(57)【要約】【課題】任意のタンパク質をよりミクロなレベルで所望の配列に集積させる技術を提供する。【解決手段】合成タンパク質２を、会合領域４と、会合領域４において会合されるタンパク質と静電的相互作用を生じさせる静電的作用部位６と、を備えるように構成する。静電的作用部位６における会合させようとするタンパク質との間での静電的相互作用により、その会合順序、会合されるポリペプチド鎖の向きなどを制御できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成タンパク質であって、
会合領域と、
前記会合領域において会合されるタンパク質と静電的相互作用を生じさせる静電的作用部位と、
を備える、合成タンパク質。
【請求項２】
前記静電的作用部位は、前記合成タンパク質に会合されるタンパク質を選択可能な程度の静電的相互作用を生じさせる部位である、請求項１に記載の合成タンパク質。
【請求項３】
前記静電的作用部位は、前記合成タンパク質に会合されるタンパク質のポリペプチド鎖の方向を選択可能な程度の静電的相互作用を生じさせる部位である、請求項１又は２に記載の合成タンパク質。
【請求項４】
前記静電的作用部位は、前記合成タンパク質と前記合成タンパク質に会合されるタンパク質との会合を促進及び／又はその会合状態を強化可能な程度の静電的相互作用を生じさせる部位である、請求項１〜３のいずれかに記載の合成タンパク質。
【請求項５】
前記静電的作用部位は、前記会合領域又はその近傍に備えられる、請求項１〜４のいずれかに記載の合成タンパク質。
【請求項６】
前記静電的作用部位は、前記会合領域の両端側にそれぞれ備えられる、請求項１〜５のいずれかに記載の合成タンパク質。
【請求項７】
前記静電的作用部位は、塩基性アミノ酸残基及び／又は酸性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の合成タンパク質。
【請求項８】
前記会合領域には、ジスルフィド結合を形成可能な官能基を有するアミノ酸を有している、請求項１〜７のいずれかに記載の合成タンパク質。
【請求項９】
前記会合領域は、中性アミノ酸を主体とする、請求項１〜８のいずれかに記載の合成タンパク質。
【請求項１０】
前記会合領域はアミロイドタンパク質の自己会合領域の少なくとも一部を有する、請求項１〜９に記載の合成タンパク質。
【請求項１１】
前記会合領域以外の部分に、酵素活性を発現可能なポリペプチド鎖を備える、請求項１〜１０のいずれかに記載の合成タンパク質。
【請求項１２】
前記合成タンパク質に会合されるタンパク質は、前記会合領域と同一又は類似の会合領域と、前記静電的作用部位と相互作用する静電的作用部位と、酵素活性を発現可能なポリペプチド鎖を備える、請求項１〜１１のいずれかに記載の合成タンパク質。
【請求項１３】
タンパク質の複合体であって、
会合領域と該会合領域において会合されるタンパク質と静電的相互作用を生じさせる静電的作用部位と、を備える２種類以上の合成タンパク質が互いに会合されている、複合体。
【請求項１４】
前記複合体は、平行βシート、逆平行βシート及びβひだ状シートから選択されるいずれかの構造部分を有する、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
前記複合体は繊維状である、請求項１３又は１４に記載の複合体。
【請求項１６】
前記２種類以上の合成タンパク質の少なくとも一つは酵素活性を発現可能なポリペプチド鎖を備える、請求項１３〜１５のいずれかに記載の複合体。
【請求項１７】
前記２種類以上の合成タンパク質は、異なる酵素活性を発現可能なポリペプチド鎖をそれぞれ備えている、請求項１６に記載の複合体。
【請求項１８】
前記異なる酵素活性を発現可能なポリペプチド鎖は当該酵素活性に基づく逐次反応が可能な順序で配列されている、請求項１７に記載の複合体。
【請求項１９】
タンパク質複合体の製造方法であって、
会合領域と当該会合領域において会合されるタンパク質と静電的相互作用を生じさせる静電的作用部位とを備える２種類以上の合成タンパク質を含有する会合用液を準備する工程と、
前記会合用液において前記２種以上の合成タンパク質を会合させる工程と、
を備える、製造方法。
【請求項２０】
前記会合工程は、熱力学的エネルギーを前記溶液に付与する工程である、請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記会合工程後、前記会合工程で得られた会合体と会合領域と当該会合領域において会合されるタンパク質と静電的相互作用を生じさせる静電的作用部位とを備える合成タンパク質とを含有する会合用液を準備する工程と、
前記会合用液において、前記会合体に前記合成タンパク質を会合させる工程と、
を実施する、請求項１９又は２０に記載の製造方法。
【請求項２２】
タンパク質複合材料であって、
請求項１３〜１８のいずれかに記載のタンパク質複合体を備える、複合材料。
【請求項２３】
さらに、前記複合体を保持する担体を備える、請求項２２記載の複合材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成タンパク質及びタンパク質複合体並びにその製造方法に関し、特に、人工的に自己組織化能が付与された合成タンパク質、タンパク質複合体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質などの生体分子、例えば、酵素は生体内の化学反応を触媒する機能分子であるが、基質に対する特異性により効率的な化学反応を担っている。この酵素を工業的に利用する試みは古くから行われ、実用化された例もある。しかしながら、これまでの試みは、各酵素あるいはタンパク質を単独で利用するものであって、複数の酵素を同時に利用する試みは多くはない。一方、生体内では複数の関連ある酵素あるいはタンパク質が複合体を形成することにより、それぞれが単独で機能するよりも効率的にあるいは新たな機能を発現していることが知られている。
【０００３】
複数の酵素を遺伝子工学的に連結して、複数の機能を有する巨大タンパク質を一つのポリペプチドとして生産する試みがある（特許文献１）。また、個々の酵素を担体に固定化し、これら担体をカラムに対して合目的的に充填して個々の酵素に基づく複数の機能を単一のカラム内で発現させるリアクターを構築し、生体内におけるのと同等の機能を発現させようとの試みがある（非特許文献１、２，３）。
【特許文献１】特開２００４−１６１１７
【非特許文献１】Stempfer G, Holl-Neugebauer B, Rudolph R. Improved refolding of an immobilized fusion protein.Nat Biotechnol.1996 Mar;14(3):329-34.
【非特許文献２】Altamirano MM, Golbik R, Zahn R, Buckle AM, Fersht AR.Related Articles,LinksRefolding chromatography with immobilized mini-chaperones.Proc Natl Acad Sci USA,1997 Apr 15;94(8):3576-8.
【非特許文献３】Tsumoto K, Umetsu M, Yamada H, Ito T, Misawa S, Kumagai I.Immobilized oxidoreductase as an additive for refolding inclusion bodies:application to antibody fragments. Protein Eng.2003 Jul;16(7):535-41.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、遺伝子工学的に複数のタンパク質を結合する手法によると、タンパク質の巨大化が避けられず、しかも巨大タンパク質の生産が困難であることから、有効に機能するタンパク質を生産するのは困難であった。また、タンパク質を固定化した担体を配列する手法では、生体内のタンパク質の配置を極めてマクロなレベルで近似しているに過ぎず、生体機能に到底到達していない。さらに、こうしたいずれの方法によっても、タンパク質をマクロなレベルで集合させているだけであるため、酵素の基質の拡散律速が大きくなることを避けられず、結果的に目的とする効果を実現することができなかった。
【０００５】
一方、生体内におけるタンパク質の配列制御は、複合体を形成するタンパク質分子が、自己集積して形成される。こうしたタンパク質の自己集積機能はタンパク質表面に存在する官能基の相互作用が分子形態により生み出されており、タンパク質の一次構造においてこれらの機能が既に書き込まれていると考えられる。しかしながら、こうした機能は未だ解明されていないため、自己組織化能を制御することは不可能である。
【０００６】
そこで、本発明は、タンパク質をよりミクロなレベルで集積させる技術を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、タンパク質分子の配列順序やポリペプチド鎖の方向などを制御しつつ集積させる技術を提供することを他の一つの目的とする。さらに、本発明は、タンパク質分子の配列を制御して得られる機能的な生体分子複合体を製造する技術を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、生体内で相互に会合して集積するタンパク質であるアミロイドタンパク質に着目し、ある種のアミロイドタンパク質をインビトロで人工的に会合させ線維状に集積させる手法に関する知見を得るとともに、この会合能力及び会合状態の安定性に着目してアミロイドタンパク質の会合部位を配列制御に利用することを見出した。さらに、本発明者らは、これらのタンパク質の会合にあたっては、会合するタンパク質間において静電的相互作用が生じていることを見出し、この静電的相互作用をも配列制御に利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００８】
本発明の一つの態様によれば、合成タンパク質であって、会合領域と、前記会合領域において会合されるタンパク質と静電的相互作用を生じさせる静電的作用部位と、を備える、合成タンパク質が提供される。
【０００９】
この態様においては、前記静電的作用部位は、前記合成タンパク質に会合される前記タンパク質を選択可能な程度の静電的相互作用を生じさせる部位とすることができる。また、前記静電的作用部位は、前記合成タンパク質に会合される前記タンパク質のポリペプチド鎖の方向を選択可能な程度の静電的相互作用を生じさせる部位としてもよい。さらに、前記静電的作用部位は、前記合成タンパク質と前記タンパク質との会合を促進又はその会合状態を強化する部位としてもよい。
【００１０】
また、この態様においては、前記静電的作用部位は、前記会合領域又はその近傍に備えるようにすることができる。さらに、前記静電的作用部位は、前記会合領域両端側にそれぞれ備えるようにすることができる。さらにまた、前記静電的作用部位は、塩基性アミノ酸残基及び／又は酸性アミノ酸残基を含むことができる。前記静電的作用部位は、塩基性アミノ酸残基及び／又は前記酸性アミノ酸残基を有することができる。
【００１１】
さらに、この態様においては、前記会合領域には、ジスルフィド結合を形成可能な官能基を有するアミノ酸を有することができる。また、前記会合領域は、中性アミノ酸を主体とすることができる。さらにまた、前記会合領域はアミロイドタンパク質の自己会合領域の少なくとも一部を有することもできる。
【００１２】
さらにまた、この態様においては、前記合成タンパク質は、前記会合領域以外の部分に、酵素活性を発現可能なポリペプチド鎖を備えることができる。
【００１３】
この態様においては、前記タンパク質は、前記会合領域と同一又は類似の会合領域と、前記静電的作用部位と相互作用する静電的作用部位と、酵素活性を発現可能なポリペプチド鎖を備えることができる。
【００１４】
また、本発明の他の態様によれば、タンパク質の複合体であって、会合領域と該会合領域において会合されるタンパク質と静電的相互作用を生じさせる静電的作用部位と、を備える２種類以上の合成タンパク質が互いに会合されている複合体が提供される。
【００１５】
この態様においては、前記複合体は、平行βシート、逆平行βシート及びβひだ状シートから選択されるいずれかの構造部分を有することができる。また、前記複合体は繊維状であってもよく、さらに、前記合成タンパク質の少なくとも一つは酵素活性を発現可能な領域を備えることができる。また、会合される前記２つ又はそれ以上の合成タンパク質は、異なる酵素活性を発現可能なポリペプチド鎖をそれぞれ備えるようにすることもできる。この場合、前記異なる酵素活性を発現可能なポリペプチド鎖は当該酵素活性に基づく逐次反応が可能な順序で配列されていてもよい。
【００１６】
また、本発明の他の一つの態様によれば、タンパク質複合体の製造方法であって、会合領域と当該会合領域において会合されるタンパク質と静電的相互作用を生じさせる静電的作用部位とを備える２種類以上の合成タンパク質を含有する会合用液を準備する工程と、前記会合用液において前記２種以上の合成タンパク質を会合させる工程と、を備える製造方法が提供される。
【００１７】
この態様において、前記会合工程は、熱力学的エネルギーを前記溶液に付与する工程とすることができる。さらに、前記会合工程後、前記会合工程で得られた会合体と会合領域と当該会合領域において会合されるタンパク質と静電的相互作用を生じさせる静電的作用部位とを備える合成タンパク質とを含有する会合用液を準備する工程と、前記会合用液において、前記会合体に前記合成タンパク質を会合させる工程と、を実施することもできる。
前記合成タンパク質は、前記会合領域以外に酵素活性を発現可能なポリペプチド鎖を備えることができる。
【００１８】
本発明のさらに他の一つの態様によれば、タンパク質複合材料であって、上記いずれかのタンパク質複合体を備える、複合材料が提供される。
【００１９】
この態様においては、さらに、前記複合体を保持する担体を備えることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を実施する形態について詳細に説明する。
本発明の合成タンパク質２は、図１に例示するように、会合領域４と、静電的作用部位６とを備えている。図１に示すように、本合成タンパク質２は、会合領域４を備えることにより、タンパク質、具体的には、会合領域４に対して会合可能な会合領域を少なくとも備えるタンパク質と会合して、複合体１０を構成することができる。
【００２１】
また、本合成タンパク質２は、静電的作用部位６を備えることにより、会合領域４におけるタンパク質との会合状態を制御できる。例えば、図２に示すように、合成タンパク質２ａ、２ｂを会合させるのに際して、合成タンパク質２ａが合成タンパク質２ｂと会合するときに、合成タンパク質２ｃと会合するときよりも、静電的親和性がより高くなる（又はより多く電荷の相殺が生じる）ように静電的作用部位６ａ、６ｂを設計することにより、合成タンパク質２ａ、２ｂとを選択的に会合させることができる。さらに、こうしたタンパク質間の静電的親和性の大小（電荷相殺量の多い少ない）を利用することで、２種類あるいはそれ以上の合成タンパク質２ａ、２ｂの配列順序を制御することができる。
【００２２】
さらに、静電的作用部位６を備えることで、会合されるタンパク質のポリペプチド鎖の方向を制御して会合させることができる。すなわち、合成タンパク質２ａ、２ｂが意図するポリペプチド鎖の方向で会合されるときに静電的に親和性が高くなるよう静電的作用部位６ａ、６ｂを設計することで、意図した方向性で合成タンパク質２ａ、２ｂを会合させることができる。
【００２３】
さらにまた、静電的作用部位６を備えることで、会合されるタンパク質２２との間の会合を促進し又はより強固な会合状態を形成することができる。逆に、会合を抑制し又は会合状態を弱くすることもできる。
【００２４】
また、本発明のタンパク質の複合体１０によれば、タンパク質２ａ、２ｂの会合順序（配列順序）や向きが制御され、又は会合状態が強化されたものとなっている。また、合成タンパク質２ａ、２ｂが酵素活性を発現可能なドメインなどの機能性領域を備える場合には、それぞれの機能性領域をミクロなレベルで意図した順序及び/又は位置関係で配列させたものとなっている。このため、これらの機能性領域の効率的な反応（例えば、生体内における逐次反応に模倣的な）を実現できるものとなっている。
【００２５】
さらに、この複合体１０によれば、合成タンパク質２の備える静電的作用部位６による静電的な相互作用を異ならせることで、一つの複合体１０において、会合する合成タンパク質２の会合状態の強さが会合部位によって異なる複合体を得ることができる。こうした複合体１０によれば、複合体１０に含まれる合成タンパク質２の会合のみならず、脱会合をも容易に制御できるものとなっている。
【００２６】
なお、この複合体１０によれば、従来タンパク質を固定していたビーズや繊維などの担体を要することもなく、ナノサイズのタンパク質の機能性ユニット（粒子）を構築することが可能となる。ナノサイズレベルでタンパク質分子がその順序や位置関係が制御されて配列されているため、他のナノサイズ材料との複合化も容易になる。さらにまた、このユニットは、生体成分、すなわち、アミノ酸で構築されるため、易分解性ももたらされる。さらに、この機能性ユニットは、会合領域が共有結合以外の水素結合等の分子間相互作用によって会合されて形成される非共有結合性の複合体であるため、会合及び脱会合を人為的に制御等することが容易となっている。
【００２７】
本発明は、このような合成タンパク質２及び当該合成タンパク質２を含む複合体のほか、複合体の製造方法及びタンパク質複合材料も併せて提供する。以下、順にこれらを説明する。
【００２８】
（合成タンパク質）
本発明の合成タンパク質２は、典型的には、会合領域４と静電的作用部位６とを有する他の合成タンパク質２と会合することを意図しているが、会合対象として、特にこういった領域を設けていない天然あるいは人工のタンパク質を排除するものではない。会合対象のポリペプチド鎖に対応した会合領域４と静電的作用部位６とを設計することにより、本発明の意図する会合制御は可能である。
【００２９】
（会合領域）
合成タンパク質２は、１又は２以上の会合領域４を備えることができる。本明細書において、「会合」とは、少なくとも互いに会合する部位を有する２分子以上が共有結合以外の分子間相互作用によって結合し、１個の分子のように行動することを意味している。共有結合以外の分子間相互作用（以下、非共有結合性分子間相互作用という。）とは、例えば、水素結合、疎水結合、イオン結合等が挙げられる。また、「会合」とは、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）におけるものであってもよく、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）におけるものであってもよく、これらの双方を含む。また、会合領域４とは、会合状態を形成するであろうと予測される又はインビボ若しくはインビトロで会合状態が観察される領域を意味するものとし、好ましくは後述する会合のためのコア配列を含んでいる。
【００３０】
会合領域４は、合成タンパク質２のポリペプチド鎖のいずれの領域にあってもよい。ポリペプチド鎖の中央部分に備えられていてもよいし、そのＮ末端側あるいはＣ末端側に備えられていてもよい。これらのうちの複数箇所に備えられていてもよい。なお、生体内にあって会合状態にあるタンパク質分子における会合部位がＣ末端側に存在しており、本合成タンパク質２が、このような会合部位に基づく会合領域４を備える場合であっても、当該会合領域４をＮ末端側や中央部分に備えることができる。なお、二つ以上の会合領域４を備える場合であっても、必ずしも同時に二つ以上の会合領域４が機能する必要はない。
【００３１】
会合領域４は、インビトロにおいては、人為的に何らかの作用を付与することで会合可能なドメインあるいはモチーフであることが好ましい。また、インビボにおいては、ある種の条件下において会合されるドメインあるいはモチーフであることが好ましい。こうした会合領域４としては、例えば、生体内において、タンパク質分子の自己会合を担っているとされるドメインやモチーフが挙げられる。
【００３２】
会合領域４は、特に限定しないが、タンパク質のフォールディング構造として知られるαヘリックス、平行βシート、逆平行βシート、階段状βシート等の二次構造を取って会合可能な領域とすることができる。後述するアミロイドは典型的には平行又は逆平行βシート構造を取ることができる。
【００３３】
会合領域４は、中性アミノ酸を主体とするポリペプチド鎖とすることができる。ここで中性アミノ酸とは、酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基以外の電荷を有しないアミノ酸を意味する。また、会合領域４において中性アミノ酸を主体とするとは、中性アミノ酸残基数が会合領域４を構成するアミノ酸残基数の５０％以上を占めることを意味するものとする。会合領域４において中性アミノ酸残基を主体とすることで、静電的作用部位６による配列制御を効果的に作用させることができる。
【００３４】
中性アミノ酸残基としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンのほか、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、プロリン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。なお、中性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンから選択される１種又は２種以上を含んでいることが好ましい。なお、中性アミノ酸としては、電荷を有しないヒドロキシプロリン等の特殊アミノ酸が挙げられる。
【００３５】
会合領域４には、ジスルフィド結合を形成可能な官能基（−ＳＨ基など）を有する、アミノ酸残基を備えることができる。このような、アミノ酸残基としては、システイン及びＳＨ基を有する特殊アミノ酸が挙げられる。また、合成タンパク質２同士がその会合領域４で会合し、こうしたアミノ酸残基が対合したときには、Ｓ−Ｓ結合が形成されることもありうる。後述する静電的作用部位６は、こうしたアミノ酸残基の対合を伴う会合を促進することもできる。
【００３６】
会合領域４としては、例えば、生体内においてアミロイドとして蓄積されるアミロイドタンパク質の自己会合領域を用いることができる。かかるアミロイドタンパク質としては、メディン（ｍｅｄｉｎ）（配列番号１）、アミロイドＡβ４０（配列番号２）、アミロイドＡβ４２（配列番号３）、ＣｏｌｄｓｈｏｃｋＢ由来ペプチド（配列番号４、５および６）、トランスサイレチン由来タンパク質（配列番号７）、トランスサイレチン由来ペプチド（配列番号８および９）、β２ミクログロブリン由来ペプチド（配列番号１０および１１）、プリオン由来のペプチド（配列番号１２、１３および１４）を挙げることができる。これらのアミロイドタンパク質はいずれもそのＣ末端側に自己会合領域を有している。アミロイドタンパク質は、剛直で枝分かれのない繊維であるため、アミロイドタンパク質の会合部位を本発明の会合領域として用いることにより、他のドメインを連結しても、十分に会合状態を形成できる。この結果、他のドメインに相当するタンパク質は有効に機能を発現できる。
【００３７】
なかでも、会合領域４としては、ｍｅｄｉｎのＣ末端側ドメインを用いることが好ましい。具体的には、少なくとも配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるドメインとすることが好ましい。また、インビトロにて会合可能である限り、この配列（配列番号１５）において、１あるいは２以上のアミノ酸が付加、欠失、挿入、及び／又は置換されていてもよい。より好ましくは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有し、他のアミノ酸が付加された形態である。
【００３８】
好適な会合領域４のアミノ酸配列の他の一例として、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を挙げることができる。また、さらに他の一例として、配列番号１７に記載のアミノ酸配列が挙げられる。なお、会合領域には、自己会合に必須のアミノ酸配列の他、当該必須アミノ酸配列に対して会合可能な立体構造を付与しあるいはそのような立体構造の形成を阻害しない他のアミノ酸配列を含めることができる。
【００３９】
なお、会合領域４あるいはその近傍においては、会合を阻害するあるいは会合を促進するようなアミノ酸残基が付加、欠失、挿入されたり、そうしたアミノ酸残基で置換されていてもよい。例えば、会合領域４が他の合成タンパク質２と会合してβシート構造を取るときには、会合領域４あるいはその近傍において、βシート構造を形成しやすい又は形成しにくいアミノ酸残基で付加、欠失等の修飾を施すことができる。こうして会合領域４における分子間相互作用を調整することで、後述する静電的作用部位６とともに、会合しようとするタンパク質１２に対する特異性や選択性を高めることができる。なお、配列番号１５に記載のアミノ酸配列は、会合のためのコア配列であると考えられるため、このアミノ酸配列中に欠失、挿入や置換はされないことが好ましい。
【００４０】
（静電的作用部位）
本発明の合成タンパク質２は、１又は２以上の静電的作用部位６を備えることができる。静電的作用部位６は、合成タンパク質２に会合される合成タンパク質２などのタンパク質を選択可能な程度の静電的相互作用、合成タンパク質２に会合されるタンパク質のポリペプチド鎖の方向を選択可能な程度の静電的相互作用及び合成タンパク質２とタンパク質との会合を促進又はその会合状態を強化する程度の静電的相互作用を発揮することができる。これらの各種の形態あるいは異なる程度の静電的相互作用は、以下の構成により実現することができる。交互にかつポリペプチド鎖も交互に会合可能に、会合領域４ａ、４ｂと静電的作用部位６ａ、６ｂとを備える合成タンパク質２ａ、２ｂの例を図３に示す。また、これらのアミノ酸配列を配列番号１８、２０に示す。
【００４１】
静電的作用部位６における静電的相互作用は、塩基性アミノ酸残基及び酸性アミノ酸残基から選択される１種又は２種以上のアミノ酸残基によって付与することができる。塩基性アミノ酸残基としては、リシン、アルギニン及び２以上のアミノ基等を有する特殊アミノ酸が挙げられる。酸性アミノ酸残基としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸、あるいは２以上のカルボキシル基等を有する特殊アミノ酸が挙げられる。
【００４２】
静電的作用部位６には、こうした電荷を有するアミノ酸残基（以下、荷電アミノ酸残基ともいう。）を単独であるいは組み合わせることで形成することができる。複数の荷電アミノ酸残基を組み合わせて静電的作用部位６を構成する場合、これらのアミノ酸残基は、連続して配置されていてもよいし、１個あるいは２個以上の他のアミノ酸残基を介して断続的に配置されていてもよい。なお、介在されるアミノ酸残基は、中性アミノ酸残基であることが好ましい。
【００４３】
複数個の荷電アミノ酸残基を組み合わせて任意の電荷の配列又はアミノ酸残基の配列を構成することで、静電的作用部位６に会合させるタンパク質に対する高い選択性を付与することができる。なお、電荷の配列とは、配列される荷電アミノ酸残基の電荷の配列を意図して用いられ、電荷アミノ酸残基配列は、電荷の配列のみならず配列されるアミノ酸残基の配列を意図して用いられる。例えば、荷電アミノ酸配列という場合には、配列される荷電アミノ酸残基の種類による相違、例えば側鎖の立体障害による静電的作用の相違が含まれている。
【００４４】
図４に、電荷配列又は荷電アミノ酸残基配列を有する静電的作用部位に基づく合成タンパク質２ａ、２ｂ間における選択的会合及び会合順序の制御例を示す。図４に示すように、互いに会合させようとする２つの合成タンパク質２ａ、２ｂの静電的作用部位６ａ、６ｂにおける電荷配列又は荷電アミノ酸配列が、互いに電荷の静電的な親和性が高くなる又は電荷を相殺するのに最適化するように設計すれば、この合成タンパク質２ａ、２ｂを他の合成タンパク質よりも選択的に会合させることができる。すなわち、合成タンパク質２ａにおいては、荷電アミノ酸配列においてミスマッチがあって電荷の反発が生じる又は電荷の相殺量がより少なくなるような静電的作用部位６を有する他の合成タンパク質２ｃとの会合は抑制されることになる。この結果、互いに会合可能な会合領域４ａ、４ｂをそれぞれ備える複数の合成タンパク質２ａ、２ｂが混在していても、静電的作用部位６ａ、２ｂにおける荷電配列あるいは荷電アミノ酸配列に基づいて合成タンパク質２ａ、２ｂを会合させるよう制御できる。また、こうした電荷配列又は荷電アミノ酸配列を用いることで、複数の合成タンパク質２ａ、２ｂ、２ｃ会合順序を制御することができるようになる。例えば、図４に示すようじ、合成タンパク質２ｂに別の静電的作用部位６ｂ’を備えるように、この静電的作用部位６ｂ’と合成タンパク質２ｃの静電的作用部位６ｃとの間で静電的親和性がより高くなるようにすれば、合成タンパク質２ｂに合成タンパク質２ｃを会合させることができる。なお、静電的作用部位６ｂの電荷配列又は荷電アミノ酸配列の配列や長さによって、追加の静電的作用部位６ｂ’を用いなくても会合順序を制御することができる。
【００４５】
合成タンパク質２における静電的作用部位６の位置は特に限定しない。静電的相互作用により、会合させようとする合成タンパク質２に対して選択性を発揮できるような位置であればよい。したがって、静電的作用部位６は、会合領域４内に存在することもあり、会合領域４の近傍であることもあり、また、会合部位４からある程度離れている場合もある。また、静電的作用部位６は、会合領域４に対して１あるいは２以上を設けることができる。２位上設けることで会合制御の精度が向上する。通常、静電的作用部位６は会合領域４の内部又はその近傍にあることが好ましく、より好ましくは会合領域４に隣接し、会合領域４の下流側（Ｎ末端側）又は上流側（Ｃ末端側）にあり、最も好ましくは、会合領域３の下流側と上流側との双方に位置されている。会合領域４のより近くにおいて静電的相互作用を発現させることで、合成タンパク質２の会合を効果的に制御することができる。また、会合領域４の上流及び下流に備えられることで、精度の高い会合制御が可能となる。
【００４６】
静電的作用部位６を会合領域４内部又はその近傍に設けた上で、さらに、当該静電的作用部位６よりも会合領域４から遠くなる位置に別の静電的作用部位６を備えることもできる。また、合成タンパク質２が２以上の会合領域４を備える場合には、各会合領域４に対して静電的作用部位６を備えることができるが、会合領域４毎に静電的作用部位６を備えることは必ずしも必要ない。
【００４７】
なお、静電的作用部位６を設ける位置によって、会合領域４における会合状態を制御することもできる。すなわち、静電的作用部位６の形成位置により、会合領域４中の所望の部位において他の合成タンパク質２の会合領域４と会合するようにすることができる。２以上の会合領域４を有する場合には、いずれか一方の会合領域４で会合させることもできる。
【００４８】
本発明の合成タンパク質２は、会合領域４と静電的作用部位６とを備えることで、合成タンパク質２の会合を制御し、会合順序や会合されるポリペプチド鎖の向きが制御された合成タンパク質２の複合体１０を構築できる。こうした複合体１０は、それ自体、制御された会合状態を有し、所定の会合形態をとることができる。
【００４９】
（他の領域）
さらに、本合成タンパク質２は、会合領域４及び静電的作用部位６以外の他の領域８を有することができる。当該他の領域８は、特に限定しないで、ポリペプチド鎖に対して連結可能な各種の分子、特に生体分子とすることができる。なかでも、他の領域８としては、任意の活性を有するタンパク質あるいはその一部（活性部位）とすることが好ましい。他の領域８に相当するタンパク質としては、抗体、ホルモン、サイトカイン、成長因子、阻害因子、酵素、蛍光などの発色体、抗菌剤、膜タンパク質、各種化合物の受容体、吸着活性体、などの各種の活性を発現可能なタンパク質を包含している。これらのタンパク質は、工業用、治療用、診断用、医薬用、農業材料に適用されうる。これらのタンパク質の由来は特に限定されないで、天然由来のアミノ酸配列からなるものの他、これらに対し人為的に挿入、欠失、置換等が行われたものであってもよいし、非天然アミノ酸を含むこともできるし、適宜修飾がおこなわれていてもよい。
【００５０】
例えば、図５に示すように、各合成タンパク質２の他の領域８にそれぞれ逐次的な酵素反応ａ、ｂ、ｃを遂行可能な異なる酵素活性を発現可能なタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃを備えさせることができる。そして、各合成タンパク質２ａ、２ｂ、２ｃの静電的作用部位の静電的相互作用により、このような各合成タンパク質２ａ、２ｂ、２ｃをタンパク質Ａ、タンパク質Ｂ及びタンパク質Ｃの順列が形成されるように会合させることで、逐次反応が可能な複合体１０を構築できる。
【００５１】
なお、他の領域８は、単一の合成タンパク質２においては必ずしも一つである必要はなく、二つ以上の他の領域８を有することもできる。これらは直接にあるいは後述するリンカー７を介して結合させることもできるし、二つ以上の会合領域と組み合わせて、会合領域４−他の領域８−会合領域４−他の領域８等のように会合領域４と他の領域８とを交互等適宜組み合わせることも可能である。なお、二つ以上の他の領域８が存在する場合には、同時に二つ以上の他のドメインが機能する必要は必ずしもない。
【００５２】
当該他の流域８は、会合領域４に対してリンカー７を介して接続されていてもよい。適切なリンカー７が会合領域４と他の領域８との間に存在されることで、これら２個の領域が互いに他の領域の機能を損なわないように構成することができる。このようなリンカー７としては、合成タンパク質２を作製するのに一般的に用いられる従来公知の各種のリンカーを用いることができる。また、プロテアーゼによる分解部位を備えるリンカーを用いることもできる。例えば、配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるリンカー７は好適な一例である。このリンカー７においては、適度な長さを備える他、ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ（エンテロキナーゼ）による切断部位を有するため、会合させて得られた合成タンパク質の複合体をエンテロキナーゼで処理して、会合領域から他の領域８を分離することができる。リンカー７が選択的切断部位を備えることで、一体構築した複合体の形態を変化させることができる他、会合領域４と他の領域８とを互いに分離精製することも可能となる。
【００５３】
（合成タンパク質の作製）
このような合成タンパク質２は、従来公知の各種方法により作製することができ、化学合成によっても取得可能であるが、好ましくは、遺伝子操作によって得られるタンパク質産生細胞を培養することにより取得する。合成タンパク質２の構成要素（会合領域４、静電的作用部位６、リンカー７及び他の領域８など）をそれぞれ生産した後に、化学合成的にこれらを結合することも可能ではあるが、合成タンパク質２のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡを、当該ＤＮＡを発現可能に保持するベクター等の遺伝子導入用ＤＮＡ構築物を適当な細胞に導入し、形質転換して、その形質転換細胞を培養することにより、産生させることが好ましい。これらの各種手法は当業者において周知であるので、その詳細な説明は省略するものとする。
【００５４】
（タンパク質複合体）
タンパク質の複合体１０は、合成タンパク質２を含むタンパク質の会合体である。タンパク質複合体１０は、合成タンパク質２の会合領域４によって本来的な会合形態が付与されているとともに、静電的作用部位６によって会合順序、ポリペプチド鎖の方向、会合領域４の部分の剛直性、会合部位が制御されたものとなっている。このため、所望の会合構造を持った複合体１０となっている。さらに、合成タンパク質２が他の領域８に機能的なポリペプチド鎖を有する場合には、これらのポリペプチド鎖の配列、位置関係、距離を制御可能であるため、ポリペプチド鎖による機能発現のために効果的な環境を有する機能性材料となっている。
【００５５】
例えば、合成タンパク質２の他の領域８に、異なる酵素活性を発現可能なポリペプチド鎖をそれぞれ備える複合体１０においては、それぞれの静電的作用部位６による会合順序制御により、異なる酵素活性を発現可能なポリペプチド鎖を当該酵素活性に基づく逐次反応が可能な順序で配列されたものとすることができる。
【００５６】
さらに、複合体１０においては、合成タンパク質２の会合領域４を基部として複数の合成タンパク質２が会合して構成されるため、個々の合成タンパク質２に備えられるタンパク質などの機能性分子が極めて近接して保持されることが可能となっている。例えば、合成タンパク質２にそれぞれ保持されるタンパク質を、これらのタンパク質がＹＦＰやＣＦＰ等の蛍光エネルギー移動が可能な蛍光タンパク質であったとしたら、蛍光エネルギー移動が可能となるような程度の距離にまで近接させて保持させることができる。
【００５７】
このような複合体１０は、構成要素である合成タンパク質２が備える他の領域８の機能に応じ、各種の機能を発現するユニット（粒子）を構成する。例えば、複合体１０は、触媒機能を発現する酵素ユニット、抗菌性などを発現する薬剤ユニット、膜タンパク質ユニット、抗体ユニット等として機能する。
【００５８】
複合体１０は、会合領域４の種類や会合形式により繊維状、球状等の各種の形態を備えることができるため、会合領域４の選択により所望の形態を有することができる。例えば、会合領域４が生体内タンパク質の自己会合部位であって当該生体内タンパク質が生体内で会合するときの形態が繊維状であるならば、繊維状となる。したがって、複合体１０の形態は、繊維状、球状、針状等の各種の形態を採ることができる。複合体の大きさは、通常、最大寸法で１０ｎｍ以上１０μｍｎｍ以下であることが好ましく、好ましくは１００ｎｍ以上６００ｎｍ以下である。
【００５９】
なお、会合複合体１０を構成する個々の合成タンパク質２は、その会合領域４が互いに会合可能である限り同一である必要はない。単一の会合形態を構成可能な同一あるいは類似の会合領域４を用いることもできるし、各合成タンパク質２の異なる位置及び／又は各合成タンパク質２に異なる会合領域４を用いることで、最終的に得られる会合形態を設計することも可能である。また、個々の合成タンパク質における他の領域８も同一である必要はない。２種類以上の他の領域８をそれぞれ別の合成タンパク質２に備えることも可能である。また、酵素機能を発現する複合体を構築する場合において、複合体の形態確認のために、蛍光タンパク質を他の領域８として備える合成タンパク質２をマーカーとして用いることもできる。
【００６０】
また、複合体１０を構成する個々の合成タンパク質２は、リンカー７を含んでいてもいなくてもよいが、リンカー７を備える場合、リンカー７の種類を選択することで、複合体１０を構築後において、複合体１０を改変することが可能となる。例えば、酵素等によって選択的に切断可能なリンカー７を１種類あるいは２種類以上を組み合わせて用いることで、必要に応じ、適時にかつ所望の他の領域８等を複合体１０から分離させることができる。こうすることで、複合体１０の形態の他、分子量、他の領域８の組成や含有量、配列間隔等も改変できるようになる。一方、他の領域８を回収することも可能となる。
【００６１】
また、タンパク質複合体１０には、他の領域８として嵩高い立体障害の大きなポリペプチド鎖を備える合成タンパク質２を用いることができる。会合領域４におけるさらなる会合を阻止するブロック剤として機能させ、複合体１０の大きさ等を調整することもできる。また、他の領域８に立体障害の大きなタンパク質を備える合成タンパク質２を会合させることで、互いの会合領域４により会合する二つの合成タンパク質２を本来の会合状態とは異なる会合状態に変形させることができる。こうしたポリペプチド鎖は、切断可能なリンカーを介して会合領域４等に連結させておけば、必要に応じ分離することができる。
【００６２】
さらに、タンパク質複合体１０には、会合領域４と静電的作用部位６とを備え、他の領域８を備えない合成タンパク質２を含んでいてもよい。また、会合領域４のみを備え、他の領域８及び静電的作用部位６を備えないタンパク質を含んでいてもよい。このようなタンパク質やポリペプチド等を含めることで、複合体１０における合成タンパク質２の含有量を調整し、他の領域８として備えられる機能分子の含有量、配列間隔や分布も調整することができる。
【００６３】
なお、複合体１０に対しては、酵素あるいは化学的手段により、部分的にペプチド鎖を除去したり、あるいは付加したりすることが可能であり、官能基や化合物による修飾も可能である。また、１種あるいは２種以上の複合体をさらに会合させることにより、高次の複合体を得ることができる。なお、この場合、必ずしも明確に一定形状を呈するまでには至っていない小さい複合体１０を、高次複合体を得るための要素として用いることができる。
【００６４】
例えば、ｍｅｄｉｎのＣ末端側の会合領域あるいは配列番号１５（好ましくは配列番号１６又は配列番号１７）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を会合領域４として備え、この会合領域４の両端側に静電的作用部位６を備え、さらにアミノ酸残基数が５０〜数１００程度の他の領域８を備える合成タンパク質を構成要素とする複合体は、直鎖繊維状形態を有し、直径は通常、約５ｎｍ以上約２０ｎｍ以下であり、好ましくは、５ｎｍ以上１０ｎｍ以下である。長さは、通常、１０ｎｍ以上１０μｍ以下であり、好ましくは１００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であり、この複合体は、アミノ酸残基数が１０〜１００程度のリンカー（好ましくは配列番号２２又は２４に記載のアミノ酸配列を有するあるいはこれらの配列からなるリンカーである。）を備えることができる。
【００６５】
（タンパク質複合体の製造方法）
こうした複合体１０は、２種類以上の合成タンパク質２を含む会合溶液において、合成タンパク質２を会合させることによって得ることができる。本発明の複合体１０の形成は、合成タンパク質２を溶解した会合用液を調製し、この会合用液に対して、会合を誘起させることにより行われる。合成タンパク質２は会合用液において溶解していることが好ましい。
【００６６】
合成タンパク質２を所望の会合順序で会合させるには、所望の順序で会合したときに最も静電的な親和性が高くなるように静電的作用部位６の電荷配列又は荷電アミノ酸配列を設計し、会合させようとする全ての合成タンパク質２を含む会合用液を調製することができる。また、所望の会合順序で会合させようとする合成タンパク質２の一部の合成タンパク質２について、所望の会合順序になるように静電的作用部位６の電荷配列又は荷電アミノ酸配列を設計して会合させ、この中間的な会合体を用いて、別の会合用液（中間的会合体は会合状態で含まれる）を調製して、追加の合成タンパク質２を所望の会合順序で会合させることもできる。
【００６７】
合成タンパク質２の会合を誘起するのに適した会合用液の液性条件は、会合領域４の種類等によって相違する。例えば、合成タンパク質２の濃度、溶媒の種類、ｐＨ、塩濃度などの液性条件、温度条件が考慮される。例えば、合成タンパク質２の濃度は、当該タンパク質が溶解していればよいが、約０．１ｍｇ／ｍｌ以上約２０ｍｇ／ｍｌ以下であることが好ましい。０．１ｍｇ／ｍｌ未満であると複合体形成にかかる時間が長くなり現実的ではなく、２０ｍｇ／ｍｌを超えると非特異的な凝集体が形成されやすくなりまた塩析によって析出されやすくなるからである。より好ましくは、約１．５ｍｇ／ｍｌ以上約５ｍｇ／ｍｌ以下であり、最も好ましくは、約１ｍｇ／ｍｌである。
【００６８】
また、溶媒としては、合成タンパク質２が不可逆的に変性せず溶解可能なものを用いることができるが、水を主体とすることが好ましく、より好ましくは水のみを用いる。ｐＨも、不可逆的変性を生じない範囲であって、ｐＨ約２〜約１１とすることができるが、約４〜約９であることが好ましい。より好ましくは約４以上約７以下である。塩濃度は、１０ｍＭ以上１００ｍＭ以下とすることが好ましい。１０ｍＭ未満であるとタンパク質が不安定となり、１００ｍＭを超えると非特異的な結合が形成されやすくなり、また塩析によって析出されやすくなるからである。
【００６９】
温度条件は、４℃以上５０℃以下とすることが好ましい。この範囲であると、有効に会合を誘起できる。４℃未満であるとタンパク質が凍結する可能性があり、５０℃を超えるとタンパク質が熱変性する可能性が高くなるからである。溶解の方法は合成タンパク質２が適当な量の溶媒に完全に溶解する方法であれば特に制限はない。
【００７０】
このような会合用液に対して会合を誘起させる方法は、特に限定しないが、例えば、合成タンパク質溶液に対して外力など熱力学的エネルギーを付与して、溶液自体やその内部において変位や対流を生じさせることにより、会合を誘起させることができる。こうした外力付与手法としては、特に限定しないが、合成タンパク質溶液が注入された容器を一定の軌道を回転（周回）させたり、自転させたり、振とう、揺動させたりなど各種の態様で動かすことの他、容器中の合成タンパク質溶液を攪拌子や超音波などによって攪拌してもよい。こうした装置としては、例えば、回転培養機や振とう機、攪拌機を用いることができる。容器を、合成タンパク質溶液を強制的に循環可能な形態とすることにより合成タンパク質溶液を攪拌することもできる。
【００７１】
これらの外力付与手法を用いたときの条件は、例えば、周回軌道の大きさ、周回速度、自転速度、振とう時間（回数）や振とう強度、攪拌回数（時間）や攪拌強度等は、合成タンパク質が会合する限り特に制限しない。好ましい外力付与手法としては、合成タンパク質溶液の入った容器を、一定の軌道で回転（周回）させる方法である。この方法を用いる場合、所定の大きさの円盤などの回転体の一部に合成タンパク質溶液が注入された容器を取り付けて、当該円盤を一定の回転数で回転させることなどが挙げられる。この軌道は、半径が５ｃｍ〜３０ｃｍ程度の円形軌道であることが好ましく、回転数を２ｒｐｍ〜１００ｒｐｍとすることが好ましい。
【００７２】
この他、合成タンパク質２を会合させるには、一般的にタンパク質の結晶化を誘起する物質を添加することによっても可能である。例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、ギ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウムセチルトリメチルアンモニウム塩、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどの無機塩類；ＰＥＧ１００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ１００００などのポリエチレングリコール類；アセトニトリル、アセトン、イソプロパノール、エタノール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ブタノール、１，３-ブチロラクトン、１，３-プロパンジオール、２，５-ヘキサンジオール、メタノール、２-メチル-２，４-ペンタンジオール等の有機溶媒を挙げることができる。凝集媒体の添加方法としては、一般的にタンパク質の結晶化に用いられる添加方法を採用することができる。
【００７３】
会合用液中において生成した複合体１０は、通常、当該溶液の溶媒に不溶となり不溶画分を構成する。したがって、複合体１０は溶液から不溶画分を分取・回収する従来公知の方法により採取することができる。分画方法としては、遠心分離法、クロマトグラフィー法、フィルター濾過法等を用いることができる。本発明においては、未会合の遊離の合成タンパク質２やその他のポリペプチドを除去できる方法を採用することが好ましい。これらの未会合成分は、会合溶液の可溶性画分に存在するため、所定の分画後、不溶画分を水等により洗浄することで容易に除去することができる。必要に応じて、クロマトグラフィーや電気泳動等により精製することも可能である。
【００７４】
既に説明したように、一旦形成した複合体１０を含む会合用液から複合体１０を分離し、この複合体１０を用いてさらに追加の会合工程を実施することもできる。複合体１０は、会合しているだけであって変性しているわけではないので、複合体１０と別の合成タンパク質２とを含む会合用液を調製し、再度会合を誘起すれば、複合体１０に対してさらに別の合成タンパク質２を会合させることができる。これにより、複合体１０における合成タンパク質２の会合順序を容易に制御できる。なお、追加の会合工程で用いられる複合体１０は、会合用液において会合状態が維持されていればよく、溶解される必要はない。
【００７５】
複合体１０が作製されたか否かの確認は、例えば、原子間力顕微鏡などの顕微鏡観察、円偏光二色性分析などの偏光分析等にて確認することができる。あるいは、他の領域８の少なくとも一部に蛍光発色性のタンパク質を用いることで複合体１０の形成を容易に視認できる。複合体１０のサイズ、サイズ分布、電気泳動度、立体構造等は必要に応じて測定することができる。
【００７６】
（タンパク質複合材料）
このように形成された１種あるいは２種以上の複合体１０を組み合わせて複合材料１００とすることもできる。複合材料１００は、例えば、複合体１０を他の材料と混合した混合形態、他の材料と混合して成形された形態、あるいは図６に示すように、従来公知の担体２０であるビーズや基板、繊維と複合化したメッシュ状等のシート状体、高分子材料や多孔質無機材料の表面や細孔に複合体１０を吸着あるいは充填等により保持させた形態を採ることができる。こうした複合材料１００は、機能を発現するタンパク質等の機能性分子が分子レベルでしかも制御されて配列されているため、従来にない新たな機能や高効率での機能実現が期待される。したがって、複合材料１００は、分子レベルのリアクターとして、燃料電池等のエネルギー関連デバイス、医療用デバイスなど各種のデバイスに適用することができる。
【００７７】
以下、本発明の実施例について具体的に説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものであって本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７８】
本実施例では、アミロイド形成タンパク質の一つであるヒトｍｅｄｉｎタンパク質のＣ末端領域とＣＦＰとを連結した合成タンパク質と、同じＣ末端領域とＹＦＰとを連結した合成タンパク質とを調製した。
【００７９】
（１）Ｍｅｄｉ１−ＹＦＰ合成タンパク質の調製
Ｍｅｄｉｎの自己会合領域を含み静電的作用部位を含めるように改変したアミノ酸配列（配列番号１８、対応するＤＮＡ配列は配列番号１９である）と、リンカーのアミノ酸配列（配列番号２４、対応するＤＮＡ配列は配列番号２５である）と、ＹＦＰのアミノ酸配列（配列番号２６、対応するＤＮＡ配列は配列番号２７である）とを有する合成タンパク質（配列番号２８）をコードするＤＮＡ（配列番号２９）を合成した（なお、発現産物としての合成タンパク質においては、Ｎ末端のメチオニン残基は外れる。）。この合成ＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２２ｂ（+）ベクターのＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩサイト間に挿入してｐＥＴ−ｍｅｄ１−ＹＦＰとした。ｐＥＴ−ｍｅｄ１−ＹＦＰベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。ＬＢ−アンピシリンプレートから単コロニーを採取し、５ｍｌのＬＢ液体培地にて３７℃で１６時間培養した。前培養の全量を１ＬのＬＢ液体培地に植菌して３７℃で２時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加えて１６℃で１６時間培養した。培養菌体を８０００ｇで１５分間遠心し、得られた沈殿に１００ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて超音波破砕した。破砕液を２００００ｇで３０分間遠心し、上清を分取した。
【００８０】
（２）Ｍｅｄｉ２−ＣＦＰ合成タンパク質の調製
Ｍｅｄｉｎの自己会合領域を含む領域のアミノ酸配列（配列番号２０、対応するＤＮＡ配列は配列番号２１である）と、リンカーのアミノ酸配列（配列番号２４、対応するＤＮＡ配列は配列番号２５である）と、ＣＦＰのアミノ酸配列（配列番号３０、対応するＤＮＡ配列は配列番号３１である）とを有する合成タンパク質（配列番号３２）をコードするＤＮＡ（配列番号３３）を合成した。このＤＮＡ合成断片を、上記（１）と同様に操作して、所定の上清に合成タンパク質を分取した。
【００８１】
（３）合成タンパク質の精製
上記（１）及び（２）で分取した各上清について以下の操作を行い精製した。すなわち、各上清を、それぞれ２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で一晩透析した。その後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ベッドボリューム１５ｍｌ）のオープンカラムに供し、非吸着画分を分取した。溶出画分を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析した。同緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＳＰ（ファルマシア製、べッドボリューム５ｍｌ）に供した。塩緩衝液（Ａ液：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０、Ｂ液：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０に１．５Ｍの塩化ナトリウムを加えたもの）でグラジエント溶出した。Ｂ液０−１００％（０−１．５Ｍ塩化ナトリウム濃度）で溶出された一部の吸着画分（２８０ｎｍ吸収極大部分）を精製Ｍｅｄｉ１−ＹＦＰ及び精製Ｍｅｄｉ２−ＣＦＰとした。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を用いて、両精製蛋白質が９０％以上の純度を持つことを確認した。
【００８２】
（４）合成タンパク質の線維化
上記で精製した合成タンパク質を単独で又は混合して用いて３種類の会合用液（１ｍｇ／ｍｌ 合成タンパク質、５０ｍＭリン酸緩衝液溶液（ｐＨ６．０）、５００ｍＭ塩化ナトリウム）を調製し、このタンパク質溶液１ｍｌを１．５ｍｌのマイクロチューブに入れ、半径２０ｃｍの円盤の外周にほぼ垂直にマイクロチューブを固定し、３７℃、８ｒｐｍで回転させた。回転開始１６時間後にＭｅｄｉ１−ＹＦＰと、Ｍｅｄｉ１−ＹＦＰとＭｅｄｉ２−ＣＦＰとの会合用液中に大量の沈殿が生じた。Ｍｅｄｉ２−ＣＦＰ会合用液中には、そのような沈殿はほとんど観察されなかった。Ｍｅｄｉ１−ＹＦＰとＭｅｄｉ２−ＣＦＰとの会合用液中に生じた沈殿が繊維状の構造を作っていることが、蛍光顕微鏡により確認された。
【００８３】
（５）蛍光スペクトル分析
上記（４）の回転サンプルのうちＭｅｄｉ１−ＹＦＰとＭｅｄｉ２−ＣＦＰとの会合用液を１６０００ｇ、１０分間、遠心分離し、上清を捨てさらに可溶性画分が残留しないように、５０ｍＭリン酸緩衝液溶液（ｐＨ６．０）、５００ｍＭ塩化ナトリウムを用いて、沈殿物を３回洗浄することにより、線維化Ｍｅｄｉ１−ＹＦＰ／Ｍｅｄｉ２−ＣＦＰ複合体を単離した。この線維化Ｍｅｄｉ１−ＹＦＰ／Ｍｅｄｉ２−ＣＦＰ複合体について吸光度を調べた結果、ＣＦＰとＹＦＰに基づく黄緑色と黄色の吸収帯が確認された。また、ＣＦＰからＹＦＰへの蛍光エネルギー移動を観察した。すなわち、ＣＦＰの励起波長である４００ｎｍの光を照射したところ、図７に示すように、ＹＦＰの５３０ｎｍの蛍光が観察された。これにより、この合成タンパク質複合体においては、ＹＦＰとＣＦＰとが数十ｎｍ以内に隣接していることが示された。
【配列表フリーテキスト】
【００８４】
配列番号１：メディン（ｍｅｄｉｎ）（ヒト）
配列番号２：アミロイドＡβ４０（ヒト）
配列番号３：アミロイドＡβ４２（ヒト）
配列番後４〜６：ＣｏｌｄｓｈｏｃｋＢ由来ペプチド（大腸菌）
配列番号７：トランスサイレチン由来タンパク質（ヒト）
配列番号８，９：トランスサイレチン由来ペプチド（ヒト）
配列番号１０、１１：β２ミクログロブリン由来ペプチド（ヒト）
配列番号１２〜１４：プリオン由来のペプチド（ヒト）
配列番号１５：メディン中の会合領域（ヒト）の一部
配列番号１６：メディン中の会合領域（ヒト）の一部
配列番号１７：メディン中の会合領域（ヒト）の一部
配列番号１８：メディン中の会合領域（ヒト）の一部を改変した配列
配列番号１９：メディン中の会合領域（ヒト）の一部を改変した配列
配列番号２０：メディン中の会合領（ヒト）域の一部を改変した配列
配列番号２１：メディン中の会合領域（ヒト）の一部を改変した配列
配列番号２２：リンカーのアミノ酸配列
配列番号２３：リンカーのアミノ酸配列のＤＮＡ配列
配列番号２４：リンカーのアミノ酸配列
配列番号２５：リンカーのアミノ酸配列のＤＮＡ配列
配列番号２６：ＹＦＰのアミノ酸配列
配列番号２７：ＹＦＰのアミノ酸配列のＤＮＡ配列
配列番号２８：合成タンパク質Ｍｅｄｉ１−ＹＦＰの全ＡＡ配列
配列番号２９：合成タンパク質Ｍｅｄｉ１−ＹＦＰの全ＤＮＡ配列
配列番号３０：ＣＦＰのアミノ酸配列
配列番号３１：ＣＦＰのアミノ酸配列のＤＮＡ配列
配列番号３２：合成タンパク質Ｍｅｄｉ２−ＣＦＰの全ＡＡ配列
配列番号３３：合成タンパク質Ｍｅｄｉ２−ＣＦＰの全ＤＮＡ配列
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明の合成タンパク質の概念図である。
【図２】本発明の合成タンパク質の静電的作用部位の作用の一例を示す図である。
【図３】交互に会合する合成タンパク質の構成の一例を示す図である。
【図４】合成タンパク質間における選択的会合及び会合順序の制御の一例を示す図である。
【図５】逐次的な酵素反応ａ、ｂ、ｃを遂行可能な異なる酵素活性を発現可能なタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃをそれぞれ備える合成タンパク質の複合体を示す図である。
【図６】担体上に固定された複合体を備える複合材料の一例を示す図である。
【図７】合成タンパク質の蛍光スペクトルを示す図である。
【符号の説明】
【００８６】
２，２ａ，２ｂ，２ｃ  合成タンパク質、４，４ａ，４ｂ，４ｃ  会合領域、６，６ａ，６ｂ  静電的作用部位、７  リンカー、８，８ａ，８ｂ，８ｃ  他の領域、１０  複合体、  ２０  担体、１００  複合材料。
【図１】
2008081467.tif 000003
【図２】
2008081467.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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