(57)【要約】【課題】  連続した３次元画像を取得する際に、画像を取得する間隔のずれをなくし、光軸方向に正確な３次元画像を撮影することのできる３次元顕微鏡システムを提供する【解決手段】  対物レンズ４の焦点位置をアクチュエータ５で光軸方向に移動し、波形発生器７が発生する走査波形信号に基づいてアクチュエータ５を光軸方向に走査する３次元顕微鏡システムにおいて、焦点位置の合焦位置からのずれ量を検出する焦点誤差検出光学系６と、焦点誤差検出光学系６から出力される焦点誤差信号が走査波形信号に追従するようにアクチュエータ５を制御する制御手段８とを備えたことを特徴とする。【選択図】                    図１
2008122629.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズの焦点位置をアクチュエータで光軸方向に移動し、波形発生器が発生する走査波形信号に基づいて前記アクチュエータを光軸方向に走査する３次元顕微鏡システムにおいて、
前記焦点位置の合焦位置からのずれ量を検出する焦点誤差検出光学系と、
該焦点誤差検出光学系から出力される焦点誤差信号が前記走査波形信号に追従するように前記アクチュエータを制御する制御手段と
を備えたことを特徴とする３次元顕微鏡システム。
【請求項２】
前記制御手段は、
前記焦点誤差検出光学系から入力する焦点誤差信号を目標値に保つ信号を出力する制御回路と、
該制御回路から出力される信号と前記波形発生器から出力される走査波形信号のいずれか一方を選択する切換手段と、
前記アクチュエータから出力される位置信号を保持するサンプルホールド回路と、
該サンプルホールド回路の出力信号と前記切換手段を介した前記走査波形信号とを加算した信号で前記アクチュエータを駆動する加算回路と
を備えたことを特徴とする請求項１記載の３次元顕微鏡システム。
【請求項３】
試料のスライス像を共焦点画像として取得する共焦点スキャナと、
前記アクチュエータから出力される位置信号に基づいて前記スライス画像を合成して３次元画像を作成する画像処理装置と
を備えたことを特徴とする請求項１又は請求項２記載の３次元顕微鏡システム。
【請求項４】
前記走査波形は三角波であることを特徴とする請求項１乃至請求項３記載の３次元顕微鏡システム。
【請求項５】
前記走査波形は階段波であることを特徴とする請求項１乃至請求項３記載の３次元顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正確な３次元画像を得ることのできる３次元顕微鏡システムに関し、特に周囲温度に対して安定な３次元顕微鏡システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
共焦点顕微鏡は、試料を薄切片にすることなくスライス画像が得られ、そのスライス画像から試料の正確な３次元立体像を構築できるので、生物やバイオテクノロジーなどの分野における生きた細胞の生理反応観察や形態観察あるいは半導体市場におけるＬＳＩの表面観察などに使用されている。
【０００３】
図５は従来の共焦点顕微鏡により３次元像撮影を行う場合の対物レンズ周辺の様子を示す説明図である。細胞などからなる観察試料（以下試料と呼ぶ）１は培養容器底板２上にある。レーザダイオード（図示せず）から出射された光３は光学系を経由し対物レンズ４を介して試料１に照射される。試料１で反射された光は対物レンズ４を介して顕微鏡（図示せず）に入射して、試料１の共焦点画像を得る。２Ａ，２Ｂはそれぞれ培養容器底板２の表面及び裏面（底面）である。対物レンズ４をアクチュエータ５で駆動することにより、焦点位置は光軸方向に沿って移動する。
【０００４】
３次元画像撮影時には、培養容器の裏面２Ｂから対物レンズ４の焦点位置までの距離Ｚが図６のように時間に対して比例して変化するように、アクチュエータ５で駆動する。このとき、一定時間間隔で撮影を行うことによって、距離Ｚを一定間隔ずつずらした連続画像を取得することができる。
【０００５】
上記のような３次元共焦点顕微鏡に関連する先行技術文献としては次のようなものがある。
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１４８４５４公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、顕微鏡には本質的に熱膨張、収縮が存在し、５℃程度の温度変化によって、１０μm 近く、焦点、すなわち距離Ｚが、ずれてしまう。このような条件の下で、一定間隔で３次元画像を取得しようとすると、距離Ｚが図７のように変動するため、光軸方向に正確な３次元画像を撮影することができなくなるという問題がある。
【０００８】
本発明はこのような課題を解決しようとするもので、連続した３次元画像を取得する際に、画像を取得する間隔のずれをなくし、光軸方向に正確な３次元画像を撮影することのできる３次元顕微鏡システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このような課題を達成するために、本発明のうち請求項１記載の発明は、
対物レンズの焦点位置をアクチュエータで光軸方向に移動し、波形発生器が発生する走査波形信号に基づいて前記アクチュエータを光軸方向に走査する３次元顕微鏡システムにおいて、
前記焦点位置の合焦位置からのずれ量を検出する焦点誤差検出光学系と、
該焦点誤差検出光学系から出力される焦点誤差信号が前記走査波形信号に追従するように前記アクチュエータを制御する制御手段と
を備えたことを特徴とする。
【００１０】
請求項２記載の発明は、
請求項１記載の３次元顕微鏡システムにおいて、
前記制御手段は、
前記焦点誤差検出光学系から入力する焦点誤差信号を目標値に保つ信号を出力する制御回路と、
該制御回路から出力される信号と前記波形発生器から出力される走査波形信号のいずれか一方を選択する切換手段と、
前記アクチュエータから出力される位置信号を保持するサンプルホールド回路と、
該サンプルホールド回路の出力信号と前記切換手段を介した前記走査波形信号とを加算した信号で前記アクチュエータを駆動する加算回路と
を備えたことを特徴とする。
【００１１】
請求項３記載の発明は、
請求項１又は請求項２記載の３次元顕微鏡システムにおいて、
試料のスライス像を共焦点画像として取得する共焦点スキャナと、
前記アクチュエータから出力される位置信号に基づいて前記スライス画像を合成して３次元画像を作成する画像処理装置と
を備えたことを特徴とする。
【００１２】
請求項４記載の発明は、
請求項１乃至請求項３記載の３次元顕微鏡システムにおいて、
前記走査波形は三角波であることを特徴とする。
【００１３】
請求項５記載の発明は、
請求項１乃至請求項３記載の３次元顕微鏡システムにおいて、
前記走査波形は階段波であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
以上説明したことから明らかなように、本発明によれば、焦点誤差信号が走査波形信号に追従するようにアクチュエータを制御することにより、対物レンズの焦点位置を合焦位置を基準とした正確な距離とすることができるので、光軸方向に正確な間隔で３次元画像を撮影することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下本発明の実施の形態について図面を用いて詳細に説明する。
【００１６】
図１は本発明の実施の形態に係る３次元顕微鏡システムの一実施例を示す構成ブロック図である。図５と同じ部分は同一の記号を付してある。
【００１７】
３次元顕微鏡システムにおいて、レーザ光源２１からのレーザ光は共焦点スキャナ２２、蛍光顕微鏡１０、焦点誤差検出光学系６及び対物レンズ４を介して試料１（図５参照）に照射され、反射光は対物レンズ４、焦点誤差検出光学系６及び蛍光顕微鏡１０を介して共焦点スキャナ２２に入射する。共焦点スキャナ２２は、試料１の共焦点画像を得て、高速カメラ２３に入射する。高速カメラ２３は共焦点画像を画像信号に変換し、画像処理部２６に入力する。共焦点スキャナ２２は、多数のピンホールを持つニポウディスクと、それに対応するマイクロレンズアレイを有するもので、シンプルな光学系からなるニポウディスク方式を採用したコンパクトなアドオンタイプである。
【００１８】
アクチュエータ５は蛍光顕微鏡１０のミラーユニット（図示せず）と対物レンズ４との間に取り付けられ、ピエゾ駆動により駆動信号入力のレベルに比例して画像の焦点方向（光軸方向）の長さが変化し、対物レンズ４の焦点位置を制御する。また、アクチュエータ５は自身の位置を検出する位置センサ（変位センサともいう）備えている。
【００１９】
アクチュエータドライバ９は、アクチュエータ５からフィードバックされる位置信号が制御回路８から入力する位置設定信号と等しくなるような駆動信号をアクチュエータ５に印加することにより、アクチュエータ５の位置制御を行う。
【００２０】
焦点誤差検出光学系６は、対物レンズ４の焦点の合焦位置（培養容器底板２の裏面などの、対物レンズ４の焦点を合せることのできる位置）からのずれ量に比例する焦点誤差信号を出力する。焦点誤差検出光学系６として、例えば特願２００６−０９８０９１、図１の２０に示された焦点誤差検出光学系を用いることができる。
【００２１】
波形発生器７は、同期信号制御器２４から走査波形発生トリガ信号を受信すると、あらかじめ波形計算部２５から送られて記憶した走査波形を発生し、３次元像取得のための目標値走査信号として制御回路８に送る。ただし、平常時は一定の目標値信号を制御回路８に出力する。
【００２２】
制御回路８は焦点誤差信号をサーボ目標値（以下目標値と呼ぶ）に追従させるための信号を発生する制御手段を構成する。波形発生器７より入力するサーボ目標値（以下目標値と呼ぶ）信号から焦点誤差検出光学系６より入力する焦点誤差信号を減算する減算手段８１と、減算手段８１の出力を増幅する増幅手段８２とからなり、増幅手段８２の出力が位置設定信号としてアクチュエータドライバ９に送られる。
【００２３】
同期信号制御器２４は、画像処理部２６から送られる画像取込開始信号により走査波形発生トリガ信号を波形発生器７に送ると共に同期信号を共焦点スキャナ２２に送り、波形発生器７から送られる垂直同期信号を受信して、画像取込トリガ信号を高速カメラ２３に送ることにより、画像処理部２６による画像信号取得のタイミングと対物レンズ４の焦点位置の走査開始タイミング及び共焦点スキャナ２２によるニポウディスク（図示せず）の回転同期制御を全て同期させる。
【００２４】
画像処理部２６はアクチュエータドライバ９から送られる対物レンズ４の光軸方向の位置信号に基づいて、正確なスライス像の光軸方向の位置を求め、スライス画像を合成して高精度な３次元画像を生成する。
【００２５】
また、高速カメラ２３は、コンピュータ２７からの制御信号で動作制御される。
【００２６】
なお、ここでは、レーザ光源２１、共焦点スキャナ２２、高速カメラ２３、同期信号制御器２４、波形計算部２５及び画像処理部２６から構成される部分を共焦点像取得部２０と呼ぶ。また、波形計算部２５及び画像処理部２６はコンピュータ２７内で構成される。
【００２７】
このような構成の３次元顕微鏡システムの動作を以下に説明する。
平常時には、焦点誤差検出光学系６から出力される焦点誤差信号に基づく制御回路８のアナログフィードバック制御により定位置への自動合焦が行われ、観察試料を定位置で連続的に観測する。３次元像取得時には、アナログフィードバック制御により目標値走査波形に追従して時間変化する位置への自動合焦が行われ、それぞれの位置で観察試料のスライス画像を取得する。
【００２８】
図２は自動合焦の動作を説明するための動作説明図である。縦軸は焦点誤差信号の信号強度Ｅを、横軸は焦点位置Ｚをそれぞれ示している。矢印Ｐ及び矢印Ｑは、培養容器底板２（図５）の表面２Ａ及び裏面２Ｂにそれぞれ対応し、矢印Ｐと矢印Ｑの間隔（Ｐ−Ｑ）が培養容器底板２の厚みに相当する。ａ，ｂは、それぞれ表面２Ａ及び裏面２Ｂにおける焦点引込幅（合焦動作の引込範囲：焦点を合わせることができる線形部の範囲）である。
【００２９】
平常時における動作を以下に説明する。
最初に、波形発生器７から出力される目標値信号を０として制御回路８によりフィードバック制御を行い、図２の矢印Ｑの位置で焦点誤差信号が０となるように、アクチュエータドライバ９を介してアクチュエータ５が駆動される。その結果、対物レンズ４の焦点位置は培養容器底板２（図５）の裏面２Ｂと一致する。この場合、例えば、対物レンズ４を培養容器底板２に近づけてゆき、培養容器底板２の表面２Ａへの合焦の後、裏面２Ｂに合焦させるようにしてもよい。この方法によれば、図２の矢印Ｐの位置に制御された後、２度目の合焦で矢印Ｑの位置に制御されることになる。
【００３０】
次に、波形発生器７により制御回路８の目標値信号の値を図５の距離Ｚに対応する焦点誤差信号値Ｖと等しくとれば（図２参照）、前述した制御回路８のフィードバック制御により、対物レンズ４の焦点位置は培養容器底板２の裏面２Ｂから距離Ｚだけ容器内部に入った位置に移動し、試料２の観察が可能となる。
【００３１】
３次元像取得時の動作を、図３に示す各信号のタイムチャートを参照して以下に説明する。
【００３２】
波形発生器７は、同期信号制御器２４から走査波形発生トリガ信号を受信すると（図３（３））、あらかじめ波形計算部２５から送られて記憶しておいた走査波形を発生し、走査された目標値信号すなわち目標値走査信号（図３（４））として制御回路８に送る。この目標値走査信号は、図６の従来技術におけるアクチュエータ５の駆動波形（階段波の場合）を、対応する焦点誤差信号のスケールに変換したものである。図３（４）では、時間の経過にしたがって段階的に電圧が増加してゆき、所定の電圧値で基点の電圧に戻る階段波形を目標値走査信号としているが、この走査波形は三角波であってもよい。制御回路８は焦点誤差検出光学系６から受信する焦点誤差信号がこの目標値走査信号に追従するようにフィードバック制御し、アクチュエータドライバ９を介してアクチュエータ５を図３（５）のように駆動することにより、対物レンズ４を光軸方向に走査する。高速カメラ２３は同期信号制御器２４から送られる画像取込トリガ信号（図３（２））により、上記の走査波形と同期したタイミングで、試料１の画像を画像処理部２６に送る。画像処理部２６は、アクチュエータ５の位置センサから出力されアクチュエータ９を介して送られる、階段波の各段の位置信号に基づき、観測試料１のスライス画像について実際の位置を求め、３次元画像を合成する。例えば、目標値信号の値Ｖを、観測試料である細胞核の中心に対応させ、その上下に走査すれば、細胞内部全体の３次元画像を得ることができる。
【００３３】
なお、同期信号制御器２４から出力される上記の各種信号は、波形発生器７から送られる垂直同期信号（図３（１））と同期している。
【００３４】
上記のような構成の３次元顕微鏡システムによれば、対物レンズ４の焦点位置は、合焦位置である培養容器底板２の裏面２Ｂを基準として、そこから焦点引込幅の範囲内で任意の位置に正確に制御することができるので、顕微鏡に熱膨張や収縮が生じても、画像を取得する間隔が光軸方向にずれることはない。したがって、光軸方向に正確な間隔で観察試料の３次元画像を撮影することができる。これは細胞のイメージングにおいて、細胞内タンパク質の正確な位置の特定や、細胞の形状の変化を観察する上で、非常に有用な機能である。
【００３５】
なお、上記の実施例では、アクチュエータの位置をカスケード制御しているが、アクチュエータの位置と駆動信号の関係が正確に把握できる場合は、アクチュエータドライバ９におけるフィードバックループを省略して開ループとし、構成を単純化することができる。
また、高速カメラ２３として、例えばビデオレートカメラを用いてもよい。
【００３６】
図４は上記の３次元顕微鏡システムの一部を変更した一変形例で、観測試料に対し長時間自動合焦を行いながら、任意の時点で３次元像を取得する手段を示す部分構成ブロック図である。図１と同じ部分は同一の記号を付して、重複する説明は省略する。
【００３７】
コントローラ８０において、制御回路８３は、焦点誤差検出光学系６から入力する焦点誤差信号を目標値Ｖに一定に保つための信号を出力する。切換スイッチ８３は波形発生器７から与えられる目標値走査信号と制御回路８３の出力信号のいずれかを選択する切換手段を構成する。サンプルホールド回路８５はアクチュエータ５から送られる位置信号をサンプリングして保持する。加算回路８６は切換スイッチ８４で選択された信号とサンプルホールド回路８５の出力信号とを加算した信号をアクチュエータ５の駆動信号として出力する。ここで、アクチュエータ５は、駆動波形入力端子を介して電圧制御ができ、モニター出力端子から出力される位置信号により、その伸縮を電圧信号としてモニターすることができるものとする。
【００３８】
図４の構成の３次元顕微鏡システムの動作を以下に説明する。
【００３９】
まず、自動合焦を行っている状態から、３次元画像取得に切り換えるときの動作を以下に示す。自動合焦の状態では切換スイッチ８４の接点は２の位置にあり、制御回路８３の出力が加算回路８６を介してアクチュエータ５に加わり、制御回路８３によるアナログフィードバック制御が行われる。その結果、焦点誤差検出光学系６から出力される出力焦点誤差信号は目標値Ｖと等しくなり、制御回路の出力は０となる。
【００４０】
３次元画像取得に切り換えるときは、上記の状態で、アクチュエータ５から出力される位置信号が、サンプリングパルスＳによりサンプルホールド回路８５にサンプルホールドされる。次に切換スイッチ８３の接点が１に切り換えられた後、サンプルホールド回路８５からサンプルホールド値が出力され、目標値Ｖに対応した位置信号がアクチュエータ５の駆動入力となる。この状態で、波形発生器７から３次元画像取得用の走査波形が出力されると、開ループ制御により、対物レンズ４の焦点位置は、目標値Ｖに対応する初期位置Ｚを基準として走査波形に追従した走査を行う。図１の実施例と同様にして画像撮影が行われることにより、合焦位置（Ｚ＝０）を基準とした３次元画像の撮影が可能となる。
【００４１】
３次元画像取得を行っている状態から自動合焦への切り換えは、上記走査を行った後、初期位置に戻った状態で、切換スイッチ８４の接点位置を２に切り換えることによって行われる。ここで、自動合焦を行う場合、フィードバック制御開始直前の対物レンズの初期位置が図２に示すＺ−Ｅグラフの線形部に入っていないと、制御がかからない。しかしながら、上記の３次元画像取得時間は、周囲温度の変化により顕微鏡が熱膨張を起こす時間に対して十分に短いので、切換時のサンプルホールド回路８５の出力値は、３次元画像取得前の自動合焦時とほぼ同等となる。
【００４２】
上記のような構成の３次元顕微鏡システムによれば、図１の場合と同様、３次元画像取得時の走査の基準点を保持しながら、正確なＺ軸情報を持った３次元画像を取得することができる。
【００４３】
また、自動合焦と３次元画像取得の切換をハードウェアで実現することにより、波形発生器７のソフトウェアを単純化することができる。
【００４４】
なお、上記の各実施例では自動合焦はアナログフィードバック制御にて行っているが、コンピュータのソフトウェアで実施してもよい。
【００４５】
また、共焦点顕微鏡以外の３次元顕微鏡システムにも適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明に係る３次元顕微鏡システムの一実施例を示す構成ブロック図である。
【図２】図１の装置の自動合焦の動作を説明するための動作説明図である。
【図３】図１の装置の３次元像取得時の動作を説明するためのタイムチャートである。
【図４】図１の実施例に係る３次元顕微鏡システムの一変形例を示す構成ブロック図である。
【図５】従来の共焦点顕微鏡により３次元像撮影を行う場合の対物レンズ周辺の様子を示す説明図である。
【図６】図５の装置の３次元像撮影時の動作を説明するための説明図である。
【図７】従来の共焦点顕微鏡により３次元像撮影を行う場合の焦点位置を示すためのタイムチャートである。
【符号の説明】
【００４７】
４  対物レンズ
５  アクチュエータ
６  焦点誤差検出光学系
７  波形発生器
８  制御手段
２２  共焦点スキャナ
８３  制御回路
８４  切換手段
８５  サンプルホールド回路
８６  加算回路
【図１】
2008122629.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2008122629.tif 000007
【図６】
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【図７】
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