(57)【要約】【課題】酸度の高い濃醇タイプの清酒の製造法を提供すること、さらに、この製造法を実現させる新規な酵母菌株を提供すること。【解決手段】本発明は、コハク酸、乳酸、リンゴ酸の生産性が高く酢酸の生産量が低いサッカロミセス  セレビシエに属する新規な酵母菌株ＦＥＲＭ Ｐ−２０９８８、及び該酵母菌株を用いる清酒の製造法等を提供する。本発明の酵母菌株を用いれば、酸度の高い濃醇タイプの清酒を製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９８８で表される酵母菌株。
【請求項２】
請求項１の酵母菌株を用いることを特徴とするアルコール飲料又は発酵食品の製造方法。
【請求項３】
清酒の製造方法である、請求項２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な酵母菌株及び該酵母菌株を用いる濃醇タイプの清酒を製造する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、全国のほとんどの清酒製造場では（財）日本醸造協会から販売されている「きょうかい酵母」を使用している。長年にわたり酸の生産能が低い菌株を選抜しているといわれており、現在のきょうかい酵母を用いても酸度の高い濃醇タイプの清酒を製造することはできない。
【０００３】
酸度の高い清酒を製造するために多酸性酵母の開発が行われている。リンゴ酸を多く生産する酵母として、ジメチルコハク酸感受性変異株（相川元庸、水津哲義、市川英治、川戸章嗣、安部康久、今安聰：醗工，７０，４７３（１９９２）：非特許文献１）、又はシクロヘキシミド耐性株（吉田清、稲橋正明、中村欽一、野白喜久雄：醸協、８８，６４５（１９９３）：非特許文献２）を用いる方法などが行われている。また、変異処理した清酒酵母から、リンゴ酸脱水素酵素低生産性であって炭素源を唯一乳酸とした場合に生育しない清酒酵母株が分離されており、これを用いてリンゴ酸及び乳酸の多い清酒を製造する方法も提案されている（特許第３０１０５４９号公報：特許文献１）。
【０００４】
これらの場合、変異処理を行い目的の特性を有する株を分離する方法がとられているが、変異処理を行なうと、一般に清酒もろみ中でのアルコール生成能やアルコール耐性という特性が失われることが知られている。
【０００５】
ＨＡＰ４遺伝子を組換え技術により形質転換することでリンゴ酸及びコハク酸を高生産する酵母も開発されている（特開２００４−１１３００４号公報：特許文献２）。しかし、組換え技術により得られた酵母で製造した清酒が日本の消費者には受け入れられないため、この酵母の実用化は極めて困難といえる。
【特許文献１】特許第３０１０５４９号公報
【特許文献２】特開２００４−１１３００４号公報
【非特許文献１】相川元庸、水津哲義、市川英治、川戸章嗣、安部康久、今安聰：醗工，７０，４７３（１９９２）
【非特許文献２】吉田清、稲橋正明、中村欽一、野白喜久雄：醸協、８８，６４５（１９９３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の課題は酸度の高い濃醇タイプの清酒の製造方法を提供すること、さらに、その製造方法を実現させる新規な酵母菌株を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、検討を重ねた結果、これまでのように変異処理することなく清酒もろみ中で自然突然変異した株を分離することにより、清酒製造に従来から多用されていた酵母（例えば、協会９号酵母）よりもリンゴ酸、コハク酸及び乳酸を多く生成し、且つ酢酸の生成能の低い酵母菌株を見いだし、そして、この酵母菌株を用いて清酒を製造した場合、前述の課題を解決できることを発見した。
【０００８】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９８８で表される酵母菌株。
［２］［１］の酵母菌株を用いることを特徴とするアルコール飲料又は発酵食品の製造方法。
［３］清酒の製造方法である、［２］の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の酵母菌株は、コハク酸、乳酸、リンゴ酸の生産性が高く酢酸の生産量が低いという特性を有するので、これを使用すれば、酸度の高い濃醇タイプの清酒を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９８８で表される酵母菌株（以下、１５ＢＹ１４−６株と呼ぶ場合がある）を提供する。受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９８８で表される酵母菌株は、茨城県つくば市東１−１−１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所に寄託されている（受領日：平成１８年８月１１日）。
【００１１】
本発明は、清酒もろみ中に含まれるサッカロマイセス  セレビシエに属する酵母の自然突然変異した株を培地中で生育させ、この培養によりリンゴ酸高生産株を選別し、さらに、リンゴ酸、コハク酸、及び乳酸を多量に生産し、且つ酢酸の生産量が少ない菌株を取得したことに基づくものである。
【００１２】
本発明の酵母菌株は、サッカロマイセス  セレビシエに属し、通常の培養条件下では、以下の様な表現形質を有している：
（１）形態は５〜６μｍの円形又は卵円形である。
（２）出芽により増殖する。
（３）ＴＴＣ染色により赤色に染まる。
【００１３】
本発明の酵母菌株は、ＴＴＣ染色により赤色に染まることから、野生酵母ではなく清酒酵母であると考えられる。
【００１４】
本発明の酵母菌株は、リンゴ酸、コハク酸及び乳酸を多量に生産する。その産生量は、従来の清酒製造に多用される協会９号株と比較して、それぞれ、約２．５倍、約１．２倍、約１．２倍である（該酵母菌を用いて製造された清酒中の濃度として比較）。その一方で、本発明の酵母菌株は酢酸の産生量が低く、その産生量は協会９号株と比較して、約０．１倍である（該酵母菌を用いて製造された清酒中の濃度として比較）（下記表４参照）。その結果、本発明の酵母菌株を用いれば、協会９号株等よりも酸度の高い濃醇タイプの清酒等のアルコール飲料や発酵食品を製造することができる。
【００１５】
本発明の酵母菌株は、発酵力に優れており、日本酒度のきれ、及びグルコース消費量が、協会９号株よりも高い。また、清酒の製造工程における炭酸ガス減量の経過、得られる清酒中のエタノール濃度、及び香気成分含有量は、本発明の酵母菌株は協会９号株とほぼ同等である（下記実施例２参照）。
【００１６】
また、本発明の酵母菌株では、協会９号株と比較して、下記表２に示すような遺伝子の発現量が変化している。
【００１７】
本発明の酵母菌株は、通常の酵母の培養に用いられる自体公知の方法により培養することができる。例えば、本発明の酵母菌株は、ＹＭ−１０培地や麹エキス培地中、好気性条件下で約２０〜３０℃にて培養することができる。
【００１８】
本発明の酵母菌株は、優れた発酵力を有しており、リンゴ酸、コハク酸及び乳酸を多量に生産し、酢酸の産生量が低いという特性を有しているので、本発明の酵母菌株を用いれば、酸度の高い濃醇タイプのアルコール飲料（清酒、焼酎、ビール、ワイン、ウイスキー等）又は発酵食品（パン等）を製造することができる。特に、本発明の酵母菌株は、清酒の製造に有用であり、本発明の酵母菌株を用いれば、酸度の高い、濃醇タイプの清酒を製造することができる。
【００１９】
本発明の酵母菌株を用いたアルコール飲料及び発酵食品の製造は、一般的な製造方法に従って行うことができる。通常、該方法は、本発明の酵母菌株によるアルコール発酵工程を含む。例えば、清酒は通常、蒸米、米麹、および水を主な原料とし、麹を製造する工程である製麹工程により製造された麹の作用によって蒸米を糖化させて米糖化液を得（糖化工程）、米糖化液に酵母を作用させアルコール発酵させてもろみを得（発酵工程）、もろみを濾す等して固液分離（固液分離工程）することによって製造されるが、この発酵工程において本発明の酵母菌株が使用され得る。
【００２０】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００２１】
（実施例１：１５ＢＹ１４−６株の取得）
福岡県内酒蔵の清酒もろみから採取したサンプルを滅菌水により適宜希釈した後、ＹＭプレートに塗布し、３０℃で３日間培養を行った。生育した２１３株を分離した。取得した２１３株をそれぞれ３０ｍｌのＹＭ−１０培地に一白金耳接種し、２０℃で３日間静置培養後、遠心分離した上清を有機酸分析に供した。対照の協会７号株（Ｋ−７）のリンゴ酸、コハク酸、乳酸生産量（それぞれ99μg/ml、394μg/ml及び75μg/ml）より高いリンゴ酸、コハク酸、乳酸生産性のいずれかを示した菌株として、７株が得られた。また対照の協会９号株（Ｋ−９）のリンゴ酸、コハク酸、乳酸生産量（それぞれ152μg/ml、391μg/ml及び56μg/ml）より高いリンゴ酸、コハク酸、乳酸生産性のいずれかを示した菌株として、１４株が得られた。一次スクリーニングで取得した合計２１株を麹エキス培地（ボーメ７）３０ｍｌに一白金耳接種し、２０℃で１０日間培養後、遠心分離した上清を有機酸分析に供した。結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
表１において、リンゴ酸、コハク酸、乳酸の単位は（μｇ／ｍｌ）である。
表１に示すとおり、数株のリンゴ酸、コハク酸、乳酸生成量が、Ｋ−７及びＫ−９に比べ、増加していた。そのうち特に１５ＢＹ１４−６のリンゴ酸、コハク酸、乳酸生成量が、Ｋ−７及びＫ−９に比べ、バランスよく増加していた。香気成分の生成に関しては、１５ＢＹ１４−６はＫ−７及びＫ−９と遜色なかった。したがって、リンゴ酸、コハク酸、乳酸を多量に生成する自然突然変異した株、１５ＢＹ１４−６株を新規な清酒製造用菌株として選択した。
【００２４】
１５ＢＹ１４−６株の形態は５〜６μｍの円形または卵円形であり、出芽により増殖した。ＴＴＣ染色性を調べたところ、赤色に染まったことから、野生酵母ではなく清酒酵母であると判断した。また、１５ＢＹ１４−６株はＫ−９株を使用した清酒もろみから分離されていることから、Ｋ−９株由来の可能性が極めて高いと考えられた。
【００２５】
１５ＢＹ１４−６株の特性を調べるために、Ｋ−９株を対照としたDNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析を行った。酵母菌株をYM-10培地(0.3% yeast extract,0.3% malt extract,0.5% Polypeptone,10% glucose) 30mlに一白金耳接種し、30℃で3日間静置して前培養を行った。次に、酵母密度が1×105cells/mlになるように100mlのYM-10培地に植菌を行い、30℃で静置培養を行った。30時間経過後サンプリングを行い、素早く4℃で遠心分離した。Total RNA はhot phenol 法で調製した。total RNAから標識cDNAを調製した。Ｋ−９株の方は Cy5で標識を行い、１５ＢＹ１４−６株の方は Cy3で標識を行った。2つの標識labeled cDNA を混合した後、DNA マイクロアレイとハイブリダイズを行った。DNA マイクロアレイを洗浄後、フルオロイメージアナライザ（FLA-8000 富士フィルム）で画像をスキャンし、画像解析ソフトArray vison(Amersham)で蛍光強度を定量化した。独立した実験を2回行った。
【００２６】
DNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析の結果、表２に示すような発現量の変化した遺伝子が抽出された。１５ＢＹ１４−６株はＫ−９に比べて表２に示すような遺伝子の発現量が変化した新規な菌株であることが確認された。尚、表中、「発現量増加」とはＫ−９株と比較して発現量が２倍以上であることを、「発現量減少」とはＫ−９株と比較して発現量が０．５倍以下であることをそれぞれ示す。この１５ＢＹ１４−６株は、ＦＥＲＭ Ｐ−２０９８８として産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
（実施例２：１５ＢＹ１４−６株を用いた清酒の製造）
前記変異株（１５ＢＹ１４−６）及び対照株協会９号（Ｋ−９）を用いて、表３に示す仕込配合で清酒の小仕込試験を行った。なお、上記協会９号酵母は、吟醸酒の製造に広く利用されかつ親株であると考えられるため、これを対照株として用いた。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
この清酒製造では、麹米には徳島精工株式会社製乾燥麹（精米歩合６０％）を使用し、掛米には徳島精工株式会社製α化米（精米歩合６０％）を用いた。発酵温度は１３℃で行った。留添後、２１日目に上槽した。小仕込試験における炭酸ガス減量の経過はＫ−７又はＫ−９に比較して差は認められなかった。このことから、今回新たに取得した株は十分実用性のある酵母であると判断した。製成酒の成分は、表４に示すとおりであった。生成したエタノール濃度に関して、取得した株はＫ−９と同等であった。日本酒度のきれ及びグルコースの消費量は取得した株の方がよく、発酵力に優れることが示された。取得した株はＫ−９よりコハク酸を１．２倍、乳酸を１．２倍、リンゴ酸を２．５倍多く生産し、好ましい酸ではない酢酸を０．１倍しか生産しなかった。酸度としては取得した株の方がＫ−９より高かった。香気成分の生産能力はほぼ同等であった。
【００３１】
【表４】
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【００３２】
１５ＢＹ１４−６株を用いて製造された清酒は、Ｋ−９株の清酒に比べてコハク酸含量が１．２倍、乳酸含量が１．２倍、リンゴ酸含量が２．５倍及び酢酸含量が０．１倍であった。ビーカーレベルでの製造試験で得られた清酒（純米酒）を１５℃で８ヶ月間貯蔵し、専門パネラー５名により官能評価を行った。評価は、良い方を１とし悪い方を５とする５段階で行った。その結果１５ＢＹ１４−６株の清酒の評価は平均２．２、Ｋ−９株の清酒の評価は２．５であり、１５ＢＹ１４−６株の方がやや濃醇で評価が優れていた。さらに、燗をつけての評価でも優れていた。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の酵母菌株は、コハク酸、乳酸、リンゴ酸の生産性が高く酢酸の生産量が低いという特性を有するので、該菌株を使用すれば、酸度の高い濃醇タイプの清酒を製造することができる。