(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸を増幅する方法、核酸を増幅する装置、ならびに、増幅に使用するための核酸を合成するための方法および装置を提供する。【解決手段】核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域で標的核酸を変性させること；この変性標的核酸にプライマーをハイブリダイズさせること；このプライマーを伸長させて得られた産物を上記と同様に変性させること；この変性産物にプライマーをハイブリダイズさせること；このプライマーを伸長させること、を含む核酸を増幅する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を増幅する方法であって：
（ａ）  核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域と、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域とが交互するパターンを、チャンネル中に形成させること；
（ｂ）  標的核酸を、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、標的核酸を変性させること；
（ｃ）  変性させた標的核酸を、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、標的核酸にプライマーをハイブリダイズさせること；
（ｄ）  （ｃ）の工程で標的核酸にハイブリダイズさせたプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
（ｅ）  （ｄ）の工程で得られた伸長産物を、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む次の領域に接触させて、伸長産物を変性させること；
（ｆ）  変性させた伸長産物を、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む次の領域に接触させて、伸長産物にプライマーをハイブリダイズさせること；および
（ｇ）  （ｆ）の工程で伸長産物にハイブリダイズさせたプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
を含む、上記方法。
【請求項２】
（ｅ）〜（ｇ）の工程を少なくとも１回繰り返すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む前記領域と、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む前記領域とが、動電的方法により形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的核酸と前記伸長産物とが、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域、および、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域に、動電的方法により接触させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域と、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域とが、機械的方法により形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的核酸と前記伸長産物とが、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域、および、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域に、機械的方法により接触させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸ポリメラーゼが、変性剤に対して耐性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
変性剤と核酸ポリメラーゼとが、前記動電的方法によって実質的に同じ速度で移動する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
核酸に含まれる核酸配列を増幅する方法であって：
（ａ）  流体装置中にすべて配置された、第１のリザーバー、第２のリザーバー、メインチャンネル、第１のチャンネル、第２のチャンネルを提供すること、ここで、第１のチャンネルは第１のリザーバーおよびメインチャンネルと連通しており、第２のチャンネルは第２のリザーバーおよびメインチャンネルと連通しており、少なくとも１つのリザーバーは変性剤を含有する液体で充填されている；
（ｂ）  第１の変性剤濃度の変性剤を含む第１領域と第２の変性剤濃度の変性剤を含む第２領域とが交互するパターンを含んでなる濃度サイクル領域を、メインチャンネル中に形成させること、ここで、第１の変性剤濃度は第２の変性剤濃度より高く、第１領域および第２領域は２つの液体を交互にまたは異なる流速で導入することにより作られる；
（ｃ）  核酸を濃度サイクル領域に導入すること；
（ｄ）  濃度サイクル領域中を核酸に通過させること；
（ｅ）  第１の変性剤濃度領域において、核酸を変性させ、変性させた核酸を得ること；
（ｆ）  第２の変性剤濃度領域において、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズされた核酸を得ること；
（ｇ）  第２の変性剤濃度領域において、ハイブリダイズされた核酸のプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
を含む、上記方法。
【請求項１０】
核酸を通過させる前記工程が、電圧を印加することによる電気泳動によって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
変性させた核酸をハイブリダイズさせる前記工程が、変性剤を失活させることなくなされる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
（ｇ）  伸長されたプライマーとハイブリダイズした核酸を濃度サイクル領域に導入すること；
（ｈ）  濃度サイクル領域中を、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸に通過させること；
（ｉ）  第１の変性剤濃度領域において、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸を変性させ、変性された、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸を得ること；
（ｊ）  第２の変性剤濃度領域において、変性された、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸をプライマーとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズされた核酸を得ること；
（ｋ）  第２の変性剤濃度領域において、ハイブリダイズした核酸のプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸ポリメラーゼが、第１のリザーバーまたは第２のリザーバーから供給される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記流体装置がマイクロ流体装置である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のチャンネルおよび第２のチャンネルの少なくとも１つが、チャンネルの流れを制御し、濃度サイクル領域を形成するポンプを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のチャンネル、前記第２のチャンネル、および前記メインチャンネルが、チャンネル交差点において連通する、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記メインチャンネルの幅が、１μｍ〜５００μｍの範囲である、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
変性剤を含有する前記液体が、動電的効果を利用したポンプにより供給される、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の変性剤濃度が、第１の変性剤濃度の０〜９０％の範囲である、請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
核酸を増幅するための装置であって：
（ａ）  第１のリザーバー、第２のリザーバー、第１のチャンネルおよび第２のチャンネル、ここで、第１のリザーバーおよび第２のリザーバーは第１のチャンネルおよび第２のチャンネルにそれぞれ連通し、第１のリザーバーおよび第２のリザーバーの少なくとも１つは、変性剤を含有する液体を貯蔵する；
（ｂ）  第１のチャンネルおよび第２のチャンネルと連通するメインチャンネル、ここで、第１の濃度で変性剤を含有する第１領域と第２の濃度で変性剤を含有する第２領域とが交互するパターン（ここで、第１の濃度は第２の濃度より高い）、第１領域、および第２領域は、第１リザーバーおよび第２リザーバーに貯蔵された２つの液体を交互または異なる流速で導入することにより形成され、ここで、核酸を第１領域と第２領域との交互パターンに接触させることにより核酸が増幅される；および
（ｃ）  サンプルリザーバーおよびサンプルチャンネル、ここで、サンプルリザーバーはサンプルチャンネルによりメインチャンネルまで連通し、サンプルリザーバーには増幅される核酸が貯蔵される；
を含んでなる、上記装置。
【請求項２１】
第１および第２のリザーバーに貯蔵された液体をメインチャンネルに導入するポンプ；および
サンプルリザーバーに貯蔵されたサンプルをメインチャンネルに導入するポンプ；
をさらに含む、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
核酸を合成する方法であって：
（ａ）  核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域と、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域との交互パターンを、チャンネル中に形成させること；
（ｂ）  標的核酸を、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、標的核酸を変性させること；
（ｃ）  変性させた標的核酸を、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、変性させた標的核酸にプライマーをハイブリダイズさせること；および
（ｄ）  （ｃ）の工程で標的核酸にハイブリダイズしたプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
を含む、上記方法。
【請求項２３】
（ａ）  核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域と、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域との交互パターンを、チャンネル中に形成させること；
（ｂ）  プレ標的核酸を、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、プレ標的核酸を変性させること；
（ｃ）  変性させたプレ標的核酸を、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、プレ標的核酸にプライマーをハイブリダイズさせること；および
（ｄ）  （ｃ）の工程でプレ標的核酸にハイブリダイズしたプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
を含む標的核酸を合成する方法をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は主に核酸処理の分野に関する。より具体的には、本発明は、核酸を増幅する方法、核酸を増幅する装置、ならびに、増幅に使用する核酸を合成するための方法および装置を提供する。
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、生物学的分析において最も重要な技術の一つである。ＰＣＲは、ヒトゲノムプロジェクトにおいて重要な役割を果たし、個々のゲノム情報を得ることが必要になるポストゲノム時代においても欠かすことができない。しかし、核酸分析は現在でも比較的高価であり、個人に適用するほどには迅速に得ることができない。ＰＣＲは、最も高価で時間のかかる手順の一つである。というのも、ＰＣＲは、高価な試薬（特に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）および時間のかかる熱サイクルが必要となるからである。より安価で迅速な代替法に対する需要は大きい。
【０００３】
ＰＣＲは、1985年、Mullisによって最初に開発された（Science, 20 December 1985, v. 230 (4732): 1350-1354）。典型的には、ＰＣＲは３ステップからなる熱サイクルを必要とする。すなわち、変性工程、アニール工程、および伸長工程である。これらの工程は、典型的には２５〜４０回繰り返される。反応緩衝液は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTPs）、MgCl2およびKClを含有する。MgCl2はＤＮＡポリメラーゼ活性に必須であり、KClは適切な変性を制御するために有用である。ＰＣＲに使用するＤＮＡポリメラーゼは、熱サイクルにおいて活性を維持すべく耐熱性であるべきである。この事実によってＰＣＲのコストは増大する。というのは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは比較的高価だからである。
【０００４】
数ミリメートルから数平方センチメートルの大きさの１つのチップ上に研究室機能を集積（複合化）したラボオンチップ（Lab-on-a-chip：LOC）技術は、分析時間および試薬消費量を減少させ得るため、より安価で迅速なＰＣＲに対する解決策を提供し得る。オンチップＰＣＲは過去１０年間活発な研究の対象であった（Anal Bioanal Chem (2003) 377 : 820-825；Lab Chip, 2004, 4, 534- 546；Anal. Chem. 2005, 77, 3887-3894）。オンチップＰＣＲはＰＣＲチップとも呼ばれる。２つのタイプのＰＣＲチップが存在する。つまり、シンプルウェルタイプと連続フロータイプである。シンプルウェルタイプのＰＣＲチップは小容量の反応ベッセルからなり、そこでＰＣＲが行われる。連続フロータイプのＰＣＲチップは蛇行チャンネルと３つの温度制御領域からなる。サンプルと反応緩衝液との混合物が、チャンネル中の３つの温度制御領域を繰り返し通過し、その結果、ＰＣＲ反応が起こる。ＰＣＲチップの性能は、伝統的なＰＣＲよりも、スピード、処理能力および反応容量の点で優れている。
【０００５】
シンプルウェルタイプのＰＣＲチップは、反応容量の少量化にすぎない。典型例は、微細加工技術によるシリコンウエハ上へのマイクロチャンバーの作製である（Anal. Chem. 2004, 76, 6434-6439）。このタイプのＰＣＲチップによれば、反応容量を小さくし、数多くの反応ウェルを配置し、結果として処理能力を増加させることは容易である。さらに、ＰＣＲとCEとをマイクロチップ上に集積することも容易である（Anal. Chem. 1996, 68, 4081-4086；Anal. Chem. 1998, 70, 158-162；Anal. Chem. 2004, 76, 3162-3170）。しかし、マイクロチップ全体を熱サイクル化するには、従来のＰＣＲ法と同様のＰＣＲ反応時間が必要である。したがって、マイクロチップ上に小型ヒーターと温度センサーを作りつけ、それによって、各工程間での迅速な温度移行を達成している（Anal. Chem. 2004, 76, 3162-3170）。しかし、これらのチップには比較的複雑な加工方法が必要となり、そのため製造コストが増大する。使用するＰＣＲチップは、たがいの汚染を防ぐために使い捨てである。
【０００６】
連続フロータイプのＰＣＲチップは、Koppらによって1998年に最初に報告された（SCIENCE, VOL. 280, 15 MAY, 1998, 1046-1048）。このタイプのＰＣＲチップは、蛇行チャンネルと３つの異なる温度領域からなる。サンプルと試薬との混合物が、蛇行チャンネル中の３領域を繰り返し通過する。この３つの領域は、変性、アニールおよび伸長に必要とされる温度に制御されている。このタイプのＰＣＲチップは、チップ全体の温度を変化させる必要がない。したがって、反応が極めて迅速であり、その結果、非特異的増幅が減少する。しかし、サイクル数が固定される。マイクロチャンネルのデザインによってサイクル数があらかじめ決定され、それを変更することができない。また、並列化も困難である。
先行技術
【０００７】
しかし、上述したシンプルウェルタイプおよび連続フロータイプのＰＣＲチップには改善の余地があり、これまでＰＣＲチップの修正がなされている。例えば、Liuらは、ＰＣＲ用の回転デバイスを報告している（電気泳動 2002, 23, 1531-1536）。このデバイスによって、サンプルと試薬の混合物が３つの異なる温度領域間を回転することができる。Krishnanらは、レイリー・ベルナール（Rayleigh-Benard）対流セル中でＰＣＲを行った（SCIENCE VOL 298 25 OCTOBER 2002）。Chenらは、動電的に同調したＰＣＲチップであって、４つの電極のそれぞれが１つのループの４つの異なる角に設置されたものを報告している（Anal. Chem. 2005, 77, 658-666）。サンプルがループに注入されると、ループの反対の２つの角に電場がかけられる。電場がかけられたループの部分はサンプルの位置と同調し、１つのループチャンネル中でサンプルを回転させることができる。
【０００８】
一方、KnappらおよびOgiwaraらは、熱サイクルが不要のＰＣＲを提案している。Knappらは、変性剤を用いることによる非熱的な核酸増幅デバイスおよび核酸増幅方法を提案した（特表2001-521622：国際公開WO1998/045481に係る国際出願に基づく）。このデバイスおよび方法は熱サイクルを必要とせず、それゆえ、熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。しかし、このデバイスおよび装置は、アニーリングおよび重合に関し各サイクルごとに反応緩衝液の希釈、中和、脱塩が必要となる。さらに、各変性工程において変性剤によるＤＮＡポリメラーゼの不活性化が生じる。チャンネルデザインによってサイクル数があらかじめ決定され、変更することができない。正確で複雑な液体操作と数多くのチャンネルが必要となる。
【０００９】
また、Ogiwaraらは、変性剤を用いるＤＮＡ増幅装置および方法を提案している(特開2005-6504)。この装置および方法は、一定温度でＤＮＡ増幅を行うことができ、そのため、一般的なＤＮＡポリメラーゼが使用される。しかし、この装置および方法では、アニーリングおよび重合に反応緩衝液の中和が必要になる。したがって、反応緩衝液の容量がサイクルごとに増加する。さらに、各変性工程において変性剤によるＤＮＡポリメラーゼの失活化が生じる。チャンネルデザインによりサイクル数があらかじめ決定され、変更することができないようである。正確で複雑な液体操作と数多くのチャンネルが必要となる。
発明の概要
【００１０】
上記したように、ＰＣＲを改善する余地は現在でも多く残されている。より安価で、より迅速かつ簡便な方法でＰＣＲを行うことに対する要望は依然として大きい。特に、これまでに提案されてきた従来のＰＣＲチップやそれを用いる方法は、熱サイクルおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを必要とするため、依然として、時間がかかり、高価であった。あるいは、熱サイクルの代わりに変性剤を使用することによって、熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用することができるものの、反応緩衝液の希釈、中和または脱塩がアニーリングおよび伸長に必要となる。さらに、変性工程ごとに、変性剤によるＤＮＡポリメラーゼの失活が生じる。サイクル数が、チャンネルデザインによりあらかじめ決まってしまい、変更することができない。１つの観点において本発明は、これらの問題を解決するための方法と装置を提供することに関する。
【００１１】
１つの観点において本発明は、より安価で、より迅速かつ簡便な方法で核酸を増幅し得る方法および装置を提供する。特に、本発明は、実質的に一定の温度にて、希釈、中和または脱塩という特別の手順なしに核酸を増幅できる方法および装置を提供しうる。また、本発明は、チャンネルデザインの変更という特別の配慮をすることなく、サイクル数を変更することができる方法および装置を提供しうる。さらに、本発明は、変性工程ごとに核酸ポリメラーゼを失活させるという特別の手順が不要な、核酸を増幅する方法および装置を提供しうる。
【００１２】
他の観点において本発明は、核酸を増幅する方法および装置を提供しうる。また、本発明は、核酸を合成する方法および装置を提供しうる。さらに他の観点において本発明は、異なる濃度の変性剤を含有する複数の領域をチャンネル中に形成する方法である。
【００１３】
以下に限定されるものではないが、本発明は以下を含む。
【００１４】
（１）  核酸を増幅する方法であって：
（ａ）  核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域と、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域とが交互するパターンを、チャンネル中に形成させること；
（ｂ）  標的核酸を、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、標的核酸を変性させること；
（ｃ）  変性させた標的核酸を、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、標的核酸にプライマーをハイブリダイズさせること；
（ｄ）  （ｃ）の工程で標的核酸にハイブリダイズさせたプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
（ｅ）  （ｄ）の工程で得られた伸長産物を、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む次の領域に接触させて、伸長産物を変性させること；
（ｆ）  変性させた伸長産物を、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む次の領域に接触させて、伸長産物にプライマーをハイブリダイズさせること；および
（ｇ）  （ｆ）の工程で伸長産物にハイブリダイズさせたプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
を含む、上記方法。
【００１５】
（２）  （ｅ）〜（ｇ）の工程を少なくとも１回繰り返すことをさらに含む、（１）に記載の方法。
【００１６】
（３）  核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む前記領域と、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む前記領域とが、動電的方法により形成される、（１）に記載の方法。
【００１７】
（４）  前記標的核酸と前記伸長産物とが、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域、および、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域に、動電的方法により接触させられる、（１）に記載の方法。
【００１８】
（５）  核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域と、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域とが、機械的方法により形成される、（１）に記載の方法。
【００１９】
（６）  前記標的核酸と前記伸長産物とが、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域、および、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域に、機械的方法により接触させられる、（１）に記載の方法。
【００２０】
（７）  前記核酸ポリメラーゼが、変性剤に対して耐性を有する、（１）に記載の方法。
【００２１】
（８）  変性剤と核酸ポリメラーゼとが、前記動電的方法によって実質的に同じ速度で移動する、（３）に記載の方法。
【００２２】
（９）  核酸に含まれる核酸配列を増幅する方法であって：
（ａ）  流体装置中にすべて配置された、第１のリザーバー、第２のリザーバー、メインチャンネル、第１のチャンネル、第２のチャンネルを提供すること、ここで、第１のチャンネルは第１のリザーバーおよびメインチャンネルと連通しており、第２のチャンネルは第２のリザーバーおよびメインチャンネルと連通しており、少なくとも１つのリザーバーは変性剤を含有する液体で充填される；
（ｂ）  第１の変性剤濃度の変性剤を含む第１領域と第２の変性剤濃度の変性剤を含む第２領域とが交互するパターンを含んでなる濃度サイクル領域を、メインチャンネル中に形成させること、ここで、第１の変性剤濃度は第２の変性剤濃度より高く、第１領域および第２領域は２つの液体を交互にまたは異なる流速で導入することにより作られる；
（ｃ）  核酸を濃度サイクル領域に導入すること；
（ｄ）  核酸に濃度サイクル領域中を通過させること；
（ｅ）  第１の変性剤濃度領域において、核酸を変性させ、変性された核酸を得ること；
（ｆ）  第２の変性剤濃度領域において、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズされた核酸を得ること；および
（ｇ）  第２の変性剤濃度領域において、ハイブリダイズされた核酸のプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
を含む、上記方法。
【００２３】
（１０）  核酸を通過させる前記工程が、電圧を適用することによる電気泳動によって行われる、（９）に記載の方法。
【００２４】
（１１）  変性させた核酸をハイブリダイズさせる前記工程が、変性剤を失活させることなくなされる、（９）に記載の方法。
【００２５】
（１２）  （ｇ）  伸長されたプライマーとハイブリダイズした核酸を濃度サイクル領域に導入すること；
（ｈ）  濃度サイクル領域中を、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸に通過させること；
（ｉ）  第１の変性剤濃度領域において、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸を変性させ、伸長プライマーとハイブリダイズした変性された核酸を得ること；
（ｊ）  第２の変性剤濃度領域において、伸長プライマーとハイブリダイズした変性された核酸とプライマーとをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズされた核酸を得ること；
（ｋ）  第２の変性剤濃度領域において、ハイブリダイズした核酸のプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
をさらに含む、（９）に記載の方法。
【００２６】
（１３）  前記核酸ポリメラーゼが、第１のリザーバーまたは第２のリザーバーから供給される、（９）に記載の方法。
【００２７】
（１４）  前記流体装置がマイクロ流体装置である、（９）に記載の方法。
【００２８】
（１５）  前記第１のチャンネルおよび第２のチャンネルの少なくとも１つが、チャンネルの流れを制御し、濃度サイクル領域を形成するポンプを有する、（９）に記載の方法。
【００２９】
（１６）  前記第１のチャンネル、前記第２のチャンネル、および前記メインチャンネルが、チャンネル交差点において連通する、（９）に記載の方法。
【００３０】
（１７）  前記メインチャンネルの幅が、１μｍ〜５００μｍの範囲である、（９）に記載の方法。
【００３１】
（１８）  変性剤を含有する前記液体が、動電的効果を利用したポンプにより供給される、（９）に記載の方法。
【００３２】
（１９）  前記第２の変性剤濃度が、第１の変性剤濃度の０〜９０％の範囲である、（９）に記載の方法。
【００３３】
（２０）  核酸を増幅するための装置であって：
（ａ）  第１のリザーバー、第２のリザーバー、第１のチャンネルおよび第２のチャンネル、ここで、第１のリザーバーおよび第２のリザーバーは第１のチャンネルおよび第２のチャンネルにそれぞれ連通し、第１のリザーバーおよび第２のリザーバーの少なくとも１つは、変性剤を含有する液体を貯蔵する；
（ｂ）  第１のチャンネルおよび第２のチャンネルと連通するメインチャンネル、ここで、第１の濃度で変性剤を含有する第１領域と第２の濃度で変性剤を含有する第２領域とが交互するパターン（ここで、第１の濃度は第２の濃度より高い）、第１領域、および第２領域は、第１リザーバーおよび第２リザーバーに貯蔵された２つの液体を交互または異なる流速で導入することにより形成され、核酸を第１領域と第２領域との交互パターンに接触させることにより核酸が増幅される；および
（ｃ）  サンプルリザーバーおよびサンプルチャンネル、ここで、サンプルリザーバーはサンプルチャンネルによりメインチャンネルまで連通し、サンプルリザーバーには増幅される核酸が貯蔵される；
を含んでなる、上記装置。
【００３４】
（２１）  第１および第２のリザーバーに貯蔵された液体をメインチャンネルに導入するポンプ；および
サンプルリザーバーに貯蔵されたサンプルをメインチャンネルに導入するポンプ；
をさらに含む、（２０）に記載の装置。
【００３５】
（２２）  核酸を合成する方法であって：
（ａ）  核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域と、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域との交互パターンを、チャンネル中に形成させること；
（ｂ）  標的核酸を、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、標的核酸を変性させること；
（ｃ）  変性させた標的核酸を、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、変性させた標的核酸にプライマーをハイブリダイズさせること；および
（ｄ）  （ｃ）の工程で標的核酸にハイブリダイズしたプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
を含む、上記方法。
【００３６】
（２３）  （ａ）  核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域と、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域との交互パターンを、チャンネル中に形成させること；
（ｂ）  プレ標的核酸を、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、プレ標的核酸を変性させること；
（ｃ）  変性させたプレ標的核酸を、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、プレ標的核酸にプライマーをハイブリダイズさせること；および
（ｄ）  （ｃ）の工程でプレ標的核酸にハイブリダイズしたプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
を含む前記標的核酸を合成する方法をさらに含む、（１）に記載の方法。
【００３７】
（２４）  （ａ）  核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域と、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域との交互パターンを、チャンネル中に形成させること；
（ｂ）  プレ標的核酸を、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、プレ標的核酸を変性させること；
（ｃ）  変性させたプレ標的核酸を、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、変性させたプレ標的核酸にプライマーをハイブリダイズさせること；および
（ｄ）  （ｃ）の工程でプレ標的核酸にハイブリダイズしたプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
を含む標的核酸を合成する方法をさらに含む、（１）に記載の方法。
また、本発明は、（ａ）標的核酸をプレ標的核酸から合成する工程と（ｂ）標的核酸を増幅する工程とを含んでなる標的核酸を増幅する方法であって、
前記標的核酸合成工程（ａ）が以下の工程（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）  核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域と、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域との交互パターンを、チャンネル中に形成させること；
（ｉｉ）  プレ標的核酸を、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、プレ標的核酸を変性させること；
（ｉｉｉ）  変性させたプレ標的核酸を、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、変性させたプレ標的核酸をプライマーとハイブリダイズさせること；
（ｉｖ）  工程（ｉｉｉ）でプレ標的核酸とハイブリダイズさせたプライマーを、核酸ポリメラーゼによって伸長し、標的核酸を入手すること；
を含んでなり、前記標的核酸増幅工程（ｂ）が以下の工程（ｖ）〜（ｘｉ）：
（ｖ）  流体装置中にすべて配置された、第１のリザーバー、第２のリザーバー、メインチャンネル、第１のチャンネル、第２のチャンネルを提供すること、ここで、第１のチャンネルは第１のリザーバーおよびメインチャンネルと連通しており、第２のチャンネルは第２のリザーバーおよびメインチャンネルと連通しており、少なくとも１つのリザーバーは変性剤を含有する液体で充填される；
（ｖｉ）  第１の変性剤濃度の変性剤を含む第１領域と第２の変性剤濃度の変性剤を含む第２領域とが交互するパターンを含んでなる濃度サイクル領域を、メインチャンネル中に形成させること、ここで、第１の変性剤濃度は第２の変性剤濃度より高く、第１領域および第２領域は２つの液体を交互にまたは異なる流速で導入することにより作られる；
（ｖｉｉ）  標的核酸を濃度サイクル領域に導入すること；
（ｖｉｉｉ）  標的核酸に濃度サイクル領域中を通過させること；
（ｉｘ）  第１の変性剤濃度領域において、標的核酸を変性させ、変性された核酸を得ること；
（ｘ）  第２の変性剤濃度領域において、変性させた標的核酸にプライマーをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズされた核酸を得ること；および
（ｘｉ）  第２の変性剤濃度領域において、ハイブリダイズされた核酸のプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
を含んでなる、上記方法を提供する。
本発明のさらなる適用範囲は、以下の詳細な説明によって明らかになるであろう。
図面の簡単な説明
本発明は、以下の詳細な説明および添付の図面によりさらに十分に理解されるであろう。以下の詳細な説明および添付の図面は、説明のためのものであって、本発明を限定するものではない。
【００３８】
図１は、本発明の装置の一例を示す概略図である。
【００３９】
図２は、本発明の装置の他の例を示す概略図である。
【００４０】
図３は、本発明の装置の他の例を示す概略図である。
【００４１】
図４は、本発明の装置の他の例を示す概略図である。
【００４２】
図５は、本発明の装置の他の例を示す概略図である。
図面中の符号の説明
１：濃度サイクル領域形成部
２：濃度サイクルチャンネル
３：サンプル部
４：変性剤緩衝液リザーバー
５：緩衝液リザーバー
６：変性剤緩衝液チャンネル
７：緩衝液チャンネル
８：サンプルリザーバー
９：サンプル注入チャンネル
１０：廃液リザーバー
１１：サンプル廃液リザーバー
１２：サンプル注入領域
発明の詳細な説明
【００４３】
本発明において使用する増幅反応には、ＰＣＲおよび本技術分野において周知の他の増幅反応が含まれる。
【００４４】
本発明において使用する核酸には、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡおよび２本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが含まれる。本明細書で使用するように、「標的核酸」という語は、増幅対象の特定の核酸配列を含む初めの核酸である。標的核酸は、血液、細胞、食品などの生物学的サンプルまたは環境試料（例えば、土壌、河川、海水、活性汚泥、またはメタン発酵汚泥など）から得ることができる。
【００４５】
本発明において使用するプライマーは、本技術分野で周知の方法によって調製することができる。プライマーは、プライマーがハイブリダイズする核酸鎖の配列に十分に相補的であるが、これは、プライマーがハイブリダイズする核酸鎖の配列に完全には相補的でないこと意味する。本発明の１つの態様において、プライマーは、サンプルを含有する溶液（以下、この溶液を「サンプル溶液」という）に含まれる。本発明の他の態様において、プライマーは、すべての溶液あるいは緩衝液に含まれる。
【００４６】
本発明において使用する核酸ポリメラーゼには、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントなどの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ；逆転写酵素；および、ＲＮＡレプリカーゼなどのＲＮＡポリメラーゼが含まれる。また、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼおよびＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなどの耐熱性ポリメラーゼを、本発明において使用することもできる。１つの態様において、耐熱性ポリメラーゼが使用される。もちろん、所望により異なる核酸ポリメラーゼの混合物を使用することも本発明の範疇である。また、所望により異なるタイプの核酸ポリメラーゼの混合物を使用することも本発明の範疇である。
【００４７】
本発明において使用する変性剤には、（１）カオトロピック剤（例えば、ホルムアミド、尿素、およびグアニジン塩酸塩）および（２）カオトロピック剤の混合物が含まれる。ｐＨを高くする塩基およびｐＨを低くする酸も、変性剤として使用することができる。さらに、核酸間の水素結合を阻害する薬剤を、本発明の変性剤として使用できる。本発明の変性剤は、正または負の電荷を有するか電気的に中性であることができる。
【００４８】
本発明において使用するチャンネルには、キャピラリーやマイクロチップ上に形成されたマイクロチャンネルが含まれる。キャピラリーの直径およびマイクロチャンネルの幅および深さは、好ましくは１μｍ〜５００μｍであり、より好ましくは１０μｍ〜１００μｍである。マイクロチャンネルの形状としては、これに限定されるものではないが、長方形、三角形、台形、および円形が挙げられる。本発明において、濃度サイクル領域が形成されるチャンネルを、濃度サイクルチャンネルまたはメインチャンネルと呼ぶ。
【００４９】
マイクロチップは、典型的には２枚の基板から構成されるが、１枚の基板から構成されてもよい。マイクロチップが２枚の基板から構成される場合、チャンネルを１枚の基板に微細加工技術により形成し、リザーバー用の穴を他の基板に穿孔（drilling）や打ち抜きなどの機械加工により作製する。これら２枚の基板を接合法により接合し、チャンネルおよびリザーバーをあらかじめ決まった位置に有するマイクロチップが作製される。本技術分野の当業者によく知られているように、本発明のマイクロチップは、マイクロ流体装置、マイクロチップラボラトリーとも呼ばれ、本発明のマイクロチップは、マイクロ流体装置、マイクロチップラボラトリーなどと呼ぶことができる。
【００５０】
マイクロチップを作製するために使用する材料としては、これに限定されないが、シリコーン樹脂（例えば、ポリ（ジメチルシロキサン））；アクリル樹脂（例えば、ポリ（メチルメタクリレート））；ポリカーボネート；ポリエーテルエーテルケトン；および環状オレフィンコポリマーなどのポリマーが挙げられる。ガラス、石英ガラスおよびシリコンを、マイクロチップを作製するための材料として使用することもできる。 
【００５１】
ポリマー材料にチャンネルを形成する微細加工技術には、ホットエンボス加工、射出成形、鋳造、およびソフトリソグラフィーなどの複製法；レーザーアブレーション、プラズマエッチング、Ｘ線リソグラフィー、LIGA、積層化、エンドミル加工などの直接製造法が含まれる。ポリマー材料に用いる接合法としては、熱接合、接着、超音波溶接、酸素プラズマ、およびラミネート法が挙げられる。
【００５２】
ガラス、石英ガラスおよびシリコン材料にチャンネルを形成する微細加工技術には、フォトリソグラフィーが含まれる。チャンネルは、等方性エッチング、異方性エッチングおよび電気化学エッチングなどのウェットエッチング；ならびに、プラズマエッチングや反応性イオンエッチングなどのドライエッチングにより作製される。ガラス、石英ガラスおよびシリコン材料に使用する接合法としては、アノード接合、熱接合およびHF接合が挙げられる。
【００５３】
本明細書で使用するように、動電的ポンプは、印加された電場における分子や粒子などの物質の動きを利用したポンプと定義される。本発明において使用する動電的ポンプには、電気浸透流、電気泳動、誘電泳動、およびこれらの組み合わせが含まれる。一方、機械的ポンプは、可動部を有するポンプと定義される。本発明において使用する機械的ポンプには、シリンジポンプ、隔膜ポンプ、蠕動ポンプ、ギアポンプおよびターボポンプが含まれる。
【００５４】
「実質的に同じ速度」という語は、速度の違いがある程度許容されることを意味する。具体的には、速度の違いは、プライマーの伸長が生じる領域において、標的核酸と伸長産物がその領域を通り抜けるか通過するまで、核酸ポリメラーゼの一部が次の高変性剤領域に接触せず、核酸ポリメラーゼがその活性を維持する程度において、許容される。核酸ポリメラーゼの許容される速度は、変性剤速度の５％以内である。しかし、当然のことながら、速度の許容される違いは、高濃度領域と低濃度領域の長さ；サイクル数；変性、ハイブリダイゼーションおよび伸長に必要な時間；標的核酸、伸長産物、核酸ポリメラーゼおよび変性剤の電気泳動速度；電気浸透流の速度；ならびに、機械的送液の速度などの種々の条件に依存する。アノード方向への標的核酸および伸長産物の典型的電気泳動速度は、１０μｍ／秒〜１ｍｍ／秒である。カソード方向への電気浸透流の典型的速度は、１０μｍ／秒〜１ｍｍ／秒である。カソード方向への変性剤の典型的速度は、尿素やホルムアミドを変性剤として使用する場合、１０μｍ／秒〜１ｍｍ／秒である。例えば、低濃度領域の長さが９ｍｍ、サイクル数が３０、標的核酸と伸長産物の電気泳動速度がアノード方向に３００μｍ／秒、変性剤と電気浸透流の速度がカソード方向に２００μｍ／秒である場合、核酸ポリメラーゼの許容される速度は、変性剤速度の５％以内である。
【００５５】
本発明において用いられる「変性剤に対する耐性」という語は、物質が変性剤含有溶液中においてその活性を維持することができること、または、物質が変性剤に接触した後その活性を回復することができることを意味する。「ハイブリダイズするために十分な量の変性剤を含有する」という語は、「ハイブリダイズするために十分少量の変性剤を含有する」という語と同義である。
【００５６】
本明細書で使用するように、「プレ標的核酸」という語は、特定の核酸配列を増幅するために使用する標的核酸の合成のためのテンプレートとして使用される核酸である。
【００５７】
本発明は、少なくとも１つの標的核酸に存在する少なくとも１つの特定の核酸配列を増幅することができる。標的核酸は典型的には２本鎖である。好ましい態様において、本発明は、マイクロチップ上のチャンネルで行われる。
【００５８】
本発明において、増幅は、チャンネル中に形成された「濃度サイクル領域」で行われる。本明細書で使用するように、「濃度サイクル領域」という語は、異なる濃度の変性剤を含有する少なくとも２つの領域（つまり、（ａ）高濃度で変性剤を含有する領域（「高濃度領域」）と（ｂ）低濃度で変性剤を含有する領域（「低濃度領域」））の交互パターンを含んでなる領域を意味する。本発明においては、１つの高濃度領域と１つの低濃度領域からなる領域を１「サイクル」とする。つまり、本発明の濃度サイクル領域は、１または２以上のサイクルを含んでなる。さらに、異なる濃度の変性剤を含有する少なくとも２つの領域のそれぞれは、それぞれ、第１領域、第２領域、第３領域などとされる。１つの態様において、第１領域の変性剤濃度は、第２領域の変性剤濃度よりも高い。第２領域の濃度は、好ましくは第１領域の変性剤濃度の０〜９０％の範囲であり、より好ましくは０〜７０％の範囲であり、最も好ましくは０〜５０％の範囲である。
【００５９】
本発明の１つの態様において、サイクルには、異なる濃度の変性剤を含有する領域が２つ（すなわち、低濃度領域と高濃度領域）のみ含まれる。この態様において、核酸変性工程は高濃度領域で行うことができ、プライマーのハイブリダイズ工程および伸長工程は低濃度領域で行うことができる。
【００６０】
他の態様において、濃度サイクルは、異なる濃度の変性剤を含有する３つの領域、すなわち、低濃度領域、中濃度領域および低濃度領域を含んでなる。この態様においては、変性工程を高濃度領域で行うことができ、ハイブリダイズ工程および伸長工程を低濃度領域および中濃度領域でそれぞれ行うことができる。
【００６１】
本発明において、各サイクルは、同じパターンで高濃度領域と低濃度領域とを有する必要はない。各サイクルの長さは異なっていてよい。高濃度領域と低濃度領域の長さは、各サイクルにおいて異なっていてよい。高濃度領域と低濃度領域の変性剤濃度は、各サイクルで異なっていてよい。具体的には、あるサイクルにおける低濃度領域の変性剤濃度を低くすることにより、好ましくない非特異的産物を抑制することができる。
【００６２】
高変性剤濃度領域の変性剤濃度や温度を初めとする適切な条件は、増幅産物、標的核酸、プライマー、核酸ポリメラーゼなどの種々の性質に基づいて決定することができる。例えば、適切な条件は、核酸のＴｍやＧＣ含量などに基づいて決定することができる。
【００６３】
１つの観点において、本発明は、核酸を増幅する方法であって：
（ａ）  核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域と、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域とが交互するパターンを、チャンネル中に形成させること；
（ｂ）  標的核酸を、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、標的核酸を変性させること；
（ｃ）  変性させた標的核酸を、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、標的核酸にプライマーをハイブリダイズさせること；
（ｄ）  （ｃ）の工程で標的核酸にハイブリダイズさせたプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
（ｅ）  （ｄ）の工程で得られた伸長産物を、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む次の領域に接触させて、伸長産物を変性させること；
（ｆ）  変性させた伸長産物を、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む次の領域に接触させて、伸長産物にプライマーをハイブリダイズさせること；および
（ｇ）  （ｆ）の工程で伸長産物にハイブリダイズさせたプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
（ｈ）  所望により、（ｅ）〜（ｇ）の工程を少なくとも１回繰り返すこと；
を含んでなる上記方法を提供する。
【００６４】
この態様においては、高濃度領域は「核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域」、低濃度領域は「変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域」に対応する。
【００６５】
本発明において、核酸配列は以下のように増幅される。まず、濃度サイクル領域をチャンネル中に形成させる。次いで、標的核酸が濃度サイクル領域を通り抜けて、核酸配列が増幅される。
【００６６】
本発明において、標的核酸は、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む最初の領域（最初の高濃度領域）に接触させられて、標的核酸が２つの１本鎖核酸に変性させられる。次いで、変性された標的核酸が、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む最初の領域（最初の低濃度領域）に接触させられて、変性された２つの１本鎖核酸がプライマーとハイブリダイズする。典型的な態様において、プライマー数は２である。次いで、各プライマーが、核酸ポリメラーゼによって伸長され、２本鎖核酸が形成される。２つのプライマーのそれぞれは、２つの１本鎖核酸のそれぞれの配列に十分に相補的であるよう設計されるため、２つのプライマーのそれぞれは、２つの１本鎖核酸のそれぞれにハイブリダイズすることができる。次の高濃度領域において、最初のサイクルで生じた伸長産物が２つの１本鎖核酸に変性される。次の低濃度領域において、２つのプライマーのそれぞれが２つの１本鎖核酸のそれぞれにハイブリダイズする。次いで、２つのプライマーのそれぞれが伸長され、２本鎖核酸が形成される。
【００６７】
本発明において、変性工程、ハイブリダイズ工程および伸長工程は、伸長産物が濃度サイクル領域を通り抜けるか濃度サイクルチャンネルを通過する際に、自動的に繰り返される。このように、チャンネルに形成された少なくとも２つのサイクルを核酸が通り抜けるか通過する際に、２つのプライマーがハイブリダイズする２領域間で特定の核酸配列が増幅される。本発明の１つの態様において、チャンネル中に形成された複数のサイクルを含んでなる濃度サイクル領域を核酸が通過するか通り抜ける際に、変性工程、ハイブリダイズ工程および伸長工程のそれぞれが繰り返される。１つの態様において、濃度サイクル領域に含まれるサイクル数は２〜５０であってよい。サイクルの繰り返し回数は、増幅物の回収率が効果的に向上するよう決定することができる。
【００６８】
本発明は１つの態様において、標的核酸および伸長産物が１サイクルを通り抜けるのに要する時間は、２００ミリ秒〜４０分間であってよく、より好ましくは２秒〜６分間であり、よりいっそう好ましくは２秒〜２分間である。標的核酸および伸長産物を変性するのに要する時間は、１００ミリ秒〜１０分間であってよく、より好ましくは１秒〜３分間、よりいっそう好ましくは１秒〜１分間である。プライマーを伸長するのに要する時間は、１００ミリ秒〜３０分間であってよく、より好ましくは１秒〜３分間、よりいっそう好ましくは１秒〜１分間である。しかし、当然ながら、標的核酸および伸長産物を変性するのに要する時間は、核酸の長さ、温度、高濃度領域の変性剤濃度およびイオン濃度などの種々の要因に依存する。さらに、当然ながら、プライマーを伸長するのに要する時間は、使用する核酸ポリメラーゼの活性に依存する。
【００６９】
本発明の１つの態様において、高濃度領域の長さは、１０μｍ〜１０ｃｍであってよく、より好ましくは１００μｍ〜５ｃｍ、よりいっそう好ましくは１ｍｍ〜３ｃｍである。しかし、当然ながら、高濃度領域の長さは、核酸の移動度および長さ、温度およびイオン濃度などの種々の要因に依存する。低濃度領域の長さは、１０μｍ〜１０ｃｍであってよく、より好ましくは１００μｍ〜５ｃｍ、よりいっそう好ましくは１ｍｍ〜３ｃｍである。しかし、当然ながら、低濃度領域の長さは、核酸の移動度および長さ、温度、および使用する核酸ポリメラーゼの活性などの種々の要因に依存する。
【００７０】
本発明においては、最初のサイクルの前に高濃度領域を形成して、標的核酸の変性を確実にすることが好ましい。最後のサイクルの後に、プライマーの伸長を確実にするのに十分な量の変性剤を含有する領域を形成させることが好ましい。
【００７１】
他の態様において、標的核酸は１本鎖核酸である。この態様においては、２つのプライマーの一方が、プライマーと実質的に相補的な配列を有する１本鎖標的核酸にハイブリダイズし、次いで、プライマーが伸長され、最初のサイクルに２本鎖核酸が形成される。
【００７２】
さらに他の態様においては、合成された２本鎖核酸を標的核酸として使用することができ、２つのプライマーがハイブリダイズできる核酸の特定の配列が、上記したのと同様に増幅される。
【００７３】
１つの態様において、本発明は、複数の標的核酸中の特定の配列の複数部分を増幅することができる。１またはそれより多くの異なるプライマー対であって、この反応の標的核酸の異なる配列にハイブリダイズできるプライマー対を使用することにより、配列の複数部分を増幅することができる。また、本発明は、標的核酸中の複数の特定の配列を増幅することができる。
【００７４】
本発明は多くの利点を有する。加熱でなく変性剤により核酸を変性させるため、増幅反応を比較的低温で行うことが可能である。これにより、時間のかかる熱サイクルや高価な耐熱性ポリメラーゼが本発明の増幅反応では不要になり、増幅反応がより迅速で安価になる。さらに、本発明においては、標的核酸および伸長産物が高濃度領域と低濃度領域を順次通り抜け、その結果、複数の高濃度領域と複数の低濃度領域とをそれぞれ通過することになる。そのため、伸長工程を希釈、中和および脱塩をすることなく行うことができ、増幅反応がより容易になる。さらに、標的核酸が、増幅反応が開始するまで核酸ポリメラーゼに接触しないため、煩雑なホットスタート法や高価な自動ホットスタートポリメラーゼを用いることなく、非特異的な増幅を抑制することが可能になる。
【００７５】
本発明においては、サンプルならびに変性剤、プライマー、核酸ポリメラーゼなどの試薬は、慣用されているあらゆる方法を用いて送液することができる。１つの態様において、サンプルおよび試薬は、動電的方法および／または機械的方法により送液される。
【００７６】
本発明の１つの態様において、少なくとも２つの高濃度領域と少なくとも２つの低濃度領域とを含んでなる濃度サイクル領域が、動電的効果を利用する動電的ポンプにより形成される。変性剤が電気的に中性である場合、変性剤を電気浸透流により送液することができる。変性剤が電気的に正または負である場合、変性剤を電気浸透流だけでなく電気泳動により送液することができる。 
【００７７】
本発明においては、以下の利点のため、動電的ポンプが好ましい。動電的ポンプは、電圧をかけるだけで動かすことができる。脈流の発生がない。動電的ポンプは、フラットな断面の流れ（いわゆる「栓流」）をチャンネルに形成させることができる。動電的ポンプのこの特徴により、正確な流量制御および簡便な操作が可能になる。また、動電的ポンプのこのような特徴は、マイクロチャンネルに濃度サイクル領域を形成させるのに好適である。さらに、動電的ポンプは、電極を増やすだけで並列化されるため並列化が容易であり、そのため、ハイスループットな増幅が容易になる。
【００７８】
他の態様において、標的核酸および伸長産物は、動電的方法により高濃度領域および低濃度領域に接触させられる。標的核酸および伸長産物は、典型的には負の電荷を有している。そのため、電気浸透流があると、標的核酸および伸長産物は、電気浸透流と電気泳動の合計により移動する。電気浸透流がないと、標的核酸および伸長産物は、電気泳動により移動する。
【００７９】
動電的なポンピングには多くの利点がある。動電的ポンプは、電圧をかけるだけで動かすことができる。脈流の発生がない。フラットな断面を有する（いわゆる栓流）。このような特徴により、正確な流量制御および簡便な操作ができるため、標的核酸を含有するサンプルの量を正確に制御することができ、そのため、再現性よく増幅できる。さらに、変性剤が電気的に中性の場合、濃度サイクル領域近傍の負に荷電した標的核酸および伸長産物が、電気浸透流があったとしてもそれ自体により移動する。
【００８０】
他の好ましい態様において、機械的ポンプは、動電的ポンプでは送液が難しい溶液を容易に送液し得るため、機械的ポンプが使用される。具体的には、機械的ポンプは、イオン性の高い溶液、導電性が異なる溶液、およびｐＨが異なる溶液を送液するために好適に使用することができる。したがって、機械的ポンプは、高ｐＨ溶液または低ｐＨ溶液の変性剤、および、イオン性の高い溶液中の標的核酸に対して好適である。
【００８１】
１つの観点において本発明は、濃度サイクル領域の形成方法を提供する。好ましい態様において、濃度サイクル領域は動電的方法により形成される。他の観点において本発明は、標的核酸および伸長産物を濃度サイクル領域に接触させる方法を提供する。
【００８２】
本発明において、濃度サイクル領域は、異なる濃度で変性剤を含有する少なくとも２つの緩衝液を混合することにより形成することができる。例えば、濃度サイクル領域は、変性剤を含有する緩衝液と変性剤を含有しない緩衝液とを混合することにより形成することができる。他の態様において、濃度サイクル領域は、より高濃度で変性剤を含有する緩衝液とより低濃度で変性剤を含有する緩衝液とを混合することにより形成することができる。
【００８３】
本明細書で使用するように、ホルムアミドおよび尿素を変性剤として使用する場合、４０％(v/v)のホルムアミドと７Ｍの尿素を含有する緩衝液を、「１００％」変性剤緩衝液と定義する。変性剤を含有しない緩衝液を、「０％」変性剤緩衝液と定義する。例えば、「５０％」の変性剤緩衝液は、「１００％」変性剤緩衝液と「０％」変性剤緩衝液とを１／１の比で混合することにより調製できる。
【００８４】
高濃度領域の典型的な変性剤濃度は、増幅反応を５０℃で行う場合、「５０％」より高く、より好ましくは「９０％」より高い。高濃度領域の変性剤濃度は「１００％」より高くてもよい。高変性剤濃度領域の変性剤濃度や温度などの適当な条件は、増幅産物、標的核酸、プライマー、核酸ポリメラーゼなどの種々の性質に基づいて決定することができる。低濃度領域の典型的な変性剤濃度は、「０％」〜「５０％」である。低変性剤濃度領域の変性剤濃度や温度などの適当な条件は、増幅産物、標的核酸、プライマー、核酸ポリメラーゼなどの種々の性質に基づいて決定することができる。
【００８５】
好ましい態様において、核酸ポリメラーゼは変性剤耐性を有する。本発明においては、ポリメラーゼの速度がチャンネル中の変性剤の速度と異なる場合、ポリメラーゼが変性剤と接触する場合がある。この場合、ポリメラーゼが変性剤耐性を有していないと、ポリメラーゼがその活性を失うことがある。しかし、ポリメラーゼが変性剤耐性を有していると、ポリメラーゼが変性剤に接触してもその活性が維持されるであろう。さらに、濃度サイクル領域中の高濃度領域と低濃度領域との界面周辺において、高濃度領域の変性剤が低濃度領域に拡散し、ポリメラーゼと接触することになる可能性がある。このような場合、ポリメラーゼは変性剤耐性を有することが好ましい。
【００８６】
好ましい態様において、変性剤と核酸ポリメラーゼは、実質的に同じ速度で移動する。ある領域に含まれる変性剤の速度が、次の領域に含まれるポリメラーゼの速度と同じであると、ポリメラーゼと変性剤の混合が起きにくくなる。したがって、ポリメラーゼが変性剤耐性を有しない場合であっても、ポリメラーゼが変性剤と実質的に同じ速度で移動することにより、ポリメラーゼが、増幅反応の間、より長期間にわたってその活性を維持することが可能になる。
【００８７】
変性剤が電気的に中性の場合、増幅反応を、ポリメラーゼを含有する緩衝液のｐＨがポリメラーゼの等電点と等しい条件にて行うことが好ましい。この態様において、変性剤および核酸ポリメラーゼは、動電的ポンプによって実質的に同じ速度で送液されうる。
【００８８】
本発明の１つの態様において、ポリメラーゼは、本発明に使用するすべての溶液および緩衝液に含まれていてよい。動電的ポンプをマイクロチップ中の溶液または緩衝液の送液に使用する場合、電気的に中性の核酸ポリメラーゼは、好ましくは、変性剤リザーバーおよび／または緩衝液リザーバー中の緩衝液に含まれ、より好ましくは、緩衝液リザーバー中の緩衝液に含まれる。ポリメラーゼが正の電荷を有する場合、ポリメラーゼは、変性剤リザーバーおよび／または緩衝液リザーバー中の緩衝液に含まれることが好ましい。ポリメラーゼが負の電荷を有する場合、ポリメラーゼは、変性剤および緩衝液リザーバー以外のリザーバー中のサンプル溶液および緩衝液に含まれることが好ましい。
【００８９】
１つの観点において、本発明は、核酸に含まれる核酸配列を増幅する方法であって：
（ａ）  流体装置中にすべて配置された、第１のリザーバー、第２のリザーバー、メインチャンネル、第１のチャンネル、第２のチャンネルを提供すること、ここで、第１のチャンネルは第１のリザーバーおよびメインチャンネルと連通しており、第２のチャンネルは第２のリザーバーおよびメインチャンネルと連通しており、少なくとも１つのリザーバーは変性剤を含有する液体で充填されている；
（ｂ）  第１の変性剤濃度の変性剤を含む第１領域と第２の変性剤濃度の変性剤を含む第２領域とが交互するパターンを含んでなる濃度サイクル領域を、メインチャンネル中に形成させること、ここで、第１の変性剤濃度は第２の変性剤濃度より高く、第１領域および第２領域は２つの液体を交互にまたは異なる流速で導入することにより作られる；
（ｃ）  核酸を濃度サイクル領域に導入すること；
（ｄ）  濃度サイクル領域中を核酸に通過させること；
（ｅ）  第１の変性剤濃度領域において、核酸を変性させ、変性させた核酸を得ること；
（ｆ）  第２の変性剤濃度領域において、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズされた核酸を得ること；
（ｇ）  第２の変性剤濃度領域において、ハイブリダイズされた核酸のプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
を含む、上記方法である。
【００９０】
１つの観点において、本発明は、核酸を増幅する装置であって：
（ａ）変性剤ポンピングユニット、ここで、このユニットは、異なる濃度で変性剤を含有する少なくとも２つの溶液を合流させ、核酸を変性させるのに十分な量で変性剤を含有する領域と変性させた核酸をプライマーとハイブリダイズさせるのに十分な量で変性剤を含有する領域との交互パターンをチャンネル中に形成させる；
（ｂ）チャンネル、ここに、変性剤を異なる濃度で含有する領域が形成される；および
（ｃ）標的核酸ポンピングユニット、ここで、このユニットは標的核酸をチャンネル中に導入する、；
を含んでなる上記装置を提供する。
【００９１】
変性剤ポンピングユニットは、異なる濃度の変性剤を含有する少なくとも２つの緩衝液を混合することによって、高濃度領域と低濃度領域とを繰り返し含んでなる濃度サイクル領域を形成する。濃度サイクル領域は、濃度サイクルチャンネルあるいはメインチャンネルに注入される。
【００９２】
標的核酸ポンピングユニットは、標的核酸を濃度サイクルチャンネルに導入する。
【００９３】
本装置は、異なる濃度の変性剤を含有する少なくとも２つの緩衝液の混合パターンを変更することによって、濃度サイクル領域のパターンおよび／またはサイクル数を変更することができる。したがって、本発明によれば、チャンネル配置やチップ上のチャンネル配置を変更することなく、核酸の増幅を行うことができる。さらに、本装置は、高濃度領域と低濃度領域の長さを制御することによって、チャンネル設計やチャンネル配置を変更することなく、変性、ハイブリダイズおよび伸長の反応時間を容易に制御することが可能である。本発明のこの特徴により、標的核酸や増幅産物に応じて柔軟に増幅反応を行うことができる。
【００９４】
好ましい態様において、濃度サイクル領域形成部は、異なる濃度の変性剤を含有する緩衝液で充填される少なくとも２つの緩衝液リザーバー；および、これらリザーバーにそれぞれ連結された少なくとも２つの緩衝液チャンネル；を含んでなる。この２つの緩衝液チャンネルは、濃度サイクルチャンネル上で合流する。１つの態様において、少なくとも２つの緩衝液チャンネルは、濃度サイクルチャンネルと１つの交差点において連通してもよい。他の態様において、少なくとも２つの緩衝液チャンネルは、濃度サイクルチャンネルと２つまたはより多くの交差点において連通してもよい。緩衝液チャンネルは、チャンネル中の流れを制御し、濃度サイクルチャンネルに濃度サイクル領域を形成させるための、１またはそれより多くのポンプを備えていてもよい。
【００９５】
濃度サイクルチャンネルはサンプル部に連結される。サンプル部は、標的核酸を含有するサンプルが充填されるサンプルリザーバーを含んでなる。注入される標的核酸の特定の核酸配列は、濃度サイクルチャンネルにおいて増幅される。１つの態様において、核酸は、メインチャンネルに電圧をかけることによって起こる電気泳動を利用して、第１および第２の変性剤とは逆に、相対的に移動させることができる。
【００９６】
１つの態様において、変性剤ポンピングユニットは、異なる濃度の変性剤を含有する緩衝液のための２つのリザーバーを備える。１つの態様において、１つのリザーバー中の緩衝液は変性剤を含有せず、もう一方のリザーバー中の緩衝液は変性剤を含有する。
【００９７】
１つの観点において本発明は、核酸を増幅する装置であって：
（ａ）  第１のリザーバー、第２のリザーバー、第１のチャンネルおよび第２のチャンネル、ここで、第１のリザーバーおよび第２のリザーバーは第１のチャンネルおよび第２のチャンネルにそれぞれ連通し、第１のリザーバーおよび第２のリザーバーの少なくとも１つは、変性剤を含有する液体を貯蔵する；
（ｂ）  第１のチャンネルおよび第２のチャンネルと連通するメインチャンネル、ここで、第１の濃度で変性剤を含有する第１領域と第２の濃度で変性剤を含有する第２領域とが交互するパターン（ここで、第１の濃度は第２の濃度より高い）、第１領域、および第２領域は、第１リザーバーおよび第２リザーバーに貯蔵された２つの液体を交互または異なる流速で導入することにより形成され、ここで、核酸を第１領域と第２領域との交互パターンに接触させることにより核酸が増幅される；および
（ｃ）  サンプルリザーバーおよびサンプルチャンネル、ここで、サンプルリザーバーはサンプルチャンネルによりメインチャンネルまで連通し、サンプルリザーバーには増幅される核酸が貯蔵される；
を含んでなる上記装置である。
【００９８】
好ましい態様において、本発明の装置は、第１および第２のリザーバーに貯蔵された液体をメインチャンネルに導入するポンプ；および、サンプルリザーバーに貯蔵されたサンプルをメインチャンネルに導入するポンプ；をさらに含む。上記したように、サンプルならびに、変性剤、プライマーおよび核酸ポリメラーゼなどの試薬は、慣用されているあらゆる方法により移動させることができる。１つの態様において、サンプルおよび試薬は、動電的効果および／または機械的効果を利用した１またはそれより多くのポンプによって送液することができる。本発明においては、動電的ポンプが好ましい。
【００９９】
他の観点において、本発明は、核酸を合成する方法であって：
（ａ）  核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域と、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域との交互パターンを、チャンネル中に形成させること；
（ｂ）  標的核酸を、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、標的核酸を変性させること；
（ｃ）  変性させた標的核酸を、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、変性させた標的核酸にプライマーをハイブリダイズさせること；および
（ｄ）  （ｃ）の工程で標的核酸にハイブリダイズしたプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
を含む上記方法を提供する。
【０１００】
また、本発明は、少なくとも１つの特定の核酸配列を合成する方法を提供する。この方法は、サイクルシークエンシング反応および逆転写反応に好適である。合成は、濃度サイクル領域が形成されるチャンネルにおいて行う。濃度サイクル領域は、少なくとも１つのサイクルを繰り返しに含んでなる。
【０１０１】
本発明においては、特定の核酸配列は以下のように合成される。典型的な態様において、標的核酸は２本鎖であり、プライマー数は１つである。標的核酸は高濃度領域において２つの１本鎖核酸に変性される。プライマーは、低濃度領域において２つの１本鎖核酸の１つにハイブリダイズし、核酸ポリメラーゼによって伸長され、２本鎖核酸が形成される。前のサイクルで生じた２本鎖核酸は、次の高濃度領域において２つの１本鎖核酸に変性される。プライマーは、次の低濃度領域において２つの１本鎖核酸の１つにハイブリダイズし、伸長されて他の２本鎖核酸が作製される。したがって、この反応の産物は、一端にプライマー配列を有する１本鎖核酸である。
【０１０２】
他の態様において、標的核酸は１本鎖核酸である。サイクル数は少なくとも１である。
【０１０３】
他の観点において、本発明は、その後に増幅させる標的核酸を合成する方法であって：
（ａ）  核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域と、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域との交互パターンを、チャンネル中に形成させること；
（ｂ）  プレ標的核酸を、核酸を変性させるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、プレ標的核酸を変性させること；
（ｃ）  変性させたプレ標的核酸を、変性させた核酸にプライマーをハイブリダイズさせるために十分な量の変性剤を含む領域に接触させて、プレ標的核酸にプライマーをハイブリダイズさせること；および
（ｄ）  （ｃ）の工程でプレ標的核酸にハイブリダイズしたプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
を含む上記方法を提供する。
【０１０４】
また、本発明は、特定の核酸配列を増幅するために用いる標的核酸の合成方法を提供する。この方法は逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に好適である。合成は、濃度サイクル領域が形成されるチャンネルにおいて行われる。濃度サイクル領域は少なくとも１つのサイクルを繰り返し含んでなる。
【０１０５】
標的核酸は以下のように合成される。典型的な態様において、プレ標的核酸は１本鎖である。典型的なプライマー数は２つである。濃度サイクル領域に含まれる典型的なサイクル数は１である。プレ標的核酸は高濃度領域で変性される。２つのプライマーのうち１つが、低濃度領域において１本鎖のプレ標的核酸にハイブリダイズし、核酸ポリメラーゼにより伸長させられ、標的核酸として使用しうる２本鎖核酸が形成される。他の態様において、プレ標的核酸は２本鎖核酸である。サイクル数は少なくとも１である。
【０１０６】
さらに他の態様において、合成された２本鎖核酸は、特定の核酸配列を増幅するための標的核酸として用いられる。増幅手順は上記したのと同様である。
【０１０７】
図１は、本発明の装置の一例を示す。この装置は、標的核酸が変性剤の流れの反対方向に移動する場合に好適である。この装置は、濃度サイクル領域形成部１、濃度サイクルチャンネル２およびサンプル部３を含んでなる。濃度サイクル形成部１は、変性剤緩衝液リザーバー４、緩衝液リザーバー５，変性剤緩衝液チャンネル６、および緩衝液チャンネル７を含んでなる。サンプル部は、サンプルリザーバー８を含んでなる。変性剤緩衝液チャンネル６および緩衝液チャンネル７は、濃度サイクルチャンネル２に交差点で合流する。濃度サイクルチャンネル２は、サンプルリザーバー８に接続される。
図１に示すように、脱塩用薬品（変性剤を失活させるための薬剤として機能する）を濃度サイクルに注入するための注入ツールや特別な手順は存在しない。したがって、変性した核酸をハイブリダイズする工程が、変性剤を失活させることなく行われる。
【０１０８】
特定の核酸配列を増幅する操作において、変性剤緩衝液リザーバー４は変性剤を含有する緩衝液で充填され、緩衝液リザーバー５は変性剤を含有しない緩衝液で充填される。サンプルリザーバー８は、標的核酸を含有するサンプル溶液によって充填される。３つの電極のそれぞれが、変性剤緩衝液リザーバー４、緩衝液リザーバー５およびサンプルリザーバー８にそれぞれ挿入される。リザーバー４およびリザーバー５にかける電位を変化させることにより、高濃度領域と低濃度領域を含んでなる濃度サイクル領域が形成される。一方、サンプルリザーバーは接地される。サイクル中の高濃度領域は、変性剤を含有する緩衝液を、変性剤緩衝液リザーバー４から変性剤緩衝液チャンネル６を介して濃度サイクルチャンネル２に注入することにより作成する。サイクル中の低濃度領域は、変性剤を含有しない緩衝液を、緩衝液リザーバー５から緩衝液チャンネル７を介して濃度サイクルチャンネル２に注入することによって作成する。濃度サイクル領域は、変性剤を含有する緩衝液の注入と、変性剤を含有しない緩衝液または実質的により少ない変性剤を含有する緩衝液の注入とを交互に繰り返すことにより作成する。標的核酸を、濃度サイクルチャンネル２へサンプルリザーバー８から注入する。注入された標的核酸は、濃度サイクル領域を通り抜けるか、濃度サイクルチャンネル２の濃度サイクル領域を通過し、濃度サイクルチャンネル２中で増幅される。また、濃度サイクルチャンネル２に存在する反応液の量を実質的に一定に保つことができ、反応の進展に応じて増加しないため、増幅に応じて試薬の注入量を調節する必要がない。増幅産物は、チャンネル中のある点で検出されるか、リザーバー４およびリザーバー５から回収される。また、チャンネルの全域をモニターすることが可能であり、これは、リアルタイム増幅法および定量的増幅法に好適である。さらに、繰り返しの増幅を行うことも可能である。つまり、最初の核酸増幅後、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸を、濃度サイクルチャンネル２の濃度サイクル領域に導入した後、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸に濃度サイクル領域中を通過させるには、
（１）第１の変性剤濃度領域において、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸を変性させて、変性された、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸を得ること；
（２）第２の変性剤濃度領域において、変性された、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸をプライマーとハイブリダイズさせて、ハイブリダイズした核酸を得ること；および
（３）第２の変性剤濃度領域において、ハイブリダイズした核酸のプライマーを核酸ポリメラーゼによって伸長させること；
という工程が必要になる。
【０１０９】
濃度サイクル領域を形成させるのに適当な電位は、チャンネル設計またはチャンネル配置および緩衝液の性質に依存する。高濃度領域と低濃度領域の長さおよびサイクル数は、反応温度、および、増幅産物、標的核酸、プライマーおよび核酸ポリメラーゼの種々の性質によって決まる。プライマー、核酸ポリメラーゼ、MgCl2およびKClなどの増幅に必要な成分は、各リザーバーおよび各チャンネルに存在させてよい。核酸ポリメラーゼは、非特異的な増幅を抑制するため、サンプルリザーバー８中に存在しない方が好ましい。また、核酸ポリメラーゼは、核酸ポリメラーゼの消費を少なくするため、変性剤緩衝液リザーバー５中に存在しない方が好ましい。
【０１１０】
また、変性剤緩衝液リザーバー４および緩衝液リザーバー５に充填された変性剤緩衝液の濃度とは異なる濃度にて変性剤を含有する領域を、これら２つの緩衝液を適当な比で混合することによって形成させることも可能である。例えば、リザーバー４が「１００％」変性剤緩衝液で充填され、リザーバー５が「０％」変性剤緩衝液で充填されている場合、「８０％」にて変性剤を含有する領域を、「１００％」緩衝液と「０％」緩衝液とを４対１(v/v)の比で混合することによりチャンネル中に形成させることができ、「２０％」にて変性剤を含有する領域を、「１００％」緩衝液と「０％」緩衝液とを１対４(v/v)の比で混合することによりチャンネル中に形成させることができる。
【０１１１】
変性剤緩衝液リザーバー４を充填する変性剤緩衝液は、「１００％」の変性剤緩衝液である必要はない。緩衝液リザーバー５を充填する変性剤緩衝液は、「０％」の変性剤緩衝液である必要はない。例えば、「９０％」の変性剤緩衝液が変性剤緩衝液リザーバー４に充填され、「１０％」の変性剤緩衝液が緩衝液リザーバー５に充填されている場合、「９０％」にて変性剤を含有する領域と「１０％」にて変性剤を含有する領域とを含んでなる濃度サイクル領域を、２つの緩衝液を交互に注入することにより、濃度サイクルチャンネル２に形成させることができる。
【０１１２】
また、異なる濃度で変性剤を含有する３つの領域を含んでなるサイクルを形成させることもできる。例えば、「１００％」の変性剤緩衝液が変性剤緩衝液リザーバー４に充填され、「０％」の変性剤緩衝液が緩衝液リザーバー５に充填されている場合、「１００％」および「０％」の変性剤領域を、２つの緩衝液を濃度サイクルチャンネル１２にそれぞれ注入することにより形成させることができ、「１０％」の変性剤濃度領域を、２つの緩衝液を１対９ (v/v)の比で混合することにより形成させることができる。
【０１１３】
図２は、本発明の装置の他の例を示す。この装置は、標的核酸が変性剤と同じ方向に移動する場合に好適である。サンプル部は、サンプルリザーバー８とサンプル注入チャンネル９を含んでなる。サンプルリザーバー８は、濃度サイクルチャンネル２にサンプル注入チャンネル９を介して連結される。この態様において、緩衝液チャンネル７および６は、サンプル注入チャンネル９と濃度サイクルチャンネルとの交差点とは異なる交差点において、濃度サイクルチャンネルに連結される。濃度サイクルチャンネル２での増幅産物は、濃度サイクルチャンネル２のある点において検出されるか、廃液リザーバー１０から回収される。また、濃度サイクルチャンネル２の全域をモニターすることも可能である。
【０１１４】
図３は、本発明の装置の他の例を示す。この装置も、標的核酸が変性剤と同じ方向に移動する場合に好適である。サンプル部は、サンプルリザーバー８とサンプル注入チャンネル９を含んでなる。変性剤緩衝液チャンネル６、緩衝液チャンネル７およびサンプル注入チャンネル９は、濃度サイクルチャンネル２に１つの交差点で合流する。濃度サイクルチャンネル２で増幅された産物は、濃度サイクルチャンネル２のある点で検出され、または、廃液リザーバー１０で回収される。また、濃度サイクルチャンネル２の全域をモニターすることも可能である。
【０１１５】
図４は、本発明の装置の他の例を示す。この装置は、標的核酸が変性剤の反対方向に移動する場合に好適である。さらに、この装置は、図４に記載したサンプル部を使用することによって一定量のサンプル溶液を正確に注入することができるため、正確な量の注入が可能になり、そのため、定量的増幅に好適である。サンプル部は、サンプルリザーバー８、サンプル注入チャンネル９およびサンプル廃液リザーバー１１を含んでなる。サンプルリザーバー８は、サンプル廃液リザーバー１１にサンプル注入チャンネル９を介して連結される。サンプル注入チャンネル９は、濃度サイクルチャンネル２と、サンプル注入領域１２において交差する。標的核酸を含有するサンプル溶液を、サンプルリザーバー８からサンプル廃液リザーバー１１にサンプル注入チャンネル９を介して送液することによって、標的核酸をサンプル注入領域１２に置く。サンプル領域１２に置かれたプラグ型の標的核酸を濃度サイクルチャンネル４に注入する。次いで、標的核酸が濃度サイクル領域を通過し、つまり、その標的核酸が、メインチャンネルに作られた濃度サイクルを通過し、一連の処理によって特定の核酸配列が増幅される。増幅産物は、チャンネルのある点で検出されるか、変性剤緩衝液リザーバー４および緩衝液リザーバー５から回収される。また、チャンネルの全域をモニターすることも可能である。
図４に示すように、脱塩用薬品（変性剤を失活させるための薬剤として機能する）を濃度サイクルに注入するための注入ツールや特別な手順は存在しない。つまり、変性した核酸をハイブリダイズする工程が、変性剤を失活させることなく行われる。また、濃度サイクルチャンネル２に存在する反応液の容量が、実質的に一定に保たれ、反応が進むにつれて増加しないため、増幅に応じて試薬の注入量を調節する必要がない。
また、繰り返し増幅を行うことも可能である。つまり、最初の核酸増幅後、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸を、濃度サイクルチャンネル２の濃度サイクル領域に導入した後、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸を濃度サイクル領域中を通過させるには、
（１）第１の変性剤濃度領域において、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸を変性させて、変性された、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸を得ること；
（２）第２の変性剤濃度領域において、変性された、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸をプライマーとハイブリダイズさせて、ハイブリダイズした核酸を得ること；および
（３）第２の変性剤濃度領域において、ハイブリダイズした核酸のプライマーを核酸ポリメラーゼによって伸長させること；
という工程が必要になる。
【０１１６】
図５は、本発明の装置の他の例を示す。この装置は、標的核酸が変性剤と同じ方向に移動する場合に好適である。増幅産物を、濃度サイクルチャンネル２中のある場所で検出し、または廃液リザーバー１０から回収する。増幅産物の濃度を、濃度サイクル領域チャンネル２の全長を通してモニターすることも可能である。例えば、蛍光検出器を増幅産物の濃度をモニターするために使用することができる。
【０１１７】
以下の限定的でない実施例により、本発明をより詳細に説明する。
実施例１
【０１１８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、図４に示すマイクロチップ装置を使用して行う。マイクロチップはポリ（メチルメタクリレート）製である。マイクロチップの製造方法は以下の通りである。チャンネルは、ホットエンボス加工を使用して一枚の基板に形成する。リザーバーは、穿孔法（drilling）を使用してもう一枚の基板に形成する。２枚の基板を熱接合法により接合する。マイクロチップの寸法は、７０ｍｍ×３５ｍｍ×２ｍｍである。チャンネルの幅と深さは、それぞれ、１００μｍと２５μｍである。リザーバーの直径は３ｍｍである。リザーバーは、電源に接続されたＰｔ電極を有する。電源はパーソナルコンピュータにより制御可能であるため、リザーバーにかける電位は自動的に制御される。本実施例で使用するプライマーは、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＶ３領域を増幅するよう設計する：
フォワードプライマー：5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’（配列番号１）；
リバースプライマー  ：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’（配列番号２）。
ＤＮＡサンプル溶液を以下のように調製する。大腸菌Ｋ１２株のいくつかのコロニーを採取し、1 mlのＴＥ緩衝液（10 mM Tris、1 mM EDTA）に溶解させる。この溶液を１００℃の湯浴中で１０分間熱し、次いで遠心分離する。上澄みを、0.5 mMのプライマー、0.2 mMのdATP、dTTP、dGTPおよびdCTP、4mMのMgCl2、50 mMのKCl、SYBR（商標）GreenIおよび10 mMのTris-HClを含有する希釈用緩衝液で１００倍に希釈する。この希釈溶液は、「ＤＮＡサンプル溶液」として使用される。
【０１１９】
変性剤緩衝液リザーバー４を、「１００％」変性剤緩衝液、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、0.5μMプライマー、0.2 mMのdATP、dTTP、dGTPおよびdCTP、4 mMのMgCl2、50 mMのKCl、SYBR（商標）GreenIおよび10 mM Tris-HClで充填する。緩衝液リザーバー、廃液リザーバーおよびサンプル廃液リザーバーを、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、0.5μMプライマー、0.2 mMのdATP、dTTP、dGTPおよびdCTP、4 mMのMgCl2、50 mMのKCl、SYBR（商標）GreenIおよび10 mM Tris-HClを含有する「０％」変性剤緩衝液で充填する。サンプルリザーバー８を、上記のサンプル溶液で充填する。サンプルリザーバー８を接地し、サンプル廃液リザーバーに電圧をかけてサンプル溶液をサンプル注入領域１２に送液する。次いで、廃液リザーバー１０を接地し、変性剤緩衝液リザーバー４および緩衝液リザーバー５に電圧をかけて、チャンネル２に濃度サイクル領域を作成し、サンプル注入領域１２に送液されたサンプル溶液を濃度サイクル領域に向けて注入する。変性剤緩衝液リザーバー４および緩衝液リザーバー５にかけた電圧を交互に変化させる。増幅産物を、ダイオードレーザーと光電子倍増管で構成されるレーザー誘起蛍光検出システムによって低濃度領域にて検出する。
実施例２
【０１２０】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を、図４に示すマイクロチップ装置を使用して行う。マイクロチップはポリ（メチルメタクリレート）製である。マイクロチップの製造方法は実施例１に記載した通りである。ＲＮＡサンプル溶液を、メタン発酵スラッジから抽出する。本実施例で使用するプライマーは、実施例１で使用したものと同じである。LightCycler（商標）ＲＮＡ増幅キットSYBRGreen（商標）Iを本実施例で使用する。このキットの「反応溶液」には、ワンステップＲＴ−ＰＣＲに必要な成分が含まれている。変性剤緩衝液リザーバー４を、「１００％」濃度にて変性剤を含有する反応溶液で充填する。緩衝液リザーバー５，廃液リザーバー１０およびサンプル廃液リザーバー１１を、反応溶液で充填する。サンプルリザーバーを、抽出したＲＮＡと反応溶液の混合物で充填する。電位をかけ、増幅産物を検出する手順は、低濃度領域が逆転写反応の濃度サイクル領域の最初に形成される以外は、基本的に実施例１と同様である。
実施例３
【０１２１】
サイクルシークエンシング（Cycle Sequencing）反応を、図１に示すマイクロチップ装置を使用して行う。マイクロチップはポリ（メチルメタクリレート）製である。マイクロチップの製造方法は実施例１に記載した通りである。マイクロチップの寸法は、７０ｍｍ×３５ｍｍ×２ｍｍである。チャンネルの幅と深さは、それぞれ、１００μｍと２５μｍである。リザーバーの直径は３ｍｍである。リザーバーは、電源に接続されたＰｔ電極を有する。電源はパーソナルコンピュータで制御可能であるため、リザーバーにかける電位は自動的に制御される。
【０１２２】
ＰＣＲ用の「ＤＮＡサンプル溶液」を、実施例１に記載したように大腸菌から調製する。ＰＣＲに使用するプライマーは、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のすべてを増幅するよう設計する：
フォワードプライマー：5’-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3’（配列番号３）；
リバースプライマー  ：5’-AAAGGAGGTG ATCCAGCC-3’（配列番号４）。
【０１２３】
ＰＣＲ産物をスピンカラムで精製し、次いで、サイクルシークエンシング反応に好適な濃度に希釈し、サイクルシークエンシング反応用の「サンプル溶液」を得る。サイクルシークエンシング反応に使用するプライマーは、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の一部を合成するよう設計する：
5’-GTA TTA CCG CGG CTG CTGG-3’（配列番号５）。
【０１２４】
BigDye（商標）Terminator Cycle Sequencing Kitを、本実施例で用いる。このキットの反応溶液には、サイクルシークエンシング反応に必要な成分が含まれる。変性剤リザーバー４を、「１００％」の濃度で変性剤を含有する反応溶液で充填する。緩衝液リザーバー５を、反応溶液で充填する。サンプルリザーバー８を、精製したＰＣＲ産物と反応溶液の混合物で充填する。サンプルリザーバー８を接地し、変性剤緩衝液リザーバー４と緩衝液リザーバー５に電圧をかけ、濃度サイクル領域をチャンネル２に作成し、サンプル溶液を濃度サイクル領域に注入する。変性剤緩衝液リザーバー４と緩衝液リザーバー５にかけた電圧を交互に変化させる。サイクルシークエンシング反応の産物を、変性剤緩衝液リザーバー４または緩衝液リザーバー５から回収する。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、本発明の装置の一例を示す概略図である。
【図２】図２は、本発明の装置の他の例を示す概略図である。
【図３】図３は、本発明の装置の他の例を示す概略図である。
【図４】図４は、本発明の装置の他の例を示す概略図である。
【図５】図５は、本発明の装置の他の例を示す概略図である。
【符号の説明】
【０１２６】
１：濃度サイクル領域形成部
２：濃度サイクルチャンネル
３：サンプル部
４：変性剤緩衝液リザーバー
５：緩衝液リザーバー
６：変性剤緩衝液チャンネル
７：緩衝液チャンネル
８：サンプルリザーバー
９：サンプル注入チャンネル
１０：廃液リザーバー
１１：サンプル廃液リザーバー
１２：サンプル注入領域
【図１】
2008099685.tif 000002
【図２】
2008099685.tif 000003
【図３】
2008099685.tif 000004
【図４】
2008099685.tif 000005
【図５】
2008099685.tif 000006
【配列表】
2008099685000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月28日(2007.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１２】
（ｈ）  伸長されたプライマーとハイブリダイズした核酸を濃度サイクル領域に導入すること；
（ｉ）  濃度サイクル領域中を、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸に通過させること；
（ｊ）  第１の変性剤濃度領域において、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸を変性させ、変性された、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸を得ること；
（ｋ）  第２の変性剤濃度領域において、変性された、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸をプライマーとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズされた核酸を得ること；
（ｌ）  第２の変性剤濃度領域において、ハイブリダイズした核酸のプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
（１２）  （ｈ）  伸長されたプライマーとハイブリダイズした核酸を濃度サイクル領域に導入すること；
（ｉ）  濃度サイクル領域中を、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸に通過させること；
（ｊ）  第１の変性剤濃度領域において、伸長プライマーとハイブリダイズした核酸を変性させ、伸長プライマーとハイブリダイズした変性された核酸を得ること；
（ｋ）  第２の変性剤濃度領域において、伸長プライマーとハイブリダイズした変性された核酸とプライマーとをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズされた核酸を得ること；
（ｌ）  第２の変性剤濃度領域において、ハイブリダイズした核酸のプライマーを、核酸ポリメラーゼにより伸長させること；
をさらに含む、（９）に記載の方法。
【外国語明細書】
2008099685000001.pdf