(57)【要約】【課題】  Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）感染による肝疾患の予防または治療に用いるための医薬組成物を提供すること。【解決手段】  骨形成因子７(bone morphogenetic protein 7; BMP-7)を有効成分とする、HCV感染による肝疾患を予防または治療するための医薬組成物が開示される。本発明の医薬組成物は、HCV感染患者においてHCV感染量を低減させるのに特に有用である。BMP-7を有効成分とする本発明の医薬組成物は、単独で投与してもよく、インターフェロン(IFN)を有効成分とする製剤またはリバビリンを有効成分とする製剤と併用投与してもよい。【選択図】  図２
2008169116.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
BMP-7を有効成分とする、HCV感染による肝疾患を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項２】
BMP-7を有効成分とする、HCV感染量を低減させるための医薬組成物。
【請求項３】
BMP-7を有効成分とする、インターフェロン製剤と併用してHCV感染量を低減させるための医薬組成物。
【請求項４】
BMP-7を有効成分とする、リバビリン製剤と併用してHCV感染量を低減させるための医薬組成物。
【請求項５】
BMP-7およびインターフェロンを有効成分とする、HCV感染量を低減させるための医薬組成物。
【請求項６】
BMP-7およびリバビリンを有効成分とする、HCV感染量を低減させるための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）感染を伴う疾患を予防および治療するための組成物に関し、とくにHCV感染量を低減させる薬剤療法に用いる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
HCVの感染はＣ型肝炎、肝硬変および肝癌等の疾患発症の原因となることが広く知られている（非特許文献１：Seeff, Am J Med.  1999, 107: 10S-15S; 非特許文献２：Hu and Tong, Hepatology 1999, 29: 1311-1316）。
【０００３】
HCVが感染後に消失すると、HCV感染によって起こる疾患の予防または治療に効果があることが認められており、HCV量を低減させるための抗HCV薬剤治療が行われている（非特許文献３：Liang and Heller, Gastroenterology 2004, 127: S62-71）。
【０００４】
現在、抗HCV薬剤療法に用いられる代表的な医薬品は各種のインターフェロン(IFN)製剤である。IFNはウイルスが感染した細胞の膜に結合し、細胞内を抗ウイルス状態にすることによりさまざまな種類のウイルスの増殖を抑制することが知られていた（非特許文献４：Friedman, Bacteriol Rev 1977, 41: 453-567）。HCVレプリコン試験系を用いて、IFNがHCVに対してもこの作用様式により増殖を抑えることが示され、HCVウイルスのNS5Aタンパク質がIFN-αの効果に関係することが明らかとなっている（非特許文献５：Blight et al., Science 2000, 290: 1972-1974; 非特許文献６：Frese et al., J Gen Virol 2001, 82: 723-733）。
【０００５】
ヒトの産生するIFNにはさまざまな種類が存在するが、一般的にIFN-α、IFN-β、IFN-γのいずれも抗HCV作用を示すことが認められている（非特許文献７：Okuse et al., Antiviral Res 2005, 65: 23-34）。臨床で用いられるIFN製剤の有効成分には、ヒトリンパ芽球由来のIFN-α、リコンビナントIFN-α-2a、リコンビナントIFN-α-2b、ヒト線維芽細胞由来のINF-βなどさまざまな種類がある。また、これらの天然型のIFNの代わりに修飾を施したIFNを用いた製剤、すなわちアミノ酸配列を一部改変したコンセンサスIFNや、ポリエチレングリコールを結合させたPEG化IFNもある。
【０００６】
しかしながら、IFNは、抗HCV療法に用いられる用量において高率に副作用を生じさせる。生じる副作用には、発熱、全身倦怠感、食欲不振、白血球減少、血小板減少、脱毛、精神症状などがある。また、IFNに対する抗体が産生される場合がある。さらに、IFN製剤単独による治療では、HCV感染を消失できない患者やHCV量が低減しない患者が数多く存在する。
【０００７】
一方、抗ウイルス剤であるリバビリンをIFN製剤と併用し、HCV量を低減させる効果を高める治療法も行われるようになった。リバビリン単独、およびIFNとの併用による抗HCV効果はHCVレプリコン試験系において確認されている（非特許文献８：Tanabe et al., J Infect Dis 2004, 189: 1129-1139）。
【０００８】
しかしながら、この２剤を併用することによっても依然として十分な臨床効果は認められていない。例えば、Herrine S.K.は、この２剤の併用療法を一般的な抗HCV療法として挙げ、慢性感染患者に対してPEG化インターフェロンの皮下注射を週一回行いリバビリンの経口服用を毎日行う治療を施した際の治療成績を要約し、その持続的なウイルス学的反応が見られた患者の割合はおおよそ55%と述べている（非特許文献９：Herrine, Ann Internal Med 2002, 136: 747-757）。すなわち、この報告は、おおよそ患者の45%では十分な臨床効果が認められないことを示している。
【０００９】
また、リバビリンを用いた治療では副作用として重篤な貧血が生じる場合があり、その場合には薬剤の用量を少なくするか中止せざるを得ない。また、リバビリンはIFNと同様に妊娠の可能性がある女性への使用に慎重になる必要があるが、これに加えて、リバビリンは精子形成に悪影響を及ぼすため男性の場合も使用中は避妊を推奨されるという問題点がある。以上のことから、リバビリンに代わる薬剤が求められている。
【００１０】
これまで述べたように、現在行われている抗HCV薬剤療法は十分に満足できるものではなく、新たな治療法が求められている。
【００１１】
骨形成因子７(bone morphogenetic protein 7; BMP-7)は、別名osteogenic protein 1(OP-1)あるいはeptotermin alphaと呼ばれる、生体内に存在するタンパク質である。
【００１２】
生体内に骨の成長に関わるタンパク質が存在することが見出され、骨形成因子(BMP)と名づけられた。このタンパク質を骨の形成や成長を促す薬剤として使用することが提案されている（特許文献１：US4294753）。後に、BMPには数種類のタンパク質が存在することが明らかになり、その1つがBMP-7として同定された。すなわち、BMP-7は骨の成長を促すタンパク質として発見された（非特許文献１０：Ozkaynak et al., EMBO J 1990, 9 9: 2085-2093; 非特許文献１１：Celeste et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 9843-9847; .非特許文献１２：Sampath et al., J Biol Chem 1992, 267: 20352-20362）。
【００１３】
BMP-7は、BMP7遺伝子がコードするアミノ酸431個の前駆タンパク質として合成され、ホモもしくはヘテロ2量体を形成し、糖化された後にプロテアーゼによる切断を受けた、C末端139個のアミノ酸からなるタンパク質であり（非特許文献１２：Sampath et al., J Biol Chem 1992, 267: 20352-20362; 非特許文献１３：Jones et al., Growth Factors 1994, 11: 215-225）、その遺伝子の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配列は公知である。
【００１４】
BMP-7の骨成長を促す作用を応用した産業上の利用が進められ、すでにチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)によって生産されたリコンビナントヒトBMP-7が、骨折の修復を促進する医薬品として臨床治療に用いられている。
【００１５】
また、歯の成長に関するBMP-7の関与が調べられており（非特許文献１４：Rutherford et al., Arch Oral Biol 1993, 38: 571-576）、BMP-7の歯周病治療への応用方法も発明されている（特許文献２：US5656593）。
【００１６】
BMP-7はラットクローナル骨芽細胞の骨肉腫細胞ROS 17/2.8では、細胞増殖を抑制し、骨芽細胞の形質を発現させ、ヒト胚カルチノーマ細胞に対しても増殖抑制作用を示すと報告されている（非特許文献１５：Maliakal et al., Growth Factors 1994, 11: 227-234; 非特許文献１６：Andrews et al., Lab Invest 1994, 71: 243-251）。
【００１７】
マウスにおいて各種臓器の発現量を比較した研究からBMP-7の発現量は腎臓に多いことが見出された（非特許文献１７：Ozkaynak et al., Biochem Biophys Res Commun 1991, 179: 116-123）。BMP-7は腎臓の虚血再灌流障害に対して保護作用を示すことが知られている（非特許文献１８：Vukicevic et al., J Clin Invest 1998, 102: 202-214）。
【００１８】
この他に、次のようなBMP-7の作用が知られている： 心筋の虚血再灌流障害に対して保護作用を示す・脳の虚血再灌流障害に対して保護作用を示す・血管新生に関与する・神経細胞の接着や集合することに関与する・交感神経細胞の樹状突起の成長を促進する（非特許文献１９：Lefer et al., J Mol Cell Cardiol 1992, 24: 585-593; 非特許文献２０：Perides et al., Neurosci Lett 1995, 187: 21-24; 非特許文献２１：Ramoshebi and Ripamonti, Anat Rec 2000, 259: 97-107; 非特許文献２２：Perides et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 10326-10330; 非特許文献２３：Lein et al., Neuron 1995, 15: 597-605）。
【００１９】
また、BMP7遺伝子がアンドロゲンにより前立腺において発現すると報告されている（非特許文献２４：Thomas et al., Prostate 1998, 37: 236-245）。さらに、BMP-7は卵巣に作用し黄体化を抑制することが示唆されている（非特許文献２５：Shimasaki et al., Proc Natl Acad Sci 1999, 96: 7282-7287）。
【００２０】
ヒト好中球、単球、およびヒト胎児皮膚線維芽細胞において、BMP-7と構造的な相同性が高いTGF-βの作用と比較したところ、細胞遊走作用を有する点は共通していたが、BMP-7はTGF-βと異なり線維形成誘導作用は有していなかった（非特許文献２６：Postlethwaite et al., J Cell Physiol 1994, 161: 562-570）。BMP-7は一部の細胞にアポトーシス誘発作用を示すことが知られている（非特許文献２７：Monroe and Sanders, Mol Cell Biol 2000, 13: 4626-4636）。
【００２１】
BMP-7が胎生期に発現し、中胚葉、脳、および眼の正常な形成に必要であることが示されている（非特許文献２８：Hogan, Curr Opin Genet Dev 1996, 6: 432-438; 非特許文献２９：Arkell and Beddington, Development 1997, 124: 1-12; 非特許文献３０：Luo et al., Genes Dev 1995, 9: 2808-2820）。
【００２２】
BMP-7は肝臓においても発現が見られる（非特許文献１７：Ozkaynak et al., Biochem Biophys Res Commun 1991, 179: 116-123）。肝細胞癌細胞においてBMP-7による細胞内smadを介したシグナル伝達経路の活性化がGlypican 3によって抑制されるという報告がなされている（非特許文献３１：Midorikawa et al., Int J Cancer 2003, 103: 455-465）。したがって、少なくとも肝細胞癌細胞に対してはBMP-7が作用を示すことが示唆される。
【００２３】
しかしながら、BMP-7の肝臓における役割、とくに、BMP-7の肝炎における役割およびBMP-7のHCV増殖に対する役割についてはこれまでに知られていなかった。
【００２４】
【特許文献１】US4294753
【特許文献２】US5656593
【非特許文献１】Seeff, Am J Med.  1999, 107: 10S-15S
【非特許文献２】Hu and Tong, Hepatology 1999, 29: 1311-1316
【非特許文献３】Liang and Heller, Gastroenterology 2004, 127: S62-71
【非特許文献４】Friedman, Bacteriol Rev 1977, 41: 453-567
【非特許文献５】Blight et al., Science 2000, 290: 1972-1974
【非特許文献６】Frese et al., J Gen Virol 2001, 82: 723-733
【非特許文献７】Okuse et al., Antiviral Res 2005, 65: 23-34
【非特許文献８】Tanabe et al., J Infect Dis 2004, 189: 1129-1139
【非特許文献９】Herrine, Ann Internal Med 2002, 136: 747-757
【非特許文献１０】Ozkaynak et al., EMBO J 1990, 9 9: 2085-2093
【非特許文献１１】Celeste et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 9843-9847
【非特許文献１２】Sampath et al., J Biol Chem 1992,  267: 20352-20362
【非特許文献１３】Jones et al., Growth Factors 1994, 11: 215-225
【非特許文献１４】Rutherford et al., Arch Oral Biol 1993, 38: 571-576
【非特許文献１５】Maliakal et al., Growth Factors 1994, 11: 227-234
【非特許文献１６】Andrews et al., Lab Invest 1994, 71: 243-251
【非特許文献１７】Ozkaynak et al., Biochem Biophys Res Commun 1991, 179: 116-123
【非特許文献１８】Vukicevic et al., J Clin Invest 1998, 102: 202-214
【非特許文献１９】Lefer et al., J Mol Cell Cardiol 1992, 24: 585-593
【非特許文献２０】Perides et al., Neurosci Lett 1995, 187: 21-24
【非特許文献２１】Ramoshebi and Ripamonti, Anat Rec 2000, 259: 97-107
【非特許文献２２】Perides et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 10326-10330
【非特許文献２３】Lein et al., Neuron 1995, 15: 597-605
【非特許文献２４】Thomas et al., Prostate 1998, 37: 236-245
【非特許文献２５】Shimasaki et al., Proc Natl Acad Sci 1999, 96: 7282-7287
【非特許文献２６】Postlethwaite et al., J Cell Physiol 1994, 161: 562-570
【非特許文献２７】Monroe and Sanders, Mol Cell Biol 2000, 13: 4626-4636
【非特許文献２８】Hogan, Curr Opin Genet Dev 1996, 6: 432-438
【非特許文献２９】Arkell and Beddington, Development 1997, 124: 1-12
【非特許文献３０】Luo et al., Genes Dev 1995, 9: 2808-2820
【非特許文献３１】Midorikawa et al., Int J Cancer 2003, 103: 455-465
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）感染による肝疾患の予防または治療方法として、HCV感染量を低減させる抗HCV療法に用いる医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、骨形成因子７(bone morphogenetic protein 7; BMP-7)を有効成分とする、HCV感染による肝疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。BMP-7前駆体タンパク質のアミノ酸をコードするBMP7遺伝子のmRNA配列はGenBank X51801に記載されている。プロテアーゼによって切断された後の成熟型のBMP-7（BMP-7前駆体タンパク質293-431；アミノ酸残基数139）の構造は、Celeste et al. (Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 9843-9847)に記載されている。本発明に用いるBMP-7としては、BMP7の全長遺伝子から生産される前駆体タンパク質を用いてもよく、成熟型のBMP-7を用いてもよい。また、BMP-7の生理活性を有する限り構造に修飾を加えたタンパク質を用いてもよく、例えば、特許US 5656593に開示される方法による短縮した成熟型BMP-7（38-139）またはアミノ酸を改変したタンパク質を用いてもよい。
【００２７】
HCV感染による肝疾患には、肝炎、肝硬変およびウイルス性肝細胞癌が含まれる。本発明の医薬組成物は、HCV感染患者においてHCV感染量を低減させるのに特に有用である。
【００２８】
別の観点においては、本発明はBMP-7を有効成分とする医薬組成物を、インターフェロン(IFN)を有効成分とする製剤またはリバビリンを有効成分とする製剤と併用投与することによる抗HCV療法を提供する。
【００２９】
IFNを有効成分とする製剤は、それ自体抗ウイルス効果を示すIFN製剤の中から選択することができる。天然型のIFNの例として、ヒトリンパ芽球由来のIFN-α、リコンビナントIFN-α-2a、リコンビナントIFN-α-2b、ヒト線維芽細胞由来のINF-βが挙げられる。また、これらの天然型のIFNの代わりに修飾IFNを用いた製剤、例えば、アミノ酸配列を一部改変したコンセンサスIFNや、ポリエチレングリコールを結合させたPEG化IFNを含む製剤を用いることもできる。しかしながら、本発明で用いることができるIFNはこれらの例に限られるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の医薬組成物は、BMP-7を有効成分とすることを特徴とする。本発明の医薬組成物に含まれるBMP-7は公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、市販のBMP-7タンパク質を用いてもよく、種々の方法で調整したものを用いてもよい。BMP-7の製造法としては、例えば、BMP-7をコードするＤＮＡを，適当な発現ベクターに中に組み込み，これを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して，所望のタンパク質を発現させることができる。BMP-7を発現させるために用いることができる宿主細胞の例としては，限定されないが，大腸菌，枯草菌等の原核生物宿主，および酵母，真菌，昆虫細胞，哺乳動物細胞等の真核生物宿主が挙げられる。
【００３１】
ベクターは，BMP-7をコードするＤＮＡの発現を駆動するプロモーター領域を含み，さらに転写および翻訳の制御配列，例えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列，３’非コード領域，エンハンサー等を含んでいてもよい。プロモーターの例としては，原核生物宿主中で用いる場合には，ｂｌａプロモーター，ｃａｔプロモーター，ｌａｃＺプロモーター，真核生物宿主中で用いる場合には，ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，酵母解糖系酵素遺伝子配列プロモーター等が挙げられる。ベクターの例には，限定されないが，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，λｇｔｌ０，λｇｔ１１，ｐＭＡＭ−ｎｅｏ，ｐＫＲＣ，ＢＰＶ，ワクチニア，ＳＶ４０，２−ミクロン等が含まれる。さらに，シグナル配列を用いてBMP-7を分泌発現させるように，あるいは，BMP-7を別のタンパク質との融合タンパク質の形で発現させるように，ベクターを構築することができる。そのような発現ベクターの構築は当該技術分野においてよく知られている。
【００３２】
BMP-7を発現するよう構築されたベクターは，トランスフォーメーション，トランスフェクション，コンジュゲーション，プロトプラスト融合，エレクトロポレーション，粒子銃技術，リン酸カルシウム沈澱，直接マイクロインジェクション等により，適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを含む細胞を適当な培地中で成長させてBMP-7を産生させ，細胞または培養上清から所望の組換えタンパク質を回収し，精製することにより，BMP-7タンパク質を得ることができる。精製は，サイズ排除クロマトグラフィー，ＨＰＬＣ，イオン交換クロマトグラフィー，および免疫アフィニティークロマトグラフィー等を用いて行うことができる。
【００３３】
また、宿主細胞中で発現されたタンパク質は、種々の翻訳後修飾を受ける場合がある。したがって、本発明の医薬組成物において用いられる組換えBMP-7タンパク質には、そのような翻訳後修飾を受けたタンパク質も含まれる。さらに、本発明の医薬組成物において用いられるBMP-7は、公知の無細胞タンパク質合成系、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物等によって調製することもできる。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することができる。例えば、薬学的に許容しうる担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００３５】
経口投与用には、BMP-7を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体と混合することにより、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方することができる。担体としては、当該技術分野において公知のものを広く使用することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤；白糖、ステアリンカカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の潤沢剤等を用いることができる。さらに錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、あるいは二重錠、多層錠とすることができる。
【００３６】
非経口投与用には、BMP-7を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうるベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００３７】
注射剤用の水溶性ベヒクルとしては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
【００３８】
油性ベヒクルとしてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００３９】
また、BMP-7の分散を制御するなどの目的で、担体、例えば、コラーゲン、ハイドロキシアパタイト、ヒアルロン酸、フィブリン、多糖、リポゾームと配合してもよい。調製された製剤は、経口剤または非経口投与剤として使用できる。
【００４０】
本発明の医薬組成物の適当な投与経路には、限定されないが、経口、直腸内、経粘膜、または腸内投与、または筋肉内、皮下、骨髄内、鞘内、直接心室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射が含まれる。投与経路は、患者の年齢や病状、併用する他の薬剤等を考慮して適宜選択することができる。
【００４１】
本発明の医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重1 kgあたり0.01 mgから1 mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり１回投与あたり0.02〜100 mgの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状、併用する他の薬剤など等を考慮して適宜選択することができる。また、本発明の医薬組成物をインターフェロン製剤またはリバビリン製剤と併用する場合には、これらの薬剤を同時に投与してもよく、別々に投与してもよい。
【００４２】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
HCVレプリコン系におけるBMP-7によるHCV増殖抑制
レプリコン試験系に用いた細胞としては、Tanabe et al., (J Infect Dis 2004, 189: 1129-1139)に記載されるHuh 7/Feo細胞を用いた。この細胞は、HCV-N, 1bから作成されたレプリコンプラスミドpHCV1bneo-delSのNeo遺伝子の代わりに、ホタルルシフェラーゼをネオマイシンホスホトランスフェラーゼにインフレームで融合したキメラ遺伝子コーディング(Feo)を導入したHCVレプリコンプラスミドを、ヒト肝臓癌細胞株Huh 7にトランスフェクションし、定常的な発現を示す細胞を選択することにより樹立した細胞株である。
【００４４】
Huh7/Feo細胞をBMP-7処置の20時間前から24ウエルプレートに2.5×104個／穴ずつ撒き、5%CO2下で37℃にて培養した。培地には、ダルベッコ改変最少必須培地(Sigma-Aldrich, Co.)にウシ胎児血清10%、ペニシリン100 IU/mL、ストレプトマイシン100 μg/mL、G418（和光純薬工業株式会社） 250 μg/mLを加えたものを用いた。
【００４５】
BMP-7は、R&D Systems Inc.製のリコンビナントヒトBMP-7の市販品を用いた。BMP-7をDMSOで溶解し培地にて希釈して培地に加え、50 ng/mLまたは100 ng/mLの濃度とした。BMP-7添加72時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼおよび蛋白量を測定した。ルシフェラーゼアッセイはLuciferase Assay System （Promega Corporation）およびルミノメーター（Promega Corporation）用いて定量した。蛋白量はProtein assay dye reagent (Bio-Rad Laboratories)およびBioPhotometer (Eppendorf AG)を用いて測定した。
【００４６】
HCVの増殖が多い場合には、ルシフェラーゼの発現が多くなりルシフェラーゼ活性は増加する。一方、宿主であるHuh7の増殖が抑制されると蛋白量は少なくなる。そのため、細胞あたりのHCVレプリコンの増殖能を評価するために、ルシフェラーゼ活性／蛋白量をその尺度に用いた。
【００４７】
薬剤処置72時間後のルシフェラーゼ活性および蛋白量を図１に示す。図中、棒はHCVレプリコンを導入したHuh7細胞の蛍光の相対光量を示す。蛍光強度はルシフェラーゼを挿入したHCVレプリコンの増殖に伴うルシフェラーゼ活性を反映する。折れ線は蛋白量を示す。蛋白量はHCVレプリコン宿主のHuh7の増殖の程度を反映する。
【００４８】
ルシフェラーゼ活性はBMP-7添加により濃度依存的に低下した。また、蛋白量もBMP-7添加により濃度依存的に減少した。図2に細胞あたりのHCV増殖量を評価するためのルシフェラーゼ活性／蛋白量を示した。この値は宿主のHuh7の増殖の程度を補正したHCVレプリコンの増殖の程度を反映する。
【００４９】
図２から明らかなように、BMP-7処置によりルシフェラーゼ活性／蛋白量の値は濃度依存的な低下を示した。したがって、BMP-7はHCVレプリコンの増殖能を抑制していることが示された。
【実施例２】
【００５０】
HCVレプリコン系におけるIFNおよびBMP-7によるHCV増殖抑制
薬剤処置条件を除いて、実施例１と同じ方法にて試験を実施した。インターフェロン(IFN)αには、PBL Biomedical Laboratories製のIFN-α2の市販品を用いた。IFN-αはDMSOで溶解し培地にて希釈した。IFN-αおよびBMP-7のそれぞれ単独または両方を培地に添加し、72時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性および蛋白量を測定した。
【００５１】
薬剤処置72時間後のルシフェラーゼ活性／蛋白量を図３に示す。蛋白量あたりの相対光量の値は、宿主のHuh7の増殖の程度を補正したHCVレプリコンの増殖の程度を反映する。BMP-7 100 ng/mL単独の適用によりHCV増殖度を示すルシフェラーゼ活性／蛋白量は低下した。ウエルあたり0.5 UのIFN-α添加は強い効果を示さなかった。一方、IFN-α 0.5 UおよびBMP-7 100 ng/mLの両方を適用することにより、IFN 1 U添加時に匹敵する強い相対光量／蛋白量の減少が認められた。以上の結果から、BMP-7がIFN-αのHCV増殖抑制効果を増強することが示された。
【実施例３】
【００５２】
HCVレプリコン系におけるリバビリンおよびBMP-7によるHCV増殖抑制
薬剤処置条件を除いて、実施例１と同じ方法にて試験を実施した。リバビリンは、Sigma-Aldrich Corporation製の市販品を用いた。リバビリンはDMSOで溶解し培地にて希釈した。薬剤処置の条件は、無処置、リバビリン 100 μM単独処置、あるいはリバビリン 100 μMとBMP-7 100 ng/mLの両方を処置する条件とした。薬剤を培地に添加後72時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性および蛋白量を測定した。各薬剤処置条件のルシフェラーゼ活性／蛋白量を無処置条件を1とした相対値として算出したところ、リバビリン単独処置条件0.52、リバビリンとBMP-7の両方を処置した条件0.26であった。以上の結果から、BMP-7がリバビリンのHCV増殖抑制効果を増強することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１はHCVレプリコン系におけるHCV増殖に対するBMP-7の効果を示す。
【図２】図２はHCVレプリコン系におけるHCV増殖に対するBMP-7の効果を示す。
【図３】図３はHCVレプリコン系におけるIFNおよびBMP-7によるHCV増殖抑制を示す。
【図１】
2008169116.tif 000003
【図２】
2008169116.tif 000004
【図３】
2008169116.tif 000005