(57)【要約】 【課題】  本発明は自己免疫性皮膚疾患、特に水疱性類天疱瘡に対する新規な医薬の提供を目的とする。【解決手段】ヒトXVII型コラーゲンに対する自己抗体と特異的に結合するポリペプチドを有効成分とする自己免疫性皮膚疾患治療薬であり、好ましくはポリペプチドがヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域を構成するアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列からなる、自己免疫性皮膚疾患治療薬である。本発明の自己免疫性皮膚疾患治療薬は、疾患の原因因子に対する特異性の高いポリペプチドを利用するものであり、ステロイド剤などの従来の治療剤に比べて副作用等の心配が無く、自己免疫性皮膚疾患の発症要因である自己抗体に対して作用するので、当該疾患の根本的な治療法を提供することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトXVII型コラーゲンに対する自己抗体と特異的に結合するポリペプチドを有効成分とする、自己免疫性皮膚疾患治療薬。  
【請求項２】
自己抗体がヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域に結合する抗体である、請求項１に記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。
【請求項３】
ポリペプチドがヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域を構成するアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列を含む、請求項２に記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。
【請求項４】
ヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域を構成するアミノ酸配列が、配列番号１に示されるアミノ酸配列である、請求項３に記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。
【請求項５】
ヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域を構成するアミノ酸配列の部分アミノ酸配列が、配列番号２〜６の何れかに記載のアミノ酸配列である、請求項３に記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。
【請求項６】
自己免疫性皮膚疾患が水疱性類天疱瘡である、請求項１〜５の何れかに記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は自己免疫性皮膚疾患治療薬、特に水疱性類天疱瘡に対して治療効果を有するポリペプチドからなる医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の高齢化に伴い、自己免疫性皮膚疾患、特に水疱性類天疱瘡患者数の増加が指摘されている。水疱性類天疱瘡は、皮膚科領域において最も頻度の高い自己免疫水疱症の１つであり、その特徴的臨床症状としては、浮腫性紅斑や水疱の発生と破損による糜爛の形成が挙げられる。糜爛が全身に生じると、細菌感染、体内の水分や蛋白などの喪失による全身浮腫、血液中の電解質異常および脱水などを引き起こすことがある。また病理組織学的所見としては、表皮下の水疱、好酸球主体の炎症細胞浸潤、蛍光抗体直接法による基底膜部領域へのIgG、C3の沈着が認められる。
【０００３】
水疱性類天疱瘡による水疱は、表皮基底膜部のヘミデスモソームを構成するタンパク質であるXVII型コラーゲン（180kDaの類天疱瘡抗原であり、BP180又はBPAG2とも呼ばれる）及びBP230（230kDa類天疱瘡抗原であり、BPAG1とも呼ばれる）に対する自己抗体が産生されることにより生じる。特に、XVII型コラーゲンのNC16A領域に対する自己抗体が当該領域に結合することにより、XVII型コラーゲンの機能が阻害されることが、水疱性類天疱瘡の病因であると考えられている（非特許文献１）。またXVII型コラーゲンは、水疱性類天疱瘡の他に、妊娠性疱疹、瘢痕性類天疱瘡、線状IgA水疱症といった自己免疫性疾患の抗原蛋白質であることも推測されている（非特許文献２）
従来、水疱性類天疱瘡の治療は、副腎皮質ホルモン等のステロイド薬の外用、テトラサイクリン系の抗生物質、ニコチン酸アミド又は副腎皮質ホルモン剤の内服による全身投与、免疫グロブリンの大量投与あるいは血漿交換療法などの対症療法が行われている。しかしながら、水疱性類天疱瘡を根本的に治癒することのできる方法は現在までのところ報告が無く、前記の対症療法でさえ、非特異的な免疫抑制作用による感染症併発や、糖尿病誘発等の副作用が発生するなどの問題を抱えている。
【非特許文献１】清水宏著、「あたらしい皮膚科学」、中山書店、2005年、第218-220頁
【非特許文献２】Yancey KB、The Journal of Clinical Investigation、2005年、第115巻、第825-828頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は自己免疫性皮膚疾患、特に水疱性類天疱瘡に対する新規な医薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、水疱性類天疱瘡を発症するモデル動物にヒトXVII型コラーゲンとこれに対する自己抗体との結合を阻害することのできるペプチドを投与することによって、当該モデル動物において水疱性類天疱瘡を治療することができることを確認し、下記の各発明を完成させた。
【０００６】
（１）ヒトXVII型コラーゲンに対する自己抗体と特異的に結合するポリペプチドを有効成分とする、自己免疫性皮膚疾患治療薬。  
（２）自己抗体がヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域に結合する抗体である、（１）に記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。
【０００７】
（３）ポリペプチドがヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域を構成するアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列を含む、（２）に記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。
【０００８】
（４）ヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域を構成するアミノ酸配列が、配列番号１に示されるアミノ酸配列である、（３）に記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。
【０００９】
（５）ヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域を構成するアミノ酸配列の部分アミノ酸配列が、配列番号２〜６の何れかに記載のアミノ酸配列である、（３）に記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。
【００１０】
（６）自己免疫性皮膚疾患が水疱性類天疱瘡である、（１）〜（５）の何れかに記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の自己免疫性皮膚疾患治療薬は、疾患の原因因子に対する特異性の高いポリペプチドを利用するものであり、ステロイド剤などの従来の治療剤に比べて副作用等の心配が無い。また、対症療法ではなく、自己免疫性皮膚疾患の発症要因である自己抗体そのものに対して作用するので、当該疾患の根本的な治療法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の自己免疫性皮膚疾患治療薬は、ヒトXVII型コラーゲン（以下、COL17と表すこととする）に対する自己抗体と特異的に結合するポリペプチドを有効成分とする。その様なポリペプチドは、COL17を構成するアミノ酸配列の部分アミノ酸配列、特にCOL17のNC16A領域を構成するアミノ酸配列、さらには同領域の部分配列からなるポリペプチドを挙げることができる。COL17の全アミノ酸配列は公知であり、またNC16A領域も既に特定されている（Gatalica B. ら、 Am J Hum Genet.、1997年、第60巻、第352-365頁）。
【００１３】
本発明を構成するポリペプチドの好ましい例は、COL17のNC16A領域を構成するアミノ酸配列（配列番号１）からなるポリペプチド、又はNC16A領域を構成するアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなり、かつヒトXVII型コラーゲンに対する自己抗体と特異的に結合する機能を有するポリペプチド、又はそれらのポリペプチドと他のポリペプチドとの融合タンパク質の形態にあるポリペプチドである。NC16A領域の部分アミノ酸配列の例としては、配列番号２〜６に示される各アミノ酸配列を挙げることができる。この配列番号１〜６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、COL17のNC16A領域に対する自己抗体と結合することで、当該自己抗体とCOL17のNC16A領域との結合を阻害し、その結果、水疱性類天疱瘡に対する治療効果を奏するものと期待される。また、COL17のNC16A領域を構成するアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列からなるポリペプチドとの融合タンパク質を構成する他のポリペプチドは、XVII型コラーゲンに対する自己抗体と特異的に結合する機能を損なわず、ヒトに対して望ましくない生理活性を示さないポリペプチドであれば、いずれも使用可能である。  
後に示す実施例から明らかなように、本発明にかかるポリペプチドは、水疱性類天疱瘡を発症するモデル動物に投与されることによって、該動物において水疱性類天疱瘡の症状である水疱の発生を抑制することができる。
【００１４】
本発明では、上記に述べたポリペプチドの機能を備える限り、数個のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドも、十個以上あるいは数十個以上のアミノ酸残基からなるポリペプチドも利用可能であり、従って本発明にいうポリペプチドについて、構成するアミノ酸残基の個数には格別の制限はない。
【００１５】
また、COL17は水疱性類天疱瘡の他に、妊娠性疱疹、瘢痕性類天疱瘡、線状IgA水疱症といった自己免疫性疾患の抗原蛋白質であることも推測されている（前記非特許文献２）。従って本発明にかかるポリペプチドは、妊娠性疱疹、瘢痕性類天疱瘡、線状IgA水疱症といった自己免疫性皮膚疾患に対しても治療効果を有すると期待される。
【００１６】
本発明にかかるポリペプチドは、種々の保護基で修飾されたアミノ酸を原料として化学合成的に製造することができる。ポリペプチドを遺伝子や宿主細胞を用いずに有機化学的に合成する方法は当業者に広く知られている。例えば、「第５版 実験化学講座16 有機化合物の合成ＩＶ」（相本三郎ら著、日本化学会編）などは、ポリペプチドの化学合成法を種々紹介しており、本発明のポリペプチドはこれらのいずれの方法を用いても合成することが出来る。また、一般にペプチドシンセサイザーと称される市販機器を用いて合成することもできる。
【００１７】
また、本発明にかかるポリペプチドは、それをコードするDNAに種々の公知の遺伝子組み換え手法を適用することで、組み換えポリペプチドとして製造することも可能である。典型的には、本発明にかかるポリペプチドをコードするDNAを適当なDNA合成機を用いて合成し、当該技術分野における参考書、例えばSambrookらのMolecular Cloning：A laboratory Manual、第2版（Cold Spring Harbor laboratory Press、1989年等）に紹介されている種々の手法を適当に選択あるいは組み合わせて本発明のポリペプチドを発現する発現ベクターを構築し、大腸菌等の適当な宿主細胞をこの発現ベクターで形質転換させ、当該ポリペプチドを生産させればよい。その際、His-tagの付加などの様に、組み換えポリペプチドの製造に利用される種々の操作を加えてもよい。
【００１８】
また本発明にかかるポリペプチドに、蛍光物質や放射性物質等の適当な標識化合物を付したり、種々の化学修飾物質やポリエチレングリコール等の高分子と結合させたり、不溶性担体へ結合させたりすることもできる。
【００１９】
本発明の自己免疫性皮膚疾患治療薬は、本発明にかかる前記ポリペプチドの他に、これらの作用を損なわない範囲で、医薬の製剤化のために一般的に利用される種々の賦形剤や他の医薬活性成分、例えば従来用いられてきたステロイド剤や抗生物質等を含んでいてもよい。特に、本発明の自己免疫性皮膚疾患治療薬は、前記ポリペプチドを安定に保持できる緩衝剤を含む剤型、例えばローション、軟膏、クリーム、スプレー、貼付剤等の外用剤、注射剤、シロップ等の液剤、または錠剤等の固形剤として利用されることが好ましい。緩衝剤を含む液剤の非限定的な例としては、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水などを挙げることができる。また、上記の剤型は、例えばグルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトール等の糖質、タンパク質、アミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、浸透圧調節剤、懸濁剤、増粘剤および／または保存剤その他、薬学的に許容可能な種々の成分を含んでいてもよい。
【００２０】
本発明の自己免疫性皮膚疾患治療薬の投与量は、患者の年齢、体重等の薬学的要因、さらには疾患の重篤度や疾患部位の範囲等の臨床的要因を基に調節することができるが、概ね0.1mg／kg体重／日〜100.0mg／kg体重／日、好ましくは1.0mg／kg体重／日〜10.0mg／kg、より好ましくは1.0mg／kg体重／日〜5.0mg／kgの範囲内で調節すればよい。
【００２１】
次に、非限定的な実施例を示して本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００２２】
＜実施例１＞  
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）をコードする市販プラスミドpGEX2-T（Amersham社）を用いて、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとグルタチオンＳトランスフェラーゼとの融合タンパク質（R1-GST）をコードするベクタープラスミド及び配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとグルタチオンＳトランスフェラーゼとの融合タンパク質（R2-GST）をコードするベクタープラスミドをそれぞれ構築した。上記融合タンパク質は、C末端側に本発明にかかるポリペプチドを、N末端側にGST全長を有し、ポリペプチドのN末端とGSTのC末端がリンカー配列等を介さずに直接つながるように設計された。
【００２３】
各ベクターで大腸菌BL21を形質転換し、得られた形質転換体から融合タンパク質R1-GSTとR2-GSTを回収、精製した。回収されたR1-GSTとR2-GSTからトロンビン（thrombin、Amersham社）で処理して、GSTが切除されたR1及びR2をそれぞれ得た。また、配列番号３〜６に示されるアミノ酸配列からなる各ポリペプチド（R3〜R6）を、ペプチド合成機を用いて化学合成した。
【００２４】
＜実施例２＞治療効果の確認
１）COL17レスキューマウスの作製
マウス129Sv／Evゲノムライブラリー（Stratagene社）から、14.7kbのマウスCOL17遺伝子をクローニングし、さらにそこから11.5kbの制限酵素NheI−NotIフラグメントをサブクローニングした。このフラグメント中にあるエクソン２からイントロン３の部位へPGK／Neoカセットを組み込んでターゲッティングベクター（Stratagene社）を作製し、129Sv／Evマウスの胚性肝細胞に組み換えベクターを導入し、正確にターゲット化された肺細胞をC57BL／6Jマウスのblastcyteに注入してキメラマウスを作製した。このキメラマウスとC57BL／６Jマウスとをさらに交配させ、F1ヘテロ動物を4世代以上にわたってクロスさせてヘテロマウス（COL17ｍ＋／−）を作製した。
【００２５】
K14プロモーターの下流へCOL17ｃDNAを組み込むことによって、表皮下層のみに特異的にヒトCOL17を発現するC57BL／６Jをバックグラウンドとするトランスジェニックマウス（COL17ｍ＋／＋、ｈ＋）とヘテロマウス（COL17ｍ＋／−）をクロスさせた。その結果得られたヘテロかつヒトCOL17トランスジーンを有するマウス（COL17ｍ＋／−、ｈ＋）同士をかけ合わせて、COL17レスキューマウス（COL17ｍ−／−、ｈ＋）を作製した。
【００２６】
２）部分ペプチドの水疱性類天疱瘡発症の抑制効果の確認
水疱性類天疱瘡患者血清10μlとポリペプチドR1, R1-GST, R2、R2-GST, R3, R4, R5, R6ポリペプチドをそれぞれ20μg、37℃、30分間反応させ、BP180 ELISA kit （MBL社）を用いてCOL17に対する自己抗体価（％ index value）を測定したところ、ポリペプチドR1−GSTの％ index valueが最も低下していた。
【００２７】
次に、5例の水疱性類天疱瘡患者より末梢血50mlをそれぞれ採取し、常法に従って自己抗体を含むIgGを精製した。COL17レスキューマウスの新生仔を２つのグループに分け、グループ１にはIgG（1mg/g 体重）とGST（800μg、陰性コントロール）を、グループ２にはIgG（1mg/g 体重）とR1-GST（600μg）をそれぞれIgGは腹腔内投与、GSTおよびR1-GSTは皮下投与した。投与の48時間後、Nikolskyサイン（最新皮膚科学体系、2002年、第１巻、第31頁）にて水疱性類天疱瘡の発症を調べたところ、グループ１には水疱性類天疱瘡の発症が確認されたが、グループ３には確認されなかった（図１）。またクループ１、３のマウスの皮膚切片をHE染色したところ、グループ１には表皮の剥離が確認されたが、グループ３には確認されなかった（図２）。さらに、皮膚切片を抗ヒトIgG抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories）、抗マウスＣ3抗体（Cappel社）を用い蛍光抗体直接法を行ったところ、グループ１にはヒトIgGの表皮真皮境界部への沈着が確認されたが、グループ３には確認されなかった（図３）。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】COL17レスキューマウスに、水疱性類天疱瘡患者由来のIgG（写真上）、IgGとR1-GST（写真下）をそれぞれ投与したときの水疱発生の様子を示した写真である。
【図２】COL17レスキューマウスに、水疱性類天疱瘡患者由来のIgG（写真上）、IgGとR1-GST（写真下）をそれぞれ投与したときの、皮膚切片の染色試験の結果を示す写真である。図中の星印（★）は表皮が剥離している部分を示す。
【図３】COL17レスキューマウスに、水疱性類天疱瘡患者由来のIgG（写真上）、IgGとR1-GST（写真下）をそれぞれ投与したときの、皮膚切片の染色試験の結果を示す写真である。図中の白抜はIgGが沈着している部分を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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