(57)【要約】      （修正有）【課題】分類レベルで昆虫を識別するためのメルクマールの策定方法の提供。【解決手段】(a)同じ分類に属し、かつ、互いに異なる少なくとも５以上の昆虫のミトコンドリアＤＮＡ由来の塩基配列を、アラインメントする工程、(b)上記アラインメントの結果、上記塩基配列から、全ての上記塩基配列において保存されている、１又はそれ以上の塩基からなる部位を抽出する工程、(c)上記部位の全部又はその一部を共通塩基グループとする工程、(d)少なくとも２以上の分類について上記工程(a)〜(c)を行う工程、(e)上記(d)で得られた複数の共通塩基グループを互いに比較し、ある分類から得られた上記共通塩基グループから選択される塩基と他の分類から得られた共通塩基グループから選択される塩基が完全に一致しないように、上記共通塩基グループから、少なくとも１以上の塩基を選択してメルクマールとする工程を含む、前記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分類レベルで昆虫を識別するための１又はそれ以上のメルクマールの策定方法であって、以下の工程：
(a)同じ分類に属し、かつ、互いに異なる少なくとも５以上の昆虫のミトコンドリアＤＮＡ由来の塩基配列をアラインメントする工程、
(b)上記アラインメントの結果、上記塩基配列から、全ての上記塩基配列において保存されている、１又はそれ以上の塩基からなる部位を抽出する工程、
(c)上記部位の全部又はその一部を共通塩基グループとする工程、
(d)少なくとも２以上の分類について上記工程(a)〜(c)を行う工程、
(e)上記(d)で得られた複数の共通塩基グループを互いに比較し、１つの分類から得られた上記共通塩基グループから選択される塩基とそれ以外の分類から得られた共通塩基グループから選択される塩基が完全に一致しないように、上記共通塩基グループから、少なくとも１以上の塩基を選択してメルクマールとする工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
分類レベルで昆虫を識別するための１又はそれ以上のメルクマールの策定方法であって、以下の工程：
(a)同じ分類に属し、かつ、互いに異なる少なくとも５以上の昆虫のミトコンドリアＤＮＡ由来の塩基配列をアラインメントする工程、
(b)上記アラインメントの結果、上記塩基配列から、全ての上記塩基配列において保存されている、１又はそれ以上の塩基からなる部位を抽出する工程、
(c)上記部位の全部又はその一部を共通塩基グループとする工程、
(d)少なくとも２以上の分類について上記工程(a)〜(c)を行う工程、
(e)上記(d)で得られた１の共通塩基グループと、前記共通塩基グループが属する分類とは異なる少なくとも１以上の分類に属する昆虫由来の塩基配列のうち上記共通塩基グループから選択される塩基に対応する塩基とを互いに比較し、上記共通塩基グループから選択される塩基が、前記共通塩基グループが属する分類とは異なる少なくとも１以上の分類に属する昆虫由来の塩基配列の対応する塩基と完全に一致しないように、上記共通塩基グループから、少なくとも１以上の塩基を選択してメルクマールとする工程
を含む、前記方法。
【請求項３】
上記工程(e)において、上記(d)で得られた１の共通塩基グループを、上記(d)で得られた複数の共通塩基グループと互いに比較したのち、さらに、前記共通塩基グループが属する分類とは異なる少なくとも１以上の分類に属する昆虫由来の塩基配列のうち上記共通塩基グループから選択される塩基に対応する塩基と互いに比較することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
上記ミトコンドリアＤＮＡ由来の塩基配列が、ミトコンドリアNADH dehydrogenase subunit 5（ＮＤ５）遺伝子由来の塩基配列である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
上記分類が目である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
上記分類が科である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
昆虫が、双翅目、半翅目、膜翅目、鱗翅目、鞘翅目からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
上記工程(a)において用いる塩基配列の長さが２０塩基以上である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
上記共通塩基グループが連続及び／又は不連続の複数の部位からなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
分類レベルで昆虫を識別するための１又はそれ以上のメルクマールの策定方法であって、以下の工程：
(a)同じ分類に属し、かつ、互いに異なる少なくとも５以上の昆虫の核ＤＮＡ由来の塩基配列を、アラインメントする工程、
(b)上記アラインメントの結果、上記塩基配列から、全ての上記塩基配列において保存されている、１又はそれ以上の塩基からなる部位を抽出する工程、
(c)上記部位の全部又はその一部を共通塩基グループとする工程、
(d)少なくとも２以上の分類について上記工程(a)〜(c)を行う工程、
(e)上記で得られた複数の共通塩基グループを互いに比較し、１つの分類から得られた上記共通塩基グループから選択される塩基とそれ以外の分類から得られた共通塩基グループから選択される塩基が完全に一致しないように、上記共通塩基グループから、少なくとも１以上の塩基を選択してメルクマールとする工程
を含む、前記方法。
【請求項１１】
分類レベルで昆虫を識別するための１又はそれ以上のメルクマールの策定方法であって、以下の工程：
(a)同じ分類に属し、かつ、互いに異なる少なくとも５以上の昆虫の核ＤＮＡ由来の塩基配列を、アラインメントする工程、
(b)上記アラインメントの結果、上記塩基配列から、全ての上記塩基配列において保存されている、１又はそれ以上の塩基からなる部位を抽出する工程、
(c)上記部位の全部又はその一部を共通塩基グループとする工程、
(d)少なくとも２以上の分類について上記工程(a)〜(c)を行う工程、
(e)上記(d)で得られた１の共通塩基グループと、前記共通塩基グループが属する分類とは異なる少なくとも１以上の分類に属する昆虫由来の塩基配列のうち上記共通塩基グループから選択される塩基に対応する塩基とを互いに比較し、上記共通塩基グループから選択される塩基が、前記共通塩基グループが属する分類とは異なる少なくとも１以上の分類に属する昆虫由来の塩基配列の対応する塩基と完全に一致しないように、上記共通塩基グループから、少なくとも１以上の塩基を選択してメルクマールとする工程
を含む、前記方法。
【請求項１２】
上記工程(e)において、上記(d)で得られた１の共通塩基グループを、上記(d)で得られた複数の共通塩基グループと互いに比較したのち、さらに、前記共通塩基グループが属する分類とは異なる少なくとも１以上の分類に属する昆虫由来の塩基配列のうち上記共通塩基グループから選択される塩基に対応する塩基と互いに比較することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
上記分類が目である請求項１０〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
上記分類が科である請求項１０〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
昆虫が、双翅目、半翅目、膜翅目、鱗翅目、鞘翅目からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１０〜１４のいずれか１項記載の方法。  
【請求項１６】
上記工程(a)において用いる塩基配列の長さが２０塩基以上である、請求項１０〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
上記共通塩基グループが連続及び／又は不連続の複数の部位からなる、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって得られたメルクマールを有する領域の塩基配列と、被検体である昆虫から得られた塩基配列中の前記メルクマールを有する領域の塩基配列に相当する塩基配列を比較し、被検体の前記塩基配列中のメルクマールに相当する部位の塩基がメルクマールの塩基と完全に一致するかを解析し、被検体の分類を識別することからなる、被検体である昆虫を分類レベルで識別するための方法。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって得られたメルクマールを有する領域の塩基配列を解析ソフト上に登録し、被検体である昆虫から得られた、前記メルクマールと同じ領域を含む塩基配列を前記解析ソフトに入力し、前記解析ソフト上で両者の塩基配列をアラインメントすることにより、被検体の塩基配列中のメルクマールに相当する部位の塩基と前記メルクマールの塩基が完全に一致するかを解析し、被検体の分類を識別することからなる、被検体である昆虫を分類レベルで識別するための方法。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって得られた、メルクマールを有する塩基配列を１又はそれ以上登録する手段と、被検体である昆虫から得られた、前記メルクマールと同じ領域を含む塩基配列を入力する手段と、前記メルクマールを有する塩基配列及び前記入力された被検体の塩基配列を比較する手段と、前記メルクマール及び前記入力された被検体の塩基配列中の前記メルクマールに相当する部位の塩基とが完全に一致するかを解析する手段と、被検体の分類を識別する手段を実行させるための、被検体である昆虫を分類レベルで同定するための解析ソフト。
【請求項２１】
請求項２０記載の解析ソフトを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって得られたメルクマール。
【請求項２３】
双翅目に特異的である請求項２２記載のメルクマールであって、配列番号１で示されるイエバエ由来の塩基配列の５’末端から、第２６９番目の塩基がＡ、第２７０番目の塩基がＡ、第２７２番目の塩基がＡ、第２７５番目の塩基がＡ、第２７６番目の塩基がＡ、第２７８番目の塩基がＡ、第２７９番目の塩基がＡ、第２８０番目の塩基がＴ、第２８４番目の塩基がＣ、第２８５番目の塩基がＡ、第２８７番目の塩基がG、第２８８番目の塩基がＡ、第２９０番目の塩基がＡ、第２９１番目の塩基がＴ、第２９３番目の塩基がＣ、第２９４番目の塩基がG、第２９７番目の塩基がＴ、第２９９番目の塩基がＡ、第３００番目の塩基がＴ、第３０２番目の塩基がG、第３０３番目の塩基がG、第３０６番目の塩基がG、第３０８番目の塩基がＴ、第３０９番目の塩基がＴ、第３１０番目の塩基がＡ、第３１２番目の塩基がG、及び第３１５番目の塩基がＴである、前記メルクマール。
【請求項２４】
半翅目に特異的である請求項２２記載のメルクマールであって、配列番号２で示されるツマグロヨコバイ由来の塩基配列の５’末端から、第１９５番目の塩基がＴ、第２０９番目の塩基がC、第２１０番目の塩基がＡ、第２１２番目の塩基がG、第２１３番目の塩基がＣ、第２１８番目の塩基がＴ、第２１９番目の塩基がＴ、第２２１番目の塩基がＡ、第２２２番目の塩基がＡ、第２２５番目の塩基がＣ、第２２８番目の塩基がＴ、第２３１番目の塩基がＴ、第２３３番目の塩基がＴ、第２３４番目の塩基がＴ、第２３５番目の塩基がＴ、第２３６番目の塩基がＴ、第２３７番目の塩基がＴ、第２３９番目の塩基がＴ、第２４０番目の塩基がＧ、第２４６番目の塩基がＧ、第２４７番目の塩基がＡ、第２５４番目の塩基がＡ、及び第２５５番目の塩基がＴである、前記メルクマール。
【請求項２５】
半翅目に特異的である請求項２２記載のメルクマールであって、配列番号２で示されるツマグロヨコバイ由来の塩基配列の５’末端から、第１９５番目の塩基がＴ、第２０９番目の塩基がC、第２１０番目の塩基がＡ、第２１２番目の塩基がG、第２１３番目の塩基がＣ、第２１８番目の塩基がＴ、第２１９番目の塩基がＴ、第２２１番目の塩基がＡ、第２２２番目の塩基がＡ、第２２５番目の塩基がＣ、第２２８番目の塩基がＴ、第２３１番目の塩基がＴ、第２３３番目の塩基がＴ、第２３４番目の塩基がＴ、第２３５番目の塩基がＴ、第２３６番目の塩基がＴ、第２３７番目の塩基がＴ、第２３９番目の塩基がＴ、第２４０番目の塩基がＧ、第２４６番目の塩基がＧ、第２４７番目の塩基がＴ、第２５４番目の塩基がＡ、及び第２５５番目の塩基がＴである、前記メルクマール。
【請求項２６】
半翅目に特異的である請求項２２記載のメルクマールであって、配列番号２で示されるツマグロヨコバイ由来の塩基配列の５’末端から、第２０９番目の塩基がC、第２１０番目の塩基がＡ、第２１２番目の塩基がG、第２１３番目の塩基がＣ、第２１８番目の塩基がＴ、第２１９番目の塩基がＴ、第２２１番目の塩基がＡ、第２２２番目の塩基がＡ、第２２５番目の塩基がＣ、第２２８番目の塩基がＴ、第２３１番目の塩基がＴ、第２３３番目の塩基がＴ、第２３４番目の塩基がＴ、第２３５番目の塩基がＴ、第２３６番目の塩基がＣ、第２３７番目の塩基がＴ、第２３９番目の塩基がＴ、第２４０番目の塩基がＧ、第２４６番目の塩基がＧ、第２５４番目の塩基がＡ、第２５５番目の塩基がＴである、前記メルクマール。
【請求項２７】
半翅目に特異的である請求項２２記載のメルクマールであって、配列番号２で示されるツマグロヨコバイ由来の塩基配列の５’末端から、第２０９番目の塩基がC、第２１０番目の塩基がＡ、第２１２番目の塩基がG、第２１３番目の塩基がＣ、第２１８番目の塩基がＴ、第２１９番目の塩基がＴ、第２２１番目の塩基がＡ、第２２２番目の塩基がＡ、第２２５番目の塩基がＣ、第２２８番目の塩基がＴ、第２３１番目の塩基がＴ、第２３３番目の塩基がＴ、第２３４番目の塩基がＴ、第２３５番目の塩基がＣ、第２３６番目の塩基がＡ、第２３７番目の塩基がＴ、第２３９番目の塩基がＴ、第２４０番目の塩基がＧ、第２４６番目の塩基がＧ、第２５４番目の塩基がＡ、第２５５番目の塩基がＴ、第２９５番目の塩基がＡ、及び第２９６番目の塩基がＡ、第２９７番目の塩基がＴ、及び第２９８番目の塩基がＴ、である、前記メルクマール。
【請求項２８】
膜翅目に特異的である請求項２２記載のメルクマールであって、配列番号３で示されるヒメハナバチ由来の塩基配列の５’末端から、第８８５番目の塩基がＴ、第８８６番目の塩基がＴ、第８９６番目の塩基がＣ、第８９７番目の塩基がＴ、第８９８番目の塩基がＴ、第８９９番目の塩基がＴ、第９０２番目の塩基がＴ、第９０４番目の塩基がＴ、第９０５番目の塩基がＴ、第９０８番目の塩基がＴ、第９１０番目の塩基がＴ、第９１１番目の塩基がＧ、第９１２番目の塩基がＴ、第９１６番目の塩基がＧ、第９１７番目の塩基がＧ、第９２５番目の塩基がＡ、第９２６番目の塩基がＴ、第９２９番目の塩基がＡ、第９３０番目の塩基がＴ、第９４５番目の塩基がＴ、第９４６番目の塩基がＣ、第９４７番目の塩基がＡ、第９５０番目の塩基がＡ、第９５１番目の塩基がＴ、第９５３番目の塩基がＴ、第９５５番目の塩基がＣ、第９５６番目の塩基がＧ、第９７１番目の塩基がＴ、第９８５番目の塩基がＣ、第９８６番目の塩基がＣ、第９８９番目の塩基がＴ、第９９８番目の塩基がＴ、第１００４番目の塩基がＴ、第１０３１番目の塩基がC、及び第１０１９番目の塩基がＴ、である、前記メルクマール。
【請求項２９】
膜翅目に特異的である請求項２２記載のメルクマールであって、配列番号３で示されるヒメハナバチ由来の塩基配列の５’末端から、第８８５番目の塩基がＡ、第８８６番目の塩基がＡ、第８９４番目の塩基がＡ、第８９６番目の塩基がＣ、第８９９番目の塩基がＴ、第９０２番目の塩基がＴ、第９０４番目の塩基がＴ、第９０５番目の塩基がＴ、第９０８番目の塩基がＴ、第９１０番目の塩基がＴ、第９１１番目の塩基がＧ、第９１２番目の塩基がＴ、第９１６番目の塩基がＧ、第９１７番目の塩基がＧ、第９２５番目の塩基がＡ、第９２６番目の塩基がＴ、第９２９番目の塩基がＡ、第９３０番目の塩基がＴ、第９４５番目の塩基がＴ、第９４６番目の塩基がＣ、第９４７番目の塩基がＡ、第９５０番目の塩基がＡ、第９５１番目の塩基がＴ、第９５３番目の塩基がＴ、第９５５番目の塩基がＣ、第９５６番目の塩基がＧ、第９７１番目の塩基がＴ、第９８５番目の塩基がＣ、第９８６番目の塩基がＣ、第９８９番目の塩基がＴ、第９９８番目の塩基がＴ、第１００４番目の塩基がＴ、第１０１３番目の塩基がC、及び第１０１９番目の塩基がＴ、である、前記メルクマール。
【請求項３０】
膜翅目に特異的である請求項２２記載のメルクマールであって、配列番号３で示されるヒメハナバチ由来の塩基配列の５’末端から、第８８５番目の塩基がＡ、第８８６番目の塩基がＴ、第８９５番目の塩基がＴ、第８９６番目の塩基がＣ、第８９９番目の塩基がＴ、第９０２番目の塩基がＴ、第９０４番目の塩基がＴ、第９０５番目の塩基がＴ、第９０８番目の塩基がＴ、第９１０番目の塩基がＴ、第９１１番目の塩基がＧ、第９１２番目の塩基がＴ、第９１６番目の塩基がＧ、第９１７番目の塩基がＧ、第９２５番目の塩基がＡ、第９２６番目の塩基がＴ、第９２９番目の塩基がＡ、第９３０番目の塩基がＴ、第９４５番目の塩基がＴ、第９４６番目の塩基がＣ、第９４７番目の塩基がＡ、第９５０番目の塩基がＡ、第９５１番目の塩基がＴ、第９５３番目の塩基がＴ、第９５５番目の塩基がＣ、第９５６番目の塩基がＧ、第９７１番目の塩基がＴ、第９８５番目の塩基がＣ、第９８６番目の塩基がＣ、第９８９番目の塩基がＴ、第９９８番目の塩基がＴ、第１００４番目の塩基がＴ、第１０１３番目の塩基がC、及び第１０１９番目の塩基がＴ、である、前記メルクマール。
【請求項３１】
鱗翅目に特異的である請求項２２記載のメルクマールであって、配列番号４で示されるチャノコカクモンハマキ由来の塩基配列の５’末端から、第９４７番目の塩基がＴ、第９４８番目の塩基がＡ、第９５０番目の塩基がＴ、第９５２番目の塩基がＡ、第９５６番目の塩基がＡ、第９５８番目の塩基がＡ、第９６１番目の塩基がＣ、第９６２番目の塩基がＡ、第９６４番目の塩基がＧ、第９６５番目の塩基がＡ、第９６６番目の塩基がＴ、第９６７番目の塩基がＡ、第９６８番目の塩基がＴ、第９６９番目の塩基がＴ、第９７０番目の塩基がＣ、第９７１番目の塩基がＧ、第９７６番目の塩基がＡ、第９７７番目の塩基がＴ、第９７９番目の塩基がＧ、第９８０番目の塩基がＧ、第９８２番目の塩基がＧ、第９８３番目の塩基がＧ、第９８６番目の塩基がＴ、第９８８番目の塩基がＡ、及び第９８９番目の塩基がＧ、である、前記メルクマール。
【請求項３２】
鞘翅目に特異的である請求項２２記載のメルクマールであって、配列番号８０で示されるマゲラニクスチリオサムシ由来の塩基配列の５’末端から、第３００番目の塩基がＴ、第３１１番目の塩基がＣ、第３１２番目の塩基がＡ、第３１４番目の塩基がG、第３１５番目の塩基がＡ、第３１６番目の塩基がＴ、第３１７番目の塩基がＡ、第３１８番目の塩基がＴ、第３２０番目の塩基がＣ、第３２１番目の塩基がG、第３２３番目の塩基がＴ、第３２５番目の塩基がＴ、第３２６番目の塩基がＡ、第３２７番目の塩基がＴ、第３２９番目の塩基がG、第３３０番目の塩基がG、第３３６番目の塩基がＴ、第３３８番目の塩基がＡ、及び第３３９番目の塩基がＴである、前記メルクマール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、昆虫を分類レベルで識別するための基準となるメルクマールの策定方法、及び前記メルクマールを基準として昆虫を分類レベルで同定する方法、並びに昆虫を分類レベルで識別するための解析ソフトに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの飲食品製造業者にとって昆虫の防除は重要な課題である。すなわち、製造工程や原料、製品等への昆虫の混入が疑われた場合、製造業者は詳細な調査を行って昆虫の混入時期や経路、原因を究明し、例えば、もし昆虫の混入が飲食品の製造工程中であったことが明らかになった場合には、全ての製造工程を厳重に確認し、再度このような混入事故がないように対策を講ずる必要がある。この際、まず行わなければならないことが、混入した昆虫の同定である。
【０００３】
昆虫をはじめとする生物由来の異物の同定は多くの場合、形態学的同定法に頼っているのが現状である。しかしながらその手法は専門的な知識や経験が必要であり、また変形したり一部位のみ混入している場合、形態に基づく識別が困難であったりする。従ってこれらの問題点を解消するため、異物より抽出したＤＮＡの塩基配列を解析し、データベースと比較することで簡便かつ変形した異物であっても同定可能な手法が確立されている（非特許文献１）。
【０００４】
しかしながらこの手法は、種レベルでの同定であるため、基準となるデータベースは望ましくは全種類の昆虫のデータを保有している必要がある。従ってデータベースが不完全なものであれば当然、ＤＮＡがデータベース化されていない昆虫が混入した場合、その昆虫は同定不能となってしまう。
【０００５】
一方、昆虫は地球上でもっとも繁栄している生物であり、これまでに知られている種類だけでも８０万種くらい、実際には、約１５０万種以上と推定されている。日本では約１０万種もの昆虫が生息しているといわれ、例えば通常一般に見られる双翅目（ハエ目）に属する昆虫は、日本だけでも五千数百もの種に分類されている。
【０００６】
従ってこれだけ多数の種が存在する昆虫について全てのデータをデータベース化するには膨大な時間と労力が必要となり現実的でない。一方、ある特定の工場周辺に生息する昆虫に限定してデータベースを構築することもできるが、昆虫混入の同定手法としては汎用的な方法とは言い難い。
【０００７】
原因究明や再発防止において飲食品に混入した昆虫を同定する場合、種レベルまで特定できることが理想的ではあるが、上記したように、膨大な時間と労力を要し、現実的でない。従って、混入した昆虫を種レベルの上位分類である目又は科レベルで確実に特定する方法は、非常に有効である。
【０００８】
一般的にバクテリア等の微生物の同定においては、塩基配列の相同性に基づく系統関係の解析が行われている。すなわち基準となる塩基配列と比較しそれとの相同性によって、同じ種に属する微生物であるかどうかを判定する。しかしながら昆虫の場合、同じ目に属する科や種であってもその塩基配列は非常に多様性に富んでいるため、相同性に基づく系統関係の解析は困難である。
【非特許文献１】形山ら、塩基配列の解析による食品内生物系異物の同定、日本食品衛生学会第76回学術講演会講演要旨集、p52（1998）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＤＮＡ解析により昆虫を同定する際、数多く存在する種レベルではなく、その上位分類である科レベル、あるいはさらに上位分類である目レベルでの識別を、塩基配列の相同性に基づく系統関係の解析を用いることなく、簡便かつ確実に行える方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究し、個々の塩基配列の違いを忠実に観察したところ、同一の分類（例えば目や科）に属する異なる昆虫間で、共通する塩基が複数存在することを見出し、この共通する複数の塩基から選び出した共通塩基グループから選択される塩基が、他の分類の共通塩基グループから選択される塩基と、及び／又は他の分類に属する昆虫の塩基配列の塩基と、完全には一致しないことを確認した上で、その共通塩基グループから複数の塩基を選択して、その分類に特異的なメルクマールとすることに成功した。さらにそのメルクマールを基準にして未知の昆虫を分類レベルで識別することに成功した。この方法は、塩基配列の相同性に基づいて系統関係の近縁度合を調べる従来の方法とは異なるものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）分類レベルで昆虫を識別するための１又はそれ以上のメルクマールの策定方法であって、以下の工程：
(a)同じ分類に属し、かつ、互いに異なる少なくとも５以上の昆虫のミトコンドリアＤＮＡ由来の塩基配列をアラインメントする工程、
(b)上記アラインメントの結果、上記塩基配列から、全ての上記塩基配列において保存されている、１又はそれ以上の塩基からなる部位を抽出する工程、
(c)上記部位の全部又はその一部を共通塩基グループとする工程、
(d)少なくとも２以上の分類について上記工程(a)〜(c)を行う工程、
(e)上記(d)で得られた複数の共通塩基グループを互いに比較し、１つの分類から得られた上記共通塩基グループから選択される塩基とそれ以外の分類から得られた共通塩基グループから選択される塩基が完全に一致しないように、上記共通塩基グループから、少なくとも１以上の塩基を選択してメルクマールとする工程
を含む、前記方法。
【００１２】
前記方法は、上記工程(e)において、上記(d)で得られた１の共通塩基グループを、上記(d)で得られた複数の共通塩基グループと互いに比較したのち、さらに、前記共通塩基グループが属する分類とは異なる少なくとも１以上の分類に属する昆虫由来の塩基配列のうち上記共通塩基グループから選択される塩基に対応する塩基と互いに比較することを含んでいてもよい。
【００１３】
（２）分類レベルで昆虫を識別するための１又はそれ以上のメルクマールの策定方法であって、以下の工程：
(a)同じ分類に属し、かつ、互いに異なる少なくとも５以上の昆虫のミトコンドリアＤＮＡ由来の塩基配列をアラインメントする工程、
(b)上記アラインメントの結果、上記塩基配列から、全ての上記塩基配列において保存されている、１又はそれ以上の塩基からなる部位を抽出する工程、
(c)上記部位の全部又はその一部を共通塩基グループとする工程、
(d)少なくとも２以上の分類について上記工程(a)〜(c)を行う工程、
(e)上記(d)で得られた１の共通塩基グループと、前記共通塩基グループが属する分類とは異なる少なくとも１以上の分類に属する昆虫由来の塩基配列のうち上記共通塩基グループから選択される塩基に対応する塩基とを互いに比較し、上記共通塩基グループから選択される塩基が、前記共通塩基グループが属する分類とは異なる少なくとも１以上の分類に属する昆虫由来の塩基配列の対応する塩基と完全に一致しないように、上記共通塩基グループから、少なくとも１以上の塩基を選択してメルクマールとする工程
を含む、前記方法。
ここで、上記（１）又は（２）記載の方法の上記ミトコンドリアＤＮＡ由来の塩基配列は、ミトコンドリアNADH dehydrogenase subunit 5（ＮＤ５）遺伝子由来の塩基配列でもよい。また、上記（１）又は（２）記載の方法の分類は目でもよく、また科でもよい。さらに、上記（１）又は（２）記載の方法の昆虫は、双翅目、半翅目、膜翅目、鱗翅目、鞘翅目からなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよい。さらに、上記（１）又は（２）記載の方法中の工程(a)において用いる塩基配列の長さは２０塩基以上を選ぶことができる。また、上記（１）又は（２）記載の方法中の共通塩基グループは、連続及び／又は不連続の複数の部位からなるものでもよい。
【００１４】
（３）分類レベルで昆虫を識別するための１又はそれ以上のメルクマールの策定方法であって、以下の工程：
(a)同じ分類に属し、かつ、互いに異なる少なくとも５以上の昆虫の核ＤＮＡ由来の塩基配列を、アラインメントする工程、
(b)上記アラインメントの結果、上記塩基配列から、全ての上記塩基配列において保存されている、１又はそれ以上の塩基からなる部位を抽出する工程、
(c)上記部位の全部又はその一部を共通塩基グループとする工程、
(d)少なくとも２以上の分類について上記工程(a)〜(c)を行う工程、
(e)上記で得られた複数の共通塩基グループを互いに比較し、１つの分類から得られた上記共通塩基グループから選択される塩基とそれ以外の分類から得られた共通塩基グループから選択される塩基が完全に一致しないように、上記共通塩基グループから、少なくとも１以上の塩基を選択してメルクマールとする工程
を含む、前記方法。
【００１５】
前記方法は、上記工程(e)において、上記(d)で得られた１の共通塩基グループを、上記(d)で得られた複数の共通塩基グループと互いに比較したのち、さらに、前記共通塩基グループが属する分類とは異なる少なくとも１以上の分類に属する昆虫由来の塩基配列のうち上記共通塩基グループから選択される塩基に対応する塩基と互いに比較することを含んでいてもよい。
【００１６】
（４）  分類レベルで昆虫を識別するための１又はそれ以上のメルクマールの策定方法であって、以下の工程：
・  同じ分類に属し、かつ、互いに異なる少なくとも５以上の昆虫の核ＤＮＡ由来の塩基配列を、アラインメントする工程、
(b)上記アラインメントの結果、上記塩基配列から、全ての上記塩基配列において保存されている、１又はそれ以上の塩基からなる部位を抽出する工程、
(c)上記部位の全部又はその一部を共通塩基グループとする工程、
(d)少なくとも２以上の分類について上記工程(a)〜(c)を行う工程、
(e)上記(d)で得られた１の共通塩基グループと、前記共通塩基グループが属する分類とは異なる少なくとも１以上の分類に属する昆虫由来の塩基配列のうち上記共通塩基グループから選択される塩基に対応する塩基とを互いに比較し、上記共通塩基グループから選択される塩基が、前記共通塩基グループが属する分類とは異なる少なくとも１以上の分類に属する昆虫由来の塩基配列の対応する塩基と完全に一致しないように、上記共通塩基グループから、少なくとも１以上の塩基を選択してメルクマールとする工程
を含む、前記方法。
【００１７】
ここで、上記方法（３）及び（４）中の分類は目又は科でもよい。また、上記方法中の昆虫は、双翅目、半翅目、膜翅目、鱗翅目、鞘翅目からなる群から選ばれる少なくとも１つでもよい。さらに、上記方法中の工程(a)において用いる塩基配列の長さは２０塩基以上を選ぶことができる。また、上記方法中の上記共通塩基グループは、連続及び／又は不連続の複数の部位からなるものでもよい。
【００１８】
（５）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法によって得られたメルクマールを有する領域の塩基配列と、被検体である昆虫から得られた塩基配列中の前記メルクマールを有する領域の塩基配列に相当する塩基配列を比較し、被検体の前記塩基配列中のメルクマールに相当する部位の塩基がメルクマールの塩基と完全に一致するかを解析し、被検体の分類を識別することからなる、被検体である昆虫を分類レベルで識別するための方法。
【００１９】
（６）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法によって得られたメルクマールを有する領域の塩基配列を解析ソフト上に登録し、被検体である昆虫から得られた、前記メルクマールと同じ領域を含む塩基配列を前記解析ソフトに入力し、前記解析ソフト上で両者の塩基配列をアラインメントすることにより、被検体の塩基配列中のメルクマールに相当する部位の塩基と前記メルクマールの塩基が完全に一致するかを解析し、被検体の分類を識別することからなる、被検体である昆虫を分類レベルで識別するための方法。
【００２０】
（７）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法によって得られた、メルクマールを有する塩基配列を１又はそれ以上登録する手段と、被検体である昆虫から得られた、前記メルクマールと同じ領域を含む塩基配列を入力する手段と、前記メルクマールを有する塩基配列及び前記入力された被検体の塩基配列を比較する手段と、前記メルクマール及び前記入力された被検体の塩基配列中の前記メルクマールに相当する部位の塩基とが完全に一致するかを解析する手段と、被検体の分類を識別する手段を実行させるための、被検体である昆虫を分類レベルで同定するための解析ソフト。
【００２１】
（８）上記（７）の解析ソフトを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【００２２】
（９）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法によって得られたメルクマール。
また、本メルクマールは具体的に以下のものでもよい。
【００２３】
双翅目に特異的である上記（９）記載のメルクマールであって、配列番号１で示されるイエバエ由来の塩基配列の５’末端から、第２６９番目の塩基がＡ、第２７０番目の塩基がＡ、第２７２番目の塩基がＡ、第２７５番目の塩基がＡ、第２７６番目の塩基がＡ、第２７８番目の塩基がＡ、第２７９番目の塩基がＡ、第２８０番目の塩基がＴ、第２８４番目の塩基がＣ、第２８５番目の塩基がＡ、第２８７番目の塩基がG、第２８８番目の塩基がＡ、第２９０番目の塩基がＡ、第２９１番目の塩基がＴ、第２９３番目の塩基がＣ、第２９４番目の塩基がG、第２９７番目の塩基がＴ、第２９９番目の塩基がＡ、第３００番目の塩基がＴ、第３０２番目の塩基がG、第３０３番目の塩基がG、第３０６番目の塩基がG、第３０８番目の塩基がＴ、第３０９番目の塩基がＴ、第３１０番目の塩基がＡ、第３１２番目の塩基がG、及び第３１５番目の塩基がＴである、前記メルクマール。
【００２４】
半翅目に特異的である上記（９）記載のメルクマールであって、配列番号２で示されるツマグロヨコバイ由来の塩基配列の５’末端から、第１９５番目の塩基がＴ、第２０９番目の塩基がC、第２１０番目の塩基がＡ、第２１２番目の塩基がG、第２１３番目の塩基がＣ、第２１８番目の塩基がＴ、第２１９番目の塩基がＴ、第２２１番目の塩基がＡ、第２２２番目の塩基がＡ、第２２５番目の塩基がＣ、第２２８番目の塩基がＴ、第２３１番目の塩基がＴ、第２３３番目の塩基がＴ、第２３４番目の塩基がＴ、第２３５番目の塩基がＴ、第２３６番目の塩基がＴ、第２３７番目の塩基がＴ、第２３９番目の塩基がＴ、第２４０番目の塩基がＧ、第２４６番目の塩基がＧ、第２４７番目の塩基がＡ、第２５４番目の塩基がＡ、及び第２５５番目の塩基がＴである、前記メルクマール。
【００２５】
半翅目に特異的である上記（９）記載のメルクマールであって、配列番号２で示されるツマグロヨコバイ由来の塩基配列の５’末端から、第１９５番目の塩基がＴ、第２０９番目の塩基がC、第２１０番目の塩基がＡ、第２１２番目の塩基がG、第２１３番目の塩基がＣ、第２１８番目の塩基がＴ、第２１９番目の塩基がＴ、第２２１番目の塩基がＡ、第２２２番目の塩基がＡ、第２２５番目の塩基がＣ、第２２８番目の塩基がＴ、第２３１番目の塩基がＴ、第２３３番目の塩基がＴ、第２３４番目の塩基がＴ、第２３５番目の塩基がＴ、第２３６番目の塩基がＴ、第２３７番目の塩基がＴ、第２３９番目の塩基がＴ、第２４０番目の塩基がＧ、第２４６番目の塩基がＧ、第２４７番目の塩基がＴ、第２５４番目の塩基がＡ、及び第２５５番目の塩基がＴである、前記メルクマール。
【００２６】
半翅目に特異的である上記（９）記載のメルクマールであって、配列番号２で示されるツマグロヨコバイ由来の塩基配列の５’末端から、第２０９番目の塩基がC、第２１０番目の塩基がＡ、第２１２番目の塩基がG、第２１３番目の塩基がＣ、第２１８番目の塩基がＴ、第２１９番目の塩基がＴ、第２２１番目の塩基がＡ、第２２２番目の塩基がＡ、第２２５番目の塩基がＣ、第２２８番目の塩基がＴ、第２３１番目の塩基がＴ、第２３３番目の塩基がＴ、第２３４番目の塩基がＴ、第２３５番目の塩基がＴ、第２３６番目の塩基がＣ、第２３７番目の塩基がＴ、第２３９番目の塩基がＴ、第２４０番目の塩基がＧ、第２４６番目の塩基がＧ、第２５４番目の塩基がＡ、第２５５番目の塩基がＴである、前記メルクマール。
【００２７】
半翅目に特異的である上記（９）記載のメルクマールであって、配列番号２で示されるツマグロヨコバイ由来の塩基配列の５’末端から、第２０９番目の塩基がC、第２１０番目の塩基がＡ、第２１２番目の塩基がG、第２１３番目の塩基がＣ、第２１８番目の塩基がＴ、第２１９番目の塩基がＴ、第２２１番目の塩基がＡ、第２２２番目の塩基がＡ、第２２５番目の塩基がＣ、第２２８番目の塩基がＴ、第２３１番目の塩基がＴ、第２３３番目の塩基がＴ、第２３４番目の塩基がＴ、第２３５番目の塩基がＣ、第２３６番目の塩基がＡ、第２３７番目の塩基がＴ、第２３９番目の塩基がＴ、第２４０番目の塩基がＧ、第２４６番目の塩基がＧ、第２５４番目の塩基がＡ、第２５５番目の塩基がＴ、第２９５番目の塩基がＡ、及び第２９６番目の塩基がＡ、第２９７番目の塩基がＴ、及び第２９８番目の塩基がＴ、である、前記メルクマール。
【００２８】
膜翅目に特異的である上記（９）記載のメルクマールであって、配列番号３で示されるヒメハナバチ由来の塩基配列の５’末端から、第８８５番目の塩基がＴ、第８８６番目の塩基がＴ、第８９６番目の塩基がＣ、第８９７番目の塩基がＴ、第８９８番目の塩基がＴ、第８９９番目の塩基がＴ、第９０２番目の塩基がＴ、第９０４番目の塩基がＴ、第９０５番目の塩基がＴ、第９０８番目の塩基がＴ、第９１０番目の塩基がＴ、第９１１番目の塩基がＧ、第９１２番目の塩基がＴ、第９１６番目の塩基がＧ、第９１７番目の塩基がＧ、第９２５番目の塩基がＡ、第９２６番目の塩基がＴ、第９２９番目の塩基がＡ、第９３０番目の塩基がＴ、第９４５番目の塩基がＴ、第９４６番目の塩基がＣ、第９４７番目の塩基がＡ、第９５０番目の塩基がＡ、第９５１番目の塩基がＴ、第９５３番目の塩基がＴ、第９５５番目の塩基がＣ、第９５６番目の塩基がＧ、第９７１番目の塩基がＴ、第９８５番目の塩基がＣ、第９８６番目の塩基がＣ、第９８９番目の塩基がＴ、第９９８番目の塩基がＴ、第１００４番目の塩基がＴ、第１０３１番目の塩基がC、及び第１０１９番目の塩基がＴ、である、前記メルクマール。
【００２９】
膜翅目に特異的である上記（９）記載のメルクマールであって、配列番号３で示されるヒメハナバチ由来の塩基配列の５’末端から、第８８５番目の塩基がＡ、第８８６番目の塩基がＡ、第８９４番目の塩基がＡ、第８９６番目の塩基がＣ、第８９９番目の塩基がＴ、第９０２番目の塩基がＴ、第９０４番目の塩基がＴ、第９０５番目の塩基がＴ、第９０８番目の塩基がＴ、第９１０番目の塩基がＴ、第９１１番目の塩基がＧ、第９１２番目の塩基がＴ、第９１６番目の塩基がＧ、第９１７番目の塩基がＧ、第９２５番目の塩基がＡ、第９２６番目の塩基がＴ、第９２９番目の塩基がＡ、第９３０番目の塩基がＴ、第９４５番目の塩基がＴ、第９４６番目の塩基がＣ、第９４７番目の塩基がＡ、第９５０番目の塩基がＡ、第９５１番目の塩基がＴ、第９５３番目の塩基がＴ、第９５５番目の塩基がＣ、第９５６番目の塩基がＧ、第９７１番目の塩基がＴ、第９８５番目の塩基がＣ、第９８６番目の塩基がＣ、第９８９番目の塩基がＴ、第９９８番目の塩基がＴ、第１００４番目の塩基がＴ、第１０１３番目の塩基がC、及び第１０１９番目の塩基がＴ、である、前記メルクマール。
【００３０】
膜翅目に特異的である上記（９）記載のメルクマールであって、配列番号３で示されるヒメハナバチ由来の塩基配列の５’末端から、第８８５番目の塩基がＡ、第８８６番目の塩基がＴ、第８９５番目の塩基がＴ、第８９６番目の塩基がＣ、第８９９番目の塩基がＴ、第９０２番目の塩基がＴ、第９０４番目の塩基がＴ、第９０５番目の塩基がＴ、第９０８番目の塩基がＴ、第９１０番目の塩基がＴ、第９１１番目の塩基がＧ、第９１２番目の塩基がＴ、第９１６番目の塩基がＧ、第９１７番目の塩基がＧ、第９２５番目の塩基がＡ、第９２６番目の塩基がＴ、第９２９番目の塩基がＡ、第９３０番目の塩基がＴ、第９４５番目の塩基がＴ、第９４６番目の塩基がＣ、第９４７番目の塩基がＡ、第９５０番目の塩基がＡ、第９５１番目の塩基がＴ、第９５３番目の塩基がＴ、第９５５番目の塩基がＣ、第９５６番目の塩基がＧ、第９７１番目の塩基がＴ、第９８５番目の塩基がＣ、第９８６番目の塩基がＣ、第９８９番目の塩基がＴ、第９９８番目の塩基がＴ、第１００４番目の塩基がＴ、第１０１３番目の塩基がC、及び第１０１９番目の塩基がＴ、である、前記メルクマール。
【００３１】
鱗翅目に特異的である上記（９）記載のメルクマールであって、配列番号４で示されるチャノコカクモンハマキ由来の塩基配列の５’末端から、第９４７番目の塩基がＴ、第９４８番目の塩基がＡ、第９５０番目の塩基がＴ、第９５２番目の塩基がＡ、第９５６番目の塩基がＡ、第９５８番目の塩基がＡ、第９６１番目の塩基がＣ、第９６２番目の塩基がＡ、第９６４番目の塩基がＧ、第９６５番目の塩基がＡ、第９６６番目の塩基がＴ、第９６７番目の塩基がＡ、第９６８番目の塩基がＴ、第９６９番目の塩基がＴ、第９７０番目の塩基がＣ、第９７１番目の塩基がＧ、第９７６番目の塩基がＡ、第９７７番目の塩基がＴ、第９７９番目の塩基がＧ、第９８０番目の塩基がＧ、第９８２番目の塩基がＧ、第９８３番目の塩基がＧ、第９８６番目の塩基がＴ、第９８８番目の塩基がＡ、及び第９８９番目の塩基がＧ、である、前記メルクマール。
【００３２】
鞘翅目に特異的である上記（９）記載のメルクマールであって、配列番号８０で示されるマゲラニクスチリオサムシ由来の塩基配列の５’末端から、第３００番目の塩基がＴ、第３１１番目の塩基がＣ、第３１２番目の塩基がＡ、第３１４番目の塩基がG、第３１５番目の塩基がＡ、第３１６番目の塩基がＴ、第３１７番目の塩基がＡ、第３１８番目の塩基がＴ、第３２０番目の塩基がＣ、第３２１番目の塩基がG、第３２３番目の塩基がＴ、第３２５番目の塩基がＴ、第３２６番目の塩基がＡ、第３２７番目の塩基がＴ、第３２９番目の塩基がG、第３３０番目の塩基がG、第３３６番目の塩基がＴ、第３３８番目の塩基がＡ、及び第３３９番目の塩基がＴである、前記メルクマール。
【発明の効果】
【００３３】
本発明により、昆虫を分類レベルで識別するためのメルクマールの策定方法が提供される。本発明のメルクマールを用いることにより、飲食品等の製造工程中で混入した昆虫を目又は科レベルで簡易、確実かつ迅速に識別することが可能となる。従って、本発明のメルクマールは、飲食品等の製造工程中の昆虫混入に関する原因究明及び再発防止に有用である。
【００３４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明は、昆虫を分類レベルで識別するための基準となるメルクマールの策定方法、及び前記メルクマールを用いて昆虫を分類レベルで識別する方法、並びに昆虫を分類レベルで識別するための解析ソフトに関する。
＜本発明の概要＞
本発明の、昆虫を科又は目レベルの分類レベルで識別することに用いるメルクマールを策定する方法は、所望の分類、例えば、目又は科に属する昆虫由来の塩基配列中の塩基のうち、すべての昆虫で保存されている塩基を抽出し、そこから他の分類と一致しないように塩基を選択し、それをメルクマールとして、被検体である昆虫の分類を識別しようとするものである。具体的には、同じ分類に属し、かつ、互いに異なる少なくとも５以上の昆虫のミトコンドリアＤＮＡ由来の塩基配列データをアラインメントして、全ての塩基配列において保存されている塩基の部位を抽出して共通塩基グループとする。このような共通塩基グループを、互いに異なる科又は目等の２以上の分類についても作成する。ついで、これらを互いに比較して、ある分類から得られた上記共通塩基グループから選択される塩基と他の分類から得られた共通塩基グループから選択される塩基が完全に一致しないように、及び／又はある分類から得られた上記共通塩基グループから選択される塩基と他の分類に属する昆虫の塩基配列中の上記共通塩基グループから選択される塩基に対応する塩基とが完全に一致しないように、上記共通塩基グループから、少なくとも１以上の塩基を選択してメルクマールとするものである。このようにして得られたメルクマールを有する領域の塩基配列と、被検体である昆虫から得られた塩基配列中の前記メルクマールを有する領域の塩基配列に相当する塩基配列を比較し、被検体の塩基配列中のメルクマールに相当する部位の塩基がメルクマールの塩基と完全に一致するかを解析することにより、被検体の分類を識別することができる。このように、本発明のメルクマールは、製造品等への混入昆虫を簡易・迅速かつ正確に同定できるものとして有用である。
【００３６】
本発明のメルクマールとは、製造品等に混入した昆虫を分類レベルで特定するための指標をいい、下記に詳しく説明するように、選択された塩基の部位及び塩基の種類が他の分類レベルとは、完全に一致しない、１塩基又は複数塩基の組み合わせからなる。本発明のメルクマール策定に用いる昆虫のＤＮＡ塩基配列（以下「シークエンスデータ」ともいう）は、ミトコンドリアＤＮＡに由来するものであっても、核ＤＮＡに由来するものであってもよい。特にミトコンドリアＤＮＡの場合には核ＤＮＡに比べて塩基置換の起こる速度が速く各分類レベル間の差異が多く見出される可能性が高いと考えられ、しかも細胞あたりの数が多く大量に調製できるため、分析が容易であり、好ましい。
【００３７】
本発明の分類は、多数の昆虫のうち、特定の性質が相似であること等により体系的にまとめあげられたものであればどのレベルの分類でもよく、具体的には網、目、科、種があげられるが、好ましくは、目又は科である。
【００３８】
本発明の昆虫は、節足動物門のうちの、昆虫網の大部分を占める有翅昆虫亜網に属するものであり、好ましくは、双翅目、半翅目、膜翅目、鱗翅目、鞘翅目に属する昆虫であるが、これらに限定されない。なお、双翅目としてはハエ、カ、アブ等を、半翅目としてはセミ、カメムシ、アブラムシ、ウンカ等を、膜翅目としてはハチ、アリ等を、鱗翅目としてはチョウ、ガ等を、鞘翅目としてはカミキリムシ、カブトムシ、ゴミムシ等を、それぞれ例示することができる。
【００３９】
本発明の策定方法に用いる昆虫は、例えば昆虫販売業者や昆虫取扱業者から分譲又は購入することもできるし、雑木林や草むら等の野外で採集したものを使用することもできる。採集した昆虫については、好ましくは専門家に同定を依頼する。
【００４０】
本発明におけるメルクマール策定には、同じ分類に属しかつ互いに異なる種類の昆虫のシークエンスデータを少なくとも５種類以上、好ましくは７種類以上、さらに好ましくは１０種類以上使用する。同じ分類、例えば同じ目あるいは同じ科に属しながらそれぞれ違った種類の昆虫のシークエンスデータを少なくとも５種類以上、好ましくは７種類以上、さらに好ましくは１０種類以上使用することにより、共通する塩基に偏りが生じることなく、その目あるいは科に共通する塩基部位を抽出し、その目あるいは科に特異的でかつ信頼性が高いメルクマールを策定することが可能となるからである。
【００４１】
本発明のアラインメントとは、個体ごとに得られた複数の塩基配列を横列に並べ、縦列に相同な座がくるように整列させて、互いに塩基配列の異同を調べることをいう。このような操作は、Multiple Alignmentともいい、分子生物学の分野で、ある塩基配列中のモチーフの抽出、特定の塩基配列が有する構造又は機能の予測、進化系統樹の作成に慣用されるものである。従って、本発明のアラインメントは、DNAspace（日立ソフト社製）等の解析ソフトを用いる等、これらの解析に通常用いられるいかなる操作も含まれる。
【００４２】
また本発明のメルクマール策定に用いる昆虫のシークエンスデータは、独自に昆虫から抽出したＤＮＡを常法に従って決定した塩基配列であっても、また公開データベースから得られる既知のシークエンスデータを用いてもよい。
【００４３】
既知のシークエンスデータは、例えばGenBank（NIH genetic sequence database）や、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）等のデータベースに登録されている昆虫のシークエンスデータを使用することができる。これらのデータベースから検索してダウンロードしたシークエンスデータはそのまま、又は連続した一定領域を取り出してからアラインメント（Multiple Alignment 解析）に供することができる。
【００４４】
さらに本発明においてアラインメントに供するシークエンスデータとしては、２０塩基以上、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは２０〜１００００塩基、さらに好ましくは５０〜５０００塩基の長さの塩基配列を用いることができる。
【００４５】
また本発明において用いる、複数の昆虫由来のシークエンスデータは、上記したようにアラインメントに供するため、共通した領域（以下「共通領域」ともいう）を含有するものでなければならない。この共通領域の選択にあたっては、特に制限はなく、ミトコンドリアＮＤ５遺伝子等の特定の機能又は構造を発現する領域であってもよく、遺伝子として機能していない領域であってもよいが、中でもミトコンドリアＮＤ５遺伝子は進化速度が速いため、各分類レベル間での差異が多く見出される可能性が高いと考えられ、メルクマール策定のための共通領域として特に好ましい。またＰＣＲ法で増幅可能な領域であることが好ましい。具体的には、下記のプライマーを用いて増幅される領域があげられる。また共通領域の大きさは、シークエンスの信頼性が高い約２０〜２０００塩基、約５０〜１０００塩基、好ましくは、１００〜７００塩基、さらに好ましくは１００〜５００塩基である。
ミトコンドリアＮＤ５遺伝子由来のプライマーセット（v1.06-1/v1.04-4）
V1.06-1  CCT GTT TCT GCT TTA GTT CA     （配列番号５）
V1.04-4  GTC ATA CTC TAA ATA TAA GCT A  （配列番号６）
核ゲノム由来のプライマーセット（28S-01/28SR-01）、
28S-01  GAC TAC CCC CTG AAT TTA AGC AT      （配列番号７）
28SR-01 GAC TCC TTG GTC CGT GTT TCA AG      （配列番号８）
核ゲノム由来のプライマーセット（ITS-1/ITS-4）
ITS-1  AAG TCG TAA CAA GGT TTC CG      （配列番号９）
ITS-4  TCC TTG TTA GTT TCT TTT CCT C   （配列番号１０）
なお、１つの分類の識別のために、複数の共通領域を選択することもできる。その場合は、１つの分類に複数のメルクマールが存在することになり、被検体である昆虫の識別精度がより高まるため、好ましい。
【００４６】
本発明の共通塩基グループは、同じ分類に属し、かつ、互いに異なる昆虫の塩基配列全てにおいて、保存された塩基の部位の全部又はその一部からなる。この部位に含まれる塩基は、一塩基ごとに単独であっても、また隣接した塩基が複数連なっていてもよい。
また、上記共通塩基グループが複数の部位からなる場合は、その複数の部位は互いに連続してもよく、及び／又は不連続であってもよい。
【００４７】
本発明の「ある分類から得られた上記共通塩基グループから選択される塩基と他の分類から得られた共通塩基グループから選択される塩基が完全に一致しないように」とは、本発明のメルクマールとして上記共通塩基グループから選択される塩基が全て、各々他のメルクマールに含まれる塩基と同じ部位の同じ種類の塩基を選択するものではないことを意味する。ある分類のためのメルクマールとして選択した塩基が、他の分類のためのメルクマールに含まれる塩基と完全に同じ位置で同じ種類の塩基である場合は、被検体がどの分類に含まれるのか判定ができないため、本発明のメルクマールとしては適さないからである。つまり、本発明のメルクマールとして選択される塩基の部位とその塩基の種類は、他のメルクマールに含まれる塩基の部位とその塩基の種類と完全に一致してはならず、従って、メルクマールに含まれる塩基を選択する場合には、他のメルクマールに含まれる塩基の部位とその部位での塩基が完全に一致していないかを確認する必要がある。確認方法は、選択したメルクマールを比較して、全てが一致していないことが確認できる方法であれば、目視、機械操作等どのような方法を用いてもよい。この確認方法としては、各々の共通塩基グループが同じ領域から選択された部位からなることを前提とし、例えば各分類のメルクマールを含有する塩基配列をアラインメントし、共通塩基グループの各部位が完全一致しないことを解析する方法等があげられる。
【００４８】
また、本発明においてメルクマールの信頼性を高めるためには、ある分類のメルクマールとして選択される塩基の部位とその塩基の種類は、他の分類に属する昆虫の塩基配列データと比較して完全に一致しないことが望ましい。具体的にはある分類のメルクマールとして選択される塩基を含有する塩基配列と、該塩基配列に相当する領域を有する他の分類に属する昆虫の塩基配列をアラインメントによって比較し、メルクマールとして選択される塩基が完全に一致しないことを確認する。比較に用いる個々の分類由来の塩基配列の数は、５個以上、好ましくは１０個以上である。例えばよく見かける昆虫の多くは五大目といわれる双翅目、半翅目、膜翅目、鱗翅目、鞘翅目に含まれるため、五大目のうちのある目のメルクマールとして選択される塩基を含有する塩基配列は、残りの４つの目に属する昆虫の塩基配列、すなわち２０個以上、好ましくは４０個以上と比較するとよい。
【００４９】
また、本発明では、上記共通塩基グループに含まれる塩基から少なくとも１以上の塩基、好ましくは３〜５０の塩基、より好ましくは５〜３０の塩基、さらに好ましくは１５〜３０の塩基を選択してメルクマールとすることができる。少なくとも１以上の塩基、好ましくは３〜５０の塩基、より好ましくは５〜３０の塩基、さらに好ましくは１５〜３０の塩基としたのは、メルクマールとしての操作の簡便性及び信頼性を考慮したためである。
【００５０】
＜メルクマールの策定方法＞
以下に、本発明のメルクマールを策定する方法を記載する。ただし、本発明はこれらの方法に限定されるものではなく、一般的に知られている他の方法を適宜改変して用いてもよい。
【００５１】
（１）昆虫の入手
ＤＮＡ抽出に用いる昆虫は、例えば昆虫販売業者や昆虫取扱業者から分譲又は購入することもできるし、雑木林や草むら等から採集したものを使用することもできる。採集した昆虫は、好ましくは専門家に同定を依頼する。
【００５２】
（２）ＤＮＡの抽出
ＤＮＡの抽出は、昆虫の全体もしくは一部（触角、胸部、翅、脚等）を用いて行うことができる。好ましくは、ノミバエ等の小型昆虫については、1匹又は数匹の個体全体を使用し、イエバエやそれ以上の体長を有する大型昆虫では、昆虫の体の一部（触角、胸部（又はその筋肉）、前翅、後翅、脚等のいずれか）を使用する。
【００５３】
ＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ（Cetyltrimethyl ammonium bromide）法や市販キットのQiagen DNeasy Tissue Kit（キアゲン社）やISOPLANTII（ニッポンジーン社）等の当業界で公知の方法を用いて抽出することができる。操作性と経済性の点からＣＴＡＢ法が好ましい。
【００５４】
（３）ＤＮＡ断片の増幅
ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片の増幅を行う。本発明で用いるＰＣＲ法は特に限定されず、公知のＰＣＲ法に加え、種々の改良方法を含む。以下はその一例である。すなわち、プライマーのセット、鋳型（被検）ＤＮＡの他にＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等の試薬類を混合してＰＣＲ反応液とする。ＰＣＲの１サイクルは、熱変性、アニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の３つのステップからなる。各ステップはそれぞれ異なる、場合により同一の反応温度と反応時間を必要とし、これらは増幅すべきＤＮＡ領域の塩基配列、その長さ等により適宜決定される。このような操作は市販のthermal cyclerを用いて行うことができる。
【００５５】
本発明に使用するプライマーの一例としては、下記に記載したような、昆虫の系統解析で用いられる既存のミトコンドリアNADH dehydrogenase subunit 5（ＮＤ５）遺伝子由来のプライマーセット（v1.06-1/v1.04-4（配列番号５及び６）及びEzo-2/AO-3（配列番号１１及び１２））、cytochrome oxidase subunitI（ＣｏＩ）遺伝子由来のプライマーセット（SKCOＩ-7/ SKCOＩ-2（配列番号１３及び１４））、又は核ゲノム由来のプライマーセット（28S-01/28SR-01（配列番号７及び８）及びITS-1/ITS-4（配列番号９及び１０））を使用することができる。
ミトコンドリアＮＤ５遺伝子由来のプライマーセット（v1.06-1/v1.04-4）
V1.06-1  CCT GTT TCT GCT TTA GTT CA       （配列番号５）
V1.04-4  GTC ATA CTC TAA ATA TAA GCT A    （配列番号６）
ミトコンドリアＮＤ５遺伝子由来のプライマーセット（Ezo-2/AO-3）
Ezo-2  TTC ATC TTT TAA CTC ATG CA     （配列番号１１）
AO-3   ATA TTC ATT TCA ACC TTG ATC    （配列番号１２）
ミトコンドリアＣｏＩ遺伝子由来のプライマーセット（SKCOＩ-7/ SKCOＩ-2）
SKCOＩ-7  CGC TCT AGA ACT AGT GGA TCA CNA AYC AYA ARG AYA TYG GNA C        （配列番号１３）
SKCOＩ-2  TCG AGG TCG ACG GTA TCA CRT ART GRA ART GNG CNA CNA CNA CRT ART A    （配列番号１４）
核ゲノム由来のプライマーセット（28S-01/28SR-01）
28S-01  GAC TAC CCC CTG AAT TTA AGC AT    （配列番号７）
28SR-01 GAC TCC TTG GTC CGT GTT TCA AG    （配列番号８）
核ゲノム由来のプライマーセット（ITS-1/ITS-4）
ITS-1  AAG TCG TAA CAA GGT TTC CG       （配列番号９）
ITS-4  TCC TTG TTA GTT TCT TTT CCT C    （配列番号１０）
また、一部の昆虫種については、既存のプライマーでは目的とするバンドを増幅することができない場合があり、これらについてはメルクマールの塩基をはさむ形で、すなわちメルクマールの塩基を含有する領域をはさむ形で、適切なプライマーを設計し、使用する。
【００５６】
例えば、鱗翅目に使用できることが確認されている新たに設計したプライマーとしては、以下のプライマーがあげられるがこれらに限定されない。
ミトコンドリアＮＤ５遺伝子由来のプライマーセット（v1.06-1/rin-r）
V1.06-1  CCT GTT TCT GCT TTA GTT CA       （配列番号５）
rin-r    GAA TAA AAT CCA GCT AAA AAA GG    （配列番号１５）
鱗翅目に属するコイガ、ハスモンヨトウについて、上記プライマーを用いると、メルクマールの塩基をはさむ446塩基の断片を増幅することができる。
【００５７】
また例えば、膜翅目に使用できることが確認されている新たに設計したプライマーとしては、以下のプライマーがあげられるがこれらに限定されない。
ミトコンドリアＮＤ５遺伝子由来のプライマーセット（maku_1-f1又はmaku_1-f2/maku_1-r1）
maku_1-f1  GCT CCW ACT CCT GTK TC    （配列番号１６）
maku_1-r1  CTA AAA AAG GAA AWC CAC   （配列番号１７）
又は、
maku_1-f2  GTT CAT TCA TCW ACT TTA G  （配列番号１８）
maku_1-r1  CTA AAA AAG GAA AWC CAC    （配列番号１７）
膜翅目に属するマルハナバチについて、上記maku_1-f1及びmaku_1-r1プライマーを用いた場合は、メルクマールの塩基をはさむ439塩基の断片を増幅することができ、膜翅目に属するハバチ科、ヒメバチ科、ヒメハラナガツチバチ、ジガバチ、オオスズメバチ、マルハナバチについて、上記maku_1-f2及びmaku_1-r1プライマーを用いた場合は、メルクマールの塩基をはさむ415塩基の断片を増幅することができる。
【００５８】
本発明のプライマーは、より多くの昆虫種で目的とするバンドを増幅することができるものを選択することが好ましい。
【００５９】
（４）ＰＣＲによる増幅の確認
ＰＣＲの結果（ＰＣＲ産物）の評価方法として、特定のＤＮＡ断片を同定しうる任意の方法、例えば、電気泳動、ゲルろ過、ハイブリダイゼーションを用いて目的の大きさのＤＮＡ断片（例えば、上記ミトコンドリアＮＤ５遺伝子由来のプライマーセットを使用した場合は、大きさが1080塩基前後のＤＮＡ断片）が増幅されていることを確認する。
【００６０】
（５）ＰＣＲ産物の精製
増幅されたＰＣＲ産物は、サイクルシークエンス反応の鋳型として用いるために、余剰のプライマー等の反応に用いた成分と分離する。この精製は、例えば、市販のQIAquick PCR Purification Kit（キアゲン社）を使用し、その製品に添付のプロトコールに従って行うことができる。
【００６１】
（６）サイクルシークエンス反応及びシークエンス産物の精製
上記のように精製したＰＣＲ産物のシークエンスを行うため、それを鋳型にして、サイクルシークエンス反応を実施する。この方法は、ＰＣＲ法に類似し、thermal cyclerを用いて、熱変性、アニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の３つのステップを繰り返し実施するが、どちらか１種類のプライマーを用い、塩基ごとに異なる４種類の蛍光色素で標識したターミネーター存在下で長さの異なる種々の１本鎖ＤＮＡを合成する方法である。
【００６２】
その後、上記で得られた反応液から、シークエンシング産物、すなわち１本鎖ＤＮＡの混合液を精製し、以降のシークエンサーに供する試料を調製する。この方法の一例として、CENTRISEP Spin Column（ＡＢＩ社）を用いる方法があげられ、添付のプロトコールに従って操作し、目的の試料を得る。
【００６３】
（７）ＤＮＡ断片のシークエンス
上記Dye Terminator法で得られたシークエンス産物につき、シークエンスを行う。方法としては電気泳動法を用いるのが一般的であり、一例として、ABI PRISM 310 Genetic Analyzerを用いて電気泳動を行い、標識に用いた蛍光物質が塩基ごとに異なることを利用して、レーザー蛍光検出器により順次塩基配列を決定することがあげられる。
【００６４】
（８）塩基配列の解析
決定された塩基配列を解析し、シークエンスデータを得る。例えばミトコンドリアＮＤ５遺伝子由来のプライマーセットの場合、５’側（プライマーV1.06-1側）と３’側（プライマーV1.04-4側）からそれぞれ３００〜６００塩基の長さのシークエンスデータが得られる。
【００６５】
（９）アラインメント
分類レベルで昆虫を識別するための基準となるメルクマールは以下のようにして策定する。まず上記のようにして得られた実分析の結果や既知データについて、分類ごとに少なくとも５種類の昆虫のシークエンスデータを選択し、上記したアラインメント（Multiple Alignment 解析）を行う。前記シークエンスデータは同じ領域を有するものでなければならないため、例えば、実分析で得られたシークエンスデータすなわち所望のプライマーを用いて増幅されシークエンスされた領域を共通領域と定め、公開データベースからはこの領域を含むシークエンスデータを選択し、そのまま、又は連続した一定領域を取り出して使用する。より具体的には、目や科の名称と遺伝子によってコードされる蛋白質（酵素等）の名称等をキーワードにして検索するか、あるいは、実分析で得られたシークエンスデータに基づいて相同性検索（ＢＬＡＳＴ検索）を行い、実分析で得られたシークエンスデータの領域を有するシークエンスデータで選択しダウンロードする。ダウンロードしたシークエンスデータはそのまま、又は連続した一定領域を取り出してからアラインメント（Multiple Alignment 解析）に使用することができる。
【００６６】
（１０）共通塩基グループの抽出
アラインメントにより得られたデータから、全種類の塩基配列において塩基が保存されている部位を抽出する。塩基が保存されているとは、得られたアラインメントデータの縦列が全種類の塩基配列において全て同じ塩基であることを意味する。抽出された部位のうち、その全部又は一部の部位を選択し、共通塩基グループとする。一部の部位を選択する場合は、所望のプライマーを用いて増幅されシークエンスされた領域を共通領域とする場合、好ましくはシークエンスの精度がより高いと考えられるシークエンス開始後（５’末端又は３’末端から）約５０番目から約４００番目の範囲内に存在する部位を選択する。また選択する部位は連続していても不連続であってもよい。選択する部位の総数は好ましくは１個以上、好ましくは３〜５０個、より好ましくは５〜３０個、さらに好ましくは１５〜３０個である。
【００６７】
（１１）メルクマールの策定
上記したように、共通塩基グループから選択される塩基が、他の分類から得られた共通塩基グループから選択される塩基と比較して、及び／又は他の分類の属する昆虫の塩基配列データと比較して、完全に一致していないことを確認する。このようにして、その分類に特異的なメルクマールを策定することができる。
【００６８】
このようにして策定されたメルクマールとして、例えば、昆虫の中でも、種類が多いとされるいわゆる五大目（双翅目、半翅目、膜翅目、鱗翅目、鞘翅目）について、本発明者が選定したメルクマールを表１に示す。
【００６９】
【表１】
2008099644.tif 000002
【００７０】
このうち、双翅目は27個の共通塩基グループ、半翅目は21個の共通塩基グループ（グループ１）、23個の共通塩基グループ（グループ２及び３）、及び25個の共通塩基グループ（グループ４）からなる4つの共通塩基グループ、膜翅目は34個の共通塩基グループ（グループ１及び２）、及び35個の共通塩基グループ（グループ３）からなる3つの共通塩基グループ、鱗翅目で25個の共通塩基グループ、鞘翅目で19個の共通塩基グループを各「目」のメルクマールとした。
【００７１】
なお策定されたメルクマールを使用して蓄積されたデータに基づき、より精度が高いメルクマールを策定することもできる。
【００７２】
＜昆虫の識別方法＞
上記のように策定したメルクマークを用いて混入した昆虫を分類レベルで識別することができる。具体的には、メルクマールを有する領域の塩基配列と、被検体の、前記メルクマールを有する領域の塩基配列に相当する塩基配列を比較し、被検体の塩基配列中の、メルクマールに相当する部位の塩基がメルクマールの塩基と完全に一致するかを解析することにより、被検体の分類を識別することができる。
【００７３】
以下に、本発明の昆虫の識別方法について解析ソフトを用いた場合について例示する。すなわち、上記の方法により得られたメルクマールを有する領域の塩基配列を予め、SeqScape（ＡＢＩ社）等の解析ソフト上に登録する。登録する分類は１つでもまたは複数であってもよい。一方、製造工程中に混入した昆虫等の被検体由来の塩基配列を上記解析ソフトに入力する。被検体由来の塩基配列については、上記＜メルクマールの策定方法＞（２）〜（８）に記載したのと同様の方法で、ＤＮＡを抽出し、被検体の塩基配列を解析することにより得ることができる。この場合、被検体の塩基配列は、基準とするメルクマールと同じ領域を含むものを調製する。得られた被検体の塩基配列を入力後、メルクマールを有する領域の塩基配列が予め登録されている分類との比較を行う。比較は、前記解析ソフト上で両者の塩基配列をアラインメントすることにより行うことができる。そして、被検体の塩基配列中のメルクマールに相当する部位の塩基と前記メルクマールの塩基が完全に一致するかを解析し、完全に一致する場合は、被検体は前記メルクマールが属する分類に属する昆虫であるといえる。このように、本発明のメルクマールを用いると、被検体である昆虫を分類レベルで識別することができる。予め複数の分類についてメルクマールを有する領域の塩基配列が登録されている場合は、被検体の塩基配列を各分類の塩基配列と順次、比較・解析を行い、被検体である昆虫を分類レベルで識別することができる。なお、分類のメルクマールとして決定した特定の塩基をマーキングする等の標識することにより、上記した比較を容易に実行することもできる。すなわち、まず、着色された対照の塩基（メルクマール）を有する塩基配列と、被検体由来の塩基配列のアラインメントを行った後に、着色された塩基だけを抜き出して両者を比較した表を作成する。これにより塩基の種類と存在する位置の全てが一致するか否かの識別が容易になり、被検体である昆虫がそのメルクマールの分類に属するか否かということが容易に識別できるため、被検体の分類レベルでの識別が可能となる。なお、この方法は複数の被検体についての解析も同時にできるため好ましい。
【００７４】
また、メルクマールを有する領域の塩基配列およびそれを用いて識別を行うプログラムを分類ごとに登録して保存しておくことにより、未知の被検体の分析時に即座に活用でき、各分類において分類レベルの識別が迅速に行える。
【００７５】
＜解析ソフト＞
本発明は、コンピュータを、本発明の昆虫の識別を実行させるための解析ソフトをも提供する。上記のようにメルクマールを用いて昆虫の識別を行う解析ソフトは、解析に用いるホストコンピュータが有する、本発明の方法により得られたメルクマールの記録手段、被検体由来の塩基配列の入力及び記録手段、メルクマール及び被検体由来の塩基配列をアラインメントにより比較する手段、上記比較結果を表示する手段等を、上記昆虫の識別を実行するために相互に協調させて働かせることができるコンピュータ用のプログラムである。この解析ソフトは、サーバに接続された情報記憶手段（ROM、RAM等）に登録され、上記識別に必要な手段を管理して、必要な機能又は処理を実行させる。従って、本発明の解析ソフトは、本発明において使用するコンピュータ上で、又はネットワーク上で機能しうるプログラム言語で記載することができる。具体的には、SeqScape（ABI社）等の解析ソフト上で、分類ごとのメルクマールが登録されたものを用いてもよい。
【００７６】
なお、本発明の解析ソフトによる昆虫の識別システムを稼動させるためには、本発明の解析ソフトの他に、通常のコンピュータネットワークに必要なプログラム、例えば周知のオペレーティングシステム(OS)やインターネットブラウザプログラム等も使用される。
【００７７】
＜コンピュータ読み取り可能な記録媒体＞
本発明の解析ソフトは、コンピュータ読み取り可能な記録媒体又はコンピュータに接続しうる記憶手段に保存することができる。従って、本発明の解析ソフトを含有するコンピュータ用記録媒体又は記憶手段も本発明に包含される。このような記録媒体又は記憶手段には、磁気的媒体（フレキシブルディスク、ハードディスクなど）、光学的媒体（CD、DVDなど）、磁気光学的媒体（MO、MD）などがある。
【実施例】
【００７８】
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．昆虫からのシークエンスデータ
（ア）昆虫
ＤＮＡ抽出に用いた昆虫は、アース製薬株式会社又は住化テクノサービス株式会社、シーアンドエス株式会社から入手した。取り扱いのない昆虫については、さいたま市見沼区において発明者が採集し、採集した昆虫の写真（デジタル画像）をシーアンドエス株式会社に送信し、同定を依頼した。これらの昆虫（計３４種）を表２に記載するが、半翅目として、ツマグロヨコバイ、ワタアブラムシ、トビイロウンカ、クサギカメムシ、モモアカアブラムシの５種、鞘翅目として、タバコシバンムシ、ヒメカツオブシムシ、ヒラタキクイムシ、アズキゾウムシの４種、膜翅目として、アミメアリ、アシナガアリ、キアシナガバチ、ハバチ科、ヒメバチ科、ヒメハラナガツチバチ、ジガバチ、オオスズメバチ、マルハナバチの９種、鱗翅目として、イガ、ノシメマダラメイガ、コイガ、ハスモンヨトウ、シャクガ科の５種、双翅目として、アカイエカ、イエバエ、センチニクバエ、キイロショウジョウバエ、オナジショウジョウバエ、クロショウジョウバエ、ヒョウモンショウジョウバエ、カスリショウジョウバエ、オオショウジョウバエ、オオキモンノミバエ、オオチョウバエ、クロバエ科の１２種を用いた。ＤＮＡの抽出には表２に記載の通り、これらの昆虫の全体もしくは一部（触角、胸部、翅、脚など）を用いた。
【００７９】
【表２】
2008099644.tif 000003
【００８０】
（イ）ＤＮＡ抽出
ＤＮＡ抽出にあたっては、ＣＴＡＢ法や市販キットのQiagen DNeasy Tissue KitやISOPLANTII（ニッポンジーン社）を用いて抽出したＤＮＡをＰＣＲで増幅して、シークエンスを行い、シークエンスデータを得た。ＤＮＡの抽出に用いた方法を表２に記載するとともに、各抽出方法を以下に記載する。
i) Qiagen DNeasy Tissue Kitを用いる方法
製品に添付の「DNeasy Tissue Handbook」に従って以下のように実施した。クロバエ科のハエ2匹を解剖し、胸部の筋肉を取り出し、それぞれの全量を1.5ml容のマイクロチューブ1本ずつ計2本に入れ、180μlのバッファーATLを加えた。20μlのproteinase Kを加え、チップの先でつぶすようにしながら攪拌した後、55℃のインキュベーターに入れた。時々攪拌を行って、各チューブにつき約20時間後と約48時間後に取り出し、15秒間攪拌し、200μlのバッファーALを加え、十分に攪拌後70℃で10分間インキュベートした。200μlのエタノール（96〜100%）を加え、十分に攪拌した。この液をDNeasy Mini spin columnに入れ、2ml容のコレクションチューブに受けて6000 x g（8000 rpm）で1分間遠心分離を行った。ろ液とコレクションチューブを捨て、DNeasy Mini spin columnを新しい2ml容のコレクションチューブに受けて500μlのバッファーAW1を加えて6000 x g（8000 rpm）で1分間遠心分離を行った。ろ液とコレクションチューブを捨て、DNeasy Mini spin columnを新しい2ml容のコレクションチューブに受けて500μlのバッファーAW2を加えて20,000 x g（14,000 rpm）で3分間遠心分離を行った後、DNeasy membraneを乾燥させた。ろ液とコレクションチューブを捨て、DNeasy Mini spin columnを1.5ml又は2ml容のマイクロチューブに移し、200μlのバッファーAEを直接DNeasy membraneに載せ、室温で1分間インキュベートした後、6,000 x g（8,000 rpm）で1分間遠心分離を行い、ＤＮＡ溶液を溶出させた。上記と同様な溶出作業をもう一度繰り返したものをＤＮＡ試料とした。
ii) ISOPLANTIIを用いる方法
ニッポンジーン社の発行するマニュアルに準じて以下のように行った。マイクロホモジナイザー（Radnoti Tissue Grinder, Catalog# 440612又は440613）に昆虫の検体と300μlのSolutionＩを入れ、検体をよく磨砕した。150μlのSolutionIIを入れ、10秒間攪拌（ボルテックス）した後、50℃の恒温水層に10分間漬け込んだ。100μlのSolutionIII-A、続いて120μlのSolutionIII-Bを入れ、１〜2秒間ボルテックスを行い、氷上で10分間冷却した。14K x g、4℃、10分間の遠心分離を行い、上層（水層）を別のチューブに分離し、そこへ2倍量のエタノール（室温保存）を入れ、よく混合した。続いて6K x g、室温にて5分間の遠心分離を行い、得られた沈殿に1mlの70%エタノールを添加して沈殿を舞い上がらせてよく洗浄した。6K x g、室温、1分間の遠心分離を行い、得られた沈殿を遠心エバポレーターにて乾燥させ、20〜50μｌのTEバッファー（pH 8.0）によく溶かしてＤＮＡ試料とした。
iii) ＣＴＡＢ（Cetyltrimethyl ammonium bromide）法
2%（w/v）CTAB（Calbiochem社製）、100mM Tris-HCl（pH 8.0）、20mM EDTA (pH 8.0)、1.4 M NaCl、1%（w/v）PVP（Polyvinylpyrrolidone）を組成とするＣＴＡＢ液を調製した。このＣＴＡＢ液650μlを昆虫の検体と共にマイクロホモジナイザーに入れた。なお、ノミバエなどの小型昆虫については、1匹（又は数匹）の個体全体を使用し、イエバエやそれ以上の体長を有する大型昆虫では、昆虫の体の一部（触角、胸部（又はその筋肉）、前翅、後翅、後脚などのいずれか）を用いた（表２）。次にこの検体とＣＴＡＢ液の入ったマイクロホモジナイザーを内部の試料が浸るように65℃の恒温水槽に漬けて10分間インキュベートした。続いてマイクロホモジナイザーのガラス管（底が磨りガラス状）とセットになった、先端が球状で磨りガラスになったガラス棒（ガラス管の底に合うように加工されたもの）で検体をすりつぶした後、1mg/ml RNaseA溶液2μlを加え、65℃、1時間インキュベートして昆虫の細胞を破砕した。1.5ml容のマイクロチューブに移し変え、等量（650μl）のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25:24:1）を加え、手で3分間転倒混和した。短時間（遠心機の最大回転数で1分間）の遠心分離を行い、有機溶媒層（下層）と水層（上層）に分画し、水層（約400μl）を新しいチューブに移した。等量のイソプロピルアルコールを加え、転倒混和後、上記と同様に遠心分離を行った。上清を捨て、沈殿を70%エタノールでリンスし、乾燥させたものを、20-50μlのTEバッファーに溶解してＤＮＡ試料とした。
（ウ）ＰＣＲ
ＤＮＡ断片の増幅は、Takara Ex Taq Polymerase (2.5 units/final 50 μl)を用い、添付のEx Taq Bufferと下記に記載したプライマーセット（各々50 pmoleずつ）、dNTP Mixture（各dNTPをそれぞれ10 nmoleずつ添加）、鋳型ＤＮＡ（調製したものを1μl）を添加して、滅菌蒸留水で最終50μlになるように調整した（表３）（Su, Z.-H., et. al., 1998, Origin and Diversification of Hindwingless Damaster Ground Beetles Within the Japanese Islands as Deduced from Mitochondrial ND5 Gene Sequences (Coleoptera, Carabidae). Mol. Biol. Evol. 15(8): 1026-1039.）。これを0.2 ml容のマイクロチューブ（ＰＣＲ用）に入れ、ＰＣＲ装置（DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 9600；旧Perkin Elmer社製）にセットして、変性（94℃、30秒）、アニーリング（50℃、30秒）、鎖伸長（70℃、60秒）の反応を35回繰り返した（表４）。なお、反応終了後、サンプルをすぐに取り出せない場合には、サンプルブロックの温度を4℃に下げて保持した。
ミトコンドリアＮＤ５遺伝子由来のプライマーセット（v1.06-1/v1.04-4）
V1.06-1  CCT GTT TCT GCT TTA GTT CA        （配列番号５）
V1.04-4  GTC ATA CTC TAA ATA TAA GCT A     （配列番号６）
鱗翅目に属するコイガ、ハスモンヨトウについて用いたプライマー
ミトコンドリアＮＤ５遺伝子由来のプライマーセット（v1.06-1/rin-r）
V1.06-1  CCT GTT TCT GCT TTA GTT CA       （配列番号５）
rin-r    GAA TAA AAT CCA GCT AAA AAA GG   （配列番号１５）
膜翅目に属するハバチ科、ヒメバチ科、ヒメハラナガツチバチ、ジガバチ、オオスズメバチ、マルハナバチについて用いたプライマー
ミトコンドリアＮＤ５遺伝子由来のプライマーセット（maku_1-f1又はmaku_1-f2/maku_1-r1）
maku_1-f1  GCT CCW ACT CCT GTK TC     （配列番号１６）
maku_1-r1   CTA AAA AAG GAA AWC CAC   （配列番号１７）
又は、
maku_1-f2  GTT CAT TCA TCW ACT TTA G  （配列番号１８）
maku_1-r1  CTA AAA AAG GAA AWC CAC    （配列番号１７）
【００８１】
【表３】
2008099644.tif 000004
【００８２】
【表４】
2008099644.tif 000005
【００８３】
（エ）ＰＣＲによる増幅の確認
上記で得られたＰＣＲ反応液の5 μlをアガロースゲル電気泳動に供した。この際、ミニゲル電気泳動システム「Mupid」を用いて電気泳動を実施（ゲル；3% NuSieve 3:1 Agarose（FMCバイオプロダクツ社製、またはCambrex Bio Science Rockland社製）、泳動条件；100V、30分）し、2μg/ml臭化エチジウム溶液中で40分間染色後、ＵＶ照射下で増幅産物の写真撮影を行い、目的のＤＮＡ断片（大きさが1080塩基前後）が増幅されていることを確認した（図１〜９で、丸で囲ったバンド）。そのうち、図１は、目的のＤＮＡ増幅断片の電気泳動の結果を示す。レーン１はツマグロヨコバイを、レーン２はタバコシバンムシを、レーン３はアミメアリを、レーン４はイガを、レーン５はアカイエカを、レーン６はヒメカツオブシムを、レーン７はノシメマダラメイガを、レーン８は鋳型を添加していないブランクを、Ｍは100塩基のladder markerを、それぞれ示す。図２は、目的とするＤＮＡ増幅断片の電気泳動の結果を示す。レーン１はイエバエを、レーン２はセンチニクバエを、レーン３はオオチョウバエを、レーン４はキイロショウジョウバエを、レーン５はクロショウジョウバエを、レーン６はカスリショウジョウバエを、レーン７はヒョウモンショウジョウバエを、レーン８はオナジショウジョウバエを、レーン９はオオショウジョウバエを、Ｂは鋳型を添加していないブランクを、Ｍは100塩基のladder markerを、それぞれ示す。図３は、クロバエ科の検体ＤＮＡの電気泳動像を示す。Ｍはサイズマーカー（100-bp ladder）を、レーン１はクロバエ科検体１のＤＮＡ（1μl/100μl添加）5μlをアプライしたものを、レーン２はクロバエ科検体１のＤＮＡ（5μl/100μl添加）5μlをアプライしたものを、レーン３はクロバエ科検体2のＤＮＡ（1μl/100μl添加）5μlをアプライしたものを、レーン４はクロバエ科検体2のＤＮＡ（5μl/100μl添加）5μlをアプライしたものを、レーン５はDNAを添加していないネガティブコントロールを、それぞれ示す。図４は、クロバエ科の検体ＤＮＡの電気泳動像を示す。Ｍはサイズマーカー（100-bp ladder）を、レーン１はクロバエ科検体１のＤＮＡ（1μl/100μl添加）を0.1μl相当量をアプライしたものを、レーン２はクロバエ科検体１のＤＮＡ（5μl/100μl添加）を0.1μl相当量をアプライしたものを、レーン３はクロバエ科検体2のＤＮＡ（1μl/100μl添加）を0.1μl相当量をアプライしたものを、レーン４はクロバエ科検体2のＤＮＡ（5μl/100μl添加）を0.1μl相当量をアプライしたものを、レーン５はクロバエ科検体１のＤＮＡ（1μl/100μl添加）を0.5μl相当量をアプライしたものを、レーン６はクロバエ科検体１のＤＮＡ（5μl/100μl添加）を0.5μl相当量をアプライしたものを、レーン７はクロバエ科検体2のＤＮＡ（1μl/100μl添加）を0.5μl相当量をアプライしたものを、レーン８はクロバエ科検体2のＤＮＡ（5μl/100μl添加）を0.5μl相当量をアプライしたものを、それぞれ示す。以上、()内に示した数値はＰＣＲ反応液への添加量を示す。図５は、異なる分類に属する昆虫由来のＤＮＡの増幅断片の電気泳動の結果を示す。レーン1はワタアブラムシ1匹から抽出したＤＮＡを、レーン２はワタアブラムシ5匹から抽出したＤＮＡを、レーン３はオオキモンノミバエから抽出したＤＮＡを、ＢはＤＮＡが添加されていないブランクを、ＭはＤＮＡサイズマーカーをそれぞれ示す。���６は、異なる分類に属する昆虫由来のＤＮＡの増幅断片の電気泳動の結果を示す。レーン1はトビイロウンカから抽出したＤＮＡを、レーン2はクサギカメムシから抽出したＤＮＡを、レーン3はモモアカアブラムシから抽出したＤＮＡを、レーン4はヒラタキクイムシから抽出したＤＮＡを、レーン5はアズキゾウムシから抽出したＤＮＡを、レーン6はコイガから抽出したＤＮＡを、レーン7はノシメマダラメイガから抽出したＤＮＡを、レーン8はハスモンヨトウから抽出したＤＮＡを、レーン9はアシナガアリから抽出したＤＮＡを、BはＤＮＡを添加していないブランクを、Mはサイズマーカー（100-bp ladder）を、それぞれ示す。図７は、異なる分類に属する昆虫由来のＤＮＡの増幅断片の電気泳動の結果を示す。レーン1はキアシナガバチの翅から抽出したＤＮＡを、レーン2はマルハナバチの翅から抽出したＤＮＡを、レーン3はシャクガの翅から抽出したＤＮＡを、レーン4はシャクガの脚から抽出したＤＮＡを、レーン5はＤＮＡを添加していないブランクを、Mはサイズマーカー（100-bp ladder）を、それぞれ示す。図８及び９は、ＰＣＲで増幅した昆虫由来のＤＮＡ断片を確認するために行った膜翅目の電気泳動の結果を示す。図１０は、ＰＣＲで増幅した昆虫由来のＤＮＡ断片を確認するために行った隣翅目の電気泳動の結果を示す。
【００８４】
鱗翅目に属するコイガ、ハスモンヨトウについて、上記v1.06-1及びrin-rプライマーを用いると、446塩基の断片が増幅された。さらに、膜翅目に属するマルハナバチについて、上記maku_1-f1及びmaku_1-r1プライマーを用いると、439塩基の断片が増幅され、膜翅目に属するハバチ科、ヒメバチ科、ヒメハラナガツチバチ、ジガバチ、オオスズメバチ、マルハナバチについて、上記maku_1-f2及びmaku_1-r1プライマーを用いると、415塩基の断片が増幅された。
【００８５】
（オ）ＰＣＲ産物の精製
上記ＰＣＲ産物の精製はQIA quickspin kit（キアゲン社）を使用し、プロトコ−ルに基づいて以下の方法で行った。すなわち、ＰＣＲ反応液（残量約45μl）にPB  Bufferを5倍量（225μl）加えて、混和した。次に、この液をQIA quickspinに入れ、13,000rpmで１分間遠心分離した。ろ液を捨て、750μl PE  Bufferを添加した後、13,000rpmで１分間遠心分離した。ろ液を捨て、再度14,000rpmで1分間遠心分離した。ろ液を捨て、新しい1.5mlエッペンチューブにカラムを移し、30μl EB  Bufferを添加し、1分間放置後、13,000rpmで2分間遠心分離して、ろ液をサンプルとした。
【００８６】
（カ）サイクルシークエンス反応及びシークエンス産物の精製
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit の日本語版プロトコール（p.22 「1本鎖ＤＮＡ、2本鎖ＤＮＡのサイクルシークエンス」、p.25「GeneAmp PCR System 9700, 9600, 2700, 2400でのサイクルシークエンス」及びp.38-40 「スピンカラム（やスピンプレート）での精製法」）に基づいていて以下のように実施した。なお、用いたプライマーの塩基配列は、目的のＤＮＡ断片のＰＣＲによる増幅に用いたものと同じである。すなわち、ＰＣＲ精製液を5〜20ng/μlになるように滅菌蒸留水で希釈し、このうち2μlにSequence premix(Big dye)を8μlと１μMの上記v1.06-1またはv1.04-4のプライマー1pmole/μlをそれぞれ単独で3.2μl添加し、滅菌蒸留水にて最終20μlに調整したサイクルシークエンス反応液を得た。これを0.2 ml容のマイクロチューブ（ＰＣＲ用）に入れ、ＰＣＲ装置（DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 9600；旧Perkin Elmer社製）にセットして、変性（96℃、1分）を行った後、変性（96℃、10秒）、アニーリング（50℃、5秒）、鎖伸長（60℃、4分）の反応を25回繰り返した。なお、反応終了後、サンプルをすぐに取り出せない場合には、サンプルブロックの温度を4℃に下げて保持した。シークエンス産物は、セントリセップカラムにて精製した。すなわち、充填剤を室温で2時間以上膨潤させて前処理の完了しているセントリセップカラムの中心部に上記シークエンス産物（約20μl）を載せるように添加し、1.5ml容のマイクロチューブを下部に受け、750 x ｇ、2分間遠心分離を行った。マイクロチューブ内に集まった溶液を精製ＤＮＡとして回収した。この溶液を減圧下で乾燥させた後、20μlのTSRまたはHi-Di formamideを添加し、10分間程度放置した後、よく混和した。この液を0.2ml容のマイクロチューブ（PCR用）に移し、DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 9600にて変性（95℃、2分）を行い、直ちに氷中に挿入して急冷し、そのまま10分間以上放置した。
【００８７】
（キ）ＤＮＡシークエンス
ABI PRISM 310 Genetic Analyzerを使用し、「ABI PRISM 310 Genetic Analyzer操作ガイド」に基づいて実施した。すなわち、上記の急冷後の試料をサンプルチューブに移し、チューブセプタで蓋をし、48穴サンプルトレーにセットした。その後は、操作ガイドに従ってDye Terminator法によりシークエンスを実施した。
【００８８】
（ク）塩基配列の解析
得られたシークエンスデータは、５’側（プライマーV1.06-1側）と３’側（プライマーV1.04-4側）からそれぞれ３００〜６００塩基長であるが、オオキモンノミバエは相補的な箇所を重ね合わせて一続きのデータとして得られた。メルクマール策定には、５’側（プライマーV1.06-1側）の領域を主として用いた。なお、得られた配列データを以下に示した。
・ツマグロヨコバイ
プライマーV1.06-1側（配列番号２）
ACTTATTCGGTTTTTTAACACAAAATATTTTATTAATGATTTTCTAATTTATGTAAGNATTGTAACTCTTATTATATCCTCATTATGTGCTAATTATGAATTTGACTTAAAAAAAATTATTGCATTATCTACTCTTAGTCAATTAGGTTNAATAATAAGAAGTTTATTTATAGGCATAGTGGAGATAACATTTTTCCATCTTCTTTCTCATGCCATATTTAAATCTCTCCTTTTTCTTTGTTCTGGTATTATTATTCATTTAATAGGCGGTTGTCAAGACATCCGATTTATAGGTTCTATTTGTTATTCGATACCCTTAACTAGATGTTGTTTAAATATTNCCAATATATCTTTATGTGGATTCCCTTTTTTGTCTGGGTTNTACTCTAAAGATTTAATTATTGATAGG
プライマーV1.04-4側（配列番号１９）
TTAATATTCTAATAAAAAAGAATTTTATAGAGTTTATTCTGTATATCTGTATAAAATTAGATAATTTTTGTAAATAATATGAAATTCCTATACCACCAAAAAATTCTCCTCAATAAATAGAATTATTTATATGATATCCAAAATTATAATTACTTATGAAAATTCAAGTAGAAAAACTATATATAAATCATATTGAACCATTCAATGAATAGAAAGAATTTATATTAATTAGATTTTTATAAAAATGAGAAAATTCATATCCAATAAAAAGACCTAATATTACTATAAATAAAGTTAAAATTTTTAAATAAAACGGTAGTAACAAAAACTTTATATCTAAATTTATAATTCATATATATATACAACCAAATTTCAAAGAAAATATAGACTAAAATTACTACTCTATATTTCATTAAATAAATTTCTTCTCTTATATTTAAATACGAAAAAAACTTAAAATTTTGATATA
・タバコシバンムシ
プライマーV1.06-1側（配列番号２０）
ATTAATTCGATTTAGATCAAGATTTAATATACAAATAATAACAATAATATTATTTATTTGTTCAATAACTATATTTATAGCTGGATTAGGGGCTAATTTTGAATTTGATTTAAAAAAGATTATTGCTCTTTCAACGTTGAGACAACTTGGATTAATAATAAGAATTTTATTTTTAGGAGATTATAAATTAGCTTTTTTTCATCCTTTTAACTCATGCATTATTTAAAGCCTTATTATTTATATGTGCTGGAAATATAATTCATAGATTATTAGGATGTCAAGATATTCGTTTTATAGGATCNTTAATTAATTTAATACCATTAACCTGCTGTTTATTTTCGCATTGCTAACTTATCATTATGNGGTATTCCCTTTCTTTCTGGATTTTACTCTAAAGACTTAATT
プライマーV1.04-4側（配列番号２１）
TTACTGTGATTATAAAAAAAATTTTTAAGTGATTGAAATGAATAATTTGTAATAATGAGGAATTCTTTTTTAATATCAAATAAATTCCTTGTGAACCAATAAATTCTGTTCATCCTTGATCAAATAATTTTTTATAAATAAATCCTAAAATTAATGGTAATTTTAAAATAATTCCTGTTGACATGATTGGTAAATTTCATATTAATGACGAAAATATTCTTGATTTATAAAAATTTATTGTCTTTGAGGAATAATATAATGAGAACTTTGAAATTTCATATCCAATAATTGACCCAATAATAATTACTATCAAAGTAGATATTTTTATCATAAATGGTAAATTAATTAAATAAGGAATATCTATAATTAATCAAGATAAAACTTGATCCTATTATAATTACAAACGTAAATAATCCTCTCATTCCTGTTAATATTATTTTTCTATTTTCTCCTAAGTGATTTTAATGAAATAAAATTACAACATTTTCCCTAATAAATAAATTAATATAAA
・イガ
プライマーV1.06-1側（配列番号２２）
TTTAGTAACAGCTGGAGTTTATTTATTAATTCGTTTTAATTTAATATTAATAGATACAATTTTTTTTAAAATTTTATTATTAATATCAAGTTTAACTATATTTATAGCTGGAATTTCTGCTAATTATGAATTTGATTTAAAGAAAATTATTGCTTTTTCTACTTTAAGACAATTAGGGTTAATAATAAGAATTTTAAGAATAGGGTTTTCTGATCTTGCTTTTTTCCATTTATTAACTCATGCAATATTTAAAGCTTTATTATTTATATGTGCTGGGGTTATTATTCATATGATAAATGATAGACAAGATATTCGATTTATGGGAGGGATTAGAAAATTTATTCCTTTAACTTCATTATGTTTTAATATTTCAAATTTAGCTTATATTTAGAGTATGACA
プライマーV1.04-4側（配列番号２３）
ATTAAAACATAATGAAGTTAAAGGAATAAATTTTCTAATCCCTCCCATAAATCGAATATCTTGTCTATCATTTATCATATGAATAATAACCCCAGCACATATAAATAATAAAGCTTTAAATATTGCATGAGTTAATAAATGGAAAAAAGCAAGATCAGAAAACCCTATTCTTAAAATTCTTATTATTAACCCTAATTGTCTTAAAGTAGAAAAAGCAATAATTTTCTTTAAATCAAATTCATAATTAGCAGAAATTCCAGCTATAAATATAGTTAAACTTGATATTAATAATAAAATTTTAAAAAAAATTGTATCTATTAATATTAAATTAAAACGAATTAATAAATAAACTCCAGCTGTTACTAAAGTAGAAGAATGAACTAAAGCAGAAACAGG
・アカイエカ
プライマーV1.06-1側（配列番号２４）
GGGGGTGTTACTTATTAATTCGATTTAATATTTTATTAGGTTGATTCTTTTATAGGACAATTTTTATTATTAATTTCTGGATTAACAATATTTATAGCGGGGTTAGGAGCTAATTTTGAATTTGATCTAAAAAAAATTATTGCTTTATCAACTTTAAGTCAATTAGGTTTAATAATAAGTATTCTATCAATTGGATTTTATAAATTAGCTTTTTTTCATTTATTAACTCACGCTTTATTTAAGGCTTTATTATTTATATGTGCAGGGGTAATTATTCATAATACAAAAAATGCACAAGATATTCGTTTTATAGGAAGATTAAGTATAAGAATACCTTTAACTTGTAGTTGTTTTAATATTGCTAATTTAGCTTTATGTGGTATACCTTTTTTAGCAGGGTTTTATTCAAAGGATTTAATCTTTAGAAGTAGTTATGGTGTCATATATTAAC
プライマーV1.04-4側（配列番号２５）
TAAAACTAAACAATTACTCATAATAAATAACTTAATAAATAAATTTTTAAATTATTATTTTGAAATTCTTGAATATATAAAGAATAATTCTTTAATTGATTATATAATATTTGACCTCCAAAAAATTCACTTCATCCTTGATCAAAACTTTTATATCTATATAATCCTAAATTTATTGGAAACTTAATTACACCTAATGTANAAATAACTGGTATAAATCATATTCCTCCTGCAAATCTACTTAAACCATAGTTTATTAAAGATTTATTATAAAAAAATAAAGAAATATTTCTTATTAAATAACCAAATACACCCCCTAAGATACAAACAATTAAAGTTAATATTTTTATATCAAAAGGTAAACAAATTATATCGGTGATTAAAAAATCATTAATCAATTTAACATTCTTCCTCCAATAATAGCTATTACTATTAAAAAAAAAATTCTAAAAC
・イエバエ
プライマーV1.06-1側（配列番号１）
TTTATTAATTCGATTTAATATTGTATTAAGAACAAGTTGAATGGGTAATTTATTACTATTATTATCAGGTTTAACAATATTTATAGCTGGATTAGGTGCTAATTATGAATTTGATTTAAAGAAGATTATTGCTTTATCTACTTTAAGACAATTAGGTTTAATAATAAGAATTTTATCTATAGGTTATTATAAATTAGCTTTTTTTCATTTATTAACTCATGCATTATTTAAGGCTTTATTATTTATATGTGCAGGAGCAATTATTCATAATATGAACAATAATCAAGATATTCGTTTAATGGGAAGTTTAAGATTAATAATACCATTAACTTCTTCTTGTTTTAATGTTGCAAATTTAGCATTATGTGGAATACCATTTTTAGCAGGATTTTATTCAAAGGATTTAATTTTGGAAATAGTATCATTTTCTTATATTAATTTAT
プライマーV1.04-4側（配列番号２６）
TTTTGAATAAAAACAAATTATATATATGTATAAAATTACAATTCAAAAAATAAAACTTAATAAATAAATTTTTAAATTATTATTTTGTAATATTTGATTAAACTGAGAATTTTTAACTAAATTATAATAAAGTTGTTGACCCCCAAAATATTCAGATCAACCTTGGTCAAATGATTTAATTCTTATTTTACCTAAAATTAAAGGATAATTAATAATTCCATAAGTAGAAATATAAGGTATAAATCATATTGAGCCTAAAAAATAAGAAAAATTATAATTTCTTAAAGCCTTATTTATAAAAAATAAAGATACATTAGAAATTAAATAACCTATTAAACCACCAATAATACATACAAATAAAGTCAATAACTTTAAATTTAAAGGTAAGATAATAACTTCCGGAGTAGGAAAAATTAATCAACTTAATATACTTCCTCCTACAATTCTTAAAATTAATAAACCTATTATACTCTTTAATATTACTCAACCTTCATCATTAAGTATATTTAAAGAAGAAAAATTAGAATCTCCAGTTATCGAATA
・センチニクバエ
プライマーV1.06-1側（配列番号２７）
CTGCAGGAGTTTATTTATTAATTCGATTTAATATTGTTTTAAGAAGATCTCCAATAGGGAATTTTTTATTATTAATTTCTGGATTAACTATATTTATGGCGGGATTAGGGGCTAATTATGAATTTGATTTAAAGAAAATTATTGCTTTATCTACTTTAAGTCAGTTGGGTTTAATAATAAGTATTTTATCAATGGGTTATTATAAGTTAGCATTTTTTCATTTATTAACACATGCTTTATTTAAGGCTTTACTATTTATATGTGCAGGAGCTATTATTCATAATATAAATAATTGTCAAGATATTCGATTGATGGGTAGTTTAAGTTTAATAATGCCTTTAACTTCTTCATGTTTA
プライマーV1.04-4側（配列番号２８）
TTTGATAAAAACACTATATACATATATATATAACTATAATTCAAAGAATAAAACTTAATAAATAAATCTTTAAATTATTATTTTGTAATACCTGATTTAATTGAGAATTTTTTACTAAATTATAATACAATTGTTGTCCTCCAAAATATTCAGATCAACCCTGATCAAAAGACTTAACGGCTAATTTACCAACAATCAAAGAATAATTTATAATCCCATAAGTAGAAATATAAGGCATAAACCATATTGATCCTAAAAAATAAGATGAATTATAATTATTTAAAGCCTTATTGAAAAAAAATAAAGAAACATTAGAAATTAAGTAACCTATTAATCCTCCTACAATACATACAAATAAAGTTAATAATTTTAAATGAGAAGGTAAAACAATCACCAAAGGGCTTGGAAAAATTAATCAACTTAATATTCTACCCCCCGAAATTCTTAAATTAATAAACCTATTATACTCCTTAATATA
・キイロショウジョウバエ
プライマーV1.06-1側（配列番号２９）
TTTATTAATTCGATTTAATATTATCTTAAGAACTTCTTGGTTAGGACAATTAATATTATTATTATCTGGATTAACAATATTTATAGCTGGATTAGGAGCTAATTTTGAATTTGATTTAAAAAAAATTATTGCTTTATCTACTTTAAGTCAATTAGGTTTAATAATAAGAATTTTGTCTATAGGATTTTTAAAATTAGCTATATTTCATTTATTAACCCATGCTTTATTTAAAGCATTATTGTTTATATGTGCTGGGGCTATTATTCATAATATAAATAATTCTCAAGATATTCGTTTAATAGGGGGGTTAAGAATTCATATACCTTTAACTTCAGCTTGTTTTAACGTATCTAA
プライマーV1.04-4側（配列番号３０）
TAAAATAATAAAATTAATAAAATTAAAATTCAAAATACAAATAATAATAAATAAATTTTCAAAGAATTATTATGTATTAAAAATAAAGTTTTAGAATATATAGATAATTTTTGATATAAATGTTGACCTCCAAAATATTCTGATCAACCTTGATCAAAACTTTTTACAACTAATTGACCATAATTTAAAGGATAAAAAATTATACCATAAGTTCTAATATAAGGTATAAATCATATAGACCCTAAAAAAGTTCTTAAATTATATATAAATAAAGATTTATTTAAAAAAAATAAATTTCTTAAAGAAATTAAATATCCAAATAAACCCCCTACAATACATACAAATAATGTTAACAATTTTATATAAATAGGTAAACAAATTATATAAGGAAAAGGAAAAATCAATCAATTTAATATTCTACCT
・オナジショウジョウバエ
プライマーV1.06-1側（配列番号３１）
TACAGCTGGTGTNTNTTTATTAATTCGATTTAATATTATCTTAAGAACTTCTTGGTTAGGACAATTAATATTATTATTATCTGGATTAACAATATTTATAGCTGGATTAGGAGCTAATTTTGAATTTGATTTAAAAAAAATTATTGCTTTATCTACTTTAAGTCAATTAGGTTTAATAATAAGAATTTTGTCTATAGGATTTTTAAAATTAGCTATATTTCATTTATTAACCCATGCTTTATTTAAAGCATTATTGTTTATATGTGCTGGGGCTATTATTCATAATATAAATAATTCTCAAGATATTCGTTTAATAGGGGGGTTAAGAATTCATATACCTTTAACTTCAGCTTGTTTTAACGTATCTAATTTAGCTTTATGTGGAATACCTTTTTTAGCT
プライマーV1.04-4側（配列番号３２）
TAAAATAATAAAATTAATAAAATTAAAATTCAAAATACAAATAATAATAAATAAATTTTCAAAGAATTATTATGTATTAAAAATAAAGTTTTAGAATATATAGATAATTTTTGATATAAATGTTGACCTCCAAAATATTCTGATCAACCTTGATCAAAACTTTTTACAACTAATTGACCATAATTTAAAGGATAAAAAATTATACCATAAGTTCTAATATAAGGTATAAATCATATAGACCCTAAAAAAGTTCTTAAATTATATATAAATAAAGATTTATTTAAAAAAAATAAATTTCTTAAAGAAATTAAATATCCAAATAAACCCCCTACAATACATACAAATAATGTTAACAATTT
・クロショウジョウバエ
プライマーV1.06-1側（配列番号３３）
ATTGGTAACTGCAGGAGTGTATTTATTAATTCGGTTTAATATTTTATTGAGAAATTCTTGAATAGGACAATTTTTACTTTTATTGTCAGGTTTAACTATATTTATAGCAGGTTTAGGAGCTAATTTTGAATTTGATTTAAAAAAAATTATTGCTTTATCTACTTTAAGTCAATTAGGGCTAATAATAAGAATTTTATCAATAGGTTTTTATAAATTAGCTATATTTCATTTATTAACTCATGCTTTATTTAAAGCTTTATTATTTATATGTGCAGGAGCAATTATCCATAATATAAATAATTCTCAGGACATTCGTTTAATGGGGGGTTTAAGAATTCACATACCTTTAACTTCAGCTTGTTTTAATGTATCAAATTT
プライマーV1.04-4側（配列番号３４）
AAAATAATAAAAAATTTACTAAAATTAAAATTCAAAATACAAATAATATTAAATAAATTTTTAAATTATTATTATGAATTAAAAATAAAGTTTGAGAATAATTTAATAATTTTTGATATAAATGTTGACCTCCAAAATATTCTGATCAACCTTGATCAAAACTTTTACTAACAATTTGACCATAATTTAAAGGATAAAAAATAACTCCATAAGTTCTAATGTAAGGTATAAATCATATTGAACCTATAAAATTTGTTAAATTGTATAAAATTATTGATTTATTAATTGTATATAAATTTCTTACTGAAATTAAATAACCAAATAAACCTCCAAAAATACAAACAAATAAAGTTAATAATTTTAAAAAAAAAGGTAAACAAATTATATGAGGCACAGGAAAGATTAATCAATTTAATATTCTA
・ヒョウモンショウジョウバエ
プライマーV1.06-1側（配列番号３５）
CTTTATTAATTCGATTTAATATTATCTTAAGAACTTCTTGGTTAGGACAATTAATATTATTATTATCTGGATTAACAATATTTATAGCTGGATTAGGAGCTAATTTTGAATTTGATTTAAAAAAAATTATTGCTTTATCTACTTTAAGTCAATTAGGTTTAATAATAAGAATTTTGTCTATAGGATTTTTAAAATTAGCTATATTTCATTTATTAACCCATGCTTTATTTAAAGCATTATTGTTTATATGTGCTGGGGCTATTATTCATAATATAAATAATTCTCAAGATATTCGTTTAATAGGGGGGTTAAGAATTCATATACCTTTAACTTCAGCTTGTTTTAACGTATCTAATTTAGCTTTATGTGGAATACCTTTTTTAGCT
プライマーV1.04-4側（配列番号３６）
AAAATAATAAAATTAATAGAAATTAAAATTCAAAATACAAATAATAATAAATAAATTTTCAAAGAATTATTATGTATTAAAAATAAAGTTTTAGAATATATAGATAATTTTTGATATAAATGTTGACCTCCAAAATATTCTGATCAACCTTGATCAAAACTTTTTACAACTAATTGACCATAATTTAAAGGATAAAAAATTATACCATAAGTTCTAATATAAGGTATAAATCATATAGACCCTAAAAAAGNNNTTAAATTATATATAAATAAAGATTTATTTAAAAAAAATAAATTTCTTAAAGAAATTAAATATCCAAATAAACCCCCTACAATACATACAAATAATGTTAACAATTTTATATAAATAGGTAAACAAATTATATAAGGAAAAGGAAAAATCAATCA
・カスリショウジョウバエ
プライマーV1.06-1側（配列番号３７）
CTTTAGTAACAGCGGGTGTATACTTATTAATTCGGTTTAATATTTTATTAGCAAATAGATGGTTAGGCCAATTTTTATTGTTATTATCTGGGTTGACAATATTTATAGCAGGATTAGGAGCTAATTTTGAATTTGATTTAAAAAAGATTATTGCTTTATCGACTTTAAGTCAGCTTGGGTTAATAATAAGAATTTTATCTATAGGATTTTATAAATTAGCGATATTTCATTTATTAACTCATGCATTATTTAAAGCTTTATTATTTATATGTGCTGGGGCAATTATTCACAATATAAATAATTCACAAGATATCCGATTAATAGGGGGATTAAGAATTCACATGCCTCTTACTTCTGCTTGTTTTAATGTTTCTAATTTAGCTTTGTGTGGGATGCC
プライマーV1.04-4側（配列番号３８）
AAATTATAAAAAATGCTGTTAAAATTAAAATTCAAAATACAAATAATATTAAATAAATTTTTAATCTATTATTATGTATTAAAAATAAAATTTGAGAAGAATCCACTAATTTTTTGTATAAATGTTGCCCCCCAAAATATTCTGATCAACCTTGATCAAAACTTTTACAAACAATTTGCCCATAATTTAAAGGAAAATAAATTAACCCATAAGTTCTAATATAAGGCATAAATCATATGGAACCTATAAAATTTGTTAATGCATAAAATCTTAAAGATTTATTAATTCTGTATAAATTTCTTAAAGAAATTAGATAACCTATTAATCCTCCTACAATACAAACAAATAAAATTAATAATTTTATATAAATAGGTAAACAAATTATATCCGGAGTTGG
・オオショウジョウバエ
プライマーV1.06-1側（配列番号３９）
TTTGTAACTGCTGGGGTTTATTTATTAATTCGTTTTAATATTTTATTAAGAAATTCAGTGATTACGGTCAATTATTATTATTATTATCTGGATTAACTATATTTATAGCAGGATTAGGGGCTAATTTTGAGTTTGACTTAAAAAAAATTATTGCCTCTATCAACTTTGAGACAGTTAGGATTGATGATGAGAATTTTATCGATAGGATTTTATAAATTAGCCATATTTCATTTATTAACTCATGCTCTTTTTAAAGCTTTATTATTTATATGTGCAGGAGCAATTATTCATAATATAAATAATTCTCAAGATATTCGATTAATAGGGGGGTTAAGAATTCCACATACCTTTAACTTCTGCTTGTTTTAATGTTTCTAATTTAGCTCTATGTGGAATACCTTTTTTAGCA
プライマーV1.04-4側（配列番号４０）
ATATTAATAAATAAATCTTGTGTAAATTATTATTATGTATAAATAATAAAATTTGAGAATAATTTACTAATTTTTGATATAAATGCTGACCCCCAAAATACTCTGATCAACCTTGATCAAATCTTTTTACAACAATTTGTCCATAATTTAAAGGAAAAAAAATTATTCCATAAGTTCTAATATAAGGTATAAATCACATAGAACCTAAAAAAACTGTTAAATTATAATTTTTTAAAGATTTATTTAAACTAAATAATTTTATTAAAGAAATAAAATAACCTCTTAGACCCCCAAAAATACAAACAAATAAAGTTAACATTTTCATAA
・オオキモンノミバエ
プライマーV1.06-1側+プライマーV1.04-4側（配列番号４１）
ATTCGGTTTATTTTTTGTTAGTGGAtTCAATAATTGGAAAAATTTTATTGTTAATTTCAGGATTAACAATGTTTATAGCAGGTCTTGGTGCTAACTTTGAATTTGATTTAAAGAAAATTATTGCTTTGTCTACACTTTCTCAGTTAGGGTTAATAATAAGAATTTTATCTATAGGGTATTATAAATTAGCCTTTTTTCATCTTTTAACTCATGCTTTATTTAAGGCCTTATTATTTATATGTGCGGGAAGTATTATTCATAACATAAATAATTTTCAAGATATTCGTGTTATAGGGGGTTTAGGAATTTATATGCCTATTACTACTGCTTGTTTTAATATTTCTAATTTAGCATTATGTGGAATACCTTTTTTAGCCGGATTTTATTCAAAGGATATAATTTTAGAAATTGTATCTATAAGTAATGTAAATATGTTAATTTTCTTTTTATTCTTTTTTTCTACCGGATTAACTGTTTGTTATTCTTTTCGGCTTGTATATTATTCAGTTACTGGAGATTTAAATTGTAGAAGATTAAATGTTTTAAGAGATGAAGGATGAGTAATATTAAAGGGTATAATAGGTTTACTTATTATATCAATTATTGGAGGTAGAATTTTAAATTGATTAATTTTTCCTACTCCTTATATGATTTGTtTACCTATTTATTTAAAACAGTTGACTTTATTTGTTTGTATTACTGGGGGTTTATTTGGTTATTTCATTTCATTGGTTAATTTATACTTTTATAATAAATCTTTAGACTTATATAATATTTCTTATTTTTTAGGATCAATATGATTTATACCTTATATTTCAACTTACGGAATTATtAATTATCCTTTAAATTTTGGTAAAATAATTTATAagtCAATAGATCAaGGTtgatCAGAGTATTTAGGAGGTCAAATAATATTTaAAATATTTATtaATATATCTCAATataATCAaTTTGTTCaAAATAATAaTTTAagaTtTATatGAgagTattTgTtttatGAATTTAT
・クロバエ科
プライマーV1.06-1側（配列番号４２）
ACTGCTGGGGTGTATTTATTAATTCGTTTTAATATTTTATTAAGATCATCTTGATTAGGAAATTTATTATTATTATTATCAGGATTAACAATATTTATAGCCGGATTAGGTGCAAATTATGAATTTGATTTAAAAAAAATTATTGCTTTATCTACTTTAAGTCAGTTAGGGTTGATCAATAAGAATTTTATCTATAGGATATTATAAATTAGCTTTTTTTCATTTATTAACACATGCTTTATTTAAGGCATTATTATTTATATGTGCTGGAGCTATTATTCATAATATAAATAATTCTCAAGATATTCGATTAATGGGGAGATTAAGATTAATAATACCACTAACTTCTTCATGTTTTAATGTGGCTAATTTAGCTTTATGTGGAATACCTTTTTTAGCAGGATTTTATTCTAAGGATTTAATTTTAGAAACAGTATCTTTATCTTACATTAATATATTTTCTTTTTTTTTATACTTTTTTTCTACAGGATTGACAGTATGTTATTCTTTTC
プライマーV1.04-4側（配列番号４３）
ATTATATATATGTATAAAATTATAATTCAAAAAATAAAACTTAATAAATAAATTTTTAAATTATNNATTCTGTAGTATTTGATTTAATTGAGAATTTTTTACTAAATTTGAATAAAGCTGTTGTCCCCCAAAATATTCTGATCATCCTTGATCAAAAGATTTAACTGTTATTCTACCAATAATTAAAGAATAATTAATAATTCCATATGTAGAAATATAAGGTATAAATCATATTGATCCTAAAAAATAAGAAGAATTATAGTTATTTAAAGCCTTATTATAAAAAAATAAAGAAATATTAGAAATTAAATACCCTCTAATACCTCCTACAATACAAACAAATAAAGTTAATAACTTTAAATAAAAAGGAAGAACTACTACTACTGGTGTAGGAAAAATTAATCAACTTAATATACTACCCCCAAAATACTTAAAATTAATACGCCCTATCTATACTCTTTAACATAACTCAACCTTCATCATTTAATATA
以下のデータは、上記プライマーのうち、maku_1-f2（配列番号１８）及びmaku_1-r1（配列番号１７）を使用してシークエンスした結果を示す。得られた配列は全て、５’側から読んだものと３’側から読んだものを合わせた結果である。
・マルハナバチ（配列番号４４）
ACTTTAGTTACTGCTGGTGTTTATTTATTAATTAATTATGAAATAATAATTGATTTAAAGTATAAAAATTTAATTTTAATAATTTCAAGAATAACAATATTAATTTCAGGTATTATAGCTAATTTTGAAATAGATTTTAAAAAAATTATTGCTTTATCAACATTAAGACAATTAGGATTTATAATAAGAATTTATTCTTTAGGTATAGTAGATTTAACATTTTTGCATTTATTTATTCATGCATTTTTTAAATCTATGATATTTATATGTGCTGGAAGATTAATTCATTATATAAATGGAATTCAAAATTTTCGTTTTTATTCTGGTATATTTTATTTATATCCAATAAAAGGATTATTAATAATATTTTCATTATTAATATTATGTGGATT
・ヒメハラナガツチバチ（配列番号４５）
ATCAACTTTAGTTACTGCTGGGATTTACATTTTAATTCGTTATAGAGAATATTTTTATAATTCTTTATTTATAAATTTTATATTTTTTATTGGGGGATTAACAATATTTATATCTGGTTTTTTGGCTAATTTCGAAAATGATATTAAAAAAATTATTGCTCTTTCTACTCTAAGTCAATTAGGTTTAATTTTTTCTGTTTTAGGGATTGGATTTAGAGATTTAGCTTATTTTCATCTTTTAAGACATGCAATATTTAAATCTGTTTTATTCATATGTGCAGGAAAATTTATTTATTCTTTAAAAGGAATTCAAGATATTCGTTATTATAGAAATTTATTTAAAATATTACCTATTACTAGAATGATTTTTATTAGATCTACATTTTCACTATGTGGATT
・ジガバチ（配列番号４６）
ACTTTAGTTACAGCGGGAATTTATTTATTAATTCGTTATGGTGAAATAATAAATATATATTCAAGTATATTGTTGTTTATTTTATCTTTGCTTACTTCATTAATAGCTGGTTTTAGAGCTTTATGTGAATATGATTTAAAGAAAATTGTTGCTTTATCAACTTTAAGTCAATTAGGTTTAATAATGATAATGGTTAGATTAAATAATTATATATTAGCTTTTTATCATTTAATAACTCATGCATTATTTAAGTCTTTATTATTTTTATGTGCTGGAAAATTTATTCATTTTAGTATATGTAATCAGGATATTCGTAAGTTTGGAGGTTTATTTTTTTTTTTTCCAATCACTAGAATTATATTTTTAATTTCTATTTTAAGGTTGTGTGGTT
・オオスズメバチ（配列番号４７）
ACTTTAGTAACAGCTGGAGTTTATTTATTAATACGATATAATAGGTATTTGATAAGAAATCATTTAATAAGTTTAATATTATTTATTTCTAGGTCTACAATAATAATATCTGGATTAATAGCTAATTTTGAAAATGATTTAAAGAAGATTATTGCATTATCTACATTAAGACAATTAGGGTTAATAATGAGAATTTTGAGGTTAGGAGAAGTAGATTTGGGGTTTATACATTTATTAATTCATGCTTTATTTAAATCTTTATTATTTATATGTAGAGGGGTATTAATTCATCAAATAAATAATAATCAGGATATTCGATTTATAGGGAGATTAGTTAGATATTATCCTTTTGTTAGGCTTGTATTTTTTGTATCGTTATTatCATTATGTGGATT
・ハバチ（配列番号４８）
GTTCATTCATCTACTTTAGTTACTGCTGGTGTATATTTATTAATTCGATTTGAAAATTTATTTAATAATAATTATAATCTAATCAAATGATTTTTATTAATTTCTATTTTAACTATATTTATATCTGGATTAAATGCTAATTTTGAGTATGATTTAAAAAAAATTATTGCTTTATCAACATTAAGTCAATTAGGTTTAATAATAAGAATTTTATTTTTAGGTTTTAGAAAATTAGCTTTTTTTCATCTTTTAACTCATGCTTTATTTAAGGCTTTATTATTTATATGTGCTGGTATTTTTATTCATAATTTAATTAATTTTCAAGATATTCGTTATATAGGATCTATTAGGCTACAAATACCTTTAGTATGTTTATGTTTTAATTTTGCAAATTTTGCTTTATGTGGATTTCCTTTTTT
・ヒメバチ（配列番号４９）
CATCTACTTTAGTTACGGCTGGAGTATATTTATTAATTCGATTTAATAATTTAATAGAAAGAAATATTTTATTTTTAATAATAATTTTATCAATTTTAACTATATTTTTATCTGGATTAGGGGCTAATTTTGAATTTGATTTAAAAAAAATTATTGCACTATCAACTTTAAGTCAATTAGGAGTAATAATTTTTTGTTTATCAATAAAGTTACCAGAAATTTCATTTTTTCATTTATCAACTCATGCAATATTTAAATCAATATTATTCATATGTTCTGGAGTAATTATTCATAATATATTAAACAATCAAGATATACGATTTATTAGAATAGTTATATATAAAATACCTTTAATTTCTTTATTATTTAATTGTTCTTCTATATCTTTATGTGGATTTC
【００８９】
２．公開データベースからのシークエンスデータ
既知のシークエンスデータを取得するために、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）のホームページのAll databaseで、キーワード検索を行った。すなわち、Search across databasesにキーワード（各「目」の名称と「ND5」）を入力し、得られた検索結果をFASTA形式で保存した。保存したシークエンスデータはそのまま、又は連続した一定領域を取り出してからアラインメント（Multiple Alignment 解析）に使用した。
【００９０】
３．メルクマールの策定
「目」に特異的な塩基（配列）の抽出は、DNAspace（日立ソフト社製）の解析ソフトを用いて、各シークエンスデータ（実分析の結果と公開データを合わせ、「目」毎に選んだ10種類の昆虫種のシークエンスデータで、これらは共通領域として５’側（ミトコンドリアＮＤ５遺伝子由来のプライマーV1.06-1側）から３００〜６００塩基長の領域を有する）につき、アラインメント（Multiple Alignment 解析）を行い、10種類のシークエンスデータのすべてに共通に存在する塩基を確定し、これらの中でシークエンスの精度がより高いと考えられるシークエンス開始後約５０番目から約４００番目の範囲内に存在する塩基配列から複数個の共通塩基を選択した。次に選択された共通塩基を含む各「目」のシークエンスデータをアラインメントし、五大目のシークエンスデータの間で共通塩基の全てが一致することがないことを確認した上で、また選択された共通塩基を含む各「目」のシークエンスデータそれぞれについて、メルクマール策定に用いた他の「目」に属する昆虫のシークエンスデータ４０種とアラインメントすることによって比較し、選択された共通塩基においてすべて一致するものがないことを確認した上で、それぞれの共通塩基が各「目」に特異的なメルクマールとした。すなわち、表１に示したように、双翅目は27個の共通塩基グループ、半翅目は21個の共通塩基グループ（グループ１）、23個の共通塩基グループ（グループ２及び３）、及び25個の共通塩基グループ（グループ４）からなる4つの共通塩基グループ、膜翅目は34個の共通塩基グループ（グループ１及び２）、及び35個の共通塩基グループ（グループ３）からなる3つの共通塩基グループ、鱗翅目で25個の共通塩基グループ、鞘翅目で19個の共通塩基グループを各「目」のメルクマールとした。
【００９１】
なお、アラインメントに用いたＤＮＡの起源の昆虫を表５に記載する。アクセッションNo.欄が空白の昆虫は本発明者が新たに塩基配列を決定したことを示す。また各「目」ごとに行ったアラインメントの結果を図１１〜図１５に、五大目間でのアラインメントの結果を図１６に示す。
【００９２】
【表５】
2008099644.tif 000006
【００９３】
４．「目」識別メルクマールの活用
SeqScape（v2.5、ABI社）の解析ソフト上で、「目」毎に登録しておいた上記塩基部位と未知データを比較し、両者の一致度を解析することにより「目」レベルでの識別を可能にした。以下に方法の概略を記した。
【００９４】
まず、「目」識別用に策定したメルクマールを登録するための作業を実施した。すなわち、SeqScapeを立ち上げ、各「目」に属する代表的な昆虫から得られたシークエンスデータを表示させ、その目のメルクマールとして決定した特定の塩基をマーキングした。こうして色付けされた対照の塩基を有する塩基配列と、識別したい塩基配列のアラインメントを行い、色付けした塩基だけを抜き出して両者を比較した表を作成した。これにより、塩基の種類と存在する位置の全てが一致するか否かが容易に識別できる。このため、被検体である昆虫が比較したメルクマールの目に属するか否かを容易に解析することができ、被検体である昆虫の分類レベルでの識別が可能となった。なお、複数の被検体を同時に解析することもできた。さらに、標識したメルクマールを有する塩基配列およびそれを用いて識別を行うプログラムを各「目」ごとに保存（登録）した場合、未知の試料の分析時に即座に活用でき、五大目において「目」レベルの識別が迅速に行うことができた。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、ＰＣＲで増幅した昆虫由来のＤＮＡ断片を確認するために行った電気泳動の結果を示す。
【図２】図２は、ＰＣＲで増幅した昆虫由来のＤＮＡ断片を確認するために行った電気泳動の結果を示す。
【図３】図３は、ＰＣＲで増幅した昆虫由来のＤＮＡ断片を確認するために行った電気泳動の結果を示す。
【図４】図４は、ＰＣＲで増幅した昆虫由来のＤＮＡ断片を確認するために行った電気泳動の結果を示す。
【図５】図５は、ＰＣＲで増幅した昆虫由来のＤＮＡ断片を確認するために行った電気泳動の結果を示す。
【図６】図６は、ＰＣＲで増幅した昆虫由来のＤＮＡ断片を確認するために行った電気泳動の結果を示す。
【図７】図７は、ＰＣＲで増幅した昆虫由来のＤＮＡ断片を確認するために行った電気泳動の結果を示す。
【図８】図８は、ＰＣＲで増幅した昆虫由来のＤＮＡ断片を確認するために行った膜翅目の電気泳動の結果を示す。
【図９】図９は、ＰＣＲで増幅した昆虫由来のＤＮＡ断片を確認するために行った膜翅目の電気泳動の結果を示す。
【図１０】図１０は、ＰＣＲで増幅した昆虫由来のＤＮＡ断片を確認するために行った隣翅目の電気泳動の結果を示す。
【図１１】図１１は、双翅目に属する昆虫由来の塩基配列で行ったアラインメントの結果を示す。
【図１２】図１２は、半翅目に属する昆虫由来の塩基配列で行ったアラインメントの結果を示す。
【図１３】図１３は、膜翅目に属する昆虫由来の塩基配列で行ったアラインメントの結果を示す。
【図１４】図１４は、鞘翅目に属する昆虫由来の塩基配列で行ったアラインメントの結果を示す。
【図１５】図１５は、鱗翅目に属する昆虫由来の塩基配列で行ったアラインメントの結果を示す。
【図１６】図１６は、五大目間に属する昆虫由来の塩基配列で行ったアラインメントの結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
配列番号１５：プライマー
配列番号１６：プライマー
配列番号１７：プライマー
配列番号１８：プライマー
【図１】
2008099644.tif 000007
【図２】
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【図３】
2008099644.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2008099644.tif 000015
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2008099644.tif 000018
【図１３】
2008099644.tif 000019
【図１４】
2008099644.tif 000020
【図１５】
2008099644.tif 000021
【図１６】
2008099644.tif 000022
【配列表】
2008099644000001.app