであってもよく、異なる種類の脂肪酸を有するリン脂質であってもよい。さらに、これらのリン脂質は、所望する性状、特性などに応じて２種以上を混合して複合体に用いてもよい。
【００２７】
〔凝固検査用試薬〕
本発明の凝固検査用試薬は、上記の組換え組織因子−リン脂質複合体、及び組換え組織因子を得るときに用いられた宿主である昆虫又は昆虫培養細胞由来の可溶性成分を含有している。
凝固検査用試薬に含まれる組換え組織因子は、昆虫又は昆虫培養細胞を宿主とする遺伝子工学的手法により得られるものである。そして、宿主として用いた昆虫又は昆虫培養細胞の可溶性成分は、宿主から組換え組織因子とともに抽出されてくるものであり、最終的に凝固検査用試薬に含まれることになる。
【００２８】
宿主として用いられる昆虫としては、その種類は限定しないが、鱗翅目が好ましく用いられ、より好ましくはカイコである。また昆虫培養細胞としては、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＨｉＦｉｖｅなどが挙げられ、これらのうちＳｆ９が好ましく用いられる。
【００２９】
宿主から組換え組織因子を抽出する際は、宿主である昆虫又は昆虫培養細胞を水や緩衝液などの適当な溶液中で破砕し、破砕して得られる破砕物を含む溶液から濾過や遠心分離などにより不溶性成分を除去する。そして、昆虫又は昆虫培養細胞由来の可溶性成分は、この昆虫又は昆虫培養細胞の破砕物を含む溶液を、濾過により不溶性成分を除去して得られた濾液や、遠心分離により不溶性成分を除去して得られた上清に含有され得る成分である。例えば、昆虫個体由来の体液、あるいは昆虫培養細胞の細胞質ゾル（サイトゾル）に溶けている成分が挙げられ、具体的には、昆虫又は昆虫培養細胞を構成する可溶性タンパク質、水溶性糖鎖、あるいは昆虫又は昆虫培養細胞が産生する可溶性タンパクなどが挙げられる。
【００３０】
本発明の凝固検査用試薬は、上記組換え組織因子−リン脂質複合体、上記昆虫又は昆虫培養細胞の可溶性成分の他、凝固検査用試薬の種類（すなわち検査しようとする凝固因子の種類）に応じて、適宜、凝固因子、カルシウムイオン、リン脂質などを含有してもよい。
【００３１】
例えば、本発明の凝固検査用試薬が、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の場合には、組換えウシ組織因子−リン脂質複合体、昆虫又は昆虫培養細胞の可溶性成分の他、第Ｉ因子、第Ｖ因子、及びカルシウムイオンを含有することが好ましい。また、第Ｉ因子及び第Ｖ因子の添加に代えて、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子及びＸ因子を除去した血漿を用いてもよい。当該血漿としては、血漿、好ましくはウシ血漿を硫酸バリウムで吸着させて得られる硫酸バリウム吸着血漿を用いることが好ましい。硫酸バリウム吸着血漿は、血漿（好ましくはウシ血漿）に硫酸バリウムを添加混合後、硫酸バリウムを除去することにより調製することができる。
【００３２】
また、本発明の凝固検査用試薬が、ＩＩ、ＶＩＩ、及びＸ因子の凝固能を総合的に調べるための検査であるヘパプラスチンテスト用の試薬の場合には、組換えウサギ組織因子−リン脂質複合体、昆虫又は昆虫培養細胞の可溶性成分の他、第Ｉ因子及び第Ｖ因子、カルシウムイオンを含有することが好ましい。また、第Ｉ因子及び第Ｖ因子の添加に代えて、上述したような、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子及びＸ因子を除去した血漿を用いてもよい。
【００３３】
また、本発明の凝固検査用試薬が、プロトロンビン時間用試薬の場合には、組換えウサギ組織因子−リン脂質複合体又は組換えヒト組織因子−リン脂質複合体、昆虫又は昆虫培養細胞の可溶性成分の他、カルシウムイオンを含有することが好ましい。
上記カルシウムイオン源としては、通常、塩化カルシウム、乳酸カルシウムやグルコン酸カルシウム等から選ばれる。
【００３４】
さらに、必要に応じて、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＰＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＢＩＳＴＲＩＳ、Ｇｌｙｃｉｎｅなどの群から選ばれる緩衝液を、ｐＨ５〜９、最終濃度約１０〜１００ｍＭとなるように含有していてもよい。
【００３５】
以上のような組成を有する本発明の凝固検査用試薬は、組換え組織因子を得るときに用いられた宿主である昆虫又は昆虫培養細胞由来の可溶性成分を含有しているが、天然のトロンボプラスチンを用いた試薬に匹敵する凝固活性を有している。また、組換えウシ組織因子−リン脂質複合体を含むＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の場合、ＰＩＶＫＡ（protein induced in vitamin K absence or antagonists）に対する感受性についても、天然のウシトロンボプラチンを用いた従来のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬に匹敵するものであり、ワーファリン等治療の効果をモニタリングするのに使用する試薬として用いることもできる。
【００３６】
ここで、ＰＩＶＫＡとは、ビタミンＫ欠乏又はビタミンＫアンタゴニスト存在下で血液中に出現する、正常な凝固因子活性をもたない前駆体の総称である。つまり、血液凝固因子のうちＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子はいずれも肝臓で合成されるが、その最終段階でビタミンＫが必要になるため、ビタミンＫ欠乏症やワーファリンなどのビタミンＫ阻害剤投与時には、これらの因子は、正常な凝固因子活性をもたない前駆体のまま血液中に出現することになる。Hemker（Hemker HC, Veltkamp JJ, Loeliger EA. Kinetic aspects of the interaction of blood clotting enzymes. 3. Demonstration of an inhibitor of prothrombin conversion in vitamin K deficiency.  Thromb Diath Haemorrh. 19:346-363 (1968)）やDenson （Denson KW, Reed SV, Haddon ME. Validity of the INR system for patients with liver impairment. Thromb Haemost. 73:162.(1995)）らによって、ウシ組織因子はＰＩＶＫＡに対する感受性が高く、ウサギ組織因子やヒト組織因子ではＰＩＶＫＡに対する感受性が低いと報告されている。このことから、現在、ワーファリン等治療の効果をモニタリングするのに、ウシ組織因子を含むＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬（トロンボテストとも言われている）が利用されている。
【００３７】
〔凝固検査用試薬の製造方法〕
本発明の凝固検査用試薬の製造方法は、組織因子のｃＤＮＡをバキュロウィルスＤＮＡへ組み込んだ組換えバキュロウィルスを昆虫又は昆虫培養細胞に感染させる工程；前記昆虫又は昆虫培養細胞において、前記ｃＤＮＡから組換え組織因子を発現させる工程；前記組換え組織因子を発現した昆虫又は昆虫培養細胞を破砕して得られる破砕物を含む溶液から不溶性成分を除去することにより、前記組換え組織因子を含む可溶性成分を得る工程；及び前記可溶性成分とリン脂質とを混合して、前記組換え組織因子とリン脂質との複合体を形成させる工程を含む。
【００３８】
本発明の製造方法で使用する組織因子のｃＤＮＡは、目的の凝固検査用試薬に用いられる組織因子のｃＤＮＡで、少なくとも可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインをコードする塩基配列を有するもので、好ましくは組織因子の可溶性ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインの全てをコードすることができる塩基配列を有するものである。例えば、ウシ組織因子の場合には、配列番号２で示されるアミノ酸配列（ＡＡＢ２０７５５）又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列をコードすることができる塩基配列が好ましく用いられ、より具体的には、クローンテック社やストラタジーン社のｃＤＮＡライブラリー等から入手できるウシ組織因子のｃＤＮＡを用いることができる。
このようなｃＤＮＡをバキュロウィルスＤＮＡ中に組み込んで、組換えバキュロウィルスを作製する。
【００３９】
バキュロウィルスとは、環状の２本鎖ＤＮＡを遺伝子としてもつ昆虫の病原ウィルスである。バキュロウィルスとしては、核多角体病ウィルス（ＮＰＶ：ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）、ＧＮ（Ｇｅａｎｕｌｏｖｉｒｕｓ）などの種類があるが、好ましくは核多角体病ウィルス（ＮＰＶ）が用いられる。ＮＰＶは感染した細胞内に、多角体と呼ばれるタンパク質を多量に合成するウィルスである。この多角体タンパクをコードする遺伝子はバキュロウィルスの増殖には不要であるため、多角体遺伝子のプロモータの下流に、この多角体遺伝子に代えて、目的とする組織因子のｃＤＮＡを挿入することにより、目的の組織因子を感染細胞内で多量に合成させることができる。
【００４０】
さらに、バキュロウィルスとしては、ウィルスが産生するシステインプロテアーゼによるタンパク質分解の影響を避けるため、システインプロテアーゼ遺伝子を人為的に欠損したバキュロウィルスが好ましく用いられる。
【００４１】
目的の組織因子のｃＤＮＡが導入された組換えバキュロウィルスは、従来より公知の組換え技術を用いて作製することができる。例えば、組織因子ｃＤＮＡをバキュロトランスファーベクターに挿入し、このトランスファーベクターとバキュロウィルスＤＮＡとを昆虫細胞にコトランスフェクトし、相同的組み換えにより組織因子ｃＤＮＡがバキュロウィルスＤＮＡへ組み込まれた組換えバキュロウィルスを作製することができる。また、バキュロウィルスを含む大腸菌ＤＨ１０  Ｂａｃ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）を用いる場合、これに組織因子ｃＤＮＡが挿入されたトランスファーベクターをトランスフェクトすることにより組換えバキュロウィルスを作製することができる。
【００４２】
次に、作製したバキュロウィルス組換え体を、宿主とする昆虫又は昆虫培養細胞に感染させる。
宿主が昆虫である場合、昆虫の種類は特に限定しないが、鱗翅目が好ましく用いられ、鱗翅目昆虫の中でもカイコがより好ましく用いられる。カイコの種類は特に限定しないが、裸蛹系統のカイコが好ましく用いられる。裸蛹系統のカイコは、繭形成にかかる遺伝子が変異したもので、蛹化はしても繭をつくらない。このような裸蛹系統のカイコとしては例えば、Ｎｄ系、Ｎｄｂ系、Ｎｄ−ｓ系、Ｎｄ−ｔ系等のカイコが知られている。また、このようなカイコの蛹を用いることが好ましい。蛹は、カイコ幼虫の消化管に存在する、食物（桑）を分解するためのセリンプロテアーゼの活性が、カイコ虫体に比べてはるかに低いからである。これにより、カイコ内で発現されたタンパク質の分解を防止することができる。また、カイコ蛹は、バキュロウィルスに対する感受性が幼虫に比べても高く、容易に個体内でウィルスが増殖し、大量の組織因子の発現が可能となるからである。
【００４３】
宿主が昆虫培養細胞である場合、昆虫培養細胞としては、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＨｉＦｉなどの樹立された昆虫培養細胞を用いることができるが、これらのうち好ましくはＳｆ９である。
昆虫培養細胞を用いる場合、発現された産生タンパクである組織因子は、細胞外に分泌されてもよいし、細胞内に蓄積されるものであってもよい。
【００４４】
感染方法としては、従来より行なわれていた方法を利用することができる。例えば、宿主が昆虫である場合には、昆虫にウィルス液を注入する注射法、針に微量のウィルス液を塗布し昆虫に接種する微量接種法等を適用することができる。あるいは、組換えバキュロウィルスを昆虫培養細胞にトランスフェクトし、次いでトランスフェクトされた昆虫培養細胞を所定期間培養して組換えバキュロウィルスを増殖させ、増殖した組換えバキュロウィルスを昆虫に接種することにより行なっても良い。また、宿主として昆虫培養細胞を用いる場合には、ウィルス液を含む培養液中で昆虫培養細胞を所定時間培養することによって、感染させることができる。
【００４５】
宿主が昆虫である場合には、感染させた昆虫を５〜１０日間飼育する。宿主が昆虫培養細胞である場合には、ウィルス液とともに昆虫培養細胞を２〜７日間培養する。飼育又は培養中に、宿主内で、組換えバキュロウィルスに挿入されたｃＤＮＡが発現して、昆虫又は昆虫培養細胞内で目的の組織因子が産生される。宿主が昆虫の場合には、産生された組織因子は、昆虫体内で蓄積される。宿主が培養細胞の場合には、産生された組織因子は、培養細胞内に蓄積又は培地内に分泌される。ここで、昆虫体内又は昆虫培養細胞内で蓄積される組換え組織因子は、翻訳後のプロセッシングによりＮ末端が切断されていると考えられる。例えば、組換えウシ組織因子の場合、昆虫体内又は昆虫培養細胞内で蓄積される組換えウシ組織因子は配列番号１で示されるものである。
所定時間飼育又は培養後、生産された組織因子を、宿主体内又は培養細胞内又は培地から抽出する。
【００４６】
宿主として昆虫を用いた場合、組織因子の昆虫からの抽出は、組換え組織因子を発現した昆虫を破砕して得られる破砕物を含む溶液から、不溶性成分を除去することにより、前記組換え組織因子を含む可溶性成分を採取することにより行なう。
【００４７】
昆虫の破砕は、ミキサー、ホモジナイザー、ブレンダー、超音波などを用いて機械的に粉砕すればよく、さらに界面活性剤などを用いる非機械的な処理を組合わせてもよい。破砕に際しては、水や緩衝液など適当な溶液中で行なうことが好ましく、このような溶液（以下、「破砕処理用溶液」という）としては、例えば、水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等の緩衝液、さらには界面活性剤を添加した緩衝液などが挙げられる。破砕物を含む溶液からの不溶性成分の除去は、濾過、遠心分離、又はこれらを適宜組み合わせて行なうことができる。
【００４８】
宿主として昆虫培養細胞を用いた場合、組織因子の昆虫培養細胞及び培地からの抽出は、組換え組織因子を発現した培養細胞を破砕して得られる破砕物を含む溶液から、不溶性成分を除去することにより、前記組換え組織因子を含む可溶性成分を採取することにより行なう。
培養細胞は、ホモジナイザーや超音波などを用いた機械的な処理により破砕してもよいし、界面活性剤などを用いた非機械的処理により破砕（溶解）してもよいし、これらの処理を組合わせて破砕してもよい。破砕に際しては、宿主として昆虫を用いる場合と同様に、適当な破砕処理溶液中で行なうことが好ましい。破砕物を含む溶液からの不溶性成分の除去は、濾過、遠心分離、又はこれらを適宜組合わせて行なうことができる。
【００４９】
なお、昆虫又は昆虫培養細胞を破砕して得られる破砕物を含む溶液には、組換え組織因子及び宿主である昆虫又は昆虫培養細胞由来の可溶性成分とともに、遺伝子導入に使用したバキュロウィルスも含まれている。界面活性剤がこのウィルスの不活化にも役立つことから、上述した組換え組織因子の昆虫又は昆虫培養細胞からの抽出において界面活性剤を使用することが好ましい。界面活性剤としては、ノニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤のいずれを用いてもよいが、殺ウィルス性の観点からノニオン系界面活性剤を用いることが好ましい。また、ノニオン系界面活性剤の添加は、組換え組織因子の可溶化にも役立つ。
【００５０】
破砕処理用溶液とは、上述したように、宿主である昆虫や昆虫培養細胞を破砕する際に用いられる溶液であり、水、リン酸緩衝液やトリス緩衝液などの緩衝液、さらには界面活性剤を添加した上記緩衝液などが挙げられる。そして、破砕処理用溶液中で昆虫や昆虫培養細胞を破砕することにより、産生された組換え組織因子や昆虫又は昆虫培養細胞由来の可溶性成分が破砕処理用溶液に溶解してくる。
【００５１】
ここで、昆虫又は昆虫培養細胞由来の可溶性成分とは、破砕処理用溶液に可溶な成分である。ゆえに、破砕物を含む溶液から濾過や遠心分離などにより不溶性成分を除去した後でも、濾過により不溶性成分を除去して得られた濾液や遠心分離により不溶性成分を除去して得られた上清に含有され得る。このような昆虫又は昆虫培養細胞由来の可溶性成分としては、例えば、昆虫個体由来の体液、あるいは昆虫培養細胞の細胞質ゾル（サイトゾル）に溶けている成分が挙げられ、具体的には、昆虫又は昆虫培養細胞を構成する可溶性タンパク質、水溶性糖鎖あるいは昆虫又は昆虫培養細胞が産生する可溶性タンパクなどが挙げられる。
【００５２】
また不溶性成分とは、上記破砕処理用溶液に不溶の成分で、具体的には、破砕されたクチクラ層や細胞膜などの固形成分、リポタンパク質、脂質、不溶性タンパク質などが該当する。
【００５３】
このようにして、破砕物を含む溶液から不溶性成分を除去して不溶性成分除去液を得る。不溶性成分除去液としては、具体的には、破砕物を含む溶液を濾過することにより得られる濾液、破砕物を含む溶液を遠心分離することにより得られる上清などが挙げられる。そして、このような不溶性成分除去液を、組換え組織因子を含む溶液（以下、「組換え組織因子含有溶液」という）として用いることができる。
【００５４】
また、不溶性成分除去後の不溶性成分除去液を、ＨＥＰＥＳ等の緩衝液（ｐＨ６〜７）等を外液として透析することにより得られた溶液を組換え組織因子含有液として用いてもよい。
【００５５】
組換え組織因子−リン脂質複合体の形成は、常法に準じて行なうことができ（Methods  Enzymol.,２２２，ｐ１７３，１９９３などを参照）、好ましくは、組換え組織因子含有溶液とリン脂質溶液とを、ニッケル存在下で混合することにより行なう。
【００５６】
組換え組織因子−リン脂質複合体の形成工程は、濾過、遠心分離等による不溶性成分の除去後に行なえばよく、透析を行なう場合には、透析の後であってもよいし、前に行なってもよい。塩析についても同様に、塩析の後に行なってもよいし、前に行なってもよい。
【００５７】
上記リン脂質溶液としては、複合体化に使用するリン脂質、すなわち炭素数１２〜２２の脂肪酸又は不飽和脂肪酸を有するリン脂質が好ましく用いられる。具体的には、前述の組換え組織因子−リン脂質複合体で例示したリン脂質を用いることができる。組換え組織因子含有溶液とリン脂質液とのモル比率が約１：１０〜１：２×１０７の範囲、より好ましくは１：３０００〜１：１５０００の範囲で使用するのが好ましい。
【００５８】
ニッケルとしては、通常、塩化ニッケル、硫酸ニッケル等のニッケル塩水溶液、あるいは緩衝液にニッケル塩を溶解させてなる溶液が用いられる。
リン脂質との複合体化は、以上のような組換え組織因子含有溶液、リン脂質溶液、ニッケル塩溶液を混合攪拌し、１〜２時間ほど反応させればよい。
【００５９】
製造しようとする凝固検査用試薬がカルシウムイオンを含有する場合には、カルシウムイオン源として、塩化カルシウム、乳酸カルシウムやグルコン酸カルシウム等を添加する。
【００６０】
また、製造しようとする凝固検査用試薬がＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の場合、第Ｉ因子及び第Ｖ因子を添加する。第Ｉ因子及び第Ｖ因子の添加に代えて、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子及びＸ因子を除去した血漿を用いてもよい。当該血漿としては、血漿、好ましくはウシ血漿を硫酸バリウムで吸着させて得られる硫酸バリウム吸着血漿を用いてもよい。硫酸バリウム吸着血漿の調製は、特に限定しないが、例えば、Charlesら「One-stage Prothrombin Time techniques (Thrombosis and Bleeding Disorders Theory and Method, 1971, p92-97)」に記載されているOwrenらの方法により調製できる。
【００６１】
さらに必要に応じて、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＰＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＢＩＳＴＲＩＳ、Ｇｌｙｃｉｎｅなどの群から選ばれる緩衝液を、ｐＨ５〜９、最終濃度約１０〜１００ｍＭとなるように添加してもよい。
【００６２】
必要に応じて添加される第Ｉ因子及び第Ｖ因子（又は硫酸バリウム吸着血漿など）、カルシウムイオン源、緩衝剤は、ウシ組織因子−リン脂質複合体形成前に添加してもよいし、同複合体形成後に添加してもよい。また、第Ｉ因子及び第Ｖ因子、カルシウムイオン源、緩衝剤の添加順序も特に限定しない。
【００６３】
以上のようにして製造される凝固検査用試薬は、組換え組織因子−リン脂質複合体、凝固検査用試薬として不可欠な成分が含まれている。ここで、凝固検査用試薬として不可欠な成分としては、具体的には、プロトロンビン時間測定試薬であればカルシウムイオンが含まれ、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬又はヘパプラスチンテスト用試薬であればカルシウム、及び第Ｉ因子、第Ｖ因子（第Ｉ因子及び第Ｖ因子に代えて硫酸バリウム吸着血漿であってもよい）が挙げられる。さらに、本発明の製造方法で製造される凝固検査用試薬には、上記製造方法に基づいて、組換え組織因子の製造に用いられた宿主の可溶性成分が含まれる。本発明者らは、宿主（昆虫又は昆虫培養細胞）の可溶性成分が、検査に関与する凝固反応には影響を及ぼさないことを発見し、当該発見に基づいて、遺伝子工学的手法で製造した組換え組織因子を抽出する工程において、クロマトグラフィ等を使用した組換え組織因子の高度な精製を行なわなくても実用化に問題ない凝固検査用試薬を提供する。従って、本発明の凝固検査用試薬の製造方法によれば、遺伝子工学的手法で製造した組換え組織因子の抽出工程、換言すると組換え組織因子の精製工程が簡略化されているので、生産コストの低減を図ることができる。
【実施例】
【００６４】
〔宿主としてカイコを用いた組換えウシ組織因子の製造〕
ウシ大脳のｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社）を入手し、非特許文献１の方法に基づいて、ＰＣＲによりウシ組織因子の遺伝子を増幅させ、ウシ組織因子の可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインをコードする完全長のウシ組織因子コード遺伝子をクローニングした。ＰＣＲ法での増幅に際しては、ｆｏｒｗａｒｄプライマーとしてＢｇＩＩＩ切断配列を有するプライマー（５’−ａｇａｔｃｔａｔｇｇｃｇａｃｃｃｃｃａａｃｇｇｇｃｃ）を使用し、ｂａｃｋｗａｒｄプライマーとしてＥｃｏＲＩ切断配列を有するプライマー（５’−ａｃｔｔａａｇａａｔａｃｇｔｃｇｃａａｃｔｃｇｃｃｇｃ）を使用した。クローニングした遺伝子の塩基配列を、シーケンサー（４２００型、ライカ）で調べたところ、配列番号２のタンパク質をコードするＤＮＡであることが確認できた。
【００６５】
クローニングしたｃＤＮＡを、システインプロテアーゼ欠損ウィルス（片倉工業、ｐＹＮＧ）のクローニングサイトに挿入して、ウシ組織因子組換えバキュロウィルス発現系を樹立させた。
【００６６】
ウシ組織因子組換えバキュロウィルスを、カイコの蛹にウィルス感染させ、５℃下で７日間放置し、十分に感染させた。
【００６７】
感染後のカイコ蛹を緩衝液中でホモジナイザーを用いて破砕し、得られた破砕液から濾過や遠心などにより固形成分を除去した。なお、クローニングしたウシ組織因子のｃＤＮＡのバキュロウィルスへの挿入から、破砕液からの固形成分除去までの工程は、片倉工業（株）の「Ｓｕｐｅｒｗｏｒｍ」サービスを利用した。
【００６８】
固形成分が除去された溶液を片倉工業（株）より入手した。さらに、この溶液について、ホモジナイザー（アズワン、回転数５０００ｒｐｍで１０ストローク）及び遠心分離（３０００×ｇ、８℃、１０分）の処理を行った。そして、上清を回収し、この上清８容量に対して、１０％ＮＰ−４０界面活性剤（カルビオケム）を２容量加えて、ＮＰ−４０界面活性剤の最終濃度２％とした。次いで、３０℃で、３時間インキュベートして、バキュロウィルスを不活性化するとともに、組換えウシ組織因子を可溶化させた。
【００６９】
バキュロウィルスの不活性化の確認は、界面活性剤で処理された溶液のウィルス力価を、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法(Reed,L.J.and Muench,H.:Amer.J.Hyg.,27,493(1938))に基づいて、顕微鏡で目視により９６穴のウィルス感染の有無を観察することにより行なった。
【００７０】
界面活性剤で処理された溶液を遠心分離（３０００×ｇ、８℃、３０分）して、リポタンパク質や脂質分画が除去された上清を得た。次に、得られた上清を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２））を用いて透析（透析用セルロースチューブ、三光純薬（株））を行なった。透析後、透析チューブ内の溶液を採取し、これを組換えウシ組織因子含有溶液ＳＷとした。この組換えウシ組織因子含有溶液ＳＷは、組換えウシ組織因子及びカイコ個体由来の可溶性成分を含むものである。
【００７１】
〔宿主としてＳｆ９を用いた組換えウシ組織因子の製造〕
ウシ大脳のｃＤＮＡライブラリー (ストラタジーン社)を入手し、非特許文献１の方法に基づいて、ＰＣＲによりウシ組織因子の遺伝子を増幅させ、ウシ組織因子の可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインをコードする完全長のウシ組織因子コード遺伝子をクローニングした。ＰＣＲ法での増幅に際しては、ｆｏｒｗａｒｄプライマーとしてＢａｍＨＩ切断配列を有するプライマー（５’−ｇｇａｔｃｃａｔｇｇｃｇａｃｃｃｃｃａａｃｇｇｇｃｃｃｃｇ）を使用し、ｂａｃｋｗａｒｄプライマーとしてＸｈｏＩ切断配列を有するプライマー（５’−ｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇｃａｇｃｇｔｔｇａｇｃｇｇｃｇｔｇ）を使用した。クローニングした遺伝子の塩基配列を、４０００Ｌ  ＤＮＡシーケンサー（ＬＩ−ＣＯＲ社）で調べたところ、配列番号２のタンパク質をコードするＤＮＡであることが確認できた。
【００７２】
クローニングしたｃＤＮＡをＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、トランスファーベクター ｐＦａｓｔ  Ｂａｃ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）に挿入した。このｐＦａｓｔ  Ｂａｃを、バキュロウィルスゲノムＤＮＡを含む大腸菌ＤＨ１０  Ｂａｃへトランスフェクションし、最終的にウシ組織因子のｃＤＮＡが導入されたバキュロウィルス（ウシ組織因子組換えバキュロウィルス）を得た。ウシ組織因子組換えバキュロウィルスを昆虫培養細胞Ｓｆ９にトランスフェクトし、７２時間処理培養してＰ１ウィルスを得た。次に、Ｐ１ウィルスをＳｆ９に感染させ、１０％ＦＢＳを含むＧｒａｃｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社）で４日間培養してＰ２ウィルスを得た。得られたＰ２ウィルスを別のＳｆ９に感染させて、感染したＳｆ９をＳｆ−９００ＩＩ  Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社）で培養した。培養後のＳｆ９を採取し、トリス緩衝液（ｐＨ７．５、１％ＣＨＡＰＳを含む）を用いてＳｆ９から組換えウシ組織因子を抽出し、組換えウシ組織因子含有溶液ＳＦを調製した。この組換えウシ組織因子含有溶液ＳＦは、組換えウシ組織因子及びＳｆ９細胞由来の可溶性成分を含むものである。
【００７３】
〔組換えウシ組織因子含有溶液を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ〕
上記の調製方法の過程で得られる組換えウシ組織因子含有溶液ＳＷ及び組換えウシ組織因子含有溶液ＳＦを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（sodium  dodecyl  sulfate-polyacrylamide  gel  electrophoresis）を行った。
【００７４】
１０μＬの組換えウシ組織因子含有溶液ＳＷに、ＳＤＳサンプルバッファーｐH７．５（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ、７２ｍＭ グリシン、０．０２％ＳＤＳを含む ）１０μLを加え、１００℃で５分間ボイルしてＳＤＳ用の試料（ＳＤＳ用試料ＳＷ）を調製した。
得られたＳＤＳ用試料ＳＷ  １０μLを５〜１０％グラジエントポリアクリルアミドゲルのウェルに注入し、泳動槽（ミニプロテインII電気泳動装置（日本バイオラッドラボラトリーズ（株））を用いて５０Ｖで３時間の泳動を行った。泳動後、ポリアクリルアミドゲルを銀染色キット（第一化学薬品株式会社）を用いて染色した。その結果を図１に示す。図１において、レーン１は分子量マーカー（プレシジョンＰｌｕｓ、日本バイオラッドラボラトリーズ（株））であり、レーン２はＳＤＳ用試料ＳＷの泳動結果である。組換えウシ組織因子のバンドが出現する位置（およそ分子量４０ｋＤａの位置）を矢印で示した。
【００７５】
１０μLの組換えウシ組織因子含有溶液ＳＦに、２×ＳＤＳサンプルバッファーｐH７．５（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ、７２ｍＭ グリシン、０．０２％ＳＤＳ）１０μLを加え、１００℃で５分間ボイルしてＳＤＳ用の試料（ＳＤＳ用試料ＳＦ）を調製した。
得られたＳＤＳ用試料ＳＦ  １０μLを５〜１０％ポリアクリルアミドゲルのウェルに注入し、泳動槽（ミニプロティアンＩＩ電気泳動装置（日本バイオラッドラボラトリーズ（株））を用いて１００Ｖで１時間の泳動を行った。泳動後、ポリアクリルアミドゲルをＣＣＢ染色キット（和光純薬工業（株））を用いて染色した。その結果を図２に示す。図２において、レーン１は分子量マーカー（プレシジョンＰｌｕｓ、日本バイオラッドラボラトリーズ（株））を、レーン２はＳＤＳ用試料ＳＦの泳動結果である。組換えウシ組織因子のバンドが出現する位置（およそ分子量４０ｋＤａの位置）を矢印で示した。
【００７６】
図１及び図２の結果より、組換えウシ組織因子含有溶液ＳＷ及び組換えウシ組織因子含有溶液ＳＦ中には、組換えウシ組織因子以外に、非常に多くの宿主由来のタンパク質が含まれていることがわかった。
図１の結果から、組換えウシ組織因子含有溶液ＳＷにおける組換えウシ組織因子の純度は約５〜１０％程度であると考えられる。
図２の結果から、組換えウシ組織因子含有溶液ＳＦにおける組換えウシ組織因子の純度は約１〜５％程度であると考えられる。
【００７７】
〔組換えウシ組織因子−リン脂質複合体の作製〕
０．２５％デオキシコール酸ナトリウムＤＯＣ（２０ｍＬ）にベイシス大豆レシチン０．４ｇ（日清製油（株））を溶解した。ローテータで室温下、完全に溶解させ、これに１，２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）０．１ｇ及び１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）０．３ｇ（いずれもAvanti polar lipid、Inc.）を懸濁させてリン脂質溶液を調製した。
【００７８】
このリン脂質溶液３７．５ｍＬに、０．５Ｍ塩化ニッケル溶液を５ｍＬ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）５．０ｍＬ、上記の組換えウシ組織因子含有溶液（組換えウシ組織因子含有溶液ＳＷ又は組換えウシ組織因子含有溶液ＳＦ）２．５ｍＬを添加し、ボルテックスで３０秒間攪拌した。撹拌後、ＢＲＡＮＳＯＮ＃２２１０型超音波装置で、３７℃、１５分間反応させた後、３７℃、１時間放置した。溶液を透析膜（透析用セルロースチューブ、三光純薬（株））に移して、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（０．１５Ｍ  塩化ナトリウム含有）ｐＨ７．３で透析を３回行ない、透析後の透析チューブ内の溶液を得て、これをウシ組織因子−リン脂質複合体含有液（ウシ組織因子−リン脂質複合体含有液ＳＷ又はウシ組織因子−リン脂質複合体含有液ＳＦ）として用いた。
【００７９】
〔ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子検査用試薬の調製〕
（１）硫酸バリウム吸着血漿の調製
クエン酸を添加したウシ血漿に、ウシ血漿の３０ｗ／ｖ％量の硫酸バリウム、及びウシ血漿の２０ｖ／ｖ％量の生理食塩水を、添加し、６０分間ローテータで攪拌した。
この混合液を、４℃、５０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した後、上清を回収した。この上清に、当該上清の３０ｗ／ｖ％の硫酸バリウムを、少しずつ添加して、硫酸バリウムに血漿中のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子吸着させた。その後遠心分離して上清を回収した。その上清を、透析チューブ（透析用セルロースチューブ、三光純薬（株））にいれ、生理食塩水を外液として、２〜８℃で透析を行なった。透析後の透析チューブ内の溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過した濾液を、硫酸バリウム吸着血漿として、以下の試薬の調製に用いた。
【００８０】
（２）ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子検査用試薬の調製
上記で調製したウシ組織因子−リン脂質複合体含有液と硫酸バリウム吸着血漿と４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、４ｍＭの乳酸カルシウムを含む）とを、１：２：１の比率で混合して撹拌し、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬を調製した。ここで、ウシ組織因子−リン脂質複合体含有液ＳＷを用いて調製されたＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬を試薬ＳＷとし、ウシ組織因子−リン脂質複合体含有液ＳＦを用いて調製されたＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬を試薬ＳＦとした。
【００８１】
〔カイコ由来の可溶性成分の凝固活性への影響〕
上記調製方法に基づいて、試薬ＳＷを３ロット（ＳＷ−１、ＳＷ−２及びＳＷ−３）調製した。また、バキュロウィルスを感染させていないカイコ蛹から、上記調製方法に準じてＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬ＳＷを調製した。これを試薬ＳＷ（未感染）とする。試薬ＳＷ（未感染）には、カイコ個体由来の可溶性成分は含有されているが、組換えウシ組織因子及びバキュロウィルス由来の可溶性成分は含有されていない。さらに、カイコ蛹にウシ組織因子ｃＤＮＡが組み込まれていないバキュロウィルスを感染させ、感染したカイコ蛹から上記調製方法に準じてＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬ＳＷを調製した。これを試薬ＳＷ（ｃＤＮＡ不含有）とする。試薬ＳＷ（ｃＤＮＡ不含有）には、カイコ個体由来及びバキュロウィルス由来の可溶性成分は含有されているが、組換えウシ組織因子は含有されていない。
【００８２】
これら５種類の試薬（ＳＷ−１、ＳＷ−２、ＳＷ−３、ＳＷ（未感染）、ＳＷ（ｃＤＮＡ不含有））を使用して、正常血漿の凝固時間（秒）を、全自動血液凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所（株））を用いて測定した。また、上記５種類の試薬について、生理食塩水で２倍希釈、４倍希釈、8倍希釈した試薬を調製し、これら希釈した試薬を用いて同様に正常血漿の凝固時間（秒）を測定した。尚、正常血漿には、コアグトロールＮ（シスメックス（株））を用いた。各試薬を用いて得られた凝固時間（秒）の結果を表１に示した。
【００８３】
【表１】
2008122288.tif 000003
【００８４】
表１において、試薬ＳＷ（未感染）及び試薬ＳＷ（ｃＤＮＡ不含有）を用いた場合では凝固時間が検出されなかったが、試薬ＳＷ−１、試薬ＳＷ−２及び試薬ＳＷ−３の試薬を用いた場合では凝固時間が検出された。これより、試薬に含まれるカイコ個体由来の可溶性成分やバキュロウィルス由来の可溶性成分は、血液凝固反応を引き起こさないということがわかった。
【００８５】
さらに、試薬ＳＷ−１、試薬ＳＷ−２及び試薬ＳＷ−３では、いずれも希釈倍率が高くなるにつれて凝固時間も長くなっていた。試薬の希釈倍率が高くなると、試薬中の組換えウシ組織因子の濃度が薄くなる。ここでは、試薬ＳＷ−１、試薬ＳＷ−２及び試薬ＳＷ−３が、いずれもこの試薬中の組換えウシ組織因子の濃度変化と相関関係がある凝固時間を示すことが確認できた。
【００８６】
以上のことから、試薬に含まれるカイコ個体由来の可溶性成分やバキュロウィルス由来の可溶性成分が血液の凝固反応には影響を及ぼさないので、凝固検査用試薬を調製する際に、組換え組織因子を精製してこれら可溶性成分を取り除く必要がないことがわかった。さらに、このことから、宿主としてＳｆ９等の昆虫培養細胞を使用する場合も、同様に、宿主由来の可溶性成分が血液の凝固反応には影響を及ぼしていないと考えられる。
【００８７】
〔試薬ＳＷ及び試薬ＳＦの感度〕
上記で調製した試薬ＳＷ及び試薬ＳＦについて、予めＥＱＵＳＴＡサーベイサンスでＩＮＲ表示値が決定された４種類のＡＫキャリブラント（ＡＫ−Ａａ、ＡＫ−Ｂｂ、ＡＫ−Ｃｃ、ＡＫ−Ｄｄ、（いずれもＩｍｍｕｎｏ社製、オーストリア）の凝固時間（秒）及び国際標準感度指標（ＩＳＩ値）を、全自動血衛凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所（株））で測定した。
【００８８】
また、対照試薬１として既知ＩＳＩ値が算出されている複合因子Ｔ「コクサイ」を用い、上記と同様にＡＫキャリブラントの凝固時間（秒）及びＩＳＩ値を測定した。複合因子Ｔ「コクサイ」は、ウシ組織因子−リン脂質複合体として天然ウシ大脳トロンボプラスチンを用いた市販品のトロンボテスト試薬である。
【００８９】
さらに、対照試薬２として精製した組換えウシ組織因子を含むＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬を調製し、これを対照試薬２として上記と同様にＡＫキャリブラントの凝固時間（秒）及びＩＳＩ値を測定した。対照試薬２は、試薬ＳＷを調製する工程において、組換えウシ組織因子含有溶液ＳＷに含まれる組換えウシ組織因子の純度を約９５％以上にするために硫安分画を行った以外は、試薬ＳＷと同様にして調製したものである。尚、試薬ＳＷ、試薬ＳＦ及び対照試薬２は、コアグトロールＮ（シスメックス（株））を測定した際に、対照試薬１を用いた場合と同程度の凝固時間が得られるように調製した。
各試薬を用いて得られた凝固時間（秒）及びＩＳＩ値の結果を表２に示す。
【００９０】
【表２】
2008122288.tif 000004
【００９１】
表２の結果より、試薬ＳＷ及び試薬ＳＦのいずれも、キャリブラントＡＫ−Ａａ〜ＡＫ−Ｄｄについて、対照試薬１及び対照試薬２と同程度の凝固時間、感度を示すことが確認できた。これより、試薬ＳＷ及び試薬ＳＦのいずれも、天然ウシ大脳トロンボプラスチンを用いた従来の試薬や精製した組換えウシ組織因子を含む試薬と同程度の凝固時間、感度を示すことがわかった。
【００９２】
〔試薬ＳＷ又は試薬ＳＦと対照試薬との凝固活性の相関性〕
上記「試薬ＳＷ及び試薬ＳＦの感度」において使用したものと同じ試薬（試薬ＳＷ、試薬ＳＦ、対照試薬１及び対照試薬２）を使用して、ワルファリン投与患者血漿（Ｎ＝２０）の凝固活性（％）を、全自動血液凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所（株））で測定した。尚、活性値（％）の算出に用いる検量線の作成には、コアグトロールＮ（シスメックス（株））を用いた。また、ワルファリン投与患者血漿は、Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｕｍａｄｉｎ  Ｓｅｔ（Ｇｅoｒｏｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）を用いた。
各試薬を用いて得られた活性値（％）の結果を表３に示した。
【００９３】
【表３】
2008122288.tif 000005
【００９４】
表３の結果より、各血漿検体について、試薬ＳＷ及び試薬ＳＦのいずれも、対照試薬１及び対照試薬２と同程度の活性値を示すことが確認できた。これより、試薬ＳＷ及び試薬ＳＦは、天然ウシ大脳トロンボプラスチンを用いた従来の試薬や精製した組換えウシ組織因子を含む試薬と同程度の活性値を示すことがわかった。
【００９５】
さらに、各血漿検体について、対照試薬１を用いたときの活性値と試薬ＳＷを用いたときの活性値の関係を図３に示す。また、対照試薬１を用いたときの活性値と試薬ＳＦを用いたときの活性値の関係を図４に示す。図３の横軸は対照試薬１を用いて測定したときの活性値（％）を示しており、縦軸は試薬ＳＷを用いて測定したときの活性値（％）を示している。図４の横軸は対照試薬１を用いて測定したときの活性値（％）を示しており、縦軸は試薬ＳＦを用いて測定したときの活性値（％）を示している。
【００９６】
図３及び図４から明らかなように、試薬ＳＷの活性値（％）及び試薬ＳＦの活性値（％）のいずれも、従来の対照試薬１の活性値（％）との間に高い相関性があることがわかった。これより、本実施例の試薬ＳＷや試薬ＳＦの活性は、天然ウシ大脳トロンボプラスチンを用いた従来の試薬に相当するものであることがわかった。
【００９７】
〔ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬のＰＩＶＫＡに対する感受性〕
組換えウシ組織因子含有溶液ＳＷを用いて、ＰＩＶＫＡの感受性を調べた。
具体的には、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬ＳＷと２０ｍＭ塩化カルシウム溶液を等量混合し、さらにヒト吸着血漿をそれぞれに混合して、ＰＩＶＫＡ感受性試験用の試薬を調製した。
尚、対照として、ウシ大脳から抽出したトロンボプラスチンを含有するウシ大脳由来トロンボプラスチン溶液、およびウサギの脳から抽出したトロンボプラスチンを含有するウサギ脳由来トロンボプラスチン溶液を用いて、上記と同様にしてＰＩＶＫＡ感受性試験用の試薬を調製した。
調製したＰＩＶＫＡ感受性試験用試薬を使用して、全自動血液凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所（株））により、正常血漿及び３種類のワルファリン投与患者血漿の凝固時間を測定した。
正常血漿としては、コアグトロールＮ（シスメックス（株））、及びこれを生理食塩水で希釈したものを用いた。コアグトロールＮの希釈倍率は、３倍希釈、５倍希釈及び７希釈である。
ワルファリン投与患者血漿は、Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｕｍａｄｉｎ  Ｓｅｔ（Ｇｅoｒｏｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）、及びこれを生理食塩水で希釈したものを用いた。ワルファリン投与患者血漿の希釈倍率は、２倍希釈、３倍希釈及び５倍希釈である。
得られた結果を図５に示した。
【００９８】
図５のＡは組換えウシ組織因子含有溶液ＳＷを用いた場合、Ｂはウシ大脳由来トロンボプラスチン溶液を用いた場合、Ｃはウサギ脳由来トロンボプラスチン溶液を用いた場合の結果である。図５の縦軸は凝固時間（秒）、横軸は血漿の希釈倍率である。Ｈｅｍｋｅｒ及びＤｅｎｓｏｎらの方法にしたがって、ＰＩＶＫＡに対する感受性を検討した。
【００９９】
図５の結果から、Ｈｅｍｋｅｒ及びＤｅｎｓｏｎらの方法にしたがって正常血漿の示す直線とワルファリン投与患者血漿が示す直線とを比較すると、ウシ大脳由来トロンボプラスチン溶液を用いた場合（図５Ｂ）はワルファリン投与患者血漿においてＰＩＶＫＡによる凝固阻害（点線）が見られた。一方、ウサギ脳由来トロンボプラスチン溶液を用いた場合（図５Ｃ）は、ＰＩＶＫＡによる凝固阻害（点線）は見られなかった。従って、天然由来のウシトロンボプラスチンはＰＩＶＫＡに対する感受性があるが、天然由来のウサギトロンボプラスチンではＰＩＶＫＡに対する感受性が低いといえる。このような結果はＨｅｍｋｅｒ及びＤｅｎｓｏｎらの報告と一致していた。
【０１００】
そして、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬ＳＷを用いた場合（図５Ａ）は、ウシ大脳由来トロンボプラスチン溶液を用いた場合（図５Ｂ）と同様の結果が得られた。これらの結果から、本実施例で使用した組換えウシ組織因子とリン脂質との複合体は、天然のウシトロンボプラスチンと同様の性質を示すことが確認できた。さらに、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬ＳＷに含まれるカイコ個体由来の可溶性成分がＰＩＶＫＡの感受性に影響を及ぼさないことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明の凝固検査試薬は、組換え組織因子の生産において宿主として使用した昆虫又は昆虫培養細胞由来の可溶性成分を含有するにもかかわらず、従来の凝固検査試薬と同程度の感度、凝固活性を示すことができるので、従来の凝固検査試薬の代用として利用することができる。また、本発明の凝固検査用試薬に用いられる組換え組織因子は、精製工程を簡略化することができるので、従来の組換え組織因子を用いる凝固検査方法と比べて、生産性がよく、しかも生産コストの低減を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】組換えウシ組織因子含有溶液ＳＷのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図２】組換えウシ組織因子含有溶液ＳＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図３】対照試薬１の活性値と試薬ＳＷの活性値との関係を示すグラフである。
【図４】対照試薬２の活性値と試薬ＳＷの活性値との関係を示すグラフである。
【図５】実施例で調製したＰＩＶＫＡ感受性試験用試薬についての、血漿の希釈倍率と凝固時間の関係を示すグラフである。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年1月15日(2008.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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