(57)【要約】    【課題】  シクロオキシゲナーゼ−２、ペプチダーゼ，カルパイン-1（ヒト型）、ペプチダーゼ，ＣＴＳＳ（カテプシンＳ）、ホスホリパーゼPLA2-II、ペプチダーゼ，腫瘍壊死因子α変換酵素（TACE）、プロテインセリン／スレオニンキナーゼ，AURKA（Aurora-A）、プロテインチロシンホスファターゼ，PTPRF（LAR）、プロテインチロシンホスファターゼ，PTPN11（SHP-2）、トロンボキサン合成酵素等の酵素活性を阻害する新規酵素活性阻害剤；トランスポーター，アデノシン、GABAペンチン、グルタメート，AMPA、グルタメート，カイナート、グルタメート，NMDA，グリシン、ロイコトリエン，システイニル，CysLT2（ヒト型）、プリン作動性P2Y等の受容体結合を阻害する新規受容体結合阻害剤。    【解決手段】  細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末含有の酵素活性を阻害する阻害剤；細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末含有の受容体結合を阻害する受容体結合阻害剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤。
【請求項２】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるペプチダーゼ，カルパイン-1（ヒト型）阻害剤。
【請求項３】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるペプチダーゼ，ＣＴＳＳ（カテプシンＳ）（ヒト型）阻害剤。
【請求項４】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるホスホリパーゼPLA2-II阻害剤。
【請求項５】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるペプチダーゼ，腫瘍壊死因子α変換酵素（TACE）（ヒト型）阻害剤。
【請求項６】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるプロテインセリン／スレオニンキナーゼ，AURKA（Aurora-A）（ヒト型）阻害剤。
【請求項７】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるプロテインチロシンホスファターゼ，PTPRF（LAR）（ヒト型）阻害剤。
【請求項８】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるプロテインチロシンホスファターゼ，PTPN11（SHP-2）（ヒト型）阻害剤。
【請求項９】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるトロンボキサン合成酵素（ヒト型）阻害剤。
【請求項１０】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるトランスポーター，アデノシン受容体結合阻害剤。
【請求項１１】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるGABAペンチン受容体結合阻害剤。
【請求項１２】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるグルタメート，AMPA受容体結合阻害剤。
【請求項１３】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるグルタメート，カイナート受容体結合阻害剤。
【請求項１４】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるグルタメート，NMDA，グリシン受容体結合阻害剤。
【請求項１５】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるロイコトリエン，システイニル，CysLT2（ヒト型）受容体結合阻害剤。
【請求項１６】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるプリン作動性P2Y受容体結合阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなる酵素活性阻害剤及び受容体結合阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
(1)シクロオキシゲナーゼ
シクロオキシゲナーゼ(COX；プロスタグランジンエンドペルオキシド合成酵素、EC1.14.99.1）はアラキドン酸の変換を触媒して環状エンドペルオキシド（PGG及びPGH）を生成させ、続いてプロスタグランジンやトロンボキサンなどの代謝産物を生成させる。この酵素には、シクロオキシゲナーゼ−１及び−２（COX-1及びCOX-2）という2種類のアイソフォームがある。COX-1はほとんどの細胞において構成的に発現される。一方、COX-2は通常の条件下では認められないが、ある種の血清因子、サイトカイン、成長因子、及びエンドトキシンによって誘導されることがある。COX-1阻害剤は抗トロンビン活性を示すが、胃潰瘍を引き起こすこともある。COX-2阻害剤は抗炎症活性を示すが、一部の分裂促進作用を阻害することもある。
シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の酵素活性を阻害する作用を有する化合物としては、特許文献１記載のように、イブプロフェン等の化合物が知られているが、多様な局面でシクロオキシゲナーゼ−２の酵素活性を阻害する上で、更なるシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤に対する要望は強い。
【０００３】
(2)ペプチダーゼ，カルパイン-1（ヒト型）
カルパインファミリーのシステインプロテアーゼはカルシウム依存性チオールプロテアーゼのユビキタス型アイソフォームと組織特異型アイソフォームの両者から成る。ユビキタス型のμ-カルパインとm-カルパインは構造的に類似しているが、カルシウム要求度には顕著な違いがある。すなわち、インビトロでは、μ-カルパイン（I型カルパイン）はμMレベルのカルシウム濃度で活性を示すのに対して、m-カルパイン（II型カルパイン）はmM濃度で活性を示す。通常の生理的条件下では、これらのプロテアーゼは、p53やサイクリンD1などの核タンパク質、並びにタリン及びN-メチル-D-アスパルテート受容体をはじめとする細胞骨格及び原形質膜と関連するタンパク質など細胞全体に見られる様々な基質の限定タンパク質分解に関与している。細胞内でのそれらの活性化については不明であるが、カルパインは、細胞周期調節、アポトーシス、及び長期増強などの過程において生理的役割を果たしている可能性が示唆されている。
ペプチダーゼ，カルパイン-1（ヒト型）の酵素活性を阻害する作用を有する化合物としては、種々の化合物が知られているが、多様な局面でペプチダーゼ，カルパイン-1（ヒト型）の酵素活性を阻害する上で、更なるペプチダーゼ，カルパイン-1（ヒト型）阻害剤に対する要望は強い。
【０００４】
(3)ペプチダーゼ，ＣＴＳＳ（カテプシンＳ）（ヒト型）
カテプシンB、H、K、L及びSはリソソームのシステインプロテアーゼであり、細胞外マトリックスの分解など多様なタンパク質分解過程に関与している。カテプシンS（CTSS）は、リンパ節、脾臓、及びBリンパ球、マクロファージ、並びに樹状細胞を含む抗原提示細胞において高度に発現される。カテプシンSはMHCクラスII不変鎖Iiの分解に介在し、抗原プロセシングに関与する。カテプシンSは月経周期における増殖期と分泌期の両方の段階にも認められる。カテプシンSを阻害させると、アレルギー又は自己免疫疾患並びに腫瘍の免疫抑制療法に有用である可能性がある。
ペプチダーゼ，ＣＴＳＳ（カテプシンＳ）（ヒト型）の酵素活性を阻害する作用を有する化合物としては、種々の化合物が知られているが、多様な局面でペプチダーゼ，ＣＴＳＳ（カテプシンＳ）（ヒト型）の酵素活性を阻害する上で、更なるペプチダーゼ，ＣＴＳＳ（カテプシンＳ）（ヒト型）阻害剤に対する要望は強い。
【０００５】
(4)ホスホリパーゼPLA2-II
ホスホリパーゼA2（PLA2）はリン脂質からのアラキドン酸の放出を触媒し、炎症性メディエーターの形成において重要である。分泌PLA2は3群に分けられ、ユビキタス性を有すること及び膵液とヘビ毒に高濃度で含まれていることから、最も高度にキャラクタライズされているPLA2酵素群である。ホスホリパーゼA2群II（PLA2-II）はリウマチ関節液及び炎症性抗原投与後の血漿中に出現する。潰瘍性大腸炎及び敗血症性ショックの患者に血清中PLA2-II値の上昇が認められている。
ホスホリパーゼPLA2-IIの酵素活性を阻害する作用を有する化合物としては、種々の化合物が知られているが、多様な局面でホスホリパーゼPLA2-IIの酵素活性を阻害する上で、更なるホスホリパーゼPLA2-II阻害剤に対する要望は強い。
【０００６】
(5)ペプチダーゼ，腫瘍壊死因子α変換酵素（TACE）（ヒト型）
腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）変換酵素（TACE／ADAM-17）は、慢性関節リウマチや多発性硬化症など多くの慢性消耗性疾患と関連する強力な炎症亢進性サイトカインTNF-αを放出させる役割を担っている。TNF-αはまた血管形成を誘導し、繊維芽細胞増殖を促進するとともに、腫瘍細胞選択的に受容体と結合して、細胞溶解を引き起こしうる。TACEはアミロイド前駆物質タンパク質の分泌への関与も示唆されている。
ペプチダーゼ，腫瘍壊死因子α変換酵素（TACE）（ヒト型）の酵素活性を阻害する作用を有する化合物としては、種々の化合物が知られているが、多様な局面でペプチダーゼ，腫瘍壊死因子α変換酵素（TACE）（ヒト型）の酵素活性を阻害する上で、更なるペプチダーゼ，腫瘍壊死因子α変換酵素（TACE）（ヒト型）阻害剤に対する要望は強い。
【０００７】
(6)プロテインセリン／スレオニンキナーゼ，AURKA（Aurora-A）（ヒト型）
プロテインセリン／スレオニンキナーゼ Aurora-A（STK6、STK15、BTAK、AIK、ARK1、AURA、Aurora関連キナーゼ 1、乳癌増幅キナーゼ）は染色体分離及び中心体機能に強く関連付けられているセリン／スレオニンキナーゼのファミリーの一つである。Auroraキナーゼには、A、B、及びCの3種類のアイソフォームがある。ヒストンH3のリン酸化がG2-M移行のAurora-A調節の分子機序である。Aurora Aの阻害は、白血病、結腸癌、乳癌など多種類のヒト癌の治療に有用である可能性がある。
プロテインセリン／スレオニンキナーゼ，AURKA（Aurora-A）（ヒト型）の酵素活性を阻害する作用を有する化合物としては、種々の化合物が知られているが、多様な局面でプロテインセリン／スレオニンキナーゼ，AURKA（Aurora-A）（ヒト型）の酵素活性を阻害する上で、更なるプロテインセリン／スレオニンキナーゼ，AURKA（Aurora-A）（ヒト型）阻害剤に対する要望は強い。
【０００８】
(7)プロテインチロシンホスファターゼ，PTPRF（LAR）（ヒト型）
PTPRF、プロテインチロシンホスファターゼ受容体型F（LAR又は白血球共通抗原関連分子）はホスホチロシン特異的プロテインホスファターゼである。ヒトLARは、上皮細胞、平滑筋細胞、及び心筋細胞など様々な細胞系列で発現するが、脾臓、脳、又は神経細胞では発現しない。チロシン脱リン酸化による細胞シグナル伝達におけるLARの生理機能は、細胞どうしの相互作用又は細胞とマトリックスとの相互作用に応答して生じる。LAR阻害剤はインスリン抵抗性の治療に有用である可能性がある。
プロテインチロシンホスファターゼ，PTPRF（LAR）（ヒト型）の酵素活性を阻害する作用を有する化合物としては、種々の化合物が知られているが、多様な局面でプロテインチロシンホスファターゼ，PTPRF（LAR）（ヒト型）の酵素活性を阻害する上で、更なるプロテインチロシンホスファターゼ，PTPRF（LAR）（ヒト型）阻害剤に対する要望は強い。
【０００９】
(8)プロテインチロシンホスファターゼ，PTPN11（SHP-2）（ヒト型）
プロテインチロシンホスファターゼ非受容体型11（SHP-2）はN末端に2つのタンデムSH2ドメイン繰り返し単位を有し、多くの成長因子受容体及びサイトカイン経路において広く発現する。すなわち、SHP-2はリガンド結合に応答してPDGF及びEGF 成長因子受容体に対して直接的作用を及ぼす結果、マイトジェンによって活性化されたプロテインキナーゼ(MAPK）を活性化すると考えられている。したがって、SHP-2活性のアップレギュレーションが、血管炎症、腫瘍細胞増殖、及び転移における原因因子であると考えられる。近年、SHP-2欠乏は、グルコース代謝のインスリン感受性を障害することが示された。
プロテインチロシンホスファターゼ，PTPN11（SHP-2）（ヒト型）の酵素活性を阻害する作用を有する化合物としては、種々の化合物が知られているが、多様な局面でプロテインチロシンホスファターゼ，PTPN11（SHP-2）（ヒト型）の酵素活性を阻害する上で、更なるプロテインチロシンホスファターゼ，PTPN11（SHP-2）（ヒト型）阻害剤に対する要望は強い。
【００１０】
(9)トロンボキサン合成酵素（ヒト型）
トロンボキサンA2（TxA2）は、ADP、エピネフリン、及び低濃度のコラーゲンやトロンビンなどの弱作動剤に対する応答を増幅させる働きをする強力な血小板活性化物質である。細胞が活性化されると、ホスホリパーゼによって放出されたアラキドン酸がシクロオキシゲナーゼによって不安定エンドペルオキシド（PGG2又はPGH2）に変換され、さらにトロンボキサン合成酵素によってTxA2に変換される。血小板の凝集によって生成したエンドペルオキシドとTxA2は、血栓に直接する血管部位にほぼ限局される高度血管収縮、たとえば冠動脈梗塞や脳梗塞、に関連する血管痙攣を引き起こしうる。TxA2の産生増加は、様々な血栓性及び虚血性障害の発症と関連がある。TxA2生合成阻害剤は、虚血性心疾患、脳梗塞、動脈硬化、及び糖尿病疾患の治療に有効である可能性がある。
トロンボキサン合成酵素（ヒト型）の酵素活性を阻害する作用を有する化合物としては、種々の化合物が知られているが、多様な局面でトロンボキサン合成酵素（ヒト型）の酵素活性を阻害する上で、更なるトロンボキサン合成酵素（ヒト型）阻害剤に対する要望は強い。
【００１１】
(10)トランスポーター，アデノシン
アデノシンのNa+依存性ヌクレオシド輸送が、アデノシンの体内分布と血漿中及び組織（脳、筋肉）中濃度の重要な決定因子であると考えられている。アデノシントランスポーターは、肝臓内プリンレベル（組織内プリンの主な供給源）の維持において、またアデノシン介在自己調節における循環機能の不活化機序として、重要な役割を果たしている可能性がある。アデノシン取り込みをブロックすると、アデノシンの心臓内蓄積が遷延し、虚血再潅流の悪影響を回避できる可能性もある。
トランスポーター，アデノシンの受容体結合を阻害する作用を有する化合物としては、種々の化合物が知られているが、多様な局面でトランスポーター，アデノシンの受容体結合を阻害する上で、更なるトランスポーター，アデノシンの受容体結合阻害剤に対する要望は強い。
【００１２】
(11)GABAペンチン
GABAペンチンは新規抗てんかん薬であり、神経障害性疼痛の治療に広く使われている。その作用機序の詳細は不明で、議論の余地があるが、GABA合成の増加と電位依存性のNa+及び／又はCa2+チャンネルの調節が原因として推定されている。
GABAペンチンの受容体結合を阻害する作用を有する化合物としては、種々の化合物が知られているが、多様な局面でGABAペンチンの受容体結合を阻害する上で、更なるGABAペンチンの受容体結合阻害剤に対する要望は強い。
【００１３】
(12)グルタメート，AMPA
グルタメートは、哺乳類の中枢神経系における主な興奮伝達物質である。その受容体アミノ酸配列はGABA、グリシン、セロトニン5-HT3及びニコチン酸アセチルコリンと同じスーパーファミリーに属し、広義のリガンド通門イオンチャンネルに含まれる。グルタメート受容体は、機能上は、リガンド通門イオンチャンネル（「イオンチャンネル型」）又はGTP結合性タンパク質を介して結合した「代謝型」受容体に分類される。リガンド通門イオンチャンネルは、Na+ 及び場合によってはCa2+を通門する統合的陽イオンチャンネルを含んでいる。グルタメートAMPA受容体作動作用は、痙攣及び神経変性を引き起こす可能性がある。グルタメートAMPA受容体拮抗作用は、抗痙攣性、神経保護性、及び抗精神病性を示す可能性がある。
グルタメート，AMPAの受容体結合を阻害する作用を有する化合物としては、種々の化合物が知られているが、多様な局面でグルタメート，AMPAの受容体結合を阻害する上で、更なるグルタメート，AMPAの受容体結合阻害剤に対する要望は強い。
【００１４】
(13)グルタメート，カイナート
グルタメートは哺乳類の中枢神経系における主な興奮伝達物質である。その受容体アミノ酸配列はGABA、グリシン、セロトニン5-HT3及びニコチン酸アセチルコリンと同じスーパーファミリーに属し、広義のリガンド通門イオンチャンネルに含まれる。グルタメート受容体は、機能上、リガンド通門イオンチャンネル（「イオンチャンネル型」）又はGTP結合性タンパク質を介して結合した「代謝型」受容体に分類される。リガンド通門イオンチャンネルは、Na+及び場合によってはCa2+を通門させる統合型陽イオンチャンネルを含んでいる。カイナート受容体作動作用は、痙攣及び神経変性を引き起こす可能性がある。カイナート受容体拮抗作用は、抗痙攣性及び神経保護性を示す可能性がある。
グルタメート，カイナートの受容体結合を阻害する作用を有する化合物としては、種々の化合物が知られているが、多様な局面でグルタメート，カイナートの受容体結合を阻害する上で、更なるグルタメート，カイナートの受容体結合阻害剤に対する要望は強い。
【００１５】
(14)グルタメート，NMDA，グリシン
グルタメートは、哺乳類の中枢神経系における主な興奮伝達物質である。その受容体アミノ酸配列はGABA、グリシン、セロトニン5-HT3及びニコチン酸アセチルコリンと同じスーパーファミリーに属し、広義のリガンド通門イオンチャンネルに含まれる。グルタメート受容体は機能上、リガンド通門イオンチャンネル（「イオンチャンネル型」）又はGTP結合性タンパク質を介して結合した「代謝型」受容体に分類される。リガンド通門イオンチャンネルは、Na+ 及び場合によってはCa2+を通門する統合型陽イオンチャンネルを含んでいる。グルタメートNMDAグリシン受容体作動作用は統合失調症患者における陰性認知機能を減少させ認知機能を改善する可能性があり、痙攣及び神経変性を引き起こす可能性がある。グルタメート NMDAグリシン受容体拮抗作用は、抗痙攣性及び神経保護性を示す可能性がある。
グルタメート，NMDA，グリシンの受容体結合を阻害する作用を有する化合物としては、種々の化合物が知られているが、多様な局面でグルタメート，NMDA，グリシンの受容体結合を阻害する上で、更なるグルタメート，NMDA，グリシンの受容体結合阻害剤に対する要望は強い。
【００１６】
(15)ロイコトリエン，システイニル，CysLT2（ヒト型）
システイニルロイコトリエン類（LTC4、LTD4、LTE4）はアラキドン酸代謝産物であり、肥満細胞や好酸球など様々な細胞から放出される。これらのエイコサノイド類はシステイニルロイコトリエン(CysLT）受容体に結合する。CysLT受容体はGタンパク質結合7回貫膜タンパク質のスーパーファミリーに属する。2型CysLT（CysLT2）受容体は、肺マクロファージ、気道平滑筋、心臓プルキンエ細胞、副腎髄質細胞、末梢血白血球、脾臓、胎盤、及び脳に存在する。CysLT2は、特異的作動剤及び拮抗剤が存在しないがゆえに、定義付けがあまり進んでいない。システイニルロイコトリエン拮抗剤は、喘息、鼻炎、蕁麻疹などと関連するアレルギー性炎症の治療に有効である可能性がある。
ロイコトリエン，システイニル，CysLT2（ヒト型）の受容体結合を阻害する作用を有する化合物としては、種々の化合物が知られているが、多様な局面でロイコトリエン，システイニル，CysLT2（ヒト型）の受容体結合を阻害する上で、更なるロイコトリエン，システイニル，CysLT2（ヒト型）の受容体結合阻害剤に対する要望は強い。
【００１７】
(16)プリン作動性P2Y
P2受容体は、代謝型 P2Yとイオンチャンネル型P2X受容体に細分される。プリン作動性 P2Y受容体はGタンパク質結合7回貫膜タンパク質のスーパーファミリーに属する。Gタンパク質結合受容体真核細胞における主要なシグナル伝達系の一つを構成している。これらの受容体のコード化配列は、作動剤と拮抗剤との間の結合部位に寄与していると考えられる領域において、哺乳類の種間で高度に保存されている。プリン作動性 P2Y受容体が存在する。プリン作動性 P2Y受容体は、中枢神経系、多くの末梢組織及び細胞中に見られる。P2Y受容体作動作用は嚢胞性線維症及びドライアイ症候群の治療に有用である可能性があるとともに、上部消化管通過を低下させ、血小板凝集を引き起こし、炎症、細胞増殖及び細胞毒性を悪化させる。P2Y受容体拮抗作用は、 血栓症の治療に有用である可能性がある。
プリン作動性P2Yの受容体結合を阻害する作用を有する化合物としては、種々の化合物が知られているが、多様な局面でプリン作動性P2Yの受容体結合を阻害する上で、更なるプリン作動性P2Yの受容体結合阻害剤に対する要望は強い。
【特許文献１】特開２００６−２０６６１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、従来技術に存した上記のような課題に鑑み行われたものであって、その目的とするところは、シクロオキシゲナーゼ−２、ペプチダーゼ，カルパイン-1（ヒト型）、ペプチダーゼ，ＣＴＳＳ（カテプシンＳ）（ヒト型）、ホスホリパーゼPLA2-II、ペプチダーゼ，腫瘍壊死因子α変換酵素（TACE）（ヒト型）、プロテインセリン／スレオニンキナーゼ，AURKA（Aurora-A）（ヒト型）、プロテインチロシンホスファターゼ，PTPRF（LAR）（ヒト型）、プロテインチロシンホスファターゼ，PTPN11（SHP-2）（ヒト型）、トロンボキサン合成酵素（ヒト型）等の酵素活性を阻害する新規酵素活性阻害剤、並びに、トランスポーター，アデノシン、GABAペンチン、グルタメート，AMPA、グルタメート，カイナート、グルタメート，NMDA，グリシン、ロイコトリエン，システイニル，CysLT2（ヒト型）、プリン作動性P2Y等の受容体結合を阻害する新規受容体結合阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者は、シクロオキシゲナーゼ−２、ペプチダーゼ，カルパイン-1（ヒト型）、ペプチダーゼ，ＣＴＳＳ（カテプシンＳ）（ヒト型）、ホスホリパーゼPLA2-II、ペプチダーゼ，腫瘍壊死因子α変換酵素（TACE）（ヒト型）、プロテインセリン／スレオニンキナーゼ，AURKA（Aurora-A）（ヒト型）、プロテインチロシンホスファターゼ，PTPRF（LAR）（ヒト型）、プロテインチロシンホスファターゼ，PTPN11（SHP-2）（ヒト型）、トロンボキサン合成酵素（ヒト型）等の酵素活性を阻害する上で有用な物質、並びに、トランスポーター，アデノシン、GABAペンチン、グルタメート，AMPA、グルタメート，カイナート、グルタメート，NMDA、グリシン、ロイコトリエン，システイニル，CysLT2（ヒト型）、プリン作動性P2Y等の受容体結合を阻害する上で有用な物質について研究を行った結果、本発明を完成したものである。
【００２０】
(1) 本発明のシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を使用してシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤の酵素活性を阻害する方法を提供するものである。
【００２１】
(2) 本発明のペプチダーゼ，カルパイン-1（ヒト型）阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を使用してペプチダーゼ，カルパイン-1（ヒト型）の酵素活性を阻害する方法を提供するものである。
【００２２】
(3) 本発明のペプチダーゼ，ＣＴＳＳ（カテプシンＳ）（ヒト型）阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を使用してペプチダーゼ，ＣＴＳＳ（カテプシンＳ）（ヒト型）の酵素活性を阻害する方法を提供するものである。
【００２３】
(4) 本発明のホスホリパーゼPLA2-II阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を使用してホスホリパーゼPLA2-IIの酵素活性を阻害する方法を提供するものである。
【００２４】
(5) 本発明のペプチダーゼ，腫瘍壊死因子α変換酵素（TACE）（ヒト型）阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を使用してペプチダーゼ，腫瘍壊死因子α変換酵素（TACE）（ヒト型）の酵素活性を阻害する方法を提供するものである。
【００２５】
(6) 本発明のプロテインセリン／スレオニンキナーゼ，AURKA（Aurora-A）（ヒト型）阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を使用してプロテインセリン／スレオニンキナーゼ，AURKA（Aurora-A）（ヒト型）の酵素活性を阻害する方法を提供するものである。
【００２６】
(7) 本発明のプロテインチロシンホスファターゼ，PTPRF（LAR）（ヒト型）阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を使用してプロテインチロシンホスファターゼ，PTPRF（LAR）（ヒト型）の酵素活性を阻害する方法を提供するものである。
【００２７】
(8) 本発明のプロテインチロシンホスファターゼ，PTPN11（SHP-2）（ヒト型）阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を使用してプロテインチロシンホスファターゼ，PTPN11（SHP-2）（ヒト型）の酵素活性を阻害する方法を提供するものである。
【００２８】
(9) 本発明のトロンボキサン合成酵素（ヒト型）阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を使用してトロンボキサン合成酵素（ヒト型）の酵素活性を阻害する方法を提供するものである。
【００２９】
(10) 本発明のトランスポーター，アデノシン受容体結合阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を使用してトランスポーター，アデノシンの受容体結合を阻害する方法を提供するものである。
【００３０】
(11) 本発明のGABAペンチン受容体結合阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を使用してGABAペンチンの受容体結合を阻害する方法を提供するものである。
【００３１】
(12) 本発明のグルタメート，AMPA受容体結合阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を使用してグルタメート，AMPAの受容体結合を阻害する方法を提供するものである。
【００３２】
(13) 本発明のグルタメート，カイナート受容体結合阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を使用してグルタメート，カイナートの受容体結合を阻害する方法を提供するものである。
【００３３】
(14) 本発明のグルタメート，NMDA，グリシン受容体結合阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を使用してグルタメート，NMDA，グリシンの受容体結合を阻害する方法を提供するものである。
【００３４】
(15) 本発明のロイコトリエン，システイニル，CysLT2（ヒト型）受容体結合阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を使用してロイコトリエン，システイニル，CysLT2（ヒト型）の受容体結合を阻害する方法を提供するものである。
【００３５】
(16) 本発明のプリン作動性P2Y受容体結合阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、クロレラの細胞壁破砕物を使用してプリン作動性P2Yの受容体結合を阻害する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００３６】
本発明のシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、ペプチダーゼ，カルパイン-1（ヒト型）阻害剤、ペプチダーゼ，ＣＴＳＳ（カテプシンＳ）（ヒト型）阻害剤、ホスホリパーゼPLA2-II阻害剤、ペプチダーゼ，腫瘍壊死因子α変換酵素（TACE）（ヒト型）阻害剤、プロテインセリン／スレオニンキナーゼ，AURKA（Aurora-A）（ヒト型）阻害剤、プロテインチロシンホスファターゼ，PTPRF（LAR）（ヒト型）阻害剤、プロテインチロシンホスファターゼ，PTPN11（SHP-2）（ヒト型）阻害剤、及びトロンボキサン合成酵素（ヒト型）阻害剤は、それぞれの酵素活性を阻害する。
【００３７】
とりわけ、本発明のシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤は、抗炎症活性を示し、シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）の酵素活性を阻害する作用は高くない。そのため、炎症の緩和に有用であり、特に、生体の恒常性を維持しながらリウマチなどの慢性炎症を緩和する上で有用である。
【００３８】
本発明のトランスポーター，アデノシン受容体結合阻害剤、GABAペンチン受容体結合阻害剤、グルタメート，AMPA受容体結合阻害剤、グルタメート，カイナート受容体結合阻害剤、グルタメート，NMDA，グリシン受容体結合阻害剤、ロイコトリエン，システイニル，CysLT2（ヒト型）受容体結合阻害剤、及びプリン作動性P2Yは、それぞれの受容体結合を阻害する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明におけるクロレラとは、クロレラ属(Chlorella)に属する単細胞緑藻類であって、例えば、Chlorella pyrenoidosa、Chlorella ellipsoidea、Chlorella vulgaris、Chlorella regularis等を挙げることができる。本発明に最も適しているのは、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）である。
【００４０】
本発明の各酵素活性を阻害する阻害剤及び各受容体結合を阻害する受容体結合阻害剤におけるクロレラの細胞壁破砕物は、例えば次のようにして得ることができる。すなわち、先ずクロレラ濃度１０乃至２５重量％のクロレラ粉体・水懸濁液を１０℃以下に調整する。次にこの懸濁液を、下記のような連続湿式微粉砕機に送入し、破砕直後のスラリーが４０℃以下になるよう微粉砕する。次いで、このようにして得られたクロレラスラリーを、直ちに１０℃以下に冷却することにより、細胞壁が破砕されたクロレラを、品質劣化を生じさせることなく得ることができる。
【００４１】
上記連続湿式微粉砕機は、冷却外套を持つ密閉シリンダー中に多数の直径０．５乃至１．５mmのグラスビーズが封入されたものである。そのグラスビーズ容量は密閉シリンダー容量の８０乃至８５％であり、グラスビーズを流入液体と混和・回転することにより、流入液体中の物質を摩砕するものである。
【００４２】
このようにして細胞壁が破砕されたクロレラは、そのまま用いることもできるが、例えば、真空乾燥後粉砕を行う等の適宜の処理を施した後に使用してもよい。
本発明の各酵素活性を阻害する阻害剤及び各受容体結合を阻害する受容体結合阻害剤は、経口適用が望ましい。経口適用の形態に特に限定はないが、好ましくは、栄養食品、栄養補助食品、錠剤、顆粒剤、ゲルカプセル、オブラートカプセル、又は飲料用液体の形態である。
また種々の形態を形成する上で、各種賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、可塑剤等を適宜用いることができる。
【００４３】
賦形剤の例としては、糖類（乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール），デンプン（バレイショ，コムギ，トウモロコシ），無機物（炭酸カルシウム，硫酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，塩化ナトリウム），結晶セルロース，植物末（カンゾウ末，ゲンチアナ末）等を挙げることができる。
【００４４】
結合剤の例としては、デンプンのり液，アラビアゴム，ゼラチン，アルギン酸ナトリウム，メチ／レセルロース（ＭＣ），エチルセルロース（ＥＣ），ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），ポリビニルアルコール（ＰＶＡ），ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ），カルポキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等を挙げることができる。
崩壊剤の例としては、デンプン，寒天，ゼラチン末，結晶セルロース，ＣＭＣ・Ｎａ，ＣＭＣ・Ｃａ，炭酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００４５】
滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム，タルク，水素添加植物油，マクロゴール，シリコーン油等を挙げることができる。
コーティング剤の例としては、糖衣（白糖，ＨＰＣ，セラック），膠衣（ゼラチン，グリセリン，ソルビトール），フイルムコーティング〔ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ），ＥＣ，ＨＰＣ，ＰＶＰ〕，腸溶性コーティング〔ヒドロキシプロビルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ），セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）〕等を挙げることができる。
【００４６】
着色剤の例としては、水溶性食用色素，レーキ色素等を挙げることができる。矯味剤の例としては、乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール等を挙げることができる。矯臭剤の例としては、芳香性精油類，光線遮断剤（酸化チタン）等を挙げることができる。可塑剤の例としては、フタル酸エステル類，植物油，ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
【実施例】
【００４７】
1. クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）乾燥粉末の製造
冷却外套を持つ密閉シリンダー中にその密閉シリンダー容量の８０乃至８５％の容量の多数の直径０．５乃至１．５mmのグラスビーズが封入されており、そのグラスビーズを流入液体と混和・回転することにより流入液体中の物質を摩砕する連続湿式微粉砕機に、１０℃以下に調整されたクロレラ・ピレノイドサ濃度１０乃至２５重量％のクロレラ・ピレノイドサ粉体・水懸濁液を送入して、破砕直後のスラリーが４０℃以下になるよう微粉砕し、次いで、このようにして得られたクロレラ・ピレノイドサスラリーを、直ちに１０℃以下に冷却し、真空乾燥後、粉砕することにより、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末（以下、「被験物質」という。）が得られた。
【００４８】
2. 酵素活性阻害と受容体結合阻害の測定
被験物質３００μｇ／ｍｌの濃度で酵素活性阻害又は受容体結合阻害の測定を行った。なお、下記の酵素及び受容体のうち、シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）の阻害率は２８％であり、それ以外は阻害率７０％以上を示した。
阻害率７０％以上を示した酵素及び受容体については、それぞれ５０％阻害濃度を測定した。
酵素活性及び受容体結合阻害の測定は、それぞれ下記の手順に従い、分光蛍光光度法及びＥＬＩＳＡ法を用いて行った。
【００４９】
(1)シクロオキシゲナーゼ
シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）
昆虫Sf21細胞中で発現させたヒト組換えシクロオキシゲナーゼ-2（米国  Sigma社製）を使用した。被験物質および／またはビヒクルを0.12μg/mlの酵素とともに、pH7.7の改変Tris-HCl緩衝液中、37℃で15分間のプレインキュベーションを行った。0.3μMのアラキドン酸（米国  Sigma社製）を添加して反応を開始し、さらに5分間のインキュベーションを行い、1NのHClを添加して反応を停止させた。一定分量を分取してEIAキットによる分光蛍光測定に付し、PGE2の形成量を求めた。
被験物質による５０％阻害濃度は２８．９μｇ／ｍｌであった。
【００５０】
シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）
ヒト血小板（台湾  MDSPS-Taiwan社製）を使用した。被験物質および／またはビヒクルを、細胞（5×107/ml）とともに、pH7.4の改変HEPES緩衝液中、37℃で15分間インキュベーションを行った。100μMのアラキドン酸（米国  Sigma社製）を添加して反応を開始し、さらに15分間インキュベーションを行った後、1NのHClを添加して反応を停止させた。一定分量を分取してEIAキットによる分光蛍光測定に付し、PGE2の形成量を求めた。
【００５１】
(2)ペプチダーゼ，カルパイン-1（ヒト型）
ヒト赤血球カルパイン-1（米国  Calbiochem社製）を使用した。被験物質および／またはビヒクルを、33μg/mlの酵素、0.05%のカゼイン-FITC（米国  Sigma社製）、及び100μMのCaCl2とともに、pH7.4のTris-HCl緩衝液中で、37℃で30分間インキュベーションを行った。次いで、20%のトリクロロ酢酸を加えて反応を停止させた。波長485nm／535nmにおける分光蛍光計の指示値に基づき、ペプチド-FITCの形成量を求めた。
被験物質による５０％阻害濃度は６３．３μｇ／ｍｌであった。
【００５２】
(3)ペプチダーゼ，ＣＴＳＳ（カテプシンＳ）（ヒト型）の酵素活性阻害
ネズミ骨髄腫NS0細胞中で発現させたヒト組換えカテプシンS（米国  R&D Systems社製）を使用した。被験物質および／またはビヒクルを0.1μg/mlの酵素とともに、pH4.5の変法酢酸塩緩衝液中、25℃で15分間のプレインキュベーションを行った。10μMのZ-Leu-Arg-AMC（米国  Enzyme System Products社製）を添加して反応を開始し、さらに30分間のインキュベーションを行った。波長360nm／465nmにおける分光蛍光計の指示値に基づき、AMCの形成量を求めた。
被験物質による５０％阻害濃度は１．９μｇ／ｍｌであった。
なお、上記「AMC」は7-アミノ-4-メチルクマリンを示す。
【００５３】
(4)ホスホリパーゼPLA2-II
ヘビホスホリパーゼPLA2-II（米国  Sigma社製）を使用した。被験物質および／またはビヒクルを0.013μg/mlの酵素とともに、pH9.0の改変グリシン-NaOH緩衝液中、37℃で15分間のプレインキュベーションを行った。0.03μCiの1-パルミトイル-2-[14C]オレオイル-L-3-ホスファチジルコリン（米国  Amersham社製）を添加して反応を開始し、さらに5分間のインキュベーションを行い、0.2MのEDTAを添加して反応を停止させた。一定分量を分取して放射能計数を行い、[14C]オレイン酸塩の形成量を求めた。
被験物質による５０％阻害濃度は５０．６μｇ／ｍｌであった。
【００５４】
(5)ペプチダーゼ，腫瘍壊死因子α変換酵素（TACE）（ヒト型）
昆虫Sf21細胞中で発現させたヒト組換えTACE（米国  R&D Systems社製）を使用した。被験物質および／またはビヒクルを13ng/mlの酵素とともに、pH9.0の改変Tris-HCl緩衝液中、25℃で15分間のプレインキュベーションを行った。10μMのMca-Pro-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Dpa-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg（米国  R&D Systems社製）を添加して反応を開始し、さらに30分間のインキュベーションを行った。波長340nm／400nmにおける分光蛍光計の指示値に基づき、Mca-Pro-Leu-Ala-Gln-Alaの形成量を求めた。
被験物質による５０％阻害濃度は４７．９μｇ／ｍｌであった。
なお、上記「Mca」は7-メトキシクマリン-4-イルアセチルを示し、「Dpa」はN-3-(2,4-ジニトロフェニル)-L-2,3-ジアミノプロピノイルを示す。
【００５５】
(6)プロテインセリン／スレオニンキナーゼ，AURKA（Aurora-A）（ヒト型）
昆虫Sf21細胞中で発現させたヒト組換えプロテインキナーゼAurora-A（米国  UBI社製）を使用した。被験物質を0.7μg/mlの酵素とともに、pH7.2の改変MOPS緩衝液中、37℃で15分間のプレインキュベーションを行った。0.25μCiの[γ32P]ATPを含有する100μMのKemptide（米国  UBI社製）及び10μMのATP を添加して反応を開始し、さらに30分間のインキュベーションを行い、3%のH3PO4を添加することで反応を停止させた。一定分量を分取して放射能計数を行い、[32P]Kemptideの量を求めた。
被験物質による５０％阻害濃度は２４１μｇ／ｍｌであった。
【００５６】
(7)プロテインチロシンホスファターゼ，PTPRF（LAR）（ヒト型）
大腸菌で発現させたヒト組換えプロテインホスファターゼLAR（米国  Biolabs社製）を使用した。被験物質および／またはビヒクルを0.13μg/mlの酵素とともに、改変HEPES緩衝液pH7.2中、37℃で15分間のプレインキュベーションを行った。10μMのDiFMUP（米国  Molecular Probes社製）を添加することで反応を開始し、60分間の反応を行った。波長358nm／450nmにおける分光蛍光計の指示値に基づき、DiFMUの形成量を求めた。
被験物質による５０％阻害濃度は１３９μｇ／ｍｌであった。
【００５７】
(8)プロテインチロシンホスファターゼ，PTPN11（SHP-2）（ヒト型）
大腸菌で発現させたヒト組換えプロテインホスファターゼPTPN11（SHP-2）（英国  Biomol社製)を使用した。被験物質および／またはビヒクルを45ng/mlの酵素とともに、pH7.2の改変HEPES緩衝液中、37℃で15分間のプレインキュベーションを行った。100μMのDiFMUP（米国  Molecular Probes社製）を添加して反応を開始し、60分間の反応を行った。波長358nm／450nmにおける分光蛍光計の指示値に基づき、DiFMUの形成量を求めた。
被験物質による５０％阻害濃度は４０．２μｇ／ｍｌであった。
【００５８】
(9)トロンボキサン合成酵素（ヒト型）
ヒト血小板トロンボキサンA2合成酵素（台湾  MDSPS-Taiwan社製）を使用した。被験物質および／またはビヒクルを10μg/mlの酵素とともに、pH7.4のTris-HCl緩衝液中、25℃で15分間のプレインキュベーションを行った。10μMのプロスタグランジンH2（米国  Cayman社製）を添加することで反応を開始し、さらに3分間のインキュベーションを行い、1NのHClを添加することで反応を停止させた。一定分量を分取してEIAキットによる分光蛍光測定に付し、トロンボキサンB2の形成量を求めた。
被験物質による５０％阻害濃度は２．２３μｇ／ｍｌであった。
【００５９】
(10)トランスポーター，アデノシン
アデノシンのトランスポーターと関連する部位に対する[3H]ニトロベンジルチオイノシンの結合を測定した。体重250±20gのダンカン・ハートレー系モルモット（台湾  MDSPS-Taiwan社製）の大脳皮質膜を、pH7.4のTris-HCl緩衝液中で調製した。12.5mg分量の膜を0.5nMの[3H]ニトロベンジルチオイノシン（米国  PerkinElmer社製）とともに、25℃で30分間インキュベーションを行った。5μMニトロベンジルチオイノシンの存在下で非特異的結合度を推定した。膜をろ過、洗浄した後、フィルターの放射能計数を行い、[3H]ニトロベンジルチオイノシンの特異的結合量を求めた。
被験物質による５０％阻害濃度は１２３μｇ／ｍｌであった。
【００６０】
(11)GABAペンチン
体重200±50gのウィスター系雄性ラットの大脳皮質膜（台湾  MDSPS-Taiwan社製）を、pH7.4の改変HEPES緩衝液中で調製した。0.1mg分量の膜を20nMの[3H]GABAペンチン（米国  ARC社製）とともに、25℃で30分間インキュベーションを行った。100μMのGABAペンチンの存在下で非特異的結合性を推定した。膜をろ過、洗浄した後、フィルターの放射能計数を行い、[3H]GABAペンチンの特異的結合量を求めた。
被験物質による５０％阻害濃度は１１７μｇ／ｍｌであった。
【００６１】
(12)グルタメート，AMPA
体重175±25gのウィスター系雄性ラットの大脳皮質膜（台湾  MDSPS-Taiwan社製）をpH7.4の改変Tris-HCl緩衝液中で調製した。5mg分量を5nMの[3H]AMPA（米国  PerkinElmer社製）とともに、4℃で90分間インキュベーションを行った。1mMのL-グルタミン酸の存在下で非特異的結合性を推定した。膜をろ過、洗浄した後、フィルターの放射能計数を行い、[3H]AMPAの特異的結合量を求めた。
被験物質による５０％阻害濃度は２１μｇ／ｍｌであった。
なお、上記「AMPA」は、D,L-α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソキサロンプロピオン酸を示す。
【００６２】
(13)グルタメート，カイナート
体重175±25gのウィスター系雄性ラットの全脳（小脳を除く）（台湾  MDSPS-Taiwan社製）を用いて、pH7.4のTris-HCl緩衝液中で、グルタメート／カイナート受容体を調製した。10mg分量を5nMの[3H]カイナート（米国  PerkinElmer社製）とともに4℃で60分間インキュベーションを行った。1mMのL-グルタミン酸の存在下で非特異的結合性を推定した。膜をろ過、洗浄した後、フィルターの放射能計数を行い、[3H]カイナートの特異的結合量を求めた。
被験物質による５０％阻害濃度は９８．８μｇ／ｍｌであった。
【００６３】
(14)グルタメート，NMDA，グリシン
体重175±25gのウィスター系雄性ラットの大脳皮質（台湾  MDSPS-Taiwan社製）を使用して、グルタメートNMDA グリシン受容体をpH7.7のHEPES緩衝液中で調製した。2.5mg分量を0.33nMの[3H]MDL-105519グリシン（米国  Amersham社製）とともに4℃で30分間インキュベーションを行った。10μMのMDL-105519の存在下で非特異的結合性を推定した。膜をろ過、洗浄した後、フィルターの放射能計数を行い、[3H]MDL-105519の特異的結合量を求めた。
被験物質による５０％阻害濃度は１２９μｇ／ｍｌであった。
【００６４】
(15)ロイコトリエン，システイニル，CysLT2（ヒト型）
CHO-K1細胞中で発現させたヒト組換えシステイニルロイコトリエンCysLT2受容体（ベルギー  Euroscreen社製）を、pH7.4の改変Tris-HCl緩衝液中で使用した。5μg分量を1.3nMの[3H]ロイコトリエンC4（米国  PerkinElmer社製）とともに25℃で30分間インキュベーションを行った。500nMのロイコトリエンC4の存在下で非特異的結合性を推定した。膜をろ過、洗浄した後、フィルターの放射能計数を行い、[3H]ロイコトリエンC4の特異的結合量を求めた。
被験物質による５０％阻害濃度は１１．９μｇ／ｍｌであった。
【００６５】
(16)プリン作動性P2Y
体重175±25gのウィスター系雄性ラットの全脳（台湾  MDSPS-Taiwan社製）を用いて、pH7.4のTris-HCl緩衝液中でプリン作動性 P2Y受容体を調製した。200μg分量を0.1nMの[35S]ATP-αS（米国  PerkinElmer社製）とともに25℃で60分間インキュベーションを行った。10μMのADP-βSの存在下で非特異的結合性を推定した。膜をろ過、洗浄した後、フィルターの放射能計数を行い、[35S]ATP-αSの特異的結合量を求めた。
被験物質による５０％阻害濃度は７７．５μｇ／ｍｌであった。
なお、上記「ADP-βS」は、アデノシン5'-(β-チオ)二リン酸を示し、「ATP-αS」は、アデノシン5'-(α-チオ)三リン酸を示す。