(57)【要約】【課題】  いびき等の症状を再現した睡眠時呼吸障害モデル動物を提供し、更には、その動物を利用して睡眠時呼吸障害に対して有効な被検物質を評価する方法等を提供すること。【解決手段】  ハムスターに、催眠または麻酔処置および鼻閉処置を施すことにより得られる睡眠時呼吸障害モデル動物およびこれに被検物質を投与し、その後前記モデル動物が発生する音を指標として評価することを特徴とする睡眠時呼吸障害に対する被検物質の評価方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハムスターに、催眠または麻酔処置および鼻閉処置を施すことにより得られる睡眠時呼吸障害モデル動物。
【請求項２】
加齢したハムスターを用いることを特徴とする請求項１記載の睡眠時呼吸障害モデル動物。
【請求項３】
肥満状態のハムスターを用いることを特徴とする請求項１または２記載の睡眠時呼吸障害モデル動物。
【請求項４】
睡眠時呼吸障害がいびきである請求項１ないし３のいずれかに記載の睡眠時呼吸障害モデル動物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の睡眠時呼吸障害モデル動物が発生する音を指標とする睡眠時呼吸障害の評価方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の睡眠時呼吸障害モデル動物に対して被検物質を投与し、その後前記モデル動物が発生する音を指標として評価することを特徴とする睡眠時呼吸障害に対する被検物質の評価方法。
【請求項７】
事前に被検物質を投与したハムスターに対し、催眠または麻酔処置および鼻閉処置を施し、その後前記ハムスターが発生する音を指標として評価することを特徴とする睡眠時呼吸障害に対する被検物質の評価方法。
【請求項８】
加齢したハムスターを用いることを特徴とする請求項７記載の睡眠時呼吸障害に対する被検物質の評価方法。
【請求項９】
肥満状態のハムスターを用いることを特徴とする請求項７または８記載の睡眠時呼吸障害に対する被検物質の評価方法。
【請求項１０】
ハムスターに対し、催眠または麻酔処置および鼻閉処置を施すことを特徴とする睡眠時呼吸障害モデル動物の作製方法。
【請求項１１】
加齢したハムスターを用いることを特徴とする請求項１０記載の睡眠時呼吸障害モデル動物の作製方法。
【請求項１２】
肥満状態のハムスターを用いることを特徴とする請求項１０または１１記載の睡眠時呼吸障害モデル動物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの睡眠時呼吸障害のモデル動物およびこのモデル動物を利用する睡眠時呼吸障害を抑制または改善する被検物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
いびきや睡眠時無呼吸症候群等の睡眠時呼吸障害は睡眠障害の１種である。睡眠中に発生した異常な呼吸音がいびきであり、１０秒以上の呼吸の停止が無呼吸と定義される。睡眠１時間あたりの無呼吸回数が５回以上または総睡眠時間中の無呼吸回数が３０回以上の時に睡眠時無呼吸症候群と診断される。睡眠時呼吸障害には他に、中枢性肺胞低換気症候群や上気道抵抗症候群等がある。また、睡眠時無呼吸症候群は閉塞型、中枢型およびそれらの両方の性質を有する混合型に分類されうる。いびきは睡眠時無呼吸症候群の主症状であるとともに、無呼吸まで悪化していなくとも、睡眠時無呼吸症候群の前段階であるという見方が一般的である。
【０００３】
いびきは、その音によって一緒に寝る家族の不眠を招き、家族関係の悪化の原因となることや、本人のコンプレックスとなって外泊の遠慮、女性では結婚の不安になることも多い。そのため、いびきはクオリティー・オブ・ライフ（ＱＯＬ）を低下させる要因となる。更に、頻繁ないびきの発生は睡眠の質を低下させ、日中の眠気や疲労回復の遅延を招く。そして睡眠時無呼吸症候群では、更に、体への様々な悪影響も報告されている。即ち、睡眠中に呼吸が抑制される睡眠時呼吸障害によって、睡眠の障害、低酸素血症、高炭酸ガス血症や呼吸性アシドーシスが引き起こされる。これが毎夜に反復、重症化されることによって、睡眠障害による疲労回復の低下や日中の眠気、低酸素血症等による高血圧症、肺高血圧症、右心不全、肺胞低換気等の呼吸循環系の障害を招く。そのほか知的能力（記憶）の障害、性格変化、抑うつ、行動異常を伴うことも報告されている。
【０００４】
以上のような状況から、睡眠時呼吸障害を治療する方法として、有効な薬物の開発が望まれている。睡眠時無呼吸症候群への適応を有する唯一の薬物としてアセタゾラミドがある。このものは過去に臨床で使用され、軽度の障害に対して有効であったことが報告（非特許文献１）されている。しかし、アセタゾラミドは副作用が多い上に効果が不十分なため、現実にはあまり用いられていない。
【０００５】
また、いびきへの適応を有する一般用医薬品として点鼻剤が開発されている。これは鼻腔中にグリセリンを噴霧して鼻詰まりを軽減することで、呼吸流量を増加させて、呼吸の抑制が軽減すると考えられている。しかし、この点鼻剤は、鼻詰まりによりいびきをかく患者のいびき音の大きさを軽減するのみのものである。このため、発症原因の多くを占める咽喉（舌根部）に主な原因があるいびきに対して、点鼻剤は有効ではないとされている。また、点鼻剤は対症療法であることや、作用時間が短いこと等他にも課題が多い。
【０００６】
このように、睡眠時呼吸障害に対して有効かつ安全で一般的に使用されうる薬物は現在のところ開発されていないが、その主な原因として、睡眠時呼吸障害、特にいびきを評価する有用な非臨床の試験方法が確立されていないことが挙げられる。
【０００７】
睡眠時呼吸障害を評価するために、これまでいくつかの非臨床の試験方法が考案されてきた。その一つとして、正常なラットに自発的に発生する無呼吸を測定する方法が知られている。しかし、この方法は睡眠時呼吸障害の主症状であるいびきの音を評価していないという問題点が挙げられる。また、睡眠時呼吸障害は主に仰臥位の時に発生するが、ラットは伏臥位で睡眠することが多く、この方法で測定している無呼吸がヒトの無呼吸を再現したものであるか不明である。更に、この評価方法で無呼吸に有効であった薬物が、臨床で有効ではなかったことが知られている。また更に、オトガイ舌筋の筋電位を測定する方法や、病態の解明方法として、飼育器内の酸素濃度および／または二酸化炭素濃度を調節することによって実験動物の睡眠障害を作り出す睡眠障害実験システムが報告（特許文献１参照）されているが、いびきの症状を再現したモデルは今までに報告されていなかった。
【特許文献１】特開２００６−１４７２９
【非特許文献１】「神経精神薬理」、９、ｐ４９３−５１３、１９８７年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の課題は、いびきを再現可能な睡眠時呼吸障害モデル動物を提供し、更には、その動物を利用して、睡眠時呼吸障害に対して有効な被検物質を評価する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、特定の動物に催眠または麻酔処置および鼻閉処置を行うことにより、いびきを再現した睡眠時呼吸障害モデル動物となることを見出した。また、このモデル動物を利用することにより、睡眠時呼吸障害の評価や睡眠時呼吸障害に対して有効な被検物質を評価できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明はハムスターに、催眠または麻酔処置および鼻閉処置を施すことにより得られる睡眠時呼吸障害モデル動物である。
【００１１】
また、本発明は上記睡眠時呼吸障害モデル動物が発生する音を指標とする睡眠時呼吸障害の評価方法である。
【００１２】
更に、本発明は睡眠時呼吸障害モデル動物に対して被検物質を投与し、その後前記モデル動物が発生する音を指標として評価することを特徴とする睡眠時呼吸障害に対する被検物質の評価方法である。
【００１３】
また更に、本発明は事前に被検物質を投与したハムスターに対し、催眠または麻酔処置および鼻閉処置を施し、その後前記ハムスターが発生する音を指標として評価することを特徴とする睡眠時呼吸障害に対する被検物質の評価方法である。
【００１４】
更にまた、本発明はハムスターに対し、催眠または麻酔処置および鼻閉処置を施すことを特徴とする睡眠時呼吸障害モデル動物の作製方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の睡眠時呼吸障害モデル動物は、ヒトのいびき等の睡眠時呼吸障害を再現することのできるものである。
【００１６】
従って、この睡眠時呼吸障害モデル動物を利用すれば、睡眠時呼吸障害の評価や睡眠時呼吸障害に対して有効な被検物質を評価することができる。  
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の睡眠時呼吸障害モデル動物（以下、単に「モデル動物」という）は、ハムスターに、催眠または麻酔処置および鼻閉処置を施したものである。なお、前記処置を施さないハムスターは殆ど睡眠時呼吸障害を起こすことはない。また、実験動物として汎用されるマウス等の動物に前記処置を施した場合には生存することすら困難である。
【００１８】
上記ハムスターに施す催眠または麻酔処置としては、アルコール等による催眠または通常の麻酔に用いられるガス剤、経口剤、注射剤等を用いて行う麻酔処置を利用することができる。好ましくは、睡眠時呼吸障害の評価等がモデル動物の発生する音を測定することから経口剤または注射剤を用いる。特に睡眠時呼吸障害の測定を行うのに十分な睡眠時間が得られ、心血管系と呼吸器系への抑制作用が弱いことから、ウレタンを主とする注射剤の麻酔剤を用いるのが好ましい。また、モデル動物への麻酔は一定の麻酔深度とすることが好ましく、また、安定した呼吸あるいは酸素摂取が可能な状態が好ましい。具体的には１分あたりの呼吸数が５０−８０回となるようにすればよい。
【００１９】
また、上記ハムスターに施す鼻閉処置とは、口呼吸を誘導するために鼻または鼻腔を閉塞する事であり、例えば、鼻腔をアロンアルファ（商品名：東亞合成株式会社製）等の瞬間接着剤等で接着する、鼻腔内に炎症性物質を塗布または鼻腔内にアレルギー反応を引き起こして鼻腔に炎症を発生させる等の方法を利用できる。この鼻閉処置は両方の鼻の鼻腔に対して行うことが好ましい。これら麻酔処置と鼻閉処置の順番については特に限定されない。
【００２０】
本発明のモデル動物は、上記した催眠または麻酔処置および鼻閉処置を行うだけでも睡眠時呼吸障害を発生するが、より睡眠時呼吸障害を発生しやすくなることから、前記処置前のハムスターとして加齢および／または肥満したハムスターを用いることが好ましい。ここで、加齢したハムスターとは、ハムスターの繁殖行動（交尾）が可能な性成熟週齢が１０〜１４週齢であるので、それよりも加齢した状態、すなわち１６週齢以上、好ましくは１８〜２４週齢程度のハムスターをいう。また、肥満したハムスターとは、先天性の要因または過栄養摂取によって、正常なハムスターを長期飼育用飼料で飼育した場合の体重と比べて２割以上、好ましくは２.５〜３割程度体重が重いハムスターをいう。本発明のモデル動物には特に加齢および肥満したハムスター（以下、「加齢・肥満ハムスター」という）を用いるのが好ましい。
【００２１】
本発明のモデル動物を製造するための好ましい態様は次の通りである。すなわち、まず、１２週齢程度のハムスターに例えば、クイックファット（Ｑｕｉｃｋ
Ｆａｔ：日本クレア株式会社製）等の高脂肪食を４〜６週間与えて１６〜１８週齢程度の加齢・肥満ハムスターとする。次に、この加齢・肥満ハムスターに、一定の麻酔深度となるような量でウレタンを腹腔内投与して麻酔処置をする。麻酔処置された加齢・肥満ハムスターは、次に瞬間接着剤等により両鼻腔を接着して鼻閉処置をする。これらの処置を行うことにより本発明のモデル動物が得られる。
【００２２】
このようにして得られる本発明のモデル動物は、催眠または麻酔処置により、その後（睡眠時）にいびきを引き起こす。この本発明のモデル動物は、特にいびきモデル動物として用いることが好ましい。
【００２３】
本発明のモデル動物は、催眠または麻酔処置および鼻閉処置後（睡眠時）にモデル動物が発生する音を指標とすることにより睡眠時呼吸障害を評価することができる。具体的に睡眠時呼吸障害の評価は、単位時間あたりに、一定の音量を超えた回数を指標にして行われる。
【００２４】
また、本発明のモデル動物に対して被検物質を投与し、睡眠時にモデル動物が発生する音を指標とすることにより、睡眠時呼吸障害に対する被検物質の評価をすることができる。本発明のモデル動物で睡眠時呼吸障害に対する評価をする被検物質とは、食品素材、化合物、生薬、漢方製剤、医薬品等である。具体的に本発明のモデル動物を用いた睡眠時呼吸障害に対する被検物質の評価は、モデル動物に被検物質を脳内（中枢）または末梢で投与後、モデル動物（薬物投与群）が発生する音を薬物非投与群と比較して評価する方法が挙げられる。具体的な評価方法としては、薬物投与群が睡眠中の一定時間に発生する音で一定の音量（例えば、バックグラウンドに対して５ｄＢ程度）を超える音が何回計測されるかを測定し、その回数が薬物非投与群と比較して有意に低減している場合には、被検物質に効果があると判断する方法が挙げられる。また、モデル動物が発生する音の測定はデジタルサウンドメーター等で測定することができる。
【００２５】
更に、本発明のモデル動物は、催眠または麻酔処理および鼻閉処置を行う前に被検物質を経口投与、腹腔内投与または経皮投与で投与しても、その後上記と同様にモデル動物が発生する音を測定し、それを指標とすることにより、睡眠時呼吸障害に対する被検物質の評価をすることができる。
【００２６】
なお、上記した本発明のモデル動物を用いた睡眠時呼吸障害の評価方法等には、モデル動物の発生する音を指標としているが、これに限定されず、常法により脳波、血流、血圧等の測定により評価する方法も可能である。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２８】
実  施  例  １
睡眠時呼吸障害モデル動物の作製：
ＳＰＦハムスター（Slc:Syrian、雄性：日本エスエルシー株式会社より購入）を、１２週齢まで通常飼料（ＭＦ：オリエンタル酵母工業株式会社製）で飼育した。加齢群には１２週齢から長期飼育用飼料（ＣＥ−７：日本クレア株式会社製）を４週間〜６週間与えた。一方、加齢・肥満群には１２週齢から高脂肪食（Ｑｕｉｃｋ
Ｆａｔ：日本クレア株式会社製）を４週間〜６週間与えた。なお、ハムスターは何れの群も全飼育期間を通して以下の飼育環境で飼育した。
【００２９】
＜飼育環境＞
ケージの種類：床敷エコンケージ
温度：２３±３℃
湿度：５０±２０％
照明時間：１２時間
飲料水：殺菌水（自由摂取）
【００３０】
上記で作製された加齢群および加齢・肥満群のハムスターに、次のようにして麻酔処置を行った。まず、ハムスターに０.８ｇ／ｋｇのウレタンを腹腔内投与し、その５分後に０.８ｇ／ｋｇのウレタンを再度投与して（総量１.６ｇ／ｋｇ）３０分静置した。静置後、呼吸数を測定し、各群のハムスターの麻酔深度を一定にするために１分あたりの呼吸数が５０−８０回のハムスターを選抜した。ハムスターの１分あたりの呼吸数が８０回以上の時は軽度の麻酔と判断してウレタンを追加投与し（総量２.１ｇ／ｋｇ以下）、１分あたりの呼吸数が５０−８０回となるようにした。前記のようにして基準内の呼吸数（麻酔深度）に達したハムスターについて５分間の呼吸音および胸郭運動を測定した（鼻閉前測定）。鼻閉前測定の後、瞬間接着剤（アロンアルファＧＥＬ−１０：東亞合成株式会社製）を用いて鼻腔を接着し、鼻閉処置を行い、睡眠時呼吸障害モデル動物を得た。
【００３１】
上記で得られた睡眠時呼吸障害モデル動物について、鼻閉処置後１時間あたりの呼吸音発生回数の測定を鼻閉処置後６時間まで行った。呼吸音発生回数の測定は、呼吸音をデジタルサウンドメーター（株式会社カスタム製）を用いて以下の条件で測定し、これをＡ／ＤコンバータＭＰ１００システム（株式会社モンテシステム製）を用いてデジタル変換したデータを２回微分して加速度を求め、一定の加速度を超える回数（５ｄＢを超えるために必要な加速度）を算出した。肥満による遅発性の呼吸音の増加を表１に示した。各群ｎ＝１１で試験し、表中の数字は平均値±標準誤差で示した。
【００３２】
＜測定条件＞
測定範囲：Ｃ特性
動特性：ＦＡＳＴ（１２５ｍＳ）
測定レンジ：ＡＵＴＯ（３０−１３０ｄＢ）
【００３３】
【表１】
2008054672.tif 000002
【００３４】
加齢群においては鼻閉処置直後から２時間程度の呼吸音の発生が認められた。この呼吸音は、鼻閉により口呼吸となったため、気道部の分泌物が破裂し、発生したものであった。この分泌物の破裂による呼吸音の発生回数は時間が経ち、気道部が乾燥するにつれて減少した。一方、加齢・肥満群では加齢群と同様に鼻閉処置直後から２時間程度の呼吸音の発生が認められ、その後発生回数の減少が一時的に認められたが、鼻閉後３時間から呼吸音の発生回数の増加が遅発的に認められ、この増加は６時間後まで持続した（Ｐ＜０.０５、対加齢群（Ｆ（１,６０）＝６.１７）、二元配置分散分析）。この遅発性の呼吸音は、気道部が乾燥した後に認められたこと、分泌物の破裂による呼吸音とは異なる音であること、加齢群では発生回数が少なかったことから、肥満によって発生した音であると考えられた。
【００３５】
これらの結果と、ヒトにおいて肥満がいびきのリスクファクターの一つであることから、この遅発性の呼吸音はヒトのいびき音を再現していると考えられた。
これらのことから、加齢群と加齢・肥満群とでは加齢・肥満群の方がいびき（睡眠時呼吸障害）モデルとして好ましいことが判った。
【００３６】
試  験  例  １
睡眠時呼吸障害の改善試験：
ＳＰＦハムスター（Slc:Syrian、雄性：日本エスエルシー株式会社より購入）を、１２週齢まで通常飼料（ＭＦ：オリエンタル酵母工業株式会社製）で飼育した。１２週齢からは高脂肪食（Ｑｕｉｃｋ
Ｆａｔ：日本クレア株式会社製）を４週間〜６週間与えた。高脂肪食を与えている期間内であって、麻酔処置および鼻閉処置を行う１３〜２０日前から、臨床においていびき患者の８０％以上に抑制効果が認められている大柴胡湯（「漢方診療」、１８、ｐ１８−２１、１９９９年）を、３７５ｍｇ／ｋｇおよび１２５０ｍｇ／ｋｇで１日１回マウス用経口ゾンデを用いて強制胃内投与した。なお、ハムスターは何れの群も全飼育期間を通して実施例１と同様の飼育環境で飼育した。
【００３７】
上記条件で飼育後、大柴胡湯３７５ｍｇ／ｋｇおよび１２５０ｍｇ／ｋｇ投与群について実施例１と同様に麻酔処置および鼻閉処置を行った。その後、鼻閉処置後１時間あたりの呼吸音発生回数の測定を鼻閉処置後６時間まで実施例１と同様に行った。いびき（睡眠時呼吸障害）モデルに対する大柴胡湯の効果を表２に示した。各群ｎ＝１１で、表中の数字は平均値±標準誤差で示した。
【００３８】
【表２】
2008054672.tif 000003
【００３９】
大柴胡湯を用いて遅発性の呼吸音に対する効果を評価した結果、大柴胡湯３７５ｍｇ／ｋｇ投与群では鼻閉処置の３〜６時間後における呼吸音の発生回数が加齢・肥満群に比較して減少する傾向が見られた。一方、大柴胡湯１２５０ｍｇ／ｋｇ投与群では遅発性の呼吸音の発生回数が有意に減少した。
【００４０】
このように、麻酔処置および鼻閉処置前の大柴胡湯の連続投与によって、いびき（睡眠時呼吸障害）モデル動物のいびき音の発生回数が減少した（Ｐ＜０.０５、対加齢・肥満群（Ｆ（１,６０）＝５.８７）、二元配置分散分析）。この結果により、いびき（睡眠時呼吸障害）モデル動物を用いればヒトのいびきに有効な被検物質を評価することができることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の睡眠時呼吸障害モデル動物はヒトのいびき等の睡眠時呼吸障害を再現することができるので、これを利用すれば睡眠時呼吸障害の評価や睡眠時呼吸障害に対して有効な被検物質を評価することができる。
以    上