(57)【要約】  【課題】容易なタンパク質の固定化でき、かつ固定化されてもタンパク質の特性を維持できる固定化方法を提供すること。  【解決手段】所定波長の光透過性を有する導電性樹脂膜（２）にタンパク質（１）を固定化することで、前記タンパク質（１）の構造に変化や損傷を与えずに、その特性を維持しつつ固定化し、所定波長の光透過性を具備する導電性樹脂膜とすることで、導電性樹脂膜（２）により励起光を遮断されずに、前記タンパク質（１）に励起光を照射する。  【選択図】図１
2008122347.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定波長の光透過性を有する導電性樹脂膜にタンパク質を固定化する方法。
【請求項２】
前記導電性樹脂膜にタンパク質を固定化する際に、少なくとも、下記（Ａ）工程又は／及び下記（Ｂ）工程を行なう請求項１記載のタンパク質を固定化する方法。
（Ａ）タンパク質を前記導電性樹脂膜に静電的に固定させる工程、
（Ｂ）タンパク質を前記導電性樹脂膜に架橋させて固定させる工程。
【請求項３】
所定波長の光透過性を有する導電性樹脂膜に、タンパク質が固定されたタンパク質固定化膜を用いたバイオセンサー。
【請求項４】
前記導電性樹脂膜は、電気応答を増幅する物質を含有することを特徴とする請求項３記載のバイオセンサー。
【請求項５】
前記導電性樹脂膜は、基板上に形成されていることを特徴とする請求項３記載のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の固定化方法及びこれを用いたバイオセンサーに関する。より詳細には、導電性樹脂膜にタンパク質を固定化するタンパク質の固定化方法及びこれを用いたバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、固層表面上にタンパク質を固定化して、タンパク質を利用したデバイスの開発が世界各国で進められている。このようなデバイスとしては、例えば、ポルフィリンをタンパク質内に有する光合成系タンパクや、電子伝達系タンパク質を用いた電子伝導デバイスや、光変化デバイス等が挙げられる。あるいは、ヘモグロビンや、ミオグロビン等を用いた酵素センサーやタンパク質センサー等も挙げられる。
【０００３】
その中でも、特にプロテオミクス分野におけるデバイスとしてのタンパクチップ、タンパクセンサー、薬剤応答チップ等もタンパク質を固層表面上に固定しているデバイスである。例えば、創薬基礎研究等において汎用されているBiacore（登録商標）システムなど、固層表面上にタンパクを固定してタンパク−タンパク間相互作用等を解析する技術分野においても用いられている。
【０００４】
このように幅広い分野においてタンパク質を固層表面上に固定化する手法が用いられているが、いかにタンパク質を固定化するかは解析精度に重要な影響を与えるため重要な技術である。
【０００５】
固層表面上にタンパク質を固定化する方法としては、例えば、直接基板に吸着させる方法や、自己組織化単分子膜（Self-assembled monolayer；ＳＡＭ膜）を形成させる方法等が挙げられる(以下、「ＳＡＭ膜形成法」という。)。ＳＡＭ膜形成法としては、例えば、Ａｕ上にＳＡＭ膜を形成させる場合には、ＨＯＯＣ（ＣＨ２）ｎＳＨ等の試薬を用いてチオール基（ＳＨ）を吸着させる手法が用いられている（非特許文献１）。また、インジウムスズ膜（Indium Tin Oxide；ＩＴＯ膜）上にＳＡＭ膜を形成させる場合には、ＩＴＯ表面上に水酸基（ＯＨ）を起立させ、ＨＯＯＣ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ等の試薬と反応させる手法も用いられている（非特許文献２）。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−３４４３８２号公報。
【非特許文献１】Electrochemical and Solid-State Letters, 5(12), E67-70 (2002)。
【非特許文献２】Langmuir, 20, P1901-1908 (2004)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、前述のタンパク質の固定化方法では固定化の際に前記タンパクの構造に変化を与えるため、タンパク質の特性を維持したまま基板に固定化することが困難であるという問題等が生じる。
【０００８】
そこで、本発明では、容易なタンパク質の固定化方法でありながら、固定化されてもタンパク質の特性を維持できる固定化方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者は、基板に直接タンパク質を固定化するのではなく、導電性を有する樹脂膜上にタンパク質を固定化させるという根本的な着想の変換を図り、以下の本発明を完成させた。
【００１０】
まず、本発明は、所定波長の光透過性を有する導電性樹脂膜にタンパク質を固定化する方法を提供する。これにより、導電性樹脂膜にタンパク質を固定化させることで、前記タンパク質の構造に変化や損傷を与えずに、その特性を維持しつつ固定化することができる。また、所定波長の光透過性を具備する導電性樹脂膜とすることで、導電性樹脂膜により励起光を遮断されずに、タンパク質に励起光を照射できる。
【００１１】
次に、本発明は、前記導電性樹脂膜にタンパク質を固定化する際に少なくとも、下記（Ａ）工程又は／及び下記（Ｂ）工程を行なうタンパク質固定化方法を提供する。（Ａ）タンパク質を前記導電性樹脂膜に静電的に固定させる工程、（Ｂ）タンパク質を前記導電性樹脂膜に架橋させて固定させる工程。これにより、たんぱく質の特性を維持しつつ導電性樹脂膜に固定することができる。
【００１２】
本発明において、「タンパク質を前記導電性樹脂膜に静電的に固定させる」とは、なんらかの電気的相互作用により固定されることをいい、電気的相互作用により固定されるあらゆる手法が包含される。また、「タンパク質を前記導電性樹脂膜に架橋させる」とは、導電性樹脂膜とタンパク質との間を橋かけするあらゆる手法が包含される。
【００１３】
また、本発明は、所定波長の光透過性を有する導電性樹脂膜に、タンパク質が固定されたタンパク質固定化膜を用いたバイオセンサーを提供する。前記タンパク質固定化膜を用いたバイオセンサーとすることで、高い解析精度を有するバイオセンサーとすることができる。
【００１４】
そして、本発明は、前記導電性樹脂膜に電気応答を増幅する物質を含有させたバイオセンサーを提供する。これにより、より高い精度で電気応答信号を検出できる。更に、本発明は、前記導電性樹脂膜を基板上に形成させるように工夫できる。これにより、前記タンパク質の構造に変化や損傷を与えずに、その特性を維持できるタンパク質固定化基板とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施するための好適な形態について説明する。なお、図面に示された実施の形態は、本発明の好適な実施の形態を例示したものであり、これにより本発明が狭く解釈されることはない。
【００１６】
図１は、本発明に係るタンパク質固定化方法を説明する概念図である。
【００１７】
図１の（Ｉ）状態、（ＩＩ）状態はいずれもタンパク質１が導電性樹脂膜２に固定された状態を示している。（Ｉ）状態は、タンパク質１が導電性樹脂膜２に直接固定された状態を示している。（ＩＩ）状態は、タンパク質１と導電性樹脂膜２を、架橋剤Ｌにより架橋させることで固定された状態を示している。
【００１８】
タンパク質１を基板等に直接固定化せずに、導電性樹脂膜２に固定化することで、タンパク質１の構造に変化や損傷を与えずに、その特性を維持しつつ固定化することができる。即ち、本発明において、光透過性を有する導電性樹脂膜２にタンパク質を固定化すればよく、その固定化手法について限定するものではない。
【００１９】
タンパク質１はその種類や構造について限定されないが、好適には、金属成分を分子構造中に含む金属タンパク質が望ましい。このような金属タンパク質の場合、従来の固定化方法によれば、タンパク質中のどの部位に活性中心である金属成分が存在するのかによって、検出される電気応答信号が異なってくる（位置特異性）。これに対して、本発明に係るタンパク質固定化方法は前記位置特異性の影響が少ないため、高い分析精度を有するセンサーとして応用できる点で望ましい。
【００２０】
前記金属タンパク質としては、例えば、ヘムタンパク質（鉄）や、ヘモシアニン（銅）、クロロフィルタンパク（マグネシウム）、カルボキシペプチダーゼ（亜鉛）、ピリビン酸キナーゼ（カリウム、マグネシウム）、アルギナーゼ（マンガン）等が挙げられる。前記ヘムタンパク質は、例えば、血中タンパク質（ヘモグロビン等）や、酸化還元酵素（カタラーゼ等）や、電子伝達系タンパク（シトクロムＢ、シトクロムＣ、Ｐ４５０等）が挙げられる。
【００２１】
導電性樹脂膜２は所定波長の光を透過する導電性樹脂膜であればよく、本発明ではその種類については特に限定されず、例えば、導電性を有する有機物質からなる樹脂膜が挙げられる。そのなかでも、ポリアニリン、ポリスチレン、ポリアセチレン等の導電性樹脂を用いることが望ましい。これらの導電性樹脂は高い導電率を有するため、より高い電気伝導作用を発揮できる点で好適である。
【００２２】
また、基板上に導電性樹脂膜２を形成させる場合には、基板上に導電性を有する有機物質（例えば、２−アミノ安息香酸等）を用いて電気化学的に形成させる手法によってもよい。具体的には、導電性有機物質（と必要に応じ架橋剤）を含有する溶液に基板を浸して、電気化学的に導電性樹脂膜を基板上に形成させる手法等を用いることができる。
【００２３】
そして、本発明では、導電性樹脂膜２の膜厚を調節することで、該導電性樹脂膜２に固定化させるタンパク質１の固定化量を制御することができる。導電性樹脂膜２の膜厚を厚くすれば、タンパク質１の固定化量を多くでき、前記導電性樹脂膜２の膜厚を薄くすればタンパク質１の固定化量を少なくすることができる。
【００２４】
前記導電性樹脂膜２の膜厚の調節方法は特に限定されないが、例えば、導電性有機物質等を含有する溶液に基盤を浸して電気化学的に導電性樹脂膜２を形成させる場合には、その掃引回数（サイクル数）を多くすることで膜厚を厚くさせることができる。
【００２５】
導電性樹脂膜２が所定波長の光透過性を有することで、かかる波長光は導電性樹脂膜２を透過する。これにより、タンパク質１へ照射することができ、前記波長光により励起させることで一定の起電力を与えることができる。このように、励起光により起電力を発生させることで電気応答信号を導電性樹脂膜２から発生させることができるため、精度の高いセンサーとして使用できる。
【００２６】
また、導電性樹脂膜２の表面の形状については特に限定されず、パターニング処理を施していてもよい。パターニングの方法としては特に限定されず、例えば二酸化ケイ素、酸化ケイ素、酸化タンタル等の絶縁体等を用いてもう１層をマスキングしてもよいし、必要に応じて、導電性樹脂膜の一部を削ってもよい。一例としては、スパッタリング法等により前記絶縁体の薄膜を形成させた後に、マスクを用いてフォトレジストでパターンを形成させる。そして、レジストパターンをエッチング液やプラズマエッチング処理によって絶縁物パターンを形成させた後、前記フォトレジストを除去する手法等が挙げられる。
【００２７】
このようにして、パターニングされた導電性樹脂膜２を用いたセンサーチップとすれば、１種類のタンパク質１で３次元の分析が可能となったり、少スケールでの分析が可能となり、マイクロチップ等に応用することもできる。
【００２８】
そして、本発明において、導電性樹脂膜２をタンパク質固定化膜として用いることで、ＳＡＭ膜等の基板に直接タンパク質を固定化する方法等と比して、より安定であり、かつ耐久性に優れたタンパク質固定化膜とすることができる。また、タンパク質固定化膜の用途や使用環境等を考慮して、所望する柔軟性を有する樹脂膜を選択できるため、より幅広い用途に用いることができる。
【００２９】
本発明において、タンパク質１は導電性樹脂膜２に固定されていればよくその固定化手法については特に限定されず、例えば、静電的に固定化させてもよいし（図１の（Ｉ）状態等参照）、架橋することで固定化してもよい（図１の（ＩＩ）状態等参照）。
【００３０】
本発明では、図１の（Ｉ）状態のように、導電性樹脂膜２の表面上に整列された状態で固定化されていることに限定されず、例えば、導電性樹脂膜２に埋もれた状態（図示せず）等であってもよく、このような状態であってもタンパク質１の電気応答を検出できるセンサー等に用いることができる。
【００３１】
更に、本発明に係るタンパク質固定化方法によれば、例えば、図１の（ＩＩ）状態のように、タンパク質１と導電性樹脂膜２とが架橋剤Ｌを介していることで、直接接していない状態であってもタンパク質１の電気応答を検出できるセンサー等に用いることができる。
【００３２】
タンパク質１を導電性樹脂膜２に直接固定化させる手法としては、イオン結合、共有結合、分子間結合、あるいは金属結合等が挙げられる。より具体的には、導電性樹脂膜２の構成化合物中の置換基にタンパク質１を電気的相互作用により固定化すること等が挙げられる。本発明において、静電的に固定化させるとは、何らかの電気的相互作用によりタンパク質１と導電性樹脂膜２とを結合させるあらゆる手法が含有される。
【００３３】
また、タンパク質１を導電性樹脂膜２に架橋することで固定化する手法としては、導電性樹脂膜２の置換基を架橋剤Ｌで活性化し、架橋剤Ｌを介してタンパク質１をカップリング反応等で固定化する手法等が挙げられる。より好適には、架橋剤Ｌを介してタンパク質１を固定化する際に架橋剤Ｌの末端基をカルボン酸基（ＣＯＯＨ）等に修飾・置換することが望ましい。かかる構造とすることで、タンパク質１が、カルボン酸基等の解離性残基を有するアミノ酸を含有する場合には、該アミノ酸を介してタンパク質１と導電性樹脂膜２を静電的に固定することも可能であるため、より強く固定化できる点で望ましい。
【００３４】
本発明において架橋剤Ｌの種類については特に限定されず、タンパク質１や導電性樹脂膜２の種類・構造等を考慮して、適宜、好適な種類を決定できる。本発明に用いることができる架橋剤Ｌの一例としては、反応末端基にチオール基（ＳＨ）やアルデヒド基（ＣＨＯ）やカルボン酸基（ＣＯＯＨ）を有する架橋剤を用いることができる。
【００３５】
そして、本発明において前記架橋剤Ｌのスペーサー構造についても限定されず、タンパク質１や導電性樹脂膜２の構造等を考慮して、適宜、好適な構造を決定でき、例えば、疎水性であるアルキル鎖や、親水性であるポリエチレンオキシド鎖等を用いることができる。
【００３６】
このように導電性樹脂膜２の個性化合物や架橋剤Ｌの置換基を、適宜、選択することでタンパク質の種類を選択的に固定したり、該タンパク質の固定化の向きを制御することもできる。一例としては、タンパク質１の官能基（ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ等）と相互作用を有する官能基を前記導電性樹脂膜２や架橋剤Ｌに導入することが挙げられる。あるいは、タンパク質１の立体的構造を考慮して、立体的相互作用を有する置換基を前記導電性樹脂膜２や架橋剤Ｌに導入してもよい。
【００３７】
なお、本発明に係るタンパク質固定化方法において、あらかじめ導電性樹脂膜２の表面を洗浄する工程を行なうことで、タンパク質１の性質をより維持でき、安定性のあるタンパク質固定化を行なうことができる。導電性樹脂膜２の洗浄方法については特に限定されないが、好適には超音波洗浄を行なうことが望ましい。
【００３８】
このように、本発明に係るタンパク質固定化方法によれば、タンパク質１の特質を保持したまま固定化することができる。即ち、本発明に係るたんぱく質固定化方法は、容易かつ、安定性・耐久性のあるタンパク質の固定化方法でありながら、固定化されたタンパク質の特性を維持できる。そのため、本発明はタンパク質を用いたデバイス、例えば電子デバイス、光変換デバイス等、またはプロテオミクス分野におけるタンパクチップ等の開発の基礎基板技術となりうる。
【００３９】
図２は、本発明に係るバイオセンサーの第１実施形態の概念図である。
【００４０】
図２の符号Ａは、本発明に係るバイオセンサーを示している。前記バイオセンサーＡでは、タンパク質１が導電性樹脂膜２に固定化されている。該導電性樹脂膜２は電極として用いられる。そして、前記導電性樹脂膜２と対向して、もう一方の電極３が設けられている。導電性樹脂膜２と電極３との間には電解質４が充填されている。また、導電性樹脂膜２と電極３とは導線５で接続されており、導線５には計測器６が設けられている。
【００４１】
タンパク質１には、該タンパク質１と相互作用している物質Ｐが存在している。このタンパク質１の解析は、例えば、以下の手順により行なうことができる。
【００４２】
まず、起電力を与えるため励起光Ｕを導電性樹脂膜２に照射する。前記励起光Ｕは、導電性樹脂膜を透過する波長を有する光である。従って、励起光Ｕは導電性樹脂膜２を透過して、タンパク質１に到達する。そして、励起光Ｕにより起電力が生じ、電気応答信号が発せられる。
【００４３】
電気応答信号は、タンパク質１と何らかの相互作用している物質Ｐの影響を受けるため、これにより電流値は増減する。図１では電気応答信号として電流が矢印Ｉ１方向に流れる状態を示している。従って、電流値等の増減を計測器６で測定することで、前記タンパク質１の分子構造等を解析することができる。
【００４４】
電気応答信号の測定方法は特に限定されないが、好適には、ボルタンメトリーにより測定することができる。ボルタンメトリーによれば、センサーＡの作用電極（導電性樹脂膜２と電極３）の電位を時間とともに変化させ（電位走査）、これにより得られる電流−時間曲線を測定することで評価できる。
【００４５】
この電流−時間曲線は電流−電位曲線に対応しており、物質によって反応する電位が異なるので反応物の定性分析に利用できる。また、電流値は濃度に依存するのでその定量分析にも利用できるため好適である。従って、センサーＡはタンパク質１や物質Ｐの定性・定量分析等に有効に用いることができる。
【００４６】
そして、前記ボルタンメトリーのなかでも、サイクリックボルタンメトリーによる測定法が好ましい。サイクリックボルタンメトリーは、前記電位走査を繰り返し行なう方法であり、反応の起こる電位、反応の速さ、反応生成物の反応性等について、電極表面（導電性樹脂膜２の表面）で起こっているタンパク質１と物質Ｐとの相互作用を把握できる簡便な測定方法である点で好ましい。
【００４７】
サイクリックボルタンメトリーにより得られる電流−電位曲線（サイクリックボルタモグラム）の電流ピークは、過電圧の増大に伴ってタンパク質１と物質Ｐとの反応量が増して電流が大きくなる効果と、時間経過に伴って電極近傍の反応物量が減少して電流が小さくなる効果により生じる。このような原理により、電流−電位曲線の電流ピーク情報を得ることでタンパク質１と物質Ｐとの情報を得ることができる。例えば、タンパク質１に物質Ｐが付着した場合には電流値が変化するため、これを測定することで種々の現象を解析できる。
【００４８】
電極３は、その材質等については特に限定されず、例えば、金属や硬質樹脂等であってもよいが、所定の柔軟性を有する軟質樹脂製とすることでバイオセンサーＡは所定の柔軟性を具備するため、種々の形状等に対応できるバイオセンサーとして幅広く利用できる点で望ましい。あるいは、透明電極とすることで光透過性等を付与させてもよい。
【００４９】
このように、励起光Ｕを照射してそのエネルギーから得られる電気応答信号を解析することで、励起光Ｕをプローブとして使用しタンパク質１や物質Ｐの状態や、それらの周囲の状態を、非接触・非破壊により解析することができる。
【００５０】
図３は、本発明に係るバイオセンサーの第２実施形態の概念図である。
【００５１】
図３の符号Ｂは、本発明に係るバイオセンサーを示している。以下、第１実施形態と共通する点については説明を割愛し、相違する点を強調して説明する。バイオセンサーＢは、導電性樹脂膜２に電気信号を増幅する物質２１を含有しており、これにより電気応答信号を増幅できるという利点を有している。これにより電気信号を増幅する物質２１を配合させることで、より微細な電気信号の増減も測定することができるため、より高い精度の解析を行なうことができる。
【００５２】
本発明において用いられる電気信号を増幅する物質２１とは、励起光Ｕ（図１参照）の照射により発生する電気応答信号（図１のＩ１参照）を増幅することができればよく、例えば、光電子補足剤を用いることで励起光Ｕにより発生する光電流を増加させる物質等を用いることができる。そして、本発明において用いる電気信号を増幅する物質の種類については限定されないが、好適には、メディエーターとしてアセチル化銅（ＣｕＯＡｃ）やカルシウムイオン（Ｃａ２＋）等の金属イオン等を用いることが望ましい。
【００５３】
前記電気信号を増幅する物質２１を導電性樹脂２に含有させる方法については、特に限定されず、例えば、導電性樹脂２にブレンドさせてもよいし、コーティング等によってもよい。また、前記物質２１の含有量についても、特に限定されず、より高い増幅作用を所望する場合にはその添加量を多くすることができる。
【００５４】
図４は、本発明に係るバイオセンサーの第３実施形態の概念図である。
【００５５】
図４の符号Ｃは、本発明に係るバイオセンサーを示している。以下、第１実施形態、第２実施形態と共通する点については説明を割愛し、相違する点を強調して説明する。バイオセンサーＣは、導電性樹脂膜２を基板２２上に形成させたものである。
【００５６】
基板２２の材質や種類等については特に限定されないが、導電性樹脂膜２が透過する光を透過する性質を具備することが望ましい。即ち、導電性樹脂膜２を透過する光の波長の光透過性を有する基板であることが望ましい。これにより、励起光Ｕが基板２２と導電性樹脂膜２を透過することができ、タンパク質１に照射することができる点で望ましい。
【００５７】
また、図３は、タンパク質１に物質Ｑが相互作用した状態を示しており、物質Ｑがタンパク質１に作用することで電気応答信号として電流が矢印Ｉ２の方向に流れている状態である。
【００５８】
そして、バイオセンサーＣの導電性樹脂膜２に、電気応答を増幅する物質（図２の符号２１参照）を含有させてもよい（図示せず）。これにより、より微細な電気信号を検出できるタンパク質固定化基板とでき、より高い精度を有するバイオセンサーとすることができる。
【００５９】
このように、本発明に係るタンパク質の固定化方法では、前記導電性樹脂膜２を基板２２上に形成させ、その上にタンパク質１を固定化させることで、タンパク質が固定化された基板を得ることもできる。これにより、容易でありながら、かつ安定であり耐久性に優れたタンパク質固定化基板を得ることができる。
【実施例１】
【００６０】
実施例１では、フッ素ドープ酸化スズ（fluorine doped tin oxide ：ＦＴＯ）基板上に２−アミノ安息香酸（amino benzoic acid：ＡＢＡ）を用いて導電性樹脂膜を形成し、該導電性樹脂膜に架橋剤を介してシトクロムＣ（Cytochrome C form Horse Heart：ＣｙｔＣ）を固定化した。そして、サイクリックボルタンメトリーにより前記シトクロムＣの電子伝達系タンパク質としての機能が保持されているか否かを検証した。
【００６１】
まず、ＦＴＯ基板の洗浄を行なった。ＦＴＯ基板を無蛍光洗剤（Alconox；Sigma Aldrich製）を用いて超音波洗浄し、その後、イソプロパノール（Sigma Aldrich社製）中で超音波洗浄を行い、最後にＭｉｌｌＱ水によって超音波洗浄を行なった。
【００６２】
超音波洗浄されたＦＴＯ基板に電気化学的に導電性樹脂膜を形成した。膜の形成は、０．０５Ｍの２−アミノ安息香酸／１ＭのＨ２ＳＯ４溶液中にＦＴＯ基板を浸して、０〜１Ｖ間を１０ｍＶ／Ｓｅｃの掃引速度で往復掃引した。
【００６３】
このようにして形成された導電性樹脂膜についてカルボン酸（ＣＯＯＨ）基の活性化を行なった。活性化は、３０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に、４ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、Sigma Aldrich社製）と１ｍＭのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ、Sigma Aldrich社製）を溶解した緩衝溶液中に、前記ＦＴＯ基板を室温下で８０分間浸すことで実施した。続いて、３μＭのシトクロムＣ／１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に前記ＦＴＯを４℃条件下で一夜浸し、シトクロムＣの固定化を実施した。
【００６４】
シトクロムＣ固定化後、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でサイクリックボルタンメトリーの測定を実施した。参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いて、電子伝達系タンパクであるシトクロムＣの酸化還元ピークを観察した。この測定結果を図５、図６に示す。図５は、導電性樹脂膜形成時のサイクリックボルタモグラムである。図６は、シトクロムＣ固定化後のサイクリックボルタモグラムである。図６において、シトクロムＣの酸化還元電位に相当する位置に酸化還元ピークが観察された。
【実施例２】
【００６５】
実施例２では、実施例１の手順と同様の手順でシトクロムＣを固定化した後、掃引速度を徐々に変化させてサイクリックボルタンメトリーを行い、これにより観察された酸化還元ピークが吸着型のものであるかどうかを検証した。
【００６６】
図７は、本発明に係る固定化方法でシトクロムＣを固定化した導電性樹脂のサイクリックボルタンメトリー曲線を重ね合わせたグラフである。測定条件は、１０ｍＶ／ｓｅｃ〜１００ｍＶ／ｓｅｃの範囲で掃引し、１０ｍＶ／ｓｅｃの掃引速度で増加させながら測定を行なった。各掃引速度で測定したサイクリックボルタンメトリー曲線を重ね合わせたグラフが図７である。図８は、図７により抽出したデータに基づいて、掃引速度と酸化電流値（Ｉｐａ）の関係をプロットした図である。
【００６７】
本実施例の結果によれば、図８の回帰直線の寄与率（Ｒ２）は０．９９２９であり、ほぼ１．０に近い数値となった。そして、図７で観察された酸化還元ピークは、吸着型（即ち、ＦＴＯ基板に固定化されたシトクロムＣによるピーク）であることが明らかとなった。
【００６８】
実施例１，２から、電気化学的な手法による容易な導電性樹脂膜の形成や、基板を溶媒中に浸しておくだけで架橋剤によるタンパクの固定化によりシトクロムＣをＦＴＯ基板に固定できたことが示された。また、当該固定化方法は、シトクロムＣの電子伝達系としての機能を損なわずに固定化されていることも示された。
【実施例３】
【００６９】
実施例３では、実施例１の手法と同様の手法で、Ｚｎ−シトクロムＣ（シトクロムＣのＦｅをＺｎに変換したもの）をＦＴＯ基板に固定化し、その光電流の計測を測定した。
【００７０】
図９は、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で光電流を測定したグラフである。図９では、４２０ｎｍ付近のソーレー帯（Soret band）と、赤色領域のＱ帯（Q-band）の両者に相当する光電流が観測された。これにより、本発明に係る固定化方法によれば、ＦＴＯ基板等が具備する透明電極の利点である光透過性を維持できることが示された。また、固定化されたＺｎ−シトクロムＣの性質も維持されていることも示された。
【実施例４】
【００７１】
実施例４では、導電性樹脂膜の膜厚を変化させて、その際のタンパク質の固定化量について検証した。
【００７２】
導電性樹脂膜の膜厚は、膜形成時の掃引回数を変化させることで制御した。具体的には、実施例３と同様の条件で固定化を行なうが、導電性樹脂膜形成時の往復掃引サイクルを５，２０，５０とした条件で導電性樹脂膜を形成させた。
【００７３】
図１０は、導電性樹脂膜形成時の往復掃引を５サイクル実施して、Ｚｎ−シトクロムＣを固定化した場合の光電流測定のグラフである。図１１は、導電性樹脂膜形成時の往復掃引を２０サイクル実施して、Ｚｎ−シトクロムＣを固定化した場合の光電流測定のグラフである。図１２は、導電性樹脂膜形成時の往復掃引を５０サイクル実施して、Ｚｎ−シトクロムＣを固定化した場合の光電流測定のグラフである。
【００７４】
最も薄い膜厚となった往復掃引５回の場合（図１０）は、ソーレー帯に該当する光電流値は５．５８Ｅ−０９Ａであった。往復掃引２０回の場合（図１１）は、ソーレー帯に該当する光電流値は９．２９Ｅ−０９Ａであった。最も厚い膜厚となった往復掃引５０回の場合（図１２）は、ソーレー帯に該当する光電流値は１．４２Ｅ−０８Ａであった。
【００７５】
以上より、実施例４において、本発明に係る固定化方法によれば導電性樹脂膜の膜厚を変えることでタンパク質の固定化量を制御できることが示された。
【実施例５】
【００７６】
実施例５では、本発明に係る固定化方法のデバイス型への応用について検討した。
【００７７】
図１３は、本発明に係る固定化方法によりデバイス化された図面代用写真である。即ち、実施例１の手順により基板に積層させた導電性樹脂膜上にシトクロムＣを固定化させたデバイスである。そして、図１４は、図１３のデバイスの光電流の測定曲線を示すグラフである。
【００７８】
図１４に示す光電流の測定曲線から、ソーレー帯（４２０ｎｍ付近）とＱ帯（５５０ｎｍ付近）がそれぞれ確認できた。従って、本発明に係る固定化方法は、少なくともタンパク質を用いたデバイスに応用できることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明に係るタンパク質の固定化方法を説明する概念図である。
【図２】本発明に係るバイオセンサーの第１実施形態の概念図である。
【図３】本発明に係るバイオセンサーの第２実施形態の概念図である。
【図４】本発明に係るバイオセンサーの第３実施形態の概念図である。
【図５】導電性樹脂膜形成時のサイクリックボルタモグラムである。
【図６】本発明に係る固定化方法でシトクロムＣを固定化した際のサイクリックボルタモグラムである。
【図７】本発明に係る固定化方法でシトクロムＣを固定化した導電性樹脂のサイクリックボルタンメトリー曲線を重ね合わせたグラフである。
【図８】図７により抽出したデータに基づいて、掃引速度と酸化電流値（Ｉｐａ）の関係をプロットした図である。
【図９】リン酸緩衝液中で光電流を測定したグラフである。
【図１０】導電性樹脂膜形成時の往復掃引を５サイクル実施して、Ｚｎ−シトクロムＣを固定化した場合の光電流測定のグラフである。
【図１１】導電性樹脂膜形成時の往復掃引を２０サイクル実施して、Ｚｎ−シトクロムＣを固定化した場合の光電流測定のグラフである。
【図１２】導電性樹脂膜形成時の往復掃引を５０サイクル実施して、Ｚｎ−シトクロムＣを固定化した場合の光電流測定のグラフである。
【図１３】本発明に係る固定化方法によりデバイス化された図面代用写真である。
【図１４】図１３のデバイスの光電流の測定曲線を示すグラフである。
【符号の説明】
【００８０】
１  タンパク質
２  導電性樹脂膜
３  電極
４  電解質
５  導線
６  計測器
２１  電気応答を増幅する物質
２２  基板
Ａ，Ｂ，Ｃ  バイオセンサー
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
2008122347.tif 000006
【図８】
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【図９】
2008122347.tif 000008
【図１０】
2008122347.tif 000009
【図１１】
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【図１】
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【図５】
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【図７】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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