(57)【要約】【課題】  高解像度での試料の蛍光観察画像を好適に取得することが可能な蛍光画像取得装置、及び蛍光画像取得方法を提供する。【解決手段】  試料ステージ１５と、所定の方向を長手方向とする画像を取得する撮像装置３１を含む画像取得部３０と、励起光源４０からの励起光による落射照明のためのダイクロイックミラー４５を含む蛍光光学系ユニット４４と、撮像装置３１によって試料Ｓを走査する部分画像の取得を複数回繰り返す走査部と、複数の部分画像を合成して試料Ｓの蛍光観察画像を生成する画像合成部と、光学系ユニット４４に対応させてシェーディング補正データを記憶する補正データ記憶部７６と、シェーディング補正データを参照して、複数の部分画像のそれぞれについてシェーディング補正を行う画像補正処理部７５とを備えて蛍光画像取得装置を構成する。【選択図】  図４
2008051773.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光測定の対象となる試料を載置する試料ステージと、
前記試料の蛍光観察画像として、第１の方向を長手方向とする１次元画像または２次元画像を取得する撮像装置を含む画像取得手段と、
前記試料に対して蛍光測定用の励起光を供給する励起光供給手段と、
前記励起光供給手段からの前記励起光を反射して前記試料へと照射するとともに、前記試料からの蛍光を前記画像取得手段へと通過させるダイクロイックミラーを含む蛍光光学系ユニットと、
前記撮像装置によって前記試料を第２の方向に走査して部分画像を取得するとともに、この部分画像の取得を前記第１の方向に沿って撮像位置をずらしながら複数回繰り返して複数の部分画像を取得するように、前記試料ステージと前記画像取得手段との位置関係を調整する走査手段と、
前記複数の部分画像を前記第１の方向に並べて合成することで、前記試料の蛍光観察画像を生成する画像合成手段と、
前記撮像装置によって取得される画像に対するシェーディング補正データを、前記蛍光光学系ユニットに対応させて記憶する補正データ記憶手段と、
前記補正データ記憶手段に記憶された前記シェーディング補正データを参照して、前記複数の部分画像のそれぞれについてシェーディング補正を行う画像補正処理手段と
を備えることを特徴とする蛍光画像取得装置。
【請求項２】
前記補正データ記憶手段は、前記撮像装置によって取得される画像に対するダーク補正データを、前記撮像装置での露光時間に対応させて記憶するとともに、
前記画像補正処理手段は、前記シェーディング補正に加えて、前記補正データ記憶手段に記憶された前記ダーク補正データを参照して、前記複数の部分画像のそれぞれについてダーク補正を行うことを特徴とする請求項１記載の蛍光画像取得装置。
【請求項３】
前記画像取得手段は、前記試料からの蛍光を異なる３つの波長成分に分解する波長分解光学系を有するとともに、
前記撮像装置として、前記波長分解光学系によって分解された３つの波長成分のそれぞれによる前記蛍光観察画像を取得する３つの撮像装置を含むことを特徴とする請求項１または２記載の蛍光画像取得装置。
【請求項４】
前記補正データ記憶手段は、前記３つの撮像装置のそれぞれによって取得される画像に対する３種類の前記シェーディング補正データを記憶することを特徴とする請求項３記載の蛍光画像取得装置。
【請求項５】
前記画像取得手段における前記撮像装置は、前記第１の方向を長手方向とする１次元画像の取得が可能な１次元センサ、または前記第１の方向を長手方向とする２次元画像の取得及びＴＤＩ駆動が可能な２次元センサであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の蛍光画像取得装置。
【請求項６】
前記画像取得手段における前記撮像装置は、
アレイ状に配列された複数の画素を有し、前記画素において光入射量に応じて生成された電荷を出力する光検出手段と、
前記光検出手段に対して前記複数の画素の一方の配列方向に沿って設けられ、前記配列方向について分割された複数の部分電荷転送部を有する電荷転送手段とを有し、
前記複数の部分電荷転送部のそれぞれは、前記光検出手段のうちの所定の光検出領域内にある画素からの電荷を出力方向に転送して出力端から出力することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項記載の蛍光画像取得装置。
【請求項７】
試料ステージ上に載置された試料を蛍光測定の対象とし、前記試料の蛍光観察画像として、画像取得手段に含まれる撮像装置によって第１の方向を長手方向とする１次元画像または２次元画像を取得する画像取得ステップと、
前記試料に対して蛍光測定用の励起光を供給し、前記励起光を反射して前記試料へと照射するとともに、前記試料からの蛍光を前記画像取得手段へと通過させるダイクロイックミラーを含む蛍光光学系ユニットを介して前記励起光を前記試料へと照射する励起光照射ステップと、
前記撮像装置によって前記試料を第２の方向に走査して部分画像を取得するとともに、この部分画像の取得を前記第１の方向に沿って撮像位置をずらしながら複数回繰り返して複数の部分画像を取得するように、前記試料ステージと前記画像取得手段との位置関係を調整する走査ステップと、
前記複数の部分画像を前記第１の方向に並べて合成することで、前記試料の蛍光観察画像を生成する画像合成ステップと、
前記撮像装置によって取得される画像に対するシェーディング補正データを、前記蛍光光学系ユニットに対応させて記憶する補正データ記憶ステップと、
前記補正データ記憶ステップで記憶された前記シェーディング補正データを参照して、前記複数の部分画像のそれぞれについてシェーディング補正を行う画像補正処理ステップと
を備えることを特徴とする蛍光画像取得方法。
【請求項８】
前記補正データ記憶ステップにおいて、前記撮像装置によって取得される画像に対するダーク補正データを、前記撮像装置での露光時間に対応させて記憶するとともに、
前記画像補正処理ステップにおいて、前記シェーディング補正に加えて、前記補正データ記憶ステップで記憶された前記ダーク補正データを参照して、前記複数の部分画像のそれぞれについてダーク補正を行うことを特徴とする請求項７記載の蛍光画像取得方法。
【請求項９】
前記画像取得手段は、前記試料からの蛍光を異なる３つの波長成分に分解する波長分解光学系を有するとともに、
前記撮像装置として、前記波長分解光学系によって分解された３つの波長成分のそれぞれによる前記蛍光観察画像を取得する３つの撮像装置を含むことを特徴とする請求項７または８記載の蛍光画像取得方法。
【請求項１０】
前記補正データ記憶ステップにおいて、前記３つの撮像装置のそれぞれによって取得される画像に対する３種類の前記シェーディング補正データを記憶することを特徴とする請求項９記載の蛍光画像取得方法。
【請求項１１】
前記画像取得手段における前記撮像装置は、前記第１の方向を長手方向とする１次元画像の取得が可能な１次元センサ、または前記第１の方向を長手方向とする２次元画像の取得及びＴＤＩ駆動が可能な２次元センサであることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか一項記載の蛍光画像取得方法。
【請求項１２】
前記画像取得手段における前記撮像装置は、
アレイ状に配列された複数の画素を有し、前記画素において光入射量に応じて生成された電荷を出力する光検出手段と、
前記光検出手段に対して前記複数の画素の一方の配列方向に沿って設けられ、前記配列方向について分割された複数の部分電荷転送部を有する電荷転送手段とを有し、
前記複数の部分電荷転送部のそれぞれは、前記光検出手段のうちの所定の光検出領域内にある画素からの電荷を出力方向に転送して出力端から出力することを特徴とする請求項７〜１１のいずれか一項記載の蛍光画像取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の蛍光観察画像を取得するための蛍光画像取得装置、及び蛍光画像取得方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、病理学の分野などにおいて、パーソナルコンピュータ等の仮想空間上であたかも実際の顕微鏡で試料を見ているかのように操作可能なバーチャル顕微鏡が知られている。このバーチャル顕微鏡で扱われる試料データは、予め実際の顕微鏡を利用して高解像度で取得された試料の画像データに基づいている。
【０００３】
このようにバーチャル顕微鏡で利用される試料の画像データを取得する画像取得装置では、バーチャル顕微鏡での画像操作を実現するために、充分に高解像度で試料の画像を取得することが要求される。このような高解像度の画像取得には、例えば、撮像装置で試料を２次元に走査することによって、試料全体に対する観察画像を取得する方法が用いられている。また、このような画像取得装置での画像取得の対象となる試料としては、吸光性の色素で染色された試料の観察画像に加えて、蛍光性の色素で染色された試料を対象とする蛍光観察画像の取得が検討されている（例えば、特許文献１：特開２００５−１６４８１５号公報、特許文献２：特表２００４−５１４９２０号公報参照）。
【特許文献１】特開２００５−１６４８１５号公報
【特許文献２】特表２００４−５１４９２０号公報
【特許文献３】特開２００４−３４７４５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記した高解像度の画像取得方法としては、具体的には例えば、所定の方向を長手方向とする画像を取得する撮像装置を用い、この撮像装置によって試料を長手方向に直交する方向に走査して部分画像を取得するとともに、この部分画像の取得を撮像位置をずらしながら複数回繰り返して複数の部分画像を取得する方法がある。この場合、得られた複数の部分画像を並べて合成することで、高解像度の試料の蛍光観察画像を取得することが可能である。
【０００５】
一方、試料の蛍光観察画像を取得するための蛍光顕微鏡では、試料を載置する試料ステージと画像を取得する撮像装置との間に設けられたダイクロイックミラーを用いて、試料に励起光を照射する落射照明の構成が用いられる。このような構成では、ダイクロイックミラーを含む励起光照射光学系、あるいは画像取得に用いられる撮像装置等に起因して、得られる画像においてシェーディングが発生する（特許文献３：特開２００４−３４７４５４号公報参照）。このようなシェーディングの影響は、上記したように複数の部分画像を合成して蛍光観察画像を生成するような場合に、例えば隣接する部分画像の境界で不自然な画像変化が生じるなど、顕著に現れる。
【０００６】
本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、高解像度での試料の蛍光観察画像を好適に取得することが可能な蛍光画像取得装置、及び蛍光画像取得方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような目的を達成するために、本発明による蛍光画像取得装置は、（１）蛍光測定の対象となる試料を載置する試料ステージと、（２）試料の蛍光観察画像として、第１の方向を長手方向とする１次元画像または２次元画像を取得する撮像装置を含む画像取得手段と、（３）試料に対して蛍光測定用の励起光を供給する励起光供給手段と、（４）励起光供給手段からの励起光を反射して試料へと照射するとともに、試料からの蛍光を画像取得手段へと通過させるダイクロイックミラーを含む蛍光光学系ユニットと、（５）撮像装置によって試料を第２の方向に走査して部分画像を取得するとともに、この部分画像の取得を第１の方向に沿って撮像位置をずらしながら複数回繰り返して複数の部分画像を取得するように、試料ステージと画像取得手段との位置関係を調整する走査手段と、（６）複数の部分画像を第１の方向に並べて合成することで、試料の蛍光観察画像を生成する画像合成手段と、（７）撮像装置によって取得される画像に対するシェーディング補正データを、蛍光光学系ユニットに対応させて記憶する補正データ記憶手段と、（８）補正データ記憶手段に記憶されたシェーディング補正データを参照して、複数の部分画像のそれぞれについてシェーディング補正を行う画像補正処理手段とを備えることを特徴とする。
【０００８】
また、本発明による蛍光画像取得方法は、（ａ）試料ステージ上に載置された試料を蛍光測定の対象とし、試料の蛍光観察画像として、画像取得手段に含まれる撮像装置によって第１の方向を長手方向とする１次元画像または２次元画像を取得する画像取得ステップと、（ｂ）試料に対して蛍光測定用の励起光を供給し、励起光を反射して試料へと照射するとともに、試料からの蛍光を画像取得手段へと通過させるダイクロイックミラーを含む蛍光光学系ユニットを介して励起光を試料へと照射する励起光照射ステップと、（ｃ）撮像装置によって試料を第２の方向に走査して部分画像を取得するとともに、この部分画像の取得を第１の方向に沿って撮像位置をずらしながら複数回繰り返して複数の部分画像を取得するように、試料ステージと画像取得手段との位置関係を調整する走査ステップと、（ｄ）複数の部分画像を第１の方向に並べて合成することで、試料の蛍光観察画像を生成する画像合成ステップと、（ｅ）撮像装置によって取得される画像に対するシェーディング補正データを、蛍光光学系ユニットに対応させて記憶する補正データ記憶ステップと、（ｆ）補正データ記憶ステップで記憶されたシェーディング補正データを参照して、複数の部分画像のそれぞれについてシェーディング補正を行う画像補正処理ステップとを備えることを特徴とする。
【０００９】
上記した蛍光画像取得装置、及び蛍光画像取得方法においては、試料の画像を取得する画像取得手段において、第１の方向を長手方向とする画像を取得する撮像装置を用いる。そして、この撮像装置によって第２の方向を走査方向として、撮像位置をずらしながら試料を複数回走査し、得られた複数の部分画像を合成することで試料の蛍光観察画像を取得している。これにより、試料の蛍光観察画像を充分に高い解像度で効率良く取得することが可能となる。
【００１０】
さらに、試料に対して励起光を照射する励起光照射光学系を、ダイクロイックミラーを含む蛍光光学系ユニット（蛍光キューブ）を用いた落射照明光学系として構成するとともに、蛍光光学系ユニットに対応させてシェーディング補正データを用意して、複数の部分画像のそれぞれについてシェーディング補正を行っている。ここで、試料の蛍光測定においては、対象とする試料の種類や蛍光測定の種類等により、使用する蛍光光学系ユニットを交換する場合がある。これに対して、上記構成によれば、蛍光光学系ユニット毎に最適なシェーディング補正を行うことができる。これにより、高解像度での試料の蛍光観察画像を好適な状態で取得することが可能となる。
【００１１】
撮像装置による試料の走査については、蛍光画像取得装置は、走査手段が、撮像装置が取得する画像の長手方向となる第１の方向に直交する方向を、試料の走査方向となる第２の方向とすることが好ましい。同様に、蛍光画像取得方法は、走査ステップにおいて、撮像装置が取得する画像の長手方向となる第１の方向に直交する方向を、試料の走査方向となる第２の方向とすることが好ましい。
【００１２】
また、蛍光画像取得装置は、補正データ記憶手段が、撮像装置によって取得される画像に対するダーク補正データを、撮像装置での露光時間に対応させて記憶するとともに、画像補正処理手段は、シェーディング補正に加えて、補正データ記憶手段に記憶されたダーク補正データを参照して、複数の部分画像のそれぞれについてダーク補正を行うことが好ましい。
【００１３】
同様に、蛍光画像取得方法は、補正データ記憶ステップにおいて、撮像装置によって取得される画像に対するダーク補正データを、撮像装置での露光時間に対応させて記憶するとともに、画像補正処理ステップにおいて、シェーディング補正に加えて、補正データ記憶ステップで記憶されたダーク補正データを参照して、複数の部分画像のそれぞれについてダーク補正を行うことが好ましい。
【００１４】
このように撮像装置で取得される画像に対してシェーディング補正に加えてダーク補正を行うことにより、得られる試料の蛍光観察画像を、より高精度な画像とすることが可能となる。また、画像取得における露光時間に対応させてダーク補正データを用意することにより、設定された露光時間に応じて最適なダーク補正を行うことができる。
【００１５】
また、試料の蛍光観察画像の取得に用いられる画像取得手段は、試料からの蛍光を異なる３つの波長成分に分解する波長分解光学系を有するとともに、撮像装置として、波長分解光学系によって分解された３つの波長成分のそれぞれによる蛍光観察画像を取得する３つの撮像装置を含むことが好ましい。このような構成では、３つの撮像装置は、異なる波長成分（色成分）によってそれぞれ形成される試料の光像を取得する。これにより、３つの撮像装置のそれぞれで取得された光像に基づいて、試料のカラーでの蛍光観察画像を取得することが可能となる。
【００１６】
この場合、蛍光画像取得装置は、補正データ記憶手段が、３つの撮像装置のそれぞれによって取得される画像に対する３種類のシェーディング補正データを記憶することが好ましい。同様に、蛍光画像取得方法は、補正データ記憶ステップにおいて、３つの撮像装置のそれぞれによって取得される画像に対する３種類のシェーディング補正データを記憶することが好ましい。これにより、画像取得手段に含まれる３つの撮像装置のそれぞれにおいて、高解像度での試料の蛍光観察画像を好適な状態で取得することが可能となる。
【００１７】
また、画像取得手段における撮像装置については、第１の方向を長手方向とする１次元画像の取得が可能な１次元センサ、または第１の方向を長手方向とする２次元画像の取得及びＴＤＩ駆動が可能な２次元センサである構成を用いることが好ましい。このような構成によれば、１次元センサまたはＴＤＩ駆動２次元センサで試料を走査することで、試料の蛍光観察画像を充分に高解像度で効率良く取得することが可能となる。
【００１８】
また、画像取得手段における撮像装置は、アレイ状に配列された複数の画素を有し、画素において光入射量に応じて生成された電荷を出力する光検出手段と、光検出手段に対して複数の画素の一方の配列方向に沿って設けられ、配列方向について分割された複数の部分電荷転送部を有する電荷転送手段とを有し、複数の部分電荷転送部のそれぞれは、光検出手段のうちの所定の光検出領域内にある画素からの電荷を出力方向に転送して出力端から出力する構成を用いても良い。
【００１９】
上記構成の撮像装置では、光検出手段の複数の画素、または光検出手段を構成する複数の垂直シフトレジスタからの電荷が並列に入力される電荷転送手段を、それぞれが出力端を有する複数の部分電荷転送部に分割したマルチタップ構造が採用されている。このような構成では、光検出手段の各画素において生成された電荷の読み出しが高速化される。また、得られる画像に対して上記のようにシェーディング補正を行うことにより、隣接するタップ間での不自然な画像変化の発生が防止される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の蛍光画像取得装置、及び蛍光画像取得方法によれば、試料の画像取得に第１の方向を長手方向とする画像を取得する撮像装置を用い、この撮像装置によって試料を第２の方向に複数回走査し、得られた複数の部分画像を合成することで試料の蛍光観察画像を取得するとともに、試料に対して励起光を照射する光学系をダイクロイックミラーを含む蛍光光学系ユニットを用いた落射照明光学系として構成し、かつ、蛍光光学系ユニットに対応させてシェーディング補正データを用意して、複数の部分画像のそれぞれについてシェーディング補正を行うことにより、高解像度での試料の蛍光観察画像を好適な状態で取得することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、図面とともに本発明による蛍光画像取得装置、及び蛍光画像取得方法の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。
【００２２】
まず、蛍光画像取得装置の全体構成について説明する。図１は、本発明による蛍光画像取得装置の一実施形態の構成を示すブロック図である。本実施形態による蛍光画像取得装置は、試料Ｓの蛍光観察画像を高解像度で取得するために用いられる蛍光顕微鏡システムであり、試料Ｓの蛍光観察画像取得を行う顕微鏡装置１０と、顕微鏡装置１０における画像取得の制御等を行う制御装置６０とを備える。蛍光測定の対象となる試料Ｓとしては、例えば、バーチャル顕微鏡で利用される画像データを取得する場合における、スライドガラスに蛍光性の色素で染色された組織切片等の生体サンプルが密封されたスライド（プレパラート）が例として挙げられる。
【００２３】
顕微鏡装置１０は、試料格納部１１と、マクロ画像取得部２０と、ミクロ画像取得部３０とを有している。試料格納部１１は、それぞれ画像取得の対象となる複数の試料（例えばそれぞれ生体サンプルが密封された複数のスライド）Ｓを格納可能に構成された格納手段である。この試料格納部１１には、操作者による試料Ｓの格納、及び取り出し等に用いられる扉１２が設けられている。また、本実施形態においては、画像取得中に誤って扉１２が開放されることを防止するためのインターロック機構１３が付設されている。
【００２４】
マクロ画像取得部２０は、試料Ｓの低倍率画像であるマクロ画像を取得するための第１の画像取得手段である。この画像取得部２０では、蛍光観察画像であるミクロ画像の取得に先立って、試料Ｓの全体像に相当する低解像度でのマクロ画像が取得される。マクロ画像は、例えば、試料Ｓの蛍光観察画像を取得する際の撮像条件を設定するために、必要に応じて用いられる。また、マクロ画像取得部２０に対して、マクロ画像取得時に試料Ｓの光像を生成するための光を照射するマクロ用光源２５が設置されている。
【００２５】
一方、ミクロ画像取得部３０は、試料Ｓの高倍率画像であるミクロ画像を取得するための第２の画像取得手段である。この画像取得部３０では、目的とする試料Ｓの高解像度でのミクロ画像が取得される。本実施形態においては、後述するように、このミクロ画像取得部３０が、試料Ｓの高解像度での蛍光観察画像を取得するための撮像装置を含む画像取得手段として機能する。また、ミクロ画像取得部３０に対して、ミクロ画像取得時に試料Ｓの光像を生成するための光を照射するミクロ用光源３５が設置されている。
【００２６】
また、顕微鏡装置１０には、顕微鏡装置１０内での各位置の間で試料Ｓを移動させる試料移動手段として、試料搬送部１４及び試料ステージ１５が設けられている。試料搬送部１４は、試料格納部１１での試料Ｓの格納位置と、マクロ画像取得部２０及びミクロ画像取得部３０のそれぞれでの画像取得位置との間で、必要に応じて試料Ｓを搬送する搬送手段である。また、試料ステージ１５は、マクロ画像またはミクロ画像の画像取得時に試料Ｓが載置されるとともに、試料Ｓの画像取得位置の設定、調整等に用いられる。
【００２７】
制御装置６０は、顕微鏡装置１０における画像取得動作の制御、画像取得条件の設定、及び取得された試料Ｓの画像データの処理等を行う制御手段である。制御装置６０は、例えばＣＰＵ及び必要なメモリ、ハードディスクなどの記憶装置を含むコンピュータによって構成される。また、この制御装置６０に対して、表示装置７１、及び入力装置７２が接続されている。表示装置７１は、例えばＣＲＴディスプレイまたは液晶ディスプレイであり、本画像取得装置の動作に必要な操作画面の表示、あるいは取得された試料Ｓの画像の表示等に用いられる。また、入力装置７２は、例えばキーボードまたはマウスであり、画像取得に必要な情報の入力、画像取得動作についての指示の入力等に用いられる。
【００２８】
図１に示した画像取得装置の構成について、さらに説明する。図２は、蛍光画像取得装置における顕微鏡装置１０、及び制御装置６０の構成の一例を示すブロック図である。また、図３は、顕微鏡装置１０におけるマクロ画像取得用の光学系の構成の一例を概略的に示す図である。また、図４は、顕微鏡装置１０におけるミクロ画像取得用（高解像度での蛍光観察画像取得用）の光学系の構成の一例を概略的に示す図である。
【００２９】
ここで、図３及び図４中に示すように、顕微鏡装置１０の構成について水平方向で互いに直交する２方向をＸ軸方向及びＹ軸方向とし、水平方向に直交する垂直方向をＺ軸方向とする。これらのうち、垂直方向であるＺ軸方向が本顕微鏡システムにおける画像取得の光軸の方向となっている。また、図２においては、試料格納部１１及び試料搬送部１４等については図示を省略している。また、本顕微鏡装置１０において画像取得の対象となる試料Ｓは、上述したように、例えば蛍光性の色素で染色された生体サンプルが密封されたスライドである。
【００３０】
蛍光測定の対象となる試料Ｓは、画像取得部２０、３０における画像取得時には、試料ステージ１５上に載置される。この試料ステージ１５は、ステッピングモータ、ＤＣモータ、またはサーボモータ等を用い、Ｘ軸方向及びＹ軸方向（水平方向）に移動可能なＸＹステージとして構成されている。このような構成において、試料ステージ１５をＸＹ面内で駆動することにより、画像取得部２０、３０での試料Ｓに対する画像取得位置の設定、調整が行われる。また、本実施形態においては、この試料ステージ１５は、マクロ画像取得部２０での画像取得位置、及びミクロ画像取得部３０での画像取得位置の間で移動可能となっている。
【００３１】
試料Ｓのマクロ画像を取得するためのマクロ画像取得位置に対し、図３に示すように、光軸２０ａに対して所定位置にそれぞれマクロ画像取得部２０、及びマクロ用光源２５が設置されている。マクロ用光源２５は、試料Ｓに対してマクロ画像取得用の光像を生成するための光を照射する照明手段である。
【００３２】
また、マクロ画像取得部２０は、試料Ｓの光像による２次元画像の取得が可能な２次元ＣＣＤセンサなどのマクロ用撮像装置２１を用いて構成されている。また、試料Ｓが配置されるマクロ画像取得位置と、撮像装置２１との間には、試料Ｓの光像を導く光学系として撮像光学系２２が設けられている。
【００３３】
図３に示す構成例においては、マクロ用光源２５として、暗視野光源２６、及び明視野光源２７の２つの光源が設けられている。これらのうち、マクロ用暗視野光源２６は、試料Ｓのマクロ画像として試料Ｓからの散乱光を検出することによる暗視野マクロ画像を取得する際に用いられる暗視野照明手段であり、マクロ画像を取得する際の光軸と直交する面に対して、マクロ画像取得部２０とは反対側から斜めに光を照射する位置に配置されている。
【００３４】
具体的には、図３に示す構成においては、暗視野光源２６は、光軸２０ａに対して、試料Ｓの斜め下方から光を照射する位置に斜光照明手段として設置されている。このような暗視野光源２６によれば、蛍光性の色素で染色された試料Ｓが画像取得の対象となっている場合でも、試料Ｓのマクロ画像を充分なコントラストで好適に取得することができる。このような高コントラストのマクロ画像は、蛍光観察画像であるミクロ画像を取得する際の画像取得範囲などの撮像条件の設定に利用する上で有効であり、蛍光観察画像の撮像条件を確実に設定することが可能となる。
【００３５】
また、本構成例では、マクロ用光源２５として、暗視野光源２６に加えて、明視野光源２７が設置されている。マクロ用明視野光源２７は、試料Ｓのマクロ画像として明視野マクロ画像を取得する際に用いられる明視野照明手段であり、試料ステージ１５の下方に透過照明手段として設置されている。これらの暗視野光源２６及び明視野光源２７は、具体的な試料Ｓの状態等によって必要に応じて使い分けられる。
【００３６】
一方、試料Ｓのミクロ画像を取得するためのミクロ画像取得位置に対し、図４に示すように、光軸３０ａに対して所定位置にそれぞれミクロ画像取得部３０、及びミクロ用光源３５が設置されている。ミクロ用光源３５は、試料Ｓに対してミクロ画像取得用の光像を生成するための光を照射する照明手段である。
【００３７】
また、ミクロ画像取得部３０は、試料Ｓの光像による高解像度の画像を取得可能なミクロ用撮像装置３１を含んで構成されている。ミクロ用撮像装置３１は、具体的には、所定の方向（第１の方向）を長手方向（長軸方向）とする１次元画像または２次元画像を取得可能な撮像装置であり、試料Ｓの蛍光観察画像、またはその他の高解像度での観察画像の取得に用いられる。
【００３８】
このようなミクロ画像取得部３０の撮像装置３１に対し、試料ステージ１５は、蛍光観察画像を取得する際に、撮像装置３１によって試料Ｓを第２の方向に走査して部分画像を取得するように、試料ステージ１５と画像取得部３０との位置関係を調整する走査手段として機能する。さらに、試料ステージ１５は、上記した部分画像の取得を第１の方向に沿って撮像位置をずらしながら複数回繰り返して複数の部分画像を取得するように、試料ステージ１５と画像取得部３０との位置関係を調整する。
【００３９】
ここで、撮像装置３１による試料Ｓに対する撮像領域（視野）の長手方向となる第１の方向と、試料Ｓの走査方向となる第２の方向とは、ＸＹ面（水平面）内において互いに異なる方向、好ましくは互いに直交する方向として設定される。また、試料Ｓの高解像度での蛍光観察画像を取得する際の試料Ｓの走査方法については、詳しくは後述する。
【００４０】
また、試料ステージ１５上で試料Ｓが配置されるミクロ画像取得位置と、撮像装置３１との間には、試料Ｓの光像を撮像装置３１へと導く光学系として、対物レンズ３２、及び導光光学系３４が設けられている。対物レンズ３２は、試料Ｓからの光（例えば蛍光）を入射して、試料Ｓの光像（例えば蛍光像）を生成する。また、導光光学系３４は、例えばチューブレンズによって構成され、対物レンズ３２を通過した試料Ｓの蛍光像などの光像をミクロ用撮像装置３１へと導く。
【００４１】
また、図４に示した構成では、対物レンズ３２に対して、ステッピングモータまたはピエゾアクチュエータ等を用いたＺステージ３３が設けられており、このＺステージ３３で対物レンズ３２をＺ軸方向に駆動することで、試料Ｓに対する焦点合わせ等が可能となっている。
【００４２】
図４に示す構成例においては、ミクロ用光源３５として、透過光源３６、及び励起光源４０の２つの光源が設けられている。これらのうち、透過光源３６は、試料Ｓのミクロ画像として透過観察画像を取得する際に用いられる透過照明手段であり、透過照明光学系３７とともに試料ステージ１５の下方から光を照射するように設置されている。また、透過照明光学系３７には、透過照明のＯＮ／ＯＦＦを切り換えるためのシャッタ３８が設けられている。
【００４３】
また、励起光源４０は、試料Ｓのミクロ画像として試料Ｓで発生した蛍光による蛍光観察画像を取得する際に用いられる励起光供給手段であり、試料Ｓに対して蛍光測定用の励起光を供給する落射照明手段として構成されている。このような励起光源４０は、例えば放電管を用いて構成される。また、この励起光源４０に対し、試料Ｓへと励起光を照射するための光学系として、導光光学系４２及び蛍光光学系ユニット４４を含む励起光照射光学系４１が設置されている。
【００４４】
励起光照射光学系４１のうちで励起光源４０側の光学系部分を構成する導光光学系４２には、励起光による落射照明のＯＮ／ＯＦＦを切り換えるためのシャッタ４３が設けられている。また、蛍光光学系ユニット（蛍光キューブ）４４は、励起光源４０からの励起光を反射して試料ステージ１５上の試料Ｓへと照射するとともに、試料Ｓからの蛍光を画像取得部３０の撮像装置３１へと通過させるダイクロイックミラー４５を含んで構成されている。
【００４５】
また、この蛍光光学系ユニット４４は、図４及び図５に示すように、ミクロ画像取得用の光軸３０ａに対して、光軸３０ａを含む挿入位置と、光軸３０ａを外れた待機位置との間で移動可能に構成されている。透過光源３６からの透過照明によって試料Ｓの透過観察画像を取得する際には、図５（ａ）に示すように、光学系ユニット４４は光軸３０ａを外れた待機位置（図４中に破線で示す位置）に配置される。一方、励起光源４０からの落射照明によって試料Ｓの蛍光観察画像を取得する際には、図５（ｂ）に示すように、光学ユニット４４は光軸３０ａを含む挿入位置（図４中に実線で示す位置）に配置される。
【００４６】
励起光照射光学系４１のうちで蛍光光学系ユニット４４以外の光学系部分については、具体的には様々な構成を用いて良い。そのような励起光照射光学系４１の例として、励起光源４０から試料Ｓへと照射される励起光の照射領域を整形するためのシリンドリカルレンズ系を含む構成を用いることができる。このシリンドリカルレンズ系は、図４に示した構成では、例えば導光光学系４２内において設けられる。光学系４１においてこのようなシリンドリカルレンズ系を用いることにより、試料Ｓに対する励起光の照射領域を、所定の方向を長手方向（長軸方向）とする領域に設定することができる。
【００４７】
また、このシリンドリカルレンズ系を含む励起光照射光学系４１は、試料Ｓでの励起光の照射領域と、撮像装置３１による試料Ｓ上での撮像領域（撮像の視野）とで長軸方向が互いに一致するとともに、照射領域が撮像領域よりも広くなるように励起光を試料Ｓへと照射するように構成されることが好ましい。この場合、励起光照射光学系４１は、試料Ｓでの撮像領域が励起光の照射領域内に含まれる照射条件で、励起光を試料Ｓへと照射することとなる。
【００４８】
なお、試料Ｓと撮像装置３１との間の光路上、あるいは励起光源４０とダイクロイックミラー４５との間の光路上には、必要に応じて励起光または蛍光を選択するための光フィルタを設置しても良い。また、このような励起フィルタあるいは蛍光フィルタなどの光フィルタについては、蛍光光学系ユニット４４においてダイクロイックミラー４５と一体に設ける構成としても良い。図４においては、そのような構成の例として、蛍光光学系ユニット４４内において、ダイクロイックミラー４５の励起光源４０側に励起フィルタ４５ａを設け、試料ステージ１５側に蛍光フィルタ４５ｂを設けた構成を示している。
【００４９】
図６は、図４に示したミクロ画像取得用の光学系の構成の具体例を示す図である。本構成例では、励起光を供給する励起光源４０として、放電管である水銀ランプ４０ａが用いられている。また、励起光源４０と蛍光光学系ユニット４４との間の導光光学系４２は、シリンドリカルレンズ系４６、フォーカスレンズ系４７、及びコリメートレンズ系４８の３つのレンズ系によって構成されている。
【００５０】
蛍光光学系ユニット４４のダイクロイックミラー４５等とともに励起光照射光学系４１を構成するこれらのレンズ系４６、４７、４８は、それぞれ１または複数のレンズによって構成されている。また、透過光源３６と試料Ｓとの間の透過照明光学系３７は、ライトガイド３７ａ、コリメートレンズ３７ｂ、ミラー３７ｃ、及びコンデンサレンズ３７ｄによって構成されている。
【００５１】
試料Ｓの蛍光観察画像などのミクロ画像の取得に用いられるミクロ画像取得部３０での撮像装置３１としては、上記したように第１の方向を長手方向とする１次元画像または２次元画像を取得可能な撮像装置が用いられる。この撮像装置３１としては、具体的には、第１の方向を長手方向とする１次元画像の取得が可能な１次元センサを用いることができる。あるいは、撮像装置３１として、第１の方向を長手方向とする２次元画像の取得及びＴＤＩ駆動が可能な２次元センサを用いることができる。
【００５２】
これらの試料ステージ１５、マクロ画像取得部２０、ミクロ画像取得部３０、マクロ用光源２５である光源２６、２７、及びミクロ用光源３５である光源３６、４０に対して、それらを駆動制御する制御手段としてステージ制御部１６、マクロ用光源制御部１７、及びミクロ用光源制御部１８が設けられている。また、マクロ画像取得部２０、ミクロ画像取得部３０は、それぞれ撮像制御部の機能を含んで構成されている。
【００５３】
ステージ制御部１６は、ＸＹステージである試料ステージ１５、及びＺステージ３３を駆動制御することにより、試料Ｓに対する撮像条件の設定、調整、蛍光観察画像取得時の撮像装置３１による試料Ｓの走査等を制御する。また、マクロ用光源制御部１７は、暗視野光源２６及び明視野光源２７を駆動制御することにより、試料Ｓの暗視野マクロ画像及び明視野マクロ画像を取得する際の光の照射を制御する。また、ミクロ用光源制御部１８は、透過光源３６、励起光源４０、及びシャッタ３８、４３を駆動制御することにより、試料Ｓの透過観察画像及び蛍光観察画像を取得する際の光の照射を制御する。
【００５４】
制御装置６０は、マクロ画像取得制御部６１及びミクロ画像取得制御部６２を含む画像取得制御部と、マクロ画像処理部６８及びミクロ画像処理部６９を含む画像データ処理部と、撮像条件設定部６５とを有している。画像取得制御部は、上記した制御部１６〜１８等を介して、顕微鏡装置１０における試料Ｓの画像取得動作を制御する。
【００５５】
また、画像データ処理部には、画像データ通信Ｉ／Ｆ（インターフェイス）６６、６７を介して、画像取得部２０で取得されたマクロ画像の画像データ、及び画像取得部３０で取得されたミクロ画像の画像データが入力されており、これらの画像データについて必要なデータ処理が行われる。また、画像データ処理部に入力された画像データ、画像データを処理して得られた各種のデータや情報、あるいは画像取得制御部で用いられる制御情報等は、必要に応じてデータ記憶部に記憶、保持される。
【００５６】
具体的には、画像取得制御部のマクロ画像取得制御部６１は、ステージ制御部１６、マクロ画像取得部２０、及びマクロ用光源制御部１７を介し、試料Ｓのマクロ画像取得位置の設定動作、マクロ画像取得部２０の撮像装置２１によるマクロ画像の取得動作、暗視野光源２６による暗視野マクロ画像取得用の光の照射動作、及び明視野光源２７による明視野マクロ画像取得用の光の照射動作を制御する。
【００５７】
ミクロ画像取得制御部６２は、ステージ制御部１６、ミクロ画像取得部３０、及びミクロ用光源制御部１８を介し、試料Ｓのミクロ画像取得位置の設定動作、ミクロ画像取得部３０の撮像装置３１によるミクロ画像の取得動作、透過光源３６による透過観察画像取得用の光の照射動作、励起光源４０による蛍光観察画像取得用の励起光の照射動作、及び光学系ユニット４４の移動動作を制御する。また、ミクロ画像取得制御部６２は、撮像条件設定部６５で設定された撮像条件を参照して、試料Ｓのミクロ画像の取得を制御する。
【００５８】
マクロ画像処理部６８には、マクロ用画像データ通信Ｉ／Ｆ６６を介して、マクロ画像取得部２０の撮像装置２１によって取得された試料Ｓのマクロ画像の画像データが入力されている。この画像処理部６８は、入力されたマクロ画像の画像データに対して補正、加工、記憶などの必要なデータ処理を実行する。
【００５９】
ミクロ画像処理部６９には、ミクロ用画像データ通信Ｉ／Ｆ６７を介して、ミクロ画像取得部３０の撮像装置３１によって取得された試料Ｓのミクロ画像の画像データが入力されている。この画像処理部６９は、画像処理部６８と同様に、入力されたミクロ画像の画像データに対して補正、加工、記憶などの必要なデータ処理を実行する。本実施形態においては、ミクロ画像処理部６９は、取得されたミクロ画像の画像データを用い、目的とする試料Ｓの高解像度の蛍光観察画像のデータである試料データを作成する。
【００６０】
撮像条件設定部６５は、顕微鏡装置１０のマクロ画像取得部２０で取得された試料Ｓのマクロ画像を参照してミクロ画像の撮像条件を設定する設定手段である。撮像条件設定部６５は、マクロ画像処理部６８において必要な処理が行われたマクロ画像を参照し、試料Ｓの蛍光観察画像などのミクロ画像の撮像条件として、画像取得の対象物を含む範囲に応じた画像取得範囲を設定する。あるいは、撮像条件設定部６５は、必要に応じて他の撮像条件、例えば焦点合わせを実行するための焦点計測位置、画像取得範囲での対象物の画像取得についての焦点情報などの焦点関連情報を設定する。
【００６１】
また、本実施形態の蛍光画像取得装置においては、図４に示すように、蛍光観察画像を取得するためのミクロ画像取得部３０に対し、画像補正処理部７５と、補正データ記憶部７６とが設けられている。補正データ記憶部７６は、撮像装置３１によって取得される画像に対するシェーディング補正データを記憶しておく記憶手段である。このシェーディング補正データは、試料Ｓに対する蛍光測定に適用される蛍光光学系ユニット４４に対応させて補正データ記憶部７６に記憶される。
【００６２】
また、画像補正処理部７５は、補正データ記憶部７６に記憶されたシェーディング補正データを参照して、撮像装置３１で取得された画像に対してシェーディング補正を行う。具体的には、撮像装置３１で試料Ｓを２次元に走査して得られた複数の部分画像のそれぞれについてシェーディング補正が行われる。
【００６３】
また、補正データ記憶部７６は、必要に応じて、撮像装置３１によって取得される画像に対するダーク補正データを、撮像装置３１での露光時間に対応させて記憶しておくこととしても良い。この場合、画像補正処理部７５は、シェーディング補正に加えて、補正データ記憶部７６に記憶されたダーク補正データを参照して、複数の部分画像のそれぞれについてダーク補正を行うことが好ましい。
【００６４】
ここで、画像取得部２０、３０における試料Ｓのマクロ画像及びミクロ画像の取得について説明しておく。マクロ画像取得部２０では、蛍光観察画像などのミクロ画像の撮像条件の設定に用いられる試料Ｓの全体像であるマクロ画像が取得される。例えば、上記したスライドガラスに組織切片等の生体サンプルが密封されたスライドを試料Ｓとした場合、マクロ画像としては、スライド全体、または蛍光性の色素で染色された生体サンプルを含む所定範囲の画像が取得される。
【００６５】
また、図３に示した構成の光学系では、マクロ画像の取得においては、対象となる試料Ｓの種類、あるいは取得しようとするマクロ画像の種類等に応じて、試料Ｓに対して斜め下方に配置された暗視野光源２６による斜光照明、または試料Ｓの下方に配置された明視野光源２７による透過照明が、適宜選択されて用いられる。
【００６６】
また、ミクロ画像取得部３０では、設定された撮像条件を参照して、目的とする解像度での試料Ｓのミクロ画像が取得される。このミクロ画像の取得は、好ましくは図７（ａ）に模式的に示すように、マクロ画像よりも高い所定の解像度で試料Ｓを２次元に走査することによって行われる。ここで、１次元ＣＣＤカメラあるいはＴＤＩ駆動２次元ＣＣＤカメラなどの撮像装置３１を用いたミクロ画像の取得について、例えば、試料Ｓに対して平行なＸＹ面内において、撮像装置３１による撮像領域の長軸方向（第１の方向）をＸ軸方向、この長軸方向に直交する方向をＹ軸方向とする。このとき、ミクロ画像の取得においては、撮像装置３１による撮像領域の長軸方向に直交する方向、図７（ａ）においてはＹ軸の負の方向が、試料Ｓに対する走査方向（第２の方向）となる。
【００６７】
画像取得部３０の撮像装置３１を用いた蛍光観察画像の取得（画像取得ステップ）においては、まず、試料Ｓに対して、蛍光光学系ユニット４４を含む励起光照射光学系４１を介して励起光を照射するとともに（励起光照射ステップ）、撮像装置３１によって試料ステージ１５上の試料Ｓを走査方向に走査して、所望の解像度を有するストリップ状の部分画像Ａを取得する。
【００６８】
さらに、図７（ａ）に示すように、このような部分画像の取得を撮像面の長軸方向（Ｘ軸の正の方向）に沿って撮像位置をずらしながら複数回繰り返して、複数の部分画像Ａ、Ｂ、…、Ｉを取得する（走査ステップ）。このような試料Ｓの走査は、例えば、走査手段として機能する試料ステージ１５を駆動して試料ステージ１５と画像取得部３０の撮像装置３１との位置関係を調整することによって行われる。
【００６９】
このようにして得られた部分画像Ａ〜ＩをＸ軸方向に並べて合成することで、試料Ｓの全体の蛍光観察画像などのミクロ画像を生成することができる。このようなミクロ画像の取得方法によれば、試料Ｓの画像データを充分に高い解像度で好適に取得することが可能である。
【００７０】
なお、図７（ａ）中において、部分画像Ａ内に斜線で示したＸ軸方向を長手方向とする領域は、撮像装置３１での撮像面に対応し、Ｘ軸方向を長軸方向とする試料Ｓ上での撮像領域を示している。また、このような撮像領域に対して、シリンドリカルレンズ系を含む励起光照射光学系４１を用いている場合には、光学系４１による励起光の照射領域は、図７（ａ）中において上記の撮像領域を囲む破線によって示すように、照射領域と撮像領域とで長軸方向が互いに一致するとともに、照射領域が撮像領域よりも広くなるように設定されることが好ましい。なお、このような励起光の照射領域については、励起光照射光学系４１の具体的な構成に応じて、様々な領域に設定して良い。
【００７１】
また、蛍光観察画像などのミクロ画像の撮像条件の設定については、撮像条件設定部６５において、マクロ画像取得部２０で取得されたマクロ画像を参照して、ミクロ画像の撮像条件として画像取得範囲、及び焦点計測位置を設定することが好ましい。これにより、ミクロ画像取得に用いられるパラメータを好適に設定して、高解像度で良好な状態の試料の蛍光観察画像を取得することが可能となる。
【００７２】
具体的には、上記と同様にスライドを試料Ｓとした場合、図７（ｂ）に示すように、試料Ｓに対する画像取得範囲は、画像取得の対象であるスライド中の生体サンプルＬを含む矩形状の範囲Ｒによって設定することができる。ミクロ画像取得部３０における試料Ｓの２次元の走査（図７（ａ）参照）は、このように設定された画像取得範囲Ｒ内について行われる。また、焦点計測位置は、ミクロ画像取得部３０において、試料Ｓのミクロ画像の取得に先立って試料Ｓに対する焦点情報を取得する際に用いられるものである。ミクロ画像取得部３０では、設定された１点または複数点の焦点計測位置について焦点計測を行って、試料Ｓのミクロ画像を取得する際の焦点情報としての焦点位置、焦点面、焦点マップ等を決定する。
【００７３】
図７（ｂ）においては、マクロ画像を用いた焦点計測位置の設定について、９点の焦点計測位置を自動で設定する場合の例を示している。ここでは、試料Ｓに対して先に設定された画像取得範囲Ｒを３×３で９等分し、そのそれぞれの領域の中心点によって、９点の焦点計測位置Ｐを設定している。
【００７４】
また、ここでは、９点の焦点計測位置のうち８点については初期設定された位置が画像取得の対象物である生体サンプルＬの範囲内に含まれているため、そのまま焦点計測位置として設定される。一方、左下の１点については生体サンプルＬの範囲外にあるため、この左下の焦点計測位置については、例えば画像取得範囲Ｒ内で中心に向けて移動するなどの方法で求められる位置Ｑを焦点計測位置として設定しても良い。あるいは、このような位置については焦点計測位置から除外しても良い。また、このような焦点計測位置については、自動ではなく操作者による手動で設定する構成としても良い。
【００７５】
以上説明した例のように、試料Ｓをスライドとした場合、ミクロ画像を取得するための撮像条件については、好ましくは、まず、マクロ画像取得部２０で取得されたマクロ画像を参照して、ミクロ画像の撮像条件として生体サンプルＬを含む画像取得範囲Ｒ、及び所定の点数の焦点計測位置Ｐを設定する。そして、ミクロ画像取得部３０において焦点計測位置Ｐに基づいて試料Ｓに対する焦点位置または焦点面などについての焦点情報を取得するとともに、得られた焦点情報、及び設定された画像取得範囲Ｒなどの撮像条件に基づいて、試料Ｓの蛍光観察画像などのミクロ画像の取得が行われる。
【００７６】
また、ミクロ画像処理部６９における試料Ｓの蛍光観察画像の画像データの作成は、例えば図７（ａ）に示した複数の部分画像Ａ、Ｂ、…、Ｉを元にして、図８に示すように行われる。ここでは、ミクロ画像取得部３０の撮像装置３１で取得されたミクロ画像の画像データとして、ストリップ状の部分画像Ａ、Ｂ、Ｃ、…の画像データ群が、画像データ通信Ｉ／Ｆ６７を介して制御装置６０に入力される。
【００７７】
ミクロ画像処理部６９は、これらの複数の部分画像を撮像領域の長手方向に並べて合成することにより、試料Ｓの全体に対する蛍光観察画像となる画像データを生成して試料データとする（画像合成ステップ）。これにより、ミクロ画像処理部６９は、複数の部分画像を合成して試料Ｓの蛍光観察画像を生成する画像合成手段として機能する。この画像処理部６９によって生成された試料データは、例えば、バーチャル顕微鏡での蛍光観察画像データとして利用することができる。
【００７８】
また、本実施形態においては、撮像装置３１で取得された複数の部分画像Ａ、Ｂ、…、Ｉのそれぞれについてシェーディング補正、あるいはさらに必要に応じてダーク補正が行われる。補正データ記憶部７６には、蛍光光学系ユニット４４に対応したシェーディング補正データが記憶されて用意される（補正データ記憶ステップ）。また、シェーディング補正に加えてダーク補正を行う場合には、補正データ記憶部７６には、設定された露光時間に対応したダーク補正データが記憶されて用意される。
【００７９】
画像補正処理部７５は、これらのシェーディング補正データ、ダーク補正データを参照し、撮像装置３１で取得された画像に対して必要なシェーディング補正、あるいはさらにダーク補正を行う（画像補正処理ステップ）。ここで使用される補正データについては、あらかじめ用意された補正データ、あるいは本測定に先立って予備的な測定を行って取得された補正データを用いることができる。
【００８０】
本実施形態による蛍光画像取得装置、及び蛍光画像取得方法の効果について説明する。
【００８１】
上記した蛍光画像取得装置、及び蛍光画像取得方法においては、試料Ｓの高解像度の画像を取得する画像取得手段であるミクロ画像取得部３０において、第１の方向を長手方向とする画像を取得する撮像装置３１を用いる。そして、この撮像装置３１によって第２の方向を走査方向として、撮像位置を第１の方向にずらしながら試料Ｓを複数回走査し、得られた複数の部分画像をミクロ画像処理部６９で合成することで試料Ｓの蛍光観察画像を取得している。これにより、試料Ｓの蛍光観察画像を充分に高い解像度で効率良く取得することが可能となる。
【００８２】
さらに、試料Ｓに対する励起光照射光学系４１を、ダイクロイックミラー４５を含む蛍光光学系ユニット４４を用いた落射照明光学系として構成するとともに、補正データ記憶部７６において蛍光光学系ユニット４４に対応させてシェーディング補正データを用意しておき、この補正データを用いて画像補正処理部７５において複数の部分画像のそれぞれについてシェーディング補正を行っている。
【００８３】
ここで、試料Ｓの蛍光測定においては、励起光源４０、及びダイクロイックミラー４５を含む励起光照射光学系４１による試料Ｓに対する照明ムラ、あるいは蛍光観察画像の取得に用いられる撮像装置３１での感度ムラ、信号ムラ等に起因して、例えば撮像装置３１で取得される画像の長手方向においてシェーディングが発生する。また、上記構成では、蛍光測定の対象とする試料Ｓの種類や蛍光測定の具体的な方法等により、使用する蛍光光学系ユニット４４を交換する場合がある。
【００８４】
例えば、蛍光光学系ユニット４４においてダイクロイックミラー４５に加えて蛍光フィルタが設けられている場合、複数種類の蛍光光学系ユニットから、測定しようとする蛍光に合った特性の蛍光フィルタを有する光学系ユニットが選択されて用いられる。このように、励起光照射光学系４１に適用される蛍光光学系ユニット４４が代わると、蛍光観察画像の取得において発生するシェーディング特性も変化することとなる。また、蛍光光学系ユニット４４において励起フィルタが設けられている場合も同様である。
【００８５】
これに対して、上記構成によれば、蛍光光学系ユニット４４に対応したシェーディング補正データを用意しておくことにより、使用する蛍光光学系ユニット毎に最適な補正データを用いて、画像に対するシェーディング補正を行うことができる。これにより、高解像度での試料の蛍光観察画像を好適な状態で取得することが可能となる。また、試料Ｓを２次元に走査することで取得される複数の部分画像のそれぞれについてシェーディング補正を行うことにより、それらの部分画像を合成して生成される蛍光観察画像において、隣接する部分画像の境界で不自然な画像変化（例えば不連続な輝度変化）が発生するなどの画質の劣化が防止される。
【００８６】
このようなシェーディング補正は、上記したように励起光照射光学系４１や画像取得部３０などの光学系に起因するデータばらつきについての補正である。したがって、シェーディング補正データは、均一な蛍光試料を較正用試料とした蛍光測定を行うことによって取得することができる。また、このようなシェーディング補正データとしては、例えば、外部から制御装置６０に入力された補正データを用いることができる。あるいは、較正用に行われた蛍光測定で取得された画像を参照して、制御装置６０のミクロ画像処理部６９において作成された補正データを用いても良い。この場合、ミクロ画像処理部６９は、補正データ作成手段として機能する。
【００８７】
また、画像補正処理部７５で行われる補正については、上記したように、補正データ記憶部７６において、撮像装置３１での露光時間に対応させてダーク補正データを用意しておき、このダーク補正データを用いて複数の部分画像のそれぞれについてダーク補正を行うこととしても良い。このように、撮像装置３１で取得される画像に対してシェーディング補正に加えてダーク補正を行うことにより、得られる試料Ｓの蛍光観察画像を、より高精度な画像とすることが可能となる。
【００８８】
ここで、試料Ｓの蛍光測定においては、試料Ｓで発生する蛍光量などに応じて、撮像装置３１による撮像の露光時間を変更する場合がある。また、ダーク補正による補正量は、露光時間によって異なる。したがって、上記のように露光時間に対応したダーク補正データを用意しておくことにより、試料Ｓに対して設定された露光時間毎に最適な補正データを用いて、画像に対するダーク補正を行うことができる。なお、上記したシェーディング補正データについても、露光時間に応じて取得しておくことによって、さらにその精度を向上することができる。
【００８９】
このようなダーク補正は、蛍光観察画像の取得に用いられる撮像装置３１が暗中で有するダーク出力についての補正である。したがって、ダーク補正データは、暗中の条件下で撮像装置３１を用いて撮像を行うことで取得することができる。また、ダーク補正データの作成等については、シェーディング補正データに関して上述した通りである。
【００９０】
図４に示した画像補正処理部７５、及び補正データ記憶部７６については、具体的にはミクロ用撮像装置３１内、または制御装置６０内に設けることができる。あるいは、撮像装置３１、制御装置６０とは別に画像補正処理装置として設ける構成としても良い。
【００９１】
図９は、蛍光観察画像の取得に用いられる撮像装置及び制御装置の構成の一例を示すブロック図である。本構成例では、画像補正処理部及び補正データ記憶部は撮像装置３１内に設けられている。具体的には、撮像装置３１は、１次元アレイまたは２次元アレイ状に配列された複数の画素を有する光検出部３１ａと、光検出部３１ａの画素から出力された電荷に対してＡ／Ｄ変換を行うＡ／Ｄ変換部３１ｂと、画像補正処理部７５ａと、補正データ記憶部７６ａと、画像データ通信Ｉ／Ｆ３１ｃとを有している。
【００９２】
また、制御装置６０は、画像データ通信Ｉ／Ｆ６７と、ハードディスクなどの記憶装置６０ａと、メモリ６０ｂとを有して構成されている。このような構成において、制御装置６０に外部から入力された補正データ、あるいはミクロ画像処理部６９において作成された補正データは、記憶装置６０ａに格納される。撮像装置３１の補正データ記憶部７６ａは、通信Ｉ／Ｆ３１ｃ、６７を介して、記憶装置６０ａに格納された必要な補正データを取得する。そして、この補正データを用いて、画像補正処理部７５ａにおいて画像に対する補正が行われる。なお、画像データ通信Ｉ／Ｆとしては、例えば CameraLink I/F を用いることができる。
【００９３】
図１０は、撮像装置及び制御装置の構成の他の例を示すブロック図である。本構成例では、画像補正処理部及び補正データ記憶部は制御装置６０内に設けられている。具体的には、撮像装置３１は、光検出部３１ａと、Ａ／Ｄ変換部３１ｂと、画像データ通信Ｉ／Ｆ３１ｃとを有している。
【００９４】
また、制御装置６０は、画像データ通信Ｉ／Ｆ６７と、メモリ６０ｂと、画像補正処理部７５ｂと、補正データ記憶部７６ｂとを有して構成されている。このような構成において、補正データは、制御装置６０内に設けられた補正データ記憶部７６ｂに直接格納される。そして、この補正データを用いて、画像補正処理部７５ｂにおいて画像に対する補正が行われる。なお、補正データ記憶部７６ｂは、例えばハードディスクなどの記憶装置によって構成される。
【００９５】
なお、上記実施形態の蛍光画像取得装置では、励起光照射光学系４１に設置されたシリンドリカルレンズ系４６により、試料Ｓに対する照射領域が所定の方向を長軸方向とする領域となるように励起光源４０からの励起光束を整形するとともに、試料Ｓでの励起光の照射領域の長軸方向と、撮像装置３１による視野となる撮像領域の長軸方向とを互いに一致させている。これにより、試料Ｓに供給される励起光の光量のうちで撮像装置３１の視野外に照射される余分な励起光の光量が低減される。
【００９６】
また、上記構成では、試料Ｓへの励起光の照射領域について、照射領域が撮像領域よりも広くなるように設定している。これにより、色収差によって波長に応じた照射領域の変化が生じている場合であっても、撮像装置３１による撮像領域を、励起光の各波長成分での照射領域内に確実に位置させることが可能となる。
【００９７】
また、上記した蛍光画像取得装置においては、図４に示したように、励起光照射光学系４１において、励起光源４０からの励起光を反射して試料Ｓへと照射するとともに、試料Ｓからの蛍光を画像取得部３０の撮像装置３１へと通過させるダイクロイックミラー４５を含む蛍光光学系ユニット（落射照明光学系ユニット）４４を設けた構成としている。このような構成によれば、試料Ｓに対する励起光の落射照明光学系と、試料Ｓにおいて発生した蛍光の画像取得部３０への導光光学系とを好適に両立させることができる。
【００９８】
また、このような蛍光光学系ユニット４４については、図５に示したように、ミクロ画像取得用の光軸３０ａに対して、光軸３０ａを含む挿入位置と、光軸３０ａを外れた待機位置との間で移動可能に構成されていることが好ましい。このような構成では、さらに、透過光源３６による試料Ｓの透過観察画像の取得と、励起光源４０による蛍光観察画像の取得とを好適に両立させることができる。
【００９９】
図１１及び図１２は、蛍光光学系ユニット（蛍光キューブ）４４の移動機構を含む励起光の落射照明光学系の構成の一例を示す斜視図である。本構成例では、励起光源４０に対して所定方向に配置された光学系支持板４１ａ上に、光源４０側から順にシリンドリカルレンズ系４６、落射照明用シャッタ４３、フォーカスレンズ系４７、コリメートレンズ系４８、及び蛍光光学系ユニット４４が設置されている。また、蛍光光学系ユニット４４に対して移動機構４４ａが設けられており、蛍光光学系ユニット４４を待機位置（図１１、図５（ａ））、及び挿入位置（図１２、図５（ｂ））の間で移動することが可能な構成となっている。なお、図１１及び図１２においては、この移動機構４４ａの具体的な構造については、図示を省略している。
【０１００】
また、このような蛍光光学系ユニット４４では、上記したように、必要に応じて、ダイクロイックミラー４５に加えて励起光の波長成分を選択する励起フィルタ、あるいは蛍光成分に対する蛍光フィルタ等をさらに設置して光学系ユニットを構成しても良い。また、移動機構４４ａにおいて、蛍光光学系ユニット４４の着脱、交換が可能な構成となっていることが好ましい。
【０１０１】
また、蛍光測定の対象となる試料Ｓには様々な種類のものがある。このため、励起光照射光学系４１においては、励起光の光量を調整するためのＮＤフィルタ等を必要に応じて設置するための光学素子設置部を設けておくことが好ましい。また、各レンズ系の前側焦点位置、及び後側焦点位置は、このような光学素子の設置位置等を考慮して設定することが好ましい。
【０１０２】
上記した蛍光画像取得装置において励起光源４０として放電管を用いる場合、その放電管については、励起光として白色光を供給する白色光源であることが好ましい。このような放電管としては、具体的には例えば、水銀ランプ、あるいはハロゲンランプなどが挙げられる。また、これ以外の放電管、あるいは放電管以外の光源装置を励起光源として用いても良い。そのような励起光源としては、例えばＬＥＤなどの発光素子が挙げられる。
【０１０３】
また、試料Ｓの蛍光観察画像を取得するための撮像装置としては、上記したように、１次元ＣＣＤセンサを用いることができる。また、１次元センサ以外にも、例えば、ＴＤＩ駆動が可能な２次元ＣＣＤセンサを用いることができる。このようなＴＤＩ駆動２次元センサの利用は、試料Ｓを撮像装置で走査することによる高解像度の蛍光観察画像の取得を高速化、高感度化する上で有効である。
【０１０４】
図１３は、ＴＤＩ駆動が可能な２次元ＣＣＤセンサからなる撮像装置の構成の一例を示すブロック図である。本構成例による撮像装置９０は、光検出部９１と、電荷転送部９２と、Ａ／Ｄ変換部９３とを備えている。また、この撮像装置９０は、電荷の出力端を複数有するマルチタップの構成を有している。このようなマルチタップ構造によれば、光検出部９１の各画素において生成された電荷の読み出しが高速化される。また、得られる画像に対して上記のようにシェーディング補正を行うことにより、隣接するタップ間での不自然な画像変化の発生が防止される。
【０１０５】
光検出部９１は、２次元アレイ状に配列され、それぞれ光電変換機能を有する複数の画素を有し、画素において光入射量に応じて生成された電荷を出力するように構成されている。また、光検出部９１に対し、その図中の下方に複数の画素の一方の配列方向である水平方向（図中の左右方向）に沿って、電荷転送部９２が設けられている。この電荷転送部９２は、光検出部１０を構成する複数の垂直シフトレジスタから出力されて並列に入力された電荷を、水平方向に転送して出力端から出力する水平シフトレジスタである。
【０１０６】
本構成例においては、電荷転送部９２は、水平方向について複数に分割された１６個の部分電荷転送部Ｔ０１〜Ｔ１６を有している。部分電荷転送部Ｔ０１〜Ｔ１６は、それぞれ複数かつ同数のセルを有して構成され、図中の左側から右側に向けて順に配置されている。また、部分電荷転送部Ｔ０１〜Ｔ１６のそれぞれでの電荷転送方向は、水平方向で図中の右側から左側に向かう方向であり、その左端部が電荷の出力端となっている。
【０１０７】
また、この電荷転送部９２での部分電荷転送部Ｔ０１〜Ｔ１６に対し、光検出部９１を対応する１６個の光検出領域Ｒ０１〜Ｒ１６に区分することができる。このような構成において、電荷転送部９２の第１部分電荷転送部Ｔ０１は、光検出部９１の第１光検出領域Ｒ０１内にある画素から垂直シフトレジスタによって出力された電荷を出力方向に転送して、その出力端から出力する。このとき、部分電荷転送部Ｔ０１の出力端から出力される信号は、光検出領域Ｒ０１内の複数の垂直シフトレジスタから部分電荷転送部Ｔ０１の複数のセルに並列に入力された電荷による信号が順次出力される信号列となる。電荷転送部９２の第２〜第１６部分電荷転送部Ｔ０２〜Ｔ１６、及び光検出部９１の第２〜第１６光検出領域Ｒ０２〜Ｒ１６についても、その構成は第１部分電荷転送部Ｔ０１、及び第１光検出領域Ｒ０１と同様である。
【０１０８】
これらの部分電荷転送部Ｔ０１〜Ｔ１６に対応して、Ａ／Ｄ変換部９３には、１６個のＡ／Ｄ変換器Ｃ０１〜Ｃ１６が設けられている。部分電荷転送部Ｔ０１〜Ｔ１６の出力端から出力された光検出部９１からの電荷によるアナログ信号は、Ａ／Ｄ変換器Ｃ０１〜Ｃ１６のうちの対応するＡ／Ｄ変換器においてデジタルのデータ信号へと変換されて、後段の処理回路等へと出力される。
【０１０９】
図１４は、図１３に示した撮像装置における光検出部及び電荷転送部の構成の一例を示す平面図である。本構成例においては、光検出部９１は、水平方向に４０９６セル、垂直方向に７０ラインで、２次元アレイ状の４０９６×７０画素から構成されている。また、垂直方向については、上下のそれぞれ３ラインずつがダミー領域９１ｂとされ、内側の６４ラインが光検出に用いられる領域９１ａとなっている。
【０１１０】
この光検出部９１に対応して、電荷転送部９２は、それぞれ２５６セルで１６個の部分電荷転送部Ｔ０１〜Ｔ１６によって構成されている。また、個々の部分電荷転送部の出力端側には、必要に応じてダミーセルが設けられる。また、本構成例においては、光検出部９１と電荷転送部９２との間に、光検出部９１と同様に４０９６セル、７０ラインの蓄積部９２ａが設けられている。
【０１１１】
さらに、図１４の構成においては、光検出部９１の上方に、下方の蓄積部９２ａ及び電荷転送部９２と同様の構成の蓄積部９３ａ、及び部分電荷転送部Ｔ１７〜Ｔ３２を有する電荷転送部９３を設けている。このような構成により、本構成例においては、光検出部９１の垂直シフトレジスタにおける電荷転送方向を上下２つの方向のいずれにも設定可能となっている。なお、この図１４の構成は、ＴＤＩ駆動が可能なマルチタップ構造の２次元ＣＣＤセンサの構成の一例を示すものであり、具体的にはこれ以外にも、例えばマルチタップ構造の１次元ＣＣＤセンサ、あるいはシングルタップ構造のＣＣＤセンサなど、様々な構成を用いることができる。
【０１１２】
図１３に示したようなマルチタップ構造の１次元センサまたは２次元センサを撮像装置３１として用いる場合、マルチタップ構造での１６チャンネルの出力に対してそれぞれ設けられているＡ／Ｄ変換器などの読み出し回路において、チャンネル間で特性ばらつきが生じる場合がある。このような特性ばらつきは、隣接するチャンネル間での画像の境界で不自然な画像変化が生じるなどのシェーディングの原因となる。これに対して、上記したように撮像装置３１で取得される画像に対してシェーディング補正を行う構成では、このようなマルチタップ構造に起因する画質の劣化を防止することができる。
【０１１３】
また、試料の蛍光観察画像の取得に用いられる画像取得手段は、上記実施形態においては単一の撮像装置３１を有するミクロ画像取得部３０を用いているが、画像取得手段の構成については、具体的には様々な構成を用いることが可能である。そのような構成の１つとして、試料Ｓからの蛍光を異なる３つの波長成分に分解する波長分解光学系を有するとともに、試料の蛍光観察画像を取得するための撮像装置として、波長分解光学系によって分解された３つの波長成分のそれぞれによる蛍光観察画像を取得する３つの撮像装置を含む構成を用いることができる。このような構成では、３つの撮像装置は、異なる波長成分（色成分）によってそれぞれ形成される試料の光像を取得する。これにより、３つの撮像装置のそれぞれで取得された光像に基づいて、試料のカラーでの蛍光観察画像を取得することが可能となる。
【０１１４】
図１５は、試料の蛍光観察画像の取得に用いられる画像取得部（上記実施形態におけるミクロ画像取得部３０）の変形例を示す構成図である。本構成例の画像取得部８０は、モアレ縞を抑制するためのローパスフィルタ８１と、ローパスフィルタ８１を透過した光のうち赤外線を更にカットするＩＲフィルタ８２とを有する。また、画像取得部８０は、ＩＲフィルタ８２を透過した入射光Ｌ１０を３つの波長成分の緑色光Ｌ１１、赤色光Ｌ１２及び青色光Ｌ１３に分解する波長分解光学系である色分解光学系８３を有する。
【０１１５】
色分解光学系８３は、ＩＲフィルタ８２側から順に配置された３つのプリズム（ダイクロイックプリズム）８４、８５、８６から構成されている。そして、色分解光学系８３の一部を構成するプリズム８４のうち、プリズム８５と対面する面上には赤色領域の波長の光成分を反射するダイクロイック膜８４ａが形成されている。また、プリズム８５とプリズム８６との間には、青色領域の波長の光成分を反射するダイクロイック膜８５ａが形成されている。また、これらのダイクロイック膜８４ａ、８５ａは、何れも緑色領域の波長の光成分を透過させる。
【０１１６】
従って、プリズム８４が有しＩＲフィルタ８２と対面する受光面Ｆ１０から入射した入射光Ｌ１０のうち緑色光Ｌ１１は色分解光学系８３内を直進し、プリズム８６が有する光出射面Ｆ１１から出力される。また、赤色光Ｌ１２は、ダイクロイック膜８４ａで反射した後、プリズム８４内で更に反射してからプリズム８４が有する光出射面Ｆ１２から出力される。更に、青色光Ｌ１３は、ダイクロイック膜８４ａを透過した後にダイクロイック膜８５ａによって反射し、プリズム８５内で更に反射してからプリズム８５が有する光出射面Ｆ１３から出力される。
【０１１７】
各光出射面Ｆ１１、Ｆ１２、Ｆ１３上には、それぞれ各色成分の光の分光特性を整えるためのトリミングフィルタ８７を介して、試料Ｓの蛍光観察画像を取得するための撮像装置８８であるＣＣＤセンサが設けられている。また、これらの３つの撮像装置８８のそれぞれは、撮像制御部８９に接続されている。このように、色分解光学系８３と、３つの撮像装置８８とを用いる構成によれば、上記したように試料Ｓのカラーでの蛍光観察画像を取得することが可能となる。
【０１１８】
このような場合には、補正データ記憶部７６において、３つの撮像装置８８のそれぞれによって取得される画像に対する３種類のシェーディング補正データを記憶しておき、画像補正処理部７５において３つの撮像装置８８のそれぞれについて対応するシェーディング補正データを用いてシェーディング補正を行うことが好ましい。これにより、画像取得部に含まれる３つの撮像装置のそれぞれにおいて、高解像度での試料の蛍光観察画像を好適な状態で取得することが可能となる。このことは、画像に対してダーク補正を行う場合にも同様である。また、このような構成では、蛍光フィルタとしてトリプルバンドパスフィルタを設けても良い。
【０１１９】
ここで、図１５に示した構成において、３つの撮像装置８８としてそれぞれ図１３に示した１６タップ構造のＣＣＤセンサを用いた場合における画像のシェーディング補正について、具体例とともに説明する。図１６は、３つの撮像装置のそれぞれで取得される画像データの一例を示すグラフである。ここでは、撮像装置での撮像面の長手方向（４０９６画素）に沿った１次元の画像データを示している。また、１６タップ構造における１タップ当たりの画素数は２５６である。
【０１２０】
図１６のグラフにおいて、横軸は長手方向での画素を示し、縦軸は各チャンネルでの輝度値（８ｂｉｔ、０〜２５５）を示している。また、グラフＲ１は赤色光用の撮像装置で得られた画像データを示し、グラフＧ１は緑色光用の撮像装置で得られた画像データを示し、グラフＢ１は青色光用の撮像装置で得られた画像データを示している。これらのグラフでは、カメラのアナログゲインをすべてのタップ、すべての撮像装置で１倍に設定している。また、アナログオフセットについては、ダークレベルが一様となるように調整している。
【０１２１】
図１６に示すグラフＲ１、Ｇ１、Ｂ１では、そのそれぞれにおいて、光学系、及び撮像装置でのタップ間の特性ばらつき等に起因するシェーディングが生じている。また、各グラフ間では、ＲＧＢでの分光特性の違いによって輝度値のレベルが異なっている。また、図１７のグラフＲ２、Ｇ２、Ｂ２は、図１６に示したグラフＲ１、Ｇ１、Ｂ１の画像データについてアナログゲインを調整した後の画像データを示している。ここでは、ＲＧＢのレベルはほぼ同程度となっているが、タップ間の特性ばらつき等によるシェーディングの影響は残っている。
【０１２２】
一方、図１８のグラフＲ３、Ｇ３、Ｂ３は、図１７に示したグラフＲ２、Ｇ２、Ｂ２に対してさらに、上記した方法によってシェーディング補正を行った後の画像データを示している。これらのグラフでは、上記したすべてのシェーディング要素の影響が除かれて、均一の画像データが得られていることがわかる。なお、図１７及び図１８に示すグラフにおいては、輝度値の縦軸について一部を拡大して示している。
【０１２３】
上記構成の蛍光画像取得装置を用いた試料Ｓの画像取得方法の一例について説明する。図１９は、試料の蛍光画像取得方法、及び蛍光画像取得装置の各部の駆動方法について概略的に示す図である。まず、画像取得を実行する試料であるスライドＳを試料格納部１１から取り出して、試料搬送部１４で搬送して試料ステージ１５上の所定位置にロードする（ステップ１）。そして、マクロ画像取得部２０により、スライドＳのマクロ画像を取得する。
【０１２４】
スライドＳのマクロ画像の取得においては、スライドＳ中の生体サンプルＬの画像を取得する際には、暗視野光源２６が用いられる（ステップ２）。また、スライドＳのラベルなどの他の部分の画像を取得する際には、明視野光源２７が用いられる（ステップ３）。また、マクロ画像の取得においては、ミクロ画像取得用の光学系では、透過照明用のシャッタ３８、及び励起光の落射照明用のシャッタ４３はともに閉じた状態である。なお、図１９においてはシャッタが閉じた状態を「×」で示し、シャッタが開いた状態を「○」で示している。
【０１２５】
マクロ画像取得部２０で取得されたマクロ画像の画像データは、制御装置６０のマクロ画像処理部６８へと入力され、マクロ画像に対して必要な処理が行われる。続いて、撮像条件設定部６５において、スライドＳのマクロ画像を参照して、蛍光観察画像であるミクロ画像の撮像条件として、画像取得の対象物である生体サンプルＬを含む範囲に応じた画像取得範囲Ｒが設定され、さらに、焦点計測位置Ｐが設定される。
【０１２６】
一方、マクロ画像の取得が完了したスライドＳは、試料搬送部１４、または試料ステージ１５により、マクロ画像取得部２０での画像取得位置から移動され、ミクロ画像取得部３０での画像取得位置にセットされる。そして、設定された焦点計測位置Ｐのそれぞれに対して焦点計測を行うことによる自動焦点合わせが実行され、ミクロ画像の撮像条件として、画像取得範囲Ｒでの対象物である生体サンプルＬの画像取得についての焦点情報が取得される（ステップ４）。
【０１２７】
この焦点情報の取得においては、透過照明用のシャッタ３８が開の状態とされ、透過光源３６からの透過照明によって焦点情報の取得が行われる（図５（ａ）参照）。また、このとき、蛍光光学系ユニット４４については、必要に応じて待機位置（ＯＵＴ）または挿入位置（ＩＮ）に配置される。また、蛍光測定の対象となるスライドＳに対して、露光時間の設定が行われる（ステップ５）。ここでは、落射照明用のシャッタ４３が開の状態とされるとともに、蛍光光学系ユニット４４が挿入位置（ＩＮ）に配置され、励起光源４０からの励起光の落射照明によって露光時間の設定が行われる（図５（ｂ）参照）。
【０１２８】
続いて、取得された焦点情報、及び設定された露光時間に基づいて、スライドＳ中の生体サンプルＬの蛍光観察画像であるミクロ画像が取得される（ステップ６）。このとき、撮像装置３１によってスライドＳを走査して部分画像を取得している際には、落射照明用のシャッタ４３が開の状態とされ、蛍光光学系ユニット４４が挿入位置に配置される。また、部分画像の取得の間で撮像位置を移動する際には、蛍光光学系ユニット４４は挿入位置に配置されたままであるが、落射照明用のシャッタ４３は閉の状態とされる。以上のステップによってスライドＳについて蛍光観察画像の取得を終了したら、そのスライドＳをアンロードして試料格納部１１へと戻す（ステップ７）。
【０１２９】
次に、上記した補正データ記憶部７６に保持される補正データの取得方法、及び補正データを用いた蛍光観察画像の取得方法について説明する。なお、以下の図２０及び図２１に示す画像取得等の動作は、基本的には高解像度の蛍光観察画像を取得するためのミクロ画像取得部３０を用いて行われるものである。
【０１３０】
図２０は、シェーディング補正データの取得方法の一例を示すフローチャートである。まず、蛍光測定の対象となる試料Ｓに対して適切な蛍光光学系ユニット４４を選択して、光学系の所定位置にセットする（ステップＳ０１）。また、顕微鏡装置１０の試料格納部１１の所定の格納位置に、シェーディング補正データ取得用の較正用スライドをセットする（Ｓ０２）。較正用スライドとしては、上記したように蛍光物質が均一に入れられたスライドを用いることができる（例えば、特開平１１−３５２２９９号公報参照）。
【０１３１】
次に、較正用スライドを試料ステージ１５上にロードする（Ｓ０３）。そして、ミクロ画像取得部３０の撮像装置３１により、シェーディング補正用の較正データとなる較正用スライドの画像データを取得する（Ｓ０４）。ここでは、Ｘ軸方向を長手方向とする１次元画像を取得可能な１次元センサまたはＴＤＩ駆動２次元センサによって、較正用スライドをＹ軸方向に１回走査して、較正用部分画像を取得する。
【０１３２】
また、取得された較正用の画像データについて、制御装置６０のミクロ画像処理部６９において、必要な画像処理が行われる（Ｓ０５）。ここでの画像処理としては、例えばゴミ除去処理がある。すなわち、較正用部分画像の取得では、その走査範囲において較正用スライド上にゴミがある場合がある。これに対して、まず、得られた部分画像でＸ軸方向の１画素毎にＹ軸方向での最頻値を求め、この最頻値から±数％の範囲外の画素をゴミと判定し、その画素を含む画素ラインを除く。そして、残ったラインについて、１画素毎にＹ軸方向の平均値を求めるなどの処理を行って、最終的なシェーディング補正データＤ１を作成する（Ｓ０６）。
【０１３３】
作成されたシェーディング補正データＤ１は、撮像装置３１内または制御装置６０内にある補正データ記憶部７６に、セットされている蛍光光学系ユニット４４と対応付けて記憶される。シェーディング補正データＤ１の作成、記憶が終了したら、較正用スライドをアンロードし（Ｓ０７）、シェーディング補正データの取得作業を終了する。なお、撮像装置として３つの撮像装置が用いられており、対応する３種類のシェーディング補正データ（例えばＲＧＢ３種類の補正データ）を取得する必要がある場合には、それぞれの撮像装置で画像が取得される波長成分に対応した３種類の較正用スライドを用意し、そのそれぞれについて較正データの取得、及び補正データの作成を行うことが好ましい。
【０１３４】
図２１は、ダーク補正データ及び試料の蛍光観察画像の取得方法の一例を示すフローチャートである。まず、実際に蛍光測定の対象となる試料のスライドＳを試料格納部１１にセットする（Ｓ１１）。ここで、蛍光光学系ユニット４４については、先に行われているシェーディング補正データの取得時に適切なユニットが選択されてセットされている。
【０１３５】
次に、スライドＳを試料ステージ１５上にロードする（Ｓ１２）。そして、制御装置６０において、そのスライドＳの蛍光観察画像を取得するために好適な露光時間が設定される（Ｓ１３）。また、シャッタを閉じた暗中の条件において、ミクロ画像取得部３０の撮像装置３１により、設定された露光時間に対応したダーク補正用の較正データが取得され（Ｓ１４）、制御装置６０のミクロ画像処理部６９において、ダーク補正データＤ２が作成される（Ｓ１５）。作成されたダーク補正データＤ２は、撮像装置３１内または制御装置６０内にある補正データ記憶部７６に、設定された露光時間と対応付けて記憶される。
【０１３６】
続いて、スライドＳに対して蛍光測定の本測定が行われ、その蛍光観察画像の画像データが取得される（Ｓ１６）。このとき、画像補正処理部７５において、補正データ記憶部７６に記憶されたシェーディング補正データ、及びダーク補正データを参照して、必要なデータ補正が行われる。蛍光観察画像データの取得が終了したら、スライドＳをアンロードし（Ｓ１７）、スライドＳの蛍光観察画像の取得作業を終了する。なお、蛍光測定の対象となるスライドＳが複数ある場合には、必要なステップを繰り返して実行する。
【０１３７】
本発明による蛍光画像取得装置、及び蛍光画像取得方法は、上記した実施形態及び構成例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、上記実施形態では、高解像度の蛍光観察画像を取得するためのミクロ画像取得部３０に加えて、マクロ画像取得部２０を設けた構成としているが、このようなマクロ画像取得部２０等については、不要であれば設けない構成としても良い。また、蛍光観察画像を取得するための画像取得部を含む光学系の具体的な構成については、図４はその一例を示すものであり、具体的には様々な構成を用いて良い。
【０１３８】
また、上記において、ミクロ画像取得部３０について３板ＣＣＤを例示したが、これに限定されるものではなく、例えば単板ＣＣＤなど具体的には様々な変形が可能である。このように単板ＣＣＤを用いる場合、光源または単板ＣＣＤセンサ前において波長選択フィルタを交換可能としておき、３回画像を取得してそれらを画像合成する構成を用いることができる。あるいは、波長選択せずに単色で画像を取得しても良い。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
本発明は、高解像度での試料の蛍光観察画像を好適に取得することが可能な蛍光画像取得装置、及び蛍光画像取得方法として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】蛍光画像取得装置の一実施形態の構成を示すブロック図である。
【図２】顕微鏡装置及び制御装置の構成の一例を示すブロック図である。
【図３】マクロ画像取得用の光学系の構成の一例を概略的に示す図である。
【図４】蛍光観察画像であるミクロ画像取得用の光学系の構成の一例を概略的に示す図である。
【図５】蛍光光学系ユニットの待機位置及び挿入位置について示す図である。
【図６】図４に示したミクロ画像取得用の光学系の構成の具体例を示す図である。
【図７】試料の観察画像の取得方法を模式的に示す図である。
【図８】ミクロ画像を用いた試料データの作成について模式的に示す図である。
【図９】撮像装置及び制御装置の構成の一例を示すブロック図である。
【図１０】撮像装置及び制御装置の構成の他の例を示すブロック図である。
【図１１】励起光の落射照明光学系の構成の一例を示す斜視図である。
【図１２】励起光の落射照明光学系の構成の一例を示す斜視図である。
【図１３】撮像装置の構成の一例を示すブロック図である。
【図１４】図１３に示した撮像装置における光検出部及び電荷転送部の構成の一例を示す平面図である。
【図１５】画像取得部の変形例を示す構成図である。
【図１６】画像データの一例を示すグラフである。
【図１７】ゲイン調整後の画像データの一例を示すグラフである。
【図１８】シェーディング補正後の画像データの一例を示すグラフである。
【図１９】試料の蛍光画像取得方法、及び蛍光画像取得装置の各部の駆動方法について示す図である。
【図２０】シェーディング補正データの取得方法を示すフローチャートである。
【図２１】ダーク補正データ及び試料の蛍光観察画像の取得方法を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【０１４１】
１０…顕微鏡装置、１１…試料格納部、１２…扉、１３…インターロック機構、１４…試料搬送部、１５…試料ステージ、１６…ステージ制御部、１７…マクロ用光源制御部、１８…ミクロ用光源制御部、２０…マクロ画像取得部、２１…マクロ用撮像装置、２２…撮像光学系、２５…マクロ用光源、２６…暗視野光源、２７…明視野光源、３０…ミクロ画像取得部、３１…ミクロ用撮像装置、３２…対物レンズ、３３…Ｚステージ、３４…導光光学系、３５…ミクロ用光源、３６…透過光源、３７…透過照明光学系、３８…透過照明用シャッタ、４０…励起光源、４１…励起光照射光学系、４２…導光光学系、４３…落射照明用シャッタ、４４…蛍光光学系ユニット、４５…ダイクロイックミラー、４６…シリンドリカルレンズ系、４７…フォーカスレンズ系、４８…コリメートレンズ系、
６０…制御装置、６１…マクロ画像取得制御部、６２…ミクロ画像取得制御部、６５…撮像条件設定部、６６、６７…画像データ通信Ｉ／Ｆ、６８…マクロ画像処理部、６９…ミクロ画像処理部、７１…表示装置、７２…入力装置、７５…画像補正処理部、７６…補正データ記憶部。
【図１】
2008051773.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2008051773.tif 000017
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図１６】
2008051773.tif 000021
【図１７】
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【図１８】
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