(57)【要約】【課題】軟骨細胞を３次元的に簡便に培養する技術を提供する。【解決手段】軟骨細胞の培養方法等であって、培養する軟骨細胞１の相当直径よりも小さい相当直径と間隔を有する複数の凸部２１が形成された培養面を有する培養基材２の前記複数の凸部２１に軟骨細胞１を播種し、前記軟骨細胞１を配置した培養基材２を培養容器中に配置して培養を行うことで軟骨細胞塊を形成させることを特徴とする軟骨細胞の培養方法等である。【選択図】図１
2008054566.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨細胞の培養方法であって、
培養する軟骨細胞の相当直径よりも小さい相当直径と間隔を有する複数の凸部が形成された培養面を有する培養基材の前記複数の凸部に軟骨細胞を播種し、
前記軟骨細胞を配置した培養基材を培養容器中に配置して培養を行うことで軟骨細胞塊を形成させることを特徴とする軟骨細胞の培養方法。
【請求項２】
前記軟骨細胞塊が相当直径１０μｍ以上５．０ｍｍ以下の軟骨細胞塊であることを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞の培養方法。
【請求項３】
前記軟骨細胞塊を形成する軟骨細胞が互いに接していることを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞の培養方法。
【請求項４】
前記複数の凸部の相当直径が０．０１μｍ以上１０μｍ以下、高さが０．０１μｍ以上１００μｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞の培養方法。
【請求項５】
前記軟骨細胞が生体軟骨より調整した軟骨細胞、または骨髄、滑膜由来間葉系幹細胞由来軟骨細胞由来であることを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞の培養方法。
【請求項６】
前記軟骨細胞が患者から採取された細胞由来であることを特徴とする請求項５に記載の軟骨細胞の培養方法。
【請求項７】
前記軟骨細胞が、培養液中にＴＧＦ−βおよび／またはデキサメタゾンを添加して培養して得られたことを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞の培養方法。
【請求項８】
前記軟骨細胞の播種密度が１×１０4〜１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度であることを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞の培養方法。
【請求項９】
軟骨細胞を培養するための軟骨細胞培養基材であって、
培養面と、
前記培養面に形成され、軟骨細胞を頂部に接して培養するための軟骨細胞の相当直径よりも小さい相当直径と間隔を有する複数の凸部と、
を含むことを特徴とする軟骨細胞培養基材。
【請求項１０】
さらに、培養液を入れるための培養器を含んで構成されることを特徴とする請求項９に記載の軟骨細胞培養基材。
【請求項１１】
前記培養面と、前記培養器とが一体に形成されたことを特徴とする請求項１０に記載の軟骨細胞培養基材。
【請求項１２】
軟骨細胞の相当直径よりも小さい相当直径と間隔を有する複数の凸部が形成された培養面を有する培養基材と、
前記複数の凸部頂部に接して培養された軟骨細胞と、を含んで構成され、
前記軟骨細胞が軟骨細胞塊を形成していることを特徴とする軟骨細胞含有生体組織再生用材料。
【請求項１３】
軟骨細胞の相当直径よりも小さい相当直径と間隔を有する複数の凸部が形成された培養面の前記複数の凸部の頂部に接して培養され、前記軟骨細胞が軟骨細胞塊を形成していることを特徴とする軟骨細胞。
【請求項１４】
前記軟骨細胞塊が相当直径１０μｍ以上５．０ｍｍ以下の軟骨細胞塊であることを特徴とする請求項１３に記載の軟骨細胞。
【請求項１５】
前記軟骨細胞塊を形成する軟骨細胞が互いに接していることを特徴とする請求項１４に記載の軟骨細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養基材を用いて軟骨細胞を培養する技術に係り、特に、培養基材を用いて所定の表現型で軟骨細胞を培養する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療目的に用いられる細胞培養技術が進歩し、再生医療やセルエンジニアリングへの応用の期待が高まっている。
軟骨組織は、自己修復能が極めて小さいため、小さな損傷では自然修復が期待できても、変形性関節症（ＯＡ）や関節リウマチ（ＲＡ）等で生じるある程度以上の損傷では、自然治癒は期待できない。軟骨組織の代表的な治療技術の一つである人工関節置換術は、人工関節の磨耗等のために１０年以上の長期使用は困難であり、適用限界がある。
【０００３】
近年、整形外科領域では、軟骨欠損部位の修復に、患者から採取した自家軟骨より単離した軟骨細胞を、一旦生体外で培養、増殖させてから欠損部位に再移植する技術が活発に研究され、一部では実用化されている。この際に、２次元的に培養された軟骨細胞を利用すると、所望する位置へ軟骨細胞を配置することが難しくなったり、繊維芽細胞へと脱分化して軟骨細胞が本来分泌するコラーゲンタイプIIやアグリカンなどの軟骨基質(マトリックス蛋白質)を分泌しなくなり、三次元軟骨組織を構築できなくなっていたりするため、適切ではない場合がある。
【０００４】
通常、軟骨細胞をシャーレのような培養表面が平坦な培養器で２次元培養すると、２次元シートしか得られない。所望する位置に細胞を配置したり、細胞が本来分泌する軟骨基質を分泌させるために、細胞の３次元培養法の開発が望まれている。また、３次元培養法のなかでも、大型な３次元組織を構築する３次元培養法は、使用するシステムが大がかりであったり、コストがかかったりする。
【０００５】
そこで、従来では、３次元培養法の一つとして、攪拌培養法が利用されている。また、３次元培養法の一つとして、ＲＷＶバイオリアクターを用いて大型軟骨を構築する方法が利用されている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】国際公開第２００５／０５６０７２Ａ１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、攪拌培養法では、細胞に与える機械的刺激や損傷が強く、細胞内部で壊死が起こりやすい。従って、静置しつつ、３次元的に組織構築する細胞培養法が望まれている。
また、ＲＷＶバイオリアクターを用いて大型軟骨を構築する方法は、培養液が多量に必要であり、熟練者による培養が必要であり、コンタミネーションを起こしやすい。従って、厳密な無菌状態で、細心の注意のもとで培養する必要がある。
【０００７】
そこで、本発明は、軟骨細胞を３次元的に簡便に培養する技術を提供することを目的とする。特に、簡便に利用可能なスフェロイド状の組織を培養する３次元培養技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するために、本発明の軟骨細胞の培養方法は、培養する軟骨細胞の相当直径よりも小さい相当直径と間隔を有する複数の凸部が形成された培養面を有する培養基材の前記複数の凸部に軟骨細胞を播種し、前記軟骨細胞を配置した培養基材を培養容器中に配置して培養を行うことで軟骨細胞塊を形成させることを特徴とする。
なお、他の発明については、本明細書の中で明らかにする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、軟骨細胞を３次元的に簡便に培養することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための最良の形態（以下「実施形態」という）について、適宜図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、軟骨細胞を培養する軟骨細胞培養基材に、培養用培養液と軟骨細胞とを配して、前記軟骨細胞を対応する培養条件下で培養するに当たって、前記軟骨細胞培養基材の培養表面に、所定の形状と間隔を有する複数の凸部が設けられた軟骨細胞培養基材を用いると、軟骨細胞を所定の表現型に制御して培養を行うことができるという知見に基づいて創作されたものである。
【００１２】
図１は、本実施形態の軟骨細胞および軟骨細胞培養基材（適宜、「培養基材」という）を示す斜視図である。図１に示すように、本実施形態の軟骨細胞１は、軟骨細胞１の相当直径よりも小さい相当直径の複数の凸部２１が形成された培養表面の前記複数の凸部２１の最上面（頂部）２１Ａに接して培養された軟骨細胞１である。ここで、「最上面（頂部）２１Ａに接して」とは、軟骨細胞１の少なくとも一部分が複数の凸部２１の頂部２１Ａに接しつつ、基材ベース上面２２Ａ（図２（ｂ）参照）に接してない状態である。典型的な例としては、軟骨細胞１が、複数の凸部２１の頂部２１Ａの上側に跨って接着されている状態である。
そして、このように軟骨細胞１が培養されると、増殖などによる細胞や播種細胞など複数の軟骨細胞１が３次元的に凝集してスフェロイド（軟骨細胞塊に相当する）を形成する。ここで、「軟骨細胞塊」とは軟骨細胞１が互いに接している状態であって、例えば、軟骨細胞１が密着している状態、重なり合っている状態、接着している状態等を含む。
【００１３】
<<軟骨細胞１>>
培養に用いられる軟骨細胞１は、軟骨細胞培養基材２で培養できるものであれば、特に限定されるものではなく、従来公知の軟骨細胞１から適宜選択できる。例えば、ヒトを対象とした再生治療に適用する場合には、軟骨細胞１はヒト由来の軟骨細胞１であることが好ましいが、患者の患部に適応する軟骨細胞１であれば非ヒト動物由来であってもよい。また、軟骨細胞１は、例えば、生体軟骨から調整したものであっても、幹細胞から軟骨細胞１に分化誘導したものであっても、さらには、これらを継代培養後に使用するものであってもよい。
【００１４】
とりわけ、再生治療の対象となる個体自身の軟骨細胞１（特に、骨髄、滑膜由来間葉系幹細胞が好ましい）を用いれば、移植の際に免疫抑制処理を施す必要が無いために最適である。個体自身から対応する軟骨細胞１を得ることができない場合には、個体と同種のドナー由来の軟骨細胞１（特に、骨髄、滑膜由来間葉系幹細胞が好ましい）を用いることができる。この場合は拒絶反応が小さくなるようなドナーの選択と、移植をする際の免疫抑制とが必要である。
換言すると、入手可能な軟骨細胞１から目的に応じて好適なものを適宜選択して、本実施形態に適用可能である。
【００１５】
また、軟骨細胞１の底面の形状は必ずしも円形ではない。従って、本実施形態においては、軟骨細胞１の大きさを規定する場合に、円形のみを想定した「直径」等の表現は用いず、「相当直径」として記載する。なお、軟骨細胞１の相当直径の定義は、後記する凸部２１の相当直径の定義を参照することができる。
【００１６】
<<軟骨細胞培養基材２>>
図２は、本実施形態の軟骨細胞培養基材２の構成を示す斜視図であって、（ａ）は全体図、（ｂ）は（ａ）で示したＡ領域の部分拡大図である。
図２（ａ）に示すように、軟骨細胞培養基材２は、基材ベース２２と、この基材ベース２２の培養表面（例えば、上面側）に形成される複数の凸部２１とを含んで構成される。そして、この複数の凸部２１は、軟骨細胞培養基材２で軟骨細胞１が培養される際に、軟骨細胞１を３次元的に凝集させる制御を行うことにより、スフェロイドを形成させるものである。
【００１７】
<<凸部２１>>
図２（ｂ）に示すように、凸部２１は、その最上面２１Ａにおいて所定の相当直径ｒを有し、所定の間隔ｇで配列している。
凸部２１の最上面２１Ａの形状は、必ずしも円形である必要はない。従って、本実施形態においては、最上面２１Ａの大きさを規定する場合に、円形のみを想定した「直径」等の表現は用いず、「相当直径」として記載する。
ここで、「相当直径」とは、凸部２１の最上面２１Ａの直径または直径に相当する長さであって、最上面２１Ａの形状が円形の場合にはその直径、矩形である場合にはその一辺の長さ、また、そのいずれにも該当しない場合には、例えば、円相当径を用いることができる。円相当径は、必ずしも円形ではない最上面２１Ａの形状を、円形とみなしてその直径を規定するものである。例えば、円相当径として、最上面２１Ａの面積と同じ面積を持つ円の直径とみなす面積円相当径、最上面２１Ａの周長と同じ長さの円の直径とみなす周長円相当径、最上面２１Ａの形状に外接する円の直径とみなす外接円相当径、最上面２１Ａの形状に内接する円の直径とみなす内接円相当径等が挙げられ、最上面２１Ａの形状に応じて適宜選択することができる。
【００１８】
凸部２１の相当直径ｒは、軟骨細胞１との接触面積を減らすために軟骨細胞１の相当直径よりも小さくすることが好ましい。このような構成とすることにより、軟骨細胞１が凸部２１の最上面２１Ａ上で培養される場合には、軟骨細胞１の底面と培養液との接触面積が増加し、軟骨細胞１と培養液間の栄養物質や老廃物との交換を促進することができるため、軟骨細胞１がスフェロイドを形成する際に所定の効果を奏する。
また、相当直径ｒの下限は、複数の凸部２１を均一な加工精度で形成することができれば特に限定されない。
具体的には、凸部２１の相当直径ｒは、好ましくは１０ｎｍ以上、１０μｍ以下であって、より好ましくは０．２μｍ以上、５．０μｍ以下である。
【００１９】
凸部２１の配列の様式は、所定の間隔ｇを満たす範囲において、様々に規定することができる。例えば、複数の凸部２１の配列の様式は、同一の凸部形成領域における効果の均一性を保持するために、２次元正方格子状や千鳥格子状であることが好ましい。
凸部２１間の間隔ｇは、凸部２１の最上面２１Ａ外周から当該凸部２１に隣接する凸部２１の最上面２１Ａ外周までの最短距離として規定する。例えば、図２に示すように、凸部２１の配列の様式が２次元正方格子状の場合には、凸部２１間の間隔はｇの長さである。
そして、本実施形態においては、凸部２１間の間隔ｇを、培養する軟骨細胞１の相当直径よりも小さく設定する。このように設定することによって、軟骨細胞１は、凸部２１間の隙間に入り込むことがなくなり、凸部２１の最上面２１Ａ上で培養されることとなる。
【００２０】
凸部２１の高さは、凸部２１間の基材ベース上面２２Ａ上に充分に培養液を浸透させ、かつ、凸部２１の最上面２１Ａ上で培養されている軟骨細胞１の一部が、基材ベース上面２２Ａに触れることを防止できる高さに設定される。凸部２１の高さは、例えば、０．１μｍ以上であれば充分であるが、凸部２１の相当直径ｒの長さよりも長い方が、より好適である。一方で、構造強度的な観点から、凸部２１の高さの上限が、凸部２１の相当直径の１００倍に設定されることが好ましい。
具体的には、凸部２１の高さは、好ましくは１０ｎｍ以上、１ｍｍ以下であって、より好ましくは０．１μｍ以上、１００μｍ以下である。
なお、凸部２１の高さ方向の形状は、特に限定されるものではなく、例えば、柱状、錐状、逆錐状等であってもよく、また、その外周部の形状や修飾等は、特に限定されるものではない。凸部２１の高さ方向の形状は、例えば、根本から先端にかけて細くなっていく形状であってもよく、根本から先端にかけて細くなり先端部に太い部分を有するきのこのような形状でもよい。
【００２１】
凸部２１や基材ベース２２を含む軟骨細胞培養基材２の材質は特に限定されないが、所望する加工精度、表面特性、光学特性、強度等に応じて適宜選択される。具体的には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニリデン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニール、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリアミド、ポリアセタール、ポリブチレンテレフタレート、ガラス強化ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、変性ポリフェニレンエーテル、ポリフェニレンスルフィド、ポリエーテルエーテルケトン、液晶性ポリマー、フッ素樹脂、ポリアレート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアミドイミド、ポリエーテルイミド、熱可塑性ポリイミド等の熱可塑性樹脂や、フェノール樹脂、メラミン樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、シリコーン樹脂、ジアリルフタレート樹脂、ポリアミドビスマレイミド、ポリビスアミドトリアゾール等の熱硬化性樹脂、およびこれらを２種以上ブレンドした材料を用いることが可能である。また、この他に石英、ガラス類等の無機物も使用することが可能である。
なお、凸部２１と基材ベース２２とは、例えば、同じ材料で構成して一体的に形成してもよく、また、異なる材質で構成して基材ベース上面２２Ａに凸部２１を接着する構成としてもよい。ただし、凸部２１と基材ベース２２とを同じ材料で構成して一体的に形成する方が、高い強度を得られるためにより好ましい。
【００２２】
また、凸部２１や基材ベース上面２２Ａを含む軟骨細胞培養基材２の培養表面は、目的に応じて、様々な処理を施すことができる。
例えば、過酸化水素やオゾン等の酸化剤を含む溶媒を用いた溶媒への浸漬や紫外線照射、プラズマ処理等の気相処理等による親水化処理、疎水化処理、溶液への浸漬等によるポリリジン、アルブミン、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ビトロネクチン、ラミニン等のタンパク質によるコート、若しくは無電解めっき、気相蒸着法による金属コート、温度感応性被覆材によるコート、光や電子線、粒子線等による表面改質が行われ、軟骨細胞１の培養に必要な表面処理が施される。  
また、これらの表面処理は、軟骨細胞培養基材２の表面全体に渡って施してもよいし、限定した領域であってもよい。例えば、一部の凸部２１と、その他の凸部２１とに対し、異なる表面処理を施してもよいし、凸部２１と、それ以外の部位とに対し、異なる表面処理を施してもよい。また、凸部２１の最上面２１Ａと、当該凸部２１の外周面とに対し、異なる表面処理を施してもよい。
【００２３】
なお、軟骨細胞培養基材２と軟骨細胞１とで軟骨細胞含有生体組織再生用材料３を構成し、この軟骨細胞含有生体組織再生用材料３を患者の体内に埋入して使用してもよい。
このような軟骨細胞含有生体組織再生用材料３を構成する軟骨細胞培養基材２は、生分解性物質（水解性物質を含む）によって構成されることがより好ましい。
【００２４】
このような軟骨細胞含有生体組織再生用材料３を構成する軟骨細胞培養基材２の材質は、例えば、アルギン酸、架橋アルギン酸、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、架橋ヒアルロン酸、セルロース、デンプン、架橋デンプンおよびこれらの誘導体等の多糖類；ゼラチン、架橋ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、フィブリン、アルブミン等の蛋白質；ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリジン等のポリペプチド；ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ（ε−カプロラクトン）、グリコール酸／乳酸共重合体、グリコール酸／カーボネート共重合体、ポリジオキサノン、シアノアクリレート系重合体等の合成高分子材料；水酸アパタイト、リン酸三カルシウム、炭酸カルシウム等の無機材料等を挙げることができる。なかでも、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ（ε−カプロラクトン）、グリコール酸／乳酸共重合体等の合成高分子材料を主成分とする軟骨細胞培養基材２は、剛性、安定性、柔軟性、透明性、耐熱性、耐湿熱性等の点で優れているため、好適である。
【００２５】
ここで、本実施形態の軟骨細胞培養基材２の製造方法を図面を参照して説明する。
図３は、軟骨細胞培養基材２の製造方法の一例であるナノインプリント法による製造工程を説明するための図である。
まず、図３（ａ）に示すように、軟骨細胞培養基材２の原料である基材原料４と金型５を用意する。基材原料４は、前記した軟骨細胞培養基材２に好適な材料である。金型５の材質は、ニッケル等の金属、カーボンやシリコン等の無機物、ＰＤＭＳ等の有機物、および樹脂組成物等から、基材原料４の材質や凸部２１の加工精度に応じて適切に選択される。金型５表面への金型凹部６の形成法は、切削加工、光リソグラフィ法、電子線直接描画法、粒子線ビーム加工法、走査プローブ加工法等の微細加工法や微粒子の自己組織化、又はこれらの手法によって形成されたマスタからのナノインプリント法、キャスト法、射出成型法に代表される成型加工法、めっき法等から適切に選択される。
【００２６】
なお、金型５の金型凹部６の深さ、大きさ、軟骨細胞培養基材２の材質等を調整することで凸部２１の高さ、相当直径ｒ、間隔ｇ等を制御できる。さらに、金型凹部６の位置を制御することで凸部２１を形成する位置を制御できる。
【００２７】
次に、図３（ｂ）に示すように、基材原料４の少なくとも表面を軟化し、金型凹部６が形成された金型５を押し付けることによって、金型凹部６の形状を基材原料４に転写する。
そして、図３（ｃ）に示すように、金型５を引き剥がすことによって、基材ベース上面２２Ａに凸部２１が一体的に形成された軟骨細胞培養基材２を得ることができる。
なお、加熱した基材原料４から金型５を離型する際に、基材ベース上面２２Ａおよび凸部２１の損傷を防ぐために、金型５の表面をフッ素系、または、シリコーン系等の離型剤でコートしておくことが好ましい。
【００２８】
そして、形成された凸部２１を含む軟骨細胞培養基材２の表面に対し、必要に応じて、浸漬法、スピンコート法、蒸着法、プラズマ重合法、インクジェット法、スクリーン印刷法のように新たに層を付加する手法や、加熱、光照射、電子線照射、プラズマ処理、浸漬処理等によって、表面修飾を施すこともできる。なお、この表面修飾処理は、凸部２１の形成後に限らず、例えば、形成前の基材原料４または金型凹部６の表面にあらかじめ表面処理を施し、凸部２１の形成と同時に凸部２１を含む細胞培養基材２の表面に修飾処理を施すこととしてもよい。
【００２９】
なお、軟骨細胞培養基材２の製造方法は前記したナノインプリント法に限定されず、例えば、切削加工法や印刷法、イオンビーム加工法、電子ビーム加工法、レーザ加工法、光リソグラフィ法、キャスト法、射出成型法による加工法等から、基材原料４の材質や凸部２１の加工精度に応じて適切に選択される。また、キャスト法や射出成型法で製造する場合には、前記した形成法により形成した金型５を用いることができる。
【００３０】
なお、このような軟骨細胞培養基材２と培養器７とを組み合わせて構成した軟骨細胞培養キット８（図４（ａ）参照）、あるいは、一体形成して構成した軟骨細胞培養キット８（図４（ｂ）参照）も本発明の範囲内に含まれる。また、軟骨細胞培養キット８としては、培養液を含む構成としてもよい。
【００３１】
＜軟骨細胞の培養方法＞
次に、本実施形態の軟骨細胞１の培養方法を図面を参照して説明する。
本実施形態の軟骨細胞１の培養条件については、選択された軟骨細胞１に対応する従来公知の培養条件の中から、適宜適切な条件を適用することができる。この選択された軟骨細胞１に対応する培養条件は、当業者であれば、容易に選択し、選択した培養条件に基づいて培養を実施することができる。
【００３２】
使用する培養液は、軟骨細胞１の培養に適切とされる従来公知の組成のものでよく、例えば、製造メーカにより提供される軟骨細胞培養用の培養液を使用することができる。このとき、軟骨細胞１の軟骨細胞培養基材２への接着や、スフェロイドの形成を補助する試薬を添加してもよい。
ただし、本実施形態においては、軟骨細胞培養基材２による軟骨細胞１の表現型の制御効果を明確に説明する必要性に鑑み、定着を除く培養中の培養液には軟骨細胞１の表現型を誘導・抑制する物質を特に含有していない培養液で培養を行うことを前提として説明する。
【００３３】
軟骨細胞１の培養に使用するインキュベータは、軟骨細胞１を培養することができれば特に限定されないが、例えば、一般的な細胞の培養に使用するものと同様のＣＯ2インキュベータを使用することができる。通常、ＣＯ2インキュベータは、ＣＯ2濃度５％、温度３７℃、相対湿度８０％に設定されている。
【００３４】
ここで、軟骨細胞１の培養手順を図４（ａ）を参照しながら説明する。図４（ａ）は、軟骨細胞１の培養手順を説明するための図であって、軟骨細胞１を培養するための軟骨細胞培養キットの一例を示す縦断面図である。
まず、軟骨細胞培養基材２をシャーレ状の培養器７底部の上面側に設置して、軟骨細胞培養キット８を構成する。そして、軟骨細胞１を培養液（図示せず）とともに培養器７内部の軟骨細胞培養基材２上に播種する。このとき、軟骨細胞培養基材２の培養表面は培養液により浸漬され、培養液中の軟骨細胞１は、軟骨細胞培養基材２上へと沈降する。
そして、培養液および軟骨細胞１が播種された軟骨細胞培養基材２をＣＯ2インキュベータ内で所定期間静置する。
【００３５】
この過程で、軟骨細胞１は、軟骨細胞培養基材２上に定着（接着）し、培養されるが、定着後には、所定の間隔毎に培養液を交換してもよい。培養に使用する培養液は、血清培養液、無血清培養液、サプリメントやサイトカイン添加培養液でも良く、例えば、無血清培養液の場合、１日もしくは２日毎に培養液を交換することが好適である。
そして、前記所定期間経過後、軟骨細胞１を使用する。この所定期間は、特に限定されるものではなく、所望する軟骨細胞１の表現型（例えば、スフェロイドの大きさ、スフェロイドに含まれる軟骨細胞１の数、細胞外マトリクスの産生量等）に対応して延長または短縮して調節することができる。
また、軟骨細胞１を使用する際には、軟骨細胞１を軟骨細胞培養基材２の凸部２１から剥離させて軟骨細胞１のみを使用してもよいし、軟骨細胞１および軟骨細胞培養基材２からなる軟骨細胞含有生体組織再生用材料３として使用してもよい。
【００３６】
また、軟骨細胞培養基材２上でスフェロイドを形成している軟骨細胞１を剥離させる方法は、軟骨細胞１を軟骨細胞培養基材２から剥離させることができればどのようなものであってもよく、従来公知の方法を利用することができる。例えば、スフェロイドを切断したり、引っ張ったり等の物理的な剥離方法や、所定の試薬や酵素等を用いた化学的な剥離方法を利用することができる。
【００３７】
図４（ｂ）は、軟骨細胞１を培養するための軟骨細胞培養キット８の他の例を示す縦断面図である。図４（ｂ）は、培養器７と軟骨細胞培養基材２とが一体に形成された軟骨細胞培養キット８であって、培養器７自身に直接複数の凸部２１が形成された構成となっている。本実施形態の軟骨細胞１の培養方法においては、このような構成の軟骨細胞培養キット８も利用することができる。
【００３８】
なお、本発明は前記実施形態に限定されるものではなく、その技術思想のおよぶ範囲で様々の変更実施を行うことができる。
本発明の軟骨細胞１や軟骨細胞培養基材２は、軟骨組織の再生に好適に用いることが考えられる。例えば、本実施形態の軟骨細胞１によれば、変形性関節症や関節リウマチの治療に好適に利用することが期待される。
【００３９】
本発明の軟骨細胞を軟骨由来疾患を有する動物に移植して治療することも期待される。この場合の動物とは、当該動物に移植可能な軟骨細胞を入手可能な動物であれば特に限定されるものではなく、ヒト、家畜（ブタ、ウシ、ウマ等）、ペット用哺乳類（イヌ、ネコ等）、両生類、鳥類等種々の動物が挙げられる。
従って、本発明の範囲は、軟骨由来疾患を患う患者の疾患部位に、軟骨細胞を前記患者の疾患部位に移植する軟骨由来疾患の治療方法まで拡張されうる。
【００４０】
また、本実施形態においては、軟骨細胞培養基材２に複数の凸部２１を形成することによって軟骨細胞１の表現型を制御する構成としたが、軟骨細胞培養基材２に複数の凹部、または、凸部２１と凹部とを組み合わせた凹凸構造を形成することによって軟骨細胞１の表現型を制御することも可能である。
【００４１】
また、本実施形態において、培養表面は、単層シート状に形成された軟骨細胞培養基材２の上面側を示しているが、軟骨細胞培養基材２の形状および軟骨細胞培養基材２における培養表面の位置はこれに限定されるものではない。
例えば、軟骨細胞培養基材２の形状は、多面体、筒状、単層シートを積層した積層体等であってもよく、軟骨細胞培養基材２の側面、下面、内面等を培養表面としてもよい。
【実施例】
【００４２】
次に、本発明のより具体的な例を実施例によって説明する。
【００４３】
＜第一実施例：軟骨細胞培養キット８の作製＞
第一実施例は、複数の凸部２１を有する軟骨細胞培養基材２と培養器７とが一体形成された軟骨細胞培養キット８（図４（ｂ）参照）を作製した実施例である。
【００４４】
第一実施例の軟骨細胞キット８は、厚さ２ｍｍのポリスチレンを主成分とした直径３５ｍｍのシャーレ状の培養器７底部の上面側に、直径２５ｍｍの円状の領域に複数の凸部２１を形成することによって作製した。ポリスチレンの分子量は２０００から３８４万である。なお、更に分子量の上限は６００万まで拡張することができる。
【００４５】
凸部２１は熱ナノインプリント法で作製した。凹凸を形成した金型５（図３参照）を１３０℃に過熱して、培養器７にプレス圧力４ＭＰａでプレスした。金型５は結晶方位（１００）、直径２５ｍｍの円状のシリコンウエハである。金型５を１００℃まで冷却後に垂直に引き上げ凸部２１を形成した。
【００４６】
図５は、第一実施例で作製した軟骨細胞培養キット８底部の上面側に形成された複数の凸部２１を示す部分斜視図である。
複数の凸部２１は２次元正方配列で配列している。それぞれの凸部２１は略円柱形状であり、最上面２１Ａの相当直径ｒが４００ｎｍで、下方に向かって末広がり状となっており、最下面では相当直径が５００ｎｍになっている。また、高さは１μｍであり、高さと一辺の比は２となり、１より大きいことが分かる。複数の凸部２１の間隔ｇは１μｍであり、培養する軟骨細胞１の相当直径ｒよりも小さい値となっている。
このように作製された軟骨細胞培養キット８の凸部２１は、軟骨細胞１の表現型を制御するための所定の形状や間隔を満たしつつも、凸部２１が軟骨細胞培養キット８から取れにくいという効果を有していた。
【００４７】
＜第二実施例：ウシ関節軟骨細胞の培養＞
第二実施例は、第一実施例と同様の製造方法で作製した軟骨細胞培養キット８でウシ関節軟骨細胞を培養し、培養された軟骨細胞（軟骨細胞塊）１について検証を行った実施例である。
【００４８】
<<軟骨細胞１の培養>>
まず、軟骨細胞１を調整するために、ウシ関節軟骨部をメスで１ｍｍ角程度にスライスし、ＰＢＳで洗った。その後、コラゲナーゼ溶液（０．２％コラゲナーゼＤＭＥＭ溶液、アンホテリシンＢ（５ｍｌ／５００ｍｌ medium）を含む）にいれ、３７℃で１２−２０時間攪拌・振とうし、コラーゲンを分解した。遠心分離（４℃、１２００ｒｐｍ、５分）により軟骨細胞を得た。その後、３×１０7cells／ｍｌになるようにセルバンカーで希釈し、凍結保存した。
【００４９】
次に、軟骨細胞１を培養するために、３種類の軟骨細胞培養キット８（以下に示す、実施例１、実施例２および比較例）の培養表面に、それぞれ、凍結融解した軟骨細胞１を２×１０6cells／ｃｍ2になるように播種した。３時間の初期培養の後、培養液（（１０-7Ｍデキサメタゾン（Sigma社製）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β３（Sigma社製、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Wako製）、ITS＋Premix（ＢＤ製）、４０μｇ／ｍｌ  Ｌ−プロリン（Sigma社製）、およびAntibiotic-Antimycotic（GIBCO BRL社製）、を含むＤＭＥＭ培養液（Sigma社製））を加え３７℃、５％ＣＯ2下で培養を続けた。
【００５０】
以下に、第二実施例で使用した３種類の軟骨細胞培養キット８の凸部２１の特性について説明する。
実施例１  凸部の相当直径ｒ：２．０μｍ、間隔ｇ：２．０μｍ、高さ：１．０μｍ
実施例２  凸部の相当直径ｒ：０．５μｍ、間隔ｇ：０．５μｍ、高さ：１．０μｍ
比較例    凸部なし（培養器７のみ）
実施例１、実施例２の凸部形成領域は１０ｍｍ×１０ｍｍの正方形状である。なお、これらの軟骨細胞培養キット８の製造方法については、第一実施例と同様であるので説明を省略する。
これら実施例１、実施例２および比較例を用いて、下記の評価を行った。
【００５１】
<<軟骨細胞の評価方法>>
１．グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量
実施例１、実施例２および比較例で培養したウシ軟骨のＧＡＧ量を、培養開始後３６日で測定した。測定は、Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit （Biocolor Ltd.）を用いた色素定量による。
【００５２】
２．走査型電子顕微鏡観察および光学顕微鏡観察
走査型電子顕微鏡観察するために、実施例１、実施例２および比較例で培養した軟骨細胞１を、２．５％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳで４℃にて３時間固定し、０．１％四酸化オスミウム（ＯｓＯ4）中４℃で２時間インキュベートし、５０、６０、７０、８０、９０、９５、１００％エタノールで３０分ずつ順次脱水処理を行った。その後、ｔ−ブチルアルコール中で凍結乾燥させ、プラチナコートし、HITACHI  Ｓ−４５００走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察を行った。
また、光学顕微鏡観察は、Olympus ＣＫＸ−４１型顕微鏡を用いて観察した。
【００５３】
３．蛍光抗体法による軟骨マーカータンパク質の検出
３６日間の培養の後、ＴＢＳ−Ｃａ（１ｍＭ  ＣａＣｌ2を含むTris-buffred saline、ｐＨ７．６）で３回洗い、４％パラフォルムアルデヒドで室温１５分固定した。ＴＢＳ−Ｃａで３回洗った後、−２０℃で３０分間メタノール処理を行い、５％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｃａで２時間ブロッキングを行った。ＴＢＳ−Ｃａで１回洗った後、一次抗体（抗マウスＩＩ型コラーゲン抗体；第１ファインケミカル）を５％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｃａで１／５００に稀釈し、４℃オーバーナイトで静置した。ＴＢＳ−Ｃａで２回洗った後、２次抗体（Jackson Immuno Research、FITC-conjugated Affinity Pure F(ab')2 fragment goat anti-mouse IgG（H+L））をＴＢＳ−Ｃａで１／１００に稀釈して加え、室温で３０分処理、ＴＢＳ−Ｃａで３回洗った後、蛍光退色防止剤（Vector Laboraories、VECTASHIELD）で封入し、Carl Zeiss AkioPlan2蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【００５４】
<<軟骨細胞の評価結果>>
図６は、軟骨細胞１で発現しているグリコサミノグリカン量の比較結果を示す図である。図６に示すように、実施例１および実施例２は、比較例と比較して、単位ＤＮＡあたりのグリコサミノグリカン量が多かった。さらに、実施例１と実施例２の比較から、２．０μｍの相当直径ｒの凸部２１を有する軟骨細胞培養キット８の方が０．５μｍの相当直径の凸部２１に比べて、グリコサミノグリカン量が多かった。
グリコサミノグリカンは、他の種類の細胞（例えば、繊維芽細胞）に比べ、軟骨細胞１において特に発現量が多いとされている。すなわち、グリコサミノグリカンの定量により、実施例１および実施例２に比べて比較例は、軟骨細胞１が脱分化を起こしていることが示された。また、実施例１と実施例２との比較から、凸部２１の形状によって軟骨細胞１の分化の度合いが異なることが示された。
【００５５】
図７ないし図９は軟骨細胞１の電子顕微鏡写真である。また、それぞれの図において、（ａ）と（ｂ）とは拡大倍率が異なる。図７および図８に示すように、実施例１および実施例２ではスフェロイドを形成しやすいことが示された。さらに、実施例１と実施例２の比較から、０．５μｍの相当直径ｒの凸部２１を有する軟骨細胞培養キット８の方が２．０μｍの相当直径ｒの凸部２１に比べて、スフェロイドを形成しやすいことが示された。一方で、図９に示すように、凸部２１を有さない比較例では軟骨細胞１はほとんどスフェロイドを形成しなかった。
【００５６】
図１０は、前記光学顕微鏡観察によって求めた軟骨細胞１のスフェロイド径分布を示す図であって、（ａ）は、凸部２１の相当直径ｒが２．０μｍ（実施例１）、（ｂ）は凸部２１の相当直径ｒが０．５μｍ（実施例２）である。
図１０に示すように、凸部２１上での軟骨細胞１のスフェロイド径分布を示しているが、２．０μｍより０．５μｍの相当直径ｒの凸部２１上での培養が、スフェロイド径をよく制御していることが分かった。
【００５７】
図１１は、軟骨細胞１におけるＩＩ型コラーゲンの発現を観察するための図であって、（ａ）は、凸部２１の相当直径ｒが２．０μｍ（実施例１）、（ｂ）は凸部２１の相当直径ｒが０．５μｍ（実施例２）である。また、図１１において、発色部分はコラーゲンタイプIIを発現している。図１１に示すように、凸部２１上の培養により構築されたスフェロイドは実施例１、実施例２の何れにおいても軟骨の特徴的なマーカーであるＩＩ型コラーゲンを発現していることが分かった。これにより、本発明の軟骨細胞培養キットによれば軟骨細胞１の脱分化を防ぐことができることが示された。
【００５８】
以上によれば、複数の凸部２１を有する軟骨細胞培養キット８（実施例１および実施例２）は、凸部２１を有さない軟骨細胞培養キット（比較例）に比べ、軟骨細胞１のスフェロイド化を誘導するのに有利であることを示した。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本実施形態の軟骨細胞および軟骨細胞培養基材を示す斜視図である。
【図２】本実施形態の軟骨細胞培養基材の構成を示す斜視図であって、（ａ）は全体図、（ｂ）は（ａ）で示したＡ領域の部分拡大図である。
【図３】軟骨細胞培養基材の製造方法の一例であるナノインプリント法による製造工程を説明するための図である。
【図４】軟骨細胞の培養手順を説明するための図であって、軟骨細胞培養キットの縦断面図である。
【図５】第一実施例で作製した軟骨細胞培養キット底部の上面側に形成された複数の凸部を示す部分斜視図である。
【図６】軟骨細胞で発現しているグリコサミノグリカン量の比較結果を示す図である。
【図７】軟骨細胞の電子顕微鏡写真である。
【図８】軟骨細胞の電子顕微鏡写真である。
【図９】軟骨細胞の電子顕微鏡写真である。
【図１０】軟骨細胞のスフェロイド径分布を示す図であって、（ａ）は、凸部の相当直径が２．０μｍ（実施例１）、（ｂ）は凸部の相当直径が０．５μｍ（実施例２）である。
【図１１】軟骨細胞におけるＩＩ型コラーゲンの発現を観察するための図であって、（ａ）は、凸部の相当直径が２．０μｍ（実施例１）、（ｂ）は凸部の相当直径が０．５μｍ（実施例２）である。
【符号の説明】
【００６０】
１      軟骨細胞
２      軟骨細胞培養基材
３      軟骨細胞含有生体組織再生用材料
４      基材原料
５      金型
６      金型凹部
７      培養器
８      軟骨細胞培養キット
２１    凸部
２１Ａ  最上面（頂部）
２２    基材ベース
２２Ａ  基材ベース上面
ｇ      間隔
ｒ      相当直径
【図１】
2008054566.tif 000003
【図２】
2008054566.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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