(57)【要約】      （修正有）【課題】胃癌腫からのリンパ節転移を検出する方法を提供する。【解決手段】ａ）患者から生体サンプルを採取するステップと、ｂ）前記サンプルにおけるマーカーレベルを測定するステップと、を含み、前記レベルが所定のカットオフレベルより高いことが、胃癌腫からのリンパ節転移を示す、方法。前記マーカーは、遺伝子、遺伝子断片、または、その相補体、タンパク質、タンパク質断片、または、ポリペプチドであり、マイクロアレイを用いる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃癌腫からのリンパ節転移を診断する方法において、
ａ）患者から生体サンプルを採取するステップと、
ｂ）前記サンプルにおけるマーカーレベルを測定するステップと、
を含み、
前記レベルが所定のカットオフレベルより高いことが、胃癌腫からのリンパ節転移を示す、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記マーカーは、遺伝子、遺伝子断片、または、その相補体である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
前記マーカーは、タンパク質、タンパク質断片、または、ポリペプチドである、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
別の診断方法を使用すること、
をさらに含む、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、
前記別の診断方法は、血清アッセイを実施すること、を含む、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、
構成的に発現された遺伝子を測定すること、
をさらに含む、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、
少なくとも８０％の感度を有する、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、
少なくとも７０％の特異性を有する、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、
前記サンプルは、リンパ節組織を含む、方法。
【請求項１０】
胃癌腫患者に対する治療法を決定または調整する方法において、
ａ．胃癌患者から生体サンプルを採取するステップと、
ｂ．前記サンプルにおけるマーカーレベルを測定するステップと、
を含み、
前記レベルが、カットオフレベルより高いか、または、低いことが、疾患の経過または健康状態と一致しており、これにより、この疾患の経過または健康状態に対する治療法が、決定または調整される、
方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、
前記マーカーは、遺伝子、遺伝子断片、または、その相補体である、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法において、
前記マーカーは、タンパク質、タンパク質断片、または、ポリペプチドである、方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法において、
構成的に発現された遺伝子を測定すること、
をさらに含む、方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法において、
前記特異性は、少なくとも７０％である、方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の方法において、
前記感度は、少なくとも約８０％である、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、
マイクロアレイを用いて行われる、方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載の方法において、
マイクロアレイを用いて行われる、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法において、
増幅法を用いることにより行われる、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法において、
前記増幅法は、ＰＣＲである、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、
前記ＰＣＲは、ＲＴ−ＰＣＲである、方法。
【請求項２１】
請求項１０に記載の方法において、
増幅法を用いることにより行われる、方法。
【請求項２２】
生体サンプルでの胃癌の診断を確定するアッセイを行うためのキットにおいて、
マーカーを検出するための材料、
を含む、キット。
【請求項２３】
請求項２２に記載のキットにおいて、
マイクロアレイ、および、試薬、
を含む、キット。
【請求項２４】
請求項２２に記載のキットにおいて、
ＰＣＲ試薬、
を含む、キット。
【請求項２５】
請求項２２に記載のキットにおいて、
使用説明書、
を含む、キット。
【請求項２６】
請求項２２に記載のキットにおいて、
前記マーカーは、ＣＥＡ、ＭＵＣ２、および、ＣＫ−１９からなる、キット。
【請求項２７】
胃癌腫からのリンパ節転移を診断する方法において、
ａ）患者から生体サンプルを採取するステップと、
ｂ）前記サンプルにおけるマーカーレベルを測定するステップと、
を含み、
前記レベルが所定のカットオフレベルより高いことが、胃癌腫からのリンパ節転移を示し、
前記マーカーは、ＣＥＡ、ＭＵＣ２、および、ＣＫ−１９からなる、
方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法において、
別の診断方法を使用すること、
をさらに含む、方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法において、
前記別の診断方法は、血清アッセイを行うこと、を含む、方法。
【請求項３０】
請求項２７に記載の方法において、
構成的に発現された遺伝子を測定すること、
をさらに含む、方法。
【請求項３１】
請求項２７に記載の方法において、
少なくとも８０％の感度を有する、方法。
【請求項３２】
請求項２７に記載の方法において、
少なくとも７０％の特異性を有する、方法。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔発明の背景〕
世界的には毎年約８７６，０００例の新たな胃癌症例がある（シブヤ、メーザーズ他、２００２年(Shibuya, Mathers et al. 2002)）。米国での、２００５年の胃癌についての新たな症例と死亡数の推計は、それぞれ、２１，８６０例と１１，５５０例である（ジェマル、マレー他、２００５年(Jemal, Murray et al. 2005)）。胃癌腫は、最も一般的なタイプの（９０％〜９５％）胃癌であり、罹患率は順に、リンパ腫、カルチノイド、および、間葉系紡錘細胞腫瘍（mesenchymal spindle cell tumors）が続く（クマール、コトラン他、２００３年(Kumar, Cotran et al. 2003)）。
【０００２】
局所領域の完全制御は、胃癌を克服するための重要な治療であり、胃全摘術または胃亜全摘術、センチネルリンパ節郭清、拡大リンパ節郭清、および、転移により罹患した隣接する組織の切除（脾切除術および膵切除術など）がある（ハルトグリンク、ヴァン・デ・ヴェルデ、２００５年(Hartgrink and van de Velde 2005); キタガワ、フジイ他、２００５年 (Kitagawa, Fujii et al. 2005) ）。根治目的の手術の後に再発した全ての患者のうち、患者の８７．５％までは局所再発が原因であり、または、残りは局所リンパ節転移症であった（ソンガン、ボーネンカンプ他、１９９６年(Songun, Bonenkamp et al. 1996)）。
【０００３】
胃食道接合部（ＧＥＪ）癌腫を有する１４８名の患者を対象とする研究では、局所リンパ節における微小転移巣の存在が、予後不良の重要な指標であるという結論に達した（ヘーレン、ケルダー他、２００５年(Heeren, Kelder et al. 2005)）。胃癌からのリンパ節転移の、現在有力な病期分類／診断は、触診および術中凍結切片検査（intra-operative frozen section examination）によって行われている。リンパ節の凍結切片検査は、感受性７４％を示し得る（キタガワ、フジイ他、２００５年(Kitagawa, Fujii et al. 2005)）。
【０００４】
適当な遺伝子マーカーを用いる、遺伝子発現解析や、ＲＴ−ＰＣＲまたは定量ＰＣＲなどの検出技術は、胃癌の診断または予後のための代替法を提供することができる。これらの方法には、転移検出検査の感受性と精度をより優れたものにする可能性がある。これまでに報告されている遺伝子マーカーには、ＣＫ１９（マツダ、キタガワ他、２００４年(Matsuda, Kitagawa et al. 2004)）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、サイトケラチン２０（ＣＫ−２０）、および、ＭＡＧＥ−３（オカダ、フジワラ他、２００１年(Okada, Fujiwara et al. 2001)）、ＣＫ１８、ＭＵＣ１、ｈＴＲＴ（アジサカ、ミワ、２００３年(Ajisaka and Miwa 2003)）がある。残念なことに、公開されているデータが示すように、それらのほとんどは、試験された腫瘍組織および腫瘍細胞系の全てにおいて一貫して発現されない。組織学的検査によって確認された胃癌からの転移を伴うリンパ節の１５％（ＣＥＡ）から７０％以上（ＭＡＧＥ−３）では、ＲＴ−ＰＣＲによって、マーカーが検出され得なかった（オカダ、フジワラ他、２００１年(Okada, Fujiwara et al. 2001)）。ＣＫ２０は、膵臓癌腫、結腸癌腫、胃癌腫、および、肺癌腫からの血液中の散在性癌細胞（disseminated cancer cells）についてのＲＴ−ＰＣＲ検査のマーカーとして使用された（チャウソフスキー、ルチャンスキー他、１９９９年(Chausovsky, Luchansky et al. 1999); チェン、チェン他、２００４年(Chen, Chen et al. 2004)）。
【０００５】
ここでは、マーカーの組み合わせは、胃癌腫からの転移を伴うリンパ節で、正常なリンパ節でのそれらのバックグラウンド発現とは区別され得る、容易に検出できるレベルで一貫して発現されるということが確認されている。このマーカーの組み合わせは、胃癌腫、または、同様の細胞起源の癌腫（食道、膵臓、および、腸の癌腫など）からの散在性癌腫細胞の検出に有用である。
【０００６】
〔発明の概要〕
本発明の一態様では、胃癌腫からのリンパ節転移を検出するために、一連のマーカーが組み合わせて用いられる。胃癌腫からの転移を伴うリンパ節では、これらのマーカーの発現レベルは、正常なリンパ節の発現レベルよりも明示的に高い。マーカーの組み合わせは、ＣＫ１９マーカー、ＣＥＡマーカー、および、ＭＵＣ−２マーカーである。
【０００７】
本発明のもう１つの態様では、胃癌腫からのリンパ節転移を診断する方法は、患者から生体サンプルを採取することと、マーカー群から選択された遺伝子の発現レベルを測定することと、を含み、この方法では、その遺伝子発現レベルが所定のカットオフレベルより高いことが、胃癌腫からの転移を示している。好ましくは、生体サンプルは、リンパ節サンプルである。
【０００８】
本発明のもう１つの態様では、マーカーは、胃癌腫からのリンパ節転移を検出するアッセイで、組み合わせて用いられる。
【０００９】
本発明のさらにもう１つの態様では、マーカーは、術中にアッセイされる。この術中アッセイは、胃から排出したリンパ節からＲＮＡを調製するステップと、１種類以上のマーカーに特異的な定量ＲＴ−ＰＣＲ方法を実施するステップと、マーカーの存在が所定のカットオフを越えているかどうかを確認するステップと、を含む方法により、行われ得る。
【００１０】
本発明は、本明細書において提供される方法を行うためのマイクロアレイまたは遺伝子チップ、ならびに、アッセイを行うためのキットおよび製造品を包含する。
【００１１】
〔詳細な説明〕
本明細書において記載され、特許請求される、本発明の方法、組成物、製品、および、キットは、マーカーの組み合わせを含む。「マーカー（"Markers"）」とは、
ａ）遺伝子、および、遺伝子発現産物（ｍＲＮＡおよび対応するｃＤＮＡ、ペプチド、タンパク質、断片、および、前述のそれぞれのものの相補物（complements）など）、ならびに、
ｂ）ａ）との物理的または化学的相互作用を通じて、遺伝子の発現または遺伝子発現産物の存在を示す組成物（プローブ、抗体、リガンド、ハプテン、および、標識など）であって、この場合、遺伝子、遺伝子発現産物、または、組成物は、配列番号ＮＭ＿００２２７６、配列番号ＮＭ＿００２４５７、および配列番号Ｍ１７３０３に一致する、組成物、
を称するために、本明細書を通じて用いられる。
【００１２】
遺伝子は、その遺伝子が配列番号で表された配列を含む場合には、その配列に相当する。遺伝子セグメントまたは断片も、その遺伝子セグメントまたは断片が、参照配列またはその相補物の一部を、その遺伝子の配列であると区別するのに十分なものとして含む場合には、そのような遺伝子の配列に相当するといえる。さらに、遺伝子発現産物も、そのＲＮＡ、ｍＲＮＡ、または、ｃＤＮＡがそのような配列（例えば、プローブ）を有する組成物とハイブリダイズするか、ペプチドまたはタンパク質の場合で、このペプチドまたはタンパク質がそのようなｍＲＮＡによってコードされる場合には、そのような配列に相当するといえる。遺伝子発現産物のセグメントまたは断片は、その遺伝子発現産物のセグメントまたは断片が、参照遺伝子発現産物またはその相補物の一部を、その遺伝子または遺伝子発現産物の配列であると区別するのに十分なものとして含む場合には、そのような遺伝子または遺伝子発現産物の配列に相当する。
【００１３】
本発明のマーカーは、３種類の周知のタンパク質：癌胎児性抗原（配列番号Ｍ１７３０３）、ムチン２（配列番号ＮＭ＿００２４５７）、および、サイトケラチン１９（配列番号ＮＭ＿００２２７６）をコードする遺伝子に相当する。個別に、癌マーカーとして使用した場合、それらの遺伝子では、特に術中使用に関して、許容できる性能を有するアッセイは実現しなかった。しかしながら、実施例に示されるように、組み合わせると、それらのマーカーは、胃癌腫転移を確定する感度が高く、かつ、特異性が高い検査を提供する。アッセイの実施不良からマイナスの結果が生じていないことを確認するために、一般に、対照もアッセイされる。ＰＢＧＤ（配列番号ＮＭ＿０００１９０）などの構成的に発現された遺伝子(consitutively expressed genes)は、これに関連して有用であり、それらをアッセイする試薬は、キットの構成要素に含まれていることが好ましい。ＰＢＧＤは、特に、ヒトにおいて既知の偽遺伝子を含まず、ヒト組織で構成的に発現され、比較的低いレベルで発現され、それゆえ、目的の標的配列の増幅の阻害をもたらす可能性が低いことから、好ましい。
【００１４】
サンプル調製は、一般に、切除した組織、好ましくは、リンパ節組織を用いて行う必要がある。組織における転移および微小転移の分布は、結節または他の組織において均一ではない。そのため、転移を捕え損なわないように十分に大きなサンプルを採取しなければならない。本方法におけるサンプリングの問題に対する１つのアプローチは、大きな組織サンプルをホモジナイズすることであり、その後、そのホモジネートの適量が、分子診断用のＲＮＡを調製するのに使用される。
【００１５】
好ましくは、本発明の方法に用いられるサンプルは、胃から排出したリンパ節からのリンパ節サンプルである。ＲＴ−ＰＣＲアッセイ用にそのようなサンプルを調製するのに有用な手法は、以下である；ホモジナイゼーションにはオムニ社（Omni）製ホモジナイザーおよび使い捨てプローブを使用し、その後、ＲＮｅａｓｙ（キアゲン社（Qiagen））キット試薬を用いてＲＮＡの精製を行う：
ａ）従前に記録されていなければ、サンプル重量をミリグラム単位で測定する。天秤上に新しいパラフィン紙を１枚置き、風袋を計り、サンプルを秤量する。結節サンプルは、３０ｍｇより多いことが好ましい。
ｂ）新しいメスを使用して、その結節の全組織を直径およそ４ｍｍに細かく切り刻む。処理中は、組織の汚染が起こらないように注意する。
ｃ）ホモジナイゼーション（ＲＬＴ）バッファーをポリプロピレンホモジナイゼーションチューブに添加する。組織１００ｍｇ当たりにホモジナイゼーションバッファー２ｍＬを使用することが好ましい。
ｄ）清潔な鉗子を使用して、組織をホモジナイゼーションバッファー中に移す。
ｅ）新しいホモジナイゼーションプローブを手動式ホモジナイザーに取り付ける。
ｆ）各結節を完全にホモジナイズする。
ｇ）標準的なキアゲン（Qiagen）プロトコールによるＲＮＡ精製手順に従って、そのホモジネートを処理し、ＲＮＡは使用するまで−６５℃以下で保存される。
ｈ）ホモジナイゼーションプローブを廃棄する。
ｉ）残っているホモジネートを、後に使用できるように、−６５℃以下で保存する。
【００１６】
診断アッセイは、こうして行われる。本発明のマーカーは、胃癌腫がリンパ節に転移しているかどうかなど、患者についての胃癌腫の臨床病期、および、予後を示す重要な臨床情報を提供するのに有用である。
【００１７】
この情報は、まとめて、本明細書において「診断情報（Diagnostic Information）」と呼ばれる。さらに、そのような診断情報は、治療法を提供する際の構成要素としての利用も含む。例えば、そのような診断情報を有する医師は、その治療法（例えば、補助療法）を、癌がリンパ節に転移している徴候に基づいたものにすることができる。
【００１８】
本発明のマーカーをアッセイするのに好ましい方法は、タンパク質またはペプチドをコードし得る遺伝子によって産生されるｍＲＮＡの量を決定することを含む。これは、競合的逆転写酵素ＰＣＲ（competitive reverse transcriptase PCR）（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット解析、または、同様の性能を有する他の試験により、実現される。増幅される相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）は、ｍＲＮＡ（ＲＮＡ）から調製された後、試験および解析のために、ＤＮＡマイクロアレイ、および、他の発展的なアッセイフォーマットに適用することもできる。それらの製造のための数多くの異なるアレイ配置、および、方法については、当業者は公知であり、米国特許第５，４４５，９３４号；同第５，５３２，１２８号；同第５，５５６，７５２号；同第５，２４２，９７４号；同第５，３８４，２６１号；同第５，４０５，７８３号；同第５，４１２，０８７号；同第５，４２４，１８６号；同第５，４２９，８０７号；同第５，４３６，３２７号；同第５，４７２，６７２号；同第５，５２７，６８１号；同第５，５２９，７５６号；同第５，５４５，５３１号；同第５，５５４，５０１号；同第５，５６１，０７１号；同第５，５７１，６３９号；同第５，５９３，８３９号；同第５，５９９，６９５号；同第５，６２４，７１１号；同第５，６５８，７３４号；および、同第５，７００，６３７号などに記載されている。ＰＣＲの結果を定量するのに用いられる、最もよく受け入れられている測定は、蛍光発光が一定の閾値を越えているサイクルの数として定義されるＣｔ（閾値サイクル）の決定である。これは、大抵のＰＣＲアナライザーのソフトウェアでＣｔセットを決定するためのアルゴリズムを用いる周知の手法に従って、容易に決定することができる。この一例を具体化したものが、セフィード社（Cepheid Corporation）のスマートサイクラーPCR装置（SmartCycler PCR Instrument）であり、これは好ましい解析プラットフォームである。
【００１９】
マイクロアレイ技術は、遺伝子の定常状態のｍＲＮＡレベルの測定を可能にする。これらの解析の成果は、典型的に、マイクロアレイ上の既知の位置にある核酸配列とハイブリダイズするサンプルから調製された標的配列を検出するのに用いられたプローブセットから発生されるシグナルの強度の測定値である。典型的に、シグナルの強度は、調製された標的の量、それゆえに、サンプル細胞で発現されたｍＲＮＡに比例する。数多くのそのような技術は、利用可能であり、有用である。遺伝子発現を決定するのに好ましい方法は、米国特許第６，２７１，００２号；同第６，２１８，１２２号；同第６，２１８，１１４号；および、同第６，００４，７５５号に見られる。
【００２０】
遺伝子の発現レベルの解析は、マイクロアレイのシグナル強度を比較することによって行われ得る。これは、試験サンプルにおける遺伝子の発現強度と対照サンプルのものとの比行列（ratio matrix）を作成することにより、行われるべきである。例えば、罹患組織の遺伝子発現の強度を、同じ種類の良性組織または正常組織から生じた発現強度と比較してよい。これらの発現強度の比は、試験サンプルと対照サンプルとの間の遺伝子発現の倍率変化を示す。本発明はまた、発現パターンの比較がパターン認識法を用いて行われる前述の方法も包含する。
【００２１】
アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションのレベルは、ハイブリダイズされたマイクロアレイプローブの強度測定値の倍率変化に基づいて区別され得る。そのように区別する（すなわち、ｐ値０．０５未満）には、１．５倍の差が好ましい。すなわち、罹患細胞が、正常細胞よりも少なくとも約１．５倍高いか、または、１．５倍低い強度を得ていることが分かれば、罹患細胞および正常細胞では遺伝子が示差的に発現されているといえる。倍率の差が大きくなるほど、その遺伝子を診断または予後ツールとして使用することがより好ましくなる。本発明の組み合わせに選択された遺伝子は、臨床検査器具類を用いて、バックグラウンドを超える量により、正常遺伝子または非変調遺伝子のものと区別することができるシグナルを発生する発現レベルを有する。本発明は、本明細書で提供される方法を行うためのマイクロアレイ、または、遺伝子チップを包含する。マイクロアレイは、マーカーに相当する単離された核酸配列、それらの相補物、または、その部分を含んでよく、そのマーカーの組み合わせは生体サンプルにおける胃癌または再発の危険性を特徴付けるのに十分なものである。マイクロアレイは、少なくとも約１．５倍過剰もしくは過少発現を判定するか、または、特徴付け、過剰もしくは過少発現に統計的に有意なｐ値を与えるか、または、ｐ値は０．０５未満であることが好ましい。好ましくは、マイクロアレイには、ｃＤＮＡアレイ、または、オリゴヌクレオチドアレイを含み、１以上の内部対照試薬も含んでよい。
【００２２】
遺伝子マーカーは、胃癌腫からの転移を有するリンパ節において、転移のないリンパ節と比べてアップレギュレートされて、示差的に発現される。アップレギュレーションは、遺伝子の発現量において、いくつかのベースラインと比べて検出できる差（それを測定するのに使用されるシステムでのノイズの寄与の範囲を超える）が認められるということを意味する相対語である。この場合、ベースラインは、胃癌腫からの転移のない正常なリンパ節におけるマーカー(makers)の遺伝子発現の測定値である。そのため、検査したリンパ節サンプルにおける目的の遺伝子は、同じ測定方法を用いるベースラインレベルと比べてアップレギュレートされているか、または、変化していない。診断または予後には、疾患／現状の問題点を確認すること（再発の可能性、および、治療法の種類を確認することなど）を含む。再発の可能性を確認するには、そのパターンを既知の再発および／もしくは既知の非再発事象に関連するパターン、または、そのような区別をするために、カットオフ値（ＰＣＲの場合では、通常、Ｃｔ）セットを超えているパターンと比較する必要がある。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のマーカー組み合わせは、癌診断、予後、または、処置のモニタリングに有用な他の遺伝子系マーカー、および、非遺伝子診断法と併用してよい。例えば、いくつかの状況では、前述の遺伝子発現に基づく方法の診断能力と、血清タンパク質マーカー（例えば、癌抗原２７．２９（「ＣＡ２７．２９」））などの従来のマーカーのデータとを組み合わせることが有益である。このアプローチは、他の検査での結果が不明瞭であった場合に特に有用である。
【００２４】
本発明は、患者から生体サンプルを採取すること、そのサンプルの遺伝子発現を測定すること、および、それによって得られた結果を、報告書を作成するために用いること、によって、胃癌診断に関する患者報告書を作成する方法、および、この方法によって得られた報告書を包含する。この報告書には、患者集団と比べた、患者の転帰、および／または、危険の確率の評価も含んでよい。
【００２５】
本発明は、マーカーに相当するマイクロアレイプローブセット、または、ＰＣＲプライマー／プローブセットを含む組成物を包含する。本発明の製造品は、遺伝子発現情報を示すのに用いられる、メディアアッセイまたはフォーマットされたアッセイも含む。これらは、例えば、マイクロアレイにおいて配列相補物またはプローブがマトリックスに付加されており、そのマトリックスに、目的の遺伝子を示す配列が結び付き、それらの存在についての読み取り可能な決定因子をもたらすマイクロアレイを含んでよい。あるいは、本発明の製品で、癌を検出するために目的遺伝子の発現レベルを示すハイブリダイゼーション、増幅、および、シグナル発生を行うための試薬キットにしてもよい。
【００２６】
本発明に従って作製されたキットは、フォーマットされたアッセイを含む。これらは、アッセイを行うのに必要な全てまたは一部の材料（試薬および使用説明書、ならびに、核酸配列、それらの相補物、または、その一部がアッセイされる培地など）を含んでよい。アッセイが別のフォーマットで行われる場合には、キットは、そのフォーマットに特有の成分を含むであろう。例えば、フォーマットが増幅フォーマット（ＰＣＲ、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ）など）ならば、キットは、そのような技術に適した試薬、および、材料を含むであろう。任意に、キットは、組織（リンパ節組織など）から核酸を抽出するためのサンプル調製試薬、および／または、製品（例えば、チューブ）を含む。キットはまた、サンプル汚染の危険性を最小限に抑えるための製品（例えば、リンパ節郭清および調製用の使い捨てメスおよび面（surface））も含んでよい。
【００２７】
好ましいキットでは、逆転写酵素、逆転写酵素プライマー、対応するＰＣＲプライマーセット（マーカー用と、好ましくは、対照用）、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼなど）、ならびに、好適な検出試薬（限定されるものではないが、スコーピオンプローブ、蛍光５’ヌクレアーゼアッセイ用のプローブ、分子指標プローブ、単一色素プライマー、または、二本鎖ＤＮＡに特異的な蛍光色素（臭化エチジウムなど）など）のような、ワンチューブＱＲＴ−ＰＣＲ法（one-tube QRT-PCR process）に必要な試薬が含められる。プライマーは、高濃度が得られる量であることが好ましい。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、様々な製造業者から、一般的、かつ、商業的に入手可能である。キットのさらなる材料としては、好適な反応管またはバイアル、バリア組成物（任意に、マグネシウムを含むワックスビーズなど）；逆転写酵素段階およびＰＣＲ段階用の、必要なバッファーおよび試薬（ｄＮＴＰなど）を含む反応混合物（典型的には、１０×）；ヌクレアーゼ−またはリボヌクレアーゼ−フリー水；リボヌクレアーゼ阻害剤；ＱＲＴ−ＰＣＲ反応の逆転写酵素段階および／またはＰＣＲ段階に用いてよい、対照核酸および／または任意のさらなるバッファー、化合物、補因子、イオン成分、タンパク質および酵素、ポリマーなどを含んでよい。任意に、キットは、核酸抽出試薬、および、材料を含む。
【００２８】
以下に実施例を挙げて特許請求する本発明を説明するが、本発明を限定するものではない。本明細書において引用される全ての参考文献は、参照して本明細書に組み入れる。
【００２９】
実施例１
本実施例は、リアルタイムＰＣＲの使用に基づく。リアルタイムＰＣＲでは、終点測定ではなく、ポリメラーゼ連鎖反応の産物は、ＰＣＲの指数増殖期の間、リアルタイムでモニタリングされる。このため、ＤＮＡおよびＲＮＡの定量は、より一層正確で再現性がある。蛍光値は各サイクルの間記録され、増幅反応における決まった時点までに増幅された産物の量を表す。反応開始時に存在する鋳型（templates）が多いほど、（Ｃｔ）値の定義である、統計的に有意な、バックグラウンドを上回るものとして、蛍光シグナルが最初に記録される時点に達するのにかかるサイクル数が少なくなる。この閾値サイクル（Ｃｔ）の概念は、蛍光に基づくＲＴ−ＰＣＲを用いた正確で再現性がある定量を可能にする。ＰＣＲ産物の同質検出（homogeneous detection）は、（ａ）二本鎖ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲグリーン）、（ｂ）蛍光プローブ（例えば、Ｔａｑ  Ｍａｎプローブ、分子指標）、および、（ｃ）直接標識プライマー（例えば、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプライマー）に基づいて行うことが好ましい。
【００３０】
胃癌腫(gastric carinoma)と診断された患者から、Ｈ＆Ｅ転移陽性リンパ節２４個、Ｈ＆Ｅ転移陰性リンパ節１８個が得られた。それらのリンパ節は、胃から排出するものとして選択された。各結節から組織片３０ｍｇを切り取った。
【００３１】
各リンパ節の組織片３０ｍｇは、以下の通りに処理した：
１．組織片をバッファーＲＬＴ  ２ｍＬに添加し、使い捨て組織粉砕機を用いて、手作業で２０〜４０秒間ホモジナイズする。
２．４．５ｍＬチューブでホモジネート４００μＬと７０％エタノール４００μＬとを、１０秒間ボルテックスすることにより混合する。
３．各サンプルについて、Ｖａｃバルブを真空マニホールド上に取り付け、使い捨てＶａｃコネクターを各バルブに取り付ける。
４．ＲＮｅａｓｙミニカラムをＶａｃコネクター上に取り付け、キャップは開放したままにする。
５．ステップ２のホモジネート／エタノール混合物７００μＬ分量をＲＮＡスピンカラム上に載せる。
６．Ｖａｃバルブをオンの位置まで回し、サンプルが濾過されるまで（およそ３０秒間）、真空を適用する（８００〜１２００ｍｂａｒ）。
７．真空を止め、洗浄バッファー１  ７００μＬをそのカラムに添加する。真空を開始し、そのカラムでその溶液を濾過させる。真空を止める。
８．洗浄バッファー２  ７００μＬをそのカラムに添加する。真空を開始し、そのカラムでその溶液を濾過させる。真空を止める。
９．真空マニホールドからそれぞれのカラムを取り出し、２ｍＬコレクションチューブ（カラムが供給されているもの）に入れる。
１０．チューブの入ったＲＮＡスピンカラムを微量遠心機で＞１０，０００ＲＰＭにて３０秒間遠心分離する。
１１．そのコレクションチューブを廃棄する。そのカラムを新しい未使用のコレクションチューブ（１．５〜１．７ｍＬポリプロピレン微量遠心チューブ）に入れる。
１２．カラムのフィルター膜に直接リボヌクレアーゼフリー水５０μＬを添加する。
１３．微量遠心機で＞１０，０００ＲＰＭにて３０秒間遠心分離する。
１４．ステップ１４を続ける前に、そのコレクションチューブを検査サンプルの起源が確認できるように確実にラベルする（例：患者ＩＤ＆結節ＩＤ）。
１５．そのカラムを廃棄する。溶出されたＲＮＡ溶液約５０μＬを、そのコレクションチューブに入れる。
【００３２】
抽出されたＲＮＡは、セフィード・スマートサイクラーＩＩ（Cepheid SmartCycler II）での一段階ＲＴ−ＰＣＲ増幅に供した。この反応物は、以下の成分を含む：５０ｍＭビシン／ＫＯＨ、ｐＨ８．２、１１５ｍＭ酢酸カリウム、８％ｖ／ｖグリセロール、０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１５０ｍＭトレハロース、０．２％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．２ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐Ｃｌ  ｐＨ８、３．５ｍＭ  ＭｎＳＯ4またはＭｎ（酢酸塩）、０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．３ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．３ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ  ＴＴＰ、１００Ｕ／ｍＬ  Ｔｔｈ、２０μｇ／ｍＬ抗体ＴＰ６−２５．３、各プローブおよびプライマー０．４〜０．８ｕＭ。プローブ配列およびプライマー配列は、非特異的誘導事象が最小限に抑えられ、それらが以下の高速ＲＴ−ＰＣＲプロフィールを用いる多重増幅／検出に適合するように設計される：９５℃３秒間、６０℃３分間、その後、９５℃１秒間、６５℃６秒間*、７２℃３秒間を３２サイクル−合計増幅時間＝１６分。
【００３３】
本実施例で用いたプライマーとプローブは以下の通りであった：
ＭＵＣ２：
上流プライマー（upper primer）：ATGAACTACGCTCCTGGCTT（配列番号５：ＮＭ＿００２４５７）
下流プライマー（lower primer）：AAACTCTCTGGGCACATTGTC（配列番号６：ＮＭ＿００２４５７）
プローブ：FAM-CGTGAAGACCTGCGGCTGTGT-BHQ1-TT（配列番号７：ＮＭ＿００２４５７）
ＣＥＡ：
上流プライマー：ACCACAGTCACGACGATCACA（配列番号８：Ｍ１７３０３）
下流プライマー：CGGGGTTGGAGTTGTTGCT（配列番号９：Ｍ１７３０３）
プローブ：テキサスレッド−CTATGCAGAGCCACCCAAACCCTT-BHQ2-TT（配列番号１０：Ｍ１７３０３）
ＣＫ１９：
上流プライマー：CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT（配列番号１１）
下流プライマー：TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC（配列番号１２）
プローブ：5'Quasar 570 d(ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT)-BHQ-2-TT)3'（配列番号１３）
ＰＢＧＤ：
プライマー１  CTGCTTCGCTGCATCGCTGAAA（配列番号１４）
プライマー２  CAGACTCCTCCAGTCAGGTACA（配列番号１５）
プローブ−FAM-CCTGAGGCACCTGGAAGGAGGCTGCAGTGT-TAMRA（配列番号１６）
【００３４】
サンプルおよびアッセイの結果を表１にまとめている。得られたＣｔ値は、検査した全サンプルの遺伝子の相対発現を確認するために用いた。確定したＣｔ値は、マーカーでは２７、内部対照（ＰＢＧＤ）では３５であった。３マーカーのいずれについてもＣｔが２７以下のサンプルは、転移について陽性と考えられ、一方、３マーカー全てについてＣｔ値が２７より大きいサンプルは、転移について陰性と考えられる。陰性診断結果を有効なものにするには、内部対照のＣｔ値は、３５より小さくなければならない。これらのカットオフ値に基づき、アッセイを用いて、１８個の陰性リンパ節のうち１７個（９４．４％特異性）、および、２４個の陽性リンパ節全て（１００％感度）を正確に評価した。
【００３５】
表１  胃腺癌を伴う患者からのリンパ節転移の検出
【表１】
2008099664.tif 000002
【００３６】
〔実施の態様〕
本発明の実施態様は以下の通りである。
（１）胃癌腫からのリンパ節転移を診断する方法において、
ａ）患者から生体サンプルを採取するステップと、
ｂ）前記サンプルにおけるマーカーレベルを測定するステップと、
を含み、
前記レベルが所定のカットオフレベルより高いことが、胃癌腫からのリンパ節転移を示す、
方法。
（２）実施態様１に記載の方法において、
前記マーカーは、遺伝子、遺伝子断片、または、その相補体（complements）である、方法。
（３）実施態様１に記載の方法において、
前記マーカーは、タンパク質、タンパク質断片、または、ポリペプチドである、方法。
（４）実施態様１に記載の方法において、
別の診断方法を使用すること、
をさらに含む、方法。
（５）実施態様４に記載の方法において、
前記別の診断方法は、血清アッセイを実施すること、を含む、方法。
【００３７】
（６）実施態様１に記載の方法において、
構成的に発現された遺伝子を測定すること、
をさらに含む、方法。
（７）実施態様１に記載の方法において、
少なくとも８０％の感度を有する、方法。
（８）実施態様１に記載の方法において、
少なくとも７０％の特異性を有する、方法。
（９）実施態様１に記載の方法において、
前記サンプルは、リンパ節組織を含む、方法。
（１０）胃癌腫患者に対する治療法を決定または調整する方法において、
ａ．胃癌患者から生体サンプルを採取するステップと、
ｂ．前記サンプルにおけるマーカーレベルを測定するステップと、
を含み、
前記レベルが、カットオフレベルより高いか、または、低いことが、疾患の経過または健康状態と一致しており、これにより、この疾患の経過または健康状態に対する治療法が、決定または調整される、
方法。
【００３８】
（１１）実施態様１０に記載の方法において、
前記マーカーは、遺伝子、遺伝子断片、または、その相補体である、方法。
（１２）実施態様１０に記載の方法において、
前記マーカーは、タンパク質、タンパク質断片、または、ポリペプチドである、方法。
（１３）実施態様１０に記載の方法において、
構成的に発現された遺伝子を測定すること、
をさらに含む、方法。
（１４）実施態様１０に記載の方法において、
前記特異性は、少なくとも７０％である、方法。
（１５）実施態様１０に記載の方法において、
前記感度は、少なくとも約８０％である、方法。
【００３９】
（１６）実施態様１に記載の方法において、
マイクロアレイを用いて行われる、方法。
（１７）実施態様１０に記載の方法において、
マイクロアレイを用いて行われる、方法。
（１８）実施態様１に記載の方法において、
増幅法を用いることにより行われる、方法。
（１９）実施態様１８に記載の方法において、
前記増幅法は、ＰＣＲである、方法。
（２０）実施態様１９に記載の方法において、
前記ＰＣＲは、ＲＴ−ＰＣＲである、方法。
【００４０】
（２１）実施態様１０に記載の方法において、
増幅法を用いることにより行われる、方法。
（２２）生体サンプルでの胃癌の診断を確定するアッセイを行うためのキットにおいて、
マーカーを検出するための材料、
を含む、キット。
（２３）実施態様２２に記載のキットにおいて、
マイクロアレイ、および、試薬、
を含む、キット。
（２４）実施態様２２に記載のキットにおいて、
ＰＣＲ試薬、
を含む、キット。
（２５）実施態様２２に記載のキットにおいて、
使用説明書、
を含む、キット。
【００４１】
（２６）実施態様２２に記載のキットにおいて、
前記マーカーは、ＣＥＡ、ＭＵＣ２、および、ＣＫ−１９からなる、キット。
（２７）胃癌腫からのリンパ節転移を診断する方法において、
ａ）患者から生体サンプルを採取するステップと、
ｂ）前記サンプルにおけるマーカーレベルを測定するステップと、
を含み、
前記レベルが所定のカットオフレベルより高いことが、胃癌腫からのリンパ節転移を示し、
前記マーカーは、ＣＥＡ、ＭＵＣ２、および、ＣＫ−１９からなる、
方法。
（２８）実施態様２７に記載の方法において、
別の診断方法を使用すること、
をさらに含む、方法。
（２９）実施態様２７に記載の方法において、
前記別の診断方法は、血清アッセイを行うこと、を含む、方法。
（３０）実施態様２７に記載の方法において、
構成的に発現された遺伝子を測定すること、
をさらに含む、方法。
【００４２】
（３１）実施態様２７に記載の方法において、
少なくとも８０％の感度を有する、方法。
（３２）実施態様２７に記載の方法において、
少なくとも７０％の特異性を有する、方法。
【配列表】
2008099664000001.app
【外国語明細書】
2008099664000001.pdf