(57)【要約】【課題】  種苗を包含する養殖時の養魚が病害に曝されることなく、健常に成長させることのできる魚類用免疫能増強剤ならびにそれを用いた餌料組成物および養殖魚の生産方法を提供すること。【解決手段】  魚類用免疫能増強剤ならびにそれを用いた飼料組成物および養殖魚の生産方法が開示されている。本発明の魚類用免疫能増強剤は、繰返し単位としてβ−ヒドロキシ脂肪酸を含む重合体を含有する。本発明の魚類用免疫用増強剤は、飼料要素とともに配合して飼料組成物として使用することができ、養殖産業における養殖魚の生産効率性を高めることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
繰返し単位としてβ−ヒドロキシ脂肪酸を含む重合体を含有する、魚類用免疫能増強剤。
【請求項２】
前記β−ヒドロキシ脂肪酸がＣ３からＣ１０の炭素原子を有する脂肪酸である、請求項１に記載の魚類用免疫能増強剤。
【請求項３】
前記重合体が、β−ヒドロキシ酪酸、β−ヒドロキシプロピオン酸、β−ヒドロキシ吉草酸、β−ヒドロキシカプロン酸、β−ヒドロキシカプリル酸、およびβ−ヒドロキシカプリン酸からなる群から選択される少なくとも１種のβ−ヒドロキシ脂肪酸を繰返し単位として含んでいる、請求項１に記載の魚類用免疫能増強剤。
【請求項４】
前記重合体がポリヒドロキシ酪酸である、請求項３に記載の魚類用免疫能増強剤。
【請求項５】
繰返し単位としてβ−ヒドロキシ脂肪酸を含む重合体を含有する魚類用免疫能増強剤と、少なくとも１種の餌料要素とを含有する、魚類の免疫能を増強させるための餌料組成物。
【請求項６】
繰返し単位としてβ−ヒドロキシ脂肪酸を含む重合体を含有する魚類用免疫能増強剤を養魚に投与する工程を包含する、養殖魚の生産方法。
【請求項７】
前記魚類用免疫能増強剤が、少なくとも１種の餌料要素と一緒に混合された餌料組成物の形態で前記養魚に投与される、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類用免疫能増強剤ならびにそれを用いた餌料組成物および養殖魚の生産方法に関し、より詳細には、養殖現場における養殖魚の生産または飼育効率を高めることのできる、魚類用免疫能増強剤ならびにそれを用いた餌料組成物および養殖魚の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、水産資源保護などの観点より、養殖を含む栽培漁業の必要性がますます高くなってきている。養殖漁業は筏、棚、延縄、生簀、池、水槽などの施設を用いて魚介類などの水産物を管理し、人為的にその成長を図ろうとするものである。
【０００３】
魚介類の養殖においても経済性は重視すべきである。この経済性を高めるためには、例えば、高密度な養殖および栄養強化された餌料の使用が提案されている。
【０００４】
高密度な状態で養殖される養魚は、一般に自然環境で成長している魚類と比較してストレスに曝されており、魚自身の免疫力が低下していると言われている。また、魚病細菌が薬剤耐性を獲得するなどの理由から、養魚の疾病状況の悪化も問題とされている。こうした魚病には、ブリの連鎖球菌症、類結節症、ノカルジア症、タイのビブリオ病、イリドウイルス感染症、サケ類の細菌性腎臓病、マス類のビブリオ病、伝染性造血器壊死症、伝染性膵臓壊死症、ウナギのパラコロ病、鰭赤病、赤点病、コイの穴あき病、クルマエビのビブリオ病などが挙げられる。
【０００５】
これらの疾病対策、特に細菌性疾病対策として以前から抗生物質などの薬剤の使用が行われている。しかし、各種薬剤に対する耐性菌の出現や大量の薬剤投与による魚類への残留等が大きな社会問題となっていることから、抗生物質などの投与を削減し、品質の高い魚類を生産するために、魚類の栄養学的、免疫学的立場からの改善を可能にした機能性餌料の開発が所望されている。
【０００６】
ここで、現在、魚類免疫系に対して賦活作用が認められている物質は少ない。例えば、グルカン（特許文献１および２）、グリチルリチン（特許文献３）、卵白（特許文献４）、所定の水難溶性微粒子低分子キチン（特許文献５）、５’−ヌクレオチド（特許文献６）、醗酵産生物である塩基性アミノ酸を含むポリペプチド（特許文献６）、ならびにアルカリゲネス・フェカリスおよびアグロバクテリウム属のバクテリアの産生する直鎖のβ−１，３−グルカンであるカードラン（特許文献７）などを含む魚類用免疫能増強剤が挙げられるが、これらすべてが充分に魚類の免疫能を増強させ得るものとは言い難い。
【０００７】
他方、従来の魚類用免疫能増強剤が、孵化してから成魚になるまでの養魚に対し、万能に効果的であるともいえない。特に、孵化して間もない状態の養魚の個体（種苗）の段階では、それ自体が副作用を引き起こし、骨格異常などのいわゆる奇形を生じ、種苗生産の効率に影響することもあり得るからである。
【０００８】
一般に種苗生産の現場においては、生産効率を高める上で、健全な種苗（健苗）育成技術の開発が所望されている。こうした健苗育成に関する技術としては、例えば、初期形態形成過程から見た形態学的なアプローチが知られている。
【０００９】
上記形態学的なアプローチから見た健苗育成技術としては、例えば、特許文献８に記載の方法が挙げられる。すなわち、特許文献８では、飼育水槽から取出した、ヒラメ、ブリ、オニオコゼなどの飼育種苗の全長と特定の主要部位長さを測定し、これを予め準備しておいた健苗の全長と当該主要部位長さとの成長変化から得られる相対成長曲線上にプロットし、その信頼値範囲に属するか否かを判別することによって飼育種苗の骨格異常形成を診断することが開示されている。さらに、特許文献８は、このような診断方法を利用して飼育水槽中の種苗に対する潜在的な骨格成長生残率をも予測して種苗の生産効率を高めることを開示している。
【００１０】
健種苗育成技術の他のアプローチとしては、生理学的な観点（すなわち、種苗各々の代謝能の向上と、免疫能の向上）が挙げられる。
【００１１】
代謝能の観点から見た健苗育成技術のアプローチとは、種苗の各成長段階におけるエネルギー効率（代謝効率）を高めるために、どのような飼育条件を設定すべきかとするものである。他方、免疫能の観点から見た健苗育成技術のアプローチとしては、魚病の影響を受けることなく種苗を如何にして健全に飼育すべきかというものである。特に後者の免疫能の向上においては、単に魚病に罹らないように種苗に対して強力な薬品を投与すればいいというものではない。これらの種苗は将来養殖魚となって家庭の食卓に上り、消費者であるヒトが直接摂取するものである。このため、いわゆる”薬漬けの魚”のイメージが定着してしまっては、養殖業界に風評被害を与えることも考えられる。
【００１２】
よって、種苗およびその延長に属する養魚の生産過程において、魚病に対する免疫能の向上はより強く所望されるものの、消費者に与えるイメージをも損なわないような配慮も必要とされる。すなわち、免疫能の向上のために、種苗および養魚だけでなく、それを摂取するヒトに対しても副作用などの悪影響を引き起こす懸念が回避された安全な免疫能増強剤の開発が所望されている。
【００１３】
【特許文献１】特開平２−２１８６１５号公報
【特許文献２】特開平２−２５６６２０号公報
【特許文献３】特開平２−２５０８３２号公報
【特許文献４】特開平３−２５１５３７号公報
【特許文献５】特開平６−２７１４７０号公報
【特許文献６】特開２０００−３２５０２６号公報
【特許文献７】特開平１０−３１３７９４号公報
【特許文献８】特開２００６−３０４７８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、上記問題の解決を課題とするものであり、その目的とするところは、種苗を包含する養殖時の養魚が病害に曝されることなく、健常に成長させることのできる魚類用免疫能増強剤ならびにそれを用いた餌料組成物および養殖魚の生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、繰返し単位としてβ−ヒドロキシ脂肪酸を含む重合体を含有する、魚類用免疫能増強剤である。
【００１６】
１つの実施態様では、上記β−ヒドロキシ脂肪酸はＣ３からＣ１０の炭素原子を有する脂肪酸である。
【００１７】
１つの実施態様では、上記重合体は、β−ヒドロキシ酪酸、β−ヒドロキシプロピオン酸、β−ヒドロキシ吉草酸、β−ヒドロキシカプロン酸、β−ヒドロキシカプリル酸、およびβ−ヒドロキシカプリン酸からなる群から選択される少なくとも１種のβ−ヒドロキシ脂肪酸を繰返し単位として含んでいる。
【００１８】
さらなる実施態様では、上記重合体はポリヒドロキシ酪酸である。
【００１９】
本発明はまた、繰返し単位としてβ−ヒドロキシ脂肪酸を含む重合体を含有する魚類用免疫能増強剤と、少なくとも１種の餌料要素とを含有する、魚類の免疫能を増強させるための餌料組成物である。
【００２０】
本発明はまた、繰返し単位としてβ−ヒドロキシ脂肪酸を含む重合体を含有する魚類用免疫能増強剤を養魚に投与する工程を包含する、養殖魚の生産方法である。
【００２１】
１つの実施態様では、上記魚類用免疫能増強剤は少なくとも１種の餌料要素と一緒に混合された餌料組成物の形態で上記養魚に投与される。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、養魚を病害に曝すことなく健全に養殖魚を得ることができる。本発明の魚類用免疫能増強剤は、養魚に副作用を与えることなく、その免疫能を増強させることができる。また、本発明の魚類用免疫能増強剤を構成する成分は、ヒトが通常摂取し得るものであるため、仮に養殖魚の体内に残留していたとしても、これを食したヒトの健康に影響を与えることもない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳述する。
【００２４】
＜魚類用免疫能増強剤＞
本発明の魚類用免疫能増強剤は、本質的に、特定の重合体から構成される。
【００２５】
本発明の魚類用免疫能増強剤は、魚類一般に対し経口摂取によって体内への取り込みが行われるものをいう。ここで、本発明おいて対象となり得る魚類の種類には、例えば、市場価値の高い魚類または熱帯魚のような観賞魚が挙げられる。これら魚類は海水魚または淡水魚のいずれのものであってもよく、より具体的な例としては、ブリ、カンパチ、ヒラメ、マダイ、トラフグ、オニオコゼ、カレイ、アジ類、サバ類、イワシ類、キス、メバル、サケ類、マス類、アユ、コイ、ヤマメ、フナ、またはキンギョなどが挙げられるが特にこれらに限定されない。さらに、本発明の魚類用免疫能増強剤は、上記のような魚類の成魚だけでなく孵化後の種苗、幼魚などの各種成長段階のいずれにおいても使用することができる。特に、繊細な生産条件を要求される種苗においても有用に用いられ得る。
【００２６】
本発明に用いられる重合体は、β−ヒドロキシ脂肪酸を繰返し単位として含む重合体である、好ましくは、Ｃ３からＣ１０の炭素原子を有するβ−ヒドロキシ脂肪酸を繰返し単位として含む重合体である。
【００２７】
このようなβ−ヒドロキシ脂肪酸を繰返し単位として含む重合体の例としては、β−ヒドロキシ酪酸、β−ヒドロキシプロピオン酸、β−ヒドロキシ吉草酸、β−ヒドロキシカプロン酸、β−ヒドロキシカプリル酸、β−ヒドロキシカプリン酸、およびこれらの組み合わせが挙げられる。本発明においては、入手が容易であるとの理由から、β−ヒドロ気シ酪酸単独を繰返し単位として有する重合体、すなわち、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を用いることが好ましい。このようなＰＨＢは、経口摂取を経て胃や小腸で全量が分解されることなく、大腸まで届く送達物質であり、かつ従来より公知の短鎖または中鎖脂肪酸と同様の生理作用を発現し得ることが知られている。
【００２８】
ポリヒドロキシ酪酸は、例えば、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）の前培養物を培地に摂取・培養させることにより当業者は容易に得ることができる。このようなポリヒドロキシ酪酸の製造方法は、例えば、国際公開第ＪＰ２００４／０１２６３８号パンフレットに開示されている。
【００２９】
本発明の魚類用免疫能増強剤を製造するにあたり、上記繰返し単位としてβ−ヒドロキシ脂肪酸を含む重合体は後述するような餌料組成物を製造する際に、餌料要素と一緒に両者をそれぞれ混合して製造することもできる。あるいは、当該重合体を当業者に公知の手法でマイクロカプセル化させてもよい。
【００３０】
本発明の魚類用免疫能増強剤は、上記投与対象の魚類（養魚）の給餌の際、餌料とともに投与してもよく、あるいはこれとは別のタイミングで当該養魚に与えてもよい。なお、養魚１個体に対する投与量は、必ずしも限定されず、投与対象の魚類（養魚）の種類、投与時の成長段階、その他投与条件によって適宜変動され得る。
【００３１】
＜餌料組成物＞
本発明の餌料組成物は、少なくとも１種の餌料要素とともに、上記魚類用免疫増強剤として上記繰返し単位としてβ−ヒドロキシ脂肪酸を含む重合体を含有する。当該餌料組成物は、上記魚類用免疫能増強剤を構成する当該重合体を含有することにより、給餌した養魚の免疫能を通常の餌料を用いた場合よりも増強させることができる。
【００３２】
本発明に用いられる餌料要素は、養殖産業一般において通常に使用される養魚の生育に必要な栄養成分全般を包含し、例えば、ワムシ、アルテミア、クロレラなどの餌料生物；大豆粉、米粉などの穀粉；大豆油、魚油などの脂質分；魚粉、サナギ粉、生魚肉ミンチなどの魚介系餌料；麩；α化澱粉、コムギグルテン、カゼインナトリウム、アルギン酸ナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、各種植物ガム、ダイズホエイなどの公知の粘結剤；各種のビタミン源；各種のミネラル源；各種のタンパク源；フラクトオリゴ糖、乳糖、オリゴ糖、ガラクトオリゴ糖などのプレビオティクス成分；などが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。複数の餌料要素が用いられる場合、各要素の構成比は特に限定されず、当業者によって適宜選択され得る。
【００３３】
本発明の餌料組成物における上記繰返し単位としてβ−ヒドロキシ脂肪酸を含む重合体の含有量（すなわち、魚類用免疫能増強剤の含有量）は、投与対象の魚類（養魚）の種類、投与時の成長段階、その他投与条件によって変動され得るため、必ずしも限定されないが、例えば、全体重量を基準として、好ましくは０．０１重量％〜４重量％であり、より好ましくは０．０５重量％〜３重量％であり、さらにより好ましくは０．１重量％〜２重量％である。
【００３４】
本発明において、上記繰返し単位としてβ−ヒドロキシ脂肪酸を含む重合体と餌料要素とは、当業者に周知の手段を用いてそれぞれが混合され、周知の方法により、ドライペレットなどの形態に加工され得る。
【００３５】
本発明の魚類用免疫能増強剤は、上記投与対象の魚類（養魚）の給餌の際、餌料とともに投与してもよく、あるいはこれとは別のタイミングで当該養魚に与えてもよい。なお、養魚１個体に対する投与量は、必ずしも限定されず、投与対象の魚類（養魚）の種類、投与時の成長段階、その他投与条件によって適宜変動され得る。
【００３６】
＜養殖魚の生産方法＞
次に、本発明の養殖魚の生産方法について説明する。
【００３７】
本発明においては、養殖対象となる養魚（例えば、市場価値の高い魚類または熱帯魚のような観賞魚が挙げられ、これら魚類は海水魚または淡水魚のいずれのものであってもよく、さらに具体的な例としては、ブリ、カンパチ、ヒラメ、マダイ、トラフグ、オニオコゼ、カレイ、アジ類、サバ類、イワシ類、キス、メバル、サケ類、マス類、アユ、コイ、ヤマメ、フナ、またはキンギョなどが挙げられる）に対し、上記魚類用免疫能増強剤または餌料組成物が投与される。なお、本発明の生産方法において、上記魚類用免疫能増強剤および餌料組成物は、上記のような魚類の成魚だけでなく孵化後の種苗、幼魚などの各種成長段階のいずれにおいても使用することができる。特に、繊細な生産条件を要求される種苗においても有用に用いられ得る。
【００３８】
本発明においては、上記養魚は、必要に応じて水温管理などがなされた、養殖漁業において通常に使用される施設・手段（例えば、筏、棚、延縄、生簀、池、水槽など）内に開放されており、当業者があらかじめ設定した時間間隔および量で上記魚類用免疫能増強剤および／または餌料組成物が投与される。なお、養魚１個体に対する投与量は、必ずしも限定されず、投与対象の魚類（養魚）の種類、投与時の成長段階、その他投与条件によって適宜変動され得る。
【００３９】
このような投与工程を通じて当該養魚を飼育することにより、免疫能が高められた養殖魚を生産することができる。免疫能の増強した養魚は、飼育水槽内で死滅する、あるいは骨格形成異常などによって商品価値を低下させるようなことはなく、市場利用価値の高い養魚の生産効率を高めることができる。
【００４０】
なお、本明細書において、上記繰返し単位としてβ−ヒドロキシ脂肪酸を含む重合体を含有する重合体、およびポリヒドロキシ酪酸は、魚類の免疫能増強剤として有用に用いられ得ることを開示したが、本発明は少なくとも対象は魚類に限定されない。すなわち、種々の免疫系を備える脊椎動物を対象にして、各種免疫能の向上を図ることが期待される。このような脊椎動物の例としては、鳥類、哺乳類が包含される。すなわち、ニワトリ、ウシ、ブタ、ウマなどの家禽・家畜類に対する免疫増強剤および飼料組成物の構成材料として、ならびにヒトに対する免疫増強剤および特定保健用食品などの食品構成材料として用いることが期待され得る。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。しかし、これらによって本発明は限定されるものではない。
【００４２】
＜調製例１：ミネラル源の予備調製＞
ＮａＣｌ（１ｇ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１５ｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（２５ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（３２ｇ）、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２・Ｈ２Ｏ（２０ｇ）、ＦｅＣ６Ｈ５Ｏ７・ｎＨ２Ｏ（２．５ｇ）、Ｃ６Ｈ１０Ｏ６Ｃａ・５Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．６ｇ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．１ｇ）、ＣｏＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（０．００３５ｇ）、ＫｌＯ３（０．０１０５ｇ）およびセルロース（１．５８６ｇ）を混合し、ミネラル源の予備調製物を調製した。
【００４３】
＜調製例２：ビタミン源の予備調製＞
チアミンヒロドクロリド（０．７２ｇ）、リボフラビン（１．２１ｇ）、ピリドキシンヒドロクロリド（０．４８ｇ）、シアノコバラミン（０．０６ｇ）、アスコルビン酸（６０．４０ｇ）、ナイアシン（４．８３ｇ）、カルシウムパントセネート（１．２１ｇ）、イノシトール（２４．１５ｇ）、ビオチン（３．６２ｇ）、葉酸（０．１８ｇ）、ｐ−アミノ安息香酸（０．６０ｇ）、ビタミンＡアセテート（０．９７ｇ）、ビタミンＤ３（０．９７）、およびビタミンＫ３（０．６０ｇ）を混合し、ビタミン源の予備調製物を調製した。
【００４４】
＜実施例１：餌料ペレットＡ１の製造＞
タンパク源としてのアジミール（魚粉）（５５重量％）と、脂質源としての大豆油（３重量％；（有）林ケミカル製）およびタラ肝臓油（８重量％；栄研商事（株）製）、小麦粉（１７重量％）、予めゼラチン化させておいたスターチ（５重量％）、調製例１で得られたミネラル源調製物（３重量％）、調製例２で得られたビタミン源調製物（１重量％）、塩化コリン（０．５重量％）、ビタミンＥ（０．１重量％；純度５０％のＤＬ−α−トコフェニルアセテート）、セルロース（５．４重量％）、およびポリヒドロキシ酪酸（外割り２重量％）を、ミキサー（（株）愛工舎製作所製ＡＣＭ−５０  ＬＡＴ）で機械混合し、これに蒸留水を１ｋｇあたり約３５％となるように添加し、ペレット成形機（（株）平賀工作所製ＡＦＺ１２Ｍ）で直径８ｍｍのペレットに成形した。これを、凍結乾燥機（共和真空技術（株）製ＲＥＬ２０６）内で凍結乾燥して、餌料ペレットＡ１とした。この餌料ペレットＡ１を、さらなる使用まで−２０℃にて保管した。
【００４５】
＜実施例２：餌料ペレットＡ２の製造＞
ポリヒドロキシ酪酸の含有量を外割り１重量％ととし、かつセルロースの含有量を６．４重量％に変更したこと以外は、実施例１と同様にして餌料組成物を得、実施例１と同様にして凍結乾燥することにより餌料ペレットＡ２を得た。
【００４６】
＜実施例３：餌料ペレットＡ３の製造＞
ポリヒドロキシ酪酸の含有量を外割り０．５重量％ととし、かつセルロースの含有量を６．９重量％に変更したこと以外は、実施例１と同様にして餌料組成物を得、実施例１と同様にして凍結乾燥することにより餌料ペレットＡ３を得た。
【００４７】
＜実施例４：餌料ペレットＡ４の製造＞
ポリヒドロキシ酪酸の含有量を外割り０．２５重量％ととし、かつセルロースの含有量を７．１５重量％に変更したこと以外は、実施例１と同様にして餌料組成物を得、実施例１と同様にして凍結乾燥することにより餌料ペレットＡ４を得た。
【００４８】
＜比較例１：餌料ペレットＢ（コントロール）の製造＞
ポリヒドロキシ酪酸を含有させることなく、かつセルロースの含有量を７．４重量％に変更したこと以外は、実施例１と同様にして餌料組成物を得、実施例１と同様にして凍結乾燥することにより餌料ペレットＢを得た。これをコントロールとした。
【００４９】
＜実施例５：魚類種苗への給餌とその免疫能の評価＞
１．養殖条件
１８℃の水温に保たれた、５つの５００リットルのダイライト水槽に、それぞれ平均全長１５．４６±１．５７ｃｍかつ平均重量３０．９６±１０．０７ｇのヒラメ種苗を５０尾ずつ収容した。その後１２日間（２００６年１１月２２日〜２００６年１２月３日）を馴到飼育期間とした。なお、この馴到飼育期間における給餌条件を、当該５水槽に対し、比較例１で得られ餌料ペレットＢを、朝８：００、昼１３：００、夕刻１７：００の時間に、各水槽の総重量に対する３％が１日の給餌量となるように設定した。
【００５０】
上記馴到飼育期間の終了後、上記のうち４水槽には、比較例１で得られた餌料ペレットＢの代わりに、実施例１〜実施例４で得られた餌料ペレットＡ１〜Ａ４のそれぞれを同様の給餌条件でヒラメ種苗に給餌した。他方の１水槽は、比較例１で得られた餌料ペレットＢを上記と同様の給餌条件でヒラメ種苗に給餌した。
【００５１】
なお、上記５水槽について、０週目から５週目までの１週間おきに、各水槽から３尾を取出し、各種苗の腎臓摘出および比重分離を通じて白血球を回収し、当該白血球に対して以下の白血球貪食能試験および包囲化試験を行った。
【００５２】
２．腎臓摘出・比重分離の方法
まず、各水槽から取出したヒラメ種苗から腎臓を摘出し、５％加イーグルＭＥＭ培地（以下、培地）を５ｍｌ入れたシャーレに摘出腎臓を入れた。これをステンレスメッシュで濾して白血球遊離細胞を分離した。分離した白血球遊離細胞を含む培地を１５ｍｌ容試験管に収容し、低速遠心分離機（ＴＯＭＹ（株）製型番：ＬＣ−１２１:２，３００／ｒｐｍ，５分間）を用いて遠心し、上清を除去した後に当該培地を８ｍｌ加えた。比重液として１．０６５Ｐｅｒｃｏｌｌ液（バイオサイエンス（株））（３．６ｍｌ）、１．５塩化ナトリウム（０．４ｍｌ）０．１５Ｍ塩化ナトリウム（４．１２８ｍｌ）を用いて細胞浮遊液を得た。その後、低速遠心分離機（ＴＯＭＹ（株）製型番：ＬＣ−１２１：７００／ｒｐｍ，５  分間、さらに１５００／ｒｐｍ，１５分間）にて比重分離を行い、沈殿した白血球を回収した。これに当該培地を加えて１５ｍｌにし、低速遠心分離機（ＴＯＭＹ（株）製型番：ＬＣ−１２１:２，３００／ｒｐｍ，５分間）を用いて遠心し、さらに培地を４ｍｌ加えて低速遠心分離機（ＴＯＭＹ（株）製型番：ＬＣ−１２１:２，３００／ｒｐｍ，５分間）を用いて遠心した。さらに上清を除去し、培地を２ｍｌ加えてマイクロピペットで攪拌し、低速遠心分離機（ＴＯＭＹ（株）製型番：ＬＣ−１２１:２，３００／ｒｐｍ，５分間）を用いて遠心し上清を除去し培地を２ｍｌ加えた。次いで、得られた残渣に含まれる白血球数をトーマ血球計算盤（エルマ販売（株））で計数し、培地で濃度調製して、１．０×１０６細胞の白血球浮遊液と、２．０×１０６細胞の白血球浮遊液とを得た。
【００５３】
３．白血球貪食能試験
上記で得られた１．０×１０６細胞の白血球浮遊液（１００μｌ）と、１０ｍｇ／ｍｌザイモサン（Ｚｙｍｏｓａｎ）（５μｌ）とをマイクロチューブに入れ、２０℃で３０分間培養した。次いで、得られた培養液をスライドガラスに塗抹し、これをギムザ染色した。その後、バイオライト（応用商事（株））で封入し顕微鏡で当該ザイモサンを貪食した細胞の数を目視でカウントした。これにより以下の貪食率と貪食指数とを計算した。
【００５４】
【数１】
2008231070.tif 000002
【００５５】
４．包囲化試験
上記で得られた２．０×１０６細胞の白血球浮遊液（１００μｌ）と、培地（８０μｌ）と、２４０細胞／ｍｌに調整したホルマリン不活化Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｏｎｕｓ  ｈｏｆｅｒｉ（２０μｌ）（ニジマスなど淡水魚の真菌症の原因ととなる真菌であって、これを一旦ホルマリンで死滅させ、その後ホルマリンを除去し、これを培地中に２４０細胞／ｍｌとなるように懸濁させたもの）とを９６穴の平底マイクロプレート３穴にそれぞれ混合して加え、２０℃で１２時間培養した。これにより、Ｉ．ｈｏｆｅｒｉの周囲を白血球で包囲させた。その後、マイクロプレート内の上清を包囲細胞とともに取出し、５％ホルマリンで固定し、保存した。この包囲細胞を、スライドガラス上に配置し、画像形成装置（ニコン社製Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｉｇｈｔ  ＤＳ−ＳＭ）を備えた顕微鏡（ニコン社製Ｎｉｋｏｎ  ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｅ６００）で画像解析し、以下の式：
【００５６】
【数２】
2008231070.tif 000003
【００５７】
により、それぞれの包囲形成指標を算出した。なお、包囲形成指標が３以上である場合、当該白血球がＩ．ｈｏｆｅｒｉを充分に包囲しており免疫能を充分発揮していることがわかる。
【００５８】
得られた結果を表１〜３に示す。
【００５９】
【表１】
2008231070.tif 000004
【００６０】
【表２】
2008231070.tif 000005
【００６１】
【表３】
2008231070.tif 000006
【００６２】
表１〜表３より明らかなように、本発明の魚類用免疫能増強剤を含有させた餌料ペレットＡ１〜Ａ４はいずれも、貪食率、貪食指数および／または包囲形成指数のいずれかにおいて、コントロール（比較例１）の結果と比較してヒラメ種苗の免疫能を増強させていることがわかる。特に、ポリヒドロキシ酪酸を２重量％にした餌料ペレットＡ１では、貪食率、貪食指数および包囲形成指数の全てについて、コントロールとの有意差を示しており、魚類種苗の免疫能のうち、白血球貪食能および包囲化能の両方に効果的であることがわかる。他方、ポリヒドロキシ酪酸の含有量を低下させるほど（実施例２〜４の餌料ペレットＡ２〜Ａ４を使用するほど）、白血球貪食能は、給餌開始後に徐々に増強される傾向にあり（表１）、他方、包囲化能は早期に増強される傾向にあることがわかる（表３）。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明によれば、養魚に対して安全な魚類用免疫能増強剤が提供される。このような魚類用免疫能増強剤は、飼料要素とともに配合して飼料組成物として使用することができる。さらに、本発明の魚類用免疫能増強剤は、養殖産業における養殖魚の生産効率性を高めることができる。なお、本発明の免疫能増強剤の対象は少なくとも魚類に限定されず、種々の免疫系を備える脊椎動物（例えば、家禽・家畜およびヒト）を対象にして、各種免疫能の向上を図ることも期待される。