(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸の単離及び検出に関する方法および装置を提供する。【解決手段】ａ）複数の多孔膜を含むろ過装置を試料と、試料が第一多孔膜から始まって次に少なくとも第二多孔膜へと続く複数の多孔膜に順次接触するように、接触させること、ｂ）試料を、第二多孔膜の名目上の孔径よりも小さい名目上の孔径を有する第一多孔膜上で、溶解すること、ｃ）ろ過装置に外力を加え、これによって核酸を複数の多孔膜の少なくとも１つの膜上で単離することを含む、試料から核酸を単離する方法、およびそのためのろ過装置。第三多孔膜は捕獲プローブを有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）複数の多孔膜を含むろ過装置を試料と、試料が第一多孔膜から始まって次に少なくとも第二多孔膜へと続く複数の多孔膜に順次接触するように、接触させること、ｂ）試料を、第二多孔膜の名目上の孔径よりも小さい名目上の孔径を有する第一多孔膜上で、溶解すること、ｃ）ろ過装置に外力を加え、これによって核酸を複数の多孔膜の少なくとも１つの膜上で単離することを含む、試料から核酸を単離する方法。
【請求項２】
ろ過装置を１以上の緩衝液又は洗浄試薬と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ろ過装置を溶出緩衝液と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
試料を第三多孔膜と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第三多孔膜が捕獲プローブを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第一多孔膜がポリマーからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ポリマーが、多糖及びポリエーテルスルホンから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第二多孔膜がシリカからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
シリカがガラス繊維である、請求項９に記載の方法。
【請求項１０】
試料が細胞からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
試料がウイルス粒子からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
試料がマイコプラズマからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ろ過装置に適用される試料が多糖を含む第一多孔膜から次にシリカを含む少なくとも第二多孔膜へと接触するように、順次配置された複数の多孔膜を含む、試料から核酸を単離するのに適したろ過装置。
【請求項１４】
多糖がセルロースである、請求項１３に記載のろ過装置。
【請求項１５】
セルロースが混合セルロースエステルである、請求項１４に記載のろ過装置。
【請求項１６】
シリカがガラス繊維である、請求項１３に記載のろ過装置。
【請求項１７】
捕獲プローブからなる第三多孔膜をさらに含む、請求項１３に記載のろ過装置。
【請求項１８】
第一多孔膜が第二多孔膜の名目上の孔径よりも小さい名目上の孔径を有する、請求項１３に記載のろ過装置。
【請求項１９】
ろ過装置に適用された試料がスルホン基からなるポリマーを含む第一多孔膜から次にシリカを含む少なくとも第二多孔膜へと接触するように、順次配置された複数の多孔膜を含む、試料から核酸を単離するのに適したろ過装置。
【請求項２０】
ポリマーがポリエーテルスルホンである、請求項１９に記載のろ過装置。
【請求項２１】
シリカがガラス繊維である、請求項１９に記載のろ過装置。
【請求項２２】
捕獲プローブからなる第三多孔膜をさらに含む、請求項１９に記載のろ過装置。
【請求項２３】
第一多孔膜が第二多孔膜の名目上の孔径よりも小さい名目上の孔径を有する、請求項１９に記載のろ過装置。
【請求項２４】
核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全般に分子生物学の分野に関する。ある特定実施形態では、本発明は、核酸の単離及び検出に関する装置、キット及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を単離することは、典型的には、転写／増幅反応及びｃＤＮＡライブラリーの構築を含む、ＰＣＲ、遺伝子クローニング、配列決定、サザン分析、ノーザン分析、ヌクレアーゼ保護アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡマッピング、インビトロ翻訳、インビトロ転写を含む大部分の分子生物学的探求の最初の工程である。従って、分析に適した高品質の無傷核酸を得ることは、しばしばその後の分析のための有用で望ましい出発点である。試料から核酸を単離するための様々な手法が記述されているが（例えば米国特許第５，０７５，４３０号；同第５，２３４，８０９号；同第５，１５５，０１８号；同第６，２７４，３０８号；同第６，２７７，６４８号；同第６，９５８，３９２号；同第６，９５３，６８６号；同第６，３１０，１９９号；同第６，９９２，１８２号；同第６，４７５，３８８号；同第５，０７５，４３０号；米国特許公開第２００６００２４７０１号；欧州特許第ＥＰ０７６５３３５号；Ｂｏｏｍら、１９９０、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２８：４９５）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これにもかかわらず、迅速で、経済的であり、高い収率を生じさせる、試料から核酸を単離する方法を提供することは有益である。また、この方法が試料の必要な操作を最小限に抑え、主として液体取り扱い工程の使用を許容し、単一装置、例えばろ過装置を用いて実施される場合は有用である。ここで述べる本発明のある実施形態はこのような方法を提供する。ここで述べる本発明の他の実施形態は、試料から核酸を単離するために使用し得る装置及びキットを提供する。本発明のさらなる他の実施形態は、試料中の核酸の検出を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ある実施形態では、本発明は、ａ）複数の多孔膜を含むろ過装置を試料と、試料が第一多孔膜から始まって次に少なくとも第二多孔膜へと続く複数の多孔膜に順次接触するように、接触させること、ｂ）試料を、第二多孔膜の名目上の孔径よりも小さい名目上の孔径を有する第一多孔膜上で、溶解すること、ｃ）ろ過装置に外力を加え、これによって核酸を複数の多孔膜の少なくとも１つの膜上で単離することを含む、試料から核酸を単離する方法を提供する。試料は、細胞試料又はウイルス試料であり得、例えばウイルス粒子で構成され得る。場合により、単離された核酸を多孔膜の１つから溶出し得る。
【０００５】
他の実施形態では、本発明は、複数の多孔膜を含むろ過装置を試料と、試料がポリマーを含む第一多孔膜から始まって次にケイ酸塩を含む少なくとも第二多孔膜へと続く複数の多孔膜に順次接触するように接触させ、これによって複数の多孔膜の少なくとも１つの膜上で核酸を単離することを含む、試料から核酸を単離する方法を提供する。ポリマー膜は、ケイ酸塩膜と比較してより小さな名目上の孔径を有し得る。試料は、膜の１つ、例えば第一多孔膜上でインサイチューで溶解し得る細胞試料又はウイルス試料又はこの両方であり得る。場合により、単離された核酸を多孔膜の１つから溶出し得る。
【０００６】
さらなる他の実施形態では、本発明は、複数の多孔膜を含むろ過装置を試料と、試料が多糖を含む第一多孔膜から始まって次にケイ酸塩を含む少なくとも第二多孔膜へと続く複数の多孔膜に順次接触するように接触させ、これによって複数の多孔膜の少なくとも１つの膜上で核酸を単離することを含む、試料から核酸を単離する方法を提供する。多糖膜は、ケイ酸塩膜と比較してより小さな名目上の孔径を有し得る。試料は、膜の１つ、例えば第一多孔膜上でインサイチューで溶解し得る細胞試料又はウイルス試料又はこの両方であり得る。場合により、単離された核酸を多孔膜の１つから溶出し得る。
【０００７】
さらなる他の実施形態では、本発明は、複数の多孔膜を含むろ過装置を試料と、試料がスルホニル基からなるポリマーを含む第一多孔膜から始まって次にケイ酸塩を含む少なくとも第二多孔膜へと続く複数の多孔膜に順次接触するように接触させ、これによって複数の多孔膜の少なくとも１つの膜上で核酸を単離することを含む、試料から核酸を単離する方法を提供する。スルホニル基からなるポリマー膜は、ケイ酸塩膜と比較してより小さな名目上の孔径を有し得る。試料は、膜の１つ、例えば第一多孔膜上でインサイチューで溶解し得る細胞試料又はウイルス試料又はこの両方であり得る。場合により、単離された核酸を多孔膜の１つから溶出し得る。
【０００８】
さらなる他の実施形態では、本発明は、複数の多孔膜を含むろ過装置を試料と、試料がスルホン基からなるポリマーを含む第一多孔膜から始まって次に多糖を含む少なくとも第二多孔膜へと続く複数の多孔膜に順次接触するように接触させ、これによって複数の多孔膜の少なくとも１つの膜上で核酸を単離することを含む、試料から核酸を単離する方法を提供する。スルホニル基からなるポリマー膜は、多糖膜と比較してより小さな名目上の孔径を有し得る。試料は、膜の１つ、例えば第一多孔膜上でインサイチューで溶解し得る細胞試料又はウイルス試料又はこの両方であり得る。場合により、単離された核酸を多孔膜の１つから溶出し得る。
【０００９】
一部の実施形態では、本発明は、複数の多孔膜を含むろ過装置を試料と、試料が最初に混合セルロースエステルを含む膜から次いでガラス繊維を含む膜へと接触するように（但し混合セルロースエステル膜の名目上の孔径はガラス繊維膜の名目上の孔径より小さい。）接触させること、及び場合により装置からＲＮＡを溶出し、これによって試料からＲＮＡを単離することを含む、試料からＲＮＡを単離する方法を提供する。試料は、膜の１つ、例えば第一多孔膜上でインサイチューで溶解し得る細胞試料又はウイルス試料又はこの両方であり得る。
【００１０】
一部の実施形態では、本発明は、複数の多孔膜を含むろ過装置を試料と、試料が最初にスルホニル基からなるポリマーを含む膜から次いでガラス繊維を含む膜へと接触するように（但しスルホニル基からなるポリマー膜の名目上の孔径はガラス繊維膜の名目上の孔径より小さい。）接触させること、及び装置からＤＮＡを溶出し、これによって試料からＤＮＡを単離することを含む、試料からＤＮＡを単離する方法を提供する。ある実施形態では、ＤＮＡの少なくとも一部はスルホニル基からなるポリマー膜上で単離される。他の実施形態では、ＤＮＡの少なくとも一部はガラス繊維膜上で単離される。試料は、膜の１つ、例えば第一多孔膜上でインサイチューで溶解し得る細胞試料又はウイルス試料又はこの両方であり得る。場合により、単離されたＤＮＡを多孔膜の１つから溶出し得る。
【００１１】
さらなる他の実施形態では、本発明は、ａ）細胞試料を、ポリマーを含む第一膜と接触させること；ｂ）細胞試料が第一膜の表面に保持されるように第一膜に外力を加えること；ｃ）第一膜の表面に保持されている細胞試料を、試料中の細胞が溶解するように溶解緩衝液と、及び試料中のＲＮＡが第一膜から溶出してシリカからなる第二膜と接触するようにＲＮＡ捕獲緩衝液と、接触させること；ｄ）溶解緩衝液及びＲＮＡ捕獲緩衝液がｃ）の第一及び第二膜を通って流れるように、第一及び第二膜に外力を加えること；ｅ）場合によりｄ）の第一及び／又は第二膜を１以上の洗浄緩衝液と接触させること；ｆ）場合により洗浄緩衝液が第一及び／又は第二膜を通って流れるように、ｅ）の第一及び／又は第二膜に外力を加えること；ｇ）ＲＮＡの少なくとも一部がシリカ膜から溶出するようにＲＮアーゼ不含水を添加し、これによって試料からＲＮＡを単離することを含む、細胞試料からＲＮＡを単離する方法を提供する。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、試料に含まれる細胞が溶解するように、ＲＮＡ捕獲緩衝液と同じ緩衝液であってよい。
【００１２】
さらなる他の実施形態では、本発明は、ａ）複数の膜と試料を接触させること（第一膜は、ポリマーからなり及び第一ポリマー膜の後に試料と接触するシリカからなる少なくとも１つの付加的な膜を含む。）；ｂ）試料がポリマー膜の表面に保持されるようにポリマー膜に外力を加えること；ｃ）ＤＮＡを含む試料が溶解するようにポリマー膜の表面に保持される試料を溶解緩衝液と接触させること；ｄ）溶解緩衝液がｃ）の第一及び第二膜を通って流れるように、第一及び第二膜の少なくとも１つに外力を加えること；ｅ）場合によりｄ）の第一及び／又は第二膜を１以上の洗浄緩衝液と接触させること；ｆ）場合により洗浄緩衝液が少なくとも第二膜を通って流れるように、少なくともｅ）の第二膜に外力を加えること；ｇ）ＤＮＡの少なくとも一部が少なくとも１つの膜から溶出するように複数の膜にヌクレアーゼ不含水を添加し、これによって試料からＤＮＡを単離することを含む、試料からＤＮＡを単離する方法を提供する。
【００１３】
ある実施形態では、本発明は、ろ過装置に適用された試料が第一多孔膜から次いで少なくとも第二多孔膜へと接触するように順次的に配置された複数の多孔膜を含み、第一多孔膜が第二多孔膜の名目上の孔径よりも小さい名目上の孔径を有する、試料から核酸を単離するのに適したろ過装置を提供する。
【００１４】
さらなる実施形態では、本発明は、ろ過装置に適用された試料がポリマーを含む第一多孔膜から次いでシリカを含む少なくとも第二多孔膜へと接触するように順次的に配置された複数の多孔膜を含む、試料から核酸を単離するのに適したろ過装置を提供する。ポリマー膜は、ケイ酸塩膜と比較してより小さい名目上の孔径を有し得る。
【００１５】
さらなる他の実施形態では、本発明は、ろ過装置に適用された試料がスルホニル基からなるポリマーを含む第一多孔膜から次いでシリカを含む少なくとも第二多孔膜へと接触するように順次的に配置された複数の多孔膜を含む、試料から核酸を単離するのに適したろ過装置を提供する。スルホニル基からなるポリマー膜は、ケイ酸塩膜と比較してより小さい名目上の孔径を有し得る。
【００１６】
さらなる他の実施形態では、本発明は、ろ過装置に適用された試料が多糖を含む第一多孔膜から次いでシリカを含む少なくとも第二多孔膜へと接触するように順次的に配置された複数の多孔膜を含む、試料から核酸を単離するのに適したろ過装置を提供する。多糖膜は、ケイ酸塩膜と比較してより小さい名目上の孔径を有し得る。
【００１７】
さらなる他の実施形態では、本発明は、ろ過装置に適用された試料がスルホニル基からなるポリマーを含む第一多孔膜から次いで多糖を含む少なくとも第二多孔膜へと接触するように順次的に配置された複数の多孔膜を含む、試料から核酸を単離するのに適したろ過装置を提供する。スルホニル基からなるポリマー膜は、多糖膜と比較してより小さい名目上の孔径を有し得る。
【００１８】
さらなる他の実施形態では、本発明は、ろ過装置に適用された試料が混合酢酸セルロースを含む第一多孔膜から次いでガラス繊維を含む少なくとも第二多孔膜へと接触するように順次的に配置された複数の多孔膜を含み、第一多孔膜が第二多孔膜の名目上の孔径よりも小さい名目上の孔径を有し得る、試料からＲＮＡを単離するのに適したろ過装置を提供する。
【００１９】
さらなる実施形態では、本発明は、ろ過装置に適用された試料がスルホニル基からなるポリマーを含む第一多孔膜から次いでガラス繊維を含む少なくとも第二多孔膜へと接触するように順次的に配置された複数の多孔膜を含み、第一多孔膜が第二多孔膜の名目上の孔径より小さくてもよい名目上の孔径を有する、試料からＤＮＡを単離するのに適したろ過装置を提供する。
【００２０】
さらなる他の実施形態では、本発明は、ろ過装置に適用された試料がスルホニル基からなるポリマーを含む第一多孔膜から次にスルホニル基からなるポリマーを含む第二多孔膜へ次にガラス繊維を含む少なくとも第三多孔膜と接触するように順次的に配置された複数の多孔膜を含み、第一多孔膜がガラス繊維膜の名目上の孔径より小さい名目上の孔径を有する、試料からＤＮＡを単離するのに適したろ過装置を提供する。
【００２１】
さらなる他の実施形態では、本発明は、ａ）ろ過装置に適用された試料が第一多孔膜から次いで少なくとも第二多孔膜へと接触するように順次的に配置された複数の多孔膜を含み、第一多孔膜が第二多孔膜の名目上の孔径よりも小さい名目上の孔径を有し得る、試料から核酸を単離するのに適したろ過装置；及びｂ）少なくとも１つの容器を含む、試料から核酸を単離するためのキットを提供する。
【００２２】
さらなる他の実施形態では、本発明は、ａ）ろ過装置に適用された試料がポリマーを含む第一多孔膜から次いでシリカを含む少なくとも第二多孔膜へと接触するように順次的に配置された複数の多孔膜を含む、試料から核酸を単離するのに適したろ過装置；及びｂ）少なくとも１つの容器を含む、試料から核酸を単離するためのキットを提供する。ポリマー膜は、ケイ酸塩膜と比較してより小さい名目上の孔径を有し得る。
【００２３】
さらなる他の実施形態では、本発明は、ａ）ろ過装置に適用された試料が多糖を含む第一多孔膜から次いでケイ酸塩を含む少なくとも第二多孔膜へと接触するように順次的に配置された複数の多孔膜を含む、試料から核酸を単離するのに適したろ過装置；及びｂ）少なくとも１つの容器を含む、試料から核酸を単離するためのキットを提供する。多糖膜は、ケイ酸塩膜と比較してより小さい名目上の孔径を有し得る。
【００２４】
さらなる他の実施形態では、本発明は、ａ）ろ過装置に適用された試料がスルホニル基からなるポリマーを含む第一多孔膜から次いでケイ酸塩を含む少なくとも第二多孔膜へと接触するように順次的に配置された複数の多孔膜を含む、試料から核酸を単離するのに適したろ過装置；及びｂ）少なくとも１つの容器を含む、試料から核酸を単離するためのキットを提供する。スルホニル基からなるポリマー膜は、ケイ酸塩膜と比較してより小さい名目上の孔径を有し得る。
【００２５】
さらなる他の実施形態では、本発明は、ａ）ろ過装置に適用された試料がスルホニル基からなるポリマーを含む第一多孔膜から次いで多糖を含む少なくとも第二多孔膜へと接触するように順次的に配置された複数の多孔膜を含む、試料から核酸を単離するのに適したろ過装置；及びｂ）少なくとも１つの容器を含む、試料から核酸を単離するためのキットを提供する。スルホニル基からなるポリマー膜は、多糖膜と比較してより小さい名目上の孔径を有し得る。
【００２６】
さらなる実施形態では、本発明は、ａ）試料から核酸を単離するのに適したろ過装置、ｂ）ポンプ、ｃ）シーケンス制御装置（ＰＬＣ）、ｄ）試料を保持するための少なくとも１つの容器、ｅ）場合により１以上の試薬又は緩衝液を保持するのに適した１以上の容器、ｆ）場合によりろ過装置からのろ液、ろ過装置からの溶出液及び／又はろ過装置からの廃棄溶液を受け取るのに適した１以上の貯蔵容器（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅｓ）、ｇ）複数のピンチ弁、ｈ）配管、及びｉ）場合により配管から１以上の液体をろ過装置に供給するシリンジカートリッジを含む、試料から核酸を単離するための自動システムを提供する。
【００２７】
さらなる実施形態では、本発明は、試料中の微生物を検出するのに適する１以上のオリゴヌクレオチドを提供する。微生物は、マイコプラズマ、ウイルス等を含み得る。
【００２８】
さらなる実施形態では、本発明は、ａ）試料を、微生物のゲノムの少なくとも一部を含む標的核酸に特異的に結合する１以上のオリゴヌクレオチドと接触させること、ｂ）標的核酸を増幅し、これによって試料中の微生物を検出することを含む、試料中の微生物を検出する方法を提供する。場合により、標的核酸は、標的核酸の少なくとも一部に特異的に結合し、これによって試料中の微生物を検出するオリゴヌクレオチドプローブに連結し得る。
【００２９】
図面の簡単な説明
図１ａ及び図１ｂは微量分配装置からなる本発明のろ過装置の一例を示す。
図２は本発明のろ過装置の一例を示す。
図３ａ及び図３ｂは多数の試料又は大容量の試料を受け取るのに適したマルチウエル形式の本発明のろ過装置の一例を示す。
図４は多数の試料又は大容量の試料を受け取るのに適したマルチウエル形式の本発明のろ過装置のもう１つ別の例を示す。
図５は単一試料型の本発明のろ過装置を示す。
図６ａは通気口付き及び通気口なしの閉鎖型の本発明のろ過装置を示す。
図６ｂは積み重ね型の本発明のろ過装置を示す。
図７は通気口付き閉鎖型の本発明のろ過装置を含む制御可能な自動システムを示す。
図８はＲＮＡｅａｓｙ（登録商標）カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて単離したｒＲＮＡと比較して、本発明の方法に従って単離したｒＲＮＡを示すアガロースゲルの写真である。
図９は試料からのＲＮＡの相対精製を示すグラフである。
【００３０】
実施態様の簡単な説明
核酸を単離する方法
一部の実施形態では、本発明は、迅速で実施し易く、試料に対して最小数の操作しか必要としない、試料から標的核酸を単離する方法を提供する。本方法は、粗細胞投入物、例えば原核又は真核細胞を受け入れ、選択的生体分子産出物を排出するという利点を提供する。粗細胞投入物は、例えばろ過装置を構成する複数の膜の１つの表面上でインサイチューで、単に細胞試料を溶解することを含み得る。溶解産物は、例えば遠心分離によって溶解産物を清澄化する必要なしに、ここで述べる方法に従って核酸を単離するように処理し得る。従って、溶解産物は、細胞デブリ、増殖培地及び増殖培地添加物と共に標的核酸を含み得る。
【００３１】
特定実施形態では、本発明は、複数の膜を含むろ過装置の一部であるガラス繊維膜上でＲＮＡを単離する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、複数の膜を含むろ過装置の一部である、スルホニル基からなるポリマー膜のようなポリマー膜上でＤＮＡを単離する方法を提供する。
【００３２】
標的核酸がＲＮＡである場合、本発明は、ＤＮアーゼの使用を必要とせず、又はこれまでに述べられている方法、例えばＱｉａｇｅｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって必要とされるよりも少ないＤＮアーゼの使用しか必要とせず、これによって時間と試薬コストを節約する、ＲＮＡを単離する方法を提供する。典型的には、核酸は、変性状態で多孔膜上で単離され、従ってその後の操作、例えばＲＴ−ＰＣＲを含むＰＣＲ、転写を介した増幅（ＴＭＡ）を容易にする。標的核酸の単離は、例えば細菌のような、対象とする病原性又は非病原性生物の特定を含む、多くの下流分析適用のために使用し得る。
【００３３】
ある実施形態では、本発明は、原核又は真核細胞のような全細胞からなる試料から核酸を単離する方法を提供する。細胞を第一膜と接触させ、溶解して、標的核酸を第二膜又はその後の膜上で単離し得る。標的核酸は第一膜及び第二膜の両方で単離し得る。試料が複数の膜の各々と連続的に接触するように、複数の膜からなるろ過装置に試料を適用し得る。従って、試料は第一膜と接触し、次に少なくとも第二膜と接触し得る。一部の実施形態では、試料は３またはそれ以上の膜と接触し得る。
【００３４】
試料が装置の第一膜と接触した後、試料（例えば標的核酸又は標的核酸の少なくとも一部）は第一膜の表面に保持されるが、試料を含有する溶液又は液体、例えば培地はろ過装置を貫流するように、外力を装置に加え得る。一部の実施形態では、外力は、例えば装置の底の出口を通して、ろ過装置に接続された重力又は真空によって与えられ得る。外力が真空であるとき、真空は２０−８００ｍｂａｒの圧差を与え得る。他の実施形態では、外力は、例えば装置が円筒からなる場合は、ピストン又は構材の作用により、ろ過装置の上部から適用され得る陽圧によって、又はシリンジの力によって提供され得る。さらなる他の実施形態では、外力は、装置を遠心分離機内に置くことによって適用される遠心力であり得る。１×ｇ−１５，０００×ｇの範囲の遠心力を使用し得る。さらなる他の実施形態では、溶媒を、例えば第一膜の上面から、吸引によって除去し得るか、又は試料を沈降させた後単に傾瀉し得る。
【００３５】
本発明の方法は、試料をろ過装置を構成する複数の多孔膜の最初の膜に接触させた後、試料を様々な緩衝液と接触させることを含み得る。従って、試料を、ろ過装置を構成する第一膜と接触させ、場合により上述した力をろ過装置に加えた後、試料を第一緩衝液と接触させ得る。試料が細胞及び／又はウイルス粒子からなる場合、第一緩衝液は溶解緩衝液であり得る。当分野で公知のいかなる溶解緩衝液も使用し得る。典型的には、溶解緩衝液は、緩衝塩、洗浄剤及び酵素、例えばプロテアーゼを含み得る。酵素は、例えばプロテイナーゼＫ又はリゾチームであり得る。１つの実施形態では、溶解緩衝液は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭＥＤＴＡ、２％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で構成され得る。
【００３６】
溶解後、試料を、試料中に含有される核酸の少なくとも一部が第一多孔膜の表面上に沈殿するように、沈殿試薬と接触させ得る。沈殿試薬は、グアニジン塩（例えば塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン）及びアルコール（例えばエタノール）を含む溶液であり得る。一部の実施形態では、沈殿試薬は２５−５０％の範囲の最終アルコール濃度を含む。試料を、核酸の少なくとも一部が第一膜の表面に沈殿するのに十分な時間、沈殿試薬と共にインキュベートし得る。一部の実施形態では、インキュベーション時間は、１−１０分間、１−５分間、３０秒間−３分間、３０秒間−２０分間、３０秒間−１時間又は１時間以上の範囲である。沈殿試薬及び溶解緩衝液は、試料から溶媒を除去するための上述した手法のいずれか、例えば外力の適用を用いて、試料から除去し得る。
【００３７】
標的分析物がＲＮＡである場合、標的核酸が第一膜を通過し、標的核酸が試料から単離されるように第二膜上に吸着又は沈殿することを可能にする、ＲＮＡ捕獲緩衝液を添加し得る。適切なＲＮＡ捕獲緩衝液の例は、４Ｍ塩酸グアニジン；５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭＥＤＴＡ、２％トリトンＸ−１００、５０％エタノールを含む。１％ドデシル硫酸ナトリウムを２％トリトンＸ−１００の代用品として使用し得る。もう１つのＲＮＡ捕獲緩衝液は、４Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭＥＤＴＡ、５％酢酸エチル、５０％エタノールで構成され得る。
【００３８】
ａ）試料をろ過装置と接触させること、ｂ）沈殿、ｃ）標的の溶出を含む、工程のいずれかの間に、装置上に保持された試料に１以上の洗浄緩衝液を適用し得る。例えば沈殿試薬と溶解緩衝液の除去後、溶解及び酵素分解から生じる望ましくない物質を除去するために試料を洗浄緩衝液と接触させ得る。当分野で公知のいかなる洗浄緩衝液も使用でき、例えば少なくとも５０％のエタノール、メタノール又はイソプロパノール又は１０ｍＭトリス−ＥＤＴＡ、ｐＨ８又は４Ｍ塩酸グアニジンを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用し得る。洗浄緩衝液は、試料から溶媒を除去するための上述した手法のいずれかを用いて除去し得る。
【００３９】
単離された標的核酸は、膜から溶出し得るか又はさらなる分析のために膜上に保持し得る。標的核酸を溶出することが望ましい場合、第一膜又は第二膜から標的核酸を収集するために溶出緩衝液を使用し得る。又は、溶出緩衝液は第一膜又は第二膜から物質、例えば望ましくない核酸を溶出し、これによって標的核酸を第一膜又は第二膜上に残してもよい。溶出緩衝液は、単離する核酸の種類に従って選択し得る。一例として、核酸がＲＮＡである場合、溶出緩衝液は、第二膜から又は第一膜と第二膜が互いに接触している又は積み重なっているときは第一及び第二膜から標的ＲＮＡを溶出するために使用し得るＲＮアーゼ不含水であり得る。他の適切な溶出緩衝液は、トリス−エチレンジアミン四酢酸（ＴＥ）緩衝液及び１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含み得る。
【００４０】
ろ過装置が３以上の膜を含むある実施形態では、標的核酸を第一又は第二膜から又は第一と第二の両方の膜から第三膜上に溶出し得る。第三膜は、捕獲プローブ、例えば標的核酸が標的核酸と標的プローブの間の特異的な化学的相互作用の結果として第三膜上に選択的に保持されるように、標的核酸についての特異的結合パートナーを含み得る。捕獲プローブは標的核酸と共有結合的又は非共有結合的に相互作用し得る。相互作用は、電荷−電荷相互作用、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力及び双極子−双極子相互作用を含み得る。捕獲プローブの例は、対象とする特定核酸配列に相補的なオリゴ、並びに核酸に結合するペプチド、タンパク質及び低分子を含む。抗生物質の一例として、例えば１６ｓＲＮＡに特異的に結合するエデインは、膜に結合し得る。捕獲プローブのもう１つの例は、ポリＡ  ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを捕獲するのに適するオリゴｄＴプローブを含み得る。膜は、アビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジンのような公知のリガンドで誘導体化し得る。ビオチニル化捕獲プローブを膜に添加し、これによって標的核酸配列に特異性を付与することができる。
【００４１】
特定実施形態において、本発明は、複数の膜［例えば、ポリマー膜（例えば混合セルロース膜）、シリカ膜又はフィルター（例えばガラス繊維又はガラス繊維膜）］からなる、マルチウエルプレート内の１以上のウエルを試料と接触させることを含む、細胞試料（例えば２３ｓ及び１６ｓ  ｒＲＮＡを含む全細胞ＲＮＡ、細胞ＤＮＡ、マイコプラズマＤＮＡ又はＲＮＡ、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ）から核酸を単離する方法を提供する。試料を最初にポリマー膜と接触させ、次にシリカ膜と接触させ得る。試料が接触する最初の膜は、試料が接触するその後の膜、例えば第二膜の名目上の孔径よりも小さい名目上の孔径を有し得る。膜は、積み重ねた形状に配置し得る。細胞試料が第一膜から単離されるように、マルチウエルプレートに真空を適用し、試料からのろ液を廃棄し得る。細胞試料を溶解緩衝液、例えばリゾチームのような１以上の溶解酵素を含む緩衝液と接触させ得る。試料を、グアニジン塩及びエタノールのような１以上の沈殿剤と接触させ得る。試料を適切な時間インキュベートし得る。マルチウエルプレートに真空を適用し、ろ液を廃棄し得る。試薬又は非標的物質を洗い流すために、５０％以上のエタノールを含むＰＢＳのような、１以上の洗浄液をマルチウエル装置に適用し得る。真空を適用し、ろ液を廃棄し得る。第二のマルチウエルプレート、すなわち収集プレートは、標的核酸を受け取るために提供され得る。第二マルチウエルプレートは、試料を受け取るマルチウエルプレートと同じ数からなり、例えば、マルチウエルプレートの各々のウエルが第二マルチウエルプレートのウエルと整列し、肩又は縁を連結する又はかみ合わせることによって、対応するように下のマルチウエルプレートと堅固に適合する寸法にし得る。
【００４２】
マルチウエルプレートからの標的核酸を収集プレートに溶出するために、試料を溶出緩衝液、例えばＲＮアーゼ不含水、ＴＥ緩衝液と接触させ得る。又は、ｐＨ６．０−８．０の低イオン強度溶液（０−５０ｍＭ）が、ＲＮＡのような標的核酸を装置から溶出するのに適する。
【００４３】
自動システム
ある実施形態では、本発明は、試料から核酸を単離するための自動システムを提供する。試料をろ過装置に適用すること、試料を溶解すること、試料を洗浄すること、試料を溶出することを含む工程のいずれか又は全部を自動化し得る。自動システムは、コンピュータ、例えばここで述べる方法の工程の各々を実施するようにプログラムされたパーソナルコンピュータを含み得る。本発明はまた、多重方式で多数の試料を処理することも考慮する。
【００４４】
自動装置の一例を図７に示す。さらなる実施形態では、本発明は、ａ）試料から核酸を単離するのに適するろ過装置（７４）、ｂ）ポンプ（７５）、ｃ）シーケンス制御装置（ＰＬＣ）（７６）、ｄ）試料を保持するのに適した少なくとも１つの容器（７１）、ｅ）場合により１以上の試薬又は緩衝液を保持するのに適した１以上の容器（７１）、ｆ）場合によりろ過装置からのろ液、ろ過装置からの溶出液及び／又はろ過装置からの廃棄溶液を受け取るのに適した１以上の貯蔵容器（７７）、ｇ）複数のピンチ弁（７２）、ｈ）配管（７３）及びｉ）場合により配管から１以上の液体をろ過装置（７４）に供給する、シリンジバレルホルダー内に位置するシリンジカートリッジ（７９）を含む、試料から核酸を単離するための自動システムを提供する。ろ過装置からの液体の適用及び／又は除去を可能にする逆止め弁（７８）を備える。
【００４５】
このように、本発明に従った自動システムは、試薬、緩衝液、試料等を含む液体が、ポンプの移動部のようないかなる移動部分とも絶対に接触しない形状をとり得る。これは、システムを通過する液体との接触を必要としないピンチ弁を使用することによって達成され得る。システムにおいて使用される配管及びろ過装置は単回使用に適してもよく、従って使い捨てであり得る。使い捨て配管とピンチ弁の組合せは、保守整備、例えば各使用と使用の間の洗浄をほとんど必要としないシステムを提供する。さらに、配管とろ過装置は１回しか使用されないので、試料の汚染の危険性が排除される又は最小限に抑えられる。これは、試料が核酸を含み、核酸の下流検出がＰＣＲ又はＴＭＡのような増幅プロトコールに基づくときに特に有用である。卓越した感受性を提供するが、増幅プロトコールは同時に、標的核酸の代わりに汚染核酸を増幅する重大な危険性も伴う。ここで述べる自動システムは、システムを通る液体がポンプの移動部に接触する際使用可能な（典型的には金属製）部分からなるより伝統的なクロマトグラフィーシステムと比較したとき、このような危険性を最小限に抑えるか又は排除し、同時に核酸単離を実施するための安価なシステムを提供する。
【００４６】
自動システムにおける使用に適したろ過装置は、ここで述べる本発明の何らかの実施形態に従ったろ過装置であり得る。このシステムは、以下のように構成され得る。１）配管が試料とろ過装置の間の液体連通を提供する；２）配管がろ過装置と１以上の選択的容器の各々との間の液体連通を提供する；３）ポンプが、ａ）試料又は緩衝液又は試薬を容器からろ過装置へと及び／又はろ過装置を通って移動させることができる外力及び／又はｂ）何らかの液体、例えば試薬、緩衝液、試料を膜の表面から、例えばろ過装置を構成する膜の最初の表面から除去することができる外力を提供し得るような形状をとり得る。最初の表面は、液体が最初に接触する表面、例えば複数の膜が連続的に配置されている場合は一番上の表面であり得る。
【００４７】
一部の実施形態では、ＰＬＣは、システムによって実施される工程の順序及び時間を制御し得る。例えばＰＬＣは、１以上のピンチ弁がいつ開く及び／又は閉じるかを制御し得る。同様にＰＬＣは、１以上の容器及び／又はろ過装置に加えられる外力の適用の期間及びタイミングを制御し得る。システムはまた、１以上の容器から設定容量の液体を回収し、この液体をろ過装置と接触させることができるシリンジポンプのようなポンプを含み得る。ポンプは、容器から得られる及び／又はろ過装置と接触する液体の容量が指定及び制御され、容器及び／又はろ過装置からの液体の回収及び／又は適用の割合が指定及び制御され得るように、プログラムすることができる。もう１つの実施形態では、ＰＬＣは、システムによって実施される工程のタイミングと期間の両方、並びに容器又は膜の表面から得られる液体の容量、システムを通る液体の流量及び／又は容器及び／又はろ過装置からの液体の回収及び／又は適用の割合を制御し得る。
【００４８】
装置を自動化する場合、以下の工程を実施し得る。初期設定において、全ての必要溶液が溶液の容器に負荷され得る。容器はピンチ弁によって制御され、シリンジに接続された二方弁に配管される。シリンジの取り込みと供給はシリンジポンプによって制御され得る。試料は二重フィルターを通して注入され得る。ろ液は廃棄物へと進む。膜は残留物を空気乾燥し得る。溶解液が二重フィルターを通して注入され得る。ろ液は廃棄物へと進む。膜は残留物を空気乾燥し得る。洗浄液が二重フィルターを通して注入され得る。ろ液は廃棄物へと進む。膜は残留物を空気乾燥し得る。溶出緩衝液が二重フィルターを通して注入され得る。ろ液は収集物貯蔵容器へと進む。膜は残留物を空気乾燥し得る。ろ液からの核酸の検出は、ゲル、ＰＣＲ又はＴＭＡによって実施され得る。
【００４９】
ろ過装置
様々なろ過装置様式の使用が考慮される。ろ過器は、簡単な手動装置であるか又は自動システムの一部であり得る。ろ過装置の寸法及び数は、試料の性質及び標的分析物によって指示される。一部の実施形態では、ろ過装置は、独立ユニット、例えばカートリッジで構成され得る。カートリッジは、複数の膜及び１以上の注入口と１以上の排出口を納めるための框体、例えば中空の本体を含み得る。注入口と排出口は、標準シリンジと適合性であるための寸法にし得るか又は真空源又は陽圧源を収容する寸法にし得る。カートリッジはさらに、流入物を収集するためのろ液カップで構成され得る。カートリッジは、遠心分離機に取り付けるための寸法にし得る。
【００５０】
ろ過装置は、カラムの上部に適用された試料が、指定された順序でカラム内の複数の多孔膜の各々と接触するように、この中に連続的に配置された複数のろ過器を含むカラムで構成され得る。例えば第一接触膜は、その後に接触する膜よりも小さな名目上の孔径を有し得る。もう１つの例として、ろ過装置は、装置に圧又は真空を適用するために使用され得る１以上の連続的に配置されたシリンジ円筒で構成され得る。
【００５１】
ろ過装置は、例えばウエルの少なくとも１つが、ろ過装置に適用された試料が第一膜、次いで１以上のその後の膜と接触するように順次的に配置された複数の膜を含むろ過装置からなる、マルチウエルプレートで構成される多重装置（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）であり得る。多重装置の少なくとも１つのウエルは、例えば、第一膜がその後の膜よりも小さな名目上の孔径を有する場合、ここで述べるろ過装置のいずれかで構成され得る。ろ過装置は、例えばウエルの少なくとも１つが、ここで様々な実施形態において述べたような複数の膜を含むろ過装置からなる、マルチウエルプレートからなる多重装置であり得る。従ってマルチウエルプレートの少なくとも１つのウエルは、ろ過器に適用された試料が第一膜、次いで１以上のその後の膜と接触するように順次的に配置された複数の膜で構成されていてよく、例えば前記第一膜はポリマーからなり、第二膜はシリカからなる。
【００５２】
全て、上述したろ過装置を有すマルチウエルプレートのウエルで構成することも考慮される。適切なマルチウエルプレートは、複数のウエル、例えば６ウエル、１２ウエル、４８ウエル、９６ウエル、３８４ウエル又はそれ以上からなるプレートを含む。マルチウエルプレートは、１つをもう１つの上に積み重ね得る。加えて、単一ウエルプレートからなる本発明のろ過装置も考慮される。一部の実施形態では、流入物及び廃棄物を受け取るためのプレート、すなわちドレーンプレートを備え得る。ドレーンプレートは、特定分析物及び試料ソース及び流入物のその後の分析が必要かどうかに依存して単一ウエル又は複数のウエルで構成され得る。プレートの少なくとも１つは、試料又は緩衝液をろ過装置に送達するのに適した１以上の注入口で構成され得る。プレートの少なくとも１つは、流入物及び廃棄物の除去を容易にする排出口で構成され得る。排出口は、真空源への連結部を収容する寸法であり得る。マルチウエルプレートは、ひとたび試料がろ過装置に適用された後、試料の処理を促進するように遠心分離機に取り付けられる寸法であり得る。
【００５３】
１つの特定実施形態では、ろ過装置は、例えばＡＰＦＦガラス繊維膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）の上に重ねた０．４５ミクロンの名目上の孔径を有する、混合セルロースエステル膜からなり得る。ろ過装置がカートリッジとして形作られている場合は、膜は１３ｍｍの直径を有し得る。あるいは、ろ過装置がマルチウエルプレートとして形作られている場合は、膜は市販のマルチウエルプレートに適合する寸法であり得る。もう１つの特定実施形態では、ろ過装置は、０．７ミクロンの名目上の孔径を有するガラス繊維膜の上に重ねた、２８ナノメートルの名目上の孔径を有する、スルホニル基からなるポリマー膜を含み得る。
【００５４】
図１は、本発明に従った構成部品からなる、単回使用の再利用可能なろ過装置の一例を示す。試料容器のふた（１）をはずし、試料を試料容器（２）に適用して、試料が複数の多孔膜（４）の第一多孔膜と接触するように、重力又は装置に加えられる何らかの外力の結果として試料が流動する。複数の多孔膜は、溶出した標的のための貯蔵容器としての役割も果たし得るろ液キャップと液体連通がある膜支持体（５）上に位置し得る。ろ液キャップ（６）も提供される。装置は、分解して、複数の多孔膜を交換し得るので、再利用に適する。図２は、再利用できない本発明の単回使用ろ過装置の一例を示す。
【００５５】
図３ａは、本発明に従ったマルチウエルろ過装置の一例を示す。各々のウエルは、一方が他方の上に積み重ねられた少なくとも２つの膜（３０及び３１）を含む。図３ｂは、本発明に従ったマルチウエルろ過装置を含む装置のもう１つの例を示す。装置は、カラー内に位置するカラーガスケット（３３）を含む、取り外し可能なカラー（３２）を含み得る。カラー（３２）は、ウエルの少なくとも１つが２以上の多孔膜からなり、第一多孔膜が第二多孔膜より小さい名目上の孔径を有する、複数のウエルを含むろ過プレート（３４）とかみ合っている。多孔膜は、一方が他方の上に積み重ねられ得る。ろ過プレート（３４）は、複数のウエルからなる収集プレート（３５）の上に位置し得る。収集プレートのウエルは、ろ過プレートのウエルに１つずつ対応し得る。収集プレートは、真空多岐管を含み得る基部（３６）上に位置し得る。
【００５６】
図４は、本発明に従ったマルチウエルろ過装置のもう１つの例を示す。この装置は、試料を受け取り、これを、ウエルの少なくとも１つが１以上の多孔膜からなる、試料、例えば大容量試料を受け取るための複数のウエルからなる取り外し可能なろ過プレート（４２）に接触させるためのホッパー（４１）を含み得る。ろ過プレートは、マルチウエルプレート、例えばＺｉｐｔｉｐ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）（４３）の上に位置し得る。Ｚｉｐｔｉｐ（登録商標）プレートのウエルは、ろ過プレートのウエルに１つずつ対応し得る。Ｚｉｐｔｉｐ（登録商標）は、ＲＮＡのような核酸を保持するのに適した樹脂又は他の固体支持体を含み得る。特定実施形態において、樹脂はポリＡ、ポリＵ又はポリＴセファロースからなり得る。Ｚｉｐｔｉｐ（登録商標）プレートは、複数のウエルからなる収集プレート（４４）の上に位置し得る。ウエルは、Ｚｉｐｔｉｐ（登録商標）プレートのウエルに１つずつ対応し、増幅オリゴ再構成酵素と共に再構成増幅試薬のようなＴＭＡ試薬を含有し得る。収集プレートは、マルチスクリーン真空多岐管を含む基部（４５）内に位置し得る。
【００５７】
図５は、本発明に従った単一試料ろ過装置のもう１つの例を示す。この装置は、細胞を保持するのに適した１以上の多孔膜を含むＭｉｃｒｏｆｉｌ（登録商標）又はＭｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）（５１）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）のような貯蔵容器を含む。貯蔵容器は、標的核酸分析物を保持するのに適した核酸捕獲樹脂を負荷したマイクロカラム（５３）の上に位置し得る。マイクロカラムは、カラムを通して溶解産物を引き上げるのに適したシリンジ（５３）と液体連通であり得る。
【００５８】
図６ａは、密封閉鎖ドーム型ろ過装置の３つの例を示す。閉鎖ドーム型装置は、無菌状態の下で試料を処理することを提供し得る。ドームは、１以上の多孔膜のための框体として使用でき、試料又は試薬のための注入口の役割をしない、１以上の通気口をさらに含み得る。通気口は、空気及び他の気体の通過を許容するが、微生物のような微粒子物の通過を妨げる何らかの適切な材料からなり得る。１つの実施形態では、通気口は、気体アクセス可能な疎水性障壁からなる。親水性障壁も考慮される。一部の実施形態では、通気口はドーム型框体構造の表面に位置し得る。もう１つの実施形態では、通気口は、１以上の多孔膜を含有するドーム型框体の一部と連通している注入口のようなドーム型框体の一部へと導く側枝として位置し得る。試料がろ過装置を通って流れるとき、通気口は、ルアーロック型栓を使用することによって閉じた状態に保持され得る。栓は、固体材料で構成され得るか、又はそれ自体に通気口があり、従って疎水性膜のような膜障壁で構成され得る。通気口の使用は、圧を低減し、従ってろ過器への損傷を防ぐ手段を提供し得る。
【００５９】
図６ｂは、複数の積み重ねられた膜カートリッジを含む、本発明に従った単回使用膜装置の一例を示す。装置内の各々のカートリッジは、次の隣接カートリッジと液体交通がある。カートリッジは、１以上の多孔膜からなり得る。カートリッジが２以上の多孔膜を含む場合、膜は、カートリッジ内に含有されるその他の多孔膜と同じか又は異なり得る。一部の実施形態では、カートリッジ内の多数の膜は、加熱ポリプロピレンを用いて融合し得る。一例として、第一カートリッジは混合セルロースエステル（ＭＣＥ）膜からなり、第一カートリッジの下に積み重ねられた第二カートリッジはガラス繊維膜からなり得る。ＭＣＥはガラス繊維フィルターより小さい名目上の孔径を有し得る。
【００６０】
図７は、本発明の１つの実施形態に従った複数膜の通気口付き装置の一例を示す。この装置は、二方真空弁（逆止め弁組立部品）によってシリンジに接続され得る。二方向真空弁は溶液多岐管に配管され得る。溶液多岐管から、溶液容器（すなわち試料、溶解、洗浄、溶出溶液／緩衝液）及び空気通気口に接続された多数のラインが出て行く。各々の溶液ラインは、電気ピンチ弁によって制御され得る。装置内の第一多孔膜の表面上で細胞を捕獲し、溶解するため、及びその後装置内の積み重ねられた膜から核酸を捕獲し、洗浄し、溶出するために、試料、次いで溶解緩衝液、次いで洗浄液、次いで溶出緩衝液が各々順次導入され得る。装置の第一多孔膜は、ＭＣＥ、ＰＥＳのようなポリマーからなり得る。第二多孔膜は、ガラス繊維のようなシリカからなり得る。ポリマー膜の名目上の孔径は、シリカ膜の名目上の孔径より小さくてよい。図７に示すシステムは、いかにして自動化を実施し得るかの一例である。
【００６１】
膜
分析物の吸着又はクロマトグラフィーのために多孔性ビーズに比べて膜を使用することの重要な利点は、２つの様式の間での液体の流動パターンの違いである。充填層におけるような多孔性ビーズを使用するとき、適用される対流中の分析物はフィルム表面に拡散し、その後ビーズの細孔内にも緩やかに拡散する。膜を使用するとき、適用される対流中の分析物は膜を通して速やかに移動し、フィルム表面に拡散するだけでよい。分析物の飽和結合は、潜在的に、ビーズよりも膜を使用してより迅速に達成され得る。膜によって意味されるのは、これを通して様々な推進力下で質量移動が起こり得る、この縦寸法よりもはるかに大きい横寸法を有する構造である。
【００６２】
バルク対流が膜表面に対して垂直である通常の流動装置に加えて、放射状流動装置も分析物の吸着及びクロマトグラフィーのために使用できる。放射状流動装置においては、流れは、多孔性円筒状フリットの周りを包む膜を通過する。流れは、内から外へ又は外から内に向かって起こり得る。
【００６３】
本発明において使用する膜は、当分野で公知のいかなる多孔性材料でも構成され得る。適切な多孔性材料の例は、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、例えばアガロース、セルロース、多糖、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエステル、フッ化ポリビニリデン、ポリプロピレン、フルオロカーボン、例えばポリ（テトラフルオロエチレン−コ−ペルフルオロ（アルキルビニルエーテル））、ポリカーボネート、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、セラミック、ナイロン、グラファイト繊維及びカーボンナノチューブのような金属及び炭素ベースの材料を含むが、これらに限定されない。
【００６４】
ある特定実施形態では、第一膜は、混合セルロースエステル膜（ＭＣＥ）のような混合セルロース又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）のようなスルホン基からなるポリマーで構成され得る。第二膜は、ガラス又はガラス繊維で構成され得る。一部の実施形態では、核酸、例えばＲＮＡを保持するのに適した樹脂を第二膜の代わりに使用し得る。捕獲プローブを含む選択的第三膜を所望する場合、第三膜はナイロンで構成され得る。
【００６５】
当業者は、本発明における使用に適した材料からなる他の膜を、膜の疎水性及びζ電位に基づいて選択し得る。液体と接触している全ての微粒子物又は巨視材料は、これらの表面で電子電荷を獲得する。ζ電位はこの電荷の表示であり、コロイド状懸濁液又は乳剤の安定性を予測し、制御するために使用できる。流動電位／荷電電流法が膜のζ電位を測定するために使用し得る（例えばＬｕら、２００６，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．２９９（２）９７２；Ｈａｇｇａｒｄら、２００５，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２１（１６）：７４３３；Ｗｅｒｎｅｒら、１９９８，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．２０８（１）２３９参照）。ζ電位は物質の表面静電状態の指標である。核酸と物質の相互作用が主として静電気によって導かれる場合、ｐＨ範囲全体にわたって同じζ電位プロフィールを有する２つの物質は、同じセットの条件下で核酸と相互作用するこれらの能力に関して同様に反応するはずである。高塩から低塩条件への切り替えを含む核酸精製プロトコールは、核酸を捕獲するために使用される物質のζ電位に対して感受性であると予想される。
【００６６】
本発明の膜は、０．０１μｍ−３００μｍ、０．１μｍ−１００μｍ、０．１μｍ−５０μｍ、０．１μｍ−２０μｍの範囲の孔径を有し得る。ある実施形態では、膜の少なくとも１つは０．４５μｍの名目上の孔径を有する。特定実施形態では、膜の少なくとも１つは０．２μｍの名目上の孔径を有する。本発明の膜は、０．１ｍｍ−１０ｍｍの範囲の厚さを有し得る。厚さとは、１つの外側表面からもう１つの外側表面までの距離を指し、力、例えば重力、真空を膜に適用したときに試料が膜を横切る間に移動する距離に相当する。膜は、対称又は非対称であり得る。膜はそれ自体、１つまたはそれ以上の層からなり得る。
【００６７】
核酸試料
ここで使用する試料は、何らかの生物学的ソースに由来する核酸を含む物質を指す、生物学的ソースは、植物、動物、ウイルス粒子のような何らかの生物であり得る。生物学的ソースは、全生物又は生物に由来する器官又は組織を含む。生物学的ソースは、単細胞、例えば細菌、マイコプラズマ、又は多細胞、例えば動物又は植物、又は非細胞、例えばウイルスであり得る。細胞ソースは、真核細胞、原核細胞を含み得る。真核細胞の例は、何らかの哺乳動物、例えばヒト、非ヒト霊長動物、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラット、ウサギ、マウス、モルモットに由来する細胞を含み得る。原核細胞の例は、エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、スタフィロコッカル・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ａｕｒｅｕｓ）のようなグラム陰性菌及びグラム陽性菌を含む。試料は、全細胞又はこの溶解産物を含み得る。試料は、天然に生じる試料又は人の手によって部分的に又は全面的に創造された又は操作されたものを含み得る。
【００６８】
ここで開示する方法に従った単離のための標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、及び２つ以上の種類の核酸の雑種を含む、試料中に認められる何らかの核酸を含む。核酸は、二本鎖、一本鎖又は多重鎖であり得る。標的がＤＮＡである場合、ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ベクターＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡを含む）又は前記のいずれかのフラグメントであり得る。標的がＲＮＡからなる場合、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｒＲＮＡ、例えば１６ｓ  ＲＮＡ、２３ｓ  ＲＮＡ又はこれらの何らかの組合せであり得る。核酸は、ヌクレオチド類似体、例えば鎖ターミネータからなり得る。標的核酸の大きさは２−３０ヌクレオチドの範囲をとり得るか、又はキロベース以上の範囲であり得る。
【００６９】
キット
本発明はまた、試料から核酸を単離するために使用し得るキットを提供する。キットは、１以上の本発明に従ったろ過装置及び１以上の容器を含み得る。装置は、１以上の対照又は試料標的核酸又は標本を含有し、本発明の方法において有用な種々の緩衝液を場合により含み得る。一例として、キットは、ウイルス粒子又は細胞を溶解するのに適した溶解緩衝液を含み得る。試薬又は非特異的に保持された又は結合された物質を除去するための洗浄緩衝液も、場合によりキットに含まれ得る。他の任意に用いられるキット試薬は、結合標的核酸を膜から溶出するための溶出緩衝液を含む。緩衝液の各々は、溶液として別々の容器中で提供され得る。あるいは、緩衝液は、乾燥形態で又は粉末として提供されてよく、使用者の所望適用に応じて溶液として作製されてよい。この場合、緩衝液はパケット中で提供され得る。キットは、装置が自動化される場合は電源を提供し、並びに真空ポンプのような外力を与える手段を提供し得る。キットはまた、装置を使用するため及び／又は本発明に従った装置及び方法と共に使用するのに適した試薬を作製するための指示書を含み得る。本発明の方法を実施する間又は本発明の装置を使用する間に得られるデータを記録し、分析するための選択的ソフトウエアも含まれ得る。
【００７０】
微生物を検出するための方法及びオリゴヌクレオチド
ある実施形態では、本発明は、試料中の微生物を検出するのに適したオリゴヌクレオチドを提供する。このオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡからなり得、微生物のゲノムの少なくとも一部に特異的に結合し得る。微生物は、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）を含むパルボウイルス又はマイコプラズマのようなウイルスであり得る。
【００７１】
ここで使用する、特異的に結合するとは、窒素含有塩基の対合、例えばグアニンを含むヌクレオチドがこの相補物、すなわちシトシンを含むヌクレオチドに特異的に結合することを指す。同様に、アデニンを含むヌクレオチドは、この相補物、すなわちチミジンを含むヌクレオチドに特異的に結合する。典型的には、配列は、中ストリンジェンシー条件下でこの相補物に特異的に結合し得る。
【００７２】
１以上の前記オリゴヌクレオチドは、１以上の種のマイコプラズマ又はＭＶＭのゲノムの少なくとも一部に特異的に結合する、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列のような短い核酸配列を含み得る。典型的には、オリゴヌクレオチドは、１０ヌクレオチドから４０ヌクレオチド長の、１５ヌクレオチドから３５ヌクレオチド長の、２０ヌクレオチドから３０ヌクレオチド長の範囲である。
【００７３】
従って、本発明は、（ａ）配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１及び／又は１２のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；（ｂ）中ストリンジェンシー条件下で配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１及び／又は１２のいずれかによってコードされるＤＮＡにハイブリダイズすることができるＤＮＡ；（ｃ）高ストリンジェンシー条件下で（ａ）のＤＮＡにハイブリダイズすることができるＤＮＡから選択される単離ＤＮＡ配列を提供する。
【００７４】
もう１つの実施形態では、本発明の核酸分子はまた、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１及び／又は１２に少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む。核酸分子が、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１及び／又は１２に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、又は少なくとも９９．９％同一である配列を含む実施形態も考慮される。一致率は、配列の長さ全体にわたる同一性を含み得る、例えば１以上のヌクレオチドが１以上の異なるヌクレオチドで置換されていてもよく、又は配列の一部のトランケーションを含み得るか、又はこの両方の組合せを含み得る。一致率は、視覚検査及び数学上の計算によって決定され得る。又は、２個の核酸配列の一致率は、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７によって記述され、ウィスコンシン大学遺伝学コンピュータグループ（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータプログラム、バージョン６．０を用いて配列情報を比較することによって決定できる。ＧＡＰプログラムのための好ましいデフォールトパラメータは、（１）ヌクレオチドに関する単一比較マトリックス（同一に対し１及び非同一に対し０の値を含む）、及びＳｃｈｗａｒｔｚとＤａｙｈｏｆｆ編集、１９７９、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８によって述べられているような、ＧｒｉｂｓｋｏｖとＢｕｒｇｅｓｓ  １９８６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５の加重比較マトリックス、（２）各々のギャップについて３．０のペナルティー及び各々のギャップ内の各々のシンボルについて付加的な０．１０ペナルティー；及び（３）末端ギャップについてはペナルティーなしを含む。配列比較の当業者によって使用される他のプログラムも使用し得る。
【００７５】
ここで使用する、中ストリンジェンシーは、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって容易に決定され得る条件を含む。基本条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、１：１、１０１−１０４、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓによって述べられ、５Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含む予備洗浄溶液、４２℃で５０％ホルムアミド、６ＸＳＳＣのハイブリダイゼーション条件（又は４２℃で５０％ホルムアミド中の、スターク溶液のような他の類似ハイブリダイゼーション溶液）、及び６０℃、０．５Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件の使用を含む。
【００７６】
ここで使用する、高ストリンジェンシーは、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって容易に決定される条件を含む。一般に、このような条件は、約６８℃、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄を伴う、上記のようなハイブリダイゼーション条件と定義される。当業者は、温度及び洗浄溶液の塩濃度は、オリゴヌクレオチドの長さのような因子に従って必要に応じて調節できることを認識する。
【００７７】
２個のオリゴヌクレオチドは、重合反応、例えばＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲを含むＰＣＲにおけるプライマーとして働き得る。ＰＣＲにおいては、特定ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、従ってポリメラーゼによるＤＮＡ合成の開始を促進する２個のプライマーを使用する。プライマーは相補的ＤＮＡ鎖に結合し、反対方向のＤＮＡ合成を開始させる。３番目のオリゴヌクレオチドは、増幅された配列内に含有される核酸配列の少なくとも一部に結合することにより、ＰＣＲ増幅配列を検出するためのプローブとして働き得る。オリゴヌクレオチドの少なくとも１個は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。ペプチド核酸は、通常ＤＮＡ及びＲＮＡ内に存在する、デオキシリボース又はリボース糖骨格がペプチド骨格に置き換えられた核酸分子である。ＰＮＡを作製する方法は当分野において公知である（例えばＮｉｅｌｓｏｎ，２００１，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：１６参照）。
【００７８】
ある実施形態では、微生物中に含有される標的核酸配列を検出することが望まれ得る。そこで、オリゴヌクレオチドの少なくとも１個を検出可能な物質で修飾し得る。適切な検出可能物質は、蛍光染料のような染料、３２Ｐのような放射性標識及び１以上の付加的な分子の結合によって検出される分子を含む。例えばオリゴヌクレオチドは、１以上の抗体に結合することによって検出され得る、ジオキシゲニンの付加によって修飾し得る。抗体もまた、１以上の検出可能な物質を含むように修飾し得る。検出可能物質はオリゴヌクレオチドプローブ上に位置し得るか、又は検出可能物質は、増幅反応におけるプライマーとして働くオリゴヌクレオチドの１個以上に位置し得る。
【００７９】
検出可能物質がリアルタイムＰＣＲにおいて使用される蛍光染料である場合、オリゴヌクレオチドはまた、消光剤で標識し得る。リアルタイムＰＣＲは一般に、隣接位置に保持される蛍光レポーターと消光剤を有するプローブで実施される。消光剤とレポーターの密接な近接がこの蛍光を妨げ、蛍光が見られるのはプローブが分解したときだけである。このプロセスは、関与するポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性に依存する。ＤＮＡの融解して、プローブは鋳型ＤＮＡの対象領域内のこの相補的配列に結合することができる（プライマーも同様である）。ポリメラーゼを活性化するためにＰＣＲを加熱するとき、ポリメラーゼはプライミングされた一本鎖ＤＮＡに対する相補鎖の書き込みを開始する。重合が持続して、この相補的配列に結合したプローブに達する。化学的には、ポリメラーゼがプローブに「過剰書き込みし」、これを別々のヌクレオチドに分解して、これによって蛍光レポーターと消光剤を分離する。これは蛍光の上昇を生じさせる。ＰＣＲが進行すると共に、ますます多くの蛍光レポーターがこの消光剤から遊離され、広く定義された蛍光の幾何上昇を生じさせる。これは、最終的な、及び従って最初のＤＮＡの量の正確な測定を可能にする。
【００８０】
特定実施形態では、本発明は、試料中のマイコプラズマを検出するのに適した１以上のオリゴヌクレオチドを提供する。意外にも、本発明者らは、複数のマイコプラズマ種のゲノムの少なくとも一部に特異的に結合する複数のオリゴヌクレオチドを発見した。従ってある実施形態では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１２種のマイコプラズマに特異的に結合する。本発明に従った１以上のオリゴヌクレオチドを用いて検出し得るマイコプラズマ種は、マイコプラズマ・オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）、マイコプラズマ・ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ・シノヴィエ（Ｍ．ｓｙｎｏｖｉａｅ）、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ａ．ｌａｉｄｌｗａｉｉ、マイコプラズマ・アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｍ．ｐｉｒｕｍ、マイコプラズマ・サリバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）、マイコプラズマ・アルスリチジス（Ｍ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）を含む。
【００８１】
本発明はまた、ａ）試料から核酸を単離すること；ｂ）単離した核酸を本発明に従った複数のオリゴヌクレオチドと接触させること；ｃ）試料からの単離核酸の少なくとも一部を増幅し、これによって試料中の微生物を検出することを含む、試料中の微生物を検出する方法を提供する。前記方法は、増幅した核酸を、検出可能物質で標識したオリゴヌクレオチドプローブと接触させる任意のステップをさらに含み得る。あるいは、一部の実施形態では、例えばリアルタイムＰＣＲを使用する場合、ステップｂ）は、単離した核酸を、検出可能物質、例えばプローブからなる少なくとも１個のオリゴヌクレオチドと接触させることを含み得る。
【実施例１】
【００８２】
シュードモナス・エルギノーサからのｒＲＮＡの単離
トリプティックソイブロス（ＴＳＢ）４ｍｌ中で一晩増殖させたシュードモナス・エルギノーサ培養物を、３５℃で対数期まで増殖させるためにＴＳＢ２０ｍｌ中に移した。６００ｎｍでの測定光学密度は０．８８８であった。プレートの計数は、４．１Ｅ０８コロニー形成単位／ミリリットル（ｃｆｕ／ｍｌ）のコロニー濃度を明らかにした。培養物をＴＳＢ中で１００倍希釈した（４．１Ｅ０６ｃｆｕ／ｍｌ）。
【００８３】
ミリポア微量分配装置（図１）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に、提供されたＹＭＴ膜の代わりに１３ｍｍのＡＰＦＦ０．７ミクロンガラスフィルター（下部膜）及び１３ｍｍの混合セルロースエステル（ＭＣＥ）０．４５ミクロン膜（上部膜）を取り付けた。２番目のミリポア微量分配装置には、提供されたＹＭＴ膜の代わりに１３ｍｍのＭＣＥ０．４５ミクロンだけを取り付けた。
【００８４】
ＴＳＢ中に４．１Ｅ０６ｃｆｕシュードモナス・エルギノーサ１ｍｌを含む陽性対照を４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけてペレットにした。
【００８５】
微量分配装置にシュードモナス・エルギノーサ（４．１Ｅ０８ｃｆｕ又は４．１Ｅ０６ｃｆｕ）１ｍｌを添加した。負荷した装置を４℃、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ろ液を廃棄した。ＴＥ中の鶏卵白リゾチーム（１００μｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ）を微量分配装置に添加した。室温で上部膜と１０分間接触させた後、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からの２５−５０％チオシアン酸グアニジニウムを含むＲＬＴ緩衝液３５０ｕｌ及びエタノール２５０μｌを含む溶液６００μｌを添加し、５分間上部膜上に置いた。装置を４℃、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。２つの膜を有する微量分配装置からのろ液を廃棄した。１つの膜だけを有する微量分配装置からのろ液を、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からのＱｉａｇｅｎミニカラムに添加した。陽性対照ペレットを同様にマイクロチューブでの溶解に供し、その後同じくＱｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（登録商標）カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に添加した。微量分配装置及びＱｉａｇｅｎカラムを、２．５−１０％チオシアン酸グアニジニウム及び２．５−１０％エタノール含むＲＷ１緩衝液７００μｌ（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（登録商標））（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で洗浄し、４℃、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、その後Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からのＲＰＥ緩衝液５００μｌで２回洗浄した。全てのろ液を廃棄した。ＲＮアーゼ不含水１００μｌを２回連続的に添加して溶出を実施した。
【００８６】
２つの膜装置、Ｑｉａｇｅｎカラムと接続した１つの膜装置、又はＱｉａｇｅｎカラム単独からの溶出物試料を、製造者の指示に従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）１．２％アガロース前染色したＳｙｂｅｒｓａｆｅ  Ｅ−ｇｅｌ  ＰｏｗｅｒＢａｓｅ（商標）のウエルに適用した。ゲルを１５分間泳動させた。ＬＡＳ−３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  Ｇｌｏｂａｌ，Ｊａｐａｎ）でＵＶ励起及び青色光放出を用いて核酸バンドを視覚化した。結果は、本発明の二重膜ろ過装置から単離したｒＲＮＡが、いかなる見かけ上のゲノムＤＮＡ汚染も含まない１６ｓ及び２３ｓ  ＲＮＡを生じたことを明らかにする。これに対し、Ｑｉａｇｅｎカラムを通した試料は、有意の検出可能なゲノムＤＮＡバンドを有した（図８）。ＭＣＥフィルター上で溶解し、その後Ｑｉａｇｅｎカラムを通した試料は、見かけ上のゲノムＤＮＡ汚染を有さなかった（データは示していない）。
【実施例２】
【００８７】
単離ＲＮＡの定量
上記実施例１で述べたようにＭＣＥ膜、次にガラス膜を通して並びにＭＣＥ膜、次にＱｉａｇｅｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を通して処理した試料から単離したＲＮＡを定量するためにＲＴ−ＰＣＲを使用した。細菌細胞ペレット（同じく上記実施例１で述べた）を対照として使用した。
【００８８】
以下の２３Ｓシュードモナス・エルギノーサ特異的プライマーを購入した。
【００８９】
【化１】
2008054660.tif 000002
【００９０】
蛍光タグ及び消光剤で標識した上記プローブを用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物の生産はプローブ上のタグ及び消光剤の切断を生じさせ、従って蛍光シグナルの生成をもたらし、この蛍光シグナルを、標準曲線と共に使用して、ＰＣＲ産物を定量した。公知濃度のシュードモナス・エルギノーサｒＲＮＡ転写産物を、出現時間（ＣＴ）及び核酸分子の標準を生成するために使用した。閾値サイクル数（ＣＴ）は、ＲＴ−ＰＣＲの反応についての蛍光シグナルがあらかじめ定められた蛍光閾値と交差する部分サイクル数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｃｙｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ）を指す。ｒＲＮＡコピー数をＣＴ値と相関させるために、シュードモナス・エルギノーサｒＲＮＡの公知量とＣＴ値の間の直線関係をまず確立した。この標準曲線を、次に、処理した試料から精製したシュードモナス・エルギノーサｒＲＮＡのコピー数を測定するために使用した。
【００９１】
ワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックスキット（ＡＢＩ）を使用した。１５μｌの最終容量になるように、正プライマー（３００ｎＭ）を逆プライマー（１０ｎＭ）、プローブ（５０ｎＭ）、２Ｘ  ＲＴ−ＰＣＲミックス、逆転写酵素及び試料からの溶出物ＲＮＡ１０μｌと混合した。ＡＢＩ７０００サイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）において、以下のサイクリングプログラムを実施した。
【００９２】
１．５０℃、３０分間
２．９５℃、１０分間
３．９５℃、０．１５分間、４０サイクル
４．６２℃、１分間。
【００９３】
逆転写酵素を含む及び含まない、試料及び陽性及び陰性対照（鋳型なし）中に存在するＲＮＡの定量を三重で実施した。
【００９４】
ガラスフィルターでの捕獲の前にＭＣＥ膜を使用することによって得られる選択的ＲＮＡ精製の程度を、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）（リアルタイムＰＣＲ）を用いて明らかにした（図９及び表１）。各々の試料についてのＤＮＡ対ＲＮＡの相対量を、各々の試料について逆転写酵素の存在下と不在下でＰＣＲを実施することによって確立した。逆転写酵素の不在下では、ゲノムＤＮＡだけが増幅された。逆転写酵素の存在下では、その後ＰＣＲを実施したときＤＮＡとＲＮＡの両方が増幅されたが、特定標的配列についてのＲＮＡの出発コピー数は、ゲノムＤＮＡに由来する出発コピーに比べて実質的に過剰（≧１０００の係数）であった。この事実のために、リボソームＲＮＡに関するＰＣＲで逆転写酵素を使用したとき、認められた増幅シグナルは基本的にＲＮＡのシグナルだけであった。逆転写酵素の存在下と不在下での標的遺伝子コピー数の比率（公知の出発核酸濃度による標準曲線から導かれる）を測定することにより、ＭＣＥ膜上での捕獲細胞の溶解に関してゲノム汚染ＤＮＡの劇的な低下が達成された。増幅核酸シグナルについてのコピー数は、実験的ＣＴ値を、シュードモナス・エルギノーサｒＲＮＡの公知量に関して定義した標準曲線上のこれの対応するコピー数値に相関させることによって決定した。ｎｏＲＴ（逆転写酵素なし）コピー数は、試料中に存在するＤＮＡコピーの数（又はＲＮＡを所望する場合はＤＮＡ汚染のレベル）を表わす。ペレット対照を標準として設定した場合、ＭＣＥ膜又は二重膜アプローチの使用によって達成されるＲＮＡ精製の程度は容易に決定された（表１）。３つの試料のｎｏＲＴ反応についてのコピー数は以下の数値を有した。陽性対照（６．６３Ｅ＋０７コピー）、ＭＣＥ膜、次にＱｉａｇｅｎカラム（１．４２Ｅ＋０６コピー）、ＭＣＥ／ＡＰＦＦ膜（３．０５Ｅ＋０５コピー）。ＭＣＥ膜を通して処理した試料は、はるかに少ない回収可能ＤＮＡを示し、従ってより純粋なＲＮＡ試料を提供する。従って、２桁に近い相対精製がＭＣＥ膜を使用して達成された（図９）。
【００９５】
【表１】
2008054660.tif 000003
【実施例３】
【００９６】
単離ＲＮＡのマルチスクリーン分析
シュードモナス・エルギノーサ細胞（１．８３Ｅ０６ｃｆｕ）を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎマニホールド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に挿入した、０．０１％ペプトンのあらかじめ湿らせた０．４５ミクロンＭＣＥ９６穴プレート上で捕獲した。次に、捕獲した細胞を０．０１％ペプトン３００ｕｌで洗った。１．０ミクロンのガラス繊維Ｂ型プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）をＭＣＥプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）の下に積み重ねた。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からのＲＬＴ緩衝液１００ｕｌ及びエタノール１０００μｌを含む溶液２００μｌを添加し、上部プレートの上に５分間置いた。溶解産物溶液のろ過後、上部フィルタープレートを除去し、廃棄した。ガラス繊維フィルタープレートをＲＷ１緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）２００μｌ及びＲＰＥ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）２００μｌで１回洗った。次に、ウエルを乾燥させるためにフィルタープレートをエタノール３００μｌで２回洗った。回収収集プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）をガラスフィルタープレートの下に加えた。各々ＲＮアーゼ不含水１００μｌでの連続溶出により、核酸をガラス繊維プレートから溶出した。
【００９７】
細菌リボソームＲＮＡの相対純度を測定するため、４８ウエル２％透明アガロースＥ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に、まず１：１０００希釈したＳｙｂｅｒ  Ｇｏｌｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）５μｌ及び試料溶出物１５μｌ又は０．５−１０Ｋｂ  ＲＮＡラダー６０ｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を負荷した。ゲルを３０分間泳動させた。ＬＡＳ−３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  Ｇｌｏｂａｌ，Ｊａｐａｎ）でＵＶ励起及び青色光放出を用いて核酸バンドを視覚化した。
【００９８】
細胞捕獲、溶解及び選択的核酸単離のプロセス全体を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅマルチスクリーンマニホールド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）のマルチフィルタープレート型を用いて実施した。細胞を、まずＭＣＥフィルタープレートでの真空ろ過によって捕獲した。次にガラス繊維フィルタープレートをＭＣＥフィルタープレートの下に置いた。ＱｉａｇｅｎのグアニジンベースのＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）の５０％溶液及びエタノールで細胞溶解を実施した。２つのプレートでのろ過は、ガラス繊維プレー上のＲＮＡ保持を生じさせた。上部ＭＣＥプレートを廃棄した後、ガラス繊維プレートをＱｉａｇｅｎ  ＲＷ１及びＲＰＥ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で洗った。次にエタノールろ過によってプレートを乾燥させた。水１００μｌによる２回の連続溶出を実施した。
【００９９】
結果は、見かけ上汚染ゲノムＤＮＡを伴わないリボソームＲＮＡ（１６Ｓ、２３Ｓ）が多重様式で得られることを明らかにした。
【実施例４】
【０１００】
細胞培養上清からのウイルスＤＮＡの単離と検出
マウスのパルボウイルス微小ウイルスに感染させた指標細胞系ヒトＮＢ−３２４Ｋから上清を収集した。上清のウイルス力価は８ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌと算定された。
【０１０１】
限外ろ過ポリエーテルスルホン膜（名目上の孔径２８ｎｍ）の２つの層を密封通気口付きドーム型Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ装置に挿入した（図６ａ）。２番目の密封通気口付きドーム型Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ装置は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＰＦＦガラス繊維膜（０．７ミクロン）を含有した。この装置を、ルアーロック型排出口を注入口に接続するルアースリップによって１つをもう１つの上に積み重ねた。
【０１０２】
ウイルス含有細胞培養上清０．５ｍｌを第一膜装置に適用した。第二装置を順次第一装置の後に置いた。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からの２５−５０％チオシアン酸グアニジニウムを含むＲＬＴ緩衝液５００ｕｌ及びエタノール５００μｌを含む溶液１ｍｌをシリンジによって添加し、１０分間上部膜上に置いた。シリンジを用いて装置を空気で洗い流すことによって過剰の液体を除去した。連続する密封通気口付きドーム型装置を、２．５−１０％チオシアン酸グアニジニウム及び２．５−１０％エタノールを含むＲＷ１緩衝液１ｍｌ（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（登録商標））（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で洗浄し、その後Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からのＲＰＥ緩衝液１ｍｌをシリンジで添加して２回洗浄した。全てのろ液を廃棄した。シリンジで空気を添加して微小分配装置を乾燥させた。装置を分離し、ヌクレアーゼ不含水５００μｌを添加して各々からの溶出を実施した。
【０１０３】
微小分配装置及びＱｉａｇｅｎ緩衝液によって単離したＤＮＡを定量するためにリアルタイムＰＣＲを使用した。あらかじめ定量したウイルス核酸を対照として使用した。正及び逆プライマー、蛍光標識及び消光剤と結合したプローブ、水、鋳型及びＡＢＩ  ２Ｘ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを、最終容量２０ｕｌになるように添加した。ＭＶＭに特異的な以下のプローブ及びプライマーを使用した；
正プライマー（ＭＶＭＪ０２２７５ｆ１）：
【０１０４】
【化２】
2008054660.tif 000004
【０１０５】
ＢｉｏＲａｄ  Ｃｈｒｏｍｏ４装置でサイクリングを実施した。１）５０℃、２分間、
２）９５℃、１０分間、３）９５℃、０．１５分間、４）６０℃、１分間、５）工程３に進む、３９回。
【０１０６】
【表２】
2008054660.tif 000005
【０１０７】
対照標準核酸は、予想されたように増幅した。ウイルスＤＮＡは、ＡＰＦＦ及び限外ろ過ポリエーテルスルホン（ＵＦ  ＰＥＳ）膜（表２ではＶＲと表わされている）から成功裏に回収され、検出された。ＡＰＦＦ膜はＵＦ  ＰＥＳ膜よりも多くの核酸を保持した。
【実施例５】
【０１０８】
マイコプラズマ・ヒオリニスからのｒＲＮＡの単離と定量
マイコプラズマ・ヒオリニスの１日培養物を、３７℃、７％ＣＯ２において、マイコプラズマブロス培地を含有する血清５０ｍｌ中で増殖させた。この培養物は、２．４×１０８ｃｆｕ／ｍｌのコロニー濃度を有した。培養物を０．１％ペプトン中で１０００倍希釈した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養物を計数し、１．１×１０７細胞／ｍｌの濃度を有することを認めた。
【０１０９】
１０ミクロンの名目上の孔径を有する２５ｍｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅポリプロピレンプレフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）と、０．５μｍ−０．１μｍポリエーテルスルホン膜（ＰＰ１０−ＨＶＥＰ）を含有する密封ドーム型通気口付きＭｉｌｌｉｐｏｒｅ装置を用意した。２５ｍｍ  ＡＰＦＦガラスフィルターを含有する第二装置も用意した。
【０１１０】
陽性対照は、細菌を含有する溶液試料についての製造者の提示プロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を通して処理した、０．１％ペプトン１ｍｌ中２．４×１０５のマイコブラズマ・ヒオリニスであった。
【０１１１】
試料を導入する前に、１０ｍｌシリンジを用いて０．１％ペプトン３ｍｌを各々の装置に通した。２個のＰＰ１０−ＨＶＥＰ装置に０．１％ペプトン３ｍｌを添加した。２個のＰＰ１０−ＨＶＥＰ装置に、０．１％ペプトン３ｍｌ中の１００倍希釈マイコプラズマ・ヒオリニス１００μｌを添加した。さらに２個のＰＰ１０−ＨＶＥＰ装置に、ＣＨＯ細胞懸濁液３ｍｌ中の１００倍希釈マイコプラズマ・ヒオリニス１００μｌを添加した。試料を添加し、１０ｍｌシリンジで装置に通した。各装置に付きＱｉａｇｅｎ  ＲＬＴ緩衝液＋エタノール（１：１）溶液１ｍｌを１０ｍｌシリンジに取り、液体１又は２滴が装置の底部から出現するまで装置に添加した。ＡＰＦＦ装置を各々のＰＰ１０−ＨＶＥＰ装置の底部にしっかりと付加した。ＲＬＴ−エタノール溶液を室温で５分間フィルター上に置き、その後溶液を装置から除去した。装置を分離し、ＡＰＦＦフィルターを有する装置をさらに処理した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＷ１緩衝液１ｍｌを１０ｍｌシリンジでＡＰＦＦフィルター装置に通した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＰＥ緩衝液１ｍｌを１０ｍｌシリンジでＡＰＦＦフィルター装置に通し、その後１回反復した。次にヌクレアーゼ不含水５００μｌをＡＰＦＦフィルター装置に添加し、通過させて、チューブに収集した。
【０１１２】
装置を通して処理した試料をウルトラフリーザーで３０分間凍結し、その後Ｓａｖａｎｔ  ＤＮＡ１２０  ＳｐｅｅｄＶａｃ（中、手動設定でのシステム）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に入れた。ＳｐｅｅｄＶａｃでの濃縮の間、試料には熱を適用しなかった。乾燥物質をヌクレアーゼ不含水５０μｌに再懸濁した。
【０１１３】
リアルタイムＰＣＲを実施した。出現時間（ＣＴ）及び核酸分子の標準を生成するために公知濃度のＲＮＡ転写産物を使用した。閾値サイクル数（ＣＴ）は、ＲＴ−ＰＣＲの反応についての蛍光シグナルがあらかじめ定められた蛍光閾値と交差する部分サイクル数を指す。ｒＲＮＡコピー数をＣＴ値と相関させるために、マイコプラズマ・ヒオリニスｒＲＮＡの公知量とＣＴ値の間の直線関係を最初に確立した。この標準曲線を、次に、処理した試料から精製したマイコプラズマ・ヒオリニスｒＲＮＡのコピー数を測定するために使用した。
【０１１４】
ワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用した。２５μｌの最終容量になるように、正プライマー（４００ｎＭ）を逆プライマー（４００ｎＭ）、プローブ（３００ｎＭ）（蛍光タグ及び消光剤で標識）、２Ｘ  ＲＴ−ＰＣＲミックス、逆転写酵素、及び試料からの溶出物ＲＮＡ５μｌと混合した。このアッセイで使用したプライマー及びプローブは以下の通りであった。
【０１１５】
【化３】
2008054660.tif 000006
【０１１６】
ＡＢＩ７０００サイクラーにおいて、以下のサイクリングプログラムを実施した。
【０１１７】
１．５０℃、３０分間
２．９５℃、１０分間
３．９５℃、０．１５分間、４０サイクル
４．５５℃、１分間。
【０１１８】
逆転写酵素を含む及び含まない、試料及び陽性及び陰性対照（鋳型なし）中に存在するＲＮＡの定量を三重で実施した。結果を表３に示す。
【０１１９】
【表３】
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【０１２０】
試料Ｎｅｇ  Ｎｏ．１及びＮｅｇ  Ｎｏ．２は陰性対照であり、マイコプラズマは存在しなかった。試料Ｍｙｃｏ  Ｎｏ．３及びＭｙｃｏ  Ｎｏ．４は、マイコプラズマを有するがＣＨＯ細胞を有さず、膜を通して処理された。試料ＣＨＯ＋Ｍｙｃｏ  Ｎｏ．５及びＣＨＯ＋Ｍｙｃｏ  Ｎｏ．６は、マイコプラズマとＣＨＯ細胞の両方を有し、膜を通して処理された。試料Ｍｙｃｏ  Ｔｕｂｅ  Ｎｏ．１及びＭｙｃｏ  Ｔｕｂｅ  Ｎｏ．２は、チューブ内でペレット化され、処理されたマイコプラズマを有する。試料、溶解ろ液Ｎｏ．１、溶解ろ液Ｎｏ．２、溶解ろ液Ｎｏ．３、溶解ろ液Ｎｏ．４、溶解ろ液Ｎｏ．５及び溶解ろ液Ｎｏ．６は、それぞれ試料Ｎｅｇ  Ｎｏ．１、Ｎｅｇ  Ｎｏ．２、Ｍｙｃｏ  Ｎｏ．３、Ｍｙｃｏ  Ｎｏ．４、ＣＨＯ＋Ｍｙｃｏ  Ｎｏ．５及びＣＨＯ＋Ｍｙｃｏ  Ｎｏ．６への溶解緩衝液の添加後のろ液を指す。ろ液は、製造者の指示に従ってＱｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙ（登録商標）  Ｍｉｎｉｋｉｔカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して処理した。試料ＮｏＲＴは、試料Ｍｙｃｏ  Ｎｏ．３及びＭｙｃｏ  Ｎｏ．４に関して逆転写酵素の不在下で実施した増幅反応を指し、試料中のＤＮＡ汚染の指標として含まれる。
【０１２１】
本明細書及び特許請求の範囲の中で使用する成分の量、反応条件等を表わす全ての数字は、全ての場合に「約」という用語によって修正されると理解されるべきである。従って、異なる指示がない限り、本明細書及び付属の特許請求の範囲において述べる数字パラメータは、本発明によって得られることを目指す所望特性に依存して変動し得る近似値である。少なくとも、及び特許請求の範囲の均等の原則の適用を制限しようとするのでなく、各々の数字パラメータは、有効桁数及び通常の数字丸めアプローチに照らして解釈されるべきである。
【０１２２】
当業者に明白であるように、本発明の多くの修正及び変法が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく実施し得る。ここで述べる特定実施形態は例としてのみ提供され、いかなる意味においても限定を意図しない。明細書及び実施例は単なる説明とみなされ、本発明の真の範囲と精神は以下の特許請求の範囲によって指示されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１ａ】微量分配装置からなる本発明のろ過装置の一例を示す。
【図１ｂ】微量分配装置からなる本発明のろ過装置の一例を示す。
【図２】本発明のろ過装置の一例を示す。
【図３ａ】多数の試料又は大容量の試料を受け取るのに適したマルチウエル形式の本発明のろ過装置の一例を示す。
【図３ｂ】多数の試料又は大容量の試料を受け取るのに適したマルチウエル形式の本発明のろ過装置の一例を示す。
【図４】多数の試料又は大容量の試料を受け取るのに適したマルチウエル形式の本発明のろ過装置のもう１つ別の例を示す。
【図５】単一試料型の本発明のろ過装置を示す。
【図６ａ】通気口付き及び通気口なしの閉鎖型の本発明のろ過装置を示す。
【図６ｂ】積み重ね型の本発明のろ過装置を示す。
【図７】通気口付き閉鎖型の本発明のろ過装置を含む制御可能な自動システムを示す。
【図８】ＲＮＡｅａｓｙ（登録商標）カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて単離したｒＲＮＡと比較して、本発明の方法に従って単離したｒＲＮＡを示すアガロースゲルの写真である。
【図９】試料からのＲＮＡの相対精製を示すグラフである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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