(57)【要約】【課題】インスリン分泌ペプチド、非ペプチド性重合体、およびキャリア物質が共有結合によって相互連結されており、生体内持続性および安定性が向上したインスリン分泌ペプチドおよびその利用の提供をする。【解決手段】インスリン分泌ペプチド（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｏｐｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）と免疫グロブリンＦｃ領域とが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれる非ペプチド性リンカーを介して連結され、前記インスリン分泌ペプチドのアミノ末端以外のアミノ酸残基に前記非ペプチド性リンカーが結合した、インスリン分泌ペプチド結合体を提供する。【選択図】図４
2008169195.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン分泌ペプチド（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｏｐｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）と免疫グロブリンＦｃ領域とが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれる非ペプチド性リンカーを介して連結され、前記インスリン分泌ペプチドのアミノ末端以外のアミノ酸残基に前記非ペプチド性リンカーが結合したことを特徴とする、インスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項２】
インスリン分泌ペプチドは、ＧＬＰ（Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）−１、エキセンディン−３（Ｅｘｅｎｄｉｎ−３）、エキセンディン−４（Ｅｘｅｎｄｉｎ−４）またはこれらの誘導体、断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）、および変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）を含む群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のインスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項３】
誘導体は、天然型のインスリン分泌ペプチドのアミノ末端のアミン基が置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）または修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されたインスリン分泌機能を保有するペプチド、これらの断片またはこれらの変異体を含む群から選ばれることを特徴とする、請求項２に記載のインスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項４】
アミノ末端のアミン基が置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）または修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されたエキセンディン−４誘導体と免疫グロブリンＦｃ領域とが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれる非ペプチド性リンカーを介して連結され、天然型のエキセンディン−４結合体より血糖低下效果及び效果の持続性が向上したことを特徴とする、インスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項５】
エキセンディン−４誘導体は、エキセンディン−４のアミノ末端のアミン基が除去された  脱アミノ化（Ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）エキセンディン−４誘導体であることを特徴とする、請求項４に記載のインスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項６】
アミノ末端のアミン基が除去された脱アミノ化（Ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）エキセンディン−４誘導体とアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）とが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれる非ペプチド性リンカーを介して連結され、天然型のエキセンディン−４結合体より血糖低下效果及び效果の持続性が向上したことを特徴とする、インスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項７】
非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域とインスリン分泌ペプチドのアミン基またはチオール基に結合したことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のインスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項８】
免疫グロブリンＦｃ領域が糖化しないことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のインスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項９】
免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインよりなる群から１個〜４個選ばれるドメインから構成されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のインスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項１０】
免疫グロブリンＦｃ領域がヒンジ領域をさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載のインスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項１１】
免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ由来のＦｃ領域であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のインスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項１２】
免疫グロブリンＦｃ領域のそれぞれのドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭよりなる群から選ばれる免疫グロブリンに由来した相異なる起源を持つドメインのハイブリッドであることを特徴とする、請求項１１に記載のインスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項１３】
免疫グロブリンＦｃ領域が同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンから構成された二量体または多量体（免疫グロブリンＦｃの組み合わせ）であることを特徴とする、請求項１１に記載のインスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項１４】
免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４  Ｆｃ領域であることを特徴とする、請求項１１に記載のインスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項１５】
免疫グロブリンＦｃ領域がヒト非糖化ＩｇＧ４  Ｆｃ領域であることを特徴とする、請求項１４に記載のインスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項１６】
非ペプチド性重合体の反応基が、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、およびスクシニミド誘導体よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のインスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項１７】
スクシニミド誘導体がスクシニミジルプロピオネート、スクシニミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシニミジル、またはスクシニミジルカーボネートであることを特徴とする、請求項１６に記載のインスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項１８】
非ペプチド性重合体が両末端に反応アルデヒド基の反応基を持つことを特徴とする、請求項１７に記載のインスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項１９】
非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項１８に記載のインスリン分泌ペプチド結合体。
【請求項２０】
（１）両末端にアルデヒド、マレイミド、またはスクシニミド誘導体反応基を持つ非ペプチド性重合体をインスリン分泌ペプチドのアミン基またはチオール基に共有結合によって連結する段階と、
（２）前記（１）の反応混合物から、アミノ末端以外のアミノ酸残基に非ペプチド性重合体が共有結合したインスリン分泌ペプチドを含む連結体を分離する段階と、
（３）分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合によって連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域およびインスリン分泌ペプチドに結合したペプチド結合体を生成する段階とを含むことを特徴とする、インスリン分泌ペプチド結合体の製造方法。
【請求項２１】
（１）両末端にアルデヒド反応基を持つ非ペプチド性重合体を用いてエキセンディン−４のリジン残基にｐＨ９．０以上で共有結合によって連結する段階と、
（２）（１）の反応混合物から、リジン残基に非ペプチド性重合体が共有結合したエキセンディン−４を含む連結体を分離する段階と、
（３）分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合によって連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域およびインスリン分泌ペプチドに結合したタンパク質結合体を生成する段階とを含むことを特徴とする、エキセンディン−４結合体の製造方法。
【請求項２２】
インスリン分泌ペプチドは、脱アミノ化（Ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）エキセンディン−４誘導体であることを特徴とする、請求項２０または請求項２１に記載のインスリン分泌ペプチド結合体の製造方法。
【請求項２３】
非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項２０または請求項２１に記載のインスリン分泌ペプチド結合体の製造方法。
【請求項２４】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質結合体を含む糖尿病治療用薬学的組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質結合体または請求項２４に記載の薬学的組成物を投与する段階を含む糖尿，肥満，急性冠症候群（ａｃｕｔｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、または多嚢胞性卵巣症候群（ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｏｖａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン分泌ペプチドの持続型剤形のためのインスリン分泌ペプチドに係り、より具体的には、インスリン分泌ペプチド、非ペプチド性重合体、およびキャリア物質が共有結合によって相互連結されて血中半減期が著しく増加し、特定のアミノ酸残基との選択的結合方法及び特定アミノ酸残基の変形によって生体内效力長続き效果をより画期的に増加させた変形されたインスリン分泌ペプチド結合体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ペプチドは、安定性が低くて容易に変性し、体内タンパク質加水分解酵素によって分解されてその活性を失い、また、相対的に小さくて腎臓を介して容易に除去されるため、薬理成分としてペプチドを含む医薬品の血中濃度および力価を維持するにはペプチド薬物を患者に頻りに投与する必要がある。ところが、ペプチド薬物は殆ど注射剤として患者に投与され、その結果生理活性ペプチドの血中濃度を維持するために頻繁に注射される。これは患者に大きな苦痛を与える。かかる問題点を克服するために様々な試みが行われてきたが、その一環としては、ペプチド薬物の生体膜透過度を増加させて口腔または鼻腔を介しての吸入によりペプチドの薬物を体内に伝達する試みがあった。しかし、この方法は、注射剤に比べてペプチドの体内伝達効率が著しく低く、よってペプチド薬物の体内活性を所望の条件に維持するところに難しさがある。
【０００３】
また、ペプチド薬物の血中安定性を増加させ、血中薬物濃度を長時間高く持続させて薬効を極大化しようとする努力が続けられてきた。このようなペプチド薬物の持続型製剤は、ペプチド薬物の安定性を高めることおよび薬物そのものの力価を十分高く維持しなければならないことが要求される一方、患者に免疫反応を誘発してはならない。
【０００４】
また、ペプチドを安定化させ且つタンパク質加水分解酵素による分解を抑制するための方法として、タンパク質加水分解酵素に敏感な特定のアミノ酸配列を変更する試みが行われてきた。例えば、血中グルコース濃度を減少させる作用を行い、第２型糖尿病治療効能を持っているＧＬＰ−１（７−３７または７−３６アミド）の場合、生理活性半減期が４分以下と非常に短いが（非特許文献１）、これはジペプチジルペプチダーゼ（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ＩＶ、以下「ＤＰＰ  ＩＶ」という）によるＧＬＰ−１のアミノ酸８番（Ａｌａ）と９番（Ａｓｐ）間の切断によるＧＬＰ−１の力価喪失に起因し、よってＤＰＰ  ＩＶに抵抗性を持つＧＬＰ−１類似体に対する様々な研究が行われてきた。例えば、Ａｌａ８をＧｌｙで置換し（非特許文献２、非特許文献３）或いはＬｅｕ、Ｄ−Ａｌａで置換することにより（非特許文献４）、ＤＰＰ  ＩＶに対する抵抗性を増加させながら活性を維持する試みがあった。また、ＧＬＰ−１のＮ末端アミノ酸Ｈｉｓ７はＧＬＰ−１の活性に非常に重要であると同時に、ＤＰＰ  ＩＶのターゲットである。したがって、特許文献１ではＮ末端をアルキルまたはアシル基に変形し、Ｇａｌｌｗｉｔｚ等は７番ＨｉｓをＮ−メチル化（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、α−メチル化（ａｌｐｈａ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）させ、或いはＨｉｓ全体をイミダゾールで置換することにより、ＤＰＰ  ＩＶ抵抗性を増加させ且つ生理活性を維持した。
【０００５】
このような変形体以外にアメリカドクトカゲ（ｇｌｉａ  ｍｏｎｓｔｅｒ）の唾液分泌物から精製されたＧＬＰ−１類似体であるエキセンディン−４（特許文献２）は、ＤＰＰ  ＩＶに対する抵抗性と共にＧＬＰ−１より高い生理活性を有し、よって体内半減期が２〜４時間とＧＬＰ−１に比べて長くなった。ところが、ＤＰＰ  ＩＶの抵抗性を増加させる方法のみでは十分な生理活性の持続時間を期待することができないが、例えば現在市販中のエキセンディン−４（エキセナチド（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ））の場合、患者に１日２回注射によって投与されなければならないが、これは依然として患者に大きい負担となっている。
【０００６】
このようなインスリン分泌ペプチドの問題点は、ペプチドの大きさが小さくて腎臓から回収されず体外に消失することに起因するところが大きく、よって、腎臓における消失を抑制するために、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高溶解度の高分子物質をペプチドの表面に化学的に付加させる方法が使用されてきた。
【０００７】
ＰＥＧは、目的ペプチドの特定の部位または様々な部位に非特異的に結合してペプチドの分子量を増加させることにより腎臓による消失を抑制し且つ加水分解を防止する効果があり、特別な副作用も起こさない。例えば、特許文献３では、ＮＰＲ−Ａに結合してｃＧＭＰの生産を活性化することにより動脈内の血圧を減少させ、よって鬱血性心不全症（Ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）治療剤として用いられるＢ型ナトリウム配設増加ペプチド（Ｂ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＢＮＰ）にＰＥＧを結合して生理活性を持続させることについて記述しており、特許文献４では、エキセンディン−４のリジン残基にＰＥＧを結合させて生体内持続時間を増加させる方法について記述している。ところが、これらの方法はＰＥＧ分子量を増加させてペプチド薬物の生体内持続時間を延長することができる一方、分子量が増加するほどペプチド薬物の力価が著しく低くなり、且つペプチドとの反応性が低くなって収率が減少するという問題がある。
【０００８】
特許文献５では、組み換え遺伝子技術を用いたＧＬＰ−１、エキセンディン−４またはその類似体とヒト血清アルブミンまたは免疫グロブリン断片（Ｆｃ）との融合タンパク質について記述しており、特許文献６では、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはその類似体とＦｃの融合タンパク質について記述している。これらの方法は、低いＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）収率問題と非特異性を克服することができる一方、血中半減期増加効果が予想より画期的でなく、場合によっては力価が低いという問題点を持っている。血中半減期増加効果を極大化するために、様々な種類のペプチドリンカーが使用されることもあるが、免疫反応を誘発する可能性がある。また、例えばＢＮＰなど、ジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）を持っているペプチドを用いる場合、折り畳み異常（ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ）の確率が高くて適用が難しいという問題点がある。
【０００９】
この他に、ＧＬＰ−１誘導体であるＮＮ２２１１は、ＧＬＰ−１のアミノ酸を置換し、アシル側鎖（ａｃｙｌ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）を結合させてアルブミンと非共有結合させることにより、体内持続時間を増加させたが、半減期が１１〜１５時間とエキセンディン−４に比べてあまり増加せず、依然として１日１回注射による投与が必要である（非特許文献５）。また、ＣＪＣ−１１３１の場合、ＧＬＰ−１とアルブミンとが血液内で共有結合するようにマレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）反応基が連結されたＧＬＰ−１誘導体であって、生体内半減期の増加を目的として開発を試みたが、最近、開発が中断された状態である。後続の物質であるＣＪＣ−１１３４は、組み換えアルブミンと共有結合によって連結されたエキセンディン−４であって、血中半減期が約１７時間（Ｒａｔ）と著しい血中安定性増加効果を示していない（非特許文献６）。
【特許文献１】米国特許第５，５４５，６１８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４２４，６８６号明細書
【特許文献３】ＷＯ２００６／０７６４７１パンフレット
【特許文献４】米国特許第６，９２４，２６４号明細書
【特許文献５】ＷＯ０２／４６２２７パンフレット
【特許文献６】米国特許第６，７５６，４８０号明細書
【非特許文献１】Kreymann et al., 1987
【非特許文献２】Deacon et al., 1998
【非特許文献３】Burcelin et al., 1999
【非特許文献４】Xiao et al., 2001
【非特許文献５】Nauck et al., 2004
【非特許文献６】Thibauoleau et al., 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明者らは、インスリン分泌ペプチドの血中半減期の増加および生体内活性の維持を同時に極大化することが可能な方法として、キャリア物質、非ペプチド性重合体及びインスリン分泌ペプチドを共有結合によって部位選択的に相互連結させる製造方法を使用し、インスリン分泌ペプチッドの中でエキセンディン−４アミノ末端のアミン基をとり除いた脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ，ＤＡ）エキセンディ−４のリシン（ｌｙｓｉｎｅ）残基に非ペプチッド性重合体を結合させたインスリン分泌ペプチッド結合体の生体内效力長続き效果が画期的に増加されることを確認してみた発明を完成した。
【００１１】
本発明の目的は、インスリン分泌ペプチドの生体内活性を維持しながら血中半減期を延長させ、著しく優れたインスリン分泌ペプチド持続型製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明の一様態によれば、インスリン分泌ペプチド、両末端に反応基を持つ非ペプチド性重合体、およびキャリア物質が相互共有結合によって連結されている持続型インスリン分泌ペプチド結合体に関することである。
【００１３】
本発明のインスリン分泌ペプチドは、インスリン分泌機能を保有したペプチドであって、膵臓ベータ細胞のインスリンの合成および発現を刺激する。このようなペプチドは、前駆物質（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）、誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）、変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）などを含み、好ましくはＧＬＰ（Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）−１、エキセンディン−３、エキセンディン−４などである。
【００１４】
ＧＬＰ−１は、小腸から分泌されるホルモンであって、一般にインスリンの生合成および分泌を促進し、グルカゴンの分泌を抑制し、細胞内のグルコース吸収を促進する。小腸からグルカゴン前駆体は３つのペプチドに分解されるが、グルカゴン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２である。ここで、ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１（１〜３７）を意味し、インスリン分泌機能のない形態であり、ＧＬＰ−１（７〜３７）の形にプロセッシングされて活性型ＧＬＰ−１（７〜３７）になる。ＧＬＰ−１（７〜３７）のアミノ酸配列は下記の通りである。
【００１５】
ＧＬＰ−１（７〜３７）
ＨＡＥＧＴ ＦＴＳＤＶ ＳＳＹＬＥ ＧＱＡＡＫ ＥＰＩＡＷ ＬＶＫＧＲ Ｇ
ＧＬＰ−１誘導体は、ＧＬＰ−１と比較したときに少なくとも８０％のアミノ酸配列で相同性を示し、化学的に修飾された形態であってもよく、インスリン分泌機能も少なくとも同等またはそれ以上を示すペプチドを意味する。
【００１６】
ＧＬＰ−１断片は、天然型ＧＬＰ−１のアミノ末端またはカルボキシ末端に対して一つまたはそれ以上のアミノ酸が追加または削除された形態を意味し、追加されたアミノ酸は天然に存在しないアミノ酸（例：Ｄ型アミノ酸）も可能である。
【００１７】
ＧＬＰ−１変異体は、天然型ＧＬＰ−１とアミノ酸配列が少なくとも一つ異なるペプチドであって、インスリン分泌機能を保有したペプチドを意味する。
【００１８】
エキセンディン−３とエキセンディン−４は、ＧＬＰ−１と５３％のアミノ酸配列類似性を示す３９個のアミノ酸からなるインスリン分泌ペプチドであり、エキセンディン−３とエキセンディン−４のアミノ酸配列は下記の通りである。
【００１９】
エキセンディン−３
ＨＳＤＧＴ ＦＴＳＤＬ ＳＫＱＭＥ ＥＥＡＶＲ ＬＦＩＥＷ ＬＫＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳ
エキセンディン−４
ＨＧＥＧＴ ＦＴＳＤＬ ＳＫＱＭＥ ＥＥＡＶＲ ＬＦＩＥＷ ＬＫＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳ
エキセンディン誘導体は、エキセンディンと比較したときに少なくとも８０％のアミノ酸配列で相同性を示し、化学的に修飾された形態であってもよく、インスリン分泌機能も少なくとも同等またはそれ以上を示すペプチドを意味する。
【００２０】
エキセンディン断片は、天然型エキセンディンのアミノ末端またはカルボキシ末端に対して一つまたはそれ以上のアミノ酸が追加または削除された形態を意味し、追加されたアミノ酸は天然に存在しないアミノ酸（例：Ｄ型アミノ酸）も可能である。
【００２１】
エキセンディン変異体は、天然型エキセンディンとアミノ酸配列が少なくとも一つ異なるペプチドであって、インスリン分泌機能を保有したペプチドを意味する。
【００２２】
エキセンディン誘導体，断片，変異体でそれぞれ使われた製造方法は独立的に使われることができるし、組み合わせて使うこともできる。例えばアミノ酸序列が一つ以上違ってアミノ末端のアミノ酸残基に脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）されたインスリン分泌ペプチッドも含まれる。
【００２３】
具体的な一様態として、本発明で使用した天然型インスリン分泌ペプチドと変形されたインスリン分泌ペプチドは固相（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ）合成法によって合成でき、天然型インスリン分泌ペプチドを含んだ大部分の天然型ペプチドは組み換え方法でも生産可能である。
【００２４】
また、本発明で使用されたエキセンディン−４は、様々な部位で非ペプチド性重合体と結合できる。
【００２５】
本発明で製造した結合体は、エキセンディン−４の結合部位によって活性差異があり得る。
【００２６】
例えば、アミノ末端とカルボキシ末端を含んだアミノ末端以外の部位にそれぞれカップリングしてインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）活性の差異を確認することができる。
【００２７】
アルデヒド反応基は、低いｐＨでアミノ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリジン残基とも共有結合を形成することができる。反応ｐＨを異にしてＰＥＧ化（Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）反応を行った後、イオン交換カラムを用いて反応混合物から位置異性体を分離することができる。
【００２８】
生体内活性に重要な部位であるアミノ末端以外の位置にカップリングする場合、天然型アミノ酸配列で修飾しようとするアミノ酸残基位置に反応性チオール基を導入して非ペプチド性重合体のマレイミドリンカーを用いて共有結合を形成することができる。
【００２９】
生体内活性に重要な部位であるアミノ末端以外の位置にカップリングする場合、天然型アミノ酸配列で修飾しようとするアミノ酸残基位置に反応性のあるアミン基を導入して非ペプチド性重合体のアルデヒドリンカーを用いて共有結合を形成することができる。
【００３０】
非ペプチッド性重合体にアルデヒドリンカーを用いると、アミノ末端とリジン残基にあるアミン基と反応し、選択的に反応収率を向上させるために、変形した形態のインスリン分泌ペプチドを使用することができる。例えば、アミノ末端ブロッキング方法、リジン残基置換方法、カルボキシ末端へのアミン基導入方法を用いて反応することが可能なアミン基を所望の位置に一つのみ維持することができ、ＰＥＧ化およびカップリング収率を向上させることができる。アミノ末端の保護方法はジメチル化（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）の他にメチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）方法でも可能であり、このようなアルキル化（ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ）方法に限定されない。
【００３１】
したがって、本発明の好適な様態として、本発明のインスリン分泌ペプチド結合体は、インスリン分泌ペプチドのアミノ末端以外のアミン基に特異的に免疫グロブリンＦｃ領域を結合したエキセンディン−４結合体である。
【００３２】
具体的な一実施例として、本発明者は、インスリン分泌ペプチドのリジン残基に選択的にカップリングするための方法として、天然型エキセンディン−４にＰＥＧを結合させるときにｐＨ９．０で反応させてリジン残基にＰＥＧ化反応を誘導し、他の方法としては、アミノ末端が除去または保護された形態のエキセンディン−４を合成してカップリングする方法を使用した。Ｎ末端ヒスチジンのαアミン基を除去して合成し、またはＮ末端ヒスチジンにメチル基を２つ付けてリンカーＰＥＧのＮ末端結合を予め防止した。このようなアミノ末端修飾方法はインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）活性に全く影響を与えない（表１）。
【００３３】
アミノ末端カップリングの場合とは異なり、リジン残基にカップリングされると、インビトロ活性が約６％程度維持されることを確認することができる（表１）。またアミノ末端との結合を遮断する方法の中で脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）方法を使ったＤＡ−エキセンディン結合体が，天然型エキセンディン−４結合体と同等なイン−ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で活性及び血中半減期を見せたが（表１）イン−ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）效力試験では予測することができなかった越等な持続性效果を見せてくれた（図４）。
【００３４】
したがって、本発明で製造したＤＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、血中半減期が５０時間以上画期的に増加し、活性に影響を与えないリジン残基にカップリングさせて力価減少も最小化させ、アミノ末端のアミン基除去で従来に予測することができなかった向上した生体内活性及び持続性を見せた。結果的に生体内效力維持面で画期的に改善した生体内活性が維持された新規な持続型エキセンディン−４剤形を製造することができる。
【００３５】
本発明で使われるインスリン分泌ペプチドはキャリア物質と非ペプチド性重合体で繋がれる。
【００３６】
本発明で使用可能なキャリア物質は兔疫グロブリンＦｃ領域、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）、トレンスペリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）及びＰＥＧで構成された群で選択されることができるし、好ましくは兔疫グロブリンＦｃ領域である。
【００３７】
免疫グロブリンＦｃ領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるため、薬物のキャリアとして使用するのに安全である。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンの全体分子に比べて相対的に分子量が少ないから、結合体の製造、精製および収率の面で有利であるうえ、アミノ酸配列が抗体ごとに異なって高い非均質性を示すＦａｂ部分が除去されるから、物質の同質性が大きく増加し且つ血中抗原性の誘発可能性も低くなるという効果も期待することができる。
【００３８】
本発明において、「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）並びに軽鎖不変領域（ＣＬ１）を除いた、重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）部分を意味し、重鎖不変領域にヒンジ部分を含むこともある。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等またはより向上した効果を持つ限りは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域のみを除き、一部または全体重鎖不変領域１（ＣＨ１）および／または軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、ＣＨ２および／またはＣＨ３に該当する相当長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、５）１つまたは２つ以上のドメインと免疫グロブリンのヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。
【００３９】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体（ｍｕｔａｎｔ）を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の少なくとも一つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換、またはこれらの組み合わせによって相異なる配列を持つものを意味する。例えば、ＩｇＧＦｃの場合、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２、または３２７〜３３１番のアミノ酸残基が変形のために適当な部位として利用できる。また、二硫化結合を形成することが可能な部位が除去され、または天然型ＦｃからＮ末端の幾つかのアミノ酸が除去され、または天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されることもできるなど、多様な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能を無くすために、補体結合部位、例えばＣｌｑ結合部位が除去されることも可能であり、ＡＤＣＣ部位が除去されることも可能である。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は国際特許公開ＷＯ９７／３４６３１号、国際特許公開第９６／３２４７８号などに開示されている。
【００４０】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野に公知になっている（Ｈ．  Ｎｅｕｒａｔｈ，  Ｒ．  Ｌ．  Ｈｉｌｌ，  Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７９）。最も通常的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。
【００４１】
場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、アミル化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）などで修飾されることも可能である。
【００４２】
前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同一の生物学的活性を示すが、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を増大させた誘導体である。
【００４３】
また、このようなＦｃ領域は、ヒト、および牛、山羊、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離した天然型から得られることも可能であり、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組み換え型またはその誘導体であり得る。ここで、天然型から得る方法は、全体免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して得ることができる。パパインを処理する場合にはＦａｂおよびＦｃで切断され、ペプシンを処理する場合にはｐＦ’ｃおよびＦ（ａｂ’）２で切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などを用いてＦｃまたはｐＦ’ｃを分離することができる。
【００４４】
好ましくはヒト由来のＦｃ領域を微生物から得た組み換え型免疫グロブリンＦｃ領域である。
【００４５】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、または糖鎖が除去された形態であり得る。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減または除去には化学的方法、酵素学的方法、および微生物を用いた遺伝工学的方法などの通常の方法が利用できる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃｌｑ）の結合力が著しく低下し、抗体−依存性細胞毒性または補体−依存性細胞毒性が減少または除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このような点から、薬物のキャリアとしての本来の目的にさらに符合する形態は、脱糖化または非糖化の免疫グロブリンＦｃ領域であるといえる。
【００４６】
本発明において、「脱糖化（Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」とは酵素で糖を除去したＦｃ領域をいい、「非糖化（Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」とは原核動物、好ましくは大腸菌で生産して糖化していないＦｃ領域をいう。
【００４７】
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト起源、または牛、山羊、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であり、好ましくはヒト起源である。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）またはこれらの混成（ｈｙｂｒｉｄ）によるＦｃ領域である。好ましくはヒトの血液に最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり、最も好ましくはリガンド結合タンパク質の半減期を向上させるものと公知になっているＩｇＧ由来である。
【００４８】
一方、本発明において、「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、二量体または多量体を形成するとき、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが相異なる起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。すなわち、ＩｇＧ  Ｆｃ、ＩｇＡ  Ｆｃ、ＩｇＭ  Ｆｃ、ＩｇＡ  Ｆｃ、ＩｇＤ  Ｆｃ、およびＩｇＥ  Ｆｃ断片よりなる群から選択された２つ以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
【００４９】
本発明において、「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」とは、単鎖の免疫グロブリンＦｃ領域内に２つ以上の相異なる起源の免疫グロブリンＦｃ断片に該当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ  Ｆｃ、ＩｇＭ  Ｆｃ、ＩｇＥ  Ｆｃ、およびＩｇＤ  ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４よりなる群から１個ないし４個のドメインから構成されたドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含むことができる。
【００５０】
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、本発明ではこれらの組み合わせまたはこれらの混成化も可能である。好ましくは、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のサブクラスであり、最も好ましくは補体依存的毒性（ＣＤＣ、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｄｅｐｅｎｄａｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）などのイフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）が殆どないＩｇＧ４のＦｃ領域である。
【００５１】
すなわち、最も好ましい本発明の薬物のキャリア用免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非糖化Ｆｃ領域である。ヒト由来のＦｃ領域はヒト生体で抗原として作用し、これに対する新規抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を起こし得る非ヒト由来のＦｃ領域に比べて望ましい。
【００５２】
本発明において、「非ペプチド性重合体」は、繰り返し単位が２つ以上結合した生体適合性重合体を意味し、前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく、任意の共有結合によって互いに連結される。
【００５３】
本発明で使用可能な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）およびＰＬＧＡ（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせよりなる群から選択でき、好ましくはポリエチレングリコールである。当該分野に既に知られているこれらの誘導体および当該分野の技術水準で容易に製造することが可能な誘導体も本発明の範囲に含まれる。
【００５４】
既存のインフレームフュージョン（ｉｎｆｒａｍｅ  ｆｕｓｉｏｎ）方法で製造された融合タンパク質で使用されたペプチド性リンカーの欠点は、生体内でタンパク質分解酵素によって容易に切断され、キャリアによる活性薬物の血中半減期増加効果が期待ほど得られないことである。ところが、本発明では、タンパク質分解酵素に抵抗性がある重合体を用いてキャリアと類似にペプチドの血中半減期を維持することができる。したがって、本発明において使用可能な非ペプチド性重合体は、前述した役割、すなわち生体内タンパク質分解酵素に抵抗性がある重合体であればいずれでもよい。非ペプチド性重合体は、分子量１〜１００ｋＤａの範囲、好ましくは１〜２０ｋＤａの範囲であることが好ましい。また、前記キャリア物質と結合する本発明の非ペプチド性重合体は、１種類の重合体だけでなく、相異なる種類の重合体の組み合わせが使用されることも可能である。
【００５５】
本発明に用いられる非ペプチド性重合体は、キャリア物質およびタンパク質薬物と結合できる反応基を持つ。
【００５６】
前記非ペプチド性重合体の両末端反応基は、反応アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、およびスクシニミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）誘導体よりなる群から選ばれることが好ましい。前記において、スクシニミド誘導体としては、スクシニミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシニミジル、スクシニミジルカルボキシメチル、またはスクシニミジルカーボネートが利用できる。特に、前記非ペプチド性重合体が両末端に反応アルデヒド基の反応基を持つ場合、非特異的反応を最小化し、非ペプチド性重合体の両末端で生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンとそれぞれ結合するのに効果的である。アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合で連結されたものより一層安定的である。アルデヒド反応基は、低いｐＨでアミノ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリジン残基と共有結合を形成することができる。
【００５７】
前記非ペプチド性重合体の両末端反応基は同一であってもよく、異なってもよい。例えば、一方の末端にはマレイミド基を、他方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、またはブチルアルデヒド基を持つことができる。両末端にヒドロキシ反応基を持つポリ（エチレングリコール）を非ペプチド性重合体として用いる場合には、公知の化学反応によって前記ヒドロキシ基を前記多様な反応基として活性化し、或いは商業的に入手可能な変形した反応基を持つポリ（エチレングリコール）を用いて本発明のタンパク質結合体を製造することができる。
【００５８】
このような本の発明のインスリン分泌ペプチド結合体はインスリン合成及び分泌促進、食欲抑制、体重減少、ベータ細胞（ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ）の血中グルコース敏感度の増加、ベータ細胞の増殖の促進、胃排出の遲延、グルカゴン抑制のような既存のインスリン分泌ペプチドの生体内活性が維持されただけでなくインスリン分泌ペプチドの血中半減期及びこれによる上記ペプチドの生体内長続き效果が画期的に増加するようにするので、糖尿、肥満、急性冠症候群（ａｃｕｔｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、多嚢胞性卵巣症候群（ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｏｖａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療に有用である。
【００５９】
また、本発明の別の様態として、本発明は、（１）両末端にアルデヒド、マレイミド、またはスクシニミド誘導体反応基を持つ非ペプチド性重合体を用いてインスリン分泌ペプチドのアミン基またはチオール基に共有結合によって連結する段階と、（２）前記（１）の反応混合物から、アミノ末端以外の位置に非ペプチド性重合体が共有結合したインスリン分泌ペプチドを含む連結体を分離する段階と、（３）分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端にキャリア物質を共有結合によって連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれキャリア物質およびインスリン分泌ペプチドに結合したペプチド結合体を生成する段階とを含む、インスリン分泌ペプチド結合体の製造方法を提供する。
【００６０】
また、好適な一様態として、本発明は、（１）両末端にアルデヒド反応基を持つ非ペプチド性重合体をエキセンディン−４のリジン残基に共有結合によって連結する段階と、（２）（１）の反応混合物から、リジン残基に非ペプチド性重合体が共有結合したエキセンディン−４を含む連結体を分離する段階と、（３）分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合によって連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域およびエキセンディン−４に結合したタンパク質結合体を生成する段階とを含む、製造方法を提供する。さらに好ましくは、（１）の非ペプチド性重合体およびエキセンディン−４のリジン残基はｐＨ９．０以上で連結される。
【００６１】
また、本発明の別の様態として、本発明のインスリン分泌ペプチド結合体を含む糖尿病治療用薬学的組成物を提供する。
【００６２】
本発明において、「投与」は、いずれの適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記結合体の投与経路は、薬物が目的の組織に到達することができる限りはいずれの一般な経路を介しても投与できる。例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与などが挙げられるが、これに制限されない。ところが、経口投与の場合には、ペプチドは消化がなされるため、経口用組成物は活性薬剤をコートし、或いは胃における分解から保護されるように剤形化することが好ましい。好ましくは、注射剤として投与できる。また、薬学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動することが可能な任意の装置によって投与できる。
【００６３】
本発明の結合体を含んだ薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。薬学的に許容される担体は、経口投与の場合には結合剤、滑濁剤、崩解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与の場合には基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。
【００６４】
本発明の薬学的組成物の剤形は、上述したような薬学的に許容される担体と混合して様々に製造できる。例えば、経口投与の場合には錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、ウエハースなどの形で製造することができ、注射剤の場合には単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。
【００６５】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、未晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、または鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含むことができる。
【００６６】
本発明の薬学的組成物は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別および体重、並びに疾患の重症度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類によって決定される。本発明の薬学的組成物は、生体内持続性および力価に優れるので、本発明の薬学的製剤の投与回数および頻度を著しく減少させることができる。
【発明の効果】
【００６７】
本発明のインスリン分泌ペプチドは、ペプチドの生体内活性が比較的高く維持され、血中半減期が著しく増加して様々なペプチド薬物の持続型剤形の開発に有用に利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
以下、下記実施例によって本発明をより詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６９】
＜実施例１：エキセンディン−４のＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）と位置異性体の分離＞
３．４Ｋ  ＢｕｔｙｒＡＬＤ（２）ＰＥＧ（２つのブチルアルデヒド基を持っているＰＥＧ）をエキセンディン−４（ＡＰ、米国）のＮ−ｔｅｒｍにＰＥＧ化させるために、ペプチドとＰＥＧのモル比を１：１５、ペプチド濃度を３ｍｇ／ｍＬにして４℃で９０分間反応した。この際、反応は１００ｍＭのＮａＯＡｃ  ｐＨ４．０で還元剤としての２０ｍＭ  ＳＣＢ（ＮａＣＮＢＨ３）を添加して行った。３．４Ｋ  ＢｕｔｙｒＡＬＤ（２）ＰＥＧをエキセンディン−４のＬｙｓにＰＥＧ化させるために、ペプチドとＰＥＧのモル比を１：３０、ペプチド濃度を３ｍｇ／ｍＬにして４℃で３時間反応した。この際、反応は１０ｍＭ  Ｎａ−ホウ酸塩ｐＨ９．０で還元剤としての２０ｍＭ  ＳＣＢを添加して行った。各反応液は、ＳＯＵＲＣＥ  Ｑ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス）を介して１次的にはモノＰＥＧ化ペプチド（Ｍｏｎｏ−ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）を精製し、ＳＯＵＲＣＥ  Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス）を介して異性体を分離した。Ｎ−ｔｅｒｍＰＥＧ化ピーク（Ｎ−ｔｅｒｍ  Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  Ｐｅａｋ）が最も前側に出るし、その後ろ側には順次２つのＬｙｓＰＥＧ化ピーク（Ｌｙｓ  Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  Ｐｅａｋ）が出ることが分かった。
【００７０】
カラム（Ｃｏｌｕｍｎ）：ＳＯＵＲＣＥ  Ｑ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス）
流速：２．０ｍＬ／分
勾配：Ａ０→４０％、８０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭトリスｐＨ８．５、Ｂ：Ａ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ）
カラム（Ｃｏｌｕｍｎ）：ＳＯＵＲＣＥＳ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス）
流速：２．０ｍＬ／分
勾配：Ａ０→１００％、４５分Ｂ（Ａ：２０ｍＭクエン酸ｐＨ３．０、Ｂ：Ａ＋０．５Ｍ  ＫＣｌ）。
【００７１】
＜実施例２：エキセンディン−４（Ｎ）−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の製造＞
実施例１の方法を用いて３．４Ｋ  ＢｕｔｙｒＡＬＤ（２）ＰＥＧをエキセンディン−４のＮ−ｔｅｒｍと反応させた後、Ｎ−ｔｅｒｍ異性体のみを精製して免疫グロブリンＦｃとカップリングさせた。ペプチドと免疫グロブリンＦｃのモル比を１：８、全体タンパク質の濃度を５０ｍｇ／ｍＬにして４℃で１７時間反応した。反応液は、１００ｍＭ  Ｋ−Ｐ  ｐＨ６．０であり、還元剤としての２０ｍＭ  ＳＣＢを添加した。カップリング反応液は、２つの精製カラムを経て精製される。まず、カップリング反応に参加していない多量の免疫グロブリンＦｃを除去するために、ＳＯＵＲＣＥ  Ｑ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス）を利用した。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で１Ｍ  ＮａＣｌを用いて塩グラジエント（Ｓａｌｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ)を与えると、相対的に結合力の弱い免疫グロブリンＦｃがまず溶出され、その後直ちにエキセンディン−４免疫グロブリンＦｃが溶出される。１次精製によってある程度免疫グロブリンＦｃが除去されるが、イオン交換カラム（Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｏｌｕｍｎ）で免疫グロブリンＦｃとエキセンディン−４免疫グロブリンＦｃとの結合力差異が大きくなく、完全には分離されない。したがって、両物質の疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）を用いて２次精製を行った。ＳＯＵＲＣＥ  ＩＳＯ（ＨＲ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス）に２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）１．５Ｍ硫安（Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ）を用いて、１次精製された試料を結合させた後、段々硫安の濃度を低めながら試料を溶出させる。ＨＩＣカラムに結合力が弱い免疫グロブリンＦｃがまず溶出され、結合力の強いエキセンディン−４−免疫グロブリンＦｃ試料が後で溶出される。しかし、これらの疎水性差異が大きくてイオン交換カラム（Ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｌｕｍｎ）より一層分離し易い。
【００７２】
カラム（Ｃｏｌｕｍｎ）：ＳＯＵＲＣＥ  Ｑ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス）
流速：２．０ｍＬ／分
勾配：Ａ０→２５％、６０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭトリスｐＨ７．５、Ｂ：Ａ＋１Ｍ  ＮａＣｌ）
カラム（Ｃｏｌｕｍｎ）：ＳＯＵＲＣＥ  ＩＳＯ（ＨＲ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス）
流速：７．０ｍＬ／分
勾配：Ａ１００→０％、８０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭトリスｐＨ７．５、Ｂ：Ａ＋１．５Ｍ  硫安）。
【００７３】
＜実施例３：エキセンディン−４（Ｌｙｓ）−免疫グロブリンＦｃ結合体の製造＞
実施例１の方法を用いて３．４Ｋ  ＢｕｔｙｒＡＬＤ（２）ＰＥＧをエキセンディン−４のＬｙｓと反応させた後、Ｌｙｓ異性体のみを精製して免疫グロブリンＦｃとカップリングさせた。２つのＬｙｓ異性体ピークのうち反応が多く進行しＮ−ｔｅｒｍ異性体と画然に区分される最も後ろ側の異性体ピークを用いてカップリングを行った。ペプチドと免疫グロブリンＦｃのモル比を１：８、全体タンパク質の濃度を５０ｍｇ／ｍＬにして４℃で１６時間反応した。反応液は１００ｍＭ  Ｋ−Ｐ  ｐＨ６．０であり、還元剤としての２０ｍＭ  ＳＣＢを添加した。カップリング反応の後、ＳＯＵＲＣＥ  Ｑ１６ｍＬとＳＯＵＲＣＥ  ＩＳＯ１６ｍＬを用いた２段階精製方法は実施例２と同様である。ＨＰＬＣ逆相分析の結果、純度９９％を示した（図１）。
【００７４】
＜実施例４：脱アミノ化エキセンディン−４（Ｌｙｓ）−免疫グロブリンＦｃ結合体の製造＞
脱アミン化エキセンディン−４（Ａｎｙｇｅｎ  Ｉｎｃ．，韓国）を用いて実施例１と同様の方法で３．４Ｋ  ＢｕｔｙｒＡＬＤ（２）ＰＥＧを脱アミン化エキセンディン−４のＬｙｓと反応させた後、別途の異性体（ｉｓｏｍｅｒ）分離過程なしでモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）のみを精製して免疫グロブリンＦｃとカップリングした。ペプチドと３．４Ｋ  ＢｕｔｙｒＡＬＤ（２）のモル比を１：３０、ペプチド濃度を３ｍｇ／ｍにして常温で３時間反応した。反応液は１００ｍＭ  Ｎａ−ホウ酸塩ｐＨ９．０であり、還元剤としての２０ｍＭ  ＳＣＢを添加した。ＳＯＵＲＣＥ  Ｑ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス）を用いてモノ−ＰＥＧ化ペプチド（Ｍｏｎｏ−Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）を精製した。
【００７５】
ペプチドと免疫グロブリンＦｃのモル比を１：１５、全体タンパク質の濃度を８０ｍｇ／ｍＬにして４℃で１５時間反応した。反応液は１００ｍＭ  Ｋ−Ｐ  ｐＨ６．０であり、還元剤としての２０ｍＭ  ＳＣＢを添加した。カップリング反応の後、ＳＯＵＲＣＥ  Ｑ１６ｍＬとＳＯＵＲＣＥ  ＩＳＯ１６ｍＬを用いた２段階精製方法は実施例２と同様である。ＨＰＬＣ逆相分析の結果、純度９６％を示した（図２）。
【００７６】
＜実施例５：脱アミノ化エキセンディン−４（Ｌｙｓ）−アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）結合体の製造＞
脱アミノ化エキセンディン−４とキャリアとして人間血液由來のアルブミン（緑十字，韓国）を用いて実施例４と同様方法で脱アミノ化エキセンディン−４（Ｌｙｓ）−アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）結合体を製造した。ＨＰＬＣ逆相分析の結果、純度９５％を示した。
【００７７】
＜実施例６：ジメチル化（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）エキセンディン−４（Ｌｙｓ）−  免疫グロブリンＦｃ結合体の製造＞
ジメチル化（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）エキセンディン−４（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｃ．，米国）を用いて実施例４と同様の方法でジメチル化エキセンディン−４（Ｌｙｓ）−免疫グロブリンＦｃ結合体を製造した。ＨＰＬＣ逆相分析の結果、純度９６％を示した。
【００７８】
＜実施例７：ＧＬＰ−１（Ｎ）−免疫グロブリンＦｃ結合体の製造＞
ＧＬＰ−１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｃ．，  米国）を用いて実施例２と同様の方法でＧＬＰ−１−（Ｎ）−免疫グロブリンＦｃ結合体を製造した。ＨＰＬＣ逆相分析の結果、純度９６％を示した。
【００７９】
＜実施例８：プロピオンＡＬＤリンカーＰＥＧを用いた結合体の製造＞
３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧを用いて実施例１と同一の方法で３．４Ｋ−エキセンディン−４を製造した。その後、実施例３と同一の方法で免疫グロブリンＦｃとカップリングした。
【００８０】
＜実施例９：持続型エキセンディン−４インビトロ活性の測定＞
エキセンディン−４持続型製剤の効力を測定する方法として、インビトロ細胞の活性を測定する方法を利用した。通常、ＧＬＰ−１のインビトロ活性の測定方法として用いられる、インスリノーマセルまたはランゲルハンス島を分離してＧＬＰ−１処理による細胞内のｃＡＭＰ増加有無を測定する試験で進行する。
【００８１】
本試験で使用されたインビトロ活性測定方法は、ＲＩＮ−ｍ５Ｆ（ＡＴＣＣ．）であり、この細胞はラットインスリノーマ細胞として知られており、ＧＬＰ−１受容体を持っていて、ＧＬＰ−１系統のインビトロ活性を測定する方法として用いられている。ＲＩＮ−ｍ５ＦにＧＬＰ−１、エキセンディン−４および試験物質を濃度別に処理して試験物質による細胞内の信号伝達物質ｃＡＭＰの発生程度を測定することによりＥＣ５０値を測定し、比較する試験で行った。
【００８２】
【表１】
2008169195.tif 000003
【００８３】
−ＤＭ  Ｅｘｅｎｄｉｎ−４：ジメチル化（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）エキセンディン−４
−ＤＡ  Ｅｘｅｎｄｉｎ−４：脱アミノ化エキセ
ンディン−４
−Ｅｘｅｎｄｉｎ−４（Ｎ）−ＰＥＧ−Ｆｃ：エキセンディン−４のＮ末端とＦｃ領域がＰＥＧで連結した結合体
−ＤＭ  Ｅｘｅｎｄｉｎ−４：ジメチル化（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）エキセンディン−４のＮ末端とＦｃ領域がＰＥＧで連結した結合体
−ＤＡ  Ｅｘｅｎｄｉｎ−４：脱アミノ化エキセンディン−４のリジン残基とＦｃ領域がＰＥＧで連結した結合体
−Ｎ．Ｄ．：未定（Ｎｏｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）
【００８４】
【表２】
2008169195.tif 000004
【００８５】
＜実施例１０：持續型エキセンディン−４のインビヴォ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）效力試験＞
エキセンディン−４の持續型製劑の效力を測定する方法でｄｂ／ｄｂマウスで飼料を制限しない状態で血中グルコース濃度減少效果を測定する方法を利用した（図４）。天然型エキセンディン−４結合体は１９２時間以後から血中グルコース濃度減少效果が消える一方に、ＤＡエックセンディン−４結合体は１回投与で２４０時間以上血中グルコース濃度減少效果が維持されることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明のインスリン分泌ペプチドは、ペプチドの生体内活性が比較的高く維持され、血中半減期が著しく増加して様々なペプチド薬物の持続型剤形の開発に有用に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】天然型エキセンディン−４（Ｌｙｓ）−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の純度を逆相カラムで分析した結果である。
【図２】脱アミノ化エキセンディン−４（Ｌｙｓ）−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の純度を逆相カラムで分析した結果である。
【図３】脱アミノ化エキセンディン−４（Ｌｙｓ）−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図４】脱アミノ化エキセンディン−４（Ｌｙｓ）−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を血中グルコース濃度減少效果を測定した結果である。
【図１】
2008169195.tif 000005
【図２】
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【図３】
2008169195.tif 000007
【図４】
2008169195.tif 000008
【外国語明細書】
2008169195000001.pdf