(57)【要約】【課題】本発明は、成長ホルモン分泌促進ヘキサペプチド（ＧＨＲＰ）から構成されている医薬を提供することにある。【解決手段】本発明は、ヒトの医薬、特に表皮成長因子(EGF)および成長ホルモン分泌促進ヘキサペプチド（ＧＨＲＰ）から構成されている医薬組合せに関し、この組合せは血流低下による組織損傷の防止に有用であり、虚血損傷後の組織修復を強化する。上記組合せは、単一の医薬組成物として使用することができる。別法として、個人は、別々の様相であるが、単一の治療計画内でEGFおよびGHRPの両方を受容することができ、これにより臓器が臨界的期間にわたる血流不足に付された場合、細胞生存が増強される。この組合せは、反応性酸素類(ROS)形成およびその付随する細胞毒性を減少させる。これは、組織または臓器が延長された期間にわたり虚血にさらされた場合、細胞生存を促進させるのに有用である。この組合せは、火傷被害者、多種外傷患者、低酸素壊死、急性呼吸窮迫症候群、および壊死性腸炎患者などの多臓器機能不全(MOF)が告知される対象における予防薬として使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長ホルモン分泌促進ヘキサペプチド（ＧＨＲＰ−６）および適当な賦形剤を含有することを特徴とする、ヒトおよび動物における動脈血液が不足している場合、組織損傷を予防することによって虚血損傷に対する予防を誘発させる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの医薬、特に血液流動抑制による組織損傷の防止および虚血損傷後の組織回復の増強に有用である、表皮成長因子(EGF)および成長ホルモン分泌促進ヘキサペプチド（ＧＨＲＰ）の医薬組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
動物身体の臓器の全部は、部分的または完全動脈血流不足後の、または静脈ドレーン不全による致死的な不可逆的組織損傷に対して感受性である。これらの概要において、細胞死は病理学的変化の漸進的カスケードの影響であり、最終的に相当する多臓器機能および個人の生存を脅かすことがある。
【０００３】
病気をますます悪化させるROS発現は、組織灌流低下、虚血／再灌流、および炎症（腹膜炎、膵臓炎など）に直結する無数のプロセスの病理学的結果の鍵である。組織灌流低下およびROS過剰産生はまた、主要な手術、血管再生手術、大規模の火傷および多数の外傷に付随する。ROS攻撃による膜脂質過酸化は、多くの病理学的状態における細胞死に応答することができる（T.D.LucasおよびI.L.Szweda.「心臓再灌流損傷。加令、脂質過酸化およびミトコンドリア機能不全」(Cardiac reperfusion injury. Aging,lipid peroxidation and mitochondrial dysfunction.)，非特許文献１）。
【０００４】
細胞ATP貯蔵の枯渇は、最も急性であり、虚血の最終的結果である（Burns TA,Davies RD,McLaren JA,Cerundolo L,Morris JP,Fuggle VS.「ヒト腎臓同種移植物の虚血／再灌流損傷におけるアポトーシス」(Apoptosis in ischemia/reperfusion injury of human renal allografts)，非特許文献２）。虚血プロセスに従い、ATP貯蔵はハイポキサンチンおよびキサンチンに分解され、これらは両方ともに、酵素キサンチンオキシダーゼ(XO)の基質として作用する。再灌流期間中に導入される分子状酸素の大量利用は、XO活性化を経てプリン酸化を導き、その結果として、スーパーオキシドアニオンおよび過酸化水素発生を導く（Ｐａｌｌｅｒ  ＭＳ，Ｈｏｉｄａｌｌ  ＪＲ，Ｆｅｒｒｉｓ  ＪＥ．「ラットにおける虚血性急性腎臓不全症における酸素フリーラディカル」(Oxigen free radicals in ischaemic acute renal failure in the rat)，非特許文献３）。
【０００５】
虚血／再灌流期間中、ROS発現および微細血管不全は組合されて、悪性循環として作用し、この場合、活性化された内皮細胞および循環白血球漸増／付着がまた、局所的組織灌流を増加させる、すなわち細胞低酸素症を増大させる（Ｒｅｄｌ  Ｈ，Ｇａｓｓｅｒ  Ｈ，Ｈａｌｌｓｔｒｏｍ  Ｓ，Ｓｃｈｌａｇ  Ｇ．「ラディカル関連細胞損傷。ショック、敗血症および臓器不全の病理学」(Radical related cell injury.In Pathobiology of Shock,sepsis and organ failure)，非特許文献４）；（Ｌｅｄｅｂｕｒ  ＨＣ，Ｐａｒｋｓ  ＴＰ．「ヒト内皮細胞における炎症性サイトキニンによる細胞内付着分子１遺伝子の転写調節：種々のNF-ｋB部位およびｐ65ホモダイマーの基本的役割」(Transcriptional regulation of the intercellular adhesion molecule 1 gene by inflammatory cytokines in human endothelial cell:essential roles of a variant NF-kB site and p65 homodimers)，非特許文献５）。
【０００６】
ROSは、炎症細胞により浸潤された組織においてNF-kBを活性化することができる（Ｃｏｎｎｅｒ  ＥＭ，Ｂｒａｎｄ  ＳＪ，Ｄａｖｉｓ  ＪＭ，Ｋａｎｇ  ＤＹ，Ｇｒｉｓｈａｍ  ＭＢ．「炎症性腸疾病における酸素および窒素の反応性代謝の役割：トキシン、メディエーター、および遺伝子発現のモジュレーター」(Role of reactive metabolites of oxygen and nitrogen in inflammatory bowel disease:toxins,mediators,and modulators of gene expression)，非特許文献６）。他方で、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)酵素系は、組織損傷カスケードをさらに増幅させる、低酸素状態を呈する細胞を犯す多形核細胞で活性化される（Ｋｕｒｏｓｅ  Ｉ，Ａｒｇｅｎｂｒｉｇｈｔ  ＬＷ，Ｗｏｌｆ  Ｒ，Ｌｉａｎｘｉ  Ｌ，Ｇｒａｎｇｅｒ  ＤＮ．「虚血／再灌流−誘発微細血管機能不全：酸化剤および脂質メディエーターの役割」(Ischemia/reperfusion-induced microvascula dysfunction:role of oxidants and lipid mediators)，非特許文献７）。
【０００７】
この有害な環境において、局所血栓形成メカニズムが活性化され、毛細管の閉塞および低酸素状態領域の膨張が生じる。このカスケードの結果として、細胞死が壊死および／またはアポトーシスにより確実なものとされ、これは臓器生存を減少させることができる（Ｔｒｅｄｇｅｒ  ＭＪ．「肝臓の虚血／再灌流損傷：理論および実施における処置」(Ischaemia-reperfusion injury of the liver:treatment in theory and practice.)，非特許文献８）。内皮／炎症細胞反応性は、身体がその免疫不調に対して反対することができない場合、大多数の化学物質を、窒素酸化物、炎症前サイトキン、前−凝固物質および血管作用性物質などの可溶性メディエーターにする。これらの物質は全身性炎症応答症候群(SIRS)の引き金になることがある（Ｋｏｗａｌ−Ｖｅｒｍ  Ａ，ＭｃＧｉｌｌ  Ｖ，Ｇａｍｅｌｌｉ  ＲＬ．「熱損傷における虚血壊死性腸疾病」(Ischemic necrotic bowel disease in thermal injury)，非特許文献９）。
【０００８】
大規模火傷は、患者の生命を救うために集中的で多種の医療行為を要する救急医療対象である。火傷した患者では、消化器官低灌流／虚血が、SRISの編成において臨界的役割を演じるものと見なされる（Ｗａｎｇ  Ｐ，Ｂａ  ＺＦ，Ｃｉｏｆｆｉ  ＷＧ，Ｂｌａｎｄ  ＫＩ，およびＣｈａｕｄｒｙ  ＩＨ．「消化器官は外傷および出血ショック後の肝細胞機能不全を発症させる原動力であるか？」(Is gut the “motor”for producing hepatocellular dysfunction after trauma and hemorrhagic shock?)，非特許文献１０）。消化器官上皮は敗血／有毒内腔と無菌腸環境との間の開拓者として作用することから、腸障壁不全は最高の臨床的関連性を有する（Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ＲＬ，Ｒｙａｎ  ＣＭ，Ｙｉｎ  ＬＭ，Ｈｕｒｌｅｙ  Ｊ，Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ＲＧ．「火傷単位における死。無菌多臓器不全。」(Death in the burn unit.Sterile multiple organ failure.)，非特許文献１１）。
【０００９】
この点に関して、実験および臨床の両方の発見は、障壁一体性の保持に関して、全身的ストレス状態中における適当な腸灌流の重要性を示すことに集中している（Ｔａｂａｔａ  Ｔ，ｄｅ  Ｓｅｒｒｅｓ  Ｓ，Ｍｅｙｅｒ  ＡＡ．「火傷損傷および消化器官虚血後の消化器官細菌性ペプチドグリカンポリサッカライドへのｌｇＭ合成にかかわる差異」(Differences in lgG synthesis to gut bacterial peptidoglycan polysaccharide after burm injury and gut ischemia)，非特許文献１２）。さらにまた、最近の発見は、腸−付随リンパ組織が虚血により活性化された場合、腸組織が炎症前サイトカイン発生源として作用することを示した。MOFは、集中治療状態下にある患者の死の第一原因であり、火傷犠牲者を最も頻繁に複雑化し、これには高度に専門化された火傷処置所における患者の７０％までが含まれる。
【００１０】
或る臓器における虚血／再灌流プロセスの結果を弱めるために、多数の合成または天然化合物が臨床前試験されているか、または臨床試験されている。腸虚血の場合、アンギオテンシンＩＩインヒビターが実験的に評価された（Ｔａｄｔｏｓ  Ｔ，Ｔａｂｅｒ  ＤＬ，Ｈｅｇｇｅｒｓ  ＪＰ，Ｈｅｒｎｄｏｎ  ＤＮ．「アンギオテンシンIIインヒビターＤｕＰ７５３は火傷およびエンドトキシン誘発腸虚血、脂質過酸化、粘膜透過および細菌移動を弱める。」(AngiotensinII inhibitor DuP753 attenuates burn and endotoxin-induced gut ischemia,lipid peroxidation,mucosal permeability and bacterial translocation.)，非特許文献１３）。
【００１１】
血小板活性化因子インヒビター（Ｓｕｎ  Ｚ，Ｗａｎｇ  Ｘ，Ｄｅｎｏ  Ｘ，Ｌａｓｓｏｎ  Ａ，Ｓｏｌｔｅｓｚ  Ｖ，Ｂｏｒｊｅｓｓｏｎ  Ａ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｒ．「ラットにおける腸虚血および再灌漑流により引き起こされる消化器官障壁機能不全に対するレキシパファント、PAFアンタゴニストの有益な効果」(Beneficial effects of lexipafant,PAF antagonist on gut barrier dysfunction causewd by intestinal ischemia and reperfusion)，非特許文献１４）、および窒素酸化物放出の増強剤がまた、試験された（Ｗａｒｄ  ＤＴ，Ｌａｗｓｏｎ  ＳＡ，Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  ＣＭ，Ｃｏｎｎｅｒ  ＷＣ，Ｓｈｅａ−Ｄｏｎｏｈｕｅ  ＤＴ．「Ｌ−アルギニン投与を介する持続的窒素酸化物産生は腸虚血および再灌流作用を改善する」(Sustained nitric oxide production via L-arginine administration ameliorates effects of intestinal ischemia-reperfusion)，非特許文献１５）。
【００１２】
別の研究には、アロブリノールの単独、またはビタミンＣおよびＥとの組合せなどの抗酸化剤治療が包含される（Ｋａｃｍａｚ  Ｍ，Ｏｔｚｕｒｋ  ＨＳ，Ｋａｅａａｙｖａｚ  Ｍ，Ｇｕｖｅｎ  Ｃ，Ｄｕｒａｋ  Ｉ．「ラット腸組織における酵素酸化防止剤防御メカニズムは、虚血−再灌流後に変えられる。アロプリノールおよび酸化防止剤組合せの効果」(Enzymatic antioxidant defense mechanism in rat intestinal tissue is changed after ischemia-reperfusion.Effects of allopurinol plus antioxidant combination)，非特許文献１６）。
これとは別に、細胞の自然の防御メカニズムを活発にすることに向けられた研究は不十分である（Ｐｉａｌｌｉ  ＳＢ，Ｈｉｎｍｉｎ  ＣＥ，Ｌｕｑｕｅｔｔｅ  ＭＨ，Ｎｏｗｉｃｋｉ  ＰＴ，Ｂｅｓｎｅｒ  ＧＥ．「ヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子は、虚血／再灌流損傷からラット腸を保護する」(Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor protects rat intestine from ischemia/reperfusion injury)，非特許文献１７）。
【００１３】
虚血／再灌流後の腎臓活動停止は、虚血腎臓に対する広範囲の防護を付与することが示されている通称ラザロイドの産生を包含する腎臓保護剤にかかわる研究を刺激した（ＤｅＶｅｃｃｈｉ  Ｅ，Ｌｕｂａｔｔｉ  Ｌ，Ｂｅｒｅｔｔａ  Ｃ，Ｆｅｒｒｅｒｏ  Ｓ，Ｒｉｎａｌｄｉ  Ｐ，Ｇａｌｌｉ  ＫＭ，Ｔｒａｚｚｉ  Ｒ，Ｐａｒｏｒｎｉ  Ｒ．「２−メチルアミノクロマンU83836による腎臓虚血−再灌流損傷からの防護」(Protection from renal ischemia-reperfusion injury by the 2-methylaminochroman U38836.)，非特許文献１８）。別の研究は、主としてアデノシンレセプターに対するアンタゴニストとして、腎臓防護におけるテオフィリンの有益な効果を報告している（Ｊｅｎｉｋ  ＡＧ，Ｃｅｒｉａｎｉ  ＪＭ，Ｇｏｒｅｎｓｔｅｉｎ  Ａ，Ｒａｍｉｒｅｚ  ＪＡ，Ｖａｉｎ  Ｎ，Ａｒｍａｄａｎｓ  Ｍ，Ｆｅｒｒａｒｉｓ  ＪＲ．「週産期仮死の新生児における腎臓機能に対するテオフィリンの効果の無作為二重ブラインドプラセボ制御試験」(Randomized,double-blind placebo-controlled trial of the effect of theophylline on renal function in term neonates with perinatal asphyxia)，非特許文献１９）。
【００１４】
動脈栄養性ペプチド［オーリクリン(Auriculin)］の投与は、急性腎臓不全を患らう患者における死亡率を減少することは示さなかった。間接的臓器合併症も減少されなかった（Ｗｅｉｓｂｅｒｇ  ＬＳ，Ａｌｌｇｒｅｎ  ＲＬ，Ｇｅｎｔｅｒ  ＦＣ，Ｋｕｒｎｉｋ  ＢＲ．「急性細管壊死の発症は、その予後に影響する。オーリクリンアナリチド急性腎臓不全研究グループ」(The Auriculin Anaritide Acute Renal Failure Study Group)，非特許文献２０）。腎臓移植手術を受ける患者に高投与量レベルで注射した場合、腎臓保護は酵素スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)によるものであった（Ｓｃｈｎｅｅｂｅｒｏｅｒ  Ｈ，Ｓｃｈｌｅｉｂｎｅｒ  Ｓ，Ｉｌｌｎｅｒ  ＷＤ，Ｍｅｓｓｍｅｒ  Ｋ，Ｌａｎｄ  Ｗ．「死体腎臓移植後の急性および慢性拒絶反応に対するフリーラディカル媒介再灌流損傷の衝撃」(The impact of free-radical mediated reperfusion injury on acute and chronic rejection events following cadaveric renal transplantation)，非特許文献２１）。
【００１５】
有毒虚血性急性腎不全の改善におけるEGFおよびTGF−αの効果は、特許文献１に示されている。数種の腎臓保護作用を示す成長因子の非経口投与は実験モデルでは有効であることが証明されているが、臨床結果は、現在まで否定的である。管理されているマルチセンター臨床試験は、プラセボ対抗試験に比較した場合、急性腎不全患者におけるIFG-1の予期される利益を示さなかった（Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ  Ｒ，Ｋｏｐｐｌｅ  Ｊ，Ｌｉｐｓｅｔｔ  Ｐ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｅ，Ｍｉｎｅｉ  Ｊ，Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ  Ｔ，Ｍｕｎｇｅｒ  Ｍ，Ｍｅｚｔｌｅｒ  Ｍ，Ｚａｌｏｇａ  Ｇ，Ｍｕｒｒａｙ  Ｍ，Ｌｏｗｒｙ  Ｓ等．「急性腎不全を患う患者における組換えヒトインスリン様成長因子Ｉのマルチセンター臨床試験」(Multicenter clinical trial of recombinant human insulin-like growth factor I in patients with acute renal failure)，非特許文献２２）。急性腎不全に対してIGF-1を用いるもう一つの臨床試験において、この効果の欠落が確認された（Ｋｏｐｐｌｅ，ＪＤ，Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ，Ｒ，Ｇｕｌｅｒ，ＨＰ，Ｐｉｋｅ，ＭおよびＣｈｉｒｏｎ研究グループ：「急性腎不全(ARF)を患う患者における組換えヒトインスリン様成長因子Ｉ(IGF-1)の効果の欠落」(lack of effect of recombinant human insulin-like growth factor-1(IGF-1) in patients with acute renal failure(ARF))，非特許文献２３）。
【００１６】
従って、達成された臓器保存技術における不十分な進歩が移殖に利用できる新しい臓器の最も重要な限界点として未だに残されている。さらにまた、生体外保存剤が両立しない作用をもたらしており（Ｓｃｈｌｕｍｐｆ−Ｒ；Ｃａｎｄｉｎａｓ−Ｄ；Ｗｅｂｅｒ−Ｍ；Ｒｏｔｈｌｉｎ−Ｍ；Ｌａｒｇｉａｄｅｒ−Ｆ．「変性ＵＷ溶液を用いる腎臓移植物の保存の初期臨床結果」(Preservation of kidney transplants with a modified UW solution initial clinical results)，非特許文献２４）、また受容者への移植後の臓器生化学的および機能的劣化が、非免疫拒絶の第一原因として残されている（Ｂａｒｂｅｒ  Ｅ，Ｍｅｎｅｎｄｅｚ  Ｓ，Ｌｅｏｎ  ＯＳ，Ｂａｒｂｅｒ  ＭＯ，ｍｅｒｉｎｏ  Ｎ，Ｃａｌｕｎｇａ  ＪＬ，Ｃｒｕｚ  ＥおよびＢｏｃｃｉ，Ｖ．「挑発的虚血状態にされているラットにおけるオゾン耐性誘発後の腎臓損傷の防止」(Prevention of renal injury after induction of ozone tolerance in rats submitted to warm ischemia.)，非特許文献２５）。
【００１７】
数種の保存剤について報告された不適当な効果は、血小板凝集メカニズムにおけるその干渉にある（Ｓａｌａｔ，Ａ，Ｍｕｅｌｌｅｒ，ＭＲ，Ｂｏｅｈｍ，Ｄ，Ｓｔａｎｇｌ，Ｐ，Ｐｕｌａｋｉ，Ｓ，Ｌａｅｎｇｌｅ，Ｆ．「インビトロ血小板凝集性に対するＵＷ溶液の影響」(influence of UW solution on in vitro platelet aggregability)，非特許文献２６）。再灌流後臓器における血管痙攣および血栓形成は報告されている中で最も困難な問題である（Ｊｅｎｇ−ＬＢ；Ｌｉｎ−ＰＪ；Ｙａｏ−ＰＣ；Ｃｈｅｎ−ＭＦ；Ｔｓａｉ−ＫＴ；Ｃｈａｎｇ−ＣＨ．「ウイスコンシン大学の溶液を用いる保存後のヒト肝臓動脈の損傷された内皮依存性弛緩」(Impaired endothelium-dependent relaxation of human hepatic artenes after preservation with the University of Wisconsin solution)，非特許文献２７）。
【００１８】
医薬業界は依然として、さらに有効で、安価な臓器保存溶液を期待している（Ｒｅｎｔｓｃｈ  Ｍ，Ｐｏｓｔ  Ｓ，Ｐａｌｍａ  Ｐ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ＡＰ，Ｍｅｎｇｅｒ  ＭＤ，Ｍｅｓｓｍｅｒ  Ｋ．「肝臓移植における温リンゲルのラクテートすすぎ液の有益な効果に対する生体内研究」(Intravital studies on beneficial effects of warm Riner‘s lactate rinse in liver transplantation)，非特許文献２８）。臨床領域における有効腎臓保護効果に影響するIGF-1の不足は、１種のみの成長因子を用いる治療が虚血／再灌流中の細胞生存を刺激するには不十分であること、および成長因子配合物がさらに効果的であるものと見なされるという見解を導入した（Ｐｌａｙｆｏｒｄ  ＲＪ．「ペプチドおよび胃腸粘膜完全性」(Peptides and gastrointestinal mucosa integrity)，非特許文献２９）。
【００１９】
虚血／再灌流現象中の臓器損傷の保護における表皮成長因子(EGF)の有益な効果は、特許文献２により特許請求されている。しかしながら、脳保護は、非常に高濃度のEGF（１ｍｇ／ｋｇ）を用いて得られるだけである。０．１ｍｇ／ｋｇの低用量では、中程度の保護効果を示すのみであり、成長因子のような物質の用量は依然として多い。これらの事実は、この発明に制限を負わせる、すなわち第一の制限は処置が高価格であることに関連し、動物における効果の達成には反復する注射（４〜５回）を要する。一例として、７０ｋｇの体重のヒトは、一回の注射に７０ｍｇのEGFを必要とし、臨床効果の確保には、これを周期的に反復しなければならない。第二の制限は、薬理学的である。特許に示されている例は、有効用量５０(ED50)および用量−応答曲線の確立の可能性を妨害する非常に狭い治療ウインドが存在することを示唆している。
【００２０】
第三の制限は、高EGF用量に付随する限界にある。ラットおよびサルにおいて、EGFが心臓拍出および動脈圧を抑制することがあることを証明する報告書が存在する（Ｋｅｉｓｅｒ  ＪＡ，Ｒｙａｎ  ＮＪ．「覚醒ラットおよびサルにおけるEGFの血流力学的作用」(Hemodynamic effect of EGF in conscious rats and monkeys)，非特許文献３０）。正常細胞周期の進行はまた、高濃度のEGFにより混乱させられることがある（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＮＴ，Ｓｃｈｕｌｉｔｚ  ＧＳ．「成長因子および傷の治癒：成長因子およびそれらのレセプターの生化学的性質」(Growth factors and wound healing:Biochemical properties of growth factors and their receptors)，非特許文献３１）。
【特許文献１】米国特許番号ＵＳ５，３６０，７９０
【特許文献２】ヨーロッパ特許ＥＰ０３５７２４０Ｂ１
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５（２）：５１０−５１４
【非特許文献２】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９８，６６（７）：８７２−８７６
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４，７４：１１５６−１１６４
【非特許文献４】Ｇ．Ｓｃｈｌａｇ，Ｈ．Ｒｅｄｌ，編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９３，９２−１１０
【非特許文献５】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，２７０：９３３−９４３
【非特許文献６】Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．１９９６，２：１３３−１４７）
【非特許文献７】Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９７，２７２：Ｈ２９７６−Ｈ２９８２
【非特許文献８】Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ，１９９８，８（１−２）：１６１−１６４
【非特許文献９】Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，１９９７，１３２（４）：４４０−４４３
【非特許文献１０】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９８，７４：１４１−１４８
【非特許文献１１】Ｂｕｒｎｓ，１９９８，２４（４）：３０７−３１１
【非特許文献１２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｕｒｍ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ，１９９６，１７（３）：２３１−２３６
【非特許文献１３】Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２０００：２３１：５６６−５７
【非特許文献１４】Ｄｉｇ  Ｓｕｒｇ，２０００，１７，５７−６５
【非特許文献１５】Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．２０００，８９，１３−１９
【非特許文献１６】Ｃａｎ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１９９９，４２，４２７−４３１
【非特許文献１７】Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．１９９９，８７，２２５−２３１
【非特許文献１８】Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９９８，５４，８５７−８６３
【非特許文献１９】Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ２０００，１０５：Ｅ４６
【非特許文献２０】Ａｒｃｈ  ｉｎｔｅｒｍ  Ｍｅｄ．１９９７；１５７：１８３３−１８３９
【非特許文献２１】Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｐｌ．１９９３，２１９−２３２
【非特許文献２２】Ｋｉｄｎｅｖ．Ｉｎｔ．１９９９；５５：２４２３−２４３２
【非特許文献２３】Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９６；７：１３７５
【非特許文献２４】Ｓｗｉｓｓ−Ｓｕｒｇ．１９９５（４）：１７５−８０；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １８０−１
【非特許文献２５】Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，１９９９；８：３７−４１
【非特許文献２６】Ｔｒａｎｓｐｌ−Ｉｎｔ．１９９６；９，Ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ４２９−４３１
【非特許文献２７】Ａｒｃｈ−Ｓｕｒｇ．１９９７，Ｊａｎ；１３２（１）：７−１２
【非特許文献２８】Ｔｒａｂｓｐｌ．Ｉｎｔ．１９９６；９（５）：４６１−７
【非特許文献２９】Ｇｕｔ．１９９５，３７：５９５−５９７）
【非特許文献３０】ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１９９６；９３（１０）：４９
【非特許文献３１】Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１９９３，１６５：７２８−７３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
肝臓および腸を虚血／再灌流に対して保護するためのEGF介入による強力な効果は、解説を予期させる。増加する証拠は、EGFの非経口投与が急性血流低下後の種々の内部上皮臓器に対する保護をもたらすものと見なされることを示している。ATP合成またはERO類産生速度の増加を妨害する化学物質に動物をさらす実験条件において、EGF介入は臓器損傷を減少させることによって有用であることが証明された。さらにまた、反復EGF投与は、組織再生、適応および機能の増大を助長する。これらのEGF治療の利益は全部が、反復投与計画および高濃度のポリペプチドの下でのみ得ることができる。多くの場合、これらの効果は、中程度であり、成長因子の組合せ治療がさらに好ましいという見解を強化する。
虚血の概念から、虚血時間が６０分よりも短い場合、EGFは組織損傷を改善するものと見なされる。より長い虚血期間の場合、EGF治療は価値がない。これは、実際の手術に要求される長い虚血期間にわたる保護としてのEGF治療の明白な限界点である。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
成長因子組合せの必要性は、長期間にわたり断固として主張されているが、臨床戦略として利用可能な組合せは存在していない。
本発明による医薬組成物の新規性は、表皮成長因子(EGF)および成長ホルモン分泌促進ペプチド（６）(GHRP-6)の組合せによる上記薬理学的相乗性によって証明される。この組合せは、臓器または組織における細胞生存を増強する。すなわち、数分から数時間にわたる血液供給の完全抑制を部分的に変化させる。この組合せは、低酸素または無酸素臓器における別種の有毒代謝物であるERO類の産生を減少または防止し、これにより虚血期間中の細胞生存を刺激する。これら２種のペプチドの組合せは、臓器適応、すなわち広範囲の外傷および修復プロセス後の腸適応を強化する点で強力な相乗活性を発揮する。
【発明の効果】
【００２３】
予防的前コンディショニングの介入によって、これらのペプチドの組合せは、細胞の自己防御メカニズムの活性化を可能にし、これにより細胞毒性剤またはストレスの多い状態に対する細胞耐性が増大される。すなわち、細胞の前コンディショニングによって、この組合せは、別段では通常の条件下に致死的である状態を非致死的に戻す。これは、虚血、低流量状態、ショック、血流力学的不全などの臨床および治療状態にある臓器または生物に対するこの組合せの適用を可能にする。
【００２４】
この組合せの保護効果に加えて、この組合せは、外傷後の組織修復、再生および機能適応を強化する。広範囲の火傷損傷、多種外傷、ショックを示す対象は、できるだけ速く当該組合せを摂取すべき対象であり、これにより多臓器不全の発現を防止または遅延させ、内臓損傷のカスケードの進行が減低される。主要または延長された期間にわたる手術、体外循環装置支持などに選ばれた対象は、内臓およびその他の内部臓器損傷にかかわる危険性を改善し、全身性炎症応答症候群を軽減するために、本発明の組合せを摂取すべきである。この組合せは、適当な血栓溶解治療が確立された時点で、血栓症および塞栓症に付随する臓器／組織損傷の軽減に良好に適用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
栄養／再生作用に関連するペプチドの相乗効果によって、この組合せは、短腸患者における腸適応の促進に有用である。肝臓実質および腎臓管系の再生をまた、この組合わせによって刺激することができる。
本発明の好適態様において、医薬組成物は単一製品中に、EGFおよびGHRP-6を組合せて含有し、これらは低酸素または無酸素事象にさらされた組織および臓器に対する強力な細胞保護作用を発揮する。この組合せは、単一のプレコンディショニングドフィシケーシヨン(pre-conditioning dosification)後に上向きに調整される種々のメカニズムによって細胞保護を提供する。この組合せは、標準的酸化防止治療様相のいずれかを補助することができる。
【００２６】
他方で、組織再生の刺激に向けられた場合、この組合せの治療的投与は反復投与を要する。EGFの用語は、天然、合成または組換え起源のものを包含する。分泌促進ペプチドの用語は、次のアミノ酸配列を有するヘキサペプチドである：Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2。GHRP-6の用語は、成長ホルモン放出ペプチドの略語として用いられる。
この組合せはまた、各対象に対するが、単一の治療計画範囲内で、両方のペプチドを独立して投与することを意味する。
この組合せを虚血組織損傷の防止に予防的に適用する場合、医薬組合せ中のEGF濃度は、凍結乾燥した塩として、または溶液としてなどのその形態に関係なく、０．５〜５０μｇ／ｍｌである。GHRP-6濃度は、同一媒質中で２〜１００μｇ／ｍｌの範囲であることができる。予防目的の場合、０．５〜１μｇ／ｍｌの用量範囲は、EGFおよびGHRP-6の両方について推奨される。
【００２７】
この組合せは、ボールスとして投与されるべきである。投与経路は末梢または深部静脈、動脈内および／または腹腔内を包含することができる。投与に用いられる媒質は、標準塩類溶液、ラクテート化リンゲル溶液、ヒト血漿、ヒトアルブミン溶液、５％デキストロース、またはその混合物を包含する。
最高の治療効果を確保するために、最初の投与は、虚血が診断されるか、予測されるか、または手術により作り出される場合、できるだけ早くなされるべきである。広範囲の火傷、多種の外傷、ショックなどを有する患者の場合、この処置は、内臓虚血の臨床的兆候または合併症の兆候が存在していなくても、予防的介入として開始されるべきである。
【００２８】
予防的投与計画は、臨床上の様相の重篤度および／または侵害の大きさに従い変動することがあり、これは熟練した専門家の裁量事項である。ボールス投与は、６時間毎に反復し、一日四回の投与で完了することができる。各投与間に６時間の沈滞期間を保持する必要がある。本ペプチドの組合せは、徐放技術用デバイスを用いて投与することができる。凍結乾燥されている場合、組合せ製剤は使用に先立ち再懸濁しなければならない。
【００２９】
前記したように、この組合せが治療を目的とするものである場合、すなわち再生および適応の刺激を目的とする場合、処置は好ましくは、徐放出系または別の手段によって投与し、相の二分画平衡(bi-compartimental equilibrium of phases)が確保されるようにすべきである。ボールス灌流は、組織再生の刺激には有効ではない。静脈経路が用いられる場合、投与期間は約４時間毎に休止されるように計算されなければならない。少なくとも８時間のクリアランス時間が処置間に存在する場合、２４時間の間に２回以上の投与を行うことができる。両方のペプチドの再生に対する推奨用量は、０．０１μｇ／ｋｇ／時間から５μｇ／ｋｇ／時間までである。
【００３０】
これらの投与および用量計画は、壊死および／またはアポトーシスが包含される虚血による組織損傷の修復を可能にする。組織が短時間の虚血期間にさらされた場合、この組合せの投与はさらに複雑に中断させる。この組合せの使用は、移植手術後に推奨され、これにより吻合治療、組織再生、および移植された臓器の最適応が確実にされる。
この組合せの反復投与はまた、大腸手術後の急性腸不全および短腸症候群の処置に推奨される。
【００３１】
例
例１．急性胃ストレス損傷の動物モデルにおけるGH分泌促進ヘキサペプチド(GHRP-6)の細胞保護効果
成熟した雄のOF-1マウス（２０−２３ｇ）に、GHRP-6（０．１μｇ／動物）または標準塩類溶液０．９％が投与されるように（両方ともにｉ．ｐ．）、無作為に割り当てた。１０〜３０分後、動物を冷水中を３０分間にわたり強制的に泳がせ、次いでさらに２０分間にわたり４℃で休ませた。その後、動物を麻酔させ、次いで殺害し、胃粘膜を切除した。試料は１０％緩衝ホルマリンに固定し、次いで顕微鏡検査用にH&EおよびPAS染色した。この試験において、糜爛、出血、および潰瘍形成を粗大病理学的臨界点であると考えた（Ｐｌａｙｆｏｒｄ  ＲＪ．「ペプチドおよび胃腸粘膜完全性」(Peptides and gastrointestinal mucosa integrity)，Ｇｕｔ．１９９５，３７：５９５−５９７）。粘液腺の１／３より深い部分が含まれている場合にのみ、顕微鏡的潰瘍形成であると考えた。管腔出血は、シアノメタヘモグロビン法によるヘモグロビン測定によって評価した(Reactivos Spinreact,Barcelona)。データは、ｇ／ｄＬで表わす。全部の測定は、模擬コードを用いるブラインド様式で行った。
表１に示されているように、GHRP-6は、粘膜損傷の強度をオキシンティック(oxyntic)粘膜上の潰瘍の数として有意に減少させた。
【００３２】
【表１】
2008231121.tif 000002
【００３３】
各群について、全部で２０匹の動物を使用した。２−テイルドｔ−テストについて確立された*ｐ＜０．０１。ｐ＜０．０５の有意レベル。
この試験は、重篤な全身的ストレスにさらされた動物の胃粘膜に対して発現されたGHRP-6の細胞保護効果を証明している。胃粘膜虚血／再灌流は、この急性損傷モデルの病理と関係があった。
【００３４】
例２．腎臓虚血／再灌流の動物モデルにおけるEGFおよびGHRP-6の予防的投与の保護効果
試験デザイン
ペプチド単独または組合せのそれぞれの潜在的壊死防止効果を、腎臓両側性虚血／再灌流のラットモデルにおいて試験した。第一相試験において、１時間の虚血期間、引続く３時間の再灌流期間を確立した。雌のウイスター(Wistar)ラット（２００−２２０ｇ）を、下記試験群に無作為に割り当てた（Ｎ＝１０）：
グループＩ：模擬虚血。
グループＩＩ：虚血および標準塩類溶液０．９％。
グループＩＩＩ：虚血およびEGF−２０μｇ／ラット。
グループＩＶ：虚血およびGHRP-6−５０μｇ／ラット。
グループＶ：EGF（５μｇ）およびGHRP-6（１０μｇ）の組合せ。
全部の処置は、虚血前の３０分の時点で腹腔内投与した。
【００３５】
虚血モデル
腎臓動脈を、微細血管クランプによって６０分間にわたりクランプ止めした。完全３時間再灌流後、動物をさらに３０分間にわたり監視し、腎臓機能化を確立した。
腎臓機能化
糸球体濾過速度(GFR)および腎臓血漿流(RPF)を、分子量マーカーとしてインスリンおよびｐ−アミノハイプリック(hypuric)を用いて試験した。クリアランス係数は、下記のとおりに測定した：
Ｃ＝Ｕｖ（ｍ）ｘ［ＰＭ］u／［ＰＭ］p
Ｕｖ（ｍ）＝最高尿量／分。
［ＰＭ］uおよび［ＰＭ］pは、各マーカーの血漿中および尿中濃度を示す。
データは、ｍｌ／分／ｇ  de pesoとして示されている。
【００３６】
尿排出量
膀胱にカテーテルを固定し、尿道をクランプ止めした。このカテーテルの自由な方の末端を目盛り付管に挿入し、尿量を１０分間にわたり採取した。
生化学的測定
腎臓組織試料を、KCl／ヒスチジン（ｐＨ７．３）緩衝液中で均質化し、この上清を使用し、酵素PLA2、カタラーゼの活性をMDA反応性代謝物として測定した。
組織学的測定
腎臓組織試料を、１０％緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィンに埋め込んだ。H&E染色し、次いで下記臨界条件を用いて独立した病理学者により評価した：
虚脱した糸球体の数、皮質出血、脊髄出血、重篤管損傷、および重篤腸損傷。
【００３７】
表２に示されているように、虚血／再灌流事象は、腎臓尿形成能力の顕著な劣化が惹起された。EGF介在は、塩類処置対照に比較して尿量減少を改善した。GHRP-6の介在は、塩類溶液処置動物に比較して、尿形成を４倍増加した。これは腎臓機能保護の特徴を示している。EGF／GHRP-6組合せ投与は、腎臓不全を完全に防止し、尿排出量は非虚血対照群に類似していた。これらのデータは、本発明のペプチド組合せの相乗効果を確認させる。
【００３８】
【表２】
2008231121.tif 000003
【００３９】
データは、平均値およびSDとして表わす。
**０．９％塩類溶液を摂取した虚血動物にかかわる平均誤差ｐ＜０．０１。
*０．９％塩類溶液を摂取した虚血動物にかかわる平均誤差ｐ＜０．０５。
顕微鏡検査は、虚血が腎臓の主要構造体：糸球体、管状器官、および間質組織に影響を及ぼすことを示した。損傷は塩類溶液摂取動物において重篤であった。EGFおよびGHRP-6は両方ともに、各独立処置に付された動物に対する腎臓保護を付与することを示した。一般に、品質的意味で、GHRP-6は、EGF単独の場合に比較して、腎臓実質に対するより大きい保護を付与するものと見なされる。両ペプチドの組合せは、各処置剤単独に比較して、着実に良好である。データを表３に示す。
【００４０】
【表３】
2008231121.tif 000004
【００４１】
**塩類溶液を摂取した虚血群にかかわる平均誤差（ｐ＜０．０１）。
＊塩類溶液を摂取した虚血群にかかわる平均誤差（ｐ＜０．０５）。
§ペプチド組合せにより処置した群に比較した、EGFおよびGHRP-6摂取群間の平均誤差ｐ＜０．０１。一方向ANOVAおよびＤuncanのマルチプルランジテスト(multiple range test)。
組織学的データは、両方の血漿マーカーのクリアランスによって与えられる腎臓機能試験によって確認した。EGFおよびGHRP-6は、独立して与えられた場合、腎臓不全を部分的に改善する。この組合せ薬剤は、総体的腎臓保護を付与することを確認させる。これらのデータを表４に示す。
【００４２】
【表４】
2008231121.tif 000005
【００４３】
（*）ペプチド組合わせにより処置された群と標準塩類溶液を摂取した群との間の誤差（ｐ＜０．０１）。
（§）ペプチド組合せにより処置した群と各ペプチド単独を摂取した群との間の誤差（ｐ＜０．０５）。
（＃）GHRP-6を摂取した群と一度、塩類溶液を摂取した群との間のｐ＜０．０５。一方向ANOVAおよびＤuncanのマルチプルランジテスト(multiple range test)によって比較。
【００４４】
第二相試験期間中、より長い虚血期間を導入し、実際の臨床に関してさらに実際的なモデルでペプチドの効果の試験を可能にした。腎臓を、３時間の虚血期間および同様の再灌流時間にさらした。表５で証明されているように、３時間の虚血期間後、明白な腎臓不全が認められた。塩類溶液摂取動物およびEGF摂取動物から採取した尿量は、無視できる程度あり、またヘモグロビンを含有していた。GHRP-6で処置された動物では、部分的腎臓保護が検出され、尿排出量は塩類溶液群およびEGF群に見出されるよりも有意に多い。対照の非虚血群について検出された尿排出量よりも少なかった。EGF／GHRP-6組合せは、非虚血群が示す尿排出量と同様であると判定される腎臓保護を付与した。
【００４５】
【表５】
2008231121.tif 000006
【００４６】
データは、平均値およびSDとして表わす。
（*）GHRP-6群と標準塩類溶液を摂取した群との間の誤差（ｐ＜０．０５）。
（§）ペプチド組合せにより処置された群、EGF処置群および塩類溶液摂取した虚血対照群との間の誤差（ｐ＜０．０１）。
（＃）GHRP-6を単独で摂取した群と比較した、組合せ摂取群との間の誤差。一方向ANOVAおよびＤuncanのマルチプルランジテスト(multiple range test)によって比較。
組織学的観点から、大部分の動物において、腎臓損傷は大規模であり、また重篤であった。品質的観点からの保護が、下記のとおりに検出された：ペプチド組合せ／GHRP-6／EGF。ペプチド組合せを摂取した動物の中で、EGFおよびGHRP-6による保護は、独立して付与された場合、無視できる程度あった。表６に示されているデータは、ペプチド組合せにより付与される保護を証明している。
【００４７】
【表６】
2008231121.tif 000007
【００４８】
（◆）GHRP-6により処置された群と塩類溶液を摂取した虚血対照群との間の誤差（ｐ＜０．０５）。
（§）ペプチド組合せを摂取した群と処置とは無関係に虚血状態にある残りの群との間の平均誤差（ｐ＜０．０５／ｐ＜０．０１）。ｐ＜０．０５について有意のレベル。一方向ANOVAおよびＤuncanのマルチプルランジテスト(multiple range test)によって比較。
腎臓機能分析はまた、ペプチド組合せが適当な速度の糸球体血流および管濾過を確実にすることを示した。付与された虚血状態においてさえも、これらの機能マーカーは模擬虚血動物において検出されるような正常範囲内にあった。データを表７に示す。
【００４９】
【表７】
2008231121.tif 000008
【００５０】
（*）組み合わせを摂取した群と残りの虚血群との間の誤差（ｐ＜０．０１）。
（§）GHRP-6で処置した群と０．９％塩類溶液処置群との間の誤差（ｐ＜０．０５）。ｐ＜０．０５について有意のレベル。一方向ANOVAおよびＤuncanのマルチプルランジテスト(multiple range test)によって比較。
この試験は、延長された期間にわたる虚血／再灌流期間による腎臓構造損傷および機能損傷の防止におけるペプチド組合せの優秀性を確認させた。
【００５１】
例３．腸虚血／再灌流モデルにおけるEGF／GHRP-6組合せの保護効果
雄のスプラギューダウレイ(Sprague Dawley)ラット（２２０−２５０ｇ）を下記処置群に無作為に割り当てた：
Ｉ．虚血／標準塩類溶液。
ＩＩ．虚血／EGF  ５００μｇ／ラット
ＩＩＩ：虚血／GHRP-6  １００μｇ／ラット
ＩＶ：虚血／組合せ−EGF（５μｇ）／GHRP-6（２μｇ）／ラット。
全部の処置は、虚血期間の開始に先立つ３０分の時点で腹腔内投与した。
【００５２】
試験モデル：
メトキシフルオラン麻酔および熱ブランケットの下に、注意深い開腹を行い、上腸間膜動脈の第一上枝を露呈した。この動脈を２時間にわたりクランプ止めし、小腸の回腸部分および十二指腸部分に重篤な虚血時間を惹起した。再灌流を３時間にわたり生じさせる。ラットを死亡させ、次いで完全剖検に付した。小腸を切り取り、出血粘膜の長さおよび／または管腔損傷を記録した。管腔内容物を標準的量の塩類溶液により洗出し、ヘモグロビン含有量を測定した。腸粘膜を温かい標準塩類溶液により洗浄し、重量を測定し、次いでその断片を使用し、ローリイ(Lowey)法によって総タンパク質含有量を測定した。別の断片を、総DNA含有量用および顕微鏡検査用に使用した。絨毛／粘膜損傷を、チウ(Chiu)により開示されたとおりに顕微鏡評価した。この尺度は、完全粘膜としてのグレード０から、順次、充分の厚さの表皮剥離としてのグレード５までであると考える。
【００５３】
この腸虚血／再灌流モデルにおける組合せ処置の保護効果を充分に説明するために、９６時間の再灌流まで、生存を監視した。
標準塩類溶液を摂取した動物は、ここで用いられた虚血／再灌流によって重大な影響を受け、総合的表皮剥離および多量の出血を伴う経壁潰瘍を示した。表８に示されているように、この試験群で試験された腸断片の大部分はグレード５パターンを示した。EGF処置は最低の保護を付与し、臨床的実用において、無関係に見える。EGF介入は最低効果を提供した。部分的保護がGHRP-6を受容した動物に見出され、この場合、粘膜損傷はさらに表面的であり、またさらに範囲限定されている。さらにまた、ペプチド組合せは粘膜損傷を格別に減少させた（表８）。試験に用いられた条件の全部は、本ペプチド組合せが虚血／再灌流事象の全体にわたり細胞保護効果を付与することを確認させる。
【００５４】
【表８】
2008231121.tif 000009
【００５５】
データは、平均値およびSDとして表わす。
（*）ペプチド組合せを受容した群と塩類溶液を受容した虚血群との間の平均誤差（ｐ＜０．０１）。
（§）GHRP-6を受容した群と塩類溶液処置群との間の平均誤差（ｐ＜０．０５）。一方向ANOVAおよびＤuncanのマルチプルランジテスト(multiple range test)によって比較。
主要内臓の顕微鏡検査は、腸損傷の大きさと遠隔の臓器に見出される腸外変化との間の密接な関連性を証明した。本組合せで処置された動物において、軽減が見出された主要損傷には：（Ｉ）肺実質における好中球性浸潤(neutrophilic enfiltration)、（ＩＩ）肝細胞腫瘍、および（ＩＩＩ）糸球体ふさ状分岐虚脱および管変化の防止。
第二の独立した試験を行い、本組合せが動物の生存を刺激するかを学習した。試験方法は上記のとおりである。全部のラットに、その傷の近くにラクテート化リンゲル液を腹腔内投与した。再灌流を開始した時点から９６時間にわたり動物を観察した。本ペプチド組合せを受容したラットの１００％が９６時間およびそれ以上にわたり生存していた。
【００５６】
【表９】
2008231121.tif 000010
【００５７】
これらの動物の病理学的試験は、本ペプチド組合せが安定した腸保護をもたらすばかりでなく、また壊死的変化の発現を減少させるという前記発見を確認させた。さらにまた、好中球漸増による遠隔標的臓器として肺および腎臓の損傷がまた、軽減された。これらの発見は、EGF／GHRP-6組合せにより惹起される全身的および多臓器保護を確認させる。
【００５８】
例４．広範囲の火傷による多臓器損傷の試験モデルにおけるEGF/GHRP-6の治療的投与の効果
Ｂａｌｂ／ｃマウス（２２−２５ｇ）の背面領域を脱毛し、次いで９５−９７℃において５秒間、平衡化した水中に浸すことによって身体表面積の２５％を含む部分に皮下熱傷をおわせた。その後すぐに、液体救急医療として標準塩類溶液を全部のマウスに与えた。この動物モデルは、我々の実験室において、予め確立され、基準化させたものであった。このモデルは、広範囲の内部変化が安定して再現されることから、我々の目的に有用である。引続く２４時間にわたり、生存しているマウスを下記群に無作為に分けた：
対照：０．９％塩類溶液を受容した模擬火傷マウス（Ｎ＝５）。
火傷し、０．９％標準塩類溶液のみを受容したマウス（Ｎ＝７）。
火傷し、EGFにより処置したマウス（Ｎ＝１０；０．１μｇEGF／動物）。
火傷し、GHRP-6により処置したマウス（Ｎ＝９；０．１μｇGHRP-6／動物）。
火傷し、ペプチド組合せにより処置したマウス（Ｎ＝１０）。EGF（０．０１μｇ）およびGHRP-6（０．０１μｇ）。
【００５９】
投与は一日二回、火傷後の１０日目まで行った。処置が完了した時点で、動物の体重を再び測定し、次いで剖検および顕微鏡検査用に死亡させた。死亡前の６時間の時点で、マウスにビンクリスチン(vincristine)（１ｍｇ／ｋｇ）の注射を施し、細胞周期を中期にとどめた。腸を切り取り、浄化し、次いで重量を測定した。断片を総DNAおよびタンパク質含有量用に採取した。別の断片をホルマリンに固定し、絨毛および陰窩の腸顕微解剖に、または常習的処理に使用した。顕微鏡スライド上の形態測定法は、DIGIPAT画像処理システムから誘導した。
【００６０】
この試験では、下記のパラメーターを考慮した：
腸重量、タンパク質含有量およびDNA含有量
中期の細胞数／陰窩
分枝陰窩数
絨毛の長さ
陰窩の深さ。
EGF、GHRP-6単独または組合せを受容したマウスの全部が、試験の終了時点で、体重の格別の増加を示した。両ペプチドを受容した動物では、その差は大きくさえあった。これらのデータを、表１０に示す。この発見は、腸粘膜に対する本組合せにより発揮される栄養効果を示している。
【００６１】
【表１０】
2008231121.tif 000011
【００６２】
火傷した後の１０日目および２０回の投与後に記録された最終体重は完全なものとされた。データは平均値およびSDで表わす。
（*）初期および最終体重間の平均誤差（ｐ＜０．０５）。
（＃）本組合せを受容した群と残りの群との間の誤差。一方向ANOVAおよびＤuncan。
表１１に示されているように、個別のペプチドそれぞれによる処置は、塩類溶液処置に比較して、腸粘膜に対して栄養／再生効果を発揮した。これらの最も重要な効果は、本ペプチド組合せを受容した群において確実に見出される。
【００６３】
【表１１】
2008231121.tif 000012
【００６４】
データは、平均値およびSDとして表わす。
（*）ペプチド組合せを受容した群と塩類溶液処理された群との間の平均誤差（ｐ＜０．０１）。
（§）各ペプチドを単独で受容した群と塩類溶液受容群との間の平均誤差（ｐ＜０．０５）。一方向ANOVAおよびポスト−Ｄuncanテスト。
この試験の最も関連する証拠は、ペプチド組合せが小腸および結腸に沿って陰窩分裂プロセスが刺激されることにより付与された小腸成長および適応を促進することを証明している。この陰窩は腸粘膜の成長および増殖単位であり、腸実質の適応にかかわる周知の形態学的証拠である。表１２は、腸の形態学的再構成にかかわるデータを示している。絨毛および陰窩拡大は、組織再生および栄養吸収に対応する。
【００６５】
【表１２】
2008231121.tif 000013
【００６６】
データは、平均値およびSDとして表わされている。
（*）ペプチド組合せを受容した群と残りの群との間の平均誤差（ｐ＜０．０５）。
（§）EGF群と０．９％塩類溶液受容群との間の平均誤差（ｐ＜０．０５）。一方向ANOVAおよびＤuncanテスト。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、下記の利点を有する：
１．本組合せは、予防および／または治療効果を発揮することができる。この効果は処置しようとする病理学的状態に適合するという要件に依存することができる。この効果は、当業者による投与計画によって容易に修正することができる。
２．細胞保護を誘発させる方法は、身体の全部の細胞における自己防衛メカニズムの刺激に基づいている。この活性化されるべきメカニズムは種々様々であるが、機能的には確認されていない。細胞保護用の多くの従来の溶液は、異種の化学構造を導入するものである（生体異物）。
３．毒性の危険を伴うことなく予想される治療的応答の誘発に、少用量で充分である。ペプチド類は、種々の種類の哺乳動物において非常に高用量でさえも安全であることが証明されている。従来の介入は中程度の効果に対してより高い用量を要求している。
【００６８】
４．生物学的応答は、特異的細胞レセプターに対するEGFおよびGHRP-6両方の相互作用により迅速に活性化される。これは、ペプチドへの延長された期間にわたる露呈の必要性を排除し、これにより毒性の危険性が減少される。
５．本ペプチド組合せは、禁忌を有しておらず、危険を伴うことなくいずれの対象にも使用することができる。
６．本方法は、それらの多くは従来では利用可能な治療を選択できなかった、非常に広範囲の通常の臨床症状および共存症に対して使用することができる。
７．本方法は、移植手術を受ける患者を包含する多くの病的状態への適応が指示される。
８．本発明の細胞保護効果は、虚血／再灌流に対する保護期間の観点で、広い治療ウインドを有する。保護期間は、移殖、再血管形成、診断処置、管理手法などにかかわる現在の臨床上の要求に適合する。
【００６９】
９．メカニズムの観点から、本組合せは種々の臨床対象点で虚血／再灌流損傷カスケードに対抗することができる。これは多価であり、従って効果的であるその薬理学的メカニズムは変更することができる。
１０．本組合せの使用は、消化器官、肝臓、膵臓および腎臓などの多くの上皮臓器に対する栄養／再生性薬剤として特異性を有する。
１１．本組合せは、現在の臨床的実施において、いずれかの別の選択肢を有していない短腸症候群矯正／腸吸収に有用であることが証明された。