(57)【要約】【課題】生物の呼吸鎖において生理的あるいは人工的に電子伝達反応を担うことのできるキノールを基質として用いる新規ペルオキシダーゼや、かかる新規ペルオキシダーゼをコードする遺伝子を提供すること。【解決手段】真性細菌アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンスＡＴＣＣ２９５２２を培養する事により、新規なキノールペルオキシダーゼ（ＱＰＯ）を単離・精製する。また、上記菌株から染色体ＤＮＡを抽出し、精製ＱＰＯのＮ末端アミノ酸の配列情報と、公知のアクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンスＨＫ５６５１株の全染色体ＤＮＡ配列に基づいてプライマーを設計することによりＰＣＲを行い、これによりＱＰＯ遺伝子を得る。ＱＰＯアミノ酸配列は既存の真性細菌由来のチトクロムｃペルオキシダーゼに高い相同性を有する配列と、ＱＰＯアミノ酸配列に特異的な配列からなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキノールペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部もしくは全部を含む配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントの条件下でハイブリダイズし、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキノールペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
請求項４又は５記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質。
【請求項７】
請求項４又は５記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項８】
抗体がモノクローナル抗体である事を特徴とする請求項７記載の抗体。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項４又は５記載のタンパク質を発現する事ができる発現系を含んでなる宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載の発現系を含んでなる宿主細胞を培地に培養し、得られる培養物からキノールペルオキシダーゼ活性を有する組換えタンパク質を採取する事を特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、真性細菌アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）ＡＴＣＣ２９５２２由来のキノールペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質、及びタンパク質をコードする遺伝子等に関する。
【背景技術】
【０００２】ペルオキシダーゼは、過酸化酵素ともよばれ、過酸化水素の存在下、種々の化合物を酸化する酵素である。また過酸化水素を種々の化合物で還元する酵素であるともいえる。ペルオキシダーゼは動物界、植物界及び微生物界に広く分布する事が知られ、各種酵素抗体標識など各種分析試薬として既に実用化されており、また、各種廃液・排水中の有機塩素化合物、環境ホルモン等の分解・除去、パルプ廃液の脱色、洗濯物の色移り防止、フェノール樹脂の合成、食品の劣化防止などの幅広い用途が期待されている。かかるペルオキシダーゼの中でも、近年、種々の微生物に由来するペルオキシダーゼが探索されてきており、例えば担子菌のコプリヌス・シネリウス（特許文献１）、ヒラタケ（非特許文献１）、ホウロクタケ（特許文献２）、白色腐朽菌のファネロカエテ・クリソスポリウム（非特許文献２）、ファネロカエテ・ソルディダ（特許文献３）、糸状菌のアルスロマイセス・ラモスス（非特許文献３）、子嚢菌ゲオトリカム・キャンディウム（非特許文献４）、コフキサルノコシカケ（非特許文献５）、カワラタケ（非特許文献６）、セリポリオプシス・スベミスポラ（非特許文献７）、ダイコミタス・スクアレンス（非特許文献８）、フレビア・ラヂアタ（非特許文献９）、そして真性細菌のフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（非特許文献１０）に由来するペルオキシダーゼを挙げることができる。【０００３】
【特許文献１】特開平３−１９４９号公報
【特許文献２】特開平８−７０８６２号公報
【特許文献３】特開２０００−１５２７８６号公報
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｙｓ．  Ａｃｔａ，１２５１，２０５−２０９，１９９５
【非特許文献２】Ｇｅｎｅ，９３，１１９−１２４，１９９０
【非特許文献３】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，５０，２４７，１９８６
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８７，４１１，１９９９
【非特許文献５】Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．２３，１０３，２００１
【非特許文献６】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，１７９，４２８−４３５，１９９１
【非特許文献７】Ｇｅｎｅ，２０６，１８５−１９３，１９９８
【非特許文献８】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４３４，３５６−３６４，１９９９
【非特許文献９】Ｇｅｎｅ，８５，３４３−３５１，１９８９
【非特許文献１０】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４３５，１１７−１２６
【０００４】かかるペルオキシダーゼのなかでも、特にチトクロムｃペルオキシダーゼは、還元型チトクロムｃの存在下、過酸化水素を還元するペルオキシダーゼであり、発芽酵母（非特許文献１１）と、真性細菌のシュードモナス・エルジノーサ（非特許文献１２）、シュードモナス・ナウティカ（非特許文献１３）、ロドバクター・カプスラタス（非特許文献１４）、ニトロソモナス・ユウロペア（非特許文献１５）、及びメチロコッカス・カプスラタス（非特許文献１６）などに由来するチトクロムｃペルオキシダーゼが知られている。【０００５】
【非特許文献１１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２１８０２−２１８０７，１９９２
【非特許文献１２】Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，２６，２５３５−２５３７，１９７２
【非特許文献１３】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４３４，２４８−２５９，１９９９
【非特許文献１４】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５８，２９−３６，１９９８
【非特許文献１５】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１１８７８−１１８８６
【非特許文献１６】Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６８，３６２−３７２，１９９７
【０００４】かかるチトクロムｃペルオキシダーゼの中でも、発芽酵母由来のものと、真性細菌由来のものでは、アミノ酸配列ならびに酵素学的な性質が大きく異なっており、前者は２９４個のアミノ酸と１つのヘムｂをもつタンパク質で、そのアミノ酸配列は他の多くのペルオキシダーゼと相同性をもつのに対し、後者は３００から４００個のアミノ酸と２つのヘムｃを共有結合したタンパク質であり、他のペルオキシダーゼと異なった、特異的なアミノ酸配列からなる。
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】本発明の課題は、アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンスＡＴＣＣ２９５２２に由来する新規なキノールペルオキシダーゼをコードする遺伝子の塩基配列を明らかにして、その有用な機能をより広く活用するための手段を提供する事にある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンスＡＴＣＣ２９５２２から新規なペルオキシダーゼを単離し、その酵素学的性質を決定したところ、従来知られている全てのペルオキシダーゼと異なり、ユビキノール−１を基質としてペルオキシダーゼ活性を有することを見いだした。ＱＰＯ遺伝子は既存の真性細菌由来のチトクロムｃペルオキシダーゼに高い相同性を有する配列と、ＱＰＯ遺伝子特異的な配列からなる。本発明はこれら知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００７】すなわち本発明は、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキノールペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項１）や、配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡ（請求項２）や、請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項３）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項４）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキノールペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質（請求項５）に関する。
【０００８】また本発明は、請求項４又は５記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質（請求項６）や、請求項４又は５記載のタンパク質に特異的に結合する抗体（請求項７）や、抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項７記載の抗体（請求項８）や、請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡを含む組換えベクター（請求項９）や、請求項４又は５記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項１０）や、請求項１０記載の発現系を含んでなる宿主細胞を培地に培養し、得られる培養物からキノールペルオキシダーゼ活性を有する組換えタンパク質を採取することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法（請求項１１）に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】本発明の対象となるＤＮＡとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキノールペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡであればどのようなものでもよく、ここで、上記キノールペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質とは、生物の呼吸鎖において生理的あるいは人工的に電子伝達反応を担うことのできるキノールを基質として用いることによりペルオキシダーゼ活性を定性的に呈するタンパク質をいう。【００１０】ここでいう「生物の呼吸鎖において生理的あるいは人工的に電子伝達反応を担うことのできるキノール」とは、ユビキノール−ｎ、ロドキノール−ｎ、プラストキノール−ｎに代表されるベンゾキノールと、トコキノール−ｎ、メナキノール−ｎ、デメチルメナキノール−ｎ、フィロキノール−ｎに代表されるナフトキノール、そしてこれらの誘導体を含む。【００１１】ユビキノール−ｎとは、次式で表される【００１２】
【化１】
2008099649.tif 000002
【００１３】式中、ｎは側鎖のイソプレン単位の数を表し、０から１０までが好ましく用いられる。【００１４】ロドキノール−ｎとは、次式で表される【００１５】
【化２】
2008099649.tif 000003
【００１６】式中、ｎは側鎖のイソプレン単位の数を表し、０から１０までが好ましく用いられる。【００１７】プラストキノール−ｎとは、次式で表される【００１８】
【化３】
2008099649.tif 000004
【００１９】式中、ｎは側鎖のイソプレン単位の数を表し、０から１０までが好ましく用いられる。【００２０】トコキノール−ｎとは、次式で表される【００２１】
【化４】
2008099649.tif 000005
【００２２】式中、ｎは側鎖のイソプレン単位の数を表し、０から１０までが好ましく用いられる。【００２３】メナキノール−ｎとは、次式で表される【００２４】
【化５】
2008099649.tif 000006
【００２５】式中、ｎは側鎖のイソプレン単位の数を表し、０から１０までが好ましく用いられる。【００２６】デメチルメナキノール−ｎとは、次式で表される【００２７】
【化６】
2008099649.tif 000007
【００２８】式中、ｎは側鎖のイソプレン単位の数を表し、０から１０までが好ましく用いられる。【００２９】フィロキノール−ｎとは、次式で表される【００３０】
【化７】
2008099649.tif 000008
【００３１】式中、ｎは側鎖のイソプレン単位の数を表し、３が好ましく用いられる。【００３２】また、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含む配列からなるＤＮＡをプローブとして、各種ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、新規なキノールペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。こうして得られるＤＮＡも本発明に包含される。かかる本発明のＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。【００３３】これら本発明のＤＮＡは、本発明に開示されたＤＮＡ配列情報等に基づき、例えばアクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンスＡＴＣＣ２９５２２株等のゲノム遺伝子から、ＰＣＲ又はＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションなど公知の方法により調製することができる。その他、化学合成によっても調製することができる。また、これら本発明のＤＮＡから、キノールペルオキシダーゼ活性を有する人工変異タンパク質をコードする本発明のＤＮＡ、すなわち、塩基配列レベルやアミノ酸配列レベルでの本発明の人工変異ＤＮＡを得るには、公知の突然変異手段を用いればよく、例えば市販の突然変異誘発キットを用いると変異を容易に導入することができる。さらに、アミノ酸配列に含まれる第１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）が欠失しているものや、後述する膜貫通領域を欠失しているものなども、アミノ酸配列の変異によるタンパク質に含まれる。【００３４】本発明のタンパク質としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキノールペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質であれば特に制限されるものではなく、これら本発明のタンパク質はそのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができ、その由来は特に制限されるものではない。【００３５】本発明の融合タンパク質としては、本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、��ＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したキノールペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質等の精製や、キノールペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質等に対する抗体の定量用などとして、また当該分野の研究用試薬としても有用である。【００３６】本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本発明のタンパク質、融合タンパク質等の全部又は一部を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、キノールペルオキシダーゼの特性やその産生機構を明らかにする上で有用である。【００３７】上記の本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のタンパク質又はエピトープを含むその断片を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７，１９７５）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２，１９８３）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）など任意の方法を用いることができる。【００３８】また前記モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本発明のタンパク質の機能解析を行うことができる。また本件発明の抗体を用いる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。【００３９】本発明の組換えベクターとしては、上記本発明のＤＮＡを含むベクターであれば特に制限されないが、本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現系を含むものが好ましく、例えば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、より具体的には、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この��現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。【００４０】本発明はまた、上記本発明のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に関する。かかる本発明のタンパク質をコードするＤＮＡや上記発現系を含む組換えベクターの宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら（ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，１９８６）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。【００４１】また、本発明の組換えタンパク質の製造方法としては、上記発現系を含んでなる宿主細胞を培地に培養し、得られる培養物からキノールペルオキシダーゼ活性を有する組換えタンパク質を採取する方法であればどのような方法でもよく、かかる本発明のタンパク質を細胞培養物から回収し精製する方法としては、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法を挙げることができる。また、上記アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、本発明のタンパク質を得ることができる。上記本発明のタンパク質の精製方法は、ペプチド合成の際にも適用することができる。
【実施例】
【００４２】以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこの実施例により限定されるものではない。実施例１（ＱＰＯの調製）［１．アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンスの培養］アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンスＡＴＣＣ２９５２２は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より購入したものを、３％トッドヒューウィッド（Ｔｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ）培地（Ｄｉｆｃｏ社製）と１．２％イーストエキストラクト（Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）からなる培地（ＴＨＢＹＥ培地）により生育させ、保存しておいたものを用いた。前培養は、１０ｍｌのＴＨＢＹＥ培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２存在下で本菌株を一晩培養することにより行った。前培養で得られた菌体を、ＹＨＢＹＥ培地３ｌを入れた３リットル容フラスコに植菌して本培養を行った。本培養は、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１８時間静置培養することにより行った。【００４３】［２．ＱＰＯの単離］ＱＰＯを単離するため、本培養１８時間後の菌体を、遠心分離により培地成分と菌体に分離し、菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した後、超音波により破砕した（処理時間：３０秒×１２回）。菌体破砕後、超遠心分離により膜画分と上清とに分離し、膜画分をさらに、界面活性剤であるスクロースモノラウレート（ナカライ社製）を０．５％含んだ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、さらにホモジナイザーを用いて均一化することにより、膜結合性のペルオキシダーゼを可溶化した。この溶液をさらに超遠心分離することにより固形物を沈殿させ、上清を粗酵素抽出液として精製に用いた。この粗酵素抽出液をあらかじめ５％スクロースモノラウレートを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）により平衡化したマクロプレップ・セラミックヒドロキシアパタイト・タイプＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を充填したカラム（１．６ｃｍ×３ｃｍ）に流し込み、ＱＰＯをカラムに結合させた。流し込み終了後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌによりカラムを洗浄した。ＱＰＯは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）から１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）への直線グラジエントによりカラムから溶出させた。活性画分に終濃度１．７Ｍになるように硫酸アンモニウムを加え、あらかじめ１．７Ｍ硫酸アンモニウム、０．２５％スクロースモノラウレートを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）により平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙ１  ＨＰ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｓｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に流し込み、ＱＰＯをカラムに結合させた。流し込み終了後、本カラムの平衡化に用いた緩衝液１０ｍｌによりカラムを洗浄した。ＱＰＯは０．０Ｍ硫酸アンモニウム、０．２５％スクロースモノラウレートを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）への直線グラジエントによりカラムから溶出させた。活性画分をさらに０．２５％スクロースモノラウレートを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＡＦ−Ｒｅｄ−５６０Ｍカラム（東ソー社製）に流し込み、素通りしたＱＰＯを回収した。これをさらに０．２５％スクロースモノラウレー���と０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＨｉｐｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙ１  Ｓ−２００ＨＲ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｓｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に流し込み、さらに分画を行った。最終的に得られた活性画分をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析を行ったところ、単一のバンドを与えた。【００４４】［３．ＱＰＯのユビキノール−ｎに対する親和性］精製したＱＰＯ  １ｎｇに、反応液［１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、８０μＭ過酸化水素、２０−４００μＭユビキノール−１］１ｍｌを加え、分光光度計ＤＵ６４０（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて、ユビキノン−１の生成を２７８ｎｍにおける吸光度の上昇により追跡することによってキノールペルオキシダーゼ活性の基質量に対する変化を測定した。その結果をＨａｎｓ−Ｗｏｏｌｆプロットに基づいてプロットすることにより、ＱＰＯのユビキノール−１に対するＫｍ値を算出した。結果を図１に示す。図１からわかるように、精製ＱＰＯはユビキノール−１に対して約１０７μＭのＫｍ値を持つことが明らかになった。大腸菌のキノール酸化酵素であるチトクロムｂｏ，ｂｄのユビキノール−１に対するＫｍ直はそれぞれ４８、１１０μＭであることが知られており、上記したＱＰＯのユビキノール−１に対するＫｍ値と類似していることから、キノールを基質とする酵素群が、互いにキノールに対する類似した親和性を持つことによって、呼吸鎖のキノールを共有しているものと考えられた。【００４５】ユビキノール−ｎ以外の「生物の呼吸鎖において生理的あるいは人工的に電子伝達反応を担うことのできるキノール」に対する親和性については、測定が困難であるため、反応液［１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２５μｇ／ｍｌ  膜画分、８０μＭ過酸化水素］に、ＮＡＤＨあるいはコハク酸を終濃度０．１ｍＭになるように加え、見かけ上のペルオキシダーゼ活性（過酸化水素濃度の減少）を測定した。過酸化水素濃度の測定にはＰｅｒｏｘｏＱｕａｎｔキット（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いた。本実験では、ＮＡＤＨとコハク酸はそれぞれ膜画分に存在するＮＡＤＨ：キノン酸化還元酵素、コハク酸：キノン酸化還元酵素によって酸化され、膜画分に存在するキノンが還元されてキノールとなり、それがＱＰＯの基質となる。実験の結果、ＮＡＤＨとコハク酸を基質としてそれぞれ３４１，８１１  ｎｍｏｌ／ｍｇ／ｍｉｎのペルオキシダーゼ活性を測定することができた。アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの呼吸鎖において電子伝達反応を担うことのできるキノールはデメチルメナキノール−ｎのみであるため、図２に示したペルオキシダーゼ活性は、デメチルメナキノール−ｎを基質としたものであると言えた。以上の実験から、本発明のＱＰＯはユビキノール−ｎのようなベンゾキノールのみならず、デメチルメナキノール−ｎのようなナフトキノールをも基質として用いることができることが示された。【００４６】実施例２（ＱＰＯ遺伝子の決定と調製）ＱＰＯのＮ末端アミノ酸配列分析を、アプロサイエンス社に受託し、Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９４  ｃＬＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて常法により分析した。その結果、配列番号３のアミノ酸配列が決定された。このＮ末端アミノ酸配列をもとに、公知のアクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンスの全染色体ＤＮＡ配列に対しＢＬＡＳＴサーチを行った結果、配列番号３のアミノ酸配列にすべて一致する配列から始まるＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）を見いだし、これをＱＰＯ遺伝子とした。【００４７】ＱＰＯ遺伝子の取得には、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いた。染色体ＤＮＡ配列をもとに、プライマー１：５’−ＴＧＡＧＣＧＣＴＣＴＡＡＡＴＡＧＡＴＡＴＴＴＡＡＴＴＡＣＴ−３’（配列番号４）及びプライマー２：５’−ＡＣＡＧＣＧＴＴＴＴＡＡＡＡＡＣＧＣＴＴＴＧ−３’（配列番号５）の２種類のプライマーを作製した。１μｌの染色体ＤＮＡ溶液に、０．３μＭのプライマー１、０．３μＭのプライマー２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１ＵのＫＯＤ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、５μｌの１０×ＫＯＤ緩衝液を加え、最終液量を５０μｌとした。ＰＣＲは、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３分、３５サイクルの条件で行った。【００４８】この結果得られた該反応液を、アガロース電気泳動により分離し、Ｐｅｒｆｅｃｔｐｒｅｐ  Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎｕｐ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用い、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収した。該ＤＮＡ断片をｐＺＥｒＯ−２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に取扱説明書に従いＥｃｏＲＶサイトを用いて連結し、このベクターを用いて大腸菌Ｔｏｐ１０株を形質転換し、形質転換された大腸菌をカナマイシン５０ｍｇ／ｌに対する薬剤耐性によってスクリーニングを行った。形質転換株から、プラスミドをＦａｓｔＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用い精製した後、ＰｓｔＩとＮｏｔＩ（共にＴａｋａｒａ社製）を用いて消化し、約１．５ｋｂｐと３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を生じるプラスミドを目的のＤＮＡ断片を含むクローンと判断して、そのプラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の配列を決定した。なお、ＤＮＡ配列の決定はｐＺＥｒＯ−２ベクター内のＳｐ６  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｐｒｉｍｉｎｇサイトと、Ｍ１３（−２０）Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｉｎｇサイトに相補的なＤＮＡ配列を持つプライマーを用い、島津製作所のシングルパスシーケンスサービスに依頼した。このように得られたＤＮＡ配列（配列番号１）の第１２１番目にあたるアデニンから第１５０３番目のアデニンにわたる配列がＱＰＯをコードする遺伝子と考えられた。また、配列から推定されるＱＰＯアミノ酸配列（配列番号２）は４６０個のアミノ酸をコードすることが予測された。上記アミノ酸配列（配列番号２）のＮ末端側１０個のアミノ酸配列は、上記得られたタンパク質Ｎ末端アミノ酸配列解析の結果から得られた配列（配列番号３）と完全に一致していた。【００４９】上記ＱＰＯ遺伝子配列（配列番号１）から予測されるアミノ酸配列（配列番号２）を、ＳＯＳＵＩシステムを用いてタンパク質二次構造予測を行った結果、第４番���にあたるフェニルアラニン（Ｐｈｅ）から第２６番目のチロシン（Ｔｙｒ）にわたる配列は、細胞質膜中に局在する可能性が高いことが予測された。このことから、ＱＰＯは一回膜貫通型の膜蛋白質であることが予測された。細胞膜貫通領域は、キノールペルオキシダーゼ活性には関与しないことが考えられた。【００５０】また、ＱＰＯアミノ酸配列（配列番号２）をモチーフ解析した結果、第５６番目のシステイン（Ｃｙｓ）から第６０番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）、第２０３番目のシステイン（Ｃｙｓ）から第２０７番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）、そして第３４５番目のシステイン（Ｃｙｓ）から第３４９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）、の３カ所にヘムｃ結合モチーフがあることが明らかになった。【００５１】上記ＱＰＯアミノ酸配列（配列番号２）に対し、相同性検索を行ったところ、有意な相同性を示す遺伝子が存在した。ＱＰＯと相同性を持つ遺伝子は大きく二つに大別され、細菌性のチトクロムｃペルオキシダーゼ遺伝子と、３カ所のヘムｃ結合領域を持つ機能不明の遺伝子であった。【００５２】ＱＰＯアミノ酸配列中、第１７０番目付近から第４６０番目付近の領域と、全長のチトクロムｃペルオキシダーゼ遺伝子には、高い相同性を確認することができた。具体的には、シュードモナス・エルジノーサ（１ＥＢ７，４２％）、パラコッカス・パントトロファス（２Ｃ１Ｖ，４０％）、シュードモナス・ナウティカ（１ＭＮＬ，４０％）、ロドバクター・カプスラタス（１ＺＺＨ，４１％）、ニトロソモナス・ユウロペア（１ＩＱＣ，４１％）由来のチトクロムｃペルオキシダーゼなどを挙げることができるが、この限りではない。括弧内の英数字は、それぞれの配列のＰＤＢ登録番号と相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ％）を示す。【００５３】ＱＰＯアミノ酸配列の全長と高い相同性を有していた、３カ所のヘムｃ結合領域を持つ機能不明の遺伝子については、大腸菌（ＡＡＣ７６５４３．１，４６％）、ペスト菌（ＡＡＭ８４４３３．１，５４％）、サルモネラ・エンテリカ（ＡＡＯ７１１９３．１，４６％）、シゲラ・フレクスネリ（ＡＡＮ４５０４４．２，４６％）、バクテロイデス・フラジリス（ＡＡＬ０９８４０．１，４６％）、ヘモフィルス・デュクレイイ（ＡＡＦ１４６２９．１，６３％）などを例として挙げることができた。括弧内の英数字は、それぞれの配列のＧｅｎｂａｎｋ登録番号と相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ％）を示す。これらの遺伝子の機能はいまだ明らかではないが、本発明のＱＰＯアミノ酸配列と高い相同性を有することから、これら遺伝子の遺伝子産物もキノールペルオキシダーゼ活性を有する可能性が高いと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ユビキノール−１の各種濃度における本発明のＱＰＯの反応速度を示す図である。
【図２】アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス菌の膜画分がしめす、呼吸鎖基質による見かけ上のペルオキシダーゼ活性を表す図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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