(57)【要約】      （修正有）【課題】目的遺伝子を含む試料のうち、一切のDNA切断部位を持たない完全な閉環状二本鎖DNAを試料ターゲットとして用いて、目的遺伝子を迅速に抽出・精製・クローニングする方法を提供する。【解決手段】プローブDNA配列と固層粒子とを含むプローブDNA複合体粒子に閉環状二本鎖DNAをハイブリダイズさせることにより、目的遺伝子DNA配列が組み込まれた閉環状二本鎖DNAを、宿主細胞に直接トランスフェクション可能な形状で固層粒子に回収し、溶出溶液で溶出し、これを宿主細胞に導入して、目的遺伝子を迅速に抽出・精製・クローニングすることを特徴とする。【選択図】  図５
2008099556.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉環状二本鎖DNAをターゲットDNA分子として用いる、目的遺伝子の抽出、精製、クローニング方法であって、
目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の配列に相補的なDNA配列と、固層粒子と、を含むプローブDNA複合体粒子に、閉環状二本鎖DNAをハイブリダイズさせることにより、目的遺伝子の塩基配列が組み込まれた閉環状二本鎖DNAを前記固層粒子に回収し、溶出溶液で溶出し、これを宿主細胞に導入し、目的遺伝子を迅速に抽出・精製・クローニングすることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記プローブDNA複合体粒子が、
前記固層粒子に結合した、プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチド相補的結合用配列を含む一本鎖DNA配列部分から成るプローブDNA結合粒子が、
目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の配列に相補的なDNA配列と、前記プローブDNA結合粒子のプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチド相補的結合用配列に相補的なDNA配列と、を含むプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドに、
前記プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチド相補的結合用配列において、80%以上の相補率にて相補的結合して成る、
プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子である、請求項１記載の抽出、精製、クローニング方法。
【請求項３】
前記プローブDNA複合体粒子が、
前記固層粒子に結合した一本鎖配列部分から成るプローブDNA結合粒子が、
目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の配列に相補的なDNA配列(Tm値A)と、前記プローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分の少なくとも一部に相補的なDNA配列部分(Tm値B)と、を含むプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドであって、Tm値AとTm値Bの差が少なくとも8℃以上（Tm値B−Tm値A＞8℃）のプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドに、
相補的結合して成るプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子である、請求項１記載の抽出、精製、クローニング方法。
【請求項４】
前記プローブDNA複合体粒子が、前記プローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分に、目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の配列に相補的なDNA配列を含むヌクレオチドが共有結合して成るプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子である、請求項１記載の抽出、精製、クローニング方法。
【請求項５】
前記プローブDNA複合体粒子における目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列に対応する当該目的遺伝子の塩基配列の隣接上流域の0〜７塩基上流を基点とする20〜50塩基配列一本鎖DNA（上流ブロッキング配列、Up-BS）及び隣接下流域の0〜７塩基下流を基点とする20〜50塩基配列一本鎖DNA（下流ブロッキング配列、Down-BS）：濃度10uM以上、BS分子数と目的遺伝子分子数の比は少なくとも1000倍以上；の存在下で、目的遺伝子を含む閉環状二本鎖DNA試料を、プローブDNA複合体粒子とハイブリダイズさせることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の抽出、精製、クローニング方法。
【請求項６】
目的遺伝子を含む閉環状二本鎖DNA試料を、0.1N〜0.4Nのアルカリ溶液中で0℃〜10℃の温度条件下、20分〜1時間、変性させて行うことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の抽出、精製、クローニング方法。
【請求項７】
目的遺伝子を含む閉環状二本鎖DNA試料をプローブDNA複合体粒子と、50〜350mMの塩濃度下でハイブリダイズさせることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の抽出、精製、クローニング方法。
【請求項８】
請求項２記載のプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子。
【請求項９】
目的遺伝子の塩基配列の一部と相補的な配列と、プローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列と、を有するプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドを、プローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分に、50℃〜70℃の範囲内で5サイクル以上サイクル・ハイブリダイズさせること、
により作成される、請求項８記載のプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子。
【請求項１０】
請求項４記載のプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子。
【請求項１１】
固層粒子に結合した一本鎖DNA配列部分から成るプローブDNA結合粒子の当該一本鎖DNA配列部分の少なくとも一部に相補的な配列と、目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の配列と、を有する一本鎖ブリッジヌクレオチドを、前記プローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分とハイブリダイズさせ、DNA合成酵素を用いて、前記一本鎖ブリッジヌクレオチドの当該目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の配列に相補的な配列を含むヌクレオチドを、前記プローブDNA結合粒子の前記一本鎖DNA配列部分に酵素化学合成的に共有結合させること、
により作成される、請求項１０記載のプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子。
【請求項１２】
請求項１〜７記載の方法により目的遺伝子を濃縮して含む宿主細胞からの回収物に含まれる閉環状二本鎖DNAをターゲットDNA分子として用いる、請求項１〜７記載のクローニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主にゲノム遺伝子ライブラリーやcDNAライブラリーからの目的遺伝子の迅速な抽出、分離精製、検出、クローニング等のための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
目的遺伝子を分離・検出するために、固層粒子に結合されたプローブDNAと目的遺伝子とのハイブリダイゼーション方法(特許文献１)や、固層粒子に結合されたプローブDNAと目的遺伝子の両方と相補的な配列を持つブリッジヌクレオチドを用いて目的遺伝子を固層に抽出する方法(特許文献２)、目的遺伝子と相補的なオリゴヌクレオチドの一端にビオチンを結合させ、ビオチンとアビジンの特異的結合反応を利用してアビジン結合粒子に目的遺伝子を抽出する方法(非特許文献１)が、以前から開発および使用されてきた。しかし、これらの方法ではいずれもターゲットとなるDNA分子の立体構造上の物理化学的性質の特定、即ち、検出しようとする目的遺伝子が含まれるDNA試料が１本鎖あるいは二本鎖の直鎖状DNA(linearDNA)か、開環状二本鎖DNA(open circleDNA)か、閉環状二本鎖DNA(super coiledないしclosed circular DNA)であるかの特定がなされておらず、そのためにこれらの方法では、抽出された目的遺伝子DNAの形状がほとんど直鎖状DNAである結果、検出は可能だが大腸菌などの宿主に導入して、大量に迅速に目的遺伝子DNAをクローニングできるDNA形態（閉環状DNA）の形で抽出することはほとんど不可能なものである。
【０００３】
これらの欠点を「１本鎖環状DNAのみを生成する性質を持つ大腸菌を用いて合成させ、１本鎖環状DNAとして抽出し、目的遺伝子のプライマーを用いてもう一方の相補的鎖を試験管内酵素合成し再二本鎖DNAとすることで大腸菌に導入できる形態にすること」で克服し、これを大腸菌に導入し大量精製・クローニング可能な方法が開発され、商品化されている(特許文献３)。しかし、この方法では１本鎖環状DNAを用いているため、複雑な抽出過程と再二本鎖DNAの酵素合成過程を含み、合成ミスを起すなど迅速性、正確性などの点で欠点がある。
【特許文献１】特開平8-89294号公報
【特許文献２】国際公開WO2004-101785号
【特許文献３】米国特許第5500356号公報
【非特許文献１】「バイオマグネチック・テクニクス・モレキュラー・バイオロジー(Biomagnetic Techniques in Molecular Biology)」、ダイナル(Dynal)社、1995年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述した「固層粒子に結合されたオリゴヌクレオチドプローブ法」、「アビジン・ビオチンプローブ法」や「ブリッジヌクレオチドプローブ法」では、目的の遺伝子を抽出するプローブの形状は特定されているが、抽出ターゲットとなるDNAの形状は特定されていない。しかし、抽出されたプラスミド(plasmid)cDNAライブラリーやプラスミドゲノムDNA、コスミド(cosmid)ゲノムライブラリーのようなDNAライブラリーはそのDNAの性質上、1)閉環状(super coiled)DNA、2)開環状(open circle)DNA、3)鎖状(linear)DNAの形態で存在する。そのためターゲットとなるDNAの物理化学的形状を特定せずに、これらの３つDNA形状の混在したDNAを用いて目的遺伝子の分離・抽出を行うと、DNAハイブリダイゼーションの性質上前記３つのDNA形態の内、ほとんど2)と3)の開環状DNA、鎖状DNAに由来する直鎖の１本鎖DNAか１本鎖の環状DNAしか分離・抽出されて来ない。しかし、このようにして分離・抽出された直鎖の１本鎖DNAや１本鎖の環状DNAは、目的遺伝子の存在を検証するには適しているが、この形状のDNAを直ちに大腸菌等の宿主細胞に導入して、ここから目的の遺伝子をクローニングすることは不可能あるいは更に多大な労力と時間を必要とする。また「１本鎖環状DNAからの二本鎖環状合成法による遺伝子クローニング法」（特許文献３）では、抽出後に複雑な試験管内酵素合成過程を必要とし、煩雑で、不正確で、かつ高コストであることも問題である。
【０００５】
また、従来のブリッジヌクレオチドプローブ法では、2つのTm値の差の必要性・有効性が無視されているが、このTm値差の大少は目的遺伝子の抽出・精製効率に多大な影響を与えるため遺伝子抽出・精製・クローニングにおいて極めて重要な要素である。
加えて、これらの従来法では、プローブDNA結合粒子やブリッジヌクレオチド内の目的遺伝子と相補的な塩基配列に相当する目的遺伝子内塩基配列の隣接上流域の0〜７塩基上流を基点とする20〜50塩基配列一本鎖DNA（上流ブロッキング配列;upstream blocking sequence、Up-BS）及び隣接下流域0〜７塩基下流を基点とする20〜50塩基配列一本鎖DNA（下流ブロッキング配列;downstream blocking sequence、Down-BS）を一切用いておらず、そのために目的遺伝子を含む変性DNA試料とプローブDNAとのハイブリダイズが、試料中のDNA同士の再ハイブリダイズによって妨げられ、結果的に目的遺伝子DNAの回収効率が激減する問題点がある。
【０００６】
さらに、これらの従来の方法では、そのターゲットDNAの物理化学的性質が特定されていないため、DNAプローブとのハイブリダイズに先立つ二本鎖DNAの変性の条件がまったく無視されており、したがって大腸菌にクローニング可能な閉環状二本鎖DNAとしての性質を保ったままのDNA変性が実現できていない。そのために、従来の方法では、目的遺伝子の一部の抽出・検出は可能だが、大腸菌に導入し、大量に精製・クローニングすることはほとんど不可能である。
【０００７】
さらに、直鎖状DNA同士のハイブリダイズによる目的遺伝子の検出・抽出・精製では、通常最適の塩濃度として400〜600mMが用いられるが、この塩濃度では変性され部分的に一本鎖化した閉環状DNA(双葉のクローバ状DNA;two-leaf clover DNA)は急速に自己対合（会合）を起こし、プローブDNAとハイブリする前に再び閉環状に閉じてしまい、プローブDNA粒子に捕捉することが出来ず、結果的に目的遺伝子クローニングの収率の低下・激減を引き起こす問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、前記３つの存在形態をとるcDNAプラスミド・ライブラリーや、ゲノム・プラスミド・ライブラリーやコスミド・ライブラリーの目的遺伝子を含む試料のうち、一切のDNA 切断（ニック）部位を持たない完全な閉環状二本鎖DNAを試料ターゲットとして用いて目的遺伝子を迅速に抽出・精製・クローニングする方法であって、目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の配列に相補的なDNA配列(プローブDNA配列)と固層粒子とを含むプローブDNA複合体粒子に閉環状二本鎖DNAをハイブリダイズさせることにより、目的遺伝子DNA配列が組み込まれた閉環状二本鎖DNAを、宿主細胞に直接トランスフェクション可能な形状で固層粒子に回収し、溶出溶液で溶出し、これを大腸菌等の宿主細胞に導入（トランスフェクト）して、目的遺伝子を迅速に抽出・精製・クローニングすることを特徴とする方法により、前記課題を解決した。
【０００９】
本発明は、50℃〜70℃の範囲内で5サイクル以上行う新規なサイクル・ハイブリダイゼーション法により作成したプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子−これは、固層粒子に結合した、プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチド相補的結合用配列を含む一本鎖DNA配列部分から成るプローブDNA結合粒子が、目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の配列に相補的なDNA配列(プローブDNA配列)と、前記プローブDNA結合粒子のプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチド相補的結合用配列に相補的なDNA配列と、を含むプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドに、前記プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチド相補的結合用配列において相補率80%以上もの高さで堅固に相補的結合して成るもの、ないし固層粒子に結合した一本鎖配列部分から成るプローブDNA結合粒子が、目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の配列と相補的な配列（Tm値A）とプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分の少なくとも一部と相補的な配列（Tm値B）とを有し、両Tm値の差が少なくとも8℃以上（Tm値B― Tm値A＞8℃）のプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドに相補的に結合して成るものである−、または、プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子−これは、プローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分に、目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の配列に相補的なDNA配列(プローブDNA配列)を含むヌクレオチドが直接共有結合して成り、その結果、プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドが固層粒子に直接結合して成るものである−を、プローブDNA複合体粒子として用いる前記方法により、前記課題を解決した。
【００１０】
本発明はまた、前記プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子のうち、特に、目的遺伝子の塩基配列の一部と相補的な配列(Tm値A)及びプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列(Tm値B)を有するプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドを、プローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分に、50℃から70℃の範囲内で5サイクル以上サイクル・ハイブリダイズさせることにより作成したものを、プローブDNA複合体粒子として用いる前記方法により、前記課題を解決した。
【００１１】
本発明はまた、前記プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子のうち、特に、固層粒子に結合した一本鎖DNA配列部分から成るプローブDNA結合粒子の当該一本鎖DNA配列部分の少なくとも一部に相補的な配列と、目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の配列と、を有する一本鎖ブリッジヌクレオチドを、前記プローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分とハイブリダイズさせ、DNA合成酵素を用いて、前記一本鎖ブリッジヌクレオチドの当該目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の配列に相補的な配列(プローブDNA配列)を含むヌクレオチドを、前記プローブDNA結合粒子の前記一本鎖DNA配列部分に酵素化学合成的に共有結合させること、により作成したものを用いる前記方法により、前記課題を解決した。
【００１２】
さらに本発明は、プローブDNA複合体粒子におけるプローブDNA配列に対応する当該目的遺伝子の塩基配列の隣接上流域の0〜７塩基上流を基点とする20〜50塩基配列一本鎖DNA（上流ブロッキング配列、Up-BS）及び隣接下流域の0〜７塩基下流を基点とする20〜50塩基配列一本鎖DNA（下流ブロッキング配列、Down-BS）の高濃度（10uM以上、BS分子数と目的遺伝子分子数の比は少なくとも1000倍以上）存在下で行う、前記目的遺伝子の抽出、精製、クローニング方法(BS法)により、前記課題を解決した。
【００１３】
さらに本発明は、目的遺伝子を含む閉環状二本鎖DNA試料を、0.1N〜0.4Nのアルカリ溶液中で0℃〜10℃の低温で20分〜1時間変性させて行う、前記目的遺伝子の抽出、精製、クローニング方法により、前記課題を解決した。
さらに本発明は、目的遺伝子を含む閉環状二本鎖DNA試料をプローブDNA複合体粒子と、低塩濃度（50〜350mM）下でハイブリダイズさせる前記抽出、精製、クローニング方法により、前記課題を解決した。
【００１４】
本発明はまた、前記本発明の抽出、精製、クローニング方法により目的遺伝子を濃縮して含む宿主細胞からの回収物に含まれる閉環状二本鎖DNAをターゲットDNA分子として、再度前記本発明の方法により抽出、精製、クローニングを行う、マルチ・サイクルクローニング方法により、従来法ではほとんど不可能ないし多大な時間と労力を要した、百万分の１（0.0001%）、千万分の１(0.00001%)程度の確率でしか存在しないような極微量の目的遺伝子の、迅速かつ確実なクローニングを可能とした。
なお、本明細書中、「宿主細胞に直接トランスフェクション可能な形状で」とは、宿主に導入して、大量に迅速に目的遺伝子DNAをクローニングできるDNA形態、即ち、少なくとも固層粒子に固定される時点まで、閉環状DNAの形状を維持していることを意味する。
【００１５】
本明細書中、プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチド相補的結合用配列とは、目的遺伝子を回収するためのプローブDNA複合体粒子として、固層粒子に結合した一本鎖配列部分から成るプローブDNA結合粒子が、目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の配列に相補的なDNA配列(プローブ配列)と、プローブDNA結合粒子の一本鎖配列部分の一部に相補的な配列を含むプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドに相補的結合して成るものを用いる場合に、プローブDNA結合粒子の一本鎖配列部分において、プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドとの相補的結合達成のためにのみ、人為的に作成した配列を意味する。
本明細書中、「相補率」とは、前記プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチド相補的結合配列の中で、対応するプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドとの相補的結合を達成した配列の、プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチド相補的結合配列全体に対する割合を意味する。
【発明の効果】
【００１６】
前記本発明による分離、精製、クローニング方法により、目的遺伝子を含むあらゆる由来、サイズ、配列等の閉環状二本鎖DNAを、迅速、正確、かつ効率よく分離、精製、クローニングすることが可能となる。また、本発明の方法を用いることにより、従来数日から数週間必要としたクローニング操作を、わずか1日（24時間以内）で完了することができる。
【００１７】
閉環状二本鎖DNA試料について
本発明で使用する目的遺伝子DNAを含む閉環状二本鎖DNA試料は、60％以上、特に好ましくは80％以上の閉環状二本鎖DNAを含むものであることが望ましい。直鎖状1本鎖あるいは二本鎖DNA、少なくとも1箇所以上にニックの入った開環状二本鎖DNAの混在が40％を越えると、閉環状二本鎖の目的遺伝子の抽出・精製・クローニングは困難になる。前記の条件を満足するDNA試料であれば、それがcDNAプラスミド・ライブラリー、ゲノムDNA ライブラリー、cDNAまたはゲノム・コスミド・ライブラリーのいずれに由来するものであってもよい。また、60％以上の閉環状二本鎖DNAを含むDNA試料の調製方法は、如何なる方法であってもよいが、例えば、CsCl方法やゲル切り出し方法、DNA吸着粒子膜(タカラバイオmimi-prep kitなど)や粒子でのDNA精製方法によっては、比較的容易に80％以上の閉環状二本鎖DNAを含む試料を調製することができる。また、閉環状二本鎖DNAの割合が80％を超えるような試料であれは、ＲＮＡの混入があっても、目的遺伝子ＤＮＡのクローニング用試料として使用可能である。
【００１８】
プローブDNA複合体粒子について
本発明で使用するプローブDNA複合体粒子は、固層粒子に結合した、目的遺伝子の少なくとも一部の配列に相補的なDNA配列(プローブDNA配列)を含むものであれば、いかなるものであってもよいが、以下の2種類が例示される。１つは目的遺伝子の塩基配列の一部と相補的な配列（Tm値A）及びプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分の少なくとも一部と相補的な配列（Tm値B）を有し、両Tm値の差が少なくとも8℃以上（Tm値B― Tm値A＞8℃）のプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドとプローブDNA結合粒子がハイブリダイズしたプローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子(図６)と、もう１つはクレノウ・フラグメント・DNA・ポリメラーゼ(Klenow fragment DNA polymerase)などのDNA合成酵素を用いて、プローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分に、プローブDNA配列を含むヌクレオチドを酵素化学的に共有結合させることによる、あらゆる任意のDNA配列が可能なプローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子である(図７)。なお、本明細書中、Tm値とは、1〜50塩基対程度の一本鎖相補的塩基配列を持つDNA分子の半分が相補的にハイブリダイズしている状態の温度を指す。
【００１９】
２つのTm値の差が少なくとも8℃以上のプローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子  
前記プローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子に関しては、プローブDNA結合粒子が目的遺伝子のプローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子とのハイブリダイゼーション、その後の洗浄等の抽出過程で解離してしまわないように、当該プローブDNA結合粒子においてプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチド相補的結合用配列が、当該DNA配列に相補的に結合すべく作成したプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドにおけるDNA配列部分と、80%以上の相補率にて相補的結合していることが好ましい。また別記としては、プローブDNA結合粒子の表面に結合した一本鎖DNA配列部分とプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドの前記一本鎖DNA配列部分に相補的な配列部分との相補的結合（Tm値B）は一個一個の化学的結合タイプとしては熱や低塩濃度やpH変動に弱い水素結合であるから、一本鎖ブリッジヌクレオチド内の目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列(プローブDNA配列)が有するTm値Aより8℃以上大きい値を形成するDNA配列を有するものである必要がある。この条件を満たす限り、プローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子の表面に結合して位置するプローブDNA配列部分の配列、長さは無限に可能であるが、一本鎖ブリッジヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの効率を出来るだけ高くすること、目的遺伝子とプローブDNA結合粒子表面に結合して位置する一本鎖DNA配列部分との非特異的ハイブリダイゼーションの発生を出来るだけ抑えるためには、10塩基配列以上100塩基配列以下であることが望ましい。したがって、「Tm値B−Tm値A＞8℃」を十分満足させるプローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子を作成するのに必要なプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分は、相補的結合形成時に水素結合腕を3つ持つdGあるいはdC塩基配列をより沢山持つ配列であることが最も望ましい。理想的にはプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドにおけるプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分と相補的な配列は、dGあるいはdCで構成される20塩基から40塩基の長さを持ち、一方当該プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドの目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列部分の塩基構成はほとんどの遺伝子配列に見出されるdＧdＣ含量＝50％（±20％）を持ち、20〜50塩基からなる配列から構成されることが望ましい。しかし、目的遺伝子DNAの性質によっては、これらの制約に縛られるものではない。これによって、目的遺伝子に対する特異性の高い配列と「Tm値B−Tm値A＞8℃」の２つの条件を十分に満足させることが可能である。本発明に利用するプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドは、固層粒子に結合した一本鎖DNA配列部分の少なくとも一部と相補的な配列を一方に有し、目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列(プローブDNA配列)をもう一方に有する。これらの相補的な配列は必ずしも末端に位置する必要はないが、ハイブリッド体形成時の立体障害を最小限にするために、末端近傍に配置されることが望ましい。
【００２０】
共有結合化方法により作成されたプローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子
前記プローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子は、プローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分とプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドをハイブリダイズさせた後に、クレノウ・フラグメント・DNA・ポリメラーゼなどのDNA合成酵素を用いて、プローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分のDNAの3'末端に目的遺伝子のDNA配列の少なくとも一部と相補的な配列(プローブDNA配列)を含むヌクレオチドを化学的に直接酵素合成・共有結合させることにより作成される。このプローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子は、プローブDNA配列を含むヌクレオチドが固層粒子表面に共有結合化されているので、100℃以下のあらゆる温度、あらゆる塩濃度、1N(規定)程度のアルカリや酸溶液にも格段に耐性であり、ハイブリダイゼーションを介する遺伝子DNA抽出・精製・クローニング用のプローブとしては、最適のプローブである。プローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子中のプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分の塩基配列もプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチド内の目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的なプローブ配列の塩基配列もあらゆる塩基配列が有効である。しかし酵素合成の効率、DNAの非特異的結合を避けるためには、プローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子のプローブDNA配列の塩基配列は自由だが、その長さは5〜数百塩基配列が望ましい。
【００２１】
前記プローブDNA配列を結合させる固層粒子は、プローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子とプローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子のいずれにおいても、ラテックス・ビーズ(latex bead)のような有機高分子粒子や有機高分子シート、その内部に磁性体を持ち磁気分離可能な粒子、金などの金属粒子やガラス粒子・板など、着色粒子や蛍光を発する粒子であって良い。
【００２２】
サイクル・ハイブリダイゼーション方法  
本発明で使用する２つのTm値の差が少なくとも8℃以上のプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドのプローブDNA結合粒子への水素結合を介した相補的結合は、サイクル・ハイブリダイゼーション方法を用いて行う。具体的には、目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列(プローブDNA配列)及びプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドを、プローブDNA結合粒子の当該一本鎖DNA配列部分に、温度50℃から70℃の範囲内で5サイクル以上サイクル・ハイブリダイズ〔1回のサイクル・ハイブリダイズの例： 50℃（20秒以上）55℃（20秒以上）→60℃（20秒以上）→65℃（20秒以上）→70℃（20秒以上）→65℃（20秒以上）→60℃（20秒以上）→55℃（20秒以上）→50℃（20秒以上）〕させることで、プローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分の塩基配列とプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチド内のプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分の少なくとも一部に相補的な配列の間のより強固な相補的水素結合の形成を達成することができる。もちろん、プローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分とプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチド内のプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列の少なくとも一部に相補的な塩基配列の間の相補的水素結合の形成は、反応温度を50℃、60℃、70℃などの一定温度に保つことでも達成されるが、これらの温度に一定に保つことで生成した分子結合体の中には理論的には最も強固な相補的結合体以下の状態でハイブリしている分子結合体があり、これは目的遺伝子を含む閉環状二本鎖DNAとのハイブリの際やその後の厳しい温度・塩濃度条件下での非特異的結合分子の洗浄除去の際には一緒に解離して失われる運命にあるので、このような不完全な結合体の存在は目的遺伝子の分離・抽出・クローニングの効率を相当程度低下させることになるので、避ける方が望まれる。
【００２３】
閉環状二本鎖DNAのアルカリ低温変性方法  
本発明で使用するDNA試料は、単に目的遺伝子の抽出・精製や検出を目的にするのみならず、抽出・精製された目的遺伝子DNAが、即、大腸菌に導入（トランスフェクト）できるよう、物理化学的形態、すなわち、少なくとも固層粒子に回収する時点まで、閉環状二本鎖DNAの形態を維持している必要がある。
プローブDNA複合体粒子と目的遺伝子DNAを含む閉環状二本鎖DNA試料とのハイブリダイゼーションに先立ち、DNA試料を熱ないしアルカリで変性させ、一本鎖化させる必要があるが、DNA試料の抽出過程で生じた3つのDNAタイプ[１）閉環状DNA、2)開環状DNA、3)鎖状DNA]は、変性過程で図１に示すように、閉環状DNAは双葉のクローバーのような一部が2本の繋がったゴム輪ような形態をとるが完全にバラバラになることはないのに対して、開環状DNAと鎖状DNAは、一旦変性すると元の相補的分子は完全に離れ離れになり、一部に長い相補的配列を有する沢山の同様の分子の存在下では二度と同じ相補的分子と再ハイブリ（再対合）することはない。したがって、変性された開環状DNAや鎖状DNAから抽出・回収されたDNAからは、直接大腸菌に導入して、目的の遺伝子DNAを増幅・クローニングすることは不可能である。  
【００２４】
又、閉環状二本鎖DNAも70℃以上などの高温処理、室温ないし高温でのアルカリ処理では、DNAにニックが入り、開環状二本鎖DNAや直鎖状二本鎖DNAの運命と同じ過程を経て、バラバラに解離する。従って、閉環状二本鎖DNAの変性においては、マイルドな変性条件が必須である。本発明においては、これを実現するため閉環状二本鎖DNA を0℃（氷水中）でゆっくりマイルドに0.1〜0.4Nアルカリ溶液中で変性させることにより、開環状二本鎖DNAの機械的・物理的・化学的切断を無視できる程度以下に抑制しながらほぼ100%の閉環状二本鎖DNAの変性・双葉のクローバー型一本鎖化を達成した。なお、実際は、0℃〜10℃の範囲なら、ほぼ同様の変性結果が得られる。
本発明で得られる閉環状二本鎖DNAの低温アルカリ変性に由来する双葉のクローバー型一本鎖DNAは、塩濃度と温度に依存して、ゆっくりあるいは急速に自己会合し、元の閉環状二本鎖DNAに戻る。  
【００２５】
隣接上・下流域の20〜100塩基配列一本鎖DNA（上流、下流ブロッキング配列、Up-BS、Down-BS）
本発明における抽出、精製、クローニング方法においては、本明細書中に記載するBS法を併用することで、いっそうその効率を増すことができる。即ち、BS法に関しては、目的遺伝子のハイブリダイゼーションターゲット配列に隣接する上・下流域の0〜7塩基上流及び下流を基点とする20〜数百塩基配列一本鎖DNA（上流、下流ブロッキング配列、Up-BS、Down-BS）が、本発明で得られる閉環状二本鎖DNAの低温アルカリ変性に由来する双葉のクローバー型一本鎖DNAの塩濃度および温度に依存した自己会合速度を遅らせる物理化学的性質を有し、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度や温度とともに、低温アルカリ変性した閉環状二本鎖DNA（双葉のクローバー型一本鎖DNA）が元の閉環状二本鎖DNAに戻るスピードを遅らせ、その結果固層粒子に固相化されたプローブDNAと目的遺伝子DNAとの結合を増加させる特性を利用する。ここで、隣接する上・下流域の20〜数百塩基配列一本鎖DNAの塩基配列の長さは、20〜100塩基配列程度が効果を持つが、長すぎるとこれ自身が非特異的結合の原因となるので、20〜50塩基配列であることが望ましい。また、隣接する上・下流域の20〜50塩基配列一本鎖DNAの濃度は、BS分子数と目的遺伝子分子数の比は少なくとも1000倍以上あることが必要で、通常少なくとも10uM以上あれば十分大きなクローニング増加効果が得られる。
【００２６】
図２に示すように、プローブDNAに対応する目的遺伝子配列の隣接上流域の0〜７塩基上流（プローブDNAとBS間の塩基配列スペース）を基点とする20〜数百塩基配列一本鎖DNA（上流ブロッキング配列、Up-BS）及び隣接下流域の0〜７塩基下流（プローブDNAとBS間の塩基配列スペース）を基点とする20〜数百塩基配列一本鎖DNA（下流ブロッキング配列、Down-BS）はそれぞれ2種類可能で、試料への添加の組み合わせはUp-BS-1単独、Up-BS-2単独、Down-BS-1単独、Down-BS-2単独、Up-BS-1とDown-BS-1の混合、Up-BS-1とDown-BS-2の混合、Up-BS-2とDown-BS-1の混合、Up-BS-2とDown-BS-2の混合の8組が可能であり、そのいずれも目的遺伝子やDNAの抽出・精製・クローニングの効率増大に効果があり、目的遺伝子の抽出・精製・クローニングのターゲットとなる塩基配列によって、その組み合わせは選択可能であるが、好ましい組み合わせの例としてはUp-BS-1とDown-BS-2の混合物が挙げられる。
【００２７】
低塩濃度下でのハイブリダイゼーション
本発明において前記BS法を併用する場合、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度を300mM以上にすると、隣接する上・下流域の20〜50塩基配列一本鎖DNAによるクローニング増加効果はかなり低下する。これに対して、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度を100〜200mMの間に保つと、隣接する上・下流域の20〜50塩基配列一本鎖DNAによる高いクローニング効率増加効果が得られる。従って、本発明で使用されるハイブリダイゼーション溶液の塩濃度は通常のサーザンハイブリダイゼーションで汎用される400〜600mMでも可能であるが、50〜350mM、好ましくは100〜250mMの間であることが望ましい。
【００２８】
マルチ・サイクルクローニング方法
本発明におけるマルチ・サイクルクローニング方法は、前記本発明の抽出、精製、クローニング方法により目的遺伝子を濃縮して含む宿主細胞からの回収物に含まれる閉環状二本鎖DNAをターゲットDNA分子として、本発明の抽出、精製、クローニングシステムを短期間（２〜４日）に繰り返すことで、極微量でしか存在しない目的遺伝子ＤＮＡも迅速に、確実にクローニング可能としたものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明は１例において、
１）目的遺伝子を含む80%以上の閉環状二本鎖DNA試料の作成、
２）目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の配列に対応するプローブDNAあるいはプローブ複合体粒子の作成；
A)目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列（Tm値A）及びプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列（Tm値B）を有し、両Tm値の差が少なくとも8℃以上（Tm値B― Tm値A＞8℃）のプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドの、プローブDNA結合粒子とのハイブリダイゼーションによるプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子の作製；
B)オリゴ(dG)ラテックス・ビーズ(oligo(dG)latex bead)などのプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分に、これと少なくとも一部に相補的な配列を有し、かつ、もう一方に目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の配列を持つ一本鎖ブリッジヌクレオチドをハイブリダイズさせ、クレノウ・フラグメント・DNAポリメラーゼなどのDNA合成酵素を用いて、目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の配列に相補的な配列(プローブDNA配列)を含むヌクレオチドを、プローブDNA結合粒子に酵素化学合成的に共有結合させることにより、プローブDNA配列が、一本鎖DNA配列部分を介して固層粒子に直接結合したプローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子の作製、
【００３０】
３）目的遺伝子を含む試料と、プローブDNA配列に対応する目的遺伝子配列の隣接上流域の0〜７塩基上流（プローブDNAとBS間のスペース塩基配列）を基点とする20〜数百塩基配列一本鎖DNA（上流ブロッキング配列、Up-BS）及び隣接下流域の0〜７塩基下流を基点とする20〜数百塩基配列一本鎖DNA（下流ブロッキング配列、Down-BS）との混合液の作製、
４）目的遺伝子を含む試料とUp-BS、Down―BS混合溶液の低温アルカリ変性及び中和処理、
５）変性・中和された目的遺伝子、Up-BS、Down―BSを含む試料混合溶液とプローブDNA複合体粒子の低塩濃度条件下でのハイブリダイゼーション、
６）洗浄・遠心操作による、目的遺伝子を結合したプローブDNA複合体粒子の回収、
７）溶出溶液による目的遺伝子の溶出・抽出・回収、
８）大腸菌へのトランスフェクション(transfection)等による目的遺伝子のクローニング、
９）PCRや制限酵素切断による目的遺伝子クローニングの検証、
の各過程から構成される。
【００３１】
前記本発明の目的遺伝子DNAの抽出・精製・クローニング方法は、わずか1日（24時間以内）で完了する。
以下に、それぞれのステップについて実施例とその結果を示す。
[実施例]
以下、本発明の具体的な実施例について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[実施例１] 目的遺伝子を含む試料中の閉環状二本鎖DNAの割合と目的遺伝子のクローニング効率の関係
本実施例は、精製された、青色コロニーを形成するプラスミドpGBM(3035塩基対)と白色コロニーを形成する734塩基対cDNAを組み込んだプラスミドpCY(3768塩基対)の混合DNA試料溶液を用いて行った。
プラスミドpGBMは、β-ガラクトシダーゼ(β-galactosidase)遺伝子を持ち、β-gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド)の存在下の寒天上で青コロニーを形成する。一方、プラスミドpCYは、マウス精巣発現遺伝子シリテスチン(cyritestin)cDNA730塩基対DNAをプラスミドpGBMのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子部位に組み込んだ組み換え体プラスミドであり、寒天上で白コロニーを形成する。この違いから、抽出・精製・クローニングの効率を寒天上で形成されるコロニータイプから検定できる利点をもつモデルシステムである。
【００３２】
pCYは、マウス精巣のcDNAライブラリーよりシリテスチンcDNA(約2650塩基対サイズ)の1044-1777間をPCR法で増幅し、抽出し、pGBMのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子内に挿入することで、作製した。
以下に、目的遺伝子を含むDNA試料中からの目的遺伝子の抽出・精製・クローニングの方法と結果を示すが、80%以上の閉環状DNAを含むDNA試料（目的の遺伝子DNAを含む）の調製は、SDS-アルカリ法、SDS-アルカリ法-CsCl超遠心法、DNA試料のゲル切り出し法、DNA吸着粒子膜ないし粒子によるDNA精製法など、いずれでの方法でも良いが、ここではSDS-アルカリ法-CsCl超遠心法、SDS-アルカリ法−DNA吸着粒子膜法を用いた例を示す。
【００３３】
1)80%以上の閉環状DNAを含むpCY、pGBMおよびマウスの脳cDNAプラスミドライブラリーの精製方法
＜SDS-アルカリ法、SDS-アルカリ法-CsCl超遠心法、SDS-アルカリ法-DNA吸着膜法＞
＜SDS-アルカリ法＞
（1）pCY及びpGBMおよびマウスの脳cDNAプラスミドライブラリーを大腸菌にトランスフェクションし、得られたそれぞれのプラスミドコロニー１個を大量培養した。
（2）5000rpm・４℃・15分遠心し、菌体を集め、0℃に冷却したソリューションA(25mMトリス・HCl<pH=8.0>、10mM EDTA、50mMグルコース)2mlに溶解した。
（3）ソリューションB(20mg リソゾーム/ソリューションA) 0.5mlを加え、氷上で１０分静置した。
【００３４】
（4）ソリューションC(1%SDS,0.2N NaOH) 5mlを加え、静かに攪拌し、氷上で７分静置した。
（5）ソリューションD(純水100ml中に29.4gK・アセテート、11.5ml 酢酸を含む) 4mlを加え、静かに攪拌し、氷上で10分静置した。
（6）10000rpm以上・4℃・90分以上遠心し、上清を１〜２枚のキムワイプを敷いたロートを通して回収した。
（7）上清に２倍量の-20℃に冷やしたエタノールを加え、10000rpM以上・4℃・20分遠心し、沈殿を回収した。
（8）試料DNAを含む沈殿をTE（10mM トリス<pH=8.0>、1mM EDTA）4mlに溶解した。
【００３５】
＜CsCl超遠心法＞
（9）試料DNA溶液4mlにCsCl 4.2gと10mg/mlエチジュムブロマイド（EtBr）溶液80 ulを加え、十分攪拌し、CsCl超遠心用チューブに入れ、チューブ専用の蓋をした。
（10）ベックマン超遠心機用バーチカルローターに試料を入れた遠心チューブをセットし、20℃・55000rpmで１８時間遠心した。
（11）形成された２つのDNAバンド（アッパー・バンド、ロウアー・バンド）の内、主に閉環状DNAを含むロウアー・バンドを18〜21ゲージの注射針を用いて回収し、TEを飽和させた1-ブタノール（SS-1-ブタノ−ル）でEtBrを除いた。
（12）EtBrを除去したDNA試料に２倍〜2.5倍量の−20℃に冷やしたエタノールを加え、10000rpm以上・4℃・20分遠心し、沈殿を回収した。
（13）回収した沈殿に適当量のTE溶液を加え、閉環状DNAを含むDNA試料とした。
【００３６】
＜SDS-アルカリ法・DNA吸着膜法＞
（A）SDS-アルカリ法で抽出したDNA試料を適当量とり、タカラバイオ社のMiniprep DNA purification kitのシリカメンブレンカラム（Miniprep Spin column）に入れ、遠心する。
（B）シリカメンブレンカラムに洗浄液を入れ、遠心する。
（C）再度、シリカメンブレンカラムに洗浄液を入れ、遠心する。
（D）シリカメンブレンカラムに１ｍMトリス・1mMEDTA（pH8.0）液を100ul加え、1.5mlチューブにセットし、遠心する。
（E）1.5mlチューブに溶出されたDNA試料を以後の本発明のDNA試料とした。
【００３７】
図３は、SDS-アルカリ法-CsCl超遠心法で精製したpCY及びpGBMを示す。SDS-アルカリ法では時に90%以上の閉環状DNAを含むDNA試料が得られることがあるが安定せず、SDS-アルカリ法-CsCl超遠心法で精製すれば95%以上もの閉環状DNAを含む試料が得られる。また、ＳＤＳ-アルカリ法での抽出後RNAを除去していない試料では、、ＤＮＡについては90%以上の閉環状ＤＮＡからなる試料（試料pCY-R、試料pGBM-R）が安定して得られる。
【００３８】
図４は、SDS・アルカリ法（試料５と６）、SDS・アルカリ法・CsCl法（試料７）、SDS・アルカリ法・DNA吸着膜法＜タカラバイオ株式会社のmini-prepキットを使用＞（試料８）で精製したマウス脳cDNAプラスミドライブラリーの泳動結果である。SDS・アルカリ法による試料５では閉環状DNAは20％以下であり開環状DNA80％以上から構成され、本発明のターゲットDNA分子である閉環状DNAはかなり少ない。一方、同じSDS・アルカリ法による別の試料５では閉環状DNAは約60％であり全体のDNAの50％を超えている。試料７は、SDS・アルカリ法CsCl法で精製した試料６を更にCsCl超遠心で精製したもので、閉環状DNAは95％を超えている。試料８は、SDS・アルカリ法・DNA吸着膜法＜タカラバイオ株式会社のmini-prepキットを使用＞で精製したもので、本発明のターゲットDNAである閉環状DNAを80％以上含む。
【００３９】
目的遺伝子の抽出・精製・クローニングに用いる「pCY用プローブ用1本鎖ブリッジヌクレオチド(bridging nucleotide、BN-CY)」、「ブリッジヌクレオチドBN-CYのポリCとハイブリダイズするオリゴ(dG)ラテックス・ビーズ」、「プローブ塩基配列と相補的な(プローブDNA配列部分に対応する)目的遺伝子DNA配列の上流及び下流のブロッキング配列(bloking sequence)(BS)」と、それぞれの調製法
【００４０】
以下に、pCY抽出用のプローブDNA配列、それに対応する目的遺伝子DNA配列の上及び下流域に位置するブロッキング配列(Up-BSとDown-BS)、PCR用の塩基配列の位置と配列を示す。
＜プローブ用1本鎖ブリッジヌクレオチド (BN-CY)の調製＞
【００４１】
【化１】
2008099556.tif 000003
【００４２】
pCYの挿入cDNA断片の1286-1315の30塩基とポリC30塩基から構成されるブリッジオリゴヌクレオチド用配列（BN−CY）を合成し、pCY抽出用プローブDNAとして用いた。
＜ブリッジヌクレオチドBN-CYのポリCとハイブリダイズするオリゴ(dG)ラテックス・ビーズ＞
オリゴ(dG)ラテックス・ビーズは、JSR株式会社より購入したものを用いた。BN-CYプローブは、ポリC部分でこのラテックス・ビーズのオリゴ(dG)とハイブリザイズし、ビーズ固層に固定される。
【００４３】
＜プローブ塩基配列部分に対応する目的遺伝子のDNA配列の上流及び下流のブロッキング配列(BS)＞
−1本鎖Up-BS(上流ブロッキング配列)−
【００４４】
【化２】
2008099556.tif 000004
【００４５】
pCYの挿入cDNA断片の1255-1384の30塩基（表１の実線部分）を合成し、用いた。
−1本鎖Down-BS(下流ブロッキング配列)−
【００４６】
【化３】
2008099556.tif 000005
pCYの挿入cDNA断片の1346-1317(マイナス鎖)の30塩基（表１の破線部分）を合成し、用いた。
＜PCR用テストに用いたプライマーの塩基配列＞
【００４７】
【化４】
2008099556.tif 000006
【００４８】
＜目的遺伝子プラスミドpCYの抽出＞
1）100uMのプローブ用1本鎖ブリッジヌクレオチド(BN-CY)2ulを100mMのNaClを含む20ulのオリゴ(dG30merラテックス・ビーズと混合し、温度50℃から70℃の範囲内で5サイクル以上サイクル・ハイブリダイズさせる方法〔1回のサイクル・ハイブリダイズの例：50℃（20秒以上）→55℃（20秒以上）→60℃（20秒以上）→65℃（20秒以上）→70℃（20秒以上）→65℃（20秒以上）→60℃（20秒以上）→55℃（20秒以上）→50℃（20秒以上）〕で、両者をハイブリダイゼーションさせた後、45℃に暖めた100mMNaClを含む洗浄液で5回洗浄し、BN-CYとオリゴ(dG)ラテックス・ビーズの複合体を得た。これに23ulの200ｍM NaClを含むハイブリダイゼーション溶液を加え、50℃の水浴に静置した。
【００４９】
2）1ulの1000uM Up-BSと1ulの1000uM Down-BS、1対100、１対10000に混合したpCYとpGBM 2ul、蒸留水5ul、0.4NのNaOH 9 ulを混合し、約0℃（氷上）で40分処理しDNAを変性(＝1本鎖化)させた後、当量(9 ul)の0.4NHCｌを加えて、中和した。また、精製した閉環状pCYを制限酵素Sac1で切断し、閉環状pCYとSac1切断pCYを10:0、9.0:1.0、7.5:2.5、5.0:5.0の比に混合し、直鎖状DNAの混入サンプルとして、pCY:pGBM混合試料用のpCYとして用いた。
【００５０】
3）変性・中和したpCY・pGBMとBS混合液を、１）で調整したBN-CYとオリゴ(dG)ラテックス・ビーズの複合体溶液に加え、50℃で1時間30分インキュベートした後、50℃に暖めたそれぞれ100mM、50mM、25mMのNaClを含む洗浄液でそれぞれ4回、2回、1回洗浄した。
4）得られたオリゴ(dG)ラテックス・ビーズ-BN-ｐCY複合体に10mMトリス-1mM EDTA溶液50 ulを加え、70℃で10分間加熱し、氷冷した。遠心して上澄を回収した。
【００５１】
＜抽出されたpCYの検出＞
前記分離精製されたpCY溶液5 ulをコンピテント(competent)大腸菌100 ulに加え、氷上20分、42℃50秒、再び氷上2分間の処理をして、SOC培地１ｍｌを加えて、37℃1時間培養し、100ug/mlのアンピシリン、β-galを含む寒天培地に撒いて、37℃孵卵器で16時間培養した。pGBMを持つ青色コロニーとpCYを持つ白色コロニーをカウントし、そのコロニー数と比率を求めた。また、それぞれのコロニーを７個取り、コロニーPCR法にてpCYに挿入された730塩基対のDNA配列を検定した。PCRは、94℃で3分、94℃で30秒、56℃で30秒、72℃で30秒で30周期行った。
【００５２】
表１より、90%以上の閉環状二本鎖DNAを含む試料では、上流ブロッキング配列(Up-BS）及び下流ブロッキング配列(Down-BS）の存在下で、非常に高い効率で目的遺伝子(pCY)のクローニングが実現できる。しかし目的遺伝子を含む試料DNA中の閉環状二本鎖DNAの割合が減少する（直鎖状あるいは開環状の割合が増加する）と、目的遺伝子のクローニング効率が大きく減少する、ことが認められる。また、ブロッキング配列不在下でも、90%以上の閉環状二本鎖DNAを含む試料では、同じ条件下での直鎖状あるいは開環状の割合の高い試料と比較して、目的遺伝子のクローニング効率が高いことが認められる。また、閉環状二本鎖ＤＮＡを多く含む試料であれば、ＲＮＡを含んでいる試料（試料pCY-R、 pGBM-R）ても、表１に見られるようにＢＳ存在下で高いクローニング効率が認められる。
【００５３】
【表１】
2008099556.tif 000007
【００５４】
(a): 1), 6),11),13),15)はBSを用いない従来法の結果である。2)〜5)、7)〜10)、12)、14)、16)はBSを加えた本発明法の結果である。(b):11)〜14)は、図１で示したSDS・アルカリ精製試料１（pCY）と試料２(pGBM)を用いた結果を示す。(c):1)〜10)のsp-pCYは図１の試料３（閉環状<super-coiled pCY>）を示し、Sac1-cut pCYは、試料３のｐCYを制限酵素Sac1で切断した直鎖状pCYを示す。また、1)〜10)のｐGBMは、図１で精製した試料４のpGBMを示す。(d): 15)、16)では、試料pCY-Rと試料pGBM-Rを用いて行った。
【００５５】
図５は、表１の実験で得られた白色コロニー、青色コロニーを無作為に７つ選んで、270塩基対のDNA断片を生成するコロニーPCRを行った結果である。白色コロニーでのみpCYに挿入されているマウス精巣由来シリテスチン遺伝子cDNAの270塩基対PCR産物が検出された。
【００５６】
[実施例２] 目的遺伝子の塩基配列の一部と相補的な配列を持ち、一方でプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドを、プローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分に、温度50℃から70℃の範囲内で5サイクル以上サイクル・ハイブリダイズさせる方法により作製したプローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子を用いた目的遺伝子のクローニング効率
【００５７】
目的遺伝子pCYの一部の塩基配列30merと相補的な配列を持ち、一方でプローブDNA結合粒子オリゴ(dG30mer)ラテックス・ビーズの一本鎖DNA配列部分のDNA30merの塩基配列と相補的な配列を有するプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチド「pCY用プローブ用1本鎖ブリッジヌクレオチド(BN-CY)」をオリゴ(dG30mer)ラテックス・ビーズにハイブリさせる条件を、60℃、70℃での定温ハイブリダイゼーション、温度50℃から70℃の範囲内でサイクル・ハイブリダイズさせる方法〔1回のサイクル・ハイブリダイズの例：(50℃（20秒以上）→55℃（20秒以上）→60℃（20秒以上）→65℃（20秒以上）→70℃（20秒以上）→65℃（20秒以上）→60℃（20秒以上）→55℃（20秒以上）→50℃（20秒以上）〕の、目的遺伝子pCYのクローニング効率への影響を検討した。
【００５８】
pCY抽出用プローブ用ブリッジヌクレオチドをオリゴ(dG30mer)ラテックス・ビーズとハイブリダイゼーションさせる以外は、実施例１と同様な実験操作で行った。
表２に示すように、Up-BS、Down-BSの存在下、3、5、20、50回、60℃、70℃いずれでも高い目的遺伝子の濃縮率が得られるが、しかし得られる目的遺伝子コロニーの総数が、サイクル・ハイブリダイゼーション5回以下や60℃定温、70℃定温ハイブリでは1/5から1/10に激減する。また、同じ20サイクルのサイクル・ハイブリダイゼーションでも、Up-BS、Down-BSを加えない従来方法では、濃縮率は10倍以下と極端に低くなることが、認められた。
【００５９】
【表２】
2008099556.tif 000008
【００６０】
[実施例３] 目的遺伝子の塩基配列の一部と相補的な配列（Tm値A）及びプローブDNA結合粒子の一本鎖プローブDNA結合粒子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列（Tm値B）を有し、両Tm値の差が少なくとも8℃以上（Tm値B― Tm値A＞8℃）のプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドによる、目的遺伝子のプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子固層への回収・クローニング
【００６１】
一本鎖ブリッジヌクレオチドの目的遺伝子の塩基配列の一部と相補的なDNA配列の有するTm値（Tm値A）とプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分と相補的なDNA配列の有するTm値（Tm値B）の差の、目的遺伝子（ここではpCY）のクローニング効率に対する影響を、Tm値Bを変化させて、検討した。プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドとしてpCY用プローブ用1本鎖ブリッジヌクレオチド(BN-CY)を用い、いろいろなTm値Bを持つブリッジヌクレオチドを作製し、これを使ってpCY/pGBM混合DNA試料からpCYのクローニングを行った。  
pCYの抽出実験操作・手順は、pCY/pGBM分子比＝1/100(10ng/840ng)の試料のみを用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００６２】
図６に、プローブDNA結合粒子とプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドの1例を示す。BN-1はここではプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分のDNA＝オリゴ(dG30mer)と相補的な配列（Tm値B）を示し、BN-2はｐCYの挿入cDNA断片の1286-1315の30塩基（表１の長方形内）と相補的なDNA配列（Tm値A）を示す。
表３は、両Tm値の差(TmB−TmA)を0.0、4.1、8.2、12.3、20.5に変えた時のｐCYのクローニング効率を示している。Tm値の差が8.2までは、85%以上のクローニング効率を示すが、それ以下では例えTm値の差TmB−TmA＞0であってもクローニング効率がかなり低下する。このような条件（Tm値の差TmB−TmA＜8.0）下では、1000個に1個や10000個に１個以下でしか存在しない目的遺伝子の有効な抽出・クローニングは困難である。
【００６３】
【表３】
2008099556.tif 000009
【００６４】
[実施例４] 目的遺伝子DNAの塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列を持ち、一方でプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するプローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドのプローブDNA結合粒子への酵素化学合成的共有結合化により作製したプローブDNA共有結合粒子による、目的遺伝子のクローニング
ブリッジヌクレオチドDNA共有結合粒子は、図７に示すように、プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドのプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分へのハイブリダイゼーションとクレノウ・フラグメント・DNAポリメラーゼによる相補的DNAの伸長、NaOHのようなアルカリ溶液中での二本鎖DNAの変性・解離、解離一本鎖ブリッジヌクレオチドDNAの洗浄除去により作製した。
【００６５】
具体的には、オリゴ(dT30mer)ラテックス・ビーズ20 ul(20mgビーズ/2ul)、100uMのpCY用プローブ1本鎖ブリッジヌクレオチド (BN-CY-2)DNA 10ulを20 ulの100〜500mM NaCl、2%アルブミンを含むハイブリダイゼーション溶液と混合しクレノウ・フラグメント・DNAポリメラーゼ(タカラバイオより購入)5ul を加えて、37℃・1時間インキュベーションした後、0.2N NaOH溶液で0℃〜10℃・40分変性し、更にTEで3回洗浄し、TE溶液を加えて、ブリッジヌクレオチドDNA共有結合粒子使用液とした。
【００６６】
図７から解るように、プローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子作製に使用するプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分の配列は任意の配列で良く、またその塩基配列の長さもハイブリダイゼーション可能な3塩基対程度から数百塩基まで可能である。同様にプローブDNA結合粒子の一本鎖DNA配列部分と少なくとも一部相補的な配列を持ち、他方に目的遺伝子の塩基配列の一部の塩基配列をもつ1本鎖ブリッジヌクレオチドも、この条件を満たす限り、任意の塩基配列と長さを持つものが使用でき、しかも前記一本鎖ブリッジヌクレオチドに基づき酵素合成したプローブDNA配列を含むプローブ用1本鎖合成相補的ブリッジヌクレオチド自体が固層ビーズに結合しており、二本鎖DNAのアルカリ変性条件下でも分解しない性質を有する。この性質により、目的遺伝子を含む閉環状二本鎖DNA試料とプローブDNA複合体粒子（アルカリに耐性ならどんな材質の固層を有してもよい）を一緒に同時に変性させることが可能となり、また洗浄時の塩濃度や温度に極めて影響されにくいなど、目的遺伝子のクローニング作業の簡便性、迅速性、正確性などを飛躍的に高めるものである。
【００６７】
＜プローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子によるpCYの抽出・精製・クローニング＞
次に、図７で作製したプローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子を使ってpCY・pGBM混合DNA試料からpCYを抽出・精製・クローニングした結果を、表４に示す。
pCYの抽出操作は、
【００６８】
1）20 ulのpCY用プローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子を0.5mlチューブに取り、12000rpmで10分遠心し、上清を捨て、プローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子を回収した。
2）これに1ulの1000uM Up-BSと1ulの1000uM Down-BS、1対100に混合した図１試料３と４のpCY 1 ulとpGBM １ulのDNA試料、蒸留水5ul、0.4NのNaOH 9 ulを一緒に加え混合し、約0℃（氷上）で40分処理しDNAを変性＝一本鎖化させた後、当量(9 ul)の0.4NのHClを加えて、氷上で中和した。
【００６９】
3）変性・中和したプローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子、pCY・pGBM、BSの混合液に、23ulの150ｍM NaClを含むハイブリダイゼーション溶液を加え、50℃で1時間30分インキュベートした後、55℃に暖めたそれぞれ100mM、50mMのNaClを含む洗浄液でそれぞれ4回、2回洗浄し、さらに室温の25mMのNaClを含む洗浄液で２回洗浄した。
4）得られたブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子-pCY複合体に10mMトリス-1mM EDTA 溶液50 ulを加え、70℃で10分間加熱し、氷冷した。遠心して上澄を回収した。
＜抽出されたpCYの検出＞
抽出されたpCYの検出は、実施例１と同様に行った。その結果を表４に示す。
【００７０】
【表４】
2008099556.tif 000010
【００７１】
表４に示すように、プローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA共有結合粒子による目的遺伝子の抽出・クローニング方法は、実施例１〜３で示したプローブ用ブリッジヌクレオチドプローブDNA結合粒子を使った場合より明らかに優れた抽出・クローニング効率の増加を示した。
【００７２】
[実施例５] プローブDNAに対応する目的遺伝子塩基配列の隣接上流域と相補的な１本鎖DNA（上流ブロッキング配列、Up-BS）及び下流域の塩基配列と相補的な１本鎖DNA（下流ブロッキング配列、Down-BS）の添加による目的遺伝子の（検出）抽出・精製・クローニング
表５は、pCY用のプローブDNAと相補的な目的遺伝子の塩基配列の１塩基上流、1塩基下流（プローブDNAとBS間のスペース塩基配列＝1塩基）を基点とする30mer(30塩基)の長さの1本鎖BSを用いた場合の結果である。BSを加えない従来法（表２のデータ1、3、5）と比較し、大きな濃縮率が見られる。また、百万分の１や千万分の１でしか存在しない極微量な目的遺伝子ＤＮＡの場合も、本発明のシステムを短期間に繰り返すこと（マルチ・サイクルクローニング方法）で、容易に、迅速に、正確に目的遺伝子の抽出、精製、クローニングが可能である。
【００７３】
【表５】
2008099556.tif 000011
【００７４】
表６は、pCY用プローブDNA塩基配列の１塩基上流、1塩基下流（プローブDNAとBS間のスペース塩基配列＝1塩基）を基点とする種々の長さの1本鎖BSを用いた、クローニング効率に与えるBS塩基配列の長さの影響を試験した結果である。
【００７５】
【表６】
2008099556.tif 000012
【００７６】
表６に示すようにプローブDNA塩基配列の１塩基上流、1塩基下流（プローブDNAとBS間のスペース塩基配列＝1塩基）を基点として、BSの塩基配列の長さを多様に変えた同様の実験では、15mer以上の長さで抽出増幅効果が見られた。特に、30merでは、pCY：pGBM比が1/10000では50%(増幅率5000倍を超える)を超える高い濃縮率、1/100000の比でも、BS濃度を100uMで30%(増幅率30000倍を超える) を超える高い濃縮率が見られる。
【００７７】
BSの塩基配列の長さを30merに固定して、プローブDNA塩基配列の端からのスペース塩基距離を種々変化させたUp-BS、Down-BSを用いた実験では、7merまで高い抽出増幅効果が見られた。
また、反応液に加えるBSの濃度は、最終濃度（前記抽出操作の3に相当）1uM以上で抽出効率増大効果が見られるが、10uMから１ｍMの範囲が最も良い効果が得られた。
表７に、プローブ（probe）DNA配列と相補的なターゲット遺伝子配列の上流（５'上流）、下流（３'下流）基点からの、BSの塩基距離の影響を示す。
【００７８】
【表７】
2008099556.tif 000013
【００７９】
BSの塩基配列の長さを30merに固定して、プローブDNA塩基配列の両端からのスペース塩基距離を変更しつつ離して行くと、7merまで50%を超える高い抽出増幅効果が見られるが、それより距離が離れるとSBの効果は急激に失われていく。また、up-BSとDown-BS単独でもある程度の効果（Up-BS単独ではpCY:pGBM比＝1/100で65〜45倍濃縮率、Down-BS単独では35〜25倍濃縮率）が得られるが、Up-BS、Down-BS並存の効果よりかなり低い。
【００８０】
[実施例６] 目的遺伝子を含む閉環状二本鎖DNAを0.1N〜0.4N(規定)のアルカリ（NaOHやKOHなど）溶液中で低温（0℃〜10℃）変性させ、部分一本鎖化させる方法による、目的遺伝子のクローニング
目的遺伝子（ここではpCY）を含む閉環状二本鎖DNAのアルカリ変性時の温度条件の結果を、表８に示す。DNA試料のアルカリ変性温度条件以外は、実施例１と同様の実験操作で行った。
表８にその結果を示す。0℃（氷上）でのDNA試料のアルカリ変性では、非常に高いクローニング効率が得られるに対し、25℃（室温）や37℃ではかなりのクローニング効率の低下が見られた。表８からこの実施例でもBSは必須であることがわかる。DNA試料のアルカリ変性は、実施例１と同様に0.2N NaOH(最終濃度)で40分間行った。10分や20分の変性では、いずれの温度でも抽出プラスミド自体の収量が減少した。
【００８１】
【表８】
2008099556.tif 000014
【００８２】
[実施例７] 閉環状二本鎖目的遺伝子DNAを含む試料とプローブDNA結合粒子との低塩濃度（100〜200mM）下でのハイブリダイゼーションによる、目的遺伝子の固層粒子への抽出・回収・クローニング
表９は、pCYの抽出・精製・クローニングの効率に対する変性試料DNAのBN-CYオリゴ(dG)ラテックス・ビーズ複合体へのハイブリダイゼーション時の溶液の塩濃度の影響を試験した結果である。
【００８３】
【表９】
2008099556.tif 000015
【００８４】
およそ100mMから200ｍMまでの塩濃度では、80%を越すクローニング効率が得られるが、250mM以上では70%を切る低いクローニング効率であり、特にノーザンハイブリダイゼーション等で使用する500mM前後の塩濃度ではクローニング効率は50%程度まで減少する。pCY/pGBM比を1/1000、1/10000とより厳しい条件下で目的遺伝子pCYのクローニングをこれらの塩濃度で行うと、5％以下まで更に低下する。
【００８５】
[実施例８]マウス脳cDNA プラスミドライブラリーからのアクチン(actin)遺伝子ｃDNAクローンの抽出・精製・クローニング
実験に使用したマウス脳cDNAプラスミドライブラリーは、タカラバイオ株式会社から購入した。これを大腸菌にtransfectして、大量培養し、実施例１で示したSDS-アルカリ法とCsCl超遠心法およびDNA吸着膜法で直鎖状DNAや開環状DNAを種々の割合で含む閉環状cDNAプラスミドライブラリーを作製し、実験に使用した。
下記のアクチン遺伝子抽出用の1本鎖プローブDNA、1本鎖Up-BS（最終濃度＝100uM）、1本鎖Down-BS（最終濃度＝100uM）、PCR用プライマー以外は、前記の[実施例１]と同様の操作で抽出・精製・クローニングを行った。
＜アクチンプローブ用1本鎖ブリッジヌクレオチド (BN-アクチン)の調製＞
【００８６】
【化５】
2008099556.tif 000016
【００８７】
アクチン遺伝子のcDNA断片の1023-1052の30塩基とポリC30塩基から構成される１本鎖ブリッジオリゴヌクレオチド用配列（BN−アクチン）を合成し、アクチン遺伝子cDNAプラスミドクローン抽出用プローブDNAとして用いた。
＜ブリッジヌクレオチドBN-アクチンのポリCとハイブリダイズするオリゴ(dG)ラテックス・ビーズ＞
オリゴ(dG)ラテックス・ビーズは、JSR株式会社より購入したものを用いた。BN-アクチンプローブは、ポリC部分でこのラテックス・ビーズのオリゴ(dG)とハイブリザイズし、ビーズ固層に固定される。
＜アクチンプローブDNA塩基配列の上流及び下流のブロッキング配列( BS)＞
−1本鎖Up-BS(上流ブロッキング配列)−
【００８８】
【化６】
2008099556.tif 000017
アクチン遺伝子のcDNA断片の992-1021の30塩基を合成し、用いた。
−1本鎖Down-BS(下流ブロッキング配列)−
【００８９】
【化７】
2008099556.tif 000018
アクチン遺伝子のcDNA断片の1083-1054(マイナス鎖)の30塩基を合成し、用いた。
＜PCR用アクチンプライマー＞
【００９０】
【化８】
2008099556.tif 000019
【００９１】
表１０に示すように、BSを用いない従来法ではアクチン遺伝子cDNAクローンを含むマウス脳cDNAプラスミドライブラリー1ugから、試料５で0個(0%)、試料６で6個(0.56%)、試料７で24個（4.07%）、試料８で4個(1.21)のアクチン陽性プラスミドコロニーが得られた。一方BSを用いた本発明では、試料５で2個(0.23%),試料６で16個(3,20%)、試料７で 101個（43.72%）、試料８でも28個(22.22%)のアクチン陽性プラスミドコロニーが得られた。BSを加えない従来法でも、本発明法のターゲット分子である閉環状DNAが豊富な試料で約4％（100個に4個）の確率でクローニング可能であり、これに本発明法であるBSを加えると更に約44％（100個に44個）と非常に高い確率で実際の遺伝子クローンがクローニングできる。
【００９２】
【表１０】
2008099556.tif 000020
【００９３】
表１０の実験６）から得られたアクチン陽性コロニーの内、2クローンの大腸菌を更に液体培養して、プラスミドを抽出・精製し、インサートDNAの切り出し用制限酵素EcoR1とNot1で切断し、また精製したDNAでPCRを行った結果を図８に示す。ほぼ完全長のアクチンcDNA(1.26k塩基対)を含むクローンが得られていることが明らかである。
【００９４】
[実施例９]マウス脳cDNA プラスミドライブラリーからのHPRT(ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ(Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase))遺伝子ｃDNAクローンの抽出・精製・クローニング
実験に使用したマウス脳cDNAプラスミドライブラリーは、タカラバイオ株式会社から購入した。これを大腸菌にトランスフェクトして、大量培養し、SDS-アルカリ法とCsCl超遠心法で直鎖状DNAや開環状DNAをほとんど含まない閉環状cDNAプラスミドライブラリー（95％以上閉環状DNAからなる）を作製し、実験に使用した。
以下に示すHPRT遺伝子抽出用の1本鎖プローブDNA、1本鎖Up-BS（最終濃度＝100uM）、1本鎖Down-BS（最終濃度＝100uM）、PCR用プライマー以外は、前記の[実施例１]と同様の操作で抽出・精製・クローニングを行った。
＜HPRTプローブ用1本鎖ブリッジヌクレオチド (BN-HPRT)の調製＞
【００９５】
【化９】
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HPRT遺伝子のcDNA断片の899-870の30塩基とポリC30塩基から構成されるブリッジオリゴヌクレオチド用配列（BN−HPRT）を合成し、HPRT遺伝子cDNAプラスミドクローン抽出用プローブDNAとして用いた。
＜ブリッジヌクレオチドBN-HPRTのポリCとハイブリダイズするオリゴ(dG)ラテックス・ビーズ＞
オリゴ(dG)ラテックス・ビーズは、JSR株式会社より購入したものを用いた。BN-HPRTプローブは、ポリC部分でこのラテックス・ビーズのオリゴ(dG)とハイブリザイズし、ビーズ固層に固定される。
＜HPRTプローブDNA塩基配列の上流及び下流のブロッキング配列 (BS)＞
−1本鎖Up-BS(上流ブロッキング配列)−
【００９６】
【化１０】
2008099556.tif 000022
HPRT遺伝子のcDNA断片の930-901(マイナス鎖)の30塩基を合成し、用いた。
−1本鎖Down-BS(下流ブロッキング配列)−
【００９７】
【化１１】
2008099556.tif 000023
HPRT遺伝子のcDNA断片の839-868の30塩基を合成し、用いた。
＜PCR用HPRTプライマー＞
【００９８】
【化１２】
2008099556.tif 000024
【００９９】
表１１に示すように、BSを用いない従来法ではHPRT遺伝子cDNAクローンを含むマウス脳cDNAプラスミドライブラリー1ugから、試料５で0個(0%)、試料６で1個(0.59%)、試料７で6個（1.35%）、試料８で1個(1.02)のHPRT陽性プラスミドコロニーが得られた。一方BSを用いた本発明では、試料５で1個(0.16%),試料６で8個(4.06%),試料７で47個（37.90%）、試料８でも11個(16.41%)のアクチン陽性プラスミドコロニーが得られた。BSを加えない従来法でも、本発明法のターゲット分子である閉環状DNAが豊富な試料で1.35％（100個に1.35個）の確率でクローニング可能であり、これに本発明法であるBSを加えると更に約37.90％（100個に約38個）と非常に高い確率で実際の遺伝子クローンがクローニングできる。
【０１００】
【表１１】
2008099556.tif 000025
【０１０１】
表１１の実験６）から得られたHPRT陽性コロニーの内、2クローンの大腸菌を更に液体培養して、プラスミドを抽出・精製し、インサートDNAの切り出し用制限酵素EcoR1とNot1で切断し、また精製したDNAでPCRを行った結果を図９に示す。ほぼ完全長のHPRT cDNA(1.2k塩基対)を含むクローンが得られた。
【０１０２】
[実施例１０]  HPRT遺伝子プローブ用ブリッジヌクレオチドDNA共有結合粒子によるマウス脳cDNA プラスミドライブラリーからのHPRT遺伝子ｃDNAクローンの抽出・精製・クローニング
＜HPRTプローブ用1本鎖ブリッジヌクレオチドDNA共有結合粒子の調製＞
実施例４のブリッジヌクレオチドDNA共有結合粒子作製法に従い、HPRT遺伝子のcDNA断片の899-870の30塩基とポリC30塩基から構成される以下の式のブリッジオリゴヌクレオチド用配列（BN−HPRT）
【０１０３】
【化１３】
2008099556.tif 000026
を合成し、ポリC部分でラテックス・ビーズのオリゴ(dG)とハイブリザイズさせた後、クレノウ・フラグメント・DNA・ポリメラーゼでHPRTプローブ用1本鎖ブリッジヌクレオチドDNA共有結合粒子を作製した。
【０１０４】
このHPRTプローブ用1本鎖ブリッジヌクレオチドDNA共有結合粒子を用いて、実施例４と同様の抽出操作方法でマウス脳cDNA プラスミドライブラリーからのHPRT遺伝子ｃDNAクローンの抽出・精製・クローニングを行った。HPRT用のBSの濃度、PCR用プライマーは実施例９と同じ濃度を用いて行った。
HPRT遺伝子cDNAクローンを含むマウス脳cDNAプラスミドライブラリー1ugから、６４個のプラスミドコロニーが得られた。コロニーPCRの結果、表１２に示すように、そのうち57個(89%)がHPRT陽性コロニーという驚異的クローニング結果が得られた。  一方、BSを含まない従来法では得られたコロニーの全てが陰性のコロニーであった。
【０１０５】
【表１２】
2008099556.tif 000027
【０１０６】
得られたHPRT陽性コロニーの内、５クローンの大腸菌を更に液体培養して、プラスミドを抽出・精製し、インサートDNAの切り出し用制限酵素EcoR1とNot1で切断し、また精製したDNAでPCRを行った結果を図１０に示す。ほぼ完全長のHPRT cDNA(1.2k 塩基対)を含むクローンが得られた。
【０１０７】
前記本発明による分離、精製、クローニング方法により、目的遺伝子を含むあらゆる由来、サイズ、配列等の閉環状二本鎖DNAを、迅速(24時間以内)、正確、かつ効率よく分離、精製、クローニングすることが可能となる。製薬分野を始めとして、遺伝子を用いるあらゆる産業分野で利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】DNA試料の抽出過程で生じる３タイプのDNAを示す図である。
【図２】目的遺伝子配列とUp-BS、Down-BS配列の位置関係を示す図である。
【図３】SDSアルカリCsCl法で精製したDNA試料(pCYおよびpGBM)の分析結果を示す図である。
【図４】SDSアルカリ法およびSDSアルカリCsCl法で精製したDNA試料(マウス脳cDNAプラスミドライブラリー)の分析結果を示す図である。
【図５】PCRによる、シリテスチンcDNA断片の検出結果を示す図である。
【図６】プローブ用一本鎖ブリッジヌクレオチドにおけるTm値AとTm値Bとの関係を示す図である。
【図７】プローブ用ブリッジヌクレオチドDNA共有結合粒子の作成方法を示す図である。
【図８】本発明の方法によるアクチン遺伝子cDNAプラスミドクローンのクローニング結果を示す図である。
【図９】本発明の方法によるHPRT遺伝子cDNAプラスミドクローンのクローニング結果を示す図である。
【図１０】本発明の方法によるHPRT遺伝子cDNAプラスミドクローンのクローニング結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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