(57)【要約】【課題】本発明は、ＮＭＲ測定によりリガンドあるいはリガンド候補化合物の標的分子への結合、および結合部位を同定する方法において、標的分子の広範な解析を実現し、リガンドあるいはリガンド候補化合物の結合、および結合部位の同定を正確に行い得る方法の提供を目的とする。【解決手段】本発明者らは、標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを取得し、標的分子とリガンドあるいはリガンド候補化合物とを接触させた後に同じ相関スペクトルを取得して、両スペクトルを比較することにより上記課題を解決した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１３C／１５Ｎ二重標識化された標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｂ）該標的分子と、少なくとも１つのリガンド、リガンド化合物、あるいはリガンド候補化合物とを接触させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｄ）工程（ａ）で得られた2次元相関スペクトルと工程（ｃ）で得られた2次元相関スペクトルとを比較する工程からなることを特徴とする標的分子とリガンドあるいはリガンド化合物との結合の検出方法。
【請求項２】
（ａ）１３C／１５Ｎ二重標識化された標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｂ）該標的分子と、リガンド候補化合物の混合物とを接触させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｄ）工程（ａ）で得られた２次元相関スペクトルと工程（ｃ）で得られた２次元相関スペクトルとを比較する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で該２次元相関スペクトルに違いが見出された場合、該リガンド候補化合物の混合物中の化合物を個別に標的分子と接触させ、標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｆ）工程（ａ）で得られた2次元相関スペクトルと工程（ｅ）で得られた２次元スペクトルとを比較する工程からなることを特徴とする標的分子に結合するリガンド化合物のスクリーニング方法。
【請求項３】
（ａ）１３C／１５Ｎ二重標識化された標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｂ）該標的分子と、少なくとも１つのリガンドまたはリガンド候補化合物とを接触させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｄ）工程（ａ）で得られた２次元相関スペクトルと工程（ｃ）で得られた２次元相関スペクトルとを比較する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で該２次元スペクトルに違いが見出された場合、違いが見られるシグナルに相当するアミノ酸を特定する工程からなることを特徴とする標的分子に結合するリガンドまたはリガンド化合物の結合部位の同定方法。
【請求項４】
（ａ）１３C／１５Ｎ二重標識化された標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｂ）該標的分子と、各種濃度のリガンドまたはリガンド化合物を接触させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｄ）工程（ａ）で得られる２次元相関スペクトルと、工程（ｃ）で得られる２次元相関スペクトルを比較する工程、
（ｅ）該２次元相関スペクトルに違いが見られた場合、該スペクトルの違いをリガンドまたはリガンド化合物濃度の関数として定量する工程からなることを特徴とする標的分子とリガンドまたはリガンド化合物との解離定数の測定方法。
【請求項５】
標的分子がポリペプチドである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
２次元相関スペクトルが、標識された主鎖の窒素原子と、該窒素原子が存在するアミノ酸残基の１つ前のアミノ酸残基中の標識されたカルボニル炭素原子の２次元相関スペクトルである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
２次元相関スペクトルが、標識された主鎖の窒素原子と、該窒素原子が存在するアミノ酸残基または１つ前のアミノ酸残基中の標識されたα炭素原子の２次元相関スペクトルである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的分子とこれと結合するリガンドあるいはリガンド候補化合物との結合を検出する方法、標的分子に結合するリガンドの結合部位の同定方法、および標的分子とリガンドとの解離定数を測定する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＭＲを用いて、標的分子に結合する基質やリガンドを同定したり、その結合部位を特定することは、これまでにも広く行われてきた。主に用いられている方法は、タンパク質中の窒素原子を、安定同位体でＮＭＲ観測可能な15Ｎを用いて標識し、1Ｈ（アミドプロトン）−１５Ｎ  ＨＳＱＣ（heteronuclearsingle quantum coherence）スペクトルを用いる方法（例えば特許文献１参照）である。具体的には、標的分子単独の状態において1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣを観測し、さらに標的分子に想定される基質やリガンドを共存させた状態で1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣを観測し、両者のスペクトルを比較し、シグナルの変化が見られるかどうかで標的生体分子に基質やリガンドが結合したかどうかを知ることができる。また、他のＮＭＲ測定を組み合わせ、1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルの各シグナルのアミノ酸の種類と番号まで含めた帰属を行い（例えば非特許文献１参照）、それらのデータを基に、基質やリガンドが標的生体分子に結合する部位の同定（例えば非特許文献２参照）を行う方法も開示されている。このような方法を、例えば標的分子を病因タンパク質とし、リガンドを低分子化合物として適用することにより、病因タンパク質を特異的に阻害する新規薬剤候補物質をスクリーニングしたり、スクリーニングの結果得られた化合物や他の方法によって得られた化合物が病因タンパク質のどの部位に結合しているかを同定することができ、迅速な薬剤設計に用いることができるため、産業上も非常に有用である。
【０００３】
1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣ測定は、感度が比較的高いので、このような標的分子に対する基質やリガンドの結合を同定するのに試料濃度が比較的少なくて済み、測定時間も短くて済むなどの特徴が有る。しかし、標的分子が、例えば高分子量タンパク質の場合には、1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルの各シグナルが重なることが多く、想定された基質やリガンドが結合するか否かの判定、また結合する場合の結合部位の判定において、不具合が生じる場合があった。また、標的高分子が常磁性金属イオンを結合するタンパク質の場合には、結合した常磁性金属イオン近傍に存在するアミドプロトンのシグナルが常磁性金属による緩和のために消失してしまい、観測できないという問題が有った。さらに、アミドプロトンは交換性の原子のためpHが比較的高い条件、特にpHが８を超えるような条件においては、そのシグナルが減少または消失してしまい観測できないという問題があった。また、標的分子がタンパク質の場合、プロリンの窒素原子にはアミドプロトンが結合していないため、プロリン残基については、シグナルが取得できないという問題も有った。
【０００４】
また、標的分子がタンパク質の場合1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣ測定において観測されるＮＭＲシグナルは、主にポリペプチド鎖の主鎖の1Ｈ−15Ｎ直接結合に由来するシグナルである。ポリペプチド鎖の主鎖においては、原子は、窒素原子、α炭素原子、カルボニル炭素原子の順番で繰り返し連結されているので、窒素原子は３原子に１つの割合でしか出現しない。すなわち、1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルにおいては、基質の結合を検出する部位が、３原子おきにしか存在しないことになる。また、1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルで検出されるシグナルは、直接結合した1Ｈと15Ｎの相関シグナルであり、これらの化学シフトの移動には相関関係があるので、２次元ＮＭＲ測定でありながら、一つのシグナルの変化は実質的に一つの原子の化学シフトの変化を見ていることになる。これらのことから、1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを用いる方法は、実際には標的分子の限られた範囲における変化だけを検出していることになる。よって、基質やリガンドが標的分子に結合したかどうか、あるいは結合部位を正確に特定するためには、より広い部位を観測でき、しかもある程度感度の良い方法が望まれていた。
【０００５】
一方、タンパク質中の炭素原子を、安定同位体でＮＭＲ観測可能な13Cを用いて標識し、1Ｈ−13CＨＳＱＣ（heteronuclear single quantum coherence）スペクトルを用いる方法（例えば特許文献２および３参照）も開発されている。具体的には、標的分子の側鎖のメチル基の炭素原子と水素原子の間のHSQC測定を行い、さらに標的分子に想定される基質やリガンドを共存させた状態で標的分子の側鎖のメチル基の炭素原子と水素原子の間のHSQC測定を行なって、両者のスペクトルを比較し、シグナルの変化を検出することにより、標的分子と基質やリガンドとの結合を検出する方法である。
【０００６】
この方法では、標的分子の主にメチル基の炭素原子と水素原子のHSQC測定を行うことで、シグナルが重なることを防いでいるが、逆にメチル基を有するアミノ酸でしかHSQCシグナルを取得することができないので、標的分子と基質あるいはリガンドとの結合を限られた範囲でしか検出することができない。さらに、標的分子の主鎖の標識された原子に結合する水素原子と、標的分子中のその他の水素原子との2次元相関シグナルを取得し、標的分子とリガンドあるいはリガンド候補化合物とを接触させた後に同じ相関シグナルを取得して、両シグナルを比較する方法（特許文献４）も開発されている。しかし、この方法も、アミドプロトンを用いた解析であるため、上記のアミドプロトンを用いる解析における難点があり、標的分子の種類や、アミノ酸の種類に限定される方法である。
【０００７】
そこで、上記のようなＮＭＲ測定方法とは異なる、リガンドやリガンド候補化合物と標的分子との結合、および結合部位の同定を、より確実に、アミノ酸の種類などに限定されずに行える方法が求められていた。
【特許文献１】特許第３０３２３０１号公報
【特許文献２】特表２００４−５１０９５２号公報
【特許文献３】特願２００５−０３０８９８号明細書
【特許文献４】特願２００５−０６７７８３号明細書
【非特許文献１】Ikura, et al., Biochemistry, 30, 5498-5504 (1992)
【非特許文献２】Hensmann, et al., Protein Science, 3, 1020-1030(1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、NMR測定によりリガンドあるいはリガンド候補化合物の結合および結合部位を同定する方法において、標的分子のより広範な範囲を観測し、リガンドやリガンド候補化合物の結合および結合部位の同定をより正確に行なえる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、標的分子であるヒトＦＫＢＰタンパク質を、13Ｃ／15Ｎ二重標識し、窒素原子とカルボニル炭素原子の２次元相関スペクトルが取得可能な２次元NMR測定を行い、さらに、標的分子とリガンド候補化合物として１−アセチルブロリンメチルエステル等とを共存させた状態で上記２次元NMR測定を行なって、得られた２つのシグナルを比較したところ、標的分子に、想定されるリガンド候補物質が結合するかどうか、また結合する場合には、リガンド物質が結合する標的分子の部位を精度良く同定することが可能なことを見いだした。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【００１０】
即ち、本発明によれば、
（１）  （ａ）13Ｃ／15Ｎ二重標識化された標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、（ｂ）該標的分子と、少なくとも１つのリガンド、リガンド化合物、あるいはリガンド候補化合物とを接触させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、（ｄ）工程（ａ）で得られた2次元相関スペクトルと工程（ｃ）で得られた2次元相関スペクトルとを比較する工程からなることを特徴とする標的分子とリガンドあるいはリガンド化合物との結合の検出方法、
（２）（ａ）13Ｃ／15Ｎ二重標識化された標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｂ）該標的分子と、リガンド候補化合物の混合物とを接触させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｄ）工程（ａ）で得られた２次元相関スペクトルと工程（ｃ）で得られた２次元相関スペクトルとを比較する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で該２次元相関スペクトルに違いが見出された場合、該リガンド候補化合物の混合物中の化合物を個別に標的分子と接触させ、標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｆ）工程（ａ）で得られた2次元相関スペクトルと工程（ｅ）で得られた２次元スペクトルとを比較する工程からなることを特徴とする標的分子に結合するリガンド化合物のスクリーニング方法、
（３）（ａ）13Ｃ／15Ｎ二重標識化された標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｂ）該標的分子と、少なくとも１つのリガンドまたはリガンド候補化合物とを接触させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｄ）工程（ａ）で得られた2次元相関スペクトルと工程（ｃ）で得られた2次元相関スペクトルとを比較する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で該２次元スペクトルに違いが見出された場合、違いが見られるシグナルに相当するアミノ酸を特定する工程からなることを特徴とする標的分子に結合するリガンドまたはリガンド化合物の結合部位の同定方法、
（４）（ａ）13Ｃ／15Ｎ二重標識化された標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｂ）該標的分子と、各種濃度のリガンドまたはリガンド化合物を接触させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｄ）工程（ａ）で得られる２次元相関スペクトルと、工程（ｃ）で得られる２次元相関スペクトルを比較する工程、
（ｅ）該２次元相関スペクトルに違いが見られた場合、該スペクトルの違いをリガンドまたはリガンド化合物濃度の関数として定量する工程からなることを特徴とする標的分子とリガンドまたはリガンド化合物との解離定数の測定方法、
（５）標的分子がポリペプチドである上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法、
（６）２次元相関スペクトルが、標識された窒素原子と標識されたカルボニル炭素原子の２次元相関スペクトルである上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法、
（７）２次元相関スペクトルが、標識された窒素原子と標識されたα炭素原子の２次元相関スペクトルである上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法が、提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の標的分子とリガンドまたはリガンド候補化合物との結合の検出方法等は、その検出に用いる２次元ＮＭＲ測定が標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを取得するものである。窒素原子は、標的分子の全てのアミノ酸残基が有するものであるので、シグナルを全てのアミノ酸残基において取得することができる。つまり、標的分子とリガンドあるいはリガンド候補物質との結合がどのアミノ酸残基において起こっていても制限なく検出することができる。このことは、標的分子とリガンドあるいはリガンド候補化合物との結合部位の同定や、解離定数の測定方法等を行う上でも非常に有利な特徴である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
（１）標的分子とリガンドあるいはリガンド候補化合物との結合の検出方法
本発明の１つは、（ａ）13Ｃ／15Ｎ二重標識化された標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、（ｂ）該標的分子と、少なくとも１つのリガンド、あるいはリガンド候補化合物とを接触させる工程、（ｃ）工程（ｂ）の標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、（ｄ）工程（ａ）で得られた2次元相関スペクトルと工程（ｃ）で得られた2次元相関スペクトルとを比較する工程からなることを特徴とする標的分子とリガンドあるいはリガンド化合物との結合の検出方法である。
【００１３】
「標的分子」とは、アミノ酸が連結した主骨格を有し、13Ｃ／15Ｎ二重標識化することができ、後述する２次元相関スペクトルが取得できるものであれば何れのものでもよい。具体的には、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、その部分フラグメント、あるいはその誘導体、リポタンパク質、その部分フラグメント、あるいはその誘導体等が挙げられる。また、その分子量も、後述する2次元相関スペクトルが取得できる範囲であれば特に制限はないが、ポリペプチドあるいはタンパク質の場合、１０〜１０００アミノ酸残基からなるものが好ましい。また、糖タンパク質あるいはリポタンパク質等の場合には、分子量が１〜１００ｋＤ程度のものが好ましく用いられる。ポリペプチドまたはタンパク質の場合は、化学合成、組換え体を用いた合成、無細胞タンパク質合成系等如何なる方法で取得されたものでもよい。
【００１４】
標的分子を13Ｃ／15Ｎ二重標識化する場合、標的分子中の全ての炭素原子あるいは窒素原子が上記安定同位体である必要はなく、少なくとも、後述する２次元相関スペクトルを取得するのに必要な窒素原子が15Ｎで、該窒素原子との相関シグナルを取得したい炭素原子が13Ｃであればよく、その他の部分の窒素原子および炭素原子は、15Ｎあるいは13Ｃで標識化されていてもされていなくてもよい。ここで、特に高分子量の標的分子の場合には、感度の低下を防ぐために、水素原子の一部または全部が重水素等で標識化されていることが好ましい。
【００１５】
また、標的分子に含まれるアミノ酸のうち、上記窒素原子および炭素原子の15Ｎあるいは13Ｃによる標識化が必要なアミノ酸は、リガンドまたはリガンド化合物が結合するアミノ酸が既に同定されていたり、または想定されている場合には、そのアミノ酸のみの窒素原子および炭素原子が15Ｎあるいは13Ｃによって二重標識化（以下、これを「標識化」と称することがある）されていればよく、それ以外のアミノ酸については標識化されていてもされていなくてもよい。下述する２次元NMR測定において、主鎖の窒素原子と、該窒素原子が存在するアミノ酸残基に隣接するアミノ酸残基の炭素原子との２次元相関スペクトルを取得する場合には、リガンドあるいはリガンド化合物が結合するアミノ酸およびそれに隣接するアミノ酸が上記標識化をされている必要がある。また、リガンドまたはリガンド化合物が結合するアミノ酸が既に同定されていたり、または想定されていない場合には、全てのアミノ酸について上記標識化がされていることが好ましい。このように標識化された標的分子を、本明細書中では、「標識化標的分子」と称することがある。
【００１６】
標的分子の標識化は、上記の窒素原子および炭素原子が標識化される方法で、通常用いられる方法により行うことができる。また、市販の標識化アミノ酸（CambridgeIsotope Laboratories社製等）を用いることができる。本発明の方法では、まず（ａ）１３C／15Ｎ二重標識化された標的分子中の標識された窒素原子と、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識されたα炭素原子、β炭素原子またはカルボニル炭素原子との２次元相関スペクトル（以下、これを「1５Ｎ−13Ｃ相関スペクトル」あるいは「1５Ｎ−13Ｃ相関シグナル」と称することがある）等を測定する。標的分子中の標識された窒素原子と２次元相関スペクトルを取得する炭素原子は、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識されたα炭素原子、β炭素原子またはカルボニル炭素原子等いずれでもよい。用いられるＮＭＲ測定方法は、上記窒素原子および炭素原子の相関スペクトルが取得できるものであれば如何なるものでもよいが、シグナルが多いと、それらが重なりあってしまい、解析が困難になるので、１つの窒素原子に対しては、１つまたは２つの炭素原子の相関スペクトルが得られるＮＭＲ測定方法が好ましく、さらには１つの窒素原子に対して１つの炭素原子の相関スペクトルが得られるＮＭＲ測定方法が最も好ましい。具体例を以下に示す。
【００１７】
窒素原子と、１つ前のアミノ酸残基のカルボニル炭素原子の２次元相関スペクトルを取得する方法としては、（Ｈ）ＮＣＯ法（Cavanagh, W.J., et al.,Protein NMR Spectroscopy. Principles and Practice, Academic Press(1996)に記載のHNCO３次元測定法をSerber,Z., et al., J. Am. Chem. Soc. 122, 3554-3555 (2000)に記載のカルボニル炭素で検出する方法に変更したものにおいて、Ｈの展開時間を省略した２次元測定：図１）あるいは、ＣＯＮ法（Bermel, W.,et al., Angew. Chem. Int. Ed. 44, 3089-3092 (2005)に記載の方法：図１）等が用いられる。また、窒素原子と同一アミノ酸残基中のカルボニル炭素原子、及び１つ前のアミノ酸残基中のカルボニル炭素原子の２次元相関スペクトルを取得する方法として(Ｈ)Ｎ(ＣＡ)ＣＯ法（Cavanagh,W.J., et al., Protein NMR Spectroscopy. Principles and Practice, AcademicPress(1996)に記載のHN（ＣＡ）ＣＯ３次元測定法をSerber, Z., et al., J. Am. Chem. Soc. 122,3554-3555 (2000)に記載のカルボニル炭素で検出する方法に変更したものにおいて、Hの展開時間を省略した２次元測定：図１）等が用いられる。また、窒素原子と、１つ前のアミノ酸残基のα炭素原子の２次元相関スペクトルを取得する方法としては(Ｈ)Ｎ(ＣＯ)ＣＡ法（Cavanagh,W.J., et al., Protein NMR Spectroscopy. Principles and Practice, AcademicPress(1996)に記載のHN(CO)CA３次元測定法をSerber, Z., et al., J. Am. Chem. Soc. 122,3554-3555 (2000)に記載のカルボニル炭素で検出する方法に変更したものにおいて、Hの展開時間を省略した２次元測定：図１）等が用いられる。また、窒素原子と同一アミノ酸残基中のα炭素原子、及び１つ前のアミノ酸残基中のα炭素原子の２次元相関スペクトルを取得する方法として(Ｈ)ＮＣＡ法（Cavanagh,W.J., et al., Protein NMR Spectroscopy. Principles and Practice, AcademicPress(1996)に記載のHNCA３次元測定法をSerber, Z., et al., J. Am. Chem. Soc. 122, 3554-3555(2000)に記載のα炭素原子で検出する方法に変更したものにおいて、Hの展開時間を省略した２次元測定：図１）あるいはＣＡＮ法（Bermel, W., etal., Angew. Chem. Int. Ed. 44, 3089-3092 (2005)に記載の方法：図１）等が用いられる。これらの測定方法のうち、(Ｈ)ＮＣＯ法、ＣＯＮ法、(Ｈ)Ｎ(ＣＯ)ＣＡ法、(Ｈ)ＮＣＡ法、ＣＡＮ法が好ましい。特に、ＣＯＮ法やＣＡＮ法は測定の際にアミドプロトンを必要としないので、アミドプロトンの結合していないプロリン残基の窒素原子と炭素原子との相関シグナルも得ることができ、これは、1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルでは得られない情報も得ることができる（図４と図５を比較すると図５は図４で観測される全てのシグナルを含み、さらにプロリン残基由来のシグナルも得られている）。また、これらの測定方法は、アミドプロトンに依存しないので、1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルでは良好なシグナルが得られないｐＨの高い条件における測定や常磁性金属を結合する分子においても良好なスペクトルを得ることができる。また、ＣＯＮ法やＣＡＮ法等の測定法はアミドプロトンに依存しないために、軽水緩衝液の代わりに重水緩衝液を溶媒として用いることができ、その場合にはアミド窒素原子の緩和時間が長くなるので感度の向上が期待できる。さらに、これらの実験方法において、標的分子中の測定に関与しない水素原子は一部または全部を重水素原子に置き換えることができ、その場合にも感度の向上が期待できる。上記の実験は、主に炭素原子でＮＭＲシグナ��を検出する方法であるが、通常のＮＭＲ装置においては、例えばＣＯＮ法の測定においてカルボニル炭素原子でＮＭＲシグナルを検出しようとするとカルボニル炭素原子とα炭素原子のカップリングのために、検出したシグナルが分裂してしまい、シグナルの複雑化と感度低下を起こす。それを防ぐためにはＩＰＡＰ法（Bermel,W., et al., Angew. Chem. Int. Ed. 44, 3089-3092 (2005)に記載の方法）を用いて、測定後の計算処理でカップリングを除去することができる。また例えば（Ｈ）ＮＣＯ法やＣＯＮ測定法の場合には窒素原子とカルボニル炭素原子が標識されているがα炭素原子が標識されていないような標的分子を作成すれば、カップリングを除去することができる。また（Ｈ）ＮＣＡ法やＣＡＮ法の測定の場合には、α炭素原子でＮＭＲシグナルを検出するので、窒素原子とα炭素原子が標識され、カルボニル炭素原子やβ炭素原子が標識されていない標的分子を作成すれば、カップリングを除去することができる。これらの方法は、上述の重水緩衝液を用いる方法や標的分子の水素原子を重水素原子に置き換える方法と必要に応じて組み合わせることが可能である。
【００１８】
上記ＮＭＲ測定において、用いられる緩衝液および標的分子の濃度等は通常ＮＭＲ測定法において用いられている範囲で適宜選択することができる。具体的には、例えば、ＮＭＲ測定用緩衝液としては、25mM リン酸カリウム pH 6.5、 50 mM NaCl、5 mM DTTのもの等が好ましく用いられる。該緩衝液に標的分子を適当な濃度で溶解することによりＮＭＲ測定用試料として用いる。標的分子の濃度はＮＭＲ測定が行い得る範囲であれば特に制限はないが、具体的には、例えば10μＭ〜10ｍＭの範囲が好ましい。
【００１９】
本発明では、次に（ｂ）該標的分子と、少なくとも１つのリガンド、あるいはリガンド候補化合物とを接触させる工程を行なう。「リガンド」とは、上記標的分子が生体内分子である場合、これに生体内で結合している物質またはその誘導体を意味する。また、「リガンド候補化合物」とは、標的分子に結合して、標的分子の機能を制御する可能性のある化合物を意味する。このような可能性のある化合物であれば如何なる構造を有するものでもよい。「リガンド化合物」とは、標的分子に結合してその機能を制御する活性のある化合物を意味する。リガンドあるいはリガンド化合物は、必ずしも１分子で標的分子に結合するものでなくてもよく、同一のまたは異なる２分子以上が融合して標的分子と複合体を形成するものでもよい。２つ以上の分子が融合して標的分子と複合体を形成するものである場合、これらと標的分子との結合状態を解析して新たなリガンド化合物の設計を行なうことができる。具体的には、例えば特許第３０３２３０１号に記載の方法等が用いられる。
【００２０】
標的分子とリガンド、リガンド化合物、あるいはリガンド候補化合物を接触させる方法は、これらが結合し得る条件下であれば如何なる方法でもよい。具体的には、上記標的分子を適当濃度で含むＮＭＲ測定用緩衝液にリガンド、リガンド化合物、あるいはリガンド候補化合物を添加する方法等が挙げられる。リガンドまたはリガンド候補化合物の濃度は、標的分子と該物質との関係により適宜選択することができるが、例えば10μＭ〜100ｍＭ程度の範囲が好ましい。標的分子に接触させるリガンド、リガンド化合物、あるいはリガンド候補化合物は、少なくとも１つである。また、リガンド候補化合物の混合物を標的分子と接触させれば一度に多数の化合物の標的分子への結合を検出することができる。リガンド候補化合物の混合物とは、例えば、ある化合物の誘導体群や、医薬品等の候補化合物ライブラリー等複数の化合物が混在しているもの等を用いることができる。
【００２１】
本発明では、次に、（ｃ）上記のＮＭＲ測定用試料中の標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程を行なう。ＮＭＲ測定方法は、上記のとおりである。
次に、（ｄ）上記工程（ａ）で得られた1５Ｎ−13Ｃ相関スペクトルと上記工程（ｃ）で得られた1５Ｎ−13Ｃ相関スペクトルとを比較する工程を行なう。ここで、比較する２つの２次元相関スペクトルは上記のＮＭＲ測定法のうち、同一の測定方法により測定されたものである必要がある。1５Ｎ−13Ｃ相関スペクトルの比較は、２つのスペクトルの相違が検出できる方法であれば如何なるものでもよい。具体的には２つのスペクトルを重ねあわせ、目視により相違を検出する方法等が用いられるし、スペクトル中のシグナルの化学シフトを一般的なＮＭＲ解析ソフトウェアを用いて同定し、その値を比較しても良い。
【００２２】
具体的な1５Ｎ−13Ｃ相関スペクトルを用いて説明すると、例えば、1５Ｎ／13Ｃ標識化標的分子（ヒトＦＫＢＰタンパク質）について、上記(Ｈ)ＮＣＯ法によりＮＭＲ測定した2次元相関スペクトルは、図４に示すとおりである。標的分子に結合することがわかっている１−アセチルブロリンメチルエステルを接触させた後に、同じ(Ｈ)ＮＣＯ法によりＮＭＲ測定して得られた２次元相関スペクトルを図４に重ね合わせたものが図８である。重ね合わせることにより両スペクトルを比較すると、図８に示されるようにシグナルにおいて相違があることがわかる。このように、両スペクトルにおいて相違が見られた場合、標的分子に接触させたリガンドまたはリガンド候補化合物と標的分子との結合を検出することができる。
【００２３】
（２）標的分子に結合するリガンド化合物のスクリーニング方法
本発明のもう１つの側面は、（ａ）13Ｃ／1５Ｎ二重標識化された標的分子中の標識された窒素原子と、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識されたα炭素原子、β炭素原子またはカルボニル炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、（ｂ）該標的分子と、リガンド候補化合物の混合物とを接触させる工程、（ｃ）工程（ｂ）の標的分子中の標識された窒素原子と、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識されたα炭素原子、β炭素原子またはカルボニル炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、（ｄ）工程（ａ）で得られた２次元相関スペクトルと工程（ｃ）で得られた２次元相関スペクトルとを比較する工程、（ｅ）工程（ｄ）で該２次元相関スペクトルに違いが見出された場合、該リガンド候補化合物の混合物中の化合物を個別に標的分子と接触させ、標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、（ｆ）工程（ａ）で得られた２次元相関スペクトルと工程（ｅ）で得られた２次元相関スペクトルとを比較する工程からなることを特徴とする標的分子に結合するリガンド化合物のスクリーニング方法である。
【００２４】
「リガンド化合物」とは、標的分子に結合して標的分子の機能を制御する活性を有する化合物を意味する。リガンド化合物のスクリーニング方法における上記工程（ａ）〜（ｄ）は、（１）に説明したものである。ここで「リガンド候補化合物の混合物」は、如何なる化合物の混合物であってもよいが、同一のＮＭＲ測定の条件で標的分子に結合し得るものの集まりであることが必要である。また、工程（ｅ）で上記リガンド候補化合物群に含まれる個々の化合物について標的分子との結合を検出するので、個々に分離し得る集団であることも必要である。
【００２５】
（ｅ）工程（ｄ）で該1５Ｎ−13Ｃ相関スペクトルに相違が見られた場合、工程（ｂ）のリガンド候補化合物の混合物中の個々の化合物を個別に標的分子と接触させ、標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程を行なう。標的分子との接触方法およびＮＭＲ測定方法は、上述のとおりである。
さらに、（ｆ）工程（ａ）で得られた1５Ｎ−13Ｃ相関スペクトルと工程（ｅ）で得られた1５Ｎ−13Ｃ相関スペクトルとを比較する工程を行なう。２つの1５Ｎ−13Ｃ相関スペクトルの比較方法は上述のとおりである。この比較により1５Ｎ−13Ｃ相関スペクトルに相違が見られた場合、標的分子と接触させたリガンド候補化合物はリガンド化合物として選択される。
【００２６】
（３）標的分子に結合するリガンドの結合部位の同定方法
本発明のさらに別の側面は、（ａ）13Ｃ／1５Ｎ二重標識化された標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、（ｂ）該標的分子と、少なくとも１つのリガンドまたはリガンド候補化合物とを接触させる工程、（ｃ）工程（ｂ）の標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、（ｄ）工程（ａ）で得られた２次元相関スペクトルと工程（ｃ）で得られた２次元相関スペクトルとを比較する工程、（ｅ）工程（ｄ）で該２次元スペクトルに違いが見出された場合、違いが見られるシグナルに相当するアミノ酸を特定する工程からなることを特徴とする標的分子に結合するリガンドまたはリガンド化合物の結合部位の同定方法である。
【００２７】
上記方法の工程（ａ）〜（ｄ）は（１）で説明したとおりである。但し、標的分子は、上記ＮＭＲ測定を行なった場合に得られる1５Ｎ−13Ｃ相関スペクトルの各シグナルがどのアミノ酸に由来するものであるかが帰属されている必要がある。工程（ｄ）で1５Ｎ−13Ｃ相関スペクトルに違いが見出されたアミノ酸は、標的分子とリガンドまたはリガンド化合物との結合に関連していると決定することができる。各シグナルの帰属は、上記ＮＭＲ測定を行なう前でも後でもよい。標的分子の各シグナルの帰属方法はそれ自体公知の通常用いられる方法で行うことができるが、以下に説明する方法で行えば効率良く帰属付けを行なうことができる。
【００２８】
具体的には、例えば、以下のように、1Ｈ−15Ｎ相関スペクトルの各シグナルの帰属を決定した後に、これをもとに標的分子のアミノ酸の15Ｎと13Cの相関シグナルを決定することができる。具体的には、(i)蛋白質のアミドプロトンと15Ｎの相関シグナルについて下述の方法によりその帰属を決定し、（ii）標的分子のアミノ酸配列上で、同定しようとするアミノ酸のα炭素原子またはカルボニル炭素原子が13Cで標識されたものを調製し、（iii）該蛋白質について、同定しようとするアミノ酸中のアミドプロトンと、同じアミノ酸の13Cで標識された炭素原子との相関シグナルを取得して、(iv)上記(i)のアミドプロトンと15Ｎの相関シグナルと（iii）のアミドプロトンと13Cに共通するアミドプロトンの化学シフトが同じであることを指標として、アミドプロトンと13Cとの相関シグナルを該アミドプロトンと15Ｎの相関シグナルに対応付けて、アミドプロトンと13Cとの相関シグナルの帰属を決定する方法である。
【００２９】
同定しようとするアミノ酸とは、１種類でもよく、複数種類でもよく、また、全部のアミノ酸でもよいが、後述するシグナルの対応付けでシグナルが重ならずに対応付けが可能な範囲であれば何れでもよい。まず、1Ｈ−15Ｎ相関スペクトルの各シグナルの帰属の決定方法を以下に詳細に説明する。
シグナルの帰属を行う標的分子は、その主要骨格であるアミノ酸配列が同定されていることが必要である。まず、シグナルの帰属を決定しようとするアミノ酸について、標的分子のアミノ酸配列上で該アミノ酸に隣接するどちらか一方のアミノ酸を特定し、該隣接アミノ酸についてはそのα炭素原子およびカルボニル炭素原子が13Ｃで、また主鎖の窒素原子が15Ｎで二重標識されていて（以下、これを「二重標識化アミノ酸」と称することがある）、それ以外のアミノ酸については、主鎖の窒素原子のみが15Ｎで標識されたアミノ酸からなるもの（以下、これを「13Ｃ／15Ｎ二重標識化標的分子」と称することがある）を調製する。標的分子がポリペプチドまたはタンパク質の場合には、該隣接アミノ酸についてはそのα炭素原子およびカルボニル炭素原子が13Ｃで、また主鎖の窒素原子が15Ｎで二重標識されていて、それ以外のアミノ酸については、主鎖の窒素原子のみが15Ｎで標識されたアミノ酸を基質として、標的分子を合成することで調製することができる。
【００３０】
次に、上記の13Ｃ／15Ｎ二重標識化標的分子について、13Ｃ／15Ｎ二重標識化アミノ酸に隣接するアミノ酸残基のアミドプロトンと主鎖の窒素原子の２次元相関スペクトルのみ（以下、これを「1Ｈ−15Ｎ相関シグナル」と称することがある）が取得可能なＮＭＲ解析を行う。具体的には、ＨＮ（ＣＯ）法等が挙げられる。ＨＮ（ＣＯ）測定により得られたシグナルは、二重標識化アミノ酸のＣ末側に隣接するアミノ酸残基のものである。ここでは、二重標識化アミノ酸のＣ端側に隣接するアミノ酸の1Ｈ−15Ｎ相関シグナルのみを取得できるＨＮ（ＣＯ）測定を行っているが、二重標識化アミノ酸のＮ端側に隣接するアミノ酸の1Ｈ−15Ｎ相関シグナルのみを取得できる測定法が有れば、その測定法を用いても良い。
【００３１】
これらのシグナルの中から、目的アミノ酸のシグナルを選択する方法としては、目的アミノ酸の主鎖の窒素原子のみが15Ｎで標識されたアミノ酸を基質として目的タンパク質を合成し、該タンパク質についてＮＭＲ測定により1Ｈ−15Ｎ相関シグナルを取得して、ＨＮ（ＣＯ）測定と比較することにより行うことができる。
上記の同定しようとするアミノ酸の1Ｈ−15Ｎ相関シグナルは、以下の方法で取得してもよい。まず、同定しようとするアミノ酸は13Ｃ／15Ｎ二重標識化アミノ酸、その他は15Ｎ標識化アミノ酸を基質として目的タンパク質を合成し、該タンパク質について二重標識化アミノ酸の1Ｈ−15Ｎ相関シグナルと、それに隣接するアミノ酸残基の1Ｈ−15Ｎ相関シグナルの両方が検出されるNMR測定、具体的にはＨＮ（ＣＡ）法等で測定する。また、同じタンパク質についてＨＮ（ＣＯ）法で測定してシグナルを取得し、ＨＮ（ＣＡ）法で得られたシグナルと比較する。ここで、重なっていないシグナルが目的アミノ酸を含む同じアミノ酸のシグナルである。また、二重標識化アミノ酸を２種類以上用いて合成した目的タンパク質を用いても、上記方法と同様の方法を用いて、アミノ酸番号の帰属が可能である。この場合には、帰属の手順が若干複雑にはなるが、試料の数を２０種類より減らすことが可能である。
【００３２】
ここで、同定しようとするアミノ酸と隣接するアミノ酸の組み合わせがその目的タンパク質配列中に１つしか存在しないようなアミノ残残基についてのみ帰属を行えば良い場合には、同定しようとするアミノ酸に隣接するアミノ酸の標識は、必ずしも13Ｃ／15Ｎの二重の標識が必要ではない。すなわち、そのカルボニル炭素原子が13Ｃ標識されていればよい。この場合には、目的タンパク質として、さらに同定しようとするアミノ酸を含む複数のアミノ酸の主鎖の窒素原子が15Ｎで標識されているものを合成する。合成されたタンパク質をＨＮ（ＣＯ）法等で測定してシグナルを取得し、これらのシグナルの組み合わせと、同定しようとするアミノ酸の主鎖の窒素原子だけを15Ｎで標識化したタンパク質の1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルと比較することによって、上記と同様にシグナルを帰属することができる。この方法を用いることによれば、カルボニル炭素原子が13Ｃ標識されていて、同定しようとするアミノ酸の主鎖の窒素原子が15Ｎで標識されているものを合成し、このＨＮ（ＣＯ）法等により測定して得られたシグナルを取得していく従来の方法に比べて、標識タンパク質の種類が少なくてすむという効果がある。上記の方法は、これを繰り返すことによって、標的分子中の全てのアミノ酸に対してＮＭＲで得られるシグナルの帰属を行うことができるが、同定しようとするアミノ酸と隣接するアミノ酸の組み合わせがその目的タンパク質配列中に１つしか存在しない場合にのみ用いることができる方法である。
【００３３】
標的分子中に同定しようとするアミノ酸と隣接するアミノ酸の組み合わせが２つ以上存在する場合、以下に示す方法により帰属を行うことができる。まず、(i)標的分子のアミノ酸配列上で同定しようとするアミノ酸に隣接するどちらか一方のアミノ酸について、その特定の原子とアミドプロトンとの相関シグナルを上記の方法で帰属を決定する。次に、(ii)帰属が決定されたアミノ酸残基中の特定の原子とアミドプロトンとの相関シグナルと、(iii)同定しようとするアミノ酸中の(i)と同じ特定の原子とアミドプロトンとの相関シグナルを、（iv）それらの間に存在する原子とアミドプロトンとの相関シグナルを取得して、共通する原子の化学シフトが同じであることをもとに対応付けていくことにより、帰属が決定されたアミノ酸に隣接するアミノ酸の相関シグナルであることを同定して帰属を決定することができる。
【００３４】
具体的には、まず、（ａ）標的分子のアミノ酸配列上で、同定しようとするアミノ酸に隣接するどちらか一方のアミノ酸について、上記の方法でその帰属を決定する。次に（ｂ）同定しようとするアミノ酸に隣接するアミノ酸のα炭素原子およびカルボニル炭素原子が13Ｃで、また主鎖の窒素原子が15Ｎで二重標識され、さらに少なくとも同定しようとするアミノ酸の主鎖の窒素原子が15Ｎで標識された標的分子を調製する。（ｃ）得られた二重標識化標的分子について、二重標識されたアミノ酸残基の13Ｃとアミドプロトンとの２次元相関スペクトルと、二重標識されたアミノ酸残基の13Ｃと隣接する同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンとの２次元相関スペクトルが取得可能なＮＭＲ測定、例えば、Ｈ（Ｎ）ＣＡ法等で測定し、シグナルを取得する。さらに、（ｄ）同定しようとするアミノ酸残基と、上記で二重標識したアミノ酸残基のアミドプロトンと主鎖の窒素原子の相関シグナルをH（NCO）CA法等で取得する。
【００３５】
次に、（ｅ）（ｄ）で取得したシグナル中の帰属が決定されているアミノ酸のアミドプロトンの化学シフトと同一の化学シフトを有するシグナルを（ｃ）で得られたシグナルの中から選択する。さらに、（ｆ）選択されたシグナルの13Ｃの化学シフトと同一の化学シフトを有するシグナルを（ｃ）で得られたシグナルの中から選択し、（ｇ）選択されたシグナルのアミドプロトンの化学シフトと同一の化学シフトを有するシグナルを（ｄ）で得られたシグナルの中から選択する。ここで、選択されたシグナルが、もとのシグナルに帰属されるアミノ酸と隣接するアミノ酸のシグナルであると決定される。
【００３６】
上記のシグナルの帰属法における標識方法についてであるが、上記標識法ではアミノ酸Ｃ（任意のアミノ酸）だけを1３C／15Ｎ二重標識化しその他のアミノ酸は15Ｎ標識化した目的タンパク質を調製したが、実際に測定シグナルを与えるのはアミノ酸Ｃ及びその一つ後ろにあるアミノ酸残基だけであるから、目的タンパク質のアミノ酸配列から、アミノ酸残基Ｃの後ろにあるアミノ酸の種類のみを15Ｎ標識化してもＨＮ（ＣＯ）、ＨＮ（ＣＡ）、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡに関して、残りのアミノ酸全てを15Ｎ標識化したものと全く同じスペクトルが得られる。また、1３C／15Ｎ二重標識化するアミノ酸の種類は一タンパク質試料に一種類である必要はなく、適宜数種類のアミノ酸を1３C／15Ｎ二重標識化し、他のアミノ酸を15Ｎ標識化しても、シグナルの帰属は可能である。この場合は、必要な標識タンパク質が２０種類より減らすことができるが、解析が若干複雑になるので、必要に応じて標識の仕方を変更すれば良い。Ｈ（Ｎ）ＣＯ、Ｈ（ＮＣＯ）ＣＡの測定だけではなく、Ｈ（ＮＣＡ）ＣＯ、Ｈ（Ｎ）ＣＡ等の測定を行っても、全く同様の方法により、シグナルの帰属が可能である。
上記の方法を用いることにより、タンパク質中の全ての残基のアミドプロトン、主鎖の窒素原子、主鎖のα炭素原子、主鎖のカルボニル炭素原子が帰属されるので、それを用いて1５N−1３C相関シグナルの帰属が容易に行える。
【００３７】
（４）標的分子とリガンドまたはリガンド化合物との解離定数の測定方法
本発明のさらに他の側面は、（ａ）1３C／1５N二重標識化された標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、（ｂ）該標的分子と、各種濃度のリガンドあるいはリガンド化合物を接触させる工程、（ｃ）工程（ｂ）の標的分子中の標識された窒素原子と標識された炭素原子との２次元相関スペクトルを測定する工程、
（ｄ）工程（ａ）で得られる２次元相関スペクトルと、工程（ｃ）で得られる２次元相関スペクトルを比較する工程、（ｅ）該２次元相関スペクトルに違いが見られた場合、該スペクトルの違いをリガンドまたはリガンド化合物濃度の関数として定量する工程からなることを特徴とする標的分子とリガンドまたはリガンド化合物との解離定数の測定方法である。
【００３８】
工程（ａ）〜（ｄ）までは上記（１）に記載のとおりであるが、工程（ｂ）において、異なる濃度のリガンド、またはリガンド化合物と標的分子を接触させたものについて同じＮＭＲ測定を行なう。リガンドまたはリガンド化合物濃度は適当に異なる濃度のものを接触させるが、最も高くは、飽和する濃度で接触させたものを調製してＮＭＲ測定を行なうことが好ましい。飽和濃度では飽和の極限化学シフト値（δsat）を測定する。飽和濃度のリガンドまたはリガンド化合物を接触させた標的分子について上記NMR測定を行なった場合、標的分子と該リガンドあるいはリガンド化合物との解離定数は下記数式１で算出される。
【００３９】
【数１】
2008051518.tif 000002
【００４０】
上記式中、［Ｐ］０は標的分子の総モル濃度であり、［Ｌ］０はリガンドあるいはリガンド化合物の総モル濃度であり、ｘは下記数式２で算出される。
【００４１】
【数２】
2008051518.tif 000003
【００４２】
式中、δfreeは遊離種の化学シフトであり、δobsは観察された化学シフト値であり、Δは飽和の場合の極限化学シフト値とリガンドまたはリガンド化合物を含まない標的分子の化学シフト値との差である。
このように測定した解離定数を測定データに対するベストフィットが標準の曲線あてはめ統計法を用いて得られるまでその値を変化させて測定する。δsatが既知でない場合には、KD及びδsatを変化させて同じ曲線当てはめ法にかける。さらに、このような解離定数の測定により、より好ましいリガンドの誘導体あるいはリガンド化合物を選択することもできる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１  ヒトFKBPタンパク質とリガンドとの結合の検出
（１）均一に13Ｃ／15Ｎ二重標識化されたヒトＦＫＢＰ蛋白質の調製
ヒトＦＫＢＰタンパク質（アミノ酸配列は、配列表の配列番号３に示される）の遺伝子（Genbank accession No.M54881）は、HumanUniversal Quick Clone cDNA (Clontech社製)、を鋳型として、配列番号１および２に記載の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法を用いて増幅し、GlutathioneS-transferase（GE Healthcare社製）との融合タンパク質となるように連結後（連結配列にPreScission Protease（GEHealthcare）切断部位を含む）、プラスミドpET24b（Novagen社製）のNde IとSal Iの部位に導入した。このプラスミドを含む大腸菌BL21(DE3)を13Ｃグルコース、１５Ｎ塩化アンモニウムを含む最小培地でＯＤ６００＝１になるまで３７℃で培養し、イソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を400μMになるように加えて蛋白質の発現を誘導した。培養温度を２８℃に下げ、さらに５時間培養後集菌した。
【００４４】
集菌した菌体を、緩衝液（50mM Tris-HCl pH8.0、1mM  EDTA、1mMdithiothreitol）400mlに懸濁し、リゾチーム0.1gを加えて４℃、30分間静置し、その後超音波破砕により溶菌した。遠心後の上清をあらかじめ緩衝液（50mMTris-HCl pH8.0、1mM  EDTA、1mM dithiothreitol）で平衡化されたQ Sepharose（GEHealthcare社製）に結合させ、NaClの0-0.4 Mのグラディエントにより、GST-FKBPを溶出させた。目的の画分をさらにGlutathioneSepharose 4B（GE Healthcare社製）に結合させ、 PreScission Protease（GEHealthcare社製）で融合タンパク質を切断後、溶出させた。さらに溶出されたFKBP画分を、あらかじめ緩衝液（50mMTris-HCl pH8.0、1mM  EDTA、1mM dithiothreitol、0.1M NaCl）で平衡化されたHi Load Superdex （GEHealthcare社製）によるゲル濾過で精製することにより、精製ヒトＦＫＢＰタンパク質溶液を得た。このヒトＦＫＢＰ蛋白質は、PreScissionProteaseによる切断の残りのアミノ酸が２残基（ＧＰ）とメチオニンの３残基がＮ端に結合した状態のものである。このタンパク質溶液をミリポア社製のCentricon-3限外濾過濃縮装置で濃縮後,ＮＭＲ測定用緩衝液（25mMリン酸カリウム pH 6.5、 50mM NaCl、5mM DTT）に置換後、最終的に1mMまで濃縮してＮＭＲ測定試料とした。
【００４５】
（２）ＮＭＲ測定
ＮＭＲ測定には、Ｂｒｕｋｅｒ社製Ａｖａｎｃｅ−５００スペクトロメーターを用い、測定試料には磁場の安定性を保つためのＮＭＲロック用に５％Ｄ２Ｏを添加し、測定を行った。測定温度は３０℃とした。
測定で得られた各残基の化学シフトの帰属は、文献（Rosen et al., Biochemistry, 30,4774-4789; Xu et al., Biopolymers, 33, 535-550 (1993)）の値を参考とし、通常用いられる３次元ＮＭＲ法を用いて行った。
薬剤を作用させる前のＦＫＢＰタンパク質の２次元相関スペクトルとして、13Ｃ／15Ｎ二重標識したヒトＦＫＢＰタンパク質の1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトル（図３）、（Ｈ）ＮＣＯ-ＩＰＡＰスペクトル（Cavanagh,W.J., et al., Protein NMR Spectroscopy. Principles and Practice, AcademicPress(1996)に記載のHNCO３次元測定法をSerber, Z., et al., J. Am. Chem. Soc. 122, 3554-3555(2000)に記載のカルボニル炭素で検出する方法に変更したものにおいて、Ｈの展開時間を省略した２次元測定でさらに、Bermel, W., et al.,Angew. Chem. Int. Ed. 44, 3089-3092 (2005)に記載ＩＰＡＰ法で観測したもの）（図４）、ＣＯＮ-ＩＰＡＰスペクトル（Bermel,W., et al., Angew. Chem. Int. Ed. 44, 3089-3092 (2005)に記載の方法）（図５）を測定した。
【００４６】
（３）FKBPタンパク質と１−アセチルブロリンメチルエステルとの複合体の形成およびNMR測定
次に、ＦＫＢＰタンパク質に結合することがわかっている１−アセチルプロリンメチルエステル（ＡＣＰＭ）を1０mMになるようにＦＫＢＰタンパク質に混合し、1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した。ＡＣＰＭ存在下と非存在下における1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを重ね合わせたものを図６に示した。この２つのスペクトルを比較し、移動が見られるシグナルに対応する残基は、図７の立体構造上で示すように、ある特定の領域に集中しており、この領域がＡＣＰＭの結合部位であることが同定された。
次に、ＡＣＰＭ存在下で、（Ｈ）ＮＣＯ-ＩＰＡＰ２次元相関スペクトルを測定し、非存在下におけるスペクトルと重ね合わせたものを図８に示した。図８においてシグナルの移動が見られた残基は1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルにおいてシグナルの移動が見られた残基とほぼ一致していた。
【００４７】
また、ＡＣＰＭ存在下で、ＣＯＮ-ＩＰＡＰ２次元相関スペクトルを測定し、非存在下におけるスペクトルと重ね合わせたものを図９に示した。図９においてシグナルの移動が見られた残基は1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルにおいてシグナルの移動が見られた残基とほぼ一致していた。さらに、上記1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルや（Ｈ）ＮＣＯ-ＩＰＡＰ２次元スペクトルでは観測されないPro88のシグナルの移動が見られ、この残基もACPMの結合に関与していることが示唆された。
【００４８】
（４）FKBPタンパク質と１−ホルミルピペリジンとの複合体の形成およびNMR測定
同様にして、ＦＫＢＰタンパク質に結合することがわかっている１−ホルミルピペリジン（ＦＯＰＩ）を1０mMになるようにＦＫＢＰタンパク質に混合し、1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した。ＦＯＰＩ存在下と非存在下における1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを重ね合わせたものを図１０に示した。この２つのスペクトルを比較し、移動が見られるシグナルに対応する残基は、図１１の立体構造上で示すように、ある特定の領域に集中しており、この領域がＦＯＰＩの結合部位であることが同定された。
【００４９】
次に、ＦＯＰＩ存在下で、（Ｈ）ＮＣＯ-ＩＰＡＰ２次元相関スペクトルを測定し、非存在下におけるスペクトルと重ね合わせたものを図１２に示した。図１２においてシグナルの移動が見られた残基は1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルにおいてシグナルの移動が見られた残基とほぼ一致していた。
また、ＦＯＰＩ存在下で、ＣＯＮ-ＩＰＡＰ２次元相関スペクトルを測定し、非存在下におけるスペクトルと重ね合わせたものを図１３に示した。図１３においてシグナルの移動が見られた残基は1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルにおいてシグナルの移動が見られた残基とほぼ一致していた。
【００５０】
（５）FKBPタンパク質と１−ピペリジンカロボキサミドとの複合体の形成およびNMR測定
さらに、ＦＫＢＰタンパク質に結合することがわかっている１−ピペリジンカロボキサミド（ＰＩＣＡ）を1０mMになるようにＦＫＢＰタンパク質に混合し、1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した。ＰＩＣＡ存在下と非存在下における1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを重ね合わせたものを図１４に示した。この２つのスペクトルを比較し、移動が見られるシグナルに対応する残基は、図１５の立体構造上で示すように、ある特定の領域に集中しており、この領域がＰＩＣＡの結合部位であることが同定された。
次に、ＰＩＣＡ存在下で、（Ｈ）ＮＣＯ-ＩＰＡＰ２次元相関スペクトルを測定し、非存在下におけるスペクトルと重ね合わせたものを図１６に示した。図１６においてシグナルの移動が見られた残基は1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルにおいてシグナルの移動が見られた残基とほぼ一致していた。
【００５１】
また、ＰＩＣＡ存在下で、ＣＯＮ-ＩＰＡＰ２次元相関スペクトルを測定し、非存在下におけるスペクトルと重ね合わせたものを図１７に示した。図１３においてシグナルの移動が見られた残基は1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルにおいてシグナルの移動が見られた残基とほぼ一致していた。さらに、上記1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルや（Ｈ）ＮＣＯ-ＩＰＡＰ２次元スペクトルでは観測されないＰｒｏ８８のシグナルの移動が見られ、この残基もACPMの結合に関与していることが示唆された。
以上のことより、（Ｈ）ＮＣＯあるいはＣＯＮ２次元測定法を用いることにより、標的分子に基質や化合物が結合したかどうかを同定すること、および結合する場合に、標的分子のどの部位に結合するのかを同定することが可能であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】標識された主鎖の窒素に結合した水素原子と、該窒素と同一または隣接するアミノ酸中のα炭素原子、あるいはカルボニル炭素原子の２次元相関スペクトルを取得するためのNMR測定方法を示した図である。
【図２】ヒトＦＫＢＰタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。PreScission Proteaseの切断による切れ残りのＮ端３残基の番号をー２、-１、０としている（以下の図でも同様）。
【図３】ヒトＦＫＢＰタンパク質の1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを示す図である。
【図４】ヒトＦＫＢＰタンパク質の（Ｈ）ＮＣＯ-ＩＰＡＰ法により得られた２次元相関スペクトルを示す図である。それぞれのアミノ酸番号は、窒素原子の属するアミノ酸の番号である。
【図５】ヒトＦＫＢＰタンパク質のＣＯＮ-ＩＰＡＰ法により得られた２次元相関スペクトルを示す図である。それぞれのアミノ酸番号は、窒素原子の属するアミノ酸の番号である。
【図６】ヒトＦＫＢＰタンパク質単独及び、ヒトＦＫＢＰタンパク質に１−アセチルプロリンメチルエステル（ＡＣＰＭ）を作用させた後の1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを示す図である。シグナルが移動した残基のみアミノ酸番号を記している。
【図７】１−アセチルプロリンメチルエステル（ＡＣＰＭ）の構造式、および、ヒトＦＫＢＰタンパク質に１−アセチルプロリンメチルエステル（ＡＣＰＭ）を作用させた後に、シグナルの位置が変化した残基を示す（灰色に着色した部分）立体構造図である。
【図８】ヒトＦＫＢＰタンパク質単独及び、ヒトＦＫＢＰタンパク質に１−アセチルプロリンメチルエステル（ＡＣＰＭ）を作用させた後の（Ｈ）ＮＣＯ-ＩＰＡＰ法により得られた２次元相関スペクトルを示す図である。それぞれのアミノ酸番号は、窒素原子の属するアミノ酸の番号である。
【図９】ヒトＦＫＢＰタンパク質単独及び、ヒトＦＫＢＰタンパク質に１−アセチルプロリンメチルエステル（ＡＣＰＭ）を作用させた後のＣＯＮ-ＩＰＡＰ法により得られた２次元相関スペクトルを示す図である。それぞれのアミノ酸番号は、窒素原子の属するアミノ酸の番号である。
【図１０】ヒトＦＫＢＰタンパク質単独及び、ヒトＦＫＢＰタンパク質に１−ホルミルピペリジン（ＦＯＰＩ）を作用させた後の1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを示す図である。シグナルが移動した残基のみアミノ酸番号を記している。
【図１１】１−ホルミルピペリジン（ＦＯＰＩ）の構造式、および、ヒトＦＫＢＰタンパク質に１−ホルミルピペリジン（ＦＯＰＩ）を作用させた後に、シグナルの位置が変化した残基を示す（灰色に着色した部分）立体構造図である。
【図１２】ヒトＦＫＢＰタンパク質単独及び、ヒトＦＫＢＰタンパク質に１−ホルミルピペリジン（ＦＯＰＩ）を作用させた後の（Ｈ）ＮＣＯ-ＩＰＡＰ法により得られた２次元相関スペクトルを示す図である。それぞれのアミノ酸番号は、窒素原子の属するアミノ酸の番号である。
【図１３】ヒトＦＫＢＰタンパク質単独及び、ヒトＦＫＢＰタンパク質に１−ホルミルピペリジン（ＦＯＰＩ）を作用させた後のＣＯＮ-ＩＰＡＰ法により得られた２次元相関スペクトルを示す図である。それぞれのアミノ酸番号は、カルボニル炭素原子の属するアミノ酸の番号である。
【図１４】ヒトＦＫＢＰタンパク質単独及び、ヒトＦＫＢＰタンパク質に１−ピペリジンカロボキサミド（ＰＩＣＡ）を作用させた後の1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを示す図である。シグナルが移動した残基のみアミノ酸番号を記している。
【図１５】１−ピペリジンカロボキサミド（ＰＩＣＡ）の構造式、および、ヒトＦＫＢＰタンパク質に１−ピペリジンカロボキサミド（ＰＩＣＡ）を作用させた後に、シグナルの位置が変化した残基を示す（灰色に着色した部分）立体構造図である。
【図１６】ヒトＦＫＢＰタンパク質単独及び、ヒトＦＫＢＰタンパク質に１−ピペリジンカロボキサミド（ＰＩＣＡ）を作用させた後の（Ｈ）ＮＣＯ-ＩＰＡＰ法により得られた２次元相関スペクトルを示す図である。それぞれのアミノ酸番号は、窒素原子の属するアミノ酸の番号である。
【図１７】ヒトＦＫＢＰタンパク質単独及び、ヒトＦＫＢＰタンパク質に１−ピペリジンカロボキサミド（ＰＩＣＡ）を作用させた後のＣＯＮ-ＩＰＡＰ法により得られた２次元相関スペクトルを示す図である。それぞれのアミノ酸番号は、窒素原子の属するアミノ酸の番号である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図７】
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【図１１】
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【図１５】
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【配列表】
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