(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｐ−セレクチンリガンド糖蛋白、該蛋白をコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞、およびＰ−セレクチンリガンド蛋白の製造方法の提供。【解決手段】（ａ）特定のアミノ酸配列を含むＰ−セレクチンリガンド蛋白である第１のアミノ酸配列および（ｂ）抗体に由来する第２のアミノ酸配列、またはＰ−セレクチンリガンド以外の蛋白の配列を含む融合蛋白、該蛋白をコードするＤＮＡ配列、宿主細胞、およびＰ−セレクチンリガンド蛋白の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８８までを含む第１のアミノ酸配列、ここで、該第１のアミノ酸配列はＰ−セレクチンに結合するものであり；および
（ｂ）抗体に由来する第２のアミノ酸配列、ここで、天然のＦｃ配列のＬｅｕ２３４およびＧｌｙ２３７に対応するアミノ酸はアラニンに変化している；
を含む融合蛋白をコードする単離ＤＮＡ。
【請求項２】
該ヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列をさらに含む請求項１のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２のＤＮＡで形質転換された宿主細胞。
【請求項４】
（ａ）融合蛋白の発現に適した条件下で請求項３の宿主細胞を培養し；ついで、
（ｂ）融合蛋白を培地から精製する
ことを含む、融合蛋白の製造方法。
【請求項５】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸４０２までを含むものである請求項１のＤＮＡ。
【請求項６】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸３１０までを含むものである請求項１のＤＮＡ。
【請求項７】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸１８９までを含むものである請求項１のＤＮＡ。
【請求項８】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸１１８までを含むものである請求項１のＤＮＡ。
【請求項９】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８８までを含むものである請求項１のＤＮＡ。
【請求項１０】
該第２のアミノ酸配列が該第１のアミノ酸配列のＣ末端に連結されているものである請求項１のＤＮＡ。
【請求項１１】
該配列が連結配列により連結されているものである請求項１０のＤＮＡ。
【請求項１２】
該第２のアミノ酸配列が該第１のアミノ酸配列のＮ末端に連結されているものである請求項１のＤＮＡ。
【請求項１３】
該配列が連結配列により連結されているものである請求項１２のＤＮＡ。
【請求項１４】
配列番号：３５のヌクレオチド１２３からヌクレオチド９３９までのヌクレオチド配列を含む請求項９のＤＮＡ。
【請求項１５】
配列番号：３５のヌクレオチド配列を含む請求項１４のＤＮＡ。
【請求項１６】
抗体のＦｃ部分の配列がヒト抗体に由来するものである請求項１のＤＮＡ。
【請求項１７】
該ヒト抗体がアイソタイプＩｇＧ１である、請求項１６のＤＮＡ。
【請求項１８】
該ヒト抗体がアイソタイプＩｇＭである、請求項１６のＤＮＡ。
【請求項１９】
（ａ）配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８８までを含む第１のアミノ酸配列、ここで、該第１のアミノ酸配列はＰ−セレクチンに結合するものであり；および
（ｂ）抗体に由来する第２のアミノ酸配列、ここで、天然のＦｃ配列のＬｅｕ２３４およびＧｌｙ２３７に対応するアミノ酸はアラニンに変化している；
を含む融合蛋白。
【請求項２０】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸４０２までを含むものである請求項１９の融合蛋白。
【請求項２１】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸３１０までを含むものである請求項１９の融合蛋白。
【請求項２２】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８８までを含むものである請求項１９の融合蛋白。
【請求項２３】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸１１８までを含むものである請求項１９の融合蛋白。
【請求項２４】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸１８９までを含むものである請求項１９の融合蛋白。
【請求項２５】
該第２のアミノ酸配列が該第１のアミノ酸配列のＣ末端に連結されているものである請求項１９の融合蛋白。
【請求項２６】
該配列が連結配列により連結されているものである請求項２５の融合蛋白。
【請求項２７】
該第２のアミノ酸配列が該第１のアミノ酸配列のＮ末端に連結されているものである請求項１９の融合蛋白。
【請求項２８】
該配列が連結配列により連結されているものである請求項２７の融合蛋白。
【請求項２９】
配列番号：３６のアミノ酸４２からアミノ酸３１３までのアミノ酸配列を含む請求項２２の融合蛋白。
【請求項３０】
配列番号：３６のアミノ酸配列を含む請求項２９の融合蛋白。
【請求項３１】
抗体のＦｃ部分の配列がヒト抗体に由来するものである、請求項１９の融合蛋白。
【請求項３２】
該ヒト抗体がアイソタイプＩｇＧ１である、請求項３１の融合蛋白。
【請求項３３】
該ヒト抗体がアイソタイプＩｇＭである、請求項３１の融合蛋白。
【請求項３４】
請求項４の方法により製造される融合蛋白。
【請求項３５】
（ａ）配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８８までを含む第１のアミノ酸配列、ここで、該第１のアミノ酸配列はＰ−セレクチンに結合するものであり；および
（ｂ）Ｐ−セレクチンリガンド以外の蛋白の配列に由来する第２のアミノ酸配列；
を含む融合蛋白をコードする単離ＤＮＡ。
【請求項３６】
（ａ）配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８８からなる第１のアミノ酸配列、ここで、該第１のアミノ酸配列はＰ−セレクチンに結合するものであり；および
（ｂ）Ｐ−セレクチンリガンド以外の蛋白の配列に由来する第２のアミノ酸配列；
を含む融合蛋白。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内皮細胞への白血球の付着を阻害することにより作用する抗炎症物質の分野に関する。より詳細には、本発明は、セレクチンとして知られる哺乳動物付着蛋白の新規リガンドに指向される。
【０００２】
本願は、現在放棄されている１９９２年１０月２３日出願の米国出願第０７／９６５６６２号の一部継続出願であった１９９３年８月２６日出願の同時係属出願第０８／１１２６０８号の一部継続出願であった１９９４年４月２８日出願の同時係属出願第０８／２３５３９８号の一部継続出願であった１９９４年９月３０日出願の同時係属出願第０８／３１６３０５号の一部継続出願であった１９９５年４月２５日出願の同時係属出願第０８／４２８７３４号の一部継続出願である。
【背景技術】
【０００３】
炎症の間、白血球は血管内皮に付着し、内皮下組織に侵入するが、これはセレクチンまたはＬＥＣＣＡＭクラスの蛋白の標的細胞上のリガンドへの特異的結合により媒介される相互作用である。かかるセレクチンにより媒介される細胞付着は、血栓性疾患および寄生虫性疾患においても起こり、腫瘍細胞の転移性拡張に関与している可能性もある。
【０００４】
セレクチン蛋白はＮ末端レクチン様ドメイン、表皮増殖因子様ドメイン、および補体結合蛋白に相同性を有する領域により特徴づけられる。これまで３種のヒトセレクチン蛋白が同定されており、それらはＥ−セレクチン（以前はＥＬＡＭ−１と呼ばれた）、Ｌ−セレクチン（以前はＬＡＭ−１と呼ばれた）およびＰ−セレクチン（以前はＰＡＤＧＥＭまたはＧＭＰ−１４０と呼ばれた）である。
【０００５】
Ｅ−セレクチンは、サイトカインによる活性化から数時間後に内皮細胞上に誘導され、好中球と内皮との間のカルシウム依存性相互作用を媒介する。Ｌ−セレクチンはリンパ球誘導受容体であり、Ｐ−セレクチンは、血小板が活性化された場合、血小板細胞表面に急激に出現し、好中球または単球の血小板へのカルシウム依存性付着を媒介する。Ｐ−セレクチンは内皮細胞のWeibl-Palade体中にも見出される。Ｐ−セレクチンはこれらの小胞から放出されて、ヒスタミンまたはスロンビンにより刺激された内皮への好中球の初期の結合を媒介する。
【０００６】
セレクチンは、標的細胞表面上に存在するリガンドとの特異的相互作用により付着を媒介すると考えられている。一般的には、セレクチンのリガンドは、少なくとも一部には炭水化物部分を含む。例えば、Ｅ−セレクチンは、末端構造
【化１】
2008099695.tif 000002
を有する炭水化物に結合し、また、末端構造
【化２】
2008099695.tif 000003
を有する炭水化物にも結合する。式中、Ｒは炭水化物鎖の残りの部分である。これらの炭水化物は血液型抗原として知られており、通常には、それぞれシアリル・ルイスｘおよびシアリル・ルイスａと呼ばれている。内皮細胞表面上にシアリル・ルイスｘ抗原のみが存在することは、Ｅ−セレクチン発現細胞への結合を促進するには十分であるかもしれない。Ｅ−セレクチンは、末端構造
【化３】
2008099695.tif 000004
を有する炭水化物にも結合する。
【０００７】
Ｅ−セレクチンと同様、各セレクチンは種々の親和性で広範な炭水化物に結合するように思われる。セレクチンにより媒介される付着の強度（結合親和性）は、細胞表面上の炭水化物密度およびセレクチン密度にも依存する。
【０００８】
Ｐ−セレクチンは、非シアル化形態のルイスｘ血液型抗原を含む炭水化物に結合し、シアリル・ルイスｘに対しては親和性が高い。また、Ｐ−セレクチンは、異種性３−硫酸化ガラクトシルセラミドでありミエロイドおよび腫瘍細胞から脂質抽出により単離されたスルファチド類を認識する可能性がある。しかしながら、Ｐ−セレクチン担持細胞のＰ−セレクチンリガンド担持細胞への結合は、リガンド担持細胞をプロテアーゼ処理した場合には見られず、Ｐ−セレクチンリガンドが糖蛋白であることが示される。
【０００９】
Ｐ−セレクチンに関する２種の推定上の糖蛋白リガンドが最近同定され、その１つは部分精製されている（Moore et al., J. Cell Biol. 118, 445-456 (1992)）（非特許文献１）。しかしながら、これらの糖蛋白のアミノ酸組成もアミノ酸配列も開示されていない。
【非特許文献１】Moore et al., J. Cell Biol. 118, 445-456 (1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の解決すべき課題は、Ｐ−セレクチンのリガンドとして作用する蛋白およびＤＮＡを同定および単離することである。加えて、本発明の解決すべき課題は、Ｐ−セレクチンリガンド糖蛋白、該蛋白をコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡで形質転換された宿主細胞、およびＰ−セレクチンリガンド蛋白の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
１の具体例において、本発明は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードする単離ＤＮＡを含む組成物を提供し、該蛋白は配列番号：２に示すアミノ酸１からアミノ酸４０２までのアミノ酸配列を含む。可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードする単離ＤＮＡを含む組成物も提供され、該蛋白は配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸３１０までを含む。さらに本発明は、成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードする単離ＤＮＡを含む組成物を提供し、該蛋白は配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸４０２までのアミノ酸配列を含む。もう１つの具体例において、本発明は、可溶性成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードする単離ＤＮＡを含む組成物を提供し、該蛋白は配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸３１０までのアミノ酸配列を含む。もう１つの具体例において、本発明は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードする単離ＤＮＡを含む組成物を提供し、該蛋白は配列番号：４に示すアミノ酸配列を含む。さらに本発明は、本発明単離ＤＮＡのいずれか１つを含む発現ベクターを含む組成物を提供し、該ＤＮＡは発現制御配列に作動可能に連結されている。上記ＤＮＡのいずれか１つを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞も提供される。さらに、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の製造方法も提供され、該方法は：
（ａ）本発明ＤＮＡのいずれか１つを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を適当な倍地中で培養し、ついで、
（ｂ）Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を培地から精製する
ことを含む。
【００１２】
もう１つの具体例において、本発明は、配列番号：２のアミノ酸２１からアミノ酸４０２までのアミノ酸配列を含む蛋白を含む組成物を提供し、該蛋白は実質的に他の哺乳動物蛋白を含まない。さらに本発明は、配列番号：２のアミノ酸２１からアミノ酸３１０までのアミノ酸配列を含む可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を含み、該蛋白は実質的に他の哺乳動物蛋白を含まない。もう１つの具体例において、本発明は、配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸４０２までのアミノ酸配列を含むＰ−セレクチンリガンド蛋白を含み、該蛋白は実質的に他の哺乳動物蛋白を含まない。また本発明は、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸４０２までのアミノ酸配列を含む成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を含む組成物を提供し、該蛋白は実質的に他の哺乳動物蛋白を含まない。さらに、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸３１０までのアミノ酸配列を含む可溶性成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を含む組成物が提供され、該蛋白は実質的に他の哺乳動物蛋白を含まない。もう１つの具体例において、本発明は、配列番号：４に示すアミノ酸配列を含む蛋白を含む組成物を提供する。
【００１３】
さらにもう１つの具体例において、本発明は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白に対して特異的な抗体を含む組成物を提供する。
【００１４】
もう１つの具体例において、本発明は、下記工程：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸４０２までのアミノ酸配列、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸４０２までのアミノ酸配列、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸３１０までのアミノ酸配列、および配列番号：４に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＰ−セレクチンリガンド蛋白にＰ−セレクチンを結合させ（該結合は第１の結合混合物を生じる）；
（ｂ）第１の結合混合物中のＰ−セレクチン蛋白とＰ−セレクチンリガンド蛋白との間の結合量を測定し；
（ｃ）Ｐ−セレクチン蛋白およびＰ−セレクチンリガンド蛋白に化合物を結合させて第２の結合混合物を得て；
（ｄ）第２の結合混合物中の結合量を測定し；ついで
（ｅ）第１の結合混合物中の結合量を第２の結合混合物中の結合量と比較する
ことを含み、第２の結合混合物の結合量の減少か起こった場合、化合物がＰ−セレクチンにより媒介される細胞間付着を阻害しうるものである、Ｐ−セレクチンにより媒介される細胞間付着の阻害剤の同定方法を提供する。
【００１５】
もう１つの具体例において、本発明は、下記工程：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸４０２までのアミノ酸配列、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸４０２までのアミノ酸配列、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸３１０までのアミノ酸配列、および配列番号：４に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＥ−セレクチンリガンド蛋白にＥ−セレクチンを結合させ（該結合は第１の結合混合物を生じる）；
（ｂ）第１の結合混合物中のＥ−セレクチン蛋白とＥ−セレクチンリガンド蛋白との間の結合量を測定し；
（ｃ）Ｅ−セレクチン蛋白およびＥ−セレクチンリガンド蛋白に化合物を結合させて第２の結合混合物を得て；
（ｄ）第２の結合混合物中の結合量を測定し；ついで
（ｅ）第１の結合混合物中の結合量を第２の結合混合物中の結合量と比較する
を含み、第２の結合混合物の結合量の減少が起こった場合、化合物がＥ−セレクチンにより媒介される細胞間付着を阻害しうるものである、Ｅ−セレクチンにより媒介される細胞間付着の阻害剤の同定方法を提供する。これらの方法を用いて、Ｅ−セレクチンをＬ−セレクチンに置き換えるとＬ−セレクチン阻害剤を探すこともできる。
【００１６】
また本発明は、（ａ）Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードするＤＮＡおよびシアリル・ルイスＸ（ｓＬｅｘ）またはシアリル・ルイスＡ（ｓＬｅａ）を合成できるフコシルトランスフェラーゼ（（α１,３／α１,４）フコシルトランスフェラーゼまたは（α１,３）フコシルトランスフェラーゼのごときフコシルトランスフェラーゼ）をコードするＤＮＡで宿主細胞を同時形質転換し；（ｂ）適当な培地中で宿主細胞を培養し；ついで（ｃ）Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を培地から精製することを含む、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の製造方法を包含する。他の特定の具体例において、対になった塩基性アミノ酸変換酵素（paired basic amino acid converting enzyme）をコードするＤＮＡおよび／またはＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（好ましくは「コア２トランスフェラーゼ」）をコードするＤＮＡで宿主細胞を同時形質転換する。好ましい具体例において、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白は全長または可溶性形態である。
【００１７】
他の具体例において、本発明は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白活性を有するＰ−蛋白リガンド蛋白を包含する。好ましい具体例において、リガンド蛋白は、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸６０までのアミノ酸配列を含む蛋白、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸６０までのアミノ酸配列を必須として含む蛋白、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８８までのアミノ酸配列を含む蛋白、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８８までのアミノ酸配列を必須として含む蛋白、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸１１８までのアミノ酸配列を必須として含む蛋白、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸１８９までのアミノ酸配列を必須として含む蛋白である。他の好ましい具体例において、配列番号：２の位置６５、１１１および２９２におけるアスパラギン残基の少なくとも１つが欠失または置換される。リガンド蛋白の特定の好ましい具体例は、配列番号：２の位置４６、４８および５１において少なくとも１つのチロシン残基を含む。これらのＰ−セレクチンリガンド蛋白をコードするＤＮＡ、かかるＤＮＡで形質転換された宿主細胞、かかる宿主細胞を培養することによる蛋白の製造方法、蛋白を含む医薬組成物、蛋白を用いるセレクチン結合阻害剤の同定方法、蛋白に対する抗体、ならびに蛋白を用いる、セレクチンにより媒介される結合の阻害方法も本発明により包含される。
【００１８】
さらなる他の具体例において、本発明は、（ａ）配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸６０までを含む第１のアミノ酸配列、および（ｂ）Ｐ−セレクチンリガンド以外の蛋白の配列に由来する第２のアミノ酸配列を含む融合蛋白をコードする単離ＤＮＡを提供する。好ましくは、発現制御配列はそれらのヌクレオチド配列に作動可能に連結される。かかるＤＮＡで形質転換された宿主細胞も提供される。また本発明は、（ａ）融合蛋白の発現に適した条件下で宿主細胞を培養し；ついで（ｂ）融合蛋白を培地から精製することを含む、融合蛋白の製造方法を提供する。かかる方法により製造される融合蛋白も提供される。
【００１９】
特定の好ましい具体例において、かかる融合蛋白の第１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸４０２まで、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸３０１まで、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８８まで、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸１１８まで、または配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸１８９までを含む。
【００２０】
他の好ましい具体例において、ＤＮＡは、配列番号：３５のヌクレオチド１２３からヌクレオチド９３９までのヌクレオチド配列、配列番号：３５のヌクレオチド配列、配列番号：３７のヌクレオチド１２３からヌクレオチド８０７までのヌクレオチド配列、配列番号：３７のヌクレオチド配列、配列番号：３９のヌクレオチド１２３からヌクレオチド１３１１までのヌクレオチド配列、配列番号：３９のヌクレオチド配列、配列番号：４１のヌクレオチド１２３からヌクレオチド７９２までのヌクレオチド配列、配列番号：４１のヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
また本発明は、（ａ）配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸６０までを含む第１のアミノ酸配列、および（ｂ）Ｐ−セレクチンリガンド以外の蛋白の配列に由来する第２のアミノ酸配列を含む融合蛋白を提供する。好ましくは、第１のアミノ酸配列は配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸４０２まで、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸３１０まで、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８８まで、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸１１８まで、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸１８９までを含む。
【００２２】
ある種の特に好ましい具体例において、融合蛋白は、配列番号：３６アミノ酸４２からアミノ酸３１３までのアミノ酸配列、配列番号：３６のアミノ酸配列、配列番号：３８のアミノ酸４２からアミノ酸２６９までのアミノ酸配列、配列番号：３８のアミノ酸配列、配列番号：４０のアミノ酸４２からアミノ酸４３７までのアミノ酸配列、配列番号：４０のアミノ酸配列、配列番号：４２のアミノ酸４２からアミノ酸２６４までのアミノ酸配列、配列番号：４２のアミノ酸配列を含む。
【００２３】
他の好ましい具体例において、第２のアミノ酸配列は第１のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に連結され、結合配列により結合されても、されなくてもよい。
【００２４】
さらなる他の具体例において、第２のアミノ酸配列は、抗体、サイトカイン、増殖因子、分化因子、ホルモン、酵素、受容体またはそれらのフラグメントならびにリガンドからなる群より選択される蛋白に由来するものである。好ましくは、第２のアミノ酸配列は、抗体配列由来、抗体のＦｃ部分由来であり、あるいはまた抗体由来の配列の変異体である。
【００２５】
さらなる具体例において、本発明は、（ａ）配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸６０までを含む第１のペプチド、およびＯ−セレクチンリガンド以外の蛋白の配列に由来する第２のペプチドを含む組成物であって、第１のペプチドおよび第２のペプチドがペプチド結合以外の部分により化学結合されている組成物を提供する。本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をかかる組成物に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
図面の簡単な説明
図１は、コア２ありおよびなしで発現されたＰ−セレクチンリガンド蛋白の結合を比較したグラフである。
図２は、コア２ありおよびなしで発現されたＰ−セレクチンリガンド蛋白の免疫沈降のオートラジオグラフである。
図３は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白（コア２ありおよびなしで発現）のＰ−セレクチン／ＩｇＧキメラ（ＬＥＣ−γ１）および抗Ｐ−セレクチンリガンド蛋白モノクローナル抗体（ＭＡｂ２７５）への結合のフローサイトメトリー分析の結果を示す。
図４は、Ｐ−およびＥ−セレクチン／ＩｇＧキメラに結合する、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を含む蛋白のオートラジオグラフである。
図５は、配列番号：２の全長Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の構造的特徴を図式的に示したものである。
【００２７】
図６は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合におけるＮ−結合糖鎖付加部位の役割を調べる目的で構築されたいくつかのＰ−セレクチンリガンド蛋白フラグメントを図式的に示す。
図７は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合におけるＮ−結合糖鎖付加部位の役割を調べるための実験結果を示す。
図８は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合における硫酸化チロシン残基の役割を調べる目的で構築されたいくつかのＰ−セレクチンリガンド蛋白フラグメントを図式的に示す。
図９〜１１は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合における硫酸化チロシン残基の役割を調べる実験の結果を示す。
図１２は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合における種々の欠失の影響を調べる目的で構築されたいくつかのＰ−セレクチンリガンド蛋白フラグメントを図式的に示す。
図１３は、実施例４（ｃ）の定量的プレート結合アッセイを図式的に示す。
【００２８】
図１４〜１７は、種々の欠失および変化したＰ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合を比較する実験の結果を示す。
図１８は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のアニオン性領域のセレクチン類への結合におけるチロシン残基の変化の影響を調べる目的で構築されたいくつかのＰ−セレクチンリガンド蛋白フラグメントを図式的に示す。
図１９〜２１は、種々の欠失および変化したＰ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合を比較する実験の結果を示す。
図２２は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のＰ−およびＥ−セレクチンへの結合についての提案されたモデルを示す。
図２３および２４は、種々の欠失および変化したＰ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチンへの結合を比較する実験の結果を示す。
【００２９】
上記の図のいくつかには、それらが示す構造中に配列番号：２の番号付けとは異なる番号づけを便利のために使用する。それらの図において、可溶性成熟Ｐ−セレクチンリガンドの１番目のアミノ酸を出発点として用いて残基の番号付けを行う。それゆえ、それらの図に使用する残基の番号は配列番号：２のものよりも４１少ない。例えば、それらの図中の残基１９は配列番号：２の残基６０に対応する。
【００３０】
図２５は、すでに３／４フコシルトランスフェラーゼおよびコア２トランスフェラーゼを発現しているＣＨＯ細胞の発現産物の分析であり、ＣＨＯ細胞はｐｓＰＳＬ.Ｔ７、ΔＴＭ、Ｉ３１６またはｐｓＰＳＬ.ＱＣでトランスフェクションされており、メトトレキセートを用いて増幅された。ならし培地を直接分析するか、あるいはまずＬＥＣ−γ１で沈降させ、ついで非還元的条件下および還元的条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【００３１】
図２６は、Ｐ−およびＥ−セレクチンによりアフィニティー捕捉されたミエロイド細胞膜蛋白のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離である。３Ｈ−グルコサミンで代謝的に標識したＵ９３７細胞から膜溶解物を調製し、固定化Ｐ−およびＥ−セレクチンならびに対照ヒトＩｇＧ１とともにアフィニティー沈降させた。ゲル電気泳動前に溶離蛋白をＤＴＴ存在下（「還元」）または不存在下（「非還元」）で処理した。レーン：レーン１はヒトＩｇＧ１によるアフィニティー捕捉；レーン２はＰ−セレクチンによるアフィニティー捕捉；レーン３はＥ−セレクチンによるアフィニティー捕捉。
【００３２】
図２７は連続的アフィニティー捕捉実験である。３Ｈ−標識Ｕ９３７溶解物種をＰ−またはＥ−セレクチンによりアフィニティー捕捉し、溶離し、ついで、抗ＰＳＧＬ−１抗血清Ｒｂ３４４３との免疫沈降に供した。レーン：１および２は、免疫前のウサギの血清（レーン１）およびＲｂ３４４３（レーン２）を用いる新鮮ミエロイド細胞膜溶解物の対照免疫沈降である。レーン３〜５は、すでにＰ−セレクチン（レーン３）、Ｅ−セレクチン（レーン４）、およびヒトＩｇＧ１（レーン５）によりアフィニティー捕捉され、ついで溶離されたミエロイド細胞膜溶解物のＲｂ３４４３との免疫沈降である。
【００３３】
図２８は、ミエロイド膜抽出物のＣＤ４３およびＰＳＧＬ−１含量の比較である。標識Ｕ９３７細胞抽出物を抗ＰＳＧＬ−１ウサギポリクローナル抗体Ｒｂ３４４３または抗ＣＤ４３マウスＭａｂとともに免疫沈降させ、ついでＳＤＳ−ＰＡＧＥ／オートラジオグラフィーに供した。レーン：１は、対照である免疫前のウサギ血清との免疫沈降である。２はＲｂ３４４３との免疫沈降である。３は対照イソタイプに合致するマウス抗体との免疫沈降である。４は抗ＣＤ４３抗体との免疫沈降である。
【００３４】
図２９は、ＣＯＳトランスフェクション実験である。ＰＳＧＬ−２またはＣＤ４３をコードするプラスミド、ならびにＦｕｃ−ＴＩＩＩまたはＦｕｃＴＶＩＩをコードするプラスミドを用いてトランスフェクションしたＣＯＳ Ｍ６細胞を３５Ｓ−メチオニンで代謝的に標識し、材料および方法において説明するように、膜をアフィニティー捕捉実験用に調製した。トランスフェクションに使用したｃＤＮＡをレーンの上に示す。（Ａ）Ｅ−セレクチン、（Ｂ）Ｐ−セレクチン、および（Ｃ）抗ＰＳＧＬ−１抗血清Ｒｂ３４４３および抗ＣＤ４３ Ｍａｂを用いて沈降を行った。
【００３５】
図３０は、Ｐ−およびＥ−セレクチン結合の阻害に関する種々のＰ−セレクチンリガンド蛋白のスクリーニングをまとめたものである（実施例１３参照）。
【００３６】
本発明者らは、ヒト内皮細胞および血小板上のＰ−セレクチンのリガンドとして作用する蛋白をコードする新規ＤＮＡを初めて同定し、単離した。ＤＮＡ配列を配列番号：１に示す。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の完全なアミノ酸配列（すなわち、成熟ペプチドにリーダー配列が付加したもの）は、配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸４０２までのアミノ酸配列により特徴付けられる。疎水性分析および既知開裂パターンとの比較により、２０ないし２２個のアミノ酸、すなわち配列番号：２のアミノ酸１から２０までまたはアミノ酸１から２２までのシグナル配列が予想された。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白は、ＰＡＣＥ（対になった塩基性アミノ酸変換酵素）開裂部位（−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−）を配列番号：２のアミノ酸３８〜４１に有する。本発明成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白は配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸４０２までのアミノ酸配列により特徴付けられる。可溶性形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白は配列番号：２のアミノ酸２１からアミノ酸３１０を含むことにより特徴付けられる。もう１つの可溶性形態の成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白は配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸３１０に示すアミノ酸配列により特徴付けられる。可溶性形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白は、さらに室温において水溶液中に可溶性であることにより特徴付けられる。もちろん、これらの蛋白をコードする、配列番号：１に示す対応ＤＮＡ配列も本発明に包含される。
【００３７】
本発明Ｐ−セレクチンリガンドは糖蛋白であり、以下の末端炭水化物の１つまたはそれ以上を含む可能性がある：
【化４】
2008099695.tif 000005
【００３８】
式中、Ｒは炭水化物鎖の残りの部分であり、直接Ｐ−セレクチンリガンド蛋白に共有結合しているか、あるいはＰ−セレクチンリガンド蛋白に共有結合した脂質部分に共有結合している。本発明Ｐ−セレクチンリガンド糖蛋白はさらに硫酸化されていてもよく、あるいは翻訳後修飾されていてもよい。ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞中で発現される場合、全長のＰ−セレクチンリガンド蛋白（配列番号：２のアミノ酸１から４０２まで、または配列番号：２のアミノ酸４２から４０２まで）は、非還元的ＡＤＡ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によれば２２０ｋＤａの見かけの分子量を有するホモダイマー蛋白である。
【００３９】
全長のＰ−セレクチンリガンド蛋白の構造を図５に図式的に示す。配列番号：２のＰ−セレクチンリガンド蛋白の３つの領域は以下のとおりである：細胞外ドメイン（配列番号：２のアミノ酸２１から３１０まで）、膜貫通ドメイン（配列番号：２のアミノ酸３１１から３２２まで）、および細胞内、細胞質ドメイン（配列番号：２のアミノ酸３３３から４０２まで）。細胞外ドメインは、Ｎ−結合糖鎖付加が可能な３つのコンセンサストリペプチド部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を有し、それらはＡｓｎ残基６５、１１１、および２９２から開始する。細胞外ドメインはさらに、チロシン硫酸化可能な３つの部位を残基４６、４８、および５１に有する。残基５５〜２６７からなる領域は高いパーセンテージのプロリンおよびスレオニンを含み、アミノ酸コンセンサス配列Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ／Ｌｅｕ−Ａｌａ／Ｔｈｒからなる１０量体の１５個のリピートを含む。ここにＸはＰｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、またはＡｒｇのいずれであってもよい。これらの領域のごとき領域は高度にＯ−糖鎖付加された蛋白の特徴を有する。
【００４０】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードする遺伝子およびフコシルトランスフェラーゼ（以下、ＦＴという）、好ましくは（α１,３／α１,４）フコシルランスフェラーゼ（「３／４ＦＴ」という）をコードする遺伝子を用いて同時トランスフェクションされたＣＯＳまたはＣＨＯ細胞は、表面上にＰ−セレクチンを発現するＣＨＯ細胞に結合しうるが、表面上にＰ−セレクチンを発現しないＣＨＯ細胞には結合しない。精製形態またはＣＨＯ細胞表面上に発現されたセレクチンに結合するためには、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードする遺伝子をＦＴをコードする遺伝子とともに同時トランスフェクションしなければならない。なぜなら、一方のみの遺伝子でのトランスフェクションではＰ−セレクチン結合活性が無いかまたは著しく低下しているからである。本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のＰ−セレクチンへの結合は、ＥＤＴＡにより、あるいはＰ−セレクチン特異的中和モノクローナル抗体により阻害されうる。本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のＰ−セレクチンへの結合は、Ｐ−セレクチン特異的非中和モノクローナル抗体により、あるいはイソタイプ対照によっては阻害されない。これらの結果は、本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の結合特異性を特徴付ける。
【００４１】
本発明の目的のために、実施例４のＣＨＯ−Ｐ−セレクチン結合アッセイにおいて細胞表面に存在するＰ−セレクチンに、あるいは別の表面に固定されたＰ−セレクチン、例えば実施例４のペトリ皿に固定化されたキメラＰ−セレクチン−ＩｇＧγ１蛋白にカルシウム依存的に結合する場合、「Ｐ−セレクチンリガンド蛋白活性」を有すると定義される蛋白であると定義され、「Ｐ−セレクチンリガンド蛋白」または「Ｐ−セレクチンリガンド糖蛋白」または単に「Ｐ−セレクチンリガンド」と呼ばれる。
【００４２】
実施例５（Ｃ）に詳述されｓＰＳＬ.Ｔ７と命名されたキメラな可溶性形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白を用いて本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の糖鎖付加状態を研究した。３／４ＦＴとともに同時トランスフェクションされたＣＯＳ細胞から産生されるｓＰＳＬ.Ｔ７蛋白を、実施例６（Ｃ）に詳述するように翻訳後糖鎖付加により徹底的に修飾した。かくして、少なくともそのいくつかがシアル化されているＮ−およびＯ−結合オリゴ糖鎖が本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白上に存在すると考えられる。
【００４３】
本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白はＥ−セレクチンおよびＬ−セレクチンにも結合する。ｓＰＳＬ.Ｔ７またはＰ−セレクチンリガンド−Ｉｇ融合物をコードするＤＮＡおよび３／４ＦＴをコードするＤＮＡで同時トランスフェクションされたＣＯＳ細胞により得られたならし培地をプラスチックマイクロタイタープレートのウェルにコーティングすると、Ｅ−セレクチンを発現するＣＨＯ細胞がプレートに結合する。しかしながら、Ｅ−セレクチンを発現しないＣＨＯ細胞はかかるプレートに結合しない。ｓＰＳＬ.Ｔ７をコードするＤＮＡおよび３／４ＦＴをコードするＤＮＡで同時トランスフェクションされたＣＯＳ細胞によるならし培地でコーティングされたマイクロタイタープレートへのＥ−セレクチン発現ＣＨＯ細胞の結合は、ＥＤＴＡの存在またはＥ−セレクチン特異的中和抗体の存在下で消滅する。ｓＰＳＬ.Ｔ７ ＤＮＡのみでトランスフェクションされたＣＯＳ細胞によるならし培地は、マイクロタイタープレートのウェルにコーティングされた場合、Ｅ−セレクチン発現ＣＨＯ細胞の結合を引き起こさない。これらの理由により、本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白は、Ｐ−セレクチンにより媒介される細胞間付着のほかにも、Ｅ−セレクチンにより媒介される細胞間付着の阻害剤として有用であると考えられる。
【００４４】
固定化されたＰ−セレクチンのＦｃキメラを用いるアフィニティー捕捉により決定されるように、ＣＯＳ細胞により産生された可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白に対して生成された抗体は、Ｐ−セレクチンに特異的に結合する主要ＨＬ−６０糖蛋白と免疫反応する。Ｕ９３７細胞は類似の免疫反応性糖蛋白リガンドを有する。よって、３Ｈ−グルコサミン標識Ｕ９３７細胞の界面活性剤抽出物とともに前以てインキュベーションされた固定化Ｐ−セレクチンのＥＤＴＡでの溶離により、単一の糖蛋白種が観察される。この主要種は、非還元的条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば２２０ｋＤの見かけの分子量を示し、還元的条件下では１００ｋＤの見かけの分子量を示す。Ｈ−６０細胞から単離された相当種の場合、Ｕ９３７リガンドは、ＣＯＳ組み換えＰ−セレクチンリガンド蛋白に対して生成されたポリクローナル抗体と免疫反応する。さらに、固定化されたＥ−セレクチンのＦｃキメラを用いる、Ｕ９３７細胞および細胞膜標品からのＥ−セレクチンリガンドのアフィニティー捕捉により、主要Ｕ９３７ Ｐ−セレクチンリガンドと同一の分子量および電気泳動上の挙動を示す単一の主要種が得られる。よって、Ｅ−およびＰ−セレクチンはＵ９３７細胞の同じ主要糖蛋白リガンドを認識し、その糖蛋白リガンドは抗Ｐ−セレクチンリガンド蛋白抗体と免疫反応し、全長の組み換えＰ−セレクチンリガンド蛋白と同じ見かけの分子量および電気泳動上の挙動を有する。
【００４５】
Ｐ−セレクチンと相互作用可能な、あるいはＰ−セレクチンにより媒介される細胞間付着を阻害しうるＰ−セレクチンリガンド蛋白のフラグメントも、本発明に包含される。かかるフラグメントは、セリンおよびスレオニン残基の頻度が少ないＰ−セレクチンリガンド蛋白の領域である配列番号：２のアミノ酸２１から５４まで；プロリン、セリンおよびスレオニンの頻度が多く、さらにアスパラギン結合糖蛋白のコンセンサス配列（Ａｓｎ−ＸＳｅｒ／Ｔｈｒ）２個を有する配列番号：２のアミノ酸５５から１２７まで；プロリン、セリン、およびスレオニンいずれの頻度も高く、１０個のアミノ酸のコンセンサス配列：Ａｌａ−（Ｔｈｒ／Ｍｅｔ）−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−（Ｐｒｏ／Ａｒｇ／Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｇｌｕ）−（Ｌｅｕ／Ｐｒｏ）−（Ａｌａ／Ｔｈｒ）の１５個のリピートを含む配列番号：２のアミノ酸１２８から２６７までのもう１つの大きなフラグメント（この大きなフラグメント中の小さいフラグメントも、Ｐ−セレクチンとの相互作用能を保持し、あるいはＰ−セレクチンにより媒介される細胞間付着の阻害剤として作用しうる。）；アスパラギン結合糖鎖付加のコンセンサスを含み、配列番号：２のアミノ酸２６８から３０８までのアミノ酸を含む領域；配列番号：２のアミノ酸３０９から３３３までにより示される蛋白の疎水性領域；ならびに配列番号：２のアミノ酸３３４から４０２までのＰ−セレクチンリガンド蛋白の両親媒性領域を含む。さらなるフラグメントは、配列番号：２のアミノ酸４３からアミノ酸５６まで、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸６０までを含んで射てもよく、アミノ酸４６、アミノ酸４８、および／またはアミノ酸５１において１個またはそれ以上の硫酸化またはリン酸化（Domcheck et al., Biochemistry 31：9865-9870 (1992)）チロシンを有していてもよい。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のフラグメントは直鎖状であってもよく、あるいは既知方法、例えばH. U. Saragovi, et al., Bio/Technology 10, 773-778 (1992)およびR. S. McDowell, et al., J. Amer.Chem. Soc. 114, 9245-9253 (1992)に記載の方法（それらを参照により本明細書に記載されているものとみなす）を用いて環化されていてもよい。本発明の目的のため、本明細書で「Ｐ−セレクチンリガンド蛋白」という場合はすべて、Ｐ−セレクチンに結合しうるフラグメントを含むものとする。
【００４６】
かかるフラグメントを免疫グロブリンのごときキャリア分子に融合させてＰ−セレクチンリガンド結合部位の価数を増加させてもよい。例えば、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸２９５までまたはアミノ酸４２からアミノ酸８８のフラグメントのごとき可溶性形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白を、「リンカー」配列を介して免疫グロブリンのＦｃ部分（得られるキメラに所望品質（例えば、長い半減期または免疫原性の低下）を付与するための無処理配列または変異配列）に融合させてもよい。２価形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白に関しては、実施例５（Ｄ）および配列番号：６に示すように、かかる融合はＩｇＧ分子のＦｃ部分に対するものであってよい。他の免疫グロブリンイソタイプを用いてかかる融合物を得てもよい。例えば、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白−ＩｇＭ融合物は１０価形態の本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を生じるであろう。
【００４７】
他の蛋白由来のアミノ酸配列への本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の融合物を構築してもよい。かかる目的に好ましいＰ−セレクチンリガンド蛋白は、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸２９５までのフラグメントまたはアミノ酸４２からアミノ酸８８までのフラグメントを包含する。望ましい融合蛋白は、例えばサイトカイン、増殖因子および分化因子（骨形態形成蛋白、例えばＢＭＰ類））、ホルモン、酵素、受容体成分またはフラグメントならびに他のリガンドのようなＰ−セレクチンリガンドとは異なる生物学的活性を有する蛋白由来のアミノ酸配列を含んでいてもよい。また、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を他の蛋白または薬剤に化学結合させることもできる。かかる使用において、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白は、セレクチン分子との相互作用能によって、治療効果を増強することにより融合または結合された薬剤の薬剤動力学および／または生体分配を変化させる。例えば、サイトカイン配列へのＰ−セレクチンリガンド蛋白の融合は、サイトカイン活性を炎症部位に指向することができる。かかる場合、融合蛋白のＰ−セレクチンリガンド蛋白部分は炎症部位において発現されたセレクチンに結合するであろう。この結合は、融合蛋白のサイトカイン部分を局在化させ、その同族の受容体または近くの細胞表面への結合を可能にするであろう。同様に、他のリガンドをかかる融合蛋白において使用して、対応受容体を発現する細胞をＰ−セレクチン発現部位に引き寄せることができる。かかる融合物の好ましい例を実施例１５において説明する。
【００４８】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を含む融合蛋白において、Ｐ−セレクチンリガンド以外の蛋白由来のアミノ酸配列をＰ−セレクチンリガンド由来の配列のＮ末端またはＣ末端に連結することができる。連結は直接的（すなわち、いずれの蛋白にも由来しない介在結合配列を含まない）であってもよく、あるいは連結配列を介するものであってもよい。
【００４９】
かかる融合蛋白を用いる哺乳動物の治療方法も本発明により企図される。かかる場合、融合蛋白を用いて、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白が融合している蛋白により効果が発揮される症状を治療する。例えば、ＩＬ−１１へのＰ−セレクチンリガンド蛋白の融合物を用いて、セレクチンをその表面に発現する骨髄内皮細胞にＩＬ−１１活性を局在化させることができる。局在化されると、融合蛋白のＩＬ−１１部分は巨核細胞の前駆細胞を刺激するであろう。同様に、ＢＭＰへのＰセレクチンリガンド蛋白の融合物を用いて、障害部位における骨または軟骨の形成を刺激することもできる。障害組織はＰ−セレクチンを発現し、そのことにより融合蛋白が結合する。局在化されると、融合蛋白のＢＭＰ部分は障害部位において骨または軟骨の産生を刺激するであろう。
【００５０】
下記実施例に詳述するように、本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を、最初は発現クローニング法（Clarkら、米国特許第４６７５２８５号）を用いて得た。ヒトプロミエロサイト細胞系ＨＬ−６０（S. J. Collins, et al., Nature 270, 347-349 (1977), ATCC番号CCL 240）からｃＤＮＡライブラリーを構築した。このライブラリーを３／４ＦＴをコードするＤＮＡとともにＣＯＳ細胞中に同時トランスフェクションし、Ｐ−セレクチンの細胞外部分およびヒトＩｇＧγ１モノクローナル抗体のＦｃ部分からなるキメラ分子への結合に関してトランスフェクション体をスクリーニングした。キメラＰ−セレクチンに結合する同時トランスフェクションを、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードする蛋白に関して豊富化した。このスクリーニング工程を数回繰り返して、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードするｃＤＮＡに関してさらにプラスミド集団豊富化した。第２のクローニング段階において、豊富化したプラスミド集団を、３／４ＦＴ遺伝子とともに再度ＣＯＳ細胞中に同時トランスフェクションし、表面上にＰ−セレクチンを発現する蛍光標識ＣＨＯ細胞系への結合に関してスクリーニングした。この方法により単一のｃＤＮＡクローンを得て、ｐＭＴ２１：ＰＬ８５と命名した。１９９２年１０月１６日にｐＭＴ２１：ＰＬ８５プラスミドをAmerican Type Culture Collectionに寄託し、受託番号ＡＴＣＣ ６９０９６を付与された。
【００５１】
本発明新規ＤＮＡを配列番号：１に示す。本発明ＤＮＡは種々の形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白をコードしうる。例えば、１の具体例において、本発明ＤＮＡは配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸４０２までのアミノ酸配列を有する全Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードする。もう１つの具体例において、本発明ＤＮＡは配列番号：２のアミノ酸２１からアミノ酸４０２までのアミノ酸配列により特徴づけられる、シグナル配列を欠いたＰ−セレクチンリガンド蛋白の１形態をコードする。さらなる具体例において、本発明ＤＮＡは、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸４０２までのアミノ酸配列により特徴づけられる成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードする。本発明ＤＮＡのもう１つの具体例は、配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸３１０までのアミノ酸配列により特徴づけられる可溶性形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白をコードする。また、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸３１０までのアミノ酸配列により特徴づけられる可溶性形態の成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードするＤＮＡも本発明の具体例である。さらに、配列番号：２のアミノ酸２１からアミノ酸３１０までのアミノ酸配列により特徴づけられる、シグナル配列を欠いた可溶性形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白をコードするＤＮＡも本発明の具体例である。本発明ＤＮＡは他のヒトＤＮＡを含まず、それゆえ、単離ＤＮＡとして特徴づけられる。上に詳述したように、Ｐ−セレクチンと相互作用するＰ−セレクチンリガンドフラグメントをコードするＤＮＡも本発明に包含される。
【００５２】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白ｃＤＮＡプローブを用いるノーザン分析により、種々のヒト細胞系（ＨＬ−６０、ＴＨＰ−１、Ｕ９３７）およびヒト単球ならびに多形核白血球においてＰ−セレクチンリガンド蛋白ｍＲＮＡ転写物の発現が観察された。それらの細胞系すべてにおいて、２.５ｋｂの主要転写物が観察された。ＨＬ６０およびＵ９３７細胞系ならびに多形核白血球において約４ｋｂのマイナーな種が観察された。対照的に、ヒト肝芽腫細胞系ＨｅｐＧ２においてＰ−セレクチンリガンドｍＲＮＡ発現が検出された。
【００５３】
サザンブロット分析によりわかるように、本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白は単一コピー遺伝子によりコードされており、多遺伝子ファミリーの一部ではない。本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のゲノム形態は、５'非翻訳領域中のヌクレオチド５４に局在する約９ｋｂの大きなイントロンを含む。多形核白血球および単球において、本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白は配列番号：３に示すＤＮＡ配列によりコードされている。この具体例において、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白は１６個のリピート領域を含む。同様に本発明単離ＤＮＡは配列番号：３に示すＤＮＡ配列においても具体化され、１９９３年１０月２２日にAmerican Type Culture Collectionに寄託され、受託番号ＡＴＣＣ ７５５７７を付与されたプラスミドｐＰＬ８５Ｒ１６に含まれている。
【００５４】
また本発明は、配列番号：１に示す単離ＤＮＡまたは配列番号：３に示す単離ＤＮＡの対立遺伝子変種、すなわちＰ−セレクチンリガンド活性を有する蛋白をコードする配列番号：１または配列番号：３の単離ＤＮＡの天然の別形態を包含する。厳密な条件下（例えば、６５℃で４ｘＳＳＣ、または４２℃で５０％ホルムアミドおよび４ｘＳＳＣ）または弛緩した条件下（５０℃で４ｘＳＳＣ、または４２℃で３０〜４０％ホルムアミド）において配列番号：１に示すＤＮＡまたは配列番号：３に示すＤＮＡにハイブリダイゼーションし、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白活性を有する単離ＤＮＡも本発明に包含される。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードし、遺伝学的コードの縮重により配列番号：１に示す単離ＤＮＡまたは配列番号：３に示すＤＮＡとは異なっており、やはりＰ−セレクチンリガンド蛋白活性を有する単離ＤＮＡも本発明に包含される。点突然変異による、あるいはＰ−セレクチンリガンド活性、半減期または生成レベルを増強する修飾を導入されたことによる、配列番号：１に示すＤＮＡまたは配列番号：３に示すＤＮＡの変種も本発明に包含される。本発明の目的のため、本明細書の「配列番号：１のＤＮＡ」は、配列番号：１に示す特定のＤＮＡ配列を含むＤＮＡのほかに、配列番号：２の成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードするＤＮＡ；Ｐ−セレクチンに結合しうる配列番号：２のＰ−セレクチンリガンド蛋白のフラグメントをコードするＤＮＡ；可溶性形態の配列番号：２のＰ−セレクチンリガンド蛋白をコードするＤＮＡ；配列番号：１のＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションし、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしており、遺伝学的コードの縮重により配列番号：１のＤＮＡとは異なっているＤＮＡ；ならびに上記配列番号：１のＤＮＡ配列の変種も包含する。同様に、「配列番号：３のＤＮＡ」は、配列番号：３に示す特定のＤＮＡ配列を含むＤＮＡのほかに、配列番号：４の成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードするＤＮＡ；Ｐ−セレクチンに結合しうる配列番号：４のＰ−セレクチンリガンド蛋白のフラグメントをコードするＤＮＡ；可溶性形態の配列番号：４のＰ−セレクチンリガンド蛋白をコードするＤＮＡ；配列番号：３のＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションし、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしており、遺伝学的コードの縮重により配列番号：３のＤＮＡとは異なっているＤＮＡ；ならびに上記配列番号：３のＤＮＡ配列の変種も包含する。
【００５５】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の膜貫通および細胞質ドメインをコードする領域が欠失され、さらに／あるいは細胞外ドメインのカルボキシ末端のアミノ酸に対するコドンの３'側にストップコドンが導入された修飾ＤＮＡの発現により、可溶性形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白をコードするＤＮＡを調製してもよい。例えば、疎水性分析により、配列番号：２に示すＰ−セレクチンリガンド蛋白が配列番号：２のアミノ酸３１１から３３２までを含む膜貫通ドメインならびに配列番号：２のアミノ酸３３３から４０２までを含む細胞質ドメインを有することが予想される。当該分野で知られた特異的突然変異法を包含する標準的な分子生物学的手法により、あるいは適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により上記修飾ＤＮＡを得てもよい。種々の可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードするいくつかのＤＮＡを得る方法を実施例５に示す。
【００５６】
全長配列の一部が欠失または変化している修飾ＤＮＡの発現により、他のフラグメントおよび別形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白をコードするＤＮＡを調製してもよい。Ｐ−セレクチンリガンド活性を保持させつつ、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白配列の実質的な欠失を行うことができる。例えば、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸１８９までの配列、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸１１８までの配列、または配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８９までの配列を含むＰ−セレクチンリガンド蛋白はそれぞれＰ−セレクチン蛋白結合活性およびＥ−セレクチン結合能を有する。１個またはそれ以上のＮ−結合糖鎖付加部位（例えば、配列番号：２のアミノ酸６５、１１１および２９２のごとき部位）が他のアミノ酸に変化させられ、あるいは欠失されたＰ−セレクチンリガンド蛋白もやはりＰ−セレクチン蛋白結合活性およびＥ−セレクチン結合能を保持している。配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸６０までを含むＰ−セレクチンリガンド蛋白（配列番号：２のアミノ酸４５からアミノ酸５８までの非常にアニオン性の領域を含む）もまたＰ−セレクチンリガンド蛋白活性を保持している。しかしながら、かかる配列に限定されたＰ−セレクチンリガンド蛋白はＥ−セレクチンに結合しない。好ましくは、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白は、配列番号：２のアミノ酸４６、４８および５１に見出されるチロシン残基のうち少なくとも１個（より好ましくは少なくとも２個、最も好ましくは３個すべて）を保持しているものであり、それらの残基の硫酸化はＰ−セレクチンリガンド蛋白活性に貢献しうる。これらの活性フラグメントおよび他の活性フラグメントまたは別形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白をコードするＤＮＡの構築を、当業者に知られた方法に従って行ってもよい。
【００５７】
本発明単離ＤＮＡを、Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991)に開示されたｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターのごとき発現制御配列に作動可能に連結して、Ｐ−セレクチンリガンドを組み換え的に製造してもよい。多くの適当な発現制御配列が当該分野において知られている。組み換え蛋白発現の一般的方法も知られており、R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990)に説明がある。本明細書の「作動可能に連結」は、酵素的または化学的な連結により本発明単離ＤＮＡおよび発現制御配列間に共有結合が形成され、その結果、連結されたＤＮＡ／発現制御配列を用いて形質転換（トランスフェクション）された宿主細胞によりＰ−セレクチンリガンド蛋白が発現されることを意味する。
【００５８】
対になったアミノ酸配列（例えば、−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−および−Ａｒｇ−Ａｒｇ−）のカルボキシル側で前駆体ペプチドを開裂して成熟蛋白を生じる、いくつかのエンド蛋白分解酵素が知られている。一般的には、かかる酵素は、対になった塩基性アミノ酸変換酵素またはＰＡＣＥとして知られ、成熟蛋白の組み換え製造方法におけるそれらの使用はＷＯ９２／０９６９８および米国特許出願第０７／８８５９７２号に十分に開示されており、参照によりそれらを本明細書に記載されているものとみなす。ＰＡＣＥファミリーの酵素は、組み換え宿主細胞における前駆体ポリペプチドの蛋白分解的プロセッシングの効率を高めることが知られている。上記のごとく、本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白はかかる
ＰＡＣＥ開裂部位を含んでいる。
【００５９】
本明細書記載の可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードするＤＮＡ配列およびＷＯ９２／０９６９８および米国特許出願第０７／８８５９７２号（参照によりそれらを本明細書に記載されているものとみなす）に記載のＰＡＣＥをコードするＤＮＡ配列または配列番号：５のＤＮＡ配列を含む宿主細胞により、本発明の可溶性成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を製造してもよい。かかる宿主細胞は、可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白ＤＮＡおよびＰＡＣＥ ＤＮＡをそれぞれ含む別個の発現ベクターでの同時形質転換または逐次形質転換の結果としてのＤＮＡを含んでいてもよい。３／４ＦＴをコードする第３のＤＮＡを、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白およびＰＡＣＥをコードするＤＮＡとともに同時形質転換してもよい。別法として、宿主細胞は、可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白ＤＮＡおよびＰＡＣＥ ＤＮＡの両方を含む単一の発現ベクターでの形質転換の結果としてのＤＮＡを含んでいてもよい。かかる発現ベクターの構築は分子生物学の当業者のレベル内である。同時形質転換および形質転換の方法も知られている。
【００６０】
ＰＡＣＥをコードする多くのＤＮＡ配列が知られている。例えば、フリン（furin）として知られる１の形態のＰＡＣＥをコードするＤＮＡがA. M. W. van den Ouweland et al., Nucl. Acids Res. 18, 664 (1990)に開示されており、参照により本明細書に記載されているものとみなす。PACESOLとして知られる可溶性形態のＰＡＣＥをコードするｃＤＮＡを配列番号：５に示す。他の形態のＰＡＣＥをコードするＤＮＡも存在し、ＰＡＣＥがアミノ酸３８〜４１においてＰ−セレクチンリガンド蛋白を開裂しうるかぎり、かかるＰＡＣＥをコードするＤＮＡを用いて本発明の可溶性成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を得てもよい。好ましくは、可溶性形態のＰＡＣＥをコードするＤＮＡを用いて本発明の可溶性成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を得る。
【００６１】
可溶性形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白およびＰＡＣＥをそれぞれコードするＤＮＡを、別個にあるいは一緒にして、上記ｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクター中に含まれるような発現制御配列に作動可能に連結して、ＰＡＣＥにより開裂された可溶性Ｐ−セレクチンリガンドを組み換え的に製造してもよい。さらなる適当な発現制御配列が当該分野において知られている。下記実施例３（Ｃ）および３（Ｄ）は本発明の可溶性成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の製造方法を説明する。
【００６２】
多くのタイプの細胞がＰ−セレクチンリガンド蛋白発現のための適当な宿主細胞として作動しうる。適当な宿主細胞は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白に特徴的な炭水化物側鎖を結合しうるものである。かかる能力は、天然に存在するかどうか、化学的突然変異により誘導されたかどうか、あるいは糖鎖付加酵素をコードするＤＮＡ配列を含む適当な発現プラスミドで宿主細胞がトランスフェクションされたかどうかに関係なく、宿主細胞中の適当な糖鎖付加酵素の存在により生じるものである。例えば、宿主細胞は、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、Ｃｏｌｏ ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換された霊長類細胞系、正常２倍体細胞、１次組織、１次移植物のインビトロ培養から得られる細胞株、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、またはＨａｋ細胞を包含する。
【００６３】
本発明単離ＤＮＡおよび適当な糖鎖付加酵素をコードする１またはそれ以上のＤＮＡを、１またはそれ以上の昆虫発現ベクター中の適当な制御配列に作動可能に連結し、昆虫発現系を用いることにより蛋白を得てもよい。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、例えばInvitrogen, San Diego, California, USAからのキット形態（MaxBacRキット）で市販されており、かかる方法は当該分野においてよく知られており、SummersおよびSmith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)（参照により本明細書に記載されているものとみなす）に記載のようなものがある。上記の適当な単離ＤＮＡを用いて、昆虫細胞において可溶性形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白を得てもよい。１形態のＰＡＣＥをコードするＤＮＡを昆虫細胞中でさらに同時発現させて、ＰＡＣＥにより開裂された形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白を得てもよい。
【００６４】
別法として、酵母のごとき下等真核細胞または細菌のごとき原核細胞においてＰ−セレクチンリガンド蛋白を製造することも可能である。潜在的に適当な酵母株は、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces株、Candida、または異種蛋白の発現能を有する酵母株を包含する。潜在的に適当な細菌株は、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、または異種蛋白の発現能を有する細菌株を包含する。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白が酵母または細菌において生成される場合、蛋白の適当な部分に適当な炭水化物を共有結合させる必要がある。既知化学的または酵素的方法を用いてかかる共有結合を行ってもよい。
【００６５】
本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をトランスジェニック動物の産生物として、例えばＰ−セレクチンリガンド蛋白をコードするＤＮＡ配列を含む体細胞または生殖細胞により特徴づけられるトランスジェニックなウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジの乳の成分として発現させてもよい。
【００６６】
ＧｌｃＮａｃトランスフェラーゼ、好ましくはコア２トランスフェラーゼとしても知られるＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ：Ｇａｌ β１−３ＧａｌＮａｃ−Ｒ（ＧｌｃＮａｃ ｔｏ ＧａｌＮＡｃ）β１−６ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.102）での宿主細胞の形質転換により、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のＰ−セレクチン結合活性を増大させてもよい。
【００６７】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白上に存在するＯ−結合グリカンはＰ−セレクチンへの結合に重要であることが示されている（D. Sako et al., Cell 75, 1175-1186 (1993)）。ミエロイド細胞のＯ−結合グリカン上のシアリルＬｅｘが複合分枝構造上に存在することが報告されている（Maemura, K. and Fukuda, M., J. Biol. Chem. 267, 24379-24386 （1992)）。かかるオリゴサッカライド構造の生成に関与する酵素が「コア２」である。コア２酵素活性はＣＯＳ細胞中に非常に低レベルで見出され、ＣＨＯ細胞中には痕跡レベルで見出される。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白、（α１,３／α１,４）フコシルトランスフェラーゼおよびコア２をコードするＤＮＡで同時形質転換された宿主細胞は、Ｐ−セレクチンに対する結合が２０〜３０倍増強されたＰ−セレクチンリガンド蛋白を生じうる。
【００６８】
ある種の好ましい具体例において、可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白、３／４ＦＴ、コア２およびＰＡＣＥをコードするＤＮＡで同時形質転換した宿主細胞によりＰ−セレクチンリガンド蛋白を製造する。
【００６９】
Ｐ−セレクチン結合糖蛋白の発現に適した培養条件下で形質転換宿主細胞を培養することにより本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を製造してもよい。次いで、得られた発現糖蛋白を、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーのごとき既知精製プロセスを用いて培地または細胞抽出物から精製してもよい。可溶性形態の本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を、レンズマメレクチン−セファロース（Sepharose）(登録商標)によるクロマトグラフィー、ついで０.５Ｍ α−メチルーマンノースでの溶離により生成することができる。ついで、溶離した可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を０〜７０％硫酸アンモニウム工程によりさらに精製し、濃縮してもよい。ついで、蛋白を回収し、再懸濁し、ＴＳＫ Ｇ４０００ＳＷＸＬによるサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製する。別法として、発現細胞から全膜フラクションを調製し、Triton X-100のごとき非イオン性界面活性剤で膜を抽出することにより本発明の全長のＰ−セレクチンリガンド蛋白を精製することができる。ついで、界面活性剤抽出物を、固定化Ｐ−セレクチンを含むアフィニティーカラムに通し、０.１％界面活性剤を含有するバッファー中の１０ｍＭ ＥＤＴＡを用いてＰ−セレクチンリガンド蛋白をカラムから溶離することができる。ついで、アフィニティーカラムから溶離した物質を透析してＥＤＴＡを除去し、レンズマメ-Sepharose（登録商標）アフィニティーカラムで精製し、再度.０５Ｍ α−メチル−マンノシドで溶離する。
【００７０】
別法として、市販蛋白濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を濃縮してもよい。濃縮工程後、濃縮物をゲル濾過媒体のごとき精製マトリックスに負荷する。別法として、アニオン交換樹脂、例えば懸垂ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基材を用いることができる。マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは蛋白精製に通常使用される他のタイプのものがある。別法として、カチオン交換工程を用いることができる。適当なカチオン交換体は、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスを包含する。スルホプロピル基が好ましい（例えば、S-Sepharose(登録商標)カラム）。コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−トヨパール（toyopearl）(登録商標)またはCibacrom blue 3GA Sepharose(登録商標)のごときアフィニティー樹脂による、あるいはフェニルエーテル、ブルエーテル、またはプロピルエーテルのごとき樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーによる、あるいは免疫アフィニティークロマトグラフィーによる１またはそれ以上のカラム工程により、培養上清からＰ−セレクチンリガンド蛋白を精製してもよい。
【００７１】
最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば懸垂メチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１またはそれ以上の逆相高品質液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＰＬＣ）工程を用いてさらにＰ−セレクチンリガンド蛋白を精製することができる。いくつかまたはすべての上記精製工程を種々組み合わせて用いて実質的に均一な単離組み換え蛋白を得ることもできる。かくして精製されたＰ−セレクチンリガンド蛋白は他の哺乳動物蛋白を実質的に含まず、本発明により「単離蛋白」と定義される。
【００７２】
単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白は、Ｐ−、Ｅ−またはＬ−セレクチンにより媒介される細胞間付着により特徴づけられる症状の治療において有用でありうる。かかる症状は、心筋梗塞、細菌もしくはウイルス感染、転移性の症状、関節炎のごとき炎症性疾患、痛風、葡萄膜炎、急性呼吸困難症候群、喘息、気腫、晩発型高血圧反応、全身性紅斑狼瘡、火傷もしくはしもやけのごとき熱的傷害、自己免疫性甲状腺炎、実験的なアレルギー性脳脊髄炎、多発性硬化症、外傷後の多発性器官傷害症候群、糖尿病、Reynaud症候群、好中球性皮膚病（Sweet症候群）、炎症性腸症候群、Grave病、糸球体腎炎、歯肉炎、歯周炎、溶血性の尿毒性症候群、潰瘍性大腸炎、Crohn病、壊死性全腸炎、顆粒球輸血関連症候群、サイトカインにより誘導される毒性等を包含する（これらに限らない）。単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白は器官移植にも有用で、移植用に器官を調製すること、および器官移植拒絶反応を抑制することの両方において有用である。したがって、器官切除前にＰ−セレクチンリガンド蛋白を生きた器官ドナーまたは生きていない器官ドナーに投与してもよい。さらに、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をエクスビボで器官保存溶液中のドナーの器官に投与してもよく、レシピエントに融着前、および／またはレシピエントに融着後に投与してもよい。単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を用いて血液透析およびロイコフォレシスの患者を治療してもよい。さらに、単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を抗転移剤として使用してもよい。単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をそれ自体、Ｐ−、Ｅ−またはＬ−セレクチンにより媒介される細胞間付着の阻害剤として用いてもよく、あるいはＰ−、Ｅ−またはＬ−セレクチンにより媒介される細胞間付着の阻害剤を設計するために使用してもよい。本発明は、単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を含有する医薬組成物ならびに単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を用いる治療方法または単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の使用方法を包含する。
【００７３】
細胞から精製された、または組み換え的に製造された単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を医薬上許容される担体と混合して医薬組成物中に用いてもよい。かかる組成物は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白および担体、希釈剤、充填剤、塩類、バッファー、安定化剤、可溶化剤、および当該分野でよく知られた他の物質を含有していてもよい。用語「医薬上許容される」は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない無毒の物質を意味する。担体の特性は投与経路に依存する。本発明医薬組成物は、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、スロンボポイエチン、幹細胞因子、およびエリスロポイエチンのごときサイトカイン、リンホカイン、または他の造血因子を含有していてもよい。医薬組成物はさらに、プラスミノーゲンアクチベーターおよび因子ＶＩＩＩのごとき血栓溶解因子または抗血栓因子を含有していてもよい。医薬組成物はさらに他の抗炎症剤を含有していてもよい。かかるさらなる因子および／または作用剤を医薬組成物に含有させて、単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白との相乗効果を発揮させ、あるいは単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白により引き起こされる副作用を最小化してもよい。逆に、特定のサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解因子または抗血栓因子、または抗炎症剤の処方に単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を含有させて、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解因子または抗血栓因子、または抗炎症剤の副作用を最小化してもよい。
【００７４】
本発明医薬組成物はリポソーム形態であってもよい。リポソーム形態においては、単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白は、水溶液中のミセル、不溶性単層、液状結晶、またはラメラ層として凝集形態となって存在する脂質のごとき両親媒性物質と混合されて、他の医薬上許容される担体とともに存在している。リポソーム処方に適する脂質は、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等を包含するが、これらに限らない。かかるリポソーム処方の調製は当業者のレベル内であり、例えば、米国特許第４２３５８７１号、第４５０１７２８号、第４８３７０２８号および第４７３７３２３号に開示されており、参照によりこれらを本明細書に記載されているものとみなす。
【００７５】
本明細書の用語「治療上有効量」は、医薬組成物または方法の各有効成分の合計量が有意な患者の利益、すなわちＰ−セレクチンまたはＥ−セレクチンにより媒介される細胞付着の治療、治癒、予防または改善、あるいはかかる症状の治療、治癒、予防または改善の速度の増加を示すに十分であることを意味する。単独投与される個々の有効成分について用いる場合、該用語は当該成分のみに関するものである。組み合わせた成分について用いる場合、該用語は、混合して、逐次または同時に投与するかどうかにかかわらず、治療効果を生じる有効成分の合計量に関するものである。
【００７６】
本発明治療方法または使用方法の実施に際して、治療上有効量の単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を、Ｐ−セレクチンにより媒介される疾病状態を有する哺乳動物に投与する。本発明方法に従って単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を単独で、あるいは受容体アンタゴニスト、リガンドアンタゴニスト、サイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子を用いる治療のごとき他の治療とともに投与することができる。１またはそれ以上のサイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子とともに共投与する場合、単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をサイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子、血栓溶解因子または抗血栓因子と同時に、あるいは逐次投与することができる。逐次投与の場合、担当医は他の抗炎症剤、サイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子、血栓溶解因子または抗血栓因子と単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白との適当な順序を決定するであろう。
【００７７】
医薬組成物中に使用される、あるいは本発明方法の実施に用いられる単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の投与を、摂食、吸入、または皮膚、皮下、または静脈注射のごとき種々の慣用的経路で行うことができる。
【００７８】
治療上有効量の単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を経口投与する場合、単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白は錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシルの形態であろう。錠剤形態で投与する場合、本発明医薬組成物はさらにゼラチンのごとき固体担体またはアジュバントを含有してもよい。錠剤、カプセル、および粉末は約５ないし９５％、好ましくは約２５％ないし９０％の単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を含有する。液体形態で投与する場合、水、鉱油、ピーナッツ油、ミネラルオイル、大豆油もしくはゴマ油のごとき動物もしくは植物の油脂、または合成油脂のごとき液体担体を添加してもよい。液体形態の医薬組成物はさらに、生理学的セイライン溶液、ブドウ糖もしくは他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールのごときグリコール類を含有してもよい。液体形態で投与する場合、医薬組成物は約０.５ないし９０重量％、好ましくは約１ないし５０重量％の単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を含む。
【００７９】
治療上有効量の単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を静脈、皮膚または皮下注射により投与する場合、単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白はパイロジェン不含の非経口的に許容される水溶液の形態であろう。かかる非経口的に許容される蛋白溶液の調製は、ｐＨ、等張性、安定性等に関して当該分野の技術の範囲内である。静脈、皮膚、または皮下注射に好ましい医薬組成物は、本発明化合物のほかに、注射用塩化ナトリウム、注射用リンゲル溶液、注射用ブドウ糖および塩化ナトリウム、注射用乳酸加リンゲル溶液のごとき等張性の担体、または当該分野で知られた他の担体を含有すべきである。本発明医薬組成物は安定化剤、保存料、バッファー、抗酸化剤、または当業者に知られた他の添加物を含有していてもよい。
【００８０】
本発明医薬組成物中の単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の量は、治療すべき症状の性質および重さ、ならびに患者の治療前の性質に依存するであろう。最終的には、担当医が個々の患者の治療に用いる単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の量を決定するであろう。最初に、担当医は単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を低用量で投与して患者の応答を観察する。患者に関して最適治療効果が得られるまで、より高用量の単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を投与し、最適効果が得られた時点で用量をもはや増加させない。本発明方法の実施に用いる種々の医薬組成物は、体重１ｋｇあたり約０.１μｇないし約１００ｍｇの単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を含有すべきである。
【００８１】
本発明医薬組成物を用いた静脈注射による治療期間は、治療すべき疾病の重さおよび個々の患者それぞれの潜在的応答に依存するであろう。単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の１回の適用期間は連続静脈投与の場合１２ないし２４時間の範囲であろう。最終的に、担当医が、本発明医薬組成物を用いた静脈注射による適当な治療期間を決定するであろう。
【００８２】
単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を用いて動物を免役して、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白と特異的に反応し、Ｐ−セレクチンにより媒介される細胞付着を阻害するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を得てもよい。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白全体または可溶性成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のごときそのフラグメントを免疫原として用いてかかる抗体を得てもよい。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の小型のフラグメント、例えば下記フラグメントを用いて動物を免疫してもよい。小型フラグメントとしては、例えば、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸５６まで、配列番号：２のアミノ酸１２７からアミノ酸１３８までがある。さらなるペプチド免疫原は配列番号：２のアミノ酸２３８からアミノ酸２４８までを含み、ペプチドのアミノ末端にアラニン残基が付加されたものである。もう１つのペプチド免疫原は、配列番号：２のアミノ酸４３からアミノ酸５６までを含み、位置４６、４８または５１のいずれかまたはすべてにおいて硫酸化チロシンを有するものである。ペプチド免疫源はカルボキシ末端にシステイン残基をさらに含んでいてもよく、キーホールリムペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）のごときハプテンに結合する。かかるペプチドを合成する方法は当該分野において知られており、例えば、R.P.Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85,2149-2154 (1963)；J.L.Krstenansky,et.al.,FEBS Lett.211,10(1987)に記載のごときものがある。
【００８３】
Ｐ−セレクチンリガンド糖蛋白またはＰ−セレクチンリガンド糖蛋白の特徴である複合型炭水化物部分に結合するモノクローナル抗体は、炎症性疾患およびある種の形態の癌の免疫検出用診断薬でありうる。小胞肺癌腫のごときいくつかの癌細胞は検出可能なレベルのＰ−セレクチンリガンド蛋白を発現しうる。癌細胞によるこのＰ−セレクチンリガンド蛋白の異常な発現はこれらの細胞の転移において役割を果たしているかもしれない。
【００８４】
Ｐ−セレクチンリガンド糖蛋白またはＰ−セレクチンリガンド糖蛋白の特徴である複合型炭水化物部分に結合する中和抗体は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の異常発現が関与している炎症性疾患およびある種の形態の癌の治療薬として有用でありうる。これらの中和モノクローナル抗体は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチンにより媒介される細胞間付着機能をブロックしうる。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の結合をブロックすることにより、不適切な炎症部位への白血球の付着が消滅または著しく減少させられる。癌細胞または白血病性細胞の場合、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白に対する中和モノクローナル抗体は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白により媒介されうる癌細胞の転移による蔓延の検出および防止において有用でありうる。さらに、これらの細胞に結合するモノクローナル抗体は、抗体依存性の細胞により媒介される細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関する癌細胞を標的とする可能性があり、よって、癌細胞の除去を助ける。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白と反応するヒト抗体を、ヒト免疫グロブリンをコードする遺伝を生殖細胞系中に含むトランスジェニック動物において産生させてもよい。下記実施例７は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白フラグメントに特異的なウサギポリクローナル抗体の製造を説明する。
【００８５】
本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を用いて、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白と結合しうる、よってＰ−セレクチンまたはＥ−セレクチンにより媒介される細胞間付着の阻害剤として作用しうる作用剤をスクリーニングしてもよい。固定化された、あるいは固定化されていない所望結合蛋白を用いる結合アッセイは当該分野においてよく知られており、本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を用いる目的に使用可能である。適当なスクリーニングアッセイは、下記実施例３および９のような細胞を用いるものであってもよい。別法として、精製蛋白を用いるスクリーニングアッセイを用いてかかる作用剤を同定してもよい。例えば、精製形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白を担体に固定化し、潜在的阻害剤の存在下および不存在下において精製Ｐ−セレクチンへの結合を測定してもよい。別法として、適当な結合アッセイは担体に固定化された精製Ｐ−セレクチンならびに可溶性形態の本発明Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を用いるものであってもよい。
【００８６】
いずれのＰ−セレクチンリガンド蛋白を上記スクリーニングアッセイにおいて使用してもよい。例えば、配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸４０２までの全長Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を用いて阻害剤をスクリーニングしてもよく、あるいは配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸４０２までの成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を用いて阻害剤をスクリーニングしてもよく、あるいは配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸３１０までの可溶性成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を用いて阻害剤をスクリーニングしてもよい。別法として、配列番号：４のアミノ酸１からアミノ酸４１２までのＰ−セレクチンリガンド蛋白、または配列番号：４のアミノ酸４２からアミノ酸４１２までの成熟形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白、または配列番号：４のアミノ酸４２からアミノ酸３２０までの可溶性成熟形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白を用いて、本発明に従って、細胞間付着の阻害剤をスクリーニングしてもよい。
【００８７】
かかるスクリーニングアッセイにおいて、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンとＰ−セレクチンリガンド蛋白とを結合させることにより第１の結合混合物を得て、第１の結合混合物中の結合量（Ｂ０）を測定する。Ｐ−、Ｅ−、またはＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白、ならびにスクリーニングすべき化合物または作用剤を結合させることにより第２の結合混合物を得て、第２の結合混合物中の結合量（Ｂ）を測定する。第１および第２の結合混合物中の結合量を、例えばＢ／Ｂ０を計算することにより比較する。第１の結合混合物中の結合と比較して第２の結合混合物中の結合の減少が観察される場合、化合物または作用剤はＰ−、Ｅ−、またはＬ−セレクチンにより媒介される細胞間付着を阻害しうると考えられる。結合混合物の処方および最適化は当業者のレベル内であり、かかる結合混合物は結合を促進または最適化するバッファーおよび塩類を含んでいてもよく、さらなる対照アッセイを本発明スクリーニングアッセイにおいて行ってもよい。
【００８８】
Ｐ−、Ｅ−、またはＬ−セレクチンに対するＰ−セレクチンリガンド蛋白の結合活性を少なくとも約１０％、好ましくは約５０％以上低下させることがわかった化合物を同定し、ついで、Ｌ−セクレチンへの結合のアッセイおよびインビボアッセイを包含する他のセクレチン結合アッセイにおいて２次スクリーニングしてもよい。これらの手段により、セレクチンにより媒介される細胞間付着に対する阻害活性を有し、抗炎症剤として適当な化合物を同定してもよい。
【実施例１】
【００８９】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白遺伝子のクローニング
Ａ.ＨＬ６０ ｃＤＮＡライブラリーの構築
Ｐ−セレクチンリガンドの発現クローニングのためにＨＬ６０ ｃＤＮＡライブラリーを構築した。Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen; San Diego, CA)を用いてヒトプロミエロサイト細胞系ＨＬ６０（S. J. Collins, et al.,上記文献）からポリＡ＋ＲＮＡを単離した。ポリＡ＋ＲＮＡフラクションから２本鎖ｃＤＮＡを合成し、平滑末端をＥｃｏＲＩアダプター（5'-AATTCCGTCGACTCTAGAG-3', 配列番号：7; 5'-CTCTAGAGTCGACGG-3', 配列番号：8）に連結した。ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼとともにインキュベーションされ、ついで、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼとともにインキュベーションされ、その後精製された発現ベクターｐＭＴ２１（R. Kaufman et al., J. Mol. Cell. Biol. 9, 946-958 (1989)）中にｃＤＮＡを連結した。連結生成物から２μ取ってイー・コリ（E. coli） DH5α細胞中にエレクトロポレーションし、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ 
ＭｇＳＯ４、および２％グリセロールを補足した１ｍｌのＳＯＢ培地（J. Sambrook et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Press, p1.90 (1989)）中、３７℃で１時間増殖させた。ライブラリーを小さい部分に分けるために、細菌懸濁液１ｍｌずつをアンピシリン存在下の寒天プレートに撒き、１ｍｌあたりのコロニー数を計算した。各コロニーが１のｃＤＮＡクローンを有すると仮定すると、６０００００クローンが得られ、１プールあたり約１６０００クローンの部分に分かれた。３８のプールそれぞれを、アンピシリン存在下のＬブロス中で一晩増殖させ、ＣｓＣｌグラジエントによりプラスミドを精製した。
【００９０】
Ｂ.Ｐ−セレクチンリガンド蛋白遺伝子のスクリーニング
第１段階において、実施例４（Ａ）のＬＥＣ−γ１結合アッセイを用いて、ＨＬ６０ ｃＤＮＡライブラリーをパンニングし、そのことにより目的プラスミドを豊富化させた。ＨＬ６０ ｃＤＮＡライブラリープール各６μｇを２μｇの３／４ＦＴ遺伝子（実施例２）とともにＣＨＯ細胞中に同時トランスフェクションした。トランスフェクションから約４５時間後、１ｍＭ ＥＧＴＡ中、３７℃で１５分間細胞をインキュベーションし、ついで、セルリフターでかき取ることによりＣＯＳ細胞をプレートから取った。１ｍＭカルシウムを含有するHanks緩衝化セイライン（ＨＢＳＳ）で細胞を２回洗浄した。細胞を４ｍｌのＨＢＳＳに再懸濁した。懸濁された、トランスフェクションされたＣＯＳ細胞を、実施例４（Ａ）において説明するＬＥＣ−γ１結合アッセイを用いてスクリーニングした。
【００９１】
付着性ＣＯＳ細胞をHirts抽出物（B. Hirts, J. Mol. Biol., 26, 365-369 (1967)）から回収し、ついで、増幅のためにイー・コリ ＤＨ５α細胞中にエレクトロポレーションした。豊富化されたプラスミド集団をＣｓＣｌグラジエントで精製し、３／４ＦＴ遺伝子（実施例２）をＣＯＳ細胞中に再トランスフェクションした。トランスフェクション、スクリーニング、ついで、プラスミド増幅工程を全部で３回繰り返し、ついで、ＬＥＣ−γ１でコーティングされたプレートに結合するプールを視覚的に検出した。その後、陽性プラスミドプールを部分に分けた。これには陽性抽出物からのHirts抽出物のイー・コリＤＨ５α細胞中へのエレクトロポレーション、ついで、上記のごとく１ｍｌあたりのコロニー数の計算を用いた。一定数のコロニーをアンピシリン存在下の寒天プレートに撒くことにより種々のプールサイズが得られた。ニトロセルロースリフトを行い、フィルターを新たな寒天プレート上に置くことにより２系のプレートを調製した。２系のプレートは、陽性であると同定されたプール由来の各コロニーおよびコロニー群を選択するためのリファレンスプレートとして役立った。
【００９２】
クローニングの第２段階において、最初のスクリーニング段階に使用したのと同じ手順により、ＣＯＳ細胞をライブラリーから分けたプールおよび３／４ＦＴ遺伝子を用いて同時トランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、実施例４（Ｂ）の蛍光ＣＨＯ：Ｐ−セレクチンアッセイを用いてトランスフェクションされた細胞をスクリーニングした。上記のごとく、陽性プールをさらに分けて、最後に各コロニーをスクリーニングし、陽性クローンを同定した。この方法を用いて、１個の陽性クローンｐＭＴ２１：ＰＬ８５を得て、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をコードしていることがわかった。ｐＭＴ２１：ＰＬ８５中に含まれるＰ−セレクチンリガンドのＤＮＡ配列を配列番号：１に示し、ｐＭＴ２１：ＰＬ８５によりコードされるＰ−セレクチンリガンド蛋白の結合特性を下記実施例４（Ｃ）において説明する。
【実施例２】
【００９３】
１,３／１,４フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング
ヒト全ゲノムＤＮＡ（Clontech Laboratories）からＰＣＲ手段を用いて１,３／１,４フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（３／４ＦＴ）をクローン化した。センスオリゴヌクレオチドプライマーは遺伝子のＸｂａＩ部位および５'末端を含み（5'-TAGCATACGCTCTAGAGCATGGATCCCCTGGGTGCAGCCAAGC-3', 配列番号：9）、アンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーは遺伝子のＥｃｏＲＩ部位および３'末端を含んでいた（5'-CCGGAATTCTCAGGTGAACCAAGCCGC-3', 配列番号：10）。ＰＣＲ生成物をＸｂａＩ、ついでＥｃｏＲＩで逐次消化し、標準的なゲル精製法により精製した。ついで、ＸｂａＩ、ついでＥｃｏＲＩで逐次消化され、標準的なゲル精製法により精製されたベクターｐＭＴ３Ｓｖ２ＡＤＡ（R. Kaufman, Methods in Enzymology,上記）中にこの遺伝子を連結した。コンピテントＨＢ１０１細胞（Biorad）をこの連結生成物でトランスフェクションし、ついで、アンピシリン存在下の寒天プレートに撒いた。アンピシリン耐性形質転換体のニトロセルロースフィルターリフトを、遺伝子の中央部の５０６〜５３０の領域に対して相捕的な放射性標識オリゴヌクレオチド（5'-AAGTATCTGTCCAGGGCTTCCAGGT-3', 配列番号：11）でプローブした（J. Sambrook et al., 上記）。
【００９４】
２０個の陽性クローンからプラスミドＤＮＡ微量標品を調製した。ついで、精製ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化して正しいサイズのインサートを有する正しいクローンを同定した。ついで、このクローン（ｐＥＡ.３／４ＦＴ）を大スケールまで増殖させ、ＣｓＣｌ密度グラジエントバンド法によりＤＮＡを単離した。下記の細胞−細胞結合アッセイにおいて遺伝子の機能を評価した。ＤＥＡＥデキストラン処理、ＤＭＳＯショック処理、ついでクロロキンインキュベーションを用いてＣＯＳ−１サル細胞（クローンＭ６； M. Horwitz et al., Mol. Appl. Genet., 2：147-149 (1983)）を３／４ＦＴでトランスフェクションした（L. Sompeyrac and K. Dana, Proc. Natl. Acad. Sci. 78：7575-7578 (1981); M. Lopata et al., Nucleic Acids Res., 12：5707-5717 (1984); H. Luthman and G. Magnuson, Nucleic Acids Res., 11：1295-1308 (1983)）。トランスフェクションされたＣＯＳ細胞を懸濁し、Ｅ−セレクチン発現ＣＨＯ細胞系への結合を定量した（G. Larsen et al., J. Biol. Chem., 267：11104-11110 (1992)）。このアッセイにより、３／４ＦＴでトランスフェクションされたＣＯＳ細胞がシアル化Lewisxエピトープを細胞表面に発現しうることが確認された。
【実施例３】
【００９５】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の発現
Ａ.ＬＥＣ１１細胞におけるＰ−セレクチンリガンドの発現
以下のようにして、機能的Ｐ−セレクチンリガンドをＳＬｅｘ陽性チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系ＬＥＣ１１（Campbell, C. and Stanley, P. Cell 35：303-309 (1983)）において発現させた。約８μｇのＰ−セレクチンリガンド遺伝子含有プラスミド８ｐＭＴ２１：ＰＬ８５、実施例１）をＬＥＣ１１細胞中にトランスフェクションした。トランスフェクションから６８時間後、細胞を２.５ｍＭの酪酸ナトリウムで４時間処理した。６−ＣＦＤ標識ＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞結合アッセイ（実施例４、セクションＢにおいて説明）を用いて調べたところ、細胞はＰ−セレクチン付着を誘導することがわかった。対照的に、ＬＥＣ１１細胞単独および対照プラスミドでトランスフェクションされたＬＥＣ１１細胞はいずれもＰ−セレクチン付着を誘導しなかった。
【００９６】
Ｂ.ＣＯＳ細胞における可溶性Ｐ−セレクチンリガンドの発現
８μｇのｐＥＤ.ｓＰＳＬ.Ｔ７（実施例５Ｃ参照）および実施例２の４μｇのｐＥＡ.３／４ＦＴプラスミド、８μｇのｐＥＤ.ｓＰＳＬ.Ｔ７のみ、あるいは８μｇのプラスミドベクター（ｐＭＴ２１）および４μｇのｐＥＡ.３／４ＦＴ遺伝子を用いてＣＯＳ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションから４５時間後、細胞をＰＢＳで２回すすぎ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足した無血清ＤＭＥＭ（フェノールレッド不含）（JRH Biosciences）中、３７℃で一晩インキュベーションした。フッ化フェニルメチルスルホニル、アプロチニンおよびＮａＮ３を添加して最終濃度をそれぞれ１ｍＭ、２μｇ／ｍｌおよび０.０２％とし、ならし培地を遠心分離してすべての残渣を除去した。
【００９７】
免疫沈降実験のために、ＣＯＳ細胞をｐＥＤ.ｓＰＳＬ.Ｔ７およびｐＥＡ.３／４ＦＴで同時トランスフェクションすることにより標識可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を得た。トランスフェクションから４５時間後、ＣＯＳ細胞を２５０μＣｉ／ｍｌの３５Ｓメチオニン（ＮＥＮ）で５時間標識し、培地を集めた。抗Ｔ７抗体との免疫沈降によりｓＰＳＬ.Ｔ７蛋白の発現を確認した。
【００９８】
Ｃ.ＣＯＳ細胞におけるＰＡＣＥにより開裂されたＰ−セレクチンリガンドの発現
ＣＯＳ細胞を実施例５（Ｃ）のｐＥＤ.ｓＰＳＬ.Ｔ７プラスミド、実施例２のｐＥＡ.３／４ＦＴ ｃＤＮＡ、および配列番号：５のＰＡＣＥ ｃＤＮＡを含むプラスミドで同時トランスフェクションした。ｐＥＤ.ｓＰＳＬ.Ｔ７プラスミドおよびｐＥＡ.３／４ＦＴプラスミドのみを用いて対照同時トランスフェクションを並行して行った。４５時間後、これらのトランスフェクションＣＯＳ細胞からのならし培地をプラスチックディッシュ上にコーティングし、ＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞への結合（実施例４）を調べた。ＰＡＣＥとともに同時発現されたＰ−セレクチンリガンドを含む培地でコーティングされたディッシュについては結合したＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞の約２０倍の増加が確認された（ＰＡＣＥとともに同時発現されなかったＰ−セレクチンリガンドを含む培地と比較）。
【００９９】
ＰＡＣＥとともに同時トランスフェクションされた精製ｐＰＳＬ.Ｔ７蛋白のＮ末端のアミノ酸配列決定により、すべてのリガンドがＰＡＣＥコンセンサス部位（配列番号：１のアミノ酸３８〜４１）において開裂されたこが示された。同時トランスフェクションされたＣＯＳ細胞の３５Ｓ−メチオニンでの放射性標識、ついでオートラジオグラフィーを行い、かなりの量のＰ−セレクチンリガンドが両方のトランスフェクションにおいて分泌されたことが示された。
【０１００】
Ｄ.ＣＨＯ細胞におけるＰ−セレクチンリガンド蛋白の発現
以下のようにして、全長形態（アミノ酸１〜４０２）のＰ−セレクチンリガンド蛋白をＣＨＯ（ＤＵＫＸ）細胞系（Urlaub & Chasin, Proc. natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980)）において発現させた。約２５μｇのｐＭＴ２１：ＰＬ８５プラスミドおよび約８μｇのｐＥＤ.３.４ＦＴ（ｐＥＡ３／４ＦＴをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで制限的に消化し、得られたフラグメントをｐＥＤプラスミドに挿入することにより得た）を、リン酸カルシウム法を用いてＣＨＯ（ＤＵＫＸ）細胞中に同時トランスフェクションした。トランスフェクション体をメトトレキセート耐性に関して選択した。２週間後、抗ＳＬｅｘ抗体（ＣＳＬＥＸ−１,米国特許第４７５２５６９号）およびヤギ赤血球（ｓＲＢＣ）の抱合体（クロミッククロリド法（Goding, J. W., J. Immunol. Methods 10：61-66 (1976)）により調製）を用いることにより、下記のごとく個々のコロニーをＳＬｅｘ発現についてスクリーニングした。洗液が透明になるまで、ｓＲＢＣを０.１５Ｍ ＮａＣｌで洗浄し、ついで、ｓＲＢＣ５０％懸濁液を０.１５Ｍ ＮａＣｌ中に調製した。５０μｇのＣＳＬＥＸ−１を含有する０.２ｍｌのｓＲＢＣ懸濁液に１ｍｌの０.０１％クロミッククロリド溶液を滴下し、その間ボルテックスで撹拌した。３７℃で３０分インキュベーション後、１０ｍｌのリン酸塩緩衝化セイライン（ＰＢＳ）溶液を反応物に添加した。抱合体を
ＰＢＳで１回洗浄し、ついで、１０ｍｌのＰＢＳに懸濁した。トランスフェクションを入れたプレートをＰＢＳで洗浄し、ついで、３ｍｌのＰＢＳおよび１ｍｌのｓＲＢＣ／ＣＳＬＥＸ−１抱合体を各プレートに添加した。陽性コロニーはトランスルミネーターで赤色を呈し、これらを、１０％ウシ胎児血清含有アルファ培地中に拾った。２週間後、コロニーをステップワイズ増幅（２、１０、２５、１００、１５０ｎＭの濃度のメトトレキセートを用いる）に供した。得られた安定な細胞系をＣＤ−ＰＳＧＬ−１（Ｒ３.４）と命名した。実施例７（Ａ）のポリクローナル抗Ｐ−セレクチンリガンド蛋白抗体を用いる免疫沈降研究によりＰ−セレクチンリガンド蛋白の発現を確認した。ＣＤ−ＰＳＧＬ−１（Ｒ３.４）細胞系により産生されるＰ−セレクチンリガンド蛋白の機能を、実施例４（Ａ）のごとくＬＥＣ−γ１への結合についてトランスフェクション体をアッセイすることにより試験した。
【０１０１】
アデノシンデアミナーゼ選択（Kaufman, et al., PNAS (USA) 83:3136-3140 (1986)）の下で、配列番号：５に示すＰＡＣＥをコードするｃＤＮＡをすでに発現している安定なＣＨＯ−ＰＡＣＥ系においてｓＰＳＬ.Ｔ７蛋白を発現させた。リン酸カルシウム法を用いてｐｓＰＳＬ.Ｔ７（２５μｇ）およびｐＥＤ.３／４ＦＴ（８μｇ）をＣＨＯ−ＰＡＣＥ細胞中に同時トランスフェクションした。メトトレキセート耐性に関してトランスフェクション体を選択し、ｓＲＢＣ／ＣＳＬＥＸ−１抱合体に結合する個々のコロニーを拾った。２週間培養後、コロニーを上記ステップワイズ増幅に供した。得られた安定な細胞系をＣＰ／ＰＳＬ−Ｔ７（Ｒ４.１）と命名した。Ｔ７特異的モノクローナル抗体または実施例４（Ａ）のＬＥＣ−γ１キメラのいずれかを用いる標準的な免疫沈降法によりｐＰＳＬ.Ｔ７蛋白の発現を確認した。同様のやり方で、ｐＭＴ２１：ＰＬ８５およびｐＥＤ.３／４ＦＴをＣＨＯ−ＰＡＣＥｃ系に同時トランスフェクションすることにより成熟全長形態（アミノ酸４２〜４０２）のＰ−セレクチンリガンド蛋白発現する安定な細胞系を得た。
【０１０２】
実施例５（Ｂ）のｓＰＳＬ.Ｑ蛋白および実施例５（Ｄ）のｓＰＳＬ.Ｆｃ蛋白を発現する安定な細胞系を以下のようにして構築した。プラスミドｐＥＤ.ｓＰＳＬ.Ｑ（２５μｇ）またはｐＥＤ.ｓＰＳＬ.Ｆｃ（２５μｇ）を、上記の約２５μｇのｐＥＤ.３／４ＦＴプラスミドおよび配列番号：５のＰＡＣＥ ｃＤＮＡとネオマイシン耐性遺伝子を含む約２０μｇのプラスミドとともに、リン酸カルシウム法を用いてＣＨＯ（ＤＵＫＸ）細胞中に同時トランスフェクションした。トランスフェクション体をメトトレキセートおよびＧ４１８抗生物質耐性に関して選択した。約２週間後、ｓＲＢＣ／ＣＳＬＥＸ−１抱合体結合を用いて個々のコロニーをＳＬＥｘ発現についてスクリーニングした。陽性コロニーを、１ｍｇ／ｍｌの濃度のＧ４１８培地中に拾った。２〜３週間培養後、細胞をステップワイズメトトレキセート増幅させて選択した。得られた安定な細胞系をＣＤ−ｓＰＳＬ.Ｑ（Ｒ８.２）およびＣＤ−ｓＰＳＬ.Ｆｃ（Ｒ８.１）と命名した。ｓＰＳＬ.ＱおよびｓＰＳＬ.Ｆｃ蛋白の発現を、実施例７（Ａ）の抗Ｐ−セレクチンリガンド蛋白ポリクローナル抗体を用いる標準的な免疫沈降法により確認した。
【実施例４】
【０１０３】
Ｐ−セレクチンにより媒介される細胞間付着のアッセイ
Ａ.ＬＥＣ−γ１結合アッセイ
キメラ形態のヒトＩｇＧγ１（ＬＥＣ−γ１）のＦｃ部分に抱合したＰ−セレクチンをコードするＤＮＡを、既知方法（Aruffo et al. Cell 67, 35-44 (1991)）を用いて構築し、高レベルのキメラＬＥＣ−γ１蛋白の発現に関してｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中に安定にトランスフェクションし、下記結合アッセイに使用するためにキメラＬＥＣ−γ１蛋白を精製した。
【０１０４】
ペトリ皿を、まず、ポリクローナル抗ヒトＩｇＧγ１ Ｆｃ抗体でコーティングし、ついで、ＬＥＣ−γ１蛋白でコーティングした。この方法は、キメラ分子のＰ−セレクチン部分がプレート表面に存在するようにＬＥＣ−γ１構築物を配向させる。カルシウムの存在下および不存在下において、配向ＬＥＣ−γ１へのＨＬ６０の付着を定量した。ＨＬ６０付着はカルシウム依存的であることが示され、キメラ分子がＨＬ６０細胞上のそのリガンドへのＰ−セレクチンの結合機能を保持していることが示された。さらに配向ＬＥＣ−γ１へのＨＬ６０細胞の結合は、Ｐ−セレクチンに対する中和モノクローナル抗体によりブロックされることも示され、Ｐ−セレクチン結合の特異性が示された。
【０１０５】
Ｂ.蛍光ＣＨＯ−Ｐ−セレクチン結合アッセイ
当該アッセイには、Ｐ−セレクチンリガンド遺伝子および３／４ＦＴ遺伝子で同時トランスフェクションされたＣＯＳ細胞表面に結合し、クラスターを形成しうる蛍光標識ＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞系（Laesen et al., J. Biol. Chem., 267, 11104-11110 (1992)）を用いた。ＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞を１％ウシ胎児血清含有ＤＭＥ中１.５ｘ１０６個／ｍｌとなるよう懸濁し、６−カルボキシフルオレセイン二酢酸（６−ＣＦＤ）を最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるよう添加することにより標識した。３７℃で１５分インキュベーション後、細胞を培地で洗浄し、１ｘ１０５個／ｍｌとなるよう再懸濁した。洗浄されたＣＯＳトランスフェクション体の入ったアッセイすべき各プレートに標識細胞５ｍｌを添加し、室温で１０分間インキュベーションした。培地で４回洗浄することにより非付着細胞除去した。ついで、付着ＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞のロゼットを求めて蛍光顕微鏡でプレートをスキャンした。
【０１０６】
Ｃ.放射性標識ＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞を用いる定量的付着アッセイ
スクリーニングの最初の段階に用いたのと同じ手順により、実施例１のｐＭＴ２１：ＰＬ８５プラスミドおよび実施例２のｐＥＡ.３／４ＦＴプラスミドでＣＯＳ細胞を同時トランスフェクションした。対照として、ＣＯＳ細胞をｐＭＴ２１：ＰＬ８５のみ、あるいはｐＥＡ.３／４ＦＴのみ、あるいはインサートを含まない同様のプラスミド（「模擬」）でトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、トランスフェクション細胞をトリプシン処理し、Costar６ウェル組織培養プレート中に分配した。既知方法を用いてＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞を３Ｈ−チミジンで１６時間標識し、ついで、１％ ＢＳＡを含有するα培地（対照）；１％ ＢＳＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび５ｍＭ ＥＧＴＡを含有するα培地；１％ ＢＳＡおよび１０μｇ／ｍｌの中和抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体を含有するα培地；ならびに１％ ＢＳＡおよび非中和抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体を含有するα培地中、１ｘ１０６／ｍｌとして個４℃で３０分プレインキュベーションした。ついで、プレインキュベーションした細胞をトランスフェクションしたＣＯＳ細胞を含むウェルに添加した。インキュベーションから１０分後、培地を４回注入することにより未結合細胞を除去した。トリプシン処理により結合ＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞を遊離させ、シンチレーションカウンティングにより定量した。
【０１０７】
Ｐ−セレクチンリガンドおよび３／４ＦＴで同時トランスフェクションされたＣＯＳ細胞は、ＣＯＳ模擬細胞と比較して５.４倍のＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞結合を誘導した。ＥＧＴＡおよびＥＤＴＡ存在下でのアッセイは、模擬トランスフェクションＣＯＳ細胞の結合レベルが低下した。同様に、中和抗Ｐ−セレクチン抗体とのインキュベーションによっても特異的結合が減少し、非中和抗体は効果がなかった。対照的に、Ｐ−セレクチンのみでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞へのＣＨＯ：Ｐ−セレクチンの結合は、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの存在下または不存在下の両方において、模擬トランスフェクションＣＯＳ細胞への結合と統計学的に相異はなかった。３／４ＦＴのみでトランスフェクションされたＣＯＳ細胞へのＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞の結合は、模擬トランスフェクションＣＯＳに対する結合よりも約２倍促進されたが、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの存在または不存在によっては影響されなかった。
【実施例５】
【０１０８】
可溶性Ｐ−セレクチンリガンドの構築
実施例１においてＨＬ６０細部からのｃＤＮＡライブラリーの製造に用いた
ＥｃｏＲＩアダプターはＸｂａＩ制限部位（ＴＣＴＡＧＡ）を配列番号：１の開始５'側に有し、それはｐＭＴ２１：ＰＬ８５プラスミド中にも存在する。可溶性形態のＰＳＬを得るために、ｐＭＴ２１：ＰＬ８５プラスミドをＸｂａＩおよびＨｉｎｃＩＩ（配列番号：１のヌクレオチド９４４の後ろを開裂）で制限消化した。かくして約９５０ｂｐのフラグメントが得られ、それはバリン２９５のコドンを含め、バリン２９５までのコードされるリガンドの細胞外セグメント全体を含んでいた。これを単離し、下記セクションＡからＤまでに示すようにして、可溶性形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白をコードするＤＮＡを得るために使用した。
【０１０９】
Ａ.ｐｓＰＳＬ.ＱＣの構築
フラグメントを精製し、Ａｓｎ２９６からＣｙｓ３１０までのコドンが再生成され、Ｃｙｓ３１０の直後に新たなストップコドンを導入された２本鎖合成オリゴヌクレオチドＤＮＡとともに、哺乳動物発現ベクターｐＥＤのＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ部位間に連結した。当該オリゴヌクレオチドの配列は以下のごとし：
5'-AACTACCCAGTGGGAGCACCAGACCACATCTCTGTGAAGCAGTGCTAG (配列番号：12)
5'-AATTCTAGCACTGCTTCACAGAGATGTGGTCTGGTGCTCCCACTGGGTAGTT (配列番号：13)
得られたプラスミドをｐＥＤ.ｓＰＳＬ.ＱＣと命名し、そのプラスミドから発現される蛋白をｓＰＳＬ.ＱＣと命名した。
【０１１０】
Ｂ.ｐｓＰＳＬ.Ｑの構築
フラグメントを精製し、Ａｓｎ２９６からＧｌｎ３０９までのコドンが再生成され、Ｇｌｎ３０９の直後に新たなストップコドンを導入された２本鎖合成オリゴヌクレオチドＤＮＡとともに、ｐＥＤプラスミド（Kaufman et al., 1991）のＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ部位間に連結した。オリゴヌクレオチドの配列は以下のごとし：
5'-AACTACCCAGTGGGAGCACCAGACCACATCTCTGTGAAGCAGTAG (配列番号：14)
5'-AATTCTACTGCTTCACAGAGATGTGGTCTGGTGCTCCCACTGGGTAGTT (配列番号：15)
得られたプラスミドをｐＥＤ.ｓＰＳＬ.Ｑと命名し、そのプラスミドから発現される蛋白をｓＰＳＬ.Ｑと命名した。
【０１１１】
Ｃ.ｐｓＰＳＬ.Ｔ７の構築
ファージＴ７大カプシド蛋白由来のエピトープを含む１４個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、さらにベクター配列由来の３２個のアミノ酸を用いてエピトープ「タグ」をＣ末端に融合させた。２つのオリゴヌクレオチドは下記配列：
5'-CTAGACCCGGGATGGCATCCATGACAGGAGGACAACAAATGGTAGGCCGTAG (配列番号：16) および 
5'-AATTCTACGGCCTACCCATTTGTTGTCCTCCTGTCATGGATGCCATCCCGGGT (配列番号：17)
を有し、それらを２本鎖化し、哺乳動物発現プラスミドｐＥＤの大ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントと連結した。得られたプラスミドｐＥＤ.Ｔ７をＸｂａＩおよびＳｍａＩで制限消化し、上記９５０ｂｐのＸｂａＩ−ＨｉｎｃＩＩフラグメントに連結し、プラスミドｐＥＤ.ｓＰＳＬ.Ｔ７を得た。
【０１１２】
ｐＥＤ.ｓＰＳＬ.Ｔ７の発現により得られる蛋白をｓＰＳＬ.Ｔ７と命名した。
【０１１３】
Ｄ.可溶性Ｐ−セレクチンリガンド−ＩｇＧＦｃキメラの構築
ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ部分に融合した可溶性の細胞外形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白をコードするプラスミドＤＮＡを以下のようにして構築した。哺乳動物発現ベクターｐＥＤ.Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードする配列を含み、該配列はユニークなＸｂａＩ制限部位を介してヒンジ領域へのコーディング配列のアミノ末端の融合を可能にする新規リンカー配列を伴っている。３つのフラグメントの連結を行った。ｐＥＤ.ＦｃをＸｂａＩで制限消化し、直鎖状にしてゲル精製した。上記ｐＭＴ２１：ＰＬ８５由来の９５０ｂｐのフラグメントは第２のフラグメントを含んでいた。第３のフラグメントは、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＤＮＡからなっていた。
5' - CTGCGGCCGCAGT (配列番号：18)
5' - CTAGACTGCGGCCGCAG (配列番号：19)
【０１１４】
連結生成物をプラスミドＤＮＡとして増幅し、正しい配置を有する個々のクローンをＤＮＡ配列決定により同定した。プラスミドをｐＥＤ.ＰＳＬ.Ｆｃと命名した。得られた可溶性Ｐ−セレクチンリガンド／Ｆｃ融合蛋白のＤＮＡコーディング領域を配列番号：６に示す。
【実施例６】
【０１１５】
発現されたＰ−セレクチンリガンドの特徴付け
Ａ.ＣＯＳ細胞上に発現された全長Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の結合特性
実施例２のｐＥＡ.３／４ＦＴプラスミドおよび実施例１のｐＭＴ２１：ＰＬ８５プラスミドでのＣＯＳ細胞の同時トランスフェクションにより、ＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞に特異的に結合するＣＯＳ細胞を得る。この結合は、ｐＥＡ.３／４ＦＴおよびｐＭＴ２１：ＰＬ８５で同時トランスフェクションした場合にのみ観察される。いずれかのプラスミドのみの使用はＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞に結合しないＣＨＯ細胞を生じる。Ｐ−セレクチンを発現しない親のＣＨＯ（ＤＵＫＸ）細胞系およびｐＥＡ.３／４ＦＴおよびｐＭＴ２１：ＰＬ８５で同時トランスフェクションされたＣＯＳ細胞の間には結合は観察されない。同時トランスフェクション細胞およびＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞の間の結合は、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡのごとき２価イオンのキレーターに対して感受性があり、Ｐ−セレクチンにより媒介される細胞付着のＣａ＋＋依存性と矛盾しない。中和抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体は、ＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞とｐＥＡ.３／４ＦＴおよびｐＭＴ２１：ＰＬ８５で同時トランスフェクションされたＣＨＯ細胞との間の結合をブロックしたが、非中和抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体は結合に影響しなかった。抗体の結果は、ＣＯＳ細胞表面に発現されるＰ−セレクチンリガンド蛋白への結合にはＰ−セレクチンの機能的ドメインが必要であることを示す。
【０１１６】
Ｂ.ＣＯＳ細胞において発現された全長Ｐ−セレクチンリガンドの電気泳動特性
同時トランスフェクションＣＯＳ細胞の界面活性剤抽出物を以下のようにして調製した。同時トランスフェクションから４５時間後、約１.５ｘ１０７個の細胞を５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭピペラジン−Ｎ,Ｎ'−ビス［２−エタンスルホン酸］（ＰＩＰＥＳ）ｐＨ７.５、１００ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭベンズアミジン、０.５μｇ／ｍｌロイペプチン、０.７５μｇ／ｍｌペプスタチン、１ｍＭエチレンジアミン、および１μｇ／ｍｌアプロチニン）に懸濁した。低速遠心分離（５００ｘｇ、１０分）により細胞残渣を除去し、超遠心（１０００００ｘｇ、６０分）により膜フラクションを集めた。高速遠心分離により得た膜ペレットを抽出バッファー（１０ｍＭ ３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）ｐＨ７.５、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.０２％ ＮａＮ３、１％ Thesit(登録商標)(Sigma),１ｍＭベンズアミジン、０.５μｇ／ｍｌロイペプチン、０.７５μｇ／ｍｌペプスタチン、１ｍＭエチレンジアミン、および１μｇ／ｍｌアプロチニン）に再懸濁した。ついで、以下のようにして試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ニトロセルロースブロットに移した。界面活性剤抽出物の一部を１％ ＳＤＳローディングバッファーに懸濁し、１００℃で５分間加熱し、ついで、８〜１６％ポリアクリルアミドゲル（還元的）または６％ゲル（非還元的）にロードし、Laemmliバッファー系中で泳動した。Immobilon-P(登録商標)トランスファー膜を用いてブロットを調製した。ブロットを１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７.５、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.０２％ ＮａＮ３、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、および１０％脱脂乳に、４℃で一晩浸した。ブロットを上記バッファー（乳不含）で１回すすぎ、ブロティングバッファー（１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７.５、０.１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ウシ血清アルブミン、０.０５％ Thesit、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２）中、室温で３０分インキュベーションした。
【０１１７】
ついで、下記のごとくブロットをＰ−セレクチンリガンドを求めてプローブした。５０ｎｇのＰ−セレクチン／Ｆｃキメラを、３μＣｉの１２５Ｉ−プロテインＡとともにブロッティングバッファー中室温で３０分インキュベーションした。この時点で、さらなる賦形剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、モノクローナル抗体）をプレインキュベーション混合物に添加して、Ｐ−セレクチンリガンドへのキメラの結合の対する影響を評価することができる。ついで、プレインキュベーションされた混合物をブロットとともに室温で６０分インキュベーションし、ついで、ブロットを同じブロッティングバッファー（ウシ血清アルブミン不含）で４回洗浄し、風乾し、ついで、−７０℃でオートラジオグラフを行った。
【０１１８】
非還元条件下において、同時トランスフェクションＣＯＳ細胞から調製した膜抽出物に関してこの方法により２つのバンドが観察された。主要バンドは約２２０ｋＤの分子量のところまで移動したが、マイナーバンドは１１０ｋＤのところまで移動した。還元条件下においては、約１１０ｋＤの分子量のただ１つのバンドが観察され、非還元条件下ではＰ−セレクチンリガンドはホモダイマーとして存在することが示された。還元されたモノマーの大体の分子量は、ｃＤＮＡクローンの推定アミノ酸配列から予想されるもの（４５ｋＤ）よりも大きく、発現された蛋白がさらなる翻訳後修飾を受けたことが示される（実施例６（Ｃ）参照）。非特異的ＩｇＧ１プローブがブロット上にバンドを生じないことにより、Ｐ−セレクチン／Ｆｃキメラの特異性を確認した。さらに、Ｐ−セレクチン／Ｆｃキメラのブロットへの結合は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、および中和抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体によって消滅した。ｐＥＡ.３／４ＦＴおよびｐＭＴ：ＰＬ８５プラスミドで同時トランスフェクションされたＣＯＳ細胞の膜抽出物からのみ、ブロット上の特異的バンドが観察された。対照トランスフェクション体（ｐＥＡ.３／４ＦＴまたはｐＭＴ２１：ＰＬ８５）からの膜抽出物はブロット上にバンドを生じなかった。
【０１１９】
Ｃ.Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の糖鎖付加
組み換えＰ−セレクチンリガンド上に共有結合した炭水化物の存在およびＰ−セレクチンへの結合におけるその役割を以下のようにして調べた。実施例５（Ｃ）のｐＥＤ.ｓＰＳＬ.Ｔ７および実施例２のｐＥＡ.３／４ＦＴプラスミドでＣＯＳ細胞を同時トランスフェクションした。４８時間後、細胞に３５Ｓ−メチオニンのパルスを与えた。２００μｌの３５Ｓメチオニン標識ｓＰＳＬ.Ｔ７ならし培地を５μｇのＬＥＣ−γ１とともに、２ｍＭ ＣａＣｌ２および１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下でインキュベーションした。４℃で２時間回転撹拌した後、プロテインＡ−Sepharoseビーズ（Pharmacia）を４℃において１時間かけて添加し、遠心分離によりペレット化させ、２ｍＭ ＣａＣｌ２および１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含有するＴｒｉｓ緩衝化セイライン（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７.５、以下ＴＢＳという）で２回洗浄した。ついで、ペレットを再懸濁し、ノイラミニダーゼ（Streptococcus pneumoniae）、Ｏ−グリカナーゼ、およびＮ−グリカナーゼ（すべてGenzymeから得た）で以下のようにして処理した。すべてのグリコシダーゼ消化を３７℃で一晩行った。ノイラミニダーゼ消化には、ペレットを５０μｌの２−（モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファー,ｐＨ６.５（Calbiochem）および０.１％ ＳＤＳ中に再懸濁し、９５℃で５分間加熱し、ついで、ペレット化させた。上清を、１.４％ ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰ）、１０ｍＭ酢酸カルシウム、２０ｍＭカコジル酸ナトリウムおよび２.５ｍＭ ＰＭＳＦを含むようにし、最終ｐＨ７.０とした。８μｌのノイラミニダーゼを添加して最終濃度１ユニット／ｍｌとした。ノイラミニダーゼ／Ｏ−グリカナーゼ消化には、試料をノイラミニダーゼとともに上記のごとく調製し、さらにＯ−グリカナーゼを添加して最終濃度０.１ユニット／ｍｌとした。Ｎ−グリカナーゼ消化には、ペレットを５４μｌのＭＥＳバッファーおよび１％ ＳＤＳに再懸濁し、９５℃で５分間加熱し、ついでペレット化させた。上清を、０.２Ｍリン酸ナトリウム、３.５％ ＯＧＰ、および２.５ｍＭ ＰＭＳＦを含むようにし、最終ｐＨを８.５とした。Ｎ−グリカナーゼを添加して最終濃度１２ユニット／ｍｌとし、上記のごとくインキュベーションした。
【０１２０】
ｓＰＳＬ.Ｔ７に対するグリコシダーゼ処理の影響を２とおりのやり方で評価した。これを行うために、各消化蛋白試料を２つの等しいフラクションに分けた。一方のフラクションを、実施例７（Ａ）のＰ−セレクチンポリクローナル抗体を用いて沈降させて電気泳動度に対する消化の影響を示した。他方のフラクションを、実施例４（Ａ）のＬＥＣ−γ１キメラを用いて沈降させて消化後に残存するＰ−セレクチンリガンド結合活性を評価した。免疫沈降した試料を、還元的条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより分析した。
【０１２１】
グリコシダーゼ処理なしの場合、オートラジオグラフィーは各沈降物に対応するバンド（分子量１１０ｋＤ）を示した。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をノイラミニダーゼで処理した場合、抗Ｐ−セレクチンリガンドポリクローナル抗体沈降物は泳動度がわずかに減少し、シアル酸除去の除去と矛盾しなかった。ＬＥＣ−γ１により沈降したＰ−セレクチンリガンド蛋白の量はノイラミニダーゼ処理後に有意に減少し、Ｐ−セレクチン／Ｐ−セレクチンリガンド相互作用におけるシアル酸残基の役割と矛盾しなかった。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白をノイラミニダーゼおよびＯ−グリカナーゼの両方で処理した場合、抗Ｐ−セレクチンリガンドポリクローナル抗体との沈降後に電気泳動度の実質的な増加が観察され、多くのＯ−結合オリゴサッカライド鎖が除去されたことが示された。しかしながら、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白からのＯ−結合オリゴサッカライドの除去が不完全であるかもしれない。なぜなら、電気泳動度が分子量３８ｋＤの蛋白（配列番号：１のアミノ酸配列から推定）に対応しなかったからである。ノイラミニダーゼ／Ｏ−グリカナーゼは、ＬＥＣ−γ１に結合したＰ−セレクチンリガンド蛋白をわずかしか消化せず、さらに、Ｐ−セレクチン／Ｐ−セレクチンリガンド相互作用におけるオリゴサッカライドの役割が示された。Ｎ−グリカナーゼで精製Ｐ−セレクチンリガンドを処理すると電気泳動度がわずかに増加し、Ｎ−結合糖鎖付加に関するいくつかのコンセンサス部位が占領されていることが示された。ＬＥＣ−γ１により沈降したＰ−セレクチンリガンド蛋白の量はわずかに減少し、Ｎ−結合糖鎖付加もＰ−セレクチン／Ｐ−セレクチンリガンド相互作用に関与しているが、シアル化およびＯ−結合糖鎖付加のような劇的なものではないことが示された。
【実施例７】
【０１２２】
Ｐ−セレクチンリガンドに特異的なポリクローナル抗体
Ａ.ポリクローナルウサギ抗Ｐ−セレクチンリガンド蛋白／マルトース結合蛋白融合蛋白
イー・コリにおいて得られた融合蛋白でウサギを免疫することにより抗Ｐ−セレクチンリガンドポリクローナル抗体を得た。融合蛋白は、Ｐ−セレクチンリガンドのアミノ末端側１／３（配列番号：１のアミノ酸１から１１０まで）がイン・フレームでマルトース結合蛋白に融合している（Maina, C. V. et al., Gene 74, 365-373 (1988); Riggs, P., in Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausbel et al., Eds., Greene Associates/Wiley Interscience (New York, 1990) chapter 16.6）。ここに用いた条件下において、融合蛋白抗体はＰ−セレクチンリガンド蛋白を認識する。
【０１２３】
Ｂ.ポリクローナルウサギ抗ｓＰＳＬ.Ｔ７蛋白
下記スキームに従って、可溶性形態の本発明蛋白（ｓＰＳＬ.Ｔ７；実施例５（Ｃ）参照）を見かけ上均一にまで精製した。ＣＯＳ細胞を３つのプラスミド（それぞれｓＰＳＬ.Ｔ７（実施例５（Ｃ））、３／４ＦＴ（実施例２）および可溶性形態のＰＡＣＥ（配列番号：５に示す）をコードしている）でトランスフェクションした。７２時間後、ならし培地を集め、組み換えｓＰＳＬ.Ｔ７を以下のようにして精製した。
【０１２４】
ならし培地を５０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０.５ｍＭ ＣａＣｌ２および０.５ｍＭ ＭｎＣｌ２,ｐＨ７.２で２倍に希釈し、同じバッファーで平衡化しておいたレンズマメ−Sepharose 4Bカラムに負荷した。負荷後、２８０ｎｍの吸光度が安定なベースラインまで低下するまでカラムを同じバッファーで洗浄した。ついで、カラムを、０.５Ｍ α−メチル−マンノシドおよび０.３Ｍ ＮａＣｌに調節した同じバッファーで溶離した。カラムの５〜１５倍体積のこの溶離バッファー中に組み換えｓＰＳＬ.Ｔ７を集めた。ついで、レンズマメレクチン溶離物を、４℃においてカラム溶離物１リットルあたり４７２ｇの硫酸アンモニウムを添加することにより０〜７０％硫酸アンモニウム沈殿させた。３０分撹拌後、沈殿を最小量のＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７.５）に再懸濁し、ＴＢＳで平衡化したＴＳＫ Ｇ４０００ＳＷＸＬゲル濾過カラムに負荷した。カラム流速０.５ｍｌ／分とし、ガードカラムを使用した。再懸濁硫酸アンモニウムペレットを２５０μｌ未満の部分試料としてカラムに注入し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン分析によりフラクションを分析した。ｓＰＳＬ.Ｔ７含有フラクションをプールし、ついで、ウサギの免疫に使用した。
【０１２５】
抗原プライミングおよびその後のブーストにより３カ月にわたって標準的方法でｓＰＳＬ.Ｔ７に対する抗体を得た。詳細には、５０μｇのｓＰＳＬ.Ｔ７（０.１％ ＳＤＳ中に混合し、１００℃で１０分加熱することにより変性）を完全フロイントのアジュバントと混合し、５カ所に皮下注射することにより最初の免疫を行った。２５μｇのｓＰＳＬ.Ｔ７（０.１％ ＳＤＳ中に混合し、１００℃で１０分加熱することにより変性）［３回目およびそれ以後のブーストには１２.５μｇ］を不完全フロイントのアジュバントと混合し、２カ所に皮下注射することにより（あるいは後に筋肉内注射）２回目以降のブースト（すべて皮下注射）を行った（２週間ごとに注射）。２週間ごとに試験採血を行って抗体力価をモニターした。抗体力価が適当なレベルに達したら、大量採血を行い、全血清フラクションを調製した。このポリクローナル抗体調合物を用いて、実施例４記載の方法と同様の方法で、ＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞へのＨＬ６０細胞の特異的結合を阻害した。
【０１２６】
このアッセイには、マイクロタイタープレートの底に撒かれたＣＨＯ細胞に結合した蛍光標識ＨＬ６０細胞（ＢＣＥＣＦＡＭ；２',７'−ビス−（２−カルボキシメチル）−５−（および−６）−カルボキシフルイレセイン,アセトキシメチルエステルで標識）を使用した。標識ＨＬ６０細胞を、ポリクローナル抗体含有血清または免疫前の血清のいずれかとともに４℃で３０分プレインキュベーションした。次いで、細胞を洗浄し、ＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞とともに１０分間インキュベーションした。ついで、プレートを洗浄し、蛍光マイクロタイタープレートリーダーを用いて蛍光を読んだ。このアッセイを用いると、１：１５希釈の抗−ｓＰＳＬ.Ｔ７ポリクローナル血清はＣＨＯ：Ｐ−セレクチンへのＨＬ６０細胞の結合を本質的に完全に阻害した。１：１５０の抗血清希釈ではＣＨＯ：Ｐ−セレクチンへのＨＬ６０細胞の結合がまだ示された。免疫前の血清はＣＨＯ：Ｐ−セレクチンへのＨＬ６０細胞の結合に影響しなかった。
【実施例８】
【０１２７】
コア２との同時形質転換
Ａ.コア２ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡの単離
コア２ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼをコードしているｃＤＮＡを、標準的な生物学的方法により単離した。公表されているヒトコア２配列（Bierhuizen, M. F. A., Fukuda, M., Proc. natl. Acad. Sci. 89, 9326-9330 (1992)）に基づいて５'および３'末端における２つのオリゴヌクレオチドを設計した。ＨＬ６０ ｃＤＮＡライブラリーのプール（Sako, D., Cell 75, 1179-1186 (1993)）を鋳型として用いて、標準的ＰＣＲプロトコールによりコア２コーディング配列を増幅した。ＰＣＲ増幅されたフラグメントを精製し、ｐＥＤベクター中にサブクローンした。ｃＤＮＡを単離するために、ＰＣＲ反応において陽性のシグナルを発したプールをイー・コリ中に形質転換し、プレートに撒いた。形質転換体をニトロセルロースフィルター上に移し、標準的プロトコールに従って３２Ｐ放射性標識ＰＣＲフラグメントとハイブリダイゼーションさせた。溶液クローンを拾い、再度プレートに撒くことにより精製した。ｃＤＮＡおよびＰＣＲクローンの配列をジデオキシ配列決定により確認した。
【０１２８】
Ｂ.コア２酵素を発現する安定なＰＳＧＬ−１チャイニーズハムスター卵巣細胞系の取得
実施例３に従って作成した、全長のＰ−セレクチンリガンド蛋白および３／４ＦＴフコシルトランスフェラーゼを発現する細胞系を、リン酸カルシウム法により、コア２ ｃＤＮＡおよびネオマイシン耐性遺伝子（ｐＭＴ４Ｎｅｏ）で同時トランスフェクションした。約２週間後、安定なＧ４１８耐性トランスフェクション体を単一単離体としてあるいはプールとして拾った。これらのトランスフェクション体を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８含有完全ＤＭＥＭ培地中で増殖させ、コア２酵素活性につき分析した（Higgins, E. A., et al., J. Biol. Chem. 266, 6280-6290 (1991)）。コア２活性に関して陽性のコロニーまたはプールを、種々の方法によりＰ−セレクチンへのＰ−セレクチンリガンド結合に関して分析した。同様の方法で、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を発現する、あるいは３／４フコシルトランスフェラーゼおよびＰＡＣＥ酵素の両方とともに可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を発現する細胞系（実施例３参照）を用いて、上記のごとく安定なコア２の同時トランスフェクション体を単離した。
【０１２９】
Ｃ.Ｐ−セレクチン結合活性に対するコア２の影響
Ｐ−セレクチン結合活性に対するコア２の影響を、３つの異なる方法により評価した。
【０１３０】
１.固定化可溶性Ｐ−セレクチンまたはＰ−セレクチン／ＩｇＧキメラへのｍＰＳＧＬ−１トランスフェクション体の結合
４℃において、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ９.５中の１μｇ／ｍｌの抗ヒトＦｃ抗体で４８ウェルプレートをコーティングした。ＨＢＳＳバッファーで２回洗浄後、Ｐ−セレクチン／ＩｇＧキメラ（濃度０.１〜１μｇ／ｍｌ、実施例５）を４℃で一晩ＨＢＳＳバッファー中にプレーティングした。４℃で３ないし４時間プレートをＢＳＡでブロックした。可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の場合、同じバッファー中の蛋白を直接プレートにコーティングした。３Ｈ標識ＣＨＯ細胞を２ｍＭ ＥＧＴＡでリフトし、ＰＢＳで３回洗浄し、最終濃度１０６個／ｍｌとして再懸濁した。この懸濁液の３００μｌの部分試料を各ウェルに添加した（３０００００個／ウェル）。室温で１２時間インキュベーション後、ウェルを無血清ＤＭＥＭで４回洗浄して未結合細胞を除去した。結合細胞を５ｍＭ ＥＧＴＡでリフトし、シンチレーションカウンターでカウントした。無処理のＰ−セレクチンリガンド蛋白結合に関する陽性対照として使用するＵ９３７細胞をガンマグロブリン（５ｍｇ／ｍｌ）で前処理して内在性Ｆｃ受容体をブロックし、ついで、Ｐ−セレクチンＩｇＧキメラに結合させた。比較結合データを図１に示す。
【０１３１】
２.Ｐ−セレクチン／ＩｇＧキメラを用いる免疫沈降
形質転換体から調製された組み換え全長または可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白（さらにコア２を伴うもの、あるいは伴わないもの）を３５Ｓ−メチオニンで標識し、ついで、実施例７および５ならびにSako, D., Cell 175, 1179-1186 (1993)にすでに記載のごとく、抗Ｐ−セレクチンリガンド蛋白ポリクローナル抗体またはＰ−セレクチン／ＩｇＧキメラのいずれかと免疫沈降させた。データを図２に示す。
【０１３２】
３.フローサイトメトリー
安定なネズミＰ−セレクチンリガンド蛋白トランスフェクション体（コア２を伴うもの、あるいは伴わないもの）を、Ｐ−セレクチン／ＩｇＧキメラ（ＬｅｃＹ１）（実施例５）または抗Ｐ−セレクチンリガンド蛋白モノクローナル抗体（Ｍａｂ２７５、配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸５６までの配列を有するペプチドに対して生成）のいずれかを用いる標準的なＦＡＣＳ法により分析した。両方の試薬をＦＩＴＣ標識プロテインＡに前以て抱合させた。２ｍＭ ＣａＣｌ２存在下においてこの抱合体とともに４℃で３０分インキュベーション後に、細胞を分析した。データを図３に示す。
【実施例９】
【０１３３】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のＥ−セレクチン結合
Bevilacqua et al., Science, 243：1160 (1989)に報告されている配列のアミノ酸−２１から５３６までを含むＥ−セレクチンをコードしているＤＮＡを用いて、Ｐ−セレクチン／ＩｇＧキメラに関して実施例５で説明したようにしてＥ−セレクチン／ＩｇＧキメラを作成した。
【０１３４】
Ｕ９３７細胞（約６.５ｘ１０７個）を組織培養プレートから回収、新鮮完全ＲＰＭＩ培地および５０μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−グルコサミン塩酸塩（糖蛋白の蛋白結合炭水化物部分を標識）［Varki, FASEB 5：226-235 (1991)］を含む５０ｍｌの培地に二等分した。４８時間インキュベーション後、両方の培養物から遠心分離により細胞を回収し、ＰＢＳで３回洗浄した。ペレット化した細胞をそれぞれ２.５ｍｌの溶解バッファー（１％ Triton X-100を含有）に懸濁し、プローブソニケーションを２分間行うことにより細胞を破壊した。界面活性剤溶解物を氷上に３時間置き、ついで、さらに２分間再ソニケーションした。溶解物を１６０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を回収し、界面活性剤不含の溶解バッファーでそれぞれ１２ｍｌとした。。２つの希釈細胞溶解物のうち１つに、Ｐ−セレクチン／ＩｇＧキメラ（実施例５参照）に前以てカップリングさせた１００μｌのプロテインＡセファロースを添加し、もう１つには、Ｅ−セレクチン／ＩｇＧキメラに前以てカップリングさせた１００μｌのプロテインＡセファロースを添加した。往復運動により混合しながら結合反応を４℃で一晩進行させた。場合によっては、Ｕ９３７細胞由来の精製膜が標識蛋白の界面活性剤抽出のための出発物質として役立った。これらの場合、界面活性剤抽出およびアフィニティー沈殿工程は上記のものと本質的に同じであった。
【０１３５】
インキュベーション後、２つの並行反応混合物をそれぞれ２０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨てた。樹脂ペレットをバッファー（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０.０２％ ＮａＮ３,ｐＨ７.５、Triton X-100含有［１回目および２回目の洗浄には０.２５％、３回目の洗浄には０.１％、４回目の洗浄には０.０１％］）で４回洗浄した。０.０１％ Triton X-100含有バッファー１ｍｌを用いて溶離前の最後の洗浄を行い、これらの洗液を液体シンチレーションカウンテイング（ＬＳＣ）による放射活性カウント定量のためにとっておいた。ついで、樹脂を、０.０１％ Triton X-100および１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するバッファー１ｍｌを用い、４℃で一晩往復運動により混合しながら溶離を行った。上清を遠心分離により回収し、ついで、ＬＳＣにより定量した。
【０１３６】
ＥＤＴＡにより樹脂から遊離した物質のオートラジオグラフィーを、１０％架橋ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し（必要ならばCentricon-10ユニットにより試料を約１００００ｃｐｍに濃縮）、ついで、製造者の説明に従ってゲルをＥＮ３ＨＡＮＣＥ（DuPont）で処理し、その後市販ゲルドライヤーでゲルを２時間乾燥させることにより行った。−８０℃で最低３日間乾燥ゲルをＸ線フィルムにさらした。
【０１３７】
前以てＵ９３７細胞の界面活性剤抽出物にさらした固定化Ｅ−またはＰ−セレクチンのＥＤＴＡでの溶離、ついで、ＥＤＴＡでの徹底的な洗浄により、遊離状態の３Ｈ−グルコサミン標識蛋白が得られた。ＥＤＴＡ溶離液からの放射性標識回収量は、ＥＤＴＡ処理前の最終洗液において観察されるカウントよりも少なくとも１０倍多かった。この観察結果は、Ｐ−およびＥ−セレクチンキメラは両方ともＵ９３７全細胞溶解物由来のリガンドをＥＤＴＡ依存的な様式でアフィニティー捕捉し、ついで、樹脂をＥＤＴＡで処理することにより、捕捉されたリガンドが遊離されたことを示唆する。
【０１３８】
ＥＤＴＡにより２種のキメラから遊離された蛋白についての評価を、非還元的条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより行った（市販１４Ｃ−標識分子量標準物質を用いた）。図４のオートラジオグラフにより示されるように、Ｐ−セレクチンキメラ（レーン２および１０）で処理した全細胞溶解物、およびＥ−セレクチンキメラ（レーン４および８）で処理した全細胞溶解物からの遊離カウントは、非還元的条件においては２００ｋＤの主要種（レーン２および４）に、還元的条件下では１００ｋＤの種（レーン８および１０）に対応していた。図４に示す異なる実験においては精製膜抽出物が全細胞のかわりに出発物質として使用され、Ｅ−セレクチンキメラ（レーン３（非還元的）、およびレーン９（還元的））およびＰ−セレクチンキメラ（示さず）は同様の結果を示した。他の実験は、Ｐ−セレクチンに結合する主要Ｕ９３７糖蛋白がＲｂ３０２６（組み換えｓＰＳＧＬ１.Ｔ７に対して生成したポリクローナル抗体）と免疫反応することを示す。それゆえ、Ｐ−およびＥ−セレクチンは、各場合において同じ特性で、単一の主要糖蛋白種を特異的に認識する。
【実施例１０】
【０１３９】
欠失または変化した形態の可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の製造および分析
Ａ.ＤＮＡ構築物の製造
以下のようにして、末端切断形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白−ＩｇＧキメラを得た。プラスミドｐＥＤ.ＰＳＬ.ＦｃをＰｓｔＩおよびＮｏｔＩで制限消化し、Ｆｃ部分を含む６ｋｂのフラグメントおよびベクターｐＥＤＦｃ６ｋｂをゲル精製した。プラスミド構築物ｐＥＤ.１４９.Ｆｃ、ｐＥＤ.４７.ＦｃおよびｐＥＤ.１９.Ｆｃを、標準的なＰＣＲ法により、下記のオリゴヌクレオチドプライマーのペアーを用いて作成した。
すべての構築物用の「上流」プライマー:
5'-CCAGGTCCAACTGCAGGTCGACTCTAGAGGGCACTTCTTCTGGGCCCACG-3' (配列番号：20)
１４８Ｆｃ用の「下流」プライマー:
5'-TATTATCTGTGCGGCCGCCCTCCAGAACCCATGGCTGCTGGTTGCAGTGG-3' (配列番号：21)
４７Ｆｃ用の「下流」プライマー:
5'-TATTATCTGTGCGGCCGCGCAGCAGGCTCCACAGTGGTAG-3' (配列番号：22)
１９Ｆｃ用の「下流」プライマー:
5'-TATTATCTGTGCGGCCGCGGAGGCTCCGTTTCTGGCAG-3' (配列番号：23)
【０１４０】
ＰＣＲ反応用鋳型ＤＮＡはｐＥＤ.ＰＳＬ.Ｆｃであった。ＰＣＲ条件は、Perkin-Elmer Thermocyclerを用いて９４℃で１分；４２℃で１分；７２℃で３分を２５サイクルである。最後のサイクル完了後、反応物を２５℃においてKlenow酵素で３０分処理した。ついで、フェノールクロロホルム抽出を行い、酢酸ナトリウムを添加して０.３Ｍとし、ついで、ＰＣＲ生成物であるＤＮＡを２.５倍体積のエタノールで沈殿させた。ＤＮＡペレットを７０％エタノールですすぎ、残存エタノールを蒸発させた。再懸濁したＤＮＡをＰｓｔＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲル精製し、上記ｐＥＤＦｃ６ｋｂフラグメントに連結した。制限分析により正しい構築物を同定し、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１４１】
ｐＥＤ.１４８Ｆｃを鋳型として用い、下記突然変異オリゴヌクレオチドを用いて部位特異的突然変異法（Maniatis et al., 1989, MolecularCloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories）を行うことによりプラスミドｐＥＤ.ΔＹ１４８.Ｆｃ、ｐＥＤ.Ｈ２４.Ｑ７０.１４８.Ｆｃを作成した。
ΔY148用：5'-CGGAGACAGGCCACCGAATTCCTGCCAGAAACG-3' (配列番号：24)
H24用：5'-CCTCCAGAAATGCTGAGGCACAGCACTGACACCACTCCTC-3' (配列番号：25) 
Q70用：5'-GAGCTGGCCAACATGGGGCAACTGTCCACGGATTCAGCAG-3' (配列番号：26)
【０１４２】
コロニーハイブリダイゼーション（Maniatis et al.上記）により陽性クローンを同定した。
【０１４３】
ｐＥＤ.ΔＹ１４８.ＦｃをＥｃｏＲＩで制限消化し、下記の２本鎖オリゴヌクレオチドに連結することによりｐＥＤ.ＦＦＦＥ.１４８.Ｆｃを構築した。
5'-AATTCGAGTTCCTAGATTTTG-3' (配列番号：27) および 
5'-AATTCAAAATCTAGGAACTCG-3' (配列番号：28).
【０１４４】
ｐＥＤ.ΔＹ１４８.ＦｃをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで制限消化し、ついで、下記の２本鎖オリゴヌクレオチドに連結することによりシリーズ
ｐＥＤ.ＦＹＹＤ.１９.Ｆｃ、ｐＥＤ.ＦＦＹＤ.１９.ＦｃおよびｐＥＤ.ＦＦＦＤ.１９.Ｆｃの構築物を作成した。
【０１４５】
pED.FYYD.19.Fc用:
5'-AATTCGAGTACCTAGATTATGATTTCCTGCCAGAAACTGAGCCTCCGC-3' (配列番号：29) および
5'-GGCCGCGGAGGCTCAGTTTCTGGCAGGAAATCATAATCTAGGTACTCG-3' (配列番号：30);
pED.FFYD.19.Fc用:
5'-AATTCGAGTTCCTAGATTATGATTTCCTGCCAGAAACTGAGCCTCCGC-3' (配列番号：31) および
5'-GGCCGCGGAGGCTCAGTTTCTGGCAGGAAATCATAATCTAGGAACTCG-3' (配列番号：32);
pED.FFFD.19.Fc用:
5'-AATTCGAGTTCCTAGATTTCGATTTCCTGCCAGAAACTGAGCCTCCGC-3' (配列番号：33) および
5'-GGCCGCGGAGGCTCAGTTTCTGGCAGGAAATCGAAATCTAGGAACTCG-3' (配列番号：34).
【０１４６】
Ｂ.欠失または変化した形態の可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の分析のためのプレート結合アッセイ
種々の変異形態の可溶性ＰＳＧＬ−１／Ｆｃキメラをコードする個々のＤＮＡを、実施例３（Ｃ）に記載のごとく、ｐＥＡ.３／４ＦＴおよびＰＡＣＥ ｃＤＮＡとともにＣＯＳ細胞中に同時トランスフェクションした。約１０７個のＣＯＳ細胞からトランスフェクション４０〜６４時間後に集めた無血清培地５０ｍｌを、２ｍＭ ＣａＣｌ２を捕捉したＴＢＳで平衡化した０.２５ｍｌのプロテインＡセファロース（Pharmacia）カラムにより精製した。２０ｍｌのＴＢＳ／ＣａＣｌ２で洗浄後、０.５ｍｌの０.１Ｍ酢酸、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２で結合物質を溶離させた。溶離した物質を１／２０倍体積の３Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９.０で中和した。２８０ｎｍの吸光度を測定し、ＰＡＧＥ／ＳＤＳ／Laemmliゲルのクーマシーブルー染色により溶離物質を定量した。
【０１４７】
硫酸化されていない形態の可溶性ＰＳＧＬ−１を得るために、上記のごとく（トランスフェクション後に細胞を５０ｍＭコール酸（Sigma）存在下で培養すること以外は）適当なＦｃキメラでのＣＯＳ細胞のトランスフェクションを行った。
【０１４８】
実施例４（Ｃ）に記載のごとく（下記の変更はあるが）、ＣＨＯ：Ｐ−セレクチン、ＣＨＯ：Ｅ−セレクチンおよびＣＨＯ：Ｌ−セレクチン発現細胞の定量的な付着を行った：ＣＯＳ細胞および抗体を省略した。そのかわり、種々の量のプロテインＡにより精製された可溶性ＰＳＧＬ−１／Ｆｃキメラを用いて４８ウェルマイクロタイタープレート（Costar）を４℃で１６時間コーティングした。未結合物質を除去し、コーティングしたウェルを、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび２ｍＭのＣａＣｌ２を含有するHankの緩衝化セイライン（ＨＢＳ）で４℃において１時間処理した。トリチウム標識したセレクチン発現ＣＨＯ細胞を添加し、実施例４（Ｃ）に記載のごとく結合を定量した。
【０１４９】
Ｃ.Ｎ−結合糖鎖付加部位の変化の効果
３種のＰ−セレクチンリガンド−ＩｇＧキメラを発現する構築物を構築して、セレクチン結合に対するＮ−結合糖鎖付加部位の影響を調べた。これらの構築物は下記配列を有する。
【０１５０】
１４８.Ｆｃ    配列番号：２のアミノ酸４２〜１８９。
【０１５１】
Ｑ７０.１４８.Ｆｃ    配列番号：２のアミノ酸４２〜１８９、配列番号：２の位置１１１のアスパラギン残基がグルタミン残基に置き換わっている。
【０１５２】
Ｈ２４.Ｑ７０.１４８.Ｆｃ    配列番号：２のアミノ酸４２〜１８９、配列番号：２の位置６５のアスパラギン残基がヒスチジン残基に、配列番号：２の位置１１１のアスパラギン残基がグルタミン残基に置き換わっている。
【０１５３】
これらの構築物を図式的に図６に示す。
【０１５４】
プロテインＡおよびＰ−セレクチン−ＩｇＧキメラへのこれらの構築物の結合を比較した。これらの実験結果を図７に示す。オートラジオグラフのレーン４、５および６を比較すると、可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白中の最初の２つのＮ−糖鎖付加部位の１つまたは両方の除去によってはＰ−セレクチンへの結合に対する有為な影響がないことが示される。
【０１５５】
Ｄ.チロシンの影響
可溶性蛋白のアニオン性領域の変化によるＰ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチンへの結合におけるチロシンの役割を調べるために構築物を作成した。下記構築物を作成した。
【０１５６】
ΔＹ１４８.Ｆｃ    配列番号：２のアミノ酸４２〜１８９、アミノ酸４６〜５２が欠失。
【０１５７】
ＦＦＦＥ.１４８.Ｆｃ    配列番号：２のアミノ酸４２〜１８９、位置４６、４８および５１のチロシン残基がフェニルアラニン残基に、位置５２のアスパラギン酸残基がグルタミン酸残基に置き換わっている。
【０１５８】
これらの構築物を図８に図式的に示す。
【０１５９】
標識硫酸存在下で対応する構築物を発現させることにより、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の硫酸化の程度および部位を調べた。１４８.ＦｃおよびΔＹ.１４８.Ｆｃの硫酸化の程度を、硫酸化されていないＰ−セレクチン−ＩｇＧキメラの硫酸かの程度と比較した。結果を図９に示す。これらのデータは、硫酸取り込みの大部分がＰ−セレクチンリガンド蛋白のアニオン性領域中へのものであることを示す。
【０１６０】
アニオン性領域の硫酸化がチロシン残基において起こるかどうかを調べるためにさらなる構築物作成した。下記構築物を作成した。
【０１６１】
ＦＹＹＤ.１９.Ｆｃ    配列番号：２のアミノ酸４２〜６０、配列番号：２の位置４６のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置き換わっている。
【０１６２】
ＦＦＹＤ.１９.Ｆｃ    配列番号：２のアミノ酸４２〜６０、配列番号：２の位置４６および４８のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置き換わっている。
【０１６３】
ＦＦＦＤ.１９.Ｆｃ    配列番号：２のアミノ酸４２〜６０、配列番号：２の位置４６、４８および５１のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置き換わっている。
【０１６４】
これらの構築物を次式的に図９に示す。
【０１６５】
これらの構築物の硫酸化の程度を１９.Ｆｃ（「ＹＹＹＤ.１９.Ｆｃ」）と比較した。結果を図１０に示す。ＦＴＴＤ.１９.Ｆｃは有意な硫酸化を示したが、ＦＦＦＤ.１９.Ｆｃは実質的にほとんど硫酸化されなかった。よって、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のアニオン性領域のチロシン残基が硫酸化の主要部位である。
【０１６６】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白から硫酸を除去すると、Ｐ−セレクチンへの結合が実質的に減少した。コール酸処理された１４８.ＦｃのＰ−セレクチンへの結合を試験した。図１１に示すように、コール酸処理による硫酸化の阻害により、Ｐ−セレクチンへのＰ−セレクチンリガンド蛋白の結合が減少した。
【０１６７】
Ｅ.Ｃ末端欠失の影響
いくつかのさらなるＣ末端欠失構築物を下記のように作成した。
２５４.Ｆｃ    配列番号：２のアミノ酸４２〜２９５。
４７.Ｆｃ    配列番号：２のアミノ酸４２〜８８。
１９.Ｆｃ    配列番号：２のアミノ酸４２〜６０。
これらの構築物を図式的に図１２に示す。
【０１６８】
２５４.Ｆｃ、１４８.Ｆｃ、４７.Ｆｃおよび１９.ＦｃのＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンへの結合を試験した。図２３および２４は、これらの欠失キメラのセレクチンへの結合および対照を比較したものである。結果を図１２にもまとめた。
【０１６９】
Ｆ.Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチン発現細胞への結合
実施例４（Ｃ）の定量的プレート結合アッセイを用いて、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンを発現する細胞への上記の種々の構築物の結合を比較した（図１３において図式的に説明する）。
【０１７０】
図１４は、Ｐ−セレクチン発現ＣＨＯ細胞への１４８.Ｆｃ、ΔＹ.１４８.Ｆｃ、ＦＦＦＥ.１４８.ＦｃおよびヒトＩｇＧ１の結合を比較する。ΔＹ.１４８.Ｆｃのアニオン性領域中のすべてのチロシン残基を欠失させると結合が消滅した。ＦＦＦＥ.１４８.Ｆｃのチロシン残基をフェニルアラニン残基に置き換えると、１４８.Ｆｃと比較して実質的に結合が減少した。よって、全長のアニオン性領域の存在はＰ−セレクチン結合に必須であり、Ｐ−セレクチン結合はこの領域の硫酸化により促進されることが示された。図１４は、１４８.Ｆｃ、ΔＹ.１４８.ＦｃおよびＦＦＦＥ.１４８.Ｆｃは、セレクチンを発現しないＣＨＯ細胞には結合しないことを示す対照実験を示す。
【０１７１】
図１５は、１４８.Ｆｃ、ΔＹ.１４８.Ｆｃ、ＦＦＦＥ.１４８.ＦｃおよびヒトＩｇＧ１のＥ−セレクチン発現細胞への結合を比較する。Ｅ−セレクチン結合は、もとの配列の欠失または変化によっては影響されなかった。よって、アニオン性領域はＥ−セレクチン結合には必要ないことが示された。
【０１７２】
図１６は、図１４および１５の結果をまとめたものである。
【０１７３】
図１７は、Ｐ−およびＥ−セレクチン発現ＣＨＯ細胞への４７.Ｆｃの結合を比較する。４７.Ｆｃは、配列番号：２の位置１１１および２９２におけるＮ−結合糖鎖付加部位の欠失にもかかわらず、両セレクチンへの実質的な結合を示した。
【０１７４】
図１９は、Ｐ−セレクチン発現ＣＨＯ細胞へのＦＹＹＤ.１９.Ｆｃ、ＦＦＦＤ.１９.Ｆｃ、Ｈ２４.Ｑ７０.１４８.Ｆｃ、１４８.ＦｃおよびヒトＩｇＧ１の結合を比較する。ＦＦＦＤ.１９.Ｆｃのアニオン性領域中のすべてのチロシン残基の置換により結合が消滅した。ＦＹＹＤ.１９.Ｆｃの位置４６のチロシン残基をフェニルアラニン残基に置き換えると、１４８.Ｆｃと比較して実質的に結合が減少した。Ｈ４２.Ｑ７０.１４８.ＦｃのＮ−結合糖鎖付加部位の変更は結合に影響しなかった。よって、Ｐ−セレクチン結合はアニオン性領域における硫酸化により促進され、Ｎ−結合糖鎖付加はＰ−セレクチン結合には必要ないことが示された。図１９は、ＦＹＹＤ.１９.Ｆｃ、ＦＦＦＤ.１９.Ｆｃ、Ｈ２４.Ｑ７０.１４８.Ｆｃおよび１４８.Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１単独以上にはセレクチンを発現しないＣＨＯ細胞に結合しないことを示す。
【０１７５】
図２０は、Ｅ−Ｐ−セレクチン発現ＣＨＯ細胞へのＦＹＹＤ.１９.Ｆｃ、ＦＦＦＤ.１９.Ｆｃ、Ｈ２４.Ｑ７０.１４８.Ｆｃ、１４８.ＦｃおよびヒトＩｇＧ１の結合を比較する。ＦＹＹＤ.１９.ＦｃおよびＦＦＦＤ.１９.Ｆｃの程度までリガンド蛋白を末端切断すると、実質的にＥ−セレクチン結合が減少した。Ｈ２４.Ｑ７０.１４８.ＦｃにおけるＮ−糖鎖付加部位の変化は、実質的にはＥ−セレクチン結合に影響しなかった。よって、配列番号：２のアミノ酸４２から６０までを含むＰ−セレクチンリガンド蛋白は選択的にＰ−セレクチンに結合でき、Ｅ−セレクチンには実質的にほとんど結合しないことが示された。
【０１７６】
図２１は、図１９および２０の結果をまとめたものである。
【０１７７】
Ｇ.Ｐ−およびＥ−セレクチン結合に関する結論
これらのデータから、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白によるＰ−セレクチン結合およびＥ−セレクチン結合の間の関係に関するいくつかの結論が導かれる。Ｎ−結合炭水化物はＰ−またはＥ−セレクチンへのＰ−セレクチンリガンド蛋白の結合には必要ない。配列番号：２のアミノ酸４２〜６０程度の小さいＰ−セレクチンリガンド蛋白はＰ−セレクチンへの結合能を有し、Ｅ−セレクチンには実質的にほとんど結合しない。
【０１７８】
図２２は、Ｐ−およびＥ−セレクチンへのＰ−セレクチンリガンド蛋白の結合に関して提案された図式的モデルを示す。Ｏ−結合ｓＬｅｘ炭水化物は、Ｐ−セレクチン結合およびＥ−セレクチン結合の両方に必要であることが示された。ここに示すデータは、硫酸化チロシン残基はＰ−セレクチン結合には関与するが、Ｅ−セレクチン結合には関与しないことを示す。出願人のデータは、Ｎ−結合糖鎖付加結合部位は不要であることも示す。
【実施例１１】
【０１７９】
ＰＳＧＬ−１形態の凝集現象およびダイマー形成に関する試験
部位特異的突然変異法および／またはストップコドンを導入されたプライマーを用いるＰＣＲ増幅により一群のＰＳＧＬ−１変異体を構築した。すべての変異体実験のための鋳型はｐＰＬ８５.Ｒ１６（ＡＴＣＣ ７５５７７、出願人により寄託）であった。
【０１８０】
第１群の変異体（Ｃ３１０ＳおよびＣ３２７Ｓ）は、野生型と比較すると１種のアミノ酸変化のみを有する全長のＰＳＧＬ−１.Ｒ１６（それぞれ位置３１０または３２７においてＣｙｓがＳｅｒになっている）。ｐＥＡ.３／４ＦＴおよびへ変異体Ｃ３０１０ＳまたはＣ３２７Ｓで同時トランスフェクションされたＣＯＳ細胞を３５Ｓ−メチオニンで標識した。細胞溶解物を調製し、変異体蛋白を実施例７（Ａ）のＰ−セレクチンリガンドポリクローナル抗体で免疫沈降させ、非還元的条件下および還元的条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
【０１８１】
変異体Ｃ３２７Ｓならびに野生型ＰＳＧＬ−１.Ｒ１６は非還元的条件下ではホモダイマーとして移動し、還元的条件下ではモノマーとして移動した。対照的に、変異体Ｃ３１０Ｓは非還元的条件下および還元的条件下いずれにおいてもモノマーとして移動し、位置３１０のシステインがＰＳＧＬ−１のダイマー形成に必要であることが示された。
【０１８２】
両方の変異体を、Ｐ−セレクチンへの結合能についても分析した。同時トランスフェクションＣＯＳ細胞の界面活性剤抽出物を、実施例４（Ａ）のＬＥＣ−γ１キメラで沈殿させた。沈殿物を非還元的条件下および還元的条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより分析した。ＰＳＧＬ−１.Ｒ１６およびＣ３２７Ｓは両方ともＬＥＣ−γ１により効果的に沈殿したが、ＬＥＣ−γ１へのＣ３１０Ｓの結合はいちじるしく減少し、ダイマー形態のＰＳＧＬ−１はモノマー形態よりも強固にＰ−セレクチンに結合することが示された。
【０１８３】
第２のセットの変異体は可溶性形態のＰＳＧＬ−１.Ｒ１６をコードしており、それらを表１に示す。部位特異的突然変異法により変異体ΔＴＭが得られ、これは膜貫通ドメインの欠失を有し、その後にＲＬＳＲＫＡが続いている。部位特異的突然変異法または所望位置にストップコドンを導入されたＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ増幅により変異体Ｌ３１１、Ｌ３１２、Ａ３１３、Ｉ３１４、Ｌ３１５、Ａ３１８およびＴ３２２を得た。変異体の名称は各末端切断形態のＰＳＧＬ−１.Ｒ１６のＣ末端アミノ酸を示す。
【０１８４】
下記判断基準に従って変異体を分析した。
１.トランスフェクションＣＯＳ細胞からの発現および分泌
２.モノマー形成対ダイマー形成
３.凝集形態の欠如
４.Ｐ−セレクチン結合（ＬＥＣ−γ１キメラ）
【０１８５】
変異体ΔＴＭおよびＩ３１６は４つの判断基準すべてを満たした。実施例５（Ａ）のｓＰＳＬ.ＱＣ、Ｌ３１１、Ｌ３１２、Ａ３１３、Ｉ３１４およびＬ３１５のごとき短い可溶性形態のＰＳＧＬ−１はダイマーを形成せず、実施例５（Ｃ）のｓＰＳＬ.Ｔ７、Ａ３１８およびＴ３２２のごとき長い可溶性形態のＰＳＧＬ−１はあまり望ましくない高分子凝集体を形成した。
【０１８６】
すでに３／４フコシルトランスフェラーゼおよびコア２トランスフェラーゼを発現しているＣＨＯ細胞を、ｐｓＰＳＬ.Ｔ７、ΔＴＭ、Ｉ３１６またはｐｓＰＳＬ.ＱＣでトランスフェクションし、メトトレキセートを用いて増幅した。安定なクローンを単離し、３５Ｓ−メチオニンで標識した。ならし培地を直接分析するか、あるいはまずＬＥＣ−γ１で沈殿させ、ついで、非還元的条件下および還元的条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図２５）。結果は、ΔＴＭおよびＩ３１６がダイマー形成およびＰ−セレクチン結合において最も効果的であることを示した。
【０１８７】
表Ｉ
【表１】
2008099695.tif 000006
【実施例１２】
【０１８８】
Ｐ−およびＥ−セレクチンへのＰＳＧＬ−１結合の特異性
材料.  ヒトＥ−セレクチンの細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含むキメラ蛋白を、先に説明したＰ−セレクチンキメラ、ＬＥＣ−γ１と同様にして構築した。バキュロウイルスに感染したトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）ハイ・ファイブ（high five）細胞(Invitrogen)において可溶性Ｅ−セレクチンキメラを発現させ、プロテインＡセファロースクロマトグラフィーにより均一に精製した。それぞれα（１,３／１,４）−フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ）、ＰＳＧＬ−１、ＣＤ４３（ロイコシアリン）、および可溶性の対になったアミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）をＣＯＳで発現させるためのプラスミドベクターｐＥＱＡ.３／４ＦＴ、ｐＰＬ８５、ｐＦＣＤ４３、およびｐＥＡ.ｓＰＡＣＥは本明細書ならびに文献においても記載されている（Sako et al. (1993) Cell 75, 1179-1186; Rehemtulla, A. & Kaufman, R. J. (1992) Curr. Opin. Biotechnol. 3, 560-565; Wasley et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 8458-8465）。公表された配列（Natsuka et al. (1994) Journal of Biological Chemistry 269, 16789-16794; Sasaki et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 14730-14737）由来のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ ｃＤＮＡ（プラスミドｐＭＴ.ＦＴ７）をＨＬ６０ ｃＤＮＡ発現ライブラリーからクローン化した。成熟（ＰＡＣＥ開裂）ＰＳＧＬ−１のＮ末端の最初の１５個のアミノ酸を含むペプチドに対してポリクローナル中和ウサギ抗体Ｒｂ３４４３を生成させた。モノクローナル抗ＣＤ４３抗体（Becton DickinsonまたはBiodesign Internationalから得た）およびイソタイプ対照抗体を、アフィニティー精製されたヤギの抗体（マウスＩｇＧに対するもの）（Cappel, Organon Teknik Corporation）が共有結合しているセファロースＴＭ−４Ｂからなる固体支持体にカップリングさせた。セレクチンキメラおよびネズミ抗体の、プロテインＡセファロース４ファストフロー（Pharmacia）および抗マウスＩｇＧ樹脂へのそれぞれのアフィニティーカップリングを、樹脂１ｍｌあたり２ｍｇの蛋白の割合で行った。抗血清Ｒｂ３４４３をプロテインＡセファロースに、樹脂１ｍｌに１ｍｇの割合でカップリングさせた。反応後の上清についてのミクロ−ＢＣＡアッセイ（Pierce）により示されるカップリング効率は少なくとも９５％であった。アプロチニンおよびペプスタチンはBoehringer Mannheimから得て、ベンズアミジン、ロイペプチン、およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）はSigmaから得た。
【０１８９】
ミエロイド細胞の標識および膜抽出.  浮遊状態で〜１.３ｘ１０６個／ｍｌまで増殖したＵ９３７またはＨＬ６０細胞を、１０％ウシ胎児血清および２.５ｍＣｉの３Ｈ−グルコサミンＨＣｌ（Dupont/NEN）を補足したＲＰＭＩ １６４０培地５０ｍｌ中で４８時間標識した。この方法により、細胞１個あたり１ｃｐｍよりも高い活性が通常的に得られた。標識細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞溶解バッファー（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＣａＣｌ２および４ｍＭ ＭｇＣｌ２,ｐＨ７.５、プロテアーゼ阻害剤アプロチニン２０ｍｇ／ｍｌ、ベンズアミジン１０ｍＭ、ロイペプチン２０ｍｇ／ｍｌ、ペプスタチン８ｍｇ／ｍｌおよびＰＭＳＦ１０ｍＭを含有）に懸濁し、氷上で数サイクルのプローブソニケーションに供した。低速遠心分離により核および細胞残渣を除去し、１０００００ｇ、１時間の遠心分離により細胞膜を上清から回収し、１Ｍ ＮａＣｌを含有する細胞溶解バッファーに懸濁することにより洗浄し、高速遠心分離し、最後に３ｍｌの膜可溶化バッファー（１％ Triton-100を含有する細胞溶解バッファー）に再懸濁した。数サイクルのソニケーションおよび氷上でのインキュベーションを行って膜フラクションを可溶化させた。最後に、低速遠心分離工程を行って不溶性膜残渣を除去した。
【０１９０】
トランスフェクションＣＯＳ細胞の標識および膜抽出.  ８μｇのプラスミドｐＰＬ８５またはｐＦＣＤ４３および４μｇのｐＥＳ.ｓＰＡＣＥ、ならびに４μｇのｐＥＡ.３／４ＦＴまたはｐＭＴ.ＦＴ７を用い、ＤＥＡＥ−デキストランおよびクロロキン（２５）を用いてＣＯＳ Ｍ６細胞をトランスフェクションした。回収してから４０〜４５時間後、トランスフェクション細胞を血清およびメチオニンを含まない培地中で３０分飢餓状態とし、ついで、無血清ＤＭＥ中［３５Ｓ］−メチオニンを５時間与えた。標識細胞を洗浄し、ＥＧＴＡとともにインキュベーションしてディッシュ表面への付着を緩め、ディッシュからかき取り、ペレット化させ、ついで、冷１０ｍＭ ＰＩＰＥＳバッファー,ｐＨ７.５（１００ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＮａＣｌ、３.５ｍＭ ＭｇＣｌ２、およびプロテアーゼ阻害剤（上記参照）を含有）中に再懸濁した。ついで、ソニケーションにより膜抽出を行い、低速遠心分離、高速遠心分離、ついで、標識ミエロイド細胞について上で説明したようにして膜溶解バッファー中で可溶化を行った。
【０１９１】
アフィニティー沈殿.  膜抽出物を細胞溶解バッファーまたはＴＢＳＣバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２,ｐＨ７.５、５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（純度約９９％、Sigma）を補足）で１：４または１：５に希釈した。かくして、Triton X-100を０.２〜０.２５％にまで希釈した抽出物を、往復運動により混合しながらヒトＩｇＧ１−プロテインＡセファロースとともに４℃で一晩インキュベーションした。ついで、前以て清澄化した上清を、Ｅ−またはＰ−セレクチンキメラ、対照ヒトＩｇＧ１、Ｒｂ３４４３またはウサギの免疫前の血清、または抗ＣＤ４３抗体、またはヤギ抗マウスＩｇＧセファロースに前以てカップリングされたイソタイプ対照と前以てカップリングされたプロテインＡセファロースと、４℃で６〜１２時間反応させた。洗液上清の放射活性がバックグラウンドレベルに低下するまで０.１〜０.５％ Triton X-100を含有するバッファー中で５回またはそれ以上樹脂を洗浄した。Ｐ−またはＥ−セレクチン樹脂に特異的に結合した蛋白の溶離を、室温において１０ｍＭ ＥＤＴＡまたは５ｍＭ ＥＤＴＡ／５ｍＭ ＥＧＴＡを用いて、あるいはＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファー（Laemmli, U. E. (1970) Nature 227, 680-685）中で煮沸することにより行った。一方、抗体樹脂に結合した蛋白の溶離を後者の方法により徹底的に行った。還元的条件下での分離のために、ジチオスレイトールを試料バッファーに添加し、最終濃度１００ｍＭとした。かくして調製した試料を７.５％ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、En3Hance（Dupont）で処理し、乾燥させ、ついで、オートラジオグラフィーフィルムにさらした。
【０１９２】
引き続き行うアフィニティー捕捉実験のために、上記のごとく膜抽出物を前以て清澄化させ、Ｐ−もしくはＥ−セレクチンまたはヒトＩｇＧ１とともにアフィニティー沈殿させ、洗浄した。ついで、４℃において１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７.５中５ｍＭ ＥＤＴＡで試料を樹脂から溶離させた（１時間転がしながら撹拌、溶離は２回行った）。最初および２回目の溶離液を一緒にし、ついで、すでに説明したプロトコールに従って固定化Ｒｂ３４４３とともに免疫沈降させた。
【０１９３】
結果：
対照ヒトＩｇＧ１と並行して、可溶性Ｅ−およびＰ−セレクチンキメラを用いて、下記の「方法」において説明するようにして３Ｈ−グルコサミン標識Ｕ９３７細胞の界面活性剤可溶化膜抽出物をプローブした。固定化セレクチンからの溶離物についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ／オートラジオグラフィーによる試験（図２６）により、Ｐ−セレクチン溶離物およびＥ−セレクチン溶離物の両方における主要蛋白種の存在が明らかとなり、その電気泳動特性は下記のごとし。非還元的条件下では分子量２００ｋＤａであり、還元により分子量１２０ｋＤａの種に変換される（図２６、それぞれレーン２および３）。場合によっては、Ｐ−セレクチン溶離物およびＥ−セレクチン溶離物の両方においてさらなるバンドが観察され、おそらく、この主要バンドに対応するものであり、自然に還元された物質の存在（非還元試料中の１２０ｋＤａ種）および不完全な還元（還元試料中の２００ｋＤａ）を反映していた。さらに、ＤＴＴでの還元により影響されないＥ−セレクチン溶離物中の分子量１５０ｋＤａの痕跡バンドが場合によって観察された。固定化ヒトＩｇＧ１を用いた対照実験（図２６、レーン１）、あるいはセレクチン樹脂の溶離をＥＤＴＡまたはＳＤＳの不存在下で行った実験（データ示さず）においてはバンドは観察されなかった。ＨＬ６０細胞を用いた場合にも本質的に同一の結果が得られた（データ示さず）。それゆえ、これらの認識の性質は、これらの蛋白と各セレクチンとのレクチンドメインを介する特異的な金属依存性相互作用であると解釈される（Lasky, L. A. (1992) Science 258, 964-969; Drickamer, K. (1988) J. Biol. Chem. 263, 9557）。
【０１９４】
Ｅ−セレクチンとともに沈殿する主要バンドの金属依存性認識および電気泳動上の挙動は、すでに同定されているＰ−セレクチンカウンターリセプター、Ｐ−セレクチン糖蛋白リガンドまたはＰＳＧＬ−１の特性と矛盾しない（Moore et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 23318-23327; Moore et al. (1992) J. Cell Biol. 118, 445-456; Sako et al.）。
【０１９５】
この種が実際にＰＳＧＬ−１であるかどうかを評価するために、Ｅ−セレクチン沈殿およびＰ−セレクチン沈殿両方のＥＤＴＡ溶離物を、ＰＳＧＬ−１特異的ポリクローナル抗血清Ｒｂ３４４３と反応させた。図２７に示すように、いずれのセレクチンとのアフィニティー捕捉により単離された主要バンドも、この抗血清を用いると免疫沈降した（それぞれレーン３および４）。対照ＩｇＧ１ ＥＤＴＡ溶離物の免疫沈降後に検出された種はなかった（図２７、レーン５）。新鮮３Ｈ−標識Ｕ９３７膜抽出物を用いる直接免疫沈降によりＲｂ３４４３の特異性が確認された。Ｒｂ３４４３との沈降によりＰＳＧＬ−１の電気泳動特性（非還元的条件下で分子量２００ｋＤａ、還元的条件下で分子量１２０ｋＤａ；図２７、レーン２）を有する単一バンドが回収された。一方、免疫前の抗血清との沈降は物質を捕捉しなかった（図２７、レーン１）。これらの結果は、Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチンの両方により特異的に捕捉される、ミエロイド細胞由来の主要蛋白種がＰＳＧＬ−１であることを示す。
【０１９６】
ＰＳＧＬ−１に対するＥ−セレクチンの特異性をさらに評価するために、ＣＤ４３（ロイコシアリンともいう）（ミエロイド細胞ＳＬｅｘ残基の主要部分を有することが知られている豊富な細胞表面シアロ糖蛋白（Maemura, K. & Fukuda, M. (1992) J. Biol. Chem. 267, 24379-24386））の存在について、Ｕ９３７膜溶解物を直接プローブした。かくして、「方法」に記載のごとく、３Ｈ−グルコサミン標識Ｕ９３７細胞の膜抽出物を抗ＣＤ４３抗体でプローブし、並行してＰＳＧＬ−１特異的抗血清Ｒｂ３４４３および対照抗体でプローブした。同量の膜溶解物から、ＣＤ４３抗体はＰＳＧＬ−１抗血清よりも３０倍過剰な放射カウントにおいて沈降させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／オートラジオグラフィーによる免疫沈降の評価（図２８）により、各抗体に対して１本の特異的バンドが明らかとなった。Ｒｂ３４４３は、ＰＳＧＬ−１の電気泳動特性を有する単一種を捕捉した（図２８、レーン２）。対照的に、ＣＤ４３抗体は、還元に感受性のない分子量１２０ｋＤａの種を沈降させ（図２８、レーン４）、ＣＤ４３中にシステインが存在しないことと矛盾しない。対照抗体との免疫沈降（図２８、レーン１および３）は予想通り陰性であることがわかった。Ｕ９３７細胞中にはＰＳＧＬ−１よりもかなり多量のＣＤ４３が存在すると思われ、ＨＬ６０細胞中のこれらの蛋白の定量結果と矛盾しない（Ushiyama et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 15229-15237）。よって、Ｅ−セレクチンがミエロイド細胞由来のＣＤ４３を沈殿させることができないのは、それらの細胞系におけるその不存在によるものではないように思われる。Ｅ−セレクチンが痕跡量のＣＤ４３を捕捉するという可能性（すなわち、図２６の非還元的条件下レーン３における強度の小さい分子量１２０ｋＤａのバンド（モノマーＰＳＧＬ−１とも矛盾しない））も排除できないが、ＰＳＧＬ−１はミエロイド膜抽出物から沈殿する主要蛋白であると思われる。
【０１９７】
ＰＳＧＬ−１ ｃＤＮＡとα（１,３／１,４）フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ）との同時トランスフェクションによりＣＯＳ細胞において発現された組み換えＰＳＧＬ−１は、最もよくＰ−セレクチンに結合に関した（Sako et al）。興味深いことに、組み換えＰＳＧＬ−１に対するＥ−セレクチンの認識を示すための初期の努力は失敗に終わった。Ｐ−セレクチン捕捉がうまく行く条件下において、Ｅ−セレクチンは同時トランスフェクションされたＣＯＳ細胞膜溶解物由来のカウンターリセプターを捕捉できなかった。この結果に対する１の解釈は、Ｆｕｃ−ＴＩＩＩは組み換えＰＳＧＬ−１をＰ−セレクチンにより認識されるように修飾できたが、Ｅ−セレクチン認識に必要なミエロイドＰＳＧＬ−１においてはそのような適当な修飾をすることができなかったというものである。ＳＬｅｘ炭水化物構造を生成することのできるミエロイドのフコシルトランスフェラーゼＦｕｃ−ＴＶＩＩについての最近のクローニング（Natsuka et al (1994) Journal of Biological Chemistry 269, 16789-12764; Sasaki et al (1994) J. Biol. Chem. 269, 14730-14737）は、この解釈を価値あるものとする。
【０１９８】
ＰＳＧＬ−１またはＣＤ４３をコードするｃＤＮＡおよびＦｕｃ−ＴＩＩＩまたはＦｕｃ−ＴＶＩＩのいずれかをコードするｃＤＮＡでＣＯＳ細胞を同時形質転換した。トランスフェクションＣＯＳ細胞から膜溶解物を調製し、固定化Ｅ−セレクチンキメラまたはＰ−セレクチンキメラあるいはＰＳＧＬ−１またはＣＤ４３に対する抗体とともにこれらを沈降させた。沈降生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／オートラジオグラフィーにより評価し、ついで、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡによるそれらの遊離（セレクチンにより媒介される結合に関して）またはＳＤＳ中での煮沸（免疫沈降物に関して）により評価した。結果を図２９に示す。
【０１９９】
図２９Ａに示すように、ＣＯＳにより発現されたＰＳＧＬ−１のＥ−セレクチン捕捉はトランスフェクションに使用したフコシルトランスフェラーゼの性質に依存した。３つの別個の実験において、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩはＥ−セレクチンによるＰＳＧＬ−１の沈殿を促進したが、Ｆｕｃ−ＴＩＩＩは促進しなかった。Ｆｕｃ−ＴＩＩＩがＰＳＧＬ−１に対してＥ−セレクチンとの反応性を付与しないことは、ＰＳＧＬ−１の発現不足によるものとすることはできない。なぜなら、特異的抗血清Ｒｂ３４４３は、有意なかなりの量のＰＳＧＬ−１をＦｕｃ−ＴＩＩＩおよびＦｕｃ−ＴＶＩＩトランスフェクション対から免疫沈降させたからである（図２９Ｃ）。さらにそのうえ、Ｐ−セレクチンは、いずれのフコシルトランスフェラーゼとも等量のＰＳＧＬ−１を沈殿させることができ（図２９Ｂ）、これらのトランスフェクションにおいてＦｕｃ−ＴＩＩＩおよびＦｕｃ−ＴＶＩＩは発現され、活性を有していたことが示される。
【０２００】
ＣＯＳ組み換え発現系において、高アフィニティーＥ−セレクチン認識もまた、適当なポリペプチドの存在に依存していた。ポリペプチドの長さ、見かけの分子量、および高頻度かつ特異的なタイプの翻訳後修飾はＣＤ４３およびＰＳＧＬ−１において類似しているが（Maemura, K. &Fukuda, M. (1992) J. Biol. Chem. 267, 24379-24386）、いずれのフコシルトランスフェラーゼも、同時トランスフェクションＣＯＳ細胞中の組み換えロイコシアリンに対して高アフィニティーＥ−セレクチン（またはＰ−セレクチン）認識を付与することはできなかった（図２９Ａ）。抗ＣＤ４３抗体との免疫沈降は、かなりの量のロイコシアリンがＦｕｃ−ＴＩＩＩ同時トランスフェクション体およびＦｕｃ−ＴＶＩＩ同時トランスフェクション体の両方において発現されたことを示す（図２９Ｃ）。Ｅ−セレクチンがＣＤ４３を捕捉できないことは、同時トランスフェクション細胞中のフコシルトランスフェラーゼ活性の不足によるものではなかった。ＰＳＧＬ−１またはＣＤ４３およびＦｕｃ−ＴＩＩＩまたはＦｕｃ−ＴＶＩＩのいずれかでトランスフェクションされたＣＯＳ細胞についてのＦＡＣＳ分析はすべて、ＳＬｅｘ特異的抗体ＣＳＬＥＸ−１との高レベルの反応性を示す。それゆえ、これらの結果から、高アフィニティーＥ−セレクチン認識には、特異的フコシルトランスフェラーゼにより適当に修飾された特異的ポリペプチドの存在が必要であることが示唆される。
【実施例１３】
【０２０１】
ＰＳＧＬ−１由来のペプチドによるＰ−セレクチン／ＰＳＧＬ−１結合の阻害
ＰＳＧＬ−１の配列（配列番号：２）由来の多くのペプチドを、Ｐ−セレクチン／ＰＳＧＬ−１結合を阻害する能力に関して試験した。試験したペプチドを図３０に記載する。
【０２０２】
以下のプロトコールに従って阻害を試験した。９６ウェルプレートのウェルを、４℃において、５０μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２（ｐＨ７.５）中のＰＳＧＬ−１でコーティングした。ウェルから液体を除去した後、ウェル１個あたり１５０μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０.０５％ゼラチン（ｐＨ７.５）を添加して未占領部位をブロックした。１／２時間ないし２時間後、ブロックバッファーをウェルから除去し、Ｌｅｃ−γ１（Ｐ−セレクチン−ヒトＩｇＧ Ｆｃキメラ）（２μｇ／ｍｌ）、ビオチン化ヤギ抗ヒト抗体、およびストレプトアビジン−抱合アルカリ性ホスファターゼ（３０分ないし１時間室温で拡散させた）ならびに潜在的阻害剤からなる混合物１００μｌをウェル１個あたりにつき添加した。各プレートを振盪し、プレートからブロックを除去するために強くたたいた。暗所で１時間、回転させながらインキュベーションを継続した。１５０μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０.０５％ツイン−２０で２回洗浄し、ついで、１５０μｌの１Ｍ ジエタノールアミン、０.５ｍＭ ＭｇＣｌ２で洗浄して未結合混合物をプレートから洗い流した。１０ｍＭ ＤＥＡ／０.５ｍＭ ＭｇＣｌ２中のアルカリ性ホスファターゼ用発色基質ＰＮＰＰを添加し、ついで、プレートを４０５ｎｍにおいて読んだ。
【０２０３】
これらのアッセイの結果を図３０に示す。配列番号：２のアミノ酸４８〜５１（チロシン残基がリン酸化されている）およびアミノ酸４２〜５６を含むペプチドは特に望ましい結果を示した。
【実施例１４】
【０２０４】
可溶性形態のＰＳＧＬ−１の精製
可溶性形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白の実質的な精製を下記プロトコールに従って行った。
【０２０５】
可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白Ｉ３１６（配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸３１６まで）を、本明細書記載のごとくＣＨＯ細胞において発現させた。ＣＨＯ細胞のならし培地を、分子量１００００または３００００のいずれかのカットオフのPellicon限外濾過膜ユニット（Millipore）で濃縮して、もとの体積の約１／１０とした。ついで、バッファーを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＣａＣｌ２,ｐＨ７.４と交換した。
【０２０６】
バッファー交換した濃縮物をToyopearl QAE 550C（TosoHaas）カラムに負荷した。別法として、バッファー交換工程を省略し、濃縮物１部を３部の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＣａＣｌ２,ｐＨ７.４で希釈し、ついで、カラムに負荷することもできる。４℃においてカラムをその５〜１０倍体積の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＣａＣｌ２,ｐＨ７.４で洗浄した。
【０２０７】
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＣａＣｌ２,ｐＨ７.４バッファー中の直線的グラジエント（０Ｍ ＮａＣｌから１.０Ｍ ＮａＣｌまで）を用い、カラムの約５倍の体積のところでＰ−セレクチンリガンド蛋白が溶離した。２つのピークがカラムから溶離した。第２のピークがＰ−セレクチンリガンド蛋白を含んでおり、バルクとして集めた。
【０２０８】
ＱＡＥカラムからのピークを分子量３００００カットオフの十字流限外濾過膜（Millipore）を用いて濃縮し、ついで、バッファーを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２,ｐＨ７.４と交換した。
【０２０９】
バッファー交換された濃縮物を、４℃においてJacalinアガロースカラムに一晩かけて負荷した。カラムを透析濾過バッファーで洗浄し、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白は、２０℃におけるメチルα−Ｄ−ガラクトピラノシド（０〜１００ｍＭまたは０〜５０ｍＭ）のグラジエントで溶離した。JacalinカラムからのフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、最も純度の高いフラクションをプールした。
【実施例１５】
【０２１０】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白融合物
異なるアミノ酸配列を有する、４種のＰ−セレクチンリガンド蛋白融合物を構築した。それらは４７.Ｆｃ、４７.ＡＧＰ、４７.ＢＭＰおよび４７.ＩＬ１１であった。
【０２１１】
４７.Ｆｃ：シグナルペプチド、ＰＡＣＥ開裂部位、およびもとのＦｃ配列のＨｉｓ２２４において変異したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した成熟Ｐ−セレクチンリガンド配列の最初の４７個のアミノ酸をコードするｃＤＮＡを構築した。ｃＤＮＡ構築物の配列を配列番号：３５に示す。融合ポイントはヌクレオチド２６１における新規なＮｏｔＩ部位である。ｃＤＮＡ構築物によりコードされるアミノ酸配列を配列番号：３６に示す。コードされる融合蛋白の成熟アミノ酸配列は配列番号：３６のアミノ酸４２から開始する。Ｆｃ部分における変異は、もとのＦｃ配列のＬｅｕ２３４およびＧｌｙ２３７がＡｌａに変化したものである。
【０２１２】
４７.ＡＧＰ：シグナルペプチド、ＰＡＣＥ開裂部位、および成熟ヒトＡＧＰの最初のロイシン残基に融合した成熟Ｐ−セレクチンリガンド配列の最初の４７個のアミノ酸をコードするｃＤＮＡを構築した。ｃＤＮＡ構築物の配列を配列番号：３７に示す。融合ポイントはヌクレオチド２６１における新規なＮｏｔＩ部位である。ｃＤＮＡ構築物によりコードされるアミノ酸配列を配列番号：３８に示す。コードされる融合蛋白の成熟アミノ酸配列は配列番号：３８のアミノ酸４２から開始する。
【０２１３】
４７.ＢＭＰ：シグナルペプチド、ＰＡＣＥ開裂部位、および成熟ヒトＢＭＰ−２の配列（その最初の８個のアミノ酸が欠失されている）に融合した成熟Ｐ−セレクチンリガンド配列の最初の４７個のアミノ酸をコードするｃＤＮＡを構築した。ｃＤＮＡ構築物の配列を配列番号：３９に示す。融合ポイントはヌクレオチド２６１における新規なＮｏｔＩ部位である。ｃＤＮＡ構築物によりコードされるアミノ酸配列を配列番号：４０に示す。コードされる融合蛋白の成熟アミノ酸配列は配列番号：４０のアミノ酸４２から開始する。
【０２１４】
４７.ＩＬ１１：シグナルペプチド、ＰＡＣＥ開裂部位、および成熟ヒトＩＬ−１１の配列に融合した成熟Ｐ−セレクチンリガンド配列の最初の４７個のアミノ酸をコードするｃＤＮＡを構築した。ｃＤＮＡ構築物の配列を配列番号：４１に示す。融合ポイントはヌクレオチド２６１における新規なＮｏｔＩ部位である。ｃＤＮＡ構築物によりコードされるアミノ酸配列を配列番号：４２に示す。コードされる融合蛋白の成熟アミノ酸配列は配列番号：４２のアミノ酸４２から開始する。
【０２１５】
本明細書において引用した特許および文献を、本発明に十分に記載されているものとみなす。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】コア２ありおよびなしで発現されたＰ−セレクチンリガンド蛋白の結合を比較したグラフである。
【図２】コア２ありおよびなしで発現されたＰ−セレクチンリガンド蛋白の免疫沈降のオートラジオグラフである。
【図３】Ｐ−セレクチンリガンド蛋白（コア２ありおよびなしで発現）のＰ−セレクチン／ＩｇＧキメラ（ＬＥＣ−γ１）および抗Ｐ−セレクチンリガンド蛋白モノクローナル抗体（ＭＡｂ２７５）への結合のフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図４】Ｐ−およびＥ−セレクチン／ＩｇＧキメラに結合する、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を含む蛋白のオートラジオグラフである。
【図５】配列番号：２の全長Ｐ−セレクチンリガンド蛋白の構造的特徴を図式的に示したものである。
【図６】Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合におけるＮ−結合糖鎖付加部位の役割を調べる目的で構築されたいくつかのＰ−セレクチンリガンド蛋白フラグメントを図式的に示す。
【図７】Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合におけるＮ−結合糖鎖付加部位の役割を調べるための実験結果を示す。
【図８】Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合における硫酸化チロシン残基の役割を調べる目的で構築されたいくつかのＰ−セレクチンリガンド蛋白フラグメントを図式的に示す。
【図９】Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合における硫酸化チロシン残基の役割を調べる実験の結果を示す。
【図１０】Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合における硫酸化チロシン残基の役割を調べる実験の結果を示す。
【図１１】Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合における硫酸化チロシン残基の役割を調べる実験の結果を示す。
【図１２】Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合における種々の欠失の影響を調べる目的で構築されたいくつかのＰ−セレクチンリガンド蛋白フラグメントを図式的に示す。
【図１３】実施例４（ｃ）の定量的プレート結合アッセイを図式的に示す。
【図１４】種々の欠失および変化したＰ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合を比較する実験の結果を示す。
【図１５】種々の欠失および変化したＰ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合を比較する実験の結果を示す。
【図１６】種々の欠失および変化したＰ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合を比較する実験の結果を示す。
【図１７】種々の欠失および変化したＰ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合を比較する実験の結果を示す。
【図１８】Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のアニオン性領域のセレクチン類への結合におけるチロシン残基の変化の影響を調べる目的で構築されたいくつかのＰ−セレクチンリガンド蛋白フラグメントを図式的に示す。
【図１９】種々の欠失および変化したＰ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合を比較する実験の結果を示す。
【図２０】種々の欠失および変化したＰ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合を比較する実験の結果を示す。
【図２１】種々の欠失および変化したＰ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチン類への結合を比較する実験の結果を示す。
【図２２】Ｐ−セレクチンリガンド蛋白のＰ−およびＥ−セレクチンへの結合についての提案されたモデルを示す。
【図２３】種々の欠失および変化したＰ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチンへの結合を比較する実験の結果を示す。
【図２４】種々の欠失および変化したＰ−セレクチンリガンド蛋白のセレクチンへの結合を比較する実験の結果を示す。
【図２５】すでに３／４フコシルトランスフェラーゼおよびコア２トランスフェラーゼを発現しているＣＨＯ細胞の発現産物の分析であり、ＣＨＯ細胞はｐｓＰＳＬ.Ｔ７、ΔＴＭ、Ｉ３１６またはｐｓＰＳＬ.ＱＣでトランスフェクションされており、メトトレキセートを用いて増幅された。ならし培地を直接分析するか、あるいはまずＬＥＣ−γ１で沈降させ、ついで非還元的条件下および還元的条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【図２６】Ｐ−およびＥ−セレクチンによりアフィニティー捕捉されたミエロイド細胞膜蛋白のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離である。３Ｈ−グルコサミンで代謝的に標識したＵ９３７細胞から膜溶解物を調製し、固定化Ｐ−およびＥ−セレクチンならびに対照ヒトＩｇＧ１とともにアフィニティー沈降させた。ゲル電気泳動前に溶離蛋白をＤＴＴ存在下（「還元」）または不存在下（「非還元」）で処理した。レーン：レーン１はヒトＩｇＧ１によるアフィニティー捕捉；レーン２はＰ−セレクチンによるアフィニティー捕捉；レーン３はＥ−セレクチンによるアフィニティー捕捉。
【図２７】連続的アフィニティー捕捉実験である。３Ｈ−標識Ｕ９３７溶解物種をＰ−またはＥ−セレクチンによりアフィニティー捕捉し、溶離し、ついで、抗ＰＳＧＬ−１抗血清Ｒｂ３４４３との免疫沈降に供した。レーン：１および２は、免疫前のウサギの血清（レーン１）およびＲｂ３４４３（レーン２）を用いる新鮮ミエロイド細胞膜溶解物の対照免疫沈降である。レーン３〜５は、すでにＰ−セレクチン（レーン３）、Ｅ−セレクチン（レーン４）、およびヒトＩｇＧ１（レーン５）によりアフィニティー捕捉され、ついで溶離されたミエロイド細胞膜溶解物のＲｂ３４４３との免疫沈降である。
【図２８】ミエロイド膜抽出物のＣＤ４３およびＰＳＧＬ−１含量の比較である。標識Ｕ９３７細胞抽出物を抗ＰＳＧＬ−１ウサギポリクローナル抗体Ｒｂ３４４３または抗ＣＤ４３マウスＭａｂとともに免疫沈降させ、ついでＳＤＳ−ＰＡＧＥ／オートラジオグラフィーに供した。レーン：１は、対照である免疫前のウサギ血清との免疫沈降である。２はＲｂ３４４３との免疫沈降である。３は対照イソタイプに合致するマウス抗体との免疫沈降である。４は抗ＣＤ４３抗体との免疫沈降である。
【図２９】ＣＯＳトランスフェクション実験である。ＰＳＧＬ−２またはＣＤ４３をコードするプラスミド、ならびにＦｕｃ−ＴＩＩＩまたはＦｕｃＴＶＩＩをコードするプラスミドを用いてトランスフェクションしたＣＯＳ Ｍ６細胞を３５Ｓ−メチオニンで代謝的に標識し、材料および方法において説明するように、膜をアフィニティー捕捉実験用に調製した。トランスフェクションに使用したｃＤＮＡをレーンの上に示す。（Ａ）Ｅ−セレクチン、（Ｂ）Ｐ−セレクチン、および（Ｃ）抗ＰＳＧＬ−１抗血清Ｒｂ３４４３および抗ＣＤ４３ Ｍａｂを用いて沈降を行った。
【図３０】Ｐ−およびＥ−セレクチン結合の阻害に関する種々のＰ−セレクチンリガンド蛋白のスクリーニングをまとめたものである（実施例１３参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
2008099695000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月24日(2007.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８８までを含む第１のアミノ酸配列、ここで、該第１のアミノ酸配列はＰ−セレクチンに結合するものであり；および
（ｂ）抗体に由来する第２のアミノ酸配列、ここで、天然のＦｃ配列のＬｅｕ２３４およびＧｌｙ２３７に対応するアミノ酸はアラニンに変化している；
を含む融合蛋白をコードする単離ＤＮＡ。
【請求項２】
該ヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列をさらに含む請求項１のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２のＤＮＡで形質転換された宿主細胞。
【請求項４】
（ａ）融合蛋白の発現に適した条件下で請求項３の宿主細胞を培養し；ついで、
（ｂ）融合蛋白を培地から精製する
ことを含む、融合蛋白の製造方法。
【請求項５】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸４０２までを含むものである請求項１のＤＮＡ。
【請求項６】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸３１０までを含むものである請求項１のＤＮＡ。
【請求項７】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸１８９までを含むものである請求項１のＤＮＡ。
【請求項８】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸１１８までを含むものである請求項１のＤＮＡ。
【請求項９】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８８までを含むものである請求項１のＤＮＡ。
【請求項１０】
該第２のアミノ酸配列が該第１のアミノ酸配列のＣ末端に連結されているものである請求項１のＤＮＡ。
【請求項１１】
該配列が連結配列により連結されているものである請求項１０のＤＮＡ。
【請求項１２】
該第２のアミノ酸配列が該第１のアミノ酸配列のＮ末端に連結されているものである請求項１のＤＮＡ。
【請求項１３】
該配列が連結配列により連結されているものである請求項１２のＤＮＡ。
【請求項１４】
配列番号：３５のヌクレオチド１２３からヌクレオチド９３９までのヌクレオチド配列を含む請求項９のＤＮＡ。
【請求項１５】
配列番号：３５のヌクレオチド配列を含む請求項１４のＤＮＡ。
【請求項１６】
抗体のＦｃ部分の配列がヒト抗体に由来するものである請求項１のＤＮＡ。
【請求項１７】
該ヒト抗体がアイソタイプＩｇＧ１である、請求項１６のＤＮＡ。
【請求項１８】
該ヒト抗体がアイソタイプＩｇＭである、請求項１６のＤＮＡ。
【請求項１９】
（ａ）配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８８までを含む第１のアミノ酸配列、ここで、該第１のアミノ酸配列はＰ−セレクチンに結合するものであり；および
（ｂ）抗体の配列に由来する第２のアミノ酸配列、ここで、天然のＦｃ配列のＬｅｕ２３４およびＧｌｙ２３７に対応するアミノ酸はアラニンに変化している；
を含む融合蛋白。
【請求項２０】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸４０２までを含むものである請求項１９の融合蛋白。
【請求項２１】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸３１０までを含むものである請求項１９の融合蛋白。
【請求項２２】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８８までを含むものである請求項１９の融合蛋白。
【請求項２３】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸１１８までを含むものである請求項１９の融合蛋白。
【請求項２４】
該第１のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸１８９までを含むものである請求項１９の融合蛋白。
【請求項２５】
該第２のアミノ酸配列が該第１のアミノ酸配列のＣ末端に連結されているものである請求項１９の融合蛋白。
【請求項２６】
該配列が連結配列により連結されているものである請求項２５の融合蛋白。
【請求項２７】
該第２のアミノ酸配列が該第１のアミノ酸配列のＮ末端に連結されているものである請求項１９の融合蛋白。
【請求項２８】
該配列が連結配列により連結されているものである請求項２７の融合蛋白。
【請求項２９】
配列番号：３６のアミノ酸４２からアミノ酸３１３までのアミノ酸配列を含む請求項２２の融合蛋白。
【請求項３０】
配列番号：３６のアミノ酸配列を含む請求項２９の融合蛋白。
【請求項３１】
抗体のＦｃ部分の配列がヒト抗体に由来するものである、請求項１９の融合蛋白。
【請求項３２】
該ヒト抗体がアイソタイプＩｇＧ１である、請求項３１の融合蛋白。
【請求項３３】
該ヒト抗体がアイソタイプＩｇＭである、請求項３１の融合蛋白。
【請求項３４】
請求項４の方法により製造される融合蛋白。
【請求項３５】
（ａ）配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８８からなる第１のアミノ酸配列、ここで、該第１のアミノ酸配列はＰ−セレクチンに結合するものであり；および
（ｂ）Ｐ−セレクチンリガンド以外の蛋白の配列に由来する第２のアミノ酸配列；
を含む融合蛋白をコードする単離ＤＮＡ。
【請求項３６】
（ａ）配列番号：２のアミノ酸４２からアミノ酸８８からなる第１のアミノ酸配列、ここで、該第１のアミノ酸配列はＰ−セレクチンに結合するものであり；および
（ｂ）Ｐ−セレクチンリガンド以外の蛋白の配列に由来する第２のアミノ酸配列；
を含む融合蛋白。