(57)【要約】【課題】  糖鎖を固相担体に固定化した固定化糖鎖体、その作成方法、およびその応用を提供する。【解決手段】  所望の糖鎖を、アジド基とアルキン基との反応により得られる基を有するスペーサーにより固相担体に結合して、固定化糖鎖体を得る。またこのような固定化糖鎖体を含む吸着材を、糖鎖の分析あるいはウィルス、毒素、微生物を除去する手段として用いる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2つ以上の単糖残基またはその誘導体を含む糖鎖が固相担体または高分子に結合した固定化糖鎖体であって、
該糖鎖が、トリアゾール環を含むスペーサーにより固相担体に結合している、固定化糖鎖体。
【請求項２】
式（Ｉ）：（G1・・・Gn）−Ｌ−Ｘ−［式中、G1、・・Gnは、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Lは、−O−（CH2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−からなる群より選択される１つ以上の連結基であり；nは２〜１００の整数であり；mは８〜２０の整数であり、；Ｘは、トリアゾール環を含む任意のスペーサーを意味する］で示される糖鎖化合物を１つ以上含む、請求項１記載の固定化糖鎖体。
【請求項３】
前記糖鎖が、動物細胞に糖鎖プライマーを加えて培養することで得られ、該糖鎖プライマーが、アジド基を有したアルキル鎖をオリゴ糖鎖に結合させた化合物である、請求項１または2記載の固定化糖鎖体。
【請求項４】
前記糖鎖が、複数の同一または異なる種類の糖鎖を含む、請求項１から３までのいずれかに記載の固定化糖鎖体。
【請求項５】
前記固相担体が、高分子化合物を含む担体、金属を含む担体、および紙からなる担体からなる群より選択される1種である、請求項１から４までのいずれかに記載の固定化糖鎖体。
【請求項６】
前記固相担体が、プレート状形態またはビーズ状形態を有する、請求項１から請求項５までのいずれかに記載の固定化糖鎖体。
【請求項７】
固相担体に糖鎖が結合した固定化糖鎖体を作成する方法であって、
少なくとも2つ以上の単糖残基またはその誘導体を含む糖鎖、アルキル基、およびアジド基とを含む化合物と、アルキン基とを反応させて結合させる工程を含む、方法。
【請求項８】
前記アルキン基が、固相担体に結合されている、請求項7記載の固定化糖鎖体を作成する方法。
【請求項９】
前記化合物が、式（Ｉ）：（G1・・・Gn）−Ｌ−Ｎ３［式中、G1、・・Gnは、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Lは、−O−（CH2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−からなる群より選択される１つ以上の連結基であり；nは２〜１００の整数であり、mは８〜２０の整数である］で表される化合物である、請求項７または８記載の固定化糖鎖体を作成する方法。
【請求項１０】
動物細胞にアジド基を有したアルキル鎖をオリゴ糖鎖に結合させた化合物を加えて培養し、糖鎖を得る工程をさらに含む、請求項７から９までのいずれかに記載の固定化糖鎖体を作成する方法。
【請求項１１】
前記固相担体が、高分子化合物を含む担体、金属を含む担体、および紙からなる担体からなる群より選択される1種である、請求項７から１０までのいずれかに記載の固定化糖鎖体を作成する方法。
【請求項１２】
請求項１から６までのいずれかに記載の固定化糖鎖体を、該固定化糖鎖体中の糖鎖部分と結合あるいは相互作用する物質と接触させる方法。
【請求項１３】
前記物質が、ウィルス、微生物、原虫、植物細胞、および動物細胞からなる群より選択される1種である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から６までのいずれかに記載の固定化糖鎖体を含むウィルス、バクテリア、および／または毒素の吸着材。
【請求項１５】
請求項１から６までのいずれかに記載の固定化糖鎖体を含む、ウィルス、バクテリア、および／または毒素の中和剤。
【請求項１６】
請求項１から６までのいずれかに記載の固定化糖鎖体を含む薬剤であって、生体防御系刺激、抗炎症、抗菌、および／または抗腫瘍転移に有用な薬剤。
【請求項１７】
請求項１から６までのいずれかに記載の固定化糖鎖体を含む診断薬。
【請求項１８】
請求項１から６までのいずれかに記載の固定化糖鎖体を含む細胞培養基材または特異的細胞分離基材。
【請求項１９】
請求項１から６までのいずれかに記載の固定化糖鎖体を含むウィルス又は細菌毒素の検出基盤。
【請求項２０】
請求項１から６までのいずれかに記載の固定化糖鎖体を含む、生体内薬物運搬体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定化糖鎖体およびその作成方法、ならびにそれを用いた毒素等吸着材に関する。より詳しくは、アジド基とアルキン基との反応により得られる基を有するスペーサーにより固相担体に結合してなる固定化糖鎖体、その作成方法、ならびにそれを用いた毒素等吸着材に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は構造が複雑であり、同じ生体分子であるDNAやタンパク質よりも産業上の利用の為の開発が遅れている。しかし、近年、糖鎖の研究が急速に進展し、産業上の利用への模索も進められてきている。特に、細胞分化、ガン化、免疫反応等への糖鎖の関わりについて新しい事実が明らかにされつつある。例えば、細胞表層における糖鎖は、タンパク質や脂質と相互作用することによって、生体内における細胞分化、ガン化、免疫反応等の重要なプロセスに関与している。また、糖鎖は、細胞表層における細胞認識、接着、細胞間のシグナル伝達において重要な役割を担っていることも明らかになってきている。
【０００３】
一方、血液浄化方法として、従来、吸着剤に患者の血液や血漿を接触させることにより、物理化学的現象や免疫反応を利用して、有害な物質を除去することが行われている。この方法においては、ヤシ殻系吸着剤や、石油ピッチ系、ピート系、木炭系等を原材料とした活性炭、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体に活性点としてアミノ基、第４級アンモニウム基等を持つアニオン性イオン交換樹脂や、ポリスチレン誘導体繊維に抗生物質を固定化させた繊維等の吸着剤が利用されている。例えば、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体に活性点としてアミノ基、第４級アンモニウム基等を持つアニオン性イオン交換樹脂は、老化した赤血球が崩壊する時にヘモグロビンが分解して生じるビリルビンの吸着剤として臨床使用されている。
【０００４】
この技術を、今後、糖鎖ポリマーを活性点とした吸着剤へと応用することができれば、病原体や毒素に特異的に結合する機能性糖鎖を固相担体に固定化することにより、医療材料に応用することが可能である。例えば、グロボ三糖を有する糖鎖ポリマーはベロ毒素を特異的に吸着することが分かっており、このような機能性糖鎖高分子を固定化した有害物質に対する吸着剤は医療に活用することができると考えられる。
【０００５】
また、糖鎖はタンパク質や脂質と相互作用することにより、生体内における様々な重要なプロセスに関与しているため、そのメカニズムを分子レベルで解析しようと、糖鎖アレイが利用されている。例えば、24種類の糖脂質をブチルシランでコーティングしたスライドガラス上にスポットし、糖脂質の脂質部分とガラス表面の疎水的相互作用を利用して固定化した糖脂質アレイがタカラバイオ株式会社より販売されている。
【０００６】
このような技術において、糖鎖を固定化する方法としては、糖鎖を非共有結合によって固相担体に固定化する方法が知られているが、安定して固定することができず、洗浄工程により糖鎖が洗い流されてしまう可能性がある。また、共有結合によって糖鎖を固相担体に固定化する手法として、ディールス・アルダー反応によって固定化する手法やマイケル付加反応によって固定化する方法も知られている。しかしながら、タンパク質との非特異的吸着が大きいことや、基板上のチオールの酸化による反応点が減少するといった問題点を有している。
【０００７】
また、特許文献１には、糖鎖がスペーサー基を介してチオアルキル化によって固相担体に結合している糖鎖アレイを作製する方法が開示されている。しかし、糖鎖を、スペーサー基を介してチオアルキル化する必要があることや、多種の糖鎖を固定化するためには原材料となる多種の糖鎖を入手し、更にチオアルキル化する必要がある。
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−７８４１８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在用いられている固定化糖鎖体では、上記のように、非特異的吸着が起こる可能性や、糖鎖を固定化する段階で糖鎖自体を修飾する工程が煩雑という問題がある。従って特異的でかつ作成が容易な固定化糖鎖体の開発が強く望まれている。
【００１０】
そこで、本発明の目的は、検出対象と特異的に相互作用することができ、かつ作成が容易な固定化糖鎖体、その作成方法、およびその応用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、以下に示す、固定化糖鎖体、その作成方法、およびその応用により上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１２】
すなわち、本発明は、少なくとも2つ以上の単糖残基またはその誘導体を含む糖鎖が固相担体または高分子に結合した固定化糖鎖体であって、糖鎖が、トリアゾール環を含むスペーサーにより固相担体に結合している、固定化糖鎖体を提供する。
【００１３】
上記固定化糖鎖体は、式（Ｉ）：（G1・・・Gn）−Ｌ−Ｘ−［式中、G1、・・Gnは、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Lは、−O−（CH2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−からなる群より選択される１つ以上の連結基であり；nは２〜１００の整数であり；mは８〜２０の整数であり、；Ｘは、トリアゾール環を含む任意のスペーサーを意味する］で示される糖鎖化合物を１つ以上含み得る。
【００１４】
上記糖鎖は、動物細胞に糖鎖プライマーを加えて培養することで得られ、糖鎖プライマー、アジド基を有したアルキル鎖をオリゴ糖鎖に結合させた化合物であり得る。
【００１５】
上記糖鎖は、複数の同一または異なる種類の糖鎖を含み得る。
【００１６】
上記固相担体は、高分子化合物を含む担体、金属を含む担体、および紙からなる担体からなる群より選択される1種であり得る。
【００１７】
上記固相担体は、プレート状形態またはビーズ状形態であり得る。
【００１８】
本発明はまた、固相担体に糖鎖が結合した固定化糖鎖体を作成する方法であって、
少なくとも2つ以上の単糖残基またはその誘導体を含む糖鎖、アルキル基、およびアジド基とを含む化合物と、アルキン基とを反応させて結合させる工程を含む、方法を提供する。
【００１９】
上記アルキン基は、固相担体に結合されていてもよい。
【００２０】
上記化合物は、式（Ｉ）：（G1・・・Gn）−Ｌ−Ｎ３［式中、G1、・・Gnは、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Lは、−O−（CH2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−からなる群より選択される１つ以上の連結基であり；nは２〜１００の整数であり、mは８〜２０の整数である］で表される化合物であり得る。
【００２１】
上記糖鎖は、動物細胞に糖鎖プライマーを加えて培養することで得られ、糖鎖プライマーは、アジド基を有したアルキル鎖をオリゴ糖鎖に結合させた化合物であり得る。
【００２２】
上記担体は、高分子化合物を含む担体、金属を含む担体、および紙からなる担体からなる群より選択される1種であり得る。
【００２３】
本発明はまた、上記の固定化糖鎖体を、固定化糖鎖体中の糖鎖部分と結合あるいは相互作用する物質と接触させる方法を提供する。
【００２４】
上記物質は、ウィルス、微生物、原虫、植物細胞、および動物細胞からなる群より選択される1種であり得る。
【００２５】
本発明はまた、上記の固定化糖鎖体を含むウィルス、バクテリア、および／または毒素の吸着材；ウィルス、バクテリア、および／または毒素の中和剤；生体防御系刺激、抗炎症、抗菌、および／または抗腫瘍転移に有用な薬剤；診断薬；細胞培養基材または特異的細胞分離基材；ウィルス又は細菌毒素の検出基盤；または生体内薬物運搬体を提供する。
【発明の効果】
【００２６】
以上のように、本発明を適用することによって、迅速で簡便でかつ特異的な固定化糖鎖体およびその作成方法が得られる。本発明に係る新規な固定化糖鎖体は、好ましくは、動物細胞により生産される糖鎖化合物をクリックケミストリーライゲーション反応を使って容易に固相担体へ固定化することによって得られる。従って、容易で強固な糖鎖の固定化ができ、様々な固定化糖鎖体を提供できる。本発明の固定化糖鎖体において、糖鎖と固相担体は、共有結合により堅固に固定化され、水中や緩衝液中でも、安定に存在し、長時間、固定化糖鎖体の機能が低下しない。この為、本発明の固定化糖鎖体は、様々な用途に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２８】
本発明の固定化糖鎖体は、少なくとも2つ以上の単糖残基またはその誘導体を含む糖鎖が固相担体または高分子に結合しており、トリアゾール環を含むスペーサーにより固相担体に結合している。ここで、限定はされないが、本発明の固定化糖鎖体は、式（Ｉ）：（G1・・・Gn）−Ｌ−Ｘ−［式中、G1、・・Gnは、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Lは、−O−（CH2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−からなる群より選択される１つ以上の連結基であり；nは２〜１００の整数であり；mは８〜２０の整数であり、；Ｘは、トリアゾール環を含む任意のスペーサーを意味する］で示される糖鎖化合物を１つ以上含むこともできる。
【００２９】
本発明の固定化糖鎖体に用いられる固相担体としては、トリアゾール環を形成するためのアジド基とアルキン基との反応を介した糖鎖の結合を可能とするものであれば、特に制限なく用いることができる。このような固相担体としては、例えば、フィルターペーパーなどの紙からなる固相担体、市販のメンブレンフィルター、ガラス固相担体、シリコン固相担体、その他の高分子化合物を含む固相担体、金、銀、プラチナ、鉄などの金属を含む固相担体等が挙げられる。固相担体としては、本発明の固定化糖鎖体の作成を容易にするために、水酸基、カルボキシル基、アミノ基等の官能基を導入するための官能基を有していること、あるいは、アミノ基などの官能基が導入されたガラス固相担体、Au-S結合により官能基の導入が可能である金固相担体等を用いることが好ましい。例えば、フィルターペーパーは水酸基を有しており、その水酸基を用いてアルキン部分を有するように固相担体を改変することができる。また、本発明で固定化糖鎖体という時は、糖鎖と高分子化合物とが結合した高分子化した糖鎖体を指すこともある。
【００３０】
本発明に用いられる糖鎖は特に限定はされない。本明細書において、糖鎖という時は、環状構造の単糖残基又はその誘導体が互いにグリコシド結合することにより形成される鎖を表わし、その種類は特に限定されない。好ましくは動物細胞を糖鎖が得られるような条件下にて培養することで得られる。動物細胞は特に限定されず、所望の糖鎖化合物の種類に応じて様々な動物細胞が用いられ得る。動物細胞の例としては、ヒト由来、マウス由来、サル由来、ラット由来などの哺乳動物細胞が挙げられ、特にＢ１６マウスメラノーマ細胞、ラットＰＣ１２細胞、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞、ラットＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ヒトＭＯＬＴ−４細胞、ヒトＨＬ−６０細胞、サル腎臓由来ベロ細胞などが好適に用いられ得る。培養は、通常の動物細胞の培養条件に従って行う。
【００３１】
糖鎖化合物が得られるような条件とは、例えば、上記の動物細胞を、室温から４５℃までの温度の間で１時間から７０時間までの間の時間でＤＭＥＭ／Ｆ１２などの培養培地で前培養した後、糖鎖プライマーを添加した培地に置換してさらに培養を行い、糖鎖伸長反応を行うことなどである。
【００３２】
ここで、糖鎖プライマーは、用いられる細胞種、所望の糖鎖構造により任意に選択することができる。好ましい糖鎖プライマーの例としては、限定されないが、式（Ｉ）：（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)z−Ｌ−Ｎ3で表される化合物が挙げられる。ここで、式中、Ｇ1、Ｇ2及びＧ3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2)m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−から選択される連結基であり；ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり、好ましくは０〜５、さらに好ましくは０から３であり、ｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない。また、mは、８〜２０の整数であり、好ましくは８〜１６、特に好ましくは１２である。単糖としては、限定はされないが、ペントース及びヘキソースを使用するのが好ましい。またアルドース、ケトースのいずれも使用することができる。
【００３３】
このような糖鎖プライマーを各種細胞の培地に添加して細胞を培養すると、細胞は、プライマーを取り込み、その糖鎖部分に更に糖を付加してグリコシル化し、その糖付加生成物を細胞内には蓄積せずに細胞外に分泌する。付加される糖は、細胞により異なる。
【００３４】
得られる細胞培養物または細胞培養物から細胞を除いた上清は、糖鎖プライマーから伸長して得られた生成物である糖鎖化合物を含有する。この細胞培養物または細胞培養物の上清をそのまま、あるいは上清を固体吸着剤等と接触させるなどして濃縮および／または精製工程に供した後に、本発明の固定化糖鎖体の作成に使用することができる。
【００３５】
本発明の固定化糖鎖体の製造方法は、限定はされないが、糖鎖のアルキル鎖に付加したアジド基と固相担体のアルキン部分とを、クリックケミストリーライゲーション反応により固相担体に結合させることによりなされ得る。クリックケミストリーライゲーション反応においては、Ｃｕ（ＰＰｈ３）３Ｂｒを触媒として用いる方法や、電子線照射による方法等が知られている。
【００３６】
あるいは、クリックケミストリーライゲーション反応により、例えば動物細胞の培養で得られた糖鎖を、予めアジド基とアルキン基とを結合させて得られるトリアゾール環と末端に別の反応性の基を有するように改変しておくこともできる。例えば、アジド基末端を有する糖鎖と市販の２−プロピニルアミンを反応させればアミノ基を末端に有する糖鎖が生成され、プロパルギルアルコールを用いれば水酸基、ベンゼンスルホン酸プロパルギルを用いればスルホン酸基、臭化プロパルギルや塩化プロパルギルを用いればハロゲン基を末端に有する糖鎖が生成される。また、市販されていない場合でも、プロパルギル基を有する化合物と、導入したい目的の官能基を有する化合物を縮合反応等で、目的の官能基を導入することもできる。
【００３７】
クリックケミストリーライゲーション反応では、トリアゾール環が形成されるように、還流溶媒（トルエン等）中において生成物がもたらされるのに充分な時間（例えば、３０〜４０時間）にてアジド基とアルキン基とを反応させる。反応混合物に触媒（銅等）を添加することによって、反応を室温にて水性溶媒中で進行させ、トリアゾール環成分を得ることができる。Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元するための還元剤の存在下で触媒量のＣｕ（ＩＩ）を添加することによって触媒される。好ましい還元剤には、アスコルビン酸塩、金属銅、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ1、グルタチオン、システイン、Ｆｅ2+、Ｃｏ2+、および印加電位が含まれる。さらに好ましい還元剤には、Ａｌ、Ｂｅ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、ＮｉおよびＺｎから成る群より選択される金属が含まれる。
【００３８】
アジド基とアルキン基とのクリックケミストリーライゲーション反応は、金属銅と接触している溶液中で反応を行うことによっても触媒され得る。金属銅は、そのクリックケミストリーライゲーション反応に対する触媒作用に直接的または間接的に寄与する。好ましい方式では、前記溶液は、水溶液である。この場合アジド基を有する糖鎖とアルキン基を有する反応化合物とは、等モル量で存在しうる。
【００３９】
あるいは、アジド基とアルキン基とのクリックケミストリーライゲーション反応は、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｄ、Ｚｒ、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｉ、ＲｈおよびＷから成る群より選択される金属イオンを有する触媒量の金属塩を添加することにより触媒される。このようなクリックケミストリーライゲーション反応は、前記金属イオンを触媒活性形に還元するための還元剤の存在下で行われる。好ましい還元剤には、アスコルビン酸塩、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ1、グルタチオン、システイン、Ｆｅ2+、Ｃｏ2+、印加電位、ならびにＡｌ、Ｂｅ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、ＮｉおよびＺｎから成る群より選択される金属が含まれる。
【００４０】
本発明の固定化糖鎖体が、式（Ｉ）：（G1・・・Gn）−Ｌ−Ｘ−で示される糖鎖化合物を含む場合において、式中、G1、・・Gnは、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合している。単糖としては、限定はされないが、ペントース及びヘキソースを使用するのが好ましい。またアルドース、ケトースのいずれも使用することができる。単糖の数を表すnは、２〜１００の整数である。Lは、−O−（CH2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−からなる群より選択される１つ以上の連結基であり、mは８〜２０の整数である。Ｘは、トリアゾール環を含む任意のスペーサーを意味するが、任意のスペーサーは、直鎖状で、側鎖がないかあるいは少ないシンプルな構造であることが望ましい。
【００４１】
より具体的に、本発明の固定化糖鎖体の製造方法を例示しながら説明する。
【００４２】
（１）糖鎖のアルキル鎖に付加したアジド基と固相担体のアルキン部分とを、クリックケミストリーライゲーション反応により固相担体に結合させる方法
【００４３】
糖鎖は、動物細胞と糖鎖プライマーとを一緒に培養することで得ることができる。この糖鎖をそのまま、あるいは固体吸着剤等と接触させるなどして濃縮および／または精製工程に供した後に、固相担体への結合に用いる。
【００４４】
一方、固相担体は、例えば水酸基を有するフィルターペーパーを用い得る。このフィルターペーパーの水酸基部分を反応させて、例えばカルボキシル基末端を有する固相担体とし得る。カルボキシル基末端の導入方法は特に限定はされないが、フィルターペーパーの水酸基とハロゲン化酢酸とを反応させることによってなされ得る。
【００４５】
次に、得られたカルボキシメチル化したフィルターに、プロパニルアミンを反応させることにより、アミド結合したプロパルギル基を有する固相担体が得られる。
【００４６】
このようにして得られた固相担体のアルキン部分と糖鎖のアジド基とを反応させて、クリックケミストリーライゲーション反応により糖鎖を固相担体に結合させる。
【００４７】
あるいは、カルボキシル基を有するレーヨン（商品名：パラモス、ダイワボウレーヨン製造）を固相担体として用いることにより、カルボキシル基に直接プロピニルアミンを反応させることができ、アミド結合したプロパルギル基を有する固相担体が得られる。さらに、２−メルカプトプロピオン酸と２−プロピニルアミンとを縮合反応により結合させて得られる化合物を用いれば、Au-S結合により金表面にプロパルギル基を導入することができる。
【００４８】
このようにして得られた固相担体のアルキン部分と糖鎖のアジド基とを反応させて、クリックケミストリーライゲーション反応により糖鎖を固相担体に結合させる。
【００４９】
（２）クリックケミストリーライゲーション反応により、糖鎖を、トリアゾール環および別の反応性の基を末端に有するように改変した後、固相担体と結合させる方法
【００５０】
糖鎖は、動物細胞と糖鎖プライマーとを一緒に培養することで得ることができる。この糖鎖をそのまま、あるいは固体吸着剤等と接触させるなどして濃縮および／または精製工程に供した後に、糖鎖を修飾する。例えば、アジド基末端を有する糖鎖と市販の２−プロピニルアミンをクリックケミストリーライゲーション反応にて反応させれば、アミノ基を末端に有する糖鎖が生成される。
【００５１】
一方、固相担体は、例えば水酸基を有するフィルターペーパーを用い得る。このフィルターペーパーの水酸基部分を反応させて、例えばカルボキシル基末端を有する固相担体とし得る。カルボキシル基末端の導入方法は特に限定はされないが、フィルターペーパーの水酸基とハロゲン化酢酸とを反応させることによってなされ得る。
【００５２】
このようにして得られた固相担体のカルボキシル基と糖鎖のアミノ基とを反応させて、アミド結合により糖鎖を固相担体に結合させる。
【００５３】
本発明の固定化糖鎖体は、単一の種類又は複数の種類の糖鎖を精製して、固定化する方法で得てもよいが、複数の種類の糖鎖が含まれる状態で、未精製のまま固定化させることも可能である。単一種類の糖鎖を精製する場合、固定化糖鎖体を毒素、ウィルス、あるいはバクテリア等の吸着材または中和剤として用いることができる。複数の種類の糖鎖を固定化することにより糖鎖アレイ等を作製することも可能である。また、未精製での糖鎖を使用することで、例えば細胞由来の糖鎖化合物から機能性糖鎖をスクリーニングすることも可能である。本発明の固定化糖鎖体と様々な物質を接触させて、糖鎖や糖鎖と相互作用する物質の分析および／または吸着などを行うことが可能である。糖鎖と相互作用する物質には、限定はされないが、ウィルス、微生物、原虫、植物細胞、動物細胞などがある。ここでいうウィルスには、病原性を有するインフルエンザウィルス、ＨＩＶウィルス、肝炎ウィルス、ＳＡＲＳウィルスなどの他、様々なＤＮＡウィルス、ＲＮＡウィルス、レトロウィルスが含まれる。また、微生物には、細菌、真菌、放線菌などが含まれる。また、毒素には、限定はされないが、生物由来の有機化合物である、アコニチン、イボテン酸、ムッシモール、エキサイトトキシン、エラブトキシン、クラ−レ、コルヒチン、サキシトキシン、シガトキシン、テタヌストキシン、テトロドトキシン、ドウモイ酸、パリトキシン、ボツリヌストキシン、リシン、シクトキシン、トリゴネリン、グラミシジン、ニコチンなど、合成物の有機化合物である、ホスゲン、サリン、ソマン、タブン、VX、ダイオキシン、トルエン、ビフェニル、モノフルオロ酢酸、塩化メチル水銀、四エチル鉛など、および有毒生物の棘や牙による毒液由来のものがある。その他単体（フッ素 (F2)、オゾン（酸素の同素体、O3）、リン（白リン・黄リン、P4）セレン (Se)、ヒ素 (As)カドミウム (Cd)、水銀 (Hg)、鉛 (Pb)、タリウム (Tl) など プルトニウム (Pu)、ポロニウム (Po) など）、無機化合物（フッ化水素 (HF)、シアン化水素 (HCN)、硫化水素 (H2S)、一酸化炭素 (CO)など、シアン化カリウム（青酸カリ、KCN）、シアン化ナトリウム (NaCN)、水酸化ナトリウム（苛性ソーダ、NaOH）、アジ化ナトリウム (NaN3)など 塩化水銀(II)（昇汞、HgCl2）、二クロム酸カリウム (K2Cr2O7)、塩化金酸 (HAuCl4)、硝酸銀 (AgNO3) などがある。
【００５４】
このように、本発明の固定化糖鎖体は、ウィルス、バクテリア、および／または毒素の吸着材；ウィルス、バクテリア、および／または毒素の中和剤；生体防御系刺激、抗炎症、抗菌、および／または抗腫瘍転移に有用な薬剤；診断薬；細胞培養基材または特異的細胞分離基材；ウィルス又は細菌毒素の検出基盤；または生体内薬物運搬体にも利用することができる。
【００５５】
以下に、本発明の糖鎖化合物の精製方法および濃縮方法の具体例を実施例の態様で示すが、本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００５６】
１２−ａｚｉｄｏｄｏｄｅｃｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅを用い、本発明におけるフィルターペーパーへの固定化を、スキーム1（図１）に従って実施した。この際、固定化する１２−ａｚｉｄｏｄｏｄｅｃｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅをＤＢＤ−ＣＯＣｌ（東京化成工業株式会社製）による蛍光標識し、最終物質が固定化されたことを確認した。
【００５７】
具体的には、以下のようにして、１２−ａｚｉｄｏｄｏｄｅｃｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅのフィルターペーパーへの固定化を行った。
（１）フィルターペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ社製、Ｎｏ．４１、φ＝５５ｍｍ）（図１の１）を１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液と飽和食塩水の混合溶液中（混合比率１：１）に浸し、一時間撹拌した後、フィルターペーパー１枚当たり１００ｍｇのブロモ酢酸を加え、一晩撹拌した。反応終了後、水で中性になるまで十分に洗い、自然乾燥させ、末端にカルボキシル基を有するペーパーフィルター（図１の２）を得た。導入されたカルボキシル基の定量を、市販の酢酸標準液を用いた検量線を基に中和滴定法により行った結果、フィルターペーパー１枚あたりのカルボキシル基の導入量は１６．０μｍｏｌであった。
【００５８】
（２）次に（１）で得られたフィルターペーパー２０枚を１５ｍｌの水に浸し、８０ｍｇの２−プロピニルアミンと、２００ｍｇのＤＭＴ−ＭＭを加え、室温にて一晩、撹拌した。反応終了後、水で十分洗い、自然乾燥させ、末端にプロパルギル基を有するペーパーフィルター（図１の３）を得た。中和滴定法によりカルボキシル基を定量した結果、反応前からのカルボキシル基の減少量から、フィルターペーパー１枚当たり１２．３μｍｏｌのプロパルギル基が導入されたことが確認できた。
【００５９】
（３）触媒としてルイス酸である三フッ化ホウ素エテラート（boron trifluorideetherate (BF3・OEt2)）と、アルコールあるいはアジド基を導入したアルコールを用いてグリコシル化を行った後、脱アセチル化反応を行うことにより、３種類の糖鎖プライマー（１２−ａｚｉｄｏｄｏｄｅｃｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ、２−ａｚｉｄｏｄｏｄｅｃｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ、及びｄｏｄｅｃｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を得た（Murozuka, Y., Kasuya, M. C., Kobayashi, M., Watanabe, Y., Sato, T. and Hatanaka, K. 2005, Chemistry and Biodiversity, 2, 1063,  Kasuya, M. C., Wang, L., Lee, Y. C., Mitsuki, M., Nakajima, N., Sato, T., Hatanaka, K., Yamagata, S. and Yamagata, T. 2000, Carbohydr. Res., 329, 755.）
【００６０】
別に、８．３ｍｇのＤＢＤ−ＣＯＣｌを１ｍｌのN,N-ジメチルホルムアミドに溶解し、ＤＢＤ−ＣＯＣｌ溶液を調製した。５００ｎｍｏｌの三種類の糖鎖プライマー（１２−ａｚｉｄｏｄｏｄｅｃｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ、２−ａｚｉｄｏｄｏｄｅｃｙｌβ−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ、及びｄｏｄｅｃｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を、１ｍｌの０．５ｍＭのキヌクリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミドに溶解し、糖鎖溶液を調製した。これらのＤＢＤ−ＣＯＣｌ溶液と糖鎖溶液を混合し、６０℃にて３時間反応させた後、Ｓｅｐ−Ｐａｃ（Ｗａｔｅｒｓ社製）で精製し、得られたメタノール抽出液を蒸発乾固させた。この乾固物を０．５ｍｌのメタノールに溶解し、５倍量の水を加え、透析により未反応のＤＢＤ−ＣＯＣｌを除去した。透析後、凍結乾燥により蛍光標識された糖鎖を得た。
【００６１】
（４）（２）で得られたプロパルギル基が導入されたフィルターペーパーを１ｃｍ２の大きさに切断し、その１ｃｍ２のフィルターペーパー切片、（３）で得られた蛍光標識された糖鎖、０．０５ｍｇのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、５ｍｇのＣｕ（ＰＰｈ３）３Ｂｒを、１ｍｌのテトラヒドロフランの入ったガラス容器に加え、室温にて４８時間撹拌し（クリックケミストリーライゲーション反応による固定化工程）、固定化糖鎖体（図１の４）を得た。
【００６２】
反応終了後、テトラヒドロフランにより十分に洗浄し、自然乾燥させた後、３６５ｎｍ及び、４５０ｎｍの紫外線を照射し、蛍光発色により糖鎖が固定化されているかどうか確認した。その結果を図２に示す。末端にアジド基を有する１２−ａｚｉｄｏｄｏｄｅｃｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅについては、比較的強い蛍光発色が認められたが、アジド基を持たないｄｏｄｅｃｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅについては、殆ど蛍光発色は認められなかった。なお、アルキル鎖の根元にアジド基を有する２−ａｚｉｄｏｄｏｄｅｃｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅについては、非常に微弱ながら蛍光発色が認められた。
【実施例２】
【００６３】
１５０枚の１００ｍｍのディッシュに各々、細胞数２×１０６ｃｅｌｌｓのマウスメラノーマB１６細胞を７ｍｌの１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン）に懸濁して播き、ＣＯ２インキュベターの中で３７℃にて４８時間、前培養を行った。
前培養後、終濃度５０μＭになるように１２‐アジドドデシル‐βラクトシド及び１％のＩＴＳＸ（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、更に、ＣＯ２インキュベターの中で３７℃にて４８時間培養し、糖鎖伸長反応を行った。糖鎖伸長反応後、培地を回収し、更にディッシュ表面をＰＢＳで洗浄することにより、培地上清全量を回収した。
【００６４】
得られた培地上清に、５０ｇのスチレン系合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ２０を加え、１６時間振盪し、糖鎖化合物を吸着剤に吸着させた。次に、１００ｍｌの水で５回洗浄した後、５０％濃度のメタノール、７０％濃度のメタノール、１００％濃度のメタノールを順に１００ｍｌで４回ずつ通液した。
【００６５】
５０％濃度のメタノール、７０％濃度のメタノールによる溶出液については、ロータリーエバポレーターにより濃縮した後、容量５０ｍｌのスチレン系合成吸着剤（ダイヤイオンＨＰ２０）を充填したカラムで、吸着剤へ再吸着を行い、適量の４０〜５０％メタノールを通液した後、２００ｍｌの７０％濃度のメタノールで目的糖鎖化合物であるＧＭ３型糖鎖化合物を溶出した。
【００６６】
一方、１００％濃度のメタノールによる溶出液については、ロータリーエバポレーターで濃縮後、乾燥した。この乾燥物に対し、３ｍｌのＤＭＳＯを加えて溶解した後、１００ｍｌの水を加えた後、容量５０ｍｌのスチレン系合成吸着剤（セパビーズＳＰ２０７）を充填したカラムで、吸着剤へ再吸着を行い、２００ｍｌの水で洗浄した後、２００ｍｌの７０％濃度のメタノールで目的糖鎖化合物であるＧＭ３型糖鎖化合物を溶出した。全溶出液を減圧濃縮及び、乾燥させた後、１８．５ｍｇの白色粉末としてＧＭ３型糖鎖化合物が得られた。
【００６７】
次に、実施例１で得られたプロパルギル基を導入したフィルターペーパー２枚、上記のようにして得られた１８．５ｍｇのＧＭ３型糖鎖化合物、２．１ｍｇのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、０．５ｍｇのＣｕ（ＰＰｈ３）３Ｂｒを、３０ｍｌのテトラヒドロフランの入ったガラス容器に加え、室温にて４８時間撹拌した（クリックケミストリーライゲーション反応による固定化工程）。反応終了後、テトラヒドロフラン、及び水により十分に洗浄し、自然乾燥させた。
【実施例３】
【００６８】
実施例１と同様にシアル酸が付加されていない１２‐アジドドデシル‐βラクトシドをクリックケミストリーライゲーション反応によりフィルターペーパーへ固定化した。
【００６９】
次に、以上の工程で得られた、１２‐アジドドデシル‐βラクトシドが固定化されたフィルターペーパー及び、ＧＭ３型糖鎖を固定化したフィルターペーパーへのインフルエンザウィルス（Ａ／ＰＲ／８／３４株）の吸着能を比較した。
【００７０】
各フィルターペーパーを入れておいた容器に、２００ｕｌの１０ｍｇ／ｍｌ  のサケ精子ＤＮＡを含む５×デンハルト液を加え、室温に３０分間インキュベートすることによりブロッキングした。ブロッキング後、ブロッキング液を除いた。
【００７１】
約１０９ｐｆｕ／ｍｌの濃度のインフルエンザウィルス溶液３、９、３０ｕｌをそれぞれ１ｍｌのＰＢＳ（−）（リン酸緩衝液）と混合した（それぞれ、×３、×９、×３０）。ブロッキングしたフィルターペーパーに、調製したインフルエンザウィルス溶液をそれぞれ１００ｕｌずつ加え、室温で１０分間インキュベートした。セルロースフィルターに未吸着のインフルエンザウィルスを除去し、２００ｕｌのＰＢＳ（−）で３回洗浄した。
その後、１５ｕｌのＳＤＳサンプルバッファーを加え、５分間、１００℃にて熱処理し、遠心分離により、吸着したウィルスを溶出した。
【００７２】
得られたウィルスタンパク質溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、電気泳動後のゲルからタンパク質をＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）メンブレン上にブロッティングした。ブロッティングしたフィルターを、５％のミルクを含むＰＢＳ（−）に３０分間浸した後、抗ＰＲ／８／３４抗体溶液に１時間浸した。その後、ＴＢＳ−Ｔ（トリス緩衝液−Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間、３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ化二次抗体溶液に３０分浸した。反応後、ＴＢＳ−Ｔで５分間、３回洗浄し、ECL ウェスタンブロッティングディテクションシステム（Western Blotting Detection System：ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）により発色を行った。
【００７３】
その結果を図３に示すが、Ｇｂ３型糖鎖を固定化したフィルターペーパーでは、インフルエンザウィルス吸着能が確認できたが、ラクトースを固定化したフィルターペーパーでは、殆どインフルエンザウィルス吸着能は確認できなかった。
【実施例４】
【００７４】
１２−アジドドデシル  β−ラクトシドを、官能基を導入するターゲットとなる糖鎖化合物として用い、クリックケミストリーライゲーション反応によりチオール基の導入を行った。図４に示すスキームに従った。
【００７５】
１０６．１４ｍｇ（１ｍｍｏｌ）の３−メルカプトプロピオン酸（図４の化合物１）、５５．０８ｍｇ（１ｍｍｏｌ）の２−プロピニルアミン（図４の化合物２）、及び３００ｍｇ（１．０８ｍｍｏｌ）のＤＭＴ−ＭＭを１０ｍｌの水に溶解し、室温にて一晩反応した。生成した沈殿物を、遠心分離により回収した後、水で十分洗浄した。その後、凍結乾燥させ、２０．２ｍｇの粉末（図４の化合物３）を得た。薄層クロマトグラフィーにより、原料の消失と新規なスポットが１スポットであることを確認した。
【００７６】
２０ｍｇ（０．０３６ｍｍｏｌ）の１２−アジドドデシル  β−ラクトシド（図４の化合物４）、５ｍｇ（０．０３５ｍｍｏｌ）の上記で得られた化合物３、２．６ｍｇ（０．０２ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピニルエチルアミン、及び０．６ｍｇ（１．２μｍｏｌ）のＣｕ（ＰＰｈ３）３Ｂｒを２００μｌのテトラヒドロフランに溶解し、室温にて４８時間、反応させた。反応後、空気を噴き込むことにより溶媒を除去し、１００μｌのジメチルスルホキシドで溶解後、５ｍｌの水を加え再沈殿させ、遠心分離により沈殿物を回収した。更に、得られた沈殿物を水で十分に洗浄した後、凍結乾燥させ２２．５ｍｇの粉末（図４の化合物５と未反応の化合物４の混合物）を得た。
【００７７】
上記の操作により得られた、化合物５と未反応の化合物４の混合物について、ＤＴＮＢ法によりチオール基の定量により、チオール基の導入率を測定したところ、４４．３％であった。
【００７８】
得られた化合物をＮＭＲにより分析した結果、原料である１２−アジドドデシル  β−ラクトシド由来のピーク以外に、クリックケミストリーライゲーション反応によって生じ得る新規なピークを検出できたことから、クリックケミストリーライゲーション反応により結合し、末端にチオール基を有する所望の糖鎖化合物できたことが確認できた。
【実施例５】
【００７９】
１２−アジドドデシル  β−ラクトシドを、官能基を導入するターゲットとなる糖鎖化合物として用い、２−プロピニルアミンをクリックケミストリーライゲーション反応により連結させることによりアミノ基の導入を行った。更に、ポリアクリル酸に縮合反応させることにより、高分子化を行った。
【００８０】
具体的には、以下のようにして、１２−アジドドデシル  β−ラクトシドへのアミノ基の導入、更にはポリアクリル酸への縮合反応による高分子化を行った。スキームについては、図５に示す。
【００８１】
アミノ基の導入
１００ｍｇ（０．１８１ｍｍｏｌ）の１２−アジドドデシル  β−ラクトシド（図５の化合物４）、１０ｍｇ（０．１８２ｍｍｏｌ）の２−プロピニルアミン（図５の化合物２）、１３ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、及び３ｍｇ（０．００６ｍｍｏｌ）のＣｕ（ＰＰｈ３）３Ｂｒを１ｍｌのテトラヒドロフランに溶解し、室温で４８時間、反応させた。その後、ガスを吹き込むことにより溶媒を除去した。残った乾固物を５００ｕｌのジメチルスルホキシドに溶解した後、１２ｍｌの水を加え糖鎖化合物を再沈殿させた。沈殿物を遠心分離により回収した後、十分に水で洗浄した、凍結乾燥させ、３４．５ｍｇの粉末（図５の化合物６と未反応の化合物４の混合物）を得た。薄層クロマトグラフィーにより、原料であるの２−プロピニルアミンの消失と新規スポットがニンヒドリン反応により呈色することを確認した。
【００８２】
得られた化合物をＮＭＲにより分析した結果、原料である１２−アジドドデシル  β−ラクトシド由来のピーク以外に、クリックケミストリーライゲーション反応によって生じ得る新規なピークを検出できたことから、クリックケミストリーライゲーション反応により所望の糖鎖化合物が生成されたことが確認された。
【００８３】
ポリアクリル酸への固定化による高分子化
以上の操作で得られたアミド基を導入した１２−アジドドデシル  β−ラクトシド（図５の化合物６）を含む粉末  ９.1ｍｇとポリアクリル酸（化合物７）５４０ｍｇを６００μｌのN,N‐ジメチルホルムアミドに溶解し、１５．２ｍｇ（４０μｍｏｌ）のＨＡＴＵを加え、一晩反応させた。反応後、空気を噴く込むことにより溶媒を除去し、１０ｍｌの水で溶解後、遠心分離し上清を回収した。次に、回収した上清を凍結乾燥させ、１８．７ｍｇの粉末を得た。得られた粉末をＮＭＲにより分析したところ、水溶性であるポリアクリル酸由来のピークに加え、水に不溶性の１２−アジドドデシル  β−ラクトシド由来のピークを検出できたことにより、ポリアクリル酸への固定化による高分子（図５の化合物８）ができたことを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明の固定化糖鎖体の製造工程を示す代表的なスキームの一例を示す。
【図２】フィルターペーパーに蛍光標識した糖鎖を検出した画像を示す。
【図３】ＧＭ３を固定化したフィルターペーパーへのウィルス吸着能をアッセイした結果を示す。
【図４】糖鎖へのチオール基導入のスキームを示す。
【図５】糖鎖へのアミノ基導入のスキームおよび糖鎖の高分子化の一例を示す。
【図１】
2008231013.tif 000002
【図２】
2008231013.tif 000003
【図３】
2008231013.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年4月5日(2007.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2008231013.tif 000007