(57)【要約】      （修正有）【課題】大腸菌K12 appAフィターゼ由来の精製された改変型フィターゼ酵素を提供する。【解決手段】新たに同定されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、並びに該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産および単離に関する。さらに詳しくは、該ポリペプチドはフィターゼ活性を有する酵素である。この酵素は、野生型酵素と比較して向上した耐熱性を示す。さらに、この酵素は低いpHにおいて改良されたプロテアーゼ安定性を示す。改変型フィターゼのグリコシル化は、改良された耐熱性とプロテアーゼ安定性を示す。この酵素は天然または組換え宿主細胞から産生させることができ、所望の場合には、フィチン酸の消化を助けるために使用することができる。特に、フィチン酸に富む成分の栄養価を高めるために食品中で使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の精製された、単離された、合成のまたは組換えのポリペプチド：
(a)  配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
(b)  (a)に示したアミノ酸配列において、W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226C、Y277D、またはこれらの任意の組合せから選択される少なくとも１つのもしくは全てのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
(c)  (b)に示したアミノ酸配列において、W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226C、およびY277Dのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
(d)  (a)〜（c）のいずれか一つのアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸をコードする１つ、２つ、または３つのヌクレオチドが発現に最適化されたコドンをコードするように改変されているポリペプチド；
(e)  (a)〜（d）のいずれか一つのアミノ酸配列を有し、かつ保存的なアミノ酸置換を有するポリペプチド；
(f)  (a)〜(e)のいずれか一つのアミノ酸配列を有し、かつ同種の分泌シグナルペプチドを欠損しているポリペプチド；
(g)  (a)〜(f)のいずれか一つのアミノ酸配列を有し、かつ植物種由来の異種の分泌シグナルペプチドまたは異種の分泌シグナル配列、または細菌もしくは真菌由来の異種の分泌シグナル配列を有しているポリペプチド；
(h)  (a)〜(g)のいずれか一つのアミノ酸配列を有し、かつターゲティング配列、N-末端認識ペプチド、トランジッドペプチド、または所望の特性を付与する配列を有するポリペプチド；
(i)  (a)〜(h)のいずれか一つのアミノ酸配列を有し、かつ異種配列を含むか、融合酵素となった異種配列を含むポリペプチド；
(j)  （A) (a)〜（i)のいずれか１つのアミノ酸配列に対して同一である10個以上の連続するアミノ酸の隣接アミノ配列；または（B) (a)〜（i)のいずれか１つの酵素学的に活性な断片を有するアミノ酸配列を有し：かつ（A)の隣接アミノ配列または（B)の酵素学的に活性な断片が、W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226C、Y277Dから選択される少なくとも１つのアミノ酸変化、またはこれらの等価物、またはこれらの任意の組合せを有するポリペプチド；
(k)  60℃以上または70℃以上または80℃以上の温度に対して耐性である活性を有する、(a)〜(j)のいずれか一つのポリペプチド；または
(l)  対応する野生型ポリペプチドより２倍以上長い胃液中での半減期を有する、(a)〜(k)のいずれか一つのポリペプチド。
【請求項２】
下記の単離された、合成のまたは組換えのポリヌクレオチド：
(a)  請求項１に記載のフィターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(b)  フィターゼポリペプチドをコードし、かつ配列番号９に示した核酸配列に対して99％以上の配列同一性を有する核酸配列を有するポリヌクレオチド；
(c)  フィターゼポリペプチドをコードし、かつ(a)または(b)に示した核酸配列において、ヌクレオチド389がG; 390がA; 437がT; 438がG; 439がG; 470がC; 472がT; 476がT; 477がG; 478がT; 689がG; 690がA; 691がG; 728がT; 729がA; 730がT; 863がT; 864がG; 1016がG、またはこれらの任意の組合せから選択される少なくとも１つのもしくは全てのヌクレオチド変化を有する核酸配列を有するポリヌクレオチド；
(d)  (c)に示した核酸配列において、ヌクレオチド389がG; 390がA; 437がT; 438がG; 439がG; 470がC; 472がT; 476がT; 477がG; 478がT; 689がG; 690がA; 691がG; 728がT; 729がA; 730がT; 863がT; 864がG; および1016がGであるヌクレオチド変化を有する核酸配列を有するポリヌクレオチド；
(e)  (b)〜（d）のいずれか一つの核酸配列を有し、かつ１つ、２つ、または３つのヌクレオチドが発現に最適化されたコドンをコードするように改変されているポリヌクレオチド； 
(f)  (b)〜（e）のいずれか一つの核酸配列を有し、当該核酸が保存的アミノ酸置換をコードし、かつ１つ、２つ、または３つのヌクレオチドが発現に最適化されたコドンをコードするように改変されているポリヌクレオチド；
(g)  (b)〜(f)のいずれか一つの核酸配列を有し、かつ同種の分泌シグナルペプチド配列を欠損しているポリペプチドをコードしている、ポリヌクレオチド；
(h)  (b)〜(g) のいずれか一つの核酸配列を有し、かつ当該核酸が異種の分泌シグナル配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；
(i)  (a)〜(h)のいずれか一つの核酸配列を有し、かつ当該核酸がターゲティング配列、N-末端認識ペプチド、トランジッドペプチド、または所望の特性を付与する配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；
(j)  (a)〜(i)のいずれか一つの核酸配列を有し、かつ当該核酸が異種配列を有するポリペプチドをコードしているか、融合酵素となっている異種配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；
(k)  (b)〜（j)のいずれか１つのヌクレオチド配列に対して同一である10個以上の連続するヌクレオチドの隣接ヌクレオチド配列を有し、当該隣接ヌクレオチドが、389がG; 390がA; 437がT; 438がG; 439がG; 470がC; 472がT; 476がT; 477がG; 478がT; 689がG; 690がA; 691がG; 728がT; 729がA; 730がT; 863がT; 864がG; または1016がG；またはこれらの任意の組合せから選択されるヌクレオチド変化を有するポリヌクレオチド；または
(l)  (a)〜(k)のいずれか一つの核酸配列に完全に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に示す核酸配列を含むベクター、ウイルス粒子、ウイルス、ファージ、コスミド、フォスミド、または人工染色体。
【請求項４】
以下の発現系：
(a) 請求項２に示す核酸配列を含む発現系；
(b) 請求項３に記載のベクター、ウイルス粒子、ウイルス、ファージ、コスミド、フォスミド、または人工染色体を含む発現系；または
(c) 発現系内で作動しうる転写制御配列、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、分泌シグナルペプチドをコードする核酸またはこれらの任意の組合せを含む、(a)または(b)の発現系。
【請求項５】
請求項２に示す核酸配列を含み、請求項４に記載の発現系を構成するベクター、ウイルス粒子、ウイルス、ファージ、コスミド、フォスミド、または人工染色体。
【請求項６】
以下の宿主細胞：
(a) 請求項２に示す核酸配列を含む宿主細胞；
(b) 請求項３に記載のベクター、ウイルス粒子、ウイルス、ファージ、コスミド、フォスミド、または人工染色体を含む宿主細胞；または
(c) (a)または（b）の宿主細胞であって、当該細胞が、(i) 原核細胞、真核細胞、もしくは植物細胞、または改変された原核、真核もしくは植物細胞；または（ii) (A)サッカロミセス属もしくはピキア属に由来する酵母細胞；(B)バチルス属に由来する細菌細胞；または(C)大腸菌(E. coli)、P. パストリス(P. pastoris)、もしくはS. ポンベ(S. pombe)の細胞である、前記宿主細胞。
【請求項７】
変異フィターゼの生成方法であって、
(a) 請求項２に記載の核酸を取得すること；および
(b) (i) 前記核酸中のヌクレオチドを別のヌクレオチドに変更させ、前記核酸中のヌクレオチドを欠失させ、または前記核酸にヌクレオチドを付加させることによって、当該変化が変異体をもたらすこと；(ii) (i)における変化を、提供された前記核酸のコドン用法から変更されたコドン用法を有するフィターゼコード配列が製造されるまで反復して繰り返すこと；または、(iii) (i)または（ii)における変化が、誤りがちのPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、アセンブリPCR、有性PCR突然変異誘発、in vivo突然変異誘発、カセット突然変異誘発、回帰的集合突然変異誘発、指数的集合突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、連結リアセンブリ、遺伝子部位飽和突然変異誘発、またはこれらの任意の組合せにより導入されること；
含む、前記方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法によって生成された機能的変異フィターゼであって、当該機能的変異フィターゼが請求項１のフィターゼの生物学的活性を保持している、前記機能的変異フィターゼ。
【請求項９】
フィチン酸含有食品の栄養価を改善する方法であって、当該フィチン酸含有食品を、(i) 請求項１に示すアミノ酸配列を有する精製された、単離された、合成のまたは組換えのフィターゼ酵素；(ii) 請求項２に示す核酸配列によってコードされる精製された、単離された、合成のまたは組換えのフィターゼ酵素；(iii) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼ；または(iv) フィターゼ活性を有するポリペプチドを発現する請求項６に記載の宿主細胞；と接触させることを含んでなり、当該フィターゼが、当該フィチン酸含有食品中のフィチン酸からの無機リン酸の遊離を触媒する、前記方法。
【請求項１０】
フィターゼ酵素をコードする、請求項２に記載の核酸を含むヌクレオチオド配列を発現する発現系を含むように改変された形質転換植物、形質転換植物の部分、または形質転換植物の細胞もしくは種子の下記の(a)または(b）への使用方法。
(a) フィターゼ活性の有効量を含む形質転換植物材料をヒトまたは動物の消化管に投与する工程を含む、異種フィターゼ酵素の活性によって消化促進に役立ち得るヒトまたは動物の治療；または
(b) 前記植物材料を食餌補助剤として組成する工程を含む、異種フィターゼ酵素の活性によって消化促進に役立ち得るヒトまたは動物の治療のための食餌補助剤の調製。
【請求項１１】
改変された植物または植物細胞もしくは種子、または改変された植物の部分であって、
(a) 前記植物、植物部分、または植物細胞もしくは種子がフィターゼ酵素をコードする請求項２に記載の核酸を含むヌクレオチド（核酸）配列を発現する発現系を含むように改変されているか；または
(b) (a)の植物、植物部分、または植物細胞もしくは種子が完全な改変植物である、前記改変された植物または植物細胞もしくは種子、または改変された植物の部分。
【請求項１２】
請求項１１に記載の改変された植物または植物細胞もしくは種子、または改変された植物の部分の下記の(a)または(b）への使用方法。
(a) フィターゼ活性の有効量を含む前記植物、植物部分、または植物細胞をヒトまたは動物の消化管に投与する工程を含む、異種フィターゼ酵素の活性によって消化促進に役立ち得るヒトまたは動物の治療；または
(b) 前記植物、植物部分、または植物細胞を食餌補助剤として組成する工程を含む、異種フィターゼ酵素の活性によって消化促進に役立ち得るヒトまたは動物の治療のための食餌補助剤の調製。
【請求項１３】
請求項１１に記載の改変された植物または植物細胞もしくは種子、または改変された植物の部分を植物材料の製造に使用する方法であって、植物細胞を植物種子、植物部分、または完全植物が製造される条件下で生育させる工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の組換えのまたは合成のフィターゼ；
請求項８に記載の機能的変異フィターゼ；
請求項２に示す配列を有するフィターゼをコードする核酸を含む組換え発現系；
請求項３に記載のベクター、ウイルス粒子、ウイルス、ファージ、コスミド、フォスミド、または人工染色体；または
請求項４に記載の発現系；
を含むように改変された植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子、または植物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子、または植物を動物飼料または食品組成物に適する組成物に変換する工程を含む、フィターゼを含む動物飼料または食品組成物を製造する方法。
【請求項１６】
フィターゼを含有する動物飼料または食品組成物を製造する方法であって、
請求項１１に記載の改変された植物または植物細胞もしくは種子、または改変された植物の部分を、当該フィターゼをコードする核酸が発現される条件下で培養すること；
前記植物細胞から植物材料を生成すること；および
前記植物細胞または植物材料を動物飼料または食品組成物に適した組成物に変換すること；
を含む、前記方法。
【請求項１７】
請求項６に記載の植物細胞またはそれから生成した植物材料と、フィチン酸含有食品とを混合して含む動物用飼料組成物または食品組成物であって、当該植物材料が植物種子、植物細胞、植物部分、または完全植物を含む、前記組成物。
【請求項１８】
フィターゼを含む飼料または食品を製造する方法であって、
(a) 請求項６に記載の植物細胞を、当該フィターゼをコードする核酸が発現される条件下で培養すること；
(b) 前記植物細胞から植物材料を生成すること；および
(c) 前記植物細胞または植物材料を飼料または食品に適した組成物に変換すること；
を含む、前記方法。
【請求項１９】
(a) 請求項６に記載の植物細胞；
(b) (a)から生成した植物材料；または
(c) 植物種子、植物細胞、植物部分、または完全植物を含む（b)の植物材料；
をフィチン酸含有食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤と混合して含む、食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤。
【請求項２０】
フィターゼの作製方法であって、
(a) (i) 請求項２に記載のフィターゼをコードする核酸、またはフィターゼをコードする核酸を含む請求項３に記載のベクター、ウイルス粒子、ウイルス、ファージ、コスミド、フォスミド、または人工染色体を準備すること；および(ii) 当該フィターゼをコードする核酸をフィターゼが発現する条件で発現させること；または
(b) 工程（a)で、発現されたフィターゼを単離すること；または
(c) 請求項６に記載の宿主細胞を、フィターゼをコードする核酸を発現させる条件下で生育させ、そして当該核酸によってコードされるフィターゼを単離すること；
を含む前記方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法によって作製した組換えにより生成されたフィターゼ。
【請求項２２】
フィターゼをグリコシル化する方法であって、
(i) 請求項２に記載のフィターゼをコードする核酸、(ii)フィターゼをコードする核酸を含む請求項３に記載のベクター、ウイルス粒子、ウイルス、ファージ、コスミド、フォスミド、または人工染色体を、フィターゼをグリコシル化できる細胞内で発現させることを含む、前記方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法によって得られたグリコシル化フィターゼ。
【請求項２４】
(a) 請求項１に記載のフィターゼポリペプチド、
(b) 請求項２に記載の核酸によってコードされるフィターゼ、
(c) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼ、
(d) 請求項１４に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子または植物
(e) 請求項２１に記載の組換えにより生成されたフィターゼ、
(f) 請求項２３に記載のグリコシル化フィターゼ、
(g) 請求項２０または２２に記載の方法によって作製されたフィターゼ、または
(h）(a)〜(g)の任意の組合せ、
を含む、食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤。
【請求項２５】
フィチン酸を分解（加水分解）する方法であって、
(a) フィチン酸を含有する組成物を準備すること；
(b) (i) 請求項１に記載のフィターゼポリペプチド、
(ii) 請求項２に記載の核酸によってコードされるフィターゼ、
(iii) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼ、
(iv) 請求項１４に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子または植物に含まれるフィターゼ、
(v) 請求項２１に記載の組換えにより生成されたフィターゼ、
(vi) 請求項２３に記載のグリコシル化フィターゼ、
(vii) 請求項２０または２２に記載の方法によって作製されたフィターゼ、
(viii) 請求項１９に記載の食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤に含まれるフィターゼ、または
(ix) (i)〜(viii)の任意の組合せを準備すること；および
(c) 前記フィチン酸含有組成物を前記フィターゼがフィチン酸を分解する（フィチン酸の加水分解を触媒する）条件下でフィターゼと接触させること；
を含む、前記方法。
【請求項２６】
フィチン酸中のリン酸モノエステル結合を分解（加水分解）する方法であって、
(a) フィチン酸を含有する組成物を準備すること；
(b) (i) 請求項１に記載のフィターゼポリペプチド、
(ii) 請求項２に記載の核酸によってコードされるフィターゼ、
(iii) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼ、
(iv) 請求項１４に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子または植物に含まれるフィターゼ、
(v) 請求項２１に記載の組換えにより生成されたフィターゼ、
(vi) 請求項２３に記載のグリコシル化フィターゼ、
(vii) 請求項２０または２２に記載の方法によって作製されたフィターゼ、
(viii) 請求項１９に記載の食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤に含まれるフィターゼ、または
(ix) (i)〜(viii)の任意の組合せを準備すること；および
(c) 前記フィチン酸含有組成物を前記フィターゼがリン酸モノエステル結合を分解する（リン酸モノエステル結合の加水分解を触媒する）条件下でフィターゼと接触させること；
を含む、前記方法。
【請求項２７】
摂取した飼料または飼料サプリメント中の無機リン酸量を増加させることによって動物の食餌を補助する方法であって、
(i) 請求項１に記載のフィターゼポリペプチド、
(ii) 請求項２に記載の核酸によってコードされるフィターゼ、
(iii) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼ、
(iv) 請求項１４に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子または植物に含まれるフィターゼ、
(v) 請求項２１に記載の組換えにより生成されたフィターゼ、
(vi) 請求項２３に記載のグリコシル化フィターゼ、
(vii) 請求項２０または２２に記載の方法によって作製されたフィターゼ、
(viii) 請求項１９に記載の食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤に含まれるフィターゼ、または
(ix) (i)〜(viii)の任意の組合せを含む組成物を動物に与えることを含む、前記方法。
【請求項２８】
フィチン酸含有飼料組成物の栄養価を改善する方法であって、
(a) フィチン酸含有飼料組成物を準備すること；
(b) (i) 請求項１に記載のフィターゼポリペプチド、
(ii) 請求項２に記載の核酸によってコードされるフィターゼ、
(iii) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼ、
(iv) 請求項１４に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子または植物に含まれるフィターゼ、
(v) 請求項２１に記載の組換えにより生成されたフィターゼ、
(vi) 請求項２３に記載のグリコシル化フィターゼ、
(vii) 請求項２０または２２に記載の方法によって作製されたフィターゼ、
(viii) 請求項１９に記載の食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤に含まれるフィターゼ、または
(ix) (i)〜(viii)の任意の組合せを準備すること；および
(c) 前記フィチン酸含有飼料組成物を前記フィターゼがフィチン酸含有飼料組成物中のフィチン酸から無機リン酸を遊離させるようにフィチン酸を触媒する（フィチン酸の加水分解を触媒する）条件下でフィターゼと接触させること；
を含む、前記方法。
【請求項２９】
フィターゼをコードする核酸中のコドンを改変する方法であって、
(i) (a) 請求項２に記載の核酸によってコードされるフィターゼ；または、(A) 請求項１に記載のフィターゼ；または（B) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼをコードするポリヌクレオチド（核酸）を準備すること；および
(b) 工程(a)の核酸中のコドンを同定し、そのコドンを置換コドンと同じアミノ酸をコードする異なるコドンに置換し、それによって、前記フィターゼのアミノ酸配列を改変しないが前記核酸を改変すること；
(ii) 前記の準備された核酸のコドン用法から変更されたコドン用法を有するフィターゼをコードする配列が製造されるまで、前記(i)の工程を反復して繰り返すこと；
(iii) 変更されたコドン用法を有するフィターゼを発現させることを、前記(i)または（ii)の工程にさらに含むこと；または
(iv) (iii)の工程においてフィターゼを宿主細胞において発現させること；
含む、前記方法。
【請求項３０】
固定されたフィターゼポリペプチドであって、前記フィターゼが、
(i) 請求項１に記載のフィターゼポリペプチド、
(ii) 請求項２に記載の核酸によってコードされるフィターゼ、
(iii) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼ、
(iv) 請求項１４に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子または植物に含まれるフィターゼ、
(v) 請求項２１に記載の組換えにより生成されたフィターゼ、
(vi) 請求項２３に記載のグリコシル化フィターゼ、
(vii) 請求項２０または２２に記載の方法によって作製されたフィターゼ、
(viii) 請求項１９に記載の食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤に含まれるフィターゼ、または
(ix) (i)〜(viii)の任意の組合せ、
である、前記固定されたフィターゼポリペプチド。
【請求項３１】
フィターゼをコードするポリヌクレオチド（核酸）を含む固定化された核酸であって、前記フィターゼが、
(i) 請求項２に記載のポリヌクレオチド（核酸）によってコードされるフィターゼ；または、
(ii) (a) 請求項１に記載のフィターゼ、もしくは(b) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼである、前記固定化された核酸。
【請求項３２】
以下の担体：
(a) 請求項２に記載のポリヌクレオチド（核酸）によってコードされるフィターゼを含む担体；
(b) (i) 請求項１に記載のフィターゼポリペプチド、
(ii) 請求項２に記載の核酸によってコードされるフィターゼ、
(iii) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼ、
(iv) 請求項１４に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子または植物に含まれるフィターゼ、
(v) 請求項２１に記載の組換えにより生成されたフィターゼ、
(vi) 請求項２３に記載のグリコシル化フィターゼ、
(vii) 請求項２０または２２に記載の方法によって作製されたフィターゼ、
(viii) 請求項１９に記載の食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤に含まれるフィターゼ、または
(ix) (i)〜(viii)の任意の組合せ、
を含む担体；
(c) ペレット、ピル、タブレット、液剤、ゲル、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、トローチ剤、包帯、またはリポソームの形態である、(a)または(b)の担体；
(d) 前記フィターゼが耐熱性または熱安定性である、(a)〜(c)の担体；
(e) 前記担体が可食性担体である、(a)〜(d)の担体；
(f) 前記担体または可食性担体がコーンスターチ、ラクトース、スクロース、ダイズフレーク、落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはプロピレングリコールを含む、(a)〜(e)の担体または可食性担体。
【請求項３３】
(a) 請求項２に記載のポリヌクレオチド（核酸）によってコードされるフィターゼ；
(b) (i) 請求項１に記載のフィターゼポリペプチド、
(ii) 請求項２に記載の核酸によってコードされるフィターゼ、
(iii) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼ、
(iv) 請求項１４に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子または植物に含まれるフィターゼ、
(v) 請求項２１に記載の組換えにより生成されたフィターゼ、
(vi) 請求項２３に記載のグリコシル化フィターゼ、
(vii) 請求項２０または２２に記載の方法によって作製されたフィターゼ、
(viii) 請求項１９に記載の食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤に含まれるフィターゼ、または
(ix) (i)〜(viii)の任意の組合せ；または
(c) 請求項３２に記載の担体、を含む可食性タブレット。
【請求項３４】
以下の有機物ミール：
(A) (a) 請求項２に記載のポリヌクレオチド（核酸）によってコードされるフィターゼ；
(b) (i) 請求項１に記載のフィターゼポリペプチド、
(ii) 請求項２に記載の核酸によってコードされるフィターゼ、
(iii) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼ、
(iv) 請求項１４に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子または植物に含まれるフィターゼ、
(v) 請求項２１に記載の組換えにより生成されたフィターゼ、
(vi) 請求項２３に記載のグリコシル化フィターゼ、
(vii) 請求項２０または２２に記載の方法によって作製されたフィターゼ、
(viii) 請求項１９に記載の方法によって作製された食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤に含まれるフィターゼ、または
(ix) (i)〜(viii)の任意の組合せ；
(c) 請求項３２に記載の担体；または
(d) 請求項３３に記載の可食性タブレット；
を含む有機物ミール；または
(B) トウモロコシ、ダイズ、またはトウモロコシとダイズのミール混合物を含む、（A)の有機物ミール。
【請求項３５】
以下の食餌剤または食餌補助剤：
(A-1） (a) 請求項２に記載のポリヌクレオチド（核酸）によってコードされるフィターゼ；
(b) (i) 請求項１に記載のフィターゼポリペプチド、
(ii) 請求項２に記載の核酸によってコードされるフィターゼ、
(iii) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼ、
(iv) 請求項１４に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子または植物に含まれるフィターゼ、
(v) 請求項２１に記載の組換えにより生成されたフィターゼ、
(vi) 請求項２３に記載のグリコシル化フィターゼ、
(vii) 請求項２０または２２に記載の方法によって作製されたフィターゼ、
(viii) 請求項１９に記載の食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤に含まれるフィターゼ、または
(ix) (i)〜(viii)の任意の組合せ；
(c) 請求項３２に記載の担体；または
(d) 請求項３３に記載の可食性タブレット；および
(A-2）生体適合性担体；
を含む食餌剤または食餌補助剤；
(B) 生体適合性担体が、生分解性または非生分解性担体である、（A)の食餌剤または食餌補助剤；
(C) さらに添加剤を含む、（A)または(B)の食餌剤または食餌補助剤；
(D) 添加剤が、塩類、糖類、保存剤、pH調整剤、タンパク質またはフィチン酸塩である、（C)の食餌剤または食餌補助剤；または
(E) 生体適合性担体が可食性担体である、（A)〜（D)のいずれかの食餌剤または食餌補助剤。
【請求項３６】
以下の遅延放出もしくは徐放性組成物、または即時もしくは迅速放出組成物：
(A) (a) 請求項２に記載のポリヌクレオチド（核酸）によってコードされるフィターゼ；
(b) (i) 請求項１に記載のフィターゼポリペプチド、
(ii) 請求項２に記載の核酸によってコードされるフィターゼ、
(iii) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼ、
(iv) 請求項１４に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子または植物に含まれるフィターゼ、
(v) 請求項２１に記載の組換えにより生成されたフィターゼ、
(vi) 請求項２３に記載のグリコシル化フィターゼ、
(vii) 請求項２０または２２に記載の方法によって作製されたフィターゼ、
(viii) 請求項１９に記載の食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤に含まれるフィターゼ、または
(ix) (i)〜(viii)の任意の組合せ；
(c) 請求項３２に記載の担体；または
(d) 請求項３３に記載の可食性タブレット；
を含む、遅延放出もしくは徐放性組成物、または即時もしくは迅速放出組成物；または、
(B) 生体適合性担体を含む、（A)の遅延放出もしくは徐放性組成物、または即時もしくは迅速放出組成物。
【請求項３７】
以下の液体または乾燥組成物：
(A) (a) 請求項２に記載のポリヌクレオチド（核酸）によってコードされるフィターゼ；
(b) (i) 請求項１に記載のフィターゼポリペプチド、
(ii) 請求項２に記載の核酸によってコードされるフィターゼ、
(iii) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼ、
(iv) 請求項１４に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子または植物に含まれるフィターゼ、
(v) 請求項２１に記載の組換えにより生成されたフィターゼ、
(vi) 請求項２３に記載のグリコシル化フィターゼ、
(vii) 請求項２０または２２に記載の方法によって作製されたフィターゼ、
(viii) 請求項１９に記載の食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤に含まれるフィターゼ、または
(ix) (i)〜(viii)の任意の組合せ；
(c) 請求項３２に記載の担体；または
(d) 請求項３３に記載の可食性タブレット；
を含む液状または乾燥組成物；または
(B) 生体適合性担体を含む、（A)の液体または乾燥組成物。
【請求項３８】
(a) 請求項２に記載のポリヌクレオチド（核酸）によってコードされるフィターゼ；
(b) (i) 請求項１に記載のフィターゼポリペプチド、
(ii) 請求項２に記載の核酸によってコードされるフィターゼ、
(iii) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼ、
(iv) 請求項１４に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子または植物に含まれるフィターゼ、
(v) 請求項２１に記載の組換えにより生成されたフィターゼ、
(vi) 請求項２３に記載のグリコシル化フィターゼ、
(vii) 請求項２０または２２に記載の方法によって作製されたフィターゼ、
(viii) 請求項１９に記載の食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤に含まれるフィターゼ、または
(ix) (i)〜(viii)の任意の組合せ；
(c) 請求項３２に記載の担体；または
(d) 請求項３３に記載の可食性タブレット；
を含む、アルコール性または非アルコール性飲料食品または飲料。
【請求項３９】
以下の多孔質マイクロビーズ、または酵素顆粒もしくは凝集顆粒：
(A) (a) 請求項２に記載のポリヌクレオチド（核酸）によってコードされるフィターゼ；
(b) (i) 請求項１に記載のフィターゼポリペプチド、
(ii) 請求項２に記載の核酸によってコードされるフィターゼ、
(iii) 請求項８に記載の機能的変異フィターゼ、
(iv) 請求項１４に記載の植物細胞、植物部分、植物器官、植物種子または植物に含まれるフィターゼ、
(v) 請求項２１に記載の組換えにより生成されたフィターゼ、
(vi) 請求項２３に記載のグリコシル化フィターゼ、
(vii) 請求項２０または２２に記載の方法によって作製されたフィターゼ、
(viii) 請求項１９に記載の食物、食品、飼料、食物サプリメント、飼料サプリメント、または食餌補助剤に含まれるフィターゼ、または
(ix) (i)〜(viii)の任意の組合せ；
(c) 請求項３２に記載の担体；または
(d) 請求項３３に記載の可食性タブレット；
を含む多孔質マイクロビーズ、または酵素顆粒もしくは凝集顆粒、または
(B) 生体適合性担体を含む、（A)の多孔質マイクロビーズ、または酵素顆粒もしくは凝集顆粒。
【請求項４０】
植物タンパクの製造方法であって、
(a) 植物タンパク源材料を酸性pH下で水に分散すること；
(b) フィターゼを(a)の植物タンパク源材料に混合すること；および
(c) 分散酸性液から植物タンパクを分離すること；
を含み、
前記フィターゼが、
(i) 配列番号８に示すアミノ酸配列において、W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226C、Y277D、またはこれらの任意の組合せから選択される１以上のアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有し、かつフィターゼ活性を有するポリペプチド,
(ii) (i)のアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも60℃の温度に対して耐性である活性を有するポリペプチド、
(iii) (i)または(ii)のアミノ酸配列を有し、かつ胃液中での半減期が対応する野生型ポリペプチドより少なくとも約２倍長いポリペプチド、
(iv) 配列番号10に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(v) 配列番号７に示す核酸配列において、ヌクレオチド389がG; 390がA; 437がT; 438がG; 439がG; 470がC; 472がT; 476がT; 477がG; 478がT; 689がG; 690がA; 691がG; 728がT; 729がA; 730がT; 863がT; 864がG; 1016がGである少なくとも１つのヌクレオチド変化またはこれらの任意の組合せを含む核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
(vi) 配列番号７の核酸配列を有し、かつヌクレオチド389がG、および390がA; ヌクレオチド437がT、438がG、および439がG; ヌクレオチド470がC、および472がT; ヌクレオチド476がT、477がG、および478がT; ヌクレオチド689がG、690がA、および691がG; ヌクレオチド728がT、729がA、および730がT; ヌクレオチド863がT、および864がG; ヌクレオチド1016がG; またはこれらの任意の組合せから選択される改変された核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
(vii) 配列番号９に示す核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、または
(viii) (v)、(vi)、または(vii)のいずれかの核酸配列に完全に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである、前記方法。
【請求項４１】
さらに、前記の単離した植物タンパクを乾燥させる工程(d)を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記工程（a)がpH2〜6の範囲の酸性pHで植物タンパク源材料を分散することを含む、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記の乾燥させ、単離した植物タンパクから食品または食餌補助剤を調製することを含む、請求項４０〜４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記食品または食餌補助剤が、飼料、食物、飼料サプリメント、または食物サプメントを含む、請求項４０〜４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、並びに該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産および単離に関するものである。さらに詳しくは、本発明のポリペプチドはフィターゼ活性を有する酵素として同定されたものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ミネラル類はあらゆる生物の成長にとって不可欠なものである。食物ミネラルは植物などの多くの供給源から得ることができる。例えば、植物の種子は、フィチン酸分子のリン酸基に結合されたイオンを含むので、豊富なミネラル源である。フィチン酸と結合したこれらのミネラルは、複数の胃をもつ反芻動物などの、ある種の家畜の食物要求を満たしている。すなわち、反芻動物は、第一胃の中の微生物がフィチン酸（myo-イノシトール-六リン酸）のイノシトールと無機リン酸への変換を触媒する酵素を産生するので、無機リン酸とミネラルを食物として補給する必要がない。この過程で、フィチン酸と結合していたミネラルが放出される。しかし、大多数の飼育動物種はフィチン酸と結合したミネラル類を効率よく利用することができない。それゆえ、例えば、単胃の動物（例：ブタ、トリ、魚）を飼育動物として育てる際には、通常、ミネラルおよび／または抗生物質（摂取する動物の消化性の寄生菌環境を改変して成長速度を速める）が飼料に補給される。
【０００３】
したがって、多くの用途において、フィチン酸の加水分解が不十分であることに関係した厄介な問題（栄養、ex vivo処理工程、健康および医学、環境保護、資源管理に関係したもの）が数多く生起している。以下にこうした問題の例を挙げるが、これらに限るものではない：
1)  飼料への無機ミネラル類の補給はコスト高につながる；
2)  加水分解されないフィチン酸の存在は、多くのex vivo用途において、例えば不要なスラッジがでることから、望ましくない問題である；
3)  飼料に抗生物質を添加することは、抗生物質耐性の病原菌を増やすために、ヒトにも動物にも等しく医学上の脅威となる；
4)  吸収されないミネラルが便から環境に排出されると、周囲の土壌、魚の養殖用の水、および地上水の生態系が全体として破壊され、害される；
5)  栄養的に価値のある食物として提供される可能性のあるものが、数多く利用されずに捨てられている現状がある。
【０００４】
栄養分を含む可能性がある多くの植物（例えば、その種子）は、摂取されたときにその栄養分を完全には利用できないような形態で、フィチン酸と結合された栄養素（例えば、リン酸）をかなりの量で含んでいる。これらの栄養素の利用可能性の問題は、ウシや他の反芻動物を含むいくつかの動物では克服されている。かかる動物はフィチン酸を加水分解して結合リン酸を遊離させるという十分な消化能力（主に消化管における共生的生活型の存在による）を備えている。しかし、大部分の飼育動物種（例えば、ブタ、魚、ニワトリ、七面鳥、その他のヒトを含めた非反芻動物）は摂取後にこれらの栄養素を効率よく遊離させる能力がない。
【０００５】
その結果、フィチン酸含有食物が大多数の動物種によって摂取される際には、栄養分を外部から補い、かつ／または、その栄養分供給の欠陥をただすためにフィターゼ活性の源を補給する必要がある。
【０００６】
さらに別の面から、加水分解されないフィチン酸の存在は、ex vivo加工（食物の加工を含むが、これに限らない）において問題となる結果を招く。一例にすぎないが、EP0321004-B1 (Vaaraら) に記載されるような、硬い穀粒を水の中に浸してそれらを軟らかくするというトウモロコシ粒の加工工程が存在する。このプロセスで浸出する水溶性の物質はコーンスティープリカー（蒸発により濃縮される）の一部となる。コーンスティープリカー中の加水分解されないフィチン酸（主にカルシウムおよびマグネシウム塩の形態のもの）はリンと結合していて、タンパク質や金属イオンを含む望ましくないスラッジを沈積させる。このスラッジはコーンスティープリカーの蒸発、輸送および貯蔵の際に問題となる。したがって、ここに開示されるフィターゼ分子は、単独でも他の試薬（プロテアーゼなどの酵素を含むが、これに限らない）と組み合わせても、この用途（例えば、不要なスラッジの防止）だけでなく、フィチン酸の加水分解が望まれる他の用途においても有用なものである。
【０００７】
飼料に抗生物質を添加することは、家畜類の生産に多くの有益な結果をもたらす。例えば、病気をよせつけないという予防的手段に加えて、外因性抗生物質の投与は成長速度を３〜５％以上高めることが分かっている。この作用のメカニズムもまた、一部には、飼育動物の消化性の寄生菌環境を改変することによって、栄養素の吸収にとって最適な寄生菌バランスをもたらしている可能性がある。
【０００８】
しかしながら、抗生物質の過剰使用に伴う大きなマイナスの結果は、病原性の抗生物質耐性微生物株が発生する危険性があることである。この危険性は差し迫っており、すでにヒトでの薬剤耐性病原菌の発生が家畜における抗生物質の使用に関連していると報じられている。例えば、動物飼料中で用いられる抗生物質アボパルシン(avoparcin)は1997年に多くの地域で禁止されてしまい、現在では別の抗生物質であるビルギニアマイシン(virginiamycin)が動物に投与されている。このビルギニアマイシンはヒトでバンコマイシンの代わりに用いられる新薬シネルシド(Synercid)に非常に似通っている。そして、いくつかの研究によれば、家畜に住み着いている一部の腸球菌はこの新薬シネルシドに耐性であることがすでに示されている。結果的に、アボパルシン(Avoparcin)やバンコマイシンのケースがそうであるように、たとえ新抗生物質が飼育動物用の包括的な予防薬として使用されるとしても、望ましくない耐性の問題が再び発生する可能性がある。したがって、研究者達は産業界での薬剤使用に対するより厳格な管理を呼びかけている。
【０００９】
本明細書に開示されるフィターゼ分子を補給した食物で飼育した動物の成長速度は、例えばアボパルシンのような抗生物質を用いたときの成長速度を超えないとしても、それと同等である。したがって、ここに開示されるフィターゼ分子は、単独でも他の試薬（プロテアーゼなどの酵素を含むが、これに限らない）と組み合わせても、この用途（例えば、飼育動物の成長速度の増加）だけでなく、フィチン酸の加水分解が望まれる他の用途においても有用なものである。
【００１０】
環境上の問題は、フィターゼ欠損動物種によるフィチン酸含有食物の摂取が、その食物にミネラルが補給されようとされまいとに係わりなく、吸収されないミネラルの排出から生じる糞便汚染につながるということである。この汚染は直ちに生息地に悪影響を及ぼすだけでなく、結果的に周囲の水にも悪影響を及ぼす。環境の変化は主に食物連鎖の底辺で起こり、それゆえ、上方へ、そして生態系全体へと浸透して、特に何年にもわたる絶え間のない汚染の後には、永久的かつ破局的損傷をもたらす可能性がある。この問題は、in vivo（例えば、家畜生産の現場、動物園、禁猟区などの動物による）およびin vitro（例えば、商業的なトウモロコシ湿式磨砕、穀物の浸漬工程など）処理加工工程を含めて、濃縮されたフィチン酸の処理加工が起こるどのようなケースにおいても出現する可能性がある。
【００１１】
フィターゼ分子を添加剤として使用するかどうかの決定は、それが外部から投与されるミネラルおよび／または抗生物質の使用に完全に代わるためであろうと、その使用を増大するためであろうと、最終的には、使用者（その生計手段が家畜生産などの関連用途に依存している者）による金銭上の実施可能性および／または費用効果のテストに合格する必要があるだろう。
【００１２】
結果的に、さまざまな用途において効率的かつ費用効果的なフィチン酸の加水分解を達成するための手段が必要とされている。特に、商業用途ではフィチン酸の加水分解を最適化するための手段が求められている。特定の面では、ヒトおよび飼育動物による消費のためにフィチン酸含有食物の栄養分供給を改善する商業上の処理方法を最適化するための手段が必要とされている。
【００１３】
以前に組換えフィターゼが利用可能であると報告されているが、新たに発見された本発明のフィターゼ分子はそれらの低い活性をしのぐものである。すなわち、ここに開示されるフィターゼ分子は、以前に確認されたフィターゼ分子（例えば、真菌由来のフィターゼ分子）よりも実質的に優れた商業上の性能を提供すると期待される。
【００１４】
フィチン酸は事実上あらゆる植物飼料中の貯蔵リン酸の供給源として存在し(Graf編, 1986)、穀類やマメ科植物の種子の通常の部分を形成している。それは、新しい植物が種子から発生するときにその植物にとって必須のミネラルと結合する働きを担っている。フィチン酸のリン酸基が種子のフィターゼ酵素により分離されると、金属イオンと結合する能力が失われ、ミネラルが植物に利用可能になる。家畜用の飼料穀粒では、フィチン酸によって結合された微量のミネラルは、フィターゼ活性のない単胃動物により吸収にあまり利用されない。
【００１５】
フィチン酸の加水分解は幾分かは結腸で起こるが、大部分のフィチン酸は単胃動物の胃腸管を通過して排泄物中に分泌され、これが過密な家畜生産の地域において糞便リン酸による汚染問題の原因となる。結腸で放出された無機リン酸は家畜にとってあまり栄養価が高いものではない。なぜならば、無機リン酸は、事実上全部というわけではないが、ほとんどが小腸で吸収されるからである。かくして、フィチン酸中の栄養的に重要な食物ミネラル類は相当な量が単胃動物には利用されない。
【００１６】
要するに、フィチン酸に結合された栄養分には、共有結合されているリン酸だけでなく、キレート化されている他のミネラル類も含まれる。その上、摂取されると、加水分解されないフィチン酸はさらに別のミネラルと出会って、それと結合するようになる。ミネラルのキレート化は、これらのミネラルが補因子として機能する酵素の活性を阻害することとなる。
【００１７】
フィチン酸のイノシトールと無機リン酸への変換は、フィターゼと称される微生物の酵素によって触媒される。フィターゼ#EC3.1.3.8のようなフィターゼは、myo-イノシトール六リン酸のD-myo-イノシトール 1,2,4,5,6-五リン酸と正リン酸への加水分解を触媒することができる。いくつかの真菌フィターゼは、報告によれば、イノシトール五リン酸を四リン酸、三リン酸、さらに低級のリン酸エステルへと加水分解する。例えば、A. ficuumフィターゼは、myo-イノシトール二および一リン酸の混合物を生産することが報告されている(Ullah, 1988)。フィターゼ産生微生物には、枯草菌(Bacillus subtilis)(Powar and Jagannathan, 1982)およびシュードモナス属(Pseudomonas)(Cosgrove, 1970)などの細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Sacchoromyces cerevisiae)(Nayini and Markakis, 1984)のような酵母、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)(Yamadaら, 1968)のような真菌が含まれる。
【００１８】
酸ホスファターゼは多種多様なリン酸エステルを触媒的に加水分解する酵素であり、通常は6.0より低い至適pHを示す(Igarashi & Hollander, 1968)。例えば、酵素#EC3.1.3.2は正リン酸モノエステルの正リン酸産物への加水分解を触媒する。酸ホスファターゼは、報告によれば、A. ficuumから精製されたものである。この酸ホスファターゼの脱グリコシル化形態は見かけの分子量が32.6 kDaである(Ullahら, 1987)。
【００１９】
フィターゼおよびそれほど特異的でない酸ホスファターゼは真菌アスペルギルス・フィッカム(Aspergillus ficuum)により細胞外酵素として産生される(Shiehら, 1969)。Ullahは、見かけ分子量が61.7 kDa（SDS-PAGEによる；グリコシル化について修正）；至適pHがpH2.5およびpH5.5；Kmが約40μm；および比活性が約50 U/mgである野生型A. ficuum由来のフィターゼを精製したと報じている(Ullah, 1988)。また、PCT特許出願WO 91/05053も、報告によれば、至適pHがpH2.5およびpH5.5；Kmが約250μm；比活性が約100 U/mg(タンパク質)であるアスペルギルス・フィッカム由来のフィターゼの単離および分子クローニングを開示している。
【００２０】
要するに、これらの以前に報告された微生物酵素の比活性は約50〜100 U/mg(タンパク質)の範囲にあった。これに対して、本発明で開示されるフィターゼ活性は約4400 U/mgであると測定された。これは活性の点で約40倍またはそれ以上の向上に相当する。
【００２１】
単胃動物用の飼料添加物としてフィターゼを生産することができる微生物を使用することの可能性はこれまでに報告されている(USPN 3,297,548 ShiehおよびWare; Nelsonら, 1971)。しかし、こうした手法の費用効果がこの用途や他の商業用途の主な制限となっている。したがって、改善されたフィターゼ分子が非常に望まれている。
【００２２】
微生物フィターゼはまた、報告によれば、ある種の工業的プロセス（例えば、コムギおよびトウモロコシの廃棄物）から動物飼料を生産するのに有用でありうる。一つには、トウモロコシの湿式磨砕法から、動物飼料として売られているグルテンが得られる。フィターゼを添加すると、この飼料製品の栄養価が改善されると報じられている。例えば、真菌のフィターゼ酵素およびプロセス条件（約50℃および約pH5.5）を使用することが以前に（例えば、EP 0 321 004）報告されている。簡単に述べると、ダイズ粉を伝統的な浸漬法（すなわち、外因性のフィターゼ酵素を添加しない方法）で加工処理する場合は、加水分解されないフィチン酸が存在することにより、その粉および廃棄物は魚、家禽、その他の非反芻動物、およびミルクで飼育されたウシの飼料として不適当なものとなってしまう。フィターゼはこの高タンパク質ダイズ原料の栄養価および商業的価値を改善するのに有用であると報告されている（Finase Enzymes, Alko, Rajamaki, Finland
を参照）。真菌フィターゼと至適pH2.5のA. niger由来の酸ホスファターゼとの組合せが、Alko社によって、フィチン酸分解製品 Finas FおよびFinase S中の動物飼料サプリメントとして使用されている。しかし、この手法の費用効果が使用を広く行きわたらせる際の大きな制限となっている。したがって、費用対効果比のよいフィターゼ供給源はダイズ粉の動物飼料としての価値を大いに高めることとなろう(Shiehら, 1969)。
【００２３】
上記の問題を解決するために、食物を外因性のフィターゼ酵素で処理することが報告されているが、この手法は完全に最適化されたものではなく、特に実施可能性と費用効果の点でそうである。この最適化には、特に大規模生産の場合に、広範な適用例が存在することを考慮に入れる必要がある。例えば、食品、それらの調製方法、および受容動物の種が多岐にわたっている。
【００２４】
特定の例として、魚の飼料ペレットを製造するには、水に入れたときに早期に（例えば、摂取前に）溶解および／または崩壊しないペレットを製造するために諸成分を高温および／または高圧にさらす必要があると考えられる。それゆえ、この製造方法では、高温および／または高圧の条件下でも安定している酵素添加物を得ることが望ましい。すなわち、異なった適用例には異なったフィターゼがそれぞれに好ましく、また、最適であることが理解されよう。
【００２５】
さらに、酵素的方法を最適化するには、中心となる触媒酵素の改変および改良を通して行なうことが重要であると考えられる。例えば、フィターゼ分子を発現させるための発現系を含むトランスジェニック植物を作出することができる。発現分子の活性に直接には関係しない要因（発現レベルなど）を向上させる試みによっては、有限な（おそらくは不十分な）レベルの最適化しかせいぜい達成されないことが理解される。したがって、改良された特性を有する分子を取得する必要性が存在している。
【００２６】
ある分子の特性を改良するための特定の方法は、定方向進化(directed evolution)と名付けられた技術的手法（DirectEvolution(登録商標)という名称が新造されて登録された、Diversa Corporationの専売特許の方法を含む）によるものである。これらの手法は、Diversa社が共同所有者となっている特許（米国特許第5,830,696号）ならびに係属中のいくつかの特許出願においてさらに改良されている。簡単に説明すると、DirectEvolution(登録商標)は、a)１つ以上の分子鋳型を突然変異誘発にかけて新規分子を作製すること、およびb)これらの後代種の中から、より望ましい特性をもつ新規分子を選択すること、を含む。
【００２７】
しかしながら、定方向進化のパワーは、出発鋳型の最初の選択だけでなく、選択した突然変異誘発法および使用したスクリーニング方法にも依存する。例えば、ランダムに選択した分子鋳型および／または次善の性質をもつ初期の分子鋳型に対する突然変異誘発順列の全範囲を作製して評価する手法は重労働である。そのような鋳型の使用は、せいぜい、遠回りの次善の経路を提供するにすぎず、おそらくは十分に改良された子孫分子をもたらす公算が極めて低いだろう。加えて、我々の現在の知識量は有益な改変を厳格に予測する能力の点で非常に限られている。
【００２８】
その結果、予め進化した性質（好ましくは、予め進化した酵素的利点）をもともと備えている分子を発見し利用することが望ましい手法である。本開示では、自然が（「自然進化」とも呼ばれているものを通して）商業用途で直ちに使用することができる分子、あるいはまた、より一層の改良を達成するために定方向進化に付すことができる分子を提供することを理解するだろう。
【００２９】
要するに、新規で、高度な活性があり、生理学的に有効で、しかも経済的な、フィターゼ活性の供給源を提供する必要性が存在している。特に、a)１以上の特定の用途において優れた活性を有し、それゆえに、これらの特定の用途を最適化するために使用可能であり、b)より一層改良された新規分子を得るために定方向進化の鋳型として使用可能であり、また、c)ハイブリダイゼーションに基づく手法などの方法により別の関連分子を同定するためのツールとして使用可能である、新規フィターゼを同定する必要がある。本発明はこれらのニーズを新規な方法で満たすものである。
【００３０】
発明の概要
本発明は、フィターゼ活性を有するフィターゼ酵素として同定された、ポリヌクレオチドおよびそれによりコードされるポリペプチドを提供する。本発明の一態様によれば、新規な組換え酵素、その活性断片、類似体および誘導体が提供される。
【００３１】
さらに特定すると、本発明は、フィチン酸含有食物の栄養価を高めるために使用可能な、細菌由来の組換えフィターゼ分子の使用に関する。以前の刊行物は真菌フィターゼの使用を開示しているが、この目的のための細菌フィターゼの使用は新規である。
【００３２】
より詳細には、本発明は、フィチン酸含有食物の栄養価を高めるために使用可能な、新たに同定された大腸菌(E. coli)由来の組換えフィターゼ分子の使用に関する。
【００３３】
この使用は、食物に含まれるフィチン酸を加水分解するために、この新たに同定された分子を使用することを含む。加水分解は、フィチン酸の摂取前、摂取後、または摂取の前後に行なうことができる。この適用例は、制限するものではないが、特に非反芻動物に関係したものであり、開示した新規フィターゼ分子の形質転換宿主中での発現、開示した新規フィターゼ分子と食物や他の物質に含まれるフィチン酸との接触、および開示した新規フィターゼ分子による動物消化系の処理が含まれる。
【００３４】
さらに、加水分解は、摂取とは無関係に、例えば、反応容器中のようなin vitro適用例において行なうこともできる。かくして、フィチン酸含有物質の処理には、食物とは言えないものを含めて、広範囲の物質の処理、例えば、糞便物質の処理が含まれる。
【００３５】
本発明の好ましい分子は大腸菌Ｂから単離された組換えフィターゼであり、これは、以前に確認された真菌フィターゼと比べて、フィチン酸およびフィチン酸の塩からのリン酸放出の効率を向上させる。
【００３６】
本発明の一態様によれば、食品に配合するのに有用なフィターゼ酵素が提供される。より詳細には、フィチン酸含有食品の栄養価を高めるために使用できるフィターゼ酵素が提供される。さらに詳細には、フィチン酸含有食品に添加したとき、それを消費する動物の成長を測定できる程度に高めるフィターゼ酵素が提供される。フィターゼ活性の有益な作用メカニズムは、大部分ではないにしても、かなりの部分がフィチン酸の加水分解からなると理論づけられる。この有益な作用は、フィチン酸含有食品の摂取前、摂取後、あるいはまた、摂取の前後に起こってもよい。有益な作用が摂取後に起こる場合には、本発明の目的は、非反芻動物による消費後にも活性が保持されているフィターゼ酵素を提供することである。
【００３７】
本発明の別の態様によれば、本発明の酵素、ならびに該酵素の活性誘導体、類似体および断片をコードする単離された核酸分子（mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNAを含む）が提供される。
【００３８】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の酵素をコードする核酸配列を含む組換え体の原核および／または真核宿主細胞を、該酵素の発現を促進させる条件下で培養し、続いて該酵素を回収することを含んでなる、組換え技術による前記ポリペプチドの産生方法を提供する。
【００３９】
本発明のさらに別の態様によれば、前記酵素または前記酵素をコードするポリヌクレオチドのトランスジェニック植物または植物器官における発現方法、ならびに該植物の作出方法を提供する。これは、そのようなフィターゼ酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を植物に導入することによって達成される。
【００４０】
本発明のさらに別の態様によれば、例えば、植物原料に含まれるフィチン酸からミネラルをin vitroで（すなわち、食物処理プロセスで）またはin vivoで（すなわち、該酵素を動物に投与することにより）遊離させるプロセスのような、商業的プロセスで使用するための、前記酵素または前記酵素をコードするポリヌクレオチドの利用方法を提供する。
【００４１】
本発明のさらに別の態様によれば、開示された食物処理プロセスにより作られた食品が提供される。
【００４２】
本発明のさらに別の態様によれば、研究、発見および開発に関係したin vitro目的のための、前記酵素または前記酵素をコードするポリヌクレオチドの利用方法を提供する。非限定的な例として、そのような方法には、他の生物由来の同様の酵素をコードしうる同様の配列を同定・単離するためのプローブの作製が含まれる。
【００４３】
非限定的な特定の例として、本発明の核酸配列と特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブの作製方法も提供される。好適な例を挙げると、ハイブリダイゼーションに基づいたこれらのプローブの使用には、PCR、ノーザンおよびサザン型のハイブリダイゼーション、RNAプロテクションアッセイ、およびin situ型のハイブリダイゼーションが含まれるが、これらに限定されるものではない。ここに開示された分子の使用には、非限定的な例として、診断用途がさらに含まれる。
【００４４】
非限定的な例によれば、これらの方法は、開示された分子に対する抗体を作製し、かかる抗体を用いて、例えば、他の生物由来の酵素中の同様の配列を同定・単離することを含む。別の非限定的な例では、これらの方法は、新規分子を作製し、続いて改良された性質をもつ後代分子を見つけ出すためにスクリーニングに基づいた手法を行なうことからなる、定方向進化のための鋳型としての本酵素の使用を含む。
【００４５】
また、トランスジェニック非ヒト生物であって、そのゲノムがフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含み、該トランスジーンがフィターゼポリペプチドの発現をもたらす、上記生物も提供される。
【００４６】
本発明はまた、配列番号７と実質的に同一のヌクレオチド配列を有し、かつ、ヌクレオチド390がG; 391がA; ヌクレオチド438がT; 439がG; 440がG; 471がC; 473がT; 477がT; 448がG; 449がT; 690がG; 691がA; 692がG; 729がT; 730がA; 731がT; 864がT; 865がG; 1017がGであるか、またはこれらの任意の組合せから選択された改変ヌクレオチド配列を有する、フィターゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに、本発明は、配列番号７と実質的に同一のヌクレオチド配列を有し、かつ、ヌクレオチド390がGで、391がA; ヌクレオチド438がTで、439がGで、440がG; 471がCで、473がT; 477がTで、448がGで、449がT; 690がGで、691がAで、692がG; 729がTで、730がAで、731がT; 864がTで、865がG; 1017がGであるか、またはこれらの任意の組合せから選択された改変ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。後者の配列は配列番号９で例示され、対応するアミノ酸配列は配列番号10である。
【００４７】
本発明の上記態様および他の態様は、当業者であれば、ここに記載した教示から明らかになるはずである。
【００４８】
図面の説明
以下の図面は、本発明の実施形態を例示したものであり、特許請求の範囲により包含される本発明の範囲を制限するものではない。
【００４９】
図１A、Bは、本発明の酵素のヌクレオチド配列および推定上のアミノ酸配列を示す。配列決定は378自動DNAシークエンサー(Applied Biosystems社製)を使って行なった。
【００５０】
図２は、本発明のフィターゼ酵素のpHおよび温度プロファイルならびに安定性のデータを示す。これらの分析に使用したアッセイは、フィターゼ活性を検出するための以下のアッセイである。すなわち、フィターゼ活性を測定するために、150μlの酵素調製物を600μlの2mM フィチン酸ナトリウムと共に、1mM CaCl2を補足した100mM Tris HClバッファー pH7.5中、37℃で30分間インキュベートする。インキュベーション後、750μlの5%トリクロロ酢酸を添加して反応を停止させた。放出されたリン酸は、1500μlの発色試薬（5.5%硫酸中の1.5%モリブデン酸アンモニウムを４倍量、および2.7%硫酸第一鉄を１倍量、Shimizu, 1992）を添加した後に分光測光的に700nmでリン酸標準品に対して測定した。700nmでのODを図２のグラフのＹ軸に示す。温度またはpHをグラフのＸ軸に示す。
【００５１】
図３は、配列番号８と配列番号10（改変型フィターゼ）との耐熱性アッセイの結果に関するグラフを示す。
【００５２】
図４は、模擬消化条件下でのフィターゼ酵素の安定性に関するグラフを示す。
【００５３】
図５は、種々の宿主細胞における野生型および改変型（配列番号10）フィターゼの発現に関するグラフを示す。
【００５４】
図６は、ペプシンを含むSGF中での残留フィターゼ活性のグラフを示す。
【００５５】
図７A、Bは、大腸菌appAフィターゼ（配列番号７）のヌクレオチド配列を示す。
【００５６】
図８は、大腸菌appAフィターゼ（配列番号８）および改変型フィターゼ（配列番号10）のアミノ酸配列を示す。
【００５７】
発明の開示
本発明は、他のフィターゼ酵素と比較して熱安定性が高いフィターゼを産生するように改変されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを有する耐熱性フィターゼを提供する。例えば、S. pombeまたはP. pastorisにおけるこの新規フィターゼの発現により、グリコシル化変異体が生産され、この変異体は、さらなる耐熱性を示した。
【００５８】
本発明は、図１に示す精製された組換えフィターゼ酵素を提供する。加えて、本発明は、図１に示す推定アミノ酸を有する成熟酵素をコードする単離された核酸分子（ポリヌクレオチド）を提供する。本発明はまた、図８および配列番号９および10に示すように、改変されたフィターゼ配列も提供する。
【００５９】
本発明のフィターゼ分子は、その構造に関しては新規である。さらに、本発明のフィターゼ分子は、活性に関して特許性がある程度に新規である。例えば、アッセイ（Food Chemicals Codex、第４版に記載されている）を用いて、本発明のフィターゼ酵素の活性は、真菌性（アスペルギルス属）フィターゼ対照と比較してはるかに優れていることが証明された。具体的には、多数の実験から、大腸菌フィターゼは、約4,400単位／mgの活性を有するのに対し、アスペルギルスフィターゼの活性は、約105単位／mgであることがわかった。これは、活性が40倍以上違うことを意味する。本明細書に提示する実施例の理解を容易にするために、よく使用されている特定の方法および／または用語を記載することにする。
【００６０】
本明細書で用いる「抗体」という用語は、フィターゼポリペプチドのエピトープを結合することができる、インタクトの免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子のフラグメント、例えば、Fab、Fab’、(Fab’)2、FvおよびSCAフラグメントを意味する。これらの抗体フラグメントは、それらが由来する抗体の抗原（例えば、フィターゼ抗原）に選択的に結合するある程度の能力を保持しており、当技術分野では公知の方法（例えば、HarlowおよびLane、前掲参照）を用いて作製することができ、さらに詳しくは以下に記載する。
【００６１】
（１）Fabフラグメントは、抗体分子の１価の抗原結合フラグメントからなるものであり、全抗体分子を酵素パパインで消化して、インタクトの軽鎖と重鎖部分とからなるフラグメントを得ることにより作製することができる。
【００６２】
（２）抗体分子のFab’フラグメントは、全抗体分子をペプシンで処理した後、還元して、インタクトの軽鎖と重鎖部分とからなる分子を得ることにより作製することができる。このように処理した抗体分子1個につき、２個のFab’フラグメントが得られる。
【００６３】
（３）抗体分子の(Fab’)2フラグメントは、全抗体分子を酵素パパインで処理するだけで、次の還元を行なわずに、得ることができる。(Fab’)2フラグメントは、２つのジスルフィド結合により一緒に保持される２個のFab’フラグメントの二量体である。
【００６４】
（４）Fvフラグメントは、２つの鎖として発現された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される。
【００６５】
（５）一本鎖抗体（SCA）は、適当なフレキシブルのポリペプチドリンカーにより連結された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む遺伝子操作された一本鎖分子である。
【００６６】
「分解有効」量という用語は、酵素と接触していないフィチン酸と比較して、少なくとも50％のフィチン酸を分解するのに必要な酵素の量を意味する。好ましくは、少なくとも80％のフィチン酸を分解する。
【００６７】
DNAの「消化」とは、DNA中の特定の配列でしか作用しない制限酵素を用いたDNAの触媒切断を意味する。本明細書で用いる各種制限酵素は、市販されているものであり、それらの反応条件、補因子およびその他の要件は、当業者には公知のものを用いた。分析のために、約20μlのバッファー溶液中の約２単位の酵素と一緒に、典型的には１μgのプラスミドまたはDNA断片を用いる。プラスミド構築用のDNA断片を単離するためには、上記より多い液量中の20〜250単位の酵素で、典型的には５〜50μgのDNAを消化した。特定の制限酵素についての好適なバッファーおよび基質量は、製造業者により指定されている。通常、37℃で約１時間のインキュベーションを実施するが、供給業者の指示に応じて変動する可能性もある。消化後、反応物を直接ゲル上で電気泳動させることにより、所望の断片を単離する。
【００６８】
本発明で用いる「エピトープ」という用語は、フィターゼ特異的抗体のような抗体のパラトープが結合する、フィターゼポリペプチドのような抗原上の抗原決定基を意味する。抗原決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的活性表面群からなり、特定の三次元構造の特性、ならびに、特定の電荷特性を有することができる。
【００６９】
図１の酵素を参照にすると、「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語は、基準酵素と少なくとも本質的に同じである少なくとも１つの生物学的機能または活性を保持する酵素を包含する。さらに、「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語の例として、低活性プロタンパク質のような「プロフォーム（pro-form）」分子が挙げられるが、このタンパク質を切断によって修飾することにより、活性が顕著に増加した成熟酵素を作製することができる。
【００７０】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖を産生するのに関与するDNAのセグメントを意味し、コード領域の先行および後続の領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに、個々のコードセグメント（エキソン）間に介入する配列（イントロン）が含まれる。
【００７１】
「単離された」という用語は、物質が、その本来の環境（例えば、それが天然に存在するものであれば、天然の環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きた動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたは酵素は単離されていないが、天然の系に共存する物質のいくつかもしくは全部から分離された同じポリヌクレオチドまたは酵素は、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部でもよいし、かつ／またはこのようなポリヌクレオチドもしくは酵素は組成物の一部でもよく、そして、そのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないという点で単離されている。
【００７２】
「単離された核酸」とは、通常5’および3’フランキング配列と直接隣接していない核酸、例えば、DNAまたはRNA分子を意味し、この核酸は、それが由来する生物の天然に存在するゲノムに存在する場合、通常5’および3’フランキング配列と直接隣接している。従って、この用語は、例えば、下記のものを表している：プラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターに組み込まれる核酸；異種細胞のゲノムに（または同種細胞のゲノムであるが、それが天然に存在する部位とは異なる部位で）組み込まれる核酸；個別分子として存在する核酸、例えば、PCR増幅または制限酵素消化により生産されたDNA、もしくはin vitro転写により生産されるRNA分子。この用語はまた、例えば、融合タンパク質の生産で用いることができる追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を成す組換え核酸も包含する。
【００７３】
「連結」とは、２つの二本鎖核酸断片間のホスホジエステル結合を形成する過程を意味する（Sambrookら、1989）。別途記載のない限り、連結しようとするDNA断片の概算当モル量0.5μgにつき10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）で、公知のバッファーおよび条件を用いて、連結を達成することができる。
【００７４】
本発明で用いる「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖のいずれであるかに応じて、それぞれ、少なくとも１個のヌクレオチド塩基または１個のヌクレオチド塩基対から構成される。さらに、核酸分子は、ヌクレオチド含有分子のあらゆる群に独占的にもしくはキメラとして属することができ、このような群の例として、限定するものではないが、下記のような核酸分子群が挙げられる：RNA、DNA、ゲノム核酸、非ゲノム核酸、天然に存在するおよび天然に存在しない核酸、ならびに、合成核酸。これには、非制限的例として、ミトコンドリアやリボソームRNAのようなあらゆる細胞小器官に関連する核酸、ならびに、天然に存在する成分と一緒には天然に存在しない１以上の成分をキメラとして含む核酸分子が含まれる。
【００７５】
さらに「核酸分子」は、限定するものではないが、アミノ酸や糖など、１以上の非ヌクレオチド系の成分を部分的に含んでいてもよい。従って、例えば、限定するものではないが、一部がヌクレオチド系で、一部がタンパク質系であるリボザイムは「核酸分子」とみなされる。
【００７６】
加えて、例として、限定するものではないが、放射活性、あるいは、非放射性標識などの検出可能な成分で標識された核酸分子も同様に「核酸分子」とみなされる。
【００７７】
特定の酵素を「コードする核酸配列」または該酵素の「DNAコード配列」もしくは該酵素を「コードするヌクレオチド配列」−ならびに、その他の類義語−は、好適な調節配列の制御下に置かれたとき、酵素に転写および翻訳されるDNAを意味する。「プロモーター配列」は、細胞中のRNAポリメラーゼと結合し、下流（3’方向）コード配列の転写を開始することができるDNA調節領域である。このプロモーターは、DNA配列の一部である。この配列領域は、その3’末端に開始コドンを有する。プロモーター配列は、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルで転写を開始するのに必要なエレメントが結合する、最小数の塩基を含んでいる。しかし、RNAポリメラーゼが上記配列と結合した後、転写が開始コドン（プロモーターを有する3’末端）で開始され、転写は3’方向で下流に進行する。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼS1を用いたマッピングにより好適に規定される）と、RNAポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在する。
【００７８】
「酵素（タンパク質）をコードする核酸」または「酵素（タンパク質）をコードするDNA」もしくは「酵素（タンパク質）をコードするポリヌクレオチド」ならびに、その他の類義語は、該酵素のコード配列だけを含むポリヌクレオチド、ならびに、追加のコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００７９】
好ましい実施形態では、「特定の核酸分子種」は、その化学的構造により定義され、例として、限定するものではないが、その一次配列が挙げられる。別の好ましい実施形態では、特定の「核酸分子種」は、核酸種の機能、もしくは該核酸種に由来する産物の機能により定義される。従って、非制限的例として、「特定の核酸分子種」は、それに属し得る１以上の活性または特性（その発現された産物に属し得る活性または特性を含む）により定義することができる。
【００８０】
本明細書において、「実施（working）核酸サンプルを核酸ライブラリーに集合させる」とは、ベクターへの連結や宿主の形質転換などにより、ベクターベースの集合体に核酸サンプルを組み込む過程を意味する。関連するベクター、宿主、およびその他の試薬、ならびにそれらの非制限的具体例については、以下に記載する。本明細書における「実施核酸サンプルを核酸ライブラリーに集合させる」の定義はまた、アダプターへの連結などにより、非ベクターベースの集合体に核酸サンプルを組み込む過程も包含する。好ましくは、このアダプターは、PCRプライマーにアニーリングして、PCRによる増幅を促進することができる。
【００８１】
従って、非制限的実施形態では、「核酸ライブラリー」は、１以上の核酸分子のベクターベースの集合体からなる。別の好ましい実施形態では、「核酸ライブラリー」は、核酸分子の非ベクターベースの集合体からなる。さらに別の好ましい実施形態では、「核酸ライブラリー」は、部分的にベクターベースで、かつ、部分的に非ベクターベースである核酸分子の組合せ集合体からなる。好ましくは、ライブラリーを構成する分子の集合体は、個々の核酸分子種別に検索可能で、しかも分離可能である。
【００８２】
本発明は、「核酸構築物」または「ヌクレオチド構築物」、あるいは「DNA構築物」を提供する。「構築物」という用語は、本明細書では、ポリヌクレオチド（例えば、フィターゼポリヌクレオチド）のような分子を表すのに用いられ、これは、場合に応じて、ベクター、もしくはベクター部分など、１以上の追加の分子成分と化学的に結合されていてもよい。特定の、しかしまったく制限的ではない形態では、ヌクレオチド構築物の例として、宿主細胞の形質転換に好適なDNA発現構築物が挙げられる。
【００８３】
「オリゴヌクレオチド」とは、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、または二本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかを意味し、これらは化学的に合成することができる。このような合成オリゴヌクレオチドは、5’リン酸を含んでいてもいなくてもよい。含んでいないものは、キナーゼの存在下で、ATPでリン酸を付加しなければ、別のオリゴヌクレオチドと連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸していない断片と連結する。
【００８４】
RNAポリメラーゼが、２つのコード配列を単一のmRNAに転写し、このmRNAが両コード配列に由来するアミノ酸を有する単一のポリペプチドに翻訳される場合、一方のコード配列が、別のコード配列に「機能的に連結している」という。これらのコード配列は、発現した配列が最終的にプロセッシングされて所望のタンパク質を産生するのであれば、互いに隣接している必要はない。
【００８５】
本発明の方法に関して、「フィターゼ特異的プローブ」という用語は、フィターゼポリペプチドをコードする核酸またはその相補的配列に、その他の酵素をコードする核酸またはその相補的配列よりも検出可能な広い範囲で、結合するプローブを意味する。
【００８６】
厳密には、「フィテート」、「フィチン酸」、および「フィチン」という用語は、次のように区別することができる：「フィテート」とは、フィチン酸のアニオン形態を意味する；「フィチン酸」とは、植物（特に、植物の葉など）中に天然に存在する化合物であるイノシトールヘキサリン酸を指し、これは、酵素フィターゼの基質として役立つと考えられる；また、「フィチン」は、フィチン酸のカルシウム−マグネシウム塩など、フィチン酸の塩を指す。このように、「フィテート」、「フィチン酸」、および「フィチン」は、化学的には関連しており、共通の化学的構造を有する、相互変換可能な形態である。従って、「フィテート」、「フィチン酸」、および「フィチン」が極めて関連し、類似し、化学的に相互変換可能であり、しかも、これらはすべて（化学的相互変換のあるなしに拘わらず）、本明細書で開示する新規のフィターゼ酵素による分解を受けることができることから、上記の用語は置き換え可能な用語である。従って、本明細書に開示する方法の説明において、「フィテート」、「フィチン酸」、および「フィチン」という用語のいずれか１つだけを用いた場合でも、「フィテート」、「フィチン酸」、および「フィチン」を含む、酵素フィターゼのいずれの基質も包含する代表的用語として機能することを理解されたい。
【００８７】
「ポリヌクレオチド」は、２個以上のヌクレオチド塩基またはヌクレオチド塩基対からなる分子である。
【００８８】
「プレフォーム（pre-form）」または「プロフォーム（pro-form）」を有する分子とは、１以上の共有結合および非共有結合化学的修飾（例えば、グリコシル化、タンパク質分解切断、二量体化またはオリゴマー化、温度誘導もしくはpH誘導によるコンホメーション変化、補因子との会合など）のいずれかの組合せを途中で受けることにより、基準プロフォーム分子と比較して特性に差異がある（例えば、活性の増加）、より成熟した分子形態を達成する分子を意味する。「プレフォーム」または「プロフォーム」の前駆体分子が、途中で２つ以上の化学的修飾（例えば、２回のタンパク質分解切断、またはタンパク質分解切断とグリコシル化の改変）を受けることにより、成熟分子を産生することができる場合には、この前駆体分子について、「プレ−プロフォーム（pre-pro-form）」という用語を用いることもできる。従って、プレ−プロ酵素は、「プレ−プロフォーム」の酵素である。同様に、プレ−プロホルモンは、「プレ−プロフォーム」のホルモンである。
【００８９】
本明細書で用いる「試薬」という用語は、本発明のフィターゼ分子を意味する。好ましくは、このようなフィターゼ分子は、フィチン酸のイノシトールおよび遊離リン酸への加水分解を触媒し、その際、フィチン酸複合体からミネラルが放出される。フィターゼ分子の例として、B型大腸菌に由来するフィターゼがある
。この代表的酵素は、図１、配列番号２に示す。さらに、本明細書で用いる「試薬」という用語は、フィチン酸分子のような本発明の基質試薬分子も包含する。好ましくは、このようなフィチン酸分子は、食物、潜在的食物、食物の副産物（in vitro副産物およびin vivo副産物の両方、例えば、生体外反応産物および動物の排泄物）、食物の前駆体、ならびに、フィチン酸のその他あらゆる供給源に存在する。
【００９０】
「組換え」酵素とは、組換えDNA技法により作製された、すなわち、所望の酵素をコードする外因性DNA構築物により形質転換された細胞から生産された酵素を意味する。また、「合成」酵素とは、化学的合成により調製された酵素である。
【００９１】
当技術分野では公知のように、２つの酵素間の「類似性」は、一方の酵素のアミノ酸配列およびその保存アミノ酸置換物を、他方の酵素の配列と比較することにより決定する。類似性は、当業者には公知の方法、例えば、BLASTプログラム（国立生物情報センター（National Center for Biological Information）の基本的局所アラインメント検索ツール（Basic Local Alignment Search Tool））により決定することができる。
【００９２】
分子対（例えば、抗体−抗原対または核酸対）のメンバーは、それらが、他の非特異的分子より大きな親和力で互いに結合している場合には、互いに「特異的に結合する」という。例えば、非特異的タンパク質と比べて、より高い効率で結合する抗原に対する抗体は、該抗原に特異的に結合すると表現することができる。（同様に、核酸プローブが、塩基対合相互作用により、標的と特異的二重らせんを形成する場合には、そのプローブは、核酸標的と特異的に結合すると表現することができる（前記参照））。
【００９３】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、配列間に少なくとも90％の同一性、好ましくは、少なくとも95％の同一性、最も好ましくは、少なくとも97％の同一性がある場合に、ハイブリダイゼーションが起こる条件を意味する。Sambrookら、1989を参照されたい。ただし、この文献は、参照により本明細書にその全文を組み込むものとする。
【００９４】
また、本発明には、配列番号１のようなフィターゼポリペプチドの配列と「実質的に同一」である配列を有するポリペプチドも含まれる。「実質的に同一の」アミノ酸配列は、基準配列と、保存的アミノ酸置換によってのみ異なる配列であり、例えば、あるアミノ酸を同じクラスの別のもので置換したもの（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンなど、１個の疎水性アミノ酸を別のアミノ酸で置換したもの、あるいは、１個の極性アミノ酸を別のアミノ酸で置換したもの、例えば、アルギニンをリシンで、グルタミン酸をアスパラギン酸で、もしくはグルタミンをアスパラギンで置換したもの）が挙げられる。
【００９５】
さらには、「実質的に同一の」アミノ酸配列は、１以上の非保存的置換、欠失、または挿入によって、基準配列とは異なる配列であり、特に、このような置換が分子の活性部位ではない部位で起こる場合に当てはまり、しかも、その際、ポリペプチドは、その挙動特性を実質的に保持している。例えば、１以上のアミノ酸をフィターゼポリペプチドから欠失させることにより、生物活性を有意に改変することなく、ポリペプチドの構造を改変することができる。例えば、フィターゼ生物活性に必要でないアミノ末端またはカルボキシル末端のアミノ酸を除去することができる。このような改変によって、これまでより小さいが活性のあるフィターゼポリペプチドの作製が可能になる。
【００９６】
本発明は、「実質的に純粋な酵素」を提供する。「実質的に純粋な酵素」という用語は、ポリペプチド（例えば、フィターゼポリペプチド、またはその断片）のような分子を表現するのに用いられるが、その際、該分子は、他のタンパク質、脂質、炭水化物、核酸、ならびに、該分子が自然に会合するその他の生物学的物質を実質的に含まない。例えば、ポリペプチドのような実質的に純粋な分子は、関心のある分子の少なくとも約60乾重量％でよい。ポリペプチドの純度は、標準的方法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、SDS-PAGE）、カラムクロマトグラフィー（例えば、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC））、ならびに、アミノ末端アミノ酸配列分析を用いて、決定することができる。
【００９７】
本発明は、精製された組換え酵素を提供する。この組換え酵素は、フィチン酸のイノシトールおよび遊離リン酸への加水分解を触媒し、その際フィチン酸複合体からミネラルが放出される。精製された酵素の例として、B型大腸菌に由来するフィターゼがある。この代表的酵素は、図１、配列番号２に示す。
【００９８】
本発明の酵素は、図１の酵素（特に、成熟酵素）以外に、配列番号１のものなど、フィターゼポリペプチドの配列と「実質的に同一の」配列を有するポリペプチドも包含する。
【００９９】
一実施形態では、本発明の配列番号２のフィターゼ酵素の分子量は、SDS-PAGEにより測定し、かつ遺伝子のヌクレオチド配列から推定したところ、約47,056キロダルトンである。pIは、6.70である。この酵素についてのpHおよび温度プロファイルならびに安定性データを図２に示す。この精製された酵素を用いて、所望であれば、イノシトールおよび遊離リン酸へのフィチン酸の加水分解を触媒することができる。本発明のフィターゼ酵素は、高い耐熱性を有する；従って、これは、特に、高い温度および／または圧力用途に使用可能であり、このような用途として、限定するものではないが、早期に水に溶解しない魚類用の食餌ペレットの調製が挙げられる。
【０１００】
本発明に包含されるフィターゼポリペプチドは、図１（配列番号２）に示すフィターゼのアミノ酸配列を有する。フィターゼポリペプチド（B型大腸菌から単離したものなど）は、フィチン酸複合体からのミネラルの放出を伴なう、フィチン酸のイノシトールおよび遊離リン酸への加水分解を触媒することを特徴とする。
【０１０１】
本発明に包含されるその他のフィターゼポリペプチドは、配列番号２に示すフィターゼなどのフィターゼポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも約50％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。アミノ酸配列相同性を決定する際の比較の長さは、例えば、少なくとも15アミノ酸、ならびに、例えば、約20、25、または35アミノ酸でよい。
【０１０２】
相同性または同一性は、一般に、配列分析ソフトウエア（例えば、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター(1710 University Avenue, Madison, WI 53705)の遺伝学コンピューターグループの配列解析ソフトウエアパッケージ）を用いて測定される。このようなソフトウエアは、様々な欠失、置換およびその他の修飾に、相同性の度合いを割り当てることにより、類似配列を比べるものである。２以上の核酸またはポリペプチド配列に関して、「相同性」および「同一性」という用語は、いずれかの数の配列比較アルゴリズムを用いて、もしくは手動によるアラインメントや目視検査により測定した比較ウィンドー（comparison window）または指定領域にわたり、比較およびアラインメントして、最大一致（maximum correspondence）について調べたとき、同じであるか、あるいは、規定パーセントの同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２以上の配列もしくはサブ配列を意味する。
【０１０３】
配列比較のため、典型的には、１つの配列を基準配列として用い、これと試験配列を比較するが、基準配列のデータベースを用いてもよい。配列比較アルゴリズムを用いる場合には、試験および基準配列をコンピューターに入力し、必要であれば、部分配列座標を指定した後、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを用いてもよいし、それ以外のパラメーターを指定してもよい。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、基準配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【０１０４】
本明細書で用いる「比較ウィンドー」とは、20〜600、通常約50〜約200、さらに一般的には約100〜約150からなる群より選択される隣接位置の数のいずれか１つのセグメントに対する照合を意味し、ここでは、ある配列と、同数の隣接位置の基準配列とを最適にアラインメントした後、２つの配列を比較する。比較のための配列アラインメント方法は、当技術分野では公知である。比較のための最適配列アラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv, Appl. Math. 2：482, 1981の局所相同性アルゴリズム；Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48：443, 1970の相同性アラインメントアルゴリズム；person & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988の類似性検索方法；これらアルゴリズムのコンピューターによる実行（ウィスコンシン遺伝学ソフトウエアパッケージのGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA、遺伝学コンピューターグループ、575 Science Dr., Madison, WI）、あるいは、手動によるアラインメントおよび目視検査により実施することができる。相同性または同一性を決定するためのその他のアルゴリズムとして、例えば、BLASTプログラム（国立生物情報センターの基本的局所アラインメント検索ツール（Basic Local Alignment Search Tool））以外に、下記のものが挙げられる：ALIGN、AMAS（Analysis of Multiply Aligned Sequences）、AMPS（Protein Multiple Sequence Alignment）、ASSET（Aligned Segment Statistical Evaluation Tool）、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN（Biological Sequence Comparative Analysis Node）、BLIMPS（Blocks IMProved Searcher）、FASTA、Intervals & Points、BMB、CLUSTAL V、CLUSTAL W、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、スミス−ウォーターマン（Smith-Waterman）アルゴリズム、DARWIN、ラスベガス（Las Vegas）アルゴリズム、FNAT（Forced Nucleotide Alignment Tool）、フレームアライン（Framealign）、フレームサーチ（Framesearch）、DYNAMIC、FILTER、FSAP（Fristensky Sequence Analysis Package）、GAP（Global Alignment Program）、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC（Sensitive Sequence Comparison）、LALIGN（Local Sequence Alignment）、LCP（Local Content Program）、MACAW（Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench）、MAP（Multiple Alignment Program）、MBLKP、MBLKN、PIMA（Pattern-Induced Multi-sequence Alignment）、SAGA（Sequence Alignment by Genetic Algorithm）およびWHAT-IF。また、このようなアラインメントプログラムを用いて、ゲノムデータベースをスクリーニングすることにより、実質的に同一の配列を有するポリヌクレオチド配列を同定することもできる。多数のゲノムデータベースが入手可能であり、例えば、ヒトゲノムの大部分が、ヒトゲノム配列決定プロジェクト（J. Roach、http://weber.u.Washington.edu/~roach/human genome progress 2.html）（Gibbs, 1995）の一環として入手可能である。少なくとも21種の他のゲノムがすでに配列決定されており、そのようなゲノムとして、例えば、M. genitalium（Fraserら、1995）、M. jannaschii（Bultら、1996）、H. influenzae（Fleischmannら、1995）、大腸菌（Blattnerら、1997）および酵母（サッカロミセス・セレビシエ）（Mewesら、1997）、およびD. melanogaster
（Adamsら、2000）が挙げられる。また、マウス、C. elegansおよびシロイヌナズナなどのモデル生物のゲノムの配列決定も大きく前進している。機能に関する注釈をつけたゲノム情報を含む複数のデータベースが様々な組織により維持されており、インターネット例えば、wwwtigr.org/tdb；www.genetics.wisc.edu；http://genome-www.stanford.edu/~ball；hiv-web.lanl.gov；www.ncbi.nlm.nih.gov；www.ebi.ac.uk；http://Pasteur.fr/other/biology；およびwww.genome.wi.mit.eduを
介してこれらにアクセスすることができる。
【０１０５】
有用なアルゴリズムの一例として、BLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムがあり、これらは、それぞれ、Altschulら、Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977、およびAltschulら、J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990にそれぞれ記載されている。BLAST分析を実施するためのソフトウエアは、国立バイオテクノロジー情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を介して一般に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントしたとき、ある正の値の閾値スコアＴと一致するか、これを満たす、クエリー（query）配列中の長さWの短いワードを識別することにより、高スコアリング配列対（HSP）を識別することを含んでなる（Altschulら、前掲）。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschulら、前掲）。これら最初の近隣ワードのヒットは、それらを含むさらに長いHSPをみいだすための検索を開始するシード（seeds）として働く。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加することができる限り、各配列に沿って両方向に延長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメーターM（マッチする残基対の報酬スコア；常に＞０）を用いて計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリクスを用いて、累積スコアを計算する。各方向のワードヒットの延長は、累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘだけ降下したとき；１以上の負のスコア残基アラインメントの蓄積により、累積スコアが、ゼロ以下に達したとき；あるいは、いずれかの配列の末端に到達したとき、停止する。BLASTアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）11、期待値（Ｅ）10、Ｍ＝５、Ｎ＝-4および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムが、デフォルトとして、ワード長３と期待値（Ｅ）10、ならびに、BLOSUM62スコアリングマトリクス（Heinkoff & Heinkoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915、1989を参照）アラインメント（Ｂ）50、期待値（Ｅ）10、Ｍ＝５、Ｎ＝-4および両鎖の比較を用いる。
【０１０６】
BLASTアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を実施する（例えば、Karlin & Altshchul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873, 1993）。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（P(N)）であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸を基準核酸と比較して、最小合計確率が約0.2より小さい、さらに好ましくは、約0.01より小さい、最も好ましくは、約0.001より小さければ、この核酸は、基準配列と類似していると考えられる。
【０１０７】
一実施形態では、タンパク質および核酸配列相同性は、基本的局所アラインメント検索ツール（BLAST）を用いて評価する。特に、５つの具体的BLASTプログラムを用いて、下記のタスクを実行する：
（１）BLASTPおよびBLAST3は、タンパク質配列データベースに対してアミノ酸クエリー配列を比較する；
（２）BLASTNは、ヌクレオチド配列データベースに対してヌクレオチドクエリー配列を比較する；
（３）BLASTXは、タンパク質配列データベースに対してクエリーヌクレオチド配列（両鎖）の６フレーム概念翻訳産物を比較する；
（４）TBLASTNは、６つのリーディングフレームすべてで翻訳されたヌクレオ
チド配列データベース（両鎖）に対してクエリータンパク質配列を比較する；
（５）TBLASTXは、ヌクレオチド配列データベースの6フレーム翻訳産物に対してヌクレオチドクエリー配列の６フレーム翻訳産物を比較する。
【０１０８】
BLASTプログラムは、クエリーアミノ酸または核酸配列と、好ましくはタンパ
ク質または核酸配列データベースから得られた試験配列との間の類似セグメント（本明細書では、「高スコアリングセグメント対」という）を同定することにより、相同性配列を同定する。高スコアリングセグメント対は、好ましくは、スコアリングマトリクスを用いて識別（すなわち、アラインメント）するが、これらマトリクスの多くは当業者に公知である。好ましくは、用いられるスコアリングマトリクスは、BLOSUM62マトリクス（Gonnetら、Science 256: 1443-1445、1992；HenikoffおよびHenikoff、Proteins 17:49-61、1993）である。それほど好ましくはないが、PAMまたはPAM250マトリクスを用いてもよい（例えば、SchwartzおよびDayhoff編、1978、Matrices for Detecting Distance Relationships：Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington：National Biomedical Research Foundation）。BLASTプログラムは、米国立医学図書館（U.S. National Library of Medicine）を通じて利用可能である。
【０１０９】
前記アルゴリズムで用いられるパラメーターは、調べようとする配列長さおよび相同性の度合いに応じて改変することができる。いくつかの実施形態では、これらパラメーターは、ユーザーからの指示なしに上記アルゴリズムで用いられるデフォルトパラメーターでよい。
【０１１０】
本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有する酵素、ならびに、このような酵素の類似体、誘導体、および断片に関する。
【０１１１】
図１の酵素の類似体、誘導体、および断片は、（a）１個以上のアミノ酸残基
が遺伝コードによりコードされていないアミノ酸残基で置換されているもの、（b）１個以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、（c）成熟酵素が別の化合物、例えば、該酵素の半減期を高める化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合しているもの、（d）成熟酵素が、6xHisタグまたは緑色蛍光タンパク質タグなどの標識またはタグを賦与する化合物のような別の化合物と融合しているもの、（e）リーダーもしくは分泌配列、または成熟酵素もしくはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列など、追加のアミノ酸が成熟酵素と融合しているものでよい。このような類似体、誘導体および断片は、本明細書の教示から、当業者に理解できる範囲内にあるものと考えられる。
【０１１２】
変異体、例えば、「断片」、「類似体」または「誘導体」酵素、ならびに、基準酵素は、１以上の置換、付加、欠失、融合および切断（いずれかの組合せでもよい）により、アミノ酸配列が異なっていてよい。
【０１１３】
好ましい変異体として、保存的アミノ酸置換により基準対照とは異なるものが挙げられる。このような置換は、同様の特性を持つ別のアミノ酸で、ポリペプチド中の所与のアミノ酸を置換するものである。保存的置換として、典型的には、下記のものが挙げられる：脂肪族アミノ酸Ala、Val、LeuおよびIle間での、一方から他方への置換；ヒドロキシル残基SerおよびThrの相互交換、酸性残基AspおよびGluの交換、アミド残基AsnおよびGln間の置換、塩基性残基LysおよびArgの交換、ならびに、芳香族残基Phe、Tyr間の置換。
【０１１４】
従って、特定の非制限的実施形態では、置換は、１つのアミノ酸を、同様の特性を持つ別のアミノ酸で置換することからなる。別の特定の非制限的実施形態では、置換は、１つのアミノ酸を、類似していないアミノ酸で置換することからなり、その際、この改変は、少なくとも１つの酵素特性に関して非阻害的もしくはサイレントであるか、または改善されている。
【０１１５】
さらに、特定の非制限的実施形態では、付加は、タンパク質のアミノまたはカルボキシ末端のいずれか、あるいは、末端部位間での付加からなり、その際、この改変は、少なくとも１つの酵素特性に関して非阻害的もしくはサイレントであるか、または改善されている。
【０１１６】
別の特定の非制限的実施形態では、改変は、基準ポリヌクレオチド（配列番号１）によりコードされた酵素における置換、付加、欠失、融合および／または切断などの複数の修飾からなり、その際、個々の修飾の作用とは無関係に、全体として考えると、これら修飾の作用は、少なくとも１つの酵素特性に関して非阻害的もしくはサイレントであるか、または改善されている。
【０１１７】
最も好ましいのは、改変前の基準ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能および活性を保持する変異体である。
【０１１８】
「変異体」という用語は、１個以上の塩基対、コドン、イントロン、エキソン、もしくはアミノ酸残基で改変された本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドであって、（それぞれ）本発明のフィターゼの生物活性を依然として保持しているものを意味する。変異体は、例えば、下記の方法を含むいくつの手段により作製することができる：誤りがちのPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、アセンブリPCR、有性(sexual)PCR突然変異誘発、in vivo突然変異誘発、カセット突然変異誘発、回帰的集合（recursive ensemble）突然変異誘発、指数的集合突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、連結リアセンブリ、GSSM、およびこれらのいずれかの組合せ。なお、これらの方法については以下にさらに詳しく説明する。
【０１１９】
本発明の一形態によれば、図１の推定アミノ酸配列を有する成熟酵素をコードする、単離された核酸分子（ポリヌクレオチド）が提供される。
【０１２０】
配列番号２をコードするポリヌクレオチドは、以下に記載するように、元々、B型大腸菌から回収されたゲノムDNAから単離したものである。これは、432アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
【０１２１】
本発明の別の形態によれば、図１のDNAを含む本発明の代表的酵素（配列番号
１）をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【０１２２】
本発明はまた、基準ポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドにも関し、その際、この改変は、サイレントな改変であり、例えば、上記改変は、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を改変しない。本発明はまた、基準ポリヌクレオチド（配列番号１）によりコードされた酵素にアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断を起こすヌクレオチド改変にも関する。本発明の好ましい形態では、これらの酵素は、基準ポリヌクレオチドがコードする酵素とほぼ同じ生物学的作用を保持する。
【０１２３】
本発明はまた、前記フィターゼポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。例えば、配列番号２をコードする核酸は本発明に含まれる。これらの核酸は、天然に存在するヌクレオチド配列を含むか、または、フィターゼをコードする天然に存在する核酸とは異なるが、遺伝コードの縮重により同じアミノ酸をコードする配列を含むことができる。本発明の核酸は、DNAまたはRNAヌクレオチド、あるいは、これらの組合せもしくは修飾を含んでいてもよい。本発明の代表的核酸を配列番号１に示す。
【０１２４】
本発明のポリヌクレオチドは、DNAが、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを含む DNAの形態をとることができる。このDNAは、二本鎖または一本鎖のいずれでもよく、一本鎖の場合には、コード鎖もしくは非コード（アンチセンス）鎖のいずれでもよい。成熟酵素をコードするコード配列は、図１に示すコード配列および／または寄託されたクローンの配列（配列番号１）と同一であるか、あるいは、異なるコード配列でもよく、後者のコード配列は、遺伝コードの重複性または縮重により図１のDNA（例えば、配列番号１）と同じ成熟酵素をコードする。
【０１２５】
図１の成熟酵素（例えば、配列番号２）をコードするポリヌクレオチドは、限定するものではないが、次のものを含むことができる：成熟酵素のコード配列のみ；成熟酵素のコード配列と、リーダー配列またはプロタンパク質配列のような追加のコード配列；成熟酵素のコード配列（および場合によっては、追加のコード配列）と、イントロンもしくは成熟酵素のコード配列の5’側および／または3’側の非コード配列などの非コード配列。
【０１２６】
本発明は、さらに、図１の推定アミノ酸（例えば、配列番号２）を有する酵素の断片、類似体および誘導体をコードする前記ポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない変異体でもよい。
【０１２７】
従って、本発明は、図１に示す同じ成熟酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびに、このようなポリヌクレオチドの変異体を含み、該変異体は、図１に示す酵素の断片、誘導体または類似体をコードする。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体および付加または挿入変異体を含む。
【０１２８】
前述したように、ポリヌクレオチドは、図１に示すコード配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列を含んでいてもよい。あるいは、当業者には公知のように、対立遺伝子変異体は、コードされた酵素の機能を実質的に改変しない、１以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有するポリヌクレオチド配列の別の形態をしていてもよい。
【０１２９】
本明細書に記載するように、変異体は、例えば、下記の方法を含むいくつの手段でも作製することができる：誤りがちのPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、アセンブリPCR、有性PCR突然変異誘発、in vivo突然変異誘発、カセット突然変異誘発、回帰的集合突然変異誘発、指数的集合突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、連結リアセンブリ、GSSM、およびこれらのいずれかの組合せ。
【０１３０】
一形態では、合成連結リアセンブリ（SLR）と呼ばれる非確率論的方法は、核酸構成ブロックをランダムにシャッフルまたはコンカテマー化またはキメラ化するのではなく、非確率論的にアセンブリさせる以外は、いくらか確率論的シャッフリングに関連しているが、この方法を用いて、変異体を作製することができる。
【０１３１】
SLR法は、シャッフルしようとするポリヌクレオチド間の高レベルの相同性の存在に依存しない。本発明を用いて、10100以上の様々なキメラからなる子孫分子のライブラリー（またはセット）を非確率論的に作製することができる。さらには、SLRを用いて、101000以上の様々な子孫キメラからなるライブラリーを作製することも可能である。
【０１３２】
従って、一形態では、本発明は、設計により選択される全アセンブリ順序を有する完成キメラ核酸分子のセットを作製する非確率論的方法を提供する。この方法は、設計により、相互に適合性の役に立つ連結可能な末端を有する複数の特定の核酸構成ブロックを作製した後、これらの核酸構成ブロックをアセンブリさせることにより、設計された全アセンブリ順序が達成されるようにするステップからなる。
【０１３３】
アセンブリさせようとする核酸構成ブロックの相互に適合性の連結可能な末端は、それらが、構成ブロックを予定した順序に連結させることができれば、このタイプの順序づけられたアセンブリに「役に立つ」と考えられる。従って、一形態では、核酸構成ブロックを連結することができる全アセンブリ順序を、連結可能な末端の設計により指定し、１以上のアセンブリステップを用いる場合には、核酸構成ブロックを連結することができる全アセンブリ順序も、アセンブリステップの連続的順序により指定する。本発明の一実施形態では、アニールされた構成小片をリガーゼ（例えば、T4 DNAリガーゼ）のような酵素で処理することにより、構成小片の共有結合を達成する。
【０１３４】
別の実施形態では、核酸構築ブロックの設計は、完成キメラ核酸分子の子孫セットを作製する基礎として役に立つ前駆体核酸鋳型のセットの配列を解析する際に得られる。これらの前駆体核酸鋳型は、突然変異を誘発させようとする、すなわちキメラ化またはシャッフリングしようとする、核酸構成ブロックの設計を助ける配列情報の供給源として役に立つ。
【０１３５】
一実施形態では、本発明は、関連遺伝子のファミリーおよびそれらのコードされた関連産物のファミリーのキメラ化を提供する。具体的実施形態では、コードされた産物は酵素である。本発明の酵素およびポリペプチドは、本発明に記載された方法に従い、突然変異を誘発することができる。
【０１３６】
従って、本発明の一形態によれば、複数の前駆体核酸鋳型の配列をアラインメントすることにより、１以上の分界点を選択する。これらの分界点は、相同性の領域に位置していてもよい。これらの分界点を用いて、作製しようとする核酸構成ブロックの境界を画定することができる。従って、前駆体分子中で識別および選択された分界点は、子孫分子のアセンブリにおける潜在的キメラ化点として役立つ。
【０１３７】
典型的には、役に立つ分界点は、少なくとも２つの前駆体鋳型が共有する相同性の領域（少なくとも１つの相同的ヌクレオチド塩基を含む）であるが、分界点は前駆体鋳型の少なくとも半分、前駆体鋳型の少なくとも2／3、前駆体鋳型の少なくとも3／4、ならびに、好ましくは、前駆体鋳型のほぼ全てが共有する相同性領域でよい。さらに好ましくは、役に立つ分界点は、前駆体鋳型の全てが共有する相同性領域である。
【０１３８】
一実施形態では、連結リアセンブリ法を網羅的に実施することにより、網羅的ライブラリーを作製する。言い換えれば、核酸構成ブロックの可能な順序づけられた組合せはすべて、完成キメラ核酸分子のセットに呈示される。同時に、各組合せにおけるアセンブリ順序（すなわち、各完成キメラ核酸の5’から3’配列までの各構成ブロックのアセンブリの順序）は、設計によるものである（すなわち、非確率論的である）。この方法の非確率論的性質のために、不要な副産物の可能性は大幅に減少する。
【０１３９】
別の実施形態では、上記方法によれば、連結リアセンブリ法が系統的に実施され、これにより、例えば、系統的にコンパートメント化されたライブラリーを作製し、これらのコンパートメントを、例えば、一つずつ系統的にスクリーニングすることができる。言い換えれば、本発明によれば、特定の核酸構成ブロックの選択的かつ賢明な使用と、順次段階を経たアセンブリ反応物の選択的かつ賢明な使用を組み合わせることにより、複数の反応容器の各々に子孫産物の特定セットが作製される、実験的設計を達成することができる。これによって、系統的試験およびスクリーニング方法を実施することが可能になる。従って、上記方法により、極めて多数の子孫分子を、これまでより小さなグループ別に系統的に試験することができる。
【０１４０】
特に、前駆体分子間に低レベルの相同性がある場合には、非常にフレキシブルで、しかも網羅的かつ系統的な方法でキメラ化を実施することができるため、本発明は、多数の子孫分子からなるライブラリー（またはセット）の作製を可能にする。本発明の連結リアセンブリの非確率論的性質により、作製された子孫分子は、好ましくは、設計により選択される全アセンブリ順序を有する完成キメラ核酸分子のライブラリーからなる。具体的実施形態では、このように作製されたライブラリーは、103〜101000またはそれを超える異なる子孫分子種を含む。
【０１４１】
一形態では、前記のように作製した完成キメラ核酸分子のセットは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態によれば、このポリヌクレオチドは遺伝子であり、これは人工の遺伝子でよい。別の実施形態によれば、このポリヌクレオチドは遺伝子経路であり、これは人工の遺伝子経路でよい。本発明によれば、本発明により作製された１以上の人工の遺伝子を、真核生物（植物を含む）中で機能し得る経路などの人工の遺伝子経路に組み込むことができる。
【０１４２】
別の実施形態では、構成ブロックが作製される段階の合成的性質により、ヌクレオチド（例えば、１個以上のヌクレオチドであり、これは、例えば、コドンまたはイントロンもしくは調節配列でよい）の設計および導入が可能になり、このヌクレオチドは後に、in vitro方法（例えば、突然変異誘発により）またはin vivo方法（例えば、宿主生物の遺伝子スプライシング能力を用いて）のいずれか
で任意に除去することができる。多くの場合、これらヌクレオチドの導入はまた、役に立つ分界点を形成する潜在的利点に加え、その他多くの理由から望ましいことは理解されよう。
【０１４３】
従って、別の実施形態によれば、本発明は、核酸構成ブロックを用いて、イントロンを導入するのを可能にする。従って、本発明によれば、機能的イントロンは、本発明の人工遺伝子に導入することができる。また、本発明により、機能的イントロンを本発明の人工遺伝子経路に導入することもできる。このように、本発明は、１（または１以上）の人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子であるキメラポリヌクレオチドの作製を可能にする。
【０１４４】
従って、本発明はまた、１（または１以上）の人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子経路であるキメラポリヌクレオチドの作製も可能にする。好ましくは、人工的に導入されたイントロンは、天然に存在するイントロンが遺伝子スプライシングに機能的に働くのと同様に、遺伝子スプライシングのための１以上の宿主細胞において機能的である。本発明は、組換えおよび／またはスプライシングのための宿主生物に導入される人工イントロン含有ポリヌクレオチドの作製方法を提供する。
【０１４５】
本発明を用いて作製される人工遺伝子はまた、別の核酸との組換え用の基質としても働くことができる。同様に、本発明を用いて作製される人工遺伝子経路はまた、別の核酸との組換え用の基質としても働くことができる。好ましい実施形態では、組換えは、人工イントロン含有遺伝子と、組換えパートナーとして働く核酸の間の相同性の領域により促進されるか、または該領域で起こる。特に好ましい実施形態では、組換えパートナーは、人工遺伝子または人工遺伝子経路など、本発明により作製された核酸でもよい。組換えは、人工遺伝子中の１（または１以上）の人工的に導入されたイントロンに存在する相同性の領域により促進されるか、または該領域で起こり得る。
【０１４６】
本発明の合成連結リアセンブリ方法は、複数の核酸構成ブロックを用いるが、それらの各々は２つの連結可能な末端を有する。各核酸構成ブロック上の２つの連結可能な末端は２つの平滑末端である（すなわち、各々がゼロ個のヌクレオチドの突出部を有する）か、好ましくは、１つの平滑末端と１つの突出部、あるいは、さらに好ましくは、やはり２つの突出部である。
【０１４７】
この目的に役に立つ突出部は3’突出部または5’突出部でよい。従って、核酸構成ブロックは3’突出部または5’突出部、あるいは、２つの3’突出部または２つの5’突出部を有していてよい。核酸構成ブロックをアセンブリさせて完成キメラ核酸分子を形成する全順序は、意図的な実験的設計により決定されるものであり、ランダムではない。
【０１４８】
一つの好ましい実施形態によれば、核酸構成ブロックは、２つの一本鎖核酸（一本鎖オリゴとも呼ばれる）を化学的に合成し、これらを接触させることにより、アニーリングして、二本鎖核酸構成ブロックを形成する。
【０１４９】
二本鎖核酸構成ブロックは、様々なサイズのものでよい。これら構成ブロックのサイズは小さくても大きくてもよい。構成ブロックの好ましいサイズは、１塩基対（突出部は一切含まない）から100,000塩基対（突出部は一切含まない）までの範囲である。これ以外の好ましいサイズ範囲として、下限が１bp〜10,000 bp（その間の全整数を含む）、上限が２bp〜100,000 bp（その間の全整数を含む）が挙げられる。
【０１５０】
本発明に役に立つ二本鎖核酸構成ブロックを作製することができる多くの方法が存在し、これらは当技術分野では公知であり、当業者により容易に実施が可能である。
【０１５１】
一実施形態によれば、二本鎖核酸構成ブロックは、初めに２つの一本鎖核酸を作製した後、これらをアニーリングして、二本鎖核酸構成ブロックを形成することにより、作製される。二本鎖核酸構成ブロックの２つの鎖は、突出部を形成するものを除いて、すべてのヌクレオチドで相補的であり、従って、突出部を除けば、ミスマッチを一切含まない。別の実施形態によれば、二本鎖核酸構成ブロックの２つの鎖は、突出部を形成するものを除いて、すべてではないが、ヌクレオチドで相補的である。従って、この実施形態によれば、二本鎖核酸構成ブロックを用いて、コドン縮重を導入することができる。好ましくは、コドン縮重は、本明細書に記載した部位飽和突然変異誘発を用いて、または１以上のN,N,G/Tカセット、あるいは、１以上のN,N,Nカセットを用いて導入することができる。
【０１５２】
本発明のin vivo組換え方法は、特定のポリヌクレオチドまたは配列の未知のハイブリッドもしくは対立遺伝子のプールについて盲目的に実施することができる。しかし、特定のポリヌクレオチドの実際のDNAまたはRNA配列を知る必要はない。
【０１５３】
遺伝子の混合集団内の組換えを用いる手法は、あらゆる有用なタンパク質、例えば、インターロイキンI、抗体、tPAおよび成長ホルモンの作製に有用となり得る。この手法を用いて、特異性または活性が改変されたタンパク質を作製することができる。この手法はまた、ハイブリッド核酸配列、例えば、プロモーター領域、イントロン、エキソン、エンハンサー配列、遺伝子の3’非翻訳領域または5’非翻訳領域の作製にも有用である。従って、この手法を用いて、発現率が増加した遺伝子を作製することができる。この手法はまた、反復DNA配列の研究にも有用である。最後に、この手法は、リボザイムまたはアプタマーに突然変異を起こすのに有用である。
【０１５４】
一形態では、本明細書に記載するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体は、DNA、RNAまたはタンパク質など、極めて複雑な線状配列の組換えを介した定方向分子進化を可能にする還元的再構築(reductive reassortment)、組換えおよび選択の反復サイクルの利用によって得られる。
【０１５５】
分子のin vivoシャッフリングは変異体の作製に有用であり、多量体を組み換える細胞の自然な特性を利用して実施することができる。in vivoでの組換えが分子の多様性に対する主要な天然経路を提供しているのに対し、遺伝的組換えは比較的複雑な過程のままであり、下記の段階を含む：１）相同性の認識；２）組換えキアズマ（染色体交差点）の作製をもたらす鎖切断、鎖侵入、および代謝段階；ならびに、３）キアズマの個々の組換え分子への分解。キアズマの形成には相同的配列の認識が必要である。
【０１５６】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドからハイブリッドポリヌクレオチドを作製する方法を包含する。本発明を用いて、部分的配列相同性の少なくとも一領域を共有する、少なくとも第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドを好適な宿主細胞に導入することにより、ハイブリッドポリヌクレオチドを作製することができる。部分的配列相同性の領域は、ハイブリッドポリヌクレオチドを作製する配列再構成が起こる過程を促進する。本明細書で用いる「ハイブリッドポリヌクレオチド」とは、本発明の方法により得られ、かつ、少なくとも２つの元のポリヌクレオチド配列からの配列を含むヌクレオチド配列である。このようなハイブリッドポリヌクレオチドは、DNA分子間の配列組み込みを促進する分子間組換え事象によって起こると考えられる。加えて、このようなハイブリッドポリヌクレオチドは、反復配列を利用して、DNA分子内のヌクレオチド配列を改変する分子内還元的再構築過程によって起こると考えられる。
【０１５７】
本発明は、生物学的に活性のポリペプチド（例えば、ハイブリッドフィターゼ）をコードすることができるハイブリッドポリヌクレオチドの作製手段を提供する。一形態では、元のポリヌクレオチドは生物学的に活性のポリペプチドをコードする。本発明の方法は、得られたハイブリッドポリヌクレオチドが元の生物学的に活性のポリペプチドに由来する活性を示すポリペプチドをコードするように、元のポリヌクレオチドの配列を組み込む細胞過程を利用することにより、新規のハイブリッドポリヌクレオチドを作製する。例えば、元のポリヌクレオチドは様々な微生物由来の特定の酵素をコードし得る。ある生物に由来する第１ポリヌクレオチドもしくは変異体によりコードされた酵素が、例えば、特定の環境条件、例えば、高塩度の下で効果的に機能するとする。また、これとは異なる生物に由来する第２ポリヌクレオチドもしくは変異体によりコードされる酵素が、超高温など、異なる条件下で効果的に機能するとする。このとき、第１および第２の元のポリヌクレオチドに由来する配列を含むハイブリッドポリヌクレオチドは、元のポリヌクレオチドによりコードされた両酵素の特性を示す酵素をコードするであろう。従って、ハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、第１および第２ポリヌクレオチドによりコードされた両酵素各々が有する環境条件、例えば、高塩度および超高温下で、効果的に機能する。
【０１５８】
元のポリヌクレオチドによりコードされた酵素として、限定するものではないが、フィターゼが挙げられる。本発明の方法により得られるハイブリッドポリペプチドは、元の酵素では示されなかった特殊な酵素活性を示すことができる。例えば、ヒドロラーゼ活性をコードするポリヌクレオチドの組換えおよび／または還元的再構築の後、ハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされたハイブリッドポリペプチドをスクリーニングして、元の各酵素から得られた特別のヒドロラーゼ活性（すなわち、ヒドロラーゼが作用する結合のタイプおよびヒドロラーゼが機能する温度）について調べることができる。従って、例えば、ヒドロラーゼをスクリーニングすることにより、元のヒドロラーゼからハイブリッドヒドロラーゼを区別する化学的機能性を確認することができ、このような化学的機能性として、例えば、下記のものが挙げられる：（a）アミド（ペプチド結合）、すなわち、プロテアーゼ；（b）エステル結合、すなわち、エステラーゼおよびリパーゼ；（c）アセタール、すなわち、グリコシダーゼ、ならびに、例えば、ハイブリッドポリペプチドが機能する温度、pHもしくは塩濃度。
【０１５９】
元のポリヌクレオチドの供給源は、個々の生物から単離したもの（「単離物」）、規定培地中で生育させた生物の収集物（「濃縮培養物」）、あるいは、非培養生物（「環境サンプル」）のいずれでもよい。生物多様性の未開発資源への到達を可能にすることから、環境サンプルから新規生物活性をコードするポリヌクレオチドを誘導する培養非依存的手法を用いるのが最も好ましい。
【０１６０】
「環境ライブラリー」は、環境サンプルから作製され、好適な原核生物宿主で増やすことができるクローン化ベクター中に収容された天然に存在する生物の集合的ゲノムを呈示する。クローン化されたDNAは、初めに環境サンプルから直接抽出し、純粋培養物中で増殖させることができる原核生物細胞の小画分に限定されるわけではない。加えて、これらサンプルに存在する環境DNAの標準化は、元のサンプルに存在するすべての種から、これまでより同等のDNA呈示を可能にする。これにより、優勢な種と比較して、呈示量が数桁少ないサンプルの微量成分から興味深い遺伝子をみいだす効率を顕著に高めることができる。
【０１６１】
例えば、１つ以上の非培養微生物から作製した遺伝子ライブラリーを、関心のある活性についてスクリーニングする。まず、関心のある生物活性分子をコードする可能性がある経路を、遺伝子発現ライブラリーの形で原核細胞中に捕獲する。次に、関心のある活性をコードするポリヌクレオチドをこのようなライブラリーから単離し、宿主細胞に導入する。そして、新規または増強された活性を有する潜在的な活性生物分子を生成する組換えおよび／または還元的再構築を促進する条件下で、上記宿主細胞を増殖させる。
【０１６２】
ポリヌクレオチドを調製することができる微生物としては、キサントバクター（Xanthobacter）、真正細菌および古細菌のような原核微生物、ならびに、真菌、数種の藻類および原生動物のような下等真核微生物が挙げられる。ポリヌクレオチドは、環境サンプルから単離することができるが、その場合、生物を培養することなく核酸を回収することもできるし、あるいは、１以上の培養生物から回収することも可能である。一形態では、このような微生物は、超好熱菌、好冷菌、低温発育菌、好塩基性菌、好圧菌および好酸性菌などの好極限性細菌でよい。好極限性微生物から単離したポリヌクレオチドコード化酵素が特に好ましい。このような酵素は、地熱温泉や深海の熱道（thermal vents）で100℃を超える温度、北極海水中の０℃を下回る温度、死海の飽和塩環境、石炭鉱床および地熱イオウ多含有泉における０前後のpH値、あるいは、汚泥における11を超えるpH値でも機能し得る。例えば、好極限性生物からクローン化および発現された数種のエステラーゼやリパーゼは、広い温度およびpH範囲において高い活性を示す。
【０１６３】
以上記載してきた、選択および単離されたポリヌクレオチドは、好適な宿主細胞中に導入する。好適な宿主細胞は、組換えおよび／または還元的再構築を促進することができるあらゆる細菌である。選択されたポリヌクレオチドは、好ましくは、好適な制御配列を含むベクター中にすでに存在する。宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核生物細胞、または酵母細胞のような下等真核生物細胞のいずれでもよく、あるいは、好ましくは、宿主細胞は、細菌細胞などの原核生物細胞でよい。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、もしくはエレクトロポレーションにより実施することができる（Davisら、1986）。
【０１６４】
好適な宿主の代表例として、下記のものを挙げることができる：大腸菌、ストレプトミセス、ネズミチフス菌などの細菌細胞；酵母などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Drosophila）S2およびSpodoptera Sf9などの昆虫細胞；CHO、COSまたはBowes黒色腫などの動物細胞；アデノウイルス；ならびに、植物細胞。好適な宿主の選択は、本明細書における教示から当業者の技量の範囲内にあると認められる。
【０１６５】
特に、組換えタンパク質を発現させるのに用いることができる各種哺乳動物細胞培養系に関して、哺乳動物発現系の例として、「SV40-形質転換したサル細胞が、初期SV40突然変異体の複製を支持する」（Gluzman, 1981）に記載されているサル腎繊維芽細胞のCOS-7系、ならびに、適合性ベクターを発現することができるその他の細胞系、例えば、C127、3T3、CHO、HelaおよびBHK細胞系が挙げられる。哺乳動物の発現ベクターは、複製起点、好適なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに、あらゆる必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、転写終結配列、および5’フランキング非転写配列を含んでなる。SV40スプライスに由来するDNA配列、ならびに、ポリアデニル化部位を用いて、必要な非転写遺伝エレメントを提供することができる。
【０１６６】
関心のあるポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択または遺伝子の増幅のために適宜改変した通常の栄養培地で培養することができる。温度やpHなどの培養条件は、発現のために選択した宿主細胞についてすでに用いたものと同様であり、当業者には明らかであろう。次に、特別の酵素活性を有するものとして識別されたクローンを配列決定することにより、活性が増強された酵素をコードするポリヌクレオチド配列を同定することができる。
【０１６７】
別の形態では、上記方法を用いて、１以上のオペロンまたは遺伝子クラスターもしくはその部分から生化学的経路をコードする新規のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、細菌および多くの真核生物は、遺伝子（その産物が関連するプロセスに関与する）を調節するための同調機構を有する。遺伝子は、単一の染色体上にまたは互いに直接隣接して、「遺伝子クラスター」と呼ばれる構造にクラスター化した後、全クラスターの転写を開始する単一プロモーターなど、単一の調節配列の制御下で一緒に転写される。従って、遺伝子クラスターは、通常機能に関して同一であるか関連している隣接遺伝子の一群である。遺伝子クラスターによりコードされる生化学的経路の一例はポリケチドである。ポリケチドは、抗生物質（テトラサイクリンおよびエリスロマイシンなど）、抗癌剤（ダウノマイシン）、免疫抑制剤（FK506およびラパマイシン）、ならびに、動物用薬品（モネンシン）など、極めて豊富な生物活性の供給源となる分子である。多くのポリケチド（ポリケチドシンターゼにより生成される）は治療薬として価値がある。ポリケチドシンターゼは、長さおよび機能性と環化のパターンが様々である非常に多種の炭素鎖の生合成を触媒する多機能酵素である。ポリケチドシンターゼ遺伝子は遺伝子クラスターに分類され、少なくとも１種（Ｉ型と呼ばれる）のポリケチドシンターゼが大きなサイズの遺伝子および酵素を有し、遺伝子操作およびこれらの遺伝子／タンパク質のin vitro実験を複雑にしている。
【０１６８】
遺伝子クラスターDNAは、様々な生物から単離して、ベクター（特に連結され
た遺伝子クラスターから検出可能なタンパク質またはタンパク質関連アレイ活性の生産を制御し調節することができる発現調節配列を含むベクター）に連結することができる。外因性DNA導入の能力が非常に大きいベクターを用いるのが、このような遺伝子クラスターの使用には特に適しており、その例として、本明細書では、例えば、大腸菌のｆ因子（すなわち稔性因子）が挙げられる。大腸菌のこのｆ因子は、接合の際、それ自体の高頻度転移に影響を与えるプラスミドであり、混合微生物サンプル由来の遺伝子クラスターのような大きなDNA断片を成し遂げて、安定的に増殖させるのに理想的である。ひとたび適切なベクターに連結されたら、異なるフィターゼ遺伝子クラスターを含む２以上のベクターを好適な宿主細胞に導入することができる。遺伝子クラスターが共有する部分的配列相同性の領域が、配列再構成を達成する過程を促進し、これによって、ハイブリッド遺伝子クラスターが得られる。次に、この新しいハイブリッド遺伝子クラスターをスクリーニングし、元の遺伝子クラスターには存在しない増強された活性について調べることができる。
【０１６９】
従って、一実施形態では、本発明は、生物学的に活性のハイブリッドポリペプチドを作製した後、下記のステップにより、このようなポリペプチドを、増強された活性についてスクリーニングする方法に関する：
１）少なくとも、機能的に連結された第１ポリヌクレオチドと、機能的に連結された第２ポリヌクレオチドとを好適な宿主細胞に導入するステップ、その際、上記少なくとも第１ポリヌクレオチドおよび第２ポリヌクレオチドが、部分的配列相同性の少なくとも１領域を共有していること；
２）配列再構成を促進する条件下で宿主細胞を増殖させることにより、機能的に連結されたハイブリッドポリヌクレオチドを取得するステップ；
３）上記ハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされたハイブリッドポリペプチドを発現させるステップ；
４）増強した生物学的活性の識別を促進する条件下で上記ハイブリッドポリペプチドをスクリーニングするステップ；および
５）上記ハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するステップ。
【０１７０】
各種酵素活性をスクリーニングする方法は、当業者には公知であり、本明細書全体を通して説明する。このような方法は、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを単離する際に用いることができる。
【０１７１】
本明細書で用いることができる発現ベクターの代表的な例として、下記のものを挙げることができる：ウイルス粒子、バキュロウイルス、バクテリオファージ１挿入ベクターまたは置換ベクター、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体（BAC）、ウイルスDNA（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびSV40の誘導体）、P1系の人工染色体（PAC）、酵母プラスミド、酵母人工染色体（YAC）、ならびに、関心のある特定の宿主に特異的なその他のベクター（バチルス、アスペルギルスおよび酵母）。従って、例えば、上記DNAを、ポリペプチドを発現させる多様な発現ベクターのいずれか１つに含有させることができる。このようなベクターとして、染色体、非染色体および合成DNA配列がある。多数の好適なベクターが当業者には公知であり、市販されている。例として、下記のベクターが挙げられる；細菌性：pQEベクター（Qiagen）、pBluescriptプラスミド、pNHベクター（λ-ZAPベクター（Stratagene）；ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T（Pharmacia）；真核生物性：pXT1、pSG5（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40（Pharmacia）。しかし、宿主内で複製可能かつ生存可能であれば、これ以外のどのようなプラスミドまたはベクターを用いてもよい。本発明では、低コピー数または高コピー数のベクターを用いることもできる。
【０１７２】
本発明で使用するのに好ましいタイプのベクターは、ｆ因子複製起点を含んでいる。大腸菌におけるｆ因子（すなわち、稔性因子）は、接合の際、それ自体の高頻度転移、ならびに、これより低い頻度の細菌染色体自体の転移に影響を与えるプラスミドである。特に好ましい実施形態では、「フォスミド（fosmid）」もしくは細菌人工染色体（BAC）ベクターと呼ばれるクローニングベクターを用いる。これらは、ゲノムDNAの大きなセグメントを安定して組み込むことができる大腸菌ｆ因子から誘導される。非培養の混合環境サンプルからのDNAを組み込む場合には、これによって、大きなゲノム断片を安定した「環境DNAライブラリー」の形に成し遂げることができる。
【０１７３】
本発明で用いる別のタイプのベクターは、コスミドベクターである。コスミドベクターは、本来、ゲノムDNAの大きなセグメントをクローン化および増殖させるよう設計されたものである。コスミドベクターへのクローン化については、「分子クローニング：研究室マニュアル」（Sambrookら、1989）に詳しく記載されている。
【０１７４】
発現ベクターにおけるDNA配列は、RNA合成を指令するのに適した発現制御配列（プロモーター）に機能的に連結させる。特に挙げられる細菌プロモーターには、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PLおよびtrpがある。真核生物のプロモーターとしては、CMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、ならびに、マウスメタロチオネイン-Iが挙げられる。適したベクターおよびプロモーターの選択は、当業者の技術レベルの範囲内にある。発現ベクターはまた、翻訳開始用のリボソーム結合部位と、転写ターミネーターも含む。加えて、このベクターは、発現を増幅するのに適した配列を含んでいてもよい。プロモーター領域は、選択マーカーを有するCAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターもしくはその他のベクターを用いて、所望の遺伝子から選択することができる。さらに、発現ベクターは、１以上の選択マーカー遺伝子を含むことにより、真核生物細胞培養用のジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、あるいは、大腸菌におけるテトラサイクリンもしくはアンピリシン耐性など、形質転換された宿主細胞を選択するための表現型特性を提供するのが好ましい。
【０１７５】
in vivo再構築は、「分子間」過程に集約されるが、これらの過程は、まとめて「組換え」と呼ばれ、細菌での場合、一般には、「RecA依存性」の現象とみられている。本発明は、配列を組換えおよび再構築する宿主細胞の組換え過程、つまり、欠失により細胞における準反復配列の複雑性を軽減するために細胞が還元過程を媒介する能力、を利用することができる。この「還元的再構築」の過程は、「分子内の」、RecA-非依存過程により起こる。
【０１７６】
従って、本発明の別の形態では、還元的再構築の方法により、変異体ポリヌクレオチドを作製することができる。この方法は、隣接した配列（元のコード配列）を含む構築物の作製、適したベクターへの挿入、続いて、適した宿主細胞への導入を含んでなる。個々の分子の再構築は、相同性領域を含む構築物における隣接配列間、もしくは準反復単位間の組合せ過程（combinatorial process）によって起こる。再構築過程は、反復配列の複雑性および程度を組み換え、かつ／または軽減し、その結果、新しい分子種を生成させる。再構築率を高めるために各種の処理を実施することができる。このような処理として、紫外線、もしくはDNA損傷化学薬品による処理、および／または増強されたレベルの「遺伝的不安定性」を展示する宿主細胞系の使用が挙げられる。従って、再構築過程は、相同的組換えまたは準反復配列の天然の特性を含めることにより、それら自身の進化を指令することができる。
【０１７７】
反復または「準反復」配列は、遺伝的不安定性においてある役割を果たしている。本発明では、「準反復配列」とは、その元の単位構造に限定されない反復配列を意味する。準反復単位は、構築物における配列のアレイ、類似配列の連続した単位、として表すことができる。いったん連結されると、隣接する配列間の接続は、ほとんど見えなくなり、得られた構築物の準反復性が分子レベルで連続することになる。得られた構築物の複雑性を軽減するために細胞が行う細胞の欠失過程は、準反復配列間で機能する。この準反復単位は、滑り（slippage）事象が起こり得る鋳型のほぼ無制限のレパートリーを提供する。従って、準反復配列を含む構築物は、欠失（および潜在的に挿入）事象が準反復単位内のほぼどこでも起こり得るように十分な分子弾性を効果的に提供する。
【０１７８】
準反復配列がすべて同じ配向、例えば、頭−尾またはその反対方向に連結されると、細胞は個々の単位を識別することができない。その結果、還元的過程が配列全体で起こる可能性がある。対照的に、例えば、単位が頭−尾ではなく、頭−頭で示される場合には、逆転が隣接する単位の終点を正確に描く結果、欠失の形成は個別の単位の喪失に有利となる。従って、本発明の方法の場合には、配列が同じ配向であることが好ましい。準反復配列のランダム配向では、再構築効率の低下をまねくのに対し、配列の一貫した配向は、最も高い効率をもたらすであろう。しかし、同じ配向の隣接した配列が少ないほど効率が下がるものの、それでも、新しい分子の効率的回収に十分な弾性を提供し得る。同じ配向の準反復配列を用いて構築物を作製することにより、効率を高めることができる。
【０１７９】
下記を含む様々な方法のいずれかを用いて、頭−尾配向に配列をアセンブリさせることができる：
a）ポリA頭およびポリT尾を含むプライマーであって、一本鎖に作製されたと
き、配向を付与するものを用いることができる。これは、プライマーの最初の数塩基をRNAから作製し、そこから容易にRNAseHを除去することにより達成される
。
【０１８０】
b）ユニーク制限切断部位を含むプライマーを使用することができる。多数の部位、一群のユニーク配列、ならびに、反復合成および連結段階が必要である。
【０１８１】
c）プライマーの内部の数塩基をチオール化し、エキソヌクレアーゼを用いて、適正にテイル（尾部）化した分子を生成する。
【０１８２】
再構築された配列の回収は、還元されたRIを含むクローニングベクターの同定により行なう。次に、再構築されたコード配列を増幅により回収することができる。産物を再クローン化し、発現させる。還元RIを含むクローニングベクターの回収は、下記により実施することができる：
１）構築物の複雑度が軽減されている場合にのみ安定して維持されるベクターの使用。
【０１８３】
２）物理的方法による、短くなったベクターの物理的回収。この場合、クローニングベクターを標準的プラスミド単離方法により回収した後、標準的方法を用いてアガロースゲルまたは低分子量カットオフを有するカラムのいずれかでサイズ分画する。
【０１８４】
３）挿入物のサイズが減少すると選択することができる分断遺伝子を含むベクターの回収。
【０１８５】
４）発現ベクターおよび適切な選択による直接選択法の使用。
【０１８６】
関連する生物からのコード配列（例えば、遺伝子）は、高度の相同性を示すと同時に、かなり多様なタンパク質産物をコードする。これらのタイプの配列は、準反復配列として、本発明において特に有用である。しかし、以下に示す実施例では、ほぼ同じ元のコード配列（準反復配列）の再構築を示すが、この方法は、このようなほぼ同じ準反復配列に限定されるわけではない。
【０１８７】
以下の実施例は本発明の方法を示す。３つのユニークな種に由来するコード化核酸配列（準反復配列）について説明する。各配列は明確に異なるセットの特性を有するタンパク質をコードする。これらの配列は、それぞれ、「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」と称する配列におけるユニークな位置で、単一または数個の塩基対が異なる。準反復配列は個別にまたは集団として増幅して、ランダムアセンブリに連結することにより、連結分子の集団においてあらゆる可能な順列・組合せが利用可能となるようにする。準反復単位の数はアセンブリ条件により制御することができる。構築物における準反復単位の平均数を反復指数（RI）として定義する。
【０１８８】
いったん形成されると、構築物は、公開されたプロトコルに従ってアガロースゲル上でサイズ分画してもよいし、しなくてもよい。次に、該構築物をクローニングベクターに挿入した後、適した宿主細胞にトランスフェクトする。次いで、該細胞を増殖させ、「還元的再構築」を実施する。還元的再構築プロセスの速度は、所望であれば、DNA損傷の導入により刺激することができる。RIの還元（低減）が「分子内」機構による反復配列間の欠失形成か、あるいは、「分子間」機構を介した組換え様事象のいずれにより媒介されているかは、重要ではない。目的とする結果は、あらゆる可能な組合せへの分子の再構築である。
【０１８９】
場合によっては、上記方法は、結合もしくは相互作用する能力、あるいは、特定の反応を触媒する（例えば、ハロアルカンの加水分解を触媒するなどの）能力を有する個別のシャッフルされたライブラリーメンバーを同定するために、シャッフルされたプールのライブラリーメンバーをスクリーニングする追加のステップを含む。
【０１９０】
このようなライブラリーから同定したポリペプチドは、治療、診断、研究および関連目的（例えば、触媒や、水溶液の容量オスモル濃度を高めるための溶質など）のために用いることができ、かつ／または、さらにシャッフリングおよび／または選択の1以上のサイクルに付してもよい。
【０１９１】
別の形態では、組換えまたは再構築の前もしくはその最中に、本発明のポリヌクレオチド、あるいは、本明細書に記載した方法により作製されたポリヌクレオチドを、元のポリヌクレオチドへの突然変異の導入を促進する薬剤または工程に付すことができる。このような突然変異の導入により、得られるハイブリッドポリヌクレオチドと、それからコードされたポリペプチドの多様性が増加する。突然変異誘発を促進する薬剤または工程として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：(+)-CC-1065、もしくは(+)-CC-1065-(N3-アデニン)のような合成類似体（SunおよびHurley、1992参照）；DNA合成を阻害することができるN-アセチル化または脱アセチル化4’-フルオロ-4-アミノビフェニル付加物（例えば、van de Pollら、1992を参照）；DNA合成を阻害することができるN-アセチル化または脱アセチル化4-アミノビフェニル付加物（同様に、van de Pollら、1992、pp. 751-758を参照）；DNA複製を阻害することができる三価クロム、三価クロム塩、多環式芳香族炭化水素（PAH）DNA付加物、例えば、7-ブロモメチル-ベンズ[a]アントラセン（BMA）、トリ(2,3-ジブロモプロピル)ホスフェート（Tris-BP）、1,2-ジブロモ-3-クロロプロパン（DBCP）、2-ブロモアクロレイン（2BA
）、ベンゾ[a]ピレン-7,8-ジヒドロジオール-9-10-エポキシド（BPDE）、白金（II）ハロゲン塩、N-ヒドロキシ-2-アミノ-3-メチルイミダゾ[4,5-f]-キノリン（N-ヒドロキシ-IQ）、およびN-ヒドロキシ-2-アミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾ[4,5-f]-ピリジン（N-ヒドロキシ-PhIP）。PCR増幅を遅速化または停止する特に好ましい手段は、紫外線、(+)-CC-1065および(+)-CC-1065-(N3-アデニン)からなる。特に好ましい手段は、DNA付加物、もしくはポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプールからのDNA付加物を含んでなるポリヌクレオチドであり、これらは、該ポリヌクレオチドを含む溶液を処理する前に、加熱などの方法により放出または回収することができる。
【０１９２】
別の形態では、本発明は、ハイブリッドまたは再構築ポリヌクレオチドの生産を可能にする本発明に従う条件下で、野生型タンパク質をコードする二本鎖鋳型ポリヌクレオチドを含むサンプルを処理することにより、生物活性を有する組換えタンパク質を作製する方法に関する。
【０１９３】
本発明はまた、専売特許のコドンプライマー（縮重N,N,N配列を含む）を用いて、点突然変異をポリヌクレオチドに導入することにより、全範囲の単一アミノ酸置換を各アミノ酸位置で呈示する子孫ポリペプチドのセットを作製することを可能にする（遺伝子部位飽和突然変異誘発（GSSM））。用いるオリゴは、第１相同配列、縮重N,N,N配列、ならびに、好ましくは（しかし必ずしも必要ではない
）第２相同配列から連続的に構成される。このようなオリゴの使用により得られる下流の子孫翻訳産物は、N,N,N配列の縮重性が20種のアミノ酸すべてのコドンを含んでいるために、ポリペプチドに沿って各アミノ酸部位にあらゆる可能なアミノ酸改変を含んでいる。
【０１９４】
一形態では、このような１つの縮重オリゴ（１つの縮重N,N,G/Tカセットからなる）を用いて、親ポリヌクレオチド鋳型中の元の各コドンを全範囲のコドン置換に付す。別の形態では、少なくとも２つの縮重N,N,G/Tカセット（同じオリゴでも、違うものでもよい）を用いて、親ポリヌクレオチド鋳型中の少なくとも２つの元のコドンを全範囲のコドン置換に付す。従って、１つのオリゴに１以上のN,N,G/T配列を含ませることにより、１以上の部位にアミノ酸突然変異を導入することができる。このような複数のN,N,G/T配列は、直接隣接していてもよいし、あるいは、１以上の別のヌクレオチド配列により隔てられていてもよい。別の形態では、付加および欠失を導入するのに使用可能なオリゴを単独で、あるいは、N,N,G/T配列を含むコドンと組み合わせて用いることにより、アミノ酸付加、欠失、および／または置換のあらゆる組合せもしくは順列を導入することができる。
【０１９５】
特定の実施形態では、連続したN,N,G/Tトリプレット、すなわち、縮重(N,N,G/T)n配列を含むオリゴを用いて、２以上の隣接するアミノ酸位置に同時に突然変異を誘発することも可能である。
【０１９６】
別の形態では、本発明は、N,N,G/T配列より縮重が低い縮重カセットの使用を提供する。例えば、いくつかのケースでは、ただ１つのNからなる縮重トリプレット配列を（例えば、オリゴにおいて）用いるのが望ましく、その際、Nは、上記トリプレットの最初の第２または第３位置にあってよい。上記トリプレットの残る２つの位置には、前記のあらゆる組合せおよび順列を含むその他いずれかの塩基を用いることもできる。あるいは、いくつかのケースでは、縮重N,N,Nトリプレット配列、もしくはN,N,G/Cトリプレット配列を（例えば、オリゴにおいて）用いるのが望ましい。
【０１９７】
しかし、本発明で開示する縮重トリプレット（N,N,G/TまたはN,N,G/Cトリプレット配列）の使用は、いくつかの理由で有利であることに留意されたい。一形態では、本発明は、ポリペプチドにおける各および全アミノ酸位置への全範囲の可能なアミノ酸（合計20種のアミノ酸）の置換を系統的かつ非常に容易に作製する手段を提供する。従って、100アミノ酸ポリペプチドについては、本発明は、2000の個別種（すなわち、１位置につき20種の可能なアミノ酸に、100のアミノ酸位置をかける）を系統的かつ非常に容易に作製する手段を提供する。縮重N,N,G/TまたはN,N,G/Cトリプレット配列を含むオリゴの使用により、20種の可能なアミノ酸をコードする32の個別配列が提供されることを理解されたい。従って、このようなオリゴを用いて、親ポリヌクレオチド配列を飽和突然変異誘発に付す反応容器中では、20の個別ポリペプチドをコードする32の個別子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、部位特異的突然変異誘発に非縮重オリゴを用いると、１反応容器につき、ただ１つの子孫ポリペプチドしか生成されない。
【０１９８】
本発明はまた、非縮重オリゴの使用も提供するが、これは、場合によっては、縮重プライマーと組み合わせて用いることができる。状況によっては、非縮重オリゴを用いて、実施ポリヌクレオチドに特定の点突然変異を発生させるのが有利であることも理解されたい。これにより、特定のサイレント点突然変異、対応するアミノ酸改変を起こす点突然変異、ならびに、停止コドンの生成や、ポリペプチド断片の対応する発現を起こす点突然変異を発生させる手段を提供する。
【０１９９】
従って、一実施形態では、各飽和突然変異誘発反応容器は、少なくとも20種の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含み、これにより、20アミノ酸すべてが、親ポリヌクレオチドで突然変異誘発されたコドン位置に対応する１つの特定アミノ酸位置に呈示される。各飽和突然変異誘発反応容器から生産された32倍縮重子孫ポリペプチドをクローン増幅に付した（例えば、発現ベクターを用いて、好適な大腸菌宿主にクローン化する）後、発現スクリーニングに付すことができる。スクリーニングにより、（親ペプチドと比較して）有利な特性変化を示す個々の子孫ポリペプチドをスクリーニングして同定したら、そこに含まれる有利なアミノ酸置換を確認することができる。
【０２００】
本明細書に開示するように、飽和突然変異誘発を用いて、親ポリペプチド中の各および全アミノ酸位置に突然変異を誘発すると、１以上のアミノ酸位置で、有利なアミノ酸変化を同定することができる。これらの有利なアミノ酸置換の全部または一部の組合せを含む１以上の新しい子孫分子を生成することができる。例えば、２つの特定の有利なアミノ酸変化が、ポリペプチドの３つのアミノ酸位置の各々で確認されれば、順列は、各位置での３つの可能性（元のアミノ酸からの変化なし、および２つの有利な変化の各々）と３つの位置を含む。従って、３×３×３、すなわち、合計27の可能性がある。そのうち７つはすでに試験済であり、６つは単一点突然変異（すなわち、３位置の各々で２つ）であり、１つはどの位置にも改変がない。
【０２０１】
別の形態では、部位飽和突然変異誘発は、スクリーニングと共に、シャッフリング、キメラ化、組換えおよびその他の突然変異誘発方法と一緒に用いることができる。本発明は、反復方式で、飽和突然変異誘発などのあらゆる突然変異誘発方法の使用を提供する。一実施形態では、いずれかの突然変異誘発方法の反復使用をスクリーニングと組み合わせて用いる。
【０２０２】
従って、非制限的例では、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、別の突然変異誘発方法と組み合わせた飽和突然変異誘発により誘導することができる。組み合わせる方法として、例えば、２以上の関連ポリヌクレオチドを好適な宿主細胞に導入し、組換えおよび還元的再構築により、ハイブリッドポリヌクレオチドを作製する方法がある。
【０２０３】
遺伝子の全配列に沿って突然変異誘発を実施する以外に、突然変異誘発を用いて、ポリヌクレオチド配列におけるどんな数の塩基も各々置換することができ、その際、突然変異を誘発しようとする塩基数は、好ましくは、15から100,000までのあらゆる整数である。従って、分子に沿ってすべての位置に突然変異を誘発するのではなく、各塩基または個別の数の塩基（好ましくは、合計15〜100,000のサブセット）を突然変異誘発に付すことができる。好ましくは、個別のヌクレオチドを用いて、ポリヌクレオチド配列に沿った各位置または位置グループに突然変異を誘発する。突然変異を誘発しようとする３つの位置のグループがコドンである。突然変異は、突然変異誘発プライマーを用いて導入するのが好ましく、その際、該プライマーは、異種カセットを含み、突然変異誘発カセットとも呼ばれている。好ましいカセットは１〜500塩基をもつことができる。このような異種カセットにおける各ヌクレオチド位置は、N、A、C、G、T、A/C、A/G、A/T、C/G、C/T、G/T、C/G/T、A/G/T、A/C/T、A/C/GまたはEであり、その際、Eは、A、C、G、またはTではない任意の塩基である（Eは、デザイナーオリゴと呼ぶことができる）。
【０２０４】
一般的な意味で、飽和突然変異誘発は、突然変異を誘発しようとする規定ポリヌクレオチド配列（ここで、突然変異を誘発しようとする配列は、好ましくは、長さが約15〜100,000塩基である）における突然変異誘発カセット（ここで、各カセットは、好ましくは、長さが約１〜500塩基である）の完全なセットに突然変異を誘発することからなる。従って、突然変異の１グループ（１〜100突然変異）を、突然変異を誘発しようとする各カセットに導入する。１つのカセットに導入すべき突然変異のグループ分けは、飽和突然変異誘発の１ラウンドの実施中に、第２のカセットに導入すべき突然変異の第２グループ分けと異なっていても、同じでもよい。このようなグループ分けの例としては、欠失、付加、特定コドンのグループ分け、ならびに、特定のヌクレオチドカセットのグループ分けが挙げられる。
【０２０５】
突然変異を誘発しようとする規定配列としては、全遺伝子、経路、cDNA、全オープンリーディングフレーム（ORF）、ならびに、全プロモーター、エンハンサー、リプレッサー／トランスアクチベーター、複製起点、イントロン、オペレーター、あるいは、あらゆるポリヌクレオチド官能基が挙げられる。一般に、この目的の「規定配列」は、15塩基ポリヌクレオチド配列、ならびに、長さが15塩基から15,000塩基（本発明では、特に、その間の全整数を挙げる）までのポリヌクレオチド配列を含むあらゆるポリヌクレオチドでよい。コドンのグループ分けに際しては、縮重突然変異誘発カセットによりコードされるアミノ酸の種類も考慮する。
【０２０６】
突然変異誘発カセットに導入することができる突然変異のグループ分けの特に好ましい実施形態では、本発明は特に、各位置で２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19および20種のアミノ酸をコードする縮重コドン置換（縮重オリゴを使用）、ならびに、これによってコードされるポリペプチドのライブラリーを提供する。
【０２０７】
本発明はまた、成熟酵素のコード配列が同じリーディングフレームで宿主細胞からの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列（例えば、細胞からの酵素の輸送を制御する機能を果たすリーダー配列）に融合され得るポリヌクレオチドを包含する。リーダー配列を有する酵素がプレタンパク質の１例であり、これは、上記リーダー配列を宿主細胞により切断させて、酵素の成熟形態を形成することができる。ポリヌクレオチドはプロタンパク質もコードすることができ、プロタンパク質の例として、追加の5’アミノ酸残基を含む成熟タンパク質が挙げら
れる。プロ配列を有する別の成熟タンパク質として、タンパク質の不活性形態であるプロタンパク質が挙げられる。いったんプロ配列が切断されると、活性の成熟タンパク質が残る。
【０２０８】
従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟酵素、またはプロ配列を有する酵素、あるいは、プロ配列とプレ配列（例えば、リーダー配列）の両方を有する酵素をコードすることができる。
【０２０９】
本発明のフィターゼ酵素のコード配列は、例えば、B型大腸菌DNAを調製し、ゲノムDNAから、フィターゼ活性をコードするDNAを回収する（例えば、PCR増幅する）ことにより同定した。このような回収方法は、当技術分野ではよく知られている。例えば、一手段は、コード配列を回収するように増幅プライマーを設計し、ゲノムDNAから遺伝子を増幅し、このDNAをベクターにサブクローン化し、得られた構築物を宿主株に形質転換した後、フィターゼ酵素を発現させて評価することからなる。このような手順は、当技術分野ではよく知られており、例えば、Sambrookら、1989（本明細書に参照によりその全文を組み込む）に記載されている。
【０２１０】
好ましい実施形態では、下記の技法により本発明の酵素をB型大腸菌ゲノムDNAから単離した：
市販のB型大腸菌ゲノムDNA（Sigma：カタログ番号D-2001、St. Louis, New Jersey）を入手した。下記のプライマーを用いて、ゲノムDNAから直接遺伝子を増幅した：
5’プライマーgtttctgaattcaaggaggaatttaaATGAAAGCGATCTTAATCCCATT（配列番号３）；および
3’プライマーgtttctggatccTTACAAACTGCACGCCGGTAT（配列番号４）。
【０２１１】
製造業者のプロトコル（Stratagene Cloning Systems, Inc., La Jolla, CA）に従い、Pfuポリメラーゼを用いた。
【０２１２】
製造業者のプロトコルに従い、PCR産物およびpQE60ベクター（Qiagen）の両方をEcoRIおよびBglII制限エンドヌクレアーゼ（New England Biolabs）で消化した。M15 pREP4宿主細胞（Qiagen）への結合および形質転換、ならびに、該宿主細胞での発現により、Ｃ末端が6X-Hisでタグ付けされたタンパク質を得た。
【０２１３】
その後、単離した核酸配列およびその他の酵素は、例えば、酵素フィターゼ活性を検出するアッセイ（Food Chemicals Codex、第４版）で、本発明の酵素に対する生物活性の保持について測定する。このような酵素としては、トランケートされた形のフィターゼ、ならびに、欠失および挿入変異体などの変異体が挙げられる。
【０２１４】
このようなアッセイのin vitro実施例は、フィターゼ活性を検出する下記のアッセイである：フィターゼ活性は、１mM CaCl2を補充した100 mM Tris HClバッファーpH 7.5中の600μlの２mMフィチン酸ナトリウムと共に、150μlの酵素調製物を37℃で30分インキュベートすることにより測定することができる。インキュベーション後、750μlの５％トリクロロ酢酸を添加することにより、反応を停止する。放出されたリン酸について、1500μlの着色試薬（5.5％硫酸中の４倍容量の1.5％モリブデン酸アンモニウムと、１倍容量の2.7％硫酸第一鉄；Shimizu、1992）を添加した後、700 nmで標準的分光光度計により測定した。酵素活性の１単位は、アッセイ条件下で、毎分１μmolのPiを遊離させるのに必要な酵素の量として定義する。比活性はタンパク質１mg当たりの酵素活性の単位で表すことができる。
【０２１５】
本発明の酵素は、フィチン酸のイノシトールおよび遊離リン酸への加水分解に関して酵素活性を有する。
【０２１６】
本発明の酵素およびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、好ましくは、均一に精製される。本発明のフィターゼポリペプチドは、いくつかの標準的方法のいずれを用いても取得することができる。例えば、フィターゼポリペプチドは、標準的組換え発現系（以下を参照）で生産するか、化学的に合成する（この手法は、小さいフィターゼポリペプチド断片に限られる）か、あるいは、それらを天然で発現する生物から精製することができる。使用可能な組換え発現方法は、哺乳動物宿主、微生物宿主、および植物宿主の使用を含む。
【０２１７】
本発明のフィターゼ分子の組換え発現は、例えば、その他の酵素など、１以上の追加の分子と組み合わせて達成することができる。この手法は、本発明のフィターゼ分子と１以上の追加の分子を含む植物または植物部分などの、組合せ産物を生産するのに使用可能であり、好ましくは、上記フィターゼ分子と追加の分子は組合せ処理で使用可能である。その結果得られる、組換えにより発現された分子は、均一化および／または精製された形態で、あるいは、あまり精製されていない形態で（例えば、フィチン酸の分解を触媒するためにその他の食物と混合したとき使用できる摂取可能な植物部分として）使用することができる。
【０２１８】
要約すれば、非制限的実施形態において、本発明は、宿主に発現させた組換え酵素を提供する。別の非制限的実施形態では、本発明は、実質的に純粋なフィターゼ酵素を提供する。従って、本発明の酵素は、組換え酵素、天然酵素、もしくは合成酵素、好ましくは、組換え酵素であり得る。
【０２１９】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、ならびに、組換え法による本発明の酵素の生産にも関する。
【０２２０】
宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターで遺伝子工学的に操作される（例えば、形質導入または形質転換もしくはトランスフェクトされる）。このようなベクターは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターである。このベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ、プリオンなどの形態をしていてよい。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化しかつ／または形質転換体を選択するかもしくは本発明の遺伝子を増幅するように、適宜修飾された通常の栄養培地中で培養することができる。温度、pHなどの培養条件は、発現用に選択された宿主細胞ですでに用いたものと同じであり、当業者には明らかであろう。
【０２２１】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技法で酵素を産生するために使用することができる。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、酵素を発現させる多様な発現ベクターのいずれかに含有させることができる。このようなベクターとして、下記のものが挙げられる：染色体、非染色体および合成DNA配列、例えば、SV40の誘導体；細菌プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組合せに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルスなどのウイルスDNA。しかし、複製可能かつ生存可能であれば、その他のどのようなベクターを用いてもよい。
【０２２２】
多様な方法によって、適したDNA配列を上記ベクターに挿入することができる。一般に、DNA配列は、当分野で公知の方法により、適した制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。これには、制限消化、ならびに、制限消化非依存的手段を用いて作製することができる平滑末端分子の使用も包含される。あるいは、挿入物は、いわゆる「リガーゼ非依存的」手段により、ベクターに組み込むことができる。特定の形態では、「リガーゼ非依存的」手段は、例えば、TOPO-TA Cloning（商標登録）（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）と称する市販のキットに従い、室温でトポイソメラーゼ媒介連結を採用することにより実施される。トポイソメラーゼの異性体、および、これより遠縁の組換え酵素（例えば、リコンビナーゼ）など、別の酵素も、このようなタイプの「リガーゼ非依存的」組込みを媒介するのに使用可能である。別の特定の形態では、「リガーゼ非依存的」手段は、例えば、宿主修復機構を用いて実施する。前記およびその他の方法は当業者の技量の範囲内にあると認められる。
【０２２３】
発現ベクター中のDNA配列は、mRNA合成を指令するために、適した発現制御配列（プロモーター）に機能的に連結される。このようなプロモーターの代表例として、下記のものが挙げられる：LTRまたはSV40プロモーター、大腸菌、lacまたはtrp、ファージλPLプロモーター、ならびに、原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスにおける遺伝子の発現を制御することが知られているその他のプロモーター。また、発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターも含む。さらに、ベクターは、発現を増幅する好適な配列を含んでもよい。
【０２２４】
加えて、発現ベクターは、好ましくは、１以上の選択マーカー遺伝子を含むことにより、形質転換した宿主細胞の選択のための表現型特性を提供する。このようなマーカーとして、真核生物の細胞培養物ではジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、あるいは、大腸菌におけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性が挙げられる。
【０２２５】
前述した好適なDNA配列、ならびに、好適なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを用いて、好適な宿主を形質転換することにより、宿主にタンパク質を発現させることができる。
【０２２６】
好適な宿主の代表例として、下記のものを挙げることができる：大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌などの細菌細胞；酵母のような真菌細胞；ショウジョウバエS2やSpodoptera Sf9のような昆虫細胞；CHO、COSまたはBowes黒色腫などの動物細胞；アデノウイルス；植物細胞など。好適な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の技量の範囲内にあるものとする。
【０２２７】
さらに具体的には、本発明は、これまで広範に説明してきた１以上の配列を含んでなる組換え構築物を含む。この構築物は、本発明の配列が順方向または逆方向に挿入されたプラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターを含む。この実施形態の好ましい態様では、上記構築物はさらに、例えば、上記配列に機能的に連結されたプロモーターなどの調節配列を含む。また、１以上の別の挿入物を組み込むことにより、別のフィターゼまたはプロテアーゼ酵素など、１以上の別の分子の発現を達成することができる。好ましくは、上記１以上の別の分子は、組合せ処理において本発明のフィターゼと組み合わせて使用できるものである。
【０２２８】
多数の好適なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、また市販されている。「プラスミド」は、小文字のｐで始まり、そして／また、これに大文字および／または数字が続く。本発明で用いる出発プラスミドは市販されており、非制限的に一般に入手可能であるが、公表された方法に従い、入手可能なプラスミドから構築することも可能である。加えて、本明細書に記載したものと同等のプラスミドは当分野では公知であり、当業者には明らかであろう。
【０２２９】
例として、下記のベクターを挙げることができる：細菌性：pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pBluescript II（Stratagene）；pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T（Pharmacia）；真核生物性：pXT1、pSG5（Stratagene）pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40（Pharmacia）。しかし、宿主において複製可能かつ生存可能であれば、上記以外のどんなプラスミドまたはベクターを用いてもよい。
【０２３０】
プロモーター領域は、選択マーカーを有するCAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたはその他のベクターを用いて、所望の遺伝子から選択することができる。２つの好適なベクターは、pKK232-8およびpCM7である。細菌プロモーターとしては、特に、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PLおよびtrpを挙げることができる。真核生物性プロモーターとしては、CML前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、ならびに、マウスメタロチオネイン-Iが挙げられる。好適なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者の技量の範囲内にある。
【０２３１】
さらに別の実施形態では、本発明は、前記構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物のような高等真核生物細胞、または酵母細胞のような下等真核生物細胞でよい。あるいは、宿主細胞は、細菌細胞のような原核生物細胞でもよい。上記構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、もしくはエレクトロポレーションにより実施することができる（Davis、1986）。
【０２３２】
宿主細胞中の構築物を通常の方法で用いることにより、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生させることができる。これ以外にも、本発明の酵素は、通常のペプチド合成装置を用いて、合成により調製することも可能である。
【０２３３】
成熟タンパク質は、好適なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細菌、あるいは、その他の細胞に発現させることができる。また、無細胞翻訳系の使用により、本発明のDNA構築物に由来するRNAを用いて、このようなタンパク質を調製することもできる。原核および真核生物宿主での使用に適したクローニングおよび発現ベクターについてはすでに記載されている（例えば、Sambrookら、1989：その開示内容を参照により本明細書に組み込むものとする）。
【０２３４】
高等真核生物による本発明の酵素をコードするDNAの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加する。エンハンサーは、通常、約10〜300 bpのDNAのシス作用エレメントであり、これは、プロモーターに作用して、その転写を増加させる。例として、複製起点の後期側bp100〜270にあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複写起点の後期側のポリオーマエンハンサー、ならびに、アデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０２３５】
一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択マーカーを含んでおり、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子やサッカロミセス・セレビシエTRP1遺伝子、ならびに、下流の構造配列の転写を指令する高度発現遺伝子由来のプロモーターなどが挙げられる。このようなプロモーターは、とりわけ、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）、Å-因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などの解糖酵素をコードするオペロンに由来するものでよい。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列と、さらに好ましくは、翻訳された酵素の分泌を指令することができるリーダー配列と、適切に読み枠を合わせて構成する。場合に応じて、異種配列は、所望の特性、例えば発現された組換え産物の安定化または単純化された精製を与えるN末端同定ペプチドを含む融合酵素をコードすることができる。
【０２３６】
細菌での使用に有用な発現ベクターは、機能的プロモーターと機能可能に読み枠を合わせて、好適な翻訳開始および終結シグナルと一緒に、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を挿入することにより、構築される。ベクターは、１以上の表現型の選択マーカーと、複製起点を含むことにより、ベクターの維持を確実にし、所望であれば、宿主内での増幅が可能である。形質転換に好適な原核生物の宿主として、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、ならびに、シュードモナス属、ストレプトミセス属、およびスタフィロコッカス属に含まれる多様な種が挙げられるが、所望であれば、これら以外のものを用いてもよい。
【０２３７】
代表的なしかし非制限的な例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは、公知のクローニングベクターpBR322（ATCC 37017）の遺伝エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌の複製起点を含むことができる。このような市販のベクターとして、例えば、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala、スエーデン）およびGEM1（Promega Biotec, Madison, WI、米国）が挙げられる。これらのpBR322「バックボーン」部分を、好適なプロモーターおよび発現させようとする構造配列と組み合わせる。
【０２３８】
好適な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖の後、選択したプロモーターを適当な手段（例えば、温度シフトもしくは化学的誘導）により誘導し、細胞をさらに培養する。
【０２３９】
細胞を、典型的には、遠心分離により回収して物理または化学的手段により破砕した後、得られた粗抽出物を次の精製のために保持する。
【０２４０】
タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結解凍サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用など、通常の方法で破砕することができ、このような方法は当業者には公知である。
【０２４１】
また、各種哺乳動物細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現させることも可能である。哺乳動物発現系の例として、記載されている（Gluzman, 1981）ようなサル腎繊維芽細胞のCOS-7系、ならびに、適合性ベクターを発現することのできるその他の細胞系、例えば、C127、3T3、CHO、HelaおよびBHK細胞系が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、好適なプロモーターおよびエンハンサー、さらには、あらゆる必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、転写終結配列、ならびに、5’フランキング非転写配列を含む。SV40スプライスに由来するDNA配列、およびポリアデニル化部位を用いて、必要な非転写遺伝エレメントを提供することもできる。
【０２４２】
酵素は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーなどの方法により、回収および精製することができる。必要に応じて、成熟タンパク質の立体配置を完成させるために、タンパク質リフォールディング工程を採用してもよい。最後に、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製工程で使用してもよい。
【０２４３】
本発明の酵素は、自然から精製された産物、もしくは化学合成方法の産物、あるいは、原核または真核生物宿主（例えば、培養中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞）から組換え技法により産生された産物のいずれでもよい。組換え生産方法に用いる宿主に応じて、本発明の酵素をグリコシル化または非グリコシル化することができる。本発明の酵素はまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでいても、含んでいなくてもよい。
【０２４４】
好ましい実施形態では、本発明の酵素は、熱に対して安定性で、かつ耐熱性であり、しかもフィチン酸の酵素的加水分解を触媒する。すなわち、この酵素は、約50℃または50℃をわずかに超える温度に短時間（すなわち、５〜30秒）またはこれより長い時間（例えば、数分または数時間）暴露された後、再生し、活性を回復することが可能である。
【０２４５】
本発明について、本明細書に記載する実施例を参照しながらさらに詳しく説明する。しかし、本発明はこのような実施例に制限されないことを理解すべきである。別途記載のない限り、部分または量はすべて重量に基づくものとする。
【０２４６】
本発明はまた、本明細書に記載した突然変異を含む、単離された変異体フィターゼポリヌクレオチドまたはそのオリゴヌクレオチド部分を提供する。本明細書で用いる「単離された」または「精製された」という用語は、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、もしくはポリペプチドに関して用いる場合、物質が通常自然界で見られるもの以外の形態をしていることを意味する。従って、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然界で細胞中に存在する場合、単離されたポリヌクレオチドもしくは精製されたポリペプチドは、それが、組成物の少なくとも約５〜10％、一般に組成物の20〜50％、特に組成物の約50〜75％、好ましくは、組成物の90〜95％以上を占める形態で存在している。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを単離する方法は当分野では公知であり、慣例的である。
【０２４７】
単離の一環として、または単離後に、ポリヌクレオチドを、例えば、突然変異誘発実験のために、あるいは、宿主中のポリヌクレオチドの増殖または発現のために、DNA分子のような他のポリヌクレオチドと結合させて、融合タンパク質を形成させることができる。単離されたポリヌクレオチドは、単独で、もしくはベクターのような他のポリヌクレオチドと結合させて、培養下のまたは生物体の宿主細胞に導入することができる。このようなポリヌクレオチドは、培養下のまたは生物体の宿主細胞に導入された場合でも、やはり「単離された」とみなされる。何故なら、これらは、それが自然に存在する形態ではないからである。同様に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびポリペプチドは、媒体調製物（例えば、細胞または組成物にポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリペプチドを導入するための溶液、または天然に存在する組成物ではない化学的もしくは酵素的反応のための溶液）のような組成物に存在させることができ、そこでも、本明細書で用いる用語と同じ意味で、単離されたポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、もしくはポリペプチドのままである。単離されたポリヌクレオチドは、ゲノムまたは他の天然に存在する細胞DNA分子において自然界で直接隣接しているヌクレオチド配列と直接隣接していないポリヌクレオチドであり得る。従って、組換えポリヌクレオチドは、ベクター、自律複製プラスミド、もしくはウイルス、または、特定のポリペプチドを通常発現しない原核もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれたポリヌクレオチドを含み得る。
【０２４８】
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」もしくは「オリゴヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」などの用語は、２個以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、リボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA）分子であり、一本鎖もしくは二本鎖DNAまたはRNA、あるいは、二本鎖DNA：RNAハイブリッドのいずれでもよい。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、１個以上の修飾塩基、例えば、イノシンまたはトリチル化塩基を含んでいてよい。ポリマー中のヌクレオチドを連結している結合はホスホジエステル結合であるが、例えば、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合など、ヌクレオチドを結合するのに通常用いられるその他の結合でもよい。ポリヌクレオチドはまた、化学的に、酵素的にまたは代謝的に修飾された形態であってもよい。
【０２４９】
本明細書で用いる「突然変異体または変異体ポリヌクレオチド」という用語は、例えば、配列番号１、７または９に記載されたヌクレオチド配列と比較して、１個または数個のヌクレオチド変化を有するヌクレオチド配列を意味する。ヌクレオチド変化は欠失、挿入または置換でよく、野生型ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのリーディングフレームに変化がないようにサイレントでもよいし、アミノ酸変化またはポリヌクレオチドへの停止コドンの導入を起こす変化、あるいは、ポリヌクレオチドの転写または翻訳に関与するヌクレオチド配列の変化、例えば、mRNAへの遺伝子転写物の改変されたスプライシングを起こす変化のいずれでもよい。
【０２５０】
説明の便宜のため、また、参照として用いるため、配列番号１または配列番号７に記載したフィターゼヌクレオチド配列は、「野生型」ポリヌクレオチドまたは「野生型」遺伝子配列と称し、また同様に、配列番号２または配列番号８に記載したポリペプチドは、野生型フィターゼポリペプチドと称する。
【０２５１】
変異体フィターゼポリヌクレオチド配列の例としては、実質的に配列番号７に記載した配列が挙げられ、その際、該ヌクレオチドは、a）配列番号９；b）すべてのTがUである配列番号９（RNA）；フィターゼコード化核酸の発現により、実質的に純粋なフィターゼ酵素が産生される；およびｃ）配列番号７（ただし、390はGであり；391はAであり；ヌクレオチド438はTであり；439はGであり；440はGであり；471はCであり；473はTであり；477はTであり；448はGであり；449はTであり；690はGであり；691はAであり；692はGであり；729はTであり；730はAであり；731はTであり；864はTであり；865はGであり；1017はGであり、またはこれらの任意の組合せである）に記載されたヌクレオチド配列を有する。さらに特定すると、パートc)に関して、本発明は、配列番号７と実質的に同一であり、かつ、ヌクレオチド390がG、および391がAであり；ヌクレオチド438がT、439がG、および440がGであり；471がC、および473がTであり；477がT、448がG、および449がTであり；690がG、691がA、および692がGであり；729がT、730がA、および731がTであり；864がT、および865がGであり；1017がGである；またはこれらの任意の組合せから選択される改変ヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を提供する。
【０２５２】
また、本発明の変異体フィターゼポリヌクレオチドの例としては、実質的に配列番号８に記載した配列を有するが、W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R180Y、N226C、Y277Dまたはこれらの任意の組合せを有するポリペプチドをコードし、かつフィターゼ活性をそのまま保持するポリヌクレオチドも含まれる。
【０２５３】
上記以外にも、本発明の突然変異ポリヌクレオチドの例として、下記のものが挙げられる：高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、例えば、65℃にて、0.5M NaHPO4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、１mM EDTA中でフィルター結合DNAとハイブリダイズさせ、68℃にて0.1×SSC/0.1％SDSで洗浄する（Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、（Green Publishing Associates, Inc.,およびJohn Wily & Sons, Inc., New York 1989）、および補足；p.2.10.3を参照；Sambrookら、Molecular Cloning：A laboratory manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）；なお、これらの文献は参照により本明細書に組み入れるものとする）ことにより、本明細書に開示される、ポリヌクレオチド配列の相補体と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、またはそのオリゴヌクレオチド部分；ならびに、配列番号８に実質的に記載したフィターゼポリペプチドをコードするが、１以上の突然変異を含むポリヌクレオチド；あるいは、このようなポリヌクレオチドに対応するRNA（例え
ば、配列番号９）。
【０２５４】
配列番号１または配列番号７のフィターゼポリヌクレオチド、あるいは、配列番号２または配列番号８のポリペプチド配列と「実質的に同一」であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、一般に、配列番号１、７もしくは９または配列番号２、８もしくは10にそれぞれ記載されているヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と少なくとも80％または85％、通常は少なくとも約90％、特に少なくとも約95％、好ましくは少なくとも約99％同一である。本発明の一形態では、配列番号１、７、９または２、８、10と実質的に同一であるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、突然変異（例えば、前段落に記載した変異体フィターゼポリヌクレオチドに存在する突然変異）を有する１以上の部位で変異することとなる。配列同一性は、配列解析ソフトウエア（例えば、遺伝学コンピューターグループ（Genetics Computer Group）の配列解析ソフトウエアパッケージ（Sequence Analysis Software Package）、ウィスコンシン大学生物工学センター（University of Wisconsin Biotechnology Center）、1710 University Avenue, Madison WI 53705）を用いて、測定することができる。
【０２５５】
本発明のポリヌクレオチドもしくはそのオリゴヌクレオチド部分は、例えば、プローブとして、または増幅反応用のプライマーとして有用である。ポリヌクレオチドの「オリゴヌクレオチド部分」とは、全長ポリヌクレオチドより小さい変異または突然変異ヌクレオチド配列を意味する。一般に、プローブまたはプライマーとして有用なオリゴヌクレオチドは、少なくとも約10個のヌクレオチドを含み、通常、約15〜30個以上のヌクレオチドを含む（例えば、表１および２を参照）。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、下記を含むあらゆる好適な方法により調製することができる：例えば、好適なポリヌクレオチドの制限酵素消化、ホスホトリエステル法（Narangら、1979、Meth. Enzymol., 68：90-99）；ホスホジエステル法（Brownら、1979、Meth. Enzymol., 68：109-151）；ジエチルホスホルアミダイト法（Beaucageら、1981、Tetrahedron Lett., 22：1859-1862）；トリエステル法（Matteucciら、1981、J. Am. Chem. Soc., 103：3185-3191）などの方法を用いた直接化学合成（自動合成法も含む）；あるいは、固相支持体法（例えば、米国特許第4,458,066号を参照）。加えて、ポリヌクレオチ
ドまたはオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示した、さもなくば当分野で公知の組換えDNA法を用いて調製することが可能である。
【０２５６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、フィターゼポリヌクレオチドの一部を含んでいてもよく、例えば、配列番号７のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド390がGであり；391がAであり；ヌクレオチド438がTであり；439がGであり；440がGであり；471がCであり；473がTであり；477がTであり；448がGであり；449がTであり；690がGであり；691がAであり；692がGであり；729がTであり；730がAであり；731がTであり；864がTであり；865がGであり；1017がGであること；または、オリゴヌクレオチドが配列番号７に関して上記置換の組合せを含むこと以外は、配列番号７の配列と実質的に同じ配列が含まれる。従って、本明細書に開示するように、オリゴヌクレオチドはどんな長さでもよく、１以上の上記突然変異を含むことができる。
【０２５７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示する突然変異フィターゼポリヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズすることができる。本明細書で用いる「選択的にハイブリダイズする」とは、オリゴヌクレオチド（またはポリヌクレオチド）プローブが、実質的に野生型配列とはハイブリダイズしないが、突然変異ポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力を意味する。選択的ハイブリダイゼーションを可能にするハイブリダイゼーション条件は、前述のように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えることにより得られ、このような条件は、一部には、プローブの長さ、相対的G：C含量、塩濃度などに応じて違ってくる（Sambrookら、前掲、1989）。高度にストリンジェントな条件であるハイブリダイゼーション条件は、例えば、約37℃（14ヌクレオチドDNAプローブの場合）、約48℃（17ヌクレオチドプローブの場合）、約55℃（20ヌクレオチドプローブの場合）、または約60℃（23ヌクレオチドプローブの場合）において、6 x SSC/0.05％ピロリン酸ナトリウム中で洗浄することを含む。
【０２５８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示する突然変異フィターゼポリヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズすることができる。本明細書で用いる「選択的にハイブリダイズする」とは、オリゴヌクレオチド（またはポリヌクレオチド）プローブが、実質的に野生型配列とはハイブリダイズしないが、突然変異ポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力を意味する。選択的ハイブリダイゼーションを可能にするハイブリダイゼーション条件は、前述のように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えることにより得られ、このような条件は、一部には、プローブの長さ、相対的G：C含量、塩濃度などに応じて違ってくる（Sambrookら、前掲、1989）。高度にストリンジェントな条件であるハイブリダイゼーション条件は、例えば、約37℃（14ヌクレオチドDNAプローブの場合）、約48℃（17ヌクレオチドプローブの場合）、約55℃（20ヌクレオチドプローブの場合）、または約60℃（23ヌクレオチドプローブの場合）において、6 x SSC/0.05％ピロリン酸ナトリウム中で洗浄することを含む。
【０２５９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、目的とする特定の変異体または突然変異体をスクリーニングするためのプローブとして用いることができる。加えて、本発明のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス分子を含み、このアンチセンス分子は、例えば、突然変異フィターゼポリヌクレオチド配列などのポリヌクレオチド配列のポリヌクレオチド調節および増幅反応に有用である。さらに、このようなオリゴヌクレオチドは、フィターゼ遺伝子調節用のリボザイムまたは三重らせん配列の一部として用いることもできる。さらにまた、このようなオリゴヌクレオチドを診断方法の一成分として用いることにより、フィターゼ転写産物のレベルを測定することもできる。さらに、このようなオリゴヌクレオチドを用いて、例えば、他の種由来のフィターゼ相同体をスクリーニングして同定することも可能である。
【０２６０】
「プライマー」または「PCRプライマー」という用語は、プライマー伸長に適した条件下に置くと、DNA合成の開始点として作用し得る単離された天然または合成オリゴヌクレオチドを意味する。プライマー伸長産物の合成は、適当な温度の好適なバッファー中でヌクレオシド三リン酸およびポリメラーゼの存在下に開始される。プライマーは、合成しようとする標的領域の一端または両端に関する情報がややあいまいである場合には、複数のプライマーを含んでいてもよい。例えば、核酸配列がタンパク質配列から決定される場合には、タンパク質配列をコードする核酸配列を合成するために作製されるプライマーは、遺伝コードの縮重に基づくあらゆる可能なコドン変異を呈示する配列を含むプライマーの集合体であってよい。この集合体に含まれる１以上のプライマーは、標的配列または標的配列に隣接する配列の末端と相同的であるだろう。同様に、保存領域が集団において有意なレベルの多型性を示す場合には、隣接配列を増幅すると考えられるプライマーの混合物を調製することができる。
【０２６１】
PCR増幅においては、関心のある標的配列に隣接するプライマー対を用いて、標的配列を増幅する。プライマー対は、典型的に、標的配列の5’末端にハイブリダイズするフォワードプライマーと、標的配列の3’末端にハイブリダイズするリバースプライマーとを含んでなる。本発明のプライマー対は、増幅産物の生成を可能にする少なくとも１つのフォワードプライマーと少なくとも１つのリバースプライマーとを含み、該産物は、フォワードおよびリバースプライマーを含む広範囲のフィターゼ特異的増幅産物、またはこのような増幅産物のネステッド（nested）増幅産物であり得る。ただし、フォワードプライマーは標的ポリヌクレオチド配列に対してリバースプライマーの5’側（つまり上流）にあり、かつプライマー同士は増幅産物を生成できるよう十分近接している必要がある。
【０２６２】
融合タンパク質をコードする核酸は、それを作製した後、発現制御配列に機能的に連結させることができる。このような融合タンパク質および組成物は、抗体を生成したり、関心のあるペプチドおよびポリペプチドを産生し精製する上で有用である。本明細書において、「機能的に連結される」という用語は、そのように表現された成分が、それらを意図したやり方で機能させる関係にあるような、並置（juxtaposition）を意味する。例えば、コード配列に機能的に連結された発現制御配列は、コード配列の発現が発現制御配列と適合性の条件下で達成されるように連結されるが、２つの機能的に連結されたコード配列は、それらが同じリーディングフレーム内にあり、それゆえ融合タンパク質をコードするように連結される。
【０２６３】
本明細書で用いる「発現制御配列」とは、それが機能的に連結された核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。発現制御配列は、それが核酸配列の転写と、適宜に翻訳を制御し調節する場合には、核酸配列に機能的に連結されている。従って、発現制御配列には、好適なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の出発コドン（すなわち、ATG）、イントロンのスプライシングシグナル、mRNAの適正な翻訳を可能にするその遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、ならびに、停止コドンが含まれる。制御配列は、少なくとも、その存在が発現に影響を及ぼし得る成分を含み、また、その存在が有利である追加の成分（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）を含むことができる。発現制御配列はプロモーターを含んでもよい。
【０２６４】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、融合タンパク質をコードし得る組換え核酸分子の一部を含むことができる。ポリヌクレオチドもしくは組換え核酸分子は、ベクター（発現ベクターでも、プラスミド、ウイルスなどに由来するものでもよい）に挿入することができる。発現ベクターは、一般に、複製起点、プロモーター、ならびに、該ベクターを含む形質転換細胞の表現型選択を可能にする１以上の遺伝子を含む。本発明における使用に適したベクターとして、限定するものではないが、細菌発現用のT7系列の発現ベクター（Rosenbergら、Gene 56：125, 1987）、哺乳動物細胞発現用のpMSXND発現ベクター（LeeおよびNathans、J. Biol. Chem. 263：3521, 1988）；昆虫細胞発現用のバキュロウイルス由来のベクターが挙げられる。
【０２６５】
また、ベクターの選択は、本発明の方法で使用するポリヌクレオチド配列のサイズおよび宿主細胞によって違ってくる。従って、本発明で用いるベクターは、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、パラインフルエンザウイルス）、ヘルペスウイルス、レオウイルス、パラミクソウイルスなど）、またはその選択された部分（例えば、コートタンパク質、スパイク糖タンパク質、キャプシドタンパク質）でよい。例えば、コスミドおよびファージミドは、大きいポリヌクレオチドを安定して増殖させることができるため、分析または改変しようとする特定の核酸のサイズが大きい場合に使用する。コスミドおよびファージミドは、特に、配列番号１または７のフィターゼポリヌクレオチド、あるいは、配列番号９に示すような突然変異フィターゼポリヌクレオチドの発現もしくは操作に適している。
【０２６６】
酵母では、構成性または誘導性プロモーターを含む多数のベクターを用いることができる（Ausubelら、前掲、1989；Grantら、Meth. Enzymol. 153：516-544, 1987；Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Washington D.C., Ch. 3, 1986；ならびにBitter, Meth. Enzymol. 152：673-684, 1987；およびThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathernら編、Cold Spring Harbor Press, Vols. IおよびII, 1982）。ADHまたはLEU2のような構成性の酵母プロモーター、もしくはGALのような誘導プロモーターを用いることができる（"Cloning in Yeast", Ch. 3, Rothstein, In "DNA Cloning" Vol. 11, A Practical Approach, Glover編, IRL Press, 1986）。あるいは、酵母染色体への外来DNA配列の組み込みを促進するベクターを用いることができる。発現ベクターの構築およびトランスフェクトされた細胞における遺伝子の発現には、やはり当分野で公知である分子クローニング技法が使用される（Sambrookら、前掲、1989；Ausubelら、前掲、1989）。このような方法として、in vitro組換えDNA法、合成法およびin vivo組換え／遺伝子組換え法が挙げられる。
【０２６７】
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ベクターに保持させて、細胞の形質転換またはトランスフェクションにより細胞に導入することができる。「形質転換」または「トランスフェクション」とは、新しいDNA（すなわち、当該細胞に対し外因性のDNA）の組み込み後に、細胞に誘発される永久的（安定的）もしくは一過性の遺伝的変化を意味する。細胞が哺乳動物細胞である場合には、永久的な遺伝的変化は、一般に、該細胞のゲノムへのDNAの導入により達成される。
【０２６８】
形質転換された細胞または宿主細胞は、どのような原核または真核生物細胞でもよいが、その細胞（またはその祖先）には組換えDNA法により本発明のポリヌクレオチド配列もしくはその断片が導入されている。宿主細胞の形質転換は、当業者には公知の方法など、通常の技法により実施することができる。宿主が大腸菌のような原核生物である場合には、DNA取込みが可能なコンピテント細胞を、対数増殖期後に回収した細胞から調製し、次に、当分野では公知の手順でCaCl2法により、あるいはMgCl2またはRbClを用いて処理することができる。形質転換は、宿主細胞のプロトプラストの形成後、またはエレクトロポレーションにより実施することができる。
【０２６９】
宿主が真核生物である場合には、このようなトランスフェクションの方法として、リン酸カルシウム共沈の使用；マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームに被包されたプラスミドの挿入など、通常の機械的方法；またはウイルスベクターの使用；あるいは、当分野では公知の他の方法が挙げられる。ある方法では、シミアンウイルス40（SV40）またはウシパピローマウイルスなどの真核生物ウイルスベクターを用いて、真核細胞を一時的に感染もしくは形質転換させてタンパク質を発現させる（Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman編、1982）。好ましくは、本明細書に記載する宿主細胞として真核生物宿主を用いる。真核細胞は酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ）でもよいし、ヒト細胞などの哺乳動物細胞でもよい。
【０２７０】
多様な宿主発現ベクター系を用いて、配列番号１または配列番号７のようなフィターゼポリヌクレオチド配列、配列番号１のコード配列、あるいは、配列番号９のような突然変異フィターゼポリヌクレオチドを発現させることができる。このような宿主発現系は、関心のあるヌクレオチド配列を作製した後精製することができるビヒクルに相当すると共に、好適なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェトした場合には、タンパク質（変異または突然変異ポリペプチドもしくはそのペプチド部分を含む）をin situで発現できる細胞に相当する。このような細胞として、限定するものではないが、下記のものを挙げることができる：ポリヌクレオチドもしくはそのオリゴヌクレオチド部分（野生型、変異体またはその他の突然変異体）を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌（例：大腸菌、枯草菌）のような微生物；ポリヌクレオチドもしくはそのオリゴヌクレオチド部分（野生型、変異体またはその他の突然変異体）を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換させた酵母（例：サッカロミセス属、ピキア属）；ポリヌクレオチドもしくはそのオリゴヌクレオチド部分（野生型、変異体またはその他の突然変異体）を含む組換えウイルス発現ベクター（例：バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例：カリフラワーモザイクウイルスまたはタバコモザイクウイルス）に感染させた、または、突然変異ポリヌクレオチドもしくはそのオリゴヌクレオチド部分を含む組換えプラスミド発現ベクター（例：Tiプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例：COS、CHO、BHK、293、3T3）。
【０２７１】
細菌系では、発現させるフィターゼタンパク質（野生型、変異体もしくはその他のフィターゼ突然変異体）について意図する用途に応じて、多数の発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体の作製のために、あるいは、ペプチドライブラリーのスクリーニングのために大量の上記タンパク質を生産しようとする場合には、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが望ましいと考えられる。このようなベクターとして、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：大腸菌発現ベクターpUR278（Rutherら、1983、EMBO J. 2：1791）、その際、フィターゼポリヌクレオチドもしくはそのオリゴヌクレオチド部分（野生型、変異型またはその他の突然変異体）を個々に、lac Zコード領域と読み枠を合わせてベクターに連結させることにより、融合タンパク質を生産することができる；pINベクター（InouyeおよびInouye、Nucl. Acids Res. 13：3101-3109, 1985；Van HeekeおよびSchuster, J. Biol. Chem. 264：5503-5509, 1989）など。またpGEXベクターを用いて、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質を発現させることもできる。一般に
、このような融合タンパク質は可溶性で、グルタチオン−アガロースビーズとの吸着の後、遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解細胞から容易に精製することができる。このpGEXベクターは、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含有するように設計されており、これにより、クローン化フィターゼタンパク質、変異体または突然変異体をGST成分から放出させることができる。
【０２７２】
昆虫系では、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV）をベクターとして用いて、外来遺伝子を発現させることができる。ウイルスをSpodoptera frugiperda細胞において増殖させる。フィターゼポリヌクレオチドもしくはそのオリゴヌクレオチド部分を上記ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）にクローン化し、AcNPVプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置く。フィターゼヌクレオチドもしくはそのオリゴヌクレオチド部分の挿入が成功すれば、ポリヘドリン遺伝子の不活性化、ならびに、非閉塞組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク質性コートを欠失したウイルス）の生産が達成される。これらの組換えウイルスを用いて、Spodoptera frugiperda細胞に感染させ、この細胞中で、挿入した遺伝子を発現させる（Smithら、1983, J. Virol. 46：584；米国特許第4,215,051号）。
【０２７３】
哺乳動物の宿主細胞には、多数のウイルスに基づく発現系を用いることができる。発現ベクターとして、アデノウイルスを用いる場合には、フィターゼポリヌクレオチドもしくはそのオリゴヌクレオチド部分を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三分節リーダー配列に連結することができる。次に、このキメラ遺伝子をin vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。E1またはE3領域のようなウイルスゲノムの非必須領域への挿入により、感染した宿主において生存可能で、しかもフィターゼタンパク質（例えば、野生型、その変異型または突然変異体）を発現させることができる組換えウイルスが得られる（LoganおよびShenk, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 81：3655-3659, 1984）。また、特定の開始シグナルも、挿入フィターゼ配列の効率的翻訳に必要と考えられる。これらのシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。全ポリヌクレオチド（それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む）を適した発現ベクターに挿入する場合には、別の翻訳制御シグナルは一切必要ないと考えられる。しかし、配列の一部だけを挿入する場合には、例えば、ATG開始コドンなどの外因性翻訳制御シグナルを付与しなければならない。さらに、挿入物全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは、所望のコード配列のリーディングフレームに合わせなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の様々な供給源からのものでよい。好適な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含有させることにより、発現効率を増強することができる（Bittnerら、Meth. Enzymol. 153：516-544, 1987）。
【０２７４】
加えて、挿入配列の発現をモジュレートしたり、発現されたポリペプチドを特定の様式で修飾・プロセッシングしたりする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）はタンパク質の機能に重要である。様々な宿主細胞が、タンパク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾に特有かつ独特の機構を有する。好適な細胞系または宿主系を選択することにより、発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングを確実にすることができる。このため、上記ポリペプチドの一次転写産物の適正なプロセッシング、グリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を備えた真核生物宿主細胞を用いることができる。このような哺乳動物細胞として、限定するものではないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38などが挙げられる。
【０２７５】
長期にわたる組換えタンパク質の高収率生産の場合には、安定した発現が好ましい。例えば、フィターゼの野生型、変異体または突然変異体などのタンパク質を安定して発現させる細胞系を作製することができる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、好適な発現制御エレメント（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーにより制御されたDNAで宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの導入後、遺伝子操作した細胞を１〜２日間富化培地中で増殖させ、次に、選択培地に変えることができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に耐性を賦与するため、細胞がその染色体にプラスミドを組み込み、増殖してフォーカスを形成するのを可能にし、このフォーカスをクローン化して細胞系へと増やすことができる。この方法は、フィターゼ変異体または突然変異体ポリペプチドを発現する細胞系を操作するのに用いれば有利である。このように操作された細胞系は、特に、変異体または突然変異体フィターゼポリペプチドの内在活性に影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価に有用である。このように操作した細胞系はまた、特異的作用対非特異的作用を有する因子同士を識別するのに有用でもある。特に、突然変異細胞系は主要な機能を欠失しているはずであり、様々な突然変異を用いてin vivoアッセイにより主要な機能ドメインを同定することができる。
【０２７６】
限定するものではないが、下記のような多数の選択系を用いることができる：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら、Cell 11：223, 1977）、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（SzybalskaおよびSzybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48：2026, 1962）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、Cell 22：817, 1980）遺伝子は、それぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞で用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性を下記のものの選択基準として用いることもできる：メトトレキセートに対する耐性を賦与するdhfr（Wiglerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567, 1980；O’Hareら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：1527, 1981）；ミコフェノール酸に対する耐性を賦与するgpt（MulliganおよびBerg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：2072, 1981）；アミノグリコシドG-148に対する耐性を賦与するneo（Colberre-Garapinら、J.Mol. Biol. 150：1, 1981）およびヒグロマイシンに対する耐性を賦与するhygro（Santerreら、Gene 30：147, 1984）。従って、本発明は、突然変異体フィターゼポリヌクレオチドもしくはそのオリゴヌクレオチド部分、または１以上のプライマーもしくはその相補体を含むベクター、例えば、コード配列またはプライマーの発現を指令する調節エレメントに機能的に連結された前記配列のいずれかを含む発現ベクターなどを提供し；また、前記配列のいずれかを、単独でまたは適宜にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を指令することができる調節エレメントに機能的に連結させて、含む宿主細胞も提供する。
【０２７７】
突然変異フィターゼポリヌクレオチド配列の相同体は、配列番号８に記載したようなフィターゼポリペプチドまたは本明細書に開示したその突然変異体のアミノ酸配列に基づいて設計された縮重プライマープールなど、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR；米国特許第4,683,202号を参照のこと。該文献を参照により本明細書に組み込むものとする）を実施することにより単離することができる。反応用の鋳型は、フィターゼ酵素または相同体を発現することが知られている生物から調製されたmRNAの逆転写によって得られるcDNAでありうる。増幅配列が確実にフィターゼの配列もしくは突然変異ポリヌクレオチド配列に相当するように、PCR産物をサブクローン化して配列決定するか、いくつもの方法で操作する（例えば、ネステッドPCRでさらに操作する）ことができる。次にPCR断片を用いて全長cDNAクローン（突然変異体ポリヌクレオチド配列を含むクローンなど）を単離するために、増幅断片を標識した後、核酸ライブラリー（例えば、バクテリオファージcDNAライブラリー）をスクリーニングすることができる。あるいは、標識断片を用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることも可能である（クローニング戦略については、例えば、Sambrookら、前掲、1989；Ausubelら、前掲、1989を参照）。
【０２７８】
野生型アミノ酸配列から改変されているフィターゼポリペプチドは、アミノ酸残基の置換を含む。例えば、負に荷電したアミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が；正に荷電したアミノ酸としては、リシンおよびアルギニンが挙げられ；また、同等の親水値を有する非荷電極性ヘッド基を有するアミノ酸として、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。しかし、多くの場合、ヌクレオチド置換はサイレントであるため、コードされたポリペプチドに変化は起こらない。
【０２７９】
フィターゼポリペプチド配列番号２もしくは配列番号８、またはそのペプチド部分と実質的に同一である突然変異フィターゼポリペプチドおよびそのペプチド部分は、本発明の範囲に含まれる。
【０２８０】
合成ポリペプチドまたはペプチドは、化学的合成、例えば、固相化学ペプチド合成法により調製することができ、これらの方法はよく知られており（例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85：2149-2154, 1963；StewartおよびYoung, Solid Phase Peptide Synthesis, 第２版、Pierce Chemical Co., Rockford, I11., pp. 11-12）、市販の実験室ペプチド設計・合成キット（Cambridge Research Biochemicals）において使用されている。このような市販の実験室キットは、Geysenら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81：3998（1984）の教示を一般に利用しており、単一プレートに接続された多数のロッドまたはピンの先端でペプチドを合成することを可能にする。このようなシステムを用いる場合には、ロッドまたはピンのプレートを反転させて、対応するウェルまたはレザバーの第２プレートに挿入するが、これらのウェルまたはレザバーは、適したアミノ酸をピンまたはロッドの先端に付着または固定させるための溶液を含んでいる。このようなプロセス工程を繰り返すことにより、すなわち、ピンまたはロッドの先端を反転させて、適した溶液中に挿入することにより、アミノ酸が所望のペプチドへと構成される。
【０２８１】
いくつかの市販されているFMOCペプチド合成システムが利用可能である。例えば、Applied Biosystems社製の431A型自動ペプチド合成装置を用いて、ポリペプチドまたは断片のアセンブリを固相支持体上で実施することができる。このような装置は、直接合成、または、他の公知の技法により連結しうる一連の断片の合成のいずれかにより、本発明のペプチドへと容易に到達させることができる。従って、ポリペプチドおよびペプチドの化学的合成法は当業者には公知であり、例えば、固相法によりペプチドを合成し、樹脂から切り離した後、分離用高性能液体クロマトグラフィーにより精製することができる（例えば、Creighton, 1983, Proteins：Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N.Y., pp. 50-60を参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸の分析により、または、例えばエドマン（Edman）分解法（例えば、Creighton, 1983、前掲、pp. 34-49を参照）を用いて、配列決定を行うことにより確認することができる。こうして、フィターゼポリペプチド、変異体または突然変異体の断片は化学的に合成することができる。
【０２８２】
本発明の一形態では、図１に示すようなフィターゼ酵素を産生する方法が提供される。この方法は、核酸の発現を可能にする条件下で、酵素（例えば、配列番号１、７または９）をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を増殖させ、場合に応じて、該核酸によりコードされた酵素を単離することを含んでなる。宿主細胞を培養する方法は、実施例に記載されており、当業者には知られている。
【０２８３】
特定の実施形態では、本発明は、トランスジェニック植物または植物器官におけるフィターゼの発現、ならびに、その作製方法を提供する。フィターゼの発現を指令することができる調節配列の制御下にあるフィターゼをコードする遺伝子により植物を形質転換するためのDNA発現構築物が提供される。これらの調節配列には、構成的、もしくは発達段階的および／または組織特異的な様式で、植物において転写を指令することができる配列が含まれる。
【０２８４】
発現の方法は、一部には、植物または植物部分の使用に応じて違ってくる。本発明によって提供されるトランスジェニック植物および植物器官は、例えば動物飼料など、様々な産業プロセスにおいて直接使用することができ、あるいはまた、発現されたフィターゼを抽出し、所望であれば、使用前に精製することもできる。これ以外にも、組換え宿主植物または植物部分を直接用いてもよい。特定の形態では、本発明は、増加量のフィターゼを含む種子を用いてフィチン酸加水分解反応を触媒する方法を提供する。この方法は、好ましくは粉砕または破砕形態の、トランスジェニック非野生型種子と、フィチン酸含有基質とを接触させることにより、種子中の酵素が反応速度を高めるようにすることを含む。種子をフィチン酸含有基質に直接添加することにより、本発明は、コスト高で面倒な酵素の抽出および精製方法を解消する。特定の、しかし、何ら制限的ではない実施形態では、本発明は、酵素の十分な供給が欠如している生物に、増加量の酵素を含む種子の形態で、酵素を投与する処置方法も提供する。好ましい実施形態では、生物に酵素を投与するタイミングは、フィチン酸含有食物の摂取に合わせて調整する。
【０２８５】
植物におけるフィターゼの発現は様々な手段により達成することができる。具体的には、例えば、双子葉植物種（例えば、タバコ、ジャガイモ、トマト、ペチュニア属、アブラナ属）などの多数の植物種を形質転換するのに、上記技法を使用することができる。加えて、例えば、植物における外来遺伝子の発現のための戦略も利用可能である。さらには、植物遺伝子由来の調節配列が同定されており、これらは植物および植物細胞において機能的に発現させることができるキメラ遺伝子を構築するのに使用できる（例えば、Kleeら、1987；Clarkら、1990；Smithら、1990）。
【０２８６】
植物への遺伝子構築物の導入は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネスによる形質転換など、数種の技法を用いて、達成することができる。このように形質転換することができる植物組織の非制限的例として、プロトプラスト、小胞子または花粉、ならびに、葉、茎、根、胚軸、および子葉のような外植片が挙げられる。さらに、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子ボンバードメント、および直接DNA取込みにより、DNAをプロトプラストや植物細胞または組織に直接導入することができる。
【０２８７】
様々な発現系により、タンパク質を植物において生産することができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（Guilleyら、1982）などの構成プロモーターは、トランスジェニック植物のほぼすべての器官における発現タンパク質の蓄積に使用することができる。あるいは、高度に組織特異的および／または発達段階特異的であるプロモーターは、所望の組織および／または所望の発達段階に向けて発現を偏らせるために本発明で使用することができる（Higgins, 1984；Shotwell, 1989）。本発明のフィターゼ分子の植物における発現に関してさらに詳しくは、例えば、USPN 5,770,413（Van Ooijenら）およびUSPN 5,593,963（Van Ooijenら）に開示されているが、これらの文献は本発明の分子を教示しておらず、真菌性フィターゼの使用について教示している。
【０２８８】
要約すると、本発明によれば、様々な手段を用いて、トランスジェニック植物または植物部分におけるフィターゼの組換え発現を達成することができる。このようなトランスジェニック植物または植物部分は、組換えにより発現したフィターゼの供給源として使用が可能であり、これをフィチン酸含有源に直接添加することができる。あるいは、組換え植物により発現したフィターゼを植物源から抽出し、所望であれば、フィターゼ基質と接触させる前に、精製することができる。
【０２８９】
本発明において、選択すべき植物としては、限定するものではないが、カリフラワー（キャベツ）、アーティチョーク（チョウセンアザミ）のような食用の花；リンゴ（リンゴ属、例えば、リンゴ）、バナナ（バショウ属、例えば、ムサ・アクミナタ）、ベリー（スグリ、スグリ属、例えば、アカフサスグリ）、サクランボ（セイヨウミザクラ、スモモ属、例えば、セイヨウミザクラ）、キュウリ（ウリ属、例えば、キュウリ）、ブドウ（ブドウ属、例えば、ヨーロッパブドウ）、レモン（レモン）、メロン（メロン）、ナッツ類（クルミノキ、クルミ属、例えば、カシグルミ；ピーナツ、ナンキンマメ）、オレンジ（ミカン属、例えば、maxima）、モモ（スモモ属、例えば、モモ）、ナシ（Pyra、例えば、communis）、スモモ（スモモ属、例えば、セイヨウスモモ）、イチゴ（イチゴ属、例えば、フラガリア・モスタカ）、トマト（トマト属、例えば、トマト）などの果実；アルファルファ（ウマヤゴシ属、例えば、ムラサキウマヤゴシ）、キャベツ（例えば、キャベツ）、エンダイブ（キクニガナ属、例えば、エンダイブ）、ニラネギ（ネギ属、例えば、ニラネギ）、レタス（アキノノゲシ属、例えば、チシャ）、ホウレンソウ（ホウレンソウ属、例えば、ホウレンソウ）、タバコ（タバコ属、例えば、タバコ）などの葉；クズウコン（クズウコン属、例えば、クズウコン）、フダンソウ（テンサイ属、例えば、フダンソウ）、ニンジン（ニンジン属、例えば、ニンジン）、キャッサバ（イモノキ、例えば、キャッサバ）、カブ（アブラナ属、例えば、アブラナ）、ハツカダイコン（ダイコン属、例えば、ダイコン）、ヤマノイモ（ヤマノイモ属、例えば、ハリイモ）、サツマイモ（サツマイモ）などの根；インゲンマメ（インゲンマメ属、例えば、インゲンマメ）、エンドウマメ（エンドウ属、エンドウ）、ダイズ（ダイズ属、例えば、ダイズ）、コムギ（コムギ属、例えば、パンコムギ）、オオムギ（オオムギ属、例えば、オオムギ）、トウモロコシ（トウモロコシ属、例えば、トウモロコシ）、コメ（イネ属、例えば、イネ）、ナタネ（ハクラン）、キビ（キビ）、ヒマワリ（ヒマワリ）、オートムギ（カラスムギ）などの種子；コールラビ（アブラナ属、例えば、キャベツ）、ジャガイモ（ナス属、例えば、ジャガイモ）などの塊茎をもたらす作物が挙げられる。
【０２９０】
本発明に関してはさらなる植物ならびに非植物発現系が使用できると考えられる。植物種の選択は主として植物またはその部分の意図される用途ならびにその植物の形質転換の受けやすさによって決定される。
【０２９１】
フィターゼをコードするDNA配列を含む発現構築物を目的植物へ導入するにはいくつかの技術が利用できる。かかる技術としては限定されるものではないが、カルシウム／ポリエチレングリコール法を用いたプロトプラストの形質転換、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションまたは(被覆)粒子ボンバードメント(Potrykus, 1990)が挙げられる。これらのいわゆる直接DNA形質転換法の他、ウイルスベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)由来のもの)および細菌ベクター(例えば、アグロバクテリア属由来のもの)などベクターを含む形質転換系が広く利用できる(Potrykus, 1990)。選択および／またはスクリーニングの後、形質転換されたプロトプラスト、細胞または植物部分は当技術分野で公知の方法を用いて完全な植物体へと再分化させることができる(Horschら, 1985)。形質転換および／または再分化技術の選択は本発明にとって重要なことではない。
【０２９２】
双子葉植物については、本発明の好ましい実施形態では、毒性遺伝子を有するvirプラスミドと導入される遺伝子構築物を含む適合プラスミドを含むバイナリーベクター系(Hoekemaら, 1983; EP 0120516 Schilperoortら)の原理を用いる。このベクターは大腸菌とアグロバクテリアの双方で複製可能であって、本発明には関連のない細部で変更されているバイナリーベクターBin19(Beven, 1984)に由来するものである。この例で用いられるバイナリーベクターは、T-DNAの左ボーダー配列と右ボーダー配列との間にカナマイシン耐性をコードする同一のNPTII遺伝子(Bevan, 1984)および必要な遺伝子構築物内にクローニングするための多重クローニング部位を含む。
【０２９３】
単子葉作物の形質転換および再分化は標準的な方法とはいえない。しかし、最近の科学の進歩は、主な単子葉植物は形質転換に従い、形質転換細胞から稔性のあるトランスジェニック植物が再分化し得ることを示している。これらの作物の再現性ある組織培養系の開発は、植物細胞へ遺伝材料を導入する有効な方法と相まって形質転換を容易にしてきた。現在のところ単子葉植物の形質転換の方法の選択肢としては、外植体または浮遊細胞のマイクロプロジェクタイルボンバードメント、およびプロトプラストの直接DNA取り込みまたはエレクトロポレーションがある。例えば、トランスジェニックイネ植物体は選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性をコードする細菌のhgh遺伝子を用いて上手く得ることができている。この遺伝子はエレクトロポレーションにより導入されたものである(Shimamotoら, 1993)。トランスジェニックトウモロコシ植物体は、ホスフィノトリシンアセチルトランフェラーゼ(除草剤ホスフィノトリシンを不活性化する酵素)をコードするStreptomyces hygroscopicus 変種遺伝子を微粒子ボンバードメントによってトウモロコシ懸濁培養不定胚形成細胞に導入することにより得られている(Gordon-Kammら, 1990)。コムギおよびオオムギなど他の単子葉作物のアリュ
ーロンプロトプラストへの遺伝材料の導入(Leeら, 1989)。コムギ植物体は不定
胚形成懸濁培養物の確立のために成熟した稠密な球状不定胚形成カルス組織だけを選抜することで不定胚形成懸濁培養物から再分化されている(Vasilｍら, 1972; Vasilら, 1974)。これら作物のための形質転換系と組み合わせると、本発明の単子葉植物への適用が可能となる。またこれらの方法は双子葉植物の形質転換および再分化にも適用できる。
【０２９４】
フィターゼ構築物の発現は、組換えDNA技術の分野の当業者に公知の植物ポリメラーゼによる遺伝子の転写、mRNAの翻訳などの詳細を必要とする。本発明の適切な理解に関連のある詳細だけを以下に述べる。公知であるか、またはフィターゼを発現させることが分かっている調節配列が本発明で使用できる。用いる調節配列の選択は目的の標的作物および／または標的器官によって異なる。かかる調節配列は植物または植物ウイルスから得てもよいし、あるいは化学的に合成してもよい。かかる調節配列としては、どの植物またはその一部を使用するかによって、構成的にまたは発達段階および／または組織特異的に植物体において転写を命令するうえで有効なプロモーターがある。これらのプロモーターとしては、限定されるものではないが、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーター(Guilleyら, 1982)などの構成的発現を示すプロモーター、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーター(Coruzziら, 1984)などの葉特異的発現のためのもの、グルタミンシンターゼ遺伝子由来プロモーター(Tingeyら, 1987)などの根特異的発現のためのもの、Brassica napas由来クルシフェリンAプロモーター(Ryanら, 1989)などの種子特異的発現のためのもの、ジャガイモ由来クラスIパタチンプロモーター(Koster-Topferら, 1989; Wenzlerら, 1989)などの塊茎特異的発現のためのもの、またはトマト由来ポリガラクツロナーゼ(PG)プロモーター(Birdら, 1988)などの果実特異的発現のためのものが挙げられる。
【０２９５】
ターミネーター配列およびポリアデニル化シグナルなどの他の調節配列としては、それ自体植物体で機能するいずれの配列も含み、その選択は当業者の技術の範囲内にある。かかる配列の例としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacience)のノパリンシンターゼ(nos)遺伝子の3’フランキング領域がある(Bevan, 上記)。調節配列はまたCaMVの35Sプロモーターに見られるようなエンハンサー配列、およびアルファルファモザイクウイルス(AlMV)RNA4のリーダー配列(Brederodeら, 1980)などのmRNA安定化配列、またはその他同じように機能するいずれの配列を含んでもよい。
【０２９６】
フィターゼは発現したタンパク質の安定性を可能にする環境で発現させるべきである。本発明においてはフィターゼの生物物理学的パラメーターに応じてかかる安定した環境を作り出すために、サイトゾル、小胞、液胞、タンパク質体または小胞体などの細胞コンパートメントの選択を用いることができる。かかるパラメーターとしては、限定されるものではないが、pHの至適化、プロテアーゼ感受性または好ましいコンパートメントのモル濃度に対する感受性が挙げられる。
【０２９７】
細胞の細胞質で発現を得るためには、発現した酵素は分泌シグナルペプチドまたはその他の標的配列を含んでいてはならない。葉緑体およびミトコンドリアでの発現については、発現した酵素はこれらのオルガネラへの輸送のためのいわゆるトランジットペプチドを含んでいなければならない。これを達成するために目的酵素に結合させ得るターゲッティング配列は公知である(Smeekensら, 1990; van den Broeckら, 1985; Wolterら, 1988)。液胞中で酵素活性が求められる場合には、分泌シグナルペプチドならびにこれらの液胞へ酵素を向ける特異的ターゲッティング配列を提供する必要がある(Tagueら, 1990)。種子中のタンパク質体においても同じことが言える。目的酵素をコードするDNA配列は、その酵素が細胞内の所望の場所でその作用を発揮することができるように改変しなければならない。
【０２９８】
フィターゼの細胞外発現を達成するには、本発明の発現構築物は分泌シグナル配列を用いる。植物宿主種と同種の(天然型)シグナル配列が好ましいが、異種シグナル配列(すなわち、他の植物種由来のものまたは微生物起源のもの)も同様に用いてよい。かかるシグナル配列は当業者に公知である。本発明の範囲内で使用できる適当なシグナル配列は、Blobelら, 1979; Von Heijne, 1986; Garciaら, 1987; Sijimonsら, 1990; Ngら, 1994;およびPowersら, 1996に記載されている
。
【０２９９】
関連のDNA構築物の全ての部分(プロモーター配列、調節配列、分泌配列、安定化配列、ターゲッティング配列または終結配列)は、所望により、当業者に公知の方法を用いて、それらの制御特性に影響を与えるように改変してもよい。本発明によって得られたフィターゼを含有する植物を用いて、いっそう高いフィターゼレベルを有する植物体または植物器官を得ることもできる。例えば、ソマクローナル変異法の使用により、あるいは交配育種法によってかかる植物体または植物器官を得ることもできる。かかる技術は当業者に周知のものである。
【０３００】
ある実施形態では、本発明はフィターゼおよびその他の分子の高効率過剰発現系を達成する方法(およびその産物)を提供する。好ましい実施形態では、本発明はトリコデルマ(Trichoderma)のフィターゼおよびpH2.5酸性ホスファターゼの高効率過剰発現系を達成する方法(およびその産物)を提供する。この系によって動物飼料産業で特に有用な酵素組成物が得られる。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、当業者には公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはEP 0659215(WO 9403612 A1)(Nevalainenら)が挙げられるが、これらの参考文献は本発明の分子を教示するものではない。
【０３０１】
ある実施形態では、本発明は酵素活性の熱失活に高い耐性を示すフィターゼ活性を有し、長期保存の際もフィターゼ活性を保持する安定な水性液体製剤を調製する方法(およびその産物)を提供する。この液体製剤は安定剤としての尿素および／またはソルビトールおよびグリセロールなどのポリオールの添加によって安定化される。また、かかる安定な水性液体製剤の使用によって得られる、単胃動物用の飼料配合物およびその製造方法も提供される。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはEP 0626010 (WO 9316175 A1)(Barendseら)が挙げられるが、これらの参考文献は本発明の分子を教示するものではない。
【０３０２】
ある実施形態では、本発明はフィチン酸と本明細書で開示される1以上の新規なフィターゼ分子を接触させることからなるフィチン酸の加水分解法を提供する。従って、本発明は、フィチン酸複合体からのミネラルの遊離を伴う、フィチン酸のイノシトールおよび遊離リン酸への加水分解を触媒する方法を提供する。この方法は、フィチン酸基質を、配列番号2で示される酵素のような本発明の酵素の分解有効量と接触させることを含む。「分解有効量」とは、酵素と接触していないフィチン酸と比べた場合に少なくとも50%のフィチン酸を分解するのに必要とされる酵素量をさす。少なくとも80%のフィチン酸が分解されるのが好ましい。
【０３０３】
もう1つの実施形態では、本発明はフィチン酸のホスホ-モノエステル結合を加水分解する方法を提供する。この方法は、有効量の本発明のフィターゼ分子(例えば配列番号２)を投与してイノシトールと遊離リン酸を得ることを含む。「有効」量とは、酵素と接触していないフィチン酸と比べた場合に少なくとも50%のホスホ-モノエステル結合を加水分解するのに必要とされる酵素量をさす。少なくとも80%の結合が加水分解されるのが好ましい。
【０３０４】
特定の態様では、所望により、フィチン酸分子内で、および／または基質源の他の分子内での化学変化(例えば加水分解)を起こすために、このフィターゼ分子を他の触媒などの他の試薬と併用してもよい。この態様によれば、好ましくはフィターゼ分子およびさらなる試薬は互いに阻害し合わず、より好ましくはフィターゼ分子とさらなる試薬は全体として付加作用を有し、よりいっそう好ましくはフィターゼ分子とさらなる試薬は全体として相乗作用を有する。
【０３０５】
基質フィチン酸分子の適切な供給源としては、食物、潜在的食物、食物の副産物(in vitro副産物とin vivo副産物の両方、例えばex vivo反応産物および動物排泄物)、食物前駆体および他のいずれかのフィチン酸の原料が挙げられる。
【０３０６】
限定されるものではないが、ある態様では、この組換えフィターゼは生物により消費でき、かつ、消費の際にも活性を保持する。別の例では、トランスジェニックアプローチを用いて、好ましくは制御された様式で、組換えフィターゼの発現を達成することができる(これらの方法は時間特異的かつ組織特異的にトランスジェニック分子の発現を制御するために利用できる)。
【０３０７】
特定の例では、供給材料(例えばトランスジェニック植物源または組換え原核生物宿主)のフィターゼ活性は消費の際に上昇しうるが、この活性の上昇は、例えばプロフォームの前駆体フィターゼ分子がより成熟した形態の顕著に高い活性の酵素に変換する際に起こり、この変換はフィターゼ源の摂取および消化によるものであると考えられる。フィチン酸基質の加水分解はフィターゼをフィチン酸と接触させた際にはいつも起こり、例えばこれは基質または酵素のいずれかあるいは両者の摂取前または摂取後、あるいは摂取の前後の双方に起こり得る。さらに、フィチン酸基質は、フィターゼのほかに、別の酵素のような1以上のさらなる試薬（その供給材料から直接、または精製後に適用することができる）と接触させてもよいと考えられる。
【０３０８】
フィターゼ供給材料はフィチン酸供給材料と、例えばin vitroまたはin vivoにおいてフィターゼ源およびフィチン酸源の一方または双方を粉砕または破壊した後で、直接接触させることができる。また、フィターゼ酵素とフィチン酸基質を接触させる前に、フィターゼ酵素を供給材料から精製してもよいし、あるいはフィチン酸基質を供給材料から精製してもよいし、あるいはフィターゼ酵素とフィチン酸の両者を供給材料から精製してもよい。酵素または基質あるいはその両者を含む精製および非精製試薬の組合せが使用できると考えられる。
【０３０９】
フィターゼ活性の供給源としては２以上の供給材料が使用できると考えられる。これは供給材料からの試薬の一定時間後の放出を達成する1つの方法として使用可能であり、例えば摂取された供給材料がin vivoで消化された場合、または供給材料がin vitro適用で処理された場合に、それらの供給材料に由来する異なる試薬からの放出が異なる時間に生じる。フィターゼ活性の２以上の供給材料の使用はまた、例えば、ある応用例の異なる処理ステップの際に直面するある範囲の条件（ある範囲のpH値、温度、塩濃度および時間間隔など）およびその変動の下でフィターゼ活性を得るのに便利である。また、種々の供給材料の使用は、フィターゼおよび／またはフィチン酸および／またはその他の材料の1以上の形態または異性体により例示されるような、種々の試薬を得るのに便利である。
【０３１０】
単一の供給材料であるトランスジェニック植物種(またはその植物部分)はフィターゼおよびフィチン酸双方の供給材料となり、酵素および基質は該単一供給源の中で異なって区画化され得る。例えば、それらは分泌されるのに対して分泌されないか、異なって発現されるか、かつ／または、異なる植物部分または器官または組織における、あるいは同じ植物部分または器官または組織内の細胞下コンパートメントにおける存在量が異なる。そこに含まれるフィターゼ分子の精製は1以上の望ましい植物部分または器官または組織または細胞下コンパートメントの単離および／またはさらなる処理を含んでもよい。
【０３１１】
特定の態様では、本発明は増大した量の酵素を含有する種子を用いてin vivoおよび／またはin vitro反応を触媒する方法を提供する。この方法はトランスジェニック非野生型種子を好ましくは粉砕した状態で反応混合物へ加え、種子中の酵素が反応速度を高めることができるようにすることを含んでなる。この種子を反応混合物に直接加えることで、この方法は費用がかかり煩雑な酵素の抽出および精製を解消するものである。処理方法も提供され、それによれば酵素の十分な供給を欠いた生物に、増大した量の酵素を含む1以上の植物種、好ましくはトランスジェニック植物種由来の種子の形態の酵素が投与される。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、かつ／または当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはUSPN 5,543,576(Van Ooijenら)およびUSPN 5,714,474(Van Ooijenら)が挙げられ、これらの文献は本発明の分子を教示するものではなく、真菌類のフィターゼを教示している。
【０３１２】
限定されるものではないが特定の例では、本発明のフィターゼ分子は、組換え消化系生物形態(または微生物もしくは菌叢)の作出、および該組換え消化系生物形態の動物への投与に使用できる。投与は所望により単独で、あるいは他の酵素および／または消化系に酵素活性を供し得るその他の生物形態と組み合わせて行うことができ、他の酵素および生物形態は組換え型であってもなくてもよい。例えば、投与はキシラン分解細菌と組み合わせて行ってもよい。
【０３１３】
限定されるものではないがある態様では、本発明は、1以上のフィチン分解酵素を、好ましくはトウモロコシまたはソルガムに存在するフィチンが実質的に分解されるような量で、含んでなる酵素調製物の存在下で、二酸化硫黄を含有する温水にトウモロコシまたはソルガム粒を浸漬する方法を提供する。この酵素調製物はフィターゼおよび／または酸性ホスファターゼ、ならびに所望によりその他の植物材料分解酵素を含んでいてもよい。浸漬時間は12〜18時間であってよい。この浸漬中に中間的な粉砕工程を差し挟むと浸漬時間が短くなる。好ましい実施形態では、トウモロコシまたはソルガム粒を、フィターゼおよび酸性ホスファターゼなどの1以上のフィチン分解酵素を含む酵素調製物の存在下、二酸化硫黄を含有する温水に浸漬して、フィチン酸およびフィチン酸の塩を除去または大幅に少なくする。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、かつ／または当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはUSPN 4,914,029(Caransaら)およびEP 0321004(Vaaraら)が挙げられるが、これらの文献は本発明の分子を教示するものではない。
【０３１４】
限定されるものではないがある態様では、本発明は、パン生地にフィターゼ分子を添加することを含んでなる、非粘着性および弾性などの所望の物理特性を有するパン生地、ならびに一定容量などの優れた品質のパン製品を得る方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明のフィターゼ分子は続いて成形して焼かれる発酵中のパン生地配合物に添加される。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、かつ／または当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはJP 03076529(Haraら)が挙げられるが、これらの文献は本発明の分子を教示するものではない。
【０３１５】
限定されるものではないがある態様では、本発明は、改良されたダイズ食品を製造する方法を提供する。ダイズを本発明のフィターゼ分子と組み合わせてダイズからフィチン酸を除去することで、消費生物にとって不可欠な微量栄養素の供給において、またタンパク質の消化性において改良されたダイズ食品が製造される。好ましい実施形態では、豆乳の製造において、フィチン酸含量を少なくするために本発明のフィターゼ分子をダイズに加えて接触させる。限定されるものではないがある例では、適用プロセスは、加熱下で豆乳を酵素とともにかきまぜることで、あるいは固定化酵素を用いて攪拌容器中で混合型反応を行うことで加速させることができる。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、かつ／または当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはJP 59166049(Kamikudoら)が挙げられるが、これらの文献
は本発明の分子を教示するものではない。
【０３１６】
ある態様では、本発明は、飲料水または液状の動物飼料用の混合製品を製造する方法を提供し、この方法はミネラル混合物およびビタミン混合物ならびに本発明の新規なフィターゼ分子を使用することを含んでなる。好ましい実施形態では、重要なミネラル／ビタミンの沈殿や破壊のリスクを伴わない消費生物に必要な栄養素の適正量・適正配合の混合物が得られ、同時に飼料中のフィチン結合リン酸の最適な利用が可能である。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、かつ／または当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはEP 0772978(Bendixenら)が挙げられるが、これらの文献は本発明の分子を教示するものではない。
【０３１７】
本発明のフィターゼ分子はまたカビの使用、および／または穀粒、および／またはその他の植物をもとにした他のアルコール性および非アルコール性飲料食品(または飲料)の製造にも使用できる。これらの飲料食品としては、酒類、ワイン、ミックスアルコール飲料(例えば、ワインクーラー、アイリッシュコーヒーなどのその他のアルコールコーヒーなど)、ビール、ニアビール、ジュース、抽出液、ホモジネートおよびピューレが挙げられる。好ましい例では、本明細書で開示されるフィターゼ分子を用いて、かかる飲料食品の製造に便利なトランスジェニック型のカビ、および／または穀粒、および／またはその他の植物を作出する。もう1つの好ましい例では、かかる飲料食品の製造工程および／または最終含量中の付加的成分として本明細書で開示されるフィターゼ分子を用いる。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、かつ／または当業者に公知である。しかし、本発明の新規性のため、これらの文献は本明細書に開示される本発明分子を教示するものではない。
【０３１８】
限定されるものではないがもう1つの例では、本発明は、フィチン量が少なくイノシトール含量が高い清酒を得る手段を提供する。かかる酒は肝臓病、動脈硬化症その他の疾病に対する直接的および／または精神的作用、すなわち予防作用を有し得る。好ましい実施形態では、酒は米麹から、原料として高フィターゼ活性を有する米麹カビを多機能的に働かせることで製造される。本発明のフィターゼ分子は活性が向上し(好ましくはトランスジェニックカビ)、かつ／または麹カビの作用を外因的に高めるために加える有用なカビを作出するのに使用できると考えられる。この菌株を蒸した米に加え、麹を常法により作製する。好ましい例では、このように準備した麹を用い、米全粒を二段階で準備し、15℃の一定した酒温で酒を製造して、フィチン量が少なくイノシトール量の多い目的の清酒を得る。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、かつ／または当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはJP 06153896(Sogaら)およびJP 06070749(Sogaら)が挙げられるが、これらの文献は本発明の分子を教示するものではない。
【０３１９】
限定されるものではないがある態様では、本発明は、胃液または腸液により消化されない摂取カルシウムをはじめとするミネラルの吸収を低コストで促進することができる吸収促進剤を得る方法を提供する。好ましい実施形態では、該ミネラル吸収促進剤は有効成分としてフィチン酸の部分加水分解を含む。好ましくはフィチン酸の部分加水分解は本発明の新規なフィターゼ分子を用いてフィチン酸またはその塩を加水分解することで製造される。該フィターゼ分子による処理は単独で行っても、かつ／または併用処理を行ってもよく(最終作用を阻害するため、または促進するため)、その後、リン酸残基を全ては遊離しないような範囲内で加水分解を阻害してもよい。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、かつ／または当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはJP 04270296(Hoshinoら)が挙げられるが、これらの文献は本発明の分子を教示するものではない。
【０３２０】
限定されるものではないがある態様では、本発明は、相加的または好ましくは相乗作用的フィターゼ加水分解活性を有する酵素組成物を製造する方法(およびそれからの産物)を提供し、該組成物は本発明の新規なフィターゼ分子および併用処理に有用な組成物を得るための1以上の付加的試薬を含んでなる。好ましい実施形態では、本発明の併用処理は位置特異性が異なる少なくとも2種類のフィターゼ、すなわち1-、2-、3-、4-、5-および6-フィターゼのいずれかの組合せを用いることで達成される。位置特異性が異なるフィターゼを組み合わせることで相加または相乗作用が得られる。かかるフィターゼを組み合わせて含む食品ならびに飼料または食品および飼料添加物などの組成物も、それらの製法と同じく本発明に含まれる。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、かつ／または当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはWO 9830681(Ohmannら)が挙げられるが、これらの文献は本発明の分子を教示するものではない。
【０３２１】
もう1つの好ましい実施形態では、本発明の併用処理はpH2.5でフィチン酸加水分解活性を有する酸性ホスファターゼを、約0.1:1.0ないし10:1、好ましくは約0.5:1.0ないし5:1、より好ましくは約0.8:1.0ないし3:1、いっそう好ましくは約0.8:1.0ないし2:1のpH2.5:5.0活性プロフィールに相当する低い割合で用いることで達成される。該酵素組成物は熱処理によってより高い相乗的フィチン酸加水分解作用を示すことが好ましい。該酵素組成物はフィチン酸の加水分解を向上させることを目的とした食品(飲用および固形食品、飼料および飼料製品)の処理に有用である。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、かつ／または当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはUSPN 5,554,399(Vanderbekeら)およびUSPN 5,443,979(Vanderbekeら)が挙げられるが、これらの文献は本発明分子を教示するものではなく、むしろ真菌(特にコウジカビ属)フィターゼの使用を教示するものである。
【０３２２】
限定されるものではないがある態様では、本発明は多糖類に作用する1以上の付加的酵素と組み合わせた、この新規なフィチン酸作用酵素からなる組成物を製造する方法(およびそれからの産物)を提供する。かかる多糖類としてはアラビナン、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン、レバン、フコイダン、カラギーナン、ガラクツロカロロース、ペクチン、ペクチン酸、アミロース、プルラン、グリコゲン、アミロペクチン、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デキストラン、パスツラン、キチン、アガロース、ケラタン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、およびアルドース、ケトース、また、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガロース、グルクロン酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、マニュロン酸、グルコサミン、ガラクトサミンおよびノイラミン酸からなる群より選択される酸またはアミンの少なくとも1種を含有する多糖類からなる群から選択することができる。
【０３２３】
特定の態様では、本発明は本発明の1以上の新規なフィターゼ分子、セルラーゼ(もっぱらというわけではないが好ましくはキシラナーゼを含む)、所望によりのプロテアーゼおよび所望により1以上の付加的試薬を含んでなる、相乗的フィチン酸加水分解活性を有する組成物を製造する方法(およびそれからの産物)を提供する。好ましい実施形態では、かかる併用処理は食品、紙製品などの木製品、ならびにクレンジング液および固形クレンジングの処理に有用である。
【０３２４】
限定されるものではないがある例では、本フィターゼ分子はセルロース成分と併用するのに有用である。多くのセルロース分解細菌のセルラーゼはセルロソームと呼ばれる個々の多酵素複合体に組織化されることが知られている。セルロソームの複数のサブユニットは、互いに、また、セルロース基質と反応する多くの機能的ドメインからなる。これらのサブユニットのあるものは、接着性複合体に種々のセルラーゼおよびキシラナーゼサブユニットを選択的に組み込んだ明らかに新しいクラスの非触媒性スキャホールドポリペプチドを含んでなる。セルロソームハイブリッドおよびセルロソームドメインのキメラ構築物の情報化応用はセルロース系バイオマスのよりよい利用を可能とし、研究、医学および工業における広範な新規の応用をもたらすであろう。
【０３２５】
限定されるものではないがもう1つの例では、本フィターゼ分子は、パルプおよび製紙工業で従来使用されてきた環境上有害な化学物質の使用の削減が望まれるバイオパルプおよびバイオ漂白の分野での単独または併用処置に有用である。廃水処理は、生物酵素が脱色のみならず有害である可能性のある物質を有用な生物産物へと生物変換する上でも有効であることが知られているその他の広範な応用を示す。
【０３２６】
限定されるものではないがもう1つの例では、本フィターゼ分子は、生物の消化系の処理において少なくとも1つの酵素活性を提供し得る生物形態を単独で、または併用処理で作出するのに有用である。特に適切な処理生物としては非反芻生物が挙げられる。特に、このアプローチは単独またはその他の生物分子(例えば、キシラナーゼ)と併用して行って、複数の生物分子を発現する組換え宿主を作出することができると考えられる。また、本フィターゼ分子および／または本フィターゼ分子を発現する組換え宿主の投与は単独で行ってもよいし、消化系で酵素活性を提供し得るその他の生物分子および／または生物形態(なお、その他の酵素および生物形態は組換え型であってもなくてもよい)を併用して行ってもよいと考えられる。例えば、投与はキシラン分解細菌を併用して行ってもよい。
【０３２７】
例えば多くの生物はフィチン酸の他、ヘミセルロースも十分に消化することができる。ヘミセルロースまたはキシランは植物素材の主成分(35%)である。反芻動物では、キシラン繊維の約50%は消化されるが、非反芻動物およびヒトの下方腸管では少量のキシランが消化されるだけである。反芻動物では、主要なキシラン分解種はButyrivibrio fibrisolvensおよびBacteroides ruminicolaであり、ヒトの結腸ではBacteroides ovatusおよびBacteroides fragilis亜種「a」が主要なキシラン分解細菌である。キシランは化学複合体であり、それらの分解には複数の酵素が必要である。腸管細菌によるこれらの酵素の発現は種間で大きく異なる。Butyrivibrio fibrisolvensは細胞外キシラナーゼを産生するが、Bacteroides種は細胞結合型のキシラナーゼ活性を有する。腸管細菌由来のキシラン分解酵素の生化学的同定はまだ完全には行われていない。キシロシダーゼ遺伝子がB. fibrosolvens 113からクローニングされている。B. fibrosolvens 49からクローニングされたキシラナーゼ遺伝子を用いたDNAハイブリダイゼーションから得られたデータは、この遺伝子は他のB. fibrosolvens株にも存在し得ることを示している。Bact. RuminicolaからクローニングされたキシラナーゼがBact. FragilisおよびBact. Uniformisに導入され、そこで高い発現を示した。Bact. Ovatus由来のアラビノシダーゼおよびキシロシダーゼ遺伝子がクローンニングされており、両活性とも新規な単一の二機能性酵素によって触媒されることが明らかである。
【０３２８】
従って、本フィターゼ分子は1)好適な宿主(Bact. FragilisまたはBact. Uniformisなど)への導入、2)結果として得られた組換え宿主における十分な発現、および3)処理された生物のフィチン酸分解能を高めることを目的とした生物への該組換え宿主の投与に使用できる。遺伝学および生化学の分野の研究を続ければ、腸管レベルでの消化の取り扱いに関する知見や洞察、また、結腸の繊維消化に関するよりよい理解が得られよう。
【０３２９】
このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、かつ／または当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはUSPN 5,624,678(Bedfordら)、USPN 5,683,911(Bodieら),USPN 5,720,971(Beaucheminら)、USPN 5,759,840(Sungら)、USPN 5,770,012(Cooper)、USPN 5,786,316(Baeckら)、USPN 5,817,500(Hansenら)および雑誌文献(Jeffries, 1996; Prade, 1996; Bayerら, 1994; Duarteら, 1994; HespellおよびWhitehead, 1990; Wongら, 1988)が挙げられるが、これらの文献は本発明分子を教示するものではないし、それらはいずれも食品、紙製品などの木製品、ならびにクレンジング液および固形クレンジングの製造におけるフィターゼ分子の添加を教示するものではない。これに対し、本発明は、フィターゼ分子（好ましくは本発明のフィターゼ分子）を、付加的なフィターゼ活性を有する調製物を得るために、開示された試薬に添加することができるということを教示する。付加的フィターゼ分子としてのこれらの試薬は互いに阻害し合わないことが好ましく、付加的フィターゼ分子としてのこれらの試薬は全体として相加作用を有することがより好ましく、付加的フィターゼ分子としてのこれらの試薬は全体として相乗作用を有することがいっそう好ましい。
【０３３０】
限定されるものではないがある態様では、本発明は、ヒドロキシル化ビタミンD3誘導体を含有する飼料組成物を動物に投与することにより、フィチン酸リン利用の向上、ならびに動物、特に家禽の頸骨軟骨形成不全の治療および予防のための方法(およびそれからの産物)を提供する。ビタミンD3誘導体は好ましくは、フィチン酸リンの利用を高めるために低レベルのカルシウムとリンを含有する飼料として動物に投与する。従って、ビタミンD3誘導体は好ましくは、フィチン酸リンの利用をさらに高めるために本発明の新規なフィターゼ分子と併用投与する。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、かつ／または当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはUSPN 5,516,525(Edwardsら)およびUSPN 5,366,736(Edwardsら)、USPN 5,316,770(Edwardsら)が挙げられるが、これらの文献は本発明分子を教示するものではない。
【０３３１】
限定されるものではないがある態様では、本発明は、1)生物体にイノシトールの形態で容易に吸収されて利用されるフィチンを含んでなり、2)排泄物中のリンを軽減することができ、かつ、3)従って、環境汚染の改善に有用な食物を得る方法(およびそれからの産物)を提供する。該食物はフィチン含有粒、乳酸産生微生物、および本発明の新規なフィターゼ分子の混合物からなる。好ましい実施形態では、該食物はフィチン含有粒(好ましくは、例えば米糠)を、好酸性を有し、乳酸を産生するが酪酸は産生せず、病原性がない有効な微生物群およびフィターゼと、混合することで製造する。有効な微生物群の例としては、例えば、放線菌のグループに属すストレプトミセス(Streptomyces)sp. ATCC 3004)および乳酸菌のグループに属すラクトバチルス(Lactobacillus)sp. (IFO 3070)が挙げられる。また、有効な微生物群の添加の好ましい量は穀粒材料に対する菌体重量で0.2重量%である。また、フィターゼの添加量は好ましくは穀粒材料中のフィチンに対して1ないし2重量%である。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、かつ／または当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはJP 08205785(Akahoriら)が挙げられるが、この文献は本発明分子を教示するものではない。
【０３３２】
限定されるものではないがある態様では、本発明は植物タンパク質の溶解度を高める方法を提供する。より詳しくは、本発明は植物タンパク源におけるタンパク質の可溶化のための方法に関し、その方法は植物タンパク源を本発明のフィターゼ分子を含む1以上のフィターゼ酵素の有効量で処理し、さらに植物タンパク源を1以上のタンパク質分解酵素の有効量で処理することを含む。もう1つの態様では、本発明はフィターゼおよび1以上のタンパク質分解酵素を含んでなる動物飼料添加物を提供する。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、かつ／または当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはEP 0756457(WO 9528850 A1)(NielsenおよびKnap)が挙げられるが、これらの文献は本発明分子を教示するものではない。
【０３３３】
限定されるものではないがある態様では、本発明は植物タンパク源材料を2ないし6のpH範囲の水に分散させ、その中に本発明のフィターゼ分子を混合することを含んでなる植物タンパク質調製物の製造方法を提供する。可溶性タンパク質を含有する酸性抽出物を分離し、乾燥させて、所望の特性の固形タンパク質を得る。タンパク質の特性を改良するために1以上のプロテアーゼを用いてもよい。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、かつ／または当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはUSPN 3,966,971(Morehouseら)が挙げられるが、この文献は本発明分子を教示するものではない。
【０３３４】
限定されるものではないがある態様では、本発明はコンポストに3種類の試薬、すなわちフィターゼ、サポニンおよびキトサンを添加することで、土壌および／またはコンポスト中の不活性なリンを活性化させて窒素成分の利用率を高め、かつ、病原性のカビの繁殖を抑える方法(およびそれからの産物)を提供する。限定されるものではないがある実施形態では、本方法は、1)培地中のフィターゼ含有微生物、好ましくは本発明の新規なフィターゼ分子を過剰発現する組換え宿主を、例えば100ml培地／100kgコンポスト湿重で添加し、2)あるいはまた、コムギふすまなどのフィターゼ含有植物源を、例えば0.2ないし1kg/100kgコンポスト湿重で添加し、3)ピート、ヨモギおよびユッカ植物などのサポニン含有源を、例えば0.5ないし3.0g/kgで添加し、4)エビ、カニなどの殻を粉砕したものなどキトサン含有材料を、例えば100ないし300kg/kgコンポスト湿重で添加することでコンポストを処理することを含み得る。限定されるものではないがもう1つの実施形態では、組換え型としての3種類の試薬、すなわちフィターゼ、サポニンおよびキトサンを用いる。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、かつ／または当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としてはJP 07277865(Toya Taisuke)が挙げられるが、この文献は本発明分子を教示するものではない。
【０３３５】
本発明の全長遺伝子の断片をcDNAまたはゲノムライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして用いて、全長DNAを単離し、また、その遺伝子に対して高い配列類似性または同じ生物活性を有する他のDNAを単離することができる。この種のプローブは少なくとも10、好ましくは少なくとも15、いっそう好ましくは少なくとも30塩基を有し、例えば少なくとも50以上の塩基を含む場合もある。またこのプローブを用いて、全長転写物に相当するDNAクローンおよびゲノムクローンすなわち調節およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含む完全な遺伝子を含むクローンを同定することもできる。
【０３３６】
本発明は配列番号1の他、フィターゼポリペプチド系のメンバーをコードする核酸分子を同定する方法を提供する。これらの方法では、サンプル、例えばフィターゼポリペプチドをコードする核酸を含む核酸ライブラリー(cDNAライブラリーなど)をフィターゼ特異的プローブ、例えばフィターゼ特異的核酸プローブを用いてスクリーニングする。フィターゼ特異的核酸プローブはフィターゼポリペプチドをコードする核酸またはその相補的配列と特異的にハイブリダイズする核酸分子（例えば、DNAまたはRNAヌクレオチドを含有する分子、またはその組合せもしくは改変体)である。本発明の方法に関して「フィターゼ特異的プローブ」とは、フィターゼポリペプチドをコードする核酸またはその相補的配列と、その他の酵素をコードする核酸またはその相補的配列よりも検出可能により高度に結合するプローブをさす。
【０３３７】
本発明はフィターゼ特異的核酸プローブの製造を助けるものである。かかるプローブを得る方法は図1に示されるアミノ酸配列をもとに設計することができる。これらのプローブは少なくとも12、例えば少なくとも15、25、35、50、100または150のヌクレオチドを含むことができ、いくつかの標準法(例えば、Ausubelら(前掲)参照)を用いて製造することができる。例えば、好ましくは、これらのプローブはPCR増幅法を用いて作製する。これらの方法では、プライマーはフィターゼ特異的アミノ酸を含み得る、フィターゼによって保存された配列(図1参照)に対応するように設計し、得られたPCR産物をプローブとして用いてcDNAライブラリーなどの核酸ライブラリーをスクリーニングする。
【０３３８】
本発明を用い、図1(配列番号1)に開示されているフィターゼ酵素をコードする単離された核酸分子と実質的に類似している核酸配列を単離することができる。単離された核酸配列は、(i)それらが以下に記載されるストリンジェントな条件下で配列番号1とハイブリダイズできる場合、または(ii)それらが遺伝子コードの縮重(例えば配列番号1との縮重)のために配列番号2で示されるフィターゼポリペプチドをコードする場合に実質的に類似していると言える。
【０３３９】
縮重したDNA配列は配列番号2のアミノ酸配列をコードするが、ヌクレオチドコード配列に変異を有する。本明細書において「実質的に類似」とは、本発明の配列に対して類似した同一性を有する配列をさす。実質的に類似しているヌクレオチド配列はハイブリダイゼーションまたは配列比較により同定することができる。実質的に類似している酵素配列は、タンパク質分解消化、ゲル電気泳動および／またはマイクロ配列決定の1以上によって同定することができる。
【０３４０】
フィターゼ酵素をコードする核酸分子を単離する1つの手段は、当技術分野で公知の手法(例えば、Ausubelら(前掲)参照)を用いて、ゲノム遺伝子ライブラリーを天然または人工的に設計されたプローブで検索することである。当業者ならば、配列番号1またはその断片(少なくとも15の連続するヌクレオチドを含む)が特に好ましいプローブであることが分かる。この目的で他の特に有用プローブとしては、配列番号1の配列とハイブリダイズ可能な断片(すなわち、少なくとも15の連続するヌクレオチドを含む)がある。
【０３４１】
また、かかるプローブはそのプローブの同定を容易にするために分析的に検出できる試薬で標識することができ、そうすることが好ましいと考えられる。有用な試薬としては、限定されるものではないが、放射活性、蛍光色素または検出可能な生成物の形成を触媒し得る酵素が挙げられる。このように、これらのプローブは、他の動物源からDNAの相補的コピーを単離するのに、あるいはかかる供給源を関連の配列に関してスクリーニングするのに有用である。
【０３４２】
本明細書に開示される特定の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列に関して、ハイブリダイゼーションは低ストリンジェント条件、中程度のストリンジェント条件またはストリンジェント条件であっても行うことができる。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの例としては、まず固定化変性核酸を含む高分子メンブランを0.9M NaCl、50mM NaH2PO4、pH7.0、5.0mM Na2EDTA、0.5%SDS、10Xデンハート液および0.5mg/mLポリリボアデニル酸からなる溶液中、45℃で30分間ハイブリダイズさせる。次に32P末端標識したオリゴヌクレオチドプローブの約2X107cpm(比活性4〜9X108cpm/μg)を溶液に添加する。インキュベーション12〜16時間後、このメンブランを0.5%SDSを含有する1X SET(150mM NaCl、20mM Tris塩酸、pH7.8、1mM Na2EDTA)中で室温にて30分間、続いてオリゴヌクレオチドプローブについては新鮮な1X SET中、10℃にて30分間で洗浄する。次にこのメンブランをハイブリダイゼーションシグナルの検出のためオートラジオグラフィーフィルムに露光する。
【０３４３】
本発明の核酸分子はフィターゼ遺伝子産物(例えば、フィターゼRNAおよびフィターゼポリペプチド)の生産のための標準法で鋳型として使用することができる。さらに、フィターゼポリペプチド(およびその断片)をコードする核酸分子、および(1)フィターゼポリペプチドをコードする核酸と相補的な、もしくはハイブリダイズする配列を含む核酸、またはその断片(例えば、少なくとも12、15、20または25のヌクレオチドを含む断片)、ならびに(2)フィターゼポリペプチドをコードする核酸に相補的な配列とハイブリダイズする配列を含む核酸、またはその断片(例えば、少なくとも12、15、20または25のヌクレオチドを含む断片)などの関連の核酸はそれらのハイブリダイゼーション特性に着目した方法で使用することができる。例えば、本明細書でさらに詳しく記載されるように、かかる核酸分子は以下の方法：フィターゼ核酸の合成を目的としたPCR法、サンプル中のフィターゼ核酸の存在を検出する方法、新たなフィターゼファミリーのメンバーをコードする核酸を同定するスクリーニング法で使用することができる。ハイブリダイゼーションに基づく使用としては、サザン型、ノーザン型、RNAプロテクションおよびハイブリダイゼーション法のいずれもが挙げられ、ここでは核酸がハイブリダイゼーション相手として用いられる。
【０３４４】
本発明のポリヌクレオチドの断片または一部は本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使用することができる。従って、本発明の酵素の断片または一部はペプチド合成により対応する全長酵素を調製するために使用することができることから、この断片は全長酵素を調製するための中間体として使用することができる。切断された断片のサイズ分画は通常、文献に記載のように(例えば、Goeddelら, 1980による)8%ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。
【０３４５】
本発明は、定方向進化に用いるための酵素、ならびにその断片、その他の誘導体および類似体、および対応するヌクレオチドを提供する。本明細書に開示される複数の鋳型の発見および使用により、単一の鋳型タンパク質の定方向進化に比べて定方向進化の発生率を著しく高められる。かくして、発見の必要性は、自然状態では分子グループの個別のしかし関連したメンバーのおそらくは達成できないまたは予測できない多くの特徴がもたらされるという前提、また、これらの特徴の利用が定方向進化を大きく助けるという前提に基づくものである。このように、ある態様では、関連はあるが個別の分子は所望の特徴の定方向進化のために独特な出発鋳型として働き得る。もう1つの態様では、それらは限定されるものではないが、種々の共通モチーフをはじめとする構造-機能情報の宝庫として働き得る。どちらの有用性もある分子に対する過度に広範囲の突然変異の組合せを一度に検索する論理学上実行不能なタスクを回避する助けとなる。例えば、100個のアミノ酸のタンパク質に対して全範囲の突然変異の組合せには10130通りを超える可能性があり(各位置について20種のアミノ酸の可能性があると仮定され
る)、実用を考えるにはあまりにも数が多すぎる。
【０３４６】
従って、特に論理的かつ技術的制限のために、「定方向進化」を行う上で望ましいアプローチとは、進化前の差異を有する複数の関連した開始鋳型を発見および作製することである。次にこれらの鋳型に対して、限定されるものではないが例としてDNA突然変異誘発およびコンビナトリアル酵素開発(このアプローチは同時係属中のUSPN 5,830,696(Shortら)にさらに詳しく述べられている)によるなど、種々の突然変異誘発操作を行うことができる。
【０３４７】
次に、作製された新規な分子の酵素活性は、限定されるものではないが例としてa)分子バイオプランニング、b)組換えクローンスクリーニング、およびc)抽出スクリーニングによるなどの種々の方法によりスクリーニングすることができる。
【０３４８】
本発明は、抗体を作製するための免疫原として使用できる酵素、その断片、その他の誘導体および類似体、ならびにそれらを発現する細胞を提供する。これらの抗体は例えばポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。本発明はまた、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を含む。かかる抗体およびフラグメントを作製するには当技術分野で公知の種々の方法を用いることができる。
【０３４９】
本発明の配列に対応する酵素に対して作製される抗体は、この酵素を動物に直接注射することにより、あるいはこの酵素を動物、好ましくはヒト以外に投与することにより得ることができる。そして、このようにして得られた抗体は酵素自身と結合する。このように、酵素の断片だけをコードする配列であっても、天然型の全酵素と結合する抗体を作製するために使用することができる。かかる抗体は次にこの酵素を発現する細胞から酵素を単離するために使用することができる。
【０３５０】
モノクローナル抗体の製造のためには、細胞系の連続培養によって抗体を作製するいずれの技術を用いてもよい。例としてはハイブリドーマ技術(KohlerおよびMilstein, 1975)、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら, 1983)およびヒトモノクローナル抗体の作製を目的とするEBV-ハイブリドーマ技術(Coleら, 1985, pp77-96)が挙げられる。
【０３５１】
一本鎖抗体の製造に関して記載されている技術(USPN4,946,778, Ladnerら)は
本発明の免疫原酵素産物に対する一本鎖抗体を作製するために採用することができる。また、トランスジェニックマウスを用いて本発明の免疫原酵素産物に対するヒト化抗体を発現させてもよい。
【０３５２】
本発明の酵素に対して作製された抗体は他の生物およびサンプル由来の同等の酵素をスクリーニングする際に用いてもよい。かかるスクリーニング技術は当技術分野で公知である。抗体はまた、この生物またはその他の生物から作製された遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためにプローブとして用いて、この反応活性または交差反応活性を同定することもできる。
【０３５３】
上記の系で作製されたポリペプチドの単離および精製は特定の系に適当な従来の方法を用いて行うことができる。例えば、分取クロマトグラフィーおよびモノクローナルまたはポリクローナル抗体などの抗体を用いる免疫学的分離を使用することができる。
【０３５４】
上記のように、フィターゼ特異的抗体を作製する上で使用できる抗原としてはフィターゼポリペプチド、例えば図1ポリペプチド断片に示されるフィターゼのいずれかが挙げられる。動物の免疫化に用いられるポリペプチドまたはペプチドは標準的な組換え、化学合成または精製法によって得ることができる。当技術分野で周知のように、免疫原性を高めるために抗原は担体タンパク質とコンジュゲートすることができる。一般に用いられる担体としては、キーホールリンペット・ヘモシアニン(KLH)、チログロブリン、ウシ血清アルブミン(BSA)および破傷風毒が挙げられる。次に、この結合したペプチドを用いて動物(例えば、マウス、ラットまたはウサギ)を免疫する。かかる担体の他、抗原とともに周知のアジュバントを投与して強い免疫応答の誘導を助けることもできる。
【０３５５】
フィターゼ特異的ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は例えばフィターゼポリペプチド、例えばそれに対して抗体が作製されたフィターゼポリペプチド(またはその断片)を含有するマトリックスに結合させて、そこから溶出することにより精製することができる。抗体精製および濃縮のその他の方法は当技術分野で周知であり、本発明のフィターゼ特異的抗体でも実施することができる(例えば、Coliganら, 1996参照)。
【０３５６】
フィターゼ特異的抗原に対応する抗イディオタイプ抗体も本発明に含まれ、標準的な方法を用いて作製することができる。これらの抗体はフィターゼ特異的抗体に対して作製されたものであることから、フィターゼ特異的エピトープを模倣している。
【０３５７】
本発明はまた、少なくとも1つのフィターゼ特異的活性またはエピトープを保持するフィターゼポリペプチドの断片のさらなる使用を含む。フィターゼ活性はフィチン酸のイノシトールおよび遊離リン酸への触媒作用を調べることでアッセイできる。かかる断片は図1に見られるフィターゼの配列を比較することで容易に同定することができる。
【０３５８】
限定されるものではないがある例では、フィターゼ特異的抗体を製造する上で、例えば少なくとも8〜10のアミノ酸を含有するフィターゼポリペプチド断片を免疫原として用いることができる。この断片は例えばフィターゼで保存されているアミノ酸配列を含むものであってもよく、このアミノ酸配列はフィターゼで保存されているアミノ酸を含むものであってよい。限定されるものではないがもう1つの例では、上記のフィターゼ断片はELISAなど、サンプルにおいてフィターゼ特異的抗体の存在を検出する免疫アッセイで使用することができる。
【０３５９】
本発明のトランスジェニック動物を作出するため種々の方法を用いることができる。概して、3種類の方法が使用できる。1つの方法では、前核ステージの胚(「一核胚」)を雌から採取し、トランスジーンをその胚にマイクロインジェクションするが、この場合にはトランスジーンは得られた成熟動物の生殖系細胞と体細胞の双方の染色体に組み込まれることとなる。もう1つの方法では、胚幹細胞を単離し、エレクトロポレーション、プラスミドトランスフェクションまたはマイクロインジェクションによってトランスジーンをその中へ組み込んだ後、コロニーを形成し、生殖系に寄与する胚にこの幹細胞を再導入する。哺乳類種のマイクロインジェクションの方法は米国特許第4,873,191号に記載されている。さらにもう1つの方法では、胚形成細胞にトランスジーンを含むレトロウイルスを感染させ、それにより胚の生殖細胞は染色体に組み込まれたトランスジーンを有するようになる。トランスジェニックとなる動物が鳥類である場合、鳥類の受精卵は一般に卵管内で最初の12時間の間に細胞分裂を始めるので、受精卵の前核へのマイクロインジェクションは前核に接近できないために問題がある。従って、一般に上記のようなトランスジェニック動物作出法では、例えば米国特許第5,162,215号に記載のように、鳥類種についてはレトロウイルス感染が好ましい。しか
し、鳥類種にマイクロインジェクションを用いる場合には、Loveら(Biotechnology, 12, Jan 1994)により発表されている手法を用いることができ、これにより前の玉の産卵の後約2時間半の時点で雌鳥を犠牲にして胚を得、胚盤の細胞質へトランスジーンをマイクロインジェクションし、その胚を宿主の殻の中で成熟するまで培養する。トランスジェニックとする動物がウシまたはブタである場合、卵が不透明なために、従来の示差干渉コントラスト顕微鏡観察によって核を確認するのが困難であることから、マイクロインジェクションの妨げとなる可能性がある。この問題を克服するためには、まず卵を遠心分離して前核を分離し、よく見えるようにすればよい。
【０３６０】
本発明の「非ヒト動物」とは、ウシ類、ブタ類、ヒツジ類、鳥類である(例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ)。本発明の「トランスジェニック非ヒト動物」は「トランスジーン」をその非ヒト動物の生殖系へ導入することで作出する。様々な発達段階の胚の標的細胞を用いてトランジーンを導入することができる。胚の標的細胞の発達段階に応じて種々の方法を用いる。接合子はマイクロインジェクションに最良の標的である。遺伝子導入の標的としての接合子の使用は、ほとんどの場合で注入されるDNAは最初の分裂の前に宿主遺伝子へ組み込まれるという主な利点を持つ(Brinsterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442, 1985)。結果としてトランスジェニック非動物の全ての細胞にトランスジーンが組み込まれているようになる。一般にこのことはまた、生殖細胞の50%がトランスジーンを含むようになるので、その創始個体の子孫へのトランスジーンの効果的な伝達に反映される。
【０３６１】
「トランスジェニック」とは、その細胞の全てに外来の遺伝材料を含む動物を表すのに用いられる。「トランスジェニック」動物は、生殖に用いられる細胞内に外来の遺伝材料を含む2種のキメラ度物を交配することで作出することができる。得られた子孫の25%がトランスジェニック、すなわち、両対立遺伝子においてそれらの細胞の全てに外来の遺伝材料を含む動物となり、得られる動物の50%は一方の対立遺伝子に外来の遺伝材料を含み、25%は外来の遺伝材料を全く含まないものとなる。
【０３６２】
本発明の実施に有用なマイクロインジェクション法では、トランスジーンを消化し、例えばゲル電気泳動によっていずれのベクターDNAも含まないように精製する。トランスジーンは、転写に関連する細胞内タンパク質と相互作用する機能し得る形で連結されたプロモーターを含み、最終的には構成的発現となることが好ましい。この点で有用なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス(CMV)、モロニー白血病ウイルス(MLV)、およびヘルペスウイルスに由来するのもの、ならびにメタロチオネイン、骨格アクチン、P-エノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPCK)、ホスホグリセレート(PGK)、DHFR、およびチミジンキナーゼをコードする遺伝子に由来するものが挙げられる。ラウス肉腫ウイルスなどのウイルスの長い末端反復(LTR)のプロモーターも使用できる。トランスジェニックとする動物が鳥類である場合、好ましいプロモーターとしてはニワトリβ-グロブリン遺伝子、ニワトリライソザイム遺伝子、およびトリ白血病ウイルスのものが挙げられる。胚幹細胞のプラスミドトランスフェクションに有用な構築物は、転写を刺激するエンハンサーエレメント、スプライシング受容体、終結およびポリアデニル化シグナル、ならびに翻訳を可能とするリボゾーム結合部位など、当技術分野で周知のさらなる調節エレメントを用いる。
【０３６３】
レトロウイルス感染もまた、上記のように非ヒト動物にトランスジーンを導入するために使用できる。発達中の非ヒト胚をin vitroで胚盤胞段階まで培養することができる。このとき、卵割球はレトロウイルス感染の標的となり得る(Jaenich, R., Proc. Natl. Acad. Sci USA 73:1260-1264, 1976)。卵割球の効果的な感染は透明層を取り除く酵素処理によって得られる(Hoganら(1986), Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)。トランスジーンを導入するために用いられるウイルスベクター系としては典型的には、トランスジーンを運ぶ複製欠陥レトロウイルスである(Jahnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6927-6931, 1985; Van der Puttrnら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-6152, 1985)。トランスフェクションはウイルス産生細胞単層上で卵割球を培養することで容易かつ効果的に得られる(Van der Petten, 上記; Stewartら, EMBO J. 6:383-388, 1987)。あるいは、感染はもっと後の段階で行ってもよい。ウイルスまたはウイルス産生細胞を卵割腔に注入することができる(D. Jahnerら, Nature 298:623-628, 1982)。創始個体の大部分は、トランスジェニック非ヒト動物となった細胞のサブセットにおいてのみ組込みが起こるので、創始個体の大部分はトランスジーンに関してモザイク状態であろう。さらに、創始個体はゲノム中の様々な場所にトランスジーンの種々のレトロウイルス挿入配列を含み、これは一般に子孫では分離すると考えられる。また、低い効率ではあるが、トランスジーンを妊娠中期胚の子宮内レトロウイルス感染によって生殖系に導入することもできる(D. Jahnerら,上記)。
【０３６４】
トランスジーンの導入のための標的細胞の第3のタイプとして、胚性幹細胞(ES)がある。ES細胞はin vitroで培養して胚と融合させた移植前胚から得られる(M. J. Evansら, Nature 292:154-156, 1981; M. O. Bradleyら, Nature 309:255-258, 1984; Gosslerら, Proc. Natl. Sci USA 83:9065-9069, 1986およびRobertsonら, Nature 322:445-448, 1986)。トランスジーンはDNAトランスフェクションまたはレトロウイルスを媒介とした形質導入によってES細胞に効率的に導入することができる。その後、かかる形質転換ES細胞を非ヒト動物の胚盤胞と組み合わせることができる。その後、そのES細胞を胚を形成し、得られたキメラ動物の生殖系に寄与する。(総説としては、Jaenisch, R., Science 240:1468-1474, 1988参照。)
「形質転換された」とは、組換え核酸技術によりそれに(またはその祖先に)異種核酸分子が導入された細胞を意味する。「異種」とは、別の種に起源するか、あるいはそのもとの形態すなわちその細胞でもともと発現していた形態から改変された核酸配列をさす。
【０３６５】
「トランスジーン」は技術によって細胞内へ挿入されるDNA片を意味し、その細胞から発達する生物のゲノムの一部となる(すなわち、安定して組み込まれているか、あるいは安定した染色体外エレメントとして)。かかるトランスジーンはトランスジェニック生物に対して部分的異種または完全に異種(すなわち、外来)である遺伝子を含んでもよいし、あるいはその生物の内在遺伝子と同種の遺伝子であってもよい。DNAへと転写され、次にゲノムへ組み込まれるRNA配列を提供することで作出されたトランスジーンもこの定義の中に含まれる。本発明のトランスジーンとしては、フィターゼまたはフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA配列を含み、トランスジェニック非ヒト動物で発現し得るポリヌクレオチドを含む。また本明細書において「トランスジェニック」とは、初期胚または受精卵のin vitro操作により、または特定の遺伝子ノックアウトを誘導するいずれかのトランスジェニック技術によりそのゲノムが変更されたいずれの生物も含む。本明細書において「遺伝子ノックアウト」とは、当業者に公知のいずれかのトランスジェニック技術によって達成された機能の完全な欠損を伴ったin vivoにおける遺伝子のターゲッティング破壊をさす。ある実施形態では、遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物とは、相同組換えによって機能しなくさせる遺伝子に向けた挿入によって標的遺伝子を機能しなくさせたものである。本明細書において「トランスジェニック」とは、トランスジーンが導入された生物を作出できる当業者に公知のいずれかのトランスジェニック技術、あるいは内在する遺伝子が機能しなくさせた、または「ノックアウト」されたものを含む。
【０３６６】
本発明の実施に用いられるトランスジーンはフィターゼまたはフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含んでなるDNA配列である。本明細書でそのように定義するならば、ある実施形態では、配列番号1で示される配列を有するポリペプチド、または配列番号2で示される配列を有するポリペプチドをコードする配列がトランスジーンである。適当であれば、トランケート型、対立遺伝子変異体および種間ホモログのように、フィターゼ活性を有するタンパク質をコードするが、遺伝子コードの縮重のために核酸配列が異なるDNA配列も本明細書で使用できる。
【０３６７】
胚はマイクロインジェクションし、トランスフェクトされた胚性幹細胞とともにコロニーを形成させた後、あるいはトランスジーンを含むレトロウイルスを感染させた後(ただし、本明細書の他所に記載されているトリ種における本発明の実施を除いて)、胚を偽妊娠の雌の卵管に移植する。得られた子孫についてトランスジーン特異的プローブを用いた血液または組織サンプルのサザンブロット分析により、トランスジーンが組み込まれたかどうかを試験する。この点でPCRが特に有用である。陽性子孫(G0)を交配して後代(G1)を得、これを組織サンプルのノーザンブロット分析によってトランスジーン発現に関して分析する。
【０３６８】
このように本発明はトランスジェニック動物のリンの取り込みを高め、かつ／またはトランスジェニック生物の厩肥の汚染物質量を約15%、典型的には約20%、より典型的には約20%ないし約50%引き下げる方法を含む。
【０３６９】
本発明の実施上使用を意図される動物は、ペット(例えばイヌ、ネコ、トリ種など)をはじめとする一般に飼育動物とみなされる動物、および食品加工に有用なもの、すなわち、食肉種や産卵用のニワトリおよびシチメンチョウなどの鳥類、ラムなどのヒツジ、肉牛や乳牛などのウシ、魚類およびブタである。本発明の目的では、これらの動物は、かかる動物がその動物の生殖細胞の染色体に組み込まれた異種DNA配列、または通常その動物に内在する1以上の付加的DNA配列(ひとまとめにして本明細書では「トランスジーン」と呼ぶ)を有していた場合に「トランスジェニック」と呼ばれる。トランスジェニック動物(その子孫を含む)はまた、偶然に体細胞の染色体に組み込まれたトランスジーンを有する場合もある。
【０３７０】
いくつかの例では、本発明のフィターゼ配列を局部的に(例えば、特定の組織または細胞タイプ内に)送達して発現させるのに有利であると考えられる。例えば、動物の腸管でのフィターゼまたは消化酵素の局部発現はそれぞれ例えばフィチン酸およびリンの消化および取り込みの助けとなる。この核酸配列は例えば唾液腺、組織および細胞に、かつ／または腸管の上皮細胞ライニングに直接送達してもよい。かかる送達法は当技術分野で公知であり、エレクトロポレーション、ウイルスベクター法および直接DNA取り込み法が挙げられる。フィターゼ活性を有するポリペプチドならばいずれのものでも本発明の方法で利用できる(例えば、ここで特に記載されるもの、ならびに本発明の他の節で記載されるもの)。
【０３７１】
例えば、本発明の核酸構築物は宿主組織内の標的細胞への取り込みに好適な形態の核酸分子を含んでなる。核酸は裸のDNAまたはRNA分子の形態であってもよく、ここでこれらの分子は1以上の構造遺伝子、1以上の調節遺伝子、アンチセンス鎖、三重らせんを形成し得る鎖などを含み得る。一般に、この核酸構築物は好適な調節領域の転写および翻訳制御下にある少なくとも1つの構造遺伝子を含む。より多くの場合では、本発明の核酸構築物はトランスフェクション効率を向上させるために送達ビヒクルに組み込んだ核酸を含んでなり、この送達ビヒクルは乾燥親水性賦形剤材料を含んでなるより大きな粒子内に分散させる。
【０３７２】
かかる送達ビヒクルのあるものは、自己複製を妨げるよう不活性化してはいるが、標的宿主細胞と結合し、標的宿主細胞の細胞質に遺伝材料を送達し、粒子に組み込まれていた構造遺伝子またはその他の遺伝子の発現を促進する天然のウイルスの能力を維持しているレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターを含んでなる。遺伝子導入の媒介に好適なレトロウイルスは、参照によりその開示を本明細書に組み入れるKahnら(1992) CIRC. RES. 71:1508-1517に記載されている。好適なアデノウイルス遺伝子送達は、参照によりその開示を本明細書に組み入れるRosenfeldら(1991) SCIENCE 252:431-434に記載されている。参照によりその開示を本明細書に組み入れるFriedman (1989) SCIENCE 244:1275-1281にはレトロウイルスおよびアデノウイルス送達の双方が記載されている。
【０３７３】
核酸送達ビヒクルの第二のタイプは、陰イオンおよび陽イオン双方のリポソーム構築物をはじめとするリポソームトランスフェクション小胞を含んでなる。陰イオンリポソームの使用には核酸をリポソーム内に捕捉する必要がある。陽イオンリポソームには核酸を捕捉する必要はなく、単に核酸とリポソームを混合することで形成することができる。陽イオンリポソームはDNAおよびRNAの両者をはじめとする負電荷を有する核酸分子と好んで結合し、多くの細胞タイプで妥当なトランスフェクション効率を示す複合体が得られる。参照によりその開示を本明細書に組み入れるFarhoodら(1992) BIOCHEM. BIOPHYS. ACTA. 1111:239-246参照。リポソーム小胞の形成に特に好ましい材料としては、参照によりその開示を本明細書に組み入れるFelgnerおよびRingold (1989) NATURE 337:387-388に記載のように、ジオレイルホルファチジルエタノールアミン(DOPE)およびジオレイルオキシトリエチルアンモニウム(DOTMA)の等モル混合物からなるリポフェクチンがある。
【０３７４】
また、これら2種の送達系を組み合わせることもできる。例えば、Kahnら(1992)(上記)は形質転換効率をさらに高めるにはレトロウイルスベクターを陽イオンDEAEデキストラン小胞に組み合わせればよいことを教示している。また、核タンパク質をウイルスおよび／またはリポソーム送達小胞に組み込むとトランスフェクション効率がいっそう高めることができる。参照によりその開示を本明細書に組み入れるKanedaら(1989) SCIENCE 243:375-378参照。
【０３７５】
もう1つの実施形態では、酵素を単独の有効成分として、または1以上のその他の薬剤および／または酵素と組み合わせて含有する消化補助剤が提供される(参照によりその開示を本明細書に組み入れる、2000年5月25日出願の同時係属出願米国出願番号09/580,937, “Dietary Aids and Methods of Use Thereof”に記載)。家畜または飼育動物の消化補助剤における酵素その他の薬剤の使用は動物の健康状態や平均余命を高めるだけでなく、家畜の健康状態を高め、家畜からの食品の製造の助けともなる。
【０３７６】
現在、数種の家畜飼料(例えば、ある種の家禽飼料)には多くのミネラル(例えば無機リン)、酵素、成長因子、薬剤およびその他家畜への送達を目的とした物質が多量に添加されている。これらのサプリメントは例えば穀粒に存在するカロリーおよび天然の栄養素の多くと取って換わっている。
【０３７７】
飼料そのものから無機リンサプリメントおよびその他のサプリメントを(例えば、微量ミネラル塩類、成長因子、酵素、抗生物質)を減らすまたはなくせば、飼料の栄養素やカロリーをもっと高くすることができる。従って、残りの食餌はより有用なエネルギーを含むこととなる。例えば、粒状ナタネミール食は一般に代謝エネルギー約3,200kcal/kg食餌を含み、ミネラル塩類は代謝エネルギーを供給しない。不要なミネラルを除いて穀粒に置き換えれば食餌中に有用なエネルギーが増す。このように本発明は一般に用いられているフィターゼ含有飼料とは異なる。例えばある実施形態では、生物の胃腸管による消化に耐性のある生体適合性材料を用いる。
【０３７８】
例えばニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、オウム、クジャク、ダチョウ、キジ、ウズラ、イエバト、エミュー、キウイ、アビ、オカメインコ、バタンインコ、カナリア、ペンギン、フラミンゴ、およびハトなどの家禽または鳥類をはじめとする多くの生物では、消化管は種子その他の鳥類によって消費される餌の消化を助けるため、堅い生体適合物(例えば、石や貝殻)を格納・使用する砂嚢を含んでいる。この生物属の典型的な消化管は、素嚢と呼ばれる、しばらく食物を溜めておく袋を含む食道を含んでいる。その素嚢から本当の胃に食物が送られ、塩酸やペプシンが消化のプロセスを始める。次に食物は、卵型で強力な筋肉の薄い壁を持つ砂嚢へ送られる。砂嚢の主な働きは食物の粒子を摩砕またはつぶすことであり、このプロセスは鳥が砂礫や砂利を少量飲み込むことで助けられている。食物は砂嚢から十二指腸に送られる。鳥類の小腸は哺乳類のものとよく似ている。小腸と大腸の接合部に長さ約4〜6インチの2つの出口のない袋、すなわち盲腸がある。大腸は短く、長さ約3〜4インチの大部分直腸からなる。直腸は排泄腔へと開いており、肛門を通って糞が排泄される。
【０３７９】
砂嚢に摂取(あるいは導入)され、供される堅い生体適合物は種々の酵素、化学薬品、治療薬および抗生物質の送達のための有用なベクターとなる。これらの堅い物質は数時間から数日の寿命を有し、一定の時間の後に通り抜ける。従って本発明は、生物に有用な消化剤または治療薬を送達するためのコーティングされ、含浸された(例えば、含浸マトリックスおよびメンブラン)食餌改変補助剤を提供する。かかる食餌補助剤は、砂嚢内で消化を助けるために典型的には生物によって摂取される物(例えば、石または砂利)を含む。本発明は生物の消化補助剤として、または治療薬または医薬または化学薬品の送達に有用な薬剤をその上にコーティングまたはそれに含浸させた生体適合物を提供する。
【０３８０】
第1の実施形態では、本発明は消化を助ける薬剤の放出のために設計された生体適合性組成物を有する食餌補助剤を提供し、この生体適合性組成物は経口摂取および生物の消化管(例えば砂嚢)での放出を目的として設計されている。「生体適合性」とは宿主生物(例えば鳥類)と接触した際にその物質の拒絶が起こったり、その物質を働かなくするような有害な応答を引き起こさない物質を意味する。この働かないということは、例えば物質の周囲に繊維構造が形成されて含浸させた薬剤の宿主生物への拡散が限定されることにより、あるいは毒性や感染のために生物の死亡率または罹患率が高まってしまうような物質によって起こり得る。生体適合性物質は非生分解性であっても生分解性であってもよい。ある実施形態では、生体適合性組成物は胃腸管による分解または消化に耐性がある。もう1つの実施形態では、生体適合性組成物は石または小石のコンシステンシーを有する。
【０３８１】
本発明で有用な非生分解性材料としては、食餌剤を付着または含浸させたものがある。かかる非生分解性材料としては、例えばアクリル系、モダクリル系、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、およびポリフッ化ビニリデンなどの熱可塑性プラスチックが挙げられる。エラストマーも有用な材料であり、例えばポリアミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコールおよびシリコーン(例えば、シリコーンベースのもの、またはシリカ含有物)が挙げられる。本発明は生体適合性組成物がかかる複数の材料を含んでもよいということを提案し、例えばこれは混合または積層してブレンドとしたもの、コポリマーまたはその組合せであってよい。
【０３８２】
本明細書において「生分解性」材料とは、in vivoで腐食または分解してより小さな化学種となる組成物を意味する。分解は例えば酵素的プロセス、化学的プロセスまたは物理的プロセスによって起こり得る。本発明での使用が意図される好適な生分解性材料としては、ポリ(ラクチド)、ポリ(グリコリド)、ポリ(酪酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリエーテルエステル、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリカーボネート、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリアクリレートが挙げられる。かかる材料は混合または積層してブレンドとしたもの、コポリマーまたはその組合せであってよい。
【０３８３】
いくつかの異なる生体適合性物質を同じ生物に同時に、または種々の組合せで(例えば、ある材料の前にあるものを)摂取または提供してもよいと考えられる。また、生体適合性物質は消化管をゆっくり通過するように設計してもよい。例えば、大きい物質または脂肪性の物質は消化管をゆっくり移動する傾向があることから、消化管をすぐに通り抜けてしまうことを避けるためにより大きな生体適合性材料を用いてもよい。かかる大きな物質は非生分解性および生分解性物質の組合せであってもよい。例えば、小さな非生分解性物質は、一定時間経過するとその生分解性部分が分解されて非生分解部分が消化管を通過するように生分解物質に包含させることができる。また、摂取を助けるために数種のフレーバーを生体適合性物質に供することができると考えられる。
【０３８４】
例えばポリペプチド(例えば、酵素、抗体、サイトカインまたは治療用の小分子)および抗生物質をはじめとする数種の薬剤を単独で、または他の薬剤を組み合わせて生体適合性物質にコーティングしてもよい。特に有用な薬剤の例は下記表1および表2に一覧化されている。また、本発明の生体適合性材料に細胞を封入して酵素または治療薬を送達するため使用できるということも考えられる。例えば、中で細胞が増殖するに十分な大きさの孔を有する多孔性物質を設計し、次にこれらの多孔性材料を消化管に取り込ませることもできる。例えば、生体適合性物質は複数の細胞種を支持する複数の微生物叢環境(例えば、異なる孔隙率、pHなど)からなってもよい。細胞は生物に特定の薬剤、酵素または化学物質を送達
するように遺伝子操作することができる。これらの細胞は真核細胞であっても原核細胞であってもよい。
【０３８５】
【表１】
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2008099688.tif 000003
【０３８６】
【表２】
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2008099688.tif 000005
2008099688.tif 000006
【０３８７】
ある種の薬剤をある条件下(例えば、あるpH、活性化剤の存在下など)で活性となる、または活性化状態となるように設計することができる。また、本発明の組成物ではプロ酵素を用いるのが有利である。例えば、プロ酵素はプロテアーゼ(例えば、生物の消化管に存在する、または消化管に人工的に導入させる唾液プロテアーゼ)によって活性化させることができる。本発明の生体適合性組成物によって送達される薬剤は、生物によって摂取させるか、あるいはその他の送達を行ってもよいが、活性化剤の添加によって活性化または不活性化することができると考えられる。消化管内での薬剤の制御のための別の機構としては、適切な消化コンパートメントで活性化される環境感受性剤がある。例えば、ある薬剤は低pHでは不活性であるが、中性pHでは活性となる。従って、その薬剤は消化管では不活性であるが、腸管では活性となる。あるいは、その薬剤は微生物特異的因子(例えば、腸内に存在する微生物)の存在に応答して活性となり得る。
【０３８８】
要するに、本発明の可能性ある利点としては、例えば(1)日常の飼料または穀粒からミネラルサプリメント(例えば、無機リンサプリメント)、酵素または動物(魚類を含む)用の治療薬の必要性を少なくする、またはおそらくはなくし、それによって飼料中に存在するカロリーおよび栄養素の量を高めること、および(2)例えば家禽、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、およびネコをはじめとする飼い動物および非飼い動物の健康および成長の増進を含む。
【０３８９】
本発明の方法および組成物には多数の酵素が使用できる。これらの酵素としては摂取された食物の適切な消化、または消化管を通じて動物に送達した化学物質、プロドラッグまたはその他の薬剤もしくは化合物の適切な代謝、活性化もしくは誘導体化に必要な酵素が挙げられる。本発明の組成物へ送達または配合できる酵素酵素の例としては、例えば、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、特にラクターゼ、フィターゼ、β-グルカナーゼ、特にエンド-β-1,4-グルカナーゼおよびエンド-β-1,3(4)-グルカナーゼ、セルラーゼ、キシロシダーゼ、ガラクタナーゼ、特にアラビノガラクタンエンド-1,4-β-ガラクトシダーゼおよびアラビノガラクタンエンド-1,3-β-ガラクトシダーゼ、エンドグルカナーゼ、特にエンド-1,2-β-グルカナーゼ、エンド-1,3-α-グルカナーゼ、およびエンド-1,3-β-グルカナーゼ、ペクチン分解酵素、特にペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、アラビナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナン-α-ラムノシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、およびα-ガラクツロニシダーゼ、マンナナーゼ、β-マンノシダーゼ、マンナンアセチルエステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アラビノキシラナーゼ、ならびにリパーゼ、ホスホリパーゼおよびクチナーゼなどの脂肪分解酵素からなる群より選択される飼料強化酵素が挙げられる。配列番号1および2ならびに下記表3に示されるフィターゼが好ましい。表3に記載の配列はそこに記載のアミノ酸置換およびヌクレオチド置換を有する配列番号1および2である。
【０３９０】
【表３】
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【０３９１】
本発明で用いる酵素はそれらの活性、送達、活性化および分解を増強するために改変することができる。かかる改変はin vivoでもin vitroでも行うことができ、以下にさらに詳しく記載するような当技術分野で一般に公知の方法およびプロセスを用いる。かかる方法論では、自動機械によって合成されたものでも組換えDNA技術によってクローニング、発現または操作されたものでもよいポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を用いるのが一般的である。
【０３９２】
好ましい実施形態では、本発明の組成物(例えば食餌補助剤)で用いる酵素は熱に安定かつ耐熱性であって、フィターゼの酵素的加水分解を触媒するフィターゼ酵素であり、すなわちこの酵素は短時間(すなわち、5ないし30秒)またはより長い時間、例えば数分または数時間の間約50℃より高い温度に曝しても復元して活性を取り戻すことができる。
【０３９３】
「飼料」および「食品」または「食物」はそれぞれ、動物およびヒトが食す、摂取する、消化することを意図した、あるいはそれに適した天然または人工の食餌、食物など、あるいは食物成分のいずれもを意味する。本明細書において「食餌補助剤」とは、例えば動物または生物に治療薬または消化剤を与える薬剤を含有する組成物を表す。「食餌補助剤」とは典型的には生物のためのカロリー摂取の供給源ではなく、言い換えれば食餌補助剤は典型的には生物にとってのエネルギー源ではなく、むしろ典型的な「食餌」または「食品」に加えて摂取される組成物である。
【０３９４】
薬剤または酵素(例えば、フィターゼ)はin vitroまたはin vivoで、すなわちそれぞれ生物の胃または砂嚢に取り込まれる、またはそこに存在する前にその作用を発揮し得る。作用の組合せも可能である。
【０３９５】
いずれの酵素を食餌補助剤に配合してもよいが、本明細書では本発明の方法および組成物の一例としてフィターゼを挙げている。本発明の食餌補助剤は1種類の酵素(例えば、フィターゼ)を含む。一般に、フィターゼ組成物を含有する食餌補助剤は液体または乾燥物である。
【０３９６】
液体組成物は、好ましくはよく精製された形態の酵素(例えば、フィターゼ)以外には何も含む必要はない。しかし通常には、グリセロール、ソルビトール、またはモノプロピレングリコールなどの安定剤も含む。また液体組成物は塩類、糖類、保存剤、pH調整剤、タンパク質、フィチン酸塩(フィターゼ基質)などのその他の添加物を含んでもよい。典型的な液体組成物は水性またはオイルベースのスラリーである。この液体組成物は徐放性を目的として生体適合性組成物に添加することができる。好ましくは酵素は生体適合性材料(例えば、生分解性または非生分解性)であり、例えば多孔質マイクロビーズに組換え細胞を添加した食餌補助組成物に加える。
【０３９７】
乾燥組成物はスプレー用乾燥組成物であってもよく、この場合、組成物は乾燥形態の酵素以外には何も含む必要はない。しかし通常には、乾燥組成物は、食品または飼料成分と容易に混合するいわゆる顆粒状であり、あるいはより好ましくはプレミックスの成分を形成する。酵素顆粒の粒径はその混合物の他の成分と適合するものであることが好ましい。これにより動物飼料に酵素を配合する安全かつ便宜な手段が得られる。好ましくはこれらの顆粒は生体適合性であり、より好ましくはこの生体適合性顆粒は非生分解性である。
【０３９８】
酵素をコーティングした凝集粒子は高剪断ミキサーにて凝集技術を用いて製造することができる。吸着顆粒は酵素を吸収する／酵素によってコーティングされる担体材料の核を持たせることで製造する。好ましくはこの担体材料は、動物の砂嚢で小石や砂利の働きを刺激する生体適合性の非生分解性材料である。凝集技術に用いる典型的な増量剤としては硫酸二ナトリウムなどの塩が挙げられる。その他の増量剤としてはカオリン、タルク、珪酸マグネシウムアルミニウムおよびセルロース繊維がある。所望によりデキストリンなどの結合剤も凝集顆粒に含ませてもよい。担体材料は生分解性および非生分解性材料を含むいずれの生体適合性材料であってもよい(例えば、石、小石、セラミック、種々のポリマー)。所望により顆粒はコーティング混合物でコーティングしてもよい。かかる混合物はコーティング剤、好ましくは硬化ヤシ油および牛脂などの疎水性コーティング剤、および所望により炭酸カルシウムまたはカオリンなどのその他の添加物を含んでなる。
【０３９９】
さらに、食餌補助組成物(例えば、フィターゼ食餌補助組成物)は着色剤、芳香化合物、安定剤、ビタミン類、ミネラル類、その他の飼料または食品強化酵素などのその他の置換物質を含んでもよい。典型的な添加物としては通常、ビタミン類、ミネラル類または飼料強化酵素などの1以上の化合物と好適な担体および／または賦形剤を含んでなる。
【０４００】
ある実施形態では、本発明の食餌補助組成物は有効量の1以上の飼料強化酵素、特に、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、特にラクターゼ、その他のフィターゼ、β-グルカナーゼ、特にエンド-β-1,4-グルカナーゼおよびエンド-β-1,3(4)-グルカナーゼ、セルラーゼ、キシロシダーゼ、ガラクタナーゼ、特にアラビノガラクタンエンド-1,4-β-ガラクトシダーゼおよびアラビノガラクタンエンド-1,3-β-ガラクトシダーゼ、エンドグルカナーゼ、特にエンド-1,2-β-グルカナーゼ、エンド-1,3-α-グルカナーゼ、およびエンド-1,3-β-グルカナーゼ、ペクチン分解酵素、特にペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、アラビナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナン-α-ラムノシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、およびα-ガラクツロニシダーゼ、マンナナーゼ、β-マンノシダーゼ、マンナンアセチルエステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アラビノキシラナーゼ、ならびにリパーゼ、ホスホリパーゼおよびクチナーゼなどの脂肪分解酵素からなる群より選択される飼料強化酵素をさらに含んでなる。
【０４０１】
本発明の動物食餌補助剤は、食餌の前または食餌と同時に単胃動物に与える。
ある実施形態では、本発明の食餌補助剤は食餌と同時に単胃動物に与える。もう1つの実施形態では、この食餌補助剤は顆粒または安定な液体の形態で食餌中に
添加する。
【０４０２】
本発明の食餌補助剤中の酵素の有効量は、約10〜20,000、好ましくは約10〜15,000、より好ましくは約10〜10,000、特に約100〜5,000、特には約100〜約2,000FYT/食餌補助剤kgである。
【０４０３】
本発明のフィターゼのその他の特殊な使用例としては、醤油加工時、およびイノシトールまたはその誘導体の製造時におけるものがある。
【０４０４】
本発明はまた、動物糞尿中のフィターゼレベルを低減させる方法に関し、ここでは動物に有効量の本発明のフィターゼを含有する食餌を与える。本明細書の冒頭で述べたように、その重要な効果の１つが環境のリン汚染を軽減することである。
【０４０５】
もう１つの実施形態では、食餌補助剤は磁性担体である。例えば磁性担体内に、磁性担体上に、または磁性担体により分布させた酵素(例えば、フィターゼ)を含有する磁性担体(例えば、多孔質磁性ビーズ)をフィチン酸塩が高い領域に分布させ、一定時間の後に磁石で回収することができる。このようにビーズを分布および再回収することでさらなる汚染が低減し、ビーズの再利用が可能となる。また、かかる磁性ビーズをin vivoで使用すると、例えばフィターゼ活性が生じ得る消化管の位置に食餌補助剤を局在化することが可能となる。例えば、消化酵素(例えば、フィターゼ)を含有する本発明の食餌補助剤を、磁性担体の食餌補助剤を動物に摂取させた後に動物の砂嚢付近に磁石を近づけることで動物の砂嚢に局在化させることができる。一定時間の後に磁石を取り除けば、食餌補助剤は消化管を通過することができる。また、この磁性担体は犠牲にした後の生物体から取り出すにも適しており、回収の助けとなる。
【０４０６】
食餌補助剤が多孔質粒子である場合、かかる粒子は典型的には、それとともに緩慢に放出することが望まれる物質に含浸させて徐放性粒子を形成する。かかる徐放性粒子は多孔質粒子を、放出することが望まれる物質に含浸させることで製造できるだけでなく、最初の分散相に所望の物質を最初に溶解することによっても製造できる。この場合、放出させる粒子をまず最初の分散相に溶解する方法によって製造された徐放性粒子もまた本発明の範囲および精神の範囲内にある。例えば多孔質中空粒子に医薬、農薬または酵素などの徐放性物質を含浸させてもよい。特に酵素を含浸させる多孔質中空粒子が生分解性ポリマーから作製される場合には、その粒子自体を農薬または肥料として使用してもよく、それらは環境に悪影響を及ばさない。ある実施形態では、多孔質粒子は本質的に磁性体である。
【０４０７】
これらの多孔質中空粒子はバイオリアクターの支持体、特に酵素支持体として使用することもできる。従って、例えば、数日、好ましくは約３〜20日の間にわたってある一定用量が放出されるリポソームなどのマイクロ小胞に薬剤酵素を封入することよって、徐放法を用いた食餌補助剤を製造するのが有利である。あるいは、薬剤(例えば、酵素)を、数日、好ましくは約２〜30日の間、さらにはその動物の寿命までの範囲の期間にわたってその薬剤(例えば、酵素)用量がゆっくりと放出される徐放性ポリマー中に組み込むなど、徐放用に処方してもよい。
【０４０８】
当技術分野で公知のように、リポソームは一般にリン脂質またはその他の脂質物質から誘導される。リポソームは水性媒質に分散した単層または多層水和液体結晶によって形成される。リポソームを形成し得る無毒の生理学上許容され、代謝可能な脂質を使用することができる。リポソーム形態の本組成物は薬剤の他に安定剤、保存剤、賦形剤などを含んでもよい。好ましい脂質としてはリン脂質およびホスファチジルコリン(レシチン)があり、天然品でも合成品でもよい。リポソームの形成法は当技術分野で公知である。例えば、Prescott編, Methods in Cell Biology, 第XIV巻, Academic Press, New York, N.Y. (1976), 33頁などを
参照。
【０４０９】
食品もしくは飼料製品または添加物の製造の際に本発明のフィターゼを用いることも本発明の範囲内にあり、すなわち、このフィターゼは製造中にのみそのフィターゼ活性を発揮し、最終的な食品または飼料製品では活性はない。この態様は例えばパン生地の製造およびベーキングに適切である。従って、フィターゼまたはフィターゼを発現する組換え酵母を磁性担体の中、磁性担体の上、または磁性担体を介して含浸させ、パン生地または食品媒体に分散させ、磁石で回収することができる。
【０４１０】
本発明の食餌補助剤は生体適合性(例えば、生分解性または非生分解性)担体にて動物に単独に投与してもよいし、あるいはその他の消化添加剤と組み合わせて投与してもよい。その本発明の食餌補助剤は敷肥（top dressing）として、または動物飼料に直接混合して、飼料とは別に与えることで、単独の経口投与形により、注射、または経皮手段により、あるいは他の成長関連可食性化合物と組み合わせて容易に投与することができ、その組合せ中の各化合物の割合は特定の生物、取り組むべき問題、および所望の応答程度によって異なる。当業者には周知であるが、ある場合に投与される特定の食餌用量は投与する特定の化合物、処置すべき問題、被験体の状態、および有効成分の活性や被験体の応答を改変し得るその他の関連因子に応じて調節されるものと理解すべきである。当技術分野では周知であるが、一般に、単回日用量または分割日用量のいずれを用いてもよい。
【０４１１】
動物飼料とは別に投与する場合、食餌補助剤配合物は、当技術分野で周知のように、無毒の医薬上許容される可食性担体と組み合わせて即時放出製剤または徐放性製剤のいずれかとすることで製造することができる。かかる可食性担体は例えばコーンスターチ、ラクトース、スクロース、ダイズフレーク、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、およびプロピレングリコールなどの固体担体または液体担体のいずれであってもよい。固体担体を用いる場合、化合物の投与剤形は、錠剤、カプセル剤、散剤、トローチ剤またはロゼンジ剤、微小分散形態としての敷肥であり得る。液体担体を用いる場合では、軟ゼラチンカプセル剤、またはシロップ剤もしくは液体懸濁剤、乳剤または溶剤が投与剤形となる。これらの投与剤形はまた、保存剤、安定剤、湿潤剤または乳化剤、溶液促進剤などの助剤を含んでもよい。それらはまたその他の治療上有用な物質を含んでもよい。
【０４１２】
このように本発明の著しい利点は、例えば1)有効成分を配合した生体適合性組成物の製造が容易なこと、2)利用し得るポリマーおよび／または有効成分の種類に関して融通がきくこと、3)収率がよく、添加効率がよいこと、4)in vivoで活
性で完全な有効物質を放出する徐放性製剤を提供し、従って、長時間にわたって有効物質の徐放性を提供することが挙げられる。また、もう1つの利点としては
、生物の消化管(例えば、砂嚢)への薬剤の局部送達によるものである。本明細書において「に含ませる」とは、長時間にわたって薬剤の徐放性を得るのに有用な組成物に薬剤を配合する方法を表す。
【０４１３】
本発明の徐放性組成物又は遅延放出組成物では、有効量の薬剤(例えば、酵素または抗生物質)が用いられる。本明細書において徐放性又は遅延放出とは、長時間にわたって生体適合性材料から薬剤を徐々に放出することをさす。徐放性は連続的であっても不連続であってよく、直線的であっても非直線的であってよく、1以上の生分解性または非生分解性組成物、薬剤添加量、賦形剤の選択、またはその他の改変によって達成することができる。しかし、生物に一度に摂取される即時放出をもたらす「即時」放出組成物を提供するのが望ましい場合もあると考えられる。また、「放出」とは必ずしも生体適合性担体から薬剤が放出することを意味するのではないと考えられる。ある実施形態ではむしろ、徐放性は生体適合性組成物に存在する薬剤がゆっくり活性化すること、または継続して活性化することを包含する。例えば、フィターゼは何も生体適合性組成物から放出されて有効となる必要はない。この実施形態では、フィターゼは生体適合性組成物上に固定化されている。
【０４１４】
動物飼料は、動物の食餌要求を満たすために通常用いられるいずれのタンパク質含有有機物ミールであってもよい。かかるタンパク質含有ミールの多くは典型的には主としてトウモロコシ、ダイズミール、またはトウモロコシ／ダイズミール混合物からなる。例えば、家禽に与える典型的な市販製品としては、Land O’Lakes AG Servicesの家禽用飼料製品であるEgg Maker CompleteならびにAgwa, Inc.の製品であるCountry Game & Turkey Growerが挙げられる(Phillip Minnaar
およびMaria MinnaarによるThe Emu Farmer’s Handbookも参照)。これらの市販製品はいずれも、それに本食餌補助剤および／またはフィターゼ酵素を配合して、かかる組成物に必要なリン、亜鉛、マンガンおよび鉄摂取物の添加量を削減またはなくすことができる動物飼料の典型例である。
【０４１５】
本発明は多くの動物(本明細書では哺乳動物(ヒトを含む)、家禽および魚類を含むものと定義される)の食餌に適用できる。特に、この食餌はブタ、畜牛、ヒツジ、ヤギ、実験齧歯類(ラット、マウス、ハムスターおよびアレチネズミ)などの商業上重要な哺乳動物、ミンクやキツネなどの毛皮動物、ならびにサルや類人猿などの動物園動物、さらにはネコやイヌなどのペット動物に使用できる。典型的な商業上重要な鳥類種としては、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、キジ、エミュー、ダチョウ、アビ、キウイ、ハト、オウム、オカメインコ、バタンインコ、カナリア、ペンギン、フラミンゴ、およびウズラが挙げられる。マスなどの商業的養殖魚も本明細書に開示される食餌補助剤から利益を受けよう。利益を受け得るその他の魚としては、例えば、特に水槽や養殖環境にある魚(例えば、熱帯魚)、金魚、その他の装飾鯉、ナマズ、マス、サケ、サメ、エイ、カレイ、シタビラメ、テラピア、メダカ、グッピー、モーリー、プラティ、カブトガニ、ゼブラフィッシュおよびドジョウが挙げられる。
【０４１６】
特に断りのない限り、形質転換はSambrook, FritschおよびManiatus, 1989の方法に記載のようにして行った。以下の実施例は本発明の例示を意図するもので、これに限定されるものではない。これら実施例に記載される手法は本発明の特定の態様を実施するのに使用できる典型的なものであるが、当業者に公知のその他の手法も使用できる。
【０４１７】
実施例１
フィターゼの単離、細菌での発現および精製
大腸菌BゲノムDNAはSigma(カタログ番号D-2001), St. Louis, New Jerseyから入手した。
【０４１８】
以下のプライマーを用いてゲノムDNAから直接遺伝子をPCR増幅した。
【０４１９】
5'プライマー：gtttctgaattcaaggaggaatttaaATGAAAGCGATCTTAATCCCATT (配列番
号3);および
3'プライマー：gtttctggatccTTACAAACTGCACGCCGGTAT (配列番号4)。
【０４２０】
PCR反応液中のPfuポリメラーゼおよび増幅は製造業者のプロトコールに従って行った(Stratagene Cloning Systems, Inc., La Jolla, CA)。
【０４２１】
PCR産物を精製し、精製産物とpQE6Oベクター(Qiagen)を双方とも、製造業者のプロトコールに従ってEcoRIおよびBglII制限エンドヌクレアーゼ(New England Biolabs)で消化した。標準的なプロトコールを用いて一晩連結反応を行い、pQE60を得た。
【０４２２】
増幅した配列を、RBSをコードする配列とフレームを合わせて挿入した。次にこの連結混合物を用い、エレクトロポレーションにより大腸菌M15S/pREP4株(Qiagen, Inc.)を形質転換した。M15/pREP4は複数コピーのプラスミドpREP4を含み、これは lacIレプレッサーを発現し、また、カナマイシン耐性 (Kanr)を付与する。プラスミドDNAを単離し、制限解析によって確認した。所望の構築物を含むクローンを、Amp(100μg/ml)およびKan(25μg/ml)を添加したLB液体培地で一晩(O/N)増殖させた。O/N培養物を用い、大量の培養物に1:100〜1:250の割合で接種した。細胞を600(O.D.600)光学濃度0.4ないし0.6の間まで増殖させた。次にIPTG(「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」)を加えて最終濃度1mMとした。IPTGはlacIレプレッサーを不活性化することでP/Oの浄化を引き起こし、遺伝子発現を増強する。細胞をさらに3〜4時間増殖させた。その後細胞を遠心分離により回収した。
【０４２３】
また、上記に示したプライマー配列を用いて、上記のハイブリダイゼーション技術により沈殿物から標的遺伝子を単離してもよい。
【０４２４】
上記の教示に照らして本発明の多くの改変およびバリエーションが可能であることから、特許請求の範囲内で本発明は特に記載されているもの以外でも実施し得る。本発明は上記の詳細な説明に関して記載されているが、以上の記載は例示を意図したものであって本発明の範囲を限定するものではないと考えられる。本発明の他の態様、利点および改変も請求の範囲に含まれる。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許およびその他の参照文献は参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
【０４２５】
本発明はまた、その他の大腸菌株(K12、W、Cをはじめとする病原性または非病原性株)ならびにあらゆる細菌からのフィターゼ分子(核酸およびそれによってコードされているフィターゼ酵素)の単離および使用も提供する。これらのものとしては以下のものに属するあらゆる公知の種および株が含まれる：
サーモトガルス（Thermotogales）
緑色非硫黄細菌（Green Nonsulfur Bacteria）
シアノバクテリアおよび葉緑体
低G+Cグラム陽性菌
フゾバクテリア
高G+Cグラム陽性菌
ガイトファガ（Gytophaga）/フレキシバクター(Flexibacter)/バクテロイデス(Bacteroides)属
フィブロバクテリア(Fibrobacteria)
スプロキーテス（Spriochaetes）
プランクトマイセス（Planctomyces）/クラミジア属
以下の亜門を含む紅色細菌(プロテオバクテリア(Proteobacteria)) ：
δおよびε型：
Desulfuromonas acetoxidans
Desulfosarcina variabilis
Bdellovibrio stolpii
Nannocystis exedens
Stigmatella aurantiaca
Myxococcus xanthus
Desulfovibrio desulfuricans
Thiovulum sp.
Campylobacter jejuni
Wolinella succinogenes
ヘリコバクター・ピロリ(Halicobacter pylori)
α型：
Methylobacterium extorquens
Beijerinckia indica
Hyphomicrobium vulgare
Rhodomicrobium vannieli
アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)
Brucella abortus
Rochalimaea quintana
Rhodopseudomonas marina subsp. Agilis
トウモロコシ(Zea mays)-ミトコンドリア
Rickettsia rickettsii
Ehrlichia risticii
Wolbachia pipientis
Anaplasma marginale
Erythrobacter longus
Rhodospirillum salexigens
Rhodobacter capsulatus
Azospirillum lipoferum
Rhodospirillum rubrum
γ型：
Ectothiorhodospira shaposhnikovii
Chromatium vinosum
Methylomonas methanica
Cardiobacterium hominis
Xanthomonas maltophilia
Coxiella burnetii
Legionella pneumophila subsp. pneumophila
Oceanospirillum linum
Acinetobacter calcoaceticus
Pseudomonas aeruginosa
Haemophilus influenzae
Vibrio parahaemolyticus
Proteus vulgaris
Erwinia carotovora
エッシュリヒア・コリ（Echerichia coli）
β型：
Eikenella corrodens
Neisseria gonorrhoeae
Vitreoscilla stercoraria
Chromobacterium violaceum
Alcaligenes faecalis
Rubrivivax gelatinosus
Pseudomonas testosteroni
Nitrosomonas europae
Spirillum volutans
【０４２６】
かかるフィターゼ分子は、これらの細菌から、ライブラリースクリーニング法、例えば発現スクリーニング、ハイブリダイゼーション法、PCR法をはじめとする公知の方法によって単離することができる(例えば、Sammbrook, 1989参照)。
【０４２７】
実施例１
耐熱アッセイ
大腸菌(K12株)由来野生型appAおよび819PH59と呼ばれる変異型(配列番号9および10)を大腸菌で発現させ、均質になるまで精製した。耐熱アッセイでは、100mM MOPS/pH7.0中0.01mg/mLタンパク質の100μLをRJリサーチサーモサイクラーで5分間所定のインキュベーション温度まで加熱した。その温度にて5分が完了したら、サンプルを4℃まで冷却し、氷上でインキュベートした。活性アッセイは、37℃にて100mM NaOAc/4mMフィチン酸塩/pH4.5の1.5mL中40μLの酵素溶液を用いて行った。2分毎に60μLアリコートを採取し、発色剤/TNOアッセイの停止液60μLに加えた。明らかに、8つのアミノ酸変異を含んだ配列番号10の改変型酵素は野生型酵素よりも耐熱性が高かった(図3参照)。
【０４２８】
実施例２
人工消化条件におけるフィターゼ酵素の安定性
in vitroで消化した大腸菌K12株および非グリコシル化819pH59フィターゼの残存活性%(初期速度に対する割合)を時間に対してプロットした。2mg/ml NaCl、6M HClおよび3.2mg/mLペプシンを含有する標準濃度の人工胃液を記載のように調製した。この溶液のpHは約1.4であり、調整しなかった。in vitro消化性アッセイは、消化溶液に1:4(vol:vol)のフィターゼを添加し、すぐに37℃でインキュベートして消化反応を開始させることで行った。この消化反応混合物のアリコートを種々の時間間隔で取り出し、TNOアッセイを用いて残存するフィターゼ活性をアッセイした。各アッセイは少なくとも2回行った。式y=Ae-ktの指数曲線をこれらのデータに当てはめた。タンパク質の半減期は式t1/2=ln 2/kを用いて求めた。大腸菌K12株フィターゼの半減期はわずか2.7±0.2分であったが、非グリコシル化819pH59フィターゼの半減期は8.4±1.1分であった。従って、野生型大腸菌K12株フィターゼの突然変異はin vitro人工消化条件下で酵素の安定性を高めるものであった。図4参照。
【０４２９】
実施例３
発現宿主の比較
819PH59由来のGSSM DNA構築物を、発現のために大腸菌、P.パストリスおよびS.ポンベに挿入した。発現したタンパク質を均質になるまで精製した。耐熱アッセイでは、100mM MOPS,pH7.0中0.01mg/mLタンパク質の100μLをRJリサーチサーモサイクラーで5分間所定のインキュベーション温度まで加熱した。その温度にて5分が完了したら、サンプルを4℃まで冷却し、氷上でインキュベートした。活性アッセイは37℃にて100mM NaOAc/4mMフィチン酸塩/pH4.5の1.46mL中40μLの酵素溶液を用いて行った。2分毎に60μLアリコートを採取し、発色剤/TNOアッセイの停止液60μLに加えた(図5参照)。
【０４３０】
実施例４
in vitroで消化した819pH59フィターゼを種々の発現宿主で発現させたものの残存活性%(初期速度に対する割合)を時間に対してプロットした。819pH59フィターゼを大腸菌(非グリコシル化)ならびにS.ポンベおよびP.パストリス(グリコシル化)で発現させた。2mg/ml NaCl、6M HClおよび3.2mg/mLペプシンを含有する標準濃度の人工胃液をS.O.P.に記載のように調製した。この溶液のpHは1.4であり、調整しなかった。in vitro消化性アッセイは、消化溶液に1:4(vol:vol)のフィターゼを添加し、すぐに37℃でインキュベートして消化反応を開始させることで行った。この消化反応混合物のアリコートを種々の時間間隔で取り出し、TNOアッセイを用いて残存するフィターゼ活性をアッセイした。各アッセイは3回行った。式y=Ae-ktの指数曲線をこれらのデータに当てはめた。タンパク質の半減期は式t1/2=ln 2/kを用いて求めた。大腸菌で発現した非グリコシル化819pH59フィターゼの半減期は8,4±1.1分であったが、S.ポンベで発現したグリコシル化819pH59フィターゼの半減期10.4±0.9分であり、P.パストリスで発現した同じフィターゼの半減期は29.2±6.7分であった。従って、819pH59フィターゼのグリコシル化はin vitro人工消化条件下で酵素の安定性を高めるものであった(図6参照)。
【０４３１】
引用文献
(本出願において引用された全ての文献の教示内容は、特に断らない限り、参考としてそのまま本明細書に含めるものとする。)
Association of Official Analytical Chemists: Official Methods of Analysis. Association of Official Analytical Chemists, Washington, DC., 1970. 
Ausubel FM, et al. Current Protocols in Molecular Biology. Greene
Publishing Assoc., Media, PA. 1987, 1989, 1992. 
Barnes WM: λバクテリオファージ鋳型からの高忠実度および高収率での最
大35-kb DNAのPCR増幅(PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 91 (6): 2216-2220,1994.
Bayer EA, Morag E, Lamed R : セルロソーム--バイオテクノロジーのため
の貴重な発見物(The cellulosome--a treasure-trove for biotechnology). Trends Biotechnol 12 (9): 379-86, (Sep) 1994.
Bevan M: 植物形質転換のためのバイナリーアグロバクテリウムベクター(Binary Agrobacterium vectors for plant transformation). Nucleic Acids Research 12 (22): 8711-21,1984.
Bird et al. Plant Mol Biol 11: 651,1988.
Blobel G, Walter P, Chang CN, Goldman BM, Erickson AH, Lingappa VR: 膜を横切るタンパク質のトランスロケーション：シグナル仮説およびその他(Translocation of proteins across membranes: the signal hypothesis and beyond). Symp Soc Exp Biol 33 : 9-36,1979.
Brederode FT, Koper-Zawrthoff EC, Bol JF: アルファルファモザイクウイルスRNA4の完全なヌクレオチド配列(Complete nucleotide sequence of alfalfa mosaic virus RNA 4). Nucleic Acids Research 8 (10): 2213-23,1980.
Clark WG, Register JC 3d, Nejidat A, Eichholtz DA, Sanders PR, Fraley RT, Beachy RN: トランスジェニックタバコ植物におけるTMVコートタンパク質の組織特異的発現はコートタンパク質介在ウイルス保護のレベルに影響を及ぼす(Tissue-specific expression of the TMV coat protein in transgenic tobacco plants affects the level of coat protein-mediated virus protection). Virology 179 (2): 6407, (December) 1990.
Cole, et al.: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. A. R. Liss, New York. 1985. 
Coligan JE, et al.: Current Protocols in Immunology. J. Wiley & Sons, New York. 1996. 
Coruzzi G, Broglie R, Edwards C, Chua NH: リブロース-1,5-ビスホスフ
ェートカルボキシラーゼの小サブユニットをコードするエンドウマメ核遺伝子の組織特異的および光調節型発現(Tissue-specific and light-regulated expression of a pea nuclear gene encoding the small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase). EMBO J 3(8): 1671-9,1984.
Cosgrove DJ: 微生物起源のイノシトールリン酸ホスファターゼ。細菌(Pseudomonas sp.)フィターゼによるmyo-イノシトール、scyllo-イノシトール、およ
びD-chiro-イノシトールの六リン酸の脱リン酸化におけるイノシトールリン酸中間体(Inositol phosphate phosphatases of microbiological origin. Inositol phosphate intermediates in the dephosphorylation of the hexaphosphates of myo-inositol, scyllo-inositol, and D-chiro-inositol by a bacterial (Pseudomonas sp.) phytase). Aust J Biol Sci 23 (6): 1207-1220,1970.
Dassa E, Cahu M, Desjoyaux-Cherel B, Boquet PL:至適pH 2.5を有する大
腸菌の酸ホスファターゼ：生理学的および生化学的研究(The acid phosphatase with optimum pH of 2.5 of Escherichia coli. Physiological and Biochemical study). J Biol Chem 257 (12): 6669-76, (Jun25) 1982. 
Davis LG, et al. Basic Methods in Molecular Biology. Elsevier, New York, 1986. 
Duarte JC, Costa-Ferreira M: アスペルギルスおよびリグノセルロース化
合物：酵素学およびバイオテクノロジーへの応用(Aspergilli and lignocellulosics: enzymology and biotechnological applications). FEMSMicrobiol Rev 13 (2-3): 377-86, (Mar) 1994. 
Food Chemicals Codex, 4th Edition. Committee on Food Chemicals Codex, Food and Nutrition Board, Institute of Medicine, National Academy of Sciences. Published: National Academy Press, Washington, DC, 1996. 
Garcia PD, Ghrayeb J, Inouye M, Walter P: 大腸菌外膜リポタンパク質の野生型および変異型シグナルペプチドは哺乳動物のシグナル認識粒子と同等の効率で相互作用する(Wild type and mutant signal peptides of Escherichia coli outer membrane lipoprotein interact with equal efficiency with mammalian signal recognition particle). J Biol Chem 262 (20): 9463-8, (July 15) 1987. 
Gluzman Y: SV40-形質転換サル細胞は初期SV40変異体の複製を支援する(SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants). Cell 23 (1): 175-182, 1981.
Goeddel DV, Shepard HM, Yelverton E, Leung D, Crea R, Sloma A, Pestka S: 大腸菌によるヒト繊維芽細胞インターフェロンの合成(Synthesis of human fibroblast interferon by E. Coli). Nucleic Acids Research 8 (18): 4057-4074, 1980. 
Gordon-Kamm WJ, Spencer TM, Mangano ML, Adams TR, Daines RJ, Start WG, O'Brien JV, Chambers SA, Adams Jr. WR, Willets NG, Rice TB, Mackey CJ,
Krueger RW, Kausch AP, Lemaux PG. Plant Cell 2 : 603,1990.
Graf E : フィチン酸：化学と応用(Phytic Acid : Chemistry and Applications). Pilatus Press, Minneapolis. 1986. 
Greiner R, Haller E, Konietzny U, Jany KD: Klebsiella terrigena 由来のフィターゼの精製および特徴付け(Purification and characterization of a phytase from Klebsiella terrigena). Arch Biochem Biophys 341 (2): 201-6, (May 15) 1997.
Greiner R, Konietzny U: フィチン酸の特別な分解産物を生成するバイオリアクターの構築(Construction of a bioreactor to produce special breakdown products of phytate). J Biotechnol 48 (1-2): 153-9, (July 18) 1996.
Greiner R, Konietzny U, Jany KD: 大腸菌由来の２種類のフィターゼの精
製および特徴付け(Purification and characterization of two phytases from Escherichia coli). Arch Biochem Biophys 303 (1): 107-13, (May 15) 1993.
Guilley H, Dudley RK, Jonard G, Balazs E, Richards KE: カリフラワー
モザイクウイルスDNAの転写:プロモーター配列の検出および転写産物の特徴付け(Transcription of Cauliflower mosaic virus DNA: detection of promoter sequences, and characterization of transcripts). Cell 30 (3): 763-73, 1982.
Hespell RB, Whitehead TR: 胃腸管細菌によるキシラン分解の生理学および遺伝学(Physiology and genetics of xylan degradation by gastrointestinal tract bacteria). J Dairy Sci 73 (10): 3013-22, (Oct) 1990.
Hoekema A, Hirsch PR, Hooykaas PJJ, Schilperoort RA. Nature 303: 179, 1983. 
Horsch RB, Fry JE, Hoffmann NL, Eichholtz D, Rogers SG, Fraley RT. Science 227: 1229, 1985.
Igarashi M, Hollander VP: ラット肝臓由来の酸ホスファターゼ：精製、結晶化および特性(Acid phosphatase from rat liver. Purification, crystallization, and properties). J Biol Chem 243 (23): 6084-9, (Dec. 10) 1968. 
International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Nomenclature Committee: Enzyme nomenclature 1992: recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes/prepared for NC-IUBMB by Edwin C. Webb. Academic Press, cl992.
Jeffries TW : 微生物キシラナーゼの生化学および遺伝学(Biochemistry and genetics of microbial xylanases). Curr Opin Biotechnol 7 (3): 337-42, (Jun.) 1996.
Klee HJ, Muskopf YM, Gasser CS: 5-エノールピルビルシキメート-3-リン
酸シンターゼをコードするシロイヌナズナ遺伝子のクローニング：配列解析およびグリホセート耐性植物を得るための遺伝子操作(Cloning of an Arabidopsis thaliana gene encoding 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase: sequence analysis and manipulation to obtain glyphosate-tolerant plants). Mol Gen Genet 210 (3): 437-42, (Dec) 1987. 
Kohler G, Milstein C: 所定の特異性の抗体を分泌する融合細胞の連続培養物(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity). Nature 256 (5517): 495-497,1975.
Koster-Topfer M, Frommer WB, Rocha-Sosa M, Rosahl S, Schell J, Willmitzer L: クラスIIパタチンプロモーターはトランスジェニックジャガイモおよ
びタバコ植物の両方において発達制御下にある(A class II patatin promoter is under developmental control in both transgenic potato and tobacco plants). Mol Gen Genet 219 (3): 390-6, (Nov) 1989.
Kozbor. Immunology Today 4: 72, 1983.
Lee B, Murdoch K, Topping J, Kreis M, Jones MG: オオムギおよびコムギの発生しつつある穀果から単離されたアリューロンプロトプラストにおける一過性の遺伝子発現(Transient gene expression in aleurone protoplasts isolated from developing caryopses of barley and wheat). Plant Mol Biol 13 (1): 21-9, 1989.
National Research Council: Nutrient Requirements of Poultry (9th Revised ed.). National Academy Press, Washington, DC, 1994.
Nayini NR, Markakis P: Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17: 24-26, 1984. 
NCBI, National Library of Medicine. National Institutes of Health: BLAST Sequence Similarity Searching (web site = www. ncbi. nlm. nih. gov).
Nelson TS, Shieh TR, Wodzinski RJ, Ware JH: ニワトリによるフィチン酸リン酸の利用に及ぼすフィターゼ補助剤の効果(Effect of supplemental phytase on the utilization of phytate phosphorus by chicks). J Nutr 101 (10): 1289-1293, 1971.
Ng DT, Walter P: 小胞体を横切るタンパク質のトランスロケーション(Protein translocation across the endoplasmic reticulum). Curr Opin Cell Biol 6 (4): 510-6, (Aug), 1994.
Potrykus I: 植物および細胞培養物への遺伝子導入法(Gene transfer methods for plants and cell cultures). Ciba Found Symp 154: 198-208; discussion 208-12, 1990.
Powar VK, Jagannathan V: 枯草菌由来のフィチン酸特異的ホスファターゼ
の精製および特性(Purification and properties of phytate-specific phosphatase from Bacillus subtilis). J Bacteriol 151 (3): 1102-1108, 1982.
Powers T, Walter P: 新生ポリペプチド結合複合体はシグナル認識粒子とリボソームとの相互作用をモジュレートする(The nascent polypeptide-associated complex modulates interactions between the signal recognition particle and the ribosome). Curr Biol 6 (3): 331-8, (March 1), 1996.
Prade RA : キシラナーゼ：生物学からバイオテクノロジーまで(Xylanases: from biology to biotechnology). Biotechnol Genet Eng Rev ; 13: 101-31, 1996.
Ryan AJ, Royal CL, Hutchinson J, Shaw CH: ナタネ(Brassica napus c.v. jet neuf)由来の12S種子貯蔵タンパク質のゲノム配列(Genomic sequence of a 12S seed storage protein from oilseed rape (Brassica napus c.v. jet neuf)). Nucl Acids Res 17 (9): 3584, 1989.
Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA: 熱安定性DNAポリメラーゼによるDNAのプライマー指令酵素的増幅(Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase). Science 239 (4839): 487-491, 1988.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Press, Cold Spring Habor, NY, 1989. 
SAS: Statistics In: SAS User's Guide (1984 ed.). SAS Institute, Carey, NC, 1984. 
Schoner FJ, Hope PP, Schwarz G, Wiesche H: ブロイラーにおけるリン、
カルシウムおよび粗灰分の性能および保持に対する微生物フィターゼおよび無機リンの匹敵する効果(Comparative effects of microbial phytase and inorganic phosphorus on performance and retention of phosphorus, calcium, and crude ash in broilers). J Anim Physiol Anim Nutr 66: 248, 1991.
Schoner FJ, Hope PP, Schwarz G, Wiesche H: ブロイラーのニワトリにお
ける微生物フィターゼおよび無機リンの効果：様々なカルシウムレベルでの性能およびミネラル保持(Effects of microbial phytase and inorganic phosphate in broiler chicken: Performance and mineral retention at various calcium levels). J Anim Physiol Anim Nutr 69: 235, 1993.
Shieh TR, Wodzinski RJ, Ware JH : アスペルギルス・フィッカムにおける無機リン酸による酸ホスファターゼの生成の調節(Regulation of the formation of acid phosphatases by inorganic phosphate in Aspergillus ficuum). J Bacteriol 100 (3): 1161-5, (Dec) 1969.
Shimamoto K, Miyazaki C, Hashimoto H, Izawa T, Itoh K, Terada R, Inagaki Y, Iida S: トランスジェニックイネ植物におけるAcトランスポゼース遺伝子と共にトランスフェクトされたトウモロコシ転位性因子Dsのトランス活性化および安定した組み込み(Trans-activation and stable integration of the maize transposable element Ds cotransfected with the Ac transposase gene in transgenic rice plants). Mol Gen Genet 239 (3): 354-60, (June) 1993.
Shimizu M : Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 56: 1266-1269, 1992.
Sijmons PC, Dekker BM, Schrammeijer B, Verwoerd TC, van den Elzen PJ, Hoekema A: トランスジェニック植物における正しくプロセッシングされたヒ
ト血清アルブミンの生産(Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants). Biotechnology (NY) 8 (3): 217-21, 1990.
Simons PC, Versteegh HA, Jongbloed AW, Kemme PA, Slump P, Bos KD, Wolters MG, Beudeker RF, Verschoor GJ: ブロイラーおよびブタにおける微生物
フィターゼによるリン利用能の改善(Improvement of phosphorus availability by microbial phytase in broilers and pigs). Br J Nutr 64 (2): 525-540, 1990.
Smeekens S, Weisbeek P, Robinson C: 葉緑体およびその内部へのタンパク質輸送(Protein transport into and within chloroplasts). Trends Biochem Sci 15 (2): 73-6, 1990. 
Smith AG, Gasser CS, Budelier KA, Fraley RT: トマト由来の雄しべ-およびターペト組織-特異的遺伝子の同定および特徴付け(Identification and characterization of stamen- and tapetum-specific genes from tomato). Mol Gen Genet 222 (1): 9-16, (June) 1990.
Tague BW, Dickinson CD, Chrispeels MJ: 植物液胞タンパク質フィトヘマ
グルチニンの短いドメインは酵母液胞にインベルターゼをターゲッティングする(A short domain of the plant vacuolar protein phytohemagglutinin targets invertase to the yeast vacuole). Plant Cell 2 (6): 533-46, (June) 1990.    Tingey SV, Walker EL, Corruzzi GM: エンドウマメのグルタミンシンテタ
ーゼ遺伝子は葉、根および結節で異なって発現される別個のポリペプチドをコードする(Glutamin synthetase genes of pea encode distinct polypeptides which are differentially expressed in leaves, roots and nodules). EMBO J 6(1): 1-9, 1987.
Ullah AH: アスペルギルス・フィッカム由来の細胞外フィターゼの生産、迅速な精製および触媒としての特徴づけ(Production, rapid purification and catalytic characterization of extracellular phytase from Aspergillus ficuum). Prep Biochem 18(4): 443-458, 1988.
Ullah AH, Gibson DM: アスペルギルス・フィッカムNRRL 3135由来の細胞外フィターゼ(E.C. 3.1.3.8)：精製および特徴付け(Extracellular phytase (E.C. 3.1.3.8) from Aspergillus ficuum NRRL 3135: purification and characterization). Prep Biochem 17(1): 63-91, 1987.
Van den Broeck G, Timko MP, Kausch AP, Cashmore AR, Van Montagu M, Herrera-Estrella L: リブロース1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サ
ブユニット由来のトランジットペプチドへの融合による葉緑体への外来遺伝子のターゲッティング(Targeting of a foreign protein to chloroplasts by fusion to the transit peptide from the small subunit of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase). Nature 313(6001): 358-63, 1985.
Vasil IK, Vasil V: 植物細胞および組織培養物における全能性と胚形成(Totipotency and embryogenesis in plant cell and tissue cultures). In Vitro 8(3): 117-27, (Nov-Dec) 1972.
Vasil V, Vasil IK: プロトプラストからのタバコおよびペチュニア植物の
再生並びに穀物プロトプラストの培養(Regeneration of tobacco and petunia plants from protoplasts and culture of corn protoplasts). In Vitro 10: 83-96, (Jul-Aug) 1974.
Von Heijne G: N-末端のトポジェニックタンパク質配列の比較解剖学に向けて(Towards a comparative anatomy of N-terminal topogenic protein sequences). J Mol Biol 189(1): 239-42, 1986.
*Walter P, Blobel G. Biochem Soc Symp 47: 183, 1986. 
Wenzler H, Mignery G, Fisher L, Park W: トランスジェニックタバコ植物の葉におけるキメラジャガイモ塊茎遺伝子のスクロース調節発現(Sucrose-regulated expression of a chimeric potato tuber gene in leaves of transgenic tobacco plants). Plant Mol Biol 13(4): 347-54, 1989.
Wolter FP, Fritz CC, Willmitzer L, Schell J, Schreier PH: Solanum tuberosum のrbcS遺伝子：進化におけるトランジットペプチドおよびエキソンシャッフリングの保存(rbcS genes in Solanum tuberosum: conservation of transit peptide and exon shuffling during evolution). Proc Natl Acad Sci USA 85(3): 846-50, (Feb.) 1988.
Wong KK, Tan LU, Saddler JN: 微生物におけるβ-1,4-キシラナーゼの多重度：機能と応用(Multiplicity of beta-1,4-xylanase in microorganisms: functions and applications). Microbiol Rev 52(3): 305-17, (Sept.) 1988.
Yamada K, et al.: Agricultural and Biological Chemistry 32: 1275-1282, 1968.
USPN 3,297,548; Filed July 28, 1964; Issued Jan. 10, 1967. Ware JH, Bluff L, Shieh TK : 酸フィターゼの調製(Preparation of acid phytase).
USPN 4,946,778; Filed Jan. 19, 1989; Issued Aug. 7, 1990. LadnerRC, Bird RE, Hardman K : 単一ポリペプチド鎖結合分子(Single polypeptide chain binding molecules).
EPO 120,516; Filed Feb. 21, 1984; Issued Oct. 3, 1984. Schilperoort RA, Hoekema A, Hooykaas RJJ: 双子葉植物のゲノムへの外来DNAの組み込み方法；アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌およびその生産方法；改変された遺伝子特性を有する植物および植物細胞；調製方法(A process of the incorporation of foreign DNA into the genome of dicotyledonous plants; Agrobacterium tumefaciens bacteria and a process for the production thereof; plants and plant cells with modified genetic properties; a process for the preparation).
EPO 321,004; Filed Oct. 28, 1988; Issued Jan. 22, 1992. Vaara T, Vaara M, Simell M, Lehmussaari A, Caransa A: 新しい酵素調製物を用いた穀類の浸漬方法(A process for steeping cereals with a new enzyme preparation).
IPN WO 91/05053; Filed Sept. 27, 1990; Issued April 18, 1991. VanGorcom R, et al.: 微生物フィターゼのクローニングおよび発現(Cloning and expression of microbial phytase).
【図面の簡単な説明】
【０４３２】
【図１Ａ】本発明の酵素のヌクレオチド配列および推定上のアミノ酸配列を示す。
【図１Ｂ】本発明の酵素のヌクレオチド配列および推定上のアミノ酸配列を示す。
【図２】本発明のフィターゼ酵素のpHおよび温度プロファイルならびに安定性のデータを示す。
【図３】配列番号８と配列番号10（改変型フィターゼ）との耐熱性アッセイの結果に関するグラフを示す。
【図４】模擬消化条件下でのフィターゼ酵素の安定性に関するグラフを示す。
【図５】種々の宿主細胞における野生型および改変型（配列番号10）フィターゼの発現に関するグラフを示す。
【図６】ペプシンを含むSGF中での残留フィターゼ活性のグラフを示す。
【図７Ａ】大腸菌appAフィターゼ（配列番号７）のヌクレオチド配列を示す。
【図７Ｂ】大腸菌appAフィターゼ（配列番号７）のヌクレオチド配列を示す。
【図８】大腸菌appAフィターゼ（配列番号８）および改変型フィターゼ（配列番号10）のアミノ酸配列を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【配列表】
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